(57)【要約】【課題】種子植物において、受精を経ずに果実の生長を人為的に誘導する手法を提供する。【解決手段】種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず果実の生長を誘導するための核酸分子であって、果実生長誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子。【選択図】図１
2019149990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず果実の生長を誘導するための核酸分子であって、果実生長誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子。
【請求項２】
果実生長誘導機能を有するポリペプチドが、下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドである、請求項１に記載の核酸分子。
ＫＫＬＲＬＳＫＤＱＳＡ［Ｉ／Ｖ／Ｆ］ＬＥ［Ｄ／Ｅ］ＴＦＫ［Ｄ／Ｅ］Ｈ［Ｎ／Ｓ］ＴＬＮＰＫＱＫ［Ｌ／Ｑ］ＡＬＡＫ［Ｑ／Ｋ］Ｌ［Ｇ／Ｎ］Ｌ［Ｔ／Ｒ］ＡＲＱＶＥＶＷＦＱＮＲＲＡＲＴＫＬＫＱＴＥＶＤＣＥ［Ｆ／Ｙ］Ｌ［Ｋ／Ｒ］ＲＣ［Ｃ／Ｖ］Ｅ［Ｎ／Ｋ］ＬＴＥＥ
・・・（Ｉ）
【請求項３】
果実生長誘導機能を有するポリペプチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、及び、配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドである、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
果実生長誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、及び、配列番号１４からなる群より選択される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、請求項１〜３の何れか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子が更に、転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含み、果実生長誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列と、転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、インフレームで連結されている、請求項１〜４の何れか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
転写抑制機能を有するポリペプチドが、下記式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）、又は、（IIｄ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドである、請求項５に記載の核酸分子。
［Ｌ／Ｆ］ＤＬＮ［Ｌ／Ｆ］［Ｘ］Ｐ                ・・・（IIａ）
［Ｌ／Ｖ］［Ｒ／Ｋ］ＬＦＧＶＸ［Ｍ／Ｖ／Ｌ］      ・・・（IIｂ）
ＴＬＸＬＦＰ                                      ・・・（IIｂ）
ＴＬＸＬＦＲ                                      ・・・（IIｄ）
（但し、上記式（IIａ）〜（IIｄ）中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）
【請求項７】
転写抑制機能を有するポリペプチドが、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号２１からなる群より選択されるアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドである、請求項５又は６に記載の核酸分子。
【請求項８】
転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、及び配列番号２２からなる群より選択される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、請求項５〜７の何れか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記核酸分子が更に、プロモーター領域の塩基配列を含み、果実生長誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、プロモーター領域の塩基配列と機能的に連結されている、請求項１〜８の何れか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子が更に、ターミネーター領域の塩基配列を含み、果実生長誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、ターミネーター領域の塩基配列と機能的に連結されている、請求項１〜９の何れか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか一項に記載の核酸分子を担持するベクター。
【請求項１２】
植物ウイルスベクター又はアグロバクテリウムベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
受精を介さず果実を生育しうる組換種子植物を作製する方法であって、請求項１〜１０の何れか一項に記載の核酸分子、又は、請求項１１若しくは１２に記載のベクターを、種子植物細胞内に導入して発現させることを含む方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０の何れか一項に記載の核酸分子、又は、請求項１１若しくは１２に記載のベクターが、細胞内に組み込まれている組換え種子植物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法により作製される組換え種子植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受精を介さず種子植物の果実の生長を誘導する核酸及びベクターと、斯かる核酸及びベクターを用いた、受精を介さず果実の生長が誘導される組換え種子植物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種子植物の種子は、主に胚及び胚乳から構成される。胚は受精卵が発育してなる幼植物個体であり、これが発芽・成長することで次世代の植物となる。胚乳は胚に隣接した組織で、発芽に際して胚の成長に必要な養分を供給する働きを有する。胚乳の構造は、雌性配偶体である胚嚢に由来する内乳と、胞子体組織に由来する周乳とに分けられる。胚及び胚乳は珠皮に包まれて胚珠を構成し、これが成熟して種子を形成する。裸子植物では胚珠は剥き出しで存在するが、被子植物では胚珠が子房に覆われており、子房が成熟して果実を形成する。
【０００３】
被子植物において、雌蕊に含まれる胚嚢は、その一端に３つの反足細胞を、他端には単一の卵細胞を含む３つの細胞からなる卵装置を有する。また、胚嚢の中央には２つの極核が存在する。雌蕊が受粉すると、花粉から伸長した花粉管により２個の精細胞が胚嚢内に運ばれ、これらがそれぞれ胚嚢内の卵細胞及び２つの極核と受精する（これを重複受精（double fertilization）と呼ぶ）。一方の精細胞と卵細胞との受精（これを生殖受精と呼ぶ）により核相２ｎの受精卵が生じ、これが分裂して胚を形成する。また、他方の精細胞と２つの極核との受精（これを栄養受精と呼ぶ）により核相３ｎの胚乳核が生じ、これが胚嚢内で分裂増殖して内乳を形成すると共に、胚乳を形成する。
【０００４】
被子植物においては、栄養受精が生じないと果実が発生しないか、発生してもその生長が誘導されない場合が多い。しかし、作物の生産効率向上等の観点からは、種子植物において、受精を経ずに果実の発生及び生長を人為的に誘導することができると望ましい。
【０００５】
受精を介さない果実の発生及び肥大（以下「単為結果性」という場合がある。）は、受粉作業などの面倒な農作業を簡便化し、食味を邪魔する種子の無い果実を作るために重要であり、従来、化学物質を用いる方法などが開発されてきた。農業資材やその施用方法としては、例えばブドウの栽培において果実の肥大促進を目的として広く行われているジベレリン処理や、スイカにおけるコルヒチン処理が知られている。さらに近年では、高純度の硫酸マグネシウムを施用しイチゴの果実を肥大させる方法（特許文献１：特開２００１−１７２０９３号）が開発されている。しかし、これらは未受精の蕾一つ一つに薬品を処理する必要性があり、作業の軽減に役に立つわけではない。また、処理に用いる化学物質の安全性などの問題もあった。
【０００６】
他方、トマトなどにおいては、受精を介さずに果実が肥大する単為結果性をもつ天然の品種が知られており、単為結果性を持つ品種と産業的に有用な性質を持つ品種との交配によって、食味や生産性の良い品種に単為結果性を付与する手法の開発や、単為結果性を引き起こす原因遺伝子の特定などが行われている。特許としては、単為結果性品種の開発方法が知られている（特許文献２：国際公開第１９９９／０２１４１１号；特許文献３：国際公開第２０００／０７４４６８号；特許文献４：特開２０１１−０４５３７３号；特許文献５：国際公開第２００９/０９８９８３号）。さらに、トマトの単為結果性品種の解析などから単為結果に関与する遺伝子ＰＡＴやＩＡＡなどが報告され、これら遺伝子の変異体を用いた種無し果実作製法も特許出願されている（特許文献６：国際公開第２００９／００５３４３号）。しかし、単為結果性を持つ品種が存在しているのはトマトなど一部の農作物に限られており、単為結果性品種のない作物においては交配による単為結果品種の作出は不可能であった。
【０００７】
また、これまで特定された単為結果性に関与する遺伝子は、遺伝子に変異が入ることによって単為結果性が誘導されていることから、他の作物に応用することが困難であったため、汎用的な効果をもつ新たな技術の開発が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１７２０９３号公報
【特許文献２】国際公開第１９９９／０２１４１１号
【特許文献３】国際公開第２０００／０７４４６８号
【特許文献４】特開２０１１−０４５３７３号公報
【特許文献５】国際公開第２００９／０９８９８３号
【特許文献６】国際公開第２００９／００５３４３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、種子植物において、受精を経ずに果実の生長を人為的に誘導する手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、特定の遺伝子を果実生長誘導因子として種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さずとも種子植物の果実の生長を誘導することが可能となることを見いだし、本発明に到達した。
【００１１】
即ち、本発明は、以下に関する。
［１］種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず果実の生長を誘導するための核酸分子であって、果実生長誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子。
［２］果実生長誘導機能を有するポリペプチドが、下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドである、［１］の核酸分子。
ＫＫＬＲＬＳＫＤＱＳＡ［Ｉ／Ｖ／Ｆ］ＬＥ［Ｄ／Ｅ］ＴＦＫ［Ｄ／Ｅ］Ｈ［Ｎ／Ｓ］ＴＬＮＰＫＱＫ［Ｌ／Ｑ］ＡＬＡＫ［Ｑ／Ｋ］Ｌ［Ｇ／Ｎ］Ｌ［Ｔ／Ｒ］ＡＲＱＶＥＶＷＦＱＮＲＲＡＲＴＫＬＫＱＴＥＶＤＣＥ［Ｆ／Ｙ］Ｌ［Ｋ／Ｒ］ＲＣ［Ｃ／Ｖ］Ｅ［Ｎ／Ｋ］ＬＴＥＥ
・・・（Ｉ）
［３］果実生長誘導機能を有するポリペプチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、及び、配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドである、［１］又は［２］の核酸分子。
［４］果実生長誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、及び、配列番号１４からなる群より選択される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、［１］〜［３］の核酸分子。
［５］前記核酸分子が更に、転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含み、果実生長誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列と、転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、インフレームで連結されている、［１］〜［４］の核酸分子。
［６］転写抑制機能を有するポリペプチドが、下記式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）、又は、（IIｄ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドである、［５］の核酸分子。
［Ｌ／Ｆ］ＤＬＮ［Ｌ／Ｆ］［Ｘ］Ｐ                ・・・（IIａ）
［Ｌ／Ｖ］［Ｒ／Ｋ］ＬＦＧＶＸ［Ｍ／Ｖ／Ｌ］      ・・・（IIｂ）
ＴＬＸＬＦＰ                                      ・・・（IIｂ）
ＴＬＸＬＦＲ                                      ・・・（IIｄ）
（但し、上記式（IIａ）〜（IIｄ）中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）
［７］転写抑制機能を有するポリペプチドが、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号２１からなる群より選択されるアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドである、［５］又は［６］の核酸分子。
［８］転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、及び配列番号２２からなる群より選択される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、［５］〜［７］の核酸分子。
［９］前記核酸分子が更に、プロモーター領域の塩基配列を含み、果実生長誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、プロモーター領域の塩基配列と機能的に連結されている、［１］〜［８］の核酸分子。
［１０］前記核酸分子が更に、ターミネーター領域の塩基配列を含み、果実生長誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、ターミネーター領域の塩基配列と機能的に連結されている、［１］〜［９］の核酸分子。
［１１］［１］〜［１０］の核酸分子を担持するベクター。
［１２］植物ウイルスベクター又はアグロバクテリウムベクターである、［１１］のベクター。
［１３］受精を介さず果実を生育しうる組換種子植物を作製する方法であって、［１］〜［１０］の核酸分子、又は、［１１］若しくは［１２］のベクターを、種子植物細胞内に導入して発現させることを含む方法。
［１４］［１］〜［１０］の核酸分子、又は、［１１］若しくは［１２］のベクターが、細胞内に組み込まれている組換え種子植物。
［１５］［１３］の方法により作製される組換え種子植物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、種子植物において、受精を経ずに果実の生長を人為的に誘導することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、シロイヌナズナＡｔ５ｇ４７３７０、Ａｔ４ｇ１６７８０、Ａｔ４ｇ１７４６０、Ａｔ１ｇ２６９６０、Ａｔ１ｇ６９７８０、Ａｔ２ｇ１８５５０、及びＡｔ３ｇ６１８９０ポリペプチドのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、及び１３）のアラインメントを示す図である。
【図２】図２Ａ〜Ｈはそれぞれ、実施例１〜８で作製したキメラ遺伝子Ａ〜Ｃの構成を模式的に示す図である。
【図３】図３Ａ〜Ｄはそれぞれ、野生型植物体及び形質転換植物体Ａ〜Ｃのつぼみの光学顕微鏡写真である。
【図４】図４Ａ〜Ｃはそれぞれ、形質転換植物体Ａ〜Ｃの未受精のさや（果実）の光学顕微鏡写真である。それぞれ野生型植物体との対比で示す。
【図５】図５Ａ及びＢはそれぞれ、形質転換植物体Ａ及びＣの未受精のさや（果実）の縦長を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
【００１５】
なお、本明細書で引用する特許公報、特許出願公開公報、及び非特許文献は、何れもその全体が援用により、あらゆる目的において本明細書に組み込まれるものとする。
【００１６】
［１．種子植物の果実の生長を誘導するための核酸分子及びベクター］
（１−１．概要）
本発明の一側面によれば、種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず種子植物の果実の生長を誘導するための核酸分子（以下適宜「本発明の核酸分子」とする）が提供される。
【００１７】
本発明の核酸分子は、果実生長誘導機能を有するポリペプチド（以下適宜「果実生長誘導ポリペプチド」と呼ぶ）をコードする塩基配列を含む。また、任意ではあるが、転写抑制機能を有するポリペプチド（以下適宜「転写抑制ポリペプチド」と呼ぶ）をコードする塩基配列を含んでいてもよい。加えて、やはり任意ではあるが、プロモーター領域やターミネーター領域、更にはその他の配列を含んでいてもよい。
【００１８】
また、本発明の別の側面によれば、本発明の核酸分子を担持するベクター（以下適宜「本発明のベクター」とする）も提供される。
【００１９】
（１−２．果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列）
本発明の核酸分子は、果実生長誘導機能を有するポリペプチド（果実生長誘導ポリペプチド）をコードする塩基配列を有する。
【００２０】
本発明において、果実生長誘導ポリペプチドのアミノ酸配列は限定されないが、以下から選択されるアミノ酸配列又はこれと類似のアミノ酸配列を有することが好ましい。
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ４７３７０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）
・シロイヌナズナＡｔ４ｇ１６７８０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）
・シロイヌナズナＡｔ４ｇ１７４６０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）
・シロイヌナズナＡｔ１ｇ２６９６０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）
・シロイヌナズナＡｔ１ｇ６９７８０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号９）
・シロイヌナズナＡｔ２ｇ１８５５０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１１）
・シロイヌナズナＡｔ３ｇ６１８９０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１３）
【００２１】
後述する実施例から明らかなように、これらのシロイヌナズナＡｔ５ｇ４７３７０、Ａｔ４ｇ１６７８０、Ａｔ４ｇ１７４６０、Ａｔ１ｇ２６９６０、Ａｔ１ｇ６９７８０、Ａｔ２ｇ１８５５０、及びＡｔ３ｇ６１８９０の各ポリペプチドは、植物細胞内で発現させた場合に果実生長誘導を有する。よって、これらのポリペプチドは何れも、本発明における果実生長誘導ポリペプチドとして好適に使用できる。
【００２２】
また、これらの各ポリペプチドとアミノ酸配列が類似するポリペプチドも、その構造の類似性ゆえに、植物細胞内で発現させた場合に同様の作用を有する蓋然性が高いことから、やはり本発明における果実生長誘導ポリペプチドとして好適に使用できる。
【００２３】
具体的に、本発明において、果実生長誘導ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有することが望ましい。
【００２４】
また、果実生長誘導ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有することが望ましい。
【００２５】
ここで、２つのアミノ酸配列の「相同性」（similarity）とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基又は類似の（即ち、物理化学的性質が類似する）アミノ酸残基が現れる比率であり、２つのアミノ酸配列の「同一性」（identity）とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率である。なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10）等を用いて求めることが可能である。
【００２６】
ここで、シロイヌナズナＡｔ５ｇ４７３７０、Ａｔ４ｇ１６７８０、Ａｔ４ｇ１７４６０、Ａｔ１ｇ２６９６０、Ａｔ１ｇ６９７８０、Ａｔ２ｇ１８５５０、及びＡｔ３ｇ６１８９０の各ポリペプチドのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、及び配列番号１３）のアラインメントを図１に示す。本アラインメントから明らかなように、これらのポリペプチドは相互に高い配列相同性を有することが分かる。特に、シロイヌナズナＡｔ５ｇ４７３７０、Ａｔ４ｇ１６７８０、及びＡｔ４ｇ１７４６０の各ポリペプチドのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１、配列番号３、及び配列番号５）は、下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを共有していることが分かる。
【００２７】
ＫＫＬＲＬＳＫＤＱＳＡ［Ｉ／Ｖ／Ｆ］ＬＥ［Ｄ／Ｅ］ＴＦＫ［Ｄ／Ｅ］Ｈ［Ｎ／Ｓ］ＴＬＮＰＫＱＫ［Ｌ／Ｑ］ＡＬＡＫ［Ｑ／Ｋ］Ｌ［Ｇ／Ｎ］Ｌ［Ｔ／Ｒ］ＡＲＱＶＥＶＷＦＱＮＲＲＡＲＴＫＬＫＱＴＥＶＤＣＥ［Ｆ／Ｙ］Ｌ［Ｋ／Ｒ］ＲＣ［Ｃ／Ｖ］Ｅ［Ｎ／Ｋ］ＬＴＥＥ
・・・（Ｉ）
【００２８】
但し、上記式（Ｉ）では各アミノ酸残基を１文字コードで表している。また、角括弧（［  ］）内にスラッシュ（／）で区切って複数のアミノ酸残基を表示している箇所は、これらのアミノ酸残基の何れかであることを表している。
【００２９】
よって、前記式（Ｉ）で表されるモチーフを有するポリペプチドは、植物細胞内で発現させた場合に果実生長誘導を有する蓋然性が高い。従って、前記式（Ｉ）で表されるモチーフを有するポリペプチドも、本発明における果実生長誘導ポリペプチドとして好適に使用することが可能である。
【００３０】
斯かる果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列は限定されないが、以下から選択される塩基配列又はこれと類似の塩基配列を有することが好ましい。
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ４７３７０遺伝子の塩基配列（配列番号２）
・シロイヌナズナＡｔ４ｇ１６７８０遺伝子の塩基配列（配列番号４）
・シロイヌナズナＡｔ４ｇ１７４６０遺伝子の塩基配列（配列番号６）
・シロイヌナズナＡｔ１ｇ２６９６０遺伝子の塩基配列（配列番号８）
・シロイヌナズナＡｔ１ｇ６９７８０遺伝子の塩基配列（配列番号１０）
・シロイヌナズナＡｔ２ｇ１８５５０遺伝子の塩基配列（配列番号１２）
・シロイヌナズナＡｔ３ｇ６１８９０遺伝子の塩基配列（配列番号１４）
【００３１】
具体的に、本発明において、果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列は、前記の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、及び配列番号１４からなる群より選択される塩基配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有することが望ましい。
【００３２】
なお、２つの塩基配列の配列同一性は、例えばEMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）（好ましくはバージョン５．００又はそれ以降）のNeedleプログラムにより、Needleman-Wunschアルゴリズムを使用して決定される（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）。
【００３３】
（１−３．転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列）
本発明の核酸分子は、前述の果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列に加えて、転写抑制機能を有するポリペプチド（転写抑制ポリペプチド）をコードする塩基配列を有することが好ましい。この場合、果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列と、転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列が、インフレームで連結されていることが好ましい。
【００３４】
本発明において、転写抑制ポリペプチドのアミノ酸配列は限定されないが、以下から選択されるアミノ酸配列又はこれと類似のアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００３５】
・シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮ遺伝子の転写抑制領域を改変したＳＲＤＸポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１５）
・シロイヌナズナＡｔ２ｇ３６０８０遺伝子の転写抑制領域ＢＲＤポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１７）
・シロイヌナズナＷＵＳＣＨＥＬ遺伝子の転写抑制領域ＷＵＳ−ｂｏｘポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１９）
・シロイヌナズナＡｔＭＹＢＬ２遺伝子の転写抑制領域Ｌ２Ｒポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２１）
【００３６】
前記のＳＲＤＸ、ＢＲＤ、ＷＵＳ−ｂｏｘ、及びＬ２Ｒの各ポリペプチドは、本発明者らが開発したＣＲＥＳ−Ｔ（Chimeric repressor silencing technology）法に用いられる転写抑制ドメインの発現産物である。具体的に、ＳＲＤＸポリペプチドについては、例えば国際公開第２００３／０５５９９３号等に、ＢＲＤポリペプチドについては、例えば特開２００９−２１３４２６号等に、ＷＵＳ−ｂｏｘポリペプチドについては、例えばIkeda et al., Plant Cell, (2009), 21:3493-3505等に、Ｌ２Ｒポリペプチドについては、例えばMatsui et al., Plant J., (2008), 55:954-967等に、それぞれ詳細に記載されている。
【００３７】
これらのＳＲＤＸ、ＢＲＤ、ＷＵＳ−ｂｏｘ、及びＬ２Ｒの各ポリペプチドをコードする塩基配列を、前記の果実生長誘導ポリペプチドとインフレームで連結し、植物細胞内に導入して発現させると、果実生長誘導ポリペプチドの果実生長誘導が強化される。よって、これらのポリペプチドは何れも、本発明における転写抑制ポリペプチドとして好適に使用できる。
【００３８】
また、これらの各ポリペプチドとアミノ酸配列が類似するポリペプチドも、その構造の類似性ゆえに、植物細胞内で発現させた場合に同様の作用を有する蓋然性が高いことから、やはり本発明における転写抑制ポリペプチドとして好適に使用できる。
【００３９】
具体的に、本発明において、転写抑制ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記の配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、及び、配列番号２１からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有することが望ましい。
【００４０】
また、転写抑制ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記の配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、及び、配列番号２１からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有することが望ましい。
【００４１】
また、前記のＳＲＤＸ、ＢＲＤ、ＷＵＳ−ｂｏｘ、及びＬ２Ｒの各ポリペプチドは、下記式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）、又は、（IIｄ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを有し、これらがその転写抑制機能を発揮する上で重要な機能を果たしていることが知られている。従って、下記式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）、又は、（IIｄ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドも、転写抑制ポリペプチドとして好適に使用することができる。
【００４２】
［Ｌ／Ｆ］ＤＬＮ［Ｌ／Ｆ］［Ｘ］Ｐ                ・・・（IIａ）
［Ｌ／Ｖ］［Ｒ／Ｋ］ＬＦＧＶＸ［Ｍ／Ｖ／Ｌ］      ・・・（IIｂ）
ＴＬＸＬＦＰ                                      ・・・（IIｂ）
ＴＬＸＬＦＲ                                      ・・・（IIｄ）
【００４３】
但し、上記式（IIａ）〜（IIｄ）では各アミノ酸残基を１文字コードで表している。また、角括弧（［  ］）内にスラッシュ（／）で区切って複数のアミノ酸残基を表示している箇所は、これらのアミノ酸残基の何れかであることを示す。また、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。
【００４４】
斯かる転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列は限定されないが、以下から選択される塩基配列又はこれと類似の塩基配列を有することが好ましい。
・ＳＵＰＥＲＭＡＮ遺伝子の転写抑制領域を改変したＳＲＤＸの塩基配列（配列番号１６）
・Ａｔ２ｇ３６０８０遺伝子の転写抑制領域ＢＲＤの塩基配列（配列番号１８）
・ＷＵＳＣＨＥＬ遺伝子の転写抑制領域ＷＵＳ−ｂｏｘの塩基配列（配列番号２０）
・ＡｔＭＹＢＬ２遺伝子の転写抑制領域Ｌ２Ｒの塩基配列（配列番号２２）
【００４５】
具体的に、本発明において、転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列は、前記の配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、及び、配列番号２２からなる群より選択される塩基配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有することが望ましい。
【００４６】
（１−４．プロモーター領域）
本発明の核酸分子は、プロモーター領域を有することが好ましい。プロモーター領域は、通常は果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列の５’側に、果実生長誘導ポリペプチドと機能的に連結されるように配置されることが好ましい。
【００４７】
プロモーター領域は、ウイルスに由来するプロモーターでもよく、微生物に由来するプロモーターでもよく、植物に由来するプロモーターでもよく、その他の生物に由来するプロモーターでもよい。
【００４８】
また、プロモーターの機能部位としては、植物体全体で機能するプロモーターでもよく、雌性配偶体とその始原細胞を含む周辺部位でのみで機能するプロモーターでもよい。さらには、特定の化学物質処理時や特定の生育環境下において、特異的に機能するプロモーターでもよい。
【００４９】
プロモーター領域の塩基配列は制限されない。例としては、以下の何れかのプロモーターの塩基配列を有するプロモーター領域が挙げられる。
【００５０】
・カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター（配列番号２３）。
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ４７３７０遺伝子のプロモーター（配列番号２４）。
・シロイヌナズナＡｔ４ｇ１６７８０遺伝子のプロモーター（配列番号２５）。
・シロイヌナズナＡｔ４ｇ１７４６０遺伝子のプロモーター（配列番号２６）。
・シロイヌナズナＡｔ１ｇ２６９６０遺伝子のプロモーター（配列番号２７）。
・シロイヌナズナＡｔ１ｇ６９７８０遺伝子のプロモーター（配列番号２８）。
・シロイヌナズナＡｔ２ｇ１８５５０遺伝子のプロモーター（配列番号２９）。
・シロイヌナズナＡｔ３ｇ６１８９０遺伝子のプロモーター（配列番号３０）。
・イネ・アクチン遺伝子のプロモーター（配列番号３１）。
【００５１】
また、配列番号２３〜配列番号３１の各塩基配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列からなるプロモーターも、本発明の核酸分子におけるプロモーター領域として好ましく利用できる。
【００５２】
（１−５．ターミネーター領域）
本発明の核酸分子は、ターミネーター領域を有することが好ましい。ターミネーター領域は、通常は果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列の３’側に、果実生長誘導ポリペプチドと機能的に連結されるように配置されることが好ましい。
【００５３】
ターミネーター領域は、ウイルスに由来するターミネーターでもよく、微生物に由来するターミネーターでもよく、植物に由来するターミネーターでもよく、その他の生物に由来するターミネーターでもよい。
【００５４】
また、ターミネーターの機能部位としては、植物体全体で機能するターミネーターでもよく、雌性配偶体とその始原細胞を含む周辺部位でのみで機能するターミネーターでもよい。さらには、特定の化学物質処理時や特定の生育環境下において、特異的に機能するターミネーターでもよい。
【００５５】
ターミネーター領域の塩基配列は制限されない。例としては、以下の何れかのターミネーターの塩基配列を有するターミネーター領域が挙げられる。
・アグロバクテリウムのノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（配列番号３２）。
・シロイヌナズナのヒートショックタンパク質遺伝子のターミネーター（配列番号３３）。
【００５６】
また、配列番号３２又は配列番号３３の各塩基配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列からなるターミネーターも、本発明の核酸分子におけるターミネーター領域として好ましく利用できる。
【００５７】
（１−６．その他の遺伝子要素）
本発明の核酸分子は、その他の１又は２以上の遺伝子要素を有していてもよい。その他の遺伝子要素の例としては、抗生物質耐性遺伝子、制限酵素配列、相同組換え配列等が挙げられる。
【００５８】
（１−７．核酸の構成）
本発明の核酸分子は、前述の果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列を有すると共に、好ましくは任意選択要素として転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列を有し、更には任意選択要素として、プロモーター領域、ターミネーター領域、及び／又はその他の遺伝子要素を有する。特に、果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列以外の任意選択要素を有する場合には、通常は転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列が果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列とインフレームで連結されると共に、果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列の５’側にプロモーター領域が、果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列の３’側に転写抑制領域及び／又はターミネーター領域が配置され、それぞれ果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列と機能的に連結される。これにより、本発明の核酸分子が種子植物の植物細胞に導入され、好ましくはゲノム内に組み込まれた場合に、各遺伝子要素が機能的に連関して作動し、果実生長誘導ポリペプチドが自律的に発現される。即ち、本発明の核酸分子は、キメラ遺伝子カセットとして構成されていることが好ましい。
【００５９】
（１−８．ベクター）
本発明の核酸分子は、通常はこれを植物細胞内に導入してゲノム内に組み込むべく、ベクターに担持した形態で使用される。
【００６０】
斯かるベクター（本発明のベクター）の形態は任意であり、直鎖状の形態であっても環状の形態であってもよい。但し、環状の形態、例えばプラスミドの形態であることが好ましい。ベクターの具体的な態様の例としては、植物ウイルスベクター、アグロバクテリウムベクター等が挙げられる。
【００６１】
植物ウイルスベクター法は、標的遺伝子を挿入した植物ウイルスゲノムのｃＤＮＡを試験管内転写し、得られたＲＮＡをベクターとして植物に接種して感染させ、ウイルス自身の増殖能及び全身移行能を利用して、発現対象遺伝子を植物に発現させる手法である。植物ウイルスベクターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）ベクター、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ベクター、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベクター、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）ベクター等が挙げられる。
【００６２】
アグロバクテリウムベクター（Ｔ−ＤＮＡベクター）法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）のＴｉプラスミドが有するＴ−ＤＮＡ（transfer DNA）配列を利用した手法である。Ｔ−ＤＮＡ配列は右境界配列（right border sequence：ＲＢ配列）と左境界配列（left border sequence：ＬＢ配列）とを両端に有し、これらの配列に挟まれた領域の遺伝子を植物ゲノムへ組み込む作用を有する。現在は、Ｔｉプラスミドを改変した２種のプラスミド、即ち、バイナリープラスミドとヘルパープラスミドとを組み合わせたＴ−ＤＮＡバイナリー系が確立されており、植物の形質転換による外来遺伝子の導入を行うことが主流である。
【００６３】
本発明の核酸分子をベクターに担持させる場合、好ましくは、本発明の果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列が植物ゲノム内に組み込まれ、機能的に発現するように構成する。
【００６４】
なお、本発明の核酸分子が、果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列に加えて、プロモーター領域やターミネーター領域を有し、植物細胞内で自律的に発現しうるキメラ遺伝子カセットとして構成されている場合には、ベクター側にプロモーターやターミネーター等の調節要素を組み込むことは必須ではなく、植物ゲノムへの組み込みに必要な要素（例えば相同組換えのためのフランキング配列や、Ｔ−ＤＮＡのＬＢ配列及びＲＢ配列等）のみをベクターに設ければよい。
【００６５】
一方、本発明の核酸分子がプロモーター領域やターミネーター領域を欠き、植物細胞内で自律的に発現しうるキメラ遺伝子カセットとして構成されている場合には、ベクターに植物ゲノムへの組み込みに必要な要素のみならず、プロモーターやターミネーター等の調節要素を組み込み、本発明の核酸分子が有する果実生長誘導ポリペプチドの発現を誘導するように構成することが好ましい。或いは、本発明のベクターを植物ゲノム内に組み込んだ場合に、本発明の核酸分子が有する果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列を、植物ゲノム内のプロモーターやターミネーター等の調節要素と機能的に連関して作動し、果実生長誘導ポリペプチドが発現されるように構成してもよい。
【００６６】
本発明のベクターは、必要に応じて、他のヘルパープラスミドと併用してもよい。他のヘルパープラスミドの例としては、Ｔ−ＤＮＡベクターの場合、ｖｉｒ領域を有するヘルパープラスミド等が挙げられる。
【００６７】
本発明のベクターは、当業者に周知の各種の遺伝子組み換え技術を適宜組み合わせて用いることにより、容易に作製することが可能である。
【００６８】
［２．受精を介さず果実を発生・成長させうる組換種子植物及びその製造方法］
本発明の別の側面によれば、受精を介さず果実を発生・成長させうる組換種子植物を作製する方法（以下適宜「本発明の方法」とする）が提供される。
本発明の方法は、上述の本発明の核酸分子又は本発明のベクターを、種子植物のゲノム内に導入して発現させることを含む。なお、本発明の核酸分子又は本発明のベクターは、複数種を併用して用いてもよい。
【００６９】
種子植物の種類は特に制限されず、果実を生じる植物であれば限定されないが、通常は被子植物が対象となる。果実を生じる被子植物の例としては、これらに制限されるものではないが、例えばナス科、マメ科、アブラナ科、イネ科、キク科、ハス科、バラ科、ウリ科、ユリ科、ミカン科、ウルシ科、等に属する植物種が挙げられる。具体例としては、タバコ、シロイヌナズナ、綿、カンキツ、キュウリ、カボチャ、スイカ、メロン、ウリ、カンピョウ、ヘチマ、ゴーヤ、プリンスメロン、アブラヤシ、オクラ、トマト、ピーマン、ナス、トウガラシ、シシトウ、リンゴ、サクランボ、ウメ、ナシ、セイヨウナシ、カキ、キウイ、バナナ、ドラゴンフルーツ、ランブータン、ライチ、モモ、マンゴー、イチゴ、ブドウ、ナス、キイチゴ、ミカン、ブルーベリー、ザクロ、スモモ、ズッキーニ、アボガド、アセロラ、オリーブ、クワ、アケビ、グアバ、アンズ、ビワ、パパイヤ、プルーン、ナツメ、クランベリー、ラズベリー、ドリアン、マンゴスチン、ランブータン、カリン、スターフルーツ、サクラ等が挙げられる。中でも、シロイヌナズナ、ナス、トマト、果実類、オイルパーム等が好ましい。
【００７０】
上述の本発明の核酸分子又は本発明のベクターを、種子植物のゲノム内に導入する手法は任意である。例えば、本発明のベクターを種子植物に生物的に感染させ、或いはアグロインフィルトレーション、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等の手法で種子植物の各組織に導入し、種子植物のゲノム内に導入することができる。更には本発明のベクターを用いず、CRISPR/Cas9システム等の公知の手法を用いて、本発明の核酸分子を直接植物のゲノム内に組み込むことも可能である。また、本発明の核酸分子又は本発明のベクターを種子植物の組織断片に導入し、これを培養して植物体とすることにより、本発明のベクターがゲノム内に導入された、本発明の核酸分子を恒常的に発現する再分化個体を得ることも可能である。
【００７１】
以上の本発明の方法により、果実生長誘導ポリペプチドをコードする塩基配列を含む本発明の核酸分子がゲノム内に組み込まれて、果実生長誘導ポリペプチドを発現する組換植物が得られる。斯かる組換植物は、果実生長誘導ポリペプチドを発現することにより、受精を経ずに果実を発生し、成長させる能力を有する。
【００７２】
なお、前述の本発明の方法により作製される組換種子植物や、本発明の核酸分子又は本発明のベクターをゲノム内に含む組換え種子植物、受精を経ずに果実を発生し、生育する能力を有する組換え種子植物等も、本発明の対象となる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例にも束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
なお、以下に記載のプライマー塩基配列の表記のうち、大文字と小文字が混在しているものについては、大文字は増幅対象遺伝子の塩基配列と相補的な領域を意味し、小文字は付加配列を意味する。
【００７４】
［概要］
実施例１は、シロイヌナズナＡｔ５ｇ４７３７０遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片をインフレームで連結し、これを更にカリフラワーモザイクウイルス（ＣＡＭＶ）３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ４７３７０ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ａ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＡ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物のさやを観察することにより、キメラ遺伝子Ａのシロイヌナズナにおける自発的さや発生促進効果を調べたものである。
【００７５】
実施例２は、シロイヌナズナＡｔ４ｇ１６７８０遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片をインフレームで連結し、これを更にＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ４ｇ１６７８０ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｂ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＢ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察することにより、キメラ遺伝子Ｂのシロイヌナズナにおける自発的さや発生促進効果を調べたものである。
【００７６】
実施例３は、シロイヌナズナＡｔ５ｇ４７３７０遺伝子をＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ４７３７０（キメラ遺伝子Ｃ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＣ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察、形質転換植物のさやを観察することにより、キメラ遺伝子Ｃのシロイヌナズナにおける自発的さや発生促進効果を調べたものである。
【００７７】
実施例４は、シロイヌナズナＡｔ１ｇ２６９６０遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片をインフレームで連結し、これを更にＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ１ｇ２６９６０ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｄ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＤ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察、形質転換植物のさやを観察することにより、キメラ遺伝子Ｄのシロイヌナズナにおける自発的さや発生促進効果を調べたものである。
【００７８】
実施例５は、シロイヌナズナＡｔ１ｇ６９７８０遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片をインフレームで連結し、これを更にＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ１ｇ６９７８０ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｅ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＥ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察、形質転換植物のさやを観察することにより、キメラ遺伝子Ｅのシロイヌナズナにおける自発的さや発生促進効果を調べたものである。
【００７９】
実施例６は、シロイヌナズナＡｔ２ｇ１８５５０遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片をインフレームで連結し、これを更にＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ２ｇ１８５５０ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｆ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＦ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察、形質転換植物のさやを観察することにより、キメラ遺伝子Ｆのシロイヌナズナにおける自発的さや発生促進効果を調べたものである。
【００８０】
実施例７は、シロイヌナズナＡｔ３ｇ６１８９０遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片をインフレームで連結し、これを更にＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ３ｇ６１８９０ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｇ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＧ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察、形質転換植物のさやを観察することにより、キメラ遺伝子Ｇのシロイヌナズナにおける自発的さや発生促進効果を調べたものである。
【００８１】
実施例８は、シロイヌナズナＡｔ４ｇ１７４６０遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片をインフレームで連結し、これを更にＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ４ｇ１７４６０ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｈ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＨ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察、形質転換植物のさやを観察することにより、キメラ遺伝子Ｈのシロイヌナズナにおける自発的さや発生促進効果を調べたものである。
【００８２】
［実施例１］形質転換用コンストラクトＡ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ４７３７０ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換
（１−１）コンストラクトＡの構築
（ａ）プラスミドｐＢＩＧ２の構築
米国ミシガン州立大学より譲渡された植物形質転換用ベクターｐＢＩＧ−ＨＹＧ（Becker, Nucleic Acid Research, (1990), 18(1):203）を制限酵素HindIII及びSstIで切断し、アガロースゲル電気泳動によって分離することで、ＧＵＳ遺伝子を除いたｐＢＩＧ−ＨＹＧのＤＮＡ断片を得た。
【００８３】
また、プラスミドｐ３５Ｓ−ＧＦＰ（Clontech社、米国）を制限酵素HindIII及びBamHIで切断し、切断断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、ＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーター（以下適宜「ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ」とする）を含むＤＮＡ断片を回収した。
【００８４】
また、以下の配列番号３４及び３５の塩基配列を有するＤＮＡを常法により合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。このＤＮＡ断片は、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）由来のオメガ(omega)配列の５’末端に制限酵素部位BamHIを、３‘末端側に制限酵素部位SmaI及びSalIを有する。この配列をベクターに導入することで、ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓによる遺伝子発現誘導効果を強めるとともに、以降のプラスミド構築に必須な制限酵素サイトを導入した。
５’−ＧＡＴＣＣＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＧＧＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＴ−３’（配列番号３４）
５’−ＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＧＴＡＡＴＴＧＴＡＡＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧＴＡＡＴＴＧＴＧ−３’（配列番号３５）
【００８５】
前記のＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓを含むＤＮＡ断片、及び、前記の合成した２本鎖ＤＮＡを、前記のＧＵＳ遺伝子を除いたｐＢＩＧ−ＨＹＧのHindIII及びSstI部位に挿入することにより、ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓを担持する植物形質転換用ベクターを得た。これをプラスミドｐＢＩＧ２とする。
【００８６】
（ｂ）プラスミドｐ３５ＳＲＤＸの構築
シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮ遺伝子の転写抑制ドメインであるＳＲＤＸの塩基配列の５’末端にＧＧＧを、３’末端にストップコドンをそれぞれ付与した、以下の配列番号３６及び３７の塩基配列を有する相補的な二本のＤＮＡ断片を作製した。
５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＴＡＧＡＡＣＴＣＣＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＧＣＴＴＡＡＧ−３’（配列番号３６）
５’−ＣＴＴＡＡＧＣＧＡＡＡＣＣＣＡＡＡＣＧＧＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＣＣＣ−３’（配列番号３７）
【００８７】
合成された二本のＤＮＡ断片をアニールし、制限酵素SmaIで切断した上記のプラスミドｐＢＩＧ２に挿入し、シークエンスを確認して、ＳＲＤＸが順方向に導入されたものを選抜した。これをプラスミドｐ３５ＳＲＤＸとする。
【００８８】
（ｃ）プラスミド３５Ｓ：Ａｔ５ｇ４７３７０ＳＲＤＸ（コンストラクトＡ）の構築
シロイヌナズナＡｔ５ｇ４７３７０遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号３８の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号３９の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ５ｇ４７３７０遺伝子の全長配列からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
５’−ｇＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＡＧＧＴＴＴ−３’ （配列番号３８）
５’−ＣＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＡＡＡＴＴＣＡＧ−３’ （配列番号３９）
【００８９】
なお、ＰＣＲ反応は、変性反応９４℃１分、アニール反応５０℃１分、伸長反応７２℃３分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００９０】
得られたＡｔ５ｇ４７３７０遺伝子のストップコドンを除く増幅産物を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、前記のプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法に従ってシークエンスを確認し、Ａｔ５ｇ４７３７０遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ５ｇ４７３７０遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。
【００９１】
得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ５ｇ４７３７０遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ４７３７０ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＡ」と略称し、コンストラクトＡが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ４７３７０ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ａ」と略称する。キメラ遺伝子Ａの構成を図２Ａに模式的に示す。
【００９２】
（１−２）形質転換植物体Ａの作成
コンストラクトＡによるシロイヌナズナ植物体の形質転換は、“Transfomation of Arabidopsis thaliana byvacuum infiltration”（http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm）に記載の方法に従った。但し、感染させるのにバキュームは用いず、単に浸すだけにした。コンストラクトＡを、土壌細菌（Agrobacterium tumefaciens）株ＧＶ３１０１（Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆｒ）ｐＭＰ９０（Ｇｍｒ）（koncz and Schell, Molecular and General Genetics, (1986), 204[3]:383-396）株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を２５０ｍＬのＬＢ培地で二日間培養した。
【００９３】
次いで、培養液から菌体を回収し、５００ｍＬの感染用培地（Infiltration medium）に懸濁した。この溶液に、１４日間生育したシロイヌナズナを１分間浸し、感染させた後、再び生育させ結種させた。回収した種子を５０％ブリーチ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌した種子を３０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む１／２ＭＳ選択培地に蒔種した。コンストラクトＡにより首尾よく形質転換された植物体は、ハイグロマイシン耐性を獲得する。そこで、上記ハイグロマイシン培地で生育する形質転換植物体を選抜し、土壌に植え換え、生育させた。こうして得られた、コンストラクトＡにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ａ」と略称する。
【００９４】
［実施例２］形質転換用コンストラクトＢ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ４ｇ１６７８０ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換
（２−１）コンストラクトＢの構築
シロイヌナズナＡｔ４ｇ１６７８０遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号４０の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号４１の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１−１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ４ｇ１６７８０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
５’−ｇＡＴＧＡＴＧＴＴＣＧＡＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＣＴＧＧＧＴＣＴ−３’ （配列番号４０）
５’−ＧＧＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＡ−３’ （配列番号４１）
【００９５】
得られたＡｔ４ｇ１６７８０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列の増幅断片を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、上記の［実施例１］（１−１）（ａ）及び（ｂ）で作製したプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓ及び転写抑制ドメインＳＲＤＸを有するプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ａｔ４ｇ１６７８０遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ４ｇ１６７８０遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。
【００９６】
得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ４ｇ１６７８０遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ４ｇ１６７８０ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＢ」と略称し、コンストラクトＢが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ４ｇ１６７８０ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｂ」と略称する。キメラ遺伝子Ｂの構成を図２Ｂに模式的に示す。
【００９７】
（２−２）コンストラクトＢを用いた形質転換による形質転換植物体Ｂの作成
前記［実施例１］（１−２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＢによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＢにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｂ」と略称する。
【００９８】
［実施例３］形質転換用コンストラクトＣ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ４７３７０）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換
（３−１）コンストラクトＣの構築
シロイヌナズナＡｔ５ｇ４７３７０遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号４２の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号４３の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ５ｇ４７３７０遺伝子の全長配列にストップコドンとSalI配列を付加した部分配列を増幅した。
５’−ｇＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＡＧＧＴＴＴ−３’ （配列番号４２）
５’−ｇｇｇｇｔｃｇａｃＴＣＡＣＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＡＡＡＴＴ−３’ （配列番号４３）
【００９９】
なお、ＰＣＲ反応は、変性反応９４℃１分、アニール反応５０℃１分、伸長反応７２℃３分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【０１００】
上記の［実施例１］（１−１）（ａ）で作製したプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓを有するプラスミドｐＢＩＧ２に、前記で作製したシロイヌナズナＡｔ５ｇ４７３７０遺伝子の全長配列にストップコドンとSalI配列を付加したものの増幅断片を、常法に従って挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ａｔ５ｇ４７３７０遺伝子が順方向に導入されたものを選抜した。
【０１０１】
得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ及びＡｔ５ｇ４７３７０が作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ４７３７０を担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＣ」と略称し、コンストラクトＣが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ４７３７０を適宜「キメラ遺伝子Ｃ」と略称する。キメラ遺伝子Ｃの構成を図２Ｃに模式的に示す。
【０１０２】
（３−２）コンストラクトＣを用いた形質転換による形質転換植物体Ｃの作成
前記［実施例１］（１−２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＣによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＣにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｃ」と略称する。
【０１０３】
［実施例４］形質転換用コンストラクトＤ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ１ｇ２６９６０ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換
（４−１）コンストラクトＤの構築
シロイヌナズナＡｔ１ｇ２６９６０遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号４４の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号４５の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１−１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ１ｇ２６９６０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
５’−ｇＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＣＴＴＡＧＣＴＴＴ−３’ （配列番号４４）
５’−ＡＴＴＧＴＡＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡ−３’ （配列番号４５）
【０１０４】
得られたＡｔ１ｇ２６９６０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列の増幅断片を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、上記の［実施例１］（１−１）（ａ）及び（ｂ）で作製したプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓ及び転写抑制ドメインＳＲＤＸを有するプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ａｔ１ｇ２６９６０遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ１ｇ２６９６０遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。
【０１０５】
得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ１ｇ２６９６０遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ１ｇ２６９６０ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＤ」と略称し、コンストラクトＤが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ１ｇ２６９６０ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｄ」と略称する。キメラ遺伝子Ｄの構成を図２Ｄに模式的に示す。
【０１０６】
（４−２）コンストラクトＤを用いた形質転換による形質転換植物体Ｄの作成
前記［実施例１］（１−２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＤによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＤにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｄ」と略称する。
【０１０７】
［実施例５］形質転換用コンストラクトＥ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ１ｇ６９７８０ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換
（５−１）コンストラクトＥの構築
シロイヌナズナＡｔ１ｇ６９７８０遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号４６の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号４７の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１−１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ１ｇ６９７８０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
５’−ｇＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＴＡＡＴＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号４６）
５’−ＡＴＴＧＴＡＣＴＧＴＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡ−３’ （配列番号４７）
【０１０８】
得られたＡｔ１ｇ６９７８０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列の増幅断片を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、上記の［実施例１］（１−１）（ａ）及び（ｂ）で作製したプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓ及び転写抑制ドメインＳＲＤＸを有するプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ａｔ１ｇ６９７８０遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ１ｇ６９７８０遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。
【０１０９】
得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ１ｇ６９７８０遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ１ｇ６９７８０ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＥ」と略称し、コンストラクトＥが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ１ｇ６９７８０ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｅ」と略称する。キメラ遺伝子Ｅの構成を図２Ｅに模式的に示す。
【０１１０】
（５−２）コンストラクトＥを用いた形質転換による形質転換植物体Ｅの作成
前記［実施例１］（１−２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＥによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＥにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｅ」と略称する。
【０１１１】
［実施例６］形質転換用コンストラクトＦ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ２ｇ１８５５０ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換
（６−１）コンストラクトＦの構築
シロイヌナズナＡｔ２ｇ１８５５０遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号４４の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号４５の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１−１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ２ｇ１８５５０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
５’−ｇＡＴＧＡＡＴＡＡＣＣＡＧＡＡＴＧＴＡＧＡＴＧＡＴＣＡＴＡＡ−３’ （配列番号４８）
５’−ＣＡＴＡＡＡＴＴＧＧＣＴＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＡＴＣＣＡＴＣ−３’ （配列番号４９）
【０１１２】
得られたＡｔ２ｇ１８５５０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列の増幅断片を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、上記の［実施例１］（１−１）（ａ）及び（ｂ）で作製したプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓ及び転写抑制ドメインＳＲＤＸを有するプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ａｔ２ｇ１８５５０遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ２ｇ１８５５０遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。
【０１１３】
得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ２ｇ１８５５０遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ２ｇ１８５５０ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＦ」と略称し、コンストラクトＦが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ２ｇ１８５５０ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｆ」と略称する。キメラ遺伝子Ｆの構成を図２Ｆに模式的に示す。
【０１１４】
（６−２）コンストラクトＦを用いた形質転換による形質転換植物体Ｆの作成
前記［実施例１］（１−２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＦによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＦにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｆ」と略称する。
【０１１５】
［実施例７］形質転換用コンストラクトＧ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ３ｇ６１８９０ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換
（７−１）コンストラクトＧの構築
シロイヌナズナＡｔ３ｇ６１８９０遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号４６の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号４７の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１−１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ３ｇ６１８９０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
５’−ｇＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧＣＴＧ−３’ （配列番号５０）
５’−ＴＧＡＣＣＡＡＡＡＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＴＴＡＧＧＧＴＡＡＴＴ−３’ （配列番号５１）
【０１１６】
得られたＡｔ３ｇ６１８９０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列の増幅断片を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、上記の［実施例１］（１−１）（ａ）及び（ｂ）で作製したプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓ及び転写抑制ドメインＳＲＤＸを有するプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ａｔ３ｇ６１８９０遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ３ｇ６１８９０遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。
【０１１７】
得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ３ｇ６１８９０遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ３ｇ６１８９０ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＧ」と略称し、コンストラクトＧが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ３ｇ６１８９０ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｇ」と略称する。キメラ遺伝子Ｇの構成を図２Ｇに模式的に示す。
【０１１８】
（７−２）コンストラクトＧを用いた形質転換による形質転換植物体Ｇの作成
前記［実施例１］（１−２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＧによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＧにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｇ」と略称する。
【０１１９】
［実施例８］形質転換用コンストラクトＨ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ４ｇ１７４６０ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換
（８−１）コンストラクトＨの構築
シロイヌナズナＡｔ４ｇ１７４６０遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号５２の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号５３の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１−１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ４ｇ１７４６０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。
５’−ＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＧＴＴＴ−３’ （配列番号５２）
５’−ＡＧＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＡＧＧＴＴＧＡ−３’ （配列番号５３）
【０１２０】
得られたＡｔ４ｇ１７４６０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列の増幅断片を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、上記の［実施例１］（１−１）（ａ）及び（ｂ）で作製したプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓ及び転写抑制ドメインＳＲＤＸを有するプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ａｔ４ｇ１７４６０遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ４ｇ１７４６０遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。
【０１２１】
得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ４ｇ１７４６０遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ４ｇ１７４６０ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＨ」と略称し、コンストラクトＨが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ４ｇ１７４６０ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｈ」と略称する。キメラ遺伝子Ｈの構成を図２Ｈに模式的に示す。
【０１２２】
（８−２）コンストラクトＨを用いた形質転換による形質転換植物体Ｈの作成
前記［実施例１］（１−２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＨによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＨにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｈ」と略称する。
【０１２３】
［評価］形質転換植物体の形質の確認
形質転換植物体Ａ〜Ｈのつぼみから雄蕊を取り除き（除雄）、未受精のさや（果実）の形質を観察した。また、コントロールとして、野生型のシロイヌナズナ植物体の未受精のさやの形質を同様に観察した。野生型植物体及び形質転換植物体Ａ〜Ｃのつぼみの光学顕微鏡写真を図３に、野生型植物体及び形質転換植物体Ａ〜Ｃのさや（果実）の光学顕微鏡写真を図４にそれぞれ示す。図３及び図４の写真から明らかなように、形質転換植物体Ａ〜Ｃの何れにおいても、野生型植物体と比較して、未受精条件下でのさやの伸長が確認された。また、同様に、形質転換植物体Ｄ〜Ｈの何れにおいても、野生型植物体と比較して、未受精条件下でのさやの伸長が確認された。このことより、キメラ遺伝子Ａ〜Ｈを有するコンストラクトＡ〜Ｈは、シロイヌナズナにおいて自発的さや（果実）伸長（未受精下でのさや伸長）を誘導することが証明された。
【０１２４】
また、形質転換植物体Ａ及びＣのさや（果実）の縦長を測定した。形質転換植物体Ａ及びＣのさやの縦長を示すグラフをそれぞれ図５Ａ及び５Ｂに示す。形質転換植物体Ａ及びＣの何れにおいても、さや（果実）の伸長がみられた。このことより、キメラ遺伝子Ａ及びＣを有するコンストラクトＡ及びＣは、シロイヌナズナにおいて自発的さや（果実）伸長（未受精下でのさや伸長）を誘導することが証明された。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明は、種子植物において受精を経ずに果実の生長を人為的に誘導することを可能とする技術であることから、特に農業生産分野等で高い利用可能性を有する。
【図１】
2019149990.tif 000003
【図２】
2019149990.tif 000004
【図３】
2019149990.tif 000005
【図４】
2019149990.tif 000006
【図５】
2019149990.tif 000007
【配列表】
2019149990000001.app