(57)【要約】【課題】試料中に含まれる微量のヘパラン硫酸及び／又はデルマタン硫酸の量を測定する方法を提供すること。【解決手段】試料中に含まれるヘパラン硫酸とデルマタン硫酸とを，それぞれ，ヘパラン硫酸はウロン酸とアミノ糖がα１，４結合した二糖に，デルマタン硫酸はウロン酸とアミノ糖がα１，３結合した二糖にまで分解する方法。より詳しくは，例えば，２，２−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で，ヘパラン硫酸とデルマタン硫酸とを，それぞれ，ヘパラン硫酸は８０分〜１８０分間，６５℃〜８５℃の温度で，デルマタン硫酸は２０分〜１００分間，６０℃〜８０℃の温度で，加熱して分解するものである方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるヘパラン硫酸を，ウロン酸とアミノ糖がα１，４結合した二糖にまで分解する方法であって，該ヘパラン硫酸を，２，２−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で，８０分〜１８０分間，６５℃〜８５℃の温度で加熱して分解するものである，方法。
【請求項２】
該加熱が１１０分〜１３０分間，７８℃〜８２℃の温度で行われるものである，請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該試料が，体液，細胞，組織，器官，細胞の培養液，組織の培養液，食品，及び飼料から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該試料が，哺乳動物から得られた体液，細胞，組織，器官，血液，血清，血漿，尿，骨髄液，及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
該哺乳動物が，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，及びネコからなる群から選択されるものである，請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該哺乳動物がヒトであり，該ヒトが，ヘパラン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者である，請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該疾患が，ハンター症候群，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群，サンフィリッポ症候群，及びスライ症候群からなる群から選択されるものである，請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該患者が，体内に蓄積したヘパラン硫酸を減少させる治療を受けたものである，請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
試料中に含まれるデルマタン硫酸とヘパラン硫酸を，それぞれ，該デルマタン硫酸をウロン酸とアミノ糖がα１，３結合した二糖に，該ヘパラン硫酸をウロン酸とアミノ糖がα１，４結合した二糖に分解する方法であって，
該デルマタン硫酸を，２，２−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で，２０分〜１００分間，６０℃〜８０℃の温度で加熱して分解するものであり，及び，
該ヘパラン硫酸を，請求項１又は２に記載の方法で分解するものである，方法。
【請求項１０】
該デルマタン硫酸の分解における該加熱が，３０分〜８０分間，６３℃〜６７℃の温度で行われるものである，請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該試料が，体液，細胞，組織，器官，細胞の培養液，組織の培養液，食品，及び飼料から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
該試料が，哺乳動物から得られた体液，細胞，組織，器官，血液，血清，血漿，尿，骨髄液，及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１３】
該哺乳動物が，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，及びネコからなる群から選択されるものである，請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該哺乳動物がヒトであり，該ヒトが，ヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者である，請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
該疾患が，ハンター症候群，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群，マロトー・ラミー症候群，サンフィリッポ症候群，及びスライ症候群からなる群から選択されるものである，請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該患者が，体内に蓄積したヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸を減少させる治療を受けたものである，請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
試料中に含まれるヘパラン硫酸の量を測定する方法であって，
請求項１乃至８の何れかに記載の方法で得られた二糖を，液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと，
該溶出液を質量分析に供するステップと，
を含んでなるものである，方法。
【請求項１８】
試料中に含まれるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の量を測定する方法であって，
請求項９乃至１６の何れかに記載の方法により，デルマタン硫酸を分解して得られた二糖及びヘパラン硫酸を分解して得られた二糖を，それぞれ，液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと，
該溶出液を質量分析に供するステップと，
を含んでなるものである，方法。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載の方法により得られた，該試料中に含まれるヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸の測定値に基づいて，該試料を提供した哺乳動物の中から，ヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸が体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
【請求項２０】
該疾患が，ハンター症候群，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群，マロトー・ラミー症候群，サンフィリッポ症候群，及びスライ症候群からなる群から選択されるものである，請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該試料が，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者であって，体内に蓄積したヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸を減少させる治療を受けた患者から，該治療の前及び該治療の後にそれぞれ得られたものであり，該試料中に含まれるヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸の量を，請求項１７又は１８に記載の方法により測定することにより得られた測定値に基づいて，該治療の効果を確認する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸を二糖にまで分解する方法に関し，更には，該二糖を液体クロマトグラフィー−質量分析法により分析することにより，ヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸の量を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は，アミノ酸を含む一群の酸性多糖である。ＧＡＧは，アミノ糖（グルコサミン，ガラクトサミン）とウロン酸（グルクロン酸等）又はガラクトースからなる二糖が，繰返し結合した長鎖構造を有している。ＧＡＧを構成する糖が硫酸化されているものもある。ＧＡＧとしては，ヒアルロン酸，コンドロイチン４−硫酸，コンドロイチン６−硫酸，へパリン，ヘパラン硫酸，デルマタン硫酸，ケラタン硫酸がある。
【０００３】
それぞれの種類のＧＡＧには，これらを特異的に分解する酵素が存在する。これらの酵素を遺伝的に欠失することにより引き起こされる遺伝子疾患もある。
【０００４】
例えば，イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）は，ヘパラン硫酸，デルマタン硫酸等の分子内に存在する硫酸エステル結合を加水分解する活性を有する酵素である。この酵素の活性が遺伝的に一部又は全て失われるとハンター症候群を発症する。ハンター症候群の患者では，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が各種の組織中に蓄積し，骨格の変形，重症の精神遅滞等の諸症状が引き起こされる。
【０００５】
また，α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）は，デルマタン硫酸，ヘパラン硫酸等の分子内に存在するイズロン酸結合を加水分解する活性を有する酵素である。この酵素の活性が遺伝的に一部又は全て失われるとハーラー症候群を発症する。シャイエ症候群は，ハーラー症候群の軽症型であり，ハーラー・シャイエ症候群はこれらの中間型であるが，いずれもα−Ｌ−イズロニダーゼの遺伝的欠損が原因となる疾患である。ハーラー症候群の患者では，組織内にデルマタン硫酸，ヘパラン硫酸が蓄積することにより，強い身体変形，精神遅滞等の諸症状が引き起こされる。
【０００６】
また，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）は，コンドロイチン４−硫酸，デルマタン硫酸等を加水分解して硫酸イオンを遊離する活性を有する酵素である。この酵素の活性が遺伝的に一部又は全て失われるとマロトー・ラミー症候群を発症する。マロトー・ラミー症候群の患者では，組織内にデルマタン硫酸等が蓄積することにより，発育遅延，四肢及び脊椎の顕著な変形等の諸症状が引き起こされる。
【０００７】
その他，ＧＡＧを分解する酵素の遺伝的欠損を原因とする疾患として，サンフィリッポ症候群，モルキオ症候群，スライ症候群等が知られている。
【０００８】
ＧＡＧを分解する酵素の欠損により引き起こされる疾患は，ムコ多糖症と総称される。ムコ多糖症の患者の組織内には，ＧＡＧが異常に蓄積される。従って，ムコ多糖症を適応症とする薬剤の効果は，例えば，組織内に存在するＧＡＧの量の変化を測定することによって定量的に求めることができる。また，組織内に存在するＧＡＧの量を測定することによって，ムコ多糖症の患者を同定することができる。
【０００９】
ＧＡＧの分析法としては，試料中に含まれるＧＡＧを還元的アミノ化反応により分解して蛍光ラベル化二糖類を得て，これを液体クロマトグラフィーで分析する方法が知られている（特許文献１）。また，試料中に含まれるＧＡＧをメタノリシス処理により二糖類にまで分解し，これを液体クロマトグラフィーに直結させた質量分析計を用いて分析する方法が知られている（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１２−１０８０５６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Auray-Blais C. et al., Mol Genet Metab. 102. 49-56 (2011)
【非特許文献２】Auray-Blais C. et al., Clin Chim Acta. 413. 771-8 (2012)
【非特許文献３】Zang H. et al., Clin Chem. 57. 1005-12 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は，ヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸を，これを構成する二糖類にまで分解する方法，及びヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸を分解して得られた二糖類を，液体クロマトグラフィー−質量分析法によって分析及び測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，ＧＡＧを構成するヘパラン硫酸とデルマタン硫酸を，塩酸メタノール存在下に分解することにより，二糖類にまで効率よく分解することができること，及び，分解して得られた二糖類を液体クロマトグラフィー−質量分析法によって分析することにより，ヘパラン硫酸とデルマタン硫酸とを，それぞれ感度良く測定することができることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を含むものである。
【００１４】
１．試料中に含まれるヘパラン硫酸を，ウロン酸とアミノ糖がα１，４結合した二糖にまで分解する方法であって，該ヘパラン硫酸を，２，２−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で，８０分〜１８０分間，６５℃〜８５℃の温度で加熱して分解するものである，方法。
２．該加熱が１１０分〜１３０分間，７８℃〜８２℃の温度で行われるものである，上記１の方法。
３．該試料が，体液，細胞，組織，器官，細胞の培養液，組織の培養液，食品，及び飼料から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，上記１又は２の方法。
４．該試料が，哺乳動物から得られた体液，細胞，組織，器官，血液，血清，血漿，尿，骨髄液，及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，上記１又は２の方法。
５．該哺乳動物が，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，及びネコからなる群から選択されるものである，上記４の方法。
６．該哺乳動物がヒトであり，該ヒトが，ヘパラン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者である，上記４の方法。
７．該疾患が，ハンター症候群，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群，サンフィリッポ症候群，及びスライ症候群からなる群から選択されるものである，上記６の方法。
８．該患者が，体内に蓄積したヘパラン硫酸を減少させる治療を受けたものである，上記６又は７の方法。
９．試料中に含まれるデルマタン硫酸とヘパラン硫酸を，それぞれ，該デルマタン硫酸をウロン酸とアミノ糖がα１，３結合した二糖に，該ヘパラン硫酸をウロン酸とアミノ糖がα１，４結合した二糖に分解する方法であって，
該デルマタン硫酸を，２，２−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で，２０分〜１００分間，６０℃〜８０℃の温度で加熱して分解するものであり，及び，
該ヘパラン硫酸を，上記１又は２の方法で分解するものである，方法。
１０．該デルマタン硫酸の分解における該加熱が，３０分〜８０分間，６３℃〜６７℃の温度で行われるものである，上記９の方法。
１１．該試料が，体液，細胞，組織，器官，細胞の培養液，組織の培養液，食品，及び飼料から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，上記９又は１０の方法。
１２．該試料が，哺乳動物から得られた体液，細胞，組織，器官，血液，血清，血漿，尿，骨髄液，及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの，又はこれらに由来するものである，上記９又は１０の方法。
１３．該哺乳動物が，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，及びネコからなる群から選択されるものである，上記１２の方法。
１４．該哺乳動物がヒトであり，該ヒトが，ヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者である，上記１２の方法。
１５．該疾患が，ハンター症候群，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群，マロトー・ラミー症候群，サンフィリッポ症候群，及びスライ症候群からなる群から選択されるものである，上記１４の方法。
１６．該患者が，体内に蓄積したヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸を減少させる治療を受けたものである，上記１４又は１５の方法。
１７．試料中に含まれるヘパラン硫酸の量を測定する方法であって，
上記１乃至８の何れかの方法で得られた二糖を，液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと，
該溶出液を質量分析に供するステップと，
を含んでなるものである，方法。
１８．試料中に含まれるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の量を測定する方法であって，
上記９乃至１６の何れかの方法により，デルマタン硫酸を分解して得られた二糖及びヘパラン硫酸を分解して得られた二糖を，それぞれ，液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと，
該溶出液を質量分析に供するステップと，
を含んでなるものである，方法。
１９．上記１７又は１８の方法により得られた，該試料中に含まれるヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸の測定値に基づいて，該試料を提供した哺乳動物の中から，ヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸が体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
２０．該疾患が，ハンター症候群，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群，マロトー・ラミー症候群，サンフィリッポ症候群，及びスライ症候群からなる群から選択されるものである，上記１９の方法。
２１．該試料が，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者であって，体内に蓄積したヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸を減少させる治療を受けた患者から，該治療の前及び該治療の後にそれぞれ得られたものであり，該試料中に含まれるヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸の量を，上記１７又は１８の方法により測定することにより得られた測定値に基づいて，該治療の効果を確認する方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば，例えば，哺乳動物から採取された試料（血清，脳脊髄液等）中に含まれる，ヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸を感度良く測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】デルマタン硫酸とヘパラン硫酸とを各25 ng/mLずつ含有する検量線作成用溶液を，表１に示す条件Ａでメタノリシス処理したものをLC/MS/MS分析して得られたイオンクロマトグラム。縦軸はカウント毎秒（ｃｐｓ），横軸は溶出時間（分）を示す。
【図２】デルマタン硫酸とヘパラン硫酸とを各25 ng/mLずつ含有する検量線作成用溶液を，表１に示す条件Ｂでメタノリシス処理したものをLC/MS/MS分析して得られたイオンクロマトグラム。縦軸はカウント毎秒（ｃｐｓ），横軸は溶出時間（分）を示す。
【図３】マウスの血清中に含まれるデルマタン硫酸の濃度の測定結果を示す図。縦軸は，マウス血清中のデルマタン硫酸の濃度（μg/mL）を示す。白棒は野生型マウス，黒棒はIDSヘミ接合体マウスの血清中のデルマタン硫酸の濃度をそれぞれ示す。誤差バーは標準偏差（n＝3）を示す。(A)は75分間，65℃，(B)は2時間，80℃，(C)は18時間，65℃でメタノリシス処理をしたものを測定した結果を，それぞれ示す。
【図４】マウスの血清中に含まれるヘパラン硫酸の濃度の測定結果を示す図。縦軸は，マウス血清中のヘパラン硫酸の濃度（μg/mL）を示す。白棒は野生型マウス，黒棒はIDSヘミ接合体マウスの血清中のヘパラン硫酸の濃度の結果をそれぞれ示す。誤差バーは標準偏差（n＝3）を示す。(A)は75分間，65℃，(B)は2時間，80℃，(C)は18時間，65℃でメタノリシス処理をしたものを測定した結果を，それぞれ示す。
【図５】rhIDSを投与したマウスの血清中に含まれるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の濃度の測定結果を示す図。縦軸は，マウス血清中のヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の濃度（μg/mL）を示す。白棒は野生型マウス，黒棒はrhIDS非投与のIDSヘミ接合体マウス，網掛け棒はrhIDS投与のIDSヘミ接合体マウスの結果をそれぞれ示す。誤差バーは標準偏差，二重♯印はｔ検定でｐ＜０．０１（野生型マウスとrhIDS非投与のIDSヘミ接合体マウスとの比較），二重星印はｔ検定でｐ＜０．０１（rhIDS非投与のIDSヘミ接合体マウスとrhIDS非投与のIDSヘミ接合体マウスとの比較）を示す。(A)はヘパラン硫酸の濃度の測定結果，(B)はデルマタン硫酸の濃度の測定結果を，それぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明において「デルマタン硫酸」というときは，ウロン酸とアミノ糖がα1,3結合した二糖の繰返し構造を含むものをいう。ウロン酸としてはL-イズロン酸，L-イズロン酸-2-硫酸，アミノ糖としてはN-アセチル-D-ガラクトサミン-4-硫酸が挙げられるが，これらに限定されるものではない。デルマタン硫酸の繰返し構造の単位となる二糖は，例えば，下記の式（I）で示される。
【００１８】
【化１】
2019060837.tif 000003
【００１９】
〔式（I）中，Ｒ１はNH2 ，NHCOCH3 ，NHSO3H，又はその塩；Ｒ２はOH，OSO3H又はその塩，Ｒ３はCOOH又はその塩；Ｒ４はCH2OH，CH2OSO3H，又はその塩；Ｒ５はOH，OSO3H，又はその塩である。但し，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ４及びＲ５の何れか１つは硫酸基を含む。〕
【００２０】
下記の（II）式に示されるものは，デルマタン硫酸の繰返し構造の単位となる二糖の，より具体的な一例であり，ウロン酸がL-イズロン酸であり，アミノ糖がN-アセチル-D-ガラクトサミン-4-硫酸であるものである。
【００２１】
【化２】
2019060837.tif 000004
【００２２】
本発明において「ヘパラン硫酸」というときは，ウロン酸とアミノ糖がα1,4結合した二糖の繰返し構造を含むものをいう。ウロン酸としてはL-イズロン酸，L-イズロン酸-2-硫酸，アミノ糖としてはD-グルコサミン，N-スルホ-D-グルコサミン-6-硫酸が挙げられるが，これらに限定されるものではない。ヘパラン硫酸の繰返し構造の単位となる二糖は，例えば，下記の式（III）で示される。
【００２３】
【化３】
2019060837.tif 000005
【００２４】
〔式（III）中，Ｒ１はNH2 ，NHCOCH3 ，NHSO3H，又はその塩；Ｒ２はOH，OSO3H又はその塩；Ｒ３はCOOH又はその塩；Ｒ４はCH2OH，CH2OSO3H，又はその塩である。但し，Ｒ１，Ｒ２，及びＲ４の何れか１つは硫酸基を含む。〕
【００２５】
下記の（IV）式に示されるものは，ヘパラン硫酸の繰返し構造の単位となる二糖の，より具体的な一例であり，ウロン酸がL-イズロン酸-2-硫酸であり，アミノ糖がN-スルホ-D-グルコサミン-6-硫酸であるものである。
【００２６】
【化４】
2019060837.tif 000006
【００２７】
塩酸メタノール中でデルマタン硫酸をウロン酸とアミノ糖がα1,3結合した二糖にまで分解する反応を，メタノリシス（メタノール分解）という。ヘパラン硫酸をウロン酸とアミノ糖がα1,4結合した二糖にまで分解する反応についても同様である。
【００２８】
ウロン酸がL-イズロン酸であり，アミノ糖がN-アセチル-D-ガラクトサミン-4-硫酸であるデルマタン硫酸のメタノリシスの反応式を下記の式（V）に例示する。
【００２９】
【化５】
2019060837.tif 000007
【００３０】
〔式（V）中，ｎは１以上の整数を示す。〕
【００３１】
ウロン酸がL-イズロン酸-2-硫酸であり，アミノ糖がN-スルホ-D-グルコサミン-6-硫酸であるヘパラン硫酸のメタノリシスの反応式を下記の式（VI）に例示する。
【００３２】
【化６】
2019060837.tif 000008
【００３３】
〔式（VI）中，ｎは１以上の整数を示す。〕
【００３４】
デルマタン硫酸のメタノール分解反応（メタノリシス）は，デルマタン硫酸を含有する試料を，2, 2-ジメトキシプロパンを含有する塩酸メタノール中で加熱して行われる。ここで，塩酸メタノールとは塩化水素を含むメタノールのことをいう。塩酸メタノールに含まれる塩化水素の濃度は，好ましくは０．５〜５ｍｏｌ／Ｌであり，より好ましくは１〜４ｍｏｌ／Ｌであり，更に好ましくは２．５〜３．５ｍｏｌ／Ｌであり，例えば３ｍｏｌ／Ｌである。またここで，塩酸メタノールに対する2, 2-ジメトキシプロパンの比率に，特に限定はないが，例えば０．５〜１．５：１０であり，特に１：１０である。また，このときのメタノール分解反応時の加熱条件は，好ましくは，６０℃〜８０℃の温度で２０分〜１００分間であり，より好ましくは，６０℃〜７０℃の温度で２０分〜９０分間であり，更に好ましくは，６３℃〜６７℃の温度で３０分〜８０分間又は６０〜８０分であり，例えば，６５℃の温度で７５分間である。
【００３５】
ヘパラン硫酸のメタノール分解反応（メタノリシス）は，ヘパラン硫酸を含有する試料を，2, 2-ジメトキシプロパンを含有する塩酸メタノール中で加熱して行われる。ここで，塩酸メタノールに含まれる塩化水素の濃度は，好ましくは０．５〜５ｍｏｌ／Ｌであり，より好ましくは１〜４ｍｏｌ／Ｌであり，更に好ましくは２．５〜３．５ｍｏｌ／Ｌであり，例えば３ｍｏｌ／Ｌである。またここで，塩酸メタノールに対する2, 2-ジメトキシプロパンの比率に，特に限定はないが，例えば０．５〜１．５：１０であり，特に１：１０である。また，このときのメタノール分解反応時の加熱条件は，好ましくは，６５℃〜８５℃の温度で８０分〜１８０分間であり，より好ましくは，７５℃〜８５℃の温度で９０分〜１８０分間であり，更に好ましくは，７８℃〜８２℃の温度で１１０分〜１３０分間であり，例えば，８０℃の温度で１２０分間である。
【００３６】
本発明の方法より，試料中に含まれるデルマタン硫酸とヘパラン硫酸の量を測定することができる。このとき，測定対象の試料は分割され，その一つはデルマタン硫酸を測定するための試料として用いられ，他の一つはヘパラン硫酸を測定するための試料として用いられる。デルマタン硫酸を測定するために用いられる試料は，上記のデルマタン硫酸のメタノール分解反応の条件で加熱される。この反応により試料中に含まれるデルマタン硫酸が二糖にまで分解される。また，ヘパラン硫酸を測定するために用いられる試料は，上記のヘパラン硫酸のメタノール分解反応の条件で加熱される。この反応により試料中に含まれるヘパラン硫酸が二糖にまで分解される。またこのとき，デルマタン硫酸又はヘパラン硫酸のいずれか一方についてのみメタノール分解反応を行い，これらの何れか一方のみを測定することもできる。
【００３７】
メタノール分解反応（メタノリシス）によりデルマタン硫酸及び／又はヘパラン硫酸を分解させて得られた二糖は，液体クロマトグラフィーに付される。そして，液体クロマトグラフィーからの溶出液は，順次，質量分析に供される。
【００３８】
このとき用いられる液体クロマトグラフィーは，上記化学式（I）〜（IV）で示される二糖を，カラムに一旦吸着させた後に溶出させることにより，他の物質から分離できるものである限り特に限定はない。
【００３９】
例えば，イオン性相互作用，疎水性相互作用，親水性相互作用等により二糖を吸着させることのできる担体を充填したカラムを用いる高速液体カラムクロマトグラフィーは，本発明の方法において，好適に用いることができる。
【００４０】
上記化学反応式（V）及び（VI）で例示されるメタノール分解反応で生じる二糖は，極性が高い。従って，これらを一旦吸着させた後に溶出させることのできる担体としては，親水性相互作用により二糖を保持することができるものが特に好ましい。つまり，親水性相互作用により二糖を保持することのできる担体を用いた高速液体クロマトグラフィーが，メタノール分解反応で得られた二糖を分離する方法として好適である。このような高速液体クロマトグラフィーとして，下記の実施例４において使用されている，親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィーが挙げられる。
【００４１】
液体クロマトグラフィーの流出口からの流路は，質量分析装置に連結されており，液体クロマトグラフィーからの溶出液は，順次，質量分析に送り込まれる。
【００４２】
このとき用いることのできる質量分析装置に特に限定はない。例えば，質量分析装置は，分析対象の分子をイオン化するためのイオン源として，光イオン化法（ＡＰＰＩ），電子イオン化法（ＥＩ），化学イオン法，電気脱離法，高速原子衝撃法（ＦＡＢ），マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ），及びエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）を含む，何れのイオン化法を採用したものであってもよい。また，質量分析装置は，イオン化された分子を分離するための分析部が，磁場偏向型，四重極型，イオントラップ型，及びタンデム四重極型を含む，何れの型のものであってもよい。
【００４３】
陽イオンモードで作動させるエレクトロスプレーイオン化法（ESI）で運用されるイオン源と，タンデム四重極型の分析部とを有する質量分析装置は，本発明の方法において好適に用いることができる。タンデム四重極型質量分析装置は，マスフィルターとして機能する四重極（Ｑ１），衝突（コリジョン）セルとして機能する四重極（Ｑ２），及びマスフィルターとして機能する四重極（Ｑ３）を直列に配置した質量分析装置である。四重極（Ｑ１）において，イオン化により生じた複数のイオンから，イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて，目的のプレカーサーイオンが分離される。次いで，コリジョンセル（Ｑ２）でプレカーサーイオンを不活性ガス等（例えばアルゴン）と衝突させてプロダクトイオン（フラグメントイオン）を生成させる。次いで，四重極（Ｑ３）において，得られたプロダクトイオンを質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて，選択的に検出する。
【００４４】
以下にタンデム四重極型質量分析装置により，上記の式（V）で示されるデルマタン硫酸のメタノール分解により得られる二糖から，プレカーサーイオン及びプロダクトイオンを生成させる方法の具体例を例示する。まず，当該二糖をイオン化することにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が４２６のプレカーサーイオンが得られる。このプレカーサーイオンは，下記の（VII）式で示される。
【００４５】
【化７】
2019060837.tif 000009
【００４６】
上記の（VII）式で示されるプレカーサーイオンを分離し，コリジョンセル（Ｑ２）で開裂させることにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が２３６のプロダクトイオンが得られる。プレカーサーイオンを開裂させてプロダクトイオンを得る反応は概略（VIII）式で示される。
【００４７】
【化８】
2019060837.tif 000010
【００４８】
以下にタンデム四重極型質量分析装置により，上記の式（VI）で示されるヘパラン硫酸のメタノール分解により得られる二糖から，プレカーサーイオン及びプロダクトイオンを生成させる方法の具体例を例示する。まず，当該二糖をイオン化することにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が３８４のプレカーサーイオンが得られる。このプレカーサーイオンは，下記の（IX）式で示される。
【００４９】
【化９】
2019060837.tif 000011
【００５０】
上記の（IX）式で示されるプレカーサーイオンを分離し，コリジョンセル（Ｑ２）で開裂させることにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が１６２のプロダクトイオンが得られる。プレカーサーイオンを開裂させてプロダクトイオンを得る反応は概略（X）式で示される。
【００５１】
【化１０】
2019060837.tif 000012
【００５２】
上記の液体クロマトグラフィーとタンデム四重極型質量分析装置とを用いた方法により，試料中に含まれるデルマタン硫酸の量を測定することができる。既知量のデルマタン硫酸をメタノール分解し，これをタンデム四重極型質量分析装置を用いて分析することにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が２３６のプロダクトイオンに対応するクロマトチャート上に検出されるピーク（検出ピーク）の面積を算出する。そして，デルマタン硫酸の量と検出ピークの面積との相関を示す検量線を作成する。また，デルマタン硫酸の含量が未知の試料を，同様にして，メタノール分解し，タンデム四重極型質量分析装置を用いて分析することにより，プロダクトイオンに対応する検出ピークの面積を算出する。得られた値を検量線に内挿することにより，試料中に含まれるデルマタン硫酸を測定することができる。
【００５３】
同様にして試料中に含まれるヘパラン硫酸の量を測定することもできる。既知量のヘパラン硫酸をメタノール分解し，これをタンデム四重極型質量分析装置を用いて分析することにより，質量電荷比（ｍ／ｚ）が１６２のプロダクトイオンに対応する検出ピークの面積を算出する。そして，ヘパラン硫酸の量と検出ピークの面積との相関を示す検量線を作成する。また，ヘパラン硫酸の含量が未知の試料を，同様にして，メタノール分解し，タンデム四重極型質量分析装置を用いて分析することにより，プロダクトイオンに対応する検出ピークの面積を算出する。得られた値を検量線に内挿することにより，試料中に含まれるヘパラン硫酸を測定することができる。
【００５４】
試料中に含まれるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の量を測定することもできる。この場合，測定対象の試料は分割され，その一つはデルマタン硫酸を測定するための試料として用い，他の一つはヘパラン硫酸を測定するための試料として用いる。デルマタン硫酸を測定するために用いられる試料は，上記のデルマタン硫酸のメタノール分解反応の条件で加熱される。また，ヘパラン硫酸を測定するために用いられる試料は，上記のヘパラン硫酸のメタノール分解反応の条件で加熱される。デルマタン硫酸とヘパラン硫酸のメタノール分解物を，それぞれ液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得て，この溶出液を，順次質量分析装置で分析することにより，試料中に含まれるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の量を測定することができる。
【００５５】
本発明において，分析対象となる試料に，特に限定はないが，例えば，体液，細胞，組織，器官，細胞の培養液，組織の培養液，食品，及び飼料，又はこれらに由来するものが挙げられる。
【００５６】
試料が細胞である場合，その細胞の由来する生物種に特に限定はない。生物種は，原核生物であっても真核生物であってもよく，例えば，細菌，酵母，植物，鳥類，両生類，爬虫類，哺乳動物である。生物種が哺乳動物である場合，その動物種に特に限定はないが，例えば，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，ネコであり，特にヒトである。
【００５７】
試料が体液，組織又は器官である場合，これらの由来する生物種に特に限定はない。生物種としては，例えば，植物，鳥類，両生類，爬虫類，哺乳動物が挙げられるが，特に哺乳動物である。生物種が哺乳動物である場合，その動物種に特に限定はないが，例えば，ヒト，サル，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ウマ，ウシ，ブタ，イヌ，ネコであり，特にヒトである。
【００５８】
試料が哺乳動物に由来するものである場合，試料は，例えば，哺乳動物から得られた体液，血液，血清，血漿，骨髄液，脳脊髄液，尿，又はこれらに由来するものである。ここで，体液とは，血液，骨髄液，脳脊髄液，唾液，涙，汗，精液，滑液，尿を含む，哺乳動物に由来する液性の成分全般のことをいう。血清又は血漿は，遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００５９】
また，試料が哺乳動物に由来するものである場合，試料は，例えば，哺乳動物から得られた細胞，組織，器官，又はこれらに由来するものである。ここで，細胞の種類に特に限定はないが，細胞としては，例えば，間葉系幹細胞，神経細胞，神経芽細胞，筋芽細胞，グリア細胞，シュワン細胞，心筋細胞，骨格筋細胞，平滑筋細胞，軟骨細胞，骨芽細胞，線維芽細胞，ケラチノサイト，上皮細胞，内皮細胞，角膜上皮細胞，角膜内皮細胞，網膜細胞，肝細胞，メサンギウム細胞，間葉細胞，血球細胞，造血細胞，樹状細胞，間質細胞，が挙げられる。また，組織についても特に限定はなく，組織としては，例えば，上皮組織，結合組織，筋組織，神経組織，線維性結合組織，軟骨組織，骨組織，が挙げられる。また，器官についても特に限定はなく，器官としては，例えば，胃，小腸，大腸，肝臓，膵臓，腎臓，脾臓，心臓，肺，下垂体，精巣，卵巣，小脳，大脳，間脳，中脳，延髄，脳下垂体が挙げられる。
【００６０】
デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が体内に蓄積する疾患が知られている。かかる疾患として，例えば，ハンター症候群，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群，マロトー・ラミー症候群が挙げられる。このような疾患においては，体内に異常に蓄積したデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸を減少させることにより，症状を軽減させる治療法が試みられている。デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸を分解する酵素を体内に投与する酵素補充療法は，そのような治療法の一例である。
【００６１】
デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者は，体内に蓄積したデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸を測定し，得られた測定値に基づいてスクリーニングすることができる。測定値が正常ヒトより異常に高値である場合，被験者は当該疾患の患者であると判断できる。本発明の方法は，かかる判断を行う目的で実施することができる。
【００６２】
デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者を治療した際の，その治療の効果は，治療の前及び治療の後で患者の体内に蓄積したデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸を測定し，治療後のこれらの減少量を測定することにより，確認することができる。これらの減少量が大きい程，治療効果が高いと判断できる。本発明の方法は，かかる治療効果の確認を行う目的で実施することができる。例えば，患者の体内に蓄積したデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が，それぞれ治療前後に，好ましくは１０％以上，より好ましくは２０％以上，更に好ましくは３０％以上減少した場合に，更により好ましくは５０％以上減少した場合に，治療効果があったと判断できる。
【００６３】
また，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者の治療を目的とした薬剤のスクリーニングは，実験動物に被験薬を投与し，被験薬の投与前後で，実験動物の体内に蓄積したデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸を測定し，投与後のこれらの減少量を測定することにより行うことができる。これらの減少量が大きい程，被験薬の治療効果は高いと判断できる。例えば，患者の体内に蓄積したデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が，それぞれ治療前後に，好ましくは１０％以上，より好ましくは２０％以上，更に好ましくは３０％以上，更により好ましくは５０％以上減少した場合に，被験薬の治療効果は高いと判断できる。
【００６４】
ハンター症候群は，イズロン酸−２−スルファターゼ活性を遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。イズロン酸−２−スルファターゼの欠損又は欠失により，患者の体内にはデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が蓄積する。従って，ハンター症候群の患者のスクリーニング，その治療法の効果の確認，その治療薬の薬効の評価，その被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。ハンター症候群の治療薬としては，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼの類似物，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと抗体の結合体としては，例えば，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。
【００６５】
また，ハーラー症候群，シャイエ症候群，ハーラー・シャイエ症候群は，Ｌ−イズロニダーゼ活性を遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。Ｌ−イズロニダーゼの欠損又は欠失により，患者の体内にはデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が蓄積する。従って，これらの疾患に関し，患者のスクリーニング，治療法の効果の確認，及び治療薬の薬効の評価，その被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。これらの疾患の治療薬としては，Ｌ−イズロニダーゼ，Ｌ−イズロニダーゼの類似物，Ｌ−イズロニダーゼと抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。Ｌ−イズロニダーゼと抗体の結合体としては，例えば，Ｌ−イズロニダーゼと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。
【００６６】
また，マロトー・ラミー症候群は，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）活性を遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。ＡＳＢの欠損又は欠失により，患者の体内には特にデルマタン硫酸が蓄積する。従って，マロトー・ラミー症候群の患者のスクリーニング，その治療法の効果の確認，その治療薬の薬効の評価，その被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。マロトー・ラミー症候群の治療薬としては，ＡＳＢ，ＡＳＢの類似物が挙げられるが，これらに限定されるものではない。
【００６７】
また，サンフィリッポ症候群は，Ａ型，Ｂ型，Ｃ型，及びＤ型に分類され，それぞれ，ヘパラン硫酸Ｎ−スルファターゼ活性，α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性，アセチルＣｏＡ：α−グルコサミニドＮ−アセチルトランフェラーゼ活性，及びＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ活性を遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。これらの酵素の欠損又は欠失により，患者の体内には特にヘパラン硫酸が蓄積する。従って，サンフィリッポ症候群の患者のスクリーニング，その治療法の効果の確認，その治療薬の薬効の評価，その被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。サンフィリッポ症候群の治療薬としては，これらの酵素，これらの酵素の類似物，これらの酵素の何れかと抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。これらの酵素と抗体の結合体としては，例えば，これらの酵素と抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。
【００６８】
また，スライ症候群は，β−グルクロニダーゼを遺伝的に一部又は全て欠く疾患である。β−グルクロニダーゼの欠損又は欠失により，患者の体内にはデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が蓄積する。従って，スライ症候群の患者のスクリーニング，その治療法の効果の確認，その治療薬の薬効の評価，その被験薬のスクリーニング等に，本発明の方法は使用できる。スライ症候群の治療薬としては，β−グルクロニダーゼ，その類似物，β−グルクロニダーゼと抗体の結合体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。β−グルクロニダーゼと抗体の結合体としては，例えば，β−グルクロニダーゼと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質が挙げられる。
【００６９】
本発明の方法は，食品，及び飼料中に含まれるヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸の量を測定する方法としても用いることができる。例えば，ヒト又はヒト以外の動物が摂取する食品又は飼料中に含まれるヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸の量を予め測定することにより，ヘパラン硫酸又は／及びデルマタン硫酸の摂取量をコントロールすることもできる。上記疾患の患者が，ヘパラン硫酸等の摂取量を制限すべき状態であるとき，本発明の方法で予めヘパラン硫酸等の量を測定した食品を摂取することにより，ヘパラン硫酸等の摂取量を適切にコントロールできる。
【実施例】
【００７０】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
【００７１】
〔実施例１：各種溶液の調製〕
試験に用いる（ａ）〜（ｌ）の溶液を以下の手順で調製した。
（ａ）MeCN/water：
0.5 mLの注射用水と4.5 mLのアセトニトリルを混合し，これをMeCN/waterとした。本溶液は用時調製とした。
（ｂ）重水素ラベル化溶媒：
氷浴下で，1.5 mLのメタノール-d4（Sigma-Aldrich社）に240 μLのアセチルクロリドを滴下し，これを重水素ラベル化溶媒とした。本溶液は用時調製とした。
（ｃ）PBS/クエン酸溶液：
クエン酸を純水に溶解して10 mMの濃度のクエン酸溶液を作製した。更に，クエン酸三ナトリウムニ水和物を純水に溶解して10 mMの濃度のクエン酸ナトリウム溶液を作製した。クエン酸溶液にクエン酸ナトリウム溶液を滴下してpH 3.0に調整した。この溶液を10 mM クエン酸緩衝液（pH 3.0）とした。また，18 mLの10 mM クエン酸緩衝液（pH 3.0）に2 mLのPBSを加えた溶液をPBS/クエン酸溶液とした。
（ｄ）移動相A：
247.5 mLの純水に，2.5 mLの1 Mギ酸アンモニウム水溶液と400 μLの水酸化アンモニウム水溶液 (25% NH4OH)を添加して混合したものを，移動相Aとした。本溶液は用時調製とした。
（ｅ）移動相B：
45 mLの純水に，5 mLの1 Mギ酸アンモニウム水溶液と，450 mLのアセトニトリルと，800 μLの水酸化アンモニウム水溶液 (25% NH4OH)とを混合したものを，移動相Bとした。本溶液は用時調製とした。
再溶解溶液
（ｆ）ヘパラン硫酸標準原液（HS標準原液）：
1.5 mLマイクロチューブにHeparan sulfate（Iduron社）を秤量し，注射用水を加えて溶解し，5.0 mg/mLの濃度の溶液を調製した。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに15 μLずつ分注し，使用時まで冷凍（-15℃以下）して保存した。この溶液をHS標準原液とした。
（ｇ）デルマタン硫酸標準原液（DS標準原液）：
1.5 mLマイクロチューブにChondroitin sulfate B sodium salt from porcine intestinal mucosa（Sigma-Aldrich社）を秤量し，注射用水を加えて溶解し，5.0 mg/mLの濃度の溶液を調製した。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに15 μLずつ分注し，使用時まで冷凍（-15℃以下）して保存した。この溶液をDS標準原液とした。
（ｈ）デルマタン硫酸内部標準溶液（DS内部標準溶液）：
ホウケイ酸ねじ口試験管に40 μLのDS標準原液を計り取り，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に400 μLの重水素ラベル化溶媒を添加し，撹拌した後，65℃で75分間反応させて，重水素化メタノール分解（deuteriomethanolysis）を行った。反応後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に500 μLのMeCN/waterを添加し，超音波処理を30分間行った。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに20 μLずつ分注し，冷凍（-15℃以下）して保存した。この溶液をデルマタン硫酸内部標準溶液（DS内部標準溶液）とした。
（ｉ）ヘパラン硫酸内部標準溶液（HS内部標準溶液）：
ホウケイ酸ねじ口試験管に40 μLのヘパリン標準原液を計り取り，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に400 μLの重水素ラベル化溶媒を添加し，撹拌した後，65℃で75分間反応させて，重水素化メタノール分解（deuteriomethanolysis）を行った。反応後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に500 μLのMeCN/waterを添加し，超音波処理を30分間行った。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに20 μLずつ分注し，冷凍（-15℃以下）して保存した。この溶液をヘパラン硫酸内部標準溶液（HS内部標準溶液）とした。
（ｊ）サンプル溶解用溶液：
5 mLのMeCN/waterに，1 μLのHS内部標準溶液及び1 μLのDS内部標準溶液を添加して撹拌した後，超音波処理を30分間行った。この溶液をサンプル溶解用溶液とした。本溶液は用時調製とした。
（ｋ）検量線作成用溶液：
480 μLのPBS/クエン酸溶液を計り取り，これにHS標準原液とDS標準原液をそれぞれ10 μLずつ添加し，デルマタン硫酸とヘパラン硫酸を，それぞれ100 μg/mLずつ含有する溶液を調製した。この溶液をPBS/クエン酸溶液で希釈し，デルマタン硫酸とヘパラン硫酸を，それぞれ2500 ng/mLずつ含有する溶液を調製した。この溶液をPBS/クエン酸溶液で2段階希釈し，デルマタン硫酸とヘパラン硫酸を，それぞれ25〜2500 ng/mLの濃度で含有する溶液を調製した。この溶液を検量線作成用溶液とした。
（l）組織抽出溶液
1 mLのポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテルに生理食塩液を添加し，全量を500 mLとした。この溶液を組織抽出溶液とした。
【００７２】
〔実施例２：血液サンプルの調製〕
野生型マウス（C57BL/6N）及びIDS遺伝子を含む染色体領域を欠損するヘミ接合体マウス（IDSヘミ接合体マウス，C57BL/6N）から血液を採取した。採取した血液をチューブに移して室温で30分間以上静置した後，遠心（2000 g，20分間）して血清を回収した。8 μLの血清に8 μLのPBSと144 μLの10mM クエン酸緩衝液（pH 3.0）を加えて撹拌した。これを20 μL計り取り，ホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。これを血液サンプル溶液とした。
【００７３】
〔実施例３：メタノリシス反応〕
上記実施例１で調製した検量線作成用溶液を，それぞれ20 μL計り取り，個別にホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。また，ブランクとして，PBS/クエン酸溶液をホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。試験管中の溶媒を窒素気流下で留去した（N=1）。乾固物に，20 μLの2, 2-ジメトキシプロパンと，200 μLの塩酸の濃度が3Nである塩酸メタノールとを添加して撹拌した後，表１に示す3種類の条件（条件Ａ〜Ｃ）でメタノリシス反応を行った。反応後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に50 μLのサンプル溶解用溶液を添加して溶解後，遠心（15000 rpm，10分間，室温）し，上清をバイアルに採取した。
【００７４】
また，上記実施例１で調製したデルマタン硫酸標準原液とヘパラン硫酸標準原液とをPBS/クエン酸溶液で希釈し，デルマタン硫酸標準原液及びヘパラン硫酸標準原液とをいずれも25.0 ng，50.0 ng/mL，500 ng/mL，及び2000 ng/mLの濃度で含有する4種類の品質管理試料（QC試料）を調製し，それぞれ，QC-LL，QC-L，QC-M，及びQC-Hとした。これらをそれぞれ20 μL計り取り，個別にホウケイ酸ねじ口試験管に分取し，試験管中の溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に，20 μLの2, 2-ジメトキシプロパンと，200 μLの塩酸の濃度が3Nである塩酸メタノールとを添加して撹拌した後，表１に示す3種類の条件（条件Ａ〜Ｃ）でメタノリシス反応を行った。反応後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に50 μLのサンプル溶解用溶液を添加して溶解後，遠心（15000 rpm，10分間，室温）し，上清をバイアルに採取した。
【００７５】
また，実施例２で調製した血液サンプル溶液を20 μL計り取り，ホウケイ酸ねじ口試験管に分取しし，試験管中の溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に，20 μLの2, 2-ジメトキシプロパンと，200 μLの塩酸の濃度が3Nである塩酸メタノールとを添加して撹拌した後，表１に示す3種類の条件（条件Ａ〜Ｃ）でメタノリシス反応を行った。反応後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に50 μLのサンプル溶解用溶液を添加して溶解後，遠心（15000 rpm，10分間，室温）し，上清をバイアルに採取した。
【００７６】
【表１】
2019060837.tif 000013
【００７７】
〔実施例４：LC/MS/MS分析〕
LC/MS/MS分析は，親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィーとタンデム四重極型質量分析装置とを組み合わせたものを用いて実施した。質量分析装置（MS/MS装置）として，QTRAP5500（エー・ビー・サイエックス社）を用い，これにHPLC装置として，Nexera X2（島津製作所）をセットした。また，LCカラムとして，Acquity UPLCTM BEH Amid 1.7 μm (2.1 Ｘ 50 mm，Waters社)を用いた。移動相として，実施例１で調製した移動相A及び移動相Bを用いた。また，カラム温度は50℃に設定した。
【００７８】
6% (v/v)の移動相Aと94% (v/v)の移動相Bからなる混合液でカラムを平衡化した後，10μLの試料を注入し，表２に示す移動相のグラジエント条件で，クロマトグラフィーを実施した。なお，移動相の流量は0.4 mL/分とした。
【００７９】
【表２】
2019060837.tif 000014
【００８０】
MS/MS装置のイオン源パラメーターを，QTRAP5500（エー・ビー・サイエックス社）の使用説明書に従って，表３に示すように設定した。
【００８１】
【表３】
2019060837.tif 000015
【００８２】
検量線作成用溶液及びQC試料の測定により，各検量線作成用溶液に含まれていたデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸に由来するプロダクトイオンのクロマトチャート上に検出されるピーク（検出ピーク）の面積を求めた。また，DS内部標準溶液，及びHS内部標準溶液に由来するプロダクトイオンの検出ピークの面積を求めた。検量線作成用溶液はN=1，QC試料（QC-LL，QC-L，QC-M，及びQC-H）はN=3で測定を行った。
【００８３】
ここで検出されるプロダクトイオンは，デルマタン硫酸については上記反応式（VIII）で得られるイオン，ヘパラン硫酸については上記反応式（X）で得られるイオンである。なお，DS内部標準溶液及びHS内部標準溶液に含まれるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸は重水素ラベルされている。従って，これらに由来するプレカーサーイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）は，それぞれ432及び390と，非ラベルのものと比較して大きな値をとる。非ラベルのデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸に由来するプレカーサーイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）は，それぞれ426及び384である。従って，これらプレカーサーイオンは，四重極（Ｑ１）において，イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて，分離されるので，個別に検出可能となる。表４にプレカーサーイオンとプロダクトイオンの（ｍ／ｚ）をまとめて示す。
【００８４】
デルマタン硫酸とヘパラン硫酸とを各25 ng/mLずつ含有する検量線作成用溶液を，表１に示す条件Ａでメタノリシス処理したものをLC/MS/MS分析して得られたイオンクロマトグラムを図１に示す。図１は，液体クロマトグラフィーからの溶出液に含まれるイオン量を，デルマタン硫酸のプレカーサーイオンに対応するｍ／ｚ＝426で順次検出したものである。図中，黒塗りしたピークがデルマタン硫酸のプレカーサーイオンに対応する。
【００８５】
また，デルマタン硫酸とヘパラン硫酸とを各25 ng/mLずつ含有する検量線作成用溶液を，表１に示す条件Ｂでメタノリシス処理したものをLC/MS/MS分析して得られたイオンクロマトグラムを図２に示す。図２は，液体クロマトグラフィーからの溶出液に含まれるイオン量を，ヘパラン硫酸のプレカーサーイオンに対応するｍ／ｚ＝384で順次検出したものである。図中，黒塗りしたピークがヘパラン硫酸のプレカーサーイオンに対応する。
【００８６】
【表４】
2019060837.tif 000016
【００８７】
各検量線作成用溶液に含まれていたデルマタン硫酸に由来する検出ピークの面積（DS検出ピーク面積）に対する，DS内部標準溶液に由来する検出ピーク（DS-IS検出ピーク面積）の面積比（DS検出ピーク面積／DS-IS検出ピーク面積）を求めた。この値を縦軸にとり，各検量線作成用溶液のデルマタン硫酸の濃度を横軸にとり，二次計画法を用いて回帰式を算出し検量線を作成した。
【００８８】
また，各検量線作成用溶液に含まれていたヘパラン硫酸に由来する検出ピークの面積（HS検出ピーク面積）に対する，HS内部標準溶液に由来する検出ピーク（HS-IS検出ピーク面積）の面積比（HS検出ピーク面積／HS-IS検出ピーク面積）を求めた。この値を縦軸にとり，各検量線作成用溶液のヘパラン硫酸の濃度を横軸にとり，二次計画法を用いて回帰式を算出し検量線を作成した。
【００８９】
また，QC試料の測定値に基づき下記の計算式により精度（％）と真度（％）を求めた。
精度（％）＝測定値の標準偏差／測定値の平均値×１００
真度（％）＝測定値の平均値／理論濃度×１００
なお，真度（％）の計算式中の理論濃度とは，QC試料に添加されたデルマタン硫酸又はヘパラン硫酸の濃度のことをいう。
【００９０】
〔実施例５：条件Ａで得られた検量線の検討〕
上記表１に示す条件Ａでメタノリシスを行った検量線作成用溶液の測定値から得られた検量線（条件Ａの検量線）は，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸のいずれについても，25.0〜2500 ng/mLの濃度範囲において良好な直線性を示した（データは示さない）。相関係数(r)は，デルマタン硫酸については0.9995，ヘパラン硫酸については0.9938であった。
【００９１】
次いで，精度及び真度についてみる。表５及び表６に各QC試料における測定値の精度及び真度を示す。これらの値は，条件Ａが，25.0〜2500 ng/mLの濃度範囲のデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の濃度を測定するためのメタノリシスの条件として，好適であることを示す。但し，25.0 ng/mLの濃度でのヘパラン硫酸の測定値は，真度及び精度ともに大きく低下した（表５）。一方，デルマタン硫酸では，25.0 ng/mLの濃度の測定値の真度及び精度は大きくは低下しなかった（表６）。
【００９２】
【表５】
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【００９３】
【表６】
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【００９４】
〔実施例６：条件Ａ，Ｂ及びＣで得られた検量線の比較〕
条件Ａ，Ｂ及びＣでメタノリシスを行った検量線作成用溶液の測定値から得られた検量線はいずれも，デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸のいずれについても，25〜2500 ng/mLの濃度範囲において良好な直線性を示した（データは示さない）。それぞれの条件における検量線の相関係数(r)を表７に示す。
【００９５】
【表７】
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【００９６】
しかし，実施例５で，条件Ａでは，25.0 ng/mLの濃度でのヘパラン硫酸の測定値の真度及び精度が，ともに低下した。従って，25.0 ng/mLの濃度のヘパラン硫酸をより正確に測定するための条件を検討することとした。そこで，条件Ａ，Ｂ及びＣにおける，QC試料（QC-LL）のヘパラン硫酸の測定値の真度及び精度を比較した。なお，QC試料（QC-LL）は，デルマタン硫酸とヘパラン硫酸とをそれぞれ25.0 ng/mLの濃度で含むものである。その結果を表８に示す。ヘパラン硫酸では，条件Ｂで測定した場合に，真度及び精度がともに高い測定値が得られた。ヘパラン硫酸では，条件Ｃで測定した場合でも，真度及び精度がともに高い測定値が得られたが，条件Ｃは熱処理に長時間を要するという欠点がある。従って，ヘパラン硫酸の測定のためのメタノール分解は条件Ｂが好ましいと結論付けられた。なお，実施例５で示されたのと同様に，ヘパラン硫酸の測定値は，条件Ａで真度及び精度がともに低下した。
【００９７】
デルマタン硫酸についても，条件Ａ，Ｂ及びＣにおける測定値の真度及び精度を比較した。その結果を表８に示す。デルマタン硫酸では，条件Ａと比較して，条件Ｂ及びＣで真度及び精度がともに低下した。
【００９８】
これらの結果は，デルマタン硫酸の測定のためのメタノール分解は条件Ａが好ましく，ヘパラン硫酸の測定のためのメタノール分解は条件Ｂが好ましいことを示すものである。
【００９９】
【表８】
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【０１００】
〔実施例７：条件Ａ，Ｂ及びＣでの血清中に含まれるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の測定結果の比較〕
生体由来の試料中に含まれるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の測定方法として，条件Ａ，Ｂ及びＣの何れが好適であるかを，実施例２に記載した野生型マウス及びIDSヘミ接合体マウスの血液から調製した血清を用いて調べた。IDSは，デルマタン硫酸，ヘパラン硫酸を含むＧＡＧを分解する活性を有する酵素である。従って，IDSヘミ接合体マウスの血中のＧＡＧの濃度は，野生型マウスと比較して高いことが知られている。
【０１０１】
野生型マウス及び，IDSヘミ接合体マウスから採取した血清中の，条件Ａ，Ｂ及びＣでのデルマタン硫酸の測定結果を図３に，ヘパラン硫酸の測定結果を図４に示す。
【０１０２】
デルマタン硫酸の測定値は，条件Ａでは，野生型マウスと比較してIDSヘミ接合体マウスで高値を示した（図３）。この結果は，IDSヘミ接合体マウスの遺伝子型を反映している。一方，条件Ｂ及びＣのデルマタン硫酸の測定値は，野生型マウスとIDSヘミ接合体マウスでほぼ同等であり，且つ，条件Ａの測定結果と比較して極めて高い値を示した（図３）。これらの結果は，条件Ｂ及びＣでは，血清中に含まれるデルマタン硫酸以外の成分に由来するプロダクトイオンが生じたことを示すと考えられる。すなわち，条件Ｂ及びＣでは，血清中のデルマタン硫酸は測定が困難である。
【０１０３】
一方，ヘパラン硫酸の測定値は，条件Ａ〜Ｃの何れにおいても，野生型マウスと比較してIDSヘミ接合体マウスで高値を示しており，IDSヘミ接合体マウスの遺伝子型を反映した測定結果となった（図４）。しかし，表８で示される結果から，ヘパラン硫酸の測定値は，条件Ａで測定した値よりも，条件Ｂで測定した値の真度及び精度が高いといえる。従って，図４で示される条件Ａ〜Ｃの測定結果においても，条件Ａでの測定値よりも条件Ｂでの測定値のほうが真度及び精度がともに高いといえる。
【０１０４】
以上の結果から，血清中に含まれるデルマタン硫酸のメタノリシスの条件としては条件Ａ（加熱温度：６５℃，加熱時間：７５分間）が好ましく，ヘパラン硫酸のメタノリシスの条件としては条件Ｂ（加熱温度：８０℃，加熱時間：2時間）が好適であると結論できる。
【０１０５】
〔実施例８：IDSを投与したマウス血液中に含まれるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の測定〕
医療用に市販されている遺伝子組換えヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（rhIDS）を生理食塩液で希釈し，0.1 mg/mLのrhIDS溶液を調製した。このrhIDS溶液を，IDS遺伝子を含む染色体領域を欠損するヘミ接合体マウス（IDSヘミ接合体マウス，C57BL/6N）に，0.5 mg/kg体重の用量で，7日毎に計4回，静脈内投与した。最後に投与した日から７日後に，マウスを放血により安楽死させた。このとき血液をチューブに採取して，室温で30分間以上静置した後，遠心（2000 g, 20分間）して血清を回収した。同様にして，ｒｈＩＤＳ非投与のＩＤＳヘミ接合体マウス（rhIDS非投与IDSヘミ接合体マウス）及び野生型マウスからも，血清を回収した。
【０１０６】
各マウスから回収した血清について，２本のホウケイ酸ねじ口試験管に，それぞれ2 μLの血清，8 μLのPBS，及び18 μLの10 mM クエン酸緩衝液（pH 3.0）とを加えて撹拌した。これを血液サンプル溶液とした。血液サンプル溶液について，実施例３に記載の条件Ｂ（加熱温度80℃，加熱時間２時間）及び条件Ａ（加熱温度65℃，加熱時間75分）でメタノリシス反応を行った。次いで，メタノリシス反応後の血液サンプル溶液について，実施例４に記載のLC/MS/MS分析を行い，血液サンプル溶液中に含まれるデルマタン硫酸とヘパラン硫酸とを定量した。ここで，デルマタン硫酸の定量は条件Ａでメタノリシス反応させたサンプル，ヘパラン硫酸の定量は条件Ｂでメタノリシス反応させたサンプルを用いて行った。測定は，野生型，IDS投与ヘミ接合体マウス，IDS非投与ヘミ接合体マウスともに３〜４匹のマウスを用いて実施した。
【０１０７】
血液サンプル溶液中のヘパラン硫酸とデルマタン硫酸の定量結果を，それぞれ図５（Ａ）及び図５（Ｂ）に示す。ヘパラン硫酸とデルマタン硫酸の定量値は，いずれも野生型マウスと比較してrhIDS非投与IDSヘミ接合体マウスで高値を示した。また，rhIDS非投与IDSヘミ接合体マウスと比較して，rhIDS投与IDSヘミ接合体マウスでは，ヘパラン硫酸とデルマタン硫酸の定量値がいずれも低下した。これらの結果は，血液サンプル溶液を，ヘパラン硫酸を定量するためのメタノリシスの条件として条件Ｂ（加熱温度：80℃，加熱時間：2時間）デルマタン硫酸を定量するためのメタノリシスの条件として条件Ａ（加熱温度：65℃，加熱時間：75分間），で処理することにより，血液中に含まれるヘパラン硫酸とデルマタン硫酸とを定量することができることを示す。更には，得られた定量値より，IDS又はIDS活性を有する物質を用いた酵素補充療法の効果を，定量的に検証することができることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明によれば，試料中に含まれる微量のヘパラン硫酸及び／又はデルマタン硫酸の濃度を正確に測定できるので，例えば，体内にヘパラン硫酸，デルマタン硫酸等のＧＡＧが蓄積するハンター症候群の患者のスクリーニング等に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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