(57)【要約】【課題】発毛因子産生促進剤及び／又は細胞接着分子産生促進剤を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明では、有機酸及び／又はその塩を含有する発毛因子産生促進剤及び／又は細胞接着分子産生促進剤を提供する。さらには、有機酸及び／又はその塩を含有する細胞賦活剤、接着力増強剤、毛再生剤及び／又は脱毛抑制剤を調製し、提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸及び／又はその塩を含有する発毛因子産生促進剤。
【請求項２】
発毛因子が肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＧＬＩ転写因子、及びＷｎｔタンパク質から選択される１種又は２種以上である、請求項１に記載の発毛因子産生促進剤。
【請求項３】
有機酸が、ヒドロキシ酸である、請求項１又は２に記載の発毛因子産生促進剤。
【請求項４】
有機酸及び／又はその塩を含有する細胞接着分子産生促進剤。
【請求項５】
細胞接着分子がデスモグレインである、請求項４に記載の細胞接着分子産生促進剤。
【請求項６】
有機酸がヒドロキシ酸である、請求項４又は５に記載の細胞接着分子産生促進剤。
【請求項７】
有機酸及び／又はその塩を含有する、毛乳頭細胞賦活剤。
【請求項８】
有機酸がヒドロキシ酸である、請求項７に記載の毛乳頭細胞賦活剤。
【請求項９】
有機酸及び／又はその塩を含有する、毛と毛包との接着力増強剤。
【請求項１０】
有機酸がヒドロキシ酸である、請求項９に記載の接着力増強剤。
【請求項１１】
有機酸及び／又はその塩を有効成分として含有する、毛再生剤及び／又は脱毛抑制剤。
【請求項１２】
有機酸がヒドロキシ酸である、請求項１１に記載の毛再生剤及び／又は脱毛抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発毛因子産生促進剤及び／又は細胞接着分子産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪は一定の周期で生え替わっており、その周期をヘアサイクルという。ヘアサイクルは、成長期（２〜６年間）、退行期（２週間）、休止期（３〜４カ月間）に大別される。薄毛は成長期が数カ月〜１年に短くなった状態であり、薄毛を改善するためには短くなった成長期を元に戻し、ヘアサイクルを正常な状態に再生する必要がある。ヘアサイクルは毛乳頭細胞や外毛根鞘細胞等から分泌される種々の因子によってコントロールされており、そのような因子として、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＧＬＩ転写因子、Ｗｎｔタンパク質等が知られている（非特許文献１、２）。また、薄毛を改善するためには脱毛を抑制することも重要であり、細胞接着分子であるデスモグレインは毛を毛包に固定する役割があることが知られている（非特許文献３）。
【０００３】
ここで、特許文献１には、タウリンは毛髪の成長期を延長することから、育毛促進効果に優れることが開示されている。
【０００４】
特許文献２には、米抽出物は肝細胞増殖因子の産生を促進することから、育毛促進効果に優れることが開示されている。
【０００５】
特許文献３には、タケノコ抽出物は毛乳頭細胞を賦活し、血管内皮細胞増殖因子及び線維芽細胞増殖因子の産生を促進することから、育毛促進効果に優れることが開示されている。
【０００６】
特許文献４には、Ｗｎｔタンパク質の活性を示すペプチドは発毛促進及び脱毛防止に有用であることが開示されている。
【０００７】
特許文献５には、細胞間接着抑制剤はデスモグレインの細胞中の存在量を減少させることから、脱毛を促進することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−０９７１１６号公報
【特許文献２】特開２００４−０９９５０３号公報
【特許文献３】特開２０１３−１８０９９９号公報
【特許文献４】特表２０１４−５２１６８５号公報
【特許文献５】特開２００１−２６１５３８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Karoline Krause and Kerstin Foitzik (2006) Biology of the Hair Follicle: The Basics. Seminars in Cutaneous Medicine and Surgery 25(1):2-10.
【非特許文献２】Rishikaysh et. al.、 (2014) Signaling Involved in Hair Follicle Morphogenesis and Development.  Int. J. Mol. Sci. 15: 1647-1670.
【非特許文献３】Yasushi Hanakawa et al. (2004) Desmogleins 1 and 3 in the Companion Layer Anchor Mouse Anagen Hair to the Follicle. Journal of Investigative Dermatology. 123(5):817-822.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、発毛因子産生促進剤及び／又は細胞接着分子産生促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、有機酸及び／又はその塩が、発毛因子の発現を増強し、その産生を増強することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
また、本発明者らは、有機酸及び／又はその塩が細胞接着分子の遺伝子発現を増強し、その産生を促進すること、さらに、毛乳頭細胞のミトコンドリア活性を高めることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、下記に掲げる有機酸及び／又はその塩を含有する発毛因子産生促進剤、細胞接着分子産生促進剤、毛乳頭細胞賦活剤、毛と毛包との接着力増強剤、毛再生剤及び／又は脱毛抑制剤を提供する。
【００１４】
項１．
有機酸及び／又はその塩を含有する発毛因子産生促進剤。
項２．
発毛因子が肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＧＬＩ転写因子、及びＷｎｔタンパク質から選択される１種又は２種以上である、項１に記載の発毛因子産生促進剤。
項３．
有機酸が、ヒドロキシ酸である、項１又は２に記載の発毛因子産生促進剤。
項４．
有機酸及び／又はその塩を含有する細胞接着分子産生促進剤。
項５．
細胞接着分子がデスモグレインである、項４に記載の細胞接着分子産生促進剤。
項６．
有機酸がヒドロキシ酸である、請求項４又は５に記載の細胞接着分子産生促進剤。
項７．
有機酸及び／又はその塩を含有する、毛乳頭細胞賦活剤。
項８．
有機酸がヒドロキシ酸である、項７に記載の毛乳頭細胞賦活剤。
項９．
有機酸及び／又はその塩を含有する、毛と毛包との接着力増強剤。
項１０．
有機酸がヒドロキシ酸である、項９に記載の接着力増強剤。
項１１．
有機酸及び／又はその塩を有効成分として含有する、毛再生剤及び／又は脱毛抑制剤。
項１２．
有機酸がヒドロキシ酸である、項１１に記載の毛再生剤及び／又は脱毛抑制剤。
【００１５】
本発明はまた、下記の方法に関する。
項１３．
外用組成物に、有機酸及び／又はその塩を含有することにより、発毛因子産生促進作用を付与する方法。
項１４．
外用組成物に、有機酸及び／又はその塩を含有することにより、細胞接着分子産生促進作用を付与する方法。
項１５．
外用組成物に、有機酸及び／又はその塩を含有することにより、毛乳頭細胞賦活作用を付与する方法。
項１６．
外用組成物に、有機酸及び／又はその塩を含有することにより、毛と毛包との接着力増強作用を付与する方法。
項１７．
外用組成物に、有機酸及び／又はその塩を含有することにより、毛再生及び／又は脱毛抑制作用を付与する方法。
【００１６】
上記方法において、発毛因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＧＬＩ転写因子、及びＷｎｔタンパク質から選択される１種又は２種以上であり得る。
【００１７】
上記方法において、有機酸は、ヒドロキシ酸であり得る。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、有機酸及び／又はその塩の発毛因子産生促進及び／又は細胞接着分子産生促進作用により、毛の良好な状態を誘導できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、異なる濃度でのＬ−酒石酸の存在下または非存在下で、ヒト頭髪毛乳頭細胞を培養し、複数の発毛因子をコードするそれぞれの遺伝子発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図２】図２は、異なる濃度でのＬ−酒石酸の存在下または非存在下で、ヒト頭髪毛乳頭細胞を培養し、線維芽細胞増殖因子であるＦＧＦ−７産生量を測定した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、異なる濃度でのＬ−酒石酸の存在下または非存在下で、ヒト外毛根鞘細胞を培養し、複数の発毛因子をコードするそれぞれの遺伝子発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、異なる濃度でのＬ−酒石酸の存在下または非存在下で、ヒト外毛根鞘細胞を培養し、血管内皮細胞増殖因子であるＧＬＩ産生量を測定した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、異なる濃度でのＬ−酒石酸の存在下または非存在下で、ヒト外毛根鞘細胞を培養し、ＧＬＩ転写因子産生量を測定した結果を示すグラフである。
【図６】図６は、Ｌ−酒石酸の存在下で、ヒト外毛根鞘細胞を培養した後に、ＧＬＩ転写因子と細胞核を染色した細胞を示す写真である。
【図７】図７は、Ｌ−酒石酸の非存在下で、ヒト外毛根鞘細胞を培養した後に、ＧＬＩ転写因子と細胞核を染色した細胞を示す写真である。
【図８】図８は、異なる濃度でのＬ−酒石酸の存在下または非存在下で、ヒト頭髪毛乳頭細胞を培養し、細胞のミトコンドリア活性を測定した結果を示すグラフである。
【図９】図９は、異なる濃度でのＬ−酒石酸の存在下または非存在下で、ヒト正常表皮角化細胞を培養し、デスモグレン３（ＤＳＧ−３）をコードする遺伝子発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、異なる濃度でのＬ−酒石酸の存在下または非存在下で、ヒト正常表皮角化細胞を培養し、デスモグレン３（ＤＳＧ−３）産生量を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、Ｌ−酒石酸の存在下で、ヒト正常表皮角化細胞を培養した後に、デスモグレン３と細胞核を染色した細胞を示す写真である。
【図１２】図１２は、Ｌ−酒石酸の非存在下で、ヒト正常表皮角化細胞を培養した後に、デスモグレン３と細胞核を染色した細胞を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、有機酸及び／又はその塩を含有する発毛因子産生促進剤、細胞接着分子産生促進剤、毛乳頭細胞賦活剤、又は接着力増強剤に関する。本発明はまた、有機酸及び／又はその塩を有効成分として含有する毛再生剤及び／又は脱毛抑制剤に関する。
【００２１】
本明細書において用語「発毛」とは、毛包内で毛の新たな発生を促す、あるいは毛の発育・成長を促すように有利にはたらく作用を包含する。なお、ここで毛とは、ヒトを含む動物における身体に生える任意の毛を意味し、例えば、毛髪（頭髪）、眉毛、睫毛、口髭、顎鬚、胸毛、背部毛などのあらゆる体毛を意味し、主には、毛髪、眉毛、又は睫毛を意味する。
【００２２】
本明細書において用語「毛再生」とは、毛包に眠る発毛因子遺伝子を覚醒し、乱れたヘアサイクルを再生することにより、一旦失われた毛を再生することを意味する。「毛再生」とは、毛包に眠る発毛因子遺伝子を覚醒し、乱れたヘアサイクルを再生することにより、一旦失われた毛を再生することを意味する。本発明においては、毛再生には、特に毛髪再生が含まれる。
【００２３】
［有機酸及び／又はその塩］
本発明で用いられる有機酸及び／又はその塩は、当業者に知られているいかなる有機酸及び／又はその塩でもあり得る。限定はされないが、具体的には、有機酸は、直鎖又は分岐鎖の飽和又は不飽和の脂肪酸であり得る。あるいは脂環族カルボン酸が例として挙げられる。
【００２４】
このうち、本発明で用いられる有機酸としては、水酸基とカルボン酸とを併せ持つヒドロキシ酸が好ましく、中でも脂肪族ヒドロキシ酸がより好ましい。脂肪族ヒドロキシ酸としては、具体的には、酒石酸、クエン酸、乳酸、グルコン酸、グリコール酸、タルトロン酸、グリセリン酸、ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸、シトラマル酸、イソクエン酸、ロイシン酸、メバロン酸、パントイン酸、リシノール酸、リシネライジン酸、セレブロン酸、キナ酸、及びシキミ酸からなる群より選択される１種又は２種以上が挙げられる。これらのうち、好ましくは、酒石酸、クエン酸、乳酸、グルコン酸であり、特に好ましくは、酒石酸である。これらは、Ｄ体でもＬ体でもよいが、好ましくはＬ体である。これらの塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩やトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、トリブチルアミン塩、モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、リジン塩、アルギニン塩、コリン塩等の有機アンモニウム塩が挙げられる。
【００２５】
ここで、「有効成分として含有する」とは、有機酸及び／又はその塩以外の有効成分を含むと含まざるとに関わらず、有機酸及び／又はその塩の単独または他の有効成分との併用の作用によって、毛再生、脱毛抑制、発毛因子産生促進、細胞接着分子産生促進、発毛関連細胞の賦活化、細胞同士の接着力強化が発揮されることを明示する意味である。毛再生や脱毛抑制作用は、発毛因子産生促進、細胞接着分子産生促進、毛乳頭細胞などの発毛に関する細胞の賦活化、細胞同士の接着力強化などの作用によって誘導される。有効成分は、実製品の表示に有効成分と表示するか否かとは直接関連はない。
【００２６】
［発毛因子］
発毛因子は、特に限定はされないが、好ましくは、肝細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＧＬＩ転写因子、およびＷｎｔタンパク質からなる群より選択される１種又は２種以上である。このうち、限定はされないが、特に好ましくは、肝細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子である、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、線維芽細胞増殖因子である、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＧＬＩ転写因子である、ＧＬＩ−１、ＧＬＩ−２、Ｗｎｔタンパク質である、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−５ａ、およびＷｎｔ−１０ａからなる群より選択される１種または２種以上である。
【００２７】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、肝細胞の増殖を促進し、肝臓の再生力を支える肝再生因子の１つである。肝細胞増殖因子は、毛根において、休止期の毛包を成長期に導き、さらに成長期の発展を刺激する作用があることも知られている。本明細書では、肝細胞増殖因子とＨＧＦとは、互換可能性のある用語として同義で用いる。
【００２８】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成および血管新生に関与する一群の糖タンパクであり、いくつかの種類が知られている。血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を始めとする各種血管内皮細胞増殖因子は、頭皮下の新しい血管を増やす作用、および既にある血管の枝分かれを増やす作用を通じて、より多くの栄養を毛母細胞に与えることで、毛再生復活促進や髪の育毛に効果を有する。血管内皮細胞増殖因子は、より具体的には、ヘアサイクルの成長期を延ばす効果に優れている。本明細書では、血管内皮細胞増殖因子とＶＥＧＦは、互換可能性のある用語として同義で用いる。
【００２９】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、胚発生に関係する成長因子の一種で、多くの種類が知られている。このうち、特に繊維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ−７）と繊維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ−１０）は、それぞれケラチノサイト成長因子ＫＧＦとＫＧＦ−２としても知られており、上皮細胞の増殖、移動、分化を刺激することで、皮膚と粘膜組織の修復再生を促進する。繊維芽細胞増殖因子は、毛根において、休止期の毛包を成長期に導き、さらに成長期の発展を刺激する作用があることも知られている。本明細書では、繊維芽細胞増殖因子とＦＧＦとは、互換可能性のある用語として同義で用いる。
【００３０】
ＧＬＩ転写因子は、ほ乳類胎児の発生において体形成に中心的な役割を果たすヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達系に関与する転写因子である。ＧＬＩ転写因子として少なくとも３つが知られているが（ＧＬＩ−１、ＧＬＩ−２、ＧＬＩ−３）、ＧＬＩ−１とＧＬＩ−２はＨｈシグナルの活性を促進することが知られている。ＧＬＩ−１は、毛包形成に関与している。
【００３１】
Ｗｎｔタンパク質は、ヒトでは複数種類（１９種類）の遺伝子が同定されている分泌性糖タンパク質である。胎児期の皮膚細胞を毛包に変化させるほか、毛包細胞を刺激して発毛を誘導する。このうち、Ｗｎｔ−５ａは、毛包形成に関与していることが知られている。
【００３２】
なお、本発明における、有機酸及び／又はその塩を含有する発毛因子産生促進剤は、発毛因子のタンパク質の発現量そのものの増加あるいは発毛因子のタンパク質をコードする遺伝子の発現量の増加のいずれか一方又はその両方を促す。
【００３３】
［細胞接着分子］
細胞接着分子として、限定はされないが、デスモグレイン（ＤＳＧ）が知られており、これらの分子は、成長期毛を毛包に固定する役割を担い、脱毛抑制に効果を有する。本明細書では、デスモグレンとＤＳＧとは、互換可能性のある用語として同義で用いる。
【００３４】
なお、本発明における、有機酸及び／又はその塩を含有する細胞接着分子促進剤は、細胞接着分子の発現量そのものの増加あるいは細胞接着分子のタンパク質をコードする遺伝子の発現量の増加のいずれか一方又はその両方を促す。
【００３５】
［発毛関連細胞賦活］
発毛の過程には、毛乳頭細胞、外毛根鞘細胞、内毛根鞘細胞、毛母細胞、脂肪細胞、毛包幹細胞、色素幹細胞、メラノサイトなどの細胞が関わっている。このうち、毛乳頭細胞は、「発毛」のプロセスを実行しているシグナル伝達物質を支配する働きを担い、毛乳頭細胞の活性化により、ヘアサイクルの正常化が導かれる。毛乳頭細胞賦活は、典型的には、ミトコンドリア活性で測定することができる。
【００３６】
［毛再生剤及び／又は脱毛抑制剤］
本発明では、有機酸及び／又はその塩を有効成分として含有する毛再生剤及び／又は脱毛抑制剤が提供される。本発明では、特には、有機酸及び／又はその塩を有効成分として含有する毛再生剤として、毛髪再生剤が提供される。すなわち、本発明によれば、有機酸及び／又はその塩が、発毛因子をコードする遺伝子発現を増強し、それらの産生を促進することで、毛母細胞の休止期から成長期への移行を促すと共に、成長期が適切な期間維持されることを促すことができ、ヘアサイクルを正常な状態に再生することができるので、毛を再生することができ、或いは脱毛の進行を予防することができる。また、本発明によれば、有機酸及び／又はその塩が、細胞接着分子の発現を増強し、その産生を促進することで、毛と毛包との接着力を増強できるので、脱毛を抑制することができる。さらには、有機酸及び／又はその塩が、毛乳頭細胞などの発毛に関する細胞の賦活化を誘導するため、毛再生と脱毛抑制を効果的に促進できる。
【００３７】
［外用組成物］
本発明の外用組成物として、好ましくは、毛再生用製品、毛髪再生用製品、発毛用製品、養毛用製品、又は脱毛抑制用製品等として、調製される。このうち、本発明の外用組成物の用途として、特に好ましくは、頭皮頭髪用化粧品（例えば、シャンプー、ヘアコンディショナー、ヘアトリートメント、ヘアエッセンス、ヘアミスト、頭皮用ローション、頭皮用クリーム、ヘアトニック）、スキンケア用化粧品（例えば、ローション、クリーム、顔用クリーム、顔用ローション、乳液、パック、液体洗顔料、石鹸、まつげ美容液）、メーキャップ化粧品（例えば、アイライナー、アイブロー）が例示され、最も好ましくは、シャンプー、ヘアコンディショナー、ヘアトリートメント、ヘアエッセンス、頭皮用ローション、頭皮用クリーム、ヘアトニック、まつげ美容液、アイライナー、アイブローであり得るが、これらに限定されない。
【００３８】
このように、本発明の外用組成物の剤形は、特に限定されず、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤、及びエアゾール剤等が挙げられる。また、有機酸及び／又はその塩を溶解させることができる程度の水を含む場合は軟膏とすることもできる。中でも、液剤、懸濁剤、乳剤、ローション剤、エアゾール剤が好ましく、液剤、ローション剤、エアゾール剤がより好ましい。本発明の外用組成物の剤形は、クリーム剤、乳剤、及び場合により軟膏剤、エアゾール剤等のように、油性基剤と水性基剤とを含む場合は、Ｗ／Ｏ型でもよく、Ｏ／Ｗ型でもよいが、使用感が良い点で、Ｏ／Ｗ型が好ましい。製剤は、第１７改正日本薬局方総則に従い、又はこれに準拠して、各成分を混合することにより製造できる。
【００３９】
これらの外用組成物中における、有機酸及び／又はその塩の濃度は、製品により、特に限定はされないが、効果の点から、有機酸として、０．０００１質量％以上が好ましく、０．００１質量％以上がより好ましく、０．００５質量％以上がさらに好ましく、また５質量％以下が好ましく、１質量％以下がより好ましく、０．５質量％以下がさらに好ましい。具体的な範囲としては、０．０００１〜５質量％が好ましく、０．００１〜１質量％がより好ましく、０．００５〜０．５質量％がさらに好ましい。
【００４０】
基剤・担体
本発明において、外用組成物は、有機酸及び／又はその塩の他、本発明の効果を損なわない範囲で、医薬外用剤、医薬部外品、化粧品用の薬学的又は生理学的に許容される基剤又は担体を含むことができる。
【００４１】
このような基剤又は担体としては、水、エタノール、流動パラフィン、スクワラン、ワセリン、ゲル化炭化水素（プラスチベースなど）、オゾケライト、ａ−オレフィンオリゴマー、及び軽質流動パラフィンのような炭化水素；メチルポリシロキサン、高重合メチルポリシロキサン、環状シリコーン、アルキル変性シリコーン、アミノ変性シリコーン、ポリエーテル変性シリコーン、ポリグリセリン変性シリコーン、シリコーン・アルキル鎖共変性ポリエーテル変性シリコーン、シリコーン・アルキル鎖共変性ポリグリセリン変性シリコーン、ポリエーテル変性分岐シリコーン、ポリグリセリン変性分岐シリコーン、アクリルシリコーン、フェニル変性シリコーン、及びシリコーンレジンのようなシリコーン油；ヤシ油、オリーブ油、コメヌカ油、シアバターのような油脂；ホホバ油、ミウロウ、キャンデリラロウ、及びラノリンのようなロウ類；セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、イソステアリルアルコール、フィトステロール、及びコレステロールのような高級アルコール；エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体；ポリビニルピロリドン；カラギーナン；ポリビニルブチラート；ポリエチレングリコール；ジオキサン；ブチレングリコールアジピン酸ポリエステル；ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸セチル、イソノナン酸イソノニル、及びテトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリットのようなエステル類；デキストリン、及びマルトデキストリンのような多糖類；カルボキシビニルポリマー、及びアルキル変性カルボキシビニルポリマーのようなビニル系高分子；メタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｓｔ−ブチルアルコール等のような低級（炭素数１〜４）アルコール；並びにエチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノプロピルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノプロピルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、ジプロピレングリコールモノエチルエーテル、及びジプロピレングリコールモノプロピルエーテルのようなグリコールエーテル；グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、エリスリトール、キシリトールなどのポリオール類などが挙げられる。
基剤又は担体は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００４２】
添加剤
本発明において、外用組成物は、医薬外用剤、医薬部外品、化粧品用の薬学的又は生理学的に許容される添加剤を含むことができる。このような添加剤としては、酸化防止剤、界面活性剤、増粘剤、保存剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、刺激軽減剤、防腐剤、着色剤、香料、溶解補助剤等が挙げられる。界面活性剤としては、例えばアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤等が挙げられる。
【００４３】
アニオン界面活性剤としては、例えば、カルボン酸系アニオン界面活性剤、スルホン酸系アニオン界面活性剤、リン酸系アニオン界面活性剤、蛋白加水分解物系アニオン界面活性剤等が挙げられる。カルボン酸系アニオン界面活性剤としては、脂肪酸塩、エーテルカルボン酸塩、アミドエーテルカルボン酸塩等が挙げられる。脂肪酸塩としては、例えばＣ８〜Ｃ２２の脂肪酸等の塩が挙げられ、具体的にはカプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、アラキジン酸、ベヘン酸等の塩が挙げられる。エーテルカルボン酸塩としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボキシレート、ポリオキシエチレンココイルエーテルカルボキシレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテルカルボキシレート、ポリオキシエチレンミリスチルエーテルカルボキシレート等の塩が挙げられる。スルホン酸系アニオン界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸塩（ラウリル硫酸塩等のＣ８〜Ｃ２２アルキル硫酸塩）、アルキルスルホン酸塩（ラウリルスルホン酸塩等のＣ８〜Ｃ２２アルキルスルホン酸塩）、アルキルオキシアルキルスルホン酸塩（アルキルオキシＣ８〜Ｃ２２アルキルスルホン酸塩）、アルキルアリール硫酸塩（ラウリルフェニル硫酸塩等のＣ８〜Ｃ２２アルキルアリール硫酸塩）、アルキルベンゼンスルホン酸塩（ラウリルベンゼンスルホン酸塩等のＣ８〜Ｃ２２アルキルベンゼンスルホン酸塩）、アルキルポリオキシエチレン硫酸塩、グリセリル硫酸塩、アシルアルキルタウリン塩（ココイルメチルタウリン塩等のＣ８〜Ｃ２２アルカノイルアルキルタウリン塩）、アシルアルキルタウリンタウリン塩（ココイルメチルメチルタウリン等のＣ８〜Ｃ２２アルカノイルアルキルタウリンとタウリン塩との混合物）、アシルイセチオン酸塩（ラウロイルイセチオン酸塩等のＣ８〜Ｃ２２アルカノイルイセチオン酸塩）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸トリエタノールアミン等）、ポリオキシアルキレン脂肪酸アミドエーテル硫酸塩、スルホコハク酸塩（Ｃ８〜Ｃ２２アルキルスルホサクシネート、ポリオキシエチレンＣ８〜Ｃ２２アルキルスルホサクシネート、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンスルホサクシネート等）等が挙げられる。リン酸系アニオン界面活性剤としては、例えば、モノアルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルリン酸塩等が挙げられる。アミノ酸系アニオン界面活性剤としては、例えば、アシルグルタミン酸塩（ココイルグルタミン酸塩等のＣ８〜Ｃ２２アルカノイルグルタミン酸塩）、アシルグリシン塩（ココイルグリシン塩等のＣ８〜Ｃ２２アルカノイルグリシン塩）、アシルアラニン塩（ココイルアラニン塩等のＣ８〜Ｃ２２アルカノイルアラニン塩）、アシルアルキルアラニン塩（ラウロイルメチルアラニン塩等のＣ８〜Ｃ２２アルカノイルアルキルアラニン塩）、アシルアスパラギン酸塩（ラウロイルアスパラギン酸塩等のＣ８〜Ｃ２２アルカノイルアスパラギン酸塩）、モノアルキルリン酸塩（Ｃ８〜Ｃ２２アルキルリン酸塩等）、アシルサルコシン塩（ココイルサルコシン塩等のＣ８〜Ｃ２２アルカノイルサルコシン塩）等が挙げられる。蛋白加水分解物系アニオン界面活性剤としては、例えば、アルキル加水分解コラーゲン塩、ヤシ油脂肪酸加水分解コラーゲン塩、アルキル加水分解シルク塩等が挙げられる。
【００４４】
カチオン界面活性剤としては、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩等が挙げられる。これらの塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩等が挙げられる。
【００４５】
両性界面活性剤としては、例えば、カルボベタイン、スルホベタイン、イミダゾリニウムベタイン、アミドベタイン等が挙げられる。具体的には、脂肪酸アミドプロピルベタイン、ヒドロキシプロピルスルホベタイン、脱塩処理した２級のイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。
【００４６】
非イオン界面活性剤としては、例えば、アミンオキサイド、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルポリグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル、アルキル糖アミド、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシアルキレン硬化ヒマシ油、アルキルモノグリセリルエーテル等が挙げられる。具体的には、ラウリルジメチルアミンオキサイド、ラウリン酸ジエタノールアミド、ミリスチルジメチルアミンオキサイド、ミリスチン酸モノエタノールアミド、ミリスチン酸ジノエタノールアミド、イソステアリン酸モノグリセライド、ラウリン酸モノエタノールアミド、オレイン酸モノグリセライド、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタントリオレエート、アルキルポリグルコシド、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド等が挙げられる。
添加剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００４７】
薬理活性成分・生理活性成分
本発明において、外用組成物は、有機酸及び／又はその塩以外の、医薬外用剤、医薬部外品、化粧品用の薬理活性成分又は生理活性成分を含むことができる。このような成分としては、血行促進成分、血管新生促進因子、保湿成分、抗炎症成分、抗菌成分、ビタミン類、ペプチド又はその誘導体、アミノ酸又はその誘導体、細胞賦活化成分、老化防止成分、角質軟化若しくは角質溶解成分、美白成分、収斂成分、血管拡張成分、抗ヒスタミン成分、抗酸化成分、代謝賦活剤、清涼化剤等が挙げられる。また、例えば、スピラノラクトン、センブリエキス、カプサイシノイド、角質増殖因子（ＫＧＦ等）、人参エキス、ミノキシジル等の有機酸及び／又はその塩以外の育毛成分を含むこともできる。
薬理活性成分又は生理活性成分は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００４８】
ｐＨ
本発明において、外用組成物のｐＨは、特に限定はされない。好ましくは、約４．０〜８．０、約４．０〜７．５、約４．０〜７．０、約５．０〜８．０、約５．０〜７．５、約５．０〜７．０、約６．０〜８．０、約６．０〜７．５、約６．０〜７．０が挙げられる。
【００４９】
上記範囲であれば、高ｐＨによる頭皮への刺激を避けることができる。また、有機酸及び／又はその塩が溶解し易くなる。
ｐＨの調整は、リン酸、塩酸、硫酸のような無機酸などのｐＨ調整剤を用いて行えばよい。また、必要に応じて、トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミンのような有機塩基；水酸化カリウム、水酸化ナトリウムのような無機塩基などのｐＨ調整剤を用いて行えばよい。
ｐＨ調整剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００５０】
［容器］
本発明において、外用組成物を充填する容器は特に限定されない。医薬品外用剤、医薬部外品、化粧品用の容器として用いられるものであればよい。
このような容器材質として、例えば、外用組成物との接触面の一部又は全部、好ましくは全部が、ポリオレフィン、アクリル酸樹脂、テレフタル酸エステル、２、６−ナフタレンジカルボン酸エステル、ポリカーボネート、ポリメチルテルペン、フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、ポリアセタール、変性ポリフェニレンエテル、ポリアリレート、ポリスルホン、ポリイミド、セルロースアセテート、アルミニウム、及びガラスからなる群より選ばれる少なくとも１種の材料で構成されている容器が挙げられる。
【００５１】
［使用方法］
本発明において、外用組成物の使用方法は、使用対象の毛の状態、頭皮の状態、年齢、性別などによって異なるが、例えば以下の方法とすればよい。
即ち、１日数回（例えば、約１〜５回、好ましくは１〜３回）、適量（例えば、約０．５〜２ｇ、又は０．５〜２ｍｌ）を皮膚（例えば、頭皮）に適用すればよい。また、有機酸及び／又はその塩の１日使用量が、例えば約０．１〜５０ｍｇとなるように組成物を皮膚（例えば、頭皮）に適用すればよい。適用方法は、剤形に合わせて、塗布、又は噴霧等とすればよい。適用期間は、例えば約７日間以上とすればよい。また、本発明の効果が十分に得られるまで適用すればよく、例えば６か月以内、少なくとも４か月以内とすればよい。
本発明の外用組成物は、毛再生、及び／又は脱毛抑制のために使用できる。
【００５２】
［発毛因子産生促進作用付与方法等〕
本発明はまた、外用組成物に、有機酸及び／又はその塩を含有することにより、発毛因子産生促進作用を付与する方法、細胞接着分子産生促進作用を付与する方法、毛乳頭細胞賦活作用を付与する方法、毛と毛包との接着力増強作用を付与する方法、毛再生及び／又は脱毛抑制作用を付与する方法、に関する。
【００５３】
これらの方法において、有機酸及び／又はその塩、発毛因子等は、外用組成物で説明した内容と同様である。
【実施例】
【００５４】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５５】
発毛促進因子の産生に及ぼすＬ−酒石酸の効果を調べるため、以下の試験を行った。以下の試験では、細胞の培養はＣＯ２（５％）インキュベーター内で行った。なお、培地への被験サンプル（Ｌ−酒石酸）の添加により、培地のｐＨに変化がないことは確認している。
【００５６】
なお、試験例の結果として表わされる遺伝子発現量は、補正値であり、試験例１および２においては、ハウスキーピング遺伝子として、ＹＷＨＡＺを用い、試験例３においては、ハウスキーピング遺伝子として、ＡＣＴＢを用いた。
【００５７】
＜試験１：発毛因子の産生に及ぼすＬ−酒石酸の影響＞
＜試験１−１：毛乳頭細胞における発毛因子の産生＞
（１）発毛因子の遺伝子発現量の測定
以下の手順に従い、毛乳頭細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＦＧＦ−７、ＨＧＦ、Ｗｎｔ−５ａおよびＧＬＩ−１の遺伝子発現量の解析を行った。
【００５８】
ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ）（東洋紡績株式会社製）を３．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように、毛乳頭細胞増殖培地（ＰＣＧＭ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  ＴＭＴＰＧＭ−２５０、東洋紡株式会社）を用いた１２ウェルプレート（ＣｅｌｌＢＩＮＤ  Ｓｕｒｆａｃｅ）に播種し、３７℃で一晩培養した。細胞の生育に問題がないことを顕微鏡観察により確認した後、Ｌ−酒石酸を終濃度０．０１ｍＭ又は０．１ｍＭになるよう培地に添加し、３７℃で６時間インキュベートした。培地を取り除き、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．３５ｍｌのＲＬＴ（株式会社キアゲン製）に細胞を溶解した。細胞溶解液を１．５ｍｌ  ｔｕｂｅに採取し、０．３５ｍＬの７０％エタノールを加えた。この溶液全量をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）に付属するスピンカラムにアプライし、製造会社が推奨するプロトコルに従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。５０ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型とし、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標）  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績株式会社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。この反応液２μｌ（合成したｃＤＮＡ）を鋳型とし、Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＩＩ  （タカラバイオ株式会社製）およびＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ株式会社製）を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲによりｍＲＮＡ発現量を求めた。なお、対照として、Ｌ−酒石酸を添加していないものを用いた。
【００５９】
（２）発毛因子産生量の測定
以下の手順に従い、毛乳頭細胞によって産生されたＦＧＦ−７を測定した。
【００６０】
ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ）（東洋紡績株式会社製）を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるよう９６ウェルプレート（ＣｅｌｌＢＩＮＤ  Ｓｕｒｆａｃｅ）に播種し、３７℃で一晩培養した。細胞の生育に問題がないことを顕微鏡観察により確認した後、Ｌ−酒石酸を終濃度０．０１ｍＭ又は０．１ｍＭになるよう培地に添加し、３７℃で２日間培養した。培養上清を１．５ｍｌ  ｔｕｂｅに採取し、Ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ−７  ＥＬＩＳＡキット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製；ＥＬＨ−ＦＧＦ−７）を用いて各サンプル中のＦＧＦ−７濃度を測定した。なお、対照として、Ｌ−酒石酸を添加していないものを用いた。
【００６１】
ＦＧＦ−７、ＨＧＦ、Ｗｎｔ−５ａ、及びＧＬＩ−１をコードする遺伝子発現量、並びにＦＧＦ−７の産生量の測定結果をそれぞれ図１及び２に示す。
【００６２】
図１に示されるとおり、Ｌ−酒石酸は０．０１〜０．１ｍＭで毛乳頭細胞におけるＦＧＦ−７、ＨＧＦ、Ｗｎｔ−５ａ、及びＧＬＩ−１の遺伝子発現を促進しており、その濃度が高ければ高いほど遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった。また、図２に示されるとおり、Ｌ−酒石酸は０．０１〜０．１ｍＭで毛乳頭細胞におけるＦＧＦ−７の産生を促進することが明らかとなった。
【００６３】
これらの結果は、Ｌ−酒石酸は、毛乳頭細胞における発毛因子の産生を促進することによりヘアサイクルの再生を促し、毛の再生を促すことを示唆するものである。
【００６４】
＜試験１−２：外毛根鞘細胞における発毛因子の遺伝子発現＞
（１）発毛因子の遺伝子発現量の測定
以下の手順に従い、外毛根鞘細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＶＥＧＦ−Ａ、ＦＧＦ−７、ＨＧＦ、及びＷｎｔ−５ａの遺伝子発現量の解析を行った。
【００６５】
ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ）に替え、ヒト毛包外毛根鞘細胞（ＨＦＯＲＳＣ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社製）を用い、毛乳頭細胞の専用の増殖培地（ＰＣＧＭ）に替え、外毛根梢細胞の専用の増殖培地（ＭＳＣＭ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  ７５０１、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、培地に添加するＬ−酒石酸の濃度を０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、又は１ｍＭに変更した以外は、試験１−１に記載の方法に従って試験を行った。
【００６６】
（２）発毛因子産生量の測定
以下の手順に従い、外毛根鞘細胞によって産生されたＶＥＧＦ−Ａ及びＧＬＩ−１を測定した。
【００６７】
ヒト外毛根鞘細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるよう９６ウェルプレート（ＣｅｌｌＢＩＮＤ  Ｓｕｒｆａｃｅ）に播種し、３７℃で２日間培養した。細胞の生育に問題がないことを顕微鏡観察により確認した後、Ｌ−酒石酸を終濃度０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、又は１ｍＭになるよう培地に添加し、３７℃で２日間培養した。
【００６８】
ＶＥＧＦ−Ａについては、培養上清を１．５ｍｌ  ｔｕｂｅに採取し、Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ−Ａ  ＥＬＩＳＡキット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製；ＥＬＨ−ＶＥＧＦ）を用いてＶＥＧＦ濃度を測定した。なお、対照として、Ｌ−酒石酸を添加していないものを用いた。
【００６９】
また、ＧＬＩ−１については、抗ＧＬＩ−１抗体（Ａｂｃａｍ社製）を用いた免疫染色により染色し、細胞核をＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２（同仁化学研究所社製）を用いて染色した後、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（モレキュラーデバイス社製）にて染色面積、強度並びに核数を計測し、ＧＬＩ−１産生量を評価した。なお、対照として、Ｌ−酒石酸を添加していないものを用いた。
【００７０】
ＶＥＧＦ−Ａ、ＦＧＦ−７、及びＧＬＩ−１の遺伝子発現量、ＶＥＧＦ−Ａの産生量、並びにＧＬＩ−１の産生量をそれぞれ図３、４及び５に示す。ここで、図５は、免疫染色画像の染色強度を定量化し、細胞数で割った値を縦軸とする。また、ＧＬＩ−１と細胞核を染色した細胞の写真を図６（Ｌ−酒石酸  １ｍＭ）及び７（対照）に示す。
【００７１】
図３に示されるとおり、Ｌ−酒石酸は０．０１〜１ｍＭで外毛根梢細胞におけるＶＥＧＦ−Ａ、ＦＧＦ−７、及びＧＬＩ−１の遺伝子発現を促進しており、その濃度が高ければ高いほど遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった。また、図４及び図５に示されるとおり、Ｌ−酒石酸は０．０１〜１ｍＭで外毛根鞘細胞におけるＶＥＧＦ−Ａ及びＧＬＩ−１の産生を促進し、その濃度が高ければ高いほど産生量が増加することが明らかとなった。図６はＬ−酒石酸を１ｍＭで添加し４８時間後に免疫染色を行った図である。図７のＬ−酒石酸未添加の細胞の染色像と比較して核内を始め細胞質におけるＧＬＩ−１の産生亢進が確認された。
【００７２】
これらの結果は、Ｌ−酒石酸は、外毛根鞘細胞における発毛因子の産生を促進することによりヘアサイクルの再生を促し、毛の再生を促すことを示唆するものである。
【００７３】
＜試験２：毛乳頭細胞の活性に及ぼすＬ−酒石酸の影響＞
以下の手順に従い、毛乳頭細胞のミトコンドリア活性を調べた。
【００７４】
ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ）（東洋紡績株式会社製）を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるよう９６ウェルプレート（ＣｅｌｌＢＩＮＤ  Ｓｕｒｆａｃｅ）に播種し、毛乳頭細胞の専用の増殖培地（ＰＣＧＭ）を用いて５％ＣＯ２下、３７℃で１日間培養した。細胞の生育に問題がないことを顕微鏡観察により確認した後、Ｌ−酒石酸を終濃度０．０１ｍＭ又は０．１ｍＭになるよう培地に添加し、３７℃で２日間培養した。その後、ミトコンドリア活性として乳酸脱水酵素活性をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所社製）を用いて測定し、細胞核数をＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２（（同仁化学研究所社製）で染色した後、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。ミトコンドリア活性及び細胞核数の測定結果を図８に示す。
【００７５】
図８に示されるとおり、Ｌ−酒石酸は０．１〜１ｍＭで毛乳乳頭細胞のミトコンドリア活性を増加させることが明らかとなった。
【００７６】
この結果は、Ｌ−酒石酸は、毛乳頭細胞を賦活することによりヘアサイクルの再生を促し、毛の再生を促すことを示唆するものである。
【００７７】
＜試験３：細胞接着分子の産生に及ぼすＬ−酒石酸の影響＞
以下の手順に従い、表皮角化細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＤＳＧ−３の遺伝子発現量の解析を行った。
（１）細胞接着分子の遺伝子発現量の測定
ヒト正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように２４ウェルプレート（ＣｅｌｌＢＩＮＤ  Ｓｕｒｆａｃｅ）に播種し、３７℃で２日間培養した。細胞の生育に問題がないことを顕微鏡観察により確認した後、Ｌ−酒石酸を終濃度０．１ｍＭ、１ｍＭ、又は１０ｍＭになるよう培地に添加し、３７℃で２４時間培養した。培地を取り除き、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．３５ｍｌのＲＬＴ（株式会社キアゲン製）で細胞を溶解した。細胞溶解液を１．５ｍｌ  ｔｕｂｅに採取し、０．３５ｍＬの７０％エタノールを加えた。この溶液全量をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）に付属するスピンカラムにアプライし、製造会社が推奨するプロトコルに従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。５０ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型とし、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標）  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績株式会社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。この反応液２μｌ（合成したｃＤＮＡ）を鋳型とし、Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＩＩ  （タカラバイオ株式会社製）およびＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ株式会社製）を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲによりｍＲＮＡ発現量を求めた。
【００７８】
（２）細胞接着分子産生量の測定
以下の手順に従い、表皮角化細胞によって産生されたＤＳＧ−３を測定した
図９に示されるとおり、Ｌ−酒石酸は０．１〜１０ｍＭで表皮角化細胞におけるＤＳＧ−３の遺伝子発現を促進しており、その濃度が高ければ高いほど遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった。また、図１０に示されるとおり、Ｌ−酒石酸は１ｍＭで表皮角化細胞におけるＤＳＧ−３の産生を促進することが明らかとなった。図１１はＬ−酒石酸を１ｍＭで添加し１２０時間後に免疫染色を行った図である。図１２のＬ−酒石酸未添加の細胞の染色像と比較して細胞間におけるＤＳＧ−３の産生亢進が確認された。
【００７９】
これらの結果は、Ｌ−酒石酸は、細胞接着分子の産生を促進することにより、毛と毛包の接着力を増強し、脱毛を抑制することを示唆するものである。
【００８０】
［製剤例］
下記表１〜３に製剤例を示す。製剤例中の含有量を示す数値は、いずれも質量％である。
【００８１】
【表１】
2019085345.tif 000002
【００８２】
【表２】
2019085345.tif 000003
【００８３】
【表３】
2019085345.tif 000004
【図１】
2019085345.tif 000005
【図２】
2019085345.tif 000006
【図３】
2019085345.tif 000007
【図４】
2019085345.tif 000008
【図５】
2019085345.tif 000009
【図６】
2019085345.tif 000010
【図７】
2019085345.tif 000011
【図８】
2019085345.tif 000012
【図９】
2019085345.tif 000013
【図１０】
2019085345.tif 000014
【図１１】
2019085345.tif 000015
【図１２】
2019085345.tif 000016