(57)【要約】      （修正有）【課題】新規ラクトナーゼ、および、ラクトナーゼを用いてウロリチンＣ、ウロリチンＡ、ウロリチンＭ６またはウロリチンＤを製造する方法の提供。【解決手段】エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性を有する新規ラクトナーゼ。前記ラクトナーゼをエラグ酸に接触させてウロリチンＭ５を生成させ、次いで、ウロリチンＭ５からウロリチンＣ等を生成する能力を有する微生物にウロリチンＭ５からウロリチンＣ、ウロリチンＡ、ウロリチンＭ６又はウロリチンＤを生成させる製造方法。前記ラクトナーゼが、至適ｐＨが７．０〜９．０で至適温度が４２〜５０℃である、分子量が３７８００〜４６２００である、ラクトナーゼ。ゴルドニバクターゼ属に属する微生物に由来する、ラクトナーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）の性質を有するラクトナーゼ：
（１）エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性を有する。
【請求項２】
下記（２）乃至（４）の性質を更に有する、請求項１に記載のラクトナーゼ：
（２）至適ｐＨが７．０以上９．０以下である；
（３）至適温度が４２℃以上５５℃以下である；
（４）分子量が３７，８００以上４６，２００以下である。
【請求項３】
ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物に由来する、請求項１又は２に
記載のラクトナーゼ。
【請求項４】
前記ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物が、ゴルドニバクター・ウ
ロリチンファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物、及びゴルドニバク
ター・フェシホミニス（Gordonibacter faecihominis）に属する微生物から成る群から選択される、請求項３に記載のラクトナーゼ。
【請求項５】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質である、ラクトナーゼ：
（Ａ）配列番号３又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号３又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換若しくは欠失、又は１〜数個のアミノ酸が挿入若しくは付加したアミノ酸からなる、エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【請求項６】
ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物を培養する工程を含む、請求項
１又は２に記載のラクトナーゼの製造方法。
【請求項７】
下記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを発現可能に保持した、又は請求項８に記載のベクターを発現可能に保持した、形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質を製造する方法。
【請求項１１】
下記工程（Ｉ）を含む、ウロリチンＭ５の製造方法：
工程（Ｉ）：下記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一以上をエラグ酸に接触させる工程。
（ｉ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のラクトナーゼ；
（ｉｉ）請求項７に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質；
（ｉｉｉ）該ラクトナーゼ若しくは該タンパク質を産生する微生物；
（ｉｖ）該微生物の処理物。
【請求項１２】
下記工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を含み、該工程（Ｉ）及び（ＩＩ）が同一の系で行われる、ウロリチンＣの製造方法：
工程（Ｉ）：下記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一以上をエラグ酸に接触させ、ウロリチンＭ５を生成する工程；
（ｉ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のラクトナーゼ；
（ｉｉ）請求項７に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質；
（ｉｉｉ）該ラクトナーゼ若しくは該タンパク質を産生する微生物；
（ｉｖ）該微生物の処理物。
工程（ＩＩ）：該ウロリチンＭ５からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＭ５からウロリチンＣを生成させる工程。
【請求項１３】
下記工程（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）を含み、該工程（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）が同一の系で行われる、ウロリチンＡの製造方法：
工程（Ｉ）：下記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一以上をエラグ酸に接触させ、ウロリチンＭ５を生成する工程；
（ｉ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のラクトナーゼ；
（ｉｉ）請求項７に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質；
（ｉｉｉ）該ラクトナーゼ若しくは該タンパク質を産生する微生物；
（ｉｖ）該微生物の処理物。
工程（ＩＩ）：該ウロリチンＭ５からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＭ５からウロリチンＣを生成させる工程。
工程（ＩＩＩ）：該ウロリチンＣからウロリチンＡを生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＣからウロリチンＡを生成させる工程。
【請求項１４】
下記工程（Ｉ）及び（ＩＶ）を含み、該工程（Ｉ）及び（ＩＶ）が同一の系で行われる、ウロリチンＭ６の製造方法：
工程（Ｉ）：下記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一以上をエラグ酸に接触させ、ウロリチンＭ５を生成する工程；
（ｉ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のラクトナーゼ；
（ｉｉ）請求項７に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質；
（ｉｉｉ）該ラクトナーゼ若しくは該タンパク質を産生する微生物；
（ｉｖ）該微生物の処理物。
工程（ＩＶ）：該ウロリチンＭ５からウロリチンＭ６を生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＭ５からウロリチンＭ６を生成させる工程。
【請求項１５】
下記工程（Ｉ）及び（Ｖ）を含み、該工程（Ｉ）及び（Ｖ）が同一の系で行われる、ウロリチンＤの製造方法：
工程（Ｉ）：下記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一以上をエラグ酸に接触させ、ウロリチンＭ５を生成する工程；
（ｉ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のラクトナーゼ；
（ｉｉ）請求項７に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質；
（ｉｉｉ）該ラクトナーゼ若しくは該タンパク質を産生する微生物；
（ｉｖ）該微生物の処理物。
工程（Ｖ）：該ウロリチンＭ５からウロリチンＤを生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＭ５からウロリチンＤを生成させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ラクトナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウロリチンＡやウロリチンＣに代表されるウロリチン類は、ザクロ、ラズベリー、ブラックベリー、クラウドベリー、イチゴ、クルミなどに含まれるエラジタンニン等に由来するエラグ酸の代謝物として知られている。
【０００３】
エラジタンニンは加水分解性タンニンに分類され、摂取されると体内で加水分解され、エラグ酸に変換されることが知られている。また、果実等にはエラグ酸としても存在している。例えば、生体内におけるウロリチン類の生成については、ゲラニインなどのエラジタンニンをラットに摂取させた後、尿中のウロリチン類を分析することによって、ウロリチン類が生じることが報告されている（非特許文献１）。また、ヒトにおいて、プニカラジンを主としたエラジタンニンを含むザクロ抽出物を摂取後、尿中においてウロリチン類が検出され、特にウロリチンＡ及びウロリチンＣが主要なエラグ酸代謝物であることが報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
これらのウロリチン類は、様々な生理活性を有することが知られており、医薬品、化粧品、飲食品の素材としての利用が期待されている。例えば、ウロリチンＡには抗酸化作用（非特許文献３）、抗炎症作用（非特許文献４）、抗糖化作用（非特許文献５）、マイトファジーの促進作用（非特許文献６）などの機能を有することが報告されており、抗老化機能を有する素材としての開発が期待されている。
【０００５】
これらのウロリチン類を合成する方法としては、２‐ブロモ‐５‐メトキシ安息香酸を出発原料として脱メチル化によって２‐ブロモ‐５‐ヒドロキシ安息香酸とし、レゾルシノールと反応させることによってウロリチンＡを得る方法などが報告されている（非特許文献７）。しかし、ウロリチン類を機能性食品（飲料、サプリメントを含む。）の素材として利用するには、化学合成法は適さない。
【０００６】
一方、エラジタンニンやエラグ酸は体内に摂取された後、腸内微生物叢によって代謝されてウロリチン類に変換されることが知られている。近年、エラグ酸からウロリチン類の一種であるウロリチンＣを生成する腸内細菌としてゴルドニバクター・ウロリチファシエンス(Gordonibacter urolithinfaciens)が分離、同定され、この腸内細菌を用いてエラグ酸を発酵させることによってウロリチンＣを産生させる方法が報告された（特許文献１、非特許文献８）。しかし、発酵液中のウロリチンＣの蓄積濃度は２ｍｇ／Ｌ程度であった。ゴルドニバクター・ウロリチファシエンス(Gordonibacter urolithinfaciens)のほかに、ゴルドニバクター・パメラエアエ(Gordonibacter pamelaeae) もエラグ酸からウロリチンＣを生産することが報告されている（特許文献１、非特許文献８）。
しかし、エラグ酸に作用してウロリチン類を代謝する経路は特定されておらず、関与する酵素、それをコードする遺伝子は報告されていらず、エラグ酸代謝の初発反応を触媒すると予想されるエラグ酸からウロリチンＭ５を生成する酵素、それをコードする遺伝子も報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開２０１４／１４７２８０号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Agric. Food Chem., 56, 393-400 (2008)
【非特許文献２】Mol. Nutr. Food Res., 58, 1199-1211 (2014)
【非特許文献３】Biosci. Biotechnol. Biochem., 76, 395-399 (2012)
【非特許文献４】J. Agric. Food Chem., 60, 8866-8876 (2012)
【非特許文献５】Mol. Nutr. Food Res., 55, S35-S43 (2011)
【非特許文献６】Nature Medicine, 22, 879-888 (2016)
【非特許文献７】J. Agric. Food Chem., 56, 393-400 (2008)
【非特許文献８】Food Func., 5, 8, 1779-1784 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規ラクトナーゼの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ウロリチン類の代謝に関与する新規ラクトナーゼを探索したところ、エラグ酸に存在する２つのエステル（ラクトン）結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒するラクトナーゼを見出し、本発明を完成させた。エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうちの一方が加水分解されたものはウロリチンＭ５とよばれるウロリチン類の一種であり、該活性を有するラクトナーゼは新規なものであった。本発明は下記の通りである。
【００１１】
〔１〕下記（１）の性質を有するラクトナーゼ：
（１）エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性を有する。
〔２〕下記（２）乃至（４）の性質を更に有する、〔１〕に記載のラクトナーゼ：
（２）至適ｐＨが７．０以上９．０以下である；
（３）至適温度が４２℃以上５５℃以下である；
（４）分子量が３７，８００以上４６，２００以下である。
〔３〕ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物に由来する、〔１〕又は〔
２〕に記載のラクトナーゼ。
〔４〕前記ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物が、ゴルドニバクター
・ウロリチンファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物、及びゴルドニ
バクター・フェシホミニス（Gordonibacter faecihominis）に属する微生物から成る群から選択される、〔３〕に記載のラクトナーゼ。
〔５〕下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質である、ラクトナーゼ：
（Ａ）配列番号３又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号３又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換若しくは欠失、又は１〜数個のアミノ酸が挿入若しくは付加したアミノ酸からなる、エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
〔６〕ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物を培養する工程を含む、〔
１〕又は〔２〕に記載のラクトナーゼの製造方法。
〔７〕下記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔８〕〔７〕に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
〔９〕〔７〕に記載のポリヌクレオチドを発現可能に保持した、又は〔８〕に記載のベクターを発現可能に保持した、形質転換体。
〔１０〕〔９〕に記載の形質転換体を培養する工程を含む、〔７〕に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質を製造する方法。
〔１１〕下記工程（Ｉ）を含む、ウロリチンＭ５の製造方法：
工程（Ｉ）：下記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一以上をエラグ酸に接触させる工程。
（ｉ）〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のラクトナーゼ；
（ｉｉ）〔７〕に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質；
（ｉｉｉ）該ラクトナーゼ若しくは該タンパク質を産生する微生物；
（ｉｖ）該微生物の処理物。
〔１２〕下記工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を含み、該工程（Ｉ）及び（ＩＩ）が同一の系で行われる、ウロリチンＣの製造方法：
工程（Ｉ）：下記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一以上をエラグ酸に接触させ、ウロリチンＭ５を生成する工程；
（ｉ）〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のラクトナーゼ；
（ｉｉ）〔７〕に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質；
（ｉｉｉ）該ラクトナーゼ若しくは該タンパク質を産生する微生物；
（ｉｖ）該微生物の処理物。
工程（ＩＩ）：該ウロリチンＭ５からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＭ５からウロリチンＣを生成させる工程。
〔１３〕下記工程（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）を含み、該工程（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）が同一の系で行われる、ウロリチンＡの製造方法：
工程（Ｉ）：下記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一以上をエラグ酸に接触させ、ウロリチンＭ５を生成する工程；
（ｉ）〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のラクトナーゼ；
（ｉｉ）〔７〕に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質；
（ｉｉｉ）該ラクトナーゼ若しくは該タンパク質を産生する微生物；
（ｉｖ）該微生物の処理物。
工程（ＩＩ）：該ウロリチンＭ５からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＭ５からウロリチンＣを生成させる工程。
工程（ＩＩＩ）：該ウロリチンＣからウロリチンＡを生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＣからウロリチンＡを生成させる工程。
〔１４〕下記工程（Ｉ）及び（ＩＶ）を含み、該工程（Ｉ）及び（ＩＶ）が同一の系で行われる、ウロリチンＭ６の製造方法：
工程（Ｉ）：下記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一以上をエラグ酸に接触させ、ウロリチンＭ５を生成する工程；
（ｉ）〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のラクトナーゼ；
（ｉｉ）〔７〕に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質；
（ｉｉｉ）該ラクトナーゼ若しくは該タンパク質を産生する微生物；
（ｉｖ）該微生物の処理物。
工程（ＩＶ）：該ウロリチンＭ５からウロリチンＭ６を生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＭ５からウロリチンＭ６を生成させる工程。
〔１５〕下記工程（Ｉ）及び（Ｖ）を含み、該工程（Ｉ）及び（Ｖ）が同一の系で行われる、ウロリチンＤの製造方法：
工程（Ｉ）：下記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一以上をエラグ酸に接触させ、ウロリチンＭ５を生成する工程；
（ｉ）〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のラクトナーゼ；
（ｉｉ）〔７〕に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質；
（ｉｉｉ）該ラクトナーゼ若しくは該タンパク質を産生する微生物；
（ｉｖ）該微生物の処理物。
工程（Ｖ）：該ウロリチンＭ５からウロリチンＤを生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＭ５からウロリチンＤを生成させる工程。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新規ラクトナーゼの提供ができる。好ましい態様においては、該ラクトナーゼをエラグ酸に作用させてウロリチンＭ５を製造でき、また、他の好ましい態様においては、該ウロリチンＭ５から、ウロリチンＭ６、ウロリチンＡ（ただし、ウロリチンＡは、ウロリチンＣを経由する。）、ウロリチンＣ、又はウロリチンＤを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施態様に係るラクトナーゼの活性のｐＨ依存性を示す図である。
【図２】本発明の一実施態様に係るラクトナーゼの活性の温度依存性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜１．ラクトナーゼ＞
本発明の一実施態様は、下記（１）の性質を有するラクトナーゼである。
（１）エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性を有する。
下記に示すように、エラグ酸には２つのエステル結合が存在する。
【００１５】
【化１】
2019126309.tif 000002
【００１６】
エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうちの一方が加水分解されたものがウロリチンＭ５である。該ウロリチンＭ５は、エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうちの両方が加水分解される途中で生成する中間体と言うこともできる。
本実施態様に係るラクトナーゼは、その至適ｐＨが、好ましくは６．０以上９．５以下、より好ましくは７．０以上９．０以下である。
また、その至適温度は、好ましくは２８℃以上６０℃以下、より好ましくは４２℃以上５５℃以下である。
また、その分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量として３７，８００以上４６，２００以下、好ましくは４２，０００である。
【００１７】
本実施態様に係るラクトナーゼは、ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微
生物に由来するものが好ましく、その中でも、ゴルドニバクター・ウロリチンファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物、ゴルドニバクター・フェシホミニス（Gordonibacter faecihominis）に属する微生物等に由来するものがより好ましい。
さらに、ゴルドニバクター・ウロリチンファシエンス（Gordonibacter urolithinfacie
ns）に属する微生物であればＤＳＭ  ２７２１３株がより好ましく、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物であればＤＳＭ  １９３７８
株がより好ましく、ゴルドニバクター・フェシホミニス（Gordonibacter faecihominis）に属する微生物であればＪＣＭ  １６０５８株がより好ましい。該微生物は、１種類を用いてもよく複数種類を用いてもよい。
【００１８】
尚、本明細書において、DSMとの文言から始まる菌株の受託番号は、DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) に保存されている微生物に付与された番号である。また、JCMとの文言から始まる菌株の受託番号は、理化学研究所バイオ
リソースセンターに保存されている微生物に付与された番号である。
また、ＤＳＭ  ２７２１３株、ＤＳＭ  １９３７８株、ＪＣＭ  １６０５８株は、いずれも各菌株と同一の菌株に制限されず、実質的に同等の菌株であってもよい。実質的に同等の菌株とは、その16S rRNA遺伝子の塩基配列が、上記菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列と９７．５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有する微生物である。さらに、いずれも各菌株、又はそれと実質的に同等の菌株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。このことは、本明細書に記載されている微生物すべてに同様に適用される。
【００１９】
ゴルドニバクター・ウロリチンファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）ＤＳＭ  ２７２１３株が有するラクトナーゼのアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号３、配列番号１とする。
ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）ＤＳＭ  １９３７８株
が有するラクトナーゼのアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号４、配列番号２とする。
【００２０】
また、本実施態様に係るラクトナーゼは、配列番号３又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換若しくは欠失、又は１〜数個のアミノ酸が挿入若しくは付加したアミノ酸からなる、エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質であってもよい。
１〜数個とは、好ましくは１〜３５個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜３個であり、アミノ酸がＮ末端側及び／又はＣ末端側に付加される場合も同様である。
置換は保存的置換が好ましく、保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys
、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換することを指す。保存的置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又
はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
また、本実施態様に係るラクトナーゼは、エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性を有する限り、アミノ酸配列（例えば、配列番号３や配列番号４で表されるアミノ酸配列）の全長に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好
ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。
【００２１】
また、本実施態様に係るラクトナーゼは、エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性を有する限り、塩基配列（例えば、配列番号１や配列番号２で表される塩基配列）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるタンパク質であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件などが挙げられる。
【００２２】
本実施態様に係るラクトナーゼによる、エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性は、例えば、後述の実施例のように、エラグ酸を原料（基質）として、生成したウロリチンＭ５を測定することにより評価することができる。
【００２３】
＜２．ラクトナーゼの製造方法＞
本発明の他の実施態様は、ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物を培
養する工程を含む、前記（１）の性質を有するラクトナーゼの製造方法である。
該製造方法におけるゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物、ラクトナ
ーゼが有する性質についての詳細な説明は、前記と同様である。
【００２４】
ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物は、Anaerobe Basal Broth (ThermoFisher Scientific社製 CM0957)、Wilkins-Chalgren Anaerobe Broth (ThermoFisher Scientific社製 CM0643)、GAM培地（日水製薬株式会社）、変法GAM培地 （日水製薬株式
会社）等の嫌気性菌の培養に用いられる一般的な培地で培養される。
培養温度は、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３３℃以上であり、一方で、好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下、さらに好ましくは３８℃以下である。
【００２５】
さらに、例えば、水溶性の有機物を炭素源として加えることができる。水溶性の有機物としては、例えば、ソルボース、フラクトース、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、などの糖類；メタノールなどのアルコール類；吉草酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ギ酸、コハク酸など有機酸類；アルギニン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、グルタミン酸などのアミノ酸などである。
炭素源として培地に加える有機物の濃度は、効率的に発育させるために適宜調節することができる。通常、０．１〜１０ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲で選択できる。
【００２６】
上記の炭素源に加えて、培地には窒素源を加えてもよい。窒素源としては、通常の培養や発酵に用いうる各種の窒素化合物を用いることができる。
好ましい無機窒素源は、アンモニウム塩、及び硝酸塩である。より好ましくは、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、クエン酸トリアンモニウム、硝酸カリウム及び硝酸ソーダである。
一方、好ましい有機窒素源は、アミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類（乳由来ペプトン、大豆由来ペプトン、大豆由来ペプチドなど）、肉エキス（例えば、ラブ‐レムコ末、カツオエキス、マグロエキス、カツオエキス、ブイヨン、貝類エキスなど）、肝臓エキス、消化血清末などである。より好ましい有機窒素源は、アルギニン、システイン、シトルリン、リジン、トリプトファン、酵母エキス、ペプトン類である。
【００２７】
さらに、炭素源や窒素源に加えて、エキス類、ビタミン類、金属塩類・無機化合物など
の微生物増殖因子を培地に加えることもできる。エキス類としては、ヘミン、ヘム鉄、消化血清末、肝臓エキス、血液消化物などが挙げられる。ビタミン類としては、ビオチン、葉酸、ピリドキサール、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＢ１２、チオオクト酸、ｐ‐アミノ安息香酸、ビタミンＫ類などが挙げられる。金属塩類・無機化合物としては、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、塩化コバルト、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、明ばん、モリブデン酸ナトリウム、塩化カリウム、ホウ酸等、塩化ニッケル、タングステン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、硫酸第一鉄アンモニウム、クエン酸鉄（ＩＩ）、酢酸ナトリウム三水和物、硫酸マグネシウム七水和物、硫酸マンガン四水和物などが挙げられる。これら金属類は、ミネラル酵母の形態で添加することも可能である。
これらの無機化合物やビタミン類など、動植物由来の増殖補助因子を添加して培養液を製造する方法は公知である。培地は、液体、半固体、あるいは固体とすることができる。好ましい培地の形態は、液体培地である。
【００２８】
ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物によるラクトナーゼの産生は、
前記培地に原料（基質）であるエラグ酸又はエラグ酸の前駆体を添加することにより誘導される。エラグ酸の前駆体としては、プニカラジン、ゲラニインなどのエラジタンニンなどが挙げられる。該原料（基質）は、前記培地中の濃度で０．０１ｇ／Ｌ以上２０ｇ／Ｌ以下となるように添加することが好ましい。
【００２９】
ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物により産生されたラクトナーゼ
を回収するには、前記ラクトナーゼ産生後にその培養物を回収し、システイン、２‐メルカプトエタノールやジチオスレイトール等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＦＳ）、ペプスタチンＡ、エチレンジアミン４酢酸のようなプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で、微生物を破砕して無細胞抽出液とする。該無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画や各種のクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製することができる。いずれも常法に従うことができる。
【００３０】
＜３．ポリヌクレオチド＞
本発明の他の実施態様は、下記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドである。詳細は既に記載した通りである。
（ａ）配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００３１】
＜４．遺伝子工学を用いた実施態様＞
本発明の他の実施態様は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；前記ポリヌクレオチドを発現可能に保持した又は前記ベクターを発現可能に保持した、形質転換体；前記形質転換体を培養する工程を含む、前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を製造する方法である。
【００３２】
前記ポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、ラクトナーゼ発現ベクターとすることができる。そして、該発現ベクターを用いて微生物等を形質転換すれば形質転換体を得ることができ、該形質転換体を培養等してラクトナーゼを産生させればラクトナーゼを取得することができる。微生物としては、例えば、乳酸菌を含む嫌気性細菌等が挙げられる。いずれも常法に従うことができる。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主、ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた系（Nature 315, 592-594 (1985)）や、菜種、トウモロコシ、ジャガイ
モなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、これらを用いてもよい。
【００３３】
＜５．ウロリチンＭ５の製造方法＞
本発明の他の実施態様は、下記工程（Ｉ）を含む、ウロリチンＭ５の製造方法である。
工程（Ｉ）：下記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一以上をエラグ酸に接触させる工程。
（ｉ）前記ラクトナーゼ；
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質；
（ｉｉｉ）該ラクトナーゼ若しくは該タンパク質を産生する微生物；
（ｉｖ）該微生物の処理物。
【００３４】
（ｉ）前記ラクトナーゼ、（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、それぞれエラグ酸と接触することで、エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解してウロリチンＭ５を生成する。また、（ｉｉｉ）該ラクトナーゼ若しくは該タンパク質を産生する微生物、（ｉｖ）該微生物の処理物では、それらに含まれるラクトナーゼ又は該タンパク質がエラグ酸と接触することで、エラグ酸に存在する２つのエステル結合のうち少なくとも一方を加水分解してウロリチンＭ５を生成する。
【００３５】
（ｉ）前記ラクトナーゼ、（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、精製したものに限定されず、部分精製したものを含む。
また、（ｉｖ）該微生物の処理物としては、例えば、界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒による処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物や、ガラスビーズや酵素による処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが挙げられる。
【００３６】
前記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一以上をエラグ酸に接触させるには、水中；水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ‐ヘキサンなどの有機溶媒中；又は、該有機溶媒とエタノールやアセトン等の水性媒体との２相混合系により行うことができる。
また、原料（基質）であるエラグ酸、及び生成物であるウロリチンＭ５の溶解度を上げるために、α‐シクロデキストリン、β‐シクロデキストリン、γ‐シクロデキストリンや、これらの誘導体を添加してもよい。
本工程は、固定化酵素、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。
本工程における温度は、好ましくは４℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、一方で、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。
ｐＨは、好ましくは５以上、より好ましくは６以上であり、一方で、好ましくは１０以下、より好ましくは９．５以下である。
原料（基質）であるエラグ酸の反応液中の濃度は、０．０１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上であり、一方で、１００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５０ｇ／Ｌ以下、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以下である。
【００３７】
本製造方法は、得られたウロリチンＭ５を定量する工程（定量工程）を含んでもよい。定量方法は常法に従うことができる。例えば、培養液に、必要に応じてギ酸などの酸を添加した酢酸エチルを加えて、激しく撹拌した後に遠心し、酢酸エチル層を取り出す。必要に応じて同様の操作を数回行い、それら酢酸エチル層を合わせてウロリチン類抽出液を得る。この抽出液をエバポレーターなどを用いて減圧下に濃縮、乾固し、メタノールに溶解させる。これをポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜などの膜を使用して濾過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィーを用いて定量する。高速液体クロマトグラフィーの条件としては、例えば以下が挙げられるが、これに限定されない。
［高速液体クロマトグラフィー条件］
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（２５０×４．６ｍｍ）（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
溶離液：水／アセトニトリル／酢酸＝７４／２５／１
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ（３０５ｎｍ）
【００３８】
また、本製造方法は、得られたウロリチンＭ５を精製する工程（精製工程）や、濃縮する工程（濃縮工程）を含んでもよい。精製工程における精製処理としては、熱等による微生物の殺菌；遠心分離、精密濾過（ＭＦ）、限外濾過（ＵＦ）、ナノ濾過（ＮＦ）などによる除菌；固形物、高分子物質の除去；有機溶媒やイオン性液体などによる抽出及び晶析；疎水性吸着剤、イオン交換樹脂、活性炭カラム等を用いた吸着等のクロマトグラフィー、脱色といった処理を行うことができる。また、濃縮工程における濃縮処理としては、エバポレーター、逆浸透膜等による濃縮が挙げられる。
さらに、ウロリチンＭ５を含む溶液は、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより粉末化することもできる。粉末化においては、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
【００３９】
＜６．ウロリチンＣの製造方法＞
本発明の他の実施態様は、上記工程（Ｉ）及び下記（ＩＩ）を含み、該工程（Ｉ）及び（ＩＩ）が同一の系で行われる、ウロリチンＣの製造方法である。
工程（ＩＩ）：ウロリチンＭ５からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＭ５からウロリチンＣを生成させる工程。
【００４０】
工程（ＩＩ）では、例えば、実施例に記載されるように、ウロリチンＭ５を含有する溶液において、ウロリチンＭ５からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物を培養し、該ウロリチンＭ５からウロリチンＣを生成させることなどが挙げられる。該微生物として、例えば、ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物が挙げられる。好まし
いゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物としては、前記＜１．ラクトナ
ーゼ＞欄に記載したゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物が挙げられる
。また、ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物の培養条件等としては、
前記＜２．ラクトナーゼの製造方法＞欄に記載したゴルドニバクター（Gordonibacter）
属に属する微生物の培養条件等の説明を援用する。
【００４１】
工程（Ｉ）及び（ＩＩ）が「同一の系で行われる」とは、工程（Ｉ）で生成したウロリチンＭ５が工程（ＩＩ）のウロリチンＭ５としてそのまま用いられて、該工程（ＩＩ）でウロリチンＣが生成されるまでの一連の流れが、同一の系で連続して行われることをいう。すなわち、工程（Ｉ）と工程（ＩＩ）との間に、例えば、工程（Ｉ）で生成したウロリチンＭ５を分離及び／又は精製する工程などを含まないことをいう。
本製造方法は、得られたウロリチンＣを定量する工程（定量工程）や、精製する工程（精製工程）、濃縮する工程（濃縮工程）を含んでもよい。それらの詳細は、前記＜５．ウロリチンＭ５の製造方法＞欄の説明を援用する。
さらに、ウロリチンＣを含む溶液は、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより粉末化することもできる。粉末化においては、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
【００４２】
＜７．ウロリチンＡの製造方法＞
本発明の他の実施態様は、上記工程（Ｉ）及び（ＩＩ）並びに下記（ＩＩＩ）を含み、上記工程（Ｉ）と（ＩＩ）とが同一の系で行われる、上記工程（ＩＩ）と下記工程（ＩＩ
Ｉ）とが同一の系で行われる、又は工程（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）が同一の系で行われる、ウロリチンＡの製造方法である。
工程（ＩＩＩ）：ウロリチンＣからウロリチンＡを生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＣからウロリチンＡを生成させる工程。
尚、上記「同一の系で行われる」については、既出の定義を援用する。
【００４３】
工程（ＩＩＩ）では、例えば、実施例に記載されるように、ウロリチンＣを含有する溶液において、ウロリチンＣからウロリチンＡを生成する能力を有する微生物を培養し、該ウロリチンＣからウロリチンＡを生成させることなどが挙げられる。該微生物として、例えば、クロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物が挙げられ、より具体的には
、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）に属する微生物、クロストリ
ジウム・アスパラギフォルメ（Clostridium asparagiforme）に属する微生物、クロスト
リジウム・シトロニアエ（Clostridium citroniae）に属する微生物が挙げられる。該微
生物は、１種類を用いてもよく複数種類を用いてもよい。
クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）に属する微生物の中では、Ｄ
ＳＭ  ２９４８５株、ＤＳＭ  １５６７０株、ＪＣＭ  １２２４３株がより好ましく、ＤＳＭ  １５６７０株がさらに好ましい。
クロストリジウム・アスパラギフォルメ（Clostridium asparagiforme）に属する微生
物の中では、ＤＳＭ  １５９８１株が好ましい。
クロストリジウム・シトロニアエ（Clostridium citroniae）に属する微生物の中では
、ＤＳＭ  １９２６１株が好ましい。
以上の微生物は、属、種、株に拘らず、１種でも２種以上を用いてもよい。
尚、本明細書において、ＤＳＭとの文言から始まる菌株の受託番号は、DSMZ (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) に保存されている微生物に付
与された番号である。また、ＪＣＭとの文言から始まる菌株の受託番号は、理化学研究所バイオリソースセンターに保存されている微生物に付与された番号である。
【００４４】
ウロリチンＣからウロリチンＡを生成する能力を有する微生物の培養条件等としては、前記＜２．ラクトナーゼの製造方法＞欄に記載したゴルドニバクター（Gordonibacter）
属に属する微生物の培養条件等の説明を援用する。
【００４５】
本製造方法は、得られたウロリチンＡを定量する工程（定量工程）や、精製する工程（精製工程）、濃縮する工程（濃縮工程）を含んでもよい。それらの詳細は、前記＜５．ウロリチンＭ５の製造方法＞欄の説明を援用する。
さらに、ウロリチンＡを含む溶液は、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより粉末化することもできる。粉末化においては、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
【００４６】
＜８．ウロリチンＭ６の製造方法＞
本発明の他の実施態様は、上記工程（Ｉ）及び下記（ＩＶ）を含み、該工程（Ｉ）及び（ＩＶ）が同一の系で行われる、ウロリチンＭ６の製造方法である。
工程（ＩＶ）：ウロリチンＭ５からウロリチンＭ６を生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＭ５からウロリチンＭ６を生成させる工程。
尚、上記「同一の系で行われる」については、既出の定義を援用する。
【００４７】
工程（ＩＶ）では、例えば、実施例に記載されるように、ウロリチンＭ５を含有する溶液において、ウロリチンＭ５からウロリチンＭ６を生成する能力を有する微生物を培養し、該ウロリチンＭ５からウロリチンＭ６を生成させることなどが挙げられる。該微生物として、例えば、ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物が挙げられる。好
ましいゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物としては、前記＜１．ラク
トナーゼ＞欄に記載したゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物が挙げら
れる。また、ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物の培養条件等として
は、前記＜２．ラクトナーゼの製造方法＞欄に記載したゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物の培養条件等の説明を援用する。
【００４８】
本製造方法は、得られたウロリチンＭ６を定量する工程（定量工程）や、精製する工程（精製工程）、濃縮する工程（濃縮工程）を含んでもよい。それらの詳細は、前記＜５．ウロリチンＭ５の製造方法＞欄の説明を援用する。
さらに、ウロリチンＭ６を含む溶液は、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより粉末化することもできる。粉末化においては、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
【００４９】
＜９．ウロリチンＤの製造方法＞
本発明の他の実施態様は、上記工程（Ｉ）及び下記（Ｖ）を含み、該工程（Ｉ）及び（Ｖ）が同一の系で行われる、ウロリチンＤの製造方法である。
工程（ＩＶ）：ウロリチンＭ５からウロリチンＤを生成する能力を有する微生物に、該ウロリチンＭ５からウロリチンＤを生成させる工程。
尚、上記「同一の系で行われる」については、既出の定義を援用する。
【００５０】
工程（Ｖ）では、例えば、実施例に記載されるように、ウロリチンＭ５を含有する溶液において、ウロリチンＭ５からウロリチンＤを生成する能力を有する微生物を培養し、該ウロリチンＭ５からウロリチンＤを生成させることなどが挙げられる。該微生物として、例えば、ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物が挙げられる。好ましい
ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物としては、前記＜１．ラクトナー
ゼ＞欄に記載したゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物が挙げられる。
また、ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物の培養条件等としては、前
記＜２．ラクトナーゼの製造方法＞欄に記載したゴルドニバクター（Gordonibacter）属
に属する微生物の培養条件等の説明を援用する。
【００５１】
本製造方法は、得られたウロリチンＤを定量する工程（定量工程）や、精製する工程（精製工程）、濃縮する工程（濃縮工程）を含んでもよい。それらの詳細は、前記＜５．ウロリチンＭ５の製造方法＞欄の説明を援用する。
さらに、ウロリチンＤを含む溶液は、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより粉末化することもできる。粉末化においては、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
【実施例】
【００５２】
以下、具体的な実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
［実施例１：ラクトナーゼ遺伝子のクローニング］
常法に従い、ゴルドニバクター・ウロリチンファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）ＤＳＭ  ２７２１３株からゲノムＤＮＡを調製した。これを鋳型とし下記プライマーセットを用いたＰＣＲでラクトナーゼ遺伝子を増幅し、発現ベクターpET-21b(+)に挿入して、pET-21b(+)_GuUroH+119を構築した。
5'- AATGGATCCGCGGAGCGCGAAGTTACACCGATCTACCGGTAA -3'（配列番号５）
5'- TATGAATTCCTACAGGTTGAACAGCTTCGCCGCGTTGCCGCC -3'（配列番号６）
【００５４】
［実施例２：大腸菌におけるラクトナーゼの発現］
大腸菌Rosetta2(DE3)株をCa法により pET-21b(+)_GuUroH+119で形質転換した。
得られた形質転換株を５ｍＬの３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地で、３７℃、２時間振盪培養した。培養液に１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、更に３７℃、３時間誘導培養した。
得られた培養液を遠心分離し、湿菌体を調製した。得られた湿菌体を０．３ｍＬのBugBuster Master Mix (Novagen製)に懸濁し、室温で緩やかに振盪し、菌を破砕した。
【００５５】
［実施例３：ラクトナーゼの発現解析］
実施例２で調製した細胞破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。アクリルアミド濃度を12.5%とし、タンパク質分子量マーカーとしてAE-1440EzStandard（アトー株式会社製）を用いた。その結果、ラクトナーゼと思われるバンドが観察され、その分子量は４２，４００であった。尚、一般にＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定は１０％程度の誤差を含むと考えられている。
【００５６】
［実施例４：ウロリチンＭ５の製造］
実施例２で調製した細胞破砕液を用いて、エラグ酸の初濃度１ｍｇ／ｍＬ（約３．３ｍＭ）含む反応液中で、３７℃、２４時間の反応を行った。
反応液１００μＬをサンプリングし、１％ギ酸を含むジメチルアセトアミド２００ｍＬを添加し混合した。得られた希釈液を遠心分離し、その上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により解析した。その条件は、下記ＨＰＬＣ条件１の通りである。
その結果、０．２６７ｍＭのウロリチンＭ５が検出された。
【００５７】
＜ＨＰＬＣ条件１＞
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ （４．６×１５０）
溶離液Ａ：１％ギ酸
Ｂ：１％ギ酸を含むアセトニトリル
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ（３４９ｎｍ）
【００５８】
［実施例５：ラクトナーゼのHis-tag付加タンパク質として発現プラスミドの構築］
実施例１と同様に、ゴルドニバクター・ウロリチンファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）ＤＳＭ  ２７２１３株由来ゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記プライマーセットを用いてＰＣＲでラクトナーゼ遺伝子をクローニングし、pET-28a(+)に挿入することにより、ラクトナーゼのＮ末側にHis-tagを付加したタンパク質として発現可能な発現プラ
スミドpET-28a_GuUroH-Histag(N)を構築した。
5'-GCCGGATCCATGGCAGACAACAAGGTCATCGACATCAACATG-3'（配列番号７）
5'-TATGAATTCCTACAGGTTGAACAGCTTCGCCGCGTTGCCGCC-3'（配列番号８）
【００５９】
［実施例６：大腸菌におけるラクトナーゼの発現］
大腸菌Rosetta2 (DE3)株をCa法によりpET-28a_GuUroH-Histag(N)で形質転換した。
得られた形質転換株を５ｍＬの３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地で、３７℃、２．５時間振盪培養した。培養液に終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、更に３０℃、４時間誘導培養した。
得られた培養液を遠心分離し、湿菌体を調製した。得られた湿菌体を０．３ｍＬのBugBuster MasteMix (Novagen製)に懸濁し、室温で緩やかに振盪し、菌を破砕した。得られた破砕液を遠心分離し、上清として可溶性画分を、沈殿として不溶性画分を調製した。
【００６０】
［実施例７：ラクトナーゼの発現解析］
実施例６で調製した可溶性画分と不溶性画分とＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。アクリルアミド濃度を12.5%とし、タンパク質分子量マーカーとしてAE-1440EzStandard（アト
ー株式会社製）を用いた。その結果、可溶性画分と不溶性画分との両方に、ラクトナーゼと思われるバンドが観察され、その分子量は４３，８００（Ｈｉｓ−ｔａｇを含めて）であった。尚、一般にＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定は１０％程度の誤差を含むと考えられている。
【００６１】
［実施例８−１：ラクトナーゼ活性の確認］
実施例６と同様に、終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて３０℃、７時間誘導した菌体を破砕し、無細胞抽出液を調製した。得られた無細胞抽出液を用いて、３７℃、７時間反応させて、原料（基質）であるエラグ酸から生成したウロリチンＭ５をＨＰＬＣにより定量した。その条件は、上記ＨＰＬＣ条件１の通りである。
その結果、無細胞抽出液の比活性は１５．７ｍＵ／ｍｇ−蛋白質であった。尚、１Ｕは、上記の条件下、１分間に１μｍｏｌのウロリチンＭ５生成を触媒する活性を指す。
【００６２】
［実施例８−２：ラクトナーゼ活性の至適ｐＨの確認］
次の緩衝液を用いて実施例８−１と同様の実験を行い、ラクトナーゼ活性の至適ｐＨを確認した。ただし、温度を３７℃、反応時間を３時間とした。
・ｐＨ２．５、３、３．５： ２０ｍＭクエン酸緩衝液
・ｐＨ３．５、４、４．５、５、５．５： ２０ｍＭ酢酸緩衝液
・ｐＨ６、６．５、７、７．５、８： ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
・ｐＨ７．５、８、８．５、９： ２０ｍＭトリス‐塩酸緩衝液
・ｐＨ９．５、１０、１０．５、１１： ２０ｍＭ炭酸緩衝液
・ｐＨ１１．５、１２： ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
結果を図１に示す。図１は、ｐＨが９のときのラクトナーゼ活性を１００とした場合の、各ｐＨにおけるラクトナーゼの相対活性である。ｐＨが７．０以上９．０以下の範囲付近において、ラクトナーゼ活性は最大活性の８０％以上の活性を示した。
【００６３】
［実施例８−３：ラクトナーゼ活性の至適温度の確認］
２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて実施例８−１と同様の実験を行い、ラクトナーゼ活性の至適温度を確認した。ただし、反応時間を３時間とした。温度として、１０、１５、２０、２８、３２、３７、４２、５０、５５、６０、７０℃を採用した。
結果を図２に示す。図２は、温度が５０℃のときのラクトナーゼ活性を１００とした場合の、各温度におけるラクトナーゼの相対活性である。温度が４２℃以上５５℃以下の範囲付近において、ラクトナーゼ活性は最大活性の８０％以上の活性を示した。
【００６４】
［実施例９：ラクトナーゼの精製］
実施例６の方法により得られた無細胞抽出液をＨｉｓ−トラップカラムを用いて精製した。
洗浄液Ａ（20 mM KPB (pH 7.4), 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole）で平衡化したHisTrap
HP (5 mL)（GE Healthcare製）に無細胞抽出液を添加し、ラクトナーゼを吸着させた後
、同洗浄液Ａでカラムを洗浄した。その後、溶出液Ｂ（20 mM KPB (pH 7.4), 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole）でラクトナーゼを溶出させた。
精製酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示し、その比活性は、４４４ｍＵ／ｍｇ−蛋白質であった。
【００６５】
［実施例１０：エラグ酸からウロリチンＭ５の製造例］
実施例６で得られた形質転換体を、５ｍＬの３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、及び３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地で、３７℃、１５時間振盪培養した。培養液を新鮮な同培地７ｍＬに植菌し、３７℃で３８時間培養後、エラグ酸０．２ｍｇ（終濃度約０．１ｍＭ）を添加し、更に、１２時間培養した。
培養液１００μＬをサンプリングし、１％ギ酸を含むジメチルアセトアミド２００ｍＬを添加し混合した。得られた希釈液を遠心分離し、その上清をＨＰＬＣにより解析した。その条件は、上記ＨＰＬＣ条件１の通りである。
その結果、０．０７６ｍＭのウロリチンＭ５と０．００８ｍＭのエラグ酸とが検出された。
【００６６】
［比較例１］
形質転換体の代わりにプラスミドを含まない宿主（大腸菌 Rosetta2 (DE3) 株）を用いたこと以外は実施例１０と同様にした。
その結果、ウロリチンＭ５は検出されなかった。
【００６７】
［実施例１１：ウロリチンＭ５からウロリチンＭ６の製造例］
ＡＢＢ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）に、ウロリチンＭ５を最終濃度が３．３ｍＭとなるように添加した後、加熱滅菌し、気相をＮ２：ＣＯ２：Ｈ２（８０％／１０％／１０％）ガスで置換したものを基本培地とした。該基本培地に、ゴルドニバクター・ウロリチファシエンスＤＳＭ  ２７２１３株を植菌し、３７℃で嫌気的に培養した。培養終了後、培養液１ｍＬに対して等量のDMSOを添加してウロリチン類を溶解し、ＨＰＬＣによりウロリチン類の定量分析を行った。その条件は、下記ＨＰＬＣ条件２の通りである。
その結果、１４日間の培養により、０．４０６ｍＭのウロリチンＭ６が生成した。
【００６８】
＜ＨＰＬＣ条件２＞
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
溶離液Ａ：１％ギ酸
Ｂ：１％ギ酸を含むアセトニトリル
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ（３０５ｎｍ）
【００６９】
［実施例１２：ウロリチンＭ５からウロリチンＣの製造例］
ＡＢＢ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）に、ウロリチンＭ５を最終濃度が３．３ｍＭとなるように添加した後、加熱滅菌し、気相をＮ２：ＣＯ２：Ｈ２（８０％／１０％／１０％）ガスで置換したものを基本培地とした。該基本培地に、ゴルドニバクター・ウロリチファシエンスＤＳＭ  ２７２１３株を植菌し、３７℃で嫌気的に培養した。培養終了後、培養液１ｍＬに対して等量のDMSOを添加してウロリチン類を溶解し、ＨＰＬＣによりウロリチン類の定量分析を行った。その条件は、上記ＨＰＬＣ条件２の通りである。
その結果、１４日間の培養により、０．０７０７ｍＭのウロリチンＣが生成した。
【００７０】
［実施例１３：ウロリチンＣからウロリチンＡの製造例１］
ＡＢＢ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）に、ウロリチンＡの前駆体として、最終濃度が１．０ｇ／ＬとなるようにウロリチンＣを添加した後、加熱滅菌し、気相をＮ２：ＣＯ２：Ｈ２（８０％／１０％／１０％）ガスで置換したものを基本培地とした。該基本培地に、クロストリジウム・ボルテアエＪＣＭ  １２２４３株、ＤＳＭ  １５６７０株、又は、ＤＳＭ  ２９４８５株を植菌し、３７℃で嫌気的に培養した。培養終了後、培養液５ｍＬに対して等量の酢酸エチルでウロリチン類を抽出し、得られた酢酸エチル相を減圧濃縮し、乾固した。このようにして得た乾固物をメタノール０．５ｍＬに再溶解し、ＨＰＬＣによりウロリチン類の定量分析を行った。その条件は、上記ＨＰＬＣ条件２の通りである。また、ＤＡＬＴＯＮ  ＰＨＡＲＭＡ社製のウロリチン類を標品として用い、ＤＭＳＯに溶解して用いた。
その結果、２週間の培養により、それぞれにおいて、添加したウロリチンＣの８９％、
１００％、８９％がウロリチンＡに変換された。
【００７１】
［実施例１４：ウロリチンＣからウロリチンＡの製造例２］
クロストリジウム・アスパラギフォルメＤＳＭ  １５９８１株を用いて５日間の培養をしたこと以外は実施例１３と同様にした結果、添加したウロリチンＣの９５％がウロリチンＡに変換された。
【００７２】
［実施例１５：ウロリチンＣからウロリチンＡの製造例３］
クロストリジウム・シトロニアエＤＳＭ  １９２６１株を用いて５日間の培養をしたこと以外は実施例１３と同様にした結果、添加したウロリチンＣの８２％がウロリチンＡに変換された。
【００７３】
［実施例１６：ウロリチンＣからウロリチンＡの製造例４］
０．１％エラグ酸（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＡＢＢ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）に、クロストリジウム・ボルテアエＪＣＭ  １２２４３株及びゴルドニバクター・パメラエアエＤＳＭ  １９３７８株を植菌し、実施例１３と同様に培養した結果、２週間の培養により、添加したエラグ酸の６７％がウロリチンＡに変換された。
【００７４】
［実施例１７：ウロリチンＣからウロリチンＡの製造例５］
クロストリジウム・ボルテアエＪＣＭ  １２２４３株及びゴルドニバクター・ウロリチファシエンスＤＳＭ  ２７２１３株を用いたこと以外は実施例１６と同様に培養した結果、２週間の培養により、添加したエラグ酸の６２％がウロリチンＡに変換された。
【００７５】
［実施例１８：ウロリチンＣからウロリチンＡの製造例６］
クロストリジウム・アスパラギフォルメＤＳＭ  １５９８１株及びゴルドニバクター・ウロリチファシエンスＤＳＭ  ２７２１３株を用いたこと以外は実施例１６と同様に培養した結果、５日間の培養により、添加したエラグ酸の６０％がウロリチンＡに変換された。
【００７６】
［実施例１９：ウロリチンＣからウロリチンＡの製造例７］
クロストリジウム・シトロニアエＤＳＭ  １９２６１株及びゴルドニバクター・ウロリチファシエンスＤＳＭ  ２７２１３株を用いたこと以外は実施例１６と同様に培養した結果、５日間の培養により、添加したエラグ酸の６０％がウロリチンＡに変換された。
【００７７】
［実施例２０：ウロリチンＭ５からウロリチンＤの製造例］
ＡＢＢ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）に、ウロリチンＭ５を最終濃度が３．３ｍＭとなるように添加した後、加熱滅菌し、気相をＮ２：ＣＯ２：Ｈ２（８０％／１０％／１０％）ガスで置換したものを基本培地とした。該基本培地に、ゴルドニバクター・ウロリチファシエンスＤＳＭ  ２７２１３株を植菌し、３７℃で嫌気的に培養した。培養終了後、培養液１ｍＬに対して等量のDMSOを添加してウロリチン類を溶解し、ＨＰＬＣによりウロリチン類の定量分析を行った。その条件は、上記ＨＰＬＣ条件２の通りである。
その結果、１４日間の培養により、０．０１１ｍＭのウロリチンＭ６が生成した。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明により、ウロリチン類の工業的生産に有利なラクトナーゼが提供される。該ラクトナーゼにより効率的にウロリチンＭ５の製造が可能となり、該ウロリチンＭ５を介したウロリチン類の生産が可能となる。ウロリチン類は、医薬品、化粧品、機能性食品の素材として有用であり、本発明は産業上、非常に有用である。
【図１】
2019126309.tif 000003
【図２】
2019126309.tif 000004
【配列表】
2019126309000001.app