(57)【要約】【課題】本発明は、不織布とポリマー多孔質膜とを含む細胞培養部材を有する細胞培養モジュールを提供することを目的とする。【解決手段】本発明によれば、親水化処理され不織布及びポリマー多孔質膜を含む細胞培養部材と、２以上の培地流出入口を有し、該細胞培養部材が収容されたケーシングとを備えた細胞培養モジュールであって、ここで、不織布は、２０％重量以上の芯鞘型複合繊維により構成され、ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜である細胞培養モジュールが提供される。【選択図】図２１
2019126341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不織布及びポリマー多孔質膜からなる細胞培養部材と、
２以上の培地流出入口を有し、該細胞培養部材が収容されたケーシングと
を備えた細胞培養モジュールであって、ここで、
前記不織布は、２０％重量以上の芯鞘型複合繊維により構成される不織布であって、
不織布の目付は、１〜５０ｇ／ｍ２であり、
芯鞘型複合繊維の芯部及び鞘部はポリオレフィン系重合体からなり、鞘部の重合体の融点は芯部の重合体の融点よりも低く、及び鞘芯比率は９０：１０〜１０：９０であり、
不織布は、細孔を有する；そして
前記ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、
表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、
マクロボイド層は、表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、該隔壁並びに表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
表面層Ａ及びＢにおける孔は、該マクロボイドに連通し；
ここで、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立した前記細胞培養部材は、集約されて、
（ｉｉ）細胞培養部材は、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）細胞培養部材は、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）細胞培養部材は、縄状に結ばれて、
収容されている、上記細胞培養モジュール。
【請求項２】
不織布が、親水化処理されている、請求項１に記載の細胞培養モジュール。
【請求項３】
芯鞘型複合繊維の繊度が０．０５〜２．２デシテックス（ｄＴｅｘ）である、請求項１又は２に記載の細胞培養モジュール。
【請求項４】
芯鞘型複合繊維同士は、熱融着により接触交点において結着部を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項５】
不織布が、芯鞘型複合繊維の繊度及び／又は鞘芯比率が異なる２種以上の芯鞘型複合繊維を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項６】
培地流出入口の径が、細胞の径よりも大きく、かつ、不織布及びポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項７】
親水化処理が、フッ素ガス処理、常圧プラズマ処理、真空プラズマ処理、コロナ処理、親水性単量体のグラフト重合処理、スルホン化処理、及び界面活性剤付与処理からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項８】
不織布の平均細孔が、０．０１〜１００μｍである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項９】
不織布の総膜厚が、５〜５００μｍである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１０】
芯鞘型複合繊維同士によって形成された結着部の面積率が５〜３０％である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１１】
ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの細孔を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１２】
表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１３】
表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１４】
ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１５】
ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１６】
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１５に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１７】
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項１５又は１６に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１８】
ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１９】
ケーシングが、メッシュ状の構造を有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項２０】
ケーシングが、非可撓性素材からなる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水化処理された不織布とポリマー多孔質膜からなる細胞培養部材を有する細胞培養モジュールに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、治療やワクチンに用いられる酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン、ウイルス（ウイルスタンパク質）等のタンパク質が培養細胞を用いて工業的に産生されている。しかし、こうしたタンパク質の生産技術は効率面に課題を抱えており、それが持続的かつ広範な供給が必須不可欠であるべきバイオ医薬品について、タイムリーな安定供給等に影響を及ぼす状況が生じていた。そのため、効率的かつ安定で迅速な生産方法の確立に向けて、高密度に細胞を培養する技術や、高効率連続生産法等のタンパク質の産生量を増大させるような革新的な技術が求められていた。
【０００３】
タンパク質を産生させる細胞として、培養基材に接着する足場依存性の接着細胞が用いられることがある。こうした細胞は、足場依存的に増殖するため、シャーレ、プレート又はチャンバーの表面に接着させて培養する必要がある。従来、こうした接着細胞を大量に培養するためには、接着するための表面積を大きくする必要があった。ところが、培養面積を大きくするには、空間を必然的に増大させる必要があり、それが培養効率を低下させ、設備の煩雑化や膨大化を招く要因となっていた。
【０００４】
培養空間を小さくしつつ、接着細胞を大量に培養する方法として、微小多孔を有する担体、特に、マイクロキャリアを用いた培養法が開発されている（例えば、特許文献１）。マイクロキャリアを用いた細胞培養系は、マイクロキャリアが互いに凝集しないようにするために十分に攪拌・拡散される必要がある。そのため、マイクロキャリアを分散させた培養液を十分に攪拌・拡散することができるだけの容積が必要となるため、培養できる細胞の密度には上限がある。また、マイクロキャリアと培養液とを分離するためには、細かな粒子を分別できるフィルターで分離させる必要があり、それがバイオ医薬品等のタンパク質やワクチン等の生産性を低下させる原因ともなっていた。こうした状況から、高密度の細胞を培養する革新的な細胞培養の方法論が希求されていた。
【０００５】
従来、付着性培養細胞の培養において、高密度培養を目的としてポリエステル繊維からなる繊維集積体を用いる培養方法（特許文献２、皮膚や歯周組織、顎骨などの組織再生・修復用の足場やテンプレートとしての不織布シートを用いる方法（特許文献３）、繊維束を構成する繊維間の配向と平均繊維径の両方を制御することによって、細胞の接着性と増殖性の両方の効率を向上させる方法（特許文献４）、さらに、骨補填材を含有する不織布を細胞足場材として使用する骨芽細胞を増殖させる方法（特許文献５）が知られている。また、哺乳動物や昆虫細胞の培養用支持体として、ポリエステル不織布で構成されるマクロ多孔性担体であるＢｉｏＮＯＣ  ＩＩ（商標）担体）が市販されている。一方で、不織布（ポリフッ化ビニリデン繊維）を足場として用いる細胞移植を目的とした３次元培養において、間葉系間質細胞の増殖における該繊維の断面形状の影響を検討した報告もある（非特許文献１）。
【０００６】
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献６〜８は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００３／０５４１７４号
【特許文献２】特開平８−３３４７３号公報
【特許文献３】特開２０１５−１５８０２６号公報
【特許文献４】国際公開第２０１６／０６８２７９号
【特許文献５】特開２０１２−１９２１０５号公報
【特許文献６】国際公開第２０１０／０３８８７３号
【特許文献７】特開２０１１−２１９５８５号公報
【特許文献８】特開２０１１−２１９５８６号公報
【特許文献９】国際公開第２０１５／０１２４１５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Schellengber, A., et al., PLOS One, vol. 9, e94353 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、不織布又は親水化処理された不織布とポリマー多孔質からなる細胞培養部材を備えた細胞培養モジュール、及び該細胞培養モジュールを用いた細胞の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、所定の構造を有する不織布及びポリマー多孔質膜からなる細胞培養部材が、細胞培養に適し、該細胞培養により細胞からの有用なタンパク質産生を促進し得ることを見出し、本発明を完成した。すなわち、限定されるわけではないが、本発明は好ましくは以下の態様を含む。
【００１１】
［１］  不織布及びポリマー多孔質膜からなる細胞培養部材と、
２以上の培地流出入口を有し、該細胞培養部材が収容されたケーシングと
を備えた細胞培養モジュールであって、ここで、
前記不織布は、２０％重量以上の芯鞘型複合繊維により構成される不織布であって、
不織布の目付は、１〜５０ｇ／ｍ２であり、
芯鞘型複合繊維の芯部及び鞘部はポリオレフィン系重合体からなり、鞘部の重合体の融点は芯部の重合体の融点よりも低く、及び鞘芯比率は９０：１０〜１０：９０であり、
不織布は、細孔を有する；そして
前記ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、
表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、
マクロボイド層は、表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、該隔壁並びに表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
表面層Ａ及びＢにおける孔は、該マクロボイドに連通し；
ここで、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立した前記細胞培養部材は、集約されて、
（ｉｉ）細胞培養部材は、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）細胞培養部材は、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）細胞培養部材は、縄状に結ばれて、
収容されている、上記細胞培養モジュール。
［２］  不織布が、親水化処理されている、［１］に記載の細胞培養モジュール。
［３］  芯鞘型複合繊維の繊度が０．０５〜２．２デシテックス（ｄＴｅｘ）である、［１］又は［２］に記載の細胞培養モジュール。
［４］  芯鞘型複合繊維同士は、熱融着により接触交点において結着部を形成する、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［５］  不織布が、芯鞘型複合繊維の繊度、鞘芯比率、及び／又は繊維径が異なる２種以上の芯鞘型複合繊維を含む、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［６］  培地流出入口の径が、細胞の径よりも大きく、かつ、不織布及びポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［７］  親水化処理が、フッ素ガス処理、常圧プラズマ処理、真空プラズマ処理、コロナ処理、親水性単量体のグラフト重合処理、スルホン化処理、及び界面活性剤付与処理からなる群から選択される、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［８］  不織布の平均細孔が、０．０１〜１００μｍである、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［９］  不織布の総膜厚が、５〜５００μｍである、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［１０］  芯鞘型複合繊維同士によって形成された結着部の面積率が５〜３０％である、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［１１］  ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの細孔を有する、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［１２］  表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［１３］  表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［１４］  ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［１５］  ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［１６］  ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［１５］に記載の細胞培養モジュール。
［１７］  ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［１５］又は［１６］に記載の細胞培養モジュール。
［１８］  ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、［１］〜［１７］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［１９］  ケーシングが、メッシュ状の構造を有する、［１］〜［１８］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［２０］  ケーシングが、非可撓性素材からなる、［１］〜［１９］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、懸濁された細胞を効率的に吸着し、従来の浮遊培養容器を用いて、安定的に培養可能となる。また、本発明によって、従来のようなフィルター膜を用いることなく、簡便に細胞を除去することが可能となる。さらに、ケーシングに収容され、モジュール化された細胞培養部材を用いることで、懸濁された細胞が簡単に吸着され、簡便かつ安定的に細胞を培養することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、細胞培養モジュールの一実施態様を示す。ケーシング内に細胞培養部材が収容されている。
【図２】図２は、細胞培養モジュールの一実施態様を示す。ケーシング内に細胞培養部材が収容されている。
【図３】図３は、細胞培養モジュールの一実施態様を示す。（Ａ）メッシュ状のケーシング内に細胞培養部材が収容されている。（Ｂ）メッシュ状のネットと、骨組みとからなるケーシングの一実施態様を示す。
【図４】図４は、スピナーフラスコ内で細胞培養モジュールを適用する際に併用するデバイスの実施態様を示す。（Ａ）回転型デバイス。細胞培養モジュールを適用した該デバイスをスピナーフラスコ内に設置し、該回転型デバイス自体を回転させて使用する。（Ｂ）固定型デバイス。細胞培養モジュールを適用した該デバイスをスピナーフラスコの底部に設置する。デバイス中央の空間でスピナーフラスコのスターラーを回転させて使用する。
【図５】図５は、可撓性バッグ型培養容器に細胞培養モジュールを適用して培養した一実施態様を示す。
【図６】図６は、振盪培養時のメッシュモジュール使用の一実施態様を示す。
【図７】図７は、ポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を示す。
【図８】図８は、細胞培養モジュールの一実施態様を示す。
【図９】図９は、細胞培養装置の一実施態様を示す。
【図１０】図１０は、細胞培養装置の一実施態様を示す。（Ａ）細胞培養装置の構成を示す図である。（Ｂ）（Ａ）における、細胞培養デバイスを載置する細胞培養部を示す図である。
【図１１】図１１は、細胞培養装置の一実施態様を示す。基本的な構成は図１０と共通であるが、各段の培地排出口が３０度ずつ反時計回りにずれており、培地が排出されやすい構造となっている。
【図１２】図１２は、細胞培養装置の一実施態様を示す。
【図１３】図１３は、細胞培養装置の一実施態様を示す。（Ａ）細胞培養装置の構成を示す。（Ｂ）円筒形容器（螺旋状流路無し）を示す図である。
【図１４】図１４は、細胞培養装置の一実施態様を示す。（Ａ）円筒形容器（螺旋状流路有り）を示す模式図である。（Ｂ）円筒形容器（螺旋状流路有り）を示す図である。
【図１５】図１５は、細胞培養の一実施態様を示す。
【図１６】図１６は、一実施形態における本発明の細胞培養モジュールを適用したＷＡＶＥ型バイオリアクター示す図である。（Ａ）細胞培養モジュールが封入されたバッグ、（Ｂ）ＷＡＶＥ２５を用いた細胞培養モジュールへの細胞吸着工程、を示している。
【図１７】図１７は、本発明の一実施形態における細胞培養装置を示す図である。（Ａ）細胞培養モジュール、（Ｂ）細胞培養部、（Ｃ）一実施形態における細胞培養装置、を示す。
【図１８】図１８は、一実施形態における細胞培養装置を示す図である。
【図１９】図１９は、一実施形態の細胞培養装置における、液滴化培地供給手段から滴下される培地の様式を示す概念図である。（Ａ）ドロップ型、（Ｂ）メッシュ型、（Ｃ）シャワー型を示す。（Ｄ）ドロップ型及びメッシュ型の液滴を供給するために使用される、一実施形態の細胞培養装置に適用される蓋体を示す図である。蓋体の培地供給口には、ステンレス鋼製のメッシュを巻いて形成したメッシュ束が挿入される。
【図２０】図２０は、一実施形態におけるサイフォン式細胞培養装置を示す図である。
【図２１】図２１は、細胞培養モジュールのタイプ別構造を示す図である。
【図２２】図２２は、バッグ型バイオリアクターの構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．細胞培養モジュール
本発明の一態様は、
不織布及びポリマー多孔質膜からなる細胞培養部材と、
２以上の培地流出入口を有し、該細胞培養部材が収容されたケーシングと
を備えた細胞培養モジュールであって、ここで、
前記不織布は、２０％重量以上の芯鞘型複合繊維により構成される不織布であって、
不織布の目付は、１〜５０ｇ／ｍ２であり、
芯鞘型複合繊維の芯部及び鞘部はポリオレフィン系重合体からなり、鞘部の重合体の融点は芯部の重合体の融点よりも低く、及び鞘芯比率は９０：１０〜１０：９０であり、
不織布は、細孔を有する；そして
前記ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、
表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、
マクロボイド層は、表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、該隔壁並びに表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
表面層Ａ及びＢにおける孔は、該マクロボイドに連通し；
ここで、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立した前記細胞培養部材は、集約されて、
（ｉｉ）細胞培養部材は、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）細胞培養部材は、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）細胞培養部材は、縄状に結ばれて、
収容されている細胞培養モジュールに関する。該細胞培養モジュールを、以下で、「本発明の細胞培養モジュール」とも呼ぶ。なお、本明細書において、「細胞培養モジュール」との記載は、単に「モジュール」と記載することができ、相互に変更しても同一のことを意味する。
【００１５】
本明細書において、「細胞培養モジュール」とは、細胞培養容器、細胞培養装置及び細胞培養システムに適用可能な、細胞培養基材をいう。細胞培養モジュールのいくつかの実施態様を図１〜３、図８、図１７（Ａ）に示す。本発明の細胞培養モジュールは、図４〜６、９〜１８、２０、及び２２のような実施態様によって使用することができる。
【００１６】
本発明の細胞培養モジュールは、不織布及びポリマー多孔質膜がケーシングに収容されていることによって、不織布及びポリマー多孔質膜がケーシング内で、継続的に形態が変形することが防止される。これによって、不織布及び／又はポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の細胞を培養することが可能となる。
【００１７】
本発明の細胞培養モジュールが備えるケーシングは、２以上の培地流出入口を有することで、細胞培地がケーシングの内部へ供給及び外部へ排出される。該ケーシングの培地流出入口の径は、ケーシングの内部へ細胞が流入可能であるように、前記細胞の径よりも大きいことが好ましい。また、培地流出入口の径が、該培地流出入口より不織布及びポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さいことが好ましい。不織布及びポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい径は、ケーシングに収容された不織布及びポリマー多孔質膜の形状、大きさによって適宜選択可能である。例えば、不織布又はポリマー多孔質膜がひも状である場合、該不織布又はポリマー多孔質膜の短辺の幅より小さく、該不織布又はポリマー多孔質膜が流出しない適度の径であれば特に限定されない。該培地流出入口の数は、細胞培地がケーシング内外へ供給及び／又は排出されやすいように、出来るだけ多く設けられていることが好ましい。好ましくは、５以上、好ましくは１０以上、好ましくは２０以上、好ましくは５０以上、好ましくは１００以上である。培地流出入口は、ケーシングの一部又は全部が、メッシュ状の構造を有していてもよい。また、該ケーシング自体がメッシュ状であってもよい。本発明において、メッシュ形状の構造とは、例えば、縦、横、及び／又は斜めの格子状の構造を有するものであって、各目開きが、流体が通過出来る程度に培地流出入口を形成するものであるが、これに限定されない。
【００１８】
本発明の細胞培養モジュールが備えるケーシングは、通常の培養条件、例えば、攪拌培養、振とう培養条件における培地の動きによって変形しない程度に強度を有することが好ましく、非可撓性素材から形成されていることが好ましい。また、ケーシングは、細胞培養において、細胞の生育に影響を与えない素材によって形成されていることが好ましい。このような材料としては、例えば、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、ナイロン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート等のポリマー、ステンレス綱、チタンなどの金属が挙げられるが、これに限定されない。本明細書において、「ケーシングが変形しない」とは、通常の培養環境下で受ける負荷において変形しないことを意味するものであり、絶対的に変形しないことを意味するものではない。
【００１９】
本発明の細胞培養モジュールは、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立した細胞培養部材が、集約されて、
（ｉｉ）細胞培養部材が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）細胞培養部材が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）細胞培養部材が、縄状に結ばれて、
収容されている。
【００２０】
本明細書において、「ケーシング内に２以上の独立した細胞培養部材が集約されて収容されている」とは、互いに独立した２以上のポリマー多孔性膜が、ケーシングで囲まれた一定空間内に集約されて収容されている状態を指す。本発明において、２以上の独立した該細胞培養部材は、該細胞培養部材の少なくとも１カ所と該ケーシング内の少なくとも１カ所とを任意の方法によって固定され、該細胞培養部材がケーシング内で動かない状態に固定されたものであってもよい。また、２以上の独立した細胞培養部材は、小片であってもよい。小片の形状は、例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形をとりうるが、好ましくは、略正方形が好ましい。本発明において、小片の大きさは、任意の大きさをとりうるが、略正方形である場合、長さは任意の長さでよいが、例えば、８０ｍｍ以下がよく、好ましくは５０ｍｍ以下がよく、より好ましくは３０ｍｍ以下がよく、さらにより好ましくは２０ｍｍ以下がよく、１０ｍｍ以下であってもよい。また、細胞培養部材の小片が略正方形である場合、その一辺の長さは、細胞培養部材がケーシング内で動かない状態となるように、ケーシングの内壁に沿って、又は内壁の一辺の長さより短く（例えば、０．１ｍｍ〜１ｍｍ程度短い）形成されたものであってもよい。これによって、細胞培養部材内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の細胞を培養することが可能となる。なお、ひも状の細胞培養部材の場合、後述するように、（ｉｉ）細胞培養部材が、折り畳まれて、（ｉｉｉ）細胞培養部材が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、（ｉｖ）細胞培養部材が、縄状に結ばれて、該ケーシングに収容されてもよい。また、ケーシング内に２以上の独立した細胞培養部材を集約して収容するために、任意の枚数の不織布及びポリマー多孔質膜を任意の順番で積層させてもよい。この場合、不織布とポリマー多孔質膜の間、不織布と不織布の間、ポリマー多孔質膜とポリマー多孔質膜の間には間仕切り（中敷き）が設けられてもよい。一態様として、不織布とポリマー多孔質膜を積層させた細胞培養部材の例として、不織布（例えば、３枚）とポリマー多孔質膜（例えば、３枚）を交互に積層し、計６枚を１ユニットとして、３ユニットを２枚の間仕切りを介して積層させた細胞培養部材とすることもできる（図２１参照）。別の態様として、不織布（例えば、４枚）の積層体を上下に１枚ずつのポリマー多孔質膜で挟んだ構造体を１ユニットして、３ユニットを２枚の間仕切りを介して積層させた細胞培養部材とすることもできる（図２１参照）。なお、間仕切りが設けられることにより、積層された不織布やポリマー多孔質膜の間に効率的に培地を供給させることができる。間仕切りは、積層された不織布とポリマー多孔質膜の間、不織布と不織布の間、ポリマー多孔質膜とポリマー多孔質膜の間に任意の空間を形成し、効率的に培地を供給させる機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、メッシュ構造を有する平面構造体を用いることができる。間仕切りの材質は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼製のメッシュを用いることができるが、これに限定されない。メッシュ構造を有する間仕切りを有する場合、積層された細胞培養部材の間に培地を供給できる程度の目開きを有していればよく、適宜選択することができる。
【００２１】
本明細書において、「折り畳まれた細胞培養部材」とは、該ケーシング内にて折り畳まれていることで、細胞培養部材の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となった細胞培養部材である。本明細書において、「折り畳まれた」とは、細胞培養部材に折り目がついた状態であってもよく、折り目がついていない状態であってもよい。
【００２２】
本明細書において、「ロール状に巻き込まれた細胞培養部材」とは、細胞培養部材が、ロール状に巻き込まれて、細胞培養部材の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となった細胞培養部材をいう。また、本発明おいて、縄状に編み込まれた細胞培養部材とは、例えば短冊状の複数の細胞培養部材を、任意の方法によって縄状に編み込み、細胞培養部材同士の摩擦力によって互いに動かない状態の細胞培養部材をいう。（ｉ）２以上の独立した細胞培養部材が集約された細胞培養部材、（ｉｉ）折り畳まれた細胞培養部材、（ｉｉｉ）ロール状に巻き込まれた細胞培養部材、及び（ｉｖ）縄状に結ばれた細胞培養部材、が、組み合わせられてケーシング内に収容されていてもよい。
【００２３】
本明細書において、「細胞培養部材がケーシング内で動かない状態」とは、該細胞培養モジュールを細胞培養培地中で培養する場合に、該細胞培養部材が継続的に形態変化しない状態になるようにケーシング内に収容されている状態をいう。換言すれば、該細胞培養部材自体が、流体によって、継続的に波打つ動きを行わないように抑制された状態である。細胞培養部材がケーシング内で動かない状態を保つため、細胞培養部材内で生育されている細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等による細胞が死滅されることなく安定的に細胞が培養可能となる。
【００２４】
本発明の細胞培養モジュールは、細胞を培養する培養装置及びシステム等であれば、市販のものを適用することが可能である。例えば、培養容器が可撓性のバッグからなる培養装置にも適用可能であり、当該培養容器内に浮遊させた状態で使用することが可能である。また、本発明の細胞培養モジュールは、例えば、スピナーフラスコ等の攪拌培養型容器に適用し、培養することが可能である。その他、培養容器としては、開放容器にも適用可能であり、閉鎖容器にも適用可能である。例えば、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ  セルファクトリー等が含まれる。
【００２５】
２．細胞培養装置への細胞培養モジュールの適用
本明細書において、「細胞培養装置」とは、一般に、細胞培養システム、バイオリアクター、又はリアクターと同義に扱われる用語であって、相互に入れ替えても同一の意味を有する。本発明の細胞培養モジュールは、以下に例示する細胞培養装置に適用することができる。また、以下に例示する装置以外の市販の装置においても適用可能である。
【００２６】
（１）サイフォン式培養装置
本発明の細胞培養モジュールは、図９及び図２０に示す、サイフォン式培養装置において適用可能である。サイフォン式培養装置とは、細胞培養部材（好ましくは、該細胞培養部材を含む細胞培養モジュール）と、該細胞培養部材が収容された細胞培養部と、該細胞培養部を内部に格納した液溜め部と、該液溜め部の上部に配置された培地供給手段と、該液溜め部の底部で連通された逆Ｕ字管と、該逆Ｕ字管の他端の下部に設置された培地回収手段と、該培地回収手段に配置された培地排出手段とを備える。ここで、前記培地供給手段から前記液溜め部に供給された培地の液面が前記逆Ｕ字管の頂上部に達したとき、サイフォンの原理により培地が前記培地回収手段に間歇的に吐出されることを特徴とする、細胞培養装置である。
【００２７】
（２）筒型気相培養装置
本発明の細胞培養モジュールは、図１０、図１１及び図１８に示す、筒型気相培養装置において適用可能である。一実施形態において、筒型気相培養装置とは、細胞培養部材（好ましくは、該細胞培養部材を含む細胞培養モジュール）と、細胞培養部材が収容された細胞培養部と、該細胞培養部の上部に配置された培地供給手段と、該細胞培養部の下部に配置された培地回収手段とを備える。ここで、前記細胞培養部が、１以上の培地排出口を有する底部と、前記底部に略垂直に配置された側部とを備えた、細胞培養装置である。また、一実施形態において、筒型気相培養装置とは、細胞培養部材（好ましくは、該細胞培養部材を含む細胞培養モジュール）と、該細胞培養部材が収容された細胞培養部と、該細胞培養部の上部に配置された培地供給手段と、該細胞培養部の下部に配置された培地回収手段とを備える。ここで、前記培地回収手段が、前記細胞培養部を収容する外筒の一部である、細胞培養装置である。
【００２８】
（３）ミスト及びシャワー型培養装置
本発明の細胞培養モジュールは、図１２に示す、ミスト及びシャワー型培養装置において適用可能である。ミスト及びシャワー型培養装置とは、
細胞培養部材（好ましくは、該細胞培養部材を含む細胞培養モジュール）と、該細胞培養部材が載置された細胞培養部材載置部と、該細胞培養部材載置部が収容された筐体と、該筐体の内部に配置された液滴化培地供給部と、該液滴化培地供給部と連通した培地供給ラインと、該培地供給ラインに連通した培地貯留部と、該培地供給ラインの一部に設けられたポンプと、
を備え、ここで、前記細胞培養部材載置部が、スリット状又はメッシュ状の複数の培地排出口を備えた、細胞培養装置である。
【００２９】
（４）気相露出型回転培養装置
本発明の細胞培養モジュールは、図１３、図１４及び図１７に示す、気相露出型回転培養装置において適用可能である。気相露出型回転培養装置とは、
細胞培養部材（好ましくは、該細胞培養部材を含む細胞培養モジュール）と、該細胞培養部材を有する細胞培養部と、該細胞培養部を貫通した軸と、該軸を回転するための回転モータと、該細胞培養部の少なくとも一部を浸漬する培地槽と、を備え、
前記軸を中心として前記細胞培養部が回転し、前記細胞培養部材に担持された細胞が気相及び液相において交互に培養されることを特徴とする、細胞培養装置である。
【００３０】
３．不織布
本発明で使用される不織布は、不織布の重量に対して、１種又は複数種の芯鞘型複合繊維により構成される。相互融着させて不織布とさせる場合、芯鞘型複合繊維は不織布に対して２０重量％以上であることが好ましい。なお、芯鞘型複合繊維の含量は、３０重量％以上、４０重量％以上、又は５０重量％以上であってもよい。
【００３１】
芯鞘型複合繊維の芯部及び鞘部は、ポリオレフィン系重合体であることが好ましい。芯部及び鞘部を構成するポリオレフィン系重合体としては、炭素原子数が２〜１６の脂肪族α−モノオレフイン、例えば、エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル１−ブテン、１−ヘキセン、１−オクテン、１−ドデセン、１−オクタデセンのホモポリオレフィン又は共重合ポリオレフィンなどが挙げられる。脂肪族α−モノオレフインは、他のオレフィン及び、又は少量（重合体重量の約１０重量％まで）の他のエチレン系不飽和モノマー、例えばブタジエン、イソプレン、ペンタジエン−１，３、スチレン、α−メチルスチレンのような類似のエチレン系不飽和モノマーと共重合されてもよい。
【００３２】
芯部を構成する重合体と鞘部を構成する重合体の組合せとしては、鞘部の重合体の融点が芯部の重合体の融点よりも低くなるように組み合わせることが好ましい。例えば、上記の重合体から、融点差が２０〜５０℃であるものを選択する。後述するように、芯部を構成するポリエステル系重合体の融点よりも鞘部を構成するポリオレフィン系重合体の融点が、例えば、４０℃以上低いものを選択することがより好ましい。上記のような性質を有する芯鞘型複合繊維としては、限定されないが、鞘部の重合体がポリエチレンであり、芯部の重合体がポリプロピレンであるような組み合わせを有するものが挙げられる。
【００３３】
後述するような繊度、及び芯鞘複合比率を有する、本発明において使用される芯鞘型複合繊維は、一般的な芯鞘型複合繊維（不織布）を製造する方法を用いて製造することが可能である。典型的には、このような製造方法は、限定されないが、以下の工程を含んでもよい。
１）一軸押出機２台と複合紡糸用ノズルを備えた複合紡糸装置により、高融点成分（例えば、ポリプロピレン）：低融点成分（例えば、ポリエチレン）の質量比を所望の割合で、紡糸温度２８０℃で紡糸し、未延伸繊維を作製し；
２）未延伸繊維を集束し、加熱可能な延伸ローラーで延伸処理して、例えば、延伸倍率４倍以上で所望の単糸繊度となるように延伸繊維を作製し；
３）ロータリーカッターで所望の繊維長（例えば、数ｍｍ）である短繊維を作製し；及び
４）上記短繊維を用いて一般的な湿式製法又は乾式製法を用いて不織布を作製する。
【００３４】
上記工程４）の湿式製法では、より具体的には、短繊維を粘度調整剤を加えた水中に均一に分散させて、分散液を調製し、次に、この分散液をメッシュ上に抄紙し、湿ったウエブを作製後、得られた湿ったウエブを、ゴム製の２枚の加熱板間に挟み、汎用の加熱加圧機を用いて、温度１４０℃の条件で１分間プレスして乾燥させることにより、短繊維の低融点成分が溶融して短繊維間が接合し、不織布を得る事ができる。なお、本発明においては、例えば、限定されないが、宇部エクシモ株式会社製の複合繊維「エアリモ」を使用することができる。
【００３５】
不織布を構成する繊維同士は、熱融着部（本明細書中、「結着部」とも称する）を有することにより一体化して不織布として形態を保持している。熱融着部は、鞘成分の融点以上かつ芯成分の融点以下に加熱することにより形成されるものであるが、熱融着部においては、鞘成分は溶融又は軟化して接着に寄与するが、芯成分は熱の影響を完全に受けて溶融するのではなく、繊維形態を維持させて、不織布の引裂強力を向上に寄与する。したがって、このように熱融着部において、鞘成分は溶融又は軟化し、一方、芯成分は繊維形態を維持させるために、両者の融点に、例えば３０℃以上の差を設けることにより、熱融着加工の際に、芯成分を熱の影響を受けさせずに、かつ鞘成分を確実に溶融させて熱融着部で溶融固着により熱接着固定することができる。
【００３６】
不織布を構成する芯鞘型複合繊維の「繊度」は、繊維の太さを表すものとして一般的に使用され、繊維の１万メートルあたりの重量（ｇ）（すなわち、デシテックス（ｄＴｅｘ））として表される。本発明において使用される芯鞘型複合繊維の繊度は、細胞培養に適した繊度であればよく、限定されないが、０．０５〜２．２デシテックスであることが好ましい。
【００３７】
また、芯鞘複合比率（質量比）は、鞘部／芯部＝２０／８０〜５０／５０が好ましい。鞘部よりも芯部の比率を同等以上にすることにより、機械的物性に優れ、実用的な強度が維持できる。なお、芯部の比率が８０質量％を超えると、接着成分となる鞘部の比率が小さくなるため、熱融着部での接着強力が低下する傾向となるため、芯部の比率の上限は８０質量％が好ましい。
【００３８】
芯鞘型複合繊維の繊維径は、細胞培養に適した直径であればよく、複合繊維の繊度及び比重により決定されるが、例えば、１〜２０μｍであることが好ましい。より好ましくは２〜１０μｍ、さらに好ましくは３〜８μｍである。
【００３９】
不織布の目付は、１〜５０ｇ／ｍ２であればよく、例えば、３〜５０ｇ／ｍ２であることが好ましい。
【００４０】
本発明に使用される不織布は、芯鞘型複合繊維の繊度、鞘芯比率、及び／又は繊維径が異なる２種以上の芯鞘型複合繊維によって構成されてもよい。異なる繊度については、例えば、繊度が１〜２．２デシテックスの太繊度繊維と、繊度が０．０５〜０．５デシテックスの細繊度繊維とによって構成されてもよい。また、本発明においては、太繊度繊維と細繊度繊維の質量比は、太繊度繊維／細繊度繊維＝２０／８０〜８０／２０が好ましい。太繊度繊維と細繊度繊維は、不織布中に混繊状態で混在されてもよく、あるいは、一方の面に太繊度繊維が堆積してなるウエブとし、他方の面に細繊度繊維が堆積してなるウエブとする積層状態により両者が存在しているものであってもよい。
【００４１】
上記の通り、不織布を構成する繊維同士は、熱融着部により熱接着固定され一体化している。熱融着部では、芯鞘型複合繊維の鞘成分が溶融固化して接着成分として機能している熱接着部を形成している。また、熱融着部を形成する方法として、熱エンボス加工あるいは超音波融着加工によって散点状の多数の熱圧着部を形成することもできる。個々の熱圧着部の形状は円形、楕円形、菱形、三角形、織目形、井形、格子形など任意の形状であってよい。なお、不織布の柔軟性や細胞の足場形成を考慮して、散点状に存在していることが好ましい。個々の熱圧着部の面積は０．２〜３ｍｍ２程度が好ましい。また、不織布の面積に対する熱圧着部の面積比率は、１０％以上３０％以下であることが好ましい。１０％未満では、本発明の目的である優れた機械物性と剛性を両立し難い。
【００４２】
本願発明において使用される不織布は、親水化処理された不織布であってもよい。不織布の親水化は、限定されないが、フッ素ガス処理、常圧プラズマ処理、真空プラズマ処理、コロナ処理、親水性単量体のグラフト重合処理、スルホン化処理、又は界面活性剤付与処理によって施すことができ、フッ素ガス処理、常圧プラズマ処理が好ましい。
【００４３】
本発明で使用される不織布の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。
【００４４】
本発明において用いられる不織布は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、ガス滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
【００４５】
４．ポリマー多孔質膜
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１〜１５０μｍ、０．０１〜１００μｍ、０．０１〜５０μｍ、０．０１μｍ〜４０μｍ、０．０１μｍ〜３０μｍ、０．０１μｍ〜２５μｍ、０．０１μｍ〜２０μｍ、又は０．０１μｍ〜１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ〜２５μｍである。
【００４６】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ〜１００μｍ、２５μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜１００μｍ、３５μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、又は６０μｍ〜１００μｍであり、好ましくは、３０μｍ〜１００μｍである。
【００４７】
本明細書において、ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は面積平均孔径である。面積平均孔径は、以下の（１）及び（２）に従って求めることができる。なお、ポリマー多孔質膜表面以外の部位の平均孔径も同様にして求めることができる。
（１）多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真から、２００点以上の開孔部について孔面積Ｓを測定し、該孔面積を真円と仮定して式Ｉからそれぞれの孔径ｄを求める。
【数１】
2019126341.tif 000003
（２）上記式Ｉによって求められた全ての孔径を以下の式ＩＩに適用し、孔の形状が真円であるとした際の面積平均孔径ｄａを求める。
【数２】
2019126341.tif 000004
【００４８】
表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０１〜２０μｍである。
【００４９】
ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０〜５００μｍであり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは、０．０１〜２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。
【００５０】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜表面の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。
【００５１】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
【００５２】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。
【００５３】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式ＩＩＩに従って求めることができる。
【数３】
2019126341.tif 000005
（式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは総膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
【００５４】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜２５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。
【００５５】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
【００５６】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド多孔質膜、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である。
【００５７】
＜ポリイミド多孔質膜＞
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
【００５８】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。
【００５９】
一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００６０】
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
【００６１】
ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。
【００６２】
ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。
【００６３】
本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
【００６４】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。
【００６５】
着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。
【００６６】
炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。
【００６７】
また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００６８】
着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。
【００６９】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００７０】
これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
【００７１】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
【００７２】
これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
【００７３】
これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
【００７４】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
【００７５】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
【００７６】
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜２５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。
【００７７】
例えば、国際公開第２０１０／０３８８７３号、特開２０１１−２１９５８５号公報、又は特開２０１１−２１９５８６号公報に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。
【００７８】
＜ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜＞
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
【００７９】
アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。
【００８０】
二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’−ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。
【００８１】
ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。
【００８２】
ポリエーテルスルホンの対数粘度は、多孔質ポリエーテルスルホン膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。
【００８３】
また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。
【００８４】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
対数粘度０．５〜１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％〜６０質量％と有機極性溶媒４０質量％〜９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、もしくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
【００８５】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ〜５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ〜５００μｍであり、かつ空孔率が５０％〜９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。
【００８６】
５．細胞培養モジュールを用いた細胞培養方法
本発明の一態様は、
（１）懸濁された細胞を含む第１培地に、細胞培養モジュールに適用する工程、
（２）細胞培養可能な温度に維持し、前記細胞培養モジュールへ前記細胞を吸着させる工程、及び、
（３）前記細胞を吸着させた前記細胞培養モジュールを、培養容器中で、第２培地にて培養する工程、
を含み、
ここで、細胞培養モジュールが、
親水化処理された不織布及びポリマー多孔質膜を含む細胞培養部材と、
２以上の培地流出入口を有し、該細胞培養部材が収容されたケーシングと
を備えた細胞培養モジュールであって、ここで、
前記不織布は、２０％重量以上の芯鞘型複合繊維により構成される不織布であって、
不織布の目付は、１〜５０ｇ／ｍ２であり、
芯鞘型複合繊維の芯部及び鞘部はポリオレフィン系重合体からなり、鞘部の重合体の融点は芯部の重合体の融点よりも低く、及び鞘芯比率は９０：１０〜１０：９０であり、
不織布は、細孔を有する
；そして
前記ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、
表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、
マクロボイド層は、表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、該隔壁並びに表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
表面層Ａ及びＢにおける孔は、該マクロボイドに連通し；
ここで、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立した前記細胞培養部材は、集約されて、
（ｉｉ）細胞培養部材は、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）細胞培養部材は、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）細胞培養部材は、縄状に結ばれて、
収容されていて、
ここで、前記第２培地が、界面活性剤を含まない、細胞の培養方法に関する。本発明の細胞の培養方法を、以下で、「本発明の細胞の培養方法」とも呼ぶ。
【００８７】
本発明に利用し得る細胞の種類は、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。動物細胞は、脊椎動物門に属する動物由来の細胞と無脊椎動物（脊椎動物門に属する動物以外の動物）由来の細胞とに大別される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。
【００８８】
本発明に利用しうる動物細胞の種類は、限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及び生殖細胞からなる群から選択される。
【００８９】
本明細書において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開第２００９／１２３３４９号（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
【００９０】
「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。
【００９１】
「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。
【００９２】
「生殖細胞」は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞を意味する。例えば、有性生殖のための配偶子、即ち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子などを含む。
【００９３】
細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択してもよい。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌で、軟部肉腫、悪性骨腫瘍などを含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」とは、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ−６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）、ＢＨＫ細胞（新生児ハムスター腎臓細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児線維芽細胞由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する細胞株が存在する。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。
【００９４】
本明細書において、「接着細胞」とは、一般に、増殖のために適切な表面に自身を接着させる必要がある細胞であって、付着細胞又は足場依存性細胞ともいわれる。本発明のいくつかの実施形態では、使用する細胞は接着細胞である。本発明に用いられる細胞は、接着細胞であって、より好ましくは、培地中に懸濁した状態でも培養可能な細胞である。懸濁培養可能な接着細胞とは、公知の方法によって、接着細胞を懸濁培養に適した状態へ馴化させることによって得ることが可能であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などや、これらの細胞から派生して得られた細胞株が挙げられる。ここに挙げられないものであっても、本発明に用いられる細胞は、接着細胞であって、馴化によって懸濁培養可能な細胞であれば、特に限定されない。
【００９５】
細胞培養部材を構成するポリマー多孔質膜による細胞培養のモデル図を図７に示す。図７は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の細胞の培養方法では、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の細胞の培養方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の細胞を培養することが可能となる。例えば、ポリマー多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の細胞を長期にわたって培養することができる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。
【００９６】
本明細書において、細胞を含まないポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図７参照）。そして、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、ポリマー多孔質膜の表面及び内部に細胞が担持された状態において、ポリマー多孔質膜、細胞、及びポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図７参照）。膜厚２５μｍのポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。１つの細胞培養容器中に複数のポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、細胞を担持した複数のポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。
【００９７】
本発明の方法を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含む細胞培養部材体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含む細胞培養部材体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含む細胞培養部材体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含む細胞培養部材体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。
【００９８】
つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する細胞の数を増やしたい場合は、積層する細胞培養部材の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられる細胞培養部材を備えた細胞培養装置であれば、細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。
【００９９】
本発明の細胞の培養方法における細胞の大量培養とは、例えば、細胞培養部材を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数が、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、５．０×１０8個以上、１．０×１０9個以上、２．０×１０9個以上、又は５．０×１０9個以上となるまで培養することをいう。
【０１００】
なお、培養中又は培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。例えば、細胞培養部材を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数を、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。例えばＣＣＫ８（次文参照）を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ  Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、細胞培養部材を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、細胞を適用し、培養した細胞培養部材を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１〜３時間インキュベーター内で保存し、上清を抜き出して４８０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。
【０１０１】
また、別の観点からは、細胞の大量培養とは、例えば、細胞培養部材を用いた培養後に不織布及び／又はポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０５個以上、２．０×１０５個以上、１．０×１０６個以上、２．０×１０６個以上、５．０×１０６個以上、１．０×１０７個以上、２．０×１０７個以上、５．０×１０７個以上、１．０×１０８個以上、２．０×１０８個以上、又は５．０×１０８個以上となるまで培養することをいう。不織布及び／又はポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、セルカウンター等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。
【０１０２】
本明細書において、「懸濁された細胞」とは、例えば、トリプシン等のタンパク質分解酵素によって、接着細胞を強制的に浮遊させて培地中に懸濁して得られた細胞や、上述の馴化工程によって培地中に浮遊培養可能となった細胞などを含んでいる。
【０１０３】
本明細書において、「培地」とは、細胞、特に動物細胞を培養するための細胞培養培地のことを指す。培地は、細胞培養液と同義の意味として用いられる。そのため、本発明において用いられる培地とは、液体培地のことを指す。培地の種類は、通常使用される培地を使用することが可能であり、培養する細胞の種類によって適宜決定される。
【０１０４】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（１）で用いられる第１培地は、細胞を培養できる培地であれば特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞を培養する場合であれば、ＪＸエネルギー製ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａを用いることができる。
【０１０５】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（２）の細胞培養可能な温度とは、細胞が細胞培養モジュールに吸着可能な温度であればよく、１０℃〜４５℃、好ましくは、１５℃〜４２℃、より好ましくは２０℃〜４０℃、さらに好ましくは２５℃〜３９℃である。また、本発明の細胞の培養方法において、該工程（２）の細胞を吸着させる時間は、例えば、５分〜２４時間、好ましくは１０分〜１２時間、より好ましくは１５分〜５００分である。
【０１０６】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（２）は、振盪及び／又は攪拌しながら、該細胞培養モジュールの該細胞培養部材へ細胞を吸着させてもよく、静置して該細胞培養モジュールの該細胞培養部材へ細胞を吸着させてもよい。振盪する方法は特に限定されないが、例えば、市販の振盪装置上に、本発明の細胞培養モジュールと細胞とを含む培養容器を載置し、振盪してもよい。振盪は、継続的又は断続的に行ってもよく、例えば、振盪と静置を交互に繰り返してもよく、適宜調整すればよい。攪拌する方法は特に限定されないが、例えば、本発明の細胞培養モジュールと細胞とを市販のスピナーフラスコ内に入れ、スターラーを回転させることで攪拌してもよい。攪拌は、継続的又は断続的に行ってもよく、例えば、攪拌と静置を交互に繰り返してもよく、適宜調整すればよい。
【０１０７】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（３）で用いられる第２培地は、接着細胞の培養に用いられる培地が選択され、例えば、Ｄ−ＭＥＭ、Ｅ−ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２などを用いることができるが、これに限定されない。第２培地は、細胞が基材へ接着するのを阻害する成分、例えば、界面活性剤が含まれない培地が好ましい。使用される第２培地は、細胞の種類によって適宜選択される。該工程（３）において、第２培地で培養することで、該工程（２）で細胞培養部材に吸着された細胞が、該細胞培養部材内に接着することを促進する。これによって、細胞が該細胞培養部材から脱落することなく安定的に培養可能である。また、本発明の細胞の培養方法は、前述の細胞培養部材を備えた細胞培養モジュールを使用する。本発明の細胞の培養方法で用いられる細胞培養モジュールは、細胞培養部材がケーシングに収容されていることによって、膜状の細胞培養部材がケーシング内で継続的に形態が変形することが防止されている。これによって、細胞培養部材内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の細胞を培養することが可能となる。
【０１０８】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（３）は、細胞を培養する培養装置及びシステム等であれば、市販のものを適用することが可能である。例えば、培養容器が可撓性バッグ型培養容器であってもよく、また、攪拌型培養容器、例えばスピナーフラスコ等の培養容器で培養することも可能である。その他、培養容器としては、開放容器にも適用可能であり、閉鎖容器にも適用可能である。例えば、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ  セルファクトリー等が含まれる。また、上記の細胞の培養方法において、細胞培養モジュールを用いることにより、生来、浮遊培養に適さない接着性の細胞であっても、細胞培養モジュールを用いることにより、細胞培養モジュールに吸着させた状態では細胞培養培地中に浮遊した状態でさせながら培養することが可能であるとなる。浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコや回転培養等が使用可能である。また、該工程（３）は、本明細書に記載の細胞培養装置で実施してもよい。
【０１０９】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（３）は、該細胞培養モジュールを含む培養容器に連続的に培地を添加し回収するような連続循環型の装置を用いて実行することも可能である。
【０１１０】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（３）は、該細胞培養モジュールを含む培養容器の外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系であってもよい。その際、細胞培養培地が細胞培養培地供給手段と細胞培養容器との間を循環する系とすることができる。
【０１１１】
６．懸濁された細胞の除去方法
本発明の一態様は、
（１）懸濁された細胞を含む第１培地に、細胞培養部材を適用する工程、
（２）細胞培養可能な温度に維持し、前記細胞培養部材へ前記細胞を吸着させる工程、
を含む、懸濁された細胞の除去方法に関する。本発明の細胞の除去方法を、以下で、「本発明の細胞の除去方法」とも呼ぶ。
【０１１２】
本発明の細胞の除去方法において使用される細胞培養部材は、前述の細胞培養部材を使用することができる。該細胞培養部材は、前述の細胞培養モジュールであってもよく、ケーシングに収容されていない細胞培養部材であってもよい。
【０１１３】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（１）で用いられる第１培地は、細胞を培養できる培地であれば特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞を培養する場合であれば、ＪＸエネルギー製ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａを用いることができる。
【０１１４】
本発明の細胞の除去方法において、該工程（２）の細胞培養可能な温度とは、細胞が細胞培養モジュールに吸着可能な温度であればよく、１０℃〜４５℃、好ましくは、１５℃〜４２℃、より好ましくは２０℃〜４０℃、さらに好ましくは２５℃〜３９℃である。また、本発明の細胞の培養方法において、該工程（２）の細胞を吸着させる時間は、例えば、５分〜２４時間、好ましくは１０分〜１２時間、より好ましくは１５分〜５００分である。
【０１１５】
本発明の細胞の除去方法において、該工程（２）は、振盪及び／又は攪拌しながら、該細胞培養モジュールの該不織布及びポリマー多孔質膜へ細胞を吸着させてもよく、静置して該細胞培養モジュールの該不織布及びポリマー多孔質膜へ細胞を吸着させてもよい。振盪する方法は特に限定されないが、例えば、市販の振盪装置上に、本発明の細胞培養モジュールと細胞とを含む培養容器を載置し、振盪してもよい。振盪は、継続的又は断続的に行ってもよく、例えば、振盪と静置を交互に繰り返してもよく、適宜調整すればよい。攪拌する方法は特に限定されないが、例えば、本発明の細胞培養モジュールと細胞とを市販のスピナーフラスコ内に入れ、スターラーを回転させることで攪拌してもよい。攪拌は、継続的又は断続的に行ってもよく、例えば、攪拌と静置を交互に繰り返してもよく、適宜調整すればよい。
【０１１６】
本発明の細胞の除去方法によって、従来は、細胞を含む培地から細胞を除去するためには、遠心分離処理やフィルターによる処理を行うなどの操作が必要であった。本発明の方法によれば、フィルター等を用いることなく、培地から細胞を除去可能することが可能となる。
【実施例】
【０１１７】
以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１１８】
以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は面積平均細孔径１９μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４２μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７４％であった。
また、実施例に使用された不織布は、宇部エクシモ社製原綿を用いて以下表１に示す構成で不織布を作製し、更に、処理等を行った。
【表１】
2019126341.tif 000006
【０１１９】
実施例１：細胞培養モジュールを用いるシャーレ型旋回バイオリアクター実験結果
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が３．２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、（総細胞数３．４０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率９６％）になるまで培養を継続した。図２１に示す様な組み合わせで培養モジュール（２タイプ）を３種の不織布に対して合計６種用意し、希釈したミルトン、超純水、７０％エタノール含有水にて洗浄した後、滅菌的に乾燥し、準備を完了した。各実験の構成を表２に示す。尚、各モジュールで使用した不織布及びポリイミド多孔質膜のサイズは、１．０×１．０ｃｍである。
【０１２０】
【表２】
2019126341.tif 000007
【０１２１】
直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシュに、表２の滅菌済６種モジュールを滅菌的に各４個ずつ入れ、そこにコージンバイオ株式会社製ＣＨＯ細胞単層培養用培地ＫＢＭ２７０を８ｍｌと浮遊細胞用培地ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ３ｍｌの混合液を添加してＣＯ２インキュベーター内でケニス社製プログラムシェーカーを用いて３５ｒｐｍの振盪速度で５分間浸漬させた。振盪停止後、ＣＨＯ  ＤＰ−１２浮遊細胞培養液（総細胞数３．４０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞数３．２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死細胞数１．３０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率９６％）１．０ｍｌｍｌを添加し、手で緩やかに攪拌後ケニス社製プログラムシェーカーを用いて３５ｒｐｍの振盪速度で、約１９時間ＣＯ２インキュベーター内で細胞を吸着させた。ディッシュ内の培地を廃して、回収された培地内の細胞数を測定し、細胞吸着率を計算した。全ての実験で、生細胞は観察されず、吸着率は１００％であった。
【０１２２】
空になったシャーレに、コージンバイオ株式会社製ＣＨＯ細胞単層培養用培地ＫＢＭ２７０を１２ｍｌ添加し、プログラムシェーカーを３５ｒｐｍの振盪速度で運転して培養を開始した。培地交換は毎日行い（旧培地をサンプリング後廃棄し、新規培地１２ｍｌを添加）、培地中の一日当たりのグルコール消費量、乳酸産生量、乳酸脱水素酵素量および抗体の産生量をロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃｅｄｅｘ  Ｂｉｏを用いて測定した。モジュールのタイプ及び不織布の種類に依存して、経時的にグルコースが消費され、抗体及び乳酸が持続的に産生される事を見出した。産生された抗体量を表３に示す。好ましい組み合わせに於いては、好適に連続的な抗体産生が達成される事を見出した。
【０１２３】
【表３】
2019126341.tif 000008
【０１２４】
実施例２：細胞培養モジュールを用いる小型バッグバイオリアクター実験結果
実施例１と同様に、抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が３．２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、（総細胞数３．４０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率９６％）になるまで培養を継続した。図２１に示す様な組み合わせで培養モジュール（２タイプ）を３種の不織布に対して、表２に示されたモジュール形態の内、Ａ−２を除く合計５種のモジュールを用意し、希釈したミルトン、超純水、７０％エタノール含有水にて洗浄した後、滅菌的に乾燥し、準備を完了した。尚、各モジュールで使用した不織布及びポリイミド多孔質膜のサイズは、１．０×１．０ｃｍである。
【０１２５】
ニプロ製ガス透過型カルチャーバッグ（Ａ３５０−ＮＬ）を図２２に示す点線に沿って滅菌的に切断し、チューブ状のバッグを作成して滅菌済各種モジュール４個を加え、シーラーを用いて滅菌的に融着させる事で、バッグ型バイオリアクターを作成した。コージンバイオ株式会社製ＣＨＯ細胞単層培養用培地ＫＢＭ２７０を８ｍｌと浮遊細胞用培地ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ３ｍｌの混合液をバッグ内に添加してＣＯ２インキュベーター内でロッキングミキサーを用いて５分間浸漬させた。ミキサーを停止後、ＣＨＯ  ＤＰ−１２浮遊細胞培養液（総細胞数３．４０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞数３．２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死細胞数１．３０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率９６％）１．０ｍｌｍｌを添加し、手で緩やかに攪拌後ロッキングミキサーを用いて、約１９時間、ＣＯ２インキュベーター内で細胞を吸着させた。吸着工程終了後、バッグ内の細胞液を回収し、培地内の細胞数を測定して細胞吸着率を計算した。回収細胞数から計算した細胞吸着率を表４に示す。
【０１２６】
【表４】
2019126341.tif 000009
【０１２７】
空になったバッグに、コージンバイオ株式会社製ＣＨＯ細胞単層培養用培地ＫＢＭ２７０を１２ｍｌ添加し、ロッキングミキサーでバッグを振盪して培養を開始した。培地交換は毎日行い（旧培地をサンプリング後廃棄し、新規培地１２ｍｌを添加）、培地中の一日当たりのグルコール消費量、乳酸産生量、乳酸脱水素酵素量および抗体の産生量をロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃｅｄｅｘ  Ｂｉｏを用いて測定した。モジュールのタイプ及び不織布の種類に依存して、経時的にグルコースが消費され、抗体及び乳酸が持続的に産生される事を見出した。産生された抗体量を表５に示す。好ましい組み合わせに於いては、好適に連続的な抗体産生が達成される事を見出した。
【０１２８】
【表５】
2019126341.tif 000010
【図１】
2019126341.tif 000011
【図２】
2019126341.tif 000012
【図３】
2019126341.tif 000013
【図４】
2019126341.tif 000014
【図５】
2019126341.tif 000015
【図６】
2019126341.tif 000016
【図７】
2019126341.tif 000017
【図８】
2019126341.tif 000018
【図９】
2019126341.tif 000019
【図１０】
2019126341.tif 000020
【図１１】
2019126341.tif 000021
【図１２】
2019126341.tif 000022
【図１３】
2019126341.tif 000023
【図１４】
2019126341.tif 000024
【図１５】
2019126341.tif 000025
【図１６】
2019126341.tif 000026
【図１７】
2019126341.tif 000027
【図１８】
2019126341.tif 000028
【図１９】
2019126341.tif 000029
【図２０】
2019126341.tif 000030
【図２１】
2019126341.tif 000031
【図２２】
2019126341.tif 000032