(57)【要約】      （修正有）【課題】ＬＰＯ  Ｏ２５ｂ保有株により引き起こされる大腸菌感染症の予防または治療に使用するための、改良された特異性を備えた、大腸菌ＭＤＲ株を指向する抗体の提供。【解決手段】多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌(E. coli)株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する単離された抗体、医療および診断におけるそれの使用、その抗体の調製方法を提供する。さらに、抗体の調製に使用する単離されたヌクレオチド配列、プラスミドおよび宿主細胞；ならびにさらに、特異的抗体により認識される単離されたエピトープを含む。【選択図】図６
2019068841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌(E. coli)株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する、単離され
た抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ抗原に共通のエピトープを交差特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
大腸菌のＯ２５ａ抗原に対比してＯ２５ｂ抗原に優先的に結合するか、あるいは両抗原に対して少なくとも同等のアフィニティーで結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
全長モノクローナル抗体の結合部位を有し、または結合部位を含んだ少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメントを有し、好ましくはＯ２５ｂ抗原を１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満のＫｄで結合するアフィニティーを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体と同じエピトープを結合し、好ましくは８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体と同じ結合部位を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌(E. coli)株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する単離された
モノクローナル抗体であって、抗体８Ｄ５−１Ｇ１０の抗原結合部位を含むか、または抗体８Ｄ５−１Ｇ１０であるかもしくはそれに由来し、または抗体８Ｄ５−１Ｇ１０の機能活性バリアントであり、好ましくは抗体８Ｄ５−１Ｇ１０が
ａ）ＤＳＭ  ２６７６３で寄託された宿主細胞により産生される抗体軽鎖の可変領域；および／または
ｂ）ＤＳＭ  ２６７６２で寄託された宿主細胞により産生される抗体重鎖の可変領域；あるいは
ｃ）（ａ）および／または（ｂ）の機能活性バリアントである可変領域
によって特徴付けられる、前記抗体。
【請求項８】
多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌(E. coli)株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する単離された
モノクローナル抗体であって、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ抗原に共通のエピトープを交差特異的に結合し、抗体８Ｄ１０−Ｃ８の抗原結合部位を含むか、または抗体８Ｄ１０−Ｃ８であるかもしくはそれに由来し、または抗体８Ｄ１０−Ｃ８の機能活性バリアントであり、好ましくは抗体８Ｄ１０−Ｃ８が
ａ）ＤＳＭ  ２８１７１で寄託された宿主細胞により産生される抗体軽鎖の可変領域；および／または
ｂ）ＤＳＭ  ２８１７２で寄託された宿主細胞により産生される抗体重鎖の可変領域；あるいは
ｃ）（ａ）および／または（ｂ）の機能活性バリアントを使用すること
によって特徴付けられる、前記抗体。
【請求項９】
下記のヌクレオチド配列を含むプラスミド：
Ａ
−ＤＳＭ  ２６７６３で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ５−１Ｇ１０−ＬＣと命名された抗体軽鎖の可変領域をコードする配列；および／または
−ＤＳＭ  ２６７６２で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ５−１Ｇ１０−ＨＣと命名された抗体重鎖の可変領域をコードする配列；
あるいは
Ｂ
−ＤＳＭ  ２８１７１で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ１０−Ｃ８−ＬＣと命名された抗体軽鎖の可変領域をコードする配列；および／または
−ＤＳＭ  ２８１７２で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ１０−Ｃ８−ＨＣと命名された抗体重鎖の可変領域をコードする配列。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体の軽鎖および／または重鎖を発現するコード配列を含む発現カセットであって、その発現カセットまたはコード配列が請求項９に記載のプラスミドに由来する、発現カセット。
【請求項１１】
請求項９に記載のプラスミドまたは請求項１０に記載の発現カセットを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体を調製する方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞を、その抗体を産生する条件下で培養または維持する方法。
【請求項１３】
候補抗体を同定する方法であって、
（ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
（ｂ）試料中の抗体、または試料により産生される抗体と、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体により認識されるエピトープとの結合を査定し、その際、抗体とエピトープの間の陽性反応によりその抗体を候補抗体と同定する
ことを含む方法。
【請求項１４】
候補抗体を同定する方法であって、
（ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
（ｂ）試料中の抗体、または試料により産生される抗体と、ＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株のＯ２５ｂ抗原および非ＭＤＲ大腸菌(E. coli)株のＯ２５ａ抗原との結合を査定し
、その際、Ｏ２５ａ抗原と対比して抗体とＯ２５ｂ抗原の間の特異的な陽性反応によりその抗体を候補抗体と同定する
ことを含む方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体を調製する方法であって、
（ａ）請求項１３または１４に従って同定した候補抗体を用意し；そして
（ｂ）候補抗体のモノクローナル抗体、またはヒト化形もしくはヒト形、またはその誘導体であって候補抗体と同じエピトープ結合特異性を備えたものを調製する
ことを含む方法。
【請求項１６】
ＭＤＲ大腸菌(E. coli)感染のリスクをもつ対象またはそれに罹患している対象を処置
する際の、対象における感染の制限またはその感染から生じる病的状態の改善に有効な量の抗体を対象に投与することを含む使用のための、好ましくは腎盂腎炎、続発性菌血症、敗血症、腹膜炎、髄膜炎、および人工呼吸器関連肺炎の治療または予防のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
好ましくは非経口または粘膜用の配合物を含む、場合により医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体の医薬製剤。
【請求項１８】
対象において、ＬＰＳ  Ｏ２５ｂを発現するＭＤＲ株により起きる大腸菌感染症である
、膀胱炎または尿道炎、上行性または血行性腎盂腎炎を含めた上部および下部尿路感染症を伴なう感染症、特に糖尿病患者におけるもの、ならびに菌血症、敗血症、腹膜炎または腸定着を伴なう感染症を判定する診断に使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
場合により、標識付きの抗体、および／または標識付きのさらなる診断試薬、および／または抗体と診断試薬のうち少なくとも１つを固定化するための固相を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体の診断用製剤。
【請求項２０】
８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体により認識される単離されたエピトープ。
【請求項２１】
下記のものを含む免疫原：
（ａ）請求項２０に記載のエピトープ；
（ｂ）場合により、（ａ）のエピトープと自然界での関連性がないさらなるエピトープ；および
（ｃ）キャリヤー。
【請求項２２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体または請求項２０に記載のエピトープをコードする、単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌(E. coli)株のＬＰＯ  Ｏ２５ｂ抗原に特異的に
結合する抗体に関連する。
【背景技術】
【０００２】
リポ多糖（ＬＰＳ）は、腸内細菌系病原体の表面に最も多く存在する抗原である。一般に、ＬＰＳは３つの構造部分をもつ：ｉ）リピドＡ（内毒素としても知られる）、ｉｉ）コアオリゴ糖、およびｉｉｉ）Ｏ抗原。後者は３〜６個の糖（血清型に依存する）の反復サブユニットから構成される。リピドＡおよびコアＯＳは１つの単一腸内細菌種において比較的良好に保存されているが、抗体に対するそれらのアクセス性は限られている。他方で、Ｏ抗原はアクセス性が高いが、それらの構造に関してはきわめて多様である（大腸菌には約１８０の異なるＯ−タイプがある）。
【０００３】
Ｏ抗原に対する抗体は大腸菌の表面に結合できるので、それらは診断薬に利用され（たとえば、疫学研究のためのＯ−タイピング）、また療法手段としても提唱されている。それにもかかわらず、広大な構造多様性があるため、Ｏ抗原特異的抗体による広域防御は困難である。
【０００４】
大腸菌により起きる腸外感染症は一般的であり、著しい罹病率および死亡率を生じる。最近出現した多剤耐性（ＭＤＲ）株の大腸菌は著しい割合の大腸菌感染症を引き起こしている。
【０００５】
これらのＭＤＲ株は大部分のクラスの臨床関連抗生物質に対する耐性を進化させたので、それらに対する治療選択肢は著しく制限されつつある。したがって、代替となる処置選択肢、たとえばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）による受動免疫化は、将来のための大きな有望性をもつ。
【０００６】
この数年に、すべての腸外大腸菌感染症の約１０％およびＭＤＲ大腸菌感染症のほぼ半分を引き起こしてる十分に解明されたＭＤＲ大腸菌のクローン系列、ＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４が出現した(Peirano et al. Int J Antimicrob Agents 2010 Apr; 35(4): 316-21; Rogers et al. J Antimicrob Chemother 2011 Jan; 66(1): 1-14; Woodford et al. FEMS Microbiol Rev 2011 Sep; 35(5): 736-55.)。この系列に属する株は限られた不均一
性を示すので、抗原性レパトアに関してきわめて類似すると考えることができる。このクラスターに属する株の大部分はＯ２５ｂ抗原を発現するので、この抗原を合成する酵素をコードする特異的遺伝子（ＬＰＳ合成遺伝子座内の）がこのクローンの同定に用いられる(Clermont et al. J Antimicrob Chemother 2008 May; 61(5): 1024-8.)。あるいは、遺
伝子の相異により示唆されるようにこの系列のＯ抗原は古典的なＯ２５抗原と異なる（したがって、それはＯ２５ｂと命名された）にもかかわらず、Ｏ２５タイピング血清による凝集を利用できる。しかし、Ｏ２５タイピング血清は非ＭＤＲ  Ｏ２５クローンとＭＤＲ
Ｏ２５ｂクローンを識別できない。
【０００７】
Rogers et al. (J Antimicrob Chemother 2011 Jan; 66(1): 1-14)は、大腸菌Ｏ２５ｂ−ＳＴ１３１株の３つの主要な特徴、すなわちそれの血清グループ（Ｏ２５ｂ）、それの系統発生グループ（Ｂ２）およびそれのＳＴ（ＳＴ１３１）による検出を記載している。検出を補助するためにこれらの特徴がそれぞれ開示されている。多様な分子手法が記載されている：すなわち、ＭＬＳＴ、ＰＣＲベースの迅速検出法、反復配列ＰＣＲおよびＰＦＧＥ。種々の免疫グロブリンを含むポリクローナル抗血清（Ｏ２５ａ株に対して産生され
たもの）がＯ２５抗原を決定するために用いられており、それはサブタイプを識別しない。
【０００８】
Jadhav et al. (PLOS ONE 2011; 6(3): e18063)は、Ｂ２−Ｏ２５ｂ−ＳＴ１３１−Ｃ
ＴＸ−Ｍ−１５ビルレント／多剤耐性タイプに関連するＯ２５ｂサブグループについて陽性であった株のビルレンス特性および遺伝子アフィニティーを記載している。ヒトの臨床分離株を分析して血清型に分類し、ビルレンスマーカープロフィールを求めた。Ｏ２５陽性株は、Ｏ抗原であるＯ１〜Ｏ１７３に対するポリクローナル抗血清を用いる血清型判定により同定された。Ｏ２５陽性株についてさらに、ｒｆｂＯ２５ｂサブグループ遺伝子座をターゲティングする対立遺伝子特異的ＰＣＲによる遺伝子タイピングが行なわれた。
【０００９】
Mora et al. (Int. J. Antimicrobial Agents 2011; 37(1): 16-21)は、ＣＴＸ−Ｍ−
１４を産生する大腸菌臨床分離株内におけるあるクローングループの出現を記載しており、それにＯ２５ｂ：Ｈ４−Ｂ２−ＳＴ１３１が含まれる。Ｏタイピングは特異的なＯ抗血清（ポリクローナル）を用いて行なわれた。
【００１０】
Clermont et al. (J Antimicrob Chemother 2008 May; 61(5): 1024-8)は、Ｏ２５ｂ  ＳＴ１３１大腸菌に特異的な対立遺伝子特異的ｐａｂＢ  ＰＣＲアッセイを開示している。
【００１１】
Szijarto et al, (FEMS Microbiol Lett 2012; 332: 131-6)は、ＬＰＳ分子のコア構造に基づく大腸菌分離株の分子タイピングを記載している。分離株のコアタイプは、コアオペロンの遺伝子をターゲティングする、それぞれＲ１−４およびＫ−１２コアタイプに特異的なプライマーを用いるＰＣＲにより決定された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Peirano et al. Int J Antimicrob Agents 2010 Apr; 35(4): 316-21
【非特許文献２】Rogers et al. J Antimicrob Chemother 2011 Jan; 66(1): 1-14
【非特許文献３】Woodford et al. FEMS Microbiol Rev 2011 Sep; 35(5): 736-55
【非特許文献４】Clermont et al. J Antimicrob Chemother 2008 May; 61(5): 1024-8
【非特許文献５】Jadhav et al. (PLOS ONE 2011; 6(3): e18063)
【非特許文献６】Mora et al. (Int. J. Antimicrobial Agents 2011; 37(1): 16-21)
【非特許文献７】Szijarto et al, (FEMS Microbiol Lett 2012; 332: 131-6)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、ＬＰＯ  Ｏ２５ｂ保有株により引き起こされる大腸菌感染症の予防または治療に使用するための、改良された特異性を備えた、大腸菌ＭＤＲ株を指向する抗体を提供することである。さらに本発明の目的は、ＭＤＲ大腸菌を迅速に信頼性をもって診断できる手段および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的は、本発明の主題により解決される。
【００１５】
本発明によれば、多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する単離された抗体が提供される。
【００１６】
具体的には、抗体はモノクローナル抗体である。
【００１７】
具体的には、抗体はＯ２５ｂ抗原のみを特異的に結合し、あるいはＯ２５ａ抗原とＯ２５ｂ抗原に共通のエピトープを交差特異的に結合する。
【００１８】
具体的観点によれば、抗体はＯ２５ｂ抗原およびＯ２５またはＯ２５ａ抗原を交差特異的に、たとえば同等の、同等より大きい、類似の、または異なるアフィニティーで結合する。
【００１９】
具体的には、本発明の抗体は大腸菌のＯ２５ａ抗原と対比してＯ２５ｂ抗原に優先的に結合するか、あるいは両抗原に対して少なくとも同等のアフィニティーで結合する。
【００２０】
具体的態様によれば、抗体はＯ２５ａ抗原と比較してＯ２５ｂ抗原の結合について少なくとも２倍大きなアフィニティーをもつ；具体的には、Ｏ２５ｂまたはＯ２５ａのいずれかの抗原の結合において少なくとも２倍、または少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍の差、または少なくとも１０倍もの差、たとえばアフィニティー（親和性）および／またはアビディティー（結合活性）の差をもつ。
【００２１】
具体的観点によれば、Ｏ２５ｂへの特異的結合は、イムノアッセイ、好ましくはイムノブロット法、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫学的方法により判定して、Ｏ２５ｂ抗原の結合について、Ｏ２５またはＯ２５ａ大腸菌株に対して産生されたポリクローナル血清によるＯ２５ｂ抗原の結合と比較してより大きなアフィニティーを特徴とする。このより高い結合アフィニティーは、具体的には少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍の差、または少なくとも１０倍もの差をもつ。
【００２２】
具体的には、本発明の抗体がターゲティングするＯ２５ｂ抗原はＳＴ１３１株のうち１種類以上に広く存在し、より具体的には大部分に存在する。
【００２３】
具体的には、抗体により認識されるエピトープは莢膜保有および無莢膜ＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株、たとえば変異株の表面に存在する。
【００２４】
さらなる具体的観点によれば、抗体は全長モノクローナル抗体の結合部位をもち、または結合部位を含んだ少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメントをもち、その抗体は好ましくは下記のものからなる群から選択される抗体である：ネズミ、ラマ(lama)、ウサギ、ヤギ、ウシ、キメラ、ヒト化またはヒト抗体、重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、および単一ドメイン抗体、たとえばＶＨ、ＶＨＨまたはＶＬ、好ましくはヒトＩｇＧ抗体、またはネズミＩｇＧ抗体。
【００２５】
さらなる具体的観点によれば、抗体は、具体的にはモノマー状態においてＯ２５ｂ抗原を１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満のＫｄで結合するアフィニティーをもつ。
【００２６】
さらなる具体的観点によれば、抗体は生菌野生型ＭＤＲ大腸菌株を含む血清試料においてインビトロ殺菌効力を示す。
【００２７】
さらなる具体的観点によれば、抗体はインビトロで食細胞による生菌野生型ＭＤＲ大腸菌株の取込みを刺激する。
【００２８】
さらなる具体的観点によれば、抗体は８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体と同じエピトープを結合する。
【００２９】
さらなる具体的観点によれば、抗体は８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体と同じ結合部位を含む。
【００３０】
具体的観点によれば、本発明は、多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、抗体８Ｄ５−１Ｇ１０の抗原結合部位を含むか、または抗体８Ｄ５−１Ｇ１０に由来し、または抗体８Ｄ５−１Ｇ１０の機能活性バリアントである抗体を提供し、好ましくは抗体８Ｄ５−１Ｇ１０は
ａ）ＤＳＭ  ２６７６３で寄託された宿主細胞により産生される抗体軽鎖の可変領域；および／または
ｂ）ＤＳＭ  ２６７６２で寄託された宿主細胞により産生される抗体重鎖の可変領域；あるいは
ｃ）（ａ）および／または（ｂ）の機能活性バリアントを使用すること
を特徴とする。
【００３１】
具体的態様によれば、抗体は８Ｄ５−１Ｇ１０抗体またはその機能活性バリアントである。
【００３２】
本発明のさらに他の抗体であって、６Ｄ１−１Ｂ２および８Ａ１−１Ｇ８と命名されたものを本明細書に例示する。これらは８Ｄ５−１Ｇ１０に類似するＣＤＲ配列をもつクローンであり、本明細書中では機能活性ＣＤＲバリアントとも解釈される。
【００３３】
具体的には、８Ｄ５−１Ｇ１０と命名された抗体は、ＤＳＭ  ２６７６３で寄託された大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドのコード配列によりコードされる可変領域を含む抗体軽鎖、およびＤＳＭ  ２６７６２で寄託された大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドのコード配列によりコードされる可変領域を含む抗体重鎖から構成される。
【００３４】
さらなる具体的観点によれば、抗体は８Ｄ５−１Ｇ１０抗体に由来し、その際、
−抗体軽鎖の可変領域は、ＤＳＭ  ２６７６３で寄託された大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドによりコードされるか、またはその機能活性バリアントである；ならびに／あるいは
−抗体重鎖の可変領域は、ＤＳＭ  ２６７６２で寄託された大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドによりコードされるか、またはその機能活性バリアントである。
【００３５】
さらなる具体的観点によれば、抗体は下記の抗体に由来する：
−抗体軽鎖の可変領域は、ＤＳＭ  ２６７６３で寄託された大腸菌宿主細胞により産生されるか、またはその機能活性バリアントである；ならびに／あるいは
−抗体重鎖の可変領域は、ＤＳＭ  ２６７６２で寄託された大腸菌宿主細胞により産生されるか、またはその機能活性バリアントである。
【００３６】
他の具体的観点によれば、本発明は、単離されたモノクローナル抗体であって、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ抗原に共通のエピトープを交差特異的に結合し、抗体８Ｄ１０−Ｃ８の抗原結合部位を含むか、または抗体８Ｄ１０−Ｃ８に由来し、または抗体８Ｄ１０−Ｃ８の機能活性バリアントである抗体を提供し、好ましくは抗体８Ｄ１０−Ｃ８は
ａ）ＤＳＭ  ２８１７１で寄託された宿主細胞により産生される抗体軽鎖の可変領域；および／または
ｂ）ＤＳＭ  ２８１７２で寄託された宿主細胞により産生される抗体重鎖の可変領域；あるいは
ｃ）（ａ）および／または（ｂ）の機能活性バリアントを使用すること
を特徴とする。
【００３７】
具体的態様によれば、抗体は８Ｄ１０−Ｃ８抗体またはその機能活性バリアントである。
【００３８】
具体的には、８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体は、ＤＳＭ  ２８１７１で寄託された大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドのコード配列によりコードされる可変領域を含む抗体軽鎖、およびＤＳＭ  ２８１７２で寄託された大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドのコード配列によりコードされる可変領域を含む抗体重鎖から構成される。
【００３９】
さらなる具体的観点によれば、抗体は８Ｄ１０−Ｃ８抗体に由来し、その際、
−抗体軽鎖の可変領域は、ＤＳＭ  ２８１７１で寄託された大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドによりコードされるか、あるいはその機能活性バリアントである；および／または
−抗体重鎖の可変領域は、ＤＳＭ  ２８１７２で寄託された大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドによりコードされるか、あるいはその機能活性バリアントである。
【００４０】
さらなる具体的観点によれば、抗体は下記の抗体に由来する：
−抗体軽鎖の可変領域は、ＤＳＭ  ２８１７１で寄託された大腸菌宿主細胞により産生されるか、あるいはその機能活性バリアントである；および／または
−抗体重鎖の可変領域は、ＤＳＭ  ２８１７２で寄託された大腸菌宿主細胞により産生されるか、あるいはその機能活性バリアントである。
【００４１】
具体的には、機能活性バリアントはＣＤＲバリアントであり、たとえばそれは少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を備えたＣＤＲ、より具体的にはＣＤＲループ配列を含む。
【００４２】
具体的には、抗体はそのような抗体から、それぞれのＣＤＲ配列、またはＣＤＲ変異体を用いて誘導され、変異体には機能活性ＣＤＲバリアント、たとえば１つのＣＤＲループ内に１、２または３つの点変異をもつものが含まれる。
【００４３】
具体的には、機能活性バリアントは、アミノ酸配列における、好ましくはＣＤＲにおける、少なくとも１つの点変異において親抗体と異なり、その際、それぞれのＣＤＲアミノ酸配列中の点変異の数は０、１、２または３のいずれかである。
【００４４】
さらなる具体的観点によれば、本発明は下記のヌクレオチド配列を含むプラスミドを提供する：
Ａ
−ＤＳＭ  ２６７６３で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ５−１Ｇ１０−ＬＣと命名された抗体軽鎖の可変領域をコードする配列；および／または
−ＤＳＭ  ２６７６２で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ５−１Ｇ１０−ＨＣと命名された抗体重鎖の可変領域をコードする配列；
あるいは
Ｂ
−ＤＳＭ  ２８１７１で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ１０−Ｃ８−ＬＣと命名された抗体軽鎖の可変領域をコードする配列；および／または
−ＤＳＭ  ２８１７２で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ１０−Ｃ８−ＨＣと命名された抗体重鎖の可変領域をコードする配列。
【００４５】
さらなる具体的観点によれば、本発明は、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖を発現するコード配列を含む発現カセットであって、発現カセットまたはコード配列が本発明
のプラスミドからなる群から選択されるプラスミドに由来するものを提供する。
【００４６】
さらなる具体的観点によれば、本発明は本発明の抗体を調製する方法であって、本発明のプラスミドまたは本発明の発現カセットで宿主細胞を形質転換する方法を提供する。
【００４７】
さらなる具体的観点によれば、本発明は本発明のプラスミドまたは本発明の発現カセットを含む宿主細胞を提供する。
【００４８】
具体的には、宿主細胞は下記において寄託されている：
Ａ
ＤＳＭ  ２６７６３および／またはＤＳＭ  ２６７６２；あるいは
Ｂ
ＤＳＭ  ２８１７１および／またはＤＳＭ  ２８１７２。
【００４９】
具体的態様は、本発明の抗体を調製する方法であって、本発明の宿主細胞を、その抗体を産生する条件下で培養または維持する方法に関する。
【００５０】
さらなる具体的観点によれば、本発明は、候補抗体を同定する方法であって、
（ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
（ｂ）試料中の抗体、または試料により産生される抗体と、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体により認識されるエピトープとの結合を査定し、その際、抗体とエピトープの間の陽性反応によりその抗体を候補抗体と同定する
ことを含む方法を提供する。
【００５１】
さらなる具体的観点によれば、本発明は、候補抗体を同定する方法であって、
（ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
（ｂ）試料中の抗体、または試料により産生される抗体と、ＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株のＯ２５ｂ抗原および非ＭＤＲ大腸菌株のＯ２５抗原またはＯ２５ａ抗原との結合を査定し、その際、Ｏ２５抗原またはＯ２５ａ抗原と対比して抗体とＯ２５ｂ抗原の間の特異的な陽性反応によりその抗体を候補抗体と同定する
ことを含む方法を提供する。
【００５２】
具体的には、候補抗体は防御抗体の候補、たとえば療法用のもの、または診断抗体の候補である。
【００５３】
さらに、さらなる具体的観点によれば、本発明は、本発明の抗体を調製する方法であって、
（ａ）本発明に従って同定した候補抗体を用意し；そして
（ｂ）候補抗体のモノクローナル抗体、またはヒト化形もしくはヒト形、またはその誘導体であって候補抗体と同じエピトープ結合特異性を備えたものを調製する
ことを含む方法を提供する。
【００５４】
他の具体的観点によれば、本発明は、本発明の抗体を調製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物を８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体により認識されるエピトープで免疫化し；
（ｂ）単離したＢ細胞から不死化細胞系を形成し；
（ｃ）ｂ）で得た細胞系をスクリーニングして、前記エピトープに結合するモノクローナル抗体を産生する細胞系を同定し；そして
（ｄ）モノクローナル抗体、またはヒト化形もしくはヒト形の抗体、またはその誘導体であってモノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を備えたものを調製する
ことを含む方法を提供する。
【００５５】
他の具体的観点によれば、本発明は、本発明の抗体を調製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物をＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株のＯ２５ｂ抗原で免疫化して、抗体を産生するＢ細胞を単離し；
（ｂ）単離したＢ細胞から不死化細胞系を形成し；
（ｃ）これらの細胞系をスクリーニングして、大腸菌のＯ２５抗原またはＯ２５ａ抗原と対比してＯ２５ｂ抗原に優先的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞系を同定し；そして
（ｄ）モノクローナル抗体、またはヒト化形もしくはヒト形の抗体、またはその誘導体であってモノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を備えたものを調製する
ことを含む方法を提供する。
【００５６】
さらなる観点によれば、本発明は、医療における本発明の抗体の使用を提供する。具体的には、ＭＤＲ大腸菌感染のリスクをもつ対象またはそれに罹患している対象を処置する際の、対象における感染の制限またはその感染から生じる病的状態の改善に有効な量の抗体を対象に投与することを含む使用のための、好ましくは腎盂腎炎、続発性菌血症、敗血症、腹膜炎、髄膜炎、および人工呼吸器関連肺炎の治療または予防のための抗体が提供される。
【００５７】
具体的には、ＭＤＲ大腸菌、好ましくはＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株を、その株が発現する莢膜多糖に関係なく殺菌するための抗体が提供される。
【００５８】
具体的観点によれば、さらに、ＭＤＲ大腸菌感染のリスクをもつ対象またはそれに罹患している対象を処置する処置方法であって、対象における感染の制限またはその感染から生じる病的状態の改善に有効な量の抗体を対象に投与することを含む方法、好ましくは腎盂腎炎、続発性菌血症、敗血症、腹膜炎、髄膜炎、および人工呼吸器関連肺炎を治療または予防するための方法が提供される。
【００５９】
具体的には、ＭＤＲ大腸菌、好ましくはＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株を、その株が発現する莢膜多糖に関係なく殺菌するための処置方法が提供される。
【００６０】
具体的観点によれば、本発明の抗体を用いる免疫療法は、たとえば種々の動物モデルにおいて判定して、生菌攻撃に対して効果的に防御できる。
【００６１】
この抗体は致死的な内毒素血症を特異的に中和することができる。そのような機能活性は適宜なインビボモデルにおいて判定できる（精製ＬＰＳによる攻撃）。
【００６２】
この抗体は補体媒介による殺菌作用によりＭＤＲ大腸菌に対して特異的に有効であり、たとえばインビトロでの血清殺菌アッセイ(serum bactericidal assay)（ＳＢＡ）により判定して、たとえば対照試料（抗体なし、または無関係な対照ｍＡｂを添加）より少なくとも２０％高い死菌率をもつ。
【００６３】
この抗体は抗体媒介による食菌作用によりＭＤＲ大腸菌に対して特異的に有効であり、たとえばインビトロでのオプソニン食作用殺菌アッセイ(opsonophagocytotic killing assay)（ＯＰＫ）により判定して、たとえば対照試料（抗体なし、または無関係な対照ｍＡｂを添加）より少なくとも２０％高い装入細菌取り込み、あるいは少なくとも２０％低い最終ｃｆｕカウントをもつ。
【００６４】
この抗体は内毒素中和機能によりＭＤＲ大腸菌に対して特異的に有効であり、たとえば
インビトロＬＡＬ活性またはトール様受容体４（ＴＬＲ４）レポーターアッセイにより判定して、たとえば対照試料（抗体なし、または無関係な対照ｍＡｂを添加）に対する内毒素アクティビティエシン(activitiesin)比較が少なくとも２０％低減する。
【００６５】
具体的態様によれば、この抗体は非経口または粘膜用の配合物で投与される。
【００６６】
さらなる観点によれば、本発明は、好ましくは非経口または粘膜用の配合物を含む、場合により医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含有する、本発明の抗体の医薬製剤を提供する。
【００６７】
さらなる観点によれば、対象において、ＬＰＳ  Ｏ２５ｂ抗原を発現するＭＤＲ株により起きる大腸菌感染症、たとえば膀胱炎または尿道炎、上行性または血行性腎盂腎炎を含めた上部および下部尿路感染症を伴なう感染症、特に糖尿病患者におけるもの、ならびに菌血症、敗血症、腹膜炎または腸定着を伴なう感染症を検出または判定する診断に使用するための、本発明の抗体を提供する。
【００６８】
具体的には、本発明に従って使用するための抗体が提供され、その際、対象の体液の試料を抗体と接触させることにより対象においてＭＤＲ大腸菌による全身感染をエクスビボ判定し、その際、抗体の特異的な免疫反応により感染を判定する。
【００６９】
具体的には、体液の試料を特異的な免疫反応について試験し、その試料は尿、血液、血液分離物または血液培養物、吸引液、喀痰、挿管対象の洗浄液、および糞便からなる群から選択される。
【００７０】
具体的には、本発明による診断用途は、臨床検体から回収した純大腸菌培養物から大腸菌の血清型をインビトロで判定することに関連する。
【００７１】
さらなる観点によれば、本発明は、場合により標識付きの抗体、および／または標識付きのさらなる診断試薬、たとえば抗体もしくは抗体と各ターゲット抗原との免疫複合体を特異的に認識する試薬、および／または抗体と診断試薬のうち少なくとも１つを固定化するための固相を含む、本発明の抗体の診断用製剤を提供する。診断用製剤は組成物として、またはたとえば構成要素を含むパーツのキットとして提供でき、たとえば、構成要素は下記を含む：
ａ）診断用抗体製剤、および／または
ｂ）さらなる診断試薬、
ならびに／あるいは抗体および診断試薬のうち少なくとも１つを固定化するための固相を、別個の構成要素として、あるいは前記ａ）および／またはｂ）のいずれかの構成要素のキャリヤーとして。
【００７２】
本発明の好ましい診断アッセイは、たとえば、被験試料から得たＯ２５ｂ抗原を発現する細菌または遊離（または単離された）Ｏ２５ｂ抗原の、抗体による凝集を検査するために、固相、たとえばラテックスビーズ、金粒子などに固定化した本発明の抗体を含む。
【００７３】
ある診断アッセイは、Ｏ２５ｂ抗原とＯ２５ａ抗原を識別できるように、Ｏ２５ｂ抗原および／またはＯ２５ａを結合する異なる特異性および／またはアフィニティーを備えた２種類の異なる抗体を伴なうことができる。
【００７４】
具体的観点によれば、本発明は、本発明の診断薬または本発明の診断方法によりＭＤＲ大腸菌による対象の感染を判定するためのコンパニオン診断薬を提供して、そのような感染症に対してたとえば免疫療法を用いる療法による処置、たとえば本発明の抗体による処
置の基礎を提供する。
【００７５】
具体的観点によれば、本発明は、生菌の量が限られている場合に、たとえば臨床検体からの遊離ＬＰＳを測定することにより、ＭＤＲ大腸菌による対象の感染を診断するための高感度ベッドサイド診断薬を提供する。そのようなアッセイの感度は、具体的には、１００ｎｇ未満、好ましくは１０ｎｇ未満のＬＰＳである。
【００７６】
さらなる観点によれば、本発明は、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体により認識される単離されたエピトープを提供する。そのようなエピトープは、単一エピトープ、または８Ｄ５−１Ｇ１０もしくは８Ｄ１０−Ｃ８と命名された特異的抗体によりそれぞれ認識されるエピトープバリアントを含むエピトープ混合物からなることができる。具体的には、８Ｄ１０−Ｃ８抗体のエピトープはＯ２５ｂとＯ２５ａの両抗原に共通のものであり、広く存在するので、この抗体は交差特異性であると考えられるが、それでもなおＯ２５ｂ抗原を優先的に、少なくともＯ２５ａ抗原を結合するのと同等に結合する。
【００７７】
さらなる観点によれば、本発明は、下記のものを含む免疫原を提供する：
（ａ）本発明のエピトープ；
（ｂ）場合により、（ａ）のエピトープと自然界での関連性がないさらなるエピトープ；および
（ｃ）キャリヤー。
【００７８】
具体的には、キャリヤーは医薬的に許容できるキャリヤーであり、好ましくは緩衝剤および／または佐剤（アジュバント）を含む。
【００７９】
本発明の免疫原は、好ましくはワクチン配合物、好ましくは非経口用のものとして提供される。
【００８０】
具体的には、本発明の免疫原は医療用として、具体的にはＭＤＲ大腸菌感染からの対象の保護またはその感染から生じる病的状態の阻止に有効な量の免疫原を対象に投与することにより対象を処置する際に使用するためのものとして提供される。
【００８１】
具体的には、本発明の免疫原は防御免疫応答を誘発するために提供される。
【００８２】
具体的観点によれば、さらに、ＭＤＲ大腸菌感染のリスクをもつ対象を処置する処置方法が提供され、その方法は、対象における感染の予防、特に病原性ＭＤＲ大腸菌に対する防御に有効な量の免疫原を対象に投与することを含む。
【００８３】
さらなる観点によれば、本発明は、本発明の抗体をコードする、または本発明のエピトープをコードする、単離された核酸を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１：Ｏ２５ｂ、Ｏ２５ａまたはＯ２抗原を発現する種々のＳＴ１３１：Ｏ２５ｂ株の、Ｏ２５ｂ特異的（Ｏ２５ａ抗原に対する交差反応性をもつものまたはもたないもの）ｍＡｂによる表面染色。
【図２】図２：イムノブロットアッセイにおける、精製したＯ２５ａおよびＯ２５ｂ  ＬＰＳ分子に対する異なるｍＡｂおよびＯ２５ウサギ血清の反応性。
【図３】図３：（ａ）：大腸菌Ｏ２５ｂ抗原の反復単位の構造。（ｂ）：比較のための大腸菌Ｏ２５ａ（Ｏ２５、時にはＯ２５（ａ）とも呼ばれる）の反復単位の構造(Kenne et al, 1985)。
【図４】図４：ラテックスビーズにカップリングしたｍＡｂ  ８Ｄ５−１Ｇ１０を用いる凝集アッセイによる、Ｏ２５ｂ抗原を発現する大腸菌株の検出。
【図５】図５：ラテックスビーズにカップリングしたｍＡｂ  ８Ｄ５−１Ｇ１０を用いる凝集アッセイによる、可溶性Ｏ２５ｂ抗原の検出。
【図６】図６：Ｏ２５ｂ特異的ネズミｍＡｂでマウスを受動免疫化することにより後続のＳＴ１３１：Ｏ２５ｂ臨床分離株による静脈内致死量攻撃に対して得られる防御。
【図７】図７：Ｏ２５ｂ特異的ｍＡｂにより媒介される補体依存性殺菌作用。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
本明細書中で用いる用語“抗体”は、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常ドメインおよび／または可変ドメインとして理解されている抗体ドメインからなるかあるいはそれらのドメインを含み、リンカー配列を含むかまたは含まない、ポリペプチドまたはペプチドを表わすものとする。ポリペプチドは、抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータストランドがループ配列により連結されたものからなるベータ−バレル構造を含むならば、抗体ドメインであると解釈される。抗体ドメインは天然構造のものであってもよく、あるいはたとえば抗原結合特性または他のいずれかの特性、たとえば安定性、あるいはＦｃ受容体であるＦｃＲｎおよび／またはＦｃガンマ受容体への結合性などの機能特性を改変するために、変異形成または誘導体化により修飾されていてもよい。
【００８６】
本明細書中で用いる抗体は、１種類以上の抗原またはそのような抗原の１以上のエピトープを結合する特異的な結合部位をもち、それには具体的には下記のものが含まれる：単一可変抗体ドメイン、たとえばＶＨ、ＶＬもしくはＶＨＨのＣＤＲ結合部位、または可変抗体ドメイン対（たとえば、ＶＬ／ＶＨ対）、ＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメインを含む抗体、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、もしくは全長抗体の結合部位。
【００８７】
本明細書中で用いる用語“抗体”は、特に下記のものを含むかあるいはそれからなる抗体フォーマットを表わものとする：単一可変抗体ドメイン、たとえばＶＨ、ＶＬもしくはＶＨＨ、あるいは可変抗体ドメインおよび／または定常抗体ドメインの組合わせであって連結配列またはヒンジ領域を含むかまたは含まないもの、これには可変抗体ドメイン対（たとえば、ＶＬ／ＶＨ対）、ＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメインを含むかまたはそれからなる抗体、たとえば重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、または全長抗体、たとえばＩｇＧタイプのもの（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体が含まれる。用語“全長抗体”は、少なくとも天然抗体モノマー中に一般にみられるＦｃドメインおよび他のドメインの大部分を含むいずれかの抗体分子を表わすために使用できる。この句は本明細書中で、その抗体分子が抗体フラグメントではないことを強調するために用いられる。
【００８８】
用語“抗体”には、具体的には、単離された形の抗体、たとえば異なるターゲット抗原を指向するかまたは異なる構造様式の抗体ドメインを含む他の抗体を実質的に含まない抗体が含まれるものとする。それでもなお、単離された抗体は、単離された抗体と、たとえば少なくとも１種類の他の抗体、たとえば異なる特異性をもつモノクローナル抗体または抗体フラグメントとの組合わせを含有する組合わせ製剤中に含まれてもよい。
【００８９】
用語“抗体”は、ヒト種を含む下記の動物に由来する抗体に適用されるものとする：たとえば、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、ラマ、ウシおよびウマを含む哺乳類、または鳥類、たとえばニワトリ。
【００９０】
用語“抗体”は、さらに、異なる種に由来する配列、たとえばネズミ由来の配列および
ヒト由来の配列をもつ、キメラ抗体に適用される。
【００９１】
抗体に関して用いる用語“キメラ”は、重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列の一部分は特定の種に由来するかまたは特定のクラスに属する抗体中の対応する配列と相同であり、一方、その鎖の残りのセグメントは他の種またはクラスの対応する配列と相同である抗体を表わす。一般に、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は哺乳類の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣し、一方、定常部は他のものに由来する抗体の配列と相同である。たとえば、可変領域は現在知られている供給源からヒト以外のホスト生物に由来する容易に入手できるＢ細胞またはハイブリドーマを用いて得ることができ、これをたとえばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせる。
【００９２】
用語“抗体”は、さらにヒト化抗体に適用される。
【００９３】
抗体に関して用いる用語“ヒト化”は、実質的にヒト以外の種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位をもち、その分子の残りの免疫グロブリン構造はヒト免疫グロブリンの構造および／または配列をベースとする分子を表わす。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全可変ドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが可変ドメイン中の適宜な枠組み構造領域に架橋したもののいずれかを含むことができる。抗原結合部位は野生型であってもよく、あるいはたとえば１以上のアミノ酸置換により修飾されたもの、好ましくはヒト免疫グロブリンにさらに近似させるために修飾されたものであってもよい。ある形態のヒト化抗体はすべてのＣＤＲ配列を保存している（たとえば、マウス抗体からの６つのＣＤＲすべてを含むヒト化マウス抗体）。他の形態は、元の抗体に対して変更された１以上のＣＤＲをもつ。
【００９４】
用語“抗体”は、さらにヒト抗体に適用される。
【００９５】
抗体に関して用いる用語“ヒト”は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域をもつ抗体を含むと解釈される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列がコードしないアミノ酸残基（たとえば、インビトロでランダムもしくは部位特異的な変異形成により、またはインビボで体細胞変異により導入された変異）を、たとえばＣＤＲ中に含むことができる。ヒト抗体には、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１以上のヒト免疫グロブリンについてのトランスジェニック動物から単離された抗体が含まれる。
【００９６】
この用語は、具体的にいずれのクラスまたはサブクラスの抗体にも適用される。抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの主クラスに配属でき、これらのうち幾つかはさらにサブクラス（イソ型）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２に分類できる。
【００９７】
この用語はさらにモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、具体的には組換え抗体に適用され、この用語には組換え手段で調製、発現、作成または単離されたすべての抗体および抗体構造体、たとえば異なる起源からの遺伝子または配列を含む動物、たとえばヒトを含めた哺乳動物を起源とする抗体、たとえばキメラ抗体、ヒト化抗体またはハイブリドーマ由来抗体が含まれる。さらなる例は、その抗体を発現するように形質転換した宿主細胞から単離された抗体、または抗体もしくは抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、または抗体遺伝子配列を他のＤＮＡ配列へスプライスすることを伴なう他のいずれかの手段で調製、発現、作成もしくは単離された抗体に関係する。
【００９８】
用語“抗体”は、抗体の誘導体、特に機能活性誘導体をも表わすと解釈される。抗体誘導体は、１以上の抗体ドメインもしくは抗体の組合わせ、および／または抗体のいずれかのドメインが他の１種類以上のタンパク質、たとえば他の抗体のいずれかの位置に融合していてもよい融合タンパク質、たとえば、ＣＤＲループ、レセプターポリペプチドを含むけれどもリガンド、足場タンパク質、酵素、毒素などをも含む結合構造体であると解釈される。抗体の誘導体は、種々の化学的手法、たとえば共有結合、静電相互作用、ジスルフィド結合などにより他の物質に会合または結合させることによって得ることができる。抗体に結合した他の物質は、脂質、糖質、核酸、有機および無機の分子、またはそのいずれかの組合わせであってもよい（たとえば、ＰＥＧまたは薬物）。具体的態様において、抗体は、生物学的に許容できる化合物と特異的に相互作用しうる追加タグを含む誘導体である。本発明に使用できるタグに関して、それが抗体のターゲットへの抗体の結合に負の影響をもたないかまたはその影響が耐容できる限り、明確な制限はない。適切なタグの例には、Ｈｉｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、カルモジュリン(Calmodulin)−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグ、およびＳ−タグが含まれる。他の具体的態様において、抗体は標識を含む誘導体である。本明細書中で用いる用語“標識”は、“標識された”抗体が生成するように抗体に直接または間接的にコンジュゲートさせる検出可能な化合物または組成物を表わす。標識はそれ自体が検出可能なもの、たとえば放射性同位体標識または蛍光標識であってもよく、あるいは酵素標識の場合は基質である化合物または組成物の化学変化を触媒し、それが検出可能であってもよい。
【００９９】
本明細書に記載する好ましい誘導体は、抗原結合に関して機能活性であり、好ましくは、たとえばＳＢＡ、ＯＰＫもしくはＬＡＬアッセイにおいて判定してＭＤＲ大腸菌およびそれの内毒素と闘う効力、または細菌攻撃に対して防御する効力、または致死的な内毒素血症を中和する効力をもつ。
【０１００】
親抗体または親抗体配列から誘導した抗体は、本明細書中で特に、たとえばインシリコ(in silico)もしくは組換え工学により、または化学的な誘導体化もしくは合成により得
られた、変異体またはバリアントであると解釈される。
【０１０１】
具体的には、本発明の抗体から誘導した抗体は、Ｏ２５ｂ抗原への差示結合、たとえばＯ２５ｂ抗原の特異的または選択的結合において機能活性であるＣＤＲ領域またはそのＣＤＲバリアントのうち少なくとも１つまたはそれ以上を含むことができる。
【０１０２】
用語“抗体”は、抗体のバリアントをも表わすと解釈される。
【０１０３】
用語“バリアント”は、特に変異抗体または抗体フラグメントなどの抗体であって、たとえば特に、特定の抗体アミノ酸配列もしくは領域を欠失させ、交換し、挿入配列を導入するために、またはアミノ酸配列を化学的に誘導体化するために、変異形成法により得られたものを表わすものとする；たとえば、定常ドメインにおいて抗体の安定性、エフェクター機能または半減期を工学的に操作するために、あるいは可変ドメインにおいて抗原結合特性を改善するために、たとえばアフィニティー成熟(affinity maturation)法により
得られたもの。いずれか既知の変異形成法を採用でき、それには、たとえばランダム化法により得られる目的位置での点変異が含まれる。ある場合には、たとえば抗体配列をランダム化するためにいずれか可能なアミノ酸または選択した好ましいアミノ酸を用いて、位置をランダムに選定する。用語“変異形成”は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を変異させるための当技術分野で認知されているいずれかの手法を表わす。好ましいタイプの変異形成には、エラープローンＰＣＲ(error prone PCR)変異形成、飽和変異形
成(saturation mutagenesis)、または他の部位特異的変異形成が含まれる。
【０１０４】
用語“バリアント”は、具体的には機能活性バリアントを包含するものとする。
【０１０５】
本明細書中で用いる、抗体の“機能活性バリアント”という用語は、たとえば１個以上のアミノ酸を挿入、欠失または置換することによりこの配列（親抗体または親配列）を修飾することから得られた配列であって、たとえばアミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸残基またはヌクレオチド配列内のヌクレオチドまたは配列の一方もしくは両方の末端の組換え法または化学的誘導体化などにより得られたものを意味し、その修飾がこの配列の活性に影響を及ぼすこと（特に、損なうこと）はない。選択したターゲット抗原に対する特異性をもつ結合部位の場合、抗体の機能活性バリアントは前決定された結合特異性をなお備えているであろう；ただし、これは、特異的エピトープに対する微細な特異性、アフィニティー、アビディティー、ＫｏｎまたはＫｏｆｆ速度などを変化させるために、変化させることができる。具体的には、本発明の抗体の機能活性バリアントは、Ｏ２５ｂ抗原を結合する効力、および大腸菌の他の抗原と対比してＯ２５ｂ抗原に優先的に結合する特異性または選択性をもち、たとえば大腸菌のＯ２５ｂ抗原に結合し、Ｏ２５ａ抗原には結合せず、またはＯ２５ａ抗原に有意には結合せず、あるいは大腸菌のＯ２５ｂおよびＯ２５ａ両方の抗原を交差特異的に結合するけれども他の抗原には結合しない。
【０１０６】
機能活性バリアントは、たとえば親抗体の配列を変化させることにより得ることができる：たとえば、６Ｄ１−１Ｂ２、８Ａ１−１Ｇ８、８Ｄ５−１Ｇ１０もしくは８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体と同じ結合部位を含むけれども結合部位以外の抗体領域内に修飾をもつ抗体；または、６Ｄ１−１Ｂ２、８Ａ１−１Ｇ８、８Ｄ５−１Ｇ１０もしくは８Ｄ１０−Ｃ８抗体のいずれかである親抗体から、結合部位内ではあるけれども抗原結合を損なわない修飾により誘導された抗体；それらは、好ましくは親抗体に類似する生物活性をもち、これにはＯ２５ｂ抗原を特異的または選択的に結合する能力、たとえば大腸菌のＯ２５ｂ抗原に結合し、Ｏ２５ａ抗原には結合せず、またはＯ２５ａ抗原を有意には結合しないこと、あるいは大腸菌のＯ２５ｂおよびＯ２５ａ両方の抗原を交差特異的に結合するけれども他の抗原には結合しないことが含まれる。場合により、機能活性バリアントは、さらにＳＢＡアッセイにおける補体媒介殺菌効力を含むことができ、および／または場合によりさらにＯＰＫアッセイにおける抗体媒介食菌効力を含むことができ、および／または場合によりさらにＬＡＬアッセイにおける内毒素中和機能を含むことができ、たとえばターゲットＭＤＲ大腸菌に対する特異的結合アッセイまたは機能試験により判定して実質的に同じ生物活性を備えている。
【０１０７】
たとえば、機能活性バリアントである抗体６Ｄ１−１Ｂ２および８Ａ１−１Ｇ８は、８Ｄ５−１Ｇ１０抗体と実質的に同じ類似の結合アフィニティーをもつ（次表を参照）。
【０１０８】
【表１】
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【０１０９】
本明細書中で用いる用語“実質的に同じ生物活性”は、親抗体について測定された活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらに少なくとも１００％、または少なくとも１１０％、または少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１６０％、または少なくとも１７０％、または少なくとも１８０％、または少なくとも１９０％、たとえ
ば最大で２００％であるのと実質的に同じ活性により示される活性を表わす。
【０１１０】
本明細書に記載する好ましいバリアントまたは誘導体は、抗原結合に関して機能活性であり、好ましくは大腸菌のＯ２５ｂ抗原を特異的に結合し、他の抗原には結合しない効力、たとえば大腸菌のＯ２５ｂ抗原に結合し、Ｏ２５ａ抗原には結合せず、またはＯ２５ａ抗原に有意には結合しない効力、あるいは大腸菌のＯ２５ｂおよびＯ２５ａ両方の抗原を交差特異的に結合する効力、たとえばＯ２５ａに対比してＯ２５ｂ抗原を優先的に結合し、またはＯ２５（Ｏ２５ａ）株に対して産生された現在のポリクローナルタイピング血清と比較してより高いアフィニティーでＯ２５ｂ抗原を結合する効力をもつ。好ましいバリアントは、大腸菌の他の抗原を結合せず、少なくとも２ｌｏｇ、好ましくは少なくとも３ｌｏｇのＫｄ値差をもち、場合によりさらにＳＢＡアッセイにおいて、たとえばその抗体を含有しない対照試料と対比して有意の細菌数減少を達成する補体媒介殺菌効力を含み、および／または場合によりさらにＯＰＫアッセイにおいて、その抗体を含有しない対照試料と対比して有意の細菌数減少を達成するような抗体媒介食菌効力を含み、および／または場合によりさらにＬＡＬもしくはＴＬＲ４シグナル伝達アッセイにおいて、その抗体を含有しない対照試料と対比して有意の遊離ＬＰＳ減少を達成するような内毒素中和機能を含み、たとえばターゲットＭＤＲ大腸菌に対する特異的結合アッセイまたは機能試験により判定して実質的に同じ生物活性をもつ。種々のアッセイにおける分析体の有意の減少とは、一般に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％、最大で約１００％（±１％）の減少を意味する。
【０１１１】
好ましい態様において、親抗体の機能活性バリアントは、
ａ）その抗体の生物活性フラグメントであり、そのフラグメントは分子の配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％を含む；
ｂ）その抗体から少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失により誘導され、その際、機能活性バリアントは、抗体などの分子またはそれの一部に対して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性をもつ；ならびに／あるいは
ｃ）抗体またはその機能活性バリアント、およびさらにそのポリペプチドまたはヌクレオチド配列に対してヘテロロガスな少なくとも１個のアミノ酸またはヌクレオチドからなる。
【０１１２】
本発明の好ましい１態様において、本発明による抗体の機能活性バリアントは前記のバリアントと本質的に同一であるが、それは異なる種の相同配列に由来するという点でそれのポリペプチドまたはヌクレオチド配列とそれぞれ異なる。これらは天然のバリアントまたはアナログと呼ばれる。
【０１１３】
用語“機能活性バリアント”には、変異体または他のいずれかの非天然バリアントのほか、天然の対立遺伝子バリアントも含まれる。当技術分野で知られているように、対立遺伝子バリアントは、ポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させることのない１個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加をもつことを特徴とする別形態の（ポリ）ペプチドである。
【０１１４】
機能活性バリアントは、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の配列変更により、たとえば１以上の点変異により得ることができ、その際、本発明の組合わせに使用した場合、その配列変更により、変更されていないポリペプチドまたはヌクレオチド配列の機能は保
持されている。そのような配列変更には（保存的）な置換、付加、欠失、変異形成または挿入を含めることができるが、これらに限定されない。
【０１１５】
具体的な機能活性バリアントはＣＤＲバリアントである。ＣＤＲバリアントには、ＣＤＲ領域において少なくとも１個のアミノ酸により修飾されたアミノ酸配列が含まれ、その修飾はアミノ酸配列の化学的変更または部分的変更であってもよく、その修飾はバリアントが非修飾配列の生物学的特性を保持できるものである。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変更は、１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の欠失もしくは置換によるもの、または１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の付加もしくは挿入によるもの、または１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の化学的誘導体化によるもの、またはその組合わせであってもよい。アミノ酸残基の置換は、保存的置換、たとえば１個の疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換するものであってもよい。
【０１１６】
保存的置換は、それらの側鎖および化学的特性において関係があるアミノ酸のファミリー内で行なわれるものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖をもつアミノ酸、酸性側鎖をもつアミノ酸、非極性脂肪族側鎖をもつアミノ酸、非極性芳香族側鎖をもつアミノ酸、非荷電極性側鎖をもつアミノ酸、小さな側鎖をもつアミノ酸、大きな側鎖をもつアミノ酸などである。
【０１１７】
点変異は、特に、ポリヌクレオチドの工学操作であって、１以上の単一（非連続）アミノ酸またはアミノ酸対を異なるアミノ酸に置換または交換するか、欠失または挿入する際に、工学的に操作されていないアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列の発現をもたらすものであると解釈される。
【０１１８】
好ましい点変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を表わす。これに関して、アミノ酸は、６４のトリプレットコドンによりコードされる２０種類の天然アミノ酸を表わす。これら２０種類のアミノ酸は、中性電荷、正電荷および負電荷をもつものに分類できる：
“中性”アミノ酸を、それらの各３文字コードおよび１文字コードならびに極性と共に以下に示す：
アラニン：（Ａｌａ，Ａ）  非極性，中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ，Ｎ）  極性，中性；
システイン：（Ｃｙｓ，Ｃ）  非極性，中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ，Ｑ）  極性，中性；
グリシン：（Ｇｌｙ，Ｇ）  非極性，中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ，Ｉ）  非極性，中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ，Ｌ）  非極性，中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ，Ｍ）  非極性，中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ，Ｆ）  非極性，中性；
プロリン：（Ｐｒｏ，Ｐ）  非極性，中性；
セリン：（Ｓｅｒ，Ｓ）  極性，中性；
トレオニン：（Ｔｈｒ，Ｔ）  極性，中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ，Ｗ）  非極性，中性；
チロシン：（Ｔｙｒ，Ｙ）  極性，中性；
バリン：（Ｖａｌ，Ｖ）  非極性，中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ，Ｈ）  極性，正（１０％）  中性（９０％）
“正”電荷アミノ酸は下記のものである：
アルギニン：（Ａｒｇ，Ｒ）  極性，正；および
リジン：（Ｌｙｓ，Ｋ）  極性，正
“負”電荷アミノ酸は下記のものである：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ，Ｄ）  極性，負；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ，Ｅ）  極性，負。
【０１１９】
本明細書に記載する抗体配列およびホモログに関する“アミノ酸配列同一性パーセント（％）”は、配列をアラインさせ、必要であれば最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後、保存的置換はいずれも配列同一性の一部ではないとみなして、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセントと定義される。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要ないずれかのアルゴリズムを含めて、アラインメントを決定するのに適したパラメーターを決定できる。
【０１２０】
抗体バリアントは、具体的にはホモログ、アナログ、フラグメント、修飾体、または糖鎖工学的操作により調製された特定のグリコシル化パターンを備えたバリアントを含むと解釈され、これらは機能性であり、機能均等物として使用でき、たとえば特定のターゲットに結合し、機能特性を備えている。
【０１２１】
本発明の抗体は、Ｆｃエフェクター機能を示してもよく、示さなくてもよい。好ましくは、抗体はＦｃエフェクター機能を示し、ＳＢＡおよび／またはＯＰＫアッセイにおいて機能活性である。具体的抗体は、活性Ｆｃ部分を欠如していてもよく、したがって抗体のＦｃ部分を含まないかまたはＦｃガンマ受容体結合部位を含まない抗体ドメインから構成され、あるいはたとえばＦｃエフェクター機能を低下させる修飾によりＦｃエフェクター機能を欠如した抗体ドメインを含む。別の抗体は、Ｆｃエフェクター機能を増大させる修飾、特にＯＰＫおよび／またはＳＢＡ活性を高める修飾を含むように工学操作されていてもよい。
【０１２２】
そのような修飾は、Ｆｃエフェクター機能の低下または増大を達成するような変異形成、たとえばＦｃガンマ受容体結合部位における変異により、あるいは抗体フォーマットのＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を妨害する誘導体もしくは作用剤により、行なうことができる。
【０１２３】
Ｆｃエフェクター機能の有意の低下とは、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性により測定して、一般に非修飾（野生型）フォーマットの１０％未満、好ましくは５％未満のＦｃエフェクター機能を表わすと解釈される。Ｆｃエフェクター機能の有意の増大とは、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性により測定して、一般に非修飾（野生型）フォーマットの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％のＦｃエフェクター機能増大を表わすと解釈される。
【０１２４】
抗体配列に関する用語“糖鎖工学的に操作された(glycoengineered)”は、糖鎖工学的
操作の結果として、改変された免疫原特性、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣをもつグリコシル化バリアントを表わすものとする。すべての抗体が重鎖定常領域の保存された位置に糖質構造を含み、各イソ型は別個のＮ連結糖質構造のアレイを保有し、それらはタンパク質のアセンブリー、分泌または機能活性に多様な影響を及ぼす。ＩｇＧ１タイプの抗体は、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に保存されたＮ連結グリコシル化部位をもつ糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複雑なバイ−アンテナ型(bi-antennary)オリゴ糖はＣＨ２ドメイン間に埋め込まれてそのポリペプチド主鎖との広域接点を形成し、それらの存在は抗体がエフェクター機能、たとえば抗体依存性の補体媒介殺菌または食菌細胞による取込みを媒介するために必須である。Ｎ２９７のＮ−グリカンの除去（たとえば、Ｎ２９７をたとえばＡに変異させることによる）またはＴ２９９のＮ−グリカンの除去により、エフェクター機能が低下した非グリコシル化抗体フォーマットになる。
【０１２５】
抗体グリコシル化の大きな相異が細胞間で生じ、微小な相異は異なる培養条件下で増殖した特定の細胞系についてすらみられる。細菌細胞での発現は、一般に非グリコシル化抗体を生成する。β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）、すなわちバイセクティング(bisecting)ＧＩｃＮＡｃの形成を触媒する
グリコシルトランスフェラーゼの発現がテトラサイクリンで調節されたＣＨＯ細胞は、改善された機能（ＡＤＣＣ）活性をもつと報告された(Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17: 176-180)。抗体の組換え産生に際してグリコシル化に影響を及ぼす要因には、宿
主細胞の選定のほかに、増殖様式、培地配合、培養密度、酸素供給、ｐＨ、精製スキームなどが含まれる。
【０１２６】
用語“抗原結合部位”または“結合部位”は、抗原結合に関与する抗体部分を表わす。抗原結合部位は、重（“Ｈ”）鎖および／または軽（“Ｌ”）鎖のＮ末端可変（“Ｖ”）領域あるいはその可変ドメインのアミノ酸残基により形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内に、“超可変領域”と呼ばれる多様性の高い３つの区域が、より保存された枠組み構造領域として知られるフランキング区域間に配置されている。抗原結合部位は結合したエピトープまたは抗原の三次元表面に対して相補的な表面を備えており、超可変領域は“相補性決定領域”、または“ＣＤＲ”と呼ばれる。ＣＤＲに含まれる結合部位を、本明細書中で“ＣＤＲ結合部位”とも呼ぶ。
【０１２７】
本明細書中で用いる用語“抗原”は、用語“ターゲット”または“ターゲット抗原”と互換性をもって用いられ、全ターゲット分子、またはそのような分子のフラグメントであって抗体の結合部位により認識されるフラグメントを表わすものとする。具体的には、抗原の下位構造体、たとえば一般に“エピトープ”とよばれるポリペプチドまたは糖質構造体、たとえば免疫関連のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを、そのような結合部位により認識できる。Ｏ２５ｂまたはＯ２５ａ抗原のような特異的抗原が、単離された抗原として、あるいは大腸菌または細胞画分の形で提供される。
【０１２８】
本明細書中で用いる用語“エピトープ”は、特に、抗体の結合部位に対して完全に特異的結合パートナーを構成するかまたは特異的結合パートナーの一部となることができる、分子構造体を表わすものとする。エピトープは天然または人工のいずれであってもよく、糖質、ペプチド構造体、脂肪酸、有機物、生化学的物質もしくは無機物、またはその誘導体、およびそのいずれかの組合わせから構成される。エピトープがペプチド構造体、たとえばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中に含まれるならば、それは通常は少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは５〜４０個のアミノ酸、より好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸を含むであろう。エピトープは、線状または高次構造のいずれのエピトープであってもよい。線状エピトープは、ポリペプチドまたは糖鎖の一次配列の単一セグメントから構成される。線状エピトープは、連続的またはオーバーラップしたものであってもよい。高次構造エピトープは、ポリペプチドがフォールディングすることによって近づけられて三次構造を形成したアミノ酸または糖質から構成され、それらのアミノ酸は線状配列中では必ずしも互いに近接してはいない。具体的には、ポリペプチド抗原に関して、高次構造または不連続エピトープは、一次配列においては離れていたけれどもポリペプチドがフォールディングして天然タンパク質／抗原になった際に分子の表面でアセンブリングして統合された構造体になった２以上の別個のアミノ酸残基の存在を特徴とする。
【０１２９】
本明細書中で用語“エピトープ”は、特に、抗体により認識される単一エピトープ、またはターゲットを特異的に認識する抗体によりそれぞれ認識されるエピトープバリアントを含むエピトープ混合物を表わすものとする；たとえば、６Ｄ１−１Ｂ２、８Ａ１−１Ｇ８、８Ｄ５−１Ｇ１０および８Ｄ１０−Ｃと命名された抗体からなる群から選択される抗体により特異的に認識されるエピトープ。具体的には、６Ｄ１−１Ｂ２、８Ａ１−１Ｇ８
、８Ｄ５−１Ｇ１０および８Ｄ１０−Ｃと命名された抗体からなる群から選択される抗体によりターゲティングされるエピトープは糖質エピトープである。
【０１３０】
用語“発現”は、下記のように解釈される。たとえば本明細書に記載する抗体などの発現生成物の目的コード配列、および制御配列、たとえば作動可能な状態で連結したプロモーターを含む核酸分子を、発現の目的に使用できる。これらの配列で形質転換またはトランスフェクションした宿主は、コードされたタンパク質を産生できる。形質転換を行なうためには、発現系をベクターに導入することができる；しかし、関連ＤＮＡを宿主の染色体に組み込むこともできる。具体的には、この用語は、たとえばベクターが保有して宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現に適切な条件下における、宿主細胞および適合性ベクターに関するものである。
【０１３１】
コードＤＮＡは、たとえば抗体などの特定のポリペプチドまたはタンパク質に関する特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始、調節、または他の形で媒介または制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは同じ遺伝子または異なる遺伝子に由来するものであってよく、同じ生物または異なる生物に由来するものであってよい。組換えクローニングベクターは、しばしば、クローニングまたは発現のための１以上の複製システム、宿主における選択のための１以上のマーカー、たとえば抗生物質耐性、および１以上の発現カセットを含むであろう。
【０１３２】
本明細書中で用いる“ベクター”は、適切な宿主生物におけるクローン化された組換えヌクレオチド配列の（すなわち、組換え遺伝子の）転写およびそれらのｍＲＮＡの転写に必要なＤＮＡ配列と定義される。
【０１３３】
“発現カセット”は、発現生成物をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡセグメントを表わし、それをベクターに既定の制限部位で挿入できる。カセット制限部位は、カセットを適正なリーディングフレーム内に確実に挿入するように設計される。一般に、外来ＤＮＡはベクターＤＮＡの１以上の制限部位で挿入され、次いで伝達可能なベクターＤＮＡと共にそのベクターにより宿主細胞内へ運ばれる。挿入または付加されたＤＮＡを含むＤＮＡのセグメントまたは配列、たとえば発現ベクターは、“ＤＮＡ構築体”とも呼ばれる。
【０１３４】
発現ベクターは、発現カセットを含み、さらに通常は宿主細胞における自律複製のための起点、またはゲノム組込み部位、１以上の選択マーカー（たとえば、アミノ酸合成遺伝子、または抗生物質、たとえばゼオシン(zeocin)、カナマイシン、Ｇ４１８またはハイグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子）、多数の制限酵素開裂部位、適切なプロモーター配列、および転写ターミネーターを含み、これらの構成要素は互いに作動可能な状態で連結している。本明細書中で用いる用語“ベクター”には、自律複製ヌクレオチド配列、およびゲノム組込みヌクレオチド配列が含まれる。一般的なタイプのベクターは“プラスミド”であり、それは一般に追加（外来）ＤＮＡを容易に受容できる二本鎖ＤＮＡの自給(self-contained)分子であり、かつ適切な宿主細胞に容易に導入できる。プラスミドベクターは、しばしばコードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含み、かつ外来ＤＮＡの挿入に適した１以上の制限部位をもつ。具体的には、用語“ベクター”または“プラスミド”は、宿主を形質転換して導入配列の発現（たとえば、転写および翻訳）を促進するために、それによりＤＮＡまたはＲＮＡ配列（たとえば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入できるビヒクルを表わす。
【０１３５】
本明細書中で用いる用語“宿主細胞”は、特定の組換えタンパク質、たとえば本明細書に記載する抗体を産生させるために形質転換した初代対象細胞およびそのいずれかの後代
を表わすものとする。必ずしもすべての後代が親細胞と厳密に同一であるとは限らない（計画的もしくは偶発的な変異または環境差による）が、そのような変異した後代は、その後代が最初に形質転換した細胞と同じ機能性を保持する限りこれらの用語に含まれることを理解すべきである。用語“宿主細胞系”は、組換え抗体などの組換えポリペプチドを生成する組換え遺伝子を発現させるために用いる宿主細胞の細胞系を表わす。本明細書中で用いる用語“細胞系”は、長期間にわたって増殖する能力を獲得した特定の細胞タイプの樹立クローンを表わす。そのような宿主細胞または宿主細胞系を細胞培地において維持および／または培養して、組換えポリペプチドを産生させることができる。
【０１３６】
本明細書に記載する抗原またはエピトープを含む組成物、たとえば免疫原組成物（本明細書中で“免疫原”とも呼ばれる）またはワクチンに対する“免疫応答”は、ホストまたは対象における、着目する組成物またはワクチンに対する細胞性および／または抗体媒介性の免疫応答の発現である。通常は、そのような応答は、着目する組成物またはワクチンに含有される抗原（単数または複数）を特異的に指向する抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞を産生する対象で構成される。
【０１３７】
“防御免疫応答”は、療法免疫応答であると解釈され、病原体に由来する抗原に対する免疫応答を表わし、それは疾患の症状、副作用または進行を何らかの形で阻止し、改善し、治療し、または少なくとも部分的に停止する。具体的には、非免疫集団のものと比較して誘導感染もしくは自然感染または毒素攻撃の有意に良好な転帰をもたらす防御免疫応答が誘発される。
【０１３８】
免疫原または免疫原組成物は、通常は抗原またはエピトープおよびキャリヤーを含み、キャリヤーは具体的にはアジュバントを含むことができる。用語“アジュバント”は、抗原と併せて投与した際には抗原に対する免疫応答を増強および／または再指向するけれども単独で投与した際には抗原に対する免疫応答を発生しない化合物を表わす。アジュバントは、リンパ球動員、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含めた幾つかの機序で免疫応答を増強することができる。代表的キャリヤーは、リポソームまたはカチオン性ペプチドである；代表的アジュバントは、リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム、ＭＦ５９またはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。
【０１３９】
本明細書中で核酸、抗体または他の化合物に関して用いる用語“単離された”または“単離”は、それが自然状態で随伴していた環境から“実質的に純粋な”形で存在するのに十分なほど分離されている化合物を表わすものとする。“単離された”は、必ずしも他の化合物もしくは物質との人為的もしくは合成による混合物の除外、または基本的活性を妨害しない、たとえば不完全な精製のため存在する可能性のある不純物の存在の除外を意味するわけではない。特に、本発明の単離された核酸分子は化学合成されたものをも含むものとする。
【０１４０】
本発明の核酸に関して、用語“単離された核酸”を時に用いる。この用語は、ＤＮＡに適用した場合、それが由来する生物の天然ゲノム中のすぐ隣の配列から分離されたＤＮＡ分子を表わす。たとえば、“単離された核酸”は、ベクター、たとえばプラスミドベクターもしくはウイルスベクターに挿入された、または原核細胞もしくは真核細胞もしくは宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、ＤＮＡ分子を含むことができる。ＲＮＡに適用した場合、用語“単離された核酸”は主に、上記に定義した単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子を表わす。あるいは、この用語は、それが自然状態で（すなわち、細胞または組織において）随伴していたであろう他の核酸から十分に分離されたＲＮＡ分子を表わすことができる。“単離された核酸”（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、さらに生物学的手段または合成手段で直接調製され、そしてそれの調製に際して存在する他の成分から分離された分子を表わすことができる。
【０１４１】
ポリペプチドまたはタンパク質、たとえば本発明の抗体またはエピトープに関して、用語“単離された”は、具体的には、それが自然状態で随伴する物質、たとえばそれらの自然環境で、またはそのような調製物がインビトロもしくはインビボで実施された組換えＤＮＡ技術によるものである場合にはそれらが調製された環境（たとえば、細胞培養）で、それらと共にみられる他の化合物を含まないかまたは実質的に含まない化合物を表わすものとする。単離された化合物に希釈剤または佐剤（アジュバント）を配合することはでき、それでもなお実際の目的については単離されている−たとえば、診断または療法に用いる場合にはポリペプチドまたはポリヌクレオチドを医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤と混合することができる。特に、本発明の単離された抗体は単離および精製された形で提供され、好ましくは単離された抗体を唯一の有効物質として含む調製物で提供されるので、Ｏ２５（ａ）株に対して産生されたポリクローナル血清調製物とは異なる。ただし、これは単離された抗体が限られた数のさらなる明確に規定された（単離された）抗体を含む組合わせ製剤で提供されることを除外しない。単離された抗体を固体、準液体または液体キャリヤー、たとえばビーズ上において提供することもできる。
【０１４２】
用語“中和する”または“中和”は、最も広い意味で本明細書において用いられ、中和が達成される機序に関係なく、ＭＤＲ大腸菌などの病原体が対象に感染するのを阻害するいずれかの分子、または効力をもつタンパク質毒素を病原体が産生することにより感染症を促進するのを阻害すること、または毒素が対象においてターゲット細胞に損傷を与えるのを阻害することを表わす。中和は、たとえばＭＤＲ大腸菌の内毒素がターゲット細胞上のそれのコグネイト受容体と結合および／または相互作用する（たとえば、ＴＬＲ４受容体と結合する）のを阻害する抗体により達成できる。中和はさらに、Ｆｃ媒介機能により内毒素分子を循環から排除することによって行なわれる可能性がある。
【０１４３】
中和効力は、一般に標準アッセイ、たとえばＬＡＬ試験により判定され、その際、内毒素の生物活性の阻害をたとえば比色法により測定する。
【０１４４】
本明細書中で用いる用語“ＭＤＲ大腸菌”は、下記のように解釈される：有意部分がわずかこの１０年で出現して広域に拡散した優性耐性クローンになったＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４クローン系列によるものである多剤耐性大腸菌感染症。多剤耐性大腸菌は、特に３クラス以上の抗生物質、たとえば下記の薬剤／グループに対して耐性を示す株であると解釈される：ペニシリン類、セファロスポリン類、カルバペネム類、アミノグリコシド類、テトラサイクリン類、フルオロキノロン類、ニトロフラントイン(nitrofurantoin)、トリメトプリム(trimethoprim)（およびそれの組合わせ）、ホスホマイシン(fosfomycin)、ポリミキシン類、クロラムフェニコール、アズトレオナム(azthreonam)、チゲサイクリン(tigecycline)。
【０１４５】
酸性の莢膜多糖（ＣＰＳ）は、大部分の病原性大腸菌を取り囲む厚い粘膜様の層の多糖である。したがって、莢膜保有および無莢膜の両方のＭＤＲ大腸菌株において、本発明の抗体により認識される特異的エピトープに特異的に到達できることは意外である。
【０１４６】
ＭＤＲ大腸菌と闘う、またはそれを中和する抗体は、病原体および病原性反応を妨害し、したがって感染を制限もしくは阻止し、および／またはそのような感染から生じる病的状態を改善し、またはＭＤＲ大腸菌の発病、特にホストの無菌の体内区画／部位内への播種およびそこでの複製を阻害することができる。これに関して“防御抗体”は、本明細書中で、感染因子に対する能動免疫または受動免疫にみられる免疫に関与する抗体であると解釈される。特に、本明細書に記載する防御抗体は、療法目的で、たとえば予防または治療のために用いて、病原体により誘発される疾患の症状、副作用または疾患進行を阻止し、改善し、治療し、または少なくとも部分的に停止することができる。具体的には、防御
抗体は、療法適用によって（すなわち、樹立した感染症に投与して）、たとえば血清の殺菌活性またはオプソニン食菌活性を誘発することにより、大腸菌生細胞を死滅させ、または複製を妨害し、あるいは全細菌細胞またはそのＬＰＳ分子を無菌身体部位から除去することができる。あるいは、予防的に適用した防御抗体は、前記または他の機序のうちのいずれかにより、感染の樹立（すなわち、非無菌部位から無菌の身体区画への大腸菌の拡散）を阻害する。
【０１４７】
用語“Ｏ２５ｂ抗原”は、本明細書において、実施例２および図３（ａ）において解明した構造を備えたＬＰＳ  Ｏ抗原であると解釈される。この構造はＯ２５（ａ）抗原のものと類似するが、別個のものである。Ｏ２５ｂは本明細書において、Ｏ２５ａと類似するけれども別個の血清型であると解釈される（図３（ａ）を参照）。
【０１４８】
用語“Ｏ２５抗原”は、本明細書において、Kenneら(Kenne L, Lindberg B, Madden JK, Lindberg AA, Gemski P Jr. Structural studies of the Escherichia coli O-antigen
25. Carbohydr Res. 28; 122(2): 249-56, 1983)が記載した五糖反復単位から形成され
る抗原であると解釈される。Ｏ２５ｂ抗原が同定される以前は、本明細書に記載するように、Ｏ２５ａの代わりに用語Ｏ２５が用いられていた（図３（ｂ）を参照）。
【０１４９】
用語“Ｏ２５ａ抗原”は、本明細書においてＯ２５抗原と同義語であると解釈される。
【０１５０】
本明細書中で用いる用語“組換え”は、“遺伝子工学により調製されたか、あるいはその結果である”ことを意味するものとする。組換え宿主は、具体的には、発現ベクターまたはクローニングベクターを含むか、あるいは特に宿主にとって外来であるヌクレオチド配列を用いて組換え核酸配列を保有するように遺伝子工学的に操作されている。組換えタンパク質は、それぞれの組換え核酸を宿主において発現させることにより調製される。本明細書中で用いる用語“組換え抗体”には、組換え手段で調製、発現、作成または単離された抗体が含まれる；たとえば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモゾーマル(transchromosomal)である動物（たとえば、マウス）またはそれから調製したハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）その抗体を発現するように形質転換した宿主細胞から、たとえばトランスフェクトーマ(transfectoma)から単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル  ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列へスプライスすることを伴なう他のいずれかの手段で調製、発現、作成または単離された抗体。そのような組換え抗体は、たとえば抗体成熟に際して起きる再配列および変異を含むように工学的に操作された抗体を含む。
【０１５１】
本明細書中で用いる用語“特異性”または“特異的結合”は、ヘテロロガスな分子集団内の着目するコグネイトリガンドの決定要因である結合反応を表わす。したがって、指定された条件（たとえば、イムノアッセイ条件）下で、抗体はそれの特定のターゲットに特異的に結合し、試料中に存在する他の分子には有意量では結合しない。特異的結合は、ターゲットの同一性、選択した高い、中等度または低い結合アフィニティーまたはアビディティーに関して、結合が選択的であることを意味する。通常は、結合定数または結合力学値が少なくとも１０倍の差（少なくとも１ｌｏｇの差であると解釈される）であれば選択的結合が達成され、好ましくは、その差は少なくとも１００倍（少なくとも２ｌｏｇの差であると解釈される）、より好ましくは少なくとも１０００倍（少なくとも３ｌｏｇの差であると解釈される）である。用語“特異性”または“特異的結合”は、１以上の分子に結合する結合因子、たとえば交差結合因子に適用されるとも解釈される。
【０１５２】
本発明の抗体は、具体的にはＯ２５ｂ抗原の結合のみにおいて選択的であり、あるいはＯ２５ａ抗原と対比してＯ２５ｂ抗原を優先的に結合し、あるいはＯ２５ａ株に対して産
生されたポリクローナル血清、すなわちＯ２５ｂ抗原に低いアフィニティーで結合する血清と比較して、より高いアフィニティーでＯ２５ｂを結合する。したがって、本発明の抗体は、それらの抗原を差示的に結合する、たとえば少なくとも同等のアフィニティー、または同等より大きいアフィニティーで、たとえば少なくとも１ｌｏｇ、好ましくは少なくとも２ｌｏｇ、より好ましくは少なくとも３ｌｏｇのＫｄ差をもつアフィニティー差で結合すると解釈できる。Ｏ２５ａ抗原と対比してＯ２５ｂ抗原に選択的に結合するそのような抗体は、好ましくは診断または療法の目的に用いられる。ある診断目的には、具体的に、Ｏ２５ｂ抗原のみを結合する抗体を、検出可能な様式で使用する。
【０１５３】
用語“同じ特異性をもつ”、“同じ結合部位をもつ”、または“同じエピトープを結合する”の使用は、同等なモノクローナル抗体が同じまたは本質的に同じ、すなわち類似の免疫反応（結合）特性を示し、前選択したターゲット結合配列に対する結合について競合することを示す。特定のターゲットに対する抗体分子の相対的特異性は、たとえばHarlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)に記載される競合アッセイによって相対的に判定でき
る。
【０１５４】
本明細書中で用いる用語“対象”は、温血哺乳動物、特にヒトを表わすものとする。特に、本発明の医療用途またはそれぞれの処置方法は、ＭＤＲ大腸菌感染に関連する病的状態の予防もしくは処置を必要とする対象または初期もしくは後期疾患を含めた疾患に罹患している対象に適用される。用語“患者”は、予防処置または治療処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。したがって、用語“処置”は、予防処置および治療処置の両方を含むものとする。
【０１５５】
対象を、たとえばＭＤＲ大腸菌による病的状態の予防または治療のために処置する。特に、そのような疾患の感染もしくは発症または疾患再発のリスクをもつ対象、あるいはそのような感染症および／またはそのような感染症に関連する疾患に罹患している対象を処置する。
【０１５６】
具体的には、用語“予防”は、防止措置を表わし、それは発病開始の防止または発病のリスクを低下させるための予防措置を包含するものとする。
【０１５７】
具体的には、本明細書に記載する対象の病的状態を処置、防止または遅延するための方法は、その状態の原因物質としてのＭＤＲ大腸菌の病原性を妨害することによる。
【０１５８】
本明細書中で用いる用語“実質的に純粋な”または“精製した”は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の化合物、たとえば核酸分子または抗体を含む調製物を表わすものとする。純度はその化合物に適した方法により測定される（たとえば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）。
【０１５９】
用語“療法有効量”、すなわち本明細書中で本発明の化合物、たとえば抗体または免疫原の“有効量”または“十分な量”と互換性をもって用いられる用語は、対象に投与した際に有益または希望する結果（臨床結果を含む）を生じるのに十分な量または活性であり、したがって、有効量またはその同義語はそれが適用される状況に依存する。
【０１６０】
有効量は、そのような疾患または傷害を治療、予防または阻害するのに十分な化合物量を意味するものとする。疾患に関して、療法有効量の本明細書に記載する抗体は、具体的にはＭＤＲ大腸菌の病原性、たとえば粘膜表面における付着および定着、無菌の身体部位内での無制御な複製、ならびに細菌産生物によるホスト細胞の中毒を阻害することが有益
となる疾患または状態を治療、調節、減弱、反転し、またはそれに影響を及ぼすために使用される。
【０１６１】
そのような有効量に相当する化合物量は、たとえばその薬物または化合物、医薬配合物、投与経路、疾患または傷害のタイプ、処置される対象またはホストの素性など多様な要因に応じて異なるであろうが、それにもかかわらず当業者がルーティンに決定できる。
【０１６２】
本発明の抗体または免疫原は、ＭＤＲ大腸菌感染症の発症を阻害するために予防的に使用でき、あるいはＭＤＲ大腸菌感染症、特に治療抵抗性であることが知られているＭＤＲ大腸菌感染症、または特定の対象の場合には他の一般的な抗生物質療法による治療に対して治療抵抗性であることが証明されている感染症を治療するための療法に使用できる。
【０１６３】
本明細書に記載する抗体の療法有効量、たとえばその必要があるヒト患者に供給される量は、具体的には０．５〜５００ｍｇ、好ましくは１〜４００ｍｇの範囲、よりさらに好ましくは最高３００ｍｇ、最高２００ｍｇ、最高１００ｍｇまたは最高１０ｍｇであってもよい；ただし、たとえば急性疾患状態を治療するためにはより高い用量を適用することができる。
【０１６４】
さらに、療法有効量の本発明抗体による対象の治療または予防計画は、単回投与からなることができ、あるいは一連の適用を含むことができる。たとえば、抗体を少なくとも１年に１回、少なくとも半年に１回、または少なくとも１か月に１回投与することができる。しかし、他の態様においては、その処置のためにほぼ週１回からほぼ１日１回の投与まで抗体を対象に投与することができる。処置期間の長さは、疾患の重症度、急性または慢性いずれの疾患であるか、患者の年齢、抗体フォーマットの濃度および活性など、多様な要因に依存する。特定の治療または予防計画のコースにわたって治療または予防に用いる有効量を増加または減少させることができることも認識されるであろう。用量の変更は、当技術分野で既知の標準的な診断アッセイにより得ることができ、かつ明らかになる。ある場合には、長期投与が必要になる可能性がある。
【０１６５】
本明細書に記載する免疫原の有効量、たとえばＭＤＲ大腸菌感染に関連する病的状態を発症するリスクをもつ患者に供給される量は、具体的には１回当たり１〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。
【０１６６】
たとえば、ＭＤＲ大腸菌感染症に対して持続する有効な免疫応答を誘発するための初回−追加免疫化計画に従って、免疫原を初回量として投与し、続いて一定の時間枠内で１回以上の追加免疫量を投与することができる。好ましいワクチン接種計画には３回の投与が含まれるであろう；たとえば１回目を０日目、２回目を５〜４０日目、３回目を１０〜１００日目、好ましくは０、２８および９０日目。好ましい促進計画によれば、投与は０、７および１４日目であってもよい。促進計画は予防のために、たとえば予定した手術に直面している患者のために適用できる。通常はミョウバン、たとえばリン酸塩または水酸化物をアジュバントとして用いる。
【０１６７】
したがって、本発明の主題は、Ｏ２５ｂに対して高特異的なネズミｍＡｂを見出したことに基づく。これらの抗体は、ＳＴ１３１系列に属するＭＤＲ株の同定のための診断試薬として大きな効力をもつ。さらに、特にヒト化によって、これらのｍＡｂはＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株により起きる大腸菌感染症の予防（たとえば、高リスクグループについて）および治療に用いるのに適切となる。
【０１６８】
Ｏ２５ｂおよびＯ２５（Ｏ２５ａ）糖質抗原は、Ｏ２５に対する免疫血清がＯ２５ｂ抗原を発現する大腸菌株の診断同定に際してルーティンに用いられるという事実に基づいて
、同一であるかまたはきわめて類似すると考えられていた。ＳＴ１３１株におけるＯ抗原合成の遺伝的バックグラウンドは完全に解明されてはいないが、ｒｆｂクラスター（Ｏ抗原合成をコードする）内の特定の遺伝子がＰＣＲベースのＯ２５ｂ株同定の基礎をなす。さらに、Ｏ２５（ａ）抗原とＯ２５ｂ抗原の相異を支持する構造データはこれまで無い。
【０１６９】
したがって、本発明の抗体がＯ２５ｂ抗原を特異的に結合し、Ｏ２５ｂ抗原とＯ２５ａ抗原を特異的に識別することができるのは意外であった。
【０１７０】
Ｏ２５ｂ抗原を発現する大腸菌株とＯ２５ａ抗原を発現する大腸菌株の遺伝的相異を確認するために、市販株８１００９(Szijarto et al, FEMS Microbiol Lett, 2012, 332: 131-6)から、保存されたフランキング遺伝子ｇｎｄおよびｇａｌＦに対して特異的なオリ
ゴヌクレオチドから出発するプライマーウォーク法(primer walk method)を用いて、Ｏ抗原合成をコードするｒｆｂクラスターを配列決定した。得られたｒｆｂオペロンのコンティグ(contig)は１１，３００ｂｐの長さであり、Ｏ２５抗原合成酵素（ＮＣＢＩ寄託番号ＧＵ０１４５５４）をコードするものに対して部分的に相同であるにすぎない。このことから、Ｏ２５ｂ  ｒｆｂオペロンの３’末端にある２０４３ｂｐ長さのセグメントはＯ２５  ｒｆｂオペロンの対応する領域と相同ではなく、この場合はこのセグメントがフコースの合成および輸送をコードする６２６７ｂｐ長さの配列により置き換えられていることが分かった。
【０１７１】
大腸菌ＳＴ１３１から単離されたＬＰＳ中に存在するＯ−特異的ＰＳの生物学的な反復単位(repeating unit)（ＲＵ）の構造を、１つの反復単位（ＲＵ）でコアＯＳを置換することにより構築された精製画分において詳細に分析した。ＬＰＳ  ＳＴ１３１のＲＵは、図３に構造を示すＯ−アセチル化された五糖である。
【０１７２】
実際に、ＳＴ１３１  Ｏ−ＰＳのＲＵ構造は、Kenneら(Kenne, Lindberg et al., Carbohydr Res. 1983 Oct 28; 122(2): 249-56)により報告されたＬＰＳ  Ｏ２５  ＲＵと異
なっており、本発明者らの知る限りそれは大腸菌リポ多糖中の新規なＯ−血清型である(Stenutz et al. FEMS Microbiol Rev. 2006 May; 30(3): 382-403. Review)。さらに、Ｌ
ＰＳ  ＳＴ１３１から単離したコアオリゴ糖の予備的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析および組成分析（糖およびメチル化の分析）の結果は、Ｋ−１２タイプ、すなわち先にＳzijarto V.らが遺伝子分析に基づいて報告したものを支持した(Szijarto et al, FEMS Microbiol Lett, 2012, 332: 131-6)。ＬＰＳ  ＳＴ１３１は２つの主要コアオリゴ糖（ＯＳ）
グリコフォーム(glycoform)からなる。グリコフォームのタイプはＯ−特異的多糖（ＰＳ
）の存否に依存する。非置換コアＯＳの優勢なグリコフォームはトランケート形のＫ−１２コアオリゴ糖、すなわち→７）−α−Ｈｅｐｐ−（１→６）−α−Ｇｌｃｐ二糖が欠如したものである。その二糖の存在がＯ−ＰＳ置換コアＯＳと非置換コアＯＳの相異である。
【０１７３】
具体的観点によれば、下記の抗体が提供される：Ｏ２５ｂ特異的エピトープを選択的に結合する抗体、たとえば８Ｄ５−１Ｇ１０抗体、または６Ｄ１−１Ｂ２もしくは８Ａ１−１Ｇ８と命名されたいずれかの抗体、または８Ｄ１０−Ｃ８抗体と同じエピトープに結合する抗体（この用語には、本質的に同じエピトープに結合するバリアントが含まれる）；あるいは８Ｄ５−１Ｇ１０抗体、または６Ｄ１−１Ｂ２もしくは８Ａ１−１Ｇ８と命名されたいずれかの抗体、または８Ｄ１０−Ｃ８抗体と同じ結合部位を含む抗体（この用語は、本質的に同じ結合部位を含むバリアントが含まれる）。６Ｄ１−１Ｂ２、８Ａ１−１Ｇ８、８Ｄ５−１Ｇ１０と命名された抗体は、特にＯ２５ｂ抗原とＯ２５ａ抗原を特異的に識別してＯ２５ｂ抗原のみを結合する結合部位を含む。８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体は、特にＯ２５ｂおよびＯ２５ａ抗原を交差特異的に結合し、Ｏ２５ａ抗原と比較してＯ２５ｂ抗原を優先的に結合する、結合部位を含む。
【０１７４】
抗体が交差競合し、したがってある時点では１種類の抗体のみがそのエピトープに結合できるならば、すなわち一方の抗体が他方の結合を阻止しまたは作用を変更するならば、それらの抗体は“同じエピトープに結合する”または“同じ結合部位を含む”または“本質的に同じ結合”特性をもつと言われる。
【０１７５】
本明細書中で抗体に関して用いる用語“競合する”または“交差競合する”は、第１抗体またはその抗原結合部が第２抗体またはその抗原結合部の結合に十分に類似する様式でエピトープに結合し、したがって第１抗体とそれのコグネイトエピトープとの結合の結果が、第２抗体の存在下では第２抗体の非存在下での第１抗体の結合と比較して検出可能なほど低減することを意味する。代わりに、第２抗体のエピトープへの第２抗体の結合も第１抗体の存在下で検出可能なほど低減する可能性はあるが、必ずしもそうではない。すなわち、第２抗体は第１抗体がそれのエピトープに結合するのを阻害することなく、第１抗体は第２抗体がそれの各エピトープに結合するのを阻害する可能性がある。しかし、各抗体が他の抗体とそれのコグネイトエピトープとの結合を検出可能なほど（同じ、より大きい、またはより少ない程度であっても）阻害する場合、それらの抗体はそれらの各エピトープ（単数または複数）の結合について互いに“交差競合する”と言われる。競合または交差競合する抗体は共に本発明に包含される。
【０１７６】
本明細書において、競合は、たとえば実施例のセクションに記載するように、競合ＥＬＩＳＡ分析により測定して約３０％より大きな相対阻害を意味する。特定の状況において、たとえば意図するＯ２５ｂ結合機能をもつように設計された新規抗体を選択またはスクリーニングするために競合分析を用いる場合、競合の適切なレベルの基準としてより高い相対阻害閾値を設定することが望ましい可能性がある。したがって、抗体を十分に競合的であるとみなす前に、たとえば、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはさらには少なくとも１００％の相対阻害が検出される場合に競合結合についての基準を設定することが可能である。
【０１７７】
具体的には、６Ｄ１−１Ｂ２、８Ａ１−１Ｇ８、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体のいずれの可変領域、特に６Ｄ１−１Ｂ２、８Ａ１−１Ｇ８、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８抗体からなる群から選択される抗体のＣＤＲ配列のうち少なくとも１、好ましくは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５もしくは少なくとも６つのＣＤＲ配列、またはその機能活性であるＣＤＲバリアントを含む、抗体が提供される。より具体的には、６Ｄ１−１Ｂ２、８Ａ１−１Ｇ８、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名されたいずれの抗体が提供される。
【０１７８】
具体的には、８Ｄ５−１Ｇ１０抗体もしくは８Ｄ１０−Ｃ８抗体、またはそのいずれかの機能活性バリアントは、寄託された材料またはそれに含まれる各ヌクレオチド配列、たとえばプラスミドのうちの１つおよび／または寄託された宿主細胞のうちの１つを用いて調製することができる。
【０１７９】
具体的観点によれば、８Ｄ５−１Ｇ１０抗体またはその機能均等バリアントは、ＤＳＭ
２６７６３および／またはＤＳＭ  ２６７６２で寄託された宿主細胞に取り込まれたいずれかのプラスミドによりコードされる可変領域を含む抗体から誘導できる；たとえば、寄託された材料の部分または（点）変異ＣＤＲ配列を用いて、特異的抗体またはそのいずれかの機能活性バリアントを工学的に作成する。
【０１８０】
さらなる具体的観点によれば、８Ｄ５−１Ｇ１０抗体またはその機能均等バリアントは、ＤＳＭ  ２６７６３および／またはＤＳＭ  ２６７６２で寄託された宿主細胞により産
生された抗体の可変領域から、またはそれを用いて誘導できる；たとえば、寄託された材料の部分配列、たとえばＣＤＲ配列のうち１以上を用いて、特異的抗体またはそのいずれかの機能活性バリアントを工学的に作成する。
【０１８１】
具体的には、６Ｄ１−１Ｂ２または８Ａ１−１Ｇ８抗体バリアントは、８Ｄ５−１Ｇ１０抗体の機能活性ＣＤＲバリアントであり、たとえばＣＤＲ配列のうち少なくとも１つに部分的変更をもつ。
【０１８２】
具体的観点によれば、８Ｄ１０−Ｃ８抗体またはその機能均等バリアントは、ＤＳＭ  ２８１７１および／またはＤＳＭ  ２８１７２で寄託された宿主細胞に取り込まれたいずれかのプラスミドによりコードされる可変領域を含む抗体から誘導できる；たとえば、寄託された材料の部分または（点）変異ＣＤＲ配列を用いて、特異的抗体またはそのいずれかの機能活性バリアントを工学的に作成する。
【０１８３】
さらなる具体的観点によれば、８Ｄ１０−Ｃ８抗体またはその機能均等バリアントは、ＤＳＭ  ２８１７１および／またはＤＳＭ  ２８１７２で寄託された宿主細胞により産生された抗体の可変領域から、またはそれを用いて誘導できる；たとえば、寄託された材料の部分配列、たとえばＣＤＲ配列のうち１以上を用いて、特異的抗体またはそのいずれかの機能活性バリアントを工学的に作成する。
【０１８４】
ある観点において、本発明は、重鎖および軽鎖を含み、その際、重鎖またはＶＨ可変領域または各ＣＤＲがそれぞれの寄託されたプラスミドおよび／またはそれぞれの寄託された宿主細胞に由来するアミノ酸配列を含む、そのようなバリアント抗体、好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはネズミ、ヒト化またはヒト抗体を提供する。
【０１８５】
ある観点において、本発明は、重鎖および軽鎖を含み、その際、軽鎖またはＶＬ可変領域または各ＣＤＲがそれぞれの寄託されたプラスミドおよび／またはそれぞれの寄託された宿主細胞に由来するアミノ酸配列を含む、そのようなバリアント抗体、好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはネズミ、ヒト化またはヒト抗体を提供する。
【０１８６】
ある観点において、本発明は、重鎖および軽鎖を含み、その際、重鎖および軽鎖、またはＶＨ／ＶＬ可変領域、または各ＣＤＲがそれぞれの寄託されたプラスミドおよび／またはそれぞれの寄託された宿主細胞に由来するアミノ酸配列を含む、そのようなバリアント抗体、好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはネズミ、ヒト化またはヒト抗体を提供する。
【０１８７】
ある観点において、本発明はまた、寄託された材料に由来するそれぞれの結合配列、たとえば可変配列および／またはＣＤＲ配列を含むそのようなバリアント抗体を提供し、その際、結合配列、たとえばいずれかのＣＤＲ配列は、寄託された材料に由来するアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性をもつ配列を含み、そのバリアントは機能活性バリアントである。
【０１８８】
本明細書に記載するように、１観点において本発明は、Ｏ２５ｂ抗原への結合に対してモノクローナル抗体８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と競合する能力を特徴とする抗体分子を提供する。６Ｄ１−１Ｂ２、８Ａ１−１Ｇ８、８Ｄ５−１Ｇ１０抗体はいずれもネズミＩｇＧ３抗体であり、８Ｄ１０−Ｃ８抗体はカッパ軽鎖を保有するネズミＩｇＧ２ｂ抗体であり、これらを本発明者らが単離および特性解明した。８Ｄ５−１Ｇ１０抗体または８Ｄ１０−Ｃ８抗体の可変ドメインは、本明細書中に述べる寄託された材料により発現される。したがって、８Ｄ５−１Ｇ１０抗体または８Ｄ１０−Ｃ８抗体の軽鎖および
重鎖ならびにＶＬ／ＶＨドメインにより決定される結合特性を本明細書に十分に開示し、それを親抗体として、または本発明の機能活性バリアントもしくは競合抗体との比較に使用できるようにする。
【０１８９】
８Ｄ５−１Ｇ１０の重鎖（８Ｄ５−１Ｇ１０−ＨＣ）の成熟した可変ドメインは、たとえばＤＳＭ  ２６７６２の宿主細胞、またはそれに取り込まれたコードプラスミドの各配列情報を用いて調製できる。
【０１９０】
８Ｄ５−１Ｇ１０の軽鎖（８Ｄ５−１Ｇ１０−ＬＣ）の成熟した可変ドメインは、たとえばＤＳＭ  ２６７６３の宿主細胞、またはそれに取り込まれたコードプラスミドの各配列情報を用いて調製できる。
【０１９１】
８Ｄ１０−Ｃ８の重鎖（８Ｄ１０−Ｃ８−ＨＣ）の成熟した可変ドメインは、たとえばＤＳＭ  ２８１７２の宿主細胞、またはそれに取り込まれたコードプラスミドの各配列情報を用いて調製できる。
【０１９２】
８Ｄ１０−Ｃ８の軽鎖（８Ｄ１０−Ｃ８−ＬＣ）の成熟した可変ドメインは、たとえばＤＳＭ  ２８１７１の宿主細胞、またはそれに取り込まれたコードプラスミドの各配列情報を用いて調製できる。
【０１９３】
他の大腸菌抗原、たとえばＯ２５抗原以外のいずれかの糖質抗原またはいずれかのコア抗原に対比してＯ２５ｂ抗原を優先的に結合する差示結合アフィニティーは、好ましくは少なくとも１０倍高く（すなわち、少なくとも１０のＫｄ差をもつ）、好ましくは少なくとも１００倍高く、より好ましくは少なくとも１０００倍高い。
【０１９４】
Ｏ２５ｂ抗原を優先的に結合する差示結合アフィニティーは、市販のタイピング血清、たとえばＳｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔからの高力価大腸菌Ｏ２５抗血清（＃８１３６９）と比較して、少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高い。
【０１９５】
Ｏ２５ａ抗原と比較してＯ２５ｂ抗原を優先的に結合する差示結合アフィニティーは、具体的には少なくとも同等であるか、または同等より大きく、たとえば少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高い。
【０１９６】
本発明の好ましい抗体は、前記の個々の抗原のいずれか、特にＯ２５ｂ抗原を、高いアフィニティーで、特に高い結合速度および／または低い離脱速度で、あるいは高い結合アビディティーで結合する。抗体の結合アフィニティーは、通常は、抗原結合部位の半分が占有される抗体濃度、すなわち解離定数（Ｋｄ、またはＫＤ）として知られるものにより特性付けられる。通常は、Ｋｄ＜１０−７Ｍ、ある場合には、たとえば療法目的にはより高いアフィニティー、たとえばＫｄ＜１０−８Ｍ、好ましくはＫｄ＜１０−９Ｍをもつ結合剤は高アフィニティー結合因子とみなされ、よりさらに好ましくはＫｄ＜１０−１０Ｍである。
【０１９７】
さらに、特に好ましい態様において、たとえば少なくとも２つの抗原に結合する際に、個々の抗原結合アフィニティーは中等度アフィニティーのもの、たとえば１０−６Ｍ未満、最大１０−７ＭのＫｄをもつものである。
【０１９８】
中等度アフィニティーの結合因子は、本発明に従って、好ましくは必要ならばアフィニティー成熟法と組み合わせて提供できる。
【０１９９】
アフィニティー成熟法は、ターゲット抗原に対するアフィニティーが増大した抗体を調製する方法である。アミノ酸変異形成を含めた、または免疫グロブリン遺伝子セグメントの体細胞変異の結果としての抗体の構造変化を用いて、抗原への結合部位のバリアントを調製し、より大きなアフィニティーのものを選択する。アフィニティー成熟した抗体は、親抗体より数ｌｏｇ倍大きなアフィニティーを示す可能性がある。単一の親抗体をアフィニティー成熟法で処理してもよい。あるいは、ターゲット抗原に対する類似の結合アフィニティーをもつ抗体のプールを親構造とみなし、それらを変異させてアフィニティー成熟した単一抗体またはアフィニティー成熟したそのような抗体のプールを得ることができる。
【０２００】
本発明による抗体の好ましいアフィニティー成熟バリアントは、結合アフィニティーにおいて少なくとも１０倍の増大、好ましくは少なくとも１００倍の増大を示す。アフィニティー成熟法は、親分子の各ライブラリーを用いる選択作戦の過程で、中等度結合アフィニティーをもつ抗体について、結合アフィニティーＫｄ＜１０−７Ｍの特異的ターゲット結合特性をもつ本発明の抗体を得るために使用できる。あるいは、本発明による抗体のアフィニティー成熟によってアフィニティーをよりいっそう増大させて、１０−８Ｍ未満または１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満、またはさらに１０−１１Ｍ未満、最も好ましくはピコモル濃度範囲のＫｄに相当する高い数値を得ることすらできる。
【０２０１】
具体的観点は、特異的な抗細菌機能活性、たとえば補体媒介殺菌作用およびオプソニン食菌作用による取込みと殺菌を特徴とする、本発明の抗体に関する。
【０２０２】
食菌エフェクター細胞は、補体の活性化を用いる他の経路によって活性化することができる。微生物の表面抗原に結合する抗体はそれらのＦｃ領域で補体カスケードの第１成分を引き付け、そして“古典的な”補体系の活性化を開始する。その結果、食菌エフェクター細胞が刺激され、それにより補体および抗体依存性の機序（ＣＤＣ）によって最終的にターゲット細菌を死滅させる。
【０２０３】
具体的態様によれば、本発明の抗体は、標準ＳＢＡまたはＯＰＫアッセイのいずれかにより測定して免疫エフェクター細胞の存在下で細胞傷害活性をもつ。対照と比較して殺菌率が有意に増大すれば、本発明の抗体についてＳＢＡまたはＯＰＫのいずれかのアッセイにより測定した細胞傷害活性を示すことができる。ＳＢＡまたはＯＰＫに関連する殺菌活性は、好ましくは絶対パーセント増大として測定され、それは好ましくは５％より高く、より好ましくは１０％より高く、よりさらに好ましくは２０％、３０％、４０％または５０％より高い。
【０２０４】
本発明の抗体は、ハイブリドーマ法を用いて同定または入手でき、そのような方法では、マウスまたは他の適切なホスト動物、たとえばハムスターを免疫化して、免疫化に用いたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生できるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで適切な融合剤、たとえばポリエチレングリコールを用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を作成する。
【０２０５】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、その抗原を指向するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降法により、またはインビトロ結合アッセイ、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）により判定する。
【０２０６】
たとえば、本発明の抗体は、源（親）抗体、たとえばカナマイシン耐性をコードするカセットでｋｐｓクラスター（莢膜合成をコードする）を置き換えることによる代表的ＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株８１００９の無莢膜変異体（たとえば、８１００９Δｋｐｓ：：ｋａｎ）でマウスを免疫化することにより得られた抗体から得ることができる。マウスから得た血清試料を次いで分析し、Ｏ２５ｂ抗原に対して最高ＩｇＧ力価を示すマウス（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット法による）の脾臓をハイブリドーマ作成に使用できる。サブクローニングの後、Ｏ２５ｂ抗原に対して特異的であり、Ｏ２５ｂ抗原を発現する生菌野生型大腸菌株の表面に結合する抗体を分泌する、ハイブリドーマクローンを選択することができる。これらのｍＡｂを、Ｏ２５ｂ抗原の特異的結合について、および場合によりＯ２５ａ抗原と対比してＯ２５ｂ抗原を優先的に結合するそれの差示結合アフィニティーについてさらに試験するために、またたとえば種々の診断または療法の目的で抗体を工学的に操作するために、次いでハイブリドーマ上清から精製することができる。
【０２０７】
差示結合抗体（本明細書中で選択抗体とも呼ぶ）は、ある場合には単一抗原に対するスクリーニングによって明らかになる。差示結合クローンの単離可能性を高めるためには、種々の抗原に対して進化的に(processively)スクリーニングすることにより多重選択圧をかけるであろう。特別なｍＡｂ選択方策は、Ｏ２５ｂおよびＯ２５ａ成分または他の大腸菌抗原を交互に用いる。
【０２０８】
抗体ライブラリー、たとえば酵母ディスプレイした抗体ライブラリーから抗体を選択するためには、組換え抗原（単数または複数）を使用できる。
【０２０９】
いずれの場合も、当技術分野で既知の抗体最適化法によって選択的結合をさらに改善することができる。たとえば、本明細書に記載する免疫グロブリン鎖の可変領域の特定領域に１以上の最適化方策を施すことができ、これには、選択したＣＤＲまたは枠組み構造領域の軽鎖シャフリング(light chain shuffling)、デスティネイショナル（部位指定）変
異形成(destinational mutagenesis)、ＣＤＲアマルガメーション（融合）(CDR amalgamation)、定方向変異形成(directed mutagenesis)が含まれる。
【０２１０】
希望する選択的結合特性を備えた抗体を同定するためのスクリーニング法は、ディスプレイ技術により実施できる（ファージ、細菌、酵母または哺乳動物の細胞を使用）。反応性は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、またはフローサイトメトリーを伴なう表面染色に基づいて、たとえば標準アッセイ法を用いて査定することができる。
【０２１１】
希望する特性を備えた差示結合抗体が同定されると、それらの抗体が認識した優性エピトープ（単数または複数）を決定できる。エピトープマッピングのための方法は当技術分野で周知であり、たとえばEpitope Mapping: A Practical Approach, Westwood and Hay,
eds., Oxford University Press, 2001に示されている。
【０２１２】
エピトープマッピングは、それに抗体が結合するエピトープの同定に関するものである。タンパク質上のエピトープの位置を決定するための多数の方法が当業者に知られており、これには抗体−抗原複合体の結晶学的分析、競合アッセイ、遺伝子フラグメント発現アッセイ、および合成ペプチドベースのアッセイが含まれる。基準抗体と“同じエピトープを結合する”抗体は、本明細書中で下記のように解釈される。２種類の抗体が同一エピトープまたは立体的にオーバーラップするエピトープを認識する場合、それらの抗体を同一エピトープまたは本質的に同一もしくは実質的に同一のエピトープを結合すると言う。２種類の抗体が同一エピトープまたは立体的にオーバーラップするエピトープに結合するかどうかを判定するために慣用される方法は競合アッセイであり、それは標識抗原または標
識抗体のいずれかを用いて多種多様なフォーマットで構成することができる。通常は、抗原を９６ウェルプレートに固定化し、非標識抗体が標識抗体の結合をブロックする能力を放射性標識または酵素標識により測定する。
【０２１３】
希望する差示結合特性を備えた抗体が同定されると、それらの抗体（抗体フラグメントを含む）を当技術分野で周知の方法、たとえばハイブリドーマ法または組換えＤＮＡ法により調製できる。
【０２１４】
組換えモノクローナル抗体は、たとえば必要な抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、周知の組換え発現ベクター、たとえば抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含む本発明のプラスミドまたは発現カセット（単数または複数）を用いて、組換え宿主細胞を発現のためのコード配列でトランスフェクションすることにより調製できる。組換え宿主細胞は原核細胞および真核細胞、たとえば前記のものであってもよい。
【０２１５】
具体的観点によれば、ヌクレオチド配列を遺伝子操作に用いて、抗体をヒト化し、または抗体のアフィニティーもしくは他の特性を改善することができる。たとえば、抗体をヒトにおける臨床試験および処置に用いる場合、免疫応答を避けるために、定常領域をヒト定常領域にさらに近似するように工学的に操作することができる。ターゲットＯ２５ｂに対してより大きなアフィニティーおよび大腸菌に対してより大きな有効性を得るために、抗体配列を遺伝子操作することが望ましい可能性がある。抗体に１以上のポリヌクレオチド変更を行なってもなおターゲットＯ２５ｂに対するそれの結合能を維持できることは当業者に自明であろう。
【０２１６】
多様な手段による抗体分子の調製は一般に十分に理解されている。たとえば、US Patent 6331415 (Cabillyら)には抗体の組換え体の調製方法が記載され、その際、単一ベクタ
ーから、または単一細胞において２つの別個のベクターから、重鎖と軽鎖を同時に発現させている。Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2): 191 -202)およびLee and Kwak (2003, J. Biotechnology 101: 189-198)には、別個の大腸菌培養において発現させたプラスミドを用いて別個に産生させた重鎖および軽鎖からのモノクローナル抗体の調製が記載されている。抗体の調製に関する多様な他の技術が、たとえばHarlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)に示されている。
【０２１７】
所望により、本発明の抗体、たとえば８Ｄ５−１Ｇ１０抗体もしくは８Ｄ１０−Ｃ８抗体、またはそれぞれの結合部位もしくはＣＤＲを配列決定し、次いでポリヌクレオチド配列またはその配列バリアントもしくは変異体を発現または伝播のためのベクターにクローニングすることができる。抗体をコードする配列を宿主細胞においてベクター内に保持し、次いでその宿主細胞を増殖させ、将来使用するために凍結することができる。細胞培養における組換えモノクローナル抗体の調製は、当技術分野で既知の手段で抗体遺伝子をＢ細胞からクローニングすることにより実施できる。
【０２１８】
他の観点において、本発明は、本発明の組換え抗体の調製をコードする配列を含む、単離された核酸を提供する。
【０２１９】
他の観点において、本発明は、本発明の組換えエピトープまたは本発明のそのようなエピトープを含む分子の調製をコードする配列を含む、単離された核酸を提供する。しかし、本発明のエピトープは合成により、たとえば当技術分野で周知であるいずれかの合成法により調製することもできる。
【０２２０】
抗体またはエピトープをコードする核酸は、いずれか適切な特徴をもつことができ、い
ずれか適切な機構またはその組合わせを含むことができる。したがって、たとえば抗体またはエピトープをコードする核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのハイブリッドの形態であってもよく、自然界に存在しない塩基、修飾された主鎖、たとえば核酸の安定性を増進するホスホチオエート主鎖、または両方を含むことができる。その核酸を、有利にはターゲット宿主細胞（単数または複数）における希望する発現、複製および／または選択を増進する機構を含む本発明の発現カセット、ベクターまたはプラスミドに取り込ませることができる。そのような機構の例には、複製起点要素、選択遺伝子要素、プロモーター要素、エンハンサーエレメント要素、ポリアデニル化配列要素、終止要素などがが含まれ、それらの適切な例が多数知られている。
【０２２１】
本発明はさらに、本明細書に記載するヌクレオチド配列のうち１以上を含む組換えＤＮＡ構築体を提供する。これらの組換え構築体は、ベクター、たとえばプラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターと併せて用いられ、開示したいずれかの抗体をコードするＤＮＡ分子がこれらに挿入される。
【０２２２】
モノクローナル抗体は、連続培養細胞系により抗体分子を調製するいずれかの方法を用いて調製される。モノクローナル抗体を調製するのに適した方法の例には、Kohler et al. (1975, Nature 256: 495-497)のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ
法(Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001;およびBrodeur et al., Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications pp 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987))が
含まれる。
【０２２３】
本発明はさらに、本明細書に記載する抗体または免疫原および医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、本発明に従ってボーラス注射もしくはボーラス注入として、または連続注入により投与される。そのような投与手段を容易にするのに適した医薬用キャリヤーは当技術分野で周知である。
【０２２４】
医薬的に許容できるキャリヤーには、一般にあらゆる適切な溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌薬および抗真菌薬、等張化剤ならびに吸収遅延剤など、本発明により提供される抗体または関連する組成物もしくは組合わせと生理的に適合するものが含まれる。医薬的に許容できるキャリヤーのさらに他の例には、無菌水、塩類溶液、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそのいずれかの組合わせが含まれる。
【０２２５】
そのような１観点において、抗体は希望する投与経路に適切な１種類以上のキャリヤーと組み合わせることができ、抗体をたとえば乳糖、ショ糖、デンプン、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギネート、ポリビニルピロリジン、ポリビニルアルコールのいずれかと混和し、一般的な投与のために場合によりさらに打錠またはカプセル封入することができる。あるいは、抗体を塩類溶液、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、トラガントゴム、および／または各種緩衝液に溶解することができる。他のキャリヤー、佐剤、および投与様式は、医薬技術分野で周知である。キャリヤーは制御放出物質または遅延物質、たとえばモノステアリン酸グリセリルもしくはジステアリン酸グリセリル（単独またはろうと共に）、または当技術分野で周知である他の物質を含有してもよい。
【０２２６】
他の医薬的に許容できるキャリヤーが当技術分野で知られており、たとえばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCESに記載されている。液状配合物は液剤、乳剤または懸濁液剤
であってもよく、懸濁化剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤およびキレート化剤などの添
加剤を含有することができる。
【０２２７】
本発明の抗体または免疫原および１種類以上の療法有効薬剤を配合した医薬組成物が考慮される。希望する純度をもつその免疫グロブリンを場合により医薬的に許容できるキャリヤー、賦形剤または安定剤と混合することにより、凍結乾燥配合物または水溶液の形態の、本発明の抗体または免疫原の安定な貯蔵用配合物を調製する。インビボ投与に使用するための配合物は、具体的には無菌であり、好ましくは無菌水溶液の形態である。これは、除菌メンブレンによる濾過または他の方法によって容易に達成できる。本明細書に開示する抗体および他の療法有効薬剤を、イムノリポソームとして配合し、および／またはマイクロカプセル内に封入してもよい。
【０２２８】
本発明の抗体または免疫原を含む医薬組成物の投与は、下記を含めた多様な方法で行なうことができる：経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳腔内、経皮、粘膜、局所、たとえばゲル剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤など、腹腔内、筋肉内、肺内、たとえば吸入法もしくは肺送達システムの使用、膣、非経口、直腸、または眼内。
【０２２９】
非経口投与に用いる代表的配合物には、皮下、筋肉内または静脈内注射に適したもの、たとえば無菌の液剤、乳剤または懸濁液剤が含まれる。
【０２３０】
１態様において、本発明の抗体または免疫原は、たとえば疾患の改善または予防のための単剤療法として対象に投与される唯一の療法有効薬剤である。
【０２３１】
あるいは、本発明の抗体または免疫原は、１種類以上の他の治療薬または予防薬と併せて投与され、それには標準処置、たとえば抗生物質、ステロイド系および非ステロイド系の炎症阻害薬、および／または他の抗体ベースの療法、たとえば抗細菌薬または抗炎症薬を用いるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３２】
併用療法は、特にたとえばＭＤＲ大腸菌感染症を処置するために用いられる標準計画を使用する。これには抗生物質、たとえばチゲサイクリン、リネゾリド(linezolide)、メチシリンおよび／またはバンコマイシンを含めることができる。
【０２３３】
併用療法においては、抗体を混合物として、または１以上の他の療法計画を併用して、たとえば併用療法の前、同時または後に投与することができる。
【０２３４】
ある場合には、本発明の免疫原を含むワクチン、すなわち単価ワクチンを免疫原の予防投与に使用できる。なお、同一または異なるターゲット病原体に対する免疫応答を誘発する異なる免疫原を含む多価ワクチンも使用できる。
【０２３５】
本発明の抗体、免疫原またはそれぞれの医薬製剤の生物学的特性は、エクスビボでの細胞実験、組織実験、および全生物実験において解明できる。当技術分野で知られているように、疾患もしくは疾患モデルに対する処置について薬物の有効性を判定するために、または薬物の薬物動態、薬力学、毒性および他の特性を判定するために、薬物はしばしばインビボで動物において試験され、これにはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルが含まれるが、これらに限定されない。これらの動物を疾患モデルと呼ぶことができる。療法薬はしばしばマウスにおいて試験され、これにはヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、およびトランスジェニックマウス（ノックイン動物およびノックアウト動物を含む）が含まれるが、これらに限定されない。そのような実験は、能動または受動免疫療法における適切な半減期、エフェクター機能、（交差）中和活性および／または免疫応答を備えた治療薬または予防薬として使用する抗体の可能性を判定するために有意義なデータを提供できる。いずれかの生物、好ましくは哺乳動物を試験に使用でき
る。たとえば霊長類、サルは、それらが遺伝的にヒトと類似するので適切な療法モデルとなる可能性があり、したがって被験薬または被験組成物の有効性、毒性、薬物動態、薬力学、半減期または他の特性を試験するために使用できる。薬剤として承認されるにはヒトにおける試験が最終的に要求され、したがってもちろんこれらの実験が考慮される。したがって、本発明の抗体、免疫原またはそれぞれの医薬組成物をヒトにおいて試験して、治療または予防におけるそれらの有効性、毒性、免疫原性、薬物動態および／または他の臨床特性を判定することができる。
【０２３６】
本発明はまた、診断目的のための、たとえば生物液体試料における細菌負荷もしくはターゲットの濃度を検出および定量測定する方法に使用するための本発明の対象抗体、または免疫試薬としての抗体を提供する。
【０２３７】
本発明は、敗血症またはＭＤＲ大腸菌感染症の程度、たとえば試料のＭＤＲ大腸菌負荷を体液などの生物学的試料において検出するための方法であって、試料を本発明の抗体と接触させることを含む方法を提供する。本発明の抗体はいずれか既知のアッセイ法、たとえば競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイ、および酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）に使用できる。
【０２３８】
好ましい診断アッセイは下記のように実施される。ターゲット抗原特異的抗体をラテックスビーズに固定化し、それを体液試料中に存在する細菌または試料から単離した細菌と共にインキュベートする。細菌の表面に発現した対応するコグネイト抗原の存在下で有色ラテックスビーズが凝集するので、陽性反応は肉眼で検出できる。
【０２３９】
本発明に従って用いる体液には、対象の生体試料、たとえば組織抽出液、尿、血液、血清、糞便および粘液が含まれる。
【０２４０】
１態様において、この方法は、抗体が固体支持体の表面に結合できる条件下で、固体支持体を特異的にターゲットとの複合体を形成する過剰の特定タイプの抗体フラグメントと接触させることを含む。抗体が結合した得られた固体支持体を、次いで生物液体試料と接触させ、これにより生物液体試料中のターゲットを抗体に結合させ、ターゲット−抗体複合体を形成させる。この複合体を検出可能なマーカーで標識することができる。あるいは、複合体の形成前にターゲットまたは抗体のいずれかを標識しておくことができる。たとえば、検出可能なマーカー（標識）を抗体にコンジュゲートさせることができる。次いで複合体を検出および定量測定し、これにより生物液体試料中のターゲットを検出し、その濃度を定量測定することができる。
【０２４１】
特定の用途について、本発明の抗体を、有機分子、酵素標識、放射性標識、有色標識、蛍光標識、色素原標識、発光性標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、金コロイド、およびその混合物からなる群から選択される標識またはレポーター分子にコンジュゲートさせる。標識またはレポーター分子にコンジュゲートした抗体は、たとえばアッセイ系または診断法において、たとえばＭＤＲ大腸菌感染症またはそれに関連する病的状態を診断するために使用できる。
【０２４２】
本発明の抗体を他の分子にコンジュゲートさせることができ、これによりそのコンジュゲートをたとえば結合アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）および結合試験において簡単に検出できる。
【０２４３】
本発明の他の観点は、抗体を含むキットを提供し、これは１種類以上の抗体のほかに、多様な診断薬または療法薬を収容することができる。キットは、診断法または療法に使用するための指示も収容できる。そのような指示は、たとえばキットに収容されたデバイス
上に、たとえばＭＤＲ大腸菌負荷を測定して疾患を診断する前にたとえば診断目的で生体試料を調製するための、たとえば細胞および／またはタンパク質含有画分を分離するための、ツールまたはデバイス上に付与することができる。有利には、そのようなキットは、本明細書に記載する多様な診断法のうち１以上に使用できる抗体および診断薬または診断試薬を収容する。他の好ましい態様において、キットは、抗体をたとえば凍結乾燥形態で収容し、場合により、凍結乾燥品を再構成するための指示および媒体を含み、および／または近い将来投与する注射用組成物を形成するために使用前に混合しうる医薬的に許容できるキャリヤー（単数または複数）との組合わせで収容する。
【０２４４】
８Ｄ５−１Ｇ１０および８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体、具体的には抗体軽鎖および／または重鎖のいずれかは、さらに、DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b / Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig (DE)に寄託された生物材料を特徴とする。
【０２４５】
これらの寄託物は形質転換された大腸菌培養物を表わし、それぞれ目的遺伝子の挿入配列でクローニングされたプラスミドを含む。目的遺伝子は、マウスモノクローナル抗体８Ｄ５−１Ｇ１０（ＩｇＧ３）の重鎖および軽鎖の可変ドメイン、ならびにマウスモノクローナル抗体８Ｄ１０−Ｃ８（ＩｇＧ２ｂ）の重鎖および軽鎖の可変ドメインである。
【０２４６】
ＤＳＭ  ２６７６３は、８Ｄ５−１Ｇ１０軽鎖（８Ｄ５−１Ｇ１０−ＬＣ）の可変ドメインコード配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌宿主細胞である。大腸菌８Ｄ５−１Ｇ１０−ＶＬ＝ＤＳＭ  ２６７６３、寄託日：２０１３年１月１５日；寄託者：Ａｒｓａｎｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ，オーストリア、ウィーン。
【０２４７】
ＤＳＭ  ２６７６２は、８Ｄ５−１Ｇ１０重鎖（８Ｄ５−１Ｇ１０−ＨＣ）の可変ドメインコード配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌宿主細胞である。大腸菌８Ｄ５−１Ｇ１０−ＶＨ＝ＤＳＭ  ２６７６２、寄託日：２０１３年１月１５日；寄託者：Ａｒｓａｎｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ，オーストリア、ウィーン。
【０２４８】
ＤＳＭ  ２８１７１は、８Ｄ１０−Ｃ８軽鎖（８Ｄ１０−Ｃ８−ＬＣ）の可変ドメインコード配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌宿主細胞である。大腸菌８Ｄ１０−Ｃ８−ＶＬ＝ＤＳＭ  ２８１７１、寄託日：２０１３年１２月１１日；寄託者：Ａｒｓａｎｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ，オーストリア、ウィーン。
【０２４９】
ＤＳＭ  ２８１７２は、８Ｄ１０−Ｃ８重鎖（８Ｄ１０−Ｃ８−ＨＣ）の可変ドメインコード配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌宿主細胞である。大腸菌８Ｄ１０−Ｃ８−ＶＨ＝ＤＳＭ  ２８１７２、寄託日：２０１３年１２月１１日；寄託者：Ａｒｓａｎｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ，オーストリア、ウィーン。
【０２５０】
下記の定義の主題は本発明の態様とみなされる：
１．  多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する、単離された抗体。
【０２５１】
２．  Ｏ２５ｂおよびＯ２５抗原に共通のエピトープを交差特異的に結合し、ならびに／あるいは大腸菌のＯ２５ａ抗原と比較してＯ２５ｂ抗原に優先的に結合し、好ましくはＯ２５（現在はＯ２５ａとして知られ、本明細書中でそのように呼ぶ）大腸菌株に対して産生されたポリクローナル血清によるＯ２５ｂ抗原結合と比較して、Ｏ２５ａ株に対して産生されたポリクローナルタイピング血清と比較したイムノアッセイにより測定して、より高いアフィニティーで結合し、好ましくはその際、イムノアッセイ、好ましくはイムノブロット法、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫学的方法により測定して、抗体はＯ２５ｂおよび
Ｏ２５ａ両抗原に対して少なくとも同等のアフィニティーをもつ、定義１に記載の抗体。
【０２５２】
３．  Ｏ２５ｂ抗原が１種類以上のＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株に広く存在する、定義１または２に記載の抗体。
【０２５３】
４．  抗体により認識されるエピトープが莢膜保有および無莢膜ＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株の表面に存在する、定義１〜３のいずれかに記載の抗体。
【０２５４】
５．  全長モノクローナル抗体の結合部位を有し、または結合部位を含んだ少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメントを有し、その抗体は好ましくはネズミ、ラマ、ウサギ、ヤギ、ウシ、キメラ、ヒト化またはヒト抗体、重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｄ、ｓｃＦｖおよび単一ドメイン抗体、たとえばＶＨ、ＶＨＨまたはＶＬ、好ましくはヒトＩｇＧ１抗体からなる群から選択される抗体である、定義１〜４のいずれかに記載の抗体。
【０２５５】
６．  Ｏ２５ｂ抗原を１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満のＫｄで結合するアフィニティーを有する、定義１〜５のいずれかに記載の抗体。
【０２５６】
７．  生菌野生型ＭＤＲ大腸菌株を含む血清試料においてインビトロ殺菌効力を示し、および／またはインビトロで食細胞による生菌野生型ＭＤＲ大腸菌株の取込みを刺激する、定義１〜６のいずれかに記載の抗体。
【０２５７】
８．  抗体が、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体と同じエピトープを結合する、定義１〜７のいずれかに記載の抗体。
【０２５８】
９．  抗体が、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体と同じ結合部位を含む、定義１〜８のいずれかに記載の抗体。
【０２５９】
１０．  抗体が、下記の可変領域を特徴とする抗体に由来する、定義１〜９のいずれかに記載の抗体：
−ＤＳＭ  ２６７６３および／またはＤＳＭ  ２６７６２で寄託された宿主細胞から得られるもの、またはその機能活性バリアント；
−ＤＳＭ  ２８１７１および／またはＤＳＭ  ２８１７２で寄託された宿主細胞から得られるもの、またはその機能活性バリアント。
【０２６０】
１１．  下記を含む、定義１０に記載の抗体：
Ａ
ａ）ＤＳＭ  ２６７６３で寄託された宿主細胞により産生されるかもしくはそれから得られる抗体軽鎖の可変領域；および／または
ｂ）ＤＳＭ  ２６７６２で寄託された宿主細胞により産生されるかもしくはそれから得られる抗体重鎖の可変領域；あるいは
ｃ）（ａ）および／または（ｂ）の機能活性バリアント；
あるいは
Ｂ
ａ）ＤＳＭ  ２８１７１で寄託された宿主細胞により産生されるかもしくはそれから得られる抗体軽鎖の可変領域；および／または
ｂ）ＤＳＭ  ２８１７２で寄託された宿主細胞により産生されるかもしくはそれから得られる抗体重鎖の可変領域；あるいは
ｃ）（ａ）および／または（ｂ）の機能活性バリアント。
【０２６１】
１２．  機能活性バリアントが少なくとも６０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を備
えたＣＤＲを含む、定義１０または１１に記載の抗体。
【０２６２】
１３．  機能活性バリアントが、アミノ酸配列における、好ましくはＣＤＲにおける、少なくとも１つの点変異において親抗体と異なり、その際、各ＣＤＲアミノ酸配列における点変異の数は０、１、２または３のいずれかである、定義１０〜１２のいずれかに記載の抗体。
【０２６３】
１４．  下記のヌクレオチド配列を含むプラスミド：
Ａ
−ＤＳＭ  ２６７６３で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ５−１Ｇ１０−ＬＣと命名された抗体軽鎖の可変領域をコードする配列；および／または
−ＤＳＭ  ２６７６２で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ５−１Ｇ１０−ＨＣと命名された抗体重鎖の可変領域をコードする配列；
あるいは
Ｂ
−ＤＳＭ  ２８１７１で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ１０−Ｃ８−ＬＣと命名された抗体軽鎖の可変領域をコードする配列；および／または
−ＤＳＭ  ２８１７２で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ１０−Ｃ８−ＨＣと命名された抗体重鎖の可変領域をコードする配列。
【０２６４】
１５．  請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体の軽鎖および／または重鎖を発現するコード配列を含む発現カセットであって、発現カセットまたはコード配列が定義１４に記載のプラスミドに由来する、発現カセット。
【０２６５】
１６．  定義１〜１３のいずれかに記載の抗体を調製する方法であって、宿主細胞を請求項１４に記載のプラスミドまたは定義１５に記載の発現カセットで形質転換する方法。
【０２６６】
１７．  定義１４に記載のプラスミドまたは定義１５に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
【０２６７】
１８．  下記で寄託された定義１７に記載の宿主細胞：
Ａ
−  ＤＳＭ  ２６７６３および／またはＤＳＭ  ２６７６２；
あるいは
Ｂ
−  ＤＳＭ  ２８１７１および／またはＤＳＭ  ２８１７２。
【０２６８】
１９．  定義１〜１３のいずれかに記載の抗体を調製する方法であって、請求項１７または１８に記載の宿主細胞を、その抗体を産生する条件下で培養または維持する方法。
【０２６９】
２０．  候補抗体を同定する方法であって、
（ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
（ｂ）試料中の抗体、または試料により産生される抗体と、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体により認識されるエピトープとの結合を査定し、その際、抗体とエピトープの間の陽性反応によりその抗体を候補抗体と同定する
ことを含む方法。
【０２７０】
２１．  候補抗体を同定する方法であって、
（ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
（ｂ）試料中の抗体、または試料により産生される抗体と、ＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ
４株のＯ２５ｂ抗原および非ＭＤＲ大腸菌株のＯ２５ａ抗原との結合を査定し、その際、Ｏ２５ａ抗原と対比して抗体とＯ２５ｂ抗原との間の特異的な陽性反応によりその抗体を候補抗体と同定する
ことを含む方法。
【０２７１】
２２．  定義１〜１３のいずれかに記載の抗体を調製する方法であって、
（ａ）定義２０または２１に従って同定した候補抗体を用意し；そして
（ｂ）候補抗体のモノクローナル抗体、またはヒト化形もしくはヒト形、またはその誘導体であって候補抗体と同じエピトープ結合特異性を備えたものを調製する
ことを含む方法。
【０２７２】
２３．  定義１〜１３のいずれかに記載の抗体を調製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物を８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体により認識されるエピトープで免疫化し；
（ｂ）単離したＢ細胞から不死化細胞系を形成し；
（ｃ）ｂ）で得た細胞系をスクリーニングして、前記エピトープに結合するモノクローナル抗体を産生する細胞系を同定し；そして
（ｄ）モノクローナル抗体、またはヒト化形もしくはヒト形の抗体、またはその誘導体であってモノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を備えたものを調製する
ことを含む方法。
【０２７３】
２４．  定義１〜１３のいずれかに記載の抗体を調製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物をＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株のＯ２５ｂ抗原で免疫化して、抗体を産生するＢ細胞を単離し；
（ｂ）単離したＢ細胞から不死化細胞系を形成し；
（ｃ）これらの細胞系をスクリーニングして、大腸菌のＯ２５ａ抗原と対比してＯ２５ｂ抗原に優先的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞系を同定し；そして
（ｄ）モノクローナル抗体、またはヒト化形もしくはヒト形の抗体、またはその誘導体であってモノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を備えたものを調製する
ことを含む方法。
【０２７４】
２５．  ＭＤＲ大腸菌感染のリスクをもつ対象またはそれに罹患している対象を処置する際の、対象における感染の制限またはその感染から生じる病的状態の改善に有効な量の抗体を対象に投与することを含む使用のための、好ましくは腎盂腎炎、続発性菌血症、敗血症、腹膜炎、髄膜炎、および人工呼吸器関連肺炎の治療または予防のための、定義１〜１３のいずれかに記載の抗体。
【０２７５】
２６．  ＭＤＲ大腸菌、好ましくはＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株を、その株が発現する莢膜多糖に関係なく殺菌するための、定義２５に記載の使用のための抗体。
【０２７６】
２７．  抗体を非経口または粘膜用の配合物中において投与する、定義２５または２６に記載の使用のための抗体。
【０２７７】
２８．  好ましくは非経口または粘膜用の配合物を含む、場合により医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含有する、定義１〜１３のいずれかに記載の抗体の医薬製剤。
【０２７８】
２９．  対象において、ＬＰＳ  Ｏ２５ｂを発現するＭＤＲ株により起きる大腸菌感染症、たとえば膀胱炎または尿道炎、上行性または血行性腎盂腎炎を含めた上部および下部尿路感染症を伴なう感染症、特に糖尿病患者におけるもの、ならびに菌血症、敗血症、腹
膜炎または腸定着を伴なう感染症を判定する診断に使用するための、定義１〜１３のいずれかに記載の抗体。
【０２７９】
３０．  対象の体液の試料を抗体と接触させることにより対象においてＭＤＲ大腸菌による全身感染をエクスビボ判定し、その際、抗体の特異的な免疫反応により感染を判定する、定義２９に記載の使用のための抗体。
【０２８０】
３１．  体液の試料を特異的な免疫反応について試験し、その試料は尿、血液、血液分離物または血液培養物、吸引液、喀痰、挿管対象の洗浄液、および糞便からなる群から選択される、定義２９または３０に記載の使用のための抗体。
【０２８１】
３２．  臨床検体から回収した純大腸菌培養物から大腸菌の血清型をインビトロで判定する、定義２９〜３１のいずれかに記載の使用のための抗体。
【０２８２】
３３．  場合により、標識付きの抗体、および／または標識付きのさらなる診断試薬、および／または抗体と診断試薬のうち少なくとも１つを固定化するための固相を含有する、定義２９〜３１のいずれかに記載の抗体の診断用製剤。
【０２８３】
３４．  ８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体により認識される単離されたエピトープ。
【０２８４】
３５．  下記のものを含む免疫原：
（ａ）定義３４に記載のエピトープ；
（ｂ）場合により、（ａ）のエピトープと自然界での関連性がないさらなるエピトープ；および
（ｃ）キャリヤー。
【０２８５】
３６．  キャリヤーが、好ましくは緩衝剤および／または佐剤を含む医薬的に許容できるキャリヤーである、定義３５に記載の免疫原。
【０２８６】
３７．  好ましくは非経口用のワクチン配合物中における、定義３５または３６に記載の免疫原。
【０２８７】
３８．  ＭＤＲ大腸菌感染からの対象の保護またはその感染から生じる病的状態の阻止に有効な量の免疫原を投与することにより対象を処置する際に使用するための、定義３５〜３７のいずれかに記載の免疫原。
【０２８８】
３９．  防御免疫応答を誘発するための、定義３８に記載の免疫原。
【０２８９】
４０．  定義１〜１３のいずれかに記載の抗体または定義３５に記載のエピトープをコードする、単離された核酸。
【０２９０】
以上の記載は以下の実施例を参照するとさらに十分に理解されるであろう。ただし、そのような実施例は本発明の１以上の態様を実施する方法の代表例にすぎず、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【実施例】
【０２９１】
実施例１：Ｏ２５ｂ特異的抗体
カナマイシン耐性をコードするカセットでｋｐｓクラスター（莢膜合成をコードする）を置き換えることにより、代表的なＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４  ８１００９株の無莢膜
変異体（８１００９Δｋｐｓ：：ｋａｎ，[Szijarto et al, FEMS Microbiol Lett, 2012, 332: 131-6])を作成した。致死量未満のこの変異株の生細胞またはホルムアルデヒド不活化細胞を用いて、２週間隔で４回、マウスを免疫化した。その後、それらのマウスから得た血清試料を分析し、Ｏ２５ｂ抗原に対して最高ＩｇＧ力価を示すマウス（ＥＬＩＳＡ、イムノブロット法、および表面染色において）の脾臓をハイブリドーマ作成に用いた。サブクローニングに続いて、精製Ｏ２５ｂ抗原に特異的でありかつＯ２５ｂ抗原を発現する生菌野生型大腸菌株に結合する抗体を分泌する、数種類のハイブリドーマクローンを選択した。これらのｍＡｂをさらに試験するためにハイブリドーマ上清から精製した。
【０２９２】
図１に示すように、発現する莢膜多糖（Ｋ５、Ｋ２、または未知のＫタイプ）に関係なくＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株であると判定された数種類の異なる臨床分離株にすべての抗体が結合した。Ｏ２５ａ抗原を発現する株への結合に関して、２タイプのｍＡｂが同定された。ｍＡｂ  ８Ｄ５−１Ｇ１０により代表される１グループはＯ２５ａ株の表面に結合しなかったが、８Ｄ１０−Ｃ８により代表される他方のｍＡｂグループはＯ２５ａ株に交差反応性であった。しかし、無関係の抗原、すなわちＯ２．（図１）または他のＯ−タイプ（示していない）を発現するいずれかの大腸菌株に結合できるｍＡｂはなかった。
【０２９３】
精製ＬＰＳを用いるイムノブロット分析によりｍＡｂの特異性をさらに確認した（図２）。しかし、Ｏ２５ｂ抗原を含むＳＴ１３１株からのＬＰＳ分子を認識したｍＡｂは、Ｏ２５ａ  ＬＰＳ抗原に対するそれらの交差反応効力において異なっていた。ｍＡｂ  ８Ｄ５−１Ｇ１０は専らＯ２５ｂ抗原に対して反応したが、ｍＡｂ  ８Ｄ１０−Ｃ８はＯ２５ａに対して交差反応性であった。この観察された交差反応性を、ＳＴ１３１：Ｏ２５ｂ株の検出にルーティンに用いられる市販のＯ２５タイピング血清（Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ，高力価大腸菌Ｏ２５抗血清，＃８１３６９）により示されたものと比較した。この市販のウサギ血清は、Ｏ２５ｂ  ＬＰＳと対比して明らかにＯ２５ａ抗原への結合に対する優先性を示した。これに対し、ネズミｍＡｂ  ８Ｄ１０−Ｃ８は少なくともＯ２５ａ分子と同じ強度でＯ２５ｂ  ＬＰＳ分子と反応した。その後の定量分析により、ｍＡｂ  ８Ｄ１０−Ｃ８の場合は市販のタイピング血清と比較してＯ２５ｂ対Ｏ２５ａの結合強度比が少なくとも１０倍高いことが明らかになった。
【０２９４】
以上のデータは、合わせて２タイプのＯ２５ｂ特異的ｍＡｂ、すなわちＯ２５ｂに対して高特異的なもの、およびＯ２５ａ抗原とＯ２５ｂ抗原に共通のエピトープを認識するものがあることを示唆する。その結果、本発明者らのデータによりＯ２５ｂの構造が古典的Ｏ２５（すなわち、Ｏ２５ａ）抗原と実際に異なることが確認された。Ｏ２５ｂサブユニットの新規な構造を実施例２に記載したように解明した。
【０２９５】
Ｏ２５ｂ特異的ｍＡｂの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を、変性した重鎖および軽鎖のプライマーによるＲＴ−ＰＣＲを用いてハイブリドーマクローンから増幅し、配列決定した。ＩｇデータベースについてのＢＬＡＳＴ、およびＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴで配列を分析し、ＣＤＲ領域をＫａｂａｔ命名法に従って決定した。
【０２９６】
ｍＡｂ  ８Ｄ５−１Ｇ１０の軽鎖および重鎖の可変部の配列を各ベクター内へクローニングし、それらを用いて大腸菌宿主細胞を形質転換し、ＤＳＭＺに寄託番号：ＤＳＭ  ２６７６３およびＤＳＭ  ２６７６２で寄託した。
【０２９７】
ｍＡｂ  ８Ｄ１０−Ｃ８の軽鎖および重鎖の可変部の配列を各ベクター内へクローニングし、それらを用いて大腸菌宿主細胞を形質転換し、ＤＳＭＺに寄託番号：ＤＳＭ  ２８１７１およびＤＳＭ  ２８１７２で寄託した。
【０２９８】
実施例２：Ｏ２５ｂ抗原の構造分析
大腸菌ＳＴ１３１のＬＰＳを熱フェノール／水法により単離し、透析、プロテイナーゼＫ消化および超遠心により精製した。ＬＰＳ調製物の平均収率は乾燥細菌質量の２．６１％であった。ＬＰＳをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、種々の数のオリゴ糖反復単位（ＲＵ）で置換されたコアオリゴ糖（ＯＳ）および非置換コアオリゴ糖からなる画分が示された。Ｏ−特異的多糖（Ｏ−ＰＳ）および種々のオリゴ糖成分を緩和な酸加水分解により放出させ、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０でのゲル濾過により単離した。それらの画分を糖およびメチル化の分析、ＮＭＲ分光分析、ならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＳ）により分析した。
【０２９９】
Ｏ−ＰＳ  ＲＵの構造を、１つの単一ＲＵで置換されたコアＯＳからなる画分を用いて決定した。単糖分析は、Ｒｈａ、Ｇｌｃ、Ｇａｌ、Ｈｅｐ、およびより少量のＧｌｃＮの存在を示した。等モル量の末端Ｒｈａｐ、末端Ｇｌｃｐ、３，６−置換Ｇｌｃｐ、３−置換Ｒｈａｐの誘導体が、痕跡量の３−置換ＧｌｃｐＮと共に同定され、Ｏ−ＰＳ  ＲＵと命名された。残りの７−置換Ｈｅｐｐ、６−置換Ｇｌｃｐ、２−置換Ｇｌｃｐ、末端Ｇａｌｐ、３，６−置換Ｇｌｃｐ、および末端Ｈｅｐｐの部分メチル化アルジトールアセテートが、Ｋ−１２タイプのコアオリゴ糖を構成していた。３，４−置換Ｈｅｐｐ、３，４，７−置換ＨｅｐｐおよびＫｄｏの誘導体は、それぞれＰおよびＰＰＥｔｎによる置換ならびにカルボキシル基の存在のため、標準メチル化および糖分析に際して検出できなかった。
【０３００】
ＬＰＳ  ＳＴ１３１のＯ−特異的ＰＳのＲＵの構造を、ＮＭＲ分光法を用いて決定した。ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹ、ならびにＨＳＱＣ−ＤＥＰＴ、ＨＭＢＣおよびＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ実験から得られた情報を合わせることにより、Ｏ−ＰＳ  １Ｈおよび１３Ｃ共鳴の完全配属が達成された。１Ｈ、１３Ｃ  ＨＳＱＣ−ＤＥＰＴスペクトルは、１３のアノマープロトンおよび炭素、ならびに１つのＫｄｏスピン系についての信号を含んでいた。これらの信号はコアオリゴ糖から、およびＯ−特異的ＰＳの１つのＲＵに由来していた。高磁場領域はＯ−アセチル基のＣＨ３の１つの信号、Ｎ−アセチル基のＣＨ３の１つの信号、および６−デオキシ糖（Ｒｈａ）に特徴的なＣＨ３の２つの高磁場信号を含んでいた。このスペクトルは、被験オリゴ糖の１４糖構造を示した。Ｐ、ＰＰおよびＰＥｔに関係する高い不均一性のため、非還元末端の８つの糖の全スピン系が完全に消散し(resolved)、ＲＵ構造、およびＫ−１２コアＯＳへのそれの連結が強調された。
【０３０１】
隣接糖残基の間の残基間連結性がＮＯＥＳＹおよびＨＭＢＣ実験により観察された。ＨＭＢＣスペクトルは、連結位置のアノマープロトンと炭素の間、および連結位置のアノマー炭素とプロトンの間のクロスピークを示し、これによりこの多糖の非還元領域の糖残基の配列が確認された。
【０３０２】
これらの測定に基づいて、Ｏ２５ｂ−特異的ＰＳの反復単位が決定された（図３（ａ））；これは、コアＯＳの第１残基：→７）−α−Ｈｅｐｐ（残基Ｌ）に代わるＲＵ残基として→３）−β−ＧｌｃｐＮＡｃ（残基Ｋ）を含む五糖である。より長いＰＳ画分が混入している可能性があるため、第１ＲＵがＯ−特異的鎖の後続ＲＵにより置換された位置を同定することはできなかった。さらに、これらの画分をそれ以上詳細に構造分析することなく、後続の反復単位におけるα−アノマーとしてのＧｌｃＮＡｃの存在（ある大腸菌多糖類について以前に報告されたもの）は除外できた。
【０３０３】
コアＯＳ、１つのＲＵで置換されたコアＯＳ、および最後にＯ−ＰＳ  ＲＵの分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて確認した（データを示していない）。すべてのスペクトルを、ここで解明したＬＰＳ  ＳＴ１３１のＲＵの構造および以前に同定されたＫ−１２コアＯＳのグリコフォーム(Duda et al. Microbiology. 2011 Jun; 157(Pt 6): 1750-60. doi: 10.1099/mic.0.046912-0. Epub 2011 Mar 3; Muller-Loennies et al. J Biol
Chem. 2003 Sep 5; 278(36): 34090-101. Epub 2003 Jun 20)に基づいて解釈した。より短いＯ−ＰＳで置換されたコアＯＳからなる画分の低分解能スペクトルのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析は、下記の優勢なイオンを含むイオンクラスターを示した：ｍ／ｚ  ２７９７．２、ｍ／ｚ  ３６５９．６、ｍ／ｚ  ４５２２．０、およびｍ／ｚ  ５３８３．６（ＰおよびＰＰＥｔｎを含む）；それぞれ１、２、３、および４つのＲＵで置換されたコアＯＳに帰属する。これらのイオン間の平均質量差は８６２．１Ｄａであり、Ｏ−特異的ＰＳのＲＵの平均質量計算値（８６１．８Ｄａ，ＲＵ−Ｈ２Ｏ）と一致した。
【０３０４】
ＲＵの分子量を考慮に入れ、ＭＳ結果を他の画分についての結果を比較して、本発明者らは第１ＲＵ（図３（ａ））による置換位置として外側コア領域の→７）−α−Ｈｅｐｐ−（１→６）−α−Ｇｌｃｐ二糖からなるより長いコアＯＳグリコフォームの存在を示した。ＬＰＳ  ＳＴ１３１が２つの主コアＯＳグリコフォームからなることが示された。グリコフォームのタイプは、Ｏ−特異的ＰＳの存在に依存する。非置換コアＯＳの優勢なグリコフォームは、→７）−α−Ｈｅｐｐ−（１→６）−α−Ｇｌｃｐ二糖を欠如したトランケート型のＫ−１２コアオリゴ糖である。そのような二糖がＯ−ＰＳ置換されたコアＯＳと非置換コアＯＳの相異である。
【０３０５】
実施例３：大腸菌Ｏ２５ｂ特異的診断アッセイ
Ｏ２５ｂ特異的ｍＡｂ  ８Ｄ５−１Ｇ１０を、１μｍ直径のラテックスビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）に調製業者の指示に従って結合させた。ラテックス結合ビーズをそれらが種々の大腸菌株を凝集させる効力について試験した。白金耳１杯分の細菌（約１０８ｃｆｕ）を、ＰＢＳ中の１％  ｍＡｂ結合ラテックスビーズ懸濁液１０μｌと混合した。図４に示すように、Ｏ２５ｂ抗原を発現する大腸菌株は、数秒間の穏やかな撹拌後に強い凝集パターンを示した。これに対し、Ｏ２５ａまたはＯ２抗原を発現する大腸菌株は、同じ試薬で凝集しなかった。したがって、この推定診断試薬は、Ｏ２５ｂ（およびＯ２５ａ）陽性大腸菌の検出に現在用いられている技術水準の凝集試薬（すなわち、Ｏ２５に対するポリクローナルウサギ血清）より特異的であると考えられる。
【０３０６】
さらに、市販の抗Ｏ２５血清は加熱殺菌した（すなわち、細胞溶解した）大腸菌細胞について凝集アッセイに使用することが推奨されているので、Ｏ２５ｂ  ｍＡｂ  −精製またはラテックスビーズ結合したもの−  がより高い感度をもつかどうか、すなわちそれらが無傷の莢膜多糖の存在下で大腸菌生細胞を凝集できるかどうかを試験した。大パネルのＯ２５ｂ臨床分離株を試験し、若干の代表株についての結果を表Ｉに提示する。２つの点で感度の改善がみられた：ｉ）代表株＃１および＃２は、加熱殺菌していない（すなわち、寒天平板から直接採取した生菌）形態において、遊離またはビーズ結合したＯ２５ｂ特異的ｍＡｂの両方で凝集できたが、市販のＯ２５ウサギ血清による凝集には細菌を予め加熱溶解する必要があった、ｉｉ）代表株＃３および＃４は加熱殺菌した形態ですら市販の血清で凝集できなかったのに対し、同じ細胞溶解物が精製ｍＡｂ  ８Ｄ５−１Ｇ１０では陽性結果を与えた。重要なことに、同じ抗体をラテックスビーズに結合させると、生菌細胞ですら凝集を生じた。これらの結果は、凝集アッセイにおけるビーズ結合ｍＡｂの卓越した感度を指摘し、これはこれまでに試験したすべてのＯ２５ｂ陽性大腸菌株が何ら前処理なしに（すなわち、加熱殺菌溶解物を調製せずに）この試薬で陽性凝集を与えたという事実によって確証される。さらに、この試薬をＯ２５ｂ発現細菌の検出のための診断ツールとして用いることは、実際にターゲット抗原を発現している細菌についてのみ陽性結果を与えるという、ＰＣＲベースの方法に優る利点をもつ。たとえば、表Ｉの代表株＃５は、診断にルーティンに用いられるＯ２５ｂ特異的遺伝子についてＰＣＲ陽性であったが、いずれの凝集アッセイにおいても陰性であった。この株は未完成の(rough)ＬＰＳ表現型
を示す（Ｏ抗原を発現しない）ことが証明されているので、このＰＣＲ結果は偽陽性とみなすことができる。そのようなアッセイをコンパニオン診断として用いる場合には、すなわちＯ２５ｂ特異的療法が有益となる可能性のあるＯ２５ｂ発現大腸菌株に感染している
患者を選定するためには、そのような偽陽性を避けることはきわめて重要である。
【０３０７】
遊離Ｏ２５ｂ  ＬＰＳ分子をラテックスビーズ結合ｍＡｂにより検出する効力も試験した。１〜１０００ｎｇの範囲の種々の量の高度精製Ｏ２５ｂ  ＬＰＳを、ＰＢＳ中の１％ビーズ懸濁液１０μｌと共にインキュベートした。図５に示すように、用量依存性の凝集パターンがみられた：最良の結果は１００ｎｇの遊離ＬＰＳについて得られ、１０００または１０ｎｇでもなお凝集を検出できたが、１ｎｇの遊離Ｏ２５ｂ  ＬＰＳでは検出できなかった。
【０３０８】
【表２】
2019068841.tif 000004
【０３０９】
実施例４：Ｏ２５ｂ特異的ｍＡｂの抗細菌効果
Ｏ２５ｂ特異的ｍＡｂ（Ｏ２５ａに対する交差反応性をもつもの、またはもたないもの）の潜在防御効果を、致死性ネズミ菌血症モデルにおいて試験した。マウス５匹のグループに１００μｇの精製した８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８を腹腔内投与した。２４時間後にマウスを致死量（パイロット実験で予め決定）のＯ２５ｂ抗原発現性大腸菌株８１００９（２×１０８ＣＦＵ／マウス）により静脈内攻撃した。マウスの致死性を１日１回、３週間モニターした。図６は、類似の転帰をもつ２つの独立した実験の結果を合わせて示す。ＰＢＳで模擬免疫化したマウスのうち９０％が感染したが、被験ｍＡｂは両方とも、モニターした感染後３週間の期間にわたって統計的に（Ｌｏｇｒａｎｋ検定）有意の生存率増大をもたらした。
【０３１０】
このインビボデータを確証するために、精製ｍＡｂの殺菌効果をインビトロでも試験した。大腸菌株８１００９の対数期中間培養物２ｍｌをＰＢＳ中で２回洗浄し、再懸濁して最終濃度５×１０５ＣＦＵ／ｍｌにした。１０μｌのこの細菌懸濁液を４℃で１５分間、３％のヒトアルブミンを補充した４０μｌのＲＰＭＩ−１６４０緩衝液中に希釈した４μｇの各ｍＡｂと共にプレインキュベートした。その後、５０μｌのプールしたヒト血清（予め大腸菌株８１００９を吸着したもの）を反応に添加し、３７℃で１、２および３時間インキュベートした。反応の最終ＣＦＵおよび抗体濃度は、合計１００μｌの体積でそれぞれ５×１０４ＣＦＵ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌであった。特定時点でコロニー計数の
ために１０μｌアリコートをＴＳＢプレートに播種した。
【０３１１】
図７に示すように、試験した両方のｍＡｂが３時間の試験期間にわたって有意にＣＦＵを低下させることができた。これに対し、無関係なｍＡｂと混合した細菌または無抗体の細菌はこの培地で定常的な増殖を示した。血清試料中の補体を不活性化した場合（５６℃で３０分間のインキュベーションによる）、いずれのｍＡｂによっても殺菌作用はみられなかった（データを示していない）。これらの結果は、両方のＯ２５ｂ特異的ｍＡｂが補体媒介による殺菌作用を誘発できることを証明する。
【図１】
2019068841.tif 000005
【図２】
2019068841.tif 000006
【図３】
2019068841.tif 000007
【図４】
2019068841.tif 000008
【図５】
2019068841.tif 000009
【図６】
2019068841.tif 000010
【図７】
2019068841.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月28日(2019.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏ２５ｂ反復単位構造：
【化１】
2019068841.tif 000012
により特徴付けられるＯ２５ｂ抗原および医薬的に許容できるキャリヤーを含む、免疫原。
【請求項２】
緩衝剤および／または佐剤を含む、請求項１に記載の免疫原。
【請求項３】
防御免疫応答を誘発するための、請求項１又は２に記載の免疫原。
【請求項４】
免疫原の非経口用配合物が皮下投与または筋肉内投与により投与される、請求項３に記載の免疫原。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の免疫原を含む、対象におけるＭＤＲ大腸菌感染の処置における使用のためのワクチン。
【請求項６】
前記感染から生じる病的状態の阻止のための、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記処置が、少なくとも１つの追加的な治療薬または予防薬での処置と組み合わせられる、請求項５又は６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記の薬が、抗生物質、ステロイド系の炎症阻害薬、非ステロイド系の炎症阻害薬、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
処置が、抗体ベースの療法と組み合わせられる、請求項５〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１１】
図７に示すように、試験した両方のｍＡｂが３時間の試験期間にわたって有意にＣＦＵを低下させることができた。これに対し、無関係なｍＡｂと混合した細菌または無抗体の細菌はこの培地で定常的な増殖を示した。血清試料中の補体を不活性化した場合（５６℃で３０分間のインキュベーションによる）、いずれのｍＡｂによっても殺菌作用はみられなかった（データを示していない）。これらの結果は、両方のＯ２５ｂ特異的ｍＡｂが補体媒介による殺菌作用を誘発できることを証明する。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌(E. coli)株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する、単離された抗体。
［態様２］モノクローナル抗体である、態様１に記載の抗体。
［態様３］Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ抗原に共通のエピトープを交差特異的に結合する、態様１または２に記載の抗体。
［態様４］大腸菌のＯ２５ａ抗原に対比してＯ２５ｂ抗原に優先的に結合するか、あるいは両抗原に対して少なくとも同等のアフィニティーで結合する、態様１〜３のいずれか１に記載の抗体。
［態様５］全長モノクローナル抗体の結合部位を有し、または結合部位を含んだ少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメントを有し、好ましくはＯ２５ｂ抗原を１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満のＫｄで結合するアフィニティーを有する、態様１〜４のいずれか１に記載の抗体。
［態様６］抗体が、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体と同じエピトープを結合し、好ましくは８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体と同じ結合部位を含む、態様１〜５のいずれか１に記載の抗体。
［態様７］多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌(E. coli)株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、抗体８Ｄ５−１Ｇ１０の抗原結合部位を含むか、または抗体８Ｄ５−１Ｇ１０であるかもしくはそれに由来し、または抗体８Ｄ５−１Ｇ１０の機能活性バリアントであり、好ましくは抗体８Ｄ５−１Ｇ１０が
ａ）ＤＳＭ  ２６７６３で寄託された宿主細胞により産生される抗体軽鎖の可変領域；および／または
ｂ）ＤＳＭ  ２６７６２で寄託された宿主細胞により産生される抗体重鎖の可変領域；あるいは
ｃ）（ａ）および／または（ｂ）の機能活性バリアントである可変領域
によって特徴付けられる、前記抗体。
［態様８］多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌(E. coli)株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ抗原に共通のエピトープを交差特異的に結合し、抗体８Ｄ１０−Ｃ８の抗原結合部位を含むか、または抗体８Ｄ１０−Ｃ８であるかもしくはそれに由来し、または抗体８Ｄ１０−Ｃ８の機能活性バリアントであり、好ましくは抗体８Ｄ１０−Ｃ８が
ａ）ＤＳＭ  ２８１７１で寄託された宿主細胞により産生される抗体軽鎖の可変領域；および／または
ｂ）ＤＳＭ  ２８１７２で寄託された宿主細胞により産生される抗体重鎖の可変領域；あるいは
ｃ）（ａ）および／または（ｂ）の機能活性バリアントを使用すること
によって特徴付けられる、前記抗体。
［態様９］下記のヌクレオチド配列を含むプラスミド：
Ａ
−ＤＳＭ  ２６７６３で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ５−１Ｇ１０−ＬＣと命名された抗体軽鎖の可変領域をコードする配列；および／または
−ＤＳＭ  ２６７６２で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ５−１Ｇ１０−ＨＣと命名された抗体重鎖の可変領域をコードする配列；
あるいは
Ｂ
−ＤＳＭ  ２８１７１で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ１０−Ｃ８−ＬＣと命名された抗体軽鎖の可変領域をコードする配列；および／または
−ＤＳＭ  ２８１７２で寄託された宿主細胞に含まれる８Ｄ１０−Ｃ８−ＨＣと命名された抗体重鎖の可変領域をコードする配列。
［態様１０］態様１〜８のいずれか１に記載の抗体の軽鎖および／または重鎖を発現するコード配列を含む発現カセットであって、その発現カセットまたはコード配列が態様９に記載のプラスミドに由来する、発現カセット。
［態様１１］態様９に記載のプラスミドまたは態様１０に記載の発現カセットを含む、宿主細胞。
［態様１２］態様１〜８のいずれか１に記載の抗体を調製する方法であって、態様１０に記載の宿主細胞を、その抗体を産生する条件下で培養または維持する方法。
［態様１３］候補抗体を同定する方法であって、
（ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
（ｂ）試料中の抗体、または試料により産生される抗体と、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体により認識されるエピトープとの結合を査定し、その際、抗体とエピトープの間の陽性反応によりその抗体を候補抗体と同定する
ことを含む方法。
［態様１４］候補抗体を同定する方法であって、
（ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
（ｂ）試料中の抗体、または試料により産生される抗体と、ＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４株のＯ２５ｂ抗原および非ＭＤＲ大腸菌(E. coli)株のＯ２５ａ抗原との結合を査定し、その際、Ｏ２５ａ抗原と対比して抗体とＯ２５ｂ抗原の間の特異的な陽性反応によりその抗体を候補抗体と同定する
ことを含む方法。
［態様１５］態様１〜８のいずれか１に記載の抗体を調製する方法であって、
（ａ）態様１３または１４に従って同定した候補抗体を用意し；そして
（ｂ）候補抗体のモノクローナル抗体、またはヒト化形もしくはヒト形、またはその誘導体であって候補抗体と同じエピトープ結合特異性を備えたものを調製する
ことを含む方法。
［態様１６］ＭＤＲ大腸菌(E. coli)感染のリスクをもつ対象またはそれに罹患している対象を処置する際の、対象における感染の制限またはその感染から生じる病的状態の改善に有効な量の抗体を対象に投与することを含む使用のための、好ましくは腎盂腎炎、続発性菌血症、敗血症、腹膜炎、髄膜炎、および人工呼吸器関連肺炎の治療または予防のための、態様１〜８のいずれか１に記載の抗体。
［態様１７］好ましくは非経口または粘膜用の配合物を含む、場合により医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含有する、態様１〜８のいずれか１に記載の抗体の医薬製剤。
［態様１８］対象において、ＬＰＳ  Ｏ２５ｂを発現するＭＤＲ株により起きる大腸菌感染症である、膀胱炎または尿道炎、上行性または血行性腎盂腎炎を含めた上部および下部尿路感染症を伴なう感染症、特に糖尿病患者におけるもの、ならびに菌血症、敗血症、腹膜炎または腸定着を伴なう感染症を判定する診断に使用するための、態様１〜８のいずれか１に記載の抗体。
［態様１９］場合により、標識付きの抗体、および／または標識付きのさらなる診断試薬、および／または抗体と診断試薬のうち少なくとも１つを固定化するための固相を含有する、態様１〜８のいずれか１に記載の抗体の診断用製剤。
［態様２０］８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と命名された抗体により認識される単離されたエピトープ。
［態様２１］下記のものを含む免疫原：
（ａ）態様２０に記載のエピトープ；
（ｂ）場合により、（ａ）のエピトープと自然界での関連性がないさらなるエピトープ；および
（ｃ）キャリヤー。
［態様２２］態様１〜８のいずれか１に記載の抗体または態様２０に記載のエピトープをコードする、単離された核酸。
【外国語明細書】
2019068841000001.pdf