(57)【要約】【課題】生体内におけるＵＣＰ１の発現を非侵襲的に観察でき、基質の投与が不要な遺伝子改変非ヒト動物を提供する。前記遺伝子改変非ヒト動物を用いた、簡便なＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】遺伝子改変非ヒト動物は、Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＵＣＰ１）プロモーターの下流に第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する。ＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法は、前記遺伝子改変非ヒト動物に候補物質を投与する投与工程と、前記遺伝子改変非ヒト動物の体内の前記第１の近赤外蛍光タンパク質の蛍光を体外から検出する検出工程と、を備える方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＵＣＰ１）プロモーターの下流に第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２】
前記非ヒト動物が、前記第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子についてヘテロ接合性である請求項１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３】
前記非ヒト動物が、前記第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子についてホモ接合性である請求項１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項４】
更に、Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＦＡＢＰ４）、アディポネクチン、レプチン及びＦａｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２７（ＦＳＰ２７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のプロモーターの下流に第２の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有し、
前記第１の近赤外蛍光タンパク質及び前記第２の近赤外蛍光タンパク質の蛍光波長が異なる遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項５】
前記非ヒト動物がマウスである請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項６】
ＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物に候補物質を投与する投与工程と、
前記遺伝子改変非ヒト動物の体内の前記第１の近赤外蛍光タンパク質の蛍光を体外から検出する検出工程と、
を備えるＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物から得られる初代培養脂肪前駆細胞及び脂肪細胞に候補物質を投与する投与工程と、
前記初代培養脂肪前駆細胞及び脂肪細胞における前記第１の近赤外蛍光タンパク質の蛍光を検出する検出工程と、
を備えるＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項４に記載の遺伝子改変非ヒト動物に候補物質を投与する投与工程と、
前記遺伝子改変非ヒト動物の体内の前記第１の近赤外蛍光タンパク質及び前記第２の近赤外蛍光タンパク質の蛍光をそれぞれ体外から検出する検出工程と、
を備えるＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｃ）を用いて、非ヒト動物のＵＣＰ１遺伝子を改変する遺伝子改変非ヒト動物の製造方法。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなる核酸を含むガイドＲＮＡ；
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ酵素；
（ｃ）近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子、並びに、該遺伝子の上流及び下流に、ＵＣＰ１遺伝子上の挿入を行う部位と相同な配列からなるＤＮＡを含むドナープラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子改変非ヒト動物及びその使用に関する。具体的には、本発明は、遺伝子改変非ヒト動物及びその製造方法、並びに、ＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪組織は、白色脂肪組織と褐色脂肪組織とに大別される。通常、その性状は大きく異なっており、白色脂肪組織が過剰なエネルギーを脂肪として蓄積するのに対し、褐色脂肪組織は逆にエネルギーを消費する。褐色脂肪組織の特徴としては、細胞内の中性脂肪由来や血中から移行した脂肪酸が褐色脂肪細胞内で酸化分解され、ミトコンドリア脱共役タンパク質（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １；ＵＣＰ１）によって熱へと変換される。
【０００３】
一方、脂肪を蓄積する白色脂肪組織においても、寒冷刺激やアドレナリン刺激等により、通常は発現しないＵＣＰ１の異所的な発現が誘導される。このような誘導型の褐色脂肪細胞は、ブライト細胞（褐色様脂肪細胞）又はベージュ細胞と呼ばれ、肩甲骨付近にみられる従来の褐色脂肪細胞とは区別されている。
【０００４】
近年、このような脂肪組織におけるＵＣＰ１の発現制御機構が注目されており、実験動物の生体内でのＵＣＰ１の動態を可視化する技術が開発されている。
【０００５】
例えば、Ｙ染色体上（例えば、非特許文献１参照）又はＵＣＰ１遺伝子座上（例えば、特許文献１参照）にルシフェラーゼ遺伝子をノックインした遺伝子改変マウスが開発されている。該マウスに基質であるルシフェリンを投与して、生体内での蛍光シグナルを検出することで、ＵＣＰ１の動態を可視化することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１５４４９０号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Galmozzi A et al., “ThermoMouse: An In Vivo Model to Identify Modulators of UCP1 Expression in Brown Adipose Tissue.”, Cell Reports, Vol. 9, p1584-1593, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１及び非特許文献１に記載の遺伝子改変マウスでは、基質であるルシフェリンを毎回投与する必要があり、手間がかかる。また、複数のマウスの同量のルシフェリンを投与しても、検出したい組織に同じようにルシフェリンが到達しているか不明である。また、ルシフェラーゼの反応にはＡＴＰも関与しており、組織中のＡＴＰ量は個体差が影響しやすい。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、生体内におけるＵＣＰ１の発現を非侵襲的に観察でき、基質の投与が不要な遺伝子改変非ヒト動物及びその製造方法を提供する。また、前記遺伝子改変非ヒト動物を用いた、簡便なＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る遺伝子改変非ヒト動物は、Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＵＣＰ１）プロモーターの下流に第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する。
【００１１】
前記非ヒト動物が、前記第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子についてヘテロ接合性であってもよい。
【００１２】
前記非ヒト動物が、前記第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子についてホモ接合性であってもよい。
【００１３】
上記第１態様に係る遺伝子改変非ヒト動物は、更に、Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＦＡＢＰ４）、アディポネクチン、レプチン及びＦａｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２７（ＦＳＰ２７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のプロモーターの下流に第２の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有し、前記第１の近赤外蛍光タンパク質及び前記第２の近赤外蛍光タンパク質の蛍光波長が異なってもよい。
【００１４】
前記非ヒト動物がマウスであってもよい。
【００１５】
本発明の第２態様に係るＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法は、上記第１態様に係る遺伝子改変非ヒト動物のうち、第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子のみを有する遺伝子改変非ヒト動物に候補物質を投与する投与工程と、前記遺伝子改変非ヒト動物の体内の前記第１の近赤外蛍光タンパク質の蛍光を体外から検出する検出工程と、を備える方法である。
【００１６】
本発明の第３態様に係るＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法は、上記第１態様に係る遺伝子改変非ヒト動物のうち、第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子のみを有する遺伝子改変非ヒト動物から得られる初代培養脂肪前駆細胞及び脂肪細胞に候補物質を投与する投与工程と、前記初代培養脂肪前駆細胞及び脂肪細胞における前記第１の近赤外蛍光タンパク質の蛍光を検出する検出工程と、を備える方法である。
【００１７】
本発明の第４態様に係るＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法は、上記第１態様に係る遺伝子改変非ヒト動物のうち、第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子及び第２の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト動物に候補物質を投与する投与工程と、前記遺伝子改変非ヒト動物の体内の前記第１の近赤外蛍光タンパク質及び前記第２の近赤外蛍光タンパク質の蛍光をそれぞれ体外から検出する検出工程と、を備える方法である。
【００１８】
本発明の第５態様に係る遺伝子改変非ヒト動物の製造方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）を用いて、非ヒト動物のＵＣＰ１遺伝子を改変する。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなる核酸を含むガイドＲＮＡ；
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ酵素；
（ｃ）近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子、並びに、該遺伝子の上流及び下流に、ＵＣＰ１遺伝子上の挿入を行う部位と相同な配列からなるＤＮＡを含むドナープラスミド。
【発明の効果】
【００１９】
上記態様の遺伝子改変非ヒト動物によれば、生体内におけるＵＣＰ１の発現を非侵襲的に観察でき、基質の投与が不要である。また、上記態様の遺伝子改変非ヒト動物の製造方法によれば、生体内におけるＵＣＰ１の発現を非侵襲的に観察でき、基質の投与が不要な遺伝子改変非ヒト動物を簡便に得られる。また、上記態様のＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法によれば、ＵＣＰ１の発現制御物質を容易に得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１におけるマウスＵＣＰ１遺伝子の転写開始部位及び翻訳開始部位周辺の配列、並びに、各ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の設計部位の配列を示す図である。
【図２】実施例１における各ｇＲＮＡ導入後の培養３日目のＨＥＫ２９３細胞を示す画像である。なお、左は明視野での画像、中央はＧＦＰの蛍光検出画像、右はＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅの蛍光検出画像である。
【図３】実施例１におけるピューロマイシン添加後の各褐色脂肪前駆細胞を示す画像である。
【図４】実施例１におけるピューロマイシン耐性細胞のゲノムＰＣＲ解析結果を示す画像である。
【図５】実施例１におけるマウス受精卵へのマイクロインジェクション法を示す概略工程図である。
【図６Ａ】実施例１における４１匹のＦ１マウスのゲノムＤＮＡ中のｉＲＦＰ７２０遺伝子内の５４３ｂｐのＰＣＲ産物の解析結果を示す画像である。
【図６Ｂ】実施例１における４１匹のＦ１マウスのゲノムＤＮＡ中のＵＣＰ１遺伝子の５’領域からｉＲＦＰ７２０遺伝子の３’ 領域までの５５１２ｂｐのＰＣＲ産物の解析結果を示す画像である。
【図６Ｃ】実施例１における４１匹のＦ１マウスのゲノムＤＮＡ中のｉＲＦＰ７２０遺伝子の５’領域からＵＣＰ１遺伝子の３’ 領域までの５２４３ｂｐのＰＣＲ産物の解析結果を示す画像である。
【図６Ｄ】実施例１における４１匹のＦ１マウスのゲノムＤＮＡ中の挿入遺伝子及びその外側領域を含む９８３７ｂｐのＰＣＲ産物の解析結果を示す画像である。
【図６Ｅ】実施例１における４１匹のＦ１マウスのゲノムＤＮＡ中のｉＲＦＰ７２０遺伝子の５’領域から挿入遺伝子の外側領域までの５５１４ｂｐのＰＣＲ産物の解析結果を示す画像である。
【図７】実施例１におけるＩｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ）を用いたマウスでのＵＣＰ１発現細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左はｉＲＦＰ７２０がノックインされていないマウス（対照群）であり、右はｉＲＦＰ７２０がノックインされたマウスである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
≪遺伝子改変非ヒト動物≫
本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物は、Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＵＣＰ１）プロモーターの下流に第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する。
【００２２】
本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物は、後述の実施例に示すように、基質を投与することなく、生体内におけるＵＣＰ１の発現を非侵襲的に観察できる。また、近赤外蛍光タンパク質は、生体物質への吸収が少ないことから、生体内での蛍光観察に好適である。
【００２３】
一般に、「Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＵＣＰ１）」は、ミトコンドリア脱共役タンパク質であり、ミトコンドリア内膜での酸化的リン酸化反応を脱共役させ、エネルギーを熱として散逸する機能を有する。このＵＣＰ１の発現は褐色脂肪細胞においてみられる。また、白色脂肪細胞から誘導された誘導型褐色脂肪細胞（ブライト細胞、褐色様脂肪細胞又はベージュ細胞と称する場合がある）においてもＵＣＰ１の発現が見られる。よって、本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物を用いることで、生体内でのＵＣＰ１の発現を可視化することができ、これにより、環境の変化（例えば、寒冷刺激、アドレナリン刺激、化合物投与等）によるＵＣＰ１発現細胞の増減や局在変化を解析することができる。
【００２４】
なお、一般に、「遺伝子改変」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムやＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）等の技術により、標的化された遺伝子組換え又は標的化された変異（例えば、ＳＮＰや部分変異等の挿入を含む。）を実行することにより、特異的な遺伝子破壊やレポーター遺伝子のノックイン等を行うことを意味する。特に、本実施形態では、第１の近赤外蛍光タンパク質（及び、必要に応じて、第２の近赤外蛍光タンパク質）のノックインを意味する。
【００２５】
＜第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子＞
第１の近赤外蛍光タンパク質としては、例えば、ＩＦＰ、ｉＲＦＰ等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、遺伝子改変非ヒト動物の生体内のビリベルジン （Ｂｉｌｉｖｅｒｄｉｎ；ＢＶ）との結合により蛍光を発することから、第１の近赤外蛍光タンパク質としては、ｉＲＦＰが好ましい。
【００２６】
ｉＲＦＰとしては、例えば、ｉＲＦＰ６７０、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ７１３、ｉＲＦＰ７２０等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２７】
本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物に用いられる第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子としては、上記近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子であればよい。当該遺伝子として具体的は、例えば、配列番号２３に示す塩基配列からなる遺伝子（ｉＲＦＰ７２０をコードする遺伝子）等が挙げられる。
【００２８】
また、本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物において、染色体上の第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挿入される位置としては、ＵＣＰ１プロモーターの下流であればよく、ＵＣＰ１プロモーターの下流であってＵＣＰ１遺伝子の上流であってもよく、ＵＣＰ１プロモーター及びＵＣＰ１遺伝子の下流であってもよい。また、このとき、ＵＣＰ１遺伝子と第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子とは直接結合していてもよく、介在配列を介して間接的に結合してもよい。
【００２９】
介在配列としては、発現されたＵＣＰ１及び第１の近赤外蛍光タンパク質の立体構造に影響を与えないものであればよい。介在配列として具体的には、例えば、ＧＳリンカー（グリシン及びセリンの繰り返し配列からなるリンカー）、ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ）、２Ａペプチド等が挙げられ、これらに限定されない。介在配列としてＩＲＥＳ又は２Ａペプチドを用いた場合、生体内において、ＵＣＰ１及び第１の近赤外蛍光タンパク質は融合タンパク質とならず、別々のタンパク質として発現される。
【００３０】
又は、第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挿入される位置としては、後述の実施例に示すように、ＵＣＰ１プロモーターの下流であって、ＵＣＰ１遺伝子と置き換わる形で挿入されていてもよい。その場合には、遺伝子改変非ヒト動物の遺伝子型としては、ＵＣＰ１の対立遺伝子のうち一方のＵＣＰ１遺伝子のみが第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子に置き変わったヘテロ接合性であってもよく、ＵＣＰ１の対立遺伝子のうち両方のＵＣＰ１遺伝子が第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子に置き変わったホモ接合性であってもよい。
【００３１】
本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物として用いられる動物としては、ヒト以外の動物であって、通常、実験動物として一般的に使用される動物であれば特に制限されない。動物として具体的には、非ヒト脊椎動物であることが好ましく、非ヒト哺乳動物であることがより好ましく、齧歯類であることがさらに好ましい。
【００３２】
実験動物として具体的には、例えば、サル、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられる。中でも、実験動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ウシ又はサルが好ましく、マウスがより好ましい。
【００３３】
実験動物としてマウスを用いる場合、通常のマウスであればよく、雑種でも系統種でもよいが、実験動物として用いられているマウスが好ましい。実験動物として用いられているマウスとして具体的には、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系マウス、Ｃ３Ｈ系マウス、ＩＣＲ系マウス、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス等が挙げられる。
【００３４】
本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物における第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子及びＵＣＰ１遺伝子の遺伝子型としては、以下の（１）〜（３）に示す第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子についてヘテロ接合性であるもの、及び、以下の（４）〜（６）に示す第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子についてホモ接合性であるものが挙げられる。
（１）第１の近赤外蛍光タンパク質＋／−、且つ、ＵＣＰ１＋／＋；
（２）第１の近赤外蛍光タンパク質＋／−、且つ、ＵＣＰ１＋／−；
（３）第１の近赤外蛍光タンパク質＋／−、且つ、ＵＣＰ１−／−；
（４）第１の近赤外蛍光タンパク質＋／＋、且つ、ＵＣＰ１＋／＋；
（５）第１の近赤外蛍光タンパク質＋／＋、且つ、ＵＣＰ１＋／−；
（６）第１の近赤外蛍光タンパク質＋／＋、且つ、ＵＣＰ１−／−。
【００３５】
生体内でのＵＣＰ１の発現を可視化するためには、上記（１）、（２）、（４）又は（５）の遺伝子型の遺伝子改変非ヒト動物を用いることができ、上記（４）の遺伝子型の遺伝子改変非ヒト動物を用いることが好ましい。
【００３６】
また、ＵＣＰ１の発現は見られないが、ＵＣＰ１プロモーター活性を可視化するためには、上記（３）又は（６）の遺伝子型の遺伝子改変非ヒト動物を用いることができ、上記（６）の遺伝子型の遺伝子改変非ヒト動物を用いることが好ましい。
【００３７】
本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物は、上述のとおり、ＵＣＰ１プロモーターの下流に第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有するのに加えて、更に、下記の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のプロモーターの下流に第２の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有してもよい。
（ｉ）Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＦＡＢＰ４）
（ｉｉ）アディポネクチン
（ｉｉｉ）レプチン
（ｉｖ）Ｆａｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２７（ＦＳＰ２７）
【００３８】
上記（ｉ）〜（ｉｖ）の各遺伝子は、一般に、脂肪細胞において発現が認められる遺伝子である。第１の近赤外蛍光タンパク質により褐色脂肪細胞（誘導型褐色脂肪細胞を含む）において特異的に発現するＵＣＰ１を、第２の近赤外蛍光タンパク質により脂肪細胞において特異的に発現する上記（ｉ）〜（ｉｖ）の各遺伝子を、同時に検出することができる。また、第１の近赤外蛍光タンパク質及び第２の近赤外蛍光タンパク質の蛍光を検出することで、第１の近赤外蛍光タンパク質及び第２の近赤外蛍光タンパク質の両方の蛍光を発する細胞を褐色脂肪細胞（誘導型褐色脂肪細胞を含む）、第２の近赤外蛍光タンパク質の蛍光のみを発する細胞を白色脂肪細胞と識別することができる。さらに、これにより、褐色脂肪細胞（誘導型褐色脂肪細胞を含む）及び白色脂肪細胞の生体内での分布及び脂肪細胞中の割合（例えば、面積比）を算出することができる。
【００３９】
＜第２の近赤外蛍光タンパク質＞
第２の近赤外蛍光タンパク質としては、上記第１の近赤外蛍光タンパク質において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００４０】
また、第１の近赤外蛍光タンパク質及び第２の近赤外蛍光タンパク質の蛍光波長は異なることが好ましい。これにより、脂肪細胞と褐色脂肪細胞とを同時に検出することができる。
【００４１】
本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物において、染色体上の第２の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挿入される位置としては、上記遺伝子のうちいずれか１種のプロモーターの下流であってもよく、上記遺伝子のうち２種以上の遺伝子のプロモーターの下流であってもよい。
【００４２】
また、本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物において、染色体上の第２の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挿入される位置としては、上記各遺伝子のプロモーターの下流であればよく、上記各遺伝子のプロモーターの下流であって上記各遺伝子の上流であってもよく、上記各遺伝子のプロモーター及び上記各遺伝子の下流であってもよい。また、このとき、上記各遺伝子と第２の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子とは直接結合していてもよく、介在配列を介して間接的に結合してもよい。介在配列としては、上記第１の近赤外蛍光タンパク質において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００４３】
又は、第２の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挿入される位置としては、上記各遺伝子のプロモーターの下流であって、上記各遺伝子と置き換わる形で挿入されていてもよい。その場合には、上記各遺伝子の対立遺伝子のうち一方の遺伝子のみが第２の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子に置き変わったヘテロ接合性であってもよく、上記各遺伝子の対立遺伝子のうち両方の遺伝子が第２の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子に置き変わったホモ接合性であってもよい。
【００４４】
本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物における第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子、第２の近赤外蛍光タンパク質、ＵＣＰ１遺伝子及び上記（ｉ）〜（ｉｖ）の脂肪細胞特異発現遺伝子のうちのいずれか１種の遺伝子型としては、例えば、以下の表１に示すものが挙げられる。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
生体内でのＵＣＰ１遺伝子及び上記（ｉ）〜（ｉｖ）の脂肪細胞特異発現遺伝子のうちのいずれか１種の両方の発現を可視化するためには、上記Ｎｏ．１、２、４、６、１０、１１、１３、１５、１９、２０、２２、２４、２８、２９、３１又は３３の遺伝子型の遺伝子改変非ヒト動物を用いることができ、上記Ｎｏ．１９の遺伝子型の遺伝子改変非ヒト動物を用いることが好ましい。
【００４７】
また、ＵＣＰ１遺伝子及び上記（ｉ）〜（ｉｖ）の脂肪細胞特異発現遺伝子のうちのいずれか１種の発現は見られないが、ＵＣＰ１のプロモーター活性及び上記（ｉ）〜（ｉｖ）の脂肪細胞特異発現遺伝子のうちのいずれか１種のプロモーター活性を可視化するためには、上記Ｎｏ．９、１８、２７又は３６の遺伝子型の遺伝子改変非ヒト動物を用いることができ、上記Ｎｏ．２７の遺伝子型の遺伝子改変非ヒト動物を用いることが好ましい。
【００４８】
≪遺伝子改変非ヒト動物の製造方法≫
本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物は、第１の近赤外蛍光タンパク質（及び、必要に応じて、第２の近赤外蛍光タンパク質）を核ゲノムに導入した遺伝子改変非ヒト動物を作製する公知の遺伝子改変技術を用いて作製することができる。
【００４９】
公知の遺伝子改変技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）を用いた方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた方法等が挙げられる。また、第１の近赤外蛍光タンパク質（及び、必要に応じて、第２の近赤外蛍光タンパク質）を対象となる非ヒト動物の受精卵、胚性幹細胞、精子又は未受精卵へ導入し、これらの細胞を用いて発生させた個体から、第１の近赤外蛍光タンパク質（及び、必要に応じて、第２の近赤外蛍光タンパク質）が胚芽細胞を含むすべての細胞の染色体上に組み込まれた個体を選択する方法によっても作製することができる。
【００５０】
中でも、本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物は、従来のＣＲＩＳＰＲシステムを活用した遺伝子改変非ヒト動物の作製方法により、効率よく得ることができる。より具体的には、外来遺伝子と該外来遺伝子の上流（５’側）及び下流（３’側）に標的遺伝子のプロモーターの下流であって、挿入を行う遺伝子座と相同な配列を有する遺伝子を含むベクターを、対象となる非ヒト動物に導入することによって作製できる。本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物において、外来遺伝子とは、上述の第１の近赤外蛍光タンパク質、及び、上述の第２の近赤外蛍光タンパク質を意味する。また、標的遺伝子とは、ＵＣＰ１遺伝子、及び、上記（ｉ）〜（ｉｖ）の脂肪細胞特異発現遺伝子のうちのいずれか１種の遺伝子を意味する。
【００５１】
＜ＣＲＩＳＰＲシステム＞
ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた遺伝子改変非ヒト動物の製造方法として具体的には、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）を用いる方法等が挙げられる。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなる核酸を含むガイドＲＮＡ；
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ酵素；
（ｃ）近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子、並びに、該遺伝子の上流及び下流に、ＵＣＰ１遺伝子上の挿入を行う部位と相同な配列からなるＤＮＡを含むドナープラスミド。
【００５２】
［ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）］
一般に、「ガイドＲＮＡ」とは細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成する、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ）と該ｃｒＲＮＡと一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを融合させたｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラのヘアピン構造を模倣したものである。
【００５３】
本実施形態の製造方法で用いられるガイドＲＮＡは、ガイド配列（具体的には、標的遺伝子である上述のＵＣＰ１遺伝子中の標的配列）を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが融合した状態で合成されたｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラであってもよい。又は、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを別々に作製し、導入前にアニーリングしてｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラとしたものであってもよい。又は、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分及びｃｒＲＮＡの融合によって作製される一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。
【００５４】
本実施形態の製造方法で用いられるガイドＲＮＡは、標的遺伝子であるＵＣＰ１遺伝子中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、例えば２０塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものとすることができ、例えば２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。さらに、標的遺伝子と非相補的な塩基配列を含み、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
【００５５】
一般に、「ＰＡＭ配列」とはＣＲＩＳＰＲ酵素により認識され得る配列であって、ＰＡＭ配列の長さや塩基配列はＣＲＩＳＰＲ酵素の由来となる細菌種によってさまざまである。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓでは「ＮＧＧ」(Ｎは任意の塩基を表す)の３塩基を認識する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は２つのＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」(Ｎは任意の塩基を表す)の５〜６塩基をＰＡＭ配列として認識する。認識するＰＡＭ配列が短く編集可能な標的遺伝子が制限されにくいことから、ＰＡＭ配列は「ＮＧＧ」であることが好ましい。
【００５６】
また、ｇＲＮＡは、単離又は合成されたＲＮＡであってもよく、発現ベクター内に組み込まれたＲＮＡの形であってもよい。
【００５７】
発現ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター、細菌ベクター、原生動物ベクター、ＤＮＡベクター及びそれらの組換えを含み得る組換えベクター等が挙げられる。
【００５８】
ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、アデノウイルス／アデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられる。
【００５９】
また、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードする核酸の形であってもよく、当該ｇＲＮＡをコードする核酸が発現ベクターにコードされている形であってもよい。
【００６０】
本実施形態の製造方法で用いられるガイドＲＮＡとして具体的には、例えば、配列番号１〜８に示す塩基配列からなる核酸を含むガイドＲＮＡが挙げられる。
【００６１】
中でも、後述の実施例に示すように、優れた導入効率を示すことから、配列番号１に示す塩基配列からなる核酸を含むガイドＲＮＡであることが好ましい。
【００６２】
［ＣＲＩＳＰＲ酵素］
一般に、「ＣＲＩＳＰＲ酵素」とは、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成するＣａｓタンパク質ファミリーの一つであり、外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断するエンドヌクレアーゼである。本明細書において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、ＤＮＡ切断活性を有するものを意味する。
【００６３】
本明細書において、ＣＲＩＳＰＲ酵素のファミリーとしては、例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても公知)、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、又はそれらの改変されたもの等が挙げられる。中でも、本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物の製造においては、Ｃａｓ９、それらのホモログ、又はそれらの改変されたものを用いることが特に好ましい。
【００６４】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的遺伝子中のＰＡＭ配列の最初又は最後のヌクレオチドから、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００又はそれ以上の塩基対以内での、一方又は両方の鎖の切断を指向する。ＰＡＭ配列の上流の何ｂｐのところを切断するかはＣＲＩＳＰＲ酵素の由来となる細菌種によって異なるが、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ：Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）を含め大部分のＣＲＩＳＰＲ酵素はＰＡＭ配列の３塩基上流を切断する。
【００６５】
また、本実施形態の製造方法で用いられるＣＲＩＳＰＲ酵素としては、ＣＲＩＳＰＲ酵素タンパク質であってもよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素コードする核酸であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸を導入する場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸が発現ベクターにコードされている形であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素タンパク質をコードする核酸が発現ベクターにコードされている形で非ヒト動物の卵細胞、精子又は受精卵に導入する場合、導入後、非ヒト動物の卵細胞、精子又は受精卵において発現させることができる。
【００６６】
発現ベクターとしては、上述のガイドＲＮＡにおいて例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００６７】
本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物の製造方法としては、例えば、以下に示す方法が挙げられる。
【００６８】
まず、非ヒト動物の卵細胞、胚性幹細胞、精子又は受精卵にガイドＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ酵素を導入する。また、第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子も同時に導入する。これらの導入方法としては、公知の遺伝子導入の手法を用いることができる。公知の遺伝子導入の手法として具体的には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が挙げられる。
【００６９】
中でも、導入対象が受精卵である場合、マイクロインジェクション法が好ましい。また、後述の実施例に示すように、導入が簡便であることから、ガイドＲＮＡをコードする核酸及びＣＲＩＳＰＲ酵素（特に、Ｃａｓ９）をコードする遺伝子を含む発現ベクターを用いることが好ましい。
【００７０】
また、第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子としては、後述実施例に示すように、該遺伝子及び該遺伝子の上流及び下流に、ＵＣＰ１遺伝子上の挿入を行う部位と相同な配列からなるＤＮＡを含むドナープラスミドを用いることが好ましい。
【００７１】
なお、ＵＣＰ１遺伝子上の挿入を行う部位としては、上述の遺伝子改変非ヒト動物において「第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挿入される位置」として例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００７２】
次いで、導入された卵細胞、精子又は受精卵内において、ガイドＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ酵素は複合体を形成する。次いで、該複合体は、ガイドＲＮＡの一部が標的遺伝子であるＵＣＰ１遺伝子のプロモーターの下流領域に結合し、ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的遺伝子中のＰＡＭ配列を認識する。続いて、３塩基上流に位置する切断部位で前記標的遺伝子を切断し、平滑末端を作製する。より具体的には、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列を起点として、標的遺伝子の二重らせん構造が引き剥され、ガイドＲＮＡ中の標的遺伝子に相補的な塩基配列とアニーリングすることで、標的遺伝子の二重らせん構造が部分的にほぐれる。このとき、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で、標的遺伝子のリン酸ジエステル結合を切断し、平滑末端を作出する。次いで、切断された領域に、ドナープラスミド上の第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子が相同組換えにより挿入される。
【００７３】
次いで、導入対象が受精卵である場合、ガイドＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ酵素の導入後、該受精卵を対応する非ヒト動物の子宮又は卵管へ移植し、発生させることで、遺伝子改変非ヒト動物を簡便に得ることができる。
【００７４】
また、本実施形態の製造方法において、ＵＣＰ１プロモーターの下流への第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子の挿入に加えて、上記（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のプロモーターの下流に第２の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子を挿入する場合は、例えば、以下に示す方法を用いればよい。
【００７５】
まず、ＵＣＰ１プロモーターの下流領域を標的配列とする第１のガイドＲＮＡに加えて、上記（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のプロモーターの下流の領域を標的配列とする第２のガイドＲＮＡを設計する。次いで、当該２種類以上のガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素及び２種類以上のドナープラスミドを卵細胞、胚性幹細胞、精子又は受精卵に、同時に導入すればよい。
【００７６】
≪ＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法≫
本実施形態のＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法は、上記実施形態の遺伝子改変非ヒト動物を用いる方法である。
【００７７】
本実施形態のＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法によれば、ＵＣＰ１の発現制御物質を容易に得られる。また、ＵＣＰ１の発現を促進する物質は、肥満治療薬として応用できる可能性がある。一方、ＵＣＰ１はガン末期患者及び甲状腺機能亢進症患者等において発現が上昇することが知られている。このことから、ＵＣＰ１の発現を抑制する物質は、ガン末期患者及び甲状腺機能亢進症患者等における体重減少を防止し、クオリティ・オブ・ライフ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ；ＱＯＬ）の向上に繋げることができる可能性がある。
【００７８】
本実施形態のＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法について、以下に詳細に説明する。
【００７９】
＜第１実施形態＞
本実施形態のＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法は、投与工程と、検出工程と、を備える方法である。本実施形態の各方法について、以下に詳細を説明する。
【００８０】
［投与工程］
投与工程では、上記実施形態の遺伝子改変非ヒト動物に候補物質を投与する。
【００８１】
候補物質としては、ＵＣＰ１遺伝子の発現を促進、又は、抑制する可能性がある物質であればよい。
【００８２】
また、本明細書において、「候補物質」には、例えば、有機又は無機の化合物（特に、低分子量の化合物） 、タンパク質、ペプチド等が含まれる。
【００８３】
また、投与対象となる遺伝子改変非ヒト動物としては、ＵＣＰ１プロモーターの下流に第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子のみを有する非ヒト動物であってもよく、ＵＣＰ１プロモーターの下流に第１の近赤外蛍光タンパク質をコードする遺伝子及び上記（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のプロモーターの下流に第２の近赤外係合タンパク質をコードする遺伝子を有する非ヒト動物であってもよい。
【００８４】
また、投与対象としては、上記遺伝子改変非ヒト動物から得られる初代培養脂肪前駆細胞及び脂肪細胞であってもよい。
【００８５】
投与対象が上記遺伝子改変非ヒト動物である場合、投与方法としては、例えば、経口的投与、経皮的投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与等が挙げられ、これらに限定されない。
【００８６】
投与対象が細胞である場合、投与方法としては、例えば、候補物質を培地等に混合して投与する方法等が挙げられる。
【００８７】
［検出工程］
検出工程では、第１の近赤外蛍光タンパク質の蛍光、及び、必要に応じて、第２の近赤外蛍光タンパク質の蛍光を検出する。
【００８８】
投与対象が上記遺伝子改変非ヒト動物である場合、例えば、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ）等を用いて、非ヒト動物の体外から第１の近赤外蛍光タンパク質の蛍光（及び、必要に応じて、第２の近赤外蛍光タンパク質の蛍光）を非侵襲的に検出することができる。
【００８９】
また、投与対象が細胞である場合、例えば、顕微紫外可視近赤外分光光度計等を用いて、細胞を観察することで蛍光を検出することができる。
【００９０】
また、第１の近赤外蛍光タンパク質の蛍光量を定量することで、ＵＣＰ１の発現量を定量することができる。
【００９１】
また、第１の近赤外蛍光タンパク質及び第２の近赤外蛍光タンパク質の蛍光を検出することで、第１の近赤外蛍光タンパク質及び第２の近赤外蛍光タンパク質の両方の蛍光を発する細胞を褐色脂肪細胞（誘導型褐色脂肪細胞を含む）、第２の近赤外蛍光タンパク質の蛍光のみを発する細胞を白色脂肪細胞と識別することができる。さらに、これにより、褐色脂肪細胞（誘導型褐色脂肪細胞を含む）及び白色脂肪細胞の生体内での分布及び脂肪細胞中の割合（例えば、面積比）を算出することができる。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９３】
［実施例１］遺伝子改変非ヒト動物の作製
１．Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現ベクターの作製及び評価
（１）ｇＲＮＡの設計
マウスＵＣＰ１遺伝子の転写開始部位及び翻訳開始部位周辺にｇＲＮＡを８個設計した（図１及び表２参照）。＋１はマウスＵＣＰ１遺伝子の転写開始部位を示し、翻訳開始部位は＋２３６である。各ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１〜ｇＲＮＡ８）の設計位置及び方向を矢印で示した。破線は相補鎖を示す。なお、ｇＲＮＡ１〜ｇＲＮＡ８について、以下、「ｇ１〜ｇ８」と称する場合がある。また、図１に示すマウスＵＣＰ１遺伝子の転写開始部位及び翻訳開始部位周辺の配列を配列番号９に示す。
【００９４】
【表２】
2019092417.tif 000003
【００９５】
（２）ｇＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡ断片の調製
ｇＲＮＡの配列を含むオリゴＤＮＡ（２００μＭ）と、それに相補的なオリゴＤＮＡ (２００μＭ)とを各２．５μＬ、１０×オリゴアニーリングバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ)１μＬ、及び、純水４μＬを混合し、９５℃で４分間加熱した。室温で徐々に温度を下げた後、最終濃度が５ｎＭになるよう段階希釈した。アニール後のＤＮＡ断片の両端には制限酵素ＢｂｓＩの配列が付加されるよう、オリゴＤＮＡを設計した。
【００９６】
（３）ｇＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡ断片の発現ベクターへの挿入
ｐＸ３３０−Ｕ６−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ−ＣＢｈ−ｈＳｐＣａｓ９（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、型番：Ｎｏ．４２２３０）をＢｂｓＩで切断後、（２）で調製した二本鎖ＤＮＡ断片を挿入した。大腸菌ＤＨ５αに導入してプラスミドＤＮＡクローンを複数単離し、ＤＮＡ配列に変異のないものを選んだ。Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社製、型番：ＧＤＶ２００２）を用いて、哺乳動物細胞へのトランスフェクションに使用可能な純度の高いプラスミドを調製した。
【００９７】
（４）ｇＲＮＡの作用効率の比較
８個のｇＲＮＡの作用効率を比較するため、以前に報告されているＥＧＦＰを使用したアッセイ方法によって評価した（参考文献１：「Mashiko D  et al., “Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA.”, Sci Rep, 2013, 3:3355, doi: 10.1038/srep03355.」。この方法では、ｇＲＮＡがＥＧＦＰ遺伝子内に挿入された標的配列を認識し、Ｃａｓ９によるＤＮＡの切断が起こると、標的配列の両側に挿入されているＥＧＦＰの相同的な配列が組み換えによって復元し、ＥＧＦＰの蛍光が観察できる。
本実施例では、標的配列としてマウスＵＣＰ１遺伝子の転写開始部位（＋１）から約５００ｂｐを使用し、８個のｇＲＮＡ全てに同じプラスミドＤＮＡを使用して効率を比較できるようにした。
【００９８】
次いで、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３を２４ウェルプレートに１ウェルあたり約２×１０５細胞撒き、５％ＣＯ２インキュベーター内において３７度で一晩接着させた。次いで、各Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現ベクターを標的配列及びＥＧＦＰ配列を含むプラスミドＤＮＡとともにリポフェクタミン法によりトランスフェクションした。トランスフェクションの効率が全てのウェルでほぼ同じであることを確認するため、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ（ＫＯ）発現ベクターも同時に各ウェルに等量ずつトランスフェクションした。結果を図２に示す。
【００９９】
図２から、ｇＲＮＡ２又はｇＲＮＡ３を用いた時に、最も多くの細胞で強いＧＦＰシグナルを検出した。ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ４又はｇＲＮＡ５を用いた時にも、ＧＦＰシグナルを検出できたが、ｇＲＮＡ２又はｇＲＮＡ３に比べてシグナルの数が少なく、強度も弱かった。ｇＲＮＡ６、ｇＲＮＡ７又はｇＲＮＡ８を用いた際には、非常に弱いＧＦＰシグナルしか観察できなかった。全てのウェルにおいてほぼ同様のＫｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ（ＫＯ）の発現を観察できたことから、トランスフェクションの効率はほとんど同じであると判断した。
【０１００】
以上のことから、このアッセイ系では ｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３が最も効率よく標的配列を認識及び切断したと考えられた。
【０１０１】
（５）培養細胞を用いたピューロマイシン耐性遺伝子のノックイン
（１）で設計した８個のｇＲＮＡの遺伝子ノックイン効率を、褐色脂肪前駆細胞を用いて比較した。ここではノックイン後の細胞を薬剤で選択できるようにするため、ピューロマイシン耐性遺伝子をノックインした。ノックインのためのドナーベクターを構築するため、マウスＵＣＰ１遺伝子の−３．８７Ｋ〜＋４．５６ＫをＢＡＣから単離し、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）のＥｃｏＲＩサイトに挿入した。ＰＣＲを用いて、ＵＣＰ１遺伝子の翻訳開始部位にピューロマイシン耐性遺伝子を挿入した。
【０１０２】
次いで、２４ウェルプレートに１ウェルあたり約２〜４×１０４の褐色脂肪前駆細胞を撒き、５％ＣＯ２インキュベーター内において３７度で一晩接着させた。次いで、各Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現ベクターとドナーベクターとをリポフェクタミン法によりトランスフェクションした。トランスフェクション２日後にピューロマイシン（最終濃度１μｇ／ｍＬ）を添加し、約１０日間培養した。ピューロマイシン添加後、培養９日目の各細胞の画像を図３に示す。なお、図３において、「ｕｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」とは、ベクターをトランスフェクションせずにピューロマイシンを添加した細胞を示す。
【０１０３】
図３から、何もトランスフェクションしていない細胞は完全に死滅したことから、ピューロマイシンが作用していることが示された。一方、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９発現ベクター及びドナーベクターをトランスフェクションした細胞では、ピューロマイシン添加後も多数の細胞が生存し、ピューロマイシン耐性遺伝子が多数の細胞でノックインされたことが示唆された。しかし、ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ３及びｇＲＮＡ４を導入した細胞は増殖が培養途中で停止してしまい、十分な量の細胞を回収することができなかった。したがって、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ５、ｇＲＮＡ６、ｇＲＮＡ７及びｇＲＮＡ８を導入した細胞を回収し、ＰＣＲ解析を行った。
【０１０４】
また、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ５発現ベクター及びＣａｓ９／ｇＲＮＡ６発現ベクター、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ５発現ベクター及びＣａｓ９／ｇＲＮＡ７発現ベクター、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ５発現ベクター及びＣａｓ９／ｇＲＮＡ８発現ベクター、並びに、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ５発現ベクター、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ６発現ベクター、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ７発現ベクター及びＣａｓ９／ｇＲＮＡ８発現ベクターを、それぞれ組み合わせてドナーベクターと共にリポフェクタミン法によりトランスフェクションした細胞も準備して、ＰＣＲ解析を行った。
【０１０５】
まず、各細胞のゲノムＤＮＡを調製した。調製したゲノムＤＮＡを用いてピューロマイシン耐性遺伝子がＵＣＰ１遺伝子座へ特異的に挿入されているかどうかをＰＣＲによって解析した。ＰＣＲに用いたプライマーの設計部位及び配列を、図４及び表３にそれぞれ示す。また、ＰＣＲによる各細胞の解析結果を図４に示す。
【０１０６】
【表３】
2019092417.tif 000004
【０１０７】
図４から、ｇＲＮＡ２を導入した細胞において、ＵＣＰ１遺伝子座への特異的なノックインを示唆するＰＣＲ産物が最も強く検出された。一方、ｇＲＮＡ５、ｇＲＮＡ６、ｇＲＮＡ７及びｇＲＮＡ８を導入した細胞では、特異的なノックインを示すＰＣＲ産物の量が非常に少なく、検出が困難であった。
【０１０８】
また、ノックインの特異性を向上させるため、これらのｇＲＮＡを組み合わせて使用したところ、より多くのＰＣＲ産物が検出され、特異的なノックインが増えたことが示唆された。しかし、一連のＰＣＲの結果よりｇＲＮＡ２を単独で用いた時に最も効率よく、且つ、特異的にノックインが起こったことが示唆された。そのため、ノックインマウスの作製にはｇＲＮＡ２を使用することにした。
【０１０９】
２．ノックインマウスの作製
（１）ドナーベクターの構築
ＵＣＰ１伝子座へ近赤外蛍光タンパク質ｉＲＦＰ７２０遺伝子をノックインするためのドナーベクターを構築した。ドナーベクター骨格にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）を使用し、マウスＵＣＰ１遺伝子配列（約−３．９ｋ〜４．５ｋ）を挿入した。さらにＵＣＰ１の翻訳開始部位に人工イントロン、ＫＯＺＡＫ配列、ｉＲＦＰ７２０遺伝子及びウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡ付加シグナル（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ：ＢＧＨｐＡ）を挿入した。イントロンレスのｍＲＮＡは上手く核から脱出できず、翻訳効率が低いと考えられているため、本研究では人工イントロンを挿入した。また、ｉＲＦＰ７２０遺伝子の終止コドンの後ろにＵＣＰ１遺伝子の第一エクソンの配列が続いており、ｉＲＦＰ７２０を含む長い第一エクソンが転写される可能性があるため、本実施例ではｉＲＦＰ７２０遺伝子の直後にＢＧＨｐＡを挿入し、転写が終結されるようにした。実際のドナーベクターの配列を塩基配列１２に示す。ｇＲＮＡ２の標的配列は翻訳開始部位付近に位置している（図１参照）。また、得られたドナーベクターではｇＲＮＡ２の標的配列はｉＲＦＰ７２０を含む挿入遺伝子により分断されている。そのため、ドナーベクター自身がｇＲＮＡ２によって認識され、Ｃａｓ９で切断される可能性は低いと考えられた。
【０１１０】
（２）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡベクター及びドナーベクターの受精卵への導入（Ｆ０マウス作製）
ここでは、最も一般的に使用されているマイクロインジェクション法を用いて（図５参照）、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ２発現ベクター及び上記（１）で作製したｉＲＦＰ７２０ノックイン用ドナーベクターをマウス受精卵の前核内に注入した。マイクロインジェクション法では一度に多数の受精卵を必要とするため、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスに性腺刺激ホルモンを投与して過剰に排卵を誘発し、成体雄マウスと交配させた。受精卵を採取し、実体顕微鏡下でベクターＤＮＡを注入し、そのうち２３６個の受精卵を仮親（偽妊娠）マウスの卵管内に移植した。仮親マウスは、事前にＩＣＲ雌マウス（１０週齢）を精管切除した雄マウスと交配させて作製した。自然分娩で約２０日後に出産させ、８４匹のマウスが誕生した。離乳時（約３週齢）まで保育させたところ、２匹死亡したため、８２匹のＦ０マウスを得た。
【０１１１】
（３）Ｆ０マウスのゲノム解析
イソフルラン麻酔下で、生後３週齢のマウス（Ｆ０）の尾を切り、ゲノムＤＮＡを調製した。ＰＣＲ解析によりＵＣＰ１遺伝子座にｉＲＦＰ７２０遺伝子がノックインされているかどうか、また非特異的な挿入がないかを調べた。ＰＣＲに用いたプライマーの配列を表４に示す。
【０１１２】
【表４】
2019092417.tif 000005
【０１１３】
その結果、８２匹中１６匹において、ＵＣＰ１遺伝子座へのｉＲＦＰ７２０遺伝子の特異的な挿入が検出された。しかし、そのうち７匹においてドナーベクター又はＣａｓ９発現ベクターの非特異的な挿入が検出されたことから、残りの９匹をＦ１の作製に用いることにした。
【０１１４】
（４）Ｆ１マウスの作製及びゲノム解析
ＵＣＰ１遺伝子座にｉＲＦＰ７２０遺伝子が特異的に挿入されており、且つ、非特異的な挿入が検出されなかったＦ０マウス（雄３匹、雌３匹）（８週齢）を用いて、それぞれＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスと交配させて、４１匹のＦ１マウスを作製した（雄２４匹、雌１７匹）。離乳時（約３週齢）まで仮親マウスに保育させた。次いで、麻酔下で尾を切り、ゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲで解析した。用いたＰＣＲプライマーは、表４に記載のものと同じものである。結果を図６Ａ〜図６Ｅに示す。
【０１１５】
図６Ａ〜図６Ｅから、１７匹（雄１２匹、雌５匹）のマウスにおいて、ＵＣＰ１遺伝子座への特異的なｉＲＦＰ７２０遺伝子のノックインが確認された（図６Ａ〜図６Ｅ中、○で示したもの）。これらのマウスにおいては、ドナーベクターやＣａｓ９発現ベクターの非特異的挿入がないことも確認した。
【０１１６】
（５）ＵＣＰ１発現脂肪細胞の蛍光イメージング
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング装置ＩＶＩＳを用いて、イソフルラン麻酔下で褐色脂肪組織の蛍光シグナルを観察した。蛍光の吸収を防ぐため、マウスの体毛は観察前にできるだけ除去した。また、通常のエサは強い蛍光を発して観察を妨げるため、観察日の３日以上前からエサを低蛍光のｉＶｉｄ♯２（オリエンタル酵母工業社製）に変更した。また、対照群として、ｉＲＦＰ７２０がノックインされていないマウスも準備した。結果を図７に示す。図７中、左はｉＲＦＰ７２０がノックインされていないマウス（対照群）であり、右はｉＲＦＰ７２０がノックインされたマウスである。
【０１１７】
図７から、ｉＲＦＰ７２０ノックインマウスの褐色脂肪組織において、特異的に強い蛍光が検出された。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物によれば、生体内におけるＵＣＰ１の発現を非侵襲的に観察でき、基質の投与が不要である。また、上記態様の遺伝子改変非ヒト動物の製造方法によれば、生体内におけるＵＣＰ１の発現を非侵襲的に観察でき、基質の投与が不要な遺伝子改変非ヒト動物を簡便に得られる。また、上記態様のＵＣＰ１の発現制御物質のスクリーニング方法によれば、ＵＣＰ１の発現制御物質を容易に得られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【配列表】
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