(57)【要約】【課題】本発明は、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を簡便に、特にほぼ１００％の確率で得る方法を提供する。【解決手段】目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物胚に導入することを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作成する方法であって、
（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物胚に導入することを含む、方法。
【請求項２】
発生段階において自己の生殖細胞を欠損する異常が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現若しくは活性の低下または欠失である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、遺伝子改変が優性形質を示し、
（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
（ｃ−１）得られた個体を他の個体と交配して、遺伝子改変動物を得ることと
をさらに含む、方法。
【請求項４】
遺伝子改変が、１または複数の遺伝子改変を含み、全ての遺伝子改変が優性形質を示す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法であって、遺伝子改変が劣性形質を示す遺伝子改変を含み、
（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
（ｃ−２）得られた雄の個体と得られた雌の個体とを交配して、遺伝子改変動物を得ることと
をさらに含む、方法。
【請求項６】
目的の遺伝子改変が、１または複数の遺伝子改変を含むものである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、
目的の遺伝子改変が、優性形質を示す遺伝子改変と劣性形質を示す遺伝子改変を含み、
方法は、
（ｃ−２）において、雄および雌のどちらも劣性形質を示す遺伝子改変をホモで有し、かつ、雄または雌のどちらかが優性形質を示す遺伝子改変をホモで有する、方法。
【請求項８】
請求項３に記載の方法であって、遺伝子改変がハプロ不全の形質を示す遺伝子改変である、方法。
【請求項９】
請求項３に記載の方法であって、遺伝子改変が外来遺伝子の導入である、方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の方法であって、遺伝子改変がノックアウトである、方法。
【請求項１１】
目的の遺伝子改変を有する生殖細胞を作製する方法であって、
目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物胚に導入すること、
を含む、方法。
【請求項１２】
発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物胚が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現若しくは活性を低下または欠失させた動物胚である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子改変動物の製造における、生殖細胞欠損動物胚の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生殖細胞欠損動物を用いる遺伝子改変動物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子改変動物は、遺伝子の生体内での機能を解析するために多用されており、外来遺伝子を導入するトランスジェニック動物、および、内在性遺伝子を破壊するノックアウト動物が知られている。
【０００３】
遺伝子改変動物の作製は、野生型の動物胚に目的の遺伝子改変を有する多能性細胞を導入すること、または動物胚に直接目的の遺伝子改変を導入することにより行われる。多能性細胞は動物胚を偽妊娠仮親の子宮に移植して発生させると動物胚から発生する個体は、細胞の一部は野生型の細胞からなり、他の部分は遺伝子改変を有する細胞からなるというキメラ状態となる。これは生殖細胞においても、同様であるが、生殖細胞に導入した多能性幹細胞が寄与した個体目的の遺伝子改変を有する精子と卵子とを交配させると、目的の遺伝子改変をホモで有する遺伝子改変動物を得ることができる。生殖細胞に導入した多能性幹細胞が寄与した個体の生殖腺から得られる目的の遺伝子改変を有する精子または卵子をもう片方の配偶子と交配させると、目的の遺伝子改変をヘテロで有する遺伝子改変動物を得ることができる。また、受精後間もない前核期の胚に目的の遺伝子改変を行うためのDNA、またはRNAを導入することにより、全身または一部の細胞が目的の遺伝子改変を受けた個体を得ることもできる。目的とする遺伝子改変が生殖細胞にも反映されていれば、安定的に遺伝子改変動物を得ることができる。このようにして、遺伝子改変動物の作製が行われている。
【０００４】
特許文献１は、発生段階または成体において致死的な表現型を示す遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を効率よく得る方法を開示する。特許文献１では、遺伝子改変動物は、臓器や組織の全部または一部が欠失する遺伝子改変を有し、これにより致死的であるはずなので、従来は、遺伝子改変をヘテロで有する親を用意し、メンデルの遺伝法則により遺伝子改変をホモで有する個体を４分の１の確率で得ていた。特許文献１は、この確率を顕著に向上させる方法を開示するが、特許文献１では、以下の原理が用いられている。すなわち、遺伝子改変動物（−／−）は通常は致死であり発生しないが、発生段階の胚において正常な多能性細胞を導入すると、この欠失が多能性細胞により補完（胚盤胞補完ともいう）され、動物を成体まで生存させることができる。そして得られた成体の配偶子はほぼ１００％ホモで遺伝子改変を有するから、得られた精子と卵子とを交配させると高い確率で、遺伝子改変をホモで有する遺伝子改変動物を得ることができるという画期的な技術である。
【０００５】
非特許文献１は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトマウスが生殖細胞を欠失することを開示する。Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトマウスは、生殖細胞が欠失するので交配させることができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＵＳ２０１１／００６７１２５Ａ１
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yamaji, M. et al., Nature Genetics, 40(8):1016-1022, 2008
【発明の概要】
【０００８】
このような状況下、本発明者らは、さらに簡便な遺伝子改変動物の作製方法が開発されれば、そのニーズは大きいと考えるに至った。本発明は、生殖細胞欠損動物を用いる遺伝子改変動物の作製方法を提供する。
【０００９】
本発明者らは、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の遺伝子破壊動物において、雄の場合は精子が完全に欠失し、雌の場合は卵子が完全に欠失することを見出した。本発明者らはまた、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物の胚に、該異常を有しない多能性細胞を導入すると、導入した細胞のみから由来する精子または卵子が得られることを見出した。本発明者らは、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物の例としてＰｒｄｍ１４遺伝子の遺伝子破壊動物を用いて、その胚に、Ｐｒｄｍ１４に関して正常な多能性細胞を導入すると、導入した細胞のみから由来する精子または卵子が得られることを見出した。本発明者らはさらに、上記において胚に導入する細胞として、遺伝子改変を有する多能性細胞を用いると、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の遺伝子破壊動物の体内で、得られる精子または卵子が、実質的に遺伝子改変を有する精子のみまたは卵子のみであることを見出した。本発明によれば、このようにして得られた遺伝子改変を有する精子および卵子を交配させることでほぼ１００％の確率で確実に遺伝子改変動物が得られる。本発明によればまた、優性形質を示す遺伝子改変を有する動物を作製する場合には、上記により得られた遺伝子改変を有する精子または卵子のいずれかを、他の卵子または精子と交配させることで１００％の確率で確実に遺伝子改変動物が得られる。
【００１０】
本発明者らはまた、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物の胚（例えば、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性を低下させた動物の胚）に、Ｐｒｄｍ１４に関して正常な多能性細胞を導入すると、導入した多能性細胞が生殖細胞に従来よりも高い割合で寄与することを見出した。本発明者らはさらに、上記において胚に導入する細胞として、遺伝子改変を有する多能性細胞を用いると、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物（例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の遺伝子破壊動物）の体内で、遺伝子改変を有する精子または卵子が従来よりも高い確率で得られることを見出した。本発明によれば、このようにして得られた遺伝子改変を有する精子および卵子を交配させることで高い確率で遺伝子改変動物が得られ、遺伝子改変動物の作製手順が大幅に簡略化される。
【００１１】
本発明は、このような知見に基づく発明である。すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作成する方法であって、
（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物胚に導入することを含む、方法。
（２）目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、
（ａ）発生段階において自己の生殖細胞を欠損する異常が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現若しくは活性の低下または欠失である、上記（１）に記載の方法。
（３）上記（１）または（２）に記載の方法であって、遺伝子改変が優性形質を示し、
（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
（ｃ−１）得られた個体を他の個体と交配して、遺伝子改変動物を得ることと
をさらに含む、方法。
（４）遺伝子改変が、１または複数の遺伝子改変を含み、全ての遺伝子改変が優性形質を示す、上記（３）に記載の方法。
（５）上記（１）または（２）に記載の方法であって、遺伝子改変が劣性形質を示す遺伝子改変を含み、
（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
（ｃ−２）得られた雄の個体と得られた雌の個体とを交配して、遺伝子改変動物を得ることと
をさらに含む、方法。
（６）目的の遺伝子改変が、１または複数の遺伝子改変を含むものである、上記（４）に記載の方法。
（７）上記（５）に記載の方法であって、
目的の遺伝子改変が、優性形質を示す遺伝子改変と劣性形質を示す遺伝子改変を含み、
方法は、
（ｃ−２）において、雄および雌のどちらも劣性形質を示す遺伝子改変をホモで有し、かつ、雄または雌のどちらかが優性形質を示す遺伝子改変をホモで有する、方法。
（８）上記（３）に記載の方法であって、遺伝子改変がハプロ不全の形質を示す遺伝子改変である、方法。
（９）上記（３）に記載の方法であって、遺伝子改変が外来遺伝子の導入である、方法。
（１０）上記（５）に記載の方法であって、遺伝子改変がノックアウトである、方法。
（１１）目的の遺伝子改変を有する生殖細胞を作製する方法であって、
目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を発生段階において自己の生殖細胞を欠損する異常を有する動物胚に導入することを含む方法。
（１２）発生段階において自己の生殖細胞を欠損する異常が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現若しくは活性の低下または欠失である、上記（１１）に記載の方法。方法。
（１３）遺伝子改変動物の製造における、生殖細胞欠損動物胚の使用。
【００１２】
本発明によれば、遺伝子改変動物を高い確率で得ることができる。本発明によれば、特に発生段階において致死性である遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を高い確率で得られる点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、第一の実施形態の一例を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、第二の実施形態の一例を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、第二の実施形態の一例を示す。
【図３】図３は、第三の実施形態の一例を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、第四の実施形態の一例を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、第四の実施形態の一例を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、生殖細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、生殖細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、生殖細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、生殖細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。
【図６】図６は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子座の遺伝子破壊部位におけるガイドRNAのターゲッティング部位を示す。
【図７】図７は、得られたＰｒｄｍ１４遺伝子座の破壊部位を示す。変異型＃１では、１１塩基対が欠失し、変異型＃４では、１７塩基対が欠失した。
【図８】図８は、ＥＳ細胞（ＥＳＣ）を移植されたＰｒｄｍ１４ノックアウト動物胚から発生させた動物の生殖細胞が導入したＥＳ細胞由来の細胞から実質的になることを示す。
【図９】図９は、Ｐｒｄｍ１４ノックアウト動物では生殖細胞が欠失することを示す補助データである。
【発明の具体的な説明】
【００１４】
本明細書では、「Ｐｒｄｍ１４」は、ＰＲドメイン含有タンパク質１４（PR domain-containing protein 14）をコードする遺伝子を意味する。Ｐｒｄｍ１４は、ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１４（RP domain zinc finger protein 14）とも呼ばれる。Ｐｒｄｍ１４タンパク質は、例えば、ＨＰＲＤ  ＩＤ：１１４５７で登録されたアミノ酸配列を有し、その遺伝子は、染色体上の８ｑ１３．３に位置することが知られている。また、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトマウスでは、卵巣および精巣において生殖細胞が欠損することが知られている（Yamaji M. et al., Nature Genetics, 40: 1016-1022, 2008）。
【００１５】
本明細書では、「生殖細胞」とは、生殖細胞を形成する特異な細胞集団として始原生殖細胞から分化して生じる細胞腫であって、始原生殖細胞から精子および卵などの配偶子が形成されるまでの分化過程で生じるすべての生殖細胞系列の細胞種を指す。
【００１６】
本明細書では、「発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物」またはその胚とは、発生段階において自己の生殖細胞を生じない動物またはその胚を意味する。例えば、そのような動物としては、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的（cell-autonomous）な異常を有する動物が挙げられる。
【００１７】
本明細書では、「細胞自律的な異常」とは、細胞が有する異常が当該細胞に対する影響しか質的にまたは量的に実質的に有しないことを意味する。「細胞自律的な異常」は、好ましくは他の細胞に働きかける機構の異常ではない。「細胞自律的な異常」は、例えば、その異常を有する細胞にのみ影響が生じる異常であるから、正常な細胞を導入すると、その細胞は、当該宿主からは異常の影響を受けない。「細胞自律的な異常」としては、例えば、組織特異的な細胞死を誘発する改変、および、組織分化に必要でかつ細胞自律的な因子を欠損した改変が挙げられる。例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現若しくは活性の低下または欠失は、細胞自律的な異常であり得る。また、生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子、より具体的には例えばＰｒｄｍ１４、Ｂｌｉｍｐ１、Ｎａｎｏｓ３、Ｓｔｅｌｌａ、Ｄｄｘ４、Ｔｎａｐ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｆｕｔ４、およびＳｏｘ１７などのエンハンサーおよび／またはプロモーターを利用して、所望のエンハンサーおよび／またはプロモーターが駆動するタイミングで、生殖細胞に特異的に細胞死を引き起こさせるシステムを組込んだ改変も、細胞自律的な異常であり得る。生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子は、例えば、生殖細胞に一時期または長期に特異的に発現する遺伝子とすることができる。
【００１８】
細胞死の誘導は、例えば、薬剤誘導性遺伝子発現システム（例えば、テトラサイクリン応答性発現誘導システム）と組み合わせることで、Ｃａｓｐａｓｅ−８、Ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｂａｒｎａｓｅ、およびジフテリアトキシンなどの細胞障害性遺伝子を、胎内の薬物（例えば、ドキシサイクリン）濃度依存的に生殖細胞（例えば、始原生殖細胞）で発現させることによって達成され得る。以下、生殖細胞特異的に細胞傷害性を発生させる方法の例を図５Ａ〜Ｄを参照して説明する。
【００１９】
図５Ａは、生殖細胞特異的プロモーターと薬剤誘導性遺伝子発現システムと組み合わせて生殖細胞特異的に薬物濃度依存的な細胞死を誘導する系において、薬剤誘導性遺伝子発現システムがＴｅｔ−Ｏｎシステムである系を例示する。図５Ａでは、生殖細胞特異的プロモーターに作動可能にリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）が連結されている。この系が組込まれた胎児は、生殖細胞特異的にｒｔＴＡを発現している。ここで、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）などのテトラサイクリン系化合物により、ｒｔＴＡが発現する生殖細胞でのみ、細胞傷害性遺伝子が誘導され、生殖細胞特異的に細胞死を誘発させることができる。
同じ目的の他の方法としては、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰなどの遺伝子組換えシステムによって生殖細胞特異的に細胞障害性遺伝子を発現させる方法が挙げられる。図５Ｂは、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰなどの組織特異的遺伝子組換えシステムを用いて生殖細胞特異的に細胞死を誘導する系を例示する。図５Ｂでは、構成的活性化型プロモーターの下流に、生理学的に意味の無い遺伝子（ダミー遺伝子）と細胞傷害性遺伝子とを連結させている。この状態では、細胞が細胞死を誘発することがない。しかし、上記においてダミー遺伝子の上流と下流にＬｏｘＰ配列を配置されている。また、この細胞は、生殖細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅを有する。この系では、細胞が生殖細胞に分化すると、生殖細胞特異的プロモーターにより駆動されるＣｒｅが生殖細胞特異的に発現し、ＬｏｘＰ配列に作用してダミー遺伝子を除去し、これにより、構成的活性化型プロモーターに作動可能に細胞傷害性遺伝子を連結させることで、生殖細胞特異的に細胞傷害性遺伝子を発現させ、結果として生殖細胞特異的に細胞を誘発することができる。この系において、Ｃｒｅリコンビナーゼに代えて、４−水酸化タモキシフェンにより活性化されるＣｒｅＥＲを用いてもよいであろう。ＣｒｅＥＲは、Ｃｒｅリコンビナーゼとエストロゲン受容体のリガンド結合領域の変異体との融合タンパク質として知られ、４−水酸化タモキシフェンにより活性化される。
同じ目的のさらに他の方法としては、生殖細胞特異的に細胞障害性シグナルのレセプターを発現させたのちに任意のタイミングでリガンドを作用させて生殖細胞特異的に細胞死を誘導する方法が挙げられる。この場合、細胞傷害性シグナルのレセプターを発現しない細胞は、リガンドに非感受性であることが好ましい。図５Ｃは、生殖細胞特異的プロモーターに作動可能に細胞傷害性シグナルレセプターを連結した系を細胞に組込んでいる。細胞が生殖細胞に分化すると、細胞表面に細胞傷害性シグナルレセプターが発現し、リガンド依存的に細胞死が誘発される。細胞傷害性シグナルレセプターとそのリガンドの例としては、ジフテリアトキシンレセプターとジフテリアトキシンが挙げられる。
同じ目的のさらに他の方法としては、化合物誘導性細胞障害システムが例示できる。他化合物誘導性細胞傷害システムの例としては、HSV-TK/GCVシステムHSV-TK/GCVシステム(Moolten FL et al., Hum. Gene Ther. 1990; 1: 125-134) を用いる系や、inducible caspase-9 (Straathof KC et al., Blood 2005; 105: 4247-4254)を用いる系が挙げられる。図５Ｄは、HSV-TK/GCVシステムを例示する。具体的には、ガンシクロビル（ＧＣＶ）は、非リン酸化形態では細胞傷害性が弱い。しかしながら、ヘルペスウイルス属が有するチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）を作用させると、ＧＣＶはリン酸化され、ＧＣＶ三リン酸に変換され、細胞傷害性を獲得する。従って、ＨＳＶ−ＴＫを生殖細胞特異的プロモーターに作動可能に連結し、ＨＳＶ−ＴＫを生殖細胞特異的に発現させることにより、生殖細胞特異的に細胞死を誘発できる。また、inducible caspase-9は、caspase-9において、ＣＡＲＤがＦＫＢＰ１２により置き換えられたタンパク質であり、ＡＰ１９０３などのタクロリムス誘導体存在下でのみ二量体化することができ、活性化して細胞に細胞死を誘発させることができる。inducible caspase-9を生殖細胞特異的プロモーターに作動可能に連結した系を導入した細胞が生殖細胞に分化すると、タクロリムス誘導体により生殖細胞特異的に細胞死が誘発される。
本発明においては、これらの方法をさらに組み合わせて用いてもよい。当業者であれば、本明細書の内容および技術常識に基づいて生殖細胞特異的な細胞死の誘導を実現することができるであろう。発生段階で生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚の生殖細胞は、胚盤胞補完法の原理により、胚に導入した多能性細胞に置き換わる。
【００２０】
本明細書では、「Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた」またはこの類似の表現は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現を低下または欠失させること、および、Ｐｒｄｍ１４のタンパク質レベルまたは活性を低下または欠失させることを意味する。
【００２１】
本明細書では、「動物」とは、哺乳動物および鳥類を意味する。動物としては、特に限定されないが、例えば、マウスおよびラットなどの齧歯類、ブタおよびウシなどの家畜動物、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ニワトリなどの鳥類、並びにサルなどの霊長類が挙げられる。本明細書では、動物は非ヒト動物である。
【００２２】
本明細書では、「多能性細胞」（pluripotent cell）とは、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞、並びに、内部細胞塊（ＩＣＭ）などの多能性細胞を意味する。多能性細胞は、あらゆる細胞に分化できることで知られ、生殖系列に寄与することができる。
【００２３】
本明細書では、「遺伝子改変を有する多能性細胞」とは、遺伝子改変を有し、かつ生殖系列に寄与することができる細胞を意味する。
【００２４】
本明細書では、「遺伝子改変」とは、遺伝子が野生型と異なることを意味し、天然の改変および人工の改変が含まれる。遺伝子改変の代表的な例としては、トランスジェニックおよびノックアウトが挙げられる。
【００２５】
本明細書では、「優性形質」とは、遺伝子改変に対して用いられる場合、遺伝子改変が父方または母方のどちらかの染色体上に１つ含むだけで遺伝子改変の表現型が表われることを意味する。優性形質を示す遺伝子改変の代表的な例としては、ハプロ不全を引き起こす遺伝子の機能破壊、Ｙ染色体上の遺伝子の破壊、ドミナントネガティブのタンパク質をコードする遺伝子の導入、およびトランスジェニックが挙げられる。
【００２６】
本明細書では、「劣性形質」とは、遺伝子改変に対して用いられる場合、遺伝子改変が父方および母方の両方の染色体で行われていなければ、遺伝子改変の表現型が表われないことを意味する。例えば、劣性遺伝子のノックアウトは、劣性形質を示す遺伝子改変の代表的な例として挙げられる。
【００２７】
本明細書では、「ホモ」とは、遺伝子改変に対して用いられる場合、父方および母方の染色体の両方に遺伝子改変を有することを意味する。
【００２８】
本明細書では、「ヘテロ」とは、遺伝子改変に対して用いられる場合、父方または母方のいずれか一方のみに遺伝子改変を有することを意味する。
【００２９】
本明細書では、「交配」とは、次世代を得るために生物の二個体間で受精を行うことを意味する。交配としては、人工授精により交配すること、および生殖を目的として雄と雌とを対合させることが挙げられる。
【００３０】
本発明によれば、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）に導入することを含む方法が提供される。上記（ａ）により、目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する生殖細胞（すなわち、目的の遺伝子改変をホモで有する生殖細胞）を高い確率で得ることができる。（ａ）を実施した後は、動物胚を仮親の子宮に移植して発生させると目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する生殖細胞を得ることができるので、その後は、常法により遺伝子改変動物を得ることができる。
【００３１】
本発明では、Ｐｒｄｍ１４をノックアウトするか実質的に完全にノックダウンすると、上記（ａ）により、生殖細胞１００個あたりの遺伝子改変を有する生殖細胞の数を、９０個以上、９５個以上、９８個以上、９９個以上、または１００個とすることができる。本発明ではまた、Ｐｒｄｍ１４をヘテロでノックアウトすると、上記（ａ）により、生殖細胞１００個あたりの遺伝子改変を有する生殖細胞の数を５個以上または１０個以上とすることができる。
【００３２】
動物胚は、８細胞期の胚から胚盤胞期の胚まで様々な胚を用いることができ、このような動物胚に多能性細胞を導入する方法は当業者に周知である。多能性細胞としては、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞や内部細胞塊（ＩＣＭ）などの多能性細胞が挙げられ、本発明において胚に導入することができる。胚に導入する多能性幹細胞の数も、適宜決定することができ、特に限定されないが例えば、胚盤胞に導入する場合には３個〜１０個程度とすることができる。
【００３３】
本発明によれば、上記（ａ）では、目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を用いることが必要である。また、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）は、例えば、遺伝子工学的な手法、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックダウンやノックアウトにより作製することができる。Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚は、発生させると生殖細胞を欠失する。
【００３４】
例えば、Ｐｒｄｍ１４ノックダウン動物胚は、動物胚にｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉を引き起こすＲＮＡを発現させることにより作製することができる。Ｐｒｄｍ１４ノックダウン動物胚は、Ｐｒｄｍ１４ノックダウン多能性細胞（例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子に対するｓｈＲＮＡを恒常的に発現する多能性細胞）をテトラプロイド補完法や胚に注入する通常のキメラ形成法で生殖系列に移行させて、交配することにより得ることができる。また、Ｐｒｄｍ１４ノックアウト動物胚は、Ｐｒｄｍ１４のヘテロノックアウト動物の雄と雌とを掛け合わせることで得ることができる。遺伝子のノックアウトは、相同組換え、およびゲノム編集（CRISPR/CAS9系）などの当業者に周知の方法により行うことができる。
【００３５】
本発明のある態様では、遺伝子改変が劣性形質を示す単一または複数の遺伝子改変である。この態様においては、本発明は、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、
（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）に導入すること、
（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
（ｃ−２）得られた雄の個体と得られた雌の個体とを交配して、遺伝子改変動物を得ることと
を含む方法が提供される。上記の（ｃ−２）において、上記（ｂ）で得られた雄の個体と雌の個体とを交配することを特徴とする。この態様は、第一の実施形態として一例を図１を参照しながら後述する。
【００３６】
本発明のある態様では、遺伝子改変が優性形質を示す単一または複数の遺伝子改変である。この態様においては、本発明は、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、
（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）に導入すること、
（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
（ｃ−１）得られた個体を他の個体と交配して、遺伝子改変動物を得ることと
を含み得る。遺伝子改変が優性形質を示す場合には、上記（ｃ−１）では、片方の性別の個体を上記（ｂ）で得られた個体とし、もう片方の性別の個体は、他の個体とすることができる。この態様は、遺伝子改変が単一の場合を第二の実施形態として一例を図２を参照しながら後述する。
【００３７】
本発明のある態様では、遺伝子改変が優性形質を示す遺伝子改変と劣性形質を示す遺伝子改変の両方を含む。この態様では、
目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、
（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）に導入すること、
（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
（ｃ−２）得られた雄の個体と得られた雌の個体とを交配して、遺伝子改変動物を得ることと
を含む方法であって、（ｃ−２）において、雄および雌のどちらも劣性形質を示す遺伝子改変をホモで有し、かつ、雄または雌のどちらかが優性形質を示す遺伝子改変をホモで有する、方法が提供される。劣性形質を示す遺伝子改変については、雌雄両方がホモで有しなければならず、優性形質を示す遺伝子改変については、雄および雌の少なくとも一方がホモで有していればよい。この態様は、第三の実施形態として一例を図３を参照しながら後述する。
【００３８】
本発明のある態様では、遺伝子改変が優性形質を示す複数の遺伝子改変のみを含む。この態様においても、本発明は、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、
（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）に導入すること、
（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
（ｃ−１）得られた個体を他の個体と交配して、遺伝子改変動物を得ることと
を含み得る。遺伝子改変が優性形質を示す遺伝子改変のみの場合には、遺伝子改変が複数であっても、上記（ｃ−１）では、片方の性別の個体を上記（ｂ）で得られた個体とし、もう片方の性別の個体は、他の個体とすることができる。この態様は、遺伝子改変が単一の場合を第四の実施形態として一例を図４を参照しながら後述する。
【００３９】
以下、第一の実施形態として、遺伝子改変が１遺伝子の改変であり劣性形質を示す遺伝子改変である場合（図１参照）、第二の実施形態として、遺伝子改変が１遺伝子の改変であり優性形質を示す遺伝子改変である場合（図２参照）、第三の実施形態として、遺伝子改変が複数遺伝子の改変であり、劣性形質を示す遺伝子改変を含む場合（図３参照）、および、第四の実施形態として、遺伝子改変が複数遺伝子の改変であり、全ての遺伝子改変が優性形質を示す遺伝子改変である場合（図４参照）を順に説明する。図中、一例としてＰＲＤＭ１４−／−で説明をするが、これに限定されず、発明は、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚）において成立するものと理解される。
【００４０】
第一の実施形態
第一の実施形態では、遺伝子改変が劣性形質を示す単一の遺伝子改変である。第一の実施形態では、遺伝子改変が劣性であるから、この遺伝子改変をホモで有する遺伝子改変動物を得ることが目標となる。以下、劣性形質を示す遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を得る方法の例として、第一の実施形態を説明する。なお、第一の実施形態では、Ｐｒｄｍ１４はその発現または活性が低下しており、これにより生殖細胞が欠失していればよいが、図１では、一例としてＰｒｄｍ１４ホモノックアウトの例が示されている。
【００４１】
まず、上記（ａ）として、雄および雌の両方の胚を含むように、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）を提供する。図１では、Ｐｒｄｍ１４がホモでノックアウトされた雄と雌の動物胚を提供する例が示されている。上記（ａ）において雄と雌を含むように胚を提供する理由は、上記（ｃ）において、上記胚から得られた雄と雌とを交配させることが必要であるためである。Ｐｒｄｍ１４は常染色体上に位置するため、例えば、Ｐｒｄｍ１４ヘテロノックアウト動物同士を交配させれば、均等に雄と雌とが得られることとなる。
【００４２】
次に、上記（ｂ）として、得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得る。宿主動物は、胚と同種の偽妊娠仮親とすることができ、得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させる方法は、当業者に周知の方法により実施することができる。個体は、帝王切開手術または分娩により得ることができる。
【００４３】
さらに上記（ｃ−２）として、上記（ｂ）により得られた雄と雌とを交配させて、遺伝子改変動物を得る。上記（ｂ）では、雄も雌も生殖細胞はほぼ１００％が遺伝子改変をホモで有する個体が得られるので、得られた雄と雌とを交配させれば、ほぼ１００％の確率で遺伝子改変をホモで有する遺伝子改変動物を得ることができる。遺伝子改変が劣性形質を示す場合には、遺伝子改変をホモで有する遺伝子改変動物を得る必要があるが、第一の実施形態では、このような動物がほぼ１００％の確率で得られることとなり有利である。
【００４４】
第二の実施形態
以下、図２ＡおよびＢを参照しながら、第二の実施形態について説明する。図２ＡおよびＢでは、遺伝子改変の例としてトランスジェニック（ＴＧ）の例が示されているが、必ずしもＴＧである必要は無く、優性形質を示す遺伝子改変であれば、例えば、ハプロ不全である遺伝子の破壊であってもよい。
【００４５】
まず、上記（ａ）として、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）を提供する。動物胚は、雄若しくは雌またはその両方とすることができる。第二の実施形態において（ａ）において雄および雌の少なくとも一方の動物胚を提供すればよい理由は、遺伝子改変が優性形質を示す場合には、目的の遺伝子改変動物は、遺伝子改変を父方および母方の染色体の少なくとも一方に有していればよいため、（ｃ−１）において、交配させる一方の性の個体が生殖細胞として遺伝子改変を有する生殖細胞を有していれば十分であるからである。従って、（ｃ−１）における他の個体は任意の個体とすることができる。優性形質を示す遺伝子改変をホモで有する多能性細胞は、特に限定されないが例えば、多能性細胞の特定遺伝子または遺伝子座の遺伝子改変により得ることができる。（ｂ）については、第一の実施形態と同じであるため説明は省略する。
【００４６】
第三の実施形態
以下、図３を参照しながら、第三の実施形態について説明する。図３では、一例として劣性形質を示す遺伝子改変を２つ有し、かつ、優性形質を示す遺伝子改変を１つ有する場合が例示されている。すなわち、第三の実施形態は、第一の実施形態と第二の実施形態との組合せに相当するものである。図３ではまた、劣性形質を示す遺伝子改変の例として、ノックアウトが例示され、優性形質を示す遺伝子改変の例としてトランスジェニックが例示されているが、第一の実施形態および第二の実施形態において説明されたように、それぞれ劣性形質を示し、優性形質を示す限りこれらに限定されない。
【００４７】
（ａ）は、第一の実施形態と同様である。すなわち、まず、上記（ａ）として、雄および雌の両方の胚を含むように、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）を提供する。この理由は、目的の遺伝子改変動物が、劣性形質を示す遺伝子改変に関してはホモで有さなければならないため、（ｃ−２）として、当該遺伝子改変をホモで有する生殖細胞を有する雄と雌とを交配させる必要があるためである。
【００４８】
第三の実施形態における特徴は、（ａ）において動物胚に導入する多能性細胞は、雄および雌のどちらに導入する多能性細胞も、劣性形質を示す遺伝子改変をホモで有することが必要であるが、優性形質を示す遺伝子改変については、雄および雌の少なくとも一方のみがホモで有していればよい点である。優性形質を示す遺伝子改変については、雄および雌の両方がホモで有していてもよい。
【００４９】
そして、（ｃ−２）において、雄および雌のどちらもその生殖細胞は劣性形質を示す遺伝子改変をホモで有し、かつ、その生殖細胞は雄または雌のどちらかが優性形質を示す遺伝子改変をホモで有する。このようにすることで、図３に示されるように、劣性形質を示す遺伝子は、必ず交配後得られる産仔ではホモで有することになり、優性形質を示す遺伝子は、交配後得られる産仔で少なくともヘテロで有することになって、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物をほぼ１００％の確率で得ることができる。
【００５０】
第四の実施形態
以下、図４ＡおよびＢを参照しながら、第四の実施形態を説明する。第四の実施形態は、優性形質を示す遺伝子改変を複数有する遺伝子改変動物を得ること以外は、第二の実施形態と同一である。従って、各工程についての説明は省略する。
【００５１】
図４Ａは、図２のＡに対応する図のみを示しているが、図２Ｂに対応する実施形態も、第四の実施形態には含まれる。遺伝子改変が複数になった点が相違し、それ以外は第二の実施形態と同一であることが理解される。
【００５２】
図４Ｂは、２つの遺伝子改変を別々の多能性細胞にそれぞれ導入し、雄と雌とを交配させて、２つの遺伝子改変をヘテロで有する遺伝子改変動物を作製するスキームを示すものである。図４Ｂでは、目的遺伝子Ａの遺伝子改変を有する精子については、図２Ａに対応する工程により、目的遺伝子Ｂの遺伝子改変を有する卵子については図２Ｂに対応する工程により作製することができる。この態様では、目的遺伝子ＡとＢとは別の染色体上に位置するものとすることが好ましく、または、離れた遺伝子座に位置するものとすることが好ましい。この態様においては、（ｃ−１）において、他の個体は、別の目的遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞をＰｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚に導入する（ａ）と（ｂ）により得られた個体である。
【００５３】
変形例
以下、変形例を説明する。この変形例は、（ａ）において、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性が低下した形態であり、完全に消失していない場合を想定するものである。この変形例においては、第一の実施形態から第四の実施形態までのいずれの形態の変形例も可能であるが、まず、最初に、第二および第四の実施形態の変形例について以下説明する。
【００５４】
（ａ）においてＰｒｄｍ１４の発現または活性が欠失した場合には、図８に示されるように生殖細胞のほぼ全てがＲＨＴ−ＥＳ細胞に由来した。そのため、目的の遺伝子改変を有する多能性細胞をＲＨＴ−ＥＳ細胞の代わりに胚に導入すれば、ほぼ全ての生殖細胞が、目的の遺伝子改変を有することになるということが、上記第一から第四の実施形態における利点であり、（ｃ−１）または（ｃ−２）においてほぼ１００％の確率で目的の遺伝子改変の表現型を示す遺伝子改変動物を得ることができる。
【００５５】
変形例では（ａ）において、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性が完全には消失していない動物胚を用いる。このような動物胚の一例として、例えば、Ｐｒｄｍ１４＋／−の動物胚およびＰｒｄｍ１４ノックダウン胚などのＰｒｄｍ１４改変胚を用いることができる。Ｐｒｄｍ１４ノックダウン胚は、当業者に周知のＲＮＡ干渉を用いた方法により容易に作製することができる。
【００５６】
例えば、後述する実施例に記載するように、Ｐｒｄｍ１４＋／−の動物胚に、ＲＨＴ−ＥＳ細胞を導入すると、生殖細胞のうちの約１６％程度がＲＨＴ−ＥＳ細胞に由来する生殖細胞であった。すなわち、Ｐｒｄｍ１４は、完全にその発現または活性が消失していなくてもよく、部分的に発現や活性が低下していれば、胚に導入した多能性細胞が生殖細胞に寄与する余地を与えることとなる。
【００５７】
そしてそのようにして得られた、少なくとも一部の生殖細胞は、遺伝子改変をホモで有する生殖細胞で構成されることとなり、別の性の配偶子と交配させることにより、一定確率で目的遺伝子をヘテロで有する遺伝子改変動物を得ることができる。
【００５８】
変形例は、第一から第四の実施形態に比べると、目的の遺伝子改変動物を得る確率が低い点で不利であるようにも思われる。しかしながら、従来の方法と比較すると、従来の方法では遺伝子改変を有する多能性細胞は、動物胚に導入され、該動物胚からキメラマウスを取得して、キメラマウスの内、キメラ率の高いマウスを選択して野生型マウスと交配させ、Ｆ１として目的の遺伝子改変動物を得る。しかし、従来法では、第一世代において、目的の遺伝子改変を有する細胞の生殖細胞への寄与が実質的に確認できない個体が多く、また、仮に生殖細胞に寄与した個体が見出されたとしても、生殖細胞に占める遺伝子改変を有する生殖細胞の割合が低く、実用上は、キメラ個体を選別する第一のスクリーニング工程と、キメラ個体を交配させて得られる産仔から目的の遺伝子改変動物を選別する第二のスクリーニング工程の２回のスクリーニング工程が必要であり、作業が繁雑であった。これに対して、本発明の変形例では、第一世代の生殖細胞は実質的な割合で全ての第一世代のマウスに組込まれるため、第一のスクリーニング工程を省略することができ、かつ第二のスクリーニングも、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物が安定して一定の割合（例えば、ヘテロノックアウトですら約１６％）で含まれることから、容易である。また、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性をより強く低下させれば、より効率よく目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物が得られる。
【００５９】
次に、第一および第三の実施形態の変形例について以下説明する。この変形例では、（ａ）において、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性が低下した形態であり、完全に消失していないこと以外は、第一および第三の実施形態の説明と同一であるので、第一および第三の実施形態を参照し、説明は省略する。また、変形例における（ａ）については、上記第二および第四の実施形態の変形例と同一であるため、上記第二および第四の実施形態の変形例を参照し、説明は省略する。以下では、従来法との対比を行い、本変形例の特徴を説明する。
【００６０】
従来法では、目的遺伝子が劣性形質を示す遺伝子である場合であっても、多能性細胞としては目的遺伝子の遺伝子改変をヘテロで有する多能性細胞を動物胚に導入して、第一世代の個体（キメラ個体）を得た。キメラ個体のうち、一部の個体は生殖系列に導入した多能性細胞か寄与しているので、これを選別した上で、野生型と交配し、全身の細胞が目的遺伝子の遺伝子改変をヘテロで有する細胞からなる第二世代の個体を得ていた。そして、さらに第二世代の個体同士を交配させることで、メンデルの遺伝法則に従い、４分の１の確率で目的の遺伝子改変をヘテロで有する遺伝子改変動物を第三世代として得ていた。
【００６１】
これに対して、本発明の変形例では、第一世代では、得られた精子または卵子には、必ず目的遺伝子の遺伝子改変をヘテロで有する多能性細胞が一定割合で寄与するので、キメラ個体を選別する作業は不要であり、省略することができるという利点を有する。第二世代と第三世代の交配については従来法と同様に行うことができる。
【００６２】
あるいは、本発明の変形例の別の態様では、第一世代において、多能性細胞が生殖細胞に一定割合で必ず寄与するので、第一世代同士を掛け合わせることで第二世代として一定確率で目的の遺伝子改変をヘテロで有する遺伝子改変動物を得ることが可能である。このようにすると、第三世代までの交配が不要であり、遺伝子改変動物を容易に得ることができる。
【００６３】
このように、いずれの実施形態およびその変形例においても、従来法よりも遙かに簡便に目的遺伝子の遺伝子改変動物を得ることが可能となる。
【００６４】
本発明の別の側面では、遺伝子改変動物の製造における生殖細胞欠損動物胚の使用が提供される。生殖細胞欠損動物胚には、例えば、所望の遺伝子改変を施した細胞を第一から第四の実施形態およびその変形例で示した通りに導入して、所望の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を製造することができる。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例によって発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性を低下させた動物胚）に、野生型の正常なＥＳ細胞を導入すると、前記動物胚を発生させて得られる個体の生殖細胞がすべて導入したＥＳ細胞で占有されることを示す。
【００６６】
実施例１：Ｐｒｄｍ１４ヘテロノックアウト動物およびノックアウト胚の作製
本実施例では、Ｐｒｄｍ１４ヘテロノックアウトマウス（Ｐｒｄｍ１４＋／−）およびノックアウト胚（Ｐｒｄｍ１４−／−）を作製した。
【００６７】
Ｐｒｄｍ１４ヘテロノックアウトマウスの作製
Ｃ５７ＢＬ６、ＢＤＦ１、およびＩＣＲは日本ＳＬＣから購入した。ｈＣａｓ９発現プラスミド（addgene 41815. Mali et al. Science., 339:823-826,2013）、およびガイドＲＮＡ発現ベクター（addgene 41823. Mali et al. Science., 339:823-826,2013） にマウスＰｒｄｍ１４の配列（配列番号１、そのアミノ酸配列が配列番号２）を組み込んだプラスミド（図６参照）をそれぞれ１０ｎｇ／μｌの濃度で含む溶液を顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いてＢＤＦ１×Ｃ５７ＢＬ６由来の前核期胚の前核へ注入した。胚を回収しＫＳＯＭ-ＡＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で１日培養し２細胞期まで発生した胚を交配後０．５日目の偽妊娠ＩＣＲ系統マウスの卵管へと移植した。出産から３週後に耳の一部を採取し５０ｍＭ  ＮａＯＨ  ９０μｌ中で９５℃、１０分間処理した後１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和しゲノムＤＮＡ溶液を採取した。得られたゲノムＤＮＡ溶液をＴＫＳ  ＧＦｌｅｘ（ＴＡＫＡＲＡ）とＰｒｄｍ１４フォワードプライマー：TACAATCTGCCCTGGTACAA（配列番号３）、Ｐｒｄｍ１４リバースプライマー：AGAACTCTCTGTGGGAACCA（配列番号４）を用いてGene Amp PCR system 9700(Applied Biosystems;AB)によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)によりＤＮＡを精製したのち、ＦＡＳＭＡＣ社により提供される受託シークエンスサービスを利用して標的部位のＤＮＡ配列を解析した。その結果、２種のＰｒｄｍ１４変異型が得られた（図７中の＃１および＃４を参照）。
【００６８】
ＥＳ細胞の調製
ＥＳ細胞は、マウスＢ６ ＥＳ細胞のＲＯＳＡ２６遺伝子座にヒストンＨ２ＢとｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色蛍光タンパク）を融合させたタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現可能に含むベクターをエレクトロポレーション法によりノックインして作製した（例えば、Molecular Reproduction and Development, Volume 82, Issue 12, pages 916-917, 2015参照）。このＥＳ細胞（以下、ＲＨＴ−ＥＳ細胞という）は、赤色蛍光を指標として移植した他の動物中でその存在部位、分布を可視化することが可能である。
【００６９】
ＲＨＴ−ＥＳ細胞は、ゼラチンコートを施したディッシュにて、Glagow's Modified Eagle's Medium(GMEM;Sigma,St.Louis,MO)に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）、０．１ｍＭ ２-メルカプトメタノール（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム塩（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、１％ Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、1,000 U/ml leukiemia inhibitory factor (LIF; Millipore)を添加した培地で培養した。なお、当然のことであるが、ＲＨＴ−ＥＳ細胞は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子に関しては正常である。
【００７０】
胚盤胞注入法を用いたキメラマウスの作製
図７に示される変異型＃１と＃４の個体を交配させ、交配後２．５日目に桑実胚を卵管と子宮還流により採取し、ＫＳＯＭ-ＡＡにより１日培養してノックアウト胚（Ｐｒｄｍ１４−／−）を胚盤胞として得た。
【００７１】
顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いてＲＨＴ−ＥＳ細胞を１個の胚盤胞に対して約５個の割合で、腔へ注入した。胚の回復を待った後、交配後２．５日目の偽妊娠ＩＣＲ系統マウスの子宮へと移植し、移植後１１日目（胎齢１３．５日目、「Ｅ１３．５」ともいう）に帝王切開し、胎仔を取り出した。得られた胎仔を蛍光顕微鏡下で観察しキメラ形成の判定を行った。
【００７２】
フローサイトメーターを用いたキメラ形成率の測定とＰｒｄｍ１４ノックアウトマウスの判定
ＲＨＴ−ＥＳ細胞に組込まれたｔｄＴｏｍａｔｏに起因する赤色蛍光から、ＲＨＴ−ＥＳ細胞とＰｒｄｍ１４−／−細胞とのキメラであることが確認されたＥ１３．５マウス胚から胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）、血球細胞、および生殖細胞を取り分けた。具体的には、臓器を含まない胚体をハサミで細切後、０．０２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって３７℃で１０分間処理することで、ＭＥＦを得た。また、生殖堤をハサミで細切後、０．０２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって３７℃下で１０分間処理することで、生殖細胞を含む細胞懸濁液を得た。さらに、肝臓をピペッティングにより解離することで、血球細胞を含む細胞懸濁液を得た。
【００７３】
上記で得られた血球細胞を含む細胞懸濁液にマウス抗ＣＤ４５−ＰＥ−Ｃｙ７抗体（ｅＢｉｏ社製）、生殖細胞を含む細胞懸濁液に抗ＳＳＥＡ１−ＡＰＣ抗体（ｅＢｉｏ社製）をそれぞれ０．５μｌ加え、遮光した氷上で３０分間静置した。血球細胞、ＭＥＦ、および生殖細胞それぞれをＰＢＳ（ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ；ＳＭ）で洗浄後、１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ；ＰＩ）を含んだＰＢＳで再懸濁し、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と解析ソフトウェア、Ｆｌｏｗ−ｊｏを用いて解析した。
また、残りのＭＥＦ懸濁液をＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩを用いてｔｄＴｏｍａｔｏ陰性細胞を分取し、上記と同様に変異配列解析をした。
【００７４】
その結果、図８に示されるように、Ｐｒｄｍ１４−／−胚にＲＨＴ−ＥＳ細胞を導入して得た胚では、ＳＳＥＡ１発現細胞（すなわち、生殖細胞）におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞の割合が９９．６％であり、生殖細胞は実質的にＲＨＴ−ＥＳ細胞に由来する細胞により占有されていた。すなわち、Ｐｒｄｍ１４−／−胚にＲＨＴ−ＥＳ細胞を導入して得た胚では、ＲＨＴ−ＥＳ細胞は、正常に生殖系列に分化し、生殖堤に移動し、始原生殖細胞に特徴的なＳＳＥＡ−１陽性の特徴を示すことが明らかとなると共に、生殖細胞のほぼ全てがＲＨＴ−ＥＳ細胞からなることが明らかとなった。また、陰性対照としての野生胚に野生型ＥＳ細胞を導入して得た胚では、ＳＳＥＡ１発現細胞におけるＥＳ細胞由来細胞の割合は０．０５７％と非常に低かった。その一方で、Ｐｒｄｍ１４＋／−胚にＲＨＴ−ＥＳ細胞を導入して得た胚では、ＳＳＥＡ１発現細胞におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞の割合はＰｒｄｍ１４遺伝子野生型の胚を用いたときと同等かそれ以上（例えば、１６．１％）であった。Ｐｒｄｍ１４＋／−胚を用いると、生殖細胞において胚由来の細胞とＲＨＴ−ＥＳ細胞由来の細胞とが混在し、かつＲＨＴ−ＥＳ細胞の寄与することができた。
【００７５】
なお、図９に示されるように上記で得られるＰｒｄｍ１４−／−胚は、生殖細胞を欠失することが確認された。
【００７６】
このように、Ｐｒｄｍ１４−／−胚にＥＳ細胞を導入すると、得られた胚における生殖細胞は、導入したＥＳ細胞により占有されることが明らかとなった。
【００７７】
ＥＳ細胞を導入したＰｒｄｍ１４−／−胚（雄および雌）を成長させて交配させれば、ＥＳ細胞に由来する個体を得ることができる。
【００７８】
発明者らは、この原理を活用して、ほぼ１００％の確率で遺伝子改変を有する生殖細胞（精子または卵子）を得る方法、簡便に遺伝子改変を有する生殖細胞を得る方法、および簡便に目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を得る方法を考案した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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