(57)【要約】      （修正有）【課題】ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ法による分析において、安定的な高感度分析を持続的に遂行するための、ナノエレクトロスプレーイオン化方法及び装置を提供する。【解決手段】液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラム一体型ニードルへ試料を含む分離溶媒導入し、分離された試料成分を該ニードルの先端部より質量分析計の試料導入オリフィスへ向けて噴霧する工程と、ガス供給用キャピラリーへ有機溶媒含有ガスを導入し、該チューブ先端部より前記カラム一体型ニードル先端部へ有機溶媒含有ガスを供給する工程とを含み、前記二つの工程を同時に行うことを特徴とするナノエレクトロスプレーイオン化方法。【選択図】図１
2019060824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラム一体型ニードルへ試料を含む分離溶媒を導入し、及び該ニードル先端部に電圧を印加して、分離された試料成分を該ニードルの先端部より質量分析計の試料導入オリフィスへ向けて噴霧しイオン化する工程と、
ガス供給用キャピラリーへ有機溶媒含有ガスを導入し、該キャピラリー先端部より前記カラム一体型ニードル先端部へ該ガスを供給する工程とを含み、
前記二つの工程を同時に行うことを特徴とするナノエレクトロスプレーイオン化方法。
【請求項２】
前記試料が、２〜１００塩基程度の塩基長を有する天然ＲＮＡ、非天然ＲＮＡ、酵素消化されたＲＮＡオリゴマー、天然型および非天然型のＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、酵素消化されたＤＮＡオリゴマー、天然型および非天然型タンパク質、タンパク質の酵素消化で生じたペプチドまたは合成ポリペプチドを含むものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ガスが、気化した有機溶媒を含む窒素ガスまたは空気であって、当該有機溶媒は水への溶解性を有する有機溶媒である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
水への溶解性を有する有機溶媒が、アルコール類、アセトニトリル、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、ジクロロメタンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ガス供給用キャピラリーの内径が、０．２〜１．０ｍｍであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ガスの流量が、１０〜１５００ｍＬ／分である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の方法を実行するためのナノエレクトロスプレーイオン化装置であって、
液体クロマトグラフィー用充填剤が充填され、質量分析計の試料導入オリフィスに接触または近接配置されたカラム一体型ニードルと、
該カラム一体型ニードルに接続されたスプレー電極と、
有機溶媒含有ガス供給手段と、
を備え、
前記有機溶媒含有ガス供給手段は、
ガス供給部と、
有機溶媒貯蔵器と、
ガス供給用キャピラリーと、を備え、
前記ガス供給部は、前記有機溶媒貯蔵器に流路を介して連結されて、ガスを該有機溶媒貯蔵器へと供給するものであり、
前記有機溶媒貯蔵器は、前記ガス供給用キャピラリーに流路を介して連結されて、該有機溶媒貯蔵器にガスが供給されて生じた有機溶媒含有ガスを前記ガス供給用キャピラリーへと供給するものであり、
前記ガス供給用キャピラリーは、その先端部を前記カラム一体型ニードル先端部に接触または近接させて配置されている、
ことを特徴とするナノエレクトロスプレーイオン化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小流量ＬＣ−ＭＳのＭＳインターフェイスにおけるナノエレクトロスプレーイオン化方法及び装置に関する。特にＲＮＡのナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析について、安定的な高感度分析を持続的に遂行するための、ナノエレクトロスプレーイオン化方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、各種の低分子ＲＮＡが生命活動とその異常に起因するがんなどの疾患に深く関わっていることが明らかにされている。一般に、低分子ＲＮＡの分析には、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに変換したのちの分子生物学的な方法で分析するという方法が採られているが、この方法には低分子ＲＮＡの機能発現に重要な化学修飾の解析や定量分析ができないという欠点があった。
【０００３】
この問題に対し、生体試料中に存在する低分子ＲＮＡを直接質量分析法で同定し、その化学構造や機能を分析するための方法が開発されている。この方法では、対象とする低分子ＲＮＡをＲＮＡ分解酵素で切断し、生成したＲＮＡオリゴマーを液体クロマトグラフィー（ＬＣ）で分離しながらエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）でイオン化し、高性能質量分析（ＭＳ）法で分析して得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを基礎にして該低分子ＲＮＡの種類や存在量、化学構造などを分析する。つまり、ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ法と呼ばれるこの分析においては、ｆｍｏｌレベル（１０−１５ｍｏｌ）の成分を分析するため、試料とするヌクレオチド断片を５０〜５００ｎｌ／分程度の超微流量のＬＣで分離し、これをナノ液滴としてイオン化して質量分析に供することが必要となる。さらにリン酸基に富む低分子ＲＮＡの分析に至っては、タンパク質やペプチドの場合とは異なり、（−）荷電をもつ親水性のヌクレオチドを「ネガティブモード」で質量分析することが求められる。ＭＳ法において「ネガティブモード」での測定は、ペプチドなどを分析対象とする「ポジティブモード」での分析に比べて感度が一桁低い。
【０００４】
上記のような制限をもつ従来のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ法では、（−）荷電をもつ親水性ヌクレオチドが分離の際に有機溶媒濃度の低い条件でＬＣカラムから溶出されるため、分離液の表面張力が大きくなってしまい、ナノエレクトロスプレーイオン化法で効率よくイオン化できず分析感度が著しく低下するという問題点がある。すなわち、低有機溶媒濃度のＬＣ分離液でナノエレクトロスプレーイオン化法を行うと、該分離液をナノ液滴として噴霧するニードルの先端に液滴が生成して、噴霧が断続的になる、ないしは噴霧が停止して分析自体が不能となってしまうことがあった。
【０００５】
このような問題に対し、マイクロリッターレベル（流量がμｌ／分レベル）までの分析に関しては、分離液を噴霧するニードルを平行に取り囲む「シース管」を備えた２重管構造のニードルを用い、該シース管から噴霧されるＬＣ分離液へ有機溶媒（シース液）を供給することによって、ニードル先端における液滴の形成を防ぐという方法が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、前記技術はマイクロリッターレベルまでの分析においては有効な方法ではあるが、ナノリッターレベル（流量がｎｌ／分レベル）の分析へ応用するには至っていない。
【０００６】
本発明者らは特許文献１において、ナノエレクトロスプレーイオン化方法及び装置として高性能なものを開発したが、より安定的にかつ高感度に分析できる方法及び装置の開発が要望されている。
【０００７】
したがって、低分子ＲＮＡなどに利用されるナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳに関しては、持続的に安定してエレクトロスプレーイオン化を行う方法は依然として模索段階にあった。
また、近年よくおこなわれているプロテオミクス分析でもこの手法を同様に用いることができる。すなわち、タンパク質やその酵素消化で生じるポリペプチドを対象とするプロテオミクス分析においても、カラムの先端形状が分析中に変化することでしばしばスプレーが不安定となり、再現性の良い結果が安定して得られない大きな問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−２８１７７７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Huber, C. and Krajete, A., Journal of Chromatography A, 870:413-424, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は前記問題点に鑑みてなされたものであり、ＲＮＡのナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を、カラムの先端形状などの不安定要因に依存せずに維持し、安定的な高感度分析を持続的に遂行するための、ナノエレクトロスプレーイオン化方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明者らが鋭意検討を行った結果、分離溶媒とともに試料を導入し、該試料を成分ごとに分離して噴霧せしめるカラム一体型ニードルの先端に対し、外部から有機溶媒含有ガスを供給することにより、安定的な高感度分析を持続的に遂行できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
［１］  液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラム一体型ニードルへ試料を含む分離溶媒を導入し、及び該ニードル先端部に電圧を印加して、分離された試料成分を該ニードルの先端部より質量分析計の試料導入オリフィスへ向けて噴霧しイオン化する工程と、
ガス供給用キャピラリーへ有機溶媒含有ガスを導入し、該キャピラリー先端部より前記カラム一体型ニードル先端部へ該ガスを供給する工程とを含み、
前記二つの工程を同時に行うことを特徴とするナノエレクトロスプレーイオン化方法。
【００１３】
［２］  前記試料が、２〜１００塩基程度の塩基長を有する天然ＲＮＡ、非天然ＲＮＡ、酵素消化されたＲＮＡオリゴマー、天然型および非天然型のＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、酵素消化されたＤＮＡオリゴマー、天然型および非天然型タンパク質、タンパク質の酵素消化で生じたペプチドまたは合成ポリペプチドを含むものであることを特徴とする、上記［１］に記載の方法。
【００１４】
［３］  前記ガスが、気化した有機溶媒を含む窒素ガスまたは空気であって、当該有機溶媒は水への溶解性を有する有機溶媒である、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］  水への溶解性を有する有機溶媒が、アルコール類、アセトニトリル、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、ジクロロメタンである、上記［３］に記載の方法。
【００１５】
［５］  前記ガス供給用キャピラリーの内径が、０．２〜１．０ｍｍであることを特徴とする、上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］  前記ガスの流量が、１０〜１５００ｍＬ／分である、上記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
【００１６】
［７］  上記［１］〜［６］に記載の方法を実行するためのナノエレクトロスプレーイオン化装置であって、
液体クロマトグラフィー用充填剤が充填され、質量分析計の試料導入オリフィスに接触または近接配置されたカラム一体型ニードルと、
該カラム一体型ニードルに接続されたスプレー電極と、
有機溶媒含有ガス供給手段と、
を備え、
前記有機溶媒含有ガス供給手段は、
ガス供給部と、
有機溶媒貯蔵器と、
ガス供給用キャピラリーと、を備え、
前記ガス供給部は、前記有機溶媒貯蔵器に流路を介して連結されて、ガスを該有機溶媒貯蔵器へと供給するものであり、
前記有機溶媒貯蔵器は、前記ガス供給用キャピラリーに流路を介して連結されて、該有機溶媒貯蔵器にガスが供給されて生じた有機溶媒含有ガスを前記ガス供給用キャピラリーへと供給するものであり、
前記ガス供給用キャピラリーは、その先端部を前記カラム一体型ニードル先端部に接触または近接させて配置されている、
ことを特徴とするナノエレクトロスプレーイオン化装置。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、分析の感度及び安定性がチップ型カラムの先端形状などの不安定要因に依存せずに、超微量の低分子成分を極めて安定的にイオン化せしめ、極めて高感度の分析を持続的に遂行することができる。これにより、従来困難であった低分子ＲＮＡの詳細かつ信頼度に優れた分析を安定的に行うことが可能となり、ＲＮＡ医薬などの開発への応用に大きく貢献することができる。
【００１８】
また、プロテオミクス分析でもカラムの寿命を長くできるだけでなく、ランニングコストの低下や得られるデータの安定性が向上することで、医薬品開発を含むプロテオミクス研究にも大きな貢献が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明にかかるナノエレクトロスプレーイオン化方法におけるナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの構成を示す図である。
【図２】ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ法における分離溶媒中の有機溶媒濃度の変化（グラジエント）を表すグラフである。
【図３】本願におけるカラム一体型ニードルとガス供給用キャピラリーの間の距離を示す図である。
【図４】有機溶媒含有ガス供給手段を備えた本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ、及び有機溶媒及び窒素ガスの混合体を溶媒供給手段により供給する旧型のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる、合成されたＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのクロマトグラムである。
【図５】有機溶媒含有ガス供給手段を備えた本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ、有機溶媒及び窒素ガスの混合体を溶媒供給手段により供給する旧型のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ、及び有機溶媒含有ガス供給手段を備えない一般的なＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる、合成されたＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのクロマトグラムである。補助溶媒なしではカラム先端に液滴形成のため溶離液および溶質がイオン化できなかった。
【図６】有機溶媒含有ガスの種類を変えた場合の、有機溶媒含有ガス供給手段を備えた本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる、合成されたＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのクロマトグラムである。
【図７】有機溶媒含有ガス供給手段を備えた本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる、ヒト５Ｓ−ｒＲＮＡ消化物のクロマトグラムである。
【図８】ヒト５Ｓ−ｒＲＮＡの塩基配列（配列番号１）を示す図である。塩基配列中の空白は、ＲＮａｓｅＴ１消化により切断される部位である。塩基配列中の下線部分は実施例３で検出されたピークに対応する塩基配列である。
【図９】有機溶媒含有ガス供給手段を備えた本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにおいて、有機溶媒含有ガス流量と、合成されたＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのクロマトグラムのピークの高さの関係を評価した結果を示すグラフである。
【図１０】ポジティブモードでの０．１％ギ酸−水でのイオン化電圧の変化とベースラインを示すグラフである。
【図１１】有機溶媒含有ガス供給手段を備えた本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる、ヒト血清アルブミンのトリプシン消化物のクロマトグラムである。
【図１２】一般的なＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００２１】
本発明にかかるナノエレクトロスプレーイオン化方法は、超微量成分を分析するナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ法において、ＬＣにより分離された試料を噴霧し、イオン化せしめるＥＳＩニードルの先端部分に対し、有機溶媒含有ガスを供給するというものである。
【００２２】
通常、ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ法においては、特にポストカラムデッドボリュームを排除するため、ＬＣを行うカラムと一体化したＥＳＩニードルを用いることができる。このカラム一体化ニードルは、先細り構造を有する逆相分離用シリカゲルカラムに液体クロマトグラフィー用の逆相分離用シリカゲル充填剤が充填されたものであり、充填剤において分離された試料成分を先細りしたカラム先端より直ちに噴霧し液滴化を防ぐことで微小帯電液滴とすることができる。前記カラム一体型ニードルの絞られた先端内径は、５〜１５μｍ程度に設計されていることが好ましい。
【００２３】
なお、本発明にかかるナノエレクトロスプレーイオン化方法に供する試料としては、一般にナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ法に適用可能なものであれば特に制限はなく、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を含むもの、もしくはそれらの混合物が挙げられる。タンパク質、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡのサイズは特に限定されない。本発明においては、特に従来法による分析が困難な酵素消化されたＲＮＡオリゴマー、タンパク質の酵素消化で生じたペプチド、または低分子ＲＮＡを含む試料が好ましい。
【００２４】
本明細書においてタンパク質とは、２０種類の天然のＬ−α−アミノ酸がペプチド結合（アミド結合）により連結したポリペプチド鎖を含む分子である。タンパク質は、天然に存在するもの、または遺伝子工学的な手法により組換え体として製造されるものであってもよい。また、２０種類の天然のＬ−α−アミノ酸が２〜１００個、ペプチド結合により連結したポリペプチド鎖を含む分子を特にペプチドと称することがある。ペプチドは、天然に存在するもの、化学合成により製造されるもの、遺伝子工学的な手法により組換え体として製造されるもの、または、タンパク質の酵素消化により生じるものであってもよい。タンパク質の酵素消化とは、タンパク質分解酵素等の酵素によりタンパク質が分解されてペプチドを生じる反応を意味する。タンパク質またはペプチドについて非天然型とは、天然型のタンパク質またはペプチドに対して何らかの人工的修飾を行ったもの、あるいは遺伝子工学技術や化学合成法で人工的に製造したものを意味する。
【００２５】
一態様において本発明の分析対象となるタンパク質またはペプチドは、天然および非天然型のタンパク質ならびにこれらの酵素消化で生じる各種のポリペプチドおよび合成ポリペプチドであってもよい。タンパク質の酵素消化で生じたペプチドの長さは特に限定されない。
【００２６】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は、糖成分としてＤ−２−デオキシリボースを有し、塩基としてアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）が糖の１’位炭素に連結し、そしてリン酸が糖の５’位炭素に連結したデオキシリボヌクレオチドを基本単位として、各ヌクレオチド間の糖の３’と５’位炭素の間でリン酸がリン酸ジエステル結合を形成して、前記デオキシリボヌクレオチドが重合した分子である。ＲＮＡ（リボ核酸）は、糖成分としてＤ−リボースを有し、塩基としてアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはウラシル（Ｕ）が糖の１’位炭素に連結し、そしてリン酸が糖の５’位炭素に連結したリボヌクレオチドを基本単位として、各ヌクレオチド間の糖の３’と５’位炭素の間でリン酸がリン酸ジエステル結合を形成して、前記リボヌクレオチドが重合した分子である。ＤＮＡまたはＲＮＡは、天然に存在するもの、天然に存在するものを酵素処理や化学処理により分解して得られるもの、化学合成により製造されるもの、遺伝子工学的な手法により製造されるものであってもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡについて非天然型とは、天然型のＤＮＡまたはＲＮＡに対して合成品およびＬｏｃｋｅｄ  ＮＡ，Ｓ化ＲＮＡなどの人工的修飾行ったものを意味する。
【００２７】
一態様において本発明の分析対象となるＲＮＡは、塩基長が３０塩基程度のマイクロＲＮＡ（miRNA）またはｓｉＲＮＡといった生体試料に含まれる２０〜３０ヌクレオチド程度の機能性の非翻訳型ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）や７０塩基程度のｔＲＮＡなどの天然型ＲＮＡ、医薬品開発などの目的で合成される非天然型ＲＮＡ、塩基長が6000塩基にも及ぶリボゾームＲＮＡ（rRNA）などの高分子ＲＮＡの酵素消化で生じる塩基長２〜５０塩基程度のオリゴヌクレオチド（酵素消化されたオリゴマー）などであってもよい。また本発明の分析対象となるＤＮＡまたはＲＮＡは、天然および非天然型のＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにこれらの酵素消化で生じる各種のオリゴヌクレオチドであってもよい。  本明細書において低分子ＲＮＡとは、２〜１００ヌクレオチド、好ましくは２〜７０ヌクレオチド、好ましくは２〜５０ヌクレオチド、２〜３０ヌクレオチド、２〜２０ヌクレオチド、２〜１５ヌクレオチドのＲＮＡを意味する。
【００２８】
これらの本発明にかかるナノエレクトロスプレーイオン化方法に供する試料は、分析に際して緩衝液または塩溶媒等に溶解させて用いることができる。
図１２は、従来の一般的なナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの構成を示した概略図である。
【００２９】
図１２において、ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳは試料分離手段１２、質量分析手段１４を備えている。
前記試料分離手段１２は、分離溶媒１８、分離溶媒送液ポンプ２０、インジェクタ２２、グラジエント発生器２４、スプレー電極２６、カラム一体型ニードル２８を有し、前記各構成は流路によって適宜接続されている。前記質量分析手段１４は、試料導入オリフィス３０と、それに接続する質量分析計３２を有しており、該オリフィス３０が前記カラム一体型ニードル２８の先端指示方向を向くように配置されている。
【００３０】
試料分離手段１０において、適宜水等に溶解された分析試料は、インジェクタ２２より導入され、分離溶媒送液ポンプ２０より設定流量で送液された分離溶媒に乗ってグラジエント発生器２４に至る。グラジエント発生器２４は、分離溶媒の組成及び濃度を試料成分の溶出特性に応じて調整し、続くカラム一体型ニードル２８における該試料成分の分離をより精密にコントロールする。カラム一体型ニードル２８には液体クロマトグラフィー用充填剤が充填されており、分離溶媒とともに導入された試料は、前記グラジエント発生器２４で調整された分離溶媒と前記充填剤とに対する親和性の差に応じて成分ごとに分離される。また、該カラム一体型ニードル２８には、スプレー電極２６によってネガティブモードで質量分析を行う場合は−１〜−２ｋＶ程度、ポジティブモードで質量分析を行う場合は＋１〜＋２ｋＶ程度の電圧が印加されており、カラム内で分離された試料成分は、該カラムと一体化したニードルの先端から噴霧され、イオンに分離溶媒分子が多数会合した微小な帯電液滴となる。液滴化した試料成分は、液滴内部イオンによりイオン化し、ニードル先端の指示方向にある試料導入オリフィス３０から質量分析手段１４に導入される。
【００３１】
図１は、本発明のナノエレクトロスプレーイオン化装置を示す概略図である。尚、上述した従来のナノエレクトロスプレーイオン化装置と同じ構成の部材については同じ番号を付し、以下の説明においては上述した従来のナノエレクトロスプレーイオン化装置と異なる部分について詳述する。
【００３２】
図１に示す本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳは、試料分離手段１２及び質量分析手段１４に加え、有機溶媒含有ガス供給手段３６を備える。そして、有機溶媒含有ガス供給手段３６は、ガス供給部３８、有機溶媒貯蔵器４０、ガス供給用キャピラリー４２を有する。ガス供給部３８及び有機溶媒貯蔵器４０、ならびに有機溶媒貯蔵器４０及びガス供給用キャピラリー４２は、それぞれ流路４６及び流路４８によって接続されている。ここで、有機溶媒貯蔵器４０は中空の円柱状であり、ガス供給部３８との連結用の流路４６及びガス供給用キャピラリー４２との連結用の流路４８の端部はいずれも有機溶媒貯蔵器４０内の有機溶媒と接触しないように配置されている。
【００３３】
前記ガス供給用キャピラリー４２の先端の指示方向が試料分析手段１２のカラム一体型ニードル２８の先端部を向くように設置されている。このように前記ガス供給用キャピラリー４２の先端がカラム一体型ニードル２８の先端部を向くように設置するには、例えば特に図示しないが、ガス供給用キャピラリー４２を、前記カラム一体型ニードル２８が設置されている基台と同一基台上に設置された三次元位置決め用の保持具により保持させる装置構成を採用できる。該保持具はガス供給用キャピラリー４２の中心部分を保持し、上下左右方向に回動自在となされており、ガス供給用キャピラリー４２の先端を種々方向に位置させることが可能である。これにより、カラム一体型ニードル２８の先端位置を種々変更しても、それに追随させてガス供給用キャピラリー４２の先端を移動させることができる。
【００３４】
有機溶媒貯蔵器４０内の有機溶媒を撹拌するために、スターラー４４をさらに有していてもよい。
ガス供給部３８としては、コンプレッサーまたはガスボンベを用いることができる。
【００３５】
流路４６及び流路４８は、有機溶媒含有ガスを供給することができる管状体であれば、材質や形状に制限はないが、例えば、樹脂製の配管を用いることもできる。
本発明の構成において、試料分離手段１２において試料を導入・分離後にイオン化し、質量分析手段１４において質量分析するに至る工程は、上記した一般的なナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの構成（図１２）と同様である。
【００３６】
ただし、本発明の構成では前記工程と同時に、有機溶媒含有ガス供給手段３６において、ガス供給部３８によって設定圧力で送気された気体が、有機溶媒貯蔵器４０を通じた後にガス供給用キャピラリー４２に導入されることにより、該ガス供給用キャピラリー４２の先端部から試料分離手段１２のカラム一体型ニードル２８の先端部へ、有機溶媒含有ガスが供給される。
【００３７】
したがって、本発明の一実施態様は、本発明のナノエレクトロスプレーイオン化方法を実行するためのナノエレクトロスプレーイオン化装置であって、液体クロマトグラフィー用充填剤が充填され、質量分析計の試料導入オリフィスに接触または近接配置されたカラム一体型ニードル２８と、該カラム一体型ニードルに接続されたスプレー電極２６と、有機溶媒含有ガス供給手段３６と、を備え、ここで当該有機溶媒含有ガス供給手段３６は、ガス供給部３８と、有機溶媒貯蔵器４０と、ガス供給用キャピラリー４２と、を備える、前記装置である。
【００３８】
本願において分離溶媒とは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）において通常用いられる移動相であり、水ないし塩類溶液と有機溶媒の混合系（例えば、メタノール溶液、アセトニトリル溶液、ギ酸水溶液、酢酸トリエチルアミン水溶液等）などが好適に用いられる。
【００３９】
一般のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ法では、試料に含まれる微量成分を分離溶媒中の有機溶媒との親和性（溶解度）に応じてより精密に分離するため、グラジエント発生器２４において、通常、有機溶媒濃度が低濃度から徐々に高濃度となるよう分離溶媒の組成比をグラジエントに調整する。このような調整において理想的なグラジエントライン（分離溶媒中の有機溶媒の濃度勾配）は図２の上段に図示するとおりである。
【００４０】
しかしながら、実際の測定では、前記グラジエントにおいて分離溶媒中の有機溶媒が低濃度となる段階、すなわち、グラジエント分析の初期段階では、有機溶媒は数％以下と少なく、このときスプレーから発生する液滴は有機溶媒のみのときに比べかなり大きいことが予想される。そのため、初期段階での分離溶媒が表面張力によりカラム一体型ニードル２８の先端に留まり、液滴を形成することが頻繁に起こる。ナノ分析に用いるカラム一体型ニードル先端は極めて微小であるため、前記液滴が生じると、図２の下段に示すように、試料成分の噴霧が断続的（状態Ａ）ないしは完全に妨げられた状態（状態Ｂ）となってしまい、正常な分析の続行が不能となる。
【００４１】
そこで、図１に示した本発明の構成及び上記実施態様の構成で表されるとおり、本発明にかかる方法においては、カラム一体型ニードルからの試料成分の噴霧と同時に該噴霧口であるニードル先端部に対して有機溶媒含有ガスを供給することによって、分離された試料成分がガスに含まれる有機溶媒と混合し、噴出口で止まることがないようにし、噴霧を妨げる前記液滴の生成を解消したのである。
【００４２】
図１に例示される本発明のナノエレクトロスプレーイオン化を含むナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ法において、導入される試料は必要に応じて適当な溶媒、例えば水、エタノール、アセトン等に溶解された溶液の状態であることが好ましい。カラム一体型ニードル２８における分離溶媒及び試料の流量は、試料の成分や分離溶媒の種類にもよるが、５０〜５００ｎｌ／分とすることが好ましい。
【００４３】
本願において有機溶媒含有ガスとは、気化した有機溶媒を含むガス、ミスト状の有機溶媒を含むガス、またはそれら両方を含むガスを包含する概念である。特に好ましくは、有機溶媒含有ガスは、有機溶媒が飽和状態のガスである。有機溶媒含有ガスは、有機溶媒貯蔵器４０の上部において、当該貯蔵器中の有機溶媒が気化することによって生じる。有機溶媒貯蔵器４０内の有機溶媒を、例えばスターラー４４により撹拌することは、当該貯蔵器内を気液平衡に近づける観点で有効である。有機溶媒が飽和状態のガスは、有機溶媒貯蔵器４０内が気液平衡にある場合に、当該貯蔵器の上部の空間に生じていると理解される。
【００４４】
本発明にかかる方法において、ガス供給用キャピラリー４２は、有機溶媒含有ガスを供給することのできる管状体であれば材質や形状に制限はないが、内径が０．２〜１．０ｍｍ、好ましくは０．２〜０．７５ｍｍ、０．４〜０．６ｍｍであってもよい。ガス供給用キャピラリー４２の先端は、キャピラリーの指示方向に対して垂直方向で切断された形状であってもよく、先細り構造（すなわち、ニードル様の構造）を有していてもよい。
【００４５】
ガス供給用キャピラリー４２からカラム一体型ニードル２８の先端部に供給される有機溶媒含有ガスの流量は、特に限定されないが、例えば１０〜１５００ｍｌ／分、好ましくは３０〜１４００ｍｌ／分、３００〜１４００ｍｌ／分であってもよい。有機溶媒含有ガスの流量は、ガス供給部３８より送気される気体の圧力と、ガス供給用キャピラリー４２の内径の組合せにより決定される。例えば、ガス供給部３８より送気される気体の圧力を１．０ｋｇ／ｃｍ２に設定した上で、ガス供給用キャピラリー４２について上記の範囲の内径を採用することで、有機溶媒含有ガスの流量について上記の範囲を達成することができる。
【００４６】
ガス供給用キャピラリー４２から供給する有機溶媒含有ガスは、有機溶媒を含むガスであれば特に限定されない。好ましくは、有機溶媒は水への溶解性を有する有機溶媒である。水への溶解性を有する有機溶媒は、特に限定されないが、水への溶解度が１％以上の有機溶媒、好ましくは５％以上または１０％以上の有機溶媒、さらに好ましくは水と任意に混合可能な有機溶媒であってよい。そのような有機溶媒として具体的なものには、メタノール、エタノールまたはイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）等のアルコール類、アセトニトリル、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、ジクロロメタン、等が挙げられる。好ましい有機溶媒は、メタノール、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチルである。さらに好ましい有機溶媒はメタノールである。また、ガスは、空気または不活性ガスであればいずれの気体を用いてもよく、好適なガスとして空気または窒素が挙げられる。
【００４７】
ガス供給用キャピラリー４２から供給する有機溶媒含有ガスの温度は、特に限定されないが、好ましくは室温、例えば２０〜３０℃、好ましくは２５℃であってもよい。
本発明にかかる方法において、カラム一体型ニードル２８は、イオン化した試料成分が導入可能な程度に質量分析計３２の試料導入オリフィス３０へ近接配置され、その先端は該オリフィスに向けられている。そして、ガス供給用キャピラリー４２は、前記カラム一体型ニードル２８に接触または近接配置され、その先端は該カラム一体型ニードルに向けられている。カラム一体型ニードル２８の先端とガス供給用キャピラリー４２の先端との間の距離（図３（ａ）で表される距離）は、０〜２０００μｍ程度であることが好ましい。０μｍとは、すなわちガス供給用ニードル４２の先端がカラム一体型ニードル２８に接触していることを意味する。２０００μｍは、ガス供給用キャピラリー４２の先端より供給される有機溶媒含有ガスがカラム一体型ニードル２８に届く距離の目安であり、より適切な距離は有機溶媒含有ガスの該ニードルへの移動が可能な範囲において適宜調整することができる。
【００４８】
さらに、通常、カラム一体型ニードル（ＥＳＩニードル）を用いたエレクトロスプレーイオン化において、該ニードル先端からの試料成分の噴霧を妨げる液滴は、その噴霧口の１〜２ｍｍ後方から生成される傾向にある。したがって、本発明においては、ガス供給用キャピラリー４２の先端をカラム一体型ニードル２８の先端に対して約１〜２ｍｍ後方に配置することが好ましい（図３（ｂ）で表される距離）。カラム一体型ニードル２８及びガス供給用キャピラリー４２をこのように配置することで、より確実に液滴の生成を解消し、正常なイオン形成を継続することができる。
【００４９】
これらニードルの配置決定の点から、本発明にかかるナノエレクトロスプレーイオン化方法には、カラム一体型ニードル２８及びガス供給用キャピラリー４２の配置を調整する位置決め手段を備えたナノエレクトロスプレーイオン化装置を用いることが好ましい。すなわち、本発明にかかるナノエレクトロスプレーイオン化装置は、カラム一体型ニードル２８の先端部を質量分析計３２の試料導入オリフィス３０に接触または近接は位置し、かつガス供給用キャピラリー４２の先端部を前記カラム一体型ニードル先端部に接触または近接配置することのできる構造を有する。
【００５０】
尚、本発明の方法及び装置は、上述の実施形態に限定されるものではなく、種々本発明の趣旨を逸脱しない範囲で変形可能である。例えば、カラム一体型ニードル２８の外周を覆ってガス供給用キャピラリーを配する二重構造管とすることもできる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明にかかるナノエレクトロスプレーイオン化方法及び装置を具体的に示すが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１：従来法との比較
図１に示す構成のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（q-ex：四重極オービトラップ型質量分析装置）を用い、合成したＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド（それぞれ５０ｆｍｏｌ）を試料として用いて、本発明にかかるナノエレクトロスプレーイオン化を評価した。合成したＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドとして用いた核酸は、以下の通りである。
５’−ＣＡＣＣＡ−３’
５’−ＵＵＵＣＧＵ（ｄＣ）（ｄＡ）−３’
５’−ＣＵＣＡＧＵ（ｄＴ）（ｄＴ）−３’
５’−ＡＡＵＵＣＧＡ（ｄＴ）（ｄＴ）−３’
試料分離手段における条件は、次のとおりである。カラムは、Develosil C30 ３μｍ  ０．１５ｍｍＩＤ×６５ｍｍＬ（野村化学株式会社）を用いた。溶離液の流量を１００ｎＬ／分とし、グラジエント溶出法により試料を分離した。Ａ液は、トリエチルアミン、ｐＨ７．０：メタノール＝９：１、Ｂ液は、１０ｍＭトリエチルアミン−酢酸、ｐＨ７．０：アセトニトリル＝６：４を用い、０％Ｂ液→４０％Ｂ液／３０分、４０％Ｂ液→７０％Ｂ液／１分、７０％Ｂ液で１０分間保持、７０％Ｂ液→０％Ｂ液／１分のグラジエントで溶出した。
【００５２】
質量分析計は、ネガティブモードで使用し、イオン化電圧は−１３００Ｖまたは−１４００Ｖとした。
また、有機溶媒含有ガスとしては気化したメタノールを含む空気を用いた。ガス供給用キャピラリーの内径は０．５０ｍｍであり、コンプレッサーの圧力は１．０ｋｇ／ｃｍ２とした。有機溶媒含有ガス供給手段の温度は２５℃とした。
【００５３】
また、比較のために、有機溶媒含有ガス供給手段を備えない、従来の一般的なＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（図１２、本明細書または図面において「補助装置なし」と表記することがある）を用いて同様の分析を行った。そして、本願の有機溶媒含有ガス供給手段の代わりに、有機溶媒及び窒素ガスの混合体を溶媒供給手段により供給する特開２０１０−２８１７７７号公報に開示されたＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（本明細書または図面において、「旧型」または「旧型補助装置」と表記することがある）を用いて分析し、本願発明の方法との比較を行った。有機溶媒及び窒素ガスの混合体は、アセトニトリルと窒素ガスの混合体を用い、窒素ガスボンベ圧は１．０ｋｇ／ｃｍ２、温度２５℃、先端ガス流速２０ｍＬ／分、アセトニトリル流量：３００ｎＬ／分とした。
【００５４】
得られたクロマトグラムを図４及び図５に示す。
補助装置なしのＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（図５下段）では、エレクトロスプレーイオン化工程において、試料溶液を噴霧するニードル先端に液滴が生じ、試験開始後ほどなくして噴霧不能となり、分析データを得ることができなかった。
【００５５】
本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（図４上段及び図５上段）、及び旧型のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（図４下段及び図５中段）では、目的物のピークが検出された。本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳは、試料中の成分がそれぞれ単一のピークの形状で現れた。しかし、旧型のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳでは、ピーク先端部が割れた形状となった。また、特にＬＣの溶離液における有機溶媒２０％以下の溶出に対して感度が向上していた。このことは、有機溶媒含有ガス供給手段を備えた本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳは、試料成分の高精度の分析が可能であることを示している。
【００５６】
実施例２：有機溶媒の種類の検討
有機溶媒含有ガスとして、気化したメタノール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはヘキサンを含む空気を用いたほかは、実施例１と同様に本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳで分析を行った。
【００５７】
得られたクロマトグラムを図６に示す。
有機溶媒含有ガスとして、気化したヘキサンを含む空気を用いた場合は、分析データを得ることができなかった（データは示さない）。これは、ヘキサンは水への溶解度が０％であるため、カラム一体型ニードルよりからの試料成分の噴霧及びイオン形成を補助しなかったことが推測される。
【００５８】
有機溶媒含有ガスとして、メタノール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチルまたはジクロロメタンの気体を含む空気を用いた場合は、カラム一体型ニードルからの試料成分の噴霧及びイオン形成が安定的に進行し、高精度の分析データが得られた。特に、有機溶媒含有ガスとして、気化したメタノールを含む空気を用いた場合は、試料成分のピークが高く、より感度の高い分析が可能であることが明らかとなった。
【００５９】
実施例３：ヒト５Ｓ−ｒＲＮＡの分析
試料として、ヒト５Ｓ−ｒＲＮＡ（配列番号１）のＲＮａｓｅＴ１消化物（５０ｆｍｏｌ）を用いたほかは、実施例１と同様に本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳで分析を行った。また、有機溶媒含有ガスとして、気化したメタノール、アセトニトリルまたはアセトンを含む空気を用いた。
【００６０】
得られたクロマトグラムを図７に示す。また、ヒト５ｓ−ｒＲＮＡの塩基配列と実施例３で検出されたピークに対応する塩基配列の関係を図８に示す。図８の塩基配列中、下線部分は実施例３で検出されたピークに対応する塩基配列を示す。
【００６１】
試料としてヒト５ｓ−ｒＲＮＡの消化物を用いた場合も、カラム一体型ニードルからの試料成分の噴霧及びイオン形成が安定的に進行し、高精度の分析データが得られた。また、有機溶媒含有ガスとして気化したメタノール、アセトニトリルまたはアセトンを含む空気のいずれを用いた場合もクロマトグラフに大きな差はなかった。いずれの有機溶媒含有ガスを用いても、高感度の分析が可能であることが明らかとなった。
【００６２】
実施例４：有機溶媒含有ガス流量の検討
ガス供給用キャピラリーとして、内径が０．１３ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．５０ｍｍ、０．７５ｍｍのチューブを用いた他は、実施例１と同様に合成したＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを試料として分析を行った。コンプレッサーの圧力は１ｋｇ／ｃｍ２で固定したため、ガス供給用キャピラリーの内径を変化させることで有機溶媒含有ガス流量を変化させることができる。ガス供給用キャピラリーの内径と、ガス流量等の関係は以下のようになった。
【００６３】
【表１】
2019060824.tif 000003
【００６４】
試料の各成分について、クロマトグラフにおけるピーク高さの相対値で評価した。結果を図９に示す。
ガス供給用キャピラリーの内径が０．１３ｍｍの場合は、噴霧及びイオン形成せず、分析データを得ることができなかった。
【００６５】
一方、ガス供給用キャピラリーの内径が０．２５ｍｍ、０．５０ｍｍ、及び０．７５ｍｍの場合は、カラム一体型ニードルからの試料成分の噴霧及びイオン形成が安定的に進行した。特に、ガス供給用キャピラリーの内径が０．５０ｍｍの場合に、噴霧及びイオン化形成の安定性が高く、また、カラム一体型ニードルの先端部に向けてガス供給用キャピラリーを設置する際に、良好なクロマトグラムが得られる位置の範囲が広いため、設置が容易であるという利点もあった。
【００６６】
実施例５：ポジティブモードでのイオン化
図１に示す構成のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用い、ナノＬＣ−ＭＳプロテオミクス分析の初期条件である、０．１％ギ酸−水でのイオン化電圧の変化とベースラインを評価した。
【００６７】
具体的には、タンパク質のトリプシン消化物（50fmol）をナノＬＣで分析し、最もイオン化しにくい初期溶媒の０．１％ギ酸−水を用いてのスプレーのしやすさを検討した。
質量分析手段における条件は次の通りである。カラムはmightySiLC18 ３μｍ、カラムサイズ０．１ｍｍＩＤ×１２０ｍｍＬ（関東化学株式会社）を用いた。０．１％ギ酸−水を流速１００ｎＬ／分で流し、試料を溶出した。
【００６８】
質量分析計はポジティブモードで使用し、１分ごとにイオン化電圧を＋１．６ｋＶから０．１ｋＶずつ下げた。
有機溶媒含有ガスとしては、気化したメタノールを含む空気を用いた。ガス供給用キャピラリーの内径は０．５０ｍｍであり、コンプレッサーの圧力は１．０ｋｇ／ｃｍ２とした。有機溶媒含有ガス供給手段の温度は２５℃とした。
【００６９】
また、比較のために有機溶媒含有ガス供給手段を備えない、従来の一般的なＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（図１２、本明細書または図面において「補助装置なし」と表記することがある）を用いて同様の分析を行った。
【００７０】
得られたベースラインのグラフを図１０に示す。
補助装置なしの場合のベースライン（図１０上段、「シースなし」と記載）から読み取れるように、有機溶媒含有ガス供給手段を備えない場合はイオン化電圧が＋１．３ｋＶでスプレーが停止し、カラムの先端に液滴が発生しイオン化しなくなった。
【００７１】
本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いた場合は、図１０の下段のベースラインから読み取れるように、＋０．９ｋＶまでイオン化した。このことは、本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳは、長時間使用によるカラム先端の劣化等に有効であり、連続運転の負荷につよいことを示すものである。
【００７２】
実施例６：タンパク質の酵素消化物の分析
試料として、ヒト血清アルブミンのトリプシン消化物を用いて、本発明の本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳで分析を行った。
【００７３】
質量分析手段における条件は次の通りである。カラムはmightySiLC18 ３μｍ、カラムサイズ０．１ｍｍＩＤ×１２０ｍｍＬ（関東化学株式会社）を用いた。溶離液の流量を１００ｎＬ／分とし、グラジエント溶出法により試料を分離した。Ａ液は０．１％ギ酸−水、Ｂ液は０．１％ギ酸−アセトニトリルを用い、Ｂ液０％→Ｂ液３５％／１８分のグラジエントで溶出した。
【００７４】
質量分析計はポジティブモードで使用し、イオン化電圧は＋１．２ｋＶ、＋１．３ｋＶ、＋１．４ｋＶ、＋１．５ｋＶまたは＋１．６ｋＶとした。
また、有機溶媒含有ガスとしては気化したメタノールを含む空気を用いた。ガス供給用キャピラリーの内径は０．５０ｍｍであり、コンプレッサーの圧力は１．０ｋｇ／ｃｍ２とした。有機溶媒含有ガス供給手段の温度は２５℃とした。
【００７５】
また、比較のために有機溶媒含有ガス供給手段を備えない、従来の一般的なＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（図１２、本明細書または図面において「補助装置なし」と表記することがある）を用いて同様の分析を行った。
【００７６】
得られたクロマトグラムを図１１に示す。図１１の左側は補助装置なし、右側は本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用い、それぞれ＋１．２ｋＶ〜＋１．６ｋＶの範囲でイオン化電圧を変えたクロマトグラムである。
【００７７】
補助装置なしの場合、＋１．３ｋＶのイオン化電圧でスプレーが不安定となり、また初期の有機溶媒濃度が低い場合に葉、カラム先端に液滴が発生してイオンかしなかった。また、イオン化電圧が＋１．２ｋＶでは、最後までイオン化しなかった。
【００７８】
本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いた場合は、＋１．２ｋＶまでほぼ同じ強度でイオン化し、安定してクロマトグラムが得られた。このことは、本発明のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳは、実際の分析においてもスプレーが安定していることを示すものである。
【符号の説明】
【００７９】
１２          試料分離手段
１４          質量分析手段
１８          分離溶媒
２０          分離溶媒送液ポンプ
２２          インジェクタ
２４          グラジエント発生器
２６          スプレー電極
２８          カラム一体型ニードル
３０          試料導入オリフィス
３２          質量分析計
３６          有機溶媒含有ガス供給手段
３８          ガス供給部
４０          有機溶媒貯蔵器
４２          ガス供給用キャピラリー
４４          スターラー
４６          流路
４８          流路
【図１】
2019060824.tif 000004
【図２】
2019060824.tif 000005
【図３】
2019060824.tif 000006
【図４】
2019060824.tif 000007
【図５】
2019060824.tif 000008
【図６】
2019060824.tif 000009
【図７】
2019060824.tif 000010
【図８】
2019060824.tif 000011
【図９】
2019060824.tif 000012
【図１０】
2019060824.tif 000013
【図１１】
2019060824.tif 000014
【図１２】
2019060824.tif 000015
【配列表】
2019060824000001.app