(57)【要約】【課題】本発明の課題は、ウシのゴナドトロフ細胞から卵胞刺激ホルモン分泌を促進する剤を提供することにある。【解決手段】ウシから抽出されたプラズマローゲンを有効成分とするウシの卵胞刺激ホルモン分泌促進剤を作製する。プラズマローゲンが、ウシの脳から抽出されたものであることや、プラズマローゲンが、エタノールアミンプラズマローゲンであるや、プラズマローゲンにおけるグリセロール骨格の１位（ｓｎ−１位）にビニルエーテル結合を介してヘキサデシル基又はヘキサデセニル基をもつことが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシから抽出されたプラズマローゲンを有効成分とするウシの卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
【請求項２】
プラズマローゲンが、ウシの脳から抽出されたものであることを特徴とする請求項１記載のウシの卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
【請求項３】
プラズマローゲンが、エタノールアミンプラズマローゲンであることを特徴とする請求項１又は２記載の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
【請求項４】
プラズマローゲンにおけるグリセロール骨格の１位（ｓｎ−１位）にビニルエーテル結合を介してヘキサデシル基又はヘキサデセニル基を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のウシの卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウシから抽出されたプラズマローゲンを有効成分とするウシの卵胞刺激ホルモン分泌促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシは単胎動物であり、通常１回の性周期で１個しか排卵しないため、基本的には１回の妊娠で１頭が生まれることとなる。そこで、ウシの繁殖においては過剰排卵を誘起させて、多数の卵子を雌ウシから回収して他の雌ウシに移植し、一度に多数の産子を得る方法が広く行われている。
【０００３】
また、ウシの繁殖管理においては１年に１産が理想的であり、分娩後再受胎するまでの空胎日数が所定の日数を超えると経済的な損失が生じてしまう。そのため、排卵を誘起して空胎日数をコントロールする方法も広く行われている。
【０００４】
排卵の誘起には、性腺刺激ホルモン（ＬＨ）や卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）という、生殖のために非常に重要なホルモンが関与していることが知られており、これらＬＨやＦＳＨの分泌を制御することがウシの繁殖において重要となる。かかるＬＨやＦＳＨは、下垂体前葉に存在するゴナドトロフ細胞から分泌される。このゴナドトロフ細胞は性機能調節の中心的な役割を担っており、近年、ゴナドトロフ細胞の解析が本発明者らを中心に進められている。
【０００５】
たとえば本発明者らは、ウシ下垂体前葉中のゴナドトロフ細胞を蛍光免疫染色法で観察し、ゴナドトロフ放出ホルモンレセプター（ＧｎＲＨＲ）はゴナドトロフの細胞膜上の特殊構造である脂質イカダ（Ｌｉｐｉｄ  Ｒａｆｔ）に限局することを解明した（非特許文献１参照）。次に本発明者らは、ウシの下垂体前葉に発現する全遺伝子を、次世代シーケンサーを用いて解析し、新規のウシの下垂体前葉で発現する受容体としてＧＰＲ６１の発見に至った（非特許文献２参照）。
【０００６】
さらに本発明者らは、ＧＰＲ６１は、ゴナドトロフの細胞表面の脂質イカダにＧｎＲＨＲと共存していることも発見した（非特許文献３参照）。上記ＧＰＲ６１はリガンドが不明のオーファン（孤児）受容体だったが、プラズマローゲンがリガンドである可能性が近年報告された（非特許文献４参照）。しかしながら、鳥の皮膚細胞由来のプラズマローゲンによる結果であり、しかもＧＰＲ６１だけでなくＧＰＲ１、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ２１、ＧＰＲ２７をノックダウンした結果にすぎず、ＧＰＲ６１を介したＦＳＨ分泌とプラズマローゲンとの関係は何ら示されていない。
【０００７】
一方、ウシのＬＨやＦＳＨ分泌に関して研究が進められ、いくつかその方法が提示されている。例えば、本発明者らは、キスペプチンを用いたウシゴナドトロフ細胞からのＬＨ分泌刺激方法について提示した（特許文献１参照）。
【０００８】
このほか、雌ウシに抗インヒビン抗体を注入して受動免疫させて、インヒビンを分泌している優勢卵胞の機能を抑制し、内因性の性腺刺激ホルモンによって小卵胞を増加させた後、外因性の性腺刺激ホルモンによって雌ウシの過剰排卵を誘起する方法（特許文献２参照）や、インヒビンを能動免疫し、ついで卵胞刺激ホルモンを投与して、発育した卵胞を多数排卵させる、ウシの過剰排卵誘起方法（特許文献３参照）が提示されている。かかる方法では、血中ＦＳＨ濃度を高めることができるが、複雑でコストが高いわりに確実性が乏しかった。
【０００９】
また、ブタ由来ＦＳＨをポリビニルピロリドン又はカルボキシメチルセルロースを含有する水溶液として、１回の注射によりウシにおいて過剰排卵を誘起する方法（特許文献４参照）が提示されている。かかる方法では、ＦＳＨの分泌を刺激することができるが、異種であるブタ由来のタンパクであるＦＳＨをウシに投与するため、投与されたウシにおいて、前記ブタ由来のＦＳＨに対する抗体ができるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１５−１４５３５１号公報
【特許文献２】特開平１０−０７２３７０号公報
【特許文献３】特開平０８−１５４９５７号公報
【特許文献４】特開平０５−０３８３４４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Gonadotropin-releasing hormone (GnRH)receptors of cattle aggregate on the surface of gonadotrophs and are increasedby elevated GnRH concentrations. Anim. Reprod. Sci. Kadokawa H, Pandey K, NaharA, Nakamura U, Rudolf FO.
【非特許文献２】Deep sequencing of thetranscriptome in the anterior pituitary of heifers before and after ovulation.J. Vet. Med. Sci. Pandey K, Mizukami Y, Watanabe K, Sakaguti S, Kadokawa H.
【非特許文献３】Heifers express G-protein coupledreceptor 61 in anterior pituitary gonadotrophs in stage-dependent manner. Anim.Reprod. Sci. Pandey K, Kereilwea O, Borromeo V, Kadokawa H.
【非特許文献４】Neuronal Orphan G-Protein CoupledReceptor Proteins Mediate Plasmalogens-Induced Activation of ERK and AktSignaling. PLoS One. Hossain MS, Mineno K, Katafuchi T.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、ウシのゴナドトロフ細胞から卵胞刺激ホルモン分泌を促進する剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、市販されるウシ脳から抽出したプラズマローゲンを、ウシ下垂体前葉の培養系に添加する実験を行った。その結果、プラズマローゲンの添加によってウシ下垂体前葉細胞からのＦＳＨ分泌を促進することを見出した。また、このＦＳＨ分泌促進には、ＧｎＲＨは必要が無いことを確認し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）ウシから抽出されたプラズマローゲンを有効成分とするウシの卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
（２）プラズマローゲンが、ウシの脳から抽出されたものであることを特徴とする上記（１）記載のウシの卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
（３）プラズマローゲンが、エタノールアミンプラズマローゲンであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
（４）プラズマローゲンにおけるグリセロール骨格の１位（ｓｎ−１位）にビニルエーテル結合を介してヘキサデシル基又はヘキサデセニル基を有することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のウシの卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に用いるプラズマローゲンは、小さい分子量のリン脂質であり、また同種のウシに由来し分子量が小さいため、抗原性が極めて低く、投与したウシにおいて、プラズマローゲンに対する抗体を作らせることなくＦＳＨを分泌させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】様々な濃度のウシ脳由来のプラズマローゲンを投与した場合の、培養した性成熟後のウシ下垂体前葉細胞からのＦＳＨ分泌量を調べた結果を示すグラフである。図中、“ｂ”はコントロール（プラズマローゲン及びＧｎＲＨなし）に対する有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
プラズマローゲンは、次の一般式（Ｉ）で示されるグリセロリン脂質の１種であり、グリセロール骨格の１位（ｓｎ−１位）にビニルエーテル結合を介したアルキル基又はアルケニル基を有する。
【００１８】
【化１】
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【００１９】
式中、Ｒ１は炭素数１〜２０のアルキル基又はアルケニル基であり、具体的にはドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基（ヘキサデカニル基）、オクタデシル基、イコサニル基などの炭素数１２〜２０のアルキル基や、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニルなどの炭素数１４〜１８のアルケニル基を挙げることができる。一方、Ｒ２は炭素数１〜２０のアルキル基若しくはアルケニル基又は炭素数６〜２６の多価不飽和脂肪酸残基である。炭素数１〜２０のアルキル基若しくはアルケニル基としては、上記Ｒ１の場合と同様に、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、イコサニル基などの炭素数１２〜２０のアルキル基や、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニルなどの炭素数１４〜１８のアルケニル基を挙げることができる。また、炭素数６〜２６の多価不飽和脂肪酸残基としては、オクタデカジエノイル基、オクタデカトリエノイル基、イコサテトラエノイル基、イコサペンタエノイル基、ドコサテトラエノイル基、ドコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基などを挙げることができる。さらに、Ｘはエタノールアミン基、コリン基、イノシトール基、グリセロール基、又はセリン基などの極性基を挙げることができ、エタノールアミン基であることが好ましい。
【００２０】
上記ウシプラズマローゲンは、脳、皮膚、腸、胃、生殖器、心臓などの生体組織から抽出されたものを挙げることができるが、脳から抽出されたものを好適に挙げることができる。なお、本発明において「ウシから抽出」には、「ウシの胃や腸に生育する微生物から抽出」も含まれるものとする。
【００２１】
生体組織又は胃腸内微生物からプラズマローゲンを抽出する方法としては特に制限されないが、ヘキサン、アセトン、エーテル、又はエタノールなどの溶媒を用いて抽出する方法を挙げることができる。また、必要に応じてアセトン沈殿法、カラムクロマトグラフィー法、又は高速液体クロマトグラフィーを用いてトリグリセリドや部分グリセリドを除去し、プラズマローゲンを含むリン脂質画分のみを分離精製してもよい。また、水系溶液分配などによりリゾプラズマローゲンを除いてもよい。
【００２２】
総リン脂質に対するプラズマローゲン型リン脂質の割合は５０％以上であることが好ましく５５％以上であることがより好ましく、６０％以上であることがさらに好ましい。なお、本発明のウシプラズマローゲンには、ウシプラズマローゲン以外のグリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質などが含まれてもよい。
【００２３】
本発明のウシのＦＳＨ促進剤は、当業者に公知の方法で製剤化することができる。例えば、薬学的に許容しうる担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化された組成物であってもよい。
【００２４】
前記組成物において、経口投与用としては、本発明のウシのＦＳＨ促進剤を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することができる。担体としては、当該技術分野において公知のものを広く使用することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、澱粉などの保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などを用いることができる。さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
【００２５】
前記組成物において、非経口投与用としては、本発明のウシのＦＳＨ促進剤を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる賦形剤を用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００２６】
注射剤用の水溶性賦形剤としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【００２７】
油性賦形剤としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００２８】
また、本発明のウシのＦＳＨ促進剤の分散を制御するなどの目的で、担体、例えば、コラーゲン、ハイドロキシアパタイト、ヒアルロン酸、フィブリン、多糖、水酸化アルミニウムゲル、リポゾームと配合してもよい。調製された製剤は、経口剤または非経口投与剤として使用できる。
【００２９】
本発明のウシのＦＳＨ促進剤の適当な投与経路としては特に限定されず、経口、直腸内、経粘膜、腸内、筋肉内、皮下、骨髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内注射が含まれる。投与経路は、患畜の年齢や病状、併用する他の薬剤などを考慮して適宜選択することができる。
【００３０】
本発明の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤の投与量としては、ＦＳＨを分泌促進しうる量であればよく、投与方法、年齢、症状などにより適宜決定することができる。例えば、本実施例の結果に基づきウシの血中のプラズマローゲン濃度が１〜２０００ｎｇ／Ｌ、好ましくは３〜１０００ｎｇ／Ｌ、より好ましくは５〜５００ｎｇ／Ｌとなるようにすることが好ましい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。
【００３２】
１．下垂体前葉細胞の調製
下垂体前葉細胞は、性成熟後の２６月齢の中黄体期黒毛和種雌子ウシ（ｎ＝１０）から得た。得られた下垂体前葉細胞をHashizumeらの方法（Biology of Reproduction, Volume 64, Issue 3, 1 March 2001, Pages 898−903）に従い、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼを用いて酵素的に分散した。分散した細胞の生細胞率は、トリパンブルー染色により９０％以上であることを確認した。
【００３３】
次に、上記で分散した下垂体前葉細胞を１０％  ウマ血清（Thermo  Fisher  Scientific社製）、２．５％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸（Thermo  Fisher  Scientific社製）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２．５％胎児ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地（Thermo  Fisher  Scientific社製）で懸濁した。
【００３４】
懸濁した上記細胞（２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、計０．３ｍＬ）を４８ウェルプレート（住友ベークライト社製）に播き、顕微鏡観察用チャンバー（μ-Slide VI 0.4, Ibidi社製）を用いて５％ＣＯ２、３７℃条件下で８２時間培養した。なお、培養した細胞を用いる際には、ＦＳＨ合成を刺激するために組換えヒトアクチビンＡ（終濃度１０ｎｇ／ｍＬ：R&D systems社製）をプラズマローゲン添加の２４時間前に加えた。
【００３５】
２．ＦＳＨの分泌
ＧｎＲＨ非存在下におけるＦＳＨの分泌に対するプラズマローゲンの影響を評価するために、上記８２時間培養後のＤＭＥＭ培地を０．１％ＢＳＡ及び１０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを含む２９５μＬのＤＭＥＭ培地で置換して２時間培養した。次に、５μＬのＤＭＥＭのみ、又は様々な濃度のウシ脳由来プラズマローゲン（グリセロール骨格の１位にビニルエーテル結合を介したステアリン酸由来のヘキサデカニル基又はオレイン酸由来のヘキサデセニル基（ヘキサデカニル基とヘキサデセニル基の割合はおよそ１：１．２７）を有し、グリセロール骨格の２位にエステル結合を介してステアリン酸由来のヘキサデカニル基又はオレイン酸由来のヘキサデセニル基を有する：終濃度０，５，５０，５００,５０００,５００００ｐｇ／ｍＬ：Product  no  39-0200:Larodan社製）を含む５μＬのＤＭＥＭを加えてさらに２時間培養した。培養後、それぞれのウェルの培地をＦＳＨレベルの放射免疫測定（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）のために回収した。
【００３６】
＜ＲＩＡ解析＞
上記で回収した培地中のＦＳＨ濃度は、１２５Ｉ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｂＦＳＨと抗ｏＦＳＨ抗血清（AFP5318C, AFP5346D,及びAFPC5288113, National  Hormone  and  Pituitary  Program  of  the  National  Institute  of  Diabetes  and  Digestive  and  Kidney  Diseases：NIDDK）を用いた二抗体ＲＩＡによって二重解析した。検出限界値は０．２０ｎｇ／ｍＬであった。
【００３７】
図１に、様々な濃度のウシ脳由来のプラズマローゲンを投与した場合の、培養した性成熟後のウシ下垂体前葉細胞からのＦＳＨ分泌量を調べた結果を示す。図中、Ｘ軸は加えたプラズマローゲン濃度、Ｙ軸は、プラズマローゲン無しで培養液のみを添加した場合(０ｐｇ／ｍＬ：Control)の培養液中ＦＳＨ濃度に対する、各濃度のウシ脳由来のプラズマローゲンを添加した場合の培養液中ＦＳＨ濃度の比率を示す。図１に示すように、コントロールと比較してプラズマローゲンが５,５０,５００,５０００ｐｇ／ｍＬでＦＳＨ分泌が上昇し、特に５０,５００ｐｇ／ｍＬで有意にＦＳＨ分泌が上昇した（Ｐ＜０．０５）。なお、図には示していないが、ＧｎＲＨ存在下でも、コントロールと比較してプラズマローゲンが５,５０ｐｇ／ｍＬでＦＳＨ分泌が上昇し、特に５０ｐｇ／ｍＬで有意にＦＳＨ分泌が上昇した（Ｐ＜０．０５）。
【００３８】
上記結果より、ウシ脳から抽出したプラズマローゲンを添加すると、ウシ下垂体前葉細胞よりＦＳＨ分泌を刺激することが明らかとなった。また、かかるＦＳＨ分泌はＧｎＲＨに依存しない、すなわちＧｎＲＨがなくてもＦＳＨの分泌を刺激可能であることが明らかとなった。本発明者らのこれまでのゴナドトロフ細胞の解析を考慮すると、このＦＳＨ分泌はプラズマローゲンがＧｎＲＨＲの細胞内伝達経路を活性化させたことによって生じたと考えられる。そのため、生体内でＧｎＲＨがほとんど分泌されていない分娩直後であっても、ウシ脳から抽出したプラズマローゲンを添加することでＧｎＲＨＲの細胞内伝達経路を活性化させＦＳＨを分泌させることが可能であることが示唆された。
【００３９】
また、５ｐｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬというごく微量で作用するため、投与量が少なくてすみ、様々な投与法を選べて低コストで済むという観点で実用性が高い。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
ＦＳＨは、卵巣・子宮の分娩後回復、発情明瞭化、受胎促進などを調節する重要なホルモンである。ウシのゴナドトロフ細胞からのＦＳＨ分泌を、ウシから抽出したプラズマローゲンによって刺激できることから、本発明は、ウシにおける過剰排卵や、繁殖障害の治療などに用いることが可能となる。
【図１】
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