(57)【要約】      （修正有）【課題】毒性のある疾患誘導性ＲＮＡの機能のモジュレーター。【解決手段】ＲＮＡ機能の強力なモジュレーターは、細胞を反応器として使用し、疾患を引き起こすＲＮＡを触媒として使用することにより、インセルロで構築することができる。アルキン部分およびアジド部分が正確に配置された小分子モジュールは、筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）の原因物質である、ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐの隣接する内部ループに結合し、ＤＭ２  ＲＮＡ機能障害の強力なオリゴマー阻害剤に変換される。さらに、このアプローチが筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を引き起こすｒ（ＣＵＧ）反復ＲＮＡに適用可能であることを示す。さらに、患者由来細胞における小分子結合部位を同定できることが示される。最後に、ｒ（ＣＵＧ）伸長を標的とする小分子は、これに小分子核酸切断モジュールを付加することにより、このＲＮＡを切断するように設計され得ることが示される。【選択図】図１Ａ
2019068831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒性のある疾患誘導性ＲＮＡの機能のモジュレーターであって、前記ＲＮＡが伸長した
リピート配列を含み、前記モジュレーターが、一つの細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列
結合モジュールであって、アルキンとアジドの両方の部分を含む、細胞透過性ＲＮＡ伸長
リピート配列結合モジュールの縮合反応から、または、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピ
ート配列結合モジュールであって、第１のモジュールがアルキン部分を含み、第２のモジ
ュールがアジド部分を含む、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールの
縮合から、生細胞内でインサイチュで形成されるＲＮＡに結合するオリゴマーであり、前
記縮合反応が、前記ＲＮＡ伸長リピート結合モジュール間で前記アルキン部分とアジド部
分との間の１，３ヒュスゲン双極子付加環化反応によって起こる、ＲＮＡに結合するオリ
ゴマーを含む、モジュレーター。
【請求項２】
前記毒性のあるＲＮＡが、ＲＮＡ伸長リピート配列ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐによって形成
される隣接する内部ループを含む、請求項１に記載のモジュレーター。
【請求項３】
各々の細胞透過性モジュールが、修飾されたカナマイシン部分を含む、請求項２に記載
のモジュレーター。
【請求項４】
前記細胞透過性モジュールがＮ３−Ｋ−Ａｋ、またはＮ３−Ｋ−ＡａＫであるか、ある
いは、一緒に使用される一対の細胞透過性モジュールがＮ３−ＫとＫ−Ａｋである、請求
項３に記載のモジュレーター。
【請求項５】
筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）の処置のための請求項２〜４のいずれか１項に
記載のモジュレーター。
【請求項６】
前記毒性のあるＲＮＡと結合した請求項２に記載のモジュレーターを形成する方法であ
って、一つの細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、前記細胞透過
性モジュールがアルキン部分とアジド部分の両方を含む、細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート
配列結合モジュールに、または、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュー
ルであって、第１のモジュールがアルキン部分を含み、第２のモジュールがアジド部分を
含む、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールに、前記毒性のあるＲＮ
Ａを含む前記生細胞を曝露する工程を含む、方法。
【請求項１０】
前記毒性のあるＲＮＡが、ＲＮＡ伸長リピート配列ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐによって形成さ
れる隣接する内部ループを含む、請求項１に記載のモジュレーター。
【請求項１１】
各々の細胞透過性モジュールが、ビス−ヘテロアリール部分、好ましくはビス−ベンズ
イミダゾール部分を含む、請求項１０に記載のモジュレーター。
【請求項１２】
前記細胞透過性モジュールが、Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋである、請求項１１
に記載のモジュレーター。
【請求項１３】
筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の処置のための、請求項１０〜１２のいずれか
一項に記載のモジュレーター。
【請求項１４】
前記毒性のあるＲＮＡと結合した請求項１１に記載のモジュレーターを形成する方法で
あって、一つの細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、前記細胞透
過性モジュールがアルキン部分とアジド部分の両方を含む、細胞透過性ＲＮＡ伸長リピー
ト配列結合モジュールに、または、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュ
ールであって、第１のモジュールがアルキン部分を含み、第２のモジュールがアジド部分
を含む、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールに、前記毒性のあるＲ
ＮＡを含む前記生細胞を曝露する工程を含む、方法。
【請求項１５】
毒性のある疾患誘導性ＲＮＡを切断する方法であって、前記ＲＮＡが伸長リピート配列
を含み、前記モジュレーターが、核酸切断部分をさらに含む、請求項１〜４または１０〜
１２のいずれか１項に記載のモジュレーターを含む、方法。
【請求項１６】
前記核酸切断部分がブレオマイシンの誘導体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者において疾患を処置する方法であって、前記疾患が伸長リピート配列を有する毒性
のあるＲＮＡの存在下で誘導され、前記患者の細胞の中に請求項１に記載のモジュレータ
ーを形成することを含む、方法。
【請求項１８】
前記疾患が筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）であり、前記毒性のあるＲＮＡがｒ
（ＣＣＵＧ）ｅｘｐ伸長リピート配列を含み、前記モジュレーターが、アルキンおよびア
ジド基を有するカナマイシン誘導体を含む細胞透過性モジュール、または、各々がカナマ
イシン誘導体を含む第１および第２のモジュールであって、アルキン基を有する第１のモ
ジュール、およびアジド基を有する第２のモジュールを含む一対の細胞透過性モジュール
からインサイチュで形成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患が筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、前記毒性のあるＲＮＡがま
たはｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐ伸長リピート配列を含み、前記モジュレーターが、アルキンおよ
びアジド基を有する１つの細胞透過性モジュール、または、各々がビス−ベンズイミダゾ
ール誘導体を含む第１および第２のモジュールであって、アルキン基を有する第１のモジ
ュール、およびアジド基を有する第２のモジュールを含む一対の細胞透過性モジュールか
らインサイチュで形成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記モジュレーターが核酸切断部分をさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年７月１８日出願の米国特許仮出願第６２／０２６，２６６号の優先
権を主張し、その開示は参照によりその全文が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ機能障害は、アポトーシス促進タンパク質のマイクロＲＮＡサイレンシング［１
］、欠損型タンパク質の翻訳［２］および機能獲得［３］をはじめとする様々な機構によ
って疾患を引き起こす。しかし、ＲＮＡ機能の小分子化学プローブを設計することも、治
療法を導くこともこれまで困難であった。非リボソームＲＮＡに小分子薬を投与するため
の広く応用できる方法が開発されたならば、それは化学生物学および医薬品化学［４］に
おいて重要な用途があり得る。ＲＮＡ媒介性疾患の１つのクラスは、伸長した反復するＲ
ＮＡ、またはマイクロサテライト障害によって引き起こされる。２０を上回るマイクロサ
テライト障害が公知であり、それには筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）および筋萎縮性側
索硬化症（ルー・ゲーリック病；ＡＬＳ）が挙げられる［５］。細胞におけるリピートの
結果は様々であり、タンパク質、ＲＮＡ、およびＤＮＡレベルの変更を含み得る。筋緊張
性ジストロフィー２型（ＤＭ２）は、ｒ（ＣＣＵＧ）リピートの伸長（ｒ（ＣＣＵＧ）ｅ
ｘｐによる毒性機能獲得に起因する。筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、ｒ（Ｃ
ＵＧ）リピートの伸長（ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐ）による毒性機能獲得に起因する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明者らは、ＲＮＡモチーフ−小分子相互作用に基づいて筋緊張性ジストロフィー２
型（ＤＭ２）を引き起こすＲＮＡの阻害剤またはモジュレーターを設計した［６］。ＤＭ
２は、ジンクフィンガータンパク質９（ＺＮＦ９）プレ−ｍＲＮＡのイントロン１に位置
するｒ（ＣＣＵＧ）リピートの伸長（ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐ）による毒性機能獲得によっ
て引き起こされる［７］。ＲＮＡは、ステムに５’ＣＣＵＧ／３’ＧＵＣＣ（２ｘ２  ヌ
クレオチド内部ループ）の繰り返し単位を含むヘアピン構造に折り畳まれる。ループは、
選択的プレ−ｍＲＮＡのスプライシングのレギュレーターである、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎ
ｄ様１タンパク質（ＭＢＮＬ１）との高親和性結合部位を形成し、該タンパク質はその結
合により不活化する（図１Ａ）。本発明者らの設計したｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐの阻害剤は
、カナマイシンＡ誘導体に基づいており、６’位でアシル化されており、５’ＣＣＵＧ／
３’ＧＵＣＣと高い親和性で結合する。特に、６’アミンのアシル化は、ｒＲＮＡとの結
合を除去する［８］。実際に細胞モデルにおいて、カナマイシン誘導体およびそのモジュ
ール式に組み立てた（または多価の）化合物は、ＤＭ２に関連する欠損を改善した［６ａ
］。その他のリピート伸長について観察されるように、モジュール式に組み立てた化合物
は、おそらくそれらの高い親和性、選択性、およびそれらが標的を捕捉する表面積がより
大きいことに起因して、細胞機能障害のより強力な阻害剤である［６ａ］。たとえ多価化
合物がインビトロでより強力で選択的であったとしても、一部の例ではそれらがあまり細
胞透過性でないために、インセルロ（ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏ）での効力は結合価の関数と
して減少する［９］。従って、リガンドサイズ、効力、および透過性の間で慎重にバラン
スをとらなければならない。
【０００４】
本発明者らはまた、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を引き起こすＲＮＡの阻害
剤またはモジュレーターを設計するためにも同様のアプローチを使用した。この例では、
ＤＭ１は、筋強直性ジストロフィー（ｄｙｓｔｏｐｈｉａ  ｍｙｏｔｏｎｉｃａ）プロテ
インキナーゼ（ＤＭＰＫ）ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置するｒ（ＣＵＧ）
リピート伸長（ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐ）による毒性機能獲得により引き起こされる［７］。
ＤＭ１についての本発明のその他の態様としては：（ｉ）ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐを標的とす
る最適化された二量体化合物の設計；（ｉｉ）ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐを標的とし、標的（結
合したＲＮＡ）および小分子と結合するＲＮＡ中の部位の検証を可能にする共有結合小分
子、；（ｉｉｉ）非常に強力かつ選択的な阻害剤をオンサイトで合成するためのインセル
ロクリックケミストリーの使用；（ｉｖ）ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐをＦＲＥＴセンサを合成す
るための触媒として使用する蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アプローチ；および（
ｖ）患者由来細胞においてｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐを切断する、ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐを標的化
する小分子の設計が挙げられる。
【０００５】
本発明は、様々な実施形態において、細胞がそれに透過性である１または２の小分子モ
ジュール、すなわちアルキン基とアジド基の両方を有する単一のモジュール、または筋緊
張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）および１型（ＤＭ１）の原因物質であるｒ（ＣＣＵＧ
）ｅｘｐまたはｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐの隣接する内部ループに結合するアルキン部分とアジ
ド部分をそれぞれ含む２つのモジュール（Ｄａｙ，Ｊ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｒａｎｕｍ，Ｌ．
Ｐ．（２００５）ＲＮＡ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｏｔｏｎｉｃ
ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．１５，５−１６．
；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｕｒｂｉｎａｔｉ，Ｃ．Ｒ．，Ｔｅｎｇ−Ｕｍｎｕａｙ，Ｐ
．，Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｇ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｂ．Ｊ．，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．
，ａｎｄ  Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．（２０００）Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕ
ｍａｎ  ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ（ＣＵＧ）（ｎ）ｅｘｐａｎ
ｓｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ
，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９，４４３９−４４４８；Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，Ｔａｋａｈａｓｈ
ｉ，Ｍ．Ｐ．，Ｊｉａｎｇ，Ｈ．，Ｂｅｃｋ，Ｃ．Ｌ．，Ｂｏｗｅｒｓ，Ｗ．Ｊ．，Ｍｏ
ｘｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．，Ｃａｎｎｏｎ，Ｓ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．（
２００２）Ｅｘｐａｎｄｅｄ  ＣＵＧ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ａｂｅｒｒａ
ｎｔ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｌｃｎ−１  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐ
ｒｅ−ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｋｅｌｅｔａ
ｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎ  ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  
１０，３５−４４）に細胞を曝露することを含む、生細胞内でＲＮＡ機能のモジュレータ
ーを形成する方法を提供し、その結果、それぞれにおいて、１つのモジュール、または２
つのモジュールは、１，３ヒュスゲン双極性環状付加反応を介して、１，３ヒュスゲン双
極子付加環化反応でのアルキンおよびアジド基の縮合により、ＤＭ１またはＤＭ２  ＲＮ
Ａ機能障害のオリゴマーの強力な阻害剤に変換される。従って、オリゴマーモジュレータ
ーのモノマー前駆体は、隣接部位と結合し、１，３ヒュスゲン双極性環状付加反応を受け
ることのできる、同じ分子上にアジドおよびアルキン単位を提示する単一の化合物であり
得るか、あるいは、一方がアルキン基を有し、他方がアジド基を有する一対の分子構造で
あり得る。
【０００６】
本発明はまた、様々な実施形態において、モジュールがアルキン部分とアジド部分の両
方を含む、細胞がそれに透過性である小分子モジュールに細胞を曝露することを含む、生
細胞内でＲＮＡ機能のモジュレーターを形成する方法を提供する。本発明はさらに、様々
な実施形態において、それぞれ筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）および１型（ＤＭ
１）の原因物質である、ＲＮＡ伸張リピート配列ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐまたはｒ（ＣＵＧ
）ｅｘｐを含有する細胞を、細胞がそれに透過性である１または複数のＲＮＡ伸張リピー
ト結合モジュールに曝露することにより形成される、ＲＮＡ機能のモジュレーターを提供
し、これら２つのモジュールは、ヒュスゲン１，３−双極性環状付加反応によって縮合し
て、毒性のあるＲＮＡの機能を妨害するオリゴマーモジュレーターを形成することのでき
るアルキン部分とアジド部分をそれぞれ含む。ＤＭ２の処置用のｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐモ
ジュレーターに関して、細胞透過性モジュールは、カナマイシン類似体を含むことができ
る。ＤＭ１の処置用のｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐモジュレーターに関して、細胞透過性モジュー
ルは、ビス−ベンズイミダゾールまたはその他のヘテロアリール化合物を含むことができ
る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】インセルロでの、ＤＭ２を引き起こすＲＮＡの強力な阻害剤を合成するためのインサイチュ・クリックケミストリーを示す図である。ＤＭ２は、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ様１タンパク質（ＭＢＮＬ１）と結合し、それを捕捉するｒ（ＣＣＵＧ）リピートによって引き起こされる。アジドおよびアルキン官能基（Ｎ３−Ｋ、Ｋ−Ａｋ、Ｎ３−Ｋ−Ａｋ、およびＮ３−Ｋ−ＡａＫ）を含む小分子は、ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐの隣接する部位と結合し、ヒュスゲン双極性環状付加反応を受ける。
【図１Ｂ】ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐの模倣物に結合しているクリック反応可能なモジュールの分子運動学（ＭＤ）シミュレーションモデルを示す図である。（ＢＩ）：立体構造検索により、隣接部位に結合したＫモジュールによって表されるアジド基およびアルキン基が極めて近いことが明らかになる。（ＢＩＩ）：Ｎ３−ＫおよびＫ−Ａａｋから得た１，４−トリアゾール付加物のＭＤシミュレーションで低エネルギー状態を示す立体図を示す図である。ＲＮＡとＫの間の水素結合は、破線で示される。（ＢＩＩＩ）：その他のリンカーモデルを示すＭＤシミュレーションの低エネルギースナップ写真を示す図である。
【図２】インセルロクリック反応およびクリック反応可能な小分子の標的の範囲の同定を示す図である。（Ａ）：小分子の細胞標的を同定するアプローチであるＣｈｅｍＲｅａｃｔＢＩＰの模式図を示す図である。クリック反応に関与する１つのＮ３基を含むビオチン化モノマー、すなわちＮ３−Ｋ−ビオチンを使用することによって研究が可能となった。このビオチン化モノマーは、細胞溶解物をストレプトアビジン樹脂の上に流すことによってクリック反応したオリゴマーおよび結合したＲＮＡ標的の単離を可能にする。（Ｂ）：ｒ（ＣＣＵＧ）３００発現細胞においてのみ合成される、プルダウンされ、鋳型にされた小分子生成物のＣｈｅｍＲｅａｃｔＢＩＰ質量スペクトル分析の結果を示す図である。（Ｃ）：クリック反応した生成物のＲＮＡ標的を単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した、ＣｈｅｍＲｅａｃｔＢＩＰの結果を示す図である。「＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）によって求めた、ｐ＜０．０５を示し；「＊＊」はｐ＜０．０１を示し；「＊＊＊」はｐ＜０．００１を示す。
【図３】インセルロでの、インサイチュクリックのＤＭ２に関連する欠損への効果を評価する細胞研究の結果を示す図である。（Ａ）：様々な化合物で処置することによるｒ（ＣＣＵＧ）３００の核内フォーカスの生成抑制に対するクリック化合物の評価を示す図である。（Ｂ）：健康な細胞とｒ（ＣＣＵＧ）３００発現細胞における、ブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）プレ−ｍＲＮＡエクソン１１の選択的スプライシングの模式図を示す図である。（Ｃ）：鋳型にされたクリック反応によるＢＩＮ１スプライシング欠損の救済を示す図である。上部、ｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下および不在下のＢＩＮ１スプライシング産物の代表的なゲル画像を示す図である。下部、処理細胞および未処理細胞におけるＢＩＮ１スプライシングパターンの定量化を示す図である。各々の化合物の濃度は、上部の対応するバーにμＭで示される。Ｎ３−Ｋ＋Ｋ−Ａｋに関して、５μＭが各々の化合物の濃度を示す。「＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ≧３）によって求めた、ｐ＜０．０５を示し；「＊＊」はｐ＜０．０１を示し；「＊＊＊」はｐ＜０．００１を示す。
【図４】Ｎ３−ＫおよびＫ−Ａｋによるインビトロクリック反応に使用したＲＮＡの二次構造を示す図である。
【図５】ｒ（ＣＣＵＧ）１２の存在下および不在下でのＮ３−ＫとＫ−Ａｋのインビトロクリック反応のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、Ｋ二量体がｒ（ＣＣＵＧ）１２の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。
【図６】ｒ（ＣＣＵＧ）１２、ｒ（ＡＵＵＣＵ）１２、ｒ（ＣＡＧ）１２、ｒ（ＣＧＧ）１２、ｒ（ＣＵＧ）１２、完全に塩基対形成したステムを含むＲＮＡヘアピン、およびビール酵母ｔＲＮＡの存在下および不在下での、Ｎ３−ＫとＫ−Ａｋのインビトロクリック反応のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、Ｋ二量体の形成がｒ（ＣＣＵＧ）１２によって選択的に触媒されることを示す（ｎ＝３）。
【図７】ｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下および不在下でのＮ３−ＫとＫ−Ａｋのインセルロクリック反応のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、Ｋ二量体がｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。「＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）により求めた、ｐ＜０．０５を示す。
【図８】ｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下および不在下でのＮ３−ＫとＮ３−Ｋ−Ａｋのインセルロクリック反応のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、二量体および三量体がｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。Ｎ３−Ｋを使用して重合の程度を制限して、ＬＣ−ＭＳ分析を容易にした（「インセルロでクリック反応した生成物の質量分析による同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏ  ｃｌｉｃｋｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」参照）。「＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）により求めた、ｐ＜０．０５を示し；「＊＊」は、ｐ＜０．０１を示す。
【図９】ｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下および不在下でのＮ３−ＫとＮ３−Ｋ−Ａａｋのインセルロクリック反応のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、二量体および三量体がｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。Ｎ３−Ｋを使用して重合の程度を制限して、ＬＣ−ＭＳ分析を容易にした（「インセルロでクリック反応した生成物の質量分析による同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏ  ｃｌｉｃｋｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」参照）。「＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）により求めた、ｐ＜０．０５を示し；「＊＊」は、ｐ＜０．０１を示す。
【図１０】ｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下および不在下でのＮ３−Ｋ−ビオチンとＫ−Ａｋのインセルロクリック反応から得た、プルダウンし、ビオチン標識した化合物のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、ビオチン化Ｋ二量体がｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。「＊＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）により求めた、ｐ＜０．０１を示す。
【図１１】ｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下および不在下でのＮ３−Ｋ−ビオチンとＮ３−Ｋ−Ａｋのインセルロクリック反応から得た、プルダウンし、ビオチン標識した化合物のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、二量体および三量体がｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。Ｎ３−Ｋ−ビオチンを使用してポリマー形成の程度を制限し、ＬＣ−ＭＳ分析を容易にした（「インセルロでクリック反応した生成物の質量分析による同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏ  ｃｌｉｃｋｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」参照）。「＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）により求めた、ｐ＜０．０５を示す。
【図１２】ｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下および不在下でのＮ３−Ｋ−ビオチンとＮ３−Ｋ−Ａａｋのインセルロクリック反応から得た、プルダウンし、ビオチン標識した化合物のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、二量体および三量体がｒ（ＣＣＵＧ）３００の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。Ｎ３−Ｋ−ビオチンを使用してポリマー形成の程度を制限し、ＬＣ−ＭＳ分析を容易にした（「インセルロでクリック反応した生成物の質量分析による同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏ  ｃｌｉｃｋｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」参照）。「＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）により求めた、ｐ＜０．０５を示し；「＊＊」は、ｐ＜０．０１を示す。
【図１３】上部、ＢＩＮ１選択的スプライシングパターンへのＫ誘導体の効果を示す代表的なゲル画像を示す図である。Ｎ３−ＫとＫ−Ａｋの１：１混合物は、予め合成した二量体と同程度にＢＩＮ１パターンを改善する。下部、処理細胞および未処理細胞におけるＢＩＮ１選択的スプライシングパターンの定量化を示す図である。モノマーＮ３−ＫおよびＫ−Ａｋの活性を、予め合成した二量体ならびに各々のモノマーの等モル混合物と比較した。予め合成した二量体は、スプライシングを最も大きく改善し、一方、アジドおよびアルキンモノマーの混合物は、各々のモノマー単独よりもスプライシングを大きく改善した。「＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ≧３）によって求めた、ｐ＜０．０５を示し；「＊＊＊」はｐ＜０．００１を示す。
【図１４】上部、Ｎ３−Ｋ−Ａｋで処理した細胞におけるＢＩＮ１スプライシングパターンの代表的なゲル画像を示す図である。細胞を１０および１μＭのＮ３−Ｋ−Ａｋで処理した場合に、スプライシングパターンの改善が観察された。中央、Ｎ３−Ｋ−Ａａｋで処理した細胞におけるＢＩＮ１スプライシングパターンの代表的なゲル画像を示す図である。細胞を１０μＭ、１μＭ、および１００ｎＭのＮ３−Ｋ−Ａｋで処理した場合に、スプライシングパターンの改善が観察された。下部、未処理細胞およびオリゴマー形成可能なＫ化合物で処理した細胞におけるＢＩＮ１スプライシングパターンの定量化を示す図である。Ｎ３−Ｋ−Ａａｋは、評価した最も強力な化合物であった。それはナノモル濃度でＢＩＮ１プレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損を有意に改善し、Ｋモノマーよりも１０００倍強力である。「＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ≧３）によって求めた、ｐ＜０．０５を示し；「＊＊」はｐ＜０．０１を示し；「＊＊＊」はｐ＜０．００１を示す。
【図１５】上部、Ｋ誘導体が、ｒ（ＣＣＵＧ）３００を発現しない細胞においてＢＩＮ１スプライシングパターンに影響を及ぼさないことを示す、代表的なゲル画像を示す図である。下部、ｒ（ＣＣＵＧ）３００を発現しない細胞におけるＢＩＮ１スプライシングパターンの定量化を示す図である。評価したいずれの化合物も、両側スチューデントｔ検定によって求めたとおり（ｎ≧３）、ｒ（ＣＣＵＧ）３００の不在下でＢＩＮ１プレ−ｍＲＮＡスプライシングパターンに統計学的に有意な効果がなかった。試験した化合物の濃度は、括弧内に示される（ｍＭ）。
【図１６】Ｋ１，４二量体の合成のためのスキームを示す図である。
【図１７】Ｋ１，５二量体の合成のためのスキームを示す図である。
【図１８】Ｎ３−Ｋ−Ａｋの合成のためのスキームを示す図である。
【図１９】Ｎ３−Ｋ−Ａａｋの合成のためのスキームを示す図である。
【図２０】Ｎ３−Ｋ−ビオチンの合成のためのスキームを示す図である。
【図２１】ＤＭ１を引き起こす毒性のあるＲＮＡ−タンパク質複合体、ならびに疾患関連細胞機能障害およびインセルロでの標的選択性を改善し、調べるために使用する、設計された小分子を示す図である。
【図２２】代謝安定性のための化合物のリード最適化を示す図である。化合物２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅは、ミクロソームにおいて不安定であり（右下のプロット）、不安定性の原因はイミノプロトンであることを突き止めた。イミノプロトンはＮ−メチル化によって除去されて、ミクロソームにおいて安定している２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳをもたらした。
【図２３】設計された小分子２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳが、患者由来細胞株（左）およびＤＭ１マウスモデル（右）においてＤＭ１に関連するプレ−ｍＲＮＡのスプライシング欠損を改善することを示す図である。Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，Ｌｏｇｉｇｉａｎ，Ｅ．，Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｌ．，ＭｃＣｌａｉｎ，Ｃ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｋｒｙｍ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．（２０００）Ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ＣＵＧ  ｒｅｐｅａｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９，１７６９−１７７３。
【図２４】設計された小分子２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳが、反応性モジュール（ＣＡ）および精製タグ（ビオチン）を付加されて２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンを生じることを示す図である。この化合物は、細胞において結合したＲＮＡと架橋（共有結合）を形成し、化学的架橋およびプルダウンによる単離（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｕｌｌ  Ｄｏｗｎ）（Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ）というアプローチを用いることにより、それらを精製および定量化させ小分子の標的を検証する。（Ａ）：プローブ化合物の構造を示す図である。（Ｂ）：プローブがｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐと選択的に反応することを示すインビトロデータを示す図である。（Ｃ）：２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンが、細胞においてＤＭ１に関連するプレ−ｍＲＮＡのスプライシング欠損を改善することを示す図である。（Ｄ）：競合的（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ（Ｃ−Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ）により測定されるように、非共有結合性化合物２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳが、ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐ標的との反応から２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンと競合することができることを示す図である。（Ｅ）：２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンによるＲＮＡ標的のプルダウンにより、化合物が疾患を引き起こす伸張した転写物と結合し、より短い（非病原性の長さの）ｒ（ＣＵＧ）リピートを含む他のＲＮＡと結合しないことが示されることを示す図である。
【図２５】化学的架橋およびプルダウンによる単離ならびにリガンド結合部位のマッピング（Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ−Ｍａｐ）を示す図である。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンと反応したＤＭＰＫ  ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの異なる領域と相補的なオリゴヌクレオチドを使用することにより、ＲＮアーゼＨによって部位特異的に消化された。消化の後、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンと反応したＲＮＡの領域をストレプトアビジン樹脂に捕捉し、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用することによって定量化した。データは、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンがＤＭＰＫ  ｍＲＮＡのｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐと結合することを示す。
【図２６】インビトロにおける、オンサイトでの薬剤合成を検証するために試験した化合物の構造を示す図である。
【図２７】核酸を触媒として使用することによるインビトロでのオリゴマー薬剤合成のデータを示す図である。（Ａ）：反応に最適な距離を求めるためのリンカー長を調査した結果を示す図である。（Ｂ）：様々なＲＮＡの存在下、Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳと２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−アミノヘキサノエートＡａｋとのインビトロでの薬剤合成の評価を示す図である。
【図２８】１つのｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐ結合リガンド上にアジドおよびアルキン部位を有するオリゴマー種を形成することのできる設計された化合物Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋを示す図である。
【図２９】標的をプルダウンし定量化するための、Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ（図２８）およびＣｈｅｍ−Ｒｅａｃｔ−ＢＩＰのスキームを使用することによるインセルロクリックケミストリーを示す図である。
【図３０】インセルロクリック化合物の、（Ａ）プレ−ｍＲＮＡスプライシング、（Ｂ）核内フォーカス、（Ｃ）およびＤＭ１に関連する翻訳欠損を改善させる能力を示す図である。
【図３１】ＤＭ１患者由来細胞においてｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐの標的切断を可能にするために、ブレオマイシンにコンジュゲートされた２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ誘導体を示す図である。（Ａ）化合物の構造を示す図である。（Ｂ）標的が切断されていることを示すｑＲＴ−ＰＣＲデータを示す図である。（Ｃ）２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳが標的化されたｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐ切断を阻害することができることを示す、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシンＡ５および２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳが細胞に同時に添加される、競合切断データを示す図である。（Ｄ）下流のＤＭ１関連プレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損の改善を示す図である。
【図３２】ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐを触媒として使用することによる、ＦＲＥＴセンサを合成するための蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）実験のスキームを示す図である。（Ａ）アプローチの概要を示す図である。（Ｂ）これらの実験で使用した化合物を示す図である。（Ｃ）代表的なデータを示す図である。
【図３３】２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳの合成スキームを示す図である。
【図３４】２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンの合成スキームを示す図である。
【図３５】２ＮＡｃ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンの合成スキームを示す図である。
【図３６】２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシンＡ５の合成スキームを示す図である。
【図３７】Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳの合成スキームを示す図である。
【図３８】Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ビオチンの合成スキームを示す図である。
【図３９】２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ活性化アルキンの合成スキームを示す図である。
【図４０】Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの合成スキームを示す図である。
【図４１】ビオチンＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの合成スキームを示す図である。
【図４２】Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＴＡＭＲＡの合成スキームを示す図である。
【図４３】ＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの合成スキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
上記の考慮点を考え合わせて、本発明者らは、小分子「モジュール」の細胞透過性なら
びにより高分子量の多価化合物の効力および選択性を活用することのでき得るＲＮＡリピ
ート伸長を標的にする戦略を開発しようと試みた。インサイチュ・クリックケミストリー
は、１，３ヒュスゲン双極子付加環化反応（ＨＤＣＲ）によって、そのような戦略をもた
らすことができた。つまり、２つのモジュールは、標的において隣接部位を結合させ、そ
うでなければ非反応性の基を極めて接近させて共有結合を形成させる；特に、アジド部分
とアルキン部分は反応して安定なトリアゾールを形成する［１０］。実際に、このアプロ
ーチは、アセチルコリンエステラーゼおよびＤＮＡ小溝を標的にするために使用されてい
る［１０−１１］。そのようなアプローチを細胞系に移すとそれは非常に影響力が強くな
り得、高選択性の化学生物学プローブの開発を可能にし得るが、これはこれまでにまだ実
証されていない。伸長した反復ＲＮＡは、それらが鋳型にする化合物のようにモジュール
式であるので、おそらくこのアプローチに理想的な標的である（図１Ａ）。
【０００９】
ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐのインセルロでの、インサイチュクリックアプローチの開発は、
二量体６’−Ｎ−アシル化カナマイシンＡ化合物（２Ｋ−４）とｒ（ＣＣＵＧ）リピート
の結合モデルを使用することによって可能になった［６ａ］。このモデルの分析により、
６”位のアジド基（Ｎ３−Ｋ）と６’位のアルキン基（Ｋ−Ａｋ）が、ｒ（ＣＣＵＧ）ｅ
ｘｐの隣接する２ｘ２ヌクレオチド内部ループとの結合によって、反応するほど非常に近
接し得ることが示された（図１Ｂ）。従って、Ｎ３−ＫおよびＫ−Ａｋが等量で混合され
る場合、二量体が形成されることができた；同様に、６”アジドと６’アルキンの両方を
提示する誘導体（Ｎ３−Ｋ−Ａｋ；図１Ｂ）は、オリゴマーを形成することができた。本
発明者らはまた、活性化された電子欠乏アルキン、Ｎ３−Ｋ−Ａａｋを含む化合物も合成
し（図１Ａ）、それはＤｅｒｖａｎのグループによってＤＮＡを鋳型として使用してポリ
アミドを構築するのに用いられた［１１ｂ］。全ての化合物は、既知経路の変形形態を用
いることによって合成した（実施例の項参照）。
【００１０】
本発明者らは最初に、ｒ（ＣＣＵＧ）１２（図４）がインビトロでＫオリゴマーの集合
体を鋳型にする能力を試験した。インキュベーション後、反応生成物を質量分析によって
分析した。実際に、原子価のより大きい化合物がｒ（ＣＣＵＧ）１２の存在下で形成され
たが、その不在下では形成されなかった（図５）。この鋳型にされた反応がｒ（ＣＣＵＧ
）１２に特異的であるか判断するために、本発明者らは、その他のＲＮＡがｒ（ＣＵＧ）
１２、ｒ（ＡＵＵＣＵ）１２、ｒ（ＣＧＧ）１２、ｒ（ＣＡＧ）１２、完全に塩基対形成
したステムを含むＲＮＡヘアピン、およびｔＲＮＡを含むオリゴマー形成を触媒する能力
を調査した（図４）。重要なことに、少量の二量体が観察されたｒ（ＣＵＧ）１２（＜１
０％；図６）を除いて、全てのＲＮＡについて重要な反応生成物は観察されなかった。親
和性はｒ（ＣＣＵＧ）１２よりもはるかに低いが、ｒ（ＣＵＧ）１２が、Ｋと結合する時
に少量の二量体を鋳型にしたことは驚くことではない［１３］。さらに、多価化合物にお
いてＫ  ＲＮＡ−結合モジュールを分離する最適な距離は、ｒ（ＣＣＵＧ）１２よりもｒ
（ＣＵＧ）１２の方がはるかに短い［１３］。総合すると、これらの研究は、鋳型にされ
た反応が、ｒ（ＣＣＵＧ）１２に対して選択的であり、官能基の位置決め、ＲＮＡ結合モ
ジュール、およびＲＮＡ標的によって制御されることを示す（図６）。これらの研究は、
細胞系においてこのアプローチを試験し、選択的プレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損およ
び核内フォーカスの形成を含むＤＭ２に関連する欠損への、鋳型にされた化合物の生物学
的影響を調べるきっかけをもたらした［３ａ］。
【００１１】
多価化合物が実際にインセルロで鋳型にされたかを確認するために、ｒ（ＣＣＵＧ）３
００を発現している細胞モデル系を用いた［１４］。細胞をＮ３−ＫとＮ３−Ｋ−Ａｋま
たはＮ３−Ｋ−Ａａｋで同時に処理した。生成物の分子量を制限し、質量スペクトル分析
を可能にするために、Ｎ３−Ｋを使用して反応を妨害した。処理後、細胞材料およびタン
パク質を有機溶媒に沈殿させることにより、反応生成物を細胞溶解物から部分的に精製し
た。精製画分の質量スペクトル分析により、オリゴマー化は、細胞をＮ３−Ｋ−Ａｋまた
はＮ３−Ｋ−ＡａＫで処理した場合に二量体と三量体の両方の反応生成物が観察される時
にｒ（ＣＣＵＧ）３００を発現している細胞で起こることが示された（図７〜９）。重要
なことに、オリゴマー化は、ＲＮＡを発現しない細胞では観察されない（図７〜９）。従
って、鋳型にされた合成は、疾患に冒された細胞にしか起こらず、ｒ（ＣＣＵＧ）３００
がそれ自体の阻害剤の合成を触媒することが示唆される。
【００１２】
鋳型にされた反応の程度と、ｒ（ＣＣＵＧ）３００が実際にオリゴマー化の触媒であっ
たのかを確認するために、本発明者らは、ＣｈｅｍＲｅａｃｔＢＩＰ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｕｌｌ
Ｄｏｗｎ；図２Ａ）というアプローチを開発し、実施した。ビオチン部分を６’位に含
むカナマイシン類似体（Ｎ３−Ｋ−ビオチン；図２０および１０〜１２）の存在下、細胞
をＫ−Ａｋ、Ｎ３−Ｋ−Ａｋ、またはＮ３−Ｋ−ＡａＫで処理した。Ｎ３−Ｋ−ビオチン
は、インセルロで重合反応を終わらせ、オリゴマー形成した化合物とそれに結合した細胞
標的を穏やかに溶解した後にストレプトアビジンビーズに捕捉させる。（図２ＢおよびＣ
）。上記のＮ３−Ｋで達成した研究に一致して、オリゴマー形成した生成物は、ｒ（ＣＣ
ＵＧ）３００発現細胞だけに形成され、生成物へのモノマーの変換は、予測した通りＮ３
−Ｋ−ＡｋよりもＮ３−Ｋ−ＡａＫでの方が大きかった［１１ｂ］。ＣｈｅｍＲｅａｃｔ
ＢＩＰによっても本発明者らが鋳型にされた反応の細胞標的を同定することができた。プ
ルダウンされた画分のｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、ｒ（ＣＣＵＧ）３００が、Ｎ３−Ｋ−
ビオチンおよびＫ−Ａｋ、Ｎ３−Ｋ−Ａｋ、またはＮ３−Ｋ−ＡａＫの生成物の主な標的
であることを確認した（図２Ｃ）。プルダウンされたｒ（ＣＣＵＧ）３００標的の量は、
効力の関数として増加する：Ｎ３−Ｋ＋Ｋ−Ａｋ＜Ｎ３−Ｋ−Ａｋ＜Ｎ３−Ｋ−Ａａｋ（
下記参照）。本発明者らのその他の実験で観察されるように、多価化合物は、細胞がｒ（
ＣＣＵＧ）３００を発現した場合にのみ観察された（図２Ｃ）。
【００１３】
その他のマイクロサテライトの障害で観察されるように、様々なタンパク質とｒ（ＣＣ
ＵＧ）ｅｘｐの結合は、核内フォーカスの形成を引き起こす［３ａ］。色素標識したオリ
ゴヌクレオチドによる蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、本
発明者らの化合物が、ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐを含有する核内フォーカスの形成を抑制する
かどうか判定した（図３Ａ）。未処理細胞では、細胞あたりのフォーカスの平均数は、９
±２である。Ｎ３−ＫまたはＫ−Ａｋで処理すると、細胞あたりのフォーカスの平均数は
、それぞれ６±２と６±１に減少する。Ｋ−ＡｋとＮ３−Ｋの等モル混合物（Ｋ−Ａｋ＋
Ｎ３−Ｋ）で処理すると、フォーカスは細胞あたり１±１に減少し、これはＫ−ＡｋとＮ
３−Ｋの反応生成物を模倣する予め合成した二量体に類似していた（Ｋ１，４二量体およ
びＫ１，５二量体；図１６および１７）。インセルロでクリック反応して自己オリゴマー
形成する誘導体である、Ｎ３−Ｋ−ＡｋおよびＮ３−Ｋ−Ａａｋは、さらにより強力であ
り、観察した細胞あたりのフォーカスは１よりも非常に小さかった（＜＜１）。このよう
に、オリゴマー化の可能な程度は、生物活性に相関する。
【００１４】
核内フォーカスの崩壊は、ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐによって捕捉されたタンパク質が遊離
していることを示唆する。従って、化合物は、フォーカスにおけるＭＢＮＬ１の隔離によ
って引き起こされる選択的プレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損も改善する可能性がある［
３ａ］。本発明者らは、本発明者らの化合物が、ブリッジングインテグレーター１（ＢＩ
Ｎ１）のプレ−ｍＲＮＡの調節不全を改善する能力を調べた（図３Ｂ〜Ｃ、１３、および
１４）［１４］。ｒ（ＣＣＵＧ）３００が細胞に存在する場合、エクソン１１は非常に頻
繁に読み飛ばされるので、包含率は成熟ｍＲＮＡ中約２０％となった。対照的に、エクソ
ン１１の包含率は、影響を受けていない細胞で約６０％である。興味深いことに、フォー
カスの崩壊によって測定される化合物の効力について観察される傾向は、本発明者らのＢ
ＩＮ１選択的スプライシング欠損の改善の結果においてそっくり再現される（図２および
３）。例えば、予め合成した二量体およびＮ３−Ｋ＋Ｋ−Ａｋは、ＢＩＮ１選択的スプラ
イシングパターンを同様の程度まで改善するが、Ｎ３−Ｋ−ＡｋおよびＮ３−Ｋ−ＡａＫ
はさらに強力である（図３Ｃ）。特に、Ｎ３−Ｋ−ＡａＫは、ナノモル濃度でスプライシ
ング欠損を改善する能力を保持し、本発明者らの第一世代のモジュール式に組み立てた化
合物よりも１００倍超改善し［６ａ］、モノマーＮ３−ＫおよびＫ−Ａｋよりも１０００
倍超良好である。重要なことに、化合物は、ｒ（ＣＣＵＧ）３００を発現しない細胞では
ＢＩＮ１スプライシングパターンに影響を及ぼさない（図１５）。まとめると、鋳型にさ
れたクリック反応に関与する本発明者らの化合物は、現在までに公知のＤＭ２に関連する
スプライシング欠損（ｓｐｌｉｃｅｏｐａｔｈｙ）を改善する最も強力な非共有結合性化
合物である。さらに、プレ−ｍＲＮＡスプライシングの改善は、結合しているｒ（ＣＣＵ
Ｇ）３００に起因するものであり、非特異的作用によるものではない。
【００１５】
要するに、これらの研究は、ＨＤＣＲを使用してインセルロで疾患に冒された細胞にお
いてのみＲＮＡ阻害剤の合成を鋳型にし得ることを確立する。Ｓｈａｒｐｌｅｓｓと同僚
によって既に明確に表現されたように［１０］、この技術には多数の用途がある。ＲＮＡ
反復障害は、特に魅力的な用途であり得る。数千もの反復単位を有し得る標的の性質によ
り、鋳型にされた産物を高収量で生成し得た。さらに、ＡＬＳ、ＤＭ１、およびＤＭ２な
どの多くのＲＮＡ機能獲得障害は、脳機能障害を引き起こすので、血液脳関門を通過する
能力を有する低分子量化合物を開発することが重要になる。まとめると、クリック反応は
、疾患の細胞と組織の両方のモデルにおいて多価化合物の効力をもつ高浸透性の低分子量
モノマーを生じ得た。
【００１６】
このアプローチは、ＤＭ２に観察されるものと同様の疾患機構を有する、ＤＭ１の原因
物質（ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐ）の標的にも適用された。ＤＭ１は、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲに
位置するｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐによって引き起こされ、それはまた、ＭＢＮＬ１などのＲＮ
Ａ生合成に関与するタンパク質と結合し、それを捕捉する（図２１）。
【００１７】
本発明者らは、細胞およびＤＭ１マウスモデルにおいてｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐと結合し、
ＤＭ１機能障害を改善させる、Ｎ−メチルペプチド骨格、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅに提示される
Ｈ  ＲＮＡ結合モジュールを含む二量体化合物を既に記載している。（図２２；Ｒｚｕｃ
ｚｅｋ  ＳＧ，Ｇａｏ  Ｙ，Ｔａｎｇ  ＺＺ，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＣＡ，Ｋｏｄａｄｅｋ
Ｔ，Ｄｉｓｎｅｙ  ＭＤ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｏｃｔ  １８；８
（１０）：２３１２−２１）。ラットミクロソームに２時間曝した後、化合物の３５％だ
けがインタクトであった。化合物を調べると、アミド結合が代謝的不安定性の原因（ｍｅ
ｔａｂｏｌｉｃ  ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）であり得ることが示唆された；従ってアミドをＮ
−メチルアミドに置き換えて２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳを生成した、これはラットミクロソーム
に安定性であることが分かった（図２２）。
【００１８】
この安定な化合物、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳを、ＤＭ１患者由来線維芽細胞におけるプレ−
ｍＲＮＡスプライシング欠損の改善について試験し（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ，Ｐ．；Ｓｔｅ
ｐｎｉａｋ−Ｋｏｎｉｅｃｚｎａ，Ｅ．；Ｓｏｂｃｚａｋ，Ｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉ
ｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１４，４２，１０８７３参照）、１００ｎＭよりも高い濃
度で欠損の５０％超を救済することを見出した（図２３）。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ（代謝的
に安定）および２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅ（代謝的に不安定）を、次にＨＳＡＬＲマウスモデルに
おけるプレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損の改善について試験した（Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ
．，Ｌｏｇｉｇｉａｎ，Ｅ．，Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｌ．，ＭｃＣｌａｉｎ，Ｃ．，Ｗｈｉ
ｔｅ，Ｒ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｋｒｙｍ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，
Ｃ．Ａ．（２０００）Ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎ
ｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ＣＵＧ  ｒｅｐｅａ
ｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９，１７６９−１７７３参照）。これらの結果は、２Ｈ−Ｋ４
ＮＭｅＳが、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅと比較してマウスモデルにおいてＣｌｃｎ１プレ−ｍＲＮ
Ａスプライシング欠損の改善で７倍超強力であることを示す（図２３）。
【００１９】
２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳの良好な活性を考え合わせて、この分子の細胞標的を化学的架橋お
よびプルダウンによる単離（Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ）を用いて探索した。このアプローチで
は、親化合物２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンの反応性誘導体は、反応性モジュール
（ＣＡ）および精製タグ（ビオチン）を含む。Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰプローブの構造を図２
４Ａに示す。この化合物のＲＮＡ標的とのインビトロ反応の試験を達成し、この化合物が
ｒ（ＣＵＧ）１０９と最も効果的に反応したことが示された（図２４Ｂ）。
【００２０】
次に、この化合物のＤＭ１患者由来線維芽細胞への適用を達成して、化合物のＲＮＡ標
的の特性を明らかにした。化合物の曝露および細胞の溶解の後、全ＲＮＡをストレプトア
ビジン樹脂に捕捉した。結合したビオチン化物質を樹脂から遊離させ、ｑＲＴ−ＰＣＲを
使用することによって定量化した。これらの研究は、３’ＵＴＲにｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐを
含んだＤＭＰＫ  ｍＲＮＡがプルダウンで著しく濃縮されることを示した（図２４Ｃ）。
２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンに対して過剰な非反応性２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳを添加
し、Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰを繰り返すことにより―この実験は、競合的化学的架橋およびプ
ルダウンによる単離（Ｃ−Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰと呼ばれる―非反応性の化合物が、プルダ
ウンされた画分中のＤＭＰＫの量を激減させることが示される（図２４Ｄ）。
【００２１】
次に、リガンド結合部位の位置付けのための化学的架橋およびプルダウンによる単離（
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐ
ｕｌｌ  Ｄｏｗｎ  ｔｏ  Ｍａｐ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ）（Ｃｈ
ｅｍ−ＣＬＩＰ−Ｍａｐ）を実施して、ＤＭＰＫ  ｍＲＮＡ中の２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ｃ
Ａ−ビオチンの結合部位を同定した（Ｙａｎｇ，Ｗ．−Ｙ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈ．Ｄ．，
Ｖｅｌａｇａｐｕｄｉ，Ｓ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｄｉｓｎｅｙ，Ｍ．Ｄ．（２０１５）Ｉｎｈ
ｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ＡＴＧ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｖｅｎｔｓ  
ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔａ
ｒｇｅｔｉｎｇ  ＲＮＡ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７，５３３６−５３４５）
。これは、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンとアンチセンスオリゴヌクレオチドおよ
びＲＮアーゼＨによってプルダウンしたＤＭＰＫ  ｍＲＮＡを正確に切断することによっ
て達成された。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンによる反応によってビオチン化され
た切断された断片をストレプトアビジン樹脂に捕捉し、精製した。定量化により、ＤＭＰ
Ｋ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐを含有する断片が、プルダウンされた画
分において著しく濃縮されたことが示され、化合物の予測した結合部位が検証された。
【００２２】
次に、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳの誘導体を、本明細書においてＤＭ２  ＲＮＡについて提示
される実験との類似性によって、ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐを標的化する二量体化合物をオンサ
イトで合成する細胞のクリック反応でそれを使用することができるように合成した。一連
の化合物（ｉ）１つのアジドを提示した（Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ）；および（ｉｉ）
Ｎ−メチル骨格から様々な距離で活性化アルキンを提示した（２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−活性
化アルキン）が合成された。これらの構造を図２６に示す。
【００２３】
最初に、本発明者らは、隣接する部位に結合した２つの化合物間のＨＤＣＲによって、
図２６に示される構造のオリゴマー化をｒ（ＣＵＧ）１２が触媒することができるかを調
べた。結果は、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋが、ｒ（ＣＵＧ）１２の存在下でＮ３−２Ｈ
−Ｋ４ＮＭｅＳと反応する最も良いアルキンスペーサー単位をもたらしたことを示す（図
２７Ａ）。最適な化合物は、次に、その他の核酸を使用することによって触媒されている
それらの結合（ｕｎｉｏｎ）について試験され（図２７Ｂ）、ｒ（ＣＵＧ）１２だけが有
意な反応収量をもたらしたことが示された。
【００２４】
次に、上で明らかになったスペーシングの教訓を用いて、単一の小分子に反応性のアジ
ド部分とアルキン部分を有する小分子を設計した。化合物Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａ
ａｋをこのように合成した（図２８）。この化合物は、ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐの存在下で、
対応するアジドおよびアルキンでタグ付けされた化合物の混合物よりも大きいオリゴマー
を形成することができるはずである。
【００２５】
患者由来細胞におけるＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋオリゴマー化の程度は、Ｃｈ
ｅｍＲｅａｃｔＢＩＰを使用することによって試験した。このアプローチでは、出発物質
および反応生成物の両方をストレプトアビジン捕捉によって細胞から精製させる（図２９
Ｂ）、Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの変形を合成した（ビオチン−Ｎ３−２Ｈ−Ｋ
４ＮＭｅＳ−Ａａｋ、図２９Ａ）。これらの研究は、オリゴマー生成物がＤＭ１由来線維
芽細胞においてのみ見出されることを示した（図２９Ｃ）。
【００２６】
上記のデータは、ＤＭ１のオンサイトでの薬物合成が実行可能であることを示したので
（図２９）、この化合物（Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ）の生物活性を評価した。
Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの添加は、ＤＭ１に関連するプレ−ｍＲＮＡスプライ
シング欠損を１０ｎＭの投与量で５０％超改善し、Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ単独による
処理またはＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳおよび２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの同時処理より
もはるかに強力であった（図３０Ａ）。次に、化合物のＲＮＡフォーカスへの影響を測定
し、クリック反応可能な化合物Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋが細胞に添加された場
合に、より少ないフォーカスが観察されたことが示された（図３０Ｂ）。最後に、ｒ（Ｃ
ＵＧ）ｅｘｐを含有するＤＭＰＫ  ｍＲＮＡは、核内に保持されるほど十分に低いレベル
で翻訳される（Ｃｈｉｌｄｓ−Ｄｉｓｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．；Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｊ．；Ｒｚｕ
ｃｚｅｋ，Ｓ．Ｇ．；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．；Ｄｉｓｎｅｙ，Ｍ．Ｄ．ＡＣＳ  Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２）。従って、Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａ
ａｋは、フォーカスでの隔離を緩和することによってＤＭＰＫの細胞内局在を変え、翻訳
を刺激することができる。Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋを添加することにより、長
い毒性のあるｒ（ＣＵＧ）リピートを含む細胞においてナノモル濃度でのＤＭＰＫ翻訳欠
損が改善されたが、病原性のリピートをもたない細胞には影響がなかった。
【００２７】
要するに、これらのデータは、化合物のリード最適化が、それらをより安定にするため
に骨格を変えることによって達成され得ることを示す。これらの化合物がアジド部分およ
びアルキン部分を備えることにより、ＤＭ１患者由来細胞におけるオンサイトでの薬物合
成が可能になり、非常に高い効力がもたらされる。
【００２８】
次に、ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐを切断するアプローチを開発した。天然物ブレオマイシン（
ｂｌｅｏｍｃｙｉｎ）はＤＮＡを切断できることが示されたが、インビトロでＲＮＡ標的
を切断したことも示された（Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．；ｄｅ  Ｖｒｏｏｍ，Ｅ．；Ｌｏｎ
ｇ，Ｅ．Ｃ．；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａｒｅｌ，Ｇ．Ａ．；ｖａｎ  Ｂｏｏｍ，Ｊ．Ｈ．；
Ｈｅｃｈｔ，Ｓ．Ｍ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃ
ａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １９９０，８７，９３７３）。従って、ブレオマ
イシンに２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳを付加することにより、これらの化合物に患者由来細胞にお
いてｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐを切断する能力を与えることができ得る。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−
ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｃｙｉｎ）Ａ５の合成は、このように達成した（図３１Ａ）
。この化合物をＤＭ１患者由来線維芽細胞に適用すると、ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価さ
れるＤＭＰＫ  ｍＲＮＡのレベルは低下するが、健康な線維芽細胞ではＤＭＰＫ  ｍＲＮ
Ａレベルには影響がなかった（図３１Ｂ）。この化合物がＤＭＰＫ  ｍＲＮＡを選択的に
切断する能力をさらに試験するため、４倍過剰の２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳに対して２Ｈ−Ｋ４
ＮＭｅＳ−ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｃｙｉｎ）Ａ５を細胞に添加した。予期した通り
、非反応性の化合物は結合に関して反応性の化合物と競合し、切断の量を低下させ、選択
性を示唆した（図３１Ｃ）。これらの切断実験は、プレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損の
改善とも相関した（図３１Ｄ）。
【００２９】
蛍光レポーターも、ＲＮＡに触媒されるクリック反応に基づいてオンサイトで合成した
。このアプローチでは、クリック反応時にＦＲＥＴを観察することができるように、クリ
ック反応を受けることのできる化合物をＦＲＥＴ対でタグ付けする（図３２Ａ）。ＦＡＭ
（フルオレセイン）およびＴＡＭＡＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）ＦＲ
ＥＴ染料対を使用し、ＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＡａｋおよびＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭ
ｅＳ−ＴＡＭＡＲＡを得た。化合物の添加により、ｒ（ＣＵＧ）１２の存在下でのみ、Ｆ
ＲＥＴの強化が示された。従って、このアプローチは、広い適用性を有するＦＲＥＴレポ
ーターのオンサイトでの合成を可能にする。
【００３０】
引用文献
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【００３２】
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７４７２。
【００４３】
［１４］Ｃ．Ｆｕｇｉｅｒ，Ａ．Ｆ．Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．Ｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｖａｓｓｉｌ
ｏｐｏｕｌｏｓ，Ｙ．Ｉｖａｒｓｓｏｎ，Ａ．Ｔｏｕｓｓａｉｎｔ，Ｖ．Ｔｏｓｃｈ，Ａ
．Ｖｉｇｎａｕｄ，Ａ．Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．Ｍｅｓｓａｄｄｅｑ，Ｙ．Ｋｏｋｕｎａｉ，Ｒ
．Ｔｓｕｂｕｒａｙａ，Ｐ．ｄｅ  ｌａ  Ｇｒａｎｇｅ，Ｄ．Ｄｅｍｂｅｌｅ，Ｖ．Ｆｒ
ａｎｃｏｉｓ，Ｇ．Ｐｒｅｃｉｇｏｕｔ，Ｃ．Ｂｏｕｌａｄｅ−Ｌａｄａｍｅ，Ｍ．Ｃ．
Ｈｕｍｍｅｌ，Ａ．Ｌ．ｄｅ  Ｍｕｎａｉｎ，Ｎ．Ｓｅｒｇｅａｎｔ，Ａ．Ｌａｑｕｅｒ
ｒｉｅｒｅ，Ｃ．Ｔｈｉｂａｕｌｔ，Ｆ．Ｄｅｒｙｃｋｅｒｅ，Ｄ．Ａｕｂｏｅｕｆ，Ｌ
．Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｕｄｄ，Ｂ．Ｓｃｈｏｓｅｒ，Ｍ．Ｐ
．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｉ．Ｎｉｓｈｉｎｏ，Ｇ．Ｂａｓｓｅｚ，Ｊ．Ｌａｐｏｒｔｅ，
Ｄ．Ｆｕｒｌｉｎｇ，Ｎ．Ｃｈａｒｌｅｔ−Ｂｅｒｇｕｅｒａｎｄ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２
０１１，１７，７２０−７２５。
【００４４】
［実施例］
コンピュータ解析のための方法
本発明者らは以前、２Ｋ−４、すなわちペプトイドによって連結された２つのＫ  ＲＮ
Ａ−結合モジュールと、２つの５’ＣＣＵＧ／３’ＧＵＣＣループを含有するＲＮＡとの
結合のモデルを公開した［１］。ペプトイドを除去し、リンカーを含めるためにＫ  ＲＮ
Ａ−結合モジュールを次のように編集した：（ｉ）１つのＫの環ＩのＣ６’には、ヘキサ
−５−インアミドかまたはＮ−（２−アミノ−２−オキソエチル）プロピオルアミドのい
ずれかを含めた；そして（ｉｉ）アジド基をもう一方のＫの環ＩＩＩのＣ６”に付加した
。リンカーの立体構造の走査を実施して、２つのＫの反応性の終端が互いのすぐ近くにあ
るかどうかを調べた。非冗長性の立体構造の徹底的走査を、ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（Ｓｃ
ｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）でＯＰＬＳ＿２００５力場を使用して実施した［２］。結
果は、複数の立体構造が２つの反応性基を非常に近接させていて、エチニルＣとアジドＮ
との最も短い距離は、ヘキサ−５−インアミドおよびＮ−（２−アミノ−２−オキソエチ
ル）プロピオルアミドリンカーにおいて、それぞれ２．６１Åおよび２．３７Åであるこ
とを示した（図１、ＢＩ）。
【００４５】
各々の構造中で最も近い反応性基を有するこれらのリンカーの組を使用して、環化付加
最終産物、Ｋ１，４−二量体およびＫ１，５−二量体のモデルを作製した。各々のリンカ
ーの組み合わせ（ヘキサ−５−インアミド＋Ｎ３またはＮ−（２−アミノ−２−オキソエ
チル）プロピオルアミド＋Ｎ３）で、Ｋ１，５−二量体は、１つの立体構造を有する。各
々のリンカーの組み合わせで、Ｋ１，４−二量体は、２つの主な立体構造、溶媒に向かう
トリアゾール環Ｃ５Ｈ（Ｃ５Ｈ−ｏｕｔ）かまたはＲＮＡ主溝に向かうトリアゾール環Ｃ
５Ｈ（Ｃ５Ｈ−ｉｎ）が可能であることを示した。合計６つのモデルをこのように作製し
た（図１、ＢＩＩおよびＢＩＩＩ）。複合体の安定性と、結合したＫのリンカーの影響を
観察するために、手短に各々の構造のエネルギー極小化、続いて分子運動学（ＭＤ）シミ
ュレーションを行った。ＭＤシミュレーションは、Ｄｅｓｍｏｎｄ［３］とＯＰＬＳ＿２
００５力場［２］を用いて実施した。各々のモデル構造を、各方向に１０Åを安定させる
（ｂｕｆｆｅｒｓ）、ＴＩＰ３水および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む斜方晶の箱で溶媒和
させた。追加のイオンを添加して系を中和させた。ＭＤシミュレーションの前に、拘束／
非拘束最小化および等温と等圧のアンサンブルを用いる短いシミュレーションからなる、
ＮＰＴ緩和プロトコルを用いて系を予め平衡させた。１０ナノ秒のＭＤシミュレーション
を、一定の温度（３００Ｋ）および圧力（１．０１３２５ｂａｒ）で実施した。位置拘束
がシミュレーションを通してＲＮＡに適用された。短距離および長距離のクーロン力の相
互作用を、９Å半径（短い）を用いるカットオフ法および許容差ｏ  １×１０−９（長い
）を用いる滑らかな粒子・メッシュ・エワルド許容差法に設定した。シミュレーションの
解析は、Ｍａｅｓｔｒｏグラフィックインターフェースによって達成した。
【００４６】
系の体積、圧力、温度および可能なエネルギーに顕著な変動がないことを観察した。値
が連続的に増加した２つの例を除いて、シミュレーションの大部分で約４〜６ナノ秒後に
系の全エネルギーを安定化させた。しかし、シミュレーション期間中の勾配は０．０５ｋ
ｃａｌ／ｐｓ未満であった。Ｋ部分とＲＮＡとの水素結合は、シミュレーションを通して
保存された。図は、ＰｙＭｏｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）を用いて準備された
。
【００４７】
化合物の合成方法および化合物の特徴づけ
略語。ＤＩＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＥＡ、Ｎ，Ｎ−ジイソ
プロピルエチルアミン；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＨＰＬＣ、高速液体ク
ロマトグラフィー；ＨＲＭＳ、高解像度質量分析；ＬＣ−ＭＳ、液体クロマトグラフィー
−質量分析；ＭｅＯＨ、メタノール；ＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ／ＴｏＦ、マトリックス支援レ
ーザー脱離イオン化飛行時間型／飛行時間型；ＭＳ、質量分析；ＮＢＤ、７−ニトロベン
ズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸
合成。Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．５９ミリモル／ｇ）は、Ａｄｖａｎｃｅｄ
ＣｈｅｍＴｅｃｈより購入した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、無水）は、
ＥＭＤより購入し、さらなる精製を行わずに使用した。ピペリジン、トリフルオロ酢酸（
ＴＦＡ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、および２−ブロモ酢酸は
、シグマ・アルドリッチより購入した。Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩ
Ｃ）、１−１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、およびＦｍｏｃ
−β−アラニンは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈより購入した。Ｆｍｏｃ−Ｎ−
メチル−Ｌ−アラニンおよびＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒ
ｔ−ブチルエステルは、Ｃｏｍｂｉ−Ｂｌｏｃｋｓより購入した。Ｎ−（４−アミノエチ
ル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルは、Ｏａｋｗｏｏｄ  Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓより購入した。クロラムブシルは、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓより購入した
。ブレオマイシンＡ５は、ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入した。ヘキストカ
ルボン酸塩（Ｐｕｓｈｅｃｈｎｉｋｏｖ  Ａ，Ｌｅｅ  ＭＭ，Ｃｈｉｌｄｓ−Ｄｉｓｎｅ
ｙ  ＪＬ，Ｓｏｂｃｚａｋ  Ｋ，Ｆｒｅｎｃｈ  ＪＭ，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＣＡ，Ｄｉｓ
ｎｅｙ  ＭＤ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００９  Ｊｕｌ  ２２；１３１（２８）
：９７６７−７９）、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅ（Ｒｚｕｃｚｅｋ  ＳＧ，Ｇａｏ  Ｙ，Ｔａｎｇ
ＺＺ，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＣＡ，Ｋｏｄａｄｅｋ  Ｔ，Ｄｉｓｎｅｙ  ＭＤ．ＡＣＳ  
Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｏｃｔ  １８；８（１０）：２３１２−２１）、および
ビオチンアミン（Ｙａｍａｄａ，Ｍ．；Ｈａｒａｄａ，Ｋ．；Ｍａｅｄａ，Ｙ．；Ｈａｓ
ｅｇａｗａ，Ｔ．Ｎｅｗ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３，３７
，３７６２）は、これまでに報告されたように合成した。Ｎ−メチルペプチドは、Ｂｉｏ
ｔａｇｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ＋ＳＰ  Ｗａｖｅマイクロ波を用いて合成した。
【００４８】
化合物の精製および分析。分取ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ２４８７二重波長吸光度検出
器およびＷａｔｅｒｓ  Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８  ＯＢＤ  ５μｍ  １９×１５０ｍｍカ
ラムを備えたＷａｔｅｒｓ１５２５  Ｂｉｎａｒｙ  ＨＰＬＣポンプを用いて実施した。
吸光度は、２８０および２２０ｎｍでモニターした。６０分で０．１％ＴＦＡを含むＨ２
Ｏ中０〜１００％ＭｅＯＨの勾配を化合物の精製に使用した。分析用ＨＰＬＣは、Ｗａｔ
ｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８  ５μｍ  ４．６×１５０ｍｍカラムを用いて実施し
た。評価した全ての化合物は、分析用ＨＰＬＣにより測定して、９５％以上の純度を有し
た。質量分析は、アプライドバイオシステムズＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ／ＴｏＦ分析計４８０
０プラスでα−ヒドロキシ桂皮酸マトリックスを用いて実施した。全てのマイクロ波反応
は、Ｂｉｏｔａｇｅイニシエーター＋ＳＰ  Ｗａｖｅマイクロ波を用いて実施した。高解
像度質量スペクトル分析は、ケミカルサイエンス質量分析センターのイリノイ大学アーバ
ナ・シャンペーン校によって実施された。
【００４９】
Ｋ１，４二量体の合成。図１６を参照されたい。Ｎ３−Ｋ（５０ｍｇ、５０μモル）お
よびＫ−Ａｋ（４５ｍｇ、５０μモル）を、ＤＭＦおよび水（３ｍＬ）の１：１混合物に
溶解し、ポリトリアゾールＣｕ（Ｉ）触媒（１０ｍｇ、１６μモル）［４］、およびＥｔ
３Ｎ（５００μＬ、３．６ミリモル）で処理した。反応混合物を、１００℃で２．５時間
電子レンジにかけ、その後、反応混合物を濃縮し、上記のような逆相ＨＰＬＣによって精
製した。収率：１１％；６．２ｍｇの白色の固体をＴＦＡ塩として得た。Ｈ１ＮＭＲ（７
００ｍＨｚ，Ｄ２Ｏ，ＴＳＰ）：δ４．３１（ｍ，２Ｈ），３．９９（ｍ，２Ｈ），３．
９２（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｍ，９Ｈ），３．５４（ｍ，７Ｈ），３．４１（ｔ，２Ｈ
，Ｊ＝１０Ｈｚ），３．３１（ｍ，２Ｈ），３．２４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７，１３），２
．７３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），２．５２（ｍ，２Ｈ），２．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８
Ｈｚ），１．９２（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｍ，４Ｈ）；Ｃ１３ＮＭＲ（１７５ｍＨｚ，
Ｄ２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝１７９．８，１６６．２，１６６．０，１６５．８，１６５．６
，１５０．３，１３２．１，１２７．８，１２１．８，１２０．１，１１８．４，１１６
．８，１０３．７，１０３．５，１０１．２，１００．３，８６．６，８２．４，８１．
７，７６．０，７５．７，７５．０，７４．９，７４．１，７４．０，７３．７，７３．
６，７２．９，７２．５，７１．６，７１．１，７０．９，６９．５，６８．２，６２．
６，５７．９，５３．１，５２．９，５２．６，５１．２，５０．９，４３．２，４２．
１，３８．０，３１．２，３０．７，３０．６，２８．１，２７．０ｐｐｍ；ＨＲＭＳ（
ＥＳＩ）ｍ／ｚ  Ｃ４２Ｈ７９Ｎ１２Ｏ１１についての計算値（Ｍ＋Ｈ）１０８７．５４
８３；実測値１０８７．５４５３。
【００５０】
Ｋ１，５二量体の合成。図１７を参照されたい。Ｂｏｃ−Ｎ３−Ｋ（２０ｍｇ、２０μ
ｍｏｌ）およびＢｏｃ−Ｋ−Ａｋ（２３ｍｇ、２０μｍｏｌ）を、トルエン（２ｍＬ）に
溶解し、アルゴン下に置いた。このサンプルをペンタメチルシクロペンタジエニルビス（
トリフェニルホスフィン）ルテニウム（ＩＩ）クロライド（６ｍｇ、０．８μｍｏｌ）で
処理し、１３０℃で３時間電子レンジにかけた。次に、反応混合物を濾過し、濃縮した。
残渣をＣＨ２Ｃｌ２中ＴＦＡの１：１混合物で０℃で２時間処理した。反応混合物を濃縮
し、上記のような逆相ＨＰＬＣによって精製した。収率：０．５％；１ｍｇの白色の固体
をＴＦＡ塩として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（７００ｍＨｚ，Ｄ２Ｏ，ＴＳＰ）：δ７．６６（
ｓ，１Ｈ），３．５２（ｍ，３２Ｈ），２．５３（ｍ，２Ｈ），２．３７（ｍ，２Ｈ），
２．２４（ｍ，２Ｈ），１．９８，（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｍ，４Ｈ），１．３４（ｍ
，４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１７５ｍＨｚ，Ｄ２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝１７９．８，１６６
．２，１６６．０，１６５．８，１６５．６，１２１．８，１２０．１，１１８．４，１
１６．８，１０３．５，１０３．４，１０１．０，９８．４，８７．６，８６．５，８２
．３，８１．２，７６．０，７５．９，７５．８，７５．７，７５．１，７４．１，７４
．０，７３．６，７３．０，７２．９，７１．７，７１．６，７１．１，６８．２，６２
．６，５７．９，５７．３，５２．６，５１．１，５１．０，５０．８，５０．５，４５
．５，４３．２，４２．１，３７．５．３０．９，３０．６，２７．０，２０．６，１９
．９，１９．２，１５．１ｐｐｍ；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  Ｃ４２Ｈ７８Ｎ１１Ｏ２
２についての計算値（Ｍ＋Ｈ）１０８８．５３２３；実測値１０８８．５３１６。
【００５１】
Ｎ３−Ｋ−Ａｋの合成。図１８を参照されたい。Ｎ３−Ｋ（２５ｍｇ、４９μｍｏｌ）
を、アセトンおよび水（２ｍＬ）の１：１混合物に溶解し、ＮＢＤ−活性化６−アミノヘ
キシン酸（６ｍｇ、４９μｍｏｌ）を添加した。反応を室温で一晩撹拌した後、溶媒を真
空除去した。得られる残渣を上記のような逆相ＨＰＬＣによって精製した。収率：２０％
；５ｍｇの白色の固体をＴＦＡ塩として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（７００ｍＨｚ，Ｄ２Ｏ，Ｔ
ＳＰ）：δ＝４．０５（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｍ，４Ｈ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝
９），３．７４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４，１４），３．７０（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｍ，
２Ｈ），３．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５，１５），３．５５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝５，１２
），３．４８（ｍ，２Ｈ），３．３４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０），２．７１（ｓ，１Ｈ），
２．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２），１．８６（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７
）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１７５ｍＨｚ，Ｄ２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝１６６．２，１６６．０，
１６５．８，１６５．６，１６２．２，１２１．８，１２０．１，１１９．６，１１８．
４，１１８．０，１１６．８，１０３．６，１０２．０，８６．５，７６．１，７５．２
，７４．３，７３．９，７３．５，７１．１，６９．１，５７．７，５３．３，５２．９
，４３．２，４１．６，１９．４，１９．０ｐｐｍ；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  Ｃ２４
Ｈ４２Ｎ７Ｏ１１についての計算値（Ｍ＋Ｈ）６０４．２９４２；実測値６０４．２９３
８。
【００５２】
Ｎ３−Ｋ−Ａａｋの合成。図１９を参照されたい。２−プロピオルアミド酢酸（Ｐｒｏ
ｐｉｏｌａｍｉｄｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（１７５ｍｇ、１．３６ミリモル）を、無
水ＤＭＦに溶解し、ＤＩＣ（２１３μＬ、１．４ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノル
ボルネン（ｎｏｒｂｏｒｅｎｅ）−２，３−ジカルボキシイミド（２４３ｍｇ、１．３６
ミリモル）、およびＤＩＥＡ（６００μＬ、３．４ミリモル）で処理した。反応混合物を
アルゴン下、室温で一晩撹拌した。次に、Ｎ３−Ｋ（２０ｍｇ、４０μモル）を、アセト
ンおよび水（２ｍＬ）の１：１混合物に溶解し、５００μＬのＮＢＤ−活性化酸を４時間
にわたって徐々に添加した。次に、溶媒を真空除去し、得られる残渣を上記のような逆相
ＨＰＬＣによって精製した。収率：２％、６００μｍｏｌ。１Ｈ  ＮＭＲ（７００ｍＨｚ
，Ｄ２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝４．０６（ｍ，１Ｈ），３．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５），３．
９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３，１１），３．８３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１０），３．５２（ｍ，
１４Ｈ），２．４３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１），１．７３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（
１７５ｍＨｚ，Ｄ２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝１６９．８，１６６．３，１６６．０，１６５．
８，１６５．６，１３１．９，１２６．０，１２１．８，１２０．１，１１８．４，１１
６．８，１０３．４，７６．５，７５．２，７４．２，７４．２，７４．１，７３．８，
７３．７，７３．４，７１．６，７１．２，６９．４，６９．２，５７．７，５３．６，
５３．３，５３．２，５３．０，５１．５，４５．５，４３．２，４２．７ｐｐｍ；ＨＲ
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  Ｃ２３Ｈ３９Ｎ８Ｏ１２についての計算値（Ｍ＋Ｈ）６１９．２
６８７；実測値６１９．２６８０。
【００５３】
Ｎ３−Ｋ−ビオチンの合成。図２０を参照されたい。Ｎ３−Ｋ（１７ｍｇ、３０μｍｏ
ｌ）を、アセトンおよび水（２ｍＬ）の１：１混合物に溶解し、ＮＢＤ−ビオチン（１２
ｍｇ、３０μｍｏｌ）を添加した。反応を室温で一晩撹拌した後、溶媒を真空除去した。
得られる残渣を上記のような逆相ＨＰＬＣによって精製した。収率：７％；１．６ｍｇの
白色の固体をＴＦＡ塩として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（７００ｍＨｚ，Ｄ２Ｏ，ＴＳＰ）：δ
＝４．６０（ｍ  １Ｈ），４．４１（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｄ
ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４，１１），３．８３（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｍ，５Ｈ），３．５５（
ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝５，１４），３．４５（ｍ，２Ｈ），３．３１（ｍ，２Ｈ），３．１９
（ｍ，１Ｈ），２．９８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８，１３），２．７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３
），２．３８（ｍ，１Ｈ），２．２８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７），１．６５（ｍ，５Ｈ），１
．３９（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１７５ｍＨｚ，Ｄ２Ｏ，
ＴＳＰ）：δ＝１７７．４，１７７．０，１６５．３，１６３．３，１６２．９，１６２
．５，１６２．２，１３４．３，１２０．５，１１７．６，１１４．７，１１１．８，１
００．５，９８．３，８３．４，７９．９，７３．０，７２．２，７１．４，７１．２，
７１．１，７０．１，６８．１，６６．２，６２．０，６０．２，５５．４，５４．７，
５１．１，５０．４，４９．８，４８．１，４４．３，４２．６，３９．６，３９．１，
３５．３，２７．８，２７．６，２５．１ｐｐｍ；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  Ｃ２８Ｈ
５０Ｎ９Ｏ１２Ｓについての計算値（Ｍ＋Ｈ）７３６．３３００；実測値７３６．３２９
７。
【００５４】
小分子二量体の合成。
【００５５】
２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳの合成。図３３を参照されたい。Ｒｉｎｋアミド樹脂（５００ｍｇ
、０．３ミリモル）をＤＭＦ中で室温で１０分間膨潤させ、次にＤＭＦ中２０％ピペリジ
ンの溶液で脱保護した（５ｍＬ、２×２０分）。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、
１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によ
って、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリ
モル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した
７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｎ−（４−アミ
ノブチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１２１ｍｇ、０．６ミ
リモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振
盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−Ｌ−アラ
ニン（２６４ｍｇ、０．８１ミリモル）、ＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）、ＨＯ
Ａｔ（１１０ｍｇ、０．８１ミリモル）、およびＤＩＥＡ（１４１μＬ、０．８１ミリモ
ル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加
熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦで除去した（２×
１０分）。このサイクルを合計４回繰り返した。次に、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄
し、その後、３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間処理した。溶液を真空濃縮し、
トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン
酸塩（８０ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＨＯＡｔ（２２ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＤＩ
Ｃ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（１００μＬ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶
液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し
、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる
逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。６４０ナノモルの２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳを単離した；０．
２％。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ（Ｃ８１Ｈ１０１Ｎ１９Ｏ９）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１４８４
．８１、ＭＳ実測値１４８４．９３（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３２分。
【００５６】
２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ官能基化中間体の合成。Ｒｉｎｋアミド樹脂（５００ｍｇ、０．３
ミリモル）をＤＭＦ中で室温で１０分間膨潤させ、次にＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液
で脱保護した（５ｍＬ、２×２０分）。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電
力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｄ
ＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）と
２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗ
のマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｎ−（４−アミノブチル
）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１２１ｍｇ、０．６ミリモル）
のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、そ
の後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（２
６４ｍｇ、０．８１ミリモル）、ＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）、ＨＯＡｔ（１
１０ｍｇ、０．８１ミリモル）、およびＤＩＥＡ（１４１μＬ、０．８１ミリモル）のＤ
ＭＦ（４ｍＬ）溶液を添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。
樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦで除去した（２×１０分）
。このサイクルを合計３回繰り返した。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電
力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｄ
ＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）と
２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗ
のマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｎ−（４−アミノエチル
）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１０５ｍｇ、０．６ミリモル）
のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、そ
の後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。
【００５７】
２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンの合成。図３４を参照されたい。上で調製した２
Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ中間体樹脂を、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマ
イクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）および
ＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×
５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１
５秒）によって、ビオチンアミン（２００ｍｇ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶
液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した
（３×５ｍＬ）。次に、Ｆｍｏｃ−β−アラニン（２５２ｍｇ、０．８１ミリモル）、Ｄ
ＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１０ｍｇ、０．８１ミリモル）、お
よびＤＩＥＡ（１４１μＬ、０．８１ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を添加し、反応
物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し
、その後、３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間で処理した。溶液を真空濃縮し、
トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン
酸塩（８０ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＨＯＡｔ（２２ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＤＩ
Ｃ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（１００μＬ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶
液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し
、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる
逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。次に、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１×１０
分）によって除去し、その後真空濃縮した。１４３ナノモル（０．０５％）の遊離アミン
二量体を単離し、クロラムブシル（１ｍｇ、３μモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミ
リモル）およびＤＩＥＡ（２５μＬ）のＤＭＦ（２００μＬ）溶液で室温にて３時間処理
した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋０
．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。１１９ナノモルの２Ｈ−
Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンを単離した；０．０４％。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビ
オチン（Ｃ１１３Ｈ１４９Ｃｌ２Ｎ２６Ｏ１４Ｓ）ＭＳ計算値２１９６．０８（Ｍ＋Ｈ）
、ＭＳ実測値２１９５．９６（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３０分。
【００５８】
２ＮＡｃ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンの合成。図３５を参照されたい。２Ｈ−Ｋ４
ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンについて上記のように合成したが、ヘキストカルボン酸塩と結
合する代わりに、ペプチドを無水酢酸およびＤＩＥＡの１：１溶液（合計量４００μＬ）
で室温で１時間処理した。８００ナノモルの２ＮＡｃ−Ｋ４ＮＭｅＳを単離した；０．３
％）。２ＮＡｃ−Ｋ４ＮＭｅＳ（Ｃ５９Ｈ９６Ｃｌ２Ｎ１４Ｏ１２ＳＮａ）ＭＳ計算値１
３１７．６３（Ｍ＋Ｎａ）、ＭＳ実測値１３１７．２８（Ｍ＋Ｎａ）；ｔＲ＝１８分。
【００５９】
２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシンＡ５の合成。図３６を参照されたい。上で調製し
た２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ中間体樹脂を、６−（Ｆｍｏｃ−アミノ）ヘキサン酸（２８６ｍｇ
、０．８１ミリモル）ＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１０ｍｇ、
０．８１ミリモル）、およびＤＩＥＡ（１４１μＬ、０．８１ミリモル）のＤＭＦ（４ｍ
Ｌ）溶液と反応させ、添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。
樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、その後、３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分
間で処理した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄
色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（８０ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＨＯＡｔ（２
２ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（
１００μＬ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間
加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ
＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。次に、Ｆｍｏｃを２
０％ピペリジン／ＤＭＦ（１×１０分）によって除去し、その後真空濃縮した。４５０ｎ
ｍｏｌ（０．２％）の遊離アミン二量体を単離し、それをＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジル
カルボナート（４５０ｎｍｏｌ、ＬＫＴ  Ｌａｂｓ）およびＤＩＥＡ（１０μＬ）の無水
ＤＭＦ（５０μＬ）中の溶液で処理した。反応物を室温で撹拌し、さらなるＮ，Ｎ’−ジ
スクシンイミジルカルボナートを、出発物質の８０〜９０％が消費されるまで定期的に添
加した。次に、ブレオマイシンＡ５−銅錯体（４５０ｎｍｏｌ）の無水ＤＭＦ中の溶液を
添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。次に、溶液を真空濃縮し、逆相ＨＰＬＣを用いて
最初に水中０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．３）を１５分間使用した後、０〜１００％の
ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡを１時間にわたって使用することによって精製した
。５２ナノモルの２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシンＡ５を単離した（０．０２％）。
２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシンＡ５（Ｃ１４６Ｈ２０３Ｎ４０Ｏ３２Ｓ２）ＭＳ計
算値３０９２．４９（Ｍ＋Ｈ）、ＭＳ実測値３０９２．１８（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３５分。
【００６０】
Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳの合成。図３７を参照されたい。Ｒｉｎｋアミド樹脂（２０
０ｍｇ、０．１２ミリモル）をＤＭＦ中で室温で１０分間膨潤させ、次にＤＭＦ中２０％
ピペリジンの溶液で脱保護した（３ｍＬ、２×２０分）。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×３
ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５
秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（２ｍＬ）およびＤＩＣ（１２５μＬ、０
．８ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×３ｍＬ）、１０％電力に
設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、３−ア
ジドプロピルアミン（６０ｍｇ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液と反応させた
。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×３ｍＬ）
。樹脂を再び、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３
×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（２ｍＬ）およびＤＩＣ（１２５μ
Ｌ、０．８ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×３ｍＬ）、１０％
電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、
Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（６０ｍ
ｇ、０．３ミリモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室
温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×３ｍＬ）。次に、Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチ
ル−Ｌ−アラニン（１３２ｍｇ、０．４ミリモル）、ＤＩＣ（１２５μＬ、０．８ミリモ
ル）、ＨＯＡｔ（５５ｍｇ、０．４ミリモル）、およびＤＩＥＡ（７０μＬ、０．４ミリ
モル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間
加熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦで除去した（２
×１０分）。このサイクルを合計４回繰り返した。次に、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗
浄し、その後、３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間処理した。溶液を真空濃縮し
、トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボ
ン酸塩（４０ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ミリモル）、Ｄ
ＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（５０μＬ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶
液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し
、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる
逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。６４０ナノモルのＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳを単離した
；０．５％。Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ（Ｃ８５Ｈ１０８Ｎ２３Ｏ１０）ＭＳ計算値（Ｍ
＋Ｈ）１６１０．８７、ＭＳ実測値１６１０．９６（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３４分。
【００６１】
Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳビオチンの合成。図３８を参照されたい。Ｒｉｎｋアミド樹
脂（５００ｍｇ、０．３ミリモル）をＤＭＦ中で室温で１０分間膨潤させ、次にＤＭＦ中
２０％ピペリジンの溶液で脱保護した（３ｍＬ、２×２０分）。樹脂をＤＭＦで洗浄し（
３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３
×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（２５０μ
Ｌ、１．６ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％
電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、
３−アジドプロピルアミン（１２０ｍｇ、１．２ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液と反
応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×
５ｍＬ）。樹脂を再び、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波
照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（
２５０μＬ、１．６ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）
、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）に
よって、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
（１２１ｍｇ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液
とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、Ｆｍｏｃ
−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（２６４ｍｇ、０．８１ミリモル）、ＤＩＣ（２５０μＬ、
１．６ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１０ｍｇ、０．８１ミリモル）、およびＤＩＥＡ（１４
０μＬ、０．８１ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を添加し、反応物をマイクロ波によ
って７５℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／
ＤＭＦで除去した（２×１０分）。このサイクルを合計３回繰り返した。樹脂をＤＭＦで
洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波
照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（
２５０μＬ、１．６ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）
、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）に
よって、Ｎ−（４−アミノエチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
（１０５ｍｇ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液
とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、樹脂をＤ
−ビオチン（１９５ｍｇ、０．８１ミリモル）、ＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）
、ＨＯＡｔ（１１０ｍｇ、０．８１ミリモル）、およびＤＩＥＡ（１４０μＬ、０．８１
ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液で処理し、添加し、反応物をマイクロ波によって７５
℃に３０分間加熱した。次に、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、その後、３０％ＴＦ
Ａ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間で処理した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸さ
せた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（４０ｍｇ、０．
０８ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１
６ミリモル）およびＤＩＥＡ（５０μＬ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波
によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０
〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精
製した。６４０ナノモルのＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ビオチンを単離した；０．２％。
Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ビオチン（Ｃ９７Ｈ１２７Ｎ２６Ｏ１２Ｓ）ＭＳ計算値（Ｍ
＋Ｈ）１８７９．９８、ＭＳ実測値１８７９．８７（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３１分。
【００６２】
２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ活性化アルキンの合成。図３９を参照されたい。各々のアルキン誘
導体について、３００ｍｇの樹脂（０．１８ミリモル）と２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ中間体を、
Ｎ−Ｆｍｏｃカルボン酸塩リンカー（０．６ミリモル）、ＤＩＣ（１２５μＬ、０．８ミ
リモル）、ＨＯＡｔ（７２ｍｇ、０．６ミリモル）、およびＤＩＥＡ（８０μＬ、０．６
ミリモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液で処理し、添加し、反応物をマイクロ波によって７５
℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦで
除去した（２×１０分）。次に樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後、ＤＩＥＡ（８０μＬ、０
．６ミリモル）を含む２ｍＬのＤＭＦに懸濁した。懸濁液にアルゴンを流し、０℃に冷却
した。次に、ＤＩＣ（１２５μＬ、０．８ミリモル）を添加し、それに続いてプロピオル
酸（３７μＬ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（５００μＬ）溶液をゆっくり添加した。反応
物を低温で１時間撹拌し、その後、ＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。次に、樹脂を３０％
ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間処理した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸
させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（４０ｍｇ、０
．０８ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．
１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（５０μＬ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ
波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２
０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて
精製した。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳプロピオル酸塩（ｎ＝０）９００ナノモル（０．５％）（
Ｃ８５Ｈ１０５Ｎ２０Ｏ１０）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１５６５．８３、ＭＳ実測値１５６
５．６１（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３１分。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳグリシン（ｎ＝１）６００ナノ
モル（０．３％）（Ｃ８７Ｈ１０８Ｎ２１Ｏ１１）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１６２２．８５
４、ＭＳ実測値１６２２．８５４（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３０分。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳβ−ア
ラニン（ｎ＝２）７５０ナノモル（０．４％）（Ｃ８８Ｈ１１０Ｎ２１Ｏ１１）ＭＳ計算
値（Ｍ＋Ｈ）１６３６．８７、ＭＳ実測値１６３６．７（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３１分。２Ｈ
−Ｋ４ＮＭｅＳアミノヘキサン酸塩（ｎ＝５、Ａａｋ）４．９３μモル（３％）（Ｃ９１
Ｈ１１６Ｎ２１Ｏ１１）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１６７８．９２、ＭＳ実測値１６７８．７
（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３１分。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳアミノオクタン酸塩（ｎ＝７）１．６μ
モル（０．９％）（Ｃ９３Ｈ１２０Ｎ２１Ｏ１１）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１７０６．９５
、ＭＳ実測値１７０７．０（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３３分。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳアミノドデカ
ン酸塩（ｎ＝１１）４．４９μモル（３％）（Ｃ９７Ｈ１２８Ｎ２１Ｏ１１）ＭＳ計算値
（Ｍ＋Ｈ）１７６３．０１、ＭＳ実測値１７６３．２（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３４分。
【００６３】
Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの合成。図４０を参照されたい。Ｒｉｎｋアミド樹
脂（８００ｍｇ、０．４７ミリモル）をＤＭＦ中で室温で１０分間膨潤させ、次にＤＭＦ
中２０％ピペリジンの溶液で脱保護した（５ｍＬ、２×２０分）。樹脂をＤＭＦで洗浄し
（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（
３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（５ｍＬ）およびＤＩＣ（５００
μＬ、３．２ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０
％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって
、３−アジドプロピルアミン（３００ｍｇ、３ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液と反応
させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５
ｍＬ）。樹脂を再び、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照
射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（５ｍＬ）およびＤＩＣ（５
００μＬ、３．２ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、
１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によ
って、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（
２４０ｍｇ、１．２ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液と
ともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、Ｆｍｏｃ−
Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（５２８ｍｇ、１．６ミリモル）、ＤＩＣ（５００μＬ、３．
２ミリモル）、ＨＯＡｔ（２２０ｍｇ、１．６ミリモル）、およびＤＩＥＡ（２８０μＬ
、１．６ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を添加し、反応物をマイクロ波によって７５
℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦで
除去した（２×１０分）。このサイクルを合計３回繰り返した。樹脂をＤＭＦで洗浄し（
３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３
×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（５ｍＬ）およびＤＩＣ（５００μ
Ｌ、３．２ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％
電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、
Ｎ−（４−アミノエチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２１０
ｍｇ、１．２ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに
室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、樹脂を、Ｎ−Ｆｍ
ｏｃ  アミノヘキサン酸（５６５ｍｇ、１．６ミリモル）、ＤＩＣ（５００μＬ、３．２
ミリモル）、ＨＯＡｔ（２２０ｍｇ、１．６ミリモル）、およびＤＩＥＡ（２８０μＬ、
１．６ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液で処理し、添加し、反応物をマイクロ波によっ
て７５℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／Ｄ
ＭＦで除去した（２×１０分）。次に樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後、ＤＩＥＡ（２８０
μＬ、１．６ミリモル）を含む５ｍＬのＤＭＦに懸濁した。懸濁液にアルゴンを流し、０
℃に冷却した。次に、ＤＩＣ（５００μＬ、３．２ミリモル）を添加し、それに続いてプ
ロピオル酸（１４８μＬ、３．２ミリモル）のＤＭＦ（５００μＬ）溶液をゆっくり添加
した。反応物を低温で１時間撹拌し、その後、ＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。次に、樹
脂を３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間処理した。溶液を真空濃縮し、トルエン
で３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（４
０ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＤＩＣ（２５
μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（５０μＬ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液で処理し
、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間に
わたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬ
Ｃを用いて精製した。５２３ナノモル（０．１％）のＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ
を単離した。Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ  Ａａｋ（Ｃ９６Ｈ１２４Ｎ２５Ｏ１２）ＭＳ計
算値（Ｍ＋Ｈ）１８１８．９８６１、ＭＳ実測値１８１９．００８１（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝
３２分。
【００６４】
ビオチン−Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの合成。図４１を参照されたい。Ｒｉｎ
ｋアミド樹脂（２５０ｍｇ、０．１５ミリモル）をＤＭＦ中で室温で１０分間膨潤させ、
次にＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液で脱保護した（３ｍＬ、２×２０分）。樹脂をＤＭ
Ｆで洗浄し（３×３ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイク
ロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（２ｍＬ）およびＤＩ
Ｃ（１２５μＬ、０．８ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×３ｍ
Ｌ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒
）によって、Ｎ−［２−（Ｄ−ビオチニルアミノ）エチル］アミン３（１００ｍｇ、０．
３ミリモル）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時
間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。残りの合成は、Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４Ｎ
ＭｅＳ−Ａａｋについて上に記載されるように合成した。２３０ナノモルのビオチン−Ｎ
３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋを単離した；０．２％）。ビオチン−Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４
ＮＭｅＳ−Ａａｋ（Ｃ１１０Ｈ１４６Ｎ２９Ｏ１５Ｓ）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）２１４５．
１３、ＭＳ実測値２１４５．０７（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３４分。
【００６５】
Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＴＡＭＲＡ（カルボキシテトラメチルローダミン）の合成
。図４２を参照されたい。Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳをＦｍｏｃ６−アミノヘキサン酸塩
とともに含有する樹脂２５０ｍｇを、１０分間かけて３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）に
よってビーズから切断した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸させた。結果として
得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（４０ｍｇ、０．０８ミリモル）、
ＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およ
びＤＩＥＡ（５０μＬ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波によって７５℃に
１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯ
Ｈ／Ｈ２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。２．９５
μモルの生成物を単離し、室温で２０分間１ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦで処理する
ことによってＦｍｏｃを除去し、溶液を真空濃縮した。残渣を、上記の条件を用いる逆相
ＨＰＬＣによって再び精製した。二量体の一部（３１５ナノモル）を、マイクロ波照射に
よって１．５時間７５℃に加熱することにより、ＤＭＦ（５００μＬ）中で５−ＴＡＭＲ
Ａ（０．４ｍｇ、０．９５μモル）とＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）と結合させ
た。反応混合物を濃縮し、上記のように精製して、２１６ナノモルのＮ３−２Ｈ−Ｋ４Ｎ
ＭｅＳ−ＴＡＭＲＡ；（０．１％）を得た。Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＴＡＭＲＡ（Ｃ
１１８Ｈ１４４Ｎ２７Ｏ１５）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）２１７９．１３３５、ＭＳ実測値２
１７９．０４８３（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３４分。
【００６６】
ＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ（フルオレセイン）の合成。図４３を参照された
い。Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳをＦｍｏｃ６−アミノヘキサン酸塩とともに含有する樹脂
５００ｍｇを、１０分間かけて３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）によってビーズから切断
した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状
物質を、ヘキストカルボン酸塩（４０ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１ｍｇ、
０．０８ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（５０μＬ
）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。
次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋０．１％
（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。生成物を単離し、室温で２０分
間１ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦで処理することによってＦｍｏｃを除去し、溶液を
真空濃縮した。残渣を、上記の条件を用いる逆相ＨＰＬＣによって再び精製して、８μモ
ルの二量体を得た。次にこれをＦＡＭアルキン（２５ｍｇ、６μｍｏｌ）および銅触媒（
１ｍｇ、１．６μｍｏｌ）とともに、ＤＭＦ（２ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）中でトリ
メチルアミン（２５０μＬ）とともに１２０℃で３時間加熱することによってクリック反
応させた。次に、反応混合物を濃縮し、上記のように精製して５５０ナノモルのＦＡＭ二
量体を得た。これをトルエンとともに３回共沸させた後、プロピオル酸スクシンイミジル
エステル４（１ｍｇ、６μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２５μＬ）のＤＭＦ（２５０μＬ）
溶液で処理した。反応物を室温で４時間撹拌し、その後上記のように精製した。５．９ナ
ノモルのＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋを単離した；（０．００２％）。ＦＡＭ−
２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ（Ｃ１２０Ｈ１３９Ｎ２６Ｏ１８）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）２
２３２．０７６１、ＭＳ実測値２２３２．０８２７（Ｍ＋Ｈ）；ｔＲ＝３５分。
【００６７】
生化学および細胞アッセイの方法
液体クロマトグラフィー・質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によるインビトロクリック反応の評
価。ＤＭ２を引き起こす反復ＲＮＡが、ＨＤＣＲによるオリゴマー化の鋳型となるかどう
かを判定するために、アルキンを含有する化合物およびアジドを含有する化合物を、１２
のＣＣＵＧリピートを含むＲＮＡとともにインキュベートした。ｒＣＣＵＧ１２（最終濃
度５０μＭ）は、５分間６０℃の１×フォールディングバッファー（８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰ
Ｏ４、ｐＨ７．０、１８５ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で折り畳まれた
。室温に冷却した後、Ｎ３−ＫおよびＫ−Ａｋ（各々の最終濃度５００μＭ）を添加し、
反応混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。各々のサンプルを、Ｔｈｅｒｍｏ  
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ−ＥＴＤ質量分析計を用いるＬＣ−ＭＳによって分析した
。１０分にわたる、０．１％ギ酸を加えた水中０〜１００％アセトニトリルの勾配を分析
に使用した。各成分の全イオン数を、Ｎ３−Ｋ、Ｋ−Ａｋ、およびＫ１，４二量体の等モ
ル混合物を含む制御注入を使用することにより測定される、各々の成分のイオン化率に正
規化した。ｒ（ＣＵＧ）１２、ｒ（ＡＵＵＣＵ）１２、ｒ（ＣＡＧ）１２、ｒ（ＣＧＧ）
１２、完全に塩基対形成したステムを含むＲＮＡヘアピン、およびビール酵母ｔＲＮＡ（
ロシュ）を使用する制御反応も、同様に評価した。
【００６８】
ＤＭ２細胞培養モデルにおけるＤＭ２に関連するプレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損の
評価。クリック反応可能な化合物のＤＭ２に関連する選択的プレ−ｍＲＮＡスプライシン
グ欠損への効果を判定するために、既に報告された細胞培養モデルを用いた［５］。手短
に言えば、Ｃ２Ｃ１２細胞を単層として増殖培地（１×ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、および
１×グルタマックス（インビトロジェン））で３７℃および５％ＣＯ２で維持した。９６
ウェルプレートの細胞が６０〜７０％の集密度に達したら、１μＬのリポフェクタミン２
０００（インビトロジェン）を製造業者の標準プロトコルに従って用いて、各サンプルに
２００ｎｇの全プラスミドをトランスフェクトした。３００個のＣＣＴＧリピートを含む
ＤＭ２ミニ遺伝子［１］およびＢＩＮ１レポーターミニ遺伝子を発現する等量のプラスミ
ドを使用した［５］。５時間後、トランスフェクションカクテルを除去し、目的の化合物
を含有する分化培地（１×ＤＭＥＭ、２％ウマ血清、および１×グルタマックス）に置き
換えた。７２時間後、Ｚｙｍｏ  Ｑｕｉｃｋ  ＲＮＡミニプレップキットを用いて全ＲＮ
Ａを回収した。約１５０ｎｇの全ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲに供した。ＢＩＮ１ミニ遺伝子
のＲＴ−ＰＣＲプライマーは、５’ＣＡＴＴＣＡＣＣＡＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＣ（フォワ
ード）および５’ＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＣＣＧＣＣ（リバース）であった
。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、１×ＴＢＥ緩衝液中２００Ｖで９０分間実施する変性８％ポリア
クリルアミドゲルを用いて分離した。産物を、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ）で染色することによって可視化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  
ＸＲ＋イメージングシステムを用いて走査した。
【００６９】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による、核内フォーカスの崩壊
におけるインセルロクリック反応の評価。ＦＩＳＨを用いて、核内フォーカスの形成への
クリック反応可能な化合物の影響を判定した。Ｃ２Ｃ１２を、Ｍａｔ−Ｔｅｋ  ９６ウェ
ルガラスボトムプレートの増殖培地で継代培養した。細胞が６０〜７０％の集密度に達し
たら、１μＬのリポフェクタミン２０００を製造業者の標準プロトコルに従って用いて、
各ウェルに２００ｎｇの全プラスミドをトランスフェクトした。ＤＭ２ミニ遺伝子［１］
およびトランスフェクションの陽性マーカーとして使用されるＥＧＦＰを発現する等量の
プラスミドを使用した。５時間後、トランスフェクションカクテルを除去し、目的の化合
物を含有する分化培地に置き換えた。細胞を化合物で７２時間処理し、その後、１ｎｇ／
μＬ  ＤＹ５４７−２’ＯＭｅ−（ＣＡＧＧ）５［６］を用いて前に記載されるようにＦ
ＩＳＨを行った。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  １０００共焦点顕微鏡を１００倍
の倍率で使用して、１×ＤＰＢＳ中で細胞を画像化した。
【００７０】
インセルロでクリック反応した生成物の質量分析による同定。Ｃ２Ｃ１２細胞を増殖培
地のＴ−７５ディッシュで増殖させた。細胞が６０〜７０％の集密度に達したら、リポフ
ェクタミン２０００を製造業者の標準プロトコルに従って用いて、各ディッシュに１０μ
ｇのＤＭ２ミニ遺伝子発現プラスミドをトランスフェクトした。５時間後、トランスフェ
クションカクテルを除去し、目的の化合物を含有する分化培地に置き換えた。トランスフ
ェクションの直後に、１２．５μＭ  Ｎ３−Ｋと、１２．５μＭ  Ｋ−Ａｋか、１２．５
μＭ  Ｎ３−Ｋ−Ａｋか、１２．５μＭ  Ｎ３−Ｋ−Ａａｋのいずれかとの混合物で細胞
を処理した。ＬＣ−ＭＳによる検出を可能にするために、Ｎ３−Ｋを添加してオリゴマー
産物の分子量を制限した。７２時間後、細胞をアセトニトリル中１０％水で凍結融解する
ことによって溶解した。解凍した溶解物を濃縮し、１ｍＬのアセトニトリル中１０％水に
再懸濁した。不溶性の細胞残屑をペレット化し、上清を質量スペクトル分析に使用した。
約２０μＬの各サンプルを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ−ＥＴＤ質量
分析計を用いるＬＣ−ＭＳによって分析した。１０分にわたる、０．１％ギ酸を加えた水
中０〜１００％アセトニトリルの勾配を分析に使用した。各成分の全イオン数を、Ｎ３−
Ｋ、Ｋ−Ａｋ、およびＫ１，４二量体の等モル混合物を含む制御注入中の各成分のイオン
化率に正規化した。
【００７１】
ｑＲＴ−ＰＣＲによる標的プルダウンの分析。Ｃ２Ｃ１２細胞を、Ｔ−２５フラスコで
増殖培地中の単層として増殖させ、６０〜７０％の集密度でトランスフェクトした。リポ
フェクタミン２０００を製造業者の標準プロトコルに従って用いて、各ディッシュに３．
４μｇのＤＭ２ミニ遺伝子発現プラスミドをトランスフェクトした。５時間後、トランス
フェクションカクテルを除去し、目的の化合物を含有する分化培地に置き換えた。トラン
スフェクションの直後に、５μＭ  Ｎ３−Ｋ−ビオチンと、５μＭ  Ｋ−Ａｋか、５μＭ
Ｎ３−Ｋ−Ａｋか、５μＭ  Ｎ３−Ｋ−Ａａｋのいずれかとの混合物で細胞を処理した
。ＬＣ−ＭＳによる検出を可能にするために、Ｎ３−Ｋ−ビオチンを添加してオリゴマー
産物の分子量を制限した。７２時間後、細胞を１×ＤＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し
た。ペレット化した細胞を、５００μＬのＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（２％  Ｔｒｉｔｏ
ｎ  Ｘ−１００、２％  ＮＰ４０、１／２５  ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（Ａｍｂｉｏｎ）、お
よび１ｕ／μＬ  ＲＱ１  ＤＮＡｓｅ（プロメガ））［７］で５分間室温で処理すること
によって溶解し、その後、７５℃で５分間インキュベートした。
【００７２】
１５ナノモルのストレプトアビジン−アガロースビーズ（シグマ、ビオチン添加量１５
μｇ／ｍＬ）を用いて約９０％の細胞溶解物をプルダウンに使用した。溶解物を５００ｒ
ｐｍで振盪しながら室温で１時間ビーズとともにインキュベートした。溶液を除去し、ビ
ーズを１×ＰＢＳの５００μＬアリコートで洗浄した。結合した材料を、１０ｍＭ  ＥＤ
ＴＡを含有する９５％ホルムアミド３０μＬ、ｐＨ８．２中で９５℃にて５分間加熱する
ことにより、ビーズから遊離させた。
【００７３】
逆転写反応を、ｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キットを用いて、製造業者のプロトコル
に従って細胞溶解物かまたは溶離した材料のいずれかの約１０％量を添加することにより
実施した。次に、各ｃＤＮＡサンプルの３０％を、各プライマーセットに対するリアルタ
イムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析に使用した。ｑＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用い
て７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバ
イオシステムズ）で実施した。ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐを含有するｍＲＮＡに対するＰＣＲ
プライマーは、５’ＧＴＧＡＧＴＴＴＧＧＧＧＡＣＣＣＴＴＧＡ（フォワード）および５
’ＣＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＴＴＴＧＣＣＣＣ（リバース）であった。１８Ｓリボソーム
ＲＮＡに対するＰＣＲプライマーは、５’ＧＴＡＡＣＣＣＧＴＴＧＡＡＣＣＣＣＡＴＴ（
フォワード）および５’ＣＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＧＴＡＧＴＡＧＣＧ（リバース）であっ
た。
【００７４】
プルダウンした反応産物のＬＣ−ＭＳによる分析。プルダウンした反応産物を検出する
ために、約４μＬの溶離材料を、０．１％ＴＦＡを含有する５体積の水に希釈し、Ｔｈｅ
ｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ−ＥＴＤ質量分析計を用いるＬＣ−ＭＳによって
分析した。
【００７５】
これらのサンプルを、ｒ（ＣＣＵＧ）３００を発現しなかった、化合物で処理した細胞
由来のプルダウンしたサンプルと比較した。１０分にわたる、０．１％ギ酸を加えた水中
０〜１００％アセトニトリルの勾配を分析に使用した。
【００７６】
患者由来神経芽細胞におけるＤＭ１スプライシング欠損の評価。５００個のＣＴＧリピ
ートを含むＤＭ１患者由来線維芽細胞（ＧＭ０３９８７）および健康な線維芽細胞（ＧＭ
０７４９２）を使用することによって、小分子二量体の生物活性を評価した。細胞を、１
２ウェルプレートで増殖培地（１Ｘ  ＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）、１０％  ＦＢＳ、１Ｘ  
ｇｌｕｔａｇｒｏ（コーニング）、１Ｘ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（コーニング）および１
Ｘ抗生物質／抗真菌薬（コーニング））中の単層として増殖させた。細胞が約８０％の集
密度に達したら、細胞を目的の化合物を含む増殖培地（１０、１、０．１および０．０１
μＭ  ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ；１００、１０および１ｎＭ  ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビ
オチン；１μＭ  Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ；５００ｎＭ  Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ＋
５００ｎＭ  ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−アミノヘキサン酸塩；１０００、１０および０．１ｎ
Ｍ  Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ；２５０、１００、および５０ｎＭ  ２Ｈ−Ｋ４
ＮＭｅＳ−ブレオマイシンＡ５）で処理した。４８時間後、細胞を溶解し、Ｚｙｍｏ  Ｑ
ｕｉｃｋ  ＲＮＡミニプレップキットを用いて全ＲＮＡを回収した。オンカラムＤＮＡ消
化を、製造業者の推奨するプロトコルによって達成した。約１５０ｎｇの全ＲＮＡを、１
００単位のスーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（ライフテクノロジーズ）を用いて５０
℃で逆転写した。次に、ＲＴ反応の２０％を、ＧｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（プロメ
ガ）を用いるＰＣＲに供した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、２５サイクルの９５℃３０秒、５８
℃３０秒、７２℃１分、および７２℃１分の最終伸長の後に観察された。産物は、１×Ｔ
ＡＥ緩衝液中１００Ｖで１時間実施した２％アガロースゲルで分離した。産物を、臭化エ
チジウムで染色することにより可視化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＸＲ＋イメ
ージングシステムを用いて走査した。ＭＢＮＬ１に対するＲＴ−ＰＣＲプライマーは、５
’ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＴＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣ（フォワード）および５’ＴＧＧＴＧＧ
ＧＡＧＡＡＡＴＧＣＴＧＴＡＴＧ（リバース）であった。
【００７７】
ＤＭ１マウスモデルを用いるスプライシング欠損の評価。全ての試験手順、マウスの取
り扱い、および飼育は、実験動物ケア評価認証協会（ｔｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  
ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）に従って達成した。ＤＭ１［８］のマウスモデ
ルに、２０ｂ系統のＨＳＡＬＲを使用した。ＨＳＡＬＲマウスは、３’ＵＴＲに２５０個
のＣＵＧリピートを含むヒト骨格アクチンＲＮＡを発現する。年齢と性別の一致するＨＳ
ＡＬＲマウスに、処置用の１００ｍｇ／ｋｇの水中２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅまたは１３．３ｍｇ
／ｋｇの２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ、および対照用の０．９％ＮａＣｌを１日１回、７日間腹腔
内注射した。最後の注射の１日後にマウスを犠牲にし、広筋を入手した。ＲＮＡを広筋組
織から抽出し、前に記載されるようにｃＤＮＡを合成した。
【００７８】
ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐを標的化するために化合物を使用することによる、小分子二量体と
ＲＮＡのインビトロ反応およびプルダウン。増殖培地（（１Ｘ  ＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）
、１０％  ＦＢＳ、１Ｘ  ｇｌｕｔａｇｒｏ（コーニング）、１Ｘ  ＭＥＭ非必須アミノ
酸（コーニング）および１Ｘ  抗生物質／抗真菌薬（コーニング）２ｍＬ）を９５℃で１
５分間熱失活させ、その後、ゆっくりと室温まで冷却した。次に、約１０，０００カウン
トのγ３２Ｐ標識ＲＮＡ（ｒＣＵＧ１０９、ＧＣに基づく塩基対形成したＲＮＡおよびｔ
ＲＮＡ）を添加し、９５℃で１分間折り畳んだ。次に、化合物の２倍希釈液（最終濃度８
００、４００、２００および１００ｎＭ）を、５０μＬのＲＮＡ溶液中に調製し、３７℃
で一晩インキュベートした。次に、ストレプトアビジン−アガロースビーズ（シグマ）の
４００μＬのスラリーを、１Ｘ  ＰＢＳで洗浄し、その後、２ｍＬの１Ｘ  ＰＢＳに再懸
濁した。次に、３０μＬのこのスラリーを各サンプルに添加し、室温で１時間インキュベ
ートした。次に、サンプルを遠心し、上清を別の管に移した。次に、ビーズを１Ｘ  ＰＢ
ＳＴで洗浄し、遠心した。上清を、非結合ＲＮＡを含む管に移した。結合ＲＮＡと非結合
ＲＮＡの全放射線カウントを、シンチレーション計数によって測定した。
【００７９】
ＤＭ１系を使用することによるＣｈｅｍ−ＣＬＩＰによる標的同定およびプルダウン。
５００個のＣＴＧリピートを含むＤＭ１患者由来線維芽細胞（ＧＭ０３９８７）および健
康な線維芽細胞（ＧＭ０７４９２）を使用して、小分子二量体の標的同定を評価した。細
胞を、増殖培地（１Ｘ  ＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）、１０％  ＦＢＳ、１Ｘ  ｇｌｕｔａｇ
ｒｏ（コーニング）、１Ｘ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（コーニング）および１Ｘ  抗生物質
／抗真菌薬（コーニング））中、１００ｍｍ２の単層として増殖させた。細胞が約８０％
の集密度になったら、それらを目的の化合物（１００ｎＭ  ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−
ビオチン）を含む増殖培地で処理した。４８時間後、細胞を溶解させ、トリゾール試薬（
ライフテクノロジーズ）を用いて全ＲＮＡを回収した。約１０μｇの全ＲＮＡをストレプ
トアビジン−アガロースビーズ（１００μＬ、シグマ）とともに室温で１時間インキュベ
ートした。次に、ビーズを１Ｘ  ＰＢＳで洗浄し、結合したＲＮＡを１００μＬの９５％
ホルムアミド、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２を６０℃で１０分間添加することにより
溶離した。Ｚｙｍｏ  Ｑｕｉｃｋ  ＲＮＡミニプレップキットを用いて結合したＲＮＡを
浄化した。約１００ｎｇのＲＮＡを、ＲＴ  ｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕ
ａｎｔａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）に使用した。ＲＴ反応の１０％は、７９００ＨＴ  
Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ）
で実施したリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に、ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（ラ
イフテクノロジーズ）とともに使用した。ｒＣＵＧを含有するｍＲＮＡである、ＤＭＰＫ
（５００リピート）、ＳＵＰＴ２０ＨＬ１（１７リピート）、ＣＡＳＫ（１６リピート）
、ＬＲＰ８（１１リピート）、ＭＡＰ３Ｋ４（１１リピート）、ＳＣＵＢＥ（７リピート
）およびＳＯＲＣＳ２（７リピート）をモニターした。ＧＡＰＤＨと比較するΔΔＣｔに
より定量した。
【００８０】
Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ−Ｍａｐによる標的同定およびプルダウン。５００個のＣＴＧリピ
ートを含むＤＭ１患者由来線維芽細胞（ＧＭ０３９８７）を使用して、小分子二量体の結
合部位の標的同定を評価した。細胞を、増殖培地（１Ｘ  ＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）、１０
％  ＦＢＳ、１Ｘ  ｇｌｕｔａｇｒｏ（コーニング）、１Ｘ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（コ
ーニング）および１Ｘ  抗生物質／抗真菌薬（コーニング））中、１００ｍｍ２の単層と
して増殖させた。細胞が約８０％の集密度になったら、それらを目的の化合物（１００ｎ
Ｍ  ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチン）を含有する増殖培地で処理した。４８時間後
、細胞を溶解し、トリゾール試薬（ライフテクノロジーズ）を用いて全ＲＮＡを回収した
。約６μｇの全ＲＮＡを、１Ｘ  ＲＮアーゼＨ緩衝液中の８μＭアンチセンスオリゴヌク
レオチドを用いて９５℃に１分間加熱し、その後氷上で冷却することにより折り畳ませた
。次に、５単位のＲＮアーゼＨ（ライフテクノロジーズ）を添加し、反応物を３７℃で１
．５時間インキュベートし、その後６５℃で２０分間熱失活させた。次に、切断したＲＮ
ＡをＤＮアーゼで３７℃で３０分間処理した後、停止緩衝液を添加し、６５℃で１０分間
インキュベートした。切断したＲＮＡ溶液をストレプトアビジン−アガロースビーズ（１
００μＬ、シグマ）とともに室温で１時間インキュベートした。次に、ビーズを１Ｘ  Ｐ
ＢＳで洗浄し、結合したＲＮＡを１００μＬの９５％ホルムアミド、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ
、ｐＨ８．２を６０℃で１０分間添加することにより溶離した。Ｚｙｍｏ  Ｑｕｉｃｋ  
ＲＮＡミニプレップキットを用いて結合したＲＮＡを浄化した。約１５０ｎｇのＲＮＡを
、ＲＴ  ｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ
）に使用した。ＲＴ反応の４０％は、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｐ
ＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ）で実施したリアルタイムＰＣＲ（ｑ
ＰＣＲ）に、ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（ライフテクノロジーズ）とともに使用
した。ＧＡＰＤＨと比較するΔΔＣｔにより定量した。
【００８１】
液体クロマトグラフィー・質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によるインビトロクリック反応の評
価。ＤＭ１を引き起こす反復ＲＮＡが、ＨＤＣＲによるオリゴマー化の鋳型となるかどう
かを判定するために、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳアジドおよび各々の２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ活性化
アルキン誘導体を、１２個のＣＵＧリピートを含むＲＮＡとともにインキュベートした。
ｒＣＵＧ１２（最終濃度１００μＭ）は、５分間６０℃の１×フォールディングバッファ
ー（８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０、１８５ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＥＤ
ＴＡ）中で折り畳まれた。室温に冷却した後、アジドおよびアルキン二量体（各々の最終
濃度２５μＭ）を添加し、反応混合物を３７℃で２４時間インキュベートした。各々のサ
ンプルを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ−ＥＴＤ質量分析計を用いるＬ
Ｃ−ＭＳによって分析した。１０分にわたる、０．１％ギ酸を加えた水中０〜１００％ア
セトニトリルの勾配を分析に使用した。ｒ（ＣＵＧ）１２との反応が最も大きかったアル
キン、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−アミノヘキサン酸塩Ａａｋを、次に、他のＲＮＡ標的の存在
下で形成された二量体の量を分析することによって、選択性について評価した。評価した
他のＲＮＡは、各々１００μＭ最終濃度のｒ（ＣＣＵＧ）１２、ｒ（ＣＡＧ）１２、ｒ（
ＣＧＧ）１２、およびビール酵母ｔＲＮＡ（ロシュ）であった。
【００８２】
ＤＭ１線維芽細胞を用いる、インセルロでクリック反応した生成物の質量分析による同
定。ＤＭ１を引き起こす反復ＲＮＡが、細胞内でのオリゴマー化の鋳型となるかどうかを
判定するために、５００個のＣＴＧリピートを含むＤＭ１患者由来線維芽細胞（ＧＭ０３
９８７）および健康な線維芽細胞（ＧＭ０７４９２）を、８０％の集密度までＴ２５ディ
ッシュ中の増殖培地（１Ｘ  ＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）、１０％  ＦＢＳ、１Ｘ  ｇｌｕｔ
ａｇｒｏ（コーニング）、１Ｘ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（コーニング）および１Ｘ  抗生
物質／抗真菌薬（コーニング））で増殖させ、等モル量のＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳビオ
チンおよび２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａｈｘ  Ａｌｋｙｎｅ（各５００ｎＭ）で２日間処理し
た。細胞を１Ｘ  ＤＰＢＳで洗浄した後、トリプシン処理した。次に、増殖培地でクエン
チし、遠心沈殿させた。細胞を１Ｘ  ＤＰＢＳで２回洗浄し、その後０．２５ｍＬの溶解
緩衝液（合計２ｍＬ＝２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００、２％  ＮＰ４０、８０ｕＬ  Ｒ
ＮＡｓｅｃｕｒｅ（１／２５）および５０ｕＬ  ＤＮＡｓｅ）を室温で５分間添加するこ
とにより溶解し、その後７５℃に５分間加熱した。２００μＬの溶解物を、ストレプトア
ビジン−アガロースビーズ（１００μＬ、シグマ）とともに室温で１時間インキュベート
した。次に、ビーズを１Ｘ  ＰＢＳτで洗浄し、２０μＬの９５％ホルムアミド、１０ｍ
Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２を６０℃で５分間添加することによって、結合したＲＮＡを溶
離した。約４μＬの各々のサンプルを、０．１％ギ酸を加えた水２０μＬに希釈し、Ｔｈ
ｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ−ＥＴＤ質量分析計を用いるＬＣ−ＭＳにより
分析した。１０分にわたる、０．１％ギ酸を加えた水中０〜１００％アセトニトリルの勾
配を分析に使用した。
【００８３】
蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いる核内フォーカスの評価。
ＦＩＳＨを用いて、核内フォーカスの形成および崩壊への小分子二量体の影響を判定した
。５００個のＣＴＧリピートを含むＤＭ１患者由来線維芽細胞（ＧＭ０３９８７）を、Ｍ
ａｔ−Ｔｅｋ  ９６ウェルガラスボトムプレートの増殖培地で約８０％の集密度まで増殖
させた。細胞を目的化合物で４８時間増殖培地において処理し、その後、１ｎｇ／μＬ  
ＤＹ５４７−２’ＯＭｅ−（ＣＡＧ）６を用いて前に記載されるように［６］ＦＩＳＨを
行った。ＭＢＮＬ１の免疫染色を、前に記載されるように［７］ＭＢ１ａ抗体（１：４希
釈）を用いて達成した。その抗体はＧｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ教授（Ｗｏｌｆｓｏｎ
Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅ
ａｓｅ）［９］により寛大にも供給されたものである。１：２００希釈のヤギ抗マウスＩ
ｇＧ  ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８コンジュゲートを用いてこれを蛍光標識した。ＤＡＰＩの
１Ｘ  ＤＰＢＳ中１μｇ／μＬ溶液を用いて未処理対照を染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆ
ｌｕｏＶｉｅｗ  １０００共焦点顕微鏡を１００倍の倍率で使用して、１×ＤＰＢＳ中で
細胞を画像化した。
【００８４】
ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いる翻訳による欠損の評価。ルシフェラーゼの
３’ＵＴＲにおいて８００個または０個のＣＴＧリピートを発現するＣ２Ｃ１２細胞株を
、９６ウェルプレートで増殖培地（１Ｘ  ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ、１Ｘ  ｇｌｕｔａ
ｇｒｏ（コーニング）および１Ｘ抗生物質／抗真菌薬（コーニング））中の単層として増
殖させた［１０］。細胞が７０％の集密度になったら、クリック官能化二量体を、１００
μＬの増殖培地（１０００ｎＭ  Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳおよび１０００、１０および
０．１ｎＭ  Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ）に添加した。細胞を化合物で４８時間
処理した後、細胞数を、ＷＳＴ−１試薬（ロシュ）を用いて正規化した。次に、細胞を１
Ｘ  ＤＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＰＰＢＴ溶解緩衝液で室温で１０分間処理することに
よって溶解した。次に、５０μＬのルシフェラーゼ基質を添加し、発光を測定した。
【００８５】
ＦＲＥＴによって測定するインビトロクリック反応の評価。ＤＭ１を引き起こす反復Ｒ
ＮＡが、ＨＤＣＲによるオリゴマー化の鋳型となるかどうかを判定するために、ＦＡＭ−
２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ  ＡａｋおよびＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ  Ａａｋを、１２のＣＵＧ
リピートを含むＲＮＡとともにインキュベートした。ｒＣＣＵＧ１２（最終濃度８０μＭ
）は、１×フォールディングバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００Ｍ
ＫＣｌ、および１０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で折り畳まれた。室温まで冷却した後、ＦＡＭ
−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ  Ａａｋ（最終濃度６０ｎＭ）およびＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ  
Ａａｋ（最終濃度４０ｎＭ）を添加し、反応混合物を３７℃で合計４８時間インキュベー
トした。ＦＲＥＴは、４８５ｎｍで励起させ、５９０ｎｍでの発光を測定することにより
測定した。ＦＲＥＴの増強は、ＲＮＡの不在下で対照とＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ  Ａ
ａｋ（最終濃度６０ｎＭ）およびＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ  Ａａｋ（最終濃度４０ｎＭ
）を比較することによって定量された。また、ＦＲＥＴは、塩基対対照ＲＮＡ（ｒ（ＧＣ
）２０）を陰性対照として用いて測定された。
【００８６】
実施例の項の引用文献
［１］Ｊ．Ｌ．Ｃｈｉｌｄｓ−Ｄｉｓｎｅｙ，Ｉ．Ｙｉｌｄｉｒｉｍ，Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｊ
．Ｒ．Ｌｏｈｍａｎ，Ｌ．Ｇｕａｎ，Ｔ．Ｔｒａｎ，Ｐ．Ｓａｒｋａｒ，Ｇ．Ｃ．Ｓｃｈ
ａｔｚ，Ｍ．Ｄ．Ｄｉｓｎｅｙ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１４，９，５３８−
５５０。
【００８７】
［２］Ｊ．Ｌ．Ｂａｎｋｓ，Ｈ．Ｓ．Ｂｅａｒｄ，Ｙ．Ｃａｏ，Ａ．Ｅ．Ｃｈｏ，Ｗ．Ｄ
ａｍｍ，Ｒ．Ｆａｒｉｄ，Ａ．Ｋ．Ｆｅｌｔｓ，Ｔ．Ａ．Ｈａｌｇｒｅｎ，Ｄ．Ｔ．Ｍａ
ｉｎｚ，Ｊ．Ｒ．Ｍａｐｌｅ，Ｒ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｄ．Ｍ．Ｐｈｉｌｉｐｐ，Ｍ．Ｐ．Ｒ
ｅｐａｓｋｙ，Ｌ．Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｂ．Ｊ．Ｂｅｒｎｅ，Ｒ．Ａ．Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，
Ｅ．Ｇａｌｌｉｃｃｈｉｏ，Ｒ．Ｍ．Ｌｅｖｙ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２００５
，２６，１７５２−１７８０。
【００８８】
［３］Ｋ．Ｊ．Ｂｏｗｅｒｓ，Ｅ．Ｃｈｏｗ，Ｈ．Ｘｕ，Ｒ．Ｏ．Ｄｒｏｒ，Ｍ．Ｐ．Ｅ
ａｓｔｗｏｏｄ，Ｂ．Ａ．Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｌ．Ｋｌｅｐｅｉｓ，Ｉ．Ｋｏｌｏ
ｓｓｖａｒｙ，Ｍ．Ａ．Ｍｏｒａｅｓ，Ｆ．Ｄ．Ｓａｃｅｒｄｏｔｉ，Ｊ．Ｋ．Ｓａｌｍ
ｏｎ，Ｙ．Ｓｈａｎ，Ｄ．Ｅ．Ｓｈａｗ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＣ
Ｍ／ＩＥＥＥ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（ＳＣ０６
），Ｔａｍｐａ，ＦＬ  ２００６。
【００８９】
［４］Ｔ．Ｒ．Ｃｈａｎ，Ｒ．Ｈｉｌｇｒａｆ，Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｖ．Ｖ．
Ｆｏｋｉｎ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００４，６，２８５３−２８５５。
【００９０】
［５］Ｃ．Ｆｕｇｉｅｒ，Ａ．Ｆ．Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．Ｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｖａｓｓｉｌｏ
ｐｏｕｌｏｓ，Ｙ．Ｉｖａｒｓｓｏｎ，Ａ．Ｔｏｕｓｓａｉｎｔ，Ｖ．Ｔｏｓｃｈ，Ａ．
Ｖｉｇｎａｕｄ，Ａ．Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．Ｍｅｓｓａｄｄｅｑ，Ｙ．Ｋｏｋｕｎａｉ，Ｒ．
Ｔｓｕｂｕｒａｙａ，Ｐ．ｄｅ  ｌａ  Ｇｒａｎｇｅ，Ｄ．Ｄｅｍｂｅｌｅ，Ｖ．Ｆｒａ
ｎｃｏｉｓ，Ｇ．Ｐｒｅｃｉｇｏｕｔ，Ｃ．Ｂｏｕｌａｄｅ−Ｌａｄａｍｅ，Ｍ．Ｃ．Ｈ
ｕｍｍｅｌ，Ａ．Ｌ．ｄｅ  Ｍｕｎａｉｎ，Ｎ．Ｓｅｒｇｅａｎｔ，Ａ．Ｌａｑｕｅｒｒ
ｉｅｒｅ，Ｃ．Ｔｈｉｂａｕｌｔ，Ｆ．Ｄｅｒｙｃｋｅｒｅ，Ｄ．Ａｕｂｏｅｕｆ，Ｌ．
Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｕｄｄ，Ｂ．Ｓｃｈｏｓｅｒ，Ｍ．Ｐ．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｉ．Ｎｉｓｈｉｎｏ，Ｇ．Ｂａｓｓｅｚ，Ｊ．Ｌａｐｏｒｔｅ，Ｄ
．Ｆｕｒｌｉｎｇ，Ｎ．Ｃｈａｒｌｅｔ−Ｂｅｒｇｕｅｒａｎｄ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０
１１，１７，７２０−７２５。
【００９１】
［６］Ｍ．Ｂ．Ｗａｒｆ，Ｍ．Ｎａｋａｍｏｒｉ，Ｃ．Ｍ．Ｍａｔｔｈｙｓ，Ｃ．Ａ．Ｔ
ｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．２００９，１０６，１８５５１−１８５５６。
【００９２】
［７］Ｙ．Ｋ．Ｈｏ，Ｗ．Ｔ．Ｘｕ，Ｈ．Ｐ．Ｔｏｏ，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１３，８
，ｅ７２４６３。
【００９３】
［８］Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，Ｌｏｇｉｇｉａｎ，Ｅ．，Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｌ．，Ｍｃ
Ｃｌａｉｎ，Ｃ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｋｒｙｍ，Ｍ．，ａ
ｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．（２０００）Ｍｙｏｔｏｎｉｃｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  
ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅ
ｄ  ＣＵＧ  ｒｅｐｅａｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９，１７６９−１７７３。
【００９４】
［９］Ｈｏｌｔ，Ｉ．；Ｍｉｔｔａｌ，Ｓ．；Ｆｕｒｌｉｎｇ，Ｄ．；Ｂｕｔｌｅｒ−Ｂ
ｒｏｗｎｅ，Ｇ．Ｓ．；Ｄａｖｉｄ  Ｂｒｏｏｋ，Ｊ．；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅ．Ｇｅｎ
ｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  ２００７，１２，１０３５。
【００９５】
［１０］Ｃｈｉｌｄｓ−Ｄｉｓｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．；Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｊ．；Ｒｚｕｃｚｅ
ｋ，Ｓ．Ｇ．；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．；Ｄｉｓｎｅｙ，Ｍ．Ｄ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２。
【００９６】
本発明は、当業者がそれを作製し使用するように十分に詳細に記載および例証されてい
るが、特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱しない様々な代替形態、変更形態、およ
び改良形態が当業者には明らかであろう。
【００９７】
本明細書において言及される全ての特許および刊行物は、各々の個々の刊行物が参照に
よりその全文が援用されると具体的かつ個別に示されるのと同程度に参照により本明細書
に援用される。
【００９８】
用いられている用語および表現は、記述の用語として使用されており、制限の用語とし
て使用されているものではなく、そのような用語および表現の使用には、示され記載され
る特徴またはその一部分の等価物を排除する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内
で様々な変更が可能であることが理解される。従って、本発明は好ましい実施形態および
任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の変更お
よび改変が当業者によってなされてよく、そのような変更および改変は添付される特許請
求の範囲により規定される本発明の範囲内にあるとみなされることは当然理解される。
【図１Ａ】
2019068831.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019068831.tif 000009
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019068831.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2019068831.tif 000018
【図１６】
2019068831.tif 000019
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月25日(2018.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月26日(2019.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ、Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ、ＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅ−Ｓ−ＡａｋまたはＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅ−Ｓ−ＴＡＭＲＡ
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の構造を有する化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物の縮合反応を含む反応産物であって、前記縮合反応が、（１）複数の請求項１に記載の化合物であって、アルキン基とアジド基の両方を有する複数の化合物から、（２）一対の請求項１に記載の化合物であって、第１の化合物がアルキン基を有し、第２の化合物がアジド基を有する一対の化合物から、またはこれらを組み合わせたものから行われるものであり、前記縮合反応は、アルキン基とアジド基の間の１，３ヒュスゲン双極性環状付加反応を介して行われるものである反応産物。
【請求項３】
複数のＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの間の縮合反応を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＡａｋとＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＴＡＭＲＡの間の縮合反応を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
伸長した反復ＲＮＡ配列ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐまたはｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐに結合している請求項２に記載の反応産物を含む組成物。
【請求項６】
前記伸長した反復ＲＮＡ配列がｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記伸長した反復ＲＮＡ配列がｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
請求項２に記載の反応産物を製造する方法であって、伸長した反復ＲＮＡ配列ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐまたはｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐを有する生細胞を、（１）複数の請求項１に記載の化合物、（２）一対の請求項１に記載の化合物、またはこれらを組み合わせたものと接触させることであって、請求項１に記載の前記化合物が、伸長した反復ＲＮＡ配列ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐまたはｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐに結合し、アルキン基とアジド基の間の１，３ヒュスゲン双極性環状付加反応を介して反応産物を形成するように接触させることを含む、前記方法。
【請求項９】
請求項４に記載の反応産物の形成をモニタリングする方法であって、伸長した反復ＲＮＡ配列ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐまたはｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐをＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＡａｋおよびＮ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＴＡＭＲＡと接触させ、ＦＲＥＴの変化を測定することを含み、ここで、請求項４に記載の反応産物が形成した時にＦＲＥＴの変化が生じる、前記方法。
【請求項１０】
前記伸長した反復ＲＮＡ配列がｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記伸長した反復ＲＮＡ配列がｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
（１）請求項１に記載の化合物の複数において、アルキン基とアジド基の両方を有する場合は、該複数の化合物を、（２）請求項１に記載の化合物の一対において、第１の化合物がアルキン基を有し、第２の化合物がアジド基を有する場合は、該一対の化合物を、またはこれらを組み合わせたものを含む、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を治療するための医薬。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬であって、前記複数の化合物または一対の化合物は、伸長した反復ＲＮＡ配列ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐに結合し、該結合した時にアルキン基とアジド基との間の１，３ヒュスゲン双極性環状付加反応を介して反応し、縮合産物を形成する医薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
用いられている用語および表現は、記述の用語として使用されており、制限の用語として使用されているものではなく、そのような用語および表現の使用には、示され記載される特徴またはその一部分の等価物を排除する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な変更が可能であることが理解される。従って、本発明は好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の変更および改変が当業者によってなされてよく、そのような変更および改変は添付される特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内にあるとみなされることは当然理解される。
一態様において、本発明は以下のものを提供する。
［項目１］
毒性のある疾患誘導性ＲＮＡの機能のモジュレーターであって、前記ＲＮＡが伸長したリピート配列を含み、前記モジュレーターが、一つの細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、アルキンとアジドの両方の部分を含む、細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールの縮合反応から、または、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、第１のモジュールがアルキン部分を含み、第２のモジュールがアジド部分を含む、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールの縮合から、生細胞内でインサイチュで形成されるＲＮＡに結合するオリゴマーであり、前記縮合反応が、前記ＲＮＡ伸長リピート結合モジュール間で前記アルキン部分とアジド部分との間の１，３ヒュスゲン双極子付加環化反応によって起こる、ＲＮＡに結合するオリゴマーを含む、モジュレーター。
［項目２］
前記毒性のあるＲＮＡが、ＲＮＡ伸長リピート配列ｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐによって形成される隣接する内部ループを含む、項目１に記載のモジュレーター。
［項目３］
各々の細胞透過性モジュールが、修飾されたカナマイシン部分を含む、項目２に記載のモジュレーター。
［項目４］
前記細胞透過性モジュールがＮ３−Ｋ−Ａｋ、またはＮ３−Ｋ−ＡａＫであるか、あるいは、一緒に使用される一対の細胞透過性モジュールがＮ３−ＫとＫ−Ａｋである、項目３に記載のモジュレーター。
［項目５］
筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）の処置のための項目２〜４のいずれか１項に記載のモジュレーター。
［項目６］
前記毒性のあるＲＮＡと結合した項目２に記載のモジュレーターを形成する方法であって、一つの細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、前記細胞透過性モジュールがアルキン部分とアジド部分の両方を含む、細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールに、または、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、第１のモジュールがアルキン部分を含み、第２のモジュールがアジド部分を含む、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールに、前記毒性のあるＲＮＡを含む前記生細胞を曝露する工程を含む、方法。
［項目１０］
前記毒性のあるＲＮＡが、ＲＮＡ伸長リピート配列ｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐによって形成される隣接する内部ループを含む、項目１に記載のモジュレーター。
［項目１１］
各々の細胞透過性モジュールが、ビス−ヘテロアリール部分、好ましくはビス−ベンズイミダゾール部分を含む、項目１０に記載のモジュレーター。
［項目１２］
前記細胞透過性モジュールが、Ｎ３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋである、項目１１に記載のモジュレーター。
［項目１３］
筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の処置のための、項目１０〜１２のいずれか一項に記載のモジュレーター。
［項目１４］
前記毒性のあるＲＮＡと結合した項目１１に記載のモジュレーターを形成する方法であって、一つの細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、前記細胞透過性モジュールがアルキン部分とアジド部分の両方を含む、細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールに、または、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、第１のモジュールがアルキン部分を含み、第２のモジュールがアジド部分を含む、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールに、前記毒性のあるＲＮＡを含む前記生細胞を曝露する工程を含む、方法。
［項目１５］
毒性のある疾患誘導性ＲＮＡを切断する方法であって、前記ＲＮＡが伸長リピート配列を含み、前記モジュレーターが、核酸切断部分をさらに含む、項目１〜４または１０〜１２のいずれか１項に記載のモジュレーターを含む、方法。
［項目１６］
前記核酸切断部分がブレオマイシンの誘導体である、項目１５に記載の方法。
［項目１７］
患者において疾患を処置する方法であって、前記疾患が伸長リピート配列を有する毒性のあるＲＮＡの存在下で誘導され、前記患者の細胞の中に項目１に記載のモジュレーターを形成することを含む、方法。
［項目１８］
前記疾患が筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）であり、前記毒性のあるＲＮＡがｒ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐ伸長リピート配列を含み、前記モジュレーターが、アルキンおよびアジド基を有するカナマイシン誘導体を含む細胞透過性モジュール、または、各々がカナマイシン誘導体を含む第１および第２のモジュールであって、アルキン基を有する第１のモジュール、およびアジド基を有する第２のモジュールを含む一対の細胞透過性モジュールからインサイチュで形成される、項目１７に記載の方法。
［項目１９］
前記疾患が筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、前記毒性のあるＲＮＡがまたはｒ（ＣＵＧ）ｅｘｐ伸長リピート配列を含み、前記モジュレーターが、アルキンおよびアジド基を有する１つの細胞透過性モジュール、または、各々がビス−ベンズイミダゾール誘導体を含む第１および第２のモジュールであって、アルキン基を有する第１のモジュール、およびアジド基を有する第２のモジュールを含む一対の細胞透過性モジュールからインサイチュで形成される、項目１７に記載の方法。
［項目２０］
前記モジュレーターが核酸切断部分をさらに含む、項目１８または１９に記載の方法。
【外国語明細書】
2019068831000001.pdf