(57)【要約】      （修正有）【課題】サンプルにおける分析物の活性型の検出および／またはこれらの分析物の活性部位に対する、試験物質の結合能の決定のための方法の提供。【解決手段】以下のステップを包含する方法：ａ）サンプルからの分析物が、固体担体の表面に対して、上記分析物の表面官能基および上記固体担体における対応する官能基の非特異的な非共有結合性の吸着または共有結合によって不動化され；ｂ）上記分析物が、その活性部位に対する選択的な結合のための化合物を介して上記分析物に選択的に結合する検出プローブとともにインキュベートされ；ｃ）上記固体担体が洗浄されて、未結合の検出プローブを除去し；ｄ）結合している検出プローブの量が決定される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおける活性型の分析物の検出のための方法であって、
以下のステップ：
ａ）上記サンプルからの分析物または複数の分析物の集合が、固体担体の表面に対して、上記分析物の表面官能基および上記固体担体における対応する官能基の、非特異的な非共有結合性の吸着または共有結合によって、不動化されるか、または
上記分析物または複数の分析物の集合の不動化の前に上記固体担体の表面に結合されておりかつ上記サンプルとの上記固体担体のインキュベーションの間に上記サンプルに含まれている上記分析物または複数の分析物の集合を選択的に結合可能である結合分子を介して、上記サンプルからの分析物または複数の分析物の集合が固体担体の表面に対して不動化される；
ｂ）分析物または複数の分析物の集合が、上記分析物の活性部位に選択的に結合するための化合物を介して上記分析物または複数の分析物の集合を選択的に結合する検出プローブとインキュベーションされ；
ｃ）それから、上記固体担体が洗浄されて、未結合の検出プローブを除去し；
ｄ）続いて、結合している検出プローブの量が、上記固体担体において直接に、決定される
を包含しており、
ステップｂ）において、上記検出プローブは、
上記分析物の活性部位に選択的に結合するための、２５００Ｄａ以下の分子量を有している低分子化合物；
共有結合されている蛍光団、ビオチンもしくは化学基を任意に有している、オリゴヌクレオチドタグ、ならびに
上記分析物の活性部位に選択的に結合するための上記化合物および上記オリゴヌクレオチドタグを共有結合的に連結している、化学リンカー
からなり、
ステップｄ）において、上記量は、上記サンプルにおける上記分析物または複数の分析物の集合の量と比例している、ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
固体担体と上記検出プローブをインキュベートするステップｂ）、または固体担体と上記サンプルをインキュベートするステップａ）において、イオン性の界面活性剤、非イオン性の界面活性剤、カゼインおよびそれから調製されているカゼインブロッキング剤、血清アルブミン、ＤＮＡ、ならびに免疫グロブリンからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤が、インキュベートされる溶液に加えられている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記分析物または複数の分析物の集合を含んでいる上記サンプルが、ステップｂ）にしたがって上記検出プローブとまずインキュベートされ、それからステップａ）にしたがう不動化が実施され、続いて、ステップｃ）およびｄ）実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記分析物が、
・酵素または複数の酵素の集合：ここで、上記活性部位に選択的に結合するための上記化合物は、当該酵素または複数の酵素の集合の選択的な阻害剤である
・受容体または複数の受容体の集合：ここで、上記活性部位に選択的に結合するための上記化合物が、当該受容体または複数の受容体の集合のアゴニストまたはアンタゴニスト
・トランスポータまたは複数のトランスポータの集合：ここで、上記活性部位に選択的に結合するための上記化合物が、輸送される分子の結合部位において、当該トランスポータまたは複数のトランスポータの集合を選択的に結合可能な物質である
からなる群から選択され、
上記オリゴヌクレオチドタグが、当該オリゴヌクレオチドタグの一方または両方の鎖に対して化学リンカーを介して共有結合されている蛍光団、ビオチンおよび反応性化学基からなる群から選択される修飾基を任意に有している、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記検出プローブが、上記オリゴヌクレオチドタグの異なる位置に化学リンカーを介して共有結合的に個々に連結されている、上記分析物の上記活性部位に選択的に結合するための同じ分子の２つ以上の分子を含んでいる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
検出が、結合されているビオチンを有している４つのプローブ分子からなる検出プローブ、ならびに蛍光団または酵素が任意に共有結合されているアビジン、ニュートラアビジンまたはストレプトアビジンの複合物を用いて、実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
結合している検出プローブの上記量が、定量的なポリメーラゼ連鎖反応によって、蛍光によって、または結合した酵素反応を介して分光光度的もしくは化学発光的に、決定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記サンプルからの上記分析物を選択的に結合可能な上記結合分子が、抗体もしくはその断片、抗体を模倣するタンパク質分子（例えば、アフィボディ、アンチカリンまたはＤＡＲＰｉｎ）、ならびにレクチン、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、オリゴペプチド、およびキレート剤からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）において、上記固体担体に対して不動化されている結合分子に対する、上記分析物または複数の分析物の集合の選択的な結合が、当該分析物または複数の分析物の集合に共有結合されているハプテン、ビオチン、ユニバーサルエピトープ、アフィニティタグまたは精製タグを介して実施される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記サンプルが、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、細菌溶解物、酵母溶解物、組織溶解物もしくは細胞溶解物、細菌、酵母、もしくは細胞の条件培養培地、滑液、羊水、腹水、胸膜液、囲心腔液、糞便抽出物、唾液、汗、および精漿からなる群から選択される、干渉する抗体を任意に含んでいる複合的な生物学的マトリクスである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記分析物が、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩとして知られているヒト前立腺特異膜抗原であり、選択的な結合のための上記化合物が、ヒト前立腺特異膜抗原の阻害剤であるか；または上記分析物が、ヒトグルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩＩであり、選択的な結合のための上記化合物が、ヒトグルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩＩの阻害剤である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
上記分析物が、ヒト前立腺特異膜抗原であり、結合のための上記化合物が、ヒト前立腺特異膜抗原の選択的な阻害剤である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記分析物が、ヒト炭酸脱水酵素ＩＸであり、選択的な結合のための上記化合物が、炭酸脱水酵素ＩＸの阻害剤であるか；または上記分析物が、ヒト炭酸脱水酵素ＸＩＩであり、選択的な結合のための上記化合物が、炭酸脱水酵素ＸＩＩの阻害剤である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
上記分析物が、インフルエンザノイラミニダーゼであり、選択的な結合のための上記化合物が、インフルエンザノイラミニダーゼの阻害剤である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
上記分析物が、ヒト繊維芽細胞活性化タンパク質であり、選択的な結合のための上記化合物が、ヒト繊維芽細胞活性化タンパク質の阻害剤であるか；または上記分析物が、ＣＤ２６としても知られるヒトジペプチジルペプチダーゼ４であり、選択的な結合のための上記化合物が、ヒトジペプチジルペプチダーゼ４の阻害剤である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、サンプルにおける分析物の活性型の検出するため、およびこれらの分析物の活性部位に結合する、試験物質の能力を決定するための方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
この技術上の解決策は、分析物（好ましくはタンパク質）の活性型の高感度な定量、およびこれらの分析物の活性部位に結合する、試験物質の能力の決定をもたらす。したがって、これらの両方の課題を解決するため現状のアプローチが、以下に要約される。
【０００３】
生物学的なサンプルにおけるタンパク質（抗原）の高感度および特異的な検出のための今日の標準は、いわゆる「酵素結合免疫吸着検定法」（略語：ＥＬＩＺＡ）、およびある程度まで「ウェスタンブロット」（略語ＷＢ）である。両方の方法は、所定の抗原を選択的に結合する（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体を調製することの見込みを利用し、サンプルにおける抗原の量に比例する、結合されている抗体の量が、測定可能なシグナルに変換される。当該抗体の調製は、過去２０年においてまったく通常の方法および商業的に利用可能な方法になっている。
【０００４】
今日のインビトロ診断の、最も多用途な、広く用いられている方法は、第１の抗体が、固体担体に不動化され、それから、生物学的サンプルに含まれている抗原が、上記抗体に結合され、洗浄後に、第２の検出抗体が、当該抗原に結合される（両方の抗体は、同じ抗原における異なるエピトープを認識する必要がある）、いわゆる「サンドイッチＥＬＩＺＡ」である。上記検出抗体は、酵素と複合されており、繰り返される洗浄および基質の添加の後に、例えば、サンプルにおける抗原の量に比例している量の、着色された発光生成物が、生成される（酵素および基質の選択に応じて）。いくつかのＥＬＩＳＡの変形（例えば、蛍光団または放射性核種が酵素の代わりに検出抗体と複合されている）がある。
【０００５】
例えば、前立腺特異抗原（略語：ＰＳＡ）は、「超高感度な」サンドイッチＥＬＩＳＡ（Abotto Diagnostics）を用いて０．００８ｎｇ／ｍｌの濃度の血清において検出され得る。血清中のＰＳＡの定量は、男性の集団の、前立腺がんについてのスクリーニング、および特に患者の処置に対する応答をモニターするために、現在、日常的に使用されている（Catalona et al. 1991, N Engl J Med, p. 1156; Stamey et al. 1987, N Engl J Med, p. 909）。前立腺がんの唯一の決定的な処置は、前立腺の摘出であり；この行為の後に、ＰＳＡは血液から消失する。外科手術がすべての腫瘍組織を摘出することに失敗していれば、しばらくの後にＰＳＡの濃度は、ふたたび検出限界まで上昇する。外科手術後の数か月から数年にわたって、ＰＳＡレベルは、今日の方法の検出限界をしたまわっている；したがって、より高感度な方法は、既存の方法よりはるかに早く正確な予後を決定し得る（Lepor et al. 2012, Bju International, p. 1770）。
【０００６】
ＥＬＩＳＡを用いた非常に高感度な試験は、いわゆる血中の干渉する異好性の抗体の存在によって一般的に制限される。これらは、サンドイッチ抗体を認識し得、抗原の存在なしにそれらに結合し、ＰＳＡの定量化のような確立されている方法においてさえ偽陽性の結果を導く（Henry et al. 2009, Nature Clinical Practice Urology, p. 164; Preissner et al. 2005, Clinical Chemistry, p. 208）。したがって、そのような抗体の少なくとも部分的な除去に達するには、市販の製品が使用される（Scantibodies）血液の処理において付加的なステップを含めることが、いくらか必要である（de Jager et al. 2005, J. Immunol Methods, p. 124）。また、干渉の程度を測定するためにコントロールを含めることが適切である（Bjerner et al. 2005, Clinical Chemistry, p. 9）。ＰＳＭＡ測定のための市販のキットは、普通、干渉する抗体の作用を回避することを補助するブロッキング剤を含んでいるか；または２つのサンドイッチ抗体が、同じ生物に由来しないが、完全に信頼できる結果は、保証されていない（(Loeb et al. 2009; Preissner et al. 2005, see above）。
【０００７】
特に上述したＰＳＡの決定のために、今日のＥＬＩＳＡ法の感度をさらに向上させることが所望されている。前立腺組織におけるＰＳＡの高発現のために、特に疾患の初期段階には、ＰＳＡの濃度より相当に低い濃度において、多くの腫瘍マーカーが血中にあると予想され得る。さらに、ＰＳＡに対する抗体と同程度の感度の抗体が、所定の抗原に対してい利用可能でない場合、ＥＬＩＳＡの感度は大きく低下する。一般的に、より高感度な検出は、ウイルス性疾患（ＨＩＶ）の早期検出または特定の細菌感染（ライム病）の信頼できる診断のためにも、有益である。
【０００８】
２桁の大きさ以上に感度を向上させ、かつ簡単なＥＬＩＳＡの構成を維持することは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（すなわち定量的ＰＣＲ（略してｑＰＣＲ））によって後に定量されるオリゴヌクレオチドを用いて、検出抗体を複合させることによって一般に達成され得る。デオキシリボ核酸（以下ではＤＮＡ）は、ユニバーサルな免疫ＰＣＲ（略語：ｉＰＣＲ）と呼ばれる方法に使用される、ビオチンの、ストレプトアビジンとの非共有的な相互作用（Ruzicka et al. 1993, Science, p. 698; Zhou et al. 1993, Nucleic Acids Research, p. 6038; EP 2189539）、または直接ｉＰＣＲと呼ばれる方法に使用される市販の化学試薬によって形成される共有結合（Hendrickson et al. 1995, NucleicAcids Research, p. 522; EP 0544212; EP 0625211）によって、上記抗体と複合され得
る。しかし、研究室条件におけるｉＰＣＲの高い感度にもかかわらず、匹敵する感度は、臨床的な実務に使用されるときに期待され得ない。ｉＰＣＲ（サンドイッチＥＬＩＳＡのような）は、生物学的マトリクス（特に血清および血漿）における干渉する抗体の存在によって引き起こされる誤った結果を生じる傾向にあるからである。したがって、生物学的マトリクスにおける決定のために制限なしに適用可能な超高感度法は、依然として必要とされている。
【０００９】
酵素阻害剤についての、これまで使用されている高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）アッセイは、基質／生成物、または試験物質による活性部位プローブの置換の定量にほとんど基づいている（Inglese et al. 2007, Nature Chemical Biology, p. 466）。アッセイの第１の型は、マラカイトグリーンおよびリン酸の反応に由来する着色された生成物の吸収測定であり、当該リン酸は、ホスホリラーゼの反応によって遊離される（Gad et al. 2014, Nature, p. 215）。最も多用途なアッセイは、活性部位プローブを利用し、試験物質による活性部位からのそれらの置換を検出する。これらのアッセイにおける典型的な読み出しは、蛍光発光または蛍光偏光であり、測定される特性は、プローブの結合状態および未結合状態の間において異なり、これらの２つの状態を識別可能にしている（Inglese et al. 2007, Nature Chemical Biology, p. 466）。これらのアッセイの汎用性にもかかわらず、それらは、多量のプローブおよび酵素の使用を必要とする低感度な検出に困る（Alquicer et al. 2012, J Biomol Screen, p. 1030）。したがって、これらのアッセイは、より弱い阻害剤が、そのＫｄを大きく超える濃度において使用されるプローブを置き換えることができないので、偽陰性の結果を多く生じる傾向にあり得る。例えば、プローブの作用濃度が、そのＫｄを超えて２０倍であり、かつ陽性の結果が、蛍光偏光における５０％減衰の後に記録されるなら、５０ｎｍｏｌ−１に満たないＫｉを有している阻害剤のみが、１μｍｏｌ−１の試験物質が使用される場合に検出される。さらに、バックグラウンドに対するシグナルの比は、典型的に１桁以下であり、したがって、試験物質の結合についての定性的な情報のみが得られる（Inglese et al. 2007, Nature Chemical Biology, p. 466; Gad et al. 2014, Nature, p. 215）。これらのアッセイのさらなる問題は、蛍光発光または着色された物質を、それらがアッセイの読み出しに干渉するために、正確に選別できないことである。
【００１０】
前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ、ＧＣＰＩＩとしても知られている）、および炭酸脱水酵素ＩＸはいずれも、酵素であり、それらの定量のための正確かつ高感度な生物分析的方法の欠如によって制限されている診断マーカーおよび予後マーカーとして見込まれる用途を有している特定の種類のがんのマーカーであると知られている（Barve et al. 2014, Journal of Controlled Release, p. 118; Hyrsl et al. 2009, Neoplasma, p. 298）。また、両方のタンパク質は、薬剤開発活動の標的である。両方のタンパク質の小分子阻害剤に複合されている毒素からなる薬剤は、有望な結果をともなって、臨床試験および前臨床試験の評価中である（Haberkorn et al. 2015, Ann Oncol 26, p. ii33; Krall et al. 2014, Angewandte Chemie-International Edition, p. 4231）。
さらに、ＧＣＰＩＩの阻害剤は、いくつかの神経疾患の動物モデルにおいて有益であり（Barinka et al. 2012, Current Medicinal Chemistry, p. 856）、ＣＡ−ＩＸの阻害は、いくつかの動物モデルにおける腫瘍成長に対する抑制作用を有している（Lock et al. 2013, Oncogene, p. 5210）。有望な結果にもかかわらず、両方のタンパク質にとってのより良好な阻害剤は、既知の化合物がいくつかの重大な副作用を示すので、依然として必要とされている。より詳細には、現状のＧＣＲＩＩ阻害剤は、多価に帯電しており、目的とされる標的器官に達するための血液脳関門を効率的に通過できず、既知のＣＡ−ＸＩ阻害剤は、不都合な薬理特性を有しているスルホンアミドである（Supuran 2008, Nature Reviews Drug Discovery, p. 168）。これらの酵素を阻害する新規な骨格の発見は、正確なスクリーニング法の非存在によって強く制限されており、阻害剤のＧＣＰＩＩ  ＨＴＳにとっての唯一の開発されているアッセイは、低い感度を有しており（Alquicer et al. 2012, J Biomol Screen, p. 1030）、ＣＡ−ＩＸにっとて利用可能な阻害剤のＨＴＳはない。本発明に基づいて、われわれは、複合的な生物マトリクスにおける両方の酵素の定量にとってこれまでで最も高感度なアッセイ、および両方の酵素の阻害剤の高感度かつ正確なスクリーニングにとって初めてのアッセイを開発し得た。
【００１１】
〔発明の開示〕
本発明は、分析物の活性型を検出するため、および／または分析物の活性部位に対して結合する、試験物質の能力を決定するための方法を提供する。上記分析物は、好ましくは結合分子を介して選択的に、固体担体に不動化されており；検出プローブは上記分析物に選択的に結合されている。上記検出プローブは、上記分析物の活性部位（リガンド部分）に選択的に結合するための化合物、およびポリメラーゼ連鎖反応のためのＤＮＡ鋳型（オリゴヌクレオチドタグ）からなり、当該化合物は、好ましくは２５００Ｄａ未満、より好ましくは１０００Ｄａ未満の分子量であり、当該化合物およびＤＮＡ鋳型は化学リンカーによって共有結合されている。未結合のプローブを洗い流した後に、結合されているプローブの量が、決定され、不動化されている分析物の量に正比例し、好ましくは上記決定は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲｔ）におけるオリゴヌクレオチドタグの検出によって実施される。また、上記プローブは、上記分析物またはそのような物質の混合物の活性部位にとよく結合している、試験物質の存在下において不動化されている分析物とインキュベートされ得る。試験物質または試験物質の混合物の、上記分析物の上記活性部位に対して結合する能力は、上記インキュベーション後の結合されている検出プローブの量を、試験物質もしくは試験物質の混合物の存在および非存在において、比較することによって決定される。
【００１２】
本発明は、したがって、サンプルにおける分析物の活性型を検出するため、および／またはこれらの分析物の活性部位に結合する、試験物質の能力を決定するための方法を提供する。当該方法は、以下のステップを包含している。
ａ）サンプルからの分析物または分析物の集合が、固体担体の表面に対して、上記分析物の表面官能基および上記固体担体における対応する官能基の非特異的な非共有結合性の吸着または共有結合によって、不動化される；
ｂ）上記分析物または分析物の集合が、上記分析物の活性部位に選択的に結合するための化合物を介して上記分析物または複数の分析物の集合を選択的に結合する検出プローブとインキュベーションされ、任意に、当該インキュベーションは、上記活性部位に結合する能力が試験される、種々の濃度の試験物質、または当該物質の混合物の存在下において実施され；
ｃ）それから、上記固体担体が洗浄されて、未結合の検出プローブを除去し；
ｄ）結合している検出プローブの量が、上記固体担体において直接または遊離後に、決定される。
ステップａ）において、上記吸着または共有結合は、好ましくは、上記分析物または複数の分析物の集合の不動化の前に上記固体担体の表面に結合されており、かつ上記サンプルとの上記固体担体のインキュベーションの間に上記サンプルに含まれている上記分析物または複数の分析物の集合を選択的に結合可能な、分子を介している。
【００１３】
ステップｂ）において、上記検出プローブは、
上記分析物の活性部位に選択的に結合するための、２５００Ｄａ以下の分子量を有している低分子化合物；
共有結合されている蛍光団、ビオチンもしくは化学基を任意に有している、オリゴヌクレオチドタグ、ならびに
上記分析物の活性部位に選択的に結合するための上記化合物および上記オリゴヌクレオチドタグを共有結合的に連結している、化学リンカー
からなる。
ステップｃ）において、上記量は、上記サンプルに上記分析物または複数の分析物の集合の量と比例している。
好ましくは、上記検出プローブを固体担体とインキュベートするステップｂ）または上記サンプルを固体担体とインキュベートするステップａ）において、イオン性の界面活性剤、非イオン性の界面活性剤、カゼインおよびそれから調製されているカゼインブロッキング剤、血清アルブミン、ＤＮＡ、ならびに免疫グロブリンからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤が、インキュベートされる溶液に加えられる。
【００１４】
サンプルにおける分析物の活性型を検出するため、およびこれらの分析物の活性部位に結合する、試験物質の能力を決定するための、本明細書に開示されている方法の好ましい実施形態において、ステップａ）を実施する前に、上記分析物または分析物の集合を含んでいる試験されるサンプルのインキュベーションは、ステップｂ）に係る検出プローブとまずインキュベートされ、ステップａ）の後に、ステップｃ）およびステップｄ）が実施される。
【００１５】
本明細書に記載の方法の他の好ましい実施形態において、上記ステップは、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）の順に実施される。
【００１６】
本発明に係る好ましい実施形態において、上記分析物は、酵素または複数の酵素の集合、ここで、上記活性部位に選択的に結合するための上記化合物は、当該記酵素または複数の酵素の集合の選択的な阻害剤であり；受容体または複数の受容体の集合、ここで、上記活性部位に選択的に結合するための上記化合物は、当該受容体または複数の受容体の選択的なアゴニストまたはアンタゴニストであり；ならびにトランスポータまたは複数のトランスポータの集合、ここで、上記活性部位に選択的に結合するための上記化合物は、輸送される分子にとっての結合部位において当該トランスポータまたは複数のトランスポータの集合、当該トランスポータまたは複数のトランスポータの集合に選択的に結合可能な物質である、からなる群から選択される。
【００１７】
好ましくは、上記オリゴヌクレオチドタグは、当該オリゴヌクレオチドタグの一方または両方の鎖の規定の部位に対して付加的な化学リンカーを介して共有結合されている、蛍光団、ビオチンまたは化学反応基からなる群から選択される１つ以上の修飾基を任意に有している、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである。
【００１８】
上記分析物の上記活性部位に潜在的に結合する物質は、上記試験物質である。
【００１９】
一実施形態において、上記検出プローブは、上記分析物の上記活性部位に選択的に結合するための同じ化合物の２つ以上を含んでおり、当該化合物のそれぞれは個々に、オリゴヌクレオチドタグの異なる位置に化学リンカーを介して共有結合されている。
【００２０】
結合されているビオチンを有している上記プローブの４つの分子、および蛍光団または酵素が任意に共有結合されている（図２Ｄを参照）アビジン、ニュートラアビジンもしくはストレプトアビジンからなる上述のような検出プローブの複合物は、上記検出のために使用され得る。
【００２１】
本発明の方法に係る好ましい他の実施形態において、結合されている検出プローブの上記量は、定量的なポリメーラゼ連鎖反応によって、蛍光によって、または結合した酵素反応を介して分光光度的もしくは化学発光的に、決定される。
【００２２】
本発明に係る方法の好ましい実施形態において、上記サンプルにおける上記分析物に選択的に結合可能な上記結合分子は、抗体およびその断片、抗体を模倣するタンパク質分子（例えば、アフィボディ、アンチカリンまたはＤＡＲＰｉｎ）、ならびにレクチン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、オリゴペプチド、およびキレート剤からなる群から選択される。
【００２３】
本発明に係る方法の好ましい他の実施形態において、ステップａ）において、上記固体担体に不動化されている結合分子に対する、上記分析物または複数の分析物の集合の選択的な結合は、上記分析物または複数の分析物の集合に共有結合されているハプテン、ビオチン、ユニバーサルエピトープまたはアフィニティタグもしくは精製タグによって媒介されている。
【００２４】
本発明に係る方法の好ましい他の実施形態において、血液、血漿、血清、脳髄液、尿、細菌溶解物、酵母溶解物、組織溶解物もしくは細胞溶解物、細菌、酵母、もしくは細胞の条件培養培地、滑液、羊水、腹水、胸膜液、囲心腔液、糞便抽出物、唾液、汗、および精漿からなる群から選択される、干渉する抗体を任意に含んでいる、複合的な生物学的マトリクスが、サンプルとして使用され得る。
【００２５】
好ましい実施形態において、上記試験物質または当該物質の混合物の、上記分析物の上記活性部位に結合する能力は、試験物質なしのインキュベーション後、および当該試験物質とのインキュベーション後における結合されている検出プローブの量における差異から決定される。
【００２６】
より好ましくは、上記分析物の上記活性部位に結合する、上記試験物質の能力は、試験物質なしのインキュベーション後および単一の濃度の試験物質とのインキュベーション後における、結合されている検出プローブの差異から、結合定数（分析物の上記活性部位への上記物質の結合について）の値として決定される。
【００２７】
本発明に係る方法の好ましい他の実施形態において、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩとしても知られるヒト前立腺特異膜抗原が、上記分析物として使用され、ヒト前立腺特異膜抗原の阻害剤が、選択的に結合するための化合物として使用されるか；またはヒトグルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩＩが分析物として使用され、ヒトグルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩＩの阻害剤が選択的に結合するための化合物として使用されるか；またはヒト炭酸脱水素酵素ＩＸが分析物として使用され、ヒト炭酸脱水素酵素ＸＩＩが選択的に結合するための化合物として使用されるか；またはヒト炭酸脱水素酵素ＸＩＩが分析物として使用され、ヒト炭酸脱水素酵素ＩＸが選択的に結合するための化合物として使用されるか；またはヒトインフルエンザノイラミニダーゼが分析物として使用され、ヒトインフルエンザノイラミニダーゼの阻害剤が選択的に結合する化合物として使用されるか；またはヒト繊維芽細胞活性化タンパク質が分析物として使用され、ヒト繊維芽細胞活性化タンパク質の阻害剤が選択的に結合される化合物として使用されるか；またはＣＤ２６としても知られるヒトジぺプジルペプチダーゼ４が分析物として使用され、ヒトジぺプジルペプチダーゼ４の阻害剤が選択的に結合するための化合物として使用される。
【００２８】
決定する上述の方法は、上記分析物を選択的に結合可能な結合分子が、選択された種類の上記固体担体に不動化されるように、典型的に進行し、ここで、上記分析物は、好ましくは酵素、受容体またはトランスポータであり得る。一般に、上記結合分子の不動化の後に、上記固体担体の表面は、非特異的な吸着を抑制するための剤をによってブロッキングされる。したがって、上記固体担体は、上記不動化されている結合分子に選択的に結合されている上記分析物を含んでいるサンプルとインキュベートされ、ここで、当該サンプルは、典型的に、上記分析物を本来的に含んでいる複合的な生物学的マトリクスである。上記分析物が結合されている上記不動化されている結合分子を有している上記固体担体は、それから上記分析物の上記活性部位への、上記プローブの上記リガンド部分の選択的な結合のための上記検出プローブとインキュベートされ、結合されている検出プローブの量は、洗浄後に、好ましくはｑＰＣＲによって、定量化される。複合的なサンプルの使用は、上記結合分子に対する上記分析物の結合の選択性によって可能にされており、当該選択性は、非選択的な不動化と違い、上記混合物の微量成分の場合においてさえ効率的な結合を可能にする。また、上記サンプルは、組換え発現によって調製されている分析物を有している溶液であり得る。そのような分析物（天然に生じる分析物と対照的に）は、不動化されている結合分子によって選択的に結合される、人工的に導入されているユニバーサルエピトープを含み得る。当該ユニバーサルエピトープはこの場合に特に選択されている。
【００２９】
他の実施形態において、内因性の、または組換え的に調製された精製された分析物が、使用され、上記分析物を結合可能な結合分子の代わりに、選択された種類の上記固体担体の表面に直接（非選択的）に不動化される。この構成は、上記分析物を選択的に結合する結合分子（いくつかの分析物には利用し難いか、または高価過ぎることがある）を必要としないので、上記分析物の上記活性部位に結合する、上記試験物質の能力を試験することにとって、特に有用である。上記分析物が、上記固体担体の表面い直接に不動化されている場合、当該表面は、典型的に、非特異的な吸着を抑制する剤を用いて続いてブロッキングされ、それから、上記固体担体は、上記分析物の上記活性部位に選択的に結合するための上記検出プローブとインキュベートされる。上記結合されたプローブの量は、未結合のプローブを洗い流した後に、好ましくはｑＰＣＲによって、決定される。
【００３０】
本発明の一局面において、上記リガンド部分を構成している上記化合物が、酵素もしくは複数の酵素の集合の、阻害剤、トランスポータもしくは複数のトランスポータの集合の、アンタゴニストおよびそれらの輸送される物質、受容体もしくは複数の受容体の集合の、アゴニスト、共アゴニスト、アンタゴニストまたはブロッカーを包含している群から好ましく選択され；そのとき、分析物は、酵素、複数の酵素の集合、トランスポータ、複数のトランスポータの集合、受容体、または複数の受容体の集合からなる群から選択される。上記分析物を選択的に結合するための上記化合物は、有機物の特性を有しており、２５００Ｄａ以下、より好ましくは１０００Ｄａ以下の総分子量を有している。
【００３１】
複数の分析物（複数の酵素、複数の受容体または複数のトランスポータ）の所定の集合に選択的に結合するための化合物の使用は、集合の構成要素間における選択性が、不動化されている結合分子によって十分に確保されているので、多数の異なるタンパク質が単一の検出プローブを用いて定量化され得る分析物の定量化にとって好ましい。さらに、当該使用は、目的の対象物および見込まれる第２の対象物の両方に選択的に結合することを試験することが可能であると証明されたので、上記分析物の上記活性部位に結合する、試験物質の能力を測定することにとって、等しく好ましい。最後に、未結合のプローブが洗い流された後に、結合されているプローブの量が決定される。
【００３２】
本発明の他の局面において、ｑＰＣＲは、不動化されているオリゴヌクレオチドタグ、およびしたがって結合されている検出プローブの検出および定量化に使用され、上記決定の感度を非常に向上させる。例えば、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ抗原、ＰＳＡと区別されている）の検出について、数十アトグラム（数十のタンパク質分子に等しい）の感度が実現された。これは、現状のＰＳＭＡ検出法よりおよそ百万倍小さい。他の抗原の検出の、そのような感度は、導入部にすでに述べたＰＳＡを用いた根治的な前立腺摘除術の後における、特定のがんの早期の検出（例えば、前立腺がんの進行を決定すること）を可能にし得る。また、１つの混合物における複数のヌクレオチド鋳型の平行する決定は、標準的かつ一般的な方法であるので、ｑＰＣＲを用いることは、複数の分析物の、同時並行の決定を可能にする。ｑＰＣＲを用いることの主な他の利点は、分析物の濃度を決定する大きなダイナミックレンジに表れている。いくつかの分析物の検出について、もとのサンプルにおける分析物の濃度における差の、６〜７桁（ＥＬＩＳＡアッセイの場合より３〜４桁大きい）大きくなる。分析物の量が検出の範囲外であった臨床サンプルの、再評価の回数を減少させるので、一般的に使用されている従来のＥＬＩＳＡと比べて数桁の範囲の拡大は、財務費用を低減させる。
【００３３】
記載されている決定方法の感度の主な制限は、固体担体の表面に対する非特異的な吸着である。本発明の他の局面は、検出プローブの非特異的な吸着が一本鎖オリゴヌクレオチドタグを二本鎖タグと置き換えることによって好ましく抑制されることである。本発明のさらなる他の局面は、非特異的なバックグラウンドからより大きく離れたシグナルが、サンプルおよび特に検出プローブを、非特異的な吸着を抑制する種々のブロッキング剤を含んでいる溶液において希釈することによって実現され得ることである。そのような剤は、好ましくは、非イオン性の界面活性剤、イオン性の界面活性剤、アルブミン、およびカゼイン調製物である。
【００３４】
本発明の他の局面において、上記分析物の上記活性部位に対する上記検出プローブの選択的な結合は、当該分析物の当該活性部位に結合する、試験物質の能力を測定することに使用される。この構成において、上記検出プローブは、上記分析物とともに、試験物質または試験される複数の物質の集合の存在下においてインキュベートされる。上記試験物質が上記分析物の上記活性部位に結合する場合、結合されているプローブの量は、上記試験物質の非存在におけるインキュベーションと比べて減少する。上記試験物質の解離定数（Ｋｄ）（上記分析物が酵素である場合の阻害定数（Ｋｉ）に対応する）は、上記プローブの結合および試験物質の使用される濃度の減少の程度から算出され得ることが分かった。したがって、設定の大きなダイナミックレンジは、非常に重大である；上記分析物に対する試験物質の解離定数が、測定に使用される単一濃度の試験物質から、上記方法のダイナミックレンジの全体において算出され得るからである。これは、試験物質の使用される濃度１ｍｍｏｌ．ｌ−１（およびそのＫｄに対応する検出プローブの使用される濃度）に基づいて、０．５ｍｍｏｌ．ｌ−１〜０．５ｎｍｏｌ．ｌ−１の範囲における物質の解離定数を、６桁の大きさの範囲において定量的に決定できること、すなわち、０．５μｍｏｌ．ｌ−１〜０．５ｐｍｏｌ．ｌ−１の範囲における上記物質の解離定数が、試験物質の使用される濃度１μｍｏｌ．ｌ−１に基づいて、定量的に決定され得ることを意味する。以下に示す通り、測定可能なＫｄの範囲は、試験物質の濃度を変更すること、または上記検出プローブの濃度を変えることによって変更され得る。
【００３５】
上記分析物の活性型を天然に含んでいる生物学的材料の使用は、上記分析物の困難な調製が必要ではないという利点だけでなく、いわゆる個別医療に適用可能である。これは、感染している患者の血液における薬物に対するウイルスタンパク質の抵抗性の測定、または患者のチトクロームＰ４５０に対する薬物の結合親和性を決定すること、およびしたがって、患者における薬剤の分解速度を予測することを包含している。
【００３６】
提案されている方法の顕著な他の利点は、固体担体の使用および洗浄による過剰な試験物質の除去の可能性が、上記方法を試験物質の蛍光による誤った結果に影響されなくするという事実である。これは、例えば蛍光偏光を用いた方法と、基本的に異なっており、したがって、植物または真菌からの抽出物によって得られた複数の物質の不純な混合物における、酵素、受容体およびトランスポータの活性部位に結合する活性物質の非常に効率的な探索を可能にする。
【００３７】
この用途において、上記固体担体は、上記分析物を選択的に結合可能な結合分子の不動化、または分析物の直接的な不動化のための基材の役割を果たす。上記固体担体は、余分な化学物質（特に未結合の検出プローブ）の、洗浄による容易な除去、およびしたがって、ＥＬＩＳＡの一般に使用されている免疫アッセイと同様に、結合されているプローブの量の選択的な決定を可能にする。上記固体担体は、結合分子の不動化、分析物およびプローブの結合、ならびに検出プローブのヌクレオチドタグの検出（好ましくはｑＰＣＲによる）に使用される溶液の置き換えを可能にする。
【００３８】
上記固体担体の材料は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、セファロース、セファデクッス、ガラス、セラミクス、金属および酸化物からなる群から選択される。結合bつンしまたは分析物の共有結合を容易にするために、上記固体担体の表面は、さらに官能化され得、好ましくは、当該表面は、クロロメチル基、トシル基、メシル基、アジド基、アルキン基、アルデヒド基、ケトン基、ヒドロキシル基、スルフィドリル基、エポキシ基またはアミノ基を含み得る。
【００３９】
上記固体担体の種類は、マイクロプレートウェルの表面、典型的に１００ｎｍ〜１００μｍの直径を有している微粒子、またはマイクロチップ上の特定の表面（「スポット」）からなる群から選択される。洗浄によって未結合の化学物質を除去する方法は、液相、液相デカンテーション、ろ過、磁気分離後の上澄の除去、および後に上澄を除去する遠心分離を包含している。
【００４０】
本発明の他の特徴は、上記分析物に選択的に結合可能な結合分子が、上記固体担体に不動化される；当該結合分子が、抗体およびそれらの断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２ＳｃＦｖ、Ｆｖ）からなる群から選択され；それから、重鎖およびそれらの断片（単一ドメイン（単一ドメイン抗体、ＶＨＨ）、組合せ的に調製された、抗体を模倣するタンパク質（例えば、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ）、レクチン、アビジン、ニュートラアビジン、オリゴペプチド、およびキレート剤（例えば、ヒスタグ付きのタンパク質の不動化用のトリス−ニトリロトリ酢酸）からなる）のみからなる抗体、である。
【００４１】
上記結合分子は、好ましくはマイクロプレートのウェルまたはマルチウェルＰＣＲプレートのポリスチレンまたはポリプロピレンの表面に対して直接に、非特異的な非共有結合的な吸着によって、好ましく不動化される。また、上記分析物を選択的に結合可能な結合分子は、上記固体担体の上記表面に共有結合的に好ましく不動化される。タンパク質性の結合分子は、その表面基（一級アミン基、チオール（スルフィドリル）基、カルボキシル基、アルデヒド基、ケトン基、およびヒドロキシル基が挙げられる）の反応によって不動化される。上記反応は、エポキシ基、クロロメチル基、トシル基、メシル基、アジド基、アルキン基、活性化カルボキシル基、アルデヒド基、ケトン基、ヒドロキシル基、スルフィドリル基、またはアミノ基からなる群から選択される、固体担体の表面に存在する反応性基または活性化された基によって直接に実施される。表面に活性化された基を有している固体担体は、市販されている（Invitrogen, PolyMicrospheres）。
【００４２】
また、不動化は、ヘテロ二官能性の連結試薬を介して実施され得；その一方の反応性基は、上記結合分子の表面にある対応する基と反応し、他の反応性基は、上記固体担体の表面にある対応する基と反応する。固体担体に対する共有結合は、最も一般的に、上記結合分子および固体担体の表面にある基のバイオオルソゴナル（bioorthogonal）な反応性対を導入することによって、達成される。必要とされる試薬の多くは、Solulink、Click Chemistry Tools、Jena Bioscience、Sigma Aldrichなどの会社から市販されている。バイオオルソゴナルな基の結合は、上記リガンドおよび上記プローブのオリゴヌクレオチド部分を結合するために使用される結合と同じである。
【００４３】
上記分析物を選択的に結合可能な結合分子の選択的な不動化のために、上記固体担体の好適に処理された表面は、上記結合分子が、当該表面に対する直接の吸着後にその活性を失う場合に、好ましく使用される。好ましくは、不動化されているビオチン結合成分を有している表面が、使用され、結合分子が、例えば市販のＮＨＳ−ビオチンエステル（Pierce）を用いて、ビオチン化されている表面である。同様に、結合分子は、選択されたユニバーサルエピトープを介して、好適に選択された表面に選択的に不動化され得る。好ましくは、Ｈｉｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ａｖｉタグ、フラッグタグ、ＧＳＴタグからなる群から選択されるペプチドタグおよびタンパク質タグが、使用される。抗体は、所定のクラスの抗体を選択的に認識する非特異的に不動化されている抗体または他の化合物を用いて表面に好ましく結合され得る。
【００４４】
上記分析物を選択的に結合可能な結合分子の不動化後に、上記固体担体の表面に対する非特異的な吸着は、ブロッキング剤を用いたインキュベーションによって、次のステップにおいて防止される。ブロッキング溶液は、アルブミン、カゼイン、カゼインブロッキング剤、核酸および免疫グロブリンからなる群から選択される剤を好ましく含んでいる。
【００４５】
それから、上記分析物を選択的に結合可能な、不動化された結合分子を有している固体担体は、上記サンプルとインキュベートされる。上記分析物の選択的な結合は、複合的な混合物のなかから分析物の結合を可能にする。上記分析物の選択的な結合は、複合的な混合物のなかから分析物を結合することを可能にする。上記分析物を選択的に認識する、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはそれらの断片は、この目的のための結合分子として好ましく使用される。複合的な混合物から分析物の分子の大部分は、抗体に結合し、かつさらに固体担体の洗浄時（特に未結合のプローブを洗い流すとき）に解放されないので、上記分析物に対する抗体の高い親和性は、高感度な検出を可能にする。本発明に係る方法において、血液、血漿、血清、脳髄液、尿、組織溶解液もしくは細胞溶解液、滑液、羊水、腹水、胸膜液、囲心腔液、糞便抽出物、唾液、汗および精漿からなる群から選択される複合的な生物学的マトリクス（干渉性の抗体を任意に含んでいる）が、サンプルとして使用され得る。
【００４６】
また、分析物の定量のための、サンドイッチ抗体に基づくこれまで使用されている免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡまたは免疫ＰＣＲ）と対照的に、定量化のわれわれの方法は、干渉性の抗体の存在に過敏ではないサンプルにおけるそれらの存在が分析物濃度の測定の結果に影響しない）ことが、確かめられた。サンプル成分の非特異的な結合を抑制するために、好ましくは、サンプルは、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カゼイン、カゼインから調製されたブロッキング剤、血清アルブミン、免疫グロブリンまたはＤＮＡからなる群から選択される成分を含んでいる溶液を用いてさらに希釈される。
【００４７】
好ましい他の実施形態において、細菌溶解物、酵母溶解物、細胞溶解物、細菌条件培地、酵母条件培地、および細胞条件培地からなる群から選択される組換え的に調製された分析物を含んでいる溶液が、サンプルとして使用される。組換え的に調製された分析物は、その選択的な結合のための上記結合分子と同様に、固体担体または固体担体の好適に処理された表面に不動化された結合分子に選択的に結合させるため（固体担体の表面への結合分子の選択的な不動化のためと上述の通りに等しく）に使用され得る、人工的に導入されているユニバーサルエピトープを含み得る。
【００４８】
精製された組換えの分析物または内因性の精製された分析物の溶液が、サンプルとして使用されるとき、結合分子に対する分析物の選択的な結合に加えて、固体担体の表面に対する直接の分析物の、共有結合的または非共有結合的な、非特異的な吸着（結合分子の直接の吸着について等しく上述されている通り）が、固体担体に分析物を不動化するために使用され得る。非共有結合的な非特異的な吸着または共有結合によって、分析物が固体担体に直接に結合される場合、それから、固体担体の表面は、ブロッキング溶液とインキュベートされる。好ましくは、ブロッキング溶液は、アルブミン、カゼイン、カゼインブロッキング剤、核酸、および免疫グロブリンからなる群から選択される成分を含んでいる。
【００４９】
結合分子に対する選択的な、または固体担体の表面に対する直接の、サンプルからの分析物の結合後に、固体担体は、分析物の活性部位（リガンド部分）に選択的に結合する、オリゴヌクレオチドタグを有している化学リンカーを介して共有結合されている、不動化された分析物の活性部位に対する、プローブのリガンド部分の選択的な結合のための、化合物からなる検出プローブの溶液とインキュベートされる。検出プローブの非特異的な結合を抑制するために、検出プローブは、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カゼインおよびカゼインから調製されたブロッキング剤、血清アルブミン、免疫グロブリンまたはＤＮＡからなる群から選択される成分を含んでいる溶液を用いて、好ましく希釈される。
【００５０】
また、結合分子を介した分析物の選択的な不動化を用いた手法は、サンプルにおける分析物を固体担体とインキュベートする前に、サンプルにおける分析物が、分析物の活性部位に検出プローブを選択的に結合する検出プローブとともに、まずインキュベートされ得ることが、確認された。分析物および検出プローブのこの混合物は、それから、固体担体およびそれに結合されている不動化された結合分子とインキュベートされる（すなわち、このステップは、サンプルにおける分析物の、固体担体とのインキュベーションのステップ、および続く、結合された固体担体との、検出プローブのインキュベーションのステップを置き換える）。
【００５１】
そのような手法は、一般的に自己タンパク質分解的に分解されるエンドプロテアーゼにとって特に有利である。それらの分解は、活性部位への結合がタンパク質分解活性を阻害した後に、検出プローブ、およびそれから固体担体とまずインキュベートすることによって、効率的に防止され得る。逆に、エンドプロテアーゼが、不動化された結合分子を有している固体担体、およびそれから検出プローブのみとまずインキュベートされる場合に、プロテアーゼの自己タンパク質分解性の分解は、固体担体とのインキュベーションの間に起こり得る。また、固体担体との分析物のインキュベーションの前における、分析物との検出プローブのインキュベーションは、分析物の活性型が、固体担体に結合されている結合分子に対して選択的に結合することによって不安定化されるか、またはそうでなければやがて不安定になる場合に、分析物の活性部位に対する検出プローブの結合が、活性型を安定化するので、有利である。さらに、この手法は、１回のインキュベーションステップおよび任意の洗浄を省き、加速に加えて、プロトコールがいくつかの場合にアッセイの感度を向上させ得る。
【００５２】
続くステップにおいて、固体担体は、洗浄されて未結合のプローブをなくし、それから、結合されているプローブの量が、好ましくはｑＰＣＲによって、決定される。ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、プライマー、ｄｓＤＮＡ検出用の蛍光発生性のプローブもしくは蛍光色素、および添加剤を有しているバッファーを典型的に含んでいる、ｑＰＣＲ反応混合物が、洗浄された固体担体に加えられる。続いて、オリゴヌクレオチドタグは、ｑＰＣＲにおいて増幅され、各サイクルの間に、各サンプルについてのＣｑ値が算出される蛍光強度が、モニターされる。Ｃｑ値は、プローブの濃度の対数に反比例し、逆に分析物の濃度に比例する。ｑＰＣＲの処理および評価は、詳細を説明する必要のない現在の通常の方法である。
【００５３】
結合された検出プローブの量は、検出に使用される溶液が固体担体に加えられ、かつ続いて結合されたプローブの量に比例する観察可能な量が測定されるように固体担体において直接に、決定される。これは、ｑＰＣＲだけでなく、詳細についてさらに説明されている多く他の方法による上述の決定を含み得る。他の構成において、洗い流し溶液が、固体担体を洗浄するためにまず加えられ、結合されたプローブがこの溶液に放出された後に、その量が、この溶液において決定される。解離速度定数Ｋｏｆｆによって説明される、活性部位からのプローブの単純な放出は、感度およびダイナミックレンジの損失なしに、結合されたプローブを溶液に放出するために使用され得ることが理解される。代替的に、化学リンカーは、洗い流し溶液に含まれている好適な試薬によって還元される（固体担体の表面から溶液へのオリゴヌクレオチドタグの急速かつ定量的な放出を生じる）ジスルフィド結合を、好ましく含んでいる。好ましくは、続くｑＰＣＲアッセイにおいてＤＮＡポリメラーゼと競合する従来の還元剤（例えば、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシルホスフィン（ＴＣＥＰ）、および不動化されたＴＣＥＰ）が、還元剤として使用される。そのような構成の利点は、例えば、放出された溶液が、新たなプレートに移され得るように、プローブとの分析物の不動化、および続く検出のために異なるマイクロプレートを用いる可能性である。これは、ｑＰＣＲ用のサーマルサイクラ―における熱サイクルに好適ではないが、ポリスチレンプレートが、ｑＰＣＲによる続く検出の前の不動化のために使用されることを可能にする。
【００５４】
本発明の実際の利点は、主に多くの受容体および酵素が、治療処置のための公的な標的であり、それらの阻害が有益であるので、重要な分析物の活性部位に強力かつ選択的に結合する多くの化合物の化学構造が、すでに知られていることである。また同様に、病原体および宿主の間における重要な相互作用は、特に病原体の表面リガンドおよび宿主細胞受容体の間の相互作用を阻害することによる、治療処置の標的である。難治性または不治のウイルス性疾患に対する最も有効な薬物は、ウイルス複製にとっての重要な酵素の非常に強力な阻害剤である。ＨＩＶプロテアーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素、およびＨＣＶ  ＮＳＳＢポリメラーゼの阻害剤は、臨床的に最も有効に使用される阻害剤に属する。臨床用途にとって、低分子物質は、必須に、毒性ではなく、水相に可溶であり、本願に開示されている方法は、分析物の選択的な結合に関する化合物だけでなく、毒性化合物、または水相に難溶もしくは完全に不溶な化合物を好ましく利用する。非常に極性かつ可溶性のオリゴヌクレオチドとのそれらの複合が、生じた検出プローブが、決定のために求められる濃度において容易に溶解されるほどに、それらの可溶性を向上させるので、分析物の選択的な結合のための不溶な化合物が、使用され得る。
【００５５】
本発明の目的のために、酵素阻害剤は、酵素の活性部位に結合可能な、したがって、基質もしくは複数の基質、および／または酵素の共因子もしくは複数の共因子を、活性部位から移動可能な（基質もしくは複数の基質の酵素触媒反応を減速させる）物質を意味する。酵素は、自由エネルギー活性障壁を下げることによって選択される化学反応を選択的に触媒する三次元構造を有しているポリヌクレオチド鎖またはポリペプチド鎖から一般的に構成されている生体高分子である。触媒の選択性は、基質もしくは複数の基質および任意に共因子が選択的に結合される、酵素の活性部位の特定の配列に起因する。同種の反応を触媒する複数の酵素の集団、および所定の集団における酵素より多くの共通する阻害剤がある。例えば、ぺプスタチンは、アスパラギン酸プロテアーゼの大集団を阻害する。切断された結合の直近は、同じであり得るが、活性部位の全体の結合キャビティ一般的に異なり、したがって、単一の集団（例えば、アスパラギン酸プロテアーゼ）においてさえ、各酵素は、多少は限られた集団の酵素のみにとっての反応を触媒する。結合キャビティにおける説明した差異に起因して、１つの酵素またはわずか数種の酵素のみの活性部位に選択的に結合する選択的な阻害剤がある。選択的な阻害剤の設計は、医薬品化学における極めて共通する困難な問題である。新たな医薬として阻害剤の開発の間に、探索は、いくつかの異なる酵素を阻害する物質にしばしば始まり、阻害剤は、標的酵素のみを阻害するために、より後に修飾される。標的酵素以外の阻害は、副作用の一般的な原因であり、よい例は、ＣＯＸ−１も阻害する非ステロイド性のＣＯＸ−２阻害剤である。
【００５６】
分析物の定量化の提案されている方法において、決定の選択性はまた、阻害剤の他に、結合分子として使用される抗体によって付与されるので、阻害剤の完全な選択性は、必要とされない。好ましくは、いくつかの酵素の共通する阻害剤は、検出プローブのリガンド部分として、種々の抗体と組み合わせて使用され得、したがって、いくつかの分析物の選択的な決定のためのアッセイは、それらのそれぞれについて個々に検出プローブを開発し、合成する必要なしに、開発され得る。
【００５７】
試験物質の阻害有効性を試験するために、いくつかの酵素の共通する阻害剤は、十分に選択的ではない薬物開発パイプラインの開始物質が、検出プローブの合成のために使用されるので、より好ましく使用される。それから、調製されたプローブは、本願に記載されているように、以降の他の物質の選択性を、直接に定量化するために使用され、得られた結果に基づいて、標的の酵素のみを選択的に阻害する剤が、選択され得る。単一のプローブを用いて、試験アッセイは、このようにして、医薬のさらなる開発のために適切な酵素にとって厳密に開発され得る。本願の実施例は、ＨＩＶプロテアーゼの選択的な阻害剤、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩおよびＩＩＩ（ＧＣＰＩＩおよびＧＰＣＩＩＩ）の共通する阻害剤、炭酸脱水素酵素ＩＩおよびＩＸ（ＣＡ−ＩＩおよびＣＡ−ＩＸ）の共通する阻害剤、ヒトインフルエンザサブタイプＮ１およびＮ２のノイラミニダーゼの共通する阻害剤、ならびにペプシンのアスパラギン酸プロテアーゼの共通する阻害剤の使用を説明している。
【００５８】
本出願の目的上、受容体は、リガンド（アゴニスト）と結合した後、酵素活性、若しくは受容体自体の他の活性の変化、または、上記受容体に直接的、若しくは非直接的に結合するタンパク質、または、特定のイオンの濃度変化による、酵素活性、若しくはイオン依存性タンパク質自体の他の活性の変化、または、第２のメッセンジャーの濃度変化にて細胞タンパク質を変化させることにより最終的に特定の遺伝子の発現を任意に変化させることを反映した細胞内シグナルを発生することが可能なタンパク質を意味する。上記受容体の一例は、典型的には、通常細胞膜の両側の構造領域を含み、１以上の膜貫通型セグメントと結合する膜結合性タンパク質である。上記受容体の重要な特徴は、リガンドと結合し、（多くの場合多量体化を介して）自身の構造を変化させることにより、細胞膜を貫通して結合するリガンドの情報を伝達することである。
【００５９】
受容体の第１の大きな集団において、上記シグナルは、受容体自体、若しくは受容体と結合するタンパク質（酵素）、ＧＴＰａｓｅｓ（Ｇ−タンパク質）若しくはプロテインキナーゼの、細胞の他方の側の構造領域における酵素活性または他の活性のどちらかの変化を介して形質導入される。
【００６０】
活性化した結合タンパク質は、その際、他のタンパク質を活性化させ、多くの場合、例えば、ホスファチジルイノシトールトリホスファイト、ジアシルグリセロール、カルシウムイオン、環状ＡＭＰまたは環状ＧＭＰ等のいわゆる第２のメッセンジャーと関連する、完全なシグナル伝達カスケードを始動させ得る。上記受容体の例は、ヒト神経系におけるいわゆる代謝型グルタミン酸受容体、ＥＧＦ受容体、インシュリン受容体、インテグリン受容体およびその他多くの受容体である。
【００６１】
受容体の第２の主要な集団は、（細胞外または細胞内の何れかにて）リガンドと結合した後、選択されたイオンの透過性の変化、すなわち上記イオンの細胞内の濃度変化により、シグナルを発生する。上記受容体は、その際、イオン型受容体と呼称され、その例には、グルタミン酸ＡＭＰＡ、カイナイトまたはＮＭＤＡ受容体が含まれる。別の種類の受容体は、例えば、ステロイドホルモン受容体であり、細胞質内に存在し、リガンドと結合した後、核に転写され、特定の遺伝子の発現を制限する。受容体リガンドは、一般に、別のタンパク質であり得、細胞外基質成分であり得、脂質、アミド酸、炭水化物、ステロイド、若しくはそれらの組み合わせにおけるペプチドまたは物質であり得る。
【００６２】
受容体のエフェクター部位（すなわち、受容体自体のイオンチャネル、酵素的活性領域、またはその他の活性領域）およびリガンドと結合する部位が、お互いに空間的に離れていることによって、受容体の活性部位と結合するための低分子量のリガンドの使用は、酵素に対する使用よりも複雑となる。本出願の目的上、受容体または受容体の集団のアゴニスト、コアゴニスト、アンタゴニストまたはブロッカーは、ＮＭＤＡイオン型グルタミン酸受容体の例によって規定される：受容体活性のための、アゴニストおよびコアゴニストの双方は、対応する結合部位と結合し、当該結合が受容体活性をもたらす構造変化を引き起こす。これらの物質のうちの各々は、受容体の別の部位と結合する；アゴニストは、生理的に、主にＬ−グルタミン酸である一方、コアゴニストは、生理的に、グリシンである。他のアゴニストは、グルタミン酸の結合部位と結合し、例えば、Ｌ−アスパラギン酸であり、または、例えば、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）等の半アゴニストである；他のコアゴニストもまた、グリシンの結合部位と結合し、例えば、Ｄ−セリンであり、または、半コアゴニストである。加えて、受容体には、例えば、ポリアミン類またはプレグネノロンスルホン酸等の受容体モジュレータ結合を含むと結合するアロステリック部位が存在する。最終的には、受容体のイオンチャネルと直接結合する物質は、これらの受容体のブロッカーとして機能し、上記チャネルを通してイオンが通過することを阻害する。その際、上記受容体のアンタゴニストは、上述のブロッカー、および、例えば、クロロホルム、フェンシクリジン、またはアマンタジン等の非競合的アンタゴニストだけではなく、（例えば、セルフォテル等の）グルタミン酸またはグリシンの部位と結合する競合的アンタゴニストであり得る。これらの物質の集団の全ては、受容体の高感度検出および受容体の対応する部位に対する試験される物質の結合能の決定のための検出プローブのリガンド部分として使用され得る。
【００６３】
検出プローブの調製に使用される物質の種類に応じて、受容体の特定の結合部位と試験される物質との結合が試験される。この方法は、特定の結合部位ではなく、物質の効果が、細胞全体に基づく現行のアッセイを使用して検出され得る点のみにおいて、ユニークである。
【００６４】
特に、ＮＭＤＡ受容体を対象とする薬剤の発展において、他のグルタミン酸受容体と比較して選択性が低く、副作用を引き起こすことが最も大きな課題であることから、受容体の選択的な阻害の試験もまた重要である。本明細書にて提案される方法は、（酵素についての上述の方法と同様に、）現行の方法では不可能な、多数のセットの物質に対して、選択性の体系的試験が可能である。これらの方法は、典型的に、例えば、試験される物質の作用機構からは正確に決定できない、試験される物質に晒した後の細胞内のカルシウムイオン濃度の変化を測定する。酵素と同様に、種々の異なる受容体と結合するリガンドは、各々の受容体のリガンドを普遍的に試験するためのプローブを調製するために使用され得る。
【００６５】
本発明の別の適用できる対象は、上にて定義された受容体には含まれていないが、例えば、テトロドトキシンまたはリドカイン等の、それらの低分子量のブロッカーが知られている、電位型チャネルである。本発明は、イオンチャネルと結合し得る検出プローブの調製のために役立ち、イオンチャネルの定量およびイオンチャネルに対する新たなブロッカーを発見するためにも使用され得る。
【００６６】
本発明の目的上、トランスポータもまた、その生物学的機能に基づき規定される。トランスポータは、リガンド、すなわち輸送される物質と選択的に結合することができるタンパク質分子であり、結合の後にその輸送を仲介することができる。トランスポータは、多くの場合、脂質の膜を介する低分子量の物質のトランスポータである一方、トランスポータは、脂質の膜を通過することができないか、あるいは、通過する効率が非常に低い。このことは、トランスポータは、通常、細胞の内部と外部との間の物質のトランスポータであることを意味する。例としては、グルコース受容体、クエン酸塩受容体、または特定の腫瘍の治療に使用される葉酸およびメタトレキサート類似物質の伝達が可能である、高親和性α葉酸塩受容体を含む。類似する種類の例はまた、脳内炎の障壁におけるアミノ酸のトランスポータである。異なる種類のトランスポータの例は、リソソームの場合において、そのリガンドを認識した上で、特定の転写後修飾されたタンパク質であり、細胞成分内の結合リガンドの輸送を仲介する、マンノース−６−リン酸受容体である。上述のトランスポータが脂質の二重層を超えるリガンドのトランスポータである必要はないが、上述のトランスポータは、特定の細胞成分に対するリガンドを選別し、輸送することは明らかである。輸送される物質または輸送される物質に対する結合部位と結合し得る他の物質は、トランスポータの高感度検出のための検出プローブのリガンド部分として、および、トランスポータに対する試験される物質の阻害能を試験するために使用され得る。
【００６７】
分析物の活性部位と選択的に結合する化合物、すなわち検出プローブのリガンド部分は、好ましくは、オリゴヌクレオチドと連結している化学リンカーを用いて調製される。上記リンカーは、分析物の活性部位における結合に影響しない部分にて、上記化合物と連結される。上記リンカーにおける連結に適した部位は、分析物の活性部位と選択的に結合するための結合型化合物と上記活性部位の三次元構造の知識から、或いは、上記リンカーの種々の連結部位を用いて多量体を調製し、分析物の活性部位内における上記多量体の連結の強さを試験することのどちらかによって決定される。さらに、上記リンカーは、分析物の活性部位と化合物とが結合できるような長さにて調製され、上記リンカーは、分析物の活性部位の結合するための空隙の外側に達し、それゆえに、分析物の活性部位と化合物との結合に影響を与えないオリゴヌクレオチドと連結し得る。上記リンカーの連結に適した部位および適した長さが発見された場合、分析物の活性部位と結合する既知の化合物が、検出プローブのリガンド部分の調製に使用され得る。上記化学リンカーは、好ましくは、ポリエチレングリコール；ペプチド；ポリアミド；脂肪族鎖またはヒドロキシル化された脂肪族鎖；ポリデキストラン、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）等の任意の有機ポリマー；およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらに、上記リンカーは、ペアの生体直交型の反応性基から選択される基、および調製された所定のペアの生体直交型の反応性基に由来の第２の対応する基を備えるオリゴヌクレオチドタグを用いて調製される。これらの基の反応により、結果として検出プローブ、すなわち化学リンカーとオリゴヌクレオチドタグとの結合を介して、分析物の活性部位と選択的に結合する化合物が生成される。ペアの生体直交型の反応性基は、好ましくは、アミン−活性化エステル、ヒドロキシル−活性化エステル、アミン−活性化リン酸、アジド−アルキン（Ｃｕ２＋触媒）、アジド−シクロオクチン、アジド−ジベンジルシクロオクチン、ヒドラジン−アルデヒドまたはケトン、芳香族ヒドラジン−芳香族アルデヒドまたは芳香族ケトン、テトラジン−アルケン、スルフヒドリル−アルケン、スルフヒドリル−メレイミド、スルフヒドリル−スルフヒドリル、アミンまたはスルフヒドリル−エポキシアルカン、アミンまたはスルフヒドリル−トシレート、メシレートまたはハロゲン化アルキル、スルフヒドリル−ビニルスルホン、アミン−アルデヒドまたはケトン（シアノボロヒドリド還元）、イソシアナート−アミンまたはヒドロキシル、アミン−塩化スルホニル、アミン−アミン（スルファニルクロリドピリジン、ジクロロピリミジンまたは塩化シアヌルを介して）、アジド−ニトリル、ジオール−ボロン酸、ジオール−フェニルボロン基およびアミン−ヒドロキシル（塩化シアヌルを介して）からなる群から選択される。
【００６８】
分析物の活性部位と選択的に結合する化合物と、生体直交型のペアに由来する第１の基および上記生体直交型のペアに由来する第２の基を含むオリゴヌクレオチドタグを備えるリンカーとの反応は、上述の化合物の溶液およびリンカーの溶液を好適な反応条件下、好適な割合、最も好ましくは室温下、１晩にて反応できる条件にて単純に混合することによって達成される。リンカーと選択的に結合する化合物はオリゴヌクレオチドよりも大量に入手できるから、反応の定量的な限界のために、モル過剰の上記化合物が使用される。上記化合物がモル過剰であることは、上記化合物が水相にて、例えば、オリゴヌクレオチドタグにおけるアミンと反応する活性化エステルであるとして調製される場合に、水相における活性化エステルは、通常加水分解され、その一部はオリゴヌクレオチドタグにおけるアミンと反応できなくなるため、特に重要である。選択的に結合する化合物は、５〜５０倍のモル過剰にて使用されることが好ましいが、水相の代わりに有機相を使用すれば、過剰の量が少なくとも、あるいは、等モル数の量を用いてさえ、定量的な連結が達成され得る。同様に、上記化合物をわずかに過剰な量用いて、例えば、アルキンと反応物におけるアジドとの間における高効率の連結が達成され得る。特定の反応条件が、ほとんど任意に、好ましくは、連結反応および低分子量の物質の種類に応じて選択され得る。いくつかの種類の反応、例えば、活性化エステルとアミンとの反応において、十分な効率性が、狭いＰＨの範囲においてのみ達成され得る。ＤＮＡは、広い範囲のＰＨにおいて安定であるために、酸性および中性の双方、並びに塩基性でさえも、連結反応にて使用され得る。上記物質が水相にて不溶である場合、上記反応は有機溶媒、例えばＤＭＳＯ中にて実施され得る。水相似て分析物を選択的に結合する化合物の不溶性は、上記化合物と非常に極性が高く、溶解性がよいＤＮＡとが連結した後、連結している低分子量の化合物の疎水性と関係なく、連結物全体が水に可溶となることから、分析物を決定する上における技術的問題とはならない。結局、ＤＮＡと連結させることによって、元々の化合物の生物学的活性を失活させることなく、著しい溶解性が達成され得る。有機相もまた、生体直交型の反応基のうちの１種が水相において安定ではない場合において、上記反応にて使用され得る。ＰＣＲ反応のためのテンプレートとしてのＤＮＡは、その特定の三次元構造を必要としておらず、従って、（プロテイン類、特に抗体とは対照的に）有機溶媒に溶解することがその機能に悪影響を与えないとの事実から、有機相の使用は可能である。連結後、得られる検出プローブは、好ましくは、検出プローブ（通常、２０，０００Ｄａ）と、上記化合物（通常、１，０００Ｄａ以下、最大でも２，０００Ｄａ以下）の分子量の大きな差異に基づき、ミクロ遠心分離カラムにおける限外濾過法にて、残留する分析物と選択的に結合する化合物から精製される。好ましくは、検出プローブを、遊離の化合物に由来する、任意の残留している未反応のオリゴヌクレオチドと共に分離する、細胞膜の「切断（ｃｕｔ  ｏｆｆ）」が使用され、その結果分子量が１０，０００Ｄａよりも大きい物質が獲得される。分析物と選択���に結合する遊離の化合物は、分析物と結合する検出プロ――ブと競合するために、検出プローブから分離する必要がある一方、残留している未反応のオリゴヌクレオチドは、検出プローブの性能には有意な影響を与えないことから、上記プローブから分離する必要はない。
【００６９】
本発明の基礎的な実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは、典型的には２００塩基以下、好ましくは３０塩基〜８０塩基の長さを有する一本鎖のＤＮＡである。結合した検出プローブの量を決定するために、オリゴヌクレオチドタグの量がｑＰＣＲによって選択的に定量される。上述のタグの長さは、ｑＰＣＲのテンプレート、すなわち、アニール（前後）におけるプライマー対、あるいは蛍光発生プローブ（例えば、オリゴヌクレオチドタグに対して相補的な配列を有し、発蛍光団および消光部を含む、加水分解性のＴａｑＭａｎプローブ；上記発蛍光団と上記消光部は、ＤＮＡ増幅の間に、ポリマラーゼによる上記プローブの分裂により分離し、蛍光シグナルが増大する）として十分である。蛍光発生プローブを使用しない場合であっても、ｑＰＣＲの間に生成される二本鎖のＤＮＡと結合するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（例えば、ロシュ）のような蛍光色素を使用すれば十分である。オリゴヌクレオチドタグの配列は、完全に任意であり；プライマーの配列、または蛍光プローブの配列もまた、その場合、上記タグの配列に選択的に依存する。
【００７０】
配列が、例えば、アプタマーの場合のように、特定の三次元構造を生成する必要があることには限定されていないとの事実により、種々の検出プローブにおいて、種々の分析物に対して種々の配列を選択することが有利に行うことができ、これらの検出プローブのうちの一種が、検出プローブの混合物中から選択的に決定され得る。そのことは、例えば、一つの反応にて多量体の分析物の並行測定のために使用される。上記処理において、各々が異なる分析物を認識する、結合分子の混合物は、固体担体に固定化される。その後、上記固体担体は、結合分子に対応するサンプルに含まれる分析物における選択的な結合のために、上記サンプルと共にインキュベートされた後、結合された分析物を有する上記固体担体は、各々が異なるオリゴヌクレオチドタグを含み、各々が異なる分析物と結合する検出プローブの混合物と共にインキュベートされる。その後、結合していない検出プローブが、洗浄（洗い落とし）によって除去され、サンプルにおける対応する分析物の量に比例する、各々の検出プローブの結合の量が選択的に決定される。
【００７１】
固体担体がマイクロプレートのウェルの表面である場合、種々の配列の同時の選択的な決定が、以下に示す方法にて達成され得る：第１の方法において、結合していないプローブを洗い流した後、検出プローブにおける各々のオリゴヌクレオチドタグの増幅のためのプライマーの混合物が、各々の配列に特有の配列、または多くの配列に共通の配列、および、各々の個々の配列に対して特定の（相補的な）種々の有色の蛍光発生プローブに添加される。ｑＰＣＲに続いて、各々のマイクロプレートのウェルにおいて、すべての検出プローブに存在するすべての配列は、同時に増幅され、それらの選択的な検出が、混合物中の一種の所定の配列のみに対して各々一種のプローブが特定される、種々の有色の蛍光発生プローブを使用することによって達成される。一つの反応にて同時に決定される配列の数は、ｑＰＣＲ装置における異なる色のフィルターの数によって制限され、それゆえに、同時に５〜６個の配列という実際的な限界が存在する。別の代替法は、結合している検出プローブを溶液に放出すること、例えば、単純に抽出溶液と共にインキュベートし、続いて、この溶液を多くのウェル内に分割することであり、各々のウェルにおいて、一種の特定の配列が選択的に増幅され、定量される。この方法は、選択的なプライマーまたは少なくとも一種の選択的なプライマーと一種の一般的なプライマーを使用することによって達成され；一方、選択的な蛍光発生プローブは必要としない。このように、決定される配列の数は全く限定されない。別の類似の方法は、特定または一般的なプライマーを用いて、元々のウェルにおいて、結合している検出プローブの配列を直接的に予め増幅し、続いて、増幅された配列を含む溶液部分割し、多くのｑＰＣＲ反応に投入し、続いて、前述の方法と同様の方法にて配列を決定することである。多くの種類の結合しているプローブの各々に対する同時の決定がまた、混合プローブを備えるチップの分析、または、次世代配列法によって達成され得る。
【００７２】
上述の全ての決定方法において、特にｑＰＣＲの装置によって、典型的には１０塩基と３０塩基の間の非常に短いオリゴヌクレオチドタグを使用することも可能である。上記オリゴヌクレオチドは、非常に短いため、ポリメラーゼ鎖反応のテンプレートとなることができないが、アニールの後、ポリメラーゼによる重合が添加されたテンプレートＤＮＡを伸長する、上記ポリメラーゼ鎖反応におけるプライマーとして働く。上記伸長されたテンプレートＤＮＡは、その後、ｑＰＣＲにてプライマー対を使用して増幅され、上記プライマーのうちの一つにおける相補的な配列の全て、または一部は、元々の伸長していないテンプレートＤＮＡには含まれていない一方、オリゴヌクレオチドタグには存在する。従って、非常に短いオリゴヌクレオチドタグの量は、定量的に決定される。
【００７３】
オリゴヌクレオチドタグの一本鎖のＤＮＡは、様々な修飾された形態にて調製され得る。以下に示す修飾は、このＤＮＡのストランドに直接導入され得るか、あるいは、このストランドが、目的の修飾を含む相補的なストランドと組み合わされ得るかのどちらかである。検出プローブが、（抗体を含むプローブとは異なり、）熱的に安定である場合、第２のストランドと選択的に組み合わされることは、リガンド部分を有するオリゴヌクレオチドタグの連結の前だけでなく、好ましくは連結後も実施され得る。この方法の利点は、一種の化学的に合成された、一本鎖のオリゴヌクレオチドタグを有するプローブが、望ましい修飾を備える二本鎖のＤＮＡを有する多数の誘導体の検出プローブの調製に簡単に使用され得ることである。主に発蛍光団、ビチオン、チオール基、アミノ基、アジド基またはオクチン基である、異なる修飾を備えるオリゴヌクレオチドは、カスタム合成の形態にて市販されている。元々のＤＮＡストランド上における第２のストランドの実際のアニールは、２種類のストランド（第２のストランドおよび検出プローブ）を、適切な割合（通常、等モル）にて混合し、加熱した後、徐々に冷却することによって実施される。
【００７４】
代替的には、望ましい修飾を含む第２のストランドは、オリゴヌクレオチドタグの元々のストランドに対するプライマーのアニールと、目的の修飾を備える塩基の混合によるポリマラーゼを用いる伸長とを同時に使用することによって導入される。上記修飾された塩基もまた市販されている。
【００７５】
従って、ｑＰＣＲによる決定のためのオリゴヌクレオチドタグは、一本鎖のＤＮＡだけでなく、二本鎖のＤＮＡによっても形成され得る。好ましくは、上記検出プローブは、上記オリゴヌクレオチドタグに結合されるビオチンによって調製される。それから、このようなプローブは、モル過剰で、四価のビオチンに結合するタンパク質、好ましくは、ニュートラビジンまたはストレプタビジン、でインキュベートされ、このタンパク質への結合の後、全体の混合物を、好ましくは１００ｋＤａ以上の分子量の化合物を捕捉するための孔を有する膜を通した限外濾過法によって、精製する。上記限外濾過法において、上記複合体は残留成分中に残り、結合していない検出プローブは通過する。それから、生じた四価の複合体は、分析物の活性型の検出、およびこれらの分析物の上記活性部位に対する、試験される物質の結合能のため、当初の検出プローブの代わりに、用いられる。このような複合体の利点は、四価であり、それ故の増加される親和性である。これらの利点は、炭酸脱水素酵素ＩＸに対する検出プローブの例によって実証され、ここで、このような複合体の使用は、当初の一価の検出プローブの使用よりも、アッセイの感度を向上した。この現象に起因して、より弱い阻害剤は、検出プローブの調製のために使用され得る。代わりに、多価のプローブは、リンカーを有する分析物の活性部位に対する選択的な結合のための化合物を、生体直交型のペアからの第１群、および生体直交型のペアからの第２群の複数のコピーを含んでいるオリゴヌクレオチドタグ（このようなオリゴヌクレオチドタグは、商業的に利用可能である）と反応させることによって、調製され得る。もしくは、このようなオリゴヌクレオチドは、要求される生体直交型の群と結合される、商業的に利用可能なヌクレオチド結合ブロックからの固相合成によって調製され得る。ＣＡ−ＩＸの検出のため、ＣＡ−ＩＸの活性部位に対する選択的な結合のための化合物の２つの分子を含んでいる一本鎖のプローブが調製され、この手順はかなり有利であることが証明された。オリゴヌクレオチドタグに対する二つのコピーの結合によって、本願の化合物と比較される場合または化合物の一つのコピーのみを有するオリゴヌクレオチドタグと比較される場合、少なくとも２０倍の向上される親和性を達成でき、上述のようにニュートラビジンを有する複合体と比較される場合、約一桁の大きさの向上される親和性を達成できた。細胞の溶解物または血清中のＣＡ−ＩＸの検出のため、１０ｆｇ（約２００ｚｍｏｌ）未満の検出限界は、１０ｆｇおよび１ｎｇの間、すなわち五桁の大きさの線形的な範囲で達成された。上記化合物の第２の分子の添加に起因する、親和性のこのような実質的な増加は、上記ＣＡ−ＩＸは二つの活性部位を有するダイマーを形成し、二価のプローブは明らかに、これらの部位の両方に対して同時に結合するという事実に起因する。ニュートラビジン複合体と比較されたより高い親和性は、上記二価のプローブにおける一本鎖のＤＮＡのより大きな柔軟性におそらく起因する。これは、ニュートラビジンと複合化されるＤＮＡよりも高く、従って、結合されている化合物は、より簡単にＣＡ−ＩＸの活性部位に到達する。
【００７６】
さらに上記結合活性を向上する方法は、金ナノ粒子における、上記検出プローブの複数のコピーの結合である。好ましくは、金ナノ粒子に対する直接の共役のため、オリゴヌクレオチドタグにおいてチオール基を含んでいる、検出プローブが調製される。それから、金ナノ粒子との検出プローブの共役は、上記二つの構成要素の溶液を混合することによって達成され、イオン強度の緩やかな増加がスクロース勾配中の遠心による、粒子および結合していない検出プローブの分離に続く。より好ましい方法は、任意に６〜１８の炭素原子を含んでいる、分鎖でないアルカン鎖に結合される、チオール基からなる、複数のコピーの分子からなるフィルムで被覆される金ナノ粒子の調製に関する。この鎖は、一方の末端において生体直交型の反応基の一つ（好ましくはアジド基）を有している、エチレングリコール鎖、任意には３から１８のエチレングリコール単位に対して（反対側の末端において）結合される。それから、これらの分子は、チオール基を介して金ナノ粒子に対して結合される。また、上記アルカンおよび上記エチレングリコール部分は、粒子の表面において半結晶構造を形成し、従って、これらのコロイドの安定性を著しく向上させる。それから、上記アジド基は、触媒なしでチアゾールを形成するために、すぐに上記アジド基と反応するジベンジルシクロオクチン（ＯＢＣＯ）基を好ましくは含んでいる、検出プローブに対する単一の共役のために使用される。ＤＢＣＯ基を有している検出プローブは好ましくは、ＤＢＣＯ基を含んでいる相補鎖のＤＮＡとペアにされる標準的な方法によって調製される、一本鎖の検出プローブから調製される。
【００７７】
極めて感度のよい検出は、極めて少量の組織を取り、それにより外科手術の侵襲性を減少することを可能とするため、前立腺摘除術後の癌患者の血清中のＰＳＡの決定のためだけなく、組織生検のためにも重要である。サブミクロモルの親和性を有する化合物から調製される検出プローブによって、１０ｆｇの感度が達成された、ＣＡ−ＩＸの実施例に従うと、上記化合物および上記分析物のミクロモルの解離定数によって、１００ｋＤａの分子量を有する１ｐｇの分析物に対応する、１０ａｍｏｌより低い感度を有する、分析物の検出が通常、可能となるであろうことが推測され得る。
【００７８】
十アトグラム（数十分子に対応している）の感度が達成された、ＰＳＭＡの検出に関する実施例に記載されるように、よりしっかりと結合している化合物によって、結合活性の利用なしであっても、著しく優れた検出の感度さえも可能となる。ウェスタンブロッティング（１００ｐｇの検出限界）またはＥＬＩＳＡ（１０ｐｇの検出限界）による、ＰＳＭＡの近年で最も感度のよい検出を用いる場合、約六桁の大きさ未満である。同時に、六桁の大きさ以上の決定の範囲が達成される。上記実施例は、１ｆｇ未満から１ｎｇを越えるＰＳＭＡの範囲における、定量的な検出を示す（ＥＬＩＳＡアッセイの最大の範囲は、約三桁の大きさである）。
【００７９】
このように結合されるプローブは、不動化される分析物に対して選択的に結合されるプローブと同様に検出されるため、分析物の決定の感度の限界は、上記検出プローブの非特異的な吸着である。従って、アッセイの感度の増加は、適した因子を検出プローブの作用溶液へと加えることで、上記検出プローブの非特異的な吸着を抑制することによって達成される。上記検出プローブは、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カゼインおよび、カゼイン、血清アルブミン、ＤＮＡまたは免疫グロブリンから調製されるブロッキング剤からなる群から選択される、添加剤を含んでいる溶液で希釈される。通常、上記検出プローブは、結合される分析物を有する固形担体とのインキュベーションの前に、適したｐＨ（好ましくは生理学的なｐＨ７．４）において、緩衝される溶液で希釈される。また通常、緩衝される溶液は、０以上から１．５ｍｏｌ．ｌ−１までの濃度において、溶解される塩（好ましくは、溶解される塩化ナトリウム）を含んでいる。また、上記溶液は任意に、０％以上から１％（体積／体積）の濃度（好ましくは０．１％（体積／体積）の濃度）で、非イオン性界面活性剤（好ましくは、Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート））を含んでいる。上記プローブの非特異的な吸着における著しい減少は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の低いレベル（好ましくは、最終濃度０．００１％から０．０２％（重量／体積）の範囲）での添加によって達成される。上記プローブの非特異的な吸着の減少はまた、カゼインブロッキング溶液の少ない量（好ましくは、２００倍から５００倍の最終希釈の範囲（上記溶液の初期濃度は５．５％（重量／体積）である））における添加によっても達成される。ＳＤＳおよびカゼインブロッカーの両方を加えることで、非特異的な結合のさらなる抑制にもつながる。上記実施例に示されるように、上記検出プローブの非特異的な吸着を削減し、同時に、上記分析物の活性部位に対する特異的な結合における親和性に著しくは影響を与えない溶液のこのような組成物を得るため、これらの物質およびこれらの組み合わせの両方の様々な濃度がそれぞれの分析物および対応している検出プローブについて試験される。非特異的な結合における減少は、典型的には、一桁から二桁の大きさ（しかし、相当により大きくてもよい）の範囲であり、それによって、シグナル対バックグラウンドの割合の増加、それ故に、同じ大きさのアッセイの感度の増加という結果となる。上記実施例にも示されるように、少なくとももう一桁の大きさだけ非特異的な結合を抑制し、その結果、同じ大きさの分析物の検出の感度を増加するための、さらに驚くべき方法は、二本鎖のタグへの一本鎖のオリゴヌクレオチドタグの置換である。
【００８０】
分析物決定の選択性のさらなる向上は、最適な作用濃度における検出プローブを用いた、結合された分析物との固体担体のインキュベーションによって実現された。最適な濃度を決定するために、対応する分析物に対するＫｄ値は、各検出プローブについて決定されており、滴定（すなわち、検出プローブの濃度を変えながら、同じ分析物濃度についての複数の測定）によって実際になされている。
【００８１】
解離定数についての式は：
Ｋｄ＝［Ｅ］＊［Ｐ］／［ＥＰ］（１）
であり、ここで、［Ｅ］は、自由な分析物の濃度であり、［Ｐ］は、自由な検出プローブの濃度であり、［ＥＰ］は、結合されている検出プローブと複合している分析物の濃度である。分析物の濃度は、合計の分析物濃度（Ｅｔｏｔ）およびプローブと複合されている分析物の濃度（ＥＰ）の差に対応し、する。
上記式にこの環系を代入し、かつ［ＥＰ］について解くことによって、式：
［ＥＰ］＝Ｅｔｏｔ＊［Ｐ］／（Ｋｄ＋［Ｐ］）（２）
（基質および酵素のミカエリス定数の決定と同様）を得る。
【００８２】
自由な検出プローブの濃度［Ｐ］は、未知であるが、分析物の総濃度が、検出プローブのＫｄまたは検出プローブの総濃度Ｐｔｏｔより低い場合、滴定評価の簡略化のために、［Ｐ］は、Ｐｔｏｔに置き換えられ得、最終的な関係は：
［ＥＰ］＝Ｅｔｏｔ＊Ｐｔｏｔ／（Ｋｄ＋Ｐｔｏｔ）（３）
と表される。
【００８３】
複合物ＥＰにおいて結合され、不動化されているプローブの濃度は、ｑＰＣＲによって測定される量である。実際の解離定数は、検出プローブの使用された分析濃度に対して、ＥＰ量の測定値をプロットすること、およびプローブの解離定数の数値決定（および予めわかっていない分析物の分析濃度）と関連している式（３）によって表される関数に、それらをフィッティングすることによって、決定される。
【００８４】
経験的に知られている特性の数字は、式（３）から、Ｐｔｏｔに対する［ＥＰ］の依存性をプロットすることに基づいて導出され得る。ＰｔｏｔがＫｄより十分に小さいとき、［ＥＰ］（すなわち、不動化された分析物に結合した検出プローブの量）は、Ｐｔｏｔの増加とともに直線的に増加する。
ＰｔｏｔがＫｄに近くなると、［ＥＰ］の上昇は緩やかになり、Ｐｔｏｔ＞＞Ｋｄにおいて徐々にプラトーに達する。このとき、［ＥＰ］値はＥｔｏｔに一致する。例えば、Ｐｔｏｔ＝Ｋｄのとき、［ＥＰ］＝１／２Ｅｔｏｔ（すなわち、分析物のちょうど半分がプローブによって結合されている）。対照的に、検出プローブの非特異的に吸着されている量の、総濃度（Ｐｔｏｔ）に対する、観察される依存性は、試験されるすべての濃度について（すなわち、特異的な相互作用の対応するＫｄより小さい、Ｋｄと同等である、またはＫｄより大きいとき）およそ直線的であり、非特異的な相互作用を特徴づける、ほとんど相当に大きい解離定数によって説明され得る。
【００８５】
これらの観察から、検出プローブの最適な作用濃度が、推定され得る。分析物の決定の最も高い感度は、所定の分析物に対するそのＫｄにおよそ等しいプローブ濃度、または所定のプローブにおいて非ゼロの非特異が観察される場合に所定の分析物に対するＫｄより十分に小さい濃度を用いたときに、達成される。
【００８６】
われわれの技術的解決は、検出の定量的なダイナミックレンジが、分析物濃度の範囲（測定されるシグナルが分析物の総濃度に線形的に比例する範囲）として規定されるときの、非常に大きいダイナミックレンジにおいて顕著である。この場合に、Ｃｑ値は、ｑＰＣＲによって測定され；Ｃｑ値は、分析物に結合している検出プローブの量（ＥＰ）の対数に反比例（負の比例定数と線形的）する。当該量は、上述の定量的なダイナミックレンジの範囲において、分析物総濃度（Ｅｔｏｔ）に比例する（すなわち、［ＥＰ］／Ｅｔｏｔ比は、この範囲において一定である）。変形された式（２）は：
［ＥＰ］／Ｅｔｏｔ＝［Ｐ］／（Ｋｄ＋［Ｐ］）（４）
プローブの濃度［Ｐ］が、その分析濃度Ｐｔｏｔによって代入され得る場合に、この条件が満たされることを意味する。ＰｔｏｔもＫｄも分析物Ｅｔｏｔの変化する総量に依存せずに、式（４）の左側全体は、ほぼ一定であるからである。変形された式（２）は：
［ＥＰ］／［Ｐ］＝Ｅｔｏｔ／（Ｋｄ＋［Ｐ］）（５）
Ｅｔｏｔ＜ＫｄまたはＥｔｏｔ＜［Ｐ］またはＥｔｏｔ＜＜Ｐｔｏｔの条件のもとに［Ｐ］が、Ｐｔｏｔによって代入され得ることを、さらに意味し、そのときの［ＥＰ］＜［Ｐ］であるから、［Ｐ］＝Ｐｔｏｔ−［ＥＰ］〜Ｐｔｏｔと表し得る（［ＥＰ］＜Ｐｔｏｔであるから）。これらの条件のもとに、測定されたシグナルは、Ｅｔｏｔに比例する。これは、測定のダイナミックレンジについての重大な知見に導く；
分析物に対するプローブの選択的な結合のＫｄより低い、またはＫｄに等しい、プローブの低濃度のとき、ダイナミックレンジは、検出の下限において、検出プローブの非特異的吸着によって制限され、検出の上限において、プローブのＫｄによって制限される。Ｋｄより高いプローブ濃度のとき非特異吸着は増大するが、検出の上限は、もはやＫｄによって制限されず、より高いプローブの濃度によって制限される。したがって、プローブの濃度が高くなるほど、ダイナミックレンジを分析物のより高い濃度に移動させ、検出の下限および上限の差の倍数は不変である。
【００８７】
［Ｅｐ］がＥｔｏｔに正比例する範囲のより正確な認識のために、［ＥＰ］についての正確な関係が、導出され得る。
［ＥＰ］＝（Ｋｄ＋Ｐｔｏｔ＋Ｅｔｏｔ−（（Ｋｄ＋Ｐｔｏｔ＋Ｅｔｏｔ）２−４＊（Ｐｔｏｔ＊Ｅｔｏｔ））０．５）／２（６）。
【００８８】
式２（線形的相関とみなす）および６にしたがって算出されたＥＰを比較することによって、線形比例から、Ｅｔｏｔに対する依存性［ＥＰ］の偏差を決定し得る。例えば、Ｅｔｏｔ＞Ｐｔｏｔである場合に、線形性からの偏差は、Ｅｔｏｔ＝１／２Ｋｄのときに約４０％であり、Ｅｔｏｔ＝１／４Ｋｄのときに約２０％であり、Ｅｔｏｔ濃度の減少につれて、偏差はさらに減少する。これは、Ｅｔｏｔ＞Ｐｔｏｔのとき、Ｅｔｏｔについての線形範囲が、およそ１／４Ｋｄに達するを意味する。対照的に、ＥｔｏｔおよびＫｄの比に関係なくＥｔｏｔ≦Ｐｔｏｔの場合、線形性からの偏差は２５％を決して超えない。これは、線形範囲が検出プローブの濃度にまで少なくとも達することを意味し、検出プローブの濃度を上昇させることによってダイナミックレンジをシフトさせる可能性を支持している。
【００８９】
全体のダイナミックレンジは、実際に、線形範囲より一様に大きく、実施例における分析物の検定においてよく証明されている。例えば、ＰＳＭＡ検出のための線形範囲は、ＰＳＭＡ濃度の６桁の大きさを網羅しており、合計のダイナミックレンジは、よそ１桁の大きさだけ広い。分析物濃度は、非線形領域の外において同様に読み取られ得、線形領域における濃度より小さい。
【００９０】
分析物定量化の線形範囲は、検出プローブと同じ活性部位に結合する試験物質の解離定数を決定するために、特に重要である。その原理は、検出プローブおよび試験物質の間における分析物の活性部位に対する結合についての、競合である。そのような大きいダイナミックレンジにおける競合の強度を測定するための可能性は、完全に新規であり、酵素反応速度論おいていまだに未知の、有益さを利用するためのいくつかの新たな関係を導出することが必要である。
【００９１】
第１に、上述した条件のもとに、結合されたプローブの決定された量は、不動化された分析物の量（より正確には、分析物の自由な活性部位の数）に正比例する。それは、活性部位に対して結合する試験物質の非存在において、分析物のすべての活性部位が、自由であり、かつ結合されたプローブの量は、活性部位の総数に対応し；試験物質が、活性部位のある数に結合されており、かつプローブがしたがってもはやそれらに結合できない場合、結合されたプローブの量は、残りの自由な活性部位の数に正比例することを意味する。したがって、活性部位の測定された濃度の、ｘ％までの減少から、ｘ％の活性部位が試験物質によって占有されていることが明らかになり；試験物質のありおよびなしの測定されたシグナルを比較は、結合された試験物質による活性部位の割合を直接に反映している。
【００９２】
試験物質の解離（阻害）定数に、検出プローブの解離（阻害）定数を説明する式（１）を適用する。
Ｋｉ＝［Ｅ］＊［Ｉ］／［ＥＩ］（７）
ここで、Ｋｉは試験物質の解離定数であり、［Ｅ］は自由な分析物の濃度であり、［Ｉ］は自由な試験物質の濃度であり、［ＥＩ］は、結合された試験物質と複合された試験物質の濃度である。次の導出における検出プローブに関連する変数は、式（１）と同じである。分析物の総量について、
Ｅｔｏｔ＝［Ｅ］＋［ＥＰ］＋［ＥＩ］（８）
を適用し、試験物質によって占有されている活性部位の比率は、
［ＥＩ］／Ｅｔｏｔ＝ｘ／１００（９）
に等しい。ここで、ｘはｍ百分率として表されている、試験物質によって占有されている活性部位との分析物の部分である。式（９）をＥｔｏｔについて解き、式（８）に代入し、式（１）から［ＥＰ］を解いて代入し、式（７）から［ＥＩ］に代入し、解くことによって、Ｋｉについての式：
Ｋｉ＝（１００／ｘ−１）＊［Ｉ］／（１＋［Ｐ］／Ｋｄ）（１０）
が得られる。試験物質の総（分析）濃度Ｉｔｏｔを用いた未結合の試験物質の濃度を表す式（９）からの［ＥＩ］を代入し、［Ｉ］について解いて、
［Ｉ］＝Ｉｔｏｔ−ｘ＊Ｅｔｏｔ／１００（１１）
を得る。Ｉｔｏｔは、結合されたプローブおよび未結合のプローブの濃度の総和（Ｉｔｏｔ＝［Ｉ］＋［ＥＩ］）である。
【００９３】
Ｋｉを算出するためにもたらされた式は、上記方法の定量的範囲における
Ｋｉ＝（１００／ｘ−１）＊（Ｉｔｏｔ−ｘ＊Ｅｔｏｔ／１００）／（１＋（［Ｐ］／Ｋｄ））（１２）
である。この式は、プローブの既知の分析濃度Ｐｔｏｔを用いて、自由な検出プローブ［Ｐ］の濃度を置き換えることによって、さらに単純化される。実質的に常に、Ｉｔｏｔは、Ｅｔｏｔより極めて大きく、全数（ｘ＊Ｅｔｏｔ／１００）は、したがって、Ｉｔｏｔに比べて無視され得る。そのとき、単純化された式は
Ｋｉ＝（１００／ｘ−１）＊Ｉｔｏｔ／（１＋（Ｐｔｏｔ／Ｋｄ））（１３）
である。
【００９４】
しかし実際上、阻害の百分率は、直接には測定されないが、試験物質よのインキュベーション後における残りの自由な分析物の量（Ｅｔｏｔ−［ＥＩ］）は、試験物質なしのインキュベーション後における分析物の総量（Ｅｔｏｔ）（すなわち（Ｅｔｏｔ−［ＥＩ］／Ｅｔｏｔ））と比較される。２つの量のそれぞれについて、当該量に反比例する（すなわち、分析物の自由な活性部位の量が減少するにつれて測定されたＣｑ値が増大する）Ｃｑ値が測定される。ΔＣｑが、試験物質とのインキュベーションについて測定されたＣｑから減じられた、試験物質なしのインキュベーションについて測定されたＣｑと規定されるなら、そのとき、
（Ｅｔｏｔ−(［ＥＩ］）／Ｅｔｏｔ＝（１＋ｅｆｆ．）−ΔＣｑ（１４）
を適用する。ここで、ｅｆｆ．は、最適条件において１に等しい、ＰＣＲ反応の効率である。
【００９５】
式（１３）は、阻害百分率について以前に述べられている関係を用いて、ふたたび公式化される。
Ｋｉ＝（（１＋ｅｆｆ．）−ΔＣｑ／（１−（１＋ｅｆｆ．）−ΔＣｑ））＊Ｉｔｏｔ／（１＋（Ｐｔｏｔ／Ｋｄ））（１５）。
【００９６】
ΔＣｑに依存するＫｉ測定の精度および範囲は、例えばこの依存性をグラフにプロットすることによって決定される。ΔＣｑに対するｌｏｇ  Ｋｉの依存性は、ΔＣｑ≧３のとき線形性であり、より低いΔＣｑのとき線形性から離れる。それは、より低いΔＣｑが、Ｋｄを算出するために使用され得ないことを意味せず、決定の標準誤差が、より低いΔＣｑのときより大きいだけである。ｑＰＣＲによるＣｑ決定の、通常の標準偏差（サイクルの０．１５に等しい）のときに、測定されたΔＣｑに依存する、決定されたＫｉの相対的な標準偏差は、以下の通りである（偏差の不均整は対数相関に起因する）。
ａ）サイクルのΔＣｑ＝０．２５のとき、＋１６４％〜４１％、試験物質による分析物の活性部位の１６％占有（すなわちこの物質による１６％阻害）に対応
ｂ）ΔＣｑ＝０．４２のとき、＋６４％〜３０％、２５％阻害に対応
ｃ）ΔＣｑ＝０．５のとき、＋５１％〜２７％、２９％阻害に対応
ｄ）ΔＣｑ＝１．０のとき、＋２５％〜１３％、５０％阻害に対応
ｅ）ΔＣｑ＝２．０のとき、＋１５％〜１３％、７５％阻害に対応
ｆ）ΔＣｑ＝３．０のとき、＋１３％〜１１％、８８％阻害に対応
ｇ）ΔＣｑ≧５．０のとき、＋１１％〜１０％、９７％阻害に対応。
【００９７】
これは、０．４２以上のΔＣｑが、Ｋｉの算出に好適であることを意味する。ここで、ΔＣｑ≧１．０のとき、著しく高い正確さが実現される。６桁の大きさの線形範囲について、適用可能なΔＣｑ範囲は、２５％〜９９．９９９９％の範囲における阻害百分率に対応する０．４２〜０．２０である。９９．９９９８％および９９．９９９９％阻害における差と同程度に小さい絶対値の差の区別は、分析物の残りの自由な部位（量が、対応する場合に０．０００２％および０．０００１％である）が測定され、検出が、対数的（絶対値の差おりむしろ倍数の変化が検出されることを意味し、ΔＣｑが１に等しい場合に２倍の変化に対応する）である事実のために、非常に良好かつ正確に可能である。標準偏差を示している線を含んでいるＫｉおよびΔＣｑの依存性は、図４におけるグラフにプロットされている。
【００９８】
分析物に二重に結合可能な２価の検出プローブを用いる方法における試験物質のＫｉを算出するための式は、同様に導出され得る。
Ｋｉ＝（１−２＊Ｒａｆｆ）／（１−Ｒａｆｆ−（Ｒａｆｆ２＋（１＋ｅｆｆ．）−ΔＣｑ−２＊Ｒａｆｆ＊（１＋ｅｆｆ．）−ΔＣｑ）０．５）（１６）
ここで、Ｒａｆｆは２価および１価のプローブの解離定数の比率に等しい。上記式は、特に、自由な活性部位の変量にともなって、１価のプローブより険しいΔＣｑの変化があることを意味する。Ｃｑ決定の正確さは変わりないので、１価のプローブについて述べられている正確さより高い、Ｋｉ決定の正確さを生じる。
【００９９】
上述の手順とともに、ウェルへＣＡ−ＩＸ  ＰＧの１ｎｇをアプライ後、濃度依存性の結合検出プローブ量を測定し、プローブの解離定数が、プローブの最も高い使用濃度、すなわち５０ｎｍｏｌ．ｌ−１よりも著しく高いことが分かった。さらに、検出プローブの濃度５ｎｍｏｌ．ｌ−１において、ゼロ・コントロールのウェルと、ＣＡ  ＩＸ  ＰＧの１ｎｇを伴うウェルとにおいて測定されたＣｑの差異は約１０サイクルであり、これは結合したプローブの量において２桁以上の差異に相当する。同じ条件下で、ＣＡ−ＩＸ  ＰＧの定量のダイナミックレンジは５０ｐｇから１ｎｇであった。表１３を参照のこと。同じ手順において、検出プローブの溶液への、０．１％から１０％（体積／体積）の濃度でのＤＭＳＯの添加は、プローブの選択的結合または非選択的結合へ影響しないことが実証された。
【０１００】
上記反応緩衝液中におけるプテロイル−ビス（Ｌ−グルタミン酸）Ａｖｉ−ＰＳＭＡの切断の反応速度パラメータ（ＫＭおよびｋｃａｔ）は、上述の手順に従って決定した。上記決定においては、阻害剤を加えず、１５ｎｍｏｌ．ｌ−１〜４００ｎｍｏｌ．ｌ−１の範囲の種々の基質濃度を用いた。すべての反応の反応率は、１３±２％であった。次に、競合阻害であると仮定し、上記パラメータを用いて、測定されたＩＣ５０の値を阻害定数（Ｋｉ）の値に変換した。上記変換は、Cheng-Prusoff式［Cheng et al., 1973, Biochemical Pharmacology, p. 3099］に従った。
【０１０１】
本発明の実際の利点は、主に多くの受容体および酵素が、治療処置のための公的な標的であり、それらの阻害が有益であるので、重要な分析物の活性部位に強力かつ選択的に結合する多くの化合物の化学構造が、すでに知られていることである。また同様に、病原体および宿主の間における重要な相互作用は、特に病原体の表面リガンドおよび宿主細胞受容体の間の相互作用を阻害することによる、治療処置の標的である。難治性または不治のウイルス性疾患に対する最も有効な薬物は、ウイルス複製にとっての重要な酵素の非常に強力な阻害剤である。ＨＩＶプロテアーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素、およびＨＣＶ  ＮＳＳＢポリメラーゼの阻害剤は、臨床的に最も有効に使用される阻害剤に属する。臨床用途にとって、低分子物質は、必須に、毒性ではなく、水相に可溶であり、本願に開示されている方法は、分析物の選択的な結合に関する化合物だけでなく、毒性化合物、または水相に難溶もしくは完全に不溶な化合物を好ましく利用する。非常に極性かつ可溶性のオリゴヌクレオチドとのそれらの複合が、生じた検出プローブが、決定のために求められる濃度において容易に溶解されるほどに、それらの可溶性を向上させるので、分析物の選択的な結合のための不溶な化合物が、使用され得る。
【０１０２】
本発明の他の局面において、上記分析物の上記活性部位に対する上記検出プローブの選択的な結合は、当該分析物の当該活性部位に結合する、試験物質の能力を測定することに使用される。この構成において、上記検出プローブは、上記分析物とともに、試験物質または試験される複数の物質の集合の存在下においてインキュベートされる。上記試験物質が上記分析物の上記活性部位に結合する場合、結合されているプローブの量は、上記試験物質の非存在におけるインキュベーションと比べて減少する。上記試験物質の解離定数（Ｋｄ）（上記分析物が酵素である場合の阻害定数（Ｋｉ）に対応する）は、上記プローブの結合および試験物質の使用される濃度の減少の程度から算出され得ることが分かった。したがって、設定の大きなダイナミックレンジは、非常に重大である；上記分析物に対する試験物質の解離定数が、測定に使用される単一濃度の試験物質から、上記方法のダイナミックレンジの全体において算出され得るからである。これは、試験物質の使用される濃度１ｍｍｏｌ−１（およびそのＫｄに対応する検出プローブの使用される濃度）に基づいて、０．５ｍｍｏｌ−１〜０．５ｎｍｏｌ−１の範囲における物質の解離定数を、６桁の大きさの範囲において定量的に決定できること、すなわち、０．５μｍｏｌ−１〜０．５ｐｍｏｌ−１の範囲における上記物質の解離定数が、試験物質の使用される濃度１μｍｏｌ−１に基づいて、定量的に決定され得ることを意味する。以下に示す通り、測定可能なＫｄの範囲は、試験物質の濃度を変更すること、または上記検出プローブの濃度を変えることによって変更され得る。
【０１０３】
本発明の他の局面において、ｑＰＣＲは、不動化されているオリゴヌクレオチドタグ、およびしたがって結合されている検出プローブの検出および定量化に使用され、上記決定の感度を非常に向上させる。例えば、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ抗原、ＰＳＡと区別されている）の検出について、数十アトグラム（数十のタンパク質分子に等しい）の感度が実現された。これは、現状のＰＳＭＡ検出法よりおよそ百万倍小さい。他の抗原の検出の、そのような感度は、導入部にすでに述べたＰＳＡを用いた根治的な前立腺摘除術の後における、特定のがんの早期の検出（例えば、前立腺がんの進行を決定すること）を可能にし得る。また、１つの混合物における複数のヌクレオチド鋳型の平行する決定は、標準的かつ一般的な方法であるので、ｑＰＣＲを用いることは、複数の分析物の、同時並行の決定を可能にする。ｑＰＣＲを用いることの主な他の利点は、分析物の濃度を決定する大きなダイナミックレンジに表れている。いくつかの分析物の検出について、もとのサンプルにおける分析物の濃度における差の、６〜７桁（ＥＬＩＳＡアッセイの場合より３〜４桁大きい）大きくなる。
【０１０４】
続くステップにおいて、固体担体は、洗浄されて未結合のプローブをなくし、それから、結合されているプローブの量が、好ましくはｑＰＣＲによって、決定される。ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、プライマー、ｄｓＤＮＡ検出用の蛍光発生性のプローブもしくは蛍光色素、および添加剤を有しているバッファーを典型的に含んでいる、ｑＰＣＲ反応混合物が、洗浄された固体担体に加えられる。続いて、オリゴヌクレオチドタグは、ｑＰＣＲにおいて増幅され、各サイクルの間に、各サンプルについてのＣｑ値が算出される蛍光強度が、モニターされる。Ｃｑ値は、プローブの濃度の対数に反比例し、逆に分析物の濃度に比例する。ｑＰＣＲの処理および評価は、詳細を説明する必要のない現在の通常の方法である。
【０１０５】
本発明はまた、新規基質の同定およびそれらの動態パラメータＫＭおよびｋｃａｔの決定を可能にする。これは、検出プローブが種々の濃度試験物質の存在下において酵素とインキュベートされるように実施される。物質が基質である場合に、これらの濃度において基質の大部分が酵素によって切断されるので、Ｋｉによって特徴づけられている活性部位からのプローブの移動だけでなく、試験物質の濃度低下にしたがった明らかなＫｉの低下がある。試験物質の変化する濃度にしたがってＫｉ値の変化がないより高い物質濃度において、測定されたＫｉが、ＫＭに対応することは、明らかである。そのとき、ｋｃａｔ算出について、
Ｋｃａｔ＝（Ｓ０−Ｓｔ＋ＫＭ＊１ｎ（Ｓ０／Ｓｔ））／（Ｅｔｏｔ＊ｔ）（１７）
を適用する。ここで、Ｓ０は初期濃度であり、Ｓｔは時間ｔにおける基質の濃度であり、ｔは、酵素と基質のインキュベーション時間である濃度Ｓｔは、式に１５にしたがって、試験物質とのインキュベーションの間に測定されるΔＣｑから算出される。ＫｉにＫＭが代入され、式は、Ｓｔに対応するＩｔｏｔについて解かれる。
【０１０６】
この用途において、上記固体担体は、上記分析物を選択的に結合可能な結合分子の不動化、または分析物の直接的な不動化のための基材の役割を果たす。上記固体担体は、余分な化学物質（特に未結合の検出プローブ）の、洗浄による容易な除去、およびしたがって、ＥＬＩＳＡの一般に使用されている免疫アッセイと同様に、結合されているプローブの量の選択的な決定を可能にする。上記固体担体は、結合分子の不動化、分析物およびプローブの結合、ならびに検出プローブのヌクレオチドタグの検出（好ましくはｑＰＣＲによる）に使用される溶液の置き換えを可能にする。
【０１０７】
極めて感度のよい検出は、極めて少量の組織を取り、それにより外科手術の侵襲性を減少することを可能とするため、前立腺摘除術後の癌患者の血清中のＰＳＡの決定のためだけなく、組織生検のためにも重要である。サブミクロモルの親和性を有する化合物から調製される検出プローブによって、１０ｆｇの感度が達成された、ＣＡ−ＩＸの実施例に従うと、上記化合物および上記分析物のミクロモルの解離定数によって、１００ｋＤａの分子量を有する１ｐｇの分析物に対応する、１０ａｍｏｌより低い感度を有する、分析物の検出が通常、可能となるであろうことが推測され得る。
【０１０８】
酵素阻害剤についての、これまで使用されている高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）アッセイは、基質／生成物、または試験物質による活性部位プローブの置換の定量にほとんど基づいている（Inglese et al. 2007, Nature Chemical Biology, p. 466）。アッセイの第１の型は、マラカイトグリーンおよびリン酸の反応に由来する着色された生成物の吸収測定であり、当該リン酸は、ホスホリラーゼの反応によって遊離される（Gad et al. 2014, Nature, p. 215）。最も多用途なアッセイは、活性部位プローブを利用し、試験物質による活性部位からのそれらの置換を検出する。これらのアッセイにおける典型的な読み出しは、蛍光発光または蛍光偏光であり、測定される特性は、プローブの結合状態および未結合状態の間において異なり、これらの２つの状態を識別可能にしている（Inglese et al. 2007, Nature Chemical Biology, p. 466）。これらのアッセイの汎用性にもかかわらず、それらは、多量のプローブおよび酵素の使用を必要とする低感度な検出に困る（Alquicer et al. 2012, J Biomol Screen, p. 1030）。したがって、これらのアッセイは、より弱い阻害剤が、そのＫｄを大きく超える濃度において使用されるプローブを置き換えることができないので、偽陰性の結果を多く生じる傾向にあり得る。例えば、プローブの作用濃度が、そのＫｄを超えて２０倍であり、かつ陽性の結果が、蛍光偏光における５０％減衰の後に記録されるなら、５０ｎｍｏｌ−１に満たないＫｉを有している阻害剤のみが、１μｍｏｌ−１の試験物質が使用される場合に検出される。さらに、バックグラウンドに対するシグナルの比は、典型的に１桁以下であり、したがって、試験物質の結合についての定性的な情報のみが得られる（Inglese et al. 2007, Nature Chemical Biology, p. 466; Gad et al. 2014, Nature, p. 215）。これらのアッセイのさらなる問題は、蛍光発光または着色された物質を、それらがアッセイの読み出しに干渉するために、正確に選別できないことである。
【０１０９】
結合分子に対する選択的な、または固体担体の表面に対する直接の、サンプルからの分析物の結合後に、固体担体は、分析物の活性部位（リガンド部分）に選択的に結合する、オリゴヌクレオチドタグを有している化学リンカーを介して共有結合されている、不動化された分析物の活性部位に対する、プローブのリガンド部分の選択的な結合のための、化合物からなる検出プローブの溶液とインキュベートされる。検出プローブの非特異的な結合を抑制するために、検出プローブは、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カゼインおよびカゼインから調製されたブロッキング剤、血清アルブミン、免疫グロブリンまたはＤＮＡからなる群から選択される成分を含んでいる溶液を用いて、好ましく希釈される。
【０１１０】
ＰＳＭＡ用の検出プローブを、尿素系ＰＳＭＡ阻害剤であるＳ，Ｓ−２−［３−［５−アミノ−１−カルボキシペンチル］−ウレイド］−ペンタン二酸を、ＤＮＡに対して結合させることによって作製した。続いて、上記阻害剤の誘導体を作製した：上記ＤＮＡオリゴヌクレオチドのアミノ基に対して結合するための、末端のＮＨＳ−エステルを有しているリンカーを有している阻害剤（化合物３）。上記ＤＮＡオリゴヌクレオチドの結合の、阻害能に関する影響の決定のために、上記化合物を、エタノールアミンと反応させた（化合物４）。
【０１１１】
本発明に係る方法の好ましい他の実施形態において、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩとしても知られるヒト前立腺特異膜抗原が、上記分析物として使用され、ヒト前立腺特異膜抗原の阻害剤が、選択的に結合するための化合物として使用されるか；またはヒトグルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩＩが分析物として使用され、ヒトグルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩＩの阻害剤が選択的に結合するための化合物として使用されるか；またはヒト炭酸脱水素酵素ＩＸが分析物として使用され、ヒト炭酸脱水素酵素ＸＩＩが選択的に結合するための化合物として使用されるか；またはヒト炭酸脱水素酵素ＸＩＩが分析物として使用され、ヒト炭酸脱水素酵素ＩＸが選択的に結合するための化合物として使用されるか；またはヒトインフルエンザノイラミニダーゼが分析物として使用され、ヒトインフルエンザノイラミニダーゼの阻害剤が選択的に結合する化合物として使用されるか；またはヒト繊維芽細胞活性化タンパク質が分析物として使用され、ヒト繊維芽細胞活性化タンパク質の阻害剤が選択的に結合される化合物として使用されるか；またはＣＤ２６としても知られるヒトジぺプジルペプチダーゼ４が分析物として使用され、ヒトジぺプジルペプチダーゼ４の阻害剤が選択的に結合するための化合物として使用される。
【０１１２】
化合物１７である、１−（６−アジドへキシル）−１−メチル−（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ)−４−アセチルアミノ−５−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノ−３−（１−エチルプロポキシ)−１−シクロへキセン−１−ホスホネートは、（Ｃａｒｂａｉｎ  ２０１０，  Ｄｏｃｔｏｒａｌ  ｔｈｅｓｉｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｕｓｓｅx）中に説明された手順と同様にして調製した。
【０１１３】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、酵素の選択的な定量のための方法の原理を示している。Ａｂは、固体担体上に不動化されている抗体であり、Ｅｎは、上記抗体によって認識されるサンプルに含まれている酵素である。
【０１１４】
図２Ａ〜Ｅは、ｑＰＣＲによって検出されるオリゴヌクレオチドタグに対して共有結合的に連結されている、分析物（ここでは阻害剤）の活性部位に対する選択的な結合のための化合物からなる検出プローブの考えられる構成を示している。オリゴヌクレオチドタグは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ；Ａ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ；Ｂ）であり得、蛍光団またはビオチンを任意に含んでいる（Ｃ）。検出プローブ上にあるビオチンは、代替的な検出のための共有結合されている蛍光団または酵素を任意に有している、４量体型のビオチン結合タンパク質（例えば、ニュートラアビジン（Ｎｅｕ））に対する結合後に、４価の粒子を形成するために使用され得る（Ｄ）。また、検出プローブは、金ナノ粒子（Ａｕ）の表面に結合され得る（Ｅ）。より高い結合活性を実現するために、分析物の選択的な結合のための２つ以上の同じ化合物は、個々に、オリゴヌクレオチドタグの異なる位置に共有結合的に連結され得る（Ｆ）。
【０１１５】
図３Ａ、Ｂは、分析物の活性部位に結合する、試験物質の力を決定する原理を示している。図３Ａは、酵素を結合している固体担体が、検出プローブのみとインキュベートされ；ｑＰＣＲにおいて測定されるシグナルが、結合されている酵素の量に比例する（下部）状況を説明している。図３Ｂは、酵素を結合している固体担体が、検出プローブおよび試験物質の混合物とインキュベートされる状況を示している。試験物質が活性部位に結合する場合に、結合される検出プローブの量は、比例的に減少し、ｑＰＣＲによって測定されるより高いＣｑを生じ、かつ酵素の総量に対する残りの自由な酵素の比率は、試験物質とのインキュベーションの間のＣｑ値、および当該物質なしのＣｑ値の差異に比例する。
【０１１６】
図４は、検出プローブを有している分析物の、試験物質とのインキュベーション後におけるサイクル数、および当該物質なしのサイクル数の間における、測定された差異（ΔＣｑ、ｘ軸）に応じた、試験物質の決定された解離定数（ｙ軸）の精度を示している。太線は、測定されたΔＣｑに応じた、試験された物質の決定された解離定数をプロットしている。大きいΔＣｑ値についての解離定数の対数は、そのΔＣｑに正比例している。小さいΔＣｑ値について、相関関係は、線形性から逸脱しており；顕著な逸脱が、ΔＣｑ値の低いほど認められ；したがって、細い破線は、直接の相関関係を示している。細いグレイの線は、その定量の解離定数＋−標準偏差の値を示している。
【０１１７】
図５は、ＰＳＭＡを選択的に結合するための検出プローブ（ｓｓＰＳＭＡ）の構造を示している。オリゴヌクレオチドタグ配列内のヌクレオチドは、１文字コードを用いて記載されている。
【０１１８】
図６は、ＰＳＭＡに選択的な検出プローブ（ｓｓＰＳＭＡ）のＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ分析において測定された質量スペクトル（電荷についての質量がｘ軸にプロットされている）を示している。記載されているピークから決定された、算出された質量は、１７４２６．８４である。
【０１１９】
図７は、ｉｑＰＣＲに対して相補的な、３’末端に修飾されているオリゴヌクレオチドを示している。一本鎖ＤＮＡの３’末端に、ビオチン（２−ヒドロキシ−１８−オキソ−２２−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＳ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）−４，７，１０，１３−テトラオキサ−１７−アザドコシルリン酸塩）が、化学リンカーを介して結合されている。
【０１２０】
図８は、種々の検出プローブの種々の濃度についての、ウェルにおけるＰＳＭＡタンパク質の量（ｘ軸）に対する、測定されたＣｑ値（ｙ軸）の依存関係を示している。
【０１２１】
図９は、ＰＳＭＡ分子の数（ｘ軸）に対する、測定されたＣｑ値（ｙ軸）の依存関係を示している。検出限界（ＬＯＤ）および定量限界（ＬＯＱ）が、縦の破線によって示されている。
【０１２２】
図１０は、本明細書に開示されている方法によって測定された計１５の正常なドナーから得られたクエン酸血漿のサンプルにおけるＰＳＭＡ濃度（ｘ軸）、および放射性酵素学的アッセイ（ｙ軸）の相関関係を示している。
【０１２３】
図１１は、本明細書に開示されている方法（ｙ軸）、および基準の酵素反応速度論（ｘ軸）を用いて測定された、Ａｖｉ−ＰＳＭＡに対する種々の物質の阻害定数Ｋｉの相関関係を示している。より良好な明確さのために、グラフの両方の軸は、対数目盛において示されている。
【０１２４】
図１２は、ｒｈＰＳＭＡ（ｙ軸）および血漿からの内因性のＰＳＭＡ（ｘ軸）についての、本明細書に開示されている方法を用いて測定された種々の物質の阻害定数Ｋｉを示している。
【０１２５】
図１３は、分析物の選択的な結合のための、調製された検出プローブの構造を示している。オリゴヌクレオチド配列内のヌクレオチドが、１文字コードを用いて記載されている。
Ａ）ＨＩＶプロテアーゼの選択的な結合のための化合物を有している、検出プローブ（ｓｓＨＩＶ１）
Ｂ）炭酸脱水酵素の選択的な結合のための化合物を有している、検出プローブ（ｓｓＣＡ）
Ｃ）アスパラギン酸プロテアーゼの選択的な結合のための化合物を有している、検出プローブ（ｓｓＡＰ）
Ｄ）インフルエンザノイラミニダーゼの選択的な結合のための化合物を有している、検出プローブ（ｓｓＡＤ＿ＮＡ）。
【０１２６】
図１４は、ｐＨ６．０における直接的な抗原吸着を採用している本明細書に開示されている方法（２つの独立した測定の平均、ｙ軸）、およびｐＨ４．７における基準の酵素反応速度論（ｘ軸）を用いて測定された、ＨＩＶプロテアーゼに対する種々の物質の阻害定数Ｋｉの相関関係を示している。より良好な明確さのために、グラフの両方の軸は、対数目盛において示されている。
【０１２７】
図１５は、ｐＨ７．４における本明細書に開示されている方法（ｙ軸）、およびｐＨ４．７における基準の酵素反応速度論（ｘ軸）を用いて測定されたＨＩＶプロテアーゼに対する種々の物質の阻害定数Ｋｉの相関関係を示している。より良好な明確さのために、グラフの両方の軸は、対数目盛において示されている。
【０１２８】
図１６は、本発明にしたがって（ｙ軸）、および基準の酵素反応速度論を用いて（ｘ軸）測定された、炭酸脱水素酵素に対する種々の物質の阻害定数Ｋｉの相関関係を示している。より良好な明確さのために、グラフの両方の軸は、対数目盛において示されている。
【０１２９】
図１７は、二価のプローブｓｓＣＡｂｉｓを用いた、細胞溶解液におけるＣＡーＩＸの量（株ＨＴ−２９、ｘ軸）に対する、測定されたＣｑ値（ｙ軸）の、依存関係を示している。
【０１３０】
図１８は、２価のプローブｓｓＣＡｂｉｓを用いて（ｙ軸）か、または市販のＥＬＩＳＡキット（RnD System、ｘ軸）によって、３６のボランティアの血液において本発明にしたがう方法によって測定されたＣＡ−ＸＩの濃度の比較を示している。実線は、対数的に変換された濃度の直線回帰を表しており、破線は、直線回帰より１．２５倍、大きい値または小さい値を示している。エラーバーは、２つ１組の標準偏差に対応する。
【０１３１】
図１９は、個々の提供者の診断によって分類されている（正常な１２の男性（正常）、淡明細胞型腎臓がんであると組織学的に確認されている１０の男性および２の女性（ｃｃＲＣＣ）、ならびに前立腺がんであると組織学的に確認されている１２の男性（ＰＣａ））、２価のプローブｓｓＣＡｂｉｓを用いた、本発明にしたがう方法による血清における、測定されたＣＡ−ＸＩの濃度を示している。表示＊および＊＊は、測定された濃度が、患者の２つの群において正常な人と比べて有意に異なっていた（マンホイットニー検定、ｐ＜０．０５）ことを示している。
【０１３２】
〔実施例〕
（溶液の組成）
改変バッファー  １００ｍｍｏｌ．ｌ−１のリン酸バッファー；１５０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌ；ｐＨ＝７．８
ＴＢＳ  ２０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＴｒｉｓ；１５０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌ；ｐＨ＝７．４
ＴＢＳＴ  ２０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＴｒｉｓ；１５０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌ；０．０５５のＴｗｅｅｎ２０（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）
ＴＢＳＴ２００  ２０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＴｒｉｓ；１５０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌ；ｐＨ＝７．４；０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）
ＴＳＢＴ’  ２０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＴｒｉｓ；２００ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌ；ｐＨ＝７．４；０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）
ＣａＳＤＳ  ２０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＴｒｉｓ；１５０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌ；ｐＨ＝７．４；０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）；０．００５のＳＤＳ（ｈｍ．／ｏｂｊ．）；５００倍希釈のカゼインブロッカー（ＳＤＴ；カタログ番号．ＣＢＣ１）
ＴＢＳＥ  ２０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＴｒｉｓ；１５０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌ；ｐＨ＝７．４；５ｍｍｏｌ．ｌ−１のＥＤＴＡ
ＭＥＳＴ  ２０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＭＥＳ；７５０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌ；ｐＨ  ６．０；０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）
ＣＬＰ  ５０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＴｒｉｓ；１００ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌ；ｐＨ＝７．４
ＨＥＰＥＳＴＣ  １００ｍｍｏｌ．ｌ−１のＨＥＰＥＳ；４００ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌ；ｐＨ＝７．５；０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）；２０００倍希釈のカゼインブロッカー（ＳＤＴ；カタログ番号．ＣＢＣ１）
ＨＥＰＥＳＴＣ’  １００ｍｍｏｌ．ｌ−１のＨＥＰＥＳ；４００ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌ；ｐＨ＝７．５；０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）；５００倍希釈のカゼインブロッカー（ＳＤＴ；カタログ番号．ＣＢＣ１）。
【０１３３】
（用語および略語の説明）
ＧＣＰＩＩ  グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ
ＰＳＭＡ  前立腺特異膜抗原
Ａｖｉ−ＰＳＭＡ  Ｎ末端に付されているＡｖｉ−タグを有している前立腺特異膜抗原の細胞外部分からなるタンパク質
ｒｈＰＳＭＡ  組換えヒト前立腺特異膜抗原
ＧＣＰＩＩＩ  グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩＩ
Ａｖｉ−ＧＣＰＩＩＩ  Ｎ末端に付されているＡｖｉ−タグを有しているグルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩＩの細胞外部分からなるタンパク質
ｓｓＰＳＭＡ  ＰＳＭＡの検出用の検出プローブ（一本鎖オリゴヌクレオチドタグを含んでいる）の意味
ｄｓＰＳＭＡ  ＰＳＭＡの検出用の検出プローブ（二本鎖オリゴヌクレオチドタグを含んでいる）の意味
ｄｓＡ３ＰＳＭＡ  ＰＳＭＡの検出用の検出プローブ（二本鎖オリゴヌクレオチドタグを含んでいる）の意味
ｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡ  ＰＳＭＡの検出用の検出プローブ（ビオチン化されている二本鎖オリゴヌクレオチドタグを含んでいる）の意味
Ｎｅｕ＿ｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡ  ＰＳＭＡの検出用の検出プローブ（ニュートラアビジンに結合されている、ビオチン化されている二本鎖オリゴヌクレオチドタグを含んでいる）の意味
ＮｅｕＨＲＰ＿ｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡ  ＰＳＭＡの検出用の検出プローブ（ペルオキシダーゼと複合されているニュートラアビジンに結合されている、ビオチン化されている二本鎖オリゴヌクレオチドタグを含んでいる）の意味
ｓｓＨＩＶ  ＨＩＶプロテアーゼの検出用のプローブ（一本鎖オリゴヌクレオチドタグを含んでいる）の意味
ＣＡ−ＩＩ  炭酸脱水酵素ＩＩ
ＣＡ−ＩＸ  炭酸脱水酵素ＩＸ
ｓｓＣＡ  炭酸脱水酵素の検出用のプローブ（一本鎖オリゴヌクレオチドタグを含んでいる）の意味
ｓｓＣＡｂｉｓ  炭酸脱水酵素の検出用の２価のプローブ
Ｎｅｕ＿ｄｓｂｉｏｔＣＡ  炭酸脱水酵素の検出用のプローブ（ニュートラアビジンに結合されている、二本鎖オリゴヌクレオチドタグを含んでいる）の意味
ｓｓＡＰ  アスパラギン酸プロテアーゼの検出用のプローブ（一本鎖オリゴヌクレオチドタグを含んでいる）の意味
ｓｓＡＤ  ＤＢＣＯの結合されているオリゴヌクレオチドの意味
ｓｓＡＤ＿ＮＡ  インフルエンザノイラミニダーゼの検出用の検出プローブの意味
ｅｑ  等量
ＲＴ  滞留時間
Ｔｗｅｅｎ２０  ポリオキシレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＵＳＢ、カタログ番号．２０６０５）
ＤＩＡＤ  ジイソプロピルアゾジカルボキシレート
ＤＢＣＯ  ジベンゾイルシクロオクチン
ＨＥＰＥＳ  Ｎ−２−ヒドロキシエチレンピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸
ＳＤＳ  ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ドデシル硫酸ナトリウムを有している、電気泳動用のポリアクリルアミドゲル
ＬＣ−ＭＳ  液体クロマトグラフィー−質量分析
ＥＳＩ  エレクトロスプレーイオン化
ＦＢＳ  ウシ胎児血清
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ＤＩＥＡ  ジイソプロピルエチレンアミン
ＡＣＮ  アセトニトリル
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＤＰＰＡ  ジフェニルホスホリルアジド
ＴＥＡ  トリエチルアミン
ＥＰＧ５  ５つの連結されているエチレングリコールの単位
ＨＯＢＴ／ＤＩＣ  ヒドロキシベンゼントリアゾール／ジイソプロピルカルボジイミド
ＡＡＺ  アセタゾールアミド
ＤＣＣ  ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＵ  ジシクロヘキシル尿素
ＴＢＴＵ  Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
ＨＲＭＳ  高分解能質量分析計。
【０１３４】
〔実施例１：ＰＳＭＡの定量化、およびＰＳＭＡ阻害剤の効能の試験〕
［１ａ：リンカーおよび活性化されているＮＨＳエステルを有している、ＰＳＭＡ阻害剤の作製］
ＰＳＭＡ用の検出プローブを、尿素系ＰＳＭＡ阻害剤であるＳ，Ｓ−２−［３−［５−アミノ−１−カルボキシペンチル］−ウレイド］−ペンタン二酸を、ＤＮＡに対して結合させることによって作製した。続いて、上記阻害剤の誘導体を作製した：上記ＤＮＡオリゴヌクレオチドのアミノ基に対して結合するための、末端のＮＨＳ−エステルを有しているリンカーを有している阻害剤（化合物３）。上記ＤＮＡオリゴヌクレオチドの結合の、阻害能に関する影響の決定のために、上記化合物を、エタノールアミンと反応させた（化合物４）。
【０１３５】
別途言及されていない限り、すべての化学薬品は、Sigma-Aldrichから購入した。分析用Jasco PU-1580 HPLC（流速：１ｍｌ／分、不変勾配：３０分間で２〜１００％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）ＡＣＮ、ＲＴ：それぞれの化合物に対して示した）、およびカラムWatrexC18 Analytical Column（５μｍ、２５０×５ｍｍ）を用いて、化合物の純度を試験した。分取スケールHPLC Waters Delta 600（流速：７ｍｌ／ｍｉｎ、勾配およびＲＴ：それぞれの化合物に対して示した）、およびカラムWaters SunFire C18 OBD Prep Column（５μｍ、１９×１５０ｍｍ）を用いて、すべての最終生成物を精製した。すべての最終生成物は、９９％以上の純度のものであった。LTQ Orbitrap XL（Thermo Fisher Scientific）のＨＲＭＳ、およびＮＭＲ（クライオプローブが備えられているBruker Avance I（商標）500 MHz、またはBruker Avance I（商標）400 MHz）によって、上記最終生成物の構造をさらに確かめた。
【０１３６】
３，３’−オキシジプロパン酸（化合物１）の作製：２．３８ｍｌ（２０ｍｍｏｌ）の３，３’−オキシジプロパンニトリルを７ｍｌの濃塩酸に溶解させ、２４時間、５０℃まで熱した。次に、反応混合物を一晩放置して冷却し、窒素気流により塩酸を除去した。生じたスラリーを水に溶解させ、凍結乾燥させた。２．２５ｇの白色の生成物を得た（収率＝７０％）。上記生成物のスペクトル分析は、［White et al. 2003, Tetrahedron-Asymmetry, p. 3633］に記載されているものと同一だった。
【０１３７】
ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）３，３’オキシジプロピオナート（化合物２）の作製：化合物１（２６０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６６０ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ、２ｅｑ）の溶液（１０ｍｌのＴＨＦ中）に対して、固体ＤＣＣ（３６８ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を一度に加えた。反応を一晩放置した後、ＤＣＵを濾過し、揮発性物質を回転させながら蒸発させた。クロマトグラフィー（Ｈｅ：ＥｔＯＡｃ  １：２）により、粗生成物をさらに精製した。３３８ｍｇの純生成物を得た（単離された収量＝６０％）。分析用ＨＰＬＣのＲＴ＝１６．２分。
【０１３８】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）による分析結果：δ 3.85 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.90 (t, J= 6.4 Hz, 4H), 2.83 (bs, 8H)。
【０１３９】
１３ＣＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）による分析結果：δ 169.07, 166.77, 65.78, 32.20, 25.73。
【０１４０】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）による分析結果：Ｃ１４Ｈ１６Ｏ９Ｎ２［ＭＮａ］＋の計算上の質量３７９．０７４８０、検出された質量３７９．０７４６９。
【０１４１】
１９−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−５，１３，１９−トリオキソ−１６−オキサ−４，６，１２トリアザナノデカン−１，３，７トリカルボン酸（化合物３）の作製：１ｍｌのＤＭＦ中に溶解している、化合物２（６９ｍｇ、１９３μｍｏｌ、１．２ｅｑ）の攪拌されている溶液に対して、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル２−（３−（６−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−１−オキソヘキサン−２−イル）ウレイド）ペンタンジオアート（１００ｍｇ、１６１μｍｏｌ、１．０ｅｑ、［Murelli et al. 2009, Journal of the American Chemical Society, str. 17090］に記載されている通りに作製された）およびＤＩＥＡ（３４μｌ、１９３μｍｏｌ、１．２ｅｑ）の溶液（１ｍｌのＤＭＦ中）を、１時間かけて滴下した。反応混合物を２時間攪拌し続けた。その後、ＨＰＬＣ分析によると、反応物質はすべて消失したことが判った。次に、溶媒を回転・真空環境下によって(by rotary vacuo)除去し、化合物を完全に乾燥させた。次に、トリフルオロ酢酸を窒素気流により除去する、室温、１時間のインキュベーションの後、１ｍｌのＴＦＡを粗混合物に加えて、標記の化合物を得た。分取用ＨＰＬＣ（勾配：４０分間で５〜５０％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）ＡＣＮ、ＲＴ  １８分間）を用いて、粗生成物を精製した。２０ｍｇの生成物を得た（単離された収量＝２２％）。分析用ＨＰＬＣのＲＴ＝１３．７分間。
【０１４２】
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）による分析結果：
【０１４３】
【化１】
2019068838.tif 000002
【０１４４】
１３ＣＮＭＲ（１２５．７ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）による分析結果：
【０１４５】
【化２】
2019068838.tif 000003
【０１４６】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）による分析結果：Ｃ２２Ｈ３２Ｏ１３Ｎ４［ＭＮａ］＋の計算上の質量５８３．１８５８１、検出された質量５８３．１８５９６。
【０１４７】
１−ヒドロキシ−４，１０，１８−トリオキソ−７−オキサ−３，１１，１７，１９−テトラアザドコサン−１６，２０，２２−トリカルボン酸（化合物４）の作製：５ｍｇ（９．８７μｍｏｌ、１ｅｑ）の化合物３を、２００μｌのＤＭＦに溶解させ、６μｌ（９９μｍｏｌ、１０ｅｑ）のエタノールアミンを、１４μｌ（８０．４μｍｏｌ、８ｅｑ）のＤＩＥＡとともに、混合物に対して加えた。上記混合物を、一晩攪拌し続けた。溶媒を回転させながら蒸発させ、上記混合物をＡＣＮ／水に溶解させ、３回凍結乾燥させた（残存しているエタノールアミンを蒸発させるために）。さらなる精製なしに、化合物を生化学研究に用いた（唯一の不純物はＮＨＳであり、ＮＨＳを無視すれば純度は９５％超であった）。分析用ＨＰＬＣ  ＲＴ＝１１．３分間。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）による分析結果：Ｃ２０Ｈ３３Ｏ１１Ｎ４［Ｍ］＋の計算上の質量５０５．２１５１３、検出された質量５０５．２１５１５。
【０１４８】
［１ｂ：ＰＳＭＡに対して選択的に結合するための検出プローブの作製］
ＰＳＭＡに対して選択的に結合するための検出プローブは、化合物３および６−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）ヘキシルリン酸の修飾を３’末端に有している一本鎖ＤＮＡの、反応によって作製した。上記一本鎖ＤＮＡの配列は、ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  Ａであった（Generi-Biotechに委託合成、ＯＰＣ精製）。
【０１４９】
オリゴヌクレオチド（以下、ｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏと表記する）を、１ｍｍｏｌ．ｌ−１の濃度で、再蒸留水に溶解させた。続いて、Amicon Ultra 0.5 ml 3K column（Millipore, カタログ番号：UFC500396）での反復される限外濾過により、溶液の一部について、水を１００ｍｍｏｌ．ｌ−１のリン酸緩衝液（１５０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌ（p.a.; Penta）を含んでいる。ｐＨ７．８。以下、「修飾緩衝液」）と置換した。上記溶液の残りは、限外濾過の各ステップ後に再蒸留水の溶液で希釈した以外は、同様に扱った。いずれの場合も、元の溶媒の総希釈度は、１０５倍であった。生じた溶液におけるオリゴヌクレオチド濃度は、２６０ｎｍにおける測定された吸収（Nanodrop ND-1000, Thermo Scientific）から算出した。オリゴヌクレオチド溶液の推定される光学濃度は、１ＯＤ＝１７４４ｐｍｏｌであった。
【０１５０】
実体および純度を確認するために、ｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏの蒸留水溶液を、陰イオンを検出するために設定されているデュアルＡＪＳ  ＥＳＩ源（4GHz, HiRes）が備えられているAgilent 6230 TOF LC/MS装置（Agilent Technologies）において、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ法で分析した。分離は、Agilent Zorbax Extend-C18 1.8μm（２．１×５０ｍｍ）カラムにより、室温にて行った。上記分離は、ＨＦＩＰ溶液（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールの２００ｍｍｏｌ．ｌ−１水溶液。トリエチルアミンの添加によりｐＨを７．０に調節した）とアセトニトリルとの比率を変化させる、流速０．３ｍｌ．ｍｉｎ−１（６分間で２〜４５％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）ＡＣＮ）の勾配溶出により行われた。５ｐｍｏｌのｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏの分析の結果、２６０ｎｍにおいて単一の吸収ピークが存在し、保持時間は４．８４分間であり、測定された質量（それぞれの電荷ｚについて、最も強いピークから算出された）は１６９８１．８７であった。分子量１６９８３．０９について、ChemBioDraw Ultra 13.0.0.3015プログラム（CambridgeSoft）により予測された最も存在量の多い質量は、１６９７９．９１であった。
【０１５１】
上記オリゴヌクレオチド（ｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏ）とＰＳＭＡ阻害剤（化合物３）との複合体の作製：６．９μｌの１ｍｏｌ．ｌ−１ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝８．０）を、１０μｌのオリゴヌクレオチド（修飾緩衝液中、１０．２ｎｍｏｌ、１ｅｑ）に加えた。攪拌後、濃度１００ｍｍｏｌ．ｌ−１、３．１μｌの化合物３の溶液（無水ＤＭＳＯ中、３０７ｎｍｏｌ、３０ｅｑ）を加えた。無水ＤＭＳＯは、ＤＭＳＯ（Sigma, A.C.S. spectrophotometric grade）を、活性化されているモレキュラーシーブス（Sigma, カタログ番号688363）とともに、振盪さ続けながら数時間インキュベートすることにより作製した。次に、１６０００ｇでの短時間の遠心分離により、上記モレキュラーシーブを除去した。
【０１５２】
生じた混合物を、室温にて２４時間インキュベートし、蒸留水で５００μｌに希釈し、その後、化合物３の加水分解生成物からの精製のために、Amicon Ultra 0.5 ml 10Kカラム（Millipore, カタログ番号UFC501096）に通した。上記カラムでの限外濾過による反復された濃縮および反復された希釈を通じて、元の溶媒（加水分解反応生成物を伴っている）は、再蒸留水により１０１０倍に希釈された。このように、２６０ｎｍにおける吸収により決定されたオリゴヌクレオチド濃度が２１５ｐｍｏｌ．μｌ−１である、４３μｌの溶液を得た（９．２ｎｍｏｌ、収率９０％）。以下、生じた生成物をｓｓＰＳＭＡと呼ぶ。ｓｓＰＳＭＡの予想される構造を、図５に示す。
【０１５３】
複合の効率を確認するために、ＬＣ−ＭＳによりｓｓＰＳＭＡを分析した。分析の手順は、オリジナルのｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏと同一であった（本項目に上述されている）。分析の結果、２６０ｎｍにおいて単一の吸収ピークが存在し、保持時間は４．８５分間であり（すなわち、オリジナルのｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏと同じ保持時間）、測定された質量（それぞれの電荷ｚについて、最も強いピークから算出された）は１７４２６．８４であった（図６）。一方、分子量１７４２８．５２について、予測された最も存在量の多い質量は１７４２５．０８であった。ｓｓＰＳＭＡ複合体の測定された質量と、上記オリジナルのオリゴヌクレオチドｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏとの差は４４４．９７であり、予測される差４４５．１７と比較される。上記オリジナルのｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏに対応する質量対電荷の比率は、スペクトル中に検出されなかった。これは、ｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏが、９０％を遥かに超えて転化していることを意味する。
【０１５４】
化合物３の加水分解の残留生成物（具体的には、６，１４−ジオキソ−３−オキサ−７，１３，１５−トリアザオクタデカン−１，１２，１６，１８−テトラカルボン酸）の存在について、上記ｓｓＰＭＳＡ溶液をまた分析した。言うまでもなく、この化合物はＰＭＳＡの活性部位に対して結合する。もしも、実際のプローブと同等またはそれ以上の量で、上記化合物がサンプル中に発生しているならば、上記化合物は結合について上記プローブと競合しうるし、それゆえ、ＰＳＭＡアッセイの感度を低下させる。分析は、上述したものと同じ手順で、ＬＣ−ＭＳにより行った。上記分析には、Waters Acquity C18 BEH column 1.8μm（１００×２．１ｍｍ）ならびに、移動相として０．１％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）酢酸およびアセトニトリルを用いた。溶出の勾配は、６分間で２〜１００％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）ＡＣＮであった。溶出の間中、推定される質量４６３．１８（ｍ／ｚ＝４６２．１８）に、少なくとも大よそは対応している（±０．２）信号は検出されなかった。
【０１５５】
バイオアッセイにおける使用に先立って、上記ｓｓＰＳＭＡ複合体および上記オリジナルのオリゴヌクレオチドｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏを、水および１０×濃縮ＴＢＳ緩衝液中で、最終濃度５μｍｏｌ．ｌ−１まで希釈した（１×ＴＢＳの最終濃度：２０ｍｍｏｌ．ｌ−１  Ｔｒｉｓ、１５０ｍｍｏｌ．ｌ−１  ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）。ポリプロピレン製薄肉エッペンドルフＰＣＲチューブ（Biotix, カタログ番号3423.AS）中に体積５０μｌを注入した状態で、上記ｓｓＰＳＭＡ複合体および上記オリジナルのオリゴヌクレオチドｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏを、Tgradient Biometra thermocycler（Labrepco）を用いて、下記の温度サイクルを課した（以下、温度アニーリング）。９８℃まで急速過熱の後、１℃ずつ反復される冷却（０．２℃／ｓ）および各ステップについて５分間の保温；温度が６０℃に到達した後、２０℃に到達するまで、５度ずつ反復される冷却（０．２℃／ｓ）および各ステップについて５分間の保温；全工程の間、リッド温度は９９℃に設定した。
【０１５６】
二本鎖オリゴヌクレオチドのタグを有している検出プローブを、同様の手順で作製した。温度アニーリングの前に、上記ｓｓＰＳＭＡ複合体を、幾つかの相異なる相補的オリゴヌクレオチドと、ほぼ等モル比で引き続いて混合した。ｄｓＰＳＭＡ検出プローブは、ｓｓＰＳＭＡを一本鎖ＤＮＡと混合することにより形成した。上記一本鎖ＤＮＡの配列は、ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  Ｇであった（相補鎖溶液の濃度の算出ために用いられる、上記溶液の光学濃度：１ＯＤ＝１６４９ｐｍｏｌ）。ｄｓＡ３ＰＳＭＡ検出プローブは、ｓｓＰＳＭＡを一本鎖ＤＮＡと混合することにより形成した。上記一本鎖ＤＮＡの配列は、ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  Ｇであった（１ＯＤ＝１７２１ｐｍｏｌ）。一方、検出プローブであるｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡプローブは、ｓｓＰＳＭＡを一本鎖ＤＮＡ（以下、ｉｑＰＣＲ＿ｂｉｏｔｉｎ）と混合することにより形成した。上記一本鎖ＤＮＡの配列は、ＣＣＡ  ＧＣＴ
ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＡＴＡ  ＡＡＡ
ＡＴＧ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＧＴＡであり（１ＯＤ＝１６３９ｐｍｏｌ）、３’末端がビオチン化されている（この修飾の構造を、図７に示す）。
【０１５７】
［１ｃ：作製された化合物、および検出プローブの阻害定数の決定］
酵素アッセイにおいて用いられる、ＰＭＳＡのビオチン化されている細胞外の部分（以下、Ａｖｉ−ＰＭＳＡと呼ぶ）を、［Tykvart et al. 2012, Protein Expression and Purification, p. 106］に従って、作製し精製した。純粋な組換えタンパク質濃度は、製造元の説明書に従って、Biochrom30装置（Biochrom）によるアミノ酸分析により決定した。次に、酵素を分取した状態で、−８０℃にて冷凍保存した。オリゴヌクレオチド濃度は、分光光度計により決定した（上記を参照）。化合物４の濃度は、化学天秤における重量から得た（蒸留水中に溶解させた）。
【０１５８】
すべての化合物のＩＣ５０値は、ＨＰＬＣに基づいている方法を用いて決定した。９６ウェルプレート中で、０．２ｎｇのＡｖｉ−ＰＳＭＡ（２５ｍｍｏｌ．ｌ−１  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、１５０ｍｍｏｌ．ｌ−１  ＮａＣｌ、および０．００１％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ８）中。ｐＨ７．４。以下、「反応緩衝液」と表記する）を、試験される阻害剤とともに混合した（総体積１８０μｌ）。１０種類の相異なる阻害剤の濃度（４倍の希釈系列）を用いて、阻害曲線を決定した。反応は、３７℃にて５分間プレインキュベートされた。その後、４μｍｏｌ．ｌ−１、２０μｌのプテロイル−ビス−Ｌ−グルタミン酸（Schircks Laboratories）
を加えることによって開始され、３７℃にて追加で２０分間インキュベートされた。酵素反応は、２５μｍｏｌ．ｌ−１、２０μｌの阻害剤２−ＰＭＰＡ（２−（ホスホノメチル）ペンタン二酸［Jackson et al., 1996, Journal of Medicinal Chemistry, p. 619］）を加えることにより停止させた。
【０１５９】
続いて、１００μｌの反応混合物を、UPLC HSS T3 column 1.8μm（2.1×100mm, Waters）が備えられているAgilent 1200 Series装置によるＨＰＬＣによって、分析した。２．７％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）アセトニトリルおよび９７．３％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）２０ｍｍｏｌ．ｌ−１リン酸（ｐＨ＝６．０）の定組成、流速０．４ｍｌ．ｍｉｎ−１で溶出させた。基質および生成物の吸光度は、２８１ｎｍにおいて検出した。これらの量は、自動積分法により決定した。得られたデータは、GraFit v.5.0.11プログラム（ErithacusSoftware）で評価した。このようにして、ＩＣ５０値を得た。
【０１６０】
上記反応緩衝液中におけるプテロイル−ビス（Ｌ−グルタミン酸）Ａｖｉ−ＰＳＭＡの切断の反応速度パラメータ（ＫＭおよびｋｃａｔ）は、上述の手順に従って決定した。上記決定においては、阻害剤を加えず、１５ｎｍｏｌ．ｌ−１〜４００ｎｍｏｌ．ｌ−１の範囲の種々の基質濃度を用いた。すべての反応の反応率は、１３±２％であった。次に、競合阻害であると仮定し、上記パラメータを用いて、測定されたＩＣ５０の値を阻害定数（Ｋｉ）の値に変換した。上記変換は、Cheng-Prusoff式［Cheng et al., 1973, Biochemical Pharmacology, p. 3099］に従った。
【０１６１】
結果として得られた化合物４のＫｉ値は、３．３ｎｍｏｌ．ｌ−１であった。上記オリジナルのｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏオリゴヌクレオチドのＫｉは、決定されなかった（最高濃度（０．５μｍｏｌ．ｌ−１）を用いてさえも、阻害は観測されなかった）。ｓｓＰＳＭＡ検出プローブのＫｉは０．１４ｎｍｏｌ．ｌ−１であった。ｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡプローブのＫｉは０．１６ｎｍｏｌ．ｌ−１であった。ｄｓＰＳＭＡプローブのＫｉは０．２８ｎｍｏｌ．ｌ−１であった。これらのデータからは、以下のことがである。すなわち、一本鎖オリゴヌクレオチドタグの結合により阻害定数が悪化することなく、実際には、一本鎖オリゴヌクレオチドタグの結合により一桁以上も阻害定数が向上される。さらに、第２の鎖の添加は阻害定数に影響せず、したがって、ＰＳＭＡの活性部位に対する検出プローブの結合能に影響しないことが確認された。これは、オリジナルの一本鎖検出プローブｓｓＰＳＭＡに対して、改変されている相補鎖と対合させることにより、種々の修飾が派生的に加えられうることを意味する。
【０１６２】
［１ｄ：ｑＰＣＲを用いる検出プローブの決定］
ｓｓＰＳＭＡ中に含まれている一本鎖ＤＮＡの設計配列は、Vector NTI 10.3（Invitrogen）で最適化して、強固な二次構造を形成しないようにした。端部を、プライマーに対して相補的な配列に用いた。このために、上記プライマーにより鋳型ＤＮＡが高効率で増幅されうること、および、所定のＰＣＲ条件において上記プライマーがプライマー二量体を形成しないことを、事前に確認した。このようにして、上記ｓｓＰＳＭＡプローブ中のオリゴヌクレオチドタグの決定の感度を、１分子のオーダーで確実なものとした。使用されたプライマーの配列は、ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＡＧおよびＣＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＴＴ（Generi-Biotech; 脱塩精製）であった。 Roche "Universal Probe Library"から加水分解プローブ＃８７（ＬＮＡ８塩基配列ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＣＣ、カタログ番号04689127001）を選択して、ｑＰＣＲ中に増幅された鋳型ＤＮＡを検出した。
【０１６３】
決定の有効性を試験するために、再蒸留水中の上記ｓｓＰＳＭＡ検出プローブの１０倍希釈系列を調製した（濃度範囲：１０ｎｍｏｌ．ｌ−１〜１０ｍｏｌ．ｌ−１。溶液１μｌあたり６〜６×１０９コピーの濃度に対応する）。次に、上記希釈系列を、ｑＰＣＲの較正のために用いた。LC 480 Probes Master（Roche, カタログ番号04707494001。製造元により推奨されている最終濃度まで希釈した）、両プライマー（それぞれの最終濃度：１μｍｏｌ．ｌ−１）、蛍光性加水分解プローブ＃８７（最終濃度：５０ｎｍｏｌ．ｌ−１）、ならびに、１μｌの鋳型ＤＮＡもしくは鋳型を含んでいないコントロール中の１μｌの蒸留水からなる、１０μｌの反応混合物。それぞれの濃度および鋳型を含んでいないコントロールは、３倍にした状態で測定した。９６ウェルプレートFrameStar 480/96（4titude, カタログ番号4ti-0951）を用い、上記ウェル内に上記反応混合物を注入した後、粘着性光学フィルム（Roche, カタログ番号4729692001）で蓋をした。ＰＣＲのタイムコースは、連続する以下の過程を含んでいた。すなわち、９５℃にて３分間；次に、３ステップ（９５℃にて１０秒間、６６℃にて３０秒間、および７２℃にて３０秒間）からなる４５回の反復；最後に、３７℃にて２分間。ＦＡＭ蛍光性分子に調整されている励起フィルターおよび放出フィルターを有している、Light Cycler 480 II（Roche）を用いた。Light Cycler 480 II Software（Roche）でSecond Derivative maximum法(method of maxima of the second derivative)を用いて、測定された蛍光曲線から閾値サイクル（Ｃｑ）を得た。
【０１６４】
鋳型の濃度の常用対数に対してプロットされている、得られたＣｑ値によると、上記アッセイが線形である範囲は、６〜６×１０８コピーの範囲（９０％超の増幅効率において）であることが示された。６コピー（Ｃｑ：約３７サイクル）は、鋳型を含んでいないコントロール（測定できる信号がなかった）と有意に異なった。データを表１にまとめた。
【０１６５】
【表１】
2019068838.tif 000004
【０１６６】
［１ｅ：最適な使用濃度、およびＰＳＭＡの量を決定するための検出プローブ用の最適な希釈剤の決定］
ＰＳＭＡに対する上記検出プローブの解離定数を決定するための個々の試験において、本来の形状のＰＳＭＡを認識する種々の抗体（2G7, J415, J591, D2B, 107-1A4。［Tykvart et al. 2014, Prostate, p. 1674］に記載されている）の溶液（１０μｌ。濃度：ＴＢＳ緩衝液中で１０ｎｇ．μｌ−１）を、９６ウェルプレートFrameStar 480/96（4titude, カタログ番号4ti-0951）のウェルの底に注入し、室温にて３０〜１２０分間インキュベートした。次に、ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳで３回洗浄した。次に、１００μｌのカゼインブロッキング剤（ＴＢＳ中で５倍希釈、"casein blocker biotin free 5.5% w/v"; SDT; カタログ番号CBC1）を上記ウェルの上記底に注ぎ、室温にて１〜１５時間インキュベートした。次に、上記ウェルの内容物を再び捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴ（０．０５％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）Ｔｗｅｅｎ２０を含んでいるＴＢＳ）で３回洗浄した。その後、１０μｌの純粋なＴＢＳＴ’緩衝液（０．１％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）Ｔｗｅｅｎ２０を含んでいるＴＢＳ）、または組換えにより作製されている精製されたヒトＰＳＭＡの細胞外の部分（以下、ｒｈＰＳＭＡ）のＴＢＳＴ’溶液（１０μｌ。濃度：１ｐｇ．μｌ−１。すなわち、約１０ｐｍｏｌ．ｌ−１）のいずれかを、上記ウェルの上記底に注いだ。ｒｈＰＳＭＡは、［Barinka et al., 2002, Journal of Neurochemistry, p. 477］に記載されている通りに作製し精製した。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、濃度はBiochrom30（Biochrom）によるアミノ酸分析によって、製造元の説明書に従い決定した。分取したタンパク質のストック溶液は、−８０℃にて保存した。室温にて６０〜１２０分間のインキュベーションの後、上記ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで５回洗浄した。最後に、上記ｓｓＰＳＭＡ検出プローブを含んでいる１０μｌのＴＢＳＴ’溶液（０．１ｐｍｏｌ．ｌ−１〜１０ｎｍｏｌ．ｌ−１の１０倍希釈系列における、幾つかの異なる濃度）を、ウェルの上記底に加え、室温にて１５〜７５分間インキュベートした。次に、上記ウェルの内容物を再び捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで１０回洗浄した。続いて、１０μｌのｑＰＣＲ混合物（上述の実施例１ｄにおける、鋳型を含んでいないコントロールの場合と同じ組成物）を、上記ウェルの上記底に加えた。次に、結合されている検出プローブの量を、実施例１ｄにおいて説明した通りに、ｑＰＣＲを用いて決定した。
【０１６７】
説明されている手順により、プローブの使用濃度（ｒｈＰＳＭＡを加えられていないウェルにおける、検出プローブの希釈系列）によって定まる、非選択的に吸着されている上記プローブの量を測定した。同様に、プローブの使用濃度（ｒｈＰＳＭＡを加えられているウェルにおける、検出プローブの希釈系列）によって定まる、ＰＳＭＡの活性部位に対して選択的に結合されている上記プローブの量を測定した。選択的に結合されているプローブの、上記プローブ濃度に対する依存性を、Microsoft Office Excel 2003の"Solver"を用いて、式（３）に説明されている関数に当て嵌めた。ここで、解を得られる変数はＥｔｏｔ（選択的に結合されているプローブの最大量）およびＫｄ（上記プローブの解離定数）とし、測定値と当て嵌められた関数から算出される値との間の相対偏差の２乗の合計を最小化した。
【０１６８】
アッセイの全体を、上述したすべての抗体を用いて連続して繰り返した。不動化されている酵素の活性部位に対して結合している上記ｓｓＰＳＭＡプローブのＫｄの値は、常に１００〜２００ｐｍｏｌ．ｌ−１の範囲であることが示された。上記の値は、上記酵素アッセイにおいて測定された阻害定数１４０ｐｍｏｌ．ｌ−１と非常によく対応している。上述のいずれの抗体に対する上記酵素の不動化も、上記検出プローブの上記酵素の上記活性部位に対する結合親和性に、影響を及ぼさなかった。それぞれの抗体について、選択的に結合されているプローブの最大量は、ｑＰＣＲから読み取られるＣｑの１５〜１６をもたらした。したがって、上記抗体の間において、上記溶液からの上記抗体の不動化の効率における有意差は全くなかった。非選択的に吸着されている検出プローブの量もまた、すべての抗体について同等であった。非選択的に吸着されている検出プローブの量は、使用したすべての濃度範囲において、上記プローブ濃度に正比例していた。同じ抗体が使用され、上記プローブ濃度が同じである条件において、上記酵素を含んでいるウェルにおけるＣｑ（上記プローブの選択的な結合に対応する）から、上記酵素を含んでいないウェルにおいて測定されたＣｑ（上記プローブの非選択的な結合に対応する）を減じることにより、信号／背景比を決定した。信号／背景比は、上記プローブ濃度が、ＰＳＭＡの上記活性部位に対して結合している上記プローブのＫｄ以下のとき、最も高かった。また、信号／背景比は、上記抗体に依存しており、ｑＰＣＡで８〜１２サイクルの範囲にあった（これは、用いられた１０ｐｇの量のｒｈＰＳＭＡについて、１００倍〜１０００倍の差に相当する）。
【０１６９】
実験の全体を、２Ｇ７抗体を用いて繰り返した。上記実験では、（１）ＴＢＳＴ’、または（２）濃度が０．００５％〜０．０２％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）の範囲のＳＤＳを加えたＴＢＳＴ’、または（３）１００倍〜１０００倍の範囲で希釈したカゼインブロッカーを加えたＴＢＳＴ’、または（４）同じ濃度の範囲内で両方の添加物を加えたＴＢＳＴ’中での希釈後、異なる濃度のｓｓＰＳＭＡ検出プローブを注入した。０．００５％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）ＳＤＳおよび５００倍希釈カゼインブロッキング剤を含んでいるＴＢＳＴ’（以下、「緩衝液ＣａＳＤＳ」）が、最適であると決定された。上記の緩衝液において、上記検出プローブの選択的な結合に関する解離定数は、ごく僅かしか増加しておらず、したがって、選択的な結合はほとんど変化しないままであった。一方、非選択的な吸着は低減した。５〜６サイクル分の測定されたＣｑの増加が示され、したがって、対応する程度分の上記信号／背景比の増加も示された。さらなる実験により、本来の形状のＰＳＭＡを認識する他の抗体を用いたときもまた、同じ効果を得ることが示された。
【０１７０】
上記２Ｇ７抗体を用いた場合、ｓｓＰＳＭＡプローブの上記解離定数のみならず、ｄｓＰＳＭＡ、ｄｓＡ３ＰＳＭＡおよびｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡの上記解離定数もまた、さらなる実験における同じ手順よりも、正確に測定された。上述の手順とは異なり、ｒｈＰＳＭＡの注入された濃度は０．１ｐｇ．μｌ−１であった。それぞれのプローブは、通常、３〜１６００ｐｍｏｌ．ｌ−１の範囲にある、１２種類の異なる濃度にて注入した。同じプローブについて、上記解離定数の決定は、数回繰り返し行った。個々の測定から決定される、結果として得られたＫｄ値は、互いにほとんど同一であった。ＴＢＳＴ’中の上記ｓｓＰＳＭＡプローブ、ｄｓＡ３ＰＳＭＡプローブ、ａ  ｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡプローブのＫｄは約６０ｐｍｏｌ．ｌ−１であり、一方、上記ｄｓＰＳＭＡプローブのＫｄは約１００ｐｍｏｌ．ｌ−１であることが判った。上記ＣａＳＤＳ緩衝液中では、上述のすべてのプローブの上記解離定数は非常に類似しており、約１００ｐｍｏｌ．ｌ−１であった。それぞれのプローブのそれぞれの濃度について考慮し、抗体が加えられていないコントロールウェルをも含めて考慮すると、一本鎖プローブの非選択的な結合と二本鎖プローブの非選択的な結合とは、互いに異なることが判った。ＴＢＳＴ’中で濃度１０００ｐｍｏｌ．ｌ−１の上記ｓｓＰＳＭＡプローブによって、２４に等しいＣｑに対応する上記プローブ量の非選択な的結合、という結果を得た。ＣａＳＤＳ中における同濃度の同じプローブによっては、３０に等しいＣｑ、という結果を得た。一方、ＴＢＳＴ’中で濃度１０００ｐｍｏｌ．ｌ−１の上記ｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡプローブ（または他の二本鎖プローブ）によって、２８に等しいＣｑに対応する上記プローブ量の非選択的な結合、という結果を得た。ＣａＳＤＳ中における同濃度の同じプローブによっては、３３に等しいｋＣｑ、という結果を得た。上記ｓｓＰＳＭＡプローブおよび他の形状のＰＳＭＡに関する解離定数は、両方の緩衝液中において、同じ手順により決定した。今度は、ＰＳＭＡを発現しており、ＰＳＭＡを約０．１ｐｇ．μｌ−１の濃度で含んでいるヒト細胞株の溶解物（全タンパク質：１ｎｇ。［Mlcochova et al. 2009, Prostate, p. 471］に記載されているＨＥＫ株１〜７５０）または、内因性のＰＳＭＡを約０．１ｐｇ．μｌ−１の濃度で含んでいる１０倍希釈したヒトクエン酸血漿、のいずれかを上記ウェルに注入した。上記細胞の溶解物において存在しているＰＳＭＡに対する、上記プローブの決定された解離定数は、ＴＢＳＴ’中で約１４０ｐｍｏｌ／ｌ−１であり、ＣａＳＤＳ中で約２５０ｐｍｏｌ／ｌ−１であった。血漿中に含まれている上記内因性のＰＳＭＡに対する、上記プローブの決定された解離定数は、ＴＢＳＴ’中で約２８０ｐｍｏｌ／ｌ−１であり、ＣａＳＤＳ中で４５０ｐｍｏｌ／ｌ−１であった。種々の抗体を用いて、上記ｓｓＰＳＭＡプローブの希釈系列について得られたＣｑ値を、表２にまとめた。
【０１７１】
【表２】
2019068838.tif 000005
【０１７２】
組換えにより作製されているビオチン化Ａｖｉタグ付加生成タンパク質（Ａｖｉ−ＰＳＭＡおよびＡｖｉ−ＧＣＰＩＩＩ）に対する、上記ｓｓＰＳＭＡプローブの解離定数は、同様の方法により決定した。精製されたＡｖｉ−ＧＣＰＩＩＩは、［Tykvart et al. 2014, Prostate, in press］に記載されている手順に従って作製した。精製されたタンパク質の濃度は、製造元の説明書に従い、Biochrom30（Biochrom）によるアミノ酸分析によって決定した。分取されたタンパク質のストック溶液は、−８０℃にて保存した。ＧＣＰＩＩＩは、ＰＳＭＡの近いヒトのホモログであり、非常に類似した酵素活性を有しているため、定量化のための他の適切な標的である。手順は、第一のステップにおいて、上記抗体の代わりに、１０ｎｇ．μｌ−１の濃度のニュートラアビジン（Pierce, カタログ番号31000）のＴＢＳ溶液を上記ウェル中に注入した以外は、本段落の冒頭において説明されている手順と同一であった。以降のステップは、ｒｈＰＳＭＡの代わりに、ＴＢＳＴ’中で０．２４ｐｇ．μｌ−１の濃度まで希釈した上述のＡｖｉ−ＰＳＭＡまたはＴＢＳＴ’中で１００ｐｇ．μｌ−１の濃度まで希釈したＡｖｉ−ＧＣＰＩＩＩを注入した以外は同じである。決定された上記ｓｓＰＳＭＡプローブの解離定数は、Ａｖｉ−ＰＳＭＡに対しては１６０ｐｍｏｌ．ｌ−１であり（酵素反応速度論によると１４０ｐｍｏｌ．ｌ−１）、Ａｖｉ−ＧＣＰＩＩＩに対しては１７００ｐｍｏｌ．ｌ−１であった。これは、上記プローブが、Ａｖｉ−ＧＣＰＩＩＩの活性部位に対してもまた、効率的に結合していることを意味している。
【０１７３】
［１ｆ：ＰＳＭＡおよびそのＧＣＰＩＩＩホモログの、溶液中における濃度の決定］
ＰＳＭＡ濃度を決定するための個々の試験において、１０μｌの上記２Ｇ７抗体溶液または１０μｌのニュートラアビジン溶液のいずれか（両方ともＴＢＳ中で１０ｎｇ．μｌ−１の濃度）を、９６ウェルプレートFrameStar 480/96のウェルの底に注入し、室温にて３０〜１２０分間インキュベートした。次に、上記ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳで３回洗浄した。次に、ＴＢＳで５倍希釈された１００μｌのカゼインブロッキング剤を、上記ウェルの上記底に注入し、室温にて１〜１５時間インキュベートした。上記ウェルの内容物を再び捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで３回洗浄した。次に、決定されるべき種々の濃縮されたタンパク質を含んでいる１０μｌのＴＢＳＴ’溶液を、上記ウェルの上記底に加えた。室温にて６０〜１２０分間のインキュベーションの後、上記ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで５回洗浄した。最後に、１０μｌの上記検出プローブのＴＢＳＴ’溶液を、ウェルの上記底に加え、室温にて１５〜７５分間インキュベートした。上記ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで１０回洗浄した。次に、１０μｌのｑＰＣＲ混合物（実施例１ｄにおける、鋳型を含んでいないコントロールの場合と同じ組成物）を、上記ウェルの上記底に加えた。続いて、実施例１ｄにおいて説明されている方法と同じｑＰＣＲにより、結合されている検出プローブの量を決定した。
【０１７４】
第一の実施形態において、上記２Ｇ７抗体を上記ウェルに注入し、表面をブロッキングした後、濃度が１ｎｇ．μｌ−１〜０．１ｆｇ．μｌ−１の１０μｌのｒｈＰＳＭＡ溶液（ＴＢＳＴ’緩衝液中における、既知の濃度の精製されたｒｈＰＳＭＡの希釈系列により調製された）を加えた。ＣａＳＤＳ中で１００ｐｍｏｌ．ｌ−１のｓｓＰＳＭＡ溶液、ＣａＳＤＳ中で１０００ｐｍｏｌ．ｌ−１のｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡ溶液、およびＣａＳＤＳ中で６０ｐｍｏｌ．ｌ−１のＮｅｕ＿ｄｅｂｉｏｔＰＳＭＡ溶液を、検出のために連続して試験した。上記Ｎｅｕ＿ｄｅｂｉｏｔＰＳＭＡ検出プローブは、３μｌのニュートラアビジン溶液（濃度：１ｍｇ．ｍｌ−１）に、２０μｌのビオチン化ｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡ検出プローブのＴＢＳ緩衝液溶液（濃度：１０μｍｏｌ．ｌ−１。ニュートラアビジンと比較して４倍モル過剰に相当する）を、混合することにより作製した。氷上における一晩のインキュベーションの後、Amicon Ultra 0.5ml 100Kによる限外濾過によって、過剰な遊離ｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡプローブから、生じた複合体を精製した。上記限外濾過においては、２回連続して、保持液の体積をＴＢＳで１０倍に希釈した。上記複合体中における上記検出プローブの最終濃度は、ｑＰＣＲによる、ｓｓＰＳＭＡの標準希釈系列（実施例１ｄにおいて説明されている）との比較によって決定した。
【０１７５】
濃度１０００ｐｍｏｌ．ｌ−１、ＣａＳＤＳ中のｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡ検出プローブ溶液を用いることにより、試験の範囲（すなわち、１０ｎｇ〜１ｆｇ）を通じて、ｒｈＰＳＭＡ濃度が決定でき、決定の線形範囲が約６桁である（１０ｎｇ〜１ｆｇ。上記範囲における７種類の濃度に由来する結果の対数当て嵌めの、信頼性のＲ２の値は１．００であった（Microsoft Office Excel 2003で算出した）。図８を参照）ことが判った。Ｃｑに関して、分析物濃度の対数に依存した線形相関が確認されたため、対数当て嵌めを用いた。濃度１００ｐｍｏｌ．ｌ−１、ＣａＳＤＳ中の上記ｓｓＰＳＭＡ検出プローブ溶液を用いた場合、線形の範囲は、ｒｈＰＳＭＡが約数百ｐｇ〜数ｆｇの範囲であった（３１６ｐｇ〜１ｆｇの範囲における１２種類の濃度に由来する結果の対数当て嵌めの、信頼性のＲ２値は０．９９であった。図８を参照）。複合検出プローブＮｅｕ＿ｄｅｂｉｏｔＰＳＭＡを用いることにより、感度およびダイナミックレンジに関する、オリジナルのプローブの好ましい特徴のすべてが保持されることも、また判った。すなわち、１ｆｇ  ｒｈＰＳＭＡより有意に低い検出限界、および、少なくとも５桁のｒｈＰＳＭＡの決定の線形範囲（２０ｐｇ〜２ｆｇの範囲における５種類の濃度の結果の、対数当て嵌めのＲ２は１．００であった。図８を参照）が保持されていた。Ｒ２値は、濃度の決定の優れた正確性を示している。というのも、上記の値は、各濃度につき単一のウェルのみから（すなわち、複製なしに）得られたためである。検出プローブをＴＢＳＴ’緩衝液中で希釈した場合は、上記緩衝液中における上記検出プローブのより高い非選択的な吸着のために、ダイナミックレンジが約１桁狭く、結果としてより低い感度となった以外は、同様の結果を得た。ｒｈＰＳＭＡの量に応じて、一本鎖プローブおよび二本鎖プローブ（ｓｓＰＳＭＡおよびｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡ）を用いて測定されたＣｑ値を、表３にまとめた。
【０１７６】
【表３】
2019068838.tif 000006
【０１７７】
上述の実施例１ｅにて示されているように、ＰＳＭＡ用の上記検出プローブはまた、ＰＳＭＡの近いホモログであるＧＣＰＩＩＩの上記活性部位に対して結合する。それ故に、上記と同じ手順により選択性の決定を試験した。上記１０μｌのｒｈＰＳＭＡ溶液の他に、１０μｌのビオチン化タグ付加精製Ａｖｉ−ＧＣＰＩＩＩの溶液、または１０μｌの組換え発現により作製された精製ヒトＧＣＰＩＩＩの細胞外の部分（以下、ｒｈＧＣＰＩＩＩ。［Hlouchova et al. 2007, Journal of Neurochemistry, p. 682］における手順に従って作製された）の溶液を、いずれも１ｎｇ．μｌ−１〜０．１ｆｇ．μｌ−１の種々の濃度にて他のウェルに注入した。濃度１０００ｐｍｏｌ．ｌ−１のｓｓＰＳＭＡプローブのＣａＳＤＳ溶液を、検出のために用いた。ｒｈＰＳＭＡは、最も低い注入量（１ｆｇ）においてさえも、検出可能であった。一方、最も高い２つ（１および１０ｎｇ）を除くすべての注入量のＡｖｉ−ＧＣＰＩＩＩまたはｒｈＧＣＰＩＩＩにおいては、分析物を全く含んでいないウェルと比べて、検出可能な差異はなかった。上記タンパク質が１０ｎｇ含まれているウェルにおいて結合されている検出プローブの量は、ＰＳＭＡが１０ｆｇ含まれているウェルにおいて結合されているプローブの量に、概ね対応していた。これは、分析されるサンプルにおけるＧＣＰＩＩＩ濃度が、ＰＳＭＡ濃度よりも約６桁以上高い場合のみにしか、ＰＳＭＡの決定は偽陽性となりえないことを意味している。また、検出プローブ濃度を１０倍に低減させ、ＰＳＭＡに対する上記プローブのＫｄを低下させることで、上記選択性を、さらなる桁数で増加させることができる。ＧＣＰＩＩＩに対する上記プローブのＫｄは、２０倍近く高いからである。本実施例によって、選択的な抗体の組み合わせにより、より多くの分析物に対して結合しているプローブに対しても、並外れて高い選択性が達成されうることが示される。
【０１７８】
他の実施形態においては、第１のステップにおいて、上記ウェルにニュートラアビジン溶液を注入した。表面をブロッキングした後、１０μｌのビオチン化タグ付加精製Ａｖｉ−ＰＳＭＡまたはビオチン化タグ付加精製Ａｖｉ−ＧＣＰＩＩＩの、ＴＢＳＴ’で希釈されている溶液を、種々の濃度にて上記ウェルに注入した。濃度１０００ｐｍｏｌ．ｌ−１の上記ｓｓＰＳＭＡプローブＣａＳＤＳ溶液を、Ａｖｉ−ＰＳＭＡの検出のために用いた。濃度１００００ｐｍｏｌ．ｌ−１の上記ｓｓＰＳＭＡプローブＣａＳＤＳ溶液を、Ａｖｉ−ＧＣＰＩＩＩの検出のために用いた。Ａｖｉ−ＰＳＭＡの検出が線形である範囲は１０ｎｇ〜１００ｆｇであり、Ａｖｉ−ＧＣＰＩＩＩの検出が線形である範囲は１０ｎｇ〜１０ｐｇであった。Ａｖｉ−ＰＳＭＡまたはＡｖｉ−ＧＣＰＩＩＩの量に依存しているＣｑの測定値を、表４にまとめた。
【０１７９】
【表４】
2019068838.tif 000007
【０１８０】
すべてのアッセイにおいて、分析物の検出の選択性を確認するコントロールが含まれていた。コントロールウェルにおいては、試験されるタンパク質の選択的な不動化のための抗体またはニュートラアビジンは上記ウェルに注入されず、表面のみがブロッキングされた。この場合、上記分析物を含まないウェルに対応している、結合されているプローブの量が観察された。一方で、ＰＳＭＡまたはＧＣＰＩＩＩの公知の競合阻害剤を、ＰＳＭＡまたはＧＣＰＩＩＩの阻害定数よりも有意に高い濃度にて含有している溶液を含んでいる上記ウェルに、検出プローブを加えることにより、結合しているプローブは、上記阻害剤を含んでいないウェルと比較して大幅に減少した。
【０１８１】
他の実施形態において、ＰＳＭＡの活性部位に対して選択的に結合しているプローブの、溶出を試験した。手順は、本実施例の冒頭にて説明されているものと同じあった。まず、２Ｇ７抗体をウェルの表面に不動化させた。上記表面をブロッキングした後、ＴＶＳＴ’緩衝液のみの他に、ｒｈＰＳＭＡのＴＢＳＴ’中の１０倍の希釈系列（２ｐｇ〜２ｆｇのｒｈＰＳＭＡ）を、上記ウェルに注入した。濃度１００ｐｍｏｌ．ｌ−１のｓｓＰＳＭＡのＣａＳＤＳ溶液を、決定のために上記ウェルに加えた。最後に、結合されていないプローブを洗い流した後、１０μｌのＴＢＳＴ’緩衝液を、幾つかのウェルに加えた。室温にて１時間後、上記ウェルから溶液（以下、「溶出液」）を回収し、ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで１０回再度洗浄した。その次に、１０μｌのｑＰＣＲ混合物（実施例１ｄにおける、鋳型コントロールを含んでいない場合と同じ組成物）を、上記ウェルに加えた。続いて、結合されているプローブの量を、実施例１ｄにおいて説明されているものと同じ手順によって、ｑＰＣＲにより決定した。さらに、回収された溶出液１μｌ中におけるプローブの量を、同じ方法にて決定した（１０μｌのｑＰＣＲ混合物（上記と同じ組成物）をクリーンウェルに注入し、１μｌの上記溶出液を加え、上述のｑＰＣＲにより検出プローブの量を決定した）。ＴＢＳＴ’によって溶出されたウェルにおける結合されている検出プローブの量と、溶出させなかったウェルにおける結合されている検出プローブの量とを比較することにより、約５０％の上記検出プローブが、１時間以内に上記表面から放出されていたことが示された。この値は、上記溶出液中において測定された、上記プローブ濃度によるものである。ＰＳＭＡ濃度に依存しているＣｑの測定値、および決定の手順を、表５にまとめた。
【０１８２】
【表５】
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【０１８３】
溶出したプローブを決定するときの線形である範囲および決定の限界は、固体担体に対して結合しているプローブを決定するときと同じであることは、明白である。このように、この手順は、結合されているプローブを溶液に対して放出させることに用いることができるので、不動化が既になされている固体担体と異なり、他の種類の固体担体においても決定を行うことができる。
【０１８４】
［１ｇ：溶液中における、ＰＳＭＡの検出の限界の決定］
濃度２．５ｎｇ．μｌ−１、１０μｌの２Ｇ７抗体ＴＢＳＥ緩衝液（ＴＢＳにＥＤＴＡを濃度５ｍｍｏｌ．ｌ−１で加えたもの）溶液を、９６ウェルプレートFrameStar 480/96のウェルの底に注入し、室温にて６時間インキュベートした。次に、上記ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳで３回洗浄した。次に、２００μｌのカゼインブロッキング剤（ＴＢＳＥ中で５倍希釈）を上記ウェルの上記底に注入し、室温にて１８時間インキュベートした。上記ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで５回洗浄した。その後、１０μｌのＴＢＳＴ’緩衝液、または、１０μｌのｒｈＰＳＭＡ  ＴＢＳＴ’溶液（０．１ｆｇ．μｌ−１〜０．５ａｇ．μｌ−１の範囲の既知の濃度のｒｈＰＳＭＡ、すなわちｒｈＰＳＭＡの総量は１ｆｇ〜５ａｇ）のいずれかを、ウェルの上記底に注入した。ここで、それぞれの濃度は、最低でも３組ずつ注入した。室温にて３時間のインキュベーションの後、上記ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで３回洗浄した。最後に、１０μｌの検出プローブｄｓＡ３ＰＳＭＡ（１：１．２）のＣａＳＤＳ緩衝液溶液（上記プローブ濃度７５ｐｍｏｌ．ｌ−１）を、ウェルの上記底に注入し、室温にて１時間インキュベートした。上記ｄｓＡ３ＰＳＭＡ（１：１．２）プローブは、上記ｓｓＰＳＭＡプローブを１．２モル過剰の相補鎖と対合させ、ｓｓＰＳＭＡ濃度を１μｍｏｌ．ｌ−１と変更させて、ｄｓＡ３ＰＳＭＡプローブと同じ手順により作製した。続いて、上記ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで１０回洗浄した。次に、１０μｌのｑＰＣＲ混合物（実施例１ｄにおける、鋳型コントロールを含んでいない場合と同じ組成物）を、上記ウェルの上記底に注入した。続いて、結合されている検出プローブの量を、実施例１ｄにおいて説明されているものと同様に、ｑＰＣＲにより決定した。注入したｒｈＰＳＭＡの量に依存している測定されたＣｑ値を、表６および図９にまとめた。ｒｈＰＳＭＡ定量の線形である範囲が０．１ｆｇまで拡張されることは、明らかである。この値は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより決定された上記ｒｈＰＳＭＡの単量体の分子量（８８．７ｋＤａ）において、約６８０分子のｒｈＰＳＭＡに（すなわち３４０個の二量体に）対応する。ｒｈＰＳＭＡを含まないウェルと２５ａｇのｒｈＰＳＭＡを含んでいるウェルとの平均Ｃｑの違いが、１サイクル以上であったため、検出の限界は少なくとも１０〜２５ａｇ（すなわち３４〜８５個の二量体）であった。
【０１８５】
【表６】
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【０１８６】
それぞれの試験されたサンプルは３回測定され、５ａｇのサンプルは６つの複製が、０のサンプルは９つの複製があった。したがって、これらのサンプルは、上記表よりも多くの行を有している。
【０１８７】
［１ｈ：複合的な生体マトリクスにおける、ＰＳＭＡ濃度の決定］
５ｎｇ．μｌ−１、１０μｌの２Ｇ７抗体ＴＢＳ溶液を、９６ウェルプレートFrameStar 480/96のウェルの底に注入し、室温にて１〜１．５時間インキュベートした。次に、上記ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳで３回洗浄した。次に、１００μｌのカゼインブロッキング剤（ＴＢＳ中で５倍希釈）を上記ウェルの上記底に注入し、室温にて２４時間インキュベートした。上記ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで３回洗浄した。その後、１０μｌのｒｈＰＳＭＡ標準溶液（ＴＢＳＴ’中で１２種類の異なる濃度（３２ｐｇ．μｌ−１〜０．１ｆｇ．μｌ−１））、または、分析されるサンプルである細胞溶解物、尿および血漿（ＴＢＳＴ’緩衝液中で様々に希釈されている）のいずれかを、上記ウェルの上記底に加えた。尿および細胞溶解物中におけるＰＳＭＡの決定にあたっては１．５時間のインキュベーション後、または、血漿中におけるＰＳＭＡの決定にあたっては１８時間のインキュベーション後（常に室温にて）、上記ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで５回洗浄した。最後に、１０μｌのｓｓＰＳＭＡ検出プローブのＣａＳＤＳ緩衝液溶液（上記プローブ濃度１０００ｐｍｏｌ．ｌ−１）を、ウェルの上記底に加え、室温にて１時間インキュベートした。続いて、上記ウェルの内容物を捨て、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで１０回洗浄した。次に、１０μｌのｑＰＣＲ混合物（実施例１ｄにおける、鋳型コントロールを含んでいない場合と同じ組成物）を、上記ウェルの上記底に加えた。続いて、結合されている検出プローブの量を、実施例１ｄにおいて説明されている通りに、ｑＰＣＲを用いて決定した。
【０１８８】
上記ｒｈＰＳＭＡの上記標準希釈系列によると、検出が線形である範囲は、上記の実施例と同じであった。次に、生体サンプル中におけるＰＳＭＡ濃度を、得られた較正曲線（ｒｈＰＳＭＡ濃度の対数に対するＣｑの相関を、線形関数に当て嵌めた）および分析される生体サンプルの希釈率の情報から算出した。まず、健康なドナーのクエン酸血漿１５サンプルにおける、上記ＰＳＭＡ濃度を決定した。このとき、１０倍、１００倍、１０００倍に希釈された個々のドナーの血漿サンプルにおいて決定された濃度の平均を、最終的な値とした。種々の希釈液から決定されたＰＳＭＡ濃度は、互いに同一であった（僅かな変異を除いて）。また、決定されたＰＳＭＡの量は、最も希釈され、ＰＳＭＡ濃度が最低であるサンプルでさえも、検出の限界を常に充分に上回った（ＰＳＭＡを含まないコントロールと比較すると、Ｃｑの差異は少なくとも３サイクルであった）。これは、上述されているＰＳＭＡの決定のためには、体積１０ｎｌ以下の血漿で充分であることを意味している。さらに、リガンド部分を介する上記検出プローブの結合の選択性を、以下の両方によって確認した。（１）注入されるプローブ溶液にＰＳＭＡの競合阻害剤を加えたときの、分析されるサンプルを含んでいる上記ウェルの上記表面に対する抑制された結合によって。およびさらに、（２）分析されるサンプルを含んでいる上記ウェルの上記表面に対する、上記リガンド部分を有していないオリゴヌクレオチドｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏの結合は、サンプルを伴わない上記表面に対する非選択的結合を超えないことによって。
【０１８９】
次に、測定された濃度を、同じサンプルにおいて放射性酵素アッセイを用いて測定された濃度と、比較した（クエン酸血漿を回収し処理する手順、および、放射性酵素アッセイによってこれらのサンプルにおける上記ＰＳＭＡ濃度を決定する手順は、［Knedlik et al. 2014, Prostate, p. 768］に説明されている）。本明細書において説明されている方法により決定された絶対値は、放射性酵素による決定と比較して、約１０倍小さかった（表７）。しかし、２種類の方法に由来する値は、非常によく相関していた。このことは、両方法の結果を比較しているグラフ上のプロット（図１０）、および、両方法の結果の間における直接的相関関係の信頼性のＲ２の値（０．９８）から理解される。測定されたＰＳＭＡの絶対濃度の差異は、不正確な放射性酵素による決定に起因しうる。上記不正確な放射性酵素による決定は、ｒｈＰＳＭＡ（標準として用いられた）と、決定されるべき血漿中の内因性ＰＳＭＡとの間における、基質の切断率の違いによるものである。所与の放射性酵素アッセイ条件における、内因性ＰＳＭＡによる基質の切断率は決定されていないが、ｒｈＰＳＭＡＳについての切断率と同じであると考えた。対照的に、本明細書において開示されている方法により決定したときは、ｒｈＰＳＭＡ標準に対する上記プローブの親和性、および内因性ＰＳＭＡに対する上記プローブの親和性の両方を、測定した。上記プローブ濃度を、個々のタンパク質に対する上記プローブの結合強度の違いによる、結果の偏向を避けるように用いた（上記プローブの両タンパク質に対するＫｄよりも、充分に高かった）。
【０１９０】
【表７】
2019068838.tif 000010
【０１９１】
ＴＢＳＴ’中で１０倍および１００倍に希釈されている尿サンプルにおけるＰＳＭＡ濃度をもまた、上述の方法により決定した。測定された濃度の間における偏差は非常に小さく、通常は１０％であった。前立腺癌に罹患している患者に由来する２つの尿サンプルにおいて、測定されたＰＳＭＡ濃度は、３３ｐｇ．ｍｌ−１および１９２ｐｇ．ｍｌ−１であった。健康な男性の尿中においては、ＰＳＭＡ濃度は１５ｐｇ．ｍｌ−１であった。一方健康な女性の尿中においては、ＰＳＭＡ濃度は８ｐｇ．ｍｌ−１でしかなかった。本方法によってＰＳＭＡを決定するためには、１μｌの尿で充分であった。しかし、測定された濃度が比較できる、充分な感度を有する参照方法は、従来利用できなかった。しかしながら、血漿中と同様に、上記検出プローブの結合は、ＰＳＭＡの競合阻害剤の添加によって抑制された。これは、ＰＳＭＡの活性部位に対する、リガンド部分を介した、上記検出プローブの選択的な結合を示している。
【０１９２】
上述の方法はまた、前立腺癌に由来する（具体的には、転移細胞であるＬＮＣａＰ、ＤＵ−１４５およびＰＣ−３に由来する）培養細胞株の、溶解物中における濃度を決定するためにも用いられた。３７℃、５％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）ＣＯ２雰囲気下において、ＲＰＭＩ培地（Sigma、ＬＮＣａＰ細胞株）または１０％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）ＦＢＳ（Sigma）を追加したＩＭＤＭ培地（Invitrogen）にて、直径１００ｍｍのペトリ皿中で細胞を培養した。上記細胞は、培養組織（SPL Life Sciences）が約９０％コンフルエントに達した後に、上記培地中で再懸濁するようにした。上記細胞を、マイクロチューブに移し、室温、２５０ｇにて５分間遠心分離した。次に、上記培地を除去し、上記細胞を、１００ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌを加えた５０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＴｒｉｓ（ｐＨ７．４。以下、ＣＬＰと表記する）で洗浄した。次に、約２０００万個の細胞を、３００μｌのＣＬＰ中で懸濁し、２ｍｌの丸底マイクロチューブに移した。上記マイクロチューブに、直径約３ｍｍのスチールボールを加えた。続いて、Tissue Lyzer（Qiagen、最大出力にて３分間）により細胞を溶解させ、均一化させた。次に、溶液を新しいチューブに移し、体積の１／１０の１０％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル（Affymetrix、カタログ番号：O330、Ｃ１２Ｅ８）を加えた。混合後、超音波処理用氷浴Elmasonic S30にて、上記溶液を１分間超音波処理した。生じた溶液を、１５分間／６００ｇ／４℃にて遠心分離し、上澄みを回収した。これが溶解物である。上記溶解物中における総タンパク質濃度を、Biorad Protein Assay試薬を用いて決定した。種々の溶解物のＴＢＳＴ’希釈液（総タンパク質の注入量が１００ｎｇ〜１００ｐｇの範囲）における、ＰＳＭＡ濃度を決定した。ＬＮＣａＰ細胞株において測定されたＰＳＭＡ濃度は０．２７ｎｇ／μｇ（総タンパク質）であった。ＤＵ−１４５細胞株およびＰＣ−３細胞株においては、ＰＳＭＡは検出されなかった。これは、所与の決定の条件において、濃度が０．１ｐｇ／μｇ（総タンパク質）以下であることを表している。上記検出プローブの結合もまた、上記検出プローブの溶液に対して、ＰＳＭＡの競合阻害剤を加えることにより抑制された。測定された濃度はまた、ウェスタンブロットによる決定に従うものであった。  １ｉ：ＰＳＭＡの種々の型およびＰＳＭＡのホモログＧＣＰＩＩＩに対する、化合物の阻害活性の試験。
【０１９３】
ＴＢＳバッファー中１０ｎｇ．μｌ−１のニュートラビジン溶液１０μｌを９６ウェルプレートＦｒａｍｅＳｔａｒ４８０／９６のウェルの底に注ぎ、１．５時間室温でインキュベートした。それから、上記ウェルの内容物をタップアウト（tapped out）し、当該ウェルを２００μｌのＴＢＳで３回洗浄した。それから、ＴＢＳで５回希釈されているカゼインブロッキング剤２００μｌをウェルの底に注ぎ、室温で２４時間インキュベートした。上記ウェルの内容物をタップアウトし、当該ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで３回洗浄した。その後、１０μｌの標準試薬を、ＴＢＳＴ´中既知の濃度の、Ａｖｉ−ＰＳＭＡ（５０ｐｇ．μｌ−１）またはＡｖｉ  ＧＣＰＰＩＩＩ（２ｎｇ．μｌ−１）と共に、ウェルの底に加えた。また、バッファーのみを含んでいるゼロコントロールをインキュベートした。室温での２時間のインキュベーションの後、上記ウェルの内容物をタップアウトし、当該ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで５回洗浄した。それから、ＴＢＳＴ‘バッファー中のｓｓＰＳＭＡの検出プローブ溶液１０μｌを、Ａｖｉ−ＰＳＭＡのウェルに対して、プローブ２００ｐｍｏｌ．ｌ−１の濃度で、またはＡｖｉ−ＧＣＰＩＩＩのウェルに対して、１０００ｐｍｏｌ．ｌ−１の濃度で、上記ウェルの底に注いだ。それに続くインキュベーションを室温で１時間実行した。続いて、上記ウェルの内容物をタップアウトし、当該ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで１０回洗浄した。それから、実施例１ｄにおいてテンプレートコントロールがない場合と同様の組成のｑＰＣＲ混合物１０μｌを上記ウェルの底に注ぎ、実施例１ｄに記載されているように、結合されている検出プローブの量をｑＰＣＲで決定した。
【０１９４】
特定の濃度の試験される物質を上記検出プローブに加えることによって、結合されている検出プローブの量の減少から、上記物質の阻害係数を導くことができた。上記試験される物質を常にある濃度だけ加え、アッセイを二重に実行した。試験のため、１５の物質を選択した。また、Ａｖｉ−ＰＳＭＡに関する上記物質の阻害係数を、実施例１ｃに記載されている酵素学的なアッセイによって測定した。上記物質の阻害係数は、数十ｐｍｏｌ．ｌ−１から数百μｍｏｌ．ｌ−１の範囲内であった。上記試験される物質に加えて、酵素と純粋な検出プローブとを含んでいるウェルで測定されるＣｑから、上記酵素と上記検出プローブとを含んでいるウェルで測定されるＣｑを引き算する場合、式（９）および（１４）を用いて、ΔＣｑを計算し、当該ΔＣｑから、上記試験される物質によって占有される酵素の活性部位の割合を導いた。ｑＰＣＲの効率を１の値で置換した。ゼロコントロール（酵素を含んでいないウェル）で測定されるＣｑから、酵素を含んでいるウェルで測定されるＣｑを引き算することによって得られたΔＣｑを用いて、上記酵素の占有される活性部位の割合の数値の決定の最大範囲を決定した。
【０１９５】
試験される物質の濃度、ΔＣｑ、実施例１ｅで同定された上記検出プローブのＫｄ（ＴＢＳＴ´中、ｓｓＰＳＭＡおよびＡｖｉ−ＰＳＭＡに対して、１６０ｐｍｏｌ．ｌ−１；ＴＢＳＴ´中、ｓｓＰＳＭＡおよびＡｖｉ−ＧＣＰＩＩＩに対して、１７００ｐｍｏｌ．ｌ−１）および上記検出プローブの濃度を数式（１５）に代入することによって、上記物質の阻害係数の値を決定した。表８に、上記決定で使用された、上記試験される物質の濃度、当該試験される物質によって占有される上記酵素の活性部位の割合、所定の酵素に関して測定される阻害係数、および実施例１ｃに記載されている酵素反応速度論で測定される阻害係数の参照の値をまとめる。それぞれの物質のＫｉを測定するため、入手可能な量よりも多くの量の酵素が必要でありうるため、Ａｖｉ−ＧＣＰＩＩＩの酵素に関する参照の値は知られていない。上記表は、Ａｖｉ−ＰＳＭＡに関する上記２つの方法の間の偏差は、高く結合されている阻害剤のせいぜい数十パーセントであり、６番目に弱い結合阻害剤に関して本明細書に開示される方法で決定される係数は、２〜４倍高いことを示す。上記２つの方法の間の優れた一致は、図１１に示される、両方の方法の結果の図の比較から明らかである。我々の方法で決定されたＫｉと、参照の酵素反応速度論で決定されたＫｉとの線形相関の信頼度の値Ｒ２は、Ａｖｉ−ＰＳＭＡに関して０．９４であった。
【０１９６】
上記２つの方法の間の小さな違いは、我々の決定における不正確さ、または酵素反応速度論の決定における不正確さが原因であり得る。我々の決定は、同じ濃度の上記試験される物質、または異なる濃度の上記試験される物質のいずれかを用いて、複数の反復を測定し、上記の結果の値を平均することによって、精度を高め得る。酵素反応速度論による決定におけるミスは、主に、基質ＫＭの不正確な決定（すべてのＫｉにおける体系的なシフト）、および上記阻害剤の濃度に依存した、反応速度の不正確なフィッティングから生じる。この点について、酵素の性質（我々の場合は特に、上記基質に対する酵素の親和性および当該酵素の触媒される反応の速度）は、基本的には溶液の組成に依存するため、適切に測定されるＫｉ値でさえ、適切な物理値として見なすことができないことは強く強調されるべきである。従って、測定されるＫｉは、一般に、特定のｐＨ、温度、使用されるバッファー物質、上記溶液のイオン強度、上記溶液中のイオンの性質、種々の添加剤（例えば、界面活性剤）、およびその他の影響に強く依存する。よく似た条件でＫｉが酵素反応速度論によって決定される場合であっても、かなり多くの場合、結果は異なる（例えば、２−ＰＭＰＡの既知の阻害剤のＫｉの決定を参照のこと）。「Jackson et al. 1996, Journal of Medicinal Chemistry, p. 619」に記載されている仕事において、２−ＰＭＰＡのＫｉは０．３ｎｍｏｌ．ｌ−１と決定された。一方で、「Kozikowski et al. 2004, Journal of Medicinal Chemistry, p. 1729」においては、１．４ｎｍｏｌ．ｌ−１と決定された。我々のアッセイでは、上記酵素反応速度論と比較して、他のバッファー剤および他の界面活性剤を使用し、さらにこれらを高い濃度で使用したため、上記結果において観察される小さな違いにつながったのであろう。
【０１９７】
同様の方法おいて、Ｎ末端に結合されているＨｉｓタグを用いて、精製されていない組換えＰＳＭＡについて、物質の阻害活性を試験したが、よく似た結果を示した。上記手法は、Ａｖｉ−ＰＳＭＡについて上記に記載されている手法と同一であったが、ニュートラビジンの不動化の後、ＴＢＳＴ‘バッファー中１ｍｍｏｌ．ｌ−１の濃度のＮｉＣｌ２の存在下で、１０μｍｏｌ．ｌ−１の濃度で共有結合されているビオチンを含んでいる、トリス−ニトリロトリ酢酸（ビオチン−トリス−ＮＴＡ）１０μｌを含んでいるウェルの１時間のインキュベーション、という１つの追加の工程、および洗浄の後にのみ、Ｈｉｓ標識されたＰＳＭＡでのインキュベーションの工程が存在していた。
【０１９８】
【表８】
2019068838.tif 000011
【０１９９】
試験される物質によって占有される活性部位の割合についての数字の異なる数値は、異なる占有の割合についての、異なる測定の精度に対応する。５０パーセント未満の占有の割合から導かれるＫｉは、信頼性が低いと判断される。重要なことに、上記試験を用いて、Ａｖｉ−ＧＣＰＩＩＩについて比較される、Ａｖｉ−ＰＳＭＡに関する第１の阻害剤の選択が見出された。ここで、Ａｖｉ−ＧＣＰＩＩＩに対する、試験される物質４の阻害活性を、酵素反応速度論によって検証した（測定されるＫｉ＝１４０ｎｍｏｌ．ｌ−１）。
【０２００】
試験される物質は通常、種々の有機溶剤に溶解する、という事実は、アセトニトリル、メタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０の存在下における我々の方法の信頼性を試験することにつながっている。上記手法は、初めにおいてのみ、ニュートラビジンの溶液の代わりに、ＴＢＳ中５ｎｇ．μｌ−１の濃度で２Ｇ７の抗体溶液をウェルに注いだ以外は、上記に記載されている手法と同一であった。それから、Ａｖｉ標識されるタンパク質の代わりに、ＴＢＳＴ´中、既知の濃度２ｐｇ．μｌ−１でｒｈＰＳＭＡ溶液を注いだ。ＴＢＳＴ´、種々に濃縮された有機溶剤を含んでいるＴＢＳＴ´、または種々の濃度のＴｗｅｅｎ２０を含んでいるＴＢＳ中、６０ｐｍｏｌ．ｌ−１の濃度で、上記ｓｓＰＳＭＡのプローブ溶液を検出のために使用した。使用される各検出プローブ溶液について、抗原を含まないゼロコントロールが含まれており、すべてを二重に測定した。アッセイにおけるプローブ希釈剤の組成物の可能性の高い影響を、抗原を含んでいるウェルおよび抗原を含んでいないウェルにおいて、測定されるＣｑを比較することで決定した。ＤＭＳＯ、アセトニトリル、またはメタノールは、０．１％、１％または１０％（体積／体積）の濃度において、測定される結果に影響を与えなかったことがわかった。同様に、希釈剤中０％から１％（体積／体積）の範囲の、種々の濃度のＴｗｅｅｎ２０は、決定において影響を有さなかった。上記濃度のＤＭＳＯ、Ｔｗｅｅｎ２０（任意には、５００倍から２０００倍に希釈されるカゼインブロッカーの添加と共に）において、１００ｐｍｏｌ．ｌ−１から１００μｍｏｌ．ｌ−１の値を有する、それぞれのＫｉ値の一連の阻害剤を試験し、それぞれのＫｉ値の決定の正確性において添加剤は影響を有さないことが分かった。また種々の濃度において、３つの阻害する物質の添加を試験し、数百ｐｍｏｌ．ｌ−１、数十ｎｍｏｌ．ｌ−１、数十μｍｏｌ．ｌ−１の阻害係数を有し、上記決定の線形の範囲内において、上記試験される物質の濃度に関係ない、よく似たＫｉ値が得られることがわかった。
【０２０１】
先行する段落に記載されている手法は、内因性の酵素に対する物質の阻害活性の試験も可能とする。従って、ｒｈＰＳＭＡだけでなく、ヒトの血漿に含まれる内因性ＰＳＭＡに関する一連の３６の物質の阻害係数は、先行する段落と同じ方法で決定された。ｒｓＰＳＭＡに関する阻害活性を決定するため、ＴＢＳＴ´中、２ｐｇ．μｌ−１の濃度でｒｈＰＳＭＡの溶液を上記ウェルに注ぎ、上記ｓｓＰＳＭＡの検出プローブをＴＢＳＴ´中、６０ｐｍｏｌ．ｌ−１の濃度で使用した。一方、内因性ＰＳＭＡに関する阻害活性の決定のため、ＴＢＳＴ´で１０倍に希釈されているクエン酸血漿を上記ウェルに注ぎ、ＴＢＳＴ´中３００ｐｍｏｌ．ｌ−１の濃度で、上記ｓｓＰＳＭＡの検出プローブを使用した。結合されている検出プローブの量の減少は、それぞれの試験される物質のみに対して１つの濃度において再度測定された。測定されるデータから、我々は、ΔＣｑ、試験される物質に占有される酵素の活性部位の割合、および上記試験される物質のＫｉを、上述される手法と同様の手法によって計算した（ＴＢＳＴ´中、ｓｓＰＳＭＡおよびｒｈＰＳＭＡに対して、Ｋｄ＝６０ｐｍｏｌ．ｌ−１；ＴＢＳＴ´中、ｓｓＰＳＭＡおよび内因性ＰＳＭＡに対して、Ｋｄ＝３００ｐｍｏｌ．ｌ−１、両方の値は実施例１ｅにて決定された）。上記試験される物質の濃度、上記物質に占有される酵素の活性部位の割合、およびｒｈＰＳＭＡまたは内因性ＰＳＭＡに関して測定された阻害係数を、表９にまとめる。ｒｈＰＳＭＡおよび内因性ＰＳＭＡに関して測定される阻害係数の比較を、図１２に図示する。まず上記試験される物質と共に、ｒｈＰＳＭＡの溶液を混合し、それから、上記検出プローブおよび得られた混合物を、不動化されている抗体２Ｇ７と共に、マルチウェルプレートに加える、という手法によって、よく似た結果が得られた。測定されるＫｉの範囲は、数十ｐｍｏｌ．ｌ−１から数百μｍｏｌ．ｌ−１の範囲であり、２つの試験される物質は、全く阻害しなかった。グラフは、両方のタンパク質についての阻害係数の間の顕著に優れた相関を明らかに立証する。ＰＳＭＡの両方の型について決定されるＫｉの間の直接の相関についての信頼度の値Ｒ２は０．９３であった。しかし、内因性ＰＳＭＡについて測定されたＫｉ値は、５回の平均において、ｒｈＰＳＭＡに対する値よりも高かった。これは、内因性ＰＳＭＡが、膜貫通型の部位および細胞内の部位が欠損している昆虫の細胞において産生される、少し異なる型のタンパク質であるという、事実が原因であるだろう。Ｋｉの違いは、内因性ＰＳＭＡについての検出プローブのＫｄは、ｒｈＰＳＭＡについての値よりも約５倍高い、という事実と一致する。サブナノモルの阻害剤に対して観察されたより大きな違いは、内因性ＰＳＭＡの決定の線形範囲を超えることによって得られ、当該内因性ＰＳＭＡは、血漿中における顕著に少ない量のＰＳＭＡが原因で、より小さい。内因性ＰＳＭＡについてのより正確な結果は、より低い濃度のこれらの阻害剤、またはより多い量の血漿を使用することで達成され得る。
【０２０２】
さらに、試験される物質のより広い範囲の阻害係数は、１つの試験される濃度から、以下の手法によって量的に決定された。当該手法では、マルチウェルプレートのウェルの底に、抗体２Ｇ７を介して２５０ｐｇのｒｈＰＳＭＡを不動化し、その後洗浄した。それから、特定のウェルを、ＴＢＳＴ´バッファー中、１００μｍｏｌ．ｌ−１の濃度の特定の試験される物質と、ＴＢＳＴ´バッファー中、１２５ｐｍｏｌ．ｌ−１の濃度の検出プローブｄｓＡ３ＰＳＭＡとの混合物で、５００倍希釈されているカゼインブロッカーの添加と共に、インキュベートした。それに続く洗浄の後、結合されている検出プローブの量をｑＰＣＲによって決定し、上記物質のそれぞれのＫｉ値を、検出プローブのみでインキュベートされたウェルにおける結合されているプローブの違い、および検出プローブと特定の試験される物質との混合物でインキュベートされたウェルにおける結合されているプローブの違いから、本発明の説明に記載されている式１５に従って計算した。上記方法において、４０の物質の阻害係数を決定した。実施例１ｃに記載されている酵素反応速度論によって決定されるように、上記物質の阻害活性は、１９ｐｍｏｌ．ｌ−１から２５０μｎｏｌ．ｌ−１の範囲を有するＫｉ値の範囲において、だいたい均等に分配されており、すべての物質のＫｉ値は、ここで記載されている手法によってかなり正確に決定されたことがわかった。決定された値は、平均して、酵素反応速度論からの値の８５％に対応し、いずれの場合においても、酵素反応速度論からの値（Ｒ２＝０．９９１）よりも２倍以上は異なっていなかった。これらの結果は、ここで記載されている手法によって１つの試験される濃度の上記物質（１００μｍｏｌ．ｌ−１）から、７ログ（１９ｐｍｏｌ．ｌ−１から２５０μｍｏｌ．ｌ−１）の範囲において、上記試験される物質のＫｉ値を正確に決定することができることを示す。
【０２０３】
【表９】
2019068838.tif 000012
【０２０４】
上記物質の表記は、上記先行する表の記載に一致している。（上記試験される物質で）占有される活性部位の割合の数字の違いは、異なる割合の占有における、異なる決定の正確性に対応する。
【０２０５】
１ｊ：化学発光法の検出を用いる、溶液中のＰＳＭＡの決定
ＴＢＳ中２．５ｎｇ．μｌ−１の濃度の２Ｇ７抗体溶液１００μｌを、９６ウェルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロプレート（カタログ番号４３７１１１）のウェルに注ぎ、室温で１時間インキュベートした。それから、上記ウェルの内容物をタップアウトし、当該ウェルを２００μｌのＴＢＳで３回洗浄した。それから、ＴＢＳで５回希釈されているカゼインブロッキング剤２００μｌを上記ウェルに注ぎ、室温で１８時間３０分間インキュベートした。それから、上記ウェルの内容物をタップアウトし、当該ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで３回洗浄した。それから、ＴＢＳＴ´中、種々の既知の濃度のｒｈＰＳＭＡ標準溶液１００μｌを、１ｎｇから１ｐｇの範囲の得られた注がれる量において、上記ウェルに加えた。ｒｈＰＳＭＡを含んでいないゼロコントロールもインキュベートし、すべてを２回反復して行った。室温での２時間４５分間のインキュベーションの後、上記ウェルの内容物をタップアウトし、当該ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで３回洗浄した。最後に、ＣａＳＤＳ中６００ｐｍｏｌ．ｌ−１の濃度で、ＮｅｕＨＲＰ＿ｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡの検出プローブ溶液１００μｌを上記ウェルに加えた。１ｍｇ．ｍｌ−１の濃度のニュートラビジン−ＨＲＰの共役溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３１００１）６．１μｌを、ＴＢＳバッファー中１０μｍｏｌ．ｌ−１（ニュートラビジン−ＨＲＰの共役に比較して、４倍モル過剰に対応している）のビオチン化される検出プローブｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡの溶液１０μｌと共に混合することで、ＮｅｕＨＲＰ＿ｄｓｂｉｏｔＰＳＭＡの検出プローブを調製した。氷上での一晩のインキュベーションの後、残りのフリーのｄｓｄｉｏｔＰＳＭＡプローブから、透過度のカットオフが１００ｋＤａの膜上で限外濾過することによって、得られた複合体を精製した。最初の溶液は、合計で１００倍希釈された。上記複合体中の検出プローブの最終濃度は、実施例１ｄに記載されているように、一連のｓｓＰＳＭＡの標準溶液との比較によって、ｑＰＣＲによって決定された。室温での１時間のインキュベーションの後、上記ウェルの内容物をタップアウトし、上記ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで１０回洗浄した。その後、１６０μｌの化学発光基質（２ｎｍｏｌ．ｌ−１の濃度の４−ヨードフェノール（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、カタログ番号１２２３９０１００）の水溶液、２．５ｍｍｏｌ．ｌ−１の濃度のルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ８５１１）、３．２％のＤＭＳＯ（体積／体積）、０．０２％（重量／体積）の過酸化水素、および０．１ｍｏｌ．ｌ−１のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）をウェルに加え、ＴｅｃａｎリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００を用いて、それぞれのウェルにおいて上記発光を測定した。
【０２０６】
検出の動的な範囲は、１ｎｇから１ｐｇの注がれた量のｒｈＰＳＭＡの範囲において観察された。１ｐｇの検出限界は、現在最も感度が高く入手可能な、ＥＬＩＳＡによるＰＳＭＡの決定（Sokoloff et al. 2000, Prostate, p.150）よりも、感度が高い決定であることを示す。発光の二重測定の測定された値を表１０にまとめる。
【０２０７】
【表１０】
2019068838.tif 000013
【０２０８】
１ｋ：基質の加水分解についてのＰＳＭＡの触媒活性の決定
セクション１ｉに記載されている手法に従って、不動化されているニュートラビジンを用いて２０ｐｇのＡｖｉ−ＰＳＭＡを上記ウェルの底に不動化し、続いて、３５ｐｍｏｌ．ｌ−１の濃度でｄｓＡ３ＰＳＭＡの検出プローブと共に、および同時に、１０ｎｍｏｌ．ｌ−１から１００μｍｏｌ．ｌ−１の範囲において、種々の濃度のフォリル−γ−Ｌ−グルタミン酸の基質と共に４０分間インキュベートし、洗浄後、結合されているプローブの量をｑＰＣＲで決定した。数式（１５）に従って、最も高い濃度の基質を含んでいるウェルと検出プローブのみを含んでいるウェルとのΔＣｑの違いから、基質のＫＭ（Ｋｉに対応する）を計算した。上記の計算されたＫｉおよびそれぞれの初期濃度の基質に対して測定されたΔＣｑの違いを元に、その後、インキュベーションの終了時の最終基質濃度、Ｓｔを同じ式に従って計算し、本発明の説明に上述された数式（１７）に従って、触媒の性能ｋｃａｔを計算した。初期濃度のフォリル−γ−Ｌ−グルタミン酸１０７ｎｍｏｌ．ｌ−１において、８０％はインキュベーションの間に解離し、これは１．２ｓ−１のｋｃａｔに対応する。３３６ｎｍｏｌ．ｌ−１の濃度において、４３％が解離し、これは２．３ｓ−１のｋｃａｔに対応し、１０４９ｎｍｏｌ．ｌ−１の濃度において、１６％が解離し、これは２．６ｓ−１のｋｃａｔに対応する。得られたｋｃａｔの値は、セクション１ｃに記載されているように酵素反応速度論によって得られる、５ｓ−１のｋｃａｔ値と一致している。
【０２０９】
実施例２：ＨＩＶ−１プロテアーゼの検出、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤の能力の試験
２ａ：リンカーと活性化されたＮＨＳエステルとを含んでいる、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤の調製
ＤＮＡオリゴヌクレオチドのアミノ基における、末端ＮＨＳエステル（化合物７）とリンカーとのＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤の連結によって、ＨＩＶ−１プロテアーゼについての検出プローブを調製した。エタノールアミンと化合物７との反応によって調製された化合物８を、阻害活性におけるＤＮＡオリゴヌクレオチドの連結の影響の決定のため、使用した。実施例１ａに記載されているように、すべての化合物を精製し特徴づけた。
【０２１０】
リトナビル（ＲＴＶ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ発のブランド名ノービアにおいて入手可能）を、商業的に入手可能なカプセルから単離した。当該カプセルにおいて、どちらかといえば非極性の化合物の油性混合物においてＲＴＶは懸濁される。５０のタブレット（それぞれ１００ｍｇのＲＴＶ）を切り開き、丸底形状のフラスコ２１個へと油性物質を絞り出した。５００ｍｌのジエチルエーテルと共に２００ｍｌのヘキサンを加えた。すべての油脂が白い沈殿へと変化するか、または溶液に溶けるまで、得られた懸濁物を３時間粉砕し、超音波処理した。上記沈殿を濾過し、再度、純粋なジエチルエーテルで粉砕／超音波処理し、その後、純粋なＲＴＶを濾過した。３．６ｇのＲＴＶを得た（収率７２％）。ＲＴＶの純度はＨＰＬＣによって決定され、９９％を上回っていた。
【０２１１】
リトナビル（ＲＴＶ）の部分加水分解による、チアゾール−５−イルメチル（（２Ｓ、３Ｓ、５Ｓ）−５−アミノ−３−ヒドロキシ−１，６−ジフェニルヘキサン−２−イル）カルバミン酸（化合物５）の調製：丸底フラスコにおいて、１．００ｇのＲＴＶを５０ｍｌのジオクサンに溶解した。５０ｍｌの濃縮された塩酸を加え、得られた混合物を６５℃で２０時間撹拌した（なお、異なる温度および／または時間では、異なる解離生成物が得られる）。２０時間後、上記混合物を室温まで冷却させた。得られる混合物が標準のｐＨを示すまで、Ｋ２ＣＯ３の添加によって混合物を中和した。回転式の蒸発装置を用いて約５０ｍｌまで上記溶媒を濃縮し、１５０ｍｌの水にスラリーを溶解し、１００ｍｌのＥｔＯＡｃによって３回洗浄した。水相を除去し、有機相を乾燥および蒸発させた。８８５ｍｇの粗混合物が得られ、さらに精製することなく次の反応に使用された（解析的ＨＰＬＣで決定されたように、純度は約８０％）。スペクトルの決定のため、予備ＨＰＬＣを使用して、５０ｍｇを精製した（勾配：２０〜５０％（体積／体積）のＡＣＮで４０分、室温１５分）。解析的ＨＰＬＣ  室温＝１７．３分。
【０２１２】
１Ｈ  ＮＭＲによる解析の結果（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：
【０２１３】
【化３】
2019068838.tif 000014
【０２１４】
１３Ｃ  ＮＭＲによる解析の結果（１２５．７ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：
【０２１５】
【化４】
2019068838.tif 000015
【０２１６】
ＨＲＭＳによる解析の結果（ＥＳＩ＋）：Ｃ２３Ｈ２８Ｏ３Ｎ３Ｓ［Ｍ］＋の計算された質量４２６．１８４５９；検出された質量４２６．１８４５４。
【０２１７】
（Ｓ）−１−（（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，６−ジフェニル−５−（（（チアゾール−５−イルメトキシ）カルボニル）アミノ）ヘキサン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−アミニウム  ２，２，２−トリフルオロ酢酸（化合物６）の調製：５２６ｍｇ（１．６４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）のＴＢＴＵを、６９０μｌのＤＩＥＡ（３．９４ｍｍｏｌ、２．４ｅｑ）と共に、１．５ｍｌのＤＭＦに溶解されている、３５６ｍｇ（１．６４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）のＢＯＣ−Ｖａｌへと加えた。ＲＴＶの粗加水分解物（７００ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を１ｍｌのＤＭＦに溶解し、５分の撹拌の後、一部に加えた。上記反応を一晩放置し、上記ＤＭＦを回転蒸発した。反応混合物を５０ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解し、飽和されているＮａＨＣＯ３によって２回、１０％ＫＨＳＯ４（重量／体積）によって２回、食塩水によって１回洗浄した。上記有機混合物を乾燥および蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーを用いて生成物を精製した（ＴＬＣ解析：ＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．６５）。さらに生成物を５ｍｌの熱いＥｔＯＡｃに溶解し、５ｍｌのジエチルエーテルを加えた。２５０ｍｇの生成物の純度を高めるため（＞９９％、ＨＰＬＣ）得られたゲルを濾過し、乾燥した。ＢＯＣ保護された化合物を純粋なＴＦＡに溶解し、１０分間超音波処理した。窒素のフローによって上記ＴＦＡを除去し、得られた油分を水／ＣＡＮに溶解し、残りのＴＦＡを除去するために凍結乾燥した。全体の収量：２５％（低い収量は、ＴＬＣから不純物と共に除去された分画が原因であった）。解析的ＨＰＬＣ  室温＝１７．４分。
【０２１８】
１Ｈ  ＮＭＲによる解析の結果（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：
【０２１９】
【化５】
2019068838.tif 000016
【０２２０】
１３Ｃ  ＮＭＲによる解析の結果（１２５．７ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：
【０２２１】
【化６】
2019068838.tif 000017
【０２２２】
ＨＲＭＳによる解析の結果（ＥＳＩ＋）：Ｃ２８Ｈ３７Ｏ４Ｎ４Ｓ［Ｍ］＋の計算された質量５２５．２５３００；検出された質量５２５．２５２９２。
【０２２３】
（５Ｓ，６Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ５，８−ジベンジル−６−ヒドロキシ−１１−イソプロピル−３，１０，１３−トリオキソ−１−（チアゾール−５−イル）−２，１６，１９，２２，２５，２８−ヘキサオキサ−４，９，１２−トリアザヘントリアコンタン−３１−オエート（化合物７）の調製：５０ｍｇ（７８．３μｍｏｌ、１ｅｑ）のＮＨＳ−ＰＥＧ５−ＮＨＳ（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ）を３０μｌ（１７２μｍｏｌ、２．２ｅｑ）のＤＩＥＡと共に０．５ｍｌのＤＭＦに溶解し、０．５ｍｌのＤＭＦに溶解されている化合物６、４６ｍｇ（８６．１μｍｏｌ、１ｅｑ）を３０分間滴下した。一晩中反応させるため、反応を放置し、その後、反応混合物を回転蒸発させ、予備ＨＰＬＣを用いて、粗生成物を精製した（勾配：２０〜５０％（体積／体積）のＡＣＮで４０分、室温３２分）。凍結乾燥後３０ｍｇを単離し（収率４０％）、解析的ＨＰＬＣによって決定したように、純度は９９％を優に超えていた。解析的ＨＰＬＣ  室温＝２１．２分。
【０２２４】
ＨＲＭＳによる解析の結果（ＥＳＩ＋）：Ｃ４６Ｈ６３Ｏ１４Ｎ５Ｓ［ＭＮａ］＋の計算された質量９６４．３９８４４；検出された質量９６４．３９９２２。
【０２２５】
チアゾール−５−イルメチル（（２４Ｓ，２７Ｓ，２９Ｓ，３０Ｓ）−２７−ベンジル−１，２９−ジヒドロキシ−２４−イソプロピル−４，２２，２５−トリオキソ−３１−フェニル−７，１０，１３，１６，１９−ペンタオキサ−３，２３，２６−トリアザヘントリアコンタン−３０−イル）カルバミン酸（化合物８）の調製：４ｍｇ（４．２５μｍｏｌ、１ｅｑ）の化合物７を２００μｌのＤＭＦに溶解し、７μｌ（４２．５μｍｏｌ、１０ｅｑ）のＤＩＥＡと共に、３μｌ（４９．７μｍｏｌ、１２ｅｑ）のエタノールアミンを混合物に加え、全体の反応混合物を一晩撹拌放置した。溶媒を回転蒸発させ、上記混合物をＡＣＮ／水に溶解し、（エタノールアミンを除去するため）３回凍結乾燥させた。さらに精製することなく、化合物を生化学実験に用いた（混入はＮＨＳのみであり、そうでなければ純度は９８％より高かった）解析的ＨＰＬＣ  室温＝１９．０分。
【０２２６】
ＨＲＭＳによる解析の結果（ＥＳＩ＋）：Ｃ４４Ｈ６５Ｏ１２Ｎ５Ｓ［ＭＮａ］＋の計算された質量９１０．４２４２６；検出された質量９１０．４２４７９。
【０２２７】
２ｂ：ＨＩＶ−１プロテアーゼの選択的な結合のための、検出プローブの調製
ＨＩＶ−１プロテアーゼの定量化のための検出プローブを、修飾バッファーにおいて、化合物７とｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏのオリゴヌクレオチドとを反応させることによって調製した。修飾バッファーにおいて８μｌのＤＭＳＯを１０μｌのオリゴヌクレオチドに加え（１０．２ｎｍｏｌ；１ｅｑ）、混合後、無水のＤＭＳＯにおいて、得られた溶液を２μｌの化合物７の溶液へと加えた（２０５ｎｍｏｌ；２０ｅｑ）。混合物を室温で４．５時間インキュベートし、それから、４８０μｌのＴＢＳを加え、同じ温度で一晩、インキュベーションを続けた。
【０２２８】
得られた検出プローブ（図１３を参照のこと）を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５
ｍｌ  ３Ｋカラムにおける超音波処理によって、化合物７の加水分解生成物から精製し、保持剤の体積は、ＴＢＳで９倍に続いて１０倍に希釈され、上記検出プローブの濃度を分光光度法で測定した。こうして調製されるプローブを酵素アッセイにおいて阻害係数を決定するために使用した（以下では、ｓｓＨＩＶ１／ＴＢＳと記載する）。ＬＣ−ＭＳによる特徴づけのため、上記プローブをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５  ｍｌ  ３Ｋカラムで再度精製し、保持剤の体積を、蒸留させた水で５倍に続いて１０倍に再度希釈した（以下では、ｓｓＨＩＶ１と記載する）。ＨＩＶ−１プロテアーゼの濃度の決定およびＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤の試験のため、上記プローブを再度１回Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５  ｍｌ  １０Ｋカラムにおける超音波処理によって精製し、まず、保持剤の体積を、二度蒸留された水で７倍から１０倍に希釈し、その後、ＴＢＳバッファーで５倍から１０倍に希釈し、検出プローブの濃度を分光光度法で測定した（ＯＤ  １＝１７４４ｐｍｏｌ）。最後に、プローブをＴＢＳで５μｍｏｌ．ｌ−１の濃度へと希釈し、実施例１ｂに記載されている手法に従って、５０μｌの体積でサーマルペアリングに曝露した。
【０２２９】
結合の効率を検証するため、ｓｓＨＩＶ１のサンプルはＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳによって解析され、手法は、当初のｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏオリゴヌクレオチドおよびｓｓＰＳＭＡの検出プローブの、手法と同一であった（実施例１ｂに記載）。結果は、５．１８分の保持時間で、２６０ｎｍにおいて１つの強い吸着ピークであり、４．９４分および４．９９分の保持時間で、２つの関連した低い強度のピークであり、１７０３５．３４および１７０８５．９９の対応している質量であった（質量の違いは当初のオリゴヌクレオチド５３．４７および１０４．１２によるものである）。１６９８１．８７付近の初期の質量は、これらのピークのｍ／ｚスペクトルにおいて確認されなかった。これら２つの新たな質量は、ｓｓＰＳＭＡの解析においてピークの最初および最後（時間４．９２分および５．００分）において小さな強度で確認されるが、当初のｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏのピークにおいては見られなかった。従って、上記溶剤は両方の修飾されたオリゴヌクレオチドの一般的な特性のみであり、当初のオリゴヌクレオチドを溶解するために使用されなかったため、ＤＭＳＯ中の不純物と共に形成された塩または付加物が生じ得る。１７８０９．０７の質量は、明らかに強いピークが与えられ、当初のｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏと比較された質量の違いは８２７．２０であった。上記検出プローブに対して予測された最も大きな質量は、１７８１０．２９の分子量において１７８０６．２９であり、ｓｓＨＩＶ１の結合と当初のｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏとの質量における予測された違いは、８２６．３８であった（ＣｈｅｍＢｉｏＤｒａｗプログラムによる）。ＬＣ−ＭＳ解析が提供している、２６０ｎｍにおけるピークの吸光度の積分値によると、ｓｓＨＩＶ１の検出プローブ（反応変換）の純度は約８０％だった。このような変換は、さらなる利用のために十分であり、サンプルはさらに精製されなかった。
【０２３０】
２ｃ：調製された化合物および検出プローブの、阻害係数の決定
アッセイにおいて使用されたＨＩＶ−１プロテアーゼ酵素は、「Kozisek et al. 2008, Journal of Virology, p. 5869; Weber et al. 2002, Journal of Molecular Biology, p.739」に記載されているように、発現され、再度折りたたまれ、精製された。最終組成物におけるＨＩＶ−１プロテアーゼの濃度は、ブレカナビル阻害剤による活性部位の滴定によって決定された。上記酵素は、使用前、−２０℃においてアリコート中で凍結貯蔵された。ｓｓＨＩＶ１／ＴＢＳの濃度は、分光光度法で決定され、化合物８の濃度は、解析のバランスにおける重量から導かれた。
【０２３１】
阻害剤の解析は、「Weber et al. 2002, Journal of Molecular Biology, p.739」に記載されているように、クロモジェニックペプチド基質ＫＡＲＶＮｌｅ＊ＮｐｈＥＡＮｌｅ−ＮＨ２を用いて実施された。反応は、総体積１ｍｌの、ｐＨ４．７において１００ｍｍｏｌ．ｌ−１の酢酸ナトリウムと３００ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌにおいて実行された。最終基質濃度はＫＭ（すなわち、１６μｍｏｌ．ｌ−１）付近に維持され、反応におけるプロテアーゼの総量は、６ｐｍｏｌから８ｐｍｏｌであった。種々の濃度の（ＤＭＳＯに溶解された）化合物８またはｓｓＨＩＶ１／ＴＢＳを混合物に加えた。ＤＭＳＯの最終濃度は、常に２．５％（体積／体積）より低かった。基質の加水分解は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光計ＵＮＩＣＡＭ  ＵＶ５００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において３０５ｎｍの吸光度での減少によって監視された。続いてデータは、ＧｒａＦｉｔプログラムにおけるＷｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎによって競合的な阻害に対する数式を用いて解析された。従って、Ｋｉ＝２．３±０．１ｎｍｏｌ．ｌ−１は、化合物８について測定され、一方でｓｓＨＩＶ１／ＴＢＳについてＫｉは０．２３±０．０３ｎｍｏｌ．ｌ−１だった。
【０２３２】
２ｄ：固体担体における直接吸着による、ＨＩＶ−１プロテアーゼの決定およびＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤の試験
本実施形態において、１０％グリセロール（体積／体積）中、２４４ｎｇ．μｌ−１の濃度で精製されたＨＩＶ−１プロテアーゼのストック溶液は、ＴＢＳで１０ｎｇ．μｌ−１へと希釈され、１０μｌは９６ウェルプレートＦｒａｍｅＳｔａｒ４８０／９６のウェルの底に注がれた。同じ体積の純粋なＰＢＳのみは、ゼロコントロールのウェルに注がれた。室温における１５分のインキュベーションの後、上記ウェルの内容物はタップアウトされ、当該ウェルは２００μｌのＴＢＳで３回洗浄された。それから、ＴＢＳで５回希釈されているカゼインブロッキング剤２００μｌを上記ウェルの底に注ぎ、室温で１時間インキュベートした。上記ウェルの内容物をタップアウトし、２００μｌのＴＢＳで３回洗浄した。１０μｌのｓｓＨＩＶ１の検出プローブを、ｐＨ６．０において、７５０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＮａＣｌおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（体積／体積）を含んでいる、２０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＭＥＳの水溶液（ここでは、ＭＥＳＴと称する）に加えた。室温における４５分のインキュベーションの後、上記ウェルの内容物をタップアウトし、当該ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで８回洗浄した。それから、実施例１ｄのテンプレートコントロールがない場合と同様の組成のｑＰＣＲ混合物１０μｌを、上記ウェルの底に注ぎ、結合されている検出プローブの量は、実施例１ｄに記載されているように、ｑＰＣＲによって決定された。
【０２３３】
記載されている方法によって、結合されている検出プローブの量は、注がれた濃度に依存して測定され、不動化されているＨＩＶプロテアーゼに関するプローブの解離定数は、最も高く使用された濃度のプローブ（すなわち、３２ｎｍｏｌ．ｌ−１）よりも高いことがわかった。３．２ｎｍｏｌ．ｌ−１の検出プローブの濃度において、ゼロコントロールのウェル、および１００ｎｇの吸着されたＨＩＶプロテアーゼを含んでいるウェルにおいて測定されたＣｑの違いは、約８サイクルであった。この違いは、結合されているプローブの量における、２桁の大きさの違いに対応する。同じ条件下において、プローブ溶液に対する０．１％、１％または１０％のＤＭＳＯの添加が、プローブの選択的結合または非選択的結合に影響しないことを検証した。最後に、種々の濃度の１２の異なるＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤を、ウェルに注がれた検出プローブ溶液に加え、阻害係数を実施例１ｉに記載されている手法によって決定した。計算のため、５０〜９９％の範囲における活性部位の占有の値のみ、および阻害剤の対応する濃度が使用された。１つの高い濃度の物質だけで、試験される物質のＨＩＶ−１プロテアーゼを阻害するための能力についての質的な情報には十分であった。しかし、質的な情報のため、動的範囲の２桁の大きさによると、一連の１０倍に希釈されている濃度を試験することが必要であった。それから、得られたＫｉ値を、実施例２ｃに記載されている酵素反応速度論の方法から得られた参照の値Ｋｉｒｅｆと比較した。それによって、図１４の両方の方法の結果の図の比較からわかるように、両方の方法の値は互いによく相関していることがわかった。我々の方法で決定されたＫｉと、参照の酵素反応速度論で決定されたＫｉとの間の線形相関の信頼度の値Ｒ２は、０．９７であった。それにも関わらず、本願の方法によって測定された平均値Ｋｉは、Ｋｉｒｅｆよりも顕著に高い（平均して１０倍以上）。これはおそらく、ｐＨ４．７（参照の値はこのｐＨにおいて決定した）およびｐＨ６．０（我々の方法はこのｐＨで実施した）における、酵素反応速度論によってＫｉｒｅｆを決定することが異なる結果につながることも知られているように、両方の方法において使用された異なるｐＨが原因である。ｐＨ６．０で決定されたＫｉｒｅｆは、我々の方法によって決定された値であるｐＨ４．７の値よりも顕著に高い。Ｋｉｒｅｆ値および２つの独立した実験から測定されたＫｉ値を、表１１にまとめる。
【０２３４】
【表１１】
2019068838.tif 000018
【０２３５】
Ｋｉ（１）およびＫｉ（２）は、２回の独立した実験において結果として決定された阻害定数を示していおり、Ｋｉｒｅｆは、酵素反応速度論（ｐＨ４．７）によって得られた基準値である。
【０２３６】
２ｅ：不動化されている抗体に対する結合による、ＨＩＶ−１プロテアーゼの検出およびＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤の試験
他の実施形態において、ＨＩＶ−１プロテアーゼ（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＭＢＳ５３６０３０）を結合しているポリクローナル抗体の溶液１０μｌを、ＴＢＳ中５ｎｇ．μｌ−１で、９６ウェルプレートＦｒａｍｅＳｔａｒ４８０／９６のウェルの底に注ぎ、室温で４５分間インキュベートした。それから、上記ウェルの内容物をタップアウトし、当該ウェルを２００μｌのＴＢＳで３回洗浄した。それから、ＴＢＳで５回希釈されているカゼインブロッキング剤２００μｌを、上記ウェルの底に注ぎ、室温で３時間インキュベートし、それから、上記ウェルの内容物をタップアウトし、当該ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで３回洗浄した。続いて、１０μｌの精製されているＨＩＶ−１プロテアーゼ溶液を、ＴＢＳＴ中異なる濃度で上記ウェルの底に注いだ。室温における１時間のインキュベーションの後、上記ウェルの内容物をタップアウトし、当該ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで３回洗浄した。それから、ＴＢＳＴ中のｓｓＨＩＶ１の検出プローブ溶液１０μｌを加えた。さらなる手法は、実施例２ｄと同様であった。
【０２３７】
上記手法は、検出プローブが１０ｎｍｏｌ．ｌ−１の濃度で注がれた際、検出の範囲が１００ｎｇから１ｎｇのＨＩＶ−１プロテアーゼに達し、１００ｎｇのプロテアーゼを含んでいるウェルと含んでいないウェルとのΔＣｑの違いは９サイクルであったことを示した。また、上記検出プローブ溶液に対する、２０００倍の最終希釈での、カゼインブロッキング剤の添加は、１００ｎｇのプロテアーゼを含んでいるウェルと含んでいないウェルとの間のΔＣｑの違いを１２サイクルに増加させ、これは、上記プローブの結合における１０００倍の違いに対応することがわかった。従って、さらなる決定のため、上記プローブはカゼインブロッキング剤を含んでいるＴＢＳＴバッファーで希釈された。上記検出プローブ溶液の代わりに、ｉｑＰＣＲ＿ａｍｉｎｏのリガンド部分を含んでいない当初のオリゴヌクレオチドの溶液を使用した場合は、１００ｎｇのＨＩＶ−１プロテアーゼの量を注ぐ場合であっても、リガンド部分を介して結合している上記検出プローブの選択性を確認する場合であっても、結合は観察されなかった。また、上記手法は、上記検出プローブ溶液に添加されている溶媒の影響について試験された。０．１％、１％および１０％（体積／体積）の最終濃度のＤＭＳＯにおいて、アセトニトリルまたはメタノールは、検出プローブの結合、プロテアーゼに対する選択的な結合またはプロテアーゼを含まない表面に対する非選択的な結合のいずれにおいても、全く影響しなかった。最後に、種々の濃度の１２の異なるＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤を、上記ウェルに注がれている上記検出プローブ溶液に加え、阻害係数を実施例１ｉに記載されている手法によって決定した。５０〜９９％の範囲における活性部位の占有の値のみおよび阻害剤の対応する濃度が使用された。決定（物質）の正確性をチェックするため、ＨＩＶ−１プロテアーゼを阻害しない多くの物質を高い濃度（１ｍｍｏｌ．ｌ−１）で徐々に加え、これらは、結合されている検出プローブの量の減少につながらなかった。すなわち、間違ったポジティブな結果は観察されなかった。試験された物質のＨＩＶプロテアーゼを阻害するための能力についての質的な情報には、１つの高い濃度の物質で十分である。しかし、量的な情報については、動的な範囲の２〜３桁の大きさが原因で、一連の１０倍に希釈されている濃度を試験することが必要であった。得られたＫｉ値は、実施例２ｃに記載されている酵素反応速度論の方法から得られた、参照の値Ｋｉｒｅｆと比較され、図１５の両方の方法の結果の図の比較から明らかであるように、両方の方法の値は互いによく相関していることがわかった。我々の方法で決定されたＫｉと参照の酵素反応速度論で決定されたＫｉとの直接の相関の信頼度の値Ｒ２は、１．００であった。それにも関わらず、本願の方法によって測定された平均値Ｋｉは、Ｋｉｒｅｆよりもかなり高い（平均して１００倍以上）。これはおそらく、実施例２ｄで議論されているように、両方の方法において使用された異なるｐＨが原因である。この場合、酵素反応速度論（４．７）および我々の方法（７．４）におけるｐＨの違いが重要である。対応する、Ｈ３Ｏ＋イオンの濃度の違いも、３桁の大きさである。この違いがお��らく、測定された値の、１００倍の違いの原因であろう。酵素反応速度論において、ｐＨ４．７を使用することには実質的な理由がある。ｐＨ７．４においては、実質的な測定には、活性はかなり小さいが、ＨＩＶプロテアーゼはｐＨ４．７において最も活性化しているためである。従って、ｐＨ７．４においてＫｉｒｅｆ値を決定することは難しい。この観点において、我々の方法は向上を提供する。生理学的なｐＨにおける測定は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の臨床的な使用の生物学的な環境とかなり近いと考えられるためである。Ｋｉｒｅｆ値および測定されたＫｉ値を、表１２にまとめる。
【０２３８】
【表１２】
2019068838.tif 000019
【０２３９】
Ｋｉは、決定された阻害定数（ｐＨ７．４）を指し、Ｋｉｒｅｆは、酵素反応速度論（ｐｈ４．７）から得られた基準値である。
【０２４０】
〔実施例３：炭酸脱水酵素ＩＩおよびＩＸの検出、およびその阻害剤の試験〕
３ａ：炭酸脱水酵素ＩＩおよびＩＸの共通阻害剤、およびそのＮＨＳエステルの調製
全ての化合物は精製され、実施例１ａにおいて説明されたような特性を有する。メチル４−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブトキシ）ベンゾエート（化合物９）の調製は、メチル４-ヒドロキシベンゾエートの１６１ｍｇ（１当量、１．０６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（４−ヒドロキシブチル）カルバメートの３００ｍｇ（１．５当量１．５９ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ１０ｍｌ中のトリフェニルフォスフィンの４００ｍｇ（１．５当量、１．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、３１２μｌ（１．５当量、１．５９ｍｍｏｌ）のＤＩＡＤを一回分添加し、上記反応物を一晩撹拌し続けた。次に、その混合反応物を蒸発させて、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル  ４：１、ＲＦ＝０．２５、ここで、メチル４−ヒドロキシベンゾエートは上記生成物と同一のＲＦを有する、それゆえ他の反応体は１．５当量が用いられた）によって精製し、２６０ｍｇの白い粉末を得た（収率７５％）。
【０２４１】
１Ｈ ＮＭＲによる分析物の結果は、以下の通りである。（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９５（ｄ，j＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），４．７１（ｓ，１Ｈ），３．９９（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．１７（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，６．３Ｈｚ，２Ｈ），１．８６−１．７５（ｍ，２Ｈ），１．６９−１．６１（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ）。
【０２４２】
１３Ｃ ＮＭＲによる分析物の結果は、以下の通りである。（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６６．９２（ｓ），１６２．７８（ｓ），１５６．１０（ｓ），１３１．６４（ｓ），１２２．５７（ｓ），１１４．１２（ｓ），７９．２０（ｓ）６７．７３（ｓ），５１．８９（ｓ），４０．２９（ｓ），２８．４９（ｓ），２６．８６（ｓ）,２６．４９（ｓ）。
【０２４３】
ＭＳ（ＥＳＩ＋）による分析物の結果はＣ１７Ｈ２５Ｏ５Ｎ〔ＭＮａ〕＋の予想質量は３４６．１７、測定質量は３４６．２であった。
【０２４４】
４−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブトキシ）安息香酸（化合物１０）の調製は、２７０ｍｇの化合物９を５ｍｌのメタノール中へ溶解して５ｍｏｌ．ｌ−１水酸化ナトリウムを５ｍｌ添加した。ＴＬＣ分析が化合物９の完全な消失を示す迄、上記混合物を還流した（６時間）。上記反応混合物を酢酸エチル（２０ｍｌ）により希釈し、その水相を１０％硫化水素カリウム（重量/体積）によって酸性のＰＨへ酸性化させて２０ｍｌの酢酸エチルによりさらに２回抽出した。僅少溶媒の除去後、結晶性白色に変化する、２４０ｍｇの油状生成物が得られた（収率９５％）。
【０２４５】
１Ｈ ＮＭＲによる分析物の結果は、（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０３（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ)，４．６５（ｓ，１Ｈ），４．０４（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．２７−３．２０（ｍ，２Ｈ），１．９１−１．７８（ｍ，２Ｈ），１．６９（ｄｄ，Ｊ＝１４．８，７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）。
【０２４６】
１３Ｃ ＮＭＲによる分析物の結果は、（１０１ＭＨｚ,ＣＤＣｌ３）δ１７１．５１（ｓ）,１６３．４６（ｓ）,１５６．２０（ｓ）,１３２．４２（ｓ）,１２１．９２（ｓ）,１１４．２８（ｓ）,７９．４２（ｓ）,６７．８６（ｓ）,４０．３６（ｓ）,２８．５６（ｓ）,２６．８９（ｓ）,２６．５３(s)。
【０２４７】
ＭＳ（ＥＳＩ−）による分析物の結果はＣ１６Ｈ２２Ｏ５Ｎ［Ｍ］−の測定質量３０８．１６、検出質量３０８．２であった。
【０２４８】
ｔｅｒｔ−ブチル（４−（４−（３−（４−スルファモイルフェニル）ウレイド）フェノキシ）ブチル）カルバメート（化合物１１）の調製は、次のとおりである。化合物１０
７２０ｍｇ（１当量、２．３３ｍｍｏｌ）を１５ｍｌの乾燥トルエンへ溶解して、８１０μｌ（２当量、４．６５ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡを添加した。ＤＰＰＡ（５５２μｌ、１．１当量、２．５６ｍｍｏｌ）を１回分において反応混合物へ添加し、反応混合物の温度を２時間の間、９０℃まで上げた。次に、その反応混合物は蒸発させ、乾燥ＡＣＮ中に溶解し、６０１ｍｇ（１．５当量、３．４９ｍｍｏｌ）のスルファニルアミドを一回分添加し、反応混合物を撹拌しながら一晩６０℃まで暖めた。１２時間後全ての揮発性物質が蒸発し、粗生成物をシリカのカラムクロマトグラフィーにより精製した（ヘキサン：酢酸エチル  ２：５、ＲＦ＝０．２５）。３４０ｍｇの生成物が得られた（単離収率３０％）。
【０２４９】
1Ｈ ＮＭＲによる分析物の結果は、（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ８．９８（ｓ，１Ｈ），８．５９（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２０（ｓ，２Ｈ），６．９１−６．８１（ｍ，３Ｈ），３．９１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．９６（ｄｄ，Ｊ＝１２．９，６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．７１−１．６１（ｍ，２Ｈ），１．５１（ｄｔ，Ｊ＝１３．１，６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）。
【０２５０】
13ＣＮＭＲによる分析物の結果は（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１５５．３７（ｓ），１５４．０２（ｓ），１５２．１６（ｓ），１４２．９９（ｓ），１３６．４０（ｓ），１３２．０４（ｓ），１２６．６１（ｓ），１２０．１４（ｓ），１１７．１２（ｓ），１１４．５０（ｓ），７７．０６（ｓ），６７．０５（ｓ），４０．３５（溶媒ピークとの重複）２７．７７（ｓ），２６．８５（ｓ），２５．７３（ｓ）。
【０２５１】
ＭＳ（ＥＳＩ＋）による分析物の結果は、Ｃ２２Ｈ３０Ｏ６Ｎ４Ｓ［ＭＮａ］＋の測定質量５０１．１７、検出質量５０１．２であった。
【０２５２】
４−（４−（３−（４−スルファモイルフェニル）ウレイド）フェノキシ）ブタン−１−アミニウム２，２，２,−トリフルオロアセテート（化合物１２）の調製は、次の通りである。５００ｍｇの化合物１１は１ｍｌのＴＦＡ中に溶解し、１５分間、超音波処理と撹拌とを交互に行った。ＴＦＡは次に窒素の流れにより除去し、その生成物をいかなる性質決定も精製もすることなしにさらなるステップに用いた。
【０２５３】
２,５−ジオキソピロリジン−１−イル  １９−オキソ−２４−（４−（３−（４−スルファモイルフェニル）ウレイド）フェノキシ）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサ−２０−アザテトラコサン−１−オエート（化合物１３）の調製は、３３ｍｇ（１当量、６７μｍｏｌ）の化合物１２を、ビスＮＨＳ−ＰＥＧ５（３６ｍｇ、１当量、６７μｍｏｌ、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ）およびＤＭＦ（１ｍｌ）中のＤＩＥＡ（２２μｌ、２．５当量、１６８μｍｏｌ）の溶液中にゆっくり加えた（１時間）。その反応混合物は３時間撹拌し続け、次にその揮発性物質を蒸発させた。最終生成物は分取ＨＰＬＣによって精製した（勾配、１５−５０％（体積/体積）ＡＣＮ４０分、ＲＴ３０分間）。１５ｍｇの生成物は９９％より高い良い純度を伴って単離された（収率２８％）。
分析ＨＰＬＣのＲＴは１８．７分である。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）による分析物の結果は、Ｃ３５Ｈ５０Ｏ１４Ｎ５Ｓ［ＭＨ］＋の測定質量７９５．３０６９５、検出質量７９６．３０６７８であった。
【０２５４】
１８−オキソ−２３−（４−（３−（４−スルファモイルフェニル）ウレイド）フェノキシ）−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ−１９−アザトリ−コサン−１−アミニウム２，２，２−トリフルオロアセテート（化合物１４）の調製は、次の通りである。４６ｍｇ（１当量、１１２μｍｏｌ）のＢｏｃ−ＰＥＧ５−ＣＯＯＨを３６ｍｇ（１当量、１１２μｍｏｌ）のＴＢＴＵおよび４９μｌ（２．５当量、２７９μｍｏｌ）のＤＩＥＡとともに０．５ｍｌのＤＭＦ中に溶解した。この溶液５５ｍｇ（１当量、１１２μｍｏｌ）の化合物１２を添加しその混合物を一晩中撹拌した。その溶媒を次に蒸発させてその粗生成物を１０ｍｌの酢酸エチルへ溶解した。その有機層を飽和重炭酸塩によって２回洗浄し、１０％（質量/体積）硫化水素カリウムによって２回洗浄し、乾燥させ蒸発させて、５３ｍｇの生成物を単離した。１ｍｌのＴＦＡを加え、その混合物を、１５分間、超音波処理と撹拌とを交互に行った。ＴＦＡは次に窒素の流れにより除去しその生成物を分取ＨＰＬＣによって精製した（勾配：１０−５０％ＡＣＮ４０分間、ＲＴ＝２２分間）。生成物の１７ｍｇを単離した（収率３１％）。分析ＨＰＬＣのＲＴは、１６．５分であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）による分析物の結果は、Ｃ３０Ｈ４８Ｏ１０Ｎ５Ｓ［ＭＨ］＋の計測質量は６７０．３１１６４、検出質量は６７０．３１１６４であった。
【０２５５】
３ｂ：炭酸脱水酵素の選択的結合用の検出プローブの調製
炭酸脱水素酵素の選択的結合のための検出プローブは、修飾バッファー中で、ｉｑＰＣＲ＿アミノオリゴヌクレオチドと化合物１３とを反応させることにより調製した。ｐＨ８．０の１ｍｏｌ．ｌ−１ＨＥＰＥＳ水性溶液２μｌを、修飾バッファー（８．２ｎｍｏｌ、１当量）中の１０μｌのオリゴヌクレオチドにはじめに追加した。撹拌後、無水ＤＭＳＯ中の５０ｍｍｏｌ．ｌ−１濃度の化合物１３の溶液８．２μｌ（４１０ｍｍｏｌ、５０当量）を加えて、再び撹拌した。最後に、無水ＤＭＳＯ５μｌを該混合物に加え、撹拌後、室温にて一晩インキュベートした。上記混合物は、次に、ｐＨ８．０の０．１ｍｏｌ．ｌ−１ＨＥＰＥＳ水溶液９００μｌ中に希釈し、室温でさらにもう一日インキュベートした。得られた検出プローブ（以降ｓｓＣＡ、図１３）は、化合物１３の加水分解生成物からアミコンウルトラ０．５ｍｌ  １０Ｋの限外濾過により精製され、当該プローブを含む濃縮水の容積は２段蒸留水中に５回連続的に１０倍希釈され、次にＴＢＳ中に５回連続的に１０倍希釈された。ｓｓＣＡプローブの濃度は、次に分光測定で定量した（ＯＤ１＝１７４４ｐｍｏｌ）。
【０２５６】
ｓｓＣＡサンプルは、実施例１ｂにおいて説明したと同様の方法で、Ａｇｉｌｅｎｔ６２３０ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳのＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳを用いて分析し、ただし０．０５％（重量／体積）酢酸アンモニウム水溶液を、ＨＦＩＰの代わりとしてＴＥＡとともに移動相として用いた。分析結果は、保持時間５．１４分で相関重量が１７６６３．２８である２６０ｎｍの主要な吸着ピークであって、一方予想された分子量は１７６６３．８６であった。ｓｓＣＡと元のｉｑＰＣＲ_アミノとの間の測定質量の差異は予想された差異６８０．３０に対し６８１．４０である。該生成物の純度は約８０％だった。
【０２５７】
炭酸脱水酵素の検出において用いるため、およびその阻害剤を試験するために、検出プローブを有するニュートラアビジンの複合体であるＮｅｕ_ｄｓｂｉｏｔＣＡを調製した。はじめに、７５０ｐｍｏｌのｓｓＣＡプローブを５００ｐｍｏｌのｉｑＰＣＲ＿ビオチンとともに５０μｌのＴＢＳにて希釈し、実施例１ｂにおいて説明された手順により熱的に対合させた。得られた溶液１０μｌを、１ｍｇ.ｍｌ−１の濃度のニュートラアビジン３μｌと混合し、混合後、はじめに３時間を室温でインキュベートし、次に氷上で一晩インキュベートした。得られたＮｅｕ＿ｄｓｂｉｏｔＣＡ複合体は、アミコンウルトラ０．５ｍｌ  １００Ｋ上の限外濾過によって精製され、その複合体を含んだ濃縮液の体積はＴＢＳにて２回連続的に１０倍希釈された。複合体中の検出プローブの最終濃度はｑＰＣＲにより、実施例１ｄに説明したようなｓｓＰＳＭＡ基準の希釈系列と比較することにより決定した。
【０２５８】
３ｃ.ＣＡ−ＩＩの検出およびＣＡ−ＩＩの阻害剤の試験
ヒト炭酸脱水酵素ＩＩの精製基準は、シグマ−アルドリッチ社から指示されたものである（ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ６１６５）。その凍結乾燥タンパク質を２段留水中に溶解した後、そのタンパク質を、最終濃度１０ｎｇ．μｌ−１から１０ｐｇ．μｌ−１となるようにＴＢＳ中に希釈し、その溶液の１０μｌを９６ウェルプレートＦｒａｍｅＳｔａｒ４８０／９６のウェルの底へアプライし、純ＴＢＳの１０μｌをコントロールのためにアプライした。４０分間室温でインキュベーションした後、ウェルの内容物を吸いきって、ウェルを２００μｌのＴＢＳを用いて３回洗浄した。次に、ＴＢＳ中にて５倍希釈されたカゼインブロッキング剤１００μｌをウェルの底へアプライし、室温にて２時間インキュベートした。続けて、ウェルの内容物を吸いきって、ウェルを２００μｌのＴＢＳＴを用いて３回洗浄した。１ｎｍｏｌ．ｌ−１濃度の検出Ｎｅｕ＿ｄｓｂｉｏｔＣＡプローブの溶液１０μｌを、合計で１０００倍希釈されたカゼインブロッカーの追加を伴う、２０ｍｍｏｌ．ｌ−１トリス、２００ｍｍｏｌ.ｌ−１塩化ナトリウムおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(体積/体積)  ｐＨ７．４の溶液（以降、ＴＢＳＴ２００バッファー）に添加した。更なる手順は、実施例２ｄと同様である。
【０２５９】
その説明された手順は、ＣＡ−ＩＩタンパク質１００ｎｇ（０コントロールと比較したΔＣｑは９サイクルである）および１０ｎｇ（０コントロールと比較したΔＣｑは５サイクルである）の両方を検出することができた。アプライされた検出プローブの溶液中において１％（体積/体積）の最終濃度となるようなＤＭＳＯの追加は、固定化されたタンパク質ＣＡ−ＩＩへのプローブの選択的な結合、または、ゼロ・コントロールにおける表面への非選択的結合を、変えることが無い、ということもまた見出した。最後に、最終濃度１００μｍｏｌ．ｌ−１における１２の異なる既知のＣＡ−ＩＩの阻害剤を、ウェルへアプライされた検出プローブの溶液へ個別に加えた。これは、全ての１２物質がＣＡ−ＩＩを阻害したということ、すなわち、試験された全ての阻害物質において、検出プローブの結合の観測可能な減少があったこと、が定性的に実証された。
【０２６０】
３ｄ：ＣＡ−ＩＸの検出およびＣＡ−ＩＸ阻害剤の試験
精製抗体Ｍ７５（Ｚａｖａｄａ ｅｔａｌ．２０００，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，ｐ．１８０８）の溶液１０μｌを、ＴＢＳ中１０ｎｇ．μｌ−１の濃度において、９６ウェルプレートＦｒａｍｅＳｔａｒ４８０／９６のウェルの底へアプライして、７５分間室温にてインキュベートした。次にウェルの内容物を吸いきって、２００μｌのＴＢＳを用いてウェルを３回洗浄した。次に、ＴＢＳ中に５倍希釈されたカゼインブロッキング剤１００μｌを、ウェルの底へアプライして室温にて２時間インキュベートし、次にウェルの内容物を吸いきって、ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで３回洗浄した。次に、ＴＢＳＴ２００中の様々な濃度での、精製炭酸脱水酵素ＩＸの溶液１０μｌを、ウェルの底に添加した。炭酸脱水素酵素ＩＸの触媒ドメインおよびＰＧドメインを含むコンストラクト（アミノ酸５５から３９０、以下、ＣＡ−ＩＸ  ＰＧと称される）は、昆虫のＳ２細胞において組換え発現により調製し、（Ｍａｄｅｒ，  ２０１０  Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒａｇｕｅ）にて述べられるように精製した。室温にて２時間インキュベーション後、ウェルの内容物を吸いきって、ウェルを２００μｌのＴＢＳＴで３回洗浄した。次にＴＢＳＴ２００中の様々な濃度での、Ｎｅｕ＿ｄｓｂｉｏｔＣＡ検出プローブの溶液１０μｌを、結果として２０００倍希釈となるようにカゼインブロッカーとともに加えた。更なる手順については、実施例２ｄと同様である。
【０２６１】
上述の手順とともに、ウェルへＣＡ−ＩＸ  ＰＧの１ｎｇをアプライ後、濃度依存性の結合検出プローブ量を測定し、プローブの解離定数が、プローブの最も高い使用濃度、すなわち５０ｎｍｏｌ．ｌ−１よりも著しく高いことが分かった。さらに、検出プローブの濃度５ｎｍｏｌ．ｌ−１において、ゼロ・コントロールのウェルと、ＣＡ  ＩＸ  ＰＧの１ｎｇを伴うウェルとにおいて測定されたＣｑの差異は約１０サイクルであり、これは結合したプローブの量において２桁以上の差異に相当する。同じ条件下で、ＣＡ−ＩＸ  ＰＧの定量のダイナミックレンジは５０ｐｇから１ｎｇであった。表１３を参照のこと。同じ手順において、検出プローブの溶液への、０．１％から１０％（体積／体積）の濃度でのＤＭＳＯの添加は、プローブの選択的結合または非選択的結合へ影響しないことが実証された。
【０２６２】
【表１３】
2019068838.tif 000020
【０２６３】
最後に、合計１２の異なるＣＡ−ＩＸ阻害剤（上記ＣＡ−ＩＩのために試験されたものと同一の物質）の様々な濃度を、ウェル中へアプライされた検出プローブ溶液へ添加し、実施例１ｉにおいて説明された手順をもって、その阻害定数を決定した。４０から９９．５％の範囲における活性部位占有率の値、および、これに対応する阻害剤の濃度のみが、計算のために用いられた。被験物質のＣＡ−ＩＸを阻害する能力についての定性的な情報のために、一つの高濃度（１００μｍｏｌ．ｌ−１）で物質を試験することで充分であった。定性的な情報を得る上で、セッティングのダイナミックレンジ（２〜３桁）のために、濃度の１０倍希釈系列を試験することは必要であり、これにより、阻害剤の２〜３の連続的な希釈物において、測定されるＫｉ値は実質的に、常に同一である。得られたＫｉ値を、次に酵素反応速度論から得られた引用Ｋｉｒｅｆ値と比較した。２つの方法によって得られたその値は、表１４に要約した。酵素反応速度論はまた、化合物１３（すなわち検出プローブ単体のリガンド部分）のＫｉｒｅｆを約４００ｎｍｏｌ．ｌ−１と決定した。その表と、図１６における両方の結果の図式的な比較とから明白なように、両方の方法により決定されるその値はとても良く相関し、絶対値でさえも一致した。ここで開示された方法により決定されたＫｉと、参照酵素反応速度論をもって決定されたＫｉｒｅｆとの間での直線相関の信頼性値Ｒ２は０．９６であった。
【０２６４】
２、３の物質にのみ、ＫｉおよびＫｉｒｅｆの間で見られるより著しい差異（５〜１０倍）があった。これらの差異の正確な理由は明らかではない。一方または他方の方法による決定に際してのエラーによってか、２つの決定法間の主要な相違によってか、の両方によって引き起こされた可能性がある。はじめに、酵素反応速度論は、大量の荷電アミノ酸を含むＰＧドメインをもたず、かつ、その部位のＮ−グリコシル化を防ぐ部分変異Ｎ３４６Ｄを含むＣＡ−ＩＸコンストラクトを用いて測定された。Ｋｉｒｅｆの決定と同様に、コンストラクトの調製および精製は、（Ｂｒｙｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｐ．  １３７６０−１３７６３）に説明されている。部分変異と同様、構造ドメインの欠失が炭酸水素酵素の特性に影響するかもしれず、故に異なる結果が引き起こされると推測されうる。そのうえ、酵素反応速度論を用いた決定は、ＣＡ−ＩＸの触媒作用の結果として、反応溶液のｐＨが初期の１０から７へ変化することを、ｐＨ指示薬を用いて測定することに基づくものである。しかしながら、ｐＨ変化はまたいかなる酵素活動がなくともＣＯ２飽和によっても発生するので、規定したｐＨにおける阻害剤の親和力が測定されず、むしろｐＨのレンジが１０から７までにわたる平均的な親和力が測定される。対して、我々の方法において、阻害剤（被験物質）の親和力は、規定したｐＨ７．４にて測定され、それは測定の間変化しない。このことは、異なるＫｉ値が決定された理由に非常になりそうである。
【０２６５】
【表１４】
2019068838.tif 000021
【０２６６】
３ｅ：ＣＡ−ＩＸの検出および厳密結合性二価プローブを用いるＣＡ−ＩＸ阻害剤の試験
ＣＡ−ＩＸ検出用の二価プローブは、化合物１３と、３’末端６−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）ヘキシルリン酸修飾および５’末端６−アミノへキシルリン酸修飾を含む配列ＡＡＡ ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＧＡ ＣＡＡ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡＡ Ａ（カスタム合成Ｇｅｎｅｒｉ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，  ＯＰＣ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のオリゴヌクレオチドと、を反応させることにより調製した。その調製、精製およびＬＣ／ＭＳ分析は実施例３ｂにおいて説明した手順と同一であった。測定された元のオリゴヌクレオチドの重量は１８１００．８５であった、一方、化合物１３との反応後のオリゴヌクレオチド（以降ｓｓＣＡｂｉｓ）の重量は１９４６２．３６であり、付加した化合物１３の質量（６８０．３０）の２倍に相当する１３６１．５０の重量差異相当である。
【０２６７】
前述の実施例において説明した手順に従って、ＨＴ−２９株（Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析により決定された、使用した総タンパク質量は１μｇ）の細胞溶解物中に含まれる約８０ｐｇのＣＡ−ＩＸを、Ｍ７５抗体を用いて固定化した。固定化ＣＡ−ＩＸは続いて、ＨＥＰＥＳＴＣバッファー中に希釈した様々な濃度のｓｓＣＡｂｉｓ検出プローブ（濃度範囲１０ｐｍｏｌ．ｌ−１から１００ｐｍｏｌ．ｌ−１）とともにインキュベートし、プローブのＫｄを２．１ｎｍｏｌ．ｌ−１として決定し（＋−０．３ｎｍｏｌ．ｌ−１）、それは一価プローブ（１分子の化合物１３のみを含むプローブ）の親和力と比較し２０倍以上の改善されたものである。同じ手順を、１μｌの血清から固定化したＣＡ−ＩＸに対して繰り返し、測定されたＫｄはほぼ同一であった（２．２ｎｍｏｌ．ｌ−１＋−０．３ｎｍｏｌ．ｌ−１）。
【０２６８】
当該アッセイの検出限界および分析のダイナミックレンジを決定するため、ＲｎＤＳｙｓｔｅｍ社製の商業的なＥＬＩＳＡキットを用いることで濃度を決定しているＣＡ−ＩＸの基準（ｓｔａｎｄａｒｄ)を調製した（ＨＴ−２９細胞株の細胞溶解物）。この基準の希釈系列は、次に、ウェル中で、３時間、固定化したＭ７５抗体と共にインキュベートした。洗浄後、ＨＥＰＥＳＴＣバッファーにおいて２００ｐｍｏｌ．ｌ−１の濃度へ希釈したｓｓＣＡｂｉｓ検出プローブを、１時間、ウェルへ加え、次の洗浄の後、結合したプローブの量をｑＰＣＲを用いて決定した。図１７に示すように、分析の直線的なレンジはＣＡ−ＩＸの８ｆｇから８００ｐｇの間で、最も低い検出された量は２．５ｆｇであった。
【０２６９】
３６人の被験者から採取した血清サンプル中のＣＡ−ＩＸの濃度は、同じ手順によって決定した。３６人の被験者は、１２人の健康な男性；組織学的に確認された腎臓明細胞癌を有している１０人の男性と２人の女性；組織学的に確認された前立腺癌を有する１２人の男性；である。１０μｌの希釈していない血清（固定化されたＭ７５抗体を配したウェル中にて２１時間インキュベートした。）においてＣＡ−ＩＸの量を決定した。サンプル中におけるＣＡ−ＩＸの濃度は、結合したプローブの量を、前のパラグラフで説明した、０．１から１．５ｎｇ．ｍｌ−１までを範囲とする、基準の希釈系列と比較することによって決定した。得られたデータを裏付けるために、全てのサンプルを拮抗的なＣＡ−ＩＸ阻害剤アセタゾルアミド（ＡＡＺ）の存在下においてもまた、プローブとともにインキュベーションした。そのプローブの結合はＡＡＺを加えることにより抑制されることと、プローブ結合の阻害の強さはアセタゾルアミドのＫｉに相当することとが確認された。ＣＡ−ＩＸの濃度１ｐｇ．ｍｌ−１未満に対応する量まで、アセタゾルアミドの添加がプローブ結合を抑制したことは、検出限界が、約１０μｌの血清の消費を伴うときに、約１ｐｇ．ｍｌ−１であること（全体において１０ｆｇ）を示す。その得られた値の更なる確認のため、全てのサンプル中におけるＣＡ−ＩＸの濃度をＲｎＤＳｙｓｔｅｍから商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキットをもって測定し、図１８に示すように、両方の方法の結果は非常に良く相関し、ただし、我々の方法で測定した濃度は、ＥＬＩＳＡキットで得た濃度に比べ、絶対値において約８０％高かった。ＥＬＩＳＡキットと比較して、我々の方法はいくつかの利点を提供する。この利点は、血清の１０倍低い消費量にて同じ感度；約２〜３桁の直線レンジ；および、何よりも、阻害剤無しでプローブとＣＡ−ＩＸとをインキュベートすることによって、結果の精度を実証することが出来る機会があることである。
【０２７０】
図１９は、グループに従って分けた、我々の方法で測定した濃度を示し、血清中のＣＡ−ＩＸの濃度が、腎臓明細胞癌の患者および前立腺癌の患者の両方が健常者よりも高く（中央値がそれぞれ順に、０．１５９、０．１６２、および、０．０６２ｎｇ．ｍｌ−１）、両方のケースにおいて差異が統計的に有意である（ｐ＜０．０５）。
【０２７１】
二価ｓｓＣＡｂｉｓプローブはまた、１０の被験物質の阻害定数を決定するために用いられた。ＴＢＳＴバッファー中に溶解したＨＴ−２９株の細胞溶解物（ウェル中のタンパク質の総量は、約８００ｐｇのＣＡ−ＩＸを含む１０μｇ）またはヒトドナーからの純粋血清の１０μｌ（約１０ｐｇのＣＡ−ＩＸを含む）のいずれかに含まれる未精製ＣＡ−ＩＸは、Ｍ７５抗体を用いてウェルの底へ固定化した。未結合物質をマトリクスから洗い落とした後、固定化ＣＡ−ＩＸを、１０％ＤＭＳＯを含むＨＥＰＥＳＴＣバッファーにおいて５００ｐｍｏｌ．ｌ−１の濃度へ希釈されたｓｓＣＡｂｉｓプローブと；個別に、１００μｍｏｌ．ｌ−１または１μｍｏｌ．ｌ−１の濃度の、様々な被験物質と；ともにインキュベートした。洗浄後、結合したプローブの量をｑＰＣＲを用いて決定し、被験物質が添加されたウェルと添加されていないウェルとにおける、結合したプローブ量の相違から、これら物質の阻害定数を、式（１６）に従って計測した。その阻害定数は、ブリンダらが（２０１３年、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１３７６０頁）において記載した、精製したトランケート体組換えタンパク質を用いた酵素反応速度論から得たＫｉｒｅｆ値と比較した。得られた値は表１５に要約され、我々の方法により得られた値は、酵素反応速度論から得られた値と同一であることが明らかである。同じ方法で、化合物１４の阻害定数は３００ｎｍｏｌ．ｌ−１と決定された。我々の方法はそれゆえこの標準分析法と同様に適切である、しかし加えていくつかの利点をもち、標準分析法とは異なり、組換えＣＡ−ＩＸを調製または精製する必要が無い、なぜなら、それは例えば血清中に含まれるような極少量のみで十分だからである；さらに、直線的レンジが大きいため、被験物質の２つの濃度のみを試験すれば十分であって、酵素反応速度論におけるように、被験物質の全希釈系列を試験する必要がないためである。さらに、我々の方法はＣＡ−ＩＸ阻害剤のＨＴＳに適する。なぜなら、我々の方法は、全工程がマイクロプレート配置上において行われてオートメーション化可能であるが、酵素反応速度論の場合は不運にもそうではないからである。
【０２７２】
【表１５】
2019068838.tif 000022
【０２７３】
〔実施例４：アスパラギン酸プロテアーゼの活性部位への選択的結合用の、ユニバーサル検出プローブ〕
４ａ：ペプスタチンＮＨＳエステルの調製
全ての化合物は精製され、実施例１ａに説明したとおりの特性を有する。（２１Ｓ，２４Ｓ，２７Ｓ，２８Ｓ，３２Ｓ，３５Ｓ，３６Ｓ）−１−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−２８，３６−ジヒドロキシ−２７，３５−ジイソブチル−２１，２４−ジイソプロピル−３２−メチル−１，１９，２２，２５，３０，３３−ヘキサオキソ−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサ−２０，２３，２６，３１，３４−ペンタアザオクタトリアコンタン−３８−オイック酸、ＮＨＳ−ＰＥＧ５−ペプスタチン（化合物１５）の調製は、以下の通りである。ペプスタチンは、２−クロロトリチルクロライド樹脂（Ｉｒｉｓ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた、固相上の標準アミノ−Ｆｍｏｃ合成により合成した。スタートアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｓｔａ−ＯＨ）は、製品の指示書に従って固相へ固定した。上記の樹脂は、Ｆｍｏｃ−Ｓｔａ−ＯＨ（樹脂代替に対して０．６当量）とともに、４当量のＤＩＥＡの存在下において、２時間、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中で反応させておいた。残りの反応性残渣は、１５分間、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ（１７：２：１）の混合物を用いてクエンチングした。他の全てのアミノ酸は、ＨＯＢｔ／ＤＩＣ方法を用いて付加した。得られたタンパク質は、次に、９５％（体積／体積）ＴＦＡ（２．５％（体積／体積）水および２．５％（体積／体積）トリイソプロピルシラン）を用いて固相から切断し、得られた粗成生物をさらに精製することなしに次のステップへ用いた（切断後の精製度は９５％以上）。１８ｍｇ（１．１当量、３３μｍｏｌ）のｂｉｓ−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステル（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ）は、２５μｌ（５当量、１６５μｍｏｌ）のＤＩＥＡとともに、０．２５ｍｌのＤＭＦへ溶解した。２０ｍｇ（１当量、３０μｍｏｌ）のペプチドは、次に、撹拌している上記溶液へゆっくり滴状で添加し（１時間の間）、その反応は３時間行った。次に揮発性物質を蒸発させ、得られた最終生成物を分取規模ＨＰＬＣにより精製した（勾配：１５−５０％（体積／体積））ＡＣＮ中に４０分、ＲＴ＝３１分）。１０ｍｇの生成物が、９９％以上の純度で単離された（収率３３％）。分析ＨＰＬＣ  ＲＴ＝１９．５分であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）による分析結果は、Ｃ４７Ｈ８１Ｏ１８Ｎ６［Ｍ］−の計算質量は１０１７．５６１２８、検出質量は１０１７．５６０７９であった。
【０２７４】
４ｂ：アスパラギン酸プロテアーゼの選択的結合用の検出プローブの調製
アスパラギン酸プロテアーゼの選択的結合用の検出プローブは、修飾バッファー中で、化合物１５とｉｑ＿ＰＣＲアミノオリゴヌクレオチドとを反応をすることにより調製した。はじめに、４μｌのｐＨ８．０  ＨＥＰＥＳ  １ｍｏｌ．ｌ−１水溶液を、修飾バッファー中の２０μｌのオリゴヌクレオチド（１６．３ｎｍｏｌ、１当量）へ添加した。撹拌後、無水ＤＭＳＯ中２０ｍｍｏｌ．ｌ−１濃度の化合物１５溶液を１６．３μｌ（３２６ｎｍｏｌ、２０当量）添加し、再び撹拌した。最後に、１５μｌのＤＭＳＯをその混合物へ添加し、撹拌後、その混合物を室温にて一晩インキュベートした。
【０２７５】
得られた検出プローブ（以降ｓｓＡＰ、図１３）は、化合物１５の加水分解生成物から、アミコンウルトラ０．５ｍｌ  １０Ｋ上の限外濾過により精製した。カラムにアプライされる前に、反応混合物は１ｍｌの２段蒸留水に希釈し、次に、限外濾過中に、プローブを含んだ濃縮水の体積を２段蒸留水にて１０回連続的に１０倍希釈した。ｓｓＡＰプローブの濃度は、分光測定で定量した（ＯＤ１＝１７４４ｐｍｏｌ）。ｓｓＡＰのサンプルは実施例３ｂにおいて説明されたものと同様の手順によって、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６２３０  ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳのＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳにより分析したが、ＡＣＮの勾配だけは６分間で５−６０％（体積／体積）であった。分析の結果、保持時間４．５４分の、２６０ｎｍの主要な吸着ピークがみられ、１７８８７．１０の重量に相当する（予想分子量は１７８８７．２０）。ｓｓＡＰと元のｉｑＰＣＲ＿アミノとの間の測定重量の差異は、予想された差異の９０４．２０と比較して９０５．２３であった。生成物の精製度は９５％以上であった。
【０２７６】
４ｃ：ヒトカゼプシンＤ用の、調製済検出プローブの阻害力の決定
ヒトカゼプシンＤ用のｓｓＡＰ検出プローブの阻害能力は、酵素反応速度論から決定した。その手順は、（Ｍａｓａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
ｐ．  １５４７４）において説明されたものと同様であった。カゼプシンＤは、（Ｆｕｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐ．  ５５５）中の手順によって調製した。円錐形の底を持つ白色９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ  Ｖ９６）のウェルへ、ｐＨ４．０のアセテートバッファー９３．５μｌ（１００ｍｍｏｌ．ｌ−１酢酸ナトリウム、３００ｍｍｏｌ．ｌ−１塩化ナトリウム）、０．５μｌのカゼプシンＤ溶液、および、既知濃度の検出プローブ溶液１μｌを次々に充填した。測定の直前に、２％（体積／体積）ＤＭＳＯ中の４０μｍｏｌ．ｌ−１濃度の、蛍光原基質の溶液（Ａｂｚ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｎｐｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ａｂｓはアミノ安息香酸であり、Ｎｐｈは４−ニトロフェニルアラニン）５μｌを加えて、次に、基質の開裂率をＴｅｃａｎ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００ｒｅａｄｅｒ（３３０ｎｍでの励起および放射４１０ｎｍ）で観察した。そのＩＣ５０値は、検出プローブの濃度のvi/v0比率への依存性から、約１ｎｍｏｌ．ｌ−１となるように決定された。上述のようなプローブの親和力は、カゼプシンＤの十分な感受性検出のために効率的である。
【０２７７】
〔実施例５：インフルエンザノイラミニダーゼの活性部位への選択的結合用検出プローブ〕
５ａ：アジド基が付加された、インフルエンザノイラミニターゼの選択的阻害剤の調製
化合物１７である、１−（６−アジドへキシル）−１−メチル−（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ)−４−アセチルアミノ−５−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノ−３−（１−エチルプロポキシ)−１−シクロへキセン−１−ホスホネートは、（Ｃａｒｂａｉｎ  ２０１０，  Ｄｏｃｔｏｒａｌ  ｔｈｅｓｉｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｕｓｓｅx）中に説明された手順と同様にして調製した。
【０２７８】
化合物１８である、１−（６−アジドへキシル）−（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノ−３−（１−エチルプロポキシ）−１−シクロへキセン−１−ホスホネートの調製は、下記の通りである。化合物１７のジアステレオマーの混合物（０．０６８ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦの４ｍｌ中に溶解し、チオフェノール（０．０５ｍｌ、０．６６ｍｍｏｌ）およびトリチルアミン（０．１５ｍｌ、０．１８ｍｍｏｌ）をこの溶液中に溶解した。その反応混合物を２日間室温にて撹拌し、次にチオフェノール（０．０５ｍｌ、０．６６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．１５ｍｌ、１．０８ｍｍｏｌ）を再び加えた。次の日、その反応混合物をロータリーエバポレーター上で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出剤はエチルアセテート：メタノール／３：１から１：２）により抽出した。収量は、脱メチル化生成物として０．０４２ｇ。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）による分析結果は、Ｃ２４Ｈ４３Ｏ７Ｎ５Ｐの計算質量は５４４．２９０６、検出質量は５４４．２９０２であった。
【０２７９】
化合物１９である、１−（６−アジドへキシル）−（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３−（１−エチルプロポキシ）−１−シクロへキセン−１−ホスホネートの調製は、以下の通りである。化合物１８（０．０４ｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）３ｍｌをトリフルオロ酢酸へ溶解し、室温において２時間撹拌後、その反応混合物を蒸発させて、残渣をリバースカラム上の分取ＨＰＬＣにより精製した（固定相Ｃ−１８修飾シリカゲル、移動相はアセトニトリル／０．１％（体積／体積）トリフルオロ酢酸を含む水）。収量は最終生成物０．０２ｇ。
【０２８０】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）による分析結果は、Ｃ１９Ｈ３７Ｏ５Ｎ５Ｐの計算質量は４４６．２５２７、検出質量は４４６．２５２７であった。
【０２８１】
５ｂ：インフルエンザノイラミニダーゼの検出プローブの調製
ジベンジルシクロオクチン基を有するオリゴヌクレオチド（以降ｓｓＡＤ）の調製は以下の通りである。最初に、２倍濃縮の５０μｌの修飾バッファーを、４８μｌの２段蒸留水中に溶解したｉｑＰＣＲアミノオリゴヌクレオチド（２０．２ｎｍｏｌ、１当量）へ添加した。無水ＤＭＳＯ中２０ｍｍｏｌ．ｌ−１（１．００８μｍｏｌ、５０当量）濃度のジベンジルシクロオクチンＮＨＳ−エステル（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．ｎｏ．７６１５２４）を５０．４μｌ添加し、撹拌した。沈殿が認められると、追加の７０μｌのＤＭＳＯを続けて添加し、撹拌した。室温にて２日間インキュベーション後、得られた修飾オリゴヌクレオチド（ｓｓＡＤ）は、アミコンウルトラ０．５ｍｌ  １０Ｋカラム上の限外濾過により精製された。カラムへアプライする前に、この反応混合物を２段蒸留水に希釈して１ｍｌとし、次に、限外濾過中に、その濃縮水の体積を２段蒸留水にて１０回連続的に１０倍希釈した。濃縮水中のオリゴヌクレオチド濃度は、分光測定で定量した（ＯＤ１＝１７４４ｐｍｏｌ）。生成物のサンプルは、実施例４ｂにおいて説明された通り、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６２３０  ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳのＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳにより分析した。分析の結果、１７２６９．７５の重量に相当する、保持時間４．４７分の、２６０ｎｍの吸着ピークが見られた。元のｉｑＰＣＲ＿ａｍｎｉｎｏに対応する重量は検出されず、反応による完全な転化が示唆される。ｓｓＡＤと元ｉｑＰＣＲアミノとの間の測定重量の差異は、予想された差異の２８７．４０と比較して、２７８．８８であった。
【０２８２】
インフルエンザノイラミニダーゼの検出プローブ（以降ｓｓＡＤ＿ＮＡ、図１３）の調製は次のとおりである。最初に、２倍濃縮の修飾バッファー８．８μｌを、２段蒸留水７．３ｍｌ中のｓｓＡＤオリゴヌクレオチド（３．０ｎｍｏｌ、１当量）に加えた。撹拌後、無水ＤＭＳＯ中２０ｍｍｏｌ．ｌ−１（３０ｎｍｏｌ、１０当量）濃度の化合物１９の溶液を１．５μｌ加え、再び撹拌した。３日室温にてインキュベーション後、得られた検出プローブｓｓＡＤ＿ＮＡは、アミコンウルトラ０．５ｍｌ  １０Ｋカラム上の限外濾過により精製した。カラムへアプライする前に、この反応混合物を２段蒸留水に希釈して１ｍｌとし、次に、限外濾過中に、その濃縮水の体積を２段蒸留水にて１０回連続的に１０倍希釈した。濃縮水中のプローブ濃度は、分光測定で定量した（ＯＤ１＝１７４４ｐｍｏｌ）。プローブのサンプルは、実施例４ｂにおいて説明された通り、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６２３０  ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳのＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳにより分析した。分析の結果、１７７１５．２５の重量に相当する、保持時間４．７３分の、２６０ｎｍの吸着ピークが見られた。元のｓｓＡＤに対応する重量は検出されず、反応による完全な転化が示唆される。ｓｓＡＤ＿ＮＡと元のｓｓＡＤとの間の測定重量の差異は、予想された差異の４４５．５０と比較して、４４５．５０であった。
【０２８３】
５ｃ：調製した検出プローブの阻害定数の決定
試験されるノイラミニダーゼＮ１型は、流行性ウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（ＧｅｎＢａｎｋＣＹ１２１６８２）に由来する。触媒ドメイン（アミノ酸８２−４６９）のコーディング配列はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社により合成され、ｐＭＴＢｉＰベクターへクローニングし、得られたコンストラクトは（シグナルペプチドに加えて）、Ｎ末端のＡｖｉ−ｔａｇと、当該タグの切断のためのトロンビン切断部位とを含む。ノイラミニターゼを昆虫のＳ２細胞中に発現させて、分泌タンパク質を、硫酸アンモニウムを用いた沈殿によって、ＳＦ９００培地（ＵＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商業的に入手可能な培地）から精製した。５０％硫酸飽和状態から得られた可溶性画分は５０ｍｍｏｌ．ｌ−１トリス、ｐＨ８．０の１５０ｍｍｏｌ．ｌ−１塩化ナトリウム中に透析され、ゲル浸透クロマトグラフィーによって、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上に濃縮および分離された。ノイラミニターゼ触媒活性を伴う複数の画分を統合して、最終濃度１０ｍｍｏｌ．ｌ−１の塩化カルシウム溶液およびトロンビンアガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を添加し、４℃にて１２時間インキュベートした。この混合物は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム上のゲル浸透クロマトグラフィーによって分けた。Ａｖｉ−ｔａｇをもたない活性型のノイラミニダーゼを含む画分（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動およびウェスタンブロッティングによる決定）は、反応速度実験の為に凍結した。
【０２８４】
ノイラミニダーゼの酵素活性は、１００ｍｍｏｌ．ｌ−１ＭＥＳ、１５０ｍｍｏｌ．ｌ−１塩化ナトリウム、ｐＨ６．１５の１０ｍｍｏｌ．ｌ−１塩化カルシウム中の蛍光基質２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸（４−ＭＵＮＡＮＡ）を用いた蛍光定量的分析をもって測定した。反応混合物の最終濃度は、１６ｎｍｏｌ．ｌ−１ノイラミニダーゼ、５００μｍｏｌ．ｌ−１の４−ＭＵＮＡＮＡ基質（ＫＭ＝１．１ｍｍｏｌ．ｌ−１）および２％ＤＭＳＯ（体積／体積）であった。基質の切断は、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  ｒｅａｄｅｒ上で、励起波長λｅｘｃ＝３６５ｎｍおよび放出波長λｅｍ＝４５０ｎｍにてモニターし、その反応は、３７℃で２０分間インキュベートし、次にナトリウムフェノキシド溶液を０．５ｍｏｌ．ｌ−１の最終濃度になるように加えることにより停止した。見かけＫｉ’値およびＫｉ値は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎによる阻害反応速度と非阻害反応速度との比率vi/v0を評価することにより得た。医療に用いられるオセルタミビルの測定Ｋｉは２４ｎｍｏｌ．ｌ−１（±４ｎｍｏｌ．ｌ−１）であり、化合物１９のＫｉは２４ｎｍｏｌ．ｌ−１（±５ｎｍｏｌ．ｌ−１）でありｓｓＡＤ＿ＮＡ検出プローブのＫｉは０．７９ｎｍｏｌ．ｌ−１（±０．０９ｎｍｏｌ．ｌ−１）であった。化合物１９の見かけＫｉおよび検出プローブsｓＡＤ＿ＮＡの見かけＫｉもまた、１００ｍｍｏｌ．ｌ−１トリス、１５０ｍｍｏｌ．ｌ−１塩化ナトリウム、1０ｍｍｏｌ．ｌ−１塩化カルシウム中で、生理的なｐＨ７．４において決定した。化合物１９のＫｉ’は約４０ｎｍｏｌ．ｌ−１であり、一方ｓｓＡＤ＿ＮＡ検出プローブのＫｉ’は約２ｎｍｏｌ．ｌ−１であった。すなわち、前述のオリゴヌクレオチドを化合物１９に結合することは、化合物１９およびオセルタミビル双方と比較して少なくとも２０倍高いノイラミニダーゼへの親和性を有する物質を生む結果になった。
【０２８５】
５ｄ：インフルエンザノイラミニダーゼＮ１に対する物質の阻害活性の試験
１０００倍希釈されたカゼインブロッカーと５ｍｍｏｌ．ｌ−１濃度の塩化カルシウムとを含むＴＢＳＴバッファー中に希釈された、Ｎ末端にｓｔｒｅｐ−ｔａｇを含む１ｎｇの精製組換えノイラミニダーゼＮ１を、前の実施例において説明した手順に従って、ｓｔｒｅｐ-ｔａｇを認識する抗体を用いて、ＰＣＲプレートのウェルの底に固定化した。続いて、固定化したノイラミニダーゼは、同じバッファー中で、２５０ｐｍｏｌ．ｌ−１濃度のｓｓＡＤ＿ＮＡ検出プローブと、さらに１００ｎｍｏｌ．ｌ−１から１ｍｍｏｌ．ｌ−１の範囲内の様々な濃度でのいくつかの異なる被験物質とともにインキュベートされ、洗浄後、結合したプローブの量をｑＰＣＲにより定量した。被験物質が含まれるウェルと検出プローブのみが含まれるウェルとの間でのΔCqの差異から、被験物質の阻害定数Ｋｉは、式（１５）と、用いた被験物質の濃度とに基づいて計算された。オセルタミビルでは、Ｋｉは４８ｎｍｏｌ．ｌ−１と決定され（前節において説明した酵素反応速度論による参照値は２４ｎｍｏｌ．ｌ−１であった。）、化合物１９のＫｉは１３８ｎｍｏｌ．ｌ−１（２４ｎｍｏｌ．ｌ−１）であり、他の物質については次の通りであった。基質４１は８５ｎｍｏｌ．ｌ−１（２６ｎｍｏｌ．ｌ−１）、基質４２は１５９ｎｍｏｌ．ｌ−１（３９ｎｍｏｌ．ｌ−１）、基質４３は６１００ｎｍｏｌ．ｌ−１（２１００ｎｍｏｌ．ｌ−１）、基質４４は３８１００ｎｍｏｌ．ｌ−１（１２７００ｎｍｏｌ．ｌ−１）。測定値は、括弧内に報告された酵素反応速度論により得られたものと非常に良く相関した（Ｒ２＝１）。
【０２８６】
〔産業上の利用可能性〕
記載されている方法は、医療における広い用途を有している。わずか数十分子のオーダーにおける優れた感度を法慮すれば、当該方法は、これまで測定不可能な濃度における血中のタンパク質マーカー（例えば、前立腺外科手術後のＰＳＡ）を決定する可能性をもたらす。
【０２８７】
さらに、分析物の活性部位に結合するプローブのために、同じ結合部位に対する試験物質の結合強度を測定することができる。大きなダイナミックレンジとの組合せにおいて、われわれのアッセイは、単一濃度の試験物質を用いたわずか１回の測定から、試験物質の阻害定数の値を決定することを可能にする。上記方法の高い感度および選択性のために、生物学的マトリクスに含まれている分析物の最少量が十分な量である。
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１】酵素の選択的な定量のための方法の原理を示している。
【図２】検出プローブの考えられる構成を示している。
【図３】分析物の活性部位に結合する、試験物質の力を決定する原理を示している。
【図４】検出プローブを有している分析物の、試験物質とのインキュベーション後におけるサイクル数、および当該物質なしのサイクル数の間における、測定された差異に応じた、試験物質の決定された解離定数の精度を示している。
【図５】ＰＳＭＡを選択的に結合するための検出プローブの構造を示している。
【図６】ＰＳＭＡに選択的な検出プローブのＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ分析において測定された質量スペクトルを示している。
【図７】ｉｑＰＣＲに対して相補的な、３’末端に修飾されているオリゴヌクレオチドを示している。
【図８】種々の検出プローブの種々の濃度についての、ウェルにおけるＰＳＭＡタンパク質の量に対する、測定されたＣｑ値の依存関係を示している。
【図９】ＰＳＭＡ分子の数に対する、測定されたＣｑ値の依存関係を示している。
【図１０】健常なドナーから得られたクエン酸血漿のサンプルにおけるＰＳＭＡ濃度、および放射性酵素学的アッセイの相関関係を示している。
【図１１】本明細書に開示されている方法）、および基準の酵素反応速度論を用いて測定された、Ａｖｉ−ＰＳＭＡに対する種々の物質の阻害定数Ｋｉの相関関係を示している。
【図１２】ｒｈＰＳＭＡおよび血漿からの内因性のＰＳＭＡについての、本明細書に開示されている方法を用いて測定された種々の物質の阻害定数Ｋｉを示している。
【図１３】分析物の選択的な結合のための、調製された検出プローブの構造を示している。
【図１４】本明細書に開示されている方法、および基準の酵素反応速度論を用いて測定された、ＨＩＶプロテアーゼに対する種々の物質の阻害定数Ｋｉの相関関係を示している。
【図１５】本明細書に開示されている方法、および基準の酵素反応速度論を用いて測定されたＨＩＶプロテアーゼに対する種々の物質の阻害定数Ｋｉの相関関係を示している。
【図１６】本発明にしたがって、および基準の酵素反応速度論を用いて測定された、炭酸脱水素酵素に対する種々の物質の阻害定数Ｋｉの相関関係を示している。
【図１７】二価のプローブｓｓＣＡｂｉｓを用いた、細胞溶解液におけるＣＡーＩＸの量に対する、測定されたＣｑ値の、依存関係を示している。
【図１８】２価のプローブｓｓＣＡｂｉｓを用いてか、または市販のＥＬＩＳＡキットによって、血液において本発明にしたがう方法によって測定されたＣＡ−ＸＩの濃度の比較を示している。
【図１９】２価のプローブｓｓＣＡｂｉｓを用いた、本発明にしたがう方法による血清における、測定されたＣＡ−ＸＩの濃度を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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