(57)【要約】      （修正有）【課題】神経発生及びグリア発生を促進するために、物質の能力又は物質の源を測定する定量的アッセイ方法の提供。【解決手段】固体支持体、及び、その上に接着される細胞外マトリックスである以下の（ａ）又は（ｂ）で示される生物学層を含む組成物。（ａ）間葉幹細胞（ＭＳＣ）、（ｂ）核酸によりトランスフェクトされているＭＳＣであって、ここで、前記核酸がＮｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードするが完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質はコードしないＭＳＣ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクリーニングデバイスを製造するための方法であって、
（ａ）固体支持体上で間葉細胞を培養し；そして
（ｂ）間葉細胞により生成される細胞外マトリックスが支持体上に残るよう、支持体から間葉細胞を除くことを含み、
前記スクリーニングデバイスは、神経発生を促進する、グリア発生を促進する、神経前駆体細胞の増殖を促進する、又は神経前駆体細胞の分化を促進する物質についての定量的アッセイに用いられる、前記方法。
【請求項２】
前記間葉細胞が、
（ａ）間葉幹細胞、及び
（ｂ）Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫、
から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記間葉細胞がヒトから得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記固体支持体が、プラスチック、ニトロセルロース及びガラスから成る群から選択される、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
胚性皮質細胞を細胞外マトリックス上で培養することを更に含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記胚性皮質細胞がマウス又はラットから得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試験物質をスクリーニングデバイスに接触させることを更に含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記試験物質が化合物又はポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試験物質が、試験細胞、試験細胞培養物、又は細胞培養物からの試験ならし培地である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験細胞が、
（ａ）間葉幹細胞、及び
（ｂ）Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫、
から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記皮質細胞の増殖及び／又は分化が測定される、請求項７〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記皮質細胞からニューロンへの分化が測定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記皮質細胞から星状細胞への分化が測定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記皮質細胞からオリゴデンドロサイトの分化が測定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
物質が、神経発生を促進する、グリア発生を促進する、神経前駆体細胞の増殖を促進する、又は神経前駆体細胞の分化を促進するか否かについて決定するための該物質の試験に使用するための組成物であって、
前記組成物は、固体支持体及びその上に接着される生物学的層を含み、前記生物学的層が、
（ａ）間葉幹細胞（ＭＳＣ）、又は
（ｂ）核酸によりトランスフェクトされているＭＳＣであって、ここで、前記核酸がNotch細胞内ドメインをコードするが、しかし完全長Notchタンパク質はコードしない、ＭＳＣ
により接着される細胞外マトリックスであり、
前記組成物は、神経発生を促進する、グリア発生を促進する、神経前駆体細胞の増殖を促進する、又は神経前駆体細胞の分化を促進する物質についての定量的アッセイに用いられる、前記組成物。
【請求項１６】
前記ＭＳＣがヒトから得られる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記固体支持体が、プラスチック、ニトロセルロース及びガラスから成る群から選択される、請求項１５又は１６に記載の組成物。
【請求項１８】
胚性皮質細胞をさらに含む、請求項１５〜１７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記胚性皮質細胞がマウス又はラットから得られる、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
試験物質をさらに含む、請求項１５〜１９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記試験物質が化合物又はポリペプチドである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記試験物質が、細胞、細胞培養物、又は細胞培養物からのならし培地である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記細胞が、
（ａ）間葉幹細胞、及び
（ｂ）Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫、
から成る群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１１年８月１９日に提出された米国特許仮出願第６１／５７５，３７８号及び２０１１年１２月２８日に提出された米国特許仮出願第６１／５８０，９９１号の利益を主張し；それらの明細書及び図面は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦サポートに関する陳述
該当事項なし。
【０００３】
分野
本出願は、神経発生及びグリア発生を促進する物質、及びそのような物質についてのアッセイの分野である。
【背景技術】
【０００４】
背景
間葉間質細胞は、間葉幹細胞として知られている多能性細胞集団を含む（［１］に概説される）。大人の哺乳類における間葉幹細胞（ＭＳＣ）の主要源は骨髄であり；骨髄から得られる多能性細胞は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄付着間質細胞（ＭＡＳＣ）、骨髄付着幹細胞及び骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）として多様に知られている。間葉幹細胞は、神経組織の修復のための有望な細胞療法として研究されてきた（［２］に概説される）。神経系へのＭＳＣ又はＭＳＣ誘導体の移植は、脳卒中、パーキンソン病、脊髄損傷、多発性硬化症、及び新生児低酸素性虚血性脳損傷を包含する神経変性疾患の多くのモデルにおいて有益であることが示されてきた[３〜９]。
【０００５】
現在の証拠は、ＭＳＣ又はそれらの誘導体の移植が損傷された神経組織[９−１３]及び正常脳組織[１４]の両者において内因性再生機構を活性化することを示唆する。それらの再生工程は、内因性神経幹細胞の増強された増殖、新生ニューロンの高められた生存率[１０〜１１]、グリア発生[７]及び炎症性サイトカイン産生のモジュレーション[１５]を包含する。神経保護及び神経増殖の増強は、移植された細胞により分泌される拡散性神経栄養因子及びサイトカインにより少なくとも部分的に介在されると思われる。実際、ＭＳＣは、培養において多くの増殖因子を分泌することが示されており[１６、１７]；そして分泌される増殖因子の同一性は、神経変性環境下での移植により調節され得る[１８、１９]。
【０００６】
従って、間葉細胞の神経発生及びグリア原性活性を担当できる、ＭＳＣにより生成される因子及びそれらの誘導体を同定することは重要である。インビトロでのＭＳＣと神経細胞との間の相互作用の研究は、数個の異なった細胞型（例えば、ニューロン、グリア細胞、神経幹細胞、間葉細胞）（個々は、支持体及び増殖培地に対して異なった必要条件を有する）のために適切である培養条件の創造の課題を有する。実際、ほとんどのシステムにおいては、共培養条件（例えば、血清の存否、又は少数の神経細胞のための支持体としてのＭＳＣ単層の使用）は、他を犠牲にして特定の細胞を選択的に好み、これは矛盾した結果を導き[２３〜２６]、そしてＭＳＣ効果の適切な定量化を妨げる。例えば、特定の培養システムはニューロンの増殖を好むが、しかしグリア細胞の増殖は好まず；そして神経前駆体細胞及び３種の主な神経細胞（ニューロン、オリゴデンドロサイト及び星状細胞）の増殖を同時に支持するシステムは見出されていない。
【０００７】
神経幹細胞の増殖及び種々の神経系統（すなわち、神経新生）への分化に対するＭＳＣ及び他の物質の効果は、神経幹／初期前駆体細胞の源としてマイトジェン駆動のニューロスフェアを用いて、インビトロで通常研究され；続いて、それらの分化は、接着性支持体上へのニューロスフェアのプレート、及びマイトジェン増殖因子の回収により誘導される[２３〜２６]。しかしながら、ニューロスフェア中の細胞は、これらの増殖条件が非生理学的に高い濃度の増殖因子及び接着されていない増殖因子に対するレスポンダーを選択するので、神経前駆体の自然のプールを反映しない [２７、２８]。従って、共培養の開始により、ニューロスフェア由来の細胞が培養条件により再プログラムされている可能性がある。さらに、ニューロスフェア共培養実験において、神経幹細胞前駆体の増殖の状態は、ニューロスフェアそれらの自体内の「盲点」[（blind spot）において生じるので、観察するのが困難である。最終的に、細胞接着状態の変化を通しての神経分化の誘導は、ニューロスフェアシステムにおける試験物質の効果を不明瞭にする。
【０００８】
以上の理由のために、同じ条件下での神経前駆体細胞、ニューロン、星状細胞及びオリゴデンドロサイトに対する神経発生及びグリア発生因子の効果を定量化できるシステムはまだ利用されていない。
【０００９】
ＳＢ６２３細胞は、Notch １細胞内ドメインをコードするベクターによりＭＳＣをトランスフェクトすることにより、ＭＳＣから誘導される。例えば、米国特許第７，６８２，８２５号を参照のこと。これまでの研究は、ヒトＭＳＣにより生成されるＥＣＭ、及びそれらに由来するＳＢ６２３細胞が、添加される因子又は血清を伴わないで、ラット胚性皮質細胞の増殖及び分化を効果的に支持することを示している（２９、また、米国特許出願第２０１０／０３１０５２９号も参照のこと、この開示は、ＭＳＣにより生成されるＥＣＭ及びＳＢ６２３細胞の特定の性質を記載するために、その全体が参照により組み込まれる）。
【００１０】
上記に示されるように、神経原性及び／又はグリア原性活性を有する物質（例えば、ＭＳＣ及びそれらの誘導体、例えばＳＢ６２３細胞）と、神経細胞の複雑な集団との間の相互作用をモデルにし、そしてそのような物質の効力を定量化する単純且つ正確なインヒドロシステムに対する必要性が残存する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
概要
培養下で異なった神経細胞の増殖及び分化に影響を及ぼす因子の効果を定量化する能力を最適化する条件下で、神経細胞集団と、ＭＳＣ及び／又はそれらの誘導体（例えば、ＳＢ６２３細胞）との共培養のためのインビトロシステムが本明細書に提供される。
【００１２】
それらの培養システムは、種々のタイプの神経細胞（例えば、ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト）に対する物質（例えば、ＭＳＣ及びそれらの誘導体、例えばＳＢ６２３細胞、ならし培地、ポリペプチド、有機化合物）の効果を測定するための定量的機能アッセイを提供するために使用され得る。特に、神経栄養性、神経原性、グリア栄養性及びグリア原性因子、及びそのような因子の源が同定され、そして定量化され得る。
【００１３】
本明細書に記載されるアッセイを用いて、神経原性及びグリア原性活性を有する多くの物質が同定されている。
【００１４】
従って、本発明の開示は、中でも次の実施形態を提供する。
１．神経発生を促進する物質についての試験方法であって、
（ａ）固体支持体上で間葉幹細胞（ＭＳＣ）を培養し；
（ｂ）ＭＳＣにより生成される細胞外マトリックスが支持体上に残るよう、支持体からＭＳＣを除き；
（ｃ）工程（ｂ）の支持体上で胚性皮質細胞を培養し；
（ｄ）工程（ｃ）の培養物に物質を添加し；そして
（ｅ）ニューロンの増殖を測定することを含んでなり、
ここで、ニューロンの増殖が、前記物質が神経発生を促進することを示唆する、方法。
２．前記ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態１の方法。
３．前記固体支持体が、プラスチック、ニトロセルロース及びガラスから成る群から選択される、実施形態１の方法。
４．前記胚性皮質細胞がマウス又はラットから得られる、実施形態１の方法。
５．前記物質が化合物又はポリペプチドである、実施形態１の方法。
６．前記物質が、細胞、又は細胞培養物である、実施形態１の方法。特定の実施形態によれば、前記細胞は間葉幹細胞である。さらなる実施形態によれば、前記細胞は、Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫（ＳＢ６２３細胞）である。
７．前記神経発生が前記細胞の表面上に発現されるタンパク質により促進される、実施形態６の方法。
８．前記物質が細胞培養からのならし培地である、実施形態１の方法。
９．ニューロンの増殖が、神経増生により、又は微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、β−チューブリンIII （ＴｕＪ１）、シナプトフィジン及びニューロン特異的エノラーゼから成る群から選択されるマーカーの発現により測定される、実施形態１の方法。
１０．前記ニューロンの増殖が、前記物質の不在下におけるニューロンの増殖と比較される、実施形態１の方法。
【００１５】
１１．グリア発生を促進する物質についての試験方法であって、
（ａ）固体支持体上で間葉幹細胞（ＭＳＣ）を培養し；
（ｂ）ＭＳＣにより生成される細胞外マトリックスが支持体上に残るよう、支持体からＭＳＣを除き；
（ｃ）工程（ｂ）の支持体上で胚性皮質細胞を培養し；
（ｄ）工程（ｃ）の培養物に物質を添加し；そして
（ｅ）グリア細胞の増殖を測定することを含んでなり、
ここで、グリア細胞の増殖が、前記物質がグリオ発生を促進することを示唆する、方法。
１２．前記ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態１１の方法。
１３．前記固体支持体が、プラスチック、ニトロセルロース及びガラスから成る群から選択される、実施形態１１の方法。
１４．前記胚性皮質細胞がマウス又はラットから得られる、実施形態１１の方法。
１５．前記物質が化合物又はポリペプチドである、実施形態１１の方法。
１６．前記物質が、細胞、又は細胞培養物である、実施形態１１の方法。特定の実施形態によれば、前記細胞は間葉幹細胞である。さらなる実施形態によれば、前記細胞は、Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫（ＳＢ６２３細胞）である。
１７．前記グリオ発生が前記細胞の表面上に発現されるタンパク質により促進される、実施形態１６の方法。
１８．前記物質が細胞培養からのならし培地である、実施形態１１の方法。
１９．前記グリア細胞の増殖が、前記物質の不在下におけるグリア細胞の増殖と比較される、実施形態１１の方法。
２０．前記グリア細胞が星状細胞である、実施形態１１の方法。
【００１６】
２１．前記星状細胞の増殖がグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グラスト（Glast）又はグルタミンシンセターゼの発現により測定される、実施形態２０の方法。
２２．前記グリア細胞がオリゴデンドロサイトである、実施形態１１の方法。
２３．前記オリゴデンドロサイトの増殖が、２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰase）、Ｏ１抗原、Ｏ４抗原、ミエリン塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト転写因子１、オリゴデンドロサイト転写因子２、オリゴデンドロサイト転写因子３、ＮＧ２及びミエリン関連糖タンパク質から成る群から選択されるマーカーの発現により測定される、実施形態２２の方法。
２４．神経発生を促進する物質についての試験方法であって、
（ａ）固体支持体上で細胞を培養し、ここで前記細胞は、Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫であり；
（ｂ）前記支持体から前記細胞を除き；
（ｃ）工程（ｂ）の支持体上で胚性皮質細胞を培養し；
（ｄ）工程（ｃ）の培養物に物質を添加し；そして
（ｅ）ニューロンの増殖を測定することを含んでなり、
ここで、ニューロンの増殖が、前記物質が神経発生を促進することを示唆する、方法。
２５．前記ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態２４の方法。
２６．前記固体支持体が、プラスチック、ニトロセルロース及びガラスから成る群から選択される、実施形態２４の方法。
２７．前記胚性皮質細胞がマウス又はラットから得られる、実施形態２４の方法。
２８．前記物質が化合物又はポリペプチドである、実施形態２４の方法。
２９．前記物質が、細胞、又は細胞培養物である、実施形態２４の方法。特定の実施形態によれば、前記細胞は間葉幹細胞である。さらなる実施形態によれば、前記細胞は、Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫（ＳＢ６２３細胞）である。
３０．前記神経発生が前記細胞の表面上に発現されるタンパク質により促進される、実施形態２９の方法。
【００１７】
３１．前記物質が細胞培養からのならし培地である、実施形態２４の方法。
３２．ニューロンの増殖が、神経増生により、又は微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、β−チューブリンIII （ＴｕＪ１）、シナプトフィジン及びニューロン特異的エノラーゼから成る群から選択されるマーカーの発現により測定される、実施形態２４の方法。
３３．前記ニューロンの増殖が、前記物質の不在下におけるニューロンの増殖と比較される、実施形態２４の方法。
３４．グリア発生を促進する物質についての試験方法であって、
（ａ）固体支持体上で細胞を培養し、ここで前記細胞は、Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫であり；
（ｂ）前記細胞により生成される細胞外マトリックスが支持体上に残るよう、支持体から細胞を除き；
（ｃ）工程（ｂ）の支持体上で胚性皮質細胞を培養し；
（ｄ）工程（ｃ）の培養物に物質を添加し；そして
（ｅ）グリア細胞の増殖を測定することを含んでなり、
ここでグリア細胞の増殖が、前記物質がグリア発生を促進することを示唆する、方法。
３５．前記ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態３４の方法。
３６．前記固体支持体が、プラスチック、ニトロセルロース及びガラスから成る群から選択される、実施形態３４の方法。
３７．前記胚性皮質細胞がマウス又はラットから得られる、実施形態３４の方法。
３８．前記物質が化合物又はポリペプチドである、実施形態３４の方法。
３９．前記物質が、細胞、又は細胞培養物である、実施形態３４の方法。特定の実施形態によれば、前記細胞は間葉幹細胞である。さらなる実施形態によれば、前記細胞は、Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫（ＳＢ６２３細胞）である。
４０．前記グリア発生が前記細胞の表面上に発現されるタンパク質により促進される、実施形態３４の方法。
【００１８】
４１．前記物質が細胞培養からのならし培地である、実施形態３４の方法。
４２．前記グリア細胞の増殖が、前記物質の不在下におけるグリア細胞の増殖と比較される、実施形態３４の方法。
４３．前記グリア細胞が星状細胞である、実施形態３４の方法。
４４．前記星状細胞の増殖がグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グラスト（Glast）又はグルタミンシンセターゼの発現により測定される、実施形態４３の方法。
４５．前記グリア細胞がオリゴデンドロサイトである、実施形態３４の方法。
４６．前記オリゴデンドロサイトの増殖が、２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰase）、Ｏ１抗原、Ｏ４抗原、ミエリン塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト転写因子１、オリゴデンドロサイト転写因子２、オリゴデンドロサイト転写因子３、ＮＧ２及びミエリン関連糖タンパク質から成る群から選択されるマーカーの発現により測定される、実施形態４５の方法。
４７．神経前駆体細胞（ＮＰＣ）を促進する物質についての試験方法であって、
（ａ）固体支持体上で間葉幹細胞（ＭＳＣ）を培養し；
（ｂ）ＭＳＣにより生成される細胞外マトリックスが支持体上に残るよう、支持体からＭＳＣを除き；
（ｃ）工程（ｂ）の支持体上で胚性皮質細胞を培養し；
（ｄ）工程（ｃ）の培養物に物質を添加し；そして
（ｅ）神経前駆体細胞の増殖を測定することを含んでなり、
ここで、ＮＰＣの増殖が、前記物質がＮＰＣの増殖を促進することを示唆する、方法。
４８．前記ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態４７の方法。
４９．前記固体支持体が、プラスチック、ニトロセルロース及びガラスから成る群から選択される、実施形態４７の方法。
５０．前記胚性皮質細胞がマウス又はラットから得られる、実施形態４７の方法。
【００１９】
５１．前記物質が化合物又はポリペプチドである、実施形態４７の方法。
５２．前記物質が、細胞、又は細胞培養物である、実施形態４７の方法。特定の実施形態によれば、前記細胞は間葉幹細胞である。さらなる実施形態によれば、前記細胞は、Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫（ＳＢ６２３細胞）である。
５３．前記神経前駆体細胞の増殖が前記細胞の表面上に発現されるタンパク質により促進される、実施形態５２の方法。
５４．前記物質が細胞培養からのならし培地である、実施形態４７の方法。
５５．前記ＮＰＣの増殖がネスチン又はＳＯＸ２の発現により測定される、実施形態４７の方法。
５６．前記ＮＰＣの増殖が、前記物質の不在下におけるＮＰＣの増殖と比較される、実施形態４７の方法。
５７．神経前駆体細胞（ＮＰＣ）を促進する物質についての試験方法であって、
（ａ）固体支持体上で細胞を培養し、ここで前記細胞は、Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞（ＭＳＣ）の子孫であり；
（ｂ）前記細胞により生成される細胞外マトリックスが支持体上に残るよう、支持体から前記細胞を除き；
（ｃ）工程（ｂ）の支持体上で胚性皮質細胞を培養し；
（ｄ）工程（ｃ）の培養物に物質を添加し；そして
（ｅ）ＮＰＣの増殖を測定することを含んでなり、
ここで、ＮＰＣの増殖が、前記物質がＮＰＣの増殖を促進することを示唆する、方法。
５８．前記ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態５７の方法。
５９．前記固体支持体が、プラスチック、ニトロセルロース及びガラスから成る群から選択される、実施形態５７の方法。
６０．前記胚性皮質細胞がマウス又はラットから得られる、実施形態５７の方法。
【００２０】
６１．前記物質が化合物又はポリペプチドである、実施形態５７の方法。
６２．前記物質が、細胞、又は細胞培養物である、実施形態５７の方法。特定の実施形態によれば、前記細胞は間葉幹細胞である。さらなる実施形態によれば、前記細胞は、Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫（ＳＢ６２３細胞）である。
６３．前記神経前駆体細胞の増殖が前記細胞の表面上に発現されるタンパク質により促進される、実施形態６２の方法。
６４．前記物質が細胞培養からのならし培地である、実施形態５７の方法。
６５．前記ＮＰＣの増殖がネスチン、グラスト又はＳＯＸ２の発現により測定される、実施形態５７の方法。
６６．前記ＮＰＣの増殖が、前記物質の不在下におけるＮＰＣの増殖と比較される、実施形態５７の方法。
６７．神経前駆体細胞（ＮＰＣ）を促進する物質についての試験方法であって、
（ａ）固体支持体上で間葉幹細胞（ＭＳＣ）を培養し；
（ｂ）前記ＭＳＣにより生成される細胞外マトリックスが支持体上に残るよう、支持体から前記ＭＳＣを除き；
（ｃ）工程（ｂ）の支持体上で胚性皮質細胞を培養し；
（ｄ）工程（ｃ）の培養物に物質を添加し；そして
（ｅ）ＮＰＣの分化を測定することを含んでなり、
ここで、ＮＰＣの分化が、前記物質がＮＰＣの分化を促進することを示唆する、方法。
６８．神経前駆体細胞（ＮＰＣ）の分化を促進する物質についての試験方法であって、
（ａ）固体支持体上で細胞を培養し、ここで前記細胞は、Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞（ＭＳＣ）の子孫であり；
（ｂ）前記細胞により生成される細胞外マトリックスが支持体上に残るよう、支持体から前記細胞を除き；
（ｃ）工程（ｂ）の支持体上で胚性皮質細胞を培養し；
（ｄ）工程（ｃ）の培養物に物質を添加し；そして
（ｅ）ＮＰＣの分化を測定することを含んでなり、
ここで、ＮＰＣの分化が、前記物質がＮＰＣの分化を促進することを示唆する、方法。
６９．前記ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態６７又は６８の方法。
７０．前記固体支持体が、プラスチック、ニトロセルロース及びガラスから成る群から選択される、実施形態６７又は６８の方法。
【００２１】
７１．前記胚性皮質細胞がマウス又はラットから得られる、実施形態６７又は６８の方法。
７２．前記物質が化合物又はポリペプチドである、実施形態６７又は６８の方法。
７３．前記物質が、細胞、又は細胞培養物である、実施形態６７又は６８の方法。特定の実施形態によれば、前記細胞は間葉幹細胞である。さらなる実施形態によれば、前記細胞は、Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫（ＳＢ６２３細胞）である。
７４．前記神経発生が前記細胞の表面上に発現されるタンパク質により促進される、実施形態７３の方法。
７５．前記物質が細胞培養からのならし培地である、実施形態６７又は６８の方法。
７６．前記ＮＰＣの分化が、前記物質の不在下におけるＮＰＣの分化と比較される、実施形態６７又は６８の方法。
７７．前記ＮＰＣの分化が、神経増生により、又は微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、β−チューブリンIII （ＴｕＪ１）、シナプトフィジン、ニューロン特異的エノラーゼ、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＡＳＴグルタミン酸トランスポーター、２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰase）、Ｏ１抗原、Ｏ４抗原、ミエリン塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト転写因子１、オリゴデンドロサイト転写因子２、オリゴデンドロサイト転写因子３、ＮＧ２及びミエリン関連糖タンパク質から成る群から選択されるマーカーの発現により明らかにされる、実施形態６７又は６８の方法。
７８．固体支持体及びその上に接着される生物学的層を含んで成る組成物であって、前記生物学的層が、
（ａ）間葉幹細胞（ＭＳＣ）、又は
（ｂ）核酸によりトランスフェクトされているＭＳＣであって、ここで、前記核酸がNotch細胞内ドメインをコードするが、しかし完全長Notchタンパク質はコードしない、ＭＳＣ
により接着される細胞外マトリックスである、組成物。
７９．前記ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態７８の組成物。
８０．前記固体支持体が、プラスチック、ニトロセルロース及びガラスから成る群から選択される、実施形態７８の組成物。
【００２２】
８１．胚性皮質細胞をさらに含む、実施形態７８の組成物。
８２．前記胚性皮質細胞がマウス又はラットから得られる、実施形態８１の組成物。
８３．試験物質をさらに含む、実施形態８１の組成物。
８４．前記試験物質が化合物又はポリペプチドである、実施形態８３の組成物。
８５．前記物質が、細胞、又は細胞培養物である、実施形態８３の組成物。特定の実施形態によれば、前記細胞は間葉幹細胞である。さらなる実施形態によれば、前記細胞は、Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫（ＳＢ６２３細胞）である。
８６．前記試験物質が、細胞、細胞培養物、又は細胞培養物からのならし培地である、実施形態８３の組成物。
８７．神経新生、神経発生、星状細胞発生、又はオリゴデンドロサイト発生に対する物質の効果を決定するためのキットであって；実施形態７８〜８６の何れか一項に記載の組成物を含んで成る、キット。
８８．ニューロン又はグリアマーカー分子の検出のための１又は２以上の試薬をさらに含む、実施形態８７のキット。
８９．前記検出が、免疫組織化学によってである、実施形態８８のキット。
９０．前記試薬が、１又は２以上の抗体を含む、実施形態８９のキット。
【００２３】
９１．前記１又は２以上の抗体が、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、β−チューブリンIII （ＴｕＪ１）、シナプトフィジン、ニューロン特異的エノラーゼ、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グラスト、グルタミンシンセターゼ、２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰase）、Ｏ１抗原、Ｏ４抗原、ミエリン塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト転写因子１、オリゴデンドロサイト転写因子２、オリゴデンドロサイト転写因子３、ＮＧ２及びミエリン関連糖タンパク質から成る群から選択される１又は２以上の抗原に対して特異的である、実施形態９０のキット。
９２．前記検出が、定量的逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によってである、実施形態９２のキット。
９３．前記試薬が、１又は２以上のオリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブを含む、実施形態９２のキット。
９４．前記１又は２以上のオリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブが、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、β−チューブリンIII （ＴｕＪ１）、シナプトフィジン、ニューロン特異的エノラーゼ、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グラスト、グルタミンシンセターゼ、２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰase）、Ｏ１抗原、Ｏ４抗原、ミエリン塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト転写因子１、オリゴデンドロサイト転写因子２、オリゴデンドロサイト転写因子３、ＮＧ２及びミエリン関連糖タンパク質から成る群から選択されるタンパク質をコードする核酸を特異的に検出する、実施形態９３のキット。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、ＥＣＭ−被覆プレート上での単独でのラット神経細胞（「Ｎ」で示される）、又はＭＳＣとの共培養でのラット神経細胞（「Ｍ」で示される）の増殖の測定の結果を示す。図１Ａは、３つの異なった時点（共培養の開始後、１日目、５日目及び７日目）での共培養におけるＤＡＰＩ−染色された神経細胞（非ＭＳＣ）核の数の測定結果を示す。各対のバーに関しては、核形態学により評価される場合、左端のバーは生存神経細胞の数を表し、そして右端のバーは死亡神経細胞の数を表す。図１Ｂは、ラットノギン（noggin）遺伝子の相対的レベルによりアッセイされる場合、単独で培養された（「Ｎ」で示される）又はＭＳＣと共に共培養された（「Ｍ」で示される）神経細胞、及びラット神経細胞の不在下で培養されたＭＳＣにおける、細胞数を示す。２つの時点（１日目及び７日目）についてのデータが示される。
【００２５】
【図２】図２（パネルＡ〜Ｅ）は、ＥＣＭ−被覆プレート上でのラット神経細胞の培養（Ｎ）及びラット神経細胞及びＭＳＣの共培養（Ｎ＋Ｍ）におけるダブルコルチン（ＤＣＸ）（図２Ａ）、微小管関連タンパク質−２（ＭＡＰ２）（図２Ｂ）、ネスチン（Ｎｅｓ）（図２Ｃ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（図２Ｄ）及び２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）（図２Ｅ）についてのｍＲＮＡの発現の時間経過を示す。共培養は、ウェル当たり２００のＭＳＣを含んだ。「日」（Ｄａｙｓ）とは、共培養の開始後の日数を言及する。
【００２６】
【図３】図３は、ラットＥ１８皮質細胞における種々の神経マーカーをコードするＲＮＡの発現が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）上で増殖される共培養においてＭＳＣ用量に依存することを示す定量的ＰＣＲ研究の結果を示す。ラットネスチン（ｒＮｅｓ）、ＭＡＰ２（ｒＭＡＰ２）及びＣＮＰａｓｅ（ｒＣＮＰａｓｅ）遺伝子発現のＭＳＣ−用量応答が５日目に評価され、ラットＧＦＡＰ（ｒＧＦＡＰ）及びヒトＧＡＰ（ｈｕＧＡＰ）発現が７日目に評価された。ヒトＭＣＳ又はＳＢ６２３細胞単独からのシグナルは、何れのラット発現アッセイにも検出されず、そしてラット細胞からのシグナルは、ヒトＧＡＰ発現アッセイにおいては検出されなかった。
【００２７】
【図４】図４は、ＥＣＭ被覆プレート上でのラット神経細胞及びＭＳＣの共培養における、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定される種々のマーカーの相対的発現レベルを示す。ラットマーカーは、ネスチン（Ｎｅｓ）、ＣＮＰａｓｅ（ＣＮＰ）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｒａｔＧＡＰ）である。培養物においてＭＳＣを同定し、そして定量化するために使用されるヒトマーカーは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｈｕＧＡＰ）である。ネスチン及びＣＮＰａｓｅの発現は、共培養の５日後にアッセイされ；他のすべてのマーカーは、共培養の７日後にアッセイした。１の発現レベルは、最低ＭＳＣ用量でのレベルであると任意には割り当てられた。（ウェル当たり３２個の細胞）。
【００２８】
【図５】図５は、ＥＣＭ被覆プレート上での共培養の２種の異なった段階でのＣＮＰａｓｅ  ｍＲＮＡの発現レベルに対するＭＳＣ濃度の効果を示す。ＣＮＰａｓｅ  ｍＲＮＡレベルは、ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化された。１の相対的発現レベルは、アッセイの特定の日（５日目又は７日目）に観察された最も高いレベルとして任意に設定された。
【００２９】
【図６】図６は、非接着性条件下で実施される、ラット神経細胞及びＭＳＣの共培養におけるマーカー発現のレベルを示す。神経細胞はまた、対照としてｂＦＧＦ及びＥＧＦの存在下で、ＭＳＣなしで培養された。各組の条件に関しては、バーは、左から右側に、ラットネスチン（ｒＮｅｓ）、ラット微小管関連タンパク質−２（ｒＭＡＰ２）、ラットグリア線維性酸性タンパク質（ｒＧＦＡＰ）、ラットダブルコルチン（ｒＤＣＸ）、ラット２’，３’−環状ヌクレオチド３’リン酸ジエステラーゼ（ｒＣＮＰａｓｅ）、ラットグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｒＧＡＰ）及びヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｈｕＧＡＰ）の発現レベルを表す。ｂＦＧＦ／ＥＧＦの存在下での神経マーカー遺伝子発現レベルは、１の値を割り当てられ、そして他の値はＧＦＡＰを除くすべてのマーカーについて、それに応じて表され、これは、ｂＦＧＦ／ＥＧＦサンプルにおいて０．１の値が割り当てられた。
【００３０】
【図７】図７は、異なった接着条件下で行われた、ラット神経細胞及びＭＳＣの共培養におけるマーカー発現のレベルを示す。「ＥＣＭ」は、ＳＢ６２３細胞由来の細胞外マトリックスにより被覆されたプレート上での共培養を示す。「Ｏｒｎ／ＦＮ」は、オルニチン及びフィブロネクチンにより被覆されたプレート上での共培養を示す。「ＵＬＡ」は、超低固定（Ultre Low Attachment）プレート上での培養を示す。ＥＣＭ及びＯｒｎ／ＦＮプレート上で、神経細胞を、１０：１の比（１．５×１０4個の細胞／ｃｍ2）でＭＳＣと共に共培養した。ＵＬＡプレート上で、神経細胞を、２：１の比でＭＳＣと共に（「＋ＭＳＣ、５Ｘ」）、又は増殖因子により補充された培地においてＭＳＣの不在下で（「ＦＧＦ２／ＥＧＦ」）培養した。各組の条件に関しては、バーは、左から右側に、ラットネスチン（Ｎｅｓ）、ラット２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰase）、ラッドグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ラットダブルコンチン（ＤＣＸ）、及びヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｈｕＧＡＰ）の発現レベルを表す。ネスチン及びＣＮＰａｓｅレベルを、培養又は共培養の５日後（「５ｄ」）にアッセイし；すべての他のマーカーは７日（「７ｄ」）にアッセイした。
【００３１】
【図８】図８は、神経細胞によるネスチンｍＲＮＡの発現に対するヘパリナーゼの効果を示す。ラット皮質細胞をＥＣＭ被覆したプレート上で培養した。皮質細胞のプレーティングの前に、ＥＣＭ被覆したプレートを、２種の濃度のヘパリナーゼＩ（０．５単位／ｍｌ及び１．５単位／ｍｌ）、又はヘパリナーゼ緩衝液（「Ｈ−緩衝液」）により処理し、あるいは処理しなかった（「添加なし」）。ネスチンｍＲＮＡ発現を、培養の開始の５日後、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。未処理のＥＣＭ被覆プレート上で培養された細胞において検出されるネスチンｍＲＮＡの量が、１の相対的発現レベルとして任意には割り当てられた。
【００３２】
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定された、ＥＣＭ被覆したプレート上で培養された神経細胞による、種々の神経マーカーをコードするｍＲＮＡの相対的発現レベルに対する精製された増殖因子（ＥＧＦ、ＢＭＰ６、ＨＢ−ＥＧＦ）及びＭＳＣならし培地（ＣＭ）の効果を示す。図９Ａは、ネスチン、すなわち神経前駆体細胞のためのマーカーの発現に対する効果を示す。図９Ｂは、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、すなわち初期ニューロンのためのマーカーの発現に対する効果を示す。図９Ｃは、ＣＮＰａｓｅ、すなわちオリゴデンドロサイトマーカーの発現に対する効果を示す。図９Ｄは、ＧＦＡＰ、すなわち星状細胞のためのマーカーの発現に対する効果を示す。
【００３３】
【図１０】図１０は、ＥＣＭ被覆プレート上での神経細胞／ＭＳＣ共培養における神経細胞によるネスチン発現に対する抗ＦＧＦ２中和抗体の効果を示す。ラット皮質細胞（５，０００個の細胞）が、これら自身により培養され（「ＭＳＣなし」）、又は２００個のＭＳＣと共に共培養された（「＋ＭＳＣ」）。追加の共培養サンプルはまた、中和抗ＦＧＦ２抗体（「＋ＭＳＣ＋ｂＦＭ１」）又は非中和抗ＦＧＦ２抗体（「＋ＭＳＣ＋ｂＦＭ２」）の何れかを含んだ。ネスチン発現は、培養又は共培養の開始の５日後、アッセイした。ＭＳＣの不在下で培養された皮質細胞におけるネスチン発現レベルを、１の相対的発現値として任意に割り当てた。
【００３４】
【図１１】図１１は、培養されたラット神経細胞におけるネスチン発現に対するＭＳＣならし培地、及びＦＧＦ２−枯渇ＭＳＣならし培地の効果を示す。ラット皮質細胞が、さらなる追加を有さない（「添加なし」）、ＭＳＣならし培地（「ＣＭ」）、免疫沈降によりＦＧＦ２を枯渇させたＭＳＣならし培地（「ＦＧＦ２−枯渇されたＣＭ」）、及びＦＧＦ２と反応させない対照抗体により処理されたＭＳＣならし培地（「ＩＰ−対照−ＣＭ」）を有するＥＣＭ−被覆プレート上で培養された。ネスチン発現は、培養の開始の５日後、アッセイした。ならし培地の不在下で培養された皮質細胞におけるネスチン発現のレベルを、１の相対的発現値として任意に割り当てた。
【００３５】
【図１２】２００個の間葉幹細胞（「＋ＭＳＣ、２００個の細胞」）の存在下で、又は間葉幹細胞（「＋ＣＭ、１０％」）からのならし培地の１：１０希釈溶液の存在下でＥＣＭ被覆プレート上で培養された神経細胞により発現される、ネスチン（Ｎｅｓ）及びグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）をコードするｍＲＮＡのレベルを示す。対照細胞は、ＭＳＣ又はならし培地の不在下で培養された（「添加なし」）。ネスチンについてのアッセイを、培養の開始の５日後に実施し；ＧＦＡＰについてのアッセイを、培養の開始の７日後に実施した。ＭＳＣとの共培養下で発現される各マーカーのレベルを、１の相対的発現として任意に割り当てた。
【００３６】
【図１３】図１３は、ＥＣＭ被覆されたプレート上で培養されたラット皮質細胞において、培養又は共培養の開始の７日後、アッセイしたＧＦＡＰ ｍＲＮＡのレベルを示す。皮質細胞を、ＭＳＣと共に共培養し（「ＭＳＣ」）、３０ｎｇ／ｍｌの組換えノギンタンパク質の存在下でＭＳＣと共に共培養し（「ＭＳＣ＋ノギン」）、又は抗ＢＭＰ４抗体の存在下でＭＳＣと共に共培養した（「ＭＳＣ＋抗ＢＭＰ４」）。ＭＳＣとの共培養において発現されたＧＦＡＰｍＲＮＡのレベルを、１の相対的発現値として任意に割り当てた。
【００３７】
【図１４】図１４は、ＥＣＭ被覆プレート上でのラット神経細胞及びＭＳＣの共培養におけるヒト骨形成タンパク質−４（「ｈｕＢＭＰ４」）、ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（「ｈｕＧＡＰ」）、ヒト線維芽細胞増殖因子−２（「ｈｕＦＧＦ２」）及びラットグリア線維性酸性タンパク質（「ｒＧＦＡＰ」）についてのｍＲＮＡの発現レベルを示す。共培養の前、ＭＳＣを、ヒトＢＭＰ−４配列に対して標的化したｓｉＲＮＡプール（「Ｎ＋ｓｉＢＭＰ４＋ＭＳＣ」）、又は対照の非ＢＭＰ４標的化ｓｉＲＮＡ（「Ｎ＋ｓｉＣｏｎｔｒ−ＭＳＣ」）でトランスフェクトした。神経細胞もまた、ＭＳＣの不在下で別々に培養した（「Ｎ単独」）。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
詳細な説明
種々の異なったタイプの神経細胞の増殖及び分化を支持するであろうインビトロ培養条件を確立することは困難であることが分かっている。本発明者は、神経前駆体細胞、ニューロン、星状細胞及びオリゴデンドロサイトがすべて増殖し、そして分化することができるインビトロ培養システムを考案した。従って、本明細書に開示される培養システムは最初に、神経細胞の増殖及び分化に対する試験物質の効果の定量的評価を可能にする。このシステムは、試験物質の存在下で細胞外マトリックス上での神経細胞（例えば、胚性齧歯類皮質細胞）の培養、続いて、１又は２以上のマーカー分子の発現についての神経細胞培養物の分析を包含する。それらのアッセイで使用される細胞外マトリックスは、（ａ）間葉幹細胞、又は（ｂ）Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードするが、しかし完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質はコードしない核酸によりトランスフェクトされた間葉幹細胞（例えば、ＳＢ６２３細胞）により生成される。
【００３９】
このシステムの様々な側面は、様々な神経原性及びグリア原性因子の能力に関する定量的情報を提供するその能力に寄与する。１つの側面によれば、神経細胞が、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞（Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むベクターによりＭＳＣをトランスフェクトすることにより、ＭＳＣから誘導された細胞）により生成される細胞外マトリックス上で培養される。別の側面によれば、神経細胞が試験物質と共に共培養される時間は、アッセイされるマーカーの検出及び定量化を最適にするよう選択される。アッセイの前の共培養の期間は、各マーカーに固有のものである。例えば、共培養は、ネスチン及びＣＮＰａｓｅの測定のために５日間；及びＧＦＡＰ、ＤＣＸ及びＭＡＰ２の測定のためには７日間行われる。さらなる別の側面によれば、培養中の細胞の濃度は最適化される。例えば、神経細胞は、１．５×１０4個の細胞／ｍｌの濃度で使用され；ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞は、０．５−１．５×１０3個の細胞/ｍｌの濃度で使用される。
【００４０】
本明細書に開示される定量アッセイシステムは、試験物質（例えば、ＭＳＣ又はそれらの誘導体ＳＢ６２３細胞、ならし培地、増殖因子、サイトカイン）及び神経細胞集団の共培養のための生物学的支持体として間葉細胞、例えばＭＳＣ及びそれらの誘導体（例えば、ＳＢ５２３細胞）からのＥＣＭを用い、そして間葉細胞及び神経細胞の両者の増殖に有利である培養システムを提供する。次に、そのようなシステムは、様々なタイプの神経細胞の増殖及び分化に対する、間葉細胞の効果、及び他の細胞及び物質の効果の定量化を可能にする。
【００４１】
本明細書に記載されるアッセイの利点は、発生の遷移が、異常物質的条件、例えば接着又は凝集（ニューロスフェア培養を参照のこと）に応答してではなく、生理学的条件下で及び時間経過とともに発生する事実を包含する。さらに、アッセイされる細胞の発生段階は、発生はニューロスフェアの内部には発生しないので、容易に決定され得る。最終的に、本明細書に開示されるアッセイは、外部増殖因子を必要とせず；従って、そのような因子の効果がこのシステムでの定量化を可能にする。
【００４２】
このシステムを用いて、本発明者は、間葉細胞ＥＣＭが神経細胞集団（例えば、胚性皮質細胞）の増殖を支持するだけでなく、また、間葉細胞ＥＣＭ上で増殖する神経細胞集団へのＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞の添加がすべての神経系統（例えば、ニューロン、星状細胞及びオリゴデンドロサイト）の増殖及び分化を実質的に増強することを確認した。
【００４３】
存在する共培養システムに比較して、より低い間葉細胞：神経細胞の比率が、本明細書に記載されるＥＣＭに基づく共培養における神経細胞の有意な増殖及び分化を誘導できる。例えば、本明細書に記載されるアッセイシステムは、５，０００個の神経細胞に対する約５０個の間葉細胞の効果を検出するのに十分な感度を有する。
【００４４】
神経原性及びグリオ原性因子、及び神経前駆体細胞の増殖及び分化を促進する因子についての定量的アッセイが本明細書に提供される。アッセイはまた、そのような因子、例えば細胞培養物又はならし培地の源を同定し、そして定量化するためにも使用され得る。
【００４５】
アッセイを実施するためには、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞（集合的には、「間葉細胞」として言及される）が、容器、例えば組織培養皿において、容器の表面上に細胞外マトリックスを積層するのに十分な時間、増殖される。何れかの固体支持体が、細胞の増殖及び細胞による細胞外マトリックスの確立をできるだけ支持するよう、細胞がその上で増殖する表面として使用され得る。適切な支持体は、プラスチック、ガラス又はニトロセルロースを包含する。さらに、支持体は、物質、例えばフィブロネクチン若しくはコラーゲン、又は再構成基底膜、例えばMatrigel（商標）により被覆され得る。
【００４６】
適切な支持体の例としては、プラスチック組織培養皿又はフラスコを挙げることができる。細胞は、１日、２日、３日、１週、２週、１ヶ月、又は所望に応じてそれらの間の任意の期間、増殖され得る。ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞により確立されるＥＣＭについてのさらなる詳細に関しては、米国特許出願公開第２０１０／０３１０５２９号を参照のこと；この開示は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞により確立されるＥＣＭ（前記出版においては、「分化−制限されたＭＡＳＣの子孫」として示される）及びその性質を記載するために、参照により組み込まれる。
【００４７】
ＭＳＣは、骨髄サンプルから接着性細胞を選択することにより得られる。骨髄は市販されているか（例えば、Lonza，Walkersville, MDから）、又は骨髄生検から入手できる。間葉幹細胞の他の源は、例えば脂肪組織、歯髄、臍帯血、胎盤及び脱落膜を包含する。ＭＳＣは何れかの動物、例えば哺乳類、例えばヒトから入手できる。
【００４８】
ＭＳＣの典型的な開示は、米国特許出願公開第２００３／０００８０９０号；Prockop (1997) Science 276:71-74 and Jiang (2002) Nature 418:41-49に提供される。ＭＳＣの単離及び精製方法は、例えば米国特許第５，４８６，３５９号；Pittenger et al. (1999) Science 284:143-147 and Dezawa et al. (2001) Eur. J. Neurosci. 14:1771-1776に見出され得る。ヒトＭＳＣは、市販されているか（例えば、BioWhittaker, Walkersville, MD）、又は例えば骨髄吸引、続いての接着性骨髄細胞の選択により、ドナーから得られる。国際公開第２００５／１００５５２号を参照のこと。
【００４９】
ＳＢ６２３細胞は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードするが、しかし完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしない配列を含むベクターによりＭＳＣをトランスフェクトすることにより、ＭＳＣから誘導され、そのようなトランスフェクトされた細胞は、外因性ＮＩＣＤを発現するが、しかし外因性の完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質を発現しない。ＭＳＣを入手し、そしてＭＳＣ集団からＳＢ６２３細胞を誘導するための方法は、例えば米国特許第７，６８２，８２５号及び米国特許出願公開番号第２０１０／０２６６５５４号に記載されており、それらの開示は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞、及びそれらの細胞の入手方法を記載するために、参照により組み込まれる。
【００５０】
所定の時間、支持体上での増殖に続いて、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞は、支持体から除かれ、支持体上に接着される細胞外マトリックスの後ろに残される。支持体から細胞を除く方法は、当業界においては周知である。本明細書に開示される方法の実施においては、支持体からの細胞の除去は、細胞により確立されたＥＣＭが支持体上に残るように十分に穏やかでなければならない。そのような方法は例えば、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＮＰ４０）及びアルカリ（例えば、ＮＨ4ＯＨ）による処理を包含する。さらなる詳細については、下記「実施例」の欄を参照のこと。
【００５１】
次に、ＥＣＭ−含有支持体が、神経細胞及び１又は２以上の試験物質の共培養のための支持体として使用され、そして神経細胞に対する試験物質の効果が決定され、そして定量化される。培養物への神経細胞及び試験物質の導入は、同時であるか、又は何れの順序でもよい。
【００５２】
任意の種類の神経細胞又は神経細胞集団も使用され得；そのような細胞は周知である。神経細胞集団の便利な源は、齧歯動物の胚性皮質細胞（例えば、ラット又はマウスからの）であえい、市販されている（BrainBits, Springfield, IL）。ある実施形態によれば、神経細胞集団は、神経前駆体細胞において富化される。
【００５３】
試験物質としては、何れかの化合物、高分子（例えば、核酸又はポリペプチド）、細胞、細胞培養物、細胞画分若しくは組織、又はそれらの組合せを挙げることができる。例えば、増殖因子及びサイトカイン、低分子量有機化合物、ｍＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、ＤＮＡ分子、ＤＮＡ又はＲＮＡ類似体、タンパク質（例えば、転写調節タンパク質）、抗体（例えば、中和抗体）、酵素（例えば、ヌクレアーゼ）、糖タンパク質、グリカン、プロテオグリカン、細胞、細胞膜調製物、細胞培養物、細胞培養物からのならし培地、亜細胞画分及び組織切片又は組織画分は、全て適切な試験物質である。試験物質はまた、電磁放射線、例えば、Ｘ線、光（例えば、紫外線、赤外線）又は音（例えば、亜音速又は超音波放射）も包含する。ある実施形態によれば、タンパク質、及びタンパク質に対する中和抗体の組合せが、試験物質として使用される。
【００５４】
天然に存在する試験物質としては、細胞により合成され、そして分泌される可溶性分子（例えば、タンパク質）、及び細胞により合成され、細胞表面に輸送され、そして細胞表面に埋め込まれたまま残存する分子（例えば、タンパク質）、並びに細胞の外部に露出される分子（例えば、表面分子、表面タンパク質又は表面糖タンパク質）の全て又は一部を挙げることができる。
【００５５】
神経細胞及び試験物質は、この方法の実施者により決定されるように、適切な期間、共培養される。例えば、共培養は、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、１ヶ月、又はそれらの間の任意の期間、実施され得る。
【００５６】
神経細胞に対する試験物質の効果は、神経細胞における１又は２以上のマーカーの発現を測定することにより決定される。選択されるマーカーに依存して、神経前駆体細胞、ニューロン、星状細胞又はオリゴデンドロサイトの形成についてアッセイすることができる。
【００５７】
１つの実施形態によれば、神経発生又はグリア発生に対する特定の生来の又は組み換えのいずれかのタンパク質の効果は、ＭＳＣ又はＳＢ６２３ ＥＣＭ上で増殖する神経細胞の培養物にタンパク質を添加し、そして適切な神経又はグリアマーカーについてアッセイすることにより決定され得る。任意には、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞からの低濃度（１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれらの間の任意の値）のならし培地がまた、培養に包含され得る。例えば、ならし培地の包含は、試験される研究以外の研究中のプロセスのために必要とされる追加の因子を提供することができ、それにより、評価されるべき多因子シグナル伝達システムの１つの成分の効果を可能にする。
【００５８】
神経前駆体細胞、ニューロン、星状細胞及びオリゴデンドロサイトのための分子及び形態形成マーカーは、当業界において周知であり；以下が例として提供される。
【００５９】
神経前駆体細胞のためのマーカーとしては、例えばネスチン、グルタミン酸トランスポーター（GLAST）、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（３−ＰＧＤＨ、星状細胞前駆体）、エフリンＢ２（ＥｆｎＢ２）、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６及びムサシ（musasi）を挙げることができる。ある実施形態によれば、増殖能力はまた、神経前駆体細胞のためのマーカーとしても使用され得る。増殖能力は例えば、ブロモデオキシウリジンの取り込み、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）ラベリング、Ｋｉ−６７の発現、又は増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の発現により測定され得る。
【００６０】
ニューロンのためのマーカーとしては、例えば微小管関連タンパク質（ＭＡＰ２）、β−チューブリンイソタイプIII （また、βIII チューブリン及びＴｕＪ−１としても知られている）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、神経フィラメントタンパク質（例えば、神経フィラメント−Ｍ）、シナプトフィジン、及びニューロン特異的エノラーゼ（また、エノラーゼ−２及びγエノラーゼとしても知られている）を挙げることができる。神経突起伸長はまた、ニューロン発達のためのマーカーとしても使用され得る。
【００６１】
追加のニューロンマーカーが下記表に列挙される：
【００６２】
【表１−１】
2019068845.tif 000003
【表１−２】
2019068845.tif 000004
【表１−３】
2019068845.tif 000005
【表１−４】
2019068845.tif 000006
【表１−５】
2019068845.tif 000007
【００６３】
グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミン酸トランスポーター（ＧＬＡＳＴ）、３−ＰＧＤＨ及びグルタミンシンターゼが、星状細胞のためのマーカーとして使用され得る。
【００６４】
オリゴデンドロサイトのためのマーカーとして、例えばＡ２Ｂ５抗原、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、Ｏ１抗原、Ｏ４抗原、ミエリン塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト転写因子１、オリゴデンドロサイト転写因子２、オリゴデンドロサイト転写因子３、ＮＧ２、及びミエリン関連糖タンパク質を挙げることができる。
【００６５】
マーカーの発現は、当業界において周知である技法により測定され得る。例えば、タンパク質の発現は、免疫蛍光、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＥＬＩＳＡ及びタンパク質ブロッティング（例えば、ウェスターンブロット）により測定され、そして定量化され得る。
【００６６】
ｍＲＮＡの発現は、例えばブロッティング、ヌクレアーゼ保護及び逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を包含する方法により測定され、そして定量化され得る。
【００６７】
アッセイされる試験物質及びマーカーに依存して、アッセイが神経細胞により生成される分子に対して特異的であり、そして特に、試験物質が細胞、例えばＭＳＣはＳＢ６２３細胞である場合、試験物質により生成される同じか又は類似する分子と交差反応しないことを確保することが必要である。例えば、ＭＳＣはネスチンを発現し；ネスチンがラット皮質細胞及びヒトＭＳＣの共培養下で神経前駆体細胞のためのマーカーとしてアッセイされる場合、ラットネスチンに対して特異的な抗体がこのアッセイに使用される。同様に、核酸発現が例えば、定量的逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）又はＴａｑＭａｎによりアッセイされる場合、種−特異的プライマー（及び、適用できる場合、プローブ）が使用される。
【００６８】
ある実施形態によれば、上記アッセイ（すなわち、神経細胞及び試験物質の共培養）において神経細胞によるマーカーの発現が、試験物質の不在下における神経細胞における同じマーカーの発現と比較される。
【００６９】
本明細書に記載されるアッセイはまた、ニューロン、星状細胞及びオリゴデンドロサイトを包含する、ＮＰＣの子孫の特徴的なマーカーの発現を測定することにより、神経前駆体細胞（ＮＰＣ）の分化を定量化するためにも使用され得る。そのようなマーカーは当業界において周知であり、そして典型的マーカーが本明細書に記載されている。
【００７０】
ある実施形態によれば、試験物質の神経原性又はグリア原性能力をアッセイするためのキット、又はニューロン前駆体細胞の増殖及び／又は分化を促進する物質の能力をアッセイするためのキットが提供される。キットは、１又は２以上の培養容器、及び容器上のＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞の増殖を可能にするための任意の培養培地と共に、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞（任意には、低温保存された状態で）の１つ又は両者を含む。キットはまた、培養容器の表面上に接着される細胞外マトリックスを残すために、培養容器からＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞を除くための試薬（例えば、非イオン性界面活性剤、例えばTriton X−100又はNonidet P−40；水酸化アンモニウム）も含むことができる。キットはまた、神経細胞（例えば、ラットＥ１８皮質細胞）のサンプルも含むことができる。様々なニューロン及びグリアマーカーに対するラベルされた抗体がまたキットに含まれ；そしてニューロン及びグリアマーカーをコードするｍＲＮＡに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブ及び／またはプライマーもまた、含まれ得る。ニューロン又はグリアマーカー（例えば、タンパク質）、又はそのコーディングｍＲＮＡを検出するであろう何れかのタイプの試薬が、キットに含まれる。免疫組織化学、ＦＡＣＳ、ＲＴ−ＰＣＲ、電気生理学及び薬理学のために適切な試薬及び／又は緩衝液及び／又は装置もまた、キットに含まれ得る。
【００７１】
さらなる実施形態によれば、本明細書に開示されるようなキットは、１又は２以上の培養容器、及びその上に接着されるＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞からのＥＣＭを含むことができる。そのようなキットは任意には、神経細胞、及びニューロン及び／又はグリアマーカーを検出するための試薬（例えば、抗体、プローブ、プライマー）を、任意には含むことができる。そのようなキットはまた、免疫組織化学、ＦＡＣＳ、ＲＴ−ＰＣＲ、電気生理学及び薬理学のために適切な試薬及び／又は緩衝液を任意には含むことができる。
【００７２】
さらなる実施形態によれば、キットは、培養容器への適用のための、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞（又はそれらの混合物）からの精製された細胞外マトリックスを含むことができる。
【００７３】
さらなる実施形態によれば、キットは、固体支持体（例えば、培養容器）及びその上に接着される生物学的層を含んでなり、ここで前記生物学的層は、
（ａ）間葉幹細胞、又は
（ｂ）Notch細胞内ドメインをコードするが、しかし完全長Notchタンパク質はコードしない核酸によりトランスフェクトされた間葉幹細胞
により接着される細胞外マトリックスである。
【００７４】
キットの操作に関しては、神経細胞が、試験物質の存在下で、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞からの細胞外マトリックスと接触して増殖され、そして神経細胞が選択されたニューロン又はグリアマーカーの発現について分析される。上記キットに関して、培養容器上へのＥＣＭの接着（ＭＳＣ及び／又はＳＢ６２３細胞による）、及びＥＣＭを確立した細胞の除去は、培養容器に神経細胞及び試験物質を添加する前に、使用者により実施される。
【実施例】
【００７５】
一般方法：
ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の調製：
ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の調製は記載されている[２９]。手短に言えば、ヒト成人骨髄吸引物（Lonza, Walkersville, MD）を、１０％ウシ胎児血清（FBS）（Hyclone, Logan, UT）、２ｍＭのＬ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン（両者とも、Invitrogen, Carlsbad, CAから）により補充されたαＭＥＭ（Mediatech, Herndon, VA）において増殖させた。第２継代上で、一部の細胞を低温保存し（ＭＳＣ調製）、そして一部の細胞をＳＢ６２３細胞の調製のためにプレートした。ＳＢ６２３細胞調製に関しては、ＭＳＣを、ヒトNotch1細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードするｐＣＩ−ｎｅｏ発現プラスミドによりトランスフェクトした。培養の１日後、トランスフェクトされた細胞を、７日間、Ｇ４１８（Invitrogen）による選択下に置き、その後、選択は解除され、そして培養物を、２度の継代により成長せしめ、そして増殖した。次に、ＳＢ６２３細胞を回収し、そしてCryostor CS5 (BioLife Solutions, Bothell, WA)を用いて低温保存した。３種の異なったドナーからの細胞を、本明細書に記載される研究に使用した。ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞を、解凍し、そして使用の前にαＭＥＭで１度洗浄した。共培養実験に関しては、次に、細胞を、２％Ｂ２７及び０．５ｍＭのGlutaMAX（すべては、Invitrogenから）により補充されたNeurobasal培地から成る神経増殖培地に再懸濁した。ＥＣＭコーティングの生成又はならし培地（ＣＭ）の生成に関しては、細胞を、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンにより補充されたαＭＥＭにプレートした。
【００７６】
プレートコーティング
ＥＣＭにより被覆されたウェルの調製のために、ＳＢ６２３細胞を、９６−ウェルプレートに又はガラスカバースリップ（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）上に、３×１０4個の細胞／ｃｍ2でプレートし、それらを１２−ウェルプレート（すべてのプレートは、Corning Inc, Corning, NYから購入された）に配置し、そして５日間、増殖した。続いて、培地を、血清を含まない培地に変え、そして細胞を、さらに２日間、培養した。次に、細胞を、いくらかの改良を伴って、前述のプロトコール[２９]を用いて、ＥＣＭから除いた。手短に言えば、細胞を、室温で４０分間、水中、０．２％Triton X-100（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）により処理し；次に細胞溶解物を注意して吸引し、そして水中、濃縮されたＮＨ4ＯＨ（Sigma−Aldrich）の１：１００（v/v）溶液を、５〜７分間、ゆっくりと添加し、次に除いた。洗浄のために、ウェルをＰＢＳで完全に満たし、そして少なくとも３時間インキュベートした。ウェルは、すぐに使用されるか、又は４℃で保存された。
【００７７】
ならし培地（ＣＭ）の調製
ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞を、３×１０4個の細胞／ｃｍ2でプレートし、そして１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンにより補充されたαＭＥＭにおいて３〜４日間、コンフルエントになるまで増殖した。次に、培地を、Neurobasal培地（Invitrogen）により置換し、そして培養物を１〜２時間、インキュベートした。この培地を捨て、そして細胞増殖のために典型的に使用される容量の半分を用いて、新鮮なNeurobasal培地により置換した。細胞を２４時間インキュベートし、その後、培地を回収し、そして粒状物を、遠心分離により除去した。培地を分注し、そして−７０℃で保存した。ＭＳＣ−ＣＭ調製物を、使用の前に２％Ｂ２７及び０．５ｍＭのGlutaMAXにより補充した。
【００７８】
ラット胚性脳皮質細胞の調製
ラット胚性（Ｅ１８）大脳皮質対を、BrainBits（Springfield, IL）から購入し；そして細胞懸濁液を記載のようにして調製した[２９]。手短に言えば、皮質を、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡと共に３７℃で５〜７分間インキュベートし、そしてトリプシンを除いた。組織を、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ、次にＰＢＳにより洗浄した。次に、０．２５ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ（MP Biomedicals, Solon, OH）を添加し、そして管の内容物を、３０秒間、渦動により混合した。得られる細胞懸濁液を、粉末化し、ＰＢＳにより希釈し、ペレット化し、そして次に、神経増殖培地（上述の）に懸濁した。
【００７９】
共培養実験
上記のようにして被覆されたプレートを、一部の神経増殖培地と共に予め加温し、そして次に、種々の数の間葉細胞を添加した。続いて、神経細胞を、対照のウェル以外のすべてに１．５×１０4個の細胞／ｃｍ2の密度で添加し、そして培養物を、示される期間インキュベートした。各時点で、四重反復のサンプルを含む別々のプレートを用いた。定量化のために、細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞を、１．５×１０3個の細胞／ｃｍ2（すなわち、ウェル当たり５００個の細胞）から出発して、減少する密度で添加した。免疫染色のために、培養物を、１２ウェルプレートのＥＣＭ被覆されたカバースリップ上にプレートした。ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞を、特に断らない限り、１．５×１０3個の細胞／ｃｍ2の一定細胞密度で添加した。
【００８０】
細胞（ＭＳＣ又はＳＢ６２３）の効果が、それらのならし培地の効果と比較されるサブセットの実験において、低温保存された細胞のアリコートを用いて、実験の前にならし培地を生成し、そして実験の日に同じドナーからの細胞アリコートを、融解し、対応する細胞懸濁液を生成した。細胞を、上記のように減少する濃度で適用し、そしてならし培地を、全培地の５０％から出発して、減少する濃度で使用した。遺伝子発現の定量化のために、すべての培養条件を、各神経マーカーについての同じ標準曲線を用いて、同じＰＣＲプレート上で試験した。
【００８１】
培地は、共培養実験の間、変えられなかった（９６ウェル形式で７〜８日間、及びカバースリップ上の細胞を用いて最大１４日間、続いた）。培養の徴候は認められず、そして神経細胞の生存率は、Trypan Blue排除を用いて、培養の最終日に評価される場合、９５％以上であった。
【００８２】
別の組の実験においては、細胞が非接着性条件下で共培養される場合、Ultra-Low Adhesion Costar １２又は２４ウェルプレートを用いた。間葉及び神経細胞を、示される量で混合し、そして神経増殖培地にプレートした。対照として、神経細胞を、単独で、又は２０ｎｇ／ｍｌ又は５０ｎｇ／ｍｌの各ＥＧＦ及びＦＧＦ２の存在下で増殖し、各ＥＧＦ及びＦＧＦ２は、R&D Systems (Minneapolis, MN) 又はPeprotech (Rocky Hill, NJ)の何れかから購入された。培地は実験の間（２週間）、変えられなかった。
【００８３】
免疫細胞化学
ガラスカバオースリップ上で増殖した培養物を、４％パラホルムアルデヒド（Electron Microscopy Science, Hatfield, PA）により２０分間、固定し、ＰＢＳにより１度、洗浄し、そして１０％正常ロバ血清（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）、１％ウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich）、０．１％Triton X-100を含むブロッキング溶液において３０分間インキュベートした。次に、ラットネスチンに対するヤギポリクローナル抗体（R&D Systems,カタログ番号AF2736）を、１：１０００でブロッキング溶液中に添加し、そして４℃で一晩インキュベートした。カバースリップをＰＢＳにより洗浄し、そして次に、ウサギポリクローナル抗グリア線維性酸性タンパク質(GFAP) (Dako, Denmark) (1:2000)、マウスモノクローナル抗微小管関連タンパク質２(MAP2) (Sigma-Aldrich) (1:1000)又はマウスモノクローナル抗２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ(CNPase) (Millipore, Billerica, MA) (1:200)の何れかを添加し、そしてカバースリップを、室温で１時間インキュベートした。洗浄の後、カバースリップを、二次抗体：ＩｇＧのDyLight 549 488-接合AffiniPure 抗ウサギF(ab’)2フラグメント（１：２０００）又はCy3-接合AffiniPure ロバ抗マウスIgG (1:1000)の何れかと組み合わせた、ＩｇＧのDyLight 488-接合AffiniPure ロバ抗ヤギF(ab’)2 フラグメント（１：１０００）と共に１時間インキュベートし、すべての商品は、Jackson Immunoresearchからであり、そしてすべては、製造業者により、複数の標識に使用するために選択された。ＰＢＳ及び水による洗浄の後、スリップを、４’，６’―ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI）（Invitrogen）を含むProLong Gold退色防止剤によりマウントした。
【００８４】
いくつかの実験においては、固定化の前、細胞を５０μｇ／ｍｌの濃度でのマイトマイシンの存在下又は不在下で１０μMの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（BRDU, Sigma-Aldrichからの）と共に７〜８時間インキュベートした。次に、培養物を２％ＰＦＡにより固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎにより透過処理し、そして０．１５ＭのＮａＣｌ及び４．２ｍＭのＭｇＣｌ2を含む緩衝液中、デオキシリボヌクレアーゼ（MP Biomedicals, Solon, OH）により、３７℃で１時間、処理した。次に、培養物を、冷メタノール（Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ）により１０分間、後−固定した。上記のようなブロッキングの後、培養物を、抗−ＢＲＤＵモノクローナル抗体（BD Pharmingen）、次に上記抗マウス二次抗体、次にAlexa Flnor−接合ＴＵＪ1、ニューロンクラスIII β−チューブリン特異的抗体（Covance, Princeton, NJ）と共にインキュベートした。
【００８５】
蛍光顕微鏡検査を、Nikon Eclipse50i (Nikon Instruments, Melville, NY)及びNikon Digital Camera DXM1200Cを用いて、行った。
【００８６】
本明細書に記載される条件下で、何れの抗体も間葉細胞とは反応しなかった。
【００８７】
遺伝子発現の定量化
様々な神経マーカーをコードするｍＲＮＡの発現の定量化のために、細胞の増殖及び培養を、９６ウェルプレートにおいて実施した。示される時間の培養の後、培養培地を、１０μｌのピペット先端を備えたNunc Immuno Washerを用いて、注意して且つ完全に吸引し；そして細胞を、Cell-to-Signal（商標）(Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX)又はSideStep（商標） (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)の何れかの溶解緩衝液２０μｌ（ウェル当たり）により３分間、溶解した。次に、溶解物を注意して上下にピペッティングし、そしてサンプル（四重反復下で）をペアで組み合わせて（従って、生物学的複製物を製造し）、保存プレートに移し、そして−７０℃で凍結した。
【００８８】
遺伝子発現の試験のために、サンプルを融解し、そしてアリコートを、ＰＣＲグレードの水により１：１０に希釈した。高い期待の発現レベルを有するサンプルを用いて、定量化のための一連の標準として作用するよう１０％溶解緩衝液により段階希釈溶液を調製した。希釈されたサンプルを、Qiagen (Valencia, CA)からのQuantiTect（登録商標）Probe RT-PCR Master Mix、及びApplied Biosystems (Foster City, CA)から購入したTaqMan（登録商標）遺伝子発現アッセイと組み合わせて、一段階ｑＲＴ−ＰＣＲ反応における鋳型として使用した。ラット及びヒト細胞からの対応するｍＲＮＡ間の交差反応の不在が、ラット神経細胞、並びにヒト間葉及び神経細胞を包含する実験において確立された。次の予め最適化されたアッセイ（すべては、エクソン−エクソン境界を越えて設計された）が使用された：ラット−特異的-ネスチン (Rn00564394_m1)、MAP2 (Rn00565046_m1 )、GFAP (Rn00566603_m1)、CNPase (Rn01399463_m1)、ダブルコルチン(Dcx)(Rn00584505_m1)、ゲリセルアルデヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ(rGAP)(Rn-1462661_g1)；及びヒト−特異的 - ゲリセルアルデヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ(huGAP) (4333764F)、骨形成タンパク質４ (BMP4) Hs00370078_m1、及び線維芽細胞増殖因子2 Hs00266645_m1。括弧内の数字は、製造業者（Applied Biosystems）のアッセイＩＤ番号を言及する。増幅反応のために、LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Germany)を、４０〜６０の増幅サイクルを有するMaster Mix製造業者のプロトコールに従ってプログラムした。分析は、Second Derivative Maximum法を用いて行われた。
【００８９】
神経突起形成の評価
神経細胞を、通常使用されるよりも１０倍低いＢ２７（０．２％）を含む神経増殖培地において、１．５×１０4個の細胞／ｃｍ2で、単独で、又は１．５×１０3個の細胞／ｃｍ2でＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞の何れかと一緒に、ＥＣＭで覆われたガラスカバースリップ上にプレートし、そして１８〜２４時間、増殖させた。次に、上記のようにして、培養物を、ＭＡＰ２発現のために固定し、そして染色し、そしてＤＡＰＩ含有培地をマウントした。約１２〜１５の倍率で、同じ露出時間を用いて、写真撮影し、そして条件当たり合計２０のニューロンを分析した。最長の神経突起の長さを、各細胞について測定し、そして細胞当たりの神経突起の数を計数した。
【００９０】
実施例１：増殖及びニューロン分化に対する間葉細胞の効果
間葉細胞の存在下又は不在下で増殖されたＥＣＭに基づく神経培養物の組成を、ネスチン、神経幹細胞／初期前駆体のマーカー及びＭＡＰ２、ニューロンマーカーについて、免疫細胞化学を用いて、最初に分析した。様々な時点で、培養物を固定し、そしてラット−特異的抗−ネスチン抗体及び抗−ＭＡＰ２抗体と共にインキュベートした。すべての培養物をまた、核−特異的染料ＤＡＰＩにより対比染色した。次に固定され、そして染色された培養物を、蛍光顕微鏡により検査した。１日目、単一陽性Ｎｅｓ+及びＭＡＰ２+細胞を、ＭＡＰ２染色及びネスチン染色が共局在した、いくらかのＭＡＰ２+Ｎｅｓ+二重陽性細胞と共に、試験されたすべての培養物に存在した。小画分の二重陰性細胞もまた存在した。３日目までに、二重陽性細胞が検出されない一方で、単一陽性細胞はそれらの突起を拡張した。５日目に、ＭＡＰ２+ニューロンは、神経突起を拡張し続ける一方で、Ｎｅｓ+細胞は数的に有意に増加した。この時点で、Ｎｅｓ+細胞はコロンーを形成した。より多くのコロニー数及びより大きなコロニーサイズが、間葉細胞の存在下で観察された。二重陽性細胞は検出されなかった。
【００９１】
９日目までに、多数のＭＡＰ２+Ｎｅｓ+二重陽性細胞、及びＭＡＰ２+Ｎｅｓ-ニューロン及びＭＡＰ２-Ｎｅｓ+細胞が観察された。二重陽性細胞は、ＭＳＣとの共培養に比較して、ＳＢ６２３との共培養において、より多数発現される一方で、間葉細胞なしでの培養物は、最少数のＭＡＰ２+Ｎｅｓ+細胞を有した。それらの二重陽性細胞は、特徴的な二小葉形状の核、薄いＭＡＰ２陽性突起、及び核周辺部、最も頻繁には、最も顕著な伸長に隣接して位置する２つの核葉間の裂け目に局在する強いネスチン反応性を有した。この形態は、培養の第１日目に存在するＭＡＰ２+Ｎｅｓ+二重陽性細胞の形態に類似した。
【００９２】
神経細胞及び間葉細胞がＰＤＬ上で共培養される場合、ほぼ同じ頻度の二重陽性及び単一陽性細胞が、細胞がＥＣＭ上で共培養される場合に観察されるように、培養の１日目に観察された。後の時点で、進行した単一陽性Ｎｅｓ+細胞は検出されなかった（非常に希なＮｅｓ+細胞が、密な核を有する丸形であった）。培養の５日目までに、少数の二重陽性細胞コロニー（各コロニーは非常に少数の細胞から成る）のみが観察された。それらの結果は、ＰＤＬ上で、ほとんどの又はすべてのＮｅｓ+細胞がニューロン分化を開始したことを示した。９日目で、二重陽性コロニーが、間葉細胞の存在下で、それらの細胞の不在下でよりも一層、顕著であった。
【００９３】
共培養物における間葉細胞の状態をまた、位相差顕微鏡法を用いて、及びα−平滑筋アクチン、すなわち間葉細胞マーカーについて染色して、試験を行った。ＰＤＬ上で、間葉細胞はかろうじて拡張し、通常約５〜７日目で消失した。ＥＣＭ上で、間葉細胞は、共培養の期間中に容易に検出され；それらは十分に広がり、移動し、そしてゆっくり増殖しているように見えた。
【００９４】
神経突起形成は、共培養におけるＥＣＭ及びＰＤＬの両者上で非常に活動的であったが、しかし培養の最初の１８〜２４時間、間葉細胞の存在下で、さらに増強された。この異なった応答を増強するために、培養物を、低濃度のＢ２７サプリメントを含む神経増殖培地にプレートした。それらの条件下で、より長い神経突起が、神経細胞のみの培養においてよりも、共培養の２４時間後、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞の存在下で観察された（表１）。しかしながら、神経突起の数の有意差は認められなかった（表１）。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
実施例２：星状細胞発生に対する間葉細胞の効果
星状細胞の成長を、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現についての免疫組織化学分析によりアッセイした。グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、星状細胞マーカー）及びネスチンについてのＥＣＭに基づく培養物の二重染色は、すべての培養において３日目の前、ＧＦＡＰ反応性の不在を示した。約５日目、ＧＦＡＰ−発現細胞が、単一又は二重陽性細胞としてのＮｅｓ+コロニー内の共培養に観察されるようになった。ＧＦＡＰ−発現細胞は、間葉細胞を含まない培養において観察されなかった。別のコロニーは、可変比率のＧＦＡＰ+Ｎｅｓ+細胞及びより十分に分化されたＧＦＡＰ+Ｎｅｓ-細胞を有した。ＧＦＡＰ+細胞は、間葉細胞を欠いている培養においてはこの時点で検出されなかった。９日目、すべての３種の表現型（ＧＦＡＰ+Ｎｅｓ+、ＧＦＡＰ+Ｎｅｓ+及びＧＦＡＰ+Ｎｅｓ-）が、すべての培養物に存在し、そしてＧＦＡＰ+Ｎｅｓ-細胞が卓越した。
【００９７】
その細胞内局在化に関しては、ＧＦＡＰ免疫反応性は、いくつかのネスチン陽性糸状細胞におけるネスチンの傍又は内に挿入フィラメントとして最初に（５日目で）出現した。後に、ネスチンは、ネスチン染色の斑状分布により証明されるように、具体的に特定の細胞においてはＧＦＡＰにより置換される一方で、他の細胞は、ネスチンのみを発現し続けた。共培養においては、ＧＦＡＰ+Ｎｅｓ+細胞は一般的に、ＧＦＡＰ+Ｎｅｓ-細胞と同じ形態を有した一方で、ＧＦＡＰ-Ｎｅｓ+細胞間では、形態が変化した。１つのタイプの細胞は、非常に長い突起、頻繁には、２００μｍを超える突起を有した。他のタイプの細胞は、小さいＧＦＡＰ-Ｎｅｓ+細胞であり、ここでネスチン反応性が、核の片側から「レース」（lace）として、又は二小葉核の裂け目で濃縮され、そして裂け目に接して位置する突起に拡張されて、核に対して偏心的に局在した。後者の形態は、先の実施例に記載されるＮｅｓ+ＭＡＰ２+細胞の形態に類似した。
【００９８】
ＧＦＡＰ+細胞は、共培養がＰＤＬに上で行われる場合、検出されなかった。
【００９９】
実施例３：オリゴデンドロサイト発生に対する間葉細胞の効果
オリゴデンドロサイト発生を、初期オリゴデンドロサイトマーカー２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）の発現の免疫組織化学分析により評価した。ＣＮＰａｓｅ+細胞は、共培養の９日目では、検出できなかった。１２日目、間葉細胞の不在下でのＥＣＭ上で増殖される培養においては、ＣＮＰａｓｅ反応性は、非常に少数の、通常分裂する細胞においてのみ検出され得た。同じ時点で、間葉細胞を含む共培養においては、ＧＮＰａｓｅ+細胞はクラスターで出現し、そしてＣＮＰａｓｅ発現は核周囲領域に局在した。ＳＢ６２３細胞による共培養においては、ＣＮＰａｓｅ染色は、細胞質全体に、より強く、より広範囲に拡張した。ＣＮＰａｓｅの発現は、ネスチン発現とは共局在しなかった。
【０１００】
ＣＮＰａｓｅ+細胞は、共培養がＰＤＬ上で行われる場合、検出されなかった。
【０１０１】
実施例４：共培養での神経細胞の増殖
神経細胞の増殖を、１．５×１０3個の細胞／ｃｍ2のＭＳＣの存在下又は不在下で、１．５×１０4個の神経細胞／ｃｍ2を含む培養物において、２種の方法を用いてアッセイした。最初の方法によれば、ＤＡＰＩ染色された核が、上記のような免疫化学分析のために調製されたスライド上で計数された。２００Ｘ倍率での５種の顕微鏡視野を、２つの実験から、計数し、そして条件ごとに平均した。非常に凝縮されるか、又は断片化された核は、死亡細胞を示すものとして考えられた。ＭＳＣ核を、それらの独得のサイズに基づいて、計数から除外した。
【０１０２】
第２の方法によれば、神経細胞増殖は、ラットノギン、すなわち単一エクソン遺伝子(Rn01467399_s) (Applied Biosystems)についての定量的ＰＣＲアッセイを用いて、マイクロプレート形式共培養において測定された。分析は、ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコールの逆転写段階を除いたことを除いてｑＲＴ−ＰＣＲについて記載されるようにして実施した。ＭＳＣからのヒトノギン配列の最少増殖が検出された（図１Ｂ）。
【０１０３】
結果を図１に示す。両方法は、ＭＳＣの存在下で、ラット神経細胞の数がＭＳＣとの７日間の共培養の間、三倍化又は四倍化する一方で、ＭＳＣの不在下で、神経細胞数はかろうじて二倍に成ったことを示した。ＤＡＰＩ染色された神経核の形態によりアッセイされる場合、１０〜２０％の細胞は所定の時間で死亡した（図１Ａ）。
【０１０４】
神経前駆体細胞の増殖をまた、ＥＣＭ上でのＭＳＣとラット神経細胞との共培養下でアッセイした。共培養の７日目、培養物を、ＢＲＤＵに対する抗体及びニューロン特異的ＴＵＪ１抗体を固定し、そして免疫染色することに続いて、７時間ＢＲＤＵにより処理した。神経細胞が単独で培養されるか、又はＭＳＣと共に共培養されるかどうかには関係なく、この時点で、培養物は、抗ＴＵＪ１及び抗ＢＲＤＵ抗体の両者との反応性を示す、かろうじて成長する突起を有する小さな細胞を含み、これが増殖する神経前駆体細胞を示す。ラットノギン遺伝子についてのＰＣＲアッセイを用いてのそれらの神経前駆体細胞の定量化は、それらの数が、神経細胞がＭＳＣと共に共培養される場合、増加されたことを示した（図１Ｂ）。
【０１０５】
実施例５：経時変化
この実験においては、ＥＣＭ上で培養される神経細胞における種々のニューロン（ダブルコルチン、ＭＡＲ２）、神経前駆体（ネスチン）及びグリアマーカー（ＧＦＡＰ及びＣＮＰａｓｅ）の発現の経時変化を、２００個のＭＳＣ／ウェルの存在下及び不在下で分析した。サンプルを、様々な時点で集め、そして凍結した。続いて、全てのサンプルを融解し、そしてｑＲＴ−ＰＣＲにより並行してアッセイした。プライマー、プローブ及び増幅条件は上記の通りであった。結果を、図２に示す。神経マーカーダブルコルチン（ＤＣＸ）及びＭＡＰ２のレベルは、最初は高く、そして培養及び共培養において時間と共に上昇する。中間の培養時で、共培養は、ＤＣＸ及びＭＡＰ２ ＲＮＡレベルに対してはほとんど効果を有していないように見る一方で；後の時間では、共培養の活性効果が顕著になる。ネスチン、すなわち神経前駆体細胞マーカーの発現は、共培養の開始で、ほとんど検出できなかったが、しかし７日間の培養にわたって着実に高められ、そしてＭＳＣの存在により増強された。ＧＦＡＰ ｍＲＮＡ、すなわち星状細胞マーカーの発現は、ＭＳＣとの共培養の不在下で検出されない一方で；共培養においては、それは、最初に、４日目で検出され、そして６日目と７日目との間で発現の大きな増加が存在した。ＣＮＰａｓｅ ｍＲＮＡ、すなわちオリゴデンドロサイトマーカーの発現は、ＭＳＣとの共培養において、最初に４日目で検出され、そして６日目と７日目との間で急増が示された。
【０１０６】
それらの結果に基づけば、ネスチン及びＣＮＰａｓｅ ｍＲＮＡ発現の検出のための最適時間は、共培養の５日目であることが決定され；そしてＤＣＸ、ＮＡＰ２及びＧＦＡＰ ｍＲＮＡ発現の検出のための最適時間は、共培養の７日目であることが決定された。
【０１０７】
実施例６：用量応答
定量アッセイに関しては、ラット皮質細胞（５０００個の細胞／ウェル）を、単独で培養するか、又はウェル当たり５００〜３２個の細胞の減少する数のＭＳＣと共に共培養した。対照として、ＭＳＣはまた、５００個の細胞／ウェルで単独で培養された。ラットネスチン、ＭＡＰ２、ＧＦＡＰ及びＣＮＰａｓｅ ｍＲＮＡについてのｑＲＴ−ＰＣＲ Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて、遺伝子発現を定量化した。ヒト特異的グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｈｕＧＡＰ）のｑＲＴ−ＰＣＲ Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて、ＭＳＣ数を見積もった。図３及び４は、共培養サンプルにおけるｒＮｅｓ、ｒＭＡＰ２、ｒＣＮＰａｓｅ又はｒＧＦＡＰ遺伝子発現の総レベルが存在するＭＳＣの数に直接的に依存することを示しており、ここで前記ＭＳＣ数は、ヒト特異的ＧＡＰ（ｈｕＧＡＰ）ｍＲＮＡについてのアッセイにより定量化される。それらの効果は、ＭＳＣ単独では、ラット特異的プローブ及び条件を用いてシグナルを付与しないので、ヒト配列の増幅により引き起こされなかった。
【０１０８】
マーカーとしてネスチン、ＭＡＰ２又はＣＮＰａｓｅを用いてＭＳＣ−依存性用量応答を観察するためには、サンプリングのタイミングが重要であった。例えば、ラットネスチン遺伝子発現を試験するための最適なタイミングは、７日目での発現が飽和に達したので、４日目と６日目との間であった。
【０１０９】
ラットＣＮＰａｓｅ ｍＲＮＡ発現は、タンパク質を検出することができただいぶ前である、ほぼ５日目で最初に検出された。５日目で、ＣＮＰａｓｅ ｍＲＮＡレベルは、共培養におけるＭＳＣ濃度に対して直接的に比例した。５日目の後、ＣＮＰａｓｅ遺伝子発現レベルは、上昇し続け；しかし７日目まで、ＭＳＣ−用量依存曲線は二相性になった（図５）。それらの後の時間で、より高い用量のＭＳＣが、観察の間、ＣＮＰａｓｅ遺伝子発現を漸進的に阻害し、そしてより低い用量は誘導性のままであった。この結果は、タンパク質レベルで確認された：１０００個の細胞／ｃｍ2のＭＳＣ又はＳＢ６２３と共に共培養された神経細胞は、１００個の細胞／ｃｍ2のＭＳＣ又はＳＢ６２３と共に共培養された神経細胞に比較して、有意に低いＣＮＰａｓｅ染色を有した。
【０１１０】
ＧＦＡＰ ｍＲＮＡの発現は、できるだけ早く検出されるよう（４日目又は５日目）、間葉細胞濃度に対して強く且つ一貫性の用量応答性を示し、そして残りの培養期間（７日目〜９日目）、飽和を示さなかった。
【０１１１】
実施例７：間葉細胞ならし培地、間葉細胞ＥＣＭ及び肝臓間葉細胞により介在される効果の定量化
この実施例においては、神経細胞分化に対する生存ＭＳＣの効果を、それらのならし培地（ＣＭ）の効果に比較し；そして支持体としてのＥＣＭの使用の効果を、ポリ−Ｄ−リシンの使用と比較した。
【０１１２】
定量的神経分化アッセイ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、間葉幹細胞培養物のどの成分が最も優れた神経新生効果を有したかを決定した。このためには、ＭＳＣに対する神経細胞の応答を、ＭＳＣ−ＣＭに対するその応答と比較し、そして細胞を、ＥＣＭ−又はＰＤＬ−被膜プレート上で共培養した。減少する濃度のＭＳＣ及びＭＳＣ−ＣＭを用いて、効果が飽和以下で分析されたことを確かめた。結果を、表２に要約する。説明を簡単にするために、表は、最高濃度の間葉細胞（５００個の細胞／ウェル）又はＭＳＣ−ＣＭ（５０％）を包含した実験からのデータを単に含む。より低い濃度のそれらの添加剤がより低いマーカー発現レベルを刺激し、このことは、応答が飽和も又はダウン−レギュレートの何れもされなかったことを確認した。結果は、指示される日において添加物を有さないＥＣＭ上で増殖された培養物中のレベルと比較して表された。
【０１１３】
１日目での類似するレベルのｒＭＡＰ２発現が、全ての試験条件下で観察され、このことは、初期ニューロン接着及び成長が類似したことを示唆する。後の５日目、生存ＭＳＣ又はＭＳＣ−ＣＭの何れかの存在は、何れの支持体上でもこのマーカーの発現を、２〜３倍に高めた。ネスチン遺伝子発現は、ＰＤＬ上でよりもＥＣＭ上で２〜３桁程度、強かった。５日目、ネスチン遺伝子発現は、ＥＣＭ及びＰＤＬの両者上でＭＳＣ−ＣＭ及び生存ＭＳＣの両者の存在下で実質的に高められた。５日目でのＣＮＰａｓｅ遺伝子発現は、生存ＭＳＣにより誘導され、そしてＥＣＭに基づく培養上でのＭＳＣ−ＣＭにより、より一層強く誘導された一方で、ＰＤＬに基づく培養上では、それは検出限界以下であった。ＣＮＰａｓｅ遺伝子誘導は、７日目、ＰＤＬ上で検出され、そしてＭＳＣ−ＣＭは生存ＭＳＣよりも、より効果的な刺激であった。ＧＦＡＰ遺伝子発現は、生存ＭＳＣにより最も劇的に、及びＭＳＣ−ＣＭによれば、より少ない程度にＥＣＭ上で誘導された。ＰＤＬ上で、ＧＦＡＰ発現は、研究を通して、定量化限界以下であった。
【０１１４】
ヒトＧＡＰ発現をまた、この研究の１日目及び７日目に試験した。１日目、ＰＤＬ−被覆されたプレート上で行われる共培養におけるヒトＧＡＰ遺伝子発現は、ＥＣＭ上で培養された細胞においてよりもわずかに低い一方で、７日目、それは定量化限界以下であった。顕微鏡検査は、ＰＤＬ上での７日後、少数の間葉細胞のみが生存し、そしてこれらはかろうじて広がった一方で、それらはＥＣＭ上で、それらの典型的な形態を示し、そして数的にわずかに上昇したことを表した。結果を、表３に要約する。
【０１１５】
【表３】
2019068845.tif 000009
【０１１６】
【表４】
2019068845.tif 000010
【０１１７】
実施例８：非接着性培養におけるＭＳＣの効果
上記実験においては、プレートのＥＣＭコーティングは、間葉細胞のコンフルエント層により生成され、ここで前記細胞の濃度は、共培養に使用される間葉細胞の最高濃度よりも約４０倍、高かった。共培養における神経幹／初期子孫細胞増殖及び分化の強い刺激が共培養における間葉ＥＣＭの存在により引き起こされるかどうかを明確にするために、皮質細胞を、減少する数のＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞と共に混合し、そして共培養を、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）により被覆されたプレートにおいて、非接着性条件下で実施した。対照として、皮質細胞を、単独で、ＦＧＦ２及びＥＧＦの存在下又は不在下でプレートし；そして間葉細胞を、共培養に使用される最高濃度で、単独でプレートした。
【０１１８】
ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）コーティングに関しては、プレートを、水中、１０μｇ／ｍｌでのＰＤＬ（Sigma−Aldrich）により、室温で１時間、被覆した。次に、ＰＤＬ溶液を吸引し、ウェルを乾燥させ、そして次にＰＢＳにより１度、洗浄した。細胞がそれらの被覆されたウェルにプレートされる前、ＰＢＳを一部の神経増殖培養培地により置換し、そしてプレートを、細胞懸濁液の調製の間、インキュベーター内で加温した。
【０１１９】
細胞を１４日間、共培養した。この間、細胞凝集物がすべてのウェルに形成された。間葉細胞単独での培養においては、それらの凝集物は小さく、そしてそれらのサイズの増大は、培養期間、観察されず；実際、それらの多くは死滅した。すべての他の条件下で、凝集物は有意に成長し、典型的なニューロスフェアを形成した。インキュベーションの最後で、すべてのウェル中の全内容物を集め、ペレット化し、そして等体積の溶解緩衝液に溶解し；次に、ラット神経マーカーの発現についてｑＲＴ−ＰＣＲにより試験した。図６は、代表的結果を提供し、これは、ＭＳＣの存在が、ＥＣＭの不在下で非接着性条件下で用量依存的にｒＮｅｓ、ｒＭＡＰ２、ｒＧＦＡＰ及びｒＣＮＰａｓｅ発現を刺激したことを示す。ラットダブルコルチン（ｒＤＣＸ、増幅ニューロンのマーカー）の発現はまた、ＰＤＬ−被覆された支持体上でのＭＳＣにより刺激された。ＭＳＣはまた、用量依存的にｒＧＡＰの発現を誘導し、このことは、ＭＳＣとの共培養が生存ラット神経細胞の全体数の上昇を刺激したことを示唆する。
【０１２０】
最高用量のＭＳＣを含む共培養に観察されるニューロスフェアがＦＧＦ２及びＥＧＦの存在下で増殖されたニューロスフェアに比較される場合、前者はネスチン遺伝子発現のレベルの１／３であるが、しかし２．５倍高いＤｃｘ発現及び５５倍高いＧＦＡＰ発現を有し、並びにより高いレベルのＭＡＰ２、ＣＮＰａｓｅ及びｒＧＡＰ発現（それぞれ、１．５、３．５及び３倍）を有した。ヒトＧＡＰ（ｈｕＧＡＰ）ｍＲＮＡが非接着条件下で、単独で培養されるＭＳＣにおいて検出されたが、しかしそのレベルは、同数の細胞が神経細胞と共に共培養される場合、劇的に低められた（それぞれ、１７．２及び３．１倍）。より低い用量のＭＳＣは、定量限界以下であるｈｕＧＡＰ発現レベルを示した。これは、非接着性条件との組み合わせの神経細胞環境が間葉細胞の増殖のために好ましくなく、そしてそれらはより低いプレート用量で生存しなかったことを示唆する。それにもかかわらず、神経成長を刺激するそれらの能力は持続した。
【０１２１】
ｂＦＧＦ及びＥＧＦの不在下で培養された皮質細胞においては、すべての神経マーカーの遺伝子発現は、ラットＧＡＰの発現のように、低かった。ＭＳＣとの共培養においては、すべてのマーカーの発現は、大部分のＭＳＣが共培養において死滅している事実にもかかわらず、及び単独で培養される場合（ｈｕＧＡＰレベルにより示される場合）、用量依存的に高められた。
【０１２２】
類似する結果が、ＭＳＣの代わりにＳＢ６２３細胞を用いて得られた。それらの結果は、ＥＣＭ上での共培養において観察される間葉細胞の刺激的効果は、ＥＣＭ自体によるものではないことを示す。
【０１２３】
実施例９：接着条件の効果
共培養における神経細胞の分化に対する接着条件の効果を評価した。このために、神経細胞を、ＳＢ６２３細胞由来のＥＣＭ被覆されたプレート、オルニチン／フィブロネクチン−被覆されたプレート、及びUltra Low Attachment (ULA)プレート (Corning, Lowell, MA)上で、ＭＳＣと共に共培養した。オルニチン／フィブロネクチン−被覆されたプレートは、ＭＳＣの接着を支持した。ＵＬＡプレート上で、神経細胞を、５倍高い濃度のＭＳＣ（ＥＣＭ又はオルニチン／フィブロネクチン上での共培養と比較して）、又は各２０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ２）及び上皮増殖因子（ＥＧＦ）の何れかと共に培養した。
【０１２４】
オルニチン／フィブロネクチンコーティング（Ｏｒｎ／ＦＮ）を、ＰＢＳ中、１５μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−オルニチン（Sigma−Aldrich）を有するウェルを、３７℃で一晩インキュベートし、次にウェルを３度洗浄し、続いてＰＢＳと共に３７℃で一晩インキュベートすることにより調製した。この後、ウェルを、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌのウシフィブロネクチン（Sigma−Aldrich）と共に３〜３０時間インキュベートし、そして細胞をプレートする前に１度洗浄した。
【０１２５】
ラット皮質細胞及びヒトＭＳＣの混合された懸濁液（１０：１の比での神経細胞／ＭＳＣ、１．５×１０4／ｃｍ2）を、ＳＢ６２３細胞ＥＣＭ−被覆されたプレート、及びオルニチン／フィブロネクチン−被覆されたプレート上にプレートした。５倍高い濃度のＭＳＣ、又はＦＧＦ２及びＥＧＦの何れかと共に混合された神経細胞（上記のようにして）を、ＵＬＡプレート上にプレートした。マーカー発現を、共培養の５又は７日に、ｑＰＴ−ＰＣＲによりアッセイした。
【０１２６】
結果を図７に示す。ＥＣＭ上でＭＳＣと共に共培養された神経細胞は、すべての他の条件と比較して、有意に高いレベルのＧＦＡＰを発現した。ＥＣＭ−被覆されたプレート上でのネスチン発現は、Ｏｒｎ／ＦＮにより被覆されたプレート上でよりも有意に高く、そして組換えサイトカインにより刺激されるか、又は高濃度のＭＳＣと共に共培養された、ＵＬＡプレート上で培養された細胞において観察される発現に類似した。７日間で、ＥＣＭ上で増殖された共培養物においては、ラットネスチン及びＧＦＡＰ発現レベルはＯｒｎ／ＦＮよりも有意に高い一方で、ラットＤＣＸ、ＣＮＰ及びヒトＧＡＰ発現レベルは類似した。ＥＣＭ上で増殖された共培養物は、非接着性共培養物よりも、ＧＦＡＰ及びＤＣＸの有意に高い発現を示した。
【０１２７】
非接着性増殖（ＵＬＡプレート上での）は、ｈｕＧＡＰレベルが、ＥＣＭ及びＯｒｎ／ＦＮ−被覆されたプレートと比較して、ＵＬＡプレート上で５倍高いＭＳＣ濃度にもかかわらず、非常に低かった。非接着性条件下で、ＦＧＦ２／ＥＧＦ及びＭＳＣは、類似するレベルのＮｅｓ及びＣＮＰａｓｅ発現を支持した。
【０１２８】
要約すると、ＥＣＭ−被覆されたプレート上で増殖された神経細胞及びＭＳＣの共培養はＯｒｎ／ＦＮ上での又はＵＬＡウェルにおける共培養と比較して、最も多様な神経細胞集団を含んだ。特に、ＥＣＭ上での共培養は、ＦＧＦ２／ＥＧＦ−駆動のスフェロイドにおけるネスチン発現に比較できるレベルのネスチン発現を支持し、そしてまた、試験される何れかの条件下で最高レベルのＧＦＡＰ発現を支持した。
【０１２９】
実施例１０：ヘパリン硫酸プロテオグリカンの役割
前述の実施例に記載されるように、豊富なネスチン−発現細胞に対するＥＣＭの肯定的効果を考慮して、ネスチン発現に対するヘパリン硫酸プロテオグリカン成分の効果を調べた。
【０１３０】
それらの実験に関しては、プレートを、上記のように、ＳＢ６２３ＥＣＭにより被覆し、次にＥＣＭを、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ及び４ｍＭのＣａＣｌ2中、ヘパリナーゼ１（Sigma−Aldrich）の溶液により、室温で一晩処理し、そして１度、洗浄した。ヘパリナーゼ濃度は、図８に示されている。
【０１３１】
ラット皮質細胞を、ヘパリナーゼ処理されたＥＣＭを含むプレート上で培養した。培養の５日後、ネスチン発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした。図８に示される結果は、ヘパリナーゼによるＥＣＭの処理がネスチン発現のヘパリナーゼ用量依存性低下をもたらすことを示す。結果から、ヘパリン硫酸がネスチン−発現神経細胞の増殖に寄与することが結論づけられ得る。
【０１３２】
実施例１１：ＭＳＣによる増殖因子及びサイトカインの発現
定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、下記表４に示されるように、一定の増殖因子及びサイトカインをコードするｍＲＮＡのＭＳＣによる発現を測定した。
【０１３３】
【表５】
2019068845.tif 000011
【０１３４】
実施例１２：サイカイン、増殖因子及び他のタンパク質の神経原性及び／又はグリア原性効果についてのアッセイ
ＥＣＭ上で培養される神経細胞に、組換え因子を単独で、又は５％ＭＳＣならし培地（ＭＳＣ−ＣＭ）と共に添加することにより、ＭＳＣにより生成される多くの増殖因子及びサイトカインを、神経発生及びグリア発生を刺激するそれらの能力について試験した。
【０１３５】
ＥＣＭを、培養下でＳＢ６２３細胞を増殖し、次に培養容器から細胞を洗浄することにより生成した。一次胚性ラット皮質細胞（Brain Bits, Springfield, IL）を、表５に示すように、５％ＭＳＣならし培地及び特定の組換えサイトカイン又は増殖因子の存在下でＥＣＭ上で５又は７日間、培養した。次に、細胞を、種−特異的定量的ＲＴ−ＰＣＲにより様々なラットニューロン及びグリアマーカーの発現についてアッセイした。それらの結果の要約を表５に示す。
【０１３６】
【表６】
2019068845.tif 000012
【０１３７】
ニューロン前駆体（ネスチン）、発生期ニューロン（ＤＣＸ）、オリゴデンドロサイト（ＣＮＰａｓｅ）及び星状細胞（ＧＦＡＰ）についてのマーカーの発現に対する３種の因子（ＥＧＦ、ＢＭＰ６及びＨＢ−ＥＧＦ）の効果を示す定量的結果を、図９に示す。
【０１３８】
実施例１３：ネスチン発現のアップレギュレーションでのＦＧＦ２の役割
線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ２）は、ＭＳＣにより分泌され（上記表４）、そして皮質細胞へのＦＧＦ２の添加は、ネスチン、ＭＡＲ２及びＣＮＰａｓｅの発現を刺激した（上記表５）。２種の追加の実験を行い、ネスチン発現の刺激におけるＦＧＦ２つの役割を確かめた。最初に、ＦＧＦ２に対するブロッキング抗体を、神経細胞及びＭＳＣの共培養物に添加した。第二に、ＭＳＣならし培地からＦＧＦ２を枯渇し、そしてそれを、神経細胞培養物に添加した。
【０１３９】
最初の実験のために、次の２種の抗体：ｂＦＭ１（ラット及びヒトＦＧＦ２の両者を認識するＦＧＦ２中和抗体）及びｂＦＭ２（ＦＧＦ２−特異的非中和抗体）（両者は、Millipore, Billerica, MAから入手された）を用いた。ラット皮質細胞を、２００個の細胞／ウェルの濃度でのＭＳＣの存在下、又はその不在下で、５，０００個の細胞／ウェルの濃度で培養した。抗体を、０．２μｇ／ｍｌの濃度で、皮質細胞及びＭＳＣの共培養物に添加した。
【０１４０】
この分析の結果を、図１０に示す。神経細胞のＭＳＣとの共培養は、予測されるように、神経細胞によるネスチン発現を増強する。しかしながら、共培養が抗ＦＧＦ２中和抗体の存在下で実施される場合、ネスチン発現は、バックグラウンドレベル以下に低められた。共培養への非中和抗ＦＧＦ２抗体の存在は、共培養中の神経細胞におけるネスチン発現のＭＳＣ依存性上方制御に対して全く効果を有さなかった。
【０１４１】
第二の実験に関しては、ＦＧＦ２枯渇ＭＳＣ−ＣＭ及び対照ＭＳＣ−ＣＭを次の通りにして調製した。ＭＳＣ−ＣＭを、抗ＦＧＦ２中和抗体ｂＦＭ１と共に、又は対照マウスＩｇＧ１と共に、５μｇ／ｍｌで一晩、４℃で、ロティサリーシェーカー上でインキュベートし、続いてタンパク質Ａ／Ｇ−plus Agarose（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）を添加し、そして１時間インキュベートした。遠心分離によりビーズを除いた後、上清液を集め、そして減菌濾過した。
【０１４２】
神経細胞を、追加の添加物を含まないか、又はＭＳＣ−ＣＭ、ＦＧＦ２枯渇ＭＳＣ−ＣＭ又は対照の免疫沈澱されたＭＳＣ−ＣＭの添加を含むＥＣＭ−被覆プレート上で５日間培養し、そしてネスチンｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。結果を図１１に示す。神経細胞へのＭＳＣ−ＣＭの添加は、期待どおり、高められたネスチン発現をもたらした。しかしながら、ＦＧＦ２枯渇ＭＳＣ−ＣＭは、ネスチン発現に対する刺激的効果をほとんど有さなかった。非ＦＧＦ２−特異的抗体を用いて同じ免疫沈澱方法にゆだねられたＭＳＣ−ＣＭは、未処理のＭＳＣ−ＣＭと同じ程度まで、ネスチン発現を刺激した。
【０１４３】
それらの結果は、ＭＳＣ枯渇ＦＧＦ２が神経細胞においてネスチン誘導を担当できる主要因子であることを示唆し、そしてまた、皮質ＥＣＭに基づく培養物における基本的なネスチンレベルが、ラット又はヒト起源のいずれかのＦＧＦ２に依存したことも示唆した。
【０１４４】
実施例１４：星状細胞成長におけるＭＳＣ由来因子の役割
間葉幹細胞の効果を、ＥＣＭ被覆プレート上での神経細胞培養におけるネスチン及びＧＦＡＰの発現に対する間葉幹細胞からのならし培地の効果と比較した。図１２に示されるように、類似するレベルのネスチンｍＲＮＡが、ウェル当たり２００のＭＳＣにより、及び１０％ＭＳＣならし培地により誘導された。しかしながら、ならし培地によるＧＦＡＰ発現の誘導は、細胞自体により誘導されたその発現の誘導よりも低かった。この結果は、星状細胞成長を担当できる成分が、ＭＳＣ自体におけるよりもＭＳＣならし培地においてあまり豊富ではなかった（そして／又はあまり活動的ではなかった）ことを示唆した。
【０１４５】
骨形態形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）、すなわちＭＳＣにより分泌される因子（上記表４）は、神経細胞の培養物に添加される場合、ＧＦＡＰの発現を刺激した（上記表５）。星状細胞発生におけるＢＭＰ４の役割を確かめるために、ラット神経細胞及びＭＳＣの共培養を、ＢＭＰアゴニスト（ノギン）及び抗ＢＭＰ４抗体の存在下で行った。R&D Systems (Minneapolis, MN)から得られた組換えヒトノギンタンパク質が、３０ｎｍ／ｍｌの最終濃度で共培養物に含まれた。ポリクローナルヤギ抗ＢＭＰ４及び正常ヤギＩｇＧ対照を、２μｇ／ｍｌで共培養に使用した。それらの試薬、及びマウスＩｇＧ１イソタイプ対照は、R&D Systems (Minneapolis, MN)から入手された。
【０１４６】
図１３は、ＢＭＰアンタゴニストであるノギンがＥＣＭ被覆プレート上でＭＳＣと共に共培養された神経細胞におけるＧＦＡＰ発現の誘導を阻害したことを示す。ＭＳＣによるＧＦＡＰ誘導の部分的阻害はまた、神経細胞が抗ＢＭＰ４抗体の存在下でＭＳＣと共に共培養される場合、観察された(図１３)。
【０１４７】
タンパク質Ａ／Ｇ−plus Agarose（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）の１時間にわたっての添加に続いて、抗ＢＭＰ４抗体又は対照（ヤギＩｇＧ、又は抗体なし）と共に、ロティカリーシェーカー上で４℃で一晩、５μｇ／ｍｌで、ＭＳＣ−ＣＭをインキュベートすることにより、ＭＳＣならし培地からＢＭＰ４を免疫沈澱する試みが行われた。遠心分離によりビーズを除いた後、上清液を集め、そして滅菌濾過した。しかしながら、ＧＦＡＰレベルは、ＢＭＰ４枯渇ＭＳＣ−ＣＭの存在下で培養された神経細胞に比較して、ＭＳＣ−ＣＭの存在下で培養された神経細胞においては有意な差は認められなかった。それにもかかわらず、抗ＢＭＰ４抗体は、組換えＢＭＰ４により駆動されるＧＦＡＰ誘導を防ぐことができた。
【０１４８】
ＭＳＣに比べてＭＳＣ−ＣＭの低い星状細胞原性活性；抗ＢＭＰ４中和抗体により処理された共培養におけるＧＦＡＰレベルの部分的低下；及びＭＳＣ−ＣＭの星状細胞原性活性に対するＢＭＰ４免疫枯渇の抗下の欠乏が、一緒になって、活性ＢＭＰ４星状細胞−誘導活性が細胞−ＥＣＭ区画（培地においてよりもむしろ）に存在し、又はそれはラット細胞により、生成されることを示唆する。
【０１４９】
共培養における活性ＢＭＰ４がＭＳＣ又はラット神経細胞により生成されるかどうかを試験するために、ＭＳＣによるＢＭＰ４の生成を、共培養の前に、ｓｉＲＮＡを用いて阻害した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションに関しては、新しく融解されたＭＳＣを、αＭＥＭ／１０％ＦＢＳ下で６ウェルプレート当たり０．４×１０6個の細胞でプレートした。次の日、細胞を、ON-TARGETplusSMARTプール ヒトBMP4 siRNA、又は２５ｎＭでの対照非標的化プールの何れかにより、DharmaFECT（登録商標）1 (すべての試薬はThermo Scientific Dharmacon（登録商標）, Lafayette, COからである)を用いて、その製造業者の説明書に従って、トランスフェクトした。次の日、細胞をトリプシン処理し、そしてリフト（lift）し、そしてＦＢＳを添加することにより、トリプシンを阻害した。次に、細胞をNeurobasal培地により２度洗浄し、そして計数した（生存率は通常、９５％超であった）。
【０１５０】
トランスフェクションの後日、等しい細胞数のトランスフェクタントを、ラット皮質細胞と共にプレートし、そして５日間、共培養した。５日目、ラットＧＦＡＰ ｍＲＮＡレベル及びヒトＢＭＰ４レベルをアッセイした。図１４に示される結果は、ＢＭＰ４−ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされたＭＳを含む共培養においては、ラットＧＦＡＰ ｍＲＮＡレベルが、有意に低められ、そしてヒトＢＭＰ４ ｍＲＮＡは実質的に検出できない一方で；ヒトＧＡＰ及びＦＧＦ２遺伝子の発現は影響を受けなかったことを示す。ＧＦＡＰｍＲＮＡレベルの低下は、対照ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされた細胞においては観察されなかった。それらの結果は、共培養において星状細胞発生の刺激に寄与するＢＭＰ４がＭＳＣ由来であったことを強く示唆した。
【０１５１】
結論及び観察
ＥＣＭ上で、Ｎｅｓ+細胞の増殖は、免疫染色及びｑＲＴ−ＰＣＲを用いて示される場合、生存間葉細胞又はそれらのならし培地により、用量依存性的に有意に拡大された一方で、ＰＤＬ上で、それらの因子に対する応答は低められた（図１及び５、並びに表２）。これは、Ｎｅｓ+幹／初期前駆体細胞の増殖が分泌された間葉細胞−由来の因子により刺激され、そして間葉細胞ＥＣＭ上での増殖により相乗的に増強されたことを示唆する。この相乗効果のための最も可能性が高い機構は、マトリックスプロテオグリカンによる神経細胞への間葉細胞由来の増殖因子の効果的蓄積、保存及び提供である。神経Ｎｅｓ+細胞の増殖が離れて作用するＭＳＣ−由来の可溶性因子により刺激され得る結論は、最近の報告と一致しており、この報告は、マウスＭＳＣと共に共培養されたが、しかし半透膜によりそれらから分離されたマウスニューロスフェアは、高い百分率のＫｉ−６７−陽性細胞を有したことを示している[３８]。実際、ＭＳＣは、インビボでの神経前駆体の維持に関与していることが示されている多くの増殖因子を分泌することが知られており[１６、３０]、そしてＢＭＰ４、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ−ＡＡを包含する、それらのいくつかの分泌が本明細書で使用されるＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞バッチにおいて確認されている[３９]。
【０１５２】
共培養下での間葉間質細胞は、Ｎｅｓ+細胞からの神経突起及び新規ニューロン形成の両者を促進した（図１及び２；表１及び２）。それらの両効果は、ＭＡＰ２タンパク質（ＭＡＰ２タンパク質は、ニューロン細胞体及び神経突起の特異的マーカーである）についての免疫染色を用いて観察され：そして組み合わされた効果がＭＡＰ２ ｍＲＮＡについての発現アッセイを用いて定量化された。増強された神経突起形成及び増加した数のＮｅｓ+ＭＡＰ２+細胞が、間葉細胞の存在下で、ＥＣＭ及びＰＤＬの両者上に観察され、これは、神経突起形成及びニューロン形成の両者の可溶性メディエーターがそれらの効果のためにはＥＣＭが必要でないように見えることを示唆する。実際、ＥＣＭ又はＰＤＬに基づく培養物へのＭＳＣ−ＣＭの添加は、生存細胞の添加と同じように、効果的にＭＡＰ２遺伝子発現を高めた（表２）。ＭＳＣの神経突起形成効果は、異なった起源のニューロンに、これまで観察されている[１６、２３、４０、４１]。
【０１５３】
ＭＳＣ及びＳＢ６２３を包含する間葉細胞は、共培養下で、ほぼ７日間、二重陽性Ｎｅｓ+ＮＡＰ２+細胞の大規模な出現により示されるように、ＥＣＭ上での新規ニューロンの形成を高めた（図１、９日目に示される）。間葉細胞の不在下で、それらの二重陽性細胞は、後で及び少数で出現した。ラットＭＡＰ２ ｍＲＮＡ発現アッセイは、ＥＳＭ及びＰＤＬ上で類似する、５日目から出発する（図５）ＭＳＣ−用量−依存的ンシグナルの有意な上昇を示した（表２）。この上昇は新生ニューロンの出現に先行しているので、ＭＡＰ２遺伝子発現のＭＳＣ用量−依存性上昇は恐らく、神経芽細胞の増殖に影響を及ぼした。ラットダブルコルチン（ｒＤｃｘ）、すなわち増殖ニューロンのマーカーについてのｍＲＮＡのレベルの測定は、ＭＡＰ２発現についてのそれらのレベルに類似し（示されていない）、このことは、ｒＤｃｘが恐らく、ＭＡＰ２のように、新生及び成熟ニューロンの両者において発現されることを示唆する。
【０１５４】
本明細書において使用されるプレーティング密度で、ＧＦＡＰ発現はＥＣＭに基づく培養の特徴であり、そしてＰＤＬに基づく培養には不在であった。ＧＦＡＰタンパク質染色は、ほぼ７日目でのＮｅｓ+糸状又は平坦な星状形の細胞においてネスチンフィラメントについての染色と密接に関連していた（図３Ａ及び３Ｂ）。いくつかの丸型のＮｅｓ+細胞は観察されたが、ＧＦＡＰはＰＤＬに基づく培養においては出現せず、ここでこの形態を有する細胞は非常に希であった。ＥＣＭ上では、生存間葉細胞の存在はＧＦＰ発現を非常に促進した一方で、ＭＳＣ−ＣＭの存在はあまり効果的ではなく（図３Ａ及び表１）、このことは、星状細胞分化を促進する因子は恐らく短命であったことを示唆する。同様の結果（肝臓ＭＳＣによってよりもＭＳＣ−ＣＭによるＧＦＡＰのより弱い誘導）が、低密度でプレートされたＭＳＣが、ＥＧＦ及びｂＦＧＦの存在下で成人海馬ニューロスフェア−由来の神経幹細胞と共に共培養される別のシステムで報告されている[２６]。このシステムによれば、細胞がポリ−オルニチン／ラミニン又はポリ−リシン／ラミニン−支持体上に播種され；しかしながら、それらの支持体はまた、短時間、１０％血清に暴露され、ＭＳＣ接着を可能にされ、これがコーティングへの血清フィブロネクチンの添加を可能にする。星状細胞を培養するための最も一般的なプロトコールは、培地の１０％ＦＢＳを含み、これがインビトロでの星状細胞発生のための複雑な「ＥＣＭコーティング」の必要性を隠すことができる。本明細書に記載される無血清システムは、この可能性を示唆している。
【０１５５】
ＰＤＬ上でのＧＦＡＰ+細胞増殖の欠如のために、可溶性の短命の星状細胞−誘導因子がそれらのシグナル伝達のためにＥＣＭを必要としたか、又は未熟な場合、丸型のＮｅｓ+細胞が誘導因子のための受容体を単純に発現しなかったかどうかは、明確ではない。実際、間葉細胞由来の因子ＴＧＦβ、ＨＧＦ及びＢＭＰは星状細胞発生の促進に関与し[２６、４３〜４５]；すべてのそれらの因子は、それらの不活性形でＥＣＭ−結合し、そしてＥＣＭから放たれる場合、短い寿命を有している。アストログリア分化のための間葉細胞由来の可溶性及び不溶性因子の重要性の別の実例は、非接着性培養の観察に由来する（図７）。すべての他の試験された分化マーカーの中で、ＧＦＡＰ遺伝子発現は、ＥＦＧ及びＦＧＦ２の存在下で形成されるニューロスフェアに比較して、ＭＳＣの存在下で形成されるニューロスフェアにおける最も劇的な上昇を示した。
【０１５６】
ＥＣＭ上で、ＧＦＡＰを発現しなかった星状細胞様Ｎｅｓ+細胞を観察した（図３Ｃ）。それらの形態は、それらがラットにおいてＧＦＡＰ−陰性である、成熟神経幹細胞をゆっくり分割する放射状グリアを表すことを暗示した[４６〜４８]。この独自性はまた、表現型解析により確かめられ得、そして確かめられたなら、本明細書に記載されるアッセイは、ＭＳＣに応答してそれらの成熟幹細胞の挙動を観察するために使用され得る。
【０１５７】
オリゴデンドロサイト分化を、初期オリゴデンドロサイトマーカー、すなわちミエリン−プロセッシング酵素ＣＮＰａｓｅを用いて観察し、前記酵素の発現は典型的には、Ｏ４発現に続き、そしてミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の発現に先行する[４９]。本明細書に記載される実験においては、ＣＮＰａｓｅタンパク質の出現は、そのｍＲＮＡの出現の後、比較的遅く検出されるが、しかしＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞の存在により促進された（図４）。定量化可能な発現レベルのＣＮＰａｓｅ ｍＲＮＡがかなり早い時期に検出され、そして直接的に、ＭＳＣ用量依存的であった（図５）。しかしながら、用量−依存曲線は、二相になり（図６Ａ）、そして最終的に逆転した。ラットＣＮＰａｓｅ発現はすべての培養物において時間と共に上昇し続けたが、後の時点で、高い用量よりもむしろ低い用量のＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞が全体的に高いレベルのＣＮＰａｓｅ ｍＲＮＡを誘導したように見えた。タンパク質染色がこの発見を確認し、そして少数のＳＢ６２３細胞が、間葉幹細胞よりも１０倍、より強いＣＮＰａｓｅ染色を誘導した一方で、両用量は、分割するＣＮＰａｓｅ−陽性細胞の数を増大させた（図６Ｂ）。
【０１５８】
それらの結果は、オリゴデンドロサイト分化の細胞密度依存性阻害の存在を示すが；しかしながら、間葉細胞が直接的に又は間接的に応答できるかどうかは不明である。オリゴデンドロサイト前駆体の拡張及び分化は、細胞密度により調節され[５０、５１]、そしてその調節機構は未知であるが、広範囲の拡散性因子よりもむしろ局所的な細胞間相互作用が関与することが報告されており；そしてその効果は細胞種特異的であり、すなわちそれはオリゴデンドロサイト系統により特異的に介在されたことが報告されている[５０]。本明細書に記載されるアッセイの結果は、より高い用量の間葉細胞が初期のオリゴデンドロサイト前駆体の増殖を高めることにより、間接的にオリゴデンドロサイト分化を阻害する可能性と一致している。ＥＣＭ上で、ＭＳＣ−ＣＭは、生存細胞よりも３倍以上高いＣＮＰａｓｅ発現を誘導し（表２）、そしてはるかに低いＧＦＡＰ発現がそれらの条件下で検出された。それらの観察は、オリゴデンドロサイトと比較して、星状細胞についての増殖速度と分化速度との間の、及び増殖バランスと分化バランスとの間の相互作用を示唆する。本明細書に開示されるデータはまた、ＥＣＭ自体がオリゴデンドロサイト増殖及び分化の促進において役割を演じることができる概念を支持する[５２]。実際、ＰＤＬ上で、さらにＭＳＣ又はＭＳＣ−ＣＭの存在下で、ＣＮＰａｓｅ発現レベルは低く、そしてタンパク質は、２週間にわたって検出されない一方で、ＥＣＭ上で、タンパク質は、他の添加剤の不在下でさえ検出された。
【０１５９】
本明細書に開示される方法及び組成物は、混合された異種間共培養物中の試験物質の神経新生活性の定量分析を可能にする。このシステムにおいては、間葉細胞由来のＥＣＭが接着性共培養のための支持体として使用され；神経細胞が外部増殖因子なしで、開始から最後まで、同じマイクロ環境下で培養され；一次神経細胞及び試験物質（例えば、ＭＳＣ調製物）が、低細胞プレーティング密度で直接的に共培養される。このシステムは、分泌された、分散性細胞関連及びマトリックス関連因子の分析を可能にする。分析は、マイクロプレート形式下で、全溶解物からの神経マーカーについてのｑＲＴ−ＰＣＲに基づく読み出しを用いて、実施され得る。
【０１６０】
間葉細胞由来のＥＣＭを、ヒトＭＳＣ由来のＥＣＭ、及びＳＢ６２３細胞由来のＥＣＭが、比較的低い細胞プレーティング密度で及び増殖因子の不在下で、ラット胚性脂質細胞の増殖及びニューロン及びグリア系統への続く分化を、高い程度、可能にする以前の観察[２８]に基づいて、神経細胞共培養のための支持体として選択した。ＥＣＭコーティングがネスチン陽性細胞増殖のための好ましい環境を創造したことが本明細書に開示されている。ＥＣＭの一体型ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、ＥＣＭのヘパリナーゼ１前処理が、対照−処理されたウェルと比較して、培養でのネスチンレベルを減じたので、重要であった。ＨＳＰＧの役割は、ＦＧＦ２シグナル伝達の関与を示唆した。実際、ＦＧＦ２をブロックする抗体は、対照抗体ではないが、神経培養において基礎レベル以下にネスチン発現を低めた。これは、ＦＧＦ２がＥＣＭに基づく培養において重要な役割を演じることを示唆する。ＦＧＦ２（ラット又はヒト起源の、又は両者の）は、神経幹／初期前駆体細胞の生存性及び遅い増殖を支持し、そして接着性培養の続く分化を可能にする生理学的刺激を提供することができる。最近の報告は、血管外基底層（画分（fractones））の形態でインビボ神経幹細胞ニッチの一体型部分として間葉細胞−由来のＥＣＭを特定し、そしてそのＨＳＰＧがＦＧＦ２の蓄積を示唆した[３１，３２]。この観察は、幹細胞ニッチをモデル化するために培養する神経細胞のためへの間葉ＥＣＭ支持体の使用を正当化する。本明細書に開示されるほとんどの結果は、ＳＢ６２３細胞由来のＥＣＭを用いて得られたが、ＭＳＣ−ＥＣＭに基づくシステムもまた、長い培養時間であるが、類似する結果をもたらす。
【０１６１】
皮質細胞集団が増殖因子又は他の試験物質の不在下でＥＣＭ上で増殖される場合、分化したグリア細胞が２〜３週で検出される[２８]。ＭＳＣの存在下で、神経細胞集団は、ＭＳＣ用量依存態様で、有意により急速に増殖し、そして分化した（実施例を参照のこと）。本明細書に記載される種特異的ｑＲＴ−ＰＣＲ読み取り法は、５０００のラット神経細胞当たり５０程のヒトＭＳＣの存在下でラット神経マーカーの誘導を検出できる。神経マーカー発現のレベルは、共培養におけるいくつかの工程の累積結果を反映した。例えば、全ネスチン発現におけるＭＳＣ駆動の上昇（図２）は、細胞性細胞拡張の増大のために、細胞当たりの発現の増加、Ｎｅｓ+幹細胞（Ｎｅｓ+コロニー及び分裂するＮｅｓ+細胞）の数の上昇、及びＮｅｓ+ＭＡＰ２+未熟前駆体の数の上昇を反映した（実施例１）。１日目での共培養において顕著なＭＡＰ２又はＤＣＸ発現のＭＳＣ駆動の上昇（図１）は、恐らく、ＭＳＣ増強された神経突起形成の結果である（実施例１及び[１５、２２、３３、３４]）。ニューロンマーカーの第二の上昇が、ＭＡＰ２及びネスチンタンパク質の両者を共発現する細胞の大規模な出現に先行して、後の時点（６〜７日目で）で観察された。それらの結果は、ニューロスフェア起源の神経前駆体の増殖、及びニューロン分化に対するＭＳＣの刺激効果を示す[２３〜２５]、これまでの報告と一致する。
【０１６２】
ＭＳＣは、インビボで神経前駆体及び神経分化の維持に関与することが示されている多くの増殖因子を分泌することが知られており[３５に概説される]、そしてＢＭＰ４、ＦＧＦ２、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ−ＡＡを包含するそれらのいくつかの分泌が、本明細書において使用されるいくつかのＭＳＣにおいて確認されている（３０、及び共同所有の米国特許出願公開番号第２０１０／０２６６５５４号）。ブロッキング実験は、ＭＳＣ−生成されたＦＧＦ２は共培養におけるＭＳＣ駆動のネスチン誘導を担当できる主要因子であったことを示した（実施例１３）。ネスチン誘導活性はまた、ＭＳＣ−ＣＭにより効果的に移され得；そしてその約８５−９０％がＦＧＦ２の免疫沈澱によりＭＳＣ−ＣＭから除かれ得た。神経幹細胞の維持におけるＦＧＦ２の決定的役割は良く知られているが（３６，３７に概説される）；しかし、本明細書に記載される結果は、ＭＳＣ駆動のネスチン誘導へのＭＳＣ駆動のＦＧＦ２の寄与が他の可能性ある寄与物を圧倒したことを示している。
【０１６３】
無血清条件下での星状細胞発生の誘導（ＧＦＡＰ発現として測定される）は、Ｅ１８皮質細胞のＥＣＭに基づく培養の顕著な特徴である。ＧＦＡＰタンパク質染色は、ほぼ７日目のネスチンフィラメントについての染色に密接に関連する（実施例２）。さらに、Ｎｅｓ+細胞拡張を付随するネスチンフィラメントの形成は、ＧＦＡＰ誘導がＮｅｓｔ+細胞拡張を支持しなかった他の支持体上で観察されなかったので、星状細胞分化のための前提条件であると思われた（３８）。ＭＳＣはＧＦＡＰ発現を非常に促進した。ノギン、すなわちＢＭＰ活性の負のレギュレーターは、共培養においてＧＦＡＰ誘導の約９０％を阻害したので、ＢＭＰは、この効果の主要メディエーターであることが本明細書において見出された。ＢＭＰ４はＭＳＣにおいて多量、発現された（３９、及び表４）。ヒトＢＭＰ４を阻止する抗体は、ＧＦＡＰ誘導の約６０％排除し、このことは、ヒトＢＭＰ４が主要な星状細胞発生ＢＭＰであったことを示唆する。ＢＭＰ４は、マウスニューロスフェアとの共培養における特別に誘導されたラットＭＳＣの星状細胞原性効果の介在に関与した（４０）。実施例１４は、ＭＳＣ−ＣＭが、これまでの報告（２５）と一致して、ＭＳＣよりも低い星状細胞原性であったことを示す。ＭＳＣ−ＣＭの星状細胞原性残留活性は、ＢＭＰ４の免疫枯渇により除去されず；これは、ＢＭＰ４が星状細胞原性残留活性を担当できず、又はそれが不活性形で存在したことを意味する。しかしながら、対照ｓｉＲＮＡによってではなく、ＢＭＰ４−ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされたＭＳＣは、共培養にプレートされる場合、星状細胞原性活性が減少した一方で、ＦＧＦ２発現はトランスフェクションにより変更されなかったことを示す（実施例１４）。まとめると、それらの結果は、ＭＳＣの星状細胞原性活性がＢＭＰ（特に、ヒトＢＭＰ４）により一部、介在されており、そして活性ＢＭＰ４がＥＣＭに関連するか又は接着されており、そして培地中に分泌されなかったことを示唆する。それらの結果は、共培養におけるブロッキングＴＧＦβ１は星状細胞発生の阻害をもたらさなかったが、他のＭＳＣ−来の因子、例えばＴＧＦβが関与した（２５、４２）可能性を排除しない。
【０１６４】
オリゴデンドロサイト分化を、初期オリゴデンドロサイトマーカー、すなわちミエリン−プロセッシング酵素ＣＮＰａｓｅを用いてモニターし、この酵素の発現は典型的には、Ｏ４発現に続き、ミエリン塩基タンパク質の発現に先行し、そして成熟工程を通して上昇する（４３）。以前の報告（２４、４４、４５）と一致して、本明細書に記載される共培養におけるオリゴデンドロサイト発生は明確にＭＳＣ依存性であり；しかしながら、ＭＳＣ用量応答のタイミングは、星状細胞発生のタイミングとは異なった。共培養の５日目、ＭＳＣ用量とＣＮＰａｓｅ発現のレベルとの間に直接的な関係が存在し；一方、７日目、上昇する用量のＭＳＣによるＣＮＰａｓｅ活性化はプラトーに達し、これを越えるＭＳＣ用量のさらなる上昇がより低い活性化レベルをもたらした（図５）。オリゴデンドロサイト前駆体の拡張及び分化は、細胞密度により調節されることが知られている（４６）。正確な細胞密度調節機構は未知であるが、オリゴデンドロサイト系統の細胞間の局所的な細胞間相互作用が関与していることが報告されている（４７）。ＣＮＰａｓｅ発現の同じ二相性用量応答が、ＭＳＣからの高い用量のならし培地で観察され、このことは、高ＭＳＣ用量での活性化レベルの逆転が高濃度の間葉細胞の存在にはよらないことを示唆する。逆に、高用量のＭＳＣは、オリゴデンドロサイト前駆体の増殖の誘導において非常に効果的であり；前駆体はより急速に高密度に達し、そしてそれら自身の分化（ＣＮＰａｓｅのさらなる蓄積）を、より早く抑制した。
【０１６５】
一次神経細胞集団に対する試験物質の効果の定量的多因子分析を可能にするインビトロシステムが本明細書に開示される。このシステムは、複雑さ、及び一次細胞集団の本質的相互作用のいくつかを保持する。このシステムは、可溶性細胞関連及び／又はマトリックス−結合神経新生因子を同定し、そして定量化するために使用され得、そしてそれぞれ、ニューロン及び星状細胞成長における可溶性ＦＧＦ２及び細胞関連又はマトリックス−結合ＢＭＰ４の重要性を示すために使用されている。最終的に、該システムは、種々のロットのＭＳＣ又はそれらの誘導体（例えば、ＳＢ６２３細胞）の効力を比較するために、及びＭＳＣに対する神経集団の効果を研究するために使用され得る。
【０１６６】
本明細書において提供されるデータは、ＳＢ６２３細胞がそれらの親ＭＳＣよりも、より効果的に初期神経前駆体の増殖及び分化を誘導できることを示唆する。
【０１６７】
要約すると、本発明者らは、神経細胞増殖及び分化の種々の段階での物質（例えば、ＭＳＣ、ＳＢ６２３細胞及びそれらの生成物）の効果のイメージング及び高処理量定量化を可能にするインビトロシステムを記載してきた。このシステムは、多くの分化プロセス、例えばＭＳＣ／神経細胞相互作用の研究を促進し、そして神経再生細胞に基づく治療のための効能アッセイのための基礎として役立つであろう。
【０１６８】
さらに、ＦＧＦ２の神経原性効果、及びＢＭＰ４の星状細胞原性効果が実証されてきた。従って、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４は、中枢又は末梢神経系の疾病、障害又は病状の治療に使用のために、神経前駆体細胞、又は共同所有の米国特許第７，６８２，８２５号に記載される何れかの神経細胞の代わりに使用され得る。そのために、米国特許第７，６８２，８２５号の開示は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４は、中枢神経病変（例えば、虚血性脳卒中、出血性脳卒中）の治療に使用のために、ニューロン前駆体細胞、ＭＡＳＣ由来のニューロン細胞、又は共同所有の米国特許第８，０９２，７９２号に記載される何れかの移植片形成ユニットの代わりに使用され得る。このために、米国特許第８，０９２，７４２号の開示は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月22日(2019.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経発生、グリア発生、神経前駆体細胞の増殖、及び神経前駆体細胞の分化に対する物質の効果を測定するについての定量的アッセイにおける使用のための培養システムであって、
前記培養システムは、
（ａ）固体支持体及びその上に接着される細胞外マトリックス、ここで、前記細胞外マトリックスは以下の(i)又は(ii)に接着される：
（i）間葉幹細胞（ＭＳＣ）、又は
（ii）核酸によりトランスフェクトされているＭＳＣであって、ここで、前記核酸がNotch細胞内ドメインをコードするが、しかし完全長Notchタンパク質はコードしないＭＳＣ；
（ｂ）胚性皮質細胞；及び
（ｃ）試験物質；
を含む、前記培養システム。
【請求項２】
前記ＭＳＣがヒトから得られる、請求項１に記載の培養システム。
【請求項３】
前記固体支持体が、プラスチック、ニトロセルロース及びガラスから成る群から選択される、請求項１又は２に記載の培養システム。
【請求項４】
前記胚性皮質細胞がマウス又はラットから得られる、請求項１〜３の何れか一項に記載の培養システム。
【請求項５】
前記試験物質が化合物又はポリペプチド、細胞、細胞培養物、及び細胞培養物からのならし培地から成る群から選択される、請求項１〜４の何れか一項に記載の培養システム。
【請求項６】
前記試験物質が試験細胞であって、該試験細胞が、
（ａ）間葉幹細胞、及び
（ｂ）Notch細胞内ドメインをコードする核酸によりトランスフェクトされている間葉幹細胞の子孫、
から成る群から選択される、請求項５に記載の培養システム。
【請求項７】
ニューロンの形成の測定に使用するための、請求項１〜６の何れか一項に記載の培養システム。
【請求項８】
前記ニューロンの形成が、神経増生により、又は微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、β−チューブリンIII （ＴｕＪ１）、シナプトフィジン及びニューロン特異的エノラーゼから成る群から選択されるマーカーの発現により測定される、請求項７に記載の培養システム。
【請求項９】
星状細胞の形成の測定に使用するための、請求項１〜６の何れか一項に記載の培養システム。
【請求項１０】
前記星状細胞の形成がグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グラスト（Glast）又はグルタミンシンセターゼの発現により測定される、請求項９に記載の培養システム。
【請求項１１】
オリゴデンドロサイトの形成の測定に使用するための、請求項１〜６の何れか一項に記載の培養システム。
【請求項１２】
前記オリゴデンドロサイトの形成が、２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰase）、Ｏ１抗原、Ｏ４抗原、ミエリン塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト転写因子１、オリゴデンドロサイト転写因子２、オリゴデンドロサイト転写因子３、ＮＧ２及びミエリン関連糖タンパク質から成る群から選択されるマーカーの発現により測定される、請求項１１に記載の培養システム。
【請求項１３】
神経前駆体細胞の増殖の測定に使用するための、請求項１〜６の何れか一項に記載の培養システム。
【請求項１４】
前記神経前駆体細胞の増殖がネスチン、グラスト（Glast）又はＳＯＸ２の発現により測定される、請求項１３に記載の培養システム。
【請求項１５】
神経前駆体細胞の分化の測定に使用するための、請求項１〜６の何れか一項に記載の培養システム。
【請求項１６】
前記神経前駆体細胞の分化が、神経増生により、又は微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、β−チューブリンIII （ＴｕＪ１）、シナプトフィジン、ニューロン特異的エノラーゼ、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＡＳＴグルタミン酸トランスポーター、２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰase）、Ｏ１抗原、Ｏ４抗原、ミエリン塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト転写因子１、オリゴデンドロサイト転写因子２、オリゴデンドロサイト転写因子３、ＮＧ２及びミエリン関連糖タンパク質から成る群から選択されるマーカーの発現により明らかにされる、請求項１５に記載の培養システム。