(57)【要約】【課題】サルモネラ属菌を含む被検微生物試料をＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析したときの高質量領域の感度を高める。【解決手段】本発明は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置を用いて微生物を分析する方法であって、シプロフロキサシンを含む培地で生育したサルモネラ属菌と、マトリックス物質を混合してマトリックス・微生物混合溶液を作製し、前記マトリックス・微生物混合溶液を乾燥させてマトリックス・微生物混合結晶を形成し、前記マトリックス・微生物混合結晶をマトリックス支援レーザ脱離イオン化の際に使用することを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置を用いて微生物を分析する方法であって、
シプロフロキサシンを含む培地で生育したサルモネラ属菌と、マトリックス物質を混合してマトリックス・微生物混合溶液を作製し、
前記マトリックス・微生物混合溶液を乾燥させてマトリックス・微生物混合結晶を形成し、
前記マトリックス・微生物混合結晶をマトリックス支援レーザ脱離イオン化の際に使用することを特徴とする微生物分析方法。
【請求項２】
前記サルモネラ属菌が、１ng/mL〜１０ng/mLの前記シプロフロキサシンを含む培地で生育したものであることを特徴とする請求項１に記載の微生物分析方法。
【請求項３】
前記マトリックス・微生物混合溶液が、前記シプロフロキサシンを含む培地で生育したサルモネラ属菌と、アルキルホスホン酸及び界面活性剤の少なくとも一方である添加剤と前記マトリックス物質とを混合したマトリックス・添加剤混合溶液を混合して、作製されることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物分析方法。
【請求項４】
前記アルキルホスホン酸がメチレンジホスホン酸である、請求項３に記載の微生物分析方法。
【請求項５】
前記界面活性剤がデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、請求項３又は４に記載の微生物分析方法。
【請求項６】
前記マトリックス物質がシナピン酸である、請求項１〜５のいずれかに記載の微生物分析方法。
【請求項７】
前記マトリックス・添加剤混合溶液が、５０％のアセトニトリルと０．６％のトリフルオロ酢酸を含む溶液に、マトリックス物質であるシナピン酸を２５mg/mL、アルキルホスホン酸であるメチレンジホスホン酸を１％、界面活性剤であるデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドを１mM、含むように混合したものである、請求項３に記載の微生物分析方法。
【請求項８】
前記マトリックス・微生物混合溶液が、前記シプロフロキサシンを含む培地で生育したサルモネラ属菌のコロニーを、前記マトリックス・添加剤混合溶液に懸濁したマトリックス・微生物懸濁液であることを特徴とする請求項７に記載の微生物分析方法。
【請求項９】
サンプルプレート上に、マトリックス物質であるシナピン酸を２５mg/mL含むエタノール溶液、あるいはシナピン酸のエタノ−ル飽和溶液を０．５μL滴下し、これを乾燥させた後、その上に、前記マトリックス・微生物懸濁液を１．２μL滴下して乾燥させて前記マトリックス・微生物混合結晶を形成する、請求項８に記載の微生物分析方法。
【請求項１０】
被検微生物であるサルモネラ属菌について得られたマススペクトルのうち質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域を含む質量域のマススペクトルパターンを、データベースに格納されているマススペクトルパターンと比較した結果に基づいて前記サルモネラ属菌の同定を行う、請求項１〜９のいずれかに記載の微生物分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を用いた微生物の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析におけるイオン化法の１つであるマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）法は、レーザ光を吸収しにくい物質やタンパク質などレーザ光で損傷を受けやすい物質を分析するために、レーザ光で吸収し易く且つイオン化しやすいマトリックス物質を分析対象物質と混合し、これにレーザ光を照射することで分析対象物質をイオン化する手法である。一般にマトリックス物質は溶液として分析対象物質と混合され、このマトリックス溶液が分析対象物質を取り込む。そして、乾燥させることによって溶液中の溶媒が気化し、分析対象物質を含んだ結晶が形成される。これにレーザ光を照射すると、マトリックス物質がレーザ光のエネルギーを吸収して急速に加熱され、気化する。その際、分析対象物質もマトリックス物質とともに気化し、その過程で分析対象物質がイオン化される。
【０００３】
こうしたＭＡＬＤＩ法を利用した質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）は、タンパク質などの高分子化合物をあまり解離させることなく分析することが可能であり、しかも微量分析にも好適であることから、生命科学の分野で広く利用されている。生命科学分野におけるＭＡＬＤＩ−ＭＳの利用の一つに、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた微生物の同定がある。これは、被検微生物を用いて得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物の同定を行う方法であり、短時間で分析結果を得ることができることから、簡便且つ迅速な微生物の同定が可能である。
【０００４】
サルモネラはグラム陰性通性嫌気桿菌の腸内細菌科に属し、食中毒の代表的な原因細菌の一つとして知られている。サルモネラ属にはSalmonella （以下「S.」と略すこともある）enterica、S. bongoriとS. subterraneaの３つの菌種が属し、さらにS. entericaは６つの亜種に分類される。食中毒を引き起こす病原性サルモネラの多くは S. entericaに属し、その亜種は多数の血清型に分類される。サルモネラ属菌の菌種や亜種、血清型の判別は、食中毒の感染経路の解明及び感染防止に重要であることから、近年、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いたサルモネラ属菌の識別が試みられている。
【０００５】
ところで、微生物を含む試料をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析すると、質量電荷比m/z 15000以上の高質量領域（又は高質量電荷比領域）の感度が低く、マススペクトルの信頼性、正確性が低くなることが知られている。サルモネラ属菌の識別に有効なマーカータンパク質の多くは質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域にあるため、現在のＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた微生物の分析技術では、サルモネラ属菌の同定を正確に行うことができない。
【０００６】
これに対して、従来より様々なアプローチでＭＡＬＤＩ−ＭＳの感度を改善するための研究・開発がなされており、その一つに、マトリックス溶液と分析対象物質を混合してマトリックス・対象物混合溶液を調製する際に、さらに別の物質をマトリックス添加剤として添加する方法がある。
【０００７】
例えば、非特許文献１、２には、マトリックス添加剤として界面活性剤を用いることにより、微生物を含む試料をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析したときの感度を改善できることが記載されている。これらの文献に記載されている方法では、被検微生物を含む溶液（被検微生物溶液）をサンプルプレートに塗布し、その上に界面活性剤を滴下した後、さらにその上にマトリックス溶液を滴下し、試料を調製する。界面活性剤は、被検微生物溶液のマトリックス溶液への溶解性を高めるために用いられている。
【０００８】
また、例えば特許文献１及び非特許文献３には、マトリックス物質である2, 5-ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）に、マトリックス添加剤としてメチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を添加することにより、分析対象であるリン酸化ペプチドを高い感度で検出できることが記載されている。上記文献に記載されている方法では、サンプルプレートにリン酸化ペプチドを含む溶液、マトリックス添加剤溶液、及びマトリックス溶液を順に滴下した後、これらを乾燥させることで試料を調製した後、この試料をＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析する。
【０００９】
さらに、非特許文献４には、液体クロマトグラフ（ＬＣ）とＭＡＬＤＩ−ＭＳとを組み合わせたＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いたペプチド分析において、マトリックス添加剤であるＭＤＰＮＡを、マトリックス物質であるＤＨＢとともに使用することが記載されている。同文献によると、ＭＤＰＮＡを用いることにより、脱塩効果により、ペプチドピークのシグナル抑制効果が軽減されるため、ペプチド由来のピークを高感度に検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開2009-121857号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 2005年, Vol.16, pp.1422-1426
【非特許文献２】Rapid Commun. Mass Spectrom., 1999年, Vol.13, pp.1067-1071
【非特許文献３】Rapid Commun. Mass Spectrom., 2008年, Vol.22, pp.1109-1116
【非特許文献４】Mass Spectrometry, 2014年, A0031
【非特許文献５】Journal of Applied Microbiology, 2012, 113, 192-199
【非特許文献６】Micobiology, 2013, 159, 2049-2057
【非特許文献７】Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2006, 50, 949-954
【非特許文献８】J. Bacteriol. March 2005 vol. 187 no. 5 1763-1772
【非特許文献９】Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80, 2928-2940
【非特許文献１０】J. Biomed. Biotechnol., 2010, 123460
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述した従来の方法は、いずれも、分析対象物質の検出感度の改善がみられるものの、やはり、質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域の感度が低く、サルモネラ属菌の菌種や亜種、血清型を正確に識別する技術として不十分であった。
【００１３】
本発明が解決しようとする課題は、サルモネラ属菌を含む被検微生物試料をＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析したときの高質量領域の感度を高めることであり、特に、従来法以上の感度向上することが、目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために成された本発明は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置を用いて微生物を分析する方法であって、
シプロフロキサシンを含む培地で生育したサルモネラ属菌と、マトリックス物質を混合してマトリックス・微生物混合溶液を作製し、
前記マトリックス・微生物混合溶液を乾燥させてマトリックス・微生物混合結晶を形成し、
前記マトリックス・微生物混合結晶をマトリックス支援レーザ脱離イオン化の際に使用することを特徴とする。
【００１５】
シプロフロキサシン（ＣＰ）は抗生物質として知られ、グラム陰性菌及びグラム陽性菌のいずれのバクテリアにも活性を示す。ＣＰは、ＤＮＡの複製を阻害することでバクテリアの細胞分裂を抑制し、それにより抗菌作用を示す。このため、ＣＰは、細胞培養においてマイコプラズマの感染対応などのために用いられている。一方、ＣＰが、細菌のＳｏｄＡ（Superoxide dismutase）の遺伝子発現を誘導するとの報告がある。例えば非特許文献５には、ＣＰが、大腸菌のＳｏｄＡの遺伝子発現を誘導することが示されている。また、非特許文献６には、ＣＰに対するサルモネラ属菌のＳｏｄＡの反応に、薬剤トランスポーターに関与する遺伝子発現制御に重要なＢａｅＳＲ制御機構（非特許文献８）が関与していることが示されている。さらに、非特許文献７では、ＣＰと反応させると、細菌（バクテリア）の細胞中の活性酸素が増加する機構が、大腸菌を用いて解明されている。さらにまた、非特許文献９では、ＣＰを添加した寒天培地で志賀毒素産生性大腸菌（ＳＴＥＣ）菌株を培養することにより志賀毒素２（Stx2）が過剰に発現されて、ＳＴＥＣ菌株が増殖することが示されている。
【００１６】
上述した非特許文献５〜７、９の知見を参考に本発明者が鋭意研究を重ねた結果、本発明に至ったものであり、ＣＰを含む培地で生育させたサルモネラ属菌を被検微生物として用いることにより、サルモネラ属菌のマーカータンパク質の一つであるＳｏｄＡ等を多く含むマトリックス・微生物混合結晶を得ることができる。そして、そのようなマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析することにより、サルモネラ属菌のマーカータンパク質由来のピークが含まれる、高質量領域の感度を高めることができる。
【００１７】
なお、上述した非特許文献９では、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果を用いて、ＣＰ添加培地を用いてＳＴＥＣ菌株を培養することの評価が行われているが、同文献に記載のＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた分析方法と本発明とでは、試料の調製方法が異なる。すなわち、非特許文献９では、サンプルプレ−ト上に試料懸濁液を0.5μＬ滴下し、これを乾燥させた後、マトリックス溶液を0.5μL滴下し、さらに乾燥させた後、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定している。前記マトリックス溶液は、３３％のアセトニトリル（ACN）及び０．２％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水溶液（非特許文献１０）に、マトリックス物質であるシナピン酸（ＳＡ）を１０mg/mLの濃度となるように溶解したものが用いられている。また、寒天培地に含まれるＣＰの好適な濃度範囲は１０〜６０ng/mLであることが示されている。
しかしながら、非特許文献９では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦを用いたＭＳ／ＭＳ測定が行われており、m/z 7821、m/z 5291等、質量電荷比m/z 10000以下の領域にあるペプチドマーカーを用いて志賀毒素２（Stx2）を同定している。つまり、非特許文献９に記載の方法と本発明とでは、分析対象となる微生物の種類（菌種）やＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた分析の対象となる質量電荷比の領域が異なることから、当然に試料の調製方法も異なる。
【００１８】
また、ＣＰは、サルモネラのＳｏｄＡの遺伝子発現を誘導する一方で、サルモネラ属菌に対して抗菌作用を示すことから、培地に添加するＣＰの量は、ＳｏｄＡの遺伝子発現の誘導作用と抗菌作用を比較考量して決定することが重要である。
本発明者は、培地に添加するＣＰの量を１〜1000ng/mLの範囲で段階的に変化させて、サルモネラ属菌のテスト用６菌株（Typhimurium, NBRC 13245、Enteritidis, NBRC 3313、Thompson, ATCC BAA-1738、Choleraesuis, NBRC 105684、Infantis, jfrlSe 1402-4、Orion, jfrlSe 1402-15）の培養実験を行ったところ、ＣＰ濃度が100ng/mL以上では生育阻害がみられた。また、サルモネラ属菌のテスト用６菌株のうち、一部の血清型（Choleraesuis、Thompson、等）では培地中のＣＰ濃度が１０ng/mLでも生育阻害が起こることが確認された。
【００１９】
従って、本発明においては、前記サルモネラ属菌が、１ng/mL〜１０ng/mLのＣＰを含む培地で生育したものであることが好ましい。
上記濃度のＣＰを含む培地であれば、少なくともサルモネラ属菌の代表的な６菌株を問題なく生育させることができる。
【００２０】
この場合、前記シプロフロキサシンを含む培地で生育したサルモネラ属菌と、アルキルホスホン酸及び界面活性剤の少なくとも一方である添加剤と前記マトリックス物質とを混合したマトリックス・添加剤混合溶液を混合して、マトリックス・微生物混合溶液を作製すると、さらに、ＭＡＬＤＩ−ＭＳの感度が向上する。
【００２１】
すなわち、アルキルホスホン酸は、タンパク質が含まれる試料をＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析する際に、アルカリ金属付加イオン（[Ｍ＋Ｎａ]＋、[Ｍ＋Ｋ]＋等）の生成を抑制することができる。従って、サルモネラ属菌のマーカータンパク質由来のピーク（マーカーピーク）のＳ／Ｎ比が向上することが期待できる。アルキルホスホン酸としては、ホスホン酸基を１個含む、ホスホン酸（Phosphonic acid）、メチルホスホン酸（Methylphosphonic acid）、フェニールホスホン酸（Phenylphosphonic acid）、1-ナフチルメチルホスホン酸（1-Naphthylmethylphosphonic acid）などが挙げられ、ホスホン酸基を２個以上含む化合物として、メチレンジホスホン酸（Methylenediphosphonic acid）、エチレンジホスホン酸（Ethylenediphosphonic acid）、エタン-1-ヒドロキシ-1,1-ジホスホン酸（Ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid）、ニトリロトリホスホン酸（Nitrilotriphosphonic acid）、エチレンジアミノテトラホスホン酸（Ethylenediaminetetraphosphonic acid）などが挙げられるが、本発明の好ましい形態としては、アルキルホスホン酸としてメチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を用いることができる。
【００２２】
また、界面活性剤は、主に微生物の構成成分の溶解性を向上するために用いられる。従って、マトリックス・微生物混合結晶に含まれるマーカータンパク質の量を増やすことができるため、マーカーピークの検出強度が向上することが期待できる。界面活性剤としては、膜タンパク質など、細胞中のタンパク質の抽出に用いられる界面活性剤を挙げることができ、特にタンパク質を変性させずに抽出することができる界面活性剤を用いることが好ましい。このような界面活性剤としては、非イオン系界面活性剤である、デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（decyl-β-D-maltopyranoside(ＤＭＰ)）、Ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（N-decyl-β-D-maltopyranoside）、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グラクトピラノシド（N-octyl-β-D-glactopyranoside）、Ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（N-dodecyl-β-D-maltoside）、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（N-octyl-β-D-glucopyranoside）などが挙げられ、両イオン性界面活性剤である、two zwitterionic surfactants、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン−Ｎ−オキシド（N,N-dimethyldodecylamine-N-oxide）、zwittergent 3-12などが挙げられるが、本発明の好ましい形態としては、界面活性剤としてＤＭＰを用いることができる。
【００２３】
また、マトリックス・微生物混合溶液を構成するマトリックス物質は、分析対象となる微生物の種類や微生物の同定レベル（科、属、種、亜種、病原型、血清型、株等）に応じた適宜の物質を選択することができる。そのようなマトリックス物質として、シナピン酸（Sinapinic acid (ＳＡ)）、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 （α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (ＣＨＣＡ)）、フェルラ酸（ferulic acid (ＦＡ)）などが挙げられるが、本発明の好ましい形態としては、マトリックス物質としてＳＡを用いることができる。一般に、ＳＡは、ＭＡＬＤＩ分析において、タンパク質などの高質量分子の分析に有効であることが知られている。
【００２４】
さらに、前記マトリックス・添加剤混合溶液は、５０％のアセトニトリルと０．６％のトリフルオロ酢酸を含む溶液に、マトリックス物質であるシナピン酸を２５mg/mL、アルキルホスホン酸であるメチレンジホスホン酸を１％、界面活性剤であるデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドを１mM、含むように混合して作製することができる。
【００２５】
さらにまた、前記マトリックス・微生物混合溶液は、前記シプロフロキサシンを含む培地で生育したサルモネラ属菌のコロニーを前記マトリックス・添加剤混合溶液に懸濁したマトリックス・微生物懸濁液とすることができる。
【００２６】
この場合、サンプルプレート上に、マトリックス物質であるシナピン酸を２５mg/mL含むエタノール溶液、あるいはシナピン酸のエタノ−ル飽和溶液を０．５μL滴下し、これを乾燥させた後、その上に、前記マトリックス微生物懸濁液を１．２μL滴下して乾燥させて前記マトリックス・微生物混合結晶を形成することが好ましい。
【００２７】
また、本発明の微生物分析方法は、被検微生物であるサルモネラ属菌について得られたマススペクトルのうち質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域を含む質量域のマススペクトルパターンを、データベースに格納されているマススペクトルパターンと比較した結果に基づいて前記サルモネラ属菌の同定を行うことが好ましい。  
【発明の効果】
【００２８】
本発明に係る微生物分析方法によれば、サルモネラ属菌をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析するときの高質量領域における感度が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型 Orion, jfrlSe 1402-15）を用いた実施例１で得られたマーカータンパク質ＳｏｄＡ由来のピークを含む領域のマススペクトルを示す図。
【図２】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型 Infantis, jfrlSe 1402-4）を用いた実施例１で得られたマーカータンパク質Ｓ７由来のピークを含む領域のマススペクトルを示す図。
【図３】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型 Infantis, jfrlSe 1402-4）を用いた実施例１で得られたマーカータンパク質Ｌ１７由来のピークを含む領域のマススペクトルを示す図。
【図４】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型 Orion, jfrlSe 1402-15）を用いた実施例２で得られたマーカータンパク質ＳｏｄＡ由来のピークを含む領域のマススペクトルを示す図。
【図５】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型 Enteritidis, NBRC 3313）を用いた実施例２で得られたマーカータンパク質ＳｏｄＡ由来のピークを含む領域のマススペクトルを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明に係る微生物分析方法では、ＣＰを含む培地で生育したサルモネラ属菌と、マトリックス物質を混合してマトリックス・微生物混合溶液を作製し、該マトリックス・微生物混合溶液を乾燥させてマトリックス・微生物混合結晶を形成し、このマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＭＳにセットして質量分析を実行することによりマススペクトルを得る。そして、得られたマススペクトルをデータベースに格納されているマススペクトルパターンと比較することにより、サルモネラ属菌である被検微生物の種類（種、亜種、病原型、血清型、株等）を同定することができる。詳しくは後述するように、本発明に係る微生物分析方法では、得られたマススペクトルのうち、特に質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域において高い感度で微生物の分子量情報を得ることができるため、該高質量領域に存在するマーカーピークを高感度に検出することができる。
【００３１】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳとしては、ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳ）を用いることが好ましい。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳは測定可能な質量電荷比の範囲が非常に広いため、微生物の構成成分であるタンパク質のような高質量分子の分析に適したマススペクトルを取得することができる。
【００３２】
以下、本発明に係る微生物分析方法を実施例１〜１２によって説明するが、これらは単なる例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
＜１．サルモネラ属菌の培養＞
(1) エタノール中にシプロフロキサシン（ＣＰ、シグマ・アルドリッチ・ジャパン合同会社）を１０mg/mL含むエタノール溶液を作製し、このエタノール溶液を水で1000倍希釈して（希釈倍率：1/1000）、ＣＰを１０μg/mL含む溶液（ＣＰ添加溶液）を作製した。また、エタノールを水で1000倍希釈（希釈倍率：1/1000）した溶液（ＣＰ非添加溶液）を作製した。
(2) ＬＢ寒天培地１００mLに対しＣＰ添加溶液を１０μL加えて混合した培地（ＣＰ添加培地）、及びＬＢ寒天培地１００mLに対しＣＰ非添加溶液を１０μL加えて混合した培地（ＣＰ非添加培地）をそれぞれ作製し、これら培地をそれぞれ無菌的に複数のシャーレに適量ずつ撒き、サルモネラ属菌生育用の寒天培地とした。この培地のＣＰ濃度は約１ng/mLである。
(3) (2)の各シャーレに、２種類のサルモネラ属菌（血清型Orion, jfrlSe 1402-15、及び血清型Infantis, jfrlSe 1402-4）のいずれかを塗布し、それぞれ３７℃で２０時間培養した。
【００３４】
＜２．マトリックス溶液の作製＞
以下の２種類のマトリックス溶液を作製した。
(1) エタノールにマトリックス物質であるシナピン酸（ＳＡ、和光純薬工業株式会社）を２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液（飽和溶液）を作製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ−１」とする。
(2) ５０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）と０．６％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水溶液に、ＳＡを２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液を作製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ−２」とする。
【００３５】
＜３．マトリックス・微生物懸濁液の調製＞
マトリックス溶液ＳＡ−２を１０μL、チューブに入れ、そこに、シャーレで培養したサルモネラのコロニー２〜３個分を懸濁し、マトリックス・試料懸濁液を作製した。
【００３６】
＜４．ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析＞
(1) ＭＡＬＤＩ用サンプルプレートに、マトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μL滴下し、乾燥させた。
(2) 続いて、サンプルプレート上にマトリックス・試料懸濁液を１．２ μL滴下し、乾燥させた。
(3) (2)で得られたマトリックス・微生物混合結晶を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにセットして分析した。
【００３７】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳとして、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い、リニアモード（ポジティブイオンモード）で測定した。データは全てラスター分析により取得した。ラスター分析は、上述の質量分析装置が備える自動測定機能であり、サンプルプレートの各ウェル内の試料に対して、予め設定されたポイント数、ショット数でレーザ照射し、マススペクトルデータを取得する手法である。
【００３８】
＜５．結果＞
図１〜図３に実施例１で得られたマススペクトルを示す。
図１は、サルモネラ属菌の血清型Orion, jfrlSe 1402-15を含むマトリックス・微生物混合結晶について得られた、ＳｏｄＡに由来するピークを含む領域のマススペクトルを示す。図１の（Ａ）はＣＰ添加培地で培養したサルモネラ、（Ｂ）はＣＰ非添加培地で培養したサルモネラのマススペクトルである。ＳｏｄＡ由来ピーク（黒矢印が指すピーク）に注目すると、ＣＰ添加培地で培養したサルモネラのＳｏｄＡ由来ピークの強度（０．６ｍＶ）は、ＣＰ非添加培地で培養したサルモネラのＳｏｄＡ由来ピークの強度（０．２ｍＶ）よりも大きく、且つマススペクトルの背景ノイズが少なかった。また、ＣＰ添加培地で培養したサルモネラのＳｏｄＡ由来ピークのＳ／Ｎ比（＝１５）は、ＣＰ非添加培地で培養したサルモネラのＳｏｄＡ由来ピークのＳ／Ｎ比（＝４）の約３倍であった。つまり、培養培地にＣＰを添加することにより、ＳｏｄＡ由来ピークの検出感度が向上した。
【００３９】
図２は、サルモネラ属菌の血清型Infantis, jfrlSe 1402-4を含むマトリックス・微生物混合結晶について得られた、リボソームタンパク質Ｓ７に由来するピークを含む領域のマススペクトルを示す。図１（Ａ）はＣＰ添加培地で培養した場合、（Ｂ）はＣＰ非添加培地で培養した場合のマススペクトルである。リボソームタンパク質Ｓ７は、サルモネラ属菌の血清型を判別するマーカータンパク質として知られている。
Ｓ７由来ピークに注目すると、ＣＰ添加培地で培養したサルモネラのＳ７由来ピークの強度（５．２ｍＶ）はＣＰ非添加培地で培養したサルモネラのＳ７由来ピークの強度（０．８ｍＶ）よりも大きく、且つ、マススペクトルの背景ノイズが少なかった。また、ＣＰ添加培地で培養したサルモネラのＳ７由来ピークのＳ／Ｎ比（１００）は、ＣＰ非添加培地で培養したサルモネラのＳ７由来ピークのＳ／Ｎ比（１５）の約７倍であった。つまり、培養培地にＣＰを添加することにより、Ｓ７由来ピークの検出感度が向上した。
【００４０】
図３は、サルモネラ属菌の血清型Infantis, jfrlSe 1402-4を含むマトリックス・微生物混合結晶について得られた、リボソームタンパク質Ｌ１７に由来するピークを含む領域のマススペクトルを示す。図１（Ａ）はＣＰ添加培地で培養した場合、（Ｂ）はＣＰ非添加培地で培養した場合のマススペクトルである。リボソームタンパク質Ｌ１７は、サルモネラ属菌の血清型を判別するマーカータンパク質として知られている。
Ｌ１７由来ピークに注目すると、ＣＰ添加培地で培養したサルモネラのＬ1７由来ピークの強度（７．４ｍＶ）はＣＰ非添加培地で培養したサルモネラのＬ１７由来ピークの強度（０．６ｍＶ）よりも大きく、且つ、マススペクトルの背景ノイズが少なかった。また、ＣＰ添加培地で培養したサルモネラのＬ１７由来ピークのＳ／Ｎ比（１００）は、ＣＰ非添加培地で培養したサルモネラのＬ１７由来ピークのＳ／Ｎ比（１０）の約１０倍であった。つまり、培養培地にＣＰを添加することにより、Ｌ１７由来ピークの検出感度が向上した。
【００４１】
図１〜図３から分かるように、サルモネラ属菌の血清型を判別するマーカータンパク質であるＳｏｄＡ、Ｓ７、Ｌ１７由来のピーク（マーカーピーク）は、いずれも質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域に存在する。従って、サルモネラの培養培地にＣＰを添加することは、サルモネラを被検微生物とするＭＡＬＤＩ−ＭＳの質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域の感度向上に貢献することが確認された。
【実施例２】
【００４２】
＜１．サルモネラ属菌の培養＞
(1) 実施例１と同じ方法で、ＣＰ添加溶液及びＣＰ非添加溶液を作製した。
(2) 実施例１と同じ方法で、ＣＰ添加培地及びＣＰ非添加培地を作製し、これら培地をそれぞれ複数のシャーレに適量ずつ撒いた。
(3) (2)の各シャーレに、２種類のサルモネラ属菌（血清型Orion, jfrlSe 1402-15、及び血清型Enteritidis, NBRC 3313）を塗布し、３７℃で２０時間培養した。
【００４３】
＜２．マトリックス溶液の作製＞
以下の３種類のマトリックス溶液を作製した。
(1) 実施例１と同じ組成で、マトリックス溶液ＳＡ−１を作製した。
(2) 実施例１と同じ組成で、マトリックス溶液ＳＡ−２を作製した。
(3) ５０％のアセトニトリル（ACN）及び０．６％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水溶液に、ＳＡを２５mg/mL、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を１％、界面活性剤であるデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（decyl-β-D-maltopyranoside、ＤＭＰ）を１ｍＭ、それぞれ含むように溶解して、マトリックス溶液を作製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ−３」とする。  
【００４４】
＜３．マトリックス・微生物懸濁液の調製＞
マトリックス溶液ＳＡ−２、又はマトリックス溶液ＳＡ−３を１０μL、チューブに入れ、そこに、シャーレで培養したサルモネラのコロニー２〜３個分を懸濁し、マトリックス・試料懸濁液を作製した。
＜４．ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析＞
(1) ＭＡＬＤＩ用サンプルプレートに、マトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μL滴下し、乾燥させた。
(2) 続いて、サンプルプレート上にマトリックス・試料懸濁液を１．２ μL滴下し、乾燥させた。
(3) (2)で得られたマトリックス・微生物混合結晶を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにセットして分析した。
【００４５】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ及び測定モードは実施例１と同じとし、ラスター分析によりデータを採取した。
【００４６】
＜５．結果＞
図４及び図５に実施例２で得られたマススペクトルを示す。
図４は、サルモネラ属菌の血清型Orion, jfrlSe 1402-15を含むマトリックス・微生物混合結晶について得られた、ＳｏｄＡに由来するピークを含む領域のマススペクトルを示す。また、図４の（Ａ）はＣＰ添加培地で培養したサルモネラのコロニーをマトリックス溶液ＳＡ−３に懸濁したマトリックス・微生物懸濁液、（Ｂ）はＣＰ添加培地で培養したサルモネラをマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁したマトリックス・微生物懸濁液、（Ｃ）は、ＣＰ非添加培地で培養したサルモネラをマトリックス溶液ＳＡ−３に懸濁したマトリックス・微生物懸濁液、（Ｄ）はＣＰ非添加培地で培養したサルモネラをマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁したマトリックス・微生物懸濁液、それぞれを用いて作製したマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析することにより得られたマススペクトルである。
【００４７】
図４に示すように、ＣＰ非添加培地及びマトリックス溶液ＳＡ−３の組み合わせ（Ｃ）は、ＣＰ非添加培地及びマトリックス溶液ＳＡ−２の組み合わせ（Ｄ）に比べて、ＳｏｄＡ由来のピークが、Ｓ／Ｎ比で約２倍向上した。
また、ＣＰ添加培地及びマトリックス溶液ＳＡ−２の組み合わせ（Ｂ）は、ＣＰ非添加培地及びマトリックス溶液ＳＡ−２の組み合わせ（Ｄ）に比べて、ＳｏｄＡ由来のピークが、Ｓ／Ｎ比で約３倍向上した。
さらに、ＣＰ添加培地及びマトリックス溶液ＳＡ−３の組み合わせ（Ａ）は、ＣＰ非添加培地及びマトリックス溶液ＳＡ−２の組み合わせ（Ｄ）に比べて、ＳｏｄＡ由来のピークが、Ｓ／Ｎ比で約１０倍向上した。
【００４８】
図５は、サルモネラ属菌の血清型Enteritidis, NBRC 3313を含むマトリックス・微生物混合結晶について得られた、ＳｏｄＡに由来するピークを含む領域のマススペクトルを示す。また、図５の（Ａ）はＣＰ添加培地で培養したサルモネラのコロニーをマトリックス溶液ＳＡ−３に懸濁したマトリックス・微生物懸濁液、（Ｂ）はＣＰ添加培地で培養したサルモネラをマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁したマトリックス・微生物懸濁液、（Ｃ）は、ＣＰ非添加培地で培養したサルモネラをマトリックス溶液ＳＡ−３に懸濁したマトリックス・微生物懸濁液、（Ｄ）はＣＰ非添加培地で培養したサルモネラをマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁したマトリックス・微生物懸濁液、それぞれを用いて作製したマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析することにより得られたマススペクトルである。
【００４９】
図５に示すように、ＣＰ非添加培地及びマトリックス溶液ＳＡ−３の組み合わせ（Ｃ）は、ＣＰ非添加培地及びマトリックス溶液ＳＡ−２の組み合わせ（Ｄ）に比べて、ＳｏｄＡ由来のピークが、Ｓ／Ｎ比で約１．５倍向上した。
また、ＣＰ添加培地及びマトリックス溶液ＳＡ−２の組み合わせ（Ｂ）は、ＣＰ非添加培地及びマトリックス溶液ＳＡ−２の組み合わせ（Ｄ）に比べて、ＳｏｄＡ由来のピークが、Ｓ／Ｎ比で約３倍向上した。
さらに、ＣＰ添加培地及びマトリックス溶液ＳＡ−３の組み合わせ（Ａ）は、ＣＰ非添加培地及びマトリックス溶液ＳＡ−２の組み合わせ（Ｄ）に比べて、ＳｏｄＡ由来のピークが、Ｓ／Ｎ比で約６倍向上した。
【００５０】
以上の結果より、２種類のサルモネラ属菌に対し、ＣＰ添加培地で培養し、且つ、ＭＤＰＮＡ及びＤＭＰを含むマトリックス溶液を用いて調製したマトリックス・微生物懸濁液から得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析することにより、ＳｏｄＡ由来のピークを含む、質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域の感度が向上することが確認された。しかも、培養培地へのＣＰ添加と、マトリックス溶液へのＭＤＰＮＡ及びＤＭＰの添加による感度向上効果は相乗的であった。
【００５１】
なお、上記実施例１、２では、ＣＰ添加培地のＣＰ濃度を約１ng/mLに設定したが、ＣＰ濃度は１ng/mL〜１０ng/mLの範囲であれば、上記実施例１、２と同様の結果が得られる。
また、上記実施例２では、マトリックス溶液ＳＡ−３がＭＤＰＮＡ及びＤＭＰの両方を含んでいるが、ＭＤＰＮＡ及びＤＭＰのいずれか一方のみをマトリックス溶液に含めても良い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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