(57)【要約】【課題】より簡便に微生物又は酵素の分解能力を迅速に比較することが可能な基質分解活性の評価方法を提供する。【解決手段】基質分解活性の評価方法である。本発明の基質分解活性の評価方法は、（Ａ）基質を含有する培地に、微生物又は酵素を接種する接種工程と、（Ｂ）接種工程の後の培地を第１温度にて保温する第１保温工程と、（Ｃ）第１保温工程の後の培地を第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、培地のうち、未分解の基質が存在する部位を白濁化させる第２保温工程と、を備える。本発明の基質分解活性の評価方法は、第２保温工程の後に、培地の状態を観測して、微生物又は酵素の基質分解活性を評価する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質を含有する培地に、微生物又は酵素を接種する接種工程と、
前記接種工程の後の前記培地を第１温度にて保温する第１保温工程と、
前記第１保温工程の後の前記培地を前記第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、前記培地のうち、未分解の前記基質が存在する部位を白濁化させる第２保温工程と、を備え、
前記第２保温工程の後に、前記培地の状態を観測して、前記微生物又は前記酵素の基質分解活性を評価することを特徴とする、基質分解活性の評価方法。
【請求項２】
前記培地は、平板培地であり、
前記観測では、前記培地の前記微生物又は前記酵素の周辺に形成された透明部分の大きさの測定を行うことを特徴とする、請求項１に記載の基質分解活性の評価方法。
【請求項３】
前記基質を含有する前記培地のｐＨは、９．８以上１０．７以下であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の基質分解活性の評価方法。
【請求項４】
前記第１温度が、２０℃〜４５℃であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の基質分解活性の評価方法。
【請求項５】
前記第２温度が、０℃〜１５℃であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の基質分解活性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、基質分解活性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二酸化炭素排出削減を目的として、ケナフ繊維を自動車等の部品の材料として用いることが行われている。ケナフの繊維化は、繊維同士を架橋するペクチンを微生物で分解する工程を有する。従って、ペクチンの分解に関わる微生物又は酵素を探索することは有用である。
この例は、ケナフに関するものであるが、種々の有機物の分解に関わる微生物又は酵素を探索することは様々な分野において有用である。
ところで、有用な微生物又は酵素を探索するためには、微生物又は酵素の分解活性を比較することが必要となる。
分解活性を比較するために、従来は、例えば、以下の評価方法が用いられていた。
【０００３】
特許文献１では、軟寒天上に、染色液として１％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を注ぎ、分解を可視化している。詳細には、軟寒天上に微生物や酵素を添加し、所定時間経過後、１％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を注ぎ、ペクチンの分解に伴う溶解斑を検出し、これにより基質分解活性の評価を行っていた。
また、特許文献２では、２３５ｎｍの吸光度から分解物を定量している。詳細には、ペクチンが分解された結果、生成する不飽和ポリガラクツロニドの極大吸収波長である２３５ｎｍの吸光度を計測し、これにより基質分解活性の評価を行っていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−１９７５７号公報
【特許文献２】再表２０１１−０４８８５２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１のように染色液を用いると、例えば、次のような不都合があった。通常、染色液による染色は、染色液を入れた後に、洗浄液で洗浄するという一連の作業を繰り返し行うことで、色のコントラストをはっきりさせる。この際に、菌等の微生物が軟寒天から浮遊してしまう。よって、微生物が軟寒天に残りにくく、微生物を回収しにくい等の不都合があった。
また、異種微生物の複数のコロニーが形成された場合に、染色液を用いると、複数のコロニー間が染色液で橋渡しされることになる。その結果、異種微生物が混ざり合ってしまい、スクリーニングができないという問題点もあった。
また、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドは、ＰＲＴＲ制度における第二種指定化学物質であり、使用を控えることが望ましい。
一方、特許文献２の方法では、吸光光度計という特別な装置を用いる必要があり、煩雑であった。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、従来法による問題点を解決でき、より簡便に微生物又は酵素の分解活性を比較することが可能な基質分解活性の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、新規な基質分解活性の評価方法を開発した。
そして、この方法によれば、従来法による問題点を解決でき、より簡便に微生物又は酵素の分解活性を比較できるということを見いだした。この成果に基づいて、次の発明を提供する。
【０００７】
〔１〕
基質を含有する培地に、微生物又は酵素を接種する接種工程と、
前記接種工程の後の前記培地を第１温度にて保温する第１保温工程と、
前記第１保温工程の後の前記培地を前記第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、前記培地のうち、未分解の前記基質が存在する部位を白濁化させる第２保温工程と、を備え、
前記第２保温工程の後に、前記培地の状態を観測して、前記微生物又は前記酵素の基質分解活性を評価することを特徴とする、基質分解活性の評価方法。
【０００８】
〔２〕
前記培地は、平板培地であり、
前記観測では、前記培地の前記微生物又は前記酵素の周辺に形成された透明部分の大きさの測定を行うことを特徴とする、〔１〕に記載の基質分解活性の評価方法。
【０００９】
〔３〕
前記基質を含有する前記培地のｐＨは、９．８以上１０．７以下であることを特徴とする、請求項〔１〕又は〔２〕に記載の基質分解活性の評価方法。
【００１０】
〔４〕
前記第１温度が、２０℃〜４５℃であることを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の基質分解活性の評価方法。
【００１１】
〔５〕
前記第２温度が、０℃〜１５℃であることを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の基質分解活性の評価方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の基質分解活性の評価方法によれば、染色液を用いることなく、簡便に微生物又は酵素の分解活性を比較することができる。また、この基質分解活性の評価方法を用いれば、染色液を用いていないから、評価後に微生物を回収してスクリーニングを行うことができる。
また、培地が平板培地であり、培地の微生物又は酵素の周辺に形成された透明部分の大きさの測定を行う場合には、より簡便に微生物又は酵素の分解活性を比較することができる。
基質を含有する培地のｐＨは、９．８以上１０．７以下であることが好ましい。この範囲内であると、未分解の基質が白濁化されやすく、評価が容易になる。
また、第１温度が、２０℃〜４５℃であると、基質の分解を促進でき、評価が容易になる。
また、第２温度が、０℃〜１５℃であると、未分解の基質が白濁化されやすく、評価が容易になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明について、本発明による典型的な実施形態の非限定的な例を挙げ、言及された複数の図面を参照しつつ以下の詳細な記述にて更に説明する。
【図１】基質分解活性の評価方法の一例を示す説明図である。
【図２】寒天平板培地の２５℃での外観写真である。
【図３】冷却後の寒天平板培地の外観写真である。
【図４】酵素の基質分解活性の評価試験における寒天平板培地の外観写真の一例である。冷却後の寒天平板培地の外観写真を示す。
【図５】微生物の基質分解活性の評価試験における寒天平板培地の外観写真の一例である。冷却前の寒天平板培地の外観写真を示す。
【図６】微生物の基質分解活性の評価試験における寒天平板培地の外観写真の一例である。冷却後の寒天平板培地の外観写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳しく説明する。なお、本明細書において、数値範囲について「〜」を用いた記載では、特に断りがない限り、下限値及び上限値を含むものとする。例えば、「１０〜２０」という記載では、下限値である「１０」、上限値である「２０」のいずれも含むものとする。すなわち、「１０〜２０」は、「１０以上２０以下」と同じ意味である。
本発明の基質分解活性の評価方法は、（Ａ）基質を含有する培地に、微生物又は酵素を接種する接種工程と、（Ｂ）接種工程の後の培地を第１温度にて保温する第１保温工程と、（Ｃ）第１保温工程の後の培地を第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、培地のうち、未分解の基質が存在する部位を白濁化させる第２保温工程と、を備える。本発明の基質分解活性の評価方法は、第２保温工程の後に、培地の状態を観測して、微生物又は酵素の基質分解活性を評価する。以下、詳細に説明する。
【００１５】
１．接種工程
接種工程では、基質を含有する培地に、微生物又は酵素を接種する。
基質は、特に限定されない。基質として、例えば、ペクチン、セルロース、アルギン酸、コラーゲン、ケラチンなどの高分子化合物を好適に例示できる。
培地中の基質の濃度は、特に限定されない。基質の濃度は、好ましくは５〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは７〜５０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１０〜３０ｇ／Ｌである。この範囲内であると、未分解の基質が冷却により白濁化されやすく、容易に評価できる。
【００１６】
（１）培地
培地は、固体培地、液体培地のいずれでもよい。培地の組成は、特に限定されず、基質の種類に応じて適宜変更できる。ここでは、好ましい培地組成の一例を説明する。
固体培地の場合には、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤は、特に限定されない。固形化剤として、例えば、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、ゼラチン、及びカラギーナンからなる群より選ばれた１種以上を好適に例示できる。培地中の固形化剤の濃度は、特に限定されない。固形化剤の濃度は、好ましくは０．５〜３０ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜２５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２〜１５ｇ／Ｌである。なお、ここで、固形化剤の濃度は、固形化剤を２種以上含む場合は、合計の濃度を意味する。
培地は、固体培地である平板培地が好ましい。平板培地を用いると、微生物又は酵素の周辺に形成された透明部分の大きさの測定が簡便となり、微生物又は酵素の分解活性を比較し易い。
【００１７】
培地は、ｐＨ調整剤を含有していることが好ましい。ｐＨ調整剤は、特に限定されないが、炭酸ナトリウムなどの炭酸塩、水酸化ナトリウム、塩酸を好適に使用できる。炭酸ナトリウムを用いる場合には、この濃度は、好ましくは５〜４０ｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜２５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１０．０〜１７．５ｇ／Ｌである。炭酸ナトリウムの濃度を、この範囲内とすると、第１温度よりも低い第２温度で保温して、未分解の基質を白濁化させることが容易になり、基質分解活性の評価が容易となる。
【００１８】
培地には、微生物の生育に必要な成分が含まれていればよい。培地の成分は特に限定されない。例えば、培地は、硫酸マグネシウム七水和物を含有していることが好ましい。硫酸マグネシウム七水和物の濃度は、好ましくは０．０１〜１．００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜０．５０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１０〜０．３０ｇ／Ｌである。
【００１９】
培地は、硫酸マンガン五水和物を含有していることが好ましい。硫酸マンガン五水和物の濃度は、好ましくは０．０１〜０．１０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０２〜０．０７ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．０３〜０．０６ｇ／Ｌである。
【００２０】
培地は、塩化カルシウム二水和物を含有していることが好ましい。塩化カルシウム二水和物の濃度は、好ましくは０．０１〜０．１０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０２〜０．０８ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．０３〜０．０７ｇ／Ｌである。
【００２１】
培地は、ペプトンを含有していることが好ましい。ペプトンの濃度は、好ましくは０．１〜１．０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．２〜０．７ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．３〜０．６ｇ／Ｌである。
【００２２】
培地は、リン酸水素二カリウムを含有していることが好ましい。リン酸水素二カリウムの濃度は、好ましくは０．０１〜０．５０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜０．４０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．０７〜０．２０ｇ／Ｌである。
【００２３】
培地のｐＨは、特に限定されない。培地のｐＨは、好ましくは９〜１１、より好ましくは９．８〜１０．７である。この範囲内であると、未分解の基質が冷却により白濁化されやすく、容易に評価できる。低すぎるｐＨでは、白濁化しにくい傾向にあり、他方、高すぎるｐＨでは、室温（２０℃）でも白濁化する可能性がある。
培地のｐＨは、培地に含まれる各種化合物の配合割合によって調整できる。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。
【００２４】
（２）微生物又は酵素
微生物又は酵素は、基質分解活性の評価対象であり、幅広い微生物又は酵素に適用することができる。
なお、接種工程における接種方法は、特に限定されず、公知の方法が用いられる。例えば、白金耳等を用いた接種方法が採用される。
【００２５】
２．第１保温工程
第１保温工程では、接種工程の後の培地を第１温度にて保温する。第１温度は、特に限定されないが、好ましくは２０℃〜４５℃であり、より好ましくは３５〜４０℃である。第１温度が、この範囲内であると、基質の分解を促進でき、基質分解活性の評価が容易になる。
第１保温工程の時間は、特に限定されず、微生物や酵素など接種するものに応じて適宜変更できる。第１保温工程の時間は、好ましくは０．５時間〜２４時間であり、より好ましくは１時間〜１８時間である。
【００２６】
３．第２保温工程
第２保温工程では、第１保温工程の後の培地を第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、培地のうち、未分解の基質が存在する部位を白濁化させる。なお、第２保温工程後においても、培地のうち、基質が分解された部位は白濁化せずに、透明である。よって、第２保温工程後は、基質が未分解の部位は白濁状態となり、基質が分解された部位は透明状態となる。
第２温度は、第１温度よりも低ければ、特に限定されないが、好ましくは０℃〜１５℃であり、より好ましくは３℃〜７℃である。第２温度が、この範囲であると、未分解の基質が白濁化されやすく、評価が容易になる。
【００２７】
４．培地の状態の観測
本発明の基質分解活性の評価方法では、第２保温工程後に、培地の状態を観測する。上述のように、第２保温工程後は、基質が未分解の部位は白濁状態となり、基質が分解された部位は透明状態となる。すなわち、第２保温工程後では、基質の分解部位と、基質の未分解部位と、が視覚的に判別可能である。
観測の方法は、特に限定されない。例えば、培地が平板培地である場合には、培地の微生物又は酵素の周辺に形成された透明部分の大きさを測定することが好ましい。この方法であると、透明部分の大きさの大小により、基質分解活性の程度を把握することが可能となる。すなわち、透明部分が大きいほど、分解された基質が多いことになるから、基質分解活性が高いことが判明する。なお、透明部分の大きさの評価方法は、特に限定されない。すなわち、透明部分の径、幅、長さによって大きさを評価してもよいし、透明部分の面積によって大きさを評価してもよい。
【００２８】
培地が液体培地である場合には、第２保温工程後の液体培地の濁度を濁度計によって、測定することが好ましい。この方法を用いると、濁度の大小により、基質分解活性の程度を把握することが可能となる。すなわち、濁度が小さいほど、透明性が高くなり、分解された基質が多いことになる。よって、この場合には基質分解活性が高いことが判明する。他方、濁度が大きいほど、透明性が低くなり、分解された基質が少ないことになる。よって、この場合には基質分解活性が低いことが判明する。
【００２９】
５．基質分解活性の評価方法の一例
基質分解活性の評価方法の一例を、図１にて説明する。この評価方法の例では、平板培地を用いている。
まず、図１（Ａ）に示す平板培地１（評価プレート）を調製する。
次に、図１（Ｂ）に示すように、平板培地１に微生物等３を接種する。なお、微生物等は、微生物又は酵素を意味する（以下、同じである）。
続いて、平板培地１を第１温度にて保温する（図１（Ｃ））。この際、微生物等３に基質分解活性がある場合には、微生物等３の周りの基質が分解される。但し、基質が分解されても、平板培地１の外観には大きな変化はない。そのため、この状態では、基質分解活性の評価は困難である。
次に、平板培地１を第２温度にて保温する（図１（Ｄ））。すると、基質が未分解の部位５は白濁し、基質が分解された部位７は透明となる。この状態で、基質が分解された透明な部位７の大きさを測定する。基質分解活性が大きい程、透明な部位７の大きさが大きくなる。
以上のようにして、基質分解活性を評価できる。
【００３０】
６．本実施形態の効果
本実施形態の基質分解活性の評価方法によれば、染色液を用いることなく、簡便に微生物等の分解能力を比較することができる。また、この基質分解活性の評価方法を用いれば、染色液を用いていないから、評価後に微生物を回収してスクリーニングを行うこともできる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により更に具体的に説明する。
【００３２】
Ａ．ペクチン分解活性の評価
１．寒天平板培地の作製
次の組成の寒天培地を作製し、シャーレ内に分注して寒天を固化させた。直径９ｃｍのシャーレを用い、シャーレ内に１８ｍＬ〜２２ｍＬの寒天培地を分注して、１０ｍｍ程度の厚みの寒天平板培地とした。この寒天平板培地の２０℃での様子を図２に示す。全面にわたって透明であることが確認された。次に、寒天平板培地を冷蔵庫に入れ、４℃に冷やした。冷却後の寒天平板培地の様子を図３に示す。全面にわたって白濁することが確認された。
＜寒天培地組成＞
硫酸マグネシウム七水和物  ０．２ｇ／Ｌ
硫酸マンガン五水和物      ０．０５ｇ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物    ０．０５ｇ／Ｌ
ペプトン                  ５ｇ／Ｌ
リン酸水素二カリウム      １ｇ／Ｌ
ペクチン                  ３０ｇ／Ｌ
寒天                      １５ｇ／Ｌ
炭酸ナトリウム            １０ｇ／Ｌ
【００３３】
２．酵素の基質分解活性
ペクチン分解酵素（ＰＥＣＴＩＮ  ＬＹＡＳＥ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．，  Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を種々の濃度（０Ｕ、０．００４５Ｕ、０．０４５Ｕ、０．４５Ｕ）に調整した。それぞれの濃度のペクチン分解酵素を寒天平板培地に接種し、４０℃で一晩静置した。その後、寒天平板培地を冷蔵庫で４℃にて冷却した。冷却後の寒天平板培地の一例を図４に示す。ペクチン分解酵素を接種した周りにハロー（透明な部位）が現れていることが確認できる。そして、ハローの大きさ（直径）を測定した。その結果、酵素濃度とハローの大きさに相関関係が見られた。すなわち、酵素濃度が大きいほど、分解活性が高く、ハローが大きくなる傾向にあることが確認された。ハローの大きさは、低い酵素濃度の場合から順に、０ｍｍ、１３．７ｍｍ、１８．７ｍｍ、２２．３ｍｍであった。
以上のように、この実験では、ハローの大きさにより、簡便に酵素の基質分解活性を評価可能であることが確認できた。
【００３４】
３．微生物の基質分解活性
ペクチン分解微生物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ｃ−１２５株）を使用した。白金耳を用いて微生物を適当量取り、寒天平板培地の表面に植菌（接種）した。３７℃で一晩静置培養し、微生物コロニーが現れたことを確認した。このときの様子を図５に示す。その後、寒天平板培地を冷蔵庫で４℃に冷却した。冷却後の寒天平板培地を図６に示す。微生物コロニーの周辺にハローが存在しており、ペクチンが分解されていることが確認された。
以上のように、この実験では、ハローにより、簡便に微生物の基質分解活性を評価可能であることが確認できた。
【００３５】
Ｂ．培地組成の検討
１．培地の作製
下記の組成の液体培地を作製した。具体的は、表１に記載のペクチン濃度、炭酸ナトリウム濃度の各種液体培地を室温（２０℃）にて作製した。そして、各液体培地のｐＨを測定した。
【００３６】
【表１】
2019149962.tif 000003
【００３７】
２．評価方法
各培地を４℃に冷却して、目視にて観察した。判定基準は以下のようにした。
判定基準
×：冷却しても白濁化（ゲル化）せず。
○：冷却により白濁化（ゲル化）した。
【００３８】
３．結果
結果を表１に併記する。
以上の結果より、基質としてのペクチンの濃度が１０．０〜３０．０ｇ／Ｌであり、かつ炭酸ナトリウム濃度が１２．５〜２０．０ｇ／Ｌの場合に、培地は、冷却により白濁化した。すなわち、この濃度の組合せでは、基質の未分解部位を確実に白濁化できることが確認できた。よって、この濃度の組合せを用いれば、冷却により白濁化する未分解部位と、冷却しても白濁化せず透明な分解部位と、を視覚的に判別でき、基質分解活性を評価できることが分かった。
【００３９】
Ｃ．実施例の効果
本実施例の基質分解活性の評価方法によれば、簡便に微生物等の分解能力を比較することができる。よって、基質分解に有用な微生物等の迅速な探索に貢献できる。
【００４０】
前述の例は単に説明を目的とするものでしかなく、本発明を限定するものと解釈されるものではない。本発明を典型的な実施形態の例を挙げて説明したが、本発明の記述および図示において使用された文言は、限定的な文言ではなく説明的および例示的なものであると理解される。ここで詳述したように、その形態において本発明の範囲または本質から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が可能である。ここでは、本発明の詳述に特定の構造、材料および実施例を参照したが、本発明をここにおける開示事項に限定することを意図するものではなく、むしろ、本発明は添付の特許請求の範囲内における、機能的に同等の構造、方法、使用の全てに及ぶものとする。
【００４１】
本発明は上記で詳述した実施形態に限定されず、本発明の請求項に示した範囲で様々な変形または変更が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の基質分解活性の評価方法を用いれば、ペクチン等の分解に関わる有用な微生物等を簡便に探索可能となる。
また、本発明の基質分解活性の評価方法において基質をペクチンとすれば、ペクチンを分解する菌の検出が可能となる。よって、果物や野菜を腐敗させる原因菌が検出できる。このように、本発明の基質分解活性の評価方法は、農業関連産業においても幅広く利用することができる。
本発明の基質分解活性の評価方法は、冷却のみで分解活性を可視化できるので、特別な薬品を用いる必要がなく、様々な場所で利用できる。例えば、農産物保存倉庫や市場等の現場でも利用可能である。
【符号の説明】
【００４３】
１…培地（平板培地）
３…微生物等
５…基質が分解されていない部位
７…基質が分解されている部位
【図１】
2019149962.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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