(57)【要約】【課題】薄切切片の破損やゆがみが生じた場合においても、切片内の組織の補正を高精度で行い、切片同士の重ねあわせを可能にし、組織の体系的理解を実現する三次元組織像再構成に関する技術を提供すること。【解決手段】組織標本を座標フレームと共に包埋する工程、前記組織標本を前記座標フレームと共に一括して薄切し、複数の薄切切片を調製する工程、前記座標フレームに基づいて前記薄切切片に座標情報を付与する工程、前記薄切切片の外的観察および／または内的観察を実施する工程、前記外的観察および／または内的観察後、前記薄切切片の前記座標情報を基準として補正を行う工程、前記座標情報および前記補正に基づいて、前記外的観察および／または内的観察情報を含む三次元組織像を再構成する工程を含む、組織の三次元組織像を再構成するための方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織標本を座標フレームと共に包埋する工程、
前記組織標本を前記座標フレームと共に一括して薄切し、複数の薄切切片を調製する工程、
前記座標フレームに基づいて前記薄切切片に座標情報を付与する工程、
前記薄切切片の外的観察および／または内的観察を実施する工程、
前記外的観察および／または内的観察後、前記薄切切片の前記座標情報を基準として補正を行う工程、
前記座標情報および前記補正に基づいて、前記外的観察および／または内的観察情報を含む三次元組織像を再構成する工程
を含む、組織の三次元組織像を再構成するための方法。
【請求項２】
前記座標フレームが前記組織標本の外周に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記座標フレームが薄切方向と垂直になるように前記組織標本内に貫通して配置される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記座標フレームが角柱および円柱から選択される柱状である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記座標フレームが凹凸もしくは突起により識別される座標を備えるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記座標フレームが異なる厚みにより識別される座標を備えるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記外的観察が、薄切された組織をヘマトキシリン・エオシン（HE）染色または免疫染色して観察することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記内的観察が、薄切された組織の全体または一部を構成する細胞における核酸、タンパク質および代謝物からなる群より選択される少なくとも1つを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
組織標本を座標フレームと共に包埋する工程、
前記組織標本を前記座標フレームと共に一括して薄切し、複数の薄切切片を調製する工程、
前記座標フレームに基づいて前記薄切切片に座標情報を付与する工程、
前記薄切切片の外的観察および／または内的観察を実施する工程、
前記外的観察および／または内的観察後、前記薄切切片の前記座標情報を基準として補正を行う工程、
前記座標情報および前記補正に基づいて、前記組織標本を分析する工程
を含む、組織標本の分析方法。
【請求項１０】
包埋された組織標本および座標フレームを一括して薄切するための薄切切片作製装置、
前記薄切切片および前記座標フレームを観察するための顕微鏡、ならびに
コンピュータ
を備え、
前記コンピュータが、前記座標フレームに基づいて前記薄切切片に座標情報を付与し、前記薄切切片の前記座標情報を基準として補正を行い、前記組織標本の三次元組織像を再構成するものである、組織の三次元組織像を再構成するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薄切切片を用いて組織を分析する際に薄切切片に生じるゆがみを補正して三次元組織像を再構成するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
組織を解析するため、凍結コンパウンドもしくはパラフィンに包埋された組織を薄切（数μm〜数十μm）し、薄切切片を得る。薄切切片は、例えばヘマトキシリン・エオシン（HE）染色や免疫染色により、顕微鏡で観察する。また薄切切片の全てもしくは一部を切断採取し、遺伝子やゲノム、タンパク質などの発現解析を実施する。そのような解析に使用した薄切切片は、解析前に染色することも可能であり、また、一部を切断採取後に残りの部分を染色し顕微鏡による観察を実施することもできる。一方で、染色を施すことで、切片に含まれる核酸やタンパク質が分解したり性質が変化することがある。複数枚の薄切切片を用いて、同一もしくは異なる要素の解析を実施し、その後、薄切切片画像を薄切順にならべ、重ね合わせのうえ再構成することで体系的解析を実施する。重ね合わせを容易にするためにマーカーを複数配置する事例がある（特許文献１および２）。また、重ね合わせの際に発生する薄切切片のゆがみを考慮し、精度を上げるために、薄切組織内部の特徴的な複数部位をあらかじめ決めておき、これをマーカーとして利用する技術に関する報告もある（特許文献３および４）。これらの技術は、隣接する薄切切片同士を重ね合わせ薄切する前の組織の三次元構造を再構築することについても記載がある。
【０００３】
薄切切片を利用した、核酸解析やタンパク質の解析の実施には、例えばレーザーマイクロダイセクション（LMD）を用いて、あらかじめ染色を施した薄切切片を光学顕微鏡で観察しながら、解析対象部位をレーザー照射により切除回収した試料を用いる。あらかじめ染色を施さずに、顕微鏡で形態を観察しながら微小領域を回収できる装置（例えば、Unipick (NeurolnDx社)、非特許文献１）を使用して解析を実施することも可能である。この場合は、回収後に染色を実施する、または隣接する薄切切片を染色することで、回収された部位の形態学的観察が可能である。隣接切片から回収部位を推定するためには、試料を回収した切片と染色観察用切片の正確な重ねあわせが必要となる。LMDや微小領域の回収装置では、一細胞レベルの極微小領域の試料回収が可能であり、重ね合わせも細胞と同程度のサイズとなる10μm程度が要求される。
【０００４】
薄切切片同士の重ねあわせを繰り返し、画像を再構築することで、薄切される前の立体像を再構成することが可能である。この際に、薄切切片の核酸解析の情報や、タンパク質解析の結果を画像にリンクさせることにより、再構成された立体画像において顕微鏡から得られる形態的情報と核酸やタンパク質の発現状態や変異の状態を体系的にとらえることが可能になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2013-83474号公報
【特許文献２】特開平8-35921号公報
【特許文献３】特開2013-257282号公報
【特許文献４】特開2008-46098号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yoda, T.ら、Scientific Reports 7, 4325 (2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
包埋された組織を薄切し、薄切切片を用いた組織の染色による形態観察や、組織に含まれる細胞の遺伝子発現解析、ゲノム解析またはタンパク質や代謝物の解析を、一枚の薄切切片もしくは複数枚の薄切切片を用いて実施する。隣接する薄切切片同士を正確に重ね合わせることにより、元の三次元を再構成することができ、形態的な情報のみならず、核酸やタンパク質などの発現に関する情報も体系的に供することが可能になる。薄切切片の再構成を実現するには、隣接もしくは近接薄切切片の重ね合わせの精度が必要となる。
【０００８】
薄切された切片が、隣接しているもの同士全くの同一であれば重ね合わせは顕微鏡で得られた画像を見比べることで比較的容易にできる。しかしながら、連続的に複数枚薄切した時に、全て平行した切断面を維持することは難しく、温度や湿度等の環境因子が異なっていたり、薄切の厚み（数μm〜数十μm）がずれたりすることにより、隣接する切片同士であっても、画像を重ね合わせることが困難な場合がある。重ね合わせの指標となるマーカーを組織と同時に包埋薄切する技術の報告がある（特許文献１および２）。これらの技術では、柱状のマーカーとなる物質を組織と同時に一つ以上包埋し、薄切切片に現れるマーカーを目印として薄切切片の向きをそろえたり、長さの校正を行う。一方で、重ね合わせの精度をあげる手法として組織内の特徴的な部位をマーカーとして利用する技術の報告がある（特許文献３および４）。隣接する切片のマーカー同士のずれを算出し、切片の位置情報の補正を行い、数μm程度のずれまで補正を実施することが可能になるとしている。これらの技術は、薄切切片ごとの一様なゆがみや長さ補正を行うことは可能である。一方で薄切された組織切片の一部を採取し核酸解析やタンパク質解析など後段の解析に利用し、残された切片部位を染色する場合には、微小領域採取やその後の染色の工程で組織部分の破れやしわ、一部のみの収縮を生じる可能がある。解析に利用した一部採取部位の細胞の数や密度などの情報は、隣接する切片からの推定が必要となる。しかしながら、重ね合わせの精度が低いと、採取し欠失している部分の正確な推定ができない。これらの補正もしくは欠失部位の推定には、上記従来の技術で示される方法での解決が困難である。即ち、組織の内外を問わず、点（点の形は問わない）で形成されるマーカーでの補正だと、マーカー部位の欠失で重ねあわせの指標が失われることにつながる。またマーカーの位置により、一部のみの破損やゆがみなどが反映しきれない可能性がある。さらに、薄切切片作成時の薄切方向にゆがみが生じる可能性があり、常に平行を保てているとは限らない。即ち薄切切片の厚みのゆらぎの補正が必要になるが、従来の点で形成されるマーカーでは、困難である。
【０００９】
これらの課題から本発明の目的は、薄切された切片の厚みが同一もしくは異なる場合や、解析の途中で切片の破損やゆがみが生じた場合においても、切片内の組織の補正を10μm程度以下の精度で行い、切片同士の重ねあわせを可能にし、組織の体系的理解を実現する三次元組織像再構成に関する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、組織標本の外周に標本を取り囲む座標フレームを配置し、組織標本と座標フレームを一括して包埋し薄切し、切片に正確な座標情報を付与することにより、薄切後の処理を経た後も精度のよい切片の重ねあわせが可能になることを見出した。さらに、組織の体系的理解を実現する三次元組織像再構成が可能になることを見出した。
【００１１】
即ち、本発明は以下を包含する。
（１）組織標本を座標フレームと共に包埋する工程、
前記組織標本を前記座標フレームと共に一括して薄切し、複数の薄切切片を調製する工程、
前記座標フレームに基づいて前記薄切切片に座標情報を付与する工程、
前記薄切切片の外的観察および／または内的観察を実施する工程、
前記外的観察および／または内的観察後、前記薄切切片の前記座標情報を基準として補正を行う工程、
前記座標情報および前記補正に基づいて、前記外的観察および／または内的観察情報を含む三次元組織像を再構成する工程
を含む、組織の三次元組織像を再構成するための方法。
【００１２】
（２）組織標本を座標フレームと共に包埋する工程、
前記組織標本を前記座標フレームと共に一括して薄切し、複数の薄切切片を調製する工程、
前記座標フレームに基づいて前記薄切切片に座標情報を付与する工程、
前記薄切切片の外的観察および／または内的観察を実施する工程、
前記外的観察および／または内的観察後、前記薄切切片の前記座標情報を基準として補正を行う工程、
前記座標情報および前記補正に基づいて、前記組織標本を分析する工程
を含む、組織標本の分析方法。
【００１３】
（３）包埋された組織標本および座標フレームを一括して薄切するための薄切切片作製装置、
前記薄切切片および前記座標フレームを観察するための顕微鏡、ならびに
コンピュータ
を備え、
前記コンピュータが、前記座標フレームに基づいて前記薄切切片に座標情報を付与し、前記薄切切片の前記座標情報を基準として補正を行い、前記組織標本の三次元組織像を再構成するものである、組織の三次元組織像を再構成するためのシステム。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、薄切切片の画像および切片から得られる外的観察・内的観察解析結果が付与された三次元組織像の再構成が可能となり、組織の体系的理解が実現できる。本発明は特に、組織の特定の位置における遺伝子・タンパク質の発現解析や、組織における遺伝子・タンパク質の発現分布解析などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の工程フローの一例を示す。
【図２】座標情報の付与と補正の一実施形態を示す図である。
【図３】座標フレームのいくつかの実施形態を示す図である。
【図４】座標フレームの別の実施形態を示す図である。
【図５】座標フレームを利用した補正の一実施形態を示す図である。
【図６】本発明のシステム構成例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、組織標本から切片を薄切して外的観察・内的観察を行う際に、切片の破損やよれを補正して組織標本の三次元組織像を再構成するための方法およびシステム、ならびに補正を行って組織標本を分析する方法を提供する。具体的には、本発明は、包埋された組織を薄切し、薄切切片を用いた組織の内的観察（例えば染色による形態観察）や、組織に含まれる細胞の外的観察（例えば遺伝子発現解析、ゲノム解析またはタンパク質や代謝物の解析）を、一枚の薄切切片もしくは複数枚の薄切切片を用いて実施し、それぞれの情報を薄切切片に付与した後、薄切の順に切片画像および解析結果を重ね合わせて三次元組織像として再構成し、組織の形態および核酸・タンパク質の発現に関する全体像を体系的に理解する技術に関する。その際、操作で生じる切片の破損やゆがみの補正を精度よく実施し、欠落した部位の二次元画像を再生することにより、薄切切片の二次元画像データと画像データに紐付けされた内的観察情報を再構成し、得られた外的観察情報と画像による内的観察データとの関連性を解析することが可能となる。
【００１７】
一態様において、組織の三次元組織像を再構成するための方法であって、
組織標本を座標フレームと共に包埋する工程、
組織標本を座標フレームと共に一括して薄切し、複数の薄切切片を調製する工程、
座標フレームに基づいて薄切切片に座標情報を付与する工程、
薄切切片の外的観察および／または内的観察を実施する工程、
外的観察および／または内的観察後、薄切切片の座標情報を基準として補正を行う工程、
座標情報および補正に基づいて、外的観察および／または内的観察情報を含む三次元組織像を再構成する工程
を含む方法を提供する。
【００１８】
本開示の方法では、組織標本を座標フレームと共に包埋する。組織標本は、薄切切片として外的観察および／または内的観察を行うことが望まれる組織標本、好ましくは生体組織であれば特に限定されるものではない。例えば、ヒトを含む動物から手術または生検により得られた組織、植物から得られた組織などを用いることができる。
【００１９】
座標フレームは、座標情報を付与することができる形状、大きさおよび数で組織標本と共に包埋する。一実施形態において、座標フレームは、組織標本の外周に配置される。例えば、組織の塊が内部にすっぽり納まるような構造で座標フレームが配置される。別の実施形態において、座標フレームは、薄切方向と垂直になるように組織標本内に貫通して配置される。組織標本内に貫通して座標フレームを配置する場合には、この配置によって組織標本内の内的観察結果に変化が生じることがあるため、座標フレームは組織標本の外周に配置されることが好ましい。あるいは、座標フレームは、組織標本の外周と組織標本内に配置される。
【００２０】
座標フレームの形状は柱状であることが好ましい。柱状の柱の底面の形状は限定されず、円（真円および楕円を含む。円柱となる）、多角形（正多角形を含む。角柱となる）のいずれでもよい。座標フレームは、座標軸を備える。座標フレームに座標軸を記入することは難しい場合があるため、座標フレームの配置位置と形状で座標軸を識別できることが好ましい。例えば、凹凸もしくは突起により識別される座標軸を備えるものとすることができる。具体的には、座標の指標となる凹凸もしくは突起が座標フレーム（好ましくは座標フレームの内側）に施されている。突起もしくは凹凸の形状も限定されるものではなく、三角形や四角形などの多角形や半円のような曲線状のものでもよい。あるいは、座標フレームは、異なる厚みにより識別される座標軸を備えるものとすることができる。具体的には、座標フレーム（例えば柱状壁）の厚みを連続的に変化させることで厚みを座標軸として使用することができる。好ましい一実施形態において、座標フレームは、組織標本を薄切する切断平面方向をXY軸とした場合の、XY座標の指標となる凹凸もしくは突起を備え、Z軸の座標の指標となる異なる厚みもしくは連続的な凹凸を備えるものとする。
【００２１】
座標フレームの大きさは、組織標本の大きさ、使用する薄切装置および観察装置の大きさに応じて、適宜選択することができる。例えば、外径20〜100μmの柱状とすることができる。座標フレームに備えられる座標の指標の数もまた組織標本の大きさ、望まれる補正の精度などに応じて、適宜選択することができる。組織標本の三次元組織像を再構成するため、少なくともX軸、Y軸およびZ軸の座標を付与することができる少なくとも3つの座標指標、好ましくは各軸について少なくとも2つ、合計少なくとも6つの座標指標を使用する。より好ましくは、各軸について少なくとも4つ、合計少なくとも12本の座標指標を使用する（例えば図１）。
【００２２】
座標フレームの素材は、組織標本および包埋材に影響されず、柱状に成形可能で有機溶剤耐性であることが好ましい。この条件を満たす素材であれば限定されることはなく、合成樹脂またはバイオポリマー、例えばフッ素樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、ポリアセタール樹脂、メタクリル酸メチル樹脂、グリコールメタクリレート樹脂などから作製することができる。
【００２３】
組織標本および座標フレームの包埋には既存の包埋材を利用することができる。例えば、汎用されるパラフィンやセロイジンのほか、エポキシ樹脂、凍結切片用包埋材などが利用できる。しかしながら細胞を薄切するための組織を支持する補助材となりうる材料であれば、これに限定されるものではない。
【００２４】
続いて、組織標本を座標フレームと共に一括して薄切し、複数の薄切切片を調製する。薄切は、組織包埋切片の調製に使用されている装置であれば特に限定されるものではなく、例えばミクロトームなどを使用することができる。薄切の厚みは、目的の外的観察および／または内的観察、組織に含まれる細胞の大きさなどに応じて変更することができ、数ミクロン〜数十ミクロン、例えば2〜30μm、好ましくは4〜20μmの厚みとすることができる。
【００２５】
薄切後の薄切切片には、座標フレームに基づいて座標情報（アドレス）を付与する。座標情報の付与は、具体的には、顕微鏡画像をデジタルデータとして処理し、座標フレームに設けられた座標軸を基準とした座標を薄切切片に付与することで行う。
【００２６】
次いで、薄切切片の外的観察および／または内的観察を実施する。外的観察は、切片を外的に観察することを意味し、そのまま、または染色（例えば、ヘマトキシリン・エオシン染色（HE染色）、パパニコロウ染色、過ヨウ素酸シッフ染色、免疫染色など）を行って、顕微鏡により観察することを含む。一方、内的観察は、薄切された組織の全体または一部を構成する細胞を内的に観察することを意味し、細胞における構成要素の測定を含む。例えば、薄切された組織の全体または一部を構成する細胞における核酸、タンパク質および代謝物からなる群より選択される少なくとも1つを測定する。核酸には、ゲノムDNA、mRNA、microRNA、ncRNAなどが含まれる。測定は、核酸、タンパク質または代謝物を量的に測定するものであってもよいし、あるいは核酸またはタンパク質を質的に測定（例えば、特定の変異の有無、特定の形態の有無を測定）するものであってもよい。
【００２７】
薄切切片は、薄切時にゆがみが生じたり（例えば図５）、薄切時および／または観察時に欠損やよれが生じる（例えば図２）ことがあり、薄切前と同じ形または位置を保っているものではない。そのため、外的観察および／または内的観察後、薄切切片の座標情報を基準として、補正を行う。具体的には、座標フレーム上の座標の間の距離、隣接する座標の位置関係、隣接する領域の外的観察および／または内的観察結果などから、薄切切片の形または位置の補正を行う。
【００２８】
補正を行った後または補正と同時に、座標情報および補正に基づいて、外的観察および／または内的観察情報を含む三次元組織像を再構成する。具体的には、複数の薄切切片の画像を薄切した順序に重ね合わせて三次元組織像を再構成し、外的観察および／または内的観察情報と共に表示する。これにより、薄切切片のゆがみ、欠損、よれなどを補正して、高精度に三次元組織像を再構成することが可能となる。このように、外的観察情報、例えば染色後の画像データだけではなく、内的観察情報、例えば遺伝子発現解析の結果を、薄切切片または組織標本の補正された位置情報と組み合わせて検討を行うことができる。
【００２９】
別の態様において、組織標本の分析方法であって、
組織標本を座標フレームと共に包埋する工程、
前記組織標本を前記座標フレームと共に一括して薄切し、複数の薄切切片を調製する工程、
前記座標フレームに基づいて前記薄切切片に座標情報を付与する工程、
前記薄切切片の外的観察および／または内的観察を実施する工程、
前記外的観察および／または内的観察後、前記薄切切片の前記座標情報を基準として補正を行う工程、
前記座標情報および前記補正に基づいて、前記組織標本を分析する工程
を含む方法を提供する。
【００３０】
組織標本の分析は、上述のように、補正された薄切切片の座標情報または再構成された三次元組織像（位置情報）と、外的観察および／または内的観察の情報とから、組織標本について分析するものである。例えば、組織標本が病理組織であり、病理組織の特定の位置における遺伝子またはタンパク質発現について分析したり、さらに組織染色の結果と併せて検討することができる。
【００３１】
また別の態様において、
包埋された組織標本および座標フレームを一括して薄切するための薄切切片作製装置、
前記薄切切片および前記座標フレームを観察するための顕微鏡、ならびに
コンピュータ
を備え、
前記コンピュータが、前記座標フレームに基づいて前記薄切切片に座標情報を付与し、前記薄切切片の前記座標情報を基準として補正を行い、前記組織標本の三次元組織像を再構成するものである、組織の三次元組織像を再構成するためのシステムを提供する。
【００３２】
本開示のシステムにおいて、薄切切片作製装置は、薄切切片の調製に使用されている装置であれば特に限定されるものではなく、例えばミクロトームなどを使用することができる。
【００３３】
顕微鏡もまた、画像データを取得できる手段であれば特に限定されるものではなく、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、大気圧電子顕微鏡などを用いることができる。得られる画像データにおいて、薄切切片上の座標フレームに基づく位置および領域に関する情報を決定し保存するため、顕微鏡はコンピュータに接続される。
【００３４】
コンピュータは、当技術分野で公知のコンポーネントから構成されるものであり、他のシステムまたは要素（例えば顕微鏡、表示部、入力部など）と有線または無線で接続される。コンピュータは、座標フレームに基づいて薄切切片に座標情報を付与し、薄切切片の座標情報を基準として補正を行い、組織標本の三次元組織像を再構成することができるように、解析部、記憶部などを備えるものとする。
【００３５】
コンピュータには、顕微鏡画像をデジタルデータとして処理し、座標フレームを基準とした座標を薄切切片に付与するためのプログラム、外的観察および／または内的観察（例えば染色、核酸、タンパク質解析）後の薄切切片のしわや欠失破損によるゆがみを補正するためのプログラム、そして二次元画像データを三次元組織像に再構成するためのプログラムが包含される。また、外的観察（例えば形態観察）により得られた情報に内的観察（例えば核酸発現）情報を関連付けるためのプログラムを包含してもよい。さらには、コンピュータモニタ上で外的観察（形態）情報を見ながら、内的観察（核酸発現）情報を確認できる描画機能を有してもよい。描画の方法は、解析の目的によるものであり、限定されるものではない。また、記憶部には、特定の組織とその性質（外的観察情報、内的観察情報を含む）との関連性、文献情報などが記憶されていてもよく、新たに解析した組織標本のデータを記憶させてもよい。記憶部に保存されたデータを学習させることにより、本開示のシステムをさらに改善することができる。
【００３６】
本開示のシステムは、さらに外的観察を行うための装置や内的観察を行うための装置を備えてもよい。例えば、内的観察を行う際に、薄切された組織の微小領域を採取するための装置、例えばレーザーマイクロダイセクション（LMD）、微小領域採取装置などを備えることができる。
【００３７】
本開示のシステムの構成は上述したものに限定されるものではない。例えば、出力装置を備えていてもよいし、あるいは外部の出力装置と接続されていてもよい。出力装置は、当技術分野で公知の任意の出力装置とすることができ、例えば画像および／またはデータ表示装置、警報装置、プリンターなどが挙げられる。この場合、コンピュータは、再構成された三次元組織像を表示装置に表示するように構成してもよい。
【００３８】
本開示のシステムにより、組織標本の薄切切片から、ゆがみや欠損を補正して正確な三次元組織像を再構成し、組織標本について高精度に分析することが可能となる。
【００３９】
以下、本発明の実施形態の具体例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００４０】
[実施例１]
本実施例では、図１に示す座標フレームの中に組織を配置し薄切切片を複数得たのち、座標情報をもとに三次元組織像を再構成する方法の工程例について説明する。
【００４１】
最初に組織(1)を取り囲むように座標フレーム(2)を配置し、組織とともに包埋する(21)。座標フレームは四方に長さの指標となる凹凸(3)が、切断断面の平面方向をXY軸(4)とした場合、Z軸(5)方向に配置されている。
【００４２】
本実施例では、実験マウスより摘出された肝臓組織(1)を材料として用い、凍結包埋材(6)で包埋した試料（組織標本）を薄切し(22)、解析し、そして隣接切片を重ね合わせる方法を想定している。図１では、座標フレーム(2)内に包埋剤(6)が充填される画を図示しているが、座標フレームを包含する形状での包埋の実施も可能である。肝臓組織(1)が収まった座標フレーム(2)を全て包埋することが重要である。包埋試料を、ヘマトキシリン・エオシン染色用に5μmの厚みに、遺伝子発現解析用に20μmの厚みに薄切し解析を実施した。その後2枚の厚みの異なる薄切切片の画像を重ね合わせる。薄切の厚みは、染色の際に観察を行いたい対象物により異なり、特に限定されるものではない。また染色の方法も限定されるものではなく、染色を実施しない組織切片の輪郭を含む形状のみを顕微鏡で観察し重ね合わせの情報として利用することも可能である。しかしながら、各切片の座標フレームと組織の輪郭を含む二次元画像データは、全ての薄切切片に対して可能な限り薄切直後に取得することが望ましい。これは温度や湿度による経時変化をできるだけ受けていない状態の薄切切片の情報を初期値として利用することが、重ねあわせ時の精度を上げることにつながるためである。
【００４３】
薄切された組織切片(7)の座標フレーム(2)に具備された長さの指標となる凹凸(3)を指標とした座標軸(8)を設定し、組織の輪郭の位置情報を座標軸から得られる（x, y）値と関連付けた(23)。
【００４４】
続いて、薄切された切片を用いた外的観察および内的観察を実施した(24)。本実施例において、外的観察は、ヘマトキシリンにより核を青紫色に、エオシンにより細胞質を赤〜ピンクに染色するヘマトキシリン・エオシン染色（HE染色）を実施し、光学顕微鏡で組織内細胞の様子を観察した。しかしながら外的観察は、生体組織を構成する特定物質の分布情報の取得を目的とし、検出対象物質に対する抗原抗体反応を用いて染色する、「免疫染色」などを行ってもよく、特に限定されるものではない。本実施例において、内的観察は組織切片の特定部位の遺伝子発現の解析を実施した。しかしながら内的観察においても、例えばゲノムの解析（変異や挿入欠出など）、タンパク質解析や、代謝物の解析などを包含し限定されるものではない。
【００４５】
前述で薄切された20μm厚の組織切片を用いて、微小領域(9)の採取を実施した。微小領域は、レーザーマイクロダイセクション（LMD）や微小領域採取装置を用いれば、単一細胞レベル（直径10μm程度）を下限として所望の大きさでの採取が可能である。また、ナイフ等で2分割や4分割としそれぞれの断片を後段の解析に回すことも可能である。さらには、微小領域を採取したり、分割したりすることなく薄切された組織全部を使用し、続く内的観察の試料として使用することも可能である。
【００４６】
本実施例では、図１および２に示すように、直径100μmの円状に微小領域(9)の試料採取を実施した。採取された試料は、非特許文献１に掲載の方法で発現遺伝子の解析を実施した。微小領域採取後の薄切切片(13)は、HE染色を実施し顕微鏡で二次元画像の記録を行った。また、5μm厚の隣接する薄切切片は、微小領域の採取などは実施せず、切片全体を用いたHE染色を実施した。
【００４７】
染色微小領域採取時、もしくは、採取後の染色工程において、薄切切片によれ(10)が生じた。このよれは、切片の組織部位におよび組織の一部にも生じた(12)。このよれは、図２に示すように、隣接する内的観察を実施した薄切切片(14)とよれが生じた外的観察を実施した薄切切片(15)を比較することで、よれの発生箇所を明示することができる。即ち、2枚の切片の座標フレーム(2)および長さの指標となる凹凸(3)を重ね合わせる。座標フレーム(2)のよれの発生箇所は(16)〜(17)の部位で、また、薄切組織部位(11)では(18)〜(19)の部位であることが分かった。本実施例においては、長さの指標となる凹凸の一つ(20)がよれにより、指標としての機能を消失してしまっている。しかしながら、座標フレーム(2)そのものが重ね合わせの際の指標として機能している。さらには複数配置した長さの指標となる凹凸(3)と座標フレーム(2)の双方を目印とすることで、本実施例のように一部がよれにより指標としての機能を失っても、重ね合わせの精度を確保すことが可能である。正確なかさねあわせが実施できることで、薄切組織(11)がもともとどのような輪郭であったのかを推定することができ、当初の輪郭(31)を再現することができる。また失われた部位の細胞の構成についても、正確に重ねあわされた隣接切片から再現でき、形補正および位置補正(25)を施した薄切切片像(33)が得られる。
【００４８】
正確な重ねあわせが実現することにより、上記のような実験途中の切片のよれや破損などの復旧だけではなく、採取され切片からなくなった微小領域（9および32）についても、採取部位の細胞の数や密度、分布などの情報を隣接切片から推定することが可能となる。よれにより一部ゆがんだ微小領域(32)についても同様である。
【００４９】
本実施例では、5μm厚の薄切切片と20μm厚の薄切切片を一枚ずつ図示したもので説明を行っているが、薄切切片の厚みおよび枚数ともにこれに限定されるものではない。HE染色や免疫染色に用いる薄切切片は、2〜6μm程度が一般的である。この範囲であれば良好な二次元画像の取得が可能である。これは、隣接する薄切切片で内的観察を実施した場合、重ねあわせで欠失部位の細胞の様子を推定するのに好都合である。また、内的観察を実施する切片は、解析対象部位（薄切された組織の一部部位もしくは全領域）で必要とする細胞数に応じて厚みを変更することが可能である。細胞数を多く必要とする場合は数十μmの厚みに、細胞数を少なめにしたい場合には、細胞の標準的な径を考慮し10μm程度の厚みで薄切することが望ましい。
【００５０】
また、重ねあわせを精度よく実施するために、外的観察をする切片と内的観察をする切片を交互に取得するのが望ましい。特に、内的観察を実施する薄切切片の前後に外的観察用の切片を取得することで、内的観察の工程中に発生する薄切切片から採取された部位の細胞構成の予測や、破損部位の推測などの正確性を確保できる。複数枚採取した薄切切片を長さの指標となる凹凸(3)と座標フレーム(2)の双方を指標とした座標を複数切片間で重ね合わせる(34)ことにより、薄切前の三次元組織像再構成(26)が可能となる。
【００５１】
[実施例２]
本実施例では、実施例１記載の三次元組織像の再構成に使用される座標フレームについて説明する。
【００５２】
実施例１で示す方法で使用した座標フレームは、実施例１においては四角形の底面を有する柱状のものを使用したが、形はこれに限定されるものではない。具体的には、図３に示すように円(35)や三角形(36)や五角形(37)などの多角形でも実現可能である。また、実施例１の事例のように組織切片部位のよれを座標フレームで補正するにあたり、組織切片部位と座標フレームが近接しているほうがより正確に補正を実施できる。近接していない場合、組織切片部位と座標フレームの間に、複数の異なるよれや破損が生じ、補正の精度が低下する可能性があるためである。このため、図３に示すように、座標フレーム（35、36および37）と薄切組織(11)がぴったり収まるような配置が望ましい。また、座標フレーム内の長さの指標となる凹凸は、数が多いほど、重ね合わせの指標としての精度が増す。しかしながら同一の形が並んでいてもゆがみが発生した場合など、どの凹凸に相当するかの同定が難しくなるため、2つ以上の形状（38、39および40）を有するものが使われることが望ましい。図３に示すように、38と39で示される2種類の凹凸が連続し、途中40で示される凹凸が挟まれることで、同定の効果があがる。
【００５３】
座標フレームの柱状の壁の厚みを変化させることで、Z軸方向(5)、即ち薄切の順序の目安とすることができる。即ち、座標フレームが円形(35)からなる柱状壁の厚み(41)がZ軸方向(5)に異なっている。これをXY軸方向に薄切(42)すると、座標フレームの太さの異なる薄切切片(43)が得られる。このような柱状壁の厚みの構成により、薄切の順番の取り違い防止効果が可能になる。
【００５４】
重ね合わせの指標として、あらかじめ組織内部に組織のZ軸方向を貫通するように柱状のマーカーをあらかじめ挿入することも、効果的である。図４に示すように組織内部マーカ(44)として利用できる。このマーカーの切断面の形状は、実施例に示す半円のように向きが特定できる形状のものが好ましいが、限定はされない。円形、多角形、星型や線形などが想定される。また、数も限定されるものではない。しかしながら、組織の一部を破砕して設置するため、数が多くなると本来の、組織を体系的に見たいという目的が達成できなくなる。数個の組織内部マーカーと座標フレームの組合せや、長さの指標となる凹凸との併用で位置あわせ精度の向上効果が得られる。断面面積は、やはり組織の一部を破砕することを鑑み、直径10μm〜100μm程度がよい。
【００５５】
[実施例３]
本実施例では、実施例１記載の三次元組織像の再構成に使用される座標フレームを指標とした薄切時のゆがみの補正について説明する。
【００５６】
薄切は、通常試料に対して平行に切り進める。一方で、包埋試料を一度薄切装置からはずし（通常固定して薄切する）、再度装着するというようなことを実施すると、細心の注意を払っていても薄切するナイフと包埋試料の角度や向きが変わってしまう。これにより、薄切切片の薄切の角度がかわってしまうことがある。図５に示すように、同時包埋された座標フレーム(81)および組織(82)から薄切を4回(83、84、85、86)実施した。それぞれの薄切から得られた切片は、図中87、88、89および90で示される。それぞれの切片は中心に薄切組織(100、101、102、103)があり、外周に座標フレームが配置している。薄切が正確に平行に実施できていれば、座標フレームの太さは同一になるはずだが、85に示される薄切のように斜めになると、96および97で示すように、座標フレームが他(98、99)と比較して太くなる。即ち、座標フレーム(81)の一辺を拡大したもの(91)で説明すると、平行に薄切する時は切断面が92の位置になるが、斜めに切断すると切断面は93の向きになる。薄切切片の座標フレームの幅を測定することにより、座標フレームの厚みはあらかじめ分かっているため、切断面(92)の切断面(93)に対する角度(94)を算出することができる。
【００５７】
以上の工程により、座標フレームを同時包埋かつ同時薄切することにより、薄切方向のゆがみ補正が可能となる。
【００５８】
[実施例４]
本実施例では、実施例１記載の三次元組織像を再構成し、外的観察（組織の形態）および外的観察（核酸・タンパク質発現）に関する全体像を体系的に理解するための解析システムについて説明する。
【００５９】
実施例１で示した方法を実施する際には、座標フレームおよび組織が同時包埋された試料を薄切する薄切装置(51)、得られた薄切切片の二次元像を観察する顕微鏡(52)、座標フレームおよび長さの指標となる凹凸と薄切された組織切片の画像を取り込み組織切片の座標軸を有する二次元画像を算出するプログラムを包含するコンピュータ(53)が必要である。薄切切片は内的観察を実施する前もしくは実施後に例えばHE染色した画像を再度顕微鏡で観察し、座標軸を有する二次元画像(54)を算出させる。染色により細胞内の核酸やタンパク質状態が変化することが懸念されるため、染色は内的観察のための対象領域を採取後に実施することもある。また薄切直後で染色前の形態を顕微鏡により観察し、上記同様座標軸を有する二次元画像を算出させることもある。染色のタイミングは、測定項目により異なり限定されない。しかしながら、薄切直後、染色の前後、微小領域採取の前後、と一枚の薄切切片に対して複数の二次元画像データを保有することにより、重ね合わせの精度が上がることが期待できる。
【００６０】
内的観察のために微小領域を採取し、各微小領域から得られる内的観察の解析結果(55)は、二次元画像データの位置情報と専用のソフトウエアを包含するコンピュータ(53)を利用して紐付けされる。このようにして得られた、それぞれの切片の複数二次元画像データおよび内的観察データを薄切切片間で重ね合わせる。これらは全て、専用のソフトウエアを包含するコンピュータで実施される。重ねあわせの結果、薄切前の三次元構造(56)が再構成され、新たに顕微鏡の観察では得られない内的観察結果(58)が付加された三次元データの表示(57)が可能になる。
【符号の説明】
【００６１】
1  組織
2  座標フレーム
3  長さの指標となる凹凸
4  XY軸方向
5  Z軸方向
6  凍結包埋剤
7  薄切切片
8  座標軸
9  微小領域
10 よれ
11 薄切組織
12 薄切組織のよれ
13 微小領域採取後の薄切切片
14 内的観察を実施した薄切切片
15 外的観察を実施した薄切切片
16〜19 よれの発生部位
20 長さの使用となる凹凸の一つ
31 当初の輪郭
32 一部ゆがんだ微小領域
33 形補正および位置補正を施した薄切切片像
34 複数切片の重ね合わせ
35 座標フレームの底面が円
36 座標フレームの底面が三角形
37 座標フレームの底面が五角形
38〜40 長さの指標となる凹凸
41 柱状壁の厚み
42 薄切
43 座標フレームの太さの異なる薄切切片
44 柱状マーカー
51 薄切装置
52 顕微鏡
53 コンピュータ
54 座標軸を有する二次元画像
55 内的観察の解析結果
56 薄切前の三次元構造
57 内的観察結果が付加された三次元データの表示
58 内的観察結果
81 座標フレーム
82 組織
83〜86 薄切
87 83の薄切により得られる切片
88 84の薄切により得られる切片
89 85の薄切により得られる切片
90 86の薄切により得られる切片
91 座標フレームの一辺を拡大したもの
92 切断面
93 切断面
94 角度
96 太くなった座標フレームの一辺
97 太くなった座標フレームの一辺
98 座標フレームの一辺
99 座標フレームの一辺
100 83の薄切により得られる薄切組織
101 84の薄切により得られる薄切組織
102 85の薄切により得られる薄切組織
103 86の薄切により得られる薄切組織
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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