(57)【要約】      （修正有）【課題】キサントモナス属（Xanthomonas）由来の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）活性化因子結合部位を同定するコンピュータプログラム、アルゴリズム、及び、前記結合部位と結合するＴＡＬＥ−活性化因子の生成方法並びにその使用、の提供。【解決手段】ＴＡＬＥ活性化因子結合部位の候補を同定する方法であって、標的遺伝子を選択するステップと、標的遺伝子配列の１つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、前記部分配列は、前記標的遺伝子の制御領域内にあり、前記部分配列は、前記標的遺伝子の前記制御領域のＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にあり、前記部分配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記部分配列の１番目（５’）のヌクレオチドはチミンであるステップと、ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の候補として、前記１つまたは複数の部分配列を選択するステップとを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キサントモナス属（Xanthomonas）由来の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）
活性化因子結合部位の候補を同定する方法であって、
標的遺伝子を選択するステップと、
標的遺伝子配列の１つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の制御領域内にあり、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の前記制御領域のＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にあり
、
前記部分配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さであり、
任意選択で、前記部分配列の１番目（５’）のヌクレオチドはチミンであるステップと
、
ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の候補として、前記１つまたは複数の部分配列を選択する
ステップとを含む方法。
【請求項２】
標的遺伝子の転写を増加させるＴＡＬＥ−活性化因子を作製する方法であって、
標的遺伝子を選択するステップと、
標的遺伝子配列の１つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の制御領域内にあり、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の前記制御領域のＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にあり
、
前記部分配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さで、好ましくは１８個のヌクレオ
チドの長さであり、
任意選択で、前記部分配列の１番目（５’）のヌクレオチドはチミンであるステップと
、
部分配列を選択するステップと、
改変された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）反復アレイを含み、前記選択さ
れた部分配列と特異的に結合する、改変されたＤＮＡ結合ドメインと、
標的遺伝子の転写を増加させる配列を含むトランス活性化ドメインと
を含む融合タンパク質を生成するステップとを含み、
それによって、前記標的遺伝子の転写を増加させるＴＡＬＥ−活性化因子を作製する、方
法。
【請求項３】
前記ＴＡＬＥ反復アレイが１６．５〜２２．５反復である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
トランス活性化ドメインがＶＰ１６、ＶＰ６４またはＮＦ−ＫＢ  ｐ６５ドメイン、好
ましくはＶＰ６４を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
１つまたは複数の処理装置によって実行されるコンピュータ実装方法であって、
ユーザ装置に、標的遺伝子に関連した情報を受け取るためのユーザ入力機構を含むユーザ
インタフェースを表示させる情報を提供するステップと、
前記ユーザ装置から、選択された標的遺伝子を受け取るステップと、
１つまたは複数のコンピュータによって、標的遺伝子配列の１つまたは複数の部分配列を
同定するステップであって、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の制御領域内にあり、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の前記制御領域のＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にあり
、
前記部分配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さであり、
任意選択で、前記部分配列の１番目（５’）のヌクレオチドはチミンであるステップと
、
前記１つまたは複数の部分配列を選択するステップと、
前記ユーザ装置に、前記選択された１つまたは複数の部分配列の少なくとも一部を表示さ
せる情報を提供するステップとを含む方法。
【請求項６】
細胞内で標的配列の転写を増加させる方法であって、前記細胞を、請求項３から５のい
ずれかに記載の方法によって作製されたＴＡＬＥ−活性化因子に接触させることを含む方
法。
【請求項７】
細胞内で標的配列の転写を増加させる方法であって、前記細胞を、請求項３から５のい
ずれかに記載の方法によって作製された２つ以上のＴＡＬＥ−活性化因子に接触させるこ
とを含む方法。
【請求項８】
前記２つ以上のＴＡＬＥ−活性化因子のうちの少なくとも１つがＶＰ６４を含み、前記
２つ以上のＴＡＬＥ−活性化因子のうちの少なくとも１つがＮＦ−ＫＢ  ｐ６５ドメイン
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的遺伝子がコーディング遺伝子または非コーディング遺伝子である、請求項１か
ら５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記非コーディング遺伝子がｍｉＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的遺伝子の前記制御領域がプロモーター領域である、請求項１から５のいずれか
に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は２０１３年２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／７６２，１２５号の
利益を主張するものである。前述の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の助成を受けた研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された補助金番号ＤＰ１  ＯＤ００６８６２
、Ｐ５０  ＨＧ００５５５０、Ｒ０１  ＮＳ０７３１２４およびＴ３２  ＣＡ００９２１
６の下での政府支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、人工のＴＡＬエフェクター活性化因子（ＴＡＬＥ−活性化因子）を設計およ
び改変するための方法、例えば、コンピュータ実装方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
キサントモナス属（Xanthomonas）由来の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター技
術の急速な進歩で、遺伝子配列または発現の標的改変のためのツールを、研究者は誰でも
構築することができるようになった。高度に保存された３３〜３５個のアミノ酸のＴＡＬ
エフェクター反復ドメインの各々は、２個の高頻度可変性残基の識別性によって規定され
た特異性で、ＤＮＡの１つのヌクレオチドに結合する。１特異的なＤＮＡ配列を認識する
ことができるタンパク質を構築するために、異なる特異性を有する反復を、単純に多量体
化アレイに結合する。最近の成果の多くは、改変されたＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ
（ＴＡＬＥＮ）、つまりＴＡＬエフェクター反復アレイと、さまざまな異なる生物と細胞
型における内在性遺伝子の日常的な標的改変を可能にするヌクレアーゼドメインとからな
る融合物に集中している。１植物およびヒトの細胞で内在性遺伝子発現を増加させること
ができる人工のＴＡＬエフェクター活性化因子（ＴＡＬＥ−活性化因子）を構築するため
に、ＴＡＬエフェクター反復アレイは、転写活性化ドメインにも融合されている。２−１
０対象の標的遺伝子用にカスタムメイドすることができる人工の転写因子は、広く有用な
研究ツールとしての将来性をすでに示して、治療的な応用への可能性がある。１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
少なくとも一部には、本発明は、１６．５〜２２．５の反復からなるＴＡＬＥ−活性化
因子は最適活性を持つという発見、およびＴＡＬＥ−活性化因子によって誘導される遺伝
子発現レベルは、使用する特異的な活性化ドメインを変えることによって、および／また
はＴＡＬＥ−活性化因子の能力を利用することによって、天然に存在する転写因子のよう
に、相乗的に機能するために微調整することができるという発見に基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって第１の態様において、本発明は、１つまたは複数の処理装置によって実行さ
れるコンピュータ実装方法を提供する。この方法は、ユーザ装置に、標的遺伝子に関連し
た情報を受け取るためのユーザ入力機構を含むユーザインタフェースを表示させる情報を
提供するステップと、ユーザ装置から、選択された標的遺伝子を受け取るステップと、１
つまたは複数のコンピュータによって、標的遺伝子配列の１つまたは複数の部分配列を同
定するステップであって、部分配列は、標的遺伝子の制御領域内、例えばプロモーター領
域にあり、部分配列は、標的遺伝子の制御領域のＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にあり、部
分配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記部分配列の１番
目のヌクレオチド（１番目の標準的ＴＡＬＥ−反復ドメインが結合するヌクレオチドの５
’側にある）はチミンであるステップと、１つまたは複数の部分配列を選択するステップ
と、ユーザ装置に、選択された１つまたは複数の部分配列の少なくとも一部を表示させる
情報を提供するステップとを含む。
【０００７】
別の態様において、本発明はキサントモナス属（Xanthomonas）由来の転写活性化因子
様エフェクター（ＴＡＬＥ）活性化因子結合部位の候補を同定する方法を提供する。この
方法は、標的遺伝子を選択するステップと、標的遺伝子配列の１つまたは複数の部分配列
を同定するステップであって、部分配列は、標的遺伝子の制御領域内、例えばプロモータ
ー領域内にあり、部分配列は、標的遺伝子の制御領域のＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にあ
り、部分配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、部分配列の１
番目のヌクレオチド（すなわち、１番目の標準的ＴＡＬＥ−反復ドメインが結合するヌク
レオチドの５’側にある）はチミンであるステップと、ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の
候補として、１つまたは複数の部分配列を選択するステップとを含む。
【０００８】
部分配列の選択は、標的遺伝子の制御領域内、例えば、プロモーター領域内で部分配列
の存在に基づき、標的遺伝子の制御領域のＤＮａｓｅＩ高感受性領域内で、部分配列の存
在に基づき、１８〜２４個のヌクレオチドの長さの部分配列を選択すること、および任意
選択で、部分配列の中の１番目のヌクレオチドのすぐ５’側にヌクレオチドとしてチミン
を持つ配列を選択することが行われた。
【０００９】
いくつかの実施形態において、方法には、以下の１つまたは複数が真であるか、または
真ではない部分配列を同定することを含めることができる：部分配列の２番目のヌクレオ
チドはアデノシンである；部分配列の最も３’側のヌクレオチドはチミンではない；およ
び／または、ＴＡＬエフェクター反復アレイ結合部位の塩基組成は、天然に存在する結合
部位の観察された成分パーセントと２標準偏差を超えて異なる、すなわち、Ａ＝０〜６３
％、Ｃ＝１１〜６３％、Ｇ＝０〜２５％、Ｔ＝２〜４２％以外である。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、標的遺伝子、例えばコーディング遺伝子、または非
コーディング遺伝子、例えばｍｉＲＮＡの転写を増加するＴＡＬＥ−活性化因子を作製す
るための方法を提供する。方法は、標的遺伝子を選択するステップと、標的遺伝子配列の
１つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、部分配列は、標的遺伝子の制御
領域内、例えばプロモーター領域内にあり、部分配列は、標的遺伝子の制御領域のＤＮａ
ｓｅＩ高感受性領域内にあり、部分配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さで、好ま
しくは１８個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、部分配列の１番目のヌクレオチ
ド（１番目の標準的ＴＡＬＥ−反復ドメインが結合するヌクレオチドの５’側にある）は
チミンであるステップと、部分配列を選択するステップと、改変された転写活性化因子様
エフェクター（ＴＡＬＥ）反復アレイを含み、選択された部分配列と特異的に結合する、
改変されたＤＮＡ結合ドメインと、標的遺伝子の転写を増加させる配列を含むトランス活
性化ドメインとを含む融合タンパク質を生成するステップとを含み、それによって、標的
遺伝子の転写を増加させるＴＡＬＥ−活性化因子を作製する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ反復アレイは、１６．５〜２２．５反復である
（Ｃ末端反復は一般的により短く、「ハーフリピート」と呼ばれる）。
【００１２】
いくつかの実施形態において、トランス活性化ドメインはＶＰ１６、ＶＰ６４またはＮ
Ｆ−ＫＢ  ｐ６５ドメイン、好ましくはＶＰ６４を含む。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、細胞内で標的配列の転写を増加させる方法であって
、細胞を、本明細書に記載の方法によって作製されたＴＡＬＥ−活性化因子に接触させる
ことを含む方法を提供する。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、細胞を、本明細書に記載の方法によって作製された
２つ以上のＴＡＬＥ−活性化因子に接触させることにより、細胞内で標的配列の転写を増
加させる方法を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、２つ以上のＴＡＬＥ−活性化因子のうちの少なくとも１
つがＶＰ６４を含み、２つ以上のＴＡＬＥ−活性化因子のうちの少なくとも１つがＮＦ−
ＫＢ  ｐ６５ドメインを含む。
【００１６】
本明細書に記載の方法によって同定された部分配列は、ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位
とも呼ばれる。
【００１７】
部分配列の１番目（５’）のヌクレオチドがチミンである本明細書に記載の方法のいく
つかの実施形態において、部分配列は、各々が単一の標準的ＴＡＬＥ−反復ドメインによ
って特定されるＤＮＡ塩基（例えば、１７〜２３塩基）と、最もアミノ末端側にある標準
的ＴＡＬＥ−反復ドメインが接触する１番目の塩基のすぐ５’側に位置する追加のＴ塩基
とを含み、このＴ塩基は部分配列（すなわち、部分配列は５’Ｔを含む）の一部であるが
、好ましい実施形態で標準的ＴＡＬＥ反復ドメインのうちの１つが結合していない（５’
Ｔは、１番目の標準的ＴＡＬＥ−反復ドメインより先行するＴＡＬＥのＮ末端と接触する
と考えられている。このＴと接触すると考えられている偽の反復様ドメインが存在する）
。例えば、Joung and Sander, Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 49-55 (201
3)を参照されたい。５’ヌクレオチドがチミン以外であるいくつかの実施形態において、
部分配列は１７〜２３個のヌクレオチドの長さとすることができ、いくつかの実施形態で
は、１７〜１８個のヌクレオチドの長さであり、したがってＴＡＬＥ反復ドメインと接触
するヌクレオチドからすべてなる。
【００１８】
定義しない限り、本明細書で使用するすべての専門用語および科学用語は、本発明が属
する当業者によって一般に理解されるものと同義である。方法と材料は、本発明で使用す
るために本明細書に記載され、当技術分野で知られた、他の、適した方法および材料も使
用することができる。材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定する意図は
ない。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録、
およびその他の参考文献は、それらの内容全体を参照によって組み込まれるものとする。
競合する場合には、定義を含めた本明細書が優先されよう。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、次の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の
範囲より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】内在性のヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を標的とする、５４個の可変長ＴＡＬＥ−活性化因子の活性を示す図である。（ａ）ヒトＶＥＧＦ−Ａプロモーター領域を表す概略図。転写開始点を黒矢印で示し、以前に公表したＤＮａｓｅＩ高感受性領域１９を灰色のバーで示す。転写開始部位と比較して＋４００から＋６５０の地点の間に位置するＤＮａｓｅＩ高感受性領域を拡大し、各々のセットにおいて最長のＴＡＬＥ−活性化因子（２４．５ＴＡＬエフェクター反復を含む）が結合した２６ｂｐの部位の位置と向きを赤矢印で示す。各々のＴＡＬＥ−活性化因子は３回検定し、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。星印は、同一セットの他の値と比較して異常値（正規分布と仮定して）の活性化倍数値を示す。試験したすべての活性化因子（セット７から１４．５反復活性化因子を除く）は、片側の、対応があるｔ検定で測定した場合、１より有意に大きい値まで、ＶＥＧＦ−Ａ発現の活性化倍数値を誘導した。
【図１Ｂ】内在性のヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を標的とする、５４個の可変長ＴＡＬＥ−活性化因子の活性を示す図である。（ｂ）５４個の可変長ＴＡＬＥ−活性化因子による２９３細胞におけるＶＥＧＦ−Ａタンパク質発現の活性化。活性化倍数値は、方法に記載されているように計算した。各々のＴＡＬＥ−活性化因子は３回検定し、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。星印は、同一セットの他の値と比較して異常値（正規分布と仮定して）の活性化倍数値を示す。試験したすべての活性化因子（セット７から１４．５反復活性化因子を除く）は、片側の、対応があるｔ検定で測定した場合、１より有意に大きい値まで、ＶＥＧＦ−Ａ発現の活性化倍数値を誘導した。
【図１Ｃ】本研究で用いたＴＡＬＥ−活性化因子構造の概略図である。本発明者らが実験のために用いたＴＡＬＥ−活性化因子構造は、Ｒｅｂａｒと同僚ら（Miller, J.C. et al. Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011)）によって記載された構造と類似している。これらのタンパク質は、ＴＡＬエフェクター反復アレイならびにＮ末端核局在化シグナル（ＮＬＳ）およびＣ末端活性化ドメイン（ＶＰ６４またはｐ６５）の側面に位置するΔ１５２Ｎ末端領域および＋９５Ｃ末端領域を含む。
【図２Ａ】内在性のヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子、ｍｉＲ−３０２／３６７クラスター遺伝子およびＮＴＦ３遺伝子を標的とする、１６個のＴＡＬＥ−活性化因子の活性を示す図である。３つの遺伝子標的のすべてについて、ＶＰ６４（緑色のバー）またはＮＦ−ＫＢ  ｐ６５（青色のバー）活性化ドメインを持つＴＡＬＥ−活性化因子で、実験を３回行った。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。（ａ）ＶＥＧＦ−Ａを標的とするＴＡＬＥ−活性化因子。ＶＥＧＦ−Ａタンパク質の活性化倍数値は、方法に記載されているように測定した。星印は、片側の、対応があるｔ検定で測定した場合、１より有意に大きい値で、ＶＥＧＦ−Ａの活性化倍数を誘導した活性化因子を示す。星印は、片側の対応があるｔ検定で測定した場合、対照と比較してＮＴＦ３転写物レベルの有意な上昇が誘導された活性化因子を示す。
【図２Ｂ】内在性のヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子、ｍｉＲ−３０２／３６７クラスター遺伝子およびＮＴＦ３遺伝子を標的とする、１６個のＴＡＬＥ−活性化因子の活性を示す図である。３つの遺伝子標的のすべてについて、ＶＰ６４（緑色のバー）またはＮＦ−ＫＢ  ｐ６５（青色のバー）活性化ドメインを持つＴＡＬＥ−活性化因子で、実験を３回行った。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。（ｂ）ｍｉＲ−３０２／３６７を標的とするＴＡＬＥ−活性化因子。ｍｉＲ−３０２ａ転写物の活性化倍数値は、方法に記載されているように測定した。星印は、片側の、対応があるｔ検定で測定した場合、１よりも有意に大きいレベルまで、ｍｉＲ−３０２ａ転写物レベルの活性化倍数を誘導した活性化因子を示す。星印は、片側の対応があるｔ検定で測定した場合、対照と比較してＮＴＦ３転写物レベルの有意な上昇が誘導された活性化因子を示す。
【図２Ｃ】内在性のヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子、ｍｉＲ−３０２／３６７クラスター遺伝子およびＮＴＦ３遺伝子を標的とする、１６個のＴＡＬＥ−活性化因子の活性を示す図である。３つの遺伝子標的のすべてについて、ＶＰ６４（緑色のバー）またはＮＦ−ＫＢ  ｐ６５（青色のバー）活性化ドメインを持つＴＡＬＥ−活性化因子で、実験を３回行った。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。（ｃ）ＮＴＦ３を標的とするＴＡＬＥ−活性化因子。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡと比較したＮＴＦ３  ｍＲＮＡの発現レベルを示す。星印は、片側の対応があるｔ検定で測定した場合、対照と比較してＮＴＦ３転写物レベルの有意な上昇が誘導された活性化因子を示す。
【図２Ｄ】ＴＡＬＥ−活性化因子の活性と、前述した計算的に由来する標的部位ガイドライン違反との間の相関関係を示す図である。（ｄ）ガイドライン違反とヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を標的とした５４個のＴＡＬＥ−活性化因子の活性。相関ｐ値を示す。
【図２Ｅ】ＴＡＬＥ−活性化因子の活性と、前述した計算的に由来する標的部位ガイドライン違反との間の相関関係を示す図である。（ｅ）（ｄ）の場合と同一データだが、それぞれがオーバーラップ部位を標的とした１４．５、１６．５、１８．６、２０．５、２２．５または２４．５のＴＡＬエフェクター反復アレイを含む６個のＴＡＬＥ−活性化因子からなる９セットへ分けた。
【図３Ａ】（ａ）ＶＥＧＦ−Ａ内のＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の概略模式図である。太い黒線はエクソンを示し、細い黒線はイントロンまたはプロモーター領域を示し、黒い矢印は転写の開始部位を示す。太い青線は、ｍｉＲＮＡを表す。灰色のバーは、デジタルＤＮａｓｅＩ高感受性領域を示す。本発明者らが標的とするＤＮａｓｅＩ高感受性領域を拡大し、赤い矢印は、ＤＮＡ上で結合した時、ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の正確な位置と活性化因子の向きを表す（矢印はその標的ＤＮＡ部位に結合した時、アミノ末端からカルボキシ末端までタンパク質の方向を示す）。
【図３Ｂ】（ｂ）ｍｉＲ−３０２／３６７内のＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の概略模式図である。太い黒線はエクソンを示し、細い黒線はイントロンまたはプロモーター領域を示し、黒い矢印は転写の開始部位を示す。太い青線は、ｍｉＲＮＡを表す。灰色のバーは、デジタルＤＮａｓｅＩ高感受性領域を示す。本発明者らが標的とするＤＮａｓｅＩ高感受性領域を拡大し、赤い矢印は、ＤＮＡ上で結合した時、ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の正確な位置と活性化因子の向きを表す（矢印はその標的ＤＮＡ部位に結合した時、アミノ末端からカルボキシ末端までタンパク質の方向を示す）。
【図３Ｃ】（ｃ）ＮＴＦ３遺伝子プロモーター領域内のＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の概略模式図である。太い黒線はエクソンを示し、細い黒線はイントロンまたはプロモーター領域を示し、黒い矢印は転写の開始部位を示す。太い青線は、ｍｉＲＮＡを表す。灰色のバーは、デジタルＤＮａｓｅＩ高感受性領域を示す。本発明者らが標的とするＤＮａｓｅＩ高感受性領域を拡大し、赤い矢印は、ＤＮＡ上で結合した時、ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の正確な位置と活性化因子の向きを表す（矢印はその標的ＤＮＡ部位に結合した時、アミノ末端からカルボキシ末端までタンパク質の方向を示す）。
【図４】可能性のあるＴＡＬＥ−活性化因子結合部位を同定する、例示的な方法のフローチャートを示す図である。
【図５】本方法に用いられる計算装置の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ＴＡＬＥ−活性化因子は幅広い応用の可能性があるが、文献に記載されたように、現在
までのところ、これらのタンパク質の低い活性と限定された標的範囲により、この技術の
頑健性に対して懸念が生じる。内在性遺伝子用に作製された、公開されたＴＡＬＥ−活性
化因子は通常、非常に適度の活性を示し３−６，８，９、前述した２６個のタンパク質の
うち１３個が（そのために、量的情報が利用可能である）３倍以上に標的遺伝子発現を誘
導し、２６個中わずか４個が５倍以上活性化した（表１）。
【００２２】
【表１−１】
2019068811.tif 000002
【表１−２】
2019068811.tif 000003
これらの低い活性が観察されたことについての１つの可能性のある説明は、いくつかのＤ
ＮＡ配列がＴＡＬＥ−活性化因子によって標的とされるには最適状態に及ばない場合があ
るということであり、Ｂｏｇｄａｎｏｖｅと同僚らによって、最近、ある概念が標的部位
を選択するための計算機的に導かれた５つのガイドラインに体系化された（Doyle, E.L. 
et al., Nucleic Acids Res 40, W117-122 (2012)、さらに以下で論ずる）。これに合わ
せて、上述の２６個の公開されたＴＡＬＥ−活性化因子に対する２０個の標的部位のうち
の１９個は、これらの５つのガイドラインの１つまたは複数に適合しない（表２）。さら
に以下で論じられるように、低い活性化倍数値が観察された別の可能性のある理由は、以
前の研究に使用されたさまざまなＴＡＬＥ−活性化因子構造のいくつかが最適でない場合
があるということがありえる。しかし、内在性遺伝子標的２，４，５，７，９，１０上で
試験されたＴＡＬＥ−活性化因子を構築するために現在まで用いられた７つの異なる構造
は、比較的少ない数の部位でのみ評価されたので、個々の効率を評価することが困難であ
った（表１および２）。したがって、広い標的範囲を持ち、頑健で十分に検証されたＴＡ
ＬＥ−活性化因子のプラットホームは、まだこれらのタンパク質を使用することに関心が
ある研究者に同定されていない。
【００２３】
本明細書に記載されているのは、単一の一般的な構造上に構築されたＴＡＬＥ−活性化
因子であり、この構造ではヒト細胞でこれらのタンパク質の活性に影響を及ぼすパラメー
タおよび影響を及ぼさないパラメータが系統的に定められる。本明細書で示すように、い
くつかの重要な定義された長さのＴＡＬＥ−活性化因子は、ヒト細胞においてタンパク質
コーディング遺伝子のみならず、非コーディングマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子の
転写も頑健に活性化することができる。さらに、現在のプラットホームで作製されたＴＡ
ＬＥ−活性化因子は、標的部位選択を制限する前述の計算機的に導かれた５つのガイドラ
インのうちの４つによって束縛されず（Doyle, E.L. et al., Nucleic Acids Res 40, W1
17-122 (2012)）、それによって、これらのタンパク質の標的範囲が大いに拡大する。最
後に、標的遺伝子発現のレベルは、使用する特異的な活性化ドメインを変えることによっ
て、および／またはＴＡＬＥ−活性化因子の能力を利用することによって、天然に存在す
る転写因子のように、相乗的に機能するために可変的に調整することができる。まとめる
と、現在のデータは、公表された文献に反して、ＴＡＬＥ−活性化因子が本当に、ヒト細
胞で広作動域にわたって、本質的に対象のいかなる内在性遺伝子の発現でも制御するため
の頑健なプラットホームであるという明白で大規模な証拠を提供する。
【００２４】
単量体ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位を選択するためのガイドラインおよび標的範囲に及
ぼす影響
Ｃｅｒｍａｋらは、最初は、改変された二量体ＴＡＬＥＮの最適なＴＡＬＥ−活性化因
子結合部位を同定するための５つのガイドラインを提案した（Cermak, T. et al. Nuclei
c Acids Res 39, e82 (2011)）。これらのガイドラインは、天然に存在するＴＡＬエフェ
クターの結合選択性に関するデータから計算機的に導かれたが、実験的には前向きに検証
されなかった。以前に要約されたように（Doyle, E.L. et al. Nucleic Acids Res 40, W
117-122 (2012)）、Ｃｅｒｍａｋガイドラインは以下のように示すことができる。
１．  ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の１番目のヌクレオチドのすぐ５’側にあるヌクレ
オチドは、チミンでなければならない。
２．  ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の１番目のヌクレオチドは、チミンであってはなら
ない。
３．  ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の２番目のヌクレオチドは、アデノシンであっては
ならない。
４．  ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の最も３’側にあるヌクレオチドは、チミンでなけ
ればならない。
５．  ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の塩基組成は、天然に存在する結合部位の観察され
た組成パーセントと２標準偏差を超えて異なってはならない。天然に存在するＴＡＬエフ
ェクター反復アレイ結合部位の組成パーセントは、次のように定量した。Ａ＝３１±１６
％、Ｃ＝３７±１３％、Ｇ＝９±８％、Ｔ＝２２±１０％。したがって、ＴＡＬＥ−活性
化因子結合部位の塩基組成は、以下の通りでなければならない。Ａ＝０〜６３％、Ｃ＝１
１〜６３％、Ｇ＝０〜２５％、Ｔ＝２〜４２％。
以前の大規模な研究において、ガイドライン２〜５の１つまたは複数に違反する標的結合
部位のために、高活性な二量体ＴＡＬＥＮを作製することが可能であることが証明された
（標的とする部位のどれもガイドライン１に違反しない）（Reyon, D. et al. Nat Biote
chnol 30, 460-465 (2012)）。本明細書に示されるように、ガイドライン違反の数と改変
された二量体ＴＡＬＥＮの活性との間に有意な相関関係は存在しない（Reyon, D. et al.
(2012)）。これらの結果は、二量体ＴＡＬＥＮの標的部位を選択する場合、ガイドライ
ン２〜５に従う必要はないことを強く示唆した。
【００２５】
最近、Ｄｏｙｌｅらは、単量体ＴＡＬエフェクター型のタンパク質のための標的結合部
位選択は、これらの同一の５つのガイドラインによって制限されなければならないことを
示唆した（Doyle, E.L. et al. Nucleic Acids Res 40, W117-122 (2012)）。ＴＡＬＥ−
活性化因子で使用する単量体ＴＡＬエフェクター反復アレイの標的部位を選択する時、Ｂ
ｏｇｄａｎｏｖｅと同僚らによって最近開発されたＴＡＬＥ−ＮＴ  ２．０ウェブ系のソ
フトウェアツール（ｂｏｇｌａｂ．ｐｌｐ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ）（Doyle, E.L. et
al. Nucleic Acids Res 40, W117-122 (2012)）がそのデフォルト設定にこれらの５つの
ガイドラインも適用している。
【００２６】
【表２】
2019068811.tif 000004
【００２７】
これらの先行技術ガイドラインの実行は、改変された単量体ＴＡＬＥ−活性化因子の標
的範囲を実質的に制限する影響を持つ。例えば、５つのガイドラインを適用すると、標的
にできる１８ｂｐの部位（１６．５のＴＡＬエフェクター反復アレイに結合される）の同
定は、ランダムなＤＮＡ配列の２７ｂｐごとに１回に制限される。対照的に、ガイドライ
ン２〜５を緩和すると、標的にできる１８ｂｐの部位を、ランダムなＤＮＡの２ｂｐごと
に１回見つけることができるようになり、標的範囲が１３倍超に改善する。
【００２８】
したがって、いくつかの実施形態において、現在の方法は、結合部位がＤＮａｓｅＩ高
感受性領域の中にあるＴＡＬＥ−活性化因子結合部位を選択することを含み、標準的ＴＡ
ＬＥ−反復ドメイン結合部位の１番目のヌクレオチドのすぐ５’側にあるヌクレオチドは
チミンであり、結合部位は１８〜２４ｂｐの長さ（５’Ｔを含めて）である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、以下の１つまたは複数も真である：
Ａ．  ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の１番目のヌクレオチドは、チミンである、
Ｂ．  ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の２番目のヌクレオチドは、アデノシンである、
Ｃ．  ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の最も３’側にあるヌクレオチドは、チミンではな
い、および／または
Ｄ．  ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の塩基組成は、天然に存在する結合部位の観察され
た組成パーセントと２標準偏差を超えて異なる、すなわち、Ａ＝０〜６３％、Ｃ＝１１〜
６３％、Ｇ＝０〜２５％、Ｔ＝２〜４２％以外である。
いくつかの実施形態において、Ｂ〜Ｄの１つまたは複数、例えば、すべてが、真であると
いうわけではない。
【００３０】
ＴＡＬＥ−活性化因子を改変する方法
本明細書に記載されているのは、ヒト細胞で内在性の遺伝子発現を頑健に活性化させる
ために使用可能なＴＡＬＥ−活性化因子構造の大規模なバリデーションおよび最適化であ
る。この構造に対するＴＡＬエフェクター反復数の影響の系統的検定により、１６．５〜
２２．５反復（標的部位は、長さが１８〜２４ｂｐで、結合部位の５’末端がＴ）からな
るＴＡＬＥ−活性化因子が最適活性を有することが証明された。データより、この構造上
に作られるＴＡＬＥ−活性化因子は、公表された計算機的に導かれた５つのガイドライン
のうちの４つを厳守する必要はないことを示す明確な実験的な証拠も提供され（Doyle, E
.L. et al., Nucleic Acids Res 40, W117-122 (2012)）、それによって、このプラット
ホームの標的範囲が、ランダムなＤＮＡ配列の２ｂｐごとに１つの１８ｂｐ部位まで大い
に拡大する。これらのパラメータは、既知または予測されたＤＮａｓｅＩ高感受性部位内
の部位を標的とするＴＡＬＥ−活性化因子を前向きに作製すること、ならびにタンパク質
コーディング遺伝子およびｍｉＲＮＡクラスター遺伝子上で高い活性と高い成功率を示す
こと、より頑健ではない活性化を記載した以前に公表した研究に対比して支持する結果、
によって検証された（表１）。
【００３１】
したがって、本明細書に記載された方法は、対象の標的配列、好ましくは標的遺伝子の
制御領域、例えば、プロモーターの一部であるかまたはそれを含む標的配列を選択するこ
とを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、例えば、１つまたは複数のデータ
ベースとの比較に基づき、既知のＤＮａｓｅＩ高感受性領域にある標的配列を選択するこ
とを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にあ
る標的配列を同定するための、当技術分野で知られたＤＮａｓｅＩ過敏性検定を実行する
ことを含む。
【００３２】
方法は、本明細書に示すガイドラインに基づいて、可能性のある（または候補となる）
ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位（すなわち、ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位は１８〜２４
ｂｐの長さで好ましくは５’Ｔを含む）、を同定することをさらに含む。いくつかの実施
形態において、ユーザは、例えば長さの入力ボックスに新しい値を入力して、この長さの
制約を変えることができる。本明細書に記載される研究は、１６．５〜２２．５の反復（
好ましくは５’Ｔを含み、１８〜２４ｂｐの長さの部位に結合する）からなるＴＡＬエフ
ェクター反復アレイは、ＴＡＬＥ−活性化因子の頑健な活性を確実に持つように作製され
なければならないことを示唆する。
【００３３】
一度、本明細書に記載される方法を用いて結合部位が同定されると、方法は、同定され
た結合部位と結合するＴＡＬＥ−活性化因子を生成することをさらに含むことができる。
ＴＡＬＥ−活性化因子は、転写活性化因子に融合するＴＡＬエフェクター反復アレイアセ
ンブリ（同定された結合部位と結合する）を含む。ＴＡＬＥ−活性化因子に使用すること
ができる転写活性化因子は、当技術分野で、例えば、１つまたは複数の、好ましくは４つ
のＶＰ１６ペプチド（すなわち、ＶＰ６４）、またはＮＦ−ＫＢ  ｐ６５トランス活性化
ドメインが知られている。例えば、Tremblay et al., Hum Gene Ther. 2012 Aug 23(8):8
83-90、Li et al., Scientific Reports 2:897 (2012) DOI: 10.1038/srep00897、および
ＵＳ２０１１０３０１０７３を参照されたい。
【００３４】
ＴＡＬエフェクター反復アレイは、一般的に３３〜３５個のアミノ酸の長さのタンデム
リピートを含む。各々の反復は、１２番目および１３番目の２つの可変的なアミノ酸であ
る反復可変性２残基（ＲＶＤ：ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉ−ｒｅｓｉｄｕｅ
）を除いてほとんど同一である。Ｃ末端の反復は一般により短く、「ハーフリピート」と
呼ばれる。各々の反復は、簡単なコードに基づいて単一塩基対と結合する。最も一般的な
４つのＲＶＤは、各々優先して４つの塩基のうちの１つと結合する（ＨＤはＣに、ＮＩは
Ａに、ＮＧはＴに、ＮＮはＧに）（例えば、Li et al., Scientific Reports 2:897 (201
2)、Boch et al., Review of Phytopathology 48: 419-36、ＵＳ２０１１０３０１０７３
を参照されたい）。したがって、Ｎ．５ドメインを持つ改変されたＴＡＬＥ−活性化因子
タンパク質は、Ｎ．５＋１．５ｂｐの長さ（５’Ｔを含む）の部位と接触する。例えば、
本明細書に記載の１２．５ドメインの長さのＴＡＬＥ−活性化因子タンパク質は、もし存
在するならば５’Ｔを含めて１４ｂｐの部位と、または、５’Ｔがなければ１３ｂｐの部
位と接触する。
【００３５】
ＴＡＬエフェクター反復アレイアセンブリのための多くの方法が、当技術分野で知られ
ており（例えば、ＲＥＡＬ（Sander, J.D. et al. Nat Biotechnol 29, 697-698 (2011)
、Reyon, D. et al. Curr Protoc Mol Biol., 2012 Oct;Chapter 12:Unit12.15）、ＲＥ
ＡＬ−Ｆａｓｔ（Reyon, D. et al. Curr Protoc Mol Biol., 2012 Oct;Chapter 12:Unit
12.15）、またはＦＬＡＳＨ（Reyon, D. et al. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012)お
よびＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４６４５１））、本レポートで使用される構造上でＴＡＬ
Ｅ−活性化因子を構築するのに用いることができる。ＲＥＡＬを実行するために必要なす
べてのプラスミドは、非営利的プラスミド配送サービスＡｄｄｇｅｎｅ（ａｄｄｇｅｎｅ
．ｏｒｇ／ｔａｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／）を通して入手可能である。ＦＬＡＳＨおよ
びＲＥＡＬ−Ｆａｓｔを実行するために必要な３７６種類のプラスミドのアーカイブも利
用できる（ＴＡＬｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ）。当技術分野で知られている分子生
物学的技術を、ＴＡＬＥ−活性化因子を構築するために用いることができる。例えば、Tr
emblay et al., Hum Gene Ther. 2012 Aug;23(8):883-90、Li et al., Scientific Repor
ts 2:897 (2012) DOI: 10.1038/srep00897、およびＵＳ２０１１０３０１０７３を参照さ
れたい。
【００３６】
ＤＮａｓｅＩ高感受性部位
本明細書で使用されるように、「ＤＮａｓｅＩ高感受性領域部位」は、ＤＮａｓｅＩの
優れた感度によって識別されて切断されるクロマチンの短い領域である。ＤＮａｓｅＩ高
感受性部位は、例えば経験的に、当技術分野で知られている方法を用いて同定することが
できるか、または、公開されたデータまたはＤＮａｓｅＩ高感受性部位のデータベースに
基づいて同定することができる。例えば、ＤＮａｓｅＩフィンガープリント法は、無傷の
核のＤＮａｓｅＩ消化、Ｓａｂｏら（Nat Methods. 2006 Jul;3(7):511-8.）が記載して
いるＤＮａｓｅＩ『ダブルヒット』フラグメントの単離、およびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＩＩ
ｘ（および２０１１年前半までのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ）プラットホーム（３６
ｂｐリード）を用いたフラグメント末端（生体内ＤＮａｓｅＩ切断部位と一致する）の直
接シーケンスを含む方法によって実行することができる。高品質のリードの一意的なマッ
ピングは、Ｂｏｗｔｉｅを用いてゲノムにマッピングすることができる。ＤＮａｓｅＩの
感度は未加工のタグ密度に直接反映され、それは１５０ｂｐの移動窓（ゲノムを横断する
２０ｂｐのステップで）の範囲内にマッピングされるタグ密度としてトラックに示される
。ＤＮａｓｅＩ感受性ゾーン（ホットスポット）を、次いで、Ｓａｂｏら（Proc Natl Ac
ad Sci U S A. 2004 Nov 30;101(48):16837-42）に記載されたホットスポットアルゴリズ
ムを使用して同定することができる。いくつかの実施形態において、１．０％の偽発見率
（ＦＤＲ：ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ  １．０％）閾値は、ホットスポ
ットアルゴリズムを等価数のランダムな一意的なマッピングの３６ｍｅｒに適用すること
によって、各々の細胞型に対して計算される。ＤＮａｓｅＩ高感受性部位（ＤＨＳ：ＤＮ
ａｓｅＩ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｔｅまたはピーク）は、次いでピーク発
見アルゴリズムを用いて、ＦＤＲ  １．０％の高感受性ゾーンの範囲内にシグナルピーク
として同定される（Ｉ−ｍａｘ）。
【００３７】
ＤＮａｓｅＩ高感受性部位を同定する他の方法を使用することもできる。例えば、Madr
igal and Krajewski, Front Genet. 2012; 3:230、Wu, Nature. 1980 Aug 28; 286(5776)
:854-60、Gross and Garrard, Annu Rev Biochem. 1988; 57:159-97、Boyle et al., Cel
l. 2008 Jan 25; 132(2):311-22を参照されたい。ＭｃＤａｎｉｅｌｌら、ＤＮａｓｅＩ
高感受性部位のデータベースを使用して候補サブサイトを同定および選択することもでき
る（例えば、ワシントン大学ＥＮＣＯＤＥデータ中に同定されたＤＮａｓｅＩ高感受性領
域）。そのような部位は、ＵＣＳＣゲノムブラウザー（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ
、Rosenbloom et al. Nucleic Acids Res 40, D912-917 (2012)）を使用して同定するこ
とができる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、対象の特定の細胞型から得た経験的なＤＮａｓｅＩ感受
性データが用いられ、すなわち、転写の増加が要求される同一の細胞型（すなわち、標的
細胞型）。いくつかの実施形態において、複数の異なる細胞型でＤＮａｓｅＩ高感受性部
位であると同定されたＤＮａｓｅＩ高感受性部位を、これらの領域は標的細胞型のオープ
ンクロマチンである可能性が高いという推論に基づいて選択する。
【００３９】
コンピュータおよびソフトウェアに基づく実施形態
いくつかの実施形態において、ここに記載されたシステムおよび方法のさまざまな実行
は、デジタル電子回路、集積回路、特注の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ：ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｃｉｒｃｕｉｔ）、コンピュ
ータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェアおよび／またはその組み合わせで実現
することができる。これらのさまざまな実行は、少なくとも１台のプログラム可能なプロ
セッサを含むプログラマブルシステム上で実行可能および／または解釈可能な１つまたは
複数のコンピュータプログラムに、実装を含めることが可能で、記憶装置、少なくとも１
台の入力装置、および少なくとも１台の出力装置からデータと命令を受信すること、およ
びデータと命令を転送することを連結した、特別なまたは一般的な目的である場合がある
。
【００４０】
これらのコンピュータプログラム（別名プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプ
リケーションまたはコード）は、プログラム可能なプロセッサのためにマシン命令を含み
、高水準手続き型プログラミング言語および／またはオブジェクト指向プログラミング言
語で、および／またはアセンブリ言語／機械語で実装することができる。本明細書で用い
られるように、「マシン可読媒体」および「コンピュータ可読媒体」という用語は、マシ
ン命令をマシン可読シグナルとして受信するマシン可読媒体を含む、マシン命令および／
またはデータをプログラム可能なプロセッサに提供するために用いられる、任意の計算機
プログラム製品、機器および／または装置（例えば、磁気ディスク、光ディスク、メモリ
、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ：Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｌｏｇｉｃ  
Ｄｅｖｉｃｅ））を指す。「マシン可読シグナル」という用語は、マシン命令および／ま
たはデータをプログラム可能なプロセッサに提供するために用いられる任意のシグナルを
指す。
【００４１】
ユーザとの対話を可能にするために、ここに記載されるシステムおよび技術を、情報を
ユーザに表示するための表示装置（例えば、ブラウン管（ＣＲＴ：ｃａｔｈｏｄｅ  ｒａ
ｙ  ｔｕｂｅ）モニタまたは液晶ディスプレイ（ＬＣＤ：ｌｉｑｕｉｄ  ｃｒｙｓｔａｌ
ｄｉｓｐｌａｙ）モニタ）およびキーボード、ならびにポインティング装置（例えば、
マウスまたはトラックボール）を備えたコンピュータに実装することができ、これによっ
てユーザはコンピュータに入力が可能になる。他の種類の装置も同様に、ユーザとの対話
を可能にするために、使用することができる。例えば、ユーザに提供されるフィードバッ
クは、感覚のフィードバック（例えば、視覚フィードバック、聴覚フィードバックまたは
触覚フィードバック）のどのような形でもよく、ユーザからの入力は、音響入力、音声入
力または触覚入力を含む、どのような形でも受信することができる。
【００４２】
ここに記載されるシステムおよび技術は、バックエンド構成要素（例えば、データサー
バとして）を含む計算機システム、またはミドルウェア構成要素（例えば、アプリケーシ
ョンサーバ）を含む計算機システム、またはフロントエンド構成要素（例えば、グラフィ
ックユーザインタフェースまたはウェブブラウザーを備えたクライアントコンピュータで
、これによりユーザはここで記載されるシステムおよび技術の実行と対話することができ
る）を含む計算機システム、あるいはそのようなバックエンド構成要素、ミドルウェア構
成要素またはフロントエンド構成要素の任意の組み合わせに実装することができる。シス
テムの構成要素は、デジタルデータ通信（例えば、通信ネットワーク）のどのような形式
または媒体ででも相互接続することができる。通信ネットワークの例には、ローカルエリ
アネットワーク（「ＬＡＮ：ｌｏｃａｌ  ａｒｅａ  ｎｅｔｗｏｒｋ」）、ワイドエリア
ネットワーク（「ＷＡＮ：ｗｉｄｅ  ａｒｅａ  ｎｅｔｗｏｒｋ」）およびインターネッ
トが含まれる。
【００４３】
計算機システムには、クライアントとサーバを含めることができる。クライアントとサ
ーバは、通常、互いに離れていて、一般的に通信ネットワークを通して対話する。クライ
アントとサーバの関係は、それぞれのコンピュータで作動し、互いにクライアント−サー
バ関係があるコンピュータプログラムによって生じる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、可能性のあるＴＡＬＥ−活性化因子結合部位のコンピュ
ータに基づく同定は、図４に示すように実行される。いくつかの実施形態において、同定
には、標的配列を含むユーザが入力したクエリーとデータベースに保管された高感受性領
域に関連したレコードとの比較が含まれる。計算機システムは、標的遺伝子に関連した情
報を受け取るためのユーザ入力機構を含むユーザインタフェースを、ユーザ装置に表示さ
せる（１０１）。対象の標的配列、好ましくは標的遺伝子の制御領域、例えば、プロモー
ターの一部であるかまたはそれを含む標的配列は、ユーザによって、例えば、クエリーボ
ックスに入力することによって、現在の方法を実行するようにプログラムされたコンピュ
ータプロセッサに提供される。制御領域は、当技術分野で知られている方法、例えば、デ
ータベース、または実証研究を使用して同定することができる。システムはユーザ入力ク
エリーを受け取り（１０２）（任意選択でクエリーをフォーマットする）、データベース
から１つまたは複数のレコードを選択するために、クエリーを使用する。いくつかの実施
形態において、プロセッサは計算機システムでアクセス可能な１つまたは複数のデータベ
ースに保存されたレコードとの比較に基づいて、標的配列の中で、ＤＮａｓｅＩ高感受性
領域を同定する。いくつかの代替の実施形態において、ユーザは、すでにＤＮａｓｅＩ高
感受性領域内にあることが知られている標的配列を提供する。いくつかの実施形態におい
て、ＤＮａｓｅＩ高感受性領域は経験的に同定することができ、配列はコンピュータに入
力された。
【００４５】
ＤＮａｓｅＩ高感受性領域が同定されると、プロセッサは次いで、本明細書で示すガイ
ドラインに基づいてその領域の範囲内に可能性のあるＴＡＬＥ−活性化因子結合部位、す
なわち、１８〜２４ｂｐの長さの部位に結合する、１６．５〜２２．５の反復からなるＴ
ＡＬＥ−活性化因子結合部位を同定する（１０３）。いくつかの実施形態において、例え
ば、長さの入力ボックスに新しい値を入力することによって、ユーザはこの長さの制約を
変えることができる。ユーザによって入力された長さの制約の変更は、最初のクエリー定
義の一部として、または、事前の検索に基づいて提供された１組の結果をさらに選別する
方法として計算機システムによって受け取られる可能性がある。本レポートの研究は、１
６．５〜２２．５の反復（１８〜２４ｂｐの長さの部位に結合する）からなるＴＡＬエフ
ェクター反復アレイのみがＴＡＬＥ−活性化因子の頑健な活性を確実に持つようにしなけ
ればならないことを示唆する。プロセッサは、次いでＴＡＬＥ−活性化因子結合部位であ
る可能性の配列を１つまたは複数選択し（１０４）、同定されたＴＡＬＥ−活性化因子結
合部位である可能性の配列をユーザに、例えば、スクリーン上のディスプレイ、コンピュ
ータ可読媒体の記憶装置、または、電子メールなどのメッセージへの封入によって提供す
る（１０５）。
【００４６】
いくつかの実施形態において、計算機システムはＴＡＬＥ−活性化因子を生成するため
に必要な情報を含むデータベースと関係している。ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の同定
の際に、ソフトウェアは追加の保存された情報にアクセスし、例えばＦＬＡＳＨまたはＲ
ＥＡＬ／ＲＥＡＬ−Ｆａｓｔを用いて、ユーザにＴＡＬＥ−活性化因子を生成するために
必要なさらなる情報へのアクセスを提供してよい。例えば、いくつかの実施形態において
、選択したアセンブリの方法に従い（ＦＬＡＳＨまたはＲＥＡＬ／ＲＥＡＬ−Ｆａｓｔ）
、計算機システムは、アセンブリのために必要なプラスミドの名前に関する情報と、任意
に印刷できるグラフィックガイドをユーザに提供する。ＲＥＡＬを実行するために必要な
すべてのプラスミドは、非営利的プラスミド配送サービスＡｄｄｇｅｎｅ（ａｄｄｇｅｎ
ｅ．ｏｒｇ／ｔａｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／）を通して入手可能である。ＦＬＡＳＨお
よびＲＥＡＬ−Ｆａｓｔを実行するために必要な３７６種類のプラスミドのアーカイブも
利用できる（ＴＡＬｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ）。
【００４７】
図５は一般的なコンピュータ装置９００と一般的なモバイル計算装置９５０の例を示し
、それらはここに記載された技術と共に使用してよい。計算装置９００は、ラップトップ
、デスクトップ、ワークステーション、携帯情報端末、サーバ、ブレードサーバ、メイン
フレームおよび他の適切なコンピュータなどのデジタル計算機のさまざまな形式を表すこ
とを意図している。計算装置９５０は、携帯情報端末、携帯電話、スマートフォンおよび
他の類似した計算装置などのモバイル装置のさまざまな形式を表すことを意図している。
ここで示される構成要素、それらの接続および関係、ならびにそれらの機能は、例示的で
あるだけで、記載されたおよび／または主張された実装例を限定するものではない。
【００４８】
計算装置９００は、プロセッサ９０２、メモリ９０４、記憶装置９０６、メモリ９０４
および高速拡張ポート９１０に接続する高速インタフェース９０８、ならびに低速バス９
１４および記憶装置９０６に接続する低速インタフェース９１２を含む。構成要素９０２
、９０４、９０６、９０８、９１０および９１２の各々は、さまざまなバスを使用して相
互接続し、共通のマザーボード上に、または、必要に応じて他の方法で装着してよい。プ
ロセッサ９０２は、外部入出力装置（例えば高速インタフェース９０８に連結したディス
プレイ９１６）にＧＵＩのグラフィック情報を示すための、メモリ９０４の中、または、
記憶装置９０６に保存された命令を含む実行命令を、計算装置９００の中で処理すること
ができる。他の実装例では、必要に応じて、複数のメモリおよびメモリの種類とともに、
複数のプロセッサおよび／または複数のバスが使用してよい。また、複数の計算装置９０
０を、必要な操作（例えば、サーバ列、一群のブレードサーバ、またはマルチプロセッサ
システムとして）の部分を提供している各々の装置と連結してよい。
【００４９】
メモリ９０４は、計算装置９００の中に情報を保存する。一実装例では、メモリ９０４
は１つまたは複数の揮発性メモリユニットである。他の実装例では、メモリ９０４は１つ
または複数の不揮発性メモリユニットである。メモリ９０４は、磁気ディスクまたは光デ
ィスクなどのコンピュータ可読媒体の別の形式であってよい。
【００５０】
記憶装置９０６は、大容量記憶装置を計算装置９００に提供することができる。一実装
例では、記憶装置９０６は、フロッピーディスク装置、ハードディスク装置、光ディスク
装置、もしくはテープ装置、フラッシュメモリもしくは他の類似したソリッドステートメ
モリ装置、または保存領域ネットワークもしくは他の構成の装置を含む一連の装置などの
コンピュータ可読媒体であってよく、あるいはそれを含んでよい。コンピュータプログラ
ム製品を、情報担体に明らかに組み入れることができる。コンピュータプログラム製品は
、実行される時、上述の方法などの、１つまたは複数の方法を実行する命令も含んでよい
。情報担体は、メモリ９０４、記憶装置９０６、プロセッサ９０２上のメモリ、または伝
搬したシグナルなどのコンピュータ可読媒体またはマシン可読媒体である。
【００５１】
低速制御装置９１２がより低帯域幅集約型の動作を管理する一方で、高速制御装置９０
８は計算装置９００のために帯域幅集約型の操作を管理する。このような機能の割り当て
は、例示であるだけである。一実装例では、高速制御装置９０８は、メモリ９０４、ディ
スプレイ９１６（例えば、グラフィックスプロセッサまたはアクセラレータを介して）、
および高速拡張ポート９１０に結合し、さまざまな拡張カード（図示せず）を取り付けて
よい。実装例では、低速制御装置９１２は、記憶装置９０６と低速拡張ポート９１４に結
合する。低速拡張ポートは、さまざまなコミュニケーションポート（例えば、ＵＳＢ、ブ
ルートゥース、イーサネット、無線イーサネット）を含んでよく、例えばキーボード、ポ
インティング装置、スキャナ、または例えばネットワークアダプタを介したスイッチもし
くはルータなどのネットワーク装置、などの１つまたは複数の入出力装置に結合してよい
。
【００５２】
図に示すように、計算装置９００はいくつかの異なる形で実装される場合がある。例え
ば、それは標準規格サーバ９２０、または一群のそのようなサーバの複数回として実装し
てよい。それは、ラックサーバシステム９２４の一部として実装してもよい。さらに、そ
れはラップトップコンピュータ９２２のようなパーソナルコンピュータで実装してよい。
あるいは、計算装置９００の構成要素を、モバイル装置の（図示せず）他の構成要素（例
えば装置９５０）と組み合わせてよい。そのような装置の各々は、１つまたは複数の計算
装置９００、９５０を含めてよく、システム全体は互いに通信している複数の計算装置９
００、９５０から構成される場合がある。
【００５３】
計算装置９５０は、その他の構成要素の中で、プロセッサ９５２、メモリ９６４、入出
力装置（例えばディスプレイ９５４）、通信インタフェース９６６、およびトランシーバ
９６８を含む。追加の記憶装置を提供するために、装置９５０は記憶装置、例えばマイク
ロドライブまたは他の装置を備えてもよい。構成要素９５０、９５２、９６４、９５４、
９６６および９６８の各々は、さまざまなバスを使用して相互接続し、構成要素のいくつ
かを共通のマザーボード上に、または、必要に応じて他の方法で装着してよい。
【００５４】
プロセッサ９５２は、メモリ９６４に保存された命令を含む計算装置９５０の中で、命
令を実行することができる。プロセッサは、別々で複数のアナログプロセッサおよびデジ
タルプロセッサを含むチップのチップセットとして実装してよい。プロセッサは、例えば
、ユーザインタフェースの制御、装置９５０が実行するアプリケーション、および装置９
５０での無線通信、などの装置９５０の他の構成部品の調整を提供する場合がある。
【００５５】
プロセッサ９５２は、制御インタフェース９５８およびディスプレイ９５４に連結した
ディスプレイインタフェース９５６を介してユーザと情報交換する場合がある。ディスプ
レイ９５４は、例えば、薄膜トランジスタ液晶ディスプレイＬＣＤ（ＴＦＴ  ＬＣＤ：Ｔ
ｈｉｎ−Ｆｉｌｍ−Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｄｉｓｐｌ
ａｙ）、または有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ：Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔ
ｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）ディスプレイ、または他の適切なディスプレイ技術である場合が
ある。ディスプレイインタフェース９５６は、画像および他の情報をユーザに示すために
ディスプレイ９５４を動かす適切な回路を含む場合がある。制御インタフェース９５８は
ユーザからコマンドを受け取り、プロセッサ９５２に送出するためにコマンドを変換する
場合がある。さらに、他の装置と装置９５０との近い領域のコミュニケーションを可能に
するように、外部インタフェース９６２はプロセッサ９５２と連絡して提供される場合が
ある。外部インタフェース９６２は、例えば、いくつかの実装例において有線通信を、ま
たは、他の実装例において無線通信を提供する可能性があり、複数のインタフェースが使
用される場合もある。
【００５６】
メモリ９６４は、計算装置９５０の中に情報を保存する。メモリ９６４は、１つまたは
複数のコンピュータ可読媒体、１つまたは複数の揮発性メモリユニット、または１つまた
は複数の不揮発性メモリユニットとして実装することができる。拡張メモリ９７４も、提
供され、拡張インタフェース９７２を介して装置９５０と接続されてもよく、例えば、シ
ングルインラインメモリモジュール（ＳＩＭＭ：Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｎ  Ｌｉｎｅ  Ｍｅｍ
ｏｒｙ  Ｍｏｄｕｌｅ）カードインタフェースを含めてもよい。そのような拡張メモリ９
７４は、追加の記憶領域を装置９５０に提供してよく、装置９５０のアプリケーションま
たは他の情報も保存してもよい。具体的には、拡張メモリ９７４は上述のプロセスを実行
するか、または補うようにという命令を含んでよく、安全性情報も含めてよい。このよう
に、例えば、拡張メモリ９７４は装置９５０用のセキュリティモジュールとして提供され
る場合があり、装置９５０の安全な使用を可能にする命令でプログラムされる可能性があ
る。さらに、不正侵入できない方法でＳＩＭＭカードに識別情報を設定するような追加情
報とともに、安全なアプリケーションが、ＳＩＭＭカードによって提供される場合がある
。
【００５７】
以下に記すように、メモリは、例えば、フラッシュメモリおよび／またはＮＶＲＡＭメ
モリを含む場合がある。ある実装例では、コンピュータプログラム製品を、情報担体に明
らかに組み入れる。コンピュータプログラム製品は、実行される時、上述の方法などの１
つまたは複数の方法を実行する命令を含む。情報担体は、メモリ９６４、拡張メモリ９７
４、プロセッサ９５２上のメモリ、または、例えばトランシーバ９６８もしくは外部イン
タフェース９６２によって受信された、伝搬されたシグナルなどのコンピュータ可読媒体
またはマシン可読媒体である。
【００５８】
装置９５０は、通信インタフェース９６６を介してワイヤレスで通信してよく、必要な
場合、デジタル信号処理回路を含んでよい。通信インタフェース９６６は、さまざまなモ
ードまたはプロトコル、例えば、数ある中で、ＧＳＭ音声通話、ＳＭＳ、ＥＭＳまたはＭ
ＭＳメッセージ交換、ＣＤＭＡ、ＴＤＭＡ、ＰＤＣ、ＷＣＤＭＡ、ＣＤＭＡ２０００また
はＧＰＲＳなどのもとで通信を提供してよい。そのような通信は、例えば、高周波トラン
シーバ９６８を介して生じる場合がある。さらに、狭域通信は、例えばブルートゥース、
ＷｉＦｉまたはその他の同様なトランシーバ（図示せず）などを使用して生じる場合があ
る。さらに、全地球測位システムＧＰＳ（ＧＰＳ：Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎ
ｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）レシーバモジュール９７０は、さらなるナビゲーション関連および位
置関連の無線データを装置９５０に提供する場合があり、装置９５０で動くアプリケーシ
ョンによって適切に使用される可能性がある。
【００５９】
装置９５０は音声コーデック９６０を用いて聞き取れるように通信してよく、ユーザか
ら口頭の情報を受け取り、それを使用可能なデジタル情報に変換してよい。例えば装置９
５０の送受話器の、例えばスピーカを介して、音声コーデック９６０は同様にユーザに可
聴音を生成してよい。そのような音は音声電話からの音を含んでよく、録音された音（例
えば、音声メッセージ、音楽ファイル、その他）を含んでよく、および装置９５０で作動
しているアプリケーションで生成する音を含んでもよい。
【００６０】
図に示すように、計算装置９５０はいくつかの異なる形で実装される場合がある。例え
ば、それは携帯電話９８０として実装される場合がある。それは、スマートフォン９８２
、携帯情報端末または他の類似したモバイル機器の一部として実装される場合もある。
【００６１】
本明細書に記載され、図に示されたステップに加えて、他のステップが提供されてよく
、または記載されたフローからステップが除かれてよく、および他の構成要素は記載され
たシステムに加えられるか、それから除去されてよい。したがって、他の実施形態は、本
発明の範囲内である。
【００６２】
標的遺伝子の発現レベルを最適化する方法
現在までに記載された、さまざまなＴＡＬＥ−活性化因子構造に存在する変形には、少
なくとも３つの原因がある。（１）ＴＡＬエフェクター反復内の、高頻度可変性残基以外
の位置に存在するアミノ酸の可変性、（２）ＴＡＬエフェクター反復アレイの側面に位置
するＴＡＬエフェクター由来の配列の長さと組成の違い、および（３）使用した活性化ド
メインの選択（例えば、ＶＰ１６またはＶＰ６４）。Ｂｏｃｈと同僚らは、非高頻度可変
性反復位置のアミノ酸の変化が結合活性に影響を及ぼしうることを示唆するデータを最近
提示した（Streubel, J., et al. Nat Biotechnol 30, 593-595 (2012)）。さまざまな報
告により、ＴＡＬエフェクター反復アレイに隣接するＴＡＬエフェクター由来の配列の長
さの違いが、ＴＡＬＥ−活性化因子の活性に影響することができることも示された（Mill
er, J.C. et al. Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011)、Zhang, F. et al. Nat Biotechn
ol 29, 149-153 (2011)、Mussolino, C. et al. Nucleic Acids Res 39, 9283-9293 (201
1)）。
【００６３】
本明細書に記載されているのは、ＴＡＬＥ−活性化因子によって誘導される遺伝子発現
レベルを微調整するために用いることができるいくつかの異なるアプローチであり、この
技術の応用範囲を広げる重要な可能性である。
【００６４】
第１に、ＴＡＬＥ−活性化因子結合の位置を変えることは（単一のＤＮａｓｅＩ高感受
性部位の中であっても）、結果として観察される活性化レベルの違いを導くことができる
。現在、任意の所与の部位から、誘導される活性化レベルを予測することはできないが、
現在の方法を用いて、高い成功率と容易性でＴＡＬＥ−活性化因子を構築することができ
ることは、当業者にとって、異なる活性のＴＡＬＥ−活性化因子のパネルを生産すること
、および経験的に、所望のレベルの発現を誘導する活性化因子を同定することを容易にす
る。
【００６５】
第２に、本明細書に記載されているように、１６．５〜２２．５のＴＡＬＥ反復からな
るＤＮＡ結合性ドメインを選ぶことは、結果としてより高活性なＴＡＬＥ−活性化因子に
なることが予測される。
【００６６】
第３に、活性化ドメインを変えることで、ＴＡＬＥ−活性化因子によって誘導される遺
伝子発現レベルに影響を及ぼすことができる。例えば、本明細書で検討される２つの細胞
株において、ＶＰ６４  ＴＡＬＥ−活性化因子は、一般に、ｐ６５活性化ドメインを持っ
ている適合した対応物より高レベルの遺伝子発現を誘導した。
【００６７】
最後に、ＴＡＬＥ−活性化因子の組み合わせを使うことは、相乗的に働いて標的遺伝子
を活性化することができる。したがって、ＴＡＬＥ−活性化因子の異なる組み合わせを試
験して、所望の遺伝子発現レベルを見つけることができる。さらに、これらの組み合わせ
を使用して標的遺伝子を複数の入力に反応させることができ、擬似回路が内在性遺伝子と
結びつく合成生物学の応用が可能になる。いくつかの実施形態において、すべてが同一の
遺伝子を標的とするが、遺伝子の制御領域で異なる場所と結合するＴＡＬＥ−活性化因子
の一対（またはそれ以上）が使用される。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ−活性
化因子のすべては、異なるトランス活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４とｐ６５のＴＡＬ
Ｅ−活性化因子の組み合わせを有し、いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ−活性化因
子のすべては、同一のトランス活性化ドメイン、例えば、すべてがＶＰ６４またはｐ６５
ドメインのどちらかを有する。
【００６８】
非コーディング遺伝子の発現を調節する方法
ＴＡＬＥ−活性化因子を使用してｍｉＲＮＡクラスターの発現を調節することができ、
したがってｌｉｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡまたはｐｉＲＮＡなどの非コーディング遺伝子
の他の種類の発現を増加させるために使用できることも現在のデータは示している。した
がって、いくつかの実施形態において、方法は非コーディング遺伝子の制御領域内のＴＡ
ＬＥ−活性化因子結合部位を選択することを含む。
【実施例】
【００６９】
本発明は以下の実施例にさらに記載され、それは特許請求の範囲に記載された本発明の
範囲を限定しない。
【００７０】
方法
次の方法が、以下の実施例に記載された実験で用いられた。
【００７１】
ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の選択。ヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子については、以前２９
３細胞について記載したＤＮａｓｅＩ高感受性部位内の標的部位を選択した（Liu, P.Q. 
et al. J Biol Chem 276, 11323-11334 (2001)）。ＮＴＦ３およびｍｉＲ−３０２／３６
７クラスター遺伝子については、ＵＣＳＣゲノムブラウザーを用いてワシントン大学ＥＮ
ＣＯＤＥデータから同定したＤＮａｓｅＩ高感受性領域内の標的部位を選択した（ｇｅｎ
ｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ、Rosenbloom, K.R. et al. Nucleic Acids Res 40, D912-917
(2012)）。これらの領域が複数の異なる細胞型のＤＮａｓｅＩ高感受性部位であると同
定されたので、これらを標的とし、したがって、これらの領域はオープンクロマチンにあ
る可能性が高いと推測した。
【００７２】
ＴＡＬＥ−活性化因子の構築。ＴＡＬエフェクター反復アレイをコードしているＤＮＡ
断片を、前述の通り、高速ライゲーションベース自動化可能ハイスループットアセンブリ
（ＦＬＡＳＨ：Ｆａｓｔ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  Ａｕｔｏｍａｔａｂｌｅ  Ｈ
ｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）法を使用して生成した（Reyon et a
l., 2012、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４６４５１）。これらの断片は、ＢｓｍＢＩ
制限酵素の消化によって生成した突出（オーバーハング）を用いて、ＥＦ１αプロモータ
ーならびに前述したＴＡＬＥ−活性化因子ＮＴ−Ｌ＋９５のΔ１５２Ｎ末端および＋９５
Ｃ末端ＴＡＬＥ由来ドメインを含む発現ベクターにクローンを作製した。２ＮＦ−ＫＢ  
ｐ６５およびＶＰ６４活性化ドメインを、＋９５ドメインのＣ末端の最後に直接融合し、
すべての融合タンパク質に核局在化シグナルを持たせる。
【００７３】
細胞培養およびトランスフェクション。ヒトＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞お
よび初代ヒトＢＪ繊維芽細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシンお
よび１％Ｇｌｕｔａｍａｘを補充したＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）で維持した。細胞は、製造業者の使用説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃ
ｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＮｕｃｌｅｏｆｅ
ｃｔｉｏｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いてトランスフェクションした。手短に言うと、ＶＥＧＦ
−ＡおよびＮＴＦ３の発現を標的としている実験では、１６０，０００個のＦｌｐ−Ｉｎ
Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞を２４穴プレートに接種し、ＴＡＬＥ−活性化因子をコードし
た３００ｎｇのプラスミド、３０ｎｇのｐｍａｘＧＦＰプラスミド（Ｌｏｎｚａ）、０．
５μｌ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔおよび１．６５μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  
ＬＴＸで、次の日にトランスフェクションした。ｍｉＲ−３０２／３６７クラスターの発
現を標的としている実験では、５ｘ１０５個のＢＪ繊維芽細胞を、ＴＡＬＥ−活性化因子
をコードした１０μｇのプラスミドおよび５００ｎｇのｐｍａｘＧＦＰプラスミドで、Ｎ
ＨＤＦキット（Ｌｏｎｚａ）およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ２ｂデバイス上のプログ
ラムＵ−０２３を用いてヌクレオフェクションした。
【００７４】
ＥＬＩＳＡアッセイ。Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＴＲＥｘ  ２９３細胞を、ヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝
子を標的としたＴＡＬＥ−活性化因子をコードしているプラスミドをトランスフェクショ
ンした。すべてのトランスフェクションは、３回行った。細胞の培地をトランスフェクシ
ョンの４０時間後に回収し、培地へ分泌されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質レベルをヒトＶＥ
ＧＦ−Ａ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてアッセイを行った。す
べての試料を、製造業者の使用説明書に従って測定した。活性化倍数値は、ＴＡＬＥ−活
性化因子を発現しているプラスミドをトランスフェクションした細胞から回収した培地の
ＶＥＧＦ−Ａレベルの平均値を、ＶＰ６４またはｐ６５活性化ドメインのみを発現してい
るプラスミドをトランスフェクションした細胞のＶＥＧＦ−Ａレベルの平均値で除するこ
とによって計算した。
【００７５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ。ＮＴＦ３  ｍＲＮＡレベルを測定するために、トランス
フェクションの２日後に細胞を回収し、全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ  Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ精製
システム（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して単離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉ
ｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘおよびオリゴｄＴプライ
マー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡを逆転写した。次いで次の
Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブセットを用いて、ＧＡＰＤＨプローブをＨＥＸでラベ
ルしマルチプレキシングを可能にしたという変更を除いて、前述２のようにｑＰＣＲを行
った。−ＮＴＦ３フォワードプライマー：５’−ＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴ
ＣＡＧＴＧＣＡＡ−３’（配列番号：５２）、ＮＴＦ３リバースプライマー：５’−ＧＣ
ＣＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＴＴＴＡＴＴＧＴ−３’（配列番号：５３）、ＮＴＦ３  ｔａｑ
ｍａｎプローブ：５’−／５６−ＦＡＭ／ＣＡＡＡＣＣＴＡＣ／ＺＥＮ／ＧＴＣＣＧＡＧ
ＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＧＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号：５４）、ＧＡＰＤＨ
フォワードプライマー：５’−ＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡ−３’（配
列番号：５５）、ＧＡＰＤＨリバースプライマー：５’−ＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣ
ＡＴＧＡＧＴ−３’（配列番号：５６）、ＧＡＰＤＨ  ｔａｑｍａｎプローブ：５’−／
５ＨＥＸ／ＴＣＣＴＧＣＡＣＣ／ＺＥＮ／ＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣＡ／３ＩＡＢｋ
ＦＱ／−３’（配列番号：５７）。すべてのＴＡＬＥ−活性化因子をコードしているプラ
スミドおよび対照のプラスミドはヌクレオフェクションによって３回細胞に導入され、各
々の試料について３回ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００７６】
ｍｉＲ−３０２ａ転写レベルを測定するために、トランスフェクションの３日後に細胞
を回収し、ＧＦＰ陽性の細胞をフローサイトメトリーによって単離した。すべてのｍｉＲ
ＮＡを、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて単離した。逆
転写およびｑＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎ  ｍｉｃ
ｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（ｈａｓ−ｍｉＲ−３０２ａのカタログ番号は０００５２９、
およびＲＮＵ４８対照のカタログ番号は００１００６）を用いて、製造業者の使用説明書
に従って行った。ｍｉＲ−３０２ａ  ＲＮＡ転写物の活性化倍数は、ＴＡＬＥ−活性化因
子をコードしているプラスミドをトランスフェクションしたＢＪ繊維芽細胞の転写レベル
を、ＶＰ６４またはｐ６５活性化ドメインのみを発現している対照プラスミドをトランス
フェクションしたＢＪ繊維芽細胞の転写レベルと比較すること、および比較ＣＴ（ΔΔＣ
Ｔ）法を使用することによって計算した。すべてのＴＡＬＥ−活性化因子および対照は３
回のヌクレオフェクションによって細胞に導入され、ｍｉＲ３０２ａ転写物および低分子
ＲＮＡ対照ＲＮＵ４８のｑＲＴ−ＰＣＲは、各々の試料について３回行った。
【００７７】
（実施例１）
最初の実験では、最適なＴＡＬＥ−活性化因子の機能のために必要とされるＴＡＬエフ
ェクター反復の数を定めることを目的とする系統的で大規模な研究を行った。Ｒｅｂａｒ
と同僚らが以前に使用してより高活性なＴＡＬＥ−活性化因子を構築した構造に基づき（
Miller, J.C. et al. Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011)）（図１Ｃ）、しかし、ＶＰ
６４活性化ドメインを有する単一で一貫した構造を利用した。最近報告された高速ライゲ
ーションベース自動化可能固相ハイスループット（ＦＬＡＳＨ）アセンブリ法（Reyon, D
. et al. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012)およびＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４６４５
１）を用いて、６組の可変長ＴＡＬＥ−活性化因子（１４．５、１６．５、１８．５、２
０．５、２２．５、または２４．５  ＴＡＬエフェクター反復アレイを有する）を、ヒト
ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内の９つの異なる標的領域のために構築した（合計５４個のＴＡＬＥ
−活性化因子）。妨害する可能性があるクロマチンが本発明者の実験に及ぼす影響を最小
にするために、選ばれた９つの領域のすべては単一の、ＶＥＧＦ−Ａ転写開始点の下流５
００ｂｐ付近にあるＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にある（図１ａ）。顕著であるのは、試
験された５４個のＴＡＬＥ−活性化因子のうち５３個は、ヒト培養細胞におけるＶＥＧＦ
−Ａタンパク質の発現の著しい増加を、５．３倍から１１４倍（平均４４．３の活性化倍
数）の範囲まで誘導した（図１ｂ）。興味深いことには、９個の標的領域の各々について
は、１４．５反復および／または２４．５反復ＴＡＬＥ−活性化因子は、１６．５〜２２
．５反復を有している他のタンパク質より実質的により低いＶＥＧＦ−Ａの活性化倍数を
示した（図１ｂ）。これらのデータは、単量体ＴＡＬＥ−活性化因子のＤＮＡ結合活性は
、単量体ＴＡＬＥ−活性化因子が少なくとも１６．５反復を、しかし、２２．５反復以下
を確実に含むことによって最適化できることを示唆する。
【００７８】
５４個のＶＥＧＦ−Ａ標的ＴＡＬＥ−活性化因子の活性に関するデータを用いて、次の
標的部位選択のための計算的に由来する５つのガイドラインの重要性を試験した（Doyle,
E.L. et al. Nucleic Acids Res 40, W117-122 (2012)）。５４個の標的部位のすべてが
、これら５つのガイドラインの１つまたは複数と適合せず、５４個の部位のうちの４９個
が実際に２つ以上のガイドラインに違反していた（すべての部位が５’Ｔを必要とするガ
イドラインを満たした点に注意）（表３）。５倍以上ＶＥＧＦ−Ａの発現を増加させるこ
とを試験された５４個の活性化因子のうちの５３個の能力は、５つの設計ガイドラインの
うちの少なくとも４つに従う絶対的な必要性がないことを明らかに証明する。ガイドライ
ン違反の総数と観察されたＴＡＬＥ−活性化因子活性のレベルとの間に相関が存在する可
能性があるどうか検討されたが、有意な相関関係は見つからなかった（ｐ＝０．５４２８
、図２Ｄ）。その代わりに、誘導された活性化倍数のレベルは、主に遺伝子座関連である
ように思われた−つまり、ガイドライン違反の数に関係なく、９つの遺伝子座のうちの１
つを標的とする可変長のＴＡＬＥ−活性化因子は、活性化倍数と同程度のレベルを示す傾
向がある（図２Ｅ）。したがって、より高活性の単量体ＴＡＬＥ−活性化因子を、５つの
設計ガイドラインのうちの４つを満たすことなく作製することができる。例えば、１６．
５のＴＡＬエフェクター反復からなるタンパク質にランダムなＤＮＡ配列の２ｂｐごとに
１回部位を作製することが可能になり、これらの規制を緩和する能力によって、１０倍超
ＴＡＬＥ−活性化因子の標的範囲が改善された。
【００７９】
【表３−１】
2019068811.tif 000005
【表３−２】
2019068811.tif 000006
【００８０】
最適の反復アレイ長を定めて、標的配列を選ぶための基準を緩和して、これらのパラメ
ータを用いて作製されたＴＡＬＥ−活性化因子が、ヒト細胞においてタンパク質コーディ
ング遺伝子およびｍｉＲＮＡ遺伝子の両方の発現を効率的に調節するかどうか試験した。
これらの実験のために、ＦＬＡＳＨを用いて１６．５または１７．５のＴＡＬエフェクタ
ー反復からなるＶＰ６４  ＴＡＬＥ−活性化因子を、ヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子プロモータ
ーの６つの付加部位に、ヒトＮＴＦ３遺伝子プロモーターの５つの部位に、および、ｍｉ
Ｒ−３０２／３６７クラスタープロモーターの５つの部位に構築した。混乱させる可能性
がある、妨げになるクロマチンの影響を最小にするために、標的とした１６の部位のすべ
てを、細胞型特異的またはデータベースで予測されたＤＮａｓｅＩ高感受性領域の中のそ
れらの位置に基づいて再び選択した（図３Ａ〜Ｂおよび方法）。ヒト細胞でこれらのＶＰ
６４  ＴＡＬＥ−活性化因子を試験することにより、１６個のタンパク質のうちの１５個
がそれらの内在性遺伝子標的の発現の著しい増加を誘導することが明らかになり、全体的
な成功率は約９４％であった（図２Ａ〜Ｃ、薄い灰色のバー）。特に、６個のＶＥＧＦ−
Ａを標的とするＴＡＬＥ−活性化因子のうちの５個、および、ｍｉＲ−３０２／３６７ク
ラスターを標的とする５個の活性化因子のうちの４個は、ヒト形質転換２９３および初代
ＢＪ繊維芽細胞それぞれで、それらの標的遺伝子の発現を５倍以上増加させた（図２ａお
よび２ｂ）。本発明者の実験に用いた２９３細胞において、ＮＴＦ３  ｍＲＮＡがほとん
ど検知不可能なレベルで発現するので、この遺伝子を標的とするタンパク質の活性化倍数
値を確実に定量化することができなかったが、最も弱い活性化因子でさえ約１０００倍の
発現の増加を誘導した（図２ｃ）。面白いことに、ＶＰ６４をＮＦ−ＫＢ  ｐ６５活性化
ドメインと交換すると、１５個の機能的な活性化因子すべてに対する活性化が減少した（
図２Ａ〜Ｃ、より暗い灰色のバー）。これらの結果は、１６．５〜１７．５の反復からな
るＶＰ６４  ＴＡＬＥ−活性化因子が、限定的な標的ガイドラインに従う必要なく内在性
のヒト遺伝子（非コーディングｍｉＲＮＡ遺伝子を含む）の発現を強く活性化させること
ができること、およびＶＰ６４  ＴＡＬＥ−活性化因子が一般に、ＮＦ−ＫＢ  ｐ６５  
ＴＡＬＥ−活性化因子より強い促進作用を持つことを示している。
【００８１】
現在のプラットホームが基本的にどんな遺伝子に対してでも強く複数の高活性なＴＡＬ
Ｅ−活性化因子を生成する能力を示すので、次の実験を行い、これらのタンパク質が相乗
的に機能することもできるかどうか判定した。複数のタンパク質の存在下で観察された活
性化倍数が個々のタンパク質の相加作用より高いならば、活性化因子は相乗的に機能する
と言われる。真核生物の天然に存在する活性化因子は、相乗的に機能し（Carey, M. et a
l. Nature 345, 361-364 (1990)）、この特性を利用して転写の組み合わせと段階的な制
御の両方が可能になる。ＴＡＬＥ−活性化因子も相乗的に作用する可能性があるかどうか
調べるために、５個のＶＰ６４または５個のｐ６５  ＴＡＬＥ−活性化因子の組み合わせ
を、ｍｉＲ−３０２／２６７クラスターおよびＮＴＦ３遺伝子の活性化について試験した
。試験したすべての組み合わせについて、複数の活性化因子の発現は、結果としてｍｉＲ
−３０２／３６７およびＮＴＦ３遺伝子の転写を実質的に高めた（図２ｂおよび２ｃ）。
相乗的活性化は、ｍｉＲ−３０２／３６７クラスター上のＶＰ６４およびｐ６５活性化因
子で（図２ｂ）、ならびにＮＴＦ３遺伝子上のｐ６５活性化因子で観察された（図２ｃ）
。したがって、ＶＰ６４およびｐ６５  ＴＡＬＥ−活性化因子の両者は、相乗的に機能し
て、内在性のヒト遺伝子の発現を増加することができ、このメカニズムを使用して個々の
活性化因子で達成されるよりも、さらに大きな活性化水準を誘導することができる。
【００８２】
参考文献
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【００８３】
他の実施形態
本発明がその詳しい説明とともに記載される一方で、前述の記載は例証的で、本発明の
範囲を限定しないことを意図し、それは添付の特許請求の範囲の請求範囲によって定義さ
れることを理解されたい。その他の態様、利点および修正は、次の特許請求の範囲の範囲
内である。
【符号の説明】
【００８４】
１０１  標的遺伝子に関連した情報を受け取るためのユーザ入力機構を含むユーザイン
タフェースを、ユーザ装置に表示させる情報を提供する
１０２  ユーザ装置から、選択された標的遺伝子を受け取る
１０３  １つまたは複数のコンピュータによって、標的遺伝子配列の１つまたは複数の
部分配列を同定する
１０４  １つまたは複数の部分配列を選択する
１０５  選択された１つまたは複数の部分配列の少なくとも一部を、ユーザ装置に表示
させる情報を提供する
９００  コンピュータ装置、計算装置
９０２  プロセッサ
９０４  メモリ
９０６  記憶装置
９０８  高速インタフェース、高速制御装置
９１０  高速拡張ポート
９１２  低速インタフェース、低速制御装置
９１４  低速バス
９１６  ディスプレイ
９２０  標準規格サーバ
９２２  ラップトップコンピュータ
９２４  ラックサーバシステム
９５０  モバイル計算装置
９５２  プロセッサ
９５４  ディスプレイ
９５６  ディスプレイインタフェース
９５８  制御インタフェース
９６０  音声コーデック
９６２  外部インタフェース
９６４  メモリ
９６６  通信インタフェース
９６８  トランシーバ
９７０  全地球測位システムＧＰＳレシーバモジュール
９７２  拡張インタフェース
９７４  拡張メモリ
９８０  携帯電話
９８２  スマートフォン
【図１Ａ】
2019068811.tif 000007
【図１Ｂ】
2019068811.tif 000008
【図１Ｃ】
2019068811.tif 000009
【図２Ａ】
2019068811.tif 000010
【図２Ｂ】
2019068811.tif 000011
【図２Ｃ】
2019068811.tif 000012
【図２Ｄ】
2019068811.tif 000013
【図２Ｅ】
2019068811.tif 000014
【図３Ａ】
2019068811.tif 000015
【図３Ｂ】
2019068811.tif 000016
【図３Ｃ】
2019068811.tif 000017
【図４】
2019068811.tif 000018
【図５】
2019068811.tif 000019
【配列表】
2019068811000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月28日(2018.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子においてキサントモナス属（Xanthomonas）由来の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）活性化因子結合部位の候補を同定する方法であって、
標的遺伝子配列の１つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、
前記標的遺伝子は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＮＴＦ３またはｍｉＲ−３０２／３６７であり、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の制御領域内にあり、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の前記制御領域のＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にあり、
前記部分配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さであり、
前記部分配列の１番目（５’）のヌクレオチドはチミンであるステップと、
ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の候補として、前記１つまたは複数の部分配列を選択するステップとを含む方法。
【請求項２】
標的遺伝子の転写を増加させるＴＡＬＥ−活性化因子を作製する方法であって、
標的遺伝子配列の１つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、
前記標的遺伝子は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＮＴＦ３またはｍｉＲ−３０２／３６７であり、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の制御領域内にあり、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の前記制御領域のＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にあり、
前記部分配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さであり、
前記部分配列の１番目（５’）のヌクレオチドはチミンであるステップと、
部分配列を選択するステップと、
改変された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）反復アレイを含み、前記選択された部分配列と特異的に結合する、改変されたＤＮＡ結合ドメインと、
標的遺伝子の転写を増加させる配列を含むトランス活性化ドメインと
を含む融合タンパク質を生成するステップとを含み、
それによって、前記標的遺伝子の転写を増加させるＴＡＬＥ−活性化因子を作製する、方法。
【請求項３】
前記ＴＡＬＥ反復アレイが１６．５〜２２．５の反復を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
トランス活性化ドメインがＶＰ１６、ＶＰ６４またはＮＦ−ＫＢ  ｐ６５ドメインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記標的遺伝子の前記制御領域がプロモーター領域である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記部分配列は１８個のヌクレオチドの長さである請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
トランス活性化ドメインがＶＰ６４ドメインを含む、請求項２から６のいずれかにに記載の方法。
【請求項８】
ＶＥＧＦ−Ａ、ＮＴＦ３またはｍｉＲ−３０２／３６７の転写を増加させる２つ以上のＴＡＬＥ−活性化因子を製造する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記２つ以上のＴＡＬＥ−活性化因子の少なくとも１つがＶＰ６４を含み、少なくとも１つがＮＦ−ＫＢ  ｐ６５ドメインを含む、請求項８に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
他の実施形態
本発明がその詳しい説明とともに記載される一方で、前述の記載は例証的で、本発明の範囲を限定しないことを意図し、それは添付の特許請求の範囲の請求範囲によって定義されることを理解されたい。その他の態様、利点および修正は、次の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は次の実施態様を含む。
［１］キサントモナス属（Xanthomonas）由来の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）活性化因子結合部位の候補を同定する方法であって、
標的遺伝子を選択するステップと、
標的遺伝子配列の１つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の制御領域内にあり、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の前記制御領域のＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にあり、
前記部分配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さであり、
前記部分配列の１番目（５’）のヌクレオチドはチミンであり、
前記部分配列の塩基組成パーセントは、アデニンが０〜６３％以外、シトシンが１１〜６３％以外、グアニンが０〜２５％以外またはチミンが２〜４２％以外であるステップと、
ＴＡＬＥ−活性化因子結合部位の候補として、前記１つまたは複数の部分配列を選択するステップとを含む方法。
［２］標的遺伝子の転写を増加させるＴＡＬＥ−活性化因子を作製する方法であって、
標的遺伝子を選択するステップと、
標的遺伝子配列の１つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の制御領域内にあり、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の前記制御領域のＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にあり、
前記部分配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さであり、
前記部分配列の１番目（５’）のヌクレオチドはチミンであり、
前記部分配列の塩基組成パーセントは、アデニンが０〜６３％以外、シトシンが１１〜６３％以外、グアニンが０〜２５％以外またはチミンが２〜４２％以外であるステップと、
部分配列を選択するステップと、
改変された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）反復アレイを含み、前記選択された部分配列と特異的に結合する、改変されたＤＮＡ結合ドメインと、
標的遺伝子の転写を増加させる配列を含むトランス活性化ドメインと
を含む融合タンパク質を生成するステップとを含み、
それによって、前記標的遺伝子の転写を増加させるＴＡＬＥ−活性化因子を作製する、方法。
［３］前記ＴＡＬＥ反復アレイが１６．５〜２２．５反復である、上記［２］に記載の方法。
［４］トランス活性化ドメインがＶＰ１６、ＶＰ６４またはＮＦ−ＫＢ  ｐ６５ドメインを含む、上記［２］に記載の方法。
［５］１つまたは複数の処理装置によって実行されるコンピュータ実装方法であって、
ユーザ装置に、標的遺伝子に関連した情報を受け取るためのユーザ入力機構を含むユーザインタフェースを表示させる情報を提供するステップと、
前記ユーザ装置から、選択された標的遺伝子を受け取るステップと、
１つまたは複数のコンピュータによって、標的遺伝子配列の１つまたは複数の部分配列を同定するステップであって、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の制御領域内にあり、
前記部分配列は、前記標的遺伝子の前記制御領域のＤＮａｓｅＩ高感受性領域内にあり、
前記部分配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さであり、
前記部分配列の１番目（５’）のヌクレオチドはチミンであり、
前記部分配列の塩基組成パーセントは、アデニンが０〜６３％以外、シトシンが１１〜６３％以外、グアニンが０〜２５％以外またはチミンが２〜４２％以外であるステップと、
前記１つまたは複数の部分配列を選択するステップと、
前記ユーザ装置に、前記選択された１つまたは複数の部分配列の少なくとも一部を表示させる情報を提供するステップとを含む方法。
［６］細胞内で標的配列の転写を増加させる方法であって、上記［２］から［５］のいずれかに記載の方法によってＴＡＬＥ−活性化因子を作製するステップと、前記細胞を前記ＴＡＬＥ−活性化因子に接触させるステップとを含む方法。
［７］細胞内で標的配列の転写を増加させる方法であって、上記［２］から［５］のいずれかに記載の方法によって２つ以上のＴＡＬＥ−活性化因子を作製するステップと、前記細胞を前記２つ以上のＴＡＬＥ−活性化因子に接触させるステップとを含む方法。
［８］前記２つ以上のＴＡＬＥ−活性化因子のうちの少なくとも１つがＶＰ６４を含み、前記２つ以上のＴＡＬＥ−活性化因子のうちの少なくとも１つがＮＦ−ＫＢ  ｐ６５ドメインを含む、上記［７］に記載の方法。
［９］前記標的遺伝子がコーディング遺伝子または非コーディング遺伝子である、上記［１］から［５］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記非コーディング遺伝子がｍｉＲＮＡである、上記［９］に記載の方法。
［１１］前記標的遺伝子の前記制御領域がプロモーター領域である、上記［１］から［５］のいずれかに記載の方法。