(57)【要約】【課題】  ガス透過性及び細胞接着性に優れた表面を有し、長期的な培養にも優れた細胞培養用の支持体を提供する。【解決手段】  両親媒性ポリマーと細胞親和性物質とを含むポリマー層により表面修飾されたシリコーン膜を有し、前記両親媒性ポリマーは、疎水部と親水部を有し、前記疎水部が、ポリウレタン由来の構造単位、ポリエチレン由来の構造単位、ナイロン由来の構造単位及びシリコーン由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位を有し、前記親水部が、ポリアミノ酸由来の構造単位、水溶性コラーゲン由来の構造単位、ゼラチン由来の構造単位、セルロース由来の構造単位、デンプン由来の構造単位、ポリスルホン酸由来の構造単位及びポリエチレングリコール由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位を有する共重合体である細胞培養用の支持体。【選択図】  図１
2019068761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性ポリマーと細胞親和性物質とを含むポリマー層により表面修飾されたシリコーン膜を有し、
前記両親媒性ポリマーは、疎水部と親水部を有し、
前記疎水部が、ポリウレタン由来の構造単位、ポリエチレン由来の構造単位、ナイロン由来の構造単位及びシリコーン由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位を有し、
前記親水部が、ポリアミノ酸由来の構造単位、水溶性コラーゲン由来の構造単位、ゼラチン由来の構造単位、セルロース由来の構造単位、デンプン由来の構造単位、ポリスルホン酸由来の構造単位及びポリエチレングリコール由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位を有する共重合体である細胞培養用の支持体。
【請求項２】
前記両親媒性ポリマーにおいて、
前記疎水部が、ポリウレタン由来の構造単位からなり、
前記親水部が、ポリアミノ酸由来の構造単位、ポリスルホン酸由来の構造単位及びポリエチレングリコール由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位からなる共重合体である請求項１記載の細胞培養用の支持体。
【請求項３】
前記ポリマー層により表面修飾されたシリコーン膜からなる請求項１又は２に記載の細胞培養用の支持体。
【請求項４】
前記細胞親和性物質がポリマー層全体に分布している請求項１から３のいずれかに記載の細胞培養用の支持体。
【請求項５】
前記細胞親和性物質が、コラーゲン類、成長因子及びムコ多糖からなる群から選択される１種以上である請求項１から４のいずれかに記載の細胞培養用の支持体。
【請求項６】
前記支持体が、長期培養に用いられるための支持体である請求項１から５のいずれかに記載の細胞培養用の支持体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の細胞培養用の支持体を、プレートの底部に、前記ポリマー層が培養面となるように配置した細胞培養プレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞親和性物質が表面修飾された細胞培養用の支持体及び細胞培養プレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体に近い環境での細胞を培養するため、酸素の供給や二酸化炭素の排出の可能なガス透過性を有する基材を用いる培養系がある。このような培養系で用いられる基材として、シリコーン膜を用いた培養系が知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、細胞への酸素の輸送と供給が可能な細胞培養装置として、ペルフルオロ炭化水素とシリコーンの混合物などのガス透過性・液不透過性膜障壁を備えた細胞培養装置が開示されている。
【０００４】
一方で、シリコーン膜は細胞との接着性が悪いという問題がある。そこで、シリコーン膜にコラーゲンをコートして細胞を接着させ培養する方法が知られている。
例えば、特許文献２には、ガス透過膜上に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞を配置し、ガス透過性膜側から酸素を供給しつつ肝細胞を培養する肝細胞培養方法が開示されている。具体的には、表面がコラーゲンコーティングされたガス透過性膜を用いて、酸素を供給しつつ培養する方法が開示されている。そして、ガス透過性膜にコラーゲンをコーティングする方法として、酸素プラズマ処理をしてコラーゲンをガス透過性膜に吸着させる方法や化学的に反応する官能基を使用して共有結合させる方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００９−５４２２３０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／０２４５９２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、シリコーン膜は細胞との接着性が悪いため、シリコーン膜を表面修飾し、改質することで細胞接着性を向上させる必要がある。
しかしながら、特許文献２で開示されるような、酸素プラズマ処理をしてコラーゲンをコーティングする方法では、プロセスが複雑であり、また、シリコーン膜の表面を均一にプラズマ処理することが困難であり、接着性の低い部分が存在するなどの問題があった。
また、化学的に結合させる方法は、化学的に反応する官能基をシリコーン膜に導入する等の非常に煩雑な合成が必要とされ、また不純物等が混入しやすいという問題があった。
【０００７】
かかる状況下、シリコーン膜の表面に、コラーゲン等などを固定させ、安定した機能性表面（接着性を有する表面等）を実現したシリコーン膜を有する細胞培養系が望まれている。
本発明の目的は、ガス透過性及び細胞接着性に優れた表面を有し、長期的な培養にも優れた細胞培養用の支持体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、特定の両親媒性ポリマーを用いることで、コラーゲン等の細胞親和性物質がシリコーン膜に安定して接着することを見出した。そして、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞  両親媒性ポリマーと細胞親和性物質とを含むポリマー層により表面修飾されたシリコーン膜を有し、前記両親媒性ポリマーは、疎水部と親水部を有し、前記疎水部が、ポリウレタン由来の構造単位、ポリエチレン由来の構造単位、ナイロン由来の構造単位及びシリコーン由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位を有し、前記親水部が、ポリアミノ酸由来の構造単位、水溶性コラーゲン由来の構造単位、ゼラチン由来の構造単位、セルロース由来の構造単位、デンプン由来の構造単位、ポリスルホン酸由来の構造単位及びポリエチレングリコール由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位を有する共重合体である細胞培養用の支持体。
＜２＞  前記両親媒性ポリマーにおいて、前記疎水部が、ポリウレタン由来の構造単位からなり、前記親水部が、ポリアミノ酸由来の構造単位、ポリスルホン酸由来の構造単位及びポリエチレングリコール由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位からなる共重合体である＜１＞記載の細胞培養用の支持体。
＜３＞  前記ポリマー層により表面修飾されたシリコーン膜からなる＜１＞又は＜２＞に記載の細胞培養用の支持体。
＜４＞  前記細胞親和性物質がポリマー層全体に分布している＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の細胞培養用の支持体。
＜５＞  前記細胞親和性物質が、コラーゲン類、成長因子及びムコ多糖からなる群から選択される１種以上である＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の細胞培養用の支持体。
＜６＞  前記支持体が、長期培養に用いられるための支持体である＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の細胞培養用の支持体。
＜７＞  ＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の細胞培養用の支持体を、プレートの底部に、前記ポリマー層が培養面となるように配置した細胞培養プレート。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ガス透過性及び細胞接着性に優れた表面を有し、長期的な培養にも優れた細胞培養用の支持体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１−１、１−２及び比較例１−１の細胞培養プレートを用いてＨｅｐＧ２を培養したときの増殖曲線である。
【図２】実施例１−３、１−４及び比較例１−２の細胞培養プレートを用いてＨｅｐＧ２を培養したときの増殖曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を変更しない限り、以下の内容に限定されない。なお、本明細書において「〜」という表現を用いる場合、その前後の数値を含む表現として用いる。
【００１３】
［細胞培養用の支持体］
本発明は、両親媒性ポリマーと細胞親和性物質とを含むポリマー層により表面修飾されたシリコーン膜を有し、前記両親媒性ポリマーが、疎水部と親水部を有し、前記疎水部が、ポリウレタン由来の構造単位、ポリエチレン由来の構造単位、ナイロン由来の構造単位及びシリコーン由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位を有し、前記親水部が、ポリアミノ酸由来の構造単位、水溶性コラーゲン由来の構造単位、ゼラチン由来の構造単位、セルロース由来の構造単位、デンプン由来の構造単位、ポリスルホン酸由来の構造単位及びポリエチレングリコール由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位を有する共重合体である細胞培養用の支持体（以下、「本発明の支持体」と記載する場合がある。）に関する。
【００１４】
上述のように、シリコーン膜は、表面に細胞親和性物質を接着させることが困難な性質を有する。一方、本発明のような構造を有する両親媒性ポリマーと細胞親和性物質とを含むポリマー層によりシリコーン膜の表面を被覆することによって、細胞接着性の優れた表面を有する支持体とすることができる。また、本発明の支持体を用いて細胞を培養すると、培養される細胞が支持体から剥離しにくく、安定して培養することができる。
なお、両親媒性ポリマーとしてポリ乳酸とＰＥＧからなる共重合体を用いて、細胞親和性物質とともにシリコーン膜の表面を被覆しても接着性に優れた表面を有する支持体を得ることができず、本発明のような構造の両親媒性ポリマーと細胞親和性物質を用いることで、接着性に優れた表面とすることができる。
【００１５】
また、本発明の支持体は、シリコーン膜を介して、細胞への酸素の供給及び二酸化炭素の排出が可能であり、本発明の支持体を用いた場合、ガスを透過しないプラスチックプレートと比較して２倍以上程度の培養期間も可能となる。そのため、本発明の支持体は、長期培養に用いられるための支持体として好適である。
【００１６】
また、本発明の支持体は、通常、スフェロイド（細胞凝集塊）が形成しやすい表面となる。例えば、ガン細胞等はスフェロイドを形成するように細胞培養することで、生体内の状態により近い機能を維持する状態となるが、スフェロイドは、酸素が供給されないと内側から壊死しやすく、長期的に培養できない欠点がある。一方、本発明の支持体を用いて細胞を培養すると、酸素を供給しながら培養することができるため、スフェロイド（細胞凝集塊）が形成する場合でも、長期的に培養が可能である。
【００１７】
また、本発明の支持体を構成するシリコーン膜は透明性が高く、本発明の支持体においても、透明が維持されることが好ましい。この場合、倒立顕微鏡などで経時的に細胞の観察が行いやすいという利点もある。本発明の支持体は、４００〜８００ｎｍの可視光線で、８５％以上の透過率を有することがより好ましく、９０％以上の透過率を有することがさらに好ましい。
【００１８】
本発明の支持体は、ガス透過性や細胞接着性等を損なわない範囲において、両親媒性ポリマーと細胞親和性物質とを含むポリマー層により表面修飾されたシリコーン膜以外の層を含んでもよいが、好適な態様は、前記両親媒性ポリマーと前記細胞親和性物質とを含むポリマー層により表面修飾されたシリコーン膜からなる支持体である。前記両親媒性ポリマーと前記細胞親和性物質とを含むポリマー層により表面修飾（被覆）されたシリコーン膜からなる支持体は、層間での剥離が起こりにくく、ガス透過性や細胞接着性に優れ、さらに、高い透明性を有する支持体とすることができる。
【００１９】
以下、本発明の支持体を構成するシリコーン膜及びポリマー層について説明する。
【００２０】
［シリコーン膜］
本発明の支持体は、シリコーン膜を有する。
本発明の支持体を構成するシリコーン膜は、ガス透過性を有し、液非透過性であるシート状やフィルム状の膜である。すなわち、シリコーン膜とは、酸素や二酸化酸素のようなガスは透過できるが液体は透過できないシート状やフィルム状の膜である。
【００２１】
このようなシリコーン膜として、酸素透過係数が、１.０００〜１０.０００ｃｍ3・ｃｍ／（ｍ2・ｄａｙ・ａｔｍ）のシリコーン膜を用いることができる。
このようなシリコーン膜を用いることで、酸素を供給及び二酸化炭素の排出をしながら細胞を培養できるため、生体内により近い環境で細胞の培養ができる。また、長期的な培養にも好適に用いられる。
また、シリコーン膜は、細胞培養プレートの一部（特に底面）としての貼り付けや形状調整等の利用しやすさや、生体に対する毒性が低く生体適合性も優れている点でも適している。
【００２２】
シリコーン膜としては、例えば、以下に説明する方法にて製造されたシリコーンゴムを用いることができる。
まず、生ゴム状の高重合度ジメチルポリシロキサンと補強材として微粉末シリカとを基本成分として、各種添加剤を配合してシリコーンゴムコンパウンドが得られる。そして、このコンパウンドに有機過酸化物や触媒などの加硫剤を使用時に添加して加熱硬化して得られるシリコーンゴムを膜状に成形する。
このシリコーンゴムの成形工程では、原料等に由来して加硫工程等を行った後も低分子シロキサンが含有される場合がある。この低分子シロキサンは、生体細胞に毒性を示す場合があるため、本発明の細胞培養プレートには、このような低分子シロキサンが可能な限り低減されたものを用いることが好ましい。低分子シロキサンの除去には、加熱による揮発等が一般的に行われる。さらに、本発明においては、シリコーンゴムに含まれる低分子シロキサンをより低減するために、減圧下での処理も行うことが好ましく、この減圧下の環境は１０００〜０．０１Ｐａ程度の真空相当、より好ましくは１００〜０．１Ｐａ程度の真空相当であることが好ましい。この処理は、併用して、減圧下（真空状態、１０００〜０．０１Ｐａ程度）で加熱処理（例えば８０〜２００℃程度）することが好ましく、その処理時間は、１時間以上、好ましくは１０時間以上、より好ましくは１日以上とすることが特に好ましい。その処理時間は、長くするほど低分子シロキサンを低減できるため上限を定めないでもよいが、その効果は一定以上の時間で飽和する場合がある。よって、その上限は１０日以下や、７日程度としてもよい。
【００２３】
具体的には、シリコーン膜としては、株式会社エス・アイ・アール社製のＣ６シリーズ等を用いることができる。
【００２４】
本発明の支持体を構成するシリコーン膜は、細胞培養プレート全体の形状や、具体的な培養対象、シリコーン膜の詳細な構造等によって、適宜、その厚み等が設計される。このシリコーン膜は、その厚みの上限は、１ｍｍ以下であることが好ましい。より好ましくは、０．５ｍｍ（５００μｍ）以下であり、さらに好ましくは、０．３ｍｍ（３００μｍ）以下である。シリコーン膜の厚みが１ｍｍを超えて厚くなりすぎると、ガス透過性が低下して細胞培養に適さない場合がある。また、厚みが厚いほど相対的な剛性が高くなりすぎて、細胞培養プレートとしての成形性が低下する場合がある。一方、シリコーン膜の厚みの下限は、５０μｍ以上であることが好ましく、より好ましくは１００μｍ以上である。シリコーン膜層が薄すぎると、細胞培養プレートの一部としての靭性等の機械特性が不足する場合がある。
【００２５】
［ポリマー層］
本発明において、ポリマー層は、両親媒性ポリマーと細胞親和性物質とを含む層である。ポリマー層は、その表面に細胞親和性物質を含む構成であり、これにより細胞の接着性が向上する。
【００２６】
ポリマー層の厚さは、具体的な培養対象、ポリマー層の組成等によって、適宜、その厚み等が設計される。ポリマー層の厚みの上限は、５μｍ以下であることが好ましい。より好ましくは、１μｍ以下である。一方、ポリマー層の厚みの下限は、０．０５μｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．１μｍ以上である。ポリマー層の厚みが厚くなりすぎると、細胞への酸素の供給が効率よく行われない場合がある。ポリマー層が薄すぎると、本発明の支持体の細胞接着性が不十分になる場合がある。
なお、ポリマー層の厚みは、ポリマー層積層前後の、シリコーン膜との厚みの差から求めてもよいし、支持体の断面を顕微鏡等で観察した厚みから求めてもよい。また、ポリマー層を形成するときの塗布液に含まれる両親媒性ポリマーと細胞親和性物質の濃度と塗布量より算出して算出することもできる。
【００２７】
ポリマー層の態様の一つとしては、両親媒性ポリマーと細胞親和性物質の混合物を含むポリマー層が挙げられる。このとき、ポリマー層の表面に細胞親和性物質が含まれる構成であれば、ポリマー層内の細胞親和性物質の分布は均一であっても不均一であってもよい。
好適には、両親媒性ポリマーと細胞親和性物質を含む塗布液をシリコーン膜上に塗布、乾燥して形成されたポリマー層であり、この場合、細胞親和性物質がポリマー層全体に分布している構成となるため、細胞親和性物質がはがれにくく、細胞接着性に優れた表面を長期的に維持できる。細胞親和性物質がポリマー層全体に分布した構成の場合、より優れた剥離強度（例えば、ポリマー層がシリコーン膜からＤＭＥＭ培地等の通常培地中で１カ月以上剥離しない剥離強度）を有する支持体となり、長期培養により好適である。
【００２８】
両親媒性ポリマーと細胞親和性物質の混合物を含むポリマー層において、ポリマー層における両親媒性ポリマーと細胞親和性物質との割合は、具体的な培養対象やポリマー層の組成等に応じて適宜調整されるものである。ポリマー層は、両親媒性ポリマー１００質量部に対して、細胞親和性物質が５質量部以上であることが好ましく、１０質量部以上であることがより好ましい。両親媒性ポリマーに対して、細胞親和性物質が少なすぎる場合、支持体の細胞接着性が不十分となりやすい。一方、ポリマー層は、両親媒性ポリマー１００質量部に対して、細胞親和性物質が１００質量部以下であることが好ましく、５０質量部以下であることがより好ましく、３０質量部以下であることがさらに好ましい。両親媒性ポリマーに対して、細胞親和性物質が多すぎる場合、細胞親和性物質とシリコーン膜の接着性が低下し、シリコーン膜から細胞親和性物質が剥がれやすい。
【００２９】
また、ポリマー層の表面に細胞親和性物質が含まれる構成であれば、ポリマー層は、単層構成であっても、異なる組成の層を複数有する積層構造であってもよい。
例えば、ポリマー層は、両親媒性ポリマーからなる層の上に細胞親和性物質からなる層が積層した積層構造としてもよい。
【００３０】
（両親媒性ポリマー）
両親媒性ポリマー（Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  Ｐｏｌｙｍｅｒ）とは、ポリマーが、疎水部と、親水部とを有することで、疎水性と、親水性との両方の特徴を有するポリマーである。
本発明においては、両親媒性ポリマーの中でも、前記疎水部が、ポリウレタン由来の構造単位、ポリエチレン由来の構造単位、ナイロン由来の構造単位及びシリコーン由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位を有し、前記親水部が、ポリアミノ酸由来の構造単位、水溶性コラーゲン由来の構造単位、ゼラチン由来の構造単位、セルロース由来の構造単位、デンプン由来の構造単位、ポリスルホン酸由来の構造単位及びポリエチレングリコール由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位を有する共重合体が用いられる。
なお、ポリマー層を構成する両親媒性ポリマーは、１種であっても、２種以上の両親媒性ポリマーを組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
また、両親媒性ポリマーは、その重合形態は特に限定されず、ブロック共重合体、ランダム共重合体、グラフト共重合体等の形態をとることができるが、ブロック共重合体であることが好ましい。
【００３２】
中でも、両親媒性ポリマーの疎水部は、ポリウレタン由来の構造単位からなることが好ましい。
【００３３】
ポリウレタンは、一般的に、ポリオールと多価イソシアネート化合物との縮重合反応により得ることができ、ポリウレタン由来の構造単位は、ポリオールと多価イソシアネートとがウレタン結合により結合した構造からなる。
ポリオールとしては、ポリエチレングリコールやポリテトラメチレングリコールや、トリメチロールプロパン、トリメチロールエタン等を挙げることができる。
イソシアネート化合物としては、トリレンジイソシアネート、ジフェニルジイソシアネート、イソホロジイソシアネート等を挙げることができる。
【００３４】
また、両親媒性ポリマーの親水部は、ポリアミノ酸由来の構造単位、ポリスルホン酸由来の構造単位及びポリエチレングリコール由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位からなることが好ましい。
【００３５】
ポリアミノ酸は、一般的に、アミノ酸を縮重合して得ることができ、ポリアミノ酸由来の構造単位は、アミノ酸がアミド結合により結合した構造からなる。ポリアミノ酸は、α−アミノ酸−Ｎ−カルボン酸無水物等のモノマーを縮重合させることにより得ることができる。ポリアミノ酸を構成するアミノ酸としては、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン等が挙げられる。
【００３６】
ポリスルホン酸は、スルホン酸基を有するポリマーであり、例えば、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸等が挙げられる。
【００３７】
特に、疎水部が、ポリウレタン由来の構造単位からなり、親水部が、ポリアミノ酸由来の構造単位、ポリスルホン酸由来の構造単位及びポリエチレングリコール由来の構造単位からなる群から選択される１種以上の構造単位からなる共重合体であることが好ましい。
好適な両親媒性ポリマーの例として、ポリウレタン・ポリアミノ酸のブロック共重合体やポリウレタン・ポリスルホン酸・ポリエチレングリコールのブロック共重合体等が挙げられる。
このような共重合体は、シリコーン膜の接着性に優れ、また、細胞親和性物質との相溶性に優れるため、シリコーン膜から剥離しにくく、培養する細胞が接着しやすいポリマー層を形成しやすい。
【００３８】
両親媒性ポリマーの分子量（重量平均分子量Ｍｗ）は、適宜決定すればよく、１万〜５万であることが好ましい。
【００３９】
（細胞親和性物質）
細胞親和性物質は、細胞接着性を有する物質であればよく、天然物質であっても合成物質であってもよい。また、細胞親和性物質は、１種であっても、２種以上の細胞親和性物質を組み合わせて用いてもよい。細胞親和性物質として、具体的には、コラーゲン類、成長因子、ムコ多糖、フィブロネクチンやラミニン、フィブリン等のタンパク質、オリゴ糖、ゼラチン等が挙げられる。この中でも、コラーゲン類、ムコ多糖及び成長因子からなる群から選択される１種以上であることが好ましい。
【００４０】
コラーゲン類は、その由来等は特に限定されないが、例えば、動物、魚由来のコラーゲンを用いることができる。コラーゲン類としては、コラーゲン加水分解物やコラーゲンの側鎖を修飾したコラーゲン誘導体等を挙げることができる。
【００４１】
ムコ多糖としては、特に限定されないが、例えば、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン誘導体あるいはこれらの金属塩等が挙げられる。
好適なムコ多糖の一つとして、ヘパリン誘導体が挙げられ、ヘパリン誘導体としは、ヘパリン、ヘパリンナトリウム、ヘパリンカリウム、ヘパリンリチウム、ヘパリンカルシウム、ヘパリン亜鉛塩、ヘパリンアンモニウム塩等が挙げられる。
【００４２】
成長因子としては、特に限定されないが、例えば、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等が挙げられる。
【００４３】
また、成長因子は、結合性成長因子であってもよい。すなわち、成長因子と、コラーゲン結合性の融合蛋白質とを結合させた結合型成長因子を用いてもよい。結合型成長因子は、従来公知の方法により合成できる。
【００４４】
細胞親和性物質として用いることのできる合成物質としては、細胞接着性を有する官能基を有するモノマーの重合体又は共重合体等が挙げられる。細胞接着性を有する官能基としては、例えば、カルボン酸基及びその塩、無水物、スルホン酸基及びその塩、スルホン酸エステル、スルホン酸アミド、リン酸基及びその塩、アミノ基、水酸基、長鎖アルキル基、メルカプト基、エーテル基、チオエーテル基、ポリエーテル基、ケトン基、アルデヒド基、アシル基、シアノ基、ニトロ基、アシルアミノ基、ハロゲン基、グリシジル基、アリル基等が挙げられる。
また、細胞接着性を有する物質であれば、両親媒性ポリマーを細胞親和性物質として用いてもよい。
【００４５】
本発明の支持体は、その製造方法が特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法で得ることができる。
（ｉ）シリコーン膜に、両親媒性ポリマーと細胞親和性物質を含む溶液を塗布する工程（ａ）を含む製造方法。
（ｉｉ）シリコーン膜に、両親媒性ポリマーの溶液を塗布する工程（ｂ１）と、前記工程（ｂ１）の後に、細胞親和性物質の溶液を塗布する工程（ｂ２）とを含む製造方法。
【００４６】
前記（ｉ）の方法によれば、シリコーン膜の表面が、両親媒性ポリマーと細胞親和性物質の混合物により被覆された支持体を得ることができる。
【００４７】
前記（ｉｉ）の方法によれば、シリコーン膜の表面が両親媒性ポリマーにより被覆され、さらに両親媒性ポリマーの層の表面が細胞親和性物質により被覆された構成の支持体を得ることができる。すなわち、シリコーン膜を被覆するポリマー層は、両親媒性ポリマーからなる層と細胞親和性物質からなる層との積層構造である支持体を得ることができる。
【００４８】
このような（ｉ）や（ｉｉ）のような製造方法とすることにより、従来のプラズマによる方法等に比べて、簡単に安定な接着性を有する支持体を製造することができる。
【００４９】
塗布液（両親媒性ポリマーと細胞親和性物質を含む溶液や両親媒性ポリマーの溶液、細胞親和性物質の溶液）をシリコーン膜へ塗布する方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、スピンコート法、バーコート法、ディップコート法、スプレーコート法、ロールコート法、ダイコート法等が挙げられる。
また、前記（ｉｉ）の方法のように、複数回塗布を行う場合は、それぞれの塗布方法は同一であってもよいし、異なる方法であってもよい。
【００５０】
塗布液を調製する溶媒としては、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等が挙げられる。
【００５１】
また、塗布液は、塗布液の組成や溶剤、塗布方法等によりその濃度を適宜調整すればよいが、固形分濃度が１．０〜１５質量％となるように調整することが好ましい。
【００５２】
また、両親媒性ポリマーと細胞親和性物質を含む溶液を調製する場合、両親媒性ポリマーの濃度が、１．０〜１０質量％、細胞親和性物質の濃度が０．１〜２．０質量％、両親媒性ポリマー１００質量部に対して細胞親和性物質が５〜１００質量部（より好ましくは、１０〜５０質量部）となるように調整することが好ましい。
【００５３】
また、前記（ｉ）の方法は、工程（ａ）以外の工程を含んでもよく、乾燥工程や洗浄工程を含んでもよい。
前記（ｉｉ）の方法についても同様に、工程（ｂ１）及び工程（ｂ２）以外の工程を含んでもよく、乾燥工程や洗浄工程を含んでもよい。
【００５４】
［細胞培養プレート］
本発明の支持体は、プレートの底部に、前記ポリマー層が培養面（上向き）となるように配置した細胞培養プレート（以後、「本発明の細胞培養プレート」と記載する場合がある。）とすることができる。
本発明の細胞培養プレートの具体的な形状としては、ディッシュやウェル形状とすることができる。
ウェル形状とする場合、細胞培養面となる部分にのみポリマー層が設けられたシリコーン膜をウェルの底部の開口部に張り付けたものであっても、表面全体にポリマー層が設けられたシリコーン膜をウェルの底部の開口部に貼り付けたものであってもよい。
また、この細胞培養プレートは、ＥＯＧ（エチレンオキサイド）滅菌等を行うことができ、適宜、滅菌処理等の処理を行って利用される。
【００５５】
本発明の細胞培養プレートを用いて細胞を培養する場合、培養条件等は、具体的な培養対象に応じて、従来公知の方法を使用することができる。
【００５６】
また、本発明の支持体は、支持体の両面から培養細胞への酸素の供給及び二酸化炭素の排出が可能であるので、酸素要求性の細胞（例えば、肝臓細部、膵細胞、神経細胞、皮膚細胞、肺細胞など）の培養に好適である。本発明の支持体は、通常市販されるプラスチックプレートと比較して、２倍以上程度の培養期間の培養が可能である。
そのため、本発明の細胞培養プレートは、細胞の長期培養用として好適に用いることができる。酸素の供給や二酸化炭素の排出が行われるため、例えば、１０日以上の培養期間であっても、安定して細胞が培養される。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００５８】
［実施例１］
＜材料＞
（Ａ）シリコーン膜（１）
・株式会社エス・アイ・アール製「Ｃ６−５３０（ＰＤＭＳ系シリコーン膜、厚み３００μｍ）」
（Ｂ）両親媒性ポリマー
・ＡＰＰ（１）：ポリウレタン・ポリスルホン酸・ポリエチレングリコールの共重合体（疎水性ブロック：ポリウレタン、親水性ブロック：ポリスルホン酸・ポリエチレングリコール、疎水性ブロックＭｗ約２万、親水性ブロックＭｗ約２万、総分子量Ｍｗ：約４万
（Ｃ）細胞親和性物質
・天然型因子：ＥＧＦ（Ｅｐｅｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−上皮細胞成長因子）、ＷＡＫＯ社製ヒト組換体、０５９−０７８７３
・ＦＮＢＣＤ−ＥＧＦ：コラーゲン結合性増殖因子（ＥＧＦ−コラーゲン結合ペプチド融合体）  なお、使用したＦＮＢＣＤ−ＥＧＦは、「高分子論文集  Ｖｏｌ．６９（２０１２）、Ｎｏ．１、Ｐ１−１０、結合性細胞増殖因子の創成と応用、北嶋  隆、多田誠一、伊藤嘉浩」に記載の方法により、フィブロネクチンのコラーゲン結合部位とＥＧＦの融合タンパクを昆虫細胞発現組換体により合成した。
・コラーゲン：ブタ由来アテロコラーゲン、株式会社高研製、ＡＰＮ−２２１
なお、コラーゲンは、凍結乾燥し、安定防腐剤のフェノキシエタノールを除去して使用した。
【００５９】
［実施例１−１］
（１）支持体の製造
ジメチルスルホキサイドに、ＡＰＰ（１）とＦＮＢＣＤ−ＥＧＦとが１０：２（ｗ／ｗ）の割合になるように溶解し、溶質濃度５質量％の溶液（溶液（１））を得た。
溶液（１）に、シリコーン膜を２５℃で１時間浸漬させて、溶液から取り出して、純水２，０００ｍＬに室温で２時間浸漬させた。その後、さらに、７０℃、２時間で熱風乾燥し、シリコーン膜の表面にＡＰＰ（１）とＦＮＢＣＤ−ＥＧＦとをコーティングした支持体（１）を得た。
【００６０】
（２）細胞培養プレートの製造
９６個のウェルの底に穴が開いている９６ウェルプレートの底の部分に、支持体（１）をＡＰＰ（１）とコラーゲンとをコーティングした面が上向きになるように取り付けて、細胞培養プレート（１）を得た。
【００６１】
［実施例１−２］
ジメチルスルホキサイドに、ＡＰＰ（１）：ＦＮＢＣＤ−ＥＧＦ：コラーゲンが１０：１：２の（ｗ／ｗ）割合になるように溶解した、濃度５質量％の溶液（溶液（２））を得た。
溶液（１）の代わりに溶液（２）を使用した以外は実施例１−１と同様にして、細胞培養プレート（２）を得た。
【００６２】
［実施例１−３］
ジメチルスルホキサイドに、ＡＰＰ（１）：コラーゲンが１０：２（ｗ／ｗ）の割合になるように溶解した、濃度２質量％の溶液（溶液（３））を得た。
溶液（１）の代わりに溶液（３）を使用した以外は実施例１−１と同様にして、細胞培養プレート（３）を得た。
【００６３】
［実施例１−４］
ジメチルスルホキサイドに、ＡＰＰ（１）を溶解し、濃度２質量％の溶液（溶液（４））を得た。
溶液（１）の代わりに溶液（４）を使用した以外は実施例１−１と同様にして、細胞培養プレート（４）を得た。
【００６４】
［比較例１−１］
（１）支持体の製造
ジメチルスルホキサイドに、ＥＧＦを溶解し、濃度５質量％の溶液（ＥＧＦ溶液）を得た。
溶液（１）の代わりにＥＧＦ溶液を使用した以外は実施例１−１と同様にして、細胞培養プレート（１’）を得た。
【００６５】
［比較例１−２］
ＥＧＦの代わりにコラーゲンを使用した以外は比較例１−１と同様にして、細胞培養プレート（２’）を得た。
【００６６】
以下に製造した細胞培養プレートのポリマー層の構成を示す。
【００６７】
【表１】
2019068761.tif 000003
【００６８】
＜評価＞
実施例１−１〜１−４、比較例１−１、１−２で作製した細胞培養プレートを用いて、ＨｅｐＧ２細胞を、培養表面に４×１０＾４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（９６ｗｅｌｌ）で播種し、培養液（ＷＥ培地）で培養した。また、培養日数１日目と５日目で培地交換を行った。培養の日数に対する細胞増殖活性を評価した。なお、細胞増殖活性は、細胞内ＡＴＰをベースにした細胞増殖検証方法により求めた。細胞増殖はＰｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉＴｅｒＧｌｏ  Ａｓｓａｙを用いて、ＧｌｏＭａｘ装置により測定した。
【００６９】
図１に、実施例１−１、１−２、比較例１−１の細胞培養プレートを用いた場合の結果を示す。図１に示すように、比較例１−１（ＥＧＦのみでコーティングした細胞培養プレート）では、培養日数に対する大きな細胞増殖の向上は見られない。これは、ＥＧＦを単に添加したのみでは、シリコーン膜への接着が弱く、時間の経過とともにＥＧＦが剥離したためと考えられる。
一方、実施例１−１（ＡＰＰ（１）とＦＮＢＣＤ−ＥＧＦとをコーティングした細胞培養プレート）は、比較例１−１に比較してＥＧＦによる細胞増殖が促進された。ＡＰＰ（１）とシリコーン膜が強固に接着し、さらに、ＡＰＰ（１）とＦＮＢＣＤ−ＥＧＦがある程度結合したからではないかと考えられる。
また、実施例１−２（ＡＰＰ（１）とＦＮＢＣＤ−ＥＧＦとＣｏｌｌａｇｅｎとをコーティングした細胞培養プレート）は、ＡＰＰ（１）によりＦＮＢＣＤやコラーゲンがシリコーン膜に接着することに加え、さらに、ＦＮＢＣＤ−ＥＧＦがコラーゲンにより、固定され、そのため、ＥＧＦによる細胞増殖が促進されたと考えられる。
【００７０】
また、図２に、実施例１−３、１−４、比較例１−２の細胞培養プレートを用いた場合の結果を示す。図２に示すように、コラーゲンだけを加えた比較例１−２の細胞培養プレートは、培養日数の経過とともに、細胞増殖の向上は見られなくなる。これは、コラーゲンを加えただけでは、コラーゲンが安定してシリコーン膜の表面に固定化されておらず、細胞培養プレートに用いた支持体の接着性が培養日数の経過に伴い低下しているためと考えられる。
実施例１−３では、培養日数の経過に対する細胞増殖が向上しており、ＡＰＰ（１）を介しコラーゲンがシリコーン膜に強固に接着していることがわかる。また、実施例１−４も実施例１−３と同等の細胞増殖を示しており、ＡＰＰ（１）が細胞接着性を有すること、また、細胞増殖性もあることを示している。
【００７１】
［実施例２］
両親媒性ポリマーとして、ポリウレタン・ポリアミノ酸共重合体（ＰＡＵ）を使用した。
なお、ＰＡＵは、特開２００１−１３６９６０号公報の実施例に記載の方法と同様にして、ウレタンプレポリマー（末端：イソシアネート基、ポリテトラメチレンエーテルグリコールとトリレジンイソシアネートとの共重合体）とγ-メチル-L-グルタメート-Nカルボキシ無水物とを１：１（ｗ／ｗ）で反応させて合成した。
ＡＰＰ（１）の代わりにＰＡＵを使用した以外は実施例１−３と同様にして、細胞培養プレート（５）を得た。
細胞培養プレート（５）を用いて、実施例１と同様の方法にて細胞増殖活性を評価したところ、比較例１−２（シリコーン膜にコラーゲンのみを添加したもの）に比べて細胞活性の向上が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の支持体はガス透過性や細胞接着性に優れるため、本発明の支持体を用いて細胞を培養することで、より生体内に近い環境で細胞を安定に培養することができ、産業上有用である。
【図１】
2019068761.tif 000004
【図２】
2019068761.tif 000005