(57)【要約】      （修正有）【課題】生物活性剤の細胞標的の捕捉および特定のための組成物および方法の提供。【解決手段】（ａ）生物活性剤の細胞標的と、（ｂ）第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の二量体と、（ｃ）第１の捕捉リガンドに連結した前記生物活性剤であって、前記第１の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、前記生物活性剤と、（ｄ）第２の捕捉リガンドを提示する固体表面であって、前記第２の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第２の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、固体表面と、を含む、システム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生物活性剤の細胞標的と、
（ｂ）第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の二量体と、
（ｃ）第１の捕捉リガンドに連結した前記生物活性剤であって、前記第１の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、前記生物活性剤と、
（ｄ）第２の捕捉リガンドを提示する固体表面であって、前記第２の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第２の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、固体表面と、
を含む、システム。
【請求項２】
前記細胞標的が、細胞内でレポーターとの融合体として発現する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記レポーターが、生物発光レポーターである、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記生物発光レポーターが、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記第１および第２の捕捉タンパク質の両方が、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記二量体が、ホモ二量体である、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記生物活性剤が、小分子である、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記細胞標的が、前記生物活性剤の結合パートナーである、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記第１の捕捉リガンドおよび第２の捕捉リガンドが、同一の分子構造を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記固体表面が、ウェル、チューブ、スライド、平板、樹脂、またはビーズからなるリストから選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記固体表面が、磁性または常磁性である、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記細胞標的が前記生物活性剤に結合し、前記第１の捕捉タンパク質が前記第１の捕捉リガンドに結合し、前記第２の捕捉タンパク質が前記固体表面上で、前記第２の捕捉リガンドに結合する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
細胞標的を捕捉する方法であって、
（ａ）第１の捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、前記生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、前記細胞標的が前記生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、
（ｂ）前記細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成するステップと、
（ｃ）前記細胞溶解物を、第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の二量体と、前記第１の捕捉リガンドが前記第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、
（ｄ）前記細胞溶解物を、第２の捕捉リガンドを提示する固体表面と、前記第１の捕捉リガンドが前記第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、
（ｅ）前記固体表面を前記細胞溶解物から分離するステップと、
を含む、方法。
【請求項１４】
細胞標的を捕捉する方法であって、
（ａ）第１の捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、前記生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、前記細胞標的が前記生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、
（ｂ）前記細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成するステップと、
（ｃ）前記細胞溶解物を、第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の二量体に結合した第２の捕捉リガンドを提示する固体表面と接触させるステップであって、前記第２の捕捉タンパク質および前記第２の捕捉リガンドが共有的に結合する、ステップと、
（ｄ）前記固体表面を前記細胞溶解物から分離するステップと、
を含む、方法。
【請求項１５】
前記細胞標的が、レポータータンパク質との融合体である、請求項１３および１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）生物活性剤の細胞標的と、
（ｂ）第１の捕捉リガンドに連結した生物活性剤と、
を含む細胞の、細胞溶解物であって、
前記細胞溶解物が、
（ｃ）第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の二量体であって、前記第１の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、二量体と、
（ｄ）第２の捕捉リガンドを提示する固体表面であって、前記第２の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第２の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、固体表面と、
を更に含む、細胞溶解物。
【請求項１７】
前記細胞標的が、レポータータンパク質との融合体である、請求項１６に記載の細胞溶解物。
【請求項１８】
前記レポータータンパク質が、生物発光レポーターである、請求項１７に記載の細胞溶解物。
【請求項１９】
前記生物発光レポーターが、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１８に記載の細胞溶解物。
【請求項２０】
前記第１および第２の捕捉タンパク質の両方が、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項１６に記載の細胞溶解物。
【請求項２１】
前記二量体が、ホモ二量体である、請求項１６に記載の細胞溶解物。
【請求項２２】
前記生物活性剤が、小分子である、請求項１６に記載の細胞溶解物。
【請求項２３】
前記細胞標的が、前記生物活性剤の結合パートナーである、請求項１６に記載の細胞溶解物。
【請求項２４】
前記第１の捕捉リガンドおよび第２の捕捉リガンドが、同一の分子構造を含む、請求項１６に記載の細胞溶解物。
【請求項２５】
前記固体表面が、ウェル、チューブ、スライド、平板、樹脂、またはビーズからなるリストから選択される、請求項１６に記載の細胞溶解物。
【請求項２６】
前記固体表面が、磁性または常磁性である、請求項２５に記載の細胞溶解物。
【請求項２７】
前記細胞標的が前記生物活性剤に結合し、前記第１の捕捉タンパク質が前記第１の捕捉リガンドに結合し、前記第２の捕捉タンパク質が前記固体表面上で、前記第２の捕捉リガンドに結合する、請求項１６に記載の細胞溶解物。
【請求項２８】
（ａ）生物活性剤の細胞標的と、
（ｂ）捕捉リガンドに連結した前記生物活性剤と、
（ｃ）捕捉タンパク質を提示する固体表面であって、前記捕捉タンパク質が、その相互作用に際して前記捕捉リガンドと共有結合を形成する、固体表面と、
を含むシステム。
【請求項２９】
前記細胞標的が、細胞内でレポーターとの融合体として発現する、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記レポーターが、生物発光レポーターである、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記生物発光レポーターが、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記捕捉タンパク質が、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３３】
前記生物活性剤が、小分子である、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３４】
前記細胞標的が、前記生物活性剤の結合パートナーである、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３５】
前記固体表面が、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、またはビーズからなるリストから選択される、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３６】
前記固体表面が、磁性または常磁性である、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記細胞標的が前記生物活性剤に結合し、前記捕捉タンパク質が前記捕捉リガンドに結合する、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３８】
細胞標的を捕捉する方法であって、
（ａ）捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、前記生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、前記細胞標的が前記生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、
（ｂ）前記細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成するステップと、
（ｃ）前記細胞溶解物を、捕捉タンパク質を提示する固体表面と、前記捕捉タンパク質が前記捕捉リガンドと共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、
（ｄ）前記固体表面を前記細胞溶解物から分離するステップと、
を含む、方法。
【請求項３９】
前記細胞標的が、レポータータンパク質との融合体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）生物活性剤の細胞標的と、
（ｂ）捕捉リガンドに連結した生物活性剤と、
を含む細胞の細胞溶解物であって、
前記細胞溶解物が、
（ｃ）捕捉タンパク質を提示する固体表面であって、前記捕捉タンパク質が、その相互作用に際して前記捕捉リガンドと共有結合を形成する、固体表面と、
を更に含む、細胞溶解物。
【請求項４１】
前記細胞標的が、レポータータンパク質との融合体である、請求項４０に記載の細胞溶解物。
【請求項４２】
前記レポータータンパク質が、生物発光レポーターである、請求項４１に記載の細胞溶解物。
【請求項４３】
前記生物発光レポーターが、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項４２に記載の細胞溶解物。
【請求項４４】
前記捕捉タンパク質が、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項４０に記載の細胞溶解物。
【請求項４５】
前記生物活性剤が、小分子である、請求項４０に記載の細胞溶解物。
【請求項４６】
前記細胞標的が、前記生物活性剤の結合パートナーである、請求項４０に記載の細胞溶解物。
【請求項４７】
前記固体表面が、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、またはビーズからなるリストから選択される、請求項４０に記載の細胞溶解物。
【請求項４８】
前記固体表面が、磁性または常磁性である、請求項４７に記載の細胞溶解物。
【請求項４９】
前記細胞標的が前記生物活性剤に結合し、前記捕捉タンパク質が前記捕捉リガンドに結合する、請求項４０に記載の細胞溶解物。
【請求項５０】
カルバメートリンカーを含む、捕捉リガンド。
【請求項５１】
クロロアルカンを更に含む、請求項５０に記載の捕捉リガンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７３６，４２６号、および２０１３年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／８８３，３１３号に対する優先権を主張し、これらの両方は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、生物活性剤の細胞標的の捕捉および特定のための組成物および方法を提供する。具体的には、捕捉リガンドに連結した生物活性剤、細胞標的（内在的、またはレポーターで任意にタグ付けされる）、捕捉タンパク質（捕捉融合体として任意に存在する）、表面（例えば、捕捉リガンド、捕捉タンパク質、または捕捉融合体を提示する）、およびそれと共に生物活性剤の細胞標的を捕捉し、特定する方法が本明細書に提供される。
【背景技術】
【０００３】
細胞に基づく表現型スクリーニングは、生物活性薬物候補の発見のためにますます使用されている。薬物候補の標的は細胞状況内で自然に機能し、それらがどのように生物活性分子（例えば、合成分子）と相互作用するかは、この状況によって優位に影響される。この理由から、生物活性分子に対する未知の標的を特定しようとする際、標的が、特定のために捕捉される前に、生細胞内で生物活性分子に結合することを可能にすることが好適である。したがって、捕捉前に、結合が細胞溶解物内で発生することを可能にする方法は、それほど好適ではない。これは、所望の生物活性を媒介する一次標的にも、および不利益または干渉につながり得る標的外にも当てはまる。そのような生物活性分子のためのタンパク質標的を発見し、確認することは、しばしば、親和性強化および質量分析法の組み合わせを使用する。そのような方法は、いくつかの困難に直面する。まず、標的分子とタンパク質標的との間のしばしば中度から弱度である結合は、標的タンパク質またはタンパク質複合体を捕捉することを困難にする、または結果を高親和性の相互作用体の方に偏倚させる。更に、親和性強化法は、典型的に候補標的分子で固定された固体支持体を使用する。固体表面上の結合の速度論は、溶液に基づく速度論と比較するとずっと遅く、標的タンパク質またはタンパク質複合体を捕捉する可能性を更に減少させる。細胞溶解物から固体支持体へのタンパク質の非特異的結合は、質量分析（ＭＳ）を使用する細胞標的の特定を更に複雑化する、高バックグラウンドにつながる。そのような方法は、しばしば多数の推定該当点につながり、二次スクリーニングを行って潜在的標的を確認することを必要とする。標的分子−タンパク質相互作用のための高速大量処理確認アッセイは、それを資源集約的な工程にする更なる開発および最適化を必要とする。
【発明の概要】
【０００４】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）生物活性剤の細胞標的と、（ｂ）第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の融合体と、（ｃ）第１の捕捉リガンドに連結した生物活性剤であって、第１の捕捉リガンドが、その相互作用に際して第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、生物活性剤と、（ｄ）第２の捕捉リガンドを提示する固体表面であって、第２の捕捉リガンドが、その相互作用に際して第２の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、固体表面と、のうちの１つ以上（例えば、全て）を含む、組成物および系（システム（ｓｙｓｔｅｍ））（例えば、細胞、反応混合物、キット、容器など）を提供する。いくつかの実施形態において、（ａ）は、生物活性化合物の複数の細胞標的を含む。いくつかの実施形態において、細胞標的は、細胞内でレポーターとの融合体として発現する。いくつかの実施形態において、レポーターは、生物発光レポーターである。いくつかの実施形態において、レポーターは、生物発光タンパク質の一部、成分、またはサブユニットである。いくつかの実施形態において、生物発光レポーターは、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、第１および第２の捕捉タンパク質の両方は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）を含む。いくつかの実施形態において、融合体は、ホモ二量体である。いくつかの実施形態において、生物活性剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、細胞標的は、生物活性剤の結合パートナーである。いくつかの実施形態において、細胞標的は、２つ以上のタンパク質、またはタンパク質および核酸の複合体などの、分子の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、第１の捕捉リガンドおよび第２の捕捉リガンドは、同一の分子構造を含む。いくつかの実施形態において、固体表面は、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）などからなるリストから選択される。いくつかの実施形態において、固体表面は、磁性である。いくつかの実施形態において、固体表面は、非磁性である。いくつかの実施形態において、細胞標的は生物活性剤に結合し、第１の捕捉タンパク質は第１の捕捉リガンドに結合し、第２の捕捉タンパク質は固体表面上で、第２の捕捉リガンドに結合する。
【０００５】
特定の実施形態において、本発明は、（ａ）第１の捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、細胞標的が生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、（ｂ）細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成するステップと、（ｃ）細胞溶解物を、第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の融合体と、第１の捕捉リガンドが第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、（ｄ）細胞溶解物を、第２の捕捉リガンドを提示する固体表面と、第１の捕捉リガンドが第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、（ｅ）固体表面を細胞溶解物から分離するステップと、を含む、細胞標的を捕捉する方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、（ａ）第１の捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、細胞標的が生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、（ｂ）細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成するステップと、（ｃ）細胞溶解物を、第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の融合体に結合した第２の捕捉リガンドを提示する固体表面と接触させるステップであって、第２の捕捉タンパク質および第２の捕捉リガンドが共有的に結合する、ステップと、（ｄ）固体表面を細胞溶解物から分離するステップと、を含む、細胞標的を捕捉する方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞標的は、細胞に内在する。いくつかの実施形態において、細胞標的は、レポーターとの融合体である。
【０００６】
特定の実施形態において、本発明は、（ａ）第１の捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、細胞標的が生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、（ｂ）第１の捕捉リガンドを、第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の融合体と、第１の捕捉リガンドが第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、（ｃ）捕捉融合体を、第２の捕捉リガンドを提示する固体表面と、第１の捕捉リガンドが第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、（ｄ）固体表面を細胞溶解物から分離するステップと、を含む、細胞標的を捕捉する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップを含む。他の実施形態において、本発明は、（ａ）第１の捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、細胞標的が生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、（ｂ）第１の捕捉リガンドを、第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の融合体に結合した第２の捕捉リガンドを提示する固体表面と接触させるステップであって、第２の捕捉タンパク質および第２の捕捉リガンドが共有的に結合する、ステップと、（ｃ）固体表面を細胞溶解物から分離するステップと、を含む、細胞標的を捕捉する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップを含む。いくつかの実施形態において、細胞標的は、レポーターとの融合体である。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）および／または（ｂ）の生成物は、細胞溶解なしで、細胞を退出する（例えば、分泌される、開口分泌、活性除去）。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）生物活性剤の細胞標的と、（ｂ）第１の捕捉リガンドに連結した生物活性剤を含む細胞の、細胞溶解物、細胞成分、または細胞画分であって、細胞溶解物は、（ｃ）第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の融合体であって、第１の捕捉リガンドが、その相互作用に際して第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、融合体と、（ｄ）第２の捕捉リガンドを提示する固体表面であって、第２の捕捉リガンドが、その相互作用に際して第２の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、固体表面と、を更に含む、細胞溶解物を提供する。いくつかの実施形態において、（ａ）は、生物活性化合物の複数の細胞標的を含む。いくつかの実施形態において、細胞標的は、レポーターとの融合体である。いくつかの実施形態において、レポーターは、生物発光レポーターである。いくつかの実施形態において、レポーターは、生物発光タンパク質の一部、成分、またはサブユニットである。いくつかの実施形態において、生物発光レポーターは、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）を含む。いくつかの実施形態において、第１および第２の捕捉タンパク質の両方は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）を含む。いくつかの実施形態において、融合体は、ホモ二量体である。いくつかの実施形態において、生物活性剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、細胞標的は、生物活性剤の結合パートナーである。いくつかの実施形態において、細胞標的は、２つ以上のタンパク質、またはタンパク質および核酸の複合体などの、分子の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、第１の捕捉リガンドおよび第２の捕捉リガンドは、同一の分子構造を含む。いくつかの実施形態において、固体表面は、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）などからなるリストから選択される。いくつかの実施形態において、細胞標的は生物活性剤に結合し、第１の捕捉タンパク質は第１の捕捉リガンドに結合し、第２の捕捉タンパク質は固体表面上で、第２の捕捉リガンドに結合する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）生物活性剤の細胞標的と、（ｂ）捕捉リガンドに連結した生物活性剤と、（ｃ）捕捉タンパク質を提示する固体表面であって、捕捉タンパク質が、その相互作用に際して捕捉リガンドと共有結合を形成する、固体表面と、のうちの１つ以上（例えば、全て）を含む組成物および系（例えば、細胞、反応混合物、キット、容器など）を提供する。いくつかの実施形態において、（ａ）は、生物活性化合物の複数の細胞標的を含む。いくつかの実施形態において、細胞標的は、細胞に内在する。いくつかの実施形態において、細胞標的は、細胞内でレポーターとの融合体として発現する。いくつかの実施形態において、レポーターは、生物発光レポーターである。いくつかの実施形態において、レポーターは、生物発光タンパク質の一部、成分、またはサブユニットである。いくつかの実施形態において、生物発光レポーターは、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、捕捉タンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、更なるステップ（ｅ）固体表面に結合する、またはそこから放出される、生物発光を測定することを含む。いくつかの実施形態において、生物活性剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、合成分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、酵素または受容体の阻害剤などの、タンパク質機能の阻害剤である。いくつかの実施形態において、細胞標的は、２つ以上のタンパク質、またはタンパク質および核酸の複合体などの、分子の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、細胞標的は、生物活性剤の結合パートナーである。いくつかの実施形態において、細胞標的は、２つ以上のタンパク質、またはタンパク質および核酸の複合体などの、分子の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、細胞標的は、生物活性剤に非共有的に結合する。いくつかの実施形態において、固体表面は、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）などからなるリストから選択される。いくつかの実施形態において、細胞標的は生物活性剤に結合し、捕捉タンパク質は捕捉リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、細胞標的は生物活性剤に非共有的に結合し、捕捉タンパク質は捕捉リガンドに共有的に結合する。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、クロロアルカンである。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、リンカーを含む。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、カルバメートリンカーを含む。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、開裂可能リンカーを含む。特定の実施形態において、捕捉リガンドは、カルバメートリンカーおよび開裂可能リンカーを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）捕捉リガンドに連結した生物活性剤と、（ｂ）捕捉タンパク質を提示する固体表面であって、捕捉タンパク質が、その相互作用に際して捕捉リガンドと共有結合を形成する、固体表面と、を含む組成物および系（例えば、反応混合物、キット、容器など）を提供する。いくつかの実施形態において、生物活性剤は、細胞標的に非共有的に結合する。いくつかの実施形態において、細胞標的は、細胞に内在する。いくつかの実施形態において、細胞標的は、細胞内でレポーターとの融合体として発現する。いくつかの実施形態において、レポーターは、生物発光レポーターである。いくつかの実施形態において、生物発光レポーターは、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、捕捉タンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、生物活性剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、細胞標的は、生物活性剤の結合パートナーである。いくつかの実施形態において、細胞標的は、生物活性剤に非共有的に結合する。いくつかの実施形態において、固体表面は、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）などからなるリストから選択される。いくつかの実施形態において、細胞標的は生物活性剤に結合し、捕捉タンパク質は捕捉リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、細胞標的は生物活性剤に非共有的に結合し、捕捉タンパク質は捕捉リガンドに共有的に結合する。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、クロロアルカンである。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、リンカーを含む。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、カルバメートリンカーを含む。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、開裂可能リンカーを含む。特定の実施形態において、捕捉リガンドは、カルバメートリンカーおよび開裂可能リンカーを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、細胞標的が生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、（ｂ）細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成するステップと、（ｃ）細胞溶解物を、捕捉タンパク質を提示する固体表面と、捕捉タンパク質が捕捉リガンドと共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、（ｄ）固体表面を細胞溶解物から分離するステップと、を含む、細胞標的を捕捉する方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞標的は、細胞に内在する。いくつかの実施形態において、細胞標的は、細胞内でレポーターとの融合体として発現する。いくつかの実施形態において、レポーターは、生物発光レポーターである。いくつかの実施形態において、生物発光レポーターは、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、捕捉タンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、生物活性剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、細胞標的は、生物活性剤の結合パートナーである。いくつかの実施形態において、細胞標的は、生物活性剤に非共有的に結合する。いくつかの実施形態において、固体表面は、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）などからなるリストから選択される。いくつかの実施形態において、細胞標的は生物活性剤に結合し、捕捉タンパク質は捕捉リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、細胞標的は生物活性剤に非共有的に結合し、捕捉タンパク質は捕捉リガンドに共有的に結合する。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、クロロアルカンである。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、リンカーを含む。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、カルバメートリンカーを含む。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、開裂可能リンカーを含む。特定の実施形態において、捕捉リガンドは、カルバメートリンカーおよび開裂可能リンカーを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本方法は、（ｅ）細胞標的を検出または分析するステップを更に含む。他の実施形態において、本方法は、（ｅ）細胞標的を固体支持体から溶出するステップと、（ｆ）細胞標的を検出または分析するステップと、を更に含む。いくつかの実施形態において、細胞標的は、質量分析（ＭＳ）を使用して検出または分析される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）生物活性剤の細胞標的と、（ｂ）捕捉リガンドに連結した生物活性剤と、を含む細胞の細胞溶解物を提供する。いくつかの実施形態において、細胞溶解物は、（ｃ）捕捉タンパク質を提示する固体表面であって、捕捉タンパク質が、その相互作用に際して捕捉リガンドと共有結合を形成する、固体表面を更に含む。いくつかの実施形態において、（ａ）は、生物活性化合物の複数の細胞標的を含む。いくつかの実施形態において、細胞標的は、細胞に内在する。いくつかの実施形態において、細胞標的は、レポーターとの融合体である。いくつかの実施形態において、レポーターは、生物発光レポーターである。いくつかの実施形態において、レポーターは、生物発光タンパク質の一部、成分、またはサブユニットである。いくつかの実施形態において、生物発光レポーターは、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、捕捉タンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、生物活性剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、合成分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、酵素または受容体の阻害剤などの、タンパク質機能の阻害剤である。いくつかの実施形態において、細胞標的は、生物活性剤の結合パートナーである。いくつかの実施形態において、細胞標的は、２つ以上のタンパク質、またはタンパク質および核酸の複合体などの、分子の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、細胞標的は、生物活性剤に非共有的に結合する。いくつかの実施形態において、固体表面は、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）などからなるリストから選択される。いくつかの実施形態において、細胞標的は生物活性剤に結合し、捕捉タンパク質は捕捉リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、細胞標的は生物活性剤に非共有的に結合し、捕捉タンパク質は捕捉リガンドに共有的に結合する。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、クロロアルカンである。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、リンカーを含む。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、カルバメートリンカーを含む。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、開裂可能リンカーを含む。特定の実施形態において、捕捉リガンドは、カルバメートリンカーおよび開裂可能リンカーを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】捕捉タンパク質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）を使用する、タンパク質またはタンパク質複合体と複合した捕捉リガンドに連結した生物活性剤（例えば、ＳＭ−ＨＴＬ）の迅速かつ特異的な捕捉のための、本発明の実施形態の概略的描示を示す。
【図２】様々な方法を使用する、タンパク質複合体の迅速かつ特異的な溶出のための、本発明の実施形態の概略的描示を示す。
【図３Ａ】ビーズ容積、ならびに様々な捕捉アッセイにおける発光上のＳＭ−ＨＴＬの存在または不在、すなわち（Ａ）ｐ３８αおよびＢＩＲＢ−クロロアルカンの効果を描写するグラフを示す。
【図３Ｂ】ビーズ容積、ならびに様々な捕捉アッセイにおける発光上のＳＭ−ＨＴＬの存在または不在、すなわち（Ｂ）ＨＤＡＣ６およびＳＡＨＡ−クロロアルカンの効果を描写するグラフを示す。
【図３Ｃ】ビーズ容積、ならびに様々な捕捉アッセイにおける発光上のＳＭ−ＨＴＬの存在または不在、すなわち（Ｃ）過剰発現したＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８αでのＢＩＲＢ−クロロアルカンプルダウンの効果を描写するグラフを示す。
【図３Ｄ】ビーズ容積、ならびに様々な捕捉アッセイにおける発光上のＳＭ−ＨＴＬの存在または不在、すなわち（Ｄ）過剰発現したＮＡＮＯＬＵＣ−ＨＤＡＣ６でのＳＡＨＡ−クロロアルカンプルダウンの効果を描写するグラフを示す。
【図４】ｐ３８αおよびＢＩＲＢ−クロロアルカン捕捉アッセイに従う、溶解物の抗ｐ３８を使用する、ウエスタン／銀染色分析を示す。
【図５】本発明の実施形態の、薬物に短期間で結合する標的タンパク質を捕捉する能力を描写するグラフを示す。
【図６Ａ】クロロアルカン修飾小分子を使用する、標的タンパク質の細胞からのプルダウンのための、カルバメートクロロアルカンリンカーの使用を描写するグラフを示す。
【図６Ｂ】クロロアルカン修飾小分子を使用する、標的タンパク質の細胞からのプルダウンのための、カルバメートクロロアルカンリンカーの使用を描写するグラフを示す。
【図６Ｃ】クロロアルカン修飾小分子を使用する、標的タンパク質の細胞からのプルダウンのための、カルバメートクロロアルカンリンカーの使用を描写するグラフを示す。
【図７】バックグラウンド上信号についての、様々な放出方法の効果を描写するグラフを示す。
【図８Ａ】（Ａ）メトトレキサート−ＣＡでのＤＨＦＲ（２１ｋＤａ）の特異的なプルダウンを実証するウエスタンブロットを示す。
【図８Ｂ】（（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞からのメトトレキサート−ＣＡによってプルダウンしたタンパク質質量分析を示す。
【図９Ａ】（Ａ）ＢＩＲＢ−ＣＡでのｐ３８（４１ｋＤａ）の特異的なプルダウンを実証するウエスタンブロットを示す。
【図９Ｂ】（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞からのＢＩＲＢ−ＣＡによってプルダウンしたタンパク質の質量分析を示す。
【図１０】クロロアルカン修飾の、連結した生物活性剤、すなわちＳＡＨＡの透過性および力価に対する最小限の影響を示す。
【図１１】低親和性標的（ＨＤＡＣ８）および低存在度標的（ＨＤＡＣ３）を含むＳＡＨＡの全ての既知の標的が、本発明の実施形態を使用して、細胞から特異的にプルダウンされ得ることを示す。（Ａ）ＳＡＨＡ−ＣＡを使用する、全ての既知の標的の特異的なプルダウンを実証するウエスタンブロット、および（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞からのＳＡＨＡ−ＣＡによる、タンパク質プルダウンの質量分析。
【図１２】ビオチン修飾と比較した、クロロアルカン修飾の、連結した生物活性剤、すなわちＳＡＨＡの透過性および力価に対する最小限の影響を示す。
【図１３】ＨＤＡＣ６のみがＳＡＨＡ−ビオチンによってプルダウンされた一方での、低親和性標的（ＨＤＡＣ８）および低存在度標的（ＨＤＡＣ３）を含む、ＳＡＨＡ−ＣＡによる、Ｋ５６２細胞からのＳＡＨＡの全ての既知の標的の特異的なプルダウンを実証するウエスタンブロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
本明細書で使用される場合、「捕捉タンパク質」という用語は、その相互作用に際してその基質および／またはリガンドと安定した共有結合を形成する、タンパク質に言及する。捕捉タンパク質は、その基質と共有結合を形成する、そのリガンドまたは酵素と結合する際、共有結合を形成する受容体であり得る。本発明の実施形態における使用のために適切な捕捉タンパク質の例は、米国特許第７，４２５，４３６号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質である。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「捕捉融合体」という用語は、捕捉タンパク質の２つ以上の複製の融合体に言及する。「捕捉二量体」という用語はまた、２つの捕捉タンパク質の融合体（例えば、ヘテロ二量体、ホモ二量体など）に言及するために使用され得る。捕捉タンパク質は、融合体内の各捕捉タンパク質が、基質および／またはリガンドと共有結合を形成することができるような方法で、安定して連係（例えば、共有的に）、連結、および／または融合される。捕捉タンパク質は、互いに直接的に結合されてもよく、またはリンカー（例えば、ペプチドまたは他の鎖あるいはポリマー）によって分離されてもよい。捕捉タンパク質は、（例えば、リンカーの有無に関わりなく）融合体タンパク質として発現してもよく、あるいは化学的または酵素的に連係した後発現であってもよい。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「捕捉リガンド」という用語は、その相互作用に際して捕捉タンパク質と共有結合を形成するリガンド、基質などに言及する。本発明の実施形態における使用のために適切な捕捉リガンドの例は、米国特許第７，４２５，４３６号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される、ＨＡＬＯＴＡＧリガンドである。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「細胞標的」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、多糖類、あるいはポリペプチド（複数可）を有するこれらのうちのいずれかを含む複合体に言及する。細胞標的は、２つ以上の成分、サブユニットまたはポリペプチドで構成されてもよく、例えば、細胞標的は、タンパク質複合体である。細胞標的の例は、受容体または酵素を含み得る。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「生物活性剤」という用語は、一般的に、あらゆる生理学的または薬理学的に活性な物質、または検出に適切な物質に言及する。いくつかの実施形態において、生物活性剤は、潜在的な治療用化合物（例えば、小分子、ペプチド、核酸など）、または薬物様分子である。本明細書に記載される実施形態における使用のための生物活性剤は、大きさまたは構造によって限定されない。
【００１９】
詳細な説明
本発明は、生物活性剤の細胞標的の捕捉および特定のための組成物および方法を提供する。具体的には、捕捉リガンドに連結した生物活性剤、細胞標的（内在的、またはレポーターで任意にタグ付けされる）、捕捉タンパク質（捕捉融合体として任意に存在する）、表面（例えば、捕捉リガンド、捕捉タンパク質、または捕捉融合体を提示する）、およびそれと共に生物活性剤の細胞標的を捕捉し、特定する方法が本明細書に提供される。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明は、細胞内の生物活性剤（例えば、小分子および／または薬物様分子）の細胞標的（例えば、タンパク質またはタンパク質複合体（複数可））の発見および確認のための高感度な方法を提供する（図１を参照されたい）。いくつかの実施形態において、本発明は、表現型スクリーニングアッセイの一部、またはそれと対をなすものとしての使用を見いだす。例えば、表現型スクリーンにおいて所望の表現型反応を産出する小分子の組は、化学的合成または酵素的手段によって、それぞれ捕捉リガンド（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧリガンド）に連結される。細胞は、（内在的、またはレポーターで任意に融合された）細胞標的を係合し、表現型反応（例えば、同一の反応、類似の反応（例えば、±１％…±２％…±５％…±１０％…±２０％…±３０％…±５０％など））を再生させる、小分子／捕捉リガンド共役体（例えば、小分子−ＨＡＬＯＴＡＧリガンド共役体（ＳＭ−ＨＴＬ））で処理される。いくつかの実施形態において、その後、細胞は溶解され、生物活性剤を通して捕捉リガンドに現在連係した細胞標的は、捕捉リガンド（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧリガンド）の、捕捉融合体（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧデハロゲナーゼ（例えば、その基質に共有的に結合するために修飾されたデハロゲナーゼ））、または捕捉タンパク質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧデハロゲナーゼ（例えば、その基質に共有的に結合するために修飾されたデハロゲナーゼ））を提示する表面との結合によって捕捉される。いくつかの実施形態において、捕捉融合体は、溶液内にある（後続して固体表面に結合する）。他の実施形態において、捕捉タンパク質または捕捉融合体は、固体表面（例えば、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）などに結合する（例えば、捕捉融合体は、その表面上に捕捉リガンドを提示する表面に結合する）。いくつかの実施形態において、細胞が溶解すると、生物活性剤を通して捕捉リガンドに現在連係した細胞標的は、捕捉リガンド（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧリガンド）の、固体表面（例えば、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）など）上に提示される捕捉タンパク質（例えば、二量体ではない）との結合によって捕捉される（図１、下部の計画を参照されたい）。
【００２１】
いくつかの実施形態において、内在的標的（例えば、小分子の既知および未知の標的）の捕捉または「プルダウン」のための方法が提供される。いくつかの実施形態において、小分子／捕捉リガンド共役体（例えば、（ＳＭ−ＨＴＬ）に結合する内在的タンパク質は、その後、捕捉タンパク質（例えば、表面（例えば、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）など上に提示される）によって共有的に結合（例えば、プルダウン）する。そのようなプルダウン法には、捕捉されたタンパク質を特定するための分析（例えば、内在的標的の表面からの溶出に従う）が続き得る。分析技術は、ウエスタンブロット、ゲル電気泳動、質量分析、核磁気共鳴分光法などを含み得る。本明細書に提供される系、組成物、および方法は、そのような文脈において使用される際、多数の利点を提供する。特定の実施形態において、細胞内でのクロロアルカン−薬物共役体（例えば、ＨＴＬ−ＳＭ）の結合は、より高い、低親和性標的を捕捉する確率につながる特異的な相互作用を促進する。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法の速度および効率（例えば、内在的標的の共有結合的捕捉について＜３０分（例えば、＜２５分、＜２０分、＜１５分、＜１０分、＜５分、＜１分））は、複合体崩壊を最小化（例えば、二次標的（例えば、ＳＭ−ＨＴＬによって結合する標的と非共有結合的に相互作用するタンパク質）の特定を維持）し、低親和性相互作用を維持する。他の実施形態において、迅速な捕捉は、非特異的な捕捉を最小化する。特定の実施形態において、内在的標的の、非共役薬物との競合による放出は、低存在度標的の検出を増加させるバックグラウンドを低減する。
【００２２】
特定の実施形態において、表面−（捕捉リガンド）−（捕捉融合体）−（捕捉リガンド）−（生物活性剤）−（細胞標的）複合体の精製（例えば、表面を精製すること（例えば、機械的分離、洗浄など）による）後、細胞標的は、任意の適切な機構によって、固体表面（例えば、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）など）から放出または溶出する（図２、上部の計画を参照されたい）。いくつかの実施形態において、過剰な非連結生物活性剤は、細胞標的を捕捉−リガンド−連結生物活性剤から離れて競合させるために、系に添加される。他の実施形態において、捕捉融合体の２つの捕捉タンパク質間の連鎖（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位）は、（例えば、化学的に、酵素的に）開裂して、（捕捉タンパク質）−（捕捉リガンド）−（生物活性剤）−（細胞標的）複合体を放出する。更に他の実施形態において、捕捉リガンドと生物活性剤との間の連鎖は、（例えば、化学的に、酵素的に）開裂して、（生物活性剤）−（細胞標的）複合体を放出する。いくつかの実施形態において、リンカーの全てまたは一部は、開裂に続いて放出された１つまたは両方の成分に結合したままである。
【００２３】
他の実施形態において、表面−（捕捉タンパク質）−（捕捉リガンド）−（生物活性剤）−（細胞標的）複合体の精製（例えば、表面を精製すること（例えば、機械的分離、洗浄など）による）後、細胞標的は、任意の適切な機構によって、固体表面（例えば、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）など）から放出または溶出する（図２、下部の計画を参照されたい）。いくつかの実施形態において、過剰な非連結生物活性剤は、細胞標的を捕捉−リガンド−連結生物活性剤から離れて競合させるために、系に添加される。他の実施形態において、レポーターと細胞標的との間の連鎖（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位）は、（例えば、化学的に、酵素的に）開裂して、レポーターを放出する。他の実施形態において、捕捉リガンドと生物活性剤との間の連鎖は、（例えば、化学的に、酵素的に）開裂して、（生物活性剤）−（細胞標的）複合体を放出する。更に他の実施形態において、捕捉タンパク質は、表面から放出され、これにより（捕捉タンパク質）−（捕捉リガンド）−（生物活性剤）−（細胞標的）複合体の全体を放出する。細胞標的がレポーターに融合／連係する任意の実施形態において、別段規定されない限り（例えば、細胞標的とレポーターとの間の連係の開裂時）、レポーターは、細胞標的を含む任意の複合体に連係したままである。
【００２４】
細胞標的がレポーター分子（例えば、フルオロフォア、ルシフェラーゼなど）に結合／融合するいくつかの実施形態において、捕捉複合体から遊離する細胞標的は、信号を発生させる、および／またはそれをレポーターから検出することによって検出される。細胞標的がレポーター分子（例えば、フルオロフォア、ルシフェラーゼなど）に結合／融合する他の実施形態において、依然捕捉複合体に結合する細胞標的は、信号を発生させる、および／またはそれをレポーターから検出することによって検出される。（例えば、細胞標的がレポーター分子に結合／融合しない）いくつかの実施形態において、捕捉複合体から遊離した細胞標的は、（例えば、生物物理学的、および／または生化学的分析（例えば、質量分析、分光法など）によって）特徴付けられる、および／または特定される。
【００２５】
生物活性剤の細胞標的の捕捉は、捕捉リガンド（例えば、小分子（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧリガンド）の、捕捉タンパク質（例えば、受容体タンパク質、ＨＡＬＯＴＡＧデハロゲナーゼなど）との、相互作用（例えば、共有結合的、または非共有結合的）によって促進される。特定の実施形態において、捕捉リガンド／捕捉タンパク質相互作用は、本明細書に記載される捕捉系および方法の別個のステップにおいて、２度発生する（図１を参照されたい）。まず、捕捉リガンドは、対象の生物活性剤に連結、または他の方法で結合する。生物活性剤が（例えば、インビボで）その細胞標的に結合すると、捕捉融合体（例えば、捕捉実体のホモ二量体）が添加され、捕捉リガンドは捕捉実体のうちの１つによって結合する。次に、複数の同一の捕捉リガンドを提示する固体支持体が添加され、捕捉融合体のうちの未結合の半分は、表面に結合する。細胞標的は、２つの捕捉リガンド／捕捉タンパク質相互作用によって固体支持体に現在連結する（図１を参照されたい）。代替的な実施形態において、捕捉融合体は、アッセイへの添加前（かつ、生物活性剤に連結した捕捉リガンドを結合する前）に、（例えば、捕捉リガンドを提示する表面との、その相互作用を介して）固体支持体に結合する。どちらの代替手段も、同一の捕捉構成につながる。
【００２６】
他の実施形態において、捕捉タンパク質は、捕捉融合体ではなく、捕捉単量体として存在する。いくつかの実施形態において、固体支持体（例えば、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）など）は、捕捉単量体（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧデハロゲナーゼ）をその表面上に提示して提供される。生物活性剤に連結した捕捉リガンドは、捕捉リガンド（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧリガンド）および捕捉タンパク質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）が相互作用する際、表面上に固定される。生物活性剤が、（例えば、レポーターによってタグ付けされる）細胞標的と（例えば、安定して、平衡してなど）相互作用している場合、細胞標的は、（例えば、生物活性剤、捕捉リガンド、および捕捉タンパク質を通して）固体支持体に連係するようになる。
【００２７】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物、方法、および系は、生物活性剤を提供する。いくつかの実施形態において、生物活性剤および捕捉リガンドの共役体が提供される。いくつかの実施形態において、生物活性剤は、細胞の生物学と相互作用することができる、任意の小分子、マクロ分子、または分子複合体である。いくつかの実施形態において、生物活性剤および捕捉リガンド（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧリガンド）は、任意の適切な構造または機構によって、融合、連結、接続などされる（例えば、化学的に（例えば、直接的または間接的に）連係する、酵素的に連係する、リンカー（例えば、ペプチド、核酸、ポリマー、エステル連鎖、ＰＥＧリンカー、炭素鎖など）によって連係する）。連鎖の型は、限定的であると考えられるべきではない。
【００２８】
いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、リンカー部分を含む、および／またはそれによって生物活性剤に連結する。いくつかの実施形態において、リンカー部分は、捕捉リガンドの一部である。いくつかの実施形態において、リンカー部分は、生物活性剤への結合のためのカップリング化学を介して、捕捉リガンドに添加される。いくつかの実施形態において、リンカー部分は、捕捉リガンドへの結合のためのカップリング化学を介して、生物活性剤に添加される。本発明は、いかなる特定のリンカー部分にも限定されない。実際、様々なリンカー部分が想到され、適切なリンカーは、アルキル基、メチレン炭素鎖、エーテル、ポリエーテル、アルキルアミドリンカー、ペプチドリンカー、修飾ペプチドリンカー、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）リンカー、ストレプトアビジン−ビオチンまたはアビジン−ビオチンリンカー、ポリアミノ酸（例えば、ポリリシン）、官能化ＰＥＧ、多糖類、グリコサミンオリゴグリカン、樹枝状ポリマー（それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、国際公開第９３／０６８６８号、およびＴｏｍａｉｉａ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２９：１３８−１７５（１９９０））、ＰＥＧ−キレートポリマー（それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、国際公開第９４／０８６２９号、国際公開第９４／０９０５６号、および国際公開第９６／２６７５４号）、オリゴヌクレオチドリンカー、リン脂質誘導体、アルケニル鎖、アルキニル鎖、二硫化物、またはこれらの組み合わせを含み得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、リンカーは、アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ベンジル、ハロ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、炭酸エステル、カルボキシレート、カルボキシル、エステル、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ、シアネート、ニトレート、亜硝酸、ニトリル、ニトロ、ニトロソ、ピリジン、チオール、硫化物、二硫化物、スルホキシド、スルホン、スリフィン酸、スルホン酸、チオシアネート、チオン、チアル、ホスフィン、ホスホン酸、ホスフェート、および／またはリン酸ジエステル基の任意の組み合わせを含む。任意の適切な官能基を利用する任意の適切なリンカーは、本発明の実施形態の範囲内である。特定の実施形態において、リンカーは、カルバメートリンカーである。いくつかの実施形態において、生物活性剤はリンカーによって捕捉リガンドに結合し、対象の実体の結合は可逆的である（例えば、開裂（例えば、光開裂可能、化学的開裂可能、酵素的開裂可能））。いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞透過性である。いくつかの実施形態において、上記のリンカーは、本明細書に記載される他の成分（例えば、捕捉タンパク質）を結合、または連結することにおいて使用を見いだす。
【００２９】
いくつかの実施形態において、捕捉リガンド（およびリンカー）は、
−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）y−（ＣＨ２）x−ハロゲンを含む、またはこれで構成され、式中、ｙは１〜８であり、ｘは２〜２０であり、ハロゲンはＣｌ、Ｂｒ、またはＦである（例えば、−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2（ＣＨ2）xＣｌ、Ｏ（ＣＯ）ＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2（ＣＨ2）6−ハロゲン、Ｏ（ＣＯ）ＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2（ＣＨ2）6−Ｃｌなど）。
【００３０】
特定の実施形態において、生物活性剤（例えば、＞１０剤、＞５０剤、＞１００剤、＞５００剤、＞１０００剤、＞５０００剤、＞１０，０００剤、＞５０，０００剤など）のライブラリが提供される。いくつかの実施形態において、系、方法、および組成物は、生物活性剤のライブラリを、表現型効果、および／または活性についてスクリーニングするために提供される。いくつかの実施形態において、本発明は、表現型効果、および／または活性を生成、誘導、誘発することなどに関与するライブラリ内の、任意の生物活性剤の細胞標的を捕捉する手段を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、生物活性剤（例えば、表現型効果、および／または活性に関与する生物活性剤）の細胞標的を捕捉、特定、特徴付けなどする手段を提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、細胞標的は、生物活性剤（例えば、小分子、タンパク質、核酸、脂質など）のための、任意の適切な結合／相互作用パートナー（例えば、受容体、酵素）を含む。特定の実施形態において、細胞標的は、生物活性剤に結合、または他の方法で（例えば、安定して、特異的に、非共有結合的に、平衡してなど）相互作用する、タンパク質である。より特定の実施形態において、細胞標的は、小分子生物活性剤に結合、または他の方法で（例えば、安定して、特異的に、非共有結合的に、平衡してなど）相互作用する、受容体タンパク質、または酵素である。本発明は、細胞標的の同一性、型、または階級によって限定されない。特定の実施形態において、何百もの、何千もの、何万もの、より異なる細胞標的のライブラリが、本発明における使用を見いだす。
【００３２】
いくつかの実施形態において、細胞標的は、アッセイが実行される細胞内で発現する。いくつかの実施形態において、細胞標的は、内在的レベル（例えば、天然存在度）で、またはその付近で発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、それらの自然または内在的存在度で、またはその付近で細胞内に存在する細胞標的の捕捉を可能にし、これによりアッセイの生物学的関連性を最大化する。特定の実施形態において、本方法は、細胞標的の内在的レベルでの捕捉を可能にするため、本方法は、生物活性剤（例えば、過剰発現に適合しないであろうと考えられる、それら）の未知の標的の捕捉のために有用である。いくつかの実施形態において、細胞標的は、細胞に内在する。
【００３３】
特定の例示的な実施形態において、捕捉タンパク質は、本明細書で「ＨＡＬＯＴＡＧデハロゲナーゼ」と称される、その基質と共有結合を形成するように修飾されたデハロゲナーゼ酵素（それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第７，４２５，４３６号、米国特許第７，４２９，４７２号、米国特許第７，８６７，７２６号、米国特許第７，８８８，０８６号、米国特許第７，９３５，８０３号、米国特許第ＲＥ４２，９３１号、米国特許第８，１６８，４０５号、米国特許第８，２０２，７００号、米国特許第８，２５７，９３９号、を参照されたい）であり、捕捉リガンドは、本明細書で「ＨＡＬＯＴＡＧリガンド」と称される、ＨＡＬＯＴＡＧデハロゲナーゼ、例えば、ハロアルカンのための基質である。いくつかの実施形態において、捕捉タンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％の同一性、８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性）を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、捕捉リガンドは、カルバメートリンカーを含む。特定の実施形態において、捕捉リガンドは、カルバメートリンカーを有するクロロアルカンリガンド、例えば、カルバメートクロロアルカンである。
【００３４】
いくつかの実施形態において、レポーターは、特定の条件（例えば、エネルギー吸収の際）によって引き起こされる際、信号（例えば、蛍光、共鳴エネルギーなど）を発生、提示、および／または放出することができる実体である。特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物、方法、および系は、細胞標的およびレポーターの融合体（例えば、生物発光レポーター（例えば、ルシフェラーゼ（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ）））を提供する。いくつかの実施形態において、細胞標的およびレポーターは、適切な構造または機構によって、融合、連結、接続などされる（例えば、（例えば、（ペプチドリンカーの有無に関わりなく）融合体構造物として発現する、化学的に（例えば、直接的または間接的に）連係する、酵素的に連結する、リンカー（例えば、ペプチド、核酸、他のポリマー（例えば、エステル連鎖、ＰＥＧリンカー、炭素鎖など）によって連結する）。
【００３５】
いくつかの実施形態において、レポーターは、（例えば、細胞標的を有する融合体タンパク質として発現する）生物発光レポーターである。特定の実施形態において、生物発光レポーターは、ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼは、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ  ｏｌｅａｒｉｕｓ、ホタル（例えば、Ｐｈｏｔｉｎｉｎｉ）、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｅｑｕｏｒｉａ、これらの突然変異体、これらの一部、これらの変異体、および本明細書に記載される系および方法に適切な任意の他のルシフェラーゼ酵素に見られるものから選択される。いくつかの実施形態において、生物発光レポーターは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓからの修飾、強化ルシフェラーゼ酵素（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＮＡＮＯＬＵＣ酵素、配列番号３、またはそれと少なくとも７０％の同一性（例えば、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％）を有する配列）である。いくつかの実施形態において、タンパク質センサは、熱安定性Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａルシフェラーゼである。例示的な生物発光レポーターは、例えば、米国特許出願第２０１０／０２８１５５２号、および米国特許出願第２０１２／０１７４２４２号に記載され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、生物発光レポーターは、ＮＡＮＯＬＵＣ（それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１０／０２８１５５２号、および同第２０１２／０１７４２４２号を参照されたい）を含む。いくつかの実施形態において、生物発光レポーターは、生物発光特性を保持する配列番号３と少なくとも７０％の同一性（例えば、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％）を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態において、ＮＡＮＯＬＵＣ酵素、またはその変異体の使用は、（例えば、低濃度での）捕捉細胞標的の検出を可能にする特性（例えば、信号強度、明るさ、高光出力、狭スペクトルなど）を提供する。いくつかの実施形態において、ＮＡＮＯＬＵＣの高光出力は、アッセイを生理学的に関連する条件下で実施するために有用な、低濃度（例えば、＜１μＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎｍ、＜１ｎｍなど）のアッセイ成分（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの発現のためのＤＮＡ）を可能にする。いくつかの実施形態において、ＮＡＮＯＬＵＣは、表現型スクリーンにおいて特定された捕捉細胞標的の検出を可能にする。
【００３７】
いくつかの実施形態において、生物発光レポーターのための基質が提供される。いくつかの実施形態において、生物発光レポーターは、基質を反応生成物に変換し、光エネルギー、例えば、発光を副生成物として放出する。いくつかの実施形態において、基質は、ルシフェラーゼ酵素の基質である。いくつかの実施形態において、基質は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＮＡＮＯＬＵＣ酵素（例えば、配列番号３）などの、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓからの修飾、強化ルシフェラーゼ酵素の基質である。いくつかの実施形態において、基質は、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジンの構造的または機能的等価物、セレンテラジンに実質的に等価な分子（例えば、構造的におよび／または機能的に）、またはセレンテラジンに機能的にまたは構造的に類似の分子を含む。いくつかの実施形態において、生物発光レポーターは、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジンの構造的または機能的等価物、またはセレンテラミドに変化したセレンテラジンの実質的等価物、セレンテラミド誘導体、セレンテラミドの構造的または機能的等価物、またはセレンテラミドの実質的等価物を変換し、光エネルギーを副生成物として放出する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、細胞標的は、結合したレポーターの特性に基づいて（例えば、蛍光、発光、質量（例えば、質量分析（ＭＳ））、放射活性、酵素活性などによって）検出される。いくつかの実施形態において、細胞標的は、細胞標的の特性に基づいて（例えば、蛍光、発光、質量（例えば、質量分析（ＭＳ））、放射活性などによって）検出される。
【００３９】
特定の実施形態において、本発明は、複数（例えば、２つ）の捕捉タンパク質の融合体を提供する。いくつかの実施形態において、両方の捕捉タンパク質は、融合される（例えば、二量体化される）際、それらの活性を保持する。いくつかの実施形態において、両方の捕捉タンパク質は、それらの対応する捕捉リガンドに共有的に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態において、捕捉融合体は、（例えば、異なる捕捉リガンドに結合する）２つの異なる捕捉タンパク質のヘテロ二量体である。他の実施形態において、捕捉融合体は、同一の捕捉リガンドに結合する同一のアミノ酸配列を有する、２つの捕捉タンパク質のホモ二量体である。いくつかの実施形態において、２つの捕捉タンパク質は、共有的に連係する。いくつかの実施形態において、捕捉タンパク質は、末端間で連係する（例えば、Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ、Ｎ−Ｃ−Ｃ−Ｎ、Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｃ、Ｃ−Ｎ−Ｃ−Ｎ）。いくつかの実施形態において、捕捉融合体は、２つの融合タンパク質として発現する。いくつかの実施形態において、２つの捕捉タンパク質は、捕捉融合体を生成するために結合した（例えば、化学的に、酵素的になど）後発現である。いくつかの実施形態において、捕捉タンパク質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質）は、任意の適切な構造または機構によって、融合、連結、接続などされる（例えば、融合体として発現する、化学的に（例えば、直接的または間接的に）連係する、酵素的に連係する、リンカー（例えば、ペプチド、核酸、ポリマー、エステル連鎖、ＰＥＧリンカー、炭素鎖など）によって連係する）。連鎖の型は、限定的であると考えられるべきではない。いくつかの実施形態において、２つの捕捉タンパク質は、直接的に連係する。いくつかの実施形態において、２つの捕捉タンパク質は、リンカーによって分離される。任意の適切なリンカー（例えば、ペプチド（例えば、プロテアーゼ開裂部位（例えば、ＴＥＶ開裂部位）を有する）、他のポリマー、アルキル鎖、置換アルキル鎖など）は、捕捉融合体の捕捉タンパク質を接続することにおいて使用を見いだす。いくつかの実施形態において、捕捉タンパク質のうちの１つまたは両方は、配列番号１と７０％以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）の配列同一性を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本発明は、捕捉タンパク質を単量体として（例えば、捕捉融合体としてではなく）提供する。いくつかの実施形態において、捕捉タンパク質は、固体表面（例えば、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、マイクロ流体チャネル、毛細管、ビーズ、粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子など）など）に連係する。いくつかの実施形態において、複数の捕捉タンパク質（例えば、単量体として）は、表面に結合する。いくつかの実施形態において、捕捉タンパク質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質）は、任意の適切な構造または機構によって、融合、連結、接続などされる（例えば、融合体として発現する、化学的に（例えば、直接的または間接的に）連係する、酵素的に連係する、リンカー（例えば、ペプチド、核酸、ポリマー、エステル連鎖、ＰＥＧリンカー、炭素鎖など）によって連係する）。連鎖の型は、限定的であると考えられるべきではない。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明は、タンパク質またはタンパク質複合体が、細胞内の生物活性小分子の結合標的であるという発見および確認のための高感度な方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、所望の表現型反応を有する小分子のライブラリを選択（例えば、表現型スクリーンから決定されるように）し、捕捉リガンド（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧリガンド）を任意の適切な手段（例えば、化学的合成）によって結合することを伴う。細胞は、その後、表現型反応を再生させるために、小分子／捕捉リガンド（ＳＭ／ＣＬ）で処理される。いくつかの実施形態において、ＳＭ／ＣＬ化合物は、細胞透過性である。いくつかの実施形態において、細胞透過性は、表現型反応の再生を可能にする。いくつかの実施形態において、クロロアルカンおよびカルバメートは、細胞透過性を維持および／または強化するのに好適である。いくつかの実施形態において、その後、細胞は溶解し、タンパク質またはタンパク質複合体に結合したＳＭ／ＣＬが捕捉される。いくつかの実施形態において、タンパク質複合体に結合したＳＭ／ＣＬの捕捉は、タンパク質相互作用体の解離を最小化する、および／または他のタンパク質の非特異的結合を低減するための迅速な捕捉を可能にする、２つの捕捉タンパク質の融合体（「捕捉融合体」または「捕捉二量体」としても知られる）によって媒介される。いくつかの実施形態において、捕捉は、低い非特異的結合特性を有する固体支持体上で行われる。いくつかの実施形態において、標的タンパク質（例えば、細胞標的）は高い特異性で溶出し、バックグラウンドを更に低減する故に、より良好な標的特定を可能にする。
【００４２】
いくつかの実施形態において、小分子／ＨＡＬＯＴＡＧリガンド共役体と連動する、捕捉融合体（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ二量体）または捕捉タンパク質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）は、高速大量処理形式における陽性相互作用の確認のために有用である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、捕捉融合体（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ二量体）または捕捉タンパク質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）は、細胞標的（例えば、タンパク質またはタンパク質複合体）に結合したＳＭ−ＣＬの迅速な捕捉のために提供される。いくつかの実施形態において、ＨＡＬＯＴＡＧ二量体または捕捉タンパク質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）は、生物活性剤の細胞標的に結合した生物活性剤／ＨＡＬＯＴＡＧリガンド共役体の捕捉のために使用される。他の捕捉系に勝る利点を提供するＨＡＬＯＴＡＧ二量体および／またはＨＡＬＯＴＡＧタンパク質の特性は、例えば、ａ）ＨＡＬＯＴＡＧのＨＡＬＯＴＡＧリガンドとの反応の迅速な速度論（例えば、リガンドが大きなタンパク質またはタンパク質複合体と複合する際でさえも）、およびｂ）２つの異なる形式を使用して達成される迅速な捕捉（図１）、である。いくつかの実施形態において、ＨＡＬＯＴＡＧ二量体（または別の捕捉融合体）またはＨＡＬＯＴＡＧタンパク質（または他の捕捉タンパク質）は、ＨＡＬＯＴＡＧリガンド（または他の捕捉リガンド）の共有的な捕捉のための、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズ（または他のタンパク質捕捉ビーズ）を作製するために使用される。ＨＡＬＯＴＡＧ（または他の捕捉タンパク質）は、機能的効率を維持するように配向される。更に、ビーズに結合するＨＡＬＯＴＡＧ二量体は定量的であり、これによりビーズ表面でのタンパク質密度の正確な制御を可能にする。他の実施形態において、ＨＡＬＯＴＡＧ二量体（または別の捕捉融合体）は、小分子／ＨＡＬＯＴＡＧリガンド（または他の捕捉リガンド）およびタンパク質複合体の結合のための、溶液に基づく迅速な速度論を活用するために、小分子／ＨＡＬＯＴＡＧリガンド（または他の捕捉リガンド）に対する特定の化学量論的過剰において、溶液に添加される。いくつかの実施形態において、捕捉融合体、捕捉タンパク質、捕捉リガンドを提示する表面、および／または最適化されたＨＡＬＯＬＩＮＫビーズが、複合体の特異的な捕捉のために使用される。いくつかの実施形態において、下流検出（例えば、質量分析）のための、タンパク質複合体のビーズからの溶出は、正確な「ヒット」を特定する上で非常に重要である。いくつかの実施形態において、捕捉融合体（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ二量体）は、任意の非特異的に結合したタンパク質を残す複合体の、選択的溶出を可能にする（例えば、バックグラウンド上の信号を改良する）ＴＥＶ開裂部位を含む。いくつかの実施形態において、捕捉リガンド（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧリガンド）で活性化したマルチウェル平板を使用して、アッセイは、高速大量処理形式に（例えば、確認のために）変換される。
【００４４】
特定の実施形態において、本発明は、捕捉タンパク質を提示する表面（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ、ＨＡＬＯＴＡＧ二量体など）を提供する。いくつかの実施形態において、その表面上の捕捉タンパク質のためのリガンド（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧリガンド）を提示する表面が提供される。捕捉融合体は、表面に添加され、表面上に固定される。その表面上に固定された捕捉融合体を有する表面は、その後、（捕捉リガンド）−（生物活性剤）−（細胞標的）複合体を捕捉するために使用される。他の実施形態において、捕捉タンパク質のその表面への固定を可能にする、官能基を提示する表面が提供される。任意の適切な化学が、そのような固定のために使用され得る。捕捉タンパク質は、表面に添加され、表面上に固定（例えば、化学的に、酵素的に、直接的に、リンカーを通してなど）される。その表面上に固定された捕捉タンパク質を有する表面は、その後、（捕捉リガンド）−（生物活性剤）−（細胞標的）複合体を捕捉するために使用される。
【実施例】
【００４５】
実験
実施例１
生物活性剤の細胞標的を捕捉する、捕捉リガンド／捕捉融合体法の機能性を実証するために、本発明の実施形態の開発中に実験を実施した。
【００４６】
ＨＥＫ２３９Ｔ細胞を９６ウェルのウェルまたは６ウェルの平板で培養した。細胞を、ＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８アルファまたはＮＡＮＯＬＵＣ−ＨＤＡＣ６（ヒストンデアセチラーゼ６）融合体タンパク質を発現するプラスミドＤＮＡで一時的に遺伝子移入し、３７℃、５％のＣＯ2で一晩インキュベートした。その後、１０μＭのクロロアルカン−薬物共役体ＢＩＲＢ−クロロアルカン（ｐ３８用）またはＳＡＨＡ−クロロアルカン（ＨＤＡＣ６用）を細胞に添加し、２時間インキュベートした。陰性対照は、クロロアルカン−薬物共役体を有さない細胞を含有した。その後、培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳ内で洗浄した。Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を含有するＨＡＬＯＴＡＧタンパク質二量体（配列番号１の二量体）およびデオキシリボヌクレアーゼＩで細胞を１０分間溶解させた。その後、ＭＡＧＮＥ  ＨＡＬＯＬＩＮＫビーズ（１μｌ床容積）を添加して、細胞を溶解させ、１５分間インキュベートした。溶解物およびビーズを、洗浄緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＩＧＥＰＡＬ）に振動を与えながら、３分間で３回洗浄した。その後、１５０μＭの非共役薬物を使用して複合体をビーズから１時間溶出し、溶出内のＮＡＮＯＬＵＣルシフェラーゼからの発光を検出するために、発光を測定した（図３Ａ〜Ｄ）。抗ｐ３８を使用する溶解物のウエスタン／銀染色分析もまた、実行した（図４）。
【００４７】
実施例２
表１に示すように、異なる量のＨＡＬＯＴＡＧタンパク質二量体（配列番号１の二量体）を、ＢＩＲＢ−クロロアルカン（例えば、生物活性−剤／捕捉−リガンド共役体）で処理されている、またはされていないＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８融合体タンパク質（例えば、レポーター／細胞−標的融合体）を発現する細胞溶解物に添加した。１５分間のインキュベートの後、ＨＡＬＯＴＡＧリガンド（ＨＡＬＯＬＩＮＫ平板、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）で活性化した白色、９６ウェルのポリスチレン平板のウェル内に試料を定置し、更に４５分間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄した。その後、５０ｕｌのＰＢＳに続けて、５０ｕｌのＮＡＮＯＧＬＯルシフェラーゼ検出試薬をウェルに添加し、発光を測定した。
【００４８】
表２は、ＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８融合体タンパク質の特異的なプルダウンを示すＨＡＬＯＴＡＧ二量体（例えば、配列番号１の二量体）の有無に関わりない、試料中の発光における差異を示す。
【表１】
2019092517.tif 000002
【表２】
2019092517.tif 000003
【００４９】
実施例３
クロロアルカン薬物共役体を使用する、細胞からＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズ上への、標的タンパク質のプルダウンの効率を実証するために、本発明の実施形態の開発中に実験を実施した。本実施例において、ＢＩＲＢ−クロロアルカン共役体（ＰＢＩ−４８３４、下記を参照のこと）を利用して、ＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８アルファ融合体タンパク質を生細胞からプルダウンした。
ＰＢＩ４８３４（ＢＩＲＢカルバメートクロロアルカン）
【化１】
2019092517.tif 000004
【００５０】
９６ウェルの平板のウェル内のＨＥＫ２９３細胞を、ＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８融合体を符号化するプラスミドＤＮＡを有するＰＥＩを使用して遺伝子移入した。遺伝子移入の２４時間後、細胞を１０μＭの最終濃度のＰＢＩ−４８３４でインキュベートした一方で、対照細胞は共役薬物で処理しなかった。２時間の平衡結合に続いて、培地を除去し、細胞をＰＢＳで素早く洗浄し、洗剤に基づく溶解緩衝液内で１０分間溶解させた。その後、０．５μｌの安定常磁性ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を含有する、９６ウェルの平板のウェルに細胞溶解物を移動し、振動を与えながら、１５〜４５分間インキュベートした。結合に続いて、未結合の画分を除去し、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質常磁性ビーズを洗浄した。その後、１５０ｕＭの非共役ＢＩＲＢ７９６を添加し、非共役ＢＩＲＢ７９６との競合によって、捕捉ＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８アルファ融合体をビーズから６０分間特異的に放出させた。放出されたＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８アルファ融合体タンパク質（＋ＰＢＩ−４８３４）および対照（−ＰＢＩ４８３４）を、ＮＡＮＯＧＬＯルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を使用して検出した。
【００５１】
ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズ上への捕捉の１５分以内に達成されたバックグラウンド上の高信号は、捕捉法の効率、および薬物に低〜中度の親和性（図５）で結合する標的タンパク質を捕捉するためのその能力を実証する。この例において、発現した融合体のうちの１％のみが、ビーズに特異的に捕捉された。しかしながら、ＮＡＮＯＬＵＣルシフェラーゼの高感度のため、捕捉のレベルは、バックグラウンド上の特異的な捕捉の検出のためには十二分である。
【００５２】
実施例４
クロロアルカン修飾薬物を使用する、カルバメートクロロアルカンリンカーの、標的タンパク質の細胞からＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズ上へのプルダウンのための利点を実証するために、本発明の実施形態の開発中に実験を実施した。本実施例において、メトトレキサート−クロロアルカン共役体ＰＢＩ−５０１５（カルバメートクロロアルカンリンカー）およびＰＢＩ−４８４８（Ｏ２クロロアルカンリンカー）を、溶解物中のＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質に対するそれらの結合効率、細胞内のＤＨＦＲに対する結合効率、およびＮＡＮＯＬＵＣ−ＤＨＦＲ融合体タンパク質を生細胞からプルダウンする能力について試験した。
ＰＢＩ−５０１５：メトトレキサートカルバメートクロロアルカン
【化２】
2019092517.tif 000005
ＰＢＩ−４８４８：メトトレキサート−Ｏ２クロロアルカン
【化３】
2019092517.tif 000006
【００５３】
メトトレキサート−クロロアルカン共役体（最終濃度１ｕＭ）を、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を発現する細胞からの溶解物に添加することによって、溶解物中のＨＡＬＯＴＡＧタンパク質に対する結合効率を測定した。０〜６０分間の結合に続いて、１μＭの蛍光ＨＡＬＯＴＡＧリガンドで反応を追跡した。未結合のＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を、蛍光ＨＡＬＯＴＡＧリガンドに対する結合を通して検出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での分析および蛍光ゲルスキャナ上での検出を続けた。結果は、両方のリンカーが、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質に対して、高速の標識化速度論を提供することを示す（図６Ａ）。
【００５４】
生細胞におけるＤＨＦＲに対する結合親和性を、ＢＲＥＴを使用して試験した。９６ウェルの平板のウェル内のＨＥＫ２９３細胞を、ＮＡＮＯＬＵＣ−ＤＨＦＲ融合体を符号化するプラスミドＤＮＡを有するＰＥＩを使用して、遺伝子移入した。ＤＮＡを、無促進因子の担体ＤＮＡプラスミド（ＰＳＩ）で、１ウェルにつき８０ｎｇの全ＤＮＡの最終濃度まで、１：５０に希釈した。遺伝子移入の２４時間後、細胞を更に２４時間血清飢餓させ、その後、１μＭのＰＢＩ−４８９０（ＴＯＭ−メトトレキサート誘導体）の存在下で、連続的に希釈したＰＢＩ−４８４８またはＰＢＩ−５０１５で処理した。２時間の平衡結合の後、フリマジン（セレンテラジン誘導体、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を２０μＭの最終濃度で添加し、ＢＲＥＴをＶａｒｉｏｓｋａｎ照度器上で測定した。用量反応ＢＲＥＴ曲線は、ＰＢＩ−４８４８がＤＨＦＲに対してより高い親和性を有することを示す（図６Ｂ）。
【００５５】
ＮＡＮＯＬＵＣ：ＤＨＦＲ（Ｎｌｕｃ：ＤＨＦＲ）を生細胞から特異的にプルダウンする能力を実証するために、９６ウェルの平板のウェル内のＨＥＫ２９３細胞を、ＮＡＮＯＬＵＣ−ＤＨＦＲ融合体を符号化するプラスミドＤＮＡを有するＰＥＩを使用して遺伝子移入した。ＤＮＡを、無促進因子の担体ＤＮＡプラスミド（ＰＳＩ）で、１ウェルにつき８０ｎｇの全ＤＮＡの最終濃度まで、１：５０に希釈した。遺伝子移入の２４時間後、細胞を更に２４時間血清飢餓させ、その後、１０μＭのＰＢＩ−４８４８またはＰＢＩ−５０１５でインキュベートした一方で、対照細胞は共役薬物で処理しなかった。２時間の平衡化結合の後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで素早く洗浄し、洗剤に基づく溶解緩衝液内で１０分間溶解させた。その後、０．５μｌの安定常磁性ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズを含有する、９６ウェルの平板のウェルに細胞溶解物を移動し、振動を与えながら、４５分間インキュベートした。結合に続いて、未結合の画分を除去し、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質常磁性ビーズを洗浄し、１５０μＭの非共役メトトレキサートを添加し、捕捉されたＮＡＮＯＬＵＣ：ＤＨＦＲを、１５０ｕＭの非共役ＢＩＲＢ７９６を添加し、非共役メトトレキサートとの競合によって、ビーズから６０分間特異的に放出させた。放出されたＮＡＮＯＬＵＣ：ＤＨＦＲ（＋ＰＢＩ５０１５または＋ＰＢＩ４８４８）および対照試料を、ＮＡＮＯＧＬＯルシフェラーゼ検出試薬によって検出した。ＰＢＩ−４８４８およびＰＢＩ−５０１５の両方が、ＨＡＬＯＴＡＧに対する類似の結合効率を有するものの、（ＤＨＦＲに対するより低い親和性を有する）ＰＢＩ−５０１５のみが、Ｎｌｕｃ：ＤＨＦＲ融合体を効率的にプルダウンしたため、プルダウン用途におけるカルバメートリンカーの利点を実証した（図６Ｃ）。
ＰＢＩ−４８９０メトトレキサート−ＴＯＭ
【化４】
2019092517.tif 000007
【００５６】
実施例５
ＮＡＮＯＬＵＣ融合体タンパク質の、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズからの特異的な放出のための方法は、例えば、
１．非共役生物活性剤との競合と、
２．捕捉リガンドに連結した生物活性剤（例えば、クロロアルカンリガンド）の使用であって、捕捉リガンドが、ＮＡＮＯＬＵＣ融合体タンパク質の高速の放出を可能にするために、化学的に開裂可能リンカー（例えば、クロロアルカンリンカー）を含有する、使用と、
３．捕捉リガンド固体支持体（例えば、ＨＡＬＯＬＩＮＫ  ＨＡＬＯＴＡＧ樹脂）の使用であって、捕捉リガンド（ＨＡＬＯＴＡＧリガンド）を固体支持体に結合するリンカーが、化学的に開裂され、捕捉タンパク質−捕捉リガンド−生物活性剤−細胞標的複合体（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ−クロロアルカン−薬物共役体−ＮＡＮＯＬＵＣ融合体タンパク質複合体）の高速の放出を可能にし得る使用と、
４．レポーターからの、細胞標的のタンパク質分解開裂、例えば、ＮＡＮＯＬＵＣタンパク質を放出したＮＡＮＯＬＵＣ融合体タンパク質、と、を含む。
【００５７】
ＮＡＮＯＬＵＣ融合体タンパク質の、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズからの特異的な放出のための、そのような方法を実証するために、本発明の実施形態の開発中に実験を実施した。本実施例において、ＢＩＲＢ−クロロアルカン共役体（ＰＢＩ−４８３４）、および開裂可能リンカー（ＰＢＩ−５１３１）を含有するＢＩＲＢクロロアルカン共役体を利用して、ＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８アルファ融合体タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞溶解物からプルダウンした。ＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８融合体を発現する細胞の溶解物を、１μＭのＰＢＩ−４８３４またはＰＢＩ−５１３１（最終濃度）でインキュベートした一方で、対照溶解物は共役薬物で処理しなかった。２時間の平衡化結合の後、０．５μｌの安定常磁性ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズを含有する、９６ウェルの平板のウェルに細胞溶解物を移動し、振動を与えながら、４５分間インキュベートした。結合に続いて、未結合の画分を除去し、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質常磁性ビーズを３回洗浄し、捕捉されたＮＡＮＬＵＣ−ｐ３８アルファ融合体を、２つの方法のうちの１つによって、ビーズから６０分間特異的に放出させた。
１．１５０μＭの非共役ＢＩＲＢ７９６を使用して、ＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８アルファ融合体上で共役ＢＩＲＢ７９６との結合を６０分間競合させた。
２．ＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８アルファ融合体を、クロロアルカンリンカーの、１０ｍＭのヒドロ亜硫酸ナトリウムでの１０分間の化学的開裂を通して迅速に放出させた（ＰＢＩ−５１３１は、クロロアルカン開裂可能リンカーである）。
【００５８】
放出されたＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８アルファ（＋ＰＢＩ４８３４／＋ＰＢＩ５１３１）および対照（−薬物）を、ＮＡＮＯＧＬＯルシフェラーゼ検出試薬で検出した。ＰＢＩ−４８３４（カルバメートリンカー）でのプルダウン効率は、ＰＢＩ−５１３１と比較してより有意に高いものの、本実施例は、特異的な捕捉における有意な増加につながるバックグラウンドを最小化するための、化学的開裂を使用する迅速な放出の利益を実証する（図７）。
【００５９】
実施例６
以下は、本発明の実施形態において使用を見いだす例示的な化合物のための、合成計画を提供する。
ＰＢＩ−４８４８：メトトレキサート−Ｏ２クロロアルカン
【化５】
2019092517.tif 000008
【００６０】
５０ｍｇのメトトレキサート水和物を、３ｍＬのＤＭＦ中で撹拌し、ＥＤＡＣ（６３ｍｇ、３３０ｕｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７７ｕＬ、５５０ｕｍｏｌ）で処理した。１０分後、１２−クロロ−３，６−ジオキソ−ドデシルアミンハイドロコライド（２１．５ｍｇ、８３ｕｍｏｌ）を添加した。３時間後、生成物を、調製ＨＰＬＣ（０．１％の水性ギ酸中の２−＞５０％のＭｅＣＮ）によって単離した。適切な画分を、濃縮し、凍結乾燥して、橙色固体を産出した。Ｍ＋Ｈに対する計算値：６６０．３、実測値６６０．７。
【００６１】
メトトレキサートペンチルアミン中間体
２ｍＬのＤＭＦ中のメトトレキサート水和物（５０ｍｇ、１１０ｕｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（６３ｍｇ、３３０ｕｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７７ｕＬ、５５０ｕｍｏｌ）混合物に対して、Ｎ−Ｂｏｃカダベリン（２２ｍｇ、１１０ｕｍｏｌ）を添加した。反応を、９０分間撹拌し、その後、水で希釈した２ｍＬの１ＮのＨＣｌで急冷し、調製ＨＰＬＣ（０．１％の水性ギ酸中の２０−＞５０％ＭｅＣＮ）に供した。適切な画分を濃縮し、凍結乾燥して、所望の生成物を産出した。Ｍ＋Ｈに対する計算値：６３９．３、実測値６３９．５。
【００６２】
メトトレキサートＮ−Ｂｏｃ−カダベリン付加物（２４ｍｇ、３８ｕｍｏｌ）を、ジオキサン（０．５ｍＬ）中の４ＭのＨＣｌで、室温で処理した。反応の完了後、溶媒を減圧下で除去し、結果として生じる残留物を、ジエチルエーテルで撹拌して、黄色沈殿物を形成し、これを遠心分離によって単離した。塩酸塩を更なる特性化なしで使用した。
ＰＢＩ−５０１５メトトレキサートカルバメートクロロアルカン
【化６】
2019092517.tif 000009
【００６３】
メトトレキサート水和物ペンチルアミンＨＣｌ塩（８ｍｇ、１４ｕｍｏｌ）を、２ｍＬのＤＭＦ中で、２−（２−（２−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エトキシ）エトキシ）エチル、（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチルカルバメート（１２ｍｇ、２１ｕｍｏｌ）およびトリエチルアミンと化合した。２時間後、反応を１ＮのＨＣｌの添加によって急冷し、生成物を、水性の０．１％のギ酸中の１０−＞５０％のＭｅＣＮで溶出する調製ＨＰＬＣによって単離した。濃縮の後、結果として生じる黄色固体を、ＤＣＭ中に吸収し、飽和ＮａＨＣＯ3で洗浄した。有機層の蒸発は、１．９ｍｇの黄色固体を産出した。Ｍ＋Ｈに対する計算値：９６４．５、実測値９６４．５。
ＰＢＩ−４８９０メトトレキサート−ＴＯＭ
【化７】
2019092517.tif 000010
【００６４】
メトトレキサート水和物ペンチルアミン塩酸塩（６ｍｇ、１０ｕｍｏｌ）を、１ｍＬのＤＭＦ中の５．４ｍｇのＴＯＭスクシンイミジルエステル（８．２ｕｍｏｌ）と化合し、５滴のＴＥＡを添加した。４５分後、反応をＨ2ＯおよびＭｅＣＮで希釈し、調製ＨＰＬＣ（０．１％の水性ギ酸中の２５−＞７５％のＭｅＣＮ）に供し、凍結乾燥を続けて、６ｍｇの青色固体を産出した。Ｍ＋Ｈに対する計算値：１０８３．５、実測値１０８３．５。
ＢＩＲＢ開裂可能リンカークロロアルカンＰＢＩ５１３１
【化８】
2019092517.tif 000011
【００６５】
レゾルシノール（３．３１ｇ、３０ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬのＤＭＦ中で溶解させ、Ｋ2ＣＯ3（３．３２ｇ、２４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、全ての固体が溶解するまで撹拌し、反応は暗褐色に変化した。６−ブロモヘキサン酸エチルエステル（４．６９ｇ、２１ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応を一晩撹拌し、その後、１ＭのＨＣｌに注入し、３×５０ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出した。化合有機層を食塩水で洗浄し、その後、セライト上に吸着させ、ヘプタン中の０−＞５０％のＥｔＯＡｃで溶出するカラムクロマトグラフィーに供した。Ｍ＋Ｈに対する計算値：２５４．１、実測値２５３．８。
【００６６】
エチル６−（３−ヒドロキシフェノキシ）ヘキサノエート（０．９６ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨおよびＨ２Ｏの混合物中で溶解させ、ＬｉＯＨ水和物（６３９ｍｇ、１５．２ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後、反応を減圧下で濃縮し、その後１ＭのＨＣｌで酸性化し、白色沈殿物を生じさせ、これは濾過および真空下での乾燥の後、５５０ｍｇの白色固体を産出した。Ｍ＋Ｈに対する計算値：２２５．１、実測値２２５．２、エチル４−アミノ安息香酸（４０５ｍｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を、氷浴中の７．７ｍＬのアセトン／２Ｎ  ＨＣｌの混合物中で撹拌した。８ｍＬのＨ2Ｏ中に溶解した硝酸ナトリウム（２１５ｍｇ、３．１２ｍｍｏｌ）の溶液を、１０分間かけて滴下で添加し、反応を更に２０分間撹拌した。その後、氷浴中の１８ｍＬの１ＮのＮａＯＨ中の６−（３−ヒドロキシフェノキシ）ヘキサノエートの撹拌した溶液に、反応を２０分間かけて滴下で添加し、暗赤色を発生させた。撹拌および冷却を４０分間継続し、その後、反応を１ＮのＨＣｌで中和し、水で希釈した。結果として生じる褐色沈殿物を、濾過によって回収し、次のステップを直接継続させた。
【００６７】
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の前ステップからのカルボン酸の溶液（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、１−（１−（４−（アミノメチル）フェニル）−３−ｔｅｒｔブチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素（５０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ、３０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、２２ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加した。４０分間の撹拌の後、反応をＥｔＯＡｃとＮａＨＣＯ3（飽和水溶液）との間で隔絶し、層を分離し、有機層を水およびＮａＣｌ（飽和水溶液）で洗浄し、乾燥、濃縮した。結果として生じる赤色固体を、調製ＨＰＬＣ（０．１％の水性ＴＦＡ中の１０％−＞１００％のＡＣＮ）によって精製し、後続濃縮物は４４ｍｇの橙色固体を産出した。Ｍ＋Ｈに対する計算値：７４５、実測値７４５。
【００６８】
ＴＨＦ（３ｍＬ）中の前反応からのエステルの溶液（４４ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）に対して、ＮａＯＨ（１Ｎ、１ｍＬ）を添加した。８日間の撹拌の後、反応を酸性化し、調製ＨＰＬＣ（０．１％の水性ＴＦＡ中の１０％−＞１００％ＡＣＮ）によって精製し、後続して濃縮して、２５ｍｇの橙色固体を産出した。Ｍ＋Ｈに対する計算値：７１７、実測値７１７。
【００６９】
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の前反応からのカルボン酸（１４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）溶液に対して、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ、１２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１７μＬ、０．１ｍｍｏｌ）を添加した。３０分間の撹拌の後、２−［２−（６−クロロ−ヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチルアンモニウム塩酸塩（Ｐｒｏｍｅｇａ、１０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加した。３６時間の撹拌の後、反応を酸性化し、調製ＨＰＬＣ（０．１％水性ＴＦＡ中の１０％−＞１００％ＡＣＮ）によって精製し、後続して濃縮して、２５ｍｇのＰＢＩ５１３１を橙色固体として産出した。Ｍ＋Ｈに対する計算値：９２３、実測値９２３。
ＢＩＲＢカルバメートクロロアルカンＰＢＩ４８３４
【化９】
2019092517.tif 000012
【００７０】
１−（１−（４−（２−アミノアセトアミド）メチル）フェニル）−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−フェニル尿素（１０ｍｇ、１８ｕｍｏｌ）を、２ｍＬのＤＭＦ中の２−（２−（２−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチルカルバメート（１２ｍｇ、２１ｕｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）と化合した。２時間後、反応を１ＮのＨＣｌの添加によって急冷し、生成物を、水性の０．１％のトリフルオロ酢酸中の１０−＞１００％のＭｅＣＮで溶出する調製ＨＰＬＣによって単離した。有機層の蒸発は、１．９ｍｇの黄色固体を産出した。Ｍ＋に対する計算値：８４６、実測値８４６。
【００７１】
Ｂｏｃ保護ＳＡＨＡアミン
７−トリチルオキシカルバモイルヘプタン酸（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ２００８，１６，２０１１−２０３３．）（２００ｍｇ、４６３ｕｍｏｌ）を、３ｍＬのＤＭＦ中の４−［（Ｎ−Ｂｏｃ）アミノメチル］アニリン（１１３ｍｇ、５１０ｕｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３５２ｍｇ、９２７ｕｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１９４ｕＬ、１．４ｍｍｏｌ）と化合した。反応を一晩撹拌し、その後、セライト上に吸着させ、ヘプタン中の０−＞１００％のＥｔＯＡｃの勾配で溶出するカラムクロマトグラフィーによって生成物を取得した。Ｍ＋Ｈに対する計算値：６３５．３、実測値６３５．９。
【００７２】
ＳＡＨＡアミン
スベロイル（４−［（Ｎ−Ｂｏｃ）アミノメチル］アニリド）ヒドロキサム酸（２８６ｍｇ、４５０ｍｍｏｌ）を、０．２５ｍＬのＴＩＳが添加された２ｍＬのＤＣＭ中で溶解させた。その後、トリフルオロ酢酸（０．９ｍＬ）を添加し、反応を３０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗反応生成物は、調製ＨＰＬＣによって精製してもよく、または更なる精製なしで使用してもよい。
ＳＡＨＡ−カルバメート（ＳＡＨＡ−クロロアルカン）ＰＢＩ５０４０
【化１０】
2019092517.tif 000013
【００７３】
スベロイル［４−（アミノメチル）アニリド］ヒドロキサム酸ＴＦＡ塩（９ｍｇ、２２ｕｍｏｌ）を、１滴のＴＥＡを有する１ｍＬのＤＭＦ中で撹拌した。その後、０．５ｍＬのＤＭＦ中の２−（２−（２−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチルカルバメート（２３ｕｍｏｌ）の１３ｍｇ部分を添加した。９０分後、反応をＨ2Ｏの添加によって急冷し、少量のＴＦＡで酸性化し、所望の生成物を、０．１％の水性ＴＦＡ中の５−＞６０％のＭｅＣＮで溶出する調製ＨＰＬＣによって単離した。Ｍ＋Ｈに対する計算値：７１９．４、実測値７１９。
ＳＡＨＡ−ビオチンＰＢＩ５４７４
【化１１】
2019092517.tif 000014
【００７４】
ビス−カルバメートの溶液に対して、ジクロロメタン（５ｍＬ）中の「ＰＢＩ  Ｊ１９０２Ｔ」（５０．０ｍｇ、１０４μｍｏｌ）、およびジクロロメタン（５ｍＬ）中の４−（アミノメチル）アニリン（３．８ｍｇ、３１μｍｏｌ）の溶液を、ゆっくりと（１０分間かけて）添加した。添加の完了後、結果として生じる黄色溶液を、２２℃で１２時間放置した。反応混合物を、シリカゲルクロマトグラフィー（０→５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、８．０ｍｇ（５５％収率）のカルバメートＳＬ＿１３３７＿３９を黄色油としてもたらした。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）８．２６（ｄ、Ｊ＝９．１、２Ｈ）、７．３６（ｄ、Ｊ＝９．１、２Ｈ）、７．０５（ｄ、Ｊ＝８．３、２Ｈ）、６．６４（ｄ、Ｊ＝８．３、２Ｈ）、５．０６（ｓ、１Ｈ）、４．５１−４．３５（ｍ、２Ｈ）、４．２７−４．２０（ｍ、４Ｈ）、３．８７−３．７４（ｍ、２Ｈ）、３．７４−３．５３（ｍ、６Ｈ）１；Ｃ21Ｈ26Ｎ3Ｏ9+［Ｍ＋Ｈ］+に対して計算されたＨＲＭＳ（ＳＩ）４６４．１７、実測値４６４．３５。
【００７５】
ジクロロメタン（５ｍＬ）中のＳＬ＿１３３７−３９（８．０ｍｇ、１７μｍｏｌ）の溶液に対して、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の「熱ＥＺ−連係アミン−ＰＥＧ２−ビオチン」の溶液（７．１ｍｇ、１９μｍｏｌ）を添加した。透明な黄色反応を、２２℃で２０時間撹拌し、この時点でＬＣＭＳ分析は、開始材料の完全な消費を示した。反応を、真空下で濃縮し、残留物を５ｍＬのＤＣＭ中に溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、１２．０ｍｇ（９９％収率）のアニリンＳＬ＿１３３７−４９を透明の油としてもたらした。Ｃ31Ｈ51Ｎ6Ｏ10Ｓ+［Ｍ＋Ｈ］+に対して計算されたＨＲＭＳ（ＳＩ）６９９．３４、実測値６９９．４８。
【００７６】
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＳＬ＿１３３７−４９（１２．０ｍｇ、１７μｍｏｌ）の溶液の溶液に対して、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の８−オキソ−８−（トリチロキシ）アミノ）オクタン酸（７．４ｍｇ、１７μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（８．０ｍｇ、２１μｍｏｌ）およびＮＥｔ３（８．７ｍｇ、８６μｍｏｌ）の溶液を添加した。透明な黄色反応を、２２℃で１７時間撹拌し、この時点でＬＣＭＳ分析は、開始材料の完全な消費を示した。反応を、真空下で濃縮し、残留物を５ｍＬのＤＣＭ中に溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、１１．５ｍｇ（６０％収率）のアニリドＳＬ＿１３３７−５３を透明の油としてもたらした。Ｃ58Ｈ78Ｎ7Ｏ13Ｓ+［Ｍ＋Ｈ］+に対して計算されたＨＲＭＳ（ＳＩ）１１１２．５４、実測値１１１２．６１。
【００７７】
ＤＣＭ（１ｍＬ）中のＳＬ＿１３３７−５３（１１．５ｍｇ、１０μｍｏｌ）の溶液に対して、トリイソプロピルシラン（８１．９ｍｇ、５１７μｍｏｌ）、続いてＴＦＡ（２５μｌ）を添加した。反応を、２２℃で２０分間撹拌し、この時点でＴＬＣ分析は、開始材料の完全な消費を示した。反応を、真空下で濃縮し、残留物を調製ＨＰＬＣ（０．１％のＴＦＡを有する、３→９５％のＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ、４５分間かけて）によって精製し、凍結乾燥後に９ｍｇ（１００％収率）のヒドロキサム酸ＳＬ＿１３３７−５７を白色固体としてもたらした。Ｃ39Ｈ64Ｎ7Ｏ13Ｓ+［Ｍ＋Ｈ］+に対して計算されたＨＲＭＳ（ＳＩ）８７０．４３、実測値８７０．４８。
【００７８】
以下の参照は、上記の合成計画のうちの１つ以上に関し、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ２０１１，３，３９２．、Ｍｕｒａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，３４４，９２６号（１９９４年９月６日）、Ｔｅｃｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ２００９，７４，５４７−５４９．、Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ２０１１，３，３９２、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２９６−３３０９。
【００７９】
実施例７
内在的標的プルダウン（ＰＢＩ−５０１５）
以下の実施例は、内在的標的を細胞から単離する、例えば、プルダウンする、クロロアルカン−薬物共役体の能力を実証する。
【００８０】
ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルの平板のウェル（２．５×１０5細胞／ウェル）に平板培養した。平板培養の４８時間後、１０ｕＭの最終濃度のメトトレキサートクロロアルカン（ＰＢＩ−５０１５）を２つのウェルに添加した一方で、対照細胞は薬物共役体で処理しなかった。２時間の平衡結合に続いて、培地を除去し、細胞をＰＢＳで素早く洗浄し、洗剤に基づく溶解緩衝液内で１０分間溶解させた。その後、１２．５ｕｌの安定常磁性ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質ビーズを含有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブに細胞溶解物を移動し、振動を与えながら、１５分間インキュベートした。結合に続いて、未結合の画分を除去し、ＨＡＬＯＴＡＧ常磁性ビーズを３回洗浄し、捕捉された標的を、１５０μＭの非共役メトトレキサートとの競合によって、ビーズから６０分間特異的に放出させた。放出された標的を、抗ＤＨＦＲ抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して、質量分析およびウエスタンブロット分析に供した。図１Ａの結果は、メトトレキサートの既知の標的であるＤＨＦＲが、細胞から特異的に単離、例えば、プルダウンされ得ることを実証する。更に、細胞内のＤＨＦＲの発現レベルは非常に低い（ウエスタンブロット分析による溶解物中には検出されなかった）ものの、ウエスタンブロット分析（図８Ａ）および質量分析（図８Ｂ）によって示されるように、それは依然効率的に捕捉された。更に、質量分析データは、本方法は非常に低いバックグラウンドを有することを示す。
【００８１】
実施例８
内在的標的プルダウン（ＰＢＩ−４８３４）
以下の実施例は、内在的標的を細胞から単離する、例えば、プルダウンする、クロロアルカン−薬物共役体の能力を実証する。
【００８２】
ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルの平板（２．５×１０5細胞）に平板培養した。平板培養の４８時間後、１０ｕＭの最終濃度のＢＩＲＢ−クロロアルカン（ＰＢＩ−４８３４）を２つのウェルに添加した一方で、対照細胞は薬物共役体で処理しなかった。２時間の平衡結合に続いて、培地を除去し、細胞をＰＢＳで素早く洗浄し、洗剤に基づく溶解緩衝液内で１０分間溶解させた。その後、１２．５ｕｌの安定常磁性ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質ビーズを含有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブに細胞溶解物を移動し、振動を与えながら、１５分間インキュベートした。結合に続いて、未結合の画分を除去し、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質常磁性ビーズを３回洗浄し、捕捉された標的を、１５０μＭの非共役ＢＩＲＢ７９６との競合によって、ビーズから６０分間特異的に放出させた。放出された標的を、抗ｐ３８アルファ抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して、質量分析およびウエスタンブロット分析に供した。図９Ａの結果は、ウエスタンブロット分析（図２Ａ）および質量分析（図９Ｂ）によって示されるように、ＢＩＲＢ７９６の既知の標的であるｐ３８アルファが、ｔ細胞から特異的に単離、例えば、プルダウンされ得ることを実証する。更に、質量分析データは、本方法は非常に低いバックグラウンドを有することを示す。
【００８３】
実施例９
ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質の常磁性ビーズに対するカップリング
Ａ．ステップ４の常磁性樹脂の合成
【化１２】
2019092517.tif 000015
４−（（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）アミノ）−４−オキソ酪酸（１）。６−アミノベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（２．０ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１．３ｇ、１３ｍｍｏｌ）、およびＴＨＦ（１５ｍＬ）を、２５ｍＬの容器中に定置し、マイクロ波合成器内で、１１０℃で９０分間加熱した。冷却時、反応混合物をＥｔ2Ｏで粉砕、濾過し、乾燥、蒸発させて、３．１ｇの生成物を明黄色固体（９９％）としてもたらした。１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ１２．１５（ｓ、１Ｈ）、１０．４５（ｓ、１Ｈ）、８．７１（ｓ、１Ｈ）、８．１６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．２Ｈｚ）、７．７０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．２Ｈｚ）、２．６２（ｍ、２Ｈ）、２．５５（ｍ、２Ｈ）．ＥＳＩ−ＭＳ：計算値Ｃ１２Ｈ１０Ｎ３Ｏ３Ｓ＋：ｍ／ｚ２７６．３、実測値ｍ／ｚ２７６。
ｔｅｒｔ−ブチル（１８−（（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）アミノ）−１５，１８−ジオキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザオクタデシル）カルバメート（２）。化合物１（４．９３ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（３−（２−（２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）カルバメート（７．４０ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）、およびＤＣＭ：ＤＭＦ（１０：１、１００ｍＬ）を、２５０ｍＬの丸底フラスコ内で、室温で共に撹拌した。ＥＤＡＣ（４．０ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応を２０時間撹拌した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨを溶媒として有する順相クロマトグラフィーによって、溶媒を蒸発、精製して、６．６２ｇの白色固体（６４％）をもたらした。１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ３−ＡＣＮ、３００ＭＨｚ）：δ９．２１（ｓ、ＮＨ）、８．６２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、８．０９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．６３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、６．６５（ｂｓ、ＮＨ）、５．４０（ｂｓ、ＮＨ）、３．５（ｍ、１２Ｈ）、３．２８（ｍ、２ｈ）、３．０６（ｍ、２ｈ）、２．６５（ｍ、２ｈ）、２．５１（ｍ、２ｈ）、２．７０（ｍ、４ｈ）、１．４０（ｓ、９Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ：計算値Ｃ２７Ｈ４０Ｎ５Ｏ７Ｓ＋：ｍ／ｚ５７８．７、実測値ｍ／ｚ５７８．４。
Ｎ１−（３−（２−（２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）−Ｎ４−（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）サクシナミド塩酸塩（３）。化合物２（６．６２ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２００ｍＬ）およびトリイソプロピルシラン（１ｍＬ）と共に、５００ｍＬの丸底フラスコ内で撹拌した。ジオキサン（３０ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）中のＨＣｌの４．０Ｍの溶液を、添加し、室温で３時間かけて撹拌した。溶媒を蒸発させ、６．４ｇの黄色吸湿性固体（９８％）をもたらした。１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）：δ１０．６２（ｓ、１Ｈ）、８．７４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、８．１５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．７７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、３．４（ｍ、１６Ｈ）、３．２８（ｍ、２Ｈ）、３．０８（ｍ、２Ｈ）、２．８０（ｍ、２Ｈ）、２．６１（ｍ、２Ｈ）、２．４１（ｍ、２Ｈ）、１．８０、（ｍ、２Ｈ）、１．６０（ｍ、２Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ：計算値Ｃ２２Ｈ３２Ｎ５Ｏ５Ｓ＋：ｍ／ｚ４７８．５９、実測値ｍ／ｚ４７８．２。
固定したシアノベンゾチアゾール−磁性セルロース（４）。カルボキシメチル磁性セルロース（７．２４ｇ、３０〜５０μＭ、Ｉｏｎｔｏｓｏｒｂ  ＭＧ  ＣＭ）を、ＤＭＦ（１００ｍＬ）中の化合物３（８００ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）と共に、２５０ｍＬの丸底フラスコ中に吸収した。ＥＤＡＣ（３８７ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）を添加し、反応を室温で２０時間撹拌した。粒子をフリット上で濾過し、まずＤＭＦ（２００ｍＬ）で、その後２５％のＥｔＯＨ（３００ｍＬ）で濯ぎ、５０％の懸濁液として４℃で保管した。
【００８４】
Ｂ．ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質常磁性ビーズの合成
ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質常磁性ビーズを作製するために、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質を、Ｎ末端システインを通して常磁性ＳＴＥＰ４樹脂上に固定した。ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質を、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質とｍｉｎｉＧｒｏＥＬ配列との間のＴＥＶプロテアーゼ認識部位（ＥＤＬＹＦＱＣ）を有するＨｉｓタグ−ｍｉｎｉＧｒｏＥ−ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）融合体として大腸菌内で発現させた。融合体を、Ｈｉｓタグを使用して精製し、その後、２ｍＭのＴＣＥＰの存在下で、ＴＥＶプロテアーゼで開裂させて、Ｎ末端低減システインを曝した。ＳＴＥＰ４樹脂上の反応性シアノ基は、低減Ｎ末端システインと反応して、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質ビーズに由来する非常に安定した結合を形成する。
【００８５】
実施例１０
以下の実施例は、クロロアルカン修飾の、連結した生物活性剤の透過性および力価に対する最小限の影響を実証する。
【００８６】
ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％の血清中で、１×１０5細胞／ｍｌで、９６ウェルの平板に平板培養し、２４時間後、培地を無血清ＤＭＥＭ培地と交換した。Ｋ５６２細胞を、２×１０5細胞／ｍｌで、９６ウェルの平板のウェルに、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中で平板培養した。細胞を、ＳＡＨＡまたはＰＢＩ−５０４０（ＳＡＨＡ−クロロアルカン）の連続希釈で２時間処理し、その後、製造業者の指示に従って、非溶解ＨＤＡＣ−Ｇｌｏ（商標）Ｉ／ＩＩアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して細胞内ＨＤＡＣ活性について試験した。図１０の結果は、ＳＡＨＡおよびＰＢＩ−５０４０によるＨＤＡＣ活性の阻害と類似の阻害を示す。クロロアルカン修飾による、ＳＡＨＡ力価における約２倍の低減は、クロロアルカンの、細胞透過性または力価に対する最小限の影響を示す。
【００８７】
実施例１１
以下の実施例は、低存在度および低親和性標的を含む内在的標的を細胞からプルダウンする、クロロアルカン−共役薬物の能力を実証する。
【００８８】
ＨＥＫ２９３細胞を、２×１０5細胞／ｍｌで、１００ｍｍの皿に平板培養した。平板培養の４８時間、２０ｎＭの最終濃度のＳＡＨＡ−クロロアルカン（ＰＢＩ−５０４０）を、皿のうちの３つに添加（１×１０7細胞／皿）した一方で、他の３つの皿は共役薬物で処理しなかった（対照）。２時間の平衡結合に続いて、培地を除去し、細胞をＰＢＳで素早く洗浄し、洗剤に基づく溶解緩衝液内で１０分間溶解させ、３０００×ｇで１分間遠心分離した。除去された溶解物を、その後、７５ｕｌの安定常磁性ＨＡＬＯＴＡＧビーズに添加し、振動を与えながら、１５分間インキュベートした。結合に続いて、未結合の画分を除去し、ＨＡＬＯＴＡＧ常磁性ビーズを３回洗浄（洗浄緩衝液は、５０ｍＭ、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１％のＩＧＥＰＡＬ）し、捕捉された標的を、４００μＭの非共役ＳＡＨＡとの競合によって、ビーズから６０分間特異的に放出させた。放出された標的を、抗ＨＤＡＣ１抗体（ＡＢＣＡＭ）、抗ＨＤＡＣ２抗体（ＡＢＣＡＭ）、抗ＨＤＡＣ６抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ＨＤＡＣ３抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、および抗ＨＤＡＣ８抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ／Ｐｒｏｍｅｇａ）で、質量分析（図１１Ｂ）およびウエスタンブロット分析（図１−Ａ）に供した。図１１の結果は、低親和性標的（ＨＤＡＣ８）および低存在度標的（ＨＤＡＣ３）を含むＳＡＨＡの全ての既知の標的が、本発明の実施形態を使用して、細胞から特異的にプルダウンされ得ることを示す。
【００８９】
実施例１２
以下の実施例は、連鎖法（クロロアルカンまたはビオチン）の薬物力価に対する効果を実証する。
【００９０】
Ｋ５６２細胞を、２×１０5細胞／ｍｌで、９６ウェルの平板のウェルに無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中で平板培養した。その後、細胞を、ＳＡＨＡ、ＰＢＩ−５０４０（ＳＡＨＡ−クロロアルカン）、またはＰＢＩ５４７５（ＳＡＨＡ−ビオチン）の連続希釈で２時間処理し、その後、製造業者の指示に従って、非溶解ＨＤＡＣ−Ｇｌｏ（商標）Ｉ／ＩＩアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して細胞内ＨＤＡＣ活性について試験した。図１２の結果は、ビオチン修飾の力価における約１６倍の低減と比較して、クロロアルカン修飾の力価における約２倍の低減を示す。これらの結果は、生物活性剤と共に使用される際の、クロロアルカン連鎖の、細胞透過性または力価に対する最小限の影響を更に実証する。
【００９１】
実施例１３
以下の実施例は、本発明の実施形態におけるビオチン連鎖と比較して、クロロアルカン連鎖によって媒介される高効率プルダウンを実証する。
【００９２】
Ｋ５６２細胞を、５×１０7細胞／皿で、１５０ｍｍの皿に平板培養した。２０ｎＭの最終濃度のＳＡＨＡクロロアルカン（ＰＢＩ−５０４０）またはＰＢＩ−５４７５（ＳＡＨＡ−ビオチン）を、２つの細胞の皿に添加した一方で、他の２つの細胞の皿は共役薬物で処理しなかった（対照）。２時間の平衡結合に続いて、培地を除去し、細胞をＰＢＳで素早く洗浄し、洗剤に基づく溶解緩衝液内で１０分間溶解させ、３０００×ｇで１分間遠心分離した。ＰＢＩ−５０４０で処理した除去された溶解物、および対照細胞の除去された溶解物を、７５ｕｌの安定常磁性ＨＡＬＴＯＧビーズに添加した。ＰＢＩ−５４７５で処理した細胞の除去された溶解物、および対照細胞の除去された溶解物を、７５ｕｌの安定常磁性ストレプトアビジンビーズ（ＧＥ）に添加した。１５分間の結合に続いて、未結合の画分を除去し、ビーズを３回洗浄し、捕捉された標的を、４００μＭの非共役ＳＡＨＡとの競合によって、ビーズから６０分間特異的に放出させた。放出された標的を、抗ＨＤＡＣ１抗体（ＡＢＣＡＭ）、抗ＨＤＡＣ２抗体（ＡＢＣＡＭ）、抗ＨＤＡＣ６抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ＨＤＡＣ３抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、および抗ＨＤＡＣ８抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ／Ｐｒｏｍｅｇａ）で、ウエスタンブロット分析（図１３）に供した。図１３の結果は、低親和性標的（ＨＤＡＣ８）および低存在度標的（ＨＤＡＣ３）を含むＳＡＨＡの全ての既知の標的が、ＳＡＨＡ−クロロアルカンによって特異的にプルダウンされ、ＨＤＡＣ６のみがＳＡＨＡ−ビオチンによってプルダウンされたことを示す。これらの結果は、クロロアルカン連鎖の、本発明の実施形態における内在的標的のプルダウンについての利点を更に実証する。
【００９３】
本開示において言及される全ての出版物および特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。本発明の記載される方法および組成物の様々な変更および変形形態が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかになるであろう。本発明は、特定の好適な実施形態に関連して記載されているものの、主張される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、本発明を実施するための、関連分野における当業者に明白な記載された態様の様々な変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2019092517.tif 000016
【図２】
2019092517.tif 000017
【図３Ａ】
2019092517.tif 000018
【図３Ｂ】
2019092517.tif 000019
【図３Ｃ】
2019092517.tif 000020
【図３Ｄ】
2019092517.tif 000021
【図４】
2019092517.tif 000022
【図５】
2019092517.tif 000023
【図６Ａ】
2019092517.tif 000024
【図６Ｂ】
2019092517.tif 000025
【図６Ｃ】
2019092517.tif 000026
【図７】
2019092517.tif 000027
【図８Ａ】
2019092517.tif 000028
【図８Ｂ】
2019092517.tif 000029
【図９Ａ】
2019092517.tif 000030
【図９Ｂ】
2019092517.tif 000031
【図１０】
2019092517.tif 000032
【図１１】
2019092517.tif 000033
【図１２】
2019092517.tif 000034
【図１３】
2019092517.tif 000035
【配列表】
2019092517000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月18日(2019.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）生物活性剤の結合パートナーである生物活性剤の細胞標的と（ｉｉ）生物発光レポーターとの融合体、及び
（ｂ）細胞透過性であり、細胞内条件下でその相互作用に際して前記細胞標的と結合することができる、捕捉リガンドに連結した生物活性剤、
を含む、細胞溶解物。
【請求項２】
前記生物発光レポーターが、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の細胞溶解物。
【請求項３】
前記捕捉リガンドが、ハロアルカン基である、請求項１に記載の細胞溶解物。
【請求項４】
前記捕捉リガンドが、クロロアルカン基である、請求項３に記載の細胞溶解物。
【請求項５】
前記ハロアルカン捕捉リガンドと、その相互作用により共有結合を形成することができるデハロゲナーゼ捕捉タンパク質を更に含む、請求項３に記載の細胞溶解物。
【請求項６】
前記デハロゲナーゼ捕捉タンパク質が、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項５に記載の細胞溶解物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
本開示において言及される全ての出版物および特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。本発明の記載される方法および組成物の様々な変更および変形形態が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかになるであろう。本発明は、特定の好適な実施形態に関連して記載されているものの、主張される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、本発明を実施するための、関連分野における当業者に明白な記載された態様の様々な変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕（ａ）生物活性剤の細胞標的と、
（ｂ）第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の二量体と、
（ｃ）第１の捕捉リガンドに連結した前記生物活性剤であって、前記第１の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、前記生物活性剤と、
（ｄ）第２の捕捉リガンドを提示する固体表面であって、前記第２の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第２の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、固体表面と、
を含む、システム。
〔２〕前記細胞標的が、細胞内でレポーターとの融合体として発現する、前記〔１〕に記載のシステム。
〔３〕前記レポーターが、生物発光レポーターである、前記〔２〕に記載のシステム。
〔４〕前記生物発光レポーターが、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記〔３〕に記載のシステム。
〔５〕前記第１および第２の捕捉タンパク質の両方が、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む、前記〔１〕に記載のシステム。
〔６〕前記二量体が、ホモ二量体である、前記〔５〕に記載のシステム。
〔７〕前記生物活性剤が、小分子である、前記〔１〕に記載のシステム。
〔８〕前記細胞標的が、前記生物活性剤の結合パートナーである、前記〔１〕に記載のシステム。
〔９〕前記第１の捕捉リガンドおよび第２の捕捉リガンドが、同一の分子構造を含む、前記〔１〕に記載のシステム。
〔１０〕前記固体表面が、ウェル、チューブ、スライド、平板、樹脂、またはビーズからなるリストから選択される、前記〔１〕に記載のシステム。
〔１１〕前記固体表面が、磁性または常磁性である、前記〔１０〕に記載のシステム。
〔１２〕前記細胞標的が前記生物活性剤に結合し、前記第１の捕捉タンパク質が前記第１の捕捉リガンドに結合し、前記第２の捕捉タンパク質が前記固体表面上で、前記第２の捕捉リガンドに結合する、前記〔１〕に記載のシステム。
〔１３〕細胞標的を捕捉する方法であって、
（ａ）第１の捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、前記生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、前記細胞標的が前記生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、
（ｂ）前記細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成するステップと、
（ｃ）前記細胞溶解物を、第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の二量体と、前記第１の捕捉リガンドが前記第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、
（ｄ）前記細胞溶解物を、第２の捕捉リガンドを提示する固体表面と、前記第１の捕捉リガンドが前記第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、
（ｅ）前記固体表面を前記細胞溶解物から分離するステップと、
を含む、方法。
〔１４〕細胞標的を捕捉する方法であって、
（ａ）第１の捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、前記生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、前記細胞標的が前記生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、
（ｂ）前記細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成するステップと、
（ｃ）前記細胞溶解物を、第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の二量体に結合した第２の捕捉リガンドを提示する固体表面と接触させるステップであって、前記第２の捕捉タンパク質および前記第２の捕捉リガンドが共有的に結合する、ステップと、
（ｄ）前記固体表面を前記細胞溶解物から分離するステップと、
を含む、方法。
〔１５〕前記細胞標的が、レポータータンパク質との融合体である、前記〔１３〕および〔１４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１６〕（ａ）生物活性剤の細胞標的と、
（ｂ）第１の捕捉リガンドに連結した生物活性剤と、
を含む細胞の、細胞溶解物であって、
前記細胞溶解物が、
（ｃ）第１の捕捉タンパク質および第２の捕捉タンパク質の二量体であって、前記第１の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第１の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、二量体と、
（ｄ）第２の捕捉リガンドを提示する固体表面であって、前記第２の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第２の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、固体表面と、
を更に含む、細胞溶解物。
〔１７〕前記細胞標的が、レポータータンパク質との融合体である、前記〔１６〕に記載の細胞溶解物。
〔１８〕前記レポータータンパク質が、生物発光レポーターである、前記〔１７〕に記載の細胞溶解物。
〔１９〕前記生物発光レポーターが、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記〔１８〕に記載の細胞溶解物。
〔２０〕前記第１および第２の捕捉タンパク質の両方が、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む、前記〔１６〕に記載の細胞溶解物。
〔２１〕前記二量体が、ホモ二量体である、前記〔１６〕に記載の細胞溶解物。
〔２２〕前記生物活性剤が、小分子である、前記〔１６〕に記載の細胞溶解物。
〔２３〕前記細胞標的が、前記生物活性剤の結合パートナーである、前記〔１６〕に記載の細胞溶解物。
〔２４〕前記第１の捕捉リガンドおよび第２の捕捉リガンドが、同一の分子構造を含む、前記〔１６〕に記載の細胞溶解物。
〔２５〕前記固体表面が、ウェル、チューブ、スライド、平板、樹脂、またはビーズからなるリストから選択される、前記〔１６〕に記載の細胞溶解物。
〔２６〕前記固体表面が、磁性または常磁性である、前記〔２５〕に記載の細胞溶解物。
〔２７〕前記細胞標的が前記生物活性剤に結合し、前記第１の捕捉タンパク質が前記第１の捕捉リガンドに結合し、前記第２の捕捉タンパク質が前記固体表面上で、前記第２の捕捉リガンドに結合する、前記〔１６〕に記載の細胞溶解物。
〔２８〕（ａ）生物活性剤の細胞標的と、
（ｂ）捕捉リガンドに連結した前記生物活性剤と、
（ｃ）捕捉タンパク質を提示する固体表面であって、前記捕捉タンパク質が、その相互作用に際して前記捕捉リガンドと共有結合を形成する、固体表面と、
を含むシステム。
〔２９〕前記細胞標的が、細胞内でレポーターとの融合体として発現する、前記〔２８〕に記載のシステム。
〔３０〕前記レポーターが、生物発光レポーターである、前記〔２９〕に記載のシステム。
〔３１〕前記生物発光レポーターが、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記〔３０〕に記載のシステム。
〔３２〕前記捕捉タンパク質が、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む、前記〔２８〕に記載のシステム。
〔３３〕前記生物活性剤が、小分子である、前記〔２８〕に記載のシステム。
〔３４〕前記細胞標的が、前記生物活性剤の結合パートナーである、前記〔２８〕に記載のシステム。
〔３５〕前記固体表面が、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、またはビーズからなるリストから選択される、前記〔２８〕に記載のシステム。
〔３６〕前記固体表面が、磁性または常磁性である、前記〔３５〕に記載のシステム。
〔３７〕前記細胞標的が前記生物活性剤に結合し、前記捕捉タンパク質が前記捕捉リガンドに結合する、前記〔２８〕に記載のシステム。
〔３８〕細胞標的を捕捉する方法であって、
（ａ）捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、前記生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、前記細胞標的が前記生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、
（ｂ）前記細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成するステップと、
（ｃ）前記細胞溶解物を、捕捉タンパク質を提示する固体表面と、前記捕捉タンパク質が前記捕捉リガンドと共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、
（ｄ）前記固体表面を前記細胞溶解物から分離するステップと、
を含む、方法。
〔３９〕前記細胞標的が、レポータータンパク質との融合体である、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４０〕（ａ）生物活性剤の細胞標的と、
（ｂ）捕捉リガンドに連結した生物活性剤と、
を含む細胞の細胞溶解物であって、
前記細胞溶解物が、
（ｃ）捕捉タンパク質を提示する固体表面であって、前記捕捉タンパク質が、その相互作用に際して前記捕捉リガンドと共有結合を形成する、固体表面と、
を更に含む、細胞溶解物。
〔４１〕前記細胞標的が、レポータータンパク質との融合体である、前記〔４０〕に記載の細胞溶解物。
〔４２〕前記レポータータンパク質が、生物発光レポーターである、前記〔４１〕に記載の細胞溶解物。
〔４３〕前記生物発光レポーターが、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記〔４２〕に記載の細胞溶解物。
〔４４〕前記捕捉タンパク質が、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含む、前記〔４０〕に記載の細胞溶解物。
〔４５〕前記生物活性剤が、小分子である、前記〔４０〕に記載の細胞溶解物。
〔４６〕前記細胞標的が、前記生物活性剤の結合パートナーである、前記〔４０〕に記載の細胞溶解物。
〔４７〕前記固体表面が、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、またはビーズからなるリストから選択される、前記〔４０〕に記載の細胞溶解物。
〔４８〕前記固体表面が、磁性または常磁性である、前記〔４７〕に記載の細胞溶解物。
〔４９〕前記細胞標的が前記生物活性剤に結合し、前記捕捉タンパク質が前記捕捉リガンドに結合する、前記〔４０〕に記載の細胞溶解物。
〔５０〕カルバメートリンカーを含む、捕捉リガンド。
〔５１〕クロロアルカンを更に含む、前記〔５０〕に記載の捕捉リガンド。
【外国語明細書】
2019092517000001.pdf