(57)【要約】      （修正有）【課題】生体外での効率的な定向増幅用のキメラ抗原受容体及びその適用の提供。【解決手段】生体外での特異選択性を持つＣＡＲコード分子。前記分子にヒト化選択的ドメインを導入することで、標的細胞に感染された後で、ＣＡＲ陽性発現の標的細胞を効率的に選別して、生体外での定向増幅を達成する。これにより、ＣＡＲ陽性標的細胞の最終製品の比例の向上、及び、ＣＡＲ遺伝子修飾性の免疫細胞製品のプロセス調製の効率の向上をもたらし、臨床上の更なる普及及び適用によって、安定した技術保証がなされる。【選択図】図９
2019126343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉに示すような構造のキメラ抗原受容体において、
2019126343.tif 000026
Ｆ０は無し又はシグナルペプチド配列であり、
Ｆ１及びＦ２の一方は抗ヒトＣＤ１９の一本鎖抗体重鎖可変領域であり、他方は抗ヒト
ＣＤ１９の一本鎖抗体軽鎖可変領域であり、
Ｚは、アミノ酸配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８における第１５１〜１６０位、Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２における第１５１〜１５８位、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に
おける第１５１〜１５９位に示す選択的ドメインであり、
Ｌ１及びＬ２は無し又は結合ペプチドであり、
Ｈは無し又はヒンジ領域であり、
ＴＭは膜貫通ドメインであり、
Ｃは無し又は共刺激シグナル受容活性化チロシンモチーフであり、
ＣＤ３ζはＣＤ３ζからのサイトゾルシグナル伝導配列であり、
「-」は結合ペプチド又はペプチド結合であり、
Ｆ１、Ｆ２、Ｚは、同時に下記のようにならない。Ｆ１は抗ヒトＣＤ１９の一本鎖抗体
軽鎖可変領域であり、Ｆ２は抗ヒトＣＤ１９の一本鎖抗体重鎖可変領域であり、Ｚのアミ
ノ酸配列は例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３における第１５１〜１５９位に示すようにな
ることを特徴とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記Ｆ１及びＦ２のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８における第２２
〜１４５位及び第１６６〜２７６位に示すようになることを特徴とする請求項１に記載の
キメラ抗原受容体。
【請求項３】
Ｆ０のアミノ酸配列は例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８における第１〜２１位に示すよう
になることを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
Ｈ-ＴＭのアミノ酸配列は例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８における第２７７〜３４５位
に示すようになることを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
Ｃ-ＣＤ３ζのアミノ酸配列は例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８における第３４６〜４９
９位に示すようになることを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列は例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ．１２又はＳＥＱＩＤＮＯ．：１３に示すようになることを特徴とする請求項１に
記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードすることを特徴とする分離され
たポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドの配列は例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示すようになることを
特徴とする請求項７に記載の分離のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１０】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体を発現し、及び／又は、
そのゲノムに外部由来の請求項７に記載のポリヌクレオチドが整合され、及び／又は、
請求項９に記載のベクターを含有することを特徴とする宿主細胞。
【請求項１１】
哺乳動物のＮＫ細胞又はＴ細胞であり、且つその細胞膜に請求項１に記載のキメラ抗原
受容体が発現されることを特徴とする遺伝子工学化されたＮＫ細胞又はＴ細胞。
【請求項１２】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体、請求項７に記載のポリヌクレオチド、請求項９に
記載のベクター又は請求項１１に記載のＮＫ細胞又はＴ細胞、及び薬学的許可可能なベク
ター又は賦形剤を含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１３】
癌又は腫瘍の予防及び／又は治療用の薬物又は製剤を調製することに用いられることを
特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請
求項５に記載のベクター、又は請求項１１に記載のＮＫ細胞又はＴ細胞の用途。
【請求項１４】
請求項７に記載のポリヌクレオチド又は請求項９に記載のベクターをＮＫ細胞又はＴ細
胞内に変換して、前記ＮＫ細胞又はＴ細胞を取得する工程を備えることを特徴とする請求
項７に記載のＮＫ細胞又はＴ細胞の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学及び免疫細胞治療の分野に属し、生体外での効率的な定向増幅用
のキメラ抗原受容体及びその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）
は、抗原特異的抗体、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル共刺激ドメイン等の複数の異なる
機能的ドメインキメラにより作られた人工の受容体分子である。このような分子の特徴は
、主に、その関連抗原や抗体を発現・認識するドメインによって直接標的細胞を認識し、
細胞内シグナル共刺激ドメインによる活性化によって、このような受容体により修飾され
た例えばＴ細胞のような免疫細胞を活性化し、直接細胞殺傷手段によって標的細胞を殺せ
ることができることにある。生体内にある自然のＴ細胞による殺傷手段と比べると、ＣＡ
Ｒによる細胞殺傷作用は、ＭＨＣ分子の制限性の制約を突破し、効果細胞の殺傷活性を向
上させる一方、効果細胞のＭＣＨ分子の突然変異の発生した標的細胞に対する認識や殺傷
効率を向上させる。
【０００３】
現在、ＣＡＲ遺伝子修飾は、主に、Ｔ細胞及びＮＫ細胞等を含む直接殺傷力を持つ免疫
細胞による標的抗腫瘍の免疫治療に適用され、主に、再発又は難治性の慢性Ｂ細胞リンパ
腫（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）等の血液腫瘍を含
む適応症に対応する。その標的としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１３３等を含む。２
０１７年９月、ノバルティス社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ
）により研究された小児及び若い人向きのＣＤ１９を標的とするＣＡＲ修飾Ｔ細胞の治療
性製品Ｋｙｍｒｉａｈは、既に正式にアメリカ食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕ
ｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ；ＦＤＡ）に批准されて市販されて、再発難治性急性
Ｂ細胞リンパ腫の治療に用いられるようになる。これは、全球で正式に承認された初めて
の遺伝子修飾性の免疫細胞製品であり、ＣＡＲ遺伝子修飾療法の安全性及び効果性が臨床
適用の検証段階になったことを表す。
【０００４】
しかしながら、現在、ＣＡＲ修飾性の免疫細胞の調製のプロセスの過程中で、依然とし
て突破されようとする様々な技術難点がある。如何に高純度のＣＡＲ陽性標的細胞を取得
するかは、普遍的な難題である。現在、異なる研究チームが電気泳動転写によってウイル
スＭＯＩ、及び二次感染等を向上させることでＴ細胞のＣＡＲコードウイルスに対する感
染効率を向上させ、ある程度でＣＡＲ陽性細胞の比例を向上させるが、取得した進展に非
常に限りがある。
【０００５】
そのため、本分野では、効率的に選別可能なＣＡＲ陽性標的細胞及びＣＡＲ陽性細胞比
例の向上方法がの至急に望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、効率的に選別可能なＣＡＲ陽性標的細胞及びＣＡＲ陽性細胞比例の向
上方法を提供することにある。
【０００７】
本発明の別の目的は、生体外での効率的な定向増幅用のキメラ抗原受容体及びその適用
を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１方面では、下記式Ｉに示すような構造のキメラ抗原受容体において、
2019126343.tif 000003
Ｆ０は無し又はシグナルペプチド配列であり、
Ｆ１及びＦ２の一方は抗ヒトＣＤ１９の一本鎖抗体重鎖可変領域であり、他方は抗ヒト
ＣＤ１９の一本鎖抗体軽鎖可変領域であり、
Ｚは、アミノ酸配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８における第１５１〜１６０位、Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２における第１５１〜１５８位、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に
おける第１５１〜１５９位に示す選択的ドメインであり、
Ｌ１及びＬ２は無し又は結合ペプチドであり、
Ｈは無し又はヒンジ領域であり、
ＴＭは膜貫通ドメインであり、
Ｃは無し又は共刺激シグナル受容活性化チロシンモチーフであり、
ＣＤ３ζはＣＤ３ζからのサイトゾルシグナル伝導配列であり、
「-」は結合ペプチド又はペプチド結合であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する
。
【０００９】
別の好適例において、前記Ｆ１-Ｌ１-Ｚ-Ｌ２-Ｆ２の長さ（又はＳｃＦｖと選択的ドメ
インの長さ）は２３７〜３４３個のアミノ酸であり、好ましくは２４７〜３０３個のアミ
ノ酸である。
【００１０】
別の好適例において、前記Ｆ１及びＦ２の長さ（つまりＳｃＦｖ軽重鎖の長さ）の各々
は、独立して１０７〜１３０個のアミノ酸であり、好ましくは１０７〜１２４個のアミノ
酸である。
【００１１】
別の好適例において、前記Ｌ１及びＬ２の長さの各々は、独立して０〜１０個のアミノ
酸であり、好ましくは０〜５個のアミノ酸である。
【００１２】
別の好適例において、前記Ｌ１-Ｚ-Ｌ２の長さは、１０〜３０個のアミノ酸であり、好
ましくは１０〜２０個のアミノ酸である。
【００１３】
別の好適例において、前記Ｚは、ヒトの核タンパク質Ｌａ／ＳＳ-ＢのＣ末端ドメイン
の第９５〜１０４位のアミノ酸配列から選ばれ、アミノ酸配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ．８における第１５１〜１６０位に示すようになる。
【００１４】
別の好適例において、前記Ｚは８個のアミノ酸のストレプトアビジンＩＩタブを含有し
、アミノ酸配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２における第１５１〜１５８位に示す
ようになる（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）。
【００１５】
別の好適例において、前記Ｚは９個のアミノ酸のストレプトアビジンタブＩＩを含有し
、アミノ酸配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３における第１５１〜１５９位に示す
ようになる（ＮＷＳＨＰＱＦＥＫ）。
【００１６】
別の好適例において、前記選択的ドメインは、前記ＣＡＲと前記ＣＡＲ標的の抗原との
結合に影響を与えず、又は基本的に影響を与えない。「基本的に影響を与えない」とは、
前記選択的ドメインを含むＣＡＲと標的抗原との結合能力Ｇ１と、選択的ドメインを含ま
ないＣＡＲのと標的抗原との結合能力Ｇ０との比、つまりＧ１／Ｇ０?８０％であり、好
ましくは?９０％であり、より好ましくは?９５％である。
【００１７】
別の好適例において、前記Ｆ０は、ＣＤ８、ＧＭ-ＣＳＦ、ＣＤ４、又はその組み合わ
せのようなタンパクのシグナルペプチドから選ばれる。好ましくは、前記Ｆ０は、ＣＤ８
に由来するシグナルペプチドである。
【００１８】
別の好適例において、前記Ｆ０のアミノ酸配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８にお
ける第１〜２１位に示すようになる。
【００１９】
別の好適例において、前記Ｌ１又はＬ２の配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８にお
ける第１４６〜１５０位に示すようになり（ＧＧＧＧＳ）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０）である。
【００２０】
別の好適例において、前記Ｆ１は、ヒト由来ＣＤ１９抗原を標的とする一本鎖抗体重鎖
可変領域又は軽鎖可変領域である。好ましくは、前記Ｆ１は、ヒト由来ＣＤ１９抗原を標
的とする一本鎖抗体重鎖可変領域である。
【００２１】
別の好適例において、前記Ｆ１及びＦ２は、ヒト由来ＣＤ１９抗原を標的とする一本鎖
抗体重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である。好ましくは、前記Ｆ１及びＦ２のアミノ酸配
列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８における第２２〜１４５位及び第１６６〜２７６
位に示すようになる。
【００２２】
別の好適例において、前記Ｈは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、又はその組み合わせ
のようなタンパクのヒンジ領域から選ばれる。好ましくは、前記Ｈは、ＣＤ８に由来する
ヒンジ領域である。
【００２３】
別の好適例において、前記ＴＭは、ＣＤ８、ＣＤ２８、又はその組み合わせのようなタ
ンパクの膜通過領域から選ばれる。好ましくは、前記ＴＭは、ＣＤ８に由来する膜通過領
域である。
【００２４】
別の好適例において、前記Ｈ-ＴＭのアミノ酸配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８
における第２７７〜３４５位に示すようになる。
【００２５】
別の好適例において、前記Ｃは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、又はその組み合わ
せのようなタンパクの共刺激シグナル分子から選ばれる。
【００２６】
別の好適例において、前記Ｃ-ＣＤ３ζのアミノ酸配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
．８における第３４６〜４９９位に示すようになる。
【００２７】
別の好適例において、前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ．８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示すようになる。
【００２８】
本発明の第２方面では、本発明の第１方面に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコー
ドする分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２９】
別の好適例において、前記のポリヌクレオチド配列は、下記群から選ばれた１つ又は複
数種類のヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
（１）配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示すような前記Ｆ０のコード配列である
。
（２）配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示すような前記Ｈ-ＴＭのコード配列で
ある。
（３）配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示すような前記Ｃ-ＣＤ３ζのコード配
列である。
（４）配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示すような前記Ｚのコード配列である。
（５）配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５及び６に示すような前記Ｆ１及びＦ２のコ
ード配列である。
【００３１】
別の好適例において、前記のポリヌクレオチド配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７
に示すようになる。
【００３２】
本発明の第３方面では、本発明の第２方面に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを
提供する。
【００３３】
別の好適例において、前記ベクターはウイルスベクターであり、好ましくは、レンチウ
イルスベクターである。
【００３４】
本発明の第３方面では、本発明の第１方面に記載のキメラ抗原受容体を発現し、及び／
又は、
そのゲノムに外部由来の本発明の第２方面に記載のポリヌクレオチドが整合され、及び
／又は、
本発明の第３方面に記載のベクターを含有する宿主細胞を提供する。
【００３５】
別の好適例において、前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞である。
【００３６】
別の好適例において、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
【００３７】
別の好適例において、前記宿主細胞は、ヒト細胞である。
【００３８】
別の好適例において、前記宿主細胞は、ＮＫ細胞又はＴ細胞である。
【００３９】
本発明の第５方面では、哺乳動物のＮＫ細胞又はＴ細胞であり、且つその細胞膜に本発
明の第１方面に記載のキメラ抗原受容体が発現される遺伝子工学化されたＮＫ細胞又はＴ
細胞を提供する。
【００４０】
別の好適例において、前記ＮＫ細胞又はＴ細胞は、体外のものである。
【００４１】
別の好適例において、前記ＮＫ細胞又はＴ細胞は、自体又は異体のものである。
【００４２】
別の好適例において、前記ＮＫ細胞又はＴ細胞は、霊長目の動物からのものである。
【００４３】
別の好適例において、前記ＮＫ細胞又はＴ細胞は、ヒト細胞である。
【００４４】
本発明の第６方面では、本発明の第１方面に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第２方
面に記載のポリヌクレオチド、本発明の第３方面に記載のベクター又は本発明の第５方面
に記載のＮＫ細胞又はＴ細胞、及び薬学的許可可能なベクター又は賦形剤を含む薬学的組
成物を提供する。
【００４５】
別の好適例において、前記薬学的組成物は、液状製剤である。
【００４６】
別の好適例において、前記薬学的組成物は、注射剤である。
【００４７】
別の好適例において、前記の薬学的組成物における前記ＮＫ細胞又はＴ細胞の濃度は、
１×１０５〜１×１０８個の細胞／ｍｌであり、好ましくは１×１０６〜１×１０７個の
細胞／ｍｌである。
【００４８】
本発明の第７の方面では、癌又は腫瘍の予防及び／又は治療用の薬物又は製剤を調製す
ることに用いられる本発明の第１方面に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第２方面に記
載のポリヌクレオチド、本発明の第３方面に記載のベクター又は本発明の第５方面に記載
のＮＫ細胞又はＴ細胞の用途を提供する。
【００４９】
別の好適例において、前記腫瘍は、血液腫瘍、固形腫瘍、又はその組み合わせから選ば
れる。
【００５０】
別の好適例において、前記血液腫瘍は、急性骨髄系細胞白血病（Ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌ
ｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍ
ａ；ＭＭ）、慢性リンパ細胞白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕ
ｋｅｍｉａ；ＣＬＬ）、急性リンパ白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  
ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌ
ａｒｇｅ  Ｂ-ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ；ＤＬＢＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（Ｎｏ
ｎ-Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ；ＮＨＬ）、又はその組み合わせから選ばれる。
【００５１】
別の好適例において、前記固形腫瘍は、胃癌、胃癌腹膜転移、肝臓癌、白血病、腎臓腫
瘍、肺癌、小腸癌、骨癌、前立線癌、結直腸癌、乳癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、リン
パ癌、鼻咽頭癌、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、非小細胞性肺癌（ｎｏｎ-ｓｍａｌｌ-ｃｅｌｌ  
ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ；ＮＳＣＬＣ）、大脳膠腫症、子宮内膜癌、中皮腫、膵癌、多発
性骨髄腫、又はその組み合わせから選ばれる。
【００５２】
本発明の第８の方面では、本発明の第２方面に記載のポリヌクレオチド又は本発明の第
３方面に記載のベクターをＮＫ細胞又はＴ細胞内に変換して、前記ＮＫ細胞又はＴ細胞を
取得する工程を備える本発明の第５方面に記載のＮＫ細胞又はＴ細胞の調製方法を提供す
る。
【００５３】
本発明の第９の方面では、治療を必要とする標的に適量の本発明の第１方面に記載のキ
メラ抗原受容体、本発明の第２方面に記載の核酸分子、本発明の第３方面に記載のベクタ
ー、又は本発明の第５方面に記載の細胞、又は本発明の第６方面に記載の薬学的組成物を
投与することを含む疾病の治療方法を提供する。
【００５４】
別の好適例において、前記疾病は、腫瘍である。
【００５５】
本発明の範囲内において、本発明の上記各技術特徴及び下記（例えば、実施例）で具体
的に記述する各技術特徴の間の何れも互いに組み合わせて、新しい又は好ましい技術方法
を構成することは、理解すべきである。紙数に限りがあるので、ここで詳しく説明しない
。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＣＤ１９-ｈｓＣＡＲ（ヒト化選択的ＣＤ１９  ＣＡＲ）及びＣＤ  １９-ｍＣＡＲ（マウスＣＤ１９  ＣＡＲ）スローウイルス発現ベクターの酵素切断の鑑定結果を示す。Ｍ：ＤＮＡ標準品、１：ｐＬｅｎｔｉ-ＣＭＶ-ＣＤ１９-ｈｓＣＡＲウイルス発現ベクター、３：ｐＬｅｎｔｉ-ＣＭＶ-ＣＤ１９-ｍＣＡＲウイルス発現ベクター、２、４：ｐＬｅｎｔｉ-ＣＭＶ空ベクター。
【図２】ＣＤ１９-ｈｓＣＡＲ及びＣＤ１９-ｍＣＡＲウイルスに感染したＴ細胞の生体外での増幅能力の測定を示す。
【図３】ペプチドを篩い分けることで抗体により刺激された後の異なるＣＡＲ分子を持つ２つのＴ細胞の生体外での増幅能力を示す。
【図４】異なるＣＡＲ受容体発現のＴ細胞の最終製品における純度を示す。
【図５】異なるＣＡＲ受容体発現のＮＫ細胞の最終製品における純度を示す。
【図６】異なるＣＡＲ受容体発現のＴ細胞の最終製品における異なる細胞亜群の比例を示す。
【図７】異なるＣＡＲ分子発現のＴ細胞の生体外での殺傷効能の評価を示す。
【図８】異なるＣＡＲ分子発現のＮＫ細胞の生体外での殺傷効能の評価を示す。
【図９】異なるＣＡＲ分子修飾のＴ細胞の生体外での殺傷関連因子の釈放活性のテストを示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｊは、ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲの設計及び評価を示す。図１０Ａは、接続配列にｓｃＦｖ領域及び選択的ドメインを含むＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ構造体の模式図である。図１０Ｂ〜１０Ｃは、ＶＨ及びＶＬのヒト化のレベルに対する評価を示す。図１０Ｄ〜１０Ｅは、ＭＳＴ法によるＣＤ１９  ｈｓＣＡＲとヒトＣＤ１９細胞外ドメインの結合親和力を示し、ＦＭＣ６３であり、マウスＣＤ１９  ＣＡＲ（ＣＤ１９  ｍＣＡＲ）を対照とし、ＣＤ１９  ｍＣＡＲのＫｄはＣＤ１９  ｈｓＣＡＲのＫｄの６倍である。図１０Ｆは、ＳｍＡｂにより再刺激されないＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ工程化Ｔ細胞及びＣＤ１９  ｍＣＡＲ工程化Ｔ細胞に比べると、ＳｍＡｂ（選択的ドメイン特異性の単クローン抗体）のｈｓＣＡＲ変換に対するＴ細胞再刺激の結果を示す。図１０Ｇは、異なる条件で調製された最終生成物におけるサブグループの組成を示す。図１０Ｈ〜１０Ｊは、ＳｍＡｂに接触し又は接触しないＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ群及びＳｍＡｂに接触しないＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ群との比較によって、ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ群におけるＣＡＲ陽性Ｔ細胞の比例のＳｍＡｂに対する再刺激の結果を示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｋは、ＳｍＡｂ媒介の再刺激（標的ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲの選択的ドメイン）の最終生成物における中枢記憶Ｔ細胞の比例及び生物機能に対する影響を示す。図１１Ａは、異なる方法で調製されたＣＤ１９  ＣＡＲ-Ｔ細胞の細胞毒性を示し、ＣＤ１９  ＣＡＲ-Ｔ細胞を異なるＥ／Ｔ比率でＲａｊｉ（人Ｂリンパ細胞瘤細胞系）と共培養し、且つ１２時間培養した後でＬＤＨ釈放法によって細胞毒性を測定する。図１１Ｂは、ＣＡＲ-Ｔ媒介の致死過程におけるサイトカインの釈放を示す（ＥＬＩＳＡ法で測定）。図１１Ｃは、ＳｍＡｂにより再刺激される記憶Ｔ細胞サブグループ組成に対する影響の結果を示し、ＰＢＭＣから分離されたＴ細胞がＣＤ１９  ｍＣＡＲ又はＣＤ１９  ｈｓＣＡＲによって変換され、変換された６日目にＳｍＡｂを加え、所定の時点に異なる記憶Ｔ細胞サブグループを定量する。図１１Ｄは、中枢記憶Ｔ細胞の増殖を示し、３回の独立した測定を示す。図１１Ｅは、最終生成物における異なるＴ細胞サブグループの組成（Ｔｔｅ、終末分化のＴ細胞；Ｔｅｍ、効果記憶Ｔ細胞；Ｔｃｍ、中枢記憶Ｔ細胞）を示す。図１１Ｆは、ＳｍＡｂにより再刺激される記憶Ｔ細胞分化に関わる多種のシグナル通路に対する影響を示す。図１１Ｇ〜１１Ｋは、フローサイトメトリーの結果によって得られた各通路のＭＦＩ値及び柱状図を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｉは、体内のＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ媒介の抗腫瘤機能を示す。図１２Ａ〜１２Ｂは、動物実験研究の模式図であり、ＮＯＤ-ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒγｃ-／-マウスに１×１０６の組成性発光酵素発現のＲａｊｉ細胞を静脈注射する。３日後、マウスに対して生物発光イメージングを行い、異なる処理で組み分けをする。マウスに１×１０６のＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ、ＳｍＡｂにより再刺激されないＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ、ＳｍＡｂにより再刺激されるＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ、胞内ドメイン無しのＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ（ストッパー（ｓｔｏｐｐｅｒ））、ＥＧＦＰ発現の慢病毒により変換されつＴ細胞（Ｍｏｃｋ）或いは等量のＰＢＳを静脈注入する。所定の時点での連続生物発光イメージングによって腫瘤進展を監視する。図１２Ｃ〜１２Ｄは、異なる処理の群におけるマウスの生存率及び中位生存時間を示す。図１２Ｅ〜１２Ｉは、異なる群の間の血清における各種のサイトカインレベルの比較（ＭＳＤ法で測定）を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｌは、ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞の患者体内での植入、増殖及び残留を示す。図１３Ａ〜１３Ｂは、注入の前及びその後で患者ＰＢにおけるＣＤ１９ｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞のカウント及び百分率（フローサイトメトリーで測定）を示す。図１３Ｃ-１３Ｄは、注入の前及びその後で患者体内のＣＤ１９  ｈｓＣＡＲの遺伝子群ＤＮＡでのコピー数及び相対増加倍数（ｑＰＣＲで測定）を示す。図１３Ｅ〜１３Ｌは、注入後で所定の時点での患者ＰＢにおける各種のサイトカインレベル（ＭＤＳ法で測定）を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｊは、ｍＣＡＲ-Ｔ治療後で再発する５名の患者におけるＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞の増殖を示し、マウスＣＤ１９  ＣＡＲ-ＴとＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-ＴがｍＣＡＲ-Ｔ及びｈｓＣＡＲ-Ｔ治療を順に受けた５名の患者での増殖及び持続性を比較する。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｆは、患者の血清の抗ＣＡＲ応答及びｍＣＡＲ媒介の細胞毒性の減衰を示す。図１５Ａ〜１５Ｃは、ＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含む抗ＣＡＲ免疫グロブリンのレベル（ＥＬＩＳＡ法で測定）を示す。血清は、前もってＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ細胞で少なくとも１回治療された患者（ｎ＝５）及び健康ドナー（ｎ＝２）から收集される。ＣＤ１９  ｍＣＡＲ又はｈｓＣＡＲの純化のｈｉｓタグの胞外ドメインをＥＬＩＳＡプレートに被覆して、血清サンプルと合わせて培養する。ＨＲＰによりマークされたヤギ抗ヒトＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体を検出に用いる。図１５Ｄ〜１５Ｆは、前もってＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔにより治療された患者に由来する血清のＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ細胞媒介に対するＲａｊｉ細胞系細胞毒性に対する影響を示す。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＳｍＡｂにより再刺激され又は再刺激されないＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ及びｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞におけるサブグループを示す。図１６Ａは、最終生成物におけるＣＡＲ陽性Ｔ細胞におけるサブグループの百分率を示す。図１６Ｂ〜１６Ｃは、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞における記憶細胞サブグループを示す。
【図１７】異なるＣＡＲ工程化Ｔ細胞で処理された動物の腹側の生物発光イメージングを示す。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｅは、患者１〜５の末梢血におけるＣＤ１９+Ｂ細胞百分率のマウスのＣＤ１９  ＣＡＲ-Ｔ及びその後のＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔの注入の前及びその後での比較を示す。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｔは、ＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ及びＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞を複数回注入した後で、ＥＬＩＳＡ法で測定された患者１〜５におけるＩＬ-６、ＩＦＮ-γ、ＩＬ-１０及びｓＣＤ２５のレベルをを示す。ＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ及びＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔで処理されたＣＲＳに関わる多種のサイトカインレベルを比較する。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明者は、幅広く突っ込んで研究することで、大量に篩い分けて、生体外での特異選
択性を持つＣＡＲコード分子を意外に取得する。前記分子は、ヒト化選択的ドメインを導
入することで、標的細胞に感染された後で、再選別の方法によってＣＡＲ陽性発現の標的
細胞を効率的に選別して、生体外での定向増幅を達成し、ＣＡＲ陽性標的細胞の最終製品
での比例を著しく向上させ、ＣＡＲ遺伝子修飾性の免疫細胞製品のプロセス調製の効率を
向上させ、このような技術製品の臨床上の更なる普及や適用により安定した技術保証を提
供することができる。その同時に、本発明の選択的ドメインが抗ヒトＣＤ１９の一本鎖抗
体の可変領域と組み合わせて、得られた前記ＣＡＲが再選別により刺激された後で、Ｔ細
胞又はＮＫ細胞を再活性化させるので、増殖効率が著しく向上する。本発明の遺伝子工学
化されたＴ細胞又はＮＫ細胞は、ＣＤ１９陽性細胞に対して、より良好な腫瘍殺傷活性及
びより高い殺傷関連因子の釈放レベルを有する。これに基づいて、本発明を完成する。
【００５８】
術語
【００５９】
本公開をより容易に理解させるために、まずある術語を定義する。本出願に使用される
ものであれば、本文で別に明確に規定されない限り、下記術語の各々も下記の意味を有す
るべきである。出願全体で他の定義も述べられる。
【００６０】
「約」という術語とは、当業者の確定した特定値又は組成の許可可能な誤差範囲内にお
ける値又は組成であってよく、如何に測定するか又は測定値や組成によって部分的に決定
される。
【００６１】
「与える」という術語とは、当業者の既知の様々な方法及び配達システムの何れかによ
って本発明の製品を受験者に物理的に導入（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄又は、
例えば注射又は点滴のような他の胃腸外投薬手段を含む）することである。
【００６２】
本文で使用されるように、「抗体」（Ａｂ）という術語は、免疫グロブリンを含むべき
であるが、それに限定されなく、抗原に特異的結合され、ジスルフィド結合によって互い
に連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、又はその抗原結合部を
含む。Ｈ鎖の各々は、重鎖可変領域（本文でＶＨと略記する）及び重鎖定常領域を含む。
重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つの定常ドメインを含む。軽鎖の各々は
、軽鎖可変領域（本文でＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１
つの定常ドメインＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、更に相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）という高度可変領域
に細分されてもよい。それに、より保守的なフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  
ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）という領域が散布される。ＶＨ及びＶＬの各々は、アミノ末端から
カルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４と
いう順位で配列される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、
抗原と互いに作用する結合ドメインを含む。
【００６３】
本文で使用されるように、「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」という術語は、抗原決定
基（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）とも呼ばれ、抗原分子における抗原
特異性を決定する特殊な化学基であり、抗体により特異的に認識される抗原部分である。
本発明において、前記選択的ドメインは、特定のエピトープを有し、それが遊離状態であ
り又は前記ＣＡＲに存在する場合、選択的ドメインに対する抗体により認識されることが
できる。
【００６４】
選択的ドメイン
【００６５】
本発明において、前記キメラ抗原受容体は、下記特徴を持つ選択的ドメインを含有する
。
（ａ）Ｌ１及びＬ２の中に存在しない特定のエピトープを有する。
（ｂ）選択的ドメインは、遊離状態であり又は前記ＣＡＲに存在する何れの場合にも、
選択的ドメインに対する抗体により認識されることができる。
（ｃ）前記ＣＡＲと前記ＣＡＲ標的の抗原との結合に影響を与えず、又は基本的に影響
を与えない。
【００６６】
別の好適例において、前記Ｚはヒトの核タンパク質Ｌａ／ＳＳ-Ｂ由来のポリペプチド
である。別の好適例において、前記Ｚは、ヒトの核タンパク質Ｌａ／ＳＳ-Ｂの８５〜１
１５位のアミノ酸配列に由来し、好ましくはヒトの核タンパク質Ｌａ／ＳＳ-ＢのＣ末端
ドメインの第９５〜１０４位のアミノ酸配列に由来する。
【００６７】
別の好適例において、前記選択的ドメインに対する抗体は、抗ヒト核タンパクＬａ／Ｓ
Ｓ-Ｂポリペプチド抗体である。
【００６８】
別の好適例において、前記Ｚのアミノ酸配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８におけ
る第１５１〜１６０位に示すように、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２における第１５１〜
１５８位に示すように、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３における第１５１〜１５９位に示
すようになる。
【００６９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
【００７０】
本文に用いられるように、キメラ免疫抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）は、細胞外ドメイン、如何なるヒンジ領域、膜貫通ドメイ
ン、及び細胞内ドメインを含む。胞外ドメインは、如何なるシグナルペプチド及び標的-
特異的結合要素（抗原結合ドメインとも呼ばれる）を含む。細胞内ドメインは、共刺激分
子及びζ鎖部分を含む。ＣＡＲがＴ細胞に発現する場合、細胞外ドメインは、特異の抗原
を認識して、細胞内ドメインによって前記シグナルを変換し、細胞の活性化・増殖、細胞
の溶解毒性及びＩＬ-２及びＩＦＮ-γ等のサイトカインの分泌を引き起こし、腫瘍細胞に
影響を与え、腫瘍細胞が生長しないようにし、死ぬように促し又は他の形態で影響し、患
者の腫瘍負荷を小さくし又は解消することができる。抗原結合ドメインは、共刺激分子及
びζ鎖からの１つ又は複数の細胞内ドメインと融合することが好ましい。
【００７１】
本文に用いられるように、「抗原結合ドメイン」と「一本鎖抗体フラグメント」の何れ
も、抗原結合活性を持つＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フ
ラグメント、又は単一のＦｖフラグメントを指す。Ｆｖ抗体は、抗体重鎖可変領域、軽鎖
可変領域を含むが、定常領域を有しなく、また全ての抗原結合部位の最小抗体フラグメン
トを有する。通常、Ｆｖ抗体は、ＶＨ及びＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを更
に含み、且つ抗原結合に必要な構造を形成することができる。抗原結合ドメインは、通常
、単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ-ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖの大きさは、通常、１つの完全な抗体の１／６で
ある。一本鎖抗体は、１本のヌクレオチド鎖によりコードされた１本のアミノ酸鎖配列で
あることが好ましい。本発明の好ましい形態として、前記ｓｃＦｖは、腫瘍高発現の抗原
を特異的に認識する抗体、好ましくは一本鎖抗体を含む。１つの実施形態において、前記
ｓｃＦｖの構造はＦ１-Ｌ１-Ｚ-Ｌ２-Ｆ２である。別の好適例において、前記ｓｃＦｖの
構造はＦ１-Ｚ-Ｆ２である。
【００７２】
１つの実施形態において、本発明のＣＡＲの構造は、Ｆ０-Ｆ１-Ｌ１-Ｚ-Ｌ２-Ｆ２-Ｈ
-ＴＭ-Ｃ-ＣＤ３ζである。好ましくは、本発明のＣＡＲの配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ．８に示すように、太字は選択的ドメインである。
【００７３】
2019126343.tif 000004
【００７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８において、第１〜２１位はシグナルペプチドＦ０であり、第２
２〜１４５位は一本鎖抗体重鎖可変領域Ｆ１であり、第１４６〜１５０位は結合ペプチド
Ｌ１であり、第１５１〜１６０位は選択的ドメインＺであり、第１６１〜１６５位は結合
ペプチドＬ２であり、第１６６〜２７６位は一本鎖抗体軽鎖可変領域Ｆ２であり、第２７
７〜３４５位はヒンジ領域及び膜通過領域Ｈ-ＴＭであり、第３４６〜４９９位は細胞内
シグナル変換及び活性化ドメインＣ-ＣＤ３ζである。
【００７５】
別の好適例において、本発明のＣＡＲの配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２に示
すように、太字は選択的ドメインである。
【００７６】
2019126343.tif 000005
【００７７】
2019126343.tif 000006
【００７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２において、第１〜２１位はシグナルペプチドＦ０であり、第
２２〜１４５位は一本鎖抗体重鎖可変領域Ｆ１であり、第１４６〜１５０位は結合ペプチ
ドＬ１であり、第１５１〜１５８位は選択的ドメインＺであり、第１５９〜１６３位は結
合ペプチドＬ２であり、第１６４-２７４位は一本鎖抗体軽鎖可変領域Ｆ２であり、第２
７５〜３４３位はヒンジ領域及び膜通過領域Ｈ-ＴＭであり、第３４４〜４９７位は細胞
内シグナル変換及び活性化ドメインＣ-ＣＤ３ζである。
【００７９】
別の好適例において、本発明のＣＡＲの配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示
すように、太字は選択的ドメインである。
【００８０】
2019126343.tif 000007
【００８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３における第１〜２１位はシグナルペプチドＦ０であり、第２
２〜１４５位は一本鎖抗体重鎖可変領域Ｆ１であり、第１４６〜１５０位は結合ペプチド
Ｌ１であり、第１５１〜１５９位は選択的ドメインＺであり、第１６０〜１６４位は結合
ペプチドＬ２であり、第１６５-２７５位は一本鎖抗体軽鎖可変領域Ｆ２であり、第２７
６〜３４４位はヒンジ領域及び膜通過領域Ｈ-ＴＭであり、第３４５-４９８位は細胞内シ
グナル変換及び活性化ドメインＣ-ＣＤ３ζである。
【００８２】
コード配列
【００８３】
本発明は、更に、本発明によるキメラ抗原受容体のポリヌクレオチドのコードに関する
。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態又はＲＮＡ形態であってよい。ＤＮＡは、コ
ード鎖又は非コード鎖であってよい。成熟したポリペプチドをコードするコード領域の配
列は、コードＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８、１２又は１３所示のポリペプチドの配列と同じ或
いは合併した変異体であってよい。本文に用いられるように、「合併した変異体」とは、
本発明において、コードにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８、１２又は１３に示すポリペプチドを
有するが、対応するコード領域の配列に差別があるヌクレオチド配列である。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチドの配列は、例えば、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ．７に示すようになる。
【００８６】
本発明のヌクレオチドの全長の配列又はそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅方法、
組換方法又は人工合成の方法によって取得されることができる。現在、完全に化学合成に
よって本発明のポリペプチド（又はそのフラグメント、又はその誘導体）のコードされた
ＤＮＡ配列を得ることが既に可能になる。そして、前記ＤＮＡ配列を本分野に既知の様々
な従来のＤＮＡ分子（又は、例えばベクター）及び細胞に導入することができる。
【００８７】
本発明は、更に、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のベクター又
はポリペプチドコード配列から遺伝子工学によって発生された宿主細胞に関する。上記ポ
リヌクレオチド、ベクター又は宿主細胞は、分離されたものであってよい。
【００８８】
本文に用いられるように、「分離された」とは、物質がその原始環境から分離されたこ
とである（自然の物質であれば、原始環境はつまり自然環境である）。活体細胞内の自然
状態でのポリヌクレオチド及びポリペプチドが分離・純化されていないが、同様なポリヌ
クレオチド又はポリペプチドが自然状態に存在する他の物質から分けられると、分離・純
化されたものである。
【００８９】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態又はＲＮＡ形態であってよい。ＤＮＡ形態は
、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は人工合成のＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖の又は二本鎖
のものであってよい。ＤＮＡは、コード鎖又は非コード鎖であってよい。
【００９０】
本発明は、更に、本発明と同じアミノ酸配列のタンパク質フラグメント、類似体及び誘
導体をコードする、上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。このポリヌクレオチドの変
異体は、自然に発生した等位変異体又は非自然に発生した変異体であってよい。これらの
ヌクレオチド変異体は、置換変異体、欠乏変異体及び挿入変異体を含む。本分野で知られ
るように、等位変異体は、１つのポリヌクレオチドの交替形態であり、１つ又は複数のヌ
クレオチドの置換、欠乏又は挿入であってよいが、本発明の融合タンパクに対するコード
機能を実質的に変えることはない。
【００９１】
本発明のポリペプチドのヌクレオチドの全長の配列又はそのフラグメントは、通常、Ｐ
ＣＲ増幅方法、組換方法又は人工合成の方法によって取得されてよい。ＰＣＲ増幅方法に
ついては、公開された関連のヌクレオチド配列に基づいて、特にオープンリーディングフ
レームによってプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡバンクを利用し又は当業者に既知の
常規の方法により調製されたｃＤＮＡバンクをテンプレートとし、増幅して関連の配列を
得る。配列が長い場合、常にＰＣＲ増幅を２回以上行って、また毎回増幅されたフラグメ
ントを正確な順序でつなぎ合わせる必要がある。
【００９２】
本発明の１つの実施形態において、前記キメラ抗原受容体のポリヌクレオチドコード配
列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示すようになる。
【００９３】
2019126343.tif 000008
2019126343.tif 000009
【００９４】
別の好適例において、シグナルペプチドＦ０のポリヌクレオチドコード配列は、例えば
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示すようになる。
【００９５】
2019126343.tif 000010
2019126343.tif 000011
【００９６】
別の好適例において、ヒンジ領域及び膜通過領域Ｈ-ＴＭのポリヌクレオチドコード配列
は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示すようになる。
【００９７】
2019126343.tif 000012
【００９８】
別の好適例において、細胞内シグナル変換及び活性化ドメインＣ-ＣＤ３ζのポリヌク
レオチドコード配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示すようになる。
【００９９】
2019126343.tif 000013
【０１００】
別の好適例において、選択的ドメインＺのポリヌクレオチドコード配列は、例えばＳＥ
Ｑ  ＩＤ  ＮＯ．４に示すようになる。
【０１０１】
2019126343.tif 000014
【０１０２】
別の好適例において、選択的ドメインＺのポリヌクレオチドコード配列は、例えばＳＥ
Ｑ  ＩＤ  ＮＯ．１４に示すようになる。
【０１０３】
2019126343.tif 000015
【０１０４】
別の好適例において、Ｌ１又はＬ２のポリヌクレオチドコード配列は、例えばＳＥＱ  
ＩＤ  ＮＯ．１１に示すようになる。
【０１０５】
2019126343.tif 000016
【０１０６】
別の好適例において、Ｆ１のポリヌクレオチドコード配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ．５に示すようになる。
【０１０７】
2019126343.tif 000017
【０１０８】
別の好適例において、Ｆ２のポリヌクレオチドコード配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ．６に示すようになる。
【０１０９】
2019126343.tif 000018
【０１１０】
一旦、関連の配列を取得すると、関連の配列を組換方法によって大量に取得することが
できる。通常、それをベクターにクローンし、また細胞に移んで、常規の方法によって増
殖された宿主細胞から分離させて関連の配列を得る。
【０１１１】
なお、特にフラグメントが短い場合、人工合成の方法によって関連の配列を合成しても
よい。通常、先に複数の小さなフラグメントを合成して、また接続させて配列の長いフラ
グメントを取得することができる。
【０１１２】
ＰＣＲ技術によるＤＮＡ／ＲＮＡの増幅方法は、本発明の遺伝子の取得に好適に使用さ
れる。ＰＣＲ用のプライマーは、本文の公開した本発明の配列情報に基づいて適当に選択
されてよく、且つ常規の方法によって合成されてよい。増幅されたＤＮＡ／ＲＮＡフラグ
メントを例えば、ゲル電気泳動のような常規の方法によって分離及び純化させてよい。
【０１１３】
本発明は、更に、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のベクター又
はタンパクコード配列から遺伝子工学により発生した宿主細胞、及び組換技術による前記
Ｔ細胞又はＮＫ細胞への本発明のＣＡＲの発現方法に関する。
【０１１４】
常規のＤＮＡの組換技術によれば、本発明のポリヌクレオチド配列によって本発明のＣ
ＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞を取得することができる。一般的に、本発明の第２方面に記
載のポリヌクレオチド又は本発明の第３方面に記載のベクターをＴ細胞又はＮＫ細胞内に
変換して、前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞を取得する工程を備える。
【０１１５】
当業者に熟知の方法は、本発明の酵素を含むＤＮＡコード配列及び好適な制御シグナル
の構築用の発現ベクターを構成することに用いられることができる。これらの方法は、生
体外ＤＮＡの組換技術、ＤＮＡ合成技術、生体内組換技術等を含む。前記のＤＮＡ配列は
、ｍＲＮＡの合成を指導するように、発現ベクターにおける適当なプロモーターに効果的
に接続されてよい。発現ベクターは、翻訳開始用のリボソーム結合部位及び転写終結因子
を更に含む。
【０１１６】
なお、発現ベクターは、好ましくは、例えば真核細胞培養用のジヒドロ葉酸還元酵素、
ネオマイシン耐性及び緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒ
ｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）、又は大腸菌用のテトラサイクリン又はアンピシリン耐性のような
、転化するように選択する宿主細胞の表現形質を提供するように、１つ又は複数の選択マ
ーカー遺伝子を含む。
【０１１７】
上記適当なＤＮＡ配列及び適当なプロモーター或いは制御配列を含むベクターは、タン
パク質を発現させるように、適当な宿主細胞の転化に使用されることができる。
【０１１８】
宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞、又は哺乳動
物細胞のような高等真核細胞であってよい。その代表的な例としては、大腸菌、枯草菌（
ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属の細菌細胞、ピキア酵母
や出芽酵母細胞の真菌細胞、植物細胞、ショウジョウバエＳ２又はＳｆ９の昆虫細胞、Ｃ
ＨＯ、ＮＳ０、ＣＯＳ７、又は２９３細胞の動物細胞等がある。本発明の１つの好ましい
実施形態において、宿主細胞としてＴ細胞又はＮＫ細胞を選択する。
【０１１９】
組換ＤＮＡによって宿主細胞を転化させる場合、当業者に熟知の常規技術によって行っ
てよい。宿主が大腸菌のような原核生物である場合、ＤＮＡを取り込める形質転換受容性
細胞は、対数増殖期の後で収穫されることができ、ＣａＣＬ２法によって処理され、用い
られる工程が本分野に周知である。別の方法としては、ＭｇＣＬ２を使用する。必要な場
合、転化は、電気穿孔法の方法で行われてもよい。宿主が真核生物である場合、リン酸カ
ルシウム共沈殿法、顕微量注入法や電気穿孔法、リポソームパッケージング等の常規の機
械方法のようなＤＮＡトランスフェクション方法を選用してよい。
【０１２０】
取得した転化子を常規の方法で培養して、本発明の遺伝子によりコードされたタンパク
質を発現させてよい。用いられる宿主細胞によって、培養に用いられる培地は、様々な常
規の培地から選ばれてよい。宿主細胞の生長に好適な条件で培養する。宿主細胞が適当な
細胞密度に生長した後で、好適な方法（例えば、温度転換又は化学誘導）によって選択さ
れたプロモーターを誘導して、細胞を一定の時間培養する。
【０１２１】
上記方法におけるタンパク質は、細胞内又は細胞膜に発現され、又は細胞外に分泌され
てよい。必要な場合、その物理的、化学的及び他の特性によって様々な分離方法でタンパ
クを分離及び純化させてよい。これらの方法は、当業者に熟知されるものである。これら
の方法の例としては、常規の復元処理、タンパク沈殿剤による処理（塩析方法）、遠心、
浸透による細菌破壊、超処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ｈｉ
ｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＨＰＬ
Ｃ）及び他の様々な液体クロマトグラフィー技術及びそれらの方法の組み合わせを含むが
、それらに限定されない。
【０１２２】
ベクター
【０１２３】
本発明は、更に、本発明に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクター
を提供する。スローウイルスのようなレトロウイルスからのベクターは、組み換え遺伝子
の長期且つ安定した整合を許可し、且つ娘細胞において増殖するため、長期の遺伝子組み
換えを達成するための好適なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような
非増殖の細胞を変換することができるので、マウス白血病ウイルスのような発癌レトロウ
イルスからのベクターを超えるというメリットを有する。それらは、また、低免疫原性の
メリットを有する。
【０１２４】
簡単に言うと、通常、本発明の発現カセット又はヌクレオチド配列をプロモーターに操
作可能に接続させて、発現ベクターに併入させる。前記ベクターは、真核細胞の複製や整
合に好適に用いられる。典型的なクローンベクターは、所望のヌクレオチド配列の発現を
調節可能な転写及び翻訳終結因子、開始配列及びプロモーターを含む。
【０１２５】
本発明の発現構造体は、基準の遺伝子伝達方法を利用して、核酸免疫及び遺伝子療法に
用いられてもよい。遺伝子伝達の方法は、本分野で既知されるものである。例えば米国特
許第５３９９３４６、５５８０８５９、５５８９４６６号を参照されたく、ここで全文を
引証することで併入させる。別の実施形態において、本発明は、遺伝子療法ベクターを提
供する。
【０１２６】
前記発現カセット又はヌクレオチド配列は、数多くのタイプのベクターにクローンされ
ることが可能である。例えば、前記発現カセット又はヌクレオチド配列は、プラスミド、
ファージミド、バクテリオファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むが、それに
限定されないベクターにクローンされることが可能である。特定の関心ベクターは、発現
ベクター、複製ベクター、プローブ発生ベクター及びシーケンシングベクターを含む。
【０１２７】
更に、発現ベクターは、ウイルスベクターとして細胞に与えられてよい。ウイルスベク
ター技術は、本分野で公知されるものであり且つ例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等（２００１Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＭａｎｕａｌＣｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＮｅｗＹｏｒｋ）及び他のウイル
ス学及び分子生物学的パンフレットに記述されている。ベクターとされることのできるウ
イルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及
びスローウイルスを含むが、それに限定されない。通常、好適なベクターは、少なくとも
１つの有機体で作用する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限酵素部位及び１つ又
は複数の選択可能なマーカー（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、
及び米国特許第６３２６１９３号）を含む。
【０１２８】
遺伝子を哺乳動物細胞に組み換えるための数多くのウイルスに基づくシステムが既に開
発される。例えば、レトロウイルスは、遺伝子の伝達システム用の便利なプラットフォー
ムを提供する。本分野に既知の技術によって、選択された遺伝子をベクターに挿入して、
レトロウイルス粒子にパッケージングしてよい。前記組換ウイルスは、後で生体内又は体
外の標的細胞に分離及び伝達されてよい。数多くのレトロウイルスシステムは、本分野で
既知されるものである。ある実施形態において、アデノウイルスベクターを使用する。数
多くのアデノウイルスベクターは、本分野で既知されるものである。１つの実施形態にお
いて、レンチウイルスベクターを使用する。
【０１２９】
例えばエンハンサーのような追加のプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節するこ
とができる。最近、数多くのプロモーターが開始部位の下流にある機能要素を含むことが
既に判明されるが、通常、これらが開始部位の上流の３０〜１１０ｂｐ領域にある。要素
が別のものに対して逆にされ又は移動される場合に、プロモーター機能を保持するように
、プロモーター要素の間の間隔は、常に、柔軟的なものである。チミジンキナーゼ（ｔｈ
ｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ；ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーター要素の間の
間隔が５０ｂｐ隔たるように増加されてから、活性が低下し始めてよい。プロモーターに
よって、転写を起動させるように、単一の要素が協力又は独立して作用してよい。
【０１３０】
好適なプロモーターの１つの例としては、即時早期サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍ
ｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ；ＣＭＶ）プロモーター配列がある。前記プロモーター配列は、そ
れに操作可能に接続された如何なるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動させる
ことのできる強構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例としては、
延伸生長因子-１α（ＥＦ-１α）がある。しかしながら、他の構成的プロモーター配列を
使用してもよく、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）早期プロモーター、マウス乳癌ウイ
ルス（ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ；ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不
全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）長
い末端反復（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ；ＬＴＲ）プロモーター、Ｍ
ｏＭｕＬＶプロモーター、鳥類白血症ウイルスプロモーター、エプスタイン・バール（Ｅ
ｐｓｔｅｉｎ-Ｂａｒｒ）ウイルス即時早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモー
ター、及び人遺伝子プロモーターを含むが、それに限定されない。その人遺伝子プロモー
ターは、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーター及びクレアチ
ンキナーゼプロモーターであってよいが、それらに限定されない。更に、本発明は、構成
的プロモーターの適用に限定されるべきではない。誘導型プロモーターは、本発明の一部
として考慮される。誘導型プロモーターの使用により分子スイッチが提供され、このよう
な発現が所望である場合、誘導型プロモーターに操作可能に接続されるポリヌクレオチド
配列の発現をつけ、又は発現が所望ではない場合、発現を閉める。誘導型プロモーターの
例としては、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲス
テロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターを含むが、それに限定されない。
【０１３１】
ウイルスベクターによってトランスフェクト又は感染された細胞集団から発現細胞を便
利に鑑定及び選択するために、細胞に導入された発現ベクターは、選択可能なマーカー遺
伝子又はレポーター遺伝子の何れの１つ又は２つを含んでもよい。他方では、選択可能な
マーカーは、単独した一段のＤＮＡに携帯されて共トランスフェクション工程に用いられ
てよい。宿主細胞で発現するように、選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の両者の
側部に適当な調節配列を有してよい。有用な選択可能なマーカーは、例えば、ｎｅｏ等の
抗生物質耐性遺伝子を含む。
【０１３２】
レポーター遺伝子は、トランスフェクト可能性のある細胞を鑑定し、調節配列の機能性
を評価することに用いられる。通常、レポーター遺伝子は、受容体有機体や組織に存在せ
ず、又は受容体有機体や組織により発現され、且つポリペプチドをコードするものである
。前記ポリペプチドの発現は、例えば、酵素活性のような容易に検出される性質により明
確に表される。ＤＮＡが既に受容体細胞に導入された後、レポーター遺伝子の発現は、好
適な時間で測定される。好適なレポーター遺伝子としては、コードルシフェラーゼ、β-
ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリ
ホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子の遺伝子（例えば、Ｕｉ-Ｔｅｉ等、２０
００ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９-８２）を含んでよい。好適な発現システ
ムは、公知されるものであり、既知の技術により調製され又は商業的に取得されることが
できる。通常、最高レベルのレポーター遺伝子発現を表示し且つ少なくとも５つの側部領
域を有する構造体は、プロモーターとして鑑定される。このようなプロモーター区は、レ
ポーター遺伝子に接続されて、試薬のプロモーターの駆動転写に対する調節能力を評価す
ることに用いられることができる。
【０１３３】
遺伝子の細胞への導入方法及び発現方法は、本分野で既知されるものである。発現ベク
ターの内容において、ベクターは、本分野における如何なる方法によって、例えば、哺乳
動物（例えば、人Ｔ細胞）、細菌、酵母又は昆虫細胞のような宿主細胞に容易に導入され
ることができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的又は生物的手段によって宿主
細胞に組み換えられてよい。
【０１３４】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、
リポフェクション法、粒子衝撃法、微量注入法、電気穿孔法等を含む。ベクター及び／又
は外源核酸を含む細胞の生産方法は、本分野で公知されるものであり。例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ等（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好適な方法は、
リン酸カルシウムによるトランスフェクションである。
【０１３５】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターを
使用することを含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、既に、遺伝子
を例えばヒト細胞のような哺乳動物に挿入する最も広く使用される方法になる。他のウイ
ルスベクターは、スローウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノ
ウイルス及びアデノ随伴ウイルス等から由来してよい。例えば、米国特許第５３５０６７
４号及び第５５８５３６２号を参照されたい。
【０１３６】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル
、マイクロバルーン、ビーズのようなコロイド分散系、及び水中油型乳剤、ミセル、混合
ミセル及びリポソームを含む脂質に基づくシステムを含む。生体外及び生体内の伝達ツー
ル（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ）の例示的なコロイド系として、リポソーム（例
えば、人造の膜小胞）を使用する。
【０１３７】
非ウイルス伝達システムを使用する場合、例示的な伝達ツールはリポソームである。核
酸を宿主細胞（生体外、体外（ｅｘｖｉｖｏ）又は生体内）に導入するために、脂質製剤
を使用すると考慮される。他方、前記核酸は、脂質につながれてよい。脂質につながれた
核酸は、リポソームの水性内部にパッケージングされて、リポソームの脂質二重層内に散
布され、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両者にもつながれた接続分子を介してリポ
ソームに付着され、リポソームに陥て、リポソームと複合して、脂質含有の溶液に分散し
、脂質と混合し、脂質と結合して、懸濁重液として脂質に含まれ、ミセルに含まれ又はミ
セルと複合し、又は他の形態で脂質につながれる。組成物につながれた脂質、脂質／ＤＮ
Ａ又は脂質／発現ベクターは、溶液における如何なる具体的な構造に限定されない。例え
ば、それらは、ミセル又は「崩壊した（ｃｏｌｌａｐｓｅｄ）」構造として、二分子層構
造に存在してよい。それらは、単に溶液に散布されて、大きさ又は形状不均一の凝集体を
形成してもよい。脂質は、脂肪物質であり、自然に発生し又は合成された脂質であってよ
い。例えば、脂質は、脂肪小滴を含み、細胞質及び長鎖の脂肪族炭化水素及び、脂肪酸、
アルコール類、アミン類、アミノアルコール類及びアルデヒド類のようなそれらの誘導体
を含む化合物に自然に発生する。
【０１３８】
本発明の１つの好ましい実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクター
である。
【０１３９】
薬学的組成物
【０１４０】
本発明は、具体的には本発明の第６方面に記載のような薬学的組成物を提供する。１つ
の実施形態において、前記薬学的組成物は、液状製剤である。好ましくは、前記薬学的組
成物は、注射剤である。好ましくは、前記薬学的組成物における前記ＣＡＲ-Ｔ細胞の濃
度は、１×１０３〜１×１０８個の細胞／ｍｌであり、より好ましくは１×１０４〜１×
１０７個の細胞／ｍｌである。
【０１４１】
１つの実施形態において、前記薬学的組成物は、中性緩衝塩水、硫酸塩緩衝塩水等の緩
衝液；ブドウ糖、マンノース、蔗糖又はグルカン、マンニトールのような炭水化物；タン
パク質；グリシンのようなポリペプチド又はアミノ酸；抗酸化剤；エチレンジアミン四酢
酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ）又
はグルタチオンのようなキレート剤；補助剤（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐
剤を含んでよい。本発明の製剤は、静脈内投与となるように調合されることが好ましい。
【０１４２】
治療性の適用
【０１４３】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉｖｉ
ｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ；ＬＶ）により変換された細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に
よる治療性の適用を備える。
【０１４４】
１つの実施形態において、本発明は、患者自体のＴ細胞（或いは異質のドナー）を分離
し、活性化させて遺伝子改変を行ってＣＡＲ-Ｔ細胞を発生させた後で、同じ患者の生体
内に注入するような種類の細胞療法を含む。このような形態によれば、被移植者の対宿主
病の確率が極めて低く、抗原がＴ細胞によりＭＨＣ分子拘束性無しに認識される。なお、
１つのＣＡＲ-Ｔだけで、前記抗原を発現させる全ての癌を治療することができる。抗体
療法と異なって、ＣＡＲ-Ｔ細胞は、生体内で複製して、腫瘍を持続的に制御する長期耐
久性を発生させることができる。
【０１４５】
１つの実施形態において、本発明のＣＡＲ-Ｔ細胞は、安定した生体内でのＴ細胞増加
を経過して、延長された時間量に持続することができる。また、ＣＡＲ媒介性免疫応答は
、養子免疫療法の工程の一部であってよく、ＣＡＲ-修飾Ｔ細胞がＣＡＲにおける抗原結
合ドメインに対する特異的な免疫応答を誘導する。例えば、抗ＣＤ１９ＣＡＲ-Ｔ細胞に
より、抗ＣＤ１９発現細胞の特異的な免疫応答が発生する。
【０１４６】
治療可能な癌は、血管新生化されず又は基本的に血管新生化されていない腫瘍、及び血
管新生化された腫瘍を含む。癌は、非固形腫瘍（例えば白血病及びリンパ腫等の血液学腫
瘍）又は固形腫瘍を含んでよい。本発明のＣＡＲで治療する癌のタイプとしては、癌、芽
細胞腫及び肉腫、及びある白血病又は悪性リンパ腫、良性及び悪性腫瘍、及び例えば肉腫
、癌及び黒素瘤のような悪性腫を含むが、それに限定されない。更に、成人腫瘍／癌及び
小児腫瘍／癌を含む。
【０１４７】
血液学癌は、血液又は骨髄の癌である。血液学（又は血液原性）癌の例としては、急性
白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄系細胞白血病、急性骨髄性白血病及び成
骨髄系細胞性、前骨髄系細胞性、粒-単球細胞型、単球細胞性及び赤白血病）、慢性白血
病（例えば、慢性骨髄系細胞（粒細胞性）白血病、慢性骨髄性白血病及び慢性リンパ細胞
白血病）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン疾病、非ホジキンリンパ腫（無痛及び高級形
態）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症
候群、有毛細胞白血病及び骨髄異形成症候群等の白血病を含む。
【０１４８】
固形腫瘍は、通常、嚢腫又は液体領域の組織の異常な塊を含まない。固形腫瘍は、良性
又は悪性であってよい。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプで名
づけられる（例えば、肉腫、癌及びリンパ腫）。肉腫及び癌のような固形腫瘍の例として
は、線維腫、粘液肉腫、脂肪肉腫中皮腫、悪性リンパ腫、膵癌、卵巣癌を含む。
【０１４９】
本発明のＣＡＲ-Ｔ細胞又はＣＡＲ-ＮＫ細胞は、哺乳動物の体外免疫及び／又は生体内
療法のワクチンのタイプとされてもよい。哺乳動物はヒトであることが好ましい。
【０１５０】
体外免疫については、ｉ）細胞の増加、ｉｉ）本発明のポリヌクレオチド又はベクター
の細胞への導入、及び／又はｉｉｉ）細胞の冷凍保存の少なくとも１つは、細胞を哺乳動
物に投与する前に、生体外で発生する。
【０１５１】
体外工程は、本分野で公知されるものであり、下記でより完全的に検討される。簡単に
いうと、細胞は、哺乳動物（好ましくはヒト）から分離されて、本発明のポリヌクレオチ
ドを含むベクターにより遺伝子修飾される（つまり、生体外の変換又はトランスフェクシ
ョン）。本発明のＣＡＲ-Ｔ細胞、ＣＡＲ-ＮＫ細胞は、治療利益を提供するために、哺乳
動物の受容体に投与されてよい。哺乳動物の受容体は人であってよく、またＣＡＲ-修飾
の細胞は受容体に対して自体のものであってよい。選択可能に、細胞は、受容体に対して
同種異系の遺伝子の、同系の遺伝子の（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）又は異系のものであってよ
い。
【０１５２】
体外免疫に対して細胞に基づくワクチンを使用する以外、本発明は、生体内免疫で患者
における抗原に対する免疫応答を引き起こす組成物及び方法を更に提供する。
【０１５３】
通常、本文に記載するように、活性化及び増加した細胞は、非免疫性応答の個体に発生
する疾病の治療及び予防に用いられてよい。そのため、本発明は、治療有効量の本発明の
ＣＡＲ-修飾のＴ細胞又はＣＡＲ-ＮＫ細胞をそれを要求する標的に投与することを備える
、癌の治療方法を提供する。
【０１５４】
本発明のＣＡＲ-Ｔ細胞又はＣＡＲ-ＮＫ細胞は、単独して投与されてもよいし、薬学的
組成物として希釈剤及び／又はＩＬ-２、ＩＬ-１７又は他のサイトカイン又は細胞集団の
ような他の成分と結合して投与されてもよい。簡単にいうと、本発明の薬学的組成物は、
本文に記載の標的細胞集団を含んでよく、１つ又は複数種類のの薬学又は生理的許可可能
なベクター、希釈剤又は賦形剤と結合してよい。
【０１５５】
本発明の薬学的組成物は、治療（又は予防）される疾病に好適な形態として投与されて
よい。適当な分量が臨床試験により決められてよいが、投与の数及び頻度は、患者の病症
、及び患者の疾病のタイプ及び厳しさのような要素によって決められる。
【０１５６】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍-抑制有効量」又は「治療量」と指摘
する場合、投与される本発明の組成物の精確量は、患者（標的）の年齢、重量、腫瘍の大
きさ、感染又は組み換え程度及び病症の個体差異を考慮して、医師により決められてよい
。本文に記載のＴ細胞又はＮＫ細胞を含む薬学的組成物は、１０４〜１０９個の細胞／ｋ
ｇ体重の分量、好ましくは１０５〜１０６個の細胞／ｋｇ体重の分量（それらの範囲内の
全ての整数値を含む）で投与されることは、一般的に指摘されてよい。Ｔ細胞又はＮＫ細
胞組成物は、これらの分量で複数回投与されてもよい。細胞は、免疫療法で公知される注
入技術（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等、ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１
６７６、１９８８参照）を利用して投与されてもよい。具体的な患者に対する最適な分量
及び治療方法は、患者の疾病の跡をモニターすることで、治療を調節して、医学分野の技
術者により容易に決められることができる。
【０１５７】
標的組成物の投与は、スプレー、注射、飲み込み、点滴、植え込み又は移植のような、
如何なる便利な形態で行われてもよい。本文に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結
節内、脊髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射又は腹腔内によって患者に投与されてよ
い。１つの実施形態において、本発明のＴ細胞又はＮＫ細胞組成物は、皮内又は皮下注射
によって患者に投与される。別の実施形態において、本発明のＴ細胞又はＮＫ細胞組成物
は、ｉ．ｖ．注射によって投与されることが好ましい。Ｔ細胞又はＮＫ細胞の組成物は、
直接腫瘍、リンパ腺又は感染位置に注入されてよい。
【０１５８】
本発明のある実施形態において、本文に記載の方法又は本分野の既知の他のＴ細胞又は
ＮＫ細胞を治療性レベルに広げる方法で活性化及び増加された細胞を利用して、如何なる
数の関連の治療形態に組み合わせて（例えば、その前に、その同時に又はその後で）患者
に投与する。前記治療形態は、抗ウイルス療法、シドフォビル及びインターロイキン-２
、シトシンアラビノシド（ＡＲＡ-Ｃとしても既知される）又はＭＳ患者に対するナタリ
ズマブ治療又は乾癬患者に対するエファリズマブ（ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）モノクローナ
ル抗体治療又はＰＭＬ患者に対する他の治療のような試薬による治療を含むが、それに限
定されない。更なる実施形態において、本発明のＴ細胞は、化学療法、輻射、シクロスポ
リン、アザチオプリン、メトプテリン、マイコフェノラート及びＦＫ５０６のような免疫
抑製剤、抗体又は他の免疫治療剤に組み合わせて使用されてよい。更なる実施形態におい
て、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンのような化学療法剤の利用、Ｘ線ト
ポグラフィー（ＸＲＴ）、シトキサンに組み合わせて（例えば、その前に、その同時に、
又はその後で）患者に投与される。例えば、１つの実施形態において、標的は、高用量化
学療法による基準的な治療をされた後で、末梢血幹細胞の移植を行ってよい。ある実施形
態において、移植の後で、標的は、本発明の広げられた免疫細胞の注入を受容する。１つ
の追加された実施形態において、広げられた細胞は、外科手術の前に又は外科手術の後で
投与される。
【０１５９】
患者に投与された上記治療の分量は、治療される病症の精確な属性及び治療の受容体に
よって変わる。人に投与する分量の比例は、本分野で許可可能な実践によって実施されて
よい。通常、毎回の治療又は毎回の治療コースでは、１×１０６個〜１×１０１０個の本
発明の修飾されたＴ細胞又はＮＫ細胞を、例えば静脉輸送によって患者に投与されてよい
。
【０１６０】
本発明の主要なメリットは、下記の通りである。
【０１６１】
（１）本発明のＣＡＲは、生体外での特異選択性を有し、再選別の方法によってＣＡＲ
陽性発現の標的細胞を効率的に選別して、生体外での定向増幅を達成し、ＣＡＲ陽性標的
細胞の最終製品での比例を著しく向上させ、ＣＡＲ陽性細胞の純度が高いので、ＣＡＲ遺
伝子修飾性の免疫細胞製品のプロセス調製の効率を向上させ、このような技術製品の臨床
上の更なる普及や適用により安定した技術保証を提供する。
【０１６２】
（２）本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞又はＮＫ細胞に対する再活性化の作用を有し、再選別
により刺激された後で、増幅効率が著しく向上する。
【０１６３】
（３）正常なＴ細胞又はＮＫ細胞と比べると、本発明の遺伝子工学化されたＴ細胞又は
ＮＫ細胞の増値能力及び増幅性質が基本的に同じであり、ＣＤ１９陽性細胞に対してより
良好な腫瘍殺傷活性を有し、且つより高い殺傷関連因子の釈放レベルを有する。
【０１６４】
以下、具体的な実施例に合わせて、本発明を更に説明する。これらの実施例は、本発明
を説明するためのものだけであるが、本発明の範囲を限制するためのものではないことは
、理解すべきである。下記実施例に具体的な条件の実験方法は明記されていないが、通常
、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等の人、分子クローン：実験室パンフレット（Ｎｅｗ  Ｙｏｒ
ｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ１９８
９）に記載の条件、又はメーカーの提案した条件等の常規の条件によって行われる。特に
説明しない限り、百分率及び部は、重量百分率及び重量部である。
【０１６５】
実施例１．特異選択性ＣＡＲ分子の調製
【０１６６】
特異的プライマを設計して、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉ
ｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）方法によってヒトｃＤＮＡライブラリーからＴ細胞受容
体タンパクＣＤ８分子のプロペプチドドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、ヒンジ領域
及び膜通過領域のコード配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）を定向増幅し、Ｔ細胞受容体タ
ンパクＣＤ３分子の細胞内シグナル変換ドメインＣＤ３ζ及びＣＤ１３７分子の細胞内シ
グナル活性化ドメインのコード配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）を増幅した。ＣＡＲ分子
における特異選択性ドメインは、ヒトの核タンパク質Ｌａ／ＳＳ-ＢのＣ末端ドメインの
第９５〜１０４のアミノ酸コード配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）に由来し、前記配列が
化学合成方法によって調製されて、ＣＡＲ分子におけるヒト化一本鎖抗体ＳｃＦｖコード
領域のＶＬとＶＨドメインとの間に挿入した。前記ＣＡＲの構造はＦ０-Ｆ１-Ｌ１-Ｚ-Ｌ
２-Ｆ２-Ｈ-ＴＭ-Ｃ-ＣＤ３ζであり、アミノ酸配列は例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に
示すようになる。上記異なるコード配列をネステッドＰＣＲによって生体外スプライシン
グ及び増幅を行って、特異選択性ドメイン含有のキメラ抗原受容体コード配列を構成した
。本発明は、抗ヒトＣＤ１９ヒト化一本鎖抗体を例として、上記選択性配列を含むＣＤ１
９を標的とするキメラ抗原受容体分子ＣＤ１９-ｈｓＣＡＲを構成し、前記ＣＡＲ分子ド
メインの下流のＣＡＲ遺伝子修飾性Ｔ細胞の調製への適用を詳しく説明することに用いら
れる。
【０１６７】
実施例２．キメラ抗原受容体発現ベクターの構成
【０１６８】
実施例１に係るＣＡＲコード配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）を、分子クローン技術に
よってスローウイルス発現ベクターｐＬｅｎｔｉ-ＣＭＶの中にクローンした。本発明で
修飾されたＣＡＲ分子のキメラ抗原受容体Ｔ細胞の調製での優勢を比較するために、常規
の標的ＣＤ１９抗原のＣＡＲ分子（アミノ酸配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９に示
す。特許番号：ＣＮ１０３４９２４０６Ａ）を対照として、ＣＤ１９-ｍＣＡＲウイルス
発現ベクターを構成した。上記スローウイルス発現ベクターは、ウイルスパッケージング
ヘルパープラスミド、コードウイルスヌクレオカプシドタンパク質Ｇａｇ／Ｐｏｌ及びＲ
ｅｖのプラスミドｐｓＰＡＸ２及びコードウイルス被膜タンパク質のプラスミドｐＶＳＶ
Ｇと合わせて使用されて、後の異なるＣＡＲ遺伝子コードスローウイルスの調製に用いら
れた。図１は、アガロースゲル電気泳動によって、異なるＣＡＲタンパクコード配列を携
帯するウイルス発現ベクターを鑑定する結果である。
【０１６９】
2019126343.tif 000019
【０１７０】
実施例３．ＣＡＲ遺伝子コードウイルスの調製
【０１７１】
パッケージング細胞としてＨＥＫ１９３Ｔを利用して、ＣＡＲ遺伝子コードウイルスの
調製を行った。対数増殖期中のＨＥＫ２９３Ｔを細胞解難して、８００ｒｐｍで５分間遠
心して、培地を捨てた後で１０％のＦＢＳ（Ｇｂｉｃｏ会社）含有のＤＭＥＭ培地（Ｇｂ
ｉｃｏ会社）によって再懸濁した。細胞計数を行った後、細胞懸濁液の密度を３．６×１
０６／ｍｌに調整して、３７℃の細胞インキュベーターに置いて用意しておいた。ウイル
スパッケージングプラスミドのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  
３０００キット（サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）会社）を使用して
、キットの明細書に基づいて操作された。スローウイルスパッケージングに必要な異なる
ＣＡＲ遺伝子含有のウイルスベクター及び実施例２の提出した２つのヘルパープラスミド
の３つのプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００と明細書の推薦した比例で
混合させてＤＮＡリポソーム複合物に調合して、室温で１５分間静置した。静置が終了し
た後で、１枚の６ウェル細胞培養用プレートを取って、ＤＮＡ-リポソーム複合物を毎孔
が１ｍｌである６ウェルプレートに加え、また、前に調製されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞懸濁
液を柔らかに均一に混合させ、６ウェルプレートに加え、リポソーム複合物と均一に混合
させた。培養用プレートをインキュベーターに入れて続けて培養し、それぞれ２４時間及
び４８時間培養する時点でウイルス含有の培養上澄みを収集した。上澄みを最後の１回に
収集した後で、２０００ｇの上澄みを１０分間遠心させ、０．４５?の濾過膜で濾過して
、分けて入れた後で−８０℃で冷凍して保存して置いた。
【０１７２】
実施例４．ＣＡＲコード遺伝子により修飾されたＴ細胞の生体外での調製
【０１７３】
ヘパリン抗凝固チューブによって３０ｍＬの健康人の末梢血を採集し、リンパ細胞分離
液によって分離を行い、分離時の遠心条件は８００ｇ、２５℃、１５分間であった。遠心
分離機は、加速係数が１に設置され、減速係数が０に設置された。遠心が終了した後で、
バフィーコートを新しい遠心管内に組み換え、４００ｇのＤ-ＰＢＳ再懸濁細胞によって
１０ｍｉｎ遠心した。細胞を、５％の正常人ＡＢ血清含有のＸ-ＶＩＶＯ１５培地（ロン
ザ（ＬＯＮＺＡ）会社）によって再懸濁して、細胞密度を１〜２×１０６／ｍＬに調整し
た。ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の結合された磁気ビーズ（Ｇｂｉｃｏ会社）を使用してＴ細胞
の選別を行い、選別の過程については明細書に従って行った。選別された細胞を、１００
０ＩＵ／ｍＬＩＬ-２含有のＸ-ＶＩＶＯ-１５培地によって再懸濁して、１０μｇ／ｍＬ
のＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（タカラ（Ｔａｋａｒａ）会社）及び５μｇ／ｍＬＯＫＴ-３
（Ｔａｋａｒａ会社）の予備被覆された培養フラスコに接種して、接種密度が１〜２×１
０６／ｍＬであり、３７℃のインキュベーターに入れて培養した。
【０１７４】
２４時間培養した後で、細胞を取り出して顕微鏡に置いて細胞の状態を観察し、スロー
ウイルス感染を行った。下記方法によってＣＤ１９-ｈｓＣＡＲ及びその対照ＣＡＲタン
パクをコードするウイルスを感染させた。４００ｇの細胞を収集し、１０ｍｉｎ遠心させ
て、再懸濁し、細胞密度を３〜５×１０６／ｍＬに調整し、１０μｇ／ｍＬＲｅｔｒｏｎ
ｅｃｔｉｎの予備被覆された培養フラスコに接種した。ウイルスを−８０℃の冷蔵庫から
取り出して、氷に置いて融化させた。感染された細胞数、ウイルス力価に基づいて、ＭＯ
Ｉ＝５０によって必要なウイルス量を算出した。ウイルスをＸ-ＶＩＶＯ-１５培地で希釈
した後で、細胞と混合させて、終濃度８μｇ／ｍＬのｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（シグマ会社（
Ｓｉｇｍａ））に加え、均一に混合させた後でインキュベーターに入れて培養した。８時
間後、新鮮な培地に交換して、続けて培養した。
【０１７５】
第５日目まで培養し、ＣＤ１９-ｈｓＣＡＲタンパクをコードするウイルスに感染した
Ｔ細胞を収集し、Ｔ細胞の選別の方法によって、抗ヒト核タンパクＬａ／Ｓ-ＢＢポリペ
プチド抗体の被覆された磁気ビーズを使用して第２回の選別を行い、選別の時、磁気ビー
ズとＴ細胞との比例は１：１であった。選別された細胞を培養フラスコに接種して続けて
培養した。その後、異なる群のＴ細胞に対して細胞の生長状態によって２〜３日ごとに補
液し、細胞密度を１〜１．５×１０６／ｍＬに保持し、第１４日目に培養し、調製を完成
した。調製された細胞を収集した後で、後の各項の分析に用いられるように、細胞凍結保
存液によって冷凍して保存した。
【０１７６】
図２は、異なるＣＡＲタンパク分子に感染されたＴ細胞の培養過程中での増殖曲線であ
る。結果によると、各群のＴ細胞の増殖能力が基本的に同じであり、著しい差異がないの
で、ＣＡＲ分子に特異性選択ドメインを導入しても、ＣＡＲ遺伝子により修飾されたＴ細
胞の増殖能力に影響を与えることはないことが判明された。図３は、異なるＣＡＲタンパ
ク分子に感染されたＴ細胞がペプチドを篩い分けることで再選別して刺激された後の増殖
曲線図である。図面から分かるように、再選別により刺激された後で、ＣＤ１９ｈｓＣＡ
ＲＴの増殖効率が対照群のＣＡＲ-Ｔより著しく高くなる。図４は、流式細胞分析技術に
よって異なる群のＣＡＲ遺伝子修飾Ｔ細胞の最終製品に対してＣＡＲ陽性細胞の純度の分
析結果であり、ＣＤ１９-ｓＣＡＲ-Ｔ細胞の純度が対照群より著しく高いことが表される
ので、特異性選択ドメインを導入することで、最終製品におけるＣＡＲ陽性細胞の比例を
効果的にの向上させ、最終製品の純度を向上させることが判明される。細胞亜群の分析結
果によると、対照群に比べると、異なる細胞亜群の最終製品での比例に関しては、２つの
群には著しい差異がないので、ＣＤ１９-ｈｓＣＡＲ分子のＴ細胞での発現により、異な
る亜群細胞の生体外での増幅性質が変わることはないことが判明される（図６）。
【０１７７】
実施例５．ＣＡＲコード遺伝子により修飾されたＮＫ細胞の生体外での調製
【０１７８】
ヘパリン抗凝固チューブによって３５ｍＬの健康人の末梢血を採集し、リンパ細胞分離
液によって分離を行い、分離時の遠心条件は８００ｇ、２５℃、１５分間であった。遠心
分離機は、加速係数が１に設置され、減速係数が０に設置された。遠心が終了した後で、
バフィーコートを新しい遠心管内に組み換え、４００ｇのＤ-ＰＢＳ再懸濁細胞で１０ｍ
ｉｎ遠心した。細胞を、１０％の正常人ＡＢ血清含有のＳＣＧＭ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉ
ｘ会社）によって再懸濁して、細胞密度を１〜２×１０６／ｍＬに調整した。また、再懸
濁された細胞を培養フラスコ或いは培養皿に接種して、接種密度が１．５×１０６／ｍＬ
であり、培養体系に終濃度５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ-３、２０μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣ
Ｄ１６モノクローナル抗体、及び１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ-２を加え、３７℃のインキ
ュベーターに入れて培養した。
【０１７９】
培養後の第３〜４日目、実施例４に記載の方法によってスローウイルスの感染及び感染
後の陽性ＮＫ細胞の選別を行った。選別された細胞を第１４日目まで培養し、細胞を収穫
し、−１９３℃に長期に冷凍して保存し、或いは直接新鮮な細胞を後の実験分析に使用し
た。最終製品において、ＣＡＲ陽性ＮＫの純度が図５に示すように、ＣＤ１９ｈｓＣＡＲ
-ＮＫの最終製品でのＣＡＲ陽性ＮＫの比例が、ＣＤ１９ｍＣＡＲ-ＮＫより著しく高かっ
た。
【０１８０】
実施例６．生体外殺傷効能の評価
【０１８１】
ＣＤ１９陽性ヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｊｉ細胞系を使用し、ＬＤＨ釈放法によってＣＤ
１９-ｈｓＣＡＲ群及びＣＤ１９-ｍＣＡＲ群の生体外殺傷活性を評価した。ＬＤＨ釈放の
検査として、Ｐｒｏｇｅｍａ会社のキットを使用し、キットの明細書に基づいて操作した
。各群の吸光度値によって、公式１に基づいて殺傷能力を算出した。具体的な方法として
は、対数増殖期中のＲａｊｉ細胞を収集し、細胞懸濁液の密度を４×１０６／ｍＬに調整
し、２×１０４／５０μＬ／孔で「Ｕ状」ボトムの９６ウェルプレートに接種した。異な
る群のＣＡＲ-Ｔ細胞を収集した後で再懸濁し、２５：１、１２．５：１、６．２５：１
及び３．１２５：１のＥ／Ｔ比例でＲａｊｉ細胞と混合させて共培養した。４時間培養し
た後で細胞上澄みを収集し、キットの明細書に基づいてＬＤＨ釈放を検出し、異なる群の
ＣＡＲ-Ｔ細胞の殺傷活性を評価した。図７に示すように、ＣＤ１９-ｈｓＣＡＲ発現Ｔ細
胞は、対照群よりも良好な殺傷活性を有した。
【０１８２】
ＣＤ１９ｓＣＡＲ-ＮＫを測定する殺傷実験において、標的細胞としてＲａｊｉ細胞系
を選択し、上記方法によって操作し、異なるＣＡＲタンパク分子に感染したＮＫ細胞のＲ
ａｊｉに対する殺傷效果を評価し、対照として正常のＮＫ細胞を使用した。実験結果は、
図８に示すように、ＣＡＲタンパク発現ＮＫ細胞のＲａｊｉに対する殺傷能力が対照群の
ＮＫ細胞より著しく高いが、ＣＤ１９ｈｓＣＡＲ-ＮＫのＲａｊｉ細胞に対する殺傷能力
がＣＤ１９ｍＣＡＲ-ＮＫより高かった。
【０１８３】
公式１：
【０１８４】
殺傷効率（％）＝（実験群−効果細胞の自発釈放−標的細胞の自発釈放）／（効果細胞
の最大釈放−効果細胞の自発釈放）×１００％
【０１８５】
実施例７．サイトカインの釈放の検出
【０１８６】
ＥＬＩＳＡキット（欣博盛（Ｎｅｏｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）会社）によって異なるＣＡ
Ｒ遺伝子により修飾されたＴ細胞の殺傷過程中のＴ細胞殺傷関連サイトカインＩＬ-２、
ＩＮＦ-γ及びＴＮＦ-αの釈放レベルを検出した。Ｒａｊｉ細胞を実施例５における接種
量で「Ｕ状」ボトムの９６ウェル細胞培養用プレートに接種して、異なるＣＡＲ分子発現
のＴ細胞をＥ／Ｔ＝２５：１の比例でＲａｊｉ細胞と混合させて、共培養を行った。１２
時間培養した後で、細胞上澄みを収集し、ＥＬＩＳＡキットの説明によって操作して、そ
れぞれ培養上澄みにおけるＩＬ-２、ＩＮＦ-γ及びＴＮＦ-α因子の濃度を検出した。図
９に示すように、ＣＤ１９-ｈｓＣＡＲ受容体発現Ｔ細胞の殺傷関連因子の釈放レベルが
対照ＣＡＲ受容体発現Ｔ細胞より著しく高いので、本発明の方法で調製されたＣＡＲ修飾
Ｔ細胞がより良好な殺傷活性を有することが判明された。
【０１８７】
ヒト化選択的（ｈｓ）ＣＤ１９  ＣＡＲの設計及び性質
ヒト化選択的ＣＡＲは、第２の世代のＣＡＲを基礎とした。第２の世代のＣＡＲは、ヒ
トＣＤ８ａ分子のヒンジドメイン及び膜貫通領域、並びに共刺激領域として４-１ＢＢ及
びＣＤ３ζを含有する細胞内シグナル伝導ドメインを含んだ。ＣＡＲ変換率の変化（特に
、患者に由来するＴ細胞において）及び注入前のＣＡＲ陽性及び陰性Ｔ細胞の非選択的増
加の何れによりも、品質制御や臨床結果解釈の不確実性が向上した。この問題を解決する
ために、ｓｃＦｖ領域の重鎖と軽鎖との間の接続配列に選択的ドメインを引き入れた（図
１０Ａ）。前記選択的ドメインは、ヒト細胞核に存在する天然タンパクの一部であり、ま
たＳｍＡｂに露出すると、あるＣＡＲ変換により得られたＴ細胞の選択的な活性化及び増
加を引き起こす可能性があった。
【０１８８】
ｓｃＦｖ領域のヒト化配列は、従来のＣＤ１９  ＣＡＲに対する別の種類の改良であっ
た（図１０Ｂ〜１０Ｃ）。マウスＣＤ１９  ｓｃＦｖ配列が宿主の免疫系により識別され
ることができるので、第２のマウスＣＤ１９  ＣＡＲ-Ｔ細胞注入が失効した。ｓｃＦｖ
領域のヒト化がオンライン・ソフト（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ）の予測と一致であ
った（図１０Ｂ〜１０Ｃ）。抗原に対する特異性は、ＣＡＲの品質を決める重要な要素で
あった。標的抗原として純化されたヒトＣＤ１９蛋白を使用してマウスＣＤ１９  ｍＣＡ
Ｒ及びＣＤ１９  ｈｓＣＡＲの親和力に対してテストを行った。ＭＳＴ法（Ｍｏｎｏｌｉ
ｔｈ  ＮＴ．１１５、ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）（図１０Ｄ）によってマウス及びヒト化選
択的ＣＡＲとリガンド（ｈＣＤ１９）との結合動力学曲線をそれぞれ製作し、得られたＣ
Ｄ１９  ｍＣＡＲ及びｈｓＣＡＲのＫｄ値がそれぞれ５０９．４±８９．８及び８３．４
±１２．２ｎＭであり、ｈｓＣＡＲの親和力はｍＣＡＲの親和力の６倍であることが判明
された。
【０１８９】
ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲの設計は、選択的エピトープＥタグを更に含んだ。体外増加段階
において、選択的ドメインの臨床レベルの抗体ＳｍＡｂをプレートの底部に被覆した。Ｃ
Ｄ１９  ｍＣＡＲにより変換されたＰＢＭＣ及びＣＤ１９  ｈｓＣＡＲにより変換され且
つＳｍＡｂに露出されないＰＢＭＣに比べると、ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲにより変換され且
つＳｍＡｂに露出するＰＢＭＣは、明らかに高い増殖能力を表現した。第１４日目、ｈｓ
ＣＡＲに感染し且つＳｍＡｂに露出するＰＢＭＣが８１．６±３．３８倍増加し、ＳｍＡ
ｂに露出されていなく且つｈｓＣＡＲに感染したＰＢＭＣ及びｍＣＡＲに感染したＰＢＭ
Ｃがそれぞれ６１．７±２．５８倍及び５８．２±２．５５倍増加した（図１０Ｆ）。
【０１９０】
１４日目、最終生成物の総細胞において、９５％を越えるものはＣＤ３+Ｔ細胞であり
、小さい一部（<５％）はＣＤ３-／ＣＤ５６+ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり、ま
た、フローサイトメトリーにより少しのＣＤ３-／ＣＤ１９+Ｂ細胞又はＣＤ３-／ＣＤ１
４+細胞が検出された（図１０Ｇ）。ＣＡＲ陽性細胞において、各群体の比例は例えば図
１６Ａに示された。
【０１９１】
最終生成物におけるＣＡＲ陽性細胞の評価によると、第１４日目、「ＣＤ１９ｈｓＣＡ
Ｒ+ＳｍＡｂ」の群における総細胞の６４．７３±４．４％はＣＡＲ陽性であり、他の３
つの群より著しく高いことが表された（図１０Ｈ〜１０Ｊ）。結果によると、選択的ドメ
インはＣＡＲ変換の細胞の特異的増加に使用されてよいことが証明された。
【０１９２】
ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞の体外抗腫瘤の致死性に対する改善
異なる群のＣＡＲ-Ｔ細胞（ＣＤ１９  ｍＣＡＲ、ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ  ｗ／ｏ  Ｓ
ｍＡｂ、ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ及びＳｍＡｂ）と白血病Ｒａｊｉ細胞系を各種のＥ／Ｔ比
率で合わせて培養した。４つのテストの比率（１：１、６．２５：１、１２．５：１及び
２５：１）によれば、ＳｍＡｂにより刺激されたＣＤ１９  ｈｓＣＡＲの何れも、他の２
組よりも優れた細胞毒性を示した（図１１Ａ）。面白いことに、低いＥ／Ｔ比（６．２５
：１）では、ＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ細胞に比べると、ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ  ｗ／ｏ  
ＳｍＡｂも大きい細胞毒性を示した。そのため、例えばＥＬＩＳＡ検出によると、Ｒａｊ
ｉ細胞と２５：１のＥ／Ｔ比例で培養する場合、ＳｍＡｂにより刺激されたＣＤ１９  ｈ
ｓＣＡＲの原因で、培地におけるＩＬ-２、ＩＦＮ-γ及びＴＮＦ-αのサイトカインの釈
放が増加した（図１１Ｂ）。
【０１９３】
注意すべきなのは、先にＳｍＡｂで活性化されることで、体外Ｔ細胞の細胞毒性機能の
改善が観察された。次に、このような活性化によりＴ記憶細胞サブグループの比例が変化
するかを検査した。ＣＤ１９  ｍＣＡＲ及びＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ  ｗ／ｏ  ＳｍＡｂ群
に比べると、ＳｍＡｂに露出するＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ群により、中枢記憶Ｔ（Ｔｃｍ）
細胞サブグループの比例が高く、また効果記憶Ｔ細胞サブグループの比例が低くなった（
図１１Ｃ〜１１Ｅ）。ＣＡＲ陽性細胞におけるサブグループの各々の比例は、例えば図１
６Ｂ〜１６Ｃに示された。
【０１９４】
どちらの下流シグナル通路が増加したＴｃｍサブグループに役立つかを探求するために
、各種の通路を検査して、ＥＲＫ１／２、ＳＴＡＴ３、Ｐ３８及びＡＫＴ通路の何れもＳ
ｍＡｂ活性化により活性化されたことを発見した（図１１Ｆ〜１１Ｋ）。
【０１９５】
動物研究における効果改善
発光酵素発現のＲａｊｉ細胞を免疫不全のマウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒγｃ-
／-ＮＳＧマウス）にｉ．ｖ．注入して、白血病マウスモデルを作った。正常な健康人Ｐ
ＢＭＣを、ｍＣＡＲ、ｈｓＣＡＲ及び対照ｈｓＣＡＲ  Ｓｔｏｐｐｅｒ  ＣＡＲ（細胞内
共刺激領域の欠乏するＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ）を含む異なる群のＣＤ１９  ＣＡＲ-Ｔ細
胞を発生することに用いた。Ｒａｊｉ細胞を注射した３日後で、ＰＢＳ又は各ＣＡＲ-Ｔ
群も白血病マウスモデルに静脈注射した。ＥＧＦＰの慢病毒変換により工程化されたＴ細
胞を模擬群とした。治療前に、及び治療後の７、１４、２１、３５、４９及び７０日目に
腫瘤負荷及び分布を監視した（図１２Ａ及び図１７）。ＳｍＡｂにより活性化されたｈｓ
ＣＡＲ-Ｔ細胞で処理されたマウスは、ＳｍＡｂ活性化無しのｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞及び用ｍ
ＣＡＲ-Ｔ細胞で処理されたマウスよりも長い生存時間を有した（図１２Ｂ〜１２Ｄ）。
処理後の２０〜５０日のマウス血清を分析すると、高濃度の炎症性サイトカインＩＦＮ-
ｒ、ＩＬ-２、ＩＬ-６及び低濃度のＩＬ-１５が示された（図１２Ｅ〜１２Ｉ）。
【０１９６】
ｈｓＣＡＲ-Ｔの先にマウスＣＡＲ-Ｔ細胞で治療された患者への注入の安全性及び効果
性
試験に５名の難治／再発の急性Ｂリンパ細胞白血病（Ｂ-ＡＬＬ）患者がいた。これら
の患者に対して、先にマウスＣＡＲ-Ｔ治療を加え、ＣＤ１９陽性Ｂリンパ細胞で再発さ
せた（表１及び表２）。患者１は、男性であり、２０１８年に９歳であり、２０１７年３
月にＡＬＬ症状が出現し、２０１７年９月にＢ-ＡＬＬに診断され、融合遺伝子型はＥ２
Ａ-ＨＬＦであった。患者１は、化学治療によって治愈されにくかった（化学治療されて
もＭＲＤ+及びＥ２Ａ-ＨＬＦ+であり、且つ中枢神経系（ＣＮＳ）関連性を示しなかった
）（治療履歴を表２に示す）。２０１８年４月に、患者１は、フルダラビン（Ｆｌｕ）、
シクロホスファミド（ＣＴＸ）及びイダルビシン（ＩＤＡ）でリンパ細胞を除去した後で
マウスＣＤ１９  ＣＡＲ-Ｔ治療を受けた。マウスＣＡＲ-Ｔ治療後の１７日に、患者１は
、ＣＭＲに達するが、ｍＣＡＲ-Ｔ治療後の３０日目に、ＭＲＤが再発した。２０１８年
５月、患者１は、リンパ細胞を除去した後でｈｓＣＡＲ-Ｔ治療を受け、且つｈｓＣＡＲ-
Ｔ処理された後で１級ＣＲＳが観察された。第１４日目、患者１は、ＣＭＲ（ＭＤＲ-）
に達し、２８日目にもＣＭＲ（ＭＤＲ-）に保持した。二か月後、患者１は、ａｌｌｏ-Ｈ
ＳＣ移植を受け、且つこの明細書を書く場合にもＣＭＲに保留した。この病例により、ヒ
ト化ＣＡＲ-Ｔ細胞がマウスＣＡＲ-Ｔ治療後で再発する患者を効果的に治療できるという
仮想が証明された。
【０１９７】
表１  患者情報及びＣＤ１９ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療後の臨床表現
2019126343.tif 000020
2019126343.tif 000021
【０１９８】
備考：ａｌｌｏ-ＨＳＣＴ：同種造血幹細胞移植；ＢＭ：骨髄；ＣＤ１９ｈｓＣＡＲ-Ｔ
：ヒト化選択的ＣＤ１９特異性ｓｃＦｖ工程で改造されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞；ＣＭ
Ｒ：細胞遺伝学的完全寛解；ＣＲＳ：サイトカイン放出症候群；ＣＳＦ：脳脊髄液；ＩＴ
Ｄ：内縦列重複；Ｍ：男性；ｍＣＡＲ-Ｔ、マウスＣＤ１９特異性のｓｃＦｖ工程で改造
されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞；ＭＲＤ：微少残存病変；Ｎ：無し；ＮＲ：緩解されず；
ＰＢ：末梢血；Ｔｏｃｉｌｉ：ニモツズマブ；Ｙ：あり；$患者４に、ＩＫＺＦ１突然変
異、ＥＲＧ（Δ３-９陽性）、ＦＡＮＣＤ２（Ｃ２０８０  Ｇ>Ａ  ｐＤ６９４Ｎ）、ＮＲ
ＡＳ（Ｇ１３Ｄ）及びＪＡＫ（Ｉ６６８Ｆ）を含む遺伝子突然変異がある；$$患者５に、
ＩＫＺＦ１突然変異、ＥＲＧ（Δ３-９陽性）及びＮＲＡＳ（Ｇ１３Ｄ）を含む遺伝子突
然変異がある；*患者４及び患者５は、ＨＳＣＴに架橋されたマウスＣＤ１９ＣＡＲ-Ｔを
受ける；患者４及び５は、それぞれＨＳＣＴを受けた１．５年及び１年に再発する場合に
ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療を受ける；**この明細書が完成する場合、患者４及び患者
５は、相変わらずＣＭＲを保持していた。
【０１９９】
患者２は、男性であり、２０１８年に１４歳であり、２０１７年６月に融合遺伝子型Ｅ
２Ａ-ＨＬＦ及び複雑染色体核型を有する急性Ｂリンパ細胞白血病（Ｂ-ＡＬＬ）と診断さ
れた。この患者は、化学治療されても治愈されにくく、且つ強化化学治療されても相変わ
らずＭＲＤ+及びＥ２Ａ-ＨＬＦ+を保持していた（表２）。２０１７年１１月、この患者
は、リンパ細胞を除去した後でＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ注入を受け、１５日目にＣＭＲ（
ＭＲＤ-）に達した。ＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ治療を３ヶ月半された後で、患者は、悪性Ｂ
リンパ細胞ＣＤ１９及びＣＤ２２陽性が再発した。２０１８年４月、患者は、組み合わせ
たＣＤ１９／ＣＤ２２  ｍＣＡＲ-Ｔ細胞注入を受けた。しかしながら、患者は、２回目
のマウスＣＡＲ-Ｔ治療（ＮＲ）されても好転せず、治療後の検査の如何なる時点でもＢ
Ｍの腫瘤負荷が低下することなく、且つ疾病が進行していた。（ＢＭにおけるリンパ細胞
：２回目のｍＣＡＲ-Ｔ注入前の０日目、０．５％（形態学）、０．５３％（フローサイ
トメトリー）、Ｅ２Ａ-ＨＬＦ融合遺伝子０．９４％；１５日目、１．５％（形態学）、
０．６％（フローサイトメトリー）、Ｅ２Ａ-ＨＬＦ融合遺伝子１３．３％；３６日目、
３０％（形態学）、４６．８１％（フローサイトメトリー）、Ｅ２Ａ-ＨＬＦ融合遺伝子
１１９．５８％）。２０１８年５月に、患者２は、ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療を受け
た（表１及び表２）。高腫瘤負荷を考慮すると、厳しいサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ
）による可能性のある副作用を避けるために、ｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞の分量を体重１ｋｇあ
たり０．３×１０６に下げた。ｈｓＣＡＲ-Ｔ注入前の０日目に（リンパ細胞除去処理後
）、形態学によって評価すると、骨髄における腫瘤負荷は３６％であるが、フローサイト
メトリーによる骨髄における腫瘤負荷は３４．８６％であった。治療後の１５日目、形態
学及びフローサイトメトリーによって評価すると、ＢＭにおける腫瘤負荷はそれぞれ１０
．５％及び１４．９８％まで低下した。ＰＢにおけるＢ細胞百分率も１５日目にほぼゼロ
に低下したが（図１８Ｂ）、３０日目に、ＢＭにおける腫瘤負荷それぞれ８２％（形態学
）及び７１．８４％（フローサイトメトリー）に反発した。その結果によると、ｈｓＣＡ
Ｒ-Ｔ細胞が効果的である可能性があるが、１５日目後で注入分量が低く且つ腫瘤負荷が
わりに高いので、消耗し尽されることが判明された。実際的に、１５日目後、ＰＢにおけ
るｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞の比例が急激に低下し、且つ３０日目にほぼ消えた（図１４Ｃ）。
残念なのは、より高い分量で再びｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞を注入しようとする場合、患者２は
、不明な原因で試験から退出した。
【０２００】
表２  ５名の患者の前に受けた治療
2019126343.tif 000022
【０２０１】
備考：Ａｒａ-Ｃ、シタラビン；ａｌｌｏ-ＨＳＣＴ、同種造血幹細胞移植；ＣＡＭ、補
完・代替医療；ＣＴＸ、シクロホスファミド；Ｄｅｘ、デキサメタゾン；ＦＬＵ、フルダ
ラビン；ＩＤＡ、イダマイシン；Ｌ-ａｓｐ、Ｌ-アスパラギナーゼ；ＭＴＸ、アメトプテ
リン；ＶＤＬＤ：ＶＣＲ、ダウノルビシン又はアドリアシン、Ｌ-アスパラギナーゼ及び
プレドニゾン又はデキサメタゾン；ＶＬＰ、心室腰椎潅流化学治療。
【０２０２】
患者３は、男性で、２０１８年に１７歳であり、２０１４年末にＢ-ＡＬＬに診断され
、その融合遺伝子型がＢＣＲ-ＡＢＬ１であった。この患者は、ＣＮＳ関連の髓外疾病に
かかり、標的治療（イマチニブ及びその後のダサチニブ）及び化学治療を受けた。ＣＭＲ
が達成された後で、この患者は、２０１５年５に、母親をドナーとして半合致ＨＳＣ移植
を行った。２０１７年６月に、患者３は、再発し、ＣＮＳ関連の髓外疾病もあり、且つ脳
脊髄液（ＣＳＦ）の腫瘤負荷が８．９６％であった。２０１７年８月、患者３は、鞘内の
化学治療の後でＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ治療を接受し、３級のＣＲＳ及び神経毒性を経過
した後でＣＭＲに達した。２０１７年１２月及び２０１８年１月に、患者３は、自然致死
細胞治療を５回受けた。２０１８年３月、患者３は、予防対策として、別の種類のＣＤ１
９  ｍＣＡＲ-Ｔを受けた（この場合、患者は再発しなかった）。４月の下旬に、２回目
のｍＣＡＲ-Ｔ治療後の２９日目、患者は、再発し、且つＣＳＦ及び骨髄のそれぞれに６
６．１３％及び０．０２％の受容体由来のリンパ細胞があった（形態的評価による）。再
発が単に偶然であったか、又はその後のマウスＣＡＲ-Ｔ治療が再発を促進したかは、ま
だ不明であった。６月、患者３は、鞘内の化学治療及びリンパ細胞除去調理の後でＣＤ１
９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療を受けた。第５日目、患者は、１級ＣＲＳを経過した。１５日目
、ＢＭ、ＰＢ及びＣＮＳにＣＭＲ（ＭＲＤ-）を達成した（表１〜２）。６３日目、患者
は、再発し、ＣＮＳ関連の髓外疾病もあり、父親をドナーとしてもう一回半合致ＨＳＣ移
植を受けた。
【０２０３】
患者４は、女性で、２０１８年に１４歳であり、２０１６年にＢ-ＡＬＬに診断された
。彼女は、２０１６年７月に第１回の化学治療を受けた後でＣＲに達したが、１ヶ月内で
再発し、且つその後で化学治療によっても治愈されにくかった。患者４は、２０１６年１
１月にＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ治療を受けてＣＲに達した。２０１７年１月、患者は、姉
をドナーとしてＨＬＡ相合のＨＳＣ移植を行った。２０１８年８月、彼女は、再発し２０
１８年９月にＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療を受けた（表１〜２）。明細書を作成する場
合、この患者は、依然としてＣＭＲを保持していた。
【０２０４】
患者５は、女性で、２０１８年に２１歳であり、２０１６年にＢ-ＡＬＬに診断された
。患者４と同様に、患者５は、２０１６年７月に化学治療を受け、ＣＲに達したが、約１
ヶ月内に再発した。患者５は、その後でも化学治療によって治愈されにくく、２０１７年
６月にＣＤ１９  ｍＣＡＲ-Ｔ治療を受けた。治療後の４３日目、患者がＣＲに達してい
ないと評価され、その日に２回目のｍＣＡＲ-Ｔ治療を受けて（４３日目）、ＣＲに達し
た。２０１７年９月、患者５は、父親をドナーとして半合致ＨＳＣ移植を受けた。２０１
８年９月、彼女は、再発し、２０１８年１０月にＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療を受けた
。この患者は、この論文の作成時にもＣＭＲを保持していた（表１〜２）。
【０２０５】
ｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞を注入された３週間内に、全ての５名の患者のＰＢにもｈｓＣＡＲ-
Ｔ細胞の異なるレベルの増加が検出された（図１３Ａ〜１３Ｄ）。そのため、患者１及び
ＣＭＲに達した患者３において、ＰＢにおけるＢ細胞の数及び比例が３０日目にもゼロに
近似していた。ＣＲに達していなかった患者２において、Ｂ細胞が２０日目後に検出され
た（図１８Ａ〜１８Ｃ）。患者４において、Ｂ細胞が３０日目後に検出された（図１８Ｄ
）。患者５については、ｈｓＣＡＲ-Ｔ処理された後で２ヶ月に、Ｂ細胞の比例が依然と
してゼロに近似していた（図１８Ｅ）。ＰＢにおけるサイトカイン濃度を測定して図１３
Ｅ〜１３Ｌに示した。患者１及び３の血清にＩＬ-２、ＩＬ-６、ｓＣＤ２５及びＴＮＦ-
αレベルの激増が検出されたが、患者２の血清に検出されなかった。患者４及び５にもＩ
Ｌ-６の激増が検出された。
【０２０６】
更に、ｈｓＣＡＲ-ＴとｍＣＡＲ-Ｔにより処理されたＣＡＲ-Ｔ細胞の増加及びサイト
カインレベルを比較した（図１４及び図１９）。患者１は、体重１ｋｇあたり０．３×１
０６のｍＣＡＲ-Ｔ及び１×１０６体重１ｋｇあたりのｈｓＣＡＲ-Ｔを受けた。ｍＣＡＲ
-Ｔ及びｈｓＣＡＲ-Ｔにより処理される前に、ＢＭにおける腫瘤負荷がそれぞれ５．０４
％及び４．００％であった。ＰＢにおけるＣＡＲ-Ｔ細胞の比例は、ｍＣＡＲ-Ｔ治療後の
３日目に最大値０．５％に達し、ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療後の１１日目に最大値６１％に達し
た（図１４Ａ）。１００μｌのＰＢにおけるＣＡＲ-Ｔ細胞の数は、ｍＣＡＲ-Ｔ治療後の
１１日目に最大値４３に達し、ｈｓＣＡＲ-Ｔ処理後の１５日目に最大値１５０００に達
した（図１４Ｂ）。患者２は、２回のｍＣＡＲ-Ｔ及び１回のｈｓＣＡＲ-Ｔ注入を受け、
且つ３回の分量が同じであり何れも０．３×１０６体重１ｋｇあたりであった。３回の注
入において、毎回の注入前に、ＢＭにおける腫瘤負荷がそれぞれ０．４３％、０．５０％
及び４６．８％であった。１回目のｍＣＡＲ-Ｔ注入後の１１日目に、ＰＢにおけるＣＡ
Ｒ-Ｔ細胞の比例が最大値６．３６％に達し、且つ２回目のｍＣＡＲ-Ｔ注入後にゼロに近
似するように保持した（図１４Ｃ）。それに対して、その後のｈｓＣＡＲ-Ｔ治療後、こ
の比例は、１５日目に７９．６４％に達した。１回目のｍＣＡＲ-Ｔ注入後の１１日目、
１００μｌのＰＢにおけるＣＡＲ-Ｔ細胞の数が最大値６９３に達し、ｈｓＣＡＲ-Ｔ注入
後の１５日目に最大値２６８００に達した（図１４Ｄ）。ほんのわずかなｍＣＡＲ-Ｔ細
胞が２回目のｍＣＡＲ-Ｔ注入後で検出された。患者３については、ＣＡＲ-Ｔ増加のピー
ク値が２回目のｍＣＡＲ-Ｔ注入後（７日）に現れ、１回目のｍＣＡＲ-Ｔ注入後（１１日
）よりも早かった（図１４Ｅ及び１４Ｆ）。２回のｍＣＡＲ-Ｔ処理に比べると、ｈｓＣ
ＡＲ-Ｔ細胞のピーク値がより高かった（１７．９６％と４．４５％及び３．８５％、図
１４Ｅ；６６９０／１００μｌと２２８０／１００μｌ及び３０７０／１００μｌ、図１
４Ｆ）。患者４及び５の何れも、ＨＳＣ移植前にｍＣＡＲ-Ｔ治療を受けて、その後でｈ
ｓＣＡＲ-Ｔ治療を受けた。患者４については、ＰＢにおけるＣＡＲ-Ｔ細胞の百分率及び
１００μｌのＰＢにおけるＣＡＲ-Ｔ細胞の数は、ｍＣＡＲ-Ｔ及びｈｓＣＡＲ-Ｔにより
処理された後で相当であった（図１４Ｇ及び１４Ｈ）。ｍＣＡＲ-Ｔ治療に比べると、患
者５は、ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療後でより高いＣＡＲ-Ｔの増加程度を示した（図１４Ｉ及び１
４Ｊ）。
【０２０７】
毎回の治療後の５名の患者の血清におけるサイトカインレベルを図１９Ａ〜１９Ｔに示
した。患者１については、ｍＣＡＲ-Ｔ治療及び再発後に、ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療によりも炎
症性サイトカインの応答が起こされ、例えばＩＬ-６及びＩＦＮ-γの通り（図１９Ａ及び
１９Ｆ）、且つ抗炎症性サイトカインＩＬ-１０のレベルが低かった（図１９Ｋ）。患者
２については、２回目のｍＣＡＲ-Ｔ治療によりＩＬ-６及びＩＬ-１０の激増が起こされ
た。ｍＣＡＲ-Ｔの結果に比べると、ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療により、ＩＦＮ-γのより高い発
現が起こされた。２回目のｍＣＡＲ-Ｔ治療後、患者２にはｓＣＤ２５のデータがなかっ
た（図１９Ｂ、１９Ｇ、１９Ｌ及び１９Ｑ）。患者３については、２回目のｍＣＡＲ-Ｔ
注入後、ＣＡＲ-Ｔ細胞が既にある程度まで拡張したようであるが（図１４Ｅ及び１４Ｆ
）、１回目のｍＣＡＲ処理後に比べると、炎症性サイトカインの反応が抑制された。しか
しながら、２回のｍＣＡＲ-Ｔ処理後、ｈｓＣＡＲ-Ｔ処理により、炎症性サイトカインの
応答が起こされ（図１９Ｃ及び１９Ｈ）、抗炎症性サイトカインＩＬ-１０のレベルを低
下させた（図１９Ｍ）。患者４及び５において、ｈｓＣＡＲ-Ｔにより処理された炎症性
サイトカインＩＬ-６及びＩＦＮ-γの何れのレベルもそのｍＣＡＲ-Ｔ処理後より低かっ
た（図１９Ｄ、１９Ｉ、１９Ｅ及び１９Ｊ）のは、ＨＳＣ移植後の造血系の次善再建（表
３）により引き起こされる可能性があった。ＨＳＣ移植後造血系の次善再建が後でサイト
カイン応答に影響を与える可能性があった。
【０２０８】
表３  患者４及び５におけるＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療前のＰＢにおける免疫細胞の
調査
2019126343.tif 000023
【０２０９】
患者２及び３については、２回目のマウスＣＡＲ-Ｔ治療後の効果低下の原因の１つは
、患者にマウスｓｃＦｖ配列を識別する抗体が発生した可能性があった。この仮設を検証
するために、５名の患者（図１５Ａ及び１５Ｂ）及び３名の健康な対照者から分離した血
清を分析した（図１５Ｃ）。ｈｓＣＡＲ-Ｔ処理の前及びその後で、血清のマウス及びヒ
トＣＤ１９  ＣＡＲの細胞外ドメインに対する反応をテストした。マウスＣＤ１９  ＣＡ
Ｒ-Ｔ細胞治療を受けた患者１〜３は、マウスＣＡＲに対するＩｇＡ陽性反応を示した。
ｈｓＣＡＲ-Ｔで処理された後で、３名の患者の血清の何れにもヒトＣＡＲに対して反応
性を持つ免疫グロブリンが検出されなかった（図１５Ａ）。同じように、患者４及び５か
らの血清にはヒトＣＡＲに対して反応性を持つ免疫グロブリンが検出されず（図１５Ｂ）
、ＨＳＣ移植の前に利用可能な血液サンプルはなかった。表４に、各患者からのマウス及
びヒトＣＤ１９  ＣＡＲに対する反応性データを列記した。
【０２１０】
表４  ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療前後の患者の血清の抗ＣＡＲ反応
2019126343.tif 000024
【０２１１】
備考：ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療の前に、患者１〜３は、マウスのＣＤ１９  ＣＡ
Ｒ-Ｔ治療を少なくとも１回受けた。患者４及び患者５は、ＨＳＣ移植後でＣＤ１９  ｈ
ｓＣＡＲ-Ｔ治療を受けた。ＨＣ１及びＨＣ２は、健康ドナーであり、陰性対照とされた
。
【０２１２】
抑制作用を更に証明するために、患者１〜３からのＴ細胞をマウスＣＡＲ又はｈｓＣＡ
Ｒで感染させて、患者の血清があり又はない場合に、白血病Ｒａｊｉ細胞系と共に異なる
Ｅ／Ｔ比例で共培養して、細胞毒性をテストした。１つの実験群において、免疫グロブリ
ンの作用を遮断するために、タンパクＧと血清を合わせて加えた（図１５Ｄ〜１５Ｆ）。
ｍＣＡＲ-Ｔ細胞の細胞毒性機能が患者の血清により抑制され、蛋白Ｇとの培養によって
抑制作用を逆転することができた。それに対して、ｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞の細胞毒性は、患
者の血清により抑制されなかった（図１５Ｄ〜１５Ｆ）。
【０２１３】
現在のＣＡＲ-Ｔ生産過程に関わる問題として、ＣＡＲ変換の及び未変換のＴ細胞の何
れも増加した。この問題を解決するために、選択的ＣＤ１９  ＣＡＲを開発した。被覆さ
れたＳｍＡｂにより活性化された後で、最終生成物におけるＣＡＲ変換のＴ細胞が３２．
２％から６４．３％まで増加し（図１０Ｈ）、百分率がほぼ倍になった。１４日目の合計
ＣＤ３+Ｔ細胞の収率も明らかにより高くなり、ＳｍＡｂで刺激されると約８０倍の増加
に達するが、ＳｍＡｂで刺激されないと約６０倍の増加に達することができた（図１０Ｆ
）。論理的に、ｈｓＣＡＲ変換のＴ細胞を、ビーズ結合のＳｍＡｂによって磁選で更に純
化することができ、このような方法はＣＡＲ陰性Ｔ細胞が効果に影響を与えるかを確認す
ることに用いられてよかった。また、患者体内に注入した後で、臨床レベルのＳｍＡｂを
注射することでｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞の活性を調節／修飾してよい。選択的ＣＡＲの別のメ
リットは、増加段階にＳｍＡｂで刺激することで、Ｔ細胞サブグループの組成を再構成で
きるので、生産物におけるＴｃｍの比例がより高くなった。従来の研究によると、ＧＤ２
ＣＡＲ-Ｔ細胞の持久性が最終生成物におけるＴｃｍの百分率と一致であることが判明
された。我々の研究において、ＳｍＡｂで刺激されたｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞で処理された白
血病マウスモデルは、他の群よりも長い生存時間を有するので（図１２Ｃ及び１２Ｄ）、
ｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞に関する抗腫瘤の改善効果ことが判明された。５名の患者の最終生成
物におけるＣＤ４／ＣＤ８の比率も測定されて表５に示された。各個体の各々の最終生成
物の間のＣＤ４／ＣＤ８の比率に大きいな差異があるようであった。
【０２１４】
表５  ５名の患者の最終生成物に対するサブグループ分析
2019126343.tif 000025
【０２１５】
備考：ＦＰ：最終生成物；ＯＯＬ：検出限界を超える。
【０２１６】
現在のＣＡＲ設計の別の主な改良特徴は、ヒト化ｓｃＦｖ配列であった。マウス対応物
に比べると、このｈｓＣＡＲのＣＤ１９に対する親和力が６倍高かった。他のゼミナール
によりも、ヒト化ＣＤ１９  ＣＡＲの設計が報告されたが、その親和力がマウス対応物に
相当であり、且つ臨床結果が示されなかった。飽和した細胞毒性作用を引き起こす高いＥ
／Ｔ比率で、高い親和力を持つｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞及び低い親和力を持つｍＣＡＲ-Ｔ細胞
は、相当な抗腫瘤細胞毒性を示した。低いＥ／Ｔ比率で、ｈｓＣＡＲ-Ｔ細胞は、より良
好な細胞毒性を表現した（図１１Ａ）。高注入分量を許さない条件で、強化された親和力
が特に有用である可能性があり、例えば、患者の厳しい副作用を避けることができた。Ｓ
ｍＡｂで刺激されなかったｍＣＡＲ-Ｔ群とｈｓＣＡＲ-Ｔ群の動物実験に相当な効果が観
察されたのは、体内の飽和したＣＡＲ-Ｔ細胞分量により引き起こされる可能性があった
（図１２Ｄ）。また、ヒト化ＣＡＲ-Ｔ細胞でヒト白血病Ｒａｊｉ細胞を殺す微環境のは
、マウスとヒトとの間で異なるものであった。マウスＣＡＲよりも、マウス環境で、それ
らの機能を達成するには、ヒト化ＣＡＲが好ましくないかもしれなかった。
【０２１７】
ヒト化ＣＡＲ-Ｔ細胞は、マウスＣＡＲ-Ｔ細胞を繰り返して注入された後で、マウスｓ
ｃＦｖ免疫識別による障壁を打ち破る可能性があった。今まで、全ての他の報告のＣＤ１
９  ＣＡＲ-Ｔ臨床試験にもマウスｓｃＦｖ  ＣＡＲが使用された。Ｋｙｍｒｉａｈ及び
Ｙｅｓｃａｒｔａの、ＦＤＡにより批准される２つの生成物も、マウスｓｃＦｖであった
。ＣＡＲ-Ｔ療法とａｌｌｏ-ＨＳＣ移植とを合わせて使用しても、数多くの患者が最終的
に再発した。このような治療を受ける患者が多くなることにつれて、マウスＣＡＲ-Ｔ治
療を受けた後でＣＤ１９+白血病細胞が再発する患者を治療するために、新しい介入手段
が至急に所望されていた。この研究において、５名の高度に治療された難治／再発のＢ-
ＡＬＬ患者を募集し、それらが利用可能な全ての選択を尽くし、且つ異なる複雑状況を表
すことができた。患者２及び３の何れも２回のｍＣＡＲ-Ｔ治療を受けた。２回目のｍＣ
ＡＲ-Ｔ治療の後で、ｍＣＡＲ-Ｔ細胞が患者２において増加しなかった（図１４Ｃ及び１
４Ｄ）。患者３におけるｍＣＡＲ-Ｔ細胞は、２回目のｍＣＡＲ-Ｔ治療の後で、一定の程
度まで増加した（図１４Ｅ及び１４Ｆ）が、炎症性サイトカインの応答をトリガーするこ
ともないし（図１９Ｃ及び１９Ｈ）、ＰＢにおけるＢ細胞百分率に影響を与えることもな
かった（図１８Ｃ）。３名の患者からの血清に対する分析によると、ＣＤ１９  ｍＣＡＲ
の胞外ドメインに対して反応性を持つＩｇＡがあることが示された（図１５Ａ）。患者の
血清に抑制成分があり、ｍＣＡＲ-Ｔ細胞の細胞毒性作用を低下させることができ（図１
５Ｄ〜１５Ｆ）、且つ蛋白Ｇを添加することで免疫グロブリンを低下させて、抑制作用を
逆転することができる（図１５Ｄ〜１５Ｆ）ことも更に証明された。移植前の血液サンプ
ルが利用不能であるので、患者４及び５がＨＳＣ移植前にマウスＣＡＲに対する抗体を発
生させるかは分からなかった。たとえ有しても、ＨＳＣ移植過程も、受容体におけるこれ
らの抗体のＢ細胞クローンの発生をなくして、ドナー遺伝子型の細胞によって造血系を再
建した。患者４及び５の病例によると、早期の治療系の選択として、ｍＣＡＲ-Ｔの代わ
りにｈｓＣＡＲ-Ｔを使用してもよいことが判明された。ｈｓＣＡＲ-ＴとｍＣＡＲ-Ｔと
の効果を比較するには、より多くな患者群体で単独して研究する必要があった。全ての５
名の患者の血清の何れにもｈｓＣＡＲに対して反応性を持つ抗体が検出されなかったので
、ｈｓＣＡＲ-Ｔを患者に繰り返して与えて効果を保持することができることが判明され
た。しかしながら、更に工夫してこの点をテストする必要があった。
【０２１８】
この５名の患者は、各種の複雑な状況を代表した。患者２及び５は、複雑な染色体を表
現した。患者３は、フィラデルフィア染色体及びＣＮＳ関連にかかった。全ての上記要素
が常規治療の不良予後に関わった。患者１及び２は、ＨＳＣ移植をしなかった。患者３は
、マウスＣＡＲ-Ｔ治療の前にＨＳＣ移植を行った。患者４及び５は、ＨＳＣ移植とマウ
スＣＡＲ-Ｔの結合療法を受けた。患者３、４及び５については、健康なＨＳＣドナーの
ＰＢＭＣを使用してＣＡＲ-Ｔ細胞を発生させ、且つ移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の症状
が観察されなかった。その結果、ＣＤ１９  ｈｓＣＡＲ-Ｔは、Ｂ細胞悪性腫瘤に関わる
状況に広く使用されることができることが判明された。
【０２１９】
また注意すべきな結果として、５名の患者は、ｈｓＣＡＲ-Ｔ治療の後で、何れも非常
に軽微な副作用を表現するが、単にしばらく熱が出るだけで、且つすぐに回復した。全て
の５名の患者のＣＲＳが１級だけであった。軽微な副作用は、結合域の親和力が高く及び
／又はＣＡＲのヒト化性質による可能性があった。
【０２２０】
つまり、抗原結合親和力、生産物の収率、純度及び体外抗腫瘤の効果について言えば、
ヒト化選択的ＣＤ１９  ＣＡＲは、そのマウス対応物より優れた。高度治療患者の結果に
よると、ｈｓＣＡＲ-Ｔ療法は、マウスＣＡＲ-Ｔ療法を経過して再発する患者を効果的に
治療することができることが証明された。
【０２２１】
本発明の言及した全ての文献は、毎編の文献が参照として単独して引証されるように、
本出願において参照として引証される。なお、本発明の上記講義内容を読んだ後で、当業
者が本発明に様々な変更や修正を加えてよく、これらの等価の形態が同様に本出願に添付
する特許請求の範囲により限定された範囲にあることは、理解すべきである。
【０２２２】
遺伝配列リスト
<110>  Xuanwu Hospital Of Capital Medical University
<120>  CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR FOR EFFICIENT SELECTIVE PROLIFERATION IN VITRO 
AND USES THEREOF
<130>
<160>  14
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  63
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  1
atggcgctgc cggtgaccgc gctgctgctg ccgctggcgc tgctgctgca tgcggcgcgt       60
ccg                                                                     63
<210>  2
<211>  207
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  2
accaccaccc cggcgccgcg tccgccgacc ccggcgccga ccattgcgag ccagccgctg       60
agcctgcgtc cggaagcgtg ccgtccggcg gcgggcggcg cggtgcatac ccgtggcctg      120
gattttgcgt gcgatattta tatttgggcg ccgctggcgg gcacctgcgg cgtgctgctg      180
ctgagcctgg tgattaccct gtattgc                                          207
<210>  3
<211>  462
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  3
aaacgtggcc gtaaaaaact gctgtatatt tttaaacagc cgtttatgcg tccggtgcag       60
accacccagg aagaagatgg ctgcagctgc cgttttccgg aagaagaaga aggcggctgc      120
gaactgcgtg tgaaatttag ccgtagcgcg gatgcgccgg cgtataaaca gggccagaac      180
cagctgtata acgaactgaa cctgggccgt cgtgaagaat atgatgtgct ggataaacgt      240
cgtggccgtg atccggaaat gggcggcaaa ccgcgtcgta aaaacccgca ggaaggcctg      300
tataacgaac tgcagaaaga taaaatggcg gaagcgtata gcgaaattgg catgaaaggc      360
gaacgtcgtc gtggcaaagg ccatgatggc ctgtatcagg gcctgagcac cgcgaccaaa      420
gatacctatg atgcgctgca tatgcaggcg ctgccgccgc gt                         462
<210>  4
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  4
aaaccgctgc cggaagtgac cgatgaatat                                        30
<210>  5
<211>  372
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  5
caggtgcagc tgcagcagag cggcgcggaa ctggtgcgtc cgggcagcag cgtgaaaatt       60
agctgcaaag cgagcggcta tgcgtttagc agctattgga tgaactgggt gaaacagcgt      120
ccgggccagg gcctggaatg gattggccag atttggccgg gcgatggcga taccaactat      180
aacggcaaat ttaaaggcaa agcgaccctg accgcggatg aaagcagcag caccgcgtat      240
atgcagctga gcagcctggc gagcgaagat agcgcggtgt atttttgcgc gcgtcgtgaa      300
accaccaccg tgggccgtta ttattatgcg atggattatt ggggccaggg caccaccgtg      360
accgtgagca gc                                                          372
<210>  6
<211>  333
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  6
gatattcagc tgacccagag cccggcgagc ctggcggtga gcctgggcca gcgtgcgacc       60
attagctgca aagcgagcca gagcgtggat tatgatggcg atagctatct gaactggtat      120
cagcagattc cgggccagcc gccgaaactg ctgatttatg atgcgagcaa cctggtgagc      180
ggcattccgc cgcgttttag cggcagcggc agcggcaccg attttaccct gaacattcat      240
ccggtggaaa aagtggatgc ggcgacctat cattgccagc agagcaccga agatccgtgg      300
acctttggcg gcggcaccaa actggaaatt aaa                                   333
<210>  7
<211>  1500
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  7
atggctctgc cagtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgcagctaga       60
ccccaggtgc agctgcagca gtcaggagca gaactcgtga gaccaggcag cagcgtgaag      120
atctcttgca aggccagcgg ctacgccttc tctagctatt ggatgaattg ggtgaagcag      180
cggccaggac agggactgga gtggattgga cagatttggc ccggcgacgg cgataccaac      240
tacaacggca agttcaaggg caaggccacc ctgacagccg acgagtctag cagcacagcc      300
tacatgcagc tgagctctct ggccagcgag gatagcgccg tgtacttttg cgccagaagg      360
gagaccacaa cagtgggccg gtactactac gccatggact attggggcca gggcacaacc      420
gtgacagtgt ctagcggagg aggcggctct aagcctctgc cagaagtgac agacgagtac      480
ggcggaggag gaagcgacat ccagctgacc cagagcccag cttctctggc agtgtctctg      540
ggacagaggg ctaccatctc ttgcaaggcc agccagagcg tggattacga cggcgacagc      600
tacctgaatt ggtatcagca gatccccggc cagcctccta agctgctgat ctacgacgcc      660
tccaacctgg tgtccggcat ccctcccaga ttcagcggaa gcggcagcgg cacagacttc      720
accctgaaca tccaccccgt ggagaaggtg gacgccgcca cataccattg ccagcagagc      780
acagaggacc cctggacctt tggcggcgga acaaagctgg agatcaagac aaccacccca      840
gcccctagac ctcctacacc agcccctaca atcgcctctc agcctctgag cctgaggcca      900
gaagcttgta gacccgcagc aggaggagca gtgcatacaa ggggcctgga cttcgcttgc      960
gacatctaca tttgggcccc tctggcagga acttgcggag tgctgctgct gtctctggtc     1020
atcaccctgt attgcaagcg gggccggaag aagctgctgt acatcttcaa gcagcccttc     1080
atgcggccag tgcagacaac acaggaggag gacggttgca gctgcagatt cccagaggag     1140
gaggaaggcg gctgcgagct gagagtgaag ttcagcagga gcgccgacgc tccagcctat     1200
aaacagggac agaaccagct gtacaacgag ctgaacctgg gcagaagaga ggagtacgac     1260
gtgctggaca agaggagagg cagagaccca gagatgggcg gcaagcctag aaggaagaac     1320
ccccaggagg gcctgtacaa cgagctgcag aaggacaaga tggccgaggc ttacagcgag     1380
atcggcatga agggcgagag gagaagaggc aaaggccacg acggactgta tcagggactg     1440
agcacagcca ccaaggacac ctacgacgct ctgcacatgc aggctctgcc tcctagataa     1500
<210>  8
<211>  499
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  8
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
20                  25                  30
Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35                  40                  45
Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser
85                  90                  95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser 
100                 105                 110
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr
115                 120                 125
Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Pro Leu Pro Glu Val Thr Asp Glu Tyr 
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu 
165                 170                 175
Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln
180                 185                 190
Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile
195                 200                 205
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val
210                 215                 220
Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
225                 230                 235                 240
Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His
245                 250                 255
Cys Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 
260                 265                 270
Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 
275                 280                 285
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
290                 295                 300
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 
305                 310                 315                 320
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
325                 330                 335
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
340                 345                 350
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
355                 360                 365
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
370                 375                 380
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
405                 410                 415
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
420                 425                 430
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 
435                 440                 445
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
450                 455                 460
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 
465                 470                 475                 480
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
485                 490                 495
Pro Pro Arg
<210>  9
<211>  263
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu 
20                  25                  30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln 
35                  40                  45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr 
50                  55                  60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro 
65                  70                  75                  80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85                  90                  95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100                 105                 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130                 135                 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145                 150                 155                 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly 
165                 170                 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180                 185                 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195                 200                 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210                 215                 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys 
225                 230                 235                 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245                 250                 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
260
<210>  10
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10
<210>  11
<211>  15
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  11
ggcggcggcg gcagc                                                        15
<210>  12
<211>  497
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  12
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 
20                  25                  30
Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35                  40                  45
Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn 
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser 
85                  90                  95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser
100                 105                 110
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr 
115                 120                 125
Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly 
145                 150                 155                 160
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val
165                 170                 175
Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val
180                 185                 190
Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly
195                 200                 205
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly
210                 215                 220
Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 
225                 230                 235                 240
Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln 
245                 250                 255
Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
260                 265                 270
Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
275                 280                 285
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 
290                 295                 300
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
305                 310                 315                 320
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
325                 330                 335
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 
340                 345                 350
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
355                 360                 365
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 
370                 375                 380
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
385                 390                 395                 400
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
405                 410                 415
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 
420                 425                 430
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
435                 440                 445
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
450                 455                 460
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
465                 470                 475                 480
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 
485                 490                 495
Arg
<210>  13
<211>  498
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  13
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
20                  25                  30
Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 
35                  40                  45
Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser
85                  90                  95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser
100                 105                 110
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr
115                 120                 125
Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 
130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly 
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
165                 170                 175
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser
180                 185                 190
Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro 
195                 200                 205
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser 
210                 215                 220
Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
225                 230                 235                 240
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys
245                 250                 255
Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
260                 265                 270
Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 
275                 280                 285
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
290                 295                 300
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 
305                 310                 315                 320
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
325                 330                 335
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
340                 345                 350
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
355                 360                 365
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
370                 375                 380
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 
405                 410                 415
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 
420                 425                 430
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 
435                 440                 445
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 
450                 455                 460
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
465                 470                 475                 480
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
485                 490                 495
Pro Arg
<210>  14
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  14
tggagccatc cgcagtttga aaaa                                              24
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2019126343.tif 000037
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【図１３Ｌ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2019126343.tif 000095
【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
2019126343.tif 000099
【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
2019126343.tif 000109
【図１９Ｈ】
2019126343.tif 000110
【図１９Ｉ】
2019126343.tif 000111
【図１９Ｊ】
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【図１９Ｋ】
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【図１９Ｌ】
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【図１９Ｍ】
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【図１９Ｎ】
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【図１９Ｏ】
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【図１９Ｐ】
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【図１９Ｑ】
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【図１９Ｒ】
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【図１９Ｓ】
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【図１９Ｔ】
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【外国語明細書】
2019126343000001.pdf