(57)【要約】      （修正有）【課題】欠点がより少ないＨＰＶに対する治療ワクチンの提供。【解決手段】ＨＰＶ１８および／またはＨＰＶ１６に対する治療ワクチンとして使用可能なデザイナー核酸構築物およびポリペプチドを提供する。さらに、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ２タンパク質の少なくとも１つのエピトープを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする核酸分子
。
【請求項２】
前記第１のポリペプチドがヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ２タンパク質の少なく
とも１つのエピトープをさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記第１のポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン内に欠失または突然変異を有するおよ
び／またはトランス活性化ドメイン内に突然変異を有するＨＰＶ１８  Ｅ２タンパク質を
含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記第１のポリペプチドが配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の核酸
分子。
【請求項５】
配列番号２１を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
配列番号２３を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記第１のポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結された、請
求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
組換えアデノウイルスである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記プロモーターが、リプレッサー・オペレーター配列に作動可能に結合され、リプレ
ッサータンパク質は、前記リプレッサータンパク質の存在下での前記プロモーターの発現
を抑制するため、それに結合することができる、請求項７または８に記載のベクター。
【請求項１０】
プロモーターに作動可能に連結された第２のポリペプチドをコードする核酸をさらに含
み、前記第２のポリペプチドは配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項７〜９
のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
前記第２のポリペプチドが配列番号３または配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む
、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記第１のポリペプチドが配列番号２２のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチ
ドが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を
含むワクチン組成物。
【請求項１４】
（ａ）請求項７〜９のいずれか一項に記載の第１のベクター、
（ｂ）プロモーターに作動可能に連結された第２のポリペプチドをコードする核酸を含
み、前記第２のポリペプチドは配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、第２のベクタ
ー、および
（ｃ）薬学的に許容できる賦形剤
を含む、ワクチン組成物。
【請求項１５】
前記第２のポリペプチドが配列番号３または配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む
、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記第１のベクター上にコードされる前記第１のポリペプチドが、配列番号２２のアミ
ノ酸配列を含み、前記第２のベクター上にコードされる前記第２のポリペプチドが、配列
番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
対象におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導するための、請求項１３〜１６のいずれか
一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記対象に２回以上投与される、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
対象におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導するための組合せ物であって、
（ａ）請求項７〜９のいずれか一項に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤
を含む、第１のワクチン組成物、および
（ｂ）プロモーターに作動可能に連結された第２のポリペプチドをコードする核酸を含み
、前記第２のポリペプチドは配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、ベクターを含む
、第２のワクチン組成物
を含む、組合せ物。
【請求項２０】
前記第２のポリペプチドが配列番号３または配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む
、請求項１９に記載の組合せ物。
【請求項２１】
前記第１のワクチン組成物においてコードされる前記第１のポリペプチドが、配列番号
２２のアミノ酸配列を含み、前記第２のワクチン組成物においてコードされる前記第２の
ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の組合せ物。
【請求項２２】
前記第１および第２のワクチン組成物が前記対象に２回以上投与される
請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組合せ物。
【請求項２３】
対象における、持続性ＨＰＶ感染、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（
ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸がん（子宮頸
部扁平上皮がん（ＳＣＣ）など）、中咽頭がん、陰茎がん、膣がんまたは肛門がんを治療
するための、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
（ａ）請求項７〜９のいずれか一項に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形
剤を含む、第１のワクチン組成物、および
（ｂ）プロモーターに作動可能に連結された第２のポリペプチドをコードする核酸を含
み、前記第２のポリペプチドは配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、ベクターを含
む、第２のワクチン組成物
を含む、パーツキット。
【請求項２５】
前記第２のポリペプチドが配列番号３または配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む
、請求項２４に記載のパーツキット。
【請求項２６】
前記第１のワクチン組成物においてコードされる前記第１のポリペプチドが、配列番号
２２のアミノ酸配列を含み、前記第２のワクチン組成物においてコードされる前記第２の
ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のパーツキット。
【請求項２７】
配列番号２０を含むポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号２２を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬の分野、またより特別にはヒトパピローマウイルス１８型、および／また
は１６型に対する治療ワクチン中で使用可能な核酸構築物およびポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のファミリーは、皮膚または粘膜のケラチノサイト
に感染することが可能な１００を超える型（サブタイプとも称される）からなる。ＨＰＶ
の４０を超える型が典型的には性交渉を介して感染し、男女双方において肛門性器領域の
ＨＰＶ感染は極めて一般的である。一部の性感染性ＨＰＶ型は、性器疣贅を引き起こし得
る。「高リスク」ＨＰＶ型（例えば、１６、１８、３１、４５型）（皮膚疣贅を引き起こ
すものと異なる）を伴う持続性感染は、例えば、頸部、外陰部、腟、陰茎、中咽頭および
肛門の前癌性病変および浸潤性がんに進行し得る。ＨＰＶ感染の大半は、感染後１〜２年
以内に自発的に除去される。健常者では、ＨＰＶ−１６のウイルス初期タンパク質Ｅ２、
Ｅ６およびＥ７に特異的な循環性Ｔｈ１型およびＴｈ２型ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにＥ６
に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が抗原負荷時に皮膚に遊走し、これはＨＰＶ−１６感染に対す
る奏効的防御が一般にこれらのウイルス初期抗原に対する全身性エフェクターＴ細胞応答
に関連することを示す。感染個体の少数派（約１％）では、ＨＰＶ感染は持続し、最終的
に性器腫瘍性病変をもたらす。高リスクＨＰＶの中のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は、子
宮頸がんの主因であり、共に症例の約７０％を引き起こし、またこれら２つの型はまた、
肛門がんおよび中咽頭がんなどの他のＨＰＶ誘発がんにおいて主要な役割を果たす。世界
的に、ＨＰＶはがんを引き起こす最も重要な感染病原体の１つである。
【０００３】
ＨＰＶに対するワクチン接種は、ＨＰＶによる感染の発生率または効果を低下させるこ
とが可能な方法であると思われる（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｅｌｉｅｆ，
２０１１，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：２５２−２５７）。
【０００４】
ＨＰＶ１６型および１８型の（エンベロープ）タンパク質Ｌ１によって形成されるウイ
ルス様粒子（ＶＬＰ）に基づく予防用ＨＰＶワクチンは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に
よる持続性感染および関連疾患の予防において極めて効率的である。これらのワクチンは
、Ｌ１タンパク質に対する中和抗体の誘導を介して無菌免疫をもたらすと考えられる。追
加的な高リスクＨＰＶ型由来のＬ１に基づくＶＬＰの添加は、かかるワクチンによって与
えられる幅広い保護をさらに増強する場合がある。
【０００５】
しかし、かかるワクチンが初期感染を予防し得る（すなわちそれらが予防をもたらす）
一方、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８によって引き起こされる確立された性器病変に対する
有益な効果の証拠が存在しないことから、それらはＨＰＶに対する治療ワクチンと考えら
れない（Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＪＡＭＡ  ２９８：７４３−
５３）。
【０００６】
これらの予防ワクチンの導入にもかかわらず、多数の人々が、持続性の高リスクＨＰＶ
感染を既に受けているかまたは受けるリスクがさらにあり、それ故、がんを患うリスクが
ある。確立されたＨＰＶ感染および関連疾患の根絶のための治療ワクチンは、未だ対処さ
れていない緊急の医学的需要である。
【０００７】
この需要に対処するための幾つかの試みについては記載がなされている。例えば、種々
の異なるワクチン接種方法、例えば、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）由来の熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）およびＨＰＶ−１６  Ｅ
７からなる融合タンパク質またはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８に由来するＥ６、Ｅ７
およびＬ２からなる融合タンパク質、キメラＬ１−Ｅ７  ＶＬＰ、ＨＰＶ−１６およびＨ
ＰＶ−１８のＥ６およびＥ７またはウシパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉ
ｒｕｓ）Ｅ２のいずれかを発現する組換えワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉ
ｒｕｓ）、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８のＥ６およびＥ７のＣＴＬエピトープを発現
するＤＮＡワクチン、ＨＰＶ−１６  Ｅ７抗原を分泌する弱毒化生リステリア菌（Ｌｉｓ
ｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｌｍ）、ならびにＨＰＶ−１６  Ｅ６およ
びＥ７ペプチドを含む合成ロングペプチド（ＳＬＰ）を用いた臨床試験が実施されている
。これらの手法の一部が限定はされないが幾つかの臨床有効性を示す一方、大部分が奏功
しておらず、これは現行の方法の改善が必要であることを示している。
【０００８】
初期ＨＰＶタンパク質Ｅ６およびＥ７をコードする遺伝子の組込みは、感染からがんに
至る過程における必要なステップであり、子宮頸がん細胞の腫瘍性表現型の維持にとって
、Ｅ６およびＥ７の持続的発現が必要とされる。したがって、Ｅ６およびＥ７は、治療ワ
クチン接種にとっての良好な標的と考えられる。前述のように、一部の試験によると、高
リスクＨＰＶに感染した女性への治療ワクチン接種が既存の病変の退縮を誘導し得ること
が示されている。Ｋｅｎｔｅｒらは、治療ワクチンとしてＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タ
ンパク質に由来するＳＬＰおよびアジュバントを用いることで、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ
）を有する患者の４７％における持続的かつ完全な退縮を示した（Ｋｅｎｔｅｒ  ｅｔ  
ａｌ．，２００９，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：１８３８−４７）。同様に、タ
ンパク質に基づくワクチン（ＴＡ−ＣＩＮ、ＨＰＶ１６  Ｅ６、Ｅ７およびＬ２の融合タ
ンパク質からなる）をＶＩＮの２／３の患者における局所免疫調節と組み合わせた試験に
よると、患者の６３％において完全な退縮が示された（Ｄａａｙａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，
２０１０，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０２：１１２９−３６）。ワクチンとしての合成
ロングペプチドの考えられる欠点として、大規模での製造可能性およびそれに伴うコスト
、潜在的に反応源性を示すアジュバントに対する需要およびそれに伴う免疫に関連した有
害作用（特に疼痛および腫脹）が挙げられる。高レベルの不快感に起因し、自発的クリア
ランス速度が依然として高い場合、ＳＬＰが初期ステージの疾患において用いられる可能
性は高くない。同様に、ＴＡ−ＣＩＮ治療の場合での局所的なイミキモド治療に対する需
要に起因し、女性の大半がイミキモド治療の持続時間にかけて持続する局所性および全身
性副作用を経験し、それが日々の活動に影響し得ることから、耐容性は重要な課題である
。
【０００９】
考えられる代替案は、ワクチン接種用にＨＰＶ  Ｅ６および／またはＥ７タンパク質を
コードするＤＮＡワクチンまたはウイルスベクターワクチンなどの核酸に基づくワクチン
接種を用いることである。
【００１０】
しかし、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７タンパク質は、発がん可能性を有し、それ故にこれら
のタンパク質をコードする核酸を含むワクチンを用いるワクチン接種は、抗原の持続的発
現の可能性に起因して細胞形質転換を誘導するリスクを提起する。
【００１１】
したがって、遺伝子ワクチン接種の場合、ワクチン接種に起因する細胞形質転換の任意
のリスクを排除するため、Ｅ６および／またはＥ７の非発がん性／解毒化バージョンを用
いることができる。野生型Ｅ６およびＥ７の発がん可能性の低下は一般に、これらのタン
パク質の機能にとって重要であることが知られている残基の欠失および／または置換によ
って達成可能である（例えば、Ｓｍａｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ  ２８１：２３１−３８；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：
４３１−４０；Ｗｉｅｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔ
ｈｅｒ  １９：６６７−７４）。しかし、これらの手法の不利な点は、それらがタンパク
質から重要なＴ細胞エピトープを除去し、かつ／または新規の望ましくないＴ細胞エピト
ープをタンパク質に導入するというリスクを有し、それ故、所望される免疫応答をもたら
さない可能性があることである。
【００１２】
ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の発がん可能性を排除するための他の方法では、Ｅ６およ
びＥ７タンパク質の混合バージョン（すなわち、野生型タンパク質の断片が再整理された
（ｒｅ−ｏｒｄｅｒｅｄ）ポリペプチド）が構築されている（例えば、Ｏｅｌｓｃｈｌａ
ｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３；Ｏｏｓｔ
ｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：３９７−
４０６；Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｈｕｍ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ  
２３：１３０１−１２）。しかし、これらの手法の場合、Ｅ６およびＥ７タンパク質の双
方の考えられるあらゆるエピトープの包含を確保するための複数分子の作製、配合および
投与がさらに必要になり、最適以下のロジスティックスおよび比較的高いコストをもたら
し、さらに記載された方法はＥ６およびＥ７中に存在しない潜在的に強力な非天然エピト
ープを導入し、また免疫応答が関連のあるＥ６／Ｅ７エピトープからかかる非天然エピト
ープの方へ転用され得ることから、記載された構築物は最適な免疫学的特性を有しない可
能性がある。遺伝子アジュバントを内蔵し、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方のＥ６お
よびＥ７断片が混ざった細胞内標的化融合タンパク質を発現する治療用ＤＮＡワクチンも
記載されており、それでエレクトロポレーション強化免疫化することにより、ＣＩＮ３の
患者において有意なＥ６／Ｅ７特異的Ｔ細胞反応が誘発された（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，
２０１４）。
【００１３】
免疫原性構築物を作製するために記載されている別のアプローチは、いわゆるマルチエ
ピトープ構築物またはミニ遺伝子である（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４
８１０号明細書；Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｍｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，
２０１１；Ｍｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。これは目的のエピトープを包含する最
小のペプチドを生成することを目的とする。しかしながら、そのようなアプローチにおけ
る潜在的な欠点は、天然タンパク質のエピトープのサブセットのみが存在し、さらに典型
的には、目的のタンパク質には天然に存在しないスペーサー配列が導入されるということ
である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、当該技術分野では、ＨＰＶに対する治療ワクチン、好ましくは前述の手法
が有する欠点がより少ないことへの需要が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８腫瘍性タンパク質Ｅ６およびＥ７の本質的にす
べての可能なＴ細胞エピトープを含むにもかかわらず、再整理されているＥ６およびＥ７
タンパク質の断片を含む一方で、同時に望ましくない強力なネオエピトープは最少数有す
ることにより、（野生型Ｅ６およびＥ７と比べて）著しく低下した検出不能なまでの形質
転換活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。これは、他者によって
先行的に報告された分子と対照をなす。本発明は、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のいずれ
かに対する治療ワクチンにおいて使用可能な分子を提供する。そのような分子はまた、Ｈ
ＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方に対する治療ワクチンにおいて組み合わせられ得る。
【００１６】
ＨＰＶ１６に関する本発明は、配列番号１で示されるような配列を含むポリペプチドを
コードする核酸分子を提供する。ＨＰＶ１８に関する本発明は、配列番号２０で示される
ようなアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００１７】
コードされるポリペプチドは、リーダー配列をさらに含んでもよい。
【００１８】
特定の実施形態では、コードされるポリペプチドは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ
）Ｅ２タンパク質、例えばＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク質またはＨＰＶ１８  Ｅ２タンパク
質の少なくとも１つのエピトープをさらに含む。Ｅ２タンパク質は、例えばそのトランス
活性化および／またはＤＮＡ結合ドメイン、例えば欠失、突然変異またはタンパク質の他
の部分の構造的再編成によって不活性化されていてもよい。ＨＰＶ１６に関する特定の実
施形態では、コードされるポリペプチドは、配列番号３または配列番号５で示されるよう
な配列を含む。ＨＰＶ１８に関する特定の実施形態では、コードされるポリペプチドは、
配列番号２２で示されるような配列を含む。
【００１９】
特定の実施形態では、本核酸配列は、例えばヒト細胞内での発現のため、コドン最適化
される。
【００２０】
ＨＰＶ１６に関する特定の実施形態では、本核酸配列は、配列番号２、配列番号４、ま
たは配列番号６で示されるような配列を含む。ＨＰＶ１８に関する特定の実施形態では、
本核酸配列は、配列番号２１または配列番号２３で示されるような配列を含む。
【００２１】
本発明はまた、本発明に従う核酸分子を含むベクターを提供し、ここでポリペプチドを
コードする配列はプロモーターに作動可能に連結されている。
【００２２】
特定の実施形態では、ベクターは、プラスミドなどのＤＮＡベクターである。他の実施
形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えばＭＶＡベクターまたは組換えアデノウ
イルスベクターである。特定の好ましい実施形態では、ベクターは組換えアデノウイルス
である。
【００２３】
特定の実施形態では、ベクター中のプロモーターは、リプレッサー・オペレーター配列
に作動可能に結合され、リプレッサータンパク質は、前記リプレッサータンパク質の存在
下でのプロモーターの発現を抑制するため、それに結合することができる。特定の実施形
態では、リプレッサー・オペレーター配列は、ＴｅｔＯ配列またはＣｕＯ配列である。
【００２４】
本発明はまた、本発明に従うベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物を提供する。
【００２５】
本発明はまた、対象におけるＨＰＶ、特にＨＰＶ１６もしくはＨＰＶ１８、またはＨＰ
Ｖ１６およびＨＰＶ１８に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明に従うワクチ
ン組成物を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。本発明はまた、ＨＰＶ、特
にＨＰＶ１６もしくはＨＰＶ１８、またはＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に対する免疫応答
を誘導する中での使用を意図した本発明に従うワクチンを提供する。
【００２６】
特定の実施形態では、ワクチンは、対象に２回以上投与される。
【００２７】
本発明はまた、対象における持続性ＨＰＶ感染（特に持続性ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１
８感染）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（
ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸がん（子宮頸部扁平上皮がん（ＳＣＣ）
など、中咽頭がん、陰茎がん、膣がんまたは肛門がんのいずれかを治療するための方法で
あって、本発明に従うワクチンを対象に投与するステップを含む、方法を提供する。本発
明はまた、対象における持続性ＨＰＶ感染（特に持続性ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８感染
）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩ
Ｎ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸がん（子宮頸部扁平上皮がん（ＳＣＣ）など、
中咽頭がん、陰茎がん、膣がんまたは肛門がんのいずれかの治療における使用を意図した
本発明に従うワクチンを提供する。
【００２８】
ＨＰＶ１６に関する本発明はまた、配列番号１、配列番号３または配列番号５で示され
るような配列を含むポリペプチドを提供する。ＨＰＶ１８に関する本発明はまた、配列番
号２０または配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００２９】
本発明はまた、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８について上述したように、分子の組合せを
提供する。そのような分子は、単一組成物中で別個の分子として組み合わせられ得る（例
えば、ＨＰＶ１６につき１つの核酸、すなわち配列番号１で示されるような配列を含むア
ミノ酸を含むポリペプチドをコードするもの、およびＨＰＶ１８につき１つの核酸、すな
わち配列番号２０で示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするもの。
それらは例えばそれぞれ別個のベクター上に存在する）。あるいは、このような分子は、
少なくとも２つの別個の組成物（ＨＰＶ１６につき１つおよびＨＰＶ１８につき１つ）を
単一の対象へ投与することによって組み合わせて使用することができる。あるいは、この
ような分子はまた、単一の核酸分子、例えば単一のベクターにおいて、ＨＰＶ１６および
ＨＰＶ１８分子を存在させることで組み合わせることができる。したがって、特定の実施
形態では、本発明は、本発明に従うベクターを提供し、当該ベクターは、配列番号１で示
されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子および配列番号２０で示さ
れるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子の両方を含む。他の実施形態
では、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核
酸分子を含むベクター、および配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
をコードする核酸分子を含むさらなるベクターを含む組成物を提供する。特定の実施形態
では、本発明は、対象におけるＨＰＶ、特にＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に対する免疫応
答を誘導する方法であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
ードする核酸分子および配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドする核酸分子を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。特定の実施形態では
、本発明は、対象における持続性ＨＰＶ感染（特に持続性ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８感
染）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（Ｖａ
ＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸がん（子宮頸部扁平上皮がん（ＳＣＣ）など
、中咽頭がん、陰茎がん、膣がんまたは肛門がんのいずれかを治療するための方法であっ
て、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子および
配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を対象に
投与するステップを含む、方法を提供する。これらＨＰＶ１６／１８の組み合わせ実施形
態の任意の特定の側面において、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
は、配列番号３または配列番号５に示されるような配列を含んでいてもよく、当該核酸配
列は任意選択的に配列番号２、配列番号４または配列番号６に示されるような配列を含ん
でいてもよく、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号２
２に示される配列を含んでいてもよく、当該核酸配列は任意選択的に配列番号２１または
配列番号２３に示される配列を含んでいてもよい。もちろん、個々のＨＰＶ１６またはＨ
ＰＶ１８の核酸、ベクター、ポリペプチド、ワクチン組成物、上記の使用または方法につ
いて記載された実施形態の特徴はいずれも、本明細書に開示されるＨＰＶ１６および１８
の組み合わせに適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の融合タンパク質の発現。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、図の上部に示される導入遺伝子を発現するＤＮＡベクターが一過性に遺伝子導入された。遺伝子導入の２４時間後、細胞は収集され、細胞抽出物がＨＰＶ１６  Ｅ７に対する抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析された（上パネル）。ＮＦ−ｋＢを示すローディング対照（下パネル）により、全レーンにおいて細胞可溶化物の類似した負荷が確認される。分子量マーカーは左側に示される。融合タンパク質の予想サイズは、Ｅ６Ｅ７ＳＨが約３８ｋＤａ；Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＥ６Ｅ７Ｅ２ＳＨが約７５ｋＤａ、ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨが約７８ｋＤａである。
【図２】軟寒天中のコロニー形成。Ａ）軟寒天アッセイの仕組みの略図。Ｂ）播種の６週後、寒天中の細胞の倍率４０倍での代表的な顕微鏡画像。白色矢印はＥ７ｗｔ遺伝子導入細胞内で認められるコロニーを強調する。Ｃ）Ｇｅｌｃｏｕｎｔ（商標）および関連ソフトウェアを用いた、寒天中、播種の６週後でのコロニーの定量化。＊：ｐ＜０．０５（ポアソン回帰モデル）；＊＊：非劣性（５％の非劣性マージンを伴う一般化線形モデル）。
【図３−１】ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨはＥ６およびＥ７活性を失っている。Ａ）Ｅ６Ｅ７ＳＨによるｐ５３分解の欠如を示す代表的なウエスタンブロット。ヒトｐ５３ヌルＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞に、ｐ５３を発現するプラスミドが、ＨＰＶ１６  Ｅ６野生型、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはｅｍｐｔｙベクターを発現するプラスミドと組み合わせて同時遺伝子導入された。非ＴＦは非遺伝子導入細胞を示す。遺伝子導入から２４時間後、細胞可溶化物が調製され、３０μｇの総タンパク質がゲル上に負荷された。上パネル−ｐ５３染色、中間パネル−Ｅ６染色、下パネル−ＮＦ−ｋＢ染色（ローディング対照）。（Ｂ）４つの独立アッセイにおけるｐ５３レベルの定量化。ｐ５３シグナルはＮＦ−κＢシグナルに正規化された。Ｃ）Ｅ６Ｅ７ＳＨによるｐＲｂ分解の欠如を示すウエスタンブロット。ｐＲｂヌルＳａｏｓ−２細胞に、ｐＲｂを発現するプラスミドが、ＨＰＶ１６  Ｅ７野生型、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはｅｍｐｔｙベクターを発現するプラスミドと組み合わせて遺伝子導入された。非ＴＦは非遺伝子導入細胞を示す。遺伝子導入から２４時間後、細胞可溶化物が調製され、１０μｇの総タンパク質がゲル上に負荷された。上パネル−ｐＲｂ染色、中間パネル−Ｅ７染色、下パネル−ＮＦ−κＢ染色（ローディング対照）。Ｄ）４つの独立アッセイにおけるｐＲｂレベルの定量化。ｐＲｂシグナルはＮＦ−κＢシグナルに正規化された。＊：ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡモデル）；＊＊：非劣性（試験はＡＮＯＶＡモデル由来の９５％ＣＩに基づいた。非劣性マージンは７５％に設定された）。
【図３−２】ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨはＥ６およびＥ７活性を失っている。Ａ）Ｅ６Ｅ７ＳＨによるｐ５３分解の欠如を示す代表的なウエスタンブロット。ヒトｐ５３ヌルＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞に、ｐ５３を発現するプラスミドが、ＨＰＶ１６  Ｅ６野生型、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはｅｍｐｔｙベクターを発現するプラスミドと組み合わせて同時遺伝子導入された。非ＴＦは非遺伝子導入細胞を示す。遺伝子導入から２４時間後、細胞可溶化物が調製され、３０μｇの総タンパク質がゲル上に負荷された。上パネル−ｐ５３染色、中間パネル−Ｅ６染色、下パネル−ＮＦ−ｋＢ染色（ローディング対照）。（Ｂ）４つの独立アッセイにおけるｐ５３レベルの定量化。ｐ５３シグナルはＮＦ−κＢシグナルに正規化された。Ｃ）Ｅ６Ｅ７ＳＨによるｐＲｂ分解の欠如を示すウエスタンブロット。ｐＲｂヌルＳａｏｓ−２細胞に、ｐＲｂを発現するプラスミドが、ＨＰＶ１６  Ｅ７野生型、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはｅｍｐｔｙベクターを発現するプラスミドと組み合わせて遺伝子導入された。非ＴＦは非遺伝子導入細胞を示す。遺伝子導入から２４時間後、細胞可溶化物が調製され、１０μｇの総タンパク質がゲル上に負荷された。上パネル−ｐＲｂ染色、中間パネル−Ｅ７染色、下パネル−ＮＦ−κＢ染色（ローディング対照）。Ｄ）４つの独立アッセイにおけるｐＲｂレベルの定量化。ｐＲｂシグナルはＮＦ−κＢシグナルに正規化された。＊：ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡモデル）；＊＊：非劣性（試験はＡＮＯＶＡモデル由来の９５％ＣＩに基づいた。非劣性マージンは７５％に設定された）。
【図４】ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨは一次ヒト上皮ケラチノサイトを不死化しない。一次ヒト上皮ケラチノサイトに、ＨＰＶ１６の野生型Ｅ６およびＥ７をコードするオープンリーディングフレーム（Ｅ６Ｅ７ｗｔ）、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨ配列またはｅＧＦＰのいずれかをコードするレンチウイルスが形質導入された。非形質導入ドナー細胞は対照として用いられた。約２００日目、Ｅ６Ｅ７ｗｔの発現のみが、寿命延長およびｈＴＥＲＴ活性化によって示される通り、一次ケラチノサイトの不死化を誘導する（記載せず）。十字記号は、細胞が老化で死滅し、さらなる培養ができなかったことを示す。詳細については、実施例２を参照のこと。２つの追加的なドナーにおいて同様の結果が得られた（記載せず）。
【図５】ＤＮＡ免疫後、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨによって誘導される免疫応答−ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析。Ａ．免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＤＮＡプラスミドまたは導入遺伝子を発現しないプラスミド（対照）で免疫された。免疫の２週後、マウスは屠殺され、単離された脾細胞がＥ７に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激された。Ｂ．個別のマウスにおけるＨＰＶ１６  Ｅ７に特異的な免疫応答が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる測定として、１０６個の脾細胞あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として与えられる。
【図６】ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨの免疫原性−ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析。（Ａ）免疫スキーム。マウスが、指定通りの挿入物を有するアデノベクターで免疫された。２週後（Ｂ）および８週後（Ｃ）でのＥ７に特異的な応答が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより分析された（１０６個の脾細胞あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として表される）。黒丸は、１×１０１０個のｖｐの用量で免疫されたマウスを表し、白丸は５×１０９個のｖｐで免疫されたマウスを表す。黒棒は、応答の幾何平均を表す。点線は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける検出下限を示す。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析（ＡＮＯＶＡ  Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）が対数変換データに対して実施された（＊：ｐ＜０．０５）。詳細については実施例３を参照のこと。
【図７】ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの免疫原性−Ｅ７四量体染色。（Ａ）免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、指定通りの導入遺伝子を発現する１×１０１０ｖｐのアデノベクターで免疫された。免疫の２週後、マウスは屠殺され、単離された脾細胞が、Ｅ７４９−５７−Ｈ２−Ｄｂ四量体と相互作用可能なＣＤ８＋細胞の存在について分析された。（Ｂ）Ｅ７四量体陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率がｙ軸上に示される。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が対数変換データに対して実施され、異なるＥ６Ｅ７ＳＨ変異体間の差異は統計学的に有意でなかった。
【図８】ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの免疫原性−ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析。（Ａ）免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、パネルＢおよびＣの下部に示される導入遺伝子を発現するアデノベクターで免疫された。免疫の２週後、マウスは屠殺され、単離された脾細胞が、Ｅ２（Ｂ）、Ｅ６（記載せず）またはＥ７（Ｃ）に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激された。応答が１０６個の脾細胞あたりのＳＦＵとして与えられる。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が対数変換データに対して実施された。Ｅ２単独をコードするアデノベクターによって誘導されるＥ２応答は、Ｅ６およびＥ７断片を含む本発明のポリペプチドによって誘導される応答よりも高い。Ｅ２対Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＥ２対Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨにおける差異は有意である（＊：ｐ＜０．０５）。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が対数変換データに対して実施された。
【図９】免疫マウスにおける持続的応答。（Ａ）免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、変異体ＨＰＶ１６  ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現する１×１０１０ｖｐのＡｄ３５ベクター、または導入遺伝子を発現しないアデノベクター（Ｅｍｔｐｙ）で免疫された。四量体染色によりＥ７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を測定するため、血液試料が２週毎に採取された。（Ｂ）免疫の２週後の免疫応答。リーダー配列を含むベクターは、リーダー配列を伴わないベクターよりも高い応答を誘導した。ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ対Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（＊：ｐ＜０．０５）。（Ｃ）応答の動態。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が２週目のデータセットの対数変換データに対して実施された。Ｅ２を含む分子によって誘導されるＥ７応答は、Ｅ２を含まない分子と比べてより高い傾向があるが、結果は統計学的に有意でなかった。
【図１０】免疫応答をブーストするための異なるアデノウイルスベクターの使用。（Ａ）免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６ベクター（ＨＰＶ１６−Ｔｘ）または導入遺伝子を発現しないＡｄ２６ベクター（ｅｍｐｔｙ）で免疫された。２週後、免疫は、同図の下部に示されるようなＡｄ３５に基づくベクターを用いて反復された。２回目の免疫の４週後、マウスは屠殺され、四量体染色によりＥ７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を測定するため、血液試料が用いられた。（Ｂ）＊はＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｔｘ／Ａｄ３５．ＨＰＶ１６−Ｔｘ対Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｔｘ／Ａｄ３５．Ｅｍｐｔｙの比較を示す（ｐ＜０．０５）（多重比較におけるα＝０．０１を伴う対数変換データに対するスチューデントｔ検定）。
【図１１】アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）におけるＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの細胞免疫原性。（Ａ）免疫スキーム。アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）が０日目に免疫された、すなわち、筋肉内免疫（ｉ．ｍ）により、動物８匹がＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを受け、対照動物２匹がＡｄ２６．Ｅｍｐｔｙを受けた。ブースト免疫（Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはＡｄ２６．Ｅｍｐｔｙ）が８週後に与えられた。１６週後、動物は同じＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ３５ベクターにより２回目のブースト免疫を受けた一方、対照動物はＡｄ３５．Ｅｍｐｔｙを受けた。アデノベクターの用量は１×１０１１ｖｐ／免疫であった。採血は数回の時点で実施された。（Ｂ）ＰＢＭＣにおける細胞免疫応答がＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより測定された。ＰＢＭＣは、ＨＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６またはＥ７に対応するペプチドプールで刺激され、１×１０６個のＰＢＭＣにおけるスポット形成単位（ＳＦＵ）の数が図示される。ｅｍｐｔｙ対照動物（ｎ＝２）は、検出可能な応答を全く示さなかった。詳細については、実施例４を参照のこと。
【図１２−１】ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクターの治療効果。（Ａ）ＴＣ−１注射および免疫スキーム。０日目、ＣＢ６Ｆ１マウスに１×１０５個のＴＣ−１細胞が皮下注射された。６日後、腫瘍が触知できた時、マウスが、５ｎｍｏｌのＯＤＮ１８２６−ＣｐＧ（Ｂ）またはＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（Ｃ）を添加した最終容量が２００μｌの０．９％生理食塩水中、１５０μｇでのＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７免疫優勢エピトープ（すなわちＨＰＶ１６  Ｅ６、ａａ４１〜６５（ＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮ；配列番号１８）およびＨＰＶ１６  Ｅ７、ａａ４３〜７７（ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ；配列番号１９））を網羅する２つのＳＬＰで免疫された。対照マウスは、ＣｐＧ単独（Ｄ）またはＡｄ２６．Ｅｍｐｔｙ（Ｅ）のいずれかを受けた。すべてのマウスが、２０日目にブースト免疫を受けた。プライム免疫においてＡｄ２６ベクターを受けたマウスが、その後、対応するＡｄ３５ベクターで免疫された。その他のマウスが、プライム免疫などの場合、ＣｐＧまたはＣｐＧ単独で免疫賦活されたＳＬＰを受けた。（Ｂ〜Ｅ）ＴＣ−１注射マウスにおける腫瘍測定。腫瘍体積は、（幅２×長さ）／２として算出された。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えると、マウスは屠殺された。マウス２匹は、（アスターリスクで表示される）２０％を超える体重減少が原因で屠殺されなければならなかった。（Ｆ〜Ｇ）最初の３５日間のパネルＢおよびＣのクローズアップ。（Ｈ）ＴＣ−１注射後の生存。Ａｄ．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨで治療されたマウスの生存は、ＳＬＰおよびＣｐＧで免疫されたマウスと比べて有意に増加した（ログランク検定ｐ＜０．０５）。Ａｄ．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨで免疫されたマウス３匹は、実験の終了時に腫瘍がなかった（９２日目）。
【図１２−２】ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクターの治療効果。（Ａ）ＴＣ−１注射および免疫スキーム。０日目、ＣＢ６Ｆ１マウスに１×１０５個のＴＣ−１細胞が皮下注射された。６日後、腫瘍が触知できた時、マウスが、５ｎｍｏｌのＯＤＮ１８２６−ＣｐＧ（Ｂ）またはＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（Ｃ）を添加した最終容量が２００μｌの０．９％生理食塩水中、１５０μｇでのＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７免疫優勢エピトープ（すなわちＨＰＶ１６  Ｅ６、ａａ４１〜６５（ＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮ；配列番号１８）およびＨＰＶ１６  Ｅ７、ａａ４３〜７７（ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ；配列番号１９））を網羅する２つのＳＬＰで免疫された。対照マウスは、ＣｐＧ単独（Ｄ）またはＡｄ２６．Ｅｍｐｔｙ（Ｅ）のいずれかを受けた。すべてのマウスが、２０日目にブースト免疫を受けた。プライム免疫においてＡｄ２６ベクターを受けたマウスが、その後、対応するＡｄ３５ベクターで免疫された。その他のマウスが、プライム免疫などの場合、ＣｐＧまたはＣｐＧ単独で免疫賦活されたＳＬＰを受けた。（Ｂ〜Ｅ）ＴＣ−１注射マウスにおける腫瘍測定。腫瘍体積は、（幅２×長さ）／２として算出された。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えると、マウスは屠殺された。マウス２匹は、（アスターリスクで表示される）２０％を超える体重減少が原因で屠殺されなければならなかった。（Ｆ〜Ｇ）最初の３５日間のパネルＢおよびＣのクローズアップ。（Ｈ）ＴＣ−１注射後の生存。Ａｄ．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨで治療されたマウスの生存は、ＳＬＰおよびＣｐＧで免疫されたマウスと比べて有意に増加した（ログランク検定ｐ＜０．０５）。Ａｄ．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨで免疫されたマウス３匹は、実験の終了時に腫瘍がなかった（９２日目）。
【図１３】ＨＰＶＡｇまたはＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨのいずれかをコードする導入遺伝子を保有するアデノウイルスベクターは、導入遺伝子発現を抑制可能な細胞でウイルス収量の増加を示す。Ａ）Ａｄ３５ベクターにおけるウイルス収量アッセイ。ＰＥＲ．Ｃ６、ＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ、およびＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞は、ＧＦＰ−ＬｕｃまたはＨＰＶＡｇをコードする導入遺伝子を保有するＡｄ３５ベクターによる感染を受けた。これらの導入遺伝子は、ＣｕＯまたはＴｅｔＯ含有ＣＭＶプロモーターのいずれかにより駆動された。ウイルス収量は、感染の４日後にＡｄ３５ヘキソンに特異的なｑＰＣＲに基づく方法により測定された。Ｂ）Ａｄ２６ベクターにおけるウイルス収量アッセイ。ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞は、ＧＦＰ−Ｌｕｃ、ＨＰＶＡｇ、またはＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードする導入遺伝子を保有するＡｄ２６ベクターによる感染を受け、すべてがＴｅｔＯ含有ＣＭＶプロモーターにより駆動された。ウイルス収量は、感染の３日後にＡｄ２６ヘキソンに特異的なｑＰＣＲに基づく方法により測定された。詳細については、実施例６を参照のこと。
【図１４】ベクター産生中での導入遺伝子発現を抑制するためのリプレッサー系の使用により、ＨＰＶＡｇをコードする導入遺伝子を保有するアデノウイルスベクターにおける導入遺伝子カセットの不安定性が阻止される。ＣＭＶＣｕＯの制御下でＨＰＶＡｇを発現するＡｄ３５ベクターは、ＰＥＲ．Ｃ６またはＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞株のいずれかでのＤＮＡ遺伝子導入により救出された。得られたウイルスプラークは、５個／細胞株で採取され、各々の細胞株での継続的感染にわたって用いられた。Ａ）１０回のウイルス継代後のベクター・導入遺伝子カセット領域の完全性のＰＣＲによる分析。ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲで継代されたウイルス単離物から得られたＰＣＲ産物が各々、中間および右パネルに示される。ＰＥＲ．Ｃ６で継代されたウイルス単離物１、２、４、および５において得られた完全長と見られるＰＣＲ産物、ならびにＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲで継代された単離物１〜５において認められたものが、サンガーＤＮＡ配列決定により分析された。クロマトグラムトレースの分析（記載せず）によると、ＰＥＲ．Ｃ６で増殖したすべての単離物（ＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲで増殖したものでない）が、ＨＰＶＡｇにおけるコード配列内に少しのフレームシフト欠失または中途での停止突然変異のいずれかを有することが示された。Ｂ）７回のウイルス継代後でのベクターがＨＰＶＡｇを発現する能力の分析。Ａ５４９細胞は、ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲで増殖されたウイルス単離物により形質導入され、ＨＰＶＡｇの発現がＨＰＶ１６  Ｅ７特異抗体を用いるウエスタンブロットにより分析された。ＨＰＶＡｇにおいて予測されたサイズは８３ｋＤａである。詳細については、実施例６を参照のこと。
【図１５】ＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７の融合タンパク質の発現。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、図の上部に示される導入遺伝子を発現するＤＮＡベクターが一過性に遺伝子導入された。遺伝子導入の２４時間後、細胞は収集され、細胞抽出物がＨＰＶ１８  Ｅ６に対する抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析された（上パネル）。ＮＦ−ｋＢを示すローディング対照（下パネル）により、両方のレーンにおいて細胞可溶化物の類似した負荷が確認される。分子量マーカーは左側に示され、矢印は融合タンパク質を示す。予想サイズ：Ｅ６Ｅ７ＳＨ  約３８ｋＤａ；Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ  約７５ｋＤａ。
【図１６】ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナー構築物による軟寒天中のコロニー形成は見られなかった。Ａ）播種の６週後、寒天中の細胞の倍率４０倍での代表的な顕微鏡画像。Ｅ７ｗｔ遺伝子導入細胞内に大きいコロニーが認められる。Ｂ）Ｇｅｌｃｏｕｎｔ（商標）および関連ソフトウェアを用いた、寒天中、播種の６週後でのコロニーの定量化。＊：ｐ＜０．０５（ポアソン回帰モデル）；＊＊：非劣性（５％の非劣性マージンを伴う一般化線形モデル）。
【図１７】ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨは、ｐ５３およびｐＲｂを分解する能力を失った。Ａ）ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨによるｐ５３分解の欠如を示す代表的なウエスタンブロット。ヒトｐ５３ヌルＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞に、ｐ５３を発現するプラスミドが、ＨＰＶ１８  Ｅ６野生型、Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはｅｍｐｔｙベクターを発現するプラスミドと組み合わせて同時遺伝子導入された。非ＴＦは非遺伝子導入細胞を示す。遺伝子導入から２４時間後、細胞可溶化物が調製され、３０μｇの総タンパク質がゲル上に負荷された。上パネル−ｐ５３染色、中間パネル−Ｅ６染色、下パネル−ＮＦ−ｋＢ染色（ローディング対照）。（Ｂ）４つの独立アッセイにおけるｐ５３レベルの定量化。ｐ５３シグナルはＮＦ−κＢシグナルに正規化された。Ｃ）ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨによるｐＲｂ分解の欠如を示すウエスタンブロット。ｐＲｂヌルＳａｏｓ−２細胞に、ｐＲｂを発現するプラスミドが、ＨＰＶ１８  Ｅ７野生型、Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはｅｍｐｔｙベクターを発現するプラスミドと組み合わせて遺伝子導入された。非ＴＦは非遺伝子導入細胞を示す。遺伝子導入から２４時間後、細胞可溶化物が調製され、１０μｇの総タンパク質がゲル上に負荷された。上パネル−ｐＲｂ染色、中間パネル−Ｅ７染色、下パネル−ＮＦ−κＢ染色（ローディング対照）。Ｄ）４つの独立アッセイにおけるｐＲｂレベルの定量化。ｐＲｂシグナルはＮＦ−κＢシグナルに正規化された。＊：ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡモデル）；＊＊：非劣性（試験はＡＮＯＶＡモデル由来の９５％ＣＩに基づいた。非劣性マージンは７５％に設定された）。
【図１８】ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨは一次ヒト生殖器ケラチノサイトを不死化しない。一次ヒト生殖器ケラチノサイトに、ＨＰＶ１８の野生型Ｅ６およびＥ７をコードするオープンリーディングフレーム（Ｅ６Ｅ７ｗｔ）、Ｅ６Ｅ７ＳＨ配列またはｅＧＦＰのいずれかをコードするレンチウイルスが形質導入された。非形質導入ドナー細胞は対照として用いられた。ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ｗｔの発現のみが、寿命延長によって示される通り、一次ケラチノサイトの不死化（および約２００日目のｈＴＥＲＴ活性化、データは記載せず）を誘導する。十字記号は、細胞が老化で死滅し、さらなる培養ができなかったことを示す。詳細については、実施例８を参照のこと。２つの追加的なドナーにおいて同様の結果が得られた（データは記載せず）。
【図１９−１】ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ変異体の免疫原性−細胞内サイトカイン染色。ＣＢ６Ｆ１マウスが、パネルの下部に示される導入遺伝子を発現するアデノベクターで免疫された。免疫の２週後、マウスは屠殺され、単離された脾細胞がＨＰＶ１８  Ｅ６に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激された。応答がＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率として与えられる。
【図１９−２】ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ変異体の免疫原性−細胞内サイトカイン染色。ＣＢ６Ｆ１マウスが、パネルの下部に示される導入遺伝子を発現するアデノベクターで免疫された。免疫の２週後、マウスは屠殺され、単離された脾細胞がＨＰＶ１８  Ｅ６に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激された。応答がＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率として与えられる。
【図２０−１】ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８組み合わせベクターの免疫原性−ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析。ＣＢ６Ｆ１マウスが、ＨＰＶ１６（配列番号３をコードする）およびＨＰＶ１８（配列番号２２をコードする）の両方からのＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ導入遺伝子を発現するアデノベクター（タイプ２６）で免疫された。プライム免疫の４週後、マウスは同じＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ導入遺伝子を有するタイプ３５のアデノウイルスベクターで異種ブースト免疫を受けた。ブースト免疫の２週後、マウスは屠殺され、単離された脾細胞がＨＰＶ１６  Ｅ７（Ａ）またはＨＰＶ１８  Ｅ６（Ｂ）に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激された。応答が１０６個の脾細胞あたりのＳＦＵとして与えられる。
【図２０−２】ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８組み合わせベクターの免疫原性−ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析。ＣＢ６Ｆ１マウスが、ＨＰＶ１６（配列番号３をコードする）およびＨＰＶ１８（配列番号２２をコードする）の両方からのＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ導入遺伝子を発現するアデノベクター（タイプ２６）で免疫された。プライム免疫の４週後、マウスは同じＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ導入遺伝子を有するタイプ３５のアデノウイルスベクターで異種ブースト免疫を受けた。ブースト免疫の２週後、マウスは屠殺され、単離された脾細胞がＨＰＶ１６  Ｅ７（Ａ）またはＨＰＶ１８  Ｅ６（Ｂ）に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激された。応答が１０６個の脾細胞あたりのＳＦＵとして与えられる。
【図２１】アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）における、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８組み合わせワクチンの細胞免疫原性。アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）は図１１に示されるようなスキームに従い、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８デザイナー構築物の組み合わせで免疫化された。０日目：筋肉内免疫（ｉ．ｍ．）により、動物８匹がＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＡｄ２６．ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの混合物を受けた。同じベクターによりブースト免疫が８週後に与えられた。１６週後、動物は同じＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質を発現する２つのＡｄ３５ベクターの混合物により２回目のブースト免疫を受けた。アデノベクターの用量は１×１０１１ｖｐ／ベクター／免疫であった。採血は数回の時点で実施された。ＰＢＭＣにおける細胞免疫応答がＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより測定された。ＰＢＭＣは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ２、Ｅ６またはＥ７に対応するペプチドプールで刺激され、１×１０６個のＰＢＭＣにおけるスポット形成単位（ＳＦＵ）の数が決定された。この図は、それぞれの免疫化後２週で、試験された６種全てのペプチドプールの累積応答を示している。詳細については、実施例１１を参照のこと。
【図２２】ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現する組み合わせアデノベクターの治療効果。０日目、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０４個のＴＣ−１細胞が皮下注射された。６日後、腫瘍が触知可能になったとき、マウスはＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＡｄ２６．ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの混合物で免疫化された。対照マウスはＡｄ２６．Ｅｍｐｔｙを受けた。すべてのマウスが、対応するＡｄ３５ベクターによって２０日目にブースト免疫を受けた。腫瘍体積は、（幅２×長さ）／２として算出された。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えると、マウスは屠殺された。グラフはＴＣ−１注射後の生存を示す。ＨＰＶ１６＋ＨＰＶ１８組み合わせワクチンで免疫されたマウス３匹は、実験の終了時に腫瘍がなかった。Ａｄ．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨで処置されたマウスの生存期間の中央値は、Ａｄ．ＨＰＶ１６／１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨで免疫されたマウスと比べて有意に異ならなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。ポリペプ
チドは、融合ポリペプチドであり、時として、本明細書中で本発明のポリペプチド、また
は本発明の融合ポリペプチドと称される。このポリペプチドは、ＨＰＶ１６のＥ６および
Ｅ７タンパク質に対する免疫応答をもたらすのに有用であり、故に核酸分子は、持続性Ｈ
ＰＶ１６感染、およびそれに伴う疾患を予防するための治療ワクチンとして用いることが
できる。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、再整理されて、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質の（
本質的に）すべてのＴ細胞エピトープが存在するように部分的に重複している断片の形態
で、仮想的にはＨＰＶ１６の完全なＥ６およびＥ７アミノ酸配列を含む入念に設計された
分子（それは天然ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質のＣ末端から１つのアミノ酸のみ欠如して
いる）である。ＨＰＶワクチンとしての幾らかの可能性を有するより初期の分子は、他者
によって記述されている（例えば、Ｋｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎ  Ｅｎｇ
ｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：１８３８−４７；Ｄａａｙａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，
Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０２：１１２９−３６；Ｓｍａｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０
０１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８１：２３１−３８；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｖ
ａｃｃｉｎｅ  ２７：４３１−４０；Ｏｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０
０６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３；Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，
２０１１，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：３９７−４０６；欧州特許第１１８３３
６８号明細書、国際公開第２０１３／０８３２８７号パンフレット）が、これらの分子の
各々は１つ以上の欠点を有する。本発明のデザイナーポリペプチド分子は、前述の手法に
対して、少なくとも１つ、典型的には幾つかの態様において有利である。特に、本発明の
分子および／またはベクターの利点として、（ｉ）それらが、核酸が（天然Ｅ６およびＥ
７タンパク質と比べて）著しく低下した検出不能なまでの形質転換活性を有することから
、所望される安全性特性を有すること；（ｉｉ）それらが、経済的に採算が合うように産
業的規模で作製することが容易な単一の核酸分子であり、複数分子手法と異なりロジステ
ィックな課題を提起しないこと；（ｉｉｉ）コードされるポリペプチドが天然ＨＰＶ１６
Ｅ６およびＥ７タンパク質の本質的にすべてのＴ細胞エピトープを含むこと；（ｉｖ）
コードされるポリペプチドの設計により、望ましくない潜在的な強力なネオエピトープ（
すなわち、天然Ｅ６およびＥ７タンパク質中に存在しないエピトープ）の導入が最少化さ
れていること；および（ｖ）特定の実施形態では、それらが、所望される免疫応答をもた
らすのに高度に反応源性のあるアジュバントに依存しないこと、が挙げられる。したがっ
て、本発明の分子は、単一の設計で様々な有利な特性を組み合わせることからの主要なス
テップフォワードを表し、また主にＨＰＶ１６に対する治療ワクチン接種にとっての優れ
た候補である。これらの分子であれば、おそらくはＨＰＶ１６に対する予防ワクチンとし
ても作用することができ、これはそれらがワクチン接種した対象でのＨＰＶ１６による持
続性感染を予防する可能性が高いことを意味する。
【００３３】
ＨＰＶ１６デザイナー分子をコードする核酸分子（配列番号１に記載のアミノ酸配列を
含む）に関し前２つの段落に記載された利点は、本発明の目的である、ＨＰＶ１８に関す
る新規デザイナー分子（配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む）をコードする核酸分
子にも準用する。
【００３４】
本発明者らは、異なるＡ６およびＥ７断片間の新たに形成された接合部に導入され得る
非天然の強力なエピトープの形成可能性を決定するためにＩＥＤＢ−ＡＲを使用した。Ｈ
ＰＶ１６デザイナー分子の特定の実施形態では、入念な設計により、再配列されたＨＰＶ
１６  Ｅ６およびＥ７配列における、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ａ、２０の最も一般的
なＨＬＡ−Ｂおよび２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子に対する予測される結合親
和性＜５０ｎＭを有する９アミノ酸長のネオエピトープの数はわずか１つに最少化された
。単一のシャッフルされたＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質が３０を超えるかかるネオエピト
ープを既に有し、また構築物が、エピトープの欠如を阻止するためにこれらの構築物に付
加された配列中にさらに幾つかのより多くのネオエピトープを含む可能性が高くなること
から、これは他者によって記述された構築物をしのぐ有意な改善である（Ｏｅｈｌｓｃｈ
ｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３）。そ
れ故、本発明の分子において改変される免疫応答の機会が天然Ｅ６およびＥ７と比べて最
少化されていることから、本発明の構築物は、他者によって記述された手法と比べて有意
に改善された免疫学的特性を有する。
【００３５】
当業者は、通常の技術を用いて、ポリペプチドが発現される予定である任意の特定の宿
主生物でのコドン使用を反映するように記述されたポリヌクレオチドによってコードされ
るポリペプチド配列に影響を与えないようにヌクレオチド置換を行うことができる。した
がって、特に指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相
互の縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を
含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでも
よい。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明に従うポリペプチドをコードする核酸は、哺乳動物細胞
、好ましくはヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。コドン最適化の方法は
公知であり、先行的に記載がなされている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パン
フレット）。野生型配列と比べて少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコ
ドンで置換される場合、配列がコドン最適化されると考えられる。本明細書中で、好まし
くないコドンは、生物において同じアミノ酸をコードする別のコドンよりも低頻度で用い
られるコドンであり、より好ましいコドンは、生物において好ましくないコドンよりも高
頻度で用いられるコドンである。特定の生物におけるコドン使用の頻度は、コドン頻度表
、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎにて見出すこと
ができる。好ましくは、２つ以上の好ましくないコドン、例えば、１０％、４０％、６０
％、８０％を超える好ましくないコドン、好ましくは、最大（例えば少なくとも９０％）
もしくはすべての好ましくないコドンは、より好ましいコドンで置換される。好ましくは
、生物において最も頻用されるコドンは、コドン最適化配列で用いられる。好ましいコド
ンによる置換は一般に、より高い発現をもたらす。
【００３７】
核酸配列は、通常の分子生物学技術を用いてクローン化され得るか、またはＤＮＡ合成
により新規に作製され得、それは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野で
事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ，ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ，Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）による通常の方法を用いて実施され得る。
【００３８】
例えばアミノ酸の置換、欠失、付加などによって、例えば通常の分子生物学的方法を用
いてタンパク質を改変することができることは当業者によって理解されるであろう。一般
に、保存的アミノ酸置換は、ポリペプチドの機能または免疫原性の欠損を伴わない限り、
適用してもよい。これは、当業者に周知の通常の方法に従って検討することができる。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明に従うコードされるポリペプチドは、シグナル配列または
シグナルペプチドとも称されるリーダー配列をさらに含む。これは、分泌経路に向かうこ
とが運命づけられた新規に合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短い（典型
的には５〜３０アミノ酸長）ペプチドである。かかる配列の存在は、発現および免疫原性
の増強をもたらし得る。使用可能な非限定例として、ＩｇＥリーダーペプチド（例えば米
国特許第６，７３３，９９４号明細書を参照；例えば配列ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴ
ＲＶＨＳ（配列番号７）を有する）またはＨＡＶＴ２０リーダーペプチド（例えば配列Ｍ
ＡＣＰＧＦＬＷＡＬＶＩＳＴＣＬＥＦＳＭＡ（配列番号９）を有する）が挙げられる。こ
れらの１つは、任意選択的に本発明のポリペプチドのＮ末端に付加することができる。他
の実施形態では、本発明に従うポリペプチドはリーダー配列を含まない。
【００４０】
種々のＨＰＶ型が存在し（１２０を超える型が同定されており、番号により参照される
）、一般にワクチンにより包含される必要がある各型に対しては型特異的抗原がワクチン
中に組み込まれる必要があり得るが、特定の抗原に対しては幾つかの交差反応性が存在し
得る。１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６
８、７３、および８２型は、発がん性のある「高リスク」の性感染性ＨＰＶであり、子宮
頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、陰
茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、および／または肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）の発症を引き起こし
得る。本発明に従うＨＰＶ（すなわち、コードされるポリペプチド中のＥ６およびＥ７断
片の由来元であるＨＰＶ）はＨＰＶ１６（配列番号１〜６について）またはＨＰＶ１８（
配列番号２０〜２３について）である。それはＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８それぞれに感
染している対象に対して用いることができる。それはまた、特定の実施形態では、他のＨ
ＰＶ型に対するワクチンと好適に組み合わせてもよい。特定の実施形態では、この組み合
わせは、同定された上記の高リスク型のＨＰＶに対するワクチン、例えばＨＰＶ１６に対
するワクチンとＨＰＶ１８に対するワクチンを伴う。他の実施形態では、本発明のワクチ
ンは、ＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、−３９、−４５、−５１、−５
２、−５６、−５８、−５９、−６８、−７３、または−８２の１つ以上に対するワクチ
ンと組み合わされる。かかる組み合わせは、例えば、ＨＰＶ感染の正確な型がいまだ確定
されない場合、または予防効果を伴う免疫応答が２つ以上のＨＰＶ型に対して所望される
場合、用いることができる。本発明のワクチンと性器疣贅を引き起こすＨＰＶ型、例えば
ＨＰＶ６および／またはＨＰＶ１１に対するワクチンとの組み合わせもまた想定される。
これらのＨＰＶ型およびそれらによりコードされるタンパク質（例えば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ
２）の配列は、公的データベース、例えば国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（Ｎ
ＣＢＩ）によって提供されるジェンバンク配列データベースにて当業者が利用可能である
。
【００４１】
ＨＰＶ１６に関する本発明に従うポリペプチドは配列番号１を含み、また一実施形態で
は、本発明に従う核酸分子は配列番号２を含む。ＨＰＶ１８に関する本発明に従うポリペ
プチドは配列番号２０を含み、また一実施形態では、本発明に従う核酸分子は配列番号２
１を含む。
【００４２】
本明細書中の配列は、当該技術分野における慣例として、５’から３’方向へ、または
ＮからＣ末端へ提示される。
【００４３】
本発明に従うポリペプチドは、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質のエピトープ、
または代わりにＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７タンパク質のエピトープを含む。特定の実施
形態では、本発明に従うポリペプチドは、かかるさらなる抗原の少なくとも１つのさらな
る抗原またはエピトープをさらに含む（ひいては、ポリペプチドをコードする核酸はそれ
らをさらにコードする）。かかるさらなる抗原は、好ましくは、ＨＰＶ抗原、好ましくは
ポリペプチド中のＥ６およびＥ７タンパク質と同じＨＰＶ型、すなわちＨＰＶ１６または
ＨＰＶ１８それぞれに属するものである。したがって、かかるさらなる抗原は、ＨＰＶタ
ンパク質またはその免疫原性断片であり得、また特定の実施形態では、ＨＰＶの、好まし
くはＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８由来のＥ２の少なくとも１つのエピトープを含むＥ２タ
ンパク質またはその断片を含む。かかるさらなる抗原またはエピトープは、配列番号１ま
たは配列番号２０を含むポリペプチド中のＥ６および／もしくはＥ７の２つの断片の間に
内部的に配置され得るが、好ましくは配列番号１または配列番号２０を含むＥ６／Ｅ７ポ
リペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合される。その代わりまたはそれに加えて、免疫応
答を刺激するアミノ酸配列が存在し得る。したがって、特定の実施形態では、本発明は、
配列番号１または配列番号２０を含むポリペプチドをコードする本発明に従う核酸分子を
提供し、ここでポリペプチドは、少なくとも１つの他の抗原、例えばＨＰＶ  Ｅ２タンパ
ク質またはその少なくとも１つのエピトープ（好ましくはより多くのエピトープ）をさら
に含む。本発明におけるＥ２抗原の付加の１つの利点は、Ｅ２が、感染の間／Ｅ６および
Ｅ７の発現がまだ極めて低い低グレードの病変において早期に発現されることが知られて
いることである。子宮頸がんの発生過程の間、Ｅ２の発現は低下し、その結果、Ｅ６およ
びＥ７レベルは上昇する（Ｙｕｇａｗａ  ａｎｄ  Ｋｉｙｏｎｏ，２００９，Ｒｅｖ  Ｍ
ｅｄ  Ｖｉｒｏｌ  １９：９７−１１３）。１つのワクチン中でＥ２、Ｅ６およびＥ７由
来のエピトープを組み合わせることにより、持続性感染から浸潤性子宮頸がん（または他
のＨＰＶ１６誘発性がん）に至る範囲を有する患者の広範な標的群における治療が可能に
なる。特定の実施形態では、Ｅ２タンパク質は野生型Ｅ２タンパク質である。特定の他の
実施形態では、Ｅ２タンパク質は、（野生型Ｅ２タンパク質と比べて）そのＤＮＡ結合ド
メイン内に欠失または１つ以上の突然変異を有する。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８  Ｅ２
タンパク質の配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎ
ｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ）中に番号ＮＰ＿０４１３２８．１およびＡＡＰ２０５９
７．１の下でそれぞれ見出すことができる。このタンパク質のＣ末端部分におけるＧ２９
３Ｖ、Ｋ２９９Ｍ、またはＣ３００ＲなどのＨＰＶ１６  Ｅ２中の幾つかの単一のアミノ
酸変化は、ＤＮＡ結合性を抑制することが知られている。ＨＰＶ１８  Ｅ２に関し、対応
するアミノ酸変化は、Ｇ２９４Ｖ、Ｋ３００Ｍ、Ｃ３０１Ｒである。ＤＮＡ結合能が欠如
したＥ２の変異体または断片を用いる利点は、それが、予測不能な転写変化を、それが発
現される細胞内での宿主細胞ＤＮＡへの直接的結合を介して阻止し得る点である。上に記
載したＤＮＡ結合ドメインにおける変異に加え、またはその代替としてのＥ２活性を阻害
するためのさらなるアプローチは、よりＮ末端側に配置されたＥ２トランス活性化ドメイ
ンの活性を抑制し、および／またはＥ２ポリペプチドの構造に影響を及ぼすと報告されて
いる変異を導入することである。ＨＰＶ１６  Ｅ２に関し、過去に記載された位置（例え
ば、Ｂｒｏｋａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）に
おけるアミノ酸変化の非限定的な例は、Ｒ３７Ａ、Ｉ７３Ａ、Ｗ９２Ａ、Ｅ３９Ａ、Ｗ３
３Ａ、Ｐ１０６ＡおよびＧ１５６Ａであり、本発明に従うＨＰＶ１６  Ｅ２は、トランス
活性化ドメイン中、任意選択的に１つ以上の変異を含み得る。ＨＰＶ１８  Ｅ２に関し、
対応するアミノ酸変化は、Ｒ４１Ａ、Ｉ７７Ａ、Ｗ９６Ａ、Ｅ４３Ａ、Ｗ３７Ａ、Ｐ１１
０ＡおよびＧ１６１Ａであり、０、本発明に従うＨＰＶ１８  Ｅ２は、トランス活性化ド
メイン中、任意選択的に１つ以上の変異を含み得る。特定の実施形態では、Ｅ２は、トラ
ンス活性化ドメインにおける変異を有し、他の実施形態では、Ｅ２はＤＮＡ結合ドメイン
に変異を有し、さらなる実施形態では、Ｅ２はトランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合
ドメインの両方において変異を有する。さらに別の代替となる実施形態では、本発明に従
うＥ２ポリペプチドは、並べ替えられた（シャッフルされた）断片に分割され、免疫原性
のＥ２エピトープを維持しながらＥ２活性を抑制する。このような実施形態は、例えばＤ
ＮＡ結合ドメイン中および／またはトランス活性化ドメイン中で、任意選択的に１つ以上
の上述した変異と組み合わせることができる。野生型ＨＰＶ  Ｅ２ポリペプチドの他にも
、全てのそのようなＥ２変異体は、本発明に従うＥ２タンパク質またはその一部もしくは
変異体として使用することができる。
【００４４】
Ｅ２タンパク質またはその一部もしくは変異体は、内部的に付加され得るが、好ましく
は配列番号１または配列番号２０を有する本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に
融合され得る。ＨＰＶ１６に関する一実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号３を
含むポリペプチドをコードする。その一実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号４
を含む。ＨＰＶ１６に関する別の実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号５を含む
ポリペプチドをコードする。その一実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号６を含
む。ＨＰＶ１８に関する一実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号２２を含むポリ
ペプチドをコードする。その一実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号２３を含む
。
【００４５】
本発明のデザイナーポリペプチドとさらなるタンパク質、例えばいわゆる担体タンパク
質、例えば、カルレティキュリン、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ）熱ショックタンパク質７０、ＩＰ１０、またはテタヌス毒素フラグメント
Ｃとのさらなる融合を行うことも可能であり（さらなる例として、Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ
ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２０１２（上記）を参照）、その場
合、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７（および任意選択的にはＥ２）エピトープに対する免疫応答
をさらに増強することができる。したがって、本発明はまた、かかるさらなる融合タンパ
ク質、およびそれをコードする核酸を提供する。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明に従う核酸分子は、ベクター中に組み込まれる。「ベクタ
ー」は、本明細書で用いられるとき、典型的には、外来遺伝子材料を、それが複製および
／または発現可能な別の細胞へ人工的に運ぶための媒体であり、本発明によると、本発明
に従う核酸分子を組み込む任意の核酸分子であり得る。これらは、クローニングなどの通
常の分子生物学技術に従って調製され得る。典型的には、かかるベクターは、細菌、酵母
、昆虫細胞、哺乳動物細胞などの好適な宿主の少なくとも１つのタイプにおいて増殖され
得る。ベクターの４つの主要なタイプは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、お
よび人工染色体である。ベクター自体は一般に、挿入物（導入遺伝子；本発明では本発明
の融合ポリペプチドをコードする核酸）およびベクターの「骨格」として寄与する配列か
らなるＤＮＡ配列である。遺伝情報を別の細胞に移すベクターの目的は、典型的には、挿
入物を標的細胞内で単離する、増殖させる、または発現させることである。好ましくは、
ポリペプチドをコードする配列は、ベクター中のプロモーターに作動可能に連結されてい
る。用語「作動可能に連結されている」は、目的のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列
の発現を可能にする様式で（例えば、ベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞内
で）プロモーターに連結されていることを意味するように意図されている。発現制御配列
は、導入遺伝子に作動可能に連結され得る。特定の実施形態では、ベクターは、標的細胞
内での導入遺伝子の発現を意図して設計され、一般に導入遺伝子の発現を駆動するプロモ
ーター配列を有する。特定の実施形態では、転写ターミネーター配列、ポリアデニル化テ
イル配列、コザック配列、ＵＴＲ、複製起点、複数のクローニング部位、遺伝子マーカー
、抗生物質耐性、およびさらなる配列などの通常用いられるベクター要素の１つ以上が存
在してもよく、当業者は、ベクターを、例えば、ベクターの伝播および増殖用の特定の細
胞内での複製のため、またベクターが導入される標的細胞内でのベクターの導入遺伝子の
発現のため、所望される特性を有するように設計することができる。好ましくは哺乳動物
細胞内での発現を意図して設計された、本発明に従う融合ポリペプチドをコードする核酸
を含むベクターは、本発明に従うワクチンとして好適である。特定の実施形態では、本発
明に従うベクターは、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体、ウイル
スベクターなどである。当業者は、宿主細胞内での遺伝子の発現を得るのに様々なプロモ
ーターが使用可能であることを認識している。真核生物細胞内での発現用の、幾つかの周
知であり、多用されるプロモーターは、ウイルス、例えばアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖ
ｉｒｕｓ）由来のプロモーター、例えばＥ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ｃ
ｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）由来のプロモーター、例えばＣＭＶ最初期（
ＩＥ）プロモーター（本明細書中でＣＭＶプロモーターと称される）（例えばｐｃＤＮＡ
，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、サルウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ
４０）（ＳＶ４０）由来のプロモーター（例えば、ｐＩＲＥＳ、カタログ番号６３１６
０５、ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）などを含む。好適なプロモーターはまた、
真核生物細胞由来であり、例えば、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子１
α（ＥＦ−１α）プロモーター、ユビキチンＣもしくはＵＢ６プロモーター、アクチンプ
ロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどが挙げられる（
例えば国際公開第２００６／０４８４５９号パンフレットを参照）。真核生物細胞内での
発現を得るのに適したプロモーターの非限定例として、ＣＭＶプロモーター（米国特許第
５，３８５，８３９号明細書）、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、例えばＣＭＶ最初期
遺伝子エンハンサー／プロモーターからのｎｔ．−７３５〜＋９５を含むもの、例えば配
列番号１３で示されるような配列を有する、本明細書に提供されるようなＣＭＶプロモー
ター、が挙げられる。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンポリＡシグナル
（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）が導入遺伝子の後に存在し得る。
【００４７】
さらに、制御配列もまた付加してもよい。用語「制御配列」は、本明細書中で「調節エ
レメント」と交換可能に用いられ、典型的にはＤＮＡに限定されないが、それが作動可能
に連結される対象の核酸配列の転写を調節する核酸のセグメントを指し、それ故、転写修
飾因子として作用する。制御配列は、転写結合ドメインであり、転写タンパク質および／
または転写因子の核酸結合ドメイン、エンハンサーまたはリプレッサーなどによって認識
される核酸配列を含むことが多い。例えば、リプレッサー配列をプロモーターに対して作
動可能に結合させることは可能であり、そこでリプレッサー配列は、リプレッサータンパ
ク質（このリプレッサータンパク質を発現する産生細胞株中での導入遺伝子の発現を低下
または阻止し得る）によって結合され得る。これは、核酸分子の、継代時および／または
これが産生細胞株中で大量に生成される時の遺伝的安定性および／または発現レベルを改
善し得る。かかる系は、当該技術分野で記載がなされている。例えば、制御配列は、１つ
以上のテトラサイクリンオペロンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）を含み得ることから、発
現がテトラサイクリンオペロンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）の存在下で阻害され
る。テトラサイクリンの不在下で、ｔｅｔＲタンパク質は、ｔｅｔＯ部位に結合し、ｔｅ
ｔＯ部位に作動可能に連結されている遺伝子の転写を抑制することができる。しかし、テ
トラサイクリンの存在下で、ｔｅｔＲタンパク質における立体構造変化は、それがオペレ
ーター配列に結合し、作動可能に連結された遺伝子の転写が生じることを阻止する。特定
の実施形態では、本発明の、例えば組換えアデノウイルスベクター中に存在する場合の核
酸分子は、任意選択的にプロモーターに作動可能に連結されたｔｅｔＯを含み得ることか
ら、１つ以上の導入遺伝子の発現が、ｔｅｔＲタンパク質が発現されるプロデューサー細
胞株中で産生される組換えアデノウイルス中で阻害される。その後、組換えアデノウイル
スが対象またはｔｅｔＲタンパク質を発現しない細胞に導入される場合、発現は阻害され
ないことになる（例えば、国際特許出願の国際公開第０７／０７３５１３号パンフレット
）。特定の他の実施形態では、本発明の核酸分子は、例えば組換えアデノウイルス中に存
在する場合、任意選択的にｃｕｍａｔｅ遺伝子スイッチ系を含み得、そこで発現の調節は
、リプレッサー（ＣｙｍＲ）の、プロモーターの下流に配置されるオペレーター部位（Ｃ
ｕＯ）への結合によって媒介される（例えば、Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  ６：４３）。本明細書で用いられるとき、用語「リプレ
ッサー」は、組換え発現ベクターの異種タンパク質産物の生成に対して阻害し、干渉し、
遅延させ、および／または抑制する能力を有する実体（例えば、タンパク質または他の分
子）を指す。例えば、例えば発現カセット内の発現ベクターに沿う適切な位置での結合部
位との干渉によるものである。リプレッサーの例として、ｔｅｔＲ、ＣｙｍＲ、ｌａｃリ
プレッサー、ｔｒｐリプレッサー、ｇａｌリプレッサー、λリプレッサー、および当該技
術分野で公知の他の適切なリプレッサーが挙げられる。ｔｅｔＯ／ｔｅｔＲオペレーター
／リプレッサー系およびＣｕＯ／ＣｙｍＲオペレーター／リプレッサー系の使用例が本明
細書に提供される。ベクター伝播中のベクター・導入遺伝子発現の抑制により、導入遺伝
子の不安定性が阻止され得、また本発明の導入遺伝子を有するベクターの生成中の収量が
増加し得る。それ故、一部の実施形態では、本発明のベクターは、リプレッサータンパク
質の結合によって、例えばリプレッサー・オペレーター配列（例えば非限定的な実施形態
ではＴｅｔＯ含有配列、例えば配列番号１１で示されるもの、またはＣｕＯ含有配列、例
えば配列番号１２で示されるもの）と作動可能に結合されるプロモーターを有することに
よって抑制可能なプロモーターを有し、リプレッサータンパク質（例えば、ＴｅｔＲタン
パク質、例えば配列番号１５で示されるようなアミノ酸配列を有するもの、またはＣｙｍ
Ｒタンパク質、例えば配列番号１７で示されるようなアミノ酸配列を有するもの）がそれ
に結合し得る。
【００４８】
特定の実施形態では、ベクターは、プラスミドＤＮＡ分子、またはその断片である。こ
れらは、ＤＮＡワクチン接種用に用いることができる。他のプラットフォーム、例えば弱
毒生二重欠失化リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株もま
た、ベクターとしての使用が可能である。
【００４９】
他の実施形態では、ベクターは、組換えウイルスベクターであり、それは複製コンピテ
ントまたは複製欠損であってもよい。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、組換え
ＤＮＡゲノムを含む。特定の実施形態では、本発明に従うベクターは、例えば、組換えア
デノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、組換えレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ
）、組換えポックスウイルス（ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、例えばワクシニアウイルス（ｖａ
ｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）（例えば、修飾ワクシニアアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖ
ａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ））、組換えアルファウイルス（ａｌｐｈａｖ
ｉｒｕｓ）、例えばセムリキ森林ウイルス（ｓｅｍｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ
）、組換えパラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、例えば組換え麻疹ウイ
ルス（ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、または別の組換えウイルスである。特定の実施形
態では、本発明に従うベクターはＭＶＡベクターである。
【００５０】
好ましい実施形態では、本発明に従うベクターは、組換えアデノウイルスである。ワク
チンとしての使用のためのアデノウイルスの利点は、報告されている極めて多数のアデノ
ウイルスベクターを用いた研究、開発、製造および臨床試験における長年の経験に基づく
、操作の容易性、大規模での良好な製造可能性、および優れた安全性の記録を含む。ワク
チンとして用いられるアデノウイルスベクターは一般に、導入遺伝子にコードされたタン
パク質に対する良好な免疫応答、例えば細胞免疫応答をもたらす。本発明に従うアデノウ
イルスベクターは、アデノウイルスの任意の型に基づく可能性があり、特定の実施形態で
はヒトアデノウイルスであり、それは任意の血清型に属し得る。他の実施形態では、それ
はサルアデノウイルス、例えばチンパンジーまたはゴリラアデノウイルスであり、それら
は任意の血清型に属し得る。特定の実施形態では、本発明に従うベクターは、ヒトアデノ
ウイルス血清型５、２６または３５に属する。組換えアデノウイルスベクターの調製は、
当該技術分野で周知である。特定の実施形態では、本発明に従うアデノウイルスベクター
は、ウイルス複製にとって必要とされるアデノウイルスゲノムのＥ１領域、例えばＥ１ａ
領域および／またはＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。特定
の実施形態では、本発明に従うアデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の少なくとも
一部が欠損している。特定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必
須遺伝子機能および非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。
【００５１】
アデノウイルスベクター、その構築方法およびその伝播のための方法は、当該技術分野
で周知であり、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、米国特許第５，８３７
，５１１号明細書、米国特許第５，８４６，７８２号明細書、米国特許第５，８５１，８
０６号明細書、米国特許第５，９９４，１０６号明細書、米国特許第５，９９４，１２８
号明細書、米国特許第５，９６５，５４１号明細書、米国特許第５，９８１，２２５号明
細書、米国特許第６，０４０，１７４号明細書、米国特許第６，０２０，１９１号明細書
、および米国特許第６，１１３，９１３号明細書、ならびにＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，
“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｍ．Ｓ
．Ｈｏｒｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６７  ａｎｄ  
６８（各々），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３
ｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）、なら
びに本明細書中に記載の他の参考文献に記載されている。典型的には、アデノウイルスベ
クターの構築は、標準の分子生物学技術、例として、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａ
ｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓ
ｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｂｏｏｋｓ（１９９２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅ
ｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、および本明細書中に記載
の他の参考文献に記載のものの使用を含む。
【００５２】
組換えアデノウイルス用に特に好ましい血清型は、ヒト血清型３５またはヒト血清型２
６である。ｒＡｄ２６ベクターの調製については、例えば、国際公開第２００７／１０４
７９２号パンフレットおよびＡｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
８１：４６５４−６３に記載されている。Ａｄ２６の例示的なゲノム配列は、ジェンバ
ンク受入番号ＥＦ１５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレット
の配列番号１の中に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製については、例えば、米国特
許第７，２７０，８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号パンフレット、および
Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：８２６３−７１に記載
されている。Ａｄ３５の例示的なゲノム配列は、ジェンバンク受入番号ＡＣ＿００００１
９および国際公開第００／７００７１号パンフレットの図６の中に見出される。
【００５３】
特定の実施形態では、アデノウイルスは、例えばゲノムのＥ１領域内に欠失を有するこ
とから複製欠損である。当業者に公知であるように、アデノウイルスゲノムからの必須領
域の欠失の場合、これらの領域によってコードされる機能は、好ましくはプロデューサー
細胞によりトランスで提供される必要がある、すなわち、Ｅ１、Ｅ２および／またはＥ４
領域の一部または全部がアデノウイルスから欠失される場合、これらはプロデューサー細
胞内に、例えばそれらのゲノムに組み込まれて、またはいわゆるヘルパーアデノウイルス
もしくはヘルパープラスミドの形態で存在する必要がある。アデノウイルスはまた、複製
にとって不要であるＥ３領域内に欠失を有してもよく、それ故、かかる欠失は補完される
必要がない。
【００５４】
使用可能なプロデューサー細胞（時として当該技術分野や本明細書中で「パッケージン
グ細胞」または「補完細胞」とも称される）は、所望されるアデノウイルスが伝播され得
る任意のプロデューサー細胞であり得る。例えば、組換えアデノウイルスベクターの伝播
は、アデノウイルス中での欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われる。かかるプロ
デューサー細胞は、好ましくはそのゲノム中に少なくともアデノウイルスＥ１配列を有し
、それにより、Ｅ１領域内に欠失を有する組換えアデノウイルスを補完する能力がある。
任意のＥ１を補完するプロデューサー細胞、例えばＥ１により不死化されたヒト網膜細胞
、例えば９１１もしくはＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書）、
Ｅ１形質転換羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照）、Ｅ１形質転換Ａ５
４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１
，６９０号明細書を参照）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，
Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１：２１３−１９）、２９３などは用いることができる
。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥ
Ｒ．Ｃ６細胞、または９１１細胞、またはＩＴ２９３ＳＦ細胞などである。プロデューサ
ー細胞内でのアデノウイルスベクターの作製は（Ｋｏｖｅｓｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１
０，Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２：１６８１−７０３）中にレビューされている。
【００５５】
特定の実施形態では、Ｅ１欠損アデノウイルスは、Ａｄ５などのサブグループＣのアデ
ノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列を含む。これは、かかるアデノウイルスのＡｄ５
のＥ１遺伝子を発現する周知の補完細胞株、例えば２９３細胞もしくはＰＥＲ．Ｃ６細胞
などにおける伝播を可能にする（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ
Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：２１３５−４３；国際公開第０３／１０４４６７号パンフ
レットを参照、その全体が参照により本明細書中に援用される）。
【００５６】
本発明のベクター中の「異種核酸」（本明細書中で「導入遺伝子」とも称される）は、
ベクター中に天然に存在しない核酸であり、本発明によると、本発明の融合ポリペプチド
をコードする核酸は、ベクター中に存在する場合、異種核酸と考えられる。それは、例え
ば標準の分子生物学技術によりベクター中に導入される。それは例えば、アデノウイルス
ベクターの欠失したＥ１またはＥ３領域内、またはＥ４領域とｒＩＴＲとの間の領域内に
クローン化され得る。導入遺伝子は一般に、発現制御配列に作動可能に連結される。好ま
しい実施形態では、導入遺伝子は、アデノウイルスベクターのＥ１領域内にクローン化さ
れる。
【００５７】
ＤＮＡベクター、ＭＶＡベクター、または組換えアデノウイルスベクターなどのベクタ
ーの生成は、当業者に周知の様々な方法に従って実施され得る。一般に、生成は、実質量
のベクター材料を作製するための培養細胞内での増殖、その後の細胞培養液からのベクタ
ーの収集、また典型的にはその後の、他の物質を除去し、医薬組成物に配合され得る精製
ベクターを得るためのベクターのさらなる精製を必要とする（例えば、Ｈｏｇａｎｓｏｎ
ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ  １：４３−８；Ｅｖａｎ
ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：２４５８−７５）。例え
ば、アデノウイルスをプロデューサー細胞の培養液から収集するための方法は、例えば国
際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットに幅広く記載されている。例えば、国際
公開第２０１０／０６０７１９号パンフレット、および国際公開第２０１１／０９８５９
２号パンフレット（双方とも参照により本明細書中に援用される）は、大量の組換えアデ
ノウイルスを得て精製するのに適した方法を記載している。
【００５８】
特定の態様では、本発明はまた、本発明に従う核酸分子によってコードされるポリペプ
チドを提供する。かかるポリペプチドは配列番号１（ＨＰＶ１６について）、または配列
番号２０（ＨＰＶ１８について）を含む。特定の実施形態では、かかるポリペプチドは、
配列番号３または配列番号５（それぞれＨＰＶ１６について）、または配列番号２２（Ｈ
ＰＶ１８について）を含んでもよい。かかるポリペプチドの特性は、上記の通りである。
かかるポリペプチドは、例えばＨＰＶに対するワクチンとして直接的に用いることができ
る。
【００５９】
本発明はまた、本発明に従う核酸分子、ベクターまたはポリペプチドを含むワクチンを
提供し、これらの態様の各々における実施形態は、上記のものを含み得る。好ましい実施
形態では、本発明に従うワクチンは、本発明に従う核酸分子を含む。さらなる好ましい実
施形態では、ワクチンは、本発明に従うベクター、好ましくはＤＮＡベクター、ＭＶＡベ
クター、または組換えアデノウイルスベクターを含む。
【００６０】
特定の実施形態では、ＨＰＶ１６デザイナーポリペプチドをコードする本発明に従うワ
クチンは、さらなる活性成分、例えば、ＨＰＶ１６と異なる少なくとも１つのＨＰＶ型、
例えば高リスクＨＰＶ型、例えばＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、Ｈ
ＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９
、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、もしくはＨＰＶ８２のＥ６および／またはＥ７タンパク質の
少なくとも１つのエピトープをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、ＨＰＶ１８
デザイナーポリペプチドをコードする本発明に従うワクチンは、さらなる活性成分、例え
ば、ＨＰＶ１８と異なる少なくとも１つのＨＰＶ型、例えば高リスクＨＰＶ型、例えばＨ
ＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１
、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、もしく
はＨＰＶ８２のＥ６および／またはＥ７タンパク質の少なくとも１つのエピトープをコー
ドする核酸を含む。
【００６１】
特に好ましくは、本発明のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８デザイナーポリペプチドの両方
をコードする、すなわち、配列番号１を有するポリペプチドおよび配列番号２０を有する
ポリペプチドをコードする、核酸を含むワクチンである。そのようなワクチンにおいて、
ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８成分は別個の分子として同一組成物中に存在してもよく、ま
たは、同一分子中に存在してもよく、例えば、同一ベクター上でコードされていてもよく
、または、ワクチンにおける組み合わせ使用のため別個のＨＰＶ１６成分および別個のＨ
ＰＶ１８成分を有するパーツキットとして提供されてもよく、例えば、投与前に再構成す
るためのものであってもよく、または、別個ではあるが本質的に同時投与のためのもので
あってもよい。そのような組み合わせの１つの利点は、そのようなワクチンは、ＨＰＶ１
６またはＨＰＶ１８（共に大部分のＨＰＶ誘導性癌の原因となる最も一般的な高リスクＨ
ＰＶ型２つ）のいずれかに感染した対象において治療的に作用し得ることであり、そのよ
うなワクチンは、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８デザイナー分子のいずれかを有する単一型
のワクチンに対して、高められた適用性を有する。
【００６２】
用語「ワクチン」は、特定の病原体または疾患に対して対象における予防および／または
治療度合いの免疫（この場合、ＨＰＶに対して治療的）を誘導するのに有効な活性成分を
含有する薬剤または組成物を指す。ワクチンは、典型的には、本発明に従う核酸分子、ま
たはベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含む。対象への投与時、本発明に従う
核酸分子によってコードされるポリペプチドは、対象において発現されることになり、そ
れによりポリペプチド中に存在するＥ６および／またはＥ７抗原断片に対する免疫応答を
もたらすことになる。本分子の利点は、ＨＰＶ１６（配列番号１〜６について）またはＨ
ＰＶ１８（配列番号２０〜２３について）Ｅ６およびＥ７の本質的にすべてのＴ細胞エピ
トープが存在することから、野生型Ｅ６またはＥ７中に存在する任意のエピトープに対す
るＴ細胞応答がワクチン中で開始され得ることである。さらに、本ワクチンは、本発明に
従う核酸分子における、上で概説されるようなあらゆる安全性および有効性の利点を有す
る。
【００６３】
ヒトへの投与については、本発明では、ベクター、および薬学的に許容できる担体もし
くは賦形剤を含む医薬組成物を用いてもよい。この場合、用語「薬学的に許容できる」は
、担体もしくは賦形剤が、用いられる用量および濃度で、任意の望ましくないかまたは有
害な効果をそれが投与される対象においてもたらさないことを意味する。かかる薬学的に
許容できる賦形剤は、当該技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎ
ａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈ
ｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨ
ａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ
ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓ
ｓ［２０００］を参照）。賦形剤は一般に、薬物の活性成分と配合される薬理学的に不活
性な物質である。賦形剤は一般に、強力な活性成分を含有する製剤を増量するために用い
られ（それ故、「増量剤」、「充填剤」または「希釈剤」と称されることが多い）、それ
により剤形を生産する際での原薬の便宜的かつ正確な調剤を可能にする。賦形剤はまた、
様々な治療増強の目的、例えば薬剤の吸収または溶解性を促進すること、または他の薬物
動態学的考慮に寄与し得る。賦形剤はまた、製造過程において、想定される有効期間にわ
たる変性の阻止などのインビトロ安定性に寄与することに加えて、粉末流動性または非粘
着性を促進することなどの関係する活性物質の取扱いに寄与する上で有用であり得る。適
切な賦形剤の選択はまた、投与経路および剤形、ならびに活性成分および他の要素に依存
する。
【００６４】
精製された核酸分子、ベクターまたはポリペプチドは、好ましくは、滅菌溶液として配
合され、投与されるが、凍結乾燥製剤を利用することも可能である。滅菌溶液は、滅菌濾
過により、または本質的に当該技術分野で公知の他の方法により調製される。次に、溶液
は、凍結乾燥されるかまたは医薬品の投与容器に充填される。溶液のｐＨは一般に、ｐＨ
３．０〜９．５、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲内である。核酸分子またはベクターま
たはポリペプチドは、典型的には、好適な緩衝液を有する溶液中に存在し、ベクターの溶
液はまた、塩を含有してもよい。任意選択的には、安定化剤、例えばアルブミンが存在し
てもよい。特定の実施形態では、洗剤が添加される。特定の実施形態では、ワクチンは、
注射用製剤に配合してもよい。これらの製剤は、核酸分子、ベクターまたはポリペプチド
を有効量含有し、滅菌溶液、懸濁液または凍結乾燥バージョンのいずれかであり、任意選
択的には安定剤または賦形剤を含有する。
【００６５】
例えば、組換えアデノウイルスベクターは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｔ
ａｎｄａｒｄ（Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎ
ｇ  Ｊ  １：４３−８）においても用いられる緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８、２５ｍ
Ｍ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール）中に貯蔵してもよい。ヒトへの投与に適した別の
有用な調製用緩衝液は、２０ｍＭトリス、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ス
クロース１０％ｗ／ｖ、ポリソルベート８０  ０．０２％ｗ／ｖである。組換えアデノウ
イルスに適した別の調製用緩衝液は、１０〜２５ｍＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．９〜
６．２）、４〜６％（ｗ／ｗ）ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ
）、７０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１８〜０．０３５％（ｗ／ｗ）ポリソルベート
８０、および任意選択的には０．３〜０．４５％（ｗ／ｗ）エタノールを含む。明らかに
、多くの他の緩衝液を用いることができ、貯蔵や精製ベクターの医薬投与に適した製剤の
数例が公知である。
【００６６】
特定の実施形態では、ベクターを含む組成物は、１つ以上のアジュバントをさらに含む
。アジュバントは、適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに増強することが当該
技術分野で公知である。用語「アジュバント」および「免疫刺激剤」は、本明細書中で交
換可能に用いられ、免疫系の刺激を引き起こす１つ以上の物質と定義される。これに関連
して、アジュバントは、本発明のベクター中の核酸分子によってコードされるポリペプチ
ドに対する免疫応答を増強するために用いられる。好適なアジュバントの例として、水酸
化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムおよび／またはアルミニウムカリウム
ホスフェート（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などの
アルミニウム塩；油エマルジョン組成物（または水中油型組成物）、例えばスクアレン−
水エマルジョン、例えばＭＦ５９（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレット
を参照）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など
（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パン
フレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７
６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；細菌
または微生物誘導体が挙げられ、その例として、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、３−
Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフを有するオリゴヌクレオチド、
ＡＤＰ−リボシル化細菌性毒素またはその突然変異体、例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）熱
不安定性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどが挙げられる。ベクターにコードさ
れるアジュバントを、例えばＣ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー形成ドメイン
の目的の抗原への融合体をコードする異種核酸を用いることにより（例えば、Ｓｏｌａｂ
ｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：３８１７−２３）
、または目的の導入遺伝子およびＴＬＲ−３作動薬、例えば異種ｄｓＲＮＡ（例えば国際
公開第２００７／１００９０８号パンフレット）の双方をコードするベクターなどを用い
ることにより、用いることも可能である。
【００６７】
他の実施形態では、本発明の組成物は、アジュバントを含まない。
【００６８】
医薬組成物は、対象、例えばヒト対象に投与してもよい。１回の投与中に対象に提供さ
れるワクチン活性成分の全用量は、熟練した施術者に公知であるように変動し得、アデノ
ウイルスについては、一般に１×１０７個のウイルス粒子（ｖｐ）〜１×１０１２ｖｐの
間、好ましくは１×１０８ｖｐ〜１×１０１１ｖｐの間、例えば３×１０８〜５×１０１
０ｖｐの間、例えば１０９〜３×１０１０ｖｐの間である。ＤＮＡワクチンについては、
１投与あたりのＤＮＡの総量は、例えば１μｇ〜１０ｍｇの間であってもよい。遺伝子銃
が投与に用いられる場合、典型的には少量、例えば１０μｇが用いられる。筋肉内注射に
おいては、典型的にはより多量、例えば最大５ｍｇが用いられる。
【００６９】
医薬組成物の投与は、標準の投与経路を用いて実施され得る。非限定的な実施形態とし
て、例えば注射による非経口投与、例えば、皮内、筋肉内など、または皮下もしくは経皮
、または粘膜投与、例えば、鼻腔内、経口、腟内、直腸などが挙げられる。一実施形態で
は、組成物は、筋肉内注射により、例えば、腕の三角筋、または大腿の外側広筋に投与さ
れる。特定の実施形態では、ワクチンはＤＮＡワクチンであり、例えばこれは、例えばＤ
ＮＡタトゥーイング（例えば、Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｕｒ
ｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５１：２２１−５０を参照）によ
り皮内投与され得る。この経路はまた、アデノウイルスベクターに使用可能である。特定
の実施形態では、本発明に従う組成物は、アデノウイルスベクターを含み、筋肉内注射に
より投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対して免疫応答を誘導するため、組成物
、例えばワクチンを投与するための様々な可能性を理解している。
【００７０】
本明細書で用いられる対象は、好ましくは哺乳動物、例えば齧歯類、例えばマウス、ま
たは非ヒト霊長類、またはヒトである。好ましくは、対象はヒト対象である。
【００７１】
本発明のワクチンは、例えば、（前）がん性病変、ならびに子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩ
Ｎ；子宮頸部異形成および子宮頸部間質性腫瘍としても公知であり、潜在的には子宮頸部
の表面上の扁平上皮細胞の前癌性形質転換および異常成長（異形成）である）から子宮頸
がん（子宮頸部扁平上皮がん（ＳＣＣ）などまで（を含む）が形成される前のような（例
えば、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験により検出されるような）偶発性および持続性ＨＰＶ感染から
のＨＰＶ（特に配列番号１〜６のいずれかを含むもしくはコードするワクチンに関しタイ
プ１６、または配列番号２０〜２３のいずれかを含むもしくはコードするワクチンに関し
タイプ１８、または本明細書に記載されるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８デザイナー分子の
両方を含むもしくはコードするワクチンに関し両タイプ）によって引き起こされる疾患の
様々なステージの１つを有する患者を治療するため、用いることができる。さらに、他の
ＨＰＶ誘発腫瘍、例えば外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、陰茎上
皮内腫瘍（ＰＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、ならびに中咽頭がん（頭頚部がんとし
ても公知）、陰茎がん、膣がん、外陰部がんおよび肛門がんのより進行したステージは、
標的化され得る。したがって、本発明のワクチンは、広範囲のＨＰＶ誘発性病変を標的に
し得、またＨＰＶ誘発性疾患の前癌ステージ、例えば（持続性）感染および／または腫瘍
ステージ（Ｅ２、Ｅ６および／もしくはＥ７の発現が最高である場合）では最も有効であ
る可能性が高い。本発明のワクチンを用いる治療を、進行したがん細胞における免疫回避
機構に対して相互作用するかまたは克服し得る化合物、例えば、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗
体、イピリムマブなどの抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ２５抗体、ＩＤ
Ｏ阻害剤、ＣＤ４０アゴニスト抗体、ＣＤ１３７アゴニスト抗体などと組み合わせること
も可能である（例えば、Ｈａｍｉｄ  ａｎｄ  Ｃａｒｖａｊａｌ，２０１３，Ｅｘｐｅｒ
ｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３：８４７−８６１；Ｍｅｌｌｍａｎ  ｅ
ｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  ４８０：４８０−８９）。治療ワクチン
接種方法はまた、ワクチンが外部性器疣贅を引き起こすＨＰＶ型のＥ６および／またはＥ
７（をコードする配列）をさらに含み、かかるＨＰＶ型による感染を受けた対象に投与さ
れる場合、原則として、外部性器疣贅またはその前駆病変を治療するため、用いることが
できる。
【００７２】
本明細書で用いられるとき、「治療する」は、患者におけるＨＰＶ１６または１８  Ｅ
６および／またはＥ７（のエピトープ）を発現する細胞に対する治療的免疫応答を誘導す
るためのワクチンの投与を意味し、それによりＨＰＶ１６または１８感染のレベルの少な
くとも低下および好ましくは完全な除去がもたらされ、その結果、腫瘍などのＨＰＶ１６
またはＨＰＶ１８誘発性疾患および／またはその症状の進行が少なくとも緩徐化し、好ま
しくは停止する。好ましくは、ワクチンによる治療もまた、より進行したステージのＨＰ
Ｖ誘発がんの寛解をもたらす。ワクチンを、分類されている確立されたＨＰＶ感染を有す
る患者に投与することが好ましいことから、対応するＨＰＶ型のポリペプチドをコードす
るワクチンが投与され得る。スクリーニングの不在下で、ワクチンはまた、ＨＰＶ感染の
可能性が高い集団、すなわち性交好きな人々の一部において投与され得る。本発明のワク
チンは、ＨＰＶ１６または１８による感染を受けていない対象に、例えば予防用途で、お
そらくは患者が感染を受けていない、またはその他として非感染対象において別のＨＰＶ
型に対するワクチンと組み合わせて投与することも可能である。本発明のワクチンはまた
、他の手段によるさらなる治療、例えば手術（ＨＰＶ１６または１８感染によって引き起
こされる病変の除去）、またはイミキモドによる治療（ＴＬＲ−７／８作動薬を含む、例
えば、Ｄａｙａａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０２：１
１２９−３６を参照）に対する対象である対象に投与され得る。治療の効果は、細胞診ま
たはＨＰＶ試験のいずれかにより測定され得る。
【００７３】
ワクチン接種は、本発明のワクチンを対象または患者に少なくとも１回投与するステッ
プを含む。１回以上のさらなるワクチンの１回以上のブースター投与を提供することも可
能である。追加免疫ワクチン接種が実施される場合、典型的にはかかる追加免疫ワクチン
接種は、同じ抗原を有する免疫原性組成物を初めて対象に投与（「プライミングワクチン
接種」と称されるような場合に相当）後、１週〜１年の間、好ましくは２週〜４か月の間
の期間に同じ対象に投与されることになる。他の追加免疫レジメンでは、異なるベクター
、例えば異なる血清型の１つ以上のアデノウイルス、またはＭＶＡなどの他のベクター、
またはＤＮＡ、またはタンパク質をプライミングまたは追加免疫ワクチン接種として対象
に投与することも可能である。特定の実施形態では、本発明の同じ形態のワクチンは、例
えば本発明に従う同じ組換えアデノウイルス（Ａｄ２６など）を用いたプライム−ブース
トレジメンで同じ患者に少なくとも２回投与される。特定の実施形態では、本発明のワク
チンは、プライム−ブーストレジメンで少なくとも２回投与されるが、ワクチンのベクタ
ーは異なり、例えばアデノウイルスベクターの２つの異なる血清型が用いられ、例として
、組換えＡｄ２６によるプライミングおよび組換えＡｄ３５による追加免疫、またはその
逆；あるいはＤＮＡによるプライミングおよびアデノウイルスベクターによる追加免疫、
またはその逆；あるいはアデノウイルスベクターによるプライミングおよびＭＶＡベクタ
ーによる追加免疫、またはその逆、が挙げられる。例示的な実施形態は、Ａｄ２６ベクタ
ーでのプライミングおよびＡｄ３５ベクターでのブースティング、Ａｄ２６ベクターでの
プライミングおよびＭＶＡベクターでのブースティング、Ａｄ３５でのプライミングおよ
びＭＶＡベクターでのブースティング、Ａｄ３５ベクターでのプライミングおよびＡｄ２
６ベクターでのブースティング等を含み、各場合において、プライミングおよびブーステ
ィング用ベクターは本発明のデザイナーポリペプチドをコードする核酸を含み、好ましく
はプライミングおよびブースティング用ベクターはそれぞれ同一の本発明のデザイナーポ
リペプチドをコードする。特定の実施形態では、本発明に従うワクチンは、プライム−ブ
ースト−ブーストレジメンで少なくとも３回投与される。さらなるブースター投与をレジ
メンに加えてもよい。同時にまたは実質的に同時に（例えば、１０分以内の間隔で）アデ
ノウイルスベクターおよびＭＶＡベクター（同一組成物内または異なる組成物内のどちら
であってもよい）を投与して、免疫応答を誘導する（例えば、国際公開第２０１０／０７
３０４３号パンフレットを参照）こともできる。
【００７４】
対象においてＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８に対するＣＴＬ応答を誘導することも本発明
の態様であり、本発明に従うワクチンを対象に投与するステップを含む。当業者は、ＨＰ
Ｖ１６配列（配列番号１〜６のいずれかをコードするまたは含む）を含むワクチンがＨＰ
Ｖ１６感染に対して最も有効であり、ＨＰＶ１６感染に対する使用が意図されており、ま
た、ＨＰＶ１８配列（配列番号２０〜２３のいずれかをコードするまたは含む）を含むワ
クチンがＨＰＶ１８感染に対して最も有効であり、ＨＰＶ１８感染に対する使用が意図さ
れていると理解するであろう。
【００７５】
本発明はまた、以下の非限定的な実施形態、すなわち
１）配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸；
２）ポリペプチドがＨＰＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも一部をさらに含む、実施形態１
に記載の核酸；
３）ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＨＰＶ１６のＥ２タンパク質に由来する
、実施形態２に記載の核酸；
４）ポリペプチドが配列番号１を有するポリペプチドのＮ末端側に融合されたＥ２タンパ
ク質の少なくとも一部を含む、実施形態２に記載の核酸；
５）ポリペプチドが配列番号１を有するポリペプチドのＣ末端側に融合されたＥ２タンパ
ク質の少なくとも一部を含む、実施形態２に記載の核酸；
６）ポリペプチドが配列番号１を有するポリペプチドのＮ末端側に融合されたＥ２タンパ
ク質の少なくとも一部を含む、実施形態３に記載の核酸；
７）ポリペプチドが配列番号１を有するポリペプチドのＣ末端側に融合されたＥ２タンパ
ク質の少なくとも一部を含む、実施形態３に記載の核酸；
８）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有する
Ｅ２タンパク質の変異体を含む、実施形態２に記載の核酸；
９）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有する
Ｅ２タンパク質の変異体を含む、実施形態３に記載の核酸；
１０）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有す
るＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態４に記載の核酸；
１１）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有す
るＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態５に記載の核酸；
１２）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有す
るＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態６に記載の核酸；
１３）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有す
るＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態７に記載の核酸；
１４）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態１に記載の核酸を含むベクター；
１５）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態２に記載の核酸を含むベクター；
１６）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態３に記載の核酸を含むベクター；
１７）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態４に記載の核酸を含むベクター；
１８）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態５に記載の核酸を含むベクター；
１９）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態６に記載の核酸を含むベクター；
２０）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態７に記載の核酸を含むベクター；
２１）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態８に記載の核酸を含むベクター；
２２）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態９に記載の核酸を含むベクター；
２３）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態１０に記載の核酸を含むベクター；
２４）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態１１に記載の核酸を含むベクター；
２５）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態１２に記載の核酸を含むベクター；
２６）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施
形態１３に記載の核酸を含むベクター；
２７）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１４に記載のベクター；
２８）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１５に記載のベクター；
２９）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１６に記載のベクター；
３０）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１７に記載のベクター；
３１）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１８に記載のベクター；
３２）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１９に記載のベクター；
３３）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２０に記載のベクター；
３４）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２１に記載のベクター；
３５）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２２に記載のベクター；
３６）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２３に記載のベクター；
３７）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２４に記載のベクター；
３８）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２５に記載のベクター；
３９）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２６に記載のベクター；
４０）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２７に記載の
ベクター；
４１）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２８に記載の
ベクター；
４２）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２９に記載の
ベクター；
４３）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３０に記載の
ベクター；
４４）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３１に記載の
ベクター；
４５）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３２に記載の
ベクター；
４６）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３３に記載の
ベクター；
４７）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３４に記載の
ベクター；
４８）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３５に記載の
ベクター；
４９）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３６に記載の
ベクター；
５０）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３７に記載の
ベクター；
５１）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３８に記載の
ベクター；
５２）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３９に記載の
ベクター；
５３）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２８に記載の
ベクター；
５４）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２９に記載の
ベクター；
５５）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３０に記載の
ベクター；
５６）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３１に記載の
ベクター；
５７）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３２に記載の
ベクター；
５８）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３３に記載の
ベクター；
５９）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３４に記載の
ベクター；
６０）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３５に記載の
ベクター；
６１）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３６に記載の
ベクター；
６２）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３７に記載の
ベクター；
６３）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３８に記載の
ベクター；
６４）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３９に記載の
ベクター；
６５）実施形態１４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
６６）実施形態１５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
６７）実施形態１６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
６８）実施形態１７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
６９）実施形態１８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
７０）実施形態１９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
７１）実施形態２０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
７２）実施形態２１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
７３）実施形態２２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
７４）実施形態２３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
７５）実施形態２４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
７６）実施形態２５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
７７）実施形態２６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
７８）実施形態２７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
７９）実施形態２８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
８０）実施形態２９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
８１）実施形態３０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
８２）実施形態３１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
８３）実施形態３２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
８４）実施形態３３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
８５）実施形態３４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
８６）実施形態３５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
８７）実施形態３６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
８８）実施形態３７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
８９）実施形態３８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
９０）実施形態３９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
９１）実施形態４０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
９２）実施形態４１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
９３）実施形態４２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
９４）実施形態４３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
９５）実施形態４４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
９６）実施形態４５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
９７）実施形態４６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
９８）実施形態４７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
９９）実施形態４８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン
組成物；
１００）実施形態４９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１０１）実施形態５０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１０２）実施形態５１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１０３）実施形態５２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１０４）実施形態５３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１０５）実施形態５４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１０６）実施形態５５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１０７）実施形態５６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１０８）実施形態５７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１０９）実施形態５８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１１０）実施形態５９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１１１）実施形態６０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１１２）実施形態６１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１１３）実施形態６２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１１４）実施形態６３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１１５）実施形態６４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチ
ン組成物；
１１６）対象におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導するための方法であって、実施形態
６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、
方法；
１１７）持続性ＨＰＶ（１６型）感染を治療するための方法であって、実施形態６５〜１
１５のいずれか一つに記載のワクチンを、持続性ＨＰＶ感染を患う対象に投与するステッ
プを含む、方法；
１１８）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）を治療するた
めの方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、ＶＩＮを
患う対象に投与するステップを含む、方法；
１１９）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）外陰部がんを治療するための方法であっ
て、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、外陰部がんを患う対象に
投与するステップを含む、方法；
１２０）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）を治療す
るための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、ＣＩ
Ｎを患う対象に投与するステップを含む、方法；
１２１）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）子宮頸がんを治療するための方法であっ
て、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、子宮頸がんを患う対象に
投与するステップを含む、方法；
１２２）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）中咽頭がんを治療するための方法であっ
て、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、中咽頭がんを患う対象に
投与するステップを含む、方法；
１２３）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を治療するた
めの方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、ＰＩＮを
患う対象に投与するステップを含む、方法；
１２４）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）陰茎がんを治療するための方法であって
、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、陰茎がんを患う対象に投与
するステップを含む、方法；
１２５）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）を治療するた
めの方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、ＶａＩＮ
を患う対象に投与するステップを含む、方法；
１２６）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）膣がんを治療するための方法であって、
実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、膣がんを患う対象に投与する
ステップを含む、方法；
１２７）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）を治療するた
めの方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、ＡＩＮを
患う対象に投与するステップを含む、方法；
１２８）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）肛門がんを治療するための方法であって
、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、肛門がんを患う対象に投与
するステップを含む、方法；
１２９）配列番号１を含むポリペプチド；
１３０）ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも一部をさらに含む、実施形態１２９に記載
のポリペプチド；
１３１）ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＨＰＶ１６のＥ２タンパク質に由来
する、実施形態１３０に記載のポリペプチド；
１３２）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部が配列番号１を有するポリペプチドのＮ末端側
に融合される、実施形態１３０に記載のポリペプチド；
１３３）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部が配列番号１を有するポリペプチドのＣ末端側
に融合される、実施形態１３０に記載のポリペプチド；
１３４）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部が配列番号１を有するポリペプチドのＮ末端側
に融合される、実施形態１３１に記載のポリペプチド；
１３５）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部が配列番号１を有するポリペプチドのＣ末端側
に融合される、実施形態１３１に記載のポリペプチド；
１３６）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１３０に記載のポリペプチド；
１３７）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１３１に記載のポリペプチド；
１３８）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１３２に記載のポリペプチド；
１３９）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１３３に記載のポリペプチド；
１４０）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１３４に記載のポリペプチド；
１４１）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１３５に記載のポリペプチド；
１４２）配列番号３に記載のポリペプチドをコードする、実施形態３に記載の核酸；
１４３）配列番号５に記載のポリペプチドをコードする、実施形態３に記載の核酸；
１４４）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１４２に記載の核酸をコードするベクター；
１４５）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１４３に記載の核酸をコードするベクター；
１４６）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１４４に記載のベクター；
１４７）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１４５に記載のベクター；
１４８）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態１４６に記
載のベクター；
１４９）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態１４７に記
載のベクター；
１５０）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態１４６に記
載のベクター；
１５１）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態１４７に記
載のベクター；
１５２）実施形態１４４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
１５３）実施形態１４５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
１５４）実施形態１４６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
１５５）実施形態１４７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
１５６）実施形態１４８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
１５７）実施形態１４９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
１５８）実施形態１５０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
１５９）実施形態１５１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
１６０）対象におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導するための方法であって、実施形態
１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む
、方法；
１６１）外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態１５２〜１
５９のいずれか１つに記載のワクチンを、ＶＩＮを患う対象に投与するステップを含む、
方法；
１６２）外陰部がんを治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか
１つに記載のワクチンを、外陰部がんを患う対象に投与するステップを含む、方法；
１６３）子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態１５２
〜１５９のいずれか１つに記載のワクチンを、ＣＩＮを患う対象に投与するステップを含
む、方法；
１６４）子宮頸がんを治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか
１つに記載のワクチンを、子宮頸がんを患う対象に投与するステップを含む、方法；
１６５）中咽頭がんを治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか
１つに記載のワクチンを、中咽頭がんを患う対象に投与するステップを含む、方法；
１６６）陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態１５２〜１
５９のいずれか１つに記載のワクチンを、ＰＩＮを患う対象に投与するステップを含む、
方法；
１６７）陰茎がんを治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１
つに記載のワクチンを、陰茎がんを患う対象に投与するステップを含む、方法；
１６８）腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態１５２〜１
５９のいずれか１つに記載のワクチンを、ＶａＩＮを患う対象に投与するステップを含む
、方法；
１６９）膣がんを治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つ
に記載のワクチンを、膣がんを患う対象に投与するステップを含む、方法；
１７０）肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態１５２〜１
５９のいずれか１つに記載のワクチンを、ＡＩＮを患う対象に投与するステップを含む、
方法；
１７１）肛門がんを治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１
つに記載のワクチンを、肛門がんを患う対象に投与するステップを含む、方法
を提供する。
１７２）配列番号２０を含むポリペプチドをコードする核酸；
１７３）ポリペプチドがＨＰＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも一部をさらに含む、実施形
態１７２に記載の核酸；
１７４）ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＨＰＶ１８のＥ２タンパク質に由来
する、実施形態１７３に記載の核酸；
１７５）ポリペプチドが配列番号２０を有するポリペプチドのＮ末端側に融合されたＥ２
タンパク質の少なくとも一部を含む、実施形態１７３に記載の核酸；
１７６）ポリペプチドが配列番号２０を有するポリペプチドのＣ末端側に融合されたＥ２
タンパク質の少なくとも一部を含む、実施形態１７３に記載の核酸；
１７７）ポリペプチドが配列番号２０を有するポリペプチドのＮ末端側に融合されたＥ２
タンパク質の少なくとも一部を含む、実施形態１７４に記載の核酸；
１７８）ポリペプチドが配列番号２０を有するポリペプチドのＣ末端側に融合されたＥ２
タンパク質の少なくとも一部を含む、実施形態１７４に記載の核酸；
１７９）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１７３に記載の核酸；
１８０）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１７４に記載の核酸；
１８１）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１７５に記載の核酸；
１８２）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１７６に記載の核酸；
１８３）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１７７に記載の核酸；
１８４）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１７８に記載の核酸；
１８５）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１７２に記載の核酸を含むベクター；
１８６）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１７３に記載の核酸を含むベクター；
１８７）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１７４に記載の核酸を含むベクター；
１８８）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１７５に記載の核酸を含むベクター；
１８９）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１７６に記載の核酸を含むベクター；
１９０）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１７７に記載の核酸を含むベクター；
１９１）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１７８に記載の核酸を含むベクター；
１９２）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１７９に記載の核酸を含むベクター；
１９３）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１８０に記載の核酸を含むベクター；
１９４）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１８１に記載の核酸を含むベクター；
１９５）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１８２に記載の核酸を含むベクター；
１９６）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１８３に記載の核酸を含むベクター；
１９７）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態１８４に記載の核酸を含むベクター；
１９８）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１８５に記載のベクター；
１９９）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１８６に記載のベクター；
２００）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１８７に記載のベクター；
２０１）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１８８に記載のベクター；
２０２）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１８９に記載のベクター；
２０３）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１９０に記載のベクター；
２０４）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１９１に記載のベクター；
２０５）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１９２に記載のベクター；
２０６）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１９３に記載のベクター；
２０７）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１９４に記載のベクター；
２０８）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１９５に記載のベクター；
２０９）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１９６に記載のベクター；
２１０）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１９７に記載のベクター；
２１１）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態１９８に記
載のベクター；
２１２）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態１９９に記
載のベクター；
２１３）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２００に記
載のベクター；
２１４）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２０１に記
載のベクター；
２１５）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２０２に記
載のベクター；
２１６）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２０３に記
載のベクター；
２１７）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２０４に記
載のベクター；
２１８）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２０５に記
載のベクター；
２１９）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２０６に記
載のベクター；
２２０）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２０７に記
載のベクター；
２２１）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２０８に記
載のベクター；
２２２）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２０９に記
載のベクター；
２２３）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２１０に記
載のベクター；
２２４）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態１９８に記
載のベクター；
２２５）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態１９９に記
載のベクター；
２２６）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２００に記
載のベクター；
２２７）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２０１に記
載のベクター；
２２８）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２０２に記
載のベクター；
２２９）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２０３に記
載のベクター；
２３０）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２０４に記
載のベクター；
２３１）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２０５に記
載のベクター；
２３２）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２０６に記
載のベクター；
２３３）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２０７に記
載のベクター；
２３４）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２０８に記
載のベクター；
２３５）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２０９に記
載のベクター；
２３６）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２１０に記
載のベクター；
２３７）実施形態１８５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２３８）実施形態１８６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２３９）実施形態１８７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２４０）実施形態１８８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２４１）実施形態１８９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２４２）実施形態１９０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２４３）実施形態１９１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２４４）実施形態１９２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２４５）実施形態１９３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２４６）実施形態１９４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２４７）実施形態１９５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２４８）実施形態１９６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２４９）実施形態１９７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２５０）実施形態１９８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２５１）実施形態１９９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２５２）実施形態２００に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２５３）実施形態２０１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２５４）実施形態２０２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２５５）実施形態２０３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２５６）実施形態２０４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２５７）実施形態２０５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２５８）実施形態２０６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２５９）実施形態２０７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２６０）実施形態２０８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２６１）実施形態２０９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２６２）実施形態２１０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２６３）実施形態２１１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２６４）実施形態２１２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２６５）実施形態２１３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２６６）実施形態２１４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２６７）実施形態２１５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２６８）実施形態２１６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２６９）実施形態２１７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２７０）実施形態２１８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２７１）実施形態２１９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２７２）実施形態２２０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２７３）実施形態２２１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２７４）実施形態２２２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２７５）実施形態２２３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２７６）実施形態２２４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２７７）実施形態２２５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２７８）実施形態２２６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２７９）実施形態２２７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２８０）実施形態２２８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２８１）実施形態２２９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２８２）実施形態２３０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２８３）実施形態２３１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２８４）実施形態２３２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２８５）実施形態２３３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２８６）実施形態２３４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２８７）実施形態２３５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２８８）実施形態２３６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
２８９）対象におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導するための方法であって、実施形態
２３７〜２８８のいずれか１つに記載のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む
、方法；
２９０）持続性ＨＰＶ（１８型）感染を治療するための方法であって、実施形態２３７〜
２８８のいずれか１つに記載のワクチンを、持続性ＨＰＶ感染を患う対象に投与するステ
ップを含む、方法；
２９１）（根底にあるＨＰＶ１８型感染を伴う）外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）を治療するた
めの方法であって、実施形態２３７〜２８８のいずれか１つに記載のワクチンを、ＶＩＮ
を患う対象に投与するステップを含む、方法；
２９２）（根底にあるＨＰＶ１８型感染を伴う）外陰部がんを治療するための方法であっ
て、実施形態２３７〜２８８のいずれか１つに記載のワクチンを、外陰部がんを患う対象
に投与するステップを含む、方法；
２９３）（根底にあるＨＰＶ１８型感染を伴う）子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）を治療す
るための方法であって、実施形態２３７〜２８８のいずれか１つに記載のワクチンを、Ｃ
ＩＮを患う対象に投与するステップを含む、方法；
２９４）（根底にあるＨＰＶ１８型感染を伴う）子宮頸がんを治療するための方法であっ
て、実施形態２３７〜２８８のいずれか１つに記載のワクチンを、子宮頸がんを患う対象
に投与するステップを含む、方法；
２９５）（根底にあるＨＰＶ１８型感染を伴う）中咽頭がんを治療するための方法であっ
て、実施形態２３７〜２８８のいずれか１つに記載のワクチンを、中咽頭がんを患う対象
に投与するステップを含む、方法；
２９６）（根底にあるＨＰＶ１８型感染を伴う）陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を治療するた
めの方法であって、実施形態２３７〜２８８のいずれか１つに記載のワクチンを、ＰＩＮ
を患う対象に投与するステップを含む、方法；
２９７）（根底にあるＨＰＶ１８型感染を伴う）陰茎がんを治療するための方法であって
、実施形態２３７〜２８８のいずれか１つに記載のワクチンを、陰茎がんを患う対象に投
与するステップを含む、方法；
２９８）（根底にあるＨＰＶ１８型感染を伴う）腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）を治療するた
めの方法であって、実施形態２３７〜２８８のいずれか１つに記載のワクチンを、ＶａＩ
Ｎを患う対象に投与するステップを含む、方法；
２９９）（根底にあるＨＰＶ１８型感染を伴う）膣がんを治療するための方法であって、
実施形態２３７〜２８８のいずれか１つに記載のワクチンを、膣がんを患う対象に投与す
るステップを含む、方法；
３００）（根底にあるＨＰＶ１８型感染を伴う）肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）を治療するた
めの方法であって、実施形態２３７〜２８８のいずれか１つに記載のワクチンを、ＡＩＮ
を患う対象に投与するステップを含む、方法；
３０１）（根底にあるＨＰＶ１８型感染を伴う）肛門がんを治療するための方法であって
、実施形態２３７〜２８８のいずれか１つに記載のワクチンを、肛門がんを患う対象に投
与するステップを含む、方法；
３０２）配列番号２０を含むポリペプチド；
３０３）ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも一部をさらに含む、実施形態３０２に記載
のポリペプチド；
３０４）ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＨＰＶ１８のＥ２タンパク質に由来
する、実施形態３０３に記載のポリペプチド；
３０５）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部が配列番号２０を有するポリペプチドのＮ末端
側に融合される、実施形態３０３に記載のポリペプチド；
３０６）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部が配列番号２０を有するポリペプチドのＣ末端
側に融合される、実施形態３０３に記載のポリペプチド；
３０７）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部が配列番号２０を有するポリペプチドのＮ末端
側に融合される、実施形態３０４に記載のポリペプチド；
３０８）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部が配列番号２０を有するポリペプチドのＣ末端
側に融合される、実施形態３０４に記載のポリペプチド；
３０９）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態３０３に記載のポリペプチド；
３１０）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態３０４に記載のポリペプチド；
３１１）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態３０５に記載のポリペプチド；
３１２）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態３０６に記載のポリペプチド；
３１３）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態３０７に記載のポリペプチド；
３１４）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有
するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態３０８に記載のポリペプチド；
３１５）配列番号２２に記載のポリペプチドをコードする、実施形態１７４に記載の核酸
；
３１６）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実
施形態３１５に記載の核酸をコードするベクター；
３１７）ベクターがアデノウイルスである、実施形態３１６に記載のベクター；
３１８）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３１７に記
載のベクター；
３１９）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３１７に記
載のベクター；
３２０）実施形態３１６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
３２１）実施形態３１７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
３２２）実施形態３１８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
３２３）実施形態３１９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワク
チン組成物；
３２４）対象におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導するための方法であって、実施形態
３２０〜３２４のいずれか１つに記載のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む
、方法；
３２５）外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態３２０〜３
２４のいずれか１つに記載のワクチンを、ＶＩＮを患う対象に投与するステップを含む、
方法；
３２６）外陰部がんを治療するための方法であって、実施形態３２０〜３２４のいずれか
１つに記載のワクチンを、外陰部がんを患う対象に投与するステップを含む、方法；
３２７）子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態３２０
〜３２４のいずれか１つに記載のワクチンを、ＣＩＮを患う対象に投与するステップを含
む、方法；
３２８）子宮頸がんを治療するための方法であって、実施形態３２０〜３２４のいずれか
１つに記載のワクチンを、子宮頸がんを患う対象に投与するステップを含む、方法；
３２９）中咽頭がんを治療するための方法であって、実施形態３２０〜３２４のいずれか
１つに記載のワクチンを、中咽頭がんを患う対象に投与するステップを含む、方法；
３３０）陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態３２０〜３
２４のいずれか１つに記載のワクチンを、ＰＩＮを患う対象に投与するステップを含む、
方法；
３３１）陰茎がんを治療するための方法であって、実施形態３２０〜３２４のいずれか１
つに記載のワクチンを、陰茎がんを患う対象に投与するステップを含む、方法；
３３２）腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態３２０〜３
２４のいずれか１つに記載のワクチンを、ＶａＩＮを患う対象に投与するステップを含む
、方法；
３３３）膣がんを治療するための方法であって、実施形態３２０〜３２４のいずれか１つ
に記載のワクチンを、膣がんを患う対象に投与するステップを含む、方法；
３３４）肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態３２０〜３
２４のいずれか１つに記載のワクチンを、ＡＩＮを患う対象に投与するステップを含む、
方法；
３３５）肛門がんを治療するための方法であって、実施形態３２０〜３２４のいずれか１
つに記載のワクチンを、肛門がんを患う対象に投与するステップを含む、方法；
３３６）配列番号１をコードする核酸および配列番号２０をコードする核酸を含む組成物
；
３３７）配列番号３をコードする核酸および配列番号２２をコードする核酸を含む実施形
態３３６に記載の組成物；
３３８）対象におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導するための方法であって、配列番号
１をコードする核酸および配列番号２０をコードする核酸を対象に投与するステップを含
む、方法；
３３９）配列番号３をコードする核酸および配列番号２２をコードする核酸を対象に投与
するステップを含む実施形態３３８に記載の方法；
３４０）（ｉ）配列番号１をコードする核酸および（ｉｉ）配列番号２０をコードする核
酸を含むパーツキット；
３４１）配列番号１をコードする核酸および配列番号２０をコードする核酸を含むワクチ
ン組成物および薬学的に許容できる賦形剤；
３４２）対象における、持続性ＨＰＶ感染、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内
腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸がん（
子宮頸部扁平上皮がん（ＳＣＣ）など）、中咽頭がん、陰茎がん、膣がんまたは肛門がん
を治療するための方法であって、配列番号１をコードする核酸および配列番号２０をコー
ドする核酸を対象に投与するステップを含む、方法。
【００７６】
本発明の実施では、別段の指示がない限り、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物
学、および組換えＤＮＡの従来の技術が当該技術の範囲内で用いられることになる。例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏ
ｎ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９８７；ｔｈｅ  ｓｅｒ
ｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭａｃＰｈｅｒ
ｓｏｎ  ＭＪ，Ｈａｍｓ  ＢＤ，Ｔａｙｌｏｒ  ＧＲ，ｅｄｓ，１９９５；Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ
，ｅｄｓ，１９８８を参照のこと。
【００７７】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。実施例は、決して本発明を限定す
るものではない。実施例はあくまで本発明を明らかにするのに役立つ。
【実施例】
【００７８】
実施例１：本質的にすべてのＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７  ＣＴＬエピトープを含むデザ
イナーポリペプチドの構築
発明者は、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質の本質的にすべてのＣＴＬエピトー
プを有し、期待／予測される強力なネオエピトープ（ネオエピトープは野生型ＨＰＶ１６
Ｅ６およびＥ７タンパク質中に存在しないエピトープを意味する）を最少数有する新規
な非腫瘍化ポリペプチド（およびそれをコードする核酸）を設計した。ＨＰＶ１６に関す
る本発明のポリペプチド（本明細書中で「Ｅ６Ｅ７ＳＨ」とも称されるときがある）は、
配列番号１で提供される配列を含む。このポリペプチドをコードするコドン最適化核酸は
、配列番号２で提供される。
【００７９】
本発明の分子は、複数分子が用いられる方法よりも作製上の利点を提供する単一分子で
ある。さらに、本発明のポリペプチドは、ＨＰＶ１６の野生型Ｅ６およびＥ７中に存在す
る本質的にすべての推定上のＣＴＬエピトープを含み、それと同時に、潜在的には免疫優
勢であり得る期待／予測される強力なネオエピトープを最少数有し、それ故に免疫応答を
関連のある野生型ＣＴＬエピトープから転用する。それ故、本発明の構築物は、あり得る
ＣＴＬエピトープがいずれか欠如し、かつ／またはより多いまたはより強力なネオエピト
ープを有する、他者によって記載された分子よりも免疫学的に好都合である。
【００８０】
例えば、配列番号１の構築物は、ＩＥＤＢウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．
ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ｂｉｎｄｉ
ｎｇ．ｈｔｍｌ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００９−０９−０１Ｂ）での「ＭＨＣクラスＩ分子
に対するペプチド結合（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  
Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」における予測ツールの、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂに対す
るＡＮＮ（Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒ
ｅｓ  ３６：Ｗ５０９−１２）およびＳＭＭ法（Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３
，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１９：１７６５−７２）ならびにＨＬＡ−Ｃに対するＮ
ｅｔＭＨＣｐａｎ法（Ｈｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ  ６１：１−１３）を用いた判定として、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ａ、２０の最も
一般的なＨＬＡ−Ｂおよび２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ＊０１
：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０７、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ−
Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ−Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２９
：０２、ＨＬＡ−Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３０：０２、ＨＬＡ−Ａ＊３１：０１、
ＨＬＡ−Ａ＊３２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３３：０３、ＨＬＡ−
Ａ＊３４：０１、ＨＬＡ−Ａ＊６８：０１、ＨＬＡ−Ａ＊６８：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊０７
：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０４、ＨＬＡ−Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３：０１、
ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ−
Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４０
：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０６、ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３、
ＨＬ−Ｂ＊４６：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ−Ｂ
＊５２：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０７：
０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０１：０２、Ｈ
ＬＡ−Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ−Ｃ
＊０８：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０２：
０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０３：０２、Ｈ
ＬＡ−Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ−Ｃ
＊０４：０３、ＨＬＡ−Ｃ＊１７：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊１４：０３）に対する予測される
結合親和性＜５０ｎＭを有する９アミノ酸長の１つのネオエピトープのみを有する。Ｚｈ
ａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）には、ＩＥＤＢ分析リソースが記載される。
【００８１】
ＩＥＤＢウェブサイトでのＳＭＭ予測ツールを用いての非限定例として、Ｏｏｓｔｅｒ
ｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：３９７−４０
６およびＯｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４
：２８８０−９３により記載されるようなシャッフルされたＥ６およびＥ７配列は各々、
コア部分において、２０の大部分のＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂに対する９つの潜在的な
強力な固有のネオエピトープ（ＡＮＮまたはＳＭＭ  ＩＣ５０＜５０ｎＭ）を有する。こ
れはさらに、その手法で用いられる付録（ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ）を除外する（ここで付
録は、付加的なネオエピトープにさらに寄与することになり、また「重複」の長さが制限
されていることに起因してより多くの天然ＭＨＣＩＩエピトープに対する機会を逃す可能
性がある）。当然ながら、国際公開第２０１３／０８３２８７号パンフレットに記載され
た、報告としてシャッフルされたＥ６およびＥ７タンパク質を伴う変異体を有する改善さ
れた分子は、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ａ、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｂおよび２０
の最も一般的なＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子に対して予測されたＩＣ５０＜５０ｎＭ（ＡＮＮ、
ＳＭＭもしくはＮｅｔＭＨＣＰａｎ）を伴う、９つのアミノ酸長を有する２２の固有のネ
オエピトープを有する。
【００８２】
したがって、本発明のデザイナー分子は、Ｅ６およびＥ７が機能性を除去するためにシ
ャッフルされる場合の他の公表された手法と比べて極めて数が少なめの予測されるネオエ
ピトープを有することにおいて明らかに好都合である。
【００８３】
発明者がこのように設計したＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨ分子（すなわち、配列番号１で
提供されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする核酸、すなわち配列番号２
を含む核酸配列を合成し、５’末端上のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびコザック配列ならびに
３’部位上のＸｂａＩ部位によって隣接させた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙでのカスタム合成および標準分子クローニング）
。
【００８４】
合成された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて、細菌耐性マーカー（アン
ピシリン）および哺乳動物耐性マーカー（ネオマイシン）の双方を有する標準の発現ベク
ターｐＣＤＮＡ２００４．Ｎｅｏにクローン化し、例えば（一過性）遺伝子導入に基づく
実験用に本発明の分子をコードするプラスミドベクターを得た。
【００８５】
これらの分子は、かかる以外にも、追加的な特徴を有するさらなる分子のための基盤と
しても用いることができた。非限定例として、幾つかのさらなる変異体を下記のように調
製した。
【００８６】
ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質配列は他のＨＰＶ１６初期タンパク質の配列
と組み合わせることで、持続性感染を有する個体を標的にし、免疫される個体における免
疫レパートリーを広げることができる。Ｅ２に対する免疫応答は、ＨＰＶ１６感染のクリ
アランスにおいて重要な役割を果たすことが示唆されている（ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａ
ｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：４７２−４７９）。Ｅ２のＥ６Ｅ７ＳＨ
への融合は、持続性感染からＬＥＥＰ手術後の浸潤性がんまたは再発性／難治性疾患とい
ったＨＰＶ関連がんの諸ステージに対する抗原を有するワクチン成分を供することになる
。したがって、かかる実施形態の非限定例として、発明者は、Ｅ６Ｅ７ＳＨとそのＮ末端
でのＥ２との融合タンパク質をコードする配列を調製した。Ｅ２配列内で、融合タンパク
質を発現する細胞内での遺伝子発現に影響を与え得るＤＮＡ結合活性を抑制するための修
飾を行うことができる。発明者は、野生型ＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク質の、位置２９３の
グリシンを、位置２９９のリジンを、また位置３００のシステインを各々、バリン、メチ
オニンおよびアルギニンに突然変異させた。これらの自発的に生じる突然変異の各々は既
に、Ｅ２のＥ２結合ドメインを有するＤＮＡ配列への結合を完全に抑制する（Ｐｒａｋａ
ｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６：１０５−１６）。
【００８７】
得られたポリペプチドは、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨと称し、配列番号３を含む。
このポリペプチドをコードするコドン最適化配列を調製し、それを配列番号４にて提供す
る。
【００８８】
発明者はまた、同じＥ２変異タンパク質が、配列番号５を含む、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７
Ｅ２ＳＨと称されるポリペプチドを生じさせる、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合ポリペプ
チドのＣ末端に融合した変異体を構築した。この構築物をコードする配列は、配列番号６
として提供する。
【００８９】
対照を目的として、発明者はまた、融合タンパク質としての完全長ＨＰＶ１６  Ｅ６お
よびＥ７における野生型配列を有するポリペプチド（ａａ１〜１５８のＥ６がａａ１〜９
８のＥ７に直接融合されたものであり、本明細書中でＥ６Ｅ７ｗｔと称される）をコード
する配列を構築した。
【００９０】
発明者はまた、リーダー配列をポリペプチドに付加する効果について試験した。非限定
例として、ＩｇＥリーダー配列（例えば、米国特許第６，７３３，９９４号明細書を参照
）［リーダーペプチドの配列は配列番号７で提供される］をコードする配列を、構築物、
例えばＬＳＥ６Ｅ７ｗｔを与えるＥ６Ｅ７ｗｔ構築物内、またＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを与
えるＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ構築物内の一部のＮ末端に融合した。その効果は、免疫マウスにお
けるＥ７四量体分析による測定によると、ＬＳ配列を有しない同じ抗原と比べて有意に（
ｐ＜０．０５）増強された免疫原性であった（例えば図９中に見られる通りである）。
【００９１】
本発明のＥ６Ｅ７ＳＨポリペプチドをコードする配列は、Ｅ２の有無にかかわらず、例
えば、ＤＮＡ構築物から、ＲＮＡから、またはウイルスベクターから発現され得る。図１
は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞内での上記のような導入遺伝子を発現するＤＮＡベクターの一
過性遺伝子導入時の発現を示す。遺伝子導入後、細胞を収集し、細胞抽出物を、ＨＰＶ１
６  Ｅ７に対する抗体を用いてのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによ
り分析した。この実験は、発現ベクターの遺伝子導入時での適切なサイズの想定される融
合タンパク質の発現を示す。
【００９２】
Ｅ２の有無にかかわらず、またコードされた融合タンパク質の免疫原性を増強するため
の追加的配列の有無にかかわらず、いずれにしてもＥ６Ｅ７を発現させるには、アデノウ
イルスベクターを用いることができる。
【００９３】
上記のＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ｗｔ対照またはＨＰＶ１６デザイナー配列をコードする遺
伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔにより、ヒト発現のために最適化され、合成された遺伝子であっ
た。コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ３’）はＡＴＧ開始コドンの直前に含め、また２つ
の停止コドン（５’ＴＧＡ  ＴＡＡ３’）は各々のコード配列の終端に付加した。遺伝子
は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を介して、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵプラスミド中
およびｐＡｄＡｐｔ２６プラスミド中に挿入した（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０
０６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７，２１３５−４３）。
【００９４】
すべてのアデノウイルスは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞内で単一の相同組換えにより作製し、前
述のように生成した（ｒＡｄ３５について：Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，
Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：２１３５−４３；ｒＡｄ２６について：Ａｂｂｉｎｋ  
ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：４６５４−６３）。ＰＥＲ．Ｃ６細胞
（Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：１９０
９−１７）は、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を有する
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
【００９５】
簡潔に述べると、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって提供され
る使用説明書に従い、リポフェクタミンを用いて、ＰＥＲ．Ｃ６細胞にＡｄベクタープラ
スミドを遺伝子導入した。細胞は、十分な細胞変性効果（ＣＰＥ）に達した１日後に収集
し、凍結解凍させ、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、−２０℃で貯蔵した。ウイル
スは、マルチウェル２４組織培養プレートの単一のウェル内で培養したＰＥＲ．Ｃ６細胞
内でプラーク精製し、増幅した。Ｔ２５組織培養フラスコ内と、その後のＴ１７５組織培
養フラスコ内で培養したＰＥＲ．Ｃ６細胞内でさらなる増幅を実施した。Ｔ１７５フラス
コの後に得られた細胞から調製したクルードライセートからの３〜５ｍｌをＰＥＲ．Ｃ６
細胞の７０％のコンフルエント層を有する２４×Ｔ１０００の５層の組織培養フラスコに
接種するのに用いた。２ステップのＣｓＣｌ精製法を用いてウイルスを精製した。最後に
、ウイルスを−８５℃でアリコート中に貯蔵した。
【００９６】
Ａｄ３５．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ｗｔ、およびＡｄ３５．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ＳＨは
、野生型ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質の融合タンパク質（Ｅ６Ｅ７ｗｔ）、な
らびに上記のようなデザイナー融合タンパク質変異体（Ｅ６Ｅ７ＳＨ、配列番号１で提供
されるアミノ酸配列を有する）の各々の発現のための、コドン最適化されたヌクレオチド
配列を含む組換えアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）ベクターである。組み合わされ
たＥ６およびＥ７配列は、Ｅ１、Ｅ３が欠失したアデノウイルスゲノムのＥ１領域内のＣ
ＭＶプロモーターの制御下に置いた。Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ｗｔ、およびＡｄ
２６．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ＳＨは、組換えアデノウイルス血清型２６に基づく等価なベ
クターである。
【００９７】
同様に、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列番号３）変異体をコードするＡｄ２６お
よびＡｄ３５に基づく組換えアデノウイルスベクターを生成した。同様に、ＨＰＶ１６  
Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨ（配列番号５）変異体をコードするＡｄ２６およびＡｄ３５を生成した
。また、Ｎ末端にＩｇＥリーダー配列を有するＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質をコード
するＡｄ３５ベクターを生成し、Ａｄ３５．ＨＰＶ１６−ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨと称した
。また、Ｎ末端でのＩｇＥリーダー配列に融合されたＥ６Ｅ７ｗｔを有する対照アデノウ
イルスを生成した。
【００９８】
組換えアデノウイルスをＰＥＲ．Ｃ６細胞で生成し、塩化セシウム勾配での遠心分離に
より精製した。リプレッサー系に結合させた構築物のさらなる例を、下の後述する実施例
で提供する。
【００９９】
実施例２．ＨＰＶ１６デザイナー構築物の形質転換活性の欠損
野生型ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質は、特定のアッセイにおける形質転換活
性（例えば軟寒天アッセイにおけるコロニー形成）として明白な腫瘍化の可能性を有する
（Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  
１１９：３８１−３９５）。実施例１に記載のＥ６Ｅ７ＳＨポリペプチドは、再整理され
た様式でのＥ６およびＥ７タンパク質の断片を含む。これは、例えばかかるアッセイにお
ける野生型Ｅ６およびＥ７タンパク質のいずれかと比べて有意に低下した形質転換活性に
より測定可能である通り、腫瘍化の可能性を排除することが期待される。
【０１００】
他者がＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の遺伝子シャッフルされた変異体が当然ながらその
発がん可能性を失っていることを報告したが（Ｏｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ
．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３；Ｈｅｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，
２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４２５９−６６）、これは遺伝子シャフリングにより
Ｅ６およびＥ７タンパク質の野生型機能が破壊されることを示している。
【０１０１】
腫瘍化特性の欠如を評価するため、発明者は、我々のＥ６Ｅ７ＳＨ構築物が（例えば、
Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １
１９：３８１−３９５で記載の通り）ＮＩＨ３Ｔ３細胞上の軟寒天中での増殖能を与える
能力を評価した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞への野生型ＨＰＶ１６  Ｅ７を発現するプラスミドの
遺伝子導入の結果、一貫してコロニー形成が生じた。これらのアッセイでは、野生型ＨＰ
Ｖ１６  Ｅ６単独の発現により、バックグラウンドを超えたコロニー形成が生じなかった
。これは、このアッセイではＥ７ｗｔがＥ６ｗｔよりもはるかに効率的であるという公表
された観察結果と一致している（Ｓｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ  Ｖｉｒｏ
ｌ  ６５：４８６０−６６）。我々のＥ６Ｅ７ＳＨ構築物の遺伝子導入は、４つの独立実
験では軟寒天中での細胞のコロニーの増殖をもたらさず（図２）、これは本発明のポリペ
プチドＥ６Ｅ７ＳＨをコードする核酸がＥ７に関連した形質転換能力を失っていることを
示した。
【０１０２】
Ｅ６およびＥ７の腫瘍化の可能性は、細胞タンパク質ｐ５３およびｐＲｂのレベルを各
々低下させるそれらの能力に関連している。本発明のポリペプチドＥ６Ｅ７ＳＨをコード
する核酸の構築物が分子レベルで野生型Ｅ６およびＥ７に関連した生物学的活性を有しな
いことを示すため、ｐ５３およびｐＲｂ分解アッセイを実施した。つまり、ＨＰＶ１６  
Ｅ６ｗｔおよび我々のＥ６Ｅ７ＳＨ構築物を、ｐ５３分解アッセイにおいて、内因性ｐ５
３が欠如したＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞内で発現させた。ｐＲｂ分解アッセイにおいては、
ＨＰＶ１６  Ｅ７ｗｔおよびＥ６Ｅ７ＳＨ構築物をｐＲｂヌルＳａｏｓ−２細胞内で発現
させた。図３で分かるように、ｐ５３と（Ｅ６Ｅ７ＳＨとでなく）Ｅ６ｗｔとの同時発現
は、ｐ５３レベルの低下をもたらす（パネルＡおよびＢ）。同様に、パネル３Ｃおよび３
Ｄは、ｐＲｂと（Ｅ６Ｅ７ＳＨとでなく）Ｅ７ｗｔとの同時発現がｐＲＢレベルの低下を
もたらすことを示す。これらのデータは、本発明のポリペプチドをコードする核酸が軟寒
天中でコロニー形成能を全く有することなく、また野生型Ｅ６およびＥ７ポリペプチドの
主な生物学的活性、すなわちｐ５３およびｐＲｂの各々の不活化を有しないことを示して
いる。
【０１０３】
本発明のポリペプチドをコードする核酸構築物の安全性をさらに実証するため、発明者
は、ＨＰＶ媒介性形質転換に対する天然標的細胞である一次ヒト包皮ケラチノサイトを用
いた。一次ヒトケラチノサイトの不死化は、Ｅ６およびＥ７野生型双方の作用を必要とす
る（Ｍｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６３：４４１７−２１）
。このアッセイは、おそらくは我々の構築物の安全性を実証するための生理学的に最も関
連性のあるインビトロアッセイである（Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５
，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１９：３８１−３９５）。ＨＰＶ１６由来の野生
型Ｅ６およびＥ７（Ｅ６Ｅ７ｗｔ）を発現するレンチウイルスを形質導入した細胞は、そ
れらの寿命の非形質導入対照細胞と比べての延長（図４）およびテロメラーゼの触媒サブ
ユニットであるｈＴＥＲＴの活性化（データは示さず）によって示されるように、一次ケ
ラチノサイトにおける不死化を誘導する。本発明のポリペプチド（Ｅ６Ｅ７ＳＨ）の発現
では、ＧＦＰが形質導入されたケラチノサイトまたは形質導入されないケラチノサイトと
比べて寿命を延ばすことができない。同様の結果が、２つの追加的な独立ドナーにおいて
得られた（データは示さず）。まとめると、これらのデータは、我々の構築物が、高度に
生理学的なモデルと考えられる、一次ヒトケラチノサイトにおける不死化を誘導する能力
を失っていることを示す。
【０１０４】
ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の同程度の断片が異なる順序で組み換えられた別の構築物
もまた、一次ヒト包皮ケラチノサイトを不死化することができなかった。しかし、最大で
約１２０〜１５０日の寿命の延長がその構築物において認められた。これは、この分野で
は一部予測不能であることを示し、この安全性に関連した態様における本発明に従う選択
されたデザイナー分子の優位性を示している。
【０１０５】
本実施例における実験は、本発明に従うＨＰＶ１６デザイナーポリペプチドをコードす
る核酸の形質転換活性の欠如と、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７  ｗｔ構築物よりも著しく
改善された安全性に関する強力な証拠を同時に提供する。
【０１０６】
実施例３．ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナー構築物に対する免疫応答
発明者は、実施例１に記載のようなＤＮＡベクターおよびアデノウイルスベクターを調
製している。
【０１０７】
発明者は、マウスが野生型Ｅ２、またはＥ６もしくはＥ７をコードするＤＮＡプラスミ
ドで免疫され、またＨＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６およびＥ７抗原による免疫により、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６マウスまたはＢａｌｂ／ｃマウスよりも広範な細胞免疫応答がＣＢ６Ｆ１で誘導さ
れる場合の初期実験に基づき、免疫応答を測定するのにＣＢ６Ｆ１マウス株を用いた。別
々の実験において、マウスを本発明の分子をコードするＤＮＡベクターで免疫し、細胞免
疫応答を測定した。ＨＰＶ１６  Ｅ７に特異的な免疫応答は、Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＤ
ＮＡプラスミドで免疫したマウスにおいて測定することができた（図５）。
【０１０８】
本実施例中に示す以下のデータは、アデノウイルスベクターを用いて実施したマウス実
験から得られる。
【０１０９】
ワクチンに誘導される免疫原性を評価するため、ＣＢ６Ｆ１マウスを、ＨＰＶ１６  Ｅ
６Ｅ７ｗｔ、ＬＳＥ６Ｅ７ｗｔ、Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクター（Ａｄ３５）ま
たは導入遺伝子をコードしないアデノベクター（Ｅｍｐｔｙ）で免疫した。マウスへの投
与について、５×１０９個のウイルス粒子（ｖｐ）および１×１０１０個のｖｐの２つの
用量を試験した。免疫の２週後および８週後、マウスを屠殺し、単離した脾細胞をＨＰＶ
１６  Ｅ７の１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激した。２週後および８週後のＥ７に特
異的な応答を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより分析した。データは図６に示す。
【０１１０】
これは、ＥＬＩＳＰＯＴ分析による測定によると、マウスのＡｄ３５．ＨＰＶ１６−Ｅ
６Ｅ７ＳＨによる免疫がＥ７に特異的な免疫応答を誘導することを示す。さらに、図６で
の結果は、Ｎ末端リーダー配列を導入遺伝子に付加することにより、アデノウイルスの発
現される導入遺伝子に対する免疫応答を増強する可能性を示す。
【０１１１】
次に、免疫原性に関してＨＰＶ１６  Ｅ２をＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨポリペプチドに
付加する効果を試験した。Ａｄ３５ベクターは、Ｎ末端（Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ）またはＣ末
端（Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨ）のいずれかに融合されたＥ２を有するポリペプチドをコードした
。ＣＢ６Ｆ１マウスを、１×１０１０個のｖｐの用量で免疫した。図７（Ｅ７四量体染色
）および図８（パネルＣ、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ）は、Ｅ７に対する免疫応答を示し
、免疫応答はＥ２を含むデザイナー構築物については、Ｅ２を含まない構築物と比べてよ
り高い傾向があるが、差異は統計学的に有意でなかった。Ｅ２に対する応答は、Ｅ６Ｅ７
ＳＨデザイナーポリペプチドに融合されたＥ２を有するアデノウイルスベクターに対する
応答と比べて、Ｅ２のみをコードするアデノウイルスベクターの場合がより高く（図８Ｂ
）、差異はＥ２対Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＥ２対Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨの双方において有意で
あった（Ｐ値：＜０．０５）。
【０１１２】
Ｅ２をさらに含むデザイナー構築物がＥ７に対する免疫応答をさらにもたらし、加えて
Ｅ２に対する免疫応答ももたらし得ることで、Ｅ２を含まない構築物よりも免疫応答の幅
が増加すると結論づけられる。
【０１１３】
リーダー配列の付加は、野生型Ｅ６およびＥ７の融合タンパク質のＮ末端に融合される
とき、より高いＥ７に特異的な応答をもたらすことが示された（図６Ｃ）。同様に、Ｅ２
Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質の免疫原性に対するリーダー配列の効果を判定した。したが
って、Ｎ末端Ｅ２の有無にかかわらないＨＰＶ１６  デザイナーポリペプチドをコードす
るＡｄ３５ベクターおよびＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードするＡｄ３５ベクターをマウス
の免疫のために用い、Ｅ７に特異的な免疫応答を測定するため、血液試料を２週間隔で採
取した（図９）。図７および８に示されるように、Ｅ６Ｅ７ＳＨに融合されたＮ末端もし
くはＣ末端のいずれかでのＥ２の存在は、免疫応答を増強する傾向が高かった。ＩｇＥリ
ーダー配列の付加により、Ｅ７に特異的な応答がさらに増強された（図９Ｂ）。本発明に
従うデザイナー分子をコードする３つすべてのアデノウイルスベクターにおいて、経時的
に持続的な免疫応答が認められ、また免疫後の最高の応答が実験の持続時間にわたっての
最高の応答に対応した。
【０１１４】
Ｎ末端Ｅ２をさらに含むデザイナー構築物によって誘導される応答が、コード化タンパ
ク質を特定の細胞区画に標的化する特定の配列、例えばＩｇＥリーダー配列の付加により
増強され得ると結論づけられる。
【０１１５】
本発明のペプチドに対する細胞免疫応答は、異なるタイプのアデノウイルスベクターを
用いて誘導され得る。先行実験では、発明者は、Ａｄ３５ベクターを用いた一方、図１０
の実験では、マウスを、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６アデノウイル
スベクターで免疫した。データは、Ａｄ２６に基づくワクチンによる免疫がまた、Ｅ７に
特異的なＴ細胞を誘導したことを示す。さらに、その結果によると、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ
６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ３５アデノウイルスベクターでの２回目の免疫が細胞免疫応答
をさらにブーストしたことが示される（図１０）。
【０１１６】
実施例４．アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）におけるＨＰＶ１６  デザイ
ナー構築物の免疫原性
本発明のデザイナー配列を発現するアデノウイルスベクターが非ヒト霊長類における免
疫応答を誘導する能力を評価するため、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノ
ベクター（Ａｄ２６）または導入遺伝子をコードしないアデノベクター（Ｅｍｐｔｙ）を
１×１０１１ｖｐの用量で筋肉内注射することにより、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａ
ｃａｑｕｅｓ）を免疫した。免疫の８週後、同じ抗原を発現するＡｄ２６ベクターによる
免疫により免疫応答をブーストした。１６週後、動物は、同じ抗原を発現するＡｄ３５ベ
クターのもう１回の注射を受けた。血液試料は数回の時点で採取し、単離した白血球をＨ
ＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６もしくはＥ７に対応するペプチドプールで一晩刺激した。特異的応
答をＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。データを図１１に示す。さらにプライム免
疫の１０週後および１８週後、本発明における新規な接合に及ぶペプチドに特異的な細胞
免疫応答を評価した。ＩＦＮγ応答の誘導は、すべての動物において＜５０ＳＦＵ／１×
１０６ＰＢＭＣの検出限界未満であった（データは示さず）。
【０１１７】
データは、Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨでの非ヒト霊長類の免疫により、
新規な接合に対してではない、コードされた導入遺伝子中に存在する３つすべてのＨＰＶ
１６タンパク質に対する細胞免疫応答が生じたことを示す。Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２
Ｅ６Ｅ７ＳＨによる追加的免疫により応答がブーストされ得、また対応するＡｄ３５ベク
ターによる１６週後の追加的ブーストにより、ＨＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６およびＥ７に特異
的な免疫応答がさらに増強された。
【０１１８】
別の実験（記載せず）では、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）を、２つ
のアデノウイルスベクター（一方がＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現し、他方がＨＰＶ１
６  Ｌ１タンパク質を発現する）の組み合わせの腟内投与により免疫した。Ｅ６およびＥ
７の双方に対する低いものの測定可能な細胞応答を、末梢単核血液細胞内で測定した。こ
れらの実験では、Ｌ１に対する強力な細胞免疫応答を検出した。
【０１１９】
実施例５．マウス腫瘍モデルにおける治療効果
ＨＰＶ１６（配列番号１を含む）に関する本発明のポリペプチドは、動物においてＨＰ
Ｖ１６に特異的な細胞免疫応答を誘導することができ、ＨＰＶ１６  Ｅ６および／または
Ｅ７を発現する細胞に対して治療効果を発揮し得る。治療的免疫、すなわち腫瘍増殖が開
始してからの免疫は、治療用ＨＰＶワクチン候補の有効性を実証するのに用いることがで
きる。Ａｄ２６およびＡｄ３５ベクターの治療効果を、ＴＣ−１細胞が注射されたマウス
（ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７を発現するマウス細胞）において試験した（Ｌｉｎ  ｅｔ
ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６：２１−６）。ＴＣ−１細胞は、マウ
スにおける皮下注射後、数日から数週以内に固形腫瘍を形成することになる。ワクチンの
不在下では、腫瘍は急速に増殖し、３０日以内に１０００ｍｍ３の所定のサイズに達した
（パネルＤおよびＥ）。このサイズに達したら、倫理的理由でマウスを屠殺する。
【０１２０】
ＳＬＰ（正の対照として用いられる；Ｋｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎ  Ｅ
ｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：１８３８−４７；Ｚｗａｖｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２
００２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：３５０−８）またはＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７Ｓ
Ｈを発現するアデノウイルスベクターを用いるプライムブースト免疫スキームの場合、Ｔ
Ｃ−１誘発腫瘍の増殖の著しい低下が認められた（図１２、パネルＢおよびＣ）。プライ
ム免疫後の最初の３０日でのより詳細な検査（パネルＦおよびＧ）によると、Ｅ２Ｅ６Ｅ
７ＳＨを発現するアデノベクターによる免疫が、腫瘍増殖に対してＳＬＰによる免疫より
も実質的に大きな影響を有することが示される。初期増殖速度ははるかに低下し、ほとん
どの場合、腫瘍は収縮した。アデノウイルスベクターによって免疫したマウスの１１匹中
３匹において、腫瘍は完全に根絶されたが、それは生存プロットに反映されている（パネ
ルＨ）。
【０１２１】
結論として、本発明のＨＰＶ１６デザイナーポリペプチドを発現するアデノウイルスベ
クターによる免疫により、ＨＰＶ１６誘発がんに対する十分に確立された負荷モデルにお
いて、腫瘍増殖が有意に低下するかまたは定着腫瘍が完全に根絶された。
【０１２２】
実施例６：ＨＰＶ由来の抗原を発現するアデノウイルスベクターの生産性および遺伝的安
定性を改善するためのリプレッサー系の利用
強力で構成的に活性なプロモーターの制御下でアデノウイルスベクターに挿入される導
入遺伝子が、導入遺伝子産物の特性に応じてベクター産生に負の影響を与え得ることは先
行的に報告されている（Ｙｏｓｈｉｄａ  ＆  Ｙａｍａｄａ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３０：４２６−３０；Ｒｕｂｉｎｃｈｉｋ
ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：８７５−８５；Ｍａｔｔｈｅｗｓ
ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：３４５−５３；Ｅｄｈｏｌ
ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：９５７９−８４；Ｇａｌｌ  ｅｔ
ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３５：２６３−７３）。導入遺伝
子依存性ベクターの生産性での課題の例として、非効率的なベクターの救出および増殖、
低い最終ベクターの収量、また深刻な場合では欠陥のある導入遺伝子カセットを有するウ
イルス突然変異体の迅速な増殖が挙げられる。これらの課題を解決するため、複数の試験
において、ベクター・導入遺伝子の発現をプロデューサー細胞内でのベクター複製中に抑
制するための可能性が探索された（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｇ
ｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：３４５−５３；Ｅｄｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  
Ｖｉｒｏｌ  ７５：９５７９−８４；Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３５：２６３−７３；Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１
２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０９：７１９−２８；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅ
ｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０８：１７７−８８）。こ
れに関して、異なる抑制系がＡｄベクターとの関連で先行的に装備されており、当然なが
ら、異なるタイプの（阻害性）導入遺伝子をコードするベクターにおいてベクターの生産
性および遺伝的安定性を改善することを示している。
【０１２３】
本明細書に記載のアデノウイルスベクターの一部、ならびに特定のＨＰＶ抗原変異体を
コードする一部の他のアデノウイルスベクターが、上記の導入遺伝子依存性ベクターの生
産性の課題の一部を提示し、それ故、おそらくはその観点でさらに改善され得ることが認
められた。したがって、発明者は、ベクター・導入遺伝子の発現を抑制するための系の使
用により、本明細書に記載されるようなＨＰＶ由来の抗原を発現するＡｄベクターの生成
特性が改善され得るか否かを検討しようと努力した。この目的のため、発明者は、２つの
既存のリプレッサー−オペレーター系、すなわちＴｅｔＲ／ＴｅｔＯ（Ｙａｏ  ＆  Ｅｒ
ｉｋｓｓｏｎ，１９９９，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：４１９−２２、欧州特許
第０９９００４１Ｂ１号明細書）およびＣｙｍＲ／ＣｕＯ（Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ
．，２００６，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：４３）を我々のアデノウイルスベク
タープラットフォームに装備した。ＴｅｔＲ／ＴｅｔＯ系およびＣｙｍＲ／ＣｕＯ系の双
方が、アデノウイルスベクターの生産性をベクター複製中でのベクター・導入遺伝子のサ
イレンシングを介して改善するため、他者により先行的に用いられている（Ｇａｌｌ  ｅ
ｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３５：２６３−７３；Ｃｏｔｔ
ｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０９
：７１９−２８；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ  ２０８：１７７−８８）。これら２つの系の装備は、ＴｅｔＯまたはＣｕＯ配列
のいずれかを有するＣＭＶプロモーターの制御下での目的の遺伝子を発現するアデノウイ
ルスベクターの作製を含んだ。さらに、その装備は、各々の同族のリプレッサータンパク
質（すなわちＴｅｔＲまたはＣｙｍＲ）を安定的に発現する細胞株の作製を必要とした。
【０１２４】
異種ポリペプチドをコードする配列がＴｅｔＯもしくはＣｕＯオペレーター配列のいず
れかを有するＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された、幾つかのＥ１が欠失したＡｄ
２６およびＡｄ３５に基づくベクターを作製した。第１に、特定のＴｅｔＯまたはＣｕＯ
含有配列（各々、配列番号１１および配列番号１２）は、ｐＡｄａｐｔ２６およびｐＡｄ
ａｐｔ３５．ＢｓｕプラスミドのＣＭＶプロモーター（配列番号１３）の転写開始部位（
ＴＳＳ）の近傍に挿入した（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  
８１：４６５４−６３；Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒ
ｏｌ  ８７：２１３５−４３）。オペレーター含有配列は、ＣＭＶプロモーターの２つの
系についての前述の場合と正確に同じ位置に挿入した（Ｙａｏ  ＆  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，
１９９９，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：４１９−２２；欧州特許第０９９０
０４１Ｂ１号明細書；Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ  ６：４３；欧州特許第１３８５９４６Ｂ１号明細書）。詳細には、ＴＳＳ（最
初に割り当てられた通り；Ｓｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．４９：１９０−９）に関しては、ＴｅｔＯおよびＣｕＯ含有配列は各々、位置−２０お
よび＋７の下流に直接挿入された。配列番号１３では、これら２つの位置は各々、位置７
１６および７４２に対応する。得られたオペレーター含有ＣＭＶプロモーターは各々、Ｃ
ＭＶＴｅｔＯおよびＣＭＶＣｕＯと称する。次に、異なる導入遺伝子を、得られた構築物
の（修飾）ＣＭＶプロモーターの下流にＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いて
挿入した。これらの導入遺伝子は、緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼの融合タン
パク質（ＧＦＰ−Ｌｕｃ）をコードする遺伝子、実施例１において上述のＨＰＶ１６  Ｌ
ＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、およびＨＰＶ１６  ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨに幾つかの類似性を有す
る別のポリペプチド（本実施例で「ＨＰＶＡｇ」と称する構築物）を含んだ。ＨＰＶＡｇ
は、ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ中に存在するのと同じリーダー配列、ならびにＨＰＶ１６のＥ
２、Ｅ６、およびＥ７配列を含む。本明細書に記載される通りの方法を用いて、得られた
修飾ｐＡｄａｐｔ２６およびｐＡｄａｐｔ３５．Ｂｓｕプラスミドを、ＣＭＶＴｅｔＯま
たはＣＭＶＣｕＯプロモーターのいずれかの制御下で上記のレポーターおよびＨＰＶ導入
遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの作製のために用いた。
【０１２５】
ＴｅｔＲまたはＣｙｍＲのいずれかを発現する細胞株を、各々、プラスミドｐｃＤＮＡ
（商標）６／ＴＲ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖ１０２５−２０）およびｐｃ
ＤＮＡ（商標）６／ＴＲの誘導体を用いてのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の安定的遺伝
子導入により作製し、ここでＴｅｔＲコード配列（ポリペプチド配列番号１５をコードす
る配列番号１４）はコドン最適化されたＣｙｍＲコード配列（ポリペプチド配列番号１７
をコードする配列番号１６）によって置換される。安定的細胞株の作製は、主に、ＣＭＶ
ＴｅｔＯまたはＣＭＶＣｕＯ駆動遺伝子の発現を抑制する能力がある細胞クローンについ
てスクリーニングするための一過性遺伝子導入に基づくアッセイを用いて、ｐｃＤＮＡ（
商標）６／ＴＲの供給業者による説明に従って実施した。得られたＰＥＲ．Ｃ６／Ｔｅｔ
ＲおよびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞株では、これらの細胞内でのベクター複製中に導入
遺伝子発現を抑制するそれらの能力について分析した。オペレーター含有ＣＭＶプロモー
ターの制御下でＧＦＰ−Ｌｕｃを発現するベクターを用いて実施された実験によると、各
々のオペレーター配列に対応するリプレッサーを発現する細胞株中での完全なウイルス複
製サイクル全体を通じて、ルシフェラーゼ遺伝子発現の少なくとも１０倍の低下が示され
た（データは示さず）。これにより、ＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲおよびＰＥＲ．Ｃ６／Ｃｙ
ｍＲ細胞株がアデノウイルスベクターの複製との関連でベクター・導入遺伝子の発現を抑
制する能力があることが確認された。
【０１２６】
アデノベクター・導入遺伝子発現のＴｅｔＲおよびＣｙｍＲ媒介性抑制のベクター収量
に対する効果を、ＨＰＶＡｇを発現するＡｄ３５に基づくベクターについて検討した（図
１３Ａ）。このため、２４ウェルプレートウェル内に３×１０５細胞／ウェルで播種した
ＰＥＲ．Ｃ６、ＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ、およびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞株に対して
、１０００ウイルス粒子／細胞で３時間の持続時間、ＣＭＶＴｅｔＯまたはＣＭＶＣｕＯ
プロモーターのいずれかからＨＰＶＡｇを発現するベクターにより、４通りの感染を施し
た。対照として、ＨＰＶＡｇの代わりにＧＦＰ−Ｌｕｃを発現する対応するベクターを用
いて平行感染を実施した。感染後４日目、クルードウイルスライセートを、ウェルの内容
物（すなわち感染細胞および培地）に対して２つの凍結−解凍サイクルを施すことにより
調製した。その後、標準としての公知のウイルス粒子力価を有する精製Ａｄ３５ベクター
を用いる、Ａｄ３５ヘキソン配列に特異的な定量ＰＣＲに基づくプロトコルによって、ア
デノベクター力価を測定した。結果によると、ＴｅｔＯおよびＣｕＯの双方を含有するＨ
ＰＶＡｇをコードするＡｄ３５ベクターが、ＧＦＰ−Ｌｕｃを発現する対照ベクターと比
べて、正常なＰＥＲ．Ｃ６細胞でのベクター収量の低下を示すことが示される。それに対
して、これらの同じベクターでは、それらの同族のリプレッサー（すなわち各々、Ｔｅｔ
ＲおよびＣｙｍＲ）を発現する細胞で生成されるとき、対照ベクターを用いて得られる収
量と同程度に高い収量が得られた。これらのデータは、プロデューサー細胞内でのベクタ
ー産生中における導入遺伝子発現の抑制が、導入遺伝子としてＨＰＶＡｇを保有するＡｄ
３５ベクターの生産性にとって有利であり得ることを示す。
【０１２７】
アデノベクター導入遺伝子発現の抑制がベクター収量に対して有し得る効果もまた、ア
デノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）由来のベクターについて検討した（図１３Ｂ）。Ａ
ｄ３５ベクターについて本質的に上記のように実施したアッセイでは、ＧＦＰ−Ｌｕｃ、
ＨＰＶＡｇ、またはＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨのいずれかをコードする、ＣＭＶＴｅｔＯプロ
モーターに制御される導入遺伝子を保有するＡｄ２６ベクターを、ＰＥＲ．Ｃ６およびＰ
ＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞を１５００ウイルス粒子／細胞で感染させるために用いた。３
日後、感染物を収集し、ウイルス粒子力価を、Ａｄ２６ヘキソン配列に特異的な定量ＰＣ
Ｒに基づく方法により測定した。結果によると、ＰＥＲ．Ｃ６細胞でのＨＰＶＡｇおよび
ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードするベクターにおける収量がＧＦＰ−Ｌｕｃをコードする
対照ベクターを用いて得られる場合よりも低いことが示される。それに対し、ＰＥＲ．Ｃ
６／ＴｅｔＲ細胞では、これらのベクターの双方が、対照ベクターにおいて得られる場合
と同程度に高い力価を示した。（Ａｄ３５ベクターにおける）上記の結果をまとめると、
これらのデータは、アデノベクター産生中での導入遺伝子発現の抑制により、ＨＰＶＡｇ
およびＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するベクターの収量が増加することを示す。
【０１２８】
発明者は、ＨＰＶＡｇに対するＣＭＶプロモーター駆動導入遺伝子を保有するアデノウ
イルスベクターの遺伝的安定性に関する主要な課題について認めている。例えば、ＰＥＲ
．Ｃ６上でこのベクターが数継代経た後、ベクター集団の大半がＨＰＶＡｇコード配列内
に大規模な欠失を保有する突然変異体ベクターからなることが認められた（データは示さ
ず）。
【０１２９】
発明者は、導入遺伝子発現抑制系、例えば上記の２つのうちの１つを利用すれば、導入
遺伝子、例えばベクターの増殖に対して阻害性を示すＨＰＶＡｇに関連した遺伝的安定性
の課題が防止され得ると判断した。このことを試験するため、ＣＭＶＣｕＯプロモーター
に駆動されるＨＰＶＡｇの発現を伴うＡｄ３５に基づくベクターを、ＰＥＲ．Ｃ６または
ＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞でのベクターの増殖時の導入遺伝子カセットの安定性につい
て評価した（図１４）。つまり、ベクターＤＮＡを２つの異なる細胞株に遺伝子導入し、
得られたウイルスプラークをアガロース層下で増殖させておいた。２つの遺伝子導入の各
々から、５つのウイルスプラークを単離し、さらに同じ細胞株（すなわち遺伝子導入用に
用いられるもの）で別々に１０回のウイルス連続継代にわたり継代した。導入遺伝子の完
全性を、ウイルス継代数１０（ＶＰＮ１０）での導入遺伝子カセットのＰＣＲ増幅、その
後の得られたＰＣＲ産物のゲル電気泳動およびサンガー配列決定による分析により評価し
た。さらに、ＶＰＮ７の継代したウイルスクローンを、そのＨＰＶＡｇを発現する能力に
ついて評価した。これは、Ａ５４９細胞を１０００個のウイルス粒子／細胞で感染させる
ための継代したウイルス単離物を用い、感染の４８時間後に細胞を溶解し、その後、ＨＰ
ＶＡｇの発現をＨＰＶ１６  Ｅ７に特異的なモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロ
ッティング（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により分析すること
により行った。ゲル電気泳動および配列決定分析の結果によると、各々がＰＥＲ．Ｃ６で
継代されていた５つ全部のウイルス単離物が、導入遺伝子カセット内に少しのフレームシ
フト欠失または中途での停止突然変異のいずれかを保有することが示された。それに対し
、かかる欠失または突然変異は、ＣｙｍＲを発現する細胞株（ＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ）
で継代されていたベクター単離物のいずれの中でも検出することができなかった。これら
のデータと一致して、すべてのＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ増殖ベクター単離物がＨＰＶＡｇ
を発現することができた一方、すべてのＰＥＲ．Ｃ６増殖ベクターがこの能力を完全に失
い、そこでこれらのベクターにおける欠陥導入遺伝子カセットが示唆された。結論として
、我々のデータは、ベクター増殖中でのベクター・導入遺伝子の発現を抑制するための、
例えばＣｙｍＲ／ＣｕＯ系のようなリプレッサー系の使用は、例えばＨＰＶＡｇを発現す
る導入遺伝子を保有するベクターにおいて見られる、深刻な導入遺伝子カセットの不安定
性を防止するための有効な手段である。
【０１３０】
実施例７：本質的にすべてのＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７  ＣＴＬエピトープを含むデザ
イナーポリペプチドの構築
ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７に関する本発明者らの設計と同様に、本発明者らは、ＨＰ
Ｖ１８  Ｅ６およびＥ７タンパク質の本質的にすべてのＣＴＬエピトープを有し、期待／
予測される強力なネオエピトープ（ネオエピトープは野生型ＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７
タンパク質中に存在しないエピトープを意味する）を最少数有する新規な非腫瘍化ポリペ
プチド（およびそれをコードする核酸）を設計した。ＨＰＶ１８に関する本発明のポリペ
プチド（本明細書中でＨＰＶ１８「Ｅ６Ｅ７ＳＨ」とも称されるときがある）は、配列番
号２０で提供されるアミノ酸配列を含む。このポリペプチドをコードするコドン最適化核
酸は、配列番号２１で提供される。
【０１３１】
ＨＰＶ１８に関する本発明の分子は、ＨＰＶ１６に関し実施例１で説明したのと同じ利
点を有する。分子は単一分子であり、複数分子が用いられる方法よりも作製上の利点を提
供する。さらに、本発明のポリペプチドは、ＨＰＶ１８の野生型Ｅ６およびＥ７中に存在
する本質的にすべての推定上のＣＴＬエピトープを含み、それと同時に、潜在的には免疫
優勢であり得る期待／予測される強力なネオエピトープを最少数有し、それ故に免疫応答
を関連のある野生型ＣＴＬエピトープから転用する。それ故、本発明の構築物は、あり得
るＣＴＬエピトープがいずれか欠如し、かつ／またはより多いまたはより強力なネオエピ
トープを有する、他者によって記載された分子よりも免疫学的に好都合である。
【０１３２】
例えば、配列番号２０のＨＰＶ１８デザイナー構築物は、ＨＰＶ１６デザイナー構築物
（配列番号１を有する）につき実施例１に記載されるような、２０の最も一般的なＨＬＡ
−Ａ、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｂおよび２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子に
対する予測される結合親和性＜５０ｎＭを有する９アミノ酸長のネオエピトープを、５つ
しか有しない。
【０１３３】
本発明のこのように設計したＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ分子（すなわち、配列番号２０
で提供されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする核酸、すなわち配列番号
２１を含む核酸配列を合成し、５’末端上のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびコザック配列なら
びに３’部位上のＸｂａＩ部位によって隣接させた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙでのカスタム合成および標準分子クローニン
グ）。
【０１３４】
合成された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて、細菌耐性マーカー（アン
ピシリン）および哺乳動物耐性マーカー（ネオマイシン）の双方を有する標準の発現ベク
ターｐＣＤＮＡ２００４．Ｎｅｏにクローン化し、例えば（一過性）遺伝子導入に基づく
実験用に本発明のＨＰＶ１８デザイナー分子をコードするプラスミドベクターを得た。
【０１３５】
これらの分子は、かかる以外にも、追加的な特徴を有するさらなる分子のための基盤と
しても用いることができた。非限定例として、幾つかのさらなる変異体を下記のように調
製した。
【０１３６】
ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質配列は他のＨＰＶ１８初期タンパク質の配列
と組み合わせることで、持続性感染を有する個体を標的にし、免疫される個体における免
疫レパートリーを広げることができる。かかる実施形態の非限定例として、本発明者らは
、Ｅ６Ｅ７ＳＨとそのＮ末端でのＥ２との融合タンパク質をコードする配列を調製した。
本発明者らは、野生型ＨＰＶ１８  Ｅ２タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＰ２０５９７
．１）の、位置２９４のグリシンを、位置３００のリジンを、また位置３０１のシステイ
ンを、ＤＮＡ結合活性を抑制するため、各々、バリン、メチオニンおよびアルギニンに突
然変異させた。これらの自発的に生じる突然変異の各々は既に、Ｅ２のＥ２結合ドメイン
を有するＤＮＡ配列への結合を完全に抑制する（Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９
２，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６：１０５−１６）。
【０１３７】
得られたポリペプチドは、ＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨと称し、配列番号２２を含む
。このポリペプチドをコードするコドン最適化配列を調製し、それを配列番号２３にて提
供する。
【０１３８】
本発明のＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨポリペプチドをコードする配列は、Ｅ２の有無にか
かわらず、例えば、ＤＮＡ構築物から、ＲＮＡから、またはウイルスベクターから発現さ
れ得る。図１５は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞内での上記のような導入遺伝子を発現するＤＮ
Ａベクターの一過性遺伝子導入時の発現を示す。遺伝子導入後、細胞を収集し、細胞抽出
物を、ＨＰＶ１８のＥ６を認識する抗体を用いてのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブ
ロッティングにより分析した。この実験は、発現ベクターの遺伝子導入時での適切なサイ
ズの想定される融合タンパク質の発現を示す。
【０１３９】
Ｅ２の有無にかかわらず、またコードされた融合タンパク質の免疫原性を増強するため
の追加的配列の有無にかかわらず、いずれにしてもＥ６Ｅ７を発現させるには、アデノウ
イルスベクターを用いることができる。
【０１４０】
上記のＨＰＶ１８デザイナー配列をコードする遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔでヒト発現の
ために最適化され、合成された遺伝子であった。コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ３’）
はＡＴＧ開始コドンの直前に含め、また２つの停止コドン（５’ＴＧＡ  ＴＡＡ３’）は
各々のコード配列の終端に付加した。遺伝子は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を介
して、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵプラスミド中およびｐＡｄＡｐｔ２６プラスミド中に挿入
した（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７，２１
３５−４３）。
【０１４１】
Ａｄ３５．ＨＰＶ１８−Ｅ６Ｅ７ＳＨは、上記のようなＨＰＶ１８デザイナー融合タン
パク質変異体（ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ、配列番号２０で提供されるアミノ酸配列を有
する）の発現のための、コドン最適化されたヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイル
ス血清型３５（Ａｄ３５）ベクターである。組み合わされたＥ６およびＥ７配列は、Ｅ１
、Ｅ３が欠失したアデノウイルスゲノムのＥ１領域内のＣＭＶプロモーターの制御下に置
いた。Ａｄ２６．ＨＰＶ１８−Ｅ６Ｅ７ＳＨは、組換えアデノウイルス血清型２６に基づ
く等価なベクターである。
【０１４２】
同様に、ＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列番号２２）変異体をコードするＡｄ２６
およびＡｄ３５に基づく組換えアデノウイルスベクターを生成した。
【０１４３】
全てのアデノウイルスベクターは、上記実施例１に記載されるように作製、調製、精製
および保存された。
【０１４４】
実施例８．ＨＰＶ１８デザイナー構築物の形質転換活性の欠損
ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質は、特定のアッセイにおける形質転換活性（例
えば軟寒天アッセイにおけるコロニー形成）として明白な腫瘍化の可能性を有する（Ｍａ
ｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１９
：３８１−３９５）。実施例７に記載のＥ６Ｅ７ＳＨポリペプチドは、再整理された様式
でのＥ６およびＥ７タンパク質の断片を含む。これは、例えばかかるアッセイにおける野
生型Ｅ６およびＥ７タンパク質のいずれかと比べて不足した形質転換活性により測定可能
である通り、腫瘍化の可能性を排除することが期待される。
【０１４５】
他者がＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の遺伝子シャッフルされた変異体が当然ながらその
発がん可能性を失っていることを報告したが（Ｏｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ
．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３；Ｈｅｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，
２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４２５９−６６）、これは遺伝子シャッフリングによ
りＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質の野生型機能が破壊されることを示している。
実施例２において、本発明者らは、本発明のＨＰＶ１６に関するデザイナー構築物がその
Ｅ６およびＥ７活性を失ったことを示した。
【０１４６】
腫瘍化特性の欠如を評価するため、本発明者らは、我々のＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ構
築物が（例えば、Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍ
ｏｌ  Ｍｅｄ  １１９：３８１−３９５で記載の通り）ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞上の軟寒天中
での増殖能を与える能力を評価した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞への野生型ＨＰＶ１８  Ｅ７を発
現するプラスミドの遺伝子導入の結果、一貫してコロニー形成が生じた。ＨＰＶ１６  Ｅ
６で得られた結果と同様に、野生型ＨＰＶ１８  Ｅ６単独の発現によってはバックグラウ
ンドを超えたコロニー形成が生じなかった。本発明者らのＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ構築
物の遺伝子導入は、４つの独立実験では軟寒天中での細胞のコロニーの増殖をもたらさず
（図１６）、これは本発明のポリペプチドＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードする核酸が
Ｅ７に関連した形質転換能力を失っていることを示した。
【０１４７】
Ｅ６およびＥ７の腫瘍化の可能性は、細胞タンパク質ｐ５３およびｐＲｂのレベルを各
々低下させるそれらの能力に関連している。本発明のポリペプチドであるＨＰＶ１８  Ｅ
６Ｅ７ＳＨをコードする核酸が分子レベルで野生型Ｅ６およびＥ７に関連した生物学的活
性を有しないことを示すため、ｐ５３およびｐＲｂ分解アッセイを実施した。つまり、Ｈ
ＰＶ１８  Ｅ６ｗｔおよび本発明者らのＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ構築物を、ｐ５３分解
アッセイにおいて、内因性ｐ５３が欠如したＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞内で発現させた。ｐ
Ｒｂ分解アッセイにおいては、ＨＰＶ１８  Ｅ７ｗｔおよびＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ構
築物をｐＲｂヌルＳａｏｓ−２細胞内で発現させた。図１７で分かるように、ｐ５３と（
ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨとでなく）ＨＰＶ１８  Ｅ６ｗｔとの同時発現は、ｐ５３レベ
ルの低下をもたらす（パネルＡおよびＢ）。同様に、パネル１７Ｃ、Ｄは、ｐＲｂと（Ｈ
ＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨとでなく）ＨＰＶ１８  Ｅ７ｗｔとの同時発現がｐＲＢレベルの
低下をもたらすことを示す。これらのデータは、本発明のＨＰＶ１８デザイナーポリペプ
チドをコードする核酸が軟寒天中でコロニー形成能を全く有することなく、また野生型Ｈ
ＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７ポリペプチドの主な生物学的活性、すなわちｐ５３およびｐＲ
ｂの各々の不活化を有しないことを示している。
【０１４８】
本発明のポリペプチドをコードする核酸構築物の安全性をさらに実証するため、本発明
者らは、ＨＰＶ媒介性形質転換に対する天然標的細胞に非常に類似した、新生児包皮（Ｈ
ＥＫｎ細胞）由来の一次ヒト生殖器ケラチノサイトを用いた。一次ヒトケラチノサイトの
不死化は、Ｅ６およびＥ７野生型双方の作用を必要とする（Ｍｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．
，１９８９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６３：４４１７−２１）。このアッセイは、おそらくは本
発明者らの構築物の安全性を実証するための生理学的に最も関連性のあるインビトロアッ
セイである（Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ
Ｍｅｄ  １１９：３８１−３９５）。ＨＰＶ１８由来の野生型Ｅ６およびＥ７（Ｅ６Ｅ
７ｗｔ）を発現するレンチウイルスを形質導入した細胞は、それらの寿命の非形質導入対
照細胞と比べての延長（図１８）およびテロメラーゼの触媒サブユニットであるｈＴＥＲ
Ｔの活性化（データは示さず）によって示されるように、一次ケラチノサイトにおける不
死化を誘導する。本発明のＨＰＶ１８デザイナーポリペプチド（ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７Ｓ
Ｈ）の発現では、ＧＦＰが形質導入されたケラチノサイトまたは形質導入されないケラチ
ノサイトと比べて寿命を延ばすことができない。同様の結果が、２つの追加的な独立ドナ
ーにおいて得られた（データは示さず）。まとめると、これらのデータは、本発明者らの
構築物が、高度に生理学的なモデルと考えられる、一次ヒトケラチノサイトにおける不死
化を誘導する能力を失っていることを示す。
【０１４９】
本実施例における実験は、本発明に従うポリペプチドをコードする核酸の形質転換活性
の欠如と、ＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７  ｗｔ構築物よりも著しく改善された安全性に関
する強力な証拠を同時に提供する。
【０１５０】
比較例８Ａ．本発明の構築物は特有の性質を有する
さらなるＨＰＶ１８デザイナー構築物が調製された（本明細書中で「ＨＰＶ１８ＤＣ２
」と称される。当該構築物のアミノ酸配列は、配列番号２４で提供される）。ＨＰＶ１８
ＤＣ２は、本発明のＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列番号２０）構築物と共通して、以下
の特徴を有する。（ａ）実質的にＨＰＶ１８の完全なＥ６およびＥ７アミノ酸配列をも含
む。（ｂ）同数の再配列された断片の形態で配列を含む。（ｃ）当該断片は、本質的にす
べてのＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７のＴ細胞エピトープが存在するよう、部分的に重複し
ている。（ｄ）望ましくない強力なネオエピトープの導入を最小化するよう設計されてい
る。したがって、本発明のデザイナー構築物およびＨＰＶ１８ＤＣ２は、構造的に、正確
なアミノ酸配列においてのみ異なる。
【０１５１】
しかしながら、これは少なくとも１つの生物学的差異へと翻訳され、このことは、その
ような分子が互いに置換可能な単なる代替物であるとは考えられないことを示している。
【０１５２】
特に、本発明の分子は、上記したように（実施例８）、一次包皮ケラチン細胞の寿命を
延長するための測定可能な機能的活性を全く欠いたものであった。対照的に、ＨＰＶ１８
ＤＣ２は一次ケラチノサイトにおける寿命の延長を誘導した。例えば、実施例８に記載の
実験によると、本発明のＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ構築物を発現するドナー細胞は７継代
の倍加を伴う８１日の寿命を有していたのに比べ、ＨＰＶ１８ＤＣ２を有する細胞は、６
７継代の倍加を伴う１２０日間のより長い寿命を有していた。同様の相違は異なるドナー
からのケラチノサイトにおける独立したアッセイにおいて認められ（ドナー３名の平均で
は、本発明の構築物を有する細胞は、９継代の倍加を伴う６２日の寿命を有していたのに
対し、ＨＰＶ１８ＤＣ２を有する細胞は、６２継代の倍加を伴う１５６日のはるかに長い
寿命を有していた）、構築物の相違に起因する相違を示した。ＨＰＶ１８ＤＣ２によって
寿命が延長されたというこの観察と一致して、ＨＰＶ１８ＤＣ２で形質導入された細胞は
、いくらかの残留Ｅ７活性（すなわち、ｐＲｂの分解／ｐ１６の発現増加）を示した。こ
れは、本発明のＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ分子で形質導入された細胞（実施例８）が当該
アッセイにおいて検出可能な活性を欠くのとは対照的である。
【０１５３】
本発明のＨＰＶ１６デザイナー構築物（実施例２に記載される）と比較して、別のＨＰ
Ｖ１６デザイナー構築物でも同様の観察が行われた。
【０１５４】
生物学的モデル系における見かけ上非常に類似した分子間で観察された相違は、そのよ
うな分子が互いに置換可能な単なる代替物であるとは考えられないことを示している。こ
のことから、本発明のデザイナー構築物の特有性および当該分野における予測不可能性が
強調される。
【０１５５】
重要なことには、実施例２および実施例８の実験から、本発明のデザイナー分子は、使
用したモデル系において野生型ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６およびＥ７タンパク質の発癌活性
を失ったと結論付けられる。
【０１５６】
実施例９．ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナー構築物に対する免疫応答
本発明者らは、実施例７に記載のようなＤＮＡベクターおよびアデノウイルスベクター
を調製した。ワクチンに誘導される免疫原性を評価するため、ＣＢ６Ｆ１マウスを、ＨＰ
Ｖ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクター（Ａｄ３５）で
、または対照として導入遺伝子をコードしないアデノベクター（Ｅｍｐｔｙ）で免疫した
。プライム免疫の２週後、マウスを屠殺し、単離した脾細胞をＨＰＶ１８  Ｅ６の１５ｍ
ｅｒペプチドプールで一晩刺激した。Ｅ６特異的免疫応答を、細胞内サイトカイン染色に
より分析した。別個の実験において、ＣＢ６Ｆ１マウスを、ＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７Ｓ
Ｈを発現するアデノベクター（Ａｄ３５またはＡｄ２６）で、または対照として導入遺伝
子をコードしないアデノベクター（Ｅｍｐｔｙ）で免疫した。
【０１５７】
図１９Ａは、ＩＣＳ分析による測定によると、マウスのＡｄ３５．ＨＰＶ１８−Ｅ６Ｅ
７ＳＨによる免疫がＥ６に特異的な免疫応答を誘導することを示す。さらに、図１９Ａの
結果は、遺伝子導入時に観察された当該Ｅ２Ｅ６Ｅ７変異体の発現がより低いにもかかわ
らず（図１５）、デザイナー構築物のＮ末端へのＥ２の融合が免疫原性を減少させないこ
とを示す。図１９Ｂは、マウスのＡｄ３５．ＨＰＶ１８−Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはＡｄ２６．
ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨによる免疫が、ＩＦＮγ産生ＨＰＶ１８−Ｅ６特異的ＣＤ
８  Ｔ細胞を同程度の割合で誘導することを示す。
【０１５８】
本発明のペプチドに対する細胞免疫応答は、異なるタイプのアデノウイルスベクターを
用いて誘導され得る。図１９Ｂに示される実験では、マウスを、ＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ
７ＳＨを発現するＡｄ２６またはＡｄ３５アデノウイルスベクターのいずれかで免疫した
。データは、これらのアデノウイルスベクターがＨＰＶ１８  Ｅ６特異的Ｔ細胞を同程度
に誘導したことを示す。
【０１５９】
実施例１０．ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８デザイナー構築物を発現するアデノベクターの
組み合わせ。
異なるＨＰＶ型に応じたデザイナー構築物の組み合わせは、異なるＨＰＶ型を処置する
ワクチンを作製する可能性を提供する。異なるデザイナー配列を発現するアデノウイルス
ベクターが免疫応答を誘導する能力を評価するため、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配
列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする）を発現するアデノベク
ター（Ａｄ２６）およびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列番号２２で示されるアミノ
酸配列を含むタンパク質をコードする）を発現するＡｄ２６を、各ベクターあたり１×１
０１０ｖｐの用量で、または導入遺伝子をコードしないアデノベクター（Ｅｍｐｔｙ）を
、筋肉内注射することにより、マウスを免疫した。免疫の４週後、同じ抗原を発現するＡ
ｄ３５ベクターによる免疫により免疫応答をブーストした。免疫応答はブースト免疫の２
週後に測定された。細胞をＨＰＶ１８のＥ６またはＨＰＶ１６のＥ７に対応するペプチド
プールで一晩刺激し、応答をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴで測定した。データを図２０に示
す。
【０１６０】
データは、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現
するＡｄ２６／３５ベクターでのマウスの免疫により、両方の（すなわち、ＨＰＶ１６お
よびＨＰＶ１８）デザイナータンパク質に対する細胞免疫応答が生じたことを示す。
【０１６１】
同様の免疫化スケジュール（Ａｄ２６プライムおよびＡｄ３５ブースト）での独立した
実験において、本発明者らは、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄおよびＨＰ
Ｖ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄが共に誘導する免疫応答を、ＨＰＶ１６  Ｅ２
Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ単独またはＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ単
独でマウスに誘導する免疫応答と比較した。免疫応答はブースト免疫の２週後に測定し、
細胞はＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ２、Ｅ６またはＥ７に対応するペプチドプールで
一晩刺激し、応答を細胞内サイトカイン染色およびＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴで測定した
。ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを
発現するＡｄの単一の組成物での同時投与が、個々のワクチン成分で免疫されたのみの動
物と比較して、全体的にＣＤ４およびＣＤ８応答幅がより小さいという結果をもたらした
にもかかわらず、同時投与は、同様の幅の免疫応答を誘導した（データは示さず）。
【０１６２】
したがって、本発明の構築物を発現するＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１
８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの同時投与により、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８両方に対する細胞
免疫応答を誘導することができる。
【０１６３】
実施例１１．アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）における組み合わせデザイ
ナー構築物の免疫原性。
本発明のデザイナー配列を発現するアデノウイルスベクターが非ヒト霊長類における免
疫応答を誘導する能力を評価するため、前の例のような２つの別個のアデノベクター、す
なわち、共にＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６ベクタ
ー、の混合物を各ベクターあたり１×１０１０ｖｐの用量で、または導入遺伝子をコード
しないアデノベクター（Ｅｍｐｔｙ）を、筋肉内注射することにより、アカゲザル（ｒｈ
ｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）を免疫した。免疫の８週後、動物は同じ抗原を発現するＡ
ｄ２６ベクターによりブースト免疫を受けた。１６週後、動物は、同じ抗原を発現するＡ
ｄ３５ベクターのもう１回の注射を受けた。血液試料は数回の時点で採取し、単離した白
血球をＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８両方のＥ２、Ｅ６またはＥ７に対応するペプチドプー
ルで一晩刺激した。特異的応答をＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。データを図２
１に示す。さらにプライム免疫の１０週後および１８週後、本発明のＨＰＶ１８デザイナ
ー分子における新規な接合に及ぶペプチドに特異的な細胞免疫応答を評価した。このよう
な接合ペプチドに対するＩＦＮγ応答の誘導は、すべての動物において＜５０ＳＦＵ／１
×１０６ＰＢＭＣの検出限界未満であった（データは示さず）。
【０１６４】
データは、共にＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを
発現するＡｄ２６ベクターの組み合わせでの非ヒト霊長類の免疫により、コードされた導
入遺伝子中に存在するいくつかのＨＰＶタンパク質に対する細胞免疫応答が生じたことを
示す。応答はＡｄ２６ベクターによる追加免疫により増進され得た。対応するＡｄ３５ベ
クターでの１６週目の追加的ブースト免疫により、免疫応答がさらに増強された。
【０１６５】
実施例１２．マウス腫瘍モデルにおける組み合わせ構築物の治療効果。
ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７に対応する本発明のポリペプチドは、ＴＣ−１モデルにお
いて治療的効果を導く（実施例５に示される通り）、マウスにおける細胞免疫応答を誘導
することができる。共にＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８デザイナータンパク質両方を発現す
るアデノウイルスベクターの組み合わせの治療効果を、この同じモデルにおいて試験した
。ワクチンの不在下では、腫瘍は急速に増殖し、３０日以内に１０００ｍｍ３の所定のサ
イズに達し、この時点において倫理的理由でマウスを屠殺した。
【０１６６】
この実験において、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノウイルスベクター
によるプライムーブースト免疫は、マウスの生存を有意に延長した（図２２）。共にＨＰ
Ｖ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノウイル
スベクターの組み合わせを用いて、同様の平均生存時間を観察した。組み合わせワクチン
を受けたマウスのグループ中、３匹の動物には９０日間のモニタリング期間終了時に腫瘍
がなかった。結論として、共に本発明のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８特異的デザイナーポ
リペプチドを発現するアデノウイルスベクターの組み合わせによる免疫により、ＨＰＶ１
６誘発がんに対する十分に確立された負荷モデルにおいて、腫瘍増殖が有意に低下するか
または定着腫瘍が完全に根絶された。
また、本発明は以下を提供する。
［１］
配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする核酸分子
。
［２］
前記第１のポリペプチドがヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ２タンパク質の少なく
とも１つのエピトープをさらに含む、［１］に記載の核酸分子。
［３］
前記第１のポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン内に欠失または突然変異を有するおよ
び／またはトランス活性化ドメイン内に突然変異を有するＨＰＶ１８  Ｅ２タンパク質を
含む、［２］に記載の核酸分子。
［４］
前記第１のポリペプチドが配列番号２２のアミノ酸配列を含む、［３］に記載の核酸分
子。
［５］
配列番号２１を含む、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［６］
配列番号２３を含む、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［７］
前記第１のポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結された、［
１］〜［６］のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
［８］
組換えアデノウイルスである、［７］に記載のベクター。
［９］
前記プロモーターが、リプレッサー・オペレーター配列に作動可能に結合され、リプレ
ッサータンパク質は、前記リプレッサータンパク質の存在下での前記プロモーターの発現
を抑制するため、それに結合することができる、［７］または［８］に記載のベクター。
［１０］
プロモーターに作動可能に連結された第２のポリペプチドをコードする核酸をさらに含
み、前記第２のポリペプチドは配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、［７］〜［９
］のいずれか一項に記載のベクター。
［１１］
前記第２のポリペプチドが配列番号３または配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む
、［１０］に記載のベクター。
［１２］
前記第１のポリペプチドが配列番号２２のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチ
ドが配列番号３のアミノ酸配列を含む、［１１］に記載のベクター。
［１３］
［７］〜［１２］のいずれか一項に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤
を含むワクチン組成物。
［１４］
（ａ）［７］〜［９］のいずれか一項に記載の第１のベクター、
（ｂ）プロモーターに作動可能に連結された第２のポリペプチドをコードする核酸を含
み、前記第２のポリペプチドは配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、第２のベクタ
ー、および
（ｃ）薬学的に許容できる賦形剤
を含む、ワクチン組成物。
［１５］
前記第２のポリペプチドが配列番号３または配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む
、［１４］に記載のワクチン組成物。
［１６］
前記第１のベクター上にコードされる前記第１のポリペプチドが、配列番号２２のアミ
ノ酸配列を含み、前記第２のベクター上にコードされる前記第２のポリペプチドが、配列
番号３のアミノ酸配列を含む、［１５］に記載のワクチン組成物。
［１７］
前記対象におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、［１３］〜［１６
］のいずれか一項に記載のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
［１８］
対象におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）［７］〜［９］のいずれか一項に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形
剤を含む、第１のワクチン組成物、および
（ｂ）プロモーターに作動可能に連結された第２のポリペプチドをコードする核酸を含み
、前記第２のポリペプチドは配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、ベクターを含む
、第２のワクチン組成物
を対象に投与するステップを含む、方法。
［１９］
前記第２のポリペプチドが配列番号３または配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む
、［１８］に記載の方法。
［２０］
前記第１のワクチン組成物においてコードされる前記第１のポリペプチドが、配列番号
２２のアミノ酸配列を含み、前記第２のワクチン組成物においてコードされる前記第２の
ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、［１９］に記載の方法。
［２１］
（ｉ）［１３］〜［１６］のいずれか一項に記載のワクチン組成物を前記対象に２回以
上投与するステップ、または
（ｉｉ）［１７］〜［２０］のいずれか一項に記載の第１および第２のワクチン組成物
を前記対象に２回以上投与するステップ
を含む、［１７］〜［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
対象における、持続性ＨＰＶ感染、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（
ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸がん（子宮頸
部扁平上皮がん（ＳＣＣ）など）、中咽頭がん、陰茎がん、膣がんまたは肛門がんを治療
するための方法であって、［１３］〜［１６］のいずれか一項に記載のワクチン組成物を
前記対象に投与するステップを含む、方法。
［２３］
（ａ）［７］〜［９］のいずれか一項に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦
形剤を含む、第１のワクチン組成物、および
（ｂ）プロモーターに作動可能に連結された第２のポリペプチドをコードする核酸を含
み、前記第２のポリペプチドは配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、ベクターを含
む、第２のワクチン組成物
を含む、パーツキット。
［２４］
前記第２のポリペプチドが配列番号３または配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む
、［２３］に記載のパーツキット。
［２５］
前記第１のワクチン組成物においてコードされる前記第１のポリペプチドが、配列番号
２２のアミノ酸配列を含み、前記第２のワクチン組成物においてコードされる前記第２の
ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、［２４］に記載のパーツキット。
［２６］
配列番号２０を含むポリペプチド。
［２７］
配列番号２２を含む、［２６］に記載のポリペプチド。
【０１６７】
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ｓａｙｓ  ｆｏｒ  ＨＰＶ  Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎ：Ｄａｖｙ  Ｃ，Ｄｏｏｒ
ｂａｒ  Ｊ（ｅｄｓ）Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｖｏｌ  １１９：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，ｐｐ  ３８１−３９５
Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ＤＡ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｄ，Ｅｖｅｌｅｇｈ  Ｃ，Ｇｒａｈａｍ  
ＦＬ，Ｐｒｅｖｅｃ  Ｌ（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  
ａ  ２９３  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｌａｃ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ
ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕ
ｓｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒ
ｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０（Ｐｔ  ２）：３４５
−３５３
ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＭＪ，Ｈａｍｅｓ  ＢＤ，Ｔａｙｌｏｒ  ＧＲ（１９９５）ＰＣＲ
２：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆ
ｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＯｘｆｏｒｄＭｅｌｌｍａｎ  Ｉ，Ｃｏｕ
ｋｏｓ  Ｇ，Ｄｒａｎｏｆｆ  Ｇ（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐ
ｙ  ｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８０：４８０−４８９
Ｍｉｓｈｒａ  Ｓ，Ｌａｖｅｌｌｅ  ＢＪ，Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ  Ｊ，Ａｒｄｉｔｏ  
ＭＴ，Ｔｅｒｒｙ  Ｆ，Ｍａｒｔｉｎ  ＷＤ，Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ＡＳ，Ｇｒｅｇｏｒｙ
ＳＨ（２０１４）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ，ＤＮＡ−ｂａｓ
ｅｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｉｎｄｕｃ
ｅｓ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉ−ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏ
ｆ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ，ＨＬＡ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ
９（８）：ｅ１０４６０６．ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０
１０４６０６
Ｍｏｉｓｅ  Ｌ，Ｂｕｌｌｅｒ  ＲＭ，Ｓｃｈｒｉｅｗｅｒ  Ｊ，Ｌｅｅ  Ｊ，Ｆｒｅｙ
ＳＥ，Ｗｅｉｎｅｒ  ＤＢ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｗ，Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ＡＳ（２０１１）
ＶｅｎｎＶａｘ，ａ  ＤＮＡ−ｐｒｉｍｅ，ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂｏｏｓｔ  ｍｕｌｔｉ−
Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ，ｉｎｄｕｃｅｓ  
ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｉｎｆ
ｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｌｏｎｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  
２９：５０１−５１１
Ｍｏｓｓ  ＳＦ，Ｍｏｉｓｅ  Ｌ，Ｌｅｅ  ＤＳ，Ｋｉｍ  Ｗ，Ｚｈａｎｇ  Ｓ，Ｌｅｅ
Ｊ，Ｒｏｇｅｒｓ  ＡＢ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｗ，Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ＡＳ（２０１１）．
ＨｅｌｉｃｏＶａｘ：ｅｐｉｔｏｐｅ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｈｅｌｉ
ｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍ
ｏｄｅｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９：２０８５−２０９１
Ｍｕｌｌｉｃｋ  Ａ，Ｘｕ  Ｙ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｒ，Ｋｏｕｔｒｏｕｍａｎｉｓ  Ｍ，Ｇ
ｕｉｌｂａｕｌｔ  Ｃ，Ｂｒｏｕｓｓａｕ  Ｓ，Ｍａｌｅｎｆａｎｔ  Ｆ，Ｂｏｕｒｇｅ
ｔ  Ｌ，Ｌａｍｏｕｒｅｕｘ  Ｌ，Ｌｏ  Ｒ，Ｃａｒｏｎ  ＡＷ，Ｐｉｌｏｔｔｅ  Ａ，
Ｍａｓｓｉｅ  Ｂ（２００６）Ｔｈｅ  ｃｕｍａｔｅ  ｇｅｎｅ−ｓｗｉｔｃｈ：ａ  ｓ
ｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌ
ｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：４３
Ｍｕｎｇｅｒ  Ｋ，Ｐｈｅｌｐｓ  ＷＣ，Ｂｕｂｂ  Ｖ，Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ，Ｓｃｈｌ
ｅｇｅｌ  Ｒ（１９８９）Ｔｈｅ  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈ
ｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ｔｏｇｅｔｈｅｒ  ａｒｅ
ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ａｎｄ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｖｉ
ｒｏｌ  ６３：４４１７−４４２１
Ｏｇｕｎ  ＳＡ，Ｄｕｍｏｎ−Ｓｅｉｇｎｏｖｅｒｔ  Ｌ，Ｍａｒｃｈａｎｄ  ＪＢ，Ｈ
ｏｌｄｅｒ  ＡＡ，Ｈｉｌｌ  Ｆ（２００８）Ｔｈｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｃ４−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ４ｂｐ）ａｃｔｓ  
ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏ
ｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓ
ｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｆｕｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｃ
４ｂｐ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ
．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：３８１７−３８２３
Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  Ｋ，Ａｌｅｙｄ  Ｅ，Ｖｒｉｊｌａｎｄ  Ｋ，Ｓｃｈｕｍａｃｈ
ｅｒ  ＴＮ，Ｈａａｎｅｎ  ＪＢ（２０１２ａ）Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ
ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ
Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １６  Ｅ６−ａｎｄ  Ｅ７−Ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔ
ｈｅｒ  ２３：１３０１−１３１２
Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  Ｋ，Ｏｈｌｓｃｈｌａｇｅｒ  Ｐ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  
ＪＨ，Ｔｏｅｂｅｓ  Ｍ，Ｇｏｍｅｚ  Ｒ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＴＮ，Ｈａａｎｅｎ
ＪＢ（２０１１）Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ
ｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｄｉｒｅｃ
ｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＰＶ  １６  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅ
ｒ  １２９：３９７−４０６
Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  Ｋ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ＪＨ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  
ＴＮ，Ｈａａｎｅｎ  ＪＢ（２０１２ｂ）ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｒ
ａｄｅｒｍａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｔａｔｔｏｏｉｎｇ．Ｃｕｒ
ｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５１：２２１−２５０
Ｐｅｔｅｒｓ  Ｂ，Ｔｏｎｇ  Ｗ，Ｓｉｄｎｅｙ  Ｊ，Ｓｅｔｔｅ  Ａ，Ｗｅｎｇ  Ｚ（
２００３）Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａ
ｓｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ
ｓ  ｔｏ  ＭＨＣ−Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９：１
７６５−１７７２
Ｐｒａｋａｓｈ  ＳＳ，Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ＳＲ，Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  ＲＢ，Ｌａｉｍｉ
ｎｓ  ＬＡ，Ａｎｄｒｏｐｈｙ  ＥＪ（１９９２）Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｎｅｃｅｓ
ｓａｒｙ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎｄ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｍ
ｐｌｙ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｅ
２  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６：１０５−１１６
Ｒｕｂｉｎｃｈｉｋ  Ｓ，Ｄｉｎｇ  Ｒ，Ｑｉｕ  ＡＪ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｄｏｎｇ  Ｊ
（２０００）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｈｉｃｈ  ｄｅｌｉｖｅｒｓ  Ｆ
ａｓＬ−ＧＦＰ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  
ｔｅｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅ
ｒ  ７：８７５−８８５
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＪＦＥＦＭＴ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．
Ｓａｋａｉ  Ｈ，Ｙａｓｕｇｉ  Ｔ，Ｂｅｎｓｏｎ  ＪＤ，Ｄｏｗｈａｎｉｃｋ  ＪＪ，
Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ（１９９６）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔ
ｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １６  Ｅ２  Ｔｒａｎｓ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｓｅｐａｒａｂｌｅ  Ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：１６０２−１６１１
Ｓｅｄｍａｎ  ＳＡ，Ｂａｒｂｏｓａ  ＭＳ，Ｖａｓｓ  ＷＣ，Ｈｕｂｂｅｒｔ  ＮＬ，
Ｈａａｓ  ＪＡ，Ｌｏｗｙ  ＤＲ，Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ＪＴ（１９９１）Ｔｈｅ  ｆｕｌ
ｌ−ｌｅｎｇｔｈ  Ｅ６  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉ
ｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ｈａｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ−ａ
ｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ
Ｅ７  ｔｏ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔ
ｕｒｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：４８６０−４８６６
Ｓｈｅｎｋ  Ｔ（１９９６）Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，Ｂａｉｎｅｓ  ＪＤ（
ｅｄｓ）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
Ｓｍａｈｅｌ  Ｍ，Ｓｉｍａ  Ｐ，Ｌｕｄｖｉｋｏｖａ  Ｖ，Ｖｏｎｋａ  Ｖ（２００１
）Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＨＰＶ１６  Ｅ７  Ｇｅｎｅｓ  ａｓ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ  
ａｇａｉｎｓｔ  Ｅ７−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ  ２８１：２３１−２３８
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ＳＨ，Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪ（２０１１）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖ
ｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ  ２３：２５２−２５７
Ｗａｔｓｏｎ  ＪＤ（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
Ｗｉｅｋｉｎｇ  ＢＧ，Ｖｅｒｍｅｅｒ  ＤＷ，Ｓｐａｎｏｓ  ＷＣ，Ｌｅｅ  ＫＭ，Ｖ
ｅｒｍｅｅｒ  Ｐ，Ｌｅｅ  ＷＴ，Ｘｕ  Ｙ，Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳ，Ｂａｌｃａｉ
ｔｉｓ  Ｓ，Ｂａｌｉｎｔ  ＪＰ，Ｊｒ．，Ｊｏｎｅｓ  ＦＲ，Ｌｅｅ  ＪＨ（２０１２
）Ａ  ｎｏｎ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ＨＰＶ  １６  Ｅ６／Ｅ７  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎ
ｈａｎｃｅｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＰＶ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ
ｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９：６６７−６７４
Ｙａｎ  Ｊ，Ｒｅｉｃｈｅｎｂａｃｈ  ＤＫ，Ｃｏｒｂｉｔｔ  Ｎ，Ｈｏｋｅｙ  ＤＡ，
Ｒａｍａｎａｔｈａｎ  ＭＰ，ＭｃＫｉｎｎｅｙ  ＫＡ，Ｗｅｉｎｅｒ  ＤＢ，Ｓｅｗｅ
ｌｌ  Ｄ（２００９）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔ
ｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  
ＨＰＶ−１６  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  Ｅ６／Ｅ７  ｆｕｓ
ｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：４３１−４４０
Ｙａｏ  Ｆ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  Ｅ（１９９９）Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉ
ｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｗｉｔｃｈ．Ｈｕ
ｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：４１９−４２７
Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｙ，Ｈａｍａｄａ  Ｈ（１９９７）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａ
ｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｅ
ｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｗ
ｉｔｈ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  
Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３０：４２６−４３０
Ｙｕｇａｗａ  Ｔ，Ｋｉｙｏｎｏ  Ｔ（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉ
ｓｍｓ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｒ
ｉｓｋ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ：ｎｏｖｅｌ  ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎｓ  ｏｆ  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒ
ｏｌ  １９：９７−１１３
Ｚｗａｖｅｌｉｎｇ  Ｓ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ  Ｍｏｔａ  ＳＣ，Ｎｏｕｔａ  Ｊ，Ｊｏｈ
ｎｓｏｎ  Ｍ，Ｌｉｐｆｏｒｄ  ＧＢ，Ｏｆｆｒｉｎｇａ  Ｒ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒ
ｇ  ＳＨ，Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪ（２００２）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐａ
ｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ａ
ｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｄ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｖａｃｃ
ｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９
：３５０−３５８
【０１６８】
表Ｉ．配列
配列番号１（ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ＳＨ、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７デザイナーポリペプチ
ドのアミノ酸配列）
【化１】
2019068852.tif 000002
配列番号２（ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ＳＨ、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７デザイナーポリペプチ
ドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）
【化２】
2019068852.tif 000003
配列番号３（ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、ＨＰＶ１６  Ｅ２／Ｅ６／Ｅ７デザイナー
ポリペプチドのアミノ酸配列）
【化３】
2019068852.tif 000004
配列番号４（ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、ＨＰＶ１６  Ｅ２／Ｅ６／Ｅ７デザイナー
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）
【化４】
2019068852.tif 000005
配列番号５（ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨ、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７／Ｅ２デザイナー
ポリペプチドをコードするアミノ酸配列）
【化５】
2019068852.tif 000006
配列番号６（ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨ、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７／Ｅ２デザイナー
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）
【化６】
2019068852.tif 000007
配列番号７（ＩｇＥリーダーペプチドアミノ酸配列）
ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ
配列番号８（ＩｇＥリーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列）
ＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＡ
ＣＣＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＣ
配列番号９（ａａ  ＨＡＶＴ２０リーダーペプチドアミノ酸配列）
ＭＡＣＰＧＦＬＷＡＬＶＩＳＴＣＬＥＦＳＭＡ
配列番号１０（ＨＡＶＴ２０リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列）
ＡＴＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡ
ＣＣＴＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣ
配列番号１１（２ｘＴｅｔＯ含有配列）
ＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡ
ＴＡＧＡＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣ
配列番号１２（ＣｕＯ含有配列）
ＡＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＧＴＡ
配列番号１３（ｐＡｄＡｐｔ２６およびｐＡｄＡｐｔ３５プラスミド中にＣＭＶプロモー
ターが存在）
【化７】
2019068852.tif 000008
配列番号１４（ＴｅｔＲ、ｐｃＤＮＡ（商標）６／ＴＲにより発現されるＴｅｔＲポリペ
プチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）
【化８】
2019068852.tif 000009
配列番号１５（ＴｅｔＲ、ｐｃＤＮＡ（商標）６／ＴＲにより発現されるＴｅｔＲポリペ
プチドのアミノ酸配列）
【化９】
2019068852.tif 000010
配列番号１６（ＣｙｍＲ、ＣｙｍＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列）
【化１０】
2019068852.tif 000011
配列番号１７（ＣｙｍＲ、ＣｙｍＲポリペプチドのアミノ酸配列）
【化１１】
2019068852.tif 000012
配列番号１８（ＨＰＶ１６  Ｅ６、ａａ４１−６５）
ＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮ
配列番号１９（ＨＰＶ１６  Ｅ７  ａａ  ４３−７７）
ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ
配列番号２０（ＨＰＶ１８−Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナー配列のアミノ酸配列）
【化１２】
2019068852.tif 000013
配列番号２１（ＨＰＶ１８−Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナー配列のヌクレオチド配列）
【化１３】
2019068852.tif 000014
配列番号２２（ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナー配列のアミノ酸配列）
【化１４】
2019068852.tif 000015
配列番号２３（ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナー配列のヌクレオチド配列）
【化１５】
2019068852.tif 000016
配列番号２４（「ＨＰＶ１８ＤＣ２」のアミノ酸配列）
【化１６】
2019068852.tif 000017
【図１】
2019068852.tif 000018
【図２】
2019068852.tif 000019
【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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