(57)【要約】      （修正有）【課題】中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法の提供。【解決手段】下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。（Ａ）特定のアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。（Ｂ）特定のアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル-ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ−１）〜（Ａ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列において、下記（Ｂ−１）〜（Ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ−１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。
（Ａ−２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。
（Ａ−３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。
（Ａ−４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。
（Ａ−５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。
（Ａ−６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ａ−７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。
（Ａ−８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。
（Ａ−９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。
（Ａ−１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。
（Ａ−１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ｂ−１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｂ−２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
（Ｂ−３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
（Ｂ−４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。
（Ｂ−５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｂ−６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
（Ｂ−７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
（Ｂ−８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。
（Ｂ−９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
（Ｂ−１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。
（Ｂ−１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
【請求項２】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ−１）〜（Ａ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列において、下記（Ｂ−１）〜（Ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ−１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。
（Ａ−２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。
（Ａ−３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。
（Ａ−４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。
（Ａ−５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。
（Ａ−６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ａ−７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。
（Ａ−８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。
（Ａ−９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。
（Ａ−１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。
（Ａ−１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ｂ−１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｂ−２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
（Ｂ−３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
（Ｂ−４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。
（Ｂ−５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｂ−６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
（Ｂ−７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
（Ｂ−８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。
（Ｂ−９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
（Ｂ−１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。
（Ｂ−１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
【請求項３】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める中鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ−１）〜（Ａ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列において、下記（Ｂ−１）〜（Ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ−１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。
（Ａ−２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。
（Ａ−３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。
（Ａ−４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。
（Ａ−５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。
（Ａ−６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ａ−７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。
（Ａ−８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。
（Ａ−９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。
（Ａ−１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。
（Ａ−１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ｂ−１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｂ−２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
（Ｂ−３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
（Ｂ−４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。
（Ｂ−５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｂ−６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
（Ｂ−７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
（Ｂ−８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。
（Ｂ−９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
（Ｂ−１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。
（Ｂ−１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
【請求項４】
前記タンパク質（Ａ）が、下記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、下記（Ｅ−１）〜（Ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（Ｄ−１）配列番号１の１０６位のバリンがイソロイシンに置換。
（Ｄ−２）配列番号１の１０８位のアスパラギンがリジンに置換。
（Ｄ−３）配列番号１の１０８位のアスパラギンがアルギニンに置換。
（Ｄ−４）配列番号１の１１０位のバリンがイソロイシンに置換。
（Ｄ−５）配列番号１の１１０位のバリンがメチオニンに置換。
（Ｄ−６）配列番号１の１１０位のバリンがロイシンに置換。
（Ｄ−７）配列番号１の１１０位のバリンがフェニルアラニンに置換。
（Ｄ−８）配列番号１の１１８位のシステインがイソロイシンに置換。
（Ｅ−１）配列番号１の１０６位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｅ−２）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
（Ｅ−３）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
（Ｅ−４）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｅ−５）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
（Ｅ−６）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がロイシンに置換。
（Ｅ−７）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
（Ｅ−８）配列番号１の１１８位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
【請求項５】
前記タンパク質（Ａ）が、前記（Ａ−１）のアミノ酸置換、並びに前記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、前記（Ｂ−１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｅ−１）〜（Ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、を有する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が大腸菌である、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
前記微生物がシアノバクテリアである、請求項６記載の製造方法。
【請求項９】
前記脂肪酸又は脂質が中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記脂肪酸又は脂質が炭素原子数８若しくは１０の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ−１）〜（Ａ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列において、下記（Ｂ−１）〜（Ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ−１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。
（Ａ−２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。
（Ａ−３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。
（Ａ−４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。
（Ａ−５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。
（Ａ−６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ａ−７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。
（Ａ−８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。
（Ａ−９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。
（Ａ−１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。
（Ａ−１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ｂ−１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｂ−２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
（Ｂ−３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
（Ｂ−４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。
（Ｂ−５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｂ−６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
（Ｂ−７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
（Ｂ−８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。
（Ｂ−９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
（Ｂ−１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。
（Ｂ−１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
【請求項１２】
前記タンパク質（Ａ）が、下記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、下記（Ｅ−１）〜（Ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項１１に記載のタンパク質。
（Ｄ−１）配列番号１の１０６位のバリンがイソロイシンに置換。
（Ｄ−２）配列番号１の１０８位のアスパラギンがリジンに置換。
（Ｄ−３）配列番号１の１０８位のアスパラギンがアルギニンに置換。
（Ｄ−４）配列番号１の１１０位のバリンがイソロイシンに置換。
（Ｄ−５）配列番号１の１１０位のバリンがメチオニンに置換。
（Ｄ−６）配列番号１の１１０位のバリンがロイシンに置換。
（Ｄ−７）配列番号１の１１０位のバリンがフェニルアラニンに置換。
（Ｄ−８）配列番号１の１１８位のシステインがイソロイシンに置換。
（Ｅ−１）配列番号１の１０６位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｅ−２）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
（Ｅ−３）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
（Ｅ−４）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｅ−５）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
（Ｅ−６）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がロイシンに置換。
（Ｅ−７）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
（Ｅ−８）配列番号１の１１８位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
【請求項１３】
前記タンパク質（Ａ）が、前記（Ａ−１）のアミノ酸置換、並びに前記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、前記（Ｂ−１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｅ−１）〜（Ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、を有する、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか１項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１５】
請求項１４記載の遺伝子を含有する、組換えベクター又はＤＮＡカセット。
【請求項１６】
請求項１４又は１５記載の遺伝子、組換えベクター又はＤＮＡカセットを含んでなる、形質転換体。
【請求項１７】
前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、請求項１６に記載の形質転換体。
【請求項１８】
前記微生物が大腸菌である、請求項１７に記載の形質転換体。
【請求項１９】
前記微生物がシアノバクテリアである、請求項１７に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質の製造方法に関する。
また本発明は、当該方法に用いるアシル-ACPチオエステラーゼ改変体、これをコードする遺伝子、及び該遺伝子を導入した形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質（油脂）を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素原子数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤や殺菌剤等に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤、毛髪リンス剤、殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤等に日常的に利用されている。さらに、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
また、炭素原子数が８や１０の中鎖脂肪酸は、健康食品への利用や、エッチング剤に利用されている。また炭素原子数が８や１０の中鎖脂肪酸を還元して得られるアルコール誘導体は、化粧品や、界面活性剤、可塑剤などの工業用原料としても利用されている。
【０００３】
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数に依存するため、脂肪酸の炭素原子数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。
例えば、ゲッケイジュ（Umbellularia californica（California bay））由来のアシル-ACP（アシルキャリヤプロテイン）チオエステラーゼ（以下単に、「TE」ともいう）をコードする遺伝子を宿主に導入することにより、炭素原子数１２の脂肪酸を蓄積させる方法（特許文献１、非特許文献１）等が提案されている。
また、クフェア・パルストリス（Cuphea palustris）やクフェア・フッケリアナ（Cuphea hookeriana）などのクフェア（Cuphea）属に属する植物由来のTEをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、得られた形質転換体における炭素原子数が８又は１０の中鎖脂肪酸の生産性が向上することが知られている。そして、特許文献２及び３には、配列番号４８で示されるアミノ酸配列からなるクフェア・パルストリス由来の野生型TEからN末側のシグナル配列を削除したアミノ酸配列（配列番号１）、若しくは配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列において、１７２位〜２２１位若しくはこれらに相当する位置で特定のアミノ酸置換を行ったTE改変体が開示されている。そして、このようなTE改変体をコードする遺伝子を大腸菌やシアノバクテリアなどの宿主に導入することで、炭素原子数が８又は１０の中鎖脂肪酸の生産性が向上することが記載されている。
【０００４】
近年、太陽光やバイオマスなどの再生可能エネルギー源を利用し、シアノバクテリアや大腸菌を培養することで脂肪酸を含むバイオケミカルスを生産する方法が注目されている。例えば、シアノバクテリアを用いて生産されるバイオ燃料として、エタノール（非特許文献２）、イソブタノール（非特許文献３）、脂肪酸（非特許文献４）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９２／２０２３６号
【特許文献２】米国特許第５，９５５，３２９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１１／００２０８８３号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Science, 1992, vol. 257(5066), p. 72-74
【非特許文献２】Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65:523-528
【非特許文献３】Nat. Biotechnol., 2009, vol. 27, p. 1177-1180
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2011, vol. 108(17), p. 6899-6904
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法を提供することを課題とする。
また本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、前記方法に好適に用いることができる形質転換体を提供することを課題とする。
さらに本発明は、前記方法及び形質転換体の使用に好適な、新規TE改変体及びこれをコードする遺伝子の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
特許文献２及び３などでも報告されているように、クフェア属に属する植物由来のTEをコードする遺伝子を導入した大腸菌やシアノバクテリアなどの形質転換体を用いた中鎖脂肪酸の生産においても、脂肪酸の生産量の向上が試みられている。
本発明者はこのような技術に関して、中鎖脂肪酸の生産性を向上させるためにクフェア属に属する植物由来の野生型のTEにアミノ酸置換を導入する部位に着目し、検討を行った。その結果、特許文献２及び３などで開示されている部位とは異なる部位でアミノ酸置換を行ったTE改変体の利用が、中鎖脂肪酸の生産に有効であることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ−１）〜（Ａ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列において、下記（Ｂ−１）〜（Ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ−１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。
（Ａ−２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。
（Ａ−３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。
（Ａ−４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。
（Ａ−５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。
（Ａ−６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ａ−７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。
（Ａ−８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。
（Ａ−９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。
（Ａ−１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。
（Ａ−１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ｂ−１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｂ−２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
（Ｂ−３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
（Ｂ−４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。
（Ｂ−５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｂ−６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
（Ｂ−７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
（Ｂ−８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。
（Ｂ−９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
（Ｂ−１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。
（Ｂ−１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
【００１０】
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法に関する。
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める中鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法に関する。
【００１１】
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）に関する。
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）をコードする遺伝子に関する。
さらに本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）をコードする遺伝子を含んでなる、形質転換体に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の脂質の製造方法によれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
また本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
さらに本発明のアシル-ACPチオエステラーゼ改変体、及びこれをコードする遺伝子は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産に好適に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書における「脂質」は、中性脂質（モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分又はアシル基の部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と「脂肪酸残基」の総称として用いる。
また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基を脂肪酸と見做して合計した全脂肪酸（総脂肪酸）の重量に対する各脂肪酸の重量割合を意味する。脂肪酸の重量（生産量）や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
【００１４】
また本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数xで二重結合の数がyであることを表す。「Cx」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに本明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
【００１５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列番号４８で示されるアミノ酸配列からなるクフェア・パルストリス由来の野生型のTEのアミノ酸配列の一部である。配列番号１で示されるアミノ酸配列では、野生型のTEのアミノ酸配列の全長から、シグナル配列（配列番号４８の２位〜５７位のアミノ酸配列）と推定される部位が除かれている。すなわち配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列番号４８で示されるアミノ酸配列から１位〜５７位のアミノ酸が除かれ、５８位のアミノ酸のＮ末端にタンパク質合成開始アミノ酸（メチオニン）が付加されている。クフェア属に属する植物由来のTEは、炭素原子数が８又は１０の中鎖アシル-ACPに対する基質特異性が高く、形質転換体における炭素原子数が８又は１０の中鎖脂肪酸の生産性の向上に好適に用いられる。
本発明では、炭素原子数が８又は１０の中鎖アシル-ACPに対する基質特異性を有するクフェア・パルストリス由来の野生型のTEに対して、前記（Ａ−１）〜（Ａ−１１）並びに（Ｂ−１）〜（Ｂ−１１）のいずれかのアミノ酸置換を行う。このようなアミノ酸置換を行った本発明のTE改変体は、野生型のTEと比較して、中鎖アシル-ACPに対する基質特異性がより向上する。そして、本発明のTE改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体は、中鎖脂肪酸の生産性に優れる。
なお、本明細書において、クフェア・パルストリス由来の野生型のTEと、これにアミノ酸変異を施したTE改変体をまとめて、「CpTE」ともいう。
【００１６】
特許文献２及び３は、CpTEのアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列）において、１７２位〜２２１位の領域でアミノ酸置換を行うと、TE改変体の、中鎖アシル-ACPに対する基質特異性が向上することを開示している。
これに対して、本発明では前記（Ａ−１）〜（Ａ−１１）並びに（Ｂ−１）〜（Ｂ−１１）で規定しているように、特許文献２及び３に開示の部位とは異なる部位でのアミノ酸置換を行う。
【００１７】
本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質（アシル-ACPチオエステラーゼ改変体）をコードする遺伝子が導入され、その発現が促進されている。本発明の形質転換体を培養することで、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が向上する。
前記アシル-ACPチオエステラーゼ改変体（以下、「TE改変体」ともいう）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有し、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）を有するタンパク質である。
なお、本明細書において「中鎖」とは、アシル基の炭素原子数が８以上１０以下、好ましくは炭素原子数が８又は１０であることをいう。また、形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００１８】
配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列番号４８で示されるアミノ酸配列のＮ末側から２位〜５７位のアミノ酸配列を除いたものであり、配列番号４８で示されるアミノ酸配列の１位、並びに５８位〜４１１位のアミノ酸配列に対応する。ここで、配列番号４８は、クフェア・パルストリス由来の野生型のTEのアミノ酸配列である。配列番号４８のアミノ酸配列中５８位〜４１１位の領域が、TEとして機能するために重要で、TE活性を示すために十分な領域であることが知られている。すなわち、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、TE活性にとって十分な領域を有するため、TE活性を有し、TEとして機能する。
TEは、脂肪酸やその誘導体（トリアシルグリセロール（トリグリセリド）等）の生合成系に関与する酵素である。当該酵素は、植物体や藻類では葉緑体等の色素体内において、細菌や真菌、動物体では細胞質内において、脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル-ACP（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤプロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する。TEの作用によって、ACP上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。TEには、基質であるアシル-ACPを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のTEが存在していることが知られており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
本明細書において、「TE活性」とは、アシル-ACPのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
【００１９】
前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を基本とし、当該アミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸が、前記（Ａ−１）〜（Ａ−１１）のいずれかで示すように置換されている。
【００２０】
タンパク質（Ａ）として規定するTE改変体では、中鎖アシル-ACPに対する特異性が向上する。すなわちタンパク質（Ａ）のTE改変体は、野生型のTEと比較して、基質として中鎖アシル-ACPを選択的に利用し、これを加水分解する活性が向上する。
中鎖アシル-ACPへの特異性を向上させ、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる観点から、タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列は、前記（Ａ−１）のアミノ酸置換を有することが好ましい。
【００２１】
本明細書においては、アミノ酸置換を有するTE改変体を下記に示すように略記することがある。
CpTE(L257I)又はL257I：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたTE改変体。
CpTE(T251R)又はT251R：配列番号１の２５１位のスレオニン（Ｔ）がアルギニン（Ｒ）に置換されたTE改変体。
CpTE(T251K)又はT251K：配列番号１の２５１位のスレオニン（Ｔ）がリジン（Ｋ）に置換されたTE改変体。
CpTE(T251H)又はT251H：配列番号１の２５１位のスレオニン（Ｔ）がヒスチジン（Ｈ）に置換されたTE改変体。
CpTE(W254I)又はW254I：配列番号１の２５４位のトリプトファン（Ｗ）がイソロイシン（Ｉ）に置換。
CpTE(W254Y)又はW254Y：配列番号１の２５４位のトリプトファン（Ｗ）がチロシン（Ｙ）に置換されたTE改変体。
CpTE(L257M)又はL257M：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）がメチオニン（Ｍ）に置換されたTE改変体。
CpTE(L257V)又はL257V：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）がバリン（Ｖ）に置換されたTE改変体。
CpTE(L257F)又はL257F：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）がフェニルアラニン（Ｆ）に置換されたTE改変体。
CpTE(V266C)又はV266C：配列番号１の２６６位のバリン（Ｖ）がシステイン（Ｃ）に置換。
CpTE(W271Y)又はW271Y：配列番号１の２７１位のトリプトファン（Ｗ）がチロシン（Ｙ）に置換されたTE改変体。
【００２２】
前記タンパク質（Ａ）は、（Ａ−１）〜（Ａ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換に加えて、下記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有することが好ましい。これらのアミノ酸置換を有する場合、中鎖アシル-ACPへの特異性と、中鎖脂肪酸若しくはこれを構成成分とする脂質の生産性が、一層向上する。
本発明において、前記タンパク質（Ａ）は、（Ａ−１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有することがより好ましく、（Ａ−１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）からなる群より選ばれる１つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。
（Ｄ−１）配列番号１の１０６位のバリンがイソロイシンに置換。
（Ｄ−２）配列番号１の１０８位のアスパラギンがリジンに置換。
（Ｄ−３）配列番号１の１０８位のアスパラギンがアルギニンに置換。
（Ｄ−４）配列番号１の１１０位のバリンがイソロイシンに置換。
（Ｄ−５）配列番号１の１１０位のバリンがメチオニンに置換。
（Ｄ−６）配列番号１の１１０位のバリンがロイシンに置換。
（Ｄ−７）配列番号１の１１０位のバリンがフェニルアラニンに置換。
（Ｄ−８）配列番号１の１１８位のシステインがイソロイシンに置換。
【００２３】
本明細書において、前記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）のアミノ酸置換を、下記のように略記することがある。
V106I：配列番号１の１０６位のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換。
N108K：配列番号１の１０８位のアスパラギン（Ｎ）がリジン（Ｋ）に置換。
N108R：配列番号１の１０８位のアスパラギン（Ｎ）がアルギニン（Ｒ）に置換。
V110I：配列番号１の１１０位のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換。
V110M：配列番号１の１１０位のバリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）に置換。
V110L：配列番号１の１１０位のバリン（Ｖ）がロイシン（Ｌ）に置換。
V110F：配列番号１の１１０位のバリン（Ｖ）がフェニルアラニン（Ｆ）に置換。
C118I：配列番号１の１１８位のシステイン（Ｃ）がイソロイシン（Ｉ）に置換。
【００２４】
本発明において前記タンパク質（Ａ）は、下記（Ａ−１＿Ｄ−１）〜（Ａ−１＿Ｄ−８）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有することがより好ましい。
（Ａ−１＿Ｄ−１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１０６位のバリンがイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ａ−１＿Ｄ−２）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１０８位のアスパラギンがリジンに置換。
（Ａ−１＿Ｄ−３）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１０８位のアスパラギンがアルギニンに、それぞれ置換。
（Ａ−１＿Ｄ−４）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ａ−１＿Ｄ−５）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがメチオニンに、それぞれ置換。
（Ａ−１＿Ｄ−６）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがロイシンに、それぞれ置換。
（Ａ−１＿Ｄ−７）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがフェニルアラニンに、それぞれ置換。
（Ａ−１＿Ｄ−８）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１８位のシステインがイソロイシンに、それぞれ置換。
【００２５】
タンパク質（Ｂ）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列を基本とし、かつ、TE活性を有する。タンパク質（Ｂ）もタンパク質（Ａ）と同様、中鎖アシル-ACPへの特異性が向上する。
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにTE活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
【００２６】
前記タンパク質（Ｂ）において、TE活性の点から、配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性は８５％以上であり、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がより好ましい。
また、前記タンパク質（Ｂ）として、配列番号１で示されるアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上５３個以下、好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつTE活性を有するタンパク質が挙げられる。なお、これらのアミノ酸変異は、前記アミノ酸置換（Ｂ−１）〜（Ｂ−１１）とは異なる。
【００２７】
さらに、タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列中に、タンパク質（Ａ）におけるアミノ酸置換と同様のアミノ酸置換を有している。すなわち、タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列は少なくとも、前記（Ｂ−１）〜（Ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。
ここで、配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、スレオニンである。配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、トリプトファンである。配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、ロイシンである。配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、バリンである。さらに、配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、トリプトファンである。
【００２８】
上述したタンパク質（Ａ）と同様、タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列も、前記（Ｂ−１）のアミノ酸置換を有することが好ましい。
【００２９】
前記タンパク質（Ｂ）は、（Ｂ−１）〜（Ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換に加えて、下記（Ｅ−１）〜（Ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有することが好ましい。これらのアミノ酸置換を有する場合、中鎖アシル-ACPへの特異性と、中鎖脂肪酸若しくはこれを構成成分とする脂質の生産性が、一層向上する。
本発明において、前記タンパク質（Ｂ）は、（Ｂ−１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｅ−１）〜（Ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有することがより好ましく、（Ｂ−１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｅ−１）〜（Ｅ−８）からなる群より選ばれる１つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。
（Ｅ−１）配列番号１の１０６位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｅ−２）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
（Ｅ−３）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
（Ｅ−４）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｅ−５）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
（Ｅ−６）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がロイシンに置換。
（Ｅ−７）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
（Ｅ−８）配列番号１の１１８位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
ここで、配列番号１の１０６位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、バリンである。配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、アスパラギンである。配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、バリンである。さらに、配列番号１の１１８位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、システインである。
【００３０】
本発明において前記タンパク質（Ｂ）は、下記（Ｂ−１＿Ｅ−１）〜（Ｂ−１＿Ｅ−８）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有することがより好ましい。
（Ｂ−１＿Ｅ−１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０６位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−２）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がリジンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−３）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がアルギニンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−４）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−５）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がメチオニンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−６）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がフェニルアラニンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、システイン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
【００３１】
アミノ酸配列または塩基配列における「相当する位置」または「相当する領域」は、目的アミノ酸配列を参照配列と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Clustal Wマルチプルアラインメントプログラム（Nucleic Acids Res., 1994, vol. 22, p. 4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Clustal Wは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute:EBI, [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ, [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
【００３２】
前記タンパク質（Ｃ）は、そのアミノ酸配列の一部として前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を含んでおり、かつTE活性を示す。なお、前記タンパク質（Ｃ）のＮ末端のアミノ酸は、開始コドンでコードされるメチオニン又はロイシンであることが好ましい。
前記タンパク質（Ｃ）を構成するアミノ酸配列中、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列以外の配列としては、本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択することができる。例えば、配列番号４８の１位〜５７位の任意の位置範囲からなるアミノ酸配列、又はこのアミノ配列に１個又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下）の変異が導入されたアミノ酸配列、等が挙げられる。変異としては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列のＮ末側に付加されることが好ましい。
あるいは、前記タンパク質（Ｃ）として、配列番号４８に示すアミノ酸配列において、配列番号４８の２位〜５７位の任意の位置でＮ末側が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、前記タンパク質（Ｃ）として、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列に、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましい。
【００３３】
前記タンパク質がTE活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。この時、総脂肪酸量に占める中鎖脂肪酸の割合を、野生型TEを発現させた系と比較することで、中鎖アシル-ACPに対する特異性が向上していることを確認できる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1995, vol. 92(23), p. 10639-10643）によって調製した各種アシル-ACPを基質とした反応を行うことにより、TE活性を測定することができる。
【００３４】
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００３５】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、クフェア・パルストリスから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するTE遺伝子を用いることができる。
なお、クフェア・パルストリス等の植物は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。
【００３６】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子（以下、「TE改変体遺伝子」又は「CpTE改変体遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。ここで、下記に示す配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡは、配列番号２で示される塩基配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（クフェア・パルストリス由来の野生型TE）をコードする。なお、前述のシグナル配列（配列番号４８の１位〜５７位のアミノ酸配列）をコードする塩基配列は、配列番号４９の１〜１７１位に相当する。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列において、下記（ａ−１）〜（ａ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列において、下記（ｂ−１）〜（ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列（好ましくは、開始コドンを除いた前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列）を有し、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ−１）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ａ−２）配列番号２の７５１位〜７５３位の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ａ−３）配列番号２の７５１位〜７５３位の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ａ−４）配列番号２の７５１位〜７５３位の塩基がヒスチジンをコードする塩基に置換。
（ａ−５）配列番号２の７６０位〜７６２位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ａ−６）配列番号２の７６０位〜７６２位の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ａ−７）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ａ−８）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がバリンをコードする塩基に置換。
（ａ−９）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ａ−１０）配列番号２の７９６位〜７９８位の塩基がシステインをコードする塩基に置換。
（ａ−１１）配列番号２の８１１位〜８１３位の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ｂ−１）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ−２）配列番号２の７５１位〜７５３位に相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｂ−３）配列番号２の７５１位〜７５３位に相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｂ−４）配列番号２の７５１位〜７５３位に相当する位置の塩基がヒスチジンをコードする塩基に置換。
（ｂ−５）配列番号２の７６０位〜７６２位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ−６）配列番号２の７６０位〜７６２位に相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ｂ−７）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｂ−８）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がバリンをコードする塩基に置換。
（ｂ−９）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基酸がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｂ−１０）配列番号２の７９６位〜７９８位に相当する位置の塩基がシステインをコードする塩基に置換。
（ｂ−１１）配列番号２の８１１位〜８１３位に相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
【００３７】
ＤＮＡ（ａ）の塩基配列は、タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列が有するアミノ酸置換に相当する塩基置換を有する。具体的には、塩基置換（ａ−１）、（ａ−２）、（ａ−３）、（ａ−４）、（ａ−５）、（ａ−６）、（ａ−７）、（ａ−８）、（ａ−９）、（ａ−１０）及び（ａ−１１）はそれぞれ、前記アミノ酸置換（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−３）、（Ａ−４）、（Ａ−５）、（Ａ−６）、（Ａ−７）、（Ａ−８）、（Ａ−９）、（Ａ−１０）及び（Ａ−１１）に対応する。
ＤＮＡ（ｂ）の塩基配列も同様に、タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列が有するアミノ酸置換に相当する塩基置換を有する。具体的には、塩基置換（ｂ−１）、（ｂ−２）、（ｂ−３）、（ｂ−４）、（ｂ−５）、（ｂ−６）、（ｂ−７）、（ｂ−８）、（ｂ−９）、（ｂ−１０）及び（ｂ−１１）はそれぞれ、前記アミノ酸置換（Ｂ−１）、（Ｂ−２）、（Ｂ−３）、（Ｂ−４）、（Ｂ−５）、（Ｂ−６）、（Ｂ−７）、（Ｂ−８）、（Ｂ−９）、（Ｂ−１０）及び（Ｂ−１１）に対応する。
【００３８】
前記ＤＮＡ（ａ）は、（ａ−１）〜（ａ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換に加えて、下記（ｄ−１）〜（ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有することが好ましい。本発明において前記ＤＮＡ（ａ）は、（ａ−１）の塩基置換、並びに下記（ｄ−１）〜（ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、を有することがより好ましい。
（ｄ−１）配列番号２の３１６位〜３１８位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｄ−２）配列番号２の３２２位〜３２４位の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｄ−３）配列番号２の３２２位〜３２４位の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｄ−４）配列番号２の３２８位〜３３０位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｄ−５）配列番号２の３２８位〜３３０位の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｄ−６）配列番号２の３２８位〜３３０位の塩基がロイシンをコードする塩基に置換。
（ｄ−７）配列番号２の３２８位〜３３０位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｄ−８）配列番号２の３５２位〜３５４位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
【００３９】
本発明において前記ＤＮＡ（ａ）は、下記（ａ−１＿ｄ−１）〜（ａ−１＿ｄ−８）からなる群より選ばれる塩基置換を有することがより好ましい。
（ａ−１＿ｄ−１）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３１６位〜３１８位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−２）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２２位〜３２４位の塩基がリジンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−３）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２２位〜３２４位の塩基がアルギニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−４）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位〜３３０位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−５）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位〜３３０位の塩基がメチオニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−６）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位〜３３０位の塩基がロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−７）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位〜３３０位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−８）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３５２位〜３５４位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
【００４０】
前記ＤＮＡ（ｂ）において、TE活性の点から、配列番号２で示される塩基配列との同一性は７０％以上であり、７５％以上が好ましく、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がより好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｂ）として、配列番号２で示される塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上３２０個以下、好ましくは１個以上２６７個以下、より好ましくは１個以上２１３個以下、より好ましくは１個以上１６０個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上８５個以下、より好ましくは１個以上７４個以下、より好ましくは１個以上６４個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１０個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつTE活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡも好ましい。なお、これらの塩基配列の変異は、前記塩基置換（ｂ−１）〜（ｂ−１１）とは異なる。
さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつTE活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡも好ましい。
【００４１】
前記ＤＮＡ（ｂ）は、（ｂ−１）〜（ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換に加えて、下記（ｅ−１）〜（ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有することが好ましい。本発明において前記ＤＮＡ（ｂ）は、（ｂ−１）の塩基置換、並びに下記（ｅ−１）〜（ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、を有することがより好ましい。
（ｅ−１）配列番号２の３１６位〜３１８位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ−２）配列番号２の３２２位〜３２４位に相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｅ−３）配列番号２の３２２位〜３２４位に相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｅ−４）配列番号２の３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ−５）配列番号２の３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｅ−６）配列番号２の３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ−７）配列番号２の３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｅ−８）配列番号２の３５２位〜３５４位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
【００４２】
本発明において前記ＤＮＡ（ｂ）は、下記（ｂ−１＿ｅ−１）〜（ｂ−１＿ｅ−８）からなる群より選ばれる塩基置換を有することがより好ましい。
（ｂ−１＿ｅ−１）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３１６位〜３１８位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−２）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２２位〜３２４位に相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−３）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２２位〜３２４位に相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−４）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−５）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−６）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−７）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−８）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３５２位〜３５４位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
【００４３】
前記ＤＮＡ（ｃ）は、その塩基配列の一部として前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を含んでおり、かつTE活性を示すタンパク質をコードする。なお、前記ＤＮＡ（ｃ）の5'末端の塩基配列は、メチオニン(ATG)又はロイシン(TTG)をコードする開始コドンであることが好ましい。
前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列中、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列以外の塩基配列としては、本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択することができる。例えば、配列番号４９の１位〜１７１位の任意の塩基配列、又はこの塩基配列に１又は数個（好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下）の変異が導入された塩基配列、等が挙げられる。変異としては、塩基の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列の5'側に付加されることが好ましい。
あるいは、前記ＤＮＡ（ｃ）として、配列番号４９に示す塩基配列において、配列番号４９の４位〜１７１位の任意の位置で5'側が欠失した塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。また、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列が、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列の5'側に付加されることが好ましい。
【００４４】
塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCR（Gene, 1989, vol. 77, p. 61-68）を利用した方法、ＯＤＡ法（Gene，1995，152，271-276）、Kunkel法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, p. 488）等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００４５】
CpTE改変体をコードする遺伝子（CpTE改変体遺伝子）は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいてCpTE改変体遺伝子を、人工的に合成できる。CpTE改変体遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、クフェア・パルストリスからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
【００４６】
前記CpTE改変体遺伝子を常法により宿主に導入することで、本発明の形質転換体を作製することができる。具体的には、前記CpTE改変体遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
【００４７】
形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、及び動物体が挙げられる。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物、シネコシスティス（Synechocystis）属の微生物、シネココッカス（Synechococcus）属のシアノバクテリア等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、モルチエレラ・エスピー（Mortierella sp．）、又はシアノバクテリアが好ましく、大腸菌又はシアノバクテリアがより好ましい。
藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、西洋アブラナ（Brassica napus）、アブラナ（Brassica rapa）、ココヤシ（Cocos nucifera）、パーム（Elaeis guineensis）、クフェア、ダイズ（Glycine max）、トウモロコシ（Zea mays）、イネ（Oryza sativa）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、クスノキ（Cinnamomum camphora）、又はヤトロファ（Jatropha curcas）が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【００４８】
製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物が好ましく、大腸菌又はシアノバクテリアがより好ましい。
【００４９】
本発明で好ましく用いることができるシアノバクテリア（藍色細菌）は真正細菌の一群であり、光合成によって酸素を産生し、ＣＯ２を固定化する能力を有する。シアノバクテリアは、クロロフィルを用いた光合成を行う原核生物の一群である。シアノバクテリアは多様性に富んでおり、細胞の形状のみを見ても、シネコシスティス・エスピー（Synechocystis sp．）PCC6803のような単細胞性のもの、ヘテロシストを形成し窒素固定を行うアナベナ・エスピー（Anabaena sp．）PCC7120のように多細胞がヒモ状に繋がっている糸状性のもの、又はらせん状や分岐状のもの等がある。生育環境についても、別府温泉から単離されたサーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongatus）BP-1のような好熱性のもの、海洋性で沿岸部に生息するシネココッカス・エスピー（Synechococcus sp．）CC9311、又は外洋に生息するシネココッカス・エスピーWH8102など、様々な条件に適応した種が見られる。また、種独自の特徴を持つものとして、ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）のように、ガス小胞を持ち毒素を産生することのできるものや、チラコイドを持たず集光アンテナであるフィコビリソームが原形質膜に結合しているグロイオバクター・ビオラセウス（Gloeobacter violaceus）PCC7421、又は一般的な光合成生物のようにクロロフィルａでなくクロロフィルｄを主要な（＞９５％）光合成色素として持つ海洋性のアクリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）なども挙げられる。シアノバクテリアでは、光合成により固定された二酸化炭素は多数の酵素反応プロセスを経てアセチル−ＣｏＡへと変換される。
本発明では、あらゆる種類のシアノバクテリアを用いることができる。例えば、シネコシスティス（Synechocystis）属、シネココッカス（Synechococcus）属、サーモシネココッカス（Thermosynechococcus）属、トリコデスミウム（Trichodesmium）属、アカリオクロリス（Acaryochloris）属、クロコスファエラ（Crocosphaera）属、及びアナベナ（Anabaena）属のシアノバクテリアが挙げられる。このうち、シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属又はアナベナ属のシアノバクテリアが好ましく、シネコシスティス属又はシネココッカス属のシアノバクテリアがより好ましい。また本発明で用いる宿主としては、シネコシスティス・エスピーPCC6803、シネコシスティス・エスピーPCC7509、シネコシスティス・エスピーPCC6714、シネココッカス・エロンガタスエスピー（Synechococcus elongatus sp．）PCC7942、サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1、トリコデスミウム・エリスラエウム（Trichodesmium erythraeum）IMS101、アカリオクロリス・マリアナ（Acaryochloris mariana）MBIC11017、クロコスファエラ・ワトソニー（Crocosphaera watsonii）WH8501、及びアナベナ・エスピー（Anabaena sp．）PCC7120がより好ましく、シネコシスティス・エスピーPCC6803及びシネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942がより好ましく、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942がさらに好ましい。
また、シアノバクテリアは、アシル-ACPシンテターゼ（以下、「aas」ともいう）の機能を喪失していることが好ましい。aasの機能を喪失させたシアノバクテリアを用いた場合、形質転換体が生産した脂質の分泌能を向上させることができる。ここで「aas」とは脂肪酸合成に関わる酵素の１種であって、遊離脂肪酸とACPタンパク質を基質として、ＡＴＰ依存的にチオエステル結合を形成し、アシル-ACPを産生する機能を有する。シアノバクテリアにおいてaasの機能を喪失させることで脂肪酸の蓄積及び分泌が促進されることが知られている（Plant Physiology, 2010, vol. 152(3), p. 1598-1610参照）。
【００５０】
遺伝子発現用プラスミド又は遺伝子発現用カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、使用する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS） II SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（1986，Plasmid 15（2），p．93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、pMW218/219（ニッポンジーン社製）、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript II SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。また、宿主がシアノバクテリアの場合は、pUC系ベクターが好ましく用いられる。
藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672参照）、及びpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
このＤＮＡ断片としては、例えば、PCR法により増幅したDNA断片や制限酵素で切断したDNA断片が挙げられる。目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
【００５１】
前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)）、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ(lipid droplet surface protein)遺伝子のプロモーター（PLOS Genetics, 2012;8(11):e1003064. doi: 10.1371）、及びリボゾームRNAをコードするrrnAオペロン遺伝子のプロモーターが挙げられる。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
【００５２】
形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。
【００５３】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的DNA断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたPCR法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。
【００５４】
各種宿主に導入するCpTE改変体遺伝子は、使用する宿主におけるコドン使用頻度にあわせてコドンを至適化されることが好ましい。各種生物が使用するコドンの情報は、Codon Usage Database（www.kazusa.or.jp/codon/）などから入手可能である。
【００５５】
本発明の形質転換体は、野生株自体に比べ、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性、特に、生産される全脂肪酸中又は全脂質中に占める中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の割合が有意に向上する。またその結果、本発明の形質転換体では、生産される脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、本発明の形質転換体は、特定の炭素原子数の脂肪酸又は脂質、特に中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数８以上１０以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の飽和脂肪酸（カプリル酸、カプリン酸）又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
以下、本明細書において、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子が導入させたものを「形質転換体」ともいう。これに対して、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子が導入させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
【００５６】
本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）の発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
本発明の形質転換体の培養条件は、宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。
【００５７】
宿主として大腸菌を用いる場合、大腸菌の培養は、例えば、ＬＢ培地又はOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養することができる。
宿主としてシアノバクテリアを用いる場合、BG-11培地（J. Gen. Microbiol., 1979, vol. 111, p. 1-61）、Ａ培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1980, vol. 77, p. 6052-6056）、ＡＡ培地（Plant Physiol., 1955, vol. 30, p. 366-372）など、シアノバクテリアの培養に通常用いられる培地を用いて、液体培養又はその変法により実施することができる。脂質生産のための培養期間としては、十分に菌体が増殖した条件で脂肪酸が高濃度に蓄積するように行えばよく、例えば、７〜４５日間、好ましくは１０〜３０日間、より好ましくは１４〜２１日間、通気攪拌培養又は振とう培養がすることが好適である。
また、宿主としてシロイヌナズナを用いる場合、シロイヌナズナの培養は、例えば、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培することができる。
【００５８】
宿主として藻類を用いる場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する藻類の量は適宜選択することができ、生育性の点から、培地当り１％（vol/vol）以上が好ましい。また、その上限値は５０％（vol/vol）以下が好ましく、１０％（vol/vol）以下がより好ましい。接種する藻類の量の数値範囲は、１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、１０℃以上が好ましく、１５℃以上がより好ましい。またその上限値は３５℃以下が好ましく、３０℃以下がより好ましい。培養温度の数値範囲は、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、１００ルクス以上が好ましく、３００ルクス以上がより好ましく、１０００ルクス以上がさらに好ましい。またその上限値は、５００００ルクス以下が好ましく、１００００ルクス以下がより好ましく、６０００ルクス以下がさらに好ましい。光照射時の照度の数値範囲は、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期は８時間以上が好ましく、１０時間以上がより好ましい。またその上限値は、２４時間以下が好ましく、１８時間以下がより好ましい。明期の数値範囲は、好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３％（大気条件と同程度）以上が好ましく、０．０５％以上がより好ましく、０．１％以上がさらに好ましく、０．３％以上がよりさらに好ましい。またその上限値は、１０％以下が好ましく、５％以下がより好ましく、３％以下がさらに好ましく、１％以下がよりさらに好ましい。二酸化炭素の濃度の数値範囲は、０．０３〜１０％が好ましく、０．０５〜５％がより好ましく、０．１〜３％がさらに好ましく、０．３〜１％がよりさらに好ましい。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１質量％以上が好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。またその上限値は、５質量％以下が好ましく、２質量％以下がより好ましく、１質量％以下がさらに好ましい。炭酸水素ナトリウムの濃度の数値範囲は、０．０１〜５質量％が好ましく、０．０５〜２質量％がより好ましく、０．１〜１質量％がさらに好ましい。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。３日以上が好ましく、７日以上がより好ましい。またその上限値は、９０日以下が好ましく、３０日以下がより好ましい。培養期間の数値範囲は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気撹拌培養又は振とう培養が好ましく、通気撹拌培養がより好ましい。
【００５９】
培養物又は生育物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物又は生育物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物又は生育物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
また、脂肪酸分解経路であるβ-酸化経路の機能を喪失させた大腸菌、若しくはaasの機能を喪失させたシアノバクテリアを宿主として作製した形質転換体を用いた場合、生産された脂質は細胞外に分泌される。よって、脂質を回収するために菌体を破壊する必要がなく、脂質回収後に残った細胞を繰り返し脂質生産に使用することができる。
【００６０】
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。前記脂肪酸エステル化合物は、ＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、ＴＡＧがより好ましい。
脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性や栄養学的観点から、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましい。具体的には、炭素原子数８以上１０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましく、炭素原子数８若しくは１０のの脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素原子数８若しくは１０の飽和脂肪酸（カプリル酸、カプリン酸）又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましい。
脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
【００６１】
本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００６２】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、生産される脂質の脂肪酸組成を改変する方法、タンパク質、遺伝子、組換えベクター若しくはＤＮＡカセット、並びに形質転換体及びその作製方法を開示する。
【００６３】
＜１＞下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ−１）〜（Ａ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは（Ａ−１）のアミノ酸置換、を有するアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列において、下記（Ｂ−１）〜（Ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは（Ｂ−１）のアミノ酸置換、を有するアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列（好ましくは、合成開始アミノ酸を除いた前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列）を有し、かつTE活性を有するタンパク質。
（Ａ−１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。
（Ａ−２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。
（Ａ−３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。
（Ａ−４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。
（Ａ−５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。
（Ａ−６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ａ−７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。
（Ａ−８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。
（Ａ−９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。
（Ａ−１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。
（Ａ−１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ｂ−１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに置換。
（Ｂ−２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、スレオニン）がアルギニンに置換。
（Ｂ−３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、スレオニン）がリジンに置換。
（Ｂ−４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、スレオニン）がヒスチジンに置換。
（Ｂ−５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、トリプトファン）がイソロイシンに置換。
（Ｂ−６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、トリプトファン）がチロシンに置換。
（Ｂ−７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がメチオニンに置換。
（Ｂ−８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がバリンに置換。
（Ｂ−９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がフェニルアラニンに置換。
（Ｂ−１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がシステインに置換。
（Ｂ−１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、トリプトファン）がチロシンに置換。
【００６４】
＜２＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
＜３＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める中鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
【００６５】
＜４＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、前記（Ｂ−１）〜（Ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは（Ｂ−１）のアミノ酸置換、を有するタンパク質である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の方法。
【００６６】
＜５＞前記タンパク質（Ａ）が、下記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換（好ましくは前記（Ａ−１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換）を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、下記（Ｅ−１）〜（Ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換（好ましくは前記（Ｂ−１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｅ−１）〜（Ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換）を有する、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｄ−１）配列番号１の１０６位のバリンがイソロイシンに置換。
（Ｄ−２）配列番号１の１０８位のアスパラギンがリジンに置換。
（Ｄ−３）配列番号１の１０８位のアスパラギンがアルギニンに置換。
（Ｄ−４）配列番号１の１１０位のバリンがイソロイシンに置換。
（Ｄ−５）配列番号１の１１０位のバリンがメチオニンに置換。
（Ｄ−６）配列番号１の１１０位のバリンがロイシンに置換。
（Ｄ−７）配列番号１の１１０位のバリンがフェニルアラニンに置換。
（Ｄ−８）配列番号１の１１８位のシステインがイソロイシンに置換。
（Ｅ−１）配列番号１の１０６位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに置換。
（Ｅ−２）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がリジンに置換。
（Ｅ−３）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がアルギニンに置換。
（Ｅ−４）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに置換。
（Ｅ−５）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がメチオニンに置換。
（Ｅ−６）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がロイシンに置換。
（Ｅ−７）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がフェニルアラニンに置換。
（Ｅ−８）配列番号１の１１８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、システイン）がイソロイシンに置換。
【００６７】
＜６＞前記タンパク質（Ａ）が、下記（Ａ−１＿Ｄ−１）〜（Ａ−１＿Ｄ−８）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、下記（Ｂ−１＿Ｅ−１）〜（Ｂ−１＿Ｅ−８）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有する、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の方法。
（Ａ−１＿Ｄ−１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１０６位のバリンがイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ａ−１＿Ｄ−２）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１０８位のアスパラギンがリジンに置換。
（Ａ−１＿Ｄ−３）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１０８位のアスパラギンがアルギニンに、それぞれ置換。
（Ａ−１＿Ｄ−４）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ａ−１＿Ｄ−５）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがメチオニンに、それぞれ置換。
（Ａ−１＿Ｄ−６）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがロイシンに、それぞれ置換。
（Ａ−１＿Ｄ−７）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがフェニルアラニンに、それぞれ置換。
（Ａ−１＿Ｄ−８）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１８位のシステインがイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０６位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−２）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がリジンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−３）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がアルギニンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−４）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−５）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がメチオニンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−６）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がフェニルアラニンに、それぞれ置換。
（Ｂ−１＿Ｅ−８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、システイン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
【００６８】
＜７＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列において、下記（ａ−１）〜（ａ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、好ましくは（ａ−１）の塩基置換、を有する塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列において、下記（ｂ−１）〜（ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、好ましくは（ｂ−１）の塩基置換、を有する塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列（好ましくは、開始コドンを除いた前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列）を有し、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ−１）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ａ−２）配列番号２の７５１位〜７５３位の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ａ−３）配列番号２の７５１位〜７５３位の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ａ−４）配列番号２の７５１位〜７５３位の塩基がヒスチジンをコードする塩基に置換。
（ａ−５）配列番号２の７６０位〜７６２位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ａ−６）配列番号２の７６０位〜７６２位の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ａ−７）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ａ−８）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がバリンをコードする塩基に置換。
（ａ−９）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ａ−１０）配列番号２の７９６位〜７９８位の塩基がシステインをコードする塩基に置換。
（ａ−１１）配列番号２の８１１位〜８１３位の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ｂ−１）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ−２）配列番号２の７５１位〜７５３位に相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｂ−３）配列番号２の７５１位〜７５３位に相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｂ−４）配列番号２の７５１位〜７５３位に相当する位置の塩基がヒスチジンをコードする塩基に置換。
（ｂ−５）配列番号２の７６０位〜７６２位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ−６）配列番号２の７６０位〜７６２位に相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ｂ−７）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｂ−８）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がバリンをコードする塩基に置換。
（ｂ−９）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基酸がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｂ−１０）配列番号２の７９６位〜７９８位に相当する位置の塩基がシステインをコードする塩基に置換。
（ｂ−１１）配列番号２の８１１位〜８１３位に相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
【００６９】
＜８＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上３２０個以下、より好ましくは１個以上２６７個以下、より好ましくは１個以上２１３個以下、より好ましくは１個以上１６０個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上８５個以下、より好ましくは１個以上７４個以下、より好ましくは１個以上６４個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加され、前記（ｂ−１）〜（ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、好ましくは（ｂ−１）の塩基置換、を有する塩基配列からなり、かつTE活性を有する前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、、前記（ｂ−１）〜（ｂ−１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、好ましくは（ｂ−１）の塩基置換、を有し、かつTE活性を有する前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡ、である、前記＜７＞項記載の方法。
【００７０】
＜９＞前記ＤＮＡ（ａ）が、下記（ｄ−１）〜（ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換（好ましくは前記（ａ−１）の塩基置換、並びに下記（ｄ−１）〜（ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換）を有し、前記ＤＮＡ（ｂ）が、下記（ｅ−１）〜（ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換（好ましくは前記（ｂ−１）の塩基置換、並びに下記（ｅ−１）〜（ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換）を有する、前記＜７＞又は＜８＞項記載の方法。
（ｄ−１）配列番号２の３１６位〜３１８位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｄ−２）配列番号２の３２２位〜３２４位の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｄ−３）配列番号２の３２２位〜３２４位の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｄ−４）配列番号２の３２８位〜３３０位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｄ−５）配列番号２の３２８位〜３３０位の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｄ−６）配列番号２の３２８位〜３３０位の塩基がロイシンをコードする塩基に置換。
（ｄ−７）配列番号２の３２８位〜３３０位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｄ−８）配列番号２の３５２位〜３５４位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ−１）配列番号２の３１６位〜３１８位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ−２）配列番号２の３２２位〜３２４位に相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｅ−３）配列番号２の３２２位〜３２４位に相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｅ−４）配列番号２の３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ−５）配列番号２の３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｅ−６）配列番号２の３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ−７）配列番号２の３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｅ−８）配列番号２の３５２位〜３５４位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
【００７１】
＜１０＞前記ＤＮＡ（ａ）が、下記（ａ−１＿ｄ−１）〜（ａ−１＿ｄ−８）からなる群より選ばれる塩基置換を有し、前記ＤＮＡ（ｂ）が、下記（ｂ−１＿ｅ−１）〜（ｂ−１＿ｅ−８）からなる群より選ばれる塩基置換を有する、前記＜７＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ−１＿ｄ−１）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３１６位〜３１８位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−２）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２２位〜３２４位の塩基がリジンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−３）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２２位〜３２４位の塩基がアルギニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−４）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位〜３３０位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−５）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位〜３３０位の塩基がメチオニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−６）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位〜３３０位の塩基がロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−７）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位〜３３０位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ−１＿ｄ−８）配列番号２の７６９位〜７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３５２位〜３５４位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−１）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３１６位〜３１８位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−２）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２２位〜３２４位に相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−３）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２２位〜３２４位に相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−４）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−５）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−６）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−７）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位〜３３０位に相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ−１＿ｅ−８）配列番号２の７６９位〜７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３５２位〜３５４位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
【００７２】
＜１１＞前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞前記微生物が大腸菌である、前記＜１１＞項記載の方法。
＜１３＞前記微生物がシアノバクテリアである、前記＜１１＞項記載の方法。
＜１４＞前記脂肪酸又は脂質が、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数８以上１０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の飽和脂肪酸（カプリル酸、カプリン酸）又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
【００７３】
＜１５＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）。
＜１６＞前記タンパク質（Ａ）が、前記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換（好ましくは前記（Ａ−１）のアミノ酸置換、並びに前記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換）を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、前記（Ｅ−１）〜（Ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換（好ましくは前記（Ｂ−１）のアミノ酸置換、並びに前記（Ｅ−１）〜（Ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換）を有する、前記＜１５＞項記載のタンパク質。
＜１７＞前記タンパク質（Ａ）が、前記（Ａ−１＿Ｄ−１）〜（Ａ−１＿Ｄ−８）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、前記（Ｂ−１＿Ｅ−１）〜（Ｂ−１＿Ｅ−８）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有する、前記＜１５＞又は＜１６＞項記載のタンパク質。
＜１８＞前記＜１５＞〜＜１７＞のいずれか１項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜１９＞前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つからなる遺伝子。
＜２０＞前記ＤＮＡ（ａ）が、前記（ｄ−１）〜（ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換（好ましくは前記（ａ−１）の塩基置換、並びに前記（ｄ−１）〜（ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換）を有し、前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記（ｅ−１）〜（ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換（好ましくは前記（ｂ−１）の塩基置換、並びに前記（ｅ−１）〜（ｅ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換）を有する、前記＜１９＞項記載の遺伝子。
＜２１＞前記ＤＮＡ（ａ）が、前記（ａ−１＿ｄ−１）〜（ａ−１＿ｄ−８）からなる群より選ばれる塩基置換を有し、前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記（ｂ−１＿ｅ−１）〜（ｂ−１＿ｅ−８）からなる群より選ばれる塩基置換を有する、前記＜１９＞又は＜２０＞項記載の遺伝子。
＜２２＞前記＜１８＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の遺伝子を含有する、組換えベクター又はＤＮＡカセット。
【００７４】
＜２３＞前記＜１８＞〜＜２２＞のいずれか１項記載の遺伝子、組換えベクター又はＤＮＡカセットを含んでなる、形質転換体。
＜２４＞前記＜１８＞〜＜２２＞のいずれか１項記載の遺伝子、組換えベクター又はＤＮＡカセットを宿主に導入する、形質転換体の作製方法。
＜２５＞前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、前記＜２３＞又は＜２４＞項記載の形質転換体、又はその作製方法。
＜２６＞前記微生物が大腸菌である、前記＜２５＞項記載の形質転換体、又はその作製方法。
＜２７＞前記微生物がシアノバクテリアである、前記＜２５＞項記載の形質転換体、又はその作製方法。
【００７５】
＜２８＞脂質を製造するための、前記＜１５＞〜＜２７＞のいずれか１項記載のタンパク質、遺伝子、組換えベクター若しくはＤＮＡカセット、形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜２９＞前記脂質が、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数８以上１０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の飽和脂肪酸（カプリル酸、カプリン酸）又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜２８＞項記載の使用。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１及び２に示す。
【００７７】
【表１】
2019068755.tif 000002
【００７８】
【表２】
2019068755.tif 000003
【００７９】
実施例１  CpTE改変体を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）CpTE遺伝子発現用プラスミドの構築
pBS-SK(-)プラスミド（アジレント・テクノロジー社製）を鋳型とし、表１記載のプライマーpBS-F及びプライマーpBS-Rを用いてＰＣＲを行い、pBS-SK(-)線状DNA配列を増幅した。
さらに、クフェア・パルストリス由来のTE遺伝子（GenBank: U38188.1、配列番号４９）を人工的に合成した。合成したDNA配列を鋳型とし、表１記載のプライマーpBS/CpTE-F及びプライマーCpTE/pBS-Rを用いてＰＣＲを行い、葉緑体移行シグナルと推定される配列を除去したクフェア・パルストリス由来のTE遺伝子（配列番号２、以下、「CpTE遺伝子」ともいう）の断片を増幅した。
次いで、前記pBS-SK(-)線状DNA配列、及びCpTE遺伝子の断片を混合し、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、pBS-SK(-)プラスミドのlacOプロモーターの下流にCpTE遺伝子の塩基配列が挿入されたプラスミドpBS-CpTEを得た。
【００８０】
（２）CpTE改変体遺伝子発現用プラスミドの構築
前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_T251R-F、プライマーCpTE_T251K-F及びプライマーCpTE_T251H-Fのいずれか１つと、プライマーCpTE_T251-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列（CpTE遺伝子の塩基配列）の７５１〜７５３位の塩基配列を改変した遺伝子断片をそれぞれ取得した。
また、前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_W254I-F及びプライマーCpTE_W254Y-Fのいずれか１つと、プライマーCpTE_W254-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６０〜７６２位の塩基配列を改変した遺伝子断片をそれぞれ取得した。
また、前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_L257I-F、プライマーCpTE_L257M-F、プライマーCpTE_L257V-F及びプライマーCpTE_L257F-Fのいずれか１つと、プライマーCpTE_L257-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６９〜７７１位の塩基配列を改変した遺伝子断片をそれぞれ取得した。
また、前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_V266C-Fと、プライマーCpTE_V266-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７９６〜７９８位の塩基配列を改変した遺伝子断片を取得した。
また、前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_W271Y-Fと、プライマーCpTE_W271-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の８１１〜８１３位の塩基配列を改変した遺伝子断片を取得した。
さらに、前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_M174I-Fと、プライマーCpTE_M174-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の５２０〜５２２位の塩基配列を改変した遺伝子断片をそれぞれ取得した。
【００８１】
これらの遺伝子断片を用いて、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、CpTE改変体遺伝子発現用プラスミドpBS-CpTE_T251R、pBS-CpTE_T251K、pBS-CpTE_T251H、pBS-CpTE_W254I、pBS-CpTE_W254Y、pBS-CpTE_L257I、pBS-CpTE_L257M、pBS-CpTE_L257V、pBS-CpTE_L257F、pBS-CpTE_V266C、pBS-CpTE_W271Y、pBS-CpTE_M174Iをそれぞれ構築した。
これらのプラスミドにおいて、配列番号２に示す塩基配列のうち、下記の塩基を置換した。
【００８２】
pBS-CpTE_T251R：配列番号１の２５１位のスレオニン（Ｔ）をコードする塩基を、アルギニン（Ｒ）をコードする塩基ＣＧＴに置換した。
pBS-CpTE_T251K：配列番号１の２５１位のスレオニン（Ｔ）をコードする塩基を、リジン（Ｋ）をコードする塩基ＡＡＡに置換した。
pBS-CpTE_T251H：配列番号１の２５１位のスレオニン（Ｔ）をコードする塩基を、ヒスチジン（Ｈ）をコードする塩基ＣＡＴに置換した。
pBS-CpTE_W254I：配列番号１の２５４位のトリプトファン（Ｗ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
pBS-CpTE_W254Y：配列番号１の２５４位のトリプトファン（Ｗ）をコードする塩基を、チロシン（Ｙ）をコードする塩基ＴＡＴに置換した。
pBS-CpTE_L257I：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
pBS-CpTE_L257M：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、メチオニン（Ｍ）をコードする塩基ＡＴＧに置換した。
pBS-CpTE_L257V：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、バリン（Ｖ）をコードする塩基ＧＴＴに置換した。
pBS-CpTE_L257F：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、フェニルアラニン（Ｆ）をコードする塩基ＴＴＴに置換した。
pBS-CpTE_V266C：配列番号１の２６６位のバリン（Ｖ）をコードする塩基を、システイン（Ｃ）をコードする塩基ＴＧＴに置換した。
pBS-CpTE_W271Y：配列番号１の２７１位のトリプトファン（Ｗ）をコードする塩基を、チロシン（Ｙ）をコードする塩基ＴＡＴに置換した。
pBS-CpTE_M174I：配列番号１の１７４位のメチオニン（Ｍ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
【００８３】
前記プラスミドpBS-CpTE_L257Iを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_V106I-F及びプライマーCpTE_V106-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６９〜７７１位に加えて、３１６〜３１８位の塩基配列も改変した遺伝子断片を取得した。
また、前記プラスミドpBS-CpTE_L257Iを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_N108R-及びプライマーCpTE_N108K-Fのいずれか１つと、プライマーCpTE_N108-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６９〜７７１位に加えて、３２２〜３２４位の塩基配列も改変した遺伝子断片をそれぞれ取得した。
また、前記プラスミドpBS-CpTE_L257Iを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_V110I-F、プライマーCpTE_V110M-F、プライマーCpTE_V110L-F及びプライマーCpTE_V110F-Fのいずれか１つと、プライマーCpTE_V110-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６９〜７７１位に加えて、３２８〜３３０位の塩基配列も改変した遺伝子断片をそれぞれ取得した。
さらに、前記プラスミドpBS-CpTE_L257Iを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_C118I-F及びプライマーCpTE_C118-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６９〜７７１位に加えて、３５２〜３５４位の塩基配列も改変した遺伝子断片を取得した。
【００８４】
これらの遺伝子断片を用いて、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、CpTE改変体遺伝子発現用プラスミドpBS-CpTEL257IV106I、pBS-CpTEL257IN108K、pBS-CpTEL257IN108R、pBS-CpTEL257IV110I、pBS-CpTEL257IV110M、pBS-CpTEL257IV110L、pBS-CpTEL257IV110F、pBS-CpTEL257IC118Iをそれぞれ構築した。
これらのプラスミドにおいて、配列番号２に示す塩基配列のうち、下記の塩基を置換した。
【００８５】
pBS-CpTEL257IV106I：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１０６位のバリン（Ｖ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
pBS-CpTEL257IN108K：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１０８位のアスパラギン（Ｎ）をコードする塩基を、リジン（Ｋ）をコードする塩基ＡＡＡに置換した。
pBS-CpTEL257IN108R：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１０８位のアスパラギン（Ｎ）をコードする塩基を、アルギニン（Ｒ）をコードする塩基ＣＧＴに置換した。
pBS-CpTEL257IV110I：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１１０位のバリン（Ｖ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
pBS-CpTEL257IV110M：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１１０位のバリン（Ｖ）をコードする塩基を、メチオニン（Ｍ）をコードする塩基ＡＴＧに置換した。
pBS-CpTEL257IV110L：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１１０位のバリン（Ｖ）をコードする塩基を、ロイシン（Ｌ）をコードする塩基ＴＴＡに置換した。
pBS-CpTEL257IV110F：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１１０位のバリン（Ｖ）をコードする塩基を、フェニルアラニン（Ｆ）をコードする塩基ＴＴＴに置換した。
pBS-CpTEL257IC118I：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１１８位のシステイン（Ｃ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
【００８６】
（３）遺伝子発現用プラスミドの大腸菌への導入、及び得られた形質転換体を用いた脂質の製造
前述のCpTE遺伝子発現用プラスミド、並びに各種CpTE改変体遺伝子発現用プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株（fadD88）（Eur. J. Biochem., 1969, vol. 7, p. 559-574）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を３０℃で一晩静置し、得られたコロニーをLBAmp液体培地（Bacto Trypton 1%, Yeast Extract 0.5%, NaCl 1%, アンピシリンナトリウム５０μg/mL）１ｍＬに接種し、３０℃で一晩培養した。この培養液２μＬを、２ｍＬのOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）に接種し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、下記の方法にて解析した。
【００８７】
（４）大腸菌培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
培養液１ｍＬに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノンを２５μＬ添加後、２Ｎ塩酸１０μＬ及びヘキサン２ｍＬを添加して激しく攪拌し、３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った。パスツールピペットにてヘキサン層（上層）を新しい蓋付きねじ口試験管に回収した。得られたヘキサン層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）１ｍＬを添加し、８０℃にて３０分間恒温した。その後、ヘキサン及び飽和食塩水を各１ｍＬ添加して激しく撹拌し、室温にて３０分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
【００８８】
得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。ガスクロマトグラフィーは、７８９０Ａ（Agilent Technologies）を用いて、下記の条件下で解析を実施した。
（解析条件）
キャピラリーカラム：DB-1 MS（30m×200μm×0.25μm、J＆W Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
カラム内流量：1.0mL/分
昇温プログラム：70℃保持１分間→70〜200℃（20℃/分昇温）→200〜320℃（50℃/分昇温）→320℃保持５分間
平衡化時間：１分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１）
圧力１４．４９ｐｓｉ、１０４ｍＬ／分
注入量：１μＬ
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：３００℃
【００８９】
また、脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養1Lあたりに含まれる各脂肪酸の量及びこれらの合計量を算出した。
さらに、野生型のCpTE遺伝子若しくはL257I遺伝子を導入した形質転換体のＣ８脂肪酸量及びＣ１０脂肪酸量をそれぞれ１とし、CpTE改変体遺伝子を導入した形質転換体のＣ８脂肪酸量及びＣ１０脂肪酸量をそれぞれ相対値で示した。
その結果を表３及び４に示す。なお表３及び４の結果は、独立した３回の培養とクロマトグラフィー解析の結果の平均値である。
【００９０】
【表３】
2019068755.tif 000004
【００９１】
【表４】
2019068755.tif 000005
【００９２】
表３から明らかなように、野生型のCpTE遺伝子を導入し野生型のCpTEを発現させた形質転換体でのＣ８脂肪酸及びＣ１０脂肪酸の生産量と比較して、本発明のCpTE改変体遺伝子を導入した形質転換体ではＣ８脂肪酸及びＣ１０脂肪酸の生産量がいずれも大きく増加した。
具体的には、野生型のCpTE遺伝子を導入した場合と比べて、T251R遺伝子を導入した場合は1.96倍、T251K遺伝子を導入した場合は1.36倍、T251H遺伝子を導入した場合は1.81倍、W254I遺伝子を導入した場合は2.32倍、W254Y遺伝子を導入した場合は1.46倍、L257I遺伝子を導入した場合は6.80倍、L257M遺伝子を導入した場合は2.10倍、L257V遺伝子を導入した場合は3.58倍、L257F遺伝子を導入した場合は1.55倍、V266C遺伝子を導入した場合は1.37倍、W271Y遺伝子を導入した場合は3.09倍、Ｃ８脂肪酸の生産量が増加した。
またＣ１０脂肪酸の生産量についても、野生型CpTE遺伝子を導入した場合と比べて、T251R遺伝子を導入した場合は2.41倍、T251K遺伝子を導入した場合は1.58倍、T251H遺伝子を導入した場合は2.23倍、W254I遺伝子を導入した場合は3.17倍、W254Y遺伝子を導入した場合は1.68倍、L257I遺伝子を導入した場合は10.06倍、L257M遺伝子を導入した場合は2.23倍、L257V遺伝子を導入した場合は3.10倍、L257F遺伝子を導入した場合は1.53倍、V266C遺伝子を導入した場合は1.57倍、W271Y遺伝子を導入した場合は4.04倍、それぞれ増加した。
【００９３】
さらに表４から明らかなように、Ｃ８脂肪酸及びＣ１０脂肪酸の生産量の増加が顕著であったCpTE(L257I)に対して、前記（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を行うことで、Ｃ８脂肪酸及びＣ１０脂肪酸の生産量がいずれも一層増加した。
具体的には、L257I遺伝子を導入した場合と比べて、L257IV106I遺伝子を導入した場合は1.40倍、L257IN108K遺伝子を導入した場合は1.32倍、L257IN108R遺伝子を導入した場合は1.20倍、L257IV110I遺伝子を導入した場合は1.18倍、L257IV110M遺伝子を導入した場合は1.52倍、L257IV110L遺伝子を導入した場合は1.76倍、L257IV110F遺伝子を導入した場合は1.75倍、L257IC118I遺伝子を導入した場合は1.21倍、Ｃ８脂肪酸の生産量がさらに増加した。
またＣ１０脂肪酸の生産量についても、L257I遺伝子を導入した場合と比べて、L257IV106I遺伝子を導入した場合は1.17倍、L257IN108K遺伝子を導入した場合は1.24倍、L257IN108R遺伝子を導入した場合は1.37倍、L257IV110M遺伝子を導入した場合は1.45倍、L257IV110L遺伝子を導入した場合は1.74倍、L257IV110F遺伝子を導入した場合は2.15倍、それぞれさらに増加した。
【００９４】
以上のように、形質転換体の宿主として大腸菌を用いた場合、本発明で規定するアミノ酸変異を導入したCpTE改変体を利用することで、中鎖脂肪酸の生産性を飛躍的に向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。
【００９５】
さらに、特許文献３（米国特許出願公開第２０１１／００２０８８３号明細書）で開示されているCpTE_M174I（配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１７４位のメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたCpTE改変体）をコードする遺伝子を導入した形質転換体のＣ８脂肪酸量及びＣ１０脂肪酸量をそれぞれ１とし、L257I遺伝子を導入した形質転換体のＣ８脂肪酸量及びＣ１０脂肪酸量をそれぞれ相対値で算出した。その結果を表５に示す。
【００９６】
【表５】
2019068755.tif 000006
【００９７】
CpTE_M174I遺伝子を導入した形質転換体ではＣ８脂肪酸の生産量が向上することが、特許文献３に記載されている。このような形質転換体と比較しても、表５から明らかなように、CpTE_L257I遺伝子を導入した場合Ｃ８脂肪酸の生産量が1.78倍向上した。さらに、Ｃ１０脂肪酸の生産量についても、2.25倍も増加した。
この結果から、CpTE_L257I遺伝子を導入した形質転換体は、Ｃ８脂肪酸及びＣ１０脂肪酸の生産には特に有効である。
【００９８】
実施例２  CpTE改変体を導入したシアノバクテリアによる脂質の製造
（１）aas遺伝子の不活性化及びCpTE改変体遺伝子発現用プラスミドの構築
シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株の野生株のゲノムＤＮＡより、表２記載のプライマーpUC118/0918up-F及びプライマー0918down/pUC118-Rを用いてＰＣＲを行い、Synpcc7942_0918遺伝子（aas遺伝子）を含む断片（2864bp、配列番号５０）を増幅した。増幅した断片をpUC118プラスミド（タカラバイオ社製）のHincIIサイト間にIn-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）を用いて挿入し、Synpcc7942_0918遺伝子（aas遺伝子）を組み込んだpUC118-Synpcc7942_0918プラスミドを取得した。
pDG1726プラスミド（Gene, 1995, vol. 167, p. 335-336）を鋳型として、表２記載のプライマー0918up/spr-F（配列番号）及びspr/0918down-R（配列番号）を用いてＰＣＲを行い、スペクチノマイシン耐性マーカー遺伝子（配列番号５１）断片（以下、「ｓｐ断片」ともいう）を取得した。
次に、前記pUC118-Synpcc7942_0918プラスミドを鋳型として、表２記載のプライマー0918up-R及びプライマー0918down-Fを用いてＰＣＲを行い、Synpcc7942_0918遺伝子（aas遺伝子）のコード領域間の927bp領域が削除された直鎖状のＤＮＡ断片を取得した。
【００９９】
前記の直鎖状ＤＮＡ断片と前記ｓｐ断片とをIn-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）を用いて結合し、ｓｐ断片が挿入されたSynpcc7942_0918遺伝子コード領域のＤＮＡ配列を含むpUC118-Synpcc7942_0918::spプラスミドを得た。
【０１００】
前記pUC118-Synpcc7942_0918::spプラスミドを鋳型とし、表２記載のプライマー0918up-R及びプライマーSp-Fを用いてＰＣＲを行い、pUC118-Synpcc7942_0918::spプラスミドを線状化した。
次に、pTrc99Aクローニングプラスミド（NCBI Accession number：M22744）の配列より人工合成したtrcプロモーター配列を鋳型とし、表２記載のプライマー0918up/Ptrc-F及びプライマーPtrc-Rを用いてＰＣＲを行い、trcプロモーター断片（Ptrc断片、配列番号５２）を増幅した。
【０１０１】
実施例１で人工的に合成したクフェア・パルストリス由来のTE遺伝子（GenBank: U38188.1）のDNA配列を鋳型とし、表２記載のプライマーPtrc/CpTE-F及びプライマーCpTE/spr-Rのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、葉緑体移行シグナルと推定される配列を除去したクフェア・パルストリス由来のTE遺伝子（CpTE遺伝子）の断片を増幅した。
次いで、前述の、線状化したpUC118-Synpcc7942_0918::spプラスミド、Ptrc断片、及びCpTE遺伝子の断片を混合し、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、Synpcc7942_0918遺伝子のコード領域間に、Ptrc断片、CpTE遺伝子の断片及びｓｐ断片をこの順で挿入した、プラスミドpUC118-Synpcc7942_0918::Ptrc-CpTE-spを得た。
【０１０２】
（２）CpTE改変体遺伝子発現用プラスミドの構築
実施例１で作製したプラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_L257I-F及びプライマーCpTE_L257-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６９〜７７１位の塩基配列を改変した遺伝子断片pBS-CpTE_L257Iを取得した。
得られた遺伝子断片と、前記プラスミドpUC118-Synpcc7942_0918::Ptrc-CpTE-spとを用いて、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、CpTE改変体遺伝子発現プラスミドpUC118-Synpcc7942_0918::Ptrc-CpTE_L257I-spを得た。
なお前記遺伝子断片pBS-CpTE_L257Iにおいて、配列番号２に示す塩基配列のうち、下記の塩基を置換した。
pBS-CpTE_L257I：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基をイソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
【０１０３】
（３）遺伝子発現用プラスミドのシアノバクテリアへの導入、及び得られた形質転換体を用いた脂質の製造
前述のCpTE遺伝子発現用プラスミド及びCpTE改変体遺伝子発現用プラスミドを用いて、自然形質転換法によりシネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株を形質転換し、スペクチノマイシン耐性により目的の遺伝子が導入された株を選抜した。
このようにしてシネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株のゲノム上のaas領域中に、CpTE遺伝子又はCpTE改変体遺伝子発現用コンストラクトを導入した、Δ0918::CpTE株及びΔ0918::CpTE_L257I株をそれぞれ取得した。
【０１０４】
下記表６に示す組成のBG-11培地25mLを加えた50mL三角フラスコ中で、一定の照明下（60μE・m-2・sec-1）、３０℃にてロータリーシェーカー（120rpm）を用いて、初発菌体濃度をＯＤ730＝０．２に設定し、前記形質転換体の培養を２週間行った。なおBG-11培地には、スペクチノマイシンを25μg/mLの濃度となるよう添加した。
【０１０５】
【表６】
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【０１０６】
培養終了後、培養液２５ｍＬにNaH2PO4  １ｇ、及び内部標準として7-ペンタデカノン（1mg/mL）２５μLを添加した。この液にヘキサン10mLを添加し、十分に攪拌し、１０分間静置した。室温、2500rpmで10分間遠心分離を行った後、上層部分をナス型フラスコに採取した。遠心分離した下層にさらにヘキサン5mLを添加して攪拌し、遠心分離を２回行い、減圧濃縮を行うことで乾燥サンプルを得た。
乾燥サンプルに14%三フッ化ホウ素溶液（ＳＩＧＭＡ社製）1mLを添加し、８０℃にて３０分恒温した。その後、ヘキサン及び飽和食塩水を各1mL添加し激しく撹拌し、室温にて３０分放置した。そして、上層のヘキサン層を回収し、脂肪酸メチルエステルを得た。
【０１０７】
得られた脂肪酸メチルエステルを、実施例１と同様の方法に従いガスクロマトグラフィー解析に供した。その結果を表７に示す。なお表７の結果は、独立した３回の培養とクロマトグラフィー解析の結果の平均値である。
【０１０８】
【表７】
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【０１０９】
表７に示すように、野生型のCpTE遺伝子を導入した形質転換体でのＣ８脂肪酸及びＣ１０脂肪酸の生産量と比較して、本発明のCpTE改変体遺伝子を導入した形質転換体ではＣ８脂肪酸の生産量は２．９７倍、Ｃ１０脂肪酸の生産量は５．１０倍も、いずれも大きく増加した。
このように、形質転換体の宿主としてシアノバクテリアを用いた場合であっても、本発明で規定するアミノ酸変異を導入したCpTE改変体を利用することで、中鎖脂肪酸の生産性を飛躍的に向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。
【０１１０】
以上のように、本発明で規定するTE改変体をコードする遺伝子を宿主に導入することで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。
【配列表】
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