(57)【要約】【課題】ＦＴ４電気化学アッセイ検出システムの提供。【解決手段】いくつかの実施形態が、遊離サイロキシンアッセイを実施するための方法を提供する。本方法は、少なくとも部分的に、遊離サイロキシンに結合する複数の抗体でコーティングされた複数のセンサを含み得るフローセルを提供するステップを含んでもよい。本方法はさらに、サンプルがセンサに接触するようにサンプルをフローセルの中に導入するステップと、一定時間、サンプルをその中でインキュベートするステップとを提供してもよい。結果として、サンプルの内部にある任意の遊離サイロキシンの少なくとも一部が、抗体の少なくともいくつかに結合することができる。加えて、本方法は、サンプルの任意の実質的量のフローセルを浄化するために、洗浄剤をフローセルの中に導入するステップを含んでもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本開示は、“Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ”と題され、２０１３年１月９日に出願された、米国仮出願第６１／７５０，５１２号に対する優先権を主張するものであり、該仮出願の全体は、参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本開示は、概して、電気化学分析を行うための電気化学検出システムに関し、より具体的には、非希釈かつ非透析全血からの遊離サイロキシンの検出を含む、複数のアッセイを実施するように構成されることができる電気化学検出システムに関する。
【背景技術】
【０００３】
電気化学は、電子伝導体および電解質の界面において溶液中で発生する化学反応を研究する化学の一分野である。反応は、電子伝導体と電解質との間に電荷移動を伴い得る。例えば、電子伝導体は、金属または半導体を備える電極であってもよい。
【０００４】
いくつかの状況の下では、外部導出電圧または化学反応によって作られる電圧のいずれかを印加することは、上記に議論される化学反応を活発にし得る。これらの状況の下、これらの化学反応は、電気化学反応として知られる。さらに、電子が１つ以上の分子の間で伝達される、いくつかの化学反応は、酸化／還元またはレドックス反応として知られる。概して、電気化学は、酸化および還元反応が、空間または時間で分離され、反応を理解するために使用され得る外部電気回路によって接続される、状況に関する。
【０００５】
いくつかの電気化学分析は、１つ以上のセンサによって監視される、検出される、または定量化される電気化学反応を誘発するための試薬を含む、使い捨てカートリッジ内において着手されてもよい。いくつかの従来のカートリッジは、カートリッジの機械的作動を介して等、プロトコルを開始する読取デバイスに動作可能に係合するように構成されてもよい。さらに、読取デバイスは、カートリッジ内部において発生する反応の試験結果を生成するために処理され得るデータ信号を受信してもよい。
【０００６】
実施例として、いくつかの従来のカートリッジは、免疫アッセイ法と併せて使用されてもよい。例えば、従来のカートリッジの一部は、事前に選択された標的分子または化合物に結合するために設計された抗体の１つ以上の種類内でコーティングされてもよい。結果として、標的分子または化合物は、抗体に結合されてもよく、定量化の異なる方法が、サンプル中の標的の量を査定するために使用されてもよい。
【０００７】
ＦＴ４としても知られる甲状腺ホルモンである、遊離サイロキシンの正確かつ迅速な測定が、１次甲状腺機能低下と２次甲状腺機能低下とを差別化し、他の潜在的な病状を診断するために使用され得る。患者の血液中において循環する遊離サイロキシンを測定する従来の方法は、困難であり、かつ時間がかかり得る。例えば、従来の方法は、有意なコストにおいて数時間を要し得る、平衡透析を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、それによって、遊離サイロキシンレベルが治療点において、速くかつ正確な様式で容易に査定されることができるシステムが、提供される。一実施形態では、電気化学検出システムは、遊離サイロキシンアッセイを実施するための方法を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、フローセルを提供するステップを含んでもよく、これは、少なくとも部分的に、遊離サイロキシン、すなわち、１つ以上の血清結合タンパク質に結合されないサイロキシンのみに結合する、複数の抗体でコーティングされる複数のセンサを含む。本方法はさらに、サンプルが複数のセンサに接触するように、サンプルをフローセルの中に導入するステップと、２分以下等の一定時間、サンプルをフローセル内部でインキュベートするステップとを提供してもよい。インキュベーションの結果として、サンプル中に含有される遊離サイロキシンの少なくとも一部が、センサに連結される抗体の少なくともいくつかに結合してもよい。加えて、本方法は、サンプルの任意の実質的量のフローセルを浄化するために、洗浄剤をフローセルの中に導入するステップを含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、サンプルは、非希釈または非透析全血であってもよく、洗浄剤は、水等の液体、水溶液、アルコール、例えば、エタノールまたはメタノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホラン（ＤＭＳＯ）、あるいは他の極性溶媒、あるいは、空気、窒素、アルゴン、ヘリウム、または酸素等の気体であってもよい。
【０００９】
一側面では、本方法は、さらに、洗浄剤を導入するステップの後に、溶液をフローセルの中に導入するステップを提供してもよい。例えば、溶液は、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素に共役されるサイロキシンの既知量の溶液であってもよい。フローセルに対する溶液の添加の結果として、溶液中のサイロキシンの少なくとも一部が、サンプル中のサイロキシンに事前に結合しなかった抗体に結合し得る。
【００１０】
一側面では、溶液を添加するステップの後に、洗浄剤の別の量が、溶液の任意の実質的量のフローセルを浄化するために、フローセルの中に導入されてもよい。いくつかの実施形態では、フローセルの洗浄の後に、基質が、複数のセンサに接触するように、フローセルの中に導入されてもよい。その後、基質は、抗体に結合されるサイロキシンに共役される酵素によって処理されるように、フローセル内部でインキュベートされてもよい。
【００１１】
いくつかの実施形態では、電気化学検出システムは、少なくとも遊離サイロキシンアッセイを実施することができるプラットフォームを製造するための方法を含む。例えば、本方法は、少なくとも１つのフローセルと選択的に流体流連通することができる入力ポートを提供するステップを含んでもよい。本方法はさらに、複数のセンサを少なくとも１つのフローセル内に配置するステップと、複数のセンサの少なくとも一部を非希釈かつ非透析全血内において見出される遊離サイロキシンに結合することができる複数の抗体でコーティングするステップとを提供してもよい。加えて、本方法は、少なくともいくつかの複数のリザーバが洗浄剤（例えば、液体または空気等の流体）、酵素に共役されるサイロキシン（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および基質を含有するように、複数のリザーバを提供するステップを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、フローセル、入力ポート、および複数のリザーバに流体接続し得る複数のチャネルを提供するステップを含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、少なくとも部分的に、複数のセンサを甲状腺刺激ホルモンまたはサイロキシンの他の形態等の他の分子に結合することができる抗体でコーティングするステップを含んでもよい。
【００１２】
さらなる別の側面では、電気化学検出システムは、遊離サイロキシンアッセイを実施するための方法を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本方法は、フローセルを提供するステップを含んでもよく、これは、少なくとも部分的に、遊離サイロキシンに結合する複数の抗体でコーティングされ得る複数のセンサを含む。本方法はさらに、全血が複数のセンサに接触するように、非希釈および／または非透析全血の一定量をフローセルの中に導入するステップを提供してもよい。本方法はさらに、一定時間、非希釈の全血をフローセル内部でインキュベートするステップを提供する。インキュベーションの結果として、全血中に含有される任意の遊離サイロキシンの少なくとも一部が、センサに連結される少なくともいくつかの抗体に結合することができる。加えて、本方法は、全血の任意の実質的量のフローセルを浄化するために、洗浄剤の第１の量をフローセルの中に導入するステップを含んでもよい。
【００１３】
一側面では、本方法はさらに、洗浄の後に、溶液をフローセルの中に導入するステップを含んでもよい。その後、溶液は、一定時間、フローセル内部でインキュベートされてもよい。例えば、溶液は、酵素に共役されるサイロキシンを含んでもよい。結果として、溶液中に含有されるサイロキシンは、全血中に含有されるサイロキシンに結合されない少なくともいくつかの抗体に結合することができる。本方法は、次いで、溶液の任意の実質的量のフローセルを浄化するために、洗浄剤の第２の量をフローセルの中に導入するステップと、基質をフローセルの中に導入するステップと、基質をフローセル内部でインキュベートするステップとを提供してもよい。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、基質の任意の実質的量のフローセルを浄化するために、洗浄剤の第３の量をフローセルの中に導入するステップと、センサに電圧を印加するステップと、アッセイを完了するためにセンサを読み取るステップとを提供してもよい。
【００１４】
一側面では、電気化学検出システムは、遊離サイロキシンアッセイを実施するためのプラットフォームを含んでもよい。例えば、プラットフォームは、少なくとも部分的に、フローセルの内部に配置される複数のセンサを含んでもよい。さらに、センサは、少なくとも部分的に、遊離サイロキシンに結合することができる複数の抗体でコーティングされてもよい。加えて、プラットフォームは、フローセルと選択的に流体流連通する第１、第２、第３、および第４の流体源を含んでもよい。例えば、第１の流体源は、一定量の非希釈かつ非透析全血を含有することが可能であってもよい。第２の流体源は、空気または他の流体等の洗浄試薬を含有してもよい。第３の流体源は、酵素に事前に共役されるサイロキシンを含む溶液を含有してもよい。また、第４の流体源は、サイロキシンに共役される酵素によって認識されることができる基質を含有してもよい。
【００１５】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
遊離サイロキシンアッセイを実施するための方法であって、
少なくとも部分的に、遊離サイロキシンに結合することができる複数の抗体でコーティングされる複数のセンサを含むフローセルを提供するステップと、
サンプルを前記複数のセンサに接触させるステップと、
前記サンプルの内部に含有される任意の遊離サイロキシンの少なくとも一部が、前記複数の抗体の少なくともいくつかに結合するように、一定時間、前記サンプルを前記フローセルの内部でインキュベートするステップと、
前記サンプルの任意の実質的量のフローセルを浄化するために、洗浄剤を前記フローセルの中に導入するステップと、
を含む、方法。
（項目２）
前記サンプルは、非希釈の全血を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記洗浄剤を導入した後に、溶液を前記フローセルの中に導入するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記溶液は、酵素に結合されるサイロキシンを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記溶液の任意の実質的量のフローセルを浄化するために、洗浄剤を前記フローセルの中に導入するステップをさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目６）
基質を前記複数のセンサに接触させるステップと、前記基質を前記フローセルの内部でインキュベートするステップとをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記時間は、２分以下である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記洗浄剤は、液体または空気である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記抗体は、抗サイロキシン抗体である、項目に記載の方法。
（項目１０）
少なくとも遊離サイロキシンアッセイを実施することができるプラットフォームを製造するための方法であって、
少なくとも１つのフローセルと選択的に流体流連通する入力ポートを提供するステップと、
複数のセンサを前記少なくとも１つのフローセル内に配置するステップと、
前記複数のセンサの少なくとも一部を遊離サイロキシンに結合することができる複数の抗体でコーティングするステップと、
複数のリザーバを提供するステップであって、少なくともいくつかの複数のリザーバは、洗浄剤、酵素に共役されるサイロキシン、および基質を含有する、ステップと、
を含む、方法。
（項目１１）
前記少なくとも１つのフローセル、前記入力ポート、および前記複数のリザーバを流体接続する複数のチャネルを提供するステップをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼである、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記洗浄剤は、流体である、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記洗浄剤は、空気または液体の少なくとも１つである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
遊離サイロキシンアッセイを実施するための方法であって、
フローセルを提供するステップであって、前記フローセルは、少なくとも部分的に、遊離サイロキシンに結合する複数の抗体でコーティングされる複数のセンサを含む、ステップと、
非希釈の全血が、前記複数のセンサに接触するように、一定量の非希釈の全血を前記フローセルの中に導入するステップと、
前記非希釈の全血の内部に含有される遊離サイロキシンの少なくとも一部が、少なくともいくつかの複数の抗体に結合するように、一定時間、前記非希釈の全血を前記フローセルの内部でインキュベートするステップと、
前記非希釈の全血の任意の実質的量のフローセルを浄化するために、洗浄剤の第１の量を前記フローセルの中に導入するステップと、
前記フローセルの中に酵素に共役されるサイロキシンを含む溶液を導入するステップであって、前記溶液は、前記センサに接触するように、前記フローセルの中に導入される、ステップと、
前記溶液中の前記サイロキシンの少なくとも一部が、前記非希釈の全血からサイロキシンをまだ結合されていない前記複数の抗体の少なくとも一部に結合するように、一定時間、前記溶液を前記フローセルの内部でインキュベートするステップと、
前記溶液の任意の実質的量のフローセルを浄化するために、洗浄剤の第２の量を前記フローセルの中に導入するステップと、
基質を前記フローセルの中に導入するステップと、
を含む、方法。
（項目１６）
一定時間、前記基質を前記フローセルの内部でインキュベートするステップをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
一定時間、前記センサに調整電圧を印加するステップと、前記電圧が遮断された後に、１度に、前記センサを読み取るステップをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記洗浄剤は、流体を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記流体は、液体および空気のうちの１つである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
遊離サイロキシンアッセイを実施するためのシステムであって、
少なくとも部分的に、フローセル内部に配置される複数のセンサであって、少なくとも部分的に、遊離サイロキシンに結合する複数の抗体でコーティングされる、複数のセンサと、
前記フローセルと選択的に流体流連通する第１の流体源であって、一定量の非希釈かつ非透析全血を含有することができる、第１の流体源と、
前記フローセルと選択的に流体流連通する第２の流体源であって、洗浄試薬を含有する、第２の流体源と、
前記フローセルと選択的に流体流連通する第３の流体源であって、酵素に共役されるサイロキシンを備える溶液を含有する、第３の流体源と、
前記フローセルと選択的に流体流連通する第４の流体源であって、前記酵素によって認識される基質を含有する、第４の流体源と、
を備える、システム。
付加的目的、利点、および新規特徴が、続く説明において記載される、または続く図面および詳細な説明の検討に応じて、当業者に明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、電気化学検出システムの異なる構成要素を例証する、簡略化されたブロック図である。
【図２】図２は、カートリッジおよび読取機の配列を示す、簡略化された例証図である。
【図３】図３は、電気化学検出のためのカートリッジ内において使用される、センサ配列の上面図である。
【図４】図４は、電気化学検出のためのカートリッジ内において使用される、センサ配列の別の実施形態の上面図である。
【図５】図５は、図３に示されるセンサ配列の分解図である。
【図６】図６は、フローセルに動作可能に係合されるセンサの平面図である。
【図７】図７は、本開示の実施形態を試験した実験結果を詳述する線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
対応する参照文字は、図面の図間の対応する要素を示す。図において使用される表題は、請求項の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００１８】
患者の血液中を循環する遊離サイロキシンの正確な測定は、甲状腺疾患診断の関連構成要素である。特に、別様にＦＴ４として知られる、遊離サイロキシンは、ますます世界中で一般的な病態になっている、１次甲状腺機能低下と２次甲状腺機能低下との間において差別化するために使用される。ほとんどのヒトでは、血液中のサイロキシンの大半が、サイロキシン結合グロブリン、アルブミン、またはプレアルブミン等の血清結合タンパク質に結合され、循環する。比較的健康な個人におけるサイロキシンの総濃度のうち、サイロキシンの約０．０３％が、非結合または「遊離」している。遊離または非結合サイロキシンの濃度は、代謝的に関連があり、総サイロキシン濃度に優る診断的有用性をもたらす。
【００１９】
遊離サイロキシンは、結合されたサイロキシンと平衡状態において存在し、これは、濃度を測定することを複雑化する。特に、遊離サイロキシンの正確な測定を取得することの困難である側面の１つが、結合サイロキシンと非結合サイロキシンとの間における平衡状態を有意に中断しないことを必要とすることである。この平衡状態が擾乱される場合、不正確な測定が生じ得る。
【００２０】
遊離サイロキシンを測定するための現在の従来的方法の少なくともいくつかは、平衡透析を含み、これは、透析膜を使用する。数時間（典型的には、１７時間）にわたって、患者からの血液サンプルが、サンプルを平衡化するために透析膜を横断して透析され得る。結果として、遊離サイロキシンは、殆どまたは全く隔離されず、異常血清結合タンパク質レベルまたは親和力が、本方法に影響を及ぼさないことを確実にする。しかしながら、これらの結果をもたらす延長時間は、適切な診断を遅延させる。
【００２１】
いくつかの従来の「迅速な」アッセイが、利用可能であるが、これらは、それ自体の欠点を有する。具体的には、いくつかの従来の迅速なアッセイは、アッセイの第１のステップにおいて希釈を使用し、希釈されたサンプルは、抗サイロキシン抗体に暴露される。抗サイロキシン抗体が、遊離サイロキシンに結合するにつれて、結合サイロキシンが、放出され、それによって、結合サイロキシンと非結合サイロキシンとの間における自然な平衡状態を改変する。さらに、サンプルがさらに希釈されるにつれて、結合タンパク質に対する抗体の割合が増加されるため、限定された希釈のみが、達成されることができる。この割合が増加するにつれて、遊離サイロキシンの濃度を正確に判定することは、より困難になる可能性がある。
【００２２】
したがって、本明細書に提供されるのは、透析または希釈を伴わず、遊離サイロキシンの検出を可能にする電気化学検出システムである。例えば、いくつかの実施形態では、電気化学検出システムは、複数のセンサを伴う少なくとも１つのフローセルを有してもよい。センサは、遊離サイロキシンに結合することができる１つ以上の抗体または他の分子でコーティングされてもよい。例えば、複数のセンサは、遊離サイロキシンのみに結合する抗サイロキシン抗体でコーティングされてもよい、すなわち、抗体は、血清結合タンパク質に結合されるサイロキシンに結合しないであろう。
【００２３】
図面を参照すると、電気化学検出システムの実施形態が、図１に例証され、概して、１０として示される。電気化学検出システム１０は、読取機１４に動作可能に係合されているときに、単一の使い捨てカートリッジ１２上で複数のアッセイプロトコルを行うための手段を提供する。加えて、電気化学検出システム１０は、仮想ラボ１６と関連付けられる読取機１４と遠隔サーバ１８との間に、試験結果または較正情報等のデータを通信するための仮想ラボ１６と動作可能に通信する複数の読取機１４を含んでもよい。上記に言及されるように、電気化学検出システム１０は、ヒトまたはペット、例えば、イヌまたはネコ等の動物の血液中において見出される、１つ以上の分子を検出するためのアッセイプロトコル等の複数のアッセイプロトコルを行う、または実施するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、電気化学検出システム１０は、血液サンプル中のサイロキシンの濃度を検出するために、アッセイを行う際の使用のために構成かつ配列されてもよい。例えば、電気化学検出システム１０は、実質的にまたは完全に、非希釈または非透析全血サンプル中の遊離サイロキシンのレベルを検出するように構成されてもよい。
【００２４】
図２に示されるように、各読取機１４は、それぞれのカートリッジ１２が読取機１４に動作可能に係合されているときに、ユーザが複数のアッセイプロトコルを実施することを可能にする制御パネル４８を有する読取機体３６を含んでもよい。一実施形態では、読取機１４は、読取機１４とそれぞれのカートリッジ１２の動作可能な係合のための第１のドッキングステーション５２と、第２のドッキングステーション５４とを含んでもよい。読取機１４の他の実施形態が、それぞれのカートリッジ１２の任意の数に係合するための１つ以上のドッキングステーションを含んでもよい。読取機１４はさらに、ユーザインターフェースおよび通信構成要素（図示せず）として作用する画面５０を含み、読取機１４が、遠隔サーバ１８を通して仮想ラボ１６と動作可能に通信することを可能にする。
【００２５】
一側面では、電気化学検出システム１０は、アッセイプロトコルが行われると、フローセルチャンバ９４Ａ、９６Ａ、および９８Ａを通して流体の連続制御放出によって、カートリッジ１２内部における免疫アッセイ反応を迅速に実施することができる。
【００２６】
反応速度論および熱力学に基づいて、同一の付近におけるこれらの分子の濃度がより高いほど、より高速の反応速度をもたらす。例えば、典型的な免疫アッセイ法では、試薬は、キュベットの表面に取着される抗体を含有するマイクロタイタトレイキュベットの中に連続的にピペットによって採取され得る。標的検体は、化学反応において抗体に結合する。この形式では、化学反応は、検出が可能となる前に、３０〜４０分かかる可能性がある。特に、マイクロタイタトレイ形式では、キュベットの表面に取着される抗体は、標的検体分子と反応する。
【００２７】
抗体の最近接の標的分子が、抗体と結合する、または反応するにつれて、抗体に最近接の領域が、標的分子を不可避的に枯渇させる。新しい標的分子の拡散が、さらなる結合を可能にするために、その面積に補充される。しかしながら、この種類の拡散は、遅く、限定された反応型システムであり、結合のためにより時間を使用する。同様に、また、抗体と相互作用する他の試薬が添加されるにつれて、バルク溶液中の拡散速度は、反応速度を制御する。一方法は、攪拌棒を使用して、またはマイクロタイタトレイ自体をかき混ぜることによって、キュベット内のバルク溶液をかき混ぜることである。このかき混ぜ作用は、新しい標的分子を提供する抗体の最近接の領域を一新する。
【００２８】
使い捨てカートリッジ等の微小流体プラットフォームは、マイクロタイタトレイ形式と比較して、少ない量の流体しか貯蔵することができないが、しかしながら、迅速な免疫アッセイ反応は、さらに、フローセル９４、９６、および９８を使用して、達成可能である。カートリッジ１２のフローセル形式は、抗体の最近接の表面積が、フローセル９４、９６、および９８を通して、試薬等の液体を連続して流動することによって補充されることを可能にし、それによって、上記に留意されるかき混ぜを達成する。代替では、カートリッジ１２は、抗体の最近接の表面にわたって前後に、試薬等の液体の小さなブロックを流動させることが可能であり得る。この代替の配列は、より少ない試薬およびサンプルを使用して、同一の補充作用を提供する。したがって、両方の配列は、迅速に、溶液を通して、均等に、標的検体および試薬を再分散させ、それによって、反応が、限定される拡散になることを防止する。
【００２９】
電気化学検出システム１０のいくつかの実施形態が、いくつかの前述の実施形態に略類似する様式で、しかし異なる物理的な構成を用いて、動作してもよい。いくつかの実施形態では、前述に言及されるカートリッジ１２の代わりに、電気化学検出システム１０は、支持構造体を含む、汎用プラットフォームを使用して動作してもよい。例えば、支持構造体は、流体バックボーン２６に実質的に類似する様式において機能してもよい。支持構造体は、上記に議論されるものと異なる構成を使用してもよい。したがって、上記または下記に議論される実施形態は、上記に議論される構成の流体バックボーン２６の使用を要求しない。むしろ、電気化学検出システム１０のいくつかの実施形態は、他の構成を伴う支持構造体を含み、それぞれ、複数のセンサを備え得る１つ以上のフローセルを支持する。
【００３０】
いくつかの例示的実施形態では、センサは、ストレプトアビジン等の物質でコーティングされてもよく、抗体は、抗体をセンサ上に保定するために、ビオチニル化されてもよい。他の実施形態では、抗体とセンサとの間における静電相互作用が、抗体を保定し得る。いくつかの実施形態では、上記に議論される複数のセンサは、異なる種類の抗体でコーティングされてもよい。例えば、一実施形態では、複数のセンサのうちの少なくとも１つは、少なくとも部分的に、遊離サイロキシンに結合することができる１つ以上の抗体でコーティングされてもよい。加えて、同一の少なくとも１つの複数のセンサはまた、少なくとも部分的に、甲状腺刺激ホルモンまたはサイロキシンの異なる形態等の異なる分子に結合することができる別の抗体内においてコーティングされてもよい。
【００３１】
一実施形態では、複数のセンサが、少なくとも部分的に、コーティングされた後に、サンプルが、フローセルの中に導入され、複数のセンサに接触することを可能にし得る。例えば、サンプルは、一定時間、フローセル内でインキュベートされてもよい。いくつかの実施形態では、その時間は、２分以下であってもよい。他の実施形態では、その時間は、所望の結果を達成するために、任意の期間であってもよい。サンプルが、センサおよび抗体に暴露されるにつれて、サンプル中に含有される任意の遊離サイロキシンの少なくとも一部は、それに結合される抗サイロキシン抗体に結合することができる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、サンプルは、非希釈の全血であってもよい。センサの感度、抗体、およびサンプルがセンサに暴露される比較的短時間のため、従来のシステムとは対照的に、サンプルの透析または希釈は、試験の前に、必要とされなくてもよい。それにもかかわらず、全血サンプルは、本開示に従って、サイロキシンアッセイが行なれる前に、透析される、または希釈されてもよい。
【００３３】
サンプルが、センサおよびそれに結合される抗体に暴露された後に、余剰サンプルが、フローセルから洗浄されてもよい。上記に説明されるように、いくつかの異なる洗浄試薬のうちの１つが、フローセルを浄化するために使用されてもよい。例えば、空気が、フローセルを通した空気の層流のため、サンプルをフローセルから取り外すために、フローセルを通して、センサにわたって通過されてもよい。他の実施形態では、液体等の他の流体が、フローセルおよびセンサを洗浄するために使用されてもよい。好適な液体は、限定ではないが、水、緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の水溶液、アルコール、例えば、エタノールまたはメタノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホラン（ＤＭＳＯ）、および他の極性溶媒を含む。洗浄の結果として、多くの場合、抗サイロキシン抗体に結合される遊離サイロキシンのみ、フローセル内に残る。
【００３４】
一実施形態では、サンプルが、フローセルを通して、センサにわたって通過した後に、次いで、溶液が、フローセルを通して通過され得る。例えば、溶液は、酵素に事前に共役された遊離サイロキシンを含んでもよい。好適な酵素は、限定ではないが、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼ、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ、およびデイミナーゼが挙げられる。好適なペルオキシダーゼは、限定ではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ヨードチロニン脱ヨードヨウ素酵素およびヨードチロシン脱ヨードヨウ素酵素等の脱ヨードヨウ素酵素、好酸球ペルオキシダーゼ、ＧＰＸ１、ＧＰＸ２、ＧＰＸ３、ＧＰＸ４、ＧＰＸ５、ＧＰＸ６、ＧＰＸ７、およびＧＰＸ８等のグルタチオンペルオキシダーゼ、ハロパーオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ヘムタンパク質、ペルオキシレドキシン、甲状腺ペルオキシダーゼ、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、およびラクトペルオキシダーゼが挙げられる。好適なオキシダーゼは、限定ではないが、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）、チトクロムＰ４５０オキシダーゼ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ、およびリシルオキシダーゼが挙げられる。好適なキナーゼ（ホスホトランスフェラーゼとも称される）は、限定ではないが、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、フルクトキナーゼ、肝フルクトキナーゼ、ガラクトキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ１、ホスホフルクトキナーゼ肝臓型（ＰＦＫＬ）、ホスホフルクトキナーゼ筋肉型（ＰＦＫＭ）、ホスホフルクトキナーゼ血小板型（ＰＦＫＰ）、ホスホフルクトキナーゼ２、リボフラビンキナーゼ、シキミ酸キナーゼ、チミジンキナーゼ、ＡＤＰ−チミジンキナーゼ、ＮＡＤ＋キナーゼ、グリセロールキナーゼ、パントテン酸キナーゼ、メバロン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、デオキシシチジンキナーゼ、フルクトース−６−リン酸１−ホスホトランスフェラーゼ（ＰＦＰ）、ジアシルグリセロールキナーゼ、ホスホイノシチド３キナーゼ（Ｃｌａｓｓ  Ｉ  ＰＩ  ３、  ａｂｄ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＰＩ  ３）、スフィンゴシンキナーゼ、およびグルコース−１，６−ビスリン酸等のＯＨアクセプタキナーゼ、ホスホグリセリン酸アスパラギン酸キナーゼ等のＣＯＯＨアクセプタキナーゼ、クレアチン等のＮアクセプタキナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、アデニル酸キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、ウリジレートキナーゼ、グアニル酸キナーゼ、およびチアミン二リン酸キナーゼ等のＰＯ４アクセプタキナーゼ、ならびにリボース−リン酸塩ジホスホキナーゼおよびチアミンジホスホキナーゼ等のチアミン二リン酸（Ｐ２Ｏ７）が挙げられる。好適なデヒドロゲナーゼは、限定ではないが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、イソクエンデヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、およびリンゴデヒドロゲナーゼが挙げられる。好適なデイミナーゼは、限定ではないが、アルギニンデイミナーゼが挙げられる。例示的実施形態では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼである。他の例示的実施形態では、酵素は、ラッカーゼまたはカタラーゼである。
【００３５】
溶液が、フローセルを通して、センサにわたって通過するにつれて、溶液中の遊離サイロキシンは、サンプル中の遊離サイロキシンに結合しなかった抗サイロキシン抗体に結合し得る。特に、この結合は、概して、競合的結合アッセイに類似する。溶液がフローセルを通して、センサにわたって通過した後に、洗浄するステップは、フローセル内部から溶液の任意の有意な量を除去するために、繰り返されてもよい。いくつかの実施形態では、洗浄ステップは、同一または異なる洗浄試薬を用いて実施されてもよい。
【００３６】
第２の洗浄ステップの後に、基質が、フローセルを通して通過され得る。具体的には、基質は、溶液中のサイロキシンに共役される酵素と調和して選ばれ得る。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、Ｌｕｍｉｇｅｎ（Ｒ）基質等の物質が、使用され得る。このステップでは、基質は、溶液中に添加されたサイロキシンを介して等、センサに結合される酵素によって、開裂され得、センサは、いくつかの前述に言及される実施形態と調和して使用されてもよい。例えば、基質と酵素の反応が、センサによって検出される可能性がある電位を生成し得、この電位に関連するデータが、計算のための構成要素、例えば、ソフトウェア構成要素１９に送信されてもよい。具体的には、上記に議論される実施例では、元々のサンプル中の遊離サイロキシンの量は、検出された信号の量に対して略反比例関係を呈し得る。
【００３７】
本開示またはその実施形態の要素を導入するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、要素の１つ以上が存在することを意味することが意図される。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備える）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、および「ｈａｖｉｎｇ（有する）」は、列挙された要素以外の付加的要素が存在し得ることを含み、かつ意味することが意図される。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例は、当業者が電気化学検出システム１０のいくつかの実施形態を採用し得る、いくつかの様式を詳述する。以下の実施例は、本開示および請求項に限定されず、むしろ、本システムのいくつかの使用に関する例証的議論であることが意図される。
【００３９】
（実施例１）
（アッセイプロトコル１−遊離Ｔ４−典型的な競合的免疫アッセイ法）
共役体が、Ｓｔａｂｉｌｚｙｍｅ（Ｒ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）中において１：５０００において希釈され、サイロキシン（Ｔ４）抗体が、１．０μｇ／ｍＬの最終濃度を提供するために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中において希釈された。１００μＬサンプルに対して２５μＬの抗体の割合のＴ４抗体を有するサンプルが、フローセル９４、９６、または９８のうちの１つに提供された後、洗浄緩衝液および基質が続いた。例えば、ＰＢＳは、洗浄緩衝液として使用された一方、基質は、５０ｍＬ  ＭｉｌｌｉＱ水毎に添加された１セットのＳｉｇｍａＦＡＳＴ錠剤の濃度において提供された。
【００４０】
一実施形態では、抗体を伴うサンプルは、フローセル９４、９６、および９８のうちの１つ以上にサンプルリザーバ４６によって正に変位されるとき、１５０μＬの量および１μＬ／秒の流率を有する。いったんサンプルが変位されると、１５０μＬのトレーサが、１μＬ／秒の流率において提供された後、３μＬ／秒の流率において４００μＬの洗浄緩衝液が続いた。最終的に、２００μＬの基質が、３μＬ／秒の流率において提供された。以下の流動時間、すなわち、２．５分時に遊離Ｔ４サンプル、２．５分時に共役体、２．２５分時に洗浄緩衝液、１．２５分時に基質、および１分４０秒時に読取時間が、使用された。したがって、アッセイプロトコルは、１０分未満以内に実施された。
【００４１】
センサ２８は、１０秒間、−１１５ｍＶの印加電圧を使用して、５秒間、開路電位（ＯＣＰ）を可能にし、８秒間、−１１５ｍＶを印加し、８秒間、ＯＣＰを可能にし、８秒間、−１１５ｍＶを再印加し、９０秒間、ＯＣＰを可能にすることによって読み取られた。９０秒ＯＣＰの終了時におけるｍＶ読取は、ソフトウェア構成要素１９によって最終値として見なされた。
【００４２】
電気化学検出システムの別の側面では、読取機１４は、カートリッジ１２の片側からカートリッジ１２を機械的に作動させた。これは、読取機１４が、読取機１４によって機械的に作動される側の対向する側を熱的に制御するための加熱源（図示せず）を提供することを可能にした。
【００４３】
（実施例２）
（アッセイプロトコル２−遊離サイロキシンアッセイ）
この実施例では、センサ２８は、単純なフローセル内部に位置付けされた、または別様に配置された。最初に、抗サイロキシン抗体（クローン１Ｈ１）が、センサ２８上にコーティングされた。具体的には、０．１μｇ／ｍＬ抗サイロキシン抗体の溶液が、０．０５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ８．０）中で調製され、センサ２８上にコーティングされた。コーティングされたセンサ２８は、ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（Ｒ）を用いて安定させられた。加えて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（共役体）に事前に共役されたサイロキシンもまた、共役体緩衝液中において１：４００００の割合において希釈された。
【００４４】
これらの最初のステップの後に、サンプルは、センサ２８に添加された。具体的には、第１のサンプルは、そこから奪取された全てのサイロキシンを有する血漿を伴う陰性対照であった。第２のサンプルは、１９ｐｍｏｌのサイロキシンの既知の濃度を含有する一方、第３のサンプルは、６４ｐｍｏｌのサイロキシンの既知の濃度を含有していた。各サンプルは、コーティングされたセンサ２８を含有する個々のフローセルに添加された。
【００４５】
３つのサンプルのそれぞれは、同一の手順を受けた。特に、約６０μＬのサンプルが、センサ２８に、合計１２０秒間、０．５μＬ／秒のレートで吸引された。その後、空気が、余剰サンプルを取り外すために、センサ２８にわたって通過された。空気洗浄の後に、希釈された共役体が、センサ２８に添加された。希釈された共役体は、コーティングされたセンサ２８に添加された。約６０μＬの希釈された共役体が、１２０秒間、０．５μＬ／秒の割合において吸引された。その後、空気は、余剰の希釈された共役体を取り外すために、センサ２８にわたって通過された。次に、基質が、センサ２８に添加された。例えば、この場合、Ｌｕｍｉｇｅｎ（Ｒ）基質が、製造業者の取扱説明書に従って、使用された。約５０μＬの基質が、１００秒間、０．５μＬ／秒のレートで吸引された。その後、空気は、余剰基質を取り外すために、センサ２８にわたって通過された。
【００４６】
基質を添加した後に、−５０ｍＶの電圧が、５秒間センサ２８に印加された。この後、付加的２０μＬの基質が、４０秒間、０．５μＬ／秒のレートで吸引された。読取が行われ、そのデータは、図７に示される。具体的には、既知の濃度サンプルから取得されたデータは、ｍＶにおける応答と正確に相関性があった。具体的には、サンプル中のサイロキシンの濃度が高くなるほど、センサ２８において読み取られた電圧が低くなった。例えば、サイロキシンが奪取された血漿サンプルは、約１５０ｍＶの電圧を呈する一方、サイロキシンの最大濃度を伴う第２のサンプルは、約３０ｍＶの最低電圧を呈した。
【００４７】
特定の実施形態が、例証かつ説明されたが、種々の修正が、当業者に明白であろうように、本開示の精神および範囲から逸脱せずに、それに対して行われることができることを前述から理解されたい。そのような変更および修正は、本明細書に添付される請求項において定義されるような本開示の範囲および教示の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
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