(57)【要約】【課題】生体組織から簡便にかつ高い細胞回収率で細胞懸濁液を調整するための方法、およびそれに用いる容器を提供すること。【解決手段】液体を保持可能な内部空間１３を内包する容器本体１０と、内部空間１３を第一空間１１と第二空間１２とに区切るように配置されたメッシュシート４０と、容器本体１０に設けられ、第一空間１１への液体の投入口２０が形成された投入部２１と、容器本体１０に設けられ、第二空間１２からの液体の排出口３０が形成された排出部３１とを備え、排出口３０から排出される液体の流れの方向Ｆと、メッシュシート４０に沿う面の法線Ｌとが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θが５０未満である、細胞懸濁液調製用容器、および、そのような容器を用いた、細胞含有試料から細胞懸濁液を調製するための方法。【選択図】図１−１
2019092393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液調製用容器であって、
液体を保持可能な内部空間を内包する容器本体と、
前記内部空間を、第一空間と第二空間とに区切るように配置されたメッシュシートと、
前記容器本体に設けられ、前記第一空間への液体の投入口が形成された投入部と、
前記容器本体に設けられ、前記第二空間からの液体の排出口が形成された排出部と、
を備え、
前記排出口から排出される液体の流れの方向と、前記メッシュシートに沿う面の法線とが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θが５０未満である、前記容器。
【請求項２】
前記メッシュシートの細孔径が５０〜３００μｍである、請求項１に記載の容器。
【請求項３】
前記容器本体が可撓性を有する、請求項１または２に記載の容器。
【請求項４】
細胞懸濁液調製用容器であって、
液体を保持可能な内部空間を内包する容器本体と、
前記内部空間を、第一空間と第二空間とに区切るように配置されたメッシュシートと、
前記容器本体に設けられ、前記第一空間への液体の投入口が形成された投入部と、
前記容器本体に設けられ、前記第二空間からの液体の排出口が形成された排出部と、
を備え、
前記容器本体が、前記メッシュシートを間に介して対向する第一側壁と第二側壁とを含み、
前記第一側壁と前記メッシュシートとが前記第一空間を囲い、
前記第二側壁と前記メッシュシートとが前記第二空間を囲い、
前記投入部が、前記第一側壁の周縁部と前記メッシュシートの周縁部との間に、前記投入口を介して前記第一空間と外部とを連通するように配置されており、
前記排出部が、前記第二側壁の周縁部と前記メッシュシートの周縁部との間に、前記排出口を介して前記第二空間と外部とを連通するように配置されており、
前記第一側壁、前記第二側壁、及び、前記メッシュシートが周縁部において一体化されている、前記容器。
【請求項５】
前記投入部と、前記排出部とが、前記容器本体の対向する位置に配置されており、
前記投入部の、前記第一空間の側の端の、前記第一側壁と前記第二側壁とが対向する方向に沿った幅をＷ１、
前記排出部の、前記第二空間の側の端の、前記第一側壁と前記第二側壁とが対向する方向に沿った幅をＷ２、
Ｗ１とＷ２との平均値をＷ、
前記投入部の、前記第一空間の側の端と、前記排出部の、前記第二空間の側の端との間の距離をＤ
としたとき、
Ｄ／Ｗが１２以上である、請求項４に記載の容器。
【請求項６】
前記第一側壁及び前記第二側壁が可撓性を有する、請求項４または５に記載の容器。
【請求項７】
細胞含有試料から細胞懸濁液を調製するための方法であって、
（ａ）液体を保持可能な内部空間を内包する容器本体と、
前記内部空間を、第一空間と第二空間とに区切るように配置されたメッシュシートと、
前記容器本体に設けられ、前記第一空間への液体の投入口が形成された投入部と、
前記容器本体に設けられ、前記第二空間からの液体の排出口が形成された排出部と、
を備える容器において、前記投入口を通じて細胞含有試料と酵素を入れ、前記第一空間内で酵素反応を実施して酵素処理液を生成する工程、
（ｂ）前記酵素処理液を前記メッシュシートに通して夾雑物を除去し、前記第二空間側に細胞懸濁液を生成し、生成された前記細胞懸濁液を、前記排出口を通じて排出する工程、
を含む、前記方法。
【請求項８】
工程（ｂ）において、前記排出口を通じて排出される前記細胞懸濁液の流れ方向と、前記メッシュシートに沿う面の法線とが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θが５０未満となるように、前記細胞懸濁液を排出する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記容器が、請求項１〜６のいずれか１項に記載の容器である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記排出口が、細胞懸濁液を閉鎖系で洗浄および濃縮することができる細胞懸濁液処理装置に接続されており、
（ｃ）前記排出口から排出された前記細胞懸濁液を、前記装置により閉鎖系で洗浄および濃縮し、細胞濃縮液を得る工程
をさらに含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、採取した生体組織などの細胞含有試料を酵素処理し、夾雑物を除去して細胞懸濁液を調製する方法、およびその方法に用いるための細胞懸濁液調製用容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞医療の分野では、治療に用いる細胞を患者に投与する場合、細胞を含む組織を生体から採取したのち、一度生体外で分離操作や洗浄などを行い、さらに投与に適した濃度の細胞懸濁液に調製して投与することが一般的に行われている。分離操作の種類としては、例えば不織布を用いたフィルター分離や遠心分離が知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、血液の入口と出口とを有する可撓性容器と該容器内部を入口側と出口側とに隔てるように配置したシート状の血液処理フィルター材を含む血液処理フィルターが開示されている。また、特許文献２には、１次側流入口と１次側流出口とをつなぐ、膜周辺部から膜中心部へ至る渦巻き形の１次側流路と、濾過膜を透過した濾液が２次側流出口に至る２次側流路が形成されている、血中低分子量物質濃度測定試料採取用のプレート型膜モジュールが開示されている。
【０００４】
一方、特許文献３には、生体組織から穿刺針を用いて採取した組織片から特定の組織幹細胞を得る際に、閉鎖系において（１）細孔径２００〜３００μｍフィルターに通過させることで組織片から血球成分を除去する工程、（２）抗生物質を含有したリン酸緩衝液で洗浄する工程、（３）得られた組織片に酵素処理を施し細胞懸濁液とする工程、（４）比重の軽い細胞を浮かせることで目的の細胞と分離させる工程、（５）その目的の細胞の懸濁液を再び、細孔径２５０〜３００μｍフィルターを通過させる工程、（６）さらに細孔径２０〜４０μｍフィルターに通過させる工程、（７）遠心分離、及びまたは４００〜５００ｎｍフィルターを通過させることで細胞懸濁液より目的の細胞を得る工程を行うことが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−７２８１６号公報
【特許文献２】特開平１０−９９６５９号公報
【特許文献３】特開２００５−２８７４７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１および２に開示されているようなフィルターを用いた分離操作は、血液等の液体組織から、凝集物や白血球等の好ましくない成分を除去するために行われ、一部をフィルター内部に残すことを意図している。しかし、例えば脂肪組織の酵素処理物から未消化物などの夾雑物を除去する場合にフィルターを用いた分離操作を行うと、早期にフィルターの目詰まりが発生してしまう。そのため、十分な量の細胞を得るためには、広大な面積を有するフィルターを使用しなければならない。一方、遠心分離による分離操作では、装置が大型になりがちであり、コスト高に繋がり、さらに利用できる施設が限定されてしまう。また、細胞を洗浄する際には、遠心分離により細胞から分離した上清を取り除くが、その際に細胞は大気に接触し、汚染などが発生する危険がある。そもそも、遠心分離にかけられてペレット化した細胞は損傷を受け死んでしまうことが多い。
【０００７】
一方、特許文献３では、閉鎖系で生体組織を酵素処理するために注射器様装置を用いることが記載されているが、閉鎖系を維持しながら生体組織に酵素を供給するための具体的な手段は開示されていない。注射器様装置の内部で閉鎖系を維持しながら生体組織に酵素を実際に供給するためには複雑な装置が必要であり、実現は容易ではないと考えられる。
【０００８】
そこで、本発明は、生体組織などの細胞含有試料から簡便にかつ高い細胞回収率で細胞懸濁液を調整するための方法、およびそれに用いる容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記のような問題に鑑み、生体組織などの細胞含有試料の酵素処理を内部で実施することができ、さらに得られた酵素処理液から夾雑物を除去するためのメッシュシートを備えた、目詰まり等を生じさせずに細胞懸濁液を調製可能な構成を有する容器、およびそれを用いた細胞懸濁液の調製方法を見出した。本発明の要旨は以下のとおりである。
【００１０】
（１）細胞懸濁液調製用容器であって、
液体を保持可能な内部空間を内包する容器本体と、
前記内部空間を、第一空間と第二空間とに区切るように配置されたメッシュシートと、
前記容器本体に設けられ、前記第一空間への液体の投入口が形成された投入部と、
前記容器本体に設けられ、前記第二空間からの液体の排出口が形成された排出部と、
を備え、
前記排出口から排出される液体の流れの方向と、前記メッシュシートに沿う面の法線とが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θが５０未満である、前記容器。
（２）前記メッシュシートの細孔径が５０〜３００μｍである、（１）に記載の容器。
（３）前記容器本体が可撓性を有する、（１）または（２）に記載の容器。
【００１１】
（４）細胞懸濁液調製用容器であって、
液体を保持可能な内部空間を内包する容器本体と、
前記内部空間を、第一空間と第二空間とに区切るように配置されたメッシュシートと、
前記容器本体に設けられ、前記第一空間への液体の投入口が形成された投入部と、
前記容器本体に設けられ、前記第二空間からの液体の排出口が形成された排出部と、
を備え、
前記容器本体が、前記メッシュシートを間に介して対向する第一側壁と第二側壁とを含み、
前記第一側壁と前記メッシュシートとが前記第一空間を囲い、
前記第二側壁と前記メッシュシートとが前記第二空間を囲い、
前記投入部が、前記第一側壁の周縁部と前記メッシュシートの周縁部との間に、前記投入口を介して前記第一空間と外部とを連通するように配置されており、
前記排出部が、前記第二側壁の周縁部と前記メッシュシートの周縁部との間に、前記排出口を介して前記第二空間と外部とを連通するように配置されており、
前記第一側壁、前記第二側壁、及び、前記メッシュシートが周縁部において一体化されている、前記容器。
（５）前記投入部と、前記排出部とが、前記容器本体の対向する位置に配置されており、
前記投入部の、前記第一空間の側の端の、前記第一側壁と前記第二側壁とが対向する方向に沿った幅をＷ１、
前記排出部の、前記第二空間の側の端の、前記第一側壁と前記第二側壁とが対向する方向に沿った幅をＷ２、
Ｗ１とＷ２との平均値をＷ、
前記投入部の、前記第一空間の側の端と、前記排出部の、前記第二空間の側の端との間の距離をＤ
としたとき、
Ｄ／Ｗが１２以上である、（４）に記載の容器。
（６）前記第一側壁及び前記第二側壁が可撓性を有する、（４）または（５）に記載の容器。
【００１２】
（７）細胞含有試料から細胞懸濁液を調製するための方法であって、
（ａ）液体を保持可能な内部空間を内包する容器本体と、
前記内部空間を、第一空間と第二空間とに区切るように配置されたメッシュシートと、
前記容器本体に設けられ、前記第一空間への液体の投入口が形成された投入部と、
前記容器本体に設けられ、前記第二空間からの液体の排出口が形成された排出部と、
を備える容器において、前記投入口を通じて細胞含有試料と酵素を入れ、前記第一空間内で酵素反応を実施して酵素処理液を生成する工程、
（ｂ）前記酵素処理液を前記メッシュシートに通して夾雑物を除去し、前記第二空間側に細胞懸濁液を生成し、生成された前記細胞懸濁液を、前記排出口を通じて排出する工程、
を含む、前記方法。
（８）工程（ｂ）において、前記排出口を通じて排出される前記細胞懸濁液の流れ方向と、前記メッシュシートに沿う面の法線とが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θが５０未満となるように、前記細胞懸濁液を排出する、（７）に記載の方法。
（９）前記容器が、（１）〜（６）のいずれかに記載の容器である、（７）または（８）に記載の方法。
（１０）前記排出口が、細胞懸濁液を閉鎖系で洗浄および濃縮することができる細胞懸濁液処理装置に接続されており、
（ｃ）前記排出口から排出された前記細胞懸濁液を、前記装置により閉鎖系で洗浄および濃縮し、細胞濃縮液を得る工程
をさらに含む、（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、採取した生体組織などの細胞含有試料から遠心分離などの開放系の操作を経ずに閉鎖系で細胞懸濁液を調製することができる。また、本発明の細胞懸濁液調製用容器をその方法に用いることにより、メッシュの目詰まりなどを発生させずに、優れた処理量および細胞回収率で細胞懸濁液を調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】本発明の細胞懸濁液調製用容器１の一実施形態を示す斜視図である。
【図１−２】図１−１の細胞懸濁液調製用容器１のＡ−Ａ線切断部断面図である。
【図１−３】図１−１の細胞懸濁液調製用容器１のＢ−Ｂ線切断部断面図である。
【図２−１】図１−１に示した本発明の細胞懸濁液調製用容器１の内部空間１３に液体を入れた状態を表す斜視図である。
【図２−２】図２−１の細胞懸濁液調製用容器１のＣ−Ｃ線切断部断面図である。
【図２−３】図２−１の細胞懸濁液調製用容器１のＣ−Ｃ線切断部の排出部３１近傍部分の概略端面図である。
【図３】本発明の細胞懸濁液調製用容器に接続する細胞懸濁液処理装置の一実施形態の概略図である。
【図４】細胞懸濁液の流れ方向と、メッシュシートに沿う面の法線とが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θと細胞懸濁液の処理量の関係を示したグラフである。
【図５】細胞懸濁液の流れ方向と、メッシュシートに沿う面の法線とが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θと細胞回収率の関係を示したグラフである。
【図６】メッシュシートの細孔径と細胞回収率の関係を示したグラフである。
【図７】実施例６と比較例３における結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（細胞懸濁液調製用容器）
図１−１〜１−３は、本発明の細胞懸濁液調製用容器の一実施形態を示す概略図である。本実施形態の細胞懸濁液調製用容器１は、液体を保持可能な内部空間１３を内包する容器本体１０と、内部空間１３を、第一空間１１と第二空間１２とに区切るように配置されたメッシュシート４０と、容器本体１０に設けられ、前記第一空間１１への液体の投入口２０が形成された投入部２１と、容器本体１０に設けられ、前記第二空間１２からの液体の排出口３０が形成された排出部３１とを備える。図１−１〜１−３では、本実施形態の細胞懸濁液調製用容器１の、内部空間１３に内容物が収容されていないときの形状の一例を模式的に示す。図２−１および２−２には、本実施形態の細胞懸濁液調製用容器１の内部空間１３に液体を満たしたときの形状の一例を示す。ただし図２−１および２−２では図示の簡素化のために液体の描写は省略している。また、細胞懸濁液調製用容器１の内部空間１３に液体を満たすためには排出口３０が封鎖されている必要があるが、封鎖するための手段の描写も省略している。
【００１６】
（容器本体）
液体を保持可能な内部空間１３の外殻を構成する容器本体１０は、内部にメッシュシート４０を後述する態様で設けることができ、かつ内部に保持する細胞等に影響を与えるようなものでなければ、どのような材質のもので、どのように形成されていてもよい。容器本体１０とメッシュシート４０は、例えば、メッシュシート４０を間に介して対向する第一側壁１５と第二側壁１６とを含み、第一側壁１５とメッシュシート４０とが第一空間１１を囲い、第二側壁１６とメッシュシート４０とが第二空間１２を囲うように構成することができる。図１−１〜１−３は、その実施態様を表したものである。この実施態様では、第一側壁１５と、第二側壁１６と、メッシュシート４０は、第一側壁周縁部１５０、第二側壁周縁部１６０およびメッシュシート周縁部４１において一体化されている。
【００１７】
容器本体１０は、少なくとも一部を透明または半透明の材料からなるものとすると、内部の細胞懸濁液の様子を目視で観察できるため好ましい。また、少なくとも一部、好ましくは全体を可撓性を有するようにすると、必要に応じてクランピングにより内部の細胞懸濁液を物理的に分離させることができるため好ましい。容器本体１０は内部空間１３に露出する部分には接着剤を含んでいないことが好ましい。容器本体１０が第一側壁１５と第二側壁１６とを含む場合、側壁の材質は、接着剤を用いずに熱融着により接着可能なものであると、製造工程の簡素化を図ることができ、かつ接着剤の細胞への影響を考慮しなくてもよいため好ましい。容器本体１０の材料の具体例としては、塩化ビニル、軟質塩化ビニル、ポリウレタン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリエチレンやポリプロピレンのようなポリオレフィン、スチレン−ブタジエン−スチレン共重合体の水添物、およびスチレン−イソプレン−スチレン共重合体またはその水添物等の熱可塑性エラストマー、ならびに、熱可塑性エラストマーとポリオレフィン、およびエチレン−エチルアクリレート等の軟化剤との混合物等が挙げられる。容器本体１０の内部空間１３を画定する内面は、ナシジ加工されていると、細胞懸濁液の排出時に残液を少なくすることができるため好ましい。
【００１８】
容器本体１０が可撓性を有する場合、内部空間１３内に液体を収容したときに形状が変化することが通常である。図１−１〜図１−３に示す細胞懸濁液調製用容器１の実施形態において第一壁部１５及び第二壁部１６が組み合わされた容器本体１０が可撓性を有する場合、内部空間１３内に液体を収容したとき、図２−１および２−２に図示するように、第一壁部１５及び第二壁部１６は中央部分が外方に向けに膨出して、内部空間１３の容積が増す。容積が増した内部空間１３内で後述する酵素処理等の各処理を行うことができる。
【００１９】
（メッシュシート）
メッシュシート４０は、内部空間１３を第一空間１１と第二空間１２とに区切るように配置される。メッシュシートとしては、水等の液体を透過させることができ、好ましくは、必要な細胞を通過させることができるものを用いる。メッシュシート４０は、細孔径が５０〜３００μｍの範囲であることが好ましい。細孔径がそのような範囲であれば、生体組織の酵素処理物に含まれる未消化の組織塊やデブリスなどの夾雑物を、メッシュの目詰まりを発生させずに除去し、必要な細胞のみを通過させることができる。この効果を一層発現させるためには細孔径は、好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは９５μｍ以上であり、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは２００μｍ以下である。また、メッシュシート４０は、開孔率が４０％以上、特に４５％以上であると、目詰まりが発生しづらく好ましい。
【００２０】
なお、本明細書において「メッシュ」とは、面状に広がりを有し、一方の表面から他方の表面へと貫通する複数の細孔が二次元的に配置され網目構造が形成されている材料を意味する。メッシュの例としては、繊維が網目構造を形成するように織られてなるものや、厚さ方向に貫通した複数の細孔が形成されたメンブレン等が挙げられるがこれらには限らない。メッシュには、一般的に「スクリーン」と呼ばれるものも包含される。メッシュにより構成されたシートを「メッシュシート」と称する。本明細書において「メッシュ」は、前記網目構造を有さず且つ三次元細孔を有する材料（例えば、繊維状多孔性媒体やスポンジ状構造物であり、前記網目構造を有さず且つ三次元細孔を有する材料）とは異なる概念である。メッシュシート４０の材質は、材料の安全性や安定性、入手容易性の観点から、合成樹脂材料、例えばナイロン、ポリエステル、レーヨン、ポリオレフィン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の少なくとも１種より選択される合成高分子やヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属が挙げられる。２種以上の材料を組み合わせる場合は、その組み合わせに特に限定はないが、ポリオレフィン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の合成高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属からなる群から選択される２種以上の材料の組み合わせが好ましい。メッシュシート４０は、少なくとも内部空間１３に液体を入れた際に、メッシュシート面がほぼ平坦となるよう容器本体１０内に設けられている。図２−１および２−２に、図１−１〜１−３に示した容器１の内部空間１３に液体（図示せず）を入れた際の様子を示す。メッシュシート４０は液体を透過することができるものであるため、投入口２０を通じて投入された液体中の液状媒体、溶解成分及びメッシュシートを透過できる大きさの成分は、第一空間１１だけでなく、メッシュシート４０を透過して第二空間１２にも移動し、メッシュシート４０を透過できない大きさの成分は第一空間１１に留まる。
【００２１】
メッシュシートの細孔径とは、メッシュシートの一方の表面から他方の表面へと貫通する細孔を、貫通方向に沿って観察することにより特定される、細孔の内周の輪郭に内接する最大内接円の直径の平均値を意味する。平均値は、例えば細孔を５０個以上、好ましくは１００個以上観察して得られた値から算出することが好ましい。メッシュシートが、繊維が網目構造を形成するように織られてなるものである場合、細孔径はメッシュの平均目開きと等しい。平均目開きは、例えばルノメーターを用いて測定した単位長（例えば１インチ）あたりの繊維数に基づいて算出することができる。
【００２２】
（投入部および排出部）
投入部２１には、内部空間１３の第一空間１１への液体の投入口２０が、排出部３１には、内部空間１３の第二空間１２からの液体の排出口３０が、それぞれ形成されている。投入口２０および排出口３０は、１つずつのみ設けられていてもよく、あるいは必要に応じて、それぞれ２つ以上ずつ設けられていてもよい。投入口２０からは、生体組織などの細胞含有試料と、細胞を分離し細胞懸濁液とするための酵素が投入され、第一空間１１内において酵素反応が行われる。酵素反応後の酵素処理液がメッシュシート４０を通過することにより、第二空間１２側に細胞懸濁液が生成される。細胞懸濁液は、排出口３０から排出される。
【００２３】
投入部２１と排出部３１は、どのように設けてもよいが、例えば、容器本体１０およびメッシュシート４０の相対関係を前述したような図１−１〜１−３に示した構成、すなわちメッシュシート４０を間に介して対向する第一側壁１５と第二側壁１６とを含むようにする場合、投入部２１は、第一側壁１５の周縁部１５０とメッシュシート４０の周縁部４１との間に、投入口２０を介して第一空間１１と外部とを連通するように配置し、排出部３１は、第二側壁１６の周縁部１６０とメッシュシート４０の周縁部４１との間に、排出口３０を介して第二空間１２と外部とを連通するように配置する。より具体的には、投入部２１および排出部３１は、中空かつ任意の断面形状を有する筒状の材料、例えば樹脂製チューブを、第一側壁１５の周縁部１５０とメッシュシート４０の周縁部４１との間に、あるいは第二側壁１６の周縁部１６０とメッシュシート４０の周縁部４１との間に挟み込むことによって設けることができる。投入部２１と排出部３１を構成するための材料の具体例としては、塩化ビニル、軟質塩化ビニル、ポリウレタン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリエチレンやポリプロピレンのようなポリオレフィン、スチレン−ブタジエン−スチレン共重合体の水添物、およびスチレン−イソプレン−スチレン共重合体またはその水添物等の熱可塑性エラストマー、ならびに、熱可塑性エラストマーとポリオレフィン、エチレン−エチルアクリレート等の軟化剤との混合物等が挙げられる。
【００２４】
投入口２０と排出口３０は、内部空間１３を閉鎖系とできるよう、それぞれに連通する投入部２１および排出部３１の少なくとも一部が、注射針を用いて試料を投入できるシリコンゴムなどにより閉鎖されているか、あるいはニードルレスポートのようなシリンジを直接挿入できる構造が形成されていることが好ましい。また、例えば投入口２０に連通する投入部２１の部分は、途中で分岐する等によって試料を投入するためのポートを複数有しており、細胞含有試料と酵素とを別々のポートから投入できるようになっていてもよい。ポートには、必要に応じてフィルターなどを設けてもよい。
【００２５】
投入部２１と排出部３１は、メッシュシート４０に対する相対的な位置が上記に説明したとおりであれば、容器本体１０のいずれの位置に設けられていてもよい。しかしながら、容器本体１０において投入部２１と排出部３１を互いに対向する位置に設けると、細胞含有試料と酵素の投入から細胞懸濁液の排出までの処理をスムーズに行うことができるため好ましい。なお、「互いに対向する位置に設ける」とは、例えば図１−１に示したように容器本体１０が四角形またはそれに準じる形状をしている場合、対向する辺の一方に投入部２１を、他方の辺に排出部３１を設けることを意味する。
【００２６】
（細胞懸濁液調製用容器の好適な第一実施形態）
本発明の細胞懸濁液調製用容器１の特に好ましい第一の実施形態（以下「第一実施形態」という場合がある）では、メッシュシート４０は、排出口３０から排出される液体の流れ方向Ｆと、メッシュシート４０に沿う面の法線Ｌとがなす狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θが５０未満となるよう設けられている。図２−３は、図２−２に示した、内部空間１３内に液体（図示せず）を収容した状態での細胞懸濁液調製用容器１のＣ−Ｃ線切断部の排出部３１近傍部分の概略端面図であり、排出口３０から排出される液体の流れ方向Ｆと、メッシュシート４０に沿う面の法線Ｌとがなす狭角の角度をθ（°）の関係が示されている。本第一実施形態では、９０−θが上記範囲であることにより、メッシュシート４０上に、排出口３０からの前記方向Ｆに沿った距離が異なる位置が含まれることとなり、未消化の組織塊やデブリスなどの夾雑物によるメッシュシート４０の目詰まりが発生しづらくなり、細胞懸濁液をスムーズに排出口３０から取り出すことができる。この現象の機構は必ずしも明らかではないが、夾雑物が、メッシュシート４０上の、排出口３０からの前記方向Ｆに沿った距離が相対的に小さい位置に目詰まりしたときでも、メッシュシート４０の、同距離が相対的により大きい位置においては目詰まりが少ないことによるものと推定される。９０−θは５０未満であることが好ましく、より好ましくは４５以下、さらに好ましくは３０以下、とりわけ好ましくは５以下である。９０−θの値が小さいほど本第一実施形態の上記の効果は高い。９０−０の下限値は特に限定されず、０であってもよい。
【００２７】
なお、本第一実施形態では、メッシュシート４０の内部空間１３に露出する部分のうち、該部分を平面視したときの面積に対して好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは１００％の面積の領域が、前記９０−θが上記の範囲となるように設けられる。メッシュシート４０において前記９０−θが上記の範囲となる領域が上記範囲であれば、本第一実施形態の上記の効果は十分に奏される。
【００２８】
（細胞懸濁液調製用容器の好適な第二実施形態）
本発明の細胞懸濁液調製用容器１の特に好ましい第二の実施形態（以下「第二実施形態」という場合がある）では、上述の構造上の特徴のなかでも特に、
容器本体１０が、メッシュシート４０を間に介して対向する第一側壁１５と第二側壁１６とを含み、
第一側壁１５とメッシュシート４０とが第一空間１１を囲い、
第二側壁１６とメッシュシート４０とが第二空間１２を囲い、
投入部２１が、第一側壁１５の周縁部１５０とメッシュシート４０の周縁部４１との間に、投入口２０を介して第一空間２１と外部とを連通するように配置されており、
排出部３１が、第二側壁１６の周縁部１６０とメッシュシート４０の周縁部４１との間に、排出口３０を介して第二空間１２と外部とを連通するように配置されており、
第一側壁１５、第二側壁１６、及び、メッシュシート４０が周縁部１５０、１６０、４１において一体化されているという特徴を備える。
本第二実施形態の細胞懸濁液調製用容器１は、第一側壁１５および第二側壁１６を構成する２枚の部材と、メッシュシート材料と、投入部および排出部用の材料を一体化するのみで、比較的容易に製造できる。
【００２９】
なお、第一側壁１５と、第二側壁１６と、メッシュシート４０とが一体化されているとは、これらの三部材が分離できない状態にあればよく、それぞれ相互に直接結合している必要はなく、これらの三部材のいずれか１つ以上又は他の部材を介して結合されていてもよい。例えば、周縁部において、第一側壁１５と第二側壁１６とが直接には結合されておらず、間にメッシュシート４０を介して結合され一体化されている場合や、周縁部において、第一側壁１５と第二側壁１６とが直接には結合されておらず、その間に、投入部２１（又は排出部３１）とメッシュシート４０とを介して結合され一体化されている場合も、第一側壁１５と、第二側壁１６と、メッシュシート４０とが「周縁部において一体化されている」一例である。
【００３０】
また、本第二実施形態によれば、メッシュシート４０の前記角θ（°）は、容器本体１０における投入部２１および排出部３１の寸法および相対的な距離により調節することができ、それにより９０−θの値が５０未満となる細胞懸濁液調製用容器１を容易に製造することができる。具体的には、投入部２１と排出部３１とが容器本体１０の対向する位置に配置されている場合、（ｉ）投入部２１の、第一空間１１の側の端２２の、第一側壁１５と第二側壁１６とが対向する方向に沿った幅をＷ１とし、（ｉｉ）排出部３１の、第二空間１２の側の端３２の、第一側壁１５と第二側壁１６とが対向する方向に沿った幅をＷ２とし、かつ（ｉｉｉ）投入部２１の、第一空間１１の側の端２２と、排出部３１の、第二空間１２の側の端３２との間の距離をＤとした場合、ＤとＷ１とＷ２との平均値であるＷとの比（Ｄ／Ｗ）により角θ（°）を調節することができる。例えば、Ｄ／Ｗを１２以上、１５以上、又は２０以上とすると、９０−θの値を５以下とすることができる。Ｄ／Ｗが大きいほど９０−θは小さい値となる。Ｄ／Ｗの上限は特に限定されないが通常は５０以下、４０以下、又は３０以下である。Ｗ１とＷ２との比は特に限定されないが、細胞懸濁液調製用容器１の製造を容易にする観点から、Ｗ１／Ｗ２は０．２〜５がより好ましく、０．５〜２がより好ましく、０．９〜１．１がより好ましく、１が特に好ましい。この実施形態では、投入部２１と排出部３１とが、投入口２０による投入経路と排出口３０による投入経路とが同軸上に位置するように配置されていることが好ましい。
【００３１】
（細胞含有試料から細胞懸濁液を調製する方法）
本発明は、別の側面において、生体組織などの細胞含有試料から細胞懸濁液を調製するための方法にも関する。当該方法は、
（ａ）液体を保持可能な内部空間を内包する容器本体と、内部空間を第一空間と第二空間とに区切るように配置されたメッシュシートと、容器本体に設けられた、第一空間への液体の投入口が形成された投入部と、容器本体に設けられた、第二空間からの液体の排出口が形成された排出部とを備える容器において、投入口を通じて細胞含有試料と酵素を入れ、第一空間内で酵素反応を実施して酵素処理液を生成する工程、および
（ｂ）酵素処理液をメッシュシートに通して夾雑物を除去し、第二空間側に細胞懸濁液を生成し、生成された細胞懸濁液を、排出口を通じて排出する工程を少なくとも含む。
細胞含有試料と共に投入する酵素は、コラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、ペプシン等の、生体組織などの細胞含有試料からの細胞の分離に用いることができる酵素を適宜用いることができる。
【００３２】
工程（ａ）で用いる容器において、メッシュシートは、水等の液体を透過させることができものであり、上記の細胞懸濁液調製用容器の実施形態において用いるメッシュシートに関して説明した範囲から選択することができる。工程（ａ）で用いる容器において、メッシュシートの細孔径は例えば５０〜３００μｍの範囲であり、好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは９５μｍ以上であり、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは２００μｍ以下である。容器は、使用前に予め滅菌しておくことが好ましい。滅菌方法としては、γ線滅菌や電子線滅菌やＥＯＧ滅菌、高圧蒸気滅菌などの医療用具の滅菌に汎用されている滅菌方法を好適に用いることができる。工程（ａ）の容器としては、上述した構造を有するものであればどのようなものであってもよいが、図１−１〜１−３に示したような構造を有する細胞懸濁液調製用容器を用いると、目詰まり等が生じずにスムーズに細胞懸濁液を調製できるため好ましい。
【００３３】
細胞懸濁液の原料となる細胞含有試料と、細胞を分離し細胞懸濁液するための酵素は、投入口を通じて容器の第一空間に入れられ、そこで酵素反応が実施される。このとき形成される、酵素と細胞含有試料とを含む反応混合物は液体状であることが好ましく、そのためには適宜分散媒体として水等の液状媒体の存在下で酵素と細胞含有試料とを第一空間に収容することが好ましい。酵素は必要に応じて酵素水溶液として添加することができる。メッシュシートは液体を透過することができるものであるため、工程（ａ）では、第一空間に入れられた反応混合物に含まれる液状媒体、溶解した成分、及び、メッシュシートを透過できる大きさの成分は第一空間だけでなく第二空間にも移動し、メッシュシートを透過できない大きさの成分は第一空間に留まる。工程（ａ）の酵素反応では、第一空間においてメッシュシートを透過できない成分が酵素処理され、目的とする細胞が液状媒体中に分散した酵素処理液となる。酵素反応後の酵素処理液がメッシュシートを通過することにより、未消化の組織塊やデブリスなどの夾雑物が除去され、第二空間に細胞懸濁液が生成され、その後排出口を通じて容器の外に排出される。工程（ａ）は、前記容器の投入口及び排出口が閉鎖された状態で実施することが好ましい。このためには、容器の投入口および排出口に連通する投入部および排出口の部分は、シリコンゴムやニードルレスポートのような、試料を投入可能な態様で封鎖されており、それにより容器内は閉鎖系となっており、外気に触れることなく酵素反応が行えるようになっていることが好ましい。また、酵素反応を実施する際には、容器ごとシェーカーに載せたり恒温槽に入れたりすることにより、適切な反応条件下におくことができる。なお、細胞含有試料と酵素を入れる際、あるいは酵素反応を実施する際には、第一空間が、第二空間に対して鉛直方向で下側になるように容器を置くと、メッシュシートの目詰まりを防ぐことができるため好ましい。
【００３４】
工程（ｂ）において細胞懸濁液を排出する際も、排出口と、細胞懸濁液を収容するための容器又は更なる処理工程のための装置とを閉鎖した流路で接続した閉鎖系で行うことが、コンタミネーションを抑制する観点から好ましい。
工程（ｂ）において細胞懸濁液を排出する際、排出口を通じて排出される細胞懸濁液の流れ方向と、メッシュシートに沿う面の法線とが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θが５０未満、好ましくは４５以下、さらに好ましくは３０以下、とりわけ好ましくは５以下となるようにすると、メッシュシートの目詰まりが発生しづらくなるため好ましい。また、容器は、排出口が最下部となる状態で保持すると、細胞懸濁液の排出がスムーズに進むため好ましい。従って、容器は排出口が最下部となるよう保持した状態で、上記の角θ（°）に基づく９０−θの値が５０未満、好ましくは４５以下、さらに好ましくは３０以下、とりわけ好ましくは５以下となる構造、より具体的には図１−１〜１−３に示したような構造を有することが好ましい。酵素処理液がメッシュシートを通過する流速は、排出口から陰圧をかける等することによって適宜調節することもできるが、重力による自然落下にまかせた流速としてもよい。酵素処理液がメッシュシートをスムーズに通過するには、メッシュシートを通過する流速は１〜６００ｍＬ／分の範囲、特に１０〜５００ｍＬ／分の範囲、とりわけ２０〜３５０ｍＬ／分の範囲とすることが好ましい。
本実施形態において、工程（ａ）を完結後に工程（ｂ）を行ってもよいし、工程（ａ）と工程（ｂ）とを並行して行ってもよい。
【００３５】
（細胞懸濁液処理装置との接続）
容器の排出口は、別途用意された細胞懸濁液処理装置に接続されていてもよく、それにより排出口から得られた細胞懸濁液を閉鎖系で洗浄および濃縮して細胞濃縮液を得るようにしてもよい。なお、細胞懸濁液の洗浄とは、組織処理液中に含まれる体液や酵素等を、希釈液、例えば生理食塩水、輸液、培地、蒸留水、無機塩、糖類、血清、蛋白質を含む液体、緩衝液、培地、および血漿等に置換することを意味する。本発明は一実施形態において、
（ａ）液体を保持可能な内部空間を内包する容器本体と、内部空間を、第一空間と第二空間とに区切るように配置されたメッシュシートと、容器本体に設けられ、第一空間への液体の投入口が形成された投入部と、容器本体に設けられ、第二空間からの液体の排出口が形成された排出部とを備える容器において、投入口を通じて細胞含有試料と酵素を入れ、第一空間内で酵素反応を実施して酵素処理液を生成する工程、
（ｂ）酵素処理液をメッシュシートに通して夾雑物を除去し、第二空間側に細胞懸濁液を生成し、生成された細胞懸濁液を、排出口を通じて排出する工程、および
（ｃ）排出口から排出された前記細胞懸濁液を、細胞懸濁液を閉鎖系で洗浄および濃縮することができる細胞懸濁液処理装置により閉鎖系で洗浄および濃縮し、細胞濃縮液を得る工程を含む、生体組織から細胞濃縮液を得る方法に関する。当該方法によれば、対象に直接投与可能な濃度を有する細胞濃縮液を、全て閉鎖系で生体組織から直接調製することができ、高い細胞回収率が実現可能である。
【００３６】
細胞懸濁液処理装置としては、例えば特開２０１５−４２１６７号に開示されている装置を利用することができる。図３にその装置の一実施形態（細胞懸濁液処理装置９００）の概略図を示す。下記の説明において、カッコ内の数字は図３における対応箇所を示す。当該文献の細胞懸濁液処理装置（９００）は、溶液入口ポート（９１５）、循環出口ポート（９１６）および循環入口ポート（９１７）を有する、細胞懸濁液の貯留容器（９０３）と、細胞懸濁液導入口（９１８）、細胞懸濁液導出口（９１９）および濾液用出口（９２０）を有する容器内に中空糸分離膜が充填されてなり、細胞懸濁液から液体を濾して濃縮を行うための細胞懸濁液処理器（９０６）と、前記貯留容器（９０３）の循環入口ポート（９１７）および前記細胞懸濁液処理器（９０６）の細胞懸濁液導入口（９１８）を連通する導入用連通管（９２８）ならびに前記細胞懸濁液処理器（９０６）の細胞懸濁液導出口（９２０）および前記貯留容器の循環出口ポート（９１６）を連通する導出用連通管（９２９）からなり、貯留容器（９０３）および細胞懸濁液処理器（９０６）の間で細胞懸濁液を循環させながら濃縮を行うための循環回路（９３０）と、濃縮された細胞濃縮液を回収する回収容器（９０５）と、前記貯留容器（９０３）内、前記細胞懸濁液処理器（９０６）内および前記循環回路（９３０）内の細胞濃縮液を前記回収容器（９０５）に送液するための回収路（９３１）と、前記貯留容器（９０３）の溶液入口ポート（９１５）に溶液を注入するための注入路（９２７）と、前記貯留容器（９０３）内または循環回路（９３０）の導入用連通管（９２８）内の細胞濃縮液の液量を検知するための検知手段（９１１）と、前記検知手段（９１１）で細胞濃縮液が所定の液量にまで濃縮されたことを検知して、前記貯留容器（９０３）から細胞懸濁液処理器（９０６）への細胞濃縮液の送液を停止させる制御手段と、を備えることを特徴とする。上記文献の装置を細胞懸濁液処理装置（９００）として用いる場合、本発明の容器の排出口は、細胞懸濁液貯留容器（９０３）の溶液入口ポート（９１５）に溶液を注入するための注入路（９２７）と、細胞懸濁液調製用容器接続部（９０１）を経て接続される。なお、上記文献の装置は細胞懸濁液の洗浄および濃縮を自動で実施することができるが、本発明で容器の排出口に接続された細胞懸濁液処理装置（９００）は、細胞懸濁液の洗浄および濃縮を手動で行うものであってもよい。
【００３７】
（細胞懸濁液処理装置：貯留容器）
細胞懸濁液処理装置（９００）で用いる貯留容器（９０３）は、処理するための細胞懸濁液を貯留し、後述のように細胞懸濁液処理器に細胞懸濁液を通液して得られる細胞濃縮液を循環して貯留する容器である。貯留容器は、溶液入口ポート、循環出口ポートおよび循環入口ポートを有する。溶液入口ポートとは、細胞懸濁液を貯留容器内に供給するためのポートをいう。循環入口ポートとは、貯留容器から細胞懸濁液処理器に通液するためのポートをいい、循環出口ポートとは、細胞懸濁液処理器で濃縮された細胞濃縮液を貯留容器に通液するためのポートをいう。これらのポートは、貯留容器の下部に設置されていることが好ましい。下部にこれらポート全てを設置することにより、溶液入口ポートを通じて供給される細胞懸濁液や希釈のための溶液が貯留容器や循環回路内を循環する液体と効率よく撹拌されることによって、効率的に濃縮および希釈を行うことができる。
【００３８】
なお、溶液入口ポート、循環出口ポート、循環入口ポートの数としては、それぞれ１つあればよいが、必要に応じて複数に増やしてもよい。例えば、前記溶液入口ポートは、細胞懸濁液だけでなく、希釈液やプライミング液用のポートとしても使用できるが、細胞懸濁液用のポートのほかに、希釈液やプライミング液用の入口ポートを設けてもよい。また、前記の３種類のポートとは別の目的のポートを設けてもよい。例えば、細胞濃縮液を回収容器に通液するための回収用ポートが挙げられる。貯留容器の回収用ポートと回収容器とを直接接続することで、貯留容器内の細胞濃縮液を速やかに回収することが可能になる。
【００３９】
前記貯留容器の材質については、細胞懸濁液または細胞濃縮液中の細胞に影響を与えないものであることが好ましく、取扱性がよいという観点から、可撓性の樹脂材料が特に好ましい。また、貯留容器の内面はナシジ加工されていることが、貯留容器内から懸濁液を排出する際の残液を少なくできる点などから利点がある。貯留容器の容積は、特に制限なく用いることができる。ただし、大きすぎると希釈に用いる希釈液量が多く必要になることから、１０００ｍＬ以下であることが好ましい。また、貯留容器の形状、各ポートの構造、材質などについては処理する細胞懸濁液の種類、容積により適宜決定すればよく、特に限定はない。
【００４０】
また、貯留容器の上部には、通気口を備えていてもよい。この通気口を備えることで貯留容器内の気体と大気との交換が可能な大気開放系となり、例えば、貯留容器内の液体を排出する際に、貯留容器内が減圧して貯留容器がつぶれることを予防する利点がある。この通気口には、エアフィルタ（９０８）を設けてもよく、外部から貯留容器内に不要な成分が混入することを防ぐことができる。
【００４１】
（細胞懸濁液処理装置：細胞懸濁液処理器）
細胞懸濁液処理器（９０６）は、細胞懸濁液から液体を濾して濃縮を行うための装置であり、前記貯留容器から細胞懸濁液を通液できるように接続されている。細胞懸濁液処理器は、細胞懸濁液導入口、細胞懸濁液導出口および濾液用出口を有する容器内に中空糸分離膜が充填されている。前記細胞懸濁液導入口は、前記貯留容器から細胞懸濁液処理器内に細胞懸濁液を導入するための入口であり、貯留容器の循環入口ポートと接続されている。
【００４２】
前記細胞懸濁液導出口は、濃縮処理された細胞懸濁液（細胞濃縮液）を取り出すための出口である。この細胞懸濁液導出口を前記貯留容器の循環出口ポートと接続することで、貯留容器と細胞懸濁液処理器との間で細胞懸濁液を循環させて濃縮を行うことができる。前記濾液用出口は、細胞懸濁液から濾された液体を取り出すための出口である。
【００４３】
細胞懸濁液処理器に用いられている中空糸分離膜は、中空糸を数十から数千本程度束ねたものを筒状の容器内に充填していることが好ましい。中空糸分離膜の配置は、直線状になっていても、撓んでいても、らせん状になっていてもよく、細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に中空糸分離膜の両端が保持されていれば特に形状は限定されない。
【００４４】
細胞懸濁液処理器に用いられている中空糸分離膜は、材料の安全性、安定性などの点から合成高分子材料を用いることができる。この中でも、ポリスルホン系、ポリオレフィン系またはセルロース系の高分子材料を好ましく用いることができる。また、中空糸分離膜の孔径は、細胞が外側に漏れ出てこなければよく、また、不要な成分を効率的に濾過できるためになるべく大きな孔径であるほうが好ましい。具体的には、平均孔径が０．０１μｍ以上から１．０μｍ以下のものが好適に用いることができる。また、中空糸の内径は、４００μｍ以上から１０００μｍ以下であるものが好適に用いられる。
【００４５】
前記細胞懸濁液導入口から供給された細胞懸濁液が中空糸分離膜の内側を通過すると、中空糸分離膜の外側に液体が濾過され、細胞濃縮液が作製される。細胞懸濁液処理器の構造としては、例えば、筒状容器に中空糸分離膜が充填され、中空糸端部が接着剤などで筒状容器端部と密着されており、端部で開口した中空糸膜に細胞懸濁液が流入および流出できるように、筒状容器の端部に細胞懸濁液導入口や細胞懸濁液導出口となるヘッダー部分が備え付けられていることが挙げられる。前記筒状容器には、濾液用出口が一つ以上備え付けられていればよく、中空糸の内側より濾過された濾液が濾液用出口より排出される構造となっている。細胞懸濁液処理器は中空糸分離膜が密閉された容器の中に充填された構造である必要があるが、細胞懸濁液導入口および細胞懸濁液導出口が濾液用出口から中空糸分離膜を構成する壁材により隔てられている構造を備えていれば、各種構造をとることが可能である。例えば、血液透析などに用いられる透析器を類似の構造として例示することができる。
【００４６】
細胞懸濁液処理器の濾液用出口（９２０）には、中空糸分離膜により濾別された濾液が流れ出るための回路が設置されている。濾液用の回路と廃液容器（９０４）は連結する方が、濾液が外部に漏洩する懸念が低減でき好ましい。前記濾液用出口から取り出した濾液は、廃液容器などに通液して回収することができる。廃液容器は、廃液の漏洩がない容器であれば特に制限なく用いることができる。
【００４７】
細胞懸濁液処理器の濾液用出口と廃液容器の間には、濾液を送液するためのポンプ（９１４）が設置されてもよいし、設置されていなくてもよい。例えば、前記濾液用出口と廃液容器とをつなぐ経路にポンプを備えることで、一定流量で濾過液を排出できることから、処理時間を一定にすることができ、細胞懸濁液処理器における濾過効率を制御することが可能になる。すなわち、ポンプを駆動させることで細胞懸濁液処理器からの濾液の排出が促進されることになり、結果として、細胞懸濁液処理器における濃縮処理を促進することができる。また、所定の濃度まで濃縮された細胞濃縮液を回収容器に通液して回収する際には、前記ポンプを停止しておくことで、速やかな回収が可能になる。また、回収された濾液は、そのまま廃棄してもよいし、殺菌処理などの再処理を施すことで、再利用してもよい。また、細胞懸濁液処理器には、前記細胞懸濁液導入口、細胞懸濁液導出口および濾液用出口のほかに、細胞懸濁液処理器内の細胞濃縮液を回収容器に送液するための細胞濃縮液回収口を設けてもよい。この細胞濃縮液回収口は回収容器（９０５）に接続することができる。
【００４８】
（細胞懸濁液処理装置：循環回路）
循環回路（９３０）は、前記貯留容器の循環入口ポートおよび前記細胞懸濁液処理器の細胞懸濁液導入口を連通する導入用連通管と、前記細胞懸濁液処理器の細胞懸濁液導出口および前記貯留容器の循環出口ポートを連通する導出用連通管とからなる回路である。この循環回路を通じて、貯留容器および細胞懸濁液処理器の間で細胞懸濁液を循環させながら濃縮を行うことで細胞濃縮液を作製することができる。循環回路を構成する管としては、一般的なプラスチック製のチューブを好適に用いることができる。塩化ビニルが安全性や耐久性の面から好適に用いることができる。なお、前記循環回路には、細胞懸濁液または細胞濃縮液の循環の制御を行いやすくする観点から、ポンプ（９１３）が設置されていることが好ましい。ポンプの数については特に限定はないが、制御しやすい観点から、１つあればよい。ポンプの位置については、導入用連通管または導出用連通管のいずれかに設置していればよいが、導入用連通管に設置していれば細胞懸濁液処理器の細胞懸濁液導入口に圧力の高い溶液を導入でき、効率的に液体を分離することができ好ましい。ポンプ（９１３）と細胞懸濁液導入口（９１８）の間には分岐（図示せず）が設けられており、分岐部にはエアチャンバが設けられ、かつ分岐部先端が圧力計と接続されていることが好ましい。
【００４９】
前記循環回路上には、いずれかに分岐部を設けていてもよい。この分岐部に配管で回収容器（９０５）に連結するように構成しておくことで、この分岐部から回収容器までの経路を最終的な回収路（９３１）として、貯留容器内、細胞懸濁液処理器内および循環回路内にある細胞濃縮液を回収容器に速やかに回収することができる。分岐部は、好ましくは、循環出口ポートになるべく近い位置に設置したほうが、回収する工程で分岐部より出口ポートまでの循環回路内に残存する残液量を少なくできるので好ましい。
【００５０】
（細胞懸濁液処理装置：回収容器）
回収容器（９０５）は、所定の濃度にまで濃縮された細胞濃縮液を回収するための容器である。回収容器は、可撓性のプラスチック容器であることが好ましい。また、その内面にナシジ加工が施されていれば、細胞濃縮液を回収した後の残液を少なくできる利点がある。また、回収容器は針やシリンジなどが接続できる接続口を具備していてもよい。このような構成とすることで、回収容器に回収された細胞濃縮液を他の容器に移し替える場合などに好適に用いることができる。回収容器の形状としては、特に限定はない。例えば、容量が大きくなると回収された細胞が接触する容器の内面積が大きくなり、付着した細胞が容器内に残り細胞の損失につながることがあることから、容器内側の容量は小さくなる形状が好ましい。
【００５１】
（細胞懸濁液処理装置：回収路）
回収路（９３１）は、前記貯留容器内、前記細胞懸濁液処理器内および前記循環回路内の細胞濃縮液を前記回収容器に送液するための路である。回収路を構成する管としては、一般的なプラスチック製のチューブを用いることができ、中でも、塩化ビニル製のチューブを安全性や耐久性の面から好適に用いることができる。
【００５２】
前記回収路としては、次の３つの態様が挙げられる。
１）前記循環回路上に分岐部を設けた場合には、この分岐部と回収容器とを連結する経路が回収路となる。
２）前記貯留容器の回収ポートと回収容器とを接続した場合には、この接続した経路が回収路となる。
３）細胞懸濁液処理器の細胞濃縮液回収口と回収容器とを接続した場合には、この接続した経路が回収路となる。
回収路については、上記いずれかの態様であることが好ましく、２つ以上を併用することも可能である。
【００５３】
（細胞懸濁液処理装置：注入路）
注入路（９２７）は、前記貯留容器の溶液入口ポートに溶液を注入するための経路である。注入路を構成する管としては、一般的なプラスチック製のチューブを用いることができ、中でも、塩化ビニル製のチューブを安全性や耐久性の面から好適に用いることができる。なお、溶液としては、細胞懸濁液に加えて、細胞懸濁液を濃縮して得られる細胞濃縮液を再度希釈するための希釈液や濃縮処理前に細胞懸濁液処理装置（９００）全体をプライミングするためのプライミング液が含まれていてもよい。希釈液には生理食塩水、輸液、蒸留水、緩衝液、培地、血漿や無機塩、糖類、血清、蛋白質を含む液体等が挙げられ、特に安全性の観点から生理食塩水や輸液を好適に用いることができる。また、プライミング液にも生理食塩水、輸液、蒸留水、緩衝液、培地、血漿や無機塩、糖類、血清、蛋白質を含む液体等が挙げられ、特に安全性の観点から生理食塩水や輸液を好適に用いることができる。希釈液およびプライミング液には同一の溶液を使用してもよいし、異なる溶液を使用してもよい。異なる溶液を使用する場合は、貯留容器の溶液入口ポートに繋がる回路上にある分岐部分より分離し、各接続部に連結する回路を設置することができる。
【００５４】
前記注入路には、液体を送液するためのポンプ（９１２）が設置されることが好ましい。ポンプにより、安定して貯留容器に液体を送液することができる。また、ポンプを設置する位置は、細胞懸濁液調製用容器接続部（９０１）、希釈液容器接続部（９０２）および任意に設けられるプライミング液容器接続部（９２６）に連結する回路の合流箇所と溶液入口ポートとを連結する回路上にあることが、送液に必要なポンプの数を少なくすることができる点から好ましい。ポンプ（９１２）とクランプ（９２１または９２２）の間には分岐（図示せず）が設けられており、分岐部にはエアチャンバが設けられ、かつ分岐部先端が圧力計と接続されていることが好ましい。
【００５５】
（細胞懸濁液処理装置：検知手段）
検知手段は、前記貯留容器内または循環回路の導入用連通管内の細胞濃縮液の液量を検知するための手段である。前記貯留容器内の液量を検知する手段としては、貯留容器内の貯留液の液面を直接検知する気泡センサーを用いることが挙げられる。また、他の実施形態としては、例えば、貯留容器に対して上下方向に平行になるようにチューブを設置し、下方で貯留容器とチューブが連通した回路とし、チューブ内の液面が貯留容器内の液面と等しくなるように調整し、このチューブに気泡センサーを設置してもよい。この手段であれば、貯留容器内の液面として、チューブ内の液面を気泡センサーで検知することができる。また、貯留容器と平行に設置された前記チューブの下方にチャンバーを設置してもよい。特にチューブより内径が大きなチャンバーを設置することにより、平行に設置されたチューブに誤って気泡が浸入して検知される不具合の発生を低減することが期待される。
【００５６】
前記導入用連通管内の細胞濃縮液の液量を検知する手段としては、貯留容器の循環入口ポートに連通する導入用連通管（９２８）に気泡センサー（９１１）を備えることが挙げられる。この形態であれば、前記貯留容器内の液量を検知する手段に比べて細胞懸濁液をより濃縮することができるため、濃縮された懸濁液（細胞濃縮液）の量を少なくでき、懸濁液中の不要成分の量を低下することができるといった利点がある。また、前記導入用連通管に設置する気泡センサーの位置としては、特に限定はないが、貯留容器に近接している位置に設置することで、貯留容器と気泡センサーとをつなぐ回路の長さを短くすることができる。
【００５７】
また、細胞懸濁液処理装置（９００）では、貯留容器の溶液入口ポートに繋がる注入路（９２７）に、気泡センサー（９１０）を設置してもよい。この気泡センサーにより気泡が検知された場合に貯留容器への細胞懸濁液、希釈液、プライミング液などの溶液の貯留を停止することができる。例えば、対象とする細胞懸濁液の処理量がわからなくても、前記気泡センサーを注入路に設置することで、処理毎にポンプの駆動時間を設定することなく対象の液体全量を処理することができる利点がある。また、ポンプの駆動時間から一定量の溶液を加える工程にすることもできる。例えば、細胞懸濁液の一部のみを処理する必要がある場合は、ポンプの駆動時間を設定することで処理を行うことができる。この気泡センサーは注入路のどこでも設置できるが、貯留容器になるべく近い位置に設置するほうが、注入路内への残液量を低減する点で有利である。
【００５８】
また、前記貯留容器の上部に別の気泡センサー（９０９）を設けてもよい。この気泡センサーを設置することで、貯留容器内の上部付近の溶液の有無を判別することができる。即ち、貯留容器の容量を超える液体が供給された場合に、前記センサーが検知して、警報として使用者に知らせることができる。
【００５９】
細胞懸濁液処理装置（９００）に用いるポンプや気泡センサーは一般的に用いられているものを使用することができる。また、回路の所望の位置にクランプを設けて流路の切り替えを行うこともできる。これらのポンプ、気泡センサーおよびクランプとしては、特に限定はなく、例えば、透析装置などに用いられているものを用いてもよい。
【００６０】
（細胞含有試料）
本発明の方法で出発原料として用いる細胞含有試料の一例としては生体組織が挙げられる。生体組織は、動物組織より採取したものであれば特に限定されないが、例えば、脂肪、皮膚、血管、角膜、口腔、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、神経、筋肉、前立腺、腸、羊膜、胎盤、臍帯などに由来するものが挙げられる。本発明の方法は、特に採取した脂肪組織から間質血管画分（ＳＶＦ）細胞を取り出すのに有用である。また、細胞含有試料の他の例としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製された細胞の培養物が挙げられる。
【００６１】
本発明により得られた細胞懸濁液または細胞濃縮液は、白血病治療、心筋再生や血管再生、幹細胞疲弊疾患、骨疾患、軟骨疾患、虚血性疾患、血管系疾患、神経病、やけど、慢性炎症、心疾患、免疫不全、クーロン病等の疾患、豊胸、シワとり、美容成形、組織陥没症等の組織増大などの再生医療などに用いることが可能である。また、得られた細胞をスキャフォールド等の構造材料に播種して培養し、治療に用いることもできる。あるいは、得られた細胞を将来の治療用途のために凍結保存してもよい。
【００６２】
本発明の方法によれば、従来法では開放系で複数ステップを経て実施されていた生体組織からの酵素処理および分離処理を経た細胞懸濁液の調製を、全て閉鎖系で、かつ同一容器内で実施することができる。また、容器内部での酵素処理液のメッシュシートの通過もスムーズに進むため、特別な技術を有しない操作者であっても、容易に細胞懸濁液の調製を実施できる。さらに、本発明の細胞懸濁液調製用容器は、特に複雑な構造を有しないため、メッシュシートの目詰まりを発生させずに短時間に細胞懸濁液を調製可能な器具を低コストで提供することができる。本発明は、従来手間がかかっていた脂肪組織からのＳＶＦ画分の採取に非常に有用である。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。以下の説明において「細孔径」はメッシュの目開きを表し、ルノメーターにより測定した結果に基づいて算出したものを使用している。
【００６４】
１．細胞懸濁液の調製
ウサギまたはヒトの脂肪組織を用意し、０．０７５％コラゲナーゼ溶液を加えて３７℃にて３０分から１時間反応させて細胞懸濁液を調製した。
【００６５】
２．メッシュシート面の角度の検討
同一個体由来の細胞懸濁液を用いて、以下の予備試験を行った。試験に用いた細胞懸濁液の細胞濃度は、いずれも１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。細孔径１００μｍ、開孔率４２％、膜面積が３．１４ｃｍ２であるナイロンメッシュシートを有する市販のセルストレーナーを遠沈管に取り付け、メッシュシート面の角度を変えることにより、通液方向（鉛直方向）とメッシュシート面の角度を調節した。所定の角度に設定したメッシュシートに、細胞懸濁液を自然落下にて通液させ、メッシュシート通過後の細胞懸濁液中に含まれる細胞数を、メッシュシート通過前の細胞懸濁液中に含まれる細胞数で除することにより細胞回収率を算出した。なお、細胞数は改良ノイバウエル血球計算盤（日本血液協会認定品）により測定した。
【００６６】
（実施例１）細胞懸濁液の流れ方向と、メッシュシートに沿う面の法線とが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θを４５に設定したところ、目詰まりの発生（メッシュシートを通過する液の流れの停止）までに３０ｍＬの細胞懸濁液を通液させることができた。細胞回収率は９５％であった。
【００６７】
（実施例２）細胞懸濁液の流れ方向と、メッシュシートに沿う面の法線とが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θを３０に設定したところ、目詰まりの発生までに３２ｍＬの細胞懸濁液を通液させることができた。細胞回収率は９８％であった。
【００６８】
（比較例１）細胞懸濁液の流れ方向と、メッシュシートに沿う面の法線とが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θを５０に設定したところ、目詰まりの発生までに２７ｍＬの細胞懸濁液を通液させることができた。細胞回収率は９０％であった。
【００６９】
（比較例２）細胞懸濁液の流れ方向と、メッシュシートに沿う面の法線とが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θを９０に設定したところ、目詰まりの発生までに２６ｍＬの細胞懸濁液を通液させることができた。細胞回収率は８８％であった。
【００７０】
図４は、細胞懸濁液の流れ方向と、メッシュシートに沿う面の法線とが成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θと細胞懸濁液の処理量の関係を示したグラフであり、図５は、９０−θと細胞回収率の関係を示したグラフである。細孔径９５μｍのメッシュシートを使用し、９０−θを５０未満にすることで、高容量の細胞懸濁液を処理でき、かつ高い細胞回収率を達成可能なことが確認された。
【００７１】
３．細胞懸濁液調製用容器を用いた試験
図１−１〜２−２に示した構造を有する細胞懸濁液調製用容器１を用いて試験を行った。試験に用いた細胞懸濁液調製用容器では、第一側壁１５及び第二側壁１６が可撓性を有する樹脂シートにより構成されている。組み込まれたポリエステル製のメッシュシート４０の細孔径が異なる三種類の容器を用意した。容器の側壁は、可撓性のポリ塩化ビニルを用いて製造した。いずれの容器も、投入部２１および排出部２２として容器端部に挟み込まれたチューブの外径は８ｍｍであり、投入部２１の容器内部側端部２２から排出部３１の容器内部側端部３２までの距離は約２０ｃｍであった。このため本明細書で規定した前記Ｄ／Ｗの値は約２５であった。メッシュシートの膜面積は２０８ｃｍ２であった。細胞懸濁液調製用容器を投入部２１が上となるように吊るし、それぞれの容器に、同一個体由来の細胞懸濁液５０ｍＬを投入口２０から自然落下により通液させ、排出口３０から取り出した。細胞懸濁液の細胞濃度は、いずれも１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。通液時の容器中のメッシュシートは、メッシュシートに沿う面の法線Ｌと通液方向Ｆ（鉛直方向）が成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θが約１であった。
【００７２】
（実施例３）メッシュシートの細孔径が９５μｍ、開孔率が４６％の容器を用いたところ、通液中に目詰まりは発生せず、細胞回収率は９５％であった。
【００７３】
（実施例４）メッシュシートの細孔径が２００μｍ、開孔率が６１％の容器を用いたところ、通液中に目詰まりは発生せず、細胞回収率は１００％であった。
【００７４】
（実施例５）メッシュシートの細孔径が３００μｍ、開孔率が６５％の容器を用いたところ、通液中に目詰まりは発生せず、細胞回収率は１００％であった。
【００７５】
図６は、メッシュシートの細孔径と細胞回収率の関係を示したグラフである。通液方向に対するメッシュシート面の角度を同一角度に揃えた場合、少なくともメッシュシートの細孔径が９５μｍ〜３００μｍの範囲において、高い回収率で細胞を回収できることが確認された。
【００７６】
４．細胞懸濁液調製用容器と細胞濃縮洗浄システムを用いた試験
図１−１〜２−２に示した構造を有する細胞懸濁液調製用容器と細胞濃縮洗浄システム（カネカ製）を接続して閉鎖系で細胞懸濁液を調製し、同一個体から得た試料から従来法により開放系で細胞懸濁液を調製した場合の結果と比較した。細胞濃縮洗浄システム（カネカ製）は、本明細書に開示する「細胞懸濁液を閉鎖系で洗浄および濃縮することができる細胞懸濁液処理装置」の一例である。なお、細胞懸濁液調製用容器は、実施例３で用いたメッシュシートの細孔径が９５μｍであるものを用いた。
【００７７】
（実施例６）細胞懸濁液調製用容器１に、脂肪組織サンプルと０．０７５％コラゲナーゼ水溶液を、容器内に細胞濃度１．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液が１０２ｍＬ調製される量で注入し、容器をシェーカーで振盪させながら酵素反応を行った。酵素反応は投入口２０及び排出口３０を閉鎖した状態で行った。酵素反応後、容器内の溶液は油層と水層の２層に分離していた。容器を投入部２１が上になるように吊るし、分離した２層の境界をクランプで挟み、油層の成分が排出部３１方向に流れないようにした。容器中のメッシュシート４０は、メッシュシートに沿う面の法線Ｌと通液方向Ｆ（鉛直方向）が成す狭角の角度をθ（°）としたとき、９０−θが約１であった。その状態のまま、排出口から陰圧をかけて、排出口から３００ｍＬ／分の速度で容器から溶液を排出させて、接続された細胞濃縮洗浄システムに細胞懸濁液を移送し、洗浄を行った。洗浄後に得られた細胞懸濁液における細胞回収率は８３％であった。
【００７８】
（比較例３）実施例６と同じ脂肪組織サンプルと０．０７５％コラゲナーゼ溶液を用いて遠心管内で細胞濃度１．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液２０ｍＬを従来どおり、遠心管の蓋を開放して上清液を排出し、洗浄液を加え、蓋を閉じて遠心分離する操作を繰り返して濃縮洗浄したところ、細胞回収率は６８％であった。
【００７９】
図７は、実施例６と比較例３における結果を示すグラフである。実施例６と比較例３の結果を比較することにより、閉鎖系を形成できる容器（細胞懸濁液調製用容器）と自動化細胞濃縮洗浄システムを利用することで、一般的な方法である遠心処理よりも高い細胞回収率で細胞を回収できることが確認された。
【符号の説明】
【００８０】
１…細胞懸濁液調製用容器、１０…容器本体、１１…第一空間、１２…第二空間、１３…内部空間、１５…第一側壁、１６…第二の側壁、２０…投入口、２１…投入部、２２…投入部の第一空間側の端、３０…排出口、３１…排出部、３２…排出部の第二空間側の端、４０…メッシュシート、４１…メッシュシート周縁部、１５０…第一側壁周縁部、 １６０…第二側壁周縁部、９０１…細胞懸濁液調製用容器接続部、９０２…希釈液バッグ接続部、９０３…貯留容器、９０４…廃液容器、９０５…回収容器、９０６…細胞懸濁液処理器、９０８…エアフィルタ、９０９…気泡センサー、９１０…気泡センサー、９１１…気泡センサー、９１２〜１４…ポンプ、９１５…溶液入口ポート、９１６…循環出口ポート、９１７…循環入口ポート、９１８…細胞懸濁液導入口、９１９…細胞懸濁液導出口、９２０…濾液用出口、９２１〜２５…クランプ、９２６…プライミング液バッグ接続部、９２７…注入路、９２８…導入用連通管、９２９…導出用連通管、９３０…循環回路、９３１…回収路
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019092393.tif 000011
【図６】
2019092393.tif 000012
【図７】
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