(57)【要約】【課題】ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた微生物の分析方法において、分析感度を高めることであり、特に高質量電荷比領域における分析感度を高めることである。【解決手段】  マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置を用いて微生物を分析する方法であって、マトリックス物質と分析対象微生物の構成成分とを含むマトリックス・微生物混合溶液をサンプルプレート上に滴下し、乾燥させることによりマトリックス・微生物混合物の一次結晶を形成する結晶化工程と、さらに、前記第１のサンプルプレート上の前記一次結晶の上に、有機溶媒と有機酸を含む水溶液、有機溶媒を含む水溶液、及び水から選ばれる１種類の添加液を滴下し、乾燥させることにより、前記一次結晶を再結晶する工程とを備え、前記再結晶工程により得られたマトリックス・微生物混合結晶を、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置を用いて分析することを特徴とする。【選択図】図１
2019138810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置を用いて微生物を分析する方法であって、
a)マトリックス物質と分析対象微生物の構成成分とを含むマトリックス・微生物混合溶液をサンプルプレート上に滴下し、乾燥させることによりマトリックス・微生物混合物の一次結晶を形成する結晶化工程と、
b)さらに、前記第１のサンプルプレート上の前記一次結晶の上に、有機溶媒と有機酸を含む水溶液、有機溶媒を含む水溶液、及び水から選ばれる１種類の添加液を滴下し、乾燥させることにより、前記一次結晶を再結晶する工程と
を備え、
前記再結晶工程により得られたマトリックス・微生物混合結晶を、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置を用いて分析することを特徴とする微生物分析方法。
【請求項２】
前記一次結晶を再結晶化する工程において、
前記第１のサンプルプレート上の前記一次結晶の上に、前記添加液を滴下し、乾燥させる操作が複数回、行われることを特徴とする請求項１に記載の微生物分析方法。
【請求項３】
前記添加液が、さらに、アルキルホスホン酸及び界面活性剤の少なくとも一方を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物分析方法。
【請求項４】
前記アルキルホスホン酸がメチレンジホスホン酸である、請求項３に記載の微生物分析方法。
【請求項５】
前記界面活性剤がデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、請求３又は４に記載の微生物分析方法。
【請求項６】
前記マトリックス物質がシナピン酸である、請求項１〜５のいずれかに記載の微生物分析方法。
【請求項７】
被検微生物について得られたマススペクトルのうち質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域を含む質量域のマススペクトルパターンを、データベースに格納されているマススペクトルパターンと比較した結果に基づいて前記被検微生物の同定を行う、請求項１〜６のいずれかに記載の微生物分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を用いた微生物の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析におけるイオン化法の１つであるマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）法は、レーザ光を吸収しにくい物質やタンパク質などレーザ光で損傷を受けやすい物質を分析するために、レーザ光で吸収し易く且つイオン化しやすいマトリックス物質を分析対象物質と混合し、これにレーザ光を照射することで分析対象物質をイオン化する手法である。一般にマトリックス物質は溶液として分析対象物質と混合され、このマトリックス溶液が分析対象物質を取り込む。そして、乾燥させることによって溶液中の溶媒が気化し、分析対象物質を含んだ結晶が形成される。これにレーザ光を照射すると、マトリックス物質がレーザ光のエネルギーを吸収して急速に加熱され、気化する。その際、分析対象物質もマトリックス物質とともに気化し、その過程で分析対象物質がイオン化される。
【０００３】
こうしたＭＡＬＤＩ法を利用した質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）は、タンパク質などの高分子化合物をあまり解離させることなく分析することが可能であり、しかも微量分析にも好適であることから、近年、生命科学の分野で広く利用されている。
【０００４】
例えば特許文献１には、被検微生物を質量分析して得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物の同定を行う方法が記載されている。この方法では、まず、被検微生物から抽出したタンパク質を含む溶液や被検微生物の懸濁液等とマトリックス溶液を混合し、乾燥させた後、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析する。そして、得られたマススペクトルパターンを、予めデータベースに収録された多数の既知微生物のマススペクトルパターン（各微生物に特徴的なピーク（マーカーピーク）の位置や形状等を含む）と照合することにより同定を行う。こうした手法はマススペクトルパターンを各微生物に特異的な情報（すなわち指紋）として利用するため、フィンガープリント法と呼ばれている。
【０００５】
ところが、微生物を含む試料をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析すると、質量電荷比m/z_15000以上の高質量領域の感度が低く、マススペクトルの信頼性、正確性が低くなることが知られている。従って、同定対象となる微生物の判別に有効なマーカーピークが高質量領域にある場合には、フィンガープリント法による被検微生物の同定を正確に行うことができない。
【０００６】
従来より様々なアプローチでＭＡＬＤＩ−ＭＳの感度を改善するための研究・開発がなされており、その一つに、マトリックス溶液と分析対象物質を混合してマトリックス・対象物混合溶液を調製する際に、さらに別の物質をマトリックス添加剤として添加する方法がある。
【０００７】
例えば、非特許文献１、２には、マトリックス添加剤として界面活性剤を用いることにより、微生物を含む試料をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析したときの感度を改善できることが記載されている。これらの文献に記載されている方法では、被検微生物を含む溶液（被検微生物溶液）をサンプルプレートに塗布し、その上に界面活性剤を滴下した後、さらにその上にマトリックス溶液を滴下し、試料を調製する。界面活性剤は、被検微生物の溶解性を高めるために用いられている。
【０００８】
また、例えば特許文献２及び非特許文献３には、マトリックス物質である2, 5-ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）に、マトリックス添加剤としてメチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を添加することにより、分析対象であるリン酸化ペプチドを高い感度で検出できることが記載されている。上記文献に記載されている方法では、サンプルプレートにリン酸化ペプチドを含む溶液、マトリックス添加剤溶液、及びマトリックス溶液を順に滴下した後、これらを乾燥させることで試料を調製した後、この試料をＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析する。非特許文献３によると、ＭＤＰＮＡを用いることにより、アルカリ金属付加イオン（[Ｍ+Ｎａ]+、[Ｍ＋Ｋ]+など）の生成が抑制されるため、ペプチド由来の[Ｍ+Ｈ]+イオンのピークを高感度に検出することができる。
【０００９】
さらに、非特許文献４には、液体クロマトグラフ（ＬＣ）とＭＡＬＤＩ−ＭＳとを組み合わせたＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いたペプチド分析において、マトリックス添加剤であるＭＤＰＮＡを、マトリックス物質であるＤＨＢとともに使用することが記載されている。同文献によると、ＭＤＰＮＡを用いることにより、脱塩効果により、ペプチドピークのシグナル抑制効果が軽減されるため、ペプチド由来のピークを高感度に検出することができる。
【００１０】
また、非特許文献５には、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた糖鎖分析において、マトリックス物質であるＤＨＢを用いて試料を調製する際にエタノールを使用することが記載されている。ＤＨＢは、特に糖鎖分析用のマトリックスとして知られおり、結晶の偏り（スィ−トスポット）をもつという特性から、特に定量分析には不向きであると思われていた。同文献によると、サンプルプレート上にマトリックス物質と分析対象物との混合結晶を形成した後、その上に、エタノールを滴下することにより薄膜結晶が形成され、結晶表面の均一性が改良されることにより、糖鎖の定量分析が可能となることが報告されている。
【００１１】
さらに非特許文献６には、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いたペプチド分析において、疎水性ペプチドと親水性ペプチドの混合物の水溶液をサンプルプレート上に滴下し、その上にエチルアセテ−トを滴下することにより、疎水性ペプチドと親水性ペプチドを別の試料として調製する方法が記載されている。すなわち、サンプルプレート上の疎水性ペプチドと親水性ペプチドの混合物溶液の上にエチルアセテートが滴下されると、水の層と、その外側の有機溶媒の層からなる二層構造が形成される。この状態でしばらく放置すると、親水性ペプチドと疎水性ペプチドが、内側の水層と外側の有機溶媒層とに分離される。従って、水層を別のサンプルプレ−ト上に移すことにより、水層及び有機溶媒層を別のサンプルプレート上で調製して試料を作製することができるため、疎水性ペプチドと親水性ペプチドをそれぞれ感度良く検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2015-184020号公報
【特許文献２】特開2009-121857号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 2005年, Vol.16, pp.1422-1426
【非特許文献２】Rapid Commun. Mass Spectrom., 1999年, Vol.13, pp.1067-1071
【非特許文献３】Rapid Commun. Mass Spectrom., 2008年, Vol.22, pp.1109-1116
【非特許文献４】Mass Spectrometry, 2014年, A0031
【非特許文献５】Rapid Commun. Mass Spectrom., 1993年, vol. 7, pp.614-619
【非特許文献６】Anal. Chem. 2003年, vol. 75, pp.2362-2369
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述した従来の方法のうち、非特許文献１〜２では、界面活性剤を含む溶液を、分析対象物質を含む溶液に続いてサンプルプレ−ト上に滴下することにより、微生物を含む分析対象物質の溶解性を向上し、検出感度の改善がみられている。
また、特許文献２、非特許文献３及び４では、ＭＤＰＮＡをマトリックス添加剤として用いることで、質量電荷比 m/z 5000以下のリン酸化ペプチド及びペプチドの感度を向上している。非特許文献５では、有機溶媒を、分析対象物質とマトリックスの混合結晶上に滴下することで、結晶の均一性を改善し、質量電荷比 m/z 5000以下の糖鎖の定量分析を可能にしている。非特許文献６では、分析対象物質の結晶上に有機溶媒を滴下することで、水と有機溶媒のニ層に親水性ペプチドと疎水性ペプチドを分離し、各分析対象物の検出感度が改善されている。非特許文献３〜６では、標準試料であるペプチドあるいは糖鎖を分析対象物質としている。
一方、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた微生物の分析方法において、特にm/z 10000以上の高質量電荷比領域の感度が低い問題があった。特に、例えばサルモネラの識別に有効なマーカーピークの一つであるＳｏｄＡ（Superoxide dismutase）由来のピークのように質量電荷比m/z 20000以上のピークの検出感度が低いという問題があった。
【００１５】
本発明が解決しようとする課題は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた微生物の分析方法において、高質量電荷比領域における感度を高めることであり、特に、従来法以上の感度向上を行うことが、目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するために成された本発明は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を用いて微生物を分析する方法であって、
a)マトリックス物質と分析対象微生物の構成成分とを含むマトリックス・微生物混合溶液をサンプルプレート上に滴下し、乾燥させることによりマトリックス・微生物混合物の一次結晶を形成する結晶化工程と、
b)さらに、前記第１のサンプルプレート上の前記一次結晶の上に、有機溶媒と有機酸を含む水溶液、有機溶媒を含む水溶液、及び水から選ばれる１種類の添加液を滴下し、乾燥させることにより、前記一次結晶を再結晶化する工程と
を備え、
前記一次結晶を再結晶化する工程により得られたマトリックス・微生物混合結晶を、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置を用いて分析することを特徴とする。
【００１７】
上記微生物分析方法では、まず、サンプルプレート上にマトリックス・微生物混合溶液を滴下し、乾燥させることにより、マトリックス・微生物混合の一次結晶を形成する。続いて、この一次結晶の上に添加液を滴下することにより該一次結晶を溶かし、これを乾燥させることにより、再びマトリックス・微生物混合物の結晶を形成する（再結晶）。この結晶（マトリックス・微生物混合結晶）がマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析用の試料となる。
【００１８】
非特許文献５に示されるように、一般に、有機溶媒を含む溶液をマトリックスと分析対象物の混合結晶上に滴下すると、結晶系が変わり、例えば不均一だった結晶が均一になるなどの変化がみられる。このとき、溶媒の揮発性や物性の違いから、結晶の大きさ・形状も変化することが予測される。その結果、ＭＡＬＤＩ-ＭＳを用いた分析を行う際、有機溶媒を加えることで、優先的に検出される分析対象物のイオン種が変化する可能性が考えられる。さらに、適切な添加剤を組み合わせることで、分析対象物のさらなる感度向上が期待できる。
また、一般的に、結晶を溶かして再結晶させると、不純物の少ない結晶が得られる。本発明においては、マトリックス・微生物混合溶液を乾燥させることにより形成された一次結晶を溶かして再結晶させることによりマトリックス・微生物混合結晶を形成するため、不純物の少ない、言い換えると、マトリックス物質及び被検微生物の含有率の大きいマトリックス・微生物混合結晶を用いてＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた分析を行うことができる。従って、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いてマトリックス・微生物混合結晶を分析したときの感度を向上させることが期待できる。
【００１９】
前記有機溶媒としては、アセトニトリル（ＡＣＮ）等を用いることができる。また、添加液としての有機溶媒と有機酸を含む水溶液における有機酸としては、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリクロロ酢酸、あるいは酢酸等の有機酸を用いることができる。添加液に有機酸が含まれていると、プロトン化分子（[Ｍ＋Ｈ]＋）あるいはその多価イオン（[Ｍ＋ｎＨ]ｎ＋）のピークを効率よく観測することができることが知られている。
添加液の組成は、マトリックス・微生物混合溶液の組成によって決定すると良い。
【００２０】
前記マトリックス・微生物混合溶液は予め作製しておいても良く、サンプルプレート上にマトリックス物質を含む溶液（マトリックス溶液）と、分析対象微生物の構成成分を含む溶液（微生物溶液）を順に滴下することにより、マトリックス・微生物混合溶液を作製しても良い。
【００２１】
上述したように、本発明では、マトリックス・微生物混合物の一次結晶を再結晶させることによりマトリックス・微生物混合結晶を得る。一般に、再結晶化を繰り返すと、不純物が減って結晶の純度が上がる。従って、本発明においては、前記一次結晶を再結晶化する工程において、前記第１のサンプルプレート上の前記一次結晶の上に、前記添加液を滴下し、乾燥させる操作は、１回に限らず、２回以上行っても良い。ただし、マトリックス・微生物混合結晶を作製する作業にかかる時間と手間を考えると、上記操作は、１回ないし３回程度が好ましい。
【００２２】
また、本発明では、前記添加液が、さらに、アルキルホスホン酸及び界面活性剤の少なくとも一方を含むことが好ましい。
【００２３】
アルキルホスホン酸は、タンパク質が含まれる試料をＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析する際に、アルカリ金属付加イオン（[Ｍ＋Ｎａ]＋、[Ｍ＋Ｋ]＋等）の生成を抑制することができる。アルキルホスホン酸としては、ホスホン酸基を１個含む、ホスホン酸（Phosphonic acid）、メチルホスホン酸（Methylphosphonic acid）、フェニールホスホン酸（Phenylphosphonic acid）、1-ナフチルメチルホスホン酸（1-Naphthylmethylphosphonic acid）などが挙げられ、ホスホン酸基を２個以上含む化合物として、メチレンジホスホン酸（Methylenediphosphonic acid）、エチレンジホスホン酸（Ethylenediphosphonic acid）、エタン-1-ヒドロキシ-1,1-ジホスホン酸（Ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid）、ニトリロトリホスホン酸（Nitrilotriphosphonic acid）、エチレンジアミノテトラホスホン酸（Ethylenediaminetetraphosphonic acid）などが挙げられるが、本発明の好ましい形態としては、アルキルホスホン酸としてメチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を用いることができる。
【００２４】
界面活性剤は、主に微生物の構成成分の溶解性を向上するために用いられる。界面活性剤としては、膜タンパク質など、細胞中のタンパク質の抽出に用いられる界面活性剤を挙げることができ、特にタンパク質を変性させずに抽出することができる界面活性剤を用いることが好ましい。このような界面活性剤としては、非イオン系界面活性剤である、デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（decyl-β-D-maltopyranoside(ＤＭＰ)）、Ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（N-decyl-β-D-maltopyranoside）、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グラクトピラノシド（N-octyl-β-D-glactopyranoside）、Ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（N-dodecyl-β-D-maltoside）、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（N-octyl-β-D-glucopyranoside）などが挙げられ、両イオン性界面活性剤である、two zwitterionic surfactants、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン−Ｎ−オキシド（N,N-dimethyldodecylamine-N-oxide）、zwittergent 3-12などが挙げられるが、本発明の好ましい形態としては、界面活性剤としてＤＭＰを用いることができる。
【００２５】
マトリックス・微生物混合溶液を構成するマトリックス物質は、分析対象となる微生物の種類や微生物の同定レベル（科、属、種、亜種、病原型、血清型、株等）に応じた適宜の物質を選択することができる。そのようなマトリックス物質として、シナピン酸（Sinapinic acid (ＳＡ)）、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 （α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (ＣＨＣＡ)）、フェルラ酸（ferulic acid (ＦＡ)）などが挙げられるが、本発明の好ましい形態としては、マトリックス物質としてＳＡを用いることができる。一般に、ＳＡは、ＭＡＬＤＩ分析において、タンパク質などの高質量分子の分析に有効であることが知られている。
【００２６】
また、本発明の微生物分析方法は、被検微生物を含む試料について得られたマススペクトルにおける質量電荷比m/z_10000以上の高質量領域を含む質量域を、データベースに格納されているマススペクトルパターンと比較した結果に基づいて被検微生物を同定する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係る微生物分析方法によれば、サンプルプレート上に形成されたマトリックス・微生物混合物質の一次結晶の上に有機溶媒と有機酸を含む水溶液、有機溶媒を含む水溶液、及び水から選ばれる１種類の添加液を滴下して前記一次結晶を溶解した後、乾燥させることにより、前記一次結晶が再結晶したマトリックス・微生物混合結晶を得、これをＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析するため、微生物の構成成分に由来するピークを高い感度で検出することができ、特に、マススペクトルの質量電荷比m/zが10000以上の高質量電荷比領域の感度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC 13245）を用いた実施例１で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 20000-40000の領域を示す図。
【図２】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC 13245）を用いた実施例１で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 37000-90000の領域を示す図。
【図３】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe 1402-15）を用いた実施例２で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 20000-40000の領域を示す図。
【図４】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe 1402-15）を用いた実施例２で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 20000-34000の領域を示す図。
【図５】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型Orion, jfrlSe 1402-15）を用いた実施例２で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 37000-90000の領域を示す図。
【図６】被検微生物として大腸菌（E. coli DH5α Electro-Cells）を用いた実施例３で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 18000-40000の領域を示す図。
【図７】被検微生物として大腸菌（E. coli DH5α Electro-Cells）を用いた実施例３で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 37000-90000の領域を示す図。
【図８】被検微生物として枯草菌（B. subtilis）を用いた実施例４で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 12000-20000の領域を示す図。
【図９】被検微生物として大腸菌（E. coli DH5α Electro-Cells）を用いた実施例５の別の方法１（マトリックス溶液ＦＡ−１、ＳＡ−３）及び別の方法２（マトリックス溶液ＦＡ−１、ＳＡ−３）で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 18000-50000の領域を示す図。
【図１０】被検微生物として大腸菌（E. coli DH5α Electro-Cells）を用いた実施例５の別の方法３（マトリックス溶液ＦＡ−２、ＳＡ−４）及び別の方法４（マトリックス溶液ＦＡ−２、ＳＡ−４）で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 18000-50000の領域を示す図。
【図１１】被検微生物として大腸菌（E. coli DH5α Electro-Cells）を用いた実施例５の別の方法３（マトリックス溶液ＦＡ−３、ＳＡ−５）及び別の方法４（マトリックス溶液ＦＡ−３、ＳＡ−５）で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 18000-50000の領域を示す図。
【図１２】被検微生物として大腸菌（E. coli DH5α Electro-Cells）を用いた実施例５の方法（マトリックス溶液ＳＡ−２、ＦＡ−４）及び別の方法５（マトリックス溶液ＳＡ−２、ＦＡ−４）で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 18000-50000の領域を示す図。
【図１３】被検微生物として大腸菌（E. coli DH5α Electro-Cells）を用いた実施例５の方法（マトリックス溶液ＳＡ−２、ＦＡ−４）及び別の方法４（マトリックス溶液ＳＡ−５、ＦＡ−３）で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 18000-50000の領域を示す図。
【図１４】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型Infantis, jfrlSe 1402-4）を用いた実施例６で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 22000-24000の領域を示す図。
【図１５】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型Infantis, jfrlSe 1402-4）を用いた実施例６で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 20000-35000の領域を示す図。
【図１６】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC 13245）を用いた実施例７で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 22300-23200の領域を示す図。
【図１７】被検微生物として大腸菌（E. coli DH5α Electro-Cells）を用いた実施例８で得られたマススペクトルの質量電荷比m/zが15000-50000の領域を示す図。
【図１８】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型Infantis, jfrlSe 1402-4）を用いた実施例９で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 20000-40000の領域を示す図。
【図１９】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型Infantis, jfrlSe 1402-4）を用いた実施例９で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 20000-34000の領域を示す図。
【図２０】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型Infantis, jfrlSe 1402-4）を用いた実施例９で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 37000-90000の領域を示す図。
【図２１】被検微生物として大腸菌（E. coli DH5α Electro-Cells）を用いた実施例１０で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 20000-50000の領域を示す図。
【図２２】被検微生物として枯草菌（B. subtilis）を用いた実施例１１で得られたマススペクトルの質量電荷比m/z 12000-25000の領域を示す図。
【図２３】被検微生物としてサルモネラ・エンテリカ（血清型Typhimurium, NBRC 13245）を用いた実施例１２で得られたマススペクトルであって、添加液を添加しなかった場合（Ａ）、添加液を１回添加した場合（Ｂ）、添加液を２回添加した場合（Ｃ）、添加液を３回添加した場合（Ｄ）のマススペクトル（ｎ＝４）の質量電荷比m/z 22000-24000の領域を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明に係る微生物分析方法では、分析対象となる微生物（以下、被検微生物）の構成成分を含む試料を調製し、これをＭＡＬＤＩ−ＭＳにセットして質量分析を実行することによりマススペクトルを得る。そして、得られたマススペクトルをデータベースに格納されているマススペクトルパターンと比較することにより被検微生物の種類（微生物が属する分類群（科、属、種、亜種、病原型、血清型、株等）を同定することができる。詳しくは後述するように、本発明に係る微生物分析方法では、得られたマススペクトルのうち、特に質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域において高い感度で微生物の分子量情報を得ることができるため、該高質量領域に被検微生物の同定に有効なマーカーピークが存在するような微生物の同定に好適である。
【００３０】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳとしては、ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳ）を用いることが好ましい。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳは測定可能な質量電荷比の範囲が非常に広いため、微生物の構成成分であるタンパク質のような高質量分子の分析に適したマススペクトルを取得することができる。
【００３１】
被検微生物の構成成分としては、細胞抽出物又は細胞抽出物からリボソームタンパク質等の細胞構成成分を精製したものの他、菌体や細胞懸濁液をそのまま使用することができる。
【００３２】
以下、本発明に係る微生物分析方法を実施例１〜１２によって説明するが、これらは単なる例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の各実施例では、本発明に係る微生物分析方法に従って調製した試料をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析するとともに、前記試料の効果の確認のため、本発明とは別の方法でも試料を調製してＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した。
【００３３】
なお、各実施例の説明に先立ち、各実施例で用いたマトリックス溶液及び添加液の組成を表１及び表２に示す。マトリックス溶液及び添加液の調製方法は後述する。
表１において、ＳＡ−１及びＳＡ−２は本発明におけるマトリックス溶液を示し、ＳＡ−３及びＦＡ−１は非特許文献１の方法におけるマトリックス溶液を示し、ＳＡ−４、ＦＡ−２及びＦＡ−３は非特許文献２の方法におけるマトリックス溶液を示す。ＳＡ−５は、ＦＡ−３（非特許文献２）のマトリックス物質をＳＡに変えて調製したマトリックス溶液を示す。ＦＡ−４は本発明のマトリックス溶液ＳＡ−２のマトリックス物質をＦＡに変えて調製したマトリックス溶液を示す。これらのマトリックス溶液は、主に、本発明と先行技術文献（非特許文献１及び２）の方法との比較評価のために用いた。
同様に、表２において、Ａ−１及びＡ−３〜６は本発明における添加液を示し、Ａ−２は非特許文献１の方法に係る溶媒組成の添加液を示す。
【００３４】
【表１】
2019138810.tif 000003
【００３５】
【表２】
2019138810.tif 000004
【実施例１】
【００３６】
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、サルモネラ・エンテリカの血清型Typhimurium, NBRC 13245（LB寒天培地、37℃で20時間培養）を用いた。
【００３７】
＜２．マトリックス溶液の調製＞
本実施例では以下の２種類のマトリックス溶液を準備した。
(1) エタノール（ＥｔＯＨ）にマトリックス物質であるシナピン酸（ＳＡ、株式会社島津ジーエルシー）を２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液（飽和溶液）を調製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ−１」とする。
(2) ５０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）と０．６％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水溶液に、ＳＡを２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液を調製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ−２」とする。
【００３８】
＜３．添加液の調製＞
５０％のＡＣＮと０．１％のＴＦＡを含む水溶液に、界面活性剤であるデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（decyl-β-D-maltopyranoside、ＤＭＰ）を１ｍＭ含むように溶解して、添加液を調製した。この添加液を「Ａ−１」とする。
【００３９】
＜４．質量分析＞
試料の分析には、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い、リニアモード（ポジティブイオンモード）で測定した。データは全てラスター分析により取得した。ラスター分析は、上述の質量分析装置が備える自動測定機能であり、サンプルプレートの各ウェル内の試料に対して、予め設定されたポイント数、ショット数でレーザ照射し、マススペクトルデータを取得する手法である。
【００４０】
＜５．試料の調製＞
＜５．１  実施例１の方法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物のコロニー数個分を、１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁してＳＡ−２／微生物懸濁液を調製した。ＳＡ−２／微生物懸濁液は、本発明のマトリックス・微生物混合溶液に相当する。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェルのマトリックス溶液ＳＡ−１を乾燥させた後、その上にＳＡ−２／微生物懸濁液１．２μＬを滴下した。
(4) その後、サンプルプレートの各ウェル内のＳＡ−２／微生物懸濁液を乾燥させてＳＡ−２／微生物混合物の一次結晶を形成した後、さらに、その上に添加液Ａ−１を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(5) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００４１】
＜５．２  別の方法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物のコロニー数個分を、１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、ＳＡ−２／試料懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェルのマトリックス溶液ＳＡ−１を乾燥させた後、その上にＳＡ−２／微生物懸濁液１．２μＬを、滴下した。
(4) その後、サンプルプレートの各ウェル内のＳＡ−２／試料懸濁液を乾燥させた。  
(5) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００４２】
＜６．結果＞
図１及び図２に、実施例１の方法及び別の方法で調製した試料について得られたマススペクトルを示す。図１及び図２の（Ａ）は実施例１の方法のマススペクトルを、図１及び図２の（Ｂ）は別の方法のマススペクトルを示す。また、図１は質量電荷比m/z_20000〜40000の領域、図２は質量電荷比m/z 37000〜90000の領域のマススペクトルである。
【００４３】
図１及び図２に示すように、いずれの質量電荷比領域においても、実施例１の方法で調製した試料の方が、別方法で調製した試料よりもマススペクトル上に現れるピーク強度が大きかった。特に、質量電荷比m/z 40000以上の高質量電荷比領域では、別の方法で調製した試料のマススペクトルは背景ノイズが大きく、ピークを検出できなかったのに対して、実施例１の方法で調製した試料ではいくつかのピークが検出された。
【００４４】
以上より、マトリックス・微生物混合物の一次結晶を、添加液Ａ−１を用いて再結晶化する操作により、高質量電荷比領域における感度が向上することが確認された。特に、本実施例の被検微生物であるサルモネラ（Typhimurium）は、食中毒の原因菌の一つであることから、本実施例の方法は、食中毒の発生原因の究明に有効であると思われた。
【実施例２】
【００４５】
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、サルモネラ・エンテリカの血清型Orion, jfrlSe 1402-15（LB寒天培地、37℃で20時間培養）を用いた。
【００４６】
＜２．マトリックス溶液の調製＞
実施例１と同じ組成で、マトリックス溶液ＳＡ−１及びＳＡ−２を調製した。
【００４７】
＜３．添加液の調製＞
実施例１と同じ組成で添加液Ａ−１を調製した。
【００４８】
＜４．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
【００４９】
＜５．試料の調製＞
＜５．１  実施例２の方法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物のコロニー数個分を、１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁してＳＡ−２／微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェルのマトリックス溶液ＳＡ−１を乾燥させた後、その上にＳＡ−２／微生物懸濁液１．２μＬを滴下した。
(4) その後、サンプルプレートの各ウェル内のＳＡ−２／微生物懸濁液を乾燥させてＳＡ−２／微生物混合物の一次結晶を形成した後、さらに、その上に添加液Ａ−１を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(5) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００５０】
＜５．２  別の方法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物のコロニー数個分を、１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、ＳＡ−２／試料懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェルのマトリックス溶液ＳＡ−１を乾燥させた後、その上にＳＡ−２／微生物懸濁液１．２μＬを、滴下した。
(4) その後、サンプルプレートの各ウェル内のＳＡ−２／試料懸濁液を乾燥させた。  
(5) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００５１】
＜６．結果＞
図３〜図５に、実施例２の方法及び別の方法で調製した試料について得られたマススペクトルを示す。図３〜図５の（Ａ）は実施例２の方法のマススペクトルを、図３〜図５の（Ｂ）は別の方法のマススペクトルを示す。また、図３は質量電荷比m/z 20000〜40000の領域、図４は質量電荷比m/z 20000〜34000の領域、図５は質量電荷比m/zが37000〜90000の領域のマススペクトルである。
【００５２】
図３〜図５に示すように、いずれの質量電荷比領域においても、実施例２の方法で調製した試料の方が、別の方法で調製した試料よりもマススペクトル上に現れるピーク強度が大きかった。特に、質量電荷比m/z 40000以上の高質量電荷比領域では、別の方法で調製した試料のマススペクトルは背景ノイズが大きく、ピークを検出できなかったのに対して、実施例２の方法で調製した試料ではいくつかのピークが検出された。
【００５３】
以上より、マトリックス・微生物混合物の一次結晶を、添加液Ａ−１を用いて再結晶化する操作により、微生物の構成成分を含む試料の高質量電荷比領域における感度が向上することが分かった。特に、本実施例の被検微生物であるサルモネラ（Orion, jfrlSe1402-15）は、食中毒の原因菌の一つであることから、本実施例の方法は、食中毒の発生原因の究明に有効であると思われた。さらに、実施例１の被検細胞であるサルモネラ（Typhimurium, NBRC 13245）と本実施例の被検微生物であるサルモネラ（Orion, jfrlSe1402-15）は、いずれもサルモネラ属に属し、血清型が異なる細菌である。実施例１及び２の結果より、マトリックス微生物混合物の一次結晶を添加液Ａ−１を用いて再結晶化する操作は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いたサルモネラの血清型の識別にも有効であることが確認された。
【実施例３】
【００５４】
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、大腸菌ＤＨ５α エレクトロセル（E. coli DH5α Electro-Cells、製品コード：TKR 9027、タカラバイオ株式会社）を用いた。大腸菌ＤＨ５α エレクトロセルは、大腸菌ＤＨ５α株を含む溶液からなるため、以下では「被検微生物溶液」という。
【００５５】
＜２．マトリックス溶液の調製＞
実施例１と同じ組成で、マトリックス溶液ＳＡ−２を調製した。ただし、本実施例では、マトリックス溶液ＳＡ−２に含まれるマトリックス物質ＳＡは、和光純薬工業株式会社から購入したものを用いた。
【００５６】
＜３．添加液の調製＞
実施例１と同じ組成で添加液Ａ−１を調製した。
【００５７】
＜４．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
【００５８】
＜５．試料の調製＞
＜５．１  実施例３の方法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物溶液を、マトリックス溶液ＳＡ−２で５０倍希釈してマトリックス・微生物混合溶液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス・微生物混合溶液を１μＬ滴下し、乾燥させてマトリックス・微生物混合物の一次結晶を形成した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェルの一次結晶の上に添加液Ａ−１を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００５９】
＜５．２  別の方法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物溶液を、マトリックス溶液ＳＡ−２で５０倍希釈してマトリックス・微生物混合溶液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス・微生物混合溶液を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００６０】
＜６．結果＞
図６及び図７に、実施例３の方法及び別の方法で調製した試料について得られたマススペクトルを示す。図６及び図７の（Ａ）は実施例３の方法のマススペクトルを、図６及び図７の（Ｂ）は別の方法のマススペクトルを示す。また、図６は質量電荷比m/z 18000〜40000の領域、図７は質量電荷比m/z 37000〜90000の領域のマススペクトルである。
【００６１】
図６及び図７に示すように、いずれの質量電荷比領域においても、実施例３の方法で調製した試料の方が、別の方法で調製した試料よりもマススペクトル上に現れるピーク強度が大きかった。特に、質量電荷比m/z 40000以上の高質量電荷比領域では、別の方法で調製した試料のマススペクトルは背景ノイズが大きく、ピークが検出できなかったのに対して、実施例３の方法で調製した試料ではいくつかのピークが確認された。以上より、被検微生物が大腸菌の場合も、サルモネラと同様、マトリックス・微生物混合物の一次結晶を、添加液Ａ−１を用いて再結晶化する操作により、微生物の構成成分を含む試料の高質量電荷比領域における感度が向上することが分かった。
【実施例４】
【００６２】
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、枯草菌（B. subtilis）を用いた。本実施例では、冷凍保存されている枯草菌を含むエタノール溶液からエタノールを乾固した後、２５％ギ酸を２０μＬ加え、被検微生物溶液を作成した。
【００６３】
＜２．マトリックス溶液の調製＞
実施例１と同じ組成で、マトリックス溶液ＳＡ−２を調製した。ただし、本実施例では、マトリックス溶液ＳＡ−２に含まれるマトリックス物質ＳＡは、実施例３と同様に、和光純薬工業株式会社から購入したものを用いた。
【００６４】
＜３．添加液の調製＞
実施例１、２と同様の組成で添加液Ａ−１を調製した。
【００６５】
＜４．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
【００６６】
＜５．試料の調製＞
＜５．１  実施例４の方法による試料の調製＞
(1) まず、サンプルプレートの各ウェルに上述の被検微生物溶液を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルに、さらにマトリックス溶液ＳＡ−２を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェルに、さらに添加液Ａ−１を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００６７】
＜５．２  別の方法による試料の調製＞
(1) まず、サンプルプレートの各ウェルに上述の被検微生物溶液を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルに、さらにマトリックス溶液ＳＡ−２を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００６８】
＜６．結果＞
図８に、実施例４の方法及び別の方法で調製した試料について得られた、質量電荷比m/z 12000〜20000の領域マススペクトルを示す。図８の（Ａ）は実施例４の方法のマススペクトルを、図８の（Ｂ）は別の方法のマススペクトルを示す。
【００６９】
図８に示すように、実施例４の方法で調製した試料の方が、別の方法で調製した試料よりもマススペクトル上に現れるピーク強度が大きかった。実施例４の方法では、サンプルプレートの各ウェルに被検微生物溶液及びマトリックス溶液を順に滴下してマトリックス・微生物溶液を調製した後、これを乾燥させてマトリックス・微生物混合物の一次結晶を形成した。そして、この上に添加液Ａ−１を滴下し、乾燥させることにより前記一次結晶を再結晶化した。このような方法でも、添加液Ａ−１を用いた再結晶化操作により、ＭＡＬＤＩ−ＭＳの感度が向上することが確認された。
【００７０】
さらに、被検微生物が枯草菌の場合も、大腸菌、サルモネラと同様、マトリックス・微生物混合物の一次結晶を添加液Ａ−１を用いて再結晶化することにより、微生物の構成成分を含む試料の高質量電荷比領域（m/z 12000〜20000の領域）における感度が向上することが確認された。
【実施例５】
【００７１】
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、大腸菌ＤＨ５α エレクトロセル（E. coli DH5α Electro-Cells、製品コード：TKR 9027、タカラバイオ株式会社）を用いた。上述した通り、大腸菌ＤＨ５α エレクトロセルは、大腸菌ＤＨ５α株を含む溶液からなるため、以下では「被検微生物溶液」という。
【００７２】
＜２．マトリックス溶液の調製＞
マトリックス物質としてフェルラ酸（ＦＡ）を用いた４種類のマトリックス溶液と、マトリックス物質としてＳＡを用いた４種類のマトリックス溶液を調製した。
（２−１）ＦＡを用いたマトリックス溶液
(1) ギ酸を１７％、ＡＣＮを３３％、水を５０％含む水溶液に、ＦＡを１２．５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液を調製した。このマトリックス溶液を「ＦＡ−１」とする。
(2) ２−プロパノールを５０％、水を５０％含む水溶液に、ＦＡを２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液を調製した。このマトリックス溶液を「ＦＡ−２」とする。
(3) ギ酸、２−プロパノール、水を１：２：３の比で混合した水溶液に、ＦＡを２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液を調製した。このマトリックス溶液を「ＦＡ−３」とする。
(4) ５０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）と０．６％のＴＦＡを含む水溶液に、ＦＡを２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液を調製した。このマトリックス溶液を「ＦＡ−４」とする。
【００７３】
（２−２）ＳＡを用いたマトリックス溶液
(1) 実施例１と同じ組成でマトリックス溶液ＳＡ−２を調製した。ただし、マトリックス溶液ＳＡ−２に含まれるマトリックス物質ＳＡは、実施例３及び４と同様に、和光純薬工業株式会社から購入したものを用いた。
(2) ７０％のＡＣＮと０．１％のＴＦＡを含む水溶液に、ＳＡを１０mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液を調製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ−３」とする。
(3) ２−プロパノールを５０％、水を５０％含む水溶液に、ＳＡを２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液を調製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ−４」とする。
(4) ギ酸、２−プロパノール、水を１：２：３の比で混合した水溶液に、ＳＡを２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液を調製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ−５」とする。
【００７４】
＜３．添加液の調製＞
以下の２種類の添加液を準備した。
(1) 実施例１と同じ組成で添加液Ａ−１を調製した。
(2) 水にＤＭＰを１ｍＭ含むように溶解して添加液を調製した。これを「Ａ−２」とする。
【００７５】
＜４．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
【００７６】
＜５．試料の調製＞
＜５．１  実施例５の方法による試料の調製＞
(1) まず、上述の被検微生物溶液をマトリックス溶液ＳＡ−２、ＦＡ−４のそれぞれで５０倍希釈してマトリックス・微生物混合溶液を調製した。
(2) 次に、２種類のマトリックス・微生物混合溶液をそれぞれ１μＬ、サンプルプレートの各ウェルに滴下し、乾燥させてマトリックス・微生物混合物の一次結晶を形成した。
(3) さらに、サンプルプレートの各ウェルに、添加液Ａ−１を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００７７】
＜５．２  別の方法１による試料の調製＞
この方法は、上述の非特許文献１に記載されている方法であって、添加液を添加せずに試料を調製する方法に相当する。
(1) まず、上述の被検微生物溶液を、７０％のＡＣＮと０．１％のＴＦＡを含む水溶液で２５倍希釈して、被検微生物溶液希釈液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルに前記被検微生物溶液希釈液を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) さらに、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＦＡ−１又はＳＡ−３のいずれかを1μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００７８】
＜５．３  別の方法２による試料の調製＞
この方法は、上述の非特許文献１に記載されている方法であって、ＤＭＰを含む添加液Ａ−２を添加して試料を調製する方法に相当する。
(1) まず、上述の被検微生物溶液を、７０％のＡＣＮと０．１％のＴＦＡを含む水溶液で２５倍希釈して、被検微生物溶液希釈液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルに前記被検微生物溶液希釈液を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) さらに、サンプルプレートの各ウェルに添加液Ａ−２を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) さらにまた、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＦＡ−１又はＳＡ−３を1μＬ滴下し、乾燥させた。
(5) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００７９】
＜５．４  別の方法３による試料の調製＞
この方法は、上述の非特許文献２に記載されている方法であって、ＤＭＰを用いずに試料を調製する方法に相当する。
(1) まず、上述の被検微生物溶液を、水で１２．５倍希釈して、被検微生物溶液希釈液を調製した。
(2) 次に、被検微生物溶液希釈液とマトリックス溶液（ＦＡ−２、ＦＡ−３、ＳＡ−４、ＳＡ−５）のそれぞれとを１：１（v/v）で混合し、マトリックス・微生物混合溶液を調製した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェルに各マトリックス・微生物混合溶液を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００８０】
＜５．５  別の方法４による試料の調製＞
この方法は、上述の非特許文献２に記載されている試料の調製方法であって、ＤＭＰを用いて試料を調製する方法に相当する。
(1) まず、上述の被検微生物溶液を、ＤＭＰを２０ｍＭ含む水溶液で１２．５倍希釈して、被検微生物溶液希釈液を調製した。
(2) 次に、被検微生物溶液希釈液とマトリックス溶液（ＦＡ−２、ＦＡ−３、ＳＡ−４、ＳＡ−５）のそれぞれとを１：１（v/v）で混合し、マトリックス・微生物混合溶液を調製した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェルに各マトリックス・微生物混合溶液を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００８１】
＜５．６  別の方法５による試料の調製＞
この方法は、添加液Ａ−１を用いない以外は、実施例５と同じ方法である。
(1) まず、上述の被検微生物溶液を、マトリックス溶液ＳＡ−２及びＦＡ−４のそれぞれで５０倍希釈して、マトリックス・微生物混合溶液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルに各マトリックス・微生物混合溶液を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【００８２】
＜６．結果＞
図９〜図１３に実施例５の方法及び別の方法で調製した試料について得られた質量電荷比m/z 18000〜50000の領域のマススペクトルを示す。
図９の（Ａ）はマトリックス溶液ＦＡ−１を用いた別の方法２（ＤＭＰあり）の結果を、（Ｂ）はマトリックス溶液ＦＡ−１を用いた別の方法１（ＤＭＰなし）の結果を、（Ｃ）はマトリックス溶液ＳＡ−３を用いた別の方法２（ＤＭＰあり）の結果を、（Ｄ）はマトリックス溶液ＳＡ−３を用いた別の方法１（ＤＭＰなし）の結果を、それぞれ示す。
【００８３】
図９（Ａ）〜（Ｄ）から分かるように、非特許文献１の方法では、マトリックス溶液としてＦＡ−１、ＳＡ−３のいずれを用いた場合でも、ＤＭＰを含む添加液Ａ−１を添加した場合と添加しなかった場合とで、マススペクトルの形状はほとんど変わらなかった。マトリックス物質としてＳＡとＦＡを用いた場合を比較すると、ＳＡを用いた場合（Ｃ、Ｄ）に比べてＦＡを用いた場合（Ａ、Ｂ）の方が、ピーク強度が大きくなる傾向が見られた。つまり、非特許文献１の方法方法では、マトリックス物質の違いによる高質量電荷比m/z領域の感度向上が見られたが、添加液Ａ−１の添加による高質量電荷比m/z領域の感度向上は確認されなかった。
【００８４】
図１０の（Ａ）はマトリックス溶液ＦＡ−２を用いた別の方法４（ＤＭＰあり）の結果を、（Ｂ）はマトリックス溶液ＦＡ−２を用いた別の方法３（ＤＭＰなし）の結果を、（Ｃ）はマトリックス溶液ＳＡ−４を用いた別の方法４（ＤＭＰあり）の結果を、（Ｄ）はマトリックス溶液ＳＡ−４を用いた別の方法３（ＤＭＰなし）の結果を、それぞれ示す。
【００８５】
図１０（Ａ）〜（Ｄ）から分かるように、非特許文献２の方法では、マトリックス溶液としてＦＡ−２を用い、且つ、被検微生物溶液希釈液にＤＭＰを含む場合（Ａ）にのみ、ピークが観察された。すなわち、マトリックス物質としてＦＡを用いた場合にのみ、ＤＭＰによる高質量電荷比m/z領域の感度向上効果が確認された。
【００８６】
図１１の（Ａ）はマトリックス溶液ＦＡ−３を用いた別の方法４（ＤＭＰあり）の結果を、（Ｂ）はマトリックス溶液ＦＡ−３を用いた別の方法３（ＤＭＰなし）の結果を、（Ｃ）はマトリックス溶液ＳＡ−５を用いた別の方法４（ＤＭＰあり）の結果を、（Ｄ）はマトリックス溶液ＳＡ−５を用いた別の方法３（ＤＭＰなし）の結果を、それぞれ示す。
【００８７】
図１１（Ａ）〜（Ｄ）から分かるように、非特許文献２の方法では、マトリックス物質としてＦＡ、ＳＡのいずれを用いた場合においても、被検微生物溶液希釈液にＤＭＰを含む場合（Ａ、Ｃ）は、含まない場合（Ｂ、Ｄ）に比べて、高強度のピークが観察された。特に、マトリックス物質としてＦＡを用いた場合は、ＳＡを用いた場合よりも、Ｓ／Ｎが高くなることが確認された。
【００８８】
図１２の（Ａ）はマトリックス溶液ＳＡ−２を用いた実施例５の方法の結果を、（Ｂ）はマトリックス溶液ＳＡ−２を用いた別の方法５の結果を、（Ｃ）はマトリックス溶液ＦＡ−４を用いた実施例５の方法の結果を、（Ｄ）はマトリックス溶液ＦＡ−４を用いた別の方法５の結果を、それぞれ示す。
【００８９】
図１２から分かるように、マトリックス物質としてＦＡ及びＳＡのいずれを用いた場合も、本実施例の方法で調製した試料の方が別の方法５で調製した試料よりも、マススペクトルに高い強度のピークが観測された。このことから、ＤＭＰを含む添加液Ａ−１を添加することによる高質量電荷比領域のピーク強度の向上効果が確認された。特に、マトリックス物質としてＦＡを用いた場合に比べて、ＳＡを用いた場合の方が、高質量電荷比領域のピークが高いＳ／Ｎで、且つ、高い強度で検出された。  
【００９０】
図１３の（Ａ）はマトリックス溶液ＳＡ−２を用いた実施例５の方法の結果を、（Ｂ）はマトリックス溶液ＦＡ−４を用いた実施例５の方法の結果を、（Ｃ）はマトリックス溶液ＳＡ−５を用いた別の方法４の結果を、（Ｄ）はマトリックス溶液ＦＡ−３を用いた別の方法４の結果を、それぞれ示す。
【００９１】
図１３に示すように、非特許文献２に記載された方法（別の方法４）では、マトリックス物質ＳＡに比べてＦＡの方が、実施例５の方法ではマトリックス物質ＦＡに比べてＳＡの方が、高質量電荷比領域のピークが、高いＳ／Ｎで、且つ、高い強度で検出された。さらに、マトリックスＦＡを用いた非特許文献２に記載された方法（別の方法４）に比べ、マトリックスＳＡを用いた実施例５の方法が、高質量電荷比領域のピークは、高いＳ／Ｎで、且つ、高い強度で検出された。
【００９２】
以上の結果を総括すると、マトリックス物質としてＳＡを用いた実施例５の方法で調製した試料を用いることにより、高質量電荷比領域のマススペクトルにおいて、最も高いＳ／Ｎで、且つ、高い強度でピークが検出されることが確認された。
【００９３】
非特許文献２において、最も推奨されているマトリックス物質であるＦＡを用い、且つ微生物溶液（被検微生物溶液希釈液）に予めＤＭＰを含む条件で調製した試料（別の方法４）に比べて、実施例５の方法（マトリックス物質としてＳＡを用い、且つ、マトリックス・微生物混合物の一次結晶にＤＭＰを添加する条件）で調製した試料の方が、高質量電荷比領域のピーク強度が約４倍となるような感度向上が確認された。すなわち、ＤＭＰを後から添加することにより、高質量電荷比領域のピークがより高感度に検出されることが確かめられた。
【００９４】
また、マトリックス物質としてＳＡを用いた場合に、別の方法４で調製した試料に比べて、本実施例５の方法で調製した試料は、高質量電荷比領域のピーク強度が約８倍となり、感度向上が確認された。すなわち、ＤＭＰを後から添加する実施例５の方法は、マトリックス物質ＳＡを用いた場合に、より効果的であることが確かめられた。
非特許文献２だけでなく、非特許文献１においても、微生物のＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた分析において、マトリックス物質としてＦＡを使用することが推奨されているが、上記結果より、本実施例５の方法は、ＦＡよりもＳＡを使用したときに、ＤＭＰを後から添加することによる高質量電荷比領域における感度改善の効果が大きくなることが確認された。
【実施例６】
【００９５】
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、サルモネラ・エンテリカの血清型Infantis, jfrlSe 1402-4（LB寒天培地、37℃で20時間培養）を用いた。
【００９６】
＜２．マトリックス溶液の調製＞
実施例１と同じ組成で、マトリックス溶液ＳＡ−１及びＳＡ−２を調製した。ただし、本実施例では、マトリックス溶液ＳＡ−１、ＳＡ−２に含まれるＳＡとして和光純薬工業株式会社から購入したものを用いた。
【００９７】
＜３．添加液の調製＞
５０％のＡＣＮと０．１％のＴＦＡを含む水溶液にＭＤＰＮＡを１％含むように溶解して添加液を調製した。これを「Ａ−３」とする。
【００９８】
＜４．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
【００９９】
＜５．試料の調製＞
＜５．１  実施例６の方法による試料の調製＞
(1) 被検微生物のコロニー数個分を１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、ＳＡ−２／微生物懸濁液を調製した。
(2) サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下し、乾燥させた後、その上にＳＡ−２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下した。
(3) (2) を乾燥させてマトリックス・微生物混合物の一次結晶を形成した後、その上に、添加液Ａ−３を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１００】
＜５．２  別方法による試料の調製＞
(1) 被検微生物のコロニー数個分を１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、ＳＡ−２／微生物懸濁液を調製した。
(2) サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下し、乾燥させた後、その上にＳＡ−２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下した。
(3) (2) を乾燥させた後、得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１０１】
＜６．結果＞
図１４及び図１５に、実施例６の方法及び別の方法で調製した試料について得られたマススペクトルを示す。図１４及び図１５の（Ａ）は実施例６の方法のマススペクトルを、図１４及び図１５の（Ｂ）は別の方法のマススペクトルを示す。また、図１４は質量電荷比m/z 22000〜24000の領域、図１５は質量電荷比m/z 20000〜35000の領域のマススペクトルである。
【０１０２】
図１４及び図１５に示すように、実施例６の方法で調製した試料の方が、別方法で調製した試料よりもマススペクトル上に現れるピーク強度が大きかった。特に、図１４に示す質量電荷比領域では、実施例６の方法で調製した試料の方が、別方法で調製した試料よりもマススペクトル上に現れるピーク強度、及びＳ／Ｎ比が大きく、約５倍の感度向上が確認された。
【０１０３】
質量電荷比m/z 20000〜35000の領域（特に質量電荷比m/z 22000〜24000の領域）は、サルモネラの血清型（実施例６においては、血清型Infantis, jfrlSe 1402-4）の識別に有効なマーカータンパク質の一つであるＳｏｄＡ（Superoxide dismutase）に由来するピークを含んでいる。図１４に示すマススペクトルにおいて、ＳｏｄＡに由来するピークのＳ／Ｎ比、ピーク強度を求めたところ、実施例６の方法で調製した試料では、Ｓ／Ｎ＝８、ピーク強度＝０．５ｍＶであるのに対して、別の方法で調製した試料では、Ｓ／Ｎ＝１．７、ピーク強度＝０．１ｍＶであった（図１４参照）。以上の結果より、実施例６の方法は、サルモネラの血清型の識別に有効であることが確認された。
【実施例７】
【０１０４】
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、サルモネラ・エンテリカの血清型Typhimurium, NBRC 13245（LB寒天培地、37℃で20時間培養）を用いた。
【０１０５】
＜２．マトリックス溶液の調製＞
実施例６と同じ組成で、マトリックス溶液ＳＡ−１、ＳＡ−２を調製した。
【０１０６】
＜３．添加液の調製＞
実施例６と同じ組成で添加液Ａ−３を調製した。
【０１０７】
＜４．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
【０１０８】
＜５．試料の調製＞
＜５．１  実施例７の方法による試料の調製＞
(1) 被検微生物のコロニー数個分を１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、ＳＡ−２／微生物懸濁液を調製した。
(2) サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下し、乾燥させた後、その上にＳＡ−２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下した。
(3) (2) を乾燥させてＳＡ−２／微生物混合物の一次結晶を形成した後、その上に、添加液Ａ−３を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１０９】
＜５．２  別方法による試料の調製＞
(1) 被検微生物のコロニー数個分を１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、ＳＡ−２／微生物懸濁液を調製した。
(2) サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下し、乾燥させた後、その上にＳＡ−２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下した。
(3) (2) を乾燥させた後、得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１１０】
＜６．結果＞
図１６に、実施例７の方法及び別の方法で調製した試料について得られた、質量電荷比m/z 22300〜23200の領域のマススペクトルを示す。図１６の（Ａ）は実施例７の方法のマススペクトルを、（Ｂ）は別の方法のマススペクトルを示す。
図１６に示すように、実施例７の方法の方が、別の方法よりも、ピーク強度が高くなることが分かった。
【０１１１】
また、図１６に示す領域は、サルモネラ・エンテリカの血清型の識別に有効なマーカータンパク質ＳｏｄＡのピークの質量電荷比を含む領域である。図１６に示すマススペクトルにおいて、ＳｏｄＡに由来するピークのＳ／Ｎ比、ピーク強度を求めたところ、実施例７の方法で調製した試料では、Ｓ／Ｎ＝８、ピーク強度＝０．７ｍＶであるのに対して、別の方法で調製した試料では、Ｓ／Ｎ＝３、ピーク強度＝０．３ｍＶであった（図１６参照）。以上の結果より、実施例７の方法は、サルモネラ・エンテリカの血清型の識別に有効であることが確認された。
【実施例８】
【０１１２】
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、大腸菌ＤＨ５α エレクトロセル（E. coli DH5α Electro-Cells、製品コード：TKR 9027、タカラバイオ株式会社）を用いた。大腸菌ＤＨ５α エレクトロセルは、大腸菌ＤＨ５α株を含む溶液からなるため、以下では「被検微生物溶液」という。
＜２．マトリックス溶液の調製＞
実施例１と同じ組成で、マトリックス溶液ＳＡ−２を調製した。ただし、マトリックス溶液ＳＡ−２に含まれるマトリックス物質ＳＡは、実施例３、４及び６と同様に、和光純薬工業株式会社から購入したものを用いた。
【０１１３】
＜３．添加液の調製＞
実施例６と同様の組成で添加液Ａ−３を調製した。
【０１１４】
＜４．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
【０１１５】
＜５．試料の調製＞
＜５．１  実施例８の方法による試料の調製＞
(1) まず、上述の被検微生物溶液をマトリックス溶液ＳＡ−２で５０倍希釈してマトリックス・微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、マトリックス・微生物懸濁液をそれぞれ１μＬ、サンプルプレートの各ウェルに滴下し、乾燥させてマトリックス・微生物混合物の一次結晶を形成した。
(3) さらに、サンプルプレートの各ウェルに、添加液Ａ−３を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１１６】
＜５．２  別の方法１による試料の調製＞
(1) まず、上述の被検微生物溶液をマトリックス溶液ＳＡ−２で５０倍希釈してマトリックス・微生物懸濁液を調製した。
(2) マトリックス・微生物懸濁液をそれぞれ１μＬ、サンプルプレートの各ウェルに滴下し、乾燥させた。
(3) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１１７】
＜６．結果＞
図１７に、実施例８の方法及び別の方法で調製した試料について得られた、質量電荷比m/z 15000〜50000の領域のマススペクトルを示す。図１７の（Ａ）は実施例８の方法のマススペクトルを、（Ｂ）は別の方法のマススペクトルを示す。
図１７に示すように、実施例８の方法の方が、別の方法よりも、ピーク強度が高かった。しかも、実施例８の方法で得られたマススペクトルでは、質量電荷比m/z 35000付近のピークが観測されたが、別の方法で得られたマススペクトルでは観測されなかった。このことから、実施例８の方法では、質量電荷比m/z 35000付近の高質量電荷比領域の感度が向上することが確認された。
【実施例９】
【０１１８】
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、サルモネラ・エンテリカの血清型Infantis, jfrlSe 1402-4（LB寒天培地、37℃で20時間培養）を用いた。
【０１１９】
＜２．マトリックス溶液の調製＞
実施例１と同じ組成で、マトリックス溶液ＳＡ−１、ＳＡ−２を調製した。ただし、マトリックス溶液ＳＡ−２に含まれるマトリックス物質ＳＡは、実施例３、４、６及び８と同様に、和光純薬工業株式会社から購入したものを用いた。
【０１２０】
＜３．添加液の調製＞
以下の３種類の添加液を調製した。
(1) ５０％のＡＣＮと０．１％のＴＦＡを含む水溶液を調製し、これを添加液Ａ−４とした。
(2) ５０％のＡＣＮを含む水溶液を調製し、これを添加液Ａ−５とした。
(3) 水（超純水）を準備し、これを添加液Ａ−６とした。
【０１２１】
＜４．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
【０１２２】
＜５．試料の調製＞
＜５．１  実施例９の方法による試料の調製＞
(1) まず、上述の被検微生物のコロニー数個分を１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、マトリックス・微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) さらに、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス・微生物懸濁液を１．２μＬ滴下し、乾燥させてマトリックス・微生物混合物の一次結晶を形成した。
(4) さらにまた、サンプルプレートの各ウェルに、各添加液（Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６）を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(5) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１２３】
＜５．２  別の方法による試料の調製＞
(1) まず、上述の被検微生物のコロニー数個分を１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、マトリックス・微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) さらに、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス・微生物懸濁液を１．２μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１２４】
＜６．結果＞
図１８〜図２０に、実施例９の方法及び別の方法で調製した試料について得られたマススペクトルを示す。図１８〜図２０の（Ａ）は添加液Ａ−４を用いた実施例９の方法のマススペクトルを、図１８〜図２０の（Ｂ）は添加液Ａ−５を用いた実施例９の方法のマススペクトルを、図１８〜図２０の（Ｃ）は添加液Ａ−６を用いた実施例９の方法のマススペクトルを、図１８〜図２０の（Ｄ）は別の方法のマススペクトルを示す。また、図１８は質量電荷比m/z 20000〜40000の領域、図１９は質量電荷比m/z 20000〜34000の領域、図２０は質量電荷比m/z 37000〜90000の領域のマススペクトルである。
【０１２５】
図１８〜図２０に示すように、いずれの質量電荷比領域においても、実施例９の方法で調製した試料の方が、別の方法で調製した試料よりもマススペクトル上に現れるピーク強度が大きかった。特に、添加液としてＡ−４、Ａ−５を用いた場合は、背景ノイズが低く抑えられ、ピークが高感度に検出されることが確認された。
【実施例１０】
【０１２６】
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、大腸菌ＤＨ５α エレクトロセル（E. coli DH5α Electro-Cells、製品コード：TKR 9027、タカラバイオ株式会社）を用いた。大腸菌ＤＨ５α エレクトロセルは、大腸菌ＤＨ５α株を含む溶液からなるため、以下では「被検微生物溶液」という。
【０１２７】
＜２．マトリックス溶液の調製＞
実施例１と同じ組成で、マトリックス溶液ＳＡ−２を調製した。ただし、マトリックス溶液ＳＡ−２に含まれるマトリックス物質ＳＡは、実施例３、４、６、８及び９と同様に、和光純薬工業株式会社から購入したものを用いた。
【０１２８】
＜３．添加液の調製＞
以下の２種類の添加液を調製した。
(1) 実施例９と同じ組成で添加液Ａ−４を調整した。
(2) 水を準備し、これを添加液Ａ−６とした。
【０１２９】
＜４．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
【０１３０】
＜５．試料の調製＞
＜５．１  実施例１０の方法による試料の調製＞
(1) まず、上述の被検微生物溶液をマトリックス溶液ＳＡ−２で５０倍希釈してマトリックス・微生物混合溶液を調製した。
(2) 次に、マトリックス・微生物混合溶液を１μＬ、サンプルプレートの各ウェルに滴下し、乾燥させてマトリックス・微生物混合物の一次結晶を形成した。
(3) さらに、サンプルプレートの各ウェルに、各添加液（Ａ−４、Ａ−６）を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１３１】
＜５．２  別の方法１による試料の調製＞
(1) まず、上述の被検微生物溶液をマトリックス溶液ＳＡ−２で５０倍希釈してマトリックス・微生物懸濁液を調製した。
(2) マトリックス・微生物懸濁液をそれぞれ１μＬ、サンプルプレートの各ウェルに滴下し、乾燥させた。
(3) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１３２】
＜６．結果＞
図２１に、実施例１０の方法及び別の方法で調製した試料について得られた、質量電荷比m/z 20000〜50000の領域のマススペクトルを示す。図２１の（Ａ）及び（Ｂ）は実施例１０の方法のマススペクトルを、（Ｃ）は別の方法のマススペクトルを示す。
【０１３３】
図２１に示すように、実施例１０の方法では、別の方法に比べて、ピーク強度が高くなった。特に、添加液としてＡ−４を用いた場合（Ａ）は、質量電荷比m/z 40000〜45000付近のピークが観測されたが、添加剤としてＡ−６を用いた実施例１０の方法、及び別の方法で得られたマススペクトル（Ｂ及びＣ）では観測されなかった。
【実施例１１】
【０１３４】
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、枯草菌（B. subtilis）を用いた。本実施例では、冷凍保存されている枯草菌を含むエタノール溶液からエタノールを乾固した後、２５％ギ酸を２０μＬ加え、被検微生物溶液を作成した。
【０１３５】
＜２．マトリックス溶液の調製＞
実施例１と同じ組成でマトリックス溶液ＳＡ−２を調製した。ただし、マトリックス溶液ＳＡ−２に含まれるマトリックス物質ＳＡは、実施例３、４、６、８、９および１０と同様に、和光純薬工業株式会社から購入したものを用いた。
【０１３６】
＜３．添加液の調製＞
実施例９と同じ組成で添加液Ａ−４を調製した。
【０１３７】
＜４．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
【０１３８】
＜５．試料の調製＞
＜５．１  実施例１１の方法による試料の調製＞
(1) まず、サンプルプレートの各ウェルに上述の被検微生物溶液を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルに、さらにマトリックス溶液ＳＡ−２を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェルに、さらに添加液Ａ−４を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１３９】
＜５．２  別の方法による試料の調製＞
(1) まず、サンプルプレートの各ウェルに上述の被検微生物溶液を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルに、さらにマトリックス溶液ＳＡ−２を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１４０】
＜６．結果＞
図２２に、実施例１１の方法及び別の方法で調製した試料について得られた、質量電荷比m/z 12000〜25000の領域のマススペクトルを示す。図２２の（Ａ）は実施例１１の方法のマススペクトルを、（Ｂ）は別の方法のマススペクトルを示す。
【０１４１】
図２２に示すように、実施例１１の方法では、別の方法に比べて、ピーク強度が高く、高質量電荷比領域での感度向上が確認された。
【実施例１２】
【０１４２】
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、サルモネラ・エンテリカの血清型Typhimurium, NBRC 13245（LB寒天培地、37℃で20時間培養）を用いた。
【０１４３】
＜２．マトリックス溶液の調製＞
実施例１と同じ組成で、マトリックス溶液ＳＡ−１、ＳＡ−２を調製した。
【０１４４】
＜３．添加液の調製＞
実施例９と同じ組成で添加液Ａ−４を調製した。
【０１４５】
＜４．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
【０１４６】
＜５．試料の調製＞
＜５．１  実施例１２の方法による試料の調製＞
本実施例では、以下の３種類の方法で試料を調製した。
＜方法１＞
(1) まず、上述の被検微生物のコロニー数個分を１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、ＳＡ−２／微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) さらに、サンプルプレートの各ウェルにＳＡ−２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) さらにまた、サンプルプレートの各ウェルに、添加液Ａ−４を１．２μＬ滴下し、乾燥させた。
(5) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１４７】
＜方法２＞
(1) まず、上述の被検微生物数個分を１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、ＳＡ−２／微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) さらに、サンプルプレートの各ウェルにＳＡ−２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) さらにまた、サンプルプレートの各ウェルに、添加液Ａ−４を１．２μＬ滴下し、乾燥させた後、再度、サンプルプレートの各ウェルに、添加液Ａ−４を１．２μＬ滴下し、乾燥させた。
(5) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１４８】
＜方法３＞
(1) まず、上述の被検微生物のコロニー数個分を１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、ＳＡ−２／微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) さらに、サンプルプレートの各ウェルにＳＡ−２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) さらにまた、サンプルプレートの各ウェルに、添加液Ａ−４を１．２μＬ滴下し、乾燥させた後、再度、サンプルプレートの各ウェルに、添加液Ａ−４を１．２μＬ滴下し、乾燥させ、さらに再び、サンプルプレートの各ウェルに、添加液Ａ−４を１．２μＬ滴下し、乾燥させた。
(5) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１４９】
＜５．２  別の方法による試料の調製＞
(1) まず、上述の被検微生物数個分を１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、ＳＡ−２／微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下し、乾燥させた。
(3) 次に、サンプルプレートの各ウェルに、上述のＳＡ−２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) 得られたマトリックス・微生物混合結晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料とした。
【０１５０】
＜６．結果＞
図２３に、別の方法で得られたマススペクトル（Ａ）、実施例１２の方法１で得られたマススペクトル（Ｂ）、方法２で得られたマススペクトル（Ｃ）、方法３で得られたマススペクトル（Ｄ）の、高質量電荷比領域（m/z 22000〜24000）におけるＳｏｄＡ由来ピークの検出状況を示す（n=4)。各マススペクトルの横に、ＳｏｄＡ由来ピークのピーク強度（mV）およびＳ／Ｎ比の値を示す。
図２３より、添加液を添加した場合（Ｂ〜Ｄ）は、添加液を添加しなかった場合（Ａ）に比べてＳｏｄＡ由来ピークが高いＳ／Ｎ比で高く検出された。特に、添加液を１回添加した場合に比べて、２回あるいは３回添加した場合の方が（つまり、再結晶化する操作を１回行うよりも２回あるいは３回行う方が）、高いＳ／Ｎ比で検出されることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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