(57)【要約】      （修正有）【課題】種子のサイズが増大した植物の製造方法を提供する。【解決手段】これまで粒形に関与するとの報告が無い新規遺伝子であり、Ｌｏｎｇ  Ｇｒａｉｎ１（ＬＩＮ１）と命名した遺伝子〈ＬＩＮ１遺伝子〉の機能を抑制することによって、植物の種子のサイズが増大する方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子のサイズが増大した植物の製造方法であって、
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、方法
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９．１１、１３、１５、１７、１９及び２１のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子
（ｄ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能が人為的に抑制されており、種子のサイズが増大した植物。
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９．１１、１３、１５、１７、１９及び２１のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子
（ｄ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の植物の種子。
【請求項４】
植物において種子のサイズが増大するか否かを判定する方法であって、被検植物における下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列を解析することを特徴とする方法
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９．１１、１３、１５、１７、１９及び２１のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子
（ｄ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
【請求項５】
植物において種子のサイズが増大するか否かを判定する方法であって、被検植物における下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする方法
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ））配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９．１１、１３、１５、１７、１９及び２１のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子
（ｄ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
【請求項６】
種子のサイズが増大した植物を育種する方法であって、
（ａ）種子のサイズが増大した植物と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体の中から、請求項４又は５に記載の方法により、種子のサイズが増大すると判定された植物を選抜する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子のサイズが増大した植物の製造方法に関する。また、本発明は、該方法によって製造された植物及びその種子に関する。さらに、本発明は、植物において種子のサイズが増大するか否かを判定する方法、及びそれを利用した種子のサイズが増大した植物の育種方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療等の科学技術の発展により、人口増加が地球規模で進行しており、それに伴い、コメやコムギといった穀物に対する需要が世界規模にて急激に増大している。さらに、地球温暖化対策としてバイオ燃料が注目されており、食料としてのみならず、その原料としての需要も、穀物に関して急速に拡大している。
【０００３】
その一方で、地球上の土地、水等は限られている。また地球温暖化や気候変動に伴い、穀物等の生産量を増加させることは困難となっている。そのため、このような限られた資源及び植物の生育に適しない環境下で、単位面積又は植物一個体あたりの収穫量を増大させることが希求されている。
【０００４】
植物において、種子のサイズは収穫量の増大に密接に関与している重要な形質である。そのため、種子サイズの増大に関与する遺伝子の解明及び利用は、前述の多収品種の同定及び作出を可能にするものと期待できる。
【０００５】
イネにおいて突然変異が生じることで種子のサイズが増大する遺伝子がいくつか報告されている。ＧＳ３は膜貫通領域を持つタンパク質をコードする遺伝子であり、またＴＧＷ６はインドール酢酸ーグルコース加水分解酵素をコードする遺伝子であり、これら遺伝子において突然変異が生じると種子が長くなることが報告されている。また、ＧＷ２はＥ３ユビキチンリガーゼ活性をもつＲＩＮＧ型タンパク質をコードする遺伝子であり、ｑＳＷ５／ＧＷ５は核局在するタンパク質をコードする遺伝子であり、これら遺伝子において突然変異が生じると種子の幅が増加することが報告されている（非特許文献１〜４）。これらの報告は、イネにおいて種子のサイズを抑制する遺伝子が存在することを示すものであり、これまで単離された４つの遺伝子は、いずれも粒形の異なる既存品種同士の交配後代を用いたＱＴＬ解析により同定されている。
【０００６】
しかしながら、例えば、ｑＳＷ５／ＧＷ５については、日本晴、コシヒカリ、ササニシキ、あそみのりにおいて既に変異型となっており、日本型イネ品種ではｑＳＷ５／ＧＷ５遺伝子を利用して種子のサイズを増大することは不可能であると考えられる。このように、既存品種から同定された遺伝子では、野生型の種子サイズをさらに増大させることが難しいことが想定され、種子サイズの調整に関与する新たな遺伝子の同定が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃ．Ｆａｎら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１２，１１６４（２００６）
【非特許文献２】Ｋ．Ｉｓｈｉｍａｒｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．４５，７０７（２０１３）
【非特許文献３】ＸＪ．Ｓｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９，６２３（２００７）
【非特許文献４】Ｊ．Ｗｅｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８，１１９９（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、種子サイズの調整に関与する遺伝子を新たに同定し、該遺伝子を標的とした、種子のサイズが増大した植物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、種子サイズの調整に関与する遺伝子を同定することを試みた。先ず、突然変異体作出の目的で、イネ品種日本晴の種子に変異原としてアルゴンイオンビームを照射し突然変異を誘発した。照射した種子を発芽させ水田で栽培し、自殖種子を採取した。自殖後代（Ｍ２）を水田で栽培し、種子のサイズが増大化（主として種子が長粒化した）変異体を達観で選抜した。翌年以降、変異体の自殖後代個体を用いて長粒形質の遺伝と固定を確認し、単位面積当たりの収量調査を実施した。また、変異体の全ゲノムリシーケンス解析を実施し、アルゴンイオンビーム照射により生じた突然変異を検出した。さらに変異体と原品種である日本晴を交配してＦ２集団を作成し、連鎖解析により種子のサイズが増大化する形質に関与する遺伝子を同定することに成功した。なお、同定した遺伝子は、これまで粒形に関与するとの報告が無い新規遺伝子であり、Ｌｏｎｇ  Ｇｒａｉｎ１（ＬＩＮ１）と称することにした。
【００１０】
さらに、このＬＩＮ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を構築し、それを導入することによる種子サイズへの影響を評価した。その結果、ＬＩＮ１遺伝子の機能をゲノム編集により抑制することによっても、種子のサイズが顕著に増大することを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の方法は以下に関する。
＜１＞  種子のサイズが増大した植物の製造方法であって、
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、方法
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９．１１、１３、１５、１７、１９及び２１のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子
（ｄ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
＜２＞  下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能が人為的に抑制されており、種子のサイズが増大した植物。
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９．１１、１３、１５、１７、１９及び２１のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子
（ｄ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
＜３＞  ＜２＞に記載の植物の種子。
＜４＞  植物において種子のサイズが増大するか否かを判定する方法であって、被検植物における下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列を解析することを特徴とする方法
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９．１１、１３、１５、１７、１９及び２１のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子
（ｄ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
＜５＞  植物において種子のサイズが増大するか否かを判定する方法であって、被検植物における下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする方法
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ））配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９．１１、１３、１５、１７、１９及び２１のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子
（ｄ）配列番号：２、４、６、８、１０．１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
＜６＞  種子のサイズが増大した植物を育種する方法であって、
（ａ）種子のサイズが増大した植物と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体の中から、＜４＞又は＜５＞に記載の方法により、種子のサイズが増大すると判定された植物を選抜する工程、を含む方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＬＩＮ１遺伝子の機能を人為的に抑制することにより、種子のサイズが増大した植物、ひいては単位面積又は一個体あたりの収穫量が増大した植物を提供することが可能となる。また、ＬＩＮ１遺伝子の機能抑制の有無を指標として、種子のサイズが増大した植物であるか否かを判定することもできる。
【００１３】
さらに、ＬＩＮ１遺伝子は本発明者らが今回新たに見出した遺伝子である。そのため、種子のサイズに関与する既知遺伝子が既に変異している品種に対しても、ＬＩＮ１遺伝子を利用することができ、種子サイズの更なる大型化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】イネ（Ｏｒｙｚａ＿ｓａｔｉｖａ）由来のＬＩＮ１遺伝子がコードするアミノ酸配列（１〜１３６位）と各植物由来のＬＩＮ１遺伝子がコードするアミノ酸配列のアライメントを示す図である。なお、図中「Ｇｌｙｃｉｎｅ＿ｍａｘ」はダイズ由来の配列を示し、「Ｃｉｃｅｒ＿ａｒｉｅｎｔｉｎｕｍ」はヒヨコマメ由来の配列を示し、「Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ＿ｃａｃａｏ」はカカオ由来の配列を示し、「Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ＿ａｎｎｕｕｓ」はヒマワリ由来の配列を示し、「Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ＿ｔｈａｌｉａｎａ」はシロイヌナズナ由来の配列を示し、「Ｂｒａｓｓｉｃａ＿ｒａｐａ」はアブラナ由来の配列を示し、「Ｓｏｒｇｈｕｍ＿ｂｉｃｏｌｏｒ」はソルガム由来の配列を示し、「Ｚｅａ＿ｍａｙｓ」はトウモロコシ由来の配列を示し、「Ｈｏｒｄｅｕｍ＿ｖｕｌｇａｒｅ」はオオムギ由来の配列を示し、「Ｔｒｉｔｉｃｕｍ＿ａｅｓｔｉｖｕｍ」はコムギ由来の配列を示す（図中の表記は、図２及び３においても同様である）。
【図２】イネ由来のＬＩＮ１遺伝子がコードするアミノ酸配列（１３７〜２９６位）と各植物由来のＬＩＮ１遺伝子がコードするアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図３】イネ由来のＬＩＮ１遺伝子がコードするアミノ酸配列（２９７〜４１２位）と各植物由来のＬＩＮ１遺伝子がコードするアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図４】アルゴンイオンビームを照射することにより作成した突然変異体（系統名：Ａｒ５−７６）の変異ホモ型及びヘテロ型、並びに野生型（野生ホモ型）における種子長を比較した結果を示す、グラフである。図中、エラーバーは標準偏差を示す。
【図５】野生型（日本晴）、Ａｒ５−７６及びＬＩＮ１遺伝子にゲノム編集を施した形質転換体（♯１）における種子長を比較した結果を示す、グラフである。図中、エラーバーは標準偏差を示す。「＊＊＊」及び「Ｎ．Ｓ．」は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって解析した結果、前者はＰ＜０．００１であり、有意差が認められたことを示し、後者は有意差が認められなかったことを示す。なお、図中の表記は、図６においても同様である
【図６】野生型（日本晴）、Ａｒ５−７６及びＬＩＮ１遺伝子にゲノム編集を施した形質転換体（♯２）における種子長を比較した結果を示す、グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜種子のサイズが増大した植物の製造方法＞
後述の実施例において示すとおり、ＬＩＮ１遺伝子の機能を抑制することによって、植物の種子のサイズが増大することが明らかになった。したがって、本発明の種子のサイズが増大した植物の製造方法は、ＬＩＮ１遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明において種子サイズ増大の対象となる「植物」としては、後述のＬＩＮ１遺伝子を有する植物であれば特に制限はなく、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、トウモロコシ等のイネ科植物、ダイズ、ヒヨコマメ等のマメ科植物、シロイヌナズナ、アブラナ等のアブラナ科植物、ヒマワリ等のヒマワリ科植物、カカオ等のアオイ科植物が挙げられる。
【００１７】
「種子」は、種皮に包まれている、有性生殖によって形成される散布体を意味し、「種子のサイズ」は、種子の長さ、幅及び厚さのうちの少なくとも１のパラメーターを意味する。また、例えば、種子が楕円形又は略楕円形である場合には、長さとは長径を意味し、幅とは短径を意味する。さらに、本発明において、「種子のサイズが増大した」とは、コントロールの植物と比較して、種子における前記少なくとも１のパラメーター（例えば、１個体から得られる種子長の平均値）が有意に増大していることが意味する。さらに、コントロールの植物とは、内在性の後述のＬＩＮ１遺伝子の機能が人為的に抑制されていない植物（例えば、野生型の植物）を意味する。
【００１８】
本発明において機能抑制の対象となる「ＬＩＮ１遺伝子」として、イネ（日本晴）由来のものであれば、典型的に配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：１に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子）が挙げられる。
【００１９】
コムギ由来のＬＩＮ１遺伝子としては、典型的に配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：３に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子）が挙げられる。
【００２０】
オオムギ由来のＬＩＮ１遺伝子としては、典型的に配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：５に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子）が挙げられる。
【００２１】
ソルガム由来のＬＩＮ１遺伝子としては、典型的に配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：７に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子）が挙げられる。
【００２２】
トウモロコシ由来のＬＩＮ１遺伝子としては、典型的に配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：９に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子）が挙げられる。
【００２３】
ダイズ由来のＬＩＮ１遺伝子としては、典型的に配列番号：１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：１１に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子）が挙げられる。
【００２４】
ヒヨコマメ由来のＬＩＮ１遺伝子としては、典型的に配列番号：１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：１３に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子）が挙げられる。
【００２５】
シロイヌナズナ由来のＬＩＮ１遺伝子としては、典型的に配列番号：１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子）が挙げられる。
【００２６】
アブラナ由来のＬＩＮ１遺伝子としては、典型的に配列番号：１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：１７に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子）が挙げられる。
【００２７】
ヒマワリ由来のＬＩＮ１遺伝子としては、典型的に配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：１９に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子）が挙げられる。
【００２８】
カカオ由来のＬＩＮ１遺伝子としては、典型的に配列番号：２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：２１に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子）が挙げられる。
【００２９】
また、自然界においてもヌクレオチド配列が変異することは起こり得ることである。そして、それに伴いコードするアミノ酸も変化し得る。したがって、本発明のＬＩＮ１遺伝子には、種子サイズの増大を抑制する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで「複数」とは、通常、５０アミノ酸以内、好ましくは４０アミノ酸以内、より好ましくは３０アミノ酸以内、さらに好ましくは２０アミノ酸以内、より好ましくは１０アミノ酸以内、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内）である。
【００３０】
さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の遺伝子が得られた場合、その遺伝子のヌクレオチド配列情報を利用して、同種若しくは他の植物から、その相同遺伝子を同定することが可能である。相同遺伝子を同定するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７−４９１，１９８８）が挙げられる。相同遺伝子を同定するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件又はこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ  尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用いれば、より相同性の高い遺伝子の単離を期待することができる。本発明のＬＩＮ１遺伝子には、種子サイズの増大を抑制する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子が含まれる。
【００３１】
同定された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、前記特定の遺伝子がコードするそれと高い相同性（高い類似性）、好ましくは高い同一性を有する。ここで「高い」とは、少なくとも３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上（例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）のことである。本発明のＬＩＮ１遺伝子には、種子サイズの増大を抑制する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と３０％以上の相同性（類似性）又は同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が含まれる。
【００３２】
なお、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対する配列番号：４に記載のそれの類似性は４１．９％（同一性は３７．０％）である。配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対する配列番号：６に記載のそれの類似性は７３．４％（同一性は６８．４％）である。配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対する配列番号：８に記載のそれの類似性は７８．３％（同一性は７３．７％）である。配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対する配列番号：１０に記載のそれの類似性は８１．５％（同一性は７６．２％）である。配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対する配列番号：１２に記載のそれの類似性は４７．０％（同一性は３９．０％）である。配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対する配列番号：１４に記載のそれの類似性は４６．３％（同一性は３６．２％）である。配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対する配列番号：１６に記載のそれの類似性は４４．４％（同一性は３４．２％）である。配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対する配列番号：１８に記載のそれの類似性は４３．５％（同一性は３４．０％）である。配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対する配列番号：２０に記載のそれの類似性は４８．７％（同一性は３３．８％）である。配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対する配列番号：２２に記載のそれの類似性は５２．２％（同一性は３９．１％）である。
【００３３】
配列の相同性は、ＢＬＡＳＴのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。例えば、ＢＬＡＳＴによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００３４】
上述の本発明のＬＩＮ１遺伝子がコードするタンパク質が種子サイズの増大を抑制する活性を有するか否かは、例えば、後述の実施例に記載するように、当該遺伝子の機能を抑制することにより、作出した植物の種子サイズが増大しているか否かを検定することにより判定することができる。
【００３５】
本発明の「ＬＩＮ１遺伝子の機能の人為的抑制」には、該機能の完全な抑制（阻害）及び部分的な抑制の双方が含まれる。また、ＬＩＮ１遺伝子の発現の人為的抑制の他、ＬＩＮ１遺伝子がコードするタンパク質の活性の人為的抑制が含まれる。そして、かかる人為的抑制は、例えば、後述の実施例において示すとおり、ＬＩＮ１遺伝子のコード領域、非コード領域、転写制御領域（プロモーター領域）等に変異を導入することによって行なうことができる。
【００３６】
本発明において、ＬＩＮ１遺伝子に導入される変異としては、該遺伝子の機能を抑制する限り特に制限はなく、例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、及び／又は挿入が挙げられるが、ナンセンス変異、フレームシフト変異、ヌル変異が好ましい。また、ＬＩＮ１遺伝子に導入される変異の個数としても、該遺伝子の機能を抑制する限り特に制限はなく、１個でもよく、また複数個（例えば、２個、３個以下、５個以下、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下）でもよい。
【００３７】
このような変異としては、例えば、後述の実施例に示すような、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列の５４０位又は該部位に対応するヌクレオチドが欠失する変異、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列の２１４位及び２１５位の間又は該部位に対応するヌクレオチド間に１ヌクレオチドが挿入される変異が挙げられる。また、これら変異により、前者においては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１８１位及び該部位に対応するアミノ酸以降のアミノ酸が異なり、また欠失することとなる。後者においては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７２位及び該部位に対応するアミノ酸以降のアミノ酸が異なり、また欠失することとなる。そして、このような欠失により、ＬＩＮ１遺伝子の機能は抑制され、種子のサイズが増大した植物を得ることができる。
【００３８】
したがって、ＬＩＮ１遺伝子に導入される変異としては、当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列全部を失わせる必要はなく、その一部が失われるか変化するように当該遺伝子内に導入されてもよい。
【００３９】
なお、遺伝子の変異により発現するタンパク質の一部が欠失する場合、通常、全体の２０％以上が欠失していればよく、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上）欠失していればよい。
【００４０】
また、このような一部を欠失させるような変異において、図１〜３に示す、各種ＬＩＮ１遺伝子がコードするアミノ酸配列のアライメントにおいて保存性の高い領域、すなわちＬＩＮ１遺伝子がコードするタンパク質の活性を奏する上で重要であると想定される領域を欠失させるような変異が挙げられる。例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の６３位及び該部位に対応するアミノ酸以降のアミノ酸が異なり、また欠失するような変異、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１４１位及び該部位に対応するアミノ酸以降のアミノ酸が異なり、また欠失するような変異、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の３０６位及び該部位に対応するアミノ酸以降のアミノ酸が異なり、また欠失するような変異が挙げられる。
【００４１】
ＬＩＮ１遺伝子への変異の導入は、当業者であれば公知の変異導入方法により達成することができる。かかる公知の方法としては、ゲノム編集法、物理的変異導入法、化学的変異剤を用いる方法、トランスポゾン等をゲノムＤＮＡに導入する方法が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４２】
ゲノム編集法は、部位特異的なヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９等のＤＮＡ二本鎖切断酵素）を利用して、標的遺伝子を改変する方法である。例えば、ＺＦＮｓ（米国特許６２６５１９６号、８５２４５００号、７８８８１２１号、欧州特許１７２０９９５号）、ＴＡＬＥＮｓ（米国特許８４７０９７３号、米国特許８５８６３６３号）、ヌクレアーゼドメインが融合されたＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５３：１１７１−１１７９（２０１２））等の融合タンパク質や、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（米国特許８６９７３５９号、国際公開２０１３／１７６７７２号）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：７５９−７１，（２０１５））やＴａｒｇｅｔ−ＡＩＤ（Ｋ．Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９，（２０１６））等のガイドＲＮＡとタンパク質の複合体を用いる方法が挙げられる。
【００４３】
物理的変異導入法としては、例えば、重イオンビーム（ＨＩＢ）照射、速中性子線照射、ガンマ線照射、紫外線照射が挙げられる（Ｈａｙａｓｈｉら、Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２００７年、第１８回国際会議、２３７〜２３９ページ、及び、Ｋａｚａｍａら、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００８年、２５巻、１１３〜１１７ページ参照のこと）。
【００４４】
化学的変異剤を用いる方法としては、例えば、化学変異剤によって種子等を処理する方法（Ｚｗａｒ及びＣｈａｎｄｌｅｒ、Ｐｌａｎｔａ、１９９５年、１９７巻、３９〜４８ページ等  参照）が挙げられる。化学変異剤としては特に制限はないが、エチルメタンスルホート（ＥＭＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）、アジ化ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドリキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、蟻酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる。
【００４５】
トランスポゾン等をゲノムＤＮＡに導入する方法としては、例えば、ＴＯＳ１７等のトランスポゾン、Ｔ−ＤＮＡ等を植物のゲノムＤＮＡに挿入する方法が挙げられる（Ｋｕｍａｒら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、２００１年、６巻、３号、１２７〜１３４ページ、及び、Ｔａｍａｒａら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、４巻、３号、９０〜９６ページ  参照）。
【００４６】
以上の方法により変異が導入された植物については、公知の方法により、ＬＩＮ１遺伝子に変異が導入されていることを確認することができる。かかる公知の方法としては、例えば、ＤＮＡシークエンス法（次世代シークエンシング法等）、ＰＣＲ法、マイクロアレイを用いた解析法、サザンブロット法、ノーザンブロット法が挙げられる。かかる方法によれば、ＬＩＮ１遺伝子に変異が導入されているか否かを、変異導入前後の当該遺伝子の配列又は長さを比較することによって判断することができる。また、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、マイクロアレイによる解析法等を利用することにより、転写制御領域等に変異が導入された植物において、ＬＩＮ１遺伝子の転写産物又は翻訳産物の発現量の低下が認められれば、該植物はＬＩＮ１遺伝子に変異が導入された植物であると確認することもできる。
【００４７】
また、ＬＩＮ１遺伝子に変異が導入されていることを確認する他の方法として、ＴＩＬＬＩＮＧ（標的誘導型ゲノム特定位傷害、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）が挙げられる（Ｓｌａｄｅら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．、２００５年、１４巻、１０９〜１１５ページ、及び、Ｃｏｍａｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、２００４年、３７巻、７７８〜７８６ページ  参照）。特に、前述の重イオンビーム照射や化学的変異剤等を用いて植物ゲノム中に非選択的変異を導入した場合には、ＬＩＮ１遺伝子又はその一部をＰＣＲで増幅した後に、該増幅産物に変異を有する個体を、前記ＴＩＬＬＩＮＧ等により選抜することができる。この場合にも、ＬＩＮ１遺伝子のヌル変異体を有する植物を得ることができる。
【００４８】
また、上述の方法により変異が導入された植物と野生型の植物とを交配させ、戻し交配を行うことにより、ＬＩＮ１遺伝子以外の遺伝子に導入された変異を除去することもできる。
【００４９】
ＬＩＮ１遺伝子に変異を導入することにより当該遺伝子の機能が抑制された植物が、ＬＩＮ１遺伝子のヘテロ接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）である場合がある。そのような場合、例えば、当該ヘテロ接合体とコントロール植物とを交配して得られるＦ１植物体同士を交配してＦ２植物体を得ることにより、当該Ｆ２植物体から当該変異が導入されたＬＩＮ１遺伝子を有するホモ接合体（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）を選抜することができる。後述の実施例に示すとおり、ヘテロ接合体に比べより種子のサイズが増大し、またＬＩＮ１遺伝子内の変異による当該遺伝子機能の抑制効果がより安定的に維持されるという観点から、ホモ接合体であることが好ましい。この場合、「当該変異が導入されたＬＩＮ１遺伝子を有するホモ接合体である植物」には、互いに同一である変異を有するＬＩＮ１対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）を２つ有する植物だけでなく、第１の変異を有し活性が抑制されたタンパク質をコードする第１のＬＩＮ１対立遺伝子と、第２の変異を有し活性が抑制されたタンパク質をコードする第２のＬＩＮ１対立遺伝子とを有する植物が含まれる。
【００５０】
本発明において、ＬＩＮ１遺伝子の機能を人為的に抑制するため方法として、上述の変異導入の他、ＬＩＮ１遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ）をコードするＤＮＡを用いる方法、ＬＩＮ１遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）を用いる方法、ＬＩＮ１遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ用いる方法（リボザイム法）といった、ＬＩＮ１遺伝子の転写産物を標的とする方法も挙げられる。
【００５１】
本発明において、ＬＩＮ１遺伝子機能の人為的な抑制は、上述の方法等に応じ、種々の植物体、種子又は植物細胞に対して行うことができる。植物細胞には、植物由来の培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物由来の細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。
【００５２】
また、本発明において、上述の、部位特異的ヌクレアーゼ、融合タンパク質又はガイドＲＮＡとタンパク質の複合体をコードするＤＮＡ、トランスポゾンをコードするＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ等を、ベクターに挿入した形態にて植物の細胞に導入してもよい。
【００５３】
ＬＩＮ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための前記ＤＮＡが挿入されるベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はないが、前記ＤＮＡを恒常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター等が挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。さらに、本発明にかかるＤＮＡとしてｓｉＲＮＡ等の短いＲＮＡをコードするＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、ｐｏｌIII系のプロモーターが好適に用いられる。
【００５４】
植物細胞へ前記ＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されたベクター等を導入する方法としては、例えば、パーティクルガン法、アグロバクテリウムを介する方法（アグロバクテリウム法）、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００５５】
なお、ＤＮＡの形態をとらずとも、上述の、部位特異的ヌクレアーゼ、融合タンパク質、トランスポゾンは、タンパク質として、上述の、ガイドＲＮＡ、二重鎖ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡは、ＲＮＡとして、植物細胞に導入しても、変異を導入することはできる。
【００５６】
また、上述の方法等により遺伝子の機能が人為的に抑制された植物細胞から植物体を再生することにより、種子のサイズが増大した植物を得ることができる。
【００５７】
例えば、イネにおいて、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｅｄｓ．）ｐｐ６６−７４，１９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００，１５０３−１５０７，１９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７−９６２，１９９１）及びアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１−２８２，１９９４）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。
【００５８】
また、ムギに関する形質転換植物体を作出する手法としては、Ｔｉｎｇａｙら（Ｔｉｎｇａｙ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１：１３６９−１３７６，１９９７）、Ｍｕｒｒａｙら（Ｍｕｒｒａｙ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２２：３９７−４０２，２００４）、およびＴｒａｖａｌｌａら（Ｔｒａｖａｌｌａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２３：７８０−７８９，２００５）に記載された方法を挙げることができる。
【００５９】
ソルガム植物体を再生させる方法としては、例えば、アグロバクテリウム法やパーティクルガン法により、未熟胚やカルスに遺伝子導入して植物体を再生させる方法、超音波によって遺伝子導入した花粉を用いて受粉する方法が好適に用いられる（Ｊ．Ａ．Ａｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７：３４１−３４８，２００１、Ａ．Ｍ．Ｃａｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１２１２−１１２１６，１９９３、Ｖ．Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２４：５１３−５２２，２００５、Ｊ．Ｍ．ＪＥＯＵＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ  １３７：２０−２８，２００２、Ｖ  Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２４（９）：５１３−５２２，２００５、Ｚｕｏ−ｙｕ  Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４４：７８９−７９８，２０００、Ｓ．Ｇｕｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２８（３）：４２９−４４４，２００９、ＺＹ  Ｚｈａｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ３４３：２３３−２４４，２００６、ＡＫ  Ｓｈｒａｗａｔ  ａｎｄ  Ｈ  Ｌｏｒｚ，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ，４（６）：５７５−６０３，２００６、Ｄ  Ｓｙａｍａｌａ  ａｎｄ  Ｐ  Ｄｅｖｉ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ，４１（１２）：１４８２−１４８６，２００３、Ｚ  Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ，３（６）：５９１−５９９，２００５）。
【００６０】
さらに、シロイヌナズナであれば、Ａｋａｍａら（Ａｋａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：７−１１，１９９２）の方法が挙げられ、本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００６１】
また、その他の植物であっても、Ｔａｂｅｉら（田部井豊  編、「形質転換プロトコール［植物編］」、株式会社化学同人、２０１２年９月２０日出版）に記載に方法を用い、形質転換及び植物体への再生を行なうことができる。
【００６２】
また、上述の方法等により、一旦、ＬＩＮ１遺伝子の機能が人為的に抑制されている植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。さらに、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。したがって本発明には、前記種子のサイズが増大した植物の子孫及びクローン、並びに、それらの繁殖材料が含まれる。
【００６３】
以上、本発明のＬＩＮ１遺伝子機能の人為的抑制に関する好適な実施形態について説明したが、本発明の機能抑制方法は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、ＬＩＮ１遺伝子の発現を抑制する低分子化合物、又は当該遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制する低分子化合物の存在下にて、植物を生育させる方法が挙げられる。かかる低分子化合物としては、特に制限はないが、例えば、ケミカルライブラリーを対象とし、植物細胞におけるＬＩＮ１遺伝子の発現を指標としてスクリーニングを行なうことにより、選抜された化合物であってもよく、またＬＩＮ１遺伝子がコードするタンパク質の立体構造を基とし、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのデザインを基に合成した低分子化合物であってもよい。
【００６４】
＜種子のサイズが増大するか否かを判定する方法＞
本発明の、種子サイズが増大するか否かを判定する方法は、被検植物における、ＬＩＮ１遺伝子、又はその発現制御領域のヌクレオチド配列を解析することを特徴とする。なお、本発明の判定方法において検出対象となるＬＩＮ１遺伝子は、上述の通りである。
【００６５】
後述の実施例において示すように、ＬＩＮ１遺伝子において、ヌクレオチドの挿入や欠失が導入されることにより、、又は、ＬＩＮ１遺伝子が欠失することで、種子のサイズは増大することとなる。したがって、ＬＩＮ１遺伝子領域のヌクレオチド配列を解析することによって、種子のサイズが増大するか否かを判定することができる。
【００６６】
また、後述の実施例において示すように、種子サイズの増大は不完全優性に遺伝することから、ＬＩＮ１遺伝子の発現量、並びにその発現量を制御する領域（エンハンサー、プロモータ−、サイレンサー、インスレーター）のヌクレオチド配列を解析することによって、種子のサイズが増大するか否かを判定することもできる。
【００６７】
ＬＩＮ１遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列の解析に際しては、本発明のＬＩＮ１遺伝子又はその発現制御領域をＰＣＲにより増幅した増幅産物を用いることができる。前記ＰＣＲを実施する場合において、用いられるプライマーは、ＬＩＮ１遺伝子又はその発現制御領域を特異的に増幅できるものである限り制限はなく、ＬＩＮ１遺伝子又はその発現制御領域の配列情報に基づいて適宜設計することができる。好適なプライマーとしては、配列番号：２９に記載のヌクレオチド配列からなるプライマー及び配列番号：３０に記載のヌクレオチド配列からなるプライマーが挙げられる。
【００６８】
なお、種子のサイズが増大するか否かを判定する方法においては、例えば、「対照のヌクレオチド配列」と比較する工程を含むことができる。被検植物におけるＬＩＮ１遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列と比較する「対照のヌクレオチド配列」は、イネであれば、例えば、日本晴におけるＬＩＮ１遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列である。
【００６９】
決定した被検植物におけるＬＩＮ１遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列と、前記対照のヌクレオチド配列とを比較することにより、被検植物において種子のサイズが増大するか否かを判定することができる。例えば、前記対照のヌクレオチド配列（例えば、配列番号：１）と比較して、ヌクレオチド配列において大きな相違がある場合（特に、新たな終止コドンの出現やフレームシフトにより、コードするタンパク質の分子量やアミノ酸配列に大きな変化が生じる場合）、被検植物は種子のサイズが増大した植物である蓋然性が高いと判定される。
【００７０】
なお、本発明の判定方法における、被検植物からのＤＮＡの調製は、常法、例えば、ＣＴＡＢ法を用いて行うことができる。ＤＮＡを調製するための植物としては、成長した植物体のみならず、種子や幼植物体を用いることもできる。また、塩基配列の決定は、常法、例えば、ジデオキシ法やマキサム−ギルバート法などにより行なうことができる。塩基配列の決定においては、市販のシークエンスキット及びシークエンサーを利用することができる。
【００７１】
被検植物におけるＬＩＮ１遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列が、対照のヌクレオチド配列と相違するか否かは、上記した直接的な塩基配列の決定以外に、種々の方法により間接的に解析することができる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用したＲＦＬＰ法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法が挙げられる。
【００７２】
本発明の、種子サイズが増大するか否かを判定する別の方法は、被検植物におけるＬＩＮ１遺伝子の発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする。
【００７３】
後述の実施例において示すように、ＬＩＮ１遺伝子において、ヌクレオチドの挿入や欠失が導入されることにより、発現産物の分子量は低減し、種子のサイズは増大することとなる。したがって、ＬＩＮ１遺伝子の増幅産物又は発現産物の分子量を検出することによって、種子のサイズが増大した植物であるかを判定することができる。
【００７４】
また、後述の実施例において示すように、種子サイズの増大は不完全優性に遺伝することから、ＬＩＮ１遺伝子の発現を検出することによって、種子のサイズが増大した植物であるかを判定することができる。
【００７５】
ここで「ＬＩＮ１の発現の検出」には、転写レベルにおける検出及び翻訳レベルにおける検出の双方を含む意である。また、「発現の検出」には、発現の有無の検出のみならず、発現の程度の検出も含む意である。
【００７６】
ＬＩＮ１遺伝子の転写レベルにおける検出は、常法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンブロッティング法により実施することができる。前記ＰＣＲを実施する場合において用いられるプライマーは、本発明の検出対象ＤＮＡを特異的に増幅できるものである限り制限はなく、既に決定されたＬＩＮ１遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計することができる。好適なプライマーとしては、配列番号：２９及び３０のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるプライマーが挙げられる
一方、翻訳レベルにおける検出は、常法、例えば、ウェスタンブロッティング法により、実施することができる。ウェスタンブロッティングに用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これら抗体の調製方法は、当業者に周知である。
【００７７】
遺伝子発現の検出の結果、被検植物において、ＬＩＮ１遺伝子の発現量が、例えば、イネにおいては、日本晴の発現量よりも有意に低ければ（例えば、ＬＩＮ１遺伝子が実質的に発現していなければ）、また、ＬＩＮ１遺伝子の増幅産物又は発現産物の分子量が日本晴における分子量と有意に異なれば、被検植物は種子のサイズが増大した植物である蓋然性が高いと判定される。
【００７８】
＜本発明の植物を育種する方法＞
本発明は、種子のサイズが増大した植物を育種する方法を提供する。かかる育種方法は、（ａ）種子のサイズが増大した植物と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体の中から、上述の方法により、種子のサイズが増大すると判定された植物を、選抜する工程を含む。
【００７９】
「種子のサイズが増大した植物」とは、例えば、ＬＩＮ１遺伝子の機能が抑制されたことにより種子のサイズが増大した植物が挙げられる。また当該植物と交配させる「任意の植物品種」としては、例えば、ＬＩＮ１遺伝子によって種子サイズの増大が抑制されている植物品種が挙げられるが、これに制限されない。また、任意の植物品種は、ＬＩＮ１遺伝子以外の種子のサイズ調整に関与する遺伝子（例えば、ＧＳ３、ＴＧＷ６、ＧＷ２、ｑＳＷ５／ＧＷ５）が既に変異している植物品種であってもよい。また、種子サイズの増大は不完全優性遺伝することから、その機能が抑制されているＬＩＮ１遺伝子をホモで保有することが好ましい。本発明の育種方法を利用すれば、種子のサイズが増大した植物の品種を、幼植物等の段階で適宜選抜することが可能となり、当該形質を有する品種の育成を、短期間で行うことが可能となる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８１】
［突然変異の誘発方法、種子のサイズが増大した突然変異体の選抜］
イネ品種日本晴の種子を直径９ｃｍのプラスチック製シャーレに入れ、３０℃で２日間、暗黒下で吸水させた。吸水させた種子は、水で湿らせたろ紙の上に種子同士が重ならないように並べてハイブリバッグに入れ、理化学研究所・仁科加速器研究センターが有する理研リングサイクロトロンで加速したアルゴンイオンビームを５Ｇｙ（ＬＥＴは２９０ｋｅＶ／μｍ）照射した。照射後、種子を播種してＭ１植物の苗を温室で育苗し、東北大学・湛水生態系野外実験施設（宮城県大崎市）の水田に移植し、Ｍ１植物を栽培した。２０１１年の秋にＭ２種子を個体毎に採取した。２０１２年に、１系統あたり５０個体のＭ２個体を東北大学・湛水生態系野外実験施設の人工塩害水田で栽培し、収穫期に実りが良好であった系統（系統名はＡｒ５−７６）を達観により選抜した。主稈の千粒重が特に高い個体からＭ３種子を採り、２０１３年にＭ３系統を人工塩害水田で再度栽培し、変異形質が遺伝することを確認した。
【００８２】
［収量調査］
２０１４年と２０１６年に、東北大学・湛水生態系野外実験施設（宮城県大崎市）の通常水田で収量調査を実施した。変異体Ａｒ５−７６と原品種である日本晴の苗を、水田１区画あたり縦７個体、横７個体の合計４９個体移植した。日照の違いによる影響を最小限に抑えるため、区画の最も外側で栽培した個体は調査に用いず、内側の縦５個体、横５個体の合計２５個体を調査対象とした。変異体Ａｒ５−７６と日本晴はそれぞれ３区画ずつ栽培し、個体毎に穂数、１穂当たり粒数、稔実率、籾の千粒重を測定して１平方メートル当たりの収量を算出した。得られた結果を表１及び２に示す。
【００８３】
【表１】
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【００８４】
【表２】
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【００８５】
その結果、表１及び２に示すとおり、１平方メートル当たりの収量は、２０１４年は日本晴が８０３．５ｇに対してＡｒ５−７６は８６９．３ｇ、２０１６年は日本晴が６４２．３ｇに対してＡｒ５−７６は７４７．８ｇであり、２カ年ともＡｒ５−７６が日本晴よりも高い収量を示した。日本晴に対するＡｒ５−７６の収量増加率は、２０１４年は８．２％、２０１６年は１６．４％であった。
【００８６】
［種子（玄米）の長さ及び幅の測定］
Ａｒ５−７６と日本晴の玄米の長さ、幅、厚さを測定した。水田でＡｒ５−７６及び日本晴を栽培し、それぞれ１０個体について１個体から１穂ずつ穂をサンプリングした。１穂についた種子を脱穀・籾すりし、健全な外見の玄米８０粒を選んだ。この玄米を穀粒判別器（ＲＧＱＩ１０、サタケ）の玄米測定モードを使用し、長さ、幅、厚さを測定した。得られた結果を表３に示す。
【００８７】
【表３】
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【００８８】
測定の結果、日本晴の玄米の長さ５．２０ｍｍに対し、Ａｒ５−７６の玄米の長さは５．４１ｍｍと、変異体では日本晴より種子長が４．０％増加していた。一方、玄米の幅は日本晴２．９０ｍｍに対してＡｒ５−７６は２．９３ｍｍ、厚さは日本晴１．９１ｍｍに対してＡｒ５−７６は１．９３ｍｍであり、幅と厚さはわずかに増加していた。以上の結果から、Ａｒ５−７６で観察された種子サイズの増大は、主として種子長の増加によることが明らかになった。
【００８９】
［全ゲノムリシーケンス解析による突然変異の検出］
突然変異体Ａｒ５−７６に生じた突然変異を明らかにする目的で、全ゲノムリシーケンス解析を行った。温室で育成したＡｒ５−７６から成葉をサンプリングし、２ｍｌのサンプルチューブ（トミー精工、ＴＭ−６２５Ｓ）内で直径４．８ｍｍのステンレス製ビーズ（ＳＵＢ−５０、トミー精工）と共に液体窒素で凍結、Ｍｉｃｒｏ  Ｓｍａｓｈ  ＭＳ−１００Ｒ（トミー精工）を用いて葉を粉砕し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  −Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ−（東洋紡）でゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを断片化してライブラリを構築し、ＨｉＳｅｑ  ２５００を用いてペアエンド法によって３３．９４  Ｇｂ（８６．１倍ゲノム相当）の塩基配列を取得した（ライブラリ調製及びシーケンシングはＢＧＩ  ＪＡＰＡＮ株式会社に外注した）。得られた塩基配列をイネ変異解析パイプライン（Ｉｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．ＲＩＫＥＮ  Ａｃｃｅｌ．Ｐｒｏｇ．Ｒｅｐ．４９，２５４）により解析し、重イオンビーム照射によって誘発された突然変異を抽出した。その結果、ＧＡＴＫで２０７ヶ所、Ｐｉｎｄｅｌで１６ヶ所の変異を抽出した。これらの変異のうち、ホモ接合型かつ遺伝子の推定アミノ酸配列が変化する１２の突然変異（欠失２、塩基置換１０）を連鎖解析の対象とした。
【００９０】
［種子長に連鎖する突然変異の確認］
Ａｒ５−７６と日本晴を人工気象器（日本医化器械製作所）で栽培し交配した。得られたＦ１個体を人工気象器（日本医化器械製作所）で栽培しＦ２種子を得た。Ｆ２及び親系統であるＡｒ５−７６と日本晴を播種・育苗し、水田で栽培した。栽培方法は前述した収量調査と同様にし、合計７５個体のＦ２個体を調査対象として穂を１個体につき１穂ずつサンプリングした。１穂についた種子を脱穀・籾すりし、健全な外見の玄米８０粒を選び、穀粒判別器（ＲＧＱＩ１０、サタケ）で種子長を測定した。Ｆ２個体の種子長は最大では５．４８ｍｍ、最小では５．０３ｍｍであり、種子長表現型が野生型と変異型（長粒型）に分離していると考えられた。
【００９１】
［Ｆ２個体の簡易ＤＮＡ抽出］
７５個体のＦ２個体について、分げつ期にＤＮＡ抽出用の葉をサンプリングした。ＤＮＡ抽出の方法は以下の通りである。数１０ｍｇの葉を２ｍｌのサンプルチューブ（トミー精工、ＴＭ−６２５Ｓ）に入れ、直径４．８ｍｍのステンレス製ビーズ（ＳＵＢ−５０、トミー精工）と共に液体窒素で凍結し、Ｍｉｃｒｏ  Ｓｍａｓｈ  ＭＳ−１００Ｒ（トミー精工）を用いて葉を粉砕した。サンプルチューブに抽出バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  ＳＤＳ）を４００μｌ加えボルテックスで混合し、１０分間室温でインキュベートした。１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清３００μｌを新しい１．５ｍｌチューブに移した。イソプロパノール３００μｌを上清に加え混合し、２分間室温でインキュベートした。１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿を乾燥させ、１ｘＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を１００μｌ加え、ボルテックスを使用して沈殿を溶解し、ＤＮＡ溶液とした。このＤＮＡ溶液を１回のＰＣＲにつき２μｌ使用した。
【００９２】
［連鎖解析］
Ａｒ５−７６の全ゲノム解析データから検出した１２の突然変異を連鎖解析の対象とした。ＰＣＲの反応液は、ＤＮＡ溶液２μｌに２ｘＧｆｌｅｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒを１２．５μｌ、プライマー対を５ｐｍｏｌずつ、Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．５μｌ加え、純水で反応液の合計を２５μｌにした。なお、後述の遺伝子Ｏｓ０６ｇ０６７５２００を解析するために用いたプライマー対の配列を、配列番号：２９及び３０に示す。ＰＣＲの条件は、熱変性９４℃１分に続いて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃３０秒の３５サイクルとした。サーマルサイクラーは９６−ｗｅｌｌ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム  ９７００（アプライドバイオシステムズ）を使用した。ＰＣＲ産物の一部は、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、島津製作所）を用いて、シングルバンドが増幅していることを確認した。残りのＰＣＲ産物は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｌｅａｎｕｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用し、残存したプライマー及びｄＮＴＰを不活化してサンガーシーケンスのための鋳型ＤＮＡとして用いた。シーケンス反応はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを、反応後の精製にはＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＣｌｅａｎＳＥＱ（ベックマン・コールター）を、シーケンシングにはＡＢＩ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。得られた配列データを用いてＦ２個体ごとの各突然変異の遺伝子型を判定し、長粒表現型を示すＦ２個体においてのみ変異ホモ型となる突然変異を探索した。
【００９３】
その結果、１２の突然変異のうち、６番染色体上の遺伝子Ｏｓ０６ｇ０６７５２００に生じた１ｂｐ欠失が、長粒表現型と連鎖することを見出した。Ｏｓ０６ｇ０６７５２００が長粒表現型の原因遺伝子であると考え、この遺伝子をＬｏｎｇ  Ｇｒａｉｎ１（ＬＩＮ１）と命名した。
【００９４】
また図４に示すとおり、Ｆ２個体のうち、ＬＩＮ１遺伝子の１ｂｐ欠失をヘテロ接合型で持つ個体の粒長は５．２８ｍｍであり、欠失をホモ接合型で持つ個体（５．３６ｍｍ）と変異を持たない個体（５．１７ｍｍ）の中間であったことから、本長粒変異は不完全優性を示すことが明らかになった。
【００９５】
なお、前記１ｂｐの欠失は、日本晴野生型のＬＩＮ１遺伝子（配列番号：１）の５４０位のヌクレオチドの欠失である。また、当該欠失に伴い、野生型のアミノ酸配列とは１８１位のアミノ酸以降異なり、その全長は野生型の４１２アミノ酸に対して、１８５アミノ酸と短くなっている（配列番号：２３及び２４に記載の配列  参照のほど）。
【００９６】
［ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集：イネの形質転換］
ＬＩＮ１遺伝子がＡｒ５−７６変異体に生じた長粒形質の原因遺伝子であることを証明する目的で、ゲノム編集によるＬＩＮ１遺伝子への変異導入を行った。ＬＩＮ１遺伝子の配列の一部（配列番号：３１に記載の２１ｂｐ）を、Ｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐ．６，２６８７１（２０１６）で報告されたＳａＣａｓ９発現バイナリーベクターにクローニングし、Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４７，９６９（２００６）の方法に従ってアグロバクテリウム法によりイネ品種日本晴に形質転換した。作成した２系統の形質転換体についてサンガーシーケンスを行い、いずれにおいてもＬＩＮ１遺伝子の標的配列に変異（１ｂｐ挿入）が導入されていることを確認した。
【００９７】
なお、当該１ｂｐは、図には示さないが、シークエンシングの結果、前記２系統において共に、日本晴野生型のＬＩＮ１遺伝子（配列番号：１）の２１４位及び２１５位の間に挿入されている（前記１の系統（形質転換体♯１のＬＩＮ１遺伝子の配列を、配列番号：２５に示す。また前記もう一つの系統（形質転換体♯２）のそれを、配列番号：２７に示す）。さらに、挿入部位の前後で波形の乱れが生じていないことから、得られた形質転換体は両アリル変異が生じたと考えられる。また、当該挿入に伴い、野生型のアミノ酸配列とは７２位のアミノ酸以降異なり、その全長は野生型の４１２アミノ酸に対して、１１７アミノ酸と短くなっている（配列番号：２５〜２８に記載の配列  参照のほど）。
【００９８】
そして、これら形質転換体等を、閉鎖系温室にて自然光下で栽培した。なお、形質転換体♯１、並びにそのコントロール（Ａｒ５−７６及び日本晴）は、２０１８年３月１２日から１０月２３日にかけて栽培し、形質転換体♯２、並びにそのコントロール（Ａｒ５−７６及び日本晴）は、２０１８年６月１日から１０月２４日にかけて栽培した。栽培期間における温室内の最高気温は３７．０℃、最低気温は２４．６℃であった。そして、得られた各玄米の種子長を穀粒判別器（ＲＧＱＩ１０、サタケ）で測定した。
【００９９】
その結果、図５及び６、並びに表４及び５に示すとおり、前記２系統の形質転換体の種子（Ｔ１種子）の長さは各々５．１３ｍｍ及び５．１８ｍｍであり、いずれもＡｒ５−７６と同程度の種子長であったことから、ＬＩＮ１遺伝子が種子のサイズが増大する形質に関与することが明らかになった。
【０１００】
【表４】
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【０１０１】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【０１０２】
以上説明したように、本発明によれば、ＬＩＮ１遺伝子の機能を人為的に抑制することにより、種子のサイズが増大した植物を提供することが可能となる。また、ＬＩＮ１遺伝子の機能抑制の有無を指標として、種子のサイズが増大した植物であるか否かを判定することもできる。さらに、ＬＩＮ１遺伝子は本発明者らが今回新たに見出した遺伝子である。そのため、種子サイズの調整に関与する既知遺伝子が既に変異している品種に対しても、ＬＩＮ１遺伝子を利用することができ、種子サイズの更なる大型化が可能となる。
【０１０３】
したがって、本発明は、種子のサイズが増大した植物、すなわち単位面積又は一個体あたりの収穫量が増大した植物を提供することができるため、世界的な食糧問題に対応する上で、またバイオ燃料の原料供給等において、極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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