(57)【要約】【課題】簡易な構成により細胞を容器から剥離するとともに、細胞に対するダメージを抑制することができる、自動培養装置を提供する。【解決手段】本発明に係る自動培養装置は、刺激応答性を有する培養容器によって細胞を培養し、別の容器から供給する溶液によって前記培養容器に対して刺激を与えることにより、細胞を前記培養容器から剥離する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養する自動培養装置であって、
前記細胞を培養する培養容器、
前記培養容器に対して供給する溶液を収容する溶液容器、
を備え、
前記培養容器は、前記溶液が与える刺激によって前記細胞に対する接着性が変化する刺激応答性を有する
ことを特徴とする自動培養装置。
【請求項２】
前記溶液において、細胞外マトリックスの重合度を低下させる酵素の濃度は０．０１ｗｔ％未満であり、
前記溶液において、アルカリ土類金属イオンに対して配位できるキレート剤の濃度は０．０１ｗｔ％未満である
ことを特徴とする請求項１記載の自動培養装置。
【請求項３】
前記細胞外マトリックスの重合度を低下させる酵素は、プロテアーゼであり、
前記アルカリ土類金属イオンに対して配位できるキレート剤は、３座以上でアルカリ土類金属イオンに配位できるキレート剤である
ことを特徴とする請求項２記載の自動培養装置。
【請求項４】
前記プロテアーゼは、トリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ、天然プロテアーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、もしくはそれらの組み換え体であり、
前記３座以上でアルカリ土類金属イオンに対して配位できるキレート剤は、ＥＤＴＡである
ことを特徴とする請求項３記載の自動培養装置。
【請求項５】
前記培養容器は、温度変化によって前記細胞に対する接着性が変化する刺激応答性を有しており、
前記培養容器は、刺激応答性材料として、ポリアクリルアミド誘導体、ポリメタクリレート誘導体、ポリビニルエーテル誘導体、ポリビニルアミン誘導体、ポリアルキレングリコール誘導体、ポリオキサゾリン誘導体、ポリサッカライド誘導体、ポリペプチド、ポリペプチド誘導体、のうち少なくともいずれかを用いて形成されている
ことを特徴とする請求項１記載の自動培養装置。
【請求項６】
前記培養容器は、ｐＨ変化によって前記細胞に対する接着性が変化する刺激応答性を有しており、
前記培養容器は、刺激応答性材料として、ポリアミン、アミン含有温度応答性ポリマ、ポリカルボン酸、カルボン酸含有温度応答性ポリマ、ポリペプチド、接着性タンパク質、のうち少なくともいずれかを用いて形成されている
ことを特徴とする請求項１記載の自動培養装置。
【請求項７】
前記培養容器は、前記溶液の組成変化、酸化反応、還元反応、のうち少なくともいずれかによって与えられる刺激により、前記細胞に対する接着性が変化する刺激応答性を有する
ことを特徴とする請求項１記載の自動培養装置。
【請求項８】
前記自動培養装置はさらに、前記溶液を前記溶液容器から前記培養容器に対して搬送する送液機構を備える
ことを特徴とする請求項１記載の自動培養装置。
【請求項９】
前記自動培養装置はさらに、
前記培養容器から剥離された前記細胞を収容する剥離細胞容器、
前記溶液容器と前記培養容器との間を接続する第１流路、
前記培養容器と前記剥離細胞容器との間を接続する第２流路、
を備え、
前記第１流路と前記第２流路はともに、気密構造を有する
ことを特徴とする請求項１記載の自動培養装置。
【請求項１０】
前記培養容器、前記溶液容器、または前記剥離細胞容器のうち少なくともいずれかは、気密構造を有する
ことを特徴とする請求項９記載の自動培養装置。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項記載の自動培養装置を用いて細胞を培養する細胞培養方法。
【請求項１２】
前記細胞培養方法は、前記自動培養装置が備える送液機構を用いて前記溶液を前記溶液容器から前記培養容器に搬送することにより、前記培養容器に対する前記細胞の接着性を低下させて、前記培養容器から前記細胞を剥離する工程を有する
ことを特徴とする請求項１１記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養する自動培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
安定した品質の細胞を大量製造するため、種々の自動培養装置が開発されている。例えば培養環境の制御のように、機械制御によるメリットが大きい要素に関しては開発が進んでおり、細胞品質の安定化が期待できる。しかし、細胞培養においてこれまで人が実施している作業を全て機械で置き換えるのは、必ずしも容易ではない。
【０００３】
無菌空間内にロボットアームのような可動機構を多数備えた自動培養装置によって人の作業を再現する試みがなされている（特許文献１−３）。一方、閉鎖系流路（気密に維持された流路）から構成される閉鎖系自動培養装置は、特許文献１−３のような可動機構を多数備える装置と比較して一般に、構造的に単純かつ小型である。また、酵素などの剥離溶液を用いることなく細胞を容器から剥離することができる培養装置も開発されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１６−０１３０６１号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１６／１４７８９８
【特許文献３】特開２０１０−１３６６６６号公報
【特許文献４】ＷＯ２０１３／１１６４２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１−３記載のような自動培養装置においては、（ａ）無菌空間によって装置の大部分を覆う必要があり装置が大型になってしまうこと、（ｂ）機械的機構が複雑であること、（ｃ）必要な部品数が多く安価に製造しにくいこと、（ｄ）メンテナンス性に難があること、などの課題がある。
【０００６】
閉鎖系流路から構成される閉鎖系自動培養装置においては、細胞を容器から剥離するために剥離溶液を用いるので、細胞に対するダメージを抑制するため、例えば遠心分離機などを用いて、細胞を剥離溶液から分離する必要がある。遠心分離機は自動培養装置とは別の装置であり、閉鎖系流路に対して直接接続されていないので、細胞を遠心分離器に対して持ち込む工程が別途必要である。この工程を自動化することは、複雑な機構が必要であるので一般に困難である。
【０００７】
特許文献４のように、剥離溶液を用いずに細胞を容器から剥離する装置においては、細胞を継代可能な状態で剥離するために複雑な機構を要するのが一般的である。したがって簡易な装置構成を実現するのは困難であると考えられる。
【０００８】
本発明は、上記のような課題に鑑みてなされたものであり、簡易な構成により細胞を容器から剥離するとともに、細胞に対するダメージを抑制することができる、自動培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る自動培養装置は、刺激応答性を有する培養容器によって細胞を培養し、別の容器から供給する溶液によって前記培養容器に対して刺激を与えることにより、細胞を前記培養容器から剥離する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る自動培養装置によれば、簡易な構成により細胞を容器から剥離するとともに、細胞に対するダメージを抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】酵素を用いる細胞継代の工程を例示する模式図である。
【図２】刺激応答を用いる細胞継代の工程を例示する模式図である。
【図３】実施形態１に係る自動培養装置１００の構成図である。
【図４】自動化機構の具体的構成例である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜細胞培養の一般的工程について＞
細胞継代においては一般に、ＥＣＭ（Ｅｘｔｒａ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ：細胞外マトリクス）を分解するプロテアーゼなどの酵素（例：トリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ、天然プロテアーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、もしくはそれらの組み換え体）や、３座以上でアルカリ土類金属イオンに配位することによりＥＣＭの複合体を解離させるキレート剤（例：ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸））などによって、細胞を容器から剥離する。細胞を剥離した後の細胞懸濁液には、酵素やキレート剤が残存し、これが細胞に対してダメージを与えるので、例えば遠心分離機により酵素やキレート剤と細胞を分離する必要がなる。一般に遠心分離は、細胞懸濁液を培養容器から遠心分離用の容器に移し替える工程をともなうので、機械によって自動化するためには煩雑な機構を必要とする。
【００１３】
図１は、酵素を用いる細胞継代の工程を例示する模式図である。この場合は以下の工程が含まれる：（１）培養液の除去、（２）洗浄液の添加、（３）洗浄液の除去、（４）洗浄液の添加、（５）洗浄液の除去、（６）酵素溶液の添加、（７）細胞剥離の確認、（８）酵素停止溶液の添加、（９）細胞への液流の印加、（１０）細胞懸濁液の遠心管への移し替え、（１１）洗浄液の添加、（１２）細胞懸濁液の遠心管への追加移し替え、（１３）遠心管のフタ閉め、（１４）遠心管の遠心機へのセット、（１５）遠心分離、（１６）遠心管のフタ開け、（１７）上清の除去、（１８）緩衝液添加、（１９）細胞塊への液流の印加、（２０）細胞懸濁液の遠沈管からの回収、（２１）細胞計数、（２２）細胞懸濁液の必要量の計量、（２３）播種。この例においては、工程（１０）、（１２）、（１３）、（１４）、（１６）、（１９）、（２０）などが遠心分離を実施するために必要であるが、これらは機械的に煩雑な機構を要する。
【００１４】
閉鎖系自動培養装置は、容器間の流路を気密流路によって構成した培養装置であり、以下の利点がある：（ａ）セッティング後は培養系が外気と接触しないのでコンタミネーションリスクが小さい、（ｂ）ピペットのような機構を用いずチューブにより簡便に送液することができる、（ｃ）ロボットアームを用いる自動培養装置と異なり無菌空間中に設置する必要がない、など。このタイプの自動培養装置は、溶液を容器間で搬送することにより培養工程を実施するので、構造が簡易である。ただし図１と同様に剥離溶液を分離する必要があるので、工程を完全に自動化するためには、図１と同様に複雑な機構を要する。
【００１５】
図１や閉鎖系自動培養装置において、複雑な機構を要するのは、剥離溶液が細胞に対してダメージを与えるのでこれを除去する必要があるからである。そこで本発明は、剥離溶液を用いることなく細胞を容器から剥離することにより、遠心分離機へ細胞を搬送する複雑な機構を用いない構成を提案する。これにより、閉鎖系自動培養装置の簡易な構造による利点を活かして、単純な機構のみで細胞継代を自動的に実施することを図る。
【００１６】
＜実施の形態１＞
細胞にダメージを与える成分（すなわち剥離溶液）を用いずに容器から細胞を剥離する手段として、刺激応答性培養容器が挙げられる。刺激応答性培養容器とは、物理・化学的な刺激によって、培養容器表面の物性が変化し、細胞に対する接着性が変化し得る培養容器である。刺激の例としては、温度変化、ｐＨ変化、溶液組成変化（イオン濃度変化、糖濃度変化、タンパク質濃度変化、ビオチン濃度変化、等）、酸化剤添加、還元剤添加、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
図２は、刺激応答を用いる細胞継代の工程を例示する模式図である。この場合は以下の工程が含まれる：（Ｉ）培養液の除去、（ＩＩ）刺激の印加、（ＩＩＩ）刺激の停止、（ＩＶ）細胞への液流の印加、（Ｖ）細胞懸濁液の培養容器からの回収、（ＶＩ）細胞計数、（ＶＩＩ）細胞懸濁液の必要量の計量、（ＶＩＩＩ）播種。図１と比較して短い工程により細胞継代を実施することができる。
【００１８】
刺激応答性容器に対して与える刺激として温度変化を用いる場合は、温度応答性培養容器上で細胞を培養し、培養温度とは異なる温度の培地や緩衝液を作用させることにより細胞に対する接着性を低下させて細胞を剥離する。動物細胞は多くの場合、４℃〜３７℃の範囲内における温度変化は短時間であれば細胞に悪影響を及ぼさない。刺激を停止する際には、培養温度程度の溶液を添加すればよい。
【００１９】
低温の培地を用いて細胞を剥離した場合、常温程度の溶液を供給することにより細胞を剥離するので、細胞懸濁液は細胞が長期間生存可能な成分構成となる。したがって溶液成分をさらに調整する必要はない。もっとも、例えば分析のために必要な場合など、用途に応じてさらに成分調整をすることは妨げない。低温の緩衝液を作用させることにより細胞を剥離する場合は、培地や濃縮培地をさらに添加することにより、細胞が長期間生存可能な成分構成に調整することが望ましい。
【００２０】
温度応答性培養容器の例としては、培養容器表面に温度応答性材料を備えるものが挙げられる。温度応答性材料としては、（ａ）ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド）のようなポリアクリルアミド誘導体、（ｂ）ポリ（オリゴエチレングリコールメタクリレート）のようなポリメタクリレート誘導体、（ｃ）ポリ（メチルビニルエーテル）のようなポリビニルエーテル誘導体、（ｄ）ポリ（Ｎ−ビニルカプロラクトン）のようなポリビニルアミン誘導体、（ｅ）ポリエチレングリコール共重合体やポリプロピレングルコール共重合体のようなポリアルキレングリコール誘導体、（ｆ）ポリ（オキサゾリン）のようなポリオキサゾリン誘導体、（ｇ）ヒドロキシプロピルセルロースのようなポリサッカライド誘導体、（ｈ）ポリペプチド、（ｉ）ポリペプチド誘導体、などが挙げられるが、これらに限定されない。容器の形状は限定されない。
【００２１】
刺激応答性容器に対して与える刺激としてｐＨ変化を用いる場合は、ｐＨ応答性培養容器上で細胞を培養し、通常の培養条件とｐＨが異なる培地や緩衝液を作用させることにより細胞に対する接着性を低下させて細胞を剥離する。細胞種にも依存するが、ｐＨの微小な変化は短時間であれば細胞に悪影響を及ぼさない。刺激を停止する際には、培地や緩衝液の添加によりｐＨを中和・希釈すればよい。
【００２２】
通常の培養条件と異なるｐＨを有する溶液を作用させる場合、細胞を剥離した後に培地や濃縮培地を添加することにより、細胞が長期間生存可能な成分構成に調整することが望ましい。ｐＨの変化方向としては、酸側・アルカリ側どちらも用いることができるが、細胞に悪影響の少ない方向とすることが望ましい。
【００２３】
ｐＨ応答性培養容器の例としては、培養容器表面にｐＨ応答性材料を備えるものが挙げられる。ｐＨ応答性材料としては、（ａ）ポリリシン、ポリエチレンイミン、キトサンのようなポリアミン類、（ｂ）ポリ（ジエチルアミノエチルメタクリレート）−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）共重合体やポリプロピレングリコール−エチレンジアミン共重合体のようなアミン含有温度応答性ポリマ、（ｃ）ポリグルタミン酸、カルボキシメチルセルロースのようなポリカルボン酸、（ｄ）ポリ（アクリル酸）−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）共重合体のようなカルボン酸含有温度応答性ポリマ、（ｅ）ポリペプチド、（ｆ）接着性タンパク質、などが挙げられるが、これらに限定されない。容器の形状は限定されない。
【００２４】
細胞・細胞膜・ＥＣＭなどがｐＨに対する十分な応答性を有し、弱酸等によって細胞剥離が可能な程度まで細胞接着が弱まることがある。そのような細胞を用いる場合、必ずしもｐＨ応答性培養容器を用いる必要はない。
【００２５】
図３は、本実施形態１に係る自動培養装置１００の構成図である。自動培養装置１００は、培養容器１１０、溶液容器１２０、剥離細胞容器１３０を備える。培養容器１１０と溶液容器１２０との間は第１閉鎖系流路１４１によって接続され、培養容器１１０と剥離細胞容器１３０との間は第２閉鎖系流路１４２によって接続されている。
【００２６】
培養容器１１０は、上述の刺激応答性容器であり、細胞を培養するために用いる。溶液容器１２０は、培養容器１１０に対して刺激を与えることにより細胞に対する接着性を低下させる溶液を収容する。この溶液は細胞に対するダメージが小さい必要があるので、従来細胞を剥離するために用いている酵素やキレート剤の濃度が充分低いことが望ましい。具体的には、溶液におけるこれらの濃度が０．０１ｗｔ％未満であることが望ましい。遠心分離においてこれらを分離する際にこの程度の濃度を目標とするからである。剥離細胞容器１３０は、培養容器１１０から剥離された細胞を収容する。
【００２７】
自動培養装置１００を閉鎖系培養装置として構成する場合、第１閉鎖系流路１４１と第２閉鎖系流路１４２は気密構造を有し、溶液がこれらのなかを通過する際に、細胞が外気にさらされないように構成されている。これにより、閉鎖系培養装置の利点を活かしつつ本発明の効果を発揮することができる。さらに、各容器のうち少なくともいずれかを気密に構成してもよい。
【００２８】
図４は、自動化機構の具体的構成例である。図３で説明した構成に加え、送液機構１５０、緩衝液保持容器、廃液保持容器、細胞観察機構を設け、送液機構１５０が各容器間で溶液を搬送することにより、細胞継代の各工程を自動的に実施することができる。
【００２９】
前述の例の工程（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）は例えば下記のように実現できる。工程（Ｉ）は、送液機構１５０が培養容器１１０中の培地を廃液保持容器に移送することにより実現できる。工程（ＩＩ）は、送液機構１５０が溶液容器１２０中の刺激溶液を培養容器１１０に移送することにより実現できる。工程（ＩＩＩ）は、送液機構１５０が緩衝液保持容器から培養容器１１０に緩衝液を移送することにより実現できる。工程（ＩＶ）は、工程（ＩＩＩ）の際に液流を発生させることにより実現できる。工程（Ｖ）〜（ＶＩＩＩ）は、細胞観察機構を用いて細胞数を計数し、送液機構１５０が培養容器１１０中の細胞懸濁液のうち一定量を剥離細胞容器１３０に移送することにより実現できる。
【００３０】
＜実施の形態１：まとめ＞
本実施形態１に係る自動培養装置１００は、刺激応答性容器を用いて細胞を培養し、刺激を与える溶液を搬送することにより細胞を容器から剥離する。これにより、剥離溶液などの細胞に対してダメージを与える溶液を用いる必要がなくなるので、遠心分離機などの外部装置に対して細胞を移送する必要はない。したがって、簡易な装置構成で細胞継代を自動化することができる。
【００３１】
＜実施の形態２＞
刺激応答性容器に対して与える刺激として、イオン濃度変化を用いることもできる。この場合は、イオン応答性培養容器上で細胞を培養し、イオン濃度の変化によって細胞を剥離することができる。培養条件におけるイオン濃度を細胞剥離のために変化させたとしても、短時間であれば細胞に悪影響を及ぼさない。刺激を停止する際には、添加液や希釈液を用いてイオン濃度を調整すればよい。
【００３２】
カドヘリンに代表される一部のＥＣＭはアルカリ土類金属イオン応答性を有し、アルカリ土類金属イオン濃度を低下させることにより細胞剥離が可能な程度まで細胞接着が弱まることがある。そのような細胞を用いる場合、必ずしもイオン応答性培養容器を用いる必要はない。
【００３３】
刺激応答性容器に対して与える刺激として、培養時に細胞と共存しても問題ない成分や培地中に含まれる成分の濃度変化を用いることもできる。このような成分としては、グルコース（ボロン酸やレクチンのようなグルコース応答性材料に対して刺激）、ビオチン（アビジンやストレプトアビジンのようなビオチン応答性材料に対して刺激）、ＰＥＧ（抗ＰＥＧ抗体のようなＰＥＧ応答性材料に対して刺激）、グルタチオン（ジスルフィド結合のような易還元性の結合に対する還元刺激）、などが挙げられる。
【００３４】
溶液を作用させることにより刺激を与えることに代えて、例えば、（ａ）培養容器をインキュベータから取り出して外気に暴露することにより温度を変化させる、（ｂ）光を照射する、（ｃ）力学的刺激を印加する、などのように、溶液交換を必要としない刺激を用いることもできる。その場合、必ずしも刺激を与える前に培養液を除去する必要はないので、プロセスの簡便さとしては有利である。他方で刺激印加機構としてその刺激に対応する特殊な機構を要するので、溶液を作用させるのみで細胞を剥離する手法と比較して、装置構成の単純さという観点では有利でない。
【００３５】
なお、溶液を作用させることにより細胞を剥離する場合、作用する溶液の浸透圧は、細胞に悪影響のない浸透圧の範囲を超えないことが望ましい。細胞に悪影響のない浸透圧の範囲は、代表的には２６０〜３２０ｍＯＳＭ/ｋｇである。
【００３６】
＜本発明の変形例について＞
本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換える事が可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について他の構成の追加・削除・置換をすることができる。
【００３７】
本発明に係る自動培養装置１００を用いて細胞継代を実施する場合には、培養する細胞の性質にも依存するが、剥離された細胞が播種可能な状態である必要がある。したがってシングルもしくは小さなクランプの状態で剥離することが好ましい。一般にコンフルエントになる前に剥離すれば、大きなクランプにならずに剥離することができる。例えば培養容器の細胞と接触する部位が適切なモルフォロジーにパターニングされていれば、細胞の形態がシングルもしくは小さいクランプの状態で、剥離された細胞を容易に得ることができる。凹凸のような物理的なパターニングに加え、細胞非接着性成分の導入や細胞接着性成分の剥離のような化学的なパターニングでもよい。細胞と接触する部位が多孔質状、繊維状、ビーズ状などである場合には、１ヵ所あたりの面積や曲率の制御によって大きなクランプの形成を抑制できる可能性がある。
【００３８】
培養容器１１０の刺激応答性材料は、接着性タンパク質、接着性タンパク質の誘導体、接着性タンパク質の組み換え体であっても構わない。接着性タンパク質が刺激に対して応答して構造変化もしくは重合度低下して接着性が低下する場合、刺激応答性材料として用いることができる。
【００３９】
自動培養装置１００は、図３〜図４で説明した構成の他、培地保持容器、装置制御機構、ネットワーク接続機構、試薬保持容器、気体濃度制御機構、温度制御機構、滅菌機構、容器輸送機構、センサ類、サンプリング機構、光照射機構、などの機構を備えていてもよく、追加の各種容器・機構を備えていてもよい。１つの筐体の内部に複数の自動培養機構、自動継代機構を備えていてもよい。
【００４０】
自動培養装置１００は、接着細胞の培養に用いることができる。浮遊細胞は、その元来の性質から、細胞懸濁液を希釈するのみで継代とすることができるので、自動培養装置１００による効果は小さい。
【００４１】
自動培養装置１００が培養する接着細胞のタイプは限定されない。細胞の由来（初代細胞、培養細胞、株化細胞、遺伝子組換えされた細胞、等）や、生物種に関しても制限はない。接着細胞の例としては、幹細胞（間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、等）、上皮細胞（血管上皮細胞、胆管上皮細胞、等）、内皮細胞（血管内非細胞、リンパ管内皮細胞、等）、線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３、等）、肝細胞、膵島細胞、神経細胞、心筋細胞、筋芽細胞、がん細胞、マクロファージ、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、などが挙げられる。培養する細胞は１種類である必要はなく、共培養系に適用してもよい。
【００４２】
接着細胞が分化能を有する場合は、自動培養装置１００を用いて培養している間に分化させてもよい。分化した細胞と未分化の細胞の刺激に対する応答が異なる場合、条件によっては、刺激応答による細胞剥離の工程中で分化した細胞と未分化の細胞を分離できる。この場合、例えば回収したい細胞のみを次工程に移送することにより、簡便に細胞を精製できる。分化能を有する接着細胞の未分化状態を維持したまま増殖させる場合においても、分化した細胞と未分化の細胞の刺激に対する応答が異なる場合、条件によっては、未分化の細胞のみを次工程に移送することができる。細胞の接着性が培養中に低下する場合も同様である。例えば細胞の分化や馴化によって浮遊性に変わる場合、スフェロイドのような凝集体を形成して接着性が低下する場合、などがこれに当てはまる。
【００４３】
培養した細胞を回収する場合は、必ずしも細胞継代と同様の方法で細胞を剥離する必要はない。回収する前段階の培養に関しては、刺激応答性を有する培養容器を用いる必要もない。細胞の回収の際は、細胞の形態はシングル、小さなクランプ、大きなクランプ、シート状、など特に限定されない。細胞の回収は自動培養装置１００の外部で実施してもよい。細胞そのものの回収ではなく、細胞が分泌する成分を継続的に回収するために、自動培養装置１００を用いてもよい。
【００４４】
＜実施例＞
以下では本発明に係る自動培養装置１００の効果を検証した結果について、比較例と併せて説明する。
【００４５】
＜実施例１＞
ｐＨ応答性培養容器を用い、ｐＨ・溶液組成変化刺激による細胞剥離を検討した。ｐＨ応答性培養容器は特願２０１５−１１７１１４に記載の通り作製し、ｈＭＳＣ（タカラバイオ）を播種し、タカラバイオ推奨のプロトコルに従い５日間培養した。得られたｈＭＳＣを含む容器から培養液を除去した後にｐＨ６．５のＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）を添加し、インキュベートした。その後、３７℃の培地を添加することによりｐＨ・溶液組成変化刺激を停止し、液流を発生させてｈＭＳＣを容器底面からさらに剥離させた。得られた細胞懸濁液は別の容器に移送し、細胞数および生存率を計数した。容器底面に残存した細胞も計数し、剥離率を算出した。その結果、ｐＨ・溶液組成変化刺激による剥離によって得られた細胞懸濁液中の細胞の生存率は９０％かつ剥離率は９５％と十分に高い値であった。
【００４６】
＜実施例２＞
実施例１で得られた細胞を評価した。実施例１において得られた細胞懸濁液を新たな容器に播種し、同様にして５日間培養した。その結果、得られた細胞の増殖率および生存率は実施例１と同等であり、ｐＨ・溶液組成変化刺激を用いた剥離による細胞の増殖性の低下は認められなかった。
【００４７】
＜実施例３＞
ｐＨ応答性培養容器を用い、ｐＨ・溶液組成変化刺激による細胞剥離を検討した。実施例１と同様にしてＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞の培養および継代を実施した。その結果、ｐＨ・溶液組成変化刺激による剥離によって得られた細胞懸濁液中の細胞の生存率は９０％かつ剥離率は９０％と十分に高い値であった。継代後の増殖性は継代前とほぼ同等であった。
【００４８】
＜実施例４＞
温度応答性培養容器を用い、温度・溶液組成変化刺激による細胞剥離を検討した。温度応答性培養容器としてセルシード社のレプセルを用い、細胞剥離液として１０℃のＰＢＳを用い、実施例１と同様にｈＭＳＣの培養および継代を実施した。その結果、温度・溶液組成変化刺激による剥離によって得られた細胞懸濁液中の細胞の生存率は８５％かつ剥離率は９０％と十分に高い値であった。継代後の増殖性は継代前とほぼ同等であった。
【００４９】
＜比較例１＞
比較例１として、通常のポリスチレン培養容器を用いて細胞の剥離を検討した。通常のポリスチレン培養容器にｈＭＳＣを播種し、実施例１と同様に培養し、実施例１と同様に剥離を検討した。その結果、温和な液流の条件ではｐＨ・溶液組成変化刺激ではポリスチレン培養容器から細胞が５％以下しか剥離しないことが判明した。
【００５０】
＜比較例２＞
比較例２として、強い液流を用いたポリスチレン培養容器からの細胞剥離を検討した。比較例１と同様にｈＭＳＣを培養し、得られた細胞に培地を高流速で３０秒間吹き付けることで細胞を培養容器底面から剥離した。その結果、得られた細胞懸濁液中の細胞の生存率は７５％と低い値であった。
【００５１】
＜比較例３＞
比較例３として、従来の細胞剥離方法で遠心分離をしない場合の細胞への影響を検討した。通常のポリスチレン培養容器上でＣＨＯを培養し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を剥離して得た細胞懸濁液を、酵素の停止処理や遠心分離による酵素・キレート剤除去を実施せずポリスチレン培養容器に播種し、その後の増殖性を測定した。その結果、遠心分離せずに播種した場合は遠心分離した場合と比較して増殖性が２０％以上低下していた。
【符号の説明】
【００５２】
１００：自動培養装置
１１０：培養容器
１２０：溶液容器
１３０：剥離細胞容器
１４１：第１閉鎖系流路
１４２：第２閉鎖系流路
１５０：送液機構
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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