(57)【要約】      （修正有）【課題】トランスジェニック動物などの生物発光レポーターシステムに有用な新規赤方偏移ルシフェリン誘導体、及び、それらの誘導体を用いる生物発光レポーターシステムの提供。【解決手段】特定の構造を有する赤方偏移ルシフェリンをトランスジェニック動物に投与する工程、及び、発光を検出する工程を含み、該トランスジェニック動物がルシフェラーゼを発現していることを特徴とする、トランスジェニック動物中の発光を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び（Ｉｃ）：
2019068817.tif 000096
2019068817.tif 000097
2019068817.tif 000098
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000099
各Ｙは、互いに独立してハロ基、ＳＯ3Ｈ、Ｃ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
各Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
各Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に４〜８員環を形成し；
ｎは１〜６；
２つのＹ置換基は、互いに結合して、５〜７個の環原子を含む環を形成してもよく；及び
少なくとも１つのＹは、ＯＨまたはＮＲ1Ｒ2の何れかである）
で表される化合物。
【請求項２】
少なくとも１つのＹが、ＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
少なくとも１つのＹが、ＮＲ1Ｒ2である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
芳香環が、１個のＯＨまたはＮＲ1Ｒ2及び５個以下のハロ基により置換されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
ハロ基が、フルオロ基である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ハロ基が、クロロ基である、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
少なくとも１つのＹが、ＳＯ3Ｈである、請求項１〜３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項８】
式（ＩＩ）：
2019068817.tif 000100
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000101
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に環を形成する）
で表される化合物。
【請求項９】
式（ＩＩＩ）：
2019068817.tif 000102
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000103
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に環を形成する）
で表される化合物。
【請求項１０】
式（Ｖ）：
2019068817.tif 000104
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000105
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に環を形成する）
で表される化合物。
【請求項１１】
式（ＶＩ）：
2019068817.tif 000106
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000107
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に環を形成する）
で表される化合物。
【請求項１２】
式（ＶＩＩ）：
2019068817.tif 000108
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000109
各Ｙは、互いに独立してＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
各Ｒ1は、互いに独立してＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
各Ｒ2は、互いに独立してＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、互いに結合して環を形成する）
で表される化合物。
【請求項１３】
Ｘが、ＣＮである、請求項１〜１２の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘが、
2019068817.tif 000110
である、請求項１〜１２の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｙが、ＮＲ1Ｒ2である、請求項８〜１４の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｙが、ＯＨである、請求項８〜１４の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｙが、ＮＨ2である、請求項１〜１５の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
サンプル中の発光を検出する方法であって、
サンプルを、請求項１〜１７の何れか１項に記載の化合物と接触させる工程、
該サンプルを、ルシフェラーゼと接触させる工程（それが該サンプル中に存在していない場合）、及び、
発光を検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、生細胞を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが、ルシフェラーゼを含む、請求項１８及び１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
トランスジェニック動物中の発光を検出する方法であって、
請求項１〜１７の何れか１項に記載の化合物を、トランスジェニック動物に投与する工程、及び、
発光を検出する工程
を含み、該トランスジェニック動物が、ルシフェラーゼを発現していることを特徴とする方法。
【請求項２２】
式（ＩＸ）：
2019068817.tif 000111
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000112
Ｙは、ＯＲ；
Ｒは、
2019068817.tif 000113
Ｗは、Ｓ、ＮＲNまたはＯ；
Ｚは、Ｓ、ＮＲN、ＯまたはＣＨ；及び
ＲNは、Ｈ、Ｃ1-4アルキル基または置換Ｃ1-4アルキル基である）
で表される化合物。
【請求項２３】
式（Ｘ）：
2019068817.tif 000114
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000115
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に４〜８員環を形成する）
で表される化合物。
【請求項２４】
式（ＸＩ）：
2019068817.tif 000116
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000117
Ｙは、ＯＲ；及び
Ｒは、
2019068817.tif 000118
である）
で表される化合物。
【請求項２５】
式（ＸＩＩ）：
2019068817.tif 000119
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000120
Ｙは、ＯＲ；
Ｒは、
2019068817.tif 000121
Ａは、ＯＲまたはＮＨＡｃ；
各Ｒ5は、互いに独立してＨ、単糖または４０ユニットまでのポリエチレングリコール部分である）
で表される化合物。
【請求項２６】
式（ＸＩＩＩ）：
2019068817.tif 000122
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000123
Ｙは、ＮＨＲ；
Ｒは、
2019068817.tif 000124
Ｒ7は、アミノ酸側鎖；
Ｒ6は、Ｈ、窒素保護基または３５アミノ酸までの鎖である）
で表される化合物。
【請求項２７】
式（ＸＩＶ）：
2019068817.tif 000125
（式中、Ｘは、−ＣＨ（ＯＲ10）2；
Ｒ10は、Ｃ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ベンジル基または置換ベンジル基；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に４〜８員環を形成する）
で表される化合物。
【請求項２８】
式（ＸＶ）：
2019068817.tif 000126
（ＸＶ）
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000127
Ｙは、ＨまたはＯＲ；及び
Ｒは、Ｃ1-10アルキル基、置換Ｃ1-10アルキルアリール基、置換アリール基、アラルキル基または置換アラルキル基である）
で表される化合物。
【請求項２９】
式（ＸＶＩ）：
2019068817.tif 000128
（式中、Ｘは、−ＣＨ（ＯＲ10）2；
Ｒ10は、Ｃ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ベンジル基または置換ベンジル基；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に４〜８員環を形成する）
で表される化合物。
【請求項３０】
式（ＸＶＩＩ）：
2019068817.tif 000129
（式中、Ｒ8は、ＣＨ2ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｒ10または−Ｃ（Ｏ）ＺＲ9；
Ｚは、ＯまたはＮＨ；
Ｒ9は、Ｃ1-7アルキル基または置換Ｃ1-7アルキル基；
Ｒ10は、ペプチド；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に４〜８員環を形成する）
で表される化合物。
【請求項３１】
式（ＸＶＩＩＩ）：
2019068817.tif 000130
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000131
Ｙは、ＯＲ；
Ｒは、
2019068817.tif 000132
各Ｒ11は、互いに独立してＨ、Ｃ1-6アルキル基、置換Ｃ1-6アルキル基、ＣＦ3、ハロゲン、ＮＯ2、ＣＯ2Ｒ12、または、少なくとも１つのＲ11がＮＯ2の場合は隣り合う何れか２個のＲ11は縮合環を形成してもよく；及び
Ｒ12は、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基または置換Ｃ1-6アルキル基である）
で表される化合物。
【請求項３２】
式（ＸＩＸ）：
2019068817.tif 000133
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000134
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ1-7アルキル基）またはＮ（置換Ｃ1-7アルキル基）；
Ｚは、存在しないかまたはＯ；
Ａは、Ｃ1-4アルキレン基または置換Ｃ1-4アルキレン基；及び
Ｒ14は、Ｈ、フェナセチル基またはセファロスポリン側鎖である）
で表される化合物。
【請求項３３】
式（ＸＸ）：
2019068817.tif 000135
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000136
Ｙは、Ｌ−Ｒ；
Ｌは、リンカー；及び
Ｒは、ボロン酸またはホウ酸エステルである）
で表される化合物。
【請求項３４】
非ルシフェラーゼ酵素の存在または量を検出する方法であって、
該酵素を含む可能性のあるサンプルを、請求項２２〜３３の何れか１項に記載の化合物と接触させる工程、
該サンプルに、ルシフェラーゼ反応混合液を添加する工程、及び、
該サンプル中の発光を検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記発光が定量化される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
非ルシフェラーゼ酵素の存在をｉｎ  ｖｉｖｏで検出する方法であって、
請求項２２〜３３の何れか１項に記載の化合物を、トランスジェニック動物に投与する工程、及び、
発光を検出する工程
を含み、該トランスジェニック動物が、ルシフェラーゼを発現していることを特徴とする方法。
【請求項３７】
非ルシフェラーゼ酵素の存在を検出する方法であって、
請求項２２〜３３の何れか１項に記載の化合物を、動物に投与する工程、
該動物からサンプルを採取する工程、
該サンプルに、ルシフェラーゼ反応混合液を添加する工程、及び、
該サンプルの発光を検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
前記酵素が、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、シトクロームＰ４５０（ＣＹＰ４５０）、フラビンモノアミンオキシダーゼ（ＦＭＯ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ベータ−ラクタマーゼまたはプロテアーゼから選択される、請求項３４〜３７の何れか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルが、前記化合物よりも前または同時に試験化合物と接触する、請求項３４〜３８の何れか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記試験化合物が、前記非ルシフェラーゼ酵素の阻害剤、前記非ルシフェラーゼ酵素の誘導因子、前記非ルシフェラーゼ酵素の基質および前記非ルシフェラーゼ酵素の活性化剤からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
非ルシフェラーゼ酵素の調節因子をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、
（ａ）細胞を試験化合物と接触させる工程、
（ｂ）請求項２２〜３３の何れか１項に記載の化合物を添加し、混合物を形成する工程、
（ｃ）該混合物に、ルシフェラーゼ反応混合液を添加する工程、および、
（ｄ）発光を検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項１〜１７または２２〜３３の何れか１項に記載の化合物を含む、キット。
【請求項４３】
ルシフェラーゼをさらに含む、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
緩衝試薬をさらに含む、請求項４２または請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
2019068817.tif 000137
2019068817.tif 000138
2019068817.tif 000139
からなる群から選択される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１２日に出願された米国仮出願第６１／７７７，２０８号に対する優先権の利益を主張するものであり、参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
【背景技術】
【０００２】
長波長で低エネルギー放出型の生物発光は、多数の発光色を用いた多重分析への応用及び短波長が強く吸収されやすい深層組織イメージングの両方において大変注目されている。光学イメージングの基本的手法の多くは、生物サンプル中の光透過率が低いため動物の全身を対象とした利用は限られている。血液中の特定の成分の吸収係数により光浸透性は抑制される。ヘモグロビン（Ｈｂ）及び酸素結合型ヘモグロビン（ＨｂＯ2）の強い吸収により、血液及び動物組織中の光伝達（並びに浸透深さ）が低下する。遠赤色及び近赤外域（６８０〜９００ｎｍ）において光を放出する発光システムは、Ｈｂ及びＨｂＯ2の吸収スペクトルが最小であるため、最適なイメージングを可能とする。光浸透性が最大となるこの領域は全身動物の「光学窓」として知られている。実験動物において生物発光レポーターシステムは広く利用されてきたが、組織透過性の低下による限界に未だ苦慮している。典型的な生物発光の発光波長（４６０〜６２０ｎｍ）は浸透深さの短い領域で起こる。６８０〜９００ｎｍの領域において明瞭な発光が得られれば、理想的な全身動物用の生物発光レポーターシステムにとって大変有益である。多くの生物発光システムが赤色側に可視発光を偏移させる改善を行ってきたが、血液透過に重要な「光学窓」と大幅に重なる十分に赤色な強い発光は得られていない。
【発明の概要】
【０００３】
いくつかの実施例で本発明は式（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び（Ｉｃ）：
2019068817.tif 000002
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000003
各Ｙは互いに独立してハロ基、ＳＯ3Ｈ、Ｃ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
各Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
各Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し４から８員環を形成し；
ｎは１から６；
２つのＹ置換基は互いに結合し５から７個の環原子を含む環を形成してもよく；及び
少なくとも１つのＹはＯＨまたはＮＲ1Ｒ2の何れかである）で表される化合物を提供する。
【０００４】
別の実施例で本発明は式（ＩＩ）：
2019068817.tif 000004
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000005
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し環を形成する）で表される化合物を提供する。
【０００５】
また、別の実施例で本発明は式（ＩＩＩ）：
2019068817.tif 000006
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000007
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し環を形成する）で表される化合物を提供する。
【０００６】
別の実施例で本発明は式（Ｖ）：
2019068817.tif 000008
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000009
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し環を形成する）で表される化合物を提供する。
【０００７】
また、別の実施例で本発明は式（ＶＩ）：
2019068817.tif 000010
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000011
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し環を形成する）で表される化合物を提供する。
【０００８】
また、別の実施例で本発明は式（ＶＩＩ）：
2019068817.tif 000012
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000013
各Ｙは互いに独立してＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
各Ｒ1は互いに独立してＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
各Ｒ2は互いに独立してＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合して環を形成する）で表される化合物を提供する。
【０００９】
また、別の実施例で本発明は式（ＩＸ）：
2019068817.tif 000014
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000015
ＹはＯＲ；
Ｒは
2019068817.tif 000016
ＷはＳ、ＮＲNまたはＯ；
ＺはＳ、ＮＲN、ＯまたはＣＨ；及び
ＲNはＨ、Ｃ1-4アルキル基または置換Ｃ1-4アルキル基である）で表される化合物を提供する。
【００１０】
別の実施例で本発明は式（Ｘ）：
2019068817.tif 000017
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000018
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し４から８員環を形成する）で表される化合物を提供する。
【００１１】
別の実施例で本発明は式（ＸＩ）：
2019068817.tif 000019
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000020
ＹはＯＲ；及び
Ｒは
2019068817.tif 000021
である）で表される化合物を提供する。
【００１２】
別の実施例で本発明は式（ＸＩＩ）：
2019068817.tif 000022
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000023
ＹはＯＲ；
Ｒは
2019068817.tif 000024
ＡはＯＲまたはＮＨＡｃ；
各Ｒ5は互いに独立してＨ、単糖または４０ユニットまでのポリエチレングリコール部分である）で表される化合物を提供する。
【００１３】
また、別の実施例で本発明は式（ＸＩＩＩ）：
2019068817.tif 000025
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000026
ＹはＮＨＲ；
Ｒは
2019068817.tif 000027
Ｒ7はアミノ酸側鎖；
Ｒ6はＨ、窒素保護基または３５アミノ酸までの鎖である）で表される化合物を提供する。
【００１４】
また、別の実施例で本発明は式（ＸＩＶ）：
2019068817.tif 000028
（式中、Ｘは−ＣＨ（ＯＲ10）2；
Ｒ10はＣ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ベンジル基または置換ベンジル基；
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し４から８員環を形成する）で表される化合物を提供する。
【００１５】
別の実施例で本発明は式（ＸＶ）：
2019068817.tif 000029
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000030
ＹはＨまたはＯＲ；及び
ＲはＣ1-10アルキル基、置換Ｃ1-10アルキルアリール基、置換アリール基、アラルキル基または置換アラルキル基である）で表される化合物を提供する。
【００１６】
別の実施例で本発明は式（ＸＶＩ）：
2019068817.tif 000031
（式中、Ｘは−ＣＨ（ＯＲ10）2；
Ｒ10はＣ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ベンジル基または置換ベンジル基；
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し４から８員環を形成する）で表される化合物を提供する。
【００１７】
別の実施例で本発明は式（ＸＶＩＩ）：
2019068817.tif 000032
（式中、Ｒ8はＣＨ2ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｒ10または−Ｃ（Ｏ）ＺＲ9；
ＺはＯまたはＮＨ；
Ｒ9はＣ1-7アルキル基または置換Ｃ1-7アルキル基；
Ｒ10はペプチド；
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1はＲ2と互いに結合し４から８員環を形成する）で表される化合物を提供する。
【００１８】
また、別の実施例で本発明は式（ＸＶＩＩＩ）：
2019068817.tif 000033
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000034
ＹはＯＲ；
Ｒは
2019068817.tif 000035
各Ｒ11は互いに独立してＨ、Ｃ1-6アルキル基、置換Ｃ1-6アルキル基、ＣＦ3、ハロゲン、ＮＯ2、ＣＯ2Ｒ12または少なくとも１つのＲ11がＮＯ2の時、隣り合う何れか２個のＲ11は縮合環を形成してもよく；及び
Ｒ12はＨ、Ｃ1-6アルキル基または置換Ｃ1-6アルキル基である）で表される化合物を提供する。
【００１９】
別の実施例で本発明は式（ＸＩＸ）：
2019068817.tif 000036
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000037
ＹはＯ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ1-7アルキル基）またはＮ（置換Ｃ1-7アルキル基）；
Ｚは存在しないかまたはＯ；
ＡはＣ1-4アルキレン基または置換Ｃ1-4アルキレン基；及び
Ｒ14はＨ、フェナセチル基またはセファロスポリン側鎖である）で表される化合物を提供する。
【００２０】
別の実施例で本発明は式（ＸＸ）：
2019068817.tif 000038
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000039
ＹはＬ−Ｒ；
Ｌはリンカー；及び
Ｒはボロン酸またはホウ酸エステルである）で表される化合物を提供する。
【００２１】
別の実施例で本発明は、サンプルを本発明記載の化合物と接触させる；サンプルとルシフェラーゼを接触させる（サンプル中に存在していない場合）；及び発光を検出する；からなるサンプル中の発光検出方法を提供する。
【００２２】
また、別の実施例で本発明は、本発明記載の化合物をトランスジェニック動物に投与する；発光を検出する（ただし、トランスジェニック動物はルシフェラーゼを発現している）；からなるトランスジェニック動物中の発光検出方法を提供する。
【００２３】
別の実施例で本発明は、本発明記載の化合物と酵素を含む可能性のあるサンプルを接触させる；サンプルにルシフェラーゼ反応混合を添加する；及びサンプル中の発光を検出する；からなる非ルシフェラーゼ酵素の存在または量を検出する方法を提供する。
【００２４】
別の実施例で本発明は、本発明記載の化合物をトランスジェニック動物に投与する、及び発光を検出する（ただし、トランスジェニック動物はルシフェラーゼを発現している）、からなる非ルシフェラーゼ酵素の存在をｉｎ  ｖｉｖｏで検出する方法を提供する。
【００２５】
また、別の実施例で本発明は、本発明記載の化合物を動物に投与する；動物からサンプルを採取する；ルシフェラーゼ反応混合液をサンプルに添加する；及びサンプルの発光を検出する；からなる非ルシフェラーゼ酵素の存在を検出する方法を提供する。
【００２６】
別の実施例で本発明は、被験化合物と細胞を接触させる；請求項２２ないし３３の何れか１項記載の化合物を添加し混合液を作製する；ルシフェラーゼ反応混合液を混合液に添加する；及び発光を検出する；からなる非ルシフェラーゼ酵素の調節因子のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法を提供する。
【００２７】
別の実施例では本発明は、本発明記載の化合物からなるキットを提供する。
【００２８】
本発明の他の態様は明細書及び付随する図面を鑑みて明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１はアミノルシフェリンコントロールのロイシン付加体（ロイシン−ルシフェリン；黒丸）またはアミノイソナフトルシフェリンのロイシン付加体（ＰＢＩ−５０４４；灰色の正方形）の生物発光反応を添加アミノペプチダーゼの関数として示す。
【図２】図２はアミノペプチターゼに対するロイシニルアミノイソナフトルシフェリンのＫｍを示す。
【図３】図３はルシフェリン基質（緑光を発する）及び本発明の基質が多重分析可能である、すなわち同一サンプルに添加し、他方からの干渉をほとんど受けずにそれぞれの発光を検出できることを示す。
【図４】図４はエステラーゼ活性の測定に本発明の発光エステル基質前駆体ＰＢＩ−５０４５を使用した結果を示す。図４Ａは発光（ＲＬＵｓ）を表し、図４Ｂはバックグラウンドに対する発光の倍数を示す。
【図５】図５はＰＢＩ−４８１３及び４７３９の細胞毒性プロファイルを示す。
【図６】図６は雌のＣＤ−１マウスにＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３を単回投与後の臨床徴候及び動物行動のデータを示す。
【図７】図７は雌のＣＤ−１マウスにＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３を単回投与後の生存率を示す。
【図８】図８は雌のＣＤ−１マウスにＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３を単回投与後の体重をグラム単位で示す。
【図９】図９は雌のＣＤ−１マウスにＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３を単回投与後の体重をパーセント表示で示す。
【図１０】図１０は雌のＣＤ−１マウスにＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３を単回投与後の解剖結果を示す。
【図１１】図１１はＰＢＩ−４３７９の化学発光シグナルを示す。
【図１２】図１２はＰＢＩ−４３７９の蛍光データを示す。
【図１３】図１３はＰＢＩ−４８１３の蛍光データを示す。
【図１４】図１４は近赤外におけるＰＢＩ−４７３９及びＰＢＩ−４８１３の特性を表すスペクトルデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の何れの実施形態が詳細に説明される前に、本発明は、以下の記述で説明される、または以下の図面に図示される詳細な構成及び項目の順序は用途を限定するものではないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であるとともに、様々な方法で実践または実行することができる。
【００３１】
定義
本明細書で使用するとき、以下の用語及び表現は記載の意味で用いる。本発明の化合物は不斉置換された炭素原子を含むため、光学活性またはラセミ体として単離され得ることを理解されたい。ラセミ体分割または光学活性開始材料からの合成などによっての光学活性体を調製する方法は当該技術分野において周知である。全てのキラル、ジアステレオマー、ラセミ体及び構造の全ての幾何異性体は本発明の一部である。
【００３２】
遊離基、置換基及び範囲を示す以下の特定の数値は説明のためであり、遊離基及び置換基のその他の定義値または記載範囲内のその他の値を除外するものではない。
【００３３】
本明細書で使用するとき、「置換」という用語は、「置換」という表記を使用して記載されている基の中の１つまたは複数の（例えば１、２、３、４または５；一部の実施例では１、２または３；他の実施例では１または２）水素が記載された基から選択したもの、または当業者に周知の適切な基により差し換えられていることを意味する。ただし、記載原子の通常の原子価を超えず、置換により安定な化合物が得られる場合に限られる。記載される適切な基として、例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ハロ基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロ環、シクロアルキル基、アルカノイル基、アルコキシカルボニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリフルオロメチルチオ基、ジフルオロメチル基、アシルアミノ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、カルボキシ基、カルボキシアルキル基、ケト基、チオキソ基、アルキルチオ基、アルキルスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルフィニル基、アリールスルホニル基、ヘテロアリールスルフィニル基、ヘテロアリールスルホニル基、ヘテロシクロスルフィニル基、ヘテロシクロスルホニル基、リン酸基、硫酸基、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシル（アルキル）アミン及びシアノ基が含まれる。さらに、記載される適切な基として、例えば−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ-、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ-、−ＮＲ2、−ＮＲ3、＝ＮＲ、−ＣＸ3、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ2、＝Ｎ2、−Ｎ3、ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｒ、−ＯＳ（＝Ｏ）2ＯＲ、−Ｓ（＝Ｏ）2ＮＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｏ2ＲＲ、−Ｐ（＝Ｏ）Ｏ2ＲＲ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ）2、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲが含まれるが、ここで各Ｘは互いに独立してハロゲン（「ハロ」）：Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ；及び各Ｒは互いに独立してＨ、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロシクロ基、保護基またはプロドラッグ部分である。当業者は容易に理解できるが、置換基がオキソ（＝Ｏ）またはチオキソ（＝Ｓ）または同種のものならば、置換原子上の２つの水素原子を差し換える。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「アルキル」という用語は例えば１から３０個の炭素原子、多くの場合１から１２個、または１から約６個の炭素原子からなる分岐、非分岐または環状炭化水素を表す。例としてメチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基、１−ブチル基、２−メチル−１−プロピル基、２−ブチル基、２−メチル−２−プロピル（ｔ−ブチル）基、１−ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチル−２−ブチル基、３−メチル−２−ブチル基、３−メチル−１−ブチル基、２−メチル−１−ブチル基、１−ヘキシル基、２−ヘキシル基、３−ヘキシル基、２−メチル−２−ペンチル基、３−メチル−２−ペンチル基、４−メチル−２−ペンチル基、３−メチル−３−ペンチル基、２−メチル−３−ペンチル基、２、３−ジメチル−２−ブチル基、３、３−ジメチル−２−ブチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基等を含むがこれらに限定されない。アルキル基は非置換または置換でもよい。アルキル基はさらに、任意で一部または全てが不飽和でもよい。よって、アルキル基の記載はアルケニル基及びアルキニル基の両方を含む。アルキル基は既に記載及び例示されているように１価の炭化水素ラジカルまたは２価の炭化水素ラジカル（すなわちアルキレン基）となり得る。
【００３５】
「アルケニル基」という用語は、一部不飽和な分岐または非分岐の１価ラジカル炭化水素鎖（すなわち炭素−炭素、ｓｐ2二重結合）を示す。一部の実施例では、アルケニル基は２から１０個または２から６個の炭素原子を有してもよい。別の実施例では、アルケニル基は２から４個の炭素原子を有している。例としてエチレン基またはビニル基、アリル基、シクロペンテニル基、５−ヘキセニル基等が含まれる。アルケニル基は非置換または置換でもよい。
【００３６】
「アルキニル基」という用語は、完全に不飽和状態の部分を有する分岐または非分岐の１価ラジカル炭化水素鎖（すなわち炭素−炭素、ｓｐ三重結合）を示す。一部の実施例では、アルキニル基は２から１０個の炭素原子または２から６個の炭素原子を有してもよい。別の実施例では、アルキニル基は２から４個の炭素原子を有してもよい。この用語の例として、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、１−ヘキシニル基、２−ヘキシニル基、３−ヘキシニル基、１−オクチニル基等の基が挙げられる。アルキニル基は非置換または置換でもよい。
【００３７】
「シクロアルキル基」という用語は単環または複数の縮合環を有する３から１０個の炭素原子からなる環状アルキル基を示す。そのようなシクロアルキル基として例えば、単環構造であるシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロオクチル基等、または多環構造であるアダマンタニル基等が含まれる。シクロアルキル基は非置換または置換でもよい。シクロアルキル基は１価または２価でもよく、上記のアルキル基と同様、任意に置換してもよい。シクロアルキル基は任意で１つ以上の不飽和部位を含んでもよく、例えばシクロアルキル基は１つ以上の炭素−炭素二重結合を含んでもよく、例えばシクロヘキセン、１、３−シクロヘキサジエン、１、４−シクロヘキサジエン等を含んでもよい。
【００３８】
「アルコキシ基」という用語はアルキル−Ｏ−を表すが、ここでアルキル基は本明細書中で定義したものである。一部の実施例では、アルコキシ基として例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、１、２−ジメチルブトキシ等を含む。アルコキシ基は非置換または置換でもよい。
【００３９】
本明細書で使用する「アリール」または「アル」はもとの芳香族化合物の炭素原子１つから水素原子１つを取り除いた芳香族炭化水素を示す。もとの環状系の飽和または不飽和の炭素原子はラジカルになり得る。アリール基は６から３０個の炭素原子を有してもよい。アリール基は単環（例えばフェニル基）または多縮合（融合）環で、その場合少なくとも１つの環が芳香性（例えばナフチル基、ジヒドロフェナンスレニル基、フルオレニル基またはアンスリル基）である。典型的なアリール基として、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル等から発生したラジカルが含まれるが、これらに限定されない。上記のアルキル基と同様、アリール基は非置換または任意に置換してもよい。
【００４０】
「ハロ」という用語はフルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを表す。同様に、「ハロゲン」という用語はフッ素、塩素、臭素及びヨウ素を表す。
【００４１】
「ハロアルキル」という用語は本明細書定義の１つまたは複数のハロ基（互いに同じでも異なっていてもよい）で置換した本明細書定義のアルキル基を表す。一部の実施例では、ハロアルキル基は１、２、３、４または５個のハロ基で置換されていてもよい。別の実施例では、ハロアルキル基は１、２または３個のハロ基で置換されていてもよい。ハロアルキル基という用語にはパーフルオロ−アルキル基も含まれる。代表的なハロアルキル基として例えば、トリフルオロメチル基、３−フルオロドデシル基、１２、１２、１２−トリフルオロドデシル基、２−ブロモオクチル基、３−ブロモ−６−クロロヘプチル基、１Ｈ、１Ｈ−パーフルオロオクチル基等が含まれる。上記のアルキル基と同様に、ハロアルキル基は任意に置換してもよい。
【００４２】
本明細書中で「ヘテロアリール基」という用語は１、２または３個の芳香環を含み、１つ以上の窒素、酸素または硫黄原子を１個の芳香環に含み、それらは非置換または例えば「置換」の定義中に記載されている１個または複数（具体的には１〜３個）の置換基で置換されていてもよく、単環、二環または三環の環状系を示す。典型的なヘテロアリール基は２〜２０個の炭素原子に加えて１個または複数のヘテロ原子を含む。ヘテロアリール基の例として、２Ｈ−ピロリル基、３Ｈ−インドリル基、４Ｈ−キノリジニル基、アクリジニル基、ベンゾ［ｂ］チエニル基、ベンゾチアゾリル基、β−カルボリニル基、カルバゾリル基、クロメニル基、シンノリニル基、ジベンゾ［ｂ、ｄ］フラニル基、フラザニル基、フリル基、イミダゾリル基、イミジゾリル基、インダゾリル基、インドリシニル基、インドリル基、イソベンゾフラニル基、イソインドリル基、イソキノリル基、イソチアゾリル基、イソオキサゾリル基、ナフチリジニル基、オキサゾリル基、ペリミジニル基、フェナントリジニル基、フェナントロリニル基、フェナルサジニル基、フェナジニル基、フェノチアジニル基、フェノキサチイニル基、フェノキサジニル基、フタラジニル基、プテリジニル基、プリニル基、ピラニル基、ピラジニル基、ピラゾリル基、ピリダジニル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、キナゾリニル基、キノリル基、キノキサリニル基、チアジアゾリル基、チアントレニル基、チアゾリル基、チエニル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基及びキサンテニル基が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施例では、「ヘテロアリール基」という用語は５または６個の環原子を含む単環芳香環で、炭素及び１、２、３または４個のヘテロ原子を含み、ヘテロ原子は独立して、非過酸化酸素、硫黄及びＮ（Ｚ）（式中、Ｚは存在しないかまたはＨ、Ｏ、アルキル基、アリール基または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアリール基から選択される。）別の実施例では、ヘテロアリール基は約８から１０個の環原子を含有するオルト縮合している二環式ヘテロ環、特にベンゾ誘導体またはプロピレン、トリメチレン、若しくはテトラメチレンジラジカルを前記複素環基に縮合させることによって誘導される基を示す。
【００４３】
「ヘテロ環」という用語は酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む飽和または一部不飽和な環系を指し、「置換基」という用語の中に定義されている１個または複数の基で任意に置換されている。ヘテロ環は単環式、二環式または三環式でもよく、１個または複数のヘテロ原子を含む。また、ヘテロ環基は環に結合したオキソ基（＝Ｏ）またはチオキソ基（＝Ｓ）を含んでもよい。ヘテロ環基の非限定的な例として、１、３−ジヒドロベンゾフラン基、１、３−ジオキソラン基、１、４−ジオキサン基、１、４−ジチアン基、２Ｈ−ピラン基、２−ピラゾリン基、４Ｈ−ピラン基、クロマニル基、イミダゾリジニル基、イミダゾリニル基、インドリニル基、イソクロマニル基、イソインドリニル基、モルフォリン基、ピペラジニル基、ピペリジン基、ピペリジル基、ピラゾリジン基、ピラゾリジニル基、ピラゾリニル基、ピロリジン基、ピロリン基、キヌクリジン基及びチオモルホリン基が含まれる。
【００４４】
「ヘテロ環」という用語の例として、限定するものではないが、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，  Ｌｅｏ  Ａ．；  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９６８）の特に第１、３、４、６、７及び９章並びにＴｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  Ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ”  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９５０  ｔｏ  ｐｒｅｓｅｎｔ）の特に第１３、１４、１６、１９及び２８巻並びにｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９６０，  ８２，  ５５６６に記載のヘテロ環の１価ラジカルを含んでもよい。一部の実施例では、「ヘテロ環」には１個または複数（例えば１、２、３または４個）の炭素原子がヘテロ原子（例えばＯ、ＮまたはＳ）と入れ替わった本明細書中に記載の「炭素環」を含む。
【００４５】
ヘテロ環の例として、ジヒドロピリジル基、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）基、チアゾリル基、テトラヒドロチオフェニル基、酸化硫黄テトラヒドロチオフェニル基、ピリミジニル基、フラニル基、チエニル基、ピロリル基、ピラゾリル基、ピペリジニル基、４−ピペリドニル基、ピロリジニル基、２−ピロリドニル基、ピロリニル基、テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロキノリニル基、テトラヒドロイソキノリニル基、デカヒドロキノリニル基、オクタヒドロイソキノリニル基、アゾシニル基、トリアジニル基、６Ｈ−１、２、５−チアジアジニル基、２Ｈ、６Ｈ−１、５、２−ジチアジニル基、チエニル基、チアントレニル基、ピラニル基、イソベンゾフラニル基、クロメニル基、キサンテニル基、フェノキサチイニル基、２Ｈ−ピロリル基、イソチアゾリル基、イソオキサゾリル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、インドリジニル基、イソインドリル基、３Ｈ−インドリル基、１Ｈ−インダゾリル基、プリニル基、４Ｈ−キノリジニル基、フタラジニル基、ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、シンノリニル基、プテリジニル基、カルバゾリル基、β−カルボリニル基、フェナントリジニル基、アクリジニル基、ピリミジニル基、フェナントロリニル基、フェナジニル基、フェノチアジニル基、フラザニル基、フェノキサジニル基、イソクロマニル基、クロマニル基、イミダゾリジニル基、イミダゾリニル基、ピラゾリジニル基、ピラゾリニル基、ピペラジニル基、インドリニル基、イソインドリニル基、キヌクリジニル基、モルホリニル基、オキサゾリジニル基、ベンゾトリアゾリル基、ベンゾイソオキサゾリル基、オキンドリル基、ベンゾオキサゾリニル基、イサチノイル基及びビス−テトラヒドロフラニル基を含むが、限定はされない。
【００４６】
例であり、限定するものではないが、炭素結合型のヘテロ環はピリジンの２、３、４、５若しくは６位、ピリダジンの３、４、５若しくは６位、ピリミジンの２、４、５若しくは６位、ピラジンの２、３、５若しくは６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール若しくはテトラヒドロピロールの２、３、４若しくは５位、オキサゾール、イミダゾール若しくはチアゾールの２、４若しくは５位、イソオキサゾール、ピラゾール若しくはイソチアゾールの３、４若しくは５位、アジリジンの２若しくは３位、アゼチジンの２、３若しくは４位、キノリンの２、３、４、５、６、７若しくは８位またはイソキノリンの１、３、４、５、６、７若しくは８位に結合している。炭素結合型ヘテロ環には２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、５−ピリジル基、６−ピリジル基、３−ピリダジニル基、４−ピリダジニル基、５−ピリダジニル基、６−ピリダジニル基、２−ピリミジニル基、４−ピリミジニル基、５−ピリミジニル基、６−ピリミジニル基、２−ピラジニル基、３−ピラジニル基、５−ピラジニル基、６−ピラジニル基、２−チアゾリル基、４−チアゾリル基、５−チアゾリル基等が含まれる。
【００４７】
例であり、限定するものではないが、窒素結合型ヘテロ環はアジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリル、１Ｈ−インダゾールの１位、イソインドールまたはイソインドリンの２位、モルフォリンの４位及びカルバゾールまたはβ−カルボリンの９位に結合できる。一部の実施例で、窒素結合型ヘテロ環には１−アジリジル基、１−アゼチジル基、１−ピロリル基、１−イミダゾリル基、１−ピラゾリル基及び１−ピペリジニル基が含まれる。
【００４８】
「炭素環」という用語は３から８個の炭素原子を単環として、７から１２個の炭素原子を二環として、約３０個までの炭素原子を多環として有する飽和、不飽和または芳香環を指す。単環式炭素環は通常３から６個の環原子を、さらに典型的には５または６個の環原子を有する。二環式炭素環は、７から１２個の環原子を有し、例えば二環を形成する［４、５］、［５、５］、［５、６］若しくは［６、６］系、または９若しくは１０個の環原子が形成する二環［５、６］若しくは［６、６］系となる。炭素環の例として、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、１−シクロペント−１−エニル基、１−シクロペント−２−エニル基、１−シクロペント−３−エニル基、シクロヘキシル基、１−シクロヘキサ−１−エニル基、１−シクロヘキサ−２−エニル基、１−シクロヘキサ−３−エニル基、フェニル基、スピリル基及びナフチル基が含まれる。上記のアルキル基と同様、炭素環は任意に置換してもよい。
【００４９】
「アルカノイル基」または「アルキルカルボニル基」という用語は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、ここでＲは定義済みのアルキル基である。
【００５０】
「アシルオキシ基」または「アルキルカルボキシ基」という用語は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、ここでＲは定義済みのアルキル基である。アシルオキシ基の例として、アセトオキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイルオキシ基及びペンタノイルオキシ基が含まれるが、これらに限定されない。定義済みの何れのアルキル基もアシルオキシ基の形成に用いてよい。
【００５１】
「アルコキシカルボニル基」という用語は−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（または「ＣＯＯＲ」）を指し、ここでＲは定義済みのアルキル基である。
【００５２】
「アミノ基」という用語は−ＮＨ2を指す。アミノ基は、本明細書中で定義した「置換」という用語に従い、任意で置換してもよい。
【００５３】
「アルキルアミノ基」という用語は−ＮＲ2を指し、ここで少なくとも１つのＲはアルキル基で、二番目のＲはアルキル基または水素である。
【００５４】
「アシルアミノ基」という用語はＮ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、ここで各Ｒは互いに独立して水素、アルキル基またはアリール基である。
【００５５】
「ヒドロキシアルキル基」という用語は−ＯＨで置換されたアルキル基を指す。
【００５６】
「アルキルカルボン酸」という用語は−ＣＯＯＨで置換されたアルキル基である。
【００５７】
「アミノ酸」という用語には、ＤまたはＬ体の天然のアミノ酸残基と同様に非天然アミノ酸（例えば、ベータ−アラニン、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１、２、３、４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、アルファ−メチルアラニン、パラ−ベンゾリルフェニルアラミン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン及びｔｅｒｔ−ブチルグリシン）も含む。この用語には通常のアミノ保護基（例えば、アセチルまたはベンゾイルカルボイル）を有する天然及び非天然アミノ酸に加えて、カルボキシ末端（例えば、（Ｃ1-6アルキル基、フェニル基またはベンジルエステルまたはアミド基）で保護されている天然及び非天然アミノ酸も含む。その他の適切なアミノ及びカルボキシ保護基は当業者に周知である。（参照、例えばＧｒｅｅｎｅ，  Ｔ．Ｗ．；  Ｗｕｔｚ，  Ｐ．Ｇ．Ｍ．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９１）及び本明細書中の引用文献）。アミノ酸側鎖には、アセチル化、モノ−、ジ−、トリ−フルオロアセチル化または１−３ｘメチル化リジン、メチル化ａｒｇ（モノ、対称的ｂｉｓ、非対称的ｂｉｓ）、リン酸化セリン、スレオニンまたはチロシン、脂肪酸アシル化、例えば、ミリストイル化、グリコシル化等、既知の修飾を受けた側鎖を含んでもよい。
【００５８】
「アミノ酸側鎖」という用語は天然または合成に関わらず、定義済みの「アミノ酸」中に存在する全てのアミノ酸側鎖を指す。これは、標準的な２０種の側鎖を含むがこれらに限定されない。
【００５９】
「ペプチド」という用語は２から３５アミノ酸またはペプチジル残基の配列を指す。配列は直鎖状でも環状でもよい。例えば、環状ペプチドは適切なアミド若しくはエステル結合または配列中の２個のシステイン残基間のジスルフィド形成の結果得られることもある。好ましくは、ペプチドは３から２０個または５から１５個のアミノ酸から構成される。ペプチド配列を本明細書中で具体的に記述する場合、アミノ末端を左、カルボキシ末端を右に記載する。
【００６０】
「中断」という用語は他の基が「中断」という用語の表現中に記載のある特定の炭素鎖の２個の隣り合う炭素原子間（及びそれらが結合している水素原子（例えば、メチル（ＣＨ3）、メチレン（ＣＨ2）またはメチン（ＣＨ）））に挿入されたことを示すが、この時、指定された各原子の通常の原子価を超えず、中断により安定な化合物が得られなければならない。炭素鎖の中断に用いるのに好ましい基には、例えば１個または複数の非過酸化オキシ基（−Ｏ−）、チオ基（−Ｓ−）、イミノ基（−Ｎ（Ｈ）−）、メチレンジオキシ基（−ＯＣＨ2Ｏ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ基（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボニルジオキシ基（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボキシラト基（−ＯＣ（＝Ｏ）−）、イミン基（Ｃ＝ＮＨ）、スルフィニル基（ＳＯ）及びスルフホニル基（ＳＯ2）が含まれる。アルキル基は１個または複数（例えば１、２、３、４、５または約６）の前述の適切な基により中断されてもよい。中断部位はアルキル基の炭素原子とアルキル基が結合している炭素原子間でもよい。
【００６１】
特に明記しない限り、「ルシフェラーゼ」という用語は天然由来、組換え型または変異型ルシフェラーゼを指す。ルシフェラーゼが天然由来であった場合、当業者は生体から容易に取得可能である。ルシフェラーゼが天然由来または組換え型若しくは変異型ルシフェラーゼであった場合、すなわち天然のルシフェラーゼのルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の活性を保持したタンパク質はルシフェラーゼをコードする核酸を発現するよう形質転換された細菌、酵母、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞等の培養液から容易に取得可能である。さらに、組換え型または変異型ルシフェラーゼはルシフェラーゼをコードする核酸を使ったｉｎ  ｖｉｔｒｏの無細胞系からも取得可能である。ルシフェラーゼはＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓより入手可能である。
【００６２】
本明細書中で用いる「生物発光」または「発光」とは光を放出する酵素と基質間の反応の結果、発生する光のことである。このような酵素（生物発光酵素）の例には、ホタルルシフェラーゼ（例えばＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓまたはＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｅｎｎｓｌｙｖａｎｉｃａ）、コメツキムシルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ等が含まれる。
【００６３】
「ルシフェラーゼ反応混合液」はルシフェラーゼ酵素及びルシフェラーゼ酵素の光シグナル発生を誘導する物質を含む。発光シグナルを発生させるのに必要な物質の具体的な濃度及び／または量は使用するルシフェラーゼ酵素のみならず、採用するルシフェラーゼ系アッセイの種類によっても変化する。一般的にホタルルシフェラーゼでは、これらの物質はＡＴＰ、マグネシウム（Ｍｇ2+）塩（例えば硫酸マグネシウム）、ホタルルシフェラーゼ酵素（例えば熱安定化ホタルルシフェラーゼ）及びルシフェリンを含んでいる。ルシフェリンはホタルルシフェラーゼの基質として使用すると光を発生できる。多くの場合、反応溶液には適切なｐＨに反応溶液を保つ緩衝剤、ルシフェラーゼ活性を保つための添加物例えばＰＲＩＯＮＥＸまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、還元剤、浄化剤、エステラーゼ、塩、アミノ酸（例えばＤ−システイン）等別の物質を添加してもよい。ルシフェラーゼ反応混合液の例には、熱安定化ホタルルシフェラーゼ、ＭｇＳＯ4、ＡＴＰ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ―９及びトリシンが含まれる。別のルシフェラーゼ反応混合液の例には、ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼ（例えばＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ、）緩衝液（例えばＴｒｉｓ−ＣｌまたはＴｒｉｓ塩基）、及び任意でバックグラウンド低下剤（例えばＴＣＥＰ）を含む。
【００６４】
化合物
本発明は式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）：
2019068817.tif 000040
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000041
各Ｙは互いに独立してハロ基、ＳＯ3Ｈ、Ｃ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
各Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
各Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2が互いに結合し４から８員環を形成し；
ｎは１から６；
２つのＹ置換基は互いに結合し５から７個の環原子を含む環を形成してもよく；及び
少なくとも１つのＹはＯＨまたはＮＲ1Ｒ2の何れかである）で表される化合物を提供する。
【００６５】
本発明の化合物は：
2019068817.tif 000042
を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
別の実施例で本発明は式（ＩＩ）：
2019068817.tif 000043
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000044
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し環を形成する）で表される化合物を提供する。
【００６７】
また、別の実施例で本発明は式（ＩＩＩ）：
2019068817.tif 000045
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000046
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し環を形成する）で表される化合物を提供する。
【００６８】
また、別の実施例で本発明は式（ＩＶ）：
2019068817.tif 000047
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000048
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し環を形成する）で表される化合物を提供する。
【００６９】
別の実施例で本発明は式（Ｖ）：
2019068817.tif 000049
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000050
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し環を形成する）で表される化合物を提供する。
【００７０】
別の実施例で本発明は式（ＶＩ）：
2019068817.tif 000051
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000052
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し環を形成する）で表される化合物を提供する。
【００７１】
追加の実施例で本発明は式（ＶＩＩ）：
2019068817.tif 000053
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000054
各Ｙは互いに独立してＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
各Ｒ1は互いに独立してＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
各Ｒ2は互いに独立してＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合して環を形成する）で表される化合物を提供する。
【００７２】
特定の実施例では、本発明の化合物の発光極大は少なくとも約６５０ｎｍ（約６５５ｎｍ、約６８０ｎｍまたは約７６０ｎｍ。ｎｍ）である。
【００７３】
基質前駆体
本発明は種々の非ルシフェラーゼ酵素の基質及びルシフェラーゼ酵素の基質前駆体となる化合物も提供する。非ルシフェラーゼ酵素として、リダクターゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、シトクロームＰ４５０、ベータ−ラクタマーゼ、グリコシラーゼ及びグルタチオントランスフェラーゼを含むがこれらに限定されない。
【００７４】
一部の実施例では、これらの基質前駆体は置換基を有している。置換基は非ルシフェラーゼ位の基質で、１または複数箇所のＹ位で切断され、
2019068817.tif 000055
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000056
各ＹはＯＨまたはＮＨ2；及び
ｎは１から３である）で表される化合物を形成する。
【００７５】
リダクターゼ基質
一部の実施例で、当該化合物はリダクターゼの基質となる。一部の実施例で、リダクターゼの基質は式：
2019068817.tif 000057
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000058
ＹはＯＲ；
Ｒは
2019068817.tif 000059
ＷはＳ、ＮＲNまたはＯ；
ＺはＳ、ＮＲN、ＯまたはＣＨ；及び
ＲNはＨ、Ｃ1-4アルキル基または置換Ｃ1-4アルキル基である）で表される。
【００７６】
一部の実施例で、リダクターゼの基質は式：
2019068817.tif 000060
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000061
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し４から８員環を形成する）で表される。
【００７７】
一部の実施例で、リダクターゼの基質は式：
2019068817.tif 000062
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000063
ＹはＯＲ；及び
Ｒは
2019068817.tif 000064
で表される。
【００７８】
リダクターゼの基質には以下の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
2019068817.tif 000065
【００７９】
グリコシダーゼ基質
一部の実施例で、当該化合物はグリコシダーゼの基質となる。一部の実施例で、グリコシダーゼの基質は式：
2019068817.tif 000066
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000067
ＹはＯＲ；
Ｒは
2019068817.tif 000068
ＡはＯＲまたはＮＨＡｃ；
各Ｒ5は互いに独立してＨ、単糖または４０ユニットまでのポリエチレングリコール部分である）で表される化合物である。
【００８０】
グリコシダーゼの基質には以下の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
2019068817.tif 000069
【００８１】
プロテアーゼ及びプロテアーゼ依存性タンパク質修飾の基質
一部の実施例で、当該化合物はプロテアーゼまたはプロテアーゼ依存性タンパク質修飾の基質となる。一部の実施例で、基質は式：
2019068817.tif 000070
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000071
ＹはＮＨＲ；
Ｒは
2019068817.tif 000072
Ｒ7はアミノ酸側鎖；
Ｒ6はＨ、窒素保護基または２０アミノ酸までの鎖である）で表される化合物である。
【００８２】
適切な窒素保護基には、当業者に従来周知のＢｏｃ、Ｃｂｚ、Ａｃ及びＦｍｏｃ等が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
これらの基質には以下の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
2019068817.tif 000073
【００８４】
オキシダーゼ基質
一部の実施例で、当該化合物はオキシダーゼの基質となる。一部の実施例で、オキシダーゼの基質は式：
2019068817.tif 000074
（式中、Ｘは−ＣＨ（ＯＲ10）2；
Ｒ10はＣ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ベンジル基または置換ベンジル基；
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し４から８員環を形成する）で表される化合物である。
【００８５】
一部の実施例で、オキシダーゼの基質は式：
2019068817.tif 000075
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000076
ＹはＨまたはＯＲ；及び
ＲはＣ1-10アルキル基、置換Ｃ1-10アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基または置換アラルキル基である）で表される化合物である。
【００８６】
一部の実施例で、オキシダーゼの基質は式：
2019068817.tif 000077
（式中、Ｘは−ＣＨ（ＯＲ10）2；
Ｒ10はＣ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ベンジル基または置換ベンジル基；
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し４から８員環を形成する）で表される化合物である。
【００８７】
オキシダーゼの基質には以下の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
2019068817.tif 000078
【００８８】
カルボキシル系の基質前駆体
一部の実施例で、当該化合物はカルボキシル系の基質前駆体である。一部の実施例で、カルボキシル系基質前駆体は式：
2019068817.tif 000079
（式中、Ｒ8はＣＨ2ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｒ10または−Ｃ（Ｏ）ＺＲ9；
ＺはＯまたはＮＨ；
Ｒ9はＣ1-7アルキル基または置換Ｃ1-7アルキル基；
Ｒ10はペプチド；
ＹはＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は互いに結合し４から８員環を形成する）で表される化合物である。
【００８９】
カルボキシル系基質前駆体には以下の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
2019068817.tif 000080
【００９０】
グルタチオントランスフェラーゼ基質
一部の実施例で、当該化合物はグルタチオントランスフェラーゼの基質でもよい。一部の実施例で、グルタチオントランスフェラーゼの基質は式（：
2019068817.tif 000081
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000082
ＹはＯＲ；
Ｒは
2019068817.tif 000083
各Ｒ11は互いに独立してＨ、Ｃ1-6アルキル基、置換Ｃ1-6アルキル基、ＣＦ3、ハロゲン、ＮＯ2、ＣＯ2Ｒ12または少なくとも１つのＲ11がＮＯ2ならば、隣り合う何れか２個のＲ11は縮合環を形成してもよく；及び
Ｒ12はＨ、Ｃ1-6アルキル基または置換Ｃ1-6アルキル基である）で表される化合物である。
【００９１】
グルタチオントランスフェラーゼの基質には以下の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
2019068817.tif 000084
【００９２】
ベータ−ラクタマーゼ基質
一部の実施例で、当該化合物はベータ−ラクタマーゼの基質となる。一部の実施例で、ベータ−ラクタマーゼの基質は式：
2019068817.tif 000085
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000086
ＹはＯ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ1-7アルキル基）またはＮ（置換Ｃ1-7アルキル基）；
Ｚは存在しないかまたはＯ；
ＡはＣ1-4アルキレン基または置換Ｃ1-4アルキレン基；及び
Ｒ14はＨ、フェナセチル基またはセファロスポリン側鎖である）で表される化合物である。
【００９３】
好ましいセファロスポリン側鎖は当業者に周知のものを含む。
【００９４】
ベータ−ラクタマーゼの基質には以下の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
2019068817.tif 000087
【００９５】
その他の基質前駆体
本発明は、生物学的に重要な過酸化水素などの様々な小分子と反応し、ルシフェラーゼ酵素の基質前駆体にもなる化合物も提供する。一部の実施例で、これらの化合物は過酸化水素反応性である。一部の実施例では、これらの化合物は式：
2019068817.tif 000088
（式中、ＸはＣＮまたは
2019068817.tif 000089
ＹはＬ−Ｒ；
Ｌはリンカー；及び
Ｒはボロン酸またはホウ酸エステルである）で表される。
【００９６】
一部の実施例で、Ｒは−Ｂ（ＯＲ15）2；式中、各Ｒ15は互いに独立してＨ及びＣ1-4アルキル基から選択される。一部の実施例で、Ｒは
2019068817.tif 000090
式中、各Ｒ16及びＲ17は互いに独立してＨ、Ｃ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ＣＦ3、フェニル基若しくは置換フェニル基；またはＲ16及びＲ17は互いに結合して３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成若しくは縮合６員芳香環と置き換えてもよい。
【００９７】
一部の実施例で、リンカーは直接結合している。別の実施例では、リンカーは
2019068817.tif 000091
（式中、Ａは−Ｃ6(Ｒ20）4−、−Ｏ−Ｃ6（Ｒ20）4−または−（ＣＲ21＝ＣＲ21）ｎ−または−Ｓ−Ｃ6（Ｒ20）4−または−ＮＲ’−Ｃ6（Ｒ20）4または直接結合；Ｒ’はＨ、Ｃ1-4アルキル基または置換Ｃ1-4アルキル基；
各Ｒ23は互いに独立してハロ基、Ｈ、Ｃ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル基、置換Ｃ1-4ヒドロキシアルキル基、Ｃ1-4アルキルカルボン酸または置換Ｃ1-4アルキルカルボン酸；
各Ｒ20は互いに独立してＨ、ハロ基、ＣＨ3、ＯＣＨ3またはＮＯ2；
各Ｒ21は互いに独立してＨまたはＣＨ3；
ｎは１または２；及び
Ｘは−Ｏ−、
2019068817.tif 000092
から選択される）である。
【００９８】
これらの化合物には以下の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
2019068817.tif 000093
【００９９】
異性体、塩及び保護形態
ある化合物は１つまたは複数の特定の幾何異性形態、光学異性形態、鏡像異性形態、ジアステレオ形態、エピ体、立体異性形態、互変異性形態、配座異性形態またはアノマー形態で存在し得る。これらの形態にはシス−及びトランス−型；Ｅ−及びＺ−型；ｃ−、ｔ−及びｒ−型；エンド及びエクソ−型；Ｒ−、Ｓ−及びメソ−型；Ｄ−及びＬ−型、ｄ−及びｌ−型；（＋）及び（−）型；ケト−、エノール−及びエノラート−型；シン−及びアンチ−型；シンクリナル−及びアンチクリナル−型、α−及びβ−型；アキシアル及びエクアトリアル型；ふね−、いす−、ツイスト−、封筒−、半いす型；及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されず、以下「異性体」（または「異性体型」）と総称する。
【０１００】
ここで留意すべきは、互変異性形態についての以下の記載を除き、構造（または構造）異性体（すなわち、空間中の原子の位置のみが異なるのではなく、原子間の結合が異なる異性体）は、本明細書で使用する「異性体」という用語から明確に除外される。例えば、メトキシ基（−ＯＣＨ3）への言及は、その構造異性体であるヒドロキシメチル基（−ＣＨ2ＯＨ）への言及とは解釈されない。同様に、オルト−クロロフェニル基への言及は、その構造異性体であるメタ−クロロフェニル基への言及とは解釈されない。しかし、ある分類の構造への言及は同分類の構造異性体を含む（例えば、Ｃ1-7アルキル基にはｎ−プロピル基及びイソ−プロピル基が含まれ；ブチル基にはｎ−、ｉｓｏ−、ｓｅｃ−及びｔｅｒｔ−ブチル基が含まれ；メトキシフェニル基にはオルト−、メタ−及びパラメトキシフェニル基が含まれる）。
【０１０１】
ここで留意すべきは、「異性体」という用語は１つまたは複数の同位体で置換された化合物を明確に含むということである。例えば、Ｈは1Ｈ、2Ｈ（Ｄ）及び3Ｈ（Ｔ）を含む何れの同位体でもよく；Ｃは12Ｃ、13Ｃ及び14Ｃを含む何れの同位体でもよく；Ｏは16Ｏ及び18Ｏを含む何れの同位体でもよく；他も同様である。
【０１０２】
特筆しない限り、特定の化合物への言及はこのような全ての異性体を含み、（完全なまたは部分的な）それらのラセミ及び他の混合物も含む。このような異性体の調製方法（例えば非対称合成）及び分離方法（例えば、断片的結晶化及びクロマトグラフィー手法）は当業界で周知であるか、または本明細書に記載の方法若しくは既知の方法を既知の様式を用いて容易に実施できる。
【０１０３】
特筆しない限り、特定の化合物への言及は以下に説明のあるように、例えばそれらのイオン、塩、溶媒または保護基も含む。当該活性化合物に対応する塩、例えば薬剤的に許容できる塩は調製、精製及び／または処理を行うのに簡便または好ましいことがある。薬剤的に許容できる塩の例はＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ，ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６：１―１９（１９７７）に記載されている。
【０１０４】
例えば、化合物が陰イオン性、または陰イオン性になり得る官能基（例えば、−ＣＯＯＨは−ＣＯＯ−になり得る）を持っている場合、適切な陽イオンと共に塩を形成できる。適切な無機陽イオンの例として、アルカリ金属イオン（Ｎａ+若しくはＫ+など）、アルカリ土類陽イオン（Ｃａ2+若しくはＭｇ2+など）及びＡｌ3+等のその他の陽イオンが含まれるが、これらに限定されない。適切な有機陽イオンの例として、アンモニウムイオン（すなわちＮＨ4+）及び置換アンモニウムイオン（例えばＮＨ3Ｒ+、ＮＨ2Ｒ2+、ＮＨＲ3+、ＮＲ4+）が含まれるが、これらに限定されない。一部の適切な置換アンモニウムイオンの例はエチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン及びトロメタミンのみならず、リジン及びアルギニン等のアミノ酸から誘導されるものである。第四級のアンモニウムイオンの一般例はＮ（ＣＨ3）4+である。
【０１０５】
化合物が陽イオン性、または陽イオン性になり得る官能基（例えば、−ＮＨ2は−ＮＨ3+になり得る）を持っている場合、適切な陰イオンと共に塩を形成できる。適切な無機陰イオンの例として、以下の無機酸からの誘導されるものが含まれるが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸及び亜リン酸。適切な有機陰イオンの例として、以下の有機酸から誘導されるものが含まれるが、これらに限定されない：酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、パルミチン酸、乳酸、リンゴ酸、パモ酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、安息香酸、ケイ皮酸、ピルビン酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、フェニルスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、パントテン酸、イセチオン酸、吉草酸、ラクトビオン酸及びグルコン酸。適切な高分子陰イオンの例として、以下の高分子酸から誘導されるものが含まれるが、これらに限定されない：タンニン酸、コルボキシメチルセルロース。
【０１０６】
当該活性化合物に対応する溶媒和化合物は調製、精製及び／または処理を行うのに簡便または好ましいことがある。本明細書中で「溶媒和化合物」という用語は、慣習的な意味で使用され、溶質（例えば、活性化合物、活性化合物の塩）及び溶媒の錯体を意味する。溶媒が水の場合、溶媒和化合物は通常、水和物、例えば一水和物、二水和物、三水和物等を意味する。
【０１０７】
当該活性化合物は化学的保護形態で調製、精製及び／または処理を行うと簡便または好ましいことがある。本明細書中で使用する「化学的保護形態」という用語は１つまたは複数の反応性官能基が保護されている基または保護基（マスクされている基若しくはマスク基、またはブロックされている基若しくはブロック基とも称される）の形態で意図しない化学反応から保護されている化合物に関連している。反応性官能基を保護することで、その保護された基に影響を及ぼすことなく、他の保護されていない反応性官能基が関与する反応を行うことができる；保護基は通常、当該分子の残りの部分に実質的な影響を及ぼすことなく、その後のステップで除去することができる。例えばＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｗｕｔｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９９）を参照されたし。
【０１０８】
例えば、ヒドロキシ基はエーテル（−ＯＲ）またはエステル（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ）として保護できる。例えば、ｔ−ブチルエーテル；ベンジル、ベンズヒドリル（ジフェニルメチル）若しくはトリチル（トリフェニルメチル）エーテル；トリメチルシリル若しくはｔ−ブチルジメチルシリルエーテル；またはアセチルエステル（−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ3、−ＯＡｃ）として保護できる。例えばアルデヒドまたはケトン基は、例えば、第一級アルコールと反応させることにより、カルボニル基（＞Ｃ＝Ｏ）をジエーテル（＞Ｃ（ＯＲ）2）に変換させ、それぞれ、アセタールまたはケタールとして保護することができる。酸の存在下で大過剰量の水を用いて加水分解させることにより、アルデヒドまたはケトン基を容易に再生させることができる。例えば、アミン基は、例えばアミドまたはウレタンとして保護できる。例えば、メチルアミド（−ＮＨＣＯ−ＣＨ3）；ベンジルオキシアミド（−ＮＨＣＯ−ＯＣＨ2Ｃ6Ｈ5、−ＮＨＣｂｚ）；ｔ−ブトキシアミド（−ＮＨＣＯ−ＯＣ（ＣＨ3）3、−ＮＨ−Ｂｏｃ）として；２−ビフェニル−２−プロポキシアミド（−ＮＨＣＯ−ＯＣ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ4Ｃ6Ｈ5、−ＮＨ−Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシアミド（−ＮＨ−Ｆｍｏｃ）として、６−ニトロベラトリルオキシアミド（−ＮＨ−Ｎｖｏｃ）として、２−トリメチルシリルエチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｔｅｏｃ）として、２、２、２−トリクロロエチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｔｒｏｃ）として、アリルオキシアミド（−ＮＨ−Ａｌｌｏｃ）として、２（−フェニルスルホニル）エチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｐｓｅｃ）として；または適切な場合には窒素酸化物として保護できる。
【０１０９】
例えば、カルボン酸基は、エステルとして保護できる。例えば、Ｃ1-7アルキルエステル（例えば、メチルエステル；ｔ−ブチルエステル）；Ｃ1-7ハロアルキルエステル（例えば、Ｃ1-7トリハロアルキルエステル）；トリＣ1-7アルキルシリル−Ｃ1-7アルキルエステル；若しくはＣ5-20アリール−Ｃ1-7アルキルエステル（例えば、ベンジルエステル、ニトロベンジルエステル）；またはアミドとして（例えば、メチルアミドとして）保護できる。
【０１１０】
例えば、チオール基は、チオエーテル（−ＳＲ）として保護できる。例えば、ベンジルチオエーテル；またはアセトアミドメチルエーテル（−Ｓ−ＣＨ2ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ3）として保護できる。
合成
2019068817.tif 000094
【０１１１】
一般的な合成方法をスキーム１に示す。適宜置換された２−ナフトエ酸はアシルアジドへの変換とそれに続く２−ナフチルアミンへのクルシウス転位により、２−ナフチルアミンに変換することができる。芳香族求電子ハロゲン化反応はハロゲン置換基を優先的に１位の位置に導入する。アッペル塩処理に続くヨウ化銅による結晶化により２、１−ナフトチアゾール骨格が得られ、当該化合物は続いて、穏和な水性条件下でＤ−システインと反応し、ルシフェリン基質となる。
【０１１２】
当業者には理解可能であるが、本明細書記載の化学式で表される化合物を合成する代替方法は当業者に明白である。さらに、様々な合成ステップは所望の化合物を得るため、順序や順番を変えて行ってもよい。本明細書記載の化合物を合成するのに有用な合成化学変換及び保護基方法論（保護及び脱保護）は当業界で周知であり、例えばＲ．  Ｌａｒｏｃｋ，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （１９８９）；  Ｔ．  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．  Ｗｕｔｓ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｄ．  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９１）；Ｌ．  Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆｉｅｓｅｒ，  Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９４）；及びＬ．  Ｐａｑｕｅｔｔｅ，  ｅｄ．，  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９５）並びにこれらの続版に記載されているものを含む。
【０１１３】
化合物の利用
本発明の化合物はルシフェラーゼ基質（例えばルシフェリン）が用いられる全ての方法に利用可能である。例えば、サンプル中の１個または複数の分子（例えば、酵素、酵素反応のコファクター、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性化剤若しくはＯＨラジカル）または１つ若しくは複数の条件（例えば、酸化還元条件）を検出するルシフェリンアナログを用いた生物発光法に利用可能である。サンプルには動物（例えば、脊椎動物）、植物、真菌類、生理液（例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌等）、細胞、細胞溶解物、細胞の培養上清、細胞の精製分画（例えば、細胞内分画）が含まれる。当該分子の存在、量、スペクトル分布、発光速度論または比活性を検出または定量可能である。当該分子は多相性溶液を含む溶液中（例えば、乳濁液若しくは懸濁液）または固相担体上（例えば、粒子、毛細管若しくはアッセイ容器）で検出または定量化できる。一部の実施例で、ルシフェリン誘導体は光学系アッセイにおいて目的の酵素（例えば、ＣＹＰ４５０酵素、ＭＡＯ  ＡまたはＢ酵素、カスパーゼ等）を検出するために用いることができる。
【０１１４】
一部の実施例で、ルシフェリンの誘導体は特定の生化学的な活動（例えば、アポトーシス及び薬剤代謝）のプローブとして用いることができる。一部の実施例で、目的の特定の酵素によって作用を受けることができる「ルシフェリン前駆体」または「基質前駆体」を用いることによって、ルシフェリン濃度は特定の酵素活性と対応する。一部の実施例で、ルシフェリン前駆体はルシフェラーゼと混合しても直接発光を促すことはできない分子だが、目的の特定の酵素の触媒作用を受けることにより、ルシフェリンへ変換される。一部の実施例で、当該手法は薬剤代謝に関与する酵素（例えば、シトクロームＰ４５０酵素、モノアミンオキシダーゼ及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）及びアポトーシス（例えば、カスパーゼ）等で利用できる。例えば、本発明のルシフェリン誘導体は６’−Ｏ−メチル基等の切断可能な基を導入し、改変することができる。一部の実施例で、ルシフェリン前駆体は特定のシトクロームＰ４５０酵素とインキュベートすると、６’Ｏ−メチル基が切断され、ルシフェラーゼにより検出可能なルシフェリンへと変換される。一部の実施例で、ルシフェリン前駆体は発光を促すために必要な他の成分と混合され、単一試薬の均一なアッセイとして提供される。例えば、サンプルに試薬を添加した際に、ルシフェリン前駆体がルシフェリンへ変換され発光が起こる。様々な実施例で、他の酵素、小分子または他の細胞プロセスについて同様のアッセイがルシフェリン前駆体からルシフェリンへの変換と結び付けて開発されている。
【０１１５】
本発明のルシフェリン誘導体は、シトクロームＰ４５０酵素、プロテアーゼまたはグリコシダーゼ等の非発光酵素の存在または活性を検出するためのアッセイ試薬として使用できる。発光酵素を用いたアッセイ及びそれらの基質は当業者に周知である。例えば、発光酵素、発光反応混合液及び非発光酵素の基質であるルシフェリン誘導体を非発光酵素が含まれることが疑われるサンプルに添加することができる。サンプル中に当該非発光酵素が存在する場合、ルシフェリン誘導体は当該非発光酵素による作用を受け、光学シグナルを発生させる光学酵素によって認識可能な基質へと変換される。反対に、非発光酵素により発光原ルシフェリン誘導体を非発光形態へと変換させることもできる（すなわち、シグナル消失アッセイ）。
【０１１６】
ルシフェリン誘導体は発光酵素より前または同時にサンプルへ添加できる。特定の実施例で、サンプルは細胞でもよい。細胞は、真核細胞（例えば、酵母、鳥、植物、昆虫若しくはヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、馬、ネコ、羊、ヤギ若しくは豚細胞を含むがこれらに限定されない哺乳類細胞等）若しくは原核細胞、若しくは２種類以上の異なる生物由来の細胞またはそれらの細胞溶解液若しくは培養上清でもよい。細胞は組換技術により遺伝子組み換えされていてもよい。ある特定の態様では、細胞は動物（例えばトランスジェニック動物）または生理学的流体（例えば、血液、血漿、尿、粘液分泌等）の中に存在していてもよい。
【０１１７】
サンプルは検出対象となる非発光酵素を複数含んでいてもよい。一部の実施例で、複数の光学酵素を用いてもよい。さらに、複数の基質を用いてもよい。複数の基質及び／または発光酵素は複数の非発光酵素またはその他の目的の分子（例えば、試験化合物）を同時に（例えば、複数反応系において）検出するために利用できる。
【０１１８】
ルシフェリン誘導体はｉｎ  ｓｉｔｕ細胞分析法としても利用できる。ルシフェラーゼを用いた細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ分析を行う方法は当業界で周知であり、例えばＵ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，９９８，２０４を参照されたい。ルシフェリン誘導体は非発光酵素に暴露されるまでは発光酵素の基質ではない。しかし、当該非発光酵素に暴露されると、誘導体は発光酵素存在下の発光反応において速やかに検出される化合物へと変換される。従って、ｉｎ  ｓｉｔｕイメージングにより非発光酵素の細胞内存在部位を特定できる。これは、発光酵素を発現している細胞とルシフェリン誘導体を接触させることで行える。
【０１１９】
反対に、発光酵素遺伝子を発現しているトランスジェニック動物には、目的の特定の非発光酵素の基質であるルシフェリン誘導体を投与できる。さらに、イメージング技術（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ生体光イメージング）を用いれば、生きたままの無傷の動物の体内で発光酵素が発現している部位における発光測定にも使用できる。従って、発光酵素を発現しているトランスジェニック動物にルシフェリン誘導体を投与し、目的の適切な非発光酵素が発現している組織中で発光酵素の基質に変換させることも可能である。発光酵素が当該組織においても発現している場合、発光シグナルが生成され、何れかの適切な方法により検出できる。よって、例えば薬剤のような試験化合物を動物を用いたアッセイで評価できる。試験化合物はルシフェリン誘導体の前に投与しておかなくてはならない。反対に、トランスジェニック動物由来の組織は組織学的アッセイで使用できる。
【０１２０】
一部の実施例で、非トランスジェニック動物に、目的の特定の非発光酵素の基質であるルシフェリン誘導体を投与してもよい。当該誘導体は適切な非発光酵素が発現している組織中で、発光酵素の基質に変換される。生物学的サンプル（例えば、血液、血清、胆汁、尿、糞便または組織）を当該動物から採取し、発光酵素と接触させる。得られるシグナルは何れかの適切な方法により検出できる。よって、例えば薬剤のような試験化合物を動物を用いたアッセイで評価できる。試験化合物はルシフェリン誘導体の前に投与しておかなくてはならない。
【０１２１】
一部の実施例で、候補薬等の試験化合物をスクリーニングに供し、例えば、（１）非ルシフェラーゼ酵素の基質、（２）非ルシフェラーゼ酵素の制御因子（例えば、阻害剤、誘導剤若しくは活性化剤）または（３）細胞状態の調整剤（例えば、生存率、反応性酸素類の増加若しくは還元ポテンシャルの増加）としての活性を評価できる。ルシフェリン誘導体は非ルシフェラーゼ酵素の基質と阻害剤を見分けるためにも使用できる。当該スクリーニングはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの何れかで行うことができる。
【０１２２】
さらに、本明細書記載の全ての生物発光原アッセイは、他の試薬を反応混合液に添加してもよく、当該試薬には、ルシフェラーゼの不活性化を阻害若しくは防止するもの、または発光シグナルを延長若しくは増強させるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
キット
本発明はキットも提供する。キットは以下のものを１種または複数含んでもよい：少なくとも１つは本発明由来であるルシフェリン誘導体、非ルシフェラーゼ酵素、ルシフェリン依存的発光酵素及び反応緩衝液。反応緩衝液は非ルシフェラーゼ酵素反応及び発光酵素反応に対してそれぞれ別の配合でもよく、または単一ステップのアッセイにおいては単一の配合でもよい。本発明のキットは非ルシフェラーゼ酵素の阻害剤、活性化剤及び／または増強剤も含んでもよい。本発明のキットはアッセイの陽性及び／または陰性対照も含んでもよい。
【０１２４】
本発明は以下の非限定的な実施例でさらに説明される。
【実施例】
【０１２５】
全ての化学物質はＳｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈまたはＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａから購入し、それ以上の精製は行わずに使用した。アッペル塩及び６−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−ナフトエ酸は既報に従い合成した。（参照、Ｃｉｉａｄｒｏ，  Ａ．  Ｍ，；  Ａｉｖａｒｅｚ―Ｂｕｉｌｌａ，  ｊ，  ４，５−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ―１，２，３−ｄｉｔｈｉａｚｏｌｈｉｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（アッペル塩）：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＩＮ―ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９４，  ５０（３３），  １００３７―１００４６及びＣｈｏ，  Ｓ．  ｊ．；  Ａｂｎ，  Ｙ．−Ｈ．；  Ｍａｉｔｉ，  Ｋ．  Ｋ．；  Ｄｉｎｉｓｈ，  Ｕ．  Ｓ．；  Ｆｕ，  Ｃ．  Ｙ．；  Ｔｂｏｎｉｙｏｔ，  Ｐ．；  Ｏｉｉｖｏ，  Ｍ，；  Ｃｈａｎｇ，  Ｙ．−Ｔ．  Ｃｈｅｍ  Ｃｏｒａｍ  ２０１０，  ４６，  ７２２―７２４．何れも参照することで本明細書に組み込まれる）。６−メトキシ−２−ナフチルアミンの調製は既に報告されているが、６−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−ナフチルアミンと同様の方法でも作製可能である。シリカゲルクロマトグラフィーはＴｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ  Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈシステムを用いて行った。ＮＭＲスペクトルはＶａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ３００  ＭＨｚシステムを用い、溶媒のピークを内部標準として測定した。反応はＥＺＣｈｒｏｍｅソフトウェアにより制御したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズの分析用ＨＰＬＣで分析し、分取用ＨＰＬＣはＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステムを用いて、流速２０ｍｌ／分、記載の線形勾配により、２５４ｎｍ及び３６０ｎｍの２波長で検出した（１”Ｃ１８シリカカラム）。
【０１２６】
実施例１。２−（７−ヒドロキシナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−イル）−４、５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸の合成
１−ブロモ−６−メトキシ−２−ナフチルアミン。６−メトキシ−２−ナフチルアミン（４００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＭｅＣＮに１２ｍｇのＮＨ4ＯＡｃ（０．１６ｍｍｏｌ）と共に懸濁し、氷浴内で撹拌した。Ｎ−ブロモスクシンイミド（２９９ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を６ｍＬの乾燥ＭｅＣＮに溶解させたが、１時間かけてゆっくりと添加した。反応溶液をさらに１時間０℃で撹拌し、その後セライトに吸着させ、減圧下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーに供し、ヘプタン中０−＞６０％ＥｔＯＡｃで溶出して３００ｍｇの橙色の固体を得た。７．９４  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．５５  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．１８  （ｄｄ，  １  Ｈ）；  ７．０９  （ｄ），  １  Ｈ）；  ７．０２  （ｄ，  １  Ｈ）；  ４．２９  （ｂｒ  ｓ，  ２  Ｈ）；  ３．８９  （ｓ，  ３  Ｈ）。
【０１２７】
７−メトキシナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル。１−ブロモ−６−メトキシ−２−ナフチルアミン（２９０ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中で撹拌し、アッペル塩（２５２ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２４時間撹拌後、反応溶液をＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄後、Ｎａ2Ｓ０4で乾燥しセライト上に吸着させた。シリカゲルクロマトグラフィーでヘプタン中０−＞４０％ＥｔＯＡｃで溶出し得られた２２８ｍｇの所望の付加体は、ピリジン５ｍＬ中に溶解し、１６８ｍｇ（０．８８２ｍｍｏｌ）のＣｕＩで処理した。反応溶液を１．５時間加熱還流し、セライト上に吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィーにおいてヘプタン中０−＞４０％ＥｔＯＡｃで溶出し、所望の生成物６３ｍｇを得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ2Ｃｌ2）  ｄ  ８．１２  （ｄ，  １）  Ｈ）；  ８．０１  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．９４  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．３９  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．３５  （ｄｄ，  １  Ｈ）；  ３．９９  （ｓ，  ３  Ｈ）。
【０１２８】
７−ヒドロキシナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル。７−メトキシナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（８８ｍｇ、０．３６６ｍｍｏｌ）を３ｇのピリジン塩酸塩に懸濁し、撹拌子の入った５−ｍＬマイクロ波バイアル内に密封した。混合物を２２０℃で２５分間照射し、１Ｎ塩酸に溶解後、ＤＣＭ及びＥｔＯＡｃの混合物で３回抽出した。濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。lＨ  ＮＭＲ  （ＣＤ2Ｃｌ2）  ｄ  ８．１０  （ｄ，  １  Ｈ）；  ８．０３  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．８８  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．３９  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．３１  （ｄｄ，  １  Ｈ）；
【０１２９】
２−（７−ヒドロキシナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−イル）−４、５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸。７−ヘトキシナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（３５ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液をＤ−システイン（５４ｍｇ、０．３０９ｍｍｏｌ）及びＫ2Ｃ０3（５４ｍｇ、０．３９１ｍｍｏｌ）を含む水溶液で処理した。室温で２０分間撹拌後、反応溶液にＡｃＯＨを加えて中和し、得られた生成物を分取用ＨＰＬＣに供し、１０ｍＭ水溶性ＮＨ4ＯＡｃ中５−＞９５％ＭｅＣＮの濃度勾配で溶出し、単離した。適切な分画を減圧化で濃縮した後、凍結乾燥した。1Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６／ＭｅＣＮ−ｄ３）  ｄ  ８．５３  （ｄ，  １  Ｈ）；  ８．４８  （ｄ，  １）  Ｈ）；  ８．３１  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．８２−７．８６  （ｍ，  ２  Ｈ）；  ５．７７  （ｄｄ，）  １  Ｈ）；  ４．３３  （ｄｄ，  １  Ｈ）；  ４．１９  （ｄｄ，  １  Ｈ）。
【０１３０】
実施例２。２−（７−アミノナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−イル）−４、５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸。
ｔｅｒｔ−ブチル（６−（アジドカルボニル）ナフタレン−２−イル）カルバマート。２０ｍＬのＤＣＭ中の２−（ｔ−ブチルカルバモイル）アミノ−６−ナフトエ酸（１．３５ｇ、４．７ｍｍｏｌ）を氷浴中で撹拌した。ＤＭＦ（０．２ｍＬ）を添加後、塩化オキサリル（４２０ｕＬ、６３０ｍｇ、４．９ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。４５分後、反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣をアセトンに溶解した。アジ化ナトリウム（９１６ｍｇ、１４．１ｍｍｏｌ）をＨ2Ｏ中の溶液として添加し、得られた反応溶液を１５分間撹拌した。さらにＨ2Ｏを加えて所望の生成物を析出させ、濾過により分離してややピンク色の固体１．２６を得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  ９．８１  （ｓ，  １  Ｈ）；  ８．５１  （ｓ，  １  Ｈ）；  ８．１９  （ｄ），  １  Ｈ）；  ８．０４  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．８４―７．９１  （ｍ，  ２  Ｈ）；  ７．５９  （ｄｄ），  １  Ｈ）；  １．５０  （ｓ，  ９  Ｈ）
【０１３１】
ｔｅｒｔ−ブチル（６−アミノアフタレン−２−イル）カルバミン酸。トルエン７５ｍＬ中のｔｅｒｔ−ブチル（６−（アジドカルボニル）ナフタレン−２−イル）カルバミン酸（２．７ｇ、８．６４ｍｍｏｌ）を２時間加熱還流した。水溶性ＮａＯＨの６Ｍ溶液（１０ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）を添加し、反応溶液を７２時間加熱還流した。室温まで冷却した反応溶液を濾過した。濾液を３ｘＥｔＯＡｃで抽出し、有機層を混合し、Ｎａ2Ｓ０4で乾燥及び蒸発させ、ややピンク色の固体１．６２ｇを得た。生成物は、シリカゲルクロマトグラフィーにおいて、ヘプタン中０−＞６０％ＥｔＯＡｃの濃度勾配で溶出させることによって、さらに精製することができた。1Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ２Ｃ１２）  ｄ  ７．８０  （ｂｒ  ｓ，  １）  Ｈ）；  ７．５８  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．５２  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．２７  （ｄｄ，  １  Ｈ）；  ６．９２―６．９８  （ｍ，  ２  Ｈ）；  ６．５９  （ｂｒ  ｓ，  ２Ｈ）；  １．５３  （ｓ，  ９  Ｈ）。
【０１３２】
ｔｅｒｔ−ブチル（６−アミノ−５−ブロモナフタレン−２−イル）カルバミン酸。ｔｅｒｔ−ブチル（６−アミノナフタレン−２−イル）カルバミン酸（１．３１ｇ、５．０７ｍｍｏｌ）を酢酸アンモニウム（３９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）と共にＭｅＣＮ中、氷浴中で撹拌した。Ｎ−ブロモスクシンイミド（９４８ｍｇ、５．３２ｍｍｏｌ）を追加のＭｅＣＮ中で溶解させ、１時間かけてゆっくりと添加した。０℃で１時間撹拌を継続し、その後セライトを加えた。減圧下で溶媒を除去後、シリカゲルクロマトグラフィーによりヘプタン中０−＞５０％ＥｔＯＡｃの濃度勾配で溶出させ、生成物（１．３３ｇ、７８％）を単離した。1ＮＭＲ  （ＣＤ2Ｃｌ2）  ｄ  ７．９４  （ｄ，  １Ｈ）；  ７．８９  （ｂｒ  ｄ，  １  Ｈ）；  ７．５８  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．３８  （ｄｄ，  １  Ｈ）；  ７．０２  （ｄ，  １  Ｈ）；  ６．６６  （ｂ）ｒ  ｓ，  １  Ｈ）；  ４．３５  （ｂｒ  ｓ，  ２  Ｈ）；  １．５４  （ｓ，  ９）  Ｈ）。
【０１３３】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−シアノナフト［２、１−ｄ］チアゾール−７−イル）カルバミン酸。ｔｅｒｔ−ブチル（６−アミノ−５−ブロモナフタレン−２−イル）カルバミン酸（５４０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）溶液を乾燥ＤＣＭ中で撹拌し、アッペル塩３５１ｍｇ（１．６８ｍｍｏｌ）を添加した。反応終了後、反応溶液はＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥後、蒸発させた。このようにして得られた租精製品をピリジン１０ｍＬに溶解し、５２９ｍｇ（２．７８ｍｍｏｌ）のＣｕＩで処理した。反応溶液を１１０℃の油浴中で４０分間加熱後、減圧下で溶媒を除去した。得られた固体をＥｔＯＡｃに溶解し、濾過した。濾液を１Ｎ塩酸で洗浄し、水層は２ｘＥｔＯＡｃで抽出して、混合した有機層はＮａ2ＳＯ4で乾燥させた。減圧下で溶媒を除去後、シリカゲルクロマトグラフィーに供し、ヘプタン中１５−＞３５％ＥｔＯＡｃで溶出させ、１４８ｍｇの黄色の固体を得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ2Ｃ１2）  ｄ  ８．２１  （ｄ），  １  Ｈ）；  ８．１２  （ｄ，  １  Ｈ）；  ８．０３  （ｄ），  １  Ｈ）；  ７．９６  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．６４  （ｄｄ，  １  Ｈ）；  ６．９０  （ｂｒ  ｓ），  １  Ｈ）；  １．５５  （ｓ，  ９）  Ｈ）。
【０１３４】
７−アミノナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル。２ｍＬのＤＣＭ中、ｔｅｒｔ−ブチル（２−シアノナフト［２、１−ｄ］チアゾール−７−イル）カルバミン酸（７２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）及びチオアニソール（０．５ｍＬ）を氷浴中で撹拌した溶液に、トリフルオロ酢酸２ｍＬを添加した。１時間後、反応溶液は減圧下で濃縮し、得られた生成物（４７ｍｇ、９４％）をシリカゲルクロマトグラフィーによりヘプタン中０−＞７５％ＥｔＯＡｃで溶出させ、単離した。1Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ2Ｃ１2）  ｄ  ８．０１  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．９０  （ｄｔ，  １  Ｈ）；  ７．７６  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．０９―７．１６  （ｍ，  ２）  Ｈ）。
【０１３５】
２−（７−アミノナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−イル）−４、５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸。７−アミノナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（２４ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液をＤ−システイン（４１ｍｇ、０．２３３ｍｍｏｌ）及びＫ2ＣＯ3（４５ｍｇ、０．３２６ｍｍｏｌ）を含む水溶液で処理した。室温で２０分間撹拌後、生成物は分子用ＨＰＬＣにてより１０ｍＭ水溶性ＮＨ4ＯＡｃ中５−＞１００％ＭｅＣＮの濃度勾配で溶出させ、生成物を単離した。適切な分画を減圧下で濃縮した後、凍結乾燥し、１２ｍｇの黄色の固体を得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  ｄ  ７．７７―７．８７  （ｍ，  ２  Ｈ）；  ７．５９  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．０１  （ｄｄ，  １  Ｈ）；  ６．９４  （ｄ，  １  Ｈ）；  ５．６９  （ｂｒ  ｓ，  ２）  Ｈ）；  ５．１８  （ｔ，  １  Ｈ）；  ３．５７―３．６８  （ｍ，  ２）  Ｈ）。
【０１３６】
実施例３。２−（７−ヒドロキシナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−イル）−４、５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸メチルエステルの合成。
２−（７−ヒドロキシナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−イル）−４、５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸メチルエステル。２−（７−ヒドロキシナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−イル）−４、５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸（８ｍｇ、２４ｕｍｏｌ）をＭｅＣＮとＭｅＯＨの混合物に懸濁し、ＴＦＡを添加してｐＨ＜３まで酸性化した。得られた溶液を、黄色が消えなくなるまで、ジアゾメタンのエーテル溶液で処理した。過剰量のジアゾメタンをＡｃＯＨの添加により中和して、エーテルを減圧下で除去し、分取用ＨＰＬＣにおいて、ＮＨ4ＯＡｃ中５−＞１００％ＭｅＣＮで溶出させ、凍結乾燥を行い、所望の生成物（３．３ｍｇ）を黄色の固体として得た。Ｃ16Ｈ13Ｎ2Ｏ3Ｓ2（Ｍ＋Ｈ）の計算値；：３４５．０、実測値：３４５。
【０１３７】
実施例４。２−（７−（ロイシル）アミノナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−イル）−４、５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸の合成。
７−（Ｂｏｃ−ロイシル）アミノナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル。ドライアイス−エチレングリコール浴中でＢｏｃ−保護ロイシン（１０８ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ５ｍＬに溶解し、まずＮ−メチルモルホリン（１００ｕＬ、０．９３ｍｍｏｌ）で処理した後、イソブチルクロロ炭酸塩（５０ｕＬ、０．５１ｍｍｏｌ）で処理した。反応溶液を１５分間間撹拌し、５ｍＬのＴＨＦに入った７−アミノナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（７０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液を氷浴に移し、７２時間撹拌を続け、その間室温まで上昇した。反応溶液をＤＣＭで希釈して１Ｎ塩酸で洗浄し、水層を２ｘＤＣＭで抽出した後、有機層をまとめてＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、セライトに吸着させた。ヘプタン中、０−＞６０％ＥｔＯＡｃで溶出させ、シリカゲルにより精製し、１１７ｍｇの所望の生成物を得た。1ＮＭＲ  （ＣＤ2Ｃ１2）  ｄ  ８．７５  （ｂｒ  ｓ，  １  Ｈ）；  ８．４０  （ｓ，  １  Ｈ）；  ８．０９  （ｄ，  １  Ｈ）；  ８．０１  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．９３  （ｄ，  １  Ｈ）；  ７．７０  （ｄ），  １  Ｈ）；  ５．００  （ｂｒ  ｓ，  １  Ｈ）；  ４．２９  （ｂｒ  ｓ，  １  Ｈ）；  １．７２−１．８７  （ｍ，  ２  Ｈ）；  １．５６―１．６６  （ｍ，  １  Ｈ）；  １．４８  （ｓ，  ９  Ｈ）；  １．０１  （ｐｓｅｕｄｏ  ｔｒ，  ６）  Ｈ）。
【０１３８】
２−（７−（ロイシル）アミノナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−イル）−４、５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸。７−（Ｂｏｃ−ロイシル）アミノナフト［２、１−ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（６９ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を０．５ｍｌのチオアニソール及び１．５ｍＬのＤＣＭと混合し、氷浴中で撹拌した。トリフルオロ酢酸（１．５ｍＬ）を添加し、ＨＰＬＣで反応をモニターした。１時間後、減圧下で溶媒を除去後、残った残渣をエーテルですりつぶした。得られた固体をＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏに溶解し、Ｄ−システイン塩酸塩水和物（５５ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（５５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）で処理した。２０分間後、反応溶液を濾過し、分取用ＨＰＬＣにおいて０．１％ギ酸中２−＞５０％ＭｅＣＮで溶出させ、生成物を分離した。Ｃ21Ｈ23Ｎ4Ｏ3Ｓ2（Ｍ＋Ｈ）の計算値：４４３．１、実測値：４４３。
【０１３９】
実施例５：ＰＢＩ−５０４４のアミノペプチダーゼ滴定
ルシフェリン検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｖ８５９Ａ）の凍結乾燥バイアルに１０ｍｌの１００ｍＭＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．５／１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4を添加し、３０分間、室温で平衡化させた。
【０１４０】
ロイシン−ルシフェリンの２０ｕＭ溶液及びＰＢＩ−５０４４の２０ｕＭ溶液をｌ００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ溶液で調製した。さらに、ＰＢＩ−５０４４の２０ｕＭ溶液を２ｕＭ及び０．２ｕＭ溶液にＨＥＰＥＳ／Ｐｒｉｏｎｅｘ溶液を用いて段階希釈した。
【０１４１】
１Ｕ／ｍｌロイシン−アミノペプチダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を各ルシフェリン希釈液（２０ｕＭ  ロイシン−ルシフェリン、２０ｕＭ  ＰＢＩ−５０４４、２ｕＭ  ＰＢＩ−５０４４または０．２ｕＭ  ＰＢＩ−５０４４）で段階希釈（図１）した。例えば、５０ｕｌの１Ｕ／ｍｌロイシン−アミノペプチダーゼを４５０ｕｌのルシフェリン希釈液に添加した（ロイシン−アミノペプチダーゼの終濃度は０．１Ｕ／ｍｌ）。さらに、１５０ｕｌのロイシン−アミノペプチダーゼ溶液を３５０ｕｌの各ルシフェリン誘導体の調製液に添加し、ロイシン−アミノペプチダーゼを段階希釈した。
【０１４２】
３連で、各段階希釈ロイシン−アミノペプチダーゼ／ルシフェリンサンプル５０ｕｌを白色９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３３５５）のウェルに添加し、平衡化されたルシフェリン検出試薬５０ｕＬを各サンプルに添加した。発光はＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により５分毎、９０分間、室温で検出した。
【０１４３】
図１はアミノルシフェリンコントロールのロイシン付加体（ロイシン−ルシフェリン；黒丸）またはアミノイソナフトルシフェリンのロイシン付加体（ＰＢＩ−５０４４；灰色の正方形）の生物発光応答を添加アミノペプチダーゼの関数として示す。図２はアミノペプチターゼに対するロイシニルアミノイソナフトルシフェリンのＫｍを示す。これらの結果、発光ペプチジル基質前駆体の実施形態及びプロテアーゼ活性の測定においてその有益な利用が示された。
【０１４４】
実施例６：ロイシン−ルシフェリン及びＰＢＩ−５０４４の多重分析
ルシフェリン検出試薬の凍結乾燥バイアル（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｖ８５９Ａ）に１０ｍｌの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５／１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4溶液を添加（ＬＤＲ）し、３０分間、室温で平衡化させた。
【０１４５】
１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５及び０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘを含む溶液で、アミノペプチダーゼを０．０１ｕ／ｍｌまで希釈した。アミノペプチダーゼ希釈液で以下の溶液を調製した：
１．２０ｕＭロイシン−ルシフェリン、
２．２０ｕＭ  ＰＢＩ−５０４４、
３．２０ｕＭロイシン−ルシフェリン／２０ｕＭ  ＰＢＩ−５０４４
【０１４６】
３連で、５０ｕｌの上記の各混合物（１−３）を５０ｕｌのＬＤＲに添加し、１５分間インキュベートした。発光はＧｌｏＭａｘ（商標登録）  ９６  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒに６３０  ｌｏｎｇ  ｐａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｅｄｍｏｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  ２５３２５３）及び５２５  ｓｈｏｒｔ  ｐａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｅｄｍｏｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  ８４６９４）を装着し、測定した。
【０１４７】
図３はルシフェリンとアミノイソナフトルシフェリン（ＰＢＩ−５０４４）の生物発光の分離にフィルターが与える影響を示している。これらの結果から、ルシフェリン基質（緑光を放出する）及び本発明の基質は多重分析可能であることが示された。すなわち、同一サンプルに添加しても、お互いからの阻害をほとんど受けずにそれぞれの発光を検出可能であった。
【０１４８】
実施例７：ＰＢＩ−５０４５の生物発光へのエステラーゼの影響
エステラーゼを含む再構築用緩衝液（１０ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｖ１４４Ａ）及びルシフェリン検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｖ８５９Ａ）を混合し、室温で３０分間インキュベートした（「ルシフェリン検出試薬」）。ＵｌｔｒａＧｌｏ（商標登録）ルシフェラーゼ（５．７ｍｇ／ｍｌを２１０ｕｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ）を３ｍｌｓのルシフェリン検出試薬にさらに添加した。
【０１４９】
１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4溶液で、ＰＢＩ−５０４５（イソナフトルシフェリンメチルエステル）の段階希釈水溶液を作製した。５０ｕｌの各ＰＢＩ−５０４５段階希釈液を白色の９６穴アッセイプレートのウェルに添加した（ｎ＝６）。そして、５０ｕｌのルシフェリン検出試薬またはＵｌｔｒａＧｌｏ（商標登録）ルシフェラーゼ含有ルシフェリン検出試薬の何れかを当該ウェルに添加した。発光はＧｌｏＭａｘ（商標登録）Ｍｕｌｔｉ＋ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により検出した。
【０１５０】
図４Ａ及び４ＢはエステラーゼがＰＢＩ−５０４５に与える影響を示す。図４Ａは発光（ＲＬＵｓ）を表し、図４Ｂはバックグラウンドに対する発光比を示す。これらの結果、発光性のエステル基質前駆体の実施様態及びプロテアーゼ活性の測定においてその有益な利用が示された。
【０１５１】
実施例８：細胞毒性評価
本実施例では、ＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３の細胞毒性をＨｅＬａ細胞にて評価した。
【０１５２】
ＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３を５ｍＭの濃度で、１０％血清を含むＤＭＥＭで調製した後、培養液で２倍段階希釈した。滴定シリーズをＨｅＬａ単層に添加し、３７℃でインキュベートした。２４時間で、基質を含む培地を無血清ＤＭＥＭと交換し、製造業者の指示に従い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ（商標登録）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にて毒性（ＡＴＰ）を測定した。
【０１５３】
これらの結果、ＰＢＩ−４８１３及び４７３９はＤ−ルシフェリンと同等の細胞毒性プロファイルを示した（図５）。Ｄ−ルシフェリンは生きた動物のイメージング実験に一般的に用いられる試薬で、本条件では無毒性であると一般的には考えられている。このデータより、生きた動物のイメージングに使用された場合、ＰＢＩ−４８１３及びＰＢＩ−４７３９も動物で良好な耐容性を示すことが示唆された。
【０１５４】
実施例９：雌のＣＤ−１マウスにおけるＰＢＩ−４７３９及びＰＢＩ−４８１３の単回投与の耐容性
本実施例では、雌のＣＤ−１マウスにおけるＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３の耐容性を異なる投与量で評価し、Ｄ−ルシフェリンと比較した。
【０１５５】
ＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３を３種類の用量で単回腹腔内投与し、Ｄ−ルシフェリンの３種類の用量と比較した。当該動物は臨床症状、行動変化及び生存について５日間モニターした。体重は毎日モニターした。死体解剖はＰＢＩ−４７３９、ＰＢＩ−４８１３、Ｄ−ルシフェリンの最も用量の高かったグループ及び溶媒のみのグループ（ＤＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で行った。動物は平均体重２７．４＋１．６［ＳＤ］である６週齢の雌のＣＤ−１マウス４０匹を用いた。
【０１５６】
表１は投与量グループを示す。各グループは４匹の動物が含まれる。
2019068817.tif 000095
【０１５７】
実験条件下、何れの動物においても試験化合物に関連する有害事象は観察されなかった。図６−１０は臨床徴候及び動物行動のデータ（図６）、生存率（図７）、体重（グラム；図８）、体重（％；図９）及び解剖結果（図１０）を示す。
【０１５８】
実施例１０：ＰＢＩ−４７３９及びＰＢＩ−４８１３のスペクトル解析
ＰＢＩ−４７３９及びＰＢＩ−４８１３のスペクトル解析のために、ＡＴＰを１ｍＭの濃度でＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｅ２６４Ａ）に添加した。ＰＢＩ−４７３９及びＰＢＩ−４８１３（１００ｍＭ  ＤＭＳＯ保存）をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで１：１００に希釈した（終濃度１ｍＭ）。５０ｕｌの各基質を５０ｕｌのＣｌｉｃｋ  Ｂｅｅｔｌｅ  Ｒｅｄ精製酵素（０．５ｍｇ／ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に３連で添加した後、サンプルをＴｅｃａｎ  Ｍ―１０００のスペクトルスキャンモードを用いて４７３９は２ｎｍ間隔、４８１３は５ｎｍ間隔で測定した。
【０１５９】
図１４は２つの基質のスペクトルデータを表し、それらの近ＩＲ特性を示している。
【図１】
2019068817.tif 000140
【図２】
2019068817.tif 000141
【図３】
2019068817.tif 000142
【図４】
2019068817.tif 000143
【図５】
2019068817.tif 000144
【図６】
2019068817.tif 000145
【図７】
2019068817.tif 000146
【図８】
2019068817.tif 000147
【図９】
2019068817.tif 000148
【図１０】
2019068817.tif 000149
【図１１】
2019068817.tif 000150
【図１２】
2019068817.tif 000151
【図１３】
2019068817.tif 000152
【図１４】
2019068817.tif 000153
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月27日(2018.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック動物中の発光を検出する方法であって、
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び／又は（Ｉｃ）：
2019068817.tif 000154
2019068817.tif 000155
2019068817.tif 000156
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000157
各Ｙは、互いに独立してハロ基、ＳＯ3Ｈ、Ｃ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
各Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
各Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に４〜８員環を形成し；
ｎは１〜６；
２つのＹ置換基は、互いに結合して、５〜７個の環原子を含む環を形成してもよく；及び
少なくとも１つのＹは、ＯＨまたはＮＲ1Ｒ2の何れかである）
で表される化合物を、トランスジェニック動物に投与する工程、及び
発光を検出する工程
を含み、該トランスジェニック動物が、ルシフェラーゼを発現していることを特徴とする方法。
【請求項２】
少なくとも１つのＹが、ＯＨである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのＹが、ＮＲ1Ｒ2である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
芳香環が、１個のＯＨまたはＮＲ1Ｒ2及び５個以下のハロ基により置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ハロ基が、フルオロ基である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ハロ基が、クロロ基である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのＹが、ＳＯ3Ｈである、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
トランスジェニック動物中の発光を検出する方法であって、
式（ＩＩ）：
2019068817.tif 000158
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000159
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に環を形成する）
で表される化合物を、トランスジェニック動物に投与する工程、及び
発光を検出する工程
を含み、該トランスジェニック動物が、ルシフェラーゼを発現していることを特徴とする方法。
【請求項９】
トランスジェニック動物中の発光を検出する方法であって、
式（ＩＩＩ）：
2019068817.tif 000160
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000161
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に環を形成する）
で表される化合物を、トランスジェニック動物に投与する工程、及び
発光を検出する工程
を含み、該トランスジェニック動物が、ルシフェラーゼを発現していることを特徴とする方法。
【請求項１０】
トランスジェニック動物中の発光を検出する方法であって、
式（Ｖ）：
2019068817.tif 000162
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000163
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に環を形成する）
で表される化合物を、トランスジェニック動物に投与する工程、及び
発光を検出する工程
を含み、該トランスジェニック動物が、ルシフェラーゼを発現していることを特徴とする方法。
【請求項１１】
トランスジェニック動物中の発光を検出する方法であって、
式（ＶＩ）：
2019068817.tif 000164
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000165
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に環を形成する）
で表される化合物を、トランスジェニック動物に投与する工程、及び
発光を検出する工程
を含み、該トランスジェニック動物が、ルシフェラーゼを発現していることを特徴とする方法。
【請求項１２】
トランスジェニック動物中の発光を検出する方法であって、
式（ＶＩＩ）：
2019068817.tif 000166
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000167
各Ｙは、互いに独立してＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
各Ｒ1は、互いに独立してＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
各Ｒ2は、互いに独立してＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、互いに結合して環を形成する）
で表される化合物を、トランスジェニック動物に投与する工程、及び
発光を検出する工程
を含み、該トランスジェニック動物が、ルシフェラーゼを発現していることを特徴とする方法。
【請求項１３】
Ｘが、ＣＮである、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｘが、
2019068817.tif 000168
である、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｙが、ＮＲ1Ｒ2である、請求項８〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｙが、ＯＨである、請求項８〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｙが、ＮＨ2である、請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
図１４は２つの基質のスペクトルデータを表し、それらの近ＩＲ特性を示している。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕式（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び（Ｉｃ）：
2019068817.tif 000169
2019068817.tif 000170
2019068817.tif 000171
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000172
各Ｙは、互いに独立してハロ基、ＳＯ3Ｈ、Ｃ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
各Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
各Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に４〜８員環を形成し；
ｎは１〜６；
２つのＹ置換基は、互いに結合して、５〜７個の環原子を含む環を形成してもよく；及び
少なくとも１つのＹは、ＯＨまたはＮＲ1Ｒ2の何れかである）
で表される化合物。
〔２〕少なくとも１つのＹが、ＯＨである、前記〔１〕に記載の化合物。
〔３〕少なくとも１つのＹが、ＮＲ1Ｒ2である、前記〔１〕または〔２〕に記載の化合物。
〔４〕芳香環が、１個のＯＨまたはＮＲ1Ｒ2及び５個以下のハロ基により置換されている、前記〔１〕に記載の化合物。
〔５〕ハロ基が、フルオロ基である、前記〔４〕に記載の化合物。
〔６〕ハロ基が、クロロ基である、前記〔４〕に記載の化合物。
〔７〕少なくとも１つのＹが、ＳＯ3Ｈである、前記〔１〕〜〔３〕の何れか１項に記載の化合物。
〔８〕式（ＩＩ）：
2019068817.tif 000173
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000174
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に環を形成する）
で表される化合物。
〔９〕式（ＩＩＩ）：
2019068817.tif 000175
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000176
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に環を形成する）
で表される化合物。
〔１０〕式（Ｖ）：
2019068817.tif 000177
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000178
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に環を形成する）
で表される化合物。
〔１１〕式（ＶＩ）：
2019068817.tif 000179
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000180
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に環を形成する）
で表される化合物。
〔１２〕式（ＶＩＩ）：
2019068817.tif 000181
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000182
各Ｙは、互いに独立してＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；
各Ｒ1は、互いに独立してＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；及び
各Ｒ2は、互いに独立してＨ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、互いに結合して環を形成する）
で表される化合物。
〔１３〕Ｘが、ＣＮである、前記〔１〕〜〔１２〕の何れか１項に記載の化合物。
〔１４〕Ｘが、
2019068817.tif 000183
である、前記〔１〕〜〔１２〕の何れか１項に記載の化合物。
〔１５〕Ｙが、ＮＲ1Ｒ2である、前記〔８〕〜〔１４〕の何れか１項に記載の化合物。
〔１６〕Ｙが、ＯＨである、前記〔８〕〜〔１４〕の何れか１項に記載の化合物。
〔１７〕Ｙが、ＮＨ2である、前記〔１〕〜〔１５〕の何れか１項に記載の化合物。
〔１８〕サンプル中の発光を検出する方法であって、
サンプルを、前記〔１〕〜〔１７〕の何れか１項に記載の化合物と接触させる工程、
該サンプルを、ルシフェラーゼと接触させる工程（それが該サンプル中に存在していない場合）、及び、
発光を検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
〔１９〕前記サンプルが、生細胞を含む、前記〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕前記サンプルが、ルシフェラーゼを含む、前記〔１８〕及び〔１９〕の何れか１項に記載の方法。
〔２１〕トランスジェニック動物中の発光を検出する方法であって、
前記〔１〕〜〔１７〕の何れか１項に記載の化合物を、トランスジェニック動物に投与する工程、及び、
発光を検出する工程
を含み、該トランスジェニック動物が、ルシフェラーゼを発現していることを特徴とする方法。
〔２２〕
式（ＩＸ）：
2019068817.tif 000184
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000185
Ｙは、ＯＲ；
Ｒは、
2019068817.tif 000186
Ｗは、Ｓ、ＮＲNまたはＯ；
Ｚは、Ｓ、ＮＲN、ＯまたはＣＨ；及び
ＲNは、Ｈ、Ｃ1-4アルキル基または置換Ｃ1-4アルキル基である）
で表される化合物。
〔２３〕式（Ｘ）：
2019068817.tif 000187
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000188
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に４〜８員環を形成する）
で表される化合物。
〔２４〕式（ＸＩ）：
2019068817.tif 000189
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000190
Ｙは、ＯＲ；及び
Ｒは、
2019068817.tif 000191
である）
で表される化合物。
〔２５〕式（ＸＩＩ）：
2019068817.tif 000192
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000193
Ｙは、ＯＲ；
Ｒは、
2019068817.tif 000194
Ａは、ＯＲまたはＮＨＡｃ；
各Ｒ5は、互いに独立してＨ、単糖または４０ユニットまでのポリエチレングリコール部分である）
で表される化合物。
〔２６〕式（ＸＩＩＩ）：
2019068817.tif 000195
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000196
Ｙは、ＮＨＲ；
Ｒは、
2019068817.tif 000197
Ｒ7は、アミノ酸側鎖；
Ｒ6は、Ｈ、窒素保護基または３５アミノ酸までの鎖である）
で表される化合物。
〔２７〕式（ＸＩＶ）：
2019068817.tif 000198
（式中、Ｘは、−ＣＨ（ＯＲ10）2；
Ｒ10は、Ｃ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ベンジル基または置換ベンジル基；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に４〜８員環を形成する）
で表される化合物。
〔２８〕式（ＸＶ）：
2019068817.tif 000199
（ＸＶ）
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000200
Ｙは、ＨまたはＯＲ；及び
Ｒは、Ｃ1-10アルキル基、置換Ｃ1-10アルキルアリール基、置換アリール基、アラルキル基または置換アラルキル基である）
で表される化合物。
〔２９〕式（ＸＶＩ）：
2019068817.tif 000201
（式中、Ｘは、−ＣＨ（ＯＲ10）2；
Ｒ10は、Ｃ1-4アルキル基、置換Ｃ1-4アルキル基、ベンジル基または置換ベンジル基；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に４〜８員環を形成する）
で表される化合物。
〔３０〕式（ＸＶＩＩ）：
2019068817.tif 000202
（式中、Ｒ8は、ＣＨ2ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｒ10または−Ｃ（Ｏ）ＺＲ9；
Ｚは、ＯまたはＮＨ；
Ｒ9は、Ｃ1-7アルキル基または置換Ｃ1-7アルキル基；
Ｒ10は、ペプチド；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2；及び
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキル基または置換Ｃ1-10アルキル基；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒に４〜８員環を形成する）
で表される化合物。
〔３１〕式（ＸＶＩＩＩ）：
2019068817.tif 000203
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000204
Ｙは、ＯＲ；
Ｒは、
2019068817.tif 000205
各Ｒ11は、互いに独立してＨ、Ｃ1-6アルキル基、置換Ｃ1-6アルキル基、ＣＦ3、ハロゲン、ＮＯ2、ＣＯ2Ｒ12、または、少なくとも１つのＲ11がＮＯ2の場合は隣り合う何れか２個のＲ11は縮合環を形成してもよく；及び
Ｒ12は、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基または置換Ｃ1-6アルキル基である）
で表される化合物。
〔３２〕式（ＸＩＸ）：
2019068817.tif 000206
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000207
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ1-7アルキル基）またはＮ（置換Ｃ1-7アルキル基）；
Ｚは、存在しないかまたはＯ；
Ａは、Ｃ1-4アルキレン基または置換Ｃ1-4アルキレン基；及び
Ｒ14は、Ｈ、フェナセチル基またはセファロスポリン側鎖である）
で表される化合物。
〔３３〕式（ＸＸ）：
2019068817.tif 000208
（式中、Ｘは、ＣＮまたは
2019068817.tif 000209
Ｙは、Ｌ−Ｒ；
Ｌは、リンカー；及び
Ｒは、ボロン酸またはホウ酸エステルである）
で表される化合物。
〔３４〕非ルシフェラーゼ酵素の存在または量を検出する方法であって、
該酵素を含む可能性のあるサンプルを、前記〔２２〕〜〔３３〕の何れか１項に記載の化合物と接触させる工程、
該サンプルに、ルシフェラーゼ反応混合液を添加する工程、及び、
該サンプル中の発光を検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
〔３５〕前記発光が定量化される、前記〔３４〕に記載の方法。
〔３６〕非ルシフェラーゼ酵素の存在をｉｎ  ｖｉｖｏで検出する方法であって、
前記〔２２〕〜〔３３〕の何れか１項に記載の化合物を、トランスジェニック動物に投与する工程、及び、
発光を検出する工程
を含み、該トランスジェニック動物が、ルシフェラーゼを発現していることを特徴とする方法。
〔３７〕非ルシフェラーゼ酵素の存在を検出する方法であって、
前記〔２２〕〜〔３３〕の何れか１項に記載の化合物を、動物に投与する工程、
該動物からサンプルを採取する工程、
該サンプルに、ルシフェラーゼ反応混合液を添加する工程、及び、
該サンプルの発光を検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
〔３８〕前記酵素が、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、シトクロームＰ４５０（ＣＹＰ４５０）、フラビンモノアミンオキシダーゼ（ＦＭＯ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ベータ−ラクタマーゼまたはプロテアーゼから選択される、前記〔３４〕〜〔３７〕の何れか１項に記載の方法。
〔３９〕前記サンプルが、前記化合物よりも前または同時に試験化合物と接触する、前記〔３４〕〜〔３８〕の何れか１項に記載の方法。
〔４０〕前記試験化合物が、前記非ルシフェラーゼ酵素の阻害剤、前記非ルシフェラーゼ酵素の誘導因子、前記非ルシフェラーゼ酵素の基質および前記非ルシフェラーゼ酵素の活性化剤からなる群から選択される、前記〔３９〕に記載の方法。
〔４１〕非ルシフェラーゼ酵素の調節因子をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、
（ａ）細胞を試験化合物と接触させる工程、
（ｂ）前記〔２２〕〜〔３３〕の何れか１項に記載の化合物を添加し、混合物を形成する工程、（ｃ）該混合物に、ルシフェラーゼ反応混合液を添加する工程、および、
（ｄ）発光を検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
〔４２〕前記〔１〕〜〔１７〕または〔２２〕〜〔３３〕の何れか１項に記載の化合物を含む、キット。
〔４３〕ルシフェラーゼをさらに含む、前記〔４２〕に記載のキット。
〔４４〕緩衝試薬をさらに含む、前記〔４２〕または前記〔４３〕に記載のキット。
〔４５〕
2019068817.tif 000210
2019068817.tif 000211
2019068817.tif 000212
からなる群から選択される化合物。
【外国語明細書】
2019068817000001.pdf