(57)【要約】【課題】  川崎病を診断及び／又は治療する新規バイオマーカーの使用方法を提供する。【解決手段】  本発明の新規バイオマーカーは、非川崎病個体と比較して、川崎病個体での一部のＣｐＧ遺伝子座のシトシンメチル化状態の変化を示す。さらに、川崎病を検出するため、一部のＣｐＧ遺伝子座のシトシンメチル化状態の変化に特異的な少なくとも１つのプライマー又は試薬を含むキットを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）個体からのサンプルにおけるＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５から選択される少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのシトシンメチル化状態を検出するステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）での少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのシトシンメチル化が対照サンプル又は非川崎病サンプルのメチル化より低い場合、前記個体が川崎病に罹患したと特定されるステップと、
を含むことを特徴とする、個体における川崎病を検出するための方法。
【請求項２】
ヘプシジンの発現レベルを測定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヘプシジンの発現レベルをＥＬＩＳＡ又はリアルタイムＰＣＲを用いて測定することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルは、生検材料、血液、血漿、血清、リンパ液、リンパ組織、脳脊髄液、骨髄、唾液、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記シトシンメチル化状態の検出のステップは、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＣＰ）、メチル化−ＣｐＧアイランド回収アッセイ（ＭＩＲＡ）、重亜硫酸塩制限分析（ＣＯＢＲＡ）、パイロシークエンス、一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）分析、制限分析及びマイクロアレイ分析からなる群から選択される１つ又は複数の方法を用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５から選択される少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのシトシンメチル化状態を特異的に検出する少なくとも１つのプライマー又は試薬を備えることを特徴とする、川崎病を診断するためのキット。
【請求項７】
前記プライマー又は試薬は、ＤＮＡ重合（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、ＤＮＡハイブリダイゼーション工程（ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）又はＤＮＡ重亜硫酸塩変換工程に使用されることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記プライマー又は試薬は、亜硫酸水素ナトリウム、メチル化感受性酵素、メチル化依存性制限酵素又はＰＣＲ試薬であることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
【請求項９】
ヘプシジンの発現レベルを測定する試薬をさらに備えることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
【請求項１０】
前記試薬は、ＥＬＩＳＡキット又はリアルタイムＰＣＲであることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
【請求項１１】
（ａ）個体からのサンプルにおけるＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５から選択される少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのシトシンメチル化状態を検出するステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）での少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのシトシンメチル化が対照サンプル又は非川崎病サンプルのメチル化より低い場合、前記個体が川崎病に罹患したと特定されるステップと、
（ｃ）川崎病の治療薬を投与するステップと、
を含むことを特徴とする、個体における川崎病を治療するための方法。
【請求項１２】
ヘプシジンの発現レベルを測定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年１１月２１日に出願された米国特許出願第６２／５８９，３４５号の利益を主張し、その内容全体を参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、ＣｐＧジヌクレオチドでのシトシン低メチル化による川崎病の検出方法及び川崎病の治療方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
川崎病（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＫＤ）とは、病因不明の皮膚粘膜リンパ節症候群（ｍｕｃｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）とも称し、小血管と中血管の両方の血管壁（血管炎症）、特に冠状動脈に影響を与える小児急性血管炎症候群である。アジア人の子供たちに川崎病の発生率は、アメリカやヨーロッパの子供たちの１０倍以上である。
【０００４】
川崎病の初期症状や明らかな症状は、５日以上続く発熱である。治療しなければ、冠状動脈拡張、瘻孔形成、冠状動脈瘤（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ａｎｅｕｒｙｓｍｓ，  ＣＡＡ）および心筋梗塞を含む重篤な冠状動脈合併症につながることがある。発熱から１０日以内に川崎病を検出できれば、免疫グロブリン大量点滴静注療法（ＩＶＩＧ）により冠動脈病変の発生率を２０〜２５％から３〜５％に大幅に低下させることができる。
【０００５】
川崎病の診断は、アメリカ心臓協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ＡＨＡ）が２００４に提案された診断基準に基づいて、５日以上続く発熱、両眼の非化膿性結膜炎（ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｎｏｎｓｕｐｐｕｒａｔｉｖｅ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、粘膜の変化、手足の硬結血管性浮腫（ｉｎｄｕｒａｔｉｖｅ  ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈａｎｄｓ  ａｎｄ  ｆｅｅｔ）、不定形発疹（ｄｙｓｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｓｋｉｎ  ｒａｓｈｅｓ）及び直径が１．５ｃｍ以上の急性の非化膿性頸部のリンパ節腫脹（ａｃｕｔｅ  ｎｏｎｐｕｒｕｌｅｎｔ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）という臨床診断が主な診断基準であるが、川崎病に対する実験室診断法が未だに確立されていない。
【０００６】
しかし、ＡＨＡの基準は日本循環器学会のガイドラインと若干異なるので、川崎病の臨床診断が複雑になっている。また、伝染性疾病、例えばブドウ球菌又はレンサ球菌の感染は川崎病の症状に類似することもある。故に、臨床医師は、罹患した小児の川崎病を正確に診断して、且つ冠動脈疾患の予防のためにＩＶＩＧを速やかに投与することが困難である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、安価且つ正確な川崎病に対する実験室診断法の需要に応じて、これら及び他の需要を満たすために提出したものである。
【０００８】
一実施例では、本発明に開示された個体における川崎病を検出するための方法は、（ａ）個体からのサンプルにおけるＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５から選択する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのシトシンメチル化状態を検出するステップと、（ｂ）前記個体は、対照サンプルと比較して、ステップ（ａ）での少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのシトシン低メチル化を有する場合、個体が川崎病に罹患したと特定されるステップとを含む。
【０００９】
もう一つの実施例では、本発明に開示された個体における川崎病を検出するための方法は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２又はそれらの組合せから選択されるＣｐＧジヌクレオチドのシトシンメチル化状態を検出するステップと、（ｂ）ヘプシジン（ｈｅｐｃｉｄｉｎ）の発現レベルを測定するステップとを含む。
【００１０】
もう一つの実施例では、本発明に開示された川崎病に罹患した個体を治療するための方法は、本文に開示された方法により個体が川崎病に罹患したと特定されるステップと、川崎病の治療薬を投与するステップとを含む。
【００１１】
本発明は、個体における川崎病を検出するためのキットも開示され、そのキットは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５から選択される少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのシトシンメチル化状態を特異的に検出する少なくとも１つのプライマー又は試薬を備える。
【００１２】
本発明は、個体における川崎病を検出するためのキットも開示され、そのキットは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２又はそれらの組合せのＣｐＧジヌクレオチドのシトシンメチル化状態を特異的に検出する少なくとも１つのプライマー又は試薬と、ヘプシジンの発現レベルを測定するための試薬とを備える。
【００１３】
本発明は、さらに川崎病を検出するための本文に記述したキットの使用を提供する。
【００１４】
本発明は、個体における川崎病検出用キットを製造するための少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのシトシンメチル化状態を検出するプライマー又は試薬の使用も提供する。そのＣｐＧジヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５から選択されるものである。
【００１５】
本出願で用いる「発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、「当該発明（ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、「この発明（ｔｈｉｓ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」及び「本発明（ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、本出願の全ての主題及び後述する特許請求の範囲を代表することを意図するものである。これらの用語を含む記載は、本出願の主題又は後述する特許請求の範囲の解釈や範囲を限定するものではない。本出願における本発明の実施形態は、発明の概要に定義されるものではなく、後述する特許請求の範囲に定義されるものである。発明の概要は、本発明の様々な態様の上位概念であり、さらに後述する発明を実施するための形態に係る概念を導入するためのものである。発明の概要は、請求される主題の重要又は必要な特徴を特定する、または請求される主題の範囲を単独で判断することを意図するものではない。本出願の主題は、明細書全体、いずれ又は全ての図面、及び特許請求の範囲の適切な部分を参照して理解されるべきである。
【００１６】
本発明は、添付の図面を参照して、下記の詳細な説明からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の例示的な実施例は、以下の図面を参照して、詳細に説明する。
【図１】図１は、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ  （Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  ＵＳＡ）により熱性対照サンプル１８例、ＩＶＩＧ治療前の川崎病サンプル１８例及びＩＶＩＧ治療後の川崎病サンプル１８例におけるｃｇ２３６７７０００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）、ｃｇ０４０８５４４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）、ｃｇ１７９０７５６７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）、ｃｇ２６２８３０５９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）、ｃｇ２７２７３０３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）、ｃｇ２３０６３９００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）、ｃｇ０００２９６４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）、ｃｇ  ０４６６８５１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）、ｃｇ１８１４９６５７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）のＣｐＧジヌクレオチドの相対的なメチル化レベルを分析する棒グラフである。「＊＊＊」、「＊＊」及び「＊」は、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５をそれぞれ示す。
【図２】図２は、標的特異的なＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐにより熱性対照サンプル１１３例、ＩＶＩＧ治療前の川崎病サンプル９２例及びＩＶＩＧ治療後の川崎病サンプル１６例におけるｃｇ２３６７７０００及びｃｇ０４０８５４４７のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルを分析する棒グラフである。「＊＊＊」は、ｐ＜０．００１を示す。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡのＢｉｏ−Ｐｌｅｘシステムにより非川崎病の熱性対照（ｎ＝１１３）、ＩＶＩＧ治療前の川崎病サンプル９２例及びＩＶＩＧ治療後の川崎病サンプル１６例における血漿ヘプシジンのレベルを分析する棒グラフである。各点は一個体を示す。「＊」は、ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ  ｔｅｓｔを用いてｐ＜０．０５を示す。
【図４Ａ】〜
【図４Ｂ】図４は、血漿ヘプシジンのレベルがＤＮＡメチル化レベルと負の相関を示すように、それぞれｃｇ２３６７７０００及びｃｇ０４０８５４４７でのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルと血漿ヘプシジンのレベルとの散布図である（ピアソンの積率相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ））（それぞれＮ＝２０９，Ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本出願で用いる「一（ａ）」及び「一（ａｎ）」という用語は、１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）の態様を指す。
【００１９】
「個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、疑似の川崎病を患う脊椎動物を指す。個体としては、温血動物、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類動物、好ましくはヒトである。非ヒト霊長類も個体に含まれる。「個体」という用語は、飼育動物、例えば、猫、犬等、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモット等）が含まれる。
【００２０】
本文に使用される「サンプル（ｓａｍｐｌｅ）」という用語は、被検材料を含む組成物を指し、例えば、疑似の川崎病を患うヒト又は他の哺乳動物などの生体からの任意の材料を指す「生物学的サンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅ）」が含まれる。生物学的サンプルは、例えば、組織、細胞、細胞ペレット、細胞抽出物、外科用サンプル、生検又は細針吸引生検などの固体材料を含む任意の形態であってもよく、又は尿、全血、血漿又は血清などの生物学的液体、又は唾液などの、個体からの任意の他の液体サンプルであってもよい。
【００２１】
遺伝子に適用される「メチル化レベル（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ）」という用語は、ＣｐＧコンテキストに存在する１つ又は複数のシトシン残基がメチル化基を有するか否かを指す。メチル化レベルは、サンプルにおいてシトシンのＣ５位又はＮ４位にメチル化基を有するか否かの細胞部分を指す。ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は、非コード転写制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）又は関連遺伝子のイントロン及びエクソンを含むコード配列に存在することができる。
【００２２】
「低メチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）」という用語は、正常対照ＤＮＡサンプルにおいて対応のＣｐＧジヌクレオチドに発現する５−ｍＣｙｔの量に対して、試験ＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列内の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドでの５−ｍＣｙｔの存在の減少に対応する平均メチル化状態を指す。
【００２３】
ＣｐＧ遺伝子座（ＣｐＧ  ｌｏｃｕｓ）という用語は、ＣｐＧジヌクレオチド又はＣｐＧ部位を称する。
【００２４】
本発明における全ての数字は、「約」という用語で修飾することができると理解される。本発明に使用される「約」という用語は、特定の値±１５％の偏差を含むことを指す。
【００２５】
（川崎病の診断方法）
本発明の一部は、特定ＣｐＧジヌクレオチドの差異メチル化レベルに基づき、川崎病を予測する。本発明の一部の実施例は、個体が川崎病を有するか又は川崎病の発症リスクを有するかどうかを診断するための方法である。その方法は、（ａ）個体のサンプルからのゲノムＤＮＡを、表１に示されるメチル化と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別する少なくとも１つの試薬又は一連の試薬と接触させるステップと、（ｂ）個体のレベルは、非川崎病又は対照サンプルと比較して、表１に示される少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド又は遺伝子座のより低いメチル化レベルを有する場合、当該個体が川崎病を患う又は川崎病の発症リスクを有すると特定されるステップとを含む。
【００２６】
もう一つの実施例では、前記方法は、個体から生物学的サンプルを得るステップと、個体からのサンプル中のＤＮＡ領域内の少なくとも１つのシトシンのメチル化レベルを測定するステップとを含む。そのＤＮＡ領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であり、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５からなる群から選択される配列を含む。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
一実施例では、以下のＣｐＧ遺伝子座の少なくとも１つのメチル化レベルの減少（本明細書に記載又は当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる）は、当該個体が川崎病を患う又は川崎病の発症リスクを有することを示す：ｃｇ２３６７７０００、ｃｇ０４０８５４４７、ｃｇ１７９０７５６７、ｃｇ２６２８３０５９又はｃｇ２７２７３０３３。もう一つの実施例では、（本文に記載の任意の方法により）上記のＣｐＧ遺伝子座の少なくとも１つのメチル化レベルを測定することにより、個体が川崎病を患うかどうか又は川崎病の発症リスクを有すると特定する。一部の実施例では、ヘプシジンのレベルを測定する。一部の実施例では、２つ又は２以上のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベル及び／又はヘプシジンのレベルの測定は、川崎病診断に対してより高い精度、感度又は特異性を提供する。
【００２９】
一部の実施例では、表１で特定されるＣｐＧ遺伝子座から選択するＤＮＡ領域又はその一部（例えば、少なくとも１つのシトシン残基）内の染色体ＤＮＡのメチル化レベルを測定する。一部の実施例では、ＣｐＧ遺伝子座の少なくとも２０、５０、１００、２００、５００個又はそれ以上の隣接塩基対内の全シトシンのメチル化レベルをさらに測定する。例えば、ｃｇ２３６７７０００でのシトシンのメチル化レベルを測定する。
【００３０】
本発明の一部の実施例では、対照又は非川崎病のＣｐＧ遺伝子座のメチル化レベルを予め決定して正規化する。一般的に、対照のＣｐＧ遺伝子座は、既知且つ相対的な一定のメチル化レベルを有する。非川崎病又は対照サンプル中の所定のメチル化レベルは、非川崎病の代表的なプール（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ｐｏｏｌ）からのものであり、非川崎病又は対照サンプル中のメチル化レベルの平均値、中央値又は他の統計的に操作され、他の要約され又は集約される代表的なものである。
【００３１】
より低いメチル化レベル又は低メチル化は相対的な用語であり、川崎病サンプル中の表１のＣｐＧ遺伝子座のメチル化レベルと参照対照レベルのメチル化レベルとの比較により決定することができる。一部の実施例では、試験サンプル中の表１のＣｐＧ遺伝子座のメチル化レベルは、非川崎病又は対照個体より１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％も低いである。
【００３２】
ＤＮＡのメチル化レベルを検出する任意の方法は、本発明の方法に使用されることができる。メチル化レベルの検出方法の非限定的な例には、メチル化感受性制限酵素分析、重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）、二亜硫酸塩（ｄｉｓｕｌｆｉｔｅ）、亜硫酸水素塩（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｌｆｉｔｅ）又はそれらの組み合わせを含む試薬の処理による化学分析、又はパイロシークエンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が含まれる。
【００３３】
亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）をＤＮＡと接触させる場合、非メチル化シトシンをウラシルに変換して、メチル化シトシンは修飾されない。他の実施例は、アレイベースのアッセイ、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ(R)  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ及びマルチプレックスＰＣＲアッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙｓ）の使用を含む。
【００３４】
定量的増幅方法（例えば、定量的ＰＣＲ又は定量的線形増幅）は、制限消化後、増幅プライマーにより隣接される遺伝子座内においてインタクトなＤＮＡの量を定量化するために使用される。定量的増幅の方法は、例えば、米国特許第６，１８０，３４９号；第６，０３３，８５４号；及び第５，９７２，６０２号に開示される。
【００３５】
他のメチル化レベル検出方法としては、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＣＰ）、メチル化−ＣｐＧアイランド回収アッセイ（ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ−ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｓｓａｙ，ＭＩＲＡ）、重亜硫酸塩制限分析（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  ＣＯＢＲＡ）、一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）分析、制限分析及びマイクロアレイ分析（Ｌｉａｎ  ＺＱ  ｅｔ  ａｌ，  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ−ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ４１：  ６２９−６３８，  ２０１２）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
実施例では、本発明に記載の方法は、血漿ヘプシジンのレベルを測定することをさらに含む。血漿ヘプシジンのレベルの測定は、本明細書に記載又は当技術分野で公知の方法、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって行うことができる。もう一つの実施例では、前記方法は、ヘプシジンｍｉＲＮＡ発現レベルを測定することをさらに含む。ヘプシジンｍｉＲＮＡの発現レベルの測定は、サンプル中に存在するｍｉＲＮＡ量を定量し、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）、ノーザンブロット分析又は他の周知の技術などの当技術分野で公知又は本明細書に記載の方法によって行うことができる。ヘプシジンｍｉＲＮＡの発現レベルの測定は、成熟形態のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ発現と相関する前駆体形態の発現レベルを測定することを含む。
【００３７】
特定の実施例では、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現量はノーザンブロット分析により測定される。例えば、細胞の全ＲＮＡを細胞から核酸抽出緩衝液の存在下でのホモジナイゼーションして、遠心分離により精製することができる。核酸が沈殿し、ＤＮＡをデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）による処理および沈殿により除去する。続いてそのＲＮＡ分子を標準的な技術に従ってアガロースゲル上でのゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースフィルターに転写する。次いでそのＲＮＡを加熱によりそのフィルター上に固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）する。特定のＲＮＡの検出および定量化は、問題のＲＮＡに相補的な適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡ試薬を用いて達成される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ７を参照、その全開示を参照により援用する。
【００３８】
一部の実施例では、ヘプシジンのｍｉＲＮＡを定量的ＲＴ  −  ＰＣＲを用いて測定する。定量的ＲＴ  −  ＰＣＲ（ｑＲＴ  −  ＰＣＲ）は、ポリメラーゼ連鎖反応の産物の量を迅速に測定するために使用される、ポリメラーゼ連鎖反応の改変である。当技術分野において公知のｑＲＴ−ＰＣＲ法にいくつかの改変があり、アガロースゲル電気泳動、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（二本鎖ＤＮＡ色素）の使用、及び蛍光レポーター試薬の使用も含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
川崎病及び非川崎病の個体中の表１に示される少なくとも１つのＣｐＧ遺伝子座の差異メチル化レベルの同定はいくつの方法でこの情報の使用が可能である。例えば、本文に開示される方法により川崎病の診断を確認される場合、個体を治療薬（例えば、単回投与又は複数回投与のＩＶＩＧ、アスピリン、抗ＴＮＦ−α薬、コルチコステロイド、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）、ＩＬ−１阻害薬（アナキンラ（ａｎａｋｉｎｒａ）及びカナキヌマブ（ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ））、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、ペントキシフィリン（Ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ）、血漿分離交換法（ｐｌａｓｍａｐｈｅｒｅｓｉｓ）又はそれらの組み合わせ）で迅速に治療することができる。もう一つの実施例では、特定の治療計画を評価することができる（例えば、治療は川崎病個体の冠状動脈合併症の予防に有効であるかどうかを確認する）。同様に、診断は、試験サンプル中の表１に示される少なくとも１つのＣｐＧ遺伝子座のメチル化レベルと非川崎病サンプルからの既知の発現プロファイルとの比較により行われる又は確認されることができる。また、これらのメチル化プロファイルは、川崎病のメチル化発現を増強する、又は予後不良プロファイルをより良好な予後プロファイルに変換する候補薬をスクリーニングすることができる。
（川崎病の診断のためのキット）
本発明は川崎病の診断に使用するためのキットも提供する。キットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５から選択される少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのシトシンメチル化状態を特異的に検出するための少なくとも１つのプライマー又は試薬を含む。
【００４０】
一実施例では、メチル化レベルの検出のためのキットは、表１で特定されるＣｐＧ遺伝子座の１つ（又は表１のＣｐＧ遺伝子座と少なくとも９０％同一の核酸配列）にハイブリダイズする、或いは表１で特定されるＣｐＧの１つに隣接するＤＮＡの領域にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマー、亜硫酸水素ナトリウム、メチル化感受性、メチル化依存性制限酵素（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）、又は増幅（例えばＰＣＲ）試薬から選択する少なくとも１つのメチル化検出試薬を含む。前記キットは、アッセイの使用に適したアッセイ装置の形態での固体支持体を提供することができる。前記キットは、川崎病診断のための検出可能な標識又は指示をさらに含むことができる。試験管、トランスファーピペットなどを含む、アッセイの実施のための他の材料もキットに含まれることができる。
【００４１】
一部の実施例では、マイクロアレイの使用が望ましい。マイクロアレイは、複雑な生化学的試料の並行分析を可能にする、核酸、タンパク質、小分子、細胞または他の物質の微視的な整列したアレイである。マイクロアレイは、微細に尖ったピンによるスライドガラス上への印刷、予め作られたマスクを用いたフォトリソグラフィー（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）、動的マイクロミラー装置（ｄｙｎａｍｉｃ  ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いたフォトリソグラフィー、インクジェット印刷、または微小電極アレイ上での電気化学が含まれる様々な技術を用いて製作することができる。
【００４２】
一実施例では、マイクロアレイは、表１中の少なくとも１つのＣｐＧ遺伝子座のメチル化状態を検出するための特異的プライマーオリゴヌクレオチドを含む。
【００４３】
本発明の実施例は、下記の実例によっても説明され、それは如何なる形式でもその範疇に何らかの制限を加えると解釈されるべきではない。逆に、本発明の他の様々な実施形態、それらの変更、および等価物は、本明細書の記載を読んだ後に、本発明の趣旨から逸脱することなく様々な変更及び修正が可能であることは、当業者に明らかである。下記の実例に述べる研究において、別途説明されない限り、慣習的手順に従うべきである。いくつの手順は、説明の目的で下文に記述する。
（実例に用いられる材料と方法の記述）
患者
台湾の高雄長庚記念小児病院からの合計２５９人の個体がこの研究に登録される。川崎病と診断される患者及び非川崎病（又は「ＦＣ」）と診断される患者から全血試料を採取する。内科医師によって診断される臨床的な川崎病はこの研究の黄金律と考えられる。ＦＣは５日間以上の発熱があるが、川崎病を患ってない患者である。それらの内、１８人の個体は有熱対照群（発熱がある非川崎病患者）であり、他の１８人の個体はＩＶＩＧ治療の前及びその３週間後に血液サンプルが採取される川崎病患者である。有熱対照群の患者は上部呼吸道感染症又は尿路感染症と診断される。
【００４４】
実験デザイン
収集した全血サンプルを白血球（ＷＢＣ）濃縮にし、続いてＤＮＡ単離を行う。Ｈｕａｎｇ  ＹＨ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１７，  ８（７）：１１２４９−１１２５８）に記載のように、ＤＮＡサンプルを重亜硫酸塩で処理する。
【００４５】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍ４５０Ｋ  ＢｅａｄＣｈｉｐによるＤＮＡメチル化プロファイリング
ＤＮＡメチル化パターン（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）のゲノム全体でのクリーニングを実施するため、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  （Ｍ４５０Ｋ）  ＢｅａｄＣｈｉｐ  （Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  ＵＳＡ）を使用する。製造業者の指示に従って、２００  ｎｇの重亜硫酸塩変換したゲノムＤＮＡを各Ｍ４５０Ｋ  ＢｅａｄＣｈｉｐアッセイに用いられる。各サンプル中の各ＣｐＧジヌクレオチドについてシトシンのメチル化百分率（β値）を計算する。
【００４６】
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によるヘプシジンの測定
血漿ヘプシジンのレベルをＥＬＩＳＡキット（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ＵＫから市販されている）を用いて測定する。
【００４７】
パイロシークエンス法によるＤＮＡメチル化の検証
ゲノムＤＮＡ（０．５μｇ）をＥＺ  ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ＵＳＡ）を用いて重亜硫酸塩修飾し、２０μｌのＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ）中に溶出させる。ポリメラーゼ連鎖反応は、２５ｎｇの重亜硫酸塩変換ＤＮＡ、１×ＰｙｒｏＭａｒｋ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）及びビオチン化フォワードプライマーＡＴＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＴＡＴＡＡＴＴとリバースプライマーＣＣＴＣＣＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＴＣＡＴを含む２５μｌの反応混合物中で行う。以下のＰＣＲパラメーターを使用する：９５℃で５分の後、次に９５℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２で３０秒の４５サイクル及び７２℃で５分の最終伸長。増幅後、ビオチン化ＰＣＲ産物を精製し、目的のＣｐＧ部位に隣接して結合するように設計されるシークエンシングプライマーＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴとインキュベートする。パイロシークエンスはＰｙｒｏＭａｒｋ  Ｑ２４機器（Ｑｉａｇｅｎ）により行って、ＰｙｒｏＭａｒｋ  Ｑ２４  １．０１０ソフトウェアでメチル化の定量を測定する。
【００４８】
統計分析
全てのデータは平均値±標準誤差として表されている。定量データはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ又はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを用いて分析される。ＩＶＩＧ治療の前及びその後のデータは対応のあるｐａｉｒｅｄ  ｔ−テスト（ｐａｉｒｅｄ  ｓａｍｐｌｅ  Ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて分析される。全ての統計分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＸＰのＳＰＳＳ  ２２．０版（ＳＰＳＳ，  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）を用いて行われ、Ｐ＜０．０５の両側Ｐ値は統計的に有意と見なす。
【００４９】
結果
図１は、有熱対照サンプルと川崎病患者との以下のＣｐＧジヌクレオチドが統計的に有意な低メチル化を示す：ｃｇ２３６７７０００、ｃｇ０４０８５４４７、ｃｇ１７９０７５６７、ｃｇ  ２６２８３０５９及びｃｇ２７２７３０３３。
【００５０】
ＣｐＧジヌクレオチドの低メチル化が川崎病と非川崎病患者とを十分に区別することを確実にするため、上記のメチル化の結果は、上位２つ（ｃｇ２３６７７０００及びｃｇ０４０８５４４７）のＣｐＧジヌクレオチドの標的特異的な配列決定を用いてパイロシークエンスにより９２人のＩＶＩＧ治療前の川崎病患者、１６人のＩＶＩＧ治療後の川崎病患者及び１１３人の有熱対照群の各患者コホートで検証される。図２は、ｃｇ２３６７７０００及びｃｇ０４０８５４４７の検証されるメチル化状態を示し、有熱対照群と比較して、ＩＶＩＧ治療前の川崎病患者でのｃｇ２３６７７０００及びｃｇ０４０８５４４７は統計的に有意な低メチル化を示す（それぞれはＰ＜０．００１とＰ＜０．００１）。図２は、川崎病患者でのｃｇ２３６７７０００及びｃｇ０４０８５４４７のメチル化状態がＩＶＩＧ治療の後に有意に増加することを示す（それぞれはＰ＜０．００１とＰ＜０．００１）。メチル化分析の結果は、メチル化アレイとパイロシークエンスとの間で一致する。
【００５１】
非川崎病患者の有熱対照群（ｎ＝１１３）及びＩＶＩＧ治療前（Ｎ＝９２）とＩＶＩＧ治療後（Ｎ＝１６）の川崎病患者での血漿ヘプシジンのレベルをＥＬＩＳＡによってＢｉｏ−Ｐｌｅｘシステムを用いて測定する。図３は、川崎病患者での血漿ヘプシジンのレベルは、有熱対照群と比較して有意に増加することを示す。
【００５２】
図４Ａ〜図４Ｂは、血漿ヘプシジンのレベルとｃｇ２３６７７０００及びｃｇ０４０８５４４７のメチル化状態との負の相関関係を示す（それぞれは、Ｒ＝−０．３１１，ｐ＜０．００１、Ｒ＝−０．３２６，ｐ＜０．００１）。
【００５３】
サポートベクターマシン（Ｓｕｐｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｃｈｉｎｅｓ，  ＳＶＭ）による分類モデル
Ｋｕｏ  ＨＣ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１６，  １３８（４）：１２２７−１２３０）に記載のＳＶＭ  分類モデルは、有熱対照群と川崎病個体との区別のために開発される。ｃｇ２３６７７０００とｃｇ０４０８５４４７のメチル化百分率及び血漿ヘプシジンのＥＬＩＳＡレベルは、ＳＶＭ分類モデルのためのＳＶＭベクターである。当該モデルは、６６人の川崎病個体と７４人の有熱対照個体をトレーニングセット（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）とし、２６人の川崎病個体と３９人の有熱対照個体を盲検テストセット（ｂｌｉｎｄ  ｔｅｓｔ  ｓｅｔ）とする。３つのＳＶＭベクトルのトレーニングセットは、５倍交差検証方針に基づいてＳＶＭモデルの訓練に使用される。特定のパラメータ（ｃｏｓｔ＝２とｇａｍｍａ＝１）を与える。上記から導き出される川崎病に特異的なＳＶＭのアライメントモデルを使用して、３つのＳＶＭベクトルの感度、特異性及び精度を計算し、その結果は表２に示される。
【００５４】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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