(57)【要約】【課題】産業利用が可能な新規微細藻類、該藻類を用いた新規栄養剤、該栄養剤を含む栄養成分補給用組成物、及び前記微細藻類を用いた栄養成分の製造方法を提供する。【解決手段】藻類は、セネデスムス・エスピー（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｐ．）ＡＢ−１Ｃ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３３８）である。栄養剤は、前記セネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株又はその抽出物を含む。栄養成分補給用組成物は、前記栄養剤を含む。栄養成分の製造方法は、セネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株を培養する培養工程を備える方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セネデスムス・エスピー（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｐ．）ＡＢ−１Ｃ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３３８）。
【請求項２】
請求項１に記載のセネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株又はその抽出物を含む栄養剤。
【請求項３】
請求項２に記載の栄養剤を含む栄養成分補給用組成物。
【請求項４】
栄養成分がエイコサペンタエン酸、カロテノイド類、リノール酸及びα−リノレン酸からなる群から選択される１種類以上である請求項３に記載の栄養成分補給用組成物。
【請求項５】
前記カロテノイド類がアスタキサンチンである請求項４に記載の栄養成分補給用組成物。
【請求項６】
食品である請求項３〜５のいずれか一項に記載の栄養成分補給用組成物。
【請求項７】
機能性食品又は栄養補助食品である請求項６に記載の栄養成分補給用組成物。
【請求項８】
飼料又はペットフードである請求項３〜５のいずれか一項に記載の栄養成分補給用組成物。
【請求項９】
化粧品である請求項３〜５のいずれか一項に記載の栄養成分補給用組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のセネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株を培養する培養工程を備える栄養成分の製造方法。
【請求項１１】
更に、前記培養工程の後に、
前記セネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株を破砕して細胞破砕物を得る破砕工程と、
前記細胞破砕物から栄養成分を分離する分離工程と、
をこの順に備える請求項１０に記載の栄養成分の製造方法。
【請求項１２】
前記栄養成分が、エイコサペンタエン酸、カロテノイド類、リノール酸及びα−リノレン酸からなる群から選択される１種類以上である請求項１０又は１１に記載の栄養成分の製造方法。
【請求項１３】
前記カロテノイド類がアスタキサンチンである請求項１２に記載の栄養成分の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類、栄養剤、栄養成分補給用組成物及び栄養成分の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油資源の枯渇及び温室効果ガスの削減の面から、バイオマス燃料の開発に高い関心が集まっており、現在、微細藻類から燃料油を生産する研究がなされている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
一方で、微細藻類の多くは、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ；ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ；ＥＰＡ）等のω３又はω６不飽和脂肪酸や、アスタキサンチン等の機能性物質を産生し、これらは様々な機能性を有する。そのため、微細藻類の健康及び機能性食品や医薬品等への利用が注目されている。
また、これまでにも、バイオ燃料用油又は機能性物質を産生する微細藻類種が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−００９９５３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Cuellar-Bermudez P. S. et al., “Extraction and purification of high-value metabolites from microalgae: essential lipids, astaxanthin and phycobiliproteins.”, Microbial Biotechnology, 8, Minireview, p190-209, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、産業的に実用化されている微細藻類は、数種の藻類種に限定されており、炭化水素、機能性油又は機能性物質を産生する新規微細藻種が求められている。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、産業利用が可能な新規微細藻類、該藻類を用いた新規栄養剤、該栄養剤を含む栄養成分補給用組成物、及び前記微細藻類を用いた栄養成分の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、セネデスムス・エスピー（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｐ．）ＡＢ−１Ｃ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３３８）が炭化水素、ＥＰＡ等の機能性油、及び、アスタキサンチン等のカロテノイド類等の多種の有用物質を産生することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る藻類は、セネデスムス・エスピー（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｐ．）ＡＢ−１Ｃ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３３８）である。
【００１０】
本発明の第２態様に係る栄養剤は、上記第１態様に係るセネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株又はその抽出物を含む。
【００１１】
本発明の第３態様に係る栄養成分補給用組成物は、上記第２態様に係る栄養剤を含む。
上記第３態様に係る栄養成分補給用組成物において、栄養成分が、エイコサペンタエン酸、カロテノイド類、リノール酸及びα−リノレン酸からなる群から選択される１種類以上であってもよい。
前記カロテノイド類がアスタキサンチンであってもよい。
上記第３態様に係る栄養成分補給用組成物は、食品であってもよい。
上記第３態様に係る栄養成分補給用組成物は、機能性食品又は栄養補助食品であってもよい。
上記第３態様に係る栄養成分補給用組成物は、飼料又はペットフードであってもよい。
上記第３態様に係る栄養成分補給用組成物は、化粧品であってもよい。
【００１２】
本発明の第４態様に係る栄養成分の製造方法は、上記第１態様に係るセネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株を培養する培養工程を備える方法である。
上記第４態様に係る栄養成分の製造方法は、更に、前記培養工程の後に、前記セネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株を破砕して細胞破砕物を得る破砕工程と、前記細胞破砕物から栄養成分を分離する分離工程と、をこの順に備えてもよい。
前記栄養成分が、エイコサペンタエン酸、カロテノイド類、リノール酸及びα−リノレン酸からなる群から選択される１種類以上であってもよい。
前記カロテノイド類がアスタキサンチンであってもよい。
【発明の効果】
【００１３】
上記態様によれば、産業利用が可能な新規微細藻類、該藻類を用いた新規栄養剤、該栄養剤を含む栄養成分補給用組成物、及び前記微細藻類を用いた栄養成分の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】セネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株の顕微鏡写真である。上の画像は、明視野での顕微鏡写真である。下の画像は蛍光での顕微鏡写真である。
【図２】１８Ｓリボソームの塩基配列に基づくセネデスムス属及びコエラストレラ属の分子系統樹を示す。既知のセネデスムス・エスピーＫｉ４株及びＪＢ１１株を点線で囲み、ＡＢ−１Ｃ株を実線で囲んだ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
≪藻類≫
本発明の一実施形態に係る藻類は、セネデスムス・エスピー（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｐ．）ＡＢ−１Ｃ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３３８）（以下、「ＡＢ−１Ｃ株」と称する場合がある。）である。
【００１６】
セネデスムス属は、分類学上、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、緑藻網（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、ヨコワミドロ目（Ｓｐｈａｅｒｏｐｌｅａｌｅｓ）、イカダモ科（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍａｃｅａｅ）に分類される。また、セネデスムス属は、イカダモ属とも呼ばれる。イカダモ科に属する藻類は、セネデスムス属の他に、デスモデスムス属（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）及びアクトデスムス属（Ａｃｕｔｏｄｅｓｍｕｓ）が知られている。イカダモ科に属する藻類は、自然界では、池や湖沼等に広く生育している。
【００１７】
ＡＢ−１Ｃ株は、セネデスムス属に属し、且つ、炭化水素、ＥＰＡ等の機能性油、及び、アスタキサンチン等のカロテノイド類等の多種の有用物質を産生する。従来、セネデスムス属に属する既知の藻類において、上述のような有用物質を産出することは知られていたが、特にアスタキサンチンを高濃度で産出するものは知られていなかった。なお、セネデスムス属の中で、炭化水素、ＥＰＡ等の機能性油と共に、カロテノイド類を産出するものと知られていたのは、セネデスムス・オブリック（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕ）、及び、セネデスムス・コマレッキ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｋｏｍａｒｅｋｉｉ）のみである。そのため、ＡＢ−１Ｃ株は、炭化水素、ＥＰＡ等の機能性油と共に、アスタキサンチンを高濃度で産出するという点で、他のセネデスムス属に属する藻類とは区別される。
【００１８】
ＡＢ−１Ｃ株は、日本国富山県の富山湾神通川の河口表層水より単離された単細胞緑藻である。ＡＢ−１Ｃ株は、２０１７年６月２７日付で、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−２２３３８として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
【００１９】
ＡＢ−１Ｃ株は、培養初期では、クロロフィルａを有するため、緑色を呈している。一方、細胞内にてアスタキサンチン等のカロテノイド類が産出され蓄積されるため、培養時間の増加に伴い、橙色を呈する。
細胞の形状及び大きさは、楕円球状又は球状で、大きさの異なるものが混在している。形状の違いは、細胞周期によるものであると推察され、球状のものは、分裂前の母細胞であると考えられる。
細胞の大きさとして具体的には、楕円球状のものでは、平均長径が１０．９μｍ程度、平均短径が８．８μｍ程度である。また、球状のものでは、平均直径が１４．６μｍ程度である。
【００２０】
ＡＢ−１Ｃ株は、二分裂で増殖する。ＡＢ−１Ｃ株は、微量の重金属イオン存在下で好適に増殖する。前記重金属イオンとしては、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｏ２＋等が挙げられる。至適温度は約２５℃、至適ｐＨは８．４付近である。
【００２１】
１８Ｓ  リボソームＤＮＡの塩基配列に基づく分子系統解析の結果、ＡＢ−１Ｃ株は、セネデスムス属に分類された。ＡＢ−１Ｃ株の１８Ｓ  リボソームＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
【００２２】
ＡＢ−１Ｃ株の近縁種である藻類としては、例えば、１８Ｓ  リボソームＤＮＡの塩基配列が、配列番号１と、９０％以上の同一性を有する藻類が挙げられる。該藻類が有する１８Ｓ  リボソームＤＮＡの塩基配列と、配列番号１に記載の塩基配列との同一性は、９５％以上であることが好ましく、９７％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。
【００２３】
なお、塩基配列同士の同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、塩基配列の同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴｎにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
【００２４】
また、藻類が有する１８Ｓ  リボソームＤＮＡの塩基配列は、公知の方法により得ることができる。例えば、対象とする藻類の細胞から公知の方法によりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法等により１８Ｓ  リボソームＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する。次に、増幅したＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーで解析することにより、対象とする藻類の１８Ｓ  リボソームＤＮＡの塩基配列を得ることができる。１８Ｓ  リボソームＤＮＡを増幅するためのプライマーとしては、例えば、本明細書の実施例で用いたプライマー等が挙げられる。
【００２５】
また、本実施形態の藻類としては、ＡＢ−１Ｃ株の変異株も好適な例として挙げられる。
本明細書において、「変異株」とは、自然発生的又は人為的に、元の藻類株のゲノム（核ゲノム、葉緑体ゲノム、ミトコンドリアゲノムを含む。以下、同じ。）に変異が生じた藻類株を意味する。ゲノムに変異を生じさせる人為的手法は、特に限定されず、紫外線照射、放射線照射、亜硝酸等による化学的処理；遺伝子導入、ゲノム編集等の遺伝子工学的手法等を例示することができる。
【００２６】
なお、本明細書において、「ＡＢ−１Ｃ株の変異株」とは、ＡＢ−１Ｃ株のゲノムに変異が生じた藻類株であって、ＡＢ−１Ｃ株が有する栄養成分組成と類似の栄養成分組成を有する藻類株を指す。例えば、総カロテノイド類の含有量が、ＡＢ−１Ｃ株の乾燥重量１００ｇあたり４００ｍｇ以上１０００ｍｇ以下であってもよく、４５０ｍｇ以上９００ｍｇ以下であってもよく、５００ｍｇ以上８００ｍｇ以下であってもよい。
【００２７】
また、例えば、アスタキサンチンの含有量が、ＡＢ−１Ｃ株の乾燥重量１００ｇあたり５０ｍｇ以上８００ｍｇ以下であってもよく、３００ｍｇ以上６００ｍｇ以下であってもよく、３５０ｍｇ以上５５０ｍｇ以下であってもよい。
【００２８】
ＡＢ−１Ｃ株の変異株としては、ＡＢ−１Ｃ株の全ゲノムに対する変異の割合が、全ゲノム中の１０％以下であることが好ましく、５％以下であることがより好ましく、３％以下であることがさらに好ましく、２％以下又は１％以下であることが特に好ましい。
【００２９】
本実施形態の藻類は、中温環境（１５〜３５℃）、弱塩基性（ｐＨ７．８〜８．８）条件下において、増殖可能である。そのため、地域や季節に応じて培養条件を変更することも可能であり、屋外大量培養に適している。
さらに、高塩耐性もあり、海水等の高塩条件下（５００ｍＭ  ＮａＣｌ等）でも増殖可能である。また、光強度としては、３５００〜５０００ｌｕｘの範囲で増殖することができ、強光下でも増殖可能である。
【００３０】
本実施形態の藻類は、燃料油となり得る炭化水素、及び、アミノ酸類、ビタミン類（特に、アスタキサンチン等のカロテノイド類）、タンパク質、脂質（特に、ＥＰＡ等の機能性油）、食物繊維等の栄養成分を豊富に含有する。
【００３１】
特に、後述する実施例で示すように、アスタキサンチンは、従来のアスタキサンチン産生藻類として知られているモノラフィディウム・エスピー（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）  ＧＫ−１２株と比較しても、高濃度に含有することが確認されている。また、従来から利用されている藻類（ヘマトコッカス）と比較しても、多種の機能性油（ＥＰＡ、α−リノレン酸及びリノール酸）及びカロテノイド類（アスタキサンチン、カンタキサンチン、β−カロテン及びルテイン）を含有することが確認されている。
【００３２】
なお、本明細書において、「機能性油」とは、中性脂肪低下作用、認知機能改善効果、血中コレステロール低下作用等の機能を有する食用油を意味する。機能性油として具体的には、例えば、ドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ；ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ；ＥＰＡ）、α−リノレン酸等のω３脂肪酸、リノール酸、アラキドン酸等のω６脂肪酸等が挙げられる。
【００３３】
本実施形態の藻類は、後述の実施例に示すように、機能性油として、ＥＰＡ、α−リノレン酸、リノール酸等を含有する。
【００３４】
また、本明細書において、「カロテノイド類」とは、黄、橙、赤色等を示す天然色素の一群を意味する。カロテノイド類として具体的には、例えば、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、δ−カロテン、リコペン、ε−カロテン等のカロテン類；ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アスタキサンチン、アンテラキサンチン、ビオラキサンチン等のキサントフィル類等が挙げられる。
本実施形態の藻類は、後述の実施例に示すように、カロテノイド類として、アスタキサンチン、カンタキサンチン、β−カロテン、ルテイン等を含有する。
【００３５】
本実施形態の藻類は、燃料油となり得る炭化水素を含有する。そのため、本実施形態の藻類を用いて、バイオマス燃料を製造することができる。
【００３６】
さらに、本実施形態の藻類は、ＥＰＡ等の機能性油、及び、アスタキサンチン等のカロテノイド類等の多種の栄養成分を含有する。そのため、本実施形態の藻類が、後述する栄養剤としてヒト又はヒト以外の動物に摂取された場合に、上記のような栄養成分が体内に吸収され得る。また、本実施形態の藻類から、適宜、栄養成分を含む抽出物を調製することができる。
【００３７】
本実施形態の藻類は、微細藻類培養用の培地を用いて培養することができる。培地としては、特に限定されないが、窒素源、リン源、微量元素（亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデン、鉄等）等を含む無機塩培地が例示される。例えば、窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、アミン類等が挙げられる。また、リン源としては、リン酸塩等が挙げられる。
【００３８】
上記培地として具体的には、例えば、ＳＧＩ培地（参考文献１：SAGER R, GRANICK S. “Nutritional studies with Chlamydomonas reinhardi.”, Ann N Y Acad Sci., vol. 56, No. 5, p.831-838, 1953.）、ＴＡＰ培地（参考文献２：Gorman, D. S. and Levine, R. P., “Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.”, Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 54, No. 6, p1665-1669, 1965.）等が挙げられる。
【００３９】
本実施形態の藻類は、上記のとおり、比較的幅広い培養条件で増殖させることができる。ｐＨ条件としては、ｐＨ７．８〜１０．０を例示することができ、ｐＨ８．０〜８．６が好ましい。
【００４０】
温度条件としては、１５〜３５℃を例示することができ、２０〜３０℃が好ましい。
【００４１】
光強度としては、３５００〜５０００ｌｕｘを例示することができ、４０００〜４５００ｌｕｘが好ましい。屋外で培養する場合には、太陽光下で培養すればよい。室内で培養する場合には、連続光で培養してもよく、明暗周期（１２Ｌ：１２Ｄ等）を設けてもよい。
【００４２】
本実施形態の藻類は、上記のように、栄養成分を豊富に含み、屋外大量培養に適しているため、後述する栄養剤として産業利用することができる。また、本実施形態の藻類から栄養成分を抽出することができ、そのままヒト又はヒト以外の動物に摂取された場合でも、栄養成分が体内に吸収され得る。
【００４３】
≪栄養剤≫
本発明の一実施形態に係る栄養剤は、上記実施形態のセネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株又はその抽出物を含む。
【００４４】
本実施形態の栄養剤が含む藻類は、上記実施形態の藻類である。すなわち、ＡＢ−１Ｃ株及びその変異株（以下、「本藻類」という。）である。本実施形態の栄養剤に含まれる本藻類の好ましい例としては、上記で例示したものと同様である。
本藻類は、適切な培地を用いて培養して増殖させ、遠心分離やろ過等の公知の方法により回収し、適宜、洗浄、乾燥等を行って、本実施形態の栄養剤に用いることができる。
【００４５】
また、本実施形態の栄養剤は、本藻類に替えて、又は本藻類と共に、本藻類の抽出物を含んでいてもよい。
本明細書において、「本藻類の抽出物」とは、本藻類の細胞に対して、物理的処理又は化学的処理を行って、細胞内の成分を抽出したものをいう。例えば、本藻類の抽出物は、物理的処理又は化学的処理によって、本藻類の細胞を破砕した細胞破砕物であってもよい。また、本藻類の抽出物は、前記細胞破砕物を濃縮したものであってもよく、前記細胞破砕物から固形分を除去したものであってもよく、前記細胞破砕物から一部の成分を分離したものであってもよい。
【００４６】
細胞に対する物理的処理又は化学的処理の方法は、特に限定されず、細胞の破砕に一般的に用いられる方法を用いることができる。物理的処理としては、例えば、ガラスビーズ、乳鉢、超音波処理、フレンチプレス、ホモジナイザー等による細胞破砕が挙げられる。化学的処理としては、例えば、中和処理、低張処理、凍結融解処理等が挙げられる。
細胞破砕物を濃縮する場合、濃縮方法は特に限定されず、一般的に用いられる濃縮方法を用いればよい。細胞破砕物の濃縮方法としては、例えば、乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥等が挙げられる。
また、細胞破砕物から固形分を除去する場合、固形分の除去方法は特に限定されず、固形分の除去等に一般的に用いられる方法を用いることができる。固形分の除去方法としては、例えば、ろ過、遠心分離等が挙げられる。
細胞破砕物から一部の成分を分離する場合、分離方法は特に限定されず、生化学物質の分離及び精製等に一般的に用いられる方法を用いることができる。分離方法としては、例えば、塩析、透析、溶媒抽出、吸着、各種クロマトグラフィー（ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等）等が挙げられる。これらの方法は、単独で用いてもよく、２以上の処理を組み合わせて用いてもよい。ただし、単一の成分に精製されたものは、「本藻類の抽出物」からは除かれる。本藻類の抽出物は、好ましくは、本藻類の細胞成分を２種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは６種以上含む。
【００４７】
上記のとおり、本藻類は、機能性油、カロテノイド類等の栄養成分を多く含むため、本藻類の抽出物も同様に、機能性油、カロテノイド類等の栄養成分を多く含む。そのため、本実施形態の栄養剤として用いることができる。
【００４８】
本実施形態の栄養剤は、本藻類又はその抽出物に加えて、適宜、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、特に限定されないが、薬学的に許容される担体等が挙げられる。
なお、「薬学的に許容される担体」とは、本藻類が含む栄養成分の機能を阻害せず、且つ、その投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体を意味する。
また、「実質的な毒性を示さない」とは、その成分が通常使用される投与量において、投与対象に対して毒性を示さないことを意味する。
薬学的に許容される担体としては、特に限定されないが、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、安定剤、希釈剤、油性基剤、増粘剤、酸化防止剤、還元剤、酸化剤、キレート剤、溶媒等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４９】
本実施形態の栄養剤における本藻類又はその抽出物の含有量は、特に限定されず、例えば、１〜１００質量％の範囲で適宜選択可能である。本実施形態の栄養剤における本藻類又はその抽出物の含有量としては、５０〜１００質量％が好ましく、６０〜９９質量％がより好ましく、７０〜９９質量％がさらに好ましい。
本藻類又はその抽出物は、適宜他の成分と混合し、定法に従って、乾燥粉末、顆粒剤、錠剤、ゼリー剤、液剤、カプセル剤等の形態とすることができる。
【００５０】
本実施形態の栄養剤は、機能性油やカロテノイド類等の栄養成分を多く含むため、栄養剤としてヒトやヒト以外の動物に使用することができる。本実施形態の栄養剤により供給される栄養成分としては、アミノ酸類、ビタミン類（特に、カロテノイド類）、タンパク質、脂質（特に、機能性油）、食物繊維等が例示される。中でも、本実施形態の栄養剤は、機能性油（ＥＰＡ、α−リノレン酸、リノール酸等）、カロテノイド類（アスタキサンチン、カンタキサンチン、β−カロテン、ルテイン等）を補給するために、好適に用いることができる。
本実施形態の栄養剤は、特に、ＥＰＡ、アスタキサンチンを補給するために、好適に用いることができる。
【００５１】
また、本実施形態の栄養剤は、後述する栄養成分補給用組成物に配合して用いてもよい。本実施形態の栄養剤を配合することにより、機能性油、カロテノイド類等の栄養成分を豊富に含む組成物を調製することができる。
【００５２】
≪栄養成分補給用組成物≫
本発明の一実施形態に係る栄養成分補給用組成物は、上記実施形態の栄養剤を含む。
【００５３】
本明細書において、「栄養成分補給用組成物」とは、ヒト又はヒト以外の動物が栄養成分を体内に取り入れるために用いられる組成物をいう。栄養成分の体内への取り込みは、経口的なものであってもよく、非経口的なものであってもよい。
【００５４】
本実施形態の栄養成分補給用組成物が含む栄養成分としては、アミノ酸類、ビタミン類（特に、アスタキサンチン等のカロテノイド類）、タンパク質、脂質（特に、ＥＰＡ、α−リノレン酸、リノール酸等の機能性油）及び食物繊維等が挙げられる。これらの成分は、上述の栄養剤が多く含む栄養成分である。これらの中でも、本実施形態の栄養成分補給用組成物は、機能性油、カロテノイド類を多く含む点に特徴がある。
特に、機能性油の中では、ＥＰＡを多く含む点に特徴があり、カロテノイド類の中では、アスタキサンチンを多く含む点に特徴がある。
例えば、ＥＰＡは、中性脂肪低下作用を有することが知られている。また、アスタキサンチンは、抗酸化作用を有することが知られている。
したがって、本実施形態の栄養成分補給用組成物を摂取することにより、上記のような栄養成分が有する体調改善効果等を得ることができる。
【００５５】
本実施形態の栄養成分補給用組成物は、ヒト又はヒト以外の動物が栄養成分を体内に取り入れるために用いられるものであれば、特に限定されない。本実施形態の栄養成分補給用組成物としては、例えば、食品、飼料、ペットフード、化粧品等が挙げられる。
【００５６】
＜食品＞
本実施形態の栄養成分補給用組成物は、食品であってもよい。
本実施形態の栄養成分補給用組成物が食品である場合、上述の栄養剤は、食品添加剤として、食品に添加されてもよい。上述の栄養剤を食品に添加することにより、上述の栄養剤が含む栄養成分が強化された食品を調製することができる。そのため、本発明の一実施形態に係る食品添加剤は、本藻類又はその抽出物を含む。
本実施形態の食品は、上述の栄養剤を食品原料に添加し、適宜他の食品添加物を添加して、食品の種類に応じた既知の方法に従って、製造することができる。
【００５７】
本実施形態の食品において、食品の種類は特に限定されない。食品としては、例えば、そば、うどん、はるさめ、中華麺、即席麺、カップ麺等の各種の麺類；パン、小麦粉、米粉、ホットケーキ、マッシュポテト等の炭水化物類；青汁、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、野菜飲料、乳酸飲料、乳飲料、スポーツ飲料、茶、コーヒー等の飲料；豆腐、おから、納豆などの豆製品；カレールー、シチュールー、インスタントスープ等の各種スープ類；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓類；飴、クッキー、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、その他の焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、はんぺん、ハム、ソーセージなどの水産又は畜産加工食品；加工乳、発酵乳、バター、チーズ、ヨーグルト等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、ドレッシング、味噌、醤油、たれ等の調味料；各種レトルト食品、ふりかけ、漬物等のその他加工食品等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５８】
上記のような食品において、上述の栄養剤の含有量は特に限定されず、食品の種類に応じて適宜含有量を設定すればよい。例えば、食品の風味等を考慮し、食品における上述の栄養剤の含有量は、本藻類又はその抽出物の含有量として、０．０１〜３０質量％を例示することができる。食品の風味等の観点からは、０．０５〜２０質量％が好ましく、０．１〜１５質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましく、０．１〜５質量％が特に好ましい。
【００５９】
あるいは、本実施形態の栄養成分補給用組成物は、機能性食品又は栄養補助食品であってもよい。機能性食品又は栄養補助食品は、上述のような一般的な食品の形態であってもよく、乾燥粉末、顆粒剤、錠剤、ゼリー剤、ドリンク剤等の形態であってもよい。この場合、上述の栄養剤と、適宜他の成分とを混合して、定法に従って、乾燥粉末、顆粒剤、錠剤、ゼリー剤、ドリンク剤等の形態とすることができる。
他の成分としては、特に限定されず、例えば、薬学的に許容される担体等が例示される。薬学的に許容される担体としては、上記の≪栄養剤≫で挙げたものと同様のものが挙げられる。また、風味等を改善するために、甘味剤、矯味剤、各種調味料、香料、油脂類、その他の食品添加物等を他の成分として用いてもよい。他の成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００６０】
上記のような機能性食品又は栄養補助食品において、上述の栄養剤の含有量は特に限定されず、機能性食品又は栄養補助食品の種類に応じて適宜含有量を設定すればよい。例えば、機能性食品又は栄養補助食品が乾燥粉末、顆粒剤、錠剤等の形態である場合、当該機能性食品又は栄養補助食品における上述の栄養剤の含有量は、本藻類又はその抽出物の含有量として、０．１〜９９質量％が例示される。風味及び栄養成分の効率的補給の観点からは、１〜９０質量％が好ましく、１０〜８５質量％がより好ましく、２０〜８５質量％がさらに好ましく、２５〜８５質量％が特に好ましい。また、機能性食品又は栄養補助食品がゼリー剤、ドリンク剤等の形態である場合、該機能性食品又は栄養補助食品における上述の栄養剤の含有量は、本藻類又はその抽出物の含有量として、０．０５〜８０質量％が例示される。風味及び栄養成分の効率的補給の観点からは、１〜７５質量％が好ましく、１０〜７０質量％がより好ましく、１５〜７０質量％がさらに好ましく、２０〜７０質量％が特に好ましい。
【００６１】
本実施形態の食品は、本藻類が含有する上述のような栄養成分を効率的に補給するために、摂取することができる。
【００６２】
＜飼料、ペットフード＞
本実施形態の栄養成分補給用組成物は、飼料又はペットフードであってもよい。
本実施形態の栄養成分補給用組成物が飼料又はペットフードである場合、上述の栄養剤は、飼料添加剤又はペットフード添加剤として、飼料又はペットフードに添加されてもよい。上述の栄養剤を飼料又はペットフードに添加することにより、上述の栄養剤が含む栄養成分が強化された飼料又はペットフードを調製することができる。そのため、本発明の一実施形態に係る飼料添加剤又はペットフード添加剤は、本藻類又はその抽出物を含む。
【００６３】
本実施形態の飼料又はペットフードは、上述の栄養剤を飼料原料又はペットフード原料に添加し、適宜他の飼料添加物又はペットフード添加物を添加して、飼料原料又はペットフードの種類に応じた既知の方法に従って、製造することができる。
【００６４】
本実施形態の飼料又はペットフードが与えられる動物の種類は特に限定されない。例えば、家畜類（牛、豚、鶏、馬、ヒツジ、ヤギ等）、魚類、貝類、愛玩動物（イヌ、ネコ、ハムスター、ウサギ、インコ、熱帯魚、爬虫類、両生類、昆虫等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
本実施形態の飼料又はペットフードにおいて、上述の栄養剤の含有量は特に限定されず、飼料又はペットフードの種類に応じて適宜含有量を設定すればよい。例えば、飼料又はペットフードにおける上述の栄養剤の含有量は、本藻類又はその抽出物の含有量として、０．０１〜９０質量％が例示され、０．１〜８０質量％が好ましく、１〜７０質量％がさらに好ましく、１〜６０質量％が特に好ましい。
【００６６】
本実施形態の飼料又はペットフードは、本藻類が含有する上述のような栄養成分を、当該動物に効率的に補給させるために用いることができる。
【００６７】
＜化粧品＞
本実施形態の栄養成分補給用組成物は、化粧品であってもよい。
本実施形態の栄養成分補給用組成物が化粧品である場合、上述の栄養剤は、化粧品添加剤として、化粧品に添加されてもよい。上述の栄養剤を化粧品に添加することにより、上述の栄養剤が含む栄養成分を含む化粧品を調製することができる。そのため、本発明の一実施形態に係る化粧品添加剤は、本藻類又はその抽出物を含む。
【００６８】
本実施形態の化粧品は、上述の栄養剤と、適宜他の成分とを混合して、化粧品の種類に応じた既知の方法に従って、製造することができる。
他の成分としては、特に限定されず、例えば、薬学的に許容される担体等が例示される。薬学的に許容される担体としては、上記「≪栄養剤≫」で挙げたものと同様のものが挙げられる。また、化粧品添加物として公知の材料を他の成分として用いてもよい。他の成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００６９】
本実施形態の化粧品において、化粧品の種類は特に限定されない化粧品としては、例えば、化粧水、乳液、ローション、クリーム、ジェル、サンスクリーン剤、パック、マスク、美容液等の基礎化粧品；ファンデーション類、化粧下地、口紅類、リップグロス、頬紅類等のメーキャップ化粧品；洗顔剤、ボディーシャンプー、クレンジング剤等の洗浄料；シャンプー、リンス、ヘアコンディショナー、トリートメント、整髪剤等の毛髪用化粧品；ボディーパウダー、ボディーローション等のボディ用化粧品等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本実施形態の化粧品において、上述の栄養剤の含有量は特に限定されず、化粧品の種類に応じて適宜含有量を設定すればよい。例えば、化粧品の使用感等を考慮し、化粧品における上述の栄養剤の含有量は、本藻類又はその抽出物の含有量として、０．０１〜３０質量％を例示することができる。化粧品の使用感等の観点からは、０．１〜２０質量％が好ましく、０．１〜１５質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましく、０．１〜５質量％が特に好ましい。
【００７１】
本実施形態の化粧品は、本藻類が含有する上述のような栄養成分を皮膚や毛髪に補給するために、皮膚や毛髪に塗布して用いることができる。
【００７２】
≪栄養成分の製造方法≫
本発明の一実施形態に係る栄養成分の製造方法は、上記実施形態のセネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株を培養する培養工程を備える方法である。
以下、本実施形態の製造方法の工程について説明する。
【００７３】
＜培養工程＞
培養工程は、本藻類を培養する工程である。
【００７４】
本工程で用いる本藻類の好適な例としては、上述の「≪藻類≫」で記載したものと同様のものが挙げられる。
また、培養工程は、上述の「≪藻類≫」に記載の方法で行うことができる。
【００７５】
本実施形態の製造方法は、更に、前記培養工程の後に、前記セネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株を破砕して細胞破砕物を得る破砕工程と、前記細胞破砕物から栄養成分を分離する分離工程と、をこの順に備えてもよい。
【００７６】
＜破砕工程＞
破砕工程は、本藻類の細胞を破砕して細胞破砕物を得る工程である。
【００７７】
本藻類の細胞の破砕方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。細胞の破砕方法としては、例えば、ガラスビーズ、乳鉢、超音波処理、フレンチプレス、ホモジナイザー等の物理的処理；中和処理、低張処理、凍結融解処理等の化学的処理等が挙げられる。これらの処理は、単独で行ってもよく、２種以上の処理を組み合わせて行ってもよい。
【００７８】
中和処理の方法としては、ｐＨ７〜１０程度の中和液に、本藻類の細胞を浸漬する方法が挙げられる。本藻類は、酸性域のｐＨに適応しているため、中性〜塩基性の中和液に浸漬することにより、細胞が破壊される。中和液の組成は、特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝液等を用いることができる。中和液への細胞の浸漬時間は、細胞が破壊される程度の時間とすればよく、例えば、１０〜３０分程度が例示される。
【００７９】
低張処理の方法としては、水などの低張液に、本藻類の細胞を浸漬する方法が挙げられる。本藻類は、細胞壁の強度が弱い又は薄いため、低張液に浸漬することにより、細胞が破裂する。低張液の組成は、特に限定されず、本藻類の細胞が破裂する程度の低張な液体であればよい。低張液としては、例えば、水、低濃度の緩衝液等を挙げることができる。低張液への細胞の浸漬時間は、細胞が破裂する程度の時間とすればよく、例えば、１〜３０分程度が例示される。
【００８０】
凍結融解処理の方法としては、本藻類の細胞に対して、凍結と融解のサイクルを１回以上行う方法が挙げられる。凍結と融解のサイクル回数は、特に限定されず、本藻類の細胞が破砕される程度の回数であればよい。凍結と融解のサイクル回数は、例えば、１〜５回程度が例示される。凍結及び融解の各時間は、特に限定されず、例えば、各々１０〜３０分程度が例示される。
【００８１】
上記のような方法で、本藻類の細胞を破砕することにより、本藻類の細胞破砕物を得ることができる。
【００８２】
＜分離工程＞
分離工程は、本藻類の細胞破砕物から栄養成分を分離する工程である。
【００８３】
本工程において、分離対象となる栄養成分は、本藻類が有する栄養成分であれば特に限定されない。上述の「≪栄養剤≫」において記載したように、本藻類は、アミノ酸類、ビタミン類（特に、カロテノイド類）、タンパク質、脂質（特に、機能性油）、食物繊維等の栄養成分を多く含む。そのため、本工程において分離対象となる栄養成分としては、機能性油及びカロテノイド類からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００８４】
前記栄養成分の中でも、機能性油としては、ＥＰＡ、α−リノレン酸及びリノール酸からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。好ましくは、機能性油としては、ＥＰＡが挙げられる。
また、カロテノイド類としては、アスタキサンチン、カンタキサンチン、β−カロテン及びルテインからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。好ましくは、カロテノイド類としては、アスタキサンチンが挙げられる。
【００８５】
本工程において分離される栄養成分は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。また、機能性油（ＥＰＡ、α−リノレン酸、リノール酸等）、カロテノイド類（アスタキサンチン、カンタキサンチン、β−カロテン、ルテイン等）等の種類ごとに分離してもよい。
【００８６】
細胞破砕物からの栄養成分の分離方法は、特に限定されず、栄養成分の種類に応じて適切な方法を選択すればよい。栄養成分の分離方法には、生化学物質の分離・精製等に一般的に用いられる方法を適宜組み合わせて用いることができる。分離方法としては、例えば、遠心分離、洗浄、塩析、透析、再結晶、再沈殿、溶媒抽出、吸着、濃縮、ろ過、ゲルろ過、限外ろ過、各種クロマトグラフィー（ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
＜任意工程＞
本実施形態の製造方法は、培養工程、破砕工程及び分離工程に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、本藻類を培養液から回収する工程（回収工程）、本藻類の細胞を洗浄する工程（洗浄工程）等が挙げられる。これらの工程は、上述の培養工程の後であって、破砕工程の前に行うことができる。
【００８８】
回収工程は、ろ過や遠心分離等の公知の方法により行うことができる。また、洗浄工程は、ｐＨ０．１〜５．０の洗浄液（緩衝液等）に細胞を懸濁し、次いでろ過や遠心分離等の方法で洗浄液から細胞を回収することにより行うことができる。
【００８９】
本実施形態の製造方法により、製造された栄養成分は、栄養剤、食品、飼料、ペットフード、化粧品、医薬品、試薬類等の各種用途に用いることができる。
【実施例】
【００９０】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９１】
［実施例１］
１．新規微細藻類の単離
日本国富山県の富山湾神通川において河口表層水を採水した。次に、河口表層水を０．４５μｍのポリカーボネートメンブレンフィルターで減圧濾過し、フィルター上に微細藻類を含む微生物を捕獲した。次に、そのフィルターごと、ＫＷＳＷ培地、ＳＧＩ培地（Ｓａｇｅｒ  ＆  Ｇｒａｎｉｃｋ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｉ）、ＩＭＫ培地及びドナリエラ用培地が入った培養液に入れ、白色蛍光灯下でエアレーションしながら培養した。なお、ＫＷＳＷ培地の組成を以下の表１に、ＳＧＩ培地の組成を以下の表２に、ＩＭＫ培地の組成を以下の表３に、ドナリエラ用培地の組成を以下の表４に示す。
【００９２】
その結果、微細藻類が増殖し、緑色又は褐色に濁った培養液の一部を、上記各培地で作製した１．５％（ｗ／ｖ）寒天培地上に塗布し、白色蛍光灯下で培養した。寒天培地上に塗布された微細藻類が増殖し、形成された個々のコロニーを単離することで微細藻類の選別及び単離（単一種化）を行った。これにより、ＡＢ−１Ｃ株が単離された。
【００９３】
【表１】
2019092480.tif 000002
【００９４】
【表２】
2019092480.tif 000003
【００９５】
【表３】
2019092480.tif 000004
【００９６】
【表４】
2019092480.tif 000005
【００９７】
【表５】
2019092480.tif 000006
【００９８】
次に、ＡＢ−１Ｃ株の顕微鏡（オリンパス社製、ＢＸ５１Ｎ−３３−ＰＨ）の観察を（倍率：５４０倍）を行った。ＡＢ−１Ｃ株の顕微鏡写真を図１に示す。上の画像は、明視野での顕微鏡写真である。下の画像は蛍光での顕微鏡写真である。
【００９９】
図１から、ＡＢ−１Ｃ株の細胞の形態は楕円球状又は球状で、大きさの異なるものが混在していることが確認された。
【０１００】
２．１８Ｓ  リボソームＤＮＡ配列に基づく系統解析
ＡＢ−１Ｃ株の細胞から抽出したＤＮＡを鋳型として、１８Ｓ  リボソームＤＮＡをＰＣＲで増幅し、配列解析を行った。ＡＢ−１Ｃ株の１８Ｓ  リボソームＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
なお、１８Ｓ  リボソームＤＮＡの増幅に使用したプライマーの配列は以下のとおりである。
フォワードプライマー：５’ −ＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧ−３’（配列番号２）
リバースプライマー：５’ −ＣＣＴＴＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＡＣ−３’ （配列番号３）
【０１０１】
ＡＢ−１Ｃ株の１８Ｓ  リボソームＤＮＡの塩基配列に基づき、最尤法による分子系統解析を行った。具体的には、データベースから得た近縁種の配列のアライメントをＭＥＧＡ５．０５  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ.ｎｅｔ/）を用いて行い、近隣接合法により分子系統樹を作成した。１８Ｓ  リボソームＤＮＡの塩基配列に基づく分子系統樹を図２に示す。なお、分子系統樹内の内部枝の統計的な支持値は、ブートストラップ法 (１０００回反復) によって求めた。
図２から、ＡＢ−１Ｃ株の１８Ｓ  リボソームＤＮＡは、下記表６に示す既知の藻類種と近縁種であることが判明した。
【０１０２】
【表６】
2019092480.tif 000007
【０１０３】
上記分子系統解析の結果より、ＡＢ−１Ｃ株は、セネデスムス属に属すると判定された。
【０１０４】
３．ＡＢ−１Ｃ株の成分分析
（１）ＡＢ−１Ｃ株の培養
ＡＢ−１Ｃ株を、ＳＧＩ培地を用いて、通気培養した。培養温度は２５℃とし、白色蛍光灯（４０００〜４５００ルクス）下で、エアレーションしながら、４〜７日間振盪培養した。培養したＡＢ−１Ｃ株を遠心分離にて回収し、凍結乾燥させた。
【０１０５】
（２）有用物質の分離及び分析
（２−１）カロテノイド類の分離及び分析
カロテノイド類の含有量については、一般財団法人日本食品分析センターに依頼し、分析を行った。なお、具体的な分析方法については、以下に示すとおりである。
【０１０６】
・アスタキサンチンの分離及び分析
凍結乾燥させたＡＢ−１Ｃ株０．１〜０．２ｇを秤量した。次に、秤量したＡＢ−１Ｃ株を用いて、以下の流れに従って、エステル型アスタキサンチンを酵素で分解後、分離及び精製を行い、高速流体クロマトグラフィーに使用する試料とした。また、高速液体クロマトグラフィーの分析条件を以下に示す。
【０１０７】
（アスタキサンチンの分離及び精製工程）
試料採取（０．２ｇ、乳鉢内）
↓＋海砂（適量）
↓＋水（１ｍＬ）
↓クロロホルム及びメタノールの混合溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）
磨砕抽出（数回に分けて、磨砕抽出。さらに、１１Ｇガラスフィルターで吸引濾過）
↓抽出液をクロロホルム及びメタノールの混合溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）
↓で１００ｍＬに定容
溶媒留去
↓＋アセトン（定容液１０ｍＬを５０ｍＬ容遠沈管に分取）
↓＋０．０５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）（６ｍＬ）
↓＋コレステロールエステラーゼ（１８００μＬ）（６０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）
酵素反応（３７℃、１２０分間）
↓＋石油エーテル（１０ｍＬ）
転溶
↓
遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分間）
↓上層を１００ｍＬ容ナスフラスコに回収
上記酵素反応から上記遠心分離をさらに２回繰り返す
↓
溶媒留去
↓＋移動相（所定量添加）
高速液体クロマトグラフィー
【０１０８】
（高速液体クロマトグラフィーの分析条件）
高速液体クロマトグラフ：ＬＣ−２０ＡＴ、株式会社島津製作所製
検出器：紫外可視吸光光度計、ＳＰＤ−２０Ａ、株式会社島津製作所製
カラム：Ｌｕｎａ３μ  Ｓｉｌｉｃａ  Φ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製
カラム温度：３０℃
移動相：ヘキサン及びアセトンの混合溶液（ヘキサン：アセトン＝８２：１８）
流量：１．２ｍＬ／ｍｉｎ
測定波長：４７０ｎｍ
注入量：４０μＬ
【０１０９】
・カンタキサンチンの分離及び分析
凍結乾燥させたＡＢ−１Ｃ株１ｇを秤量した。次に、秤量したＡＢ−１Ｃ株を用いて、以下の流れに従って、分離及び精製を行い、高速流体クロマトグラフィーに使用する試料とした。また、高速液体クロマトグラフィーの分析条件を以下に示す。
【０１１０】
（カンタキサンチンの分離及び精製工程）
試料採取（１ｇ、乳鉢内）
↓＋海砂（適量）
↓＋水（１ｍＬ）
↓クロロホルム及びメタノールの混合溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）
磨砕抽出（数回に分けて、磨砕抽出。さらに、１１Ｇガラスフィルターで吸引濾過）
↓抽出液をクロロホルム及びメタノールの混合溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）
↓で１００ｍＬに定容
↓１００ｍＬ容ナスフラスコに６０ｍＬ分取
溶媒留去
↓＋ＨＡＥＴ混合溶液（３０ｍＬ）
↓（ヘキサン、アセトン、エタノール及びトルエンの混合溶液）
↓（ヘキサン：アセトン：エタノール：トルエン＝１０：７：６：７）
↓＋水（１ｍＬ）
↓４０ｗ／ｖ％水酸化カリウム−メタノール溶液（４ｍＬ）
けん化（５６℃水浴中３０分間）
↓３００ｍＬ容褐色分液漏斗へ移す
↓＋ＨＡＥＴ混合溶液（３０ｍＬ）
↓＋３ｗ／ｖ％無水硫酸ナトリウム溶液（４０ｍＬ）
↓＋ＨＡＥＴ混合溶液（３０ｍＬ）
抽出
↓水（５０ｍＬ）で数回洗浄
上層回収
↓
溶媒留去
↓＋２−プロパノール（所定量添加）
高速液体クロマトグラフィー
【０１１１】
（高速液体クロマトグラフィーの分析条件）
高速液体クロマトグラフ：ＬＣ−２０ＡＴ、株式会社島津製作所製
検出器：紫外可視吸光光度計、ＳＰＤ−２０Ａ、株式会社島津製作所製
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＬ−Ｃ１８  Φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、インタクト株式会社製
カラム温度：４０℃
移動相：メタノール及び水の混合溶液（メタノール：水＝９６：４）
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
測定波長：４７０ｎｍ
注入量：２０μＬ
【０１１２】
・ルテインの分離及び分析
凍結乾燥させたＡＢ−１Ｃ株０．１〜０．２ｇを秤量した。次に、秤量したＡＢ−１Ｃ株を用いて、以下の流れに従ってエステル型ルテインをケン化処理後、分離及び精製を行い、高速流体クロマトグラフィーに使用する試料とした。また、高速液体クロマトグラフィーの分析条件を以下に示す。
【０１１３】
（ルテインの分離及び精製工程）
試料採取（０．１〜０．２ｇ、乳鉢内）
↓＋海砂（適量）
↓＋水（１ｍＬ）
↓クロロホルム及びメタノールの混合溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）
磨砕抽出（数回に分けて、磨砕抽出。さらに、１１Ｇガラスフィルターで吸引濾過）
↓抽出液をクロロホルム及びメタノールの混合溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）
↓で１００ｍＬに定容
↓１００ｍＬ容ナスフラスコに２ｍＬ分取
溶媒留去
↓＋ＨＡＥＴ混合溶液（３０ｍＬ）
↓＋水（１ｍＬ）
↓４０ｗ／ｖ％水酸化カリウム−メタノール溶液（４ｍＬ）
けん化（５６℃水浴中３０分間）
↓３００ｍＬ容褐色分液漏斗へ移す
↓＋ＨＡＥＴ混合溶液（３０ｍＬ）
↓＋３ｗ／ｖ％無水硫酸ナトリウム溶液（４０ｍＬ）
↓＋ＨＡＥＴ混合溶液（３０ｍＬ）
抽出
↓水（５０ｍＬ）で数回洗浄
上層回収
↓
溶媒留去
↓＋ヘキサン及びアセトンの混合溶液（所定量添加）（ヘキサン：アセトン＝８１：１９）
高速液体クロマトグラフィー
【０１１４】
（高速液体クロマトグラフィーの分析条件）
高速液体クロマトグラフ：ＬＣ−１０ＡＴＶＰ、株式会社島津製作所製
検出器：紫外可視吸光光度計、ＳＰＤ−２０Ａ、株式会社島津製作所製
カラム：Ｌｕｎａ３μ  Ｓｉｌｉｃａ  Φ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製
カラム温度：３０℃
移動相：ヘキサン及びアセトンの混合溶液（ヘキサン：アセトン＝８２：１８）
流量：１．２ｍＬ／ｍｉｎ
測定波長：４５０ｎｍ
注入量：３０μＬ
【０１１５】
・β−カロテンの分離及び分析
凍結乾燥させたＡＢ−１Ｃ株０．１〜０．２ｇを秤量した。次に、秤量したＡＢ−１Ｃ株を用いて、以下の流れに従って分離及び精製を行い、高速流体クロマトグラフィーに使用する試料とした。また、高速液体クロマトグラフィーの分析条件を以下に示す。
【０１１６】
（β−カロテンの分離及び精製工程）
試料採取（０．１〜０．２ｇ、乳鉢内）
↓＋海砂（適量）
↓＋水（１ｍＬ）
↓クロロホルム及びメタノールの混合溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）
磨砕抽出（数回に分けて、磨砕抽出。さらに、１１Ｇガラスフィルターで吸引濾過）
↓抽出液をクロロホルム及びメタノールの混合溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）
↓で１００ｍＬに定容
↓１００ｍＬ容ナスフラスコに２ｍＬ分取
溶媒留去
↓＋ＨＡＥＴ混合溶液（３０ｍＬ）
↓＋水（１ｍＬ）
↓４０ｗ／ｖ％水酸化カリウム−メタノール溶液（４ｍＬ）
けん化（５６℃水浴中３０分間）
↓３００ｍＬ容褐色分液漏斗へ移す
↓＋ＨＡＥＴ混合溶液（３０ｍＬ）
↓＋３ｗ／ｖ％無水硫酸ナトリウム溶液（４０ｍＬ）
↓＋ＨＡＥＴ混合溶液（３０ｍＬ）
抽出
↓水（５０ｍＬ）で数回洗浄
上層回収
↓
溶媒留去
↓＋ヘキサン及びアセトンの混合溶液（所定量添加）（ヘキサン：アセトン＝８１：１９）
↓５０ｍＬ容ナスフラスコに２ｍＬ分取
溶媒留去
↓＋エタノール（所定量添加）
高速液体クロマトグラフィー
【０１１７】
（高速液体クロマトグラフィーの分析条件）
高速液体クロマトグラフ：ＬＣ−２０ＡＤ、株式会社島津製作所製
検出器：紫外可視吸光光度計、ＳＰＤ−２０ＡＶ、株式会社島津製作所製
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−４．５μｍ  Φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ジーエルサイエンス株式会社製
カラム温度：４０℃
移動相：アセトニトリル、メタノール、テトラヒドロフラン及び酢酸の混合溶液
（アセトニトリル：メタノール：テトラヒドロフラン：酢酸＝５５：４０：５：０．１）（０．０５ｇ／Ｌ  ｄｌ−α−トコフェロール含有）
流量：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
測定波長：４５５ｎｍ
注入量：２０μＬ
【０１１８】
・総カロテノイド類の分析
総カロテノイド類の含有量は、吸光光度法により測定した。含有されていることが確認されたカロテノイド類のうち、最も含量が高い成分であるアスタキサンチンの測定条件で定量を行った。アスタキサンチンの吸光係数Ｅ１％１ｃｍ＝２２００（波長４７８ｎｍ、アセトン）より算出した。
【０１１９】
測定結果としては、ＡＢ−１Ｃ株の乾燥重量１００ｇ中の総カロテノイド類の含有量が６６６ｍｇであり、アスタキサンチンの含有量が４１５ｍｇであり、カンタキサンチンの含有量が６６．９ｍｇであり、β−カロテンの含有量が４２．３ｍｇであり、ルテインの含有量が３４．４ｍｇであった。この結果を以下の表７にも示す。なお、対照として、ヘマトコッカス及びＭｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＧＫ−１２株の乾燥重量１００ｇ中のアスタキサンチンの含有量を示す。
【０１２０】
（２−２）脂肪酸の分離及び分析
凍結乾燥させたＡＢ−１Ｃ株１〜３０ｍｇを秤量した。次に、ＡＢ−１Ｃ株をキャップ付きの耐圧試験管に入れた。そこへ、ＢＦ３−Ｍｅｔｈａｎｏｌ溶液を０．４ｍＬ入れ、１００℃で４０分間反応させることにより、ＡＢ−１Ｃ株の細胞中に含まれる中性脂肪酸を、脂肪酸メチル（バイオディーゼルフューエル成分）へ変換した。反応終了後冷却し、反応液中へペンタンを入れることにより、生成した脂肪酸メチルをペンタン層へ移した。一定時間放置後、ペンタン層を回収した。このペンタン抽出を数回繰り返した。その後、得られたペンタン抽出液を揮発させ、脂肪酸メチルを残渣とした回収した。この残渣をヘキサンに溶解させ、脂肪酸分析の試料とした。
【０１２１】
次に、試料中の脂肪酸の含有量をキャピラリーガスクロマトグラフィー（ＧＣ、ＧＣ−２０１０、島津製作所製）にて測定した。キャピラリーガスクロマトグラフィーの分析条件を以下に示す。
【０１２２】
（キャピラリーガスクロマトグラフィーの分析条件）
カラム：ＩｎｅｒｔＣＡＰ  ＷＡＸ（ＧＬサイエンス製、３０ｍ、内径０．２５ｍｍ）
ガス：ヘリウムガス（Ｈｅ、７０ｋＰａ）
検出：ＦＩＤ
【０１２３】
測定結果としては、ＡＢ−１Ｃ株の乾燥重量１００ｇ中のＥＰＡの含有量は、４００ｍｇであった。
また、ＡＢ−１Ｃ株の乾燥重量中のオレイン酸の含有量は１７．８質量％、パルミチン酸の含有量は５．１質量％、リノール酸の含有量は４．６質量％、α−リノレン酸の含有量は４．５質量％、ステアリン酸の含有量は１．８質量％であった。
また、脂肪酸中のオレイン酸の含有量は４４．６質量％、パルミチン酸の含有量は１２．８質量％、リノール酸の含有量は１１．５質量％、α−リノレン酸の含有量は１１．４質量％、ステアリン酸の含有量は４．６質量％、γ−リノレン酸の含有量は０．２質量％、ＥＰＡの含有量は０．９質量％であった。
上記の結果のうち一部を以下の表７にも示す。なお、対照として、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＧＫ−１２株の乾燥重量１００ｇ中のＥＰＡの含有量を示す。
【０１２４】
（２−３）炭化水素の分離及び分析
凍結乾燥させたＡＢ−１Ｃ株１〜３０ｍｇを秤量した。次に、ＡＢ−１Ｃ株をビーズ入りアシストチューブに入れた。そこへ、０．１Ｍ水酸化カリウムのメタノール液０．１Ｍを入れた後、キャップ付きの試験管に入れた。次に、８０℃で９０分間反応させることにより、ケン化させた。反応終了後冷却し、反応液中へ水１．０ｍＬを加えて撹拌し、さらに、ヘキサン２ｍＬを入れて撹拌した。次に、静置し、ヘキサン層をキャップ付きの試験管に回収した。次に、キャップを開けたまま乾燥器内でヘキサンを気化させた。次に、トリメチルシリル（ＴＭＳ）化剤を５０μＬ加え、キャップをした後６０℃で３０〜６０分間放置した。次に、水０．５ｍＬ加え混合した後、ヘキサン０．５ｍＬ加えた。次に、ヘキサン層を１．５ｍＬバイアルに移し、ヘキサンを気化させた。そこへ、正確にヘキサン１ｍＬを加え、炭化水素分析の試料とした。
【０１２５】
次に、試料中の炭化水素の含有量をキャピラリーガスクロマトグラフィー（ＧＣ、ＧＣ−２０１０、島津製作所製）にて測定した。キャピラリーガスクロマトグラフィーの分析条件を以下に示す。
【０１２６】
（キャピラリーガスクロマトグラフィーの分析条件）
カラム：ＤＢ−１ｍｓ（ＳＥＧ、内径０．２５ｍｍ)
ガス：ヘリウムガス（Ｈｅ、７０ｋＰａ）
検出：ＦＩＤ
【０１２７】
測定結果としては、油成分中の炭化水素の含有量は６６．８質量％であった。
【０１２８】
【表７】
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【０１２９】
以上のことから、セネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株から、燃料油となり得る炭化水素、リノール酸、α−リノレン酸、ＥＰＡ等の機能性油、及び、アスタキサンチン等のカロテノイド類等の多数の有用物質が得られることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
セネデスムス・エスピーＡＢ−１Ｃ株によれば、バイオ燃料、機能性油又は機能性物質等の有用物質が得られる。さらに、前記得られた有用物質は、機能性食品若しくは栄養補助食品等の食品、愛玩動物用のペットフード若しくは家畜や養殖魚介類の飼料、又は、化粧品等に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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