(57)【要約】【課題】がんの転移形成能に関与する因子（タンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド）および前記因子を用いたがん患者の予後予測方法を提供すること。【解決手段】がんの転移形成能に関与する因子として、少なくとも特定の位置にアミノ酸置換が生じたＳＭＡＤ４タンパク質、ＡＴＭタンパク質およびＰＩＫ３ＣＡタンパク質のいずれか、ならびにこれらタンパク質をコードするポリヌクレオチドを選択することで、前記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取された試料において、タンパク質のアミノ酸置換を検出する工程を含む、がん患者における予後の予測方法であって、
前記アミノ酸置換が、以下の（１）から（４）のうち少なくともいずれか１つの置換である、前記予測方法。
（１）配列番号１の２５６番目のグルタミンがロイシンに置換
（２）配列番号２の２６８４番目のグルタミンがロイシンに置換
（３）配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンがバリンに置換
（４）配列番号３の１０６６番目のアラニンがスレオニンに置換
【請求項２】
前記採取された試料からがん細胞を回収する工程をさらに含み、前記検出工程が、がん細胞が発現するタンパク質のアミノ酸置換を検出する、請求項１に記載の予測方法。
【請求項３】
採取された試料において、ポリヌクレオチドの塩基置換を検出する工程を含む、がん患者における予後の予測方法であって、
前記塩基置換が、以下の（Ｉ）から（ＩＶ）のうち少なくともいずれか１つの置換である、前記予測方法。
（Ｉ）配列番号１の２５６番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換
（ＩＩ）配列番号２の２６８４番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換
（ＩＩＩ）配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンに対応するコドンがバリンに対応するコドンに置換
（ＩＶ）配列番号３の１０６６番目のアラニンに対応するコドンがスレオニンに対応するコドンに置換
【請求項４】
採取された試料において、ポリヌクレオチドの塩基置換を検出する工程を含む、がん患者における予後の予測方法であって、
前記塩基置換が、以下の（ｉ）から（ｉｖ）のうち少なくともいずれか１つの置換である、前記予測方法。
（ｉ）配列番号４の１３０５番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉ）配列番号５の８４３６番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉｉ）配列番号５の８４４１番目のチミンがグアニンに置換
（ｉｖ）配列番号６の３３５３番目のグアニンがアデニンに置換
【請求項５】
前記採取された試料からがん細胞を回収する工程をさらに含み、前記検出工程が、がん細胞においてポリヌクレオチドの塩基置換を検出する、請求項３又は４に記載の予測方法。
【請求項６】
採取された試料からがん細胞を回収する工程を、試料中に含まれるがん細胞を保持可能な保持部を複数設けた細胞保持手段と誘電泳動力を発生させる手段とを備えた細胞回収装置を用いて行なう、請求項２又は５に記載の予測方法。
【請求項７】
前記試料が血液試料であり、がん細胞が血中循環がん細胞である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
以下の（１）から（４）のいずれかのポリペプチドからなる、がんの転移形成能に関与するタンパク質。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号１の２５６番目のグルタミンがロイシンに置換した前記ポリペプチド
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８４番目のグルタミンがロイシンに置換した前記ポリペプチド
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンがバリンに置換した前記ポリペプチド
（４）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号３の１０６６番目のアラニンがスレオニンに置換した前記ポリペプチド
【請求項９】
請求項８に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１２】
配列番号４〜６のいずれか１つの塩基配列において、以下の（ｉ）から（ｉｖ）のうち少なくともいずれか１つの置換を有する、塩基配列の遺伝子。
（ｉ）配列番号４の１３０５番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉ）配列番号５の８４３６番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉｉ）配列番号５の８４４１番目のチミンがグアニンに置換
（ｉｖ）配列番号６の３３５３番目のグアニンがアデニンに置換
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載される遺伝子の存在を測定するためのプローブ。
【請求項１４】
請求項８に記載のタンパク質を特異的に認識する抗体、またはそのフラグメント。
【請求項１５】
請求項８に記載のタンパク質を認識し、前記置換を有さないタンパク質を認識しない、請求項１４に記載の抗体、またはそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの転移形成能に関与する因子（タンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド）ならびに前記因子を用いたがん患者の予後予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲノム薬理学の急速な進歩により、がん、糖尿病、高血圧といった各種疾患の分子レベルでの解明が可能となり、患者間の個体差（例えば、薬物の吸収、分布または代謝、ならびに病態および疾患に対する感受性の差異）に、遺伝子の変異が関与している場合があることが明らかとなってきている。
【０００３】
特にがん関連分野において、遺伝子の変異はタンパク質の発現、構造ならびに機能に異常をきたし、正常細胞のがん化を誘引する原因である。現在までに、がん関連遺伝子変異は数多く報告されている。例えばセリン／スレオニンキナーゼやチロシンキナーゼ遺伝子における変異は、細胞の増殖を直接制御する重要な酵素をコードしていることから、アミノ酸配列の置換や欠失などによる自己リン酸化の亢進として検出されるキナーゼ活性の自発活性化により細胞をがん化に導くことが知られている。
【０００４】
なかでも肺がんに関しては、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、上皮成長因子受容体）遺伝子（１０％から４０％）やＫＲＡＳ遺伝子（１０％から２０％）の変異、ＡＬＫ（Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｋｉｎａｓｅ、未分化リンパ腫リン酸化酵素）遺伝子とＥＭＬ４（Ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍ  Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｋｅ  ４）遺伝子との融合やＡＬＫ遺伝子とＫＩＦ５Ｂ（Ｋｉｎｅｓｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  ５Ｂ）遺伝子との融合等（５％）が生じていることも明らかとなっている（非特許文献１から５）。
【０００５】
前述した遺伝子変異やそれに伴う異常タンパク質（アミノ酸置換が生じたタンパク質）等を標的に、分子標的治療薬が開発されている。しかしながら多くの治療薬は集団内の特定のがん細胞には効果を示す一方、不均一性を示す残りのがん細胞やがん幹細胞（悪性がん細胞）には薬効を示さないため、残存した悪性がん細胞の増殖に伴う再発や転移が課題となっている。したがって、治療法もしくは治療薬の選定またはがん細胞の悪性度を測定可能な標的因子（標的タンパク質および標的遺伝子）が求められている。
【０００６】
特にヒトのがんにおいて、がんの転移形成能に関与する因子（タンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を同定することは、前記因子を標的とした新規ながんの治療方法や検査方法、治療薬の開発に大きく寄与するため、強く望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊａｎｋｕ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、７（２０１０）、４０１−４１４
【非特許文献２】Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１５（２００９）、３１４３−３４１９
【非特許文献３】Ｌｏｖｌｙ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、８（２０１１）、６８−７０
【非特許文献４】Ｐａｅｚ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４（２００４）、１４９７−１５００
【非特許文献５】Ｓｏｄａ，Ｍ．Ｅｔ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４４８（２００７）、５６１−５６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、がんの転移形成能に関与する因子（タンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド）および前記因子を用いたがん患者の予後予測方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、がん細胞で発現するタンパク質のうち、特定の位置にアミノ酸置換が生じたＳＭＡＤ４（ＳＭＡＤ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ４）タンパク質、ＡＴＭ（ＡＴＭ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）タンパク質およびＰＩＫ３ＣＡ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ３−Ｋｉｎａｓｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａｌｐｈａ）タンパク質、ならびにこれらタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、がんの転移形成能に関与する因子であることを見出し、本発明に到達した。
【００１０】
すなわち本発明の第一の態様は、
採取された試料において、タンパク質のアミノ酸置換を検出する工程を含む、がん患者における予後の予測方法であって、
前記アミノ酸置換が、以下の（１）から（４）のうち少なくともいずれか１つの置換である、前記予測方法である。
（１）配列番号１の２５６番目のグルタミンがロイシンに置換
（２）配列番号２の２６８４番目のグルタミンがロイシンに置換
（３）配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンがバリンに置換
（４）配列番号３の１０６６番目のアラニンがスレオニンに置換
【００１１】
また本発明の第二の態様は、第一態様に記載の予測方法において、前記採取された試料からがん細胞を回収する工程をさらに含み、前記検出工程が、がん細胞が発現するタンパク質のアミノ酸置換を検出する、予測方法に関する。
【００１２】
また、本発明の第三の態様は、採取された試料において、ポリヌクレオチドの塩基置換を検出する工程を含む、がん患者における予後の予測方法であって、
前記塩基置換が、以下の（Ｉ）から（ＩＶ）のうち少なくともいずれか１つの置換である、前記予測方法である。
（Ｉ）配列番号１の２５６番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換
（ＩＩ）配列番号２の２６８４番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換
（ＩＩＩ）配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンに対応するコドンがバリンに対応するコドンに置換
（ＩＶ）配列番号３の１０６６番目のアラニンに対応するコドンがスレオニンに対応するコドンに置換
【００１３】
また本発明の第四の態様は、採取された試料において、ポリヌクレオチドの塩基置換を検出する工程を含む、がん患者における予後の予測方法であって、
前記塩基置換が、以下の（ｉ）から（ｉｖ）のうち少なくともいずれか１つの置換である、前記予測方法である。
（ｉ）配列番号４の１３０５番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉ）配列番号５の８４３６番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉｉ）配列番号５の８４４１番目のチミンがグアニンに置換
（ｉｖ）配列番号６の３３５３番目のグアニンがアデニンに置換
【００１４】
また本発明の第五の態様は、第三態様及び第四態様の予測方法において、前記採取された試料からがん細胞を回収する工程をさらに含み、前記検出工程が、がん細胞においてポリヌクレオチドの塩基置換を検出する、予測方法に関する。
【００１５】
また本発明の第六の態様は、採取された試料からがん細胞を回収する工程を、試料中に含まれるがん細胞を保持可能な保持部を複数設けた細胞保持手段と誘電泳動力を発生させる手段とを備えた細胞回収装置を用いて行なう、前記第二又は第五の態様のいずれかに記載の予測方法である。
【００１６】
また本発明の第七の態様は、前記試料が血液試料であり、がん細胞が血中循環がん細胞である、前記第一から第六の態様のいずれか１つに記載の方法である。
【００１７】
さらに本発明の第八の態様は、以下の（１）から（４）のいずれかのポリペプチドからなる、がんの転移形成能に関与するタンパク質である。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号１の２５６番目のグルタミンがロイシンに置換した前記ポリペプチド
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８４番目のグルタミンがロイシンに置換した前記ポリペプチド
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンがバリンに置換した前記ポリペプチド
（４）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号３の１０６６番目のアラニンがスレオニンに置換した前記ポリペプチド
【００１８】
また本発明の第九の態様は、前記第八の態様に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１９】
また本発明の第十の態様は、前記第九の態様に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。
【００２０】
また本発明の第十一の態様は、前記第八の態様に記載のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２１】
また本発明の第十二の態様は、配列番号４〜６のいずれか１つの塩基配列であって、以下の（ｉ）から（ｉｖ）のうち少なくともいずれか１つの置換を有する、遺伝子に関する。
（ｉ）配列番号４の１３０５番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉ）配列番号５の８４３６番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉｉ）配列番号５の８４４１番目のチミンがグアニンに置換
（ｉｖ）配列番号６の３３５３番目のグアニンがアデニンに置換
【００２２】
また本発明の第十三の態様は、第十一の態様又は第十二の態様に記載される遺伝子の存在を測定するためのプローブに関する。
【００２３】
また本発明の第十四の態様は、第八の態様に記載のタンパク質を特異的に認識する抗体に関する。
【００２４】
また本発明の第十五の態様は、第十四の態様に記載される抗体が、前記置換を有さない配列からなる遺伝子から発現されるタンパク質を認識しない抗体に関する。
【００２５】
また本発明の第十六の態様は、第八の態様に記載のタンパク質を特異的に認識する低分子化合物に関する。
【００２６】
また本発明の第十七の態様は、第十六の態様に記載される低分子化合物が、前記置換を有さない配列からなる遺伝子から発現されるタンパク質を認識しない低分子化合物に関する。
【００２７】
また本発明の第十八の態様は、第八の態様に記載のタンパク質を用いた、がんワクチンの製造方法に関する。
【００２８】
また本発明の第十九の態様は、第八の態様に記載のタンパク質、第九の態様に記載のポリヌクレオチドおよび第十二の態様に記載の遺伝子のいずれかを用いた、細胞障害性Ｔ細胞が有するＴ細胞受容体の同定方法に関する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の因子（タンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド）は、がんの転移形成能に関与する因子である。従って、前記因子を検出（具体的には、前記因子が有するアミノ酸置換または塩基置換を検出）することで、がん患者の予後予測、手術前後や遺伝子治療におけるがんの検査や、がんの再発検査などを高精度に実施できる。また前記因子を標的とする抗体医薬、核酸医薬、低分子化合物などの創薬を実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の予測方法のうち、がん細胞を回収する工程で使用可能な、がん細胞を保持可能な細胞回収装置の一例を示した図（分解図）である。
【図２】図１に示す装置の正面図である。
【図３】図１に示す装置を用いた、がん細胞を回収する工程の一例を示した図である。
【図４】実施例４で取得した５種の遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞と、ネガティブコントロールとして遺伝子導入未実施のＷｉＤＲ細胞をそれぞれ接着細胞培養用２４ウェルプレートに播種し、９６時間培養後、正立顕微鏡を用いて観察された細胞形態の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、がんの限定は特になく、例えば、白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫などの造血細胞悪性腫瘍、脳腫瘍、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、食道がん、胃がん、虫垂がん、大腸がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、副腎がん、消化管間質腫瘍、中皮腫、口腔底がん、歯肉がん、舌がん、頬粘膜がんなどの喉頭がん、口腔がん、頭頚部がん、唾液腺がん、副鼻腔がん、甲状腺がん、腎臓がん、肺がん、骨肉腫、骨がん、前立腺がん、精巣腫瘍、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肛門がん、メラノーマが挙げられる。また原発性腫瘍であってもよいし転移性腫瘍であってもよい。
【００３２】
本発明の予後予測方法を適用するがん患者は、抗がん剤の投与をすでに受けた患者であってもよいし、当該抗がん剤の投与を現在受けている患者であってもよいし、当該抗がん剤の投与を受ける前の患者であってもよい。また、がんの疑いのある患者も本発明におけるがん患者に含まれる。
【００３３】
本発明の予後予測方法において、採取された試料に特に限定はなく、例えば、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、髄液、羊水、リンパ液、腹水、組織、器官（肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、リンパ節、動脈など）といった生体試料、ならびに前記生体試料中に含まれる細胞／組織の培養物や培養液（培養試料）が挙げられる。なお、がん患者から採取された試料は、その性状に応じて、予め希釈、混合、分散、懸濁などの処理を行なってもよい。前記生体試料のうち、血液試料（例えば、全血、血漿、血清などの血液検体や、当該血液検体を生理食塩水などで希釈した試料）は、がん患者からの試料採取や試料中に含まれるがん細胞の回収が容易に行なえる点で、本発明における試料として好ましい。
【００３４】
本発明の予後予測方法では、対象から試料を採取する工程をさらに含んでもよい。試料の採取は、試料の種類に応じて異なるが、注射、穿刺、スワブ、分取などの方法により行われる。こうして採取された試料からがん細胞を回収する工程をさらに含んでもよい。こうして得られた試料は、がん細胞を含んでいることが好ましい。試料が全血、血漿、血清といった血液試料である場合、試料に含まれるがん細胞は、血中循環がん細胞（ＣＴＣ）であることが好ましい。血中循環がん細胞は、例えば、血液試料を密度勾配遠心法（特開２０１５−００６１６９号公報）やフィルター法（特開２０１４−２３３２６７号公報）などに供して、ＣＴＣを含む（ＣＴＣが濃縮された）画分を取得し、当該画分からＣＴＣを回収できる。試料が、穿刺などにより取得された組織である場合、組織から細胞を分離し、がん細胞マーカーなどで識別してフローサイトメトリーを行うことにより、がん細胞を分離することもできる。
【００３５】
密度勾配遠心法によりがん細胞を含む画分を取得する場合には、密度勾配溶液に試料を重層した後、遠心分離を行なう。当該遠心分離により試料中に含まれる夾雑細胞（血液試料の場合、赤血球、白血球など）は下層（密度勾配溶液側）に移動する一方、がん細胞は上層（試料側）に残るため、当該上層を回収することでがん細胞を含む（がん細胞が濃縮された）画分を取得することができる。なお、前述したがん細胞を含む画分の取得を、前記上層と前記下層とが分離可能な容器（特開２０１５−００６１６９号公報）を用いて行なうと、がん細胞を含む画分の取得が容易となるため好ましい。さらに、試料が血液試料の場合には、当該試料を密度勾配溶液に重層する前に、当該試料を溶血させる工程（溶血操作）を行なうと、夾雑細胞である赤血球の細胞数を減少させることができ、前記上層への赤血球の混入数も減少するため好ましい。なお、前記溶血操作は密度勾配遠心分離後に実施してもよく、その場合は、再度遠心分離などによる夾雑細胞の除去操作を行なってもよい。
【００３６】
前述した方法で得られたがん細胞を含む画分は、凍結保存や化学固定による保存処理を行なってもよい。例えば、凍結保存する場合は、細胞保存溶液に溶液置換をした後、０℃以下の温度、好ましくは−２０℃以下、さらに好ましくは−８０℃以下の温度で保存すればよい。化学固定する場合は、細胞懸濁液に安定化剤を添加し、タンパク質を不溶化および／または不活性化する細胞固定処理を施すことで、前記細胞の劣化を長時間抑制すればよい。化学固定に用いる安定化剤としては、例えば、アルデヒド類、酸類、脱水剤・有機溶媒類、金属塩類などの細胞固定剤を含む溶液が挙げられる。
【００３７】
前述した方法で得られたがん細胞を含む画分には、がん細胞以外の夾雑細胞（血液試料の場合、特に白血球）がまだ多く含まれる。従って、前記画分中に存在するがん細胞を特異的に検出してから、がん細胞を回収すると好ましい。がん細胞を検出するには、例えば、がん細胞を含む画分をスライドに塗布するか、またはがん細胞を保持可能な装置にがん細胞を含む画分を導入してがん細胞を前記装置に保持させた後、顕微鏡や光学検出器などを利用して、前記がん細胞が有する特徴に基づき、がん細胞を検出すればよい。また、がん細胞を含む画分をフローサイトメーターに導入することでがん細胞を検出してもよい。
【００３８】
がん細胞を回収可能な細胞回収装置の一例を図１に示し、その正面図を図２に示す。
図１および図２に示す細胞回収装置１００は、
貫通孔１１ａを有する平板状の遮光部材１１と、
貫通孔１２ａを有する平板状の絶縁体１２と、
導入口２１、排出口２２および貫通部２３を有する平板状のスペーサー２０と、
遮光部材１１の下部およびスペーサー２０の上部と密着するよう設けた電極基板３１・３２と、
電極基板３１・３２同士を接続する導線４０と、
電極基板３１・３２に信号を印加する信号発生器５０と、
を備えている。
【００３９】
遮光部材１１が有する貫通孔１１ａと絶縁体１２が有する貫通孔１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１および絶縁体１２を設けている。貫通孔１１ａ、貫通孔１２ａおよび遮光部材１１の下部に密着して設けた電極基板３１により、細胞回収手段１０内に保持部６０が構成され、導入口２１から細胞を含む液体を導入すると、貫通部２３を通じて保持部６０へ細胞が導入される。電極基板３２はスペーサー２０上部に密着して設けており、導入口２１から導入した、細胞を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお、保持部６０に保持した細胞の回収を容易にするため、電極基板３２はスペーサー２０から取り外し可能な構造となっている。また電極基板３１・３２をＩＴＯ（酸化インジウムスズ）などの透明電極にすると、保持部６０に保持された細胞を、顕微鏡や光学検出器を用いて検出可能となるため好ましい。
【００４０】
図１および図２に示す細胞回収装置１００にがん細胞を保持させる際は、がん細胞を含む画分をスペーサー２０に設けた導入口２１から導入後、信号発生器５０から導線４０を介して電極基板３１・３２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力を発生させ、がん細胞を保持させるとよい。がん細胞を含む画分を細胞回収装置１００に導入する際は、予め当該画分を遠心分離することでがん細胞を含むペレットを得た後、マンニトール、グルコ−ス、スクロ−スなどの糖を含む溶液に当該ペレットを懸濁させてから細胞回収装置１００に導入すると、がん細胞へのダメ−ジが少なくなるため好ましい。なお、前記ペレットの懸濁液として前述した糖の他に、ＢＳＡやカゼイン等のタンパク質、親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含んでもよい。前記ペレットの懸濁液中に含まれる糖の濃度はがん細胞と等張になる濃度とすればよく、糖としてマンニトールを用いる場合は終濃度で２５０ｍＭから３５０ｍＭの間とすればよい。電極基板３１・３２へ印加する交流電圧としては、ピ−ク電圧が１Ｖから２０Ｖ程度で、周波数１０ｋＨｚから１０ＭＨｚ程度である、正弦波、矩形波、三角波、台形波が例示できる。具体例として、生きたがん細胞を保持部に１つずつ保持させたい場合は、周波数１００ｋＨｚから３ＭＨｚの矩形波を使用すると好ましい。
【００４１】
前述した通りがん細胞の検出は、当該がん細胞が有する特徴に基づき検出すればよい。例えば、血液試料中に含まれるがん細胞（ＣＴＣ）を検出する場合は、細胞核を有し、かつ白血球マーカー（ＣＤ４５など）を実質的に発現していない、および／またはがん細胞由来マーカーもしくは上皮系マーカー（サイトケラチン（ＣＫ）やＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）など）を発現している細胞をＣＴＣとして検出する態様が挙げられる（Ｓ．Ｌ．Ｗｅｒｎｅｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｉｒｃ．Ｂｉｏｍａｒｋ．，４：３，ｄｏｉ：１０．５７７２／６０７２５（２０１５）参照）。なお、ＣＫにはＣＫ１からＣＫ２０まで２０種類のタンパク質が知られているが、そのいずれもが前記上皮系マーカーとして使用可能である。ここで「白血球マーカーを実質的に発現していない」とは、白血球マーカーの発現がほとんど確認できないことをいい、具体的には、対象細胞におけるマーカーの発現量が、白血球マーカーを発現する細胞（白血球など）の発現量の半分未満、好ましくは１／３未満、より好ましくは１／５未満、さらにより好ましくは１／１０未満である場合に「白血球マーカーを実質的に発現しない」と評価し得る。また、対象細胞におけるマーカーの発現量が、白血球マーカーを発現しないことが知られている陰性対照細胞（例えば、血管内皮細胞、間葉系幹細胞）と同等の発現量である場合も「白血球マーカーを実質的に発現しない」と評価し得る。
【００４２】
がん細胞の検出を当該がん細胞が有する光学的特徴に基づき検出する場合、細胞核の検出は、４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）やＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（商品名）などの細胞核染色試薬で染色して検出すればよい。また、マーカーの検出は、当該マーカーを直接呈色試薬や蛍光試薬で染色して検出してもよく、当該マーカーに対する標識化抗体又は当該マーカーに対する一次抗体と当該一次抗体に対する標識二次抗体を用いて検出してもよく、当該マーカーの遺伝子を特異的に増幅して検出してもよい。中でもマーカーの検出を当該マーカーに対する標識化抗体を用いて検出する方法は、当該マーカーを簡便、高感度、かつ特異的に検出できる方法であり好ましい。なお、抗体を標識する物質も特に限定はなく、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商品名）などの蛍光物質が挙げられる。
【００４３】
がん細胞検出の別の態様として、細胞の大きさに基づき検出する態様が挙げられる。がん細胞の多くは赤血球（直径７μｍから８μｍ、厚さが２μｍ程度の円盤形）や白血球（マクロファージを除けばおよそ直径６μｍから１５μｍの球状）と比較して径が大きい（ＣＴＣの場合、直径１０μｍから３０μｍ）ことが知られており（Ｒｏｓｔａｇｎｏ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１７（４Ａ），２４８１−２４８５（１９９７））、赤血球や白血球と比較して径が大きな細胞を指標とすることにより、がん細胞を精度よく検出できる。
【００４４】
がん細胞検出のさらに別の態様として、細胞核の大きさに基づき検出する態様が挙げられる。がん細胞の多くは正常細胞と比較して細胞核が大きいことが知られており、正常細胞と比較して細胞核が大きな細胞を抽出することにより、正常細胞とほぼ同じ径のがん細胞であっても精度よく検出することが可能となる（特開２０１３−５０８７２９号および特開２０１３−０２４７６８号参照）。細胞核の大きさの測定は、具体的には、前述した細胞核染色試薬で染色して測定すればよい。
【００４５】
検出器によるがん細胞の検出は、例えば、カメラなどの撮像手段で撮像することで得られた画像（明視野像、蛍光画像、発光画像など）をパソコン等に取り込んだ後、ソフトウェアを用いてがん細胞か否かを判別すればよい。ソフトウェアを用いずに、目視によりがん細胞か否かを判別することもできる。
【００４６】
前述した方法で検出したがん細胞は、細胞を採取可能な採取手段を用いて回収すればよい。採取手段としては、例えば、ポンプや電気浸透流などを用いた吸引による採取手段が挙げられる。がん細胞がポリ−Ｌ−リジンなどの接着物質により比較的強く基板に接着されている場合、高流速で吸引する必要があるため、採取手段としてシリンジポンプを用いる場合は、流量を０．０１から５．０μＬ／ｓの間とすると好ましい。細胞の吸引で用いる細管の材質としては、ガラス、金属、樹脂等が挙げられるが、耐衝撃性および光透過性が高いガラスが好ましい。また、細管の内径は、吸引後の細管内での詰まりを防ぐため、吸引する細胞の直径よりも大きくすることが好ましい。例えば、直径３０μｍの保持部（保持部間の距離は５０μｍ）に導入された細胞を吸引する場合は、細管の内径を２５μｍから３５μｍの間とすることができる。
【００４７】
本発明の予後予測方法では、回収したがん細胞が発現するタンパク質のうち、がんの転移形成能に関与する特定タンパク質、または当該特定タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に特定ポリヌクレオチドとも表記する）を検出することでがん患者の予後予測を行なう。
【００４８】
前記特定タンパク質は具体的には、以下の（１）から（５）のうち少なくともいずれか１つである。
（１）配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＰ＿００５３５０．１）に記載のアミノ酸配列を含むＳＭＡＤ４（ＳＭＡＤ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ４）タンパク質において、少なくとも配列番号１の２５６番目のグルタミンがロイシンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号７のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
（２）配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＰ＿００００４２．３）に記載のアミノ酸配列を含むＡＴＭ（ＡＴＭ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）タンパク質のうち、少なくとも配列番号２の２６８４番目のグルタミンがロイシンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号８のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＡＴＭタンパク質において、少なくとも配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンがバリンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号９のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
（４）配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＰ＿００６２０９．２）に記載のアミノ酸配列を含むＰＩＫ３ＣＡ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ３−Ｋｉｎａｓｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａｌｐｈａ）タンパク質において、少なくとも配列番号３の１０６６番目のアラニンがスレオニンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号１０のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
（５）配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＰ＿００００４２．３）に記載のアミノ酸配列を含むＡＴＭ（ＡＴＭ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）タンパク質のうち、少なくとも配列番号２の２６８４番目のグルタミンがロイシンに置換し、かつ少なくとも配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンがバリンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号１５のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
【００４９】
また前記特定ポリヌクレオチドは具体的には、以下の（Ｉ）から（Ｖ）のうち少なくともいずれか１つである。
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＳＭＡＤ４タンパク質をコードするヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号１の２５６番目のグルタミンに対応するコドン（ＣＡＡまたはＣＡＧ）がロイシンに対応するコドン（ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧのいずれか）に置換したポリヌクレオチド
（ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＡＴＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８４番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換したポリヌクレオチド
（ＩＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＡＴＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンに対応するコドン（ＴＴＴまたはＴＴＣ）がバリンに対応するコドン（ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、ＧＴＧのいずれか）に置換したポリヌクレオチド
（ＩＶ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＰＩＫ３ＣＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号３の１０６６番目のアラニンに対応するコドン（ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧのいずれか）がスレオニンに対応するコドン（ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧのいずれか）に置換したポリヌクレオチド
（Ｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＡＴＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８４番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換し、かつ少なくとも配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンに対応するコドン（ＴＴＴまたはＴＴＣ）がバリンに対応するコドン（ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、ＧＴＧのいずれか）に置換したポリヌクレオチド
【００５０】
前記（Ｉ）のポリヌクレオチドの一態様として、
（ｉ）配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００５３５９．５）に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１３０５番目のアデニンがチミンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号１１で表される。
前記（ＩＩ）のポリヌクレオチドの一態様として、
（ｉｉ）配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００００５１．３）に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも８４３６番目のアデニンがチミンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号１２で表される。
前記（ＩＩＩ）のポリヌクレオチドの一態様として、
（ｉｉｉ）配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも８４４１番目のチミンがグアニンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号１３で表される。
前記（ＩＶ）のポリヌクレオチドの一態様として、
（ｉｖ）配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６２１８．２）に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも３３５３番目のグアニンがアデニンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号１４で表される。
（Ｖ）配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００００５１．３）に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも８４３６番目のアデニンがチミンに置換し、かつ少なくとも８４４１番目のチミンがグアニンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号１６で表される。
【００５１】
本発明のさらなる態様では、がんの転移形成能に関与する限りにおいて、本発明の遺伝子の配列（配列番号１１〜１４、及び１６）に対し少なくとも９０％、好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の配列同一性を有する配列の遺伝子に関していてもよい。但し、本発明の遺伝子が有する変異の位置、すなわち配列番号１１の場合は１３０５位、配列番号１２の場合は８４３６位、配列番号１３の場合は８４４１位、配列番号１４の場合は３３５３位、においては、置換、欠失、及び／又は付加はされない。
【００５２】
本発明のさらなる態様では、がんの転移形成能に関与する限りにおいて、本発明のタンパク質の配列（配列番号７〜１０、及び１５）において、１又は複数の置換、欠失、及び／又は付加を含む改変タンパク質に関していてもよい。改変タンパク質において、置換、欠失、及び／又は付加は、１又は数個であることが好ましい。別の態様では、改変タンパク質は、本発明の改変タンパク質の配列に対し少なくとも９０％、好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の配列同一性を有する配列のタンパク質に関していてもよい。但し、かかる改変タンパク質は、本発明のタンパク質が有する変異の位置、すなわち配列番号７の場合は２５６位、配列番号８の場合は２６８４位、配列番号９の場合は２６８６位、配列番号１０の場合は１０６６位、配列番号１５の場合は２６８４位及び２６８６位においては、アミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加はされない。
【００５３】
前記特定タンパク質を検出するには、例えば前記特定タンパク質が有するアミノ酸置換（具体的には、配列番号１の２５６番目のロイシン、配列番号２の２６８４番目のロイシン、配列番号２の２６８６番目のバリン、配列番号３の１０６６番目のスレオニンのうち少なくともいずれか１つ）を特異的に認識可能な抗体、もしくはそのフラグメントを用いた抗原抗体反応、または低分子化合物の結合により検出すればよい。特異的に認識可能な抗体、もしくはそのフラグメント、または低分子化合物とは、特定の配列を有するタンパク質に対してのみ結合できる抗体、もしくはそのフラグメント、または低分子化合物をいう。より具体的に、特定タンパク質が有するアミノ酸置換を特異的に認識可能な抗体、もしくはそのフラグメント、または低分子化合物とは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質に対しては結合できない一方で、配列番号１の２５６番目のロイシン、配列番号２の２６８４番目のロイシン、配列番号２の２６８６番目のバリン、配列番号３の１０６６番目のスレオニンのうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むタンパク質に対しては結合できる抗体、もしくはそのフラグメント、または低分子化合物をいう。また、抗体、またはそのフラグメントには、抗体の軽鎖及び重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有し、目的のタンパク質に特異的に結合できる物質であれば任意のもの、例えば抗体の軽鎖及び重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有するスキャフォールドなどが含まれるものとする。
【００５４】
本発明の抗体、またはそのフラグメントは、前記特定タンパク質が有するアミノ酸置換（具体的には、配列番号１の２５６番目のロイシン、配列番号２の２６８４番目のロイシン、配列番号２の２６８６番目のバリン、配列番号３の１０６６番目のスレオニンのうち少なくともいずれか１つ）を特異的に認識することから、本発明の抗体、またはそのフラグメントは、前記アミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるペプチドをエピトープとする。このようなエピトープは、置換されたアミノ酸と、およびその上流（Ｎ末側）、および／または下流（Ｃ末側）のそれぞれ１〜１０個の連続するアミノ酸とから構成されうる。
【００５５】
採取された試料において、タンパク質のアミノ酸置換を検出する工程は、一例として免疫染色が行われてもよい。より具体的に、免疫染色では、前記アミノ酸置換を有するタンパク質と、抗体とを反応させることで検出をすることができる。このような抗体を金コロイドや蛍光物質で直接標識していてもよいし、標識を有する二次抗体を用いてかかる抗体を検出してもよい。免疫染色法としては、本技術分野に既知の手法を用いることができるが、ウエスタンブロット法や蛍光免疫染色法が用いられてもよい。
【００５６】
前記特定ポリヌクレオチドを検出する方法の一例として、前記特定ポリヌクレオチドが有する塩基置換を特異的に認識するプローブを用いて検出する方法や、前記ポリヌクレオチドが有する塩基置換を含むプライマーを用いた特異的増幅により検出する方法や、がん細胞を直接遺伝子変異解析して検出する方法があげられる。がん細胞を直接遺伝子変異解析することで前記特定ポリヌクレオチドを検出する場合、解析対象のがん細胞は、前述した方法で回収したがん細胞を用いてもよいが、培養試料など試料中に含まれるがん細胞が多い場合および／または夾雑細胞が少ないときは、前述した密度勾配遠心法やフィルター法などにより得られたがん細胞を含む画分（がん細胞が濃縮された画分）をそのまま遺伝子変異解析に供してもよい。遺伝子変異解析手法に関しては特に限定はなく、例えば、回収したがん細胞から、遺伝子を抽出した後、遺伝子解析をすればよい。その際に抽出した遺伝子の増幅反応を行なってもよい。遺伝子（ポリヌクレオチド）の増幅法としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法や、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などを用いることができる。遺伝子変異解析においては、サンガー法、サイクルシークエンス法、次世代シークエンシングなどの手法により、抽出した遺伝子（またはその増幅産物）の塩基配列を決定すればよい。
【００５７】
前述した方法で得られた、前記特定タンパク質または前記特定ポリヌクレオチドの検出結果に基づき、対象患者（前記試料を採取した患者）における予後を予測することができる。本発明による予後の予測方法は、医師が行なわずに、医療補助者などが行なうことができるし、装置およびソフトウェア上で自動的に関連付けすることができる。したがって、本発明の方法は、医師による治療効果判断のための予備的方法、または医師によるがん患者の予後予測のための情報を得る方法ということもできる。
【００５８】
本発明では、がん患者から採取したがん細胞が発現するタンパク質のうち、がんの転移形成能に関与する特定タンパク質または特定ポリヌクレオチドを検出することで、当該がん患者における予後を予測するが、前記検出に基づく予後予測は定性的に、すなわち前記特定タンパク質または前記特定ポリヌクレオチドの有無に基づき行なってもよいし、定量的に、すなわち前記特定タンパク質または前記特定ポリヌクレオチドの量に基づき行なってもよい。また予後の判断基準も特に限定はなく、例えば、前記特定タンパク質または前記特定ポリヌクレオチドが少しでもあれば予後が悪化していると予測してもよく、前記特定タンパク質または前記特定ポリヌクレオチドが一定の閾値以上存在しているとき予後が悪化していると予測してもよく、前記特定タンパク質または前記特定ポリヌクレオチドの量と予後とを相関させてもよい。予後予測の一例として、アミノ酸置換またはヌクレオチド置換を検出したがん細胞の割合に基づいて、予後を決定することができ、割合が高くなるにともない予後が不良であると決定することができる。また、４種類の置換のうち、２つ以上の組み合わせを有するがん細胞の存在または割合に基づいて予後を決定することができる、例えば置換の組み合わせが多いがん細胞が存在する場合、またはそのようながん細胞の割合が多くなるほど、予後が不良であると決定することができる。予後が不良であると決定された場合には、さらに治療を継続することが好ましい。本発明の置換を有するがん細胞は、いわゆるがん幹細胞でありうる。したがって、本発明で予後を不良と決定された対象に対しては、がん幹細胞を治療標的とする治療が行われうる。がん幹細胞を治療標的とする治療としては、薬剤排出を抑制する薬剤などを用いることが挙げられる。がん幹細胞は、一般に、薬剤排出により薬剤耐性を発揮するため、薬剤排出を抑制する薬剤を併用することでがん幹細胞を効果的に減少しうる。
【００５９】
がん幹細胞は、細胞増殖がほとんど起こらない静止期と呼ばれる状態にとどまっているため、細胞分裂を阻害する一般的な抗癌剤の奏効性は低いことが知られている。したがって、細胞分裂抑制に関わる因子の機能を阻害する薬剤と抗癌剤を併用することで、静止期から増殖期に移行させ、がん幹細胞を効果的に減少しうる。また、がん幹細胞が有する抗酸化システムを阻害する薬剤を用いることで、酸化作用によるがん幹細胞の効率的な減少を可能にする。更には、がんの転移形成能に関与する遺伝子の存在を認識するポリヌクレオチド、または遺伝子から発現されるたんぱく質を特異的に認識する抗体に対し、抗癌剤を結合した複合体を使用することで、がん幹細胞をより効果的に死滅しうる。
【００６０】
本発明の好ましい態様の一つとして、前記特定タンパク質もしくは前記特定ポリヌクレオチドの有無またはその量を指標とすることに加えて、がん原発組織およびがん転移組織以外の試料由来のがん細胞数を指標とすることで、がん患者の予後を予測する方法が挙げられる。がん原発組織およびがん転移組織以外の試料由来のがん細胞数と予後とは関連性があり、当該がん細胞数が多いほど予後が悪い（血液試料中に含まれるがん細胞の場合は特表２０１１−５０５０１２号参照）。このことから、がん原発組織およびがん転移組織以外の試料由来のがん細胞数を計測することで、患者の予後を予測することができる。従って、前記特定タンパク質もしくは前記特定ポリヌクレオチドに基づく本発明の予後予測方法に加え、がん原発組織およびがん転移組織以外の試料由来のがん細胞数を計測することで、がん患者の予後予測をより精度高く行なうことができる。なお、がん細胞数を指標とする場合においては、単に採取した試料中に一定のしきい値以上のがん細胞が存在するかを評価してもよく、試料を複数回採取し、当該採取した各試料中に含まれるがん細胞数の経時変化を評価してもよい。
【００６１】
以下、試料として血液試料を、試料からがん細胞を回収する装置として図１および図２に示す細胞回収装置１００をそれぞれ用い、本発明の予後予測をがんの転移形成能に関与する特定ポリヌクレオチドの検出により行なう場合を例に説明するが、本発明は本説明の内容に限定されるものではない。
［１］がん患者（がんの疑いのある患者も含む）から血液を採取する。なお、血液を採取する際、クエン酸、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの抗凝固剤を添加してもよい。また必要に応じ、採取した血液を生理食塩水などで希釈してもよい。
［２］採取した血液（または希釈した血液）を密度勾配遠心法に供し、当該血液中に含まれる夾雑細胞（赤血球、白血球など）を除去する。密度勾配遠心法は、物質をその比重に基づき分離する方法であり、密度勾配を形成した媒体（密度勾配溶液）上に採取した血液（または希釈した血液）を重層した後、遠心分離を行なうことにより、夾雑細胞やごみを除去し、がん細胞（ＣＴＣ）を含む画分（上層）を回収することができる。なお、前記遠心分離を行なう前に、採取した血液（または希釈した血液）に、夾雑細胞（赤血球、白血球など）と結合可能な結合剤（例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））を添加することもできる。前記結合剤は、赤血球、白血球および／またはこれら細胞の表面抗原と結合することで細胞凝集体を形成し、これら細胞の密度を大きくすることができるため、密度勾配遠心法によるＣＴＣの分離を容易にする。密度勾配遠心法により夾雑細胞やごみが除去されたＣＴＣを含む画分は、速やかに後続の操作を行なうことが好ましいが、後続の操作を速やかに行なえない場合は、凍結保存による保存処理を行なってもよい。凍結保存する際は、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ２（日本全薬工業社製）などの細胞保存溶液にＣＴＣを含む画分を懸濁させた後、−８０℃で凍結保存すればよい。
［３］［２］で得られたＣＴＣを含む画分に塩化アンモニウムを含む溶液を添加して撹拌することで、当該画分に混入した赤血球を溶血させる。本操作により、分離回収したＣＴＣの観察が良好になる。
［４］［３］で得られた溶血処理後のＣＴＣを含む溶液を遠心分離することで血液成分を除去することでＣＴＣをペレット状にした後、適切な溶液を用いてＣＴＣを懸濁させる。
［５］［４］で調製したＣＴＣを含む懸濁液を再度遠心分離し、ＣＴＣを含むペレットを回収する。なお、必要に応じ、前記回収したペレットを溶液に再度懸濁させ、遠心分離する工程を追加してもよい。
［６］［５］で得られたＣＴＣを、図１に示す細胞回収装置１００に設けた細胞保持手段１０上に展開後、誘電泳動力８０により細胞７０を保持部６０へ保持させる（図３（１））。
［７］接着物質９０を細胞回収装置１００に導入し、ＣＴＣを保持部６０に接着する（図３（２））。接着物質９０としては、例えばポリ−Ｌ−リジンを用いることができ、その濃度は０．０１（ｗ／ｖ）％以下とするとよい。
［８］保存処理剤および細胞膜透過処理剤を細胞回収装置１００に導入し、ＣＴＣの保存および膜透過処理を施す。保存処理剤としては、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒドドナー化合物（加水分解を受けることでホルムアルデヒドを放出可能な化合物）、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類、メタノール、エタノールなどのアルコール類、および重金属を含む溶液が例示できる。細胞膜透過処理剤としては、メタノール、エタノールなどのアルコール類や、サポニンなどの界面活性剤が例示できる。
［９］抗体による非特異的な反応を防ぐため、保存および膜透過処理後の標的細胞を保持した保持部に対してタンパク質によるブロッキング処理を施す。
［１０］ブロッキング処理した後、白血球が発現するタンパク質（白血球マーカー）、上皮系細胞が発現するタンパク質（上皮系マーカー）、もしくはがん細胞が発現するタンパク質（がん細胞由来マーカー）に対する蛍光標識抗体、または細胞核を蛍光染色させる試薬を用いて細胞を標識し（図３（３））、洗浄後、蛍光顕微鏡２００などで細胞の蛍光像および明視野像を観察する（図３（４））。白血球が発現するタンパク質に対する抗体としては、抗ＣＤ４５抗体を用いることができる。また、上皮系細胞が発現するタンパク質に対する抗体としては、抗ＣＫ抗体や抗ＥｐＣＡＭ抗体などを用いることができる。細胞核を蛍光染色させる試薬としては、４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）やＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（商品名）などを用いることができる。
［１１］観察した蛍光像および明視野像を基に標的細胞（ＣＴＣ）７１を検出する（図３（４））。ＣＴＣの検出は例えば、細胞核が染色されており、抗ＣＤ４５抗体では標識されず、かつ上皮系細胞が発現するタンパク質に対する抗体（抗ＣＫ抗体や抗ＥｐＣＡＭ抗体など）またはがん細胞が発現するタンパク質に対する抗体で標識された細胞をＣＴＣとして検出すればよい。また細胞核が染色されており、抗ＣＤ４５抗体では標識されず、かつ赤血球や白血球と比較して明視野像での細胞の形状が大きい細胞をＣＴＣとして検出してもよい。
［１２］蛍光顕微鏡２００で検出したＣＴＣ７１を回収するために、電極基板３２をスペーサー２０から取り外した後、回収装置３００で吸引することでＣＴＣ７１を回収する（図３（５））。電極基板３２を取り外す際は、スペーサー２０を剥がさないよう取り外す必要がある。もしスペーサー２０が絶縁体１２から剥がれると、装置内に保持されている溶液が系外に流れてしまい、ＣＴＣ７１が破壊されるからである。回収装置３００によるＣＴＣ７１の吸引は、前記（１１）で検出したＣＴＣ７１が保持されている保持部６０に回収装置３００を移動させ、回収装置３００により液を吸引することでＣＴＣ７１を回収する。なお、回収装置３００によるＣＴＣ７１の吸引位置を、ＣＴＣ７１を標本化した保持部６０の中心から水平方向に一定距離ずらした位置とすると、ＣＴＣ７１の吸引を容易に行なえるため好ましい。具体的にはＣＴＣ７１の吸引位置を、保持部６０の中心から水平方向に保持部６０の直径の０．１倍から２倍の長さ分（ただし隣接する保持部６０間の距離の２分の１以下）ずらし、かつ保持部６０の高さから垂直方向に保持部６０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置とすると好ましい。また、回収装置３００によるＣＴＣ７１の吸引操作の前に、ＣＴＣ７１と保持部６０との接着性を弱める酵素を含む溶液を添加する操作を行なってもよい。
［１３］回収装置３００による吸引で回収したＣＴＣ７１を回収チュ−ブ４００へ吐出する（図３（６））。回収チュ−ブ４００へＣＴＣ７１が吐出されたかどうかを光学検出器２００で検出してもよい。
［１４］回収チュ−ブ４００に回収されたＣＴＣ７１中の核酸を抽出し、ＰＣＲ法により抽出した核酸に含まれる特定ポリヌクレオチドを増幅した後、サンガー法により特定ポリヌクレオチドの塩基配列を決定することで、特定ポリヌクレオチドの塩基置換を検出する。ＰＣＲ増幅産物の配列解析には、次世代シーケンサーと呼称されるハイスループットな解析が可能な装置を使用してもよい。次世代シーケンサーとしては、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸシステム（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、ＨｉＳｅｑ／Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ（ＧＡＩＩｘ）／  ＭｉＳｅｑ（イルミナ社）及びＩｏｎ  ＰＧＭシーケンサー（Ｉｏｎ  ＰＧＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）があげられる。
【００６２】
本発明の好ましい態様の一つとして、配列番号４〜６のいずれか１つの塩基配列であって、以下の（ｉ）から（ｉｖ）のうち少なくともいずれか１つの置換を有する、塩基配列からなるがんの転移形成予測のための遺伝子に関する：
（ｉ）配列番号４の１３０５番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉ）配列番号５の８４３６番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉｉ）配列番号５の８４４１番目のチミンがグアニンに置換
（ｉｖ）配列番号６の３３５３番目のグアニンがアデニンに置換
【００６３】
これらの置換を有する塩基配列からなる遺伝子は、がんの転移形成能に関与することが明らかにされていることから、かかる遺伝子の存在を認識するプローブ、またはかかる遺伝子から発現されるタンパク質を特異的に認識する抗体は、予後の予測に有用である。また、かかる遺伝子から発現されるタンパク質の機能を活性化、もしくは抑制することで細胞周期もしくは増殖制御、細胞死、免疫シグナル伝達または炎症シグナル伝達などを制御する低分子化合物や活性を中和することができる抗体は、がんの治療、または転移の抑制に有用でありうる。また、がんの転移形成能に関与することから、かかる遺伝子の発現を抑制できる核酸医薬、例えばデコイ核酸、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムなども、がんの治療、または転移の抑制に有用でありうる。さらに別の態様では、かかる遺伝子を有するがん細胞、より好ましくはがん幹細胞を用いたスクリーニング系を用いることで、候補薬剤のがん転移抑制作用を評価することができる。
【００６４】
本発明の特定タンパク質は、がん特異的抗原として、がんワクチン等の製造、およびそれを用いた治療への適用が可能である。がん特異的抗原は、がん細胞を認識して死滅させるのに有効なＴ細胞の発生を誘導できる。一例として、本発明の特定タンパク質（がん特異的抗原）の部分配列を含むがん抗原ペプチドを人工的に合成し、当該ペプチドを皮下または皮内に注射して体内の樹状細胞に前記特定タンパク質（前記特異的抗原）を認識させ、当該樹状細胞からＴ細胞に情報が伝達されることで細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、それを用いてがんを治療するペプチドワクチン療法への適用が挙げられる。別の例として、末梢血から採取した単球をサイトカインによって分化させ、抗原提示能力が強い樹状細胞にした後、本発明の特定タンパク質（がん特異的抗原）を認識させる、または本発明の特定ポリヌクレオチド（がん特異的抗原をコードするポリヌクレオチド）を樹状細胞に直接導入することで細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、がんを治療する樹状細胞ワクチン療法への適用も可能である。さらに別の例として、前記特異的抗原を認識した樹状細胞とリンパ球とを共培養することによって誘導、増殖させた細胞障害性Ｔ細胞を用いた活性化リンパ球療法への利用も可能である。また近年では、リンパ球に特定の抗原に対する抗原受容体遺伝子（例えば、がん特異的抗原を認識するＴ細胞受容体（Ｔ−Ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ［ＴＣＲ］）や、がん細胞表面に発現している標的抗原に対するキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ［ＣＡＲ］））を遺伝子導入／発現させ、がん抗原特異的に改変した細胞障害性Ｔ細胞を利用する治療法の開発が進められている。
なお本発明の特定タンパク質および特定ポリヌクレオチドは、細胞障害性Ｔ細胞が有するＴ細胞受容体の同定にも利用可能であり、これにより、抗腫瘍効果が向上した遺伝子導入Ｔ細胞を作製できる。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。
【００６６】
実施例１  肺がん、胃がん、扁平上皮がん（口腔がん）、大腸がん、乳がん患者からの血中循環がん細胞（ＣＴＣ）の検出および、がん関連遺伝子変異の解析
（１）インフォームドコンセントを得たステージＩＶの各がん患者から、血液を採取した。
（２）（１）で採取した血液に、生理食塩水、白血球・血小板結合剤（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加することで、希釈血液試料を調製した。
（３）調製した希釈血液試料を、密度１．０８４ｇ／ｍＬの密度勾配溶液に重層し、２０００×ｇで１０分間、室温にて遠心後、上清を回収した。
（４）（３）で回収した上清に、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムと含む溶血液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間、室温にて遠心分離した。当該操作により上清に混入した赤血球が破壊され、分離回収した細胞の観察が良好になる。
（５）上清を除去後、分離回収した細胞を含むペレットを、３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁し、３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離後、上清を除去した。再度３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した後、３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離し、上清を除去した。当該操作は、血液成分を除去し、標的細胞を濃縮するための操作である。
（６）（５）で上清を除去した細胞を含む懸濁液を図１および２に示す細胞回収装置１０００に展開し、交流電圧を３分間印加することで前記装置が有する保持部６０に細胞を保持させた。本実施例で用いた細胞回収装置１００は、直径３０μｍで深さ４０μｍの微細孔からなる微細孔を複数有した絶縁体１２と前記絶縁体と下部電極基板の間に設置した遮光性のクロム膜（遮光部材１１）とからなる保持部６０を、厚さ１ｍｍのスペーサー２０と下部電極基板３１とで挟んだ構造であり、スペーサー２０を上部電極基板３１と下部電極基板３２とで挟んだ構造である。
（７）（６）の条件で交流電圧を印加しながら、０．０１（ｗ／ｖ）％のポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭマンニトール水溶液を導入し、３分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、前記水溶液を吸引除去した。
（８）５０％（ｖ／ｖ）エタノールと１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む水溶液（以下、細胞膜透過試薬）を導入し、１０分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部６０に導入した細胞を標本化した。
（９）細胞膜透過試薬を吸引除去し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）を導入することで、残留した細胞膜透過試薬を洗浄した。
（１０）細胞膜内外のタンパク質と特異的に結合可能な蛍光標識された抗体と、細胞核を標識する蛍光試薬（ＤＡＰＩ：４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ（同仁化学研究所社））を含む水溶液（以下、標識試薬）を導入し、３０分間静置した。なお前記標識された抗体として、白血球表面に発現しているＣＤ４５に対する抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社）と、上皮系細胞の細胞質内で発現しているＣＫ（サイトケラチン）に対する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いている。
（１１）標識試薬を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した標識試薬を除去した。
（１２）（１１）で標識した細胞を含む細胞回収装置１００を蛍光顕微鏡のステージ上に載置した後、複数の保持部６０に捕捉した全ての細胞を観察するために保持部６０全体の撮像を行なった。これにはコンピューター制御式電動ステージ、電子増倍型冷却ＣＣＤカメラ（ＥＭＣＣＤ、ＦＬＯＶＥＬ社製ＡＤＴ−１００）を装備した蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＩＸ７１）を用いた。画像取得及び解析ソフトウェアにはＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いた。
（１３）（１２）で撮像した細胞の中から、
細胞核を有していることを示すＤＡＰＩで染色されている細胞（ＤＡＰＩ陽性）であり、
白血球で発現しているＣＤ４５に対する抗体で染色されていない細胞（ＣＤ４５陰性）であり、
上皮系の性質を有していることを示すＣＫに対する抗体で染色されていない細胞（ＣＫ陰性）であり、かつ赤血球や白血球と比較して明視野像での細胞の形状が大きい細胞を標的細胞（がん細胞）として計数した。
（１４）細胞回収装置１００の上部電極基板３２を取り外した後、蛍光顕微鏡のステージ上へ載置し、保持部６０内に保持された、（１３）で計数済の標的細胞を円筒状の細管により吸引し、ＰＣＲチューブ内へ標的細胞を吐出した。
（１５）標的細胞の遺伝子ホットスポット解析を、当該標的細胞における変異を同定するために実行した。具体的には前記標的細胞から抽出したゲノムＤＮＡを１細胞全ゲノム増幅キット（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ａｍｐｌｉ１）により増幅し、得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、ＩｏｎＰＧＭシーケンサーおよびＩｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈｏｔｓｐｏｔ  Ｐａｎｅｌ  ｖ２キット（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）によって５０種のがん関連遺伝子における変異を解析した。
【００６７】
検出されたがん関連遺伝子変異は、既知のもの、および未知のものが混在していた。なお、がん細胞株を用いたシークエンス結果の質が担保されていることを確認した遺伝子変異を、解析した個々のＣＴＣが有しているがん関連遺伝子変異とした。その遺伝子変異より、後述の比較例１および２で得られた遺伝子変異を除いたものが、ＣＴＣ固有の遺伝子変異であると同定した。それらは全て未知の遺伝子変異であり、当該遺伝子変異が形質に与える影響は未知であった。変異のタイプはミスセンス変異あるいはインフレーム変異であり、タンパクレベルで影響を与える変異である可能性が示唆された。また、ＳＩＦＴアルゴリズムに基づく同遺伝子変異のタンパク機能への影響予測（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．、４（２００９）、１０７３−１０８１）では、タンパク機能に影響を与える遺伝子変異である事が示唆された。
【００６８】
本例で取得した遺伝子変異（塩基置換）および当該変異に相当するタンパク質変異（アミノ酸置換）の位置を表１に示す。表１に示す変異（塩基置換およびアミノ酸置換）はいずれもステージＩＶのがん患者特有の変異であることから、前記変異を検出することでがん患者の予後予測が可能であることが示唆される。
【表１】
2019060869.tif 000002
【００６９】
比較例１  がん原発組織およびがん転移組織における遺伝子変異
実施例１（１）において採血したがん患者からがん原発組織を採取した。
がん原発組織および転移組織の切除検体、あるいはホルマリン固定パラフィン包埋組織検体より、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社製品）を用いて抽出したゲノムＤＮＡを、上述のＩｏｎＰＧＭ（サーモフィッシャー）Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑTM  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈｏｔｓｐｏｔ  Ｐａｎｅｌ  ｖ２によって５０種のがん関連遺伝子変異を解析した。
【００７０】
比較例２  正常の血球（白血球）における遺伝子変異
実施例１（１）において採血したがん患者から白血球を採取した。
患者末梢血よりＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製品）を用いて抽出したゲノムＤＮＡを、上述のＩｏｎＰＧＭ（サーモフィッシャー）Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑTM  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈｏｔｓｐｏｔ  Ｐａｎｅｌ  ｖ２によって５０種のがん関連遺伝子変異を解析した。
【００７１】
実施例２  抗体・プローブ作成
本発明の因子に対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、マウス、ラットなど、その由来となる動物種に制限されない。しかし抗体産生細胞を作製する際の細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。
【００７２】
まず公知の方法にしたがい、感作抗原を動物に免疫した。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）、生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに免疫応答の増強に有用なアジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ）を適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。続いて、免疫した哺乳動物の血清中に所望の抗体が上昇するのを確認した後、哺乳動物から免疫細胞を採取するが、好ましい免疫細胞としては、特に脾臓細胞由来のＢ細胞が挙げられる。 免疫細胞懸濁液は、脾臓内から注射針とピンセットを用いてＲＰＭＩ１６４０培地に取り出して調製した。
【００７３】
続いて、前記免疫細胞とミエローマ細胞を融合し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを作製した。具体的には、前記細胞融合は、細胞融合促進剤の存在下で実施される。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用される。免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他には細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００７４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって融合細胞を作製する。続いて、適当な培養液を添加した後、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより融合細胞の洗浄を行う。次に前記融合細胞をＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培養液）に懸濁し、１ウェルあたり２００μＬとなるように９６ウエルプレートに播種した。７日間、３７℃、５％ＣＯ２環境にて培養することで、脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。
【００７５】
前記ハイブリドーマから得られた抗体は、モノクローナル抗体である。転移形成能を有するがん細胞の検出において、抗体は直接的または間接的に標識される。直接的な標識には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンおよびフィコエリスリンなど蛍光色素を抗体に結合させる。抗体と蛍光色素との結合には、抗体のアミノ基と反応する活性エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル）を導入した化合物や、ＳＨ基を標識に利用する場合は、マレイミド基を導入した低分子を使用する。別の手法として、検出可能なシグナルをもたらす蛍光タンパク質および酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）を抗体に結合してもよい。間接的な標識には、抗体に特異的な第２の抗体もしくは特異的な結合対（ビオチン−アビジン等）を用いて標識することで目的の細胞を検出する。
【００７６】
実施例３  予後予測
（１）インフォームドコンセントを得た癌患者から、治療経過に合わせて血液を数回採取した。
（２）（１）で採取した血液を溶血法、比重分離法、磁気ビーズ分離法等の１つ、もしくいずれかの組合せを用いることにより、血液内のＣＴＣを濃縮した。
（３）濃縮後の細胞群を、生理食塩水、（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）、マンニトール等の細胞を等張に調整された糖溶媒に懸濁した。
（４）前記懸濁液をガラススライド、もしくは細胞と同サイズのマイクロウェルが多数配置されたようなマイクロウェルチップに展開した標本を作製した。
（５）ホルムアルデヒドやエタノール等に例示される細胞固定液、膜透過液を導入し、約１０分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部に導入した細胞を標本化した。
（６）細胞固定、膜透過液を吸引除去し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）を導入することで、残留した細胞固定、膜透過液を洗浄した。
（７）がんの転移形成に関与する因子に結合する蛍光標識された抗体と、細胞核を標識する蛍光試薬（ＤＡＰＩ：４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を含む水溶液を導入し、３０分間静置した。なお、混入した白血球の標識には、白血球表面に発現しているＣＤ４５に対する抗体を用いた。
（８）標識液を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した標識液を除去した。
（９）標識後の標本（ガラススライド、マイクロウェルチップ）を蛍光顕微鏡のステージ上に載置した後、複数の保持孔に捕捉した全ての細胞を観察するために保持部全体の撮像を行なった。これにはコンピューター制御式電動ステージ、電子増倍型冷却ＣＣＤカメラ（ＥＭＣＣＤ；ＦＬＯＶＥＬ，ＡＤＴ−１００）を装備した蛍光顕微鏡（ＩＸ７１；  Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いた。画像取得及び解析ソフトウェアにはＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いた。
（１０）（９）で撮像した細胞の中から、
細胞核を有していることを示すＤＡＰＩで染色されている細胞（ＤＡＰＩ陽性）であり、
白血球で発現しているＣＤ４５に対する抗体で染色されていない細胞（ＣＤ４５陰性）であり、がん転移形成に関与する因子の対する抗体で染色された標的細胞（ＤＡＰＩ陽性／ＣＤ４５陰性／がん転移因子陽性細胞）を計数した。
予後予測の閾値は、健常者からの偽陽性数（ベースライン）、ＣＴＣ数と無増悪生存期間および全生存期間の評価にて決定する。
【００７７】
例えば、進行性乳がん、前立腺がん、大腸がんにて米国ＦＤＡ認可を取得しているＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムでは、ベースライン若しくは処置終了時の患者において５以上ＣＴＣが検出された場合、無増悪生存期間および全生存期間の中央値が短く、ＣＴＣ数が５個未満の患者は最長の無増悪生存期間および全生存期間の中央値を示した。加えて、処置前のＣＴＣ数が５個以上の患者において、処置後に５個未満に低下した群は、５個以上のＣＴＣ数を維持した患者より長い無増悪および全生存期間の中央値を有した（Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５１（２００４）、７８１−７９１）。
【００７８】
実施例４  がん細胞株への遺伝子導入
（１）実施例１で取得した遺伝子変異のうち、ＳＭＡＤ４遺伝子およびＰＩＫ３ＣＡ遺伝子を選択し、それぞれ野生型（ＳＭＡＤ４遺伝子：配列番号４、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子：配列番号６）と変異型（ＳＭＡＤ４遺伝子：配列番号１１、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子：配列番号１４）のｃＤＮＡをそれぞれ合成した。合成したｃＤＮＡはシーケンスにより配列を確認した。なおこれらの操作はユニーテック社に委託した。
（２）レトロウイルスベクターの骨格としてｐＭＸｓ−Ｎｅｏベクターを用い、（１）で合成したｃＤＮＡをそれぞれ挿入したベクターを作製した。また、ｐＭＸ−Ｎｅｏを基に、Ｎｅｏ（ネオマイシン）遺伝子を緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子に置換した空ベクターを作製した。作製したベクターは、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動により前記配列が挿入されていることを確認した。また、シーケンスにより挿入した配列を確認した。なおこれらの操作はユニーテック社に委託した。
（３）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社）を用い、（２）で作製したベクターをそれぞれパッケージング細胞である２９３Ｔ細胞に形質導入し、４８時間培養後に採取した培養液上清をフィルターろ過することにより、各種レトロウイルス液を得た。
（４）ヒト大腸がん細胞株ＷｉＤＲに対しレトロウイルス感染を行ない、前記遺伝子をそれぞれ形質導入した。レトロウイルス感染は、ＷｉＤＲ細胞を６ウェルプレートに播種し、２４時間後に（３）で取得したレトロウイルス液をそれぞれ２倍希釈となるようウェルに加え、そのまま４８時間培養することにより行なった。前記方法により、５種の遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞（野生型ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞、変異型ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞、野生型ＳＭＡＤ４遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞、変異型ＳＭＡＤ４遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞およびＥＧＦＰ遺伝子（空ベクター）導入ＷｉＤＲ細胞）を取得した。
【００７９】
実施例５  遺伝子導入細胞の形態観察
実施例４で取得した５種の遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞と、ネガティブコントロールとして遺伝子導入未実施のＷｉＤＲ細胞をそれぞれ接着細胞培養用２４ウェルプレートに播種し、９６時間培養後、正立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＩＸ７１）を用いて細胞形態を観察した。
【００８０】
取得した細胞形態画像を図４に示す。ネガティブコントロールである遺伝子導入未実施のＷｉＤＲ細胞は、敷石状に隣接して増殖していた（腫瘍組織で主に観察される上皮細胞様形態、図４（１））。ＥＧＦＰ遺伝子（空ベクター）（図４（２））、野生型ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子（図４（３））および変異型ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子（図４（４））を導入したＷｉＤＲ細胞は、いずれもネガティブコントロール（図４（１））と同様に上皮細胞様形態を取っていた。また、野生型ＳＭＡＤ４遺伝子（図４（５））および変異型ＳＭＡＤ４遺伝子（図４（６））を導入したＷｉＤＲ細胞は、ともに丸く浮遊系の形態となって増殖していた。ＳＭＡＤ４は腫瘍組織から血管内へ浸潤する際、上皮間葉転換により間葉系細胞へ形態変化させる因子であることが示唆された。
【符号の説明】
【００８１】
１００：細胞回収装置
１０：細胞保持手段
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ・１２ａ：貫通孔
２０：スペーサー
２１：導入口
２２：排出口
２３：貫通部
３１・３２：電極基板
４０：導線
５０：信号発生器
６０：保持部
７０：細胞
７１：標的細胞（ＣＴＣ）
８０：誘電泳動力
９０：接着物質
２００：蛍光顕微鏡
３００：回収装置
４００：回収チューブ
【図１】
2019060869.tif 000003
【図２】
2019060869.tif 000004
【図３】
2019060869.tif 000005
【図４】
2019060869.tif 000006
【配列表】
2019060869000001.app