(57)【要約】      （修正有）【課題】貝類の体内、特に消化器官内に存在するノロウイルスに対しても充分に不活化できる方法を提供する。【解決手段】抗ノロウイルス抗体を投入した飼育水を用いて貝類を飼育することを特徴とする。貝類に含まれるノロウイルスのみならず、貝類表面に付着したノロウイルス及び飼育水中に浮遊するノロウイルスも合せて不活化できることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ノロウイルス抗体を投入した飼育水を用いて貝類を飼育することを特徴とする貝類のノロウイルス不活化方法。
【請求項２】
貝類に含まれるノロウイルスのみならず、貝類表面に付着したノロウイルス及び飼育水中に浮遊するノロウイルスも合せて不活化できることを特徴とする請求項１記載の貝類のノロウイルス不活化方法。
【請求項３】
前記抗ノロウイルス抗体は水溶性蛋白質からなる免疫グロブリンであることを特徴とする請求項１又は２記載の貝類のノロウイルス不活化方法。
【請求項４】
バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞で発現させたノロウイルス様粒子（ＶＬＰ：Virus like particle）を鳥類又は哺乳類に接種して得られたポリクローナル抗体を貝類のノロウイルス不活化に使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、貝類による食中毒を防止するために用いる貝類の浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
貝類は、新鮮な食材として生食用に用いられたり、貝付きのまま消費者の手元に届けられることが増えている。
この場合に、貝類由来の食中毒対策として、大腸菌，腸炎ビブリオ菌及びノロウイルス等の洗浄浄化，殺菌等の処理が出荷前に行われている。
【０００３】
貝類におけるウイルス性食中毒の主な原因はノロウイルスである。
特に牡蠣は消化器官である中腸線を含む牡蠣全部分を生食として摂取するため、牡蠣の中腸線に蓄積したノロウイルスがヒトの腸粘膜細胞に感染・増殖することに伴って、下痢や嘔吐、発熱等の胃腸炎症状が誘起される。
ノロウイルスの感染力は、ヒトが１０〜１００個程度のウイルスを摂取したのみで発症する非常に感染力の強いウイルスである。
実際、食中毒症状を訴える者の吐瀉物に菌類が検出されない場合、ノロウイルスが検出されることが多い。
【０００４】
しかし、従来の清浄な海水を１〜２日程度かけ流す洗浄浄化方法では、確実に貝類に含まれるノロウイルスを１０〜１００個程度以下にできない。
また、従来の次亜塩素酸ソーダ等による殺菌方法は、遊離残留塩素濃度が１０〜２０ｐｐｍという高い濃度液においても、ノロウイルスを十分死滅させることが出来ないこと、海水中の有機物により塩素活性が失活すること、貝類の体内においても同様に有機物によって塩素活性が失活するため十分な対策ではない。
従って、海水中及び貝殻表面や剥き貝の表面の殺菌はある程度行えるものの、貝体内の殺菌を行うことができない。
すなわち、従来の方法は、貝類の体内に取り込まれているノロウイルスを排出させてウイルス量を減少させるものであって、貝類の体内に存在するノロウイルスを充分に不活化できるものではなかった。
【０００５】
特許文献１には、海洋深層水を用いて牡蠣を水槽の中でかけ流し畜養することで、浄化する方法を開示する。
しかし、同公報に開示する技術も牡蠣の体内に取り込まれているノロウイルスを不活化できるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−１５９４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、貝類の体内、特に消化器官内に存在するノロウイルスに対しても充分に不活化できる方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る貝類のノロウイルス不活化方法は、抗ノロウイルス抗体を投入した飼育水を用いて貝類を飼育することを特徴とする。
これにより、貝類に含まれるノロウイルスのみならず、貝類表面に付着したノロウイルス及び飼育水中に浮遊するノロウイルスも合せて不活化できる。
この場合に、抗ノロウイルス抗体は水溶性蛋白質からなる免疫グロブリンであるのが好ましい。
【０００９】
ノロウイルス（Norovirus）は、電子顕微鏡で観察される形態学的分類では、小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）に属され、胃腸炎，食中毒の原因ウイルスとして知られている。
ノロウイルスに属するウイルスは、Genogroup Ｉ（ＧＩ）と、Genogroup ＩＩ（ＧＩＩ）の２つの遺伝子群に分類されている。
また、（ＧＩ）はさらに１４の遺伝子型に分類され、（ＧＩＩ）は１７の遺伝子型に分類され、極めて多様性を持った集団として存在する。
また、新しい遺伝子型も存在しているとみられている。
ノロウイルスのゲノムは、ＯＲＦ１〜３の３つのオープンリーディングフレームを有し、ＯＲＦ１は非構造蛋白質であり、ＯＲＦ２は構造蛋白質となっており、このＯＲＦ２はウイルスのカプシドを構成している。
【００１０】
よって、このＯＲＦ２（ＶＰ１）領域をバキュロウイルスによる発現系に組み込み、昆虫細胞で発現させると、ノロウイルス様粒子（ＶＬＰ：Virus like particle）を作出することができる。
このようにして作出したＶＬＰは、構造がノロウイルスそのものであり、ウイルス粒子と同等の抗原性を有するが、内部にゲノムＲＮＡを持たず中空で感染性がない。
そこで、バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞で発現させたノロウイルス様粒子（ＶＬＰ：Virus like particle）を鳥類又は哺乳類に接種して得られたポリクローナル抗体を貝類のノロウイルス不活化に使用する方法に特徴がある。
【００１１】
なお、抗体力価・高アフィニティーの抗ノロウイルス抗体を作製するためには、ＶＬＰとオイルアジュバントを混和し、鳥類または哺乳類の筋肉内に接種し、数週間後に再度追加接種するのが好ましい。
一定間隔期間ごとに追加接種することで抗体力価・高アフィニティーを維持させることができる。
この水溶性蛋白質である抗ノロウイルス抗体は、塩化ナトリウム水溶液や清浄海水にて溶解状態でも安定化する。
貝類を浸漬した浄化用水槽の海水に抗ノロウイルス抗体溶液を直接投入し、貝類が海水の濾水活動条件である通気や海水温度を維持し１晩蓄養させるとよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明による貝類の体内に取り込まれてノロウイルスを不活化する方法は上記のとおりであるから、次に記載する効果を奏する。
貝類の飼育槽や出荷前の浄化過程における蓄養タンクの飼育水中に抗ノロウイルス抗体を投入することで、貝類表面に付着したノロウイルス及び、貝類から排出されて飼育水に浮遊するノロウイルスの感染性を確実に不活化することに加えて、従来の方法では実現できなかった貝類の体内に蓄積したノロウイルス及び、貝類から排出された糞中に含まれるノロウイルスの感染性も確実に不活化できる。
本来抗体は、生体の免疫防御システムにおいて、生体内、消化管内にて病原体の感染・増殖を阻止する機能を持つ蛋白質である。
また、抗体の大きな特徴に、一つの抗体が決まった抗原だけにしか反応しない特異性があり、「鍵と鍵穴の関係」に例えられるほど抗原抗体反応のアフィニティーや結合力が強く簡単に解離しない。
抗体は、貝類の体内においても高い活性と安定性を示す。
抗体の特異的作用により貝類の組織に作用せず、ヒトの食品として貝類の品質を低下させない。
貝類の体内に抗体が含まれた状態でヒトに食されても安全である。
逆に抗ノロウイルス抗体が含まれる貝類は、ノロウイルス感染症を予防するサプリメントともいえる。
また、抗体が含まれていても貝類本来の甘味や風味に影響を与えない。
【００１３】
抗ノロウイルス抗体のうち、ＧＩ．５株とＧＩＩ．４株の２種類のＶＬＰに対する抗体を用いると、ヒトの食中毒から分離されている多様な遺伝子型のノロウイルスに対して対応している。
仮に新たな遺伝型のノロウイルスが出現した場合、同様にその遺伝型ＶＬＰをバキュロウイルス発現系にて作出し、追加して動物への接種抗原とすることで迅速に対応できる。
【００１４】
抗ノロウイルス抗体は、モノクローナル抗体までの作製や精製を必要とせず、鳥類及び哺乳類から得られるポリクローナル抗体を採集することで安価で大量に生産できることから、貝類の出荷前洗浄工程における大量使用かつ低コストを必要とされる産業利用に対応でき、極めて簡易的な方法で効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】（ａ）は抗ノロウイルス抗体のノロウイルスＶＬＰのＡ型ＨＢＧＡへの結合阻害効果を示す図であり（横軸は抗体濃度  μｇ／ｍＬ）、（ｂ）は抗ノロウイルス抗体のノロウイルスＶＬＰのＯ型ＨＢＧＡへの結合阻害効果を示す図であり（横軸は抗体濃度  μｇ／ｍＬ）、（ｃ）は抗ノロウイルス抗体のノロウイルスＶＬＰのＢ型ＨＢＧＡへの結合阻害効果を示す図である（横軸は抗体濃度  μｇ／ｍＬ）。
【図２】抗ノロウイルス抗体のノロウイルス感染症患者から検出される各遺伝子型ノロウイルスに対する有効性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
抗ノロウイルス抗体作製用の抗原として、ノロウイルスの構造蛋白をコードする遺伝子ＯＲＦ２（ＶＰ１）領域をバキュロウイルスに組み込み、培養昆虫細胞で発現させたノロウイルスＶＬＰをオイルアジュバントと混和し、鳥類または哺乳類の筋肉内に接種し、一定間隔期間ごとに追加接種して、摂取動物に抗ノロウイルス抗体を産生させる。
【００１７】
接種動物から採取された抗ノロウイルス抗体を含むポリクローナル抗体を、塩化ナトリウム水溶液及びリン酸緩衝液に溶解後、フィルターろ過滅菌を行い冷蔵もしくは冷凍させたものを流通させる。
【００１８】
貝類の浄化用の浄化水を貯留した浄化槽に抗ノロウイルス抗体溶液を投入した後、浄化処理後の牡蠣を浸漬する。
抗ノロウイルス抗体を含む飼育水を循環と通気（空気を通すこと）させて貝類に呼吸をさせて、貝類の体内に飼育水と共に抗ノロウイルス抗体を取り込みさせる。
この浸漬時間は１６〜２４時間である。
【実施例１】
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明は一例を説明するためのものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】
＜抗ノロウイルス抗体の作製＞
遺伝子組換え技術で発現させたノロウイルスＶＬＰとオイルアジュバント混和物を産卵鶏の胸筋内に接種し、接種鶏が産卵した卵の卵黄より抗ノロウイルス抗体を含有するポリクローナル抗体を抽出した。
評価試験に用いる陰性コントロール抗体は、通常飼育産卵鶏が産卵した卵の卵黄よりポリクローナル抗体を抽出した。
【００２１】
＜抗ノロウイルス抗体のノロウイルスＶＬＰの組織血液型抗原(Histo-blood group antigen:HBGA)結合阻害評価試験＞
ノロウイルスの感染は、ノロウイルス受容体であるＨＢＧＡへの結合が重要とされている。
ＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked Immuno Sorvent Assay）を用いて抗ノロウイルス抗体のノロウイルスＶＬＰのＨＢＧＡ結合阻害を測定した。
ＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレートにＡ型，Ｏ型，Ｂ型の各血液型のＨＢＧＡを一晩吸着固相化させた後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、スキムミルクＰＢＳ−Ｔを分注して１時間ブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
抗ノロウイルス抗体または陰性コントロール抗体を４００μｇ／ｍＬから１．５６３μｇ／ｍＬ濃度まで２倍階段希釈した希釈系列抗体液とノロウイルスＧＩＩ．４株ＶＬＰ  １μｇ／ｍＬ（ノロウイルス粒子数として５．５×１０１０個／ｍＬ）を等量混合し１時間反応させた各混合溶液１００μＬをウエルに分注して１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。
抗ノロウイルスＶＬＰマウスＩｇＧ標識抗体を各ウエルに分注し１時間反応後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄後、発色試薬を各ウエルに分注して３０分間呈色反応させて、各ウエルに停止液を分注して呈色反応を停止させ、ＯＤ値を測定した。
【００２２】
図１のグラフ（ａ），（ｂ），（ｃ）に示すように、抗ノロウイルス抗体５０μｇでノロウイルス５．５×１０１０個相当のノロウイルスＶＬＰのＨＢＧＡへの結合阻害がＡ型、Ｏ型、Ｂ型の全てのＨＢＧＡで確認された。
抗ノロウイルス抗体によるＨＢＧＡへの結合阻害はノロウイルスの非感染性に付与しており、ノロウイルスを不活化したこととなる。
【００２３】
＜抗ノロウイルス抗体の各遺伝子型ノロウイルスに対する有効性＞
ＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレートに各遺伝子型ノロウイルスＶＬＰを一晩吸着固相化させた後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、スキムミルクＰＢＳ−Ｔを分注して１時間ブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
抗ノロウイルス抗体または陰性コントロール抗体の２倍階段希釈液を１００μＬ各ウエルに分注して１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。抗ニワトリＩｇＧ標識抗体を各ウエルに分注し１時間反応後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄後、発色試薬を各ウエルに分注して３０分間呈色反応させて、各ウエルに停止液を分注して呈色反応を停止させ、ＯＤ値を測定した。
陰性コントロール抗体のＯＤ値（０．０８６）に対して２倍以上であるＯＤ値０．１００以上を陽性とし、陽性を示す抗体希釈液の最大希釈倍数の逆数を抗体価とした。
その結果を図２のグラフに示す。
【００２４】
ノロウイルス発症患者より検出される遺伝子型ＧＩ．４、ＧＩ．５、ＧＩＩ．２、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４、ＧＩＩ．６、ＧＩＩ．１７の各ＶＬＰに対して高い交差反応を示し、各遺伝子型のノロウイルスＶＬＰに対して抗ノロウイルス抗体が結合することより、多様な遺伝子型が存在するノロウイルスに対して幅広くノロウイルスの感染性を不活化する効果を示した。
【００２５】
＜有機物存在下におけるノロウイルス不活化評価試験＞
ノロウイルスの不活化に有効な消毒剤として次亜塩素酸ナトリウムをあげているが、有機物存在下では不活化効果が著しく消失する。
そこで、有機物存在下における抗ノロウイルス抗体のノロウイルス不活化評価試験を実施した。
牡蠣中腸線内容物を１０％濃度として懸濁したリン酸緩衝液にノロウイルスＶＬＰをウイルス粒子数相当として、５．５×１０１０／ｍＬ、５．５×１０９／ｍＬ、５．５×１０８／ｍＬ、５．５×１０７／ｍＬ、５．５×１０６／ｍＬの各濃度になるよう添加して調製した。
１０％牡蠣中腸線内容物リン酸緩衝液にノロウイルスＶＬＰ各濃度を添加した溶液１００μＬを体外診断用医薬品ノロウイルス抗原キット「イムノキャッチ−ノロ」にアプライして、ノロウイルス抗原の有無の判定を行い、本キットの検出限界値を求めた。
次に、ノロウイルスＶＬＰ  ５．５×１０１０／ｍＬ濃度添加の１０％牡蠣中腸線内容物リン酸緩衝液と抗ノロウイルス抗体１０ｍｇ／ｍＬリン酸緩衝液を１：１で混合し３０秒後に、本キットにアプライしてノロウイルス抗原の有無の判定を行った。
同様にノロウイルスＶＬＰ  ５．５×１０７／ｍＬ濃度溶液と抗ノロウイルス抗体０．０１ｍｇ／ｍＬリン酸緩衝液を１：１で混合し同様に３０秒後に、本キットにアプライしてノロウイルス抗原の有無の判定を行った。
その結果を下記表１に示す。
【００２６】
１０％牡蠣中腸線内容物リン酸緩衝液にノロウイルスＶＬＰ懸濁させた検体において、本キットの検出感度は５．５×１０７／ｍＬで陽性反応を示し、５．５×１０６／ｍＬでは陰性反応を示した。
抗ノロウイルス抗体は、有機物存在下においても僅か３０秒の反応時間で、抗ノロウイルス抗体１０ｍｇ／ｍＬでノロウイルスＶＬＰ  ５．５×１０１０／ｍＬを、抗ノロウイルス抗体０．０１ｍｇ／ｍＬでノロウイルスＶＬＰ  ５．５×１０７／ｍＬを検出限界以下とした。
すなわち、抗ノロウイルス抗体は、有機物存在下でも瞬時にウイルスに特異的に結合しノロウイルスの抗原性をなくしたことから、ノロウイルスの感染性を不活化したことになる。
【表１】
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【００２７】
＜貝類の体内に取り込まれたノロウイルス不活化評価試験＞
食用として流通できるマガキを濾過海水でかけ流し４８時間以上無給餌に置いたマガキを被験貝として用いた。
人工海水で１２時間通気撹拌し十分な酸素濃度のある人工海水にノロウイルスＶＬＰを０．０１ｎｇ／ｍＬ（ノロウイルス５．５×１０５個／ｍＬ相当）濃度になるように添加してよく撹拌した後、２つの水槽に同量ずつ分けた。
各水槽に総重量が同程度になるようマガキ１１個／水槽を投入し２４時間飼育後、抗ノロウイルス抗体または陰性コントロール抗体を水槽に添加して通気撹拌しながらさらに２４時間飼育した。
開殻して軟体部を取り出し、さらに中腸線を採材乳剤化して分析サンプルとした。
また、飼育海水及び、マガキが排泄した糞または代謝物等を回収して分析を行った。
【００２８】
＜貝類の体内への抗体の取り込み確認＞
海水に添加した抗体を牡蠣が体内に取り込み消化器官内（中腸線）に滞留していることの確認試験として、ＥＬＩＳＡ法を用いて中腸線内の抗体量を定量した。
抗ニワトリＩｇＧヤギＩｇＧをＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレートに一晩吸着固相化させた後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔを分注して１時間ブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
中腸線乳剤または、抗体添加海水（飼育水）及び、検量線用の既知ニワトリＩｇＧを適性濃度に希釈して１００μＬをウエルに分注して１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。
抗ニワトリＩｇＧヤギＩｇＧ標識抗体を各ウエルに分注し１時間反応後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄後、発色試薬を各ウエルに分注して３０分間呈色反応させて、各ウエルに停止液を分注して呈色反応を停止させＯＤ値を測定し、検量線より総ニワトリＩｇＧ抗体濃度を算出した。
その結果を下記表２に示す。
【００２９】
抗体を添加した海水に２４時間飼育した全ての牡蠣の中腸線内容物から抗体が検出された。
また、牡蠣から排泄された糞（代謝物を含む）からの抗体が検出され、海水中の抗体を取り込み消化器官内に滞留することが確認された。
【００３０】
＜貝類の体内のノロウイルスＶＬＰの検出確認＞
抗ノロウイルスＶＬＰ  ＩｇＧをＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレートに一晩吸着固相化させた後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＳＭ−ＰＢＳ−Ｔを分注して１時間ブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
中腸線乳剤または、抗体添加海水（飼育水）及び、検量線用の既知ノロウイルスＶＬＰを適性濃度に希釈して１００μＬをウエルに分注して１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。
抗ノロウイルスＶＬＰモルモットＩｇＧを各ウエルに分注し１時間反応後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄後、抗モルモットＩｇＧ標識抗体を各ウエルに分注し１時間反応後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄後、発色試薬を各ウエルに分注して３０分間呈色反応させて、各ウエルに停止液を分注して呈色反応を停止させＯＤ値を測定し、検量線よりノロウイルスＶＬＰ濃度を算出した。
その結果を下記表２に示す。
【００３１】
牡蠣投入前のノロウイルスＶＬＰ添加海水１ｍＬあたり、２．７５×１０５（ウイルス粒子数）であり、陰性コントロール抗体を添加した海水で飼育した対照区の牡蠣１１検体中８検体の中腸線からノロウイルスＶＬＰが検出され、中腸線１ｇあたり４．８１×１０５から１．０６×１０７であった。
また、海水中に排泄された糞１ｇあたり２．７５×１０７が検出された。
抗ノロウイルスＶＬＰ抗体を添加した海水で飼育した試験区の牡蠣１１検体の全検体の中腸線及び、海水中に排泄された糞のからノロウイルスＶＬＰは検出されず検出限界以下であった。
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の貝類の体内に取り込まれたノロウイルスを不活化する方法は、鳥類及び哺乳類が持つ生体の免疫防御システムにおいて重要や役割を担う抗体を活用し、有機物が存在する貝類の消化器官内、貝類排泄物内、飼育海水においても、多様な遺伝子型であるノロウイルスと瞬時に特異的抗原抗体反応で結合し、ノロウイルスの感染性を不活化する機能性を蛋白質でありながら、無味無臭の抗体の特性より貝類の組織に作用せず、貝類の品質を低下させないこと、ヒトに食されても安全であることから産業上の有効性は極めて大きい。
また、モノクローナル抗体ではなく、鳥類または哺乳類が産生するポリクローナル抗体とすることで、安価に大量製造できること、貝類生産現場においては、貝類の浄化用の浄化水を貯留した浄化槽に抗ノロウイルス抗体溶液を投入し一晩浸漬飼育させるのみと簡易的かつ汎用性が高いことから迅速な普及が期待される。
【図１】
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【図２】
2019149996.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月21日(2019.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ノロウイルス抗体を投入した飼育水を用いて貝類を飼育する、貝類のノロウイルス不活化方法であって、
貝類に含まれるノロウイルスのみならず、貝類表面に付着したノロウイルス及び飼育水中に浮遊するノロウイルスも合せて不活化できるものであり、
前記抗ノロウイルス抗体は水溶性蛋白質からなる免疫グロブリンであって、バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞で発現させたノロウイルス様粒子（ＶＬＰ：Virus like particle）を鳥類に接種して得られたポリクローナル抗体であることを特徴とする貝類のノロウイルス不活化方法。
【請求項２】
鳥類の抗ノロウイルス様中空粒子抗体を含有する卵黄水溶性蛋白質抽出液を投入した飼育水を用いて貝類を飼育し、貝類に含まれるノロウイルス、貝類表面に付着したノロウイルス及び飼育水中に浮遊するノロウイルスを合せて不活化する方法であって、
前記抗ノロウイルス様中空粒子抗体は、バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞で発現させた２種類以上のノロウイルス様粒子を鳥類に接種して得られた免疫グロブリンであることを特徴とする貝類のノロウイルス不活化方法。