(57)【要約】【課題】  幹細胞の分化を抑えた状態で細胞増殖させ、かつ温和に幹細胞を回収することのできる支持体および培養した細胞の回収方法を提供する。【解決手段】  機能層により被覆された繊維を少なくとも表面に含む繊維シートを有し、前記繊維シートを構成する繊維の繊維間距離が１μｍ以上２０μｍ以下であり、前記機能層は、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質との混合物、および／または、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質とが化学的に結合した物質を含む、幹細胞培養用の支持体。また、当該支持体を、前記熱感受性ポリマーのＬＣＳＴよりも低い温度に冷却することで、前記支持体の上で培養した幹細胞を、支持体から剥離して回収する幹細胞の回収方法。【選択図】  図２
2019068760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を培養し、回収するための支持体であり、
機能層により被覆された繊維を少なくとも表面に含む繊維シートを有し、
前記繊維シートを構成する繊維の繊維間距離が１μｍ以上２０μｍ以下であり、
前記機能層は、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質との混合物、および／または、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質とが化学的に結合した物質を含む、幹細胞培養用の支持体。
【請求項２】
前記繊維シートを構成する繊維の繊維長が１０μｍ以上１００μｍ以下である請求項１に記載の幹細胞培養用の支持体。
【請求項３】
前記機能層は、熱感受性ポリマーからなる樹脂層を介して繊維を被覆している請求項１または２に記載の幹細胞培養用の支持体。
【請求項４】
前記繊維シートは、ポリテトラフルオロエチレンの延伸シートである請求項１から３のいずれかに記載の幹細胞培養用の支持体。
【請求項５】
前記熱感受性ポリマーが、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドである請求項１から４のいずれかに記載の幹細胞培養用の支持体。
【請求項６】
前記幹細胞が、ガン幹細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、末梢血幹細胞のいずれかである請求項１から５のいずれかに記載の幹細胞培養用の支持体。
【請求項７】
前記繊維シートがガス透過膜上に形成された、請求項１から６のいずれかに記載の幹細胞培養用の支持体。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の支持体が、インサート底部に配置された、幹細胞培養用のインサート。
【請求項９】
請求項７に記載の支持体が、ウェル底部に配置された、幹細胞培養用のウェル。
【請求項１０】
支持体上で培養した幹細胞を剥離して回収する方法であり、
前記支持体は、機能層により被覆された繊維を少なくとも表面に含む繊維シートを有し、前記繊維シートを構成する繊維の繊維間距離が１μｍ以上２０μｍ以下であり、前記機能層は、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質との混合物、および／または、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質とが化学的に結合した物質を含む支持体であり、
前記支持体を、前記熱感受性ポリマーのＬＣＳＴよりも低い温度に冷却することで、前記支持体の上で培養した幹細胞を、支持体から剥離して回収する幹細胞の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞培養用の支持体、インサート、ウェルおよび当該支持体を用いた幹細胞の回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、再生医療や臓器移植、遺伝子治療等への応用が期待されている。幹細胞は培養増殖しても、すぐ分化してしまい、元来の幹細胞のもつ多分化能などの性質が失われてしまうことが多く、幹細胞を未分化の状態を維持して培養させる方法について様々な研究がおこなわれている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、−５０〜２００℃のガラス転移温度および０．５〜９ギガパスカルのヤング率を有する非水溶性ポリマーからなる平均孔径１μｍの孔を有する、ハニカム状多孔質体（蜂の巣状の微小な孔を有する薄膜）の培養基材が開示されている。また、当該培養基材を用いて、間葉系幹細胞を培養すると未分化の状態を維持して培養できることが記載されている。
【０００４】
一方、幹細胞は、その培養方法のみならず、増殖した幹細胞の回収時にも、機能の損失が起こりやすく、どのように増殖した幹細胞を回収するかも重要となる。
培養した細胞の回収方法として、特許文献２、３には、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等の特定の温度にて相転移するポリマーの層を有する基材を用い、温度変化を利用して細胞を回収する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０６３３７２号公報
【特許文献２】特開平５−２４４９３８号公報
【特許文献３】特開平３−２９２８８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１の薄膜状の基材は、培養時の幹細胞の基材への接着性が不十分であったり、また、培養した細胞は、トリプシン等の酵素を用いて回収する必要があり、幹細胞の回収時に機能が損なわれる可能性がある。
また、特許文献２や３の基材はスフェロイド状などの塊で細胞を増殖させ、回収するので、幹細胞の培養に用いた場合、分化してその機能が損なわれるという問題がある。
【０００７】
幹細胞は、上述のように分化しやすく、培養増殖させるときの足場となる支持体の形状（構造）により、培養される幹細胞の分化のしやすさ等が影響を受けやすい。そのため、支持体の形状が重要であるが、どのような構造の支持体を使用すれば、幹細胞の分化を抑制した状態で培養でき、かつ、その機能を維持したまま回収が可能であるか、明らかになっていないのが現状である。
かかる状況下、本発明の目的は、幹細胞の分化を抑えた状態で細胞増殖させ、かつ温和に幹細胞を回収することのできる支持体および培養した幹細胞の回収方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞  幹細胞を培養し、回収するための支持体であり、機能層により被覆された繊維を少なくとも表面に含む繊維シートを有し、前記繊維シートを構成する繊維の繊維間距離が１μｍ以上２０μｍ以下であり、前記機能層は、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質との混合物、および／または、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質とが化学的に結合した物質を含む、幹細胞培養用の支持体。
＜２＞  前記繊維シートを構成する繊維の繊維長が１０μｍ以上１００μｍ以下である＜１＞に記載の幹細胞培養用の支持体。
＜３＞  前記機能層は、熱感受性ポリマーからなる樹脂層を介して繊維を被覆している＜１＞または＜２＞に記載の幹細胞培養用の支持体。
＜４＞  前記繊維シートは、ポリテトラフルオロエチレンの延伸シートである＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の幹細胞培養用の支持体。
＜５＞  前記熱感受性ポリマーが、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドである＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の幹細胞培養用の支持体。
＜６＞  前記幹細胞が、ガン幹細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、末梢血幹細胞のいずれかである＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の幹細胞培養用の支持体。
＜７＞  前記繊維シートがガス透過膜上に形成された、＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の幹細胞培養用の支持体。
＜８＞  ＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の支持体が、インサート底部に配置された、幹細胞培養用のインサート。
＜９＞  ＜７＞に記載の支持体が、ウェル底部に配置された、幹細胞培養用のウェル。
＜１０＞  支持体上で培養した幹細胞を剥離して回収する方法であり、前記支持体は、機能層により被覆された繊維を少なくとも表面に含む繊維シートを有し、前記繊維シートを構成する繊維の繊維間距離が１μｍ以上２０μｍ以下であり、前記機能層は、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質との混合物、および／または、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質とが化学的に結合した物質を含む支持体であり、前記支持体を、前記熱感受性ポリマーのＬＣＳＴよりも低い温度に冷却することで、前記支持体の上で培養した幹細胞を、支持体から剥離して回収する幹細胞の回収方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、幹細胞の分化を抑えた状態で細胞増殖させ、かつ温和に幹細胞を回収することのできる支持体および培養した幹細胞の回収方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１のインサートを用いて７日培養した間葉系幹細胞の形態を示す顕微鏡観察写真である。
【図２】実施例１のインサートを用いて７日培養後、回収した間葉系幹細胞の形態を示す顕微鏡観察写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を変更しない限り、以下の内容に限定されない。なお、本明細書において「〜」という表現を用いる場合、その前後の数値を含む表現として用いる。
【００１３】
１．本発明の支持体
本発明は、機能層により被覆された繊維を少なくとも表面に含む繊維シートを有し、前記繊維シートを構成する繊維の繊維間距離が１μｍ以上２０μｍ以下であり、前記機能層は、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質との混合物、および／または、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質とが化学的に結合した物質を含む、幹細胞培養用の支持体（以下、「本発明の支持体」と記載する場合がある。）に関する。
【００１４】
なお、「ＬＣＳＴ」とは、下限臨界共溶温度（Lower critical solution temperature）のことで、この温度以上で相転移挙動を示す温度を指すものである。また、本発明において、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーとは、降温によりゲルからゾルに相転移するポリマーのことを意味する。
【００１５】
本発明の支持体は、上述のように、少なくとも繊維シートの表面に、機能層により被覆された繊維を含む。そして、機能層は、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質との混合物、および／または、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質とが化学的に結合した物質を含む構成である。そのため、温度変化により機能層に含まれる熱感受性ポリマーの状態を変化させることで、本発明の支持体上で培養した幹細胞を、温和に剥離することができる。
【００１６】
また、機能層を有する多孔質膜であっても、その孔径が大きすぎたり小さすぎると幹細胞の機能性を維持して培養することは困難である。本発明の支持体は、繊維シートを有し、繊維シートはその表面が適度な凹凸を有し、さらに、繊維間距離が１〜２０μｍであるため、一般的に数μｍ〜数十μｍ（例えば、間葉系幹細胞の場合、１０〜２０μｍ）の幹細胞の培養に適した孔径となる。これにより、幹細胞の不要な接着により延伸したり、幹細胞の機能性が損なわれることを抑制することができる。
また、本発明の支持体は、特定の繊維間距離の繊維シートを有することにより、生体内と同様な形状で培養が可能であり、分化しやすく感受性の高い幹細胞であっても、その機能を維持した状態で培養することができる。例えば、間葉系幹細胞では、生体内に近い、延伸しない球形様の形態のまま培養が可能であり、さらに、球形を維持した状態で回収が可能である。
【００１７】
そのため、本発明の支持体を用いることで、生体内と同様の形状で、機能を維持した状態で幹細胞を培養でき、かつ、機能や未分化能を維持した状態で幹細胞を回収することができる。
【００１８】
本発明の支持体は、幹細胞の培養および回収に好適であり、幹細胞の中でも、ガン幹細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、末梢血幹細胞のいずれかを培養し、回収するのにより好適である。
【００１９】
（繊維シート）
本発明の支持体を構成する繊維シート（以下、「本発明の繊維シート」と記載する場合がある）は、機能層により被覆された繊維を少なくとも表面に含み、繊維間距離が１〜２０μｍである繊維シートであり、多孔性を有するものである。
なお、本発明において、「繊維間距離」とは、支持体の表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真において観察される複数本の繊維から形成される微細孔に内接する円の直径を意味する。内接する円が楕円の場合は、短径とする。「繊維間距離が１〜２０μｍ」とは、支持体の表面の１ｍｍ×１ｍｍの領域における走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真で観察される微細孔の９０％以上の微細孔において、繊維間距離が１〜２０μｍであることを意味する。
【００２０】
繊維間距離が大きすぎる場合、培養細胞の支持体への接着性が不十分となり、繊維間距離が小さすぎる場合、支持体と培養細胞の接着面が増えることで幹細胞が延伸されて培養され、幹細胞の多機能性が損なわれる。繊維間距離が１〜２０μｍの繊維シートを用いることで、個々の幹細胞が周囲に不要に接着せず、幹細胞の機能性を維持した状態で培養される。
好ましくは、繊維間距離が１〜１０μｍであり、より好ましくは、１〜５μｍである。
【００２１】
また、本発明の繊維シートを構成する繊維の繊維長は、１０〜１００μｍであることがより好ましく、１０〜５０μｍであることがさらに好ましい。なお、「繊維長」は、支持体の表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真から求めることができる。「繊維長が１０〜１００μｍ」とは、支持体の表面の１ｍｍ×１ｍｍの領域における走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真で観察される繊維の９０％以上の繊維について長さが１０〜１００μｍであることを意味する。
【００２２】
本発明の繊維シートの材質としては、生体適合性の材料であれば特に制限はないが、例えば、含フッ素ポリマー（ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等）、ポリオレフィン（ポリエチレン、ポリプロピレン等）、ポリエステル、ポリウレタン、セルロース繊維（セルロース繊維、再生セルロース繊維）、ポリアミド、ポリイミド、ガラス繊維からなる群から選択される少なくとも１以上であることが好ましい。
【００２３】
また、本発明の繊維シートは、多孔性を有する、繊維が集合して形成されたシートであればよく、その種類は、培養方法等に応じて適宜選択される。例えば、本発明の繊維シートとしては、織布、不織布、フェルト、編物、織物等が使用できる。また、延伸により樹脂をフィブリル化した延伸シート（フィブリルシート）を用いることもできる。
【００２４】
本発明において、好適な繊維シートの一つは、延伸により樹脂をフィブリル化した延伸シート（フィブリルシート）である。延伸方法は特に限定されず、例えば、延伸シートとしては、１軸延伸のフィブリルシートを用いることができる。
一般的に、１軸延伸のフィブリルシートは、島状のノードから延伸方向にフィブリルが配向した略長方形の微細孔を有する構造である。この場合、「繊維間距離」は、微細孔に内接する楕円の短径となり、フィブリル間の長さにほぼ等しい。また、「繊維長」は、ノードの長さでなく、フィブリルの長さであり、ノード間の長さを意味する。
【００２５】
特に、薄く均一な多孔性の膜としやすいため、本発明の繊維シートはポリテトラフルオロエチレンの延伸シートであるｅＰＴＦＥがより好ましい。
【００２６】
本発明の繊維シートの厚さは、支持体の構成や熱感受性ポリマーの種類等により適宜設計されるが、その厚みの上限は７００μｍ以下であることが好ましく、５００μｍ以下であることがより好ましく、１００μｍ以下がさらに好ましい。また、本発明の繊維シートの厚みの下限は、１０μｍ以上であることが好ましく、３０μｍ以上であることがより好ましく、５０μｍ以上であることがさらに好ましい。このような範囲であると、例えば、本発明の繊維シートを単独で支持体として用いた場合であっても機械強度が十分である。さらに、培地交換がより容易にできるため、幹細胞の分化や機能損失が起こりにくい。
【００２７】
本発明において、繊維シートは、幹細胞培養時の細胞接着性や、幹細胞回収時の温度変化による細胞の脱離特性を損なわなければ、繊維シートの表面に、機能層により被覆されていない繊維を含んでもよい。幹細胞培養時の細胞接着性や、幹細胞回収時の細胞の脱離特性をより向上させるためには、本発明の繊維シートの表面部分は、機能層により被覆された繊維からなることが好ましい。
また、繊維シートの表面だけでなく、繊維シート内部の繊維が、機能層により被覆されていてもよい。例えば、本発明の繊維シートは、機能層により被覆された繊維からなる繊維シートであってもよい。
【００２８】
また、機能層により被覆された繊維は、少なくとも一部が機能層により被覆されていれば、機能層により被覆されていない部分があってもよい。
【００２９】
（機能層）
本発明において、機能層は、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質との混合物、および／または、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質とが化学的に結合した物質を含む。
ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーとは、上述の通り、ＬＣＳＴより低い温度に冷却することにより、ゲルからゾルへ相転移をするポリマーのことを意味する。
【００３０】
本発明において用いられる熱感受性ポリマーとしては、ＬＣＳＴの温度が０〜５０℃、好ましくは１５〜４０℃を有するものが適当である。温度が高すぎると、幹細胞の培養時または幹細胞の回収時に幹細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。また、温度が低すぎると一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または幹細胞が死滅してしまうため好ましくない。
【００３１】
熱感受性ポリマーは、特に限定されず、例えば、１種または複数のアクリルアミド（モノマー）を重合または共重合することにより、製造することができる。具体的には、アクリルアミド、メタクリルアミドなどの(メタ)アクリルアミド化合物、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等のＮ−アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド等のＮ,Ｎ−ジアルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体等の重合体またはこれらの共重合体を用いることができる。
【００３２】
熱感受性ポリマーとして特に好ましいのは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの重合体であるポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）である。
【００３３】
熱感受性ポリマーの分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）で１万〜５万であることが好ましい。
【００３４】
細胞親和性物質とは、細胞接着性を有すれば特に限定されず、天然物質であっても、合成物質であってもよい。細胞親和性物質としては、オリゴ糖等の糖類、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリン等のタンパク質やそれらの成分である細胞接着ペプチド等が挙げられる。特に、好適な細胞親和性物質のひとつは、コラーゲンである。
【００３５】
また、熱感受性ポリマーと細胞親和性物質とが化学的に結合した物質は、例えば、熱感受性ポリマーと細胞親和性物質に反応性置換基を導入した後に反応させて合成することができる。原料となる熱感受性ポリマーや細胞親和性物質は、上述の熱感受性ポリマーや細胞親和性物質を用いることができる。
【００３６】
機能層の厚さは、形成される繊維シートの繊維間距離が１〜２０μｍとなるように、培養される幹細胞や機能層の組成に応じて適宜決定される。機能層の厚みが厚すぎると、機能層により被覆された繊維の繊維径が大きくなり、繊維間距離の調整が困難となる場合がある。そのため、機能層の厚さは、１０μｍ以下であることが好ましく、５μｍ以下であることがより好ましく、１μｍ以下であることがより好ましい。
一方、機能層の厚みが薄すぎる場合、機能層の効果が十分に発揮されず、細胞培養時の幹細胞の接着性や、細胞回収時の温度変化による幹細胞の脱離が起こりにくい。そのため、機能層の厚さの上限は、０．０１μｍ以上であることが好ましく、０．０５μｍ以上であることがより好ましく、０．１μｍ以上であることがさらに好ましい。
なお、機能層の厚みは、走査型電子顕微鏡やレーザー顕微鏡により繊維シートの断面を観察することによって、算出することができる。また、製造時の熱感受性ポリマーや細胞親和性物質の濃度等から算出することも可能である。
また、繊維を被覆する機能層の厚みは、均一であっても不均一であってもよい。
【００３７】
熱感受性ポリマーと細胞親和性物質との割合は、熱感受性ポリマーや細胞親和性物質の種類等により適宜決定されるものである。機能層において、細胞親和性物質が少なすぎる場合、幹細胞培養時の細胞接着性が不十分となるため、熱感受性ポリマー１００質量部に対して、細胞親和性物質が５０質量部以上であることが好ましく。また、機能層において、熱感受性ポリマーが少なすぎる場合、温度変化による幹細胞の脱離が起こりにくくなるため、熱感受性ポリマー１００質量部に対して、細胞親和性物質が１００質量部以下であることが好ましい。
【００３８】
熱感受性ポリマーと細胞親和性物質とを化学的に結合した物質を含む機能層が形成される場合には、熱感受性ポリマーに由来する部位と細胞親和性物質に由来する部位の重量比が２：１〜１：１（熱感受性ポリマーに由来する部位：細胞親和性物質に由来する部位が２：１〜１：１）となるような物質を用いることが好ましい。また、熱感受性ポリマーと細胞親和性物質との構造に応じて、適宜、熱感受性ポリマーや細胞親和性物質を別に混合するなどしてもよい。
【００３９】
機能層は、繊維を直接被覆してもよいし、他の層を介して被覆してもよい。他の層としては、熱感受性ポリマーからなる層や両親媒性ポリマーからなる層等の樹脂層を挙げることができる。
なお、樹脂層を構成する熱感受性ポリマーは、上述の熱感受性ポリマーと同様のポリマーを使用することができる。両親媒性ポリマー（Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  Ｐｏｌｙｍｅｒ）とは、ポリマーが、疎水部と、親水部とを有することで、疎水性と、親水性との両方の特徴を有するポリマーである。
【００４０】
また、機能層は、熱感受性ポリマーからなる樹脂層を介して、繊維を被覆していることが好ましい。このような構成にすることにより、幹細胞培養中に機能層が繊維から剥離しにくく、安定して幹細胞を培養することができる。
樹脂層の厚みは、培養される幹細胞や、繊維径等により適宜決定される。樹脂層は機能層の厚みより厚くすることができ、例えば、樹脂層を、０．３〜０．４μｍとし、機能層を０．１〜０．２μｍとすることができる。なお、樹脂層の厚みは、機能層と同様に、走査型電子顕微鏡やレーザー顕微鏡による繊維シートの断面の観察から算出することができる。
【００４１】
本発明の支持体の構造は、本発明の目的を損なわない範囲で特に限定されず、本発明の繊維シートからなる単層構造であっても、本発明の繊維シートを他のシートと組み合わせた積層構造であってもよい。
また、本発明の支持体が積層構造である場合、幹細胞培養時の細胞接着性や、幹細胞回収時の温度変化による細胞の脱離特性を損なわないように、繊維シートにおける機能層により被覆された繊維を含む面が、本発明の支持体の表面となるように繊維シートと他のシートとが積層される。
また、本発明の支持体の形状は、特に限定されず目的に応じて適宜決定され、インサートやディッシュ、ウェル等に用いることができる。
【００４２】
本発明の支持体の好適な態様の一つは、本発明の繊維シートからなる支持体である。本発明の繊維シートを単独で支持体として用いた場合、例えば、インサートとして使用することができる。すなわち、インサート底部に本発明の支持体が配置された幹細胞培養用のインサートとすることができる。
【００４３】
本発明の支持体の好適な別の態様は、本発明の繊維シートがガス透過膜上に形成された積層型の支持体（以下、「本発明の積層型支持体」と記載する場合がある）である。この場合、繊維シートにおける、機能層により被覆された繊維を含む面が、支持体の表面となるように、繊維シートはガス透過膜上に積層される。
【００４４】
なお、ガス透過膜とは、ガス透過性を有する一方で、液体非透過性の膜を意味する。ガス透過膜の材質は、生体適合性があるものであればよいが、具体的には、シリコーン膜、エチレンビニルアルコール共重合体膜、有孔低密度ポリエチレンシート膜、ポリ（１−トリメチルシリル−１−プロピン）膜等を用いることができ、シリコーン膜が好ましい。また、ガス透過膜の厚みは、通常、５０〜１０００μｍであり、１００〜５００μｍが好ましい。
【００４５】
本発明の積層型支持体は、例えば、ウェルの底部に利用することができる。すなわち、ウェルの底部に、積層型の支持体が配置された幹細胞培養用のウェルとして使用することができる。上述のように、本発明の積層型支持体はガス透過膜を有するため、ウェルの底部として使用した場合であっても支持体の両面から酸素の供給や二酸化炭素の排出が可能である。そのため、酸素を供給しながら幹細胞を培養することができ、より生体内に近い環境で幹細胞を培養することができる。  
【００４６】
本発明の支持体は、その製造方法は特に限定されるものではないが、例えば、機能層を構成する材料を溶解（または分散）した溶液（塗布液）を未修飾の繊維シート（機能層で被覆された繊維を含まない繊維シート）に塗布することで製造することができる。このような製造方法とすることにより、容易に機能層で繊維を被覆することができる。また、繊維を複数の層で被覆することも容易にできる。
【００４７】
塗布液（熱感受性ポリマーおよび細胞親和性物質を含む溶液）の濃度は、０．１〜１質量％であることが好ましく、０．２０〜０．５質量％であることがより好ましい。濃度が低すぎると、形成される機能層が薄くなりすぎるために、温度変化により温和に回収することが困難となる場合がある。また、濃度が高すぎると、形成される機能層が厚くなりすぎるために、繊維シートの網目構造が変化し、幹細胞が基材に接着することで延伸し、機能を維持しにくくなるおそれがある。
【００４８】
塗布方法としては、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、スピンコート法、バーコート法、ディップコート法、スプレーコート法、ロールコート法、ダイコート法等が挙げられる。なお、繊維シートと機能層との間に、他の層を有する場合、各層の塗布方法は同一であっても、異なってもよい。
【００４９】
例えば、繊維間距離が２〜２０μｍ、繊維長が１０〜１００μｍの未修飾の繊維シート（好ましくは、延伸シート）を用い、この未修飾の繊維シートに、機能層を構成する材料を溶解させた溶液（濃度０．１〜１質量％）を塗布、乾燥して、製造することができる。
【００５０】
また、本発明の支持体が積層構造である場合、上記繊維シートと他のシートとを圧着等により貼り付けて製造することができる。
【００５１】
２．本発明の幹細胞回収方法
上述した本発明の支持体を用いて培養した幹細胞は、温度変化による熱感受性ポリマーの相転移を利用して剥離することができる。すなわち、本発明は、支持体上で培養した幹細胞を剥離して回収する方法であり、前記支持体は、機能層により被覆された繊維を少なくとも表面に含む繊維シートを有し、前記繊維シートを構成する繊維の繊維間距離が１μｍ以上２０μｍ以下であり、前記機能層は、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質との混合物、および／または、ＬＣＳＴを有する熱感受性ポリマーと細胞親和性物質とが化学的に結合した物質を含む支持体であり、前記支持体を、前記熱感受性ポリマーのＬＣＳＴよりも低い温度に冷却することで、前記支持体の上で培養した幹細胞を、支持体から剥離して回収する幹細胞の回収方法（以下、「本発明の幹細胞回収方法」と記載する場合がある）に関する。
【００５２】
このようにすることにより、トリプトシン等の酵素を使用することなく幹細胞を回収することができ、増殖した幹細胞を傷つけることなく温和に回収することができる。特に、本発明の支持体を用いて培養増殖させた幹細胞を、上述の方法で回収することで、生体内での形状と近い形状で培養された幹細胞を、形状や機能性を維持した状態で、個々の幹細胞として回収することができる。
例えば、熱感受性ポリマーがＰＮＩＰＡＡｍである場合、３７℃で幹細胞を培養し、培養後に２５℃以下に冷却することで、ゲル状の機能層がゾル状になり、増殖した幹細胞を支持体から剥離、回収することが可能となる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００５４】
１．材料
（Ａ）インサートセル（未修飾）
・１０ミリインサート、２４ｗｅｌｌ、インサートの繊維組成：多孔質ポリ４フッ化エチレン樹脂の一軸延伸シート、厚み５０〜７０μｍ、繊維長１０〜５０μｍ、繊維間距離２〜５μｍ
（Ｂ）熱感受性ポリマー
・ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）：ＡＬＤＲＩＣＨ社製、Ｍｎ２０，０００〜４０，０００、製品番号５３５３１１、ＰＣｏｄｅ：１００２３２１７６７
（Ｃ）細胞親和性物質
・コラーゲン：ブタ由来アテロコラーゲン（株式会社高研製、ＡＰＮ−２２１、製品番号Ｌｏｔ  Ｎｏ．Ｐ１６２４０１１３）
なお、コラーゲンは、凍結乾燥し、安定防腐剤のフェノキシエタノールを除去して使用した。
【００５５】
２．本発明の支持体を有するインサートの製造
（１）溶液の調製
ＰＮＩＰＡＡｍとコラーゲンとを１：１（ｗ／ｗ）の割合となるように水（超純水）に溶解し、濃度０．２５質量％の水溶液（ＰＮＩＰＡＡｍ−コラーゲン水溶液）を得た。
また、ＰＮＩＰＡＡｍを水（超純水）に溶解し、濃度０．５質量％の水溶液（ＰＮＩＰＡＡｍ水溶液）を得た。
【００５６】
（２）本発明の支持体を有するインサートの製造
インサートセル（未修飾）に室温でＰＮＩＰＡＡｍ水溶液を、１ウェルあたり、１０μＬ加えて、均一に全面ぬらした後、１時間熱風乾燥した。この操作を３回繰り返した。
その後、濃度０．２５質量％のＰＮＩＰＡＡｍ−コラーゲン水溶液を同様に１ウェルあたり、１０μＬ加えて、均一に全面ぬらした後、１時間熱風乾燥した。この操作を１〜２回繰り返し、本発明の支持体を有するインサート（１）を得た。
【００５７】
なお、得られたインサート（１）は、繊維間距離１〜４μｍ、繊維長１０〜５０μｍであり、多孔性を維持していた。
【００５８】
３０ミリインサート（６ｗｅｌｌ）の場合は、１ウェルあたり、１００μＬのＰＮＩＰＡＡｍ水溶液またはＰＮＩＰＡＡｍ−コラーゲン溶液を加える以外は、１０ミリインサート（２４ｗｅｌｌ）と同様にしてインサートを製造した。
【００５９】
３．評価
（１）幹細胞の培養および回収
作製したインサート（１）を用いて、ラット骨髄由来間葉系幹細胞（コスモ・バイオ社；Code No.MSB01）を、培養表面に４×１０＾４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ラット骨髄由来間葉系幹細胞用培地（コスモ・バイオ社；Code No.MSB01）を用いて、３７℃で７日間培養した。図１に、培養７日目のインサート（１）上の細胞の状態を観察した顕微鏡写真を示す。
培養７日目に、インサート（１）の外側の培地と内側の培地を取り除き、２０℃の培地（ラット骨髄由来間葉系幹細胞用培地（コスモ・バイオ社；Code No.MSB01）を加えて、培地を交換した。次いで、内側の培地の一部を採取し、９６ｗｅｌｌの一般プラスチックプレートに播種した。図２に、採取したインサート（１）内側の培地を播種したプラスチックプレート上の細胞の状態を観察した顕微鏡写真を示す。
図１に示すように、インサート（１）を用いて間葉系幹細胞を培養することで、生体内の形態に近い球形で培養できることが確認できた。
また、図２に示すように、２０℃の培地に培地交換後に採取した内側の培地を播種したプラスチックプレート上には、細胞が観察され、培地を３７℃から２０℃とすることで、インサート（１）上から細胞が剥離したことが確認できた。また、細胞は、図１と同様の球状の形状を維持した状態で回収された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の支持体を用いることで、種々の応用が期待される幹細胞を分化を抑えた状態で細胞増殖し、回収することができるため産業上有用である。
【図１】
2019068760.tif 000003
【図２】
2019068760.tif 000004