(57)【要約】      （修正有）【課題】多数の非標的細胞及び／又は非標的細胞の多数の核酸を含有するか又は含有する可能性のある液体生体試料中の、目的の微生物及び／或いは目的の核酸の選択的単離のための方法の提供。【解決手段】ａ）サポニン、ｂ）遊離核酸を溶解させることができる酵素溶液、及びｃ）場合によっては溶液中の溶解されない目的微生物の沈殿のための薬剤を用いる、目的微生物及び／又は目的微生物の核酸の選択的単離のための方法及びその使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
●細胞膜又はカプシドがコレステロールを含有しない目的微生物、並びに
●非標的要素、すなわち：
−細胞膜がコレステロールを含有する非標的細胞、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するエンベロープを有するウイルス、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するマイコプラズマ、及び
−場合によっては、目的微生物及び／又は非標的細胞のデブリ
を特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の目的微生物の選択的単離のための方法であって、
ａ）コレステロールを含有する細胞膜、又はコレステロールを含有するウイルスエンベロープ、又はコレステロールを含有するマイコプラズマの膜を不安定化するために、液体生体試料をサポニン製剤と接触させる工程、
ｂ）非標的細胞を特異的に溶解するために非標的細胞の浸透圧衝撃を実施する工程、
ｃ）試料中の溶液に溶解した非標的要素由来の遊離核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を溶解することができる少なくとも一の酵素の溶液を添加し、目的微生物が選択的に得られることを可能にする工程
を含む、方法。
【請求項２】
●細胞膜又はカプシドがコレステロールを含有しない目的微生物、並びに
●非標的要素、すなわち：
−細胞膜がコレステロールを含有する非標的細胞、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するエンベロープを有するウイルス、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するマイコプラズマ、及び
−場合によっては、目的微生物及び／又は非標的細胞のデブリ
を特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の目的微生物の選択的単離のための方法であって、
ａ）コレステロールを含有する細胞膜、及び／又はコレステロールを含有するウイルスエンベロープ、及び／又はコレステロールを含有するマイコプラズマの膜を不安定化するために、液体生体試料をサポニン製剤と接触させる工程、
ｂ）非標的細胞を特異的に溶解するために非標的細胞の浸透圧衝撃を実施する工程、
ｃ）試料中の溶液に溶解しない目的微生物を沈殿させるための薬剤を添加し、目的微生物が選択的に得られることを可能にする工程
を含む、方法。
【請求項３】
液体生体試料中の目的微生物を選択的に単離するための方法であって、試料中の溶液に溶解されない目的微生物を沈殿させるための薬剤を添加することからなる工程を更に含み、前記工程は、工程ａ）で、工程ａ）及びｂ）の後で、又は工程ｃ）の後で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
●細胞膜又はカプシドがコレステロールを含有しない目的微生物、並びに
●非標的要素、すなわち：
−細胞膜がコレステロールを含有する非標的細胞、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するエンベロープを有するウイルス、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するマイコプラズマ、及び
−場合によっては、目的微生物及び／又は非標的細胞のデブリ
を特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の目的の核酸の選択的単離のための方法であって、
ａ）コレステロールを含有する細胞膜、及び／又はコレステロールを含有するウイルスエンベロープ、及び／又はコレステロールを含有するマイコプラズマの膜を不安定化するために、液体生体試料をサポニン製剤と接触させる工程、
ｂ）非標的細胞を特異的に溶解するために非標的細胞の浸透圧衝撃を実施する工程、
ｃ）試料中の溶液に溶解した非標的要素由来の遊離核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を溶解することができる少なくとも一の酵素の溶液を添加する工程、
ｄ）工程（ｃ）で添加した酵素を不活化する工程、及び、
ｅ）工程（ｃ）の酵素により分解されない目的微生物の核酸を利用可能にする工程
を含む、方法。
【請求項５】
●細胞膜又はカプシドがコレステロールを含有しない目的微生物、並びに
●非標的要素、すなわち：
−細胞膜がコレステロールを含有する非標的細胞、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するエンベロープを有するウイルス、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するマイコプラズマ、及び
−場合によっては、目的微生物及び／又は非標的細胞のデブリ
を特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の目的の核酸の選択的単離のための方法であって、
ａ）コレステロールを含有する細胞膜、及び／又はコレステロールを含有するウイルスエンベロープ、及び／又はコレステロールを含有するマイコプラズマの膜を不安定化するために、液体生体試料をサポニン製剤と接触させる工程、
ｂ）非標的細胞を特異的に溶解するために非標的細胞の浸透圧衝撃を実施する工程、
ｃ）試料中の溶液に溶解しない目的微生物の沈殿剤を添加する工程、及び
ｄ）工程ａ）及びｂ）の作用により利用可能でない目的微生物の核酸を利用可能にする工程
を含む、方法。
【請求項６】
液体生体試料中の目的の核酸を選択的に単離するための方法であって、試料中の溶液に溶解されない目的微生物を沈殿させるための薬剤を添加することからなる工程を更に含み、前記工程は工程ａ）で、工程ａ）及びｂ）の後で、又は工程ｃ）の後で、又は工程ｄ）の後で実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
サポニンが等濃度で、試料と少なくとも同量かそれ以上の量であることを特徴とする、請求項１から６の何れか一項に記載の単離方法。
【請求項８】
サポニンの最終濃度が０．０２％超及び２０％以下であることを特徴とする、請求項１から７の何れか一項に記載の単離方法。
【請求項９】
沈殿剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなることを特徴とする、請求項２、３、及び５から８の何れか一項に記載の単離方法。
【請求項１０】
サポニンがトリテルペノイドからなることを特徴とする、請求項１から９の何れか一項に記載の単離方法。
【請求項１１】
遊離核酸を溶解することができる酵素が、次いで、
●ＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡ及び／又はＤＴＴ及び／又はβ−メルカプトエタノール及び／又はＤＥＰＣ、及び／又はグアニジンを添加することにより化学的に、
且つ／或いは
●ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤の存在下又は非存在下で、４０から１００℃の間に温度を上昇させることにより物理的に、
不活化されることを特徴とする、請求項１、３、４、及び６から１０の何れか一項に記載の単離方法。
【請求項１２】
少なくとも一の沈殿剤を添加することからなる、必要に応じて予めサポニンで処理された液体生体試料中の細菌及び真菌から選択される目的微生物の沈殿の改良された方法。
【請求項１３】
沈殿剤が、ＰＥＧ、グリコーゲン、核酸から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３の何れか一項に記載の方法であって、前記方法の間、
●ｐＨが５を下回る、好ましくは６を下回れば、塩基性
●ｐＨ１０を上回る、好ましくは９を上回れば、酸性
の溶液を添加することにより、ｐＨが５から１０、好ましくは６から９の範囲に維持され、
そのためｐＨが前記範囲にあることを特徴とする、方法。
【請求項１５】
液体生体試料中の目的微生物の単離又は目的微生物の核酸の単離のための、サポニン製剤の使用、及び遊離核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を溶解することができる少なくとも一の酵素の溶液の使用、並びに、場合によっては、少なくとも一の沈殿剤の使用。
【請求項１６】
０．０２％超及び２０％以下の最終濃度をもたらすサポニン製剤、及び／又は０．１から２０％の濃度の沈殿剤、及び／又は５００から２００００酵素単位を含有する遊離核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を溶解することができる酵素を使用することを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
生体試料中の目的微生物の沈殿のための、ＰＥＧ及び／又はグリコーゲン及び／又は核酸の使用であって、前記試料が、必要であれば、予めサポニンと接触させられている、使用。
【請求項１８】
請求項１から１４の何れか一項に記載の方法に基づくか、又は請求項１５から１７のいずれか一項に記載の使用に基づく診断検査。
【請求項１９】
目的微生物、非標的細胞、並びに、場合によっては、エンベロープウイルス、マイコプラズマ及び／又は目的微生物及び／若しくは非標的細胞のデブリを特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の、目的微生物を単離するため並びに／或いは目的微生物の核酸を単離するための診断キットであって、
（ａ）容器と
（ｂ）少なくとも一のサポニン製剤と、
（ｃ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の少なくとも一の沈殿剤の溶液
を含む、診断キット。
【請求項２０】
（ｄ）核酸を溶解することができる少なくとも一の酵素を更に含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載のキットであって、
ｄ又はｄ’）少なくとも一の酸性溶液及び／又は少なくとも一の塩基性溶液、並びに／或いは
ｅ）ＥＤＴＡ及び／又は  ＥＧＴＡ及び／又は  ＤＴＴ及び／又はβ−メルカプトエタノール及び／又はＤＥＰＣ及び／又はグアジニン、並びに／或いは
ｆ）少なくとも一の界面活性剤又は陰イオン剤
を更に含むことを特徴とする、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に多数の非標的細胞及び／又は非標的細胞の多数の核酸を含有するか又は含有する可能性のある液体生体試料中の、目的の微生物及び／或いは目的の核酸の選択的単離のための方法に関する。また、本発明は、該方法の使用と、特に目的微生物、非標的細胞、並びに、場合によっては目的微生物及び／若しくは非標的細胞のデブリを含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の、目的微生物を単離するための方法或いは目的微生物の核酸を単離するための方法に基づく診断検査と、目的微生物及び／又は目的微生物の核酸を単離するためのキットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術は、一定数の科学刊行物及び特許刊行物からなる。すなわち、１９９２年にＢａｋｅｒらは、ヒト細胞を特異的に溶解して全血からマラリア原虫病原体を単離するための、サポニンと呼ばれる試薬の使用について記述した。Ｂａｋｅｒらは、およそ０．０１５％の低い最終濃度のサポニンが、クエン酸塩で緩衝された２０μＬの全血中にヒト細胞を溶解させ得、ＰＣＲ検出実施のための十分に清浄な溶解物を供給し得ることを証明した。
【０００３】
欧州特許出願公開第０７４５８４９号は、より多量の全血（５ｍＬ）に対しサポニンをおよそ０．０２０−０．１２５％の最終濃度で使用して、この特異的手法を再検討した。
【０００４】
別の欧州特許出願公開第２１８５６８１号は、平均的な量の全血（すなわち、５ｍＬ）に対し、より濃縮されたサポニン溶液（すなわち、最終濃度が２から１０％）を使用して、サポニン溶液の調製方法を提示している。本発明は、この種のサポニン溶液のために、低張性又は生理学的緩衝液を使用することを提示する。
【０００５】
しかしながら、現在のところ、大量の生体試料中の非常に少量の病原性細胞を単離及び識別するために利用可能な迅速溶液は存在しない。例えば、敗血症については、全血１０ｍＬ中の１から１０個のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の病原体から６時間以内に識別できること、或いは、最も困難なケースでは、８００μｇを超える非標的（ヒト）核酸の中から１ｆｇの標的病原体の核酸を識別できることが必要である。
【０００６】
感染症の診断で直面する問題は、したがって、次の通りである：
１）病原体の細胞をごく少数しか含まない一方、ヒト細胞を非常に多く含み、また、病原体の単離及び識別を妨害しないように除去されるべき他の細胞又は粒子を通常含む、マトリックス試料の複雑さ、及び
２）非常に大量の試料から非常に少ない数の病原体を単離するという物理的な限界。
【０００７】
まとめると、課題は、僅かしか最初は存在しない病原性標的の最大量を保持しながら、病原性標的の濃度を人工的に上げてそれらの検出を容易にするために、最大量の非標的要素（細胞及び／又は粒子）を除去することである。
【発明の概要】
【０００８】
ここに記載の本発明は、比較的短時間で大量の生体試料（例えば、およそ１０ｍｌ）から少数の病原体を単離及び識別することが可能な方法である。これらの病原体は、非網羅的に、細菌、ウイルス及び真菌である。本発明により、以前の文献には記載されてない検出限界で、全血１０ｍＬ中３ＣＦＵ（すなわち、０．３ＣＦＵ／ｍＬ）もの少量を識別することが可能になる。本発明の新規性は以下に基づく：
１．臨床的要件では０．１から１ＣＦＵ／ｍＬであるのに対し、およそ０．３ＣＦＵ／ｍＬという、過去に達成されていない優れた検出限界。
２．ＥＤＴＡ又はクエン酸塩で緩衝された全血のみならず、ヘパリンで緩衝された全血といった、種々の全血を使用することが可能。ヘパリンは病院で多く使われる試薬だが、核酸及び酵素反応の増幅を阻害する能力ゆえに、分子生物学のアプローチでは受け入れられないことが多い。本発明は、文献に記載されている分子的方法では一般的ではない、ヘパリンで緩衝された血液を扱うことができる。
３．１０ｍＬ以上の大量の全血が使用可能。
４．病原体の沈殿を促進するためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の使用。ＰＥＧによるＤＮＡ又はウイルスの沈殿は文献に非常によく記載されている。しかしながら、バクテリア細胞、又は酵母等の真菌の沈殿のためのＰＥＧの使用は当該技術分野には見られない。サポニンは界面活性剤様試薬であるため、病原性細胞又は粒子は、遠心分離効果の下で、試験管の内側で浮くか、又は試験管の底に沈殿しにくくなる。ＰＥＧの添加は、特定の処理をされた試料のために必要とされない場合であっても、標的の、浮遊のリスクのない定常性の沈殿を保証する。更に、このＰＥＧの添加は、病原体を含有するペレットのプラスチック試験管への接着性及び表面洗浄液への耐性を向上させる。
５．サポニンを用いた特異的溶解と、高濃度ヌクレアーゼに基づく処理の組み合わせ；換言すれば、非標的細胞の溶解、これが自身の核酸を放出し、次に該核酸がヌクレアーゼを用いた処理により分解される。この特異的溶解が大量のヒト核酸を放出する。通常、全血１０ｍｌから８８０μｇのヒトＤＮＡが抽出され得る。これらのヒト核酸は、病原性核酸のごく僅かなコピー数を検出することが目的である場合、以下の重大な問題の原因である：
ｉ）病原性標的核酸の精製中、ヒト核酸が、それらの過剰のために核酸捕捉試薬を飽和状態にして、競合する（例えば、シリカ膜、磁気シリカビーズ、クロマトグラフィー又はアフィニティーマトリックス等）。
ｉｉ）ヒト核酸が、病原性分子の増幅中に干渉する。ヒト核酸の最大量の除去で、検出限界が向上する。これらの重要なポイントにより、本発明は、サポニンを用いた溶解後にヒト核酸の最大量を除去するために大量のヌクレアーゼを使用する。サポニンと高濃度ヌクレアーゼを用いる処理とを組み合わせることは、今まで文献に一度も記載されていない。
６．最後に、本発明人らは、ｐＨ６から９の緩衝されたサポニン溶液は、血液中、特に赤血球内の望ましくない要素の沈殿を阻害し得ることを証明した。これまで、科学者らはｐＨ７に近い緩衝液をサポニンに対して使用してきたが、このｐＨの作用と試料の安定性とを関連付けたことはかつて一度もなかった。
【０００９】
まとめると、本発明は、臨床範囲の検出値（０．１から１ＣＦＵ／ｍＬ）と適合する病原体の検出限界を達成するための化学物質の様々な使用を組み合わせるものである。サポニン＋ＰＥＧと、少なくとも一のヌクレアーゼとの併用は、かつて記載されたことはなく、これまで未知であった技術上の改良を可能にする。これらの試薬の組み合わせは、識別又は検出用の分析試料を調製するために、全部（サポニン＋ＰＥＧ＋ヌクレアーゼ）であっても、或いは部分的（サポニン＋ヌクレアーゼ、若しくはサポニン＋ＰＥＧのみ、又はＰＥＧのみ）であってもよい。
【００１０】
この目的のために、本発明は、
●細胞膜又はカプシドがコレステロールを含有しない目的微生物、並びに
●非標的要素、すなわち：
−細胞膜がコレステロールを含有する非標的細胞、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するエンベロープを有するウイルス、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するマイコプラズマ、及び
−場合によっては、目的微生物及び／又は非標的細胞のデブリ
を特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の目的微生物の選択的単離のための方法であって、以下の工程：
ａ）コレステロールを含有する細胞膜、又はコレステロールを含有するウイルスエンベロープ、又はコレステロールを含有するマイコプラズマの膜を不安定化するために、液体生体試料をサポニン製剤と接触させること、
ｂ）非標的細胞を特異的に溶解するために非標的細胞の浸透圧衝撃を実施すること、
ｃ）試料中の溶液に溶解した非標的要素由来の遊離核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を溶解することができる少なくとも一の酵素の溶液を添加し、目的微生物が選択的に得られることを可能にすること
を含む、方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、
●細胞膜又はカプシドがコレステロールを含有しない目的微生物、並びに
●非標的要素、すなわち：
−細胞膜がコレステロールを含有する非標的細胞、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するエンベロープを有するウイルス、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するマイコプラズマ、及び
−場合によっては、目的微生物及び／又は非標的細胞のデブリ
を特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の目的微生物の選択的単離のための方法であって、以下の工程：
ａ）コレステロールを含有する細胞膜、及び／又はコレステロールを含有するウイルスエンベロープ、及び／又はコレステロールを含有するマイコプラズマ膜を不安定化するために、液体生体試料をサポニン製剤と接触させること、
ｂ）非標的細胞を特異的に溶解するために非標的細胞の浸透圧衝撃を実施すること、
ｃ）試料中の溶液に溶解しない目的微生物を沈殿させるための薬剤を添加し、目的微生物が選択的に得られることを可能にすること
を含む、方法を包含する。
【００１２】
第三の実施態様によれば、本発明は、
●細胞膜又はカプシドがコレステロールを含有しない目的微生物、並びに
●非標的要素、すなわち：
−細胞膜がコレステロールを含有する非標的細胞、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するエンベロープを有するウイルス、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するマイコプラズマ、及び
−場合によっては、目的微生物及び／又は非標的細胞のデブリ
を特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の目的微生物の選択的単離のための方法であって、以下の工程：
ａ）コレステロールを含有する細胞膜、及び／又はコレステロールを含有するウイルスエンベロープ、及び／又はコレステロールを含有するマイコプラズマの膜を不安定化するために、液体生体試料をサポニン製剤と接触させること、
ｂ）非標的細胞を特異的に溶解するために非標的細胞の浸透圧衝撃を実施すること、
ｃ）試料中の溶液に溶解しない目的微生物を沈殿させるための薬剤を添加すること、及び
ｄ）試料中の溶液に溶解した非標的要素由来の遊離核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を溶解することができる少なくとも一の酵素の溶液を添加し、目的微生物が選択的に得られることを可能にすること
を含む、方法を包含する。
【００１３】
この最後に述べた方法の工程ｃ）は、工程ａ）及びｂ）の後、又は工程ｄ）の後に、工程ａ）とは独立に実施され得る。
【００１４】
また、本発明は、
●細胞膜又はカプシドがコレステロールを含有しない目的微生物、並びに
●非標的要素、すなわち：
−細胞膜がコレステロールを含有する非標的細胞、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するエンベロープを有するウイルス、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するマイコプラズマ、及び
−場合によっては、目的微生物及び／又は非標的細胞のデブリ
を特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の目的の核酸の選択的単離のための方法であって、以下の工程：
ａ）コレステロールを含有する細胞膜、及び／又はコレステロールを含有するウイルスエンベロープ、及び／又はマイコプラズマの膜を不安定化するために、液体生体試料をサポニン製剤と接触させること、
ｂ）非標的細胞を特異的に溶解するために非標的細胞の浸透圧衝撃を実施すること、
ｃ）試料中の溶液に溶解した非標的要素由来の遊離核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を溶解することができる少なくとも一の酵素の溶液を添加すること、
ｄ）工程（ｃ）で添加した酵素を不活化すること、及び、
ｅ）工程（ｃ）の酵素により分解されなかった目的微生物の核酸を利用可能にすること
を含む、方法に関する。
【００１５】
第五の実施態様によれば、本発明は、
●細胞膜又はカプシドがコレステロールを含有しない目的微生物、並びに
●非標的要素、すなわち：
−細胞膜がコレステロールを含有する非標的細胞、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するエンベロープを有するウイルス、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するマイコプラズマ、及び
−場合によっては、目的微生物及び／又は非標的細胞のデブリ
を特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の目的の核酸の選択的単離のための方法であって、以下の工程：
ａ）コレステロールを含有する細胞膜、及び／又はコレステロールを含有するウイルスエンベロープ、及び／又はコレステロールを含有するマイコプラズマの膜を不安定化するために、液体生体試料をサポニン製剤と接触させること、
ｂ）非標的細胞を特異的に溶解するために非標的細胞の浸透圧衝撃を実施すること、
ｃ）試料中の溶液に溶解しない目的微生物を沈殿させるための薬剤を添加すること、及び
ｄ）工程ａ）及びｂ）の作用により利用可能でない目的微生物の核酸を利用可能にすること
を含む、方法を包含する。
【００１６】
第六の実施態様によれば、本発明は、
●細胞膜又はカプシドがコレステロールを含有しない目的微生物、並びに
●非標的要素、すなわち：
−細胞膜がコレステロールを含有する非標的細胞、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するエンベロープを有するウイルス、及び
−場合によっては、コレステロールを含有するマイコプラズマ、及び
−場合によっては、目的微生物及び／又は非標的細胞のでプリ
を特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の目的の核酸の選択的単離のための方法であって、以下の工程：
ａ）コレステロールを含有する細胞膜、及び／又はコレステロールを含有するウイルスエンベロープ、及び／又はコレステロールを含有するマイコプラズマの膜を不安定化するために、液体生体試料をサポニン製剤と接触させること、
ｂ）非標的細胞を特異的に溶解するために非標的細胞の浸透圧衝撃を実施すること、
ｃ）試料中の溶液に溶解しない目的微生物を沈殿させるための薬剤を添加すること、及び
ｄ）試料中の溶液に溶解した非標的要素由来の遊離核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を溶解することができる少なくとも一の酵素の溶液を添加すること、
ｅ）工程（ｄ）で添加した酵素を不活化すること、
ｆ）目的微生物の以下の核酸：
●工程（ｄ）の酵素により分解されていない核酸、及び
●工程ａ）及びｂ）の作用により利用可能でない核酸を得ること
を含む、方法を包含する。
【００１７】
この最後に述べた方法の工程ｃ）は、工程ａ）及びｂ）の後、又は工程ｄ）の後に、工程ａ）とは独立に実施され得る。
【００１８】
また、第七の態様によれば、本発明は、少なくとも一の沈殿剤を添加することからなる、必要に応じて予めサポニンで処理された液体生体試料中の細菌及び真菌（好ましくは酵母）から選択される目的微生物の沈殿の改良された方法にも関する。
【００１９】
沈殿剤（複数可）を添加することにより、液体生体試料中に含有される微生物の沈殿効率を向上させることができる。
【００２０】
いずれの実施態様においても、単離の方法は、サポニンが等濃度で、試料と少なくとも同量かそれ以上の量であることを特徴とする。
【００２１】
サポニンの最終濃度は、０．０２％超及び２０％以下であり、好ましくは０．０５％から２０％、より好ましくは０．５から２０％であり、更により好ましくは０．０８から４％である。
【００２２】
非標的細胞を特異的に溶解するための非標的細胞の浸透圧衝撃は、工程ａ）に記載の通り、液体生体試料をサポニン製剤に接触させることに固有の性質である。本サポニン製剤は、大量に使用され、以下の効果を有する：
−コレステロールを含有する細胞膜、すなわち非標的細胞の膜を弱めるか又は不安定化し、同時に、
−非標的細胞の膨張及びその溶解につながる浸透圧をもたらす。
【００２３】
換言すれば、工程ａ）及びｂ）は、コレステロールを含有する非標的細胞の細胞膜、及びコレステロールを含有するウイルスエンベロープ、及びコレステロールを含有するマイコプラズマの膜を特異的に溶解するために液体生体試料をサポニン製剤と接触させることからなる一つの工程として書き換えることができる。
【００２４】
また、単離の方法は、サポニンがトリテルペノイドからなることを特徴とする。サポニンは、コレステロールを含有する膜又はエンベロープに対して特異的である。
【００２５】
本発明による、目的微生物を単離するための方法及び目的微生物の沈殿の改良された方法の文脈では、使用される沈殿剤は、ＰＥＧ、グリコーゲン、及び核酸（ＤＮＡ／ｔＲＮＡ等）から選択される。また、これらの混合物を使用することも可能である。
【００２６】
使用される沈殿剤は、好ましくはＰＥＧである。
【００２７】
目的微生物の核酸を単離するための方法の文脈では、沈殿剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなってもよい。
【００２８】
本発明の文脈で使用される沈殿剤の濃度は、０．１％から２０％、好ましくは１％から２０％である。
【００２９】
目的微生物の単離のための方法の最後で、その実施態様が何であれ、得られた培養液を目的微生物の更なる単離のために処理することが可能であり、それゆえ目的微生物の検出が可能となる。これは、一般的な細胞技術、例えば、細胞診手法（フローサイトメトリー他）、免疫学的手法（イムノアッセイによる検出のための抗体若しくはファージを用いた技術）又は古典的な細胞培養技術を使用してなされる。
【００３０】
したがって、得られた培養液を、一般的な培養のために適切な培地上、好ましくは、ペトリ皿中の固形培地上（例えば、栄養寒天培地）に、酵母のために少なくとも２４時間、例えば４８時間、酵母に適した温度、例えば３０℃、好ましくは３７℃で、又は目的微生物の増殖に適した任意の培地に適用することができる。また、微生物の増殖及びその後の個別／単離を可能にする、任意の既知の技術並びにプロトコールも使用され得る。
【００３１】
単離方法のいくつかの変形例によると、遊離核酸を溶解することができる酵素は、次いで、
●ＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡ及び／又はＤＴＴ及び／又はβ−メルカプトエタノール及び／又はＤＥＰＣ、及び／又はグアニジンを添加することにより化学的に、且つ／或いは
●ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤の存在下又は非存在下で、４０から１００℃の間に温度を上昇させることにより物理的に
不活化される酵素である。
【００３２】
本発明による単離方法が、試料中の溶液に溶解した非標的要素由来の遊離核酸ｉ（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を溶解することができる単一の酵素のみを含む場合、この酵素はＤＮａｓｅである。
【００３３】
遊離核酸を溶解することができる少なくとも一の酵素が添加される単離方法のいくつかの変形例によると、すなわち、用いられる該方法が沈殿剤の添加を含まない工程（ｃ）の間、又は該方法が沈殿剤の添加を含む工程（ｄ）の間、遊離核酸を溶解することができる酵素は、
●ＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡ及び／又はＤＴＴ及び／又はβ−メルカプトエタノール及び／又はＤＥＰＣ、及び／又はグアニジンを添加することにより化学的に、且つ／或いは
●ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤の存在下又は非存在下で、４０から１００℃の間に温度を上昇させることにより物理的に
不活化され得る酵素である。
【００３４】
沈殿剤を添加する工程と、試料中の溶液に溶解した非標的要素由来の遊離核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を溶解することができる少なくとも一の酵素を添加する工程とを含む、本発明による目的微生物及び目的微生物の核酸を単離するための方法において、これらの二つの工程は順序が定められておらず、該方法の実施では逆であってもよい。
【００３５】
遊離核酸を溶解することができる酵素を不活化する工程を含む、本発明による目的微生物の核酸を単離するための方法の文脈では、沈殿剤はこの不活化工程の後で添加されてもよい。
【００３６】
また、本発明は、液体生体試料、好ましくは血液中の目的微生物若しくは目的微生物の核酸を単離するための方法、又は目的微生物を沈殿させるための方法であって、該方法の間、
●ｐＨが５を下回る、好ましくは６を下回れば、塩基性
●ｐＨ１０を上回る、好ましくは９を上回れば、酸性
の溶液を添加することにより、ｐＨが５から１０、好ましくは６から９の範囲に維持され、そのためｐＨが前記範囲内にあることを特徴とする、方法に関する。
【００３７】
使用の変形例によれば、本発明は、０．０２％超及び２０％以下、好ましくは０．０５％超及び２０％以下の最終濃度をもたらすサポニン製剤、及び／又は０．１から２０％、好ましくは０．１から４％、更により好ましくは０．５から４％の濃度の沈殿剤、及び／又は５００から２００００酵素単位を含有する遊離核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を溶解することができる酵素を使用する。
【００３８】
別の態様によれば、本発明は、液体生体試料中の目的微生物の単離又は目的微生物の核酸の単離のための、サポニン製剤の使用、及び遊離核酸ｉ（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を溶解することができる少なくとも一の酵素の溶液の使用、並びに、場合によっては、好ましくはＰＥＧ、グリコーゲン及び核酸（好ましくはＤＮＡ、ｔＲＮＡ）から選択される少なくとも一の沈殿剤の使用を包含する。
【００３９】
別の態様によれば、本発明は、必要であれば事前にサポニンで処理した液体生体試料中の目的微生物、好ましくは細菌及び真菌（好ましくは酵母）の沈殿のためのＰＥＧの使用を包含する。
【００４０】
本発明は、目的微生物を単離するための上述の方法、又は目的微生物の単離のための上述の使用、又は微生物の上述の沈殿方法に基づく診断検査に更に関する。
【００４１】
また、本発明は、目的微生物の核酸を単離するための上述の方法、又は目的微生物の核酸の単離のための上述の使用に基づく診断検査にも関する。
【００４２】
診断は、例えば、微生物学で使用される古典的な検出技術、イムノアッセイ技術又はＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ等の古典的な生物学的技術を用い、当業者に知られている一般的な技術により実施され得る。
【００４３】
また、本発明は、目的微生物、非標的細胞、並びに、場合によっては、エンベロープを有するウイルス、マイコプラズマ及び／又は目的微生物及び／若しくは非標的細胞のデブリを特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の目的微生物を単離するための診断キットであって、
（ａ）容器と
（ｂ）少なくとも一のサポニン製剤と、
（ｃ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の、少なくとも一の沈殿剤の溶液と
を含む、キットにも関する。
【００４４】
最後に、本発明は、目的微生物、非標的細胞、並びに、場合によっては、エンベロープウイルス、マイコプラズマ及び／又は目的微生物及び／若しくは非標的細胞のデブリを特に含むか又は含む可能性のある液体生体試料中の目的微生物の核酸を単離するための診断キットであって、
（ａ）容器と、
（ｂ）少なくとも一のサポニン製剤と、
（ｃ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の、少なくとも一の沈殿剤の溶液と
を含む、キットに関する。
【００４５】
上記の二つのキットは、（ｄ）核酸を溶解することができる少なくとも一の酵素の、少なくとも一の溶液を更に含み得る。
【００４６】
前記キットは、
（ｃ）又は（ｄ’）少なくとも一の酸性溶液及び／又は少なくとも一の塩基性溶液、並びに／或いは
（ｄ）ＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡ及び／又はＤＴＴ及び／又はβ−メルカプトエタノール及び／又はＤＥＰＣ、及び／又はグアニジン、並びに／或いは
（ｅ）少なくとも一の界面活性剤又は陰イオン剤
を更に含む。
【００４７】
本明細書において、核酸の溶解を可能にする酵素（単数又は複数）は、ＤＮＡｓｅ  Ｉ、ＲＮＡｓｅＩｆ等、当業者に知られ且つ一般的に使用されている酵素であり、目的微生物の核酸を利用可能にすることからなる工程は、例えば、機械的溶解、次いで核酸の精製及びＰＣＲ増幅又は他の任意の既知の技術のような、当業者に知られている一般的な方法で実施される。
【００４８】
本特許出願の残りの部分において、使用される用語の定義は以下の通りである：
−「ウイルスエンベロープ」とは、コレステロールを含有しないカプシドウイルスのカプシドと対照的に、コレステロールを含有するエンベロープウイルスのエンベロープを意味する。したがって、ウイルスエンベロープはサポニン感受性である。
−「細胞膜及び／又はウイルスエンベロープ及び／又はマイコプラズマの膜を不安定化する」とは、膜レベル及び／又はウイルスエンベロープのレベル及び／又はマイコプラズマの膜のレベルでの浸透圧の調節低下、膜輸送の阻害、並びに細胞膜、マイコプラズマの膜、ウイルスエンベロープのレベルでのポア出現の可能性につながる物理化学的機序を意味する。
−用語「目的微生物」とは、特にヒトにとって病原性の可能性がある、利用可能なコレステロールを含有しないすべての微生物を含む。これらの微生物は、ウイルス（エンベロープウイルスを除く）、細菌、真菌（酵母）、また微細な動物をも含む。
−「目的の核酸」は、上に定義された「目的微生物」の細胞又は粒子に含まれる核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）に相当する。
−「非標的細胞」とは、上に定義された「目的の核酸」を含まない生存生物のすべての細胞として理解されるべきである。
−「ＥＤＴＡ」という略称は、エチレンジアミン四酢酸に相当する。
−「ＥＧＴＡ」という略称は、エチレングリコール四酢酸に相当する。
−「ＤＴＴ」という略称は、ジチオスレイトールに相当する。
−「ＤＥＰＣ」とう略称は、ジエチルピロカルボネートに相当する。
−ＣＦＵは、コロニー形成単位の略である。
−用語「界面活性剤」は、他の分子の物理化学的修飾を誘導し得る分子のすべてのクラスを意味する。これらの界面活性剤は、例えば、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｂｒｉｊ９７等の化学的性質のものであってもよく、又は酵素のものであってもよい。
−「液体生体試料」とは、次の群から選択される、「目的微生物」を含有する液体試料として理解されるべきである：羊膜液、房水、胆汁、血液、乳腺分泌物、気管支肺胞洗浄液、脳脊髄液、乳糜、糜粥、糞便、間質液、リンパ液、月経液、粘液、血漿、胸膜液、膿、唾液、皮脂、精液、血清、痰、汗、滑液、涙、尿、硝子体液。
【００４９】
更に、上記の目的の核酸を選択的に単離するための方法及びその使用は、目的の核酸が目的微生物の細胞又は粒子に含まれる核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）に相当する程度に、目的微生物の単離を可能にすることが明らかでなければならない。換言すれば、目的の核酸の選択的単離は、目的の核酸が由来する目的微生物の単離を可能にする。
【実施例】
【００５０】
添付の実施例は、本発明による方法の有効性を実証するために提示されており、例示の目的のために示されており、網羅的ではない。
【００５１】
実施例１：４％サポニン溶液で処理した全血１０ｍＬ中の緑膿菌５及び１０ＣＦＵの検出
５０ｍＬのプラスチック試験管中、ＥＤＴＡで処理した全血２０ｍＬに２０、１０、２及び０（陰性コントロール）ＣＦＵの緑膿菌を接種した。血液中に挿入されたＣＦＵの数は、ペトリ皿中の寒天培地にストリークすることにより確認された。接種した２０ｍＬの血液を二つに分け、各１０ｍＬを５０ｍＬのプラスチック試験管二本に入れて二つ組とした。濾過した４％サポニン溶液４０ミリリットル、ｐＨ８．０で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、及び４％のＰＥＧ−８０００を、接種した血液に添加した。試験管を二回反転させることにより攪拌し、室温で５分間インキュベートし、１２０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットの剥離を防止する１５ｍＬの４％ＰＥＧ−８０００で付着しているペレットを三回洗浄した。ｐＨ７．５で１０ｍＭのトリス−ＨＣｌを２００μＬ、該ペレットに添加した。
【００５２】
次に、１０μＬのＤＮＡｓｅ  Ｉ（５００μ／μｌ；Ｒｏｃｈｅ）及び２μＬのＲＮＡｓｅ  Ｉｆ（５０μ／μＬ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を前記試験管に入れた。ペレットを酵素で１０分間分解し、インキュベーションの２分後と４分後の二回、ボルテックスにより撹拌した。ヌクレアーゼでの分解後、ｐＨ８．０、０．５ＭのＥＤＴＡ１０μＬを前記試験管に添加した。試料を、直径１ｍｍのガラスビーズ２００ｍｇと直径０．１ｍｍのジルコニウムビーズ５０ｍｇが入った容量１．５ｍＬのマイクロチューブに移した。該マイクロチューブを８０℃で１０分間温めた。次いで、２０μＬのプロテイナーゼＫ（Ｎｏｖａｇｅｎ）と４０μＬの１０％ＳＤＳを該チューブに添加した。該マイクロチューブを室温で５分間インキュベートし、８０℃で５分間加熱した。
【００５３】
シュードモナス細胞の機械的溶解は、ビーズが入っている該チューブをボルテックスを用いて２０分間撹拌することにより実施された。溶解上清中に存在するＤＮＡは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ製Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｂｌｏｏｄ（登録商標）キットを用いて精製された。定量的ＰＣＲ増幅は溶出液全量すなわち４０μｌを用いて実施された。以下の表１で明らかなように、緑膿菌５ＣＦＵの試料は、本発明の方法によりレプリカ上でよく検出され、挿入された１ＣＦＵについては二つのうち一つのレプリカの部分検出であった：
2019068818.tif 000002
表Ｉ：本発明による方法を用いた緑膿菌の検出限界評価
【００５４】
実施例２：４％サポニン溶液で処理した全血１０ｍＬ中のカンジダ・アルビカンス２８及び１４０ＣＦＵの検出
５０ｍＬのプラスチック試験管中、ＥＤＴＡで処理した全血２０ｍＬに１４０、２８及び０（陰性コントロール）ＣＦＵのカンジダ・アルビカンスを接種した。血液中に挿入されたＣＦＵの数は、ペトリ皿中の寒天培地にストリークすることにより確認された。接種した２０ｍＬの血液を二つに分け、各１０ｍＬを５０ｍＬのプラスチック試験管二本に入れて二つ組とした。濾過した４％サポニン溶液４０ミリリットル、ｐＨ８．０で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、及び４％のＰＥＧ−８０００を、接種した血液に添加した。試験管を二回反転させることにより攪拌し、室温で５分間インキュベートし、１２０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットの剥離を防止する１５ｍＬの４％ＰＥＧ−８０００でペレットを三回洗浄した。ｐＨ７．５で１０ｍＭのトリス−ＨＣｌを２００μＬ、該ペレットに添加した。次に、１０μＬのＤＮＡｓｅ  Ｉ（５００μ／μｌ；Ｒｏｃｈｅ）及び２μＬのＲＮＡｓｅ  Ｉｆ（５０μ／μＬ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を前記試験管に入れた。ペレットを酵素で１０分間分解し、インキュベーションの２分後と４分後の二回、ボルテックスにより撹拌した。ヌクレアーゼでの分解後、ｐＨ８．０、０．５ＭのＥＤＴＡ１０μＬ、１０％ＳＤＳ４０μｌ、及びプロテイナーゼＫ２０μＬを前記試験管に添加した。試料を、直径１ｍｍのガラスビーズ２００ｍｇと直径０．１ｍｍのジルコニウムビーズ５０ｍｇが入った容量１．５ｍＬのマイクロチューブに移した。該マイクロチューブを８０℃で６０分間加熱した。カンジダ・アルビカンス細胞の機械的溶解は、ボルテックスを用いてビーズを２０分間撹拌することにより実施された。溶解上清中に存在するＤＮＡは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ製Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｂｌｏｏｄ（登録商標）キットを用いて精製され、二度目はＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ製ｇＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ＸＳ（登録商標）キットを用いて精製された。定量的ＰＣＲ増幅は溶出液全量すなわち４０μｌを用いて実施された。以下の表２で明らかなように、本発明の方法によりカンジダ・アルビカンス２８ＣＦＵの試料はレプリカ上で検出された：
2019068818.tif 000003
表２：本発明による方法を用いたカンジダ・アルビカンスの検出
【００５５】
実施例３：４％サポニン溶液で処理した全血１０ｍＬ中の２００００ビリオンのヒトアデノウイルス５の検出
５０ｍＬのプラスチック試験管中、ＥＤＴＡで処理した全血１０ｍＬに、２００００ビリオンのヒトアデノウイルス５を接種した。ｐＨ８．０で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、及び４％のＰＥＧ−８０００と共に濾過した４％サポニン溶液４０ミリリットルを、接種した血液に添加した。試験管を二回反転させることにより攪拌し、室温で５分間インキュベートし、１２０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットの剥離を防止する１５ｍＬの４％ＰＥＧ−８０００でペレットを三回洗浄した。ｐＨ７．５で１０ｍＭのトリス−ＨＣｌを２００μＬ、該ペレットに添加した。次に、１０μＬのＤＮＡｓｅ  Ｉ（５００μ／μｌ；Ｒｏｃｈｅ）及び２μＬのＲＮＡｓｅ  Ｉｆ（５０μ／μＬ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を前記試験管に入れた。ペレットを酵素で１０分間分解し、インキュベーションの２分後と４分後の二回、ボルテックスにより撹拌した。ヌクレアーゼでの分解後、ｐＨ８．０、０．５ＭのＥＤＴＡ１０μＬ及び１０％ＳＤＳ４０μｌを前記試験管に添加した。試料を、直径１ｍｍのガラスビーズ２００ｍｇと直径０．１ｍｍのジルコニウムビーズ５０ｍｇが入った容量１．５ｍＬのマイクロチューブに移した。該マイクロチューブを８０℃で１０分間加熱した。ウイルス粒子の機械的溶解は、ビーズが入っている該チューブをボルテックスを用いて２０分間撹拌することにより実施された。溶解上清中に存在するＤＮＡは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ製Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｂｌｏｏｄ（登録商標）キットを用いて精製された。核酸が４０μｌで溶出された。定量的ＰＣＲ増幅が、溶出液１０μｌを用いて実施された。以下の表３の通り、２００００ビリオンが本発明の方法によってよく検出された：
2019068818.tif 000004
表３：本発明の方法によるヒトアデノウイルス５の検出限界評価
【００５６】
実施例４：様々な濃度のサポニンを用いたヒト血液細胞の溶解の有効性
５０ｍＬのプラスチック試験管中、ＥＤＴＡで処理した全血１０ｍＬに２４及び０（陰性コントロール）ＣＦＵの緑膿菌を接種した。血液中に挿入されたＣＦＵの数は、ペトリ皿中の寒天培地にストリークすることにより確認された。濾過したサポニン溶液４０ミリリットル、ｐＨ８．０で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、及び４％のＰＥＧ−８０００を、接種した血液に添加した。サポニンの最終濃度は０．００５％、０．０２％、０．０８％及び０．４％であった。各濃度を二重に試験した。試験管を三回反転させることにより攪拌し、室温で１０分間インキュベートし、１２０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットの剥離を防止する１５ｍＬの４％ＰＥＧ−８０００で付着しているペレットを三回洗浄した。ｐＨ７．５で１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、ＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）５０００μ、ＲＮＡｓｅ  Ｉｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）１００μを４００μＬ、該ペレットに添加した。ペレットを、９０分間撹拌しながら３２℃でインキュベートした。試料を、ｐＨ８．０で０．５ＭのＥＤＴＡ１０μＬとｂｕｆｆｅｒ  Ｂ３（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）４００μｌが入ったマイクロチューブに移した。該マイクロチューブを１０分間８０℃で加熱し、次いで氷中で５分間冷却した。リジンを５μｇ、該チューブに添加した。該マイクロチューブを更に１０分間氷中でインキュベートし、次いで、供給業者の条件に従って、但しプロテイナーゼＫとエタノールの比率は保ちつつ量を二倍にして、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅ製Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｂｌｏｏｄ（登録商標）キットを用いて処理した。定量的ＰＣＲ増幅を、ヒトＤＮＡを検出するために溶出液２μｌ、及び緑膿菌のＤＮＡを検出するためにＰＣＲ用の３８μＬを用いて実施した。
【００５７】
殆どのマイクロチューブは緑膿菌に対して陽性であった（０．４％サポニンで処理した非接種血液である陰性コントロールは、当然陰性）。本実施例は、濃度が０．４％よりかなり低いサポニンで緑膿菌を検出することが可能であることを示す。
【００５８】
最終濃度が０．０８％以上のサポニンでの増幅では、ヒトＤＮＡ又は極微量のヒトＤＮＡも検出することに成功しなかった（表４）。対照的に、最終濃度が０．０２％以下のサポニンでは、検出されたヒトＤＮＡの量が非常に多かった（約２８Ｃｑ）。これは、白血球が、サポニンの最終濃度が０．０８％又は０．４％では非常によく溶解するのに対し、０．０２％以下ではもはや完全に溶解されないことを証明する。
【００５９】
2019068818.tif 000005
表４：ヒト白血球の溶解評価
【００６０】
実施例５：０．４％サポニン溶液で処理した全血１０ｍＬ中の緑膿菌２１ＣＦＵの検出
５０ｍＬのプラスチック試験管中、ＥＤＴＡで処理した全血１０ｍＬに２１（試験管５本）及び０（陰性コントロール、試験管１本）ＣＦＵの緑膿菌を接種した。血液中に挿入されたＣＦＵの数は、ペトリ皿中の寒天培地にストリークすることにより確認された。濾過した０．４％サポニン溶液４０ミリリットル、ｐＨ８．０で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、及び４％のＰＥＧ−８０００を、接種した血液に添加した。試験管を三回反転させることにより攪拌し、室温で１０分間インキュベートし、１２０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットの剥離を防止する１５ｍＬの４％ＰＥＧ−８０００で付着しているペレットを三回洗浄した。ｐＨ７．５で１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、ＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）５０００μ、ＲＮＡｓｅ  Ｉｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）１００μを８００μＬ、該ペレットに添加した。ペレットを、９０分間撹拌しながら３２℃でインキュベートした。ｐＨ８．０で０．５ＭのＥＤＴＡを１０μＬ及びｂｕｆｆｅｒ  Ｂ３（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を４００μｌ添加し、次いで前記試験管を１０分間８０℃で加熱し、次いで５分間氷中で冷却した。リジンを５μｇ、前記試験管に添加した。前記試験管を更に１０分間氷中でインキュベートし、次いで、供給業者の条件に従って、但しプロテイナーゼＫとエタノールの比率は保ちつつ量を四倍にして、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅ製Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｂｌｏｏｄ（登録商標）キットを用いて処理した。定量的ＰＣＲ増幅を、ヒトＤＮＡを検出するために溶出液２μｌ、及び緑膿菌のＤＮＡを検出するためにＰＣＲ用の３８μＬを用いて実施した。
【００６１】
2019068818.tif 000006
表５：緑膿菌のＤＮＡ検出のための定量的ＰＣＲ
【００６２】
実施例６：４％サポニンで処理した全血１０ｍＬから開始の固形培地で１１７ＣＦＵのカンジダ・アルビカンス培養による検出
５０ｍＬのプラスチック試験管中、ＥＤＴＡで処理した全血１０ｍＬに、１１７ＣＦＵのカンジダ・アルビカンスを接種した。血液中に挿入されたＣＦＵの数は、ペトリ皿中の寒天培地にストリークすることにより確認された。濾過した４％サポニン溶液４０ミリリットル、ｐＨ８．０で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、及び４％のＰＥＧ−８０００を、接種した血液に添加した。試験管を二回反転させることにより攪拌し、室温で５分間インキュベートし、１２０００ｇで１０分間遠心分離した。得られたペレットを、２１２μｌのトリプトン塩（ＡＥＳ）又は２１２μｌのヌクレアーゼ混合液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５のトリス；ＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）５０００μ；ＲＮＡｓｅ  Ｉｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）１００ｕ）で再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートし、次いでペトリ皿ＳＤＣ中の固形培地（ｂｉｏＭeｒｉｅｕｘ）にストリークした。次いで、３０℃で４８時間インキュベートした後、コロニー数を計数した。
【００６３】
表６は、ヌクレアーゼ処理の有無にかかわらず、平均で６６％のＣＦＵが検出されたことを示す。
【００６４】
2019068818.tif 000007
表６：４％サポニン溶液で処理後のカンジダ・アルビカンスのペトリ皿コロニーの計数
【００６５】
実施例７：血液中に存在する緑膿菌の遠心分離による沈殿に対するＰＥＧの促進効果
ＥＤＴＡで処理した全血２００μｌを１．５ｍＬのプラスチック試験管に分配した。１０ｍＭのＭｇＣｌ２１ｍＬ、又は最終４％のＰＥＧを補充したＭｇＣｌ２１ｍＬを該試験管に添加した。次に、１２９ＣＦＵの緑膿菌をこれらの試験管に接種した。該試験管を５秒間ボルテックスし、次いで５０００ｇで１０分間遠心分離した。次いでペレットをトリプトン塩１００μｌで再懸濁させ、次いでペトリ皿ＴＳＡ（ｂｉｏＭeｒｉｅｕｘ）中の固形培地にストリークした。該ペトリ皿を３７℃で２４時間インキュベートし、計数した。
【００６６】
ＰＥＧの添加は、沈殿収率の２３．５％改善に寄与した（表７）。
【００６７】
2019068818.tif 000008
表７：ＰＥＧの有無にかかわらず遠心分離した後の緑膿菌のペトリ皿コロニーの計数
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月7日(2019.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2019068818000001.pdf