(57)【要約】【課題】標的に対して選択的に物質を送達することができる物質送達担体としての、ｐＨ環境応答性かつ温度応答性のポリマーの提供。【解決手段】繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）を含み、ｐＨ７．４における下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）は３７℃以上であり、繰り返し単位（ＩＩ）中のＲ3が除去されることによってＬＣＳＴが低下する、温度応答性ポリマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式で表される繰り返し単位（Ｉ）：
【化１】
2019085438.tif 000047
［式中、Ｒ1はそれぞれ独立して、水素又はメチル基である］
と、以下の式で表される繰り返し単位（ＩＩ）：
【化２】
2019085438.tif 000048
［式中、
Ｒ2はそれぞれ独立して、水素又はメチル基であり、
Ｒ3は、それぞれ独立して、温度３７℃、ｐＨ７．０未満の水溶液中で除去可能であってかつ少なくとも１つの陰イオン性基を含む基である］
とを含む、温度応答性ポリマーであって、
ｐＨ７．４における下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）は３７℃以上であり、
Ｒ3が除去されることによってＬＣＳＴが低下する、
温度応答性ポリマー。
【請求項２】
Ｒ1及びＲ2は水素である、請求項１に記載の温度応答性ポリマー。
【請求項３】
Ｒ3は、温度３７℃、ｐＨ５．５以上７．０未満の水溶液中で除去可能な基である、請求項１又は２に記載の温度応答性ポリマー。
【請求項４】
Ｒ3は、それぞれ独立して以下：
【化３】
2019085438.tif 000049
［式中、矢印はＮＨ基への結合を示す］
からなる群から選択される基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の温度応答性ポリマー。
【請求項５】
繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）の合計（１００モル％）に対する繰り返し単位（ＩＩ）の割合が１０モル％以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の温度応答性ポリマー。
【請求項６】
少なくとも一種の、検出可能な標識又は医薬を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の温度応答性ポリマー。
【請求項７】
前記検出可能な標識が、蛍光標識、発光標識、造影剤、金属原子、１種又は２種以上の金属原子を含む化合物、放射性同位体、１種又は２種以上の放射性同位体を含む化合物、ナノ粒子、又はリポソームである、請求項６に記載の温度応答性ポリマー。
【請求項８】
前記医薬が抗癌剤である、請求項７に記載の温度応答性ポリマー。
【請求項９】
以下の式（３）：
【化４】
2019085438.tif 000050
［式中、
Ｌ1及びＬ2はリンカーであるか、又は存在せず、
Ｒ3は、それぞれ独立して以下：
【化５】
2019085438.tif 000051
［式中、矢印はＮＨ基への結合を示す］
からなる群から選択される基であり、
Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、チオール基、アジド基、検出可能な標識又は医薬であり、
ｍ＝１０〜３０００であり、
ｎ＝１〜３００であり、
ｍ＋ｎに対するｎの割合が１０％以下であり、
各繰り返し単位の順序は任意である］
で表される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の温度応答性ポリマー。
【請求項１０】
一部又は全てのＲ3が除去された後の温度応答性ポリマーのＬＣＳＴは３７℃未満となる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の温度応答性ポリマー。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の温度応答性ポリマーを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度応答性ポリマー及びそれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）
近年、正常組織に分布することなく、標的に対して選択的に薬物を送達することができるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に関する研究が盛んに行われている。
【０００３】
環境応答性ＤＤＳとして、低ｐＨ環境で応答するＤＤＳが知られている。正常組織周辺のｐＨ（約７．４）と比較して、癌組織周辺のｐＨ（６．５〜６．８）は低い。また、細胞はエンドサイト―シスによって細胞外の物質を取り込んでいるが、細胞内の後期エンドソーム及びリソソームは、ｐＨ５．５〜６．０の酸性環境となっている。したがって、低ｐＨ環境に応答して機能発現するＤＤＳは、癌細胞に対して選択的に薬効を発現することができると考えられる。非特許文献１及び２は、ヒドラジド基とアドリアマイシンのＣ−１３位のカルボニル基との間で形成されるシッフ塩基（ヒドラゾン結合）を介してドキソルビシンを安定に内包したｐＨ応答型高分子ミセルを開示している。ヒドラゾン結合は、正常組織周辺のｐＨでは安定であるが、癌組織及び癌細胞内の酸性環境下では解離するために、癌組織内で効率的にドキソルビシンを放出することができる。
【０００４】
２．温度応答性ポリマー
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）は、温度応答性を示すバイオマテリアルとして最も広く利用されているポリマーの１つである。ＰＮＩＰＡＭは、約３２℃の下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を有し、ＬＣＳＴ未満の温度では水溶性であるが、ＬＣＳＴ以上の温度では水不溶性となる。
【０００５】
非特許文献３は、ｐＨに依存してＬＣＳＴが変化する温度応答性ポリマーを開示している。当該文献中で調製されたＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）とアクリル酸（ＡＡ）との共重合体（Ｐ（ＰＮＩＰＡＭ−ｃｏ−ＡＡ））は、ｐＨ４．０では３７℃以上のＬＣＳＴを有するが、ｐＨ３．０ではＬＣＳＴが約３３℃まで急激に低下する。また、当該文献中で調製されたＮＩＰＡＭとβ−メチルアクリル酸（ＭＡＡ）との共重合体（Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ｃｏ−ＭＡＡ））は、ｐＨ７〜３の範囲でＬＣＳＴが約３５．５℃〜約３２．５℃へと緩やかに変化する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Younsoo Bae. et al, Angew Chem Int Ed, 2003, Vol. 42, pp. 4690-4643
【非特許文献２】Younsoo Bae. et al, Bioconjugate Chem, 2005, 16 (1), pp. 122-130
【非特許文献３】Xiaoye Gao, et al, J. Mater. Chem. B, 2013, 1, pp. 5578-5587
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、標的に対して選択的に物質（例えば医薬）を送達可能な物質送達担体として使用できる、ｐＨ環境応答性かつ温度応答性のポリマーを提供することを目的とする。特に、通常の生体内体液のｐＨ（生理的ｐＨ：約７．４）において水溶性（親水性）であるが、標的部位のｐＨ（例えば腫瘍組織周辺ではｐＨ６．５〜６．８）においては水不溶性（疎水性）となって当該標的部位に分布するような温度応答性ポリマーを提供することを目的とする。
【０００８】
ＰＮＩＰＡＭは生体内温度（約３７℃）において水不溶性であるため、物質送達担体として使用することは困難である。
【０００９】
非特許文献３に開示されているＰ（ＮＩＰＡＭ−ｃｏ−ＡＡ）は、ｐＨ３〜４という生体環境とはかけ離れた条件でＬＣＳＴを変化させるため、物質送達担体としての利用に適していない。また、非特許文献３に開示されているＰ（ＮＩＰＡＭ−ｃｏ−ＭＡＡ）は、例えば生理的ｐＨ（７．４）から腫瘍組織周辺のｐＨ（６．５〜６．８）へのｐＨ変化に鋭敏に応答することができない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討した結果、ポリ（Ｎ−イシプロピルアクリルアミド／２−アミノイソプロピルアクリルアミド）共重合体（Ｐ（ＮＩＰＡＭ／ＡＩＰＡＭ））を基本骨格とし、その側鎖のアミノ基に、陰イオン性基を含みかつ酸性条件下で除去可能な基を結合させることで上記課題を解決できることを見出し、本発明に至った。
【００１１】
本発明は、以下の［１］〜［１６］を包含する。
［１］
以下の式で表される繰り返し単位（Ｉ）：
【化１】
2019085438.tif 000002
［式中、Ｒ1はそれぞれ独立して、水素又はメチル基である］
と、以下の式で表される繰り返し単位（ＩＩ）：
【化２】
2019085438.tif 000003
［式中、
Ｒ2はそれぞれ独立して、水素又はメチル基であり、
Ｒ3は、それぞれ独立して、温度３７℃、ｐＨ７．０未満の水溶液中で除去可能であってかつ少なくとも１つの陰イオン性基を含む基である］
とを含む、温度応答性ポリマーであって、
ｐＨ７．４における下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）は３７℃以上であり、
Ｒ3が除去されることによってＬＣＳＴが低下する、
温度応答性ポリマー。
［２］
Ｒ1及びＲ2は水素である、［１］に記載の温度応答性ポリマー。
［３］
Ｒ3は、温度３７℃、ｐＨ５．５以上７．０未満の水溶液中で除去可能な基である、［１］又は［２］に記載の温度応答性ポリマー。
［４］
Ｒ3は、それぞれ独立して以下：
【化３】
2019085438.tif 000004
［式中、矢印はＮＨ基への結合を示す］
からなる群から選択される基である、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の温度応答性ポリマー。
［５］
繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）の合計（１００モル％）に対する繰り返し単位（ＩＩ）の割合が１０モル％以下である、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の温度応答性ポリマー。
［６］
少なくとも一種の、検出可能な標識又は医薬を含む、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の温度応答性ポリマー。
［７］
前記検出可能な標識が、蛍光標識、発光標識、造影剤、金属原子、１種又は２種以上の金属原子を含む化合物、放射性同位体、１種又は２種以上の放射性同位体を含む化合物、ナノ粒子、又はリポソームである、［６］に記載の温度応答性ポリマー。
［８］
前記医薬が抗癌剤である、［７］に記載の温度応答性ポリマー。
［９］
以下の式（３）：
【化４】
2019085438.tif 000005
［式中、
Ｌ1及びＬ2はリンカーであるか、又は存在せず、
Ｒ3は、それぞれ独立して以下：
【化５】
2019085438.tif 000006
［式中、矢印はＮＨ基への結合を示す］
からなる群から選択される基であり、
Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、チオール基、アジド基、検出可能な標識又は医薬であり、
ｍ＝１０〜３０００であり、
ｎ＝１〜３００であり、
ｍ＋ｎに対するｎの割合が１０％以下であり、
各繰り返し単位の順序は任意である］
で表される、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の温度応答性ポリマー。
［１０］
一部又は全てのＲ3が除去された後の温度応答性ポリマーのＬＣＳＴは３７℃未満となる、［１］〜［９］のいずれか１つに記載の温度応答性ポリマー。
［１１］
［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の温度応答性ポリマーを含む、組成物。
［１２］
それを必要とする対象に、有効量の［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の温度応答性ポリマーを投与することを含む、疾患（例えば癌）の診断又は検出方法であって、ここで前記温度応答性ポリマーは少なくとも１つの検出可能な標識を含む、前記方法。
［１３］
疾患（例えば癌）を診断又は検出するための、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の温度応答性ポリマーであって、ここで前記温度応答性ポリマーは少なくとも１つの検出可能な標識を含む、前記温度応答性ポリマー。
［１４］
疾患（例えば癌）を診断又は検出するための医薬の製造のための、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の温度応答性ポリマーの使用であって、ここで前記温度応答性ポリマーは少なくとも１つの検出可能な標識を含む、前記使用。
［１５］
それを必要とする対象に、有効量の［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の温度応答性ポリマーを投与することを含む、疾患（例えば癌）の治療方法であって、前記温度応答性ポリマーは少なくとも１つの医薬(例えば抗癌剤）を含む、前記方法。
［１６］
疾患（例えば癌）を治療するための［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の温度応答性ポリマーであって、少なくとも１つの医薬(例えば抗癌剤）を含む、前記温度応答性ポリマー。
［１７］
疾患（例えば癌）を治療するための医薬の製造のための、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の温度応答性ポリマーの使用であって、ここで前記温度応答性ポリマーは、少なくとも１つの医薬(例えば抗癌剤）を含む、前記使用。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の温度応答性ポリマーを使用することで、生体内の標的組織又は細胞に対して選択的に物質（例えば医薬）を送達することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中での、Ｐ［ＮＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ］のＬＣＳＴプロファイルを示す。
【図２】図２は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中でのＰ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ］、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中でのＰ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、及びＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中でインキュベーションした後のＰ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］のＬＣＳＴプロファイルを示す。
【図３】図３は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中でのＰ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ］、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中でのＰ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、及びＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中でインキュベーションした後のＰ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］のＬＣＳＴプロファイルを示す。
【図４】図４は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中でのＰ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ］、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中でのＰ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、及びＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中でインキュベーションした後のＰ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］のＬＣＳＴプロファイルを示す。
【図５】図５は、ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．８、７．４でインキュベーションした後における、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］のＬＣＳＴを示す。
【図６】図６は、ｐＨ７．４及び６．０における、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ］、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｂ］及びＤ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］の細胞内取り込み量の評価結果を示す。図中の［相対細胞内取込量］は、［フローサイトメーターで測定された細胞の蛍光強度］を［蛍光分光光度計で測定されたポリマー溶液の蛍光強度］で割った値である。
【図７】図７は、ｐＨ７．４及び６．０における、Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ］、Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］、Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］及びＤ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］の細胞内取り込み量の評価結果を示す。図中の［相対細胞内取込量］は、［ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで測定された細胞溶解液の蛍光強度］を［蛍光分光光度計で測定されたポリマー溶液の蛍光強度］で割った値である。
【図８】図８は、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］の細胞への取り込みを示す共焦点レーザー走査型顕微鏡像である。青：細胞核（Hoechst）、赤：リソソーム（LysoTracker Red DND-99（登録商標））、緑：Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］（Alexa Fluor（登録商標）488）、レンズ倍率：40倍。
【図９】図９は、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ］及びＤ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］の腫瘍集積量の評価結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、「Ｃ1-10アルキル基」とは、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基である。Ｃ1-10アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基及びそれらの異性体が挙げられる。
【００１５】
本明細書において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。
【００１６】
本明細書において、「ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基」は、上記「Ｃ1-10アルキル基」中の置換可能な水素原子が、１個以上の、例えば１〜５個のハロゲン原子で置換された「Ｃ1-10アルキル基」を含む。具体的には、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、３，３，３−トリフルオロプロピル、４−フルオロブチル、４，４，４−トリフルオロブチルなどが挙げられる。
【００１７】
本明細書において、「Ｃ1-40アルキレン基」とは、炭素数１〜４０の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキレン基のことである。具体的には例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、へキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デシレン基、ウンデシレン基、ドデシレン基、トリデシレン基、テトラデシレン基、ペンタデシレン基、ヘキサデシレン基、ヘプタデシレン基、オクタデシレン基、ノナデシレン基、イコサニレン基、ヘンイコサニレン基、ドコサニレン基、トリコサニレン基、テトラコサニレン基、ペンタコサニレン基、ヘキサコサニレン基、ヘプタコサニレン基、オクタコサニレン基、ノナコサニレン基、トリアコンタニレン基、ヘントリアコンタニレン、ドトリアコンタニレン基、トリトリアコンタニレン基、テトラトリアコンタニレン基、ペンタトリアコンタニレン基、ヘキサトリアコンタニレン基、ヘプタトリアコンタニレン基、オクタトリアコンタニレン基、ノナトリアコンタニレン基、テトラコンタニレン基及びそれらの異性体が挙げられる。
【００１８】
本明細書において、「Ｃ1-10アルキレン基」とは、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキレン基のことである。具体的には例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、へキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デカレン基及びそれらの異性体が挙げられる。
【００１９】
本明細書において、「Ｃ6-14アリーレン基」とは、炭素数が６〜１４の芳香族炭素環からなる２価の基であって、例えばフェニレン基、ナフチレン基、アントラセニレン基などが挙げられる。
【００２０】
本明細書において、「５〜１０員のヘテロアリーレン基」とは、５〜１０員の芳香族ヘテロ環からなる２価の基であって、当該芳香族ヘテロ環としては、例えばピロール環、インドール環、チオフェン環、ベンゾチオフェン環、フラン環、ベンゾフラン環、ピリジン環、キノリン環、イソキノリン環、チアゾール環、ベンゾチアゾール環、イソチアゾール環、ベンゾイソチアゾール環、ピラゾール環、インダゾール環、オキサゾール環、ベンゾオキサゾール環、イソキサゾール環、ベンゾイソキサゾール環、イミダゾール環、ベンゾイミダゾール環、トリアゾール環、ベンゾトリアゾール環、ピリミジン環、ウリジン環、ピラジン環、ピリダジン環などが挙げられる。
【００２１】
本明細書において、「オキソ基」とは、それが結合する炭素原子と一緒になってカルボニル基を形成する基のことである。
【００２２】
本発明の一態様は、以下の式で表される繰り返し単位（Ｉ）：
【化６】
2019085438.tif 000007
［式中、Ｒ1はそれぞれ独立して、水素又はメチル基であり、好ましくは水素である］
と、以下の式で表される繰り返し単位（ＩＩ）：
【化７】
2019085438.tif 000008
［式中、
Ｒ2はそれぞれ独立して、水素又はメチル基であり、好ましくは水素であり、
Ｒ3は、それぞれ独立して、温度３７℃、ｐＨ７．０未満の水溶液中で除去可能であってかつ少なくとも１つの陰イオン性基を含む基である］
とを含む、温度応答性ポリマーであって、
ｐＨ７．４における下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）は３７℃以上であり、
Ｒ3が除去されることによってＬＣＳＴが低下する、
温度応答性ポリマーである。以下で「本発明の温度応答性ポリマー」とも呼ぶ。なお、本明細書において「Ｒ1はそれぞれ独立して」とは、繰り返し単位が複数存在する場合に、当該繰り返し単位中のＲ1も複数存在するが、当該Ｒ1同士が互いに同一であっても異なっても良いことを意味する。「Ｒ2はそれぞれ独立して」「Ｒ3はそれぞれ独立して」についても同様である。
【００２３】
本明細書において「温度応答性ポリマー」とは、下限臨界共溶温度：Lower Critical Solution Temperature（ＬＣＳＴ）において相転移を生じ、可逆的に親水性／疎水性変化を起こす性質を有するポリマーのことである。
【００２４】
本明細書において「下限臨界共溶温度」とは、温度応答性ポリマーの相転移温度であり、当該相転移温度未満の温度では温度応答性ポリマーが親水性となり、前記相転移温度以上の温度では疎水性となる温度である。下限臨界共溶温度未満の温度において温度応答性ポリマーは水可溶性又は水膨潤性であり、下限臨界共溶温度以上の温度において温度応答性ポリマーは水不溶性である。本願において、波長５００ｎｍの光の透過率を吸光光度計で測定し、５０％の透過率を示す温度を下限臨界共溶温度とした。
【００２５】
本明細書における「温度３７℃、ｐＨ７．０未満の水溶液中で除去可能であってかつ少なくとも１つの陰イオン性基を含む基」は、温度３７℃であって、例えばｐＨが７．０未満、６．８以下、６．５以下、６．０以下、５．５以下、５．０以下、４．５以下、４．０以下、３．０以下又は２．０以下であり、かつｐＨが１．０以上、２．０以上、３．０以上、４．０以上、５．０以上、５．５以上又は６．０以上の水溶液中で除去可能である。好ましくは、温度３７℃、ｐＨ５．５以上７．０未満の水溶液中で温度応答性ポリマーから除去可能である。
【００２６】
本明細書における「温度３７℃、ｐＨ７．０未満の水溶液中で除去可能であってかつ少なくとも１つの陰イオン性基を含む基」は、少なくとも１つの、例えば１個、２個、３個、４個、５個又はそれ以上の陰イオン性基を有する。ここで陰イオン性基とは、プロトン交換能を有する任意の基であり、例えば、カルボキシル基（−ＣＯ2Ｈ）、スルホ基（−ＳＯ3Ｈ）、ホスホン酸基（−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）が挙げられる。好ましくは、カルボキシル基である。
【００２７】
「温度３７℃、ｐＨ７．０未満の水溶液中で除去可能であってかつ少なくとも１つの陰イオン性基を含む基」は、好ましくは、繰り返し単位（ＩＩ）中のＮＨ基とアミド結合で連結している。
【００２８】
「温度３７℃、ｐＨ７．０未満の水溶液中で除去可能であってかつ少なくとも１つの陰イオン性基を含む基」は、少なくとも１個の、例えば１個、２個、３個、４個、５個又はそれ以上のカルボキシル基を有する。
【００２９】
「温度３７℃、ｐＨ７．０未満の水溶液中で除去可能であってかつ少なくとも１つの陰イオン性基を含む基」としては、例えば以下の基が挙げられる。
【化８】
2019085438.tif 000009
［式中、矢印はＮＨ基への結合を示す。］
【００３０】
好ましくは、「温度３７℃、ｐＨ７．０未満の水溶液中で除去可能であってかつ少なくとも１つの陰イオン性基を含む基」は、以下の基から成る群から選択される。
【化９】
2019085438.tif 000010
［式中、矢印はＮＨ基への結合を示す。］
【００３１】
本発明の温度応答性ポリマーは、好ましくは、数平均分子量（Ｍｎ）が、5,000 Da〜100,000 Daであり、重量平均分子量（Ｍｗ）と前記数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が、1.5以下である。
【００３２】
本発明の温度応答性ポリマーは、少なくとも一種の検出可能な標識を含んでもよい。本明細書において「検出可能な標識」とは、既存の任意の検出手段により検出し得る任意の原子又は化合物のことである。検出手段としては、特に限定されないが、例えば、肉眼、光学検査装置（例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡、in vivoイメージング装置）、Ｘ線装置（例えば、単純Ｘ線装置、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）装置）、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）装置、核医学検査装置（例えば、シンチグラフ装置、ＰＥＴ（positron emission tomography）装置、ＳＰＥＣＴ（single photon emission computed tomography）装置）、超音波検査装置及びサーモグラフィー装置などが挙げられる。各検出手段に適した標識は当業者に知られており、例えば、Lecchi et al., Q J Nucl Med Mol Imaging. 2007; 51（2）: pp. 111-26などに記載されている。検出可能な標識としては、特に限定されないが、例えば、蛍光標識、発光標識、造影剤、金属原子、１種又は２種以上の金属原子を含む化合物、放射性同位体、１種又は２種以上の放射性同位体を含む化合物、ナノ粒子、及びリポソームが挙げられる。
【００３３】
肉眼および光学検査装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の蛍光標識および発光標識が挙げられる。具体的な蛍光標識としては、特に限定されないが、例えば、Ｃｙ（商標）シリーズ（例えば、Ｃｙ（商標）２、３、５、５．５、７など）、DyLight（商標）シリーズ（例えば、DyLight（商標） 405、488、549、594、633、649、680、750、800など）、Alexa Fluor（登録商標）シリーズ（例えば、Alexa Fluor（登録商標）405、488、549、594、633、647、680、750など）、HiLyte Fluor（商標）シリーズ（例えば、HiLyte Fluor（商標） 488、555、647、680、750など）、ATTOシリーズ（例えば、ATTO488、550、633、647N、655、740など）、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、テキサスレッド、ＧＦＰ、ＲＦＰ、Ｑｄｏｔ、IRDye（登録商標）（例えばIRDye（登録商標）700DX）などを用いることができる。
【００３４】
また、具体的な発光標識としては、特に限定されないが、例えば、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン、イクオリンなどを用いることができる。
【００３５】
Ｘ線装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の造影剤が挙げられる。具体的な造影剤としては、特に限定されないが、例えば、ヨウ素原子、ヨウ素イオン、ヨウ素含有化合物などを用いることができる。
【００３６】
ＭＲＩ装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の金属原子や１種又は２種以上の該金属原子を含む化合物、例えば１種又は２種以上の該金属原子の錯体などが挙げられる。具体的には、特に限定されないが、例えば、ガドリニウム（ＩＩＩ）（Ｇｄ（ＩＩＩ））、イットリウム−８８（88Ｙ）、インジウム−１１１（111Ｉｎ）、およびこれらと、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、（１，２−エタンジイルジニトリロ）四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン、２，２’−ビピリジン（ｂｉｐｙ）、１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ＤＰＰＥ）、２，４−ペンタンジオン（ａｃａｃ）、シュウ酸塩（ｏｘ）などの配位子との錯体、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、酸化マンガン（ＭｎＯ）などを用いることができる。
【００３７】
核医学検査装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の放射性同位体や１種又は２種以上の該放射性同位体を含む化合物、例えば１種又は２種以上の該放射性同位体の錯体などが挙げられる。放射性同位体としては、特に限定されないが、例えば、テクネチウム−９９ｍ（99mＴｃ）、インジウム−１１１（111Ｉｎ）、ヨウ素−１２３（123Ｉ）、ヨウ素−１２４（124Ｉ）、ヨウ素−１２５（125Ｉ）、ヨウ素−１３１（131Ｉ）、タリウム−２０１（201Ｔｌ）、炭素−１１（11Ｃ）、窒素−１３（13Ｃ）、酸素−１５（15Ｏ）、フッ素−１８（18Ｆ）、銅−６４（64Ｃｕ）、ガリウム−６７（67Ｇａ）、クリプトン−８１ｍ（81mＫｒ）、キセノン−１３３（133Ｘｅ）、ストロンチウム−８９（89Ｓｒ）、イットリウム−９０（90Ｙ)などを用いることができる。また、放射性同位体を含む化合物としては、特に限定されないが、例えば、123Ｉ−ＩＭＰ、99mＴｃ−ＨＭＰＡＯ、99mＴｃ−ＥＣＤ、99mＴｃ−ＭＤＰ、99mＴｃ−テトロフォスミン、99mＴｃ−ＭＩＢＩ、99mＴｃＯ4−、99mＴｃ−ＭＡＡ、99mＴｃ−ＭＡＧ３、99mＴｃ−ＤＴＰＡ、99mＴｃ−ＤＭＳＡ、18Ｆ−ＦＤＧなどが挙げられる。
【００３８】
超音波検査装置での検出に適した標識としては、特に限定されないが、例えば、ナノ粒子、リポソームなどを用いることができる。
【００３９】
本発明の温度応答性ポリマーは、少なくとも一種の医薬を含んでもよい。医薬は特に限定されないが、抗癌剤が好ましい。抗癌剤としては、特に限定されないが、例えば、アドリアマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、マイトマイシン−Ｃ、ダウノマイシン、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、塩酸ゲムシタビン、エムタンシン、カリキアマイシン、毒素（例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素などの細胞毒素）、含ホウ素医薬（例えばボルテゾミブ、或いは、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に使用され得るｐ−ボロノフェニルアラニンなどの薬剤）、核酸医薬（例えば、デコイ核酸、アンチセンス核酸、siRNA、miRNA、リボザイム、アプタマー）、光線力学的療法（ＰＤＴ）に使用され得る光増感剤（例えばポルフィリン誘導体）などが挙げられる。
【００４０】
本発明の温度応答性ポリマーが少なくとも一種の検出可能な標識又は医薬を含む場合、それらは当該ポリマーの末端基として直接又はリンカーを介して当該ポリマーに導入されても良い。
【００４１】
一実施形態において、本発明の温度応答性ポリマーは、以下の式（３）：
【化１０】
2019085438.tif 000011
［式中、
Ｌ1及びＬ2はリンカーであるか、又は存在せず、
Ｒ3は、それぞれ独立して以下：
【化１１】
2019085438.tif 000012
［式中、矢印はＮＨ基への結合を示す］
からなる群から選択される基であり、
Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、チオール基、アジド基、検出可能な標識又は医薬であり、
ｍ＝１０〜３０００であり、
ｎ＝１〜３００であり、
ｍ＋ｎに対するｎの割合が１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下又は５％以下であり、
各繰り返し単位の順序は任意である］
で表される。
【００４２】
ｍ及びｎは重合度である。ｍの下限は１０であるが、好ましくは１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００である。ｍの上限は３０００であるが、好ましくは３０００、２０００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００又は２００である。ｎの下限は１であるが、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０である。ｍの上限は３００であるが、好ましくは２５０、２００、１５０、１００、７５又は５０である。ｍ及びｎは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく定量により算出することができる。
【００４３】
本明細書において「リンカー」とは、二つの官能基を連結するための二価の基である。リンカーとしては特に限定されないが、例えば、Ｃ1-40アルキレン基である。ここで前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のオキソ基で置換されていてもよく、前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のハロゲンで置換されていてもよく、隣接するメチレン基同士が１〜１０個の不飽和結合で結ばれていてもよく、そして前記アルキレン基中のメチレン基のうち、１〜２０個のメチレン基がＮＨ、Ｎ（Ｃ1-10アルキル）、Ｏ、Ｓ、Ｃ6-14アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレンで置き換えられていてもよい。リンカーは、例えば−ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣ（ＣＨ3）2−、−Ｓ−Ｓ−などであってもよい。
【００４４】
ｐＨ７．４における本発明の温度応答性ポリマーの下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）は３７℃以上である。したがって、生体に投与後、本発明の温度応答性ポリマーは体液中で水溶性ポリマーとして存在する。一方、酸性環境（例えば腫瘍組織周辺）ではＲ3で表される基が除去されてＬＣＳＴが低下する。そのため、本発明の温度応答性ポリマーは当該環境において疎水性となり、当該環境に選択的に分布することになる。
【００４５】
好ましくは、本発明の温度応答性ポリマーにおいて、一部又は全てのＲ3が除去された後の温度応答性ポリマーのＬＣＳＴは３７℃未満となる。
【００４６】
本発明の温度応答性ポリマーは、例えば以下の工程を経て製造され得る。
（１）重合反応によりポリアクリル酸を調製する。
（２）ポリアクリル酸中のカルボキシル基に、１，２−ジアミノプロパンの１位のアミノ基が保護基（例えばＢｏｃ基など）で保護された化合物とイソプロピルアミンとを所望の割合で縮合する。
（３）保護基を脱保護する。
（４）脱保護後のアミノ基に、温度３７℃、ｐＨ７．０未満の水溶液中で除去可能であってかつ少なくとも１つの陰イオン性基を含む基を導入する。
【００４７】
あるいは、本発明の温度応答性ポリマーは、繰り返し単位（Ｉ）及び（ＩＩ）の由来となるモノマーを用いた重合反応によって製造され得る。
【００４８】
発明の温度応答性ポリマーの製造にあたり、重合反応は、当業者に周知の重合法（例えば、フリーラジカル重合、可逆的付加−開裂型連鎖（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル（ＡＴＲＰ）重合など）により行われ得る。重合の際、開始剤として、例えば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）などのアゾ系開始剤、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）又は過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を加えてもよい。
【００４９】
本発明の一態様は、本発明の温度応答性ポリマーを含む、組成物である。以下で「本発明の組成物」とも呼ぶ。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝剤、賦形剤又はこれらの組み合わせをさらに含んでも良い。例えば、発明の温度応答性ポリマーが検出可能な標識を含む場合、本発明の組成物は疾患(例えば癌）の診断用又は検出用の組成物として使用することができる。また、例えば本発明の温度応答性ポリマーが医薬(例えば抗癌剤）を含む場合、本発明の組成物は疾患治療用（例えば癌治療用）組成物として使用することができる。本発明の組成物を対象に投与する場合は、その投与経路は特に限定されないが、例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、関節内投与、腹腔内投与、眼内投与などが挙げられる。また、投与量は疾患の種類、対象の年齢、体重、性別などにより適宜選択される。
【００５０】
本明細書において「対象」とは、任意の哺乳動物のことである。「対象」としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダを挙げることができる。好ましくは、対象はヒトである。
【００５１】
本発明の一態様は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の温度応答性ポリマーを投与することを含む、疾患（例えば癌）の診断又は検出方法であって、ここで前記温度応答性ポリマーは少なくとも１つの検出可能な標識を含む、前記方法に関する。
【００５２】
本発明の一態様は、疾患（例えば癌）を診断又は検出するための、本発明の温度応答性ポリマーであって、ここで前記温度応答性ポリマーは少なくとも１つの検出可能な標識を含む、前記温度応答性ポリマーに関する。
【００５３】
本発明の一態様は、疾患（例えば癌）を診断又は検出するための医薬の製造のための、本発明の温度応答性ポリマーの使用であって、ここで前記温度応答性ポリマーは少なくとも１つの検出可能な標識を含む、前記使用に関する。
【００５４】
本発明の一態様は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の温度応答性ポリマーを投与することを含む、疾患（例えば癌）の治療方法であって、前記温度応答性ポリマーは少なくとも１つの医薬(例えば抗癌剤）を含む、前記方法に関する。
【００５５】
本発明の一態様は、疾患（例えば癌）を治療するための本発明の温度応答性ポリマーであって、少なくとも１つの、医薬(例えば抗癌剤）を含む、前記温度応答性ポリマーに関する。
【００５６】
本発明の一態様は、疾患（例えば癌）を治療するための医薬の製造のための、本発明の温度応答性ポリマーの使用であって、ここで前記温度応答性ポリマーは、少なくとも１つの、医薬(例えば抗癌剤）を含む、前記使用に関する。
【００５７】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００５８】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００５９】
＜試薬及びその略称＞
ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート（ｔ−ＢＡ，９８％）：Sigma-Aldrich社（水素化カルシウムで脱水してから蒸留精製して使用した。）
２−ブタノン（９９％）：和光純薬工業株式会社（モレキュラーシーブ（４Ａ）で脱水してから蒸留精製して使用した。）
Ｓ−１−ドデシル−Ｓ’−（α，α’−ジメチル−α’’−酢酸）トリチオカーボネート（ＤＤＭＡＴ，９８％）：Sigma-Aldrich社
２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ，９８％）：Sigma-Aldrich社（メタノールで再結晶精製して使用した。）
Ｎ−２（アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド塩酸塩：Sigma-Aldrich社
Ｓ−メチルメタンチオスルホネート（ＭＭＴＳ）：東京化成工業株式会社
ジクロロメタン：和光純薬工業株式会社
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：和光純薬工業株式会社
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）：和光純薬工業株式会社
メタノール：和光純薬工業株式会社
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：和光純薬工業株式会社
エタノール：和光純薬工業株式会社
イソプロピルアミン：和光純薬工業株式会社
トリエチルアミン（ＴＥＡ）：和光純薬工業株式会社
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８ＮＨＳエステル：Thermo Fisher Scientific社
ｔｅｒｔ−ブチル（２−アミノプロピル）カルバメート：AstaTech社
４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）：和光純薬工業株式会社
２−（２−カルボキシエチル）−３−メチルマレイン酸無水物：Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, pp. 6218-6221 (2013) に記載の方法に従って調製した。
トリカルバリル酸無水物：Biomaterials 32, pp. 3106-3114 (2011) に記載の方法で調製した。
ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ  ＮＨＳエステル：LI-COR社
Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ：Promega社
【００６０】
＜細胞種及び動物＞
Ａ５４９細胞：ＡＴＣＣより入手
ＢＡＬＢ／ｃマウス：日本チャールスリバー社
【００６１】
＜測定機器及び解析ソフト＞
ＮＭＲ：AVANCE III 400, Bruker社
サイズ排除クロマトグラフィー：カラム：TSK-gel superAW3000, superAW4000, superAWL-guard column (東ソー株式会社), 検出器：RI-2031（日本分光株式会社）
吸光光度計：V-650（日本分光株式会社）
共焦点レーザー顕微鏡：LSM710（カールツァイスマイクロスコピー社）
フローサイトメーター：Guava easyCyte (Merck KGaA)
IVIS Imaging System：Caliper Life Sciences社
蛍光分光光度計：FP-8300 (日本分光株式会社）
【００６２】
＜本願実施例で製造された温度応答性ポリマーの表記＞
繰り返し単位（Ｉ）及び（ＩＩ）の合計（１００モル％）に対する繰り返し単位（ＩＩ）の割合がＸモル％である温度応答性ポリマーをＰ［ＮＩＰＡＭ／Ｘ％ＡＩＰＡＭ−Ｒ3］と表記する。
【００６３】
また、繰り返し単位（ＩＩ）中のＲ3がＡである場合、Ａはそれぞれ独立して以下のいずれか１つの基とする。
【化１２】
2019085438.tif 000013
【００６４】
また、繰り返し単位（ＩＩ）中のＲ3がＢである場合、Ｂはそれぞれ独立して以下のいずれか１つの基とする。
【化１３】
2019085438.tif 000014
【００６５】
また、繰り返し単位（ＩＩ）中のＲ3がＣである場合、Ｃは以下の基とする。
【化１４】
2019085438.tif 000015
【００６６】
また、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／Ｘ％ＡＩＰＡＭ−Ｒ3］の１つの末端基が標識部分Ｄ１（又はＤ２）となったポリマーを、「Ｄ１（又はＤ２）−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／Ｘ％ＡＩＰＡＭ−Ｒ3］」と表記する。
【００６７】
実施例１
Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］及びＤ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］の製造
（１）化合物１の製造
【化１５】
2019085438.tif 000016
ＡＩＢＮ（３．２ｍｇ，１９．５μｍｏｌ）、ＤＤＭＡＴ（０．１４ｇ，０．３９ｍｍｏｌ）、２−ブタノン（５ｇ，６９．５ｍｍｏｌ）、ｔ−ＢＡ（５ｇ，３９．０５ｍｍｏｌ）を二口試験管内で室温、アルゴン雰囲気下で混合後、凍結脱気を４回行った。その後、二口試験管を撹拌しながら７０℃のオイルバスに浸漬し重合を開始した。重合開始から２時間後に、二口試験管を液体窒素に浸漬して重合を停止し、７．５ｍｌのＴＨＦを加えた。反応溶液をメタノール／水混合溶媒に滴下して、再沈殿によって精製を行った。この精製操作を３回行った。沈殿物を回収し、減圧乾燥を一晩行い、黄色い生成物（化合物１）を得た（４．３ｇ，収率：８６％）。得られた化合物１の物性は1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，１２８ＳＮ）とサイズ排除クロマトグラフィーにより評価した。
【表１】
2019085438.tif 000017
【００６８】
（２）化合物２の製造
【化１６】
2019085438.tif 000018
１００ｍｇの化合物１をＴＨＦに１００ｍｇ／ｍＬで溶解し、化合物１に対して５０当量のＭＭＴＳを加えて混合し、さらに２５当量のプロピルアミンを加えて２４時間撹拌した。メタノールに対して透析を一回行い、さらに水に対して４回透析を行った後、凍結乾燥を行い、化合物２を得た（収率：９８％）。
【表２】
2019085438.tif 000019
【００６９】
（３）化合物３の製造
【化１７】
2019085438.tif 000020
５０ｍｇの化合物２を１ｍＬのメタノールに溶解した。１５当量のＮ−２（アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド塩酸塩を０．５ｍＬのメタノールに溶解し、１６．５当量のＴＥＡを加えて混合し、化合物２のメタノール溶液に加えた。その後１５当量のＤＭＴ−ＭＭを加え、２４時間撹拌した。反応後、メタノールに対して１回、水に対して４回透析を行い、凍結乾燥して化合物３を得た（収率：９９％）。
【表３】
2019085438.tif 000021
【００７０】
（４）化合物４の製造
【化１８】
2019085438.tif 000022
５００ｍｇの化合物３を５．２ｍＬのジクロロメタンに溶解し、３．１２５ｍＬのＴＦＡを加えて撹拌した。２０時間室温で撹拌し、その後、減圧乾燥により溶媒を除いた。得られた生成物に１．５６ｍＬのＴＨＦを加えて、水に対して透析して、凍結乾燥することにより化合物４を得た（収率：８３％）。
【表４】
2019085438.tif 000023
【００７１】
（５）化合物５の製造
【化１９】
2019085438.tif 000024
４０ｍｇの化合物４をＤＭＳＯに溶解し（１ｍｇ／ｍＬ）、ｔｅｒｔ−ブチル（２−アミノプロピル）カルバメート（２．５ｍｏｌ％，２．３２μｌ）を加えた。そして、そこに２２３μＬのＴＥＡと４４１ｍｇのＤＭＴ−ＭＭを加えて３時間撹拌した。その後、４５６μＬのイソプロピルアミン、８９３μＬのＴＥＡ、１．７ｇのＤＭＴ−ＭＭを加えて、５日間撹拌した。反応後、メタノールに対して２回透析し、水に対して４回透析し、凍結乾燥することにより化合物５を得た（収率：９０％）。ｍ＝９３．６、ｎ＝２．４であった。なおｍ及びｎは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく定量により算出された。
【表５】
2019085438.tif 000025
【００７２】
（６）化合物６（Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ］）の製造
【化２０】
2019085438.tif 000026
１０ｍｇの化合物５を１ｍＬのＴＦＡ（９５％）に溶解し、一晩撹拌した。その溶液をメタノールと水に対して透析し、凍結乾燥することで化合物６（Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ］）を得た（収率：９０％）。
【表６】
2019085438.tif 000027
【００７３】
（７）化合物７（Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］）の製造
【化２１】
2019085438.tif 000028
１５ｍｇの化合物６を０．５Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．２）３ｍＬに溶解した。そして１１．１ｍｇの２−（２−カルボキシエチル）−３−メチルマレイン酸無水物を１１１μＬのエタノールに溶解し、それを化合物６の溶液に加えて、その後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９に調整した。この混合溶液を４°Ｃで３時間撹拌し、限外濾過（分画分子量：３，０００）により、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．２）中で精製し、さらに脱イオン水で精製した。精製したポリマー溶液を凍結乾燥し、化合物７を得た（収率：９５％）。
【表７】
2019085438.tif 000029
【００７４】
（８）化合物８の製造
【化２２】
2019085438.tif 000030
１０ｍｇの化合物７を１ｍＭのＮａＯＨ水溶液に１ｍｇ／ｍＬで溶解し、４時間撹拌した。水に対する透析による精製後、凍結乾燥により化合物８を得た（収率：９６％）。
【表８】
2019085438.tif 000031
【００７５】
（９）化合物９（Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］）の製造
【化２３】
2019085438.tif 000032
化合物８をＤＭＳＯに１．２ｍｇ／ｍＬで溶解し、ＴＥＡを５０μＬ加えて、さらにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ＮＨＳエステルを１当量加えた。混合液を一晩撹拌した後、メタノールと水に対して透析し、さらにＰＤ１０カラムを通すことにより精製を行い、凍結乾燥することで化合物９を得た。
【００７６】
（１０）化合物１０（Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］）の製造
【化２４】
2019085438.tif 000033
化合物８をＤＭＳＯに１．２ｍｇ／ｍＬで溶解し、そこに２当量のＩＲＤｙｅ  ７００ＤＸ  ＮＨＳエステルのＤＭＳＯ溶液を加え、混合液を一晩撹拌した。メタノールと水に対して透析し、さらにＰＤ１０カラムを通すことにより精製を行い、凍結乾燥することで化合物１０を得た。
【００７７】
実施例２
Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］及びＤ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］の製造
【化２５】
2019085438.tif 000034
Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ］及びＰ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］は、実施例１（５）の製造において、ｔｅｒｔ−ブチル（２−アミノプロピル）カルバメートを５ｍｏｌ％使用した以外は、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ］及びＰ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］と同様の方法で製造した。ｍ＝９１．２、ｎ＝４．８であった。なおｍ及びｎは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく定量により算出された。Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］は、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］を用いて、実施例１（８）及び（１０）と同様の方法で製造した。以下に、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］のＮＭＲデータを示す。
【表９】
2019085438.tif 000035
【００７８】
実施例３
Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］及びＤ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］の製造
【化２６】
2019085438.tif 000036
Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ］及びＰ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］は、実施例１（５）の製造において、ｔｅｒｔ−ブチル（２−アミノプロピル）カルバメートを１０ｍｏｌ％使用した以外は、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ］及びＰ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］と同様の方法で製造した。ｍ＝８６．４、ｎ＝９．６であった。なおｍ及びｎは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく定量により算出された。Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］は、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］を用いて、実施例１（８）及び（１０）と同様の方法で製造した。以下に、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］のＮＭＲデータを示す。
【表１０】
2019085438.tif 000037
【００７９】
実施例４
Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｂ］及びＤ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｂ］の製造
【化２７】
2019085438.tif 000038
Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｂ］は、実施例１の（７）の製造において、２−（２−カルボキシエチル）−３−メチルマレイン酸無水物の代わりにトリカルバリル酸無水物を使用した以外は、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］と同様の方法で製造した。Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｂ］は、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｂ］を用いて、実施例１（８）及び（９）と同様の方法で製造した。なお、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｂ］からトリフルオロアセチル基を除去した以下の化合物のＮＭＲデータを示す。
【化２８】
2019085438.tif 000039
【表１１】
2019085438.tif 000040
【００８０】
実施例５
Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］及びＤ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］の製造
【化２９】
2019085438.tif 000041
Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］は、実施例１の（７）の製造において、２−（２−カルボキシエチル）−３−メチルマレイン酸無水物の代わりにコハク酸無水物を使用した以外は、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］と同様の方法で製造した。Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］は、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］を用いて、実施例１（８）及び（９）と同様の方法で製造した。Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］は、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］を用いて、実施例１（８）及び（１０）と同様の方法で製造した。なお、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］からトリフルオロアセチル基を除去した以下の化合物のＮＭＲデータを示す。
【化３０】
2019085438.tif 000042
【表１２】
2019085438.tif 000043
【００８１】
比較例１
Ｐ［ＮＩＰＡＭ］、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ］及びＤ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ］の製造
【化３１】
2019085438.tif 000044
Ｐ［ＮＩＰＡＭ］は、実施例１（５）において、ｔｅｒｔ−ブチル（２−アミノプロピル）カルバメートを使用せずにイソプロピルアミンのみを縮合させることによって製造した。Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ］は、Ｐ［ＮＩＰＡＭ］を用いて実施例１（８）及び（９）と同様の方法で製造した。なお、Ｐ［ＮＩＰＡＭ］からトリフルオロアセチル基を除去した以下の化合物のＮＭＲデータを示す。
【化３２】
2019085438.tif 000045
【表１３】
2019085438.tif 000046
【００８２】
実施例６
ＬＣＳＴの評価
Ｐ［ＮＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ］を試験化合物として用いて、それらのＬＣＳＴを評価した。
【００８３】
各試験化合物を０．５ｗ／ｖ％でＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、０．１°Ｃ／分で温度を変化させ３００ｒｐｍで撹拌しながら、波長５００ｎｍの光の透過率を吸光光度計で測定し、ＬＣＳＴ（５０％の透過率を示す温度）を測定した。結果を図１に示す。
【００８４】
実施例７
ＬＣＳＴのｐＨ応答性の評価
Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］を試験化合物として用いて、それらのＬＣＳＴのｐＨ応答性を評価した。
【００８５】
５ｍｇのＰ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］及びＰ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］をＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に０．５ｗ／ｖ％で溶解し、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０又は５．５）に対して、室温で２日間透析を行った。その後、実施例６と同様の方法でＬＣＳＴを測定した。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中でのＰ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］及びＰ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］のＬＣＳＴも測定した。結果を図２〜４に示す。Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］及びＰ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］のｐＨ７．４におけるＬＣＳＴは３７℃以上であり、このことはこれらの試験化合物が生体内の体液中で水溶性であることを示す。一方、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］及びＰ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］はいずれも、酸性条件に曝すことでＡ基が脱離してＬＣＳＴが急激に低下した。
【００８６】
また、５ｍｇのＰ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］を、ｐＨ５．０及び５．５のＭＥＳ緩衝液、並びに６．０、６．８及び７．４のＰＢＳ緩衝液にそれぞれ０．５ｗ／ｖ％となるように溶解した。調製されたＰ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］の溶液のそれぞれを、溶解に使用したＭＥＳ緩衝液又はＰＢＳ緩衝液に対して室温で２日間透析を行った後、実施例６と同様の方法でＬＣＳＴを測定した。結果を図５に示す。ｐＨが７．０未満となることで、ＬＣＳＴの急激な低下が観察された。
【００８７】
実施例８
本発明の温度応答性ポリマーの細胞内への取り込みの評価
Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ］、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｂ］及びＤ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］を試験化合物として用いて、それらの細胞内への取り込みを評価した。
２４ウェルプレートに５ ｘ １０4 ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌでＡ５４９細胞を播種し、一晩インキュベーションした後、培地を取り除き、ｐＨ６．０又はｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を加えた。そこに同じ緩衝液に溶解した試験化合物の溶液を加え（最終ポリマー濃度：１０μＭ）、１時間インキュベートした。その後、細胞をダルベッコＰＢＳで洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を剥がし、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＰＢＳを加えて、フィルターをかけた後、フローサイトメトリーにより蛍光強度を測定した。結果を図６に示す。Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｂ］及びＤ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］は、ｐＨ７．４の時と比較して、ｐＨ６．０の緩衝液中でインキュベートした場合に、より多く細胞内に取り込まれた。一方、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ］は、ｐＨ７．４の場合とｐＨ６．０の場合とで有意な差は認められなかった。
【００８８】
Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ］、Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］、Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］を試験化合物として用いて、それらの細胞内への取り込みを評価した。
９６ウェルプレートに１０4 ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌでＡ５４９細胞を播種し、一晩インキュベーションした後、培地を取り除き、ｐＨ６．０又はｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を加えた。そこに同じ緩衝液に溶解した試験化合物の溶液を加え（最終ポリマー濃度：１０μＭ）、１時間インキュベートした。その後、細胞をダルベッコＰＢＳで洗浄し、１５μＬ／ｗｅｌｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒで細胞を溶解し、その蛍光強度をＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍで測定した。結果を図７に示す。Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ｃ］、Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］、Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／１０％ＡＩＰＡＭ−Ａ］は、ｐＨ７．４の時と比較して、ｐＨ６．０の緩衝液中でインキュベートした場合に、より多く細胞内に取り込まれた。一方、Ｄ２−Ｐ［ＮＩＰＡＭ］は、ｐＨ７．４の場合とｐＨ６．０の場合とで有意な差は認められなかった。
【００８９】
Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］を試験化合物として、細胞内への取り込みを顕微鏡にて観察した。
A549 細胞を 2 x 104 cell / wellで、８ウェルガラスプレートに播種し、一晩インキュベーションを行った後、培地を取り除き、ｐＨ６．０又はｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を加えた。そこに同じ緩衝液に溶解した試験化合物の溶液を加え（最終ポリマー濃度：１０μＭ）、１時間インキュベートした。その後、細胞をダルベッコPBSで２回洗浄し、Lysotracker Red DND-99とHoechst33342により細胞を染色した。染色後、ダルベッコPBSで３回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定化した。固定化した細胞を共焦点レーザー走査型顕微鏡LSM710により観察した。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．０）にてインキュベートした後のＤ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］の細胞内への取り込みを示す顕微鏡画像を図８に示す。
【００９０】
実施例９
本発明の温度応答性ポリマーのマウス体内分布の評価
Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］及びＤ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ］を試験化合物として用いて、その生体内分布を評価した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、６〜８週齢）に１ｘ１０6／ｍｏｕｓｅでＣＴ２６細胞を皮下に注射し、皮下腫瘍モデルを作製した。そして、２００μｇの試験化合物の溶液を尾静脈から注射し、所定時間後に腫瘍を摘出し、passive lysis bufferによるホモジェナイズを行い、その溶解液の蛍光強度から、ポリマーの腫瘍への集積量を定量した。結果を図９に示す。図中の横軸は、注射してから腫瘍を摘出するまでの時間を示す。縦軸は、投与した薬剤の内、1ｇあたりの腫瘍に集積した量を示す。Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ］と比較して、Ｄ１−Ｐ［ＮＩＰＡＭ／２．５％ＡＩＰＡＭ−Ａ］が腫瘍組織に高濃度で集積した。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の温度応答性ポリマーは、標的に対して選択的に物質（例えば医薬）を送達可能な物質送達担体として好適に利用することができる。
【図１】
2019085438.tif 000052
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019085438.tif 000058
【図８】
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【図９】
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