(57)【要約】【課題】本発明は、より安定で、長期作用性の、および／または効果的な治療用タンパク質を含む組成物を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、エラスチン様ペプチド（ELP）および治療用タンパク質を含む治療剤および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、機能的アナログを含む、ＧＬＰ−１受容体作動薬、インスリン、または第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子である。本発明は、さらに、コードするポリヌクレオチド、ならびに治療剤を製造および使用する方法を提供する。当該治療剤は、治療剤としてのその利用に関連する改善点を有し、これには、特に半減期、体内からの排除および／または体内持続性、溶解性、および生物学的利用能のうちの１つまたは複数が含まれる。【選択図】  図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラスチン様ペプチド（ELP）成分、および治療成分を含む治療剤であって、前記治療成分単独と比較したときに、前記治療成分の循環半減期が延長され、および／または治療有効量が低減されている治療剤。
【請求項２】
前記治療成分が、表１に掲載されている治療用タンパク質、またはその機能的部分、もしくは機能的アナログである、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
ＥＬＰ成分が前記治療用タンパク質と、そのＮおよび／またはＣ末端で共有結合している、請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
治療成分が前記ＥＬＰ成分と、前記ＥＬＰ成分のＮ末端で共有結合し、第２の治療成分が前記ＥＬＰ成分と、前記ＥＬＰ成分のＣ末端で共有結合している、請求項１から３のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項５】
治療成分が前記ＥＬＰ成分と、そのＮおよび／またはＣ末端で共有結合している、請求項１から４のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項６】
第１のＥＬＰ成分が前記治療成分と、前記治療成分のＮ末端で共有結合し、および第２のＥＬＰ成分が前記治療成分と、前記治療成分のＣ末端で共有結合している、請求項１から５のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項７】
前記ＥＬＰ成分と前記治療成分との間に、スペーサー部分をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項８】
前記スペーサー部分が、１つまたは複数のプロテアーゼ抵抗性部分、非ペプチド性化学的部分、およびプロテアーゼ切断部位を含む、請求項７に記載の治療剤。
【請求項９】
前記プロテアーゼ切断部位が、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、メタロプロテアーゼ切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、Ｔｅｖ切断部位、およびカテプシン切断部位である、請求項８に記載の治療剤。
【請求項１０】
前記スペーサー部分が、式［（Ｇｌｙ）ｎ−Ｓｅｒ］ｍ（配列番号２２）を有する非切断可能部分を含み、式中、ｎは１〜４であり、ｍは１〜４である、請求項９に記載の治療剤。
【請求項１１】
前記ＥＬＰが、配列番号１〜１２より選択される少なくとも１つの繰返しユニットを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項１２】
前記繰返しユニットが、ＶＰＧＸＧ（配列番号３）である、請求項１１に記載の治療剤。
【請求項１３】
Ｘが任意の天然または非天然のアミノ酸残基であり、Ｘは少なくとも２つのユニット間で変化する、請求項１２に記載の治療剤。
【請求項１４】
各Ｘが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン残基から独立に選択される、請求項１３に記載の治療剤。
【請求項１５】
約５０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項１６】
前記ＥＬＰ成分が、３７℃より高いＴｔを有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項１７】
遺伝的にコードされた融合タンパク質である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項１８】
請求項１７に記載の治療剤をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御要素をさらに含む、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記発現制御要素がプロモーターを含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１８から２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載のベクター、または請求項１８から２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の治療剤、および薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の治療剤、または請求項２３に記載の医薬組成物の有効量を、これを必要とする対象に投与する工程を含む、対象の疾患、障害、または状態を治療または予防するための方法。
【請求項２５】
前記対象が、表１に掲載する効能を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）成分、およびグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１受容体作動薬を含む治療剤。
【請求項２７】
前記ＧＬＰ−１受容体作動薬が、ＧＬＰ−１またはその機能的アナログである、請求項２６に記載の治療剤。
【請求項２８】
前記ＧＬＰ−１受容体作動薬が、エキセンジン−４またはその機能的アナログである、請求項２６に記載の治療剤。
【請求項２９】
前記ＥＬＰ成分が前記ＧＬＰ−１受容体作動薬と、そのＮおよび／またはＣ末端で共有結合している、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項３０】
第１のＧＬＰ−１受容体作動薬が前記ＥＬＰ成分と、前記ＥＬＰ成分のＮ末端で共有結合し、および第２のＧＬＰ−１受容体作動薬が前記ＥＬＰ成分と、前記ＥＬＰ成分のＣ末端で共有結合している、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項３１】
前記ＧＬＰ−１受容体作動薬が前記ＥＬＰ成分と、そのＮおよび／またはＣ末端で共有結合している、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項３２】
第１のＥＬＰ成分が前記ＧＬＰ−１受容体作動薬と、前記ＧＬＰ−１受容体作動薬のＮ末端で共有結合し、および第２のＥＬＰ成分が前記ＧＬＰ−１受容体作動薬と、前記ＧＬＰ−１受容体作動薬のＣ末端で共有結合している、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項３３】
前記ＥＬＰ成分と前記ＧＬＰ−１受容体作動薬との間に、スペーサー部分をさらに含む、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項３４】
前記スペーサー部分が、１つまたは複数のプロテアーゼ抵抗性部分、非ペプチド性化学的部分、およびプロテアーゼ切断部位を含む、請求項３３に記載の治療剤。
【請求項３５】
前記プロテアーゼ切断部位が、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、メタロプロテアーゼ切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、Ｔｅｖ切断部位、およびカテプシン切断部位である、請求項３４に記載の治療剤。
【請求項３６】
前記スペーサー部分が、式［（Ｇｌｙ）ｎ−Ｓｅｒ］ｍ（配列番号２２）を有する非切断可能部分を含み、式中、ｎは１〜４であり、ｍは１〜４である、請求項３４に記載の治療剤。
【請求項３７】
前記ＥＬＰが、配列番号１〜１２より選択される少なくとも１つの繰返しユニットを含む、請求項２６から３６のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項３８】
前記繰返しユニットが、ＶＰＧＸＧ（配列番号３）である、請求項３７に記載の治療剤。
【請求項３９】
Ｘが任意の天然または非天然のアミノ酸残基であり、Ｘは少なくとも２つのユニット間で変化する、請求項３８に記載する治療剤。
【請求項４０】
各Ｘが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン残基から独立に選択される、請求項３８に記載の治療剤。
【請求項４１】
約５０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項２６から４０のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項４２】
前記ＥＬＰ成分が、３７℃より高いＴｔを有する、請求項２６から４０のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項４３】
遺伝的にコードされた融合タンパク質である、請求項２６から４２のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項４４】
請求項４３に記載の治療剤をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４５】
前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御要素をさらに含む、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
前記発現制御要素が、プロモーターを含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
請求項４４から４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４８】
請求項４７に記載のベクター、または請求項４４から４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞。
【請求項４９】
請求項２６から４３のいずれか一項に記載の治療剤、および薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５０】
請求項２６から４３のいずれか一項に記載の治療剤、または請求項４９に記載の医薬組成物の有効量を、これを必要とする対象に投与する工程を含む、対象の生物学的状態、障害、または疾患を治療または予防するための方法。
【請求項５１】
前記対象が糖尿病を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）成分、およびインスリンまたはその機能的アナログを含む治療剤。
【請求項５３】
前記ＥＬＰ成分が前記インスリンまたは機能的アナログと、そのＮおよび／またはＣ末端で共有結合している、請求項５２に記載の治療剤。
【請求項５４】
第１のインスリンまたは機能的アナログが前記ＥＬＰ成分と、前記ＥＬＰ成分のＮ末端で共有結合し、および第２のインスリンまたは機能的アナログが前記ＥＬＰ成分と、前記ＥＬＰ成分のＣ末端で共有結合している、請求項５２または５３に記載の治療剤。
【請求項５５】
前記インスリンまたは機能的アナログが前記ＥＬＰ成分と、そのＮおよび／またはＣ末端で共有結合している、請求項５２に記載の治療剤。
【請求項５６】
第１のＥＬＰ成分が前記インスリンまたは機能的アナログと、そのＮ末端で共有結合し、および第２のＥＬＰ成分が前記インスリンまたは機能的アナログと、そのＣ末端で共有結合している、請求項５２または５３に記載の治療剤。
【請求項５７】
前記ＥＬＰ成分と前記インスリンまたは機能的アナログとの間に、スペーサー部分をさらに含む、請求項５２から５６のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項５８】
前記スペーサー部分が、１つまたは複数のプロテアーゼ抵抗性部分、非ペプチド性化学的部分、およびプロテアーゼ切断部位を含む、請求項５７に記載の治療剤。
【請求項５９】
前記プロテアーゼ切断部位が、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、メタロプロテアーゼ切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、Ｔｅｖ切断部位、またはカテプシン切断部位である、請求項５８に記載の治療剤。
【請求項６０】
前記スペーサー部分が、式［（Ｇｌｙ）ｎ−Ｓｅｒ］ｍ（配列番号２２）を有する非切断可能部分を含み、式中、ｎは１〜４であり、ｍは１〜４である、請求項５８に記載の治療剤。
【請求項６１】
前記ＥＬＰ成分が、配列番号１〜１２より選択される少なくとも１つの繰返しユニットを含む、請求項５２から６０のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項６２】
前記繰返しユニットが、ＶＧＰＸＧ（配列番号３）である、請求項６１に記載の治療剤。
【請求項６３】
前記繰返しユニットが、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号５）、またはＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号７）であり、Ｘは任意の天然または非天然のアミノ酸残基であり、Ｘは少なくとも２つのユニット間で変化する、請求項６１に記載の治療剤。
【請求項６４】
各Ｘが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン残基から独立に選択される、請求項６２または６３に記載の治療剤。
【請求項６５】
約５０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項５２から６４のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項６６】
前記ＥＬＰ成分が、３７℃より高いＴｔを有する、請求項５２から６５のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項６７】
遺伝的にコードされた融合タンパク質である、請求項５２から６６のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項６８】
請求項６７に記載の治療剤をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６９】
前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御要素をさらに含む、請求項６８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７０】
前記発現制御要素がプロモーターを含む、請求項６９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
請求項６８から７０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７２】
請求項７１に記載のベクター、または請求項６８から７０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞。
【請求項７３】
請求項５２から６７のいずれか一項に記載の治療剤、および薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項７４】
請求項５２から６７のいずれか一項に記載の治療剤、または請求項７３に記載の医薬組成物の有効量を、これを必要とする対象に投与する工程を含む、対象の生物学的状態、障害、または疾患を治療または予防するための方法。
【請求項７５】
前記対象が糖尿病を有する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
エラスチン様ペプチド（ELP）成分、および第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはその機能的アナログを含む治療剤。
【請求項７７】
前記ＥＬＰ成分が、前記第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子または機能的アナログと、前記第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子のＮおよび／またはＣ末端で共有結合している、請求項７６に記載の治療剤。
【請求項７８】
第１の第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子または機能的アナログが前記ＥＬＰと、前記ＥＬＰ成分のＮ末端で共有結合し、および第２の第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子または機能的アナログが前記ＥＬＰ成分と、前記ＥＬＰ成分のＣ末端で共有結合している、請求項７６または７７に記載の治療剤。
【請求項７９】
前記第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子または機能的アナログが前記ＥＬＰ成分と、前記ＥＬＰ成分のＮおよび／またはＣ末端で共有結合している、請求項７６に記載の治療剤。
【請求項８０】
第１のＥＬＰ成分が前記第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子または機能的アナログと、そのＮ末端で共有結合し、および第２のＥＬＰ成分が前記第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子または機能的アナログと、そのＣ末端で共有結合している、請求項７６または７７に記載の治療剤。
【請求項８１】
前記ＥＬＰ成分と第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子または機能的アナログとの間に、スペーサー部分をさらに含む、請求項７６から８０のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項８２】
前記スペーサー部分が、１つまたは複数のプロテアーゼ抵抗性部分、非ペプチド性化学的部分、およびプロテアーゼ切断部位を含む、請求項８１に記載の治療剤。
【請求項８３】
前記プロテアーゼ切断部位が、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、メタロプロテアーゼ切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、Ｔｅｖ切断部位、およびカテプシン切断部位である、請求項８２に記載の治療剤。
【請求項８４】
前記スペーサー部分が、式［（Ｇｌｙ）ｎ−Ｓｅｒ］ｍ（配列番号２２）を有する非切断可能部分を含み、式中、ｎは１〜４であり、ｍは１〜４である、請求項８２に記載の治療剤。
【請求項８５】
前記ＥＬＰ成分が、配列番号１〜１２より選択される少なくとも１つの繰返しユニットを含む、請求項７６から８４のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項８６】
前記繰返しユニットが、ＶＰＧＸＧ（配列番号３）である、請求項８５に記載の治療剤。
【請求項８７】
Ｘが任意の天然または非天然のアミノ酸残基であり、Ｘは少なくとも２つのユニット間で変化する、請求項８６に記載する治療剤。
【請求項８８】
各Ｘが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン残基から独立に選択される、請求項８６に記載の治療剤。
【請求項８９】
約７０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項７６から８８のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項９０】
前記ＥＬＰ成分が３７℃より高いＴｔを有する、請求項７６から８９のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項９１】
遺伝的にコードされた融合タンパク質である、請求項７６から９０のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項９２】
請求項９１に記載の治療剤をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項９３】
前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御要素をさらに含む、請求項９２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
前記発現制御要素がプロモーターを含む、請求項９３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
請求項９２から９４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９６】
請求項９５に記載のベクター、または請求項９２から９５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞。
【請求項９７】
請求項７６から９１のいずれか一項に記載の治療剤、および薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項９８】
請求項７６から９１までのいずれか一項に記載の治療剤、または請求項９７に記載の医薬組成物の有効量を、これを必要とする対象に投与する工程を含む、生物学的状態、障害、または疾患について対象を予防または治療するための方法。
【請求項９９】
前記対象が出血を有する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記対象が血友病を有する、請求項９８または９９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本出願は、２００８年６月２７日に申請された米国特許仮出願第６１／０７６，２２１号の優先権を主張し、その全体を、本明細書において参考として援用する。
【０００２】
[0002]  本出願は、エラスチン様ペプチドを含む治療剤を開示し、２００７年９月６日付けの国際申請日を有する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第２００７／０７７７６７号（2008年3月13日に国際公開第２００８／０３０９６８号として公表）に関連する。また本出願は、２００６年１２月２０日付けの国際申請日を有する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第２００６／０４８５７２号（2007年6月28日に国際公開第２００７／０７３４８６号として公表）にも関連する。国際公開第２００８／０３０９６８号および同第２００７／０７３４８６号のそれぞれを、本明細書においてそのまま参考として援用する。
【０００３】
電子申請されたテキストファイルに関する説明
[0003]  本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容を、本明細書においてそのまま参考として援用する。配列表のコンピューターで読取り可能なフォーマットのコピー（ファイルネーム：PHAS_010_01US_SeqList_ST25.txt、記録日：2009年6月26日、ファイルサイズ50kb）。
【背景技術】
【０００４】
[0004]  治療用タンパク質またはペプチドは、その自然の状態では、または組換え技術によって産生された場合には、とりわけ、血清中で安定な期間、血清半減期（すなわち循環半減期）が短い、または体内持続性が限定的である不安定な分子であり得る。またかかる分子は、処方化する際には、例えば水溶液中で処方化した場合、極めて不安定でもあり得る。
【０００５】
[0005]  いくつかの例では、ポリエチレングリコール（PEG）をタンパク質分子と結合させると、長期作用性で、活性持続性の分子となる。しかし、ＰＥＧを結合させると、多くの場合、タンパク質の治療活性を顕著に低下させ、または消失させてしまうことさえあり得る。また、治療用タンパク質および／またはペプチドは、血清半減期の延長能力を有するある種のタンパク質と融合させることによっても、安定化が行われてきた。例えば、いくつかの例では、融合状態にない治療用タンパク質に比べて、アルブミン、トランスフェリン、および抗体断片と融合した治療用タンパク質では、血清半減期が延長している。米国特許第７，２３８，６６７号（特にアルブミンコンジュゲートに関して）、同第７，１７６，２７８号（特にトランスフェリンコンジュゲートに関して）、および同第５，７６６，８８３号をそのまま、本明細書において参考として援用するが、これらを参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0006]  当技術分野では、より安定で、長期作用性の、および／または効果的なタンパク質分子について、なおもニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0007]  本発明は、エラスチン様ペプチド（ELP）成分および治療用タンパク質成分を含む治療剤を提供する。ＥＬＰ成分は、エラスチンタンパク質の配列に構造的に関連する、またはこれに由来する構造的ペプチドユニットを含み、これは繰り返しユニットであり得る。かかるＥＬＰ成分は、治療剤に、ある種の治療上の長所、例えば、治療用タンパク質成分の比較的良好な安定性、溶解性、生物学的利用能、半減期、持続性、および／または生物学的作用等をもたらす。かかる特性は、例えば、治療成分の融合していない、または結合していない対照物と対比させて判定可能である。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ成分は、可逆的逆相転移を引き起こす場合があり、これは、さらなる実用的および／または治療的長所をもたらし得る。本発明は、さらに、本発明の治療剤をコードするポリヌクレオチド、ならびに特定の生物学的状態を治療または予防する方法を提供する。
【０００８】
[0008]  第１の態様では、本発明は、エラスチン様ペプチド（ELP）成分および治療用タンパク質成分を含む治療剤、ならびに必要とする対象または患者に送達するための、同治療剤を含む医薬組成物を提供する。治療成分は、表１に掲載する治療用タンパク質、またはその機能的アナログの活性部分から選択され得る。特定の実施形態では、治療成分はＧＬＰ−１受容体作動薬、例えばＧＬＰ−１、エキセンジン（exendin）−４、またはこれらの機能的アナログである。かかる治療成分は、一般的に、グルコースに依存した様式で膵臓からのインスリン分泌を増加させる上でとりわけ効果的である。そのほかの実施形態では、治療成分は、インスリンまたはその機能的アナログであり、これは、一般的に血液からのグルコースの取込み、および細胞内貯蔵を促進する上で効果的である。なおも別の実施形態では、治療成分は第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、またはこれらの機能的アナログであり、これらは、一般的に第Ｘ因子または第ＩＸ因子の活性化による凝固を促進する上で効果的である。
【０００９】
[0009]  ＥＬＰ成分および治療成分は様々な手段により共有結合可能であり、そのような手段として、化学結合（例えば、コンジュゲーション）、および遺伝子組換え融合技術が挙げられる。さらに、１分子当たりのＥＬＰ成分数または治療成分の数、および分子中のそれぞれの位置は、必要に応じて変化し得る。治療剤は、１つまたは複数のスペーサーまたはリンカー部分をさらに含むことができ、かかる部分は、ＥＬＰ成分および治療成分の所望の機能的独立性を付与することに加えて、任意選択により治療成分のタンパク質加水分解による放出、または活性化を可能にするプロテアーゼ感受性特性等の、さらなる機能性を付与し得る。治療剤は、１つまたは複数のターゲティング成分、例えば治療剤が特定の細胞タイプ、例えば癌細胞、または特定の器官を標的と定めるようにするためのペプチド、またはタンパク質をさらに含み得る。
【００１０】
[0010]  第２の態様では、本発明は、本発明の治療剤をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド等のポリヌクレオチドを提供する。例えば、ヌクレオチド配列は、表１に掲載する少なくとも１つの治療用タンパク質（またはその機能的アナログ）の機能部分を有するＥＬＰ融合体をコードする。特定の実施形態では、治療成分は、ＧＬＰ−１受容体作動薬（GLP-1およびエキセジン-4を含む）、インスリン、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、またはこれらの機能的アナログである。かかるポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列、例えばプロモーター要素および／またはそのほかの転写もしくは発現関連シグナル等に作動可能に結合した追加の制御要素（複数可）をさらに含み得る。ポリヌクレオチドは、様々なベクターに挿入可能で、かかるベクターは、例えばバクテリアおよび真核宿主細胞等を含む宿主細胞内で治療剤を産生するのに有用であり得る。
【００１１】
[0011]  第３の態様では、本発明は、対象における、例えばヒト患者を含む哺乳動物患者における疾患、障害、または状態を治療または予防するための方法を提供する。当該方法は、本発明の治療剤（または同治療剤を含む医薬組成物）を、これを必要とする対象または患者に有効量投与する工程を含む。例えば、患者は、表１に掲載する生物学的活性または好ましい効能を有する薬物を必要とし得る。特定の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬／ＥＬＰ化合物を用いて、またはインスリン／ＥＬＰ化合物を用いて、本発明は、１型または２型糖尿病、高血糖症、および耐糖能障害を含む１つまたは複数の障害を治療するための方法を提供する。そのほかの特定の実施形態では、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子／ＥＬＰ化合物を用いて、本発明は、血友病、術後出血、抗凝固剤誘発性出血、血小板減少症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、および頭蓋内出血を含む１つまたは複数の障害を治療するための方法を提供する。
【００１２】
[0012]  本発明の様々なそのほかの態様、特徴、および実施形態は、下記の開示および添付の特許請求の範囲からより徹底して明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】[0013]１０ユニットからなるＶＰＧＸＧ（配列番号３）繰返しモチーフを含むＥＬＰ成分をコードする、プラスミドｐＥＴ２４ｄ−ＥＬＰ１−９０を表す図であり、ゲスト位置（guest position）Ｘには、５：３：２の比でＶ、ＧおよびＡが配置される。このモチーフは８回繰り返され、最後にＣ末端で１０回のユニット繰返しがあり、このときＸには、４：３：２：１の比でＶ、Ｇ、ＡおよびＷが配置される。このＥＬＰ成分は、一般的に［（ＶＰＧＸＧ）１０］９として表される。
【図２Ａ】[0014]Ｎ末端エキセンジン−４成分を有するフレームにクローン化された、ＶＰＧＸＧ（配列番号３）繰返しモチーフ（図１の通り）を備えるＥＬＰ成分をコードする、プラスミドｐＥＴ２４ｄ−Ｅｘ−４  ＥＬＰ１−９０を表す図である。
【図２Ｂ】エキセンジン−４／ＥＬＰ融合体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号２３および２４）を表す図である。プライマー配列を示す（配列番号３５〜４０）。
【図３Ａ】[0015]Ｎ末端Ｔｅｖ（タバコエッチウィルス（TobaccoEtch virus）システインプロテアーゼ）切断部位を有するエキセンジン−４構築物のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号２５および２６）を表す図である。プライマー配列を示す（配列番号３８、４１、４２）。
【図３Ｂ】やはり、Ｎ末端Ｔｅｖ切断部位を有するが、さらに優れたプロテアーゼの標的とするために、Ｔｅｖ切断部位のＮ末端側に追加の配列を有するエキセンジン−４構築物のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号２７および２８）を表す図である。プライマー配列を示す（配列番号３８、４３、４４）。
【図４Ａ】[0016]図１〜３に示す通りであるが、細胞内周辺腔内への分泌を指令するようにＤｓｂＡリーダー配列を有するエキセンジン−４／ＥＬＰ融合体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号２９および３０）を表す図である。プライマー配列を示す（配列番号３８、４５、４６）。
【図４Ｂ】図４Ａの融合体をコードするプラスミドｐＥＴ２４ｄ−ＤｓｂＡ−Ｅｘ−４  ＥＬＰ１−９０を表す図である。
【図５Ａ】[0017]ＧＬＰ−１（A8G、７〜３７）ＥＬＰ１−９０をコードするｐＰＢ０８６８を表す図である。
【図５Ｂ−１】コードされた融合タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５３および５４）を表す図である。
【図５Ｂ−２】図５Ｂ−１の続きである。
【図５Ｂ−３】図５Ｂ−２の続きである。
【図６Ａ】[0018]ＧＬＰ−１（A8G、７〜３７）ＥＬＰ１−１２０をコードするｐＰＢ１０２２を表す図である。
【図６Ｂ−１】コードされた融合タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５５および５６）を表す図である。
【図６Ｂ−２】図６Ｂ−１の続きである。
【図６Ｂ−３】図６Ｂ−２の続きである。
【図７Ａ】[0019]第ＶＩＩ因子−ＥＬＰ１−９０をコードするｐＰＢ０７８８を表す図である。
【図７Ｂ−１】コードされた融合タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５７および５８）を表す図である。
【図７Ｂ−２】図７Ｂ−１の続きである。
【図７Ｂ−３】図７Ｂ−２の続きである。
【図７Ｂ−４】図７Ｂ−３の続きである。
【図７Ｂ−５】図７Ｂ−４の続きである。
【図７Ｂ−６】図７Ｂ−５の続きである。
【図８Ａ】[0020]フレーム内にクローン化されたＥＬＰ成分を有するインスリン（B、C、およびA鎖）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号３１および３２）を表す図である。プライマー配列を示す（配列番号４７および４８）。
【図８Ｂ】図８Ａのインスリン／ＥＬＰ融合体を発現するプラスミドｐＥＴ２４ｄ  インスリン−ＥＬＰ１−９０を表す図である。
【図９】[0021]一時的に形質移入されたＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３から得られたＦＶＩＩ−ＥＬＰ１−９０について、マウス抗ヒトＦＶＩＩモノクロナール抗体を用いて検出したウェスタンブロットの図である。各レーンは、（１）培地、（２）相転移により精製された後のＦＶＩＩ  ＥＬＰ１−９０、およびＦＶＩＩコントロール、である。
【図１０】[0022]エキセンジン−４／ＥＬＰ４−６０融合体の遺伝子組換え生成物を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。各レーンは、（Ｍ）タンパク質マーカー、（１）全溶解物に由来するエキセンジン−４  ＥＬＰ４−６０、（２）不溶性溶解物に由来するエキセンジン−４  ＥＬＰ４−６０、（３）可溶性溶解物に由来するエキセンジン−４  ＥＬＰ４−６０、（４）第１回転移に由来するエキセンジン−４  ＥＬＰ４−６０（容積不変）、（５）第２回転移に由来するエキセンジン−４  ＥＬＰ４−６０（濃縮済み）、（６）第３回転移に由来するエキセンジン−４  ＥＬＰ４−６０（濃縮済み）。
【図１１】[0023]第ＶＩＩａ因子−ＥＬＰ１−９０による、および比較として第ＶＩＩａ因子による、第Ｘ因子の活性化を示す図である。図示の通り、第ＶＩＩａ因子−ＥＬＰは全活性を保持している。
【図１２】[0024]第ＶＩＩａ因子−ＥＬＰ１−９０は、ラットにｉ．ｖ．経由で投与したときに、長いＰＫを有することを示す図である。第ＶＩＩａ因子の約４５〜６０分に比較して、第ＶＩＩａ因子（-ELP）は、約６９０分のＴ１／２を有する。
【図１３】[0025]エキセンジンペプチドの活性と比較して、ＧＬＰ１−ＥＬＰおよびエキセンジン−４−ＥＬＰでは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高活性を有することを示す図である。
【図１４】[0026]ＧＬＰ１−ＥＬＰは、ラットにｉ．ｖ．経由で投与したときに、約１２．９時間のＴ１／２を、また皮下（SQ）に投与したときには約８．６時間のＴ１／２を有することを示す図である。
【図１５】[0027]ＧＬＰ−１  ＥＬＰは、ウサギにｉ．ｖ．経由で投与したときに、約２０時間の、また皮下に投与したときには約２４時間の長い半減期を有することを示す図である。
【図１６】[0028]ＧＬＰ−１−ＥＬＰを用いることにより、糖尿病マウスで血糖管理が持続することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
[0029]  本発明は、エラスチン様ペプチド（ELP）（「ELP成分」）および治療成分を含む治療剤を提供する。治療成分は、表１から選択され得る（例えば、表１に掲載されている治療用タンパク質、またはその機能的部分またはその機能的アナログから選択される）。特定の実施形態では、治療成分は、ＧＬＰ−１もしくはエキセンジン−４などのＧＬＰ−１受容体作動薬であり、またはインスリン、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、もしくはこれらの機能的アナログであり得る。ＥＬＰ成分は、エラスチンタンパク質の配列に関連する、または由来する構造的ユニットを含み、かかるＥＬＰ成分は、ある種の治療上の長所、例えば治療成分の比較的良好な持続性、安定性、溶解性、生物学的利用能、半減期、および／または生物学的作用等をもたらす。かかる特性は、例えば、治療成分の融合していない、または結合していない対照物と対比させて判定可能である。本発明は、さらに、本発明の治療剤をコードするポリヌクレオチドのほか、表１に掲載されている好ましい効能を含む、とりわけ糖尿病（例えば１型および２型）、高血糖、出血、血友病、および大規模な出血（hemorrhage）を含む、特定の生物学的状態を治療または予防する方法を提供する。
【００１５】
[0030]  考察を確実に行う上で、参照し易くするように、本考察に現れるいくつかの用語の定義を下記に記載する。
【００１６】
[0031]  本明細書で用いる場合、用語「治療剤」または「治療成分」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物学的効果を誘発する能力を有する薬剤または成分を指す。生物学的効果は、対象または患者の状態、障害、または疾患を治療および／または予防するのに有用であり得る。
【００１７】
[0032]  本明細書で用いる場合、用語「結合した」とは、特定成分が、もう一つのものと直接共有結合で結合した状態（例えば、化学的結合、または遺伝子組換え融合技術により）、あるいはもう一方のものと、中間部分、またはブリッジ、スペーサー、もしくはリンカー等の部分を介して間接的に共有結合で結合した状態（例えば、化学的結合、または遺伝子組換え融合技術により）のいずれかを意味する。
【００１８】
[0033]  本明細書で用いる場合、「半減期」（これは一般的に、in vivoでの半減期、または循環半減期を意味する）とは、活性薬剤の生物活性が５０％消失するのに要する時間を指す。かかる用語は、活性薬剤が体内に留まる全体的な時間である「持続性」、および半減期および持続性を表す数値と相関性を有しても、有さなくてもよい、動的に変化する変数である「排除速度」と対比される。
【００１９】
[0034]  用語「機能的アナログ」とは、天然型タンパク質の活性アナログ（例えば、化学的アナログまたはタンパク質アナログのいずれか）、誘導体、断片、切断型異性体等であるタンパク質を指す。例えば、機能的アナログは、表１に掲載する治療用タンパク質の機能的アナログであり得、またはＧＬＰ−１受容体作動薬（例えば、GLP-1、エキセンジン）、インスリン、もしくは第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子の機能的アナログであり得る。ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏ分析法で、または１つもしくは複数の指標となるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析法で決定される、対応する天然型ポリペプチドの生物学的活性の一部または全部を保持するとき、活性である。活性を決定する、特定の治療用タンパク質に関する典型的な活性測定法を表１に掲載する。さらに、かかる生物学的活性、およびある分子が「機能的アナログ」であるかどうかを決定する、ＧＬＰ−１受容体作動薬、インスリン、および第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子の分析法は、本明細書の別の箇所に詳記されている。
【００２０】
[0035]  本明細書で用いる場合、用語「天然の」とは、アミノ酸配列を引用する場合には、当該アミノ酸配列は天然型タンパク質に見出されることを指す。
【００２１】
[0036]  本明細書で用いる場合、用語「スペーサー」とは、ＥＬＰ成分と治療成分との間に挿入され得る任意の部分、ペプチド、またはそのほかの化学的な部分を指す。例えば、スペーサーは、１つの末端でＥＬＰ成分と共有結合し、またもう一方の末端で治療成分と共有結合する２価の基であり得る。したがって、治療剤は、その意図する目的において、薬剤の有効性を阻害しない追加の化学構造を取り込むのに利用可能である。スペーサーは、例えば、薬剤の薬物動態を制御するために設けられるプロテアーゼ感受性スペーサー部分であり得、またはスペーサーはプロテアーゼ抵抗性部分であり得る。
【００２２】
[0037]  治療成分およびＥＬＰ成分は、治療剤がその意図する目的において有効であるように、またＥＬＰ成分が存在することにより、治療成分が何らかの機能的、治療的、または病理学的側面について増強されるように、化学カップリングおよび遺伝子組換え技術を含む、任意の適する共有結合様式で互いに結合可能である。例えば、ＥＬＰが結合した治療成分は、例として、その生物学的利用能、生物学的非利用能、治療有効量、生物学的作用、処方適合性、タンパク質分解またはそのほかの分解様式に対する抵抗性、溶解性、投与後の体内における半減期またはそのほかの持続性に関する指標、投与後に体内から排除される速度等について増強され得る。かかる増強は、例えば、結合していない、または融合していない対照治療剤と比較することにより決定可能である（例えば、表１に掲載する天然型GLP-1、エキセンジン、インスリン、または第VII/VIIa因子、または治療用タンパク質と比較して決定される）。
【００２３】
[0038]  いくつかの実施形態では、本発明の治療剤は、可溶形態で体内を循環し、または体内中に存在し、腎臓によるろ過を免れ、これにより活性な形態で体内に持続的に留まる。いくつかの実施形態では、本発明の治療剤は、腎臓からろ過されるカットオフ値と一般的に認められている分子量よりも小さい分子量、例えば約６０ｋＤ未満を有し、またはいくつかの実施形態では、約５５、５０、４５、４０、３０、または２０ｋＤａ未満であり、また結合していない（例えば、融合していない、または結合していない）治療剤対照物よりも体内に少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍長く滞留する。
【００２４】
[0039]  １分子当たりのＥＬＰ成分および／または治療成分の数、および分子中のそれらの各位置は、本発明の実施形態において変化し得る。例えば、薬剤が遺伝子組換え融合体である実施形態では、少なくとも１つのＥＬＰ成分は、Ｎ末端およびＣ末端のうちの一方、または両方に配置され得る。ＥＬＰ成分が、融合体のＮ末端およびＣ末端の両方にある場合には、ＥＬＰ成分は治療成分の両脇を固める。あるいは、治療成分が、Ｎ末端およびＣ末端のいずれか一方または両方に配置され得る。治療成分が、Ｎ末端およびＣ末端の両方にある場合には、治療成分はＥＬＰ成分の両脇を固める。さらなる実施形態では、異なる治療成分が、分子のＮ末端およびＣ末端に位置する。本明細書で詳細に考察するように、特定の実施形態では、かかる治療成分（複数可）は、スペーサー部分でタンパク質分解が生じてＥＬＰ成分と治療成分とが切り離されることにより放出され得る。特定の実施形態では、治療成分は、融合状態では不活性であるが、タンパク質分解によりＥＬＰ成分（複数可）から遊離すると活性となり得る。あるいは、治療成分は、融合状態にあっても活性のままであり、治療剤を生物学的に活性にするタンパク質分解プロセスを不要にしている。
【００２５】
[0040]  遺伝子組換え融合体として作製される場合には、治療剤は公知の遺伝子組換え発現技術により作製可能である。例えば、遺伝子組換え技術を用いて治療剤を作製するためには、かかる融合タンパク質をコードする核酸配列が、宿主細胞内で転写され、および／または翻訳されて所望の融合タンパク質となるように、キメラ遺伝子をコードする核酸配列を適するプロモーター配列に作動的に連結させる。好ましいプロモーターとして、Ｔ７  プロモーター等の大腸菌（E. coli）中での発現に有用なものが挙げられる。真核生物系または原核生物系を含む、一般的に用いられている任意の発現系を用いることができる。具体例として、酵母菌（例えば、サッカロミセス属の種（Saccharomyces spp．）、ピキア属の種（Pichia spp．））、バキュロウィルス、哺乳動物系、および大腸菌やカウロバクター等の細菌系が挙げられる。
【００２６】
[0041]  本発明の様々な態様および実施形態を、下記のセクションでさらに詳細に記載する。
【００２７】
エラスチン様ペプチド（ELP）成分
[0042]  本発明の治療剤は、１つまたは複数のＥＬＰ成分を含み得る。ＥＬＰ成分は、エラスチンタンパク質に関連する、または由来する構造的なペプチドユニットもしくは配列を含み、またはそれらから構成される。かかる配列は、表１に掲載されているもののほか、ＧＬＰ−１受容体作動薬（例えば、GLP-1またはエキセンジン-4）、インスリン、および第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子等の、治療用タンパク質の特性を、生物学的利用能、治療有効量、生物学的作用、処方適合性、タンパク質分解に対する抵抗性、溶解性、投与後の体内における半減期またはそのほかの持続性に関する指標、および／または体内から排除される速度のうちの１つまたは複数において改善するのに有用である。
【００２８】
[0043]  ＥＬＰ成分は、３〜約２０個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態では４〜１０個、例えば５個または６個のアミノ酸からなる構造的ユニットから構成される。特定のＥＬＰ成分では、個々の構造的ユニットの長さは変化してもよく、また一定であってもよい。特定の実施形態では、ＥＬＰ成分は、ポリテトラ−、ポリペンタ−、ポリヘキサ−、ポリヘプタ−、ポリオクタ−、およびポリノナペプチドモチーフを繰り返す構造的ユニットから構成される。典型的な構造的ユニットとして、配列番号１〜１２（下記）で定義されるユニットが挙げられ、これらは、治療成分の特性を改善するのに有効なＥＬＰを作り出すために、タンデム式の繰返しユニットを含む繰返しの構造的ユニットとして利用してもよく、またいくつかを組み合わせたものを利用してもよい。したがって、ＥＬＰ成分は、下記に定義するような配列番号１〜１２から選択される構造的ユニット（複数可）を含み、またはかかるユニットから実質的に構成され得る。
【００２９】
[0044]  かかる構造的ユニットを含むＥＬＰ成分は、サイズが異なってもよい。例えば、ＥＬＰ成分は、配列番号１〜１２で定義されるユニットの１つ、または組合せを含む、約１０〜約５００個の構造的ユニット、または特定の実施形態では約１５〜約１５０個の構造的ユニット、または特定の実施形態では約２０〜約１００個の構造的ユニット、または約５０〜約９０個の構造的ユニットを含み得、またはかかるユニットから実質的に構成され得る。したがって、ＥＬＰ成分は、約５０〜約２０００個のアミノ酸残基、または約１００〜約６００個のアミノ酸残基、または約２００〜約５００個のアミノ酸残基、または約２００〜約４００個のアミノ酸残基からなる長さを有し得る。
【００３０】
[0045]  いくつかの実施形態では、ＥＬＰ成分、または場合によっては、治療剤は、約６５ｋＤａ未満、または約６０ｋＤａ未満、または約５５ｋＤａ未満、または約５０ｋＤａ未満、または約４０ｋＤａ未満、または約３０ｋＤａもしくは２５ｋＤａ未満のサイズを有する。３つの主要な血液タンパク質である、ヒト血清アルブミン（HSA）、トランスフェリン（Tf）、およびＩｇＧ、またはグリコシル化された形態のＩｇＧのＦｃ部分は、治療用途の改善を狙いとして、タンパク質およびペプチドの半減期を延ばすために活用されてきた。かかる分子は、５８５、６７９、および４８０アミノ酸長であり、それぞれ、約６６、７７、および〜７５ｋＤａ（グリコシル化部分を含む）の分子量を与える。これらは、それぞれ球形で、比較的コンパクトである。これら分子の半減期は、荷電分布、新生児型Ｆｃ受容体（FcRn）（HSAおよびFc）による、またはＴｆ受容体（TfR）を介したＴｆの循環による分子の修復、および腎臓糸球体からのろ過を阻止する分子サイズを含め、いくつかの因子で決定される。ＨＳＡは、腎臓からろ過されると一般的にみなされているカットオフ値（約７０ｋＤａ）よりも若干小さいが、その荷電分布がろ過を阻止するのに役立っている。ＨＳＡ、Ｔｆ、およびＦｃで達成されているのと同程度に半減期を伸ばすためには、タンパク質として少なくともこのような分子量範囲、すなわち５５０個を超えるアミノ酸を有し、つまり６５ｋＤａを超えることが必要または望ましいと予想される。しかし、ＨＳＡ、Ｔｆ、およびＦｃに比較してアミノ酸の数が少なく（例えば、約300〜400個の範囲）、約３０〜４０ｋＤａのＥＬＰでも、ＨＳＡ、Ｔｆ、およびＦｃに匹敵する、および／または凌駕する半減期を有し得る。
【００３１】
[0046]  いくつかの実施形態では、非転移状態にあるＥＬＰ成分は、拡張した、比較的非構造的で、非球形の形態を有することができ、したがって、かかる分子は、ＨＳＡ、Ｔｆ、およびＦｃと比較して大きく広がった、腎臓でのろ過を免れるような構造を有することができる。かかる実施形態では、本発明の治療剤は、腎臓からろ過されると一般的にみなされているカットオフ値よりも小さい分子量、例えば約６０ｋＤ未満、またはいくつかの実施形態では約５５、５０、４５、４０、３０、または２５ｋＤａ未満の分子量を有し、また結合していない（例えば、融合していない、または結合していない）治療剤対照物よりも体内に少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍長く滞留する。
【００３２】
[0047]  特定の実施形態では、ＥＬＰ成分は可逆的逆相転移を引き起こす。すなわち、ＥＬＰ成分は、転移温度（Tt）以下では構造的に不規則で、極めて水に溶け易いが、温度がＴｔよりも上昇すると、不規則状態から規則状態へと鋭敏な（２〜３℃の範囲）相転移を示し、ＥＬＰ成分の脱溶媒和および凝集を引き起こす。例えば、ＥＬＰは十分な大きさに達すると不溶性ポリマーを形成し、これは遠心分離により溶液から容易に除去および分離され得る。かかる相転移は可逆的で、分離された不溶性のＥＬＰは、温度がＥＬＰのＴｔよりも低い状態に戻ると、バッファー溶液中に完全に再溶解可能となる。したがって、いくつかの実施形態では、逆転移サイクリング手順を用いて、例えば、温度依存性の治療剤溶解度を利用して、または媒体に塩を添加して、本発明の治療剤を、別の汚染タンパク質から高純度で分離することができる。高純度を実現するために、逆相転移サイクルを連続して利用することも可能である。温度やイオン強度に加えて、治療剤の逆転移を調節するのに有用なそのほかの環境変数として、ｐＨ、無機性および有機性の溶質および溶媒の添加、側鎖のイオン化または化学修飾、および圧力が挙げられる。
【００３３】
[0048]  特定の実施形態では、ＥＬＰ成分は可逆的逆相転移を引き起こさない、または生物学的に関連するＴｔでかかる転移を引き起こさず、したがって分子の生物学的および／または生理学的特性の改善は（本明細書の別の箇所に記載するように）、あらゆる相転移特性とは完全にまたは実質的に独立であり得る。しかし、かかる相転移特性により、さらなる実用的長所が、例えばかかる分子の回収および精製に関連してもたらされ得る。
【００３４】
[0049]  特定の実施形態では、ＥＬＰ成分（複数可）は構造的ユニットから形成可能で、かかるユニットとして下記のものが、非限定的に挙げられる：
（ａ）テトラペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＧ（配列番号１）；
（ｂ）テトラペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＩＰＧＧ（配列番号２）；
（ｃ）ペンタペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号３）またはＶＰＧＸＧ、ここでＸは、天然または非天然の任意のアミノ酸残基であり、またＸは任意選択により、ポリマーの繰返しまたはオリゴマーの繰返しの中で変化する；
（ｄ）ペンタペプチドＡｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、またはＡＶＧＶＰ（配列番号４）；
（ｅ）ペンタペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ、またはＩＰＧＸＧ（配列番号５）、ここでＸは、天然または非天然の任意のアミノ酸残基であり、またＸは任意選択により、ポリマーの繰返しまたはオリゴマーの繰返しの中で変化する；
（ｅ）ペンタペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＩＰＧＶＧ（配列番号６）；
（ｆ）ペンタペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ、またはＬＰＧＸＧ（配列番号７）、ここでＸは、天然または非天然の任意のアミノ酸残基であり、またＸは任意選択により、ポリマーの繰返しまたはオリゴマーの繰返しの中で変化する；
（ｇ）ペンタペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＬＰＧＶＧ（配列番号８）；
（ｈ）ヘキサペプチドＶａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＶＡＰＧＶＧ（配列番号９）；
（Ｉ）オクタペプチドＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＧＶＧＶＰＧＶＧ（配列番号１０）；
（Ｊ）ノナペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＦＧＶＧＡＧ（配列番号１１）；および
（Ｋ）ノナペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＶＧＶＰＧＧ（配列番号１２）。
配列番号１〜１２で定義されるかかる構造的ユニットは、構造的繰返しユニットを形成することができ、または本発明に基づきＥＬＰ成分を形成するために組み合わせて用いることができる。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ成分は、配列番号１〜１２から選択される構造的ユニットのうちの１つまたは組み合わせたもの（例えば、2、3、または4個を）から、全体的に（またはほぼ全体的に）形成される。別の実施形態では、ＥＬＰ成分の少なくとも７５％、または少なくも８０％、または少なくとも９０％は、配列番号１〜１２から選択される構造的ユニットのうちの１つまたは組み合わせたものから形成され、これらは繰返しユニットとして存在し得る。
【００３５】
[0050]  特定の実施形態では、ＥＬＰ成分（複数可）は繰返しユニットを含むが、これには、Ｘが上記で定義された通りであり、またＥＬＰ成分全体（ＶＰＧＸＧ（配列番号３）以外の構造的ユニットを含み得る）に占めるＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号３）ペンタペプチドユニットの割合（%）が、ＥＬＰ成分の約７５％を超える、または約８５％を超える、または約９５％を超えるような、ペンタペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号３）のタンデム式繰返しユニットが含まれる。ＥＬＰ成分は、配列番号３のペンタペプチドからなる５〜１５回のユニット繰返し（例えば、約10回のユニット繰返し）を有するモチーフを含むことができ、ゲスト残基Ｘは、複数あるユニットのうち少なくとも２つ、または少なくとも３つのユニット中で変化する。ゲスト残基は、アミノ酸Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｇ、およびＷ等から独立に選択され得る（および、所望の逆相転移特性を保持するように選択され得る）。繰返しモチーフそのものは、典型的なＥＬＰ成分を作り出すために、約８〜１０回等、例えば約５〜約１２回繰り返され得る。本パラグラフで記載するように、ＥＬＰ成分は、当然ながら配列番号１〜１２で定義される構造的ユニットの任意の１つ、またはこれらを組み合わせたものから構成され得る。
【００３６】
[0051]  いくつかの実施形態では、ＥＬＰ成分はβ−ターン構造を含み得る。β−ターン構造を生み出すのに適する典型的なペプチド配列は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ第９６／０５１８６号に記載されており、その全体を本明細書において、参考として援用する。例えば、β−ターン形成を阻害しないで、エラスチンペンタペプチド配列、ＶＰＧＸＧ（配列番号３）の４番目の残基（Ｘ）を変更することができる。あるいは、ＥＬＰ成分は、β−ターンを欠いてもよく、またさもなければ異なる立体構造および／または折りたたみの特徴を有してもよい。
【００３７】
[0052]  特定の実施形態では、ＥＬＰ成分は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）からなるポリマーの繰返しまたはオリゴマーの繰返しを含み、その場合、ゲスト残基Ｘは任意のアミノ酸である。Ｘは、天然のアミノ酸であっても、また非天然のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｘは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから選択される。いくつかの実施形態では、Ｘは、プロリンまたはシステイン以外の天然のアミノ酸である。
【００３８】
[0053]  ゲスト残基Ｘは（例えば、配列番号３、またはそのほかのＥＬＰの構造的ユニットについて）、非古典的（非遺伝的にコードされた）アミノ酸であり得る。非古典的アミノ酸の例として、一般的なアミノ酸のＤ型異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、Ａ−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、ザルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸等のデザイナーアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸アナログが挙げられる。
【００３９】
[0054]  Ｘの選択は、ＥＬＰの各構造的ユニット間で独立である（例えば、本明細書で定義する各構造的ユニットについてゲスト残基Ｘを有する）。例えば、Ｘは、各構造的ユニットについて、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸、またはいくつかの実施形態における疎水性側鎖を含む中性の側鎖を有するアミノ酸として、独立に選択され得る。
【００４０】
[0055]  なおも別の実施形態では、ＥＬＰ成分（複数可）は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）、ＩＰＧＸＧ（配列番号５）、またはＬＰＧＸＧ（配列番号７）、またはこれらを組み合わせたものからなるポリマーまたはオリゴマーの繰返しを含むことができ、Ｘは上記定義の通りである。
【００４１】
[0056]  各実施形態では、ＥＬＰ配列の構造的ユニット、または場合によってはポリマーもしくはオリゴマーの繰返しは、分子の全体的な効果を阻害しない、すなわち上記のような治療成分に特定の改善を付与する際に阻害しない、１つまたは複数のアミノ酸残基によって分離され得る。特定の実施形態では、かかる１つまたは複数のアミノ酸は、ＥＬＰ成分の相転移特性も阻害しない、またはこれに実質的に影響を及ぼさない（かかる1つまたは複数のアミノ酸を欠くものと比較して）。
【００４２】
[0057]  各繰返しにおいて、Ｘは独立に選択される。得られたＥＬＰ成分の構造は、表記法ＥＬＰｋ［ＸｉＹｊ−ｎ］を用いて記載可能であり、ここでｋは特定のＥＬＰ繰返しユニットを表し、カッコ内の大文字は一文字表記法によるアミノ酸コードであり、対応する下付き文字は、構造的ユニット内の各ゲスト残基Ｘの相対的な比を表し（該当する場合）、およびｎはＥＬＰの全長を構造的な繰返しの数で記載する。例えば、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）からなる１０回繰返しユニットを含むＥＬＰ成分を表し、Ｘは５：２：３の相対比でバリン、アラニン、およびグリシンである；ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）からなる４回繰返しユニットを含むＥＬＰ成分を表し、Ｘは１：２：１の相対比でリジン、バリン、およびフェニルアラニンである；ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）からなる９回繰返しユニットを含むポリペプチドを表し、Ｘは１：７：１の相対比でリジン、バリン、およびフェニルアラニンである；ＥＬＰ１［Ｖ−５］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）からなる５回繰返しユニットを含むポリペプチドを表し、Ｘはもっぱらバリンである；ＥＬＰ１［Ｖ−２０］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）からなる２０回繰返しユニットを含むポリペプチドを表し、Ｘはもっぱらバリンである；ＥＬＰ２［５］は、ペンタペプチドＡＶＧＶＰ（配列番号４）からなる５回繰返しユニットを含むポリペプチドを表す；ＥＬＰ３［Ｖ−５］は、ペンタペプチドＩＰＧＸＧ（配列番号５）からなる５回繰返しユニットを含むポリペプチドを表し、Ｘはもっぱらバリンである；ＥＬＰ４［Ｖ−５］は、ペンタペプチドＬＰＧＸＧ（配列番号７）からなる５回繰返しユニットを含むポリペプチドを表し、Ｘはもっぱらバリンである。本パラグラフに記載するような、かかるＥＬＰ成分は、治療成分の治療特性を増大させるために、本発明に関連して利用可能である。
【００４３】
[0058]  さらに、Ｔｔは、ゲスト残基の疎水性の関数である。したがって、ゲスト残基（複数可）のアイデンティティー、およびそのモル分率（複数可）を変えることにより、０〜１００℃の範囲で逆転移を示すＥＬＰを合成することができる。したがって、あるＥＬＰ長におけるＴｔは、ＥＬＰ配列中の疎水性ゲスト残基をより大きな割合で組み込むことにより低下させることができる。適する疎水性ゲスト残基の例として、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。中程度に疎水性のチロシンも利用可能である。反対に、Ｔｔは、グルタミン酸、システイン、リジン、アスパラギン酸、アラニン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グリシン、アルギニン、およびグルタミンからなる群より選択される、好ましくは、アラニン、セリン、トレオニン、およびグルタミン酸から選択される残基等を組み込むことにより上昇し得る。
【００４４】
[0059]  いくつかの実施形態のＥＬＰ成分は、約１０〜約８０℃、例えば、約３５〜約６０℃、または約３８〜約４５℃の範囲にあるＴｔをもたらすように選択、または設計される。いくつかの実施形態では、Ｔｔは約４０℃より高く、または約４２℃より高く、または約４５℃より高く、または約５０℃より高い。いくつかの実施形態では、転移温度は、対象または患者の体温よりも高く（例えば＞３７℃）、これによりｉｎ  ｖｉｖｏで可溶性が維持されるが、または別の実施形態では、Ｔｔは体温よりも低く（例えば、＜３７℃）、別の長所がもたらされ、例えば治療剤が持続的に放出されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬物デポーを形成する。
【００４５】
[0060]  Ｔｔは一般的にＭＷの減少と共に上昇するので、ＥＬＰ成分のＴｔは、ＥＬＰの鎖長を変化させることにより調整可能である。分子量が１００，０００を超えるポリペプチドの場合、Ｕｒｒｙらが開発した疎水性の尺度（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５１８６号、その全体を、本明細書において参考として援用する）が、特定のＥＬＰ配列に関するおよそのＴｔを予測するのに好ましい。しかし、いくつかの実施形態では、ＥＬＰ配列中に疎水性のゲスト残基（例えば、疎水性の側鎖を有するアミノ酸残基）をより大きな割合で組み込むことにより、目標とするＴｔを維持しながらＥＬＰ成分の長さを比較的短く保つことが可能である。分子量が１００，０００未満のポリペプチドの場合、Ｔｔは、下記の二次方程式により予測または決定可能である：Ｔｔ＝Ｍｏ＋Ｍ１Ｘ＋Ｍ２Ｘ２、式中Ｘは融合タンパク質のＭＷであり、Ｍ0＝１１６．２１、Ｍ１＝−１．７４９９、Ｍ２＝０．０１０３４９である。
【００４６】
[0061]  ＥＬＰ成分の、したがって治療成分と結合したＥＬＰ成分のＴｔは、ゲスト残基Ｘのアイデンティティーと疎水性により影響されるが、分子のさらなる特性も影響を受け得る。かかる特性として、分子の溶解度、生物学的利用能、持続性、および半減期が挙げられ、ただし、これらに限定されない。
【００４７】
[0062]  国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第２００７／０７７７６７号（国際公開第２００８／０３０９６８号として公表済み）をそのまま、本明細書において参考として援用するが、これに記載されているように、ＥＬＰが結合した治療成分は、当該治療成分の生物学的活性を保持し得る。さらに、ＥＬＰそれ自身は、長期半減期を示し得る。したがって、本発明に基づくＥＬＰ成分は治療成分と結合すると、当該治療成分の半減期を実質的に（例えば、特定の実施形態では、１０％、２０％、３０％、５０％、１００％、２００％、５００％以上長く）増加させる。かかる半減期（または、いくつかの実施形態では、持続性もしくは排除速度）は、治療成分のフリーの（結合していない、または融合していない）形態の半減期と比較して決定される。さらに、ＥＬＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏでこれを投与したときに、血液を多く含む器官を標的とすることができ、したがって、身体の様々な器官または部位において事前に決定された所望の物質的な分布を実現し、または治療剤の所望の選択性もしくはターゲティングを実現するように、体内で分配可能である。要するに、本発明で検討される治療剤は、本明細書に記載するそのほかの潜在的有益性の中でも、とりわけ半減期（例えば、循環半減期）が延長した活性組成物として投与され、またはｉｎ  ｖｉｖｏで生み出される。
【００４８】
[0063]  したがって、本発明は、治療成分が生物学的に活性であるような治療（in vivoで）用途のための様々な薬剤を提供する。かかる治療成分として、表１に掲載されているもの（例えば、全長または機能的部分またはその機能的アナログ）のほか、ＧＬＰ−１もしくはエキセンジン−４等のＧＬＰ−１受容体作動薬、インスリン、または第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、およびこれらの機能的アナログが挙げられる。かかる治療成分の構造および活性を、以下に詳記する。治療剤のいくつかの形態において、治療成分をＥＬＰ成分に結合させる場合、それは、直接的な共有結合、または間接的な（適当なスペーサー基を介した）結合により達成される（本明細書の別の箇所で記載するように）。さらに、治療成分（複数可）およびＥＬＰ成分（複数可）は、かかる直接的または間接的な共有結合を含む任意の適する方法で、互いに隣接して構造的に配置され得る。
【００４９】
グルカゴン様ペプチド（GLP）−１受容体作動薬
[0064]  本発明の特定の実施形態では、治療剤はＧＬＰ−１、エキセンジン−４、またはこれらの機能的アナログ等のＧＬＰ−１受容体作動薬と融合した、または結合したＥＬＰ成分を含む。
【００５０】
[0065]  ヒトＧＬＰ−１は、遠位回腸、膵臓、および脳内に存在するＬ−細胞中で合成されるプレプログルカゴンに由来する３７アミノ酸残基ペプチドである。ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド、ＧＬＰ−１（７〜３７）、およびＧＬＰ−２を与えるプレプログルカゴンのプロセッシングは、主にＬ−細胞内で生じる。簡便なシステムが、このペプチドの断片およびアナログを記載するために用いられる。例えば、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７〜３７）は、アミノ酸残基第１番目〜第６番目を取り除き、天然のアミノ酸残基である第８番目（Ala）をＧｌｙに置換することにより、ＧＬＰ−１から形式的に誘導されたＧＬＰ−１の断片を表す。同様に、Ｌｙｓ３４（Ｎε−テトラデカノイル）−ＧＬＰ−１（７〜３７）は、３４位のＬｙｓ残基のε−アミノ基がテトラデカノイル化されているＧＬＰ−１（７〜３７）を表している。本明細書においてＣ末端が伸長されたＧＬＰ−１アナログと言えば、３８位のアミノ酸残基は、別途指示がない限りＡｒｇであり、３９位の任意選択的なアミノ酸残基も、別途指示がない限りＡｒｇであり、そして４０位の任意選択的なアミノ酸残基は、別途指示がない限りＡｓｐである。また、Ｃ末端が伸長されたアナログが、４１、４２、４３、４４または４５位にまで伸長する場合には、この伸長部のアミノ酸配列は、別途指示がない限りヒトプレプログルカゴンにおける対応する配列の通りである。
【００５１】
[0066]  ＧＬＰ−１の親ペプチドであるプログルカゴン（PG）は、由来とする組織に依存して様々なペプチド生成物を生み出すいくつかの切断部位を有し、これには、膵臓でのグルカゴン（PG［３２〜６２］）およびＧＬＰ−１［７〜３６］ＮＨ２（PG［７２〜１０７］）、ならびにＧＬＰ−１［７〜３６］ＮＨ２（７８〜１０７PG）が主要生成物である、腸のＬ細胞でのＧＬＰ−１［７〜３７］（PG［７８〜１０８］）およびＧＬＰ−１［７〜３６］ＮＨ２（PG［７８〜１０７］）が含まれる。本発明に基づくＧＬＰ−１成分は、プログルカゴンの任意の生物学的に活性な生成物もしくは誘導体、またはこれらの機能的アナログであり得、これには、ＧＬＰ−１（１〜３５）、ＧＬＰ−１（１〜３６）、ＧＬＰ−１（１〜３６）アミド、ＧＬＰ−１（１〜３７）、ＧＬＰ−１（１〜３８）、ＧＬＰ−１（１〜３９）、ＧＬＰ−１（１〜４０）、ＧＬＰ−１（１〜４１）、ＧＬＰ−１（７〜３５）、ＧＬＰ−１（７〜３６）、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド、ＧＬＰ−１（７〜３７）、ＧＬＰ−１（７〜３８）、ＧＬＰ−１（７〜３９）、ＧＬＰ−１（７〜４０）、およびＧＬＰ−１（７〜４１）、または上記のアナログが含まれる。一般的に、いくつかの実施形態のＧＬＰ−１成分はＧＬＰ−１（A-B）として表される場合があり、その場合Ａは１〜７の整数、Ｂは３８〜４５の整数であり、任意選択により、下記に定義する１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。
【００５２】
[0067]  全体として、腸内Ｌ細胞中で処理されたのち、ＧＬＰ−１は、特に食事に応答して循環系に放出される。ＧＬＰ−１の血漿濃度は、空腹時レベルの約１５ｐｍｏｌ／Ｌから食後ピークレベルの４０ｐｍｏｌ／Ｌまで上昇する。血漿グルコース濃度の所与の上昇につき、グルコースを経口投与した場合には、静脈内投与した場合と比較して血漿インスリンは約３倍増加する（Kreymannら、1987年、Lancet、第2（8571）巻：1300〜4頁）。インスリン放出のかかる消化増強効果は、インクレチン効果として公知で、主に体液性であり、またＧＬＰ−１は、今日、ヒトでの最も強力な生理的インクレチンと考えられている。ＧＬＰ−１は膵臓β細胞中で発現していることが公知のＧＬＰ−１受容体に結合することにより、インスリンの産生を調節している。インスリン分泌促進作用のほか、ＧＬＰ−１は、グルカゴン分泌を抑制し、胃内容物排出を遅延させ（Wettergrenら、1993年、DigDis Sci、第３8巻；665〜73頁）、また末梢グルコース処理を増大させ得る（D'Alessioら、1994年、J. Clin Invest、第93巻：2293〜6頁）。
【００５３】
[0068]  作用が組み合わさることにより、インスリン非依存性糖尿病（NIDDM）を治療するために現在用いられているそのほかの薬剤に対して、ＧＬＰ−１特有の治療上の長所がもたらされる。第１に、ＧＬＰ−１を単回皮下投与すると、ＮＩＤＤＭ患者の食後グルコースレベルを、完全に正常化することができる（Gutniakら、1994年、DiabetesCare、第17巻：1039〜44頁）。この効果は、インスリン放出量の増加、およびグルカゴン分泌量の低下の両方によって調節され得る。第２に、ＧＬＰ−１を静脈内に輸液すると、ＮＩＤＤＭ患者の食後胃内容物排出を遅延させることができる（Williamsら、1996年、J.Clin Endo Metab、第81巻：327〜32頁）。第３に、スルホニル尿素とは異なり、ＧＬＰ−１のインスリン分泌促進作用は、血漿グルコース濃度に依存する（Holz etら、1993年、Nature、第３61巻：362〜5頁）。したがって、血漿グルコース濃度が低下するとＧＬＰ−１媒介インスリン放出量が減少するので、重度の低血糖に陥るのを防ぐ。
【００５４】
[0069]  健常者に投与すると、ＧＬＰ−１は、血糖レベルのほか、インスリン濃度およびグルカゴン濃度（Orskov、1992年、Diabetologia、第３5巻：701〜11頁）、グルコース依存性の効果（Weirら、1989年、Diabetes、第３8巻：338〜342頁）に強く影響を及ぼす。さらに、ＧＬＰ−１は糖尿病患者に有効であり（Gutniak, M.、1992年、N.Engl J Med、第226巻：1316〜22頁）、２型糖尿病患者の血糖レベルを正常化し、１型糖尿病患者の血糖管理を改善する（Nauckら、1993年、Diabetologia、第３6巻：741〜4頁、Creutzfeldtら、1996年、DiabetesCare、第19巻：580〜6頁）。
【００５５】
[0070]  しかし、ＧＬＰ−１は、代謝的に不安定で、血漿半減期（ｔ1/2）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでわずか１〜２分にすぎない。さらに、体外から投与されたＧＬＰ−１は、急速に分解もする（Deaconら、1995年、Diabetes、第44巻：1126〜3１頁）。この代謝的不安定性は、天然型ＧＬＰ−１の治療潜在能力を限定的なものにしている。
【００５６】
[0071]  ＧＬＰ−１［７〜３６］ＮＨ２は、アミノ酸配列：ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ（配列番号１３）を有し、これは、本発明に基づくＧＬＰ−１成分として利用可能である。あるいは、ＧＬＰ−１成分は、第２位にグリシン（Ｇ）を含み得、例えば、配列ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ（配列番号１７）を与える。ＧＬＰ−１成分は、例えば、米国特許第２００７／００４１９５１号に開示するようなＧＬＰ−１の生物学的に活性な断片であり得、同特許をそのまま本明細書において参考として援用する。ＧＬＰ−１のそのほかの断片、および改変された配列が、当技術分野において公知である（米国特許第５，６１４，４９２号；同第５，５４５，６１８号；欧州特許出願公開第０６５８５６８  Ａ１号；国際公開第９３／２５５７９号、これらをそのまま、本明細書において参考として援用する）。かかる断片、および改変された配列は、本発明のほか下記に記載されているものに関連して利用可能である。
【００５７】
[0072]  ＧＬＰ−１の特定の構造的および機能的アナログが、アメリカドクトカゲ（HelodermasuspectumおよびHeloderma horridum）の毒液から単離され、臨床的有用性が示された。かかる分子は、本発明に基づき利用できることが分かる。特に、エキセンジン−４は、アメリカドクトカゲ（Heloderma suspectum）の毒液から単離されたアミノ酸３９残基からなるペプチドで、ヒトＧＬＰ−１と約５２％の相同性を共有する。エキセンジン−４は、インスリンの放出を刺激し、これにより血糖レベルを低下させる、強力なＧＬＰ−１受容体作動薬である。エキセンジン−４は、アミノ酸配列：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１４）を有する。エキセナチド（exenatide）（Byetta（登録商標）として市販されている）として公知のエキセンジン−４の合成バージョンは、２型糖尿病を治療するために承認されている。エキセナチドは、天然型ＧＬＰ−１の構造的アナログであるが、注入後の半減期は長い。
【００５８】
[0073]  エキセナチドは、それ自身血糖レベルを下げる能力を有するが、またそのほかの医薬品、例えば血糖管理を改善するメトホルミン、チオゾリジンジオン（thiozolidinedione）、スルホニル尿素、および／またはインスリンとの併用も可能である。エキセナチドは、事前充填済みのペン型デバイスを用いて、皮下注射により１日２回投与される。エキセナチドに対するヒトの典型的な反応として、内因性インスリンの初期迅速放出の改善、β−細胞の増殖および複製の増加、膵臓によるグルカゴン放出の抑制、胃内容物排出の遅延、および食欲の低下が挙げられ、これらはすべて血糖を下げるように働く。スルホニル尿素やメグリチニドとは異なり、エキセナチドは、グルコースが存在するときにのみ、インスリンの合成および分泌を増加させ、したがって低血糖のリスクを低下させる。エキセナチドは治療上有効であるものの、１日２回の注射を必要とすること、消化器系の副作用があること、および天然型ＧＬＰ−１と同様に半減期が比較的短いこと（すなわち、約2時間）を含むある種の難点を有する。
【００５９】
[0074]  ＧＬＰ−１およびエキセンジン−４の様々な機能的アナログが公知で、本発明に基づき利用できることが分かる。これらには、リラグルチド（Novo Nordisk、国際公開第９８／００８８７１号）、Ｒ１５８３／タスポグルチド（taspoglutide）（Roche、国際公開第００／０３４３３１号）、ＣＪＣ−１１３１（ConjuChem、国際公開第００／０６９９１１号）、ＺＰ−１０／ＡＶＥ００１０（Zealand Pharma、Sanofi-Aventis、国際公開第０１／００４１５６号）、およびＬＹ５４８８０６（Eli Lilly、国際公開第０３／０１８５１６号）が含まれる。
【００６０】
[0075]  ＮＮ２２１１としても公知のリラグルチドは、１日１回注射用として設計されているＧＬＰ−１受容体作動薬アナログである（Harderら、2004年、DiabetesCare、第27巻：1915〜21頁）。リラグルチドは、２型糖尿病の患者を対象に、いくつかの試験でテストされ、様々な期間にわたり有効であることが示された。１つの試験では、リラグルチドを用いた治療は、１週間の治療後、２型糖尿病の患者において、血糖管理を改善し、β−細胞の働きを改善し、および内因性のグルコース放出を低下させた（Degnら、2004年、Diabetes、第53巻：1187〜94頁）。同様の試験では、０．６−ｍｇリラグルチド治療を８週間行うと、プラセボの被験者と比較して、２型糖尿病の被験者では、体重増加を伴わないで血糖管理が顕著に改善した（Harderら、2004年、DiabetesCare、第27巻：1915〜21頁）。
【００６１】
[0076]  したがって、特定の実施形態では、本発明に基づくＧＬＰ−１受容体作動薬は、国際公開第９８／００８８７１号に記載の通りであり、その全体を本明細書において参考として援用する。ＧＬＰ−１受容体作動薬は、天然型ＧＬＰ−１に対する１つ、２つ、またはこれ以上のアミノ酸置換基に加えて、少なくとも１つの親油性置換基を有することができる。例えば、親油性置換基は、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−から選択されるアシル基であり得、ｎは４〜３８、例えば４〜２４の整数である。親油性置換基は、直鎖または分岐したアルキルまたは脂肪酸からなるアシル基であり得る（例えば、国際公開第98/008871号に記載されている通りであり、これを本明細書において参考として援用する）。
【００６２】
[0077]  特定の実施形態では、ＧＬＰ−１成分は、Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７〜３８）、Ａｒｇ２８，３４Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７〜３９）、Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０−ＧＬＰ−１（７〜４０）、Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７〜３９）、Ａｒｇ３４Ｌｙｓ４０−ＧＬＰ−１（７〜４０）、Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３９−ＧＬＰ−１（７〜３９）、Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，４０−ＧＬＰ−１（７〜４０）、Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ｇｌｙ８Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７〜３９）、Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０−ＧＬＰ−１（７〜４０）、Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７〜３９）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４Ｌｙｓ４０−ＧＬＰ−１（７〜４０）、Ｇｌｙ８Ａｒｇ２８，３４Ｌｙｓ３６，３９−ＧＬＰ−１（７〜３９）、およびＧｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３５，４０−ＧＬＰ−１（７〜４０）であり、それぞれ任意選択により親油性置換基を有する。例えば、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、配列／構造Ａｒｇ３４Ｌｙｓ２６−（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル）））−ＧＬＰ−１（７〜３７）を有し得る。
【００６３】
[0078]  Ｒ１５８３またはＢＩＭ５１０７７としても公知のタスポグルチドは、メトホルミンで治療された２型糖尿病の被験者の血糖管理を改善し、体重を下げることが示されたＧＬＰ−１受容体作動薬である（Abstract No. A-1604、2008年6月7日、68th AmericanDiabetes Association Meeting、San Francisco、CA）。
【００６４】
[0079]  したがって、特定の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、国際公開第００／０３４３３１号に記載されている通りであり、その全体を、本明細書において参考として援用する。ある典型的な実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、配列［Ａｉｂ８，３５］ｈＧＬＰ−１（７〜３６）ＮＨ２（例えば、タスポグルチド）を有し、Ａｉｂはα−アミノイソブチル酸である。
【００６５】
[0080]  ＣＪＣ−１１３１は、ＧＬＰ−１アナログであり、ＧＬＰ−１が、皮下注射後に血清アルブミンと共有結合による不可逆的な結合を形成するのを可能にする反応性化学リンカー基と結合した、ＧＬＰ−１のＤＰＰ−ＩＶ−抵抗形態からなる（Kimら、2003年、Diabetes、第52巻：751〜9頁）。１２週間の、ランダム化、二重盲検、プラセボ対照多施設試験で、ＣＪＣ−１１３１およびメトホルミン治療は、２型糖尿病患者の空腹時血糖レベルの低下に有効であった（Ratnerら、Abstract No. 10-OR、2005年6月10〜14日、65th American Diabetes AssociationMeeting、San Francisco、CA）。
【００６６】
[0081]  したがって、特定の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、国際公開第００／０６９９１１号に記載の通りであり、その全体を本明細書において参考として援用する。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、血液成分のアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基と反応して、安定な共有結合を形成する反応性基で改変される。特定の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、スクシンイミジル基およびマレイミド基からなる群から選択される反応性の基で改変される。ある典型的な実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、配列／構造：Ｄ−Ａｌａ８Ｌｙｓ３７−（２−（２−（２−マレイミドプロピオンアミド（エトキシ）エトキシ）アセタミド））−ＧＬＰ−１（７〜３７）（例えば、CJC-1131）を有する。
【００６７】
[0082]  ＺＰ−１０としても公知のＡＶＥ００１０は、本発明と関連して利用され得るＧＬＰ−１受容体作動薬である。最近行われた二重盲検試験では、ＡＶＥ００１０の１日１回の投与で治療された患者は顕著なＨｂＡ１ｃレベルの低下を示した（Ratnerら、Abstract No. 433-P、68th American Diabetes Association Meeting、SanFrancisco、CA.）。この試験の結論では、１日１回投与した場合のＨｂＡ１ｃ＜７％の患者の割合（%）は、プラセボの３２％に比較して４７〜６９％の範囲であった。さらに、ＡＶＥ００１０で治療を受けた患者では、用量依存の体重減少および食後血漿グルコースの低下が認められた。
【００６８】
[0083]  したがって、特定の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、国際公開第０１／００４１５６号に記載の通りであり、その全体を本明細書において参考として援用する。例えば、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、配列：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＳＫＫＫＫＫＫ−ＮＨ２（配列番号１８）（例えば、AVE0010）を有し得る。
【００６９】
[0084]  ＬＹ５４８８０６は、ジペプチダーゼ−ペプチジルＩＶ（DPP-IV）によるタンパク質分解に抵抗性であるように設計されたＧＬＰ−１誘導体である（Jacksonら、Abstract No. 562、2005年6月10〜14日、65th American Diabetes AssociationMeeting、San Francisco、CA）。高血糖の動物モデルでは、ＬＹ５４８８０６は、高血糖の段階において血糖値を顕著に低下させることが示された（Sahaら、2006年、J.Pharm. Exp. Ther.、第３16巻：1159〜64頁）。さらに、ＬＹ５４８８０６は、公知の作用機序、すなわち高血糖の状況下で生ずるインスリン放出刺激に整合して、インスリンレベルを顕著に増加させることが示された。
【００７０】
[0085]  したがって、特定の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬は国際公開第０３／０１８５１６号に記載の通りであり、その全体を本明細書において参考として援用する。いくつかの実施形態では、本発明の治療剤はＧＬＰ−１アナログを含み、かかるアナログの骨格または断片は、第８位にアラニン以外のアミノ酸を含む（第8位アナログ）。当該骨格は、第７位にＬ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、またはヒスチジンの修飾形態、例えばデサミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、またはα−メチル−ヒスチジンも含み得る。いくつかの実施形態では、かかる第８位アナログは、天然型ＧＬＰ−１の対応するアミノ酸と比較して、第１２、１６、１８、１９、２０、２２、２５、２７、３０、３３、および３７位に、１つまたは複数の追加の変更を含み得る。別の実施形態では、かかる第８位アナログは、天然型ＧＬＰ−１の対応するアミノ酸と比較して、第１６、１８、２２、２５、および３３位に、１つまたは複数の追加の変更を含み得る。ある典型的な実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、配列：ＨＶＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＩＫＧＲＧ−ＯＨ（配列番号１９）（例えば、LY548806）を有する。
【００７１】
[0086]  したがって、本発明は、エラスチン様ペプチド（ELP）およびＧＬＰ−１受容体作動薬を含む治療剤を提供する。例えば、特定の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、ＧＬＰ−１（配列番号１３、１７、または５９）またはその機能的アナログである。別の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、エキセンジン−４（配列番号１４）またはその機能的アナログである。ＧＬＰ−１のかかる機能的アナログまたはエキセンジン−４は、１、２、３または最大約５個分のアミノ酸を含む１〜１０個分のアミノ酸がＣ末端で短縮された機能的断片を含む（配列番号１３、１４、１７、または５９に関して）。かかる機能的アナログでは、天然型の配列（例えば、配列番号１３、１４、および５９）を基に、１〜１０個のアミノ酸の挿入、削除、および／または置換を（まとめて）含むことができ、またそれぞれの場合、ペプチドの活性を維持している。例えば、ＧＬＰ−１またはエキセンジン−４の機能的アナログでは、配列番号１３、５９、および１４を基に１〜約３、４、または５個の挿入、削除、および／または置換を（まとめて）有することができ、またそれぞれの場合、ペプチドの活性を維持している。かかる活性は、本明細書に記載するものを含め、任意の利用可能な分析法を用いて確認または分析することができる。かかる実施形態またはそのほかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体作動薬成分は、天然型配列（配列番号１３、５９、および１４）と、少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。２つの配列間（例えば、天然型配列と機能的アナログとの間）の配列同一性は、Ｔａｔｕｓｏｖａら、「Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、第１７４巻：２４７〜２５０頁（1999年）を含む、任意の位置合わせツールを用いて決定することができる。かかる機能的アナログは、追加の化学修飾物、例えば本セクションに記載するものおよび／または当技術分野で公知のそのほかものを、さらに含み得る。
【００７２】
[0087]  特定の実施形態では、ＧＬＰ１−ＥＬＰ融合体は、本明細書で配列番号５４および５６として例示されている配列を有する。処理されると、かかる融合タンパク質の成熟形態は、ＧＬＰのＨｉｓ７から始まる。
【００７３】
[0088]  別の態様では、本発明は、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、高血糖、肥満、過食症、多食症、高血圧、シンドロームＸ、脂質異常症、認知障害、アテローム性動脈硬化症、非脂肪性肝疾患、心筋梗塞、冠動脈性心疾患、およびそのほかの心血管系障害を治療または予防するための方法を提供する。当該方法は、エラスチン様ペプチド（ELP）およびＧＬＰ−１受容体作動薬（上記のような）を含む治療剤を、かかる治療を必要とする患者に投与する工程を含む。かかる実施形態またはそのほかの実施形態では、本発明は、食物摂取量を低減し、β−細胞アポトーシスを抑制し、β−細胞機能およびβ−細胞重量を増加させる、および／またはβ−細胞にグルコース感受性を復活させるための方法を提供する。一般的に、患者はヒトであってもよく、またヒト以外の動物患者（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、またはウマ）であってもよい。好ましくは、当該患者はヒトである。
【００７４】
[0089]  本発明に基づくＥＬＰ／ＧＬＰ−１受容体作動薬化合物による治療は、１つまたは複数の薬理学的に活性な物質、例えば抗糖尿病薬、抗肥満薬、食欲調節薬、抗高血圧薬、糖尿病に関連して引き起こされた合併症を治療および／または予防するための薬剤、および肥満に関連して引き起こされた合併症および障害を治療および／または予防するための薬剤と併用することもできる。本明細書の文脈において、「抗糖尿病薬」の表現には、インスリン抵抗性、およびインスリン抵抗性が病態生理学的機序である疾患を治療および／または予防するための化合物が含まれる。
【００７５】
[0090]  ＧＬＰ−１もしくはエキセンジン−４アナログ、またはＧＬＰ−１受容体作動薬／ＥＬＰ化合物が、ＧＬＰ−１受容体に結合する能力は、標準的な方法により決定可能で、例えば、細胞表面上にＧＬＰ−１受容体を発現する適当な細胞、例えばＲＩＮｍＳＦ細胞またはＩＮＳ−１細胞等のインスリノーマ細胞株を提供する工程を含む、受容体結合活性スクリーニング法により決定することができる。ラジオイムノアッセイ法を用いて、トレーサーの膜への特異的な結合を測定することができるが、これに加えてｃＡＭＰ活性またはグルコース依存性インスリン生成も測定することができる。１つの方法では、細胞に核酸導入してこれによりＧＬＰ−１受容体タンパク質を発現させるために、ＧＬＰ−１受容体をコードするポリヌクレオチドを利用する。したがって、かかる方法は、ＧＬＰ受容体作動薬候補が活性かどうかを試験し、または確認するために利用可能である。典型的な分析法を本明細書においてさらに詳細に記載する。
【００７６】
[0091]  さらに、公知の方法が、ＧＬＰ−１受容体作動薬またはＧＬＰ−１受容体作動薬／ＥＬＰの生物学的活性レベルを、ｉｎ  ｖｉｖｏで測定または予測するために利用可能である（例えば、Siegelら、1999年、RegulPept、第79巻（2〜3）：93〜102頁を参照されたい）。特に、ＧＬＰ−１受容体作動薬またはＧＬＰ−１受容体作動薬／ＥＬＰ化合物について、ＧＬＰ−１活性を測定するための様々な公知の分析法を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでインスリン生成を誘発するかかる作動薬または化合物の能力を評価することができる。例えば、ＥＬＰ／ＧＬＰ−１受容体作動薬化合物は、不死化β−細胞等の細胞に導入可能であり、得られた細胞はグルコースと接触することができる。かかる細胞が、グルコースに応答してインスリンを生成すると、次いでｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的に活性と考えられる、改変されたＧＬＰ−１が生み出される（Fehmannら、1992年、Endocrinology、第130巻：159〜166頁）。典型的な分析法を、本明細書でさらに詳細に記載する。
【００７７】
[0092]  ＧＬＰ−１受容体作動薬／ＥＬＰ化合物が、β−細胞の増殖を増強し、β−細胞のアポトーシスを阻害し、および膵島成長を調節する能力も、公知の分析法を用いて測定することができる。膵臓β−細胞の増殖は、３Ｈ−チミジン、またはＢｒｄＵの取込み分析法により評価可能であり（例えば、Buteauら、2003年、Diabetes、第52巻：124〜32頁を参照されたい）、この分析法では、ＩＮＳ（８３２／１３）細胞等の膵臓β−細胞は、ＥＬＰ／ＧＬＰ−１受容体作動薬化合物と接触し、３Ｈ−チミジン、またはＢｒｄＵの取込み量の増加について分析される。ＥＬＰ／ＧＬＰ−１受容体作動薬化合物の抗アポトーシス活性は、培養インスリン分泌細胞中で、および／またはβ−細胞のアポトーシス発生率が過剰となった結果、糖尿病を発症している動物モデル内で測定可能である（例えば、Bulottaら、2004年、CBiochem Biophys、第40巻（3 suppl）：65〜78号を参照）。
【００７８】
[0093]  ＧＬＰ−１のほか、当該ファミリーのそのほかのペプチド、例えばプロ−グルカゴン遺伝子のプロセシングから誘導されたもの等、例えばＧＬＰ−２、ＧＩＰ、およびオキシントモジュリン等も、治療潜在能力を増強するためにＥＬＰ成分（本明細書に記載のような）に結合または融合可能と考えられる。
【００７９】
インスリン
[0094]  別の実施形態では、本発明は、インスリンと結合した（例えば、融合または結合による）ＥＬＰ成分を含む治療剤を提供する。糖尿病を治療するために、インスリン注射、例えばヒトインスリン注射が利用可能である。体内のインスリン産生細胞はβ−細胞と呼ばれ、同細胞は膵臓分泌腺中に見出される。これらの細胞は、共に凝集して「ランゲルハンス島」を形成するが、「ランゲルハンス」は、これを説明したドイツ人医学生の名に由来する。
【００８０】
[0095]  インスリン合成は、第１１番染色体上に存在するインスリン遺伝子の翻訳に始まる。翻訳の際には、１１０アミノ酸長のタンパク質をコードする２つのイントロンがｍＲＮＡ産物から切り出される。かかる一次翻訳産物は、プレプロインスリンと呼ばれ、活性を有さない。これは、細胞膜を通過するために当該タンパク質に必要とされる、２４アミノ酸長からなるシグナルペプチドを含む。
【００８１】
[0096]  プレプロインスリンが小胞体に到達すると、プロテアーゼはシグナルペプチドを切断してプロインスリンを生み出す。プロインスリンは３つのドメインからなる：アミノ末端Ｂ鎖、カルボキシル末端Ａ鎖、およびＣ−ペプチドとして公知の中央に位置する結合ペプチドである。インスリンは、２個のジスルフィド架橋により互いに結び付けられたＡ鎖（21個のアミノ酸−ＧＩＶＥＱＣＣＡＳＶＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ）（配列番号１５）、およびＢ鎖（30個のアミノ酸−ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ）（配列番号１６）と命名されたアミノ酸からなる２本の鎖から構成される。Ａ鎖中には、Ａ鎖の第６残基と第１１残基を結び付けるＡ鎖内の第３のジスルフィド架橋がある。ほとんどの種では、Ａ鎖およびＢ鎖の長さおよびアミノ酸組成は類似しており、３つのジスルフィド結合の位置は、極めて保存的である。このような理由から、ブタインスリンは、糖尿病患者の不足したヒトインスリンレベルに置き換わることができる。今日、ブタインスリンは、その多くが、細菌によるヒトプロインスリン（遺伝子組換え型インスリン）の大量生産に取って代わられている。
【００８２】
[0097]  インスリンは、溶液中で二量体を形成する傾向を有し、亜鉛イオンの存在下では、インスリン二量体は六量体に会合する。インスリンの単量体は血液に容易に拡散し、即効性を有するが、六量体は徐々に拡散し、作用の発現は遅延的である。遺伝子組換え型インスリンの設計において、インスリンの構造は、インスリン分子が二量体や六量体を形成する傾向が低減するような、ただし、インスリン受容体への結合を阻害しないようなやり方で改変され得る。このように、短期的作用から長期的作用まで変化した様々な製剤が作製される。
【００８３】
[0098]  小胞体中では、プロインスリンは、Ｃ−ペプチドを除去するいくつかの特異的なペプチダーゼに暴露され、成熟した活性型のインスリンを生み出す。ゴルジ装置中では、インスリンとフリーのＣ−ペプチドは分泌顆粒中に詰め込まれ、同顆粒はβ−細胞の細胞質内に蓄積する。顆粒の開口分泌は、β−細胞内へのグルコースの進入が契機となって引き起こされる。インスリン分泌は、代謝に対して多大な影響力を有する。
【００８４】
[0099]  グルコースの上昇に応答した、２段階のインスリン放出が存在する。第１は、インスリンの速やかな放出である。これは、分泌顆粒に貯蔵されている、処理済みのインスリンの放出に起因する。少し遅れて、第２の、より持続性のある新規合成インスリンの放出がある。
【００８５】
[0100]  一旦放出されると、酵素により分解される前の、ほんの短い時間だけ活性となる。肝臓および腎臓中に見出されるインスリナーゼは、血漿中を循環するインスリンを分解し、その結果インスリンは、わずか約６分の半減期しか有さない。この短期間の作用は、インスリンの循環レベルに急速な変化をもたらす。
【００８６】
[0101]  改善した治療特性を有するインスリンアナログが開発されており（Owensら、2001年、Lancet、第３58巻：739〜46頁；Vajoら、2001年、Endocr Rev、第22巻：706〜17頁）、かかるアナログを、本発明に関連して利用することができる。インスリンＢ鎖のＣＯＯＨ末端延長、およびアルブミンに対して極めて高い親和性を有する脂肪酸−アシル化インスリンの遺伝子工学的な設計を含む、様々な戦略が、長期作用性インスリンアナログを生み出すために用いられる。しかし、利用可能な長期作用性インスリン化合物を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで治療した場合、低血糖および高血糖となる過剰反応が、なおも高頻度で引き起こされ、またＨｂＡ１ｃの低下も中程度である。したがって、真に長期作用性で、安定なヒトインスリンアナログを開発することは、依然重要な課題として残る。
【００８７】
[0102]  本発明に基づき利用可能なインスリンの機能的アナログとして、リスプロ（lispro）、アスパート（aspart）、およびグルリシン（glulisine）等の即効性アナログが挙げられ、これらは、皮下注射後迅速に吸収され（＜30分）、１時間でピークに達し、また比較的短い作用時間（3〜4時間）を有する。さらに、２種類の長期作用性インスリンアナログ、グラルギン（glargine）およびデテミル（detemir）が開発されたが、これらは本発明に関連して利用可能である。長期作用性のインスリンアナログは、作用が発現するまで約２時間かかり、４〜６時間で生物学的作用が頭打ちとなり、最長２４時間持続し得る。
【００８８】
[0103]  したがって、１つの実施形態では、インスリン成分は、リスプロ（Eli Lillyのフマログ（Humalog）としても公知）のＡ鎖および／またはＢ鎖を含み得る。インスリンリスプロは、ヒトインスリンと異なり、インスリンＢ鎖の第２８位のプロリンがリジンで置換され、第２９位のリジンがプロリンで置換されている。かかる改変は、受容体結合に変化をもたらさないが、インスリン二量体および六量体の形成を阻止するのに役立っており、食後注射でより多量の活性インスリン単量体の利用を可能にしている。
【００８９】
[0104]  別の実施形態では、インスリンはアスパート（Novo Nordiskのノボログ（Novolog）としても公知）のＡ鎖および／またはＢ鎖を含み得る。インスリンアスパートは、ヒトインスリンＢ鎖の第２８位で、プロリンがアスパラギン酸にアミノ酸が単一置換するように設計されている。かかる改変はインスリンの六量体形成を阻止するのに役立ち、迅速作用性のインスリンを生み出している。
【００９０】
[0105]  なおも別の実施形態では、インスリンは、グルリシン（Sanofi-Aventisのアピドラ（Apidra）としても公知）のＡ鎖および／またはＢ鎖を含み得る。インスリングルリシンは、ヒトインスリンＢ鎖の第３位のアスパラギンをリジンに、第２９位のリジンをグルタミンに置換することにより生み出された、短期作用性アナログである。インスリングルリシンは、通常のヒトインスリンよりも作用発現が迅速で、また作用期間は短い。
【００９１】
[0106]  別の実施形態では、インスリンは、グラルギン（Sanofi-Aventisのランタス（Lantus）としても公知）のＡ鎖および／またはＢ鎖を含み得る。インスリングラルギンは、Ａ鎖の第２１位のアミノ酸アスパラギンがグリシンに置換されており、Ｂ鎖のＣ末端に２個のアルギニンが付加されている点で、ヒトインスリンと異なる。就寝時に用いるプロタミン含有中間型（NPH）インスリン（中程度に作用するインスリン）と比較して、インスリングラルギンは、２型糖尿病の患者に生ずる夜間低血糖との関連性は低い。
【００９２】
[0107]  なおも別の実施形態では、インスリンは、デテミル（Novo Nordiskのレベミル（Levemir）としても公知）に由来するＡ鎖および／またはＢ鎖を含み得る。インスリンデテミルは、可溶性（中性pHで）の長期作用性インスリンアナログであり、同アナログでは、Ｂ３０のアミノ酸であるトレオニンが除去され、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基に、炭素１４個からなるミリストイル脂肪酸がアセチル化されている。皮下注射後、デテミルは解離し、これによりアルブミン分子との可逆的結合を可能にするフリーの脂肪酸が露出される。したがって、定常状態では、フリーの非結合インスリン濃度は大幅に低減して、安定な血漿グルコースレベルを実現する。
【００９３】
[0108]  いくつかの実施形態では、インスリンは１本鎖インスリンアナログ（SIA）であり得る（例えば、第６，６３０，４３８号、および国際公開第０８／０１９３６８号に記載の通りで、これらをそのまま、本明細書において参考として援用する）。１本鎖インスリンアナログには、Ａ鎖およびＢ鎖がポリペプチドリンカーによって共有結合している構造的に関連したタンパク質の一群が含まれる。当該ポリペプチドリンカーは、Ｂ鎖のＣ末端をＡ鎖のＮ末端に連結する。ＳＩＡが、グルコースの取込み作用、およびインスリン受容体結合作用を有するのに必要な構造的配置を、当該リンカーが提供する限り、当該リンカーは任意の長さであってよい。いくつかの実施形態では、リンカーは約５〜１８アミノ酸長である。別の実施形態では、リンカーは、９〜１５アミノ酸長である。特定の実施形態では、リンカーは約１２アミノ酸長である。ある典型的な実施形態では、リンカーは、配列ＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲ（配列番号２０）、またはＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２１）を有する。ただし、本配列の多くの変形形態が、例えば長さ（追加または除去の両方で）、および生み出されたＳＩＡが、グルコースの取込みおよびインスリン受容体結合活性について有する有効性を実質的に損なわないアミノ酸の置換等において可能であると理解すべきである。例えば、生み出されたＳＩＡの活性を実質的に低下させずに、数個の異なるアミノ酸残基をいずれかの端部において追加、除去することができる。
【００９４】
[0109]  現在臨床開発段階にある典型的な１本鎖インスリンアナログとして、アルブリン（albulin）が挙げられる（Duttaroyら、2005年、Diabetes、第54巻：251〜8頁）。アルブリンは、酵母菌中または哺乳動物細胞中で産生可能である。これは、ドデカペプチドリンカーにより互いに連結され、天然型ヒト血清アルブミンのＮＨ２末端に融合した、ヒトインスリンのＢ鎖およびＡ鎖からなる（天然型ヒトインスリンと１００％の同一性を有する）。アルブリンを発現および精製する場合、Ｄｕｔｔａｒｏｙらは、４つのオーバーラッピングプライマーとＰＣＲ増幅法を用いて、ドデカペプチドリンカーにより互いに連結したヒト成熟インスリンＢ鎖およびＡ鎖を含む、１本鎖インスリンをコードする合成遺伝子構築物を構築した。得られたＰＣＲ産物は、ヒト血清アルブミン（HSA）のシグナルペプチドと、成熟ＨＳＡのＮＨ２末端との間にインフレームでライゲートされ、酵母菌中で発現させるためにｐＳＡＣ３５ベクター中に組み込まれた。本発明に基づけば、アルブリンのＨＳＡ成分は、本明細書に記載のＥＬＰ成分と置き換え可能である。
【００９５】
[0110]  したがって、１つの態様では、本発明は、エラスチン様ペプチド（ELP）およびインスリンまたはその機能的アナログを含む治療剤を提供する。例えば、特定の実施形態では、インスリンは、ヒトインスリンまたはブタインスリン等の哺乳動物インスリンである。本発明に基づけば、ＥＬＰ成分はインスリンＡ鎖もしくはＢ鎖、または両方に結合され得る（例えば、遺伝子組換え融合、または化学結合による）。インスリンはＡ、Ｂ、およびＣ鎖（配列番号５１および５２）のそれぞれを含むことができ、またＡ鎖およびＢ鎖のみを含む、処理済みの形態を含むこともできる。いくつかの実施形態では、Ａ鎖およびＢ鎖は短いリンキングペプチドで連結され、１本鎖インスリンを形成する。インスリンは、ヒトインスリンの機能的アナログであり得、これには、１、２、３、または約５個のアミノ酸を含む１〜１０個のアミノ酸がＮ末端および／またはＣ末端（A鎖およびB鎖のいずれか一方、または両方の）で切り離された機能的断片が含まれる。機能的アナログは、天然型配列（例えば、配列番号１５および１６）を基に１〜１０個のアミノ酸の挿入、削除、および／または置換を（まとめて）、それぞれの場合において、ペプチドの活性を維持しながら含み得る。例えば、機能的アナログは、天然型配列（これは、Ａ鎖およびＢ鎖、またはＡ鎖、Ｂ鎖およびＣ鎖を含み得る）を基に、１、２、３、４、または５個のアミノ酸の挿入、削除、および／または置換を（まとめて）有し得る。かかる活性は、本明細書に記載する方法を含む任意の利用可能な分析法を用いて確認または分析可能である。かかる実施形態またはそのほかの実施形態では、インスリン成分は、Ａ鎖およびＢ鎖について各天然型配列（配列番号１５および１６）と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を有する。２種類の配列間（例えば、天然型配列と機能的アナログとの間）の配列同一性は、Ｔａｔｕｓｏｖａら、Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ＦＥＭＳ  ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ、第１７４巻：２４７〜２５０頁（1999年）を含む、任意の位置合わせツールを用いて決定可能である。インスリン成分は、当技術分野で公知のさらなる化学修飾を含み得る。
【００９６】
[0111]  別の態様では、本発明は１型および２型糖尿病を含む、糖尿病を治療または予防するための方法を提供する。当該方法は、エラスチン様ペプチド（ELP）成分、およびインスリン（またはその機能的アナログ）成分を含む治療剤の有効量を、これを必要とする患者に投与する工程を含む。一般的には、患者はヒトであっても、またヒト以外の動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、またはウマ）の患者であってもよい。好ましくは、患者はヒトである。
【００９７】
[0112]  インスリンアナログまたはＥＬＰ含有インスリンアナログのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合特性を特徴づけるために、インスリン受容体を発現する様々な細胞株内で、競合結合分析法を実施することができる（Jehleら、1996年、Diabetologia、第３9巻：421〜432頁）。例えば、ヒトインスリン受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞を用いた競合結合分析法を採用することができる。インスリンは、インスリン受容体よりも弱い親和性を有するＩＧＦ−１受容体にも結合可能である。ＥＬＰ含有インスリンアナログの結合親和性を決定するために、１２５Ｉ標識ＩＧＦ−１を用いて、Ｌ６細胞中で競合結合分析法を実施することができる。
【００９８】
[0113]  インスリン活性には、末梢グルコース処理、および肝臓グルコース産生阻害が含まれる。上記生物学的活性を調節するＥＬＰ含有インスリンアナログの能力は、公知の方法を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析可能である。例えば、ＥＬＰ含有アナログが３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞中でのグルコースの取込みに与える効果について測定することが可能で、またインスリンの同効果と比較可能である。生物学的に活性なアナログで細胞を前処理すると、一般的に、２−デオキシグルコースの取込み増加が用量に依存して引き起こされる。ＥＬＰ含有インスリンアナログがグルコース産生を調節する能力は、任意の数の細胞型、例えばＨ４ＩＩｅヘパトーマ細胞内で測定可能である。かかる分析では、生物学的に活性なアナログで前処理すると、一般的に、グルコース放出量阻害が用量に依存して引き起こされる。
【００９９】
第ＶＩＩ（VIIa）因子
[0114]  特定の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子と結合（例えば、融合または結合による）したＥＬＰ成分を含む治療剤を提供する。凝固は、多くの異なるセリンプロテアーゼのほか、その必須補助因子および阻害剤が関与する、血液凝固物形成の生物学的プロセスである。凝固は、第ＶＩＩ因子（FVII）および第ＶＩＩａ因子（FVIIa）が、膜結合補助因子である組織因子（TF）に暴露されることにより開始し、第Ｘａ因子（FXa）、およびさらなるＶＩＩａの産生を引き起こす。当該プロセスは、第ＩＸａ因子（FIXa）およびさらなるＦＸａの産生に乗じて伝播し、これらの因子は、その補助因子であるＦＶＩＩＩａおよびＦＶａと結合すると、血小板結合複合体を形成し、最終的にトロンビンおよびフィブリン塊の形成を引き起こす。トロンビンは、ＦＶおよびＦＶＩＩ等の補助因子、ならびに第ＸＩ因子等のチモーゲンの活性化による凝固をさらに増幅する機能も果たす。さらにトロンビンは、血小板を活性化して止血血栓形成に必要な血小板凝集を引き起こす。
【０１００】
[0115]  第ＶＩＩ因子はチモーゲン形態で血液中を循環し、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、またはトロンビンのいずれかにより、軽微なタンパク質分解を受けてその活性形態である第ＶＩＩａ因子に変換される。第ＶＩＩａ因子は、２本鎖、５０キロダルトン（kDa）の血漿セリンプロテアーゼである。この酵素の活性形態は、触媒ドメインを含む重鎖（254個のアミノ酸残基）、および２つの上皮細胞増殖因子（EGF）−様ドメインを含む軽鎖（152個の残基）を含む。血漿中を循環する成熟した第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子は、４０６個のアミノ酸残基（配列番号３３）から構成される。軽鎖および重鎖はジスルフィド結合により共に保持されている。
【０１０１】
[0116]  上記の通り、第ＶＩＩａ因子は、１つのペプチド結合がタンパク質分解を受けることにより、その１本鎖チモーゲンである第ＶＩＩ因子から生み出され、これは血漿中に約０．５μｇ／ｍｌで存在する。チモーゲンの第ＶＩＩ因子から活性型の２本鎖分子への変換は、分子内ペプチド結合の切断によって生ずる。ヒト第ＶＩＩ因子では、切断部位は、Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３である（Hagenら、1986年、PNAS USA、第83巻：2412〜6頁）。
【０１０２】
[0117]  本出願で用いる場合、「第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子」とは、非活性型（第ＶＩＩ因子）または活性型（第ＶＩＩａ因子）のいずれか、またはこれらの混合物からなる生成物を意味する。上記定義範囲内の「第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子」には、ヒト天然型第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列を有するタンパク質も含まれる。かかるタンパク質が実質的に第ＶＩＩａ因子の活性を保持する限り、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子には、若干改変されたアミノ酸配列、例えばＮ末端アミノ酸の削除または追加を含む、改変されたＮ末端も含まれる。上記定義範囲内の「第ＶＩＩ因子」には、個体に存在し、また個体から個体に生じ得る天然の対立遺伝子変異も含まれる。また、グリコシル化またはそのほかの翻訳後修飾の程度と場所は、選択された宿主細胞、および宿主細胞環境の性質に依存して変化し得る。
【０１０３】
[0118]  カルシウムイオンの存在下で、第ＶＩＩａ因子は高い親和性を伴いＴＦに結合する。ＴＦは２６３個のアミノ酸残基からなる糖タンパク質で、２１９残基の細胞外ドメイン、１本鎖膜貫通ドメイン、および短い細胞質ドメインから構成される（Morrisseyら、1987年、Cell、第50巻：129〜35頁）。ＴＦの細胞外ドメインは、それぞれ約１０５個のアミノ酸からなる２つのフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインから構成される。ＦＶＩＩａの結合は、ＴＦの細胞外ドメインによって完全に制御されている（Mullerら、1994年、Biochem.、第３3巻：10864〜70頁）。アミノ酸１６〜２６、およびアミノ酸１２９〜１４７の領域内の残基が、ＦＶＩＩａの結合ならびに分子の凝固機能に寄与している。残基Ｌｙｓ２０、Ｔｒｐ４５、Ａｓｐ５８、Ｔｙｒ９４、およびＰｈｅ１４０は、ＦＶＩＩａ結合自由エネルギー（△G）に大いに寄与（１ｋｃａｌ／ｍｏｌ）している。
【０１０４】
[0119]  ＴＦは、血管内皮によって血漿から分離された細胞上で、構成的に発現されている。内皮細胞および単球上でのＴＦの発現は、炎症性サイトカインまたは細菌性リポ多糖への暴露によって誘発される（Drake ら、1989年、J.Cell Biol.、第109巻：389頁）。組織が損傷して、ＴＦの細胞外ドメインが露出すると、高親和性でカルシウム依存性のＦＶＩＩとの複合体を形成する。ＦＶＩＩは、ＴＦと一旦結合するとペプチド結合の切断によって活性化可能となり、セリンプロテアーゼＦＶＩＩａを生成する。ｉｎ  ｖｉｖｏでかかる工程を触媒する酵素は、まだ明らかになっていないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＦＸａ、トロンビン、ＴＦ：ＦＶＩＩａ、およびＦＩＸａがこの切断を触媒することができる。ＦＶＩＩａは、その生理的な基質であるＦＸおよびＦＩＸに対して弱い活性しか有さないが、ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体はＦＸおよびＦＩＸを迅速に活性化する。
【０１０５】
[0120]  ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体は、血液凝固の外因経路において主たる開始剤の役目を果たす。当該複合体は、ＦＸから第Ｘａ因子（FXa）、ＦＩＸから第ＩＸａ因子（FIXa）、およびさらにＦＶＩＩからＦＶＩＩａに活性化することにより、外因経路を開始する。ＴＦ：ＦＶＩＩａの作用は、最終的にプロトロンビンから多くの生物学的機能を担うトロンビンへの変換を引き起こす。トロンビンの最も重要な活性の中でも、特に重要なのは、フィブリノゲンからフィブリンへの変換であり、フィブリンは重合して凝血塊を形成する。ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体は、接触活性化系の生理作用の伝播において、二次因子としても関与する。
【０１０６】
[0121]  止血の維持は生存上重要なので、凝固の開始とその後の調節は複雑である。止血（正常な血栓形成および溶解）と血栓形成（病原性血栓形成）との間には絶妙なバランスが存在する。凝固異常が関与する重篤な臨床症状として、深部静脈血栓症、心筋梗塞、肺塞栓症、脳卒中、および播種性血管内凝固症候群（敗血症における）が挙げられる。血栓形成が不十分な、多くの出血性血液凝固障害も存在する。かかる障害として、凝固促進療法を必要とする血友病Ａ（FVIIIの欠損）、または血友病Ｂ（FIXの欠損）が挙げられる。かかる治療分野の課題は、過剰凝固と過少凝固との間のウィンドウが狭く、この狭いウィンドウ内で治療を管理することにある。
【０１０７】
[0122]  治療剤として外因性ＦＶＩＩａを使用すると、血友病ＡおよびＢの患者で止血が誘発されることが明らかにされた（Hedner、2001年、SeminarsHematol.、第３8巻（suppl. 12）：43〜7頁；Hedner、2004年、Seminars Hematol.、第41巻（suppl. 1）：35〜9頁）。これも、肝臓疾患、抗凝固剤誘発性出血、手術、血小板減少症、血小板無力症、ベルナール・スーリエ症候群、フォン・ヴィレブランド病、およびそのほかの出血異常を有する患者の出血を治療するために利用されてきた（例えば、Robertsら、2004年、Blood、第104巻：3858〜64頁を参照）。
【０１０８】
[0123]  遺伝子組換え型ヒトＦＶＩＩａの市販製剤が、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）として販売されている。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）は、血友病ＡまたはＢ患者の出血エピソードを治療するために適応され、現在入手可能であって、出血エピソードに有効である唯一の遺伝子組換え型ＦＶＩＩａである。遺伝子組換え型ＦＶＩＩａの循環半減期は２．３時間であることが、「Summary Basis for Approval for NovoSeven（商標）」、ＦＤＡ参照番号９６−０５９７で報告された。さらに、遺伝子組換え型ＦＶＩＩａの半減期は、小児患者においてより短く（約１．３時間）、かかる母集団では、より高い用量の遺伝子組換え型ＦＶＩＩａが必要となり得ることを示唆している（Robertsら、2004年、Blood、第104巻：3858〜64頁）。したがって、所望の治療効果または予防効果を実現し、維持するためには、比較的高用量、および頻繁投与を必要とする。その結果、適切に用量調節するのは困難であり、また静脈内投与を頻繁に行う必要があるので、患者の生活パターンは制約を受ける。
【０１０９】
[0124]  分子の循環半減期がより長ければ、必要投与回数は低減すると考えられる。現在利用可能なＦＶＩＩａ療法では高頻度の投与が関連していること、および強化された治療効果と併用すれば、さらに最適なＦＶＩＩａ治療レベルが得られる可能性があることを考慮すれば、ｉｎ  ｖｉｖｏで半減期が延長された、改善型のＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａ様分子に対するニーズが明らかに存在する。
【０１１０】
[0125]  遺伝子組換え型ヒト凝固因子ＶＩＩａ（rFVIIa、NovoSeven；Novo Nordisk A/S、コペンハーゲン、デンマーク）は、阻害剤と併用して、血友病患者の出血エピソードを治療するのに有効であることが立証されている。ごく一部の患者は、ｒＦＶＩＩａ治療から効果を得られない場合もあるが、効能が強化された遺伝子的に改変されたＦＶＩＩａ分子からは、おそらくベネフィットが得られると考えられる。そのために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで優れた止血プロフィールを示す、固有活性が増大したＦＶＩＩａアナログについて調査されてきた（例えば、国際公開第０２／０７７２１８号または同第０５／０７４９７５号が参照されるが、これらをそのまま本明細書において参考として援用する。およびTranholmら、2003年、Blood、第102巻（10）：3615〜20頁。これも参考として援用する）。かかるアナログは、血小板減少症および外傷を含むｒＦＶＩＩａの効果が認められたそのほかの適応においても、より効果的な止血剤として利用可能である。
【０１１１】
[0126]  したがって、いくつかの実施形態では、本発明に基づき利用可能な第ＶＩＩａ因子アナログは、国際公開第０２／０７７２１８号、または同第０５／０７４９７５号に記載の通りである。例えば、ＦＶＩＩａアナログは、第２９８位のメチオニンと置換したグルタミンを有する（すなわち、M298Q-FVlla）。ある典型的な実施形態では、ＦＶＩＩａアナログは、第１５８位のバリンがアスパラギン酸に置換し、第２９６位のグルタミン酸がバリンに置換した、２個の追加の変異を含む（すなわち、V158D/E296V/M298Q-FVlla）。追加的に、または二者択一的に、第ＶＩＩａ因子アナログは、第３３７位でリジンと置換したアラニン残基を有し得る（すなわち、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa）。なおも別の実施形態では、第ＶＩＩａ因子アナログは、Ｑ２５０Ｃ；Ｐ４０６Ｃ；および４０７Ｃから選択される置換または挿入を有し、この場合にはシステインがＣ末端配列にも導入された（例えば、米国特許第７，２３５，６３８号が参照されるが、その全体を本明細書において参考として援用する）。第ＶＩＩａ因子アナログは、第２４７位、２６０位、３９３位、３９６位、および／または４０５位の１つまたは複数の位置で、置換または挿入をさらに含み得る。
【０１１２】
[0127]  かかる実施形態またはそのほかの実施形態において、第ＶＩＩａ因子アナログは、天然型第ＶＩＩａ因子の配列との比較において下記より選択される置換を含む：（ａ）Ｌｙｓ１５７が、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、およびＧｌｕからなる群より選択されるアミノ酸に代わる置換、（ｂ）Ｌｙｓ３３７がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕからなる群より選択されるアミノ酸に代わる置換、（ｃ）Ａｓｐ３３４が、ＡｌａまたはＡｓｎ以外の任意のアミノ酸に代わる置換、および（ｄ）Ｓｅｒ３３６が、ＡｌａまたはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸に代わる置換（例えば、米国特許第７，１７６，２８８号が参照されるが、その全体を本明細書において参考として援用する）。追加的に、または二者択一的に、第ＶＩＩａ因子アナログは、第ＶＩＩ因子の第３０５位のＬｅｕが、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸残基に代わる置換を含む（例えば、米国特許第６，９０５，６８３号が参照されるが、その全体を本明細書において参考として援用する）。
【０１１３】
[0128]  したがって、１つの態様では、本発明は、エラスチン様ペプチド（ELP）、および第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはその機能的アナログを含む治療剤を提供する。例えば、特定の実施形態では、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子は、ヒト第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子である（例えば、配列番号３３）。第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子は、ヒト第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子の機能的アナログであり得、これには、１、２、３、または約５個のアミノ酸を含む１〜１０個のアミノ酸がＮ末端および／またはＣ末端で切り離された機能的断片が含まれる。機能的アナログは、天然型配列（例えば、配列番号３３）を基に１〜１０個のアミノ酸の挿入、削除、および／または置換を（まとめて）、それぞれの場合において、ペプチドの活性を維持しながら含み得る。例えば、かかるアナログは、天然型の全長配列または重鎖もしくは軽鎖の一方またはその両方を基に、１〜約５個のアミノ酸の挿入、削除、および／または置換を（まとめて）有し得る。かかる活性は、本明細書に記載する方法を含む任意の利用可能な分析法を用いて確認または分析可能である。かかる実施形態またはそのほかの実施形態では、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子成分は、天然型配列（配列番号３３）と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を有する。２種類の配列間（例えば、天然型配列と機能的アナログとの間）の配列同一性は、Ｔａｔｕｓｏｖａら、Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ＦＥＭＳ  ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ、第１７４巻：２４７〜２５０頁（1999年）を含む、任意の位置合わせツールを用いて決定可能である。
【０１１４】
[0129]  典型的な実施形態では、第ＶＩＩ因子−ＥＬＰ融合体は、配列番号５８のアミノ酸配列を有する。配列番号５８は、望む場合には、第ＶＩＩ因子配列とＥＬＰ配列との間に、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位をさらに含み、これは発現後にＥＬＰ配列を除去するのに有用であり得る。しかし、本発明に基づき、当該ｔｅｖ配列はすべて除去可能であり、または本明細書に開示される別の連結配列と置換可能である。
【０１１５】
[0130]  別の態様では、本発明は出血関連障害を治療または予防するための方法を提供する。当該方法は、エラスチン様ペプチド（ELP）および第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはその機能的アナログを含む治療剤の有効量を、これを必要とする患者に投与する工程を含む。特定の実施形態では、出血関連障害として、血友病（AまたはB）、術後出血、抗凝固剤誘発性出血、血小板減少症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、肝臓疾患、血小板無力症、ベルナール・スーリエ症候群、フォン・ヴィレブランド病の患者の出血、および頭蓋内出血のうちの１つまたは複数が挙げられる。一般的に、患者はヒト、またはヒト以外の動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、またはウマ）の患者である。好ましくは、当該患者はヒトである。
【０１１６】
[0131]  第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子アナログ候補、またはＥＬＰ含有第ＶＩＩａ因子アナログのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合特性を特徴づけるために、ＴＦ結合分析をこれまでに記載したように実施することができる（例えば、Chaingら、1994年、Blood、第83巻（12）：3524〜35頁を参照）。端的に述べれば、遺伝子組換え型ヒトＴＦは、４℃、一晩、カーボネート抗原バッファー中で、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩプレート上にコーティング可能である。ＢＳＡも、コントロール用として同プレート上にコーティング可能である。ＥＬＰ含有第ＶＩＩａ因子アナログは、様々な濃度でＴＢＳ−Ｔバッファー中に添加可能である。数回洗浄後、単一特異的ポリクロナールのウサギ抗ヒトＦＶＩＩａ血清を添加し、約１時間、室温でインキュベーションする。次に、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧを添加し、次に検出用に用いられるアルカリホスファターゼ基質ＰＮＰＰを添加する。バックグラウンドを差し引いたのち、第ＶＩＩａ因子が固定化されたＴＦと結合する程度に関して直接的に比例関係にある約４０５ｎｍにおける吸収を求める。次に、かかる数値は、第ＶＩＩａ因子を含有するコントロール血漿と比較可能である。
【０１１７】
[0132]  第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子アナログまたはＥＬＰ含有第ＶＩＩａ因子アナログの凝固能力は、ヒトＦＶＩＩ欠損血漿内で測定可能である。かかる分析法では、ＥＬＰ含有第ＶＩＩａ因子アナログは、ＦＶＩI欠損血漿中で、様々な濃度に直接希釈される。凝固測定装置では、血漿±ＦＶＩＩａアナログ１容が、Ｉｎｎｏｖｉｎ（商標）（Dade、Miami、Fla）トロンビン時間試薬（遺伝子組換え型ヒト組織因子とリン脂質およびＣａＣｌ２）２容で混合され得る。血栓形成は任意選択により検出され、凝固までの時間が測定される。凝固時間（秒）を、ＦＶＩＩ−欠損血漿のみの平均凝固時間と比較し、ＦＶＩＩａアナログ濃度に対して、部分凝固時間（fractional clotting time）としてプロットする。
【０１１８】
治療用タンパク質
[0133]  本発明は、ＥＬＰ成分、および表１から選択される少なくとも１つの治療用タンパク質を含む治療剤をさらに提供する。ＥＬＰ成分および治療用タンパク質は、本明細書に記載する遺伝子組換え融合または化学結合により結合可能である。かかる治療用タンパク質は、タンパク質名およびＧｅｎｅＳｅｑアクセッション番号別に表１に掲載されている。各治療用タンパク質のアミノ酸配列は、当技術分野で公知であるが、表１に掲載する各治療用タンパク質について、本明細書において参考として援用する。かかる治療用タンパク質は、やはり表１に掲載されている米国特許または国際公表にさらに記載されているが、かかる米国特許および国際公表を本明細書において、特にかかる治療用タンパク質の構造および記載された機能的アナログに関して、参考として援用する。
【０１１９】
[0134]  表１は、掲載された各治療用タンパク質の生物学的活性、ならびに機能的アナログまたは本発明の薬剤の（例えば、ELP成分との融合体）活性を決定するための典型的な分析方法について、さらに記載する。一般的に、表１に掲載する治療用タンパク質の機能的アナログには、１、２、３、４、または約５個のアミノ酸を含む、１〜１０個のアミノ酸がＮ末端および／またはＣ末端で切り離された機能的断片が含まれ得る。機能的アナログは、ベース配列（例えば、表１に掲載するような）を基に１〜１０個のアミノ酸の挿入、削除、および／または置換を（まとめて）、それぞれの場合において、治療用タンパク質の全部または一部の生物学的活性（表１に掲載するような）を維持しながら含み得る。例えば、機能的アナログは、ベース配列を基に、１、２、３、４、または５個のアミノ酸の挿入、削除、および／または置換を（まとめて）有し得る。かかる活性は、当該表に記載する方法を含む任意の利用可能な分析法を用いて確認または分析可能である。かかる実施形態またはそのほかの実施形態では、治療用タンパク質は、対応するベース配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を有する。当該分子は、当技術分野でそれぞれについて公知の追加的な化学修飾をさらに含み得る。
【０１２０】
[0135]  いくつかの実施形態では、治療用タンパク質（例えば、表１から選択されるような）は、約２５ｋＤａ未満、または約１０ｋＤａ未満、または約５ｋＤａ未満のサイズを有し、また対応する本発明の治療剤（例えば、ELP成分を含む）は、約６０ｋＤａ、５５ｋＤａ、５０ｋＤａ、または４０ｋＤａ未満の分子量を有する。
【０１２１】
[0136]  表１は、各治療用タンパク質について、好ましい適応をさらに掲載するが、対応する治療剤は、かかる適応に関連する治療方法または予防方法等において有用であることが分かる。
【０１２２】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
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【表６９】
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【表７０】
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【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【表７７】
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【表７８】
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【表７９】
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【表８０】
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【表８１】
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【表８２】
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【表８３】
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【表８４】
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【表８５】
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【表８６】
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【表８７】
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【表８８】
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【表８９】
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【表９０】
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【表９１】
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【表９２】
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【表９３】
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【表９４】
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【表９５】
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【表９６】
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【表９７】
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【表９８】
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【表９９】
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【表１００】
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【表１０１】
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【表１０２】
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【表１０３】
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【表１０４】
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【表１０５】
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【表１０６】
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【表１０７】
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【表１０８】
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【表１０９】
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【表１１０】
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【表１１１】
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【表１１２】
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【表１１３】
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【表１１４】
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【表１１５】
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コンジュゲーションおよび結合
【０１２３】
[0132]  本発明は、ＥＬＰ成分と、表１に記載する治療用タンパク質のほか、ＧＬＰ−１受容体作動薬、インスリン、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、および上記のような機能的アナログ等の、治療成分とを含む治療剤を提供する。かかる薬剤は、遺伝子組換え技術および／または化学結合（例えばコンジュゲーション）により調製可能である。
【０１２４】
[0133]  本発明の特定の実施形態に基づき、遺伝子組換え技術により作製されたＥＬＰ融合タンパク質には、遺伝子融合により相互に結び付いたＥＬＰ成分および治療成分が含まれる。例えば、融合タンパク質は、ＥＬＰ成分と共にインフレームでクローン化された治療成分（またはその逆）をコードするポリヌクレオチドを翻訳することにより生成可能である。かかるＥＬＰ融合タンパク質は、ＥＬＰ成分のＮ末端および／またはＣ末端に結合した治療成分の１つまたは複数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質成分は、ＥＬＰ成分のＮおよびＣ末端の両方に結合し、当該融合タンパク質は１つまたは複数の等しい治療成分を、ＥＬＰ成分のいずれか一方の端または両端に含み得る。
【０１２５】
[0134]  特定の実施形態では、ＥＬＰ成分および治療成分は、様々な長さのリンカーペプチドを用いて融合可能であり、これにより、物理的により隔たって分離され、また融合タンパク質間でより大きな空間的動きが可能となり、したがって、例えば治療成分がそれを認識する受容体と結合する際に、当該治療成分の近付き易さは最大となる。リンカーペプチドは、柔軟性の、またはより剛性の高いアミノ酸から構成され得る。例えば、柔軟性のリンカーは、比較的短い側鎖を有するアミノ酸を含むことができ、かかるアミノ酸は疎水性であり得る。非限定的に、柔軟性のリンカーは、グリシン残基および／またはセリン残基からなるストレッチ部を含み得る。さらに剛性の高いリンカーは、例えばより立体的に込み合ったアミノ酸側鎖を、例えば（非限定的に）チロシンまたはヒスチジンを含み得る。リンカーは、約５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸残基未満であり得る。リンカーは、ＥＬＰ成分および治療成分と、これらの中間で、例えば、遺伝子組換え融合により共有結合可能である。
【０１２６】
[0135]  リンカーまたはペプチドスペーサーは、プロテアーゼで切断可能であってもよく、また非切断可能であってもよい。例として、切断可能なペプチドスペーサーには、様々な種類のプロテアーゼ、例えばＴｅｖ、トロンビン、第Ｘａ因子、プラスミン（血液プロテアーゼ）、メタロプロテアーゼ、カテプシン（例えば、ＧＦＬＧ等）、およびそのほかの体内区画に見出されるプロテアーゼによって（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで）認識されるペプチド配列が非限定的に含まれる。切断可能なリンカーを用いるいくつかの実施形態では、融合タンパク質（「治療剤」）は、融合体としては不活性、低活性、または低能力であり得、ｉｎ  ｖｉｖｏでスペーサーが切断されると活性化される。あるいは、治療剤が、融合体として十分に活性な場合には、非切断可能スペーサーを用いてもよい。非切断可能スペーサーは、任意の適する種類であり得、これには、例えば式［（Ｇｌｙ）ｎ-Ｓｅｒ］ｍ（配列番号２２）を有する非切断可能スペーサー部分が含まれるが、式中、ｎは１〜４であり、ｍは１〜４である。あるいは、骨格ＥＬＰとは異なる短いＥＬＰ配列が、必要な効果を実現しつつ、リンカーまたはスペーサーの代わりに利用可能であろう。
【０１２７】
[0136]  なおも別の実施形態では、治療剤は、各末端でＥＬＰ成分に挟まれた治療成分を有する遺伝子組換え融合体である。治療成分は不活性であるが、１つのＥＬＰ成分がタンパク質分解を受けて取り除かれるとｉｎ  ｖｉｖｏで活性となるように、上記ＥＬＰ成分の少なくとも１つは、切断可能なスペーサーを介して結合可能である。得られた、１つのＥＬＰが融合した融合体は活性となり、ｉｎ  ｖｉｖｏで延長された半減期（または本明細書に記載するそのほかの特性）を有する。
【０１２８】
[0137]  別の実施形態では、本発明はＥＬＰ成分および治療成分からなる化学的コンジュゲート（chemicalconjugate）を提供する。当該コンジュゲートは、当技術分野で周知の任意のいくつかの方法を用いて、ＥＬＰ成分を治療成分に化学的に結合させることにより、作製可能である（例えば、Nilssonら、2005年、AnnRev Biophys Bio Structure、第３4巻：91〜118頁を参照）。いくつかの実施形態では、化学的コンジュゲートは、治療成分を直接的に、または短いまたは長いリンカー部分を介して、共有結合を形成するための治療タンパク質成分上の１つまたは複数の官能基、例えばアミン、カルボキシル、フェニル、チオール、またはヒドロキシル基を介してＥＬＰ成分に共有結合させることにより形成可能である。様々な従来型のリンカー、例えばジイソシアナート、ジイソチオシアナート、カルボジイミド、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒド等が利用可能である。
【０１２９】
[0138]  非ペプチド系の化学スペーサーも、適する種類であればいずれもさらに該当し得るが、これには、例えばＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．が出版する、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｇｒｅｇ  Ｔ.  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、１９９５年に記載されている機能性のリンカー、およびＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ.（Rockford, Illinois）から入手可能な「Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」に記載されているものが含まれ、これらの開示は、それぞれの全体を本明細書において参考として援用される。概略的な化学スペーサーとして、Ｌｙｓのアミン基に結合可能な同種二官能性リンカー、ならびに一方の端でＣｙｓと結合し、他方の端でＬｙｓと結合可能な異種二官能性リンカーが挙げられる。
【０１３０】
[0139]  特定の実施形態では、室温（またはヒト体温、例えばTt>３７℃）で転移しない、比較的小型のＥＬＰ成分（例えば、約３０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａ、または１０ｋＤａ未満のELP成分）が、化学的に結合し、または架橋する。例えば、同一または異なる特性を有する２つの比較的小型のＥＬＰ成分が、化学的に結合し得る。いくつかの実施形態では、かかるカップリングは、ＥＬＰのＣ末端またはその周辺に１個のシステイン残基を付加することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じ得る。かかるＥＬＰ成分は、標的における活性または親和力を増大させるように、１つまたは複数の治療成分とそれぞれ融合可能である。
【０１３１】
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
[0140]  別の態様では、本発明は、本発明の治療剤をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドは、ＥＬＰ成分および治療成分をコードする配列に加えて、１つまたは複数の発現制御要素をさらに含む。例えば、ポリヌクレオチドは、発現制御要素として、１つまたは複数のプロモーター、または転写エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル、およびポリアデニレーションシグナルを含み得る。当該ポリヌクレオチドは、任意の適するベクター内に挿入可能で、同ベクターは、発現用の任意の適する宿主細胞内に含まれ得る。
【０１３２】
[0141]  ポリヌクレオチドを含むベクターを、治療剤を発現させるために細胞に導入することができる。ベクターは、治療剤をコードする挿入物が転写可能である限り、エピソーム性のままであってもよく、また染色体に組み込まれた状態となってもよい。ベクターは、標準的な遺伝子組換えＤＮＡ技術により構築可能である。ベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウィルス、または当技術分野で公知の任意のそのほかの種類であり得、これらは、原核細胞または真核細胞での複製および発現に用いられる。当業者であれば、プロモーター等の多種多様な転写シグナル、およびＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合するのを制御するそのほかの配列を含む、当技術分野で公知の多種多様な成分（発現制御要素等）が、かかるベクターに含まれ得ると理解されよう。ベクターが発現する細胞内で有効であることが公知の任意のプロモーターを、治療剤の発現を開始するのに利用可能である。適するプロモーターは、誘発可能、または構築可能であり得る。適するプロモーターの例として、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ラウス肉腫ウィルスの３’長末端繰返し配列に含まれるプロモーター、ＨＳＶ−１（単純ヘルペスウィルス-1）チミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の制御配列等、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されてきた下記の動物転写制御領域、すなわち膵臓線房細胞内で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域、膵臓β−細胞内で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞内で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣細胞、乳腺細胞、リンパ系細胞、およびマスト細胞内で活性なマウス乳癌ウィルス制御領域、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域、肝臓で活性なα−フェトタンパク質遺伝子制御領域、肝臓で活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域、赤血球系細胞内で活性なβ−グロブリン遺伝子制御領域、脳内のオリゴデンドロサイト細胞内で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋内で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、および視床下部で活性なゴナンドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域が挙げられる。
【０１３３】
医薬組成物
[0142]  本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤と共に、本発明の治療剤（上記のような）を含む医薬組成物をさらに提供する。かかる医薬組成物は、それぞれの治療用タンパク質、例えば表１に掲載する治療用タンパク質、ＧＬＰ−１受容体作動薬、インスリン、および第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子の実施形態に関して上記治療方法で利用可能である。
【０１３４】
[0143]  本発明の治療剤は、ペプチド薬を投与（例えば、非経口的に）したときに、これが有するある種の欠点を克服することができ、かかる欠点として、いくつかの実施形態では、かかるペプチドは、血漿プロテアーゼによって容易に代謝され、または腎臓でのろ過により循環から排除され得るという限界が挙げられる。従来、ペプチド薬を経口で投与すると、胃でのタンパク質分解作用に加えて、胃の強い酸性が、かかるペプチド薬を、これがその意図した標的組織に到達する前に分解するので、やはり問題となり得る。胃の酵素作用や膵臓の酵素作用により生成したペプチドおよびペプチド断片は、消化管刷子縁膜内でエキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼによって切断されてジペプチドおよびトリペプチドとなるが、たとえ膵臓酵素によるタンパク質分解を免れたとしても、ポリペプチドは刷子縁ペプチダーゼにより分解を受ける。生き延びて胃を通過したペプチド薬は、いずれも腸粘膜内でさらに代謝作用を受け、そこでは浸透障壁が細胞内への進入を妨げる。特定の実施形態では、本発明の治療剤は、かかる欠点を克服することができ、また増強された有効性、生物学的利用能、治療半減期、持続性、分解支援性等を有する組成形態を提供することができる。したがって、本発明の治療剤には、経口および非経口投与形態のほか、様々な他の投与形態が含まれ、これによりペプチド薬が極めて効果的な方法で利用可能となる。例えば、いくつかの実施形態では、かかる薬剤は、高い粘膜吸収性を実現し、同時に低用量で使用する能力を実現することができ、最適な治療効果をもたらす。
【０１３５】
[0144]  本発明の治療剤は、融合していないまたは結合していない対照物よりも低用量および／または低頻度で投与可能である。当業者は、それぞれの場合において、望ましい用量を決定し得るが、治療ベネフィットを得るための治療剤の適する用量は、例えば、１日に、被投与者の体重１キログラム当たり、約１マイクログラム（μg）〜約１００ミリグラム（mg）の範囲、好ましくは１日に、体重１キログラム当たり、約１０μｇ〜約５０ｍｇの範囲、および最も好ましくは１日に、体重１キログラム当たり、約１０μｇ〜約５０ｍｇの範囲であり得る。望ましい用量は１回の用量として、または１日を通じて適当な間隔で投与される２回以上の小分け用量として提供され得る。かかる小分け用量は、例えば、単位投与剤形１個当たり約１０μｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約５０μｇ〜約５００ｍｇ、および最も好ましくは約５０μｇ〜約２５０ｍｇの活性成分を含む単位投与剤形で投与可能である。あるいは、連続的な輸液として、被投与者の病状がそのように求めるならば、当該用量は投与され得る。
【０１３６】
[0145]  投与様式および剤形は、当然ながら、所定の治療用途にとって望ましく、効果的である、ペプチド活性型治療剤の治療量に影響を及ぼす。例えば、経口投与による用量の場合、非経口投与法で用いられる用量レベルの少なくとも２倍、例えば２〜１０倍であり得る。
【０１３７】
[0146]  本発明の治療剤は、そのままで、ならびに薬学的に許容されるエステル、塩、およびこれらのそのほか生理的に機能する誘導体を含む様々な形態で投与可能である。本発明は、獣医用途およびヒトの医療用途の両方のための医薬処方も検討対象であり、これには本発明の治療剤が含まれる。かかる医薬処方および薬剤処方では、治療剤は、１つまたは複数の薬学的に許容される、かかる治療剤のための担体（複数可）、および任意選択により、そのほかの任意の治療成分と共に用いることができる。担体（複数可）は、処方のそのほかの成分に適合性を有し、その被投与者にとって過度に有害とならないという観点から、薬学的に許容されなければならない。治療剤は、上記のように所望の薬学的効果を実現するのに有効な量で、および所望の日用量を実現するのにふさわしい量で提供される。
【０１３８】
[0147]  治療剤の処方には、非経口投与ならびに非経口ではない投与に適するものが含まれ、また具体的な投与方式として、経口、直腸、口腔、局所、鼻腔、眼、皮下、筋肉中、静脈内、経皮、髄腔内、関節内、動脈内、くも膜下、気管支、リンパ管、膣、および子宮内投与が挙げられる。経口および非経口投与に適する処方が好ましい。
【０１３９】
[0148]  治療剤が、液体溶液を含む処方で用いられる場合には、当該処方は、経口および非経口により、有利に投与可能である。治療剤が液体懸濁物処方中で、または生体適合性のある担体処方中の粉末として用いられる場合には、当該処方は、経口、直腸、または気管支経由で有利に投与され得る。
【０１４０】
[0149]  治療剤が、粉末化された固体状態で直接用いられる場合には、当該活性薬剤は、経口により有利に投与可能である。あるいは、かかる薬剤は、粉末のガス状懸濁物が形成されるようにキャリアガス中の粉末を噴霧することにより、気管支経由で投与可能であり、かかる粉末は、適当な噴霧装置を備える呼吸回路から患者によって吸入される。
【０１４１】
[0150]  本発明の治療剤を含む処方は、単位投与剤形の状態で便利に提供され、また薬学分野で周知の任意の方法によって調製され得る。かかる方法は、一般的に、治療剤を１つまたは複数の副成分を構成する担体と関連付ける工程を含む。一般的に、処方は、治療剤を液体担体、微粉化された固体担体、または両方と均一かつ緊密に関連付け、次いで、必要ならば、生成したものを所望の処方に基づく剤形に成形することにより調製される。
【０１４２】
[0151]  経口投与に適する処方は、分離したユニットとして、例えばカプセル、カシェ、錠剤、またはトローチ剤として提供可能で、それぞれは、予め決定された量の活性成分を、粉末または顆粒として、または水溶液もしくは非水溶液中の懸濁物、例えばシロップ、エリキシル剤、エマルジョン、または吸入剤として含む。
【０１４３】
[0152]  錠剤は、任意選択により１つまたは複数の副成分と共に、圧縮または成形により作製可能である。圧縮錠剤は、粉末または顆粒等の自由流動形態にある治療剤を適当な機械で圧縮することにより調製可能であり、かかる治療剤は、任意選択によりバインダー、錠剤分解物質、潤滑剤、不活性賦形剤、界面活性剤、または抜染剤と共に混合される。粉末化されたペプチド活性型治療剤−ＥＬＰ構築物（複数可）と適する担体との混合物からなる成形錠剤は、適当な機械で成形することにより作製可能である。
【０１４４】
[0153]  シロップは、ペプチド活性型治療剤−ＥＬＰ構築物（複数可）を、砂糖、例えばショ糖の濃縮水溶液に添加することにより作製可能であり、このシロップにも任意の副成分（複数可）を添加することができる。かかる副成分（複数可）は、香味料、適する防腐剤、砂糖の結晶化を阻止する薬剤、およびポリヒドロキシアルコール、例えばグリセリンまたはソルビトール等の、任意のそのほかの成分の溶解度を増加させる薬剤を含み得る。
【０１４５】
[0154]  非経口投与に適する処方は、治療剤からなる滅菌された水性製剤を好都合に含み、かかる製剤は好ましくは被投与者の血液と等張である（例えば、生理的食塩水）。かかる処方は、懸濁化剤および増粘剤、またはペプチド活性型治療剤が、血液成分または１つもしくは複数の器官を標的と定めるように設計されるそのほかの微粒子系を含み得る。処方は単位投与剤形または複数投与剤形で提供され得る。
【０１４６】
[0155]  鼻腔スプレー処方は、防腐剤および等張化剤を含む、治療剤からなる精製された水溶液を含む。かかる処方は、好ましくは鼻腔粘膜に適合性を有するｐＨおよび等張状態に調整される。
【０１４７】
[0156]  直腸投与のための処方は、ココアバター、硬化油脂、または硬化脂肪カルボン酸（hydrogenatedfatty carboxylic acid）等の適切な担体と共に座剤として提供され得る。
【０１４８】
[0157]  局所処方は、１つまたは複数の媒体、例えば鉱物油、石油、ポリヒドロキシアルコール、または局所医薬品処方に用いられるそのほかの基剤等に溶解または懸濁された治療剤を含む。
【０１４９】
[0158]  上記成分に加えて、本発明の処方は、賦形剤、バッファー、香味料、錠剤分解物質、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、防腐剤（酸化防止剤を含む）等から選択される１つまたは複数の副成分をさらに含み得る。
【０１５０】
[0159]  本発明の特徴および利点は、下記の非限定的な実施例において、より完全に示される。
【実施例１】
【０１５１】
様々なＥＬＰ成分構築物の構築
[0160]  クローニング工程は、大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（rec A1、endA1、gyrA96、thi-1、hsdR17（rk−, mk+）、supE44、relA1、lac[F'、proAB、/αclqZΔM15、Tn10（Tetr）]）（StratageneLa Jolla、CA）内で実施した。ｐＵＣ１９（NEB、Beverly、MA）を、ＥＬＰ構築物のクローニングベクターとして用いた（MeyerおよびChilkoti、Nat.Biotechnol.、第17巻（11）：1112〜5頁、1999年）。ｐＥＴ１５ｂベクターおよびｐＥＴ２４ｄベクター（Novagen）の改変形態を、ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（DE3）株（F-、ompT、hsdSB（rＢ-mＢ-）、gal、dcm、rne131、（DE3））（Invitrogen Carlsbed、CA）、またはＢＬＲ（DE3）（F-、ompT、hsdSB（rＢ-mＢ-）、gal、dcm、Δ（srl-recA）306::Tn10（TcR）（DE3））（Novagen Madison、WI）内でＥＬＰおよびＥＬＰ融合タンパク質を発現させるために用いた。合成ＤＮＡオリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡより購入した。すべてのベクター構築物を、標準的な分子生物学プロトコール（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、1995年）を用いて作製した。
【０１５２】
ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］遺伝子シリーズの構築物
[0161]  ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］シリーズは、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）からなる複数の繰返しユニットを含むポリペプチドを指し、Ｘは、相対比が５：２：３のバリン、アラニン、およびグリシンである。
【０１５３】
[0162]  ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］シリーズモノマーのＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］は、５’リン酸化、ＰＡＧＥ精製された４種類の合成オリゴをアニーリングして、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端を有する二重らせんＤＮＡを形成することにより作製された（MeyerおよびChilkoti、Nat.Biotechnol.、第17巻（11）：1112〜5頁、1999年）。当該オリゴは、ＩＸリガーゼバッファー（Invitrogen）、５０μｌ中の４種類のオリゴからなる１μＭの混合物の中で、ヒーティングブロックを用いて９５℃でアニーリングされ、次いで、当該ブロックは室温まで徐々に冷却された。ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］／ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡセグメントは、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ＣＩＡＰで脱リン酸化されたｐＵＣ１９ベクター（Invitrogen）にライゲートされて、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］が形成された。ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］シリーズライブラリーの構築は、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］に由来するＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］ＰｆｌＭＩ／ＢｇＩＩ断片を、ＰｆｌＭＩで線形化され、ＣＩＡＰで脱リン酸化されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］に挿入して、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−２０］を形成することから開始した。次に、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−２０］は、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］ＰｆｌＭＩ／ＢｇＩＩ断片またはＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−２０］ＰｆｌＭＩ／ＢｇＩＩ断片のそれぞれを、ＰｆｌＭＩで消化されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−２０］にライゲートすることにより、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−３０］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−４０］へとさらに構築された。この手順は、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］シリーズを伸長させて、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−６０］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］遺伝子を作製するために用いられた。
【０１５４】
ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］遺伝子シリーズの構築
[0163]  ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］シリーズは、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）からなる複数の繰返しユニットを含むポリペプチドを指し、Ｘは、相対比が１：２：１のリジン、バリン、およびフェニルアラニンである。
【０１５５】
[0164]  ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］シリーズモノマーのＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］は、５’リン酸化、ＰＡＧＥ精製された２種類の合成オリゴをアニーリングして、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端を有する二重らせんＤＮＡを形成することにより作製された（MeyerおよびChilkoti、1999年）。当該オリゴは、１Ｘリガーゼバッファー（Invitrogen）、５０μｌ中の４種類のオリゴからなる１μＭの混合物の中で、ヒーティングブロックを用いて９５℃でアニーリングされ、次いで、当該ブロックは室温まで徐々に冷却された。ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］／ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡセグメントは、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ＣＩＡＰで脱リン酸化されたｐＵＣ１９ベクター（Invitrogen）にライゲートされて、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］が形成された。ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］シリーズライブラリーの構築は、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］に由来するＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］ＰｆｌＭ１／ＢｇｌＩ断片を、ＰｆｌＭ１で線形化され、ＣＩＡＰで脱リン酸化されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］に挿入して、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−８］を形成することから開始した。同様の手順を用いて、各ライゲーションにおいてＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］シリーズを２倍化して、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−１６］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−３２］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−６４］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−１２８］を形成した。
【０１５６】
ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１］遺伝子シリーズの構築
[0165]  ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１］シリーズは、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）からなる複数の繰返しユニットを含むポリペプチドを指し、Ｘは、相対比が１：７：１のリジン、バリン、およびフェニルアラニンである。
【０１５７】
[0166]  ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１］シリーズモノマーのＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］は、５’リン酸化、ＰＡＧＥ精製された４種類の合成オリゴをアニーリングして、ＰｆｌＭＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端を有する二重らせんＤＮＡを形成することにより作製された。次に、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］  ＤＮＡセグメントは、ＰｆｌＭ１／ＨｉｎｄＩＩＩ脱リン酸化ＰＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］ベクターにライゲートされ、これにより、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］がＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］に置き換わって、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］モノマーができた。ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１］シリーズは、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］シリーズと同様の方法で伸長されて、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−１８］、ＰＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−３６］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−７２］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−１４４］が作製された。
【０１５８】
ＥＬＰ１［Ｖ］遺伝子シリーズの構築
[0167]  ＥＬＰ１［Ｖ］シリーズは、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）からなる複数の繰返しユニットを含むポリペプチドを指し、Ｘはもっぱらバリンである。
【０１５９】
[0168]  ＥＬＰ１［Ｖ］シリーズモノマーのＥＬＰ１［Ｖ−５］は、５’リン酸化、ＰＡＧＥ精製された２種類の合成オリゴをアニーリングして、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端を有する二重らせんＤＮＡを形成することにより作製された。次に、ＥＬＰ１［Ｖ−５］  ＤＮＡセグメントは、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ脱リン酸化ｐＵＣ１９ベクターにライゲートされて、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ−５］モノマーができた。ＥＬＰ１［Ｖ］シリーズは、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］シリーズと同様の方法で作製されて、最終的にｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ−５］から、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ−６０］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ−１２０］まで伸長した。
【０１６０】
ＥＬＰ２遺伝子シリーズの構築
[0169]  ＥＬＰ２シリーズは、ペンタペプチドＡＶＧＶＰからなる複数の繰返しユニットを含むポリペプチドを指す。
【０１６１】
[0170]  ＥＬＰ２シリーズモノマーのＥＬＰ２［５］は、５’リン酸化、ＰＡＧＥ精製された２種類の合成オリゴをアニーリングして、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端を有する二重らせんＤＮＡを形成することにより作製された。次に、ＥＬＰ２［５］ＤＮＡセグメントは、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ脱リン酸化ｐＵＣ１９ベクターにライゲートされて、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［５］モノマーができた。ＥＬＰ２シリーズは、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］シリーズと同様の方法で伸長されて、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［１０］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［３０］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［６０］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［１２０］が作製された。
【０１６２】
ＥＬＰ３［Ｖ］遺伝子シリーズの構築
[0171]  ＥＬＰ３［Ｖ］シリーズは、ペンタペプチドＩＰＧＸＧ（配列番号５）からなる複数の繰返しユニットを含むポリペプチドを指し、Ｘはもっぱらバリンである。
【０１６３】
[0172]  ＥＬＰ３［Ｖ］シリーズモノマーのＥＬＰ３［Ｖ−５］は、５’リン酸化、ＰＡＧＥ精製された２種類の合成オリゴをアニーリングして、ＰｆＬＭ１アミノ末端、および好都合なカルボキシル末端制限部位を欠くことに起因してＧＧＣカルボキシル適合末端を有する二重らせんＤＮＡを形成することにより作製されたが、モノマーのシームレス付加はなおも可能である。次に、ＥＬＰ３［Ｖ−５］  ＤＮＡセグメントは、ＰｆｌＭ１／ＢｇＩＩ脱リン酸化ｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−５］にライゲートされ、これにより、ＥＬＰ４［Ｖ−５］がＥＬＰ３［Ｖ−５］に置き換わってｐＵＣ１９−ＥＬＰ３［Ｖ−５］モノマーができた。ＥＬＰ３［Ｖ］シリーズは、アニーリングされたＥＬＰ３オリゴを、ＰｆｌＭＩで消化されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ３［Ｖ−５］にライゲートすることにより伸長された。各ライゲーションにより、ＥＬＰ３［Ｖ］シリーズは５個ずつ伸長して、ＥＬＰ３［Ｖ−１０］、ＥＬＰ３［Ｖ−１５］等ができた。
【０１６４】
ＥＬＰ４［Ｖ］遺伝子シリーズの構築
[0173]  ＥＬＰ４［Ｖ］シリーズは、ペンタペプチドＬＰＧＸＧ（配列番号７）からなる複数の繰返しユニットを含むポリペプチドを指し、Ｘはもっぱらバリンである。
【０１６５】
[0174]  ＥＬＰ４［Ｖ］シリーズモノマーのＥＬＰ４［Ｖ−５］は、５’リン酸化、ＰＡＧＥ精製された２種類の合成オリゴをアニーリングして、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端を有する二重らせんＤＮＡを形成することにより作製された。次に、ＥＬＰ４［Ｖ−５］ＤＮＡセグメントは、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ脱リン酸化ｐＵＣ１９ベクターにライゲートされて、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−５］モノマーができた。ＥＬＰ４［Ｖ］シリーズは、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］シリーズと同様の方法で伸長されて、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−１０］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−３０］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−６０］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−１２０］が作製された。
【０１６６】
[0175]  ＥＬＰ遺伝子は、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ０、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ６、およびｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１等のそのほかのベクターにも挿入された。ｐＥＴベクターシリーズは、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡより入手可能である。
【０１６７】
[0176]  ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ０ベクターは、マルチクローニング制限部位（SacI-NdeI-NcoI-XhoI-SnaBI-BamHI）を含むＳＤ０二重らせんＤＮＡセグメントを用いて、ｐＥＴ１５ｂベクターを改変することにより形成された。ＳＤ０二重らせんＤＮＡセグメントは、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ適合末端を有し、そしてこれがＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで線形化され、５’脱リン酸化されたｐＥＴ１５ｂにライゲートされて、ｐｅｔ１５ｂ−ＳＤ０ベクターが形成された。
【０１６８】
[0177]  ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３ベクターは、ヒンジ領域〜トロンビン切断部位の上流にあるＳｆｉＩ制限部位と、これに続くマルチクローニング部位（NdeI-NcoI-XhoI-SnaBI-BamHI）を含むＳＤ３二重らせんＤＮＡセグメントを用いて、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ０ベクターを改変することにより形成された。ＳＤ３二重らせんＤＮＡセグメントは、ＳａｃＩおよびＮｄｅＩ適合末端を有し、そしてこれがＳａｃＩ／ＮｄｅＩで線形化され、５’脱リン酸化されたｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ０にライゲートされて、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３ベクターが形成された。
【０１６９】
[0178]  ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５ベクターは、トロンビン切断部位の上流にあるＳｆｉＩ制限部位と、これに続くヒンジおよびマルチクローニング部位（NdeI-NcoI-XhoI-SnaBI-BamHI）を含むＳＤ５二重らせんＤＮＡセグメントを用いて、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３ベクターを改変することにより形成された。ＳＤ５二重らせんＤＮＡセグメントは、ＳｆｉＩおよびＮｄｅＩ適合末端を有し、そしてこれが、ＳｆｉＩ／ＮｄｅＩで線形化され、５’脱リン酸化されたｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３にライゲートされて、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５ベクターが形成された。
【０１７０】
[0179]  ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ６ベクターは、リンカー領域〜ＴＥＶ切断部位の上流にあるＳｆｉＩ制限部位と、これに続くマルチクローニング部位（NdeI-NcoI-XhoI-SnaBI-BamHI）を含むＳＤ６二重らせんＤＮＡセグメントを用いて、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３ベクターを改変することにより形成された。ＳＤ６二重らせんＤＮＡセグメントは、ＳｆｉＩおよびＮｈｅＩ適合末端を有し、そしてこれが、ＳｆｉＩ／ＮｄｅＩで線形化され、５’脱リン酸化されたｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３にライゲートされて、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ６ベクターが形成された。
【０１７１】
[0180]  ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１ベクターは、ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩ適合末端を有するＳＤ２１二重らせんＤＮＡセグメントを用いて、ｐＥＴ２４ｄベクターを改変することにより形成された。ＳＤ２１二重らせんＤＮＡセグメントは、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで線形化され、５’脱リン酸化されたｐＥＴ２４ｄにライゲートされて、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１ベクターが形成されたが、これには、最小数の余分のアミノ酸を含むＥＬＰを挿入および発現させるための２つの停止コドンをＳｆｉＩ部位の直後に備えた、新規のマルチクローニング部位ＮｃｏＩ−ＳｆｉＩ−ＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ−ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｆＩ−ＸｈｏＩが含まれた。
【０１７２】
[0181]  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−６０］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］プラスミドは、ＰｆｌＭＩおよびＢｇｌＩで消化され、ＥＬＰ含有フラグメントは、本明細書ですでに記載したように、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３発現ベクターのＳｆｉＩ部位にライゲートされて、それぞれ、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−６０］、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］およびｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］が形成された。
【０１７３】
[0182]  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ−６０］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ−１２０］プラスミドは、ＰｆｌＭＩおよびＢｇｌＩで消化され、ＥＬＰ含有フラグメントは、本明細書ですでに記載したように、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５発現ベクターのＳｆｉＩ部位にライゲートされて、それぞれ、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ１［Ｖ−６０］、およびｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ１［Ｖ−１２０］が形成された。
【０１７４】
[0183]  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］プラスミドは、ＰｆｌＭＩおよびＢｇｌＩで消化され、ＥＬＰ含有フラグメントは、本明細書ですでに記載したように、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ６発現ベクターのＳｆｉＩ部位にライゲートされて、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ６−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］が形成された。
【０１７５】
[0184]  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−６４］およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−１２８］プラスミドは、ＰｆｌＭＩおよびＢｇｌＩで消化され、ＥＬＰ含有フラグメントは、本明細書ですでに記載したように、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１発現ベクターのＳｆｉＩ部位にライゲートされて、それぞれｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−６４］、およびｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−１２８］が形成された。
【０１７６】
[0185]  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−７２］およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−１４４］プラスミドは、ＰｆｌＭＩおよびＢｇｌＩで消化され、ＥＬＰ含有フラグメントは、本明細書ですでに記載したように、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１発現ベクターのＳｆｉＩ部位にライゲートされて、それぞれｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−７２］、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−１４４］が形成された。
【０１７７】
[0186]  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［６０］およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［１２０］プラスミドは、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ＥＬＰ含有フラグメントは、本明細書ですでに記載したように、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１発現ベクターのＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲートされて、それぞれｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ２［６０］、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ２［１２０］が形成された。
【０１７８】
[0187]  ＸＬ１―Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−６０］およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−１２０］プラスミドは、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ＥＬＰ含有フラグメントは、本明細書ですでに記載したように、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１発現ベクターのＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲートされて、それぞれｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ４［Ｖ−６０］、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ４［Ｖ−１２０］が形成された。
【実施例２】
【０１７９】
インスリンＡペプチド（ＩｎｓＡ）を含む融合タンパク質の単離および精製
[0188]  ＥＬＰ−ＩｎｓＡ融合タンパク質には、下記事項が含まれた：
【０１８０】
[0189]  インスリンＡペプチド、およびＥＬＰ１［Ｖ−６０］ポリペプチドを含み、両者の間にエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有する。
【０１８１】
[0190]  インスリンＡペプチド、およびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチドを含み、両者の間にエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有する。
【０１８２】
[0191]  インスリンＡペプチド、およびＥＬＰ１［Ｖ−１２０］ポリペプチドを含み、両者の間にエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有する。
【０１８３】
[0192]  インスリンＡペプチド、およびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］ポリペプチドを含み、両者の間にエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有する。
【０１８４】
[0193]  各ＥＬＰ−ＩｎｓＡ融合タンパク質を含む大腸菌株ＢＬＲ（DE3）（Ｎovagen）の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Sigma）が補充されたＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ（Q-BlOgene、San Diego、CA）、５ｍｌに植菌し、２５０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で５時間増殖させた。次に、培養物５ｍｌを培溶液５００ｍｌに植菌し、２５℃で４時間、１ｍＭのＩＰＴＧで誘発する前に、２５℃で１６時間増殖させた。培養物を収集し、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、および完全ＥＤＴＡフリー・プロテアーゼインヒビター（Complete EDTA free Protease inhibitor）、１錠（Roche、Indianapolis、IN）からなる溶液４０ｍｌに懸濁した。氷上で３分間、超音波破砕を行うことにより、細胞を溶解したが、これは、３５％の破砕力で１０秒間破砕し、３０秒間のクーリングダウン時間を置くように構成された。４℃、３０分間、２０，０００ｇで遠心分離して細胞残屑を除去した。
【０１８５】
[0194]  逆相転移は、終濃度が１．０ＭとなるようにＮａＣｌを細胞溶解物に室温で添加することにより誘発し、これに続き、室温、１５分間、２０，０００ｇで遠心分離した。得られたペレットには、各ＥＬＰ−ＩｎｓＡ融合タンパク質、およびＮａＣｌにより非特異的に沈殿したタンパク質が含まれた。
【０１８６】
[0195]  当該ペレットを、氷冷した２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴの溶液４０ｍｌに再懸濁し、４℃、１５分間、２０，０００ｇで再度遠心分離して、ＮａＣｌにより非特異的に沈殿したタンパク質を除去した。逆相転移サイクルをさらに２回繰り返して、各ＥＬＰ−ＩｎｓＡ融合タンパク質の純度を上げ、最終容積を０．５ｍｌまで小さくした。
【実施例３】
【０１８７】
ＥＬＰ１の半減期
[0196]  ＥＬＰ１の薬物動態は、ｌｅｇ／ｆｌａｎｋ  ＦａＤｕ異種移植片を有するヌードマウス（Balb/cnu/nu）に［１４Ｃ］ＥＬＰ１を静脈内注射し、投与後の様々な時間において血液サンプルを収集することにより決定された。血液薬物動態は特徴的な分布、および大型の巨大分子に対して排除反応を示したが、これは、二相性の指数プロセスにより良く説明された。
【０１８８】
[0197]  排除反応および分布反応の両方に近似させるために、血漿濃度のタイムコース曲線を、２コンパートメントモデルの解析解に当てはめた。具体的な薬物動態パラメーターを下記表１に示す。ＥＬＰの分布容積（１．３３８μｌ）は、仮説に基づく血漿容積の１．３６３μｌにほぼ等しかったが（Barbee, R.W.ら、Am. J. Physio.、第263巻（3）（1992年）R728〜R733頁）、これは、投与直後にＥＬＰは、特定の器官や組織に速やかに分布または結合しなかったことを示唆している。ＡＵＣは、中央コンパートメントまたは血漿におけるＥＬＰへの累積的な暴露の指標である。体クリアランスは、ＥＬＰの血漿濃度に関連した、体内におけるＥＬＰ排除速度として定義され、腎臓、肝臓、およびそのほか器官を含むすべての器官を経由するクリアランスの合計である。
【０１８９】
【表１１６】
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【０１９０】
[0198]  物質輸送速度定数は、標準２コンパートメントモデル（ｋ１；中央コンパートメントから末梢コンパートメント；ｋ２；末梢コンパートメントから中央コンパートメント；およびｋｅ；中央コンパートメントからの排除）から求められる。分布容積（Ｖｄ）、中央コンパートメント濃度タイムコース曲線下面積（ＡＵＣ）、および体クリアランス（ＣｌＢ）を示す。データは、平均値として表されている（n=5、ただし、類似のコホートからn=3で算出されたＶｄおよび初期血漿濃度（Ｃ０）を除く）。
【実施例４】
【０１９１】
ヌードマウスにおける、ＥＬＰの生体分布
１４Ｃ標識ＥＬＰ１−１５０および／または１４Ｃ標識ＥＬＰ２−１６０
[0199]  １４Ｃ標識ＥＬＰ１−１５０および／または１４Ｃ標識ＥＬＰ２−１６０を、ＦａＤｕ腫瘍を有するヌードマウスに投与した（平均+/-SD、n=6）。腫瘍を、ＥＬＰの投与後に４１．５℃のウォーターバス中で加温した。分布は、血液含量が最も高い器官：肝臓、腎臓、脾臓、および肺で最大であった。
【０１９２】
１４Ｃ標識ＥＬＰ２−［Ｖ１Ａ８Ｇ７−１６０］
[0200]  １４Ｃ標識ＥＬＰ２−［Ｖ１Ａ８Ｇ７−１６０］（Tｔ>６０℃）を、血漿濃度が１５μＭとなるようにヌードマウスに投与した。ヌードマウスの右後肢に位置する移植したＦａＤｕ腫瘍を１時間加温（４１℃）した後、ＥＬＰ濃度を求めた。データを平均値と９５％信頼区間として示す。Ｎ＝６。
【０１９３】
[0201]  １４Ｃ標識ＥＬＰ２−［Ｖ１Ａ８Ｇ７−１６０］を全身投与して１．５時間後に、ＥＬＰ濃度を測定した。血液含量が最も高い器官：肝臓、腎臓、脾臓、および肺で、最大の分布が認められた。
【実施例５】
【０１９４】
エキセンジン−４  ＥＬＰ融合体
[0202]  エキセンジン−４（Ex-4）のＤＮＡ配列（配列番号１４）は、大腸菌の発現に最適化されたコドンを用いて、アミノ酸配列から逆翻訳された。エキセンジン−４をコードするＤＮＡ配列は、プラスミドｐＥＴ２４ｄ−ＥＬＰ１−９０（図１）内の制限部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩに適合性を有するオーバーハンギング５’および３’末端を備えた合成オリゴヌクレオチドを共にアニーリングすることにより構築された。このプラスミドは、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化され、アニーリングされたＤＮＡ配列はカットベクターにライゲートされた。挿入は、制限消化およびＤＮＡ配列決定により確認された。得られたプラスミドは、ｐＥＴ２４ｄ−Ｅｘ−４  ＥＬＰ１−９０として定義され（図２Ａ）、得られたエキセンジン−４−ＥＬＰ融合体の配列を、図２Ｂに示す。融合体構築物のプライマーも示す。
【０１９５】
[0203]  ｐＥＴ２４ｄ−Ｅｘ−４  ＥＬＰ１−９０は、大腸菌株ＢＲＬ（Invitrogen）を形質転換するために用いられ、選択された形質転換物を、振盪フラスコ中の培溶液３（１．２％トリプトンペプトン、２．４％酵母エキス、５ｇ／Ｌカザミノ酸、２％グリセリン、リン酸二カリウム２．３１３ｇ／Ｌ、リン酸一カリウム１２．５４１ｇ／Ｌ）内で増殖させた。１Ｌの培養液３に１ＯＤ細胞を植菌することによる自己誘導方式を用いて産生を進行させ、誘導物質を添加せずに３７℃で１７時間増殖を進行させた。生成物は、細胞ペレットを収集することにより回収され、細胞を破壊するように超音波処理を受け、そしてＥＬＰ部分によって調節された熱および／または塩誘発転移を行って回収された（Improved Non-chromatographic Purification of a Recombinant Proteinby Cationic Elastin-like Polvpeptides、Dong Woo Lim、Kimberly Trabbic-Carlson、J. Andrew MacKay、およびAshutosh Chilkoti. Biomacromolecules、2007年、第8巻、1417〜1424頁）。
【０１９６】
[0204]  この実施例は、１−９０と規定されたＥＬＰに関する。これはＶＰＧＸＧ（配列番号３）のモチーフに基づき、Ｘは、１０回のユニット繰返しの中で相対比が５：３：２となるＶ、Ｇ、またはＡであり、これが８回繰り返されて、最後に（Ｃ末端に）１０回のユニット繰返しを備え、このときＸは比が４：３：２：１となるＶ、Ｇ、ＡおよびＷである。
【０１９７】
[0205]  ［（ＶＰＧＸＧ）１０］９において、Ｘ残基が、繰返しユニットに基づき１０回連続した繰返しの中（下付きの数字）にある場合には、［（Ｖ1,4,5,6,10Ｇ2,7,9Ａ3,8）8（Ｖ1,4,5,6Ｇ2,7,9Ａ3,8Ｗ10）］として記載され得る。
【０１９８】
［0206］  ＥＬＰは、任意の長さの繰返しユニットを任意に組み合わせた中の、ＶＰＧＸＧ（配列番号３）ユニットの任意の組合せであり得、Ｘは、２０個の天然アミノ酸のうちのプロリンを除くいずれかである。さらに、アミノ酸は非天然のアミノ酸であり得るが、かかるアミノ酸を特定のコドンで取り込むように遺伝子工学的に作製されたｔＲＮＡを許容する宿主株が、遺伝子工学的に作り出されている（Wang L、Brock A、HerberichB、Schultz PG.、Expanding thegenetic code of Escherichia coli.[2001年]、Science、第292巻、498〜500頁）。
【０１９９】
[0207]  この構築物は細胞質ゾル内で産生され、通常、メチオニンアミノペプチダーゼで除去されるＮ末端メチオニンを有した。しかし、メチオニンの完全かつ正確なプロセッシングを保証することができない。すなわち、この酵素は、エキセンジン−４部分のＮ末端ヒスチジンを除去し得る。これは、未処理の、処理済みの、および不正確に処理された生成物の混合物をもたらすおそれがある。したがって、正しく処理されたＮ末端を有する生成物を産生するために、さらなる構築物が開発された。
【０２００】
[0208]  Ｎ―末端メチオニンとエキセンジン−４のＮ末端のヒスチジンとの間にＴｅｖプロテアーゼ（タバコモザイクウィルス・システインプロテアーゼ）切断部位を付加するように、プライマーを設計した。こうすれば、メチオニンの除去が可能となり、Ｔｅｖ認識配列は、エキセンジン−４の成熟したＮ末端（ヒスチジン）を与える。これは産生後に行ってもよく、また産生の際に認識配列を切断するように、Ｔｅｖプロテアーゼを、例えばインテインとして同時発現させてもよい（Ge, X.、Yang, D.S.C.、Trabbic-Carlson,K.、Kim, B.、Chilkoti, A.およびFilipe C.D.M.、Self-Cleavable StimulusResponsive Tags for Protein Purification without Chromatoqraphy、J. Am. Chem. Soc.、第127巻、11228〜11229頁、2005年）。Ｔｅｖエキセンジン−４配列を図３Ａに示す。図３Ｂは、Ｔｅｖプロテアーゼのより優れた標的となるように付加され、「リンカーＴｅｖ」と名付けられた、追加の配列を示している。
【０２０１】
[0209]  正しく処理されたＥｘ−４のＮ末端を得るための別の経路は、ペリプラズムに産生を指令するリーダー配列またはシグナル配列を利用することであり、同配列は、プロセスにおいてシグナルペプチダーゼにより切断される。この場合、シグナル配列、ＤｓｂＡがもたらされ、これはペリプラズム内にポリペプチドを直接分泌するようにシグナル認識粒子に対して転写を指令する（図４を参照）。プラスミドｐＥＴ２４ｄ−ＤｓｂＡ−Ｅｘ−４  ＥＬＰ１−９０を図４Ｂに示す。
【０２０２】
[0210]  この実施例では、エキセンジン−４の配列を有する治療剤の調製について説明しているが、かかる配列は、ＧＬＰ−１、インスリン、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、または表１に掲載するそのほかの治療用タンパク質と置き換えることができ、エキセンジン−４について詳記した方法とまったく同じ、または類似した方法で産生可能である。
【実施例６】
【０２０３】
ＧＬＰ１−ＥＬＰ融合タンパク質
[0211]  ＥＬＰプラスミド構築物が、２種類のＧＬＰ１−ＥＬＰ融合タンパク質、ＧＬＰ１（A8G, ７〜３７）ＥＬＰ１−９０およびＧＬＰ１（A8G, ７〜３７）ＥＬＰ１−１２０を調製するために用いられた。このプラスミド構築物、融合体をコードするヌクレオチド配列、ならびに得られた融合タンパク質のアミノ酸配列を図５および６に示す。
【０２０４】
[0212]  両構築物は、Ｎ末端Ｔｅｖプロテアーゼ部位を含み、ＧＬＰ１のＨｉｓ７がＮ末端にある成熟型へのプロセッシングを可能にしている。処理された融合タンパク質は、それぞれ約３９，５３６および約５０，８２８の計算分子量を有する。
【実施例７】
【０２０５】
ＦＶＩＩ  ＥＬＰ融合タンパク質
[0213]  凝固第ＶＩＩ因子（FVII）遺伝子は、ｃＤＮＡクローン（Oragene）に基づきＰＣＲ法を用いて改変して、５’末端および３’末端に、ＥＬＰ含有ベクターにクローニングするための制限部位を付け加えた。５’末端にＮｈｅＩ部位を付加し、３’末端にはＮｏｔＩ部位を付加した。第ＶＩＩ因子遺伝子のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、添付の配列リストにそれぞれ配列番号３４および３３として示す。第ＶＩＩ因子（FVII）遺伝子をＰＣＲ増幅するために用いた５’および３’プライマーのＤＮＡ配列は以下の通りであった：
Ｐ１３：ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣ（配列番号４９）
Ｐ１４：ＴＡＴＴＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧ（配列番号５０）
【０２０６】
[0214]  得られたＰＣＲ断片は、制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化され、そして制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩですでに消化済みのプラスミドｐｃＤＮＡ３．１＋ＥＬＰ１−９０にライゲートされた（図７Ａ）。
【０２０７】
[0215]  得られたプラスミドｐｃＤＮＡ３．１＋ＦＶＩＩ−ＥＬＰ１−９０を、ＨＥＫ２９３細胞に一時的に形質導入し、培地を収集した。ＥＬＰ融合体を相転移により精製した（図９および１０）。
【０２０８】
[0216]  第ＶＩＩ因子−ＥＬＰ融合体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図７Ｂに示す。示す通り、第ＶＩＩ因子−ＥＬＰ融合タンパク質は、第ＶＩＩ因子成分とＥＬＰ成分の間にＴｅｖプロテアーゼリンカーを含む。このリンカーは、任意選択的である。
【実施例８】
【０２０９】
インスリン融合タンパク質
[0217]  ヒトインスリン遺伝子のｃＤＮＡは、ｐＥＴ２４ｄ−ＥＬＰ１−９０に挿入するために、５’末端および３’末端で改変を受ける。５’プライマーには、細菌発現させるためのＮ末端メチオニン、およびＮｄｅＩ制限酵素部位が付加される。３’プライマーには、ＸｈｏＩ制限酵素部位が付加される。ＰＣＲ産物およびプラスミドは、共に制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化され、共にライゲートされる。ＥＬＰ１に融合したインスリン（Ｂ、Ｃ、およびＡ鎖）の配列を図８Ａに示す。
【０２１０】
[0218]  正しく挿入されたことを、制限消化およびＤＮＡ配列決定により確認する。得られるプラスミドはｐＥＴ２４ｄインスリン−ＥＬＰ１−９０と規定され、これを図８Ｂに示す。
【０２１１】
[0219]  天然型インスリン形態は、大腸菌から回収した後に、Ｃ−ペプチド鎖を除去するためのトリプシン処理およびカルボキシペプチダーゼＢ処理することにより生成される。
【０２１２】
[0220]  Ｂ鎖のＮ末端が正しく処理されるように、エキセンジン−４融合体について行われた改変と同様の改変（プロテアーゼ切断部位、シグナル配列）を実施することができる（実施例４を参照）。あるいは、最初の２つの残基はＭｅｔ−Ａｒｇであり得、これらも、最終物質の生成において、トリプシン消化によって除去可能である（R. M. Belagaje、S. G. Reams、S. C. LyおよびW. F. Prouty、Increased production of low molecular weight recombinant proteins inEscherichia coli.、Protein Sci.、第6巻、1953〜1962頁、1997年）。
【０２１３】
[0221]  追加の構築物では、Ｃ末端融合のためのインスリンｃＤＮＡがＥＬＰの３’末端に配置され、インスリン配列とＥＬＰ配列との間にリンカーが付加され、および／または余計なプロセシングを不要とするように、Ｃ−ペプチドを有さないインスリンの改変形態（すでに記載した１本鎖インスリン）が用いられる。
【実施例９】
【０２１４】
コンジュゲーション用のＥＬＰ遺伝子の合成
[0222]  ５０個のアミノ酸をコードする遺伝子が、標準的な分子生物学プロトコールを用いて化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築された。５０個のアミノ酸配列には、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）の１０回の繰返しが含まれ、ゲスト残基（５：３：２のモル比のＶ、Ｇ、およびＡ）は、Ｔｔが４０℃となるように選択された。この遺伝子は、標準的な分子生物学の技術により、端と端が結合するようにオリゴマー化されて、オリゴマー化したＥＬＰ遺伝子が生み出された。さらに、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）を１０回繰り返したポリペプチドを含む、単一の５０個のアミノ酸配列が構築されたが、ゲスト残基は、４：３：２：１のモル比のＶ、Ｇ、Ａ、およびＣである。この配列は、構築物の長さ方向の選択されたポイントで、１つのシステイン残基を最終構築物に導入するように、オリゴマー化プロセスの任意のサイクルで付加され得る。
【０２１５】
[0223]  ここで説明する実施例は、１−９０と規定されたＥＬＰに関する。これは、ＶＰＧＸＧ（配列番号３）モチーフに基づき、８回繰り返される１０回のユニット繰返しにおいて、Ｘは５：３：２の比のＶ、Ｇ、またはＡであり、これに付加された最終（Ｃ末端）の１０回のユニット繰返しにおいては、Ｘは４：３：２：１の比のＶ、Ｇ、Ａ、およびＣである。すなわち、［（ＶＰＧＸＧ）１０］９（配列番号３）。
【０２１６】
[0224]  あるいは、当該残基は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸のうちの１つであり得る。かかるアミノ酸の狙いは、例えばインスリンを化学的に結合させるための反応性側鎖を提供することにある。このような具体的なケースでは、ＥＬＰを使用すれば、治療用タンパク質（例えば、インスリン）の循環半減期が延長されて、持続性の基本的血糖管理が実現するであろう。体温で転移するＥＬＰに結合させれば、インスリンは、Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）（Sanofi Aventis）と同様の様式で、注射部位で析出型のデポーを形成するが、注射をより寛容性にする、ｍ−クレゾールを用いた酸性（ｐＨ４．０）条件で処方する必要はない。
【実施例１０】
【０２１７】
第ＶＩＩ因子−ＥＬＰの効力および半減期
[039]  図１１は、第ＶＩＩａ因子−ＥＬＰ１−９０、および比較として第ＶＩＩａ因子による第Ｘ因子の活性化を示す図である。第ＶＩＩ因子−ＥＬＰは、ＨＥＫ細胞中で産生された。第ＶＩＩａ因子はヒト血漿から得られた。示す通り、第ＶＩＩａ因子−ＥＬＰは、全活性を維持している。
【０２１８】
[040]  図１２は、ｉ．ｖ．でラットに投与した場合、第ＶＩＩａ因子−ＥＬＰは、約６９０分の半減期を示した。対照的に、第ＶＩＩ因子は４５〜６０分の半減期を示した。本実施例の半減期は、第ＶＩＩ因子についてはサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定された。
【０２１９】
[041]  やはり、対照的に、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）について報告された半減期は４５分であり、第ＶＩＩａ因子−アルブミン融合体について報告された半減期は２６３分であり、また第ＶＩＩａ因子−ＰＥＧについて報告された半減期は、マウスで３００分、イヌで６００分である。
【実施例１１】
【０２２０】
ＧＬＰ−１（またはエキセンジン−４）のｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイ
[0132]  ＧＬＰ−１受容体（GLP1R）が活性化されると、ｃＡＭＰの二次メッセンジャーが細胞中に産生される。したがって、ＧＬＰ−１またはエキセンジン−４アナログ、および関連する治療剤は、細胞表面上のＧＬＰ１Ｒを活性化させ、またｃＡＭＰを産生させるこれらの能力に基づき試験することができる。
【０２２１】
[0133]  本バイオアッセイでは、ＧＬＰ１ＲをコードするｃＤＮＡで核酸導入されたＣＨＯ細胞を用いる。これらの細胞は、ＧＬＰ−１による刺激に反応し、高レベルのｃＡＭＰを産生する。対数増殖期の細胞を蒔き、濃度が高められた試験化合物（例えば、本発明の治療剤、またはＧＬＰ−１、またはエキセンジン−４の機能的アナログ）を細胞に添加する。３７℃において生理的バッファー内で適当な時間（通常15〜60分）インキュベーションした後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Sunnyvale、CA）より入手可能なＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ  ｃＡＭＰアッセイキットを用いて生成したｃＡＭＰを測定する。ＧＬＰ−１ペプチドまたはエキセンジン−４ペプチドと比較したときに（または本発明の治療剤の融合していない、もしくは結合していない対照物と比較したときに）、各試験化合物のＥＣ５０は、ペプチドに導入された特定の改変に起因する、またはＥＬＰ成分に付加された特別な化学的または遺伝子組換えによるカップリングに起因する活性の変化を表す。
【０２２２】
[0134]  図１３に示す通り、ＧＬＰ１−ＥＬＰ（PB0868）およびエキセンジン−４−ＥＬＰ（PB0859）は、いずれも、エキセンジン単独との比較で明らかなようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで高活性を維持している。アルブゴン（Albugon）（登録商標）およびリラグルチド（Liraglutide）（登録商標）の比活性は、エキセンジンペプチドの１／５０〜１／１００であることに留意されたい。
【実施例１２】
【０２２３】
ＧＬＰ−１（またはエキセンジン−４）のｉｎ  ｖｉｖｏバイオアッセイ
[0135]  ＧＬＰ−１、またはエキセンジンアナログ、または関連する治療剤の活性は、動物中で試験可能である。本アッセイでは、健常動物または糖尿病動物を用いることができる。血糖濃度が３００〜５００ｍｇ／ｄｌの糖尿病動物に、異なる用量のＧＬＰ−１、またはエキセンジンアナログ、または関連する治療剤を注射し、血糖の変化をグルコメーターでモニターする。投与後の異なる時点におけるグルコースの低下を、標準量のＧＬＰ−１またはエキセンジン−４ペプチドから得られた結果と比較するか、本発明の治療剤の融合していない、または結合していない対照物の結果と比較する。あるいは、体外からグルコースを投与した後の所定の時間における健常動物または糖尿病動物の血糖上昇を、ＧＬＰ−１またはエキセンジン−４（または、治療剤の融合していない、または結合していない対照物）と比較する。このようにして、アナログおよび融合タンパク質の活性を、天然型のペプチドと比較することができる。
【０２２４】
[0136]  図１４は、ｉ．ｖ．および皮下の両方で、投与されたラットにおける、ＧＬＰ１−ＥＬＰ１−１２０の薬物動態を示す図である。各時点で３匹のラットが用いられた。用量は約１０ｍｇ／ｋｇであった。ｉ．ｖ．投与したときのＴ１／２は約１２．９時間であった。皮下投与したときのＴ１／２は約８．６時間であった。
【０２２５】
[0137]  図１５は、ｉ．ｖ．および皮下の両方で、投与されたウサギにおける、ＧＬＰ１−ＥＬＰ１−１２０の薬物動態を示す図である。各時点で３匹のウサギが用いられた。用量は約１ｍｇ／ｋｇであった。ｉ．ｖ．投与したときのＴ１／２は約２０時間であった。皮下投与したときのＴ１／２は約２４時間であった。
【０２２６】
[0138]  図１６が、糖尿病マウスにおいて、ＧＬＰ１−ＥＬＰ１−９０がもたらす持続性の血糖管理を示す図である。
【０２２７】
[0139]  本明細書で引用するすべての参考資料は、その全体を本明細書において参考として援用する。本発明は、本発明の具体的な態様、特徴、および概略的な実施形態を参照しながら本明細書において説明されてきたが、本発明の利用はそのように制限されるものではなく、むしろ数多くのそのほかの変形形態、修正形態、および別の実施形態まで拡張され、またこれらを含むものと、本明細書の開示に基づき、かかる形態それ自体が、本発明の分野における当業者に対して示唆するように、理解されよう。
【図１】
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【図２Ａ】
2019085420.tif 000120
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2019085420.tif 000122
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2019085420.tif 000124
【図４Ｂ】
2019085420.tif 000125
【図５Ａ】
2019085420.tif 000126
【図５Ｂ−１】
2019085420.tif 000127
【図５Ｂ−２】
2019085420.tif 000128
【図５Ｂ−３】
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【図６Ａ】
2019085420.tif 000130
【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
2019085420.tif 000132
【図６Ｂ−３】
2019085420.tif 000133
【図７Ａ】
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【図７Ｂ−１】
2019085420.tif 000135
【図７Ｂ−２】
2019085420.tif 000136
【図７Ｂ−３】
2019085420.tif 000137
【図７Ｂ−４】
2019085420.tif 000138
【図７Ｂ−５】
2019085420.tif 000139
【図７Ｂ−６】
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【図８Ａ】
2019085420.tif 000141
【図８Ｂ】
2019085420.tif 000142
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月27日(2019.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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