(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるための方法及び組成物の提供。【解決手段】細胞における２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドのレベルを増大させることにより、細胞によるＩＦＮの産生を十分に増大させる。【選択図】図６Ｃ
2019068829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるための方法であって、
該細胞による該Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるために十分であるように、該細胞における２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドのレベルを増大させるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞を前記環状ジヌクレオチドと接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記環状ジヌクレオチドが、２個の２'−５'ホスホジエステル連結を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記環状ジヌクレオチドが、１個の２'５'ホスホジエステル連結および１個の３'−５'ホスホジエステル連結を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記環状ジヌクレオチドが、１個のグアノシンヌクレオシドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記環状ジヌクレオチドが、１個のアデノシンヌクレオシドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記環状ジヌクレオチドが、１個のアデノシンヌクレオシドおよび１個のグアノシンヌクレオシドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞におけるｃＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の活性を増大させることによって前記環状ジヌクレオチドのレベルを増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＦＮがインターフェロンアルファまたはインターフェロンベータである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が哺乳動物細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
１個の２'−５'ホスホジエステル連結を含む、環状ジヌクレオチド。
【請求項１３】
２個の２'−５'ホスホジエステル連結を含む、請求項１２に記載の環状ジヌクレオチド。
【請求項１４】
１個の２'−５'ホスホジエステル連結および１個の３'−５'ホスホジエステル連結を含む、請求項１３に記載の環状ジヌクレオチド。
【請求項１５】
グアノシンヌクレオシドおよびアデノシンヌクレオシドの少なくとも１個を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の環状ジヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法１１９条（ｅ）に基づき、本出願は、その出願の開示が参照により本明細書に組み込まれる２０１３年５月３日出願の米国特許仮出願第６１／８１９，４９９号の出願日に対する優先権を主張する。
【０００２】
米国政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所によって認可された認可番号ＡＩ０６３３０２、ＡＩ０７５０３８、ＡＩ０８０７４９、ＡＩ０８２３５７、およびＯＤ００８６７７に基づく政府支援によって成された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
序文
インターフェロン（「ＩＦＮ」とも称される）は、その一部が抗ウイルス性、免疫調節性、および抗増殖性である、様々な生物学的活性を有するタンパク質である。これらは、ウイルス、ポリペプチド、分裂促進因子などの様々な誘導因子への曝露に応答して哺乳動物細胞によって産生される相対的に小さく、種特異的な単鎖ポリペプチドである。インターフェロンは、ウイルスによる攻撃から動物の組織および細胞を保護し、重要な宿主防御機構である。多くの場合に、インターフェロンは、それを産生した種の組織および細胞に対して、他の種類の組織および細胞よりも良好な保護を提供し、これは、ヒト由来インターフェロンが、他の種に由来するインターフェロンよりもヒト疾患の処置において有効であり得ることを示している。インターフェロンは、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型インターフェロンとして分類され得る。哺乳動物Ｉ型インターフェロンには、ＩＦＮ−α（ａｌｐｈａ）、ＩＦＮ−β（ベータ）、ＩＦＮ−κ（カッパ）、ＩＦＮ−δ（デルタ）、ＩＦＮ−ε（イプシロン）、ＩＦＮ−τ（タウ）、ＩＦＮ−ω（オメガ）、およびＩＦＮ−ζ（ゼータ、リミチンとしても公知）が含まれる。
【０００４】
インターフェロンの産生を誘導する剤は、ワクチンアジュバントとして、かつエフェクターＴ細胞およびメモリーＴ細胞応答を開始する製剤において、使用されている。有効なアジュバントは、毒性副作用を最小化し、ワクチン接種の用量および投薬量を低減し、かつ免疫応答を拡大しながら、抗原に対する特異的免疫応答を増強する。細胞内病原体および癌細胞に由来する抗原と同時製剤化されて、細胞内病原体を処置し、腫瘍量を低減するために有効な細胞および体液免疫応答を活性化し得る有効なアジュバントが依然として必要とされている。インターフェロンタンパク質の免疫調節活性、およびインターフェロンの産生を調節するシグナル伝達経路は、新たなアジュバントを設計するためのターゲットとして、関心を集めている。
【０００５】
インターフェロン分子は、複数の段階で作用する抗癌活性を有するので、インターフェロンは、多数のヒト癌の処置において可能性を有する。第一に、インターフェロンタンパク質は、ヒト腫瘍細胞の増殖を直接的に阻害し得る。抗増殖活性はまた、シスプラチン、５ＦＵ、およびパクリタキセルなどの様々な認可された化学療法薬と相乗作用を有する。第二に、インターフェロンタンパク質の免疫調節活性は、抗腫瘍免疫応答の誘導をもたらし得る。この応答には、ＮＫ細胞の活性化、マクロファージ活性の刺激、およびＭＨＣクラスＩの表面発現の誘導が含まれ、抗腫瘍細胞傷害性Ｔリンパ球活性の誘導をもたらす。加えて、インターフェロンは、免疫系における抗原の交差提示において役割を果たす。そのうえ、一部の研究はさらに、ＩＦＮ−βタンパク質が、抗血管新生活性を有し得ることを示している。新たな血管の形成である血管新生は、充実性腫瘍の成長にとって重要である。証拠によって、ＩＦＮ-βは、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦなどの血管新生促進因子の発現を阻害することによって、血管新生を阻害し得ることが示されている。最後に、インターフェロンタンパク質は、組織リモデリングにおいて重要であるコラゲナーゼおよびエラスターゼなどの酵素の発現を調節することによって、腫瘍侵襲性を阻害し得る。
【０００６】
インターフェロンはまた、２つの異なる機構に基づく抗ウイルス活性を有すると考えられる。例えば、Ｉ型インターフェロンタンパク質（αおよびβ）は、ヒトＢ型肝炎（「ＨＢＶ」）およびＣ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）の複製を直接的に阻害し得るが、他にも、これらのウイルスに感染した細胞を攻撃する免疫応答を刺激し得る。
【発明の概要】
【０００７】
概要
細胞におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるための方法および組成物を提供する。該方法の態様には、細胞によるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるために十分であるように、細胞における２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドのレベルを増大させることを含む。また、本方法を実行するための組成物およびキットを提供する。
【０００８】
一態様では、本明細書において、細胞によるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるために十分であるように、細胞における２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドのレベルを増大させることによって、細胞におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させる方法を提供する。
【０００９】
ある種の実施形態では、上記方法は、細胞を環状ジヌクレオチドと接触させるステップを含む。ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個の２'−５'ホスホジエステル連結を有する。他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個の２'−５'ホスホジエステル連結および１個の３'−５'ホスホジエステル連結を有する。
【００１０】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のグアノシンヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個のグアノシンヌクレオシドを含有する。ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のアデノシンヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個のアデノシンヌクレオシドを含有する。他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のアデノシンヌクレオシドおよび１個のグアノシンヌクレオシドを含む。
【００１１】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000003
を有し、
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000004
である。
【００１２】
一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000005
を有する。
【００１３】
上記方法のある種の実施形態では、細胞におけるｃＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の活性を増大させることによって、上記環状ジヌクレオチドのレベルを増大させる。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする核酸の発現を増強することによって、ｃＧＡＳの活性を増大させる。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする核酸を細胞に導入することによって、ｃＧＡＳの活性を増大させる。
【００１４】
ある種の実施形態では、上記方法は、インターフェロン（ＩＦＮ）アルファの産生を増大させるためのものである。他の実施形態では、ＩＦＮは、インターフェロンベータである。
【００１５】
ある種の実施形態では、上記方法は、哺乳動物細胞におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるためのものである。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、上記細胞はインビトロである。他の実施形態では、上記細胞はインビボである。
【００１６】
別の態様では、本明細書において、対象におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させる方法であって、対象におけるＩ型インターフェロンの産生を増大させるために有効な量の２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチド活性作用物質を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１７】
活性作用物質には、これだけに限定されないが、本明細書に記載の２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドのいずれかが含まれ得る。ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個の２'−５'ホスホジエステル連結を有する。他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個の２'−５'ホスホジエステル連結および１個の３'−５'ホスホジエステル連結を有する。
【００１８】
一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のグアノシンヌクレオシドを含有する。ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個のグアノシンヌクレオシドを含有する。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のアデノシンヌクレオシドを含有する。特定の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個のアデノシンヌクレオシドを含有する。他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のアデノシンヌクレオシドおよび１個のグアノシンヌクレオシドを含有する。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000006
を有し、
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000007
である。
【００１９】
本方法の一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000008
を有する。
【００２０】
ある種の実施形態では、上記２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチド活性作用物質には、ｃＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の細胞活性を増大させる作用物質が含まれる。特定の実施形態では、上記作用物質は、ｃＧＡＳをコードする核酸を含む。
【００２１】
ある種の実施形態では、上記方法は、対象におけるインターフェロン（ＩＦＮ）アルファの産生を増大させるためのものである。他の実施形態では、上記方法は、対象におけるインターフェロンベータの産生を増大させるためのものである。
【００２２】
ある種の実施形態では、対象は、ウイルス感染症を有している。ある種の実施形態では、対象は、細菌感染症を有している。他の実施形態では、対象は、新生物疾患を有している。ある種の実施形態では、対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００２３】
別の態様では、本明細書において、対象におけるインターフェロン遺伝子刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅ）（ＳＴＩＮＧ）媒介性応答を増大させるための方法であって、対象におけるＳＴＩＮＧ媒介性応答を増大させるために有効な量のＳＴＩＮＧ活性作用物質を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。ある種の実施形態では、ＳＴＩＮＧ媒介性応答は、２個の３'−５'ホスホジエステル結合を有する環状ジヌクレオチドに非応答性である。
【００２４】
ＳＴＩＮＧ活性作用物質には、これだけに限定されないが、本明細書に記載の２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドのいずれかが含まれ得る。ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個の２'−５'ホスホジエステル連結を有する。他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個の２'−５'ホスホジエステル連結および１個の３'−５'ホスホジエステル連結を有する。
【００２５】
一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のグアノシンヌクレオシドを含有する。ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個のグアノシンヌクレオシドを含有する。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のアデノシンヌクレオシドを含有する。特定の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個のアデノシンヌクレオシドを含有する。他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のアデノシンヌクレオシドおよび１個のグアノシンヌクレオシドを含有する。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000009
を有し、
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000010
である。
【００２６】
本方法の一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000011
を有する。
【００２７】
ある種の実施形態では、上記ＳＴＩＮＧ活性作用物質には、ｃＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の細胞活性を増大させる作用物質が含まれる。特定の実施形態では、上記作用物質は、ｃＧＡＳをコードする核酸を含む。
【００２８】
ある種の実施形態では、上記ＳＴＩＮＧ活性作用物質には、ＳＴＩＮＧの細胞活性を増大させる作用物質が含まれる。特定の実施形態では、上記作用物質は、ＳＴＩＮＧをコードする核酸を含む。
【００２９】
ある種の実施形態では、対象は、ウイルス感染症を有している。ある種の実施形態では、対象は、細菌感染症を有している。他の実施形態では、対象は、新生物疾患を有している。ある種の実施形態では、対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００３０】
別の態様では、本明細書において、２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドを提供する。そのような環状ジヌクレオチドは、例えば、これだけに限定されないが、細胞または対象におけるＩ型インターフェロンの産生を増大させるための方法を含めた本方法を実行する際に有用である。
【００３１】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個の２'−５'ホスホジエステル連結を有する。他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個の２'−５'ホスホジエステル連結および１個の３'−５'ホスホジエステル連結を有する。
【００３２】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のグアノシンヌクレオシドを含有する。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個のグアノシンヌクレオシドを含有する。ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のアデノシンヌクレオシドを含有する。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個のアデノシンヌクレオシドを含有する。他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のアデノシンヌクレオシドおよび１個のグアノシンヌクレオシドを含有する。
【００３３】
一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000012
を有し、
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000013
である。
【００３４】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000014
を有する。
【００３５】
別の態様では、本明細書において、２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含有する組成物を提供する。
【００３６】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個の２'−５'ホスホジエステル連結を有する。他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個の２'−５'ホスホジエステル連結および１個の３'−５'ホスホジエステル連結を有する。
【００３７】
上記組成物のある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のグアノシンヌクレオシドを含有する。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個のグアノシンヌクレオシドを含有する。ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のアデノシンヌクレオシドを含有する。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個のアデノシンヌクレオシドを含有する。他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個のアデノシンヌクレオシドおよび１個のグアノシンヌクレオシドを含有する。
【００３８】
上記組成物のある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000015
を有し、
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000016
である。
【００３９】
上記組成物のある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000017
を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
添付の図面と併せて次の詳細な説明を読むことで、本発明は最も良好に理解される。一般的な実施に従って、図面の様々な特徴は、正確な縮尺ではないことが強調される。むしろ、様々な特徴の寸法は、明確にするために、任意に拡大また縮小されている。図面には、次の図が含まれる。
【図１Ａ】アルギニン２３２までの環状ジヌクレオチドマップに対するヒトＳＴＩＮＧ変異体の可変的な応答性を示す図である。ＴＨＰ−１細胞に、ＳＴＩＮＧをターゲティングするｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡをコードするベクターを形質導入した。次いで、細胞を、環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧ）、ｄｓＤＮＡ、環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡ）、ポリ−イノシン：シトシン（ｐＩ：Ｃ）、またはセンダイウイルスで刺激し、ヒトインターフェロン−β  ｍＲＮＡの誘導を、定量逆転写酵素ＰＣＲによって評価した。
【図１Ｂ】アルギニン２３２までの環状ジヌクレオチドマップに対するヒトＳＴＩＮＧ変異体の可変的な応答性を示す図である。ウェスタンブロット法によって、ＳＴＩＮＧのノックダウンが有効であることが確認された。
【図１Ｃ】アルギニン２３２までの環状ジヌクレオチドマップに対するヒトＳＴＩＮＧ変異体の可変的な応答性を示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されている量の様々なマウス（ｍ）またはヒト（ｈ）ＳＴＩＮＧ発現プラスミドを形質移入し、次いで、合成ｃｄＧ（５μＭ）を移入することによって、６時間後に刺激した。ＧＴは、Ｇｏｌｄｅｎｔｉｃｋｅｔ（Ｇｔ）マウスに由来するＳｔｉｎｇのヌルＩ１９９Ｎ対立遺伝子を示している。ＳＴＩＮＧ活性化を、同時形質移入されたＩＦＮ−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを使用することによって評価した。
【図１Ｄ】アルギニン２３２までの環状ジヌクレオチドマップに対するヒトＳＴＩＮＧ変異体の可変的な応答性を示す図である。Ｇｔ（ＳＴＩＮＧ−ヌル）マクロファージに、示されているＳＴＩＮＧ対立遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを形質導入し、次いで、４８時間後に、ｃｄＧ（５μＭ）またはｄｓＤＮＡ  ７０マーオリゴヌクレオチド（０．５μｇ／ｍＬ）を移入することによって刺激した。ＩＦＮ誘導を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＮＤ、検出されず。
【図１Ｅ】アルギニン２３２までの環状ジヌクレオチドマップに対するヒトＳＴＩＮＧ変異体の可変的な応答性を示す図である。ＳＴＩＮＧと３２Ｐ−ｃ−ジ−ＧＭＰとの結合アッセイ法。ＳＴＩＮＧタンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させ、細胞溶解産物を、３２Ｐ−ｃｄＧとのＵＶ架橋に掛け、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解した。結合を、オートラジオグラフィーによって定量化した。抗ＳＴＩＮＧポリクローナル抗体での細胞溶解産物のウェスタンブロットによって、様々なＳＴＩＮＧタンパク質の同様の発現が確認された。
【図１Ｆ】アルギニン２３２までの環状ジヌクレオチドマップに対するヒトＳＴＩＮＧ変異体の可変的な応答性を示す図である。ｃＧＡＭＰに対するｍＳＴＩＮＧの応答性は、Ｒ２３１の変異によって影響を受ける。示されている変異を、Ｃにおいてと同様に試験した。
【図２】ｈＳＴＩＮＧ変異体の配列アラインメントである。ｈＳＴＩＮＧをＴＨＰ−１細胞からクローニングし、参照ＳＴＩＮＧ対立遺伝子（ＮＣＢＩ  ＮＰ＿９３８０２３．１）と比較した。
【図３】ヒトＳＴＩＮＧのＲ２３２は、ｃ−ジ−ＧＭＰに対する応答性のためには必要であるが、ｃ−ジ−ＧＭＰの結合のためには必要ではないことを示す図である。（Ａ）２９３Ｔ細胞に、マウス（ｍ）ＳＴＩＮＧまたはヒト（ｈ）ＳＴＩＮＧの示されている対立遺伝子を形質移入し、次いで、ｃ−ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧ）で刺激した。ＳＴＩＮＧ活性を、同時形質移入されたＩＦＮ−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトの誘導によって検出し、刺激されていない細胞のルシフェラーゼ活性を上回る誘導倍数として表した。（Ｂ）形質移入された２９３Ｔ細胞の溶解産物を、α３２Ｐ−ｃ−ジ−ＧＭＰの存在下でＵＶ架橋し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次いで、オートラジオグラフィーによって解析した。溶解産物をまた、ＳＴＩＮＧおよび発現対照としてのＡＣＴＩＮについて平行してウェスタンブロット処理した。
【図４】Ｇ２３０ＡおよびＨ２３２Ｒが両方とも、ｃ−ジ−ヌクレオチドに対する最適な応答性には必要であるが、ｃ−ジ−ヌクレオチドへの結合には必要ないことを示す図である。（Ａ、Ｂ）２９３Ｔ細胞に、マウス（ｍ）ＳＴＩＮＧまたはヒト（ｈ）ＳＴＩＮＧの示されている対立遺伝子を形質移入し、次いで、ｃ−ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧ）で刺激した。ＳＴＩＮＧ活性を、同時形質移入されたＩＦＮ−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトの誘導によって検出した。
【図５Ａ】ＳＴＩＮＧ変異体がｃＧＡＳに対して応答性であることを示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されているＳＴＩＮＧ対立遺伝子を、かつ示されているとおりのヒトおよびマウスｃＧＡＳ（ｗｔおよびＧＳ＞ＡＡ突然変異）を形質移入した。ＳＴＩＮＧ活性化を、同時形質移入されたＩＦＮ−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって評価した。
【図５Ｂ】ＳＴＩＮＧ変異体がｃＧＡＳに対して応答性であることを示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されているＳＴＩＮＧ対立遺伝子を、かつＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅに由来するｃＧＡＭＰシンターゼ（ＤｎｃＶ）をコードする哺乳動物発現ベクターを形質移入した。ＳＴＩＮＧ活性化を、Ａにおいてのとおりに評価した。
【図５Ｃ】ＳＴＩＮＧ変異体がｃＧＡＳに対して応答性であることを示す図である。ｒＷｓｐＲ、ｒＤｎｃＶ、およびｒｃＧＡＳのインビトロで酵素的に生成された産生物を、示されているマウスおよびヒトＳＴＩＮＧタンパク質を発現するジギトニン透過化ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。化学的に合成された環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧ）およびｃＧＡＭＰが、対照として含まれた。ＳＴＩＮＧ活性化を、ＡおよびＢにおいてのとおりに評価した。
【図６Ａ】ｃＧＡＳが、２'−５'ホスホジエステル連結を含有する非標準の環状ジヌクレオチドを産生することを示す図である。精製組換えＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、およびｃＧＡＳをα３２Ｐ−ＧＴＰまたはα３２Ｐ−ＡＴＰおよび示されている非標識ヌクレオチドと混合した。反応物を、ＴＬＣランニング緩衝液と混合し、核酸種を、ＰＥＩ−セルロースＴＬＣプレートで分離した。
【図６Ｂ】ｃＧＡＳが、２'−５'ホスホジエステル連結を含有する非標準の環状ジヌクレオチドを産生することを示す図である。α３２Ｐ−ＧＴＰで標識されたＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、およびｃＧＡＳ産物を、ヌクレアーゼＰ１およびヘビ毒ホスホジエステラーゼで消化し、核酸種を、ＰＥＩ−セルロースＴＬＣプレートで分離した。
【図６Ｃ】ｃＧＡＳが、２'−５'ホスホジエステル連結を含有する非標準の環状ジヌクレオチドを産生することを示す図である。６００ＭＨｚおよび５０℃で得られたＨＰＬＣ精製ｃＧＡＳ産物の１Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣ。ホスホジエステル結合についての厳密な結合相関（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｂｏｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）が示されている。ｃＧＡＳ産物のＮＭＲによって明瞭にされた構造も示されている。
【図７Ａ】ｃＧＡＳ産物の追加のＮＭＲ分析である。すべてのデータの取得を、Ｄ２Ｏおよび５０℃で行った。９００ＭＨｚフィールドでの多重度編集１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ実験。メチンおよびメチルプロトンに対応する正相シグナルは緑色で示されており、メチレンプロトンに対応する逆相シグナルは、青色で示されている。
【図７Ｂ】ｃＧＡＳ産物の追加のＮＭＲ分析である。すべてのデータの取得を、Ｄ２Ｏおよび５０℃で行った。９００ＭＨｚフィールドでの多重度編集１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ実験。メチンおよびメチルプロトンに対応する正相シグナルは緑色で示されており、メチレンプロトンに対応する逆相シグナルは、青色で示されている。
【図７Ｃ】ｃＧＡＳ産物の追加のＮＭＲ分析である。すべてのデータの取得を、Ｄ２Ｏおよび５０℃で行った。６００ＭＨｚフィールドでの１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ実験。
【図７Ｄ】ｃＧＡＳ産物の追加のＮＭＲ分析である。すべてのデータの取得を、Ｄ２Ｏおよび５０℃で行った。９００ＭＨｚフィールドでの１Ｈ−１Ｈ  ＮＯＥＳＹ実験。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
詳細な説明
細胞におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるための方法および組成物を提供する。上記方法の態様は、細胞によるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるために十分であるように、細胞における２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドのレベルを増大させることを含む。また、本方法の実施形態を実行するための組成物およびキットを提供する。
【００４２】
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は、記載されている特定の実施形態に限定されることなく、したがってもちろん、変動し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用する専門用語は、特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、限定的であることを意図したものではないことを理解されたい。
【００４３】
値の範囲が示されている場合、文脈から明確にそうでないと示されない限り、その範囲の上限および下限の間の、下限の十分の１の位までの各々の介在する値、およびその記載の範囲内の任意の他の記述された値または介在する値が、本発明の範囲内に包含されると理解される。記述された範囲内における任意の特に除外される限度次第で、これらのより小さい範囲の上限および下限が、さらに小さい範囲に含まれてもよく、本発明の範囲内にも包含される。記述された範囲が、これらの限度の一方または両方を含む場合、その含まれた限度のいずれか一方または両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
【００４４】
本明細書において、特定の範囲は、用語「約」が先行する数値で示される。本明細書において、用語「約」は、「約」の後に来る正確な数、さらには、この用語の後にくる数に近いか、またはほぼその数である数に、文字上の支持を与えるために使用されている。数が、具体的に言及されている数の近似値または概数であるかどうかを決定する際には、挙げられた数の近似値または概数は、その数が提示されている文脈において、具体的に言及されている数の実質的な等価を提供する数であればよい。
【００４５】
別段に定義しない限り、本明細書において使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様また同等の任意の方法および物質も、本発明の実行また試験において使用することができるが、代表的な例示的方法および材料をここでは記載する。
【００４６】
本明細書において引用するすべての公報および特許は、それぞれ個別の公報または特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれ、かつ引用する公報に関連して方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。いずれの公報の引用も、出願日前のその開示についてであり、本発明が、先行発明によって、そのような広報に先行する権利がないことを認めるものであると解釈されるべきではない。さらに、提示されている公告日は、実際の公告日とは異なることがあり、これは、独立に、確認する必要があることがある。
【００４７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈から明確にそうでないと示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。さらに、特許請求の範囲は、場合による要素を除外するために、立案されていることがあることに留意されたい。したがって、この言明は、特許請求の範囲の要素の言及に関連して「単に」、「のみ」などの排他的専門用語を使用するための、または「マイナスの」限定を使用するための先行する基本として役立つものであることが意図されている。
【００４８】
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本明細書において記載および例示されている個別の実施形態はそれぞれ、本発明の範囲または意図から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離するか、またはそれと組み合わせることができる別個の構成要素および特徴を有する。いずれの言及されている方法も、言及されている事象の順序で、または論理上可能である任意の他の順序で実施することができる。
【００４９】
方法
上記で概説したとおり、細胞における、例えば、インビトロまたはインビボでのＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させる方法を提供する。Ｉ型インターフェロンの産生の増大とは、本方法が、対照と比較した場合に、細胞におけるＩ型インターフェロンの産生を増大させることを意味する。増大の規模は変動し得、一部の事例では、適切な対照と比較した場合に、２倍以上、例えば、１０倍以上を含む５倍以上である。したがって、一部の事例では、上記方法は、例えば、適切な対照と比較した場合に、２倍以上、例えば、１０倍以上を含む５倍以上の規模で、細胞におけるＩ型インターフェロンの産生を増大させる方法である。これらの実施形態では、上記方法の実行前に、インターフェロンの産生が検出不可能な場合に、その増大が、検出可能な量のインターフェロンの産生をもたらすことがある。インターフェロンの産生は、これだけに限定されないが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）攻撃バイオアッセイ法、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）レプリコンベースのバイオアッセイ法を含めた任意の適切な方法を使用して、またはＩ型インターフェロンシグナル伝達経路の調節下でクローニングされたレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を使用することによって測定することができる。例えば、Ｍｅａｇｅｒ  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６１：２１〜３６（２００２）；Ｖｒｏｌｉｊｋら、Ｃ．Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１０：２０１〜２０９（２００３）；およびＦｒａｎｃｏｉｓら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４９（９）：３７７０〜３７７５（２００５）を参照されたい。
【００５０】
本方法は、これだけに限定されないが：ＩＦＮ−α（アルファ）、ＩＦＮ−β（ベータ）、ＩＦＮ−κ（カッパ）、ＩＦＮ−δ（デルタ）、ＩＦＮ−ε（イプシロン）、ＩＦＮ−τ（タウ）、ＩＦＮ−ω（オメガ）、およびＩＦＮ−ζ（ゼータ、リミチンとしても公知）を含めた任意のＩ型インターフェロンの産生を増大させるために使用することができる。一部の実施形態では、上記方法は、ＩＦＮ−αの産生を増大させるためのものである。一部の実施形態では、上記方法は、ＩＦＮ−βを増大させるためのものである。
【００５１】
上記方法の態様は、細胞によるＩ型インターフェロンの産生を増大させるために十分であるように、細胞における２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドのレベルを増大させることを含む。２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドのレベルの増大とは、本方法が、対照と比較した場合に、２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドの量を増大させることを意味する。以下の実験セクションにおいて実証されているとおり、２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドは、Ｉ型インターフェロンの産生のレベルを増大させることができる。増大の規模は、変動し得、一部の事例では、適切な対照と比較した場合に、２倍以上、例えば、１０倍以上、１５倍超、２０倍超、２５倍超、３０倍超、３５倍超、４０倍超、４５倍超、５０倍超、または１００倍超を含む５倍以上である。
【００５２】
２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドレベルのレベルの増大は、様々な異なる手法を使用して達成することができる。一部の事例では、上記方法は、ターゲット細胞に、ターゲット細胞における２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドのレベルを増大させる環状ジヌクレオチド活性作用物質を供給するステップを含む。環状ジヌクレオチド活性作用物質は様々であってよく、それには、これらだけに限定されないが：小分子、核酸、タンパク質、およびペプチド作用物質が含まれる。
【００５３】
一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチド活性作用物質は、環状ジヌクレオチド活性作用物質と接触していない対照と比較した場合に、細胞または対象におけるＩＦＮ−α（アルファ）、ＩＦＮ−β（ベータ）、ＩＦＮ−κ（カッパ）、ＩＦＮ−δ（デルタ）、ＩＦＮ−ε（イプシロン）、ＩＦＮ−τ（タウ）、ＩＦＮ−ω（オメガ）、および／またはＩＦＮ−ζ（ゼータ、リミチンとしても公知）を増大させる。このような実施形態では、増大は、２倍の増大から４５倍の増大、５倍の増大から４０倍の増大、１０倍の増大から３５倍の増大、１５倍の増大から３０倍の増大、２０倍の増大から３０倍の増大などを含めた１．５倍の増大から５０倍またはそれ以上の増大である。
【００５４】
一部の事例では、環状ジヌクレオチド活性作用物質は、２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドまたはその機能性類似体である。２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドには、これらだけに限定されないが、本明細書に記載の２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドが含まれる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「環状ジヌクレオチド」は、各ヌクレオシドの２'または３'炭素が、ホスホジエステル結合によって他方のヌクレオシドの５'炭素に連結している２個のヌクレオシド（すなわち、第１および第２ヌクレオシド）を含有する化合物を指す。したがって、２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドは、少なくとも第１または第２のヌクレオシドの２'炭素が他方のヌクレオシドの５'炭素に連結している環状ジヌクレオチドを指す。２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドについては、以下でより詳細に論述する。
【００５６】
２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドの機能性類似体は、２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドと同様の機能活性（例えば、Ｉ型ＩＦＮの産生の増大）を示し、同様の構造を有し得る化合物である。一部の事例では、機能性類似体は、小分子作用物質である。該当する天然に存在するか、または合成の小分子化合物には、５０ダルトンより多く、約２，５００ダルトンよりは少ない分子量を有する小さな有機化合物を含めた有機分子などの多数の化学群が含まれる。候補作用物質は、タンパク質との構造的相互作用、特に、水素結合に必要な官能基を含み、典型的には、少なくとも１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、好ましくは、少なくとも２個の機能性化学基を含む。候補作用物質は、１個または複数の上記の官能基で置換された環状炭素または複素環状構造および／または芳香族またはポリ芳香族構造を含み得る。候補作用物質はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはそれらの組み合わせを含めた生体分子からも見出される。他の方法では、そのような分子は、適切なスクリーニングプロトコルを使用することによって、同定することができる。
【００５７】
一部の事例では、環状ジヌクレオチド活性作用物質は、環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の細胞活性を増大させる作用物質である。以下の実験セクションにおいて論述するとおり、ｃＧＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）のレベルを増大させることで、細胞における環状ジヌクレオチドの産生および／または活性を増大させ得る。したがって、細胞におけるＩ型インターフェロンの産生を増大させるために十分であるように、ターゲット細胞を、ｃＧＭＰシンターゼ産生および／または細胞活性を増大させる作用物質と接触させることができる。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチド活性作用物質は、ｃＧＡＳをコードする核酸である。様々なｃＧＡＳ酵素をコードする核酸には、これらだけに限定されないが、Ｓｕｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：７８６〜９１に記載されているもの、およびＧＥＮＢＡＮＫに寄託され、寄託番号：ＮＭ＿１３８４４１．２およびＮＰ＿６１２４５０．２（ヒト）；ＮＭ＿１７３３８６．４およびＮＰ＿７７５５６２．２（ハツカネズミ（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））を与えられたものが含まれる。
【００５８】
ある種の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする核酸は、次の配列：
2019068829.tif 000018
を有する。
【００５９】
一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする核酸は、野生型ｃＧＡＳ核酸配列と４０％〜９９％、４５％〜９９％、５０％〜９９％、５５％〜９９％、６０％〜９９％、６５％〜９９％、７０％〜９９％、７５％〜９９％、８０％〜９９％、８５％〜９９％、９０％〜９９％、または９５％〜９９％の配列同一性を有する核酸である。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする核酸は、野生型ｃＧＡＳ核酸配列と４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０〜９９％の配列同一性を有する核酸である。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする核酸は、野生型ｃＧＡＳ核酸配列と４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有する核酸である。
【００６０】
一部の事例では、環状ジヌクレオチド活性作用物質は、ｃＧＡＳをコードする核酸を含有するベクターである。ベクターを、対象細胞に直接供給することができる。言い換えると、ベクターが、細胞によって取り込まれるように、細胞を、環状ジヌクレオチド活性作用物質をコードする核酸（例えば、ｃＧＡＳをコードする核酸）を有するベクターと接触させる。電気穿孔法、塩化カルシウム形質移入、およびリポフェクションなどの、細胞を、プラスミドである核酸ベクターと接触させるための方法は、当技術分野で周知である。ウイルスベクター送達では、細胞を、環状ジヌクレオチド作用物質をコードする核酸を含むウイルス粒子と接触させる。レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、本発明の方法に特に適している。一般に使用されるレトロウイルスベクターは、「不完全」であり、すなわち、生産性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞系での増殖を必要とする。該当する核酸を含むウイルス粒子を生成するために、上記核酸を含むレトロウイルス核酸を、パッケージング細胞系によって、ウイルスカプシド中にパッケージングする。種々のパッケージング細胞系が、カプシドに組み込まれる異なるエンベロープタンパク質（環境栄養性、両栄養性、または異種栄養性）を供給し、このエンベロープタンパク質が、細胞についてのウイルス粒子の特異性を決定する（マウスおよびラットでは環境栄養性；ヒト、イヌ、およびマウスを含めた多くの哺乳動物細胞種では両栄養性；ならびにマウス細胞を除く多くの哺乳動物細胞では異種栄養性）。適切なパッケージング細胞系を使用することで、パッケージングされたウイルス粒子によって、細胞がターゲティングされることを保証することができる。初期化因子をコードする核酸を含むレトロウイルスベクターをパッケージング細胞系に導入し、パッケージング系によって生成されるウイルス粒子を収集する方法は、当技術分野で周知である。
【００６１】
環状ジヌクレオチド活性の活性作用物質をコードする核酸を対象細胞に供給するために使用されるベクターは、該当する核酸の発現の促進、すなわち、転写活性化のための適切なプロモーターを含み得る。言い換えると、該当する核酸は、プロモーターに機能的に連結される。これには、遍在的に作用するプロモーター、例えば、ＣＭＶ−β−アクチンプロモーター、または特定の細胞集団において活性であるか、もしくはテトラサイクリンなどの薬物の存在に応答するプロモーターなどの誘導性プロモーターが含まれ得る。転写活性化では、転写が、ターゲット細胞における基礎レベルを超えて１０倍以上、１００倍以上、１０００倍以上増大することが意図されている。加えて、環状ジヌクレオチド活性作用物質を対象細胞に供給するために使用されるベクターは、環状ジヌクレオチド活性の活性作用物質を取り込んだ細胞を同定するように、ターゲット細胞において選択可能なマーカーをコードする核酸配列を含んでよい。
【００６２】
環状ジヌクレオチド活性作用物質は、ポリペプチドとして細胞に供給することもできる。例えば、一部の事例では、環状ジヌクレオチド活性作用物質は、ｃＧＡＳポリペプチドである。様々なｃＧＡＳ酵素のアミノ酸配列には、これらだけに限定されないが、Ｓｕｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：７８６〜９１に記載されているもの、ならびにＧＥＮＢＡＮＫに寄託され、寄託番号：ＮＭ＿１３８４４１．２およびＮＰ＿６１２４５０．２（ヒト）；ＮＭ＿１７３３８６．４およびＮＰ＿７７５５６２．２（ハツカネズミ）を与えられたものが含まれる。
【００６３】
ある種の実施形態では、ｃＧＡＳポリペプチドは、次の配列：
2019068829.tif 000019
を有する。
【００６４】
一部の実施形態では、ｃＧＡＳポリペプチドは、野生型ｃＧＡＳアミノ酸配列と４０％〜９９％、４５％〜９９％、５０％〜９９％、５５％〜９９％、６０％〜９９％、６５％〜９９％、７０％〜９９％、７５％〜９９％、８０％〜９９％、８５％〜９９％、９０％〜９９％、または９５％〜９９％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ｃＧＡＳポリペプチドは、野生型ｃＧＡＳアミノ酸配列と４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０〜９９％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ｃＧＡＳポリペプチドは、野生型ｃＧＡＳアミノ酸配列と４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドである。
【００６５】
そのようなポリペプチドは、場合により、産物の溶解度を増大させるポリペプチドドメインに融合させることができる。このドメインを、規定のプロテアーゼ切断部位、例えば、ＴＥＶプロテアーゼによって切断されるＴＥＶ配列を介して、ポリペプチドに連結させることができる。このリンカーはまた、例えば、１〜１０個のグリシン残基の１つまたは複数の柔軟な配列を含んでよい。一部の実施形態では、融合タンパク質の切断を、産物の溶解度を維持する緩衝液中で、例えば、０．５〜２Ｍ尿素の存在下、溶解度を増大させるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在下などで行う。該当するドメインには、エンドソーム分解性（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）ドメイン、例えば、インフルエンザＨＡドメイン；および産生を援助する他のポリペプチド、例えば、ＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメインなどが含まれる。ポリペプチドを、安定性の改善のために処方することができる。例えば、ペプチドをペグ化することができ、この場合、ポリエチレンオキシ基は、血流中における寿命の増強をもたらす。
【００６６】
加えて、または別法では、環状ジヌクレオチド活性作用物質を、ポリペプチド透過性ドメインに融合させて、細胞による取り込みを促進することができる。いくつかの透過性ドメインが当技術分野で公知であり、本発明の非組み込み型（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）ポリペプチドにおいて使用することができ、ペプチド、ペプチド模倣物質、および非ペプチド担体が含まれる。例えば、透過性ペプチドは、ペネトラチンとも称されるキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子Ａｎｔｅｎｎａｐａｅｄｉａの第３アルファへリックスに由来し得、これは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号：０３）を含む。別の例としては、透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｔａｔ塩基性領域アミノ酸配列を含み、これは、例えば、天然に存在するｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７を含み得る。他の透過性ドメインには、ポリ−アルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１  ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４〜５６の領域、ノナ−アルギニン、オクタ−アルギニンなどが含まれる（例えば、特に、転座ペプチドおよびペプトイドの教示について参照により本明細書に組み込まれるＦｕｔａｋｉら、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．  ４（２）：８７〜９６（２００３）；およびＷｅｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９７（２４）：１３００３〜８（２０００）；公開された米国特許出願第２００３０２２０３３４号；同第２００３００８３２５６号；同第２００３００３２５９３号；および同第２００３００２２８３１号を参照されたい）。ノナ−アルギニン（Ｒ９）配列は、特徴づけられているさらに効率的なＰＴＤの１種である（Ｗｅｎｄｅｒら、２０００；Ｕｅｍｕｒａら、２００２）。融合が行われる部位を、ポリペプチドの生物学的活性、分泌、または結合特性を最適化するように選択することができる。最適な部位は、常套的な実験によって決定される。
【００６７】
本明細書において提供する方法の実施形態を実行する際には、有効量の活性作用物質、すなわち、環状ジヌクレオチド活性作用物質（上記のとおりものなど）を、ターゲット細胞または細胞に供給する。本明細書で使用する場合、「有効量」または「有効な量」は、例えば、インビトロで細胞に導入すること、対象に投与することなどによって、細胞と接触させた場合に、細胞における環状ジヌクレオチドのレベルの増大をもたらすために十分な活性作用物質の量を意味する。「有効量」は、細胞、および／または生体、および／または化合物、および／または所望の結果の性質、および／または処置される対象の疾患およびその重症度ならびに年齢、体重などに応じて変動する。
【００６８】
一部の事例では、有効量の活性作用物質を、細胞を活性作用物質と接触させることによって、細胞に供給する。細胞と活性作用物質との接触は、任意の簡便なプロトコルを使用して行うことができる。上記プロトコルは、ターゲット細胞の位置に応じて、活性作用物質とターゲット細胞とのインビトロまたはインビボ接触を提供し得る。例えば、ターゲット細胞が、単離された細胞、例えば、インビトロの細胞（すなわち、培養中）、またはエクスビボの細胞（「エクスビボ」にある細胞または器官は、身体の外部で改変され、その場合、そのような細胞または器官は、典型的には、生体の身体に戻される）である場合には、活性作用物質を、ターゲット細胞の生存を許容する細胞培養条件下の細胞に直接導入することができる。そのような技術には、これらに必ずしも限定されないが、ウイルス感染、形質移入、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、ウイルスベクター送達などが含まれる。方法の選択は一般に、接触させる細胞の種類および活性作用物質の性質、ならびに形質転換を行う状況（例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に左右される。これらの方法の一般的な論述は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９５において見出すことができる。ターゲット細胞または細胞が多細胞生物の一部である別の例としては、活性作用物質が、例えば、インビボプロトコルを介して、ターゲット細胞と接触し得るように、該作用物質を生体または対象に投与することができる。「インビボ」とは、ターゲットにおいて、コンストラクトが動物の生体身体に投与されることを意味する。
【００６９】
一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチド活性作用物質を、インビトロまたはエクスビボの有糸分裂細胞または有糸分裂後細胞におけるｃ−ジ−ＡＭＰ活性を調節するために、すなわち、個体に再導入することができる改変細胞を作製するために使用する。これらの実施形態における該当する有糸分裂細胞および有糸分裂後細胞には、任意の真核細胞、例えば、多能性幹細胞、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、および胚性生殖細胞；体性細胞、例えば、造血細胞、線維芽細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、血管内皮細胞、腸細胞など、およびそれらの系統制限前駆細胞および前駆体；ならびに新生物、または癌細胞、すなわち、癌細胞に関連した１つまたは複数の特性、例えば、過増殖、接触阻害、他の組織を侵襲する能力などを実証している細胞が含まれる。ある種の実施形態では、真核細胞は、癌細胞である。ある種の実施形態では、真核細胞は、造血細胞、例えば、マクロファージ、ＮＫ細胞などである。細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、マウス、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、霊長類、ヒトなどに由来してよい。細胞は、確立された細胞系に由来してよいか、または細胞は、一次細胞であってよく、この際、「一次細胞」、「一次細胞系」、および「一次培養」は、対象に由来していて、培養の限られた数の継代、すなわち、分裂のためにインビトロで成長させ得る細胞および細胞培養について言及するために、本明細書において互換的に使用される。例えば、一次培養は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されていてよいが、危機段階を経るには十分な回数ではない培養である。典型的には、本発明の一次細胞系を、インビトロで１０回未満の継代で維持する。
【００７０】
細胞が一次細胞であれば、これらは、任意の簡便な方法によって、個体から採取することができる。例えば、血液細胞、例えば、白血球、例えば、マクロファージは、成分除去、白血球成分除去、密度勾配分離などによって採取することができる一方で、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、小腸、胃などの組織に由来する細胞は、生検によって採取することができる。適切な溶液を、採取した細胞の分散また懸濁のために使用することができる。そのような溶液は一般に、好都合には、ウシ胎児血清または他の天然に存在する因子を、一般に５〜２５ｍＭの低濃度の許容される緩衝剤と併せて補足されている平衡塩溶液、例えば、通常生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス液などである。簡便な緩衝剤には、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝剤、乳酸緩衝剤などが含まれる。細胞をすぐに使用することもできるし、長期間にわたって貯蔵、凍結することができ、その際、解凍して、再び使用することができる。そのような場合、細胞を１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝培地中で、またはそのような凍結温度で細胞を保存するために当技術分野で一般に使用されるようないくつかの他のそのような溶液中で凍結させ、凍結された培養細胞を解凍するために当技術分野で一般に公知のとおりの手法で解凍することができる。
【００７１】
環状ジヌクレオチド活性作用物質を、真核細胞または原核細胞によって生産することができ、これを、当技術分野で公知の方法を使用して、変性、例えば、熱変性、ＤＴＴ還元などによってさらにプロセシングすることができ、さらに、再び折り畳むことができる。
【００７２】
一次配列を変更しない該当する改変には、ポリペプチドの化学的誘導体化、例えば、アシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化などが含まれる。また、糖鎖形成の改変、例えば、その合成およびプロセシングの間に、またはさらなるプロセシングステップにおいてポリペプチドの糖鎖形成パターンを改変することによって；例えば、ポリペプチドを、哺乳動物のグリコシル化またはデグリコシル化酵素などの、糖鎖形成に影響を及ぼす酵素に曝露することによって作製されたものが含まれる。また、リン酸化アミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンを有する配列が包含される。
【００７３】
また、タンパク質分解性変性に対する抵抗性を改善するか、または溶解度特性を最適化するか、または治療薬としてさらに適切なものとするために、普通の分子生物学的技術および合成化学を使用して改変された環状ジヌクレオチド活性作用物質ポリペプチド（例えば、ｃＧＡＳポリペプチド）が、本発明に含まれる。そのようなポリペプチドの類似体には、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含有するものが含まれる。Ｄ−アミノ酸を、一部またはすべてのアミノ酸残基の代わりに用いることができる。
【００７４】
環状ジヌクレオチド活性作用物質は、任意の適切な方法を使用してインビトロ合成によって調製することができる。様々な市販の合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ,Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎなどによる自動シンセサイザーを利用することができる。シンセサイザーを使用することによって、天然に存在するアミノ酸を、非天然アミノ酸に置き換えることができる。特定の配列および調製手法を、簡便さ、経済性、必要な純度などによって決定する。
【００７５】
所望の場合には、他の分子または表面への連結を可能にする様々な基を、合成の間または発現の間にペプチドに導入することができる。したがって、チオエーテルを作製するためにはシステインを、金属イオン錯体に連結するためにヒスチジンを、アミドまたはエステルを形成するためにはカルボキシル基を、アミドを形成するためにはアミノ基を使用することなどができる。
【００７６】
環状ジヌクレオチド活性作用物質は、組換え合成の従来の方法に従って単離および精製することもできる。溶解産物を、発現宿主から調製し、その溶解産物を、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製法を使用して精製することができる。多くの部分で、使用される組成物は、所望の生成物２０重量％以上、例えば、所望の生成物９５重量％以上を含めて所望の生成物７５重量％以上を含み、治療目的では、生成物の調製方法およびその精製方法に関連した混入物に関連して９９．５重量％以上であってよい（この百分率は、全タンパク質に対してでよい）。
【００７７】
環状ジヌクレオチド活性作用物質は、小分子（例えば、２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチド）ポリペプチド、または環状ジヌクレオチド活性作用物質ポリペプチド（例えば、ｃＧＡＳ）をコードする核酸であるが、環状ジヌクレオチド活性および／または産生を調製するために、その環状ジヌクレオチド活性作用物質を、十分な期間にわたって、例えば、３０分から２４時間、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間まで、または３０分から２４時間までの任意の他の期間にわたって、細胞に供給することができ、これを、毎日から、４日毎、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎の頻度で、またはほぼ毎日からほぼ４日毎の任意の他の頻度で繰り返すことができる。作用物質を、対象細胞に、１回または複数回、例えば、１回、２回、３回、または３回より多く供給することができ、細胞を、作用物質と共に、各接触事象の後に多少の時間にわたって、例えば、１６〜２４時間にわたってインキュベートし、その時間の後に、培地を新鮮な培地に替えて、細胞をさらに培養することができる。
【００７８】
ある種の実施形態では、細胞によるＩ型インターフェロンの産生を増大させるために十分であるように、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、または１０種以上の異なる環状ジヌクレオチド活性作用物質を、細胞に供給する。一部の事例では、活性作用物質は、２種以上の異なる２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドを含む。ある種の実施形態では、活性作用物質は、１個の２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチド、およびｃＧＡＳをコードする核酸またはｃＧＡＳポリペプチドを含む。２種以上の異なる環状ジヌクレオチド活性作用物質を細胞に供給する事例では、すなわち、環状ジヌクレオチド活性作用物質カクテルでは、環状ジヌクレオチド活性作用物質を、同時に供給することができ、例えば、２種の環状ジヌクレオチドを同時に送達するか、または１種の環状ジヌクレオチド、およびｃＧＡＳをコードする核酸を含有する１種のベクターを同時に送達する。別法では、これらを連続して供給することができ、例えば、第１の環状ジヌクレオチド活性作用物質を最初に供給し、続いて、環状ジヌクレオチド活性作用物質を供給するなどか、またはその逆である。
【００７９】
環状ジヌクレオチドレベルに変化が生じるように、有効量の環状ジヌクレオチド活性作用物質を細胞に供給する。環状ジヌクレオチド活性作用物質の有効量は、陰性対照、例えば、空のベクターまたは無関係ポリペプチドと接触させた細胞と比較して、観察される環状ジヌクレオチド産生の量の２倍以上の増大をもたらす量である。すなわち、有効量または有効な用量の環状ジヌクレオチド活性作用物質は、観察される環状ジヌクレオチドの量の２倍の増大、３倍の増大、４倍の増大、またはそれ以上、一部の事例では、５倍の増大、６倍の増大、またはそれ以上、時には、観察される活性量の７倍もしくは８倍またはそれ以上の増大、例えば、１０倍、５０倍、もしくは１００倍、またはそれ以上の増大、一部の事例では、観察される活性量の２００倍、５００倍、７００倍、もしくは１０００倍、またはそれ以上の増大をもたらす。活性量は、任意の適切な方法によって測定することができる。例えば、細胞によって産生されるインターフェロンの量を、環状ジヌクレオチド活性作用物質と接触させた後に、例えば、環状ジヌクレオチド活性作用物質と接触させてから２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、７２時間後、またはそれ以上後に評価することができる。
【００８０】
細胞と環状ジヌクレオチド活性作用物質との接触は、任意の培養培地中、細胞の生存を促進する任意の培養条件下で行うことができる。例えば、細胞を、ウシ胎児血清または熱不活性化ヤギ血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、チオール、特に、２−メルカプトエタノール、および抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充されたＩｓｃｏｖｅ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ  １６４０などの簡便な任意の適切な栄養培地中に懸濁させることができる。上記培養は、細胞が応答し得る成長因子を含有してよい。本明細書において定義するとおりの成長因子は、膜貫通受容体に対する特異的な作用によって、培養中または無傷の組織中で細胞の生存、成長、および／または分化を促進し得る分子である。成長因子には、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子が含まれる。
【００８１】
上記の方法に従って、細胞を、環状ジヌクレオチドレベルの増大を有するようにエクスビボで改変することができる。一部の実施形態では、改変細胞を選択する、例えば、改変細胞の富化集団を作成することが望ましいことがある。環状ジヌクレオチド活性作用物質で改変されたものとして細胞をマーキングする、細胞への任意の簡便な改変を使用することができる。例えば、選択可能なマーカーを、細胞のゲノムに挿入して、細胞集団を、遺伝子的にマーキングされた細胞を残りの集団から分別することによって、遺伝子修飾を含むものについて富化することができるようにする。分別は、使用された選択可能なマーカーに適した任意の簡便な分別技術によるものであってよい。例えば、蛍光マーカーを挿入してあるならば、細胞を、蛍光活性化細胞の選別によって分別することができる一方で、細胞表面マーカーを挿入してあるならば、細胞を、親和性分別技術、例えば、磁気分別、アフィニティークロマトグラフィー、固体マトリックスに結合させた親和性試薬での「パンニング」、または他の簡便な技術によって、異種の集団から分別することができる。正確な分別をもたらす技術には、蛍光活性化セルソーターが含まれ、これは、多数のカラーチャンネル、低角度、および鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなどの様々な程度の洗練法（ｓｏｐｈｉｓｔｉｃａｔｉｏｎ）を有し得る。細胞を、死細胞に関連する色素（例えば、ヨウ化プロピジウム）を使用することによって、死細胞に対して選択することができる。遺伝的に改変された細胞の生存率に対して過度に有害ではない任意の技術を使用することができる。
【００８２】
このようして、環状ジヌクレオチド活性作用物質を含む細胞について高度に富化された細胞組成を得る。「高度に富化された」とは、遺伝的に改変された細胞が、細胞組成の７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、例えば、細胞組成の約９５％以上、または９８％以上であることを意味する。言い換えると、上記組成は、環状ジヌクレオチド活性作用物質を含む細胞からなる実質的に純粋な組成であってよい。
【００８３】
本明細書に記載の方法によって生産された環状ジヌクレオチド活性作用物質を含む細胞を、すぐに使用することができる。別法では、細胞を、液体窒素温度で凍結させ、長期間にわたって貯蔵することができ、その際、解凍して、再び使用することができる。そのような場合、細胞を１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝培地中で、またはそのような凍結温度で細胞を保存するために当技術分野で一般に使用されるようないくつかの他のそのような溶液中で凍結させ、凍結された培養細胞を解凍するために当技術分野で一般に公知のとおりの手法で解凍することができる。
【００８４】
環状ジヌクレオチド活性作用物質を含む細胞を、様々な培養条件下でインビトロで培養することができる。細胞を、培養中で増やす、すなわち、その増殖を促進する条件下で増殖させることができる。培養培地は、液体であるか、または例えば、寒天、メチルセルロースなどを含有する半固体であってよい。細胞集団を、通常、ウシ胎児血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、チオール、特に、２−メルカプトエタノール、および抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充されたＩｓｃｏｖｅ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ  １６４０などの適切な栄養培地中に懸濁させることができる。上記培養は、調節性Ｔ細胞が応答し得る成長因子を含有してよい。本明細書において定義するとおりの成長因子は、膜貫通受容体に対する特異的な作用によって、培養中または無傷の組織中で細胞の生存、成長、および／または分化を促進し得る分子である。成長因子には、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子が含まれる。
【００８５】
疾患を処置するために、または抗ウイルス薬、抗病原薬、もしくは抗癌薬として、または生物学的研究のために、環状ジヌクレオチド活性作用物質で改変されている細胞を対象に移植することができる。対象は、新生児、若年者、または成人であってよい。特に重要であるのは、哺乳動物対象である。本方法で処置され得る哺乳動物種には、イヌおよびネコ；ウマ；ウシ；ヒツジなど、ならびに霊長類、特にヒトが含まれる。動物モデル、特に、小さい哺乳動物、例えば、マウス、ウサギなどを、実験調査で使用することができる。
【００８６】
細胞を、単独で、または例えば、移植されている組織中でのその増殖および／または組織化を支持するための適切な基質もしくはマトリックスと共に、対象に供給することができる。一部の事例では、少なくとも１×１０３細胞、例えば、５×１０３細胞、１×１０４細胞、５×１０４細胞、１×１０５細胞、１×１０６細胞、またはそれ以上を投与する。次の経路：非経口、皮下、静脈内、頭蓋内、髄腔内、眼内のいずれかを介して、または脊髄液へと、細胞を対象に導入することができる。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入することができる。局所送達、すなわち、損傷部位に送達する方法の例には、例えば髄腔内送達では、例えばＯｍｍａｙａレザバーを介するもの（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２２２，９８２号および同第５３８５５８２号を参照されたい）；例えば、関節への大量注射、例えば、シリンジによるもの；連続注入、例えば、対流を伴うなどのカニューレ挿入によるもの（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００７０２５４８４２を参照されたい）；または細胞が可逆的に取り付けられているデバイスの埋め込みによるもの（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００８００８１０６４号および同第２００９０１９６９０３号を参照されたい）が含まれる。
【００８７】
本発明の他の態様では、環状ジヌクレオチド活性作用物質を、インビボにおけるＩ型インターフェロンの産生を増大させるために使用する。これらのインビボ実施形態では、上記環状ジヌクレオチド活性作用物質を、個体に直接投与する。一部の実施形態では、対象に投与される環状ジヌクレオチド活性作用物質は、２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドを含有する。
【００８８】
環状ジヌクレオチド活性作用物質を、対象にペプチド、小分子、および核酸を投与するための任意の適切な方法によって投与することができる。環状ジヌクレオチド活性作用物質を、様々な製剤に組み込むことができる。特に、本発明の環状ジヌクレオチド活性作用物質を、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって、薬学的組成物に製剤化することができる。本方法を実行する際に使用することができる薬学的組成物を以下に記載する。
【００８９】
そのような事例では、有効量の環状ジヌクレオチド活性作用物質を、対象に投与する。環状ジヌクレオチド活性作用物質の「有効量」または「治療有効量」とは、疾患の重症度、期間、および／または症状を低減するために必要な量を意味する。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチド活性作用物質を含有する薬学的組成物の有効量は、本明細書において提供する場合、０．０２５ｍｇ／ヒト対象の体重ｋｇから１０００ｍｇ／ヒト対象の体重ｋｇの間である。ある種の実施形態では、薬学的組成物を、１０００ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、９５０ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、９００ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、８５０ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、８００ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、７５０ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、７００ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、６５０ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、６００ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、５５０ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、５００ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、４５０ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、４００ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、３５０ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、３００ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、２５０ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、２００ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、１５０ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、１００ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、９５ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、９０ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、８５ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、８０ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、７５ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、７０ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満、または６５ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれ未満の量でヒト対象に投与する。
【００９０】
別の態様では、本明細書において、対象におけるインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）媒介性応答、例えば、ＳＴＩＮＧ媒介性免疫応答を増大させるための方法を提供する。ある種の実施形態では、上記方法は、対象におけるＳＴＩＮＧ媒介性応答を増大させるために有効な量のＳＴＩＮＧ活性作用物質を対象に投与するステップを含む。「ＳＴＩＮＧ」媒介性応答は、これだけに限定されないが、細菌病原体、ウイルス病原体、および真核病原体に対する免疫応答を含めた、ＳＴＩＮＧによって媒介されるあらゆる応答を指す。例えば、Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９：５３８〜５５０（２００８）；Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｎａｔｕｒｅ  ４６１：７８８〜７９２（２００９）；およびＳｈａｒｍａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３５：１９４〜２０７（２０１１）を参照されたい。ＳＴＩＮＧはまた、自己ＤＮＡの不適切な認識によって開始されるある種の自己免疫疾患（例えば、Ｇａｌｌら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３６：１２０〜１３１（２０１２）を参照されたい）において、さらには、ＤＮＡワクチンに応答しての適応免疫の誘導（例えば、Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｎａｔｕｒｅ  ４６１：７８８〜７９２（２００９）を参照されたい）のために機能する。対象におけるＳＴＩＮＧ媒介性応答の増大とは、対照対象（例えば、ＳＴＩＮＧ活性作用物質を投与されない対象）と比較した場合の、対象におけるＳＴＩＮＧ媒介性応答の増大を意味する。ある種の実施形態では、上記方法は、対象におけるインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）媒介性応答を増大させるためのものであり、この際、ＳＴＩＮＧ媒介性応答は、２個の３'−５'ホスホジエステル結合を有する環状ジヌクレオチド（すなわち、標準の環状ジヌクレオチド）には非応答性である。
【００９１】
以下の実験セクションにおいて記載するとおり、２'−５'ホスホジエステル結合を有する環状ジヌクレオチドは、ＳＴＩＮＧシグナル伝達を活性化することが示されている。さらに、２'−５'ホスホジエステル結合を有するそのような環状ジヌクレオチドは、２個のホスホジエステル結合を有する環状ジヌクレオチドには非応答性であるＳＴＩＮＧの対立遺伝子を刺激することが示されている。したがって、一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧ活性作用物質は、本明細書に記載の環状ジヌクレオチド活性作用物質（例えば、環状ジヌクレオチド、ｃＧＡＳをコードする核酸）である。
【００９２】
他の実施形態では、ＳＴＩＮＧ活性作用物質は、ＳＴＩＮＧまたはＳＴＩＮＧポリペプチドをコードする核酸である。様々なＳＴＩＮＧをコードする核酸には、これらだけに限定されないが、Ｎｉｔｔａら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５７（１）：４６〜５８（２０１３）およびＪｉｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９０（６）：２８３５〜２８４３（２０１３）において記載されているもの、ならびにＧＥＮＢＡＮＫに寄託され、寄託番号：ＮＭ＿１９８２８２．２およびＮＰ＿９３８０２３．１（ヒト）；ＮＭ＿０２８２６１．１およびＮＰ＿０８２５３７．１（ハツカネズミ）；およびＮＭ＿０５７３８６．４およびＮＰ＿４７６７３４．１（キイロショウジョウバエ）を与えられたものが含まれる。
【００９３】
ある種の実施形態では、ＳＴＩＮＧをコードする核酸は、次の配列：
2019068829.tif 000020
を有する。
【００９４】
一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧをコードする核酸は、野生型ＳＴＩＮＧ核酸配列と４０％〜９９％、４５％〜９９％、５０％〜９９％、５５％〜９９％、６０％〜９９％、６５％〜９９％、７０％〜９９％、７５％〜９９％、８０％〜９９％、８５％〜９９％、９０％〜９９％、または９５％〜９９％の配列同一性を有する核酸である。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧをコードする核酸は、野生型ＳＴＩＮＧ核酸配列と４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０〜９９％の配列同一性を有する核酸である。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧをコードする核酸は、野生型ＳＴＩＮＧ核酸配列と４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有する核酸である。
【００９５】
ＳＴＩＮＧのアミノ酸配列には、これらだけに限定されないが、Ｎｉｔｔａら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５７（１）：４６〜５８（２０１３）およびＪｉｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９０（６）：２８３５〜２８４３（２０１３）において記載されているもの、ならびにＧＥＮＢＡＮＫに寄託され、寄託番号：ＮＭ＿１９８２８２．２およびＮＰ＿９３８０２３．１（ヒト）；  ＮＭ＿０２８２６１．１およびＮＰ＿０８２５３７．１（ハツカネズミ）；およびＮＭ＿０５７３８６．４およびＮＰ＿４７６７３４．１（キイロショウジョウバエ）を与えられたものが含まれる。
【００９６】
ある種の実施形態では、ＳＴＩＮＧポリペプチドは、次の配列：
2019068829.tif 000021
を有する。
【００９７】
他の実施形態では、ＳＴＩＮＧポリペプチドは、次の配列：
2019068829.tif 000022
を有する。
【００９８】
一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧポリペプチドは、野生型ＳＴＩＮＧアミノ酸配列と４０％〜９９％、４５％〜９９％、５０％〜９９％、５５％〜９９％、６０％〜９９％、６５％〜９９％、７０％〜９９％、７５％〜９９％、８０％〜９９％、８５％〜９９％、９０％〜９９％、または９５％〜９９％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ｃＧＡＳポリペプチドは、野生型ＳＴＩＮＧアミノ酸配列と４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０〜９９％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧポリペプチドは、野生型ＳＴＩＮＧアミノ酸配列と４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドである。
【００９９】
上記の方法は、様々な異なる用途において使用される。次いで、いくつかの用途を、次の有用性セクションにおいて総説する。
【０１００】
有用性
本明細書において提供する方法および組成物は、様々な用途において使用され、そのような用途には、対象におけるＩ型インターフェロン（例えば、インターフェロン−β）の増大が望ましい用途が含まれる。加えて、本明細書において提供する方法および組成物は、様々な用途において使用され、そのような用途には、対象におけるＳＴＩＮＧ媒介性応答の増大が望ましい用途が含まれる。該当する具体的な用途には、対象に治療有効量の環状ジヌクレオチド活性作用物質を供給することによるＩ型インターフェロンの増大から利益を得る疾患状態について、対象を処置する用途が含まれる。一部の事例では、健康な個体において、例えば、疾患または状態の予防のために、Ｉ型インターフェロンまたはＳＴＩＮＧ媒介性応答を増大させることが望ましいことがある。したがって、一部の実施形態では、本明細書において提供する方法および組成物は、感染症または他の疾患を予防するためのワクチンにおいて「アジュバント」効果を生じさせるために使用することができ、その際、活性作用物質は、将来の疾患または感染症から保護するための免疫記憶を刺激する。
【０１０１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法で処置するために適した対象には、これだけに限定されないが、癌、自己免疫疾患または障害、アレルギー反応、慢性感染症、および免疫不全疾患または障害を含めた免疫学的または炎症性の疾患または障害を有している個体が含まれる。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明の方法で処置するために適した対象には、新生物疾患（例えば、癌）などの細胞増殖性疾患を有している個体が含まれる。細胞増殖性疾患は、これだけに限定されないが、新生物疾患状態、例えば、癌を含めた、細胞の望ましくない増殖によって特徴づけられる。
【０１０３】
細胞増殖性疾患の例には、これだけに限定されないが、内皮細胞の異常な刺激（例えば、アテローム硬化症）、充実性腫瘍および腫瘍転位、良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および膿原性肉芽種、血管機能不全、異常な創傷治癒、炎症および免疫障害、ベーチェット病、通風または通風性関節炎、例えば、関節リウマチに随伴する異常な血管新生、乾癬、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症（水晶体後方線維増殖）などの他の眼血管由来疾患、黄斑変性、角膜移植片拒絶、神経血管性緑内障およびＯｓｔｅｒ  Ｗｅｂｂｅｒ症候群、乾癬、再狭窄、真菌感染症、寄生虫感染症、ならびにサイトメガロウイルス感染症などのウイルス感染症が含まれる。本発明の方法に従って処置される対象には、上述の障害のいずれかを有している任意の個体が含まれる。
【０１０４】
他の実施形態では、本方法で処置するために適した対象には、ウイルスに感染していると臨床的に診断されている個体が含まれる。一部の実施形態では、上記ウイルスは、肝炎ウイルス（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、デルタなど）であり、特にＨＣＶが、本発明の方法での処置に適している。ＨＣＶに感染した個体は、その血中にＨＣＶ  ＲＮＡを有しており、かつ／またはその血清中に抗ＨＣＶ抗体を有していると同定される。そのような個体には、ナイーブ個体（例えば、ＨＣＶについて以前に処置されたことのない個体、特に、ＩＦＮ−αベースまたはリバビリンベースの治療を以前に受けたことのない個体）およびＨＣＶについての以前の処置が失敗した個体が含まれる。
【０１０５】
一部の実施形態では、本明細書において提供する方法で処置するために適した対象には、これだけに限定されないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含めた神経変性疾患または障害を有している個体が含まれる。
【０１０６】
他の実施形態では、本発明の方法で処置するために適した対象には、多発性硬化症を有している個体が含まれる。多発性硬化症は、乏突起神経膠芽細胞によって産生されるミエリンに対するリンパ球攻撃での中枢神経系内の炎症、プラーク形成、および脳および脊髄中の軸索突起のミエリン鞘の破壊での脱髄によって特徴づけられ、経時的に重大な神経学的身体障害へと至る自己免疫神経変性疾患を指す。典型的には、発症時に、そのほかの点では健康なヒトが、片側性視力喪失、めまい、運動失調、共調運動不全、歩行困難、知覚不全、感覚異常、感覚消失によって特徴づけられる感覚機能障害、尿失禁するまでの排尿障害、複視、構音障害、または麻痺までの様々な程度の運動性衰弱によって症状発現される神経学的総体的症状（発作）の急性または亜急性発症を示す。上記症状は、無痛性であり、数日から数週間にわたって残り、次いで、部分的に、または完全に解消することがある。緩解期間の後に、２回目の発作が生じる。１回目の発作後のこの期間の間に、患者は、推定（ｐｒｏｂａｂｌｅ）ＭＳに罹患していると規定される。推定ＭＳ患者は、数年間にわたって診断されないままであることがある。２回目の発作が生じると、臨床的に確定的なＭＳ（ＣＤＭＳ）の診断が成される（Ｐｏｓｅｒ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  １９８３；Ｃ．  Ｍ．  Ｐｏｓｅｒら、Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １９８３；  １３、２２７）。
【０１０７】
用語「対象」および「患者」は、本明細書に記載の薬学的方法、組成物、および処置を必要とし得る任意の哺乳動物または非哺乳動物種の１つまたは複数のメンバーを意味する。したがって、対象および患者には、限定ではないが、霊長類（ヒトを含む）、イヌ、ネコ、有蹄類（例えば、ウマ、ウシ、ブタ（例えば、ブタ））、鳥類、および他の対象が含まれる。ヒトおよび商業上の重要性を有する非ヒト動物（例えば、家畜および家庭動物）が、特に重要である。
【０１０８】
「哺乳動物」は、任意の哺乳動物種の１つまたは複数のメンバーを意味し、例として、イヌ；ネコ；ウマ；ウシ；ヒツジ；げっ歯類など、および霊長類、特に、ヒトが含まれる。非ヒト動物モデル、特に、哺乳動物、例えば、霊長類、マウス、ウサギなどを、実験調査のために使用することができる。
【０１０９】
状態または疾患を「処置する」またはその「処置」には、（１）その状態の症状の少なくとも１つを予防すること、すなわち、疾患に曝露されるか、もしくは罹患しやすい可能性があるが、まだその疾患の症状を経験もしくは表示していない哺乳動物において、臨床症状を有意に発生させないこと、（２）疾患を阻害すること、すなわち、疾患もしくはその症状の発生を阻止もしくは低減すること、または（３）疾患を軽減すること、すなわち、疾患またはその臨床症状を退縮させることが含まれる。したがって、本明細書で使用する場合、用語「処置する」は、疾患の予防および既存の状態の処置の両方を指すために使用される。例えば、環状ジヌクレオチド活性作用物質を投与する場合、細胞増殖の予防は、例えば、腫瘍の再増殖を予防し、転移増殖を予防するなどのために、明白な疾患の発生前に、本化合物を投与することによって達成され得る。別法では、上記化合物を、患者の臨床症状を安定化または改善することによって進行中の疾患を処置するために使用する。
【０１１０】
併用療法
本方法において使用するために、本明細書に記載の環状ジヌクレオチド活性作用物質を、根底にある状態またはその状態の症状を処置する他の剤を含めた他の薬学的活性剤と組み合わせて投与することができる。「〜と組み合わせて」は、本明細書で使用する場合、例えば、第１の化合物を、第２の化合物の投与の全過程の間に投与する使用；第１の化合物を、第２の化合物の投与と重複するある期間にわたって投与する使用、例えば、第１の化合物の投与を、第２の化合物の投与前に開始し、第１の化合物の投与を、第２の化合物の投与が終了する前に終了する使用；第２の化合物の投与を、第１の化合物の投与前に開始し、第２の化合物の投与を、第１の化合物の投与を終了する前に終了する使用；第１の化合物の投与を、第２の化合物の投与前に開始し、第２の化合物の投与を、第１の化合物の投与が終了する前に終了する使用；第２の化合物の投与を、第１の化合物の投与の開始前に開始し、第１の化合物の投与を、第２の化合物の投与が終了する前に終了する使用を指す。したがって、「組み合わせて」は、また、２種以上の化合物の投与を伴うレジメンを指す。「〜と組み合わせて」は、また、本明細書で使用する場合、同じまたは異なる製剤中で、同じまたは異なる経路によって、かつ同じまたは異なる剤形種で投与することができる２種以上の化合物の投与を指す。
【０１１１】
新生物疾患の併用療法で使用するための他の剤の例には、これらだけに限定されないが、サリドマイド、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、２−ＭＥ、ＳＵ６６６８、ネオバスタット、Ｍｅｄｉ−５２２、ＥＭＤ１２１９７４、ＣＡＩ、セレコキシブ、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、ＴＮＰ４７０、アバスチン、グリベック、ハーセプチン、およびその混合物が含まれる。併用療法で使用するための化学療法薬の例には、これらだけに限定されないが、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソウレア、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロフォスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホル−アミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が含まれる。
【０１１２】
他の抗ウイルス薬も、本発明の処置方法において送達することができる。例えば、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）を阻害する化合物は、直接的な抗ウイルス活性を発揮する可能性を有することがあり、そのような化合物は、本明細書において記載するとおりの変異リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）と組み合わせて投与することができる。Ｃ型肝炎  ＮＳ３プロテアーゼの有効な阻害物質である薬物を、本明細書において記載するとおりの変異リステリアと組み合わせて投与することができる。Ｃ型肝炎  ＮＳ３プロテアーゼ阻害物質は、ウイルス複製を阻害する。ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼの阻害物質などの他の剤も、併用療法のための魅力的な薬物であり、本明細書に記載の併用療法において使用するために企図される。ＨＣＶタンパク質配列に相補的であり、ウイルスコアタンパク質の発現を阻害するＨｅｐｔａｚｙｍｅ（商標）およびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどのリボザイムも、本明細書に記載の併用療法において使用するために適している。
【０１１３】
多発性硬化症の併用療法において使用するための他の剤の例には、これらだけに限定されないが；グラチラマー；コルチコステロイド；チザニジン（Ｚａｎａｆｌｅｘ）およびバクロフェン（Ｌｉｏｒｅｓａｌ）などの筋弛緩薬；アマンタジン（Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ）またはモダフィニル（Ｐｒｏｖｉｇｉｌ）などの倦怠を低減する薬物；ならびにＭＳに随伴し得るうつ病、疼痛、および膀胱または腸制御問題のために使用することもできる他の薬物が含まれる。
【０１１４】
併用療法の状況では、併用療法用の化合物を、環状ジヌクレオチド活性作用物質を投与するのと同じ投与経路（例えば、肺内、経口、腸内など）によって投与することができる。代わりに、環状ジヌクレオチド活性作用物質と併用療法において使用するための化合物を、異なる投与経路によって投与することもできる。
【０１１５】
アジュバント
ある種の実施形態では、これだけに限定されないが、本明細書において提示した疾患および状態を含めた疾患または状態を治療または予防するための薬物またはワクチンと一緒に投与すると、上記環状ジヌクレオチド活性作用物質は、アジュバントとして機能する。一部の実施形態では、上記環状ジヌクレオチド活性作用物質を、ワクチンと一緒に投与する。ワクチンと共に投与される活性作用物質は、将来の疾患および／または感染症を予防する免疫記憶を刺激することを含めた、ワクチンによって誘発される免疫応答を増強するアジュバントとして機能し得る。
【０１１６】
ある種の実施形態では、ワクチンのためのアジュバントとして投与される上記環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質は、例えば、比較的弱い抗原の免疫原性を増大させ、免疫応答を誘発するために必要な抗原の量を低減し、防御免疫を維持するために必要な免疫頻度を低減することによって、ワクチンの有効性を増強し、免疫無防備状態の個体または低い免疫応答を有する他の個体におけるワクチンの有効性を増強し、かつ／または粘膜免疫などのターゲット組織での免疫を増大させ得る。このような実施形態では、１種または複数種の抗原と共に同時投与される上記環状ジヌクレオチド活性作用物質は、抗原に対する細胞および体液免疫を促進し、かつワクチン接種の有効性を増大させる特定のサイトカインプロファイルを誘導し得る。
【０１１７】
ワクチンを調製するために使用される抗原は、身体に通常は存在しない物質を含有するウイルス、細菌、および寄生虫などの様々な微生物、さらには、腫瘍細胞に由来し得る。これらの物質は、抗原、および細菌細胞または癌細胞などの抗原を含有する細胞の両方を破壊する免疫応答を生じさせるための抗原として使用することができる。ある種の事例では、微生物病原体の単離されたかまたは粗製の抗原を、感染症を処置するためのワクチンにおいて使用することができ；単離されたか、または粗製の腫瘍細胞抗原を、癌を処置するためのワクチンにおいて使用することができ；病的に異常な細胞に関連すると考えられる単離されたか、または粗製の抗原を、特定の細胞を破壊のためにターゲティングするのが有益である様々な疾患を処置するために使用することができる。
【０１１８】
抗原の供給源であり得る微生物には、病原細菌を含めた細菌；ウイルス（例えば、インフルエンザ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、麻疹（Ｍｅａｓｌｅｓ）、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ））；寄生虫（例えば、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ））；真菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））などの臨床的に関連する微生物が含まれる。例えば、抗原は、炭疽（バシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ））、ペスト（エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ））、結核（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、サルモネラ症（サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ））、胃癌（ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ））、性行為感染症（クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）またはナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ））の原因因子などの細菌、特に、病原細菌などに由来し得る。他の代表的な例には、インフルエンザウイルス、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）ウイルス、天然痘（ｓｍａｌｌｐｏｘ）ウイルス、西ナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＭＥＲＳウイルス、呼吸系発疹ウイルス、麻疹ウイルスなどの特定のウイルスに由来する抗原が含まれる。該当する真菌には、これらだけに限定されないが、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種が含まれ、該当する寄生虫には、トリパノソーマ症、リーシュマニア、肺ペスト、およびライム病（ボレリア・バーグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ））の原因因子が含まれる。
【０１１９】
ワクチンにおいて使用される病的に異常な細胞は、病的状態を有している１つもしくは複数の個体、または得られたワクチンで処置された特定の個体を含めた１つもしくは複数のそのような個体から得られるエクスビボもしくはインビトロ培養細胞などの任意の供給源から得ることができる。
【０１２０】
環状ジヌクレオチド活性作用物質を含有するアジュバントと共に使用するためのワクチン製剤は、例えば、感染患者または増殖培養に由来する弱毒化および不活性化ウイルスおよび細菌病原体、精製高分子、多糖、類毒素、組換え抗原、病原体由来の外来遺伝子を含有する生体、合成ペプチド、ポリ核酸、抗体、および腫瘍細胞を含んでよい。
【０１２１】
組換え抗原は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）およびＡｎｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９９８）に記載されている組換え方法を使用して、例えば、細菌、酵母、昆虫、爬虫類、または哺乳動物細胞中で、任意の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を単離およびクローニングすることによって、得ることができる。ウイルス、細菌、および原生動物病原体に由来する表面抗原をコードするいくつかの遺伝子が、成功裏にクローニングされ、発現され、ワクチン開発のための抗原として使用されている。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスの主な表面抗原、ＨｂｓＡｇ、コレラ毒素のｂサブユニット、大腸菌のエンテロトキシン、マラリア寄生虫のスポロゾイト周囲のタンパク質、およびエプスタイン−バーウイルスからの糖タンパク質膜抗原、さらには腫瘍細胞抗原が、様々な周知のベクター／宿主系において発現され、精製され、ワクチンにおいて使用されている。
【０１２２】
環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質を含有するワクチン製剤は、有利には、他のワクチンアジュバントおよび担体を含有してよい。これらの担体およびアジュバントには、これらだけに限定されないが、イオン交換樹脂、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、乳剤（例えば、油／水乳剤）、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１２３】
ワクチン化合物または製剤が、自然免疫、体液免疫、細胞媒介性免疫、またはこれらの種類の免疫応答の任意の組み合わせを誘導するかどうかを決定する任意の簡便な方法を使用することができる。例えば、ＳＴＩＮＧによって自然免疫応答を誘導するワクチン化合物または製剤の能力は、本明細書に記載の方法、さらには他の方法を使用して決定することができる。自然免疫応答を検出するためのそのような方法は、一般に、ワクチン投与の数時間内に行うことができる。体液応答を誘導するワクチン化合物または製剤の能力は、ワクチンで初回刺激され、抗原で追加免疫された動物における抗原特異的抗体の力価を測定することによって、またはＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、もしくは他の周知の方法によって抗原と交差反応する抗体の存在を決定することによって、決定することができる。細胞免疫応答は、例えば、例えばＦＡＣＳ選別および当技術分野で周知の他の方法などの様々な方法を使用して、抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を測定することによって、決定することができる。体液および細胞免疫応答を検出する方法は、一般に、ワクチン投与から数日または数週後に行うことができる。
【０１２４】
環状ジヌクレオチド
別の態様では、本明細書において、２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドを提供する。本明細書で使用する場合、「環状ジヌクレオチド」は、各ヌクレオシドの２'または３'炭素がホスホジエステル結合によって、他のヌクレオシドの５'炭素に連結している２個のヌクレオシド（すなわち、第１および第２のヌクレオシド）を含有する化合物を指す。したがって、２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドは、少なくとも１個のヌクレオシドの２'炭素が、他のヌクレオシドの５'炭素に連結している環状ジヌクレオチドを指す。本明細書において論述しているとおり、２'−５'ホスホジエステル連結を含有する環状ジヌクレオチドは、細胞または対象におけるＩ型インターフェロンの産生を増大させるための本明細書に記載の方法を実行する際に使用することができる。本明細書で使用する場合、「環状ジヌクレオチド」には、本明細書に記載の環状ジヌクレオチドの立体異性体型のすべてが含まれる。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」は、糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）またはその類似体に共有結合している窒素塩基を含有する組成を指す。ヌクレオシドの例には、これらだけに限定されないが、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジン、およびイノシンが含まれる。一部の実施形態では、ヌクレオシドは、デオキシリボース糖を含有する。ヌクレオシドの類似体には、これらだけに限定されないが、デオキシアデノシン類似体（例えば、ジダノシンおよびビダラビン）；デオキシシチジン類似体（例えば、シタラビン、エマトリシタビン（Ｅｍａｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）、ラミブジン、およびザルシタビン）；デオキシグアノシン類似体（アバカビルおよびエンテカビル）；（デオキシ−）チミジン類似体（例えば、スタブジン、テルビブジン、およびジドブジン）；およびデオキシウリジン類似体（例えば、イドクスウリジンおよびトリフルリジン）が含まれる。
【０１２６】
いずれの特定の操作理論にも束縛されることなく、かつ以下の実施例において示すとおり、環状ジヌクレオチドは、細胞におけるＩ型ＩＦＮ産生を増大させ得る。ある種の実施形態では、環状ジヌクレオチドは、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）に関係する機構を介して、Ｉ型ＩＦＮ産生を増大させる。
【０１２７】
環状ジヌクレオチドには、本方法を実行する際に使用することができる本明細書において具体的に記載したもの、さらには、本明細書において具体的に記載したもののアイソフォーム（例えば、互変異性体）が含まれる。環状ジヌクレオチドは、任意の適切な方法を使用して得ることができる。例えば、環状ジヌクレオチドは、出発物質としてヌクレオシド誘導体を使用する化学合成によって作製することができる。環状ジヌクレオチドはまた、以下の実験セクションにおいて記載するとおり、組換え精製ｃＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）を使用して、インビトロ合成によって作製することができる。さらに、そのような環状ジヌクレオチドの構造は、ＮＭＲ分析を使用して確認することができる。
【０１２８】
本明細書において提供する環状ジヌクレオチドは、次の命名法：環状［Ｘ１（Ａ−５'）ｐＸ２（Ｂ−５'）ｐ］によって記載することができ、Ｘ１およびＸ２は、第１および第２のヌクレオシドであり、Ａは、ホスホジエステル結合によって第２のヌクレオシドの５'炭素に連結している第１ヌクレオシドの炭素（例えば、２'または３'位）であり、Ｂは、ホスホジエステル結合によって第１のヌクレオシドの５'炭素に連結している第２のヌクレオシドの炭素（例えば、２'または３'位）である。例えば、この命名法に基づくと、環状［Ｇ（２'−５'）ｐＡ（３'−５'）ｐ］は、以下の式：
2019068829.tif 000023
を有する。
【０１２９】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個の２'−５'ホスホジエステル結合を有する。特定の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、１個の３'−５'ホスホジエステル結合をさらに含有する（例えば、環状［Ｘ１（２'−５'）ｐＸ２（３'−５'）ｐ］または環状［Ｘ１（３'−５'）ｐＸ２（２'−５'）ｐ］）。他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、２個の２'−５'ホスホジエステル結合を含有する（環状［Ｘ１（２'−５'）ｐＸ２（２'−５'）ｐ］）。
【０１３０】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、環状［Ａ（２'−５'）ｐＡ２'−５'）ｐ］；環状［Ｔ（２'−５'）ｐＴ（２'−５'）ｐ］；環状［Ｇ（２'−５'）ｐＧ（２'−５'）ｐ］；環状［Ｃ（２'−５'）ｐＣ（２'−５'）ｐ］；または環状［Ｕ（２'−５'）ｐＵ（２'−５'）ｐ］である。ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、環状［Ａ（２'−５'）ｐＡ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｔ（２'−５'）ｐＴ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｇ（２'−５'）ｐＧ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｃ（２'−５'）ｐＣ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｕ（２'−５'）ｐＵ（３'−５'）ｐ］；環状［Ａ（２'−５'）ｐＴ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｔ（２'−５'）ｐＡ（３'−５'）ｐ］；環状［Ａ（２'−５'）ｐＧ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｇ（２'−５'）ｐＡ（３'−５'）ｐ］；環状［Ａ（２'−５'）ｐＣ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｃ（２'−５'）ｐＡ（３'−５'）ｐ］；環状［Ａ（２'−５'）ｐＵ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｕ（２'−５'）ｐＡ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｔ（２'−５'）ｐＧ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｇ（２'−５'）ｐＴ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｔ２'−５'）ｐＣ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｃ（２'−５'）ｐＴ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｔ（２'−５'）ｐＵ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｕ（２'−５'）ｐＴ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｇ（２'−５'）ｐＣ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｃ２'−５'）ｐＧ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｇ（２'−５'）ｐＵ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｕ（２'−５'）ｐＧ（３'−５'）ｐ］；環状［Ｃ（２'−５'）ｐＵ（３'−５'）ｐ］；または環状［Ｕ（２'−５'）ｐＣ（３'−５'）ｐ］である。
【０１３１】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000024
を有し、
式中、ＸおよびＹは、窒素塩基を含む任意の有機分子であってよい。本明細書で使用する場合、「窒素塩基」は、これだけに限定されないが、ピリミジン誘導体（例えば、シトシン、チミン、およびウラシル）およびプリン誘導体（例えば、アデニンおよびグアニン）、さらには、置換ピリミジンおよびプリン誘導体、ピリミジンおよびプリン類似体、ならびにそれらの互変異性体を含めた、塩基の化学的特性を有する窒素含有分子を指す。ある種の実施形態では、ＸおよびＹは、それぞれ、以下のいずれか１つである：
2019068829.tif 000025
。
【０１３２】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式（環状［Ｇ（２'５'）ｐＡ（３'５'）ｐ］）：
2019068829.tif 000026
を有する。
【０１３３】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式（環状［Ｇ（３'５'）ｐＡ（２'５'）ｐ］）：
2019068829.tif 000027
を有する。
【０１３４】
他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式の環状［Ｇ（２'５'）ｐＡ（２'５'）ｐ］：
2019068829.tif 000028
を有する。
【０１３５】
他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式の環状［Ａ（２'５'）ｐＡ（３'５'）ｐ］：
2019068829.tif 000029
を有する。
【０１３６】
また他の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式の環状［Ｇ（２'５'）ｐＧ（３'５'）ｐ］：
2019068829.tif 000030
を有する。
【０１３７】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式の環状［Ａ（２'５'）ｐＡ（２'５'）ｐ］：
2019068829.tif 000031
を有する。
【０１３８】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式の環状［Ｇ（２'５'）ｐＧ（２'５'）ｐ］：
2019068829.tif 000032
を有する。
【０１３９】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000033
2019068829.tif 000034
2019068829.tif 000035
の１つを有し、
式中、Ｒは、任意のアミノ酸側鎖である。
【０１４０】
薬学的組成物
別の態様では、本明細書において、本明細書において提供する環状ジヌクレオチド活性作用物質のいずれか、および薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物を提供する。薬学的組成物のある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチド活性作用物質は、１種または複数種の環状ジヌクレオチドである。
【０１４１】
用語「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の規制当局によって認可されているか、または動物、特にヒトにおいて使用するために米国薬局方もしくは他の一般に認められている外国薬局方において挙げられていることを意味する。用語「担体」は、ミトコンドリア輸送タンパク質阻害物質をそれと共に投与する希釈剤、アジュバント、添加剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、例えば、水中の生理食塩水、およびラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物、または合成由来のものを含めた油などの滅菌液体であってよい。生理食塩水は、薬学的組成物を静脈内投与する場合に、好ましい担体である。生理食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に、注射用液剤のための液体担体として使用することができる。適切な薬学的品添加剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望の場合には、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態を取り得る。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体を含む坐剤として製剤化することができる。阻害物質は、中性形態または塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸に由来するものなどの遊離のアミノ基で形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離のカルボキシル基で形成されるものが含まれる。適切な薬学的担体の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」においてＥ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎによって記載されている。そのような組成物は、治療有効量のミトコンドリア輸送タンパク質（例えば、Ｍｉｒｏタンパク質、ＴＲＡＫタンパク質、またはＫｈｃ）阻害物質を好ましくは精製形態で、患者に適正に投与するための形態が得られるような適切な量の担体と一緒に含有する。製剤は、投与様式に適しているべきである。
【０１４２】
薬学的組成物はまた、例えば、抗酸化剤などの様々な安定化剤のいずれかを含むことができる。薬学的組成物がポリペプチドを含む場合、上記ポリペプチドを、ポリペプチドのインビボ安定性を増強するか、または別段に、その薬理学的特性を増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を増大させるか、毒性を低減するか、溶解度または取り込みを増強する）様々な周知の化合物と錯体形成させることができる。そのような改変または錯生成剤の例には、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩が含まれる。組成物のポリペプチドはまた、それらのインビボ属性を増強する分子と錯体形成させることができる。そのような分子には、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質が含まれる。
【０１４３】
様々な種類の投与に適した製剤に関するさらなるガイダンスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．、第１７版（１９８５）において見出すことができる。薬物送達のための方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３（１９９０）を参照されたい。
【０１４４】
薬学的組成物を製剤化するために使用される成分は、好ましくは、高い純度を有し、かつ有害である可能性がある混入物を実質的に含有しない（例えば、少なくとも米国食品（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄ）（ＮＦ）グレード、一般に、少なくとも分析グレード、さらに典型的には、少なくとも薬学的グレード）。さらに、インビボでの使用が意図されている組成物は、無菌であり得る。所与の化合物を、使用前に合成しなければならない限り、その結果生じる生成物は、典型的には、合成または精製プロセスの間に存在し得る毒性の可能性があるいずれの作用物質も、特に、いずれの内毒素も、実質的に含有しない。非経口投与のための組成物も無菌であり、実質的に等張性で、ＧＭＰ条件下で作製される。
【０１４５】
薬学的組成物は、静脈内投与、経口投与、埋め込み注射剤による投与、経粘膜投与、経皮投与、筋肉内投与、髄腔内投与、または皮下投与のために製剤化することができる。一部の実施形態では、薬学的組成物を、静脈内投与のために製剤化する。他の実施形態では、薬学的組成物を、皮下投与のために製剤化する。いくつかの常套的に使用される薬学的担体を使用する次の送達系は、本組成物を投与するために企図される多くの実施形態のうちの代表に過ぎない。
【０１４６】
注射可能な薬物送達系には、液剤、懸濁剤、ゲル剤、マイクロスフェア、およびポリマー注射剤が含まれ、これは、溶解度改変剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール、およびスクロース）およびポリマー（例えば、ポリカプリラクトン（ｐｏｌｙｃａｐｒｙｌａｃｔｏｎｅ）およびＰＬＧＡ）などの添加剤を含んでよい。埋め込み可能な系には、ロッドおよびディスクが含まれ、これは、ＰＬＧＡおよびポリカプリラクトンなどの添加剤を含有してよい。オステオポンチンまたは本発明の核酸は、遺伝子ガンを使用して粒子に結合させて投与することもできる。
【０１４７】
経口送達系には、錠剤およびカプセル剤が含まれる。これらは、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピリロドン（Ｐｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｉｌｏｄｏｎｅ）、他のセルロース材料、およびデンプン）、希釈剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、デンプン、リン酸二カルシウム、ならびにセルロース材料）、崩壊剤（例えば、デンプンポリマーおよびセルロース材料）、および滑沢剤（例えば、ステアリン酸塩およびタルク）などの添加剤を含有してよい。
【０１４８】
経粘膜送達系には、貼付剤、錠剤、坐剤、膣坐剤、ゲル剤、およびクリーム剤が含まれ、これらは、溶解補助剤および促進剤（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩、およびアミノ酸）、および他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸などの親水性ポリマー）などの添加剤を含有してよい。
【０１４９】
皮膚送達系には、例えば、水性および非水性ゲル剤、クリーム剤、多層乳剤、マイクロ乳剤、リポソーム剤、軟膏剤、水性および非水性液剤、ローション剤、エアロゾル剤、炭化水素基剤、および散剤が含まれ、これらは、溶解補助剤、浸透促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、およびアミノ酸）、および親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などの添加剤を含有してよい。一実施形態では、薬学的に許容される担体は、リポソームまたは経皮促進剤である。
【０１５０】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチド活性作用物質を含有する薬学的組成物を、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するように製剤化する。血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しての薬物送達のための１つの戦略は、マンニトールまたはロイコトリエンなどの浸透の手段によるか、または生化学的に、ブラジキニンなどの血管作動性物質の使用によるかのいずれかによる、ＢＢＢの破壊を必要とする。ＢＢＢ破壊剤は、組成物が血管内注射によって投与される場合、治療用組成物と共に同時投与することができる。ＢＢＢを通過するための他の戦略は、カベオイル（ｃａｖｅｏｉｌ）−１媒介性トランスサイトーシス、グルコースおよびアミノ酸担体などの担体媒介性輸送体、インスリンまたはトランスフェリンでは受容体媒介性トランスサイトーシス、およびｐ−糖タンパク質などの能動流出輸送体を含めた内在性輸送系の使用を必要とし得る。血管の内皮壁を通過する輸送を促進するために、能動輸送部分を、本発明において使用する治療用化合物にコンジュゲートすることもできる。別法では、ＢＢＢの背後でのＮＤ薬学的組成物の薬物送達は、局所送達、例えば、例えばＯｍｍａｙａレザバーによる髄腔内送達によるもの（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２２２，９８２号および同第５３８５５８２号を参照されたい）；例えば、硝子体中または頭蓋内への、例えば、シリンジによる大量注射によるか；例えば、例えば対流を伴うカニューレ挿入による連続注入によるもの（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００７０２５４８４２号を参照されたい）；または阻害薬学的組成物が可逆的に装備されているデバイスを埋め込むことによるものであってよい（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００８００８１０６４号および同第２００９０１９６９０３号を参照されたい）。
【０１５１】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質を含有する薬学的組成物を、例えば、サイトゾル輸送を増強する送達ビヒクル中で製剤化する。任意の簡便なプロトコルを、細胞の形質膜を通過し、サイトゾルに至る環状ジヌクレオチド活性作用物質の送達を促進するために使用することができる。ある種の実施形態では、薬学的組成物中の同じ送達ビヒクルによって送達されるように、上記環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質および、ワクチン中で使用するために有効な抗原を一緒に製剤化することができる。
【０１５２】
一部の事例では、上記環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質を、薬学的組成物中の送達ビヒクルを含むリポソーム中に封入することができる。薬物送達および他の治療用途のためにリポソームを使用する方法は、当技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８３２９２１３号、同第６４６５００８号、同第５０１３５５６号、米国特許出願第２００７０１１０７９８号、およびＡｎｄｒｅｗｓら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ２０１２  ９：１１１８を参照されたい。ポリエチレングリコール（「ペグ化」）を二重層に加えることによって、リポソームを、それらの表面がより親水性になるように改変することができ、それによって、血流中でのそれらの循環時間が増大する。これらは、「ステルス」リポソームとして公知であり、特に、環状ジヌクレオチド活性作用物質などの親水性（水溶性）分子のための担体として有用である。
【０１５３】
ある種の実施形態では、ポリ（乳酸）、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ乳酸−コ−グリコール酸などの生分解性材料から作製されたナノ粒子またはマイクロ粒子、ポリエチレンイミンまたはアルギナートマイクロ粒子、およびシクロデキストリンなどのデドリマー（ｄｅｄｒｉｍｅｒ）を含めた陽イオン性マイクロ粒子を、環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質のための送達ビヒクルとして使用して、細胞取り込みを促進することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８１８７５７１号、Ｋｒｉｓｈｎａｍａｃｈａｒｉら、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ２００９  ６１：２０５、Ｇａｒｚｏｎら、２００５  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：１３８４を参照されたい。
【０１５４】
別の実施形態では、光化学的内部移行を使用して、環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質のサイトゾル取り込みを増強することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１２０２２６２１７号を参照されたい。このような実施形態では、上記環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質を、光感作性剤と同時投与することができる。次いで、特定の波長の光にターゲット細胞を曝露することによって、環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質の内部移行を惹起する。
【０１５５】
ある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質を送達するための送達ビヒクルは、ターゲティング送達ビヒクル、例えば、リポソームの表面上に１個または複数個のターゲティング部分または生体内分布調整剤を含有するリポソームであってもよい。ターゲティング部分は、所望のターゲットと特異的に結合または相互作用し得る任意の作用物質であってよい。
【０１５６】
特異的結合剤は、ターゲティングされたタンパク質、ペプチド、生体高分子、細胞、組織など（例えば、環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質がその所望の作用を発揮するタンパク質ペプチド、生体高分子、細胞、組織など）に特異的に結合する任意の分子であってよい。ターゲット部位の性質に応じて、特異的結合剤は、これだけに限定されないが、ペプチド分析物のエピトープに対する抗体、または特異的結合対のメンバーなどの任意の認識分子であってよい。例えば、適切な特異的結合対には、これらだけに限定されないが：受容体／リガンド対のメンバー；リガンド−受容体の結合部分；抗体／抗原対のメンバー；抗原−抗体の結合性断片；ハプテン；レクチン／炭水化物対のメンバー；酵素／基質対のメンバー；ビオチン／アビジン；ビオチン／ストレプトアビジン；ジゴキシン／抗ジゴキシン；ペプチドアプタマー結合対のメンバーなどが含まれる。
【０１５７】
ある種の実施形態では、特異的結合部分には、抗体が含まれる。本明細書において定義される場合の抗体には、これだけに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄ断片を含めた抗原への特異的結合を保持している抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびに抗体の抗原結合性部分および非抗体タンパク質を含む融合タンパク質が含まれ得る。抗体にはまた、Ｆａｂ'、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ'）２、およびまたは抗原への特異的結合を保持している他の抗体断片が含まれ得る。
【０１５８】
ある種の実施形態では、ターゲティング部分は、環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質を含有するターゲティング送達ビヒクルが腫瘍の部位または特異的免疫細胞に送達されるように、腫瘍細胞または免疫細胞上で発現される分子（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌなど）と特異的に相互作用する結合剤である。
【０１５９】
所望の場合には、上記で挙げた送達ビヒクルの任意の組み合わせを、ターゲット細胞への環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質の送達を有利に増強するために使用することができる。
【０１６０】
薬学的組成物の成分は、別々に、または一緒に混合して単位剤形で、例えば、無水の凍結乾燥散剤または無水濃縮物として供給することができる。組成物を注入によって投与すべき場合には、滅菌薬学的グレードの水または生理食塩水を含有する輸液ボトルを用いて分配することができる。組成物を注射によって投与する場合には、成分を投与前に混合し得るように、滅菌注射用水または生理食塩水のアンプルを準備することができる。
【０１６１】
一部の実施形態では、薬学的組成物を、対象に投与するために適した濃度まで再構成することができる無水滅菌凍結乾燥散剤として供給する。一部の実施形態では、薬学的組成物を、無水濃縮物として供給する。一部の実施形態では、薬学的組成物を、無水滅菌凍結乾燥散剤として、少なくとも０．５ｍｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、少なくとも３ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも６０ｍｇ、または少なくとも７５ｍｇの単位投薬量で供給する。
【０１６２】
再構成可能な送達系のための液剤、懸濁剤、および散剤には、懸濁化剤（例えば、ゴム、キサンタン、セルロース系、および糖）、湿潤剤（例えば、ソルビトール）、溶解補助剤（例えば、エタノール、水、ＰＥＧ、およびプロピレングリコール）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｐａｎｓ、Ｔｗｅｅｎｓ、およびセチルピリジン）、防腐剤および抗酸化剤（例えば、パラベン、ビタミンＥおよびＣ、ならびにアスコルビン酸）、固化防止剤、コーティング剤、ならびにキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）などのビヒクルが含まれる。
【０１６３】
一部の実施形態では、薬学的組成物を、塩の形態として製剤化する。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンと共に形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンと共に形成されるものが含まれる。
【０１６４】
ある種の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書において提供する環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質のいずれかのプロドラッグ誘導体を含有する。そのようなプロドラッグは後で、薬学的組成物を投与された対象の身体内で環状ジヌクレオチドまたはＳＴＩＮＧ活性作用物質の活性形態に変換され得る。
【０１６５】
キット
例えば経口または注射可能用量で本環状ジヌクレオチド活性作用物質、例えば、１種または複数種の環状ジヌクレオチドの単位用量を備えたキットを提供する。本キットでは、簡便か、または望ましくあり得るように、１つまたは複数の構成要素が、同じか、または異なる容器内に存在する。
【０１６６】
単位用量を含有する容器に加えて、該当する病的状態を処置する際の環状ジヌクレオチドの使用および付随する利益を記載する説明書が存在する。説明書は、様々な異なる形式で提供することができる。ある種の実施形態では、説明書は、本方法を実行するための完全なプロトコル、またはそれを得るための手段（例えば、説明書を提供するウェブページを使用者に示すウェブサイトＵＲＬ）を含んでよく、この場合、これらの説明は、基材上に印刷されていてよく、基材は、添付文書、包装、試薬容器などのうちの１つまたは複数であってよい。
【０１６７】
当業者に、本発明を作製および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために、次の実施例を記載するが、これらは、本発明者らが発明とみなすものの範囲を限定することを意図したものでもなければ、以下の実験がすべてであるか、または実験のみが行われたことを示すために意図されたものでもない。使用された数値（例えば、量、温度など）に関して確度を保証する努力は成されているが、多少の実験誤差および偏差は考慮されるべきである。別段に示さない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【０１６８】
実験
Ｉ．  結果および論述
病原体由来の核酸の認識は、哺乳動物において自然免疫応答を開始させる主な機構である（Ｂａｒｂａｌａｔら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１１）２９：１８５）。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）を含めた、生殖細胞系によってコードされる核酸のセンサーのいくつかのファミリーは記載されている（Ｐａｌｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２００９）２２７：２２１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｃｅｌｌ（２０１０）１４０：８０５）。核酸と結合すると、これらのセンサーは、宿主防御を提供するサイトカインと他の免疫エフェクタータンパク質との産生をもたらすシグナル伝達カスケードを開始する。
【０１６９】
外来二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡがサイトゾルに存在すると、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生によって支配される強力な抗ウイルス応答が引き起こされる（Ｉｓｈｉｉら、Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）７：４０；Ｓｔｅｔｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００６）２４：９３）。しかしながら、ｄｓＤＮＡとインターフェロンの産生を結び付ける分子機構は、十分には特徴づけられていない（Ｂｕｒｄｅｔｔｅ  ＆  Ｖａｎｃｅ、Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１３）１４：１９）。宿主タンパク質であるＳＴＩＮＧは同定されており、サイトゾルｄｓＤＮＡに対するＩＦＮ応答に必要であることが示されている（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ＆  Ｂａｒｂｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ（２００８）４５５：６７４；Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｎａｔｕｒｅ（２００９）４６１：７８８；Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ（２００９）１０６：８６５３；およびＺｈｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００８）２９：５３８）。ＳＴＩＮＧはまた、細菌由来のセカンドメッセンジャーと称される環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）に対するインターフェロン応答に必要であることが示されている（Ｊｉｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１１）１８７：２５９５；およびＳａｕｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ（２０１１）７９：６８８）。ＣＤＮは、特定の細菌病原体によってサイトゾルに分泌または放出されて（Ｗｏｏｄｗａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１０）３２８：１７０３）、ＳＴＩＮＧに直接結合する（Ｂｕｒｄｅｔｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７８：５１５）。しかしながら興味深いことに、マウスＳＴＩＮＧの変異（Ｒ２３１Ａ）対立遺伝子は、ＣＤＮに対する応答性を消失させているが、サイトゾルＤＮＡ（Ｉｄ）に対するインターフェロン応答に、感知できるほどの影響を及ぼさないと同定された。反対に、野生型マウスＳＴＩＮＧを発現する２９３Ｔ細胞は、ＣＤＮに対して応答するが、ｄｓＤＮＡには応答しない。したがって、サイトゾルＣＤＮおよびｄｓＤＮＡに対するＩＦＮ応答は両方とも、ＳＴＩＮＧを必要とするが、これらの化学的に別個のリガンドに対する応答は、遺伝子的に切り離され得る。
【０１７０】
２つの研究に基づき（Ｓｕｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３３９：７８６；およびＷｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３３９：８２６）、ｄｓＤＮＡがサイトゾル内に存在することが、ｃＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）と称されるＤＮＡ依存性センサーによって、ＣＤＮ、環状ＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）の産生につながると提案された。ｃＧＡＭＰは、ＳＴＩＮＧに結合し、それを活性化することが示された。しかしながら、ＳＴＩＮＧ  Ｒ２３１Ａ変異体が、ＣＤＮに対する応答性を欠くにも関わらず、どのようにしてｄｓＤＮＡに対する応答を未だ開始し得るかは、不明なままであった。したがって、ｃＧＡＳがＳＴＩＮＧを活性化させる機構が調査された。
【０１７１】
先行する研究（Ｓａｕｅｒら、Ｂｕｒｄｅｔｔｅら）は、主に、マウスＳＴＩＮＧに焦点を当てており、ヒトＳＴＩＮＧがＣＤＮに応答し得るかどうかは未だ不明であった（Ｃｏｎｌｏｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、（２０１３）１９０：５２１６）。以前に報告されたとおり（Ｓｕｎら、Ｗｕら）、ヒトＴＨＰ−１細胞系は、ＳＴＩＮＧに依存して、ＣＤＮに強く応答することが見出された（図１Ａ、Ｂ）。ｈＳＴＩＮＧを、ＴＨＰ−１細胞からクローニングし、そのアミノ酸配列を、以前に広く研究された参照対立遺伝子（ＮＰ＿９３８０２３．１；本明細書ではｈＳＴＩＮＧＲＥＦと示す）（７）（図２）と比較した。ｈＳＴＩＮＧＲＥＦおよびｈＳＴＩＮＧＴＨＰ−１は４つのアミノ酸位で異なることが見出された。特に、ｈＳＴＩＮＧＲＥＦは、アミノ酸２３２位でヒスチジン（Ｈ）をコードするのに対して、ｈＳＴＩＮＧＴＨＰ−１は、ＣＤＮに対する応答性に重要であるｍＳＴＩＮＧにおけるＲ２３１に対応するこの位置で、アルギニン（Ｒ）をコードする。したがって、内因性ＳＴＩＮＧを含まない２９３Ｔ細胞において、これらの対立遺伝子を発現させることによって、個々のｈＳＴＩＮＧ対立遺伝子の機能性が試験された（Ｂｕｒｄｅｔｔｅら）。以前に観察されたとおり（Ｂｕｒｄｅｔｔｅら）、２９３Ｔ細胞におけるｍＳＴＩＮＧの過剰発現は、ＩＦＮ−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトのリガンド非依存性活性化を誘導するために十分であるが；しかしながら、より少ない量のｍＳＴＩＮＧの２９３Ｔ細胞への移入で、細胞は、ＣＤＮに対して応答性になる。同様に、ｈＳＴＩＮＧＴＨＰ−１を発現する２９３Ｔ細胞は、ＣＤＮ刺激に対して応答性であった。反対に、ｈＳＴＩＮＧＲＥＦを発現する細胞は、応答性が不十分であるか、または非応答性であった（図１Ｃ）。興味深いことに、環状ジＧＭＰに結合した３種の最近のＳＴＩＮＧの結晶構造は、応答性が不十分なｈＳＴＩＮＧＲＥＦタンパク質のものであったことが観察された（Ｈｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  ＆  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（２０１２）１９：７２８；Ｏｕｙａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１２）３６：１０７３；Ｙｉｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ（２０１２）４６：７３５）。
【０１７２】
２９３Ｔ細胞は、おそらく、ｃＧＡＳまたはことによると他のＤＮＡセンサーが発現しないことによって、ｄｓＤＮＡによる刺激に対して応答性ではない（Ｓｕｎら）。したがって、ｈＳＴＩＮＧ変異体がＤＮＡ刺激に応答し得るかどうかを試験するために、ＳＴＩＮＧ−ヌル（「ゴールデンチケット」）（Ｓａｕｅｒら）、ただし（ｃＧＡＳ＋）マクロファージに、ｈＳＴＩＮＧ発現ベクターを形質導入した。興味深いことに、ＣＤＮに非応答性であるｈＳＴＩＮＧＲＥＦ変異体でも、ｄｓＤＮＡに対する応答性は示した（図１Ｄ）。したがって、ｈＳＴＩＮＧＲＥＦは、ＣＤＮおよびｄｓＤＮＡに対する応答性を切り離していると以前に記載された（Ｂｕｒｄｅｔｔｅら）マウスＳＴＩＮＧのＲ２３１Ａ変異の表現型を模写している。ｍＳＴＩＮＧＲ２３１Ａ変異体と同様に、ｈＳＴＩＮＧＲＥＦは、ＣＤＮにはなお結合し（図１Ｅ）（Ｈｕａｎｇら、Ｏｕｙａｎｇら、およびＹｉｎら）、このことは、この対立遺伝子が、ＣＤＮ結合の下流のステップで損なわれていることを示している。
【０１７３】
ｈＳＴＩＮＧ対立遺伝子での上記の結果と一致して、ｍＳＴＩＮＧのＲ２３１Ｈ変異体は、ｈＳＴＩＮＧＴＨＰのＲ２３２ＡまたはＲ２３２Ｈ変異体と同様に、ＣＤＮに対して応答性が不十分であった（図３Ａ）。したがって、アルギニン２３１／２３２は、マウス／ヒトＳＴＩＮＧにおけるＣＤＮに対する応答性に重要であると結論付けられた。しかしながら、ｈＳＴＩＮＧＲＥＦへのＨ２３２Ｒ変異の導入は、ＣＤＮに対する応答性を回復するためには十分ではなく；実際に、第２の置換（Ｇ２３０Ａ）も必要であることが観察された（図４）。再度、試験したすべての変異ＳＴＩＮＧ対立遺伝子は、環状ジＧＭＰに結合し、これは、残基２３０および２３２が、ＣＤＮ結合ポケットをカバーするがＣＤＮ結合ポケットを形成していないループに位置するという事実と一致した（図３Ｂ）（Ｂｕｒｄｅｔｔｅ  ＆  Ｖａｎｃｅ）。
【０１７４】
重要なことに、ｍＳＴＩＮＧＲ２３１Ａも、化学的に合成されたｃＧＡＭＰに対して非応答性であった（図１Ｆ）（Ｋｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．（２０１３）．  １３５：４９０６）。これによって、ＳＴＩＮＧのＲ２３１Ａ／Ｒ２３２Ｈ変異は、ｃＧＡＭＰの産生を介してＳＴＩＮＧを活性化させると考えられるｃＧＡＳ酵素に応答性であるのだろうかという疑問が生じた。ヒトまたはマウスｃＧＡＳ発現は、非常に低レベルのｃＧＡＳ発現でも、ｈＳＴＩＮＧＲＥＦおよびｍＳＴＩＮＧＲ２３１Ａ変異体を強く活性化させるために十分であるということが見出された（図５Ａ）。この結果について、いくつかの説明が考察された。説明の１つは、この応答は、単に、哺乳動物細胞におけるシンターゼ過剰の発現によるというものであるが；しかしながら、ｃＧＡＭＰを産生する細菌酵素の過剰発現（ＤｎｃＶ  ｆｒｏｍ  Ｖ．  ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Ｄａｖｉｅｓ、Ｃｅｌｌ（２０１２）１４９：３５８）は、ｈＳＴＩＮＧＲＥＦまたはｍＳＴＩＮＧＲ２３１Ａを活性化させず、野生型ｍＳＴＩＮＧおよびｈＳＴＩＮＧＴＨＰ−１は活性化させた（図５Ｂ）。代替の仮説の１つは、ｃＧＡＳは、ＳＴＩＮＧと物理的に相互作用し得、それによって、ｃＧＡＭＰ産生とは独立に、ＳＴＩＮＧを活性化させるというものである。しかしながら、この説明も、不正確であると考えられる。以前に実証されたとおり（Ｓｕｎら）、ヒトまたはマウスｃＧＡＳの触媒活性のない変異体の過剰発現は、ＳＴＩＮＧを活性化させることができず（ＧＳ＞ＡＡ；図２Ａ）、ｃＧＡＳシグナル伝達が、ＳＴＩＮＧとの直接的な物理的相互作用よりも、セカンドメッセンジャーの産生に依存していると論じられている。この解釈を確認するために、ｃＧＡＳの酵素産物を、インビトロでＡＴＰ、ＧＴＰ、およびｄｓＤＮＡを精製組換えｃＧＡＳに供給することによって生じさせた。陰性対照として、ｄｓＤＮＡ（ｃＧＡＳ活性を刺激するために必要とされる）を、平行反応から省いた。次いで、その結果生じたｃＧＡＳ産物を精製し、ＳＴＩＮＧ変異体を発現する２９３Ｔ細胞に移入した。合成ｃＧＡＭＰとは逆に、ｃＧＡＳ産物は、ｈＳＴＩＮＧＲＥＦおよびｍＳＴＩＮＧＲ２３１Ａを活性化させることができた（図５Ｃ）。この実験によって、ｃＧＡＳが、直接的な物理的相互作用を介してｈＳＴＩＮＧＲＥＦを活性化させるモデルが除外された。
【０１７５】
したがって、ｃＧＡＳの実際の産物は、以前に提案された（Ｓｕｎら、Ｗｕら）とおりの標準ＣＤＮではないと仮定された。ｃＧＡＳは、変異ＳＴＩＮＧ対立遺伝子を刺激することができる新規の、２'−５'ホスホジエステル結合を含有するＣＤＮを産生し得ると仮定された。重要なことに、そのような非標準ＣＤＮは、標準３'−５'ホスホジエステル連結ＣＤＮと同一の質量であり、したがって、これら２つの生成物を、以前に公開されたｃＧＡＳ生成物の質量分光分析によって識別することは容易ではないと考えられる（Ｓｕｎら、Ｗｕら）。この仮説を試験するために、放射標識α３２Ｐ−ＧＴＰまたはα３２Ｐ−ＡＴＰを、組換え精製ｃＧＡＳまたはＶに供給した。コレラＤｎｃＶおよび産物を、薄層クロマトグラフィーによって分析した。以前に報告されたとおり、ＤｎｃＶは、ＡＴＰのみが供給されると、多少のｃ−ジ−ＡＭＰを産生し、ＧＴＰのみが供給されると、多少のｃ−ジ−ＧＭＰを産生したが、ＡＴＰおよびＧＴＰの両方を供給されると、ｃＧＡＭＰを好ましくは作製した（Ｄａｖｉｅｓら、細胞（２０１２）１４９：３５８）。（図６Ａ）。興味深いことに、ｃＧＡＳは、ＡＴＰおよびＧＴＰ基質の両方を必要とし、その結果生じた産物は、ＤｎｃＶによって産生された標準ＣＤＮのいずれとも有意に異なって移動し、このことは、ｃＧＡＳが、新規の非標準ＣＤＮを産生することを示唆した（図６Ａ）。
【０１７６】
ｃＧＡＳおよびＤｎｃＶ産物を、特異的ヌクレアーゼ消化によって分析した。ｃＧＡＳ産物は、３'−５'ホスホジエステル連結を選択的に消化するヌクレアーゼＰ１によって部分的に切断され、ｃＧＡＳ産物が少なくとも１個の３'−５'ホスホジエステル連結（図６Ｂ）を含有することを示唆した。しかしながら、２'−５'および３'−５'ホスホジエステル連結の両方を切断するヘビ毒ホスホジエステラーゼでのｃＧＡＳ産物の処理とは対照的に、ＧＭＰの生成をもたらさなかったので、ヌクレアーゼＰ１消化は不完全であった（図３Ｂ）。これは、ｃＧＡＳ産物が、１個の２'−５'ホスホジエステル連結を含有することを示唆している。
【０１７７】
ＣＤＮは、ワクチンアジュバントまたは免疫治療薬として有用であると提案されている（Ｃｈｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１０）２８：３０８０）。合成ＳＴＩＮＧ活性化因子であるＤＭＸＡＡは、新規の化学療法薬としてヒト治験において試験されている。残念なことに、ＤＭＸＡＡは、ヒトにおいて有効であるとは見いだされず、その原因は、ｈＳＴＩＮＧを刺激し得ないためである可能性がある（Ｃｏｎｌｏｎら）。この状況において、これらは、非標準２'−５'連結ＣＤＮが、標準ＣＤＮまたはＤＭＸＡＡに対する応答性が不十分なものでしかない変異体を含めた多様なＳＴＩＮＧ変異体の強力なパンアゴニストとして機能することを示しているので、本発明者らの結果は重要である。
【０１７８】
ＩＩ．  材料および方法：
Ａ．  マウスおよび細胞系
ＴＨＰ−１細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、およびＬ−グルタミンを補充されたＲＰＭＩ  １６４０中で増殖させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、およびＬ−グルタミンを補充されたＤＭＥＭ中で増殖させた。Ｇｐ２レトロウイルスパッケージング細胞系を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、およびＬ−グルタミンを補充されたＤＭＥＭ中で維持した。動物試験計画書は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって許可された。
【０１７９】
Ｂ．  ＳＴＩＮＧノックダウン
ヒトＳＴＩＮＧ（クローンＩＤ  ＮＭ＿１９８２８２．１−９０１ｓ１ｃ１）のノックダウンを、ｐＬＫＯ．１（Ｔｈｅ  ＲＮＡｉ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）を使用して達成した。ヒトＳＴＩＮＧのノックダウンでの配列は、
2019068829.tif 000036
であり、これは、
2019068829.tif 000037
フォワードオリゴおよび
2019068829.tif 000038
リバースオリゴに対応する。オリゴをアニーリングし、ＡｇｅＩおよびＥｃｏＲＩ消化されたｐＬＫＯ．１（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングし、スクランブルｓｈＲＮＡ対照コンストラクトと平行して、ＴＨＰ−１細胞にレトロウイルスによって形質導入した。安定な細胞系を、ピューロマイシンで選択した。ＴＨＰ−１細胞を、１μｇ／ｍＬ  ＰＭＡと共に２４時間にわたって分化させた。細胞を２４時間にわたって停止させ、次いで、示されているリガンドで６時間にわたって再刺激した。ＩＦＮ誘導を、下記のとおり、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
【０１８０】
Ｃ．  細胞刺激および試薬
骨髄マクロファージおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して刺激した。別段の指定がない限り、環状ジＧＭＰ、環状ジＡＭＰ、ポリＩ：Ｃ、およびワクシニアウイルス７０マーＤＮＡを、以前に記載されたとおりに調製し（Ｂｕｒｄｅｔｔｅら）、同様の濃度で使用した。センダイウイルスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ｃＧＡＭＰを、以前に記載されたとおりに合成した（Ｋｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら）。
【０１８１】
Ｄ．  クローニング、突然変異誘発、およびプラスミド
５'  ｈＳＴＩＮＧ  ＨｉｎｄＩＩＩ
2019068829.tif 000039
および３'  ｈＳＴＩＮＧ  ＮｏｔＩ
2019068829.tif 000040
を使用して、ＴＨＰ−１  ＳＴＩＮＧ対立遺伝子をｃＤＮＡから増幅した。その結果生じたＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ消化を使用してｐＣＤＮＡ３にクローニングした。ＴＨＰ−１  ＳＴＩＮＧを増幅し、上記で挙げた３'プライマーおよび５'  ｈＳＴＩＮＧ  ＸｈｏＩ
2019068829.tif 000041
およびＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ消化を使用してＭＳＣＶ２．２にクローニングした。ＩＦＮ−ルシフェラーゼ、ＴＫ−Ｒｅｎｉｌｌａ、およびマウスＳＴＩＮＧプラスミドを、以前に記載されたとおりに使用した（Ｂｕｒｄｅｔｔｅら）。ヒトＳＴＩＮＧにおける変異を、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して導入した。マウスおよびヒトｃＧＡＳに対応するｃＤＮＡクローン（ＭＧＣ  Ｆｕｌｌｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ  Ｈｕｍａｎ  ＭＢ２１Ｄ１  ｃＤＮＡ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＢＣ１０８７１４．１、Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ：６０１５９２９；ＥＳＴ  Ｆｕｌｌｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅ３３００１６Ａ１９Ｒｉｋ  ｃＤＮＡ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＢＣ１４５６５３．１、Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ：４０１３０９５６）を、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手したが、これは、以前に記載されたものに対応する（Ｓｕｎら、Ｗｕら）。マウスｃＧＡＳを、フォワードオリゴ５'−ｍｃＧＡＳ−ＫｐｎＩ
2019068829.tif 000042
およびリバースオリゴ３'−ｍｃＧＡＳ−ＮｏｔＩ
2019068829.tif 000043
を用いて、Ｎ末端フラッグタグと共に、ｃＤＮＡクローンから増幅した。同様に、ｈｃＧＡＳを、フォワードオリゴ５'−ｈｃＧＡＳ−ｆｌａｇ−ＫｐｎＩ
2019068829.tif 000044
およびリバース  ３'−  ｈｃＧＡＳ−ＮｏｔＩ
2019068829.tif 000045
を用いて増幅した。両方のＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位で、ｐｃＤＮＡ３にクローニングした。ＤｎｃＶを、ＤｎｃＶ  ｆｗｄ  ＢａｍＨＩ
2019068829.tif 000046
およびＤｎｃＶ  ｒｅｖ  ＮｏｔＩ
2019068829.tif 000047
を用いて増幅し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを使用してｐＣＤＮＡ３にクローニングした。ＭＳＣＶ２．２へのクローニングのために、ＤｎｃＶを、ＤｎｃＶ  ｆｗｄ  ＸｈｏＩ
2019068829.tif 000048
およびＤｎｃＶ  ｒｅｖ  ＮｏｔＩを使用して増幅した。その結果生じたＤＮＡを、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで消化されたＭＳＣＶ  ２．２にクローニングした。細菌ｍｃＧＡＳ過剰発現のためのコンストラクトを、次のとおりに構築した。Ｎ末端Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯタグを、ｐＣＤＦ−Ｄｕｅｔ２テンプレート（Ｍ．  Ｒａｐｅ  ｌａｂ、ＵＣ−Ｂｅｒｋｅｌｅｙからの寄贈）からのＨｉｓ６  ＳＵＭＯ  Ｎｃｏ
2019068829.tif 000049
およびＨｉｓ６  ＳＵＭＯ  Ｓａｌ
2019068829.tif 000050
を使用してＰＣＲによって増幅し、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを使用してｐＥＴ２８ａにクローニングして、ｐＥＴ２８ａ−Ｈ６ＳＵＭＯを作製した。全長ｍｃＧＡＳを、ｍｃＧＡＳ  ｆｗｄ  Ｓａｌ
2019068829.tif 000051
およびｍｃＧＡＳ  ｒｅｖ  Ｘｈｏ
2019068829.tif 000052
を使用して、上記のマウスｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅し、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩを使用してｐＥＴ２８ａ−Ｈ６ＳＵＭＯにクローニングして、Ｎ末端Ｈｉｓ６  ＳＵＭＯタグに融合している全長ｍｃＧＡＳを発現するｐＥＴ２８ａ−Ｈ６ＳＵＭＯ−ｍｃＧＡＳを作製した。
【０１８２】
Ｅ．  タンパク質精製
ＷｓｐＲコンストラクト（ｐＱＥ−ＷｓｐＲ＊）は、Ｓｔｅｖｅ  Ｌｏｒｙ（Ｈａｒｖａｒｄ）からの寛大な寄贈であった。ＷｓｐＲ精製およびｃ−ジ−ＧＭＰ合成反応を、以前に記載されたとおりに実施した（Ｍｅｒｉｇｈｉら、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００７）６５：８７６）。ＤｎｃＶおよび変異ＤｎｃＶのための過剰発現株およびプラスミドは、Ｊ．  Ｍｅｋａｌａｎｏｓから得た。ＤｎｃＶタンパク質を過剰発現させ、以前に記載されたとおりに精製した（Ｄａｖｉｅｓら）。簡単には、ＤｎｃＶタンパク質産生を、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて、３７℃で３時間にわたって、対数増殖中期で誘導した。細胞を溶解し、ＤｎｃＶタンパク質を、変性条件下で精製した。透明溶解液をＮｉ−ＮＴＡと共にインキュベートし、尿素溶離緩衝液（２Ｍ尿素、１０ｍＭトリス  ｐＨ＝８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）中で溶離した。溶離したタンパク質を、２５ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ＝７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＤＴＴに対して透析した。Ｈ６ＳＵＭＯ−ｍｃＧＡＳを、１８℃で０．５ｍＭ  ＩＰＴＧと共に終夜誘導することによって、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞中で発現させた。細胞を、フレンチプレスによって５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ＝８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、５ｍＭ  ＢＭＥ、および０．２ｍＭ  ＰＭＳＦに溶解させた。透明溶解液を、Ｎｉ−ＮＴＡと共にインキュベートし、結合したタンパク質を、２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ＝７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾールで溶離した。溶離液を、１０％グリセロールを含有する２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ＝７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノールに対して透析した。タンパク質を急速冷凍させ、−８０℃で貯蔵した。
【０１８３】
Ｆ．  ｃＧＡＳ産物の精製および構造特性決定
ｃＧＡＳ産物を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ１８−Ａカラム（５μｍ、２５０ｍｍ×１０ｍｍ、１８０Å）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣでの逆相ＨＰＬＣを使用して精製した。精製条件には、５０℃および５ｍＬ／分の流速で２０分かけての溶媒Ａの１００％〜０％の勾配が含まれ、この際、溶媒Ａは、水中の１００ｍＭ酢酸アンモニウムであり、溶媒Ｂはアセトニトリルである。過剰のアンモニアを除去するために、精製した溶離画分を複数回蒸発させた。共鳴帰属を、ＣＯＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ、ＮＯＥＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣ、および１Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣを使用して行った。ｃＧＡＳ産物の特性決定：
2019068829.tif 000053
３１Ｐ｛デカップリングさせた１Ｈ｝  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、５０℃、δ）：（すべての共鳴が一重線である）−０．９６、−１．８６；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｈ］−Ｃ２０Ｈ２４Ｎ１０Ｏ１３Ｐ２について計算された単一同位体質量、６７３．０９２７；実測値、６７３．０９０９。［Ｍ＋Ｎａ  ２Ｈ］−Ｃ２０Ｈ２４Ｎ１０Ｏ１３Ｐ２について計算された単一同位体質量、６９５．０７５２；実測値、６９５．０７２８。
【０１８４】
Ｇ．  ルシフェラーゼアッセイ法
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、０．５％〜％１０６％細胞％ｍｌ−１で、ＴＣ処理済み９６ウェルプレート内で平板培養した。翌日、細胞に、ＩＦＮ−β−ホタルルシフェラーゼおよびＴＫウミシイタケルシフェラーゼレポーターコンストラクトと一緒に、示されているコンストラクトを形質移入した。示されているリガンドで、６％時間にわたって刺激した後に、細胞を、２５℃で５％分間にわたって、受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）に溶解させた。細胞溶解産物をホタルルシフェラーゼ基質（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）およびウミシイタケルシフェラーゼ基質セレンテラジン（Ｂｉｏｔｉｕｍ）と共にインキュベートし、およびルミネセンスをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。Ｉｆｎｂ相対的発現を、ウミシイタケルミネセンスに対するホタルルミネセンスとして計算した。
【０１８５】
Ｈ．  インビトロ環状ジヌクレオチド合成
インビトロＤｎｃＶ反応を、２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ＝８、２０Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１０％グリセロール、および１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中で実施した。反応物は、図に示されているとおり、２５０μＭ  ＧＴＰ、２５０μＭ  ＡＴＰまたは１２５μＭ  ＧＴＰ、および１２５μＭ  ＡＴＰを含有した。加えて、示されている場合には、３３ｎＭ  α３２Ｐ−ＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）または３３ｎＭ  α３２Ｐ−ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）が、反応物に含まれた。反応を、１μＭ精製ＤｎｃＶタンパク質を加えることによって開始した。インビトロｃＧＡＳ反応を、４０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ＝７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で実施した。冷ヌクレオチドおよびアルファ標識ＧＴＰは、ＤｎｃＶ反応においてと同じ濃度である。反応を、２００ｎＭ精製ｃＧＡＳを添加することによって開始した。示されている場合、ニシン精巣ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を、０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で反応物に添加した。ＷｓｐＲ反応を、以前に記載されたとおりに行った（１４）。反応物を、３７℃で１時間にわたってインキュベートし、９５℃で５分間にわたって沸騰させ、１３，０００ｒｐｍで１０分間にわたって回転させた。反応物を除去し、ＴＬＣランニング緩衝液（１：１．５（ｖ／ｖ）の飽和ＮＨ４ＳＯ４および１．５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ３．６）と１：５で混合し、ＰＥＩセルロースＴＬＣプレート（Ｓｉｇｍａ）にスポットした。溶媒の移動の後に、ＴＬＣプレートをホスホイメージャースクリーンに露出し、Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナを使用して画像化した。２９３Ｔ細胞へのインビトロ産物移入では、反応を拡大し、放射標識されたヌクレオチドを省き、ＡＴＰおよびＧＴＰの濃度を２ｍＭに増加させた。
【０１８６】
Ｉ．  ヌクレアーゼ消化
ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）由来のヌクレアーゼＰ１およびクロタラス・アダマンテウス（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）由来のヘビ毒ホスホジエステラーゼＩを、Ｓｉｇｍａから購入した。α３２Ｐ−ＧＴＰで標識されたインビトロ環状ジヌクレオチド合成からの反応物を、Ｐ１緩衝液（４０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ＝６、２ｍＭ  ＺｎＣｌ２）またはＳＶＰＤ緩衝液（４０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ＝８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）のいずれかで１：５で希釈し、続いて、それぞれ２．５ｍＵヌクレアーゼＰ１またはＳＶＰＤで消化させた。消化を３７℃で４５分間にわたってインキュベートし、ヌクレオチド産物を、ＴＬＣによって分離した。
【０１８７】
Ｊ．  ＮＭＲデータ
図６Ｃに示されている１Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣスペクトルにおいて、リン核Ｐ−１１は、グアノシンの２'リボースプロトン（Ｈ−１２）に、さらに、アデノシンの５'リボースメチレンプロトン（Ｈ−１０）および４'リボースプロトン（Ｈ−９）に相関する。他のリン核（Ｐ−２２）は、アデノシンの３'リボースプロトン（Ｈ−８）に、さらに、グアノシンの５'リボースメチレンプロトン（Ｈ−２１）および４'リボースプロトン（Ｈ−２０）に相関する。したがって、ホスホジエステル連結の位置化学は、環状［Ｇ（２'−５'）ｐＡ（３'−５'）ｐ］であると決定された。上記のピークを帰属するためには、それぞれグアノシンおよびアデノシンに対応するリボーススピン系を正確に同定することが重要であった。アデニンヌクレオ塩基（Ｈ−２、Ｈ−５）およびグアニンヌクレオ塩基（Ｈ−１７）に対応するプロトンを、個別のヌクレオ塩基のための参照スペクトル、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣおよび１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲ（図７Ａおよび７Ｂ）に基づき、帰属した。１Ｈ−１Ｈ  ＮＯＥＳＹ実験によって、アデニンプロトンＨ−５と３'リボースプロトン（Ｈ−８）との間の、さらに、グアニンプロトンＨ−１７と１'リボースプロトン（Ｈ−１８）との間のスルースペース相互作用が示された（図７Ｄ）。対応するリボーススピン系における残りのプロトンを、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ（図７Ｃ）、および特に５'メチレンプロトン（Ｈ−１０およびＨ−２１）を識別する多重度編集１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ（図７Ａおよび７Ｂ）によって同定した。
【０１８８】
Ｋ．  ＲＮＡ、ｃＤＮＡ合成、および定量ＲＴ−ＰＣＲ
哺乳動物細胞系からのＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ＲＮＡを、ＲＱ１  ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理した。ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で逆転写した。以前に記載されたとおりに、マウスｉｆｎＢを、マウスｒｐｓ１７に対して定量化した（Ｗｏｏｄｗａｒｄら）。以前に記載されたとおりに、ヒトｉｆｎＢを、ヒトＳ９に対して定量化した（Ｗｕら）。
【０１８９】
添付の項目もあるが、本開示は、次の項目によっても定義される。
１．  細胞におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるための方法であって、
該細胞によるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるために十分であるように、該細胞における２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドのレベルを増大させるステップ
を含む、方法。
２．  前記細胞を前記環状ジヌクレオチドと接触させるステップを含む、項目１に記載の方法。
３．  前記環状ジヌクレオチドが、２個の２'−５'ホスホジエステル連結を含む、項目２に記載の方法。
４．  前記環状ジヌクレオチドが、１個の２'５'ホスホジエステル連結および１個の３'−５'ホスホジエステル連結を含む、項目３に記載の方法。
５．  前記環状ジヌクレオチドが、１個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目１に記載の方法。
６．  前記環状ジヌクレオチドが、２個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目５に記載の方法。
７．  前記環状ジヌクレオチドが、１個のアデノシンヌクレオシドを含む、項目１に記載の方法。
８．  前記環状ジヌクレオチドが、２個のアデノシンヌクレオシドを含む、項目７に記載の方法。
９．  前記環状ジヌクレオチドが、１個のアデノシンヌクレオシドおよび１個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目１に記載の方法。
１０．  前記環状ジヌクレオチドが、式
2019068829.tif 000054
によって表される、項目１に記載の方法：
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000055
である。
１１．  前記環状ジヌクレオチドが、式
2019068829.tif 000056
によって表される、項目１０に記載の方法。
１２．  前記環状ジヌクレオチドが、式
2019068829.tif 000057
によって表される、項目１に記載の方法：
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000058
である。
１３．  前記細胞におけるｃＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の活性を増大させることによって前記環状ジヌクレオチドのレベルを増大させる、項目１に記載の方法。
１４．  ｃＧＡＳをコードする核酸の発現を増強することによって前記ｃＧＡＳの活性を増大させる、項目１３に記載の方法。
１５．  前記ｃＧＡＳをコードする核酸を前記細胞に導入することによって該ｃＧＡＳの活性を増大させる、項目１３に記載の方法。
１６．  前記ＩＦＮがインターフェロンアルファである、項目１に記載の方法。
１７．  前記ＩＦＮがインターフェロンベータである、項目１に記載の方法。
１８．  前記細胞が哺乳動物細胞である、項目１に記載の方法。
１９．  前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目１８に記載の方法。
２０．  前記細胞がインビトロである、項目１に記載の方法。
２１．  前記細胞がインビボである、項目１に記載の方法。
２２．  対象におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるための方法であって、
該対象における該Ｉ型インターフェロンの産生を増大させるために有効な量の、２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチド活性作用物質を該対象に投与するステップ
を含む、方法。
２３．  前記２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチド活性作用物質が、２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドを含む、項目２２に記載の方法。
２４．  前記環状ジヌクレオチドが、２個の２'−５'ホスホジエステル連結を含む、項目２３に記載の方法。
２５．  前記環状ジヌクレオチドが、１個の２'−５'ホスホジエステル連結および１個の３'−５'ホスホジエステル連結を含む、項目２３に記載の方法。
２６．  前記環状ジヌクレオチドが、１個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目２３に記載の方法。
２７．  前記環状ジヌクレオチドが、２個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目２６に記載の方法。
２８．  前記環状ジヌクレオチドが、１個のアデノシンヌクレオシドを含む、項目２３に記載の方法。
２９．  前記環状ジヌクレオチドが、２個のアデノシンヌクレオシドを含む、項目２８に記載の方法。
３０．  前記環状ジヌクレオチドが、１個のアデノシンヌクレオシドおよび１個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目２３に記載の方法。
３１．  前記環状ジヌクレオチドが、式
2019068829.tif 000059
によって表される、項目２３に記載の方法：
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000060
である。
３２．  前記環状ジヌクレオチドが、式
2019068829.tif 000061
によって表される、項目３１に記載の方法。
３３．  前記環状ジヌクレオチドが、式
2019068829.tif 000062
によって表される、項目２３に記載の方法：
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000063
である。
３４．  前記２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチド活性作用物質が、ｃＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の細胞活性を増大させる作用物質を含む、項目２２に記載の方法。
３５．  前記作用物質が、前記ｃＧＡＳをコードする核酸を含む、項目３４に記載の方法。
３６．  前記ＩＦＮがインターフェロンアルファである、項目２２に記載の方法。
３７．  前記ＩＦＮがインターフェロンベータである、項目２２に記載の方法。
３８．  前記対象がウイルス感染症を有している、項目２２に記載の方法。
３９．  前記対象が細菌感染症を有している、項目２２に記載の方法。
４０．  前記対象が新生物疾患を有している、項目２２に記載の方法。
４１．  前記対象が哺乳動物である、項目２２に記載の方法。
４２．  前記哺乳動物がヒトである、項目４１に記載の方法。
４３．  １個の２'−５'ホスホジエステル連結を含む、環状ジヌクレオチド。
４４．  ２個の２'−５'ホスホジエステル連結を含む、項目４３に記載の環状ジヌクレオチド。
４５．  １個の２'−５'ホスホジエステル連結および１個の３'−５'ホスホジエステル連結を含む、項目４３に記載の環状ジヌクレオチド。
４６．  １個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目４３に記載の環状ジヌクレオチド。
４７．  ２個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目４６に記載の環状ジヌクレオチド。
４８．  １個のアデノシンヌクレオシドを含む、項目４３に記載の環状ジヌクレオチド。
４９．  ２個のアデノシンヌクレオシドを含む、項目４８に記載の環状ジヌクレオチド。
５０．  １個のアデノシンヌクレオシドおよび１個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目４３に記載の環状ジヌクレオチド。
５１．  式
2019068829.tif 000064
によって表される、項目４３に記載の環状ジヌクレオチド：
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000065
である。
５２．  式
2019068829.tif 000066
によって表される、項目５１に記載の環状ジヌクレオチド。
５３．  式
2019068829.tif 000067
によって表される、項目４３に記載の環状ジヌクレオチド：
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000068
である。
５４．  ２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
５５．  前記環状ジヌクレオチドが、２個の２'−５'ホスホジエステル連結を含む、項目５４に記載の組成物。
５６．  前記環状ジヌクレオチドが、1個の２'−５'ホスホジエステル連結および１個の３'−５'ホスホジエステル連結をさらに含む、項目５４に記載の組成物。
５７．  前記環状ジヌクレオチドが、1個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目５４に記載の組成物。
５８．  前記環状ジヌクレオチドが、２個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目５７に記載の組成物。
５９．  前記環状ジヌクレオチドが、１個のアデノシンヌクレオシドを含む、項目５４に記載の組成物。
６０．  前記環状ジヌクレオチドが、２個のアデノシンヌクレオシドを含む、項目５９に記載の組成物。
６１．  前記環状ジヌクレオチドが、１個のアデノシンヌクレオシドおよび１個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目５４に記載の組成物。
６２．  前記環状ジヌクレオチドが、式
2019068829.tif 000069
によって表される、項目５４に記載の組成物：
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000070
である。
６３．  前記環状ジヌクレオチドが、式
2019068829.tif 000071
によって表される、項目６２に記載の組成物。
６４．  前記環状ジヌクレオチドが、式
2019068829.tif 000072
によって表される、項目５４に記載の組成物：
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000073
である。
６５．  対象におけるインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）媒介性応答を増大させるための方法であって、
該対象におけるＳＴＩＮＧ媒介性応答を増大させるために有効な量のＳＴＩＮＧ活性作用物質を該対象に投与するステップ
を含む、方法。
６６．  前記ＳＴＩＮＧ活性作用物質が、２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドを含む、項目６５に記載の方法。
６７．  前記環状ジヌクレオチドが、２個の２'−５'ホスホジエステル連結を含む、項目６６に記載の方法。
６８．  前記環状ジヌクレオチドが、１個の２'−５'ホスホジエステル連結および１個の３'−５'ホスホジエステル連結を含む、項目６７に記載の方法。
６９．  前記環状ジヌクレオチドが、１個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目６６に記載の方法。
７０．  前記環状ジヌクレオチドが、２個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目６９に記載の方法。
７１．  前記環状ジヌクレオチドが、１個のアデノシンヌクレオシドを含む、項目６６に記載の方法。
７２．  前記環状ジヌクレオチドが、２個のアデノシンヌクレオシドを含む、項目７１に記載の方法。
７３．  前記環状ジヌクレオチドが、１個のアデノシンヌクレオシドおよび１個のグアノシンヌクレオシドを含む、項目６６に記載の方法。
７４．  前記環状ジヌクレオチドが、式
2019068829.tif 000074
によって表される、項目６６に記載の方法：
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000075
である。
７５．  前記環状ジヌクレオチドが、式
2019068829.tif 000076
によって表される、項目７４に記載の方法。
７６．  前記環状ジヌクレオチドが、式
2019068829.tif 000077
によって表される、項目６６に記載の方法：
式中、ＸおよびＹは、それぞれ
2019068829.tif 000078
である。
７７．  前記ＳＴＩＮＧ活性作用物質が、ｃＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の細胞活性を増大させる作用物質を含む、項目６５に記載の方法。
７８．  前記作用物質が、前記ｃＧＡＳをコードする核酸を含む、項目７７に記載の方法。
７９．  前記ＳＴＩＮＧ活性作用物質が、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）の細胞活性を増大させる作用物質を含む、項目６５に記載の方法。
８０．  前記作用物質が、前記ＳＴＩＮＧをコードする核酸を含む、項目７７に記載の方法。
８１．  前記ＳＴＩＮＧ媒介性応答が、２個の３'−５'ホスホジエステル結合を有する環状ジヌクレオチドに対して非応答性である、項目６５に記載の方法。
８２．  前記対象がウイルス感染症を有している、項目６５に記載の方法。
８３．  前記対象が細菌感染症を有している、項目６５に記載の方法。
８４．  前記対象が新生物疾患を有している、項目６５に記載の方法。
８５．  前記対象が哺乳動物である、項目６５に記載の方法。
８６．  前記哺乳動物がヒトである、項目８５に記載の方法。
【０１９０】
前述は、本発明の原理を単に例示したものである。当業者であれば、本明細書においては明確に記載されていないか、または示されていないが、本発明の原理を具体化し、本発明の意図および範囲内に含まれる様々なアレンジを考案することができることは分かるであろう。さらに、本明細書において列挙されているすべての例および条件についての記載は、主に、本発明者らが当技術分野に提供する本発明の原理および概念を理解する際に、読者の助けとなることが意図されており、そのような具体的に列挙された例および条件への限定は伴わないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態、さらにその具体的な例を列挙する本明細書におけるすべての言述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することが意図されている。加えて、そのような等価物には、現在公知の等価物および将来開発される等価物、すなわち、構造に関わらず、同じ機能を果たす、将来開発される任意の要素の両方が含まれることが意図されている。したがって、本発明の範囲を、本明細書において示され、かつ記載されている例示的な実施形態に限定することは意図されていない。むしろ、本発明の範囲および意図は、添付の請求の範囲によって体現されている。
【０１９１】
本明細書において引用したすべての公報および特許出願は、それぞれの個別の公報または特許出願が、具体的に、かつ個別に、参照により組み込まれると示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。いずれの公報の引用も、出願日前のその開示に関するものであり、本発明が、先行発明によって、そのような広報に先行する権利がないことを認めるものであると解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
2019068829.tif 000079
【図１Ｂ】
2019068829.tif 000080
【図１Ｃ】
2019068829.tif 000081
【図１Ｄ】
2019068829.tif 000082
【図１Ｅ】
2019068829.tif 000083
【図１Ｆ】
2019068829.tif 000084
【図２】
2019068829.tif 000085
【図３】
2019068829.tif 000086
【図４】
2019068829.tif 000087
【図５Ａ】
2019068829.tif 000088
【図５Ｂ】
2019068829.tif 000089
【図５Ｃ】
2019068829.tif 000090
【図６Ａ】
2019068829.tif 000091
【図６Ｂ】
2019068829.tif 000092
【図６Ｃ】
2019068829.tif 000093
【図７Ａ】
2019068829.tif 000094
【図７Ｂ】
2019068829.tif 000095
【図７Ｃ】
2019068829.tif 000096
【図７Ｄ】
2019068829.tif 000097
【配列表】
2019068829000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月21日(2019.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるための方法であって、
該細胞による該Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるために十分であるように、該細胞における２'−５'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドのレベルを増大させるステップ
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
[本発明1001]
細胞におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるための方法であって、
該細胞による該Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増大させるために十分であるように、該細胞における2'−5'ホスホジエステル連結を含む環状ジヌクレオチドのレベルを増大させるステップ
を含む、方法。
[本発明1002]
前記細胞を前記環状ジヌクレオチドと接触させるステップを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記環状ジヌクレオチドが、2個の2'−5'ホスホジエステル連結を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記環状ジヌクレオチドが、1個の2'5'ホスホジエステル連結および1個の3'−5'ホスホジエステル連結を含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記環状ジヌクレオチドが、1個のグアノシンヌクレオシドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記環状ジヌクレオチドが、1個のアデノシンヌクレオシドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記環状ジヌクレオチドが、1個のアデノシンヌクレオシドおよび1個のグアノシンヌクレオシドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記細胞におけるｃＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の活性を増大させることによって前記環状ジヌクレオチドのレベルを増大させる、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記ＩＦＮがインターフェロンアルファまたはインターフェロンベータである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記細胞が哺乳動物細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
1個の2'−5'ホスホジエステル連結を含む、環状ジヌクレオチド。
[本発明1013]
2個の2'−5'ホスホジエステル連結を含む、本発明1012の環状ジヌクレオチド。
[本発明1014]
1個の2'−5'ホスホジエステル連結および1個の3'−5'ホスホジエステル連結を含む、本発明1013の環状ジヌクレオチド。
[本発明1015]
グアノシンヌクレオシドおよびアデノシンヌクレオシドの少なくとも1個を含む、前記本発明のいずれかの環状ジヌクレオチド。
上記組成物のある種の実施形態では、上記環状ジヌクレオチドは、以下の式：
2019068829.tif 000098
を有する。