(57)【要約】【課題】キシロースやアラビノース等の五炭糖の資化能を有する組換え酵母おけるエタノール発酵能を向上させる。【解決手段】五炭糖の資化能を有する組換え酵母において、エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を低下させる。【選択図】図１
2019068788.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
五炭糖の資化能を有する組換え酵母において、エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を低下させたことを特徴とする組換え酵母。
【請求項２】
エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる上記遺伝子は、ヘキソキナーゼ遺伝子、グルコースリン酸イソメラーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子及びフルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項３】
上記遺伝子の活性を維持する酵母と比較してグリセリン生産量が低減していることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項４】
上記五炭糖はキシロース及び/又はアラビノースであることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項５】
キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されキシロース資化能を有することを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項６】
更にキシルロキナーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項５記載の組換え酵母。
【請求項７】
ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群から選ばれる酵素をコードする遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項８】
上記ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群は、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼであることを特徴とする請求項７記載の組換え酵母。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか一項記載の組換え酵母を、資化可能な五炭糖を含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
【請求項１０】
上記培地はセルロースを含有しており、上記エタノール発酵では、少なくとも上記セルロースの糖化が同時に進行することを特徴とする請求項９記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシロース代謝能を有する組換え酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系バイオマスは、エタノール等の有用なアルコールや有機酸の原料として有効に利用されている。セルロース系バイオマスを利用したエタノール製造において、エタノール生産量を向上させるため、基質として５単糖のキシロースを利用できる酵母が開発されている。例えば、特許文献１は、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ（XR）遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ（XDH）遺伝子を染色体に組み込んだ酵母を開示している。一方、キシロースイソメラーゼ（XI）遺伝子(シロアリの腸内原生生物由来)を導入したキシロース資化酵母に関する報告（特許文献２）がある。XRとXDHとを導入した場合又はXIを導入した場合のいずれも、キシロース資化経路においてキシルロースが生成し、キシルロキナーゼによりキシルロースがキシルロース5リン酸となる。そして、キシルロース5リン酸は、ペントースリン酸経路において代謝され、グリセルアルデヒド3リン酸となる。グリセルアルデヒド3リン酸は、解糖系に合流することにより最終的にエタノールになる。
【０００３】
解糖系はグルコースを代謝する経路であり、酵母における主要な経路はエムデン-マイヤーホフ経路である。エムデン-マイヤーホフ経路（エムデン-マイヤーホフ-パルナス経路と称する場合もある）には、中間代謝産物としてグリセロアルデヒド3リン酸が含まれる。キシロース資化経路及びペントースリン酸経路において、キシロースから代謝されたグリセロアルデヒド3リン酸は解糖系に合流して最終的にエタノールになる。
【０００４】
キシロースの資化経路が導入されていない酵母においては、エムデン-マイヤーホフ経路の遺伝子を破壊することは、グルコースの代謝を直接的に阻害することに繋がるため、グルコースを主要の糖源とする培地においては、増殖やエタノール発酵が阻害される（ホスホフルクトキナーゼ遺伝子（PFK1遺伝子）破壊について非特許文献１のFig.1）。また、キシロースの資化経路が導入されている酵母においても、エムデン-マイヤーホフ経路の遺伝子であるグルコースリン酸イソメラーゼ遺伝子（PGI1遺伝子）を破壊した株では、キシロースを炭素源とする培地で増殖しないことが報告されている(非特許文献２及び３)。
【０００５】
ところで、グリセリンは酵母におけるエタノール生産における代表的な副生物でありエタノールの収率を上げるにはグリセリンを低減することが重要である。これまで、グリセルアルデヒド3リン酸からグリセリンを生産する経路に関与する遺伝子であるGPD1、GPD2、GPP1及びGPP2の破壊、発現量の低減や活性を弱めることでエタノールの生産性の向上させる取り組みが報告されている。しかしながら、これらの経路を直接的弱めることは、エタノール生産速度が低下するなど副作用があることもまた報告されている（非特許文献４及び５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2009-195220号公報
【特許文献２】特開2011-147445号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Applied Microbiology and Biotechnology 2013, 97, 3569-3577
【非特許文献２】Yeast. 2011, 28, 645-660
【非特許文献３】FEMS yeast research 8, 2008, 217-224
【非特許文献４】Appl Environ Microbiol. 2011, 77, 5857-5867
【非特許文献５】Appl Environ Microbiol. 2013, 79, 3273-3281
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、特に、キシロースやアラビノース等の五炭糖の資化能を有する組換え酵母おけるエタノール発酵能を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、キシロースやアラビノース等の五炭糖の資化能を有する組換え酵母において、エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を低下させることで当該組換え酵母におけるエタノール発酵能が大幅に向上できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は以下を包含する。
（１）五炭糖の資化能を有する組換え酵母において、エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を低下させたことを特徴とする組換え酵母。
（２）エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる上記遺伝子は、ヘキソキナーゼ遺伝子、グルコースリン酸イソメラーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子及びフルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（３）上記遺伝子の活性を維持する酵母と比較してグリセリン生産量が低減していることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（４）上記五炭糖はキシロース及び/又はアラビノースであることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（５）キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されキシロース資化能を有することを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（６）更にキシルロキナーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする（５）記載の組換え酵母。
（７）ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群から選ばれる酵素をコードする遺伝子が導入されたものであることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（８）上記ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群は、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼであることを特徴とする（７）記載の組換え酵母。
（９）上記（１）〜（８）いずれかに記載の組換え酵母を、資化可能な五炭糖を含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
（１０）上記培地はセルロースを含有しており、上記エタノール発酵では、少なくとも上記セルロースの糖化が同時に進行することを特徴とする（９）記載のエタノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る組換え酵母は、五炭糖の資化能を有する組換え酵母であって、エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を維持した酵母と比較すると、エタノール発酵能が大幅に向上している。したがって、本発明に係る組換え酵母及びこれを利用したエタノールの製造方法では、優れたエタノール収率を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】グルコース及びキシロースからのエタノール発酵工程を概略的に示す代謝マップである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
＜組換え酵母＞
本発明に係る組換え酵母は、五炭糖の資化能を有し、且つ、エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を低下させたものである。ここで、五炭糖の資化能を有するとは、本来的には五炭糖資化能（代謝能と同義）を有しない酵母に対して五炭糖資化関連酵素遺伝子を導入することで五炭糖資化能を獲得すること、或いは、本来的に五炭糖資化関連酵素遺伝子を備えており五炭糖資化能を有していることの両方を意味する。より具体的に、五炭糖としては、特に限定されないが、リボース、アラビノース、キシロース及びリキソース等のアルドペントース並びにリブロース及びキシルロース等のケトペントースを意味する。本発明に係る組換え酵母は、五炭糖の中でもキシロース及び/又はアラビノースの資化能を有することが好ましく、特にキシロースの資化能を有することが好ましい。
【００１４】
例えば、キシロース資化能を有する酵母としては、本来的にはキシロース資化能を有しない酵母に対して、キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されることによりキシロース資化能が付与された酵母、その他のキシロース資化関連遺伝子が導入されることによりキシロース資化能が付与された酵母を挙げることができる。また、アラビノース資化能を有する酵母としては、本来的にはアラビノース資化能を有しない酵母に対して、例えば、原核生物由来のL-アラビノースイソメラーゼ遺伝子、L-リブロキナーゼ遺伝子、L-リブロース-5-ホスフェート4-エピメラーゼ遺伝子や、真核生物由来のL-アラビトール-4-デヒドロゲナーゼ遺伝子、L-キシロースレダクターゼ遺伝子が導入されることにより、アラビノース資化能が付与された酵母を挙げることができる。
【００１５】
本発明に組換え酵母は、エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を低下させたものである。
【００１６】
エムデン-マイヤーホフ経路は、グルコースをグルコース-6-リン酸、フルクトース-1,6,-二リン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、ホスホエノールピルビン酸などを経由してピルビン酸にまで分解するまでの経路を意味している（岩波生物学辞典 第4版）。エムデン-マイヤーホフ経路において、グリセルアルデヒド3リン酸より上流には、グルコースをグルコース-6-リン酸とする反応、グルコース-6-リン酸をフルクトース-6-リン酸とする反応、フルクトース-6-リン酸をフルクトース-1,6,-二リン酸とする反応、フルクトース-1,6,-二リン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸又はジヒドロキシアセトンリン酸とする反応からなる4つの反応が含まれる。
【００１７】
エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を低下させるとは、言い換えると、これら４つの反応のそれぞれについて、関連する酵素をコードする遺伝子の発現量を低下させること、これら酵素の活性を阻害する物質を存在させること、これら酵素をコードする遺伝子を酵素活性の低い変異型酵素をコードする変異型遺伝子と置換すること等を含む意味である。ただし、エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を低下させるとは、これら反応に関与する酵素をコードする遺伝子を欠損する等によって、これら反応自体が破壊される形態は含まない。すなわち、エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を低下させるとは、グルコースからグリセルアルデヒド3リン酸までの代謝反応は進行するが、グルコースの資化速度が低下することを意味する。グルコースの資化速度は、培地中に含まれるグルコースの濃度に基づいて判断することができる。
【００１８】
上記４つの反応に関連する酵素をコードする遺伝子の発現量を低下させるには、当該遺伝子におけるプロモーター領域をプロモーター活性の低いプロモーターに置換する、当該遺伝子におけるターミーネータ領域を遺伝子の発現量を低減する効果を有するターミーネータ領域に置換するといった技術を採用することができる。遺伝子の発現量を低減する効果を有するターミーネータ領域を使用する技術については米国特許US 9,512,436 B2を参照することができる。
【００１９】
これら４つの反応を含むグルコースからのエタノール発酵工程及びキシロースからのエタノール発酵工程を図１に概略的に示す。グルコースをグルコース-6-リン酸とする反応には、ヘキソキナーゼが関与する。グルコース-6-リン酸をフルクトース-6-リン酸とする反応にはグルコースリン酸イソメラーゼが関与する。フルクトース-6-リン酸をフルクトース-1,6,-二リン酸とする反応にはホスホフルクトキナーゼが関与する。フルクトース-1,6,-二リン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸又はジヒドロキシアセトンリン酸とする反応にはフルクトース二リン酸アルドラーゼが関与する。
【００２０】
したがって、本発明に係る組換え酵母では、ヘキソキナーゼ遺伝子、グルコースリン酸イソメラーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子及びフルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の活性を低下させることが好ましい。特に、本発明に係る組換え酵母では、グルコースリン酸イソメラーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子及びフルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の活性を低下させることが好ましい。
【００２１】
本発明に係る組換え酵母において、活性を低下させる遺伝子は、遺伝子の塩基配列や遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列、さらに当該タンパク質の機能に関するアノテーション情報等が格納されたデータベースを利用して特定することができる。このようなデータベースとしては、特に限定されないが、DDBJ（日本DNAデータバンク）、GenBank、EMBL、Unigene、TIGR Database、SGD（The Saccharomyces Genome Database）、DBGET (GenomeNet)、Entrez、SRS(EMBL)及びKEGG等を挙げることができる。
【００２２】
例えば、GenBankやSGD等のサッカロマイセス・セレビジエに関する遺伝子情報を格納したデータベースを使用することによって、活性を低下させる遺伝子を特定することができる。例えば、ヘキソキナーゼをコードする遺伝子としては、サッカロマイセス・セレビジエにおけるHXK1遺伝子及びHXK2遺伝子を挙げることができる。また、グルコースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子としては、サッカロマイセス・セレビジエにおけるPGI1遺伝子を挙げることができる。さらに、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子としては、サッカロマイセス・セレビジエにおけるPFK1遺伝子及びPFK2遺伝子を挙げることができる。なお、これらPFK1遺伝子とPFK2遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼのそれぞれ異なるサブユニットをコードしており、ヘテロ8量体を形成するため、どちらか一方が欠損した場合にはホスホフルクトキナーゼ活性が欠損することになる。さらにまた、フルクトース二リン酸アルドラーゼをコードする遺伝子としては、サッカロマイセス・セレビジエにおけるFBA1遺伝子を挙げることができる。
【００２３】
また、活性を低下させる遺伝子としては、これらHXK1遺伝子、HXK2遺伝子、GLK1遺伝子、PGI1遺伝子、PFK1遺伝子、PFK2遺伝子及びFBA1遺伝子とは塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００２４】
ところで、本発明に係る組換え酵母は、五炭糖のうち例えばキシロースに対する資化能（キシロース資化能）、すなわち培地中に含まれるキシロースを資化してエタノールを生産することができる。なお、培地中に含まれるキシロースとは、キシロースを構成糖とするキシランやヘミセルロース等を糖化するプロセスによって得られたものでも良いし、培地に含まれるキシランやヘミセルロース等が糖化酵素により糖化されることで培地に供給されるものであってもよい。後者の場合は、所謂、同時糖化発酵の系を意味する。
【００２５】
キシロース代謝能を有するとは、本来的にはキシロース代謝能を有しない酵母に対してキシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されることによりキシロース資化能が付与された酵母、その他のキシロース資化関連遺伝子が導入されることによりキシロース資化能が付与された酵母を挙げることができる。
【００２６】
キシロースイソメラーゼ遺伝子（XI遺伝子）としては、特に限定されず、如何なる生物種由来の遺伝子を使用しても良い。例えば、特開2011-147445号公報に開示されたシロアリの腸内原生生物由来の複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子を、特に制限されることなく使用することができる。また、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、嫌気性のカビであるピロマイセス（Piromyces）sp. E2種由来（特表2005-514951号公報）、嫌気性のカビであるシラマイセス・アベレンシス（Cyllamyces aberensis）由来、バクテリアであるバクテロイデス・セタイオタミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）由来、バクテリアであるクロストリディウム・ファイトファーメンタス由来、ストレプトマイセス・ムリナスクラスター由来の遺伝子を利用することもできる。
【００２７】
具体的に、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。このヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子のコーディング領域の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。
【００２８】
ただし、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、配列番号１及び２にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００２９】
また、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号１及び２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００３０】
さらに、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号１及び２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。
【００３１】
さらにまた、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号１及び２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００３２】
上述したように、配列番号１と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号２とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、キシロースイソメラーゼ遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミーネータ等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のキシロースイソメラーゼ活性を測定すればよい。キシロースイソメラーゼ活性とは、キシロースをキシルロースに異性化する活性を意味する。よって、キシロースイソメラーゼ活性は、基質としてキシロースを含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、キシロースの減少量及び/又はキシルロースの生成量を測定することで評価できる。
【００３３】
特に、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基に対して特定の変異を導入したアミノ酸配列からなり、キシロースイソメラーゼ活性が向上した変異型キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子を使用することが好ましい。具体的に、変異型キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列における３３７番目のアスパラギンがシステインに置換されたアミノ酸配列をコードする遺伝子を挙げることができる。配列番号２に示すアミノ酸配列における３３７番目のアスパラギンがシステインに置換されたアミノ酸配列からなるキシロースイソメラーゼは、野生型のキシロースイソメラーゼと比較して優れたキシロースイソメラーゼ活性を有する。なお、変異型キシロースイソメラーゼは、上記３３７番目のアスパラギンをシステインに置換したものに限定されず、上記３３７番目のアスパラギンをシステイン以外のアミノ酸に置換したものでも良いし、上記３３７番目のアスパラギンに加えて更に異なるアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものでも良いし、上記３３７番目のアスパラギン以外の他のアミノ酸残基を置換したものでも良い。
【００３４】
一方、キシロースイソメラーゼ遺伝子以外のキシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
【００３５】
キシロース代謝関連遺伝子としては、特に限定されないが、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を挙げることができる（Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66:3381-3386及びToivari MN et al., Metab. Eng. 3:236-249参照）。その他にも、キシロースリダクターゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子を利用することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することができる。キシルロキナーゼ遺伝子としては、Pichia stipitis由来のキシルロキナーゼ遺伝子を利用することもできる。
【００３６】
また、キシロース代謝能を本来的に有する酵母としては、特に限定されないが、Pichia stipitis、Candida tropicalis及びCandida prapsilosis等を挙げることができる。
【００３７】
ところで、本発明に係る組換え酵母は、五炭糖のうち例えばアラビノースに対する資化能（アラビノース資化能）、すなわち培地中に含まれるアラビノースを資化してエタノールを生産することができるものであってもよい。アラビノース資化能は、原核生物由来のL-アラビノースイソメラーゼ遺伝子、L-リブロキナーゼ遺伝子、L-リブロース-5-ホスフェート4-エピメラーゼ遺伝子や、真核生物由来のL-アラビトール-4-デヒドロゲナーゼ遺伝子、L-キシロースレダクターゼ遺伝子を、アラビノース資化能を有しない酵母に導入することで当該酵母に付与することができる。
【００３８】
一方、本発明に係る組換え酵母は、更に他の遺伝子が導入された酵母であってもよい。他の遺伝子としては特に限定されないが、例えば、グルコース等の糖代謝に関与する遺伝子を導入したものであっても良い。一例として組換え酵母は、β−グルコシダーゼ遺伝子を導入することでβ−グルコシダーゼ活性を有する酵母とすることができる。
【００３９】
ここでβ−グルコシダーゼ活性とは、糖のβ-グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する活性を意味する。すなわち、β−グルコシダーゼは、セロビオース等のセロオリゴ糖をグルコースに分解することができる。β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞表層提示型遺伝子として導入することもできる。ここで、細胞表層提示型遺伝子とは、当該遺伝子がコードするタンパク質が細胞の表層にディスプレイされるように発現するように改変された遺伝子である。例えば、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子とは、βグルコシダーゼ遺伝子と細胞表層局在タンパク質遺伝子とを融合した遺伝子である。細胞表層局在タンパク質とは、酵母の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。例えば、凝集性タンパク質であるα-またはａ-アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などが挙げられる。一般に細胞表層局在タンパク質は、N末端側に分泌シグナル配列及びC末端側にGPIアンカー付着認識シグナルを有している。分泌シグナルを有する点では分泌性タンパク質と共通しているが、細胞表層局在タンパク質はGPIアンカーを介して細胞膜に固定されて輸送される点が分泌性タンパク質と異なる。細胞表層局在タンパク質は、細胞膜通過の際、GPIアンカー付着認識シグナル配列が選択的に切断され、新たに突出したC末端部分でGPIアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼC（PI-PLC）によりGPIアンカーの根元部分が切断される。ついで、細胞膜から切り離されたタンパク質は細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に局在する（例えば、特開2006-174767号公報参照）。
【００４０】
βグルコシダーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、Aspergillus aculeatus由来のβグルコシダーゼ遺伝子（Murai et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:4857-4861）を挙げることができる。その他にも、βグルコシダーゼ遺伝子としては、Aspergillus oryzae由来のβグルコシダーゼ遺伝子、Clostridium cellulovorans由来のβグルコシダーゼ遺伝子及びSaccharomycopsis fibuligera由来のβグルコシダーゼ遺伝子等を利用することができる。
【００４１】
また、本発明に係る組換え酵母は、βグルコシダーゼ遺伝子に加えて、或いはβグルコシダーゼ遺伝子以外に、セルラーゼを構成する他の酵素をコードする遺伝子を導入したものでもよい。βグルコシダーゼ以外にセルラーゼを構成する酵素としては、結晶セルロースの末端からセロビオースを遊離するエキソ型のセロビオハイドロラーゼ（CBH1及びCBH2）、結晶セルロースを分解できないが非結晶セルロース（アモルファスセルロース）鎖をランダムに切断するエンド型のエンドグルカナーゼ（EG）を挙げることができる。
【００４２】
さらに、組換え酵母に導入する他の遺伝子としては、培地中のキシロースの利用を促進できるような遺伝子を挙げることができる。具体的には、キシルロースを基質としてキシルロース-5-リン酸を生成する活性を有するキシルロキナーゼをコードする遺伝子を挙げることができる。キシルロキナーゼ遺伝子を導入することによって、ペントースリン酸経路の代謝流束を向上させることができる。
【００４３】
さらにまた、本発明に組換え酵母は、ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群から選ばれる酵素をコードする遺伝子が導入することができる。ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素としては、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼを挙げることができる。これら酵素をコードする遺伝子を１種以上導入することが好ましい。また、これら遺伝子のうち２種以上組み合わせて導入することがより好ましく、３種以上組み合わせて導入することが更に好ましく、全種類の遺伝子を導入することが最も好ましい。
【００４４】
より具体的にキシルロキナーゼ（XK）遺伝子としては、特に由来生物を限定せずに用いることができる。なおXK遺伝子は、キシルロースを資化する細菌や酵母など多くの微生物が保持している。XK遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩのＨＰ等の検索により適宜入手できる。好ましくは、酵母、乳酸菌、大腸菌、植物などに由来するXK遺伝子が挙げられる。XK遺伝子としては、例えば、S. cerevisiae S288C 株由来のXK遺伝子であるXKS1（GenBank：Z72979）（CDSのコード領域の塩基配列及びアミノ酸配列）が挙げられる。
【００４５】
また、より具体的にトランスアルドラーゼ（TAL）遺伝子、トランスケトラーゼ（TKL）遺伝子、リブロース-5-リン酸エピメラーゼ（RPE）遺伝子、リボース-5-リン酸ケトイソメラーゼ（RKI）遺伝子は、特に由来生物を限定せずに用いることができる。これら遺伝子はペントースリン酸経路を備える多くの生物であれば保持している。例えば、S.cerevisiaeなどの汎用酵母もこれらの遺伝子を保持している。これらの遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩ等のＨＰにアクセスすることにより適宜入手できる。好ましくは、真核細胞又は酵母等、宿主真核細胞と同一の属、さらに好ましくは宿主真核細胞と同一種に由来の各遺伝子が挙げられる。TAL遺伝子としてはTAL1遺伝子、TKL遺伝子としてはTKL1遺伝子及びTKL2遺伝子、RPE遺伝子としてはRPE1遺伝子、RKI遺伝子としてはRKI1遺伝子を好ましく用いることができる。例えば、これら遺伝子としては、S. cerevisiae S288 株由来のTAL1遺伝子（GenBank：U19102）、S. cerevisiae S288 株由来のTKL1遺伝子（GenBank：X73224）、S. cerevisiae S288 株由来のRPE1遺伝子（GenBank：X83571）、S. cerevisiae S288 株由来のRKI1遺伝子（GenBank：Z75003）が挙げられる。
【００４６】
＜組換え酵母の作製＞
本発明に係る組換え酵母は、例えば、キシロースやアラビノース等の五炭糖に関する代謝能を有しない酵母に対して、上述したキシロース代謝関連酵素遺伝子やアラビノース代謝関連遺伝子を導入するとともに、エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を低下させるように改変することで作製することができる。或いは、本発明に係る組換え酵母は、例えば、上記五炭糖に関する代謝能を有する酵母に対して、エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を低下させるように改変することで作製することができる。なお、本発明に係る組換え酵母を作製するに際して、上述した他の遺伝子を導入しても良い。
【００４７】
遺伝子の発現量を低下させるには、内在する当該遺伝子のプロモーターに転写が低下する変異を導入、発現量が弱い他の遺伝子のプロモーターに置換する、二倍体の組換え酵母に存在する一対の遺伝子のうち一方を欠損させても良いい。遺伝子の発現を抑制する手法としては、所謂、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を挙げることができる。また、遺伝子の発現量を低減する効果を有するターミーネータ領域を使用しても良い（米国特許US 9,512,436 B2）。
【００４８】
また、キシロース代謝関連遺伝子やアラビノース代謝関連遺伝子及び他の遺伝子等を酵母に導入する際、全ての遺伝子を同時に導入しても良いし、異なる発現ベクターを利用して逐次導入しても良い。
【００４９】
宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないがCandida Shehatae、Pichia stipitis、Pachysolen tannophilus、Saccharomyces cerevisiae及びSchizosaccharomyces pombeなどの酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。また、酵母としては、実験面での利便性のために使われる実験株でも良いし、実用面での有用性のために使われている工業株（実用株）でも良い。工業株としては、例えば、ワイン、清酒や焼酎作りに用いられる酵母株を挙げることができる。
【００５０】
また、宿主となる酵母としては、ホモタリック性を有する酵母を使用することが好ましい。特開2009-34036号公報に開示される手法によれば、ホモタリック性を有する酵母を利用することで、簡便にゲノムへの多コピー遺伝子導入が可能となる。ホモタリック性を有する酵母とは、ホモタリックな酵母と同義である。ホモタリック性を有する酵母としては、特に限定されず、如何なる酵母をも使用することができる。ホモタリック性を有する酵母としては、Saccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。その他にもホモタリック性を有する酵母としては、アルコール酵母（台研396号、NBRC0216）（出典：「アルコール酵母の諸特性」酒研会報、No37、p18-22(1998.8)）、ブラジルと沖縄で分離したエタノール生産酵母（出典：「ブラジルと沖縄で分離したSaccharomyces cerevisiae野生株の遺伝学的性質」日本農芸化学会誌、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4)）及び180（出典「アルコール発酵力の強い酵母のスクリーニング」日本醸造協会誌、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6)）を挙げることができる。また、ヘテロタリックな表現型を示す酵母においても、HO遺伝子を発現可能に導入することによってホモタリック性を有する酵母として使用することができる。すなわち、本発明において、ホモタリック性を有する酵母とは、HO遺伝子を発現可能に導入された酵母も含む意味である。
【００５１】
また、導入する遺伝子のプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
【００５２】
すなわち、上述した遺伝子は、発現を制御するプロモーターやその他の発現制御領域とともに酵母のゲノムに導入してもよい。または、上述した遺伝子は、宿主となる酵母のゲノムに本来的に存在する遺伝子のプロモーターやその他の発現制御領域により発現制御されるように導入してもよい。
【００５３】
また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)”、“Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual”などに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００５４】
＜エタノール製造＞
以上で説明した組換え酵母を使用してエタノールを製造する際には、少なくともキシロースやアラビノース等の五炭糖を含有する培地にてエタノール発酵培養を行う。すなわち、エタノール発酵を行う培地とは、炭素源として少なくとも代謝可能な五炭糖を含有することとなる。なお、培地には、予めグルコース等の他の炭素源が含まれていても良い。
【００５５】
また、エタノール発酵に利用する培地に含まれるキシロースやアラビノース等の五炭糖は、バイオマス由来とすることができる。言い換えると、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスと、セルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースを糖化してキシロースやアラビノース等の五炭糖を生成するヘミセルラーゼとを含む組成であってもよい。ここで、セルロース系バイオマスとしては、従来公知の前処理を施したものであっても良い。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、セルロース系バイオマスの粉砕処理等を挙げることができる。また、前処理としては、例えば、粉砕したセルロース系バイオマスを希硫酸溶液やアルカリ溶液、イオン液体に浸漬する処理、水熱処理、微粉砕処理といった処理を適用しても良い。これら前処理により、バイオマスの糖化率を向上させることができる。
【００５６】
なお、以上で説明した組換え酵母を使用してエタノールを製造する際には、上記培地が更にセルロース及びセルラーゼを含む組成であってもよい。この場合、上記培地には、セルラーゼがセルロースに作用することで生成するグルコースを含有することとなる。エタノール発酵に利用する培地がセルロースを含有する場合、当該セルロースは、バイオマス由来とすることができる。言い換えると、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスに含まれるセルラーゼを糖化できるセルラーゼを含む組成であってもよい。
【００５７】
また、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスを糖化処理した後の糖化液を添加してもよい。この場合、糖化液には、残存するセルロースやセルラーゼとセルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースに由来するキシロースやアラビノース等の五炭糖とが含まれる。
【００５８】
以上のように、本発明に係るエタノールの製造方法は、少なくともキシロースやアラビノース等の五炭糖を糖源とするエタノール発酵の工程を含むこととなる。本発明に係るエタノールの製造方法は、キシロースやアラビノース等の五炭糖を糖源としたエタノール発酵によりエタノールを製造することができる。本発明に係る組換え酵母を利用したエタノールの製造方法では、エタノール発酵の後、培地からエタノールを回収する。エタノールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、組換え酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
【００５９】
一般に、酵母を用いたエタノール発酵生産において、グリセリンは代表的な副産物として知られている。このエタノール発酵生産においてエタノール収率を向上させるには、グリセリン生産量を低減することが重要である。しかし、グリセリン生産量を低減するため、グリセルアルデヒド3リン酸からのグリセリン生産経路に関与する遺伝子（GPD1、GPD2、GPP1及びGPP2）を破壊・発現低下した場合、エタノール生産速度が低下するなどの問題が指摘されていた（Appl Environ Microbiol. 2011, 77, 5857-5867, Appl Environ Microbiol. 2013 ,79, 3273-3281）。
【００６０】
しかしながら、本発明に係る組換え酵母は、後述の実施例に示すように、グリセリン生産量が非常に低いといった特徴を有している。特に、本発明に係る組換え酵母は、グリセルアルデヒド3リン酸からのグリセリン生産経路に関与する遺伝子を破壊・発現低下していないにも拘わらず、グリセリン生産量が低いといった有利な特徴がある。したがって、本発明に係る組換え酵母を利用することによって、グリセルアルデヒド3リン酸からのグリセリン生産経路に関与する遺伝子を破壊・発現低下した酵母を使用した場合と比較して優れたエタノール収率を達成できる。
【００６１】
また、本発明に係るエタノールの製造方法は、培地に含まれるセルロースをセルラーゼにより糖化する工程と、キシロースやアラビノース等の五炭糖と糖化により生成されたグルコースとを糖源とするエタノール発酵の工程とが同時に進行する、いわゆる同時糖化発酵処理としても良い。ここで、同時糖化発酵処理とは、セルロース系バイオマスを糖化する工程とエタノール発酵工程とを区別せずに同時に実施する処理を意味する。
【００６２】
なお、糖化方法としては、特に限定されないが、セルラーゼやヘミセルラーゼ等のセルラーゼ製剤を利用する酵素法等を挙げることができる。セルラーゼ製剤は、セルロース鎖及びヘミセルロース鎖の分解に関与する複数の酵素を含んでおり、エンドグルカナーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、グルコシダーゼ活性及びキシロシダーゼ活性等の複数の活性を示す。セルラーゼ製剤としては、特に限定されないが、例えば、Trichoderma reeseiや、Acremonium cellulolyticusなどが生産するセルラーゼを挙げることができる。セルラーゼ製剤としては、市販されているものを使用しても良い。
【００６３】
同時糖化発酵処理では、セルロース系バイオマス（前処理後であってもよい）を含む培地にセルラーゼ製剤と上述した組換え微生物とを加え、所定の温度範囲で当該組換え酵母を培養する。培養温度としては特に限定されないが、エタノール発酵の効率を考慮して25〜45℃とすることができ、30〜40℃とすることが好ましい。また、培養液のpHを4〜6とすることが好ましい。また、培養に際して、攪拌や振とうしてもよい。さらに、先に酵素の至適温度（40〜70℃）で糖化を行い、その後、温度を所定の温度（30〜40℃）に下げて酵母を添加するといった変則的な同時糖化発酵でもよい。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６５】
〔実施例１〕
本実施例では、グリセルアルデヒド3リン酸より上流のエムデン-マイヤーホフ経路の遺伝子の一つであるグルコースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子（PGI1遺伝子）の活性を低下させた、キシロース代謝能を有する組換え酵母を作製した。
【００６６】
＜導入ベクターの作製＞
（１）XI・XKS1・TKL1・TAL1・RKI1・RPE1遺伝子導入及びGRE3遺伝子破壊用プラスミド
GRE3遺伝子座にGRE3遺伝子を破壊しながら、ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子の377番目のアミノ酸がアスパラギンからスレオニンに置換され、キシロースの資化速度が向上した変異遺伝子（XI_N337C； WO2014/156194参照）、酵母由来のキシルロキナーゼ（XKS1）遺伝子、ペントースリン酸回路のトランスケトラーゼ1（TKL1）遺伝子、トランスアルドラーゼ1（TAL1）遺伝子、リブロースリン酸エピメラーゼ1（RPE1）遺伝子、リボースリン酸ケトイソメラーゼ（RKI1）遺伝子を酵母に導入するために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_GRE3- P_HOR7- TKL1- TAL1-FBA1_P-P_ADH1-RPE1- RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1- P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3を作製した。
【００６７】
このプラスミドには、5’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株由来の、HOR7プロモーターが付加されたTKL1遺伝子、FBA1プロモーターが付加されたTAL1遺伝子、ADH1プロモーターが付加されたRKI1遺伝子、TEF1プロモーターが付加されたRPE1遺伝子、TDH1プロモーターとDIT1ターミーネータが付加されたXI_N337C（全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）、TDH3プロモーターとHIS3ターミーネータが付加されたXKS1遺伝子、酵母ゲノム上への相同組換え領域として、GRE3遺伝子の5’側末端より上流約700bpの領域の遺伝子配列（5U_GRE3）、及びGRE3遺伝子3’側末端より下流の約800bpの領域のDNA配列（3U_GRE3）、並びにマーカーとして、G418遺伝子を含む遺伝子配列（G418 marker）が含まれるように構築した。なお、マーカー遺伝子は両側にLoxP配列を導入することで、マーカー除去が可能な配列にしている。
【００６８】
なお、各DNA配列は、下記表１のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されており、それらを用いて、Saccharomyces cerevisiae BY4742ゲノム、XI_N337C合成遺伝子DNA、LoxP配列の合成DNAを鋳型に目的のDNA断片を増幅し、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）等を用いて順次DNA断片を結合、プラスミドpUC19にクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
【００６９】
（２）PGI1遺伝子ターミーネータ変換用プラスミド
PGI1遺伝子のターミーネータについて、発現量が弱いターミーネータであるGIC1（US20130244243）と置き換えるために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_PGI1-PGI1-T_GIC1-LoxP-P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP-3U_PGI1を作製した。このプラスミドには、酵母ゲノム上への相同組換え及びホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子（PGI1）のターミーネータを置換するための領域として、PGI1遺伝子の上流約800bpのDNA配列（5U_PGI1）及びPGI1のORF、PGI1遺伝子の下流約750bpのDNA配列（3U_PGI1）、並びにマーカーとして、G418遺伝子を含む遺伝子配列（G418 marker）が含まれるように構築した。
【００７０】
なお、各DNA配列は表１のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されており、それらを用いて、プラスミドpUC-5U_GRE3-P_HOR7-TKL1-TAL1-FBA1_P-P_ADH1-RPE1-RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3若しくは酵母OC2株のゲノムDNAを鋳型に目的のDNA断片を増幅、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いて順次DNA断片を結合、プラスミドpUC19にクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
【００７１】
【表１】
2019068788.tif 000003
2019068788.tif 000004
【００７２】
＜ベクター導入酵母株の作製＞
2倍体酵母のSaccharomyces cerevisiae OC2株（NBRC2260）を宿主とした。酵母の形質転換はFrozen-EZ Yeast Transformation II（ZYMO RESEARCH）を用い、添付のプロトコルに従って行った。
【００７３】
上記（１）で作製したプラスミド：pUC-5U_GRE3-P_HOR7-TKL1-TAL1-FBA1_P-P_ADH1-RPE1-RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3の相同組換え部位をPCRで増幅した断片を用いて、OC2株の形質転換を行い、G418を含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された選択株をUz2126株と命名した。本株を胞子形成培地（1% リン酸カリウム、0.1% イーストエキストラクト、0.05% ブドウ糖、2% 寒天）で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のGRE3遺伝子座領域に変異型XI、TKL1、TAL1、RPE1、RKI1及びXKS1遺伝子が組み込まれGRE3遺伝子が破壊されている株を取得した。これをUz2126-2-1dS株とした。
【００７４】
次に、上記（２）で作製したプラスミド：pUC-5U_PGI1-PGI1-T_GIC1-LoxP-P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP-3U_PGI1の相同組換え部位間をPCRで増幅した断片を用いて、上記Uz2126-2-1dS株の形質転換を行い、G418を含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された選択株はヘテロに（1コピー）組換えが起こっていることを確認し、Uz2154-2-6株と命名した。
【００７５】
Uz2154-2-6株を胞子形成培地で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行い、Uz2154-2-6dS株と命名した。最終的に作製した株の遺伝型をまとめると以下になる。
【００７６】
【表２】
2019068788.tif 000005
【００７７】
＜発酵試験＞
上記で作製した株からそれぞれ5株を用いてフラスコ発酵試験を実施した。フラスコ発酵試験では、まず、グルコース濃度20g/LのYPD液体培地（イーストエキストラクト 10ｇ/L、ペプトン 20g/L、グルコース 20g/L）を20ml分注した100ml容バッフル付きフラスコに供試株を植菌し、30℃、120rpmで24時間培養を行った。集菌後、成分が異なる各種エタノール生産用の培地を8ml分注した10ml容フラスコに植菌し（菌濃度0.3g乾燥菌体/L）、振盪培養（80rpm、振幅35mm）、温度を31℃又は34℃にて発酵試験を行った。なお、フラスコにつける栓は、内径1.5mmニードルを通したゴム製で、ニードルの先に逆止弁を取り付けることでフラスコが嫌気的に保たれるようにした。
【００７８】
発酵液中のグルコース、キシロース、エタノールについてHPLC（LC-10A；島津製作所）を使用して、下記条件にて測定した。
カラム：AminexHPX-87H
移動相：0.01N H2SO4
流量：0.6ml/min
温度：30℃
検出器：示差屈折率検出器 RID-10A 
【００７９】
＜発酵試験結果１＞
発酵試験の結果を表３に示した。なお、表３に示した結果は、グルコース50g/L、キシロース100g/L、イーストエキストラクト10g/L、ペプトン20g/L及び酢酸1.68g/Lを含む培地を用い、発酵温度を31℃とした試験の結果である。また、各物質濃度、グリセリン・エタノール収率は、独立して取得した組換え株5株の発酵時間66時間後のデータ平均値である。
【００８０】
【表３】
2019068788.tif 000006
【００８１】
表３に示したように、PGI1遺伝子の活性を低下させた株は、コントロール株と比較してキシロースの資化速度が向上しており、グリセリン収率が大幅に低下し、且つエタノール収率が大幅に向上した。さらに、PGI1遺伝子の活性を低下させた株は、コントロール株と比較して酢酸資化能にも優れることが分かった。
【００８２】
＜増殖試験＞
また、上記で作製した株及びコントロール株を用いて、グルコースを炭素源とした培地を用いた増殖試験を行った。YPD液体培地（組成：イーストエキス10g/L、ペプトン20g/L、グルコース20g/L）で12時間培養し、菌体を回収して、YPD液体培地10mlを入れたTPP社製の50ml培養チューブに植菌し増殖試験を行った。試験はリアルタイム細胞培養モニター装置RTS-1（BIOSAN LTD.）を使用し、培養条件30℃、10分間隔で培養液のOD（850nm）を測定した。各株の比増殖速度を測定した結果を表４に示した。
【００８３】
【表４】
2019068788.tif 000007
【００８４】
表４に示したように、PGI1遺伝子の活性を低下させた株は、コントロール株と比較してグルコースを炭素源とした培地における比増殖速度が低いことが明らかとなった。本実施例で示したように、グルコースリン酸イソメラーゼ遺伝子等のエムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子の活性を低下すると、グルコースの資化速度が低下する。一方、キシロース資化に関しては、エムデン-マイヤーホフ経路におけるグリセルアルデヒド3リン酸より上流に含まれる遺伝子は直接的な代謝経路ではないため、グルコースの資化よりは影響が少ないと考えられる。
【００８５】
一般的にキシロース資化経路導入株では、グルコースの資化がキシロースの資化より圧倒的に速く、グルコースの資化が終わった後に引き続きキシロースの資化が進むケースが多い。本実施例で作製したPGI1遺伝子の活性を低下させた株では、グルコース資化速度をやや遅らせることができ、グルコースとキシロースの代謝経路が合流するグルコースリン酸イソメラーゼより下流の解糖経路（図１参照）について、キシロース由来の炭素源の資化が相対的に優先され、エタノールの生産性が改善すると考えられた。
【図１】
2019068788.tif 000008
【配列表】
2019068788000001.app