(57)【要約】      （修正有）【課題】クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の外膜タンパク質の表面露出領域の免疫原性断片の反復単位からなるポリペプチド、並びにこれらの融合タンパク質を含む医薬組成物及びワクチンの提供。【解決手段】クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（Ｃｔ）による感染症の治療又は予防のための医薬組成物の製造における、ａ）クラミジア種の血清型に発現される同じ外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）の１つ又は複数の表面露出断片を含むアミノ酸配列；及び、ｂ）ａ）に定義したのと同じ配列か、又はａ）の前記血清型とは異なるクラミジア種の血清型に発現される前記外膜タンパク質の変異型由来の対応する表面露出断片の何れかである、２つ以上の別のアミノ酸配列を含むポリペプチドの使用。【選択図】図４
2019163253.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）による感染症の治療または予防のための医薬組成物の製造における
ａ）クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の血清型に発現される同じ外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）の１つ又は複数の表面露出断片を含むアミノ酸配列；及び
ｂ）ａ）に定義したのと同じ配列か、又はａ）の前記血清型とは異なるクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の血清型に発現される前記外膜タンパク質の変異型由来の対応する表面露出断片の何れかである、２つ以上の別のアミノ酸配列
を含むポリペプチドの使用であって、
前記外膜タンパク質がクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の任意の血清型由来のＭＯＭＰであり、前記ポリペプチドがＭＯＭＰの可変ドメイン１、２、３、４の１つ又は複数を含むことを特徴とする使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用において、前記ポリペプチドが３つ以上の異なるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が各々、様々なクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）血清型によって異なる、同じ外膜タンパク質の様々な変異型からの１つ又は複数の表面露出断片を含むことを特徴とする使用。
【請求項３】
請求項１に記載の使用において、前記ポリペプチドがアミノ酸配列の３回以上の反復を含み、前記アミノ酸配列が、様々なクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）血清型によって異なる、同じ外膜タンパク質の１つ又は複数の表面露出断片を含み、前記アミノ酸配列が、同じクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）血清型に由来することを特徴とする使用。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の使用において、前記外膜タンパク質が、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）又は肺炎クラミジア（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉａ若しくはＪ由来のＭＯＭＰであることを特徴とする使用。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の使用において、前記アミノ酸配列が、直線化されることを特徴とする使用。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の使用において、ＭＯＭＰの前記可変ドメイン４（ＶＤ４）を含む前記アミノ酸配列が、互いに隣接して配置されるか、又はリンカーで隔てられることを特徴とする使用。
【請求項７】
請求項６に記載の使用において、前記タンパク質が、式Ｉ：
ｘｘ１−ＶＤ４−ｘｘ２（式Ｉ）
（式中、
ＶＤ４は、配列番号１５〜２０又はこれらと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
ｘｘ１は、
ｉ）アミノ酸配列
ＥＷＱＡＳＬＡＬＳＹＲＬＮＭＦＴＰＹＩＧＶＫＷＳＲＡＳＦＤＡＤＴＩＲＩＡＱＰＫ（配列番号２１）、又は
ｉｉ）ｉ）の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、１〜３８個のアミノ酸残基を含み、ｉ）の前記アミノ酸配列においてＣ末端のＫで開始するサブ配列
から構成され、
ｘｘ２は、
ｉｉｉ）アミノ酸配列
ＤＴＭＱＩＶＳＬＱＬＮＫＭＫＳＲＫＳＣＧＩＡＶＧＴＴＩＶＤＡ（配列番号２２）、又は
ｖｉ）ｉｉｉ）の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、１〜２９個のアミノ酸残基を含み、ｉｉｉ）の前記アミノ酸配列においてＮ末端のＤで開始するサブ配列
から構成される）
で定義されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の使用において、前記配列が、配列番号２３〜２８、４９〜５９から選択されることを特徴とする使用。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載の使用において、前記タンパク質が、ＭＯＭＰの前記可変ドメイン１（ＶＤ１）を含む断片をさらに含み、ＭＯＭＰのＶＤ１を含む前記アミノ酸配列が、互いに隣接して配置されるか、又はリンカーで隔てられることを特徴とする使用。
【請求項１０】
請求項９に記載の使用において、前記ポリペプチドが、式ＩＩ：
ｙｙ１−ＶＤ１−ｙｙ２（式ＩＩ）
（式中、
ＶＤ１は、配列番号１〜６又はこれらと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
ｙｙ１は、
ｖ）アミノ酸配列
ＤＡＩＳＭＲＶＧＹＹＧＤＦＶＦＤＲＶＬＫＴＤＶＮＫＥＦＱＭＧ  配列番号７）、又は
ｖｉ）ｖ）の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、１〜３０個のアミノ酸残基を含み、ｖ）の前記アミノ酸配列においてＣ末端のＧで開始するサブ配列
から構成され、
ｙｙ２は、
ｖｉｉ）アミノ酸配列ＮＰＡＹＧＲＨＭＱＤＡＥＭＦＴＮＡＡ（配列番号８）、又は
ｖｉｉｉ）ｖｉｉ）の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、１〜１８個のアミノ酸残基を含み、ｖｉｉ）の前記アミノ酸配列においてＮ末端のＮで開始するサブ配列
から構成される）
で定義されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の使用において、前記配列が、配列番号９〜１４、４５〜４８から選択されることを特徴とする使用。
【請求項１２】
請求項１乃至１１の何れか１項に記載の使用において、前記ポリペプチドが、ＭＯＭＰの前記可変ドメイン２（ＶＤ２）を含む断片をさらに含み、ＭＯＭＰのＶＤ２を含む前記アミノ酸配列が、互いに隣接して配置されるか、又はリンカーで隔てられることを特徴とする使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用において、前記ポリペプチドが、式ＩＩＩ：
ｚｚ１−ＶＤ２−ｚｚ２（式ＩＩＩ）
（式中、
ＶＤ２は、配列番号２９〜３４又はこれらと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
ｚｚ１は、
ｉｘ）アミノ酸配列ＴＬＧＡＴＳＧＹＬＫＧＮＳＡＳＦＮＬＶＧＬＦＧ（配列番号３５）、又は
ｘ）ｉｘ）の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、１〜２３個のアミノ酸残基を含み、ｉｘ）の前記アミノ酸配列においてＣ末端のＧで開始するサブ配列
から構成され、
ｚｚ２は、
ｘｉ）アミノ酸配列ＶＶＥＬＹＴＤＴＴＦＡＷＳＶＧＡＲＡＡＬＷＥ（配列番号３６）、又は
ｘｉｉ）ｘｉ）の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、１〜２２個のアミノ酸残基を含み、ｘｉ）の前記アミノ酸配列においてＮ末端のＶで開始するサブ配列
から構成される）
で定義されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項１４】
請求項１乃至１３の何れか１項に記載の使用において、前記ポリペプチドが、ＭＯＭＰの前記可変ドメイン３（ＶＤ３）を含む断片をさらに含み、ＭＯＭＰのＶＤ３を含む前記アミノ酸配列が、互いに隣接して配置されるか、又はリンカーで隔てられることを特徴とする使用。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用において、前記ポリペプチドが、式ＩＶ：
ｑｑ１−ＶＤ３−ｑｑ２（式ＩＶ）
（式中、
ＶＤ３は、配列番号３７〜４２又はこれらと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
ｑｑ１は、
ｘｉｉｉ）アミノ酸配列
ＡＴＬＧＡＳＦＱＹＡＱＳＫＰＫＶＥＥＬＮＶＬＣＮＡＡＥＦＴＩＮＫＰＫＧＹＶＧ（配列番号４３）、又は
ｘｉｖ）ｘｉｉｉ）の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、１〜２２個のアミノ酸残基を含み、ｘｉｉｉ）の前記アミノ酸配列においてＣ末端のＧで開始するサブ配列
から構成され、
ｑｑ２は、
ｘｖ）アミノ酸配列
ＴＧＴＫＤＡＳＩＤＹＨＥＷＱＡＳＬＡＬＳＹＲＬＮＭＦＴＰＹＩＧＶＫＷＳ（配列番号４４）、又は
ｘｖｉ）ｘｖ）の前記アミノ酸配列のサブ配列であって、１〜３５個のアミノ酸残基を含み、ｘｖ）の前記アミノ酸配列においてＮ末端のＴで開始するサブ配列
から構成される）
で定義されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項１６】
請求項１乃至１５の何れか１項に記載の使用において、前記ポリペプチドが、組み換えにより生成された場合に前記ポリペプチドの輸送を促進する部分（例えば、シグナルペプチド）、前記ポリペプチドの精製を容易にする部分（例えば、ｈｉｓタグ）及び／又は免疫原性を増強する部分（例えば、Ｔ細胞抗原）をさらに含むことを特徴とする使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用において、前記免疫原性を増強する部分が、ＣＴ０４３、ＣＴ００４、ＣＴ４１４、ＣＴ６８１又はその部分などのＣｔ抗原から選択される別のＴ細胞標的であることを特徴とする使用。
【請求項１８】
請求項１７に記載の使用において、前記部分が、配列番号６０〜６８から選択されることを特徴とする使用。
【請求項１９】
請求項１乃至１８の何れか１項に記載の使用において、前記ポリペプチドが、
ａ）異種免疫反復配列を投与することを含む実験セットアップで試験したとき、１０−３以下の５０％中和力価で、クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清亜型Ｄをｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和する能力、又は
ｂ）異種免疫反復配列を投与することを含むマウスモデルで試験したとき、感染から７日後に、マウスの少なくとも５０％において、クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清亜型Ｄをｉｎ  ｖｉｖｏで中和する能力、又は
ｃ）異種免疫反復配列を投与したとき、免疫応答をクラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の複数の血清亜型にｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大する能力
を有し、
前記異種免疫反復配列が請求項１に定義されるペプチドであり、前記可変ドメインが２以上の血清型由来であることを特徴とする使用。
【請求項２０】
クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）による感染症の治療または予防のための医薬組成物の製造における、請求項１乃至１９の何れか１項に定義されるポリペプチドをコード化する核酸の使用。
【請求項２１】
クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）による感染症の治療または予防のための医薬組成物であって、請求項１−１９に定義されるポリペプチド又は請求項２０に定義される核酸を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の医薬組成物において、薬理的に許容される担体、賦形剤、アジュバント又は免疫モジュレータをさらに含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の医薬組成物において、前記アジュバントが、ＤＤＡ／ＴＤＢ又はミョウバンであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２４】
請求項２２に記載の医薬組成物において、前記担体が、ウイルス様粒子であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２１乃至２４の何れか１項に記載の医薬組成物において、アジュバントを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の医薬組成物において、前記アジュバントが、ＤＤＡ／ＴＤＢ又はミョウバンであることを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の外膜タンパク質の表面露出領域の免疫原性断片の反復単位からなるポリペプチド、並びにこれらの融合タンパク質を含む医薬組成物及びワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）は、様々な感染症の原因となる細胞内の細菌性病原体である。肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、ヒトの急性呼吸器感染症の原因であり、冠状動脈性心臓疾患の発症に関与すると考えられている。クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）は、ヒトの性行為感染症及び眼への感染症（トラコーマ）の病原体である。また、動物において、クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）によるいくつかの感染症が知られており、例えば、ブタに感染するクラミジア・スイス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  Ｓｕｉｓ）、及び小型反芻動物（ヒツジ及びヤギ）の流産を引き起こすヒツジ流行性流産クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｈｉｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）などがある。
【０００３】
世界中で、９千２百万人の人が、性行為により、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（Ｃｔ）に感染している１。Ｃｔによる尿路性器感染症は、高い発生率と、子宮外妊娠及び不妊症のリスク因子である２ことから、公衆衛生上の懸念事項である。これ以外にも、Ｃｔ感染症は、ＨＩＶの感染を促進する３と共に、ＨＰＶ誘導性子宮頸癌の補因子としても作用する４ことが判明している。性器Ｃｔ感染症を治療しないままでいると、感染症の持続期間が長引く可能性があり、完全なクリアランスは、最初の１２か月以内に達成されない場合が多い５。ヒトでの研究から、性器再感染に対してある程度の防御免疫が生じることはわかっているが、これは、よくても部分的であると思われる６。感染症は、抗生物質治療により有効に抑制される。しかし、無症候性症例の高い発生率は、持続可能な疾病対策は、有効なクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）ワクチンが開発されて初めて予想が可能になることを示唆している。
【０００４】
Ｃｔに対するワクチンは、生殖管粘膜において防御性Ｔ細胞及びＢ細胞免疫を誘発する必要がある７。感染症のクリアランス及び再感染に対する抵抗の免疫機構については、多くの研究で記載されている。様々な動物モデル及びクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種が、防御免疫応答及び免疫応答の損傷を明らかにするために用いられてきた。マウスの場合、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞性免疫応答が、Ｃｔ感染症の消散に重要な役割を果たすという全体的合意が形成されている８、９、１０が、防御における体液性免疫の役割は、それほどはっきりしないままである。モルモットの場合、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）感染症に対する免疫は、粘膜表面の分泌ＩｇＡにより少なくとも部分的に媒介され１１、１２、マウスモデルでは、防御免疫における抗体の役割を支持するエビデンスが増加している９。過去数年にわたって明らかにされた動物モデルからのデータは、感染が定着した後に抗体が形成されると、ごく小さな役割しか果たさないが、感染の時点で存在する（例えば、二次応答において）と、有意なレベルの防御、すなわち、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）特異的ＣＤ４＋細胞の存在下で明らかに増幅される効果を促進することを示している９、１３、１４。他方で、抗体を伴わない強力な細胞性免疫（ＣＭＩ）応答は、細菌の複製を制御し得るが、最悪の場合、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）感染症に関連する疾患を悪化させる恐れがある１５、１６。細胞性免疫と抗体同士のこの相互作用の重要性も一層明らかになり、感染の初期段階での中和抗体の優先的役割を支持するのに対し、ＣＤ４＋細胞は、感染の残りの段階全体を通して主要なエフェクターである１７  １８  １９。要約すると、抗体とＴ細胞同士の免疫エフェクター機構の均衡が、疾患の克服に極めて重要であると思われる。
【０００５】
本発明者ら及びその他により、ヒト又は動物モデルの何れかにおいて自然感染中に認識される多様なクラミジア抗原が同定されている２０、２１  ２２、２３  ２４、２５、２６  ２７。特に、１９９８年のゲノム配列の公開及び近年のハイスループット技術によって、８７５のオープンリーディングフレームのほぼ全ゲノムの試験が達成された２８。重要なことには、感染中に抗原性としてタンパク質を同定しても、これらがワクチンとして防御性であることを必ずしも意味せず２９、これらの多数の抗原の特性決定にもかかわらず、これらのうちのごく少数しか動物モデルでのワクチンとして防御を媒介しないことが明らかにされている３０  ３１、３２。さらに、大部分のワクチンについて、観測された部分的防御が、中和抗体を全く含まないＴ細胞により媒介されることも近年報告されている。従って、初期段階で感染に対処して、均衡型免疫応答を生み出すことができる中和抗体を生成するワクチン候補が不足している。
【０００６】
現在まで、中和抗体に関して説得力のあるデータは、３つの表面露出抗原についてのものしかない；クラミジア外膜に局在し、ポリンとして機能するＰｏｒＢ３３。これに対する抗体は、クラミジアの感染力を中和することがわかっている３４、特許参照文献：米国特許第７，１０５，１７１号明細書。さらに近年のもう１つの抗原は、ＰｍｐＤである。このタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和抗体を産生することが判明しているが、これらの抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの関連性はまだ明らかにされていない３５。
【０００７】
ＭＯＭＰは、中和抗体の典型的な標的抗原であり、記載された最初の抗原分子の１つである。これは、表面露出膜貫通タンパク質であり、構造的（ポリン）特性を有する３６、３７、３８。ＭＯＭＰは、Ｃｔ膜中のタンパク質の約６０％を占める４０ｋＤａタンパク質であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で有効性が証明されている中和抗体の標的である。ＭＯＭＰは、５つの定常セグメントにより隔てられる４つの可変表面露出ドメイン（ＶＤ−１〜ＶＤ−４）から構成され３６  ３９、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）の血清亜型（約１５）分類の分子基準である（図１）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ中和抗体エピトープが、これらのＶＤにマッピングされている４０  ４１  ４２  ４３  ４４。Ｃｔ尿路性器血清亜型の分布プロフィールは、世界中の地域について記載されており、ＭＯＭＰベースのワクチンの必要な血清亜型カバレッジに関する疫学的データを提供する。世界中で検出される最も一般的な血清亜型は、Ｅ（患者の２２〜４９％）で、これに血清亜型Ｆ及びＦ（それぞれ、１７〜２２％及び９〜１９％）が続き、血清亜型Ｅ、Ｄ及びＦをターゲティングするワクチンが、有意な影響力を有すると共に、ヒト人口の７０％超をカバーし得ることを意味する。
【０００８】
ＭＯＭＰは、ヒト及び動物において高度に免疫原性であるため、組み換えにより自然に精製されたタンパク質及びＤＮＡワクチン両方の、ワクチン候補として極めて詳細に研究されている。これらのワクチン化の試みにより、多様な結果が得られている１７、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７。ワクチンとしてＭＯＭＰが相対的に一貫していない理由は、完全には理解されていないが、合成ＭＯＭＰ免疫原が、タンパク質のネイティブ構造を模倣しないことが主な懸案事項となっている５４。これに関して、この膜結合システインリッチ分子の構造、及びネイティブタンパク質構造を達成するような様々な産物の再生は、極めて困難であり、大規模ワクチン生産には不適である５８。従って、明らかにワクチンの可能性はあるものの、フルサイズＭＯＭＰは、これまでのところ実現可能なワクチン候補ではなく、そのため、選択エピトープ（例えば、ＶＤ４において高度に保存されたＴＴＬＮＰＴＩＡＧなど３６、５９）を基材とする、又はＭＯＭＰ由来の中和標的エピトープ（例えば、ＶＤのエピトープなど）に富んだ選択エピトープを基材とするワクチンを構築するするいくつかの試みがなされている（国際公開第９４０６８２７号パンフレット、米国特許第６３８４２０６号明細書）６０、６１、６２、６３、６４  ５１、６５  ６６。
【０００９】
ＶＤ１、ＶＤ２及びＶＤ４が特に注視されているが、これは、血清型分類に用いられる中和モノクローナル抗体が、これらの領域にマップすることが判明したためである。これらのＶＤ領域は、自然感染中に抗体によってターゲティングされることから、当然、免疫−診断学を開発する試みは、これらの領域に集中した。例えば、Ｍｙｇｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．は、ＥＬＩＳＡに基づく診断ツールをみいだそうとして、様々な血清変異型由来のＶＤ領域を含有する様々な多重抗原（ｐｏｌｙａｎｔｉｇｅｎ）を構築した６７。上記の分析から、血清変異型の数を増加し、種特異的ＴＴＬＮＰＴＩＡＧをある組み換えポリ抗原に導入することによって、単一の血清型抗原を用いたアッセイと比較して、アッセイの特異性及び感受性の増大が可能であることが明らかにされた。
【００１０】
ＶＤ４領域は、可変領域に埋め込まれ、高度に保存された種特異的ＴＴＬＮＰＴＩＡＧを含有することがわかっているため、主にＶＤ４が免疫原として関心を集めている。重要なことには、ＶＤ４領域におけるこの保存エピトープは、広範に交差反応性の免疫応答を誘導することができ、この応答は、複数の血清亜型、中でも最も優勢なＤ、Ｅ及びＦを中和することができる（図２）。ＶＤ４領域又はこの領域由来の保存エピトープを呈示するペプチドは、単独で、ＶＤ１などの他の領域と融合したキメラペプチドとして、又は抗体応答を強化するＴ細胞エピトープと混合して、免疫付与のために用いられている６０、６８、５１、６５、６４  ６９。これらの構築物はすべて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染を中和するある程度の機能的能力を有する抗体を産生したが、一般に、これらの戦略は、低い免疫原性という問題を有し、その力価は、性器クラミジア攻撃に対する防御有効性に変換されなかった。
【００１１】
これらのペプチドベースの構築物を用いた場合に、防御性が不足する理由は、投与経路、誘発される免疫応答の種類、攻撃用量など、多数考えられるが、最も可能性が高いのは、ワクチンとして使用する上で、ワクチン分子が十分に免疫原性ではないことが考えられる。ＶＤ４に基づく戦略は、さらに、ＴＴＬＮＰＴＩＡＧエピトープを除いて、前述したような断片は、１つ又は２つの血清変異型に対して高度に特異的であるという制限があることから、ヒトの疾患を引き起こす最も一般的な血清変異型をカバーするために、ワクチンを複数の成分から構成しなければならない問題も抱えている。
【００１２】
国際公開第２０１２１７２０４２号パンフレットでは、ＶＤ領域内のＢ細胞エピトープは、ＭＯＭＰの非可変性ドメイン由来の規定Ｔ細胞（Ｔｈ１及びＴｈ２）エピトープと組み合わせて、ニワトリにおいて、クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔａｔｔｃｉ）血清亜型Ｄに対する多重エピトープ（ｐｏｌｙ−ｅｐｉｔｏｐｅ）ワクチンとして機能し得ることが既に開示されており、実施例において、複数のＴ細胞エピトープと一緒に、各々が、同じ血清変異型の様々な可変ドメイン由来のＶＤ領域から得られる、最大３つのＢ細胞エピトープの組み合わせが記載されている。ＭＯＭＰの表面露出領域の可変ドメインの反復配列の使用、及び異なる血清変異型の使用は、提案させておらず、従って、様々な血清変異型に対して高い力価及び広範な応答が得られない。
【００１３】
本発明の目的は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの様々なＣｔ血清亜型に対して防御性である、高力価の中和抗体応答を生み出すことができる組み換え融合分子を調製することである。本発明はさらに、免疫系の両アームを活性化するワクチンを提供する目的で、これらの抗体促進断片と、Ｔ細胞の標的であるＣｔ抗原との組み合わせも記載する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、病原体、例えば、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（Ｃｔ）に対する効率的なワクチンを開示し、これは、最大抗体応答のためのＣｔ抗原の表面露出断片の反復配列（相同性免疫反復配列）を含む。本発明の一実施形態では、これらの表面露出断片は、Ｔ細胞エピトープを含有し得る表面露出断片のフランキング領域を覆うように伸長されている。一例は、Ｃｔ  ＭＯＭＰ抗原由来のＶＤ１又はＶＤ４領域の伸長形態を呈示する規定の大型断片であり、これは、免疫反復配列フォーマットで、Ｃｔに対する高レベルの表面結合及び中和抗体を提供する。別の重要な実施形態では、免疫反復配列技術を用いて、様々な血清変異型由来の可変Ｂ及びＴ細胞エピトープを含有する断片の融合物（異種免疫反復配列）により、異なる血清変異型に対する高い力価及び広範な応答を取得する。本発明のさらに別の実施形態では、これらの表面露出反復配列を、ＰＭＰ又はＯＭＰなどの他の表面露出抗原の断片と、組み換えにより融合させる。最後に、本発明は、これらの免疫反復配列構築物と、強力なＴ細胞抗原、例えば、Ｃｔ由来のＭＯＭＰ（ＣＴ６８１）、ＣＴ０４３又はＣＴ００４との組み合わせを開示し、これらは一緒に、Ｃｔ感染症の様々な感染段階に対して、非常に効率的なワクチンを形成する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、
ａ）クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の血清型に発現される同じ外膜タンパク質の１つ又は複数の表面露出断片を含むアミノ酸配列；及び
ｂ）ａ）に定義したのと同じ配列か、又はａ）の血清型とは異なるクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の血清型に発現される前記外膜タンパク質の変異型由来の対応する表面露出断片の何れかである２つ以上の別のアミノ酸配列
を含むポリペプチドを開示する。
【００１６】
従って、本発明は、クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の外膜タンパク質の表面露出領域の免疫原性部分を含むアミノ酸配列の、３つ以上、例えば、４つ以上の免疫反復配列を含むポリペプチドを開示する。従って、本発明は、クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の血清型に発現される同じ外膜タンパク質の１つ又は複数の表面露出断片、及びａ）に定義したのと同じ配列か、又はａ）の血清型とは異なるクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の血清型に発現される前記外膜タンパク質の変異型由来の対応する表面露出断片の何れかである２つ以上、例えば、３つ以上の別のアミノ酸配列を含むポリペプチドを開示する。
【００１７】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、３つ以上の異なるアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は各々、様々なクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）血清型によって異なる、同じ外膜タンパク質の様々な変異型若しくはアイソタイプからの１つ又は複数の表面露出断片を含み、前記アミノ酸配列は、異なるクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）血清型に由来する（本発明者らの用語では異種免疫反復配列）が、本発明はまた、アミノ酸配列の３回以上の反復を含むポリペプチドも開示し、ここで、前記アミノ酸配列は、様々なクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）血清型によって異なる、同じ外膜タンパク質の１つ又は複数の表面露出断片を含み、前記アミノ酸配列は、同じクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）に由来する（本発明者らの用語では相同的免疫反復配列）。
【００１８】
外側膜タンパク質は、好ましくは、任意のクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）血清型に由来する主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）であり、表面露出断片は、ＭＯＭＰの可変ドメイン１（ＶＤ１）、可変ドメイン２（ＶＤ２）、可変ドメイン３（ＶＤ３）又は可変ドメイン４（ＶＤ４）から選択される。表面露出断片は、任意選択で、ジスルフィド結合を阻止するように、アミノ酸配列においてシステインの置換により直線化することができる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の血清亜型Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｆ、Ｉａ及びＪの何れかに由来するＭＯＭＰの可変ドメイン４（ＶＤ４）の３つ以上の反復単位を有する免疫反復配列を含むポリペプチドであり、ここで、各可変ドメインは、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清亜型Ｄ（ＳｖＤ）のＭＯＭＰのアミノ酸配列（配列番号６８）のアミノ酸残基３０９〜３３８位の位置に対応するアミノ酸配列から構成され、また、前記免疫反復配列中の可変ドメインは、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の血清亜型ＤのＶＤ４、血清亜型ＥのＶＤ４、血清亜型ＦのＶＤ４、血清亜型ＧのＶＤ４、血清亜型ＧのＶＤ４、血清亜型ＩａのＶＤ４、血清亜型ＪのＶＤ４から独立に選択されるか、又はこれらと８０％の配列同一性を有する。
【００２０】
血清亜型Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｆ、Ｉａ及びＪ由来のＶＤ４のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５〜２０に対応する。各可変ドメインは、
ｉ）アミノ酸配列ＥＷＱＡＳＬＡＬＳＹＲＬＮＭＦＴＰＹＩＧＶＫＷＳＲＡＳＦＤＡＤＴＩＲＩＡＱＰＫ（配列番号２１）、又は
ｉｉ）ｉ）のアミノ酸配列のサブ配列であって、１つ又は複数のアミノ酸残基を含むサブ配列
の何れかによって、Ｎ末端側でさらにフランキング／伸長することができる。
【００２１】
Ｃ末端側で、前記可変ドメインを、
ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＴＭＱＩＶＳＬＱＬＮＫＭＫＳＲＫＳＣＧＩＡＶＧＴＴＩＶＤＡ（配列番号２２）、
ｉｖ）ｉｖ）のアミノ酸配列のサブ配列であって、１つ又は複数のアミノ酸残基を含むサブ配列、
又はこれらと８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
によって、さらにフランキング／伸長することができる。
【００２２】
従って、好ましい実施形態は、各々がクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に由来する、２〜８つの異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドとして表すことができ、これは、式Ｉ：
ｘｘ１−ＶＤ４−ｘｘ２（式Ｉ）
に定義されるアミノ酸配列を含み、
式中、
ＶＤ４は、配列番号１５〜２０又はこれらと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
ｘｘ１は、
ｉ）アミノ酸配列
ＥＷＱＡＳＬＡＬＳＹＲＬＮＭＦＴＰＹＩＧＶＫＷＳＲＡＳＦＤＡＤＴＩＲＩＡＱＰＫ（配列番号２１）、又は
ｉｉ）ｉ）のアミノ酸配列のサブ配列であって、１〜３８個のアミノ酸残基を含み、ｉ）のアミノ酸配列においてＣ末端のＫで開始するサブ配列
から構成され、
ｘｘ２は、
ｉｉｉ）アミノ酸配列
ＤＴＭＱＩＶＳＬＱＬＮＫＭＫＳＲＫＳＣＧＩＡＶＧＴＴＩＶＤＡ（配列番号２２）
ｖ）ｉｉｉ）のアミノ酸配列のサブ配列であって、１〜２９個のアミノ酸残基を含み、ｉｉｉ）のアミノ酸配列においてＮ末端のＤで開始するサブ配列
から構成される。
【００２３】
ＭＯＮＰのＶＤ４の免疫反復配列を含む融合タンパク質の実施例を配列番号４９〜５９により表示する。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、ポリペプチドは、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の血清亜型Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉａ及びＪの何れかに由来するＭＯＭＰの３つ以上の可変ドメイン１（ＶＤ）の免疫反復配列をさらに含み、各可変ドメインは、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の血清型Ｄ（ＳｖＤ）のＭＯＭＰのアミノ酸配列（配列番号６８）のアミノ酸配列においてアミノ酸残基９１〜１０５位の位置に対応し、血清亜型ＤのＶＤ１、血清亜型ＥのＶＤ１、血清亜型ＦのＶＤ１、血清亜型ＧのＶＤ１、血清亜型ＪのＶＤ１からなる群から独立に選択される、アミノ酸配列から構成される。
【００２５】
血清型Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｆ、Ｇ、Ｉａ及びＪ由来のＶＤ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１〜６に対応する。各可変ドメインは、
ｖｉ）アミノ酸配列ＳＭＲＶＧＹＹＧＤＦＶＦＤＲＶＬＫＴＤＶＮＫＥＦＱＭＧ（配列番号７）、又は
ｖｉｉ）ｖ）のアミノ酸配列のサブ配列であって、１つ又は複数のアミノ酸残基を含むサブ配列
の何れかによって、Ｎ末端側でさらにフランキング／伸長することができる。
【００２６】
Ｃ末端側で、前記可変ドメインを、
ｖｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＰＡＹＧＲＨＭＱＤＡＥＭＦＴＮＡＡＣＭＡＬＮＩＷＤ（配列番号８）、
ｉｘ）ｘ）のアミノ酸配列のサブ配列であって、１つ又は複数のアミノ酸残基を含むサブ配列、
又はこれらと８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
によって、さらにフランキング／伸長することができる。
【００２７】
従って、別の好ましい実施形態は、各々がクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に由来する、２〜８つの異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドとして表すことができ、これは、式Ｉに定義されるアミノ酸配列を含み、さらに式ＩＩ：
ｙｙ１−ＶＤ１−ｙｙ２（式ＩＩ）
に定義されるアミノ酸配列も含み、
式中、
ＶＤ１は、配列番号１〜６又はこれらと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
ｙｙ１は、
ｖ）アミノ酸配列ＤＡＩＳＭＲＶＧＹＹＧＤＦＶＦＤＲＶＬＫＴＤＶＮＫＥＦＱＭＧ（配列番号７）、又は
ｖｉ）ｖ）のアミノ酸配列のサブ配列であって、１〜３０個のアミノ酸残基を含み、ｖ）のアミノ酸配列においてＣ末端のＧで開始するサブ配列
から構成され、
ｙｙ２は、
ｖｉｉ）アミノ酸配列ＮＰＡＹＧＲＨＭＱＤＡＥＭＦＴＮＡＡ（配列番号８）、又は
ｖｉｉｉ）ｖｉｉ）のアミノ酸配列のサブ配列であって、１〜１８個のアミノ酸残基を含み、ｖｉｉ）のアミノ酸配列においてＮ末端のＮで開始するサブ配列
から構成される。
【００２８】
ＶＤ１の免疫反復配列を含むポリペプチドの例を配列番号９〜１４及び４５〜４８により表示する。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、式ＩＩＩ及び／又は式ＩＶ：
ｚｚ１−ＶＤ２−ｚｚ２（式ＩＩＩ）
ｑｑ１−ＶＤ３−ｑｑ２（式ＩＶ）
に定義されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＭＯＭＰの可変ドメイン２（ＶＤ２）及び／又は可変ドメイン３（ＶＤ３）をさらに含み、
式中、
ＶＤ２は、配列番号２９〜３４又はこれらと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
ｚｚ１は、
ｉｘ）アミノ酸配列ＴＬＧＡＴＳＧＹＬＫＧＮＳＡＳＦＮＬＶＧＬＦＧ（配列番号３５）、又は
ｘ）ｉｘ）のアミノ酸配列のサブ配列であって、１〜２３個のアミノ酸残基を含み、ｉｘ）のアミノ酸配列においてＣ末端のＧで開始するサブ配列
から構成され、
ｚｚ２は、
ｘｉ）アミノ酸配列ＶＶＥＬＹＴＤＴＴＦＡＷＳＶＧＡＲＡＡＬＷＥ（配列番号３６）、又は
ｘｉｉ）ｘｉ）のアミノ酸配列のサブ配列であって、１〜２２個のアミノ酸残基を含み、ｘｉ）のアミノ酸配列においてＮ末端のＶで開始するサブ配列
から構成され、
また、上記式において、
ＶＤ３は、配列番号３７〜４２又はこれらと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から独立に選択され、
ｑｑ１は、
ｘｉｉｉ）アミノ酸配列
ＡＴＬＧＡＳＦＱＹＡＱＳＫＰＫＶＥＥＬＮＶＬＣＮＡＡＥＦＴＩＮＫＰＫＧＹＶＧ（配列番号４３）、又は
ｘｉｖ）ｘｉｉｉ）のアミノ酸配列のサブ配列であって、１〜２２個のアミノ酸残基を含み、ｘｉｉｉ）のアミノ酸配列においてＣ末端のＧで開始するサブ配列
から構成され、
ｑｑ２は、
ｘｖ）アミノ酸配列ＴＧＴＫＤＡＳＩＤＹＨＥＷＱＡＳＬＡＬＳＹＲＬＮＭＦＴＰＹＩＧＶＫＷＳ（配列番号４４）、又は
ｘｖｉ）ｘｖ）のアミノ酸配列のサブ配列であって、１〜３５個のアミノ酸残基を含み、ｘｖ）のアミノ酸配列においてＮ末端のＴで開始するサブ配列
から構成される。
【００３０】
免疫反復配列は、異種、すなわち、可変ドメインが、異なる血清型由来のものであってもよいし、又は相同性、すなわち、可変ドメインが１つの血清型由来のものであってもよい。免疫反復配列の好ましい数は、２、３、４、５、６、７若しくは８反復配列である。
【００３１】
さらに、ポリペプチド中の免疫反復配列を直線化する、すなわちシステイン残基をセリンで置換してもよい。
【００３２】
免疫反復配列を含むポリペプチドは、上記に加え、組み換えにより生成された場合にポリペプチドの輸送を促進する部分（例えば、シグナルペプチド）、ポリペプチドの精製を容易にする部分（例えば、ｈｉｓタグ）及び／又は免疫原性を増強する部分（例えば、Ｔ細胞抗原）をさらに含んでよい。Ｔ細胞標的は、ＣＴ０４３、ＣＴ００４、ＣＴ４１４、ＣＴ６８１又はその部分などのＣｔ抗原から選択することができる。こうした融合タンパク質の例を配列番号６０〜６７に表示する。
【００３３】
以下の機能的能力を有する本発明のポリペプチド：
ａ）異種免疫反復配列を投与することを含む実験セットアップで試験したとき、１０−３以下の５０％中和力価で、クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清亜型Ｄをｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和する能力；
ｂ）異種免疫反復配列を投与することを含むマウスモデルで試験したとき、感染から７日後に、マウスの少なくとも５０％において、クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清亜型Ｄをｉｎ  ｖｉｖｏで中和する能力；
ｃ）異種免疫反復配列を投与したとき、免疫応答をクラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の複数の血清亜型にｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大する能力。
【００３４】
本発明はまた、前記ポリペプチドをコードする核酸も開示する。
【００３５】
開示したポリペプチド又は核酸は、ワクチンなどの医薬組成物の調製に用いられる。ワクチンは、さらに、薬理的に許容される担体（ウイルス様粒子）、賦形剤、アジュバント（例えば、ＤＤＡ／ＴＤＢ若しくはミョウバン）又は免疫モジュレータをさらに含んでよい。医薬組成物は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）又は肺炎クラミジア（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染症などのクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）感染症に対する予防又は治療用途に使用することができる。
【００３６】
また、医薬組成物を投与することにより、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）又は肺炎クラミジア（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染症などのクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）感染症を予防、治療及び／又はその発生数を低減するための方法も開示される。
【００３７】
以下に、本発明をさらに詳しく説明し、例示する。
【００３８】
好ましい外膜タンパク質は、ＭＯＭＰであるが、体液性応答をターゲティングするクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種由来の他の表面露出抗原を含んでもよい。
【００３９】
表面露出領域からの免疫反復配列は、同じ血清型由来（相同性免疫反復配列）であってもよいし、又は可変エピトープを含み、かつ異なる血清型由来（異種免疫反復配列）の断片を呈するものであってもよい。好ましい実施形態において、免疫反復配列は、Ｔ細胞エピトープに富むことがわかっている可変及び保存領域の両方を含有する伸長断片を含む。
【００４０】
外膜タンパク質の好ましい表面露出領域は、ＭＯＭＰ由来のＶＤ１、ＶＤ２、ＶＤ３及びＶＤ４から選択される。
【００４１】
実施例に記載する免疫反復配列を構築するために用いられるアミノ酸配列は、表１、２及び３から選択される。
【００４２】
ＭＯＭＰのＶＤ４の可変ドメインは、以下：
Ｌａ１−Ａａ２−Ａａ１−Ａａ３−Ｌａ２
のように定義されるアミノ酸配列として表すことができ、
上記式中、
Ａａ１は、アミノ酸配列ＴＴＬＮＰＴＩＡＧ（全ての血清亜型について保存されている）から構成され；Ａａ２は、以下：ＳＡＴＡＩＦＤＴ（血清亜型Ｄ及びＥ由来）、ＬＶＴＰＶＶＤＩ（血清型亜Ｆ）、ＬＡＫＰＶＶＤＩ（血清亜型Ｇ）及びＬＡＥＡＩＬＤＶ（血清亜型Ｉａ及びＪ）からなる群から選択される。
【００４３】
Ａａ２が、血清亜型Ｄ又はＥ由来の配列であるとき、Ａａ３は、ＡＧＤＶＫＴＧＡＥＧＱＬＧ（血清亜型Ｄ由来）及びＡＧＤＶＫＡＳＡＥＧＱＬＧ（血清亜型Ｅ）に記載される配列から選択される。
【００４４】
Ａａ２が、血清亜型Ｆ由来の配列であるとき、Ａａ３は、配列ＣＧＳＶＡＧＡＮＴＥＧＱＩＳ（血清亜型Ｆ由来）である。
【００４５】
Ａａ２が、血清亜型Ｇ由来の配列であるとき、Ａａ３は、配列ＣＧＳＶＶＡＡＮＳＥＧＱＩＳ（血清亜型Ｇ由来）である。
【００４６】
Ａａ２が、血清型Ｉａ又はＪ）由来の配列であるとき、Ａａ３は、配列ＫＧＴＶＶＳＳＡＥＮＥＬＡ（血清型Ｉａ由来）及びＫＧＴＶＶＡＳＧＳＥＮＤＬＡ（血清型Ｊ由来）から選択される。
【００４７】
ＭＯＭＰの可変ドメインＶＤ４を図２に示す。免疫反復配列は、やはり図２に示す何れかの末端に伸長部をさらに含むのが好ましい。
【００４８】
ＶＤ４ドメインのＮ末端側は、より保存され、かつＴ細胞エピトープに富んだＬａ１由来の１つ又は複数のアミノ酸によりフランキング又は伸長することができ、ここで、Ｌａ１は、膜に埋め込まれて、アミノ酸配列ＥＷＱＡＳＬＡＬＳＹＲＬＮＭＦＴＰＹＩＧＶＫＷＳＲＡＳＦＤＡＤＴＩＲＩＡＱＰＫ、又はこれと８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＭＯＭＰのＶＤ４の一部である。
【００４９】
ＶＤ４のＣ末端側は、より保存され、かつＴ細胞エピトープに富んだＬａ２由来の１つ又は複数のアミノ酸により、相応にフランキング又は伸長することができ、ここで、Ｌａ２は、Ｃ末端側で膜に埋め込まれて、アミノ酸配列ＤＴＭＱＩＶＳＬＱＬＮＫＭＫＳＲＫＳＣＧＩＡＶＧＴＴＩＶＤＡ、又はこれと８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＭＯＭＰのＶＤ４の一部である。
【００５０】
類似した図（図１を参照）で、表１の配列番号１〜６により示される様々な血清亜型の可変ドメイン（Ａａ２−Ａａ１−Ａａ３）を含むＭＯＭＰの可変ドメイン１（ＶＤ１）を含む免疫反復配列を表することができる。対応するＮ末端及びＣ末端伸長部（Ｌａ１及びＬａ２）は、それぞれアミノ酸配列ＳＭＲＶＧＹＹＧＤＦＶＦＤＲＶＬＫＴＤＶＮＫＥＦＱＭＧ（Ｌａ１）及びＮＰＡＹＧＲＨＭＱＤＡＥＭＦＴＮＡＡＣＭＡＬＮＩＷＤ（Ｌａ２）を有し、これらは、表２に配列番号７〜８により示される。
【００５１】
ＶＤ２及びＶＤ３を含む免疫反復配列は、同様に、図１及び表１から推定することができる。
【００５２】
従って、前述の例Ｌａ１−Ａａ２−Ａａ１−Ａａ３−Ｌａ２は、免疫反復単位の１つを規定する。これに加えて、例えば、ＶＤ１がＶＤ４単位に付加されれば、より大きな免疫反復単位を形成する、もう１つの配列の付加として表すことができる。よって、本発明のポリペプチドは、免疫反復単位の２、３、４、５、６、７若しくは８回の反復を含む。
【００５３】
定義
外膜タンパク質
クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の外膜タンパク質は、２％Ｓａｒｋｏｓｙｌなどのデタージェントで、インタクトな精製済み基本小体（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｂｏｄｙ）を処理した後、超遠心分離（１００，０００ｇで１時間）に付すことによって単離することができ、これにより、細胞質ゾル成分を含む上清と、以前記載されている７０外膜タンパク質を含有するペレットが得られる。次に、外膜タンパク質を、標準的タンパク質技術、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の質量分析により同定することができる。
【００５４】
表面露出断片又は領域
細菌表面露出又は外膜タンパク質は、膜貫通タンパク質、分泌及びリポタンパク質、並びにアンカーを欠く表面タンパク質を含む。インタクトな細菌上の表面露出領域は、抗体に接触可能である。タンパク質の表面露出領域（「サーフェソーム（ｓｕｒｆａｃｅｏｍｅ）」を同定する方法は、例えば、インタクトな細菌の膜タンパク質のビオチン化の後、ストレプトアビジンを用いてビオチン標識画分を単離するステップを含む。次に、単離したタンパク質を質量分析により同定することができる。別の手法は、プロテアーゼ、例えば、トリプシンでインタクトな細菌を処理（「シェービング（ｓｈａｖｉｎｇ）」）して、表面露出ペプチドを切断した後、放出されたペプチドを収集して、質量分析による同定に付すものである。
【００５５】
変異型
本明細書に提供する外膜タンパク質の変異型は、クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の様々な血清型由来の同じ遺伝子によってコードされるタンパク質を表す。変異型タンパク質は、参照ポリペプチドと有意な相同性を有する。
【００５６】
タンパク質のアイソフォーム
本出願に関連して、タンパク質の「アイソフォーム」は、同じタンパク質のいくつかの異なる形態の何れか、例えば、同じ機能を有するが、異なる遺伝子によりコード化され、その配列に小さな相違を有し得るタンパク質、又は単一のヌクレオチド多型、ｍＲＮＡの差次的スプライシング、若しくは翻訳後修飾の何れかから生成するタンパク質として理解される。異なる血清型の細菌は、特定のタンパク質の異なるアイソフォームを有することができる。
【００５７】
クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種
「クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種」という用語は、動物又はヒトにおいてクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）感染症を引き起こすことができる細菌として理解される。例として、クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びクラミジア・ムリダルム（Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）がある。また、動物においては、クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）によるいくつかの感染症が知られており、例えば、ブタに感染するクラミジア・スイス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  Ｓｕｉｓ）、及び小型反芻動物（ヒツジ及びヤギ）の流産を引き起こすヒツジ流行性流産クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｈｉｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）などがある。
【００５８】
血清変異型、血清型亜型又は血清型
ＭＯＭＰ可変領域に対する特異的モノクローナル抗体の反応性及びその詳細な配列分析に基づき、Ｃｔは、１５の異なる血清変異型に区分することができ、これらの血清変異型のうち、Ａ、Ｂ、Ｂａ及びＣは、トラコーマを引き起こし、Ｄ〜Ｋは、性行為感染症（ＳＴＤ）、Ｌ１〜Ｌ３は、性病性リンパ肉芽腫を引き起こし、ＭｏＰｎ（クラミジア・ムリダルム（Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ））はマウスに感染する。血清変異型は、同じ意味で、血清型亜型又は血清型と記述される場合もある。
【００５９】
免疫反復配列
免疫反復配列は、抗原の免疫原性部分又は断片を含む１つ又は複数のアミノ酸配列の反復単位として理解される。反復される単位は、反復される１つ又は複数のＶＤ領域として表すことができ、これらは任意選択で、前述のように、伸長することができ、例えば、３つの反復単位を含む４つの例が挙げられる：ＶＤ４−ＶＤ４−ＶＤ４、ＶＤ４−ＶＤ１−ＶＤ４−ＶＤ１−ＶＤ４−ＶＤ１、ＶＤ４Ｄ−ＶＤ４Ｄ−ＶＤ４Ｄ、ＶＤ４Ｄ−ＶＤ４Ｆ−ＶＤ４Ｇ、ＶＤ４Ｄ−ＶＤ３Ｅ−ＶＤ４Ｄ−ＶＤ３Ｅ−ＶＤ４Ｄ−ＶＤ３Ｅ。
【００６０】
相同性免疫反復配列
１つの血清変異型のみに由来する抗原の免疫原性部分又は断片を含む１つ又は複数のアミノ酸配列の反復単位（図４）。
【００６１】
異種免疫反復配列
異なる血清変異型に由来する同じ抗原をコード化する免疫原性部分又は断片を含む１つ又は複数のアミノ酸配列の反復単位（図４）。
【００６２】
異種攻撃
ワクチン接種に用いられるタンパク質が、攻撃に用いられる血清変異型とは異なる細菌血清変異型に由来する、状況を指す。
【００６３】
相同性攻撃
ワクチン接種に用いられるタンパク質が、攻撃に用いられる血清変異型と同じ細菌血清変異型に由来する、状況を指す。
【００６４】
ＭＯＭＰ
Ｃｔの主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）は、Ｃｔの発生周期の全段階中に発現され、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）外膜の全タンパク質の約６０％を占める。ＭＯＭＰは、４つの高可変ドメイン（ＶＤ１−４又はＶＳ１−４）により分断される保存ドメインに区分することができる５９（図１）。
【００６５】
ＶＤ１
アミノ酸９１〜１０５に対応し、Ｃｔ由来のＭＯＭＰにおいて高可変領域を構成する、Ｂａｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）３６により定義されるＭＯＭＰの可変ドメイン１（ＶＤ１）（それぞれ、ＳｖＤ、Ｅ、Ｆ、Ｆ、Ｉａ及びＪ由来の配列番号１〜６ＶＤ１）。伸長ＶＤ１領域（ＶＤ１ｅｘｔ）は、配列番号５７〜１１５に対応し、Ｃｔ由来のＭＯＭＰにおいて高保存領域によりフランキングされる前記高可変領域を構成する（それぞれ、ＳｖＤ、Ｅ、Ｆ、Ｆ、Ｉａ及びＪ由来の配列番号９〜１４ＶＤ１ｅｘｔ）（図３）。
【００６６】
ＶＤ４
アミノ酸３０９〜３３８に対応し、Ｃｔ由来のＭＯＭＰ中の高可変領域を構成する、Ｂａｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）３６により定義されるＭＯＭＰの可変ドメイン４（それぞれ、ＳｖＤ、Ｅ、Ｆ、Ｆ、Ｉａ及びＪ由来の配列番号１５〜２０のＶＤ）。伸長ＶＤ４領域（ＶＤ４ｅｘｔ）は、配列番号２８２〜３４９に対応し、Ｃｔ由来のＭＯＭＰ中の高保存領域によってフランキングされる前記高可変領域を構成する（それぞれ、ＳｖＤ、Ｅ、Ｆ、Ｆ、Ｉａ及びＪ由来の配列番号２３〜２８のＶＤ４ｅｘｔ）。
【００６７】
直線化
本発明において「直線化」という用語は、完全長タンパク質、オリゴペプチド、短いペプチド及びそれらの断片を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を指し、この場合、前記アミノ酸システインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成するのを妨げるために、セリンで置換されている。
【００６８】
中和エピトープ
本発明で使用する中和エピトープは、抗体が結合する抗原決定基を規定し、感染の状況において、例えば、細菌の感染症及び疾患を定着する上で重要な宿主細胞と細菌の相互作用を阻止して、細菌のクリアランスを促進することにより、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）負荷の感染力を低減するアミノ酸配列を意図する。
【００６９】
中和
中和は、細菌が、感染症を定着させる、又は疾患若しくはその症状を引き起こす効率若しくは能力の低下、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）ＥＢ形成の阻害などの細菌の任意の生物活性を包含する。
【００７０】
中和抗体
前述したように中和抗体に結合する抗体。
【００７１】
ポリペプチド
本発明において「ポリペプチド」という用語は、その通常の意味を有するものとする。すなわち、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結される、任意の長さのアミノ酸鎖であり、完全長タンパク質、オリゴペプチド、短いペプチド及びこれらの断片などを含む。
【００７２】
ＩＦＮ−γ
「ＩＦＮ−γ」という用語は、インターフェロン−ガンマであると理解される。ＩＦＮ−γの測定は、免疫学的Ｔ細胞応答の指標として用いられる。
【００７３】
含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）
本明細書の全体を通して、文脈から別の意味に解釈すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群の包含を意味するが、何れか他の要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群の除外を意味するわけではないことは理解されよう。
【００７４】
免疫原性部分又は断片
本発明の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、Ｂ細胞又はＴ細胞のエピトープなどのポリペプチドの免疫原性部分又は断片を含む。
【００７５】
ポリペプチドの免疫原性部分又は断片は、動物又はヒトにおいて、及び／又は生体サンプルにおいて免疫応答を誘発するポリペプチドの一部であり、これは、本明細書に記載の生物学的アッセイの何れかによって決定される。ポリペプチドの免疫原性部分又は断片は、Ｔ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープの何れかであってよい。免疫原性部分又は断片は、ポリペプチドの１つ又は少数の比較的小さい部分に関する場合もあり、これらは、ポリペプチド配列全体に散在するか、又はポリペプチドの特定の部分に位置することができる。少数のポリペプチドの場合、エピトープは、全配列に及ぶポリペプチド全体に散在することも明らかにされている７１。
【００７６】
免疫応答中に認識される関連Ｔ細胞エピトープをみいだすために、「ブルートフォース（ｂｒｕｔｅ  ｆｏｒｃｅ）」方法を使用することができる。Ｔ細胞エピトープは直鎖状であることから、ポリペプチドの欠失突然変異体は、合成で構築された場合、例えば、これらの欠失変異体を、例えば本明細書に記載のＩＦＮ−γアッセイに付すことにより、ポリペプチドのどの領域が免疫認識に必須であるかを明らかにするであろう。別の方法は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープの欠失のための重複オリゴペプチドを使用するが、これは、好ましくは合成であり、例えば、ポリペプチド由来の２０アミノ酸残基の長さを有する。これらのペプチドは、生物学的アッセイ（例えば、本明細書に記載するＩＦＮ−γアッセイ）で試験することができ、これらのいくつかは、ペプチドにおけるＴ細胞エピトープの存在のエビデンスとして、陽性応答を与えるであろう（よって、免疫原性である）。ＭＨＣクラスＩエピトープの欠失については、結合して７２、その後これらの合成ペプチドを生成するペプチドを予測し、これらを、例えば、本明細書に記載するＩＦＮ−γアッセイなどの関連する生物学的アッセイで試験することが可能である。好ましくは、前記ポリペプチド由来の８〜１１アミノ酸残基の長さを有するペプチド。Ｂ細胞エピトープは、例えば、Ｈａｒｂｏｅ  ｅｔ  ａｌ７３に記載されているように、目的のポリペプチドを包含するオーバーラップペプチドに関するＢ細胞認識を分析することによって決定することができる。
【００７７】
免疫原性
免疫原性ポリペプチドは、現在又は過去にクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）に感染した生物学的サンプル又は個体において免疫応答を誘導するポリペプチドとして定義される。
【００７８】
融合タンパク質
融合タンパク質は、共有結合により互いに連結した２つ又は複数のポリペプチドと理解される。融合タンパク質は、ポリペプチドの優れた特徴を備えて生産することができる。例えば、組み換えにより生産する場合、融合タンパク質の輸送を促進する融合パートナー（例えば、シグナルペプチド）、融合タンパク質の精製を促進する融合パートナー（例えば、ｈｉｓタグ）、融合タンパク質の免疫原性を増強する融合パートナーはすべて興味深い候補である。免疫原性を増強するために、融合パートナーは、クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）由来の別のポリペプチド、例えば、ポリペプチド、ポリペプチド断片又は少なくとも１つのＴ細胞エピトープ若しくはＢ細胞エピトープであってもよい。
【００７９】
医薬組成物
医薬組成物は、任意のワクチン（治療及び予防の両方）又は任意の診断試薬として定義される。
【００８０】
ワクチン、タンパク質
本発明の別の部分は、融合タンパク質又は本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含むワクチンに関する。こうしたワクチン組成物の最適な機能を確実にするために、免疫学的及び薬学的に許容される担体、ビヒクル若しくはアジュバントを含むことが好ましい。
【００８１】
本発明の融合タンパク質が、ヒトなどの哺乳動物により認識される有効なワクチンは、ワクチン接種していない個体と比較して、病原性クラジミア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）細菌による攻撃後、標的器官における細菌負荷を低減し、生存期間を延長し、及び／又は体重の減少を軽減する。
【００８２】
好適な担体は、１つ又は複数のポリペプチドが、疎水性標識共有結合相互作用により結合しているポリマー、例えば、可塑性物質（例：ポリスチレン）、あるいは、１つ又は複数のポリペプチドが共有結合しているポリマー、例えば、多糖、又はポリペプチド（例：ウシ血清アルブミン、オボアルブミン若しくはスカシガイヘモシアニン）などからなる群から選択される。好適なビヒクルは、希釈剤及び懸濁剤からなる群から選択される。アジュバントは、好ましくは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、Ｑｕｉｌ  Ａ、ポリＩ：Ｃ、水酸化アルミニウム、フロイント不完全アジュバント、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、トレハロースジベヘナート（Ｄｉｂｅｐｈｅｎａｔｅ）（ＴＤＢ）及びムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、モノミコリルグリセロール（ＭＭＧ）又はこれらの組み合わせから選択される。好ましい組み合わせは、ＴＤＢ及び／又はポリＩ：Ｃと組み合わせたＤＤＡなどのカチオン性リポソームである。
【００８３】
活性成分としてペプチド配列を含有するワクチンの調製物は、米国特許第４，６０８，２５１号明細書；同第４，６０１，９０３号明細書；同第４，５９９，２３１号明細書及び同第４，５９９，２３０号明細書（これらは全て、参照により本明細書に組み込む）によって例示されているように、概して十分に理解されている。
【００８４】
治療ワクチン
本発明はまた、Ｄ．Ｌｏｗｒｙ（Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）により例示される文献に記載されているように、治療ワクチンとして使用するための、本発明のポリペプチド又は核酸の使用にも関する。治療的特性を有する抗原は、ワクチンとして投与したとき、実験動物におけるＣｔ感染症の重症度を軽減するか、又は過去の感染の再活性化を阻止するその能力に基づいてみいだすことができる。治療ワクチンに用いる組成物は、前述したように、ワクチン用に調製することができる。
【００８５】
本発明はまた、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の様々な血清変異型から防御する広範な抗体中和能力を備えた、新規の高度に免疫原性のワクチン抗原を記載する。本発明者らは、ＭＯＭＰ抗原由来の規定断片の反復単位が、ここで免疫反復配列と称する高度に免疫原性の分子を提供することを立証する。様々なアジュバント中にＶＤ４伸長断片（ＭＯＭＰのＶＤ４可変ドメイン及び隣接する保存フランキング領域に及ぶ）を含有する相同性免疫反復単位によるワクチン接種が、非常に高い抗体力価をもたらすことから、本発明者らは、これらの構築物が、ＶＤ４伸長断片の単一単位による免疫よりはるかに効率的であることを立証する。効果の増大は、何れも、力価の顕著な増大、細菌の表面の抗体ターゲティングの増大、中和能力の増大、Ｔ細胞応答の増大及び拡大、並びに相同性株による攻撃からの防御の増大として観測することができる。本発明者らは、さらに、免疫反復単位技術を用いて、例えば、血清亜型Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧなどの様々な血清変異型に由来するＶＤ４伸長断片を基材とする異種免疫反復単位を構築することにより、他の血清変異型に対する防御及びその中和を改善できることも明らかにする（図３）。
2019163253.tif 000003
【００８６】
異種免疫反復単位は、高度に免疫原性であったが、これに加えて、相同性免疫反復配列と比較して、ＶＤ４領域内の直鎖状エピトープのより多様なレパトアをターゲティングする抗体応答（ペプチドスキャンにより測定）のより広範な微細特異性を伴って、抗体応答の範囲を拡大した。本発明者らはまた、高度に免疫原性の異種免疫反復単位が、ＶＤ１及びＶＤ４伸長断片の融合物を含むより大きな断片を基材とし得ることも明らかにすると共に、動物モデルにおいて、これらの異種免疫反復単位により促進される防御が、主として抗体により媒介されることも確認する。一般に、Ｃｔに対する効率的防御免疫応答には、強力なＣＭＩ成分（例えば、Ｔ細胞エピトープ）が必要であることは一般に認識されており、本発明者らは、Ｔ細胞に富んだ領域を含むように、ＶＤ４領域をＮ末端側に十分に伸長することによって、１つの構築物において、高力価の中和抗体を生成する能力と、残留感染を排除する強力なＴ細胞応答とを組み合わせた免疫反復配列を作製できることも明らかにしている。本発明者らはまた、免疫反復配列を、ワクチンの可能性を有するＴ細胞抗原と融合又は混合することができること、並びにこの組み合わせが、Ｃｔに対する早期抗体媒介性防御と、残留生物の効率的なＣＭＩ媒介性クリアランスの両方を達成することも立証した。
【００８７】
ＭＯＭＰは、Ｃｔワクチンにおいて一般に認識される能力を有する重要な防御抗原である。しかし、ＭＯＭＰ抗原は、多くの内部ジスルフィド結合を有する複雑な構造を有し、重要な中和エピトープを組み換え分子中に露出させるのが極めて困難であることから、ワクチンによってターゲティングするのが非常に難しい抗原である。その上、ＭＯＭＰ抗原は、高度に可変性であり、ヒト疾患を引き起こす様々な株に存在する血清変動性の大部分の原理となっている。従って、インタクトなＭＯＭＰを基材とするあらゆるワクチンは、ヒトに疾患を引き起こす主要な株をカバーするために、分子のいくつか（少なくとも４〜５つ）の異なる形態を組み込まなければならないと考えられる。前述したように、ＭＯＭＰ抗原は、４つの可変領域（ＶＤ１〜４領域）を含み、そのうち特にＶＤ１及びＶＤ４は、重要な中和エピトープを含有するが、これらの領域を呈示する断片を基材とするワクチンは、これまでのところ、動物攻撃試験において何らかのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を有する上で、機能性抗体の十分に高い力価を誘導することができなかった５１  ７４。
【００８８】
本発明の免疫反復技術は、この問題を解決する。すなわち、本発明者らは、ＭＯＭＰ抗原由来の保存配列がフランキングする重要な可変ＶＤ１及び／又はＶＤ４領域を反復することにより、並外れたレベルの機能性抗体を促進する免疫原を取得した。驚くことに、保存断片の間に置かれた様々な血清亜型由来の可変領域を使用する異種免疫反復構築物では、免疫原性の向上が達成され得ること、並びにこの戦略によって、様々な血清変異型から防御する広範な中和抗体応答が生み出されることも明らかにした。さらに、免疫反復技術の実施により、直接的エフェクター機能と、隣接Ｂ細胞エピトープに対する加速されたリコール応答を促進する能力とを備えたＴ細胞を促進する多数の関連Ｔ細胞エピトープも提供される。
【００８９】
従って、本発明者らは、広範な応答と、様々な血清亜型を中和する能力を有する効率的なＣｔワクチンを開発する上での新たな発見を呈示する。
【００９０】
多数の反復単位と組織化構造とを備えた抗原は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の活性化に最適であり、体液性応答の増大及びＴ細胞ヘルプに対する依存性の低減をもたらす。これは、様々な病原体（肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）多糖体及びサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）重合フラジェリン）由来の天然多糖体ベースの抗原について最初に報告されており、この場合、抗原の反復性が、複数のＢＣＲを同時にトリガーすることにより、事前のＴ細胞ヘルプを必要とせずに、プラズマＢ細胞からの抗体産生を誘発すると想定される。このような抗原は、２型Ｔ細胞非依存性Ｂ細胞抗原と呼ばれ、これは、人工系において、最小エピトープを構成し、接近して位置する多数の反復単位（典型的に、１２〜１６の最小値７５）に依存することが判明している。これは、大きな断片（６９アミノ酸、Ｍｗ＞７ｋＤａ）が反復され、これらの断片がＢ細胞及びＴ細胞エピトープの両方を含むという本発明者らの技術とは明らかに異なる７６。
【００９１】
以前の観測結果７５とは対照的に、本発明者らは、ただ４つの反復単位による増大を観測し、これは、８つの反復単位によって、それ以上改善されない。重要なことには、超可変ドメインが挿入された保存配列の反復は、応答を反復保存エレメントに対してだけではなく、重要なことには、可変挿入片に対しても増幅する。この驚くべき増幅を裏付ける分子機構は、完全には明らかではないが、恐らく、重要なエピトープの多くが、可変領域と保存領域との間のオーバーラップに位置し、これにより、エピトープの保存部分のある程度の認識を共有する様々なＢＤＲの同時トリガーを可能にし得ることに関連すると考えられる。完全には明らかではないが、実際の結果として、異種免疫反復技術は、様々な血清変異型をターゲティングする多様な抗体応答の生成を促進する多価免疫原の合成を可能にする。
【００９２】
本発明の免疫反復構築物は、ＣｔＭＯＭＰ由来の可変ドメインを使用する従来の試みと比較して、極めて優れた免疫原性の抗原をもたらす。ＭＯＭＰのＶＤを基材とする従来のワクチンは全て、ある程度の機能的能力を有する抗体を生成するものの、生殖器クラミジア攻撃からのｉｎ  ｖｉｖｏ防御に変換される力価を生み出すことはできなかった５１、６５、６４。特に、異種免疫反復戦略は、多くの病原体に見られる非常に根本的な問題を解決することから、多様かつ可変性の抗原に対する多様な抗体応答を促進する方法である。
2019163253.tif 000004
2019163253.tif 000005
2019163253.tif 000006
2019163253.tif 000007
2019163253.tif 000008
2019163253.tif 000009
2019163253.tif 000010
【００９３】
本発明の核酸、すなわち、前述の融合タンパク質をコード化する核酸を用いて、免疫原性ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ発現を実施することができる。換言すれば、Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９３（参照により本明細書に組み込まれる）に論述されているように、前記核酸をいわゆるＤＮＡワクチンに用いることができる。
【００９４】
ＤＮＡワクチン接種に用いられ、定義される融合ポリペプチドをコード化するプラスミドＤＮＡの構築及び調製において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主細胞を用いることができる。次に、目的のプラスミドを担持する宿主株の一晩の培養物からプラスミドＤＮＡを作製して、例えば、内毒素除去ステップを含むＱｉａｇｅｎ  Ｇｉｇａ−Ｐｌａｓｍｉｄカラムキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、精製することができる。ＤＮＡワクチン接種に用いるプラスミドＤＮＡは、内毒素を含まないことが必要である。
【００９５】
従って、本発明はまた、本発明の核酸を含むワクチンにも関し、このワクチンは、ワクチンが投与されたヒトなどの動物による免疫原性ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ発現を実施し、発現されたポリペプチドの量は、ヒトなどの動物における病原性細菌によって引き起こされる感染症に対して実質的に増大した耐性を付与する上で有効なものである。
【００９６】
こうしたＤＮＡワクチンの有効性は、場合によっては、免疫応答を調節する能力を有するポリペプチドをコード化するＤＮＡ断片と一緒に発現産物をコード化する遺伝子を投与することによって増強することができる。
【００９７】
細胞性免疫応答を有効に活性化する１つの可能性は、非病原性微生物又はウイルスにおいて関連免疫原性ポリペプチドを発現させることにより達成することができる。このような微生物の公知の例としては、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属及びシュードモナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ）属があり、ウイルスの例としては、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ）及びアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）がある。
【００９８】
従って、本発明の別の重要な態様は、現在入手可能な生ＢＣＧワクチンの改善であり、微生物が融合ポリペプチドを発現し、分泌することを可能にするように、１種以上の融合ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列の１つ又は複数のコピーが微生物に組み込まれている。免疫応答を増強するために、本発明の核酸配列の２つ以上のコピーの組み込みが考慮される。
【００９９】
別の可能性は、本発明の融合ポリペプチドをコード化するＤＮＡを、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）又はアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）などの弱毒化ウイルスに組み込むことである（Ｒｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ  １９９７）。組み換えワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ）は、感染した宿主細胞の細胞質又は核内に進入することができるため、目的の融合ポリペプチドは、免疫応答を誘導し、これが、ＴＢからの防御を誘導すると考えられる。
【０１００】
ＤＮＡワクチンは、１６年以上前に開発されたが、ヒトにおける病期Ｉ及びＩＩの前の臨床試験は稀である。しかし、２つの動物用ワクチンがライセンスを得ており：１つは、ウエストナイルウイルス（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  Ｖｉｒｕｓ）（ウマ）に対するもので、もう１つは、サケ（Ｓａｌｍｏｎ）における伝染性造血器壊死症ウイルスに対するものである。これは、ＤＮＡワクチンが、優れた防御効果を有し得ること、並びに、新規のＤＮＡワクチンが、動物の大きさ又は種によって制限されないことを示している。第１世代ＤＮＡワクチンのマウスモデルについて観察されたＤＮＡワクチンによる大きな成功は、ヒトにはうまく移行しなかった。それでも、研究者らは、近年、ヒトへの単回用量の遺伝子ガン投与ＨＡ  ＤＮＡワクチンによる防御抗体レベルを立証した。
【０１０１】
「核酸免疫」又は一般に好まれる名称「ＤＮＡワクチン」は、遺伝子産物に対する免疫の誘導を目的とする、発現カセット若しくは発現ベクターとしての、又はウイルスベクターに組み込まれる、抗原コード化ＤＮＡ若しくはＲＮＡの接種である。従って、ＤＮＡワクチンの本発明者らの定義には、抗原コード化ＤＮＡ又はＲＮＡのあらゆる種類の送達系が含まれる。ワクチン遺伝子は、発現に必要である重要な特徴だけを備える環状プラスミド又は線状発現カセットの形態であってよい（プロモータ、ワクチン遺伝子及びポリアデニル化シグナル）。送達系は、最も一般的には、アジュバントを含む、又は含まないバッファー中のネイキッドＤＮＡ、ナノ粒子に結合された、及び／用いて、化合物を含有するアジュバント中に製剤化された、又はアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＡＶ）、αウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（ｐｏｘＶｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ）などの生ウイルス若しくは細菌ベクターに挿入されたＤＮＡであってよい。ＤＮＡワクチンは、生ウイルスワクチンに関連する同じ危険性を伴わずに、体液性及び細胞性免疫の両方を引き起こすことから、非常に有望である。生弱毒化ウイルスワクチンとは対照的に、ＤＮＡワクチンは、特定の受容体に結合しなければならない生ウイルスと同じ、又はそれとは異なる組織若しくは細胞に送達することができる。その天然形態での抗原の生産は、宿主免疫系に対する抗原の呈示を改善する。生弱毒化ワクチンとは異なり、ＤＮＡワクチンは、感染性ではないため、病毒性に逆戻りする可能性はない。
【０１０２】
ＤＮＡワクチンは、従来のワクチンに対して多くの利点をもたらす。これは、卵中での増殖の必要がなく、短時間で大量に生産することができ、費用効果的で、再現性であり、しかも、ＤＮＡは、安定的で、極端な温度に対して耐性であるため、最終生成物は、低温貯蔵条件を必要としない。既存のライセンス取得不活性化ワクチンは全て、体液性抗体応答を誘導するのに効率的であるが、生弱毒化ウイルスワクチンだけが、細胞傷害性細胞性応答も効率的に誘導する。ＤＮＡワクチンは、この能力も有するため、誘導された応答は、特異性及び抗体アイソフォームに関して、不活性化ワクチンよりウイルス感染に対する天然の応答をより良好に模倣し得る。
【０１０３】
ＤＮＡワクチンは、体液性及び細胞性免疫の両方を活性化することにより、天然のウイルス感染により獲得された応答と同等の免疫応答を誘導する。ＤＮＡワクチンに対する広範な応答は、トランスフェクトされた宿主細胞により発現されるコード化遺伝子によってもたらされるものであり、これは、Ｔｈ１及びＴｈ２免疫応答の両方を誘導する。ネイティブ形態での抗原の生産によって、宿主免疫系に対する抗原の提示が向上する。
【０１０４】
ＤＮＡワクチン投与の最も一般的な２つのタイプは、ネイキッドＤＮＡの食塩水注射及び遺伝子ガンＤＮＡ接種である（ヘリウム圧力を用いて投与される、固体金ビーズにコーティングされたＤＮＡ）。ＤＮＡの食塩水筋肉内注射は、優先的に、Ｔｈ１ＩｇＧ２ａ応答を生成するが、遺伝子ガン送達は、より多くのＴｈ２  ＩｇＧ１応答を開始する傾向がある。筋肉内注射したプラスミドは、細胞外デオキシリボ核酸によって分解される危険性があるが、誘導された応答は、多くの場合、遺伝子ガン方法によって誘導されたものより長命である。表皮への遺伝子ガン送達によるワクチン接種は、恐らく、皮膚が、プロフェッショナル抗原提示細胞などの体液性及び細胞傷害性細胞性免疫応答の両方を誘発するのに必要なすべての細胞型（ランゲルハンス及び樹状細胞）を含むために、免疫の最も有効な方法であることが証明されている。致死量のインフルエンザウイルスからの完全な防御は、マウスにおいて１μｇという少量のＤＮＡで達成されている。標準的ＤＮＡワクチンベクターは、真核細胞における最適発現のために操作した細胞プラスミドにクローニングされた目的の遺伝子から構成される。重要な特徴には、以下のものが含まれる；細菌における生産を可能にする複製起点、細菌培養物中のプラスミド選択を可能にする細菌の抗生物質耐性、哺乳動物における最適な発現のための強力な構成プロモータ（サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）又はシミアンウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ）由来のプロモータは、最も高い遺伝子発現をもたらす）、ウシ成長ホルモン（ＢＨＧ）又はシミアンウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ）ポリアデニル化などのｍＲＮＡ転写物を安定化するためのポリアデニル化配列、並びに抗原遺伝子の挿入のための複数のクローニング部位。イントロンＡ配列は、遺伝子の発現を顕著に改善する。多くの細菌ＤＮＡワクチンベクターは、非メチル化シチジンリン酸−グアノシン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドモチーフを含み、これは、宿主において強力な自然免疫応答を誘発し得る。近年、ＤＮＡワクチン構築物に対して免疫応答を増強し、カスタマイズするいくつかの手法が開発されている（第２世代ＤＮＡワクチン）。例えば、２つの遺伝子を同時に発現するために、ジシストロニックベクター又は複数の遺伝子発現プラスミドが用いられている。特定の組織に遺伝子発現を限定する特異的プロモータが作製されており、また、免疫応答を増強するようにサイトカイン／抗原融合遺伝子が構築されている。さらに、遺伝子は、宿主において最適な遺伝子発現のために最適化されたコドンであってもよいし、ナイーブリーダ配列を、翻訳効率を高める最適化リーダで置換してもよい。
【０１０５】
ＤＮＡワクチンの投与は、ネイキッドＤＮＡ若しくはＲＮＡの食塩水若しくは緩衝食塩水注射、又は粒子に結合したＤＮＡ断片を発現するＤＮＡプラスミド若しくは直鎖状遺伝子発現ＤＮＡ断片の注射により行うか、あるいは、遺伝子ガンにより接種するか、又はアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、修飾ワクシニアウイルス（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＶＡ）、ワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＡＶ）、αウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）などにより送達することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、Ｆｉｎｄｌａｙ  ｅｔ  ａｌ７７から改変したＭＯＭＰ（血清亜型Ｄ、株：Ｄ／Ｂ−１２０）膜形態のモデルである。ＡＡ配列、及び５つの定常セグメント（ＣＳ）の間に描かれる線状モデルＭＯＭＰにおいて、ＶＤ１、ＶＤ２、ＶＤ３及びＶＤ４を黒い線で示す。
【図２】図２は、血清亜型Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｆ、Ｉａ及びＪのＭＯＭＰ  ＶＤ４ｅｘｔのアミノ酸配列のアラインメントである。血清亜型Ｄ配列をプロトタイプとして用い、他の血清亜型における保存アミノ酸を「．」として示す。Ｂａｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ（ＰＮＡＳ，１９８８）３６による可変ドメインＶＤ４は、グレーで網かけし、保存エピトープＴＴＬＮＰＴＩＡＧを四角で囲む。
【図３】図３は、Ｆｉｎｄｌａｙ  ｅｔ  ａｌから改変したＭＯＭＰ（血清亜型Ｄ、株：Ｄ／Ｂ−１２０）膜形態のモデルである。図中、本発明で説明するＶＤ１ｅｘｔ及びＶＤ４ｅｘｔを網かけして示す。
【図４】図４は、相同性及び異種免疫反復配列の設計を示す図である。免疫反復配列は、例えば、４つのＶＤ４ｅｘｔ領域からなる融合タンパク質であり、同じ血清亜型由来、すなわち相同性免疫反復配列、又は異なる血清亜型由来、すなわち異種免疫反復配列の何れかである。各ＶＤ４ｅｘｔ領域内の可変ＶＤ４領域に斜線を引いて示す。
【図５】図５は、単量体ＶＤ４ｅｘｔ単位と比較して、ＶＤ４ｅｘｔの相同性免疫反復配列による免疫後に増強及び拡大された免疫応答である。
【図６】図６は、ＳｖＤ、Ｅ、Ｆ及びＧ由来の異種免疫反復配列から構成される構築物は、ＳｖＦ由来の相同性免疫反復配列と比較して、複数の血清亜型に対し、強力な応答を誘導したことを示す。
【図７Ａ】図７は、（ＳｖＥｅｘｔＶＤ４）＊４及び（ＳｖＦｅｘｔＶＤ４）＊４由来の相同性免疫反復配列から構成される構築物と比較した、ＳｖＤ、Ｅ、及びＦ由来の伸長ＶＤ４単位からなる異種免疫反復配列（ＣＴＨ８９）による免疫後の抗体応答の微細な特異性である。
【図７Ｂ】図７は、（ＳｖＥｅｘｔＶＤ４）＊４及び（ＳｖＦｅｘｔＶＤ４）＊４由来の相同性免疫反復配列から構成される構築物と比較した、ＳｖＤ、Ｅ、及びＦ由来の伸長ＶＤ４単位からなる異種免疫反復配列（ＣＴＨ８９）による免疫後の抗体応答の微細な特異性である。
【図７Ｃ】図７は、（ＳｖＥｅｘｔＶＤ４）＊４及び（ＳｖＦｅｘｔＶＤ４）＊４由来の相同性免疫反復配列から構成される構築物と比較した、ＳｖＤ、Ｅ、及びＦ由来の伸長ＶＤ４単位からなる異種免疫反復配列（ＣＴＨ８９）による免疫後の抗体応答の微細な特異性である。
【図７Ｄ】図７は、（ＳｖＥｅｘｔＶＤ４）＊４及び（ＳｖＦｅｘｔＶＤ４）＊４由来の相同性免疫反復配列から構成される構築物と比較した、ＳｖＤ、Ｅ、及びＦ由来の伸長ＶＤ４単位からなる異種免疫反復配列（ＣＴＨ８９）による免疫後の抗体応答の微細な特異性である。
【図８】図８は、ＳｖＤ、ＳｖＥ及びＳｖＦ由来の伸長ＶＤ４からなる異種免疫反復配列（ＣＴＨ８９）による免疫は、ＳｖＤ攻撃後に早期Ｔ細胞非依存性防御を誘導することを示す。
【図９】図９は、ＣＴＨ８９特異的血清によるｉｎ  ｖｉｖｏ中和である。
【図１０】図１０は、異種免疫反復配列と組み換えＭＯＭＰとの結合である。
【図１１】図１１は、ＳｖＤ（ＣＴＨ８７）由来の単一ＶＤ１−ＶＤ４単位（ＣＴＨ８７）によるワクチン接種と比較した、ＳｖＤ、ＳｖＥ及びＳｖＦ由来のＶＤ１−ＶＤ４領域の異種免疫反復配列（ＣＴＨ８８）によるワクチン接種である。
【図１２】図１２は、Ｔ細胞抗原とＶＤ４の免疫反復配列との結合である。
【図１３】図１３は、異種ＶＤ４免疫反復配列とＴ細胞抗原融合分子とのカクテルによる免疫である。
【図１４】図１４は、アジュバント送達系としてのＣＡＦ０１とミョウバンの比較である。
【図１５】図１５は、ＳｖＤ、ＳｖＥ、ＳｖＦ及びＳｖＧ由来のＶＤ４ｅｘｔ領域から構成される異種免疫反復配列によるワクチン接種である。
【図１６】図１６は、ＳｖＤ、ＳｖＥ、ＳｖＦ、ＳｖＧ、ＳｖＩａ及びＳｖＪ由来の伸長ＶＤ４ｅｘｔ領域から構成される異種免疫反復配列によるワクチン接種である。
【０１０７】
材料及び方法
クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の培養
Ｃｔ血清亜型Ｄ、Ｅ及びＦをＨｅｌａ２２９細胞において増殖させた（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）。５％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ；熱不活性化）、１％ｖ／ｖＨｅｐｅｓ、１％ｖ／ｖＬ−グルタミン、１％ｖ／ｖピルビン酸塩及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）培地中で、細胞を培養した。６ウェルプレート中のＨｅｌａ２２９細胞の半密集単層を、０．３ｍｌ  ＳＰＧ緩衝液／ウェル中のＣｔ血清亜型Ｅ又はＦの、細胞当たり１．５封入体形成単位で感染させた。プレートを、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  ３Ｓにより７５０ｇで１時間遠心分離した後、プレートロッカー上で、３５℃で２時間インキュベートした。２時間後、５％グルコース及び１μｇ／ｍｌシクロヘキシミドを補充した２ｍｌの培地をウェル毎に添加し、加湿空気中５％ＣＯ２の雰囲気において３７℃で７２時間さらにインキュベートした。
【０１０８】
Ｃｔの回収
感染から７２時間後にクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）を回収した。セルスクレイパーを用いて、細胞をウェルから取り出し、３５．０００ｇ及び４℃で３０分遠心分離した。ペレットをＨＢＳＳ中に再懸濁させ、氷上で音波処理した後、５００ｇ及び４℃で１５分遠心分離した。上澄みを回収し、氷上に取っておき、前と同じ量までペレットを再懸濁させ、音波処理及び遠心分離を繰り返した。２つの上清をプールし、３００００ｇ及び４℃で３０分間遠心分離した後、注射器を用いて、ペレットをＳＰＧ緩衝液（３ｍｌ／プレート）に再懸濁させた。短時間の音波処理後、懸濁液を３０％ジアトリゾエート溶液（７６ｍｌのＨ２Ｏ中５０ｇのメグルミンジアトリゾエート、７．７ｇのナトリウムジアトリゾエート）上に穏やかに重ねた後、４０，０００ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、ペレットをＳＰＧ緩衝液中に再懸濁させた後、−７０℃で保存した。ＭｃＣｏｙ細胞上での滴定により、バッチのＩＦＵを定量し、ＢＣＡによりバッチの濃度を決定した。
【０１０９】
抗原及び融合物調製方法
クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清亜型Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧのゲノムは一般に入手可能である（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ）。全て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質発現系へのクローニングのために合成により得られた、クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）抗原及び融合物をコードする遺伝子（ＤＮＡ２．０）。ｐＥＴ４１１ベクターは、ヒスチジンアフィニティタグを用いた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組み換えクラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）タンパク質の発現に使用した。細菌宿主は、ＢＬ２１−ＳＴＡＲ（商標）であった。対数期ＯＤ６００〜０．５に到達するまで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を３７℃で増殖させてから、タンパク質発現を４時間にわたって誘導した後、細胞を遠心分離（６，０００ｇで１５分間）により回収した。ベンゾナーゼ、ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ及びプロテアーゼ阻害剤カクテルＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有するＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を単離した。封入体を遠心分離（１０，０００ｇで１０分間）により分離した。ペレットを、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５中に溶解させてから、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にロードした後、５０〜５００ｍＭイミダゾールの勾配を適用することによって、結合タンパク質を溶離した。抗原及び融合物の等電点に応じて、これらをイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により、タンパク質濃度を決定した。
【０１１０】
動物
８〜１２週齢のメスＢ６Ｃ３Ｆ１マウスをＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得した。動物は、標準的な環境条件下で収容し、標準的飼料及び水を不断給餌した。マウスの使用は、デンマーク法務省（Ｄａｎｉｓｈ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｊｕｓｔｉｃｅ）（Ｌｏｖ  ｏｍ  ｄｙｒｅｆｏｒｓｏｇ，ｊｖｆ  ｌｏｖｂｅｋｅｎｄｅｌｓｅｒ  ｎｒ．７２６  ａｆ９．１９９３年９月）、及び動物保護委員会により規定される規則に従う。実験の詳細な説明は、本出願人が開催する地域倫理審査委員会（ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｅｔｈｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄ）に提出し、承認された（２０１２−１５−２９３４−００１００）。
【０１１１】
免疫
マウスは、１４日おきに３回免疫した。ポリペプチドをＣＡＦ０１中で乳化させた後、皮下（ｓｃ）及び鼻内（ｉ．ｎ．）経路により同時に投与した。両ルートにより投与されたワクチンは、２５０ｕｇのＤＤＡ及び１００ｕｇのＴＤＢ中で乳化させた５ｕｇのペプチド（前掲参照）から構成された。負の対照として、ペプチドを含まないＤＤＡ／ＴＤＢを単独で注射した。
【０１１２】
クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）特異的細胞性応答
血液リンパ球及び脾細胞を精製した。血液リンパ球は、各群の８匹からプールし、脾細胞は、個別に（ｎ＝４）培養し、培養は、５×１０−５  Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭグルタミン、１％ピルビン酸塩、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％ＨＥＰＥＳ及び１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を補充した２００μｌの量のＲＰＭＩ−１６４０に２×１０５細胞／ウェルを含有する丸底マイクロプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）において３回繰り返した。１〜１０μｇ／ｍｌの個別の抗原又はＶＤ１及びＶＤ４ペプチドプール（各々２μｇ／ｍｌのペプチド）で細胞を再刺激した。細胞生存能の正の対照及び負の対照として、それぞれＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（５μｇ／ｍｌ）又は培地による刺激。５％ＣＯ２中で、３７℃で７２時間のインキュベーション後、上清を回収し、使用まで−２０℃で保存した。分泌したＩＦＮ−γの量を酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により決定した。
【０１１３】
血清抗体
最後のワクチン接種から様々な時点で、マウスから採血し、血清を遠心分離により単離した。血清を、Ｃｔ表面（ＳｖＤ、ＳｖＥ及びＳｖＦ）に対する、ＳｖＥ  ＶＤ４単量体に対する、並びにＳｖＤ、ＳｖＥ及びＳｖＦのＶＤ４領域にまたがるペプチド（表４及び５）に対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより試験した。手短には、プレートを炭酸塩緩衝液中の４℃の抗原（１〜１０ｕｇ／ｍｌ）で一晩被覆し、ＢＳＡでブロックした後、洗浄した。次に、プレートを、前希釈したサンプルと一緒に４℃で一晩インキュベートし、洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合二次抗体と一緒に１時間インキュベートした。ＴＭＢ基質とのインキュベーションにより反応物を視覚化してから、反応を硫酸で停止し、４５０ｎｍで読み取りをした。ＳｖＤ（ＳｖＥ）（表６）及びＳｖＦ（表７）のＶＤ４領域にまたがる９量体オーバーラップペプチドパネルに対するＥＬＩＳＡ反応性を調べた際、微細な変更を実施した。手短には、プレートをストレプトアビジンで処理してから、ビオチニル化ペプチドで被覆し、脱脂粉乳を用いて室温で２時間ブロックした後、洗浄した。次に、プレートを、前希釈した（１：１００）血清サンプルと一緒に室温で２時間インキュベートし、洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合二次抗体と一緒に１時間インキュベートした。ＴＭＢ基質とのインキュベーションにより反応物を視覚化してから、反応を硫酸で停止し、４５０ｎｍで読み取りをした。
【０１１４】
中和アッセイ
５％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ；熱で不活性化）、１％ｖ／ｖＨｅｐｅｓ、１％ｖ／ｖＬ−グルタミン、１％ｖ／ｖピロビン酸塩及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンで補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、９６ウェル平底マイクロプレートにおいて、ＨａＫ細胞を密集まで増殖させた。
【０１１５】
クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）ストックを事前に滴定し、ＳｖＥについては３×１０６ＩＦＵ／ｍｌ、ＳｖＤについては２×１０６ＩＦＵ／ｍｌ及びＳｖＦについては５×１０６ＩＦＵ／ｍｌまで希釈した。ワクチン接種マウスから単離した血清（プールしたもの）を５６℃で１／２時間かけて熱不活性化し、２〜４倍希釈した後、４〜５回滴定した。８０μｌの細菌懸濁液を８０μｌの血清（＋／−２０μｇ／ｍｌのペプチド）と混合してから、低速揺動プラットフォーム上で、３７℃で３０分間インキュベートした後、５０μｌの懸濁液を、事前に調製しておいたＨａＫ細胞に、２回繰り返して接種した。このために、培地をＨａＫ単層から除去し、０．５％グルコース及び１０μｇ／ｍｌシクロヘキサミドを補充した１００μｌの前記培地を添加した後、５０μｌの血清／細菌懸濁液を添加した。低速揺動プラットフォーム上で、プレートを３５℃でインキュベートした後、接種材料を除去し、０．５％グルコース及び１０μｇ／ｍｌシクロヘキサミドを補充した１００μｌの前記培地を添加した。次に、加湿空気中５％ＣＯ２の雰囲気においてプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を取り出し、単層を９６％エタノールで１０分固定した。本発明者らの研究室で作製したポリクローナルウサギ抗ＣＴ７５５血清、続いてＦＩＴＣ結合ブタ抗ウサギ免疫グロブリン（Ｄａｋｏ）で染色することにより、封入体を視覚化した。バックグラウンド染色は、ヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で実施した。
【０１１６】
膣攻撃及び膣クラミジア負荷
Ｃｔ血清亜型Ｄ攻撃の１０日及び３日前に、２．５ｍｇのメドロキシプロゲステロンアセタト（Ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎａｃｅｔａｔ）（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ；Ｐｆｉｚｅｒ）の注射により、発情周期を合わせた。最終ワクチン接種から６週間後に、１０μｌのＳＰＧ緩衝液中の４〜８×１０５ＩＦＵのＣｔ血清亜型Ｄで、マウスをｉ．ｖａｇ攻撃した。感染から３、７、１０及び１４日後、膣スワブを取得した。スワブを、０．６ｍｌのＳＰＧ緩衝液中でガラスビーズと一緒にボルテックスした後、−８０℃で分析まで保存した。１７に記載されているように、感染負荷を決定した。手短には、ＭｃＣｏｙ細胞単層を滴定量のスワブ懸濁液で、２回繰り返して感染させた。プレートを７５０×ｇで、ＲＴにて１時間遠心分離した後、３５℃で２時間のインキュベーションを実施した。続いて、感染培地を新鮮な培地に取り換え、細胞を３７℃で３０時間インキュベートした。本発明者らの研究室で作製したポリクローナルウサギ抗ＣＴ６８１血清、続いてＦＩＴＣ結合ブタ抗ウサギ免疫Ｉｇ（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で染色することにより、封入体を視覚化した。バックグラウンド染色は、ヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔａａｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で実施した。各ウェルについて少なくとも２０の個別の視野を観察する蛍光顕微鏡検査により、封入体を数え上げた。
【０１１７】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の欠失
モノクローナル抗マウスＣＤ４（クローンＧＫ１．５）及び抗マウスＣＤ８（クローンＹＴＳ１５６及びＹＴＳ１６９、Ｓｅｐｈｅｎ  Ｇｏｂｂｏｌｄから無償提供）７８，７９を、ＨｉＴｒａｐタンパク質Ｇ  ＨＰカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、本発明者らの研究室で作製したハイブリドーマ上清から精製した。精製済みＩｇＧをＰＢＳに対して透析し、０．２２ｕｍを通してろ過した後、タンパク質濃度をＯＤ２８０ｎｍにより決定した。感染日から−７、−４、−１及び＋２及び＋６日に、２５０〜３００μｇの精製済み抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８抗体の混合物の４回の注射により、マウスからＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を欠失させた。ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４抗体（クローンＲＭ４−４）及びＰＥ−結合抗ＣＤ８抗体（クローン５３−６）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、感染から１日後に、ＰＢＭＣでのＦＡＣＳ分析により、ＣＤ４＋及び抗ＣＤ８＋Ｔ細胞の欠失を確認した。
【０１１８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ欠失
クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）血清亜型Ｄストックを滴定した後、８×１０４ＩＦＵ／μｌまで希釈し、異種ＶＤ４免疫反復ＳｖＤ−ＳｖＥ−ＳｖＦ（ＣＴＨ８９）で免疫したマウスから単離した血清と混合した。Ｃｔ血清亜型Ｄ攻撃の１０及び３日前に、２．５ｍｇのメドロキシプロゲステロンアセタト（Ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎａｃｅｔａｔ）（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ；Ｐｆｉｚｅｒ）の注射により、発情周期を合わせた。１０μｌの前記混合物（４×１０５ＩＦＵのＣｔ血清亜型Ｄ）で、マウスをｉ．ｖａｇ攻撃した。感染から３、７及び１０日後、膣スワブを取得した。
【０１１９】
統計的解析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４を用いて統計的解析を実施した。クラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）、次にダンポストテスト（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ）又はマン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）を用いて、膣クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）負荷の中央値を解析した。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：単量体ＶＤ４ｅｘｔ単位と比較した、ＶＤ４ｅｘｔの相同性免疫反復配列による免疫後の免疫応答の増強
序論
この場合、本発明者らは、血清亜型Ｅの伸長ＶＤ４断片を含むポリペプチド単位（配列については、図２を参照）（ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔ）を選択した。これらのドメインに対する免疫応答を増強するために、本発明者らは、ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔ単位が、反復して提示される、組み換えポリペプチドを設計した。本構築物の反復形態が、単量体形態と比較して、抗体応答を増強することができるかどうかを調べるために、本発明者らは、これらの単位が、単一単位として、又は反復方式の何れかで提示される組み換えポリペプチドを設計した。血清亜型Ｅ（ＳｖＥ）の場合、単量体（ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔ）＊１（ＣＴＨ１８１）、伸長ＶＤ４単位の４免疫反復配列（ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔ）＊４（ＣＴＨ５２７）及び８免疫反復配列（ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔ）＊８（ＣＴＨ５２６）を構築した。これらの免疫反復構築物は、アジュバントＣＡＦ０１を用いて製剤化した後、マウスをワクチン接種するのに用いた。各マウスは、２×５μｇのペプチドでワクチン接種し、従って、ＶＤ４の量は同じである。構築物の免疫原性を、ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔ、ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔを包含するペプチド、及びクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）の細菌表面に対して、ＥＬＩＳＡにより試験した。
【０１２１】
結果
群当たり６匹のマウスに、１４日の間隔を置いて２回免疫した。ワクチン（２×５μｇ）をＣＡＦ０１中で乳化した後、ｓｃ．及びｉ．ｎ経路により同時に投与した。最後のワクチン接種から特定の時点で、血液を採取して、ＳｖＥ由来の伸長ＶＤ４に対する、及びＳｖＥの細菌表面に対する、抗体レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。単一ＶＤ４ｅｘｔ単位によるワクチン接種（単量体ＶＤ４ｅｘｔ、ＣＴＨ１８１）は、（ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔ）＊４の４ＶＤ４ｅｘｔ反復配列から構成される相同性免疫反復により誘導されるレベルと比較して、低いレベルのＶＤ４ｅｘｔ特異的抗体を誘導した（図５Ａ）。（ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔ）＊４で免疫した後に認められるより高い抗体応答は、（ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔ）＊１で免疫したマウスから単離した血清と比較して、より強度の細菌表面の認識をもたらした（図５Ｂ）。伸長ＶＤ４領域にまたがる１０ａａオーバーラップを有する２０量体ペプチドに対する応答もまた、１：５００血清希釈度で試験したとき、単量体ＶＤ４ｅｘｔ単位で免疫したマウスの群と比較して、増強され、（ＶＤ４ｅｘｔ）＊４相同性免疫反復配列群に、より広範なエピトープ認識パターンをもたらした（図５Ｃ）。単量体構築物で免疫した群では、応答は、ＴＴＬＮＰＴＩＡＧエピトープを含有する中央領域に排他的にターゲティングされるのに対し、そのエピトープの上流及び下流の両方で相同性免疫反復配列に暴露される複数のＢ細胞エピトープによる免疫は、様々なエピトープの多様なエピトープ認識パターンをもたらした。本発明者らは、引き続き、８（ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔ）＊８（ＣＴＨ５２６、配列番号３０）の免疫反復配列が、４（ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔ）＊４より免疫原性であるかどうかを調べた。２つの構築物は、伸長ＶＤ４単位及びＳｖＥの細菌表面に対して同様のレベルの抗体を誘導した。
【０１２２】
結論
本発明者らは、血清亜型Ｅ由来の伸長ＶＤ４単位の免疫反復で免疫することによって、力価（図５Ａ及びＢ）、並びに伸長ＶＤ４単位に対して指令される応答の範囲（図５Ｃ）の両方として測定される抗体応答を大幅に増強することができ、細菌表面対して強力な反応性をもたらすことができる。反復単位の数を４から８に増加することによる抗体力価及び中和力価の増大は認められなかった。
【０１２３】
実施例２：ＳｖＤ、Ｅ、Ｆ及びＧ由来の異種免疫反復単位から構成される構築物（ＣＴＨ５１８）は、ＳｖＦ由来の相同性免疫反復配列と比較して、様々な血清亜型に対する、より強力な応答を誘導した。
【０１２４】
序論
本発明者らは、ＳｖＤ、ＳｖＥ，ＳｖＦ及びＳｖＧ由来の伸長ＶＤ４単位から構成される異種免疫反復配列（ＣＴＨ５１８）による免疫が、強力な免疫原性を維持すると共に、ＳｖＦ（ＳｖＦ  ＶＤ４ｅｘｔ）＊４由来の伸長ＶＤ４単位から構成される相同性免疫反復配列（ＣＴＨ５２９）による免疫と比較して、複数の血清亜型の表面を認識する、より広範な抗体応答を誘導することができるかどうかを調べた。これらの免疫反復構築物は、アジュバントＣＡＦ０１で製剤化して、マウスをワクチン接種するのに用いた。上記構築物の免疫原性は、血清亜型Ｄ、Ｅ及びＦの細菌表面に対してＥＬＩＳＡにより試験した。
【０１２５】
結果
異種免疫反復配列は、ＳｖＦ由来の相同性免疫反復配列について認められた応答と同じ高レベルで、血清亜型Ｆ株の表面を認識する抗体応答を促進した。しかし、４つの血清亜型（ＳｖＤ、ＳｖＥ，ＳｖＦ、ＳｖＧ）由来の伸長ＶＤ４領域を含有する異種免疫反復配列での免疫によって、本発明者らは、血清亜型Ｆ由来の相同性免疫反復配列と比較して、Ｄ及びＥ血清亜型に対する顕著に増加した力価を観測した。
【０１２６】
結論
異種伸長ＶＤ４の免疫反復配列から構成される構築物による免疫は、異種免疫反復配列の顕著な免疫原性を維持しながら、複数の血清亜型（Ｄ、Ｅ及びＦ）の表面を認識する、より広範な応答を誘導した。
【０１２７】
実施例３：（ＳｖＥｅｘｔ  ＶＤ４）＊４、（ＳｖＦｅｘｔ  ＶＤ４）＊４及び以前公開されたＡ８−ＶＤ４ペプチド６５由来の相同性免疫反復配列から構成される構築物と比較した、血清亜型Ｄ、Ｅ及びＦ由来の伸長ＶＤ４単位の異種免疫反復配列による免疫後の抗体応答の特異性。
【０１２８】
序論
本発明者らは、血清亜型Ｅ（ＳｖＥｅｘｔＶＤ４）＊４（ＣＴＨ５２７）、ＳｖＦ（ＳｖＦｅｘｔＶＤ４）＊４反復単位（ＣＴＨ５２４）及びＡ８−ＶＤ４ペプチド由来の伸長ＶＤ４領域から構成される相同性免疫反復配列による免疫と比較して、ＳｖＤ、ＳｖＥ、ＳｖＦ由来の伸長ＶＤ４ドメインからなる異種免疫反復配列（ＣＴＨ８９）による免疫後の免疫応答の特異性を調べた。これらの構築物は、アジュバントＣＡＦ０１で製剤化して、マウスをワクチン接種するのに用いた。構築物の免疫原性は、Ｄ、Ｅ及びＦのＶＤ４領域にまたがるペプチドパネル（長さ９及び２０ＡＡ）に対してＥＬＩＳＡにより試験した（表４〜７）。血清（６〜８匹のマウス）を試験し、バックグラウンドを上回るが、ＯＤ＝１．０に満たない応答は、白いボックスで、１．０を超える応答は、塗りつぶしたボックスで示す。ボックスの長さは抗体により認識された区域を示す。
【０１２９】
結果
全ての構築物が、可変ドメイン（ＶＤ）内に位置するＶＤ４ｅｘｔの保存ＴＴＬＮＰＴＩＡＧ部分に対する高い抗体応答を誘導した。一般に、相同性免疫反復配列により生成された抗体は、その代表的相同性ＶＤ４ｅｘｔ領域を認識するのに優れていたが、これらの構築物を、異なる血清亜型由来のＶＤ４ｅｘｔを包含するペプチドに対して試験したところ、そのエピトープ認識は、例えば、構築物（ＳｖＦｅｘｔＶＤ４）＊４で免疫した動物からの血清による血清亜型Ｅ  ＶＤ４領域の認識（逆の場合も同じ）のように、限定された（図７Ｂ及びＣ）。異種免疫反復配列（ＣＴＨ８９）による免疫後に生成された抗体は、相同性免疫反復配列及びＡ８−ＶＤ４で免疫した動物からの血清より、はるかに広範なエピトープレパトアを認識した（７Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）。この構築物は、相同性免疫反復配列での免疫により達成されたものと同レベル（又はより高レベル）で、血清亜型Ｅ及びＦの両方を包含するエピトープレパトアをカバーすることができた。
【０１３０】
中央のＣＤ４ペプチドＦＤＴＴＴＬＮＰＴＩＡＧＡＧＤＶＫを呈示する１７ＡＡペプチドが、ＣＴＨ８９特異的抗体結合について、クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）生物と競合することができるかどうかを明らかにするために、競合中和アッセイを実施した。様々な濃度のＣＴＨ８９及びＡ８−ＶＤ４特異的血清を濃度２０μｇ／ｍｌでペプチドと混合した（図７Ｄ）。結果から、Ａ８−ＶＤ４特異的血清とは対照的に、前記ペプチドは、ＣＴＨ８９特異的血清の中和能力を完全には排除することはできなかったが、これは、この血清が、より広範な中和エピトープのレパトアをターゲティングすることを示唆している。
【０１３１】
結論
異種伸長ＶＤ４の免疫反復配列による免疫は、ＶＤ４領域の保存及び血清亜型特異的部分の両方を認識する、広範な応答を誘導したが、これは、より広範な中和エピトープのレパトアに変換される。
【０１３２】
実施例４：ＳｖＤ、ＳｖＥ及びＳｖＦ由来の伸長ＶＤ４からなる異種免疫反復配列（ＣＴＨ８９）による免疫は、ＳｖＤ攻撃後に早期Ｔ細胞非依存性防御を生み出す。
【０１３３】
序論
ＶＤ４反復単位によるワクチン接種後に認められた早期防御の原因であるエフェクター機構を調べるために、ＣＴＨ８９でワクチン接種したマウスから、攻撃の前に、Ｔ細胞を欠失させた後、欠失及び非欠失マウスにおいて早期防御を誘導する能力を比較した。
【０１３４】
結果
群当たり８匹のマウスを、１４日おきに３回免疫した。ワクチン（２×５μｇ）をＣＡＦ０１中で乳化した後、ｓｃ．及びｉ．ｎ経路により同時に投与した。最後のワクチン接種から特定の時点で、マウスから採血して、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）に対する抗体応答、中和力価、並びにＴ細胞欠失有り無しの場合のｉｎ  ｖｉｖｏ防御を測定した。Ｔ細胞サブセットの欠失は、ＣＴＨ８９に対するＴ細胞応答を排除した（図８Ａ）。ＣＴＨ８９は、血清亜型Ｄの表面を認識する（図８Ｃ）強力な抗体応答を誘導し（図８Ｂ）、約１：１０３の５０％中和力価で、細菌をｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和することができた（図８Ｄ）。しかし、本発明者らは、Ｔ細胞欠失マウスでの攻撃から３日後に有意な防御を認めた（図８Ｅ）が、これは、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）に対する早期防御において、ＶＤ４単位を認識する抗体応答のｉｎ  ｖｉｖｏでの役割を示唆している。最後に、本発明者らは、ＣＴＨ８９血清が、ＳｖＤで得られたレベルの非常に高い５０％中和力価で、ＳｖＥ及びＳｖＦ感染を中和することもできたことを立証した（図８Ｄ）。
【０１３５】
結論
免疫反復配列は、血清亜型Ｄによる膣攻撃に対するＴ細胞非依存性早期防御を生み出すが、これは、ＶＤ４特異的抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの役割を示唆するものである。
【０１３６】
実施例５：ＣＴＨ８９特異的血清によるｉｎ  ｖｉｖｏ中和
序論
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血清により媒介される防御作用に変換することができるかどうかを調べるために、本発明者らは、続いて、ＣＴＨ８９免疫後に生成された抗体が、ナイーブマウスからの血清と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏで感染を中和／阻害することができるかどうかを調べた。
【０１３７】
結果
ＳｖＤ細菌を、ＣＴＨ８９免疫マウスから単離した血清又はナイーブマウスから単離した血清と混合した。次に、デプロプロベラ（Ｄｅｐｒｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ）処理マウスを４×１０５細菌で感染させた。ＣＴＨ８９血清をコーティングしたＳｖＤで感染させたマウスは、ナイーブ血清をコーティングしたＳＶＤで攻撃したマウスと比較して、細菌感染を効率的に制御した。７及び１０目日に、対照群のそれぞれ２及び３匹に対し、８匹のマウスのうち６匹が浄化された（図９）。
【０１３８】
結論
異種ＶＤ４免疫反復配列による免疫後に生成された血清は、ナイーブマウスから単離された血清と比較して、ＳｖＤによるマウスの感染を効率的に阻止する。
【０１３９】
実施例６：組み換えＭＯＭＰと異種伸長ＶＤ４の免疫反復配列との融合
序論
ＭＯＭＰは、体液性及び細胞性免疫応答の両方の標的であるが、中和抗体の生成及び感染の防御において再生ネイティブＭＯＭＰは比較的成功している５４，５６にもかかわらず、組み換えＭＯＭＰ（ｒＭＯＭＰ）を基材とする実験的ワクチンは失敗している。本発明者らは、全ての可変ドメインを含む、アミノ酸５６〜３４９の組み換えＭＯＭＰ（ＣＴＨ５２１）を設計した。また、本発明者らは、血清亜型Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧの伸長ＶＤ４断片を含有するポリペプチド単位（ＭＯＭＰのＶＤ４可変ドメイン及び隣接する保存フランキング領域を包含する）（ＣＴＨ５１８）も選択した。最後に、ＣＴＨ５２１をＣＴＨ５１８と融合させたハイブリッド（ＣＴ５２２）も構築した（図１０）。
【０１４０】
結果
群当たり８匹のマウスを、１４日おきに３回免疫した。ワクチンをＣＡＦ０１中で乳化した後、ｓｃ．（５μｇ）及びｉ．ｎ．（５μｇ）経路により同時に投与した。ワクチン接種後に、血液サンプルを採取して、ＶＤ４ｅｘｔ単位、組み換えＭＯＭＰに対する抗体、及び細菌表面に対する抗体を測定した。ＣＴ５２２及びＣＴ５１８による免疫後に生成された抗体は、ＣＴ５２１免疫後に単離した血清と比較して、はるかに高いレベルで、ＶＤ４領域（図１０Ａ）及び細菌表面（図１０Ｃ）を認識した。さらに、ＣＴＨ５１８及びＣＴＨ５２２由来の抗体は、同じレベルで、また、ＣＴ５２１よりはるかに高いレベルで、ＳｖＤ感染を中和することができた（図１０Ｄ）。
【０１４１】
結論
組み換えＭＯＭＰと異種伸長ＶＤ４の免疫反復配列との融合により、免疫反復配列単独と同じ機能性抗体を誘発する分子が得られる。
【０１４２】
実施例７：ＳｖＤ由来の単一ＶＤ１−ＶＤ４単位（ＣＴＨ８７）によるワクチン接種と比較した、ＳｖＤ、ＳｖＥ及びＳｖＦ由来のＶＤ１ｅｘｔ−ＶＤ４ｅｘｔ領域の異種免疫反復配列（ＣＴＨ８８）によるワクチン接種
序論
本発明者らは、次に、別のＶＤ領域を伸長ＶＤ４領域に融合させて、中和抗体を誘導する能力を依然として維持できるかどうかを調べた。従って、ＶＤ１領域の伸長形態を伸長ＶＤ４領域に結合した構築物を設計した。本発明者らは、ＳｖＤ由来のＶＤ１及びＶＤ４の伸長単位からなる相同性単位（ＣＴＨ８７）と、異なる血清亜型（Ｄ、Ｅ及びＦ；ＣＴＨ８８）由来のＶＤ１及びＶＤ４の伸長単位からなる異種免疫反復配列の両方を作製した。
【０１４３】
結果
群当たり１２匹のマウスを、１４日おきに３回免疫した。ワクチンをＣＡＦ０１中で乳化した後、ｓｃ．（５μｇ）及びｉ．ｎ．（５μｇ）経路により同時に投与した。ＣＴＨ８７で免疫したマウスからの抗体は、ＳｖＤ、ＳｖＥ及びＳｖＦの何れの細菌表面も認識し（図１１Ａ）；最も高い力価は、相同性ＳｖＤ株に対して、最も低い力価は、最も遠位のＳｖＦに対して得られた。異種ＶＤ１ｅｘｔ−ＶＤ４ｅｘｔ単位の免疫反復配列での免疫の結果、単量体構築物と比較し、細菌の表面に対して有意に高いレベルの抗体が生成されるとともに、応答の範囲が広がり、これによって、力価が、ＳｖＤ及びＳｖＥに対して６から１２倍、ＳｖＦに対してほぼ２５倍増加した（図１１Ａ）。１：２０００の中和力価を有する異種ＶＤ１−ＶＤ４免疫反復配列構築物と比較して、血清亜型Ｄ由来の単量体ＶＤ１ｅｘｔ−ＶＤ４ｅｘｔ構築物で免疫した動物からの血清は、ごくわずかな中和力価しか呈示しなかったことから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて感染を中和するこれらの抗体の能力は、さらに向上した（図１１Ｂ）。最後に、異種ＶＤ１ｅｘｔ−ＶＤ４ｅｘｔ免疫反復配列構築物によるワクチン接種は、膣攻撃モデルにおいてＳｖＤ攻撃から非常に効率的に防御した（図１１Ｃ）。
【０１４４】
結論
本発明者らは、血清亜型Ｄ、Ｅ及びＦ由来の異種ＶＤ１ｅｘｔ−ＶＤ４ｅｘｔ単位の免疫反復配列での免疫により、これら３つの免疫変異体全ての細菌表面に対して指令される抗体応答を大幅に増強できることを立証した。重要なことには、本発明者らは、異種免疫反復配列でのワクチン接種によって、血清亜型Ｆ表面認識のより高い選択的増大（血清亜型Ｄ及びＥの６〜１２倍に対して２５倍）が認められることも明らかにし、これは、異種免疫反復配列が、共有エピトープに対してだけではなく、血清亜型Ｆ特異的エピトープに対しても抗体レベルを増大することを示唆している。本発明者らは、ＳｃＤ由来の単一ＶＤ１−ＶＤ４単位（ＣＴＨ８７）と比較して、異種ＶＤ１−ＶＤ４の免疫反復配列（ＣＴＨ８８）で誘導された抗体は、早期ｉｎ  ｖｉｖｏ防御をもたらすｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和力価を生み出したことを立証した（図１１Ｃ）。
【０１４５】
実施例８：Ｔ細胞抗原とＶＤ４の免疫反復配列の結合
序論
クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に対する効率的な防御免疫応答において、ＣＭＩ成分が必要であることは一般に認識されているため、本発明者らは、次に、異種免疫反復配列を、ワクチンの可能性を有するＴ細胞抗原に融合できるかどうかを調べた。本発明者らの目的は、Ｃｔに対する早期抗体媒介性防御と、残留生物の効率的ＣＭＩ媒介クリアランスの両方を提供することであった。ＣＴ０４３と、ＣＴ４１４及びＣＴ６８１の一部から構成される構築物を異種ＶＤ１−ＶＤ４の免疫反復配列（ＣＴＨ９１）に融合した。
【０１４６】
結果
群当たり１２匹のマウスを、１４日おきに３回免疫した。ワクチン（２×５μｇ）をＣＡＦ０１中で乳化した後、ｓｃ．及びｉ．ｎ経路により同時に投与した。最後のワクチン接種から特定の時点で、マウスから採血して、抗体応答及び中和力価を測定した。ＣＴＨ９１及びＣＴＨ８８による免疫後に生成された抗体は、同様のレベルでＶＤ４ｅｘｔ領域を認識し（図１２Ａ）、両群から単離した血清は、ＳｖＤ感染を中和することができた（図１２Ｂ）。ＣＴＨ８８で免疫したマウスと比較して、ＣＴＨ９１に対するＴ細胞応答は、ＣＴ４１４及びＣＴ０４３の何れの認識についても、より強力であった（図１２Ｃ）。このＴ及びＢ細胞応答によって、両群の感染から３日後、有意な防御が起こったが、感染から７及び１０日後では、融合したＴ及びＢ細胞標的（ＣＴＨ９１）でワクチン接種した群は、ＣＴＨ８８と比較して、より高レベルの防御を誘導した（図１２Ｄ）。
【０１４７】
結論
本発明者らは、Ｔ細胞抗原を反復ＶＤ領域と融合させて、早期防御を誘導する能力を依然として維持することができた。さらに、これらの構築物は、残留生物の効率的なＣＭＩ媒介性クリアランスを誘導し、感染から７日後に高レベルの防御を達成した。
【０１４８】
実施例９：異種ＶＤ４免疫反復配列とＴ細胞抗原融合分子のカクテルによる免疫
序論
次に、本発明者らは、免疫反復配列を、ワクチンの可能性を有するＴ細胞抗原に融合して、Ｃｔに対する早期抗体媒介性防御と、残留生物の効率的なＣＭＩ媒介性クリアランスの両方を依然としてもたらすことができるかどうかを調べた。従って、本発明者らは、ＣＴ０４３と、ＣＴ４１４の一部及びＣＴ６８１から構成される強力なＴ細胞ハイブリッド（ＣＴＨ９３）をＣＴＨ８９と混合して（図１３Ａ）、ＳｖＤ細菌をｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和するとともに、膣攻撃に対する早期防御を誘導する能力を依然として維持することができるかどうかを調べた。
【０１４９】
結果
群当たり１２匹のマウスを、１４日おきに３回免疫した。ワクチン（２×５μｇ）をＣＡＦ０１中で乳化した後、皮下（ｓｃ）及び鼻内（ｉ．ｎ）経路により同時に投与した（図１３）。ＣＴＨ８９又はＣＴＨ８９とＣＴＨ９３との混合物による免疫後に生成された抗体は、ＶＤ４領域を強度に認識し（図１３Ｂ）、同様の５０％中和力価で細菌を中和した（図１３Ｃ）。Ｔ細胞抗原融合物（ＣＴＨ９３、図１３Ｄ）による免疫後、この分子も、ＭＯＭＰ（ＣＴ６８１）を含有するため、同じ中和エピトープを含む可能性もあるが、はるかに低いレベルのＶＤ４認識及び中和が観測された。また、この分子がもたらしたＴＴＬＮＰＴＩＡＧエピトープの認識も非常に低かった（データは示していない）。このことは、以前報告されているように、中和抗体の誘導のためのワクチン抗原としての、フルサイズ組み換えＭＯＭＰの限界をはっきりと示している。ＣＴＨ８９並びにＣＴＨ８９及びＣＴＨ９３ワクチンのカクテルは何れも、感染から３日後に防御を誘導した（図１３Ｅ）。これは、感染から３日後に有意な防御を全く誘導しなかったＣＴＨ９３でワクチン接種したマウスとは対照的であった。感染から７日後に、強力なＴ細胞標的（ＣＴＨ９３）を含むワクチンは何れも、有意なレベルの防御を誘導した（図１３Ｄ及びＥ）。
【０１５０】
結論
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和及び血清亜型Ｄ攻撃に対するｉｎ  ｖｉｖｏ保護の喪失なしに、異種ＶＤ４反復配列を強力なＴ細胞抗原と混合することができた。さらに、Ｂ及びＴ細胞標的の混合物は、残留生物の効率的なＣＭＩ媒介クリアランスを誘導し、感染から７日後に高レベルの防御をもたらした。
【０１５１】
実施例１０：様々なアジュバント系の効果の試験
序論
異種免疫反復配列に対する高い抗体応答が、ＣＡＦ０１を用いてワクチンを投与したときだけに認められるのかどうかを調べるために、本発明者らは、ＣＡＦ０１又はミョウバン中のＣＴＨ５２７（ＳｖＥ  ＶＤ４ｅｘｔ）＊４による免疫後に抗体応答及び免疫力価を比較した。
【０１５２】
結果
何れのアジュバント系も、ＣＴＨ５２７と一緒に投与したとき、ＳｖＥの表面に対する高い抗体応答を誘導し、両群からの抗体は、ＳｖＥをｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和することができた（図１４）。
【０１５３】
実施例１１：ＳｖＤ、ＳｖＥ、ＳｖＦ及びＳｖＧ由来の短い長さのＶＤ４ｅｘｔ領域から構成される異種免疫反復配列によるワクチン接種
序論
本発明者らは、次に、ＣＴＨ５１８構築物（ＣＴＨ５１８配列番号５３）と比較して、短い長さのＶＤ４領域から構成される異種免疫反復配列構築物（ＣＴＨ２８５配列番号６９及びＣＴＨ２８６配列番号７０）を比較した（図１５Ａ）。
【０１５４】
結果
群当たり４匹のマウスを、１４日おきに３回免疫した。ワクチンをＣＡＦ０１中で乳化した後、皮下（ｓｃ、５μｇ）及び鼻内（ｉ．ｎ、５μｇ）経路により同時に投与した。群当たり４匹のマウスからの脾細胞を単離し、ＶＤ４ｅｘｔ領域を呈示するオーバーラップペプチドに対するＴ細胞応答（図１５Ｂ）と、血清亜型Ｄ及びＦ感染を中和する血清の能力（図１５Ｃ）を調べた。様々な血清亜型からのＶＤ４ｅｘｔ領域が、３８ａａ短縮されたＣＴＨ２８５によるワクチン接種後に、はるかに低いレベルのＶＤ４Ｔ細胞認識、及び中和が認められた。これに対し、ＣＴＨ２８６（各ＶＤ４ｅｘｔ領域は、２４ａａ短縮）は、同様のレベルのＴ細胞応答を誘導し、血清亜型Ｄ感染を中和する、ＣＴＨ５１８と同じ能力を有した。
【０１５５】
結論
本発明者らは、ＶＤ４ｅｘｔ領域の長さを３８ａａ短縮することにより、Ｔ細胞応答と血清亜型Ｄ及びＦ感染を中和する能力の両方が低減されることを立証した。
【０１５６】
実施例１２：ＳｖＤ、ＳｖＥ、ＳｖＦ、ＳｖＧ、ＳｖＩａ及びＳｖＪ由来の伸長ＶＤ４ｅｘｔ領域から構成される異種免疫反復配列によるワクチン接種
序論
本発明者らは、次に、ＶＤ４ｅｘｔ領域の長さを伸長することにより、免疫配列構築物に対するＴ細胞応答を増強することができるかどうかを調べた。２つの構築物ＣＴＨ６９（配列番号４７）及びＣＴＨ７２（配列番号４８）を設計した。ＣＴＨ６９は、ＣＴＨ８８と類似しているが、ＳｖＤ、ＳｖＥ及びＳｖＦ由来のＶＤ４ｅｘｔ領域を、Ｎ末端側で１２ａａだけ伸長した（図１６Ｂ）。ＣＴＨ７２はまた、ＳｖＧ、ＳｖＩａ及びＳｖＪ由来のＶＤ１及びＶＤ４ｅｘｔ領域も含有した。
【０１５７】
結果
マウスを１４日おきに３回免疫した。ワクチンをＣＡＦ０１中で乳化した後、皮下（ｓｃ、５μｇ）及び鼻内（ｉ．ｎ、５μｇ）経路により同時に投与した。免疫に用いた抗原に対するＴ細胞応答、及び様々な血清亜型由来のＶＤ１及びＶＤ４領域を呈示するペプチドプールに対するＴ細胞応答を調べた（図１６）。ＶＤ４ｅｘｔ領域を伸長すると、ＣＴＨ８８で得られたＴ細胞応答（＜２０．０００ｐｇ／ｍｌ）と比較して、有意な、より高いＴ細胞応答（＞４０．０００ｐｇ／ｍｌ）を誘導した（図１６Ｂ）。重要なことには、伸長した構築物は何れも、血清亜型Ｄ感染を依然としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和することができた（図１６Ｃ）。ワクチンの防御効果を比較すると、ＣＴＨ６９及びＣＴＨ７２は、感染から７日後に有意なレベルの防御を誘導し、その理由は、恐らく、ＣＴＨ８８と比較して、これらのワクチンにより誘導されたより強力なＴ細胞応答によって説明することができよう（図１６Ｄ）。
【０１５８】
結論
ＶＤ４ｅｘｔ領域の伸長は、感染から７日後に防御の増強をもたらすＣＴＨ８８と比較して、Ｔ細胞応答を増強した。
【０１５９】
参照文献：
１．ＷＨＯ．Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｃｕｒａｂｌｅ  Ｓｅｘｕａｌｌｙ  Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；２００１．
２．Ｐａａｖｏｎｅｎ  Ｊ，Ｅｇｇｅｒｔ−Ｋｒｕｓｅ  Ｗ．Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ  １９９９，５（５）：４３３−４４７．
３．Ｐｌｕｍｍｅｒ  ＦＡ，Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  ＪＮ，Ｃａｍｅｒｏｎ  ＤＷ，Ｎｄｉｎｙａ−Ａｃｈｏｌａ  ＪＯ，Ｋｒｅｉｓｓ  ＪＫ，Ｇａｋｉｎｙａ  ＭＮ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍａｌｅ−ｆｅｍａｌｅ  ｓｅｘｕａｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９１，１６３（２）：２３３−２３９．
４．Ａｎｔｔｉｌａ  Ｔ，Ｓａｉｋｋｕ  Ｐ，Ｋｏｓｋｅｌａ  Ｐ，Ｂｌｏｉｇｕ  Ａ，Ｄｉｌｌｎｅｒ  Ｊ，Ｉｋａｈｅｉｍｏ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊａｍａ  ２００１，２８５（１）：４７−５１．
５．Ｇｏｌｄｅｎ  ＭＲ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ  ＪＡ，Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  Ｌ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＥ．Ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｓｅｘ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｄｉｓ  ２０００，２７（６）：３２９−３３７．
６．Ｂａｔｔｅｉｇｅｒ  ＢＥ，Ｘｕ  Ｆ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＥ  Ｒｅｋａｒｔ  ＭＬ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２０１  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１７８−１８９．
７．Ｂｒｕｎｈａｍ  ＲＣ，Ｒｅｙ−Ｌａｄｉｎｏ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５，５（２）：１４９−１６１．
８．Ｓｕ  Ｈ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ．ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｌａｙ  ａ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９５，６３（９）：３３０２−３３０８．
９．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＧ，Ｓｕ  Ｈ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＲＰ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ  ｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＣＤ４（＋）Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＣＤ８（＋）Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２０００，６８（１２）：６９７９−６９８７．
１０．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＲＰ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００２，７０（６）：２７４１−２７５１．
１１．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＳＪ．Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９８，１１（１）：３７−４１．
１２．Ｒａｎｋ  Ｒ．Ｉｎ：  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９：Ｐｐ．２３９−２９６．
１３．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＧ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＲＰ．Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ＣＤ４＋  ａｎｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００１，６９（４）：２６４３−２６４９．
１４．Ｍｏｏｒｅ  Ｔ，Ｅｋｗｏｒｏｍａｄｕ  ＣＯ，Ｅｋｏ  ＦＯ，  ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｌ，Ｒａｍｅｙ  Ｋ，Ａｎａｎａｂａ  ＧＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００３，１８８（４）：６１７−６２４．
１５．Ｐａｌ  Ｓ，Ｒａｎｇｅｌ  Ｊ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＥＭ，ｄｅ  ｌａ  Ｍａｚａ  ＬＭ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９９，１８（７−８）：７５２−７６１．
１６．Ｄａｒｖｉｌｌｅ  Ｔ，Ｈｉｌｔｋｅ  ＴＪ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｕｅ  ｔｏ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０１０，２０１  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１１４−１２５．
１７．Ｈａｎｓｅｎ  Ｊ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＫＴ，Ｆｏｌｌｍａｎｎ  Ｆ，Ａｇｇｅｒ  ＥＭ，Ｔｈｅｉｓｅｎ  Ｍ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｐ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ  Ｍａｊｏｒ  Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｉｍｅｓ  ａ  Ｔｈ１  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｔｈａｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００８，１９８（５）：７５８−７６７．
１８．Ｏｌｓｅｎ  ＡＷ，Ｔｈｅｉｓｅｎ  Ｍ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｄ，Ｆｏｌｌｍａｎｎ  Ｆ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｐ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  （ＣＴＨ１）  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｍｏｄｅｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，５（５）：ｅ１０７６８．
１９．Ｌｉ  Ｗ，Ｍｕｒｔｈｙ  ＡＫ，Ｇｕｅｎｔｚｅｌ  ＭＮ，Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＪＰ，Ｆｏｒｓｔｈｕｂｅｒ  ＴＧ，Ｓｅｓｈｕ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｏｂｕｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２０１０，７８（９）：３９４２−３９４９．
２０．Ｏｌｓｅｎ  ＡＷ，Ｆｏｌｌｍａｎｎ  Ｆ，Ｈｏｊｒｕｐ  Ｐ，Ｌｅａｈ  Ｒ，Ｓａｎｄ  Ｃ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００７，１９６：１５４６−１５５２．
２１．Ｏｌｓｅｎ  ＡＷ，Ｆｏｌｌｍａｎｎ  Ｆ，Ｊｅｎｓｅｎ  Ｋ，Ｈｏｊｒｕｐ  Ｐ，Ｌｅａｈ  Ｒ，  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＴ５２１  ａｓ  ａ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  Ｔｈ１  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００６，１９４（９）：１２５８−１２６６．
２２．Ｆｏｌｌｍａｎｎ  Ｆ  Ｏｌｓｅｎ  ＡＷ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＫＴ，Ｈａｎｓｅｎ  ＰＲ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｐ，Ｔｈｅｉｓｅｎ  Ｍ．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００８，１９７  ８９７−９０５．
２３．Ｓｈａｒｍａ  Ｊ，Ｚｈｏｎｇ  Ｙ，Ｄｏｎｇ  Ｆ，Ｐｉｐｅｒ  ＪＭ，Ｗａｎｇ  Ｇ，Ｚｈｏｎｇ  Ｇ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ  ａｒｒａｙｅｄ  ｗｉｔｈ  １５６  ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００６，７４（３）：１４９０−１４９９．
２４．Ｃｏｌｅｒ  ＲＮ，  Ｂｈａｔｉａ  Ａ，  Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ  ＪＦ，Ｐｒｏｂｓｔ  Ｐ，Ｂａｒｔｈ  Ｂ，Ｏｖｅｎｄａｌｅ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｅｎｉｔａｌ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００９，５５（２）：２５８−２７０．
２５．Ｋａｒｕｎａｋａｒａｎ  ＫＰ，Ｒｅｙ−Ｌａｄｉｎｏ  Ｊ，Ｓｔｏｙｎｏｖ  Ｎ，Ｂｅｒｇ  Ｋ，Ｓｈｅｎ  Ｃ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８，１８０（４）：２４５９−２４６５．
２６．Ｙｕ  Ｈ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ，Ｓｈｅｎ  Ｃ，Ｋａｒｕｎａｋａｒａｎ  ＫＰ，Ｂｒｕｎｈａｍ  ＲＣ．  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９，１８２（３）：１６０２−１６０８．
２７．Ｍｏｌｉｎａ  ＤＭ，  Ｐａｌ  Ｓ，Ｋａｙａｌａ  ＭＡ，Ｔｅｎｇ  Ａ，Ｋｉｍ  ＰＪ，Ｂａｌｄｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１０，２８（１７）：３０１４−３０２４．
２８．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ＲＳ，Ｋａｌｍａｎ  Ｓ，Ｌａｍｍｅｌ  Ｃ，Ｆａｎ  Ｊ，Ｍａｒａｔｈｅ  Ｒ，Ａｒａｖｉｎｄ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｓ：Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８２（５３８９）：７５４−７５９．
２９．Ｓｅｔｔｅ  Ａ，Ｒａｐｐｕｏｌｉ  Ｒ．Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ：ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｒａ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１０，３３（４）：５３０−５４１．
３０．Ｉｇｉｅｔｓｅｍｅ  ＪＵ，Ｅｋｏ  ＦＯ，Ｂｌａｃｋ  ＣＭ．Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｉｎ  ｆｕｔｕｒｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２０１１，１０（１１）：１５８５−１５９６．
３１．Ｒｏｃｋｅｙ  ＤＤ，Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｌｅｉ  Ｌ，Ｚｈｏｎｇ  Ｇ．Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２００９，８（１０）：１３６５−１３７７．
３２．Ｆａｒｒｉｓ  ＣＭ，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＲＰ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ  ｍｏｄｅｌ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２０１１，７９（３）：９８６−９９６．
３３．Ｋｕｂｏ  Ａ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ＲＳ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＰｏｒＢ，  ａ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｏｒｉｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔ．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２０００，３８（４）：７７２−７８０．
３４．  Ｋａｗａ  ＤＥ，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ  Ｊ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ＲＳ．Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰｏｒＢ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００４，２２（３１−３２）：４２８２−４２８６．
３５．Ｃｒａｎｅ  ＤＤ，Ｃａｒｌｓｏｎ  ＪＨ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＥＲ，Ｂａｖｏｉｌ  Ｐ，Ｈｓｉａ  ＲＣ，Ｔａｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ  ｉｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｃｏｍｍｏｎ  ｐａｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００６，１０３（６）：１８９４−１８９９．
３６．Ｂａｅｈｒ  Ｗ，Ｚｈａｎｇ  ＹＸ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｔ，Ｓｕ  Ｈ，Ｎａｎｏ  ＦＥ，Ｅｖｅｒｅｔｔ  ＫＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ  １９８８，８５（１１）：４０００−４００４．
３７．Ｂａｖｏｉｌ  Ｐ，Ｏｈｌｉｎ  Ａ，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ  Ｊ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９８４，４４（２）：４７９−４８５．
３８．Ｈａｔｃｈ  ＴＰ，Ａｌｌａｎ  Ｉ，Ｐｅａｒｃｅ  ＪＨ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９８４，１５７（１）：１３−２０．
３９．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ＲＳ，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ  Ｒ，Ｗａｇａｒ  ＥＡ，Ｉｎｏｕｙｅ  Ｃ，Ｕｒｄｅａ  ＭＳ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９８７，１６９（９）：３８７９−３８８５．
４０．Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ，Ｐｅｒｒｙ  ＬＪ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９８２，３８（２）：７４５−７５４．
４１．  Ｐｅｅｌｉｎｇ  Ｒ，Ｍａｃｌｅａｎ  ＩＷ，Ｂｒｕｎｈａｍ  ＲＣ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９８４，４６（２）：４８４−４８８．
４２．Ｚｈａｎｇ  ＹＸ，Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｓ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｔ，Ｔａｙｌｏｒ  ＨＲ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８７，１３８（２）：５７５−５８１．
４３．  Ｚｈａｎｇ  ＹＸ，Ｓｔｅｗａｒｔ  ＳＪ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｓｅｒｏｖａｒ−  ａｎｄ  ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９８９，５７（２）：６３６−６３８．
４４．Ｃｏｔｔｅｒ  ＴＷ，Ｍｅｎｇ  Ｑ，Ｓｈｅｎ  ＺＬ，Ｚｈａｎｇ  ＹＸ，Ｓｕ  Ｈ  Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ（ＩｇＡ）ａｎｄ  ＩｇＧ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ  １９９５，６３（１２）：４７０４−４７１４．
４５．  Ｂａｎｄｅａ  ＣＩ，Ｄｅｂａｔｔｉｓｔａ  Ｊ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｋ，Ｉｇｉｅｔｓｅｍｅ  Ｊ，Ｔｉｍｍｓ  Ｐ，Ｂｌａｃｋ  ＣＭ．Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｓｅｒｏｖａｒｓ  ａｍｏｎｇ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｒｕｒａｌ  ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｒｂａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００８，４６（１）：３５５−３５６．
４６．Ｈｓｕ  ＭＣ，Ｔｓａｉ  ＰＹ，Ｃｈｅｎ  ＫＴ，Ｌｉ  ＬＨ，Ｃｈｉａｎｇ  ＣＣ，  Ｔｓａｉ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００６，５５（Ｐｔ  ３）：３０１−３０８．
４７．Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ  Ｋ，Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ  Ｍ，Ｈｊａｌｔａｌｉｎ  Ｏｌａｆｓｓｏｎ  Ｊ，Ｓｔｅｉｎｇｒｉｍｓｓｏｎ  Ｏ．Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｇｅｎｉｔａｌ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｒｅａｔｅｒ  Ｒｅｙｋｊａｖｉｋ  ａｒｅａ，Ｉｃｅｌａｎｄ．Ｓｅｘ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｄｉｓ  ２００３，３０（３）：２４９−２５６．
４８．Ｌｙｓｅｎ  Ｍ，Ｏｓｔｅｒｌｕｎｄ  Ａ，Ｒｕｂｉｎ  ＣＪ，Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｔ，Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｉ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ  Ｂ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｍｐＡ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｂｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  デ  ｆｒｏｍ  ａｌｌ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  １  ｙｅａｒ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｔｒａｃｉｎｇ  ｉｎ  ａ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｃｏｕｎｔｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００４，４２（４）：１６４１−１６４７．
４９．Ｍｉｌｌｍａｎ  Ｋ，Ｂｌａｃｋ  ＣＭ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＥ，Ｓｔａｍｍ  ＷＥ，Ｊｏｎｅｓ  ＲＢ，Ｈｏｏｋ  ＥＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ  ｓｔｒａｉｎ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００４，  １８６（８）：２４５７−２４６５．
５０．Ｍｉｌｌｍａｎ  Ｋ，Ｂｌａｃｋ  ＣＭ，Ｓｔａｍｍ  ＷＥ，Ｊｏｎｅｓ  ＲＢ，Ｈｏｏｋ  ＥＷ，３ｒｄ，Ｍａｒｔｉｎ  ＤＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏＧｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｏｍｐＡ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ２００６，８（３）：６０４−６１１．
５１．Ｓｕ  Ｈ，Ｐａｒｎｅｌｌ  Ｍ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ＭＯＭＰ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：  ｓｅｒｕｍ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｏ  ｎｏｔ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９５，１３（１１）：１０２３−１０３２．
５２．  Ｐａｌ  Ｓ，Ｂａｒｎｈａｒｔ  ＫＭ，Ｗｅｉ  Ｑ，Ａｂａｉ  ＡＭ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＥＭ，ｄｅ  ｌａ  Ｍａｚａ  ＬＭ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  デ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｕｔ  ｆａｉｌｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９９，１７（５）：４５９−４６５．
５３．Ｚｈａｎｇ  ＤＪ，Ｙａｎｇ  Ｘ，Ｓｈｅｎ  Ｃ，Ｂｒｕｎｈａｍ  ＲＣ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＭＯＭＰ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｍｏｕｓｅ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ  ｓｔｒａｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９，９６（２）：３１４−３２１．
５４．Ｐａｌ  Ｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒ  Ｉ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＥＭ，ｄｅ  ｌａ  Ｍａｚａ  ＬＭ．  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｍｏｕｓｅ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｎ  ｅｌｉｃｉｔ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００１，６９（１０）：６２４０−６２４７．
５５．Ｓｈａｗ  Ｊ，Ｇｒｕｎｄ  Ｖ，Ｄｕｒｌｉｎｇ  Ｌ，Ｃｒａｎｅ  Ｄ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｕｌｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｌｉｃｉｔ  ａ  ＣＤ４（＋）ｔｙｐｅ  ２  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｔｙｐｅ  １  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００２，７０（３）：１０９７−１１０５．
５６．Ｋａｒｉ  Ｌ，Ｗｈｉｔｍｉｒｅ  ＷＭ，Ｃｒａｎｅ  ＤＤ，Ｒｅｖｅｎｅａｕ  Ｎ，Ｃａｒｌｓｏｎ  ＪＨ，Ｇｏｈｅｅｎ  ＭＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｎａｔｉｖｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａ  ｔｒａｃｈｏｍａ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９，１８２（１２）：８０６３−８０７０．
５７．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ  ＪＲ，Ｐａｌ  Ｓ，Ｔｉｆｒｅａ  Ｄ，ｄｅ  ｌａ  Ｍａｚａ  ＬＭ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖａｇｉｎａｌ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１，２９（３２）：５２７６−５２８３．
５８．Ｙｅｎ  ＴＹ，Ｐａｌ  Ｓ，ｄｅ  ｌａ  Ｍａｚａ  ＬＭ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ａｎｄ  ｆｒｅｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｍｏｕｓｅ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００５，４４（１６）：６２５０−６２５６．
５９．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ＲＳ，Ｗａｇａｒ  ＥＡ，Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ  ＧＫ．Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｓｅｒｏｖａｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８８，１６７（３）：８１７−８３１．
６０．Ｍｕｒｄｉｎ  ＡＤ，Ｓｕ  Ｈ，Ｋｌｅｉｎ  ＭＨ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ．Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｒｏｍ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＶ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９５，６３（３）：１１１６−１１２１．
６１．Ｍｕｒｄｉｎ  ＡＤ，Ｓｕ  Ｈ，Ｍａｎｎｉｎｇ  ＤＳ，Ｋｌｅｉｎ  ＭＨ，Ｐａｒｎｅｌｌ  ＭＪ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ．Ａ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｉｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９３，６１（１０）：４４０６−４４１４．
６２．Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ  Ａ，Ｂｒｏｓｓａｙ  Ｌ，Ｐａｒａｄｉｓ  Ｇ，Ｈｅｂｅｒｔ  Ｊ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＶ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｋ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９４，１４０（Ｐｔ９）：２４８１−２４８７．
６３．Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ  Ａ，Ｂｒｏｓｓａｙ  Ｌ，Ｐａｒａｄｉｓ  Ｇ，Ｈｅｂｅｒｔ  Ｊ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｂ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９４，６２（８）：３５４７−３５４９．
６４．Ｍｏｔｉｎ  ＶＬ，ｄｅ  ｌａ  Ｍａｚａ  ＬＭ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＥＭ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６０  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  Ｃ３Ｈ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ４  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９，６（３）：３５６−３６３．
６５．Ｓｕ  Ｈ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｍｏｎ  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ  ａｎｄ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９３，１１（１１）：１１５９−１１６６．
６６．Ｔｏｙｅ  Ｂ，Ｚｈｏｎｇ  ＧＭ，Ｐｅｅｌｉｎｇ  Ｒ  Ｂｒｕｎｈａｍ  ＲＣ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｌｏｎｅｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９０，５８（１２）：３９０９−３９１３．
６７．Ｍｙｇｉｎｄ  Ｐ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｇ，Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｋ，Ｂｉｒｋｅｌｕｎｄ  Ｓ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒａ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｏｌｙａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２０００，４９（５）：４５７−４６５．
６８．Ｑｕ  Ｚ，Ｃｈｅｎｇ  Ｘ，ｄｅ  ｌａ  Ｍａｚａ  ＬＭ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＥＭ．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＶ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９４，１２（６）：５５７−５６４．
６９．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＥＭ，Ｃｈｅｎｇ  Ｘ，Ｑｕ  Ｚ，ｄｅ  ｌａ  Ｍａｚａ  ＬＭ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９６，３３（４−５）：３３５−３３９．
７０．Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ，Ｋｒｏｍｈｏｕｔ  Ｊ，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ  Ｊ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９８１，３１（３）：１１６１−１１７６．
７１．Ｒａｖｎ  Ｐ，Ｄｅｍｉｓｓｉｅ  Ａ，Ｅｇｕａｌｅ  Ｔ，Ｗｏｎｄｗｏｓｓｏｎ  Ｈ，Ｌｅｉｎ  Ｄ，Ａｍｏｕｄｙ  ＨＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＥＳＡＴ−６  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９９，１７９（３）：６３７−６４５．
７２．Ｓｔｒｙｈｎ  Ａ，  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ＬＯ，Ｒｏｍｍｅ  Ｔ，Ｈｏｌｍ  ＣＢ，Ｈｏｌｍ  Ａ，Ｂｕｕｓ  Ｓ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｉｎｔｏ  ａｎ  ａｒｒａｙ  ｏｆ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９６，２６（８）：１９１１−１９１８．
７３．Ｈａｒｂｏｅ  Ｍ，Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ  Ｔ，Ｗｉｋｅｒ  ＨＧ，Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｄｓ  Ｉ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｐ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＳＡＴ−６  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９６，６４（１）：１６−２２．
７４．Ｖｏｌｐ  Ｋ，  Ｍａｔｈｅｗｓ  Ｓ，Ｔｉｍｍｓ  Ｐ，Ｈａｆｎｅｒ  Ｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ（ＧＰＩＣ  ａｇｅｎｔ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｇｏｏｄ  ｖａｇｉｎａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｉｖｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００１，７９（３）：２４５−２５０．
７５．Ｈｉｎｔｏｎ  ＨＪ，Ｊｅｇｅｒｌｅｈｎｅｒ  Ａ，Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＭＦ．Ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８，３１９：１−１５．
７６．Ｋｉｍ  ＳＫ，ＤｅＭａｒｓ  Ｒ．Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１，１３（４）：４２９−４３６．
７７．Ｆｉｎｄｌａｙ  ＨＥ，ＭｃＣｌａｆｆｅｒｔｙ  Ｈ，Ａｓｈｌｅｙ  ＲＨ．Ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｎｎｅｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｍａｊｏｒ  Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．ＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５，５：５．
７８．Ｃｏｂｂｏｌｄ  ＳＰ，Ｊａｙａｓｕｒｉｙａ  Ａ，Ｎａｓｈ  Ａ，Ｐｒｏｓｐｅｒｏ  ＴＤ，Ｗａｌｄｍａｎｎ  Ｈ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８４，３１２（５９９４）：５４８−５５１．
７９．Ｑｉｎ  Ｓ，Ｃｏｂｂｏｌｄ  Ｓ，Ｔｉｇｈｅ  Ｈ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｒ  Ｗａｌｄｍａｎｎ  Ｈ．ＣＤ４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐａｉｒｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８７，１７（８）：１１５９−１１６５．
【図１】
2019163253.tif 000011
【図２】
2019163253.tif 000012
【図３】
2019163253.tif 000013
【図４】
2019163253.tif 000014
【図５】
2019163253.tif 000015
【図６】
2019163253.tif 000016
【図７Ａ】
2019163253.tif 000017
【図７Ｂ】
2019163253.tif 000018
【図７Ｃ】
2019163253.tif 000019
【図７Ｄ】
2019163253.tif 000020
【図８−１】
2019163253.tif 000021
【図８−２】
2019163253.tif 000022
【図９】
2019163253.tif 000023
【図１０】
2019163253.tif 000024
【図１１】
2019163253.tif 000025
【図１２】
2019163253.tif 000026
【図１３−１】
2019163253.tif 000027
【図１３−２】
2019163253.tif 000028
【図１４】
2019163253.tif 000029
【図１５】
2019163253.tif 000030
【図１６】
2019163253.tif 000031
【配列表】
2019163253000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月18日(2019.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）による感染症の治療または予防のための医薬組成物の製造における
ａ）クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の血清型に発現される同じ外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）の１つ又は複数の表面露出断片を含むアミノ酸配列；及び
ｂ）ａ）に定義したのと同じ配列か、又はａ）の前記血清型とは異なるクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）の血清型に発現される前記外膜タンパク質の変異型由来の対応する表面露出断片の何れかである、２つ以上の別のアミノ酸配列
を含むポリペプチドの使用であって、
前記外膜タンパク質がクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の任意の血清型由来のＭＯＭＰであり、前記ポリペプチドがＭＯＭＰの可変ドメイン１、２、３、４の１つ又は複数を含むことを特徴とする使用。