(57)【要約】【課題】骨格筋を構成する実質細胞の筋線維が傷害された筋ジストロフィー等の筋変性の進行を抑制する筋変性抑制剤を提供することを課題とする。【解決手段】レチノイドアゴニスト、好ましくはタミバロテン単剤あるいはこれと第二の活性薬剤との両剤を有効成分とする筋変性抑制剤であり、それを投与することを特徴とする、該剤である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイドアゴニストを有効成分とする筋変性抑制剤。
【請求項２】
前記レチノイドアゴニストがタミバロテン（Ａｍ−８０）である請求項１記載の筋変性抑制剤である。
【請求項３】
筋変性の抑制の予防、抑制、治療のために医薬品を製造するための請求項１または２記載の筋変性抑制剤の使用方法。
【請求項４】
一種類以上の第二の活性薬剤と組み合わせて用いることを特徴とする請求項１または２記載の筋変性抑制剤の使用方法。
【請求項５】
請求項１または２記載の筋変性抑制剤を経口投与することを特徴とする筋変性抑制剤の使用方法。
【請求項６】
請求項１または２記載の筋変性抑制剤をヒト一個体あたり０．５〜２０ｍｇを含み、また、第二の活性薬剤をヒト一個体あたり５〜２０ｍｇを含む請求項４記載の筋変性抑制剤の使用方法。
【請求項７】
請求項４記載の第二の活性薬剤が、ステロイドホルモンからなる群から選ばれる請求項４または６記載の筋変性抑制剤の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋変性抑制剤及びその使用方法に関し、詳しくは筋変性抑制剤としての合成レチノイド及びそれを用いた筋変性の抑制法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋は身体活動や運動、全身の代謝調節などの機能を担い、健康を維持する上で重要な組織である。疫学的にも、骨格筋量の多い人の方が長寿であり、心血管イベントのリスクも低いとの報告があり、骨格筋組織を維持することは健康長寿の実現に重要と考えられる。
【０００３】
骨格筋を構成する主な実質細胞は筋線維であり、筋機能を担っている。
筋線維が傷害された場合、幹細胞である筋衛星細胞により再生される。しかし、筋ジストロフィーなどの筋疾患では筋再生が追いつかず、筋線維が消失して行き、脂肪細胞や線維芽細胞に置き換わる筋変性が進行する。筋変性の際に、脂肪細胞や線維芽細胞の供給源となるのは血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦＲα）を特異的に発現している間葉系前駆細胞であることを本発明者らは明らかにしてきた（非特許文献１，２）。
【０００４】
一方、間葉系前駆細胞は筋変性に関与する病的な特性だけでなく、筋衛星細胞による筋再生を支持・促進する有益な性質をも併せ持っている。
【０００５】
筋機能の維持には再生の促進と筋変性の抑制が重要であり、従来の研究では、筋衛星細胞の機能を向上させて再生促進作用を図るものが多いが（特許文献１を参照）、本発明者らは、脂肪化・線維化の原因となる間葉系前駆細胞を標的とした新筋変性抑制剤の開発を目的に検討を行った。
【０００６】
筋ジストロフィーは遺伝性の難病であり、原因遺伝子は５０種類以上存在する。中でも、細胞膜の裏打ちタンパク質であるジストロフィンの変異を原因とするＤｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＤＭＤ）は、筋ジストロフィーの中で最も重篤で患者数が多い。現在、臨床現場で唯一使用されているのがステロイドホルモンであり、歩行可能期間が延長することが示されている（非特許文献３）。しかし、抗炎症以外の効能は不明である。
【０００７】
ＤＭＤ治療薬として抗マイオスタチン療法の開発が進められている。マイオスタチンは骨格筋量の負の制御因子であり、その欠損動物は筋量増加を呈する。また、ＤＭＤのモデル動物であるｍｄｘマウスに抗マイオスタチン抗体を投与する事で筋ジストロフィーの病態が改善したとの報告がある（非特許文献４）。
【０００８】
現在これら基礎研究を下に米国でＰｈａｓｅ  ＩＩやＰｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ相試験が行なわれている。
マイオスタチンは、筋線維に直接作用するが、筋衛星細胞や間葉系前駆細胞に働くという証拠はなく、なぜ病態が改善したかについては不明である。
【０００９】
また、最初に開発の進められた抗マイオスタチン中和モノクローナル抗体Ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ（ＭＹＯ−０２９）の第ＩＩ相試験はベッカー型、顔面肩甲上腕型、肢帯型の筋ジストロフィ患者を対象にして行われたが、有効性を示すことができず、開発は中止された経緯もある（非特許文献５）。
【００１０】
２０１６年９月にアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＡＯ）のエキソンスキッピング薬がＦＤＡに条件付きで承認されている。ＡＯをｏｕｔ  ｏｆ  ｆｒａｍｅによる変異が起きているジストロフィンに用いることで、ｉｎ  ｆｒａｍｅ型に変更させる薬剤である（非特許文献６）。
【００１１】
しかし、抗マイオスタチン療法にしてもエキソンスキッピング療法にしても、あくまでも患者骨格筋内での筋線維の残存が前提となっており、筋線維が脂肪・線維芽細胞に置き換わった筋変性状態ではその効果は期待できない。そのため、対症療法ではあるが、筋変性の進行を抑制する薬物開発が強く望まれている。
【００１２】
膝ＯＡおよび肩腱板断裂は高齢者で多発する関節疾患で、ＱＯＬおよびＡＤＬを低下させる要因となる。我が国における膝ＯＡの有病率は２５３０万人にものぼると推定され、また、肩腱板断裂は８０歳以上の約半数で生じているという推定もある。病態の進行に筋機能低下の関与が示唆されてきたが、実際の患者における筋病理変化は不明であった。
【００１３】
しかし、最近、本発明者らは膝ＯＡ患者骨格筋で脂肪化・線維化を伴う顕著な筋変性が生じていることを明らかにし（非特許文献７）、本発明がこれら関節疾患にも有効である可能性を示した。
【００１４】
本発明は、筋線維への作用を薬効とするこれまでの開発研究と異なり、脂肪化・線維化の原因となる間葉系前駆細胞に対して直接作用するため、筋変性を病態とする様々な疾患を治療対象にできる可能性がある。筋変性の抑制は、即ち筋線維の保存につながるため、筋線維を標的とする先行の開発研究の治療効果を増強することにもなると考えられる。
【００１５】
さらに、本発明は単に間葉系前駆細胞の病的変化を抑制するだけでなく間葉系前駆細胞の二面性の制御機構に基づいており、筋再生を支持する有益な性質を間葉系前駆細胞に付与することによる筋再生促進効果も期待できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２０１５−１５７７８５号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｎａｔ.  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ.  １２（２）：１４３−５２  （２０１０)
【非特許文献２】Ｊ.  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ.  １２４（２１）：３６５４−６４  （２０１１）
【非特許文献３】Ｊ.  Ｎｅｕｒｏｌ.  ２６０（１２）：３０２３―２９  （２０１３）
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  ４２０（６９１４）：４１８−２１  （２００２）
【非特許文献５】神経治療  ３２：４８７−９０  （２０１４）
【非特許文献６】Ａｍ.  Ｊ.  Ｐａｔｈｏｌ.  １７９（１）：１２―２２  （２０１１）
【非特許文献７】Ａｍ  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ.  １８７（１２）：２６７４―２６８５  （２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
骨格筋には健康の維持・促進機能があり、筋変性の進行による筋機能低下は解決が望まれる重要課題であるが、筋変性を抑制する有効な方法は現在ない。筋変性が進行する代表的な疾患の筋ジストロフィーにおいては、これまでも世界的に研究開発が進められているが、決定的な治療法は未だ見いだされていない。
【００１９】
そこで、本発明の目的は、筋変性をきたす疾患等に対する有効な治療法を確立し、筋変性を効率的に抑制することができる治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは骨格筋の脂肪化や線維化といった筋変性の元となる間葉系前駆細胞を発見し、本細胞の特性を研究してきた。間葉系前駆細胞には筋変性に寄与する側面と、筋再生を支持・促進する側面の二面性があるので、筋変性を抑制するという課題の解決に向け、間葉系前駆細胞の二面性の解析及び高品質なヒト間葉系前駆細胞を用いた脂肪分化定量解析実験を実施したところ、レチノイン酸（ＲＡ）シグナルが間葉系前駆細胞による筋変性の抑制に重要であることを見出した。
【００２１】
さらに、ヒト間葉系前駆細胞の脂肪分化を高効率に抑制する合成レチノイドＡＭ８０、ＡＭ５８０を同定し、ＡＭ８０の経口投与によりＤＭＤモデルマウスの筋変性を劇的に抑制することを見出した。
【００２２】
これらの成果から、合成レチノイドアゴニストにより間葉系前駆細胞においてＲＡシグナルを活性化させることは、筋変性を抑制する有効な手段になることが期待される。本発明はかかる知見に基づき完成するに至ったものである。
【００２３】
即ち、本発明は次の（１）〜（７）に関するものである。
（１）レチノイドアゴニストを有効成分とする筋変性抑制剤である。
（２）前記レチノイドアゴニストがタミバロテン（Ａｍ−８０）である（１）記載の筋変性抑制剤である。
（３）筋変性の抑制の予防、抑制、治療のために医薬品を製造するための前記（１）または（２）記載の変性抑制剤の使用方法。
（４）一種類以上の第二の活性薬剤と組み合わせて用いることを特徴とする（１）または（２）記載の変性抑制剤の使用方法。
（５）前記（１）または（２）の変性抑制剤を経口投与することを特徴とする、筋変性抑制剤の使用方法である。
（６）前記（１）または（２）の変性抑制剤をヒト一個体あたり０．５〜２０ｍｇを含み、また、第二の活性薬剤をヒト一個体あたり５〜２０ｍｇを含む前記（４）記載の筋変性抑制剤の使用方法である。
（７）前記（４）記載の第二の活性薬剤が、ステロイドからなる群から選ばれる前記（４）または（６）記載の筋変性抑制剤の使用方法である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によりレチノイドアゴニスト、好ましくは、タミバロテン（Ａｍ−８０）、あるいは、第二の活性薬剤との併用による投与により筋変性を抑制することが可能である。本発明により治療されるべき筋変性疾患としてはＤＭＤ、変形性膝関節症（膝ＯＡ）、肩腱板断裂症が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】間葉系前駆細胞の二面性を調べる網羅的遺伝子発現解析の概要図である。ＤＭＤモデルマウス骨格筋中で筋変性に寄与している間葉系前駆細胞（右）と、再生筋中で筋再生を支持している間葉系前駆細胞（左）を比較解析した。間葉系前駆細胞はＰＤＧＦＲαをマーカーに識別できる。
【図２】再生過程の間葉系前駆細胞とジストロフィー筋の間葉系前駆細胞におけるＡｌｄｈ１ａ２、Ｃｒａｂｐ１、Ｃｒａｂｐ２の発現比較であるグラフである。Ａｌｄｈ１ａ２、Ｃｒａｂｐ１、Ｃｒａｂｐ２の発現は再生過程の間葉系前駆細胞で顕著に高かった。
【図３】ＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイによるＡｌｄｈ１ａ２の酵素活性測定の結果を示すグラフである。Ａｌｄｈ１ａ２の酵素活性が高い細胞は緑蛍光を発する。Ａｌｄｈ１ａ２の選択的阻害剤ＷＩＮ１８４４６により蛍光が消失することからＡｌｄｈ１ａ２の酵素活性を反映していることが分かる。Ａｌｄｈ１ａ２の酵素活性があるのは再生過程のＰＤＧＦＲα陽性間葉系前駆細胞だけである。（赤色のプロット）
【図４】間葉系前駆細胞の脂肪分化、線維芽細胞分化に対するＲＡの効果を示す図である。脂肪分化、線維芽細胞分化ともに抑制された。
【図５】ＲＡによるヒト間葉系前駆細胞の脂肪分化抑制結果を示す図である。脂肪滴の蛍光染色を行い蛍光強度を測定し、薬剤非添加群を対照に相対定量した。
【図６】ＡＭ８０およびＡＭ５８０によるヒト間葉系前駆細胞の脂肪分化抑制効果を示すグラフである。
【図７】ＡＭ８０の経口投与によるＤＢＡ/２−ｍｄｘマウスの筋変性抑制および筋再生促進を示す写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態について具体的に説明する。
本発明の筋変性抑制剤はレチノイドアゴニストを有効成分とするものである。本発明において、レチノイドアゴニストにはその薬剤学的に許容可能な有機又は無機の酸付加塩を含む。特に、好ましいレチノイドアゴニストとしてはタミバロテン（Ａｍ８０）を挙げることができる。
【００２７】
また、本発明の筋変性抑制剤はステロイドを好適に併用することができる。ステロイドもその薬剤学的に許容可能な有機又は無機の酸付加塩を含むものであり、特に好ましくはプレドニソロンを挙げることができる。
【００２８】
本発明の筋変性抑制剤は各種筋量増加剤・筋細胞修復剤と併用することによりタミバロテンの筋変性抑制活性を増強する作用を有する。本発明において、筋量増加剤としてマイオスタチン阻害剤、β−アゴニストが挙げられ、筋細胞修復剤としては、アンチセンス核酸医薬が挙げられる。
【００２９】
本発明の筋変性抑制剤は、有効量を経口、経直腸、局所、あるいは非経口的、静脈内又は腫瘍内への注射のいずれかにより投与することで、ヒトにおける筋変性を効果的に抑制することができる。
【００３０】
本発明の筋変性抑制剤は、錠剤、カプセル、丸剤、リポソーム等の固体またはゲル状、あるいは液状でもよい。
【００３１】
本発明の筋変性抑制剤で治療するにあたり、治療される筋変性のタイプにより適切ないかなる量とすることもでき、有効量を適用する方法は治療する筋変性の存在割合により変化する。一例として、レチノイドアゴニストとレキシノイドアゴニストを合計でヒト一個体あたり０．５〜２００ｍｇを含み、かつ、ステロイドをヒト一個体あたり１．０〜５００ｍｇを含むようにすることができる。また、レチノイドアゴニストは好適にはヒト一個体あたり０．５〜２０ｍｇとすることができる。
【００３２】
本発明の筋変性抑制剤は、好ましくは、レチノイドアゴニスト単独あるいはステロイドを同時に投与し、筋変性を抑制させ、筋力の減少を抑制させる。筋変性を抑制するために、必要に応じて〜５年間投与することができる。
【実施例】
【００３３】
以下に本発明を実施例に基づき説明する。なお、下記の実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではないことは勿論である。
【００３４】
筋変性を抑制するという課題の解決に向け、間葉系前駆細胞の二面性の制御機構について解析を行った。
【００３５】
ヘビ毒を筋注し再生誘導後３日目の野生型マウス骨格筋から再生を支持している間葉系前駆細胞を、また、ジストロフィー筋において筋変性に寄与している間葉系前駆細胞を、それぞれＰＤＧＦＲαをマーカーに用いセルソーターで単離した。単離細胞からＲＮＡを精製後、マイクロアレイで網羅的遺伝子発現解析を行い、特性の違いを調べた（図１）。
【００３６】
網羅的遺伝子発現解析の結果、ＲＡの合成酵素Ａｌｄｈ１ａ２、および、ＲＡの輸送タンパクＣｒａｂｐ１、Ｃｒａｂｐ２が再生過程の間葉系前駆細胞の方で高発現していた。網羅的遺伝子発現解析の結果を確かめるため、リアルタイムＰＣＲ法で遺伝子発現の定量を行った。その結果、再生過程の間葉系前駆細胞でＡｌｄｈ１ａ２、Ｃｒａｂｐ１、Ｃｒａｂｐ２の発現は顕著に高かったが、ジストロフィー筋における間葉系前駆細胞でこれらの遺伝子はほぼ発現が認められなかった（図２）。
【００３７】
Ａｌｄｈ１ａ２の酵素活性をＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイにより解析した。本アッセイでは、基質のＢｏｄｉｐｙ−ａｍｉｎｏａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅがＡｌｄｈ１ａ２によってＢｏｄｉｐｙ−ａｍｉｎｏａｃｅｔａｔｅへ変換されると緑色蛍光を発することを原理とする。コントロールサンプルにはＡｌｄｈ１ａ２の選択的阻害剤ＷＩＮ１８４４６を添加し、それにより緑色蛍光を消失した細胞がＡｌｄｈ１ａ２活性を有すると判定する。再生誘導後３日目の野生型マウス骨格筋およびＤＭＤモデルマウス骨格筋から単核細胞を調整し、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイを行った。その結果、再生筋由来の単核細胞に緑色蛍光を発するＡｌｄｈ１ａ２活性の高い細胞を認め、それらはＰＤＧＦＲα陽性間葉系前駆細胞であった。一方、ジストロフィー筋由来の単核細胞においてはＡｌｄｈ１ａ２活性が全く見られなかった。（図３）。
【００３８】
これらの結果から、筋再生過程の間葉系前駆細胞特異的にＲＡ合成が活性化し筋再生を支持しており、筋変性過程ではＲＡ合成が低下し脂肪化・線維化といった変性に寄与していると考えられた。
【００３９】
即ち、間葉系前駆細胞においてＲＡシグナルを活性化することは、筋再生促進と筋変性抑制につながると予想される。この仮説を確かめるため、間葉系前駆細胞の脂肪分化、および、線維芽細胞分化系において、ＲＡシグナルの影響を調べた。
【００４０】
マウス骨格筋から間葉系前駆細胞をセルソーターで単離し培養した。脂肪分化は１０μｇ／ｍｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ、０．２５μＭ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、０．５  ｍＭ  ＩＢＭＸで刺激することで、線維芽細胞分化は５  ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βで刺激することにより誘導した。ＲＡは１  μＭで添加した。脂肪分化はＦＡＢＰ−４とＰＰＡＲγの免疫蛍光染色により、線維芽細胞分化はＣｏｌ１ａ１とＣＯｌ１ａ２の遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ法で定量することにより評価した。その結果、間葉系前駆細胞の脂肪分化、線維芽細胞分化ともにＲＡの添加により顕著に抑制された（図４）。
【００４１】
本発明者らは、ヒト骨格筋からの高精度な間葉系前駆細胞の単離・培養系を確立している。ヒト間葉系前駆細胞を脂肪分化誘導し、ＲＡによる分化抑制効果の濃度依存性を調べた。脂肪分化はＢｏｄｉｐｙにより脂肪滴を蛍光染色し、ハイスループットイメージングシステムにより定量解析することで評価した。その結果、ヒト間葉系前駆細胞においても１０  μＭ  ＲＡにより脂肪分化は顕著に抑制され、濃度を下げていくと抑制効果は弱まった（図５）。
【００４２】
そこで、この定量解析系を用いて、より効率的にヒト間葉系前駆細胞に作用するＲＡ受容体作動薬を探索した結果、ＡＭ８０およびＡＭ５８０が効率よく脂肪分化を抑制することを見出した（図６）。
【００４３】
また、現在ＤＭＤの対症療法といて用いられている唯一の薬剤である合成ステロイド、プレドニゾロンと、ＡＭ８０との併用がヒト間葉系前駆細胞の脂肪分化に及ぼす影響を調べた結果、ＡＭ８０とプレドニゾロンとの併用は非常に効率よく脂肪分化を抑制することを見出した。
【００４４】
ＲＡ受容体作動薬による筋変性抑制効果を検証するため、本発明者らが作製した重篤なＤＭＤモデルマウスであるＤＢＡ/２−ｍｄｘマウスにＡＭ８０を経口投与した。５週齢のＤＢＡ/２−ｍｄｘマウスにＡＭ８０含有（０．００２％（ｗ／ｗ））またはコントロールの餌を６週間給餌した。
【００４５】
骨格筋を採取し組織学的解析を行った。筋ジストロフィーマウスでは特に横隔膜の病変が顕著なため、横隔膜の組織像を精査した。その結果、筋変性の劇的な抑制と筋再生促進効果が観察された（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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