(57)【要約】【課題】被験者である妊婦に対する負担が比較的少ない方法により採取可能な生体試料中で検出され、かつ、妊娠後、比較的初期の段階の妊婦が、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いか否かを精度よく判定できる、妊娠糖尿病の発症リスクの判定用バイオマーカーを提供すること。【解決手段】妊娠糖尿病を発症していない妊婦から採取された尿中のエタノールアミン又はメチオニンの濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者と比べ、低いか否かや、前記尿中の１，３−ジホスホグリセリン酸、シキミ酸−３−リン酸、又はＮ−アセチル−Ｌ−アラニンの濃度が、前記対照者と比べ、高いか否かを解析することにより、前記妊婦が、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いか否かを判定することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする妊娠糖尿病の発症リスクの判定方法。
（ａ）妊娠糖尿病を発症していない妊婦から採取された尿中の、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］から選択される１又は２種以上の代謝物質の濃度を測定する工程；
［Ａグループ］
エタノールアミン、メチオニン
［Ｂグループ］
１，３−ジホスホグリセリン酸、シキミ酸−３−リン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン
（ｂ）工程（ａ）で測定した代謝物質の濃度を、妊娠糖尿病を発症しない対照者における前記代謝物質の濃度と比較する工程；
（ｃ）工程（ａ）で測定した代謝物質が［Ａグループ］の代謝物質である場合、工程（ａ）で測定した代謝物質の濃度が、対照者における代謝物質の濃度よりも低いとき、前記妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価し、
工程（ａ）で測定した代謝物質が［Ｂグループ］の代謝物質である場合、工程（ａ）で測定した代謝物質の濃度が、対照者における代謝物質の濃度よりも高いとき、前記妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価する工程；
【請求項２】
妊婦が、妊娠１３〜２２週の妊婦であることを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
工程（ｃ）において、
工程（ａ）で測定したエタノールアミンの濃度が、対照者におけるエタノールアミンの濃度と比べ、少なくとも４４％減少したとき、妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価し、
工程（ａ）で測定したメチオニンの濃度が、対照者におけるメチオニンの濃度と比べ、少なくとも５１％減少したとき、妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価し、
工程（ａ）で測定した１，３−ジホスホグリセリン酸の濃度が、対照者における１，３−ジホスホグリセリン酸の濃度と比べ、少なくとも２．５倍増加したとき、妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価し、
工程（ａ）で測定したシキミ酸−３−リン酸の濃度が、対照者におけるシキミ酸−３−リン酸の濃度と比べ、少なくとも１．５倍増加したとき、妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価し、
工程（ａ）で測定したＮ−アセチル−Ｌ−アラニンの濃度が、対照者におけるＮ−アセチル−Ｌ−アラニンの濃度と比べ、少なくとも１．５倍増加したとき、妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の判定方法。
【請求項４】
代謝物質が、エタノールアミン又は１，３−ジホスホグリセリン酸を含む代謝物質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
【請求項５】
以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］から選択される１又は２種以上の代謝物質からなることを特徴とする妊娠糖尿病の発症リスクの判定用バイオマーカーであって、
代謝物質が［Ａグループ］の代謝物質である場合、妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の前記代謝物質の濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者における前記代謝物質の濃度と比べ、低く、
代謝物質が［Ｂグループ］の代謝物質である場合、妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の前記代謝物質の濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者における前記代謝物質の濃度と比べ、高い、
前記判定用バイオマーカー。
［Ａグループ］
エタノールアミン、メチオニン
［Ｂグループ］
１，３−ジホスホグリセリン酸、シキミ酸−３−リン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン
【請求項６】
妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中のエタノールアミンの濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者におけるエタノールアミンの濃度と比べ、４４％減少し、
妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中のメチオニンの濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者におけるメチオニンの濃度と比べ、５１％減少し、
妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の１，３−ジホスホグリセリン酸の濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者における１，３−ジホスホグリセリン酸の濃度と比べ、２．５倍増加し、
妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中のシキミ酸−３−リン酸の濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者におけるシキミ酸−３−リン酸の濃度と比べ、１．５倍増加し、
妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンの濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者におけるＮ−アセチル−Ｌ−アラニンの濃度と比べ、１．５倍増加することを特徴とする
請求項５に記載の判定用バイオマーカー。
【請求項７】
代謝物質が、エタノールアミン又は１，３−ジホスホグリセリン酸を含む代謝物質であることを特徴とする請求項５又は６に記載の判定用バイオマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠糖尿病を発症していない妊娠女性から採取された尿中の、後述する［Ａグループ］及び［Ｂグループ］の代謝物質群（以下、これらを総称して「本件代謝物質群」ということがある）から選択される１又は２種以上の代謝物質の濃度を測定する工程（ａ）を含む、妊娠糖尿病の発症リスクの判定方法や、本件代謝物質群から選択される１又は２種以上の代謝物質からなる、妊娠糖尿病の発症リスクの判定用バイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus；ＧＤＭ）は、妊娠中に発症した、糖尿病に至っていない糖代謝異常を呈した状態である。ＧＤＭは、巨大児、早期産、子癇前症等の母体や胎芽又は胎児における様々な合併症のリスクと関連していることが報告されている（非特許文献１）。またＧＤＭは、出産後の子供の成長にも影響を及ぼし、例えば、肥満や代謝異常を引き起こすことが報告されている（非特許文献２〜４）。このため、日本では、ほぼ全員の妊娠女性に対して、ＧＤＭスクリーニング、すなわち、妊娠初期に、ランダム血糖値検査と、妊娠２４〜２８週の５０ｇグルコースチャレンジテスト（ＧＣＴ）、又は２回目のランダム血糖値検査との実施が推奨されている。ＧＤＭスクリーニングにおいて陽性の妊娠女性に対しては、さらに、７５ｇ経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行い、ＧＤＭの診断が行われる（非特許文献５）。
【０００３】
妊娠女性の母体及び胎児の健康管理をする上で、ＧＤＭを早期発見することに加えて、ＧＤＭの発症リスクを判定し、ＧＤＭの発症を予防することも重要である。近年、メタボローム解析を用いて、糖尿病やグルコース代謝異常を、早期検出することが報告されている（非特許文献６、７）。また、ＧＤＭと関連する代謝産物を同定するために、妊婦から羊水、尿、又は血液を採取し、メタボリックプロファイリング解析が行われたことが報告されている（非特許文献８〜１０）。また、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）と胎盤性成長因子（ＰＩＧＦ）は、子癇前症、妊娠糖尿病等の妊娠性疾患の発症リスクを判定できるバイオマーカーであることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、本件代謝物質群が、ＧＤＭの発症リスクを判定できるバイオマーカーであることについては、これまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００７−５０６９７９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】HAPO Study Cooperative Research Group et al. N Engl J Med. 2008;358(19):1991-2002.
【非特許文献２】Ouyang F. et al. Obesity (Silver Spring). 2016;24(4):938-46.
【非特許文献３】Kim SY. et al. Exp Diabetes Res. 2011;2011:541308.
【非特許文献４】Boney CM. et al. Pediatrics. 2005;115(3):e290-6.
【非特許文献５】Minakami H. et al. J Obstet Gynaecol Res. 2011;37(9):1174-97.
【非特許文献６】Wang TJ. et al. Nat Med. 2011;17(4):448-53.
【非特許文献７】Menni C. et al. Diabetes. 2013;62(12):4270-6.
【非特許文献８】Graca G. et al. J Proteome Res. 2010;9(11):6016-24.
【非特許文献９】Graca G. et al. Mol Biosyst. 2012;8(4):1243-54.
【非特許文献１０】Diaz SO. et al. J Proteome Res. 2011;10(8):3732-42.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、被験者である妊婦に対する負担が比較的少ない方法により採取可能な生体試料中で検出され、かつ、妊娠後、比較的初期の段階の妊婦が、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いか否かを精度よく判定できる、妊娠糖尿病の発症リスクの判定用バイオマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため、出産時点で妊娠糖尿病を発症していた妊婦（ｐｒｅＧＤＭ群）と、発症していなかった妊婦（対照群）のそれぞれについて、妊娠糖尿病未発症の妊娠初期に、予め採取された尿を用いてメタボローム解析を行ったところ、本件代謝物質群が、妊娠糖尿病の発症リスクを精度よく判定できるバイオマーカーであることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする妊娠糖尿病の発症リスクの判定方法。
（ａ）妊娠糖尿病を発症していない妊婦から採取された尿中の、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］から選択される１又は２種以上の代謝物質の濃度を測定する工程；
［Ａグループ］
エタノールアミン、メチオニン
［Ｂグループ］
１，３−ジホスホグリセリン酸、シキミ酸−３−リン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン
（ｂ）工程（ａ）で測定した代謝物質の濃度を、妊娠糖尿病を発症しない対照者における前記代謝物質の濃度と比較する工程；
（ｃ）工程（ａ）で測定した代謝物質が［Ａグループ］の代謝物質である場合、工程（ａ）で測定した代謝物質の濃度が、対照者における代謝物質の濃度よりも低いとき、前記妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価し、
工程（ａ）で測定した代謝物質が［Ｂグループ］の代謝物質である場合、工程（ａ）で測定した代謝物質の濃度が、対照者における代謝物質の濃度よりも高いとき、前記妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価する工程；
〔２〕妊婦が、妊娠１３〜２２週の妊婦であることを特徴とする上記〔１〕に記載の判定方法。
〔３〕工程（ｃ）において、
工程（ａ）で測定したエタノールアミンの濃度が、対照者におけるエタノールアミンの濃度と比べ、少なくとも４４％減少したとき、妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価し、
工程（ａ）で測定したメチオニンの濃度が、対照者におけるメチオニンの濃度と比べ、少なくとも５１％減少したとき、妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価し、
工程（ａ）で測定した１，３−ジホスホグリセリン酸の濃度が、対照者における１，３−ジホスホグリセリン酸の濃度と比べ、少なくとも２．５倍増加したとき、妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価し、
工程（ａ）で測定したシキミ酸−３−リン酸の濃度が、対照者におけるシキミ酸−３−リン酸の濃度と比べ、少なくとも１．５倍増加したとき、妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価し、
工程（ａ）で測定したＮ−アセチル−Ｌ−アラニンの濃度が、対照者におけるＮ−アセチル−Ｌ−アラニンの濃度と比べ、少なくとも１．５倍増加したとき、妊婦は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価する
ことを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の判定方法。
〔４〕代謝物質が、エタノールアミン又は１，３−ジホスホグリセリン酸を含む代謝物質であることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の判定方法。
〔５〕以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］から選択される１又は２種以上の代謝物質からなることを特徴とする妊娠糖尿病の発症リスクの判定用バイオマーカーであって、
代謝物質が［Ａグループ］の代謝物質である場合、妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の前記代謝物質の濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者における前記代謝物質の濃度と比べ、低く、
代謝物質が［Ｂグループ］の代謝物質である場合、妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の前記代謝物質の濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者における前記代謝物質の濃度と比べ、高い、
前記判定用バイオマーカー。
［Ａグループ］
エタノールアミン、メチオニン
［Ｂグループ］
１，３−ジホスホグリセリン酸、シキミ酸−３−リン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン
〔６〕妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中のエタノールアミンの濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者におけるエタノールアミンの濃度と比べ、４４％減少し、
妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中のメチオニンの濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者におけるメチオニンの濃度と比べ、５１％減少し、
妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の１，３−ジホスホグリセリン酸の濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者における１，３−ジホスホグリセリン酸の濃度と比べ、２．５倍増加し、
妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中のシキミ酸−３−リン酸の濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者におけるシキミ酸−３−リン酸の濃度と比べ、１．５倍増加し、
妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンの濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者におけるＮ−アセチル−Ｌ−アラニンの濃度と比べ、１．５倍増加することを特徴とする
上記〔５〕に記載の判定用バイオマーカー。
〔７〕代謝物質が、エタノールアミン又は１，３−ジホスホグリセリン酸を含む代謝物質であることを特徴とする上記〔５〕又は〔６〕に記載の判定用バイオマーカー。
【０００９】
また本発明の実施の他の形態として、
上記工程（ａ）〜（ｃ）を含む、妊娠糖尿病の発症リスクを診断するためのデータを収集する方法；や、
上記工程（ａ）〜（ｃ）を含み、さらに、工程（ｃ）において、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価（診断）された妊婦に対して、妊娠糖尿病の発症を予防する処置（例えば、食事療法や運動等）を施す工程（ｐ）を任意で含む、妊娠糖尿病の発症リスクの診断方法；や、
妊娠糖尿病の発症リスクの判定（診断）方法におけるバイオマーカーとして使用するための、本件代謝物質群から選択される１又は２種以上の代謝物質であって、代謝物質が上記［Ａグループ］の代謝物質である場合、妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の前記代謝物質の濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者における前記代謝物質の濃度と比べ、低く、代謝物質が上記［Ｂグループ］の代謝物質である場合、妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の前記代謝物質の濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者における前記代謝物質の濃度と比べ、高い、前記代謝物質；
を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、妊娠糖尿病未発症の妊婦が、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いか低いかを診断する上で有用な、精度の高い診断用データを取得できるため、例えば、妊娠糖尿病の発症リスクの高い妊婦に対して、妊娠糖尿病発症前にその発症を予防する処置（例えば、食事療法や運動等）を施すことにより、妊娠糖尿病の発症を予防することができる。さらに、妊娠糖尿病の発症を予防することは、妊娠糖尿病による合併症（例えば、子癇前症、低血糖、不妊症、妊娠高血圧症候群、早期産、羊水過多症等の母体における合併症；流産、奇形、巨大児、肥厚性心筋症等の胎芽又は胎児における合併症；呼吸窮迫症候群、低血糖、高カルシウム血症、高マグネシウム多血症、高ビリルビン血症等の新生児における合併症）のリスクや、出産後の妊婦がその後２型糖尿病に罹患するリスクの低減にもつながる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｐｒｅＧＤＭ群及び対照群における尿中のエタノールアミン濃度（図１Ａ）並びに１，３−ＤＰＧ濃度（図１Ｂ）を測定した結果を示す図である。
【図２】ｐｒｅＧＤＭ群及び対照群における尿中のシキミ酸−３−リン酸濃度（図２Ａ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン濃度（図２Ｂ）、並びにメチオニン濃度（図２Ｃ）を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の妊娠糖尿病の発症リスクの判定方法としては、被験者である妊娠糖尿病未発症の妊婦（以下、「被験者」ということがある）から採取された尿中の、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］から選択される１又は２種以上の代謝物質の濃度（以下、「被験者における代謝物質濃度」ということがある）を測定し、必要に応じて定量する工程（ａ）；工程（ａ）で測定した「被験者における代謝物質濃度」を、妊娠糖尿病を発症しない対照者における前記代謝物質の濃度（以下、「対照者における代謝物質濃度」ということがある）と比較する工程（ｂ）；及び、工程（ａ）で測定した代謝物質が以下の［Ａグループ］の代謝物質である場合、工程（ａ）で測定した「被験者における代謝物質濃度」が、「対照者における代謝物質濃度」よりも低いとき、前記被験者（妊婦）は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価し、工程（ａ）で測定した代謝物質が以下の［Ｂグループ］の代謝物質である場合、工程（ａ）で測定した「被験者における代謝物質濃度」が、「対照者における代謝物質濃度」よりも高いとき、前記被験者（妊婦）は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価する工程（ｃ）；の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法（以下、「本件判定方法」ということがある）であれば特に制限されず、本件判定方法は、医師による妊娠糖尿病の発症リスクの診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。
［Ａグループ］
エタノールアミン（ethanolamine）、メチオニン（methionine）
［Ｂグループ］
１，３−ジホスホグリセリン酸（1,3-diphosphoglycerate；１，３−ＤＰＧ）、シキミ酸−３−リン酸（shikimate-3-phosphate）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン（N-Acetyl-L-alanine）
【００１３】
また、本発明の妊娠糖尿病の発症リスクの判定用バイオマーカーとしては、上記［Ａグループ］及び［Ｂグループ］から選択される１又は２種以上の代謝物質からなる、妊娠糖尿病の発症リスクの判定（診断）に用いるためのバイオマーカーであって、代謝物質が上記［Ａグループ］の代謝物質である場合、妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の前記代謝物質の濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者における前記代謝物質の濃度と比べ、低く、代謝物質が上記［Ｂグループ］の代謝物質である場合、妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の前記代謝物質の濃度が、妊娠糖尿病を発症しない対照者における前記代謝物質の濃度と比べ、高い、前記判定用バイオマーカー（以下、「本件判定用バイオマーカー」ということがある）であれば特に制限されない。
【００１４】
上記被験者としては、妊娠糖尿病を発症していない妊娠女性であればよく、妊娠初期（通常、妊娠０〜１５週）、妊娠中期（通常、妊娠１６〜２７週）、及び妊娠後期（通常、妊娠２８〜３９週）のいずれの妊娠女性であってもよいが、妊娠糖尿病は、妊娠中期に発症することが多いため、妊娠初期又は妊娠中期の妊娠女性が好ましい。かかる妊娠初期としては、妊娠４〜１５週が好ましく、妊娠８〜１５週がより好ましく、妊娠１３〜１５週がさらに好ましい。また、上記妊娠中期としては、妊娠１６〜２５週が好ましく、妊娠１６〜２４週がより好ましく、妊娠１６〜２２週がさらに好ましい。したがって、上記被験者としては、妊娠４〜２５週の妊婦が好ましく、妊娠８〜２４週の妊婦がより好ましく、妊娠１３〜２２週の妊婦がさらに好ましい。
【００１５】
本明細書において、「妊娠糖尿病」とは、妊娠中に発症した、糖尿病に至っていない糖代謝異常を呈した状態を意味し、より具体的には、妊娠中の空腹時の血糖値が９２ｍｇ／ｄＬ以上１２６ｍｇ／ｄＬ未満を呈する状態；或いは、妊娠中に、７５ｇのブドウ糖（Glucose；Ｇｌｃ）又はデンプン部分加水分解産物（partial hydrolysate of starch；ＰＨＳ）を用いた経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施した場合、実施後２時間において、血糖値が１５３ｍｇ／ｄＬ以上２００ｍｇ／ｄＬ未満を呈する状態；を意味する。したがって、妊娠糖尿病には、妊娠前又は妊娠中に発症した糖尿病や糖尿病合併妊娠は含まれない。かかる糖尿病とは、具体的に、妊娠前又は妊娠中の空腹時の血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上を呈する状態；妊娠前又は妊娠中に、上記ＯＧＴＴを実施した場合、実施後２時間において、血糖値が２００ｍｇ／ｄＬ以上を呈する状態；或いは、妊娠前又は妊娠中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）値が６．５％以上を呈する状態；を意味する。また、上記糖尿病合併妊娠とは、妊娠前に糖尿病に罹患したことがあり、かつ妊娠中に糖尿病網膜症を罹患した状態を意味する。
【００１６】
本件判定方法及び本件判定用バイオマーカーにおいて、尿中の本件代謝物質群の濃度は、採取された尿から尿試料（サンプル）を調製し、本件代謝物質群を特異的に検出できる公知の方法、例えば、質量分析法を用いて測定することができる。かかる質量分析法とは、尿試料を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、或いは飛行時間差によりイオン化した尿試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法、電界脱離イオン化（ＦＤ）法、高速原子衝撃（ＦＡＢ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法等の方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化した尿試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型等の分離方法を適宜選択することができる。また、２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を利用することができる。また、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）や液体クロマトグラフィー（ＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、本件代謝物質群を夾雑物から分離・精製して分析することができる。
【００１７】
本件判定方法及び本件判定用バイオマーカーにおいて、尿中の本件代謝物質群の濃度は、絶対値であっても、相対値であってもよく、相対値とする場合、例えば、濃度が既知の本件代謝物質群（内部標準）を基準とした相対値を挙げることができる。
【００１８】
本件判定方法及び本件判定用バイオマーカーにおいて、「妊娠糖尿病を発症しない対照者における代謝物質の濃度」は、比較対象である「被験者における代謝物質濃度」や、「妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の代謝物質の濃度」に対応するものを用いる。このため、「被験者における代謝物質濃度」や、「妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の代謝物質の濃度」が、絶対値又は相対値である場合、「妊娠糖尿病を発症しない対照者における代謝物質の濃度」は、それぞれ絶対値、相対値である。上記「妊娠糖尿病を発症しない対照者における代謝物質の濃度」は、本件判定方法を実施する際、対照者から採取された尿から尿試料を調製し、その都度測定してもよいが、予め測定したものを用いてもよい。また、上記対照者から採取・調製した尿試料は、被験者由来の尿試料と実質的に同じ方法により調製されたものが好ましい。また、「妊娠糖尿病を発症しない対照者における代謝物質の濃度」の測定に用いる方法は、比較対象である「被験者における代謝物質濃度」や、「妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦から採取された尿中の代謝物質の濃度」の測定に用いた方法と実質的に同じものが好ましい。
【００１９】
上記対照者としては、妊娠糖尿病を発症しないことが明らかな対照者であればよく、通常、妊娠糖尿病を発症しないことが明らかな女性であり、妊娠糖尿病を発症しないことが明らかな妊娠女性が好ましい。また、上記対照者としては、被験者と年齢、ＢＭＩ（Body Mass Index）、及び／又は出産回数（Parity）が類似した者（統計学的な有意差が無い状態の者）が好ましい。
【００２０】
本件判定方法の工程（ｃ）において、工程（ａ）で測定した代謝物質が上記［Ａグループ］の代謝物質である場合、工程（ａ）で測定した「被験者における代謝物質濃度」が、「対照者における代謝物質濃度」よりも低いとき、被験者（妊婦）は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価（判定）し、工程（ａ）で測定した「被験者における代謝物質濃度」が、「対照者における代謝物質濃度」よりも低くないとき、被験者（妊婦）は、妊娠糖尿病を発症するリスクが低いと評価（判定）する。また、本件判定方法の工程（ｃ）において、工程（ａ）で測定した代謝物質が上記［Ｂグループ］の代謝物質である場合、工程（ａ）で測定した「被験者における代謝物質濃度」が、「対照者における代謝物質濃度」よりも高いとき、被験者（妊婦）は、妊娠糖尿病を発症するリスクが高いと評価（判定）し、工程（ａ）で測定した「被験者における代謝物質濃度」が、「対照者における代謝物質濃度」よりも高くないとき、被験者（妊婦）は、妊娠糖尿病を発症するリスクが低いと評価（判定）する。
【００２１】
「被験者における代謝物質濃度」が、「対照者における代謝物質濃度」よりも低いか否か、或いは高いか否かを判定するために、閾値（カットオフ値）は任意のものを設定することができ、かかる閾値としては、例えば、「対照者における代謝物質濃度」の平均値、「平均値＋標準偏差（ＳＤ）」、「平均値＋２ＳＤ」、「平均値＋３ＳＤ」、中央値、「中央値＋ＳＤ」、「中央値＋２ＳＤ」、「中央値＋３ＳＤ」等を挙げることができる。また、閾値は、感度（妊娠糖尿病をその後発症する者を、正しく陽性と判定できる割合）及び特異度（妊娠糖尿病をその後発症しない者を、正しく陰性と判定できる割合）が高くなるように、「被験者における代謝物質濃度」のデータと、「対照者における代謝物質濃度」のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を用いて算出することもできる。
【００２２】
本件判定方法及び本件判定用バイオマーカーにおいて、「妊娠糖尿病を発症しない対照者に対する被験者」又は「妊娠糖尿病を発症しない対照者に対する妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦」の、上記［Ａグループ］の代謝物質（エタノールアミン又はメチオニン）濃度の低下レベルは、「妊娠糖尿病を発症しない対照者」、「被験者」、及び「妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦」の特徴、測定方法等により異なるため、一概に特定することはできないが、エタノールアミンの場合、例えば、少なくとも２８％の減少であり、好ましくは少なくとも３０％の減少、より好ましくは少なくとも３２％の減少、さらに好ましくは少なくとも３４％の減少、さらにより好ましくは少なくとも３５％の減少、特に好ましくは少なくとも３７％の減少、特により好ましくは少なくとも３９％の減少、特にさらに好ましくは少なくとも４１％の減少、特にさらにより好ましくは少なくとも４３％の減少、最も好ましくは少なくとも４４％の減少である。また、メチオニンの場合、上記低下レベルは、例えば、少なくとも２０％の減少であり、好ましくは少なくとも２３％の減少、より好ましくは少なくとも２６％の減少、さらに好ましくは少なくとも３０％の減少、さらにより好ましくは少なくとも３３％の減少、特に好ましくは少なくとも３６％の減少、特により好ましくは少なくとも４０％の減少、特にさらに好ましくは少なくとも４２％の減少、特により好ましくは少なくとも４４％の減少、特にさらに好ましくは少なくとも４６％の減少、特にさらにより好ましくは少なくとも４８％の減少、また特に好ましくは少なくとも５０％の減少、最も好ましくは少なくとも５１％の減少である。
【００２３】
本件判定方法及び本件判定用バイオマーカーにおいて、「妊娠糖尿病を発症しない対照者に対する被験者」又は「妊娠糖尿病を発症しない対照者に対する妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦」の、上記［Ｂグループ］の代謝物質（１，３−ＤＰＧ、シキミ酸−３−リン酸、又はＮ−アセチル−Ｌ−アラニン）濃度の増加レベルは、「妊娠糖尿病を発症しない対照者」、「被験者」、及び「妊娠糖尿病を発症するリスクが高い妊婦」の特徴、測定方法等により異なるため、一概に特定することはできないが、１，３−ＤＰＧの場合、例えば、少なくとも１．１倍の増加であり、好ましくは少なくとも１．２倍の増加、より好ましくは少なくとも１．４倍の増加、さらに好ましくは少なくとも１．６倍、さらにより好ましくは少なくとも１．８倍の増加、特に好ましくは少なくとも２．０倍の増加、特により好ましくは少なくとも２．１倍の増加、特にさらに好ましくは少なくとも２．２倍の増加、特にさらにより好ましくは少なくとも２．３倍の増加、また特に好ましくは少なくとも２．４倍の増加、最も好ましくは少なくとも２．５倍の増加である。また、シキミ酸−３−リン酸又はＮ−アセチル−Ｌ−アラニンの場合、上記増加レベルは、例えば、少なくとも１．１倍の増加であり、好ましくは少なくとも１．２倍の増加、より好ましくは少なくとも１．３倍の増加、さらに好ましくは少なくとも１．４倍の増加、さらにより好ましくは少なくとも１．５倍の増加、特に好ましくは少なくとも最も好ましくは少なくとも１．６倍の増加である。
【００２４】
本件判定方法及び本件判定用バイオマーカーにおいて、代謝物質としては、本件代謝物質群から選択される１又は２種以上の代謝物質であればよく、具体的に、エタノールアミン、メチオニン、１，３−ＤＰＧ、シキミ酸−３−リン酸、及びＮ−アセチル−Ｌ−アラニンからなる群から選択される１種；エタノールアミンとメチオニンとの２種の組合せ；エタノールアミンと１，３−ＤＰＧとの２種の組合せ；エタノールアミンとシキミ酸−３−リン酸との２種の組合せ；エタノールアミンとＮ−アセチル−Ｌ−アラニンとの２種の組合せ；メチオニンと１，３−ＤＰＧとの２種の組合せ；メチオニンとシキミ酸−３−リン酸との２種の組合せ；メチオニンとＮ−アセチル−Ｌ−アラニンとの２種の組合せ；１，３−ＤＰＧとシキミ酸−３−リン酸との２種の組合せ；１，３−ＤＰＧとＮ−アセチル−Ｌ−アラニンとの２種の組合せ；シキミ酸−３−リン酸とＮ−アセチル−Ｌ−アラニンとの２種の組合せ；エタノールアミンと、メチオニンと、１，３−ＤＰＧとの３種の組合せ；エタノールアミンと、メチオニンと、シキミ酸−３−リン酸との３種の組合せ；エタノールアミンと、メチオニンと、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンとの３種の組合せ；エタノールアミンと、１，３−ＤＰＧと、シキミ酸−３−リン酸との３種の組合せ；エタノールアミンと、１，３−ＤＰＧと、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンとの３種の組合せ；エタノールアミンと、シキミ酸−３−リン酸と、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンとの３種の組合せ；エタノールアミンと、メチオニンと、１，３−ＤＰＧと、シキミ酸−３−リン酸との４種の組合せ；エタノールアミンと、メチオニンと、１，３−ＤＰＧと、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンとの４種の組合せ；エタノールアミンと、１，３−ＤＰＧと、シキミ酸−３−リン酸と、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンとの４種の組合せ；エタノールアミンと、メチオニンと、１，３−ＤＰＧと、シキミ酸−３−リン酸と、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンとの５種の組合せ；を挙げることができ、これらの中でもエタノールアミン又は１，３−ＤＰＧを含むものが好ましい。
【００２５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
１．方法
［尿試料の調製］
子供の健康と環境に関する全国調査（ＪＥＣＳ）の千葉ユニットセンターの参加者の中から、妊娠初期（１４〜２１週）の女性を３年間（２０１１〜２０１４）募集し、参加に同意した者から尿を採取し、−２０℃で保存した。また、妊娠女性参加者のうち、妊娠初期の診療（Ｔ１アンケート）では、ＧＤＭを発症しておらず、かつ、その後の出産時においてＧＤＭを発症していると診断された者をＧＤＭ発症前群（ｐｒｅＧＤＭ群）とした。さらに、ｐｒｅＧＤＭ群１２１名の年齢、ＢＭＩ（Body Mass Index）、及び出産回数（Parity）を調べ、これら値とマッチングした者であって、妊娠初期の診療を含めてＧＤＭを発症しなかった者を対照群とした（表１参照）。なお、本実施例は、ヘルシンキ宣言にしたがって行われ、プロトコールは、千葉大学大学院医学研究院、及び医学研究院生命倫理委員会によって承認された。さらに、妊娠女性参加者からは、書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００２７】
【表１】
2019027885.tif 000002
【００２８】
［親水性相互作用クロマトグラフィタンデム質量分析（ＨＩＬＩＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるメタボローム解析］
尿の保存条件（−２０℃）下で安定と考えられている２６３種類の代謝産物について、尿中の濃度を調べるために、ｐｒｅＧＤＭ群６７名及び対照群６７名の尿を用いて、文献「Soga T. et al. Anal Chem. 2009;81(15):6165-74.」及び文献「Yuan M. et al. Nat Protoc. 2012;7(5):872-81.」記載の方法に従って、ＨＩＬＩＣ−ＭＳ／ＭＳによるメタボローム解析を行った。すなわち、尿６０μＬを、１４，０００ｇで１０分間遠心分離した後、４０μＬの上清と、前処置手順で目減りした試料を調整するための６０μＬの内部標準を含むメタノール（１ｎＭのリドカイン、及び正イオンモードにはＮ，Ｎ−ジエチル−２−フェニルアセタミド、負イオンモードにはＤ−camphor−１０−スルホン酸）とを、Amicon Ultra-0.5 3k フィルターカラム（Merck Millipore社製）に置いた後、１４,０００ｇで１時間遠心分離し、濾過物（残渣）を尿試料とし用い、Prominence UFLCシステム（Shimadzu社製）及びQTRAP 4500システム（AB SCIEX社製）を用いて分析した。すなわち、濾過物を、３．５−μｍXBridge BEHアミドカラム（Waters 社製）を用いて、４．６ｍｍ（内径）×１００ｍｍ、流速３５０μＬ／分でＨＩＬＩＣクロマトグラフィを介して質量分析計（QTRAP 4500システム）に送達した。本実施例では、移動相Ａ（２０ｍＭの水酸化アンモニウム／２０ｍＭの酢酸アンモニウム［ｐＨ＝９．５］超高純度の水：アセトニトリル［９５：５］）及び移動相Ｂ（高速液体クロマトグラフィ−グレードアセトニトリル）の勾配を使用して標的メタボロームを解析した。各代謝産物ＳＲＭ遷移のトータルイオンカレントからのピーク領域は、MultiQuant v3.0ソフトウェア（AB SCIEX社製）を使用して積分（integrated）した。使用したピーク積分設定値は、文献「Yuan M. et al. Nat Protoc. 2012;7(5):872-81.」に記載のとおりである。
【００２９】
［統計分析］
ｐｒｅＧＤＭ群の測定値と、対照群の測定値との統計学的有意差は、その分布に従ってunpaired t-test又はMann-Whitney testを使用して分析した。潜在構造に対する直交射影判別分析（orthogonal projections to latent structures Discriminant Analysis；ＯＰＬＳ−ＤＡ）を行い、Microsoft R open 3.3.0 (R Core Team, 2016, R Core Team R:A Language and Environment for Statistical Computing R Foundation for Statistical Computing, Vienna 2016)において、パッケージropls（文献「Thevenot EA., et al. J Proteome Res. 2015;14(8):3322-35.」参照)を使用して、両群のメタボロームプロファイルを解析した。Variable importance of projection（ＶＩＰ）値が１．５を超える代謝物質を、ＧＤＭ発症リスクの診断用バイオマーカーの候補物質として同定した。また、各代謝物質の感度及び特異度は、ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線及び対応領域を使用して、ＲＯＣＲパッケージで行ったＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）の下で分析した。
【００３０】
２．結果
ｐｒｅＧＤＭ群と対照群における尿中の２６３種類の代謝産物の濃度を測定したところ、１８７種類の代謝物質が検出された。そのうち、ＶＩＰ値が１．５を超えるＧＤＭ発症リスクの診断用バイオマーカーの候補物質は、２０種類あることが示された。さらに、ＲＯＣＲパッケージで行ったＲＯＣ曲線を用いて、感度及び特異度を検討したところ、５種類の物質（エタノールアミン、１，３−ジホスホグリセリン酸［１，３−ＤＰＧ］、シキミ酸−３−リン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン、及びメチオニン）が同定された。
【００３１】
［エタノールアミン］
ｐｒｅＧＤＭ群において、尿中のエタノールアミン濃度は、０．０３９（中央値）であり、対照者群の値（０．０７０）と比べ、約４４％減少し、有意差が認められた（Ｐ＝０．０００００２４７）（図１Ａ参照）。この結果は、ＧＤＭを（将来）発症する者由来の尿中のエタノールアミン濃度は、ＧＤＭを発症しない者と比べ、低いことを示している。
また、ｐｒｅＧＤＭ群及び対照者群の尿中のエタノールアミン濃度を基に、ＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣ値は、０．８２１と高い値を示した。また、ｐｒｅＧＤＭ群と対照群とを区別するためのカットオフ値として、０．０５６を設定したところ、ＧＤＭを発症する者の感度（ＧＤＭを発症する者の中で検査陽性者の割合）及び特異度（ＧＤＭを発症しない者の中で検査陰性の割合）は、それぞれ７４％及び８１％であった。
この結果は、ＧＤＭ発症前の妊婦から採取された尿中のエタノールアミン濃度を測定し、適切なカットオフ値を設定すると、エタノールアミン濃度を指標として、ＧＤＭの発症リスクを判定できることを示している。
【００３２】
［１，３−ＤＰＧ］
ｐｒｅＧＤＭ群において、尿中の１，３−ＤＰＧ濃度は、０．０３７（中央値）であり、対照者群の値（０．０１５）と比べ、約２．５倍増加し、有意差が認められた（Ｐ＝０．００００００２３８）（図１Ｂ参照）。この結果は、ＧＤＭを（将来）発症する者由来の尿中の１，３−ＤＰＧ濃度は、ＧＤＭを発症しない者と比べ、高いことを示している。
また、ｐｒｅＧＤＭ群及び対照者群の尿中の１，３−ＤＰＧ濃度を基に、ＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣ値は、０．８４８と高い値を示した。また、ｐｒｅＧＤＭ群と対照群とを区別するためのカットオフ値として、０．０３０を設定したところ、ＧＤＭを発症する者の感度（ＧＤＭを発症する者の中で検査陽性者の割合）及び特異度（ＧＤＭを発症しない者の中で検査陰性の割合）は、それぞれ６１％及び１００％であった。
この結果は、ＧＤＭ発症前の妊婦から採取された尿中の１，３−ＤＰＧ濃度を測定し、適切なカットオフ値を設定すると、１，３−ＤＰＧ濃度を指標として、ＧＤＭの発症リスクを判定できることを示している。
【００３３】
［シキミ酸−３−リン酸］
ｐｒｅＧＤＭ群において、尿中のシキミ酸−３−リン酸濃度は、０．０４７（中央値）であり、対照者群の値（０．０３２）と比べ、約１．５倍増加し、有意差が認められた（Ｐ＝０．０００１１３）（図２Ａ参照）。この結果は、ＧＤＭを（将来）発症する者由来の尿中のシキミ酸−３−リン酸濃度は、ＧＤＭを発症しない者と比べ、高いことを示している。
また、ｐｒｅＧＤＭ群及び対照者群の尿中のシキミ酸−３−リン酸濃度を基に、ＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣ値は、０．７６８と高い値を示した。また、ｐｒｅＧＤＭ群と対照群とを区別するためのカットオフ値として、０．０３９を設定したところ、ＧＤＭを発症する者の感度（ＧＤＭを発症する者の中で検査陽性者の割合）及び特異度（ＧＤＭを発症しない者の中で検査陰性の割合）は、それぞれ６７％及び７４％であった。
この結果は、ＧＤＭ発症前の妊婦から採取された尿中のシキミ酸−３−リン酸濃度を測定し、適切なカットオフ値を設定すると、シキミ酸−３−リン酸濃度を指標として、ＧＤＭの発症リスクを判定できることを示している。
【００３４】
［Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン］
ｐｒｅＧＤＭ群において、尿中のＮ−アセチル−Ｌ−アラニン濃度は、０．０７１（中央値）であり、対照者群の値（０．０４６）と比べ、約１．５倍増加し、有意差が認められた（Ｐ＝０．０００８）（図２Ｂ参照）。この結果は、ＧＤＭを（将来）発症する者由来の尿中のＮ−アセチル−Ｌ−アラニン濃度は、ＧＤＭを発症しない者と比べ、高いことを示している。
また、ｐｒｅＧＤＭ群及び対照者群の尿中のＮ−アセチル−Ｌ−アラニン濃度を基に、ＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣ値は、０．７３５と高い値を示した。また、ｐｒｅＧＤＭ群と対照群とを区別するためのカットオフ値として、０．０５を設定したところ、ＧＤＭを発症する者の感度（ＧＤＭを発症する者の中で検査陽性者の割合）及び特異度（ＧＤＭを発症しない者の中で検査陰性の割合）は、それぞれ７８％及び５８％であった。
この結果は、ＧＤＭ発症前の妊婦から採取された尿中のＮ−アセチル−Ｌ−アラニン濃度を測定し、適切なカットオフ値を設定すると、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン濃度を指標として、ＧＤＭの発症リスクを判定できることを示している。
【００３５】
［メチオニン］
ｐｒｅＧＤＭ群において、尿中のメチオニン濃度は、０．００６４（中央値）であり、対照者群の値（０．０１３）と比べ、約５１％減少し、有意差が認められた（Ｐ＝０．００２２９）（図２Ｃ参照）。この結果は、ＧＤＭを（将来）発症する者由来の尿中のメチオニン濃度は、ＧＤＭを発症しない者と比べ、低いことを示している。
また、ｐｒｅＧＤＭ群及び対照者群の尿中のメチオニン濃度を基に、ＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣ値は、０．７１８と高い値を示した。また、ｐｒｅＧＤＭ群と対照群とを区別するためのカットオフ値として、０．００８２を設定したところ、ＧＤＭを発症する者の感度（ＧＤＭを発症する者の中で検査陽性者の割合）及び特異度（ＧＤＭを発症しない者の中で検査陰性の割合）は、それぞれ６８％及び７２％であった。
この結果は、ＧＤＭ発症前の妊婦から採取された尿中のメチオニン濃度を測定し、適切なカットオフ値を設定すると、メチオニン濃度を指標として、ＧＤＭの発症リスクを判定できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、妊婦における、妊娠糖尿病の発症リスクの診断及び治療の他、妊娠糖尿病合併症妊娠による胎児の奇形（例えば、心肥大、心室中隔欠損等の心奇形；小頭症等の骨角奇形；腎形成不全、尿管重複等の腎奇形；十二指腸閉鎖、直腸閉鎖等の消化管奇形など）の予防や、出産後に２型糖尿病に罹患するリスクを予防することに資するものである。
【図１】
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【図２】
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