(57)【要約】      （修正有）【課題】フィブロインの分子量を低下させることなく、繭を直接溶解させ、フィブロインとセリシンを含む繭タンパク質溶液を得る、繭タンパク質溶液の製造方法及び固体繭タンパク質の製造方法の提供。【解決手段】溶解温度、２０℃以上、１２０℃以下で、塩化カルシウムとエタノールと水を含む溶液に乾繭を溶解させ、第１の繭タンパク質溶液を得る第１の工程と、第１の繭タンパク質溶液から塩化カルシウムを除去し、第２の繭タンパク質溶液を得る第２の工程、を含む繭タンパク質溶液の製造方法。さらに、第２の繭タンパク質溶液からエタノールと水を除去し、固体繭タンパク質を得る第３の工程を含む固体繭タンパク質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶解温度、２０℃以上、１２０℃以下で、塩化カルシウムとエタノールと水を含む溶液に乾繭を溶解させ、第１の繭タンパク質溶液を得る第１の工程と、
第１の繭タンパク質溶液から塩化カルシウムを除去し、第２の繭タンパク質溶液を得る第２の工程、
を含む、繭タンパク質溶液の製造方法。
【請求項２】
塩化カルシウムとエタノールと水を含む溶液中の塩化カルシウムとエタノールと水の配合比がモル比で表して、塩化カルシウム：エタノール：水＝０．０１〜２．０：０．１〜１０．０：３．０〜２０．０である、請求項１に記載の繭タンパク質溶液の製造方法。
【請求項３】
第１の工程で得られる第１の繭タンパク質溶液中の繭タンパク質の濃度が、０．０００１質量体積％以上、５０質量体積％以下である、請求項１または請求項２に記載の繭タンパク質溶液の製造方法。
【請求項４】
溶解温度、２０℃以上、１２０℃以下で、塩化カルシウムとエタノールと水を含む溶液に乾繭を溶解させ、第１の繭タンパク質溶液を得る第１の工程と、
第１の繭タンパク質溶液を透析し、第２の繭タンパク質溶液を得る第２の工程と、
第２の繭タンパク質溶液からエタノールと水を除去し、固体繭タンパク質を得る第３の工程と、
を含む固体繭タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繭タンパク質溶液の製造方法に関する。繭タンパク質は化粧品、あるいは生体適合材料として、医療用縫合糸、創傷被覆材、人工血管、軟骨支持材または角膜再生材等に使用されている。
【背景技術】
【０００２】
フィブロインおよびセリシンは、蚕や蜘蛛等の生物が産生するタンパク質である。本発明において、繭タンパク質とはフィブロインおよびセリシンを指す。蚕が産生する繭玉は、幼虫が体内で産生し吐き出す繭糸からなる。繭糸は、繊維質のフィブロインのフィラメントを膠質のセリシンで被覆したものである。繭玉は、一本の長い繭糸から膠質のセリシンを接着剤とし、幼虫により営繭されたものである。特許文献１に、繭玉中の繭タンパク質の存在比はフィブロインが７０〜８０質量％、セリシンが２０〜３０質量％であり、その他、脂肪分等の少量の夾雑物が含まれると記載されている。
【０００３】
蚕の幼虫が営繭し何ら処理していない状態の繭玉を、生繭と呼ぶ。生繭に対し、生繭内の蛹の発蛾による繭の穴あけ、および保存中の着色の防止のため、生繭を加熱乾燥処理したものを乾繭と呼ぶ。特許文献１に、乾繭は、生繭を１１５〜１２０℃に加熱した後、５〜６時間かけて８０℃程度の温度に徐々に下げる加熱乾燥処理されたものであることが記載されている。
【０００４】
乾繭から繭糸を引き出す際は、上記加熱乾燥処理により、セリシンが硬く固化しフィブロインからなるフィラメント同士が硬く接着していることから、セリシンを柔らかくするために煮繭を行う。特許文献１に、煮繭は、１００〜１０５℃の水蒸気または熱水に乾繭を１０分間程さらす工程であることが記載されている。煮繭後、柔らかくなった繭玉から繭糸を引き出し数本揃えて生糸とする。絹糸は、生糸からセリシンを適度に除くことで、生糸に対し光沢や柔軟性を増した糸である。セリシンが被覆した状態のフィブロインである生糸から絹糸を得るためには、一般的に、生糸にアルカリ性の溶液、例えば、石鹸液、灰汁またはソーダ液等に接触させることでセリシンを溶解させて除き、これらアルカリ性溶液に難溶なフィブロインを残す作業である精練を行う。
【０００５】
一方で、繭から絹糸を得る際の煮繭および精練により、フィブロインの分子量が低下することが知られている。通常、フィブロインの分子量が低下すると、繊維とした際の破断強度が低下し好ましくない。特に、医療用縫合糸等の生体適合性材料においては、蚕が産生したままのフィブロインの分子量を低下させていない高強度な材料であることが求められる。
【０００６】
例えば、特許文献１には「従来の絹糸生産方法である生繭−乾繭工程−煮繭工程−繰糸工程−生糸−精練工程−絹糸においては、生繭や乾繭の保存状態および各工程の温度もしくは時間等の条件でフィブロインの分解程度は異なるが、生糸の段階までにフィブロインが低分子量化されやすく、その後の精練工程ではフィブロインは分解して低分子量化していることが発明者らにより、電気泳動法による分析によって初めて明らかにされた」と記載されている。特許文献２には、生糸をマルセル石鹸、炭酸ソーダまたは苛性ソーダ等のｐＨ１０．５〜１１．５の強塩基に接触させる、あるいはマルセル石鹸を主剤とし炭酸ナトリウムまたは珪酸ナトリウムを加えた熱水に接触させる過度の精練を行ったところ、セリシンは除かれたもののフィブロインが加水分解によって低分子量化され、得られた絹の引張強度が元々の生糸に対し低下していたことが記載されている。
【０００７】
一方、純粋なフィブロインのみを含む溶液を得るには、精練によりセリシンを除去した絹糸または絹布を特定の中性塩溶液に溶解させてフィブロイン溶液を得た後、溶液から塩を除く透析を行う必要がある。なお、絹糸を編んで布としたものを絹布と呼ぶ。
【０００８】
特許文献３には、精練された絹を塩水溶液に溶解させた後、限外濾過膜からなる限外濾過装置で透析し脱塩を行う、フィブロイン溶液の製造法が開示されている。また、特許文献３には、創傷医療のための損傷被覆材に使用するために、精練された絹を、塩化カルシウムとエタノールと水の比が、塩化カルシウム：エタノール：水＝１：２：８とし７０〜８０℃に加熱した溶液に溶解させた後、透析チューブにより塩化カルシウムを除去する透析を行うことが記載されている。特許文献４には、フィブロインを塩化カルシウム水溶液に溶解し、次いで脱塩して得られるフィブロイン溶解物を、塩化カルシウムとともに有機溶剤に溶解する方法が開示されている。また、特許文献５においては、家蚕フィブロインを溶解する際に臭化リチウム等の中性塩や、銅エチレンジアミン等の錯体が溶解した水溶液を使用している。しかしながら、これらの溶媒中にフィブロインを長時間置くと、フィブロインの分子鎖が分解するため、再生絹糸（再生フィブロインと呼ぶことがある）が得られたとしても力学物性は極めて低いなどの欠点があると記載されている。
【０００９】
非特許文献１〜３には、フィブロインをアルカリ金属塩である臭化リチウムの水溶液に溶解させることが記載されている。非特許文献１には、「精練絹糸は、塩化カルシウムのエタノール水溶液や高濃度の臭化リチウム水溶液に容易に溶解するが、塩化カルシウムのエタノール水溶液ではフィブロインが分解されやすい。臭化リチウム水溶液はタンパク質をほとんど分解せずにフィブロインタンパク質を溶解でき、透析して臭化リチウムを除去することでフィブロイン水溶液を得ることができる。しかし、セリシン層の溶解については臭化リチウム水溶液では必ずしも十分ではなく、また繭層タンパク質全体の溶解に関しては知見が見当たらない。繭層をそのまま溶解することができれば、繭層タンパク質を分解することなく溶解できる可能性がある。」と記載されている。
【００１０】
繭玉からフィブロインをそのまま溶解させる方法として、生繭屑を塩化カルシウムおよび臭化リチウム等の水溶液に溶解させ、透析等の手段で塩を除去することが、知られている。生繭屑とは生繭が変色および穴が開いている等で絹糸の原料にならず、前述の加熱乾燥処理を行っていない繭である。
【００１１】
例えば、特許文献６には、生繭屑は、塩化カルシウム等のアルカリ土類金属塩の水溶液に溶解することが記載されている。特許文献７には、生繭屑を塩化カルシウムとメタノールを含む水溶液に加熱溶解した後で透析することにより、再生フィブロインを得ることが開示されている。
【００１２】
特許文献１には、生繭、乾繭、煮繭した繭の繭層、繭糸、生糸または絹布を中性塩水溶液に溶解後、分別沈殿処理に付し、セリシンと分ける未分解フィブロインの製造法が開示されている。特許文献１の実施例において、中性塩としてチオシアン酸リチウムが使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００１−１６３８９９号公報
【特許文献２】特許平０１−２２９８０３号公報
【特許文献３】特開２００５−５２１６２号公報
【特許文献４】特開平１１−１８０９９９号公報
【特許文献５】特開２００９−２２１４０１号公報
【特許文献６】特開平７−８９０７号公報
【特許文献７】特開平８−１０３９０３号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Nippon  Silk  Gakkaishi  20巻、89−94頁（2012）
【非特許文献２】Nippon  Silk  Gakkaishi  21巻、45−47頁（2013）
【非特許文献３】Nippon  Silk  Gakkaishi  22巻、109−116頁（2014）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、フィブロインを任意の分子量に調整することが可能な、乾繭を溶剤に直接溶解させてフィブロインとセリシンを含む繭タンパク質溶液を得る工業的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
直接、繭を塩溶液に溶解させた場合、生繭は塩溶液に可溶であることが知られている。生繭屑は、養蚕農家においては入手可能であるが、通常、絹糸用の製品繭としては、生繭に対し前記加熱乾燥処理を行った乾繭が用いられる。実際にフィブロインを生産する工業的な製造においては、フィブロインの原料として乾繭を用いることが好ましい。しかしながら、生繭に対し前述の加熱乾燥処理を行っている乾繭は、繭中の水分が抜けることでセリシンが硬化しており、塩溶液に対する溶解速度が遅いと思われた。
【００１７】
しかしながら、本発明者らが塩化カルシウムと水に加え、エタノールをモル比で表して、塩化カルシウム：エタノール：水＝１：２：８で含む溶液に乾繭を溶解させたところ、意外なことに、９０℃、３時間の溶解条件で溶解し、繭タンパク質が析出することなく安定に溶解した（実施例１〜３参照）。このようにして得られた、繭タンパク質であるフィブロインおよびセリシン、塩化カルシウムとエタノールと水を含む繭タンパク質溶液から透析により、塩化カルシウムを除去し、繭タンパク質溶液を得た。得られた繭タンパク質溶液中のフィブロインの重量平均分子量を測定したところ、溶解前の繭と同等であり、重量平均分子量の低下は見られなかった（実施例１参照）。このようにして、本発明者らは本発明に到達するに至った。
【００１８】
本発明は、以下の発明１〜４を含む。
［発明１］
溶解温度、２０℃以上、１２０℃以下で、塩化カルシウムとエタノールと水を含む溶液に乾繭を溶解させ、第１の繭タンパク質溶液を得る第１の工程と、
第１の繭タンパク質溶液から塩化カルシウムを除去し、第２の繭タンパク質溶液を得る第２の工程、
を含む、繭タンパク質溶液の製造方法。
【００１９】
［発明２］
塩化カルシウムとエタノールと水を含む溶液中の塩化カルシウムとエタノールと水の配合比がモル比で表して、塩化カルシウム：エタノール：水＝０．０１〜２．０：０．１〜１０．０：３．０〜２０．０である、発明１の繭タンパク質溶液の製造方法。
【００２０】
［発明３］
第１の工程で得られる第１の繭タンパク質溶液中の繭タンパク質の濃度が、０．０００１質量体積％以上、５０質量体積％以下である、発明１または発明２の繭タンパク質溶液の製造方法。
【００２１】
［発明４］
溶解温度、２０℃以上、１２０℃以下で、塩化カルシウムとエタノールと水を含む溶液に乾繭を溶解させ、第１の繭タンパク質溶液を得る第１の工程と、
第１の繭タンパク質溶液を透析し、第２の繭タンパク質溶液を得る第２の工程と、
第２の繭タンパク質溶液からエタノールと水を除去し、固体繭タンパク質を得る第３の工程と、
を含む固体繭タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法により、得られるフィブロインの分子量を任意の分子量に調整することが可能であり、直接、乾繭を溶剤に溶解させ、分子量の調整されたフィブロインを含む繭タンパク質溶液を得る、繭タンパク質溶液の工業的な製造方法が提供される。
【００２３】
また、本発明の繭タンパク質溶液の製造方法および繭タンパク質の製造方法により、乾繭を使用した場合であっても、溶解に安価且つ生体に対して安全な原料である塩化カルシウムと水を使用し、さらにエタノールを加えることで、繭の溶解速度を高めることができ、安価且つ容易に繭タンパク質溶液および繭タンパク質の大量生産が可能となる。本発明の繭タンパク質溶液の製造方法および繭タンパク質の製造方法は工業的に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
１．繭タンパク質溶液の製造方法
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法は、
溶解温度、２０℃以上、１２０℃以下で、塩化カルシウムとエタノールと水を含む溶液に乾繭を溶解させ、第１の繭タンパク質溶液を得る第１の工程と、
第１の繭タンパク質溶液から塩化カルシウムを除去し、第２の繭タンパク質溶液を得る第２の工程、
を含む。
【００２５】
１−１．第１の工程
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法における第１の工程は、溶解温度、２０℃以上、１２０℃以下で、塩化カルシウムとエタノールと水を含む溶液に乾繭を溶解させ、第１の繭タンパク質溶液を得る工程である。
【００２６】
第１の工程において、第１の繭タンパク質溶液に乾繭の溶け残り等がある場合は、溶け残りを濾過または遠心分離によって、除去することができる。膠質のセリシンは、濾布を目詰まりさせることがあり、遠心分離で固形物を除くことの方が簡便である。
【００２７】
［繭］ 
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法における原料には、保存中に蚕の蛹が発蛾することおよび着色がない様に、前述の加熱乾燥処理を施した乾繭を用いる。乾繭は繭タンパク質であるフィブロインおよびセリシンを含有していればよく、営繭する蚕の種類は問わない。蚕の種類には、野蚕または天蚕等の天然蚕、野蚕を人が家畜化し品種管理された家蚕、特定のタンパク質からなるセリシンを産生するために遺伝子組み換えされたトランスジェニック蚕が挙げられる。本発明の繭タンパク質溶液の製造方法において原料となる乾繭は、入手が容易であることから家蚕が産生した生繭に対し前述の加熱乾燥処理を行った乾繭が好ましい。
【００２８】
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法における原料である乾繭の形状は、蛹を取り出した繭玉のまま、または繭玉を裁断もしくは粉砕したものでもよい。繭玉のままでは嵩張ることから、０．０００１ｍｍ角以上、５０ｍｍ角以下の大きさに裁断または粉砕したものが好ましく、さらに好ましくは、０．００１ｍｍ角以上、１０ｍｍ角以下の大きさに裁断または粉砕されたものである。５０ｍｍ角より大きいと、嵩張りを低下させる効果がなく、０．０００１ｍｍ角より細かく裁断する必要はない。
【００２９】
［中性塩水溶液］
繭を溶解することのできる溶液としては、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化リチウム、チオシアン酸ナトリウム、またはチオシアン酸リチウム等の中性塩水溶液を用いる。
【００３０】
［アルコール］
繭を上述の中性塩を含む溶液に溶解させる際は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールまたはイソプロピルアルコール等のアルコールを添加する（特許文献３、６、非特許文献１〜３）。
【００３１】
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法における第１工程において、乾繭を溶解させる溶液は、塩化カルシウムおよび水を含む溶液に、生体への安全性が比較的高いエタノール加えることで乾繭の溶解速度が向上する。
【００３２】
［水］ 
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法における第１工程において、乾繭を溶解させる溶液に使用する水は、適宜選択することができ、水道水、蒸留水、イオン交換水、純水、超純水のいずれでもよい。不純物による影響が少ないことから、好ましくは、蒸留水、イオン交換水、純水、超純水であり、特に、好ましくは、イオン交換水、純水、超純水である。
【００３３】
［溶液］
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法における第１工程において使用される、塩化カルシウムとエタノールと水を含む溶液は、全液の質量を基準として、塩化カルシウムとエタノールと水を８０質量％以上、１００質量％以下含む。安全性の観点から、好ましくは、塩化カルシウムとエタノールと水のみからなる溶液である。塩化カルシウムとエタノール以外に繭の溶解を妨げない溶剤を加えてもよい。このような溶剤として、メタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、トルエンまたはジクロロメタンを例示することができる。
【００３４】
［溶液の配合比］
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法における第１工程において使用される、塩化カルシウムとエタノールと水を含む溶液中の塩化カルシウムとエタノールと水の配合比は、モル比で表して、塩化カルシウム：エタノール：水＝０．０１〜２．０：０．１〜１０．０：３．０〜２０．０である。溶解速度の観点から、好ましくは、塩化カルシウム：エタノール：水＝０．１〜１．８：０．５〜５．０：５．０〜１５．０である。特に好ましくは、塩化カルシウム：エタノール：水＝０．５〜１．５：１．０〜３．０：６．０〜１３．０である。
【００３５】
［繭タンパク質の濃度］
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法における、第１の繭タンパク質溶液の濃度は、繭が溶解し析出することがなければ、特に限定されない。第１の繭タンパク質溶液の濃度は、第１の繭タンパク質溶液全体の体積（容積）にしめる繭タンパク質の割合を求める質量体積％で表して、０．０００１％以上、５０％以下であり、好ましくは０．００１％以上、２５％以下である。特に好ましくは０．５％以上、２０％以下である。０．０００１％より少ないと、第１の繭タンパク質溶液が薄すぎて現実的でない。５０％より濃いと、第１の繭タンパク質溶液が濃すぎて溶液に繭が溶解しにくい。
【００３６】
質量体積％とは、溶液１００ｍｌに溶解している溶質の質量（ｇ）を言い、溶質の質量（ｇ）／  溶液の体積（ｍｌ）×１００で表される。
【００３７】
［溶解温度（液温）］
塩溶液の種類にもよるが、繭の溶解は、通常４℃以上、１２０℃以下で可能である。４℃より低いと、第１の繭タンパク質溶液に塩が析出する虞がある。１２０℃より高いと繭タンパク質が変質または分解してしまう虞がある。
【００３８】
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法における第１工程において、繭を溶解させる際の液温は、工業的に利用可能な溶解速度が得られ、フィブロインが加水分解しにくい温度であり、２０℃以上、１２０℃以下であり、好ましくは４０℃以上、１１０℃以下である。より好ましくは、５０℃以上、１００℃以下である。温度調節によって、フィブロインの分子量を調整することができる。
【００３９】
［溶解時間］
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法における第１工程において、乾繭を溶解させ第１の繭タンパク質溶液を得る時間は、溶液の組成にもよるが、繭と溶液が接触してから、１０分以上、４８時間以内であり、好ましくは、３０分以上、３６時間以内である。１０分より短いと、繭に溶液が浸透せず、溶解しにくい。４８時間より長いと繭タンパク質溶液中のフィブロインが加水分解し低分子量化する。特に好ましくは、塩化カルシウム：エタノール：水＝０．５〜１．５：１．０〜３．０：６．０〜１３．０（モル比）において、１時間以上、９時間以内である。この際、溶解時間を短縮する目的で攪拌を行ってもよい。溶解時間によって、フィブロインの分子量を調整することができる（実施例の表１参照）。
【００４０】
１−２．第２の工程
本発明の繭タンパク質溶液の製造方法における第２の工程は、第１の繭タンパク質溶液から塩化カルシウムを除去し、第２の繭タンパク質溶液を得る工程である。
【００４１】
第２の工程における第１の繭タンパク質溶液からの塩化カルシウムを除去する方法は、特に限定されないが、透析、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、脱塩カラム等を例示することができ、処理量によって使い分けることができる。簡便性と処理量の観点から、透析または限外濾過が好ましい。
【００４２】
２．第３の工程（固体繭タンパク質の製造方法）
固体繭タンパク質は以下の製法により製造できる。
溶解温度、２０℃以上、１２０℃以下で、塩化カルシウムとエタノールと水を含む溶液に乾繭を溶解させ、第１の繭タンパク質溶液を得る第１の工程と、
第１の繭タンパク質溶液を透析し、第２の繭タンパク質溶液を得る第２の工程と、
第２の繭タンパク質溶液からエタノールと水を除去し、固体繭タンパク質を得る第３の工程を含む。
第１の工程および第２の工程については前述の通りである。
【００４３】
本発明の繭タンパク質の製造方法における第３の工程は、第２の繭タンパク質溶液からエタノールと水を除去し、固体状の繭タンパク質を得る工程である。第３の工程におけるエタノールおよび水の除去方法としては、自然乾燥、加熱乾燥、減圧乾燥または凍結乾燥を挙げることができる。繭タンパク質の変質を抑制する目的から、自然乾燥、減圧乾燥または凍結乾燥を選択することが好ましく、特に好ましくは凍結乾燥である。
【００４４】
本発明の繭タンパク質の製造方法によれば、前述の乾燥処理をした乾繭から、フィブロインとセリシンの分子レベルの混合物としての繭タンパク質を得ることができる。
【００４５】
３．フィブロインの分子量
本発明の繭タンパク質の製造方法において、乾繭が含む本来のフィブロインの分子量を低下させることなく、フィブロインとセリシンの分子レベルの混合物としての繭タンパク質を得ることができる。
【００４６】
蚕が産生した直後のフィブロインの分子量について、特許文献１には「蚕は体内の絹糸腺腔に絹を分泌し、液状絹と言われている。液状絹はフィブロインとセリシンから成り、フィブロインは分子量約３７０，０００である（非特許文献  Tasiro Yutaka and Otsuki Eiichi, Jounal of Cell Biology, Vol. 46, P1(1970)）」と記載されている。また、非特許文献Prog.Polym.Sci.2007；32(8‐9）:991‐1007には、蚕が産生するフィブロインの分子量は３７０，０００であることが記載されている。
【００４７】
繊維とした場合、実用的な強度を得るためには重量平均分子量５０，０００以上であることが好ましく、より好ましくは、重量平均分子量７５，０００以上であるとの報告もある。
【００４８】
蚕が産生した直後のフィブロインの分子量の文献値は３７０,０００であることから、
繭を溶解して得られたフィブロインの分子量が５００，０００以上であると、蚕が産生した直後のフィブロインが変質している虞がある。
【００４９】
本願の繭タンパク質溶液の製造方法で得られる溶液中、または固体繭タンパク質の製造方法で得られる固体の繭タンパク質は、フィブロインとセリシンを含む。フィブロインの分子量は、５０，０００以上、３７０，０００以下である。なお、フィブロインの分子量はゲル浸透クロマトグラフィー(Gel Permeation Chromatography、以下ＧＰＣということがある)により測定可能である。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５１】
［繭タンパク質の収率の計算方法］
乾繭から得られた繭タンパク質の収率は、以下の式より算出した。
収率（％）＝（繭タンパク質の収量／乾繭質量）×１００
【００５２】
［重量平均分子量（Ｍｗ）の測定］
繭タンパク質であるフィブロインの重量平均分子量（Ｍｗ）測定は、ＧＰＣにより測定した。ヘキサフルオロアセトン３水和物、１ｍＬの入った試験管中に繭タンパク質１０ｍｇを計り入れ、室温（２５℃）で溶解させ溶液を得た。溶液からマイクロシリンジで５μＬを採取し下記溶離液２ｍＬに添加し、ＧＰＣ用測定試料とした。測定試料を下記のＧＰＣ装置中のカラムに注入し、ポリメチルメタクリレートを基準物質として検量線を作成し、フィブロインの重量平均子量を算出した。 
【００５３】
装置：東ソー株式会社製、製品名：HLC‐8320GPC
カラム：東ソー株式会社製、製品名：TSK  gel  Super  HM−H  を連結し２個使用
溶離液：5mMトリフルオロ酢酸ナトリウム含有ヘキサフルオロイソプロパノール(HC(CF３)２OH）
【００５４】
実施例１
ジムロート型還流器付き１００ｍＬガラス製フラスコ中に、１０ｍｍ×１０ｍｍに裁断した乾繭（品種、錦秋×鐘和）１．００ｇを採取し、塩化カルシウム／エタノール水溶液（塩化カルシウム：エタノール：水＝１：２：８（モル比））５０ｍＬを加えた。次いで、フラスコ底部を９０℃のオイルバスに漬け３時間加温し、繭を溶解させ、繭タンパク質溶液を得た。次いで、繭タンパク質溶液を濾過し、濾液を回収した。この濾液を透析チューブ（米国スペクトラムラボラトリーズ社製、再生セルロース膜（製品名、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ４、分子量分画１２−１４ｋＤａ）、以下同様）中に加え、透析液にイオン交換水を使用し透析を行い、塩化カルシウムとエタノールを除去した。透析液を８時間毎に入れ替え、計１２回行った。この透析チューブ中の溶液を凍結乾燥し、多孔質の繭タンパク質（Ｉ）を得た。繭タンパク質（Ｉ）の収量は、０．５２ｇであり、収量は５１．９％であった。上述のＧＰＣにより繭タンパク質中のフィブロインの重量平均分子量（Ｍｗ）を測定したところ、測定値は３９０，０００であった。
【００５５】
実施例２
ジムロート型還流器付き１００ｍＬガラス製フラスコに、１０ｍｍ×１０ｍｍに裁断した乾繭（品種、錦秋×鐘和）１．００ｇを採取し、塩化カルシウム／エタノール水溶液（塩化カルシウム：エタノール：水＝１：２：８（モル比））５０ｍＬを加えた。次いで、フラスコ底部を９０℃のオイルバスに漬け６時間加温し、繭を溶解させ、繭タンパク質溶液を得た。繭タンパク質溶液を濾過し、濾液を回収した。この濾液を透析チューブ（米国スペクトラムラボラトリーズ社製、再生セルロース膜中に加え、透析液にイオン交換水を使用し透析を行い、塩化カルシウムとエタノールを除去した。透析液を８時間毎に入れ替え、計１２回行った。この透析チューブ中の溶液を凍結乾燥し、多孔質の繭タンパク質（ＩＩ）を得た。繭タンパク質（ＩＩ）の収量は、０．７８ｇであり、収量は７８．０％であった。上述のＧＰＣにより、繭タンパク質中のフィブロインの重量平均分子量（Ｍｗ）を測定したところ、測定値は２６０，０００であった。
【００５６】
実施例３
ジムロート型還流器付き１００ｍＬガラス製フラスコに、１０ｍｍ×１０ｍｍに裁断した乾繭（品種、錦秋×鐘和）１．００ｇを採取し、塩化カルシウム／エタノール水溶液（塩化カルシウム：エタノール：水＝１：２：８（モル比））５０ｍＬを加えた。次いで、フラスコ底部を９０℃のオイルバスに付け２４時間加温し、繭を溶解させ、繭タンパク質溶液を得た。繭タンパク質溶液を濾過し、濾液を回収した。この濾液を透析チューブ（米国スペクトラムラボラトリーズ社製、再生セルロース膜（中に加え、透析液にイオン交換水を使用し透析を行い、塩化カルシウムとエタノールを除去した。透析液を８時間毎に入れ替え、計１２回行った。この透析チューブ中の溶液を凍結乾燥し、多孔質の繭タンパク質（ＩＩＩ）を得た。繭タンパク質（ＩＩＩ）の収量は、０．８３ｇであり、収量は７８．０％であった。上述のＧＰＣにより、繭タンパク質中のフィブロインの重量平均分子量（Ｍｗ）を測定したところ、測定値は１４０，０００であった。
【００５７】
比較例１
ジムロート型還流器付き１００ｍＬガラス製フラスコに、１０ｍｍ×１０ｍｍに裁断した乾繭（品種、錦秋×鐘和）２．７３ｇを採取し、濃度９ｍｏｌ／Ｌの臭化リチウム水溶液４５ｍＬを加えた。次いで、室温（２５℃）で４時間静置し、繭を溶解させ、繭タンパク質溶液を得た。繭タンパク質溶液を濾過し、濾液を回収した。この濾液を透析チューブ中に加え、透析液にイオン交換水を使用し透析を行い、臭化リチウムを除去した。透析液を８時間毎に入れ替え、計１２回行った。この透析チューブ中の溶液を凍結乾燥し、多孔質の繭タンパク質（ＰＩ）を得た。繭タンパク質（ＰＩ）の収量は、１．０９ｇであり、収量は３９．８％、繭タンパク質中のフィブロインの重量平均分子量（Ｍｗ）は５６０，０００であった。
【００５８】
比較例２
ジムロート型還流器付き１００ｍＬガラス製フラスコに、１０ｍｍ×１０ｍｍに裁断した乾繭（品種、錦秋×鐘和）１．００ｇを採取し、濃度９ｍｏｌ／Ｌの臭化リチウム水溶液２０ｍＬを加えた。次いで、９０℃で３時間静置し、繭を溶解させ、繭タンパク質溶液を得た。繭タンパク質溶液を濾過し、濾液を回収した。この濾液を透析チューブ（米国スペクトラムラボラトリーズ社製、再生セルロース膜中に加え、透析液にイオン交換水を使用し透析を行い、臭化リチウムを除去した。透析液を８時間毎に入れ替え、計１２回行った。この透析チューブ中の溶液を凍結乾燥し、多孔質の繭タンパク質（ＰＩＩ）を得た。繭タンパク質（ＰＩＩ）の収量は、０．９２ｇであり、収量は９２％、繭タンパク質中のフィブロインの重量平均分子量（Ｍｗ）は１７０，０００であった。
【００５９】
表１に、実施例１〜３及び比較例１、２で調製した繭タンパク質（Ｉ）〜（ＩＩＩ）、（ＰＩ）、（ＰＩＩ）についての収率と、各繭タンパク質が含むフィブロインの重量平均分子量を示す。
【００６０】
【表１】
2019163244.tif 000002
【００６１】
実施例１で得られた繭タンパク質（Ｉ）が含むフィブロインの重量平均分子量の測定値、３９０，０００は、蚕が産生しているフィブロイン本来の重量平均分子量の前記文献値、３７０，０００とほぼ一致していた。実施例１〜３の重量平均分子量の測定値を比較すれば、溶解時間を長くすることで、得られた繭タンパク質が含むフィブロインの重量平均分子量が減少していた。
【００６２】
一方で、臭化リチウムを用いた比較例１は、繭タンパク質溶液の重量平均分子量が５６０，０００であり、蚕が産生するフィブロインの分子量の文献値３７０，０００を超えておりフィブロインが変質している可能性があり、収率も低い。比較例２は、実施例１と溶解温度及び溶解時間が同じであるが、重量平均分子量が１７０，０００であり、繭タンパク質が短時間で低分子量化した。