(57)【要約】【課題】造血前駆体の集団および造血前駆体のための幹細胞を富化する方法を提供すること。【解決手段】造血前駆体のための幹細胞の集団を富化する方法が、本明細書で記載される。上記方法は、造血分化を、ヒト胚性幹細胞もしくはヒト人工多能性幹細胞の集団において誘導する工程；上記集団を、ＣＤ４３、ならびにＣＤ３４、ＣＤ３１およびＣＤ１４４のうちの少なくとも１つの発現に基づいて選別する工程；ならびにＣＤ３４＋ＣＤ４３−、ＣＤ３１＋ＣＤ４３−およびＣＤ１４４＋ＣＤ４３−のうちの少なくとも１つである画分を選択する工程を包含する。本明細書で記載される方法によって得られる造血前駆体の集団もまた、提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願図面に記載の発明
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１１年１１月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／５６２，０９４号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、造血前駆体（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の集団、および造血前駆体のための幹細胞の集団を富化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から造血幹細胞（ＨＳＣ）を生成できるということは、移植のための患者にマッチした幹細胞の無制限数の生成およびヒト造血発生およびヒト造血疾患を研究するための新規インビトロモデルの誘導を可能にする。ｈＰＳＣを血清ベースの培地中で間質細胞とともに共培養することによるか、またはｈ規定の無血清培地において特定のモルフォゲンで該ＰＳＣの分化を誘導することによるか、のいずれかによって、ｈＰＳＣから造血系統の細胞を得ることが可能であるということは、多くの研究から示されてきた（Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｌｅｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｐｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｖｏｄｙａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｚａｍｂｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。これらのアプローチは、広い範囲の造血前駆体を生じるが、このような培養物の後代を免疫無防備状態のマウスへと移植することは、代表的には、骨髄系統にしばしば制限される低レベルの生着を生じた（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。これらの知見から、造血分化（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）のために使用する条件は、ＨＳＣの発生を支援しないことが示唆される。ｈＰＳＣからＨＳＣを生成することにおける失敗に寄与する大きな要因は、少なくとも２つの別個のプログラム（そのうちの一方のみが、ＨＳＣを生じる）からなる胚性造血系の複雑さである。
【０００４】
ＨＳＣは、二次造血（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）プログラムから生成され、内皮細胞の特殊化した集団（血液生成内皮細胞（ＨＥ；  （Ｄｚｉｅｒｚａｋ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｋ，  ２００８）として公知）から発生する。マウスにおいては、ＨＥは、発生中の脈管構造内の種々の部位（そのうちで、最もよく特徴付けられているのは、胚の尾部において見いだされる傍大動脈内臓葉（Ｐ−Ｓｐ）／大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）領域である）において特定されている。上記マウスＨＥは、造血マーカーおよび内皮マーカーの一団（ＶＥ−カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄ）、Ｓｃａ−１、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ３４、Ｒｕｎｘ１、Ｓｃｌ、Ｇａｔａ２およびＬｍｏ２が挙げられる（（Ｄｚｉｅｒｚａｋ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｋ，  ２００８）において総説されている）の発現によって特徴付けられる。ＨＳＣは、Ｅ１０．５においてＡＧＭ領域で最初に検出可能であり、上記マーカーセットに加えて低いＣＤ４５発現の獲得によって特徴付けられる（Ｂｅｒｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｔａｏｕｄｉ  ａｎｄ  Ｍｅｄｖｉｎｓｋｙ，  ２００７；  Ｙｏｋｏｍｉｚｏ  ａｎｄ  Ｄｚｉｅｒｚａｋ，  ２０１０）。ヒトＰ−Ｓｐ／ＡＧＭ領域はまた、二次造血（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）の部位である。なぜならそれは、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、Ｃ−ＫＩＴ、ＳＣＬ、Ｃ−ＭＹＢ、ＧＡＴＡ２およびＧＡＴＡ３を含むＨＥおよび造血発生を示すマーカーを発現する前駆体を含み（Ｌａｂａｓｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｏｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ｔａｖｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、在胎日齢（ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  ｄａｙ）３２までにインビボ多系統再配置（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）能力を有する（Ｉｖａｎｏｖｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）からである。
【０００５】
二次造血は、原始赤血球（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、マクロファージおよび巨核球の生成によって特徴付けられる初期卵黄嚢（ＹＳ）限定プログラム（ｅａｒｌｉｅｒ  ｙｏｌｋ  ｓａｃ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｇｒａｍ）（一次造血として公知）の後に起こる（（Ｐａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）において総説されている）。大部分の証拠から、一次造血は、潜在能が制限されており、ＨＳＣもしくはリンパ系細胞を生成する能力を有しないことが示されている。しかし、近年の研究から、上記ＹＳは、循環の前にもしくは循環の非存在下で、リンパ系前駆体を生成し得ることが示された（Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。しかしながら、これらの卵黄嚢集団のさらなる特徴付けから、リンパ系細胞は、ＶＥ−ｃａｄ−ＣＤ４１＋一次造血前駆体とは異なって、ＶＥ−ｃａｄ＋ＣＤ４１−  ＨＥ様前駆体から発生することが明らかにされた（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。これらの知見は、上記ＹＳが一次造血潜在能および二次造血潜在能の両方を示すこと、かつ上記２つの集団が、別個の前駆体から発生することを示す。
【０００６】
今日の大部分の研究から、ＰＳＣからの系統発生は胚における系統の拘束を再現するという解釈が裏付けられている（Ｍｕｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ，  ２００８）。従って、ＰＳＣからのＨＳＣの生成は、ＨＥ発生を促進する培養条件を確立する工程に依存するのみならず、これらの前駆体が特殊化される場合に、これらを同定するための方法にも依存する。以前の研究において、本発明者らは、Ｔ細胞潜在能を使用して、マウスＥＳＣ分化培養物における二次造血の開始を記録し、このプログラムが、一次造血の開始後４８時間で出現するＦｌｋ−１＋  Ｓｏｘ１７＋前駆体から始まることを実証した（Ｉｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。いくつかの研究から、ｈＥＳＣからＴリンパ球を生成することが可能であることが実証された（Ｇａｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇａｌｉｃ，  Ｚ．，  Ｋｉｔｃｈｅｎ，  Ｓ．Ｇ．，  Ｋａｃｅｎａ，  Ａ．，  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  Ａ．，  Ｂｕｒｋｅ，  Ｂ．，  Ｃｏｒｔａｄｏ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｚａｃｋ，  Ｊ．Ａ．  （２００６）．  Ｔ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０３，  １１７４２−１１７４７
【非特許文献２】Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ，  Ｆ．，  Ｖｅｌｇｈｅ，  Ｉ．，  Ｖａｎｗａｌｌｅｇｈｅｍ，  Ｌ．，  Ｄｅ  Ｓｍｅｄｔ，  Ｍ．，  Ｖａｎ  Ｃｏｐｐｅｒｎｏｌｌｅ，  Ｓ．，  Ｔａｇｈｏｎ，  Ｔ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｈ．Ｄ．，  Ｌｅｃｌｅｒｃｑ，  Ｇ．，  Ｌａｎｇｅｒａｋ，  Ａ．Ｗ．，  Ｋｅｒｒｅ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｚｏｎｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８２，  ６８７９−６８８８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
無血清培養物において特定のモルフォゲンで誘導したｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣから二次造血プログラムの開始を記録するためのＴ細胞潜在能の使用が、本明細書で記載される。
【０００９】
一実施形態において、培養の６日目〜９日目の間に出現し、ＨＥ／二次造血前駆体を示す表面マーカーおよび遺伝子を発現し、ＯＰ９−ＤＬ４間質細胞上での培養後にＴ細胞潜在能を示す、候補となる二次造血前駆体集団を同定した。Ｔ細胞前駆体に加えて、この集団はまた、間質細胞との共培養後に、赤芽球前駆体および骨髄系前駆体（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）を生じる。この集団の特性は、それが、ヒトＰ−Ｓｐ由来二次造血プログラムのインビボ等価性、よってヒトＨＳＣの前駆体を表わし得ることを示唆する。
【００１０】
一局面において、造血前駆体のための幹細胞の集団を富化する方法であって、造血分化を、ヒト胚性幹細胞もしくはヒト人工多能性幹細胞の集団において誘導する工程；該集団を、ＣＤ４３、ならびにＣＤ３４、ＣＤ３１およびＣＤ１４４のうちの少なくとも１つの発現に基づいて選別する工程；ならびにＣＤ３４＋ＣＤ４３−、ＣＤ３１＋ＣＤ４３−およびＣＤ１４４＋ＣＤ４３−のうちの少なくとも１つである画分を選択する工程を包含する方法が提供される。
【００１１】
さらなる局面において、本明細書で記載される方法を使用して得られる造血前駆体の集団が提供される。
【００１２】
さらなる局面において、造血前駆体のための幹細胞の集団を富化する方法であって、造血分化の間にアクチビン／ノーダル（ｎｏｄａｌ）シグナル伝達を阻害する工程を包含する方法が提供される。一実施形態において、アクチビン／ノーダルシグナル伝達を阻害する工程は、上記集団を、アクチビン／ノーダルインヒビター、好ましくは、ＳＢ−４３１５４２とともに培養する工程を包含する。
【００１３】
さらなる局面において、造血前駆体のための、造血分化を受けている幹細胞の集団を富化するためのアクチビン／ノーダルインヒビターの使用が提供される。一実施形態において、上記アクチビン／ノーダルインヒビターは、ＳＢ−４３１５４２である。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
造血前駆体のための幹細胞の集団を富化する方法であって、該方法は、
ａ．造血分化を、ヒト胚性幹細胞もしくはヒト人工多能性幹細胞の集団において誘導する工程；
ｂ．該集団を、ＣＤ４３、ならびにＣＤ３４、ＣＤ３１およびＣＤ１４４のうちの少なくとも１つの発現に基づいて選別する工程；ならびに
ｃ．ＣＤ３４＋ＣＤ４３−、ＣＤ３１＋ＣＤ４３−およびＣＤ１４４＋ＣＤ４３−のうちの少なくとも１つである画分を選択する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
造血分化を誘導する工程は、無血清で行われる、項目１に記載の方法。
（項目３）
造血分化を誘導する工程は、間質なしで行われる、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記造血分化を誘導する工程は、０日目〜４日目の間に、前記集団をＢＭＰ４とともに培養する工程を包含する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記造血分化を誘導する工程は、１日目〜８日目の間に、前記集団をｂＦＧＦとともに培養する工程を包含する、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記造血分化を誘導する工程は、３日目〜１３日目の間もしくは４日目〜９日目の間に、前記集団を、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ、ＩＬ−６およびＩＬ−１１のうちの少なくとも１つ、ならびに／またはこれらの組み合わせとともに培養する工程を包含する、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記造血分化を誘導する工程は、４日目〜１３日目の間もしくは６日目〜９日目の間に、前記集団をＳＣＦおよびＥＰＯのうちの少なくとも一方とともに培養する工程を包含する、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記造血分化を誘導する工程は、６日目〜１３日目の間もしくは８日目〜９日目の間に、前記集団を、ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３およびＩＬ−３のうちの少なくとも１つ、ならびに／またはこれらの組み合わせとともに培養する工程を包含する、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記造血分化を誘導する工程は、前記集団を、最大１ｎｇ／ｍｌまでのアクチビンＡ、好ましくは、約０．３ｎｇ／ｍｌ、およびさらに好ましくは、約０ｎｇ／ｍｌとともに培養する工程を包含する、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記造血分化を誘導する工程は、アクチビン／ノーダルシグナル伝達を阻害する工程を包含する、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
アクチビン／ノーダルシグナル伝達を阻害する工程は、前記集団を、アクチビン／ノーダルインヒビターとともに培養する工程を包含する、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記インヒビターは、ＳＢ−４３１５４２である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記インヒビターは、分化の１．５日目〜５日目の間もしくは２日目〜４日目の間、または分化の約１．７５日目に、細胞の培養物に添加される、項目１１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記選別する工程は、分化の約６日目〜約１３日目もしくは約７日目〜約１０日目の間に行われる、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記集団は、ＣＤ４３およびＣＤ３４の発現に基づいて選別され、前記選択される画分は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３−である、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記集団は、ＣＤ４３およびＣＤ３１の発現に基づいて選別され、前記選択される画分は、ＣＤ３１＋ＣＤ４３−である、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記集団は、ＣＤ４３およびＣＤ１４４の発現に基づいて選別され、前記選択される画分は、ＣＤ１４４＋ＣＤ４３−である、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記画分は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の造血前駆体を含む、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法を使用して得られる、造血前駆体の集団。
（項目２０）
造血前駆体のための幹細胞の集団を富化する方法であって、該方法は、造血分化の間にアクチビン／ノーダルシグナル伝達を阻害する工程を包含する、方法。
（項目２１）
前記アクチビン／ノーダルシグナル伝達を阻害する工程は、前記集団を、アクチビン／ノーダルインヒビター、好ましくは、ＳＢ−４３１５４２とともに培養する工程を包含する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記集団は、１μＭ〜１０ｍＭの間、１μＭ〜１ｍＭ、もしくは約６μＭの前記アクチビン／ノーダルインヒビターとともに培養される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
造血前駆体のために、造血分化を受けている幹細胞の集団を富化するためのアクチビン／ノーダルインヒビターの使用。
（項目２４）
前記アクチビン／ノーダルインヒビターは、ＳＢ−４３１５４２である、項目２１に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明の好ましい実施形態のこれらおよび他の特徴は、添付の図面が参照される以下の詳細な記載においてより明らかになる。
【図１】図１は、アクチビンＡおよびＢＭＰ４でのｈＥＳＣの造血誘導を示す。（Ａ）ヒト多能性幹細胞の造血誘導に使用される分化スキーム。ＥＢを、ＢＭＰ−４の存在下で培養の最初の２４時間の間に生成し、その後、ＢＭＰ−４およびｂＦＧＦの存在下で、さらに２４時間にわたって培養し、次いで、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦおよびアクチビンＡの存在下で、次の４８時間（２〜４日目）にわたって培養した。いくつかの実験に関して、ＳＢ−４３１５４２（ＳＢ）を、アクチビンＡの代わりに添加した。４日目に、ＢＭＰ４およびアクチビンＡ（もしくはＳＢ）を除去し、示されるようにＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＧＦ−１、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３、ＩＬ−３およびＤＫＫ１で置き換えた。（Ｂ）ＥＢにおいて経時的に検出される造血前駆体の頻度。Ｅｒｙ：赤芽球コロニー（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｏｌｏｎｙ）；  Ｅｒｙ／Ｍｙｅｌｏｉｄ：赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）および少数の骨髄系細胞から構成されるコロニー；およびＭｙｅｌｏｉｄ：マクロファージもしくはマスト細胞のいずれかからなるコロニー。（Ｃ）１３日目のＥＢにおける造血前駆体発生に対するアクチビンＡ刺激もしくは阻害の効果。（Ｄ）０．３ｎｇ／ｍｌ  アクチビンＡ＋（Ａ）において示されるサイトカインで処理したＥＢにおける示された日数でのＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４１およびＣＤ４５発現のフローサイトメトリー分析。
【図２】図２は、９日目のＣＤ３４／ＣＤ４３集団の一次造血潜在能を示す。（Ａ）９日目のＥＢから単離したＣＤ３４画分およびＣＤ４３画分を示すフローサイトメトリー分析；  Ｐ１：  １０％±３％、Ｐ２：  １．５％±０．７％、Ｐ３：  １２．５％±−４％、Ｐ４：  ２１％±８％およびＰ５：  ３５％±９％（±ＳＤ，  ｎ＝５）。（Ｂ）上記ＣＤ３４／ＣＤ４３画分の赤芽球および骨髄系前駆体潜在能。（Ｃ）（Ａ）において示された画分のＣＤ４１ａ、ＣＤ２３５ａおよびＣＤ４５の発現を示すフローサイトメトリー分析。（Ｄ）６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３−集団およびＣＤ３４＋ＣＤ４３＋集団の造血潜在能。６日目の選別（上側パネル）：造血研究のために単離した集団を示すフローサイトメトリー分析。細胞を単離し、集合物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）として３日間にわたって培養し、分析した。９日目の再集合物（Ｒｅａｇｇ）  （中央パネルおよび下側パネル）：培養の３日間後に、示された選別画分から生成した集団のＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４１ａ、ＣＤ２３５ａおよびＣＤ４５の発現を示すフローサイトメトリー分析。（Ｅ）Ｐ１およびＰ２  ６日目の画分から生成した９日目の集合物集団の原始赤芽球／骨髄系潜在能。左のグラフは、上記Ｐ１画分およびＰ２画分に由来するＣＤ３４＋集団全体から生成した全コロニーの割合を示す。右のグラフは、上記２つの異なる画分から生成したコロニーの異なるタイプの割合を示す。（Ｆ）示された遺伝子に関する上記異なるＣＤ３４／ＣＤ４３画分のＲＴ−ｑＰＣＲ発現分析。バーは、３回の独立した実験からのサンプルの平均値±平均値の標準偏差を示す。＊は、ｔ検定によって決定される場合の統計的有意性を示す；  ＊  （ｐ≦０．０５）、＊＊  （ｐ≦０．０１）。
【図３】図３は、上記ＣＤ３４／ＣＤ４３集団のＴ細胞潜在能を示す。（Ａ）ＯＰ９−ＤＬ４での共培養の１４日後の画分Ｐ１−Ｐ４から生成したＣＤ４５＋細胞の割合および共培養の２８日目において画分Ｐ１から生成したＣＤ７＋ＣＤ５＋  Ｔリンパ系前駆体の割合を示すフローサイトメトリー分析。（Ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ４３−画分からのＴ細胞発生の動態。培養物を示されるように採取し、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｃ）共培養の４２日目でのＣＤ３４＋ＣＤ４３＋前駆体からのＴＣＲαβおよびＴＣＲγδ  Ｔ細胞の発生。（Ｄ）６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３−前駆体のＴ細胞潜在能。２８日目に培養物を採取し、ＣＤ４およびＣＤ８発現について分析した。（Ｅ）１１日目のＥＢから単離したＣＤ３４＋ＣＤ４３−前駆体およびＣＤ４３＋ＣＤ４３ｌｏｗ前駆体のＴ細胞潜在能。３１日目に培養物を採取し、細胞を分析した。
【図４】図４は、ＳＢ−４３１５４２処理ＥＢから単離したＣＤ３４＋前駆体の潜在能を示す。（Ａ）示された時間の間においてＳＢを添加した後の、分化の５日目におけるＣＤ３４＋ＫＤＲ＋集団の発生を示すフローサイトメトリー分析（ＳＢ）、  Ａｃｔ：  ＥＢを、分化の１〜４日目の間にアクチビンＡで処理した。（Ｂ）分化の２日目に３０分間にわたってＤＭＳＯ、アクチビン−Ａおよび／もしくはＳＢで処理したＥＢの細胞溶解物からの、Ｓｍａｄ２およびホスホ−Ｓｍａｄ２の発現についてのイムノブロット分析；  デンシトメトリーを行い、コントロール発現（ＤＭＳＯ）に対する％としてホスホ−ＳＭＡＤ２レベルのグラフとして示した。（Ｃ）分化の９日目、１２日目および１６日目における、アクチビンＡ誘導性ＥＢおよびＳＢ処理ＥＢにおけるＣＤ４３＋集団のＣＤ４１ａ、ＣＤ２３５ａおよびＣＤ４５の共発現を示すフローサイトメトリー分析。（Ｄ）分化の示された日での、アクチビンＡ誘導性ＥＢおよびＳＢ処理ＥＢの前駆体潜在能。（Ｅ）９日目のアクチビンＡ誘導性ＥＢおよびＳＢ処理ＥＢから単離したＣＤ３４＋画分のｑＰＣＲベースの発現分析。バーは、３回の独立した実験からのサンプルの平均値±平均値の標準偏差を表す。＊は、ｔ検定によって決定される場合の統計的有意性を示す；  ＊  （ｐ≦０．０５）。
【図５】図５は、ＳＢ処理ＣＤ３４＋集団のリンパ系潜在能を示す。（Ａ）共培養の２８日目および４２日目における、ＣＤ７＋ＣＤ５＋集団、ＣＤ４＋ＣＤ８＋集団、およびＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋集団の発生を示すＳＢ処理ＥＢのフローサイトメトリー分析。（Ｂ）ｈＥＳＣ由来Ｔ細胞の機能分析。α−ＣＤ３抗体およびα−ＣＤ２８抗体での刺激の４日間後の、前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）パラメーター、ならびにｈＥＳＣ由来Ｔ細胞のＣＤ２５、ＣＤ３８およびＣＤ４５ＲＯ発現を示すフローサイトメトリー分析。コントロール細胞を、サイトカイン単独で処理した。
【図６】図６は、ＣＤ３４＋前駆体の造血潜在能を示す。（Ａ）８日目のＳＢ処理ＥＢからのＣＤ３４＋集団のフローサイトメトリー分析。（Ｂ）ＯＰ９−ＤＬ１間質細胞上での共培養の７日間後の、ＳＢ処理ＣＤ３４＋集団およびアクチビンＡ誘導性ＣＤ３４＋集団のフローサイトメトリー分析。培養を、２４ウェルプレートのウェルにおいて各集団につき２０，０００細胞で開始した。（Ｃ）共培養の７日間後の、上記２つのＣＤ３４＋集団の前駆体潜在能。コロニー数を、１ウェルあたりで計算する。バーは、５回の独立した実験の代表である単一の実験の培養物の平均値の標準偏差を表す。＊は、ｔ検定によって決定される場合の統計的有意性を示す；  ＊  （ｐ≦０．０１５）  ＊＊  （ｐ≦０．００１）。（Ｄ）共培養の７日間後のＳＢ処理ＣＤ３４＋前駆体から、および９日目のＥＢ集団からの選別の直後にプレート培養したＣＤ４３＋一次前駆体（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）（ＣＤ４３＋）から生成したコロニー（およびそれらからの細胞）の形態および相対的サイズを示す写真。矢印は、小型の原始赤芽球様コロニーを示す。元の倍率：  コロニー  ×１００；  細胞  ×１０００。（Ｅ）ＣＤ３４＋由来赤芽球コロニーおよびＣＤ３４−ＣＤ４３＋由来赤芽球コロニーのプールにおけるβ−グロビンおよびε−グロビン発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。バーは、ｎ≧７の個々に単離したコロニーに由来するサンプルの平均値±平均値の標準偏差を表す。＊は、ｔ検定によって決定される場合の統計的有意性を示す；  ＊  （ｐ≦０．０５）  ＊＊  （ｐ≦０．０１）。
【図７】図７は、ｈｉＰＳＣ由来ＣＤ３４／ＣＤ４３集団の造血潜在能を示す。（Ａ）ｈｉＰＳＣ由来ＳＢ処理ＣＤ３４＋集団およびｈｉＰＳＣ由来アクチビンＡ誘導性ＣＤ３４＋集団のフローサイトメトリー分析。（Ｂ）分化の９日目および１１日目での上記２つのｈｉＰＳＣ  ＣＤ３４＋集団の前駆体潜在能。（Ｃ）示された時間においてＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の出現を示す、ＳＢ処理集団およびアクチビンＡ誘導性集団のフローサイトメトリー分析。２８日目において、ＣＤ８＋ＣＤ４＋集団は、ＣＤ３を共発現した。（Ｄ）ｈＥＳＣ分化培養物における一次造血および二次造血の出現を示すモデル。一次造血は、分化の２日目〜４日目の間のアクチビン／ノーダルシグナル伝達に依存し、分化の６日目においてＣＤ３４＋ＣＤ４３＋前駆体から発生する。一次造血プログラムは、分化の９日目までに検出され得るＣＤ４３＋ＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋集団として発生する。二次造血は、分化の２日目〜４日目の間のアクチビン／ノーダルシグナル伝達に依存せず、６日目程度の早さで特定されるが、１２日目（この段階では、それは、ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａを発現しないＣＤ４３＋ＣＤ４５＋集団として検出される）までは延びない。
【図８】図８は、ＰＳＣ由来のＴ細胞集団におけるＴＣＲ  Ｄβ２−Ｊβ２再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を示す。ｈＥＳＣ由来のＴ細胞集団およびｉＰＳＣ由来のＴ細胞集団におけるＴＣＲ  Ｄβ２−Ｊβ２再配列を示すＰＣＲベースの分析。ヒト出生後胸腺および２９３Ｔ線維芽細胞を、それぞれ、再配列したおよび再配列していない生殖細胞系列コントロールとして使用した。矢尻-生殖細胞系列ＰＣＲ生成物。＊-ＴＣＲ再配列から生じるＰＣＲ生成物。
【図９】図９は、ＣＤ３４＋前駆体の造血潜在能を示す。誘導の２日目もしくは３日目のいずれかにおいてアクチビンＡもしくはＳＢで処理した９日目のＥＢにおけるＣＤ３４およびＣＤ４３発現のフローサイトメトリー分析。
【図１０】図１０は、ＯＰ９−ＤＬ１共培養の後の、ＳＢ処理ＣＤ３４＋集団の骨髄系潜在能を示す。ＯＰ９−ＤＬ１細胞上での共培養の７日後に、ＳＢ処理ＣＤ３４＋細胞から生成した骨髄系コロニーの異なるタイプを示す写真。Ｍａｓｔ：好塩基性顆粒を有する細胞からなるコロニー、ＧＭ：マクロファージおよび好中球からなるコロニー、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ：好中球からなるコロニー。元の倍率：コロニー  ×１００、細胞  ×１０００。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（詳細な説明）
ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）からの造血幹細胞の効率的生成は、分化の間の二次造血プログラムの適切な特殊化に依存する。本発明者らは、無血清培養および間質なしの培養において特定のモルフォゲンで誘導したヒト胚性および人工ＰＳＣからの二次造血の開始を追跡するためにＴリンパ球潜在能を使用した。本発明者らは、このプログラムが、ＣＤ３４、ＶＥ−カドヘリン、ＧＡＴＡ２、ＬＭＯ２およびＲＵＮＸ１の発現を含む血液生成内皮細胞の特徴を有する前駆体集団から発生することを示す。Ｔ細胞とともに、これらの前駆体は、骨髄系細胞および赤血球系細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｅｌｌ）を生成する能力を示す。分化の初期ステージの間のアクチビン／ノーダルシグナル伝達の操作から、二次造血前駆体集団の発生は、この経路に依存しないことが明らかにされ、そのことにより、それが一次造血から区別された。まとめると、これらの知見から、ＰＳＣからＴリンパ系前駆体を生成することは可能であること、および、この系統は、その出現がヒト二次造血の開始のしるしである集団から発生するということが実証される。
【００１６】
一局面において、造血前駆体のための幹細胞の集団を富化する方法であって、造血分化を、ヒト胚性幹細胞もしくはヒト人工多能性幹細胞の集団において誘導する工程；該集団を、ＣＤ４３および、ＣＤ３４、ＣＤ３１およびＣＤ１４４のうちの少なくとも１つの発現に基づいて選別する工程；ならびに、ＣＤ３４＋ＣＤ４３−、ＣＤ３１＋ＣＤ４３−およびＣＤ１４４＋ＣＤ４３−のうちの少なくとも１つである画分を選択する工程を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態において、上記選別する工程は、約６日目〜約１３日目の間に行われる。いくつかの実施形態において、上記選別する工程は、１０日目に行われる。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」とは、（有糸分裂を介して）分裂し得、多様な特殊化した細胞タイプへと分化し得、より多くの幹細胞を生成するように自己再生し得る細胞をいう。幹細胞としては、全能性、多能性、多分化能性、少能性および／もしくは単能性である幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
用語「富化する」とは、本発明の状況において使用される場合、細胞の集団において所望の１つの細胞タイプ、もしくは複数の細胞タイプの相対量を増大させる任意の単離プロセスもしくは選別プロセスを含む。一実施形態において、細胞の富化された集団は、所望の細胞タイプについて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％である。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」もしくは「ＥＳ細胞」とは、早期ステージ胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、多能性であり、すなわち、限定なく、それらは、３種の一次胚葉：外胚葉、内胚葉、および中胚葉の全ての誘導体へと分化する能力がある。これらは、成体の身体における２２０より多くの細胞タイプのそれぞれを含む。多能性は、成体において見いだされる成体幹細胞から胚性幹細胞を区別する；胚性幹細胞は、全ての胚葉の細胞を生成し得る一方で、成体幹細胞は、多分化能性であり、限られた数の細胞タイプを生成し得るに過ぎない。ヒトＥＳ細胞は、約１４μｍの寸法である一方で、マウスＥＳ細胞は、８μｍに近い。さらに、既定の条件下では、胚性幹細胞は、それら自体を無制限に増殖させ得る。いくつかの例において、胚性幹細胞は、胚性幹細胞系として維持される。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」とは、特定の遺伝子の「強制的」発現を誘導することによって非多能性細胞（代表的には、成体体細胞）から人工的に得られた、任意の多能性幹細胞をいう。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「造血幹細胞」および／もしくは「造血前駆細胞」とは、任意の成熟骨髄系および／もしくはリンパ系の細胞へと発生し得る細胞をいう。造血幹細胞は、骨髄、肝臓、脾臓、移動した末梢血もしくは臍帯血に由来し得る。
【００２２】
造血分化をヒト胚性幹細胞もしくはヒト人工多能性幹細胞の集団において誘導する方法は、例えば、以下に記載されるように、当業者に公知である：１）Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ｍ．，  Ｄ’Ｓｏｕｚａ，  Ｓ．Ｌ．，  Ｌｙｎｃｈ−Ｋａｔｔｍａｎ，  Ｍ．，  Ｓｃｈｗａｎｔｚ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｇ．  （２００７）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １０９，  ２６７９−２６８７；  ２）Ｃｈａｄｗｉｃｋ，  Ｋ．，  Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  Ｌｉ，  Ｌ．，  Ｍｅｎｅｎｄｅｚ，  Ｐ．，  Ｍｕｒｄｏｃｈ，  Ｂ．，  Ｒｏｕｌｅａｕ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｂｈａｔｉａ，  Ｍ．  （２００３）．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ＢＭＰ−４  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １０２，  ９０６−９１５；  ３）Ｎｇ，  Ｅ．Ｓ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｒ．Ｐ．，  Ａｚｚｏｌａ，  Ｌ．，  Ｓｔａｎｌｅｙ，  Ｅ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｅｌｅｆａｎｔｙ，  Ａ．Ｇ．  （２００５）．  Ｆｏｒｃｅｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｓｔｅｒｓ  ｒｏｂｕｓｔ，  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  １０６，  １６０１−１６０３．）；４）  Ｄａｖｉｓ，  Ｒ．Ｐ．，  Ｎｇ，  Ｅ．Ｓ．，  Ｃｏｓｔａ，  Ｍ．，  Ｍｏｓｓｍａｎ，  Ａ．Ｋ．，  Ｓｏｕｒｒｉｓ，  Ｋ．，  Ｅｌｅｆａｎｔｙ，  Ａ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，  Ｅ．Ｇ．  （２００８）．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａ  ＧＦＰ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＭＩＸＬ１  ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅａｋ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １１１，  １８７６−１８８４；  ５）Ｖｏｄｙａｎｉｋ，  Ｍ．Ａ．，  Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｊ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｓｌｕｋｖｉｎ，  ＩＩ  （２００６）．  Ｌｅｕｋｏｓｉａｌｉｎ  （ＣＤ４３）  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １０８，  ２０９５−２１０５；  ６）Ｙｕ，  Ｃ．，  Ｌｉｕ，  Ｙ．，  Ｍｉａｏ，  Ｚ．，  Ｙｉｎ，  Ｍ．，  Ｌｕ，  Ｗ．，  Ｌｖ，  Ｙ．，  Ｄｉｎｇ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｄｅｎｇ，  Ｈ．  （２０１０）．  Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄ��ｒｉｖｅｄ  ｈｅｍａｔｏ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １１６，  ４７８６−４７９４；および７）Ｚａｍｂｉｄｉｓ，  Ｅ．Ｔ．，  Ｐｅａｕｌｔ，  Ｂ．，  Ｐａｒｋ，  Ｔ．Ｓ．，  Ｂｕｎｚ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｃｉｖｉｎ，  Ｃ．Ｉ．  （２００５）．  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｈｅｍａｔｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ，  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ，  ａｎｄ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｓｔａｇｅｓ  ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｙｏｌｋ  ｓａｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｂｌｏｏｄ  １０６，  ８６０−８７０。
【００２３】
本明細書で使用される場合、細胞を「選別する」こととは、当業者に公知であるように、例えば、ＦＡＣＳを使用して選別することのような、特定の基準（分染およびマーカー発現が挙げられるが、これらに限定されない）に従ってグループへと細胞を分離する操作をいう。上記特定の基準を区別するための任意の数の方法が使用され得る（マーカー抗体および染色色素が挙げられるが、これらに限定されない）。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「発現」もしくは「発現のレベル」とは、発現生成物の測定可能なレベル（例えば、発現したメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルまたは転写物の特定のエキソンもしくは他の部分のレベル、発現したタンパク質もしくはその一部のレベル、バイオマーカーのＤＮＡ多型の数もしくは存在、該バイオマーカーの酵素活性もしくは他の活性、ならびに特定の代謝物質のレベルが挙げられるが、これらに限定されない）に言及する。
【００２５】
好ましい実施形態において、造血分化を誘導する工程は、無血清条件下で行われる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、間質なしの条件下で行われる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「間質」とは、支持組織もしくはマトリクスをいう。例えば、間質は、細胞の集団を増やすために使用され得る。当業者は、特定の細胞タイプを増やすために適した間質のタイプを理解する。間質の例としては、ＭＳ−５、ＯＰ９、Ｓ１７、ＨＳ−５、ＡＦＴ０２４、ＳＩ／ＳＩ４、Ｍ２−１０Ｂ４が挙げられる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団をＢＭＰ４とともに、好ましくは、０日目〜４日目の間に培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を約１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４とともに培養する工程を包含する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団をｂＦＧＦとともに、好ましくは、１日目〜８日目の間に培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を約５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦとともに培養する工程を包含する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−１１のうちの少なくとも１つ；ならびに／またはこれらの組み合わせとともに、好ましくは、３日目〜１３日目の間に、さらに好ましくは、４日目〜９日目の間に培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を約１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦとともに培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を約１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６とともに培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を約５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１１とともに培養する工程を包含する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上記造血分化を誘導する工程は、上記集団をＳＣＦおよびＥＰＯのうちの少なくとも一方とともに、好ましくは、４日目〜１３日目の間に、さらに好ましくは、６日目〜９日目の間に培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を約５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦとともに培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を約２Ｕ／ｍｌのＥＰＯとともに培養する工程を包含する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を、ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３およびＩＬ−３のうちの少なくとも１つ；ならびに／またはこれらの組み合わせとともに、好ましくは、６日目〜１３日目の間、さらに好ましくは、８日目〜９日目の間に培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を約３０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯとともに培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を約１０ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ−３とともに培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を約３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３とともに培養する工程を包含する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、上記集団を、最大１ｎｇ／ｍｌまでのアクチビンＡ、好ましくは、約０．３ｎｇ／ｍｌ、およびさらに好ましくは、約０ｎｇ／ｍｌとともに培養する工程を包含する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、造血分化を誘導する工程は、アクチビン／ノーダルシグナル伝達を阻害する工程を包含する。好ましい実施形態において、アクチビン／ノーダルシグナル伝達を阻害する工程は、上記集団を、アクチビン／ノーダルインヒビター、好ましくは、ＳＢ−４３１５４２とともに培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、アクチビン／ノーダルシグナル伝達は、約６ｐＭのＳＢ４３１５４２で阻害される。別の実施形態において、「Ｌｅｆｔｙ」は、ノーダルを阻害するために使用される。いくつかの実施形態において、上記インヒビターは、分化の１．５日目〜５日目の間、もしくは２日目〜４日目の間、もしくは約１．７５日目に、細胞の培養物に添加される。
【００３５】
「Ｌｅｆｔｙ」とは、増殖因子のＴＧＦ−βファミリーのタンパク質メンバー；例えば、Ｌｅｆｔｙ１およびＬｅｆｔｙ２をいう。
【００３６】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の他のインヒビターは、当該分野で公知である（例えば、ＴＧＦ−β  ＲＩインヒビターであるＳＤ  ２０８、Ｄ  ４４７６、ＳＢ  ５０５１２４、ＧＷ  ７８８３８８およびＳＪＮ  ２５１１、ならびにアクチビンＡインヒビターであるフォリスタチンが挙げられるが、これらに限定されない）。
【００３７】
いくつかの実施形態において、上記選別する工程は、分化の６日目〜約１３日目の間、好ましくは、約７日目〜約１０日目の間に行われる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、上記集団は、ＣＤ４３およびＣＤ３４の発現に基づいて選別され、該選択される画分は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３−である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、上記集団は、ＣＤ４３およびＣＤ３１の発現に基づいて選別され、該選択される画分は、ＣＤ３１＋ＣＤ４３−である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記集団は、ＣＤ４３およびＣＤ１４４の発現に基づいて選別され、該選択される画分は、ＣＤ１４４＋ＣＤ４３−である。
【００４１】
さらなる局面において、本明細書で記載される方法を使用して得られる造血前駆体の集団が提供される。
【００４２】
さらなる局面において、造血前駆体のための幹細胞の集団を富化する方法であって、造血分化の間にアクチビン／ノーダルシグナル伝達を阻害する工程を包含する方法が提供される。一実施形態において、上記アクチビン／ノーダルシグナル伝達を阻害する工程は、上記集団をアクチビン／ノーダルインヒビターである、ＳＢ−４３１５４２とともに培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記アクチビン／ノーダルインヒビターは、約１日目〜約５日目の間に上記集団に添加される。いくつかの実施形態において、上記アクチビン／ノーダルインヒビターは、約２日目〜約４日目の間に上記集団に添加される。いくつかの実施形態において、上記アクチビン／ノーダルインヒビターは、約１．７５日目に上記集団に添加される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、約６日目〜約１３日目の間に選別される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、約７日目〜約１０日目の間に選別される。いくつかの実施形態において、上記細胞は選別され、該選択される細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３−、ＣＤ３１＋ＣＤ４３−、および／もしくはＣＤ１４４＋ＣＤ４３−である。いくつかの実施形態において、造血前駆体のための幹細胞の上記集団は、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超および約１００％超のうちのいずれか１つまで富化される。
【００４３】
さらなる局面において、造血前駆体のための、造血分化を受けている幹細胞の集団を富化するためのアクチビン／ノーダルインヒビターの使用が提供される。一実施形態において、上記アクチビン／ノーダルインヒビターは、ＳＢ−４３１５４２である。いくつかの実施形態において、上記アクチビン／ノーダルインヒビターは、約１日目〜約５日目の間に上記集団に添加される。いくつかの実施形態において、上記アクチビン／ノーダルインヒビターは、約２日目〜約４日目の間に上記集団に添加される。いくつかの実施形態において、上記アクチビン／ノーダルインヒビターは、約１．７５日目に上記集団に添加される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、約６日目〜約１３日目に選別される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、約７日目〜約１０日目の間に選別される。いくつかの実施形態において、上記細胞は選別され、該選択される細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３−、ＣＤ３１＋ＣＤ４３−、および／もしくはＣＤ１４４＋ＣＤ４３−である。いくつかの実施形態において、造血前駆体のための幹細胞の上記集団は、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超および約１００％超のうちのいずれか１つまで富化される。
【００４４】
一実施形態において、上記集団は、上記アクチビン／ノーダルインヒビターの１μＭ〜１０ｍＭの間、１μＭ〜１ｍＭ、もしくは約６μＭとともに培養される。
【００４５】
本発明の利点は、以下の実施例によってさらに例証される。本実施例および本明細書に示されるそれらの具体的な詳細は、例証のために示されるに過ぎず、本発明の特許請求の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４６】
（材料および方法）
（ヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の維持および分化）
ｈＥＳＣ系Ｈ１（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）および再プログラムされたヒトｉＰＳ細胞系（ＭＳＣ−ｉＰＳ１；  （Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８））を、この研究において使用した。それらを、以前に記載されるとおり（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、ｈＥＳＣ培地中の照射したマウス胚性線維芽細胞上で維持した。分化の前に、上記細胞を、ｈＥＳＣ培地中、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）上で２４〜４８時間にわたって培養することによって、フィーダーを除去した。ＥＢを生成するために、ｈＰＳＣを、コラゲナーゼＢ（１ｍｇ／ｍｌ；  Ｒｏｃｈｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）で２０分間にわたって、続いて、短時間のトリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％）工程で処理した。細胞を、細胞スクレイパーで穏やかに剥がして、小さな集合物（１０〜２０細胞）を形成させた。集合物を、ペニシリン／ストレプトマイシン（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、アスコルビン酸（１ｍＭ）、モノチオグリセロール（ＭＴＧ，  ４×１０−４Ｍ；  Ｓｉｇｍａ）、およびトランスフェリン（１５０μｇ／ｍＬ）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁した。ＢＭＰ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、アクチビンＡ、６μＭ  ＳＢ−４３１５４２、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍＬ）、Ｄｋｋ（１５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１１（５ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍＬ  最終）、ＴＰＯ（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）およびＦｌｔ−３Ｌ（１０ｎｇ／ｍＬ）を、示されるように添加した。培養物を、５％  ＣＯ２／５％  Ｏ２／９０％  Ｎ２環境において最初の８日間にわたって維持し、次いで、５％  ＣＯ２／空気環境へと移した。全ての組換え因子はヒトであり、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）から購入した。
【００４７】
（Ｔ系統分化のためのＯＰ９−ＤＬ４共培養）
Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  ４を発現するようにレトロウイルスで形質導入したＯＰ９細胞（ＯＰ９−ＤＬ４）を生成し、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２０％  ＦＢＳを補充したα−ＭＥＭ培地（ＯＰ９培地）中で、先に記載されるように（Ｌａ  Ｍｏｔｔｅ−Ｍｏｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）維持した。５〜１０×１０４の選別したヒトＥＢ由来サブセットを、ＯＰ９−ＤＬ４細胞を含む６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、ｒｈＦｌｔ−３Ｌ（５ｎｇ／ｍＬ）およびｒｈＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ）を補充したＯＰ９培地中で培養した。ｒｈＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を、最初の８日間のみにわたって添加した。５日間ごとに、共培養物を、激しくピペッティングし、４０μｍ細胞ストレーナーを通して間質細胞を除去することによって、新鮮なＯＰ９−ＤＬ４細胞の上に移した。
【００４８】
（赤芽球／骨髄系分化のためのＯＰ９−ＤＬ１共培養）
選別した細胞を、２４ウェルプレート中のＶＥＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、ＴＰＯ（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１１（５ｎｇ／ｍＬ）、およびＢＭＰ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＯＰ９培地中、照射したＯＰ９−ＤＬ１単層上で７日間にわたって、２×１０４細胞／ウェルの濃度で培養した。細胞を上記のように採取した。
【００４９】
（再集合アッセイ）
選別した集団を、２５×１０４細胞／ｍＬで６日目の培地に再懸濁し（図１Ａ）そして５０μＬを、低クラスター９６ウェルプレートのウェルに添加した。翌日、１条件あたり２ウェルをプールし、１ｍＬの培地を添加した低クラスター２４ウェルプレートへと移した。２４時間後、８日目の培地を上記ウェルに添加し、正常酸素条件（ｎｏｒｍｏｘｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）に移した。
【００５０】
（Ｔ細胞活性化）
ＳＢ処理ＣＤ３４＋＋ＣＤ４３−細胞を、ＯＰ９−ＤＬ４細胞上で３７〜４０日間にわたって共培養した。刺激のときに、共培養物を、１２ウェルプレートの個々のウェル中の新鮮なＯＰ９−ＤＬ４細胞上に播種した。全てのウェルに２ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−７およびｒｈＩＬ−２を補充したＯＰ９培地を与え、刺激したウェルに、５μｇ／ｍＬ  α−ＣＤ３（クローンＨＩＴ３ａ）ｍＡｂおよび１μｇ／ｍＬ  α−ＣＤ２８（クローン２８．２）ｍＡｂを添加した。４日間の後に、フローサイトメトリーを行った。
【００５１】
（フローサイトメトリーおよび細胞選別）
以下の抗体を、これらの研究のために使用した：ＣＤ３−ＡＰＣ（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ４−ＡＰＣ−ＥＦｌｕｏｒ７５０（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ５−ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＬ１７Ｆ１２）、ＣＤ７−ＦＩＴＣ（クローンＭ−Ｔ７０１）、ＣＤ８−ｅＦｌｕｏｒ−６５０  ＮＣ（クローンＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ３１−ＦＩＴＣ（クローンＷＭ５９）、ＣＤ３３−ＦＩＴＣ（クローンＨＩＭ  ３−４）、ＣＤ３４−ＡＰＣ（クローン８Ｇ１２）、ＣＤ３４−ＰＥ−ＣＹ７（クローン４Ｈ１１）、ＣＤ４１−ＡＰＣ（クローンＨＩＰ８）、ＣＤ４２ｂ−ＰＥ（クローンＨＩＰ１）、ＣＤ４３−ＰＥ（クローン１Ｇ１０）、ＣＤ４５−ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７５０（クローン２Ｄ１）またはＣＤ４５−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（クローンＨ１３０）、ＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＢ１５９）、ＣＤ９０−ＡＰＣ（クローン５Ｅ１０）、ＣＤ１１７−ＡＰＣ（クローン１０４Ｄ２）、ＣＤ１４４−ＰＥ（クローン１２３４１３）、ＫＤＲ−ＰＥ（クローン８９１０６）、ＴＣＲγδ−ＦＩＴＣ（クローン１１Ｆ２）、ＴＣＲαβ−ＰＥ（クローンＴ１０Ｂ９．１Ａ−３１）。染色した細胞を、示された時点において、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを使用して分析した。データ分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行った。Ｔリンパ系研究については、生細胞および６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）取り込みの欠如に対してゲーティングし、続いて、ＣＤ４５を発現する細胞に対してゲーティングすることによって、分析を行った。全ての抗体を、以下を除いて、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から購入した：ＣＤ８  ｅＦｌｕｏｒ−６５０  ＮＣおよびＣＤ３４−ＰＥ−ＣＹ７をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から購入し、ＫＤＲをＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。細胞を、Ｓｉｃｋ  Ｋｉｄｓ／ＵＨＮフローサイトメトリー施設においてＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩ（ＢＤ）セルソータ−で選別した。
【００５２】
（Ｔリンパ系前駆体頻度分析）
アクチビンＡ誘導性ＥＢもしくはＳＢ処理ＥＢのいずれかから単離したＣＤ３４＋ＣＤ４３−細胞の限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）を、連続希釈によって行った。ＣＤ３４＋ＣＤ４３−を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａセルソータ−を使用して上記ＥＢ集団から選別し、上記アクチビンＡ処理サブセットのうちの１００００（ｎ＝２２）、３０００（ｎ＝５４）、１０００（ｎ＝５７）、３００（ｎ＝８４）もしくは１００（ｎ＝９０）の細胞、または上記ＳＢ処理サブセットのうちの１００００（ｎ＝２１）、３０００（ｎ＝５４）、１０００（ｎ＝６０）、３００（ｎ＝８３）、１００（ｎ＝１１４）もしくは３０（ｎ＝４８）の細胞を、ＯＰ９−ＤＬ４細胞を含む９６ウェルプレートの個々のウェルへと入れた。前駆体を１６日間にわたって培養し、その後、採取およびフローサイトメトリー分析を行った。ＣＤ４５＋ＣＤ７＋  ＣＤ４３＋ＣＤ５＋細胞の存在をスコア付けした。前駆体頻度を、ポワソンモデルに適用される最尤法（Ｇｒｏｔｈ，  １９８２）によって決定した。
【００５３】
（造血コロニーアッセイ）
５×１０３〜２．５×１０４の選別した細胞もしくは２．５×１０４〜５．０×１０４の非分画ＥＢ集団のいずれかを、以前に詳細に記載されるように（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、特定のサイトカインを含む１％  メチルセルロースに蒔くことによって、造血コロニー潜在能の分析を行った。赤芽球、赤芽球／骨髄系細胞および骨髄系細胞（マクロファージもしくはマスト細胞のいずれか）からなるコロニーを、１０〜１４日間の後に定量化した。
【００５４】
（定量的リアルタイムＰＣＲ）
総ＲＮＡを、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）で調製し、ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）で処理した。１００ｎｇ〜１μｇ  ＲＮＡを、ランダムヘキサマーおよびオリゴ（ｄＴ）を使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｃＤＮＡへと転写した。リアルタイム定量的ＰＣＲを、ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ  ＥＰ  ＲｅａｌＰｌｅｘ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で行った。全ての実験を、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ）を使用して三連にて行った。オリゴヌクレオチド配列は、要求に応じて入手可能である。遺伝子発現を、コントロール（ＡＣＴＢ）に対するＤｅｌｔａＣｔとして評価した。
【００５５】
（ウェスタンブロット）
分化の２日目にＤＭＳＯ、アクチビンＡ、および／もしくはＳＢを添加して３０分間後に、ウェルを採取し、ＲＩＰＡ緩衝液を使用して氷上で溶解した。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に転写し、Ｓｍａｄ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  １：１０００）およびホスホ−Ｓｍａｄ２抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  １：１０００，  Ｓｅｒ  ４６５／４６７）で一晩プローブした。膜を、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｄｙｓｓｅｙ画像化システムを使用してスキャンした。
【００５６】
（Ｔ細胞レセプター再配列のＰＣＲ分析）
ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキットを使用して、アクチビンＡ処理もしくはＳＢ処理したＣＤ３４＋ＣＤ４３−／ＯＰ９−ＤＬ４共培養物から単離した。ゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）を、３０サイクル（９５℃において１分間；６６℃において２分間；および７２℃において５分間）にわたって、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１Ｕ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、および以前に公開されたプライマーの各々４００ｎＭ（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）を含む２５μＬ  反応緩衝液中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、Ｄβ２−Ｊβ２  Ｔ細胞レセプター遺伝子再配列を検出した。ＰＣＲ生成物を、２９３Ｔ線維芽細胞およびヒト出生後胸腺細胞（ＰＮＴ）を、それぞれ、生殖細胞系列コントロールおよび再配列コントロールとして使用して、アガロースゲル電気泳動を使用して分離した。
【００５７】
（結果および考察）
（ｈＥＳＣの無血清および間質なしでの造血分化）
無血清条件および間質なしの条件下での二次造血プログラムの前駆体を生成するために、本発明者らは、ＢＭＰ−４、アクチビンＡ、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦと、造血サイトカインとを一緒にした、最適化ステージ特異的組み合わせを有する既知組成培地中で、胚様体（ＥＢ）としてＨ１  ｈＥＳＣの分化を誘導した（図１Ａ）。この誘導スキームでは、コロニー形成細胞が分化の６日目程度の早さで検出された。それらの数は、次の３日間にわたってわずかに増え、次いで、分化の１１日目まで劇的に増え、その後、１５日目まで低レベルへと下降した（図１Ｂ）。これらのステージで検出された前駆体の大部分は、赤芽球に限定されたが、多分化能性赤芽球−骨髄系細胞および骨髄系コロニー形成細胞の両方がまた、少数ではあったものの存在した。赤芽球前駆体およびそれらの発生の一時的なパターンが優勢であることは、この早期の造血集団がヒト一次造血を代表し得ることを示唆する。
【００５８】
アクチビン／ノーダルシグナル伝達は、ｍＥＳＣ培養物における一次造血発生に必要とされる（Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）ので、本発明者らは次に、この経路がｈＥＳＣ誘導性造血に影響を及ぼすかどうかを決定するために、アクチビンＡ濃度を変化させた（図１Ｃ）。アクチビンＡの濃度を上昇させると、１３日目のＥＢにおいて骨髄系前駆体の減少および赤芽球前駆体の増加がもたらされた。対照的に、アクチビン／ノーダルインヒビターであるＳＢ−４３１５４２（ＳＢ；  （Ｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２））の添加によってこの経路を阻害すると、ほぼ全ての赤芽球前駆体が除去された（図１Ｃ）。これらの結果から、この早期赤芽球前駆体集団の発生は、分化の２日目〜４日目の間のアクチビン／ノーダルシグナル伝達のレベルによって影響を受けることが示される。０．３ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡが骨髄系前駆体および赤芽球前駆体の両方を効率的に誘導したと仮定して、本発明者らは、別段示されなければ、その後の研究についてこの濃度を使用した。
【００５９】
ＥＢを、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４１およびＣＤ４５（ｈＥＳＣ−分化培養において発生する最も早期の造血細胞上で発現すると以前に示された細胞表面マーカー（Ｖｏｄｙａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６））の発現について規定した時点でアッセイした。ＣＤ３４＋細胞の実質的な集団は、分化の６日目までに検出された。この集団は、次の９日間にわたってサイズが着実に減少し、１５日目までにはもはや検出不能であった（図１Ｄ）。ＣＤ４３＋細胞は、９日目までに出現し、その時点で、ＣＤ３４およびＣＤ４３発現パターンは、他者によって報告されたもの（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｖｏｄｙａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）に類似であった。ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋集団は経時的に減少したが、ＣＤ３４−ＣＤ４３＋集団は増大した。ＣＤ４１＋細胞は、分化の９日目までに存在したのに対して、ＣＤ４５＋細胞は、１３日目まで有意なレベルでは検出されなかった。
【００６０】
（ＣＤ３４／ＣＤ４３集団の造血潜在能）
分化の９日目において観察されたプロフィール（図２Ａ）は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）がＴ細胞前駆体を同定したステージにもっともよく似ているので、本発明者らは次に、コロニーアッセイおよび表面マーカー発現によって、造血潜在能に関してこのステージからの異なるＣＤ３４／ＣＤ４３画分を分析した。全ての赤芽球、骨髄系および赤芽球／骨髄系前駆体をＣＤ４３＋画分へと分離し（図２Ｂ）、より早期の研究からの知見（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｖｏｄｙａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）を確認した。Ｐ１（ＣＤ３４＋ＣＤ４３−）もＰ５（ＣＤ３４−ＣＤ４３−）も、いかなるコロニー形成細胞をも含まなかった。ＣＤ４３＋前駆体から生成される赤芽球コロニーの大部分は、小型で密集した形態であり、高レベルのε−グロビンおよび非常に低レベルのβ−グロビンを発現する大きな有核細胞を含んだ（図６Ｄ，  Ｅ）。このことは、それらが原始赤芽球（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ）であることを示した。
【００６１】
以前の研究から、ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａの共発現は、原始赤芽球（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ）および巨核球前駆体を含むｈＥＳＣ培養物において早期に発生する集団を同定することが示された（Ｋｌｉｍｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｖｏｄｙａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。フローサイトメトリー分析から、ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａは、赤芽球前駆体をもっぱら含むＣＤ４３＋  Ｐ３集団およびＣＤ４３＋  Ｐ４集団上でも広く発現されていることが示された。ＣＤ４５発現は、Ｐ２画分およびＰ３画分の小サブセットに制限され、ＣＤ２３５ａとは決して共発現しなかった（図２Ｃおよびデータは示さず）。Ｐ１画分およびＰ５画分における細胞は、これらのマーカーのうちのいずれも発現しなかった。まとめると、これらの結果は、以前に記載されたものと一致し、ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａの早期の発現がヒト一次造血の出現のしるしであるという解釈を裏付ける。
【００６２】
（ＣＤ４３＋ＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋集団は、ＣＤ３４＋前駆体から発生する）
本発明者らは次に、規定した条件下で生成した原始赤芽球集団がＣＤ３４＋中間体に由来するかどうかを決定することを対象にした。なぜなら、以前の研究から、血清誘導性培養物において生成した最も早期のｈＥＳＣ由来の造血細胞がＣＤ３４＋前駆体から発生することを示したからである（Ｖｏｄｙａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。この問題に対処するために、本発明者らは、分化の６日目（ＣＤ４３＋ＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋原始集団の増殖より前のステージ）での前駆体を分析した。この段階において検出されたＣＤ３４＋ＣＤ４３−集団およびより小さいＣＤ３４＋ＣＤ４３＋集団の両方（図２Ｄ）を選別し、再集合させ、さらに３日間にわたって培養し（合計で９日目）、その後、分析した。ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋由来の集団全体が、ＣＤ４３を発現し、これらの細胞の大部分が、ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａを共発現した（図２Ｄ，下側パネル）。対照的に、ＣＤ３４＋ＣＤ４３−由来の集団のうちの５０％のみがＣＤ４３を発現し、これらのうち、約６０％が、ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａを共発現した（中央パネル）。これらの差異と一致して、ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋集団は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３−集団より１３倍多くの前駆体を生成し（図２Ｅ）、その大部分は、原始赤芽球であった。ＣＤ３４＋ＣＤ４３−集団は、主に骨髄系前駆体を生じた。まとめると、これらのデータから、ヒト一次造血は、分化培養において６日目程度の早さで出現するＣＤ３４＋前駆体から発生し、ＣＤ４３の共発現によって同定され得ることが明らかに実証される。
【００６３】
（ＣＤ３４／ＣＤ４３画分の二次造血潜在能）
ＲＴ−ｑＰＣＲ分析から、ＳＯＸ１７（これは、マウスＥＳＣ分化モデルにおいて二次造血の出現を規定する（Ｉｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０））は、Ｐ１細胞において最高のレベルで発現し、Ｐ２細胞においてより低い程度で発現し、Ｐ３およびＰ４の原始集団では全く発現しないことが明らかとなった（図２Ｆ）。ＬＭＯ２およびＧＡＴＡ２は、全ての集団において発現したのに対して、ＧＡＴＡ１発現は、赤芽球前駆体を最高頻度で含んだＰ４由来の集団において最高であった。
【００６４】
９日目のＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋集団の二次潜在能（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）をさらに評価するために、各々を、ＯＰ９−ＤＬ４上で共培養することによってＴ細胞潜在能についてアッセイした（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。Ｔ細胞前駆体は、これらの細胞が最高のレベルのＳＯＸ１７を発現するという結果と一致して、Ｐ１においてのみ検出された（図３Ａ）。Ｐ３画分およびＰ４画分は、ＯＰ９−ＤＬ４間質上での２週間の培養後に、いかなるＣＤ４５＋細胞をも生成しなかったのに対して、Ｐ２細胞は、２週間の時点で検出可能である一時的なＣＤ４５＋集団を生じたが、Ｔリンパ球を生成することができなかった（図３Ａ）。Ｐ１細胞は、培養して１４日目程度の早さでＣＤ５＋ＣＤ７＋  Ｔ細胞前駆体を、２８日目までにＣＤ４＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、および４２日目にＴＣＲαβ＋もしくはＴＣＲγδ＋いずれかを発現するＣＤ３＋  Ｔ細胞を生成した（図３Ｂ，Ｃ）。Ｔ細胞発生の程度をさらに特徴付けるために、本発明者らは、ＴＣＲ  Ｄβ２−Ｊβ２再配列の存在について、共培養した細胞に由来するゲノムＤＮＡを分析した。図８に示されるように、上記ｈＥＳＣ由来のＴ細胞は、ポリクローナルＤβ２−Ｊβ２再配列を示す多重ＰＣＲ生成物を含んだ。本明細書で記載されるｈＥＳＣ由来のＣＤ３４＋／ＯＰ９−ＤＬ４培養物からの早期および後期のＴ系統分化マーカーの発現パターンは、臍帯血由来ＨＳＣを使用して代表的には観察されるもの（Ａｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）に類似している。
【００６５】
ＥＢ発生の時間分析から、分化の６日目のＣＤ３４＋集団はまた、１１日目にＣＤ３４＋ＣＤ４３−集団およびＣＤ３４＋ＣＤ４３ｌｏｗ集団の両方を含んだ（図３Ｅ）ので、Ｔ細胞潜在能を有する前駆体を含むことが明らかにされた（図３Ｄ）。このステージにおいて同定されたＣＤ３４＋ＣＤ４３ｌｏｗ集団は、以前に記載されたＴ前駆体集団（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）に類似であり得る。対照的に、３日目のＫＤＲ＋血管芽細胞集団は、Ｔ細胞を生じなかった。このことは、リンパ系潜在能を有する前駆体が分化の３日目〜６日目の間のどこかで発生することを示す（データは示さず）。
【００６６】
まとめると、これらの分析からの知見は、分化の９日目では、二次造血前駆体（Ｔ細胞潜在能によって規定されるとおり）がＣＤ３４＋ＣＤ４３−集団に制限され、ＣＤ４３＋一次造血集団とは異なることを示す。
【００６７】
（アクチビン／ノーダルシグナル伝達の要件が、一次造血および二次造血を区別する）  アクチビン／ノーダルシグナル伝達は、ｍＥＳＣ分化培養における一次造血において役割を果たすことは公知であり（Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、本発明者らのここでの以前の知見は、それが赤芽球前駆体の早期の変動（ｗａｖｅ）に必要とされることを示した（図１Ｃ）ので、本発明者らは次に、本発明者らが、上記経路の適切にステージ設定した（ｓｔａｇｅｄ）阻害を介してＣＤ４３＋／ＣＤ４１ａ＋／ＣＤ２３５ａ＋集団全体の発生を選択的にブロックし得るかどうかを決定することを対象とした。分化の最初の２４時間以内に添加すると、アクチビン／ノーダルインヒビターであるＳＢは、原始線条／中胚葉形成のためのこの経路の公知の要件（Ｃｏｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）と一致して、分化の５日目に検出したＫＤＲ＋ＣＤ３４＋造血性中胚葉集団の誘導を完全にブロックした（図４Ａ）。しかし、ＳＢの添加を遅らせて分化の２日目〜４日目の間に添加した場合、ＫＤＲ＋集団およびＣＤ３４＋集団は通常どおりに発生し、アクチビンＡ誘導性集団におけるものとサイズが類似であった（図４Ｃ）。ウェスタンブロット分析から、２日目のＥＢにおいてホスホ−ＳＭＡＤ２の存在が示された。このことは、内因性アクチビン／ノーダルシグナル伝達がこのステージにおいて活発であることを示した（図４Ｂ）。デンシトメトリーからは、ホスホ−ＳＭＡＤ２のレベルは、ＳＢ処理後に有意に低下することが確認された。このことは、ＳＢがアクチビン／ノーダルシグナル伝達をブロックしたことを示した。９日目のＥＢの分析から、２日目〜４日目の間のこの経路の阻害は、ＣＤ４３＋集団の発生を完全にブロックするが、ＣＤ３４＋細胞に影響を及ぼさないようであることが明らかになった（図４Ｃ）。９日目でのＣＤ４３＋集団の完全な阻害は、分化の２日目でのＳＢの添加に依存した。なぜなら、３日目まで遅らせたところ、いくらかのＣＤ４３＋細胞の発生を生じたからである（図９）。大きなＣＤ４３＋集団は、培養の１２日目までのＳＢ処理ＥＢから発生した。しかし、アクチビンＡ誘導性ＥＢに由来するものとは対照的に、これらの細胞は、ＣＤ４１ａもＣＤ２３５ａも発現しなかったが、ＣＤ４５は発現した（図４Ｃ）。ＳＢ処理ＣＤ４３＋集団のマーカープロフィールは、培養の１２日目〜１６日目の間に変化しなかった。９日目に予測したように、アクチビンＡ誘導性集団の大部分は、ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａを共発現した。
【００６８】
ＣＤ４３＋ＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５＋集団の非存在および本発明者らの以前の結果と一致して、赤芽球前駆体は、ここでアッセイした時点のいずれにおいてもＳＢ処理ＥＢで検出されなかった（図４Ｄ）。ＲＴ−ｑＰＣＲ分析から、ＳＢ処理ＥＢから単離したＣＤ３４＋集団は、アクチビンＡ誘導性ＥＢにおいて生成したＣＤ３４＋ＣＤ４３−集団より高いレベルのＳＯＸ１７およびＡＭＬ１Ｃを発現することが明らかになった（図４Ｅ）。ＬＭＯ２、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、およびＨＯＸＢ４の発現のレベルは、上記２つの集団において匹敵した。
【００６９】
アクチビンＡ誘導性ＣＤ３４＋細胞に類似して、ＳＢ処理の９日目のＣＤ３４＋前駆体は、ＯＰ９−ＤＬ４細胞上で培養した場合にＴ細胞を生成した（図５Ａ）。興味深いことに、限界希釈分析から、ＳＢ処理ＣＤ３４＋集団におけるＴ細胞前駆体の頻度は、アクチビンＡ誘導性ＣＤ３４＋ＣＤ４３−集団におけるより３倍超高いことが明らかになった（表１）。このことは、分化培養早期での一次造血プログラムの阻害が、９日目のＣＤ３４＋集団におけるＴ細胞前駆体の富化と合致することを示した。アクチビンＡ誘導性前駆体から生成したＴ細胞で認められるように、ＳＢ処理ＣＤ３４＋細胞に由来するＴ細胞はまた、ポリクローナルＤβ２−Ｊβ２再配列を示した（図８）。共培養の３６〜４３日目までに、細胞の大部分は、生殖細胞系列バンドの喪失によって示されるように、ＴＣＲβ再配列を示した。
【００７０】
【表１】
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ａ  アクチビンＡもしくはＢのいずれかで処理したＥＢ培養物から得られた、選別したＣＤ３４＋＋ＣＤ４３−を、ＯＰ９−ＤＬ４細胞を含む９６ウェル／プレートのウェルに数を制限して入れ、１６日間にわたって培養し、その後、フローサイトメトリー分析のために採取した。
ｂ  個々のウェルを、ＣＤ４５＋ＣＤ４３＋ＣＤ７＋＋ＣＤ５＋染色に基づいてＴ細胞の存在についてスコア付けした。ポワソンモデルに適用される最尤法を介して統計分析を行った。
【００７１】
これらのＴ細胞が機能的であったかどうかを決定するために、３５〜４０日間にわたって培養した細胞を、可溶性のα−ＣＤ３抗体およびα−ＣＤ２８抗体で４日間にわたって刺激した。図５Ｂに示されるように、刺激したＣＤ３＋  Ｔ細胞は、コントロール細胞と比較して、前方散乱の増大を示し、これは、サイズの増大を反映し、早いステージでの活性化を示した（Ｊｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。上記α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８誘導性細胞はまた、活性化ヒトＴ細胞上で古典的にアップレギュレートされるＣＤ２５およびＣＤ３８の２つのマーカーの有意により高いレベルを発現した（Ｐ≦０．０１）（Ｆｕｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０；  Ｓｃｈｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。また、通常のヒトＴ細胞活性化と一致して、ＣＤ４５ＲＯアイソフォームの増大は、刺激ｈＥＳＣ由来のＴ細胞で観察された（図５Ｂ）。活性化マーカーの発現におけるこれらの変化は、ｈＥＳＣ由来のＴ細胞が、刺激を感知しこれに応答し得る機能的Ｔ細胞レセプターを有することを示す。まとめると、広範囲なＴＣＲ再配列の証明とともに、機能的Ｔ細胞レセプターの存在から、ｈＥＳＣ由来のＴ細胞は、通常の成熟を受けていることが示唆される。
【００７２】
まとめると、これらの研究からの知見は、アクチビン／ノーダル経路の早期ステージの阻害が一次造血をブロックする一方で、二次ＣＤ３４＋集団（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ＣＤ３４＋  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のＴ細胞潜在能を増強することを実証する。それらはまた、ＳＢ処理ＥＢにおいて発生するＣＤ４３＋集団が、ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａ発現に関して９日目のアクチビンＡ誘導性集団とは異なることを示し、よって、本発明者らがＣＤ４３発生の明確な一次ステージ（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔａｇｅ）および二次ステージ（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｓｔａｇｅ）を定義することを可能にする。
【００７３】
（ＣＤ３４＋集団の造血潜在能）
上記アクチビンＡ誘導性（示されず）およびＳＢ処理の二次ＣＤ３４＋集団は、ＣＤ３１、ＫＤＲおよびＶＥ−ＣＡＤ（ＨＥ上で見いだされるマーカー）（（Ｔａｖｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）において総説される）、ならびにＣＤ９０およびＣＤ１１７（ＣＤ３４＋  臍帯血由来のＨＳＣ上で見いだされるマーカー）（図６Ａ；（Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｎｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１））を共発現する。しかし、これらの集団は、ＣＤ４５を発現しなかった。上記集団がＴ細胞潜在能に加えて骨髄系潜在能および赤芽球潜在能を示したかどうかを決定するために、上記細胞を、造血性サイトカインの存在下でＯＰ９−ＤＬ１間質細胞上で培養した。造血細胞の増殖のために通常使用される野生型ＯＰ９細胞（Ｆｅｕｇｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）ではなく、ＯＰ９−ＤＬ１細胞を使用した。なぜなら、本発明者らは、それらがより多数の赤芽球前駆体の発生を支援することを見いだしたからである（示さず）。共培養の７日間の後に、アクチビンＡ誘導性ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋集団、ならびにＣＤ４１ａ＋小集団を生成した。これらのＣＤ４１ａ＋細胞のうちのいくつかでのＣＤ４２ｂの共発現は、それらが発生している巨核球を表すことを示唆する。ＳＢ処理ＣＤ３４＋細胞は、有意なレベルのＣＤ４１ａもしくはＣＤ２３５ａを発現しないＣＤ４３＋ＣＤ４５＋集団を生じた（図６Ｂ）。
【００７４】
ＣＤ３４＋ＣＤ４３−集団はまた、共培養の７日間の後に、赤芽球および骨髄系前駆体潜在能を獲得した（図６Ｃ）。興味深いことに、ＳＢ処理細胞は、アクチビンＡ誘導性前駆体より有意に高い数の赤芽球および赤芽球−骨髄系前駆体を生じた。このことは、Ｔ細胞前駆体に加えて、この集団がまた赤芽球／骨髄系潜在能において富化されていることを示唆した。上記共培養から生成した赤芽球前駆体は、９日目のＣＤ４３＋由来の原始赤芽球コロニーより実質的に大きなコロニーを生じた（図６Ｄ）。両方のコロニータイプが、有核赤血球を含んだ（図６Ｄ，下側パネル）が、ＣＤ３４＋−ＯＰ９−ＤＬ１共培養由来のコロニーは、ＣＤ４３由来の原始コロニーより有意に高い量のβ−グロビンを発現した（図６Ｅ）。ε−グロビン発現については逆のパターンが認められたが、大きなコロニーが、このグロビンのかなりのレベルをなお発現する。ＣＤ３４＋由来の骨髄系集団は、マクロファージ系統、マスト細胞系統および好中球系統の前駆体からなった（図１０）。まとめると、これらの共培養研究からの知見は、ＣＤ３４＋二次集団が、Ｔ細胞潜在能に加えて、赤芽球および骨髄系を示すことを明らかに示す。
【００７５】
（ｉＰＳＣからの二次造血発生）
上記の定向分化アプローチが、他のヒト多能性幹細胞系に適用され得るかどうかを決定するために、本発明者らは、図１Ａにおけるように、ｉＰＳＣ系ＭＳＣ−ｉＰＳ１（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）を誘導した。図７（Ａ，Ｂ）に示されるように、分化は、予測したＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋集団およびＣＤ３４＋／ＣＤ４１＋集団、ならびに赤芽球、赤芽球／骨髄系および骨髄系前駆体の範囲の発生をもたらした。２日目〜４日目の間のＳＢの添加は、ｈＥＳＣ系で認められるように、ＣＤ４１＋／ＣＤ４３＋集団ならびに赤芽球および赤芽球−骨髄系前駆体の発生を阻害した。さらに、アクチビンＡ分化条件もしくはＳＢ分化条件のいずれかによって生成したＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３を共発現し（図７Ｃ）、Ｄβ２−Ｊβ２  ＴＣＲ再配列を示した（図８）ＣＤ４＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成した。まとめると、これらの結果からは、Ｔ細胞発生およびアクチビン／ノーダルシグナル伝達のステージ設定した操作の組み合わせは、ｈｉＰＳＣ培養物における二次造血前駆体を同定および富化し、該二次造血前駆体を一次造血前駆体から区別するために使用し得ることが実証される。
【００７６】
ｈＰＳＣからのＨＳＣの誘導は、早期胚においてこの集団を生じる発生プログラムを確立するストラテジーを要する。異なるモデル生物を使用する研究を考察することによって、発生の進行であって、ＨＥとして公知の二次造血前駆体集団の誘導および、この集団における造血の発生運命へのその後の特殊化を含むＨＳＣの生成に至るという、多分化能性前駆体および移植可能な細胞を生じるという、発生の進行が概説される。ＰＳＣ分化培養における胚性造血を反復することの大きな難題は、２つの造血プログラムが空間的に分離しておらず、結果として、早期ステージにおける一次造血の優勢が、該２つのプログラムが進むにつれて二次造血前駆体を同定することを困難にしている。この研究において、本発明者らは、ｈＰＳＣからの二次造血の開始を追跡するためにＴ細胞潜在能を使用し、そうするにあたって、発生上の潜在能、細胞表面マーカーおよびアクチビン／ノーダルシグナル伝達に対する依存性に基づいて、一次造血プログラムから区別され得る二次造血プログラムを同定した。
【００７７】
転写因子ＧＡＴＡ２、ＬＭＯ２、ＡＭＬ１Ｃ、ならびに造血表面マーカー（ＣＤ４５もしくはＣＤ４３）ではなく内皮表面マーカー（ＫＤＲ、ＣＤ３１、ＶＥ−ＣＡＤ）を含む二次ＣＤ３４＋集団の発現プロフィールは、それがヒトＨＥの等価物を表すことを示唆する。Ｔ細胞潜在能を有するこれらの特徴を伴う集団の生成は、特有であり、ＨＳＣを生成することにおける重要な最初の工程を表す。いくつかの他の研究が、造血潜在能を示すｈＥＳＣ由来の内皮前駆体集団を記載した（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；  Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｚａｍｂｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。これらの報告のうちの最も近年のものにおいて、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ  （２０１２）は、一次造血プログラムの前駆体であるＢＬ−ＣＦＣ（血管芽細胞）とは異なるようである血液生成内皮前駆体（ＨＥＰ）を同定した。しかし、リンパ系潜在能は、この研究においても他の研究のうちのいずれにおいても評価されていなかったので、これらの集団が二次造血プログラムの前駆体を表すかどうかは明確でない。
【００７８】
ＯＰ９−ＤＬ１上での７日間にわたる共培養の後に、ＣＤ３４＋集団は、ＣＤ４３およびＣＤ４５の発現をアップレギュレートし、赤芽球および骨髄系前駆体潜在能（造血の発生運命へのＨＥの特殊化の等価物を表し得る移行）を獲得する。本発明者らの研究は、ＯＰ９−ＤＬ１間質が、赤芽球前駆体発生を促進することにおいてＯＰ９間質より効率的であることを示した。このことは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達がこの特殊化工程に必要とされ得ることを示唆した。ＣＤ３４＋由来の赤芽球前駆体は、アクチビン誘導性ＣＤ４３＋由来原始赤芽球コロニーとは形態的に異なり、かつこれより有意に高いレベルのβ−グロビンを発現する大きな赤芽球コロニーを生成する。これらの結果と、それらが表現型上および時間的に異なる集団から発生するという事実とを合わせると、これらの赤芽球前駆体が同じではないことが明らかに実証される。以前の研究は、血清誘導性ＥＢにおいて異なる赤芽球前駆体が経時的に出現することを記載し、それらが一次造血および二次造血の両方の後代を表すことを示唆した（Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｚａｍｂｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。本明細書で記載されるＣＤ３４＋由来の赤芽球前駆体は、ＣＤ４３＋由来の一次前駆体とは異なるが、それらは、高レベルのε−グロビンをなお発現する。ＣＤ３４＋由来の前駆体が、一次プログラムを過ぎた１つの工程（一次赤血球生成および二次赤血球生成との間の移行）を表すことは、可能である。
【００７９】
９日目のＥＢにおいてＣＤ３４＋二次前駆体が同定されたので、本発明者らは、初めて、以下の特性を示す別個のヒト二次造血集団および一次造血集団（モデル；図７Ｄ）を規定することができた。第１に、９日目において出現する一次造血集団は、ＣＤ４３と一緒に、ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａを発現するのに対して、９日目の後に発生する二次集団は、ＣＤ４３と一緒に、ＣＤ４５を発現するが、ＣＤ４１ａもＣＤ２３５ａも発現しない。ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａは、それらが、それぞれ、巨核球および赤芽球系統に制限される二次プログラムにおいてより後期のステージで発現する（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１；  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）。第２に、ヒト一次造血プログラムの発生は、分化の２日目を過ぎて、アクチビン／ノーダルシグナル伝達に依存する。二次造血は、対照的に、分化の２日目〜４日目の間にこの経路を必要としない。第３に、一次造血および二次造血はともに、ＣＤ３４＋前駆体から発生する。６日目でのＣＤ４３＋とＣＤ３４との共発現は、一次プログラムの開始を規定するようである。なぜなら、原始赤芽球前駆体の大部分は、この集団に由来するからである。両方のプログラムがＣＤ３４＋前駆体から発生するという事実は、このマーカーがＰＳＣ分化培養における造血発生をモニターするために十分ではなく、発生の最も早期のステージにおいて一次前駆体および二次前駆体を区別する新たな表面マーカーを同定する必要性を強調することを明らかに示す。
【００８０】
この研究において低分子ＳＢ−４３１５４２でアクチビン／ノーダルシグナル伝達経路を操作することは、ｈＥＳＣ培養における造血システムの確立におけるその役割への、同様にヒト二次造血の起源への新規な考察を提供した。ＳＢ−４３１５４２は、アクチビン／ノーダル経路の非常に強力かつ選択的なインヒビターとして同定されたが、他の経路の阻害も、ＢＭＰ４、ＥＲＫ、ＪＮＫもしくはｐ３８  ＭＡＰＫを含むキナーゼの阻害も観察されてこなかった｛Ｉｎｍａｎ，  ２００２  ＃４８｝。ＳＢが２日目のＥＢにおいてホスホ−Ｓｍａｄ２レベルを低下させること（図４Ｂ）、および、それが赤芽球コロニー形成に対してアクチビンＡとは反対の効果を有する（図１Ｂ）という本発明者らの実証は、原始赤芽球系統に対するその効果が、未知の標的ではなくアクチビン／ノーダル経路の阻害を介して媒介されるという強力な証拠を提供する。以前の研究から、アクチビン／ノーダルが、ＢＭＰ−４およびＷｎｔ経路に加えて、全て、原始線条形成、中胚葉誘導および造血特殊化を含むｈＰＳＣ培養における早期の誘導工程において役割を果たすことが実証された（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｋｒｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｖｉｊａｙａｒａｇａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。この報告におけるアクチビン／ノーダル経路インヒビターのステージ設定した添加は、発生の早期ステージにおけるこの経路の役割を強化する。なぜなら、分化の１日目〜２日目の間の添加は、いかなるＫＤＲ＋細胞の発生をも妨いだからである。このことは、中胚葉形成の欠如を示す。さらに、本発明者らの研究は、ヒト一次造血発生の最も早期のステージにおけるアクチビン／ノーダルシグナル伝達の以前に同定されていなかった要件を証明する。この点に関して、以前の研究が、この経路がまたマウス一次造血発生に必要とされることを示した（Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）ように、マウスおよびヒトの一次造血は、同様に調節されるようである。本発明者らのウェスタン分析は、２日目のＥＢにおいてアクチビン／ノーダルシグナル伝達を示すホスホ−ＳＭＡＤ２の存在を実証する一方で、この効果を媒介する相互作用する経路および／もしくは下流経路は、現在も未知である。分化の２日目〜４日目の間にＳＢと一緒に、Ｗｎｔ、ＮｏｔｃｈおよびＳＨＨを含む他の経路のアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストの添加は、阻害効果にほとんど影響を有しなかった。このことは、それらがこの効果を媒介することに直接関与しないことを示唆した（データは示さず）。
【００８１】
一次造血をブロックすることに加えて、分化の早期ステージにおいてＳＢを添加すると、ＣＤ３４＋集団の潜在能に影響を及ぼすようでもあった。ＳＢ処理ＣＤ３４＋集団は、より高いレベルのＳＯＸ１７およびＡＭＬ１Ｃを発現し、対応するアクチビンＡ誘導性集団より高い頻度の赤芽球およびＴ細胞前駆体を含んだ。これらの結果は、分化の早期ステージにおけるシグナル伝達の操作が、より後期のステージの細胞の潜在能に影響を及ぼし得、よってこのような研究のための規定した誘導条件および正確なステージ特異的プロトコルを使用することが重要であることを強調し得るということを明らかに実証する。
【００８２】
まとめると、ここで報告された知見から、Ｔリンパ系、骨髄系および赤芽球潜在能、ならびにプレＨＳＣ集団を示す表面マーカーおよび遺伝子発現パターンを示す二次造血前駆体集団を同定した。本発明者らは、ここで同定した二次前駆体が、ｈＰＳＣからのＨＳＣの生成における第１の工程を表し、よって、最も早い造血前駆体へのその特殊化および移植可能な幹細胞への成熟を制御する調節経路を定義するための、容易にアクセス可能な標的集団を提供するという仮説を立てている。二次造血のマーカーを提供することに加えて、規定の誘導条件下でのｈＰＳＣからＴ細胞を生成する能力は、この系統の発生起源、ならびにインビトロモデルおよびインビボモデルにおいて上記細胞の機能的潜在能を研究する特有の機会を提供する。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書で記載されてきたが、本発明の趣旨もしくは添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明に対するバリエーションが行われ得ることは、当業者によって理解される。本明細書で開示される全ての文書は、参考として援用される。
【００８４】
（参考文献）
【００８５】
【数１】
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【００８６】
【数２】
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【００９１】
【数７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【外国語明細書】
2019136045000001.pdf