(57)【要約】【課題】本発明の目的は、ＡＧＥｓ、特にグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓに対して高い選択性および親和性を有するモノクローナル抗体、およびそれを利用した分析方法を提供することである。さらに本発明の目的は、前記モノクローナル抗体を用いた疾患の診断方法、治療方法および予防方法を提供することである。【解決手段】本発明により、モノクローナル抗体およびそれを用いた分析方法、ならびに疾患の診断方法、治療方法および予防方法が提供される。【選択図】図１
2019041668.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）重鎖可変領域の各相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３）および軽鎖可変領域の各相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、
（Ａ）
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：２に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
（Ｂ）
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：９に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：１０に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：１１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：１３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：１４に示すアミノ酸配列に含まれる連続する１２残基のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：１５に示すアミノ酸配列に含まれる連続する９残基のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
を含む、抗体またはその抗原結合断片；または
２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片である、
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
１）重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、それぞれ：
配列番号：４のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および配列番号：８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
配列番号：１２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および配列番号：１６のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、である、抗体またはその抗原結合断片；または
２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片である、
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記エピトープがグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープである、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、またはｓｃ（Ｆｖ）２である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはその抗原結合断片である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
１×１０−５Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ値）でグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
【請求項８】
糖尿病、耐糖能異常、網膜症、腎症、末梢神経障害、下肢壊疽、動脈硬化、血栓症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、がん、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能障害、中枢神経障害、およびアルツハイマー病から選択される疾患の診断、治療、または予防に用いるための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
疾患が、メラノーマ、肺がん、および肝臓がんから選択されるがんである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１の発現ベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、終末糖化産物（ＡＧＥｓ）、特にグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（ＡＧＥｓ）は、生体内でアミノ酸、主にリシンのアミノ基が還元糖によって非酵素的に修飾された後、酸化・脱水・縮合などの複雑な反応を経て生成する物質の総称である。加齢や高血糖状態で生成するＡＧＥｓは糖尿病合併症や動脈硬化などの生活習慣病と関連していると考えられている。特に、糖代謝中間体のグリセルアルデヒドに由来するＡＧＥｓ（グリセルＡＧＥｓ；Glycer-AGEs）は、毒性ＡＧＥｓ（Toxic AGEs：ＴＡＧＥ）とも称され、診断、予防において有用なバイオマーカーとして注目されている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
ＡＧＥｓに含まれる構造はいくつか特定されており、その一つであるカルボキシメチルリシン（Ｎε−（カルボキシメチル）リシン、ＣＭＬ）は、グルコースとリシンの反応で生成するアマドリ化合物の糖部分が遷移金属の存在下で酸化的に解裂してエリスロン酸とともに生成される物質として同定されている。ＡＧＥｓ研究の歴史から、ＡＧＥｓの定量は構造が明らかになっているＣＭＬの定量で代替されてきた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣＭＬの主な生成経路は、シッフ塩基あるいはアマドリ化合物の酸化的開裂によると考えられている。また、ＣＭＬはグリオキサール（ＧＯ）およびグリコールアルデヒドを前駆体とする分子内カニッツァロ反応やグルコースの自動酸化によっても生成することが知られている。タンパク質中のＣＭＬは酸加水分解に安定なこともあり、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法やガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）法で定量することが可能である（非特許文献１）。
【０００４】
エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法によるＡＧＥｓの定量として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて作成したＡＧＥｓ（ＡＧＥｓ含有ウシ血清アルブミン、ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）を抗原とする、抗ＡＧＥｓ−ＢＳＡ抗体を用いた競合enzyme-linked immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ）法に始まるが、後にこれらの抗体はＣＭＬ構造をエピトープとする抗ＣＭＬ抗体であることが判明した（非特許文献１）。一方で、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）にグリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド、メチルグリオキサール、またはグリオキサールを添加してそれぞれ作成したＡＧＥｓを抗原として抗血清を調製し、得られた抗血清を精製してＣＭＬ非結合性の画分を得たとの報告がされている（非特許文献４）。当該画分として得られたポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイが行われており、ＣＭＬ以外のＡＧＥｓの定量方法として利用されている（非特許文献５および６）。
【０００５】
例えば、不妊治療の成否とグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycer-AGEs）との相関についての研究がされており、血中のGlycer-AGEs量が高いと継続妊娠率が不良であるとの報告がされている（非特許文献１〜３、５および６）。そういった研究においては、上述のポリクローナル抗体のうちの抗グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイが利用されている（非特許文献５および６）。
【０００６】
また、グリセルアルデヒド由来のＡＧＥｓを抗原としたモノクローナル抗体の作成について報告がされている（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】金沢医科大学雑誌、３７（４）：１４１−１６１、２０１２；
【非特許文献２】金沢医科大学雑誌、４０（２-３）：９５−１０３、２０１５；
【非特許文献３】Diagnostics 6(2), 23, 2016; doi:10.3390；
【非特許文献４】Molecular Medicine 6(2): 114-125, 2000；
【非特許文献５】Human Reproduction, 26(3), 604-610, 2011；
【非特許文献６】日本未病システム学会雑誌、２１（１）：９３−９６、２０１５；
【非特許文献７】Immunology Letters 167(2), 141-146, 2015。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ＡＧＥｓ、特にグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓに対して高い選択性および親和性を有するモノクローナル抗体、およびそれを利用した分析方法を提供することである。さらに本発明の目的は、前記モノクローナル抗体を用いた疾患の診断方法、治療方法および予防方法、特に不妊症の診断方法、治療方法、および予防方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、研究の結果、特定のモノクローナル抗体が、良好な選択性および抗原への高い結合性を有し、分析方法や診断方法、治療方法および予防方法に利用可能であることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
本発明により、以下の発明が提供される。
［１］１）重鎖可変領域の各相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３）および軽鎖可変領域の各相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、
（Ａ）
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：２に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
（Ｂ）
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：９に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：１０に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：１１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：１３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：１４に示すアミノ酸配列に含まれる連続する１２残基のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：１５に示すアミノ酸配列に含まれる連続する９残基のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
を含む、抗体またはその抗原結合断片；または
２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片である、
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
［２］１）重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、それぞれ：
配列番号：４のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および配列番号：８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
配列番号：１２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および配列番号：１６のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、である、抗体またはその抗原結合断片；または
２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片である、
［１］に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
［３］前記エピトープがグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープである、［１］または［２］に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
［４］完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、またはｓｃ（Ｆｖ）２である、［１］〜［３］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
［５］マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはその抗原結合断片である、［１］〜［４］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
［６］１×１０−５Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ値）でグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合する、［１］〜［５］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
［８］糖尿病、耐糖能異常、網膜症、腎症、末梢神経障害、下肢壊疽、動脈硬化、血栓症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、がん、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能障害、中枢神経障害、およびアルツハイマー病から選択される疾患の診断、治療、または予防に用いるための、［７］に記載の医薬組成物。
［９］疾患が、メラノーマ、肺がん、および肝臓がんから選択されるがんである、［８］に記載の医薬組成物。
［１０］［１］〜［６］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸。
［１１］［１０］に記載の核酸を含む発現ベクター。
［１２］［１１］の発現ベクターを含む宿主細胞。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は本発明の抗体（６Ｂ３）の、各種ＡＧＥｓに対する結合特性を確認するための競合ＥＬＩＳＡ法による試験結果を示す。数値は、各試料の吸光度を対照ＢＳＡの吸光度を１として示す。
【図２】図２は本発明の抗体（１１Ｇ４）の、各種ＡＧＥｓに対する結合特性を確認するための競合ＥＬＩＳＡ法による試験結果を示す。数値は、各試料の吸光度を対照ＢＳＡの吸光度を１として示す。
【図３】図３は１１Ｇ４と６Ｂ３との交差競合を確認するための試験結果を示すグラフである。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１２】
ＡＧＥｓの中でも、グリセルアルデヒド由来のＡＧＥｓ（Glycer-AGEs）は、ＴＡＧＥ（Toxic AGEs）とも称せられ、糖尿病、特に糖尿病血管合併症、糖尿病網膜症、糖尿病腎症、および糖尿病大血管症などに関わることが報告されている。さらに、Glycer-AGEsは高血圧症、アルツハイマー病などの認知症、がん（例えば肝臓がん、膵臓がん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、乳がん、膀胱がん、悪性黒色腫、および肺がん）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、不妊症などに慣用することが報告されている。したがって、Glycer-AGEsはこれらの疾患の診断のためのバイオマーカーとして使用することができ、本発明の抗体はバイオマーカーの検出において使用することができる。
【００１３】
さらに本発明にかかる抗体は、生体におけるGlycer-AGEsの効果を中和するために使用することができ、疾患の治療などにおいても使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の１つの側面において、本発明の抗体は単離された抗体である。単離された抗体は、天然に存在して何ら外的操作（人為的操作）が施されていない抗体、即ちある個体の体内で産生され、そこに留まっている状態の抗体は含まれない。本発明の抗体は典型的にはモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である。
【００１５】
アミノ酸配列に関して使用する用語「実質的に同一」とは、比較される二つのアミノ酸配列間で配列上の相違が比較的小さく且つ配列上の相違が抗原に対する特異的結合性に関して実質的な影響を与えないことを意味する。実質的に同一なアミノ酸配列はアミノ酸配列の一部の改変を含んでいてもよく、例えば、アミノ酸配列を構成する１〜数個（例えば、１〜３個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個（例えば、１〜３個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列が改変されていてもよい。アミノ酸配列の変異の位置は特に限定されず、複数の位置で変異を生じていてもよい。アミノ酸配列において改変されるアミノ酸の数は示された全アミノ酸の例えば１０％以内に相当する数であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内に相当する数である。さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内に相当する数である。
【００１６】
アミノ酸を置換する場合には、置換するアミノ酸の側鎖と類似の生化学的特性を持った側鎖を有するアミノ酸と置換することができる（保存的アミノ酸置換）。１つの態様において、実質的に同一なアミノ酸配列は、例えば、１つもしくは複数の保存的置換を含んでいてもよい。保存的アミノ酸置換は当業者に知られており、例えば以下の表に示す例が挙げられる（例えば、ＷＯ２０１０／１４６５５０など）。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
また、天然に存在するアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分類される：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）極性、荷電なし：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性（負荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性（正荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００１９】
１つの態様として、置換するアミノ酸と同じ群に属するアミノ酸を用いて置換してもよい。
【００２０】
二つのアミノ酸配列が実質的に同一であるか否かは、各アミノ酸配列を含む抗体（他の領域の配列は同一）の抗原に対する結合特異性を比較することによって判定できる。例えば、基準となる抗体の生理食塩水環境下での抗原に関する解離定数（Ｋｄ値）をＡとしたとき、比較対象の抗体のＫｄ値がＡ×１０−１〜Ａ×１０の範囲であれば実質的な同一性を認定できる。
【００２１】
本発明に係る核酸は、典型的には、単離された核酸であり、例えばｃＤＮＡ分子など遺伝子組み換え技術によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態の核酸をいう。
【００２２】
本明細書における用語「核酸」はＤＮＡ（ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、ＤＮＡ類似体、およびＲＮＡ類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定されず、即ち１本鎖および２本鎖のいずれであってもよい。好ましくは２本鎖ＤＮＡである。またコドンの縮重も考慮される。即ちタンパク質をコードする核酸の場合には、その発現産物として当該タンパク質が得られる限り任意の塩基配列を有していてよい。
【００２３】
ＡＧＥｓはタンパク質の糖化反応により形成される。グルコースやフルクトースなどの還元糖とタンパク質の遊離のアミノ基が非酵素的に反応してシッフ塩基からアマドリ化合物を生成し、その後不可逆的な脱水や縮合、酸化、還元などの反応を繰り返し、特有の蛍光を持つ黄褐色の複雑な物質ＡＧＥｓが生成するに至る。一方で、リシンなどのアミノ酸残基が糖と反応して得られる化合物がＡＧＥｓの構造として特定されており、蛍光を有さないピラリン、Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）、Ｎε−カルボキシエチルリシン（ＣＥＬ）、およびＮω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）などもＡＧＥｓとして知られている。その他、芳香環を有するアルグピリミジン、ペントシジン、クロスリン、ＧＡ−ピリジン、ベスペルリシン、ピロピリジンなどの化合物がＡＧＥｓとして特定されている。これらの化合物をアミノ酸残基として含有するペプチドやタンパク質もＡＧＥｓに含まれる。
【００２４】
ＡＧＥｓを形成するタンパク質糖化反応の基質としては、グルコース、フルクトースなどの還元糖の他に、生体内の糖代謝などにより生成する、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド、メチルグリオキサール、グリオキサール、および３−デオキシグルコソンなどが想定されている。こうした還元糖およびアルデヒドを使用し、ＢＳＡなどのタンパク質と反応させてＡＧＥｓを形成する試みがされている。このようにして調製されるグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycer-AGEs）、グルコース由来ＡＧＥｓ（Glu-AGEs）、グリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycol-AGEs）、フルクトース由来ＡＧＥｓ（Fru-AGEs）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ（MGO-AGEs）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ（GO-AGEs）、および３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ（3-DG-AGEs）などの各種ＡＧＥｓのうち、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓは、糖尿病などの各種疾患に関与するとの報告がされており、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓを抗原とするポリクローナル抗体を用いた分析方法により、Glycer-AGEsの血中濃度を測定する手法が知られている。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体は、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycer-AGEs）およびグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycol-AGEs）に対して特異的に結合する特性を有している。
【００２６】
本発明の１つの側面において、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycer-AGEs）および／またはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycol-AGEs）のエピトープと結合し、グルコース由来ＡＧＥｓ（Glu-AGEs）、フルクトース由来ＡＧＥｓ（Fru-AGEs）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ（MGO-AGEs）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ（GO-AGEs）、および３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ（3-DG-AGEs）から選択される、１以上のＡＧＥｓとは結合しない、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。より具体的には、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycer-AGEs）およびグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycol-AGEs）のエピトープと結合し、グルコース由来ＡＧＥｓ（Glu-AGEs）、フルクトース由来ＡＧＥｓ（Fru-AGEs）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ（MGO-AGEs）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ（GO-AGEs）、および３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ（3-DG-AGEs）とは結合しない、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。さらに具体的には、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓおよびグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合し、グルコース由来ＡＧＥｓ（Glu-AGEs）、フルクトース由来ＡＧＥｓ（Fru-AGEs）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ（MGO-AGEs）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ（GO-AGEs）、３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ（3-DG-AGEs）、Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）、およびＮε−カルボキシエチルリシン（ＣＥＬ）とは結合しない、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【００２７】
本発明の１つの側面において、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。ここで、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓおよびグリコールアルデヒド由来ＡＧＥは、グリセルアルデヒドまたはグリコールアルデヒドの存在下でＢＳＡ、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）などのタンパク質糖化反応により生じるＡＧＥｓであり、ＡＧＥｓを含むタンパク質である。本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、タンパク質糖化反応で生じた化学構造をエピトープとするという特徴を有している。好ましい態様において、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、還元糖および糖代謝などで生じるアルデヒド、特にグルコース由来ＡＧＥｓ、フルクトース由来ＡＧＥｓ、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ、グリオキサール由来ＡＧＥｓ、および３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓとは結合しない。これらのＡＧＥｓも各還元糖またはアルデヒドをＢＳＡなどのタンパク質に添加してタンパク質糖化反応により調製される。抗体の結合特異性については、公知の手法、例えば競合ＥＬＩＳＡ法などにより特定することができる。
【００２８】
本発明は、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供し、該抗体または断片は、ＡＧＥｓが関与する疾患の治療、予防および／または診断に使用することができる。本発明で使用できる抗体は、本明細書に記載のとおり、複数の形態をとることができ、本発明は、本明細書で定義するとおり６個のＣＤＲのセット（それと実質的に同一のアミノ酸配列、例えば、１〜３個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加を含む配列を含む）を含む抗体構造を提供する。
【００２９】
従来の抗体構造ユニットは、典型的には４量体を含む。各４量体は、典型的には、２つの同一のポリペプチチド鎖対からなり、各対は、１つの「軽」鎖（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）と１つの「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖とλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεに分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体アイソタイプを定義する。ＩｇＧは複数のサブクラスを有し、サブクラスとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が挙げられるがこれらに限定されない。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有するが、これらに限定されない。従って、本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、その定常領域の化学的および抗原的特徴により定義される免疫グロブリンの任意のサブクラスを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤおよびＩｇＥである。治療用抗体には、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含まれ得る。
【００３０】
各鎖には、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。可変領域では３つのループが重鎖および軽鎖の各Ｖドメインについて集合しており、抗原結合部位を形成する。各ループは、相補性決定領域とも称され（以下、「ＣＤＲ」とも称する）、この部分におけるアミノ酸配列の変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が最も顕著である。「可変」とは、可変領域の特定のセグメントが、抗体の配列において広範囲に異なるという事実を意味する。可変領域内の可変性は、均一に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９〜１５アミノ酸長以上の「超可変領域」と称される極度に可変性の短い領域により分離される１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的不変のストレッチからなる。
【００３１】
各ＶＨおよびＶＬは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）と４つのＦＲからなり、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。
【００３２】
超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域における、アミノ酸残基２４〜３４付近（ＶＬ  ＣＤＲ１；「ＶＬ」は軽鎖の可変領域を意味する）、５０〜５６付近（ＶＬ  ＣＤＲ２）および８９〜９７付近（ＶＬ  ＣＤＲ３）と重鎖可変領域における、３１〜３５付近（ＶＨ  ＣＤＲ１；「ＶＨ」は重鎖の可変領域を意味する）、５０〜６５付近（ＶＨ  ＣＤＲ２）および９５〜１０２付近（ＶＨ  ＣＤＲ３）のアミノ酸残基；Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)、および／または超可変性ループを形成するそれらの残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＶＬ  ＣＤＲ１）、５０〜５２（ＶＬ  ＣＤＲ２）および９１〜９６（ＶＬ  ＣＤＲ３）と、重鎖可変領域における２６〜３２（ＶＨ  ＣＤＲ１）、５３〜５５（ＶＨ  ＣＤＲ２）および９６〜１０１（ＶＨ  ＣＤＲ３）；Chothia and Lesk (1987)J. Mol. Biol. 196:901-917を包含する。
【００３３】
本明細書にわたり、可変ドメインの残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）について言及する場合には、Ｆｃ領域で使用されるＥＵナンバーシステムとともに、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを通常用いる（例えば、Kabat et al., 上記 (1991))。
【００３４】
ＣＤＲは、抗原結合の形成に寄与し、より詳細には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、抗体分子の可変領域における特異的な抗原結合部位（パラトープ）と相互作用する決定基を意味する。エピトープは、アミノ酸や糖側鎖などの分子にグループ分けされ、通常、特異的な構造特性および特異的な電荷特性を有する。本明細書で示すとおり、本発明に係る「６Ｂ３」および「１１Ｇ４」と本明細書で称する２つの異なる抗体は、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓへの結合に関して交差競合することが確認されており、同じエピトープに結合すると考えられている。
【００３５】
各種ＡＧＥｓは、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ），ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）など）とアルデヒドまたは還元糖を混合し、反応をさせることにより調製することができる。例えば、グリセルアルデヒドをＢＳＡと反応させることにより、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡを調製することができ、これをＡＧＥｓの標品として使用することができる。グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓにおいて、本発明の抗体は、例えば、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡに対して結合性を有し、ＢＳＡに対して結合性を有さない抗体を選抜することにより、調製することができる。本発明の１つの側面において、本発明の抗体が結合するエピトープは、グリセルアルデヒドとタンパク質から非酵素的反応により生成する構造を含む。
【００３６】
本発明の１つの側面において、以下の（Ａ）および（Ｂ）で特定されるアミノ酸配列を重鎖可変領域および軽鎖可変領域の相補性決定領域に含む抗体、またはその抗原結合断片が提供される：
（Ａ）
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：２に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
（Ｂ）
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：９に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：１０に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：１１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：１３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：１４に示すアミノ酸配列に含まれる連続する１２残基のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：１５に示すアミノ酸配列に含まれる連続する９残基のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列。
【００３７】
本発明の１つの側面によれば、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：４のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列であるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片；または重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：１２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：１６のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列である、抗体またはその抗原結合断片が提供される。その具体的な態様として、本発明は本明細書記載のモノクローナル抗体である６Ｂ３および１１Ｇ４を含む。これらの抗体はマウス由来の抗体であり、上記の配列番号で示される重鎖可変領域と軽鎖可変領域に加えて、マウス抗体の定常領域を有している。なお、上記の配列番号で示される重鎖可変領域または軽鎖可変領域と実質的に同一のアミノ酸配列の例として、Ｎ末端またはＣ末端に１または２のアミノ酸が付加された配列が挙げられる。例えば、上記の配列番号で示される重鎖可変領域と実質的に同一のアミノ酸配列として、Ｎ末端またはＣ末端に１または２のアミノ酸（例えば、天然型アミノ酸から選択されるアミノ酸）、より具体的にはＧｌｕおよびＧｌｎから選択される１つのアミノ酸が付加した配列が挙げられる。
【００３８】
本発明の１つの側面によれば、上記の重鎖可変領域および軽鎖可変領域またはそれらのＣＤＲで特定される抗体またはその抗原結合断片を参照抗体として、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、参照抗体と交差競合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。本発明の１つの態様において、モノクローナル抗体である６Ｂ３または１１Ｇ４を参照抗体として、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、参照抗体と交差競合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【００３９】
本発明の抗体は、例えばモノクローナル抗体である６Ｂ３または１１Ｇ４を参照抗体として、Glycer-AGEsまたはGlycol-AGEsとの標準的な結合アッセイを行うことにより交差競合に関する特性を確認することができる。交差競合の確認は、例えば、フローサイトメトリーや交差競合ＥＬＩＳＡアッセイにより確認することができる。
【００４０】
本発明の１つの側面において、上記の抗体またはその抗原結合断片を含む、疾患の治療、予防または診断のための医薬組成物が提供される。対象疾患としては、Glycer-AGEsまたはGlycol-AGEsが関与する疾患であれば特に限定されず、例えば、糖尿病、糖尿病最小血管合併症（糖尿病網膜症、糖尿病腎症、および糖尿病神経障害）、および糖尿病大血管症、高血圧症、アルツハイマー病などの認知症、がん（例えば肝臓がん、膵臓がん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、乳がん、膀胱がん、悪性黒色腫、および肺がん）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、不妊症などが挙げられる。本発明の別の態様によれば、疾患は、糖尿病、耐糖能異常、網膜症、腎症、末梢神経障害、下肢壊疽、動脈硬化、血栓症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、がん（例えば、メラノーマ、肺がん、および肝臓がんなど）、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能障害、中枢神経障害、およびアルツハイマー病が挙げられる。
【００４１】
本発明の１つに態様において、対象の組織（例えば血液）中に存在するGlycer-AGEsおよびGlycol-AGEsの量を本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いて測定する工程を含む、疾患の診断方法が提供される。ここでの診断とは既に記載した通りである。本発明の別の態様において、試料（例えば、採血により得られた血液試料）中に存在するGlycer-AGEsおよびGlycol-AGEsの量を本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いて測定する工程を含む、試料の分析方法が提供される。
【００４２】
本発明の抗体の抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、またはｓｃ（Ｆｖ）２である。本発明の抗体は、例えば、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはキメラ抗体である。これらの抗体またはその抗原結合断片は、当業者に公知の方法により調製することができる。
【００４３】
本発明の抗体の抗原結合断片は、例えば、１×１０−４Ｍ以下、具体的には１×１０−５Ｍ以下、より具体的には１×１０−６Ｍ以下、さらに具体的には１×１０−７Ｍ以下、好ましくは１×１０−８Ｍ以下の平衡解離定数Ｋｄでグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合する。抗体のＫｄ値は、当技術分野において十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のＫｄ値を決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いること、好ましくはBiacore(登録商標)システムのようなバイオセンサーシステムを用いることによる。
【００４４】
本発明の１つの側面において、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の製造方法が提供される。該方法は、本発明の抗体をコードする核酸がトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程を含み、周知技術に基づいて様々な方法で実施され得る。
【００４５】
本発明の１つの側面において、本発明の抗体をコードする核酸が提供される。このようなポリヌクレオチドは、例えば、重鎖および軽鎖それぞれの可変領域および定常領域の両方をコードする。ポリヌクレオチドはＲＮＡの形態であってもＤＮＡの形態であってもよい。ポリペプチドをコードするコーディング配列は、遺伝コードの冗長性または縮重を含んでいてもよい。
【００４６】
いくつかの実施態様において、本発明の抗体をコードする１つ以上の核酸は、発現ベクターに組み込まれ、当該発現ベクターは、導入される宿主細胞の染色体外であるか、またはそのゲノム中にインテグレートされるよう設計され得る。発現ベクターは、任意数の適切な制御配列（転写および翻訳調節配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点などが挙げられるが、これらに限定されない）または他の要素（選択遺伝子など）を含むことができ、これらは全て、当分野でよく知られるように操作可能に連結される。いくつかの場合、２つの核酸を用いて、それぞれを異なる発現ベクターに入れるか（例えば、第一の発現ベクターに重鎖、第二の発現ベクターに軽鎖）、あるいはそれらを同一の発現ベクターにいれることができる。制御配列の選択を含む、１つ以上の発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの因子によって決まり得る。
【００４７】
一般に、選択される宿主細胞に適した任意の方法（例えば、トランスフォーメーション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、インフェクションなど）を用いて、１つ以上の核酸が１つ以上の発現調節要素に操作可能に連結されるように（例えば、ベクターにおいて、細胞でのプロセスにより作出される構築物において、宿主細胞のゲノムにインテグレートされて）、核酸および／または発現が適した宿主細胞に導入され、組換え宿主細胞が作出される。得られた組換え宿主細胞は、発現に適した条件下（例えば、インデューサーの存在下、適した非ヒト動物中、適した塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助剤などを添加した培地など）で維持でき、それによりコードされた１つ以上のポリペプチドが製造される。いくつかの場合において、重鎖が１つの細胞で製造され、軽鎖が別の細胞で製造される。
【００４８】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当分野で既知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能な多くの不死化細胞株が含まれ、これには、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝臓がん細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、および多数の他の細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。細菌、酵母、昆虫および植物を含む（これらに限定されない）非哺乳動物細胞を用いて、組換え抗体を発現させることもできる。いくつかの実施態様において、抗体は、ウシやニワトリなどのトランスジェニック動物において製造することができる。
【実施例】
【００４９】
［実施例１］ＡＧＥｓの調製
ＡＧＥｓは公知の方法により調製することができる（Hum. Reprod. 26: 604-610 (2011)、Mol. Med. 6: 114-125 (2000)など）。具体的には以下の方法により各種ＡＧＥｓを調製した。
【００５０】
（１）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ウシ血清アルブミン（Glycer-AGEs-BSA）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma-Aldrich）、ＤＬ−グリセルアルデヒド（ＤＬ−ＧＬＡ、ナカライテスク）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ、同仁化学研究所）は購入により入手した。
ＤＬ−ＧＬＡ（１８０ｍｇ）とＤＴＰＡ（３９ｍｇ）を秤量し、５０ｍｌの培養用チューブに移した。チューブにリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４、２０ｍｌ）を加えてボルテックスミキサーにてＤＬ−ＧＬＡが溶解するまで攪拌した。その後、ＢＳＡ（５００ｍｇ）を加えて溶解するまで攪拌した（溶液中のＢＳＡの濃度：２５ｍｇ／ｍｌ）。
【００５１】
得られた混合物をクリーンベンチ内で０．２μｍフィルターに通して無菌溶液とした。チューブ内の液体が蒸発しないように、パラフィルム（商標）などのフィルムにてチューブの蓋を密閉して３７℃で１週間インキュベートした。
【００５２】
得られた反応溶液（２．５ｍｌずつ）をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア、８本）にアプライし、ＰＤ−１０カラムのプロトコールにしたがって、リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４、３．５ｍｌずつ）で溶出させた。
【００５３】
カラム４本分の溶出液（計１４ｍｌ）を集めて分画分子量６〜８ｋＤａの透析チューブ（Spectra/Por Dialysis Membrane、幅：２３ｍｍ）に入れ、１４ｍｌのチューブ２本を予め冷やしておいた２ＬのＰＢＳ中に入れて攪拌して透析した。透析は低温室内（５℃）で行い、２４時間ごとに透析液（ＰＢＳ）を交換し、３日間透析した。
【００５４】
透析終了後、２本の透析チューブ内の液を合わせて５０ｍｌの培養用チューブに入れて、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glycer-AGEs-BSA）としてタンパク質量を測定し、培養用ＰＢＳにて必要なタンパク質濃度に調整した。
ＤＬ−ＧＬＡを添加しなかったことを除いて実施例１と同じ手法で、対照ＢＳＡを調製した。
【００５５】
（２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有マウス血清アルブミン（Glycer-AGEs-MSA）およびグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ウサギ血清アルブミン（Glycer-AGEs-RSA）
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に、２５ｍｇ／ｍＬのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ、Sigma-Aldrich）あるいはウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ、Sigma-Aldrich）、ＤＬ−グリセルアルデヒド（０．１Ｍ，ナカライテスク）、およびジエチレントリアミン５酢酸（５ｍＭ、ＤＴＰＡ、同仁化学研究所）を含有する溶液を調製した。該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の未反応物などは、ＰＤ−１０ゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）にて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。
【００５６】
（３）グルコース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glu-AGEs-BSA）およびフルクトース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Fru-AGEs-BSA）
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に、２５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma-Aldrich）、Ｄ−グルコース（０．５Ｍ、和光純薬）またはＤ−フルクトース（０．５Ｍ、和光純薬）、およびＤＴＰＡ（５ｍＭ、同仁化学研究所）を含む溶液を調製し、該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で８週間インキュベートした。低分子量の未反応物などはＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳにて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。
【００５７】
（４）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glycer-AGEs-BSA）、グリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glycol-AGEs-BSA）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（MGO-AGEs-BSA）、およびグリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（GO-AGEs-BSA）
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に、０．１Ｍのグリセルアルデヒド（ナカライテスク）、グリコールアルデヒド（ナカライテスク）、メチルグリオキサール（Sigma-Aldrich）、あるいはグリオキサール（Sigma-Aldrich）と、ＢＳＡ（２５ｍｇ／ｍＬ）およびＤＴＰＡ（５ｍＭ）を含む溶液を調製した。該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で１週間インキュベートした。無菌条件下、３７℃で１週間インキュベートし、その後、低分子量の未反応物などはＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳにて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。
【００５８】
（５）３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（3-DG-AGEs-BSA）
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にＢＳＡ（２５ｍｇ／ｍＬ、Sigma-Aldrich）、３−デオキシグルコソン（０．２Ｍ、同仁化学研究所）およびＤＴＰＡ（５ｍＭ）を含む溶液を調製した。該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で２週間インキュベートした。その後、低分子量の未反応物などはＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳにて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。
【００５９】
（６）Ｎε−カルボキシメチルリジン含有ＢＳＡ（CML-BSA）
０．２  Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に、ＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ、Sigma-Aldrich）、グリオキシル酸（４５ｍＭ、和光純薬）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１５０ｍＭ、Sigma-Aldrich）を含む溶液を調製した。該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、低分子量の未反応物などはＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳにて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。
【００６０】
［実施例３］Glycer-AGEsに特異的なモノクローナル抗体の作製
（１）マウスへの免疫
免疫抗原として、Glycer-AGEs-MSA（１ｍｇ／ｍｌ）を同じ容量のFreund’s Adjuvant, Complete（Sigma-Aldrich）と混合してエマルジョンを調製し（抗原の濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）、ＧＡＮＰ（登録商標）マウス（トランスジェニック社）３匹の背部皮下に初回免疫をした（抗原の量：２００μｇ／匹ずつ）。Glycer-AGEs-MSA（１ｍｇ／ｍｌ）を同じ容量のFreund’s Adjuvant, Incomplete（Sigma-Aldrich）と混合して調製したエマルジョン（抗原の濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて２週間おきに追加免疫（抗原の量：５０μｇ／匹）を行った。初回免疫から４回免疫した後に尾静脈より採血を行い、抗体価の確認を行った。抗体価の高かったものに対して、追加免疫用のエマルジョン（抗原の量：５０μｇ）をマウスの腹腔内に最終投与し、その３日後に細胞融合用に脾臓を摘出した。
【００６１】
（２）抗体価の測定
抗血清の力価をＥＬＩＳＡで評価した。９６穴マイクロタイタープレート（NUNC）に、免疫抗原であるグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（Glycer-AGEs-MSA）を１μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／ウェルずつ加え、一晩４℃で固相化した。０．０５％（ｖ/ｖ）Tween 20を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、０．５％（ｗ/ｖ）ゼラチンを含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で１時間ブロッキングした。抗血清は１０００倍から３倍ずつ段階希釈し、７２９０００倍までの希釈系列を調製後、抗原固相化プレートに５０μｌ／ウェルずつ入れて１時間静置した。洗浄後、ＰＢＳ−Ｔで２５００倍に希釈した２次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ （ZYMED）を５０μｌ／ウェルずつ入れて１時間静置した。洗浄後、各ウェルに０．０２％（ｗ/ｖ）の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で０．５ｍｇ／ｍＬに調製したｏ−フェニレンジアミン溶液１００μＬを添加し、２５℃で１０分間静置した後に、１Ｍ硫酸溶液１００μＬを各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定した。
その結果、抗血清の９０００倍以上の希釈溶液において、抗原と有意な反応性を示したマウスを細胞融合に使用した。
【００６２】
（３）脾臓細胞の調製と細胞融合
マウスから摘出した脾臓をすりつぶし、１匹あたり約１×１０８個の脾臓細胞を調製した。ミエローマ細胞であるＰ３Ｕ１を培養し、細胞融合当日に生細胞率が９５％以上のＰ３Ｕ１を調製した。前記脾臓細胞とＰ３Ｕ１を５：１（細胞数の比）で混ぜ、５０％（ｗ/ｖ）濃度の分子量１，４５０のポリエチレングリコールにより細胞融合を行った。融合後、細胞を培地で洗浄し、ＨＡＴ培地に懸濁させ、９６穴培養プレートの各ウェルに１×１０５個／ウェルとなるように細胞を播きこみ、ハイブリドーマの選択培養を行った。細胞融合１０日目にハイブリドーマ培養上清を回収し、培養上清中の抗体価の測定を行った。
【００６３】
（４）抗体産生陽性ウェルのスクリーニング
細胞融合後、１０日目の培養上清を回収し、抗体産生陽性ウェルのスクリーニングを後述の実施例４の方法で行った。グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（Glycer-AGEs-MSA）に陽性、ウシ血清アルブミン由来カルボキシメチルリシン（CML-BSA）、およびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に陰性であるクローンについて選択し、細胞を２４穴プレートに移した。細胞を１〜２日間培養し、再度実施例４の方法でスクリーニングをしたところ、最終的に、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（Glycer-AGEs-MSA）に陽性、グリコールアルデヒドＡＧＥｓ由来ＢＳＡ（Glycol-AGEs-BSA）に弱陽性、グルコース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glu-AGEs-BSA）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（MGO-AGEs-BSA）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（GO-AGEs-BSA）、Ｎε−カルボキシメチルリシン含有ＢＳＡ（CML-BSA）、及びマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）陰性であるクローンを選択した。
【００６４】
（５）クローニング
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（Glycer-AGEs-MSA）に対する特異性の高かったクローンを限界希釈法でクローニングを行った。すなわち、細胞を１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地で５個／ｍＬに調製し、９６穴培養プレート２枚分の各ウェルに２００μＬずつ添加した。１０日後、後述の実施例４の方法で培養上清中のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（Glycer-AGEs-MSA）に対する抗体価を測定し、陽性であることを確認し、それぞれのウェルに由来するクローンを得た。特異性を十分に備えた本発明の抗体として６Ｂ３、および１１Ｇ４を得た。
【００６５】
［実施例４］抗体のスクリーニング
９６穴マイクロタイタープレート（NUNC）の各ウェルに、固相化抗原としてＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍＬに調製したグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（Glycer-AGEs-MSA）を５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間放置した。また、同時に特異性確認のためグルコース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glu-AGEs-BSA）、グリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glycol-AGEs-BSA）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（MGO-AGEs-BSA）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（GO-AGEs-BSA）、Ｎε−カルボキシメチルリシン含有ＢＳＡ（CML-BSA）、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を同様に５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間放置した。次に、０．０５％（ｖ/ｖ）Tween20を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、０．５％ゼラチンを含むＰＢＳ−Ｔ（ブロッキング液）を各ウェルに２００μＬずつ添加し、２５℃で１時間静置した。洗浄後、培養上清を原液のまま各ウェルに５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間静置した。次に、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、各ウェルに２５００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ZYMED）を５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間静置した。次に、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、各ウェルに０．０２％（ｗ/ｖ）の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で０．５ｍｇ／ｍＬに調製したｏ−フェニレンジアミン溶液１００μＬを添加し、２５℃で１０分間静置した後に、１Ｍ硫酸溶液１００μＬを各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定した。
【００６６】
特異性を十分に備えた本発明の抗体として６Ｂ３、および１１Ｇ４を得た。対照のＢＳＡを１とした場合の吸光度を図１（６Ｂ３）および図２（１１Ｇ４）に示す。
６Ｂ３の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号：４および配列番号：８のアミノ酸配列であり、１１Ｇ４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号：１２および配列番号：１６のアミノ酸配列であることを確認した。
【００６７】
［実施例５］モノクローナル抗体の解離定数測定
得られたモノクローナル抗体について、以下の手法で解離定数（Ｋｄ値）を測定した。グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（２００μｇ/ｍＬ、９８μＬ）をセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア）上にアミンカップリングキット（ＧＥヘルスケア）を用いて固定後、各種抗体を（６Ｂ３：０．００１〜１００ｎＭ、１１Ｇ４：０．８〜８００ｎＭ、ウサギポリクローナル抗体：０．１〜１０００ｎＭ）の濃度で希釈した抗体希釈液を作成し、Biacore T200（ＧＥヘルスケア）を用いてＫｄ値を算出した。その結果、６Ｂ３は４７．６ｎＭ、１１Ｇ４は３７６ｎＭ、ウサギポリクローナル抗体は７５１ｎＭであった。
【００６８】
［実施例６］６Ｂ３と１１Ｇ４の交差競合確認試験
（１）ビオチン標識化６Ｂ３の調製
Biotin Sulfo-OSu（３．２ｍｇ、同仁化学研究所）をＲＯ水（１４５．４μＬ）に溶解させ、ビオチン化溶液として使用した。下記試薬をＲＯ水に溶解させて１Ｌとし、さらにＲＯ水を９Ｌ加えてＰＢＳとして使用した。
【００６９】
塩化ナトリウム（和光純薬）                        ８０ｇ
リン酸２水素カリウム（和光純薬）                    ２ｇ
リン酸水素２ナトリウム１２水和物（和光純薬）      ２９ｇ。
【００７０】
ビオチン化溶液（１３．４μＬ）を６Ｂ３抗体（１０ｍｇ／ｍＬ、５００μＬ）に加え、ミニディスクローター（バイオクラフト）を用いて転倒混和しながら２時間室温で反応させた。反応中に精製用プレパックカラム（ＮＡＰ−５、ＧＥヘルスケア）にＰＢＳ（１０ｍＬ）を加えて平衡化を行った。平衡化したＮＡＰ−５に反応液を加え、その後ＰＢＳ（１ｍＬ）を加えてビオチン標識化６Ｂ３抗体を回収した。
【００７１】
（２）試薬調製
下記試薬をＲＯ水に溶解させて１Ｌとし、コーティング溶液として使用した。
炭酸ナトリウム（和光純薬）                      １．５９ｇ
炭酸水素ナトリウム（和光純薬）                  ２．９３ｇ。
ＢＳＡ（５ｇ、Sigma-Aldrich）をＰＢＳ（５００ｍＬ）に溶かし、ブロッキング溶液として使用した。
【００７２】
５０ｍＭトリス（６．１ｇ、和光純薬）をＲＯ水（約９００ｍＬ）に溶解させて、６Ｎ塩酸（和光純薬）でｐＨ７．４に調整した。得られた溶液にグリセロール（１ｍＬ、Sigma-Aldrich）、Tween-20 （１ｍＬ、ナカライテスク）を加え、ＲＯ水にて１Ｌにメスアップした。得られた溶液を希釈溶液として使用した。
【００７３】
下記試薬をＲＯ水に溶解させて１Ｌとし、さらにＲＯ水を９Ｌ加えた後で、Tween-20 （５ｍＬ）を加えた。得られた溶液を洗浄溶液として使用した。
塩化ナトリウム（和光純薬）                        ８０ｇ
リン酸２水素カリウム（和光純薬）                    ２ｇ
リン酸水素２ナトリウム１２水和物（和光純薬）      ２９ｇ。
【００７４】
（３）抗原の固相化
コーティング溶液中で１．０μｇ／ｍＬに調整したグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（原液：１０ｍｇ／ｍＬＰＢＳ溶液）の溶液を、１００μＬずつ９６穴マイクロタイタープレート（COSTAR）に加え、４℃で一晩インキュベートした。
【００７５】
（４）ブロッキング
固相化の処理を行った各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、ブロッキング溶液（２００μＬ）を加え、室温で１時間放置した。
【００７６】
（５）競合実験
希釈溶液を用いて、抗体（１１Ｇ４）と対照のマウスＩｇＧ（Thermo Fisher）の３倍希釈系列を、各抗体につき１ｍｇ／ｍＬより８点調製した。ビオチン標識化６Ｂ３抗体ＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）をＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ、和光純薬）含有希釈溶液にて１０，０００倍に希釈し、ビオチン標識化６Ｂ３抗体希釈溶液とした。
【００７７】
ブロッキング溶液で処理した各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、１１Ｇ４と対照のマウスＩｇＧの３倍希釈系列溶液（各５０μＬ）およびビオチン標識化６Ｂ３抗体希釈溶液（５０μＬ）を加え、プレートミキサーで２分間撹拌後、３０℃水平振とう条件下で２時間インキュベートした
【００７８】
（６）二次抗体の添加
洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液（Thermo Fisher、１．２５ｍｇ/ｍＬを希釈溶液にて５，０００倍に希釈した溶液、１００μＬ）を加え、プレートミキサーで３０秒間撹拌後、３７℃で１時間インキュベートした。
【００７９】
（７）発色
洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄後、１００μＬの基質溶液（ELISA POD基質 TMB溶液(Easy)、ナカライテスク）を加え、プレートミキサーで３０秒間撹拌後、室温で３０分間インキュベート後に１Ｎ  ＨＣｌ（１００μＬ）を加え発色を停止した。
【００８０】
（８）吸光度測定およびデータ解析
マイクロプレートリーダー(Cytation5、Biotek）で４５０ｎｍの吸光度を測定し、得られた吸光度の値から競合率を算出した。結果を図３に示す。１１Ｇ４の添加により濃度依存的に発色が低下し、１１Ｇ４が６Ｂ３と交差競合することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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