(57)【要約】      （修正有）【課題】生体磁性粒子の安定化及び振動化による電磁冷凍の方法及びシステムを提供する。【解決手段】生物組織内の磁性粒子を整列させるための静磁場と同時に振動磁場を印加することができる。このような磁性粒子の鎖は自然に又は人工的に導入されたものとし得る。針状電極を用いてイオンを発生させ、冷凍すべき組織を断熱する空気層を攪乱する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物組織を冷凍するシステムであって、
生物組織を収容するように構成された容器と、
前記生物組織に静磁場を印加するように構成された静磁場発生器と、
前記容器内の前記生物組織に振動磁場を印加するように構成された振動磁場発生器と、
前記容器内の前記生物組織を冷凍するように構成された冷凍素子と、
を備えるシステム。
【請求項２】
前記振動磁場は前記静磁場に対して直角方向に一次元又は二次元的に印加される、請求
項１記載のシステム。
【請求項３】
前記振動磁場の強度は前記静磁場の強度の１０％である、請求項２記載のシステム。
【請求項４】
前記静磁場の強度は１５ｍＴより大きい、請求項１−３のいずれかに記載のシステム。
【請求項５】
前記容器内の前記生物組織に電圧を印加するように構成された少なくとも一つの電極を
更に備える、請求項１−４のいずれかに記載のシステム。
【請求項６】
前記少なくとも一つの電極は針状であり、前記容器内の前記生物組織の表面に隣接する
空気境界層でイオンを発生するように構成されている、請求項５記載のシステム。
【請求項７】
請求項１−６のいずれかに記載のシステムで生物組織を冷凍する方法であって、該方法
は、
前記容器内の前記生物組織に前記静磁場を印加するステップと、
前記容器内の前記生物組織に前記振動磁場を印加するステップと、
前記容器内の前記生物組織を冷凍するステップと、
を備える方法。
【請求項８】
前記振動磁場は前記静磁場に対して直角方向に印加される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記静磁場の強度は１５ｍＴより大きい、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記振動磁場の強度は前記静磁場の強度の１０％である、請求項７−９の何れかに記載
の方法。
【請求項１１】
請求項５に記載のシステムで生物組織を冷凍する方法であって、該方法は、
前記容器内の前記生物組織に前記静磁場を印加するステップと、
前記容器内の前記生物組織に前記振動磁場を印加するステップと、
前記容器内の前記生物組織に電場を印加するステップと、
前記容器内の前記生物組織を冷凍するステップと、
を備える方法。
【請求項１２】
前記振動磁場は前記静磁場に対して直角方向に印加される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記静磁場の強度は１５ｍＴより大きい、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
前記振動磁場の強度は前記静磁場の強度の１０％である、請求項１１−１３の何れかに
記載の方法。
【請求項１５】
冷凍前に前記生物組織内に磁性粒子を導入するステップを更に備える、請求項７記載の
方法。
【請求項１６】
前記磁性粒子の導入ステップは、前記生物組織の遺伝子活性化によって前記磁性粒子を
生成するように前記生物組織を励起することにより実行される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
生物組織を冷凍する方法であって、該方法は、
生物組織を収容し冷凍するように構成された冷凍容器を用意するステップ、
静磁場を前記容器内の前記生物組織に印加することによって前記生物組織内の磁性粒子
を整列させるステップと、
前記静磁場に直角方向の振動磁場を前記容器内の前記生物組織に印加することによって
前記生物組織内の磁性粒子を振動させるステップと、
前記静磁場と前記振動磁場が活性である間前記生物組織を冷凍するステップと、
を備える方法。
【請求項１８】
生物組織を冷凍する方法であって、該方法は、
生物組織を収容し冷凍するように構成された冷凍容器で、前記生物組織に向けら前記生
物組織に実質的に近接するが離された複数の針状電極を有する、冷凍容器を用意するステ
ップと、
静磁場を前記容器内の前記生物組織に印加することによって前記生物組織内の磁性粒子
を整列させるステップと、
前記静磁場に直角であって前記静磁場を中心に回転する成分を有する振動磁場を前記容
器内の前記生物組織に印加することによって前記生物組織内の磁性粒子を楕円状又は円状
に振動させるステップ、
前記針状電極と前記生物組織との間に電圧差を与え、前記生物組織を包囲する空気層内
にイオンを生成するステップ、
前記電圧差、前記静磁場及び前記振動磁場が活性である間生物組織を冷凍するステップ
と、
を備える方法。
【請求項１９】
前記静磁場の強度は１５ｍＴより大きい、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記振動磁場の強度は前記静磁場の強度の１０％である、請求項１８又は１９記載の方
法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年７月１０日に出願された米国特許出願第１４／３２８，６０２号
及び２０１３年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／８５９，９４０号の優先
権を主張するものであり、両出願の全開示内容は参照することにより本明細書に組み込ま
れる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、電磁冷凍に関し、特に微小磁性粒子（通常生体マグネタイト）に楕円又は円
偏光振動を生じさせる磁界を印加してそれらの表面に氷の結晶が生成しないようにするこ
とによって電磁冷凍を向上させる技術に関する。より具体的には、生体磁性粒子の安定化
及び振動化による電磁冷凍の向上に関する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の第１の態様では、生物組織を冷凍するシステムが提供され、該システムは、生
物組織を収容するように構成された容器、前記生物組織に静磁場を印加するように構成さ
れた静磁場発生器、前記容器内の前記生物組織に振動磁場を印加するように構成された振
動磁場発生器、前記容器内の前記生物組織を冷凍するように構成された冷凍素子を備える
。
【０００４】
本発明の第２の態様では、生物組織を冷凍する方法が提供され、該方法は、生物組織を
収容し冷凍するように構成された冷凍容器を用意するステップ、静磁場を前記容器内の前
記生物組織に印加することによって前記生物組織内の磁性粒子を整列させるステップ、前
記静磁場に直角の振動磁場を前記容器内の前記生物組織に印加することによって前記生物
組織内の磁性粒子を振動させるステップ、前記静磁場と前記振動磁場が活性であるある間
前記生物組織を冷凍するステップを備える。
【０００５】
本発明の第３の態様では、生物組織を冷凍する方法が提供され、該方法は、生物組織を
収容し冷凍するように構成された冷凍容器で、前記生物組織に向けられ前記生物組織に実
質的に近接するが離された複数の針状電極を有する、冷凍容器を用意するステップ、静磁
場を前記容器内の前記生物組織に印加することによって前記生物組織内の磁性粒子を整列
させるステップ、前記静磁場に直角であって前記静磁場を中心に回転する成分を有する振
動磁場を前記容器内の前記生物組織に印加することによって前記生物組織内の磁性粒子を
楕円状又は円状に振動させるステップ、前記針状電極と前記生物組織との間に電圧差を与
え、前記生物組織を包囲する空気層内にイオンを生成するステップ、前記電圧差、前記静
磁場及び前記振動磁場が活性である間生物組織を冷凍するステップを備える。
【０００６】
本明細書に組み込まれその一部を構成する添付の図面は、本発明の一以上の実施形態を
示し、代表的な実施形態の説明とともに、本発明の原理及び実施の形態を説明するのに役
に立つものである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】磁場を用いる代表的な冷凍容器を示す。
【図２】代表的な組織冷凍方法を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、微小磁性粒子（通常生体マグネタイト）に楕円又は円偏光振動を生じさせる
磁場を印加してそれらの表面に氷の結晶が生成しないようにすることにより電磁冷凍を向
上させる技術に関する。
【０００９】
本明細書のいたるところで、本発明の概念の利用及び実装を説明するためにいくつかの
実施形態及び変形例が記載される。この説明のための記載は、本明細書に開示される概念
の範囲を限定するものでなく、本発明の概念の例示として理解されたい。様々な図面にお
いて対応する部分は同じ参照番号で示されている。
【００１０】
冷凍は、限定されないが流体工業等の様々な分野における重要な技術的プロセスである
。冷凍は生物学的及び化学的過程の時間速度を低減するため、例えば人や動物が食べる食
物を腐敗させる微生物活動を低減するために使用することができる。
【００１１】
農場と食卓との間における人間の食物の損失額は（米国のような先進技術国においてさ
え）４０％に上り得る（例えば、参考文献５０参照）。この無駄を減らす能力の向上は人
類の持続可能な未来に重要な意味を持っている。冷蔵及び冷凍技術は、材料の冷凍時の氷
晶の生成のために出荷用の植物性及び動物性組織の貯蔵に困難がある。例えば、果物及び
野菜の冷凍は特に問題がある。最近、日本の千葉市所在のＡＢＩ社は、氷晶の成長により
破壊される細胞の問題を大幅に低減すると主張する「セルアライブシステム」（ＣＡＳ）
を市販している。ＣＡＳシステムは通常の冷凍技術と選択振動電場及び磁場との結合並び
に音波の印加を利用している。ＡＢＩ社は最小の氷晶成長による細胞超構造の損傷で大量
の動物及び野菜食材を冷凍することができたと主張している。プログラム可能なＣＡＳ冷
凍庫は、試料に冷気を吹き付けることによって試料の過冷却を０℃から−２０℃の臨界温
度範囲内に制御しながら、試料を低周波数の振動電場及び磁場及び弱い音波に曝している
（例えば、参考文献１,２及び３参照）。
【００１２】
しかしながら、ＣＡＳシステムが氷晶の生成をほぼ抑制しながら生物組織を有効に冷凍
することができる理由の公的に入手可能な文書は、熱力学及び統計力学の基本原理に反す
る。例えば、公的に入手可能な文書は、弱い振動磁場が水分子を振動させ、氷晶核生成を
抑制すると断言している。しかしながら、このような主張は、水分子は反磁性であり、こ
のような振動磁場の効果は背景熱雑音より何桁も小さいため、信じられない。少なくとも
一つの同業者による論評（例えば、参照することにより組み込まれる参考文献９参照）及
び回答（例えば、参照することにより組み込まれる参考文献１参照）はこの問題に取り組
んでいるが、明確な解決は示されていない。いずれにしても、これらの冷凍庫は正常に動
作し、現在高価なマグロの風味を保つために船上でも広く使用されている。
【００１３】
本発明の代表的な実施形態において記載されるように、カリフォルニア工科大学で古生
態学の教授、ハインツ・ローウェンスタムにより５０年以上前になされた発見がＣＡＳシ
ステムの動作の仕方に関連する。特に、ローウェンスタムは、ヒザラ貝などの軟体動物の
原始群の歯は生物学的に沈殿したマグネタイト結晶（Ｆｅ３Ｏ４）の層で覆われているこ
とを発見した。ミネラルは、人体が骨や歯内でミネラル燐灰石を形成するのとほぼ同様の
生物学的沈殿物である。しかしながら、それは強磁性、即ち磁石に強く吸引される動物内
の唯一の既知の生体物質である。ローウェンスタムの最初の発見以来、多くの研究が、マ
グネタイトの生物学的沈殿はむしろ一般的であり、走磁性バクテリア及び多くの属の真核
生物、例えば原生生物及び植物、及び魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳類などの種々
の動物内で起こることを示している。カリフォルニア工科大学のキルシェビクのグループ
は、生物学的沈殿マグネタイト結晶（Ｆｅ３Ｏ４）は人体の組織内に存在し、一部のガン
組織にも、数ｐｐｍのレベルで存在することを示している。同等のレベルがほとんどの動
物組織並びに種々のバクテリア及び原生生物内に存在する。数ｐｐｍは少量であるように
思われるが、代表的な組織内にはこれらのクラスタの多くが存在し、例えば人間の脳内に
は１００，０００／グラム程度存在する。
【００１４】
生物組織の冷凍保存分析にとって、生物組織内に存在する磁性結晶のすべてが冷凍保存
システム（例えばＣＡＳ冷凍庫）で使用されるレベル及び周波数の磁場と極めて強く相互
作用する（例えば、場合によっては熱雑音限界の何千倍に上る）という事実が重要である
。それに反して、反磁性粒子は熱雑音レベル以下である。
【００１５】
強磁性物質の存在は、冷凍中に組織内で起こっていることを物理的に説明し得る唯一の
メカニズムであると考えられるが、公的に入手し得る文献のいずれにも可能なメカニズム
として言及されていない。更に、これまでの研究は、ＣＡＳ技術が生存率の向上を主張す
る生物学的研究において哺乳類細胞株を成長せるために使用する液体培地の多くには強磁
性汚染物質が存在することを証明している。従って、このような強磁性汚染物質が生物組
織内に自然に存在する強磁性クラスタと同様に作用している可能性もある。
【００１６】
工業的に重要なプロセスに対する基本的な物理的メカニズムが明らかにされると、新た
な理解が関連する技法の改良のための可能な洞察力がもたらされることが知られている。
このような改良のためのいくつかの新たな機会が本開示に以下で提示され検討される。
【００１７】
バクテリアや動物組織内に見られる生物学的磁気結晶のクラスタは細胞死後すぐに凝集
して最小エネルギー構造になりやすいことが知られている。磁気結晶を保持する細胞骨格
タンパク質は細胞死後急速に退化し、磁気結晶が凝集塊になり得る。この凝集塊は孤立し
た磁性粒子又は鎖よりも有効に周囲の液体を同相で振動させることができない。凝集塊が
有効でない理由は少なくとも２つあり、（１）それらの磁気モーメントが鎖に比較して小
さいため（それらが感じる磁気トルクが小さくなる）ため、（２）音響振動を周囲の組織
に伝達する凝集塊の表面積がそれらの粒子を長い鎖に延ばしたときの面積よりはるかに小
さいためである。
【００１８】
従って、冷凍前に粒子が凝集しないようにすると電磁冷凍効果を高められる。本発明は
、例えば１５ｍＴより大きい静磁場を用いて電磁冷凍を向上させる新規な方法を提供する
。このような磁場は、磁性粒子が手持ち磁石の近傍の鉄くずのように延ばされた状態に保
つことによって磁性粒子が凝集し得ないようにすることができる。本開示に記載する方法
に基づいて、冷凍前の凍結防止を向上させるいくつかのタイプの磁気前処理を開発するこ
とができる。
【００１９】
ＣＡＳ技術のような電磁冷凍技術は血液、精液、人の卵細胞、受精胚及び細胞培養液等
の多くの「液体」組織を冷凍保存するために使用できる。本発明の模範的な実施形態によ
れば、適切に調整した強磁性粒子を添加することで氷晶生成プロセスを抑制するよう作用
する磁気振動サイトの密度を増大させ、それに相応して冷凍初期に望ましい核生成サイト
の数を増大させることによって、電磁冷凍技術の有効性を向上させることができる。従っ
て、生物組織内に自然に存在する強磁性クラスタに加えて強磁性粒子を添加することによ
って冷凍保存方法及びシステムを高性能化することができる。
【００２０】
冷凍保存を促進する十分な磁性物質を所有しない、もしくは十分な量の追加の強磁性粒
子を受け入れるのに適さない、一部の生物組織の場合には、遺伝子工学を使って、ほとん
どの群の動物及び植物における天然のマグネタイト沈殿細胞の生成を制御する転写因子を
ターンオンさせることができる。適切な因子をターンオンすることによって、より多くの
天然振動磁性クラスタを生成させ、電磁冷凍中の氷晶核生成を抑制することができる。
【００２１】
電磁冷凍（ＣＡＳ）に関する特許文献では、冷凍すべき生物組織に印加された弱い音波
レベルが通常固体及び液体表面に僅かな熱絶縁をもたらす不活性空気の表面境界層を撹乱
すると主張している。それゆえ、音波は絶縁をもたらすこの境界層を除去し、冷凍プロセ
スを改善すると主張している。
【００２２】
しかしながら、後の項で記載する本発明の代表的な実施形態は、このような説明は科学
的に正しくないことを明らかにする。はっきり言えば、音波を印加した状態での電磁冷却
中の熱輸送は静電「コロナ」風効果の結果である。静電コロナ風効果は針電極のアレイの
付加により高めることができる（例えば、参考文献１１参照）。針電極のアレイは、高電
圧電界を印加して多数のイオンを発生させ静電コロナ効果を最大にして冷凍すべき生物組
織を包囲する空気を動かすことができる。それゆえ、針電極は電磁冷凍庫内の熱輸送を増
大させるために使用することができる。言い換えれば、当業者に知られているように、針
電極は静電効果によりイオンを発生する。このような場合には、先のとがった電極はより
高い値の局所的静電界を生成し、そこでイオンを生成しやすい。この場合、静電界内のイ
オンの移動は冷凍すべき生物組織の周囲の空気層を撹乱することができる。
【００２３】
冷凍保存中の氷核生成及び結晶化に対する電磁場の可能な抑制作用はいくつかの工業的
方法の出発点である。これらの方法はグローバル食品保存技術の大きな進歩をもたらすこ
とができる。例えば、強い電場は冷凍する必要のある物質（例えば、生物組織）の表面の
不活性空気の表面境界層を撹乱することができ、よってより高速の蒸発及びより大きな熱
輸送をもたらすことができる。
【００２４】
更に、上述したように、大部分の生物組織は微量の強磁性物質、例えば生物学的に沈殿
したマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）並びに生物系に偶発的に含まれる環境汚染物質を含む。
微量の存在であるが、これらの粒子の数密度は高く、弱い低周波数磁場と非常に強い相互
作用を呈し得る。当業者に知られているように、このような弱い低周波数磁場は電磁冷凍
保存で使用することができる。
【００２５】
本発明の代表的な実施形態は、生物組織内の振動強磁性クラスタにより発生される低周
波数の音波が、組織が結晶になる前の超臨界状態になることを可能にしながら、どのよう
に氷晶核生成の抑制を生じるかを記載している。結晶化が生物組織を損傷し、冷凍時にそ
れらの状態を退化させることは当業者に知られているので、このような方法によれば、生
物組織は良好に保存され得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、強い静磁場での新鮮組織の前処理はマグネトソーム鎖の崩壊
の抑制及び逆戻りにより冷凍を高めることができる。その後、振動磁場及び静磁場の同時
印加によりマグネトソーム鎖を保存することができる。特に、磁性粒子の鎖を保存し、生
物組織の冷凍を向上させるためには、低周波数で回転する磁場を振動磁場より高い強度を
有する静磁場に直角に、生物組織に印加するのが有利である。
【００２７】
当業者に知られているように、マグネトソームは走磁性微生物内に存在する膜結合構造
である。それらは、自発強磁性であるそれらの被包性単一ドメインマグネタイト結晶の永
久磁気双極子モーメントのために地球磁場の磁力線に沿って整列し得る。個々の細胞は、
その種又は組織に依存して、１個から数千個の個別のマグネトソームを含み得る。マグネ
トソーム内の各磁気結晶は脂質二重層で囲まれ、固有の可用性膜貫通タンパクが膜に分類
される。本発明では、「マグネトソーム」は、生物組織内に存在する任意の磁性粒子又は
磁性粒子のクラスタを自然に含有されるか人工的に導入されるかを問わずに示す一般的な
用語として使用する。
【００２８】
当業者に知られているように、水は液体から固体状態へ凍結する際に体積を膨張する。
水の体積は凍結時に約１０％膨張する。氷に変わる際のこの膨張は、成長する氷晶による
鋭いエッジの損傷と単純な膨張効果とによって細胞膜を破壊し得る。当業者に知られてい
るように、水の凍結により細胞膜内部に生じる損傷は、水を過冷却し、膨張過程を経ずに
ガラス状態に冷却する、及び／又は形成される氷晶の大きさを制限することによって回避
することができる。電子顕微鏡使用者は、通常数ｍｍ３の小さな試料を低音液体中に、時
々高い圧力で直接浸すことによって、これを達成することができる。しかしながら、生物
組織内への熱伝導速度が遅いためにこの状態に保存し得る組織の大きさが制限される。
【００２９】
本開示で上述したように、グラムサイズ以上の対象物、例えばねずみの脳、野菜又は無
傷の魚の（細胞超構造を維持しながらの）冷凍はやりがいのある問題であった。更に上述
したように、ＣＡＳ技術などの電磁冷凍技術は、繊細な果物及び野菜の輸送に役立ち、歯
（例えば、参考技術文献４及び５参照）及び胚肝細胞（例えば、参考技術文献６参照）等
の人の移植組織の高度冷凍保存に役立ち得る。電磁冷凍は更にショウジョウバエ等の小動
物の生きた固体そのものの冷凍生存を促進することもできる（例えば、参考文献７参照）
。
【００３０】
他方、本開示で上述したように、ＡＢＩグループにより公開されたＣＡＳシステムに関
する論文及び特許文献（例えば、参考文献１，２，３及び８参照）は基礎生物物理学と一
致しない２つの作用機序を仮定している。特に、参考文献１，２，３及び８に提示されて
いる第１の主張は、振動電場及び磁場は水分子を直接小刻みに動かして過冷却状態にて氷
晶の核生成を抑制するはずであり、試料内部の急速恒温冷却を促進するはずであると述べ
ている。更に、参考文献１，２，３、及び８に提示されている第２の主張は、弱い音波は
不活性空気の熱境界層を撹乱して試料内への熱伝導を向上させるはずであると述べている
。
【００３１】
第１の主張（磁場による「小刻み振動」）に関して、ウォウク（例えば、参考文献９参
照）は、当業者に知られているように、水分子は反磁性であり、ＣＡＳ冷凍庫で使用され
ている弱い振動磁場（例えば、１０ガウス又は１ｍＴ以下）に曝されたとき熱雑音以上の
効果を生じないことを指摘している。ウォウク（例えば、参考文献９参照）は、電場は使
用条件に応じて氷晶の生成を僅かに抑制又は促進することが知られているが、これらの装
置に要求されるレベルではないことも言及している。
【００３２】
ＣＡＳ冷凍庫の磁気アスペクトの直接検査において、鈴木等（例えば、参考文献１０参
照）も、振動磁場単独の印加はダイコン又はサツマイモの検査試料の冷却時間曲線に変化
を与えず、検査した組織の細胞微構造に目に見える効果を与えないことを報告している。
【００３３】
当業者に知られているように、結果が再現可能であれば、異なる科学的な説明が正当化
されるかもしれない。このような異なる科学的な説明が本開示に記載され、間違った科学
的説明に基づいては不可能な改善を可能にすることができる。
【００３４】
第２の主張（即ち、音波の印加は空気層を撹乱する）に関して、ＣＡＳシステムで使用
される音波レベルの分析（例えば、本開示の表１参照）は、１振動サイクル中に個々の水
分子に到達するエネルギーはその最大強度（１０Ｗ／ｍ２）でも、熱雑音のエネルギーよ
り何桁も低い。表１に示すように、音波レベルも大部分の人間環境内の周囲雑音のレベル
より十分に低い。従って、参考文献１，２，３及び８においてＡＢＩグループにより提案
されている試料表面の熱境界層の音響破壊は正しくないと思われる。更に、当業者に知ら
れているように、音響振動はまた過冷却水を突然結晶化させるトリガの一つであると考え
られている。このような現象はＣＡＳシステム（例えば、参考文献２，３参照）に記載さ
れている電磁冷凍と矛盾する。
【００３５】
【表１】
2019163925.tif 000003
【００３６】
熱輸送への静電効果
本開示に記載したように、熱輸送への静電効果及び生物学的に沈殿される強磁性物質は
、なぜこの冷凍技術が正常に機能し、電磁冷凍技術の改善をもたらし得るかという生物学
的難問に対する可能な解に直接的な関係を有する。
【００３７】
参考文献１１において、濡れた材料の乾燥速度への静電場の効果が研究されている。当
業者は、輸送現象の研究から、気体流の相対速度が漸近的に零に低下する大部分の材料の
表面に比較的不活性の空気の薄い層が存在することを知っている。参考文献１２，１３及
び１４に記載されているように、これらの表面境界層は材料からの気体の拡散をさまたげ
、その内部への対流熱伝導速度を制限する。
【００３８】
鋭い通電点は電極終点から出るイオンの結果として電気風又はコロナ風を生成し、この
イオン風は停滞している表面境界層を破壊して表面の熱伝導に顕著な増大を生じさせるこ
とは当業者に知られている（例えば、参考文献１５，１６，１７，１８，１９及び２０参
照）。この効果は以前より、溶接中の熱い表面の冷却速度を増大するため、例えば半導体
素子を冷却するため、及びＣＯ２レーザ内の光学素子を冷却するため(例えば、参考文献
１８参照)に使用されている。音波破壊のエネルギーに比較して、１つのイオン当たりの
この静電効果は、本開示の表２で概説されるように、熱雑音の数倍の大きさである。
【００３９】
ＣＡＳ冷凍庫で使用される電場に相当する静電場は空気分子の不活性表面境界層を破壊
し、乾燥時間を劇的に短縮することができる（参考文献１１）。同様の効果によって、Ｃ
ＡＳ冷凍庫内に印加される高電圧静電場は材料表面の不活性気体の表面境界層を破壊して
冷却効率を増大する。大和田他の参考文献２で示される冷却増強は、実際上それ以前に報
告された参考文献１１のものに類似する。従って、ＤＣ又はＡＣの電場は過冷却のために
必要とされる急速除熱を促進することが期待されるが、ＡＣ電場の生成の方が変成器の使
用によって確実により容易である。電極へのスパイク状突起の付加は、すでに観察されて
いるように(参考文献１１)、可動イオン生成を促進してＣＡＳ効果の冷却を高めるかもし
れない。
【００４０】
【表２】
2019163925.tif 000004
【００４１】
生物学的に沈殿される強磁性物質
本質的により関心のある質問は、冷凍保存への弱い振動磁場の作用の可能なメカニズム
に関係がある。当該技術分野で知られているように、振動磁場と物質との間で相互作用効
果を生じ得る可能な物理的結合メカニズムは４つしかない。例えば、電気誘導、反磁性、
常時性、及び強磁性である。しかしながら、数百μＴより弱い低周波数場に対しては、強
磁性しか役に立たず、他のメカニズムは熱雑音限界よりはるかに低いピーク相互作用エネ
ルギーを有する（このようなメカニズムの復習のためには、例えば参考文献２参照）。
【００４２】
対照的に、強磁性物質の粒子は背景熱エネルギーの数百倍から数千倍の相互作用エネル
ギーを有し得る（例えば、参考文献２参照）。更に、大和田他（参考文献２，３）及びウ
ォウク（参考文献９）は、広範囲の生物組織内における強磁性物質、主として生物学的に
沈殿されるマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、の周知の存在（例えば、参考文献２３，２４，
２５，２６，２７，２８及び３０参照）を考察していない。広く複製されているこれらの
観測結果（例えば、参考文献３１，３２，３３，３４，３５，３６参照）は、強磁性物質
の一部は動物内の磁気知覚細胞小器官の基であるという仮説を強くサポートしている。更
に、人間の脳組織が広範囲にわたって研究されている（例えば、参考文献３０，３１，３
２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１参照）。しかしながら、参
考文献４２及び４３に示されるように、特異性細胞内のマグネタイト沈殿物は広範囲に発
見されている。
【００４３】
時々、同様に環境内に偏在し得る無機質由来の一部の強磁性物質（例えば、参考文献４
４参照）も生物組織内に入り込み得る（例えば、参考文献４５参照）。典型的な動物組織
は１〜１０００ｎｇ／ｇの範囲内の強磁性物質の背景濃度を有し、典型的には約４ｎｇ／
ｇのレベルである。より高レベルの濃度を有する組織は磁気知覚部（magnetoreception）
に含まれるホスト細胞と考えられるが、その他は鉄蓄積生成物に関連するかもしれず、あ
るいはことによると磁気化学的な役割を有することさえある（例えば、参考文献４６参照
）。当業者に知られているように、一部の動物の磁場を感知する能力は比較的最近に証明
されている。例えば、渡り鳥は磁気知覚器官を有することが証明されている。
【００４４】
エデル他による魚の生物マグネタイトを含有する細胞の最近の高分解能研究（例えば、
参考文献４７参照）は、個々の細胞が驚くべき磁性を有し、走磁性バクテリアの典型的な
細胞の１００倍のマグネタイト濃度を有することを証明している。これらの細胞は地球磁
場内で背景熱雑音の１５００倍までの相互作用エネルギーを有する。当業者に知られてい
るように、背景熱雑音エネルギーはｋＴ程度であり、ここでｋはボルツマン定数、Ｔは絶
対温度である。上述した熱雑音の約１５５０倍の相互作用エネルギーはＣＡＳ冷凍庫（例
えば、参考文献１参照）で使用される典型的な磁場（０．１ｍＴ）内でｋＴの約４５００
倍である。
【００４５】
人間の細胞について実行された研究作業（参考文献３９）は大脳皮質及び小脳内に約４
ｎｇ／ｇのマグネタイト（髄膜内の１０倍）の存在を報告している。これらの値は種々の
他の動物組織内で超伝導磁気測定により測定される値と同等である（例えば、参考文献２
７参照）。上記の参考文献で測定されたレベルの脊椎動物細胞濃度で、典型的な組織の１
グラム当たり約１００，０００細胞の最小推定が得られる（本開示の表３参照）。
【００４６】
【表３】
2019163925.tif 000005
【００４７】
更に、このような研究は、マグネタイト含有組織内の細胞の平均距離は強磁性クラスタ
から２０μｍ程度であり得ることを暗に示している。より小さい粒子サイズは対応してよ
り多くの粒子になり且つ最も近いクラスタからより近くなることを暗に示している。
【００４８】
電磁冷凍の改善
本開示によれば、ＣＡＳ冷凍プロセス中に観測される静電的改善は不活性空気の表面境
界効果の簡単な破壊をもたらし、結果としてより効果的な熱輸送プロセスをもたらす。組
織からの向上した除熱は観測される超臨界冷却を生成する一つの要因である。続いて、コ
ロナ風の発生を促進する鋭い針先のアレイによる冷凍庫の機能強化が、先行研究（例えば
、参考文献１１参照）に見られるように、この効果を増強する。
【００４９】
ＣＡＳ仮説の構成要素を試験する試みにおいて、鈴木他（例えば参考文献１０参照）は
、磁気処理は熱輸送にかかわるという主張のみを調査している。このような主張は、試験
構成要素の時間／温度曲線に何の磁気効果も観測されないために、正しくないことが証明
された。組織中に分散された微小強磁性粒子の振動がＣＡＳ冷凍庫の報告された作用に含
まれるならば、もしかすると氷晶核生成の抑制のための２つの可能なメカニズムが存在す
るかもしれない。
【００５０】
第１のもっとも明白なメカニズムは、これらの粒子は通常は氷晶の形成のための核生成
サイトのいくつかとして作用する可能性である。この場合、振動は初期結晶成長にかかわ
る数百の水分子の凝集を抑制しようとする（例えば、参考文献４８参照）。
【００５１】
第２のメカニズム、即ち振動粒子からの低周波数音波は、マグネタイト含有細胞から外
へ放射する。物体の外部からの音響波（氷晶の核生成をトリガし得る）と異なり、振動す
る強磁性粒子に近い音響波は周囲の組織内に空間的に大きな勾配で急速に消散する。これ
らの勾配は氷晶核生成構造になる水分子の凝集を様々にせん断することにより分裂するよ
うに作用し得る（例えば、参考文献４８参照）。
【００５２】
これらの状態のいずれにおいても、強磁性クラスタの周囲の細胞質への機械的結合は、
磁気エネルギーを隣接組織へ変換するための重要な機能である。本開示によれば、これら
の冷凍庫の磁場印加状態をこの変換のために生物マグネタイトの結合が最大になるように
調整することができ、既存の文献はこれが試みられるまで仮説誘導していない。
【００５３】
更に、静磁気バクテリアのこれまでの研究では、マグネトソーム鎖の線形ストリングが
細胞の死後急速に複数の塊に崩壊することが知られている（例えば、参考文献４９参照）
。強磁性粒子の細長い分布は、それらのより大きな有効表面及び磁気モーメントのために
、粒子の球状塊と比較して静磁気エネルギーの音波への変換に有効である。動物組織の岩
石磁気特性の詳細な分析は、粒子間磁気相互作用効果を増大させることによって測定され
るように、極めて類似の死後効果がそれらの細胞環境内でも働くことも示唆している（例
えば、参考文献２６，２９参照）。
【００５４】
本発明によれば、中程度に強い磁場の印加は冷凍プロセス中のマグネトソーム鎖の崩壊
を抑制するように作用し、それによって磁場から音響波へのエネルギー変換の効率を高め
ることができる。強い外部ＤＣ磁場を印加することによって既に塊にされた粒子の集合を
強制的に線形の鎖に再組立てさせ、静かに結晶を小刻みに振動させてそれらが互いに相対
的に運動するようにすることもできる。これは、それらを核生成サイトのプールから除去
し、外部磁場とのそれらの磁気相互作用を高める。このような「小刻み振動」は、超音波
的に、又はＤＣ（静）磁場に直角に整列したＡＣ（振動）磁場の印加によって実行するこ
とができる。いくつかの実施形態では、ＤＣ磁場が一方向にマグネトソーム鎖を整列させ
るとき、ＡＣ磁場をＤＣ磁場に対して直角方向にするのが有利であり、ＡＣ磁場は鎖を構
成する粒子をその整列方向に直角の方向に振動させることができる。例えば、粒子は密接
な接触状態になり得るため、整列方向の振動が妨げられるかもしれない。
【００５５】
先行研究（例えば、参考文献４９参照）において、バクテリア(M.magnetotacticum)か
らマグネトソーム鎖の崩壊を抑制するために少なくとも１５ｍＴの静磁場が必要とされる
ことを計算している。このような結果は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で実験的に評価さ
れ、これより強い磁場を印加し、確かに有効であった。
【００５６】
冷却中の磁気振動は、実質的に物理的な運動を確実にするために、静磁場に対して直角
方向に適切な振幅（例えば静磁場の１０％）を有する低周波数ＡＣ磁場を印加することに
よって達成することができる。原理的には、目標組織内に生成される生物マグネタイトの
結晶サイズ及び形状の詳細な研究に基づいて、マグネトソーム鎖の崩落の抑制及び各組織
の振動のための最適磁気状態を決定することができる。
【００５７】
振動磁場成分及び背景磁場が同一平面にある場合、磁性粒子は各振動サイクル中に背景
液体に関して２回一時的に休止する。振動磁気成分を第３次元方向にウォブルさせる（静
磁場に垂直な平面内で楕円形又は円形に振動させる）と、これらの過渡的休止が除去され
、核生成のチャンスを更に抑制することができる。このような円偏光振動磁場の特定的使
用は先行技術文献には存在しない。
【００５８】
本開示によれば、重要な動物組織細胞、例えば血液、精液、又は小さな胎児の冷凍保存
を、液体培地に細菌性マグネトソーム等の安定化強磁性粒子を添加し、この磁気音響変換
を生起するより多くの分散サイトを与えることによって向上させることができる。
【００５９】
上述したように、強磁性粒子は互いに凝集して大きな凝集体になり、磁気振動の極めて
有効な変換器にならなくなりやすい。当業者に知られているように、いくつかの実施形態
では、磁性流体の調合に日常的に行われているように、凝集を防止するために合成粒子を
なにかで被覆する必要があり得る。ＣＡＳ技術がどのように正常動作するか（及び正常動
作する場合の）その基礎的な物理的原理を理解することは冷凍保存のプロセスを改良する
ための重要なステップである。
【００６０】
本発明の代表的な実施形態によれば、図１は生物組織（１１０）が収容される代表的な
容器（１０５）を示す。生物組織は自然に又は人工的に導入された磁性粒子（１１５）を
含有する。ＤＣ磁場（１２０）が印加され、磁性粒子（１１５）を整列させる。ＡＣ磁場
（１２５）がＤＣ磁場（１２０）に直角に印加される。いくつかの実施形態では、針状電
極（１３０）が存在し、生物組織と電極との間に電圧を印加してイオンを発生させること
ができる。例えば、針状電極と生物組織との間に電圧差を印加する方法を提供するために
、容器内に生物組織と接触する電極を存在させることができる。代わりに、生物組織は単
に容器の電圧レベル（例えば、接地レベル）に維持し、針状電極に電圧を印加することが
できる。
【００６１】
本発明の代表的な実施形態によれば、図２は組織を冷凍する代表的な方法を示し、該方
法は、静磁場を生物組織に印加することによって容器内の生物組織内の磁性粒子を整列さ
せ（２０５）、静磁場に直角であり、それを中心に２次元的又は３次元的に振動する振動
磁場を容器内の生物組織に印加することによって生物組織内の磁性粒子を振動させ（２１
０）、静磁場及び振動磁場を活性にしながら生物組織を凍結する（２２０）。いくつかの
実施形態では、イオン風を生成するために針状電極により電圧を印加することができる（
２１５）。
【００６２】
図２の代表的な方法は追加のステップを含むこともできる。例えば、冷凍前に磁性粒子
を生物組織内に導入し、３次元で振動する合成磁場ベクトルを生成するように調整された
正弦状に振動する磁場で直交コイルを駆動することができる。
【００６３】
本発明において、冷凍素子は容器内の生物組織を冷凍するように構成された任意の装置
であり、例えば冷凍庫と呼ぶことができる。
【００６４】
本発明において、空気境界層は冷凍すべき試料を包囲する空気の層を指す。
【００６５】
本発明において、容器内の生物組織に電界を印加するステップは、例えば生物組織を針
電極で取り囲み、それらに電圧を印加するステップを指す。結果として、生物組織と針電
極との間に電圧差が生成されるとき、電界が生物組織に印加される。
【００６６】
本開示にはいくつもの参考文献が引用され、以上で言及され、以下に記載されている。
これらのすべての参考文献の開示内容は参照することによりそっくりそのまま本明細書に
組み込まれる。
【００６７】
本発明の多数の実施形態を開示したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様
々な変更をなし得ることは理解されよう。従って、他の実施形態も後記の請求項の範囲に
含まれる。
【００６８】
上述した実施形態は、開示の実施形態がどのように構成され使用されるかの完全な開示及
び説明として当業者に提供され、発明者（達）が発明とみなす範囲を限定する意図はない
。
【００６９】
本明細書に開示される方法及びシステムを実施する上述した形態の当業者に自明の変更
は後記の請求項の範囲内に含まれることを意図している。本明細書で述べたすべての特許
及び公開公報は当業者の技術レベルを示している。本開示で引用した全ての参考文献は参
照することにより、あたかも各参考文献が参照することによりそっくりそのまま組み込ま
れているのと同程度に組み込まれている。
【００７０】
本発明は特定の方法又はシステムに限定されず、変更可能であること勿論であることを
理解されたい。また、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を記述するためにのみ使
用され、限定することを意図していないことも理解されたい。本明細書及び添付の請求項
で使用されている単数表現は、特に明記しないかぎり複数の指示対象を含む。用語「複数
の」は特に明記しない限り２つ以上の指示対象を含む。特段の定めのない限り、本明細書
使用される技術用語及び科学用語は本発明が属する技術分野における通常の知識を有する
者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。
【００７１】
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【図１】
2019163925.tif 000006
【図２】
2019163925.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月22日(2019.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物組織を冷凍するシステムであって、
生物組織を収容するように構成された容器と、
前記生物組織に静磁場を印加するように構成された静磁場発生器と、
前記容器内の前記生物組織に振動磁場を印加するように構成された振動磁場発生器と、
前記容器内の前記生物組織を冷凍するように構成された冷凍素子と、
前記容器内の前記生物組織に電圧を印加するように構成され、針の形状を有し、前記容器内の前記生物組織の表面に隣接する空気境界層でイオンを生成するように構成された少なくとも１つの電極と、
を備え、
前記振動磁場の強度は前記静磁場の強度の１０％であり、
前記振動磁場は、３次元において、前記静磁場に垂直な平面内で楕円形又は円形に振動し、これにより氷晶の生成を抑制するシステム。
【請求項２】
生物組織を冷凍するシステムであって、
生物組織を収容するように構成された容器と、
前記生物組織に静磁場を印加するように構成された静磁場発生器と、
前記容器内の前記生物組織に振動磁場を印加するように構成された振動磁場発生器であって、前記振動磁場は、３次元において、前記静磁場に垂直な平面内で楕円形又は円形に振動し、これにより氷晶の生成を抑制する、振動磁場発生器と、
前記容器内の前記生物組織を冷凍するように構成された冷凍素子と、
を備え、
前記振動磁場の強度は前記静磁場の強度の１０％であるシステム。
【請求項３】
前記静磁場の強度は１５ｍＴより大きい、請求項１又は２のいずれかに記載のシステム。
【請求項４】
生物組織を冷凍する方法であって、該方法は、
生物組織を収容するように構成された容器と、
前記容器内の前記生物組織に静磁場を印加するように構成された静磁場発生器と、
前記容器内の前記生物組織に振動磁場を印加するように構成された振動磁場発生器と、
前記容器内の前記生物組織を冷凍するように構成された冷凍素子と、
前記容器内の前記生物組織に電圧を印加するように構成され、針の形状を有し、前記容器内の前記生物組織の表面に隣接する空気境界層でイオンを生成するように構成された少なくとも１つの電極と、
を含むシステムを用意するステップと、
前記容器内の前記生物組織に前記静磁場を印加するステップと、
前記容器内の前記生物組織に前記振動磁場を印加するステップと、
前記容器内の前記生物組織を冷凍するステップと、
を備え、
前記振動磁場の強度は前記静磁場の強度の１０％であり、
前記振動磁場は、３次元において、前記静磁場に垂直な平面内で楕円形又は円形に振動し、これにより氷晶の生成を抑制する方法。
【請求項５】
前記静磁場の強度は１５ｍＴより大きい、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生物組織を冷凍する方法であって、該方法は、
生物組織を収容するように構成された容器と、
前記容器内の前記生物組織に静磁場を印加するように構成された静磁場発生器と、
前記容器内の前記生物組織に振動磁場を印加するように構成された振動磁場発生器であって、前記振動磁場は、３次元において、前記静磁場に垂直な平面内で楕円形又は円形に振動し、これにより氷晶の生成を抑制する、振動磁場発生器と、
前記容器内の前記生物組織を冷凍するように構成された冷凍素子と、
を含むシステムを用意するステップと、
前記容器内の前記生物組織に前記静磁場を印加するステップと、
前記容器内の前記生物組織に前記振動磁場を印加するステップと、
前記容器内の生物組織に電場を印加するステップと、
前記容器内の前記生物組織を冷凍するステップと、
を備え、
前記振動磁場の強度は前記静磁場の強度の１０％である方法。
【請求項７】
前記静磁場の強度は１５ｍＴより大きい、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
冷凍前に磁性粒子を生物組織内に導入するステップをさらに備える、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記導入するステップは、前記生物組織の遺伝子活性化によって行われ、これにより、前記生物組織を誘導して前記磁性粒子を生成する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
冷凍前に磁性粒子を生物組織内に導入するステップをさらに備える、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記導入するステップは、前記生物組織の遺伝子活性化によって行われ、これにより、前記生物組織を誘導して前記磁性粒子を生成する請求項１０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
本発明の第１の態様では、生物組織を冷凍するシステムが提供され、該システムは、生物組織を収容するように構成された容器、前記生物組織に静磁場を印加するように構成された静磁場発生器、前記容器内の前記生物組織に振動磁場を印加するように構成された振動磁場発生器、前記容器内の前記生物組織を冷凍するように構成された冷凍素子と、前記容器内の前記生物組織に電圧を印加するように構成され、針の形状を有し、前記容器内の前記生物組織の表面に隣接する空気境界層でイオンを生成するように構成された少なくとも１つの電極と、を備え、前記振動磁場の強度は前記静磁場の強度の１０％であり、前記振動磁場は、３次元において、前記静磁場に垂直な平面内で楕円形又は円形に振動し、これにより氷晶の生成を抑制する。本発明の第２の態様では、生物組織を冷凍するシステムであって、生物組織を収容するように構成された容器と、前記生物組織に静磁場を印加するように構成された静磁場発生器と、前記容器内の前記生物組織に振動磁場を印加するように構成された振動磁場発生器であって、前記振動磁場は、３次元において、前記静磁場に垂直な平面内で楕円形又は円形に振動し、これにより氷晶の生成を抑制する、振動磁場発生器と、前記容器内の前記生物組織を冷凍するように構成された冷凍素子と、を備え、前記振動磁場の強度は前記静磁場の強度の１０％である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
本発明の第３の態様では、生物組織を冷凍する方法が提供され、該方法は、生物組織を収容するように構成された容器と、前記容器内の前記生物組織に静磁場を印加するように構成された静磁場発生器と、前記容器内の前記生物組織に振動磁場を印加するように構成された振動磁場発生器と、前記容器内の前記生物組織を冷凍するように構成された冷凍素子と、前記容器内の前記生物組織に電圧を印加するように構成され、針の形状を有し、前記容器内の前記生物組織の表面に隣接する空気境界層でイオンを生成するように構成された少なくとも１つの電極と、を含むシステムを用意するステップと、前記容器内の前記生物組織に前記静磁場を印加するステップと、前記容器内の前記生物組織に前記振動磁場を印加するステップと、前記容器内の前記生物組織を冷凍するステップと、を備え、前記振動磁場の強度は前記静磁場の強度の１０％であり、前記振動磁場は、３次元において、前記静磁場に垂直な平面内で楕円形又は円形に振動し、これにより氷晶の生成を抑制する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明の第４の態様では、生物組織を冷凍する方法が提供され、該方法は、生物組織を収容するように構成された容器と、前記容器内の前記生物組織に静磁場を印加するように構成された静磁場発生器と、前記容器内の前記生物組織に振動磁場を印加するように構成された振動磁場発生器であって、前記振動磁場は、３次元において、前記静磁場に垂直な平面内で楕円形又は円形に振動し、これにより氷晶の生成を抑制する、振動磁場発生器と、前記容器内の前記生物組織を冷凍するように構成された冷凍素子と、を含むシステムを用意するステップと、前記容器内の前記生物組織に前記静磁場を印加するステップと、前記容器内の前記生物組織に前記振動磁場を印加するステップと、前記容器内の前記生物組織を冷凍するステップと、を備え、前記振動磁場の強度は前記静磁場の強度の１０％である。
【外国語明細書】
2019163925000001.pdf