(57)【要約】      （修正有）【課題】宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換え産生ポリペプチドを分離する方法の提供。【解決手段】ＨＣＰと組換え産生ポリペプチドとを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、前記清澄化細胞培養上清をプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填することと、少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄してＨＣＰを除去することと、前記組換え産生ポリペプチドを回収することと、を含む、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換え産生ポリペプチドを分離する方法であって、  前記ＨＣＰと前記組換え産生ポリペプチドとを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄してＨＣＰを除去することと、
前記組換え産生ポリペプチドを回収することと、
を含む、方法。
【請求項２】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換え産生ポリペプチドを分離する方法であって、  プロテインＡクロマトグラフィーカラムを平衡化緩衝液で平衡化することと、
前記プロテインＡクロマトグラフィーカラム上に清澄化細胞培養上清を充填することと、
充填された前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを前記平衡化緩衝液で再平衡化することと、
充填された前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを、少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む第１の洗浄緩衝液で洗浄して、ＨＣＰを除去することと
充填された前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを第２の洗浄緩衝液で洗浄することと、
前記組換え産生ポリペプチドを溶出緩衝液で溶出させることと、
を含む、方法。
【請求項３】
組換え産生ポリペプチドを含む製剤中のプロテアーゼ汚染を低減する方法であって、
ＨＣＰと前記組換え産生ポリペプチドとを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、  前記清澄化細胞培養上清をプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄してＨＣＰを除去することと、
前記組換え産生ポリペプチドを回収することと、
前記製剤を調製することと、
を含む、方法。
【請求項４】
組換え産生ポリペプチドの安定性を向上させる方法であって、
前記組換え産生ポリペプチドと１種以上の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）とを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄してＨＣＰを除去することと、
前記組換え産生ポリペプチドを回収することと、
回収された前記組換え産生ポリペプチドを含む製剤を調製することと、
を含む、方法。
【請求項５】
組換え産生ポリペプチドを含む組成物中の宿主細胞タンパク質レベルを低減する方法であって、
前記組換え産生ポリペプチドと１種以上の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）とを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄してＨＣＰを除去することと、
を含む、方法。
【請求項６】
前記ＨＣＰが１種以上のプロテアーゼを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＣＰが、セリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、およびそれらの組合せから選択される１種以上のプロテアーゼを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＣＰがカテプシンＤを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
組換え産生ポリペプチドを含む組成物中のカテプシンＤを低減する方法であって、
前記組換え産生ポリペプチドとカテプシンＤとを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄してカテプシンＤを除去することと、を含む、方法。
【請求項１０】
前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が６〜１２炭素原子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が８〜１２炭素原子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が８〜１０炭素原子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂肪酸または脂肪酸塩が、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、およびそれらの組合せから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記洗浄緩衝液がカプリル酸またはカプリル酸塩を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記洗浄緩衝液が約２５ｍＭ〜約２００ｍＭの脂肪酸を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記洗浄緩衝液が約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの脂肪酸を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記洗浄緩衝液が塩化ナトリウムを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記洗浄緩衝液が約１．０Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で前記塩化ナトリウムを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記洗浄緩衝液が約２Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記洗浄緩衝液が約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記洗浄緩衝液が約７〜約９のｐＨを有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記洗浄緩衝液が約８〜約９のｐＨを有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記洗浄緩衝液が約８．５〜約９のｐＨを有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記洗浄緩衝液が約９のｐＨを有する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記洗浄緩衝液が約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記洗浄緩衝液が、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．０Ｍ〜約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記洗浄緩衝液が、約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記洗浄緩衝液が、約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が抗ＩＬ−１８抗体または抗ＩＬ６抗体またはそれらのフラグメントである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
細胞培養採取物を清澄化して清澄化細胞培養採取物を取得し、前記清澄化細胞培養採取物を前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムに充填する工程を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記カラムを前記洗浄緩衝液で洗浄する前に、充填された前記プロテインＡカラムを平衡化緩衝液で平衡化することをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記平衡化緩衝液がリン酸ナトリウムを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記平衡化緩衝液が約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記平衡化緩衝液が約６〜約８のｐＨで約２０ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記平衡化緩衝液が約７のｐＨで約２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記カラムを前記脂肪酸洗浄緩衝液で洗浄した後、第２の洗浄工程をさらに含む、請求項１および３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の洗浄緩衝液がリン酸ナトリウムを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の洗浄緩衝液が約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２の洗浄緩衝液が約６〜約８のｐＨで約２０ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の洗浄緩衝液が約７のｐＨで約２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記組換えタンパク質を回収することが、前記組換えタンパク質を前記プロテインＡカラムから溶出緩衝液で溶出させることを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記溶出緩衝液がクエン酸ナトリウムを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記溶出緩衝液が約２５ｍＭ〜約２００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記溶出緩衝液が約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記溶出緩衝液が約２．０〜約５．０のｐＨを有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記溶出緩衝液が約３．０〜約４．０のｐＨを有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記溶出緩衝液が約３．５のｐＨで約１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法により精製された組換え産生ポリペプチド。
【請求項５０】
前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントを含む、請求項４９に記載の組換え産生ポリペプチド。
【請求項５１】
前記組換え産生ポリペプチドが抗ＩＬ−１８抗体または抗ＩＬ６抗体である、請求項４９に記載の組換え産生ポリペプチド。
【請求項５２】
プロテインＡクロマトグラフィーカラムで宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換え産生ポリペプチドを分離するための洗浄緩衝液であって、少なくとも６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸または脂肪酸塩を含む、洗浄緩衝液。
【請求項５３】
前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が６〜１２炭素原子である、請求項５２に記載の洗浄緩衝液。
【請求項５４】
前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が８〜１２炭素原子である、請求項５２に記載の洗浄緩衝液。
【請求項５５】
前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が８〜１０炭素原子である、請求項５２に記載の洗浄緩衝液。
【請求項５６】
前記脂肪酸または脂肪酸塩が、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、およびそれらの組合せから選択される、請求項５２または５３に記載の洗浄緩衝液。
【請求項５７】
前記洗浄緩衝液がカプリル酸またはカプリル酸塩を含む、請求項５６に記載の洗浄緩衝液。
【請求項５８】
前記洗浄緩衝液が約２５ｍＭ〜約２００ｍＭの脂肪酸を含む、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項５９】
前記洗浄緩衝液が約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの脂肪酸を含む、請求項５２〜５８のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項６０】
前記洗浄緩衝液が塩化ナトリウムを含む、請求項５２〜５９のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項６１】
前記洗浄緩衝液が約１．０Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、請求項６０に記載の洗浄緩衝液。
【請求項６２】
前記洗浄緩衝液が約２Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、請求項６１に記載の洗浄緩衝液。
【請求項６３】
前記洗浄緩衝液が約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、請求項６２に記載の洗浄緩衝液。
【請求項６４】
前記洗浄緩衝液が約７〜約９のｐＨを有する、請求項５２〜６３のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項６５】
前記洗浄緩衝液が約８〜約９のｐＨを有する、請求項５２〜６４のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項６６】
前記洗浄緩衝液が約８．５〜約９のｐＨを有する、請求項５２〜６５のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項６７】
前記洗浄緩衝液が約９のｐＨを有する、請求項５２〜６６のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項６８】
前記洗浄緩衝液が約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む、請求項５２〜６７のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項６９】
前記洗浄緩衝液が、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．０Ｍ〜約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む、請求項５２〜６８のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項７０】
前記洗浄緩衝液が約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む、請求項５２〜６９のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項７１】
前記洗浄緩衝液が、約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む、請求項５２〜７０のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項７２】
前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項５２〜７１のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１３年５月１５日出願の先行米国仮特許出願第６１／８２３，５２０号明細書（その全体が参照により組み込まれる）に基づく利益を主張する。
【０００２】
配列リストの参照
本出願には、２０１４年５月１３日に作成された８，５２１バイトのサイズを有するテキストファイルＰＵＲＩＦ３００ＷＯ１＿ＳＬとして本出願と共に提出された配列リストが参照により組み込まれる。
【０００３】
本発明は、組換え産生ポリペプチドの精製に関する。より特定的な実施形態では、本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換え産生ポリペプチドを分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
組換え産生ポリペプチド、たとえば、抗体および他のタンパク質は、広範にわたる診断用途および治療用途に使用される。組換えポリペプチドの製造プロセスは、一般的には、宿主細胞でのポリペプチドの発現と、ポリペプチドの精製と、を含む。
【０００５】
発現は、一般的には、宿主細胞が組換えポリペプチドを産生するのに適した条件下で原核宿主細胞または真核宿主細胞を培養することを含む。組換えポリペプチドは、宿主細胞内のさまざまな位置で発現されうるので、このことが、産物の単離および精製に用いられる方法に影響を及ぼしうる。
【０００６】
組換えポリペプチドが発現された後、「細胞採取」と呼ばれるプロセスで、細胞培養培地から無傷宿主細胞および細胞デブリが分離される。たとえば、遠心分離または濾過により細胞培養培地から宿主細胞を分離して、組換えポリペプチドと他の不純物とを含む清澄化流体（これは「細胞培養上清」と呼ばれうる）を提供することが可能である。清澄化細胞培養上清に見いだされうる不純物の例としては、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、核酸、内毒素、ウイルス、タンパク質変異体、およびタンパク質凝集体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０００７】
精製とは、清澄化細胞培養上清から不純物を除去することを意味し、典型的には、１つ以上のクロマトグラフィー工程を含む。典型的なプロセスは、キャプチャー工程と、中間精製工程または中間ポリッシング工程と、最終ポリッシング工程と、を含む。キャプチャー工程として、多くの場合、アフィニティークロマトグラフィーたとえばプロテインＡクロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーが使用される。キャプチャーに続いて、多くの場合、純度およびウイルス汚染物質除去を向上させるために、少なくとも２つの中間精製工程または中間ポリッシング工程が行われる。中間精製工程または中間ポリッシング工程は、多くの場合、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により達成される。多くのプロセスでは、最終ポリッシング工程は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、またはゲル濾過を用いて達成される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
好ましくは、バイオ医薬製品は、宿主細胞タンパク質などの不純物の濃度が、所望の産物に対して１００万分のいくつかまたはそれ以下の範囲に低減されて、非常に高い純度を有する。したがって、不純物とくに宿主細胞タンパク質の除去を最適化する精製プロセスの必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載されているのは、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換え産生ポリペプチドを分離する方法である。一実施形態では、本方法は、組換え産生ポリペプチドとＨＣＰとを含む清澄化細胞培養上清を提供する工程と、プロテインＡクロマトグラフィーカラム上に清澄化細胞培養上清を充填する工程と、少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液でプロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄して、ＨＣＰを除去する工程と、組換え産生ポリペプチドを回収する工程と、を含む。他の実施形態では、本方法は、プロテインＡクロマトグラフィーカラムを平衡化緩衝液で平衡化する工程と、プロテインＡクロマトグラフィーカラム上に清澄化細胞培養上清を充填する工程と、充填されたプロテインＡクロマトグラフィーカラムを平衡化緩衝液で再平衡化する工程と、充填されたプロテインＡクロマトグラフィーカラムを、少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む第１の洗浄緩衝液で洗浄して、ＨＣＰを除去する工程と、充填されたプロテインＡクロマトグラフィーカラムを第２の洗浄緩衝液で洗浄する工程と、組換え産生ポリペプチドを溶出緩衝液で溶出させる工程と、を含む。他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドを含む製剤のプロテアーゼ汚染を低減する方法を記載する。他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドの安定性を向上させる方法を記載する。他の実施形態では、製剤中のプロテアーゼレベルを含めてＨＣＰレベルを低減する方法を提供する。除去されうるプロテアーゼの例としては、セリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼたとえばカテプシンＤ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびアミノペプチダーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
一実施形態では、脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長は、６〜１２炭素原子である。他の実施形態では、脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長は、８〜１２炭素原子である。他の実施形態では、脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長は、８〜１０炭素原子である。一実施形態では、脂肪酸または脂肪酸塩は、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、およびそれらの組合せから選択される。より特定的な実施形態では、洗浄緩衝液は、カプリル酸またはカプリル酸塩を含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約２５ｍＭ〜約２００ｍＭの脂肪酸を含む。他の実施形態では、洗浄緩衝液は、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの脂肪酸を含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約１００ｍＭの脂肪酸を含む。
【００１１】
一実施形態では、洗浄緩衝液は、塩化ナトリウムを含む。より特定的な実施形態では、洗浄緩衝液は、約１．０Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約２Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む。
【００１２】
一実施形態では、洗浄緩衝液は、約７〜約９のｐＨを有する。他の実施形態では、洗浄緩衝液は、約８〜約９のｐＨを有する。他の実施形態では、洗浄緩衝液は、約８．５〜約９のｐＨを有する。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約９のｐＨを有する。
【００１３】
より特定的な実施形態では、洗浄緩衝液は、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む。他の実施形態では、洗浄緩衝液は、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．０Ｍ〜約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む。他の実施形態では、洗浄緩衝液は、約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約９．０のｐＨで約１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む。
【００１４】
一実施形態では、細胞培養採取物を清澄化して清澄化細胞培養採取物を取得し、これをプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填する。一実施形態では、充填されたプロテインＡカラムを平衡化緩衝液で再平衡化した後、洗浄緩衝液でカラムを洗浄する。一実施形態では、平衡化緩衝液は、リン酸ナトリウムを含む。一実施形態では、平衡化緩衝液は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。一実施形態では、平衡化緩衝液は、約６〜約８のｐＨで約２０ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。他の実施形態では、平衡化緩衝液は、約７のｐＨで約２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。
【００１５】
一実施形態では、本方法は、カラムを脂肪酸洗浄緩衝液で洗浄した後、第２の洗浄工程を含む。一実施形態では、第２の洗浄緩衝液は、リン酸ナトリウムを含む。一実施形態では、第２の洗浄緩衝液は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。一実施形態では、第２の洗浄緩衝液は、約６〜約８のｐＨで約２０ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。一実施形態では、第２の洗浄緩衝液は、約７のｐＨで約２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。
【００１６】
一実施形態では、組換えタンパク質は、プロテインＡカラムから組換えタンパク質を溶出緩衝液で溶出させることにより回収される。一実施形態では、溶出緩衝液は、クエン酸ナトリウムを含む。一実施形態では、溶出緩衝液は、約２５ｍＭ〜約２００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。一実施形態では、溶出緩衝液は、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。一実施形態では、溶出緩衝液は、約２．０〜約５．０のｐＨを有する。一実施形態では、溶出緩衝液は、約３．０〜約４．０のｐＨを有する。一実施形態では、溶出緩衝液は、約３．５のｐＨで約１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。
【００１７】
一実施形態では、以上の方法により精製される組換え産生ポリペプチドは、抗体またはその結合フラグメントである。一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体１（ヒト抗インターロイキン（ＩＬ）−６抗体）または抗体２（ヒトＩＬ−１８に対するモノクローナル抗体）（ＮＣＩＭＢ受託番号４１７８６）から選択される完全ヒトモノクローナル抗体を含む。
【００１８】
他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体１の軽鎖酸可変配列（配列番号８）を有する抗体を含む。他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体１の重鎖可変配列（配列番号７）を有する抗体を含む。他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体１の軽鎖可変配列（配列番号８）と抗体１の重鎖可変配列（配列番号７）とを有する抗体を含む。
【００１９】
他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体２の軽鎖酸可変配列（配列番号１８）を有する抗体を含む。他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体２の重鎖可変配列（配列番号１６）を有する抗体を含む。他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体２の軽鎖可変配列（配列番号１８）と抗体２の重鎖可変配列（配列番号：１６）とを有する抗体を含む。
【００２０】
一実施形態では、抗体は、抗体１または抗体２の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖アミノ酸配列を含む。ＣＤＲ領域またはＣＤＲという用語は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ），公共サービス（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ），ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎまたは後版）またはＣｈｏｔｈｉおよびＬｅｓｋ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））により定義された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。抗体は、典型的には、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含有する。ＣＤＲという用語は、場合にもよるが、ここでは、抗原または認識されるエピトープに対する抗体の親和性による結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含有するこれらの領域の１つまたはこれらの領域のいくつかさらには全部を表すために使用される。６つの短いＣＤＲ配列のうち、重鎖の第３のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、より大きいサイズ可変性（それを生成する遺伝子の構成の機序に本質的に起因するより大きい多様性）を有する。それは、２アミノ酸程度に短いこともあるが、既知の最長サイズは、２６である。ＣＤＲの長さはまた、特定の基礎的フレームワークにより収容可能な長さによっても異なりうる。機能的には、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定に部分的な役割を果たす。当業者であれば、抗体のＣＤＲ領域を決定することが可能である。一般的には、ＨＣＤＲ１は、約５アミノ酸長であり、カバット残基３１〜３５からなり、ＨＣＤＲ２は、約１７アミノ酸長であり、カバット残基５０〜６５からなり、ＨＣＤＲ３は、約１１または１２アミノ酸長であり、カバット残基１００Ｄを任意選択で含むカバット残基９５〜１０２からなり、ＬＣＤＲ１は、約１１アミノ酸長であり、カバット残基２４〜３４からなり、ＬＣＤＲ２は、約７アミノ酸長であり、カバット残基５０〜５６からなり、かつＬＣＤＲ３は、約８または９アミノ酸長であり、カバット残基９５を任意選択で含むカバット残基８９〜９７からなる。
【００２１】
一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、ＬＣＤＲ１（配列番号４）、ＬＣＤＲ２（配列番号５）、ＬＣＤＲ３（配列番号６）、およびそれらの組合せから選択される抗体１の１つ以上の軽鎖ＣＤＲ配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む抗体またはその結合フラグメントである。一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、ＨＣＤＲ１（配列番号１）、ＨＣＤＲ２（配列番号２）、ＨＣＤＲ３（配列番号３）、およびそれらの組合せから選択される抗体１の１つ以上の重鎖ＣＤＲ配列を含む重鎖アミノ酸配列を含む抗体である。一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体１のＬＣＤＲ１（配列番号４）、ＬＣＤＲ２（配列番号５）、およびＬＣＤＲ３（配列番号６）を含む軽鎖アミノ酸配列と、抗体１のＨＣＤＲ１（配列番号１）、ＨＣＤＲ２（配列番号２）、およびＨＣＤＲ３（配列番号３）を含む重鎖アミノ酸配列と、を含む抗体またはその結合フラグメントである。
【００２２】
一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、ＬＣＤＲ１（配列番号１２）、ＬＣＤＲ２（配列番号１３）、ＬＣＤＲ３（配列番号１４）、およびそれらの組合せから選択される抗体２の１つ以上の軽鎖ＣＤＲ配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む抗体またはその結合フラグメントである。一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、ＨＣＤＲ１（配列番号９）、ＨＣＤＲ２（配列番号１０）、ＨＣＤＲ３（配列番号１１）、およびそれらの組合せから選択される抗体２の１つ以上の重鎖ＣＤＲ配列を有する重鎖アミノ酸配列を含む抗体である。一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体２のＬＣＤＲ１（配列番号１２）、ＬＣＤＲ２（配列番号１３）、およびＬＣＤＲ３（配列番号１４）を含む軽鎖アミノ酸配列と、抗体２のＨＣＤＲ１（配列番号９）、ＨＣＤＲ２（配列番号１０）、およびＨＣＤＲ３（配列番号１１）を含む重鎖アミノ酸配列と、を含む抗体またはその結合フラグメントである。
【００２３】
他の実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーカラムで宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換え産生ポリペプチドを分離するための洗浄緩衝液を提供する。一実施形態では、洗浄緩衝液は、少なくとも６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸または脂肪酸塩を含む。一実施形態では、脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長は、６〜１２炭素原子である。一実施形態では、脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長は、８〜１２炭素原子である。一実施形態では、脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長は、８〜１０炭素原子である。一実施形態では、脂肪酸または脂肪酸塩は、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、およびそれらの組合せから選択される。一実施形態では、洗浄緩衝液は、カプリル酸またはカプリル酸塩を含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約２５ｍＭ〜約２００ｍＭの脂肪酸を含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの脂肪酸を含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約１００ｍＭの脂肪酸を含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約１．０Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約２Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約７〜約９のｐＨを有する。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約８〜約９のｐＨを有する。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約８．５〜約９のｐＨを有する。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約９のｐＨを有する。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．０Ｍ〜約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約９．０のｐＨで１００ｍＭトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約９．０のｐＨで約１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、サンプル精製プロセスのフロー図である。
【図２】図２は、溶出液純度に及ぼす洗浄ｐＨ、塩化ナトリウム洗浄、およびカプリル酸ナトリウムの影響を示している。
【図３】図３は、溶出液純度に及ぼすカプリル酸ナトリウムと塩化ナトリウムとの相互作用の影響を示している。
【図４】図４は、回収率に及ぼす塩化ナトリウムおよびカプリル酸ナトリウムを用いた洗浄の影響を示している。
【図５】図５は、回収率に及ぼす塩化ナトリウムとカプリル酸ナトリウムとの相互作用の影響を示している。
【図６】図６は、ＨＣＰレベルに及ぼす洗浄ｐＨと洗浄塩化ナトリウムおよびカプリル酸ナトリウムとの相互作用を示している（濾過前）。
【図７】図７は、ＨＣＰレベルに及ぼす洗浄ｐＨおよび塩化ナトリウムの二次相互作用を示している（濾過前）。
【図８】図８は、ＨＣＰレベルに及ぼす洗浄塩化ナトリウムとカプリル酸ナトリウムとの相互作用を示している（濾過後）。
【図９】図９は、純度、回収率、および濾過前ＨＣＰレベルに及ぼす洗浄ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの組み合わせた影響を示している。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａ〜Ｃは、濾過前ＨＣＰレベルに及ぼす洗浄ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの組合せの影響を示すグラフである。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｃは、濾過前ＨＣＰレベルに及ぼす洗浄ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの組合せの影響を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＨＣＰレベルに及ぼす洗浄ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの影響を示している。
【図１２】図１２は、溶出液純度に及ぼす洗浄ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの影響を示している。
【図１３】図１３は、純度に及ぼす洗浄ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの組み合わせた影響を示している。
【図１４】図１４は、回収率に及ぼす洗浄ｐＨの影響を示している。
【図１５】図１５は、溶出液中ＨＣＰレベルに及ぼすカプリル酸ナトリウムの影響を示している。
【図１６】図１６は、溶出液中ＨＣＰレベルに及ぼす洗浄ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの影響を示している。
【図１７】図１７は、塩化ナトリウムとカプリル酸ナトリウムとの相互作用および溶出液中ＨＣＰレベルに及ぼす相互作用の影響を示している。
【図１８】図１８は、プロテアーゼ活性に及ぼす洗浄ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの影響を示している。
【図１９】図１９は、洗浄ｐＨと塩化ナトリウムとカプリル酸ナトリウムとの相互作用およびプロテアーゼ活性に及ぼす相互作用の影響を示している。
【図２０】図２０ＡおよびＢは、カプリル酸ナトリウムの（Ａ）非併用時および（Ｂ）併用時のプロテアーゼ活性に及ぼす洗浄ｐＨおよび塩化ナトリウムの影響を示している。
【図２１】図２１は、プロテアーゼ活性に及ぼすｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの組み合わせた影響を示している。
【図２２】図２２は、プロテアーゼ活性に及ぼすｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの影響を示している。
【図２３】図２３は、実施例３の８つの脂肪酸洗浄緩衝液ランでの抗ＩＬ−１８溶出液中のＨＣＰレベルを示すグラフである。
【図２４】図２４は、抗ＩＬ６抗体を含有するペレット化粒子中の検出不能なレベルのＨＣＰを示す質量スペクトルである。
【図２５】図２５は、さまざまな宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルを含有する抗ＩＬ６抗体のいくつかのロットの４０℃貯蔵後の純度損失率、凝集率、およびフラグメント化率（ＳＥＣにより測定された）を示すグラフである。
【図２６】図２６は、４０℃でのフラグメント化率（ＲＰ−ＨＰＬＣによる）に及ぼすＨＣＰの影響を示すグラフである。
【図２７】図２７は、プロテアーゼ活性に及ぼすカプリル酸塩洗浄の影響を示すグラフである。
【図２８】図２８は、粒子形成ロットのアスパルチルプロテアーゼ活性およびセリンプロテアーゼ活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
緒言
プロテインＡ精製時に遭遇した一般的な問題は、不純物、たとえば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、および他の細胞培養由来の不純物が、カラム樹脂および対象のタンパク質に非特異的に結合することである。たとえば、多量の宿主細胞タンパク質、たとえば、最大で約５００ｎｇ／ｍｇ、６００ｎｇ／ｍｇ、７００ｎｇ／ｍｇ、８００ｎｇ／ｍｇ、９００ｎｇ／ｍｇ、１０００ｎｇ／ｍｇ、１５００ｎｇ／ｍｇ、２０００ｎｇ／ｍｇ、またはそれを超えるＨＣＰを有する、プロテインＡカラムからの溶出液が観測されてきた。ＨＣＰの存在が問題でありうるのは、組換え抗体産物中の汚染物質の許容レベルに関する保健規則があるからだけでなく、たとえば、プロテアーゼ活性、および目に見える微粒子、フラグメント、または凝集体の経時的形成を含めて、ＨＣＰの存在が産物の安定性および／または有効性に悪影響を及ぼしうるからである。
【００２６】
少なくとも１つのプロテインＡ洗浄緩衝液中に脂肪酸を組み込むことにより、プロテインＡ溶出液中の宿主細胞タンパク質のレベルを実質的に減少させうることを、出願人は見いだした。一例では、少なくとも１つのプロテインＡ洗浄緩衝液中に脂肪酸を組み込むことにより、溶出液中のプロテアーゼ活性を実質的に減少させうる。プロテアーゼの例としては、セリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼたとえばカテプシンＤ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、およびそれらの組合せが挙げられる。そのほかに、プロテインＡ洗浄緩衝液中に脂肪酸を組み込むことにより、組換え産生ポリペプチドを含有する製剤のプロテアーゼ活性を低減させうる。さらに、プロテインＡ洗浄緩衝液中に脂肪酸を組み込むことにより、たとえば、粒子形成および／またはフラグメント化を低減させて、組換え産生ポリペプチドの安定性を向上させうる。
【００２７】
本明細書に記載されているのは、組換え産生ポリペプチドの精製プロセスである。より特定的な実施形態では、組換え産生抗体の精製プロセスを記載する。
【００２８】
用語
とくに定義されていないかぎり、本明細書で用いられる科学技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。さらに、とくに文脈上必要とされないかぎり、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般的には、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリダイゼーションとの関連で用いられる命名法ならびにそれらの技術は、当技術分野で通常用いられる周知のものである。アミノ酸は、本明細書では、その一般に知られる三文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨される一文字記号のいずれかにより称されうる。ヌクレオチドも同様に、その一般に受け入れられている一文字コードにより称されうる。
【００２９】
本開示に従って用いられる場合、以下の用語は、とくに指定がないかぎり、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、たとえば、本発明の説明に利用される組成物中の成分の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流量、圧力、およびそれらの範囲を修飾するために使用される。「約」という用語は、たとえば、化合物、組成物、濃縮物、または製剤の製造に使用される典型的な測定および取扱いの手順により、これらの手順での偶発的エラーにより、方法を実施するために使用される出発材料または成分の製造、供給源、または純度、および他の類似の要件の差により、生じる可能性のある数値量の変動を意味する。「約」という用語はまた、特定の初期濃度または初期混合を有する製剤のエージングに起因して異なる量、および特定の初期濃度または初期混合を有する製剤の混合または処理に起因して異なる量も包含する。「約」という用語により修飾された場合、本明細書に添付された特許請求の範囲は、そのような均等物を含む。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、「抗体」という用語は、抗原の抗原決定基の特徴部に相補的な内表面の形状および電荷分布の三次元結合空間を有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される少なくとも１つの結合ドメインを含む１つのポリペプチドまたは一群のポリペプチドを意味する。抗体は、典型的には、２対のポリペプチド鎖の四量体形を有し、各対は、１本の「軽」鎖と１本の「重」鎖とを有する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合により重鎖に結合されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）および続いていくつかの定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）およびその他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインにアライメントされ、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインにアライメントされる。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいてλ鎖またはκ鎖のいずれかとして分類される。κ軽鎖の可変ドメインはまた、本明細書ではＶＫとも記されうる。
【００３２】
本明細書で用いられる「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合フラグメントから形成される多重特異的抗体（たとえば、二重特異的抗体）、ＣＤＲ移植ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、所望の生物学的活性を呈する抗体フラグメント（たとえば、抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、イントラボディー、ならびに以上のいずれかのエピトープ結合フラグメントまたは誘導体を包含する。特定的には、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性フラグメント、すなわち、少なくとも１つの抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意のアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、サブアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはアロタイプ（たとえば、Ｇｍ、たとえば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ、もしくはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、もしくはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、およびＫｍ（１、２、もしくは３））でありうる。抗体は、限定されるものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなどを含めて、任意の哺乳動物種、またはトリ（たとえば、ニワトリ）などの他の動物に由来しうる。抗体は、異種ポリペプチド配列、たとえば、精製を促進するタグに融合されうる。
【００３３】
分子とカラム材料との相互作用を考察するときの「結合」または「結合する」という用語は、分子がカラム材料の内部または表面上に可逆的に固定化されるような条件下で分子をカラム材料に暴露することを意味する。
【００３４】
「細胞培養上清」という用語は、対象の組換えポリペプチドを産生する宿主細胞を培養することにより得られる溶液を意味する。組換えポリペプチドに加えて、細胞培養上清は、細胞培養培地の成分、宿主細胞により分泌された代謝副産物、さらには培養細胞の他の成分をも含みうる。本明細書で用いられる場合、「清澄化細胞培養上清」という用語は、宿主細胞が除去または採取されて、細胞培養上清に細胞デブリおよび／または無傷細胞が一般的には含まれない組成物を意味する。
【００３５】
本明細書で用いられる「賦形剤」という用語は、タンパク質の安定性向上、タンパク質の溶解性向上、および／または粘度の減少などの有益な物理的性質を製剤に付与する、希釈剤、媒体、保存剤、結合剤、または薬剤安定化剤として通常使用される不活性物質を意味する。賦形剤の例としては、タンパク質（たとえば、限定されるものではないが、血清アルブミン）、アミノ酸（たとえば、限定されるものではないが、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、グリシン）、界面活性剤（たとえば、限定されるものではないが、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ポリソルベート、および非イオン性界面活性剤）、糖（たとえば、限定されるものではないが、グルコース、スクロース、マルトース、およびトレハロース）、ポリオール（たとえば、限定されるものではないが、マンニトールおよびソルビトール）、脂肪酸およびリン脂質（たとえば、限定されるものではないが、アルキルスルホネートおよびカプリレート）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
「宿主細胞」という語句は、組換えポリペプチドを発現する細胞を意味する。特定的には、「宿主細胞」という用語は、ベクターなどの核酸の取込みが可能であるまたは取込みが行われた、かつ核酸の複製および１種以上のコード産物の産生を支援する、細胞を意味する。「宿主細胞」という用語は、原核細胞、たとえば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、酵母細胞、たとえば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、たとえば、バキュロウイルス、ならびに真核細胞を含めて、さまざまな細胞型を意味しうる。真核宿主細胞の例としては、哺乳動物細胞、たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ベロ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒーラ細胞、ＣＶ１サル腎臓細胞、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、３Ｔ３細胞、骨髄腫細胞系、ＣＯＳ細胞（たとえば、ＣＯＳ１およびＣＯＳ７）、ＰＣ１２細胞、ＷＩ３８細胞が挙げられる。宿主細胞という用語はまた、たとえば、異なる細胞型または細胞系の混合培養物を含めて、細胞の組合せまたは混合物をも包含する。
【００３７】
「不純物」という用語は、サンプル中に存在する組換え産生ポリペプチド以外の任意の異物、特定的には、生体高分子、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を意味する。汚染物質は、対象の組換えポリペプチド以外の宿主細胞タンパク質を含みうる。
【００３８】
組換えポリペプチドと１種以上の汚染物質とを含む組成物または溶液から組換えポリペプチドを「精製」するという用語は、組成物または溶液から少なくとも１種の汚染物質を（完全にまたは部分的に）除去することにより、組成物中または溶液中の所望のタンパク質の純度を向上させることを意味する。
【００３９】
「ｍＡｂ」という用語は、モノクローナル抗体を意味する。
【００４０】
本明細書で用いられる「薬学的に許容可能」という語句は、連邦政府もしくは州政府の監督官庁により認可されているか、または米国薬局方、欧州薬局方、もしくは動物、より特定的にはヒトに使用するための他の一般に公認された薬局方に列挙されていることを意味する。
【００４１】
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、ペプチド結合により互いに連結された２つ以上のアミノ酸残基を有する分子を意味すべく同義的に用いられうる。「ポリペプチド」という用語は、抗体および他の非抗体タンパク質を意味しうる。非抗体タンパク質としては、酵素、レセプター、細胞表面タンパク質のリガンド、分泌タンパク質、融合タンパク質、それらのフラグメントなどのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ポリペプチドは、他のポリペプチドに融合されたものまたは融合されていないものでありうる。ポリペプチドはまた、修飾、たとえば、限定されるものではないが、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、およびＡＤＰリボシル化も含みうる。ポリペプチドは、タンパク質ベースの治療剤を含めて、科学的または商業的な関心の対象となりうる。
【００４２】
「組換え」という用語は、ヒトが介入することにより人工的または合成的に（すなわち、非天然に）改変された生物学的物質、たとえば、核酸またはタンパク質を意味する。
【００４３】
宿主細胞タンパク質の除去との関連で用いられるときの「除去」という用語は、精製産物中の宿主細胞タンパク質の量の低減を意味する。除去の結果、精製産物に宿主細胞タンパク質が不在になることもならないこともある。一般的には、除去とは、精製産物中の宿主細胞タンパク質が、元の組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルと比較して、少なくとも１／２、１／３、１／４、１／５、１／１０、１／１５、１／２０、１／２５、最大で１／３０、１／３５、１／４０、１／４５、または１／５０に低減されることを意味する。
【００４４】
組換え産生ポリペプチドの製剤、たとえば、組換え産生抗体または抗体フラグメントを含む医薬製剤との関連で本明細書で用いられる「安定性」および「安定」という用語は、製造、調製、輸送、および貯蔵の条件下での粒子形成、凝集、分解、またはフラグメント化に対する製剤中のポリペプチドの耐性を意味する。「安定」製剤は、製造、調製、輸送、および貯蔵の条件下で生物学的活性を維持する。安定性は、参照製剤と比較して、ＨＰＳＥＣ、静的光散乱（ＳＬＳ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、円二色性（ＣＤ）、尿素アンフォールディング技術、内因性トリプトファン蛍光、示差走査熱量測定、および／またはＡＮＳ結合技術により測定される、粒子形成、凝集、分解、またはフラグメント化の程度により、評価可能である。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、「実質的に純粋」とは、存在する主要種である（たとえば、モル基準で組成物中のいずれの他の個別種よりも多い）生物学的物質を意味する。一実施形態では、実質的に精製された画分は、生物学的物質が、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準）を占める、組成物である。一般的には、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％超、または約８５％超、約９０％超、約９５％超、または約９９％超を占めるであろう。一実施形態では、生物学的物質は、本質的に均一になるまで精製され（従来の検出方法により組成物中に汚染物質種を検出できない）、組成物は、本質的に単一の高分子種を含む。
【００４６】
組換えポリペプチド産生
一実施形態では、組換えポリペプチドは、１種以上の対象のポリペプチドを発現可能なベクターを用いて安定的または一過的のいずれかでトランスフェクトされた宿主細胞を用いて産生される。本明細書で用いられる場合、「ベクター」という用語は、対象の核酸を細胞内に配達するために使用可能な物質組成物を意味する。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物に関連付けられたポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含めて、多くのベクターが知られているが、これらに限定されるものではない。「ベクター」という用語は、自律複製するプラスミド、または自律複製しないウイルスもしくはベクターもしくはプラスミドを含みうる。「トランスフェクション」という用語は、遺伝子改変細胞を産生するように外因性遺伝物質を細胞内に導入することを意味する。ベクターは、当技術分野で公知の方法を用いて宿主細胞内に導入可能である。たとえば、ベクターは、物理的、化学的、または生物学的な手段により宿主細胞内に移入可能である。ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（正荷電リポソーム媒介トランスフェクションを含む）、粒子照射、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ベクターを宿主細胞内に導入するための生物学的方法としては、たとえば、ウイルスベクターを含めて、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられ、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、たとえば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含めて、脂質ベースの系が挙げられる。宿主細胞は、組換えポリペプチド、たとえば、商業的または科学的な関心の対象となるポリペプチドを発現するように、遺伝子工学操作が可能である。
【００４７】
「細胞培養」という用語は、多細胞の生物や組織以外の細胞の成長および増殖を意味する。ｐＨ、温度、湿度、雰囲気、撹拌などの細胞培養条件は、細胞培養物の成長および／または生産性の特性を改善すべく変更可能である。宿主細胞は、懸濁状態または固体基材に結合された状態で培養されうる。宿主細胞は、小規模培養で、たとえば、実験室環境で、２５ｍｌ程度の少量から、約５０ｍｌまで、約１００ｍｌまで、約１５０ｍｌまで、または約２００ｍｌまでの量で、培養可能である。他の選択肢として、培養は、大規模、たとえば、約３００ｍｌ、５００ｍｌ、または１０００ｍｌから、約５０００ｍｌまで、約１０，０００ｍｌまで、および約１５，０００ｍｌまでの量でありうる。商業規模のバイオリアクターもまた、たとえば、約１，０００Ｌまで、約５，０００Ｌまで、または約１０，０００Ｌまでの培地量で使用可能である。哺乳動物細胞による組換えポリペプチドの大規模産生は、連続、バッチ、およびフェドバッチの培養系を含みうる。宿主細胞は、たとえば、マイクロ担体を用いてまたは用いずに、流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル、振盪フラスコ、または撹拌タンクバイオリアクターで培養されうるとともに、バッチ、フェドバッチ、連続、半連続、または灌流のモードで操作されうる。大規模細胞培養は、典型的には、何日間さらには何週間にもわたり維持され、その間、細胞は、所望のタンパク質産物を産生する。
【００４８】
組換えポリペプチドの産生に好適な宿主細胞としては、原核細胞および真核細胞の両方が挙げられる。真核細胞の例としては、哺乳動物細胞が挙げられる。組換えポリペプチドの産生に好適な哺乳動物細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ベロ細胞、ヒーラ細胞、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、ＣＶ１サル腎臓細胞、３Ｔ３細胞、骨髄腫細胞系、たとえば、ＮＳ０およびＮＳ１、ＰＣ１２細胞、ＷＩ３８細胞、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７を含む）、およびＣ１２７細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一般的には、哺乳動物細胞培養は、約６．５〜約７．５のｐＨ、約３６℃〜約３８℃、典型的には、約３７℃の温度、かつ約８０％〜約９５％の相対湿度に維持される。哺乳動物細胞培養培地は、典型的には、約１％〜約１０％または約５％〜約６％の二酸化炭素（ＣＯ2）雰囲気を必要とする緩衝系を含有する。
【００４９】
宿主細胞は、さまざまな細胞培養培地中に維持可能である。「細胞培養培地」という用語は、宿主細胞を成長させる栄養溶液を意味する。細胞培養培地配合物は、当技術分野で周知である。典型的には、細胞培養培地は、緩衝剤、塩、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、および微量必須元素を含む。細胞培養培地は、血清、ペプトン、および／またはタンパク質を含有することも含有しないこともある。細胞培養培地は、細胞培養要件および／または所望の細胞培養パラメーターに依存して、追加濃度または増加濃度の成分、たとえば、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、成長因子、緩衝剤、抗生物質、脂質、微量元素などが追加されうる。無血清培養培地および規定培養培地を含めて、種々の培養培地が市販されており、限定されるものではないが、最少必須培地（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、ハムＦ１０培地（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基本培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）、ＨｙＣｌｏｎｅ細胞培養培地（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、および特定の細胞型に合わせて配合された化学的規定（ＣＤ）培地、たとえば、ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。所望により、市販の培地にサプリメント成分を添加することが可能である。
【００５０】
本明細書で用いられる「組換えポリペプチド」という用語は、培養宿主細胞により産生される遺伝子工学操作されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。本明細書で用いられる場合、「異種」という用語は、宿主細胞により産生される通常は発現されない組換えポリペプチドを意味する。しかしながら、異種ポリペプチドは、生物に固有のポリペプチドであるが、なんらかの方法で意図的に改変されたものを含む。たとえば、異種ポリペプチドは、このポリペプチドを発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞により発現されるポリペプチドを含みうる。細胞培養により発現される組換えポリペプチドは、細胞内で産生されうるか、または回収および／もしくは捕集が可能な培養培地中に分泌されうる。
【００５１】
一実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体またはその結合フラグメントである。抗体は、単独または他のアミノ酸配列との組合せのいずれかで、オリゴクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、ＣＤＲ移植抗体、多重特異的抗体、二重特異的抗体、触媒抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体、および可溶形または結合形の標識可能な抗体、さらにはエピトープ結合フラグメントを含めてそれらのフラグメント、変異体、または誘導体でありうる。抗体は、任意の種に由来しうる。抗体という用語はまた、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体可変領域（ダイアボディー）、およびジスルフィド結合可変領域（ｄｓＦｖ）をはじめとする結合フラグメントをも含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスでありうる。一実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、精製を容易にするために、親和性タグなどの異種ポリペプチド配列に融合されうる。親和性タグの例としては、ポリヒスチジンタグ、ＧＦＰタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ、Ｖ５タグ、およびＭｙｃタグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
一実施形態では、抗体は、抗ＩＬ−１８抗体または抗ＩＬ６抗体またはそれらのフラグメントである。他の実施形態では、抗体は、宿主細胞タンパク質と共精製される任意の抗体でありうる。
【００５３】
他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体１の軽鎖酸可変配列（配列番号８）を有する抗体を含む。他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体１の重鎖可変配列（配列番号７）を有する抗体を含む。他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体１の軽鎖可変配列（配列番号８）と抗体１の重鎖可変配列（配列番号７）とを有する抗体を含む。
【００５４】
他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体２の軽鎖酸可変配列（配列番号１８）を有する抗体を含む。他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体２の重鎖可変配列（配列番号１６）を有する抗体を含む。他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体２の軽鎖可変配列（配列番号１８）と抗体２の重鎖可変配列（配列番号：１６）とを有する抗体を含む。
【００５５】
一実施形態では、抗体は、抗体１または抗体２の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖アミノ酸配列を含む。ＣＤＲ領域またはＣＤＲという用語は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ），公共サービス（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ），ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎまたは後版）またはＣｈｏｔｈｉおよびＬｅｓｋ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））により定義された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。抗体は、典型的には、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含有する。ＣＤＲという用語は、場合にもよるが、ここでは、抗原または認識されるエピトープに対する抗体の親和性による結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含有するこれらの領域の１つまたはこれらの領域のいくつかさらには全部を表すために使用される。６つの短いＣＤＲ配列のうち、重鎖の第３のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、より大きいサイズ可変性（それを生成する遺伝子の構成の機序に本質的に起因するより大きい多様性）を有する。それは、２アミノ酸程度に短いこともあるが、既知の最長サイズは、２６である。ＣＤＲの長さはまた、特定の基礎的フレームワークにより収容可能な長さによっても異なりうる。機能的には、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定に部分的な役割を果たす。当業者であれば、抗体のＣＤＲ領域を決定することが可能である。一般的には、ＨＣＤＲ１は、約５アミノ酸長であり、カバット残基３１〜３５からなり、ＨＣＤＲ２は、約１７アミノ酸長であり、カバット残基５０〜６５からなり、ＨＣＤＲ３は、約１１または１２アミノ酸長であり、カバット残基１００Ｄを任意選択で含むカバット残基９５〜１０２からなり、ＬＣＤＲ１は、約１１アミノ酸長であり、カバット残基２４〜３４からなり、ＬＣＤＲ２は、約７アミノ酸長であり、カバット残基５０〜５６からなり、かつＬＣＤＲ３は、約８または９アミノ酸長であり、カバット残基９５を任意選択で含むカバット残基８９〜９７からなる。
【００５６】
一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、ＬＣＤＲ１（配列番号４）、ＬＣＤＲ２（配列番号５）、ＬＣＤＲ３（配列番号６）、およびそれらの組合せから選択される抗体１の１つ以上の軽鎖ＣＤＲ配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む抗体またはその結合フラグメントである。一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、ＨＣＤＲ１（配列番号１）、ＨＣＤＲ２（配列番号２）、ＨＣＤＲ３（配列番号３）、およびそれらの組合せから選択される抗体１の１つ以上の重鎖ＣＤＲ配列を含む重鎖アミノ酸配列を含む抗体である。一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体１のＬＣＤＲ１（配列番号４）、ＬＣＤＲ２（配列番号５）、およびＬＣＤＲ３（配列番号６）を含む軽鎖アミノ酸配列と、抗体１のＨＣＤＲ１（配列番号１）、ＨＣＤＲ２（配列番号２）、およびＨＣＤＲ３（配列番号３）を含む重鎖アミノ酸配列と、を含む抗体またはその結合フラグメントである。
【００５７】
一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、ＬＣＤＲ１（配列番号１２）、ＬＣＤＲ２（配列番号１３）、ＬＣＤＲ３（配列番号１４）、およびそれらの組合せから選択される抗体２の１つ以上の軽鎖ＣＤＲ配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む抗体またはその結合フラグメントである。一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、ＨＣＤＲ１（配列番号９）、ＨＣＤＲ２（配列番号１０）、ＨＣＤＲ３（配列番号１１）、およびそれらの組合せから選択される抗体２の１つ以上の重鎖ＣＤＲ配列を有する重鎖アミノ酸配列を含む抗体である。一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、抗体２のＬＣＤＲ１（配列番号１２）、ＬＣＤＲ２（配列番号１３）、およびＬＣＤＲ３（配列番号１４）を含む軽鎖アミノ酸配列と、抗体２のＨＣＤＲ１（配列番号９）、ＨＣＤＲ２（配列番号１０）、およびＨＣＤＲ３（配列番号１１）を含む重鎖アミノ酸配列と、を含む抗体またはその結合フラグメントである。
【００５８】
精製
細胞培養物から組換え産生ポリペプチド（本明細書では「標的ポリペプチド」または「標的」とも呼ばれる）を回収する際の第１の工程は、他の残留不純物と共に組換え産生ポリペプチドを含有する清澄化細胞培養上清を得るために、培養培地から無傷宿主細胞および宿主細胞デブリを除去することである（「採取」と呼ばれる）。採取は、一般的には、遠心分離、凝集／沈殿、深層濾過、および無菌濾過により達成されるが、他の方法を使用することも可能である。
【００５９】
組換え産生抗体は、細胞内、ペリプラズム空間内に産生可能であるか、または培地中に直接分泌可能である。抗体が細胞内に産生される場合、第１の工程として、たとえば、遠心分離または限外濾過により、宿主細胞または溶解フラグメントのいずれかである微粒子状デブリが除去される。抗体が培地中に分泌される場合、たとえば、ＡｍｉｃｏｎやＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットなどの市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて、発現系からの上清が濃縮されうる。タンパク質分解を阻害するために、ベスタチン、アプロチニン、ペプスタチン、ロイペプチン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤または１種以上のプロテアーゼ阻害剤を含むプロテアーゼ阻害剤カクテルが含まれうる。他の実施形態では、外来汚染物質の成長を防止するために、１種以上の抗生物質が含まれうる。抗生物質の例としては、アクチノマイシンＤ、アンピシリン、カルベニシリン、セフォタキシム、ホスミドマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、ポリミキシンＢ、およびストレプトマイシンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
清澄化細胞培養上清を取得した後、限定されるものではないが、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、外来性および内在性ウイルス、内毒素、凝集体、ならびに他の種を含めて、細胞培養上清内に含まれうる他の不純物を除去することにより、標的ポリペプチドをさらに精製することが可能である。ほとんどの精製方法は、静止材料（固相）との化学的または物理的な相互作用の差に基づいて溶液（移動相）中の標的分子を分離するなんらかの形態のクロマトグラフィーを含む。一般的なクロマトグラフィー法およびその使用は、当業者に公知である。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照されたい。組換えポリペプチド精製のための多種多様な方法が公知であり、限定されるものではないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびそれらの組合せが挙げられる。タンパク質精製のための他の技術、たとえば、イオン交換カラム分画、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂セファロースクロマトグラフィー（たとえば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫安沈殿もまた、精製プロセスに含まれうる。多くの場合、親和性、電荷、疎水性度、および／またはサイズなどの異なる原理に基づいて異なるプロセスによりポリペプチドを分離するように、異なる精製プロセスの組合せが使用される。特定の組換えポリペプチドに合わせて精製スキームを調整できるように、各技術に対して多種多様なクロマトグラフィー樹脂が入手可能である。カラムクロマトグラフィーは、ポンプを用いて設定流量で充填カラム上に溶媒を押し出すＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＫＴＡ  ＡＶＡＮＴシステムなどの自動システムより実施可能であるか、または重力フローにより実施可能である。自動フローシステムおよび重力フローシステムは両方とも、自動画分捕集システムに結合可能である。
【００６１】
一実施形態では、精製スキームとして、精製プロセスの組合せが利用される。精製スキーム１００の一例が、図１にフロー図として示されている。サンプル精製スキーム１００は、組換えポリペプチドが、たとえば、宿主細胞内発現により、産生され、そして採取される第１の工程１０１を含む。組換えポリペプチドの産生および採取の方法は、以上に考察されている。次いで、たとえば、アフィニティークロマトグラフィーを用いて、組換えポリペプチドをキャプチャーする１０２。一実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体であり、かつプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーがキャプチャー１０２に使用される。精製プロセスはまた、１つ以上のポリッシングクロマトグラフィー工程１０４、１０５を含みうる。ウイルスクリアランスを改善するために、精製スキーム１００にウイルス不活性化工程１０３および／またはウイルス濾過工程１０６もまた、含まれうる。最後に、精製産物を濃縮し、最終製剤緩衝液１０７中に透析濾過することが可能である。図１に提供されたスキームは、単なる例にすぎず、たとえば、工程の順序、工程の数、および各工程に使用される精製方法の変更は、十分に当業者の能力の範囲内にあることは、注目に値する。
【００６２】
一実施形態では、キャプチャー１０２は、アフィニティークロマトグラフィーにより達成される。アフィニティークロマトグラフィーとは、ポリペプチドと固相に共有結合された結合パートナーとの特異的可逆的相互作用に基づいて組換え産生ポリペプチドなどの生体分子を分離するクロマトグラフィー法を意味する。親和性相互作用の例としては、抗原と抗体、酵素と基質、またはレセプターとリガンドの可逆的相互作用が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡやプロテインＧなどの微生物タンパク質の使用を含む。プロテインＡは、主にＦｃ領域を介して哺乳動物ＩｇＧに結合する細菌細胞壁タンパク質である。プロテインＡ樹脂は、さまざまな抗体アイソタイプ、とくに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４のアフィニティー精製および単離に有用である。本明細書に記載の精製プロセスに使用するのに好適である入手可能な多くのプロテインＡ樹脂が存在する。樹脂は、一般的には、その骨格組成に基づいて分類され、たとえば、ガラス系またはシリカ系の樹脂、アガロース系樹脂、および有機ポリマー系樹脂が挙げられる。
【００６３】
一実施形態では、組換え産生抗体をキャプチャーするために、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーが使用される。アフィニティークロマトグラフィー担体を通る流量は、分離を最適化するための重要なパラメーターである。分離時間の低減が望ましいこともあるが、流れが速すぎる流量では、内部ビーズ体積に達するのに必要な拡散時間よりも速く移動相が固相を通って移動するおそれがある。一般的には、少なくとも約５０ｃｍ／時、１００ｃｍ／時、１５０ｃｍ／時、２００ｃｍ／時、または２５０ｃｍ／時から、約３００ｃｍ／時、３５０ｃｍ／時、４００ｃｍ／時、４５０ｃｍ／時、または５００ｃｍ／時までの流量が使用される。カラム寸法もまた、変更可能である。実験台規模のカラムは、一般的には、１ｃｍ未満または５ｃｍ未満のカラム直径を有し、一方、大規模または商業生産規模では、１メートルまで、さらには２メートルまでの直径を有するカラムを使用可能である。大規模生産または商業生産では、カラム床の高さは、一般的には、少なくとも約１０ｃｍ、１５ｃｍ、または２０ｃｍ、かつ最大で約２５ｃｍまたは３０ｃｍである。
【００６４】
プロテインＡ精製との関連で用いられる緩衝溶液の組成および緩衝溶液の体積は、変更可能である。「緩衝液」または「緩衝溶液」という用語は、ｐＨ変化に対して耐性でありうる溶液を意味する。多くの場合、緩衝液は、弱共役酸塩基対、たとえば、弱酸とその共役塩基、または弱塩基とその共役酸）で作製される。いくつかの緩衝液では、緩衝剤は、結晶の酸または塩基として供給され、たとえば、トリスは、結晶の塩基として供給され、緩衝溶液を形成するために水中に溶解される。緩衝溶液のｐＨは、適切な酸または塩基を用いて調整可能である。たとえば、塩酸（ＨＣｌ）を用いてトリス緩衝溶液のｐＨを調整可能である。他の緩衝液は、２つの成分、たとえば、遊離酸または遊離塩基と対応する塩とを所望のｐＨが達成される比で混合することにより、調製される。たとえば、クエン酸ナトリウム緩衝溶液は、所望のｐＨの溶液が形成されるようにクエン酸とクエン酸三ナトリウムとを組み合わせることにより、所望のｐＨに調整可能である。他の緩衝液は、緩衝液成分とその共役酸または共役塩基とを混合することにより作製される。たとえば、リン酸緩衝液は、第一リン酸ナトリウム溶液と第二リン酸ナトリウム溶液とを所望のｐＨが達成される比で混合することにより作製される。他の実施形態では、重炭酸ナトリウム緩衝液系は、所望のｐＨを有する緩衝溶液が形成されるように炭酸ナトリウムの溶液と重炭酸ナトリウムの溶液とを組み合わせることにより調製可能である。
【００６５】
一実施形態では、カラムは、充填前に「平衡化緩衝液」で平衡化される。「平衡化緩衝液」という用語は、たとえば、カラムのｐＨを調整することにより、カラムマトリックスから望ましくない残留物を除去したり、標的タンパク質を充填するためのカラムマトリックスの固相を調製したりするために使用可能な緩衝液を意味する。抗体精製に使用する場合、平衡化緩衝液のｐＨは、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０である。一実施形態では、平衡化緩衝液は、緩衝剤、たとえば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」と呼ばれることが多い）（ｐＨ範囲５．８〜８．０）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ範囲６．８〜８．２）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ範囲６．５〜７．９）、または他のリン酸塩緩衝剤（ｐＨ５．８〜８．０）を、少なくとも約１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、または７５ｍＭ、かつ最大で約１００ｍＭ、１２５ｍＭ、または１５０ｍＭの濃度で含む。一実施形態では、緩衝溶液のｐＨは、塩酸（ＨＣｌ）や水酸化ナトリウム／水酸化カリウム（ＮａＯＨ／ＫＯＨ）などの適切な酸または塩基を用いて調整可能である。一実施形態では、平衡化緩衝液は、少なくとも約１０ｍＭ、１５ｍＭ、または２０ｍＭ、かつ最大で約２５ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、または１００ｍＭのリン酸ナトリウムを、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨで、含む。そのほかに、緩衝液は、限定されるものではないが、酸化的損傷から保護するために、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＤＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤、内因性プロテアーゼによる標的ポリペプチドの分解を阻害するために、限定されるものではないが、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をはじめとするプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼを不活性化するために、限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）をはじめとする金属キレート化剤、タンパク質構造を安定化するために、限定されるものではないが、グリセロール、界面活性剤、および糖をはじめとするオスモライト、または溶解性を向上させるために、限定されるものではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4などの塩をはじめとするイオン性安定化剤を含めて、タンパク質の純度、安定性、および機能を向上させるために、１種以上の添加剤を含みうる。一実施形態では、カラムは、組換え産生ポリペプチドをカラムに充填する前に、少なくとも約５かつ最大で約１０または２０カラム体積の平衡化緩衝液を用いて、平衡化される。
【００６６】
一実施形態では、清澄化細胞培養上清は、カラム上に充填される。一実施形態では、清澄化細胞培養上清は、平衡化緩衝液でカラムを平衡化した後、カラム上に充填される。さらなる実施形態では、清澄化細胞培養上清は、充填緩衝液と組み合わせてカラム上に充填される。「充填緩衝液」とは、標的をカラムに充填する前に標的ポリペプチドを含む組成物と組み合わされる緩衝液を意味する。一般的には、標的ポリペプチドは、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌ、かつ最大で約３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌの濃度で充填される。一実施形態では、清澄化細胞培養上清は、標的ポリペプチドの所望の濃度を達成するためにおよび／または溶液のｐＨを調整するために、充填緩衝液で約１：１、１：２、または１：３の比に希釈される。他の実施形態では、清澄化細胞培養上清は、カラム上に直接充填される（すなわち、上清は、充填緩衝液で希釈されない）。一実施形態では、カラムは、清澄化細胞培養上清を充填した後、平衡化緩衝液で再平衡化される。より特定的な実施形態では、カラムは、標的ポリペプチドがカラム上に充填された後、少なくとも約５かつ最大で約１０または２０カラム体積の平衡化緩衝液または充填緩衝液で再平衡化される。一般的には、標的ポリペプチドは、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨでプロテインＡカラム上に充填される。いくつかの実施形態では、充填緩衝液は、平衡化緩衝液と同一である。他の実施形態では、充填緩衝液および平衡化緩衝液は、同一ではない。他の実施形態では、充填緩衝液はまた、充填後にカラムを洗浄するための洗浄緩衝液としても使用される。
【００６７】
一実施形態では、充填緩衝液は、緩衝剤、たとえば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」と呼ばれることが多い）（ｐＨ範囲５．８〜８．０）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ範囲６．８〜８．２）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ範囲６．５〜７．９）、または他のリン酸塩緩衝剤、たとえば、リン酸ナトリウムまたはリン酸塩−クエン酸塩緩衝剤（ｐＨ５．８〜８．０）を、少なくとも約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、または５０ｍＭ、かつ最大で約６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭの濃度で、含む。一実施形態では、緩衝溶液のｐＨは、塩酸（ＨＣｌ）や水酸化ナトリウム／水酸化カリウム（ＮａＯＨ／ＫＯＨ）などの適切な酸または塩基を用いて調整可能である。抗体精製に使用する場合、充填緩衝液のｐＨは、一般的には、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０に調整される。より特定的な実施形態では、充填緩衝液は、少なくとも約１０ｍＭ、１５ｍＭ、または２０ｍＭ、かつ最大で約２５ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、または１００ｍＭのリン酸ナトリウムを含み、かつ少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨを有する。一実施形態では、カラムは、少なくとも約５かつ最大で約１０または２０カラム体積の平衡化緩衝液または充填緩衝液を用いて充填した後、再平衡化される。そのほかに、平衡化緩衝液は、限定されるものではないが、酸化的損傷から保護するために、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＤＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤、内因性プロテアーゼによる標的ポリペプチドの分解を阻害するために、限定されるものではないが、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をはじめとするプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼを不活性化するために、限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）をはじめとする金属キレート化剤、タンパク質構造を安定化するために、限定されるものではないが、グリセロール、界面活性剤、および糖をはじめとするオスモライト、または溶解性を向上させるために、限定されるものではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4などの塩をはじめとするイオン性安定化剤を含めて、タンパク質の純度、安定性、および機能を向上させるために、１種以上の添加剤を含みうる。
【００６８】
「洗浄緩衝液」という用語は、標的組成物をカラムに充填した後、かつ組換え産生標的ポリペプチドの溶出前、カラム材料を通り抜ける緩衝液を意味する。洗浄緩衝液は、標的の実質的溶出を伴うことなく、１種以上の汚染物質、たとえば、宿主細胞タンパク質をカラム材料から除去するように機能しうる。一般的には、洗浄緩衝液は、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨを有する。一実施形態では、プロセスは、１種の洗浄緩衝液を含み、カラムは、少なくとも約５または最大で約１０もしくは２０カラム体積の単一洗浄緩衝液を用いて洗浄される。他の実施形態では、プロセスは、２種以上の洗浄緩衝液を含みうる。たとえば、プロセスは、２つの異なる洗浄緩衝液を含みうる。たとえば、プロセスは、少なくとも約５または最大で約１０もしくは２０カラム体積の第１の洗浄緩衝液を用いてカラムを洗浄する第１の洗浄工程と、少なくとも約５または最大で約１０もしくは２０カラム体積の第２の洗浄緩衝液カラムを洗浄する第２の洗浄工程と、を含みうる。一実施形態では、少なくとも１種の洗浄緩衝液は、平衡化緩衝液と同一である。他の実施形態では、少なくとも１種の洗浄緩衝液は、平衡化緩衝液とは異なる。
【００６９】
さらなる実施形態では、プロテインＡ精製からの溶出液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の残留レベルが低減される精製プロセスを記載する。より特定的な実施形態では、残留ＨＣＰレベルは、プロテインＡカラムで使用される洗浄緩衝液中に脂肪酸を組み込むことにより低減される。一実施形態では、宿主細胞タンパク質から組換え産生ポリペプチドを分離する方法を記載する。他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドの安定性を向上させる方法を記載する。他の実施形態では、組換え産生ポリペプチドを含有する製剤のプロテアーゼ汚染を低減する方法を提供する。
【００７０】
一般的には、短鎖脂肪酸、たとえば、約６炭素原子未満の鎖長を有する脂肪酸は、溶出液中のＨＣＰのレベルを有意に改変しない。しかしながら、脂肪酸の鎖長を増加させると、ＨＣＰの低減が観測される。特定的には、中鎖長（すなわち、約６炭素原子〜約１２炭素原子）の脂肪酸を洗浄緩衝液中に組み込むと、溶出液中に観測されるＨＣＰの量は、有意に低減される。プロテインＡ洗浄緩衝液中に組み込むのに好適な脂肪酸または脂肪酸塩の例としては、限定されるものではないが、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、またはそれらの組合せおよび塩を含めて、少なくとも約６、７、８、または９炭素原子、かつ最大で約１０、１１、または１２炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、脂肪酸は、少なくとも約２５ｍＭまたは５０ｍＭ、かつ最大で約７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、または２００ｍＭの濃度で洗浄緩衝液中に含まれる。一実施形態では、洗浄緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」と呼ばれることが多い）（ｐＨ範囲５．８〜８．０）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ範囲６．８〜８．２）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ範囲６．５〜７．９）などの緩衝剤を用いて調製された脂肪酸溶液を含み、脂肪酸は、少なくとも約２５ｍＭまたは５０ｍＭ、かつ最大で約７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、または２００ｍＭの濃度を有し、かつ緩衝剤は、少なくとも約１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、または７５ｍＭ、かつ最大で約１００ｍＭ、１２５ｍＭ、または１５０ｍＭの濃度を有し、かつ溶液は、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨを有する。一実施形態では、緩衝溶液のｐＨは、塩酸（ＨＣｌ）や水酸化ナトリウム／水酸化カリウム（ＮａＯＨ／ＫＯＨ）などの適切な酸または塩基を用いて調整可能である。
【００７１】
理論により拘束されることを望むものではないが、脂肪酸は、抗体上の結合部位に対してＨＣＰとの競合に打ち勝ってＨＣＰを除去すると考えられる。たとえば、宿主細胞タンパク質のレベルは、脂肪酸を含まない対照緩衝液で洗浄されたカラムから得られる溶出液中の宿主細胞タンパク質のレベルの７５％、５０％、２５％、１０％、さらには５％程度の低さに低減することが可能である。他の実施形態では、宿主細胞タンパク質のレベルは、脂肪酸を含まない洗浄液を用いて得られる宿主細胞タンパク質のレベルと比較して、少なくとも１／２、１／３、１／４、１／５、１／１０、１／１５、１／２０、１／２５、かつ最大で１／３０、１／３５、１／４０、１／４５、または１／５０に低減することが可能である。
【００７２】
他の実施形態では、プロテインＡ洗浄液中に脂肪酸を組み込むことにより、プロテインＡ精製から得られる組換え産生ポリペプチドたとえば抗体の安定性を向上させることが可能である。一実施形態では、プロテインＡ洗浄液中に脂肪酸を組み込むことにより、プロテアーゼ活性が低減され、これにより、組換え産生ポリペプチドたとえば組換え産生抗体の安定性を向上させることが可能である。一実施形態では、プロテインＡ洗浄液中に脂肪酸を組み込むことにより、溶出液中またはプロテインＡ精製工程から得られる組換え産生ポリペプチドを含有する下流の製剤中のプロテアーゼ、たとえば、セリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼたとえばカテプシンＤ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびアミノペプチダーゼの活性が低減される。プロテアーゼ活性の低減は、限定されるものではないが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）製のＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）プロテアーゼアッセイキットＥ６６３８を含めて、任意の好適な感度のアッセイを用いて測定可能である。また、アスパルチルプロテアーゼのカテプシンＤやセリンプロテアーゼのトリプシンなどのプロテアーゼの対照調製物に対して、＞１０ｎｇ／ｍＬのレベルを確実に検出または定量できる任意のアッセイを使用しうる。
【００７３】
他の実施形態では、プロテインＡ洗浄液中に脂肪酸を組み込むことにより、溶出液中またはプロテインＡ精製工程から得られる組換え産生ポリペプチドを含有する下流の製剤中の、産物の安定性に関連付けられる粒子形成が低減される。他の実施形態では、プロテインＡ洗浄液中に脂肪酸を組み込むことにより、溶出液中またはプロテインＡ精製工程から得られる組換え産生ポリペプチドを含有する下流の製剤中の、産物の安定性に関連付けられる遅延発生粒子形成が低減される。粒子形成は、目視検査により決定可能である。たとえば、粒子、透明性／乳光、および色の目視検査は、それぞれ、欧州薬局方（ＰｈＥｕｒ）セクション２．９．２０、２．２．１、および２．２．２に適合する手順に基づいて行うことが可能である。サンプル中の粒子レベルは、一連の硫酸バリウム目視粒子標準と比較可能である。一例として、使用可能な標準は、「目に見える粒子がない」（０）、「目に見える粒子が実際上ない」４つの段階（１〜４）、および「目に見える粒子を含有する」３つの段階（５、６、および７）を含む。一実施形態では、「目に見える粒子を含有する」と称されるサンプルはいずれも、「不合格」として処理される。一実施形態では、乳光は、Ｈａｃｈｅ−Ｌａｎｇｅ（Ｌｏｖｅｌａｎｄ，ＣＯ）から入手される安定化ホルマジン標準（２６６０６４２）の希釈液との比較により評価可能である。色は、Ｓｉｇｍａ−Ｆｌｕｋｅ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製の標準（８３９５２）との比較により評価可能である。本明細書で用いられる場合、「遅延発生」という用語は、初期の製剤では観測されないが、一定期間後、たとえば、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後、または最大で１２ヶ月後、１８ヶ月後、もしくは２４ヶ月後に生じる粒子形成を意味する。一実施形態では、組換え産生ポリペプチドを含有する製剤を、約０℃、５℃、もしくは１０℃または約０℃、５℃、もしくは１０℃以上かつ約２５℃もしくは４０℃または約２５℃もしくは４０℃以下の温度で、貯蔵した場合、粒子形成が低減される。
【００７４】
他の実施形態では、プロテインＡ洗浄液中に脂肪酸を組み込むことにより、溶出液中または下流の製剤中の、産物の安定性にも関連付けられるポリペプチドのフラグメント化が低減される。一実施形態では、少なくとも１つのプロテインＡ洗浄液中に脂肪酸が組み込まれた精製プロセスの下流の製剤中の組換え産生ポリペプチドは、４０℃で貯蔵した場合、１ヶ月間あたり５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．９５％、０．９０％、０．８０％、または０．７５％よりも少ないフラグメント化率を有する。ポリペプチドのフラグメント化を検出する方法は公知であり、たとえば、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）が挙げられる。
【００７５】
脂肪酸に加えて、洗浄緩衝液の他の要素が、溶出液中に検出されるＨＣＰのレベルに影響を及ぼしうる。特定的には、洗浄緩衝液のｐＨを増加させると、ＨＣＰレベルが減少しうる。そのほかに、洗浄緩衝液中の塩化ナトリウムなどの塩の濃度もまた、溶出液中に検出されるＨＣＰレベルに影響を及ぼしうる。一般的には、塩または塩化ナトリウムの濃度が増加すると、溶出液中のＨＣＰレベルは減少する。一実施形態では、洗浄緩衝液は、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨを有し、かつ少なくとも約０．２５Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、１．２５Ｍ、１．５Ｍ、１．７５Ｍ、または２Ｍの塩たとえば塩化ナトリウム、かつ最大で約２．０Ｍ、２．２５Ｍ、２．５Ｍ、２．７５Ｍ、または３．０Ｍの塩たとえば塩化ナトリウムと、少なくとも約２５ｍＭまたは５０ｍＭ、かつ最大で７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、または２００ｍＭの濃度で脂肪酸と、を含む。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む。他の実施形態では、洗浄緩衝液は、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．０Ｍ〜約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む。より特定的な実施形態では、洗浄緩衝液は、約８．０〜約９．０のｐＨで１００ｍＭトリス中に約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む。より特定的な実施形態では、洗浄緩衝液は、約８．０〜約９．０のｐＨで１００ｍＭトリス中に約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと、約２．０Ｍ〜約２．５Ｍの塩化ナトリウムと、を含む。
【００７６】
そのほかに、洗浄緩衝液は、限定されるものではないが、酸化的損傷から保護するために、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＤＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤、内因性プロテアーゼによる標的ポリペプチドの分解を阻害するために、限定されるものではないが、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をはじめとするプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼを不活性化するために、限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）をはじめとする金属キレート化剤、タンパク質構造を安定化するために、限定されるものではないが、グリセロール、界面活性剤、および糖をはじめとするオスモライト、または溶解性を向上させるために、限定されるものではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4などの塩をはじめとするイオン性安定化剤を含めて、タンパク質の純度、安定性、および機能を向上させるために、１種以上の添加剤を含みうる。
【００７７】
「溶出緩衝液」という用語は、標的ポリペプチドをカラムから溶出させるために（すなわち、除去するために）使用される緩衝液を意味する。溶出ｐＨは、カラムに対するポリペプチドの結合親和性に依存して変化しうる。いくつかの抗体は、より高い結合親和性を呈し、かつより低い溶出ｐＨを必要としうる。一般的には、溶出緩衝液のｐＨは、充填緩衝液のｐＨ未満である。典型的には、溶出緩衝液は、少なくとも約２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、または３．５、かつ最大で、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．５、４．７、４．８、４．９、または５．０のｐＨを有する。溶出緩衝液の例としては、少なくとも約２５ｍＭまたは５０ｍＭかつ最大で約１００ｍＭ、１５０ｍＭ、または２００ｍＭの濃度でクエン酸ナトリウム、クエン酸、または酢酸を含む緩衝液が挙げられる。一実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも約２５ｍＭまたは５０ｍＭかつ最大で約１００ｍＭ、１５０ｍＭ、または２００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、かつ少なくとも約２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、または３．５、かつ最大で約３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．５、４．７、４．８、４．９、または５．０のｐＨを有する。そのほかに、溶出緩衝液は、限定されるものではないが、酸化的損傷から保護するために、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＤＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤、内因性プロテアーゼによる標的ポリペプチドの分解を阻害するために、限定されるものではないが、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をはじめとするプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼを不活性化するために、限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）をはじめとする金属キレート化剤、タンパク質構造を安定化するために、限定されるものではないが、グリセロール、界面活性剤、および糖をはじめとするオスモライト、または溶解性を向上させるために、限定されるものではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４などの塩をはじめとするイオン性安定化剤を含めて、タンパク質の純度、安定性、および機能を向上させるために、１種以上の添加剤を含みうる。一実施形態では、標的分子は、少なくとも５かつ最大で１０または２０カラム体積の溶出緩衝液を用いて溶出される。溶出液は、当業者に周知の技術を用いて、たとえば、ＯＤ280ｎｍに設定された分光光度計を用いて吸光度をモニターすることにより、モニター可能である。一実施形態では、プロテインＡ精製工程は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、または８５％、かつ最大で約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、または９５％の回収率を有する。回収率は、たとえば、カラム上に充填された量を基準にして溶出液中のタンパク質のパーセントを計算することにより、決定可能である。
【００７８】
ポリッシングクロマトグラフィー工程１０４、１０５は、ウイルス、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、内毒素、およびＤＮＡのさらなるクリアランスを提供するとともに、凝集体、望ましくない産物変異体、および他の副次的汚染物質の除去を支援する。ポリッシング工程１０４、１０５は、一般的には、１つ以上のクロマトグラフィー工程、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、およびそれらの組合せを含む。
【００７９】
一実施形態では、精製プロセスは、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィー工程を含む。「イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、共有結合荷電置換基を保有する固定マトリックスを用いたクロマトグラフィープロセスを意味する。「イオン交換材料」は、共有結合されていないその対イオンを周囲溶液中の類似荷電の結合パートナーまたはイオンと交換する能力を有する。ポリペプチドは、正電荷または負電荷のいずれかを有しうる多数の官能基を有する。イオン交換クロマトグラフィーは、移動相のｐＨおよび／またはイオン濃度に依存する正味電荷に基づいてポリペプチドを分離する。したがって、ポリペプチドは、移動相のｐＨおよび／またはイオン濃度を調整することにより分離可能である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、カラムによりキャプチャーされ、次いで、溶出される（「結合・溶出」モードとも呼ばれる）。他の実施形態では、標的ポリペプチドは、カラムを貫流し、汚染物質は、結合される（「フロースルーモード」とも呼ばれる）。イオン交換材料からの溶出は、一般的には、イオン交換マトリックスの荷電部位に対して組換えポリペプチドと競合するように緩衝液のイオン強度を増加させることにより、達成される。溶出プロセスは、漸進的（グラジエント溶出）または段階的（ステップ溶出）であり、溶出液は、ＯＤ280ｎｍに設定されたＵＶ分光光度計を用いてモニター可能である。
【００８０】
対イオンの電荷に依存して、「イオン交換クロマトグラフィー」は、「陽イオン交換」、「陰イオン交換」、または「混合モードイオン交換」と呼ぶこともできる。「陽イオン交換」という用語は、カラムを通過または貫流する水性溶液中の陽イオンとの交換に利用可能な遊離陽イオンを有して負に荷電した固相を有するクロマトグラフィー法を意味する。陽イオン交換クロマトグラフィーは、標的ポリペプチドを正に荷電する条件下に標的が維持される場合、組換えポリペプチドを精製するために使用可能である。たとえば、溶液ｐＨがポリペプチドの等電点未満になるように、溶液を調整することが可能である。標的ポリペプチドに加えて、他の正荷電不純物もまた、陽イオンカラム樹脂に結合されうる。このように、標的ポリペプチドは、樹脂への不純物の結合を維持した状態で標的ポリペプチドを溶出させる条件下（たとえば、ｐＨおよび塩濃度）でカラムから溶出させることにより、回収可能である。陽イオン交換樹脂は、スルホプロピル基、スルホエチル基、スルホイソブチル基などの強酸性リガンドまたはカルボキシル基などの弱酸性リガンドを含みうる。一般に使用される陽イオン交換樹脂の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）樹脂、スルホエチル（ＳＥ）樹脂、スルホプロピル（ＳＰ）樹脂、リン酸塩（Ｐ）樹脂、およびスルホン酸塩（Ｓ）樹脂が挙げられる。
【００８１】
「陰イオン交換」という用語は、固相を通過または貫流する水性溶液中の陰イオンとの交換に利用可能な遊離陰イオンを有して正に荷電した固相を有するクロマトグラフィー法を意味する。陰イオン交換カラムは、典型的には、負荷電不純物が樹脂に結合されると同時に正荷電標的ポリペプチドがフロースルーストリーム中に回収されるように、フロースルーモードで操作される。しかしながら、陰イオン交換カラムはまた、標的ポリペプチドおよび除去される不純物のｐＩに依存して、結合・溶出モードで使用されうる。陰イオン交換に使用される正荷電基の例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）やジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）などの弱塩基性基、および第４級アミン（Ｑ）基、トリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）基、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基などの強塩基性基が挙げられる。
【００８２】
一実施形態では、プロテインＡキャプチャー工程１０２から得られる溶出液は、１つ、２つ以上、または３つ以上のイオン交換分離に付され、第２のイオン交換分離工程は、第１のイオン交換分離と反対の電荷に基づく分離を含む。たとえば、キャプチャー１０２の後、陰イオン交換工程１０４が利用される場合、第２のイオン交換クロマトグラフィー工程１０５は、陽イオン交換工程でありうる。反対に、陽イオン交換工程１０４がキャプチャー１０２に続く場合、その工程に陰イオン交換工程１０５が続くであろう。他の選択肢として、他の実施形態では、精製スキーム１００は、陽イオン交換工程のみまたは陰イオン交換工程のみを含みうる。
【００８３】
一実施形態では、精製スキーム１００は、ポリッシング工程１０４または１０５として少なくとも１つの疎水相互作用分離を含む。「疎水相互作用クロマトグラフィー」（ＨＩＣ）とは、ポリペプチドとクロマトグラフィー樹脂の固相に結合された疎水リガンドとの可逆的相互作用に基づくクロマトグラフィー分離を意味する。疎水相互作用クロマトグラフィーは、多くの場合、抗体凝集体などのタンパク質凝集体およびプロセス関連不純物を除去するために使用される。ＨＩＣ時、標的ポリペプチドは、高い塩濃度でカラムに結合し、塩濃度の減少により溶出される。標的ポリペプチドと疎水リガンドとの相互作用は、高いイオン強度の緩衝液を用いることにより増強されるので、ＨＩＣは、イオン交換クロマトグラフィーの後で使用するのに好適な精製工程でありうる。種々のイオンは、それらが疎水相互作用（塩析効果）を促進するか、または水の構造の撹乱（カオトロピック効果）により疎水相互作用を弱めるかに依存して、いわゆる疎溶媒性系列（ｓｏｌｕｐｈｏｂｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ）で並べることが可能である。
【００８４】
他の実施形態では、精製スキームは、ポリッシング工程１０４または１０５として「疎水電荷誘導クロマトグラフィー」（ＨＣＩＣ）を含む。ＨＣＩＣは、低ｐＨでイオン化するリガンドのｐＨ依存性挙動に基づく。ＨＣＩＣは、高い塩濃度を必要とすることなく標的ポリペプチドとカラム材料との疎水相互作用が可能になるように、高密度でヘテロ環式リガンドを利用する。ＨＣＩＣでの溶出は、イオン化性リガンドと結合タンパク質との電荷反発を生じるようにｐＨを低下させることにより達成可能である。
【００８５】
一実施形態では、精製スキーム１００は、たとえば、内在性レトロウイルスおよび外来性ウイルスを除去するために、１つ以上のウイルス不活性化工程１０３および／またはウイルスクリアランス工程１０６を含む。一実施形態では、ウイルス不活性化工程１０３は、標的分子のキャプチャー１０２の後、組み込まれうる。ウイルス不活性化技術は、公知であり、たとえば、熱不活性化（パスツール殺菌）、ｐＨ不活性化、溶媒／界面活性剤を用いた脂質エンベロープの撹乱、ＵＶおよびγ線照射、ならびに化学的不活性化剤の使用が挙げられる。一実施形態では、ウイルス不活性化は、混合物を低ｐＨで一定時間インキュベートすることと、ｐＨを中和することと、濾過により微粒子を除去することと、を含む、低ｐＨウイルス不活性化工程を含む。一実施形態では、低ｐＨウイルス不活性化は、組換えポリペプチドを約２〜約５または約３〜約４または約３．３〜約３．８のｐＨに調整することを含む。サンプル混合物のｐＨは、クエン酸、酢酸、カプリル酸、または他の好適な酸を含めて、任意の好適な酸により低下させうるが、これらに限定されるものではない。ｐＨレベルの選択は、組換え産生ポリペプチドおよび他の緩衝液成分の安定性プロファイルに依存する。典型的には、調整された溶液は、少なくとも約３０または４５分間かつ最大で約１、１．５、または２時間にわたり、典型的には室温でインキュベートされる。ウイルス不活性化後、組換えポリペプチド溶液のｐＨは、精製プロセスを継続する前に、より中性のｐＨ、たとえば、約４．５〜約８．５または約４．５〜約５．５に調整可能である。
【００８６】
他の実施形態では、ウイルス濾過などのウイルスクリアランス工程１０５が精製スキームに含まれうる。ウイルス保持フィルターは、市販されており、親水ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルター、親水ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルター、再生セルロースフィルターなどの限外濾過器または精密濾過器が挙げられる。除去されるウイルスのサイズに基づいて、ウイルスフィルターをレトロウイルスフィルターおよびパルボウイルスフィルターに分類することが可能である。
【００８７】
一実施形態では、精製スキームは、抗体サンプルのさらなる精製および濃縮を行うために、限外濾過（ＵＦ）および／または透析濾過（ＤＦ）工程１０７を含む。ＵＦ／ＤＦにより、標的ポリペプチドの濃度を増加させたり、さらには緩衝塩を特定の製剤緩衝剤に置き換えたりすることが可能である。限外濾過（ＵＦ）とは、静水圧により液体が半透膜に押圧されるタイプの膜濾過を意味する。懸濁固体および高分子量溶質たとえば標的ポリペプチドは、保持物中に保持され、一方、水および低分子量溶質は、膜を通過して濾液中に保持される。このようにして、液体および塩が除去されるので、標的抗体が濃縮される。一般的には、濃縮物中の低分子量組成物は、一定に維持されるので、濃縮溶液のイオン強度は、比較的一定した状態を維持する。「透析濾過」とは、抗体などのタンパク質、ペプチド、核酸、および他の生体分子を含有する溶液から、塩または緩衝成分の濃度を除去、置換、または低減するために、限外濾過膜を使用する方法を意味する。連続透析濾過（定体積透析濾過とも呼ばれる）は、組換え産生ポリペプチドを含有する製剤を形成するために、水または新しい緩衝液たとえば製剤緩衝液を保持物に添加することにより、保持物中に最初からあった緩衝塩（または他の低分子量種）を洗浄除去することを含む。典型的には、新しい緩衝液は、保持物の体積および産物の濃度が透析濾過時にあまり変化しないように、濾液を生成するのと同一の速度で添加される。
【００８８】
製剤
一実施形態では、精製組換え産生ポリペプチドは、液状製剤で調製される。より特定的な実施形態では、液状製剤中の組換え産生ポリペプチドは、抗体または抗体フラグメントである。一実施形態では、液状製剤は水などの水性担体を含む。一実施形態では、液状製剤は無菌である。他の実施形態では、液状製剤は、均一である。他の実施形態では、製剤は等張性である。一実施形態では、液状製剤は、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、１７５ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌ、または３００ｍｇ／ｍｌの精製組換え産生ポリペプチドを含む。一実施形態では、製剤は、少なくとも約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、または６．５、かつ最大で約６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．５、８．０、８．５、または９．０のｐＨを有する。製剤はまた、緩衝剤、糖、塩、界面活性剤、可溶化剤、希釈剤、結合剤、安定化剤、親油性溶媒、アミノ酸、キレート化剤、保存剤、またはそれらの組合せをはじめとする通常の賦形剤および／または添加剤を含みうるが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
他の実施形態では、精製組換え産生ポリペプチドは、凍結乾燥製剤として調製される。より特定的な実施形態では、凍結乾燥製剤中の組換え産生ポリペプチドは、抗体または抗体フラグメントである。本明細書で用いられる場合、「凍結乾燥」という用語は、少なくとも５０％の湿分が除去される凍結乾燥などの乾燥手順に付された製剤を意味する。一実施形態では、凍結乾燥製剤は、凍結乾燥保護剤を含む。「凍結乾燥保護剤」という用語は、凍結乾燥時および後続の貯蔵時、ポリペプチドの化学的および／または物理的不安定性を有意に防止または低減する、対象の組換え産生ポリペプチドと組み合わされる分子を意味する。凍結乾燥保護剤としては、糖およびその対応する糖アルコール、アミノ酸、たとえば、グルタミン酸一ナトリウム、アルギニン、またはヒスチジン、メチルアミン、たとえば、ベタイン、リオトロピック塩、たとえば、硫酸マグネシウム、ポリオール、たとえば、三価以上の高分子量糖アルコール、たとえば、グリセリン、デキストラン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、プルロニック（登録商標）、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。凍結乾燥保護剤の追加の実施例としては、グリセリンおよびゼラチン、ならびに糖類のメリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、およびスタキオースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。還元糖の例としては、グルコース、マルトース、ラクトース、マルツロース、ｉｓｏ−マルツロース、およびラクツロースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。非還元糖の例としては、糖アルコールおよび他の直鎖状ポリアルコールから選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。糖アルコールの例としては、モノグリコシド、二糖、たとえば、ラクトース、マルトース、ラクツロース、およびマルツロースの還元により得られる化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。グリコシド側基は、グルコシドまたはガラクトシドでありうる。糖アルコールの追加の例としては、グルシトール、マルチトール、ラクチトール、およびｉｓｏ−マルツロースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、トレハロースまたはスクロースが凍結乾燥保護剤として使用される。一実施形態では、凍結乾燥保護剤は、「凍結乾燥保護量」で製剤に添加される。つまり、凍結乾燥保護量の凍結乾燥保護剤の存在下でのタンパク質の凍結乾燥の結果、タンパク質は、凍結乾燥時および貯蔵時、その物理的および化学的な安定性および完全性を本質的に維持する。「再構成」製剤とは、組換え産生ポリペプチドが再構成製剤中に分散されるように凍結乾燥製剤を希釈液中に溶解させることにより調製された製剤のことである。再構成製剤は、患者に投与するのに好適である。「希釈液」としては、無菌水、注入用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）、無菌生理食塩水溶液、リンゲル液、またはデキストロース溶液をはじめとする薬学的に許容可能な希釈液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。代替実施形態では、希釈液は、塩および／または緩衝剤の水性溶液を含みうる。一実施形態では、組換えポリペプチドは、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、または５０ｍｇ／ｍｌ、かつ最大で約６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌの濃度で凍結乾燥製剤に含まれる。より特定的な実施形態では、凍結乾燥製剤は、少なくとも約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または２５ｍＭ、かつ最大で約３０ｍＭ、４０ｍＭ、または５０ｍＭの濃度で、緩衝剤としてヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸などのアミノ酸を含む。一実施形態では、凍結乾燥製剤は、少なくとも約５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、または２２５ｍＭ、かつ最大で約２５０ｍＭまたは３００ｍＭの濃度でトレハロースやスクロースなどの糖を含む。一実施形態では、凍結乾燥製剤は、少なくとも約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、または０．０５％（ｗ／ｖ）、かつ最大で約０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、または０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０などの界面活性剤を含む。一実施形態では、凍結乾燥製剤は少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８または７．９、かつ最大で約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨを有する。
【００９０】
一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、非経口投与に供すべく製剤化される。一実施形態では、製剤は、注射可能である。一実施形態では、組換え産生ポリペプチドは、静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与に供すべく製剤化される。
【００９１】
本明細書に記載されるように精製された組換え産生ポリペプチドを用いて調製された製剤は、製造時、調製時、輸送時、および貯蔵時、安定性、低レベル〜検出不能レベルの抗体フラグメント化、低レベル〜検出不能レベルの粒子形成（すなわち、目に見える粒子を含まないまたは実際上含まないかつ透明〜わずかに乳白色の状態を維持する）、低レベル〜検出不能レベルのプロテアーゼ活性、および組換え産生ポリペプチドの生物学的活性のごくわずか〜ゼロの損失を呈する。
【００９２】
本明細書で用いられる「低レベル〜検出不能レベルのフラグメント化」という用語は、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により決定したときに、単一ピークが、たとえば、約８０％、約８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％未満の全長ポリペプチドを含有して非分解ポリペプチドを示し、かつそれぞれ約５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％超のポリペプチドを有する他の単一ピークを含有していない、サンプルを意味する。他の実施形態では、製剤は、組換え産生ポリペプチドのフラグメント化の低減を呈する。一実施形態では、脂肪酸がプロテインＡ洗浄緩衝液中に組み込まれた組換え産生ポリペプチドを含む製剤は、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、もしくは７日間、または少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、もしくは６週間、約４０℃で貯蔵した後、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定したときに、５％未満のフラグメント化ポリペプチドを含む。他の実施形態では、脂肪酸がプロテインＡ洗浄緩衝液中に組み込まれた組換え産生ポリペプチドを含む製剤は、少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、もしくは１２週間、または少なくとも約１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、もしくは１２ヶ月月間、約４℃または約５℃で貯蔵した後、ＲＰ−ＨＰＬＡにより決定したときに、５％未満のフラグメント化ポリペプチドを含む。
【００９３】
本明細書で用いられる「低レベル〜検出不能レベルの粒子形成」という語句は、欧州薬局方（ＰｈＥｕｒ）セクション２．９．２０、２．２．１、２．２．２などの好適な公定書に記載の方法に適合する手順に従って粒子および透明性／乳光を目視検査したときに、「目に見える粒子を含まないまたは実際上含まないかつ透明〜わずかに乳白色の状態を維持する」サンプル、または目視検査したときに、粒子が検出されない（すなわち、製剤が無色透明な状態を維持する）サンプルを意味する。一実施形態では、本明細書に記載されるように精製された組換え産生ポリペプチドを含む製剤は、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、もしくは７日間、または少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、もしくは６週間、約４０℃で貯蔵した後、目視検査により決定したときに、無色透明である。他の実施形態では、製剤は、少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、もしくは１２週間、または少なくとも約１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、もしくは１２ヶ月月間、約４℃または約５℃で貯蔵した後、目視検査により決定したときに、無色透明である。
【００９４】
本明細書で用いられる「低い〜検出不能なプロテアーゼ活性」という用語は、たとえば、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）プロテアーゼアッセイキット（Ｅ６６３８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）などの蛍光プロテアーゼアッセイを用いて、プロテアーゼ活性が検出限界未満（たとえば、約１０ｎｇ／ｍＬ未満）であるサンプルを意味する。一実施形態では、本明細書に記載されるように精製された組換え産生ポリペプチドを含む製剤は、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、もしくは７日間、または少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、もしくは６週間、約４０℃で貯蔵した後、低い〜検出不能なプロテアーゼ活性を示す。他の実施形態では、製剤は、少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、もしくは１２週間、または少なくとも約１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、もしくは１２ヶ月月間、約４℃または約５℃で貯蔵した後、低い〜検出不能なプロテアーゼ活性を示す。
【００９５】
一実施形態では、製剤は、組換え産生ポリペプチドの安定性の向上を呈する。特定的には、プロテインＡ洗浄緩衝液中に脂肪酸を組み込むことにより、脂肪酸を含まないプロテインＡ洗浄緩衝液を用いて調製された製剤と比較して向上した安定性を有する抗体製剤が得られる。一実施形態では、本明細書に記載されるように精製された組換え産生ポリペプチドを含む製剤は、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、もしくは７日間、または少なくとも約１週間２週間、３週間、４週間、５週間、もしくは６週間、または少なくとも約１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、もしくは６ヶ月間、約４０℃で貯蔵した後、安定である。他の実施形態では、本明細書に記載されるように精製された組換え産生ポリペプチドを用いて調製された製剤は、少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、もしくは１２週間、または少なくとも約１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、もしくは１２ヶ月間、または少なくとも約１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間、１１年間、もしくは１２年間、約４℃または約５℃で貯蔵した後、安定である。
【００９６】
宿主細胞タンパク質の検出
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度の残留レベルを決定する方法は、公知であり、たとえば、一次抗体が、組換えポリペプチドを生成するために使用された特定の宿主細胞、たとえば、ＣＨＯ細胞およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から産生されるＨＣＰに特異的である、免疫アッセイ、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などを用いて、残留ＨＣＰレベルを検出することを含む。一次抗体は、当業者に公知の従来の方法に従って産生されうる。たとえば、一次抗体は、抗体産生に使用された宿主細胞の細胞溶解物に対して生成されうる。ＨＣＰ免疫アッセイプラットフォームの１つは、Ｇｙｒｏｓ（Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ）から市販されている。
【００９７】
プロテアーゼの検出
ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）プロテアーゼアッセイキット（Ｅ６６３８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、サンプルのプロテアーゼ活性を評価することが可能である。単一のｐＨまたは複数のｐＨでサンプルを読み取って、プロテアーゼ活性対ｐＨのプロファイルを作成することが可能である。異なるプロテアーゼは、異なる活性対ｐＨプロファイルを有するので、異なるｐＨレベルで測定すれば、サンプル中の多種多様なタイプのプロテアーゼを検出する能力が向上する。
【００９８】
他の実施形態では、約１０％未満の誤差で、ｐＨ範囲４〜９にわたり、ＢＯＤＩＰＹ蛍光アッセイを使用することが可能である。キット中の検出基質は、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−カゼインコンジュゲートである。消化カゼイン基質の色素標識フラグメントがサンプルの活性プロテアーゼにより放出される場合、色素の自己クエンチングの減少に起因して蛍光強度の増加が起こりうる。タンパク質サンプルは、典型的には４〜８の範囲内のｐＨで、２０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液中に１０倍希釈可能である。対応するプラセボを調製することが可能である。所望のｐＨが達成されるように２０ｍＭクエン酸と２０ｍＭ第二リン酸ナトリウムとを混合することにより、クエン酸リン酸緩衝液を調製することが可能である。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−カゼインコンジュゲート検出基質を適切な緩衝液中に希釈して、４〜８の各ｐＨで約１０μｇ／ｍＬの作用試薬を作製することが可能である。等体積（典型的には１００μＬ）のサンプルおよび作用試薬を白色マイクロプレートのウェルに添加して、ｐＨ範囲４〜８にわたるアッセイサンプルおよび対応するプラセボをトリプリケート方式で作製することが可能である。サンプルをシールし、３〜５時間の典型的な持続時間にわたり４０℃でインキュベートすることが可能である。４８５ｎｍで色素蛍光を励起し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）蛍光プレートリーダー（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で４９５ｎｍカットオフフィルターを用いて５３０ｎｍの発光強度を記録することが可能である。次いで、サンプルの強度対ｐＨを記録することが可能である。この方法の変動に基づく製造業者のガイドラインに従って、ブランクと比較して約２０％未満のサンプル強度の増加は、プロテアーゼ活性に関して陰性であるとして処理可能である。サンプルの結果から緩衝液の分を引き算して、ｐＨに対してプロットすることが可能であり、これを用いて、サンプルのプロテアーゼ活性の存在を決定することが可能である。多重反復試験を行って、低い読み値の変動を評価することが可能である。相対定量のために、カテプシンＤやトリプシンなどの既知のプロテアーゼの対照調製物をコンパレーターとして使用することが可能である。プロテアーゼの存在を確認するために、プロテアーゼ阻害剤をサンプルに添加して、検出プロテアーゼ活性の相対的減少または排除を結果の確認に用いることが可能である。サンプル中のプロテアーゼの存在の診断に使用されるプロテアーゼ阻害剤の例としては、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチンＨＣｌ、Ｅ−６４、ＥＤＴＡ、ロイペプチンを含有する広範なプロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログＮｏ．Ｐ２７１４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｉｕｓ，ＭＯ）を１×提案濃度で使用することが挙げられうる。プロテアーゼ活性のさらなる確認のために、各個別の阻害剤を使用することも可能である。プロテアーゼ阻害剤は、市販されており、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）などの好適な供給業者から調達可能である。たとえば、ＡＥＢＳＦ−ＨＣｌ（セリンプロテアーゼを阻害する）、カタログＮｏ．７８４３１、アプロチニン（セリンプロテアーゼを阻害��る）、カタログＮｏ．７８４３２、ベスタチン（Ｂｅｓｔａｔｉｎ）（アミノペプチダーゼを阻害する）、カタログＮｏ．７８４３３、Ｅ−６４（システインプロテアーゼを阻害する）、カタログＮｏ．７８４３４、ロイペプチン（セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼを阻害する）、カタログＮｏ．７８４３５、ペプスタチンＡ（アスパルチルプロテアーゼを阻害する）、カタログＮｏ．７８４３６、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、メタロプロテアーゼを阻害する）。
【実施例】
【００９９】
以下の実施例は、本発明の実施を例示するために与えられている。それらは、本発明の全範囲を限定したり規定したりすることを意図したものではない。
【０１００】
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【０１０１】
実施例で利用される試薬は、市販されているか、または当技術分野で公知の商業的に利用可能な機器、方法、もしくは試薬を用いて調製可能である。実施例は、本発明の種々の態様および本発明に係る方法の実施を例示したものである。実施例は、本発明の多種多様な実施形態の網羅的説明を提供することを意図したものではない。したがって、明確に理解することを目的に、例示および実例により、本発明をやや詳細に説明してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の趣旨または範囲から逸脱することなく多くの変更および修正を加えうることは、容易に分かるであろう。
【０１０２】
本明細書に挙げた出版物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が具体的かつ個別的に明示されて参照により組み込まれたのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
実施例１：ＨＣＰレベルに及ぼすｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの影響
ヒトＩＬ−１８に特異的に結合するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＮＣＩＭＢ受託番号４１７８６）の標準的精製プロセスでは、多量のＨＣＰ（すなわち、６３０ｎｇ／ｍｇ）が観測され、プロテインＡ精製でも他のプロセス工程でも排除されなかった。ＨＣＰレベルを低減する能力に関して、追加の洗浄液工程を評価した。特定的には、ＨＣＰクリアランス、回収率、および産物に及ぼす洗浄ｐＨ、洗浄塩化ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、およびそれらの組合せの影響を調べた。実験は、１６の実験ランと標準的洗浄緩衝液を用いた追加のラン（実験１７）とを含んでいた。実験洗浄液の組成は、表１に示される。表１の実験洗浄緩衝液はすべて、１００ｍＭトリス中に作製され、ｐＨは、濃ＨＣｌを用いて調整された。プロテインＡクロマトグラフィー緩衝液は、表２に示されるように調製された。ランはすべて、２０ｃｍの床高さおよび３．９３ｍＬのカラム体積を有するＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（Ｃ１１−０３２  ＴＲＩＣＯＲＮ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行われ、かつ表３に概説されるプロセスに従ってＡＫＴＡ  ＡＶＡＮＴシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて３５０ｃｍ／時（１．１７ｍＬ／分）で一晩行われた。
【０１０４】
【表１】
2019163263.tif 000004
【０１０５】
【表２】
2019163263.tif 000005
【０１０６】
【表３】
2019163263.tif 000006
【０１０７】
プロテインＡカラムから溶出させた後、溶出液を０．１ＭトリスでｐＨ５．０に中和し、ＨＣＰ分析のために１ｍＬのサンプルを採取した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（製品Ｎｏ．ＳＣＧＰ００５２５）を用いて溶出液を濾過し、高ＨＣＰレベルに関連付けられる沈殿物を除去した。濾過によるこの沈殿物の除去は、ＨＣＰレベルの低減に役立ちうる。濾過後、濃度決定、ＨＣＰアッセイ（濾過後）、およびＨＰＳＥＣのために、中和溶出液のさらなるサンプル採取を行った。２８０ｎｍの吸着により、各サンプルの濃度を決定した。すべてのサンプルを１：２０希釈したので、値に２０を掛け算し（希釈を補正するため）、そして１．５５の吸光係数（実験的に決定された）で割り算した。ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００を備えＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステムでサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を行った。製剤をＰＢＳ中に約１０ｍｇ／ｍＬに希釈して２５μＬを注入することにより、２５０μｇを注入した。ＣＨＯ細胞由来のＨＣＰを検出するために、アフィニティー精製ヒツジ抗血清を有するオープン免疫アッセイプラットフォーム（Ｇｙｒｏｓ）を用いて、宿主細胞タンパク質に関してサンプルを解析した。蛍光プロテアーゼ検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製２３２６６）を使用し、基質としてＦＴＣ−カゼインを用いて、サンプルのタンパク質分解活性を測定した。キットの説明書に含まれる手順に従い、トリプシン標準曲線に対して等価なｎｇ／ｍＬ値として計算される単位で結果を報告した。結果は表４に示される。
【０１０８】
【表４】
2019163263.tif 000007
【０１０９】
表４に見られるように、純度は、各因子（ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウム）により個別に有意な影響を受けた。そのほかに、カプリル酸ナトリウムと塩化ナトリウムとの相互作用が、結果から示唆される。
【０１１０】
表５は、影響の有意性を示している（Ｐｒｏｂ＞Ｆ値が０．０５超のものは、有意でないと判定されるであろう）。
【０１１１】
【表５】
2019163263.tif 000008
【０１１２】
溶出液純度に及ぼす３つの因子（洗浄ｐＨ、塩化ナトリウム洗浄液、およびカプリル酸ナトリウム）の影響を図２に示す。洗浄塩化ナトリウムおよびカプリル酸ナトリウムの両方が中点値である場合、ｐＨの増加が溶出液純度に影響を及ぼし、ｐＨを７．０から９．０まで増加させると、０．６％の減少を示す（左上隅に表示）。図３は、カプリル酸ナトリウムの不在下で洗浄塩化ナトリウムを増加させたときの溶出液純度の減少を示している（灰色の線）。しかしながら、カプリル酸ナトリウムの存在下では、この作用が逆になり、洗浄塩化ナトリウムを増加させると純度が増加した（黒色の線）。そのほかに、個々の因子（洗浄塩化ナトリウムおよびカプリル酸ナトリウム）が回収率に有意な影響を及ぼしたことが、結果から示唆され、この場合も、カプリル酸ナトリウムと洗浄塩化ナトリウムとの相互作用として現れ、同様に、洗浄塩化ナトリウムと洗浄塩化ナトリウムとの二次相互作用にも現れうる。表６の最後の列は、影響の有意性を示している。
【０１１３】
【表６】
2019163263.tif 000009
【０１１４】
回収率に及ぼす洗浄塩化ナトリウムおよびカプリル酸ナトリウムの影響を図４に示す。洗浄塩化ナトリウムは、曲線により表される。すなわち、洗浄塩化ナトリウムとカプリル酸ナトリウムとの二次相互作用が現れる。図４の結果は、洗浄塩化ナトリウムおよびカプリル酸ナトリウムを増加させると、全回収率がそれぞれ２〜４％低減することを示している。図５は、カプリル酸ナトリウムの不在下で洗浄塩化ナトリウムを増加させると（左下）、回収率がわずかに増加したことを示している（灰色の線）。しかしながら、カプリル酸ナトリウムの存在下では、回収率の低減が見られた（黒色の線）。カプリル酸ナトリウムおよび洗浄塩化ナトリウムの影響は、右上隅に示されている。すなわち、洗浄塩化ナトリウムが存在しないと、カプリル酸ナトリウムの増加に伴って回収率が増加した（灰色の線）。しかしながら、多量の洗浄塩化ナトリウムの存在下では、回収率の減少が見られた（黒色の線）。
【０１１５】
濾過前のＨＣＰの分析により、すべての個々の因子（洗浄ｐＨ、洗浄塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウム）で有意な影響が同定され、さらにはカプリル酸ナトリウムと洗浄ｐＨとの相互作用および洗浄ｐＨと洗浄塩化ナトリウムとの相互作用が同定された。表７の最後の列は、影響の有意性を示している。
【０１１６】
【表７】
2019163263.tif 000010
【０１１７】
３つすべての因子を低値から高値に増加させると、溶出液中のＨＣＰレベルが減少したことから、ｐＨ９．０の洗浄緩衝液と２．５Ｍ塩化ナトリウムおよび１００ｍＭカプリル酸ナトリウムとにより、ＨＣＰクリアランスが改善されたことが示唆される。これは、実験的に確認された。実験時に達成された最低ＨＣＰレベルは、ラン７の時であった（１０５．７ｍｇ／ｍｇ）。これとは対照的に、３つの因子を低値にしたラン８では、最高ＨＣＰレベルが観測された（１６１８ｎｇ／ｍｇ）。
【０１１８】
そのほかに、２つの相互作用が同定された。これらは、図６に見られる。洗浄ｐＨと洗浄塩化ナトリウムとの相互作用は、左のボックスに見られる。これから、ｐＨ９で洗浄塩化ナトリウムを増加させた場合、濾過前のＨＣＰレベルに及ぼす影響はごくわずかであったことが示されるが（黒色の線）、ｐＨを７に低減した場合、より大きい影響を示す（灰色の線）。カプリル酸ナトリウムでも、影響は同一であった。すなわち、ｐＨ９では、カプリル酸ナトリウムを用いても用いないでも、濾過前のＨＣＰレベルは、より低かったが（黒色の線）、ｐＨ７では、カプリル酸ナトリウムレベルの増加に伴って、低減レベルはより大きくなった（灰色の線）。
【０１１９】
分析により、すべての個々の因子（洗浄ｐＨ、洗浄塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウム）で濾過後のＨＣＰレベルに対して有意な影響が同定され、さらにはカプリル酸ナトリウムと洗浄ｐＨとの相互作用、カプリル酸ナトリウムと洗浄塩化ナトリウムとの相互作用、および２つの二次相互作用、すなわち、一方は洗浄ｐＨ、他方は洗浄塩化ナトリウムの二次相互作用が同定された。表８の最後の列は、影響の有意性を示している。
【０１２０】
【表８】
2019163263.tif 000011
【０１２１】
図７は、洗浄ｐＨおよび洗浄塩化ナトリウムに対して曲線により表される２つの二次相互作用を有する濾過後のＨＣＰレベルを示している。高いおよび低い洗浄塩化ナトリウムレベルで最低ＨＣＰレベルが達成されたので、洗浄塩化ナトリウムの結果は興味深い。この原因は、少ない洗浄塩化ナトリウムを用いた高ＨＣＰレベルを有するサンプルが、より高い濁度およびより多くの沈殿を生じた可能性があるので、０．２μｍ濾過により除去されて、濾過後のＨＣＰレベルが低減されたことにあると考えられる。
【０１２２】
図８は、洗浄塩化ナトリウムとカプリル酸ナトリウムとの相互作用を示している。洗浄塩化ナトリウムの不在下（灰色の線）では、２．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下（黒色の線）よりも、濾過後のＨＣＰのより少ない低減が観測された。
【０１２３】
各レスポンス（純度、回収率、濾過前ＨＣＰ、および濾過後ＨＣＰ）に及ぼす各因子（洗浄ｐＨ、洗浄塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウム）の組み合わせた影響を図９に示す。右側の列から分かるように、洗浄ｐＨの増加に伴ってＨＣＰレベルが減少したことから、ＨＣＰクリアランスに関してはより高いｐＨのほうが良いことが示唆される。しかしながら、純度は、ｐＨの増加に伴って減少した。この性質は、一般的には、望ましくない。図９は、ｐＨが回収率に影響を及ぼさないことを示しているが、これは、ｐＨが回収率のモデルに含まれていなかったためである。左側の列は、洗浄塩化ナトリウムの増加によりＨＣＰが低減したことを示している。しかしながら、それはまた、洗浄塩化ナトリウムの増加により回収率が低減し、純度はわずかに影響を受けたかまたはまったく影響を受けなかったことを示している。中央の列は、カプリル酸ナトリウムの増加によりＨＣＰが低減し、純度が増加したことを示している。しかしながら、カプリル酸ナトリウムの増加により回収率も低減した。これらの条件を用いて予測された値は、左側の軸に見られる。
【０１２４】
図１０Ａ〜Ｃは、濾過前のＨＣＰレベルに及ぼす３つの因子の組み合わせた影響を示している。３つのグラフはすべて、等高線グリッドにより示されるように、因子がその最高値のときに最低ＨＣＰレベルが達成されたことを示している。このことから、ＨＣＰ除去に関しては、レベルの増加により、ＨＣＰの追加のクリアランスがさらにもたらされることが示唆される。しかしながら、５０％の産物回収率の犠牲を払ってすべてのＨＣＰを除去することは、望ましくないこともある。すべてのレスポンスに対して条件を最適化するために、望ましさ関数をモデルに追加し、各レスポンスに対して範囲を設定し、そして重要性を割り当てた。ＨＣＰ除去の重要性に最高の重要性を与えた。なぜなら、これは、洗浄工程の目的であったからである。回収率に純度よりも高い重要性を割り当てた。なぜなら、これは、これがキャプチャー工程であり、凝集体がプロセスの追加の工程により除去されうるからである。
【０１２５】
図１１には、Ｘ軸上に最適条件が示されている。ここでは、洗浄塩化ナトリウムおよびカプリル酸ナトリウムは両方とも、依然として最大値（すなわち、それぞれ２．５Ｍおよび１００ｍＭ）であり、洗浄ｐＨは、ｐＨ８．４５に設定される。ｐＨをそれ以上増加させても、回収率もＨＣＰクリアランスも増加しなかったが、純度は悪影響を受けた。また、これらの条件下で合理的な低回収率（８１％）が観測されたことに注意することも重要である。プロテインＡに対しては、＞９０％の回収率が期待されよう。しかしながら、洗浄塩化ナトリウムを増加させると回収率が減少し、ひいては、ＨＣＰレベルが増加した。このことから、洗浄液中に高レベルの塩化ナトリウムがあると、産物が洗浄除去されるおそれがあることが示唆される。
【０１２６】
カプリル酸ナトリウムおよびｐＨは、溶出液純度に影響を及ぼしうることが、実験から実証された。ｐＨを増加させるとより低純度になったが（これらは望ましくない）、これは、キャプチャーカラムによる洗浄工程であり、プロセスには凝集体を除去するための追加のクロマトグラフィー工程が存在する。そのほかに、カプリル酸ナトリウムを洗浄緩衝液に添加すると、純度が増加することが、結果から示唆される。理論により拘束されることを望むものではないが、カプリル酸ナトリウムは、抗体上の結合部位に対する競合に打ち勝つことによりＨＣＰを除去したと考えられる。この場合には、なぜ純度が増加したかの説明にもなろう。回収率に及ぼすカプリル酸ナトリウムおよび洗浄塩化ナトリウムの影響は、完全に望ましいものではなかったが、このことよりもＨＣＰレベルの低減のほうが重要であろう。
【０１２７】
濾過前のＨＣＰの結果から、３つの因子はすべて、プロテインＡ洗浄緩衝液で使用した場合、ＨＣＰレベルを低減する能力を有していたことが示される。そのほかに、洗浄ｐＨとカプリル酸ナトリウムとの相乗的相互作用により、ＨＣＰクリアランスが増加したことが、結果から示された。濾過後のＨＣＰレベルは、濾過前のＨＣＰの結論とやや食い違っていたが、たとえ濾過によりＨＣＰを除去できたとしても、沈殿物によりフィルターが目詰まりするおそれがあり、これは、製造上それほど望ましいものにはならないため、濾過後のレベルよりも濾過前のＨＣＰの結果に重点を置いた。
【０１２８】
実施例２：ＨＣＰ除去に及ぼすｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの影響
この実験の目的は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）に特異的に結合する第２のモノクローナル抗体を対象として、ＨＣＰ除去に及ぼす３つの因子（ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウム）およびそれらの組合せの有効性を、プロテインＡ洗浄緩衝液に組み込まれる場合について、評価することであった。手順は、実施例１に対して以上に記載したものと同一であった。結果は表９に示される。
【０１２９】
【表９】
2019163263.tif 000012
【０１３０】
表１０の結果は、純度が、各因子（ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウム）により個別に有意な影響を受けたことを示している。そのほかに、カプリル酸ナトリウムと洗浄塩化ナトリウムとの相互作用および洗浄塩化ナトリウムと洗浄ｐＨとの相互作用が、結果から示唆される。また、溶出液純度に及ぼす洗浄ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウムの影響を図１２に示す。このことから、３つすべての成分のレベルを増加させることにより、溶出液純度が低減したことが分かる。
【０１３１】
図１３は、塩化ナトリウムの不在下では、ｐＨまたはカプリル酸ナトリウムレベルのいずれのレベルを変化させても（左側および右側の黒色の線）、純度にほとんど影響を及ぼさなかったことを示している。しかしながら、塩化ナトリウムの存在下では、カプリル酸ナトリウムまたはｐＨのいずれかを増加した場合（左側および右側の灰色の線）、溶出液純度に悪影響を及ぼした。回収率分析でのみ、洗浄ｐＨおよびその二次相互作用が回収率に対して有意であると同定された（表１１）。図１４に示される結果から、ｐＨを増加させるとより高い回収率値が得られることが示唆される。興味深いことに、溶出液中のＨＣＰ分析でのみ、有意な因子としてカプリル酸ナトリウムが同定された（表１２）。溶出液中のＨＣＰレベルに及ぼすカプリル酸ナトリウムの影響を図１５に示す。
【０１３２】
モデルに高レベルのノイズがあったため、代替分析を行った。代替分析は、溶出液中ＨＣＰ値でのｌｏｇＨＣＰの標準的最小二乗解析であった。代替分析の結果から、洗浄塩化ナトリウムが有意な影響を有することと、かつカプリル酸ナトリウムと洗浄塩化ナトリウムとの相互作用、さらにはカプリル酸ナトリウムの個別の影響が存在することが示される（表１３）。
【０１３３】
【表１０】
2019163263.tif 000013
【０１３４】
【表１１】
2019163263.tif 000014
【０１３５】
【表１２】
2019163263.tif 000015
【０１３６】
【表１３】
2019163263.tif 000016
【０１３７】
図１６のデータは、ＨＣＰレベルに及ぼす３つの因子の影響を示している。カプリル酸ナトリウムレベルの増加は、ＨＣＰレベルに及ぼす最大の影響を示した。図１７には、洗浄塩化ナトリウムとカプリル酸ナトリウムとの相互作用が見られる。塩化ナトリウムの不在下では、カプリル酸ナトリウムを増加させると、ＨＣＰレベルが少し減少した（灰色の線）。しかしながら、塩化ナトリウムの存在下では、カプリル酸ナトリウムを増加させると、クリアランスがさらに低減された（黒色の線）。
【０１３８】
プロテアーゼ活性のバックワード分析により、すべての個々の因子（洗浄ｐＨ、洗浄塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウム）で有意な影響が同定され、さらにはカプリル酸ナトリウムと洗浄ｐＨとの相互作用、カプリル酸ナトリウムと洗浄塩化ナトリウムとの相互作用、および洗浄ｐＨと洗浄塩化ナトリウムとの相互作用が同定された。表１４の最後の列は、影響の有意性を示している。
【０１３９】
【表１４】
2019163263.tif 000017
【０１４０】
図１８は、各因子（洗浄ｐＨ、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウム）を増加させたときの濾過後のＨＣＰレベルに起因するプロテアーゼ活性の明確な減少を示している。図１９は、洗浄ｐＨとカプリル酸ナトリウムとの相互作用を示している。特定的には、カプリル酸ナトリウムの存在下では、活性の差はほとんどなかった。しかしながら、カプリル酸ナトリウムの不在下では、洗浄ｐＨの増加によりプロテアーゼ活性が低減した。
【０１４１】
図２０ＡおよびＢは、洗浄液中にカプリル酸ナトリウムを組み込む利点を示している。図２０Ａは、カプリル酸ナトリウムの不在下でのプロテアーゼ活性を示している。図２０Ｂは、カプリル酸ナトリウムの存在下でのプロテアーゼ活性を示している。カプリル酸ナトリウム（Ａ）の不在下では、高いｐＨおよび塩化ナトリウム濃度で最小の活性が観測された。これとは対照的に、低いｐＨおよび塩化ナトリウムレベルでは、最大の活性が観測された。しかしながら、カプリル酸ナトリウムの存在下では、等高線が変化した（Ｂ）。高ｐＨおよび無塩化ナトリウムでは、最大の値が観測された。洗浄塩化ナトリウムを増加させると、ｐＨ７および９の両方で活気を示さなかったので、等高線は平坦化されてｐＨの影響が除去された。図２１は、単一のグラフですべての影響を示している。
【０１４２】
ＨＣＰ除去を改善するために、洗浄液カプリル酸ナトリウムを最大値（すなわち１００ｍＭ）に設定した。（図２２）洗浄ｐＨをｐＨ８．１に設定した。なぜなら、ｐＨをそれ以上増加させると回収率が減少したからである。また、洗浄塩化ナトリウムを１．９Ｍに設定した。なぜなら、塩化ナトリウムレベルをそれ以上増加させると純度が低減したからである。カプリル酸ナトリウムおよびｐＨは、溶出液純度に影響を及ぼすことが、結果から確認される。しかしながら、この実施例では、３つすべての因子を増加させると純度が減少したが、実施例１のＩＬ−１８抗体では、カプリル酸ナトリウムの存在下で純度の増加が見られた。洗浄ｐＨを減少したときに回収率の低減が観測された以外は、３つの因子は、回収率にほとんど影響を及ぼさなかった。しかしながら、これは、他の因子からのノイズに帰属可能であった。カプリル酸ナトリウムのみは、溶出液中のＨＣＰに有意な影響を及ぼした。ｌｏｇ転換を行ってデータを線形モデルに転換した場合、洗浄塩化ナトリウムおよびカプリル酸ナトリウムを増加させるとＨＰＣ値が低減することが、結果ことから示唆された。ｐＨについても同じことが言えたが、影響はそれほど有意ではなかった。実施例１のＩＬ−１８抗体で見られたように、最適条件は、３つすべての因子をそれらの高値で含む。プロテアーゼ活性に及ぼす影響は、ＨＣＰに及ぼす全影響に現れた。それは予想されたことであった。結果の組合せから、３つすべての因子を組み合わせることにより、ＨＣＰ除去に関して改善された洗浄液が提供されることが示唆される。
【０１４３】
実施例３：ＨＣＰ低減に関する他の脂肪酸の評価
この実験の目的は、実施例１で使用したモノクローナル抗体［抗ＩＬ−１８抗体］を対象として、ＨＣＰ除去に及ぼすプロテインＡ洗浄緩衝液の成分としてのカプリル酸ナトリウム以外の脂肪酸の有効性を評価することであった。実施例１で抗ＩＬ−１８抗体に対して決定された最適条件である９．０の洗浄ｐＨおよび２．５Ｍの塩化ナトリウムを用いて、実験を行った。すべての実験洗浄緩衝液を１００ｍＭトリス中に作製し、９．０の最終ｐＨが達成されるようにＨＣｌまたはトリスを用いてｐＨ調整した。溶解性に基づいて、緩衝液のいくつかは、２．５Ｍ塩化ナトリウムを含んでいたが、他のものは、２．５Ｍ塩化ナトリウムを用いずに作製された（表１６参照）。実施例１に記載されるように、プロテインＡクロマトグラフィー緩衝液を調製し、手順は、実施例１に記載のものと同一であった。表１５は、不飽和脂肪酸のリストを提供し、表１６は、実験洗浄緩衝液に関する詳細を提供する。
【０１４４】
【表１５】
2019163263.tif 000018
【０１４５】
【表１６】
2019163263.tif 000019
【０１４６】
結果を表１７に示す。純度は、すべてのランで予想よりも低かった。しかしながら、純度の低減は、抗ＩＬ−１８抗体清澄化採取物の老化に起因しうるものであった。したがって、ＨＣＰクリアランスおよび回収率のみを評価し、前の実施例の対照ランと比較した。
【０１４７】
【表１７】
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【０１４８】
【表１８】
2019163263.tif 000021
【０１４９】
ラン１〜６の回収率は、２つの対照洗浄緩衝液のものに匹敵した。ラン７および８では、回収率の有意な低減が観測された（他のランのほぼ半分）。これらのランでは、クロマトグラフィーラン時、洗浄液で大きなピークが観測された。したがって、ドデカン酸ナトリウムおよびラウリン酸は、プロテインＡ洗浄緩衝液に添加した場合、回収率の損失をもたらすと思われる。
【０１５０】
図２３は、ラン１（短鎖脂肪酸酪酸ナトリウムを使用）の８５０ｎｇ／ｍｇ程度に高いものから８５ｎｇ／ｍｇ（ドデカン酸ナトリウムを使用）まで、濾過前のＨＣＰレベルの広範なレベル範囲を示している。これらの値が溶出液中ＨＣＰの減少を呈するものであるかを決定するために、それらを対照緩衝液と比較した。１００ｍＭトリス、２．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ９．０（＋１００ｍＭの脂肪酸）でラン１〜４を行って、同様に２．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する第２の対照ラン（表１８）と比較した。この対照は、５９９ｎｇ／ｍｇの濾過前プロテインＡ溶出液中ＨＣＰ濃度を達成した。したがって、酪酸ナトリウムおよび酪酸（ラン１および２）は両方とも、試験したレベルでＨＣＰのクリアランスの増加を示さなかったことが分かる。ヘキサン酸ナトリウム（ラン３）での値は、対照よりもわずかに小さかったことから（５９９ｎｇ／ｍｇと比較して５００ｍｇ／ｍｇ）、対照を上回った小さな低減が実証された。
【０１５１】
デカン酸ナトリウムおよびデカン酸（ｄｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）は、２．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液に溶解しなかった。したがって、それらは、塩化ナトリウムを含まない緩衝液（すなわち、１００ｍＭトリス、ｐＨ９．０）と比較するべきである。デカン酸ナトリウムおよびデカン酸（ｄｅｏｉｃ  ａｃｉｄ）で、それぞれ、６００ｎｇ／ｍｇから８５ｎｇ／ｍｌおよび９７ｎｇ／ｍｇに低減されたことは、ＨＣＰレベルの有意な低減を表している。これは、同一の条件下で得られたカプリル酸ナトリウムで得られた結果（２０６ｎｇ／ｍｇ）よりも少なかった。
【０１５２】
ドデカン酸ナトリウムおよびラウリン酸では、結果は、それぞれ、８８および９９ｎｇ／ｍｇであった。しかしながら、回収率は低かった（約４５％）。産物およびＨＣＰの両方がカラムから洗浄された可能性があるので、低い回収率が低いＨＣＰレベルを生じた可能性がある。しかしながら、さらなる最適化により、ＨＣＰ除去および回収率の両方に関して許容可能な条件を提供することが可能であった。
【０１５３】
ラン１〜４の濾過後の結果は、濾過前のものに匹敵する。ＨＣＰレベルが濾過後に低減されたのは、おそらく、濾過時に沈殿物が除去されたためであろう。
【０１５４】
デカン酸ナトリウムおよびデカン酸（ｄｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）のラン（ラン５および６）は、対照洗浄状態と比較して、改善されたＨＣＰ除去を呈した。興味深いことに、ＨＣＰレベルは、それぞれ、１４０ｎｇ／ｍｇおよび１３９ｎｇ／ｍｇであった。これらは、濾過前の値よりも高かった。これは、ＨＣＰアッセイの誤差による起因しうる。この変動にもかかわらず、平均および最高の結果は両方とも、対照緩衝液およびカプリル酸ナトリウムを含有する緩衝液の両方と比較して、ＨＣＰレベルの有意な低減を示す（表１９）。異なる脂肪酸洗浄緩衝液での溶出液中のＨＣＰレベルのまとめを図２３に提供する。
【０１５５】
【表１９】
2019163263.tif 000022
【０１５６】
評価された脂肪酸でＨＣＰの除去に広範な変動があったことは明らかである。酪酸ナトリウム、酪酸を含めて、短鎖脂肪酸およびそのナトリウム塩は、緩衝液対照よりも低いＨＣＰレベルをもたらさなかった。しかしながら、脂肪酸の鎖長を４から６に増加させたヘキサン酸ナトリウムおよびヘキサン酸の場合、ナトリウム塩では８４４ｎｇ／ｍｇから５０２ｎｇ／ｍｇに、脂肪酸では８４４ｎｇ／ｍｇから５９９ｎｇ／ｍｇに、ＨＣＰの低減が観測された。
【０１５７】
カプリル酸ナトリウムは、８個の炭素原子を含有し、中鎖脂肪酸（７〜１２個の炭素原子）として分類される。前の実施例で得られた結果から、カプリル酸ナトリウムは、１００ｍＭトリス、ｐＨ９中に１００ｍＭカプリル酸ナトリウムを含有する緩衝液で、ＨＣＰレベルを２０６ｍｇ／ｍｇに低減可能であることが実証された。同様に、デカン酸ナトリウム、デカン酸、ドデカン酸ナトリウム、およびラウリン酸の結果から、これらの脂肪酸もまた、ＨＣＰレベルを（１５０ｎｇ／ｍｇに）低減可能であることから、中鎖脂肪酸は、プロテインＡ洗浄緩衝液に組み込まれた場合、ＨＣＰを低減する能力を有することが示唆される。抗体精製時、たとえば、商品のコストを低減するために、高い回収率を維持することが重要であるので、ドデカン酸ナトリウムおよびラウリン酸で観測された回収率の低減は、完全に望ましいものではなかった。しかしながら、ＨＣＰレベルの低減とのバランスをとった場合、回収率の低減は、許容可能なこともある。
【０１５８】
多くの脂肪酸は、ＨＣＰレベルを低減するためにプロテインＡ洗浄緩衝液に組込み可能であることが、結果から実証される。一般的には、ＨＣＰレベルは、鎖長の増加に伴って減少した。特定的には、１２の鎖長を有する脂肪酸では、回収率に及ぼす潜在的に望ましくない影響が観測され、６の鎖長を有する脂肪酸では、ＨＣＰ除去の低減が観測されたので、中鎖長脂肪酸が最も望ましい候補でありうることが、結果から示唆される。しかしながら、プロテインＡ洗浄緩衝液でこれらの追加の脂肪酸が実用可能な成分となるように、条件を最適化することが可能でありうる。
【０１５９】
実施例４：プロテインＡクロマトグラフィー時のＨＣＰ除去に及ぼすカプリル酸塩洗浄緩衝液の影響
この実験の目的は、抗ＩＬ−１８抗体（ＮＣＩＭＢ受託番号４１７８６）を対象としてプロテインＡクロマトグラフィー時に宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去するためのカプリル酸塩洗浄緩衝液の有効性を試験することであった。２．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ９．０中、５０ｍＭの濃度で、カプリル酸の２つの形態、すなわち、カプリル酸ナトリウムおよびカプリル酸を試験した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕｒＲｅマトリックス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、２０ｃｍの床高さおよび３．９８ｍＬのカラム体積を有するＴｒｉｃｏｒｎ  ０．５ｍｍカラムにより、３５０ｃｍ／時の線流速で、４つのクロマトグラフィーランを行った。使用前、カラムを２カラム体積の０．５Ｍ水酸化ナトリウムで殺菌し、続いて、１５分間保持した。プロセス緩衝液およびカラム体積は、表２０に示される。使用後、カラムを２カラム体積の０．５Ｍ水酸化ナトリウムで殺菌し、続いて、１５分間保持した。溶出液ピーク捕集では、ＯＤは、１００ｍＡＵで開始し、１００ｍＡＵで終了した（０．５ＯＤ）。すべての画分をタンパク質濃度に関してＡ２８０でアッセイし、実施例１に記載のＧｙｒｏｓ  ＨＣＰアッセイを用いてＨＣＰを定量した。
【０１６０】
【表２０】
2019163263.tif 000023
【０１６１】
ラン２は、１つのカプリル酸ナトリウム洗浄液を使用し、第２の洗浄液を使用しない対照ランであった。しかしながら、第２の洗浄液が不在のため、溶出ピークの前縁で高い塩化ナトリウム濃度を生じた。この実験で使用した抗ＩＬ−１８抗体（ＮＣＩＭＢ受託番号４１７８６）は、高い塩濃度で相分離することが知られており、この溶出液でも相分離した。したがって、ラン２は、廃棄され、分析されなかった。ラン１、３、および４の結果はまた、表２１にも示される。
【０１６２】
【表２１】
2019163263.tif 000024
【０１６３】
カプリル酸は、ＨＣＰを排除可能であったが、試験したレベルではカプリル酸ナトリウムと同程度ではなかったことが、結果から示唆される。いずれの場合も、ＨＣＰレベルは、対照と比較して有意に低減された。対照溶出液では、ＨＣＰのレベルは、６８０ｎｇ／ｍＬであり、カプリル酸実験では、これが１／４に低減されて１５２ｎｇ／ｍｇとなり、カプリル酸ナトリウム実験では、１／３５に低減された。カプリル酸洗浄液の濃度を増加させることにより、溶出液中のＨＣＰをさらに低減することが可能である。カプリル酸およびカプリル酸ナトリウムは両方とも、プロテインＡ溶出液中のＨＣＰレベルを低減可能であることが、結果から実証される。
【０１６４】
実施例５：宿主細胞プロテアーゼ誘導粒子形成の低減
この実験の目的は、抗ＩＬ６抗体を対象として遅延発生粒子形成を研究することであった。遅延発生粒子形成は、５℃で６ヶ月後、５０ｍｇ／ｍＬの抗ＩＬ６抗体を含有する製剤で観測された。生物汚染度は、０ｃｆｕ／ｍＬであったことから、細菌汚染は示唆されない。粒子の質量スペクトル分析から、粒子は、抗ＩＬ６抗体および上昇レベルのフラグメントを含有することが判明した。重元素は、ＳＥＭにより検出されなかった。ＨＣＰは、２Ｄ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより検出されなかった（図２４）。
【０１６５】
プロテインＡ精製からの溶出液中のＨＣＰレベルは、ｐＨ７．５で２０ｍＭトリス、１Ｍ  ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液（「標準的洗浄緩衝液」）を使用した場合、１００ｎｇ／ｍｇ超であった。プロテインＡ精製時、１００ｍＭトリス、５０ｍＭカプリル酸ナトリウム、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．０を含有するカプリル酸塩洗浄液を組み込むことにより、ＨＣＰレベルは、１００ｎｇ／ｍｌ超から１０ｎｇ／ｍｌ未満に低減された。２８０ｎｍでのＵＶ検出を備えたＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ，Ｍｏｎｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、抗ＩＬ６抗体の純度を測定した。約２５０μｇのタンパク質をアッセイカラム上に注入した。可溶性凝集体、単量体、およびフラグメントの溶出を、それぞれ、約６〜８分、８．５分、および９〜１１．５分で行った。０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ硫酸ナトリウム、および０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有するｐＨ６．８の移動相を用いて、１．０ｍＬ／分の流量で、サンプルを２０分間アッセイした。
【０１６６】
最高ＨＣＰレベル（すなわち、約１００ｎｇ／ｍｇ超）を有する抗ＩＬ６抗体ロットで、ＳＥＣにより、４０℃でより高いフラグメント化率を検出した（図２５および２６）。１ｍＭ  ｐＨ７．０リン酸緩衝液中に抗ＩＬ６抗体サンプルを約１ｍｇ／ｍＬに希釈し、フラグメント化に関して逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により１０μＬの注入量を分析した。分析を行うために、水中０．１％ＴＦＡ（移動相Ａ、ｍｐＡ）およびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ（ｍｐＢ）を用いて、７５℃でグラジエント溶出により、Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）ＰＬＲＰ−Ｓ  ＣＭ８１００９２／００カラムを使用した。ｍｐＢのグラジエント（５％で３分、５〜３４％で３分、３４〜４４％で１６分、４４〜７５％で２．５分保持し、続いて、９５％で８分間のカラム状態調節を行った）を用いて、種を溶出させた。
【０１６７】
４０℃でＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した場合、フラグメント化率は、最高ＨＣＰレベル（すなわち、約１００ｎｇ／ｍｇ超）を有するロットでは約３％／月であったが、カプリル酸塩洗浄工程を用いて精製された、かなり低いＨＣＰレベルを有するかつ検出可能なプロテアーゼ活性のないロットは、かなり低い約２〜２．５％／月のフラグメント化率を有していた。
【０１６８】
１００ｎｇ／ｍｇ超のＨＣＰレベルを有するロットはすべて、目視検査に基づいて、遅延発生する目に見える粒子を形成した（表２４）。
【０１６９】
2019163263.tif 000025
【０１７０】
蛍光プロテアーゼアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）プロテアーゼアッセイキット）を実施して、ＨＣＰプロテアーゼに関連付けられる安定性を診断した。プロテアーゼ活性を有するロットはすべて、遅延発生粒子を形成した。これとは対照的に、カプリル酸塩洗浄液（白記号）を用いて精製されたロットは、プロテアーゼ活性を示さず（図２７参照）、遅延発生粒子を形成しなかった（表２５）。
【０１７１】
2019163263.tif 000026
【０１７２】
表２５に示される結果から、最も安定なロット（ロットＥ、Ｆ、およびＧ）は、プロテインＡ精製時にカプリル酸塩洗浄液を用いたロットであったことが明確に実証される。表２６に示されるように、プロテインＡ精製時に標準的洗浄が行われた、かつ高いＨＣＰレベルおよび検出可能なプロテアーゼ活性を示した、ロットＤは、３〜１２ヶ月で有意な粒子形成を呈した。これとは対照的に、ロットＤと同一の細胞培養培地から精製された、かつ有意により低いＨＣＰレベルを有していた、かつプロテアーゼ活性を有していなかった、ロットＥは、経時的にごくわずかな粒子形成を示した。したがって、プロテインＡ精製時にカプリル酸塩洗浄を用いてＨＣＰ／プロテアーゼレベルを低減すると、ＨＣＰプロテアーゼ誘導遅延発生粒子形成が軽減されると思われる。遅延発生粒子形成の最良予測因子は、高いＨＣＰレベルおよびプロテアーゼ活性であると考えられる。
【０１７３】
マイクロプレートＨＴＳフォーマットでＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）プロテアーゼアッセイキットを用いて、粒子形成ロットＢのアスパルチルプロテアーゼ活性およびセリンプロテアーゼ活性を調べた。結果を図２８に示す。ペプスタチン（アスパルチルプロテアーゼ阻害剤）は、劇的にプロテアーゼ活性を低減した。ＡＥＢＳＦ（セリンプロテアーゼ阻害剤）は、より高いｐＨでより小さい影響を及ぼした（他のセリン阻害剤もまた、影響を及ぼした）。他のクラスの阻害剤は、プロテアーゼ活性を低減しなかった（図示せず）。
【０１７４】
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【０１７５】
実施例６：精製プロセスの種々の時点での宿主細胞タンパク質の同定
この実施例では、抗ＩＬ６精製プロセスのいくつかの工程で、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびプロテアーゼ活性の高スループット診断の検査および同定を行った。細胞培養培地からのサンプル、次いで、標準的プロセスおよびカプリル酸塩プロセスの両方でプロテインＡインプロセス生成物のサンプル、ならびに標準的洗浄およびカプリル酸塩洗浄の両方でプロテインＡ工程からの洗浄画分のサンプル、を分析した。
【０１７６】
最終薬剤物質および任意の中間精製サンプルに存在するプロテアーゼの存在およびクラス／タイプの検出および診断を行うために、蛍光プロテアーゼアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）プロテアーゼアッセイキット）を種々の市販のプロテアーゼ阻害剤と共に使用した。ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）プロテアーゼアッセイキット（Ｅ６６３８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、サンプルのプロテアーゼ活性を評価した。キット中の検出基質は、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−カゼインコンジュゲートである。典型的には４〜８の範囲内のｐＨで、２０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液中にサンプルを１０倍希釈可能した。対応するプラセボを調製した。所望のｐＨが達成されるように２０ｍＭクエン酸と２０ｍＭ第二リン酸ナトリウムとを混合することにより、クエン酸リン酸緩衝液を調製した。試薬の調製を提供された手順に適合させた。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−カゼインコンジュゲート検出基質を適切な緩衝液中に希釈して、４〜８の各ｐＨで約１０μｇ／ｍＬの作用試薬を作製した。等体積（典型的には１００μＬ）のサンプルおよび作用試薬を白色マイクロプレートのウェルに添加して、ｐＨ範囲４〜８にわたるアッセイサンプルおよび対応するプラセボをトリプリケート方式で作製した。サンプルをシールし、３〜５時間の典型的な持続時間にわたり４０℃でインキュベートした。４８５ｎｍで色素蛍光を励起し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）蛍光プレートリーダー（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で４９５ｎｍカットオフフィルターを用いて５３０ｎｍの発光強度を記録した。次いで、サンプルの強度対ｐＨを記録した。この方法の変動に基づく製造業者のガイドラインに従って、ブランクと比較して約２０％未満のサンプル強度の増加は、プロテアーゼ活性に関して陰性であるとして処理した。サンプルの結果から緩衝液の分を引き算して、ｐＨに対してプロットし、これを用いて、サンプルのプロテアーゼ活性の存在を決定した。多重反復試験を行って、低い読み値の変動を評価した。相対定量のために、カテプシンＤやトリプシンなどの既知のプロテアーゼの対照調製物をコンパレーターとして使用した。プロテアーゼの存在を確認するために、プロテアーゼ阻害剤をサンプルに添加して、検出プロテアーゼ活性の相対的減少または排除を結果の確認に用いた。
【０１７７】
二次元質量分析（２Ｄ−ＭＳ）を用いて、細胞培養培地中および種々のプロテインＡ産物中および洗浄工程中のセリンプロテアーゼおよびアスパルチルプロテアーゼ（カテプシンＤ）を同定した。プロテアーゼを含めて、２６４種のＨＣＰを細胞培養培地中で同定した。標準的洗浄液を用いて、２４種のＨＣＰがプロテインＡ産物中に観測された。これとは対照的に、カプリル酸塩洗浄液を用いて、８種のＨＣＰのみがプロテインＡ産物中に認められた。カプリル酸塩処理によりＨＣＰ低減が達成されたことが、結果から明確に実証される。
【０１７８】
最終薬剤物質中のプロテアーゼレベルは非常に低いので、質量分析を用いたカテプシンＤの存在の陽性同定を可能にするのに十分な高プロテアーゼレベルを有するサンプルを作製するために、アスパルチルプロテアーゼのアフィニティー精製および富化および濃縮が必要であった（固定化ペプスタチン７８６−７８９、Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯを用いて）。アフィニティー精製を用いて、最終薬剤物質中のプロテアーゼを同定した。固定化ペプスタチン（７８６−７８９、Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、薬剤物質からのアスパルチルプロテアーゼのキャプチャー、富化、および溶出を行った。２Ｄ質量分析により富化サンプルを分析して、プロテアーゼを同定した。この親和性樹脂材料は、アスパルチルプロテアーゼに結合するリガンドを含有する。製造業者の手順に従って、アスパルチルプロテアーゼを親和性樹脂に結合し、抗ＩＬ６抗体を洗浄除去し、最後に、さらなる分析および同定のために、富化／濃縮されたキャプチャーされたアスパルチルプロテアーゼをカラムから溶出させた。検出能力を向上させるために、大量の薬剤物質を用いて、これらのサンプルの濃縮／富化を行った。
【図１】
2019163263.tif 000028
【図２】
2019163263.tif 000029
【図３】
2019163263.tif 000030
【図４】
2019163263.tif 000031
【図５】
2019163263.tif 000032
【図６】
2019163263.tif 000033
【図７】
2019163263.tif 000034
【図８】
2019163263.tif 000035
【図９】
2019163263.tif 000036
【図１０Ａ−Ｂ】
2019163263.tif 000037
【図１０Ｃ】
2019163263.tif 000038
【図１１】
2019163263.tif 000039
【図１２】
2019163263.tif 000040
【図１３】
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【図１４】
2019163263.tif 000042
【図１５】
2019163263.tif 000043
【図１６】
2019163263.tif 000044
【図１７】
2019163263.tif 000045
【図１８】
2019163263.tif 000046
【図１９】
2019163263.tif 000047
【図２０】
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【図２１】
2019163263.tif 000049
【図２２】
2019163263.tif 000050
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月10日(2019.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え産生ポリペプチドを含む組成物中の宿主細胞タンパク質レベルを低減する方法であって、
前記組換え産生ポリペプチドと１種以上の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）とを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む洗浄緩衝液で前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄してＨＣＰを除去することと、
を含み、前記洗浄緩衝液が約１．０Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、方法。
【請求項２】
前記ＨＣＰが１種以上のプロテアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＣＰが、セリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、およびそれらの組合せから選択される１種以上のプロテアーゼを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＣＰがカテプシンＤを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記洗浄緩衝液が約８．５〜約９のｐＨを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記洗浄緩衝液が約９のｐＨを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記洗浄緩衝液が、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．０Ｍ〜約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記洗浄緩衝液が、約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記洗浄緩衝液が、約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が抗ＩＬ−１８抗体または抗ＩＬ６抗体またはそれらのフラグメントである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞培養採取物を清澄化して清澄化細胞培養採取物を取得し、前記清澄化細胞培養採取物を前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムに充填する工程を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記カラムを前記洗浄緩衝液で洗浄する前に、充填された前記プロテインＡカラムを平衡化緩衝液で平衡化することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記平衡化緩衝液がリン酸ナトリウムを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記平衡化緩衝液が約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記平衡化緩衝液が約６〜約８のｐＨで約２０ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記平衡化緩衝液が約７のｐＨで約２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記カラムを前記脂肪酸洗浄緩衝液で洗浄した後、第２の洗浄工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の洗浄緩衝液がリン酸ナトリウムを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の洗浄緩衝液が約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の洗浄緩衝液が約６〜約８のｐＨで約２０ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の洗浄緩衝液が約７のｐＨで約２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換えタンパク質を回収することが、前記組換えタンパク質を前記プロテインＡカラムから溶出緩衝液で溶出させることを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記溶出緩衝液がクエン酸ナトリウムを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記溶出緩衝液が約２５ｍＭ〜約２００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記溶出緩衝液が約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記溶出緩衝液が約２．０〜約５．０のｐＨを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記溶出緩衝液が約３．０〜約４．０のｐＨを有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記溶出緩衝液が約３．５のｐＨで約１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法により精製された組換え産生ポリペプチド。
【請求項３１】
前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントを含む、請求項３０に記載の組換え産生ポリペプチド。
【請求項３２】
前記組換え産生ポリペプチドが抗ＩＬ−１８抗体または抗ＩＬ６抗体である、請求項３０に記載の組換え産生ポリペプチド。
【請求項３３】
プロテインＡクロマトグラフィーカラムで宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換え産生ポリペプチドを分離するための洗浄緩衝液であって、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び約１．０Ｍ〜約２．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、洗浄緩衝液。
【請求項３４】
前記洗浄緩衝液が約２Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、請求項３３に記載の洗浄緩衝液。
【請求項３５】
前記洗浄緩衝液が約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、請求項３４に記載の洗浄緩衝液。
【請求項３６】
前記洗浄緩衝液が約８．５〜約９のｐＨを有する、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項３７】
前記洗浄緩衝液が約９のｐＨを有する、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項３８】
前記洗浄緩衝液が、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．０Ｍ〜約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項３９】
前記洗浄緩衝液が約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項４０】
前記洗浄緩衝液が、約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【請求項４１】
前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項３３〜４０のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
最終薬剤物質中のプロテアーゼレベルは非常に低いので、質量分析を用いたカテプシンＤの存在の陽性同定を可能にするのに十分な高プロテアーゼレベルを有するサンプルを作製するために、アスパルチルプロテアーゼのアフィニティー精製および富化および濃縮が必要であった（固定化ペプスタチン７８６−７８９、Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯを用いて）。アフィニティー精製を用いて、最終薬剤物質中のプロテアーゼを同定した。固定化ペプスタチン（７８６−７８９、Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、薬剤物質からのアスパルチルプロテアーゼのキャプチャー、富化、および溶出を行った。２Ｄ質量分析により富化サンプルを分析して、プロテアーゼを同定した。この親和性樹脂材料は、アスパルチルプロテアーゼに結合するリガンドを含有する。製造業者の手順に従って、アスパルチルプロテアーゼを親和性樹脂に結合し、抗ＩＬ６抗体を洗浄除去し、最後に、さらなる分析および同定のために、富化／濃縮されたキャプチャーされたアスパルチルプロテアーゼをカラムから溶出させた。検出能力を向上させるために、大量の薬剤物質を用いて、これらのサンプルの濃縮／富化を行った。
本発明の様々な態様を以下に示す。
１．宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換え産生ポリペプチドを分離する方法であって、
前記ＨＣＰと前記組換え産生ポリペプチドとを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄してＨＣＰを除去することと、
前記組換え産生ポリペプチドを回収することと、
を含む、方法。
２．宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換え産生ポリペプチドを分離する方法であって、  プロテインＡクロマトグラフィーカラムを平衡化緩衝液で平衡化することと、
前記プロテインＡクロマトグラフィーカラム上に清澄化細胞培養上清を充填することと、
充填された前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを前記平衡化緩衝液で再平衡化することと、
充填された前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを、少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む第１の洗浄緩衝液で洗浄して、ＨＣＰを除去することと
充填された前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを第２の洗浄緩衝液で洗浄することと、
前記組換え産生ポリペプチドを溶出緩衝液で溶出させることと、
を含む、方法。
３．組換え産生ポリペプチドを含む製剤中のプロテアーゼ汚染を低減する方法であって、  ＨＣＰと前記組換え産生ポリペプチドとを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、  前記清澄化細胞培養上清をプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄してＨＣＰを除去することと、
前記組換え産生ポリペプチドを回収することと、
前記製剤を調製することと、
を含む、方法。
４．組換え産生ポリペプチドの安定性を向上させる方法であって、
前記組換え産生ポリペプチドと１種以上の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）とを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄してＨＣＰを除去することと、
前記組換え産生ポリペプチドを回収することと、
回収された前記組換え産生ポリペプチドを含む製剤を調製することと、
を含む、方法。
５．組換え産生ポリペプチドを含む組成物中の宿主細胞タンパク質レベルを低減する方法であって、
前記組換え産生ポリペプチドと１種以上の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）とを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄してＨＣＰを除去することと、
を含む、方法。
６．前記ＨＣＰが１種以上のプロテアーゼを含む、上記５に記載の方法。
７．前記ＨＣＰが、セリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、およびそれらの組合せから選択される１種以上のプロテアーゼを含む、上記５に記載の方法。
８．前記ＨＣＰがカテプシンＤを含む、上記５に記載の方法。
９．組換え産生ポリペプチドを含む組成物中のカテプシンＤを低減する方法であって、
前記組換え産生ポリペプチドとカテプシンＤとを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄してカテプシンＤを除去することと、を含む、方法。
１０．前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が６〜１２炭素原子である、上記１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が８〜１２炭素原子である、上記１〜９のいずれかに記載の方法。
１２．前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が８〜１０炭素原子である、上記１〜９のいずれかに記載の方法。
１３．前記脂肪酸または脂肪酸塩が、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、およびそれらの組合せから選択される、上記１〜１０のいずれかに記載の方法。
１４．前記洗浄緩衝液がカプリル酸またはカプリル酸塩を含む、上記１３に記載の方法。１５．前記洗浄緩衝液が約２５ｍＭ〜約２００ｍＭの脂肪酸を含む、上記１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．前記洗浄緩衝液が約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの脂肪酸を含む、上記１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．前記洗浄緩衝液が塩化ナトリウムを含む、上記１〜１６のいずれかに記載の方法。１８．前記洗浄緩衝液が約１．０Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で前記塩化ナトリウムを含む、上記１７に記載の方法。
１９．前記洗浄緩衝液が約２Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、上記１７に記載の方法。
２０．前記洗浄緩衝液が約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、上記１７に記載の方法。
２１．前記洗浄緩衝液が約７〜約９のｐＨを有する、上記１〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．前記洗浄緩衝液が約８〜約９のｐＨを有する、上記１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．前記洗浄緩衝液が約８．５〜約９のｐＨを有する、上記１〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．前記洗浄緩衝液が約９のｐＨを有する、上記１〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．前記洗浄緩衝液が約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む、上記１〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．前記洗浄緩衝液が、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．０Ｍ〜約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む、上記１〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．前記洗浄緩衝液が、約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む、上記１〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．前記洗浄緩衝液が、約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む、上記１〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、上記１〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．前記抗体が抗ＩＬ−１８抗体または抗ＩＬ６抗体またはそれらのフラグメントである、上記２９に記載の方法。
３１．細胞培養採取物を清澄化して清澄化細胞培養採取物を取得し、前記清澄化細胞培養採取物を前記プロテインＡクロマトグラフィーカラムに充填する工程を含む、上記１〜３０のいずれかに記載の方法。
３２．前記カラムを前記洗浄緩衝液で洗浄する前に、充填された前記プロテインＡカラムを平衡化緩衝液で平衡化することをさらに含む、上記１〜３１のいずれかに記載の方法。３３．前記平衡化緩衝液がリン酸ナトリウムを含む、上記３２に記載の方法。
３４．前記平衡化緩衝液が約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、上記３３に記載の方法。
３５．前記平衡化緩衝液が約６〜約８のｐＨで約２０ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、上記３４に記載の方法。
３６．前記平衡化緩衝液が約７のｐＨで約２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、上記３５に記載の方法。
３７．前記カラムを前記脂肪酸洗浄緩衝液で洗浄した後、第２の洗浄工程をさらに含む、上記１および３〜９のいずれかに記載の方法。
３８．前記第２の洗浄緩衝液がリン酸ナトリウムを含む、上記３７に記載の方法。
３９．前記第２の洗浄緩衝液が約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、上記３８に記載の方法。
４０．前記第２の洗浄緩衝液が約６〜約８のｐＨで約２０ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、上記３８に記載の方法。
４１．前記第２の洗浄緩衝液が約７のｐＨで約２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、上記３７に記載の方法。
４２．前記組換えタンパク質を回収することが、前記組換えタンパク質を前記プロテインＡカラムから溶出緩衝液で溶出させることを含む、上記１〜４１のいずれかに記載の方法。
４３．前記溶出緩衝液がクエン酸ナトリウムを含む、上記４２に記載の方法。
４４．前記溶出緩衝液が約２５ｍＭ〜約２００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、上記４３に記載の方法。
４５．前記溶出緩衝液が約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、上記４３に記載の方法。
４６．前記溶出緩衝液が約２．０〜約５．０のｐＨを有する、上記４２に記載の方法。
４７．前記溶出緩衝液が約３．０〜約４．０のｐＨを有する、上記４６に記載の方法。
４８．前記溶出緩衝液が約３．５のｐＨで約１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、上記４２に記載の方法。
４９．上記１〜４８のいずれかに記載の方法により精製された組換え産生ポリペプチド。５０．前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントを含む、上記４９に記載の組換え産生ポリペプチド。
５１．前記組換え産生ポリペプチドが抗ＩＬ−１８抗体または抗ＩＬ６抗体である、上記４９に記載の組換え産生ポリペプチド。
５２．プロテインＡクロマトグラフィーカラムで宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換え産生ポリペプチドを分離するための洗浄緩衝液であって、少なくとも６炭素原子の鎖長を有する脂肪酸または脂肪酸塩を含む、洗浄緩衝液。
５３．前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が６〜１２炭素原子である、上記５２に記載の洗浄緩衝液。
５４．前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が８〜１２炭素原子である、上記５２に記載の洗浄緩衝液。
５５．前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が８〜１０炭素原子である、上記５２に記載の洗浄緩衝液。
５６．前記脂肪酸または脂肪酸塩が、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、およびそれらの組合せから選択される、上記５２または５３に記載の洗浄緩衝液。
５７．前記洗浄緩衝液がカプリル酸またはカプリル酸塩を含む、上記５６に記載の洗浄緩衝液。
５８．前記洗浄緩衝液が約２５ｍＭ〜約２００ｍＭの脂肪酸を含む、上記５２〜５７のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
５９．前記洗浄緩衝液が約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの脂肪酸を含む、上記５２〜５８のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
６０．前記洗浄緩衝液が塩化ナトリウムを含む、上記５２〜５９のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
６１．前記洗浄緩衝液が約１．０Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、上記６０に記載の洗浄緩衝液。
６２．前記洗浄緩衝液が約２Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、上記６１に記載の洗浄緩衝液。
６３．前記洗浄緩衝液が約２．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含む、上記６２に記載の洗浄緩衝液。
６４．前記洗浄緩衝液が約７〜約９のｐＨを有する、上記５２〜６３のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
６５．前記洗浄緩衝液が約８〜約９のｐＨを有する、上記５２〜６４のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
６６．前記洗浄緩衝液が約８．５〜約９のｐＨを有する、上記５２〜６５のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
６７．前記洗浄緩衝液が約９のｐＨを有する、上記５２〜６６のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
６８．前記洗浄緩衝液が約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む、上記５２〜６７のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
６９．前記洗浄緩衝液が、約８〜約９のｐＨで約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．０Ｍ〜約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む、上記５２〜６８のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
７０．前記洗浄緩衝液が約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む、上記５２〜６９のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
７１．前記洗浄緩衝液が、約９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス中に約１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムと約２．５Ｍの塩化ナトリウムとを含む、上記５２〜７０のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
７２．前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、上記５２〜７１のいずれかに記載の洗浄緩衝液。