(57)【要約】【課題】アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＤ）の治療をｍＲＮＡ治療に基づいて行う改善された方法及び組成物を提供する。【解決手段】本発明は、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＤ）を治療するための、ｍＲＮＡ治療に基づく方法及び組成物を提供する。詳しくは、本発明は、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を、ＡＳＤの症状または特徴の少なくとも１つを、強度、重症度、若しくは頻度の点で低減させる、または発症を遅延させるような有効用量及び投与間隔で、治療を必要としている被検体に投与することによりＡＳＤを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを、１個以上のリポソーム内に封入する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリポソームは、カチオン性脂質または非カチオン性脂質（複数可）、コレステロール系脂質（複数可）及びＰＥＧ修飾脂質（複数可）を含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１３年１０月２２日に出願された、米国仮特許出願第６１／８９４,２９４号に対する優先権を主張するものであり、その開示は参照により本願に組み入れられたものとする。
【背景技術】
【０００２】
アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＤ）は、酵素アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）の遺伝子変異を特徴とする、常染色体劣性遺伝による遺伝性代謝疾患であり、シトルリン、アスパラギン酸塩及び他の分子に対するこの酵素の結合能力に影響を及ぼす。ＡＳＳタンパク質の欠陥により尿素サイクルが攪乱され、過剰な窒素が肝臓で適切に尿素にプロセッシングされなくなる。アンモニア及び尿素サイクルの他の副生成物（シトルリンなど）の蓄積は有毒であり、この蓄積が生後数日で出現すると、脱力（嗜眠）、哺乳不良、嘔吐、痙攣及び意識消失などの症状を引き起こす。現在、この疾患の治療法はなく、食事管理、タンパク質含有量の多い食事の最小限化、並びにアルギニン及びフェニル酢酸の栄養補助食品による治療が標準である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、特に、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＤ）の治療をｍＲＮＡ治療に基づいて行う改善された方法及び組成物を提供する。本発明には、リポソーム内に封入した、ヒトＡＳＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを投与することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質が高効率かつ持続的に産生され、臨床的に意義のある疾患マーカーであるアンモニア血漿濃度を低下させることに成功したという知見が包含される。
【０００４】
一態様では、本発明は、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を、ＡＳＤの症状または特徴の少なくとも１つを、強度、重症度、若しくは頻度の点で低減させる、または発症を遅延させるような有効用量及び投与間隔で、治療を必要としている被検体に投与することを含む、ＡＳＤ治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡをリポソーム内に封入する。
【０００５】
別の態様では、本発明は、ＡＳＳ１をコードするｍＲＮＡをリポソーム内に有効用量封入して含む、ＡＳＤを治療するための組成物を提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、好適なリポソームには、１種以上のカチオン性脂質、１種以上の非カチオン性脂質、１種以上のコレステロール系脂質及び１種以上のＰＥＧ修飾脂質が含まれる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、かかる１種以上のカチオン性脂質は、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、並びにその組み合わせ、からなる群から選択される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、かかる１種以上のカチオン性脂質は、式Ｉ-ｃ１−ａの化合物
【化１】
2019163322.tif 000002
、またはその薬理学的に許容される塩を含み、式中、
各Ｒ２は互いに独立して水素またはＣ１−３アルキル基であり、
各ｑは互いに独立して２〜６であり、
各Ｒ'は互いに独立して水素またはＣ１−３アルキル基であり、
各ＲＬは互いに独立してＣ８−１２アルキル基である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、かかる１種以上のカチオン性脂質は、ｃＫＫ−Ｅ１２
【化２】
2019163322.tif 000003
を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明に好適な前述の１種以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、及びその組み合わせから選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、前述の１種以上のコレステロール系脂質は、コレステロール、ＰＥＧ化コレステロール及びＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキシアミドコレステロール（ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ））、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジンから選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、リポソームは、１種以上のＰＥＧ修飾脂質をさらに含む。いくつかの実施形態では、かかる１種以上のＰＥＧ修飾脂質は、鎖長Ｃ６−Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合している鎖長が最高５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、Ｎ−オクタノイルスフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］のような誘導体化したセラミドである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾した、すなわちＰＥＧ化した脂質はＰＥＧ化コレステロールまたはジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）−ＰＥＧ−２Ｋである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、ｃＫＫ−Ｅ１２と、ＤＯＰＥと、コレステロールとＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００と、ＤＯＰＥと、コレステロールとＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３と、ＤＯＰＥと、コレステロールとＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥと、ＤＯＰＥと、コレステロールとＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、から選択される組み合わせを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）は、モル比で、リポソームの約３０〜６０％（例えば、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）は、モル比で、リポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％を構成する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）と、非カチオン性脂質（複数可）（例えば、ＤＯＰＥ）と、コレステロール系脂質（複数可）（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）との比は、それぞれ、約３０〜６０：２５〜３５：２０〜３０：１〜１５であってよい。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）と、非カチオン性脂質（複数可）（例えば、ＤＯＰＥ）と、コレステロール系脂質（複数可）（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）との比は、それぞれ、約４０：３０：２０：１０である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）と、非カチオン性脂質（複数可）（例えば、ＤＯＰＥ）と、コレステロール系脂質（複数可）（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）との比は、それぞれ、約４０：３０：２５：５である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）と、非カチオン性脂質（複数可）（例えば、ＤＯＰＥ）と、コレステロール系脂質（複数可）（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）との比は、それぞれ、約４０：３２：２５：３である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）と、非カチオン性脂質（複数可）（例えば、ＤＯＰＥ）と、コレステロール系脂質（複数可）（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）との比は、約５０：２５：２０：５である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、リポソームのサイズはリポソーム粒子の最長直径で決定する。いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、サイズが約５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、または５０ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、サイズが約１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、または６０ｎＭ未満である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを、範囲が約０．１〜５．０ｍｇ／ｋｇ体重の用量、例えば、約０．１〜４．５、０．１〜４．０、０．１〜３.５、０．１〜３．０、０．１〜２．５、０．１〜２．０、０．１〜１.５、０．１〜１．０、０．１〜０．５、０．１〜０．３、０．３〜５．０、０．３〜４．５、０．３〜４．０、０．３〜３.５、０．３〜３．０、０．３〜２．５、０．３〜２．０、０．３〜１.５、０．３〜１．０、０．３〜０．５、０．５〜５．０、０．５〜４．５、０．５〜４．０、０．５〜３.５、０．５〜３．０、０．５〜２．５、０．５〜２．０、０．５〜１.５、または０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重で投与する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを、約５．０、４.５、４．０、３.５、３．０、２.５、２．０、１.５、１．０、０．８、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重以下の用量で投与する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、提供組成物を静脈内に投与する。いくつかの実施形態では、提供組成物を経肺送達により投与する。ある実施形態では、経肺送達は、エアゾール化、吸入、噴霧化または点眼法により実施される。いくつかの実施形態では、提供組成物を、吸入可能な粒子、噴霧化可能な脂質、または吸入可能な乾燥粉末として製剤化する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、提供組成物を１日１回、週１回、月２回、月１回投与する。いくつかの実施形態では、提供組成物を、７日に１回、１０日に１回、１４日に１回、２８日に１回または３０日に１回投与する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＡＳＳ１タンパク質を肝臓に発現させる。いくつかの実施形態では、提供組成物を投与することにより、肝臓総タンパク質中のＡＳＳ１タンパク質が約１００ｎｇ／ｍｇ以上の量（例えば、約２００ｎｇ／ｍｇ、４００ｎｇ／ｍｇ、５００ｎｇ／ｍｇ、１０００ｎｇ／ｍｇ、２０００ｎｇ／ｍｇまたは３０００ｎｇ／ｍｇ以上）の量で発現する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、組成物を投与することにより、ＡＳＳ１タンパク質血清濃度が上昇する。いくつかの実施形態では、組成物を投与することにより、ＡＳＳ１タンパク質血清濃度が治療前のベースラインのＡＳＳ１タンパク質血清濃度と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、３倍、４倍または５倍上昇する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、組成物を投与することにより、被検体のシトルリン量が治療前ベースラインのシトルリン量より低下する。いくつかの実施形態では、組成物を投与することにより、血漿中シトルリン量が治療前ベースラインの血漿中シトルリン量と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下する。いくつかの実施形態では、組成物を投与することにより、血漿中シトルリン量を約２０００μＭ、１５００μＭ、１０００μＭ、７５０μＭ、５００μＭ、２５０μＭ、１００μＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、６０μＭ、５０μＭ、４０μＭ、または３０μＭより少ない値まで低下させる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、組成物を投与することにより、被検体のアンモニア濃度が治療前のベースラインのアンモニア濃度より低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物を投与することにより、血漿中または血清中のアンモニア濃度を約３０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２７５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約２５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２２５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約２０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１７５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約１５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１２５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約１０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約７５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約１００μｍｏｌ／Ｌ以下、または約５０μｍｏｌ／Ｌ以下まで低下させる。特定の実施形態では、提供組成物を投与することにより、血漿中または血清中のアンモニア濃度を約５０μｍｏｌ／Ｌ以下まで低下させる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、提供組成物を投与することにより、生体試料中のアンモニア濃度を、治療前のベースラインのアンモニア濃度に比較して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％低下させる。好適な生体試料は、全血、血清、血漿、または尿であってよい。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはコドンが最適化されている。いくつかの実施形態では、コドンが最適化されたｍＲＮＡは、配列番号３、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５（コドンが最適化された、ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡ配列に相当する）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４の５’ＵＴＲ配列（５’ＵＴＲ配列Ｘに相当する）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号５の３’ＵＴＲ配列（３’ＵＴＲ配列Ｙに相当する）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６の３’ＵＴＲ配列（３’ＵＴＲ配列Ｙに相当する）を含む。いくつかの実施形態では、コドンが最適化されたｍＲＮＡは、配列番号７または配列番号８（コドンが最適化された、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列を有するヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡ配列に相当する）を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、かかる１つ以上の修飾ヌクレオチドは、プソイドウリジン、Ｎ−１−メチル−プソイドウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニルシチジン、Ｃ−５プロピニルウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び／または２−チオシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは修飾されていない。
【００２７】
特定の実施形態では、本発明は、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）をコードするｍＲＮＡを有効用量リポソーム内に封入して含む、ＡＳＤを治療するための組成物を提供し、これにおいて、かかるｍＲＮＡは、配列番号３、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５を含み、さらに、かかるリポソームは、カチオン性脂質または非カチオン性脂質、コレステロール系脂質及びＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００２８】
特定の実施形態では、本発明は、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）をコードするｍＲＮＡを有効用量リポソーム内に封入して含む、ＡＳＤを治療するための組成物を提供し、これにおいて、かかるｍＲＮＡは、配列番号７または配列番号８を含み、さらに、かかるリポソームは、カチオン性脂質または非カチオン性脂質、コレステロール系脂質及びＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００２９】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以降に記載の発明を実施するための形態、図面及び請求項において明らかである。しかしながら、発明を実施するための形態、図面、及び請求項は、本発明の実施形態を指してはいるが、あくまで例示的なものに過ぎず、それに限定されないことを理解されるべきである。本発明の範囲内でのさまざまな変更及び修正は当業者には明らかとなるであろう。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＤ）を治療する方法であって、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を、ＡＳＤの症状または特徴の少なくとも１つを、強度、重症度、若しくは頻度の点で低減させる、または発症を遅延させるような有効用量及び投与間隔で、治療を必要としている被検体に投与することを含む、前記治療方法。
（項目２）
ｍＲＮＡをリポソーム内に封入する、項目１に記載の方法。
（項目３）
リポソームが、１種以上のカチオン性脂質、１種以上の非カチオン性脂質、１種以上のコレステロール系脂質及び１種以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
１種以上のカチオン性脂質が、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉＮ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、並びにその組み合わせからなる群から選択されるカチオン性脂質を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
１種以上のカチオン性脂質が、ｃＫＫ−Ｅ１２
【化６】
2019163322.tif 000004
を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
１種以上の非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、項目３〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
１種以上のコレステロール系脂質が、コレステロール及び／またはＰＥＧ化コレステロールである、項目３〜６に記載の方法。
（項目８）
１種以上のＰＥＧ修飾脂質が、鎖長Ｃ６−Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合している鎖長が最高５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目３〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
カチオン性脂質が、重量で、リポソームの約３０〜５０％を構成する、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
カチオン性脂質が、重量で、リポソームの約４０％を構成する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の比が、モル比で約４０：３０：２０：１０である、項目３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の比が、重量で約４０：３０：２５：５である、項目３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の比が、重量で約４０：３２：２５：３である、項目３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
リポソームが、
ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；
Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；
ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；または
ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ
から選択される組み合わせを含む、項目２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
リポソームのサイズが約１００ｎＭ未満である、項目２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
ｍＲＮＡを、範囲が約０．１〜５．０ｍｇ／ｋｇ体重の有効用量で投与する、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
ｍＲＮＡを、範囲が約０．１〜３．０ｍｇ／ｋｇ体重の有効用量で投与する、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
ｍＲＮＡを、範囲が約０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重の有効用量で投与する、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
組成物を静脈内に投与する、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
組成物を週１回投与する、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
組成物を週２回投与する、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
組成物を月２回投与する、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
組成物を月１回投与する、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
組成物を１４日に１回投与する、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
ＡＳＳ１タンパク質が、肝臓に発現する、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
組成物の投与により、肝臓の総タンパク質量中ＡＳＳ１タンパク質量の発現量が約１００ｎｇ／ｍｇ以上になる、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
組成物の投与により、ＡＳＳ１タンパク質血清濃度が上昇する、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
組成物の投与により、被検体のシトルリン量が治療前ベースラインのシトルリン量と比較して低下する、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
組成物の投与により、被検体のアンモニア濃度が治療前ベースラインのアンモニア濃度と比較して低下する、項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
組成物の投与により、アンモニア血漿濃度が約５０μｍｏｌ／Ｌ以下まで低下する、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
組成物の投与により、アンモニア血漿濃度が約３００μｍｏｌ／Ｌ以下まで低下する、項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
組成物の投与により、アンモニア血漿濃度が約１５００μｍｏｌ／Ｌ以下まで低下する、項目１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
ｍＲＮＡがコドンが最適化されているｍＲＮＡである、項目１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
コドンが最適化されたｍＲＮＡが、配列番号３、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
ｍＲＮＡが、配列番号４の５’ＵＴＲ配列をさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
ｍＲＮＡが、配列番号５または配列番号６の３’ＵＴＲ配列をさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
ｍＲＮＡは、配列番号７または配列番号８を含む、項目１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、項目１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
１つ以上の修飾ヌクレオチドが、プソイドウリジン、Ｎ−１−メチル−プソイドウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニルシチジン、Ｃ−５プロピニルウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び／または２−チオシチジンを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
ｍＲＮＡが修飾されていない、項目１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
カチオン性脂質ｃＫＫ−Ｅ１２
【化７】
2019163322.tif 000005
を含むリポソーム内にアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）をコードするｍＲＮＡを有効用量封入した、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＤ）を治療するための組成物。
（項目４２）
リポソームが１種以上の非カチオン性脂質、１種以上のコレステロール系脂質、及び１種以上のＰＥＧ修飾脂質をさらに含む、項目４１に記載の組成物。
（項目４３）
１種以上の非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、項目４２に記載の組成物。
（項目４４）
１種以上のコレステロール系脂質が、コレステロール及び／またはＰＥＧ化コレステロールから選択される、項目４２または４３に記載の組成物。
（項目４５）
１種以上のＰＥＧ修飾脂質が、鎖長Ｃ６−Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合している鎖長が最高５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目４２〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４６）
リポソームが、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む、項目４１〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４７）
カチオン性脂質が、モル比で、リポソームの約３０〜５０％を構成する、項目４１〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４８）
カチオン性脂質が、モル比で、リポソームの約４０％を構成する、項目４７に記載の組成物。
（項目４９）
ｃＫＫ−Ｅ１２：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの比が、モル比で約４０：３０：２０：１０である、項目４６〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５０）
ｃＫＫ−Ｅ１２：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの比が、モル比で約４０：３０：２５：５である、項目４２〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５１）
ｃＫＫ−Ｅ１２：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの比が、モル比で約４０：３２：２５：３である、項目４２〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５２）
リポソームのサイズが約１００ｎＭ未満である、項目４１〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５３）
組成物を、静脈内投与用に製剤化する、項目４１〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５４）
ｍＲＮＡが、配列番号３配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５を含む、項目４１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５５）
ｍＲＮＡが、配列番号４の５’ＵＴＲ配列をさらに含む、項目５４に記載の組成物。
（項目５６）
ｍＲＮＡが、配列番号５または配列番号６の３’ＵＴＲ配列をさらに含む、項目５４に記載の組成物。
（項目５７）
ｍＲＮＡが、配列番号７または配列番号８を含む、項目４１〜５６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５８）
アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＤ）を治療するための組成物であって、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）をコードするｍＲＮＡを有効用量リポソーム内に封入して含み、ここで、前記ｍＲＮＡは、配列番号３、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５を含み、さらに、前記リポソームは、カチオン性脂質または非カチオン性脂質、コレステロール系脂質及びＰＥＧ修飾脂質を含む、前記組成物。
（項目５９）
アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＤ）を治療するための組成物であって、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）をコードするｍＲＮＡを有効用量リポソーム内に封入して含み、ここで、前記ｍＲＮＡは、配列番号７または配列番号８を含み、さらに、前記リポソームは、カチオン性脂質または非カチオン性脂質、コレステロール系脂質及びＰＥＧ修飾脂質を含む、前記組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
図面はあくまでも例示に過ぎず、それに限定されるものではない。
【図１】図１は、さまざまな用量でのヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子による治療後にＥＬＩＳＡにより検出された例示的ＡＳＳ１タンパク質量を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄは、ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子を静脈内に単回投与した後の肝臓中ヒトＡＳＳ１タンパク質量を、用量と相関する要素として比較した例示的ウエスタンブロットを示す。複数のＣＤ１マウスを投与から２４時間後に屠殺し、各肝臓を回収して上記のように解析した。ヒトＡＳＳ１タンパク質を２Ｈ８マウスのモノクローナル抗体を使用して検出した。肝臓総タンパク質５０マイクログラムを各ウェルに入れた。組換えヒトＡＳＳ１タンパク質を陽性対照として各ゲルに担持させた（Ｒ５対照）。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｄは、ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子を静脈内に単回投与した後の肝臓中ヒトＡＳＳ１タンパク質量を、用量と相関する要素として比較した例示的ウエスタンブロットを示す。複数のＣＤ１マウスを投与から２４時間後に屠殺し、各肝臓を回収して上記のように解析した。ヒトＡＳＳ１タンパク質を２Ｈ８マウスのモノクローナル抗体を使用して検出した。肝臓総タンパク質５０マイクログラムを各ウェルに入れた。組換えヒトＡＳＳ１タンパク質を陽性対照として各ゲルに担持させた（Ｒ５対照）。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｄは、ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子を静脈内に単回投与した後の肝臓中ヒトＡＳＳ１タンパク質量を、用量と相関する要素として比較した例示的ウエスタンブロットを示す。複数のＣＤ１マウスを投与から２４時間後に屠殺し、各肝臓を回収して上記のように解析した。ヒトＡＳＳ１タンパク質を２Ｈ８マウスのモノクローナル抗体を使用して検出した。肝臓総タンパク質５０マイクログラムを各ウェルに入れた。組換えヒトＡＳＳ１タンパク質を陽性対照として各ゲルに担持させた（Ｒ５対照）。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｄは、ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子を静脈内に単回投与した後の肝臓中ヒトＡＳＳ１タンパク質量を、用量と相関する要素として比較した例示的ウエスタンブロットを示す。複数のＣＤ１マウスを投与から２４時間後に屠殺し、各肝臓を回収して上記のように解析した。ヒトＡＳＳ１タンパク質を２Ｈ８マウスのモノクローナル抗体を使用して検出した。肝臓総タンパク質５０マイクログラムを各ウェルに入れた。組換えヒトＡＳＳ１タンパク質を陽性対照として各ゲルに担持させた（Ｒ５対照）。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡで測定したヒトのアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）タンパク質の蓄積量を例示的グラフで示したものである。検出されたタンパク質は、脂質ナノ粒子（ＡＳＳ１  ｍＲＮＡを１．０ｍｇ／ｋｇ封入）の静脈内単回投与によりＡＳＳ１  ｍＲＮＡが送達された結果、経時的に産生されたものである。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅは、ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子（用量１．０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に単回投与した後の、経時的な肝臓中ヒトＡＳＳ１タンパク質量を例示的ウエスタンブロットで示している。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｅは、ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子（用量１．０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に単回投与した後の、経時的な肝臓中ヒトＡＳＳ１タンパク質量を例示的ウエスタンブロットで示している。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｅは、ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子（用量１．０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に単回投与した後の、経時的な肝臓中ヒトＡＳＳ１タンパク質量を例示的ウエスタンブロットで示している。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｅは、ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子（用量１．０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に単回投与した後の、経時的な肝臓中ヒトＡＳＳ１タンパク質量を例示的ウエスタンブロットで示している。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子（用量１．０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に単回投与した後の、経時的な肝臓中ヒトＡＳＳ１タンパク質量を例示的ウエスタンブロットで示している。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｉは、各処置マウスの肝臓におけるｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるヒトＡＳＳ１メッセンジャーＲＮＡの検出を示す。外因性ｍＲＮＡは、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子の単回投与（１．０ｍｇ／ｋｇ）を行った後少なくとも７日間は観察可能である。ヒトＡＳＳ１ｍＲＮＡは類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｉは、各処置マウスの肝臓におけるｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるヒトＡＳＳ１メッセンジャーＲＮＡの検出を示す。外因性ｍＲＮＡは、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子の単回投与（１．０ｍｇ／ｋｇ）を行った後少なくとも７日間は観察可能である。ヒトＡＳＳ１ｍＲＮＡは類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｉは、各処置マウスの肝臓におけるｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるヒトＡＳＳ１メッセンジャーＲＮＡの検出を示す。外因性ｍＲＮＡは、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子の単回投与（１．０ｍｇ／ｋｇ）を行った後少なくとも７日間は観察可能である。ヒトＡＳＳ１ｍＲＮＡは類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｉは、各処置マウスの肝臓におけるｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるヒトＡＳＳ１メッセンジャーＲＮＡの検出を示す。外因性ｍＲＮＡは、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子の単回投与（１．０ｍｇ／ｋｇ）を行った後少なくとも７日間は観察可能である。ヒトＡＳＳ１ｍＲＮＡは類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｉは、各処置マウスの肝臓におけるｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるヒトＡＳＳ１メッセンジャーＲＮＡの検出を示す。外因性ｍＲＮＡは、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子の単回投与（１．０ｍｇ／ｋｇ）を行った後少なくとも７日間は観察可能である。ヒトＡＳＳ１ｍＲＮＡは類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。
【図５Ｆ】図５Ａ〜５Ｉは、各処置マウスの肝臓におけるｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるヒトＡＳＳ１メッセンジャーＲＮＡの検出を示す。外因性ｍＲＮＡは、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子の単回投与（１．０ｍｇ／ｋｇ）を行った後少なくとも７日間は観察可能である。ヒトＡＳＳ１ｍＲＮＡは類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。
【図５Ｇ】図５Ａ〜５Ｉは、各処置マウスの肝臓におけるｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるヒトＡＳＳ１メッセンジャーＲＮＡの検出を示す。外因性ｍＲＮＡは、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子の単回投与（１．０ｍｇ／ｋｇ）を行った後少なくとも７日間は観察可能である。ヒトＡＳＳ１ｍＲＮＡは類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。
【図５Ｈ】図５Ａ〜５Ｉは、各処置マウスの肝臓におけるｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるヒトＡＳＳ１メッセンジャーＲＮＡの検出を示す。外因性ｍＲＮＡは、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子の単回投与（１．０ｍｇ／ｋｇ）を行った後少なくとも７日間は観察可能である。ヒトＡＳＳ１ｍＲＮＡは類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。
【図５Ｉ】図５Ａ〜５Ｉは、各処置マウスの肝臓におけるｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるヒトＡＳＳ１メッセンジャーＲＮＡの検出を示す。外因性ｍＲＮＡは、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子の単回投与（１．０ｍｇ／ｋｇ）を行った後少なくとも７日間は観察可能である。ヒトＡＳＳ１ｍＲＮＡは類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｉは、ｃＫＫ−Ｅ１２脂質ナノ粒子を含有するＡＳＳ１  ｍＲＮＡ１ｍｇ／ｋｇの投与後の、さまざまな測定時点におけるマウス肝臓中のＡＳＳ１タンパク質量を例示的に免疫組織化学染色で示している。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の単回投与後少なくとも１週間は検出可能である。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｉは、ｃＫＫ−Ｅ１２脂質ナノ粒子を含有するＡＳＳ１  ｍＲＮＡ１ｍｇ／ｋｇの投与後の、さまざまな測定時点におけるマウス肝臓中のＡＳＳ１タンパク質量を例示的に免疫組織化学染色で示している。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の単回投与後少なくとも１週間は検出可能である。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｉは、ｃＫＫ−Ｅ１２脂質ナノ粒子を含有するＡＳＳ１  ｍＲＮＡ１ｍｇ／ｋｇの投与後の、さまざまな測定時点におけるマウス肝臓中のＡＳＳ１タンパク質量を例示的に免疫組織化学染色で示している。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の単回投与後少なくとも１週間は検出可能である。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｉは、ｃＫＫ−Ｅ１２脂質ナノ粒子を含有するＡＳＳ１  ｍＲＮＡ１ｍｇ／ｋｇの投与後の、さまざまな測定時点におけるマウス肝臓中のＡＳＳ１タンパク質量を例示的に免疫組織化学染色で示している。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の単回投与後少なくとも１週間は検出可能である。
【図６Ｅ】図６Ａ〜６Ｉは、ｃＫＫ−Ｅ１２脂質ナノ粒子を含有するＡＳＳ１  ｍＲＮＡ１ｍｇ／ｋｇの投与後の、さまざまな測定時点におけるマウス肝臓中のＡＳＳ１タンパク質量を例示的に免疫組織化学染色で示している。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の単回投与後少なくとも１週間は検出可能である。
【図６Ｆ】図６Ａ〜６Ｉは、ｃＫＫ−Ｅ１２脂質ナノ粒子を含有するＡＳＳ１  ｍＲＮＡ１ｍｇ／ｋｇの投与後の、さまざまな測定時点におけるマウス肝臓中のＡＳＳ１タンパク質量を例示的に免疫組織化学染色で示している。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の単回投与後少なくとも１週間は検出可能である。
【図６Ｇ】図６Ａ〜６Ｉは、ｃＫＫ−Ｅ１２脂質ナノ粒子を含有するＡＳＳ１  ｍＲＮＡ１ｍｇ／ｋｇの投与後の、さまざまな測定時点におけるマウス肝臓中のＡＳＳ１タンパク質量を例示的に免疫組織化学染色で示している。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の単回投与後少なくとも１週間は検出可能である。
【図６Ｈ】図６Ａ〜６Ｉは、ｃＫＫ−Ｅ１２脂質ナノ粒子を含有するＡＳＳ１  ｍＲＮＡ１ｍｇ／ｋｇの投与後の、さまざまな測定時点におけるマウス肝臓中のＡＳＳ１タンパク質量を例示的に免疫組織化学染色で示している。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の単回投与後少なくとも１週間は検出可能である。
【図６Ｉ】図６Ａ〜６Ｉは、ｃＫＫ−Ｅ１２脂質ナノ粒子を含有するＡＳＳ１  ｍＲＮＡ１ｍｇ／ｋｇの投与後の、さまざまな測定時点におけるマウス肝臓中のＡＳＳ１タンパク質量を例示的に免疫組織化学染色で示している。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、類洞壁細胞並びに肝細胞で検出可能である。ヒトＡＳＳ１タンパク質は、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の単回投与後少なくとも１週間は検出可能である。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂは、ＡＳＳ１ｍＲＮＡ含有ｃＫＫ−Ｅ１２リポソーム１ｍｇ／ｋｇ投与後２４時間のマウス肝臓中のＡＳＳ１タンパク質量を、低倍率（４×）免疫組織化学染色で示している。未処置マウスの肝臓（左）と比較すると、肝臓全体にわたりヒトＡＳＳ１タンパク質の広範な分布が示されている。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂは、ＡＳＳ１ｍＲＮＡ含有ｃＫＫ−Ｅ１２リポソーム１ｍｇ／ｋｇ投与後２４時間のマウス肝臓中のＡＳＳ１タンパク質量を、低倍率（４×）免疫組織化学染色で示している。未処置マウスの肝臓（左）と比較すると、肝臓全体にわたりヒトＡＳＳ１タンパク質の広範な分布が示されている。
【図８】図８は、ＥＬＩＳＡで測定したヒトのアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）タンパク質量を例示的にグラフで示す。検出されたタンパク質は、各種の脂質ナノ粒子の静脈内単回投与によりＡＳＳ１  ｍＲＮＡが送達された結果産生されたものである。
【図９】図９は、ＡＳＳ１ｍＲＮＡをＡＳＳ１ＫＯ細胞株（ＳＫ（−））にトランスフェクションした後の、タンパク質への１４Ｃアルギニンの取り込みを、安定発現陽性ＡＳ１細胞株（ＳＫ（＋）、クローン＃５）と比較したものを示す。対照は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみで処置したＳＫ（−）細胞である。
【図１０】図１０は、ＡＳＳ１ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子投与後２４時間のラット肝臓中のヒトＡＳＳ１タンパク質量を示す。
【図１１】図１１は、１．０ｍｇ／ｋｇのＡＳＳ１ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を１４日に１回、３０日間投与したＡＳＳ１ノックアウトマウスのアンモニア血漿濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
本発明がより容易に理解されるよう、特定の用語を最初に下記に定義する。以下の用語及び他の用語のさらなる定義は、本明細書を通して記載される。発明の背景を説明し、その実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物及び他の参照資料は、参照により本明細書に取り込まれる。
【００３２】
アルキル：本明細書で使用する場合、「アルキル」とは、炭素原子１〜１５個を有する直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素基のラジカル（「Ｃ１−１５アルキル」）をいう。いくつかの実施形態では、アルキル基は、炭素原子を１〜３個有する（「Ｃ１−３アルキル」）。Ｃ１−３アルキル基の例としては、メチル基（Ｃ１）、エチル基（Ｃ２）、Ｎ−プロピル基（Ｃ３）、及びイソプロピル基（Ｃ３）が挙げられる。いくつかの実施形態では、アルキル基は、炭素原子を８〜１２個有する（「Ｃ８−１２アルキル」）。Ｃ８−１２アルキル基の例としては、ｎオクチル基（Ｃ８）、Ｎ−ノニル基（Ｃ９）、Ｎ−デシル基（Ｃ１０）、Ｎ−ウンデシル基（Ｃ１１）、Ｎ−ドデシル基（Ｃ１２）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。接頭辞「Ｎ−」（ｎｏｒｍａｌ）とは、分岐していないアルキル基をいう。例えば、Ｎ−Ｃ８アルキル基は−（ＣＨ２）７ＣＨ３などを指し、Ｎ−Ｃ１０アルキル基は−（ＣＨ２）９ＣＨ３などを指す。
【００３３】
アミノ酸：本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、その最も広い意味において、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質をいう。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は天然に生じるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり、実施形態によっては、アミノ酸はｄ−アミノ酸であり、実施形態によっては、アミノ酸はｌ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に生じるペプチドに一般に見られる２０の標準ｌ−アミノ酸の任意のものをいう。「非標準アミノ酸」とは、合成して調製したのか、または天然資源から得たのかにかかわらず、上記の標準アミノ酸以外のあらゆるアミノ酸をいう。本明細書で使用する場合、「合成アミノ酸」は化学的に修飾したアミノ酸を包含し、これには、塩類、アミノ酸誘導体（アミド類など）、及び／または置換が含まれるが、これらに限定されるものではない。アミノ酸は、ペプチドのカルボキシ末端及び／またはアミノ末端にあるアミノ酸を含めて、ペプチドの循環血中半減期をその活性に悪影響を及ぼすことなく変化させ得るメチル化、アミド化、アセチル化、保護基、及び／または、他の化学基との置換により修飾可能である。アミノ酸はジスルフィド結合に関与していてよい。アミノ酸は、１種以上の化学的実体（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分等）との会合のような１つまたは翻訳後修飾を含んでよい。用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」と同じ意味で使用され、遊離のアミノ酸及び／またはペプチドのアミノ酸残基を指すことがある。用語が遊離のアミノ酸を指すのか、またはペプチドの残基を指すのかは、その用語が使用されている文脈から明らかとなるであろう。
【００３４】
動物：本明細書で使用する場合、用語「動物」とは、動物界の任意のメンバーをいう。いくつかの実施形態では、「動物」とは、任意の発達段階にあるヒトをいう。いくつかの実施形態では、「動物」とは、任意の発達段階にある非ヒト動物をいう。ある実施形態では、かかる非ヒト動物は哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または虫類が含まれるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、動物はトランスジェニック動物、遺伝子工学処理動物、及び／またはクローンであってよい。
【００３５】
約（Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）または約（ａｂｏｕｔ）：本明細書で使用する場合、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」は、１つ以上の対象となる値に付される場合、記載されている基準値と同様の値をいう。ある実施形態では、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」とは、記載されている基準値からいずれの方向（より大またはより小）においても２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の値以内に入る数値範囲をいうが、他に断りがあるかまたは文脈から他の意味が明らかな場合はその限りではない（ただし、このような数値が可能値の１００％を超える場合を除く）。
【００３６】
生物学的に活性である：本明細書で使用する場合、語句「生物学的に活性である」とは、生物系、特に生物において活性がある任意の薬剤の特性をいう。例えば、生物に投与した場合にその生物に対して生物学的作用がある薬剤は、生物学的に活性であると見なされる。
【００３７】
送達：本明細書で使用する場合、用語「送達」は、局所送達及び全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達というときは、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードしたタンパク質が発現して標的組織内に保持される状況（「局所分布」または「局所送達」とも呼ばれる）、及び、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードしたタンパク質が発現して患者の循環血液系内（例えば、血清）に分泌され、全身に分布し他組織に取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも呼ばれる）を包含する。
【００３８】
発現：本明細書で使用する場合、核酸配列の「発現」とは、ｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳、多数のポリペプチドから一つの完全タンパク質（例えば、酵素）の構築、及び／または１つのポリペプチドまたは完全に構築されたタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾をいう。本願では、用語「発現」及び「産生」、及び文法上の同等表現は、同じ意味で使用される。
【００３９】
機能的：本明細書で使用する場合、「機能的」生物学的分子は、その特徴とされる特性及び／または活性を示す形態にある、生物学的分子である。
【００４０】
半減期：本明細書で使用する場合、用語「半減期」は、核酸若しくはタンパク質の濃度または活性のようなある量が、ある期間開始時の測定値の半分まで減少するのに要する時間である。
【００４１】
改善する（Ｉｍｐｒｏｖｅ）、上昇する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）、または低下させる（ｒｅｄｕｃｅ）：本明細書で使用する場合、用語「改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）」、「上昇する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、（「低下させる（ｒｅｄｕｃｅ）」）、または文法上の同等表現は、本明細書に記載の治療開始前の同一個人における測定値、または本明細書に記載の治療を行わない一個の対照被検体（または複数の対照被検体）における測定値、といったベースライン測定値と比較した値を指す。「対照被検体」とは、治療される被検体と同一の疾患型に罹患しており、治療される被検体とほぼ同じ年齢の被検体である。
【００４２】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用する場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」とは、多細胞生物内ではなく人工的環境、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養中などにおいて発現する事象をいう。
【００４３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ：本明細書で使用する場合、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」とは、ヒト及び非ヒト動物のような多細胞生物体内で発現する事象をいう。細胞由来系の文脈では、かかる用語を使用して生きた細胞内に発現する事象をいう場合がある（これは、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系とは対照的である）。
【００４４】
単離された：本明細書で使用する場合、用語「単離された」とは、物質及び／または実体で、（１）初めに産生されたときに（自然界及び／または実験的設定において）、それが会合していた成分の少なくとも一部から分離されているもの、並びに／または（２）人の手により作製、調製、及び／または製造が行われたものをいう。単離された物質及び／または実体は、それらが初めに会合していた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％以上から分離されてよい。いくつかの実施形態では、単離された物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％以上の純度である。本明細書で使用する場合、他の成分が実質的に含まれていない場合、物質は「純粋」である。本明細書で使用する場合、単離された、物質及び／または実体の純度計算には、添加剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）を含めないものとする。
【００４５】
局所的な分布または送達：本明細書で使用する場合、用語「局所分布」、「局所送達」、または文法上の同等表現は、組織特異的な送達または分布をいう。典型的に、局所的な分布または送達では、ｍＲＮＡでコードされるタンパク質（例えば、酵素）が翻訳され、細胞内で発現するかまたは限定的に分泌されて、患者の循環血液系に入らないようにさせる必要がある。
【００４６】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用する場合、用語「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをいう。ｍＲＮＡは、本明細書で使用する場合、修飾ＲＮＡ及び非修飾ＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード領域及び非コード領域を含有してよい。ｍＲＮＡは、天然資源から精製し、組換え発現系を用いて作製することができ、任意選択で精製、化学的合成などが可能である。適切な場合、例えば、化学合成した分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基若しくは糖類、骨格修飾などを有する類似体のようなヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、特に明記しない限り５’から３’の方向で提示される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニルシチジン、Ｃ−５プロピニルウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）；化学的修飾塩基；生物学的修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレートした塩基；修飾糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及び六炭糖）；及び／または修飾リン酸基（例えば、チオリン酸エステル結合及び５’−Ｎ−アミド亜リン酸エステル結合）である、またはこれらを含んでいる。
【００４７】
核酸：本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、その最も広い意味において、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれる、または組み込まれ得る、任意の化合物及び／または物質をいう。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれる、または組み込まれ得る、化合物及び／または物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）をいう。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖をいう。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ並びに、一本鎖及び／若しくは二本鎖のＤＮＡ及び／若しくはｃＤＮＡを包含する。
【００４８】
患者：本明細書で使用する場合、用語「患者」または「被検体」とは、例えば、試験、診断、予防、美容、及び／または治療を目的として提供組成物が投与され得る任意の生物をいう。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／またはヒトなどの哺乳類）が含まれる。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。ヒトには、出生前及び出生後の両形態が含まれる。
【００４９】
薬理学的に許容される：用語「薬理学的に許容される」は、本明細書で使用する場合、正しい医学的判断の範囲内で、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適であり、過渡の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症がなく、妥当な利益／リスクの度合いに見合った物質をいう。
【００５０】
薬理学的に許容される塩：薬理学的に許容される塩は、当技術分野において周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、薬理学的に許容される塩についてＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１−１９で詳細に記載している。本発明の化合物の薬理学的に許容される塩には、好適な無機及び有機の酸及び塩基に由来する塩が挙げられる。薬理学的に許容される、非毒性酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸のような無機酸で形成されるアミノ基、または、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸若しくはマロン酸のような有機酸で形成されるアミノ基、または、イオン交換法のような当該技術分野で使用される他の方法を使用して形成されるアミノ基、の塩である。他の薬理学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が挙げられる。適切な塩基由来の塩としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム及びＮ＋（Ｃ１−４アルキル）４の塩が挙げられる。代表的アルカリまたはアルカリ土類の金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等が挙げられる。さらなる薬理学的に許容される塩としては、適切な場合には、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成される、非毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられる。さらなる薬理学的に許容される塩としては、四級化アルキルアミノ塩を形成するための適切な求電子剤、例えば、ハロゲン化アルキルを使用してアミンの四級化により形成される塩が挙げられる。
【００５１】
全身的な分布または送達：本明細書で使用する場合、用語「全身分布」、「全身送達」、または文法上の同等表現は、身体全体または生物体全体に影響が及ぶ送達または分布の、機構または方法をいう。典型的には、全身分布または全身送達は、体の循環系、例えば、血流を介して達成される。「局所的な分布または送達」の定義と対比される。
【００５２】
被検体：本明細書で使用する場合、用語「被検体」とは、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）をいう。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、被検体はヒトである。被検体は患者であり得、疾患の診断または治療のために医療提供者を訪れるヒトを指す。用語「被検体」は、本明細書では「個人」または「患者」と同じ意味で使用される。被検体は、疾患または障害に罹患している、または罹患しやすい被検体であり得るが、その疾患または障害の症状を呈していてもいなくてもよい。
【００５３】
実質的に：本明細書で使用する場合、用語「実質的に」とは、対象とする特徴または特性の範囲または程度が完全またはほぼ完全に示されている定性的条件をいう。生物学分野の当業者は、生物学的及び化学的現象が、完全に終了する、及び／または、完了まで進行する、または、絶対的な結果を達成若しくは回避することは、生じたとしてもまれであることを理解できよう。したがって、用語「実質的に」は、本明細書では、多くの生物学的及び化学的現象に固有の、完全性に欠ける可能性を捕捉するために使用する。
【００５４】
標的組織：本明細書で使用する場合、用語「標的組織」とは、治療すべき疾患に罹患している任意の組織をいう。いくつかの実施形態では、標的組織には、疾患に関連する病理、症状、または特徴を示す組織が含まれる。
【００５５】
治療的有効量：本明細書で使用する場合、治療剤の「治療的有効量」とは、疾患、障害、及び／または病態に罹患しているまたは罹患しやすい被検体に投与した場合に、疾患、障害、及び／または病態の症状（複数可）を治療する、診断する、予防する、及び／またはその発症を遅延させるのに十分である量を意味する。治療的有効量は、典型的には、少なくとも１つの単位用量を含む投与レジメンで投与されることは当業者には理解されるであろう。
【００５６】
治療：本明細書で使用する場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、特定の疾患、障害、及び／または病態の症状若しくは特徴の１つ以上について、部分的または完全に、回復させる、改善する、軽減させる、抑制する、予防する、発症を遅延させる、重症度を低減させる、及び／または発生率を低下させるために使用される任意の方法をいう。治療は、疾患の徴候を示していない、及び／または疾患の初期徴候しか示していない被検体に、疾患に関連した病理の発症リスクを低下させることを目的として施行してよい。
【００５７】
（詳細な説明）
本発明は、特に、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＤ）を治療するための、ｍＲＮＡ治療に基づく方法及び組成物を提供する。詳しくは、本発明は、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を、ＡＳＤの症状または特徴の少なくとも１つを、強度、重症度、若しくは頻度の点で低減させる、または発症を遅延させるような有効用量及び投与間隔で、治療を必要としている被検体に投与することによりＡＳＤを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを、１個以上のリポソーム内に封入する。本明細書で使用する場合、用語「リポソーム」とは、任意の層状、多重層状、または固体のナノ粒子の小胞をいう。典型的に、リポソームは、本明細書で使用する場合、１種以上の脂質の混合または１種以上の脂質とポリマー（複数可）との混合により形成することができる。したがって、用語「リポソーム」は、本明細書で使用する場合、脂質系ナノ粒子及びポリマー系ナノ粒子の両方を包含する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリポソームは、カチオン性脂質または非カチオン性脂質（複数可）、コレステロール系脂質（複数可）及びＰＥＧ修飾脂質（複数可）を含有する。
【００５８】
アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＤ）
本発明は、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＤ）に罹患しているかまたは罹患しやすい被検体を治療するために使用してよい。ＡＳＤは、酵素アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）の遺伝子変異を特徴とする、常染色体劣性遺伝による遺伝性代謝疾患である。Ｉ型ＡＳＤを引き起こす少なくとも５０の変異がＡＳＳ１遺伝子で同定されている。これらの変異の大部分で、単一アミノ酸の置換が関与している。ＡＳＳ１遺伝子内の変異の多くは、その結果として作られるタンパク質の構造及びそのタンパク質のシトルリン、アスパラギン酸塩及び他の分子に対する結合能力に影響を与える可能性が高い。ＡＳＳ１遺伝子内変異のうちの少数は、通常より異常に短い酵素を産生させ、その酵素は尿素サイクルでの役割を有効に果たすことができない。
【００５９】
ＡＳＳ１タンパク質の欠陥により尿素サイクルが攪乱され、肝臓が、タンパク質がエネルギーに利用される際に生成される過剰な窒素を適切に尿素に処理するのを妨げる。アンモニア及び尿素サイクルの他の副生成物（シトルリンなど）の蓄積は有毒であり、この蓄積が生後数日で発症した場合、脱力（嗜眠）、哺乳不良、嘔吐、痙攣及び意識消失などの症状を引き起こす。これらの医学的問題は、多くの場合、生命を脅かす可能性がある。
【００６０】
本明細書に記載する組成物及び方法は、ＡＳＤの症状または特徴の少なくとも１つを治療するために使用してよい。
【００６１】
アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）
いくつかの実施形態では、本発明は、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＤ）を治療するために、ＡＳＳ１をコードするｍＲＮＡを被検体に送達する方法及び組成物を提供する。好適なＡＳＳ１ｍＲＮＡは、天然に生じるＡＳＳ１タンパク質活性の置き換え可能、かつ／またはＡＳＤに関連した１つ以上の症状の強度、重症度、及び／または頻度を低下させることができる、ＡＳＳ１タンパク質の完全長、断片または部分の任意をコードする。
【００６２】
いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ配列はヒトＡＳＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列である。天然に生じるヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を表１に示す。
【表１−１】
2019163322.tif 000006
【表１−２】
2019163322.tif 000007
【００６３】
いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡは、配列（配列番号１）の野生型ｈＡＳＳ１ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡは、下記に示す配列のような、コドンを最適化したｈＡＳＳ１配列であってよい
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（配列番号３）。
【００６４】
さらなる例示的なｍＲＮＡ配列は、下記実施例の項に記載されており、例えば、配列番号７及び配列番号８はいずれも、ＡＳＳ１をコードするコドン最適化済みｍＲＮＡの枠付けをする５’及び３’の非翻訳領域を含んでいる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ配列は、ヒトＡＳＳ１タンパク質の相同体または類似体ｍＲＮＡ配列であってよい。例えば、ヒトＡＳＳ１タンパク質の相同体または類似体は、野生型または天然に生じるヒトＡＳＳ１タンパク質と比べた場合、アミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入を１つ以上含有し、実質的なＡＳＳ１タンパク質活性は維持されている修飾ヒトＡＳＳ１タンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、本発明に好適なｍＲＮＡは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が配列番号２と相同であるアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に好適なｍＲＮＡは、ヒトＡＳＳ１タンパク質と実質的に同一なタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に好適なｍＲＮＡは、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が、配列番号２と同一であるアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に好適なｍＲＮＡは、ヒトＡＳＳ１タンパク質の断片または部分をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に好適なｍＲＮＡは、ヒトＡＳＳ１タンパク質の断片または部分をコードし、これにおいて、かかるタンパク質の断片または部分は野生型タンパク質のＡＳＳ１活性と同様の活性をそのまま維持している。いくつかの実施形態では、本発明に好適なｍＲＮＡは、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と同一であるヌクレオチド配列を有する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡは、別のタンパク質に融合させた（例えば、Ｎ末端またはＣ末端での融合）ＡＳＳ１タンパク質の完全長、断片または部分を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＡＳＳ１タンパク質の完全長、断片または部分をコードするｍＲＮＡに融合させたタンパク質は、シグナルまたは細胞標的配列をコードする。
【００６７】
送達ビヒクル
本発明によれば、本明細書に記載する、ＡＳＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ（例えば、ＡＳＳ１タンパク質の完全長、断片または部分）は、裸のＲＮＡ（包み込まれていない）として、または送達ビヒクルを介して送達してよい。本明細書で使用する場合、用語「送達ビヒクル」、「運搬（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ビヒクル」、「ナノ粒子」または文法上の同等表現は同じ意味で使用される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＡＳＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡは、単一送達ビヒクルを介して送達してよい。いくつかの実施形態では、ＡＳＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡは、それぞれの組成物が異なる１種以上の送達ビヒクルを介して送達してよい。さまざまな実施形態によれば、好適な送達ビヒクルとしては、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー系担体、脂質ナノ粒子及び脂質リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然由来エキソソーム及び合成由来エキソソーム、天然、合成及び半合成の層状体、ナノ粒子状物質、リン酸カルシウムまたはケイ酸カルシウムのナノ粒子状物質、リン酸カルシウムナノ粒子状物質、二酸化ケイ素ナノ粒子状物質、ナノ結晶粒子、半導体ナノ粒子状物質、ポリ（Ｄ−アルギニン）、ゾルまたはゲル、ナノデンドリマー（ｎａｎｏｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、デンプン系送達システム、ミセル、エマルジョン、ニオソーム、マルチドメイン−ブロックポリマー（ビニルポリマー、ポリプロピルアクリル酸ポリマー、動的ポリ複合体）、乾燥散剤、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド並びに他のベクタータグが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６９】
リポソーム送達ビヒクル
いくつかの実施形態では、好適な送達ビヒクルはリポソーム送達ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子である。本明細書で使用する場合、リポソーム送達ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子は、通常、１つ以上の二重層でなる膜により外側の媒体から隔離した水性画分を内部に有する顕微鏡的小胞として特徴付けられる。リポソームの二重膜は、典型的に、空間的に分離された親水性領域と疎水性領域を含む、合成または天然由来の脂質のような両親媒性分子で形成される（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８）。リポソームの二重膜は、両染性（ａｍｐｈｏｐｈｉｌｉｃ）のポリマー及び界面活性剤（例えば、ポリメロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）、ニオソーム等）で形成することもできる。本発明の文脈において、リポソーム送達ビヒクルは、典型的に、標的とする細胞または組織に所望のｍＲＮＡを輸送するために機能する。
【００７０】
カチオン性脂質
いくつかの実施形態では、リポソームは、１種以上のカチオン性脂質を含んでよい。本明細書で使用する場合、語句「カチオン性脂質」とは、生理的ｐＨなどの選択ｐＨで実効正電荷を有する多数の脂質種の任意のものをいう。幾つかのカチオン性脂質は文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物及び方法での使用に特に好適なカチオン性脂質は、国際特許公開ＷＯ２０１０／０５３５７２（及び、特に、段落[００２２５]に記載のＣＩ２−２００）及びＷＯ２０１２／１７０９３０に記載のものであり、これらはともに参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、本発明の組成物及び方法は、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００２）などの２０１２年３月２９日出願Ｕ．Ｓ．特許仮出願第６１／６１７，４６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のイオン化可能なカチオン性脂質を含む、脂質ナノ粒子を使用する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、提供リポソームは、ＷＯ２０１３０６３４６８、並びに、本出願と同日付で同時出願されたＵ．Ｓ．仮出願（名称「メッセンジャーＲＮＡの送達のための脂質製剤（Ｌｉｐｉｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｓｓｅｒｎｇｅｒ  ＲＮＡ）」）に記載のカチオン性脂質を含み、これらはいずれも参照により本明細書に取り込まれる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ-ｃ１−ａ
【化３】
2019163322.tif 000008
、の化合物またはその薬理学的に許容される塩を含み、式中、
各Ｒ２は互いに独立して水素またはＣ１−３アルキル基であり、
各ｑは互いに独立して２〜６であり、
各Ｒ'は互いに独立して水素またはＣ１−３アルキル基であり、
各ＲＬは互いに独立してＣ８−１２アルキル基である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は互いに独立して水素、メチル基またはエチル基である。いくつかの実施形態では、各Ｒ２は互いに独立して水素またはメチル基である。いくつかの実施形態では、各Ｒ２は水素である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、各ｑは互いに独立して３〜６である。いくつかの実施形態では、各ｑは互いに独立して３〜５である。いくつかの実施形態では、各ｑは４である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、各Ｒ'は互いに独立して水素、メチル基またはエチル基である。いくつかの実施形態では、各Ｒ'は互いに独立して水素またはメチル基である。いくつかの実施形態では、各Ｒ'は互いに独立して水素である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、各ＲＬは互いに独立してＣ８−１２アルキル基である。いくつかの実施形態では、各ＲＬは互いに独立してＮ−Ｃ８−１２アルキル基である。いくつかの実施形態では、各ＲＬは互いに独立してＣ９−１１アルキル基である。いくつかの実施形態では、各ＲＬは互いに独立してＮ−Ｃ９−１１アルキル基である。いくつかの実施形態では、各ＲＬは互いに独立してＣ１０アルキル基である。いくつかの実施形態では、各ＲＬは互いに独立してＮ−Ｃ１０アルキル基である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は互いに独立して水素またはメチル基であり；各ｑは互いに独立して３〜５であり；各Ｒ'は互いに独立して水素またはメチル基であり；かつ、各ＲＬは互いに独立してＣ８−１２アルキル基である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は水素であり；各ｑは互いに独立して３〜５であり；各Ｒ'は水素であり；かつ、各ＲＬは互いに独立してＣ８−１２アルキル基である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は水素であり；各ｑは４であり；各Ｒ'は水素であり；かつ、各ＲＬは互いに独立してＣ８−１２アルキル基である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ-ｇ
【化４】
2019163322.tif 000009
、の化合物またはその薬理学的に許容される塩を含み、各ＲＬは互いに独立してＣ８−１２アルキル基である。いくつかの実施形態では、各ＲＬは互いに独立してＮ−Ｃ８−１２アルキル基である。いくつかの実施形態では、各ＲＬは互いに独立してＣ９−１１アルキル基である。いくつかの実施形態では、各ＲＬは互いに独立してＮ−Ｃ９−１１アルキル基である。いくつかの実施形態では、各ＲＬは互いに独立してＣ１０アルキル基である。いくつかの実施形態では、各ＲＬはＮ−Ｃ１０アルキル基である。
【００８１】
特定の実施形態では、提供リポソームには、カチオン性脂質ｃＫＫ−Ｅ１２、または（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）が含まれる。ｃＫＫ−Ｅ１２の構造を下記に示す：
【化５】
2019163322.tif 000010
【００８２】
いくつかの実施形態では、かかる１種以上のカチオン性脂質は、Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＴＭＡ」であってよい.（Ｆｅｉｇｎｅｒｅｔａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８９７，３５５）。ＤＯＴＭＡは、単独で製剤化可能であり、または、中性脂質、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）または他のカチオン性脂質若しくは非カチオン性脂質と組み合わせて、リポソーム運搬（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ビヒクルまたは脂質ナノ粒子内に入れることが可能であり、このようなリポソームを使用して標的細胞内への核酸送達を促進させることができる。他の好適なカチオン性脂質としては、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）（「ＤＯＧＳ」）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１７１，６７８；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３３４，７６１）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）が挙げられる。
【００８３】
さらなる例示的なカチオン性脂質としては、１，２−ステアリルオキシ（ジステアリルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（「ＤＳＤＭＡ」）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（「ＤＯＤＭＡ」）、１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（「ＤＬｉｎＤＭＡ」）、１，２−ジリノレニルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（「ＤＬｅｎＤＭＡ」）、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）、Ｎ−（ｌ，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−ｌ−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ（ｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏｘｙ））プロパン（「ＣＬｉｎＤＭＡ」）、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ（ｏｘａｐｅｎｔｏｘｙ））−３−ジメチル−ｌ−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９'、ｌ−２’−オクタデカジエンオキシ（ｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏｘｙ））プロパン（「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３、４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｅ）（「ＤＭＯＢＡ」）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル（ｄｉｏｌｅｙｌｃａｒｂａｍｙｌ）−３−ジメチルアミノプロパン（「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」）、２，３−ジリノレオイルオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）−Ν，Ν−ジメチルプロピルアミン（「ＤＬｉｎＤＡＰ」）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｃａｒｂａｍｙｌ）−３−ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」）、１，２−ジリノレオイルカルバミル（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌｃａｒｂａｍｙｌ）−３−ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［ｌ,３］−ジオキソラン（「ＤＬｉＮ−−ＤＭＡ」）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［ｌ,３］−ジオキソラン（「ＤＬｉＮ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」）、及び２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）オクタデカ−９,１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉＮ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（ＷＯ２０１０／０４２８７７；Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０）を参照のこと）、またはその混合物も挙げられる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）；ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１）。いくつかの実施形態では、１種以上のカチオン性脂質は、イミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニジニウム部分の少なくとも１つを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、かかる１種以上のカチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ,９Ｚ，２８Ｚ,３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６,９,２８,３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ,５ｓ,６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１，１６−ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３（ＷＯ２０１２／１７０８８９：その教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＩＣＥ（ＷＯ２０１１／０６８８１０：その教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＨＧＴ５０００（Ｕ．Ｓ．特許仮出願Ｎｏ．６１／６１７，４６８：その教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）またはＨＧＴ５００１（ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ）（特許仮出願Ｎｏ．６１／６１７，４６８）、ＷＯ２０１０／０５３５７２に開示のようなアミノアルコールリピドイド（ａｍｉｎｏａｌｃｏｈｏｌ  ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」  Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．”Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６），Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．「Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７，１８６４−１８６９）から選ばれてよい。
【００８５】
いくつかの実施形態では、リポソーム内のカチオン性脂質の割合は、１０％より大きい、２０％より大きい、３０％より大きい、４０％より大きい、５０％より大きい、６０％より大きい、または７０％より大きくてよい。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）は、重量で、リポソームの約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、モル比で、リポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％を構成する。
【００８６】
非カチオン性／ヘルパー脂質
いくつかの実施形態では、提供リポソームは、１種以上の非カチオン性（「ヘルパー」）脂質を含有する。本明細書で使用する場合、語句「非カチオン性脂質」とは、中性、両性イオン型またはアニオン性の任意の脂質をいう。本明細書で使用する場合、語句「アニオン性脂質」とは、生理的ｐＨなどの選択ｐＨで実効負電荷を持つ多数の脂質種のうちの任意のものをいう。非カチオン性脂質には、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはその混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８７】
いくつかの実施形態では、このような非カチオン性脂質を単独で使用してよいが、好ましくは他の添加剤、例えば、カチオン性脂質と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、モル比で、リポソームに存在する総脂質の約５％〜約９０％、または約１０％〜約７０％を構成してよい。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、中性脂質、すなわち、組成物を製剤化及び／または投与する条件下で実効電荷を持たない脂質である。いくつかの実施形態では、リポソーム内の非カチオン性脂質の割合は、５％より大きい、１０％より大きい、２０％より大きい、３０％より大きい、または４０％より大きくてよい。
【００８８】
コレステロール系脂質
いくつかの実施形態では、提供リポソームは、１種以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、好適なコレステロール系カチオン性脂質として、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキシアミドコレステロール（ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ））、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ・プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７４４，３３５）、またはＩＣＥが挙げられる。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質は、モル比で、リポソームに存在する総脂質の約２％〜約３０％、または約５％〜約２０％を構成してよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質の割合は、５％より大きい、１０％、２０％より大きい、３０％より大きい、または４０％より大きくてよい。
【００８９】
ＰＥＧ化脂質
いくつかの実施形態では、提供リポソームは、１種以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、Ｎ−オクタノイルスフィンゴシン−ｌ−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８ＰＥＧ−２０００セラミド）などの誘導体化セラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）のような、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾したリン脂質及び誘導体化された脂質を、１種以上のカチオン性脂質、実施形態によっては他の脂質と組み合わせてリポソーム構成に使用することもまた本発明で意図される。意図されるＰＥＧ修飾脂質には、鎖長Ｃ６−Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合している鎖長が最高５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾した、すなわちＰＥＧ化した脂質はＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ−２Ｋである。このような成分の付加により、複合体の凝集を予防することができ、また、循環血中寿命を延長させ、脂質と核酸を結合させた組成物の標的細胞への送達量を増加させる手段も提供され得るか（Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５−２３７）、または、ｉｎ  ｖｉｖｏで製剤からの交換を急速に行わせるために付加成分を選択してよい（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８８５，６１３を参照のこと）。
【００９０】
いくつかの実施形態では、特に有用な交換可能な脂質は、短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧ−セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質及び誘導体化脂質は、モル比で、リポソーム中に存在する総脂質の約０％〜約１５％、約０．５％〜約１５％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％、または約２％を構成してよい。
【００９１】
さまざまな実施形態によれば、脂質ナノ粒子を構成する、カチオン性脂質、非カチオン性脂質及び／またはＰＥＧ修飾脂質の選択は、かかる脂質同士の相対モル比と同様に、選択脂質（複数可）の特徴、意図される標的細胞の性質、送達されるべきｍＲＮＡの特徴に基づいて行う。考慮すべきさらなる項目としては、例えば、アルキル鎖の飽和度、並びに、選択脂質（複数可）のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）及び毒性が挙げられる。したがって、これらに応じてモル比を調整してよい。
【００９２】
ポリマー
いくつかの実施形態では、好適な送達ビヒクルは、ポリマーを担体として、単独で使用して、または、本明細書に記載のさまざまな脂質など他の担体と組み合わせて使用し製剤化する。したがって、いくつかの実施形態では、リポソーム送達ビヒクルには、本明細書で使用する場合、ナノ粒子含有ポリマーも包含される。好適なポリマーには、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸のコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルジネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が含まれてよい。ＰＥＩが存在する場合、分子量が１０〜４０ｋＤａの範囲の分岐ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａの分岐ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ＃４０８７２７）であってよい。
【００９３】
本発明に好適なリポソームとして、本明細書に記載するカチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール脂質、ＰＥＧ化脂質及び／またはポリマーの任意のものを１種以上、さまざまな比で含めてよい。非限定的な例として、好適なリポソーム製剤には、ｃＫＫ−Ｅ１２と、ＤＯＰＥと、コレステロールと、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００と、ＤＯＰＥと、コレステロールと、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３と、ＤＯＰＥと、コレステロールと、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥと、ＤＯＰＥと、コレステロールと、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、から選択される組み合わせを含めてよい。
【００９４】
さまざまな実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）は、モル比で、リポソームの約３０〜６０％（例えば、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）の割合は、モル比で、リポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％以上である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）と非カチオン性脂質（複数可）とコレステロール系脂質（複数可）とＰＥＧ化脂質（複数可）との比は、それぞれ、約３０〜６０：２５〜３５：２０〜３０：１〜１５であってよい。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）と非カチオン性脂質（複数可）とコレステロール系脂質（複数可）とＰＥＧ化脂質（複数可）との比は、それぞれ、約４０：３０：２０：１０である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）と非カチオン性脂質（複数可）とコレステロール系脂質（複数可）とＰＥＧ化脂質（複数可）との比は、それぞれ、約４０：３０：２５：５である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）と非カチオン性脂質（複数可）とコレステロール系脂質（複数可）とＰＥＧ化脂質（複数可）との比は、それぞれ、約４０：３２：２５：３である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）と非カチオン性脂質（複数可）とコレステロール系脂質（複数可）とＰＥＧ化脂質（複数可）との比は、約５０：２５：２０：５である。
【００９６】
ｍＲＮＡの合成
本発明によるｍＲＮＡを、多種多様な任意の公知の方法にしたがって合成してよい。例えば、本発明によるｍＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）により合成してよい。簡単に言えば、ＩＶＴは、典型的に、プロモーターを含有する直鎖ＤＮＡまたは環状ＤＮＡの鋳型、リボヌクレオシド三リン酸のプール、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含み得る緩衝液系、並びに、適切な、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼのＴ３、Ｔ７またはＳＰ６）、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて実施する。その正確な条件は、具体的用途により異なってくる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明によるｍＲＮＡを調製するため、ＤＮＡの鋳型をｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写させる。好適なＤＮＡの鋳型は、典型的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用にプロモーター、例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターを有し、それに続いて、所望のｍＲＮＡの所望のヌクレオチド配列及び終止シグナルを有する。
【００９８】
本発明による所望のｍＲＮＡ配列（複数可）は、標準的方法を使用して決定し、また、ＤＮＡの鋳型に組み込んでよい。例えば、所望のアミノ酸配列（例えば、酵素配列）から開始し、縮重している遺伝暗号に基づき仮想逆翻訳（ｖｉｒｔｕａｌ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を実施する。その後、最適化アルゴリズムを使用して好適なコドンを選択してよい。典型的には、一方でＧ／Ｃ含量を最適化して可能な限りの最高Ｇ／Ｃ含量を達成し、もう一方で、使用コドンにしたがったｔＲＮＡの頻度を可能な限り考慮に入れる。最適化されたＲＮＡ配列を確立し、それを例えば、適切な表示装置を用いて表示させ、元の（野生型の）配列と比較することができる。二次構造を解析して、ＲＮＡの領域について安定化及び不安定化の特性それぞれを算出することも可能である。
【００９９】
修飾ｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本発明によるｍＲＮＡを、非修飾または修飾ｍＲＮＡとして合成してよい。典型的に、ｍＲＮＡを修飾して安定性を高める。ｍＲＮＡの修飾としては、例えば、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を挙げることができる。したがって、本発明によるｍＲＮＡの修飾として、例えば、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、天然に生じるヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成され得、これらとしては、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、並びに、修飾ヌクレオチドとして、例えば、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、４−アセチルシトシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、７−メチルグアニン、イノシン、１−メチルイノシン、プソイドウラシル（５−ウラシル）、ジヒドロウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、１−メチル−プソイドウラシル、ケウオシン、β−Ｄ−マンノシルケウオシン、ワイブトキソシン、及びホスホルアミド酸のような、プリン及びピリミジンの類似体または誘導体、チオリン酸エステル、ペプチド・ヌクレオチド、メチルホスホン酸、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシン並びにイノシンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような類似体の調製は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，３７３，０７１、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，４０１，７９６、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，４１５，７３２、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，４５８，０６６、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，５００，７０７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６６８，７７７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９７３，６７９、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０４７，５２４、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１３２，４１８、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１５３，３１９、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，２６２，５３０及び５，７００，６４２より当業者に公知であり、これらの開示内容は参照によりその全体が取り込まれる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＡＳＳ１をコードするｍＲＮＡ）は、ＲＮＡ骨格修飾を含有してよい。典型的に、骨格修飾は、ＲＮＡに含有されているヌクレオチドの骨格のリン酸基が化学的に修飾されている修飾である。例示的な骨格修飾には、典型的に、メチルホスホン酸基、メチルホスホルアミド酸（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）基、ホスホルアミド酸基、チオリン酸基（例えば、シチジン５’−Ｏ−（１−チオリン酸））、ボラノリン酸基、正電荷をもつグアニジニウム基等からなる群の基を、ホスホジエステル結合に代えて他のアニオン性基、カチオン性基または中性基で置換することによる修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＡＳＳ１をコードするｍＲＮＡ）は糖修飾を含有してよい。典型的な糖修飾は、そのヌクレオチドに含有されている糖の化学的修飾であり、これらには、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−デオキシ−２’−デアミン（ｄｅａｍｉｎｅ）−オリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン５’−三リン酸、２’−メチルウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、及びそれらの異性体（２’−アラシチジン５’−三リン酸、２’−アラウリジン５’−三リン酸）、またはアジドトリホスファート（ａｚｉｄｏｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（２’−アジド−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）からなる群から選ばれる糖修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＡＳＳ１をコードするｍＲＮＡ）は、ヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含有してよい。塩基修飾を含有する修飾ヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも呼ばれる。このような塩基修飾ヌクレオチドの例としては、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、２−アミノアデノシン５’−三リン酸、２−チオシチジン５’−三リン酸、２−チオウリジン５’−三リン酸、４−チオウリジン５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン（ａｍｉｎｏａｌｌｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）５’−三リン酸、５−アミノアリルウリジン（ａｍｉｎｏａｌｌｙｌｕｒｉｄｉｎｅ）５’−三リン酸、５−ブロモシチジン５’−三リン酸、５−ブロモウリジン５’−三リン酸、５−ヨードシチジン５’−三リン酸、５−ヨードウリジン５’−三リン酸、５−メチルシチジン５’−三リン酸、５−メチルウリジン５’−三リン酸、６−アザシチジン５’−三リン酸、６−アザウリジン５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、７−デアザアデノシン５’−三リン酸、７−デアザグアノシン５’−三リン酸、８−アザアデノシン５’−三リン酸、８−アジドアデノシン５’−三リン酸、ベンゾイミダゾールリボシド５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン５’−三リン酸、プソイドウリジン５’−三リン酸、ピューロマイシン５’−三リン酸またはキサントシン５’−三リン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０３】
典型的に、ｍＲＮＡ合成には、Ｎ末端（５’）への「キャップ」付加、及びＣ末端（３’）への「テール」付加が挙げられる。キャップの存在は、大部分の真核細胞に見られるヌクレアーゼに抵抗性を与える上で重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するために機能する。
【０１０４】
したがって、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＡＳＳ１をコードするｍＲＮＡ）は５’末端キャップ構造を含む。５’末端キャップは典型的に、以下のとおり付加される：まず、ＲＮＡ末端のホスファターゼで末端リン酸基の１つを５’ヌクレオチドから除去し、末端リン酸基２つを残す；次いで、グアニリルトランスフェラーゼによりグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を末端リン酸基に加え、５’５’５三リン酸エステル結合を作る；その後、グアニンの７位の窒素を、メチルトランスフェラーゼによりメチル化させる。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'（Ａ、Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ａ及びＧ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＡＳＳ１をコードするｍＲＮＡ）は、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３'末端にあるポリＡテールとしては、典型的に、約１０〜３００アデノシン型ヌクレオチド（配列番号９）（例えば、約１０〜２００アデノシン型ヌクレオチド、約１０〜１５０アデノシン型ヌクレオチド、約１０〜１００アデノシン型ヌクレオチド、約２０〜７０アデノシン型ヌクレオチド、または約２０〜６０アデノシン型ヌクレオチド）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡには、３’ポリ（Ｃ）テール構造が含まれる。好適なｍＲＮＡの３'末端にあるポリＣテールには、典型的に、約１０〜２００シトシン型ヌクレオチド（配列番号１０）（例えば、約１０〜１５０シトシン型ヌクレオチド、約１０〜１００シトシン型ヌクレオチド、約２０〜７０シトシン型ヌクレオチド、約２０〜６０シトシン型ヌクレオチド、または約１０〜４０シトシン型ヌクレオチド）が挙げられる。ポリＣテールを、ポリＡテールに付加してよく、または、ポリＡテールと置き換えてよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡには、５’及び／または３’の非翻訳領域が含まれる。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を与える１種以上の要素、例えば、鉄応答性エレメントが含まれる。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、約５０〜５００ヌクレオチドの長さであってよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域には、１つ以上のポリアデニル化シグナル、細胞内位置のｍＲＮＡの安定性に影響を与えるタンパク質が結合する部位、またはｍｉＲＮＡが結合する１つ以上の部位が含まれる。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、５０〜５００ヌクレオチド以上の長さであってよい。
【０１０８】
キャップ構造
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’末端キャップ構造を含む。５’末端キャップは典型的に、以下のとおり付加される：まず、ＲＮＡ末端のホスファターゼで末端リン酸基の１つを５’ヌクレオチドから除去し、末端リン酸基２つを残す；次いで、グアニリルトランスフェラーゼによりグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を末端リン酸基に加え、５’５’５三リン酸エステル結合を作る；その後、グアニンの７位の窒素を、メチルトランスフェラーゼによりメチル化させる。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'（Ａ、Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ａ及びＧ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０９】
天然に生じるキャップ構造は、最初に転写されたヌクレオチドの５'末端に三リン酸架橋により結合している７−メチルグアノシンを含み、これが、ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシド）のジヌクレオチドキャップとなる。Ｉｎ  ｖｉｖｏでは、キャップは酵素により付加される。キャップは、細胞核内で付加され、酵素グアニリルトランスフェラーゼにより触媒される。ＲＮＡの５'末端へのキャップ付加は、転写開始直後に起こる。末端のヌクレオシドは典型的にグアノシンであり、他の全ヌクレオチドに対し逆方向、すなわち、Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）ＧｐＮｐＮｐとなっている。
【０１１０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写で作製される一般的なｍＲＮＡのキャップはｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇであり、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによる転写において、５'末端にキャップ構造を有するＲＮＡを得るためにジヌクレオチドキャップとして使用されてきた。キャップ付加されたｍＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成する最も一般的な方法では、予め形成したｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）型のジヌクレオチドを転写開始因子として使用する。
【０１１１】
これまで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳実験で使用する合成ジヌクレオチドキャップの通常型は、アンチリバースキャップ類似体（「Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ：ＡＲＣＡ」）または修飾ＡＲＣＡであり、一般に、２'位または３'位のＯＨ基が−ＯＣＨ３で置換されている修飾されたキャップ類似体である。
【０１１２】
さらなるキャップ類似体には、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣからなる群から選択される化学構造；非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２、７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２、２、７ＧｐｐｐＧ）、左右対称ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７、２'ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２'ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７、３'ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７、３'ｄＧｐｐｐＧ及びそれらの四リン酸誘導体）（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｎｏｖｅｌ  ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ’  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照のこと）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、好適なキャップは、最初に転写されたヌクレオチドの５'末端に三リン酸架橋により結合している７−メチルグアニル酸（「ｍ７Ｇ」）であり、これが、ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシド）となる。本発明の実施形態に使用されるｍ７Ｇキャップの好ましい実施形態はｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇである。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、キャップはＣａｐ０構造である。Ｃａｐ０構造には、塩基１及び２に結合しているリボースの２’−Ｏ−メチル残基がない。いくつかの実施形態では、キャップはＣａｐ１構造である。Ｃａｐ１構造は、塩基２に２’−Ｏ−メチル残基を有する。いくつかの実施形態では、キャップはＣａｐ２構造である。Ｃａｐ２構造は、塩基２と３の両方に結合している２’−Ｏ−メチル残基を有する。
【０１１５】
多種多様なｍ７Ｇキャップ類似体が当技術分野で公知であり、その多くが市販されている。これらには、上記のｍ７ＧｐｐｐＧ、並びに、ＡＲＣＡ３’−ＯＣＨ３及び２’−ＯＣＨ３キャップ類似体が含まれる（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３））。本発明の実施形態に使用するさらなるキャップ類似体には、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸（Ｎ７-ｂｅｎｚｙｌａｔｅｄｄｉｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１０：１４７９−１４８７（２００４）に記載）、チオリン酸エステルキャップ類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１３：１７４５−１７５５（２００７）に記載）、並びにＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．８，０９３，３６７及び８，３０４，５２９に記載のキャップ類似体（ビオチン化キャップ類似体を含む）が挙げられ、これらは参照により本明細書に取り込まれる。
【０１１６】
テール構造
典型的に、「テール」の存在はｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するために機能する。ポリＡテールは、天然のメッセンジャー及び合成のセンスＲＮＡを安定化させると考えられている。したがって、ある実施形態では、長いポリＡテールをｍＲＮＡ分子に付加し、それによりＲＮＡをより安定化させることが可能である。ポリＡテールは、当該技術分野で認められている多種多様な技術を使用して付加することができる。例えば、長いポリＡテールは、ポリＡポリメラーゼを使用して合成ＲＮＡまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡに付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２−１２５６）。転写ベクターは、長いポリＡテールをコードすることもできる。さらに、ポリＡテールは、ＰＣＲ産物から直接転写することにより付加が可能である。ポリＡは、センスＲＮＡの３'末端にＲＮＡリガーゼで連結してもよい（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９９１  ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと）。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。典型的に、ポリＡテールの長さは、少なくとも約１０、５０、１００，２００、３００，４００、少なくとも５００ヌクレオチドであり得る（配列番号１１）。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの３'末端にあるポリＡテールには、典型的に、約１０〜３００アデノシン型ヌクレオチド（配列番号９）（例えば、約１０〜２００アデノシン型ヌクレオチド、約１０〜１５０アデノシン型ヌクレオチド、約１０〜１００アデノシン型ヌクレオチド、約２０〜７０アデノシン型ヌクレオチド、または約２０〜６０アデノシン型ヌクレオチド）が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３'末端にある好適なポリＣテールには、典型的に、約１０〜２００シトシン型ヌクレオチド（配列番号１０）（例えば、約１０〜１５０シトシン型ヌクレオチド、約１０〜１００シトシン型ヌクレオチド、約２０〜７０シトシン型ヌクレオチド、約２０〜６０シトシン型ヌクレオチド、または約１０〜４０シトシン型ヌクレオチド）が含まれる。ポリＣテールは、ポリＡテールに付加してよく、または、ポリＡテールと置き換えてよい。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールの長さを調整して、本発明の修飾されたセンスｍＲＮＡ分子の安定性を制御し、これにより、タンパク質の転写を制御する。例えば、ポリＡテールの長さはセンスｍＲＮＡ分子の半減期に影響するので、ポリＡテールの長さを調整してｍＲＮＡのヌクレアーゼに対する抵抗度を修正し、これにより、標的細胞におけるポリヌクレオチド発現及び／またはポリペプチド産生の経時変化を制御できる。
【０１１９】
５’及び３’非翻訳領域
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡには、５’及び／または３’の非翻訳領域が含まれる。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を与える１種以上の要素、例えば、鉄応答性エレメントが含まれる。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、約５０〜５００ヌクレオチドの長さであってよい。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域には、１つ以上のポリアデニル化シグナル、細胞内位置のｍＲＮＡの安定性に影響を与えるタンパク質が結合する部位、またはｍｉＲＮＡが結合する１つ以上の部位が含まれる。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、５０〜５００ヌクレオチド以上の長さであってよい。例示的な３'及び／または５'ＵＴＲ配列は、安定であるｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路の酵素）を由来として、センスｍＲＮＡ分子の安定性を高めることができる。例えば、５’ＵＴＲ配列には、ヌクレアーゼ抵抗性の改善及び／またはポリヌクレオチドの半減期の改善のためにＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列、またはその断片が含まれてよい。さらに意図されるのは、ポリヌクレオチドをさらに安定化させるために、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列、またはその断片を、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端または非翻訳領域に含めることである。一般に、これらの修飾により、非修飾ポリヌクレオチドに比べると、ポリヌクレオチドの安定性及び／または薬物動態特性（例えば、半減期）が改善され、これらには、例えば、このようなポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏヌクレアーゼによる消化に対する抵抗性改善のためになされる修飾が含まれる。
【０１２１】
リポソームの形成
本発明の組成物に使用するためのリポソーム運搬（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ビヒクルは、現在、当技術分野で公知のさまざまな技術により調製することができる。提供組成物に使用するためのリポソームは、現在、当技術分野で公知のさまざまな技術により調製することができる。例えば、適切な溶媒に選択脂質を溶解させてその脂質を好適な容器または器の内壁に付着させ、その後、溶媒を蒸発乾涸させて容器内側に薄膜を残すかまたは噴霧乾燥させるといった従来技術にしたがい多重膜ベシクル（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ：ＭＬＶ）を調製しうる。次いで、ボルテックスによる撹拌運動中の容器に水相を加えてよく、これでＭＬＶが形成される。その後、多層膜ベシクルを均質化、超音波処理または押出することにより単層膜ベシクル（ＵＬＶ）を形成することができる。さらに、界面活性剤除去法により単層膜ベシクルを形成することができる。
【０１２２】
ある実施形態では、提供組成物はリポソームを含み、ここで、ｍＲＮＡはそのリポソームの両面で会合するとともに、その同一リポソーム内に封入されている。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームを静電相互作用によりｍＲＮＡと会合させてよい。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームを静電相互作用によりｍＲＮＡと会合させてよい。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、リポソーム内に封入されたｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、かかる１種以上のｍＲＮＡ種は同一のリポソーム内に封入されてよい。いくつかの実施形態では、かかる１種以上のｍＲＮＡ種は異なる複数のリポソーム内に封入されてよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１個以上のリポソーム内に封入され、これらのリポソームは脂質組成、脂質成分のモル比、サイズ、電荷（ゼータ電位）、標的にするリガンド及び／またはこれらの組み合わせにおいて異なる。いくつかの実施形態では、かかる１個以上のリポソームは、カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾脂質及び／またはその組み合わせからなる組成が異なっていてよい。いくつかの実施形態では、かかる１種以上のリポソームは、そのリポソーム作製に使用するカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール及びＰＥＧ修飾脂質のモル比が異なっていてよい。
【０１２４】
所望のｍＲＮＡをリポソームに組み込む方法はしばしば「搭載」と呼ばれる。例示的な方法は、Ｌａｓｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。リポソームが組み込まれた核酸は、完全または部分的に、リポソームの内部空間に位置するか、リポソーム二重膜内に位置するか、またはリポソーム膜の外面と会合してよい。核酸をリポソーム内に組み込むことを本明細書では「封入」ともいい、その場合、核酸はその全体がリポソームの内部空間内に含有されている。リポソームのような運搬（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ビヒクルにｍＲＮＡを組み込む目的は、核酸を分解する酵素若しくは化学薬品、及び／または核酸を短時間で排泄させる系若しくは受容体を含有し得る環境から、核酸を保護するためであることが多い。したがって、いくつかの実施形態では、好適な送達ビヒクルは、そこに含有されているｍＲＮＡの安定性を高めることができ、かつ／または標的細胞または組織へのｍＲＮＡの送達を促進する。
【０１２５】
リポソームのサイズ
本発明の好適なリポソームは、さまざまなサイズで作製してよい。いくつかの実施形態では、提供リポソームは、これまでに公知のｍＲＮＡ封入リポソームより小さくてよい。いくつかの実施形態では、リポソームのサイズ縮小とｍＲＮＡ送達の高効率とは関連している。リポソームの適切なサイズの選択には、標的とする細胞または組織の部位、及び、ある程度は、リポソーム作製の用途が考慮されうる。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによりコードされる抗体の全身分布を促進するために適切なサイズのリポソームを選択する。いくつかの実施形態では、特定の細胞または組織へのｍＲＮＡのトランスフェクションを制限することが望ましい場合がある。例えば、肝細胞を標的にするには、リポソームを、その大きさが肝臓の肝類洞内膜の内皮細胞層の小孔より小さくなるようなサイズにすることがあるが、そのような場合は、リポソームは、このような内皮細胞の小孔を容易に通り抜けて標的とする肝細胞に到達することができると考えられる。
【０１２７】
別法または追加として、リポソームは、特定の細胞または組織への分布を制限するかまたは明らかに回避させるのに十分な直径をもつ大きさのリポソームとなるようサイズ調整してよい。例えば、リポソームの大きさを肝類洞内膜の内皮細胞層の小孔より大きくして、肝細胞へのリポソーム分布が制限されるようなサイズにしてよい。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、リポソームのサイズはリポソーム粒子の最長直径で決定する。いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、サイズが約２５０ｎＭ以下（例えば、約２２５ｎＭ、２００ｎＭ、１７５ｎＭ、１５０ｎＭ、１２５ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、または５０ｎＭ以下）である。いくつかの実施形態では、好適なリポソームのサイズは、約１０〜２５０ｎＭの範囲（例えば、約１０〜２２５ｎＭ、１０〜２００ｎＭ、１０〜１７５ｎＭ、１０〜１５０ｎＭ、１０〜１２５ｎＭ、１０〜１００ｎＭ、１０〜７５ｎＭ、または１０〜５０ｎＭの範囲）である。いくつかの実施形態では、好適なリポソームのサイズは、約１００〜２５０ｎＭの範囲（例えば、約１００〜２２５ｎＭ、１００〜２００ｎＭ、１００〜１７５ｎＭ、１００〜１５０ｎＭの範囲）である。いくつかの実施形態では、好適なリポソームのサイズは、約１０〜１００ｎＭの範囲（例えば、約１０〜９０ｎＭ、１０〜８０ｎＭ、１０〜７０ｎＭ、１０〜６０ｎＭ、または１０〜５０ｎＭの範囲）である。
【０１２９】
リポソーム集団のサイズ制御には当技術分野で公知の多種多様な別法が利用可能である。サイズを制御するそのような方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，７３７，３２３に記載があり、参照により本明細書に組み込まれる。リポソーム懸濁液をバス型またはプローブ型超音波処理で超音波処理すると段階的にサイズが縮小され、直径約０．０５ミクロン未満の小さなＵＬＶが作製される。均一化法は、せん断エネルギーを利用して大きなリポソームを小さくするもう一つの方法である。典型的な均一化の手順では、標準的なエマルジョン・ホモジナイザーに通し、選択したサイズ、典型的には、約０．１〜０．５ミクロンのリポソームが得られるまでＭＬＶを再循環させる。リポソームのサイズは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ＢｉｏＥｎｇ．，１０：４２１−１５０（１９８１）に記載されるような準電気性光散乱法（ｑｕａｓｉ-ｅｌｅｃｔｒｉｃｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＱＥＬＳ）により測定してよく、参照により本明細書に組み込まれる。形成されたリポソームを超音波処理することにより平均リポソーム径は小さくなり得る。間欠的な超音波処理サイクルをＱＥＬＳ評価と交互に行い効率的にリポソームを合成してもよい。
【０１３０】
医薬組成物
Ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの発現を促進するために、リポソームなどの送達ビヒクルを、追加の核酸、担体、標的リガンド若しくは定化剤１種以上と組み合わせて、または好適な添加剤とともに混合した薬理学的組成物にして、製剤化することが可能である。薬物の製剤化及び投与法についての手法は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎに記載されている。
【０１３１】
提供される、リポソームに封入または会合させたｍＲＮＡ、及びそれを含有する組成物は、被検体の臨床状態、投与部位と投与方法、投与計画、被検体の年齢、性別、体重など当業臨床医に関連する因子を考慮に入れ、現在の医療にしたがい投与及び用量決定してよい。本明細書の目的のための「有効量」は、試験的臨床研究、薬理学、臨床及び医療分野の当業者に知られているような関連因子を考慮して決定してよい。いくつかの実施形態では、投与された量は、症状のほか、当業者が疾患の進行、退縮または改善の測定値として適当であるとして選択する他の指標について、少なくとも何らかの安定化、改善または消失が達成されるのに有効な量である。例えば、量及び投与の好適レジメンは、少なくとも一過性にタンパク質（例えば、酵素）を産生させるレジメンである。
【０１３２】
好適な投与経路には、例えば、経口、経腸、経膣、経粘膜、気管内若しくは吸入を含む経肺、または経腸による投与；皮内、経皮（局所）、筋肉内、皮下、髄内注射による非経口送達、並びに、くも膜下腔内、脳室内直接、静脈内、腹腔内、または経鼻の非経口送達が挙げられる。
【０１３３】
別法または追加として、リポソームに封入したｍＲＮＡ及び本発明の組成物を、全身ではなく局所的に、例えば、標的組織内へ医薬組成物を直接注射して、好ましくは、徐放性製剤にして投与してよい。局所送達はさまざまな方法で影響を受け、その標的とする組織により異なる。例えば、本発明の組成物を含有するエアロゾルは、吸入可能であり（経鼻、経気管、または気管支送達）；本発明の組成物は、例えば、損傷部位、疾患症状発現部位、または疼痛部位に注入可能であり；組成物は、経口、気管、または食道の適応には薬用ドロップで提供可能であり；組成物は胃または腸への投与用に、液体、錠剤またはカプセルの形態で供給可能であり、直腸または膣の適応には坐剤形態で供給可能であり；または、組成物は、クリーム、点眼薬の使用、若しくは注射でも眼への送達さえ可能である。治療的分子またはリガンドと複合体化させた提供組成物含有製剤は、外科的処置で投与することも可能であり、例えば、組成物が移植部位から周辺細胞へ広がることができるようにするポリマーまたは他の構造体若しくは物質に会合させて投与可能である。別法として、それらは、ポリマーまたは支持体を使用せずに外科的処置で適応可能である。
【０１３４】
本発明の提供方法では、本明細書に記載する治療的有効量の治療剤（例えば、ＡＳＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の単回並びに頻回投与が意図される。治療剤は、被検体の病態（例えば、ＡＳＤ）の性質、重症度及び程度に応じ、一定の間隔で投与可能である。いくつかの実施形態では、治療的有効量の本発明治療剤（例えば、ＡＳＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ）は、髄腔内に一定の間隔で定期的に投与してよい（例えば、年１回、６か月に１回、５か月に１回、３か月に１回、隔月（２か月に１回）、毎月（月１回）、隔週（２週間に１回）、３０日に１回、２８日に１回、１４日に１回、１０日に１回、７日に１回、毎週、連日または継続的）。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、提供するリポソーム及び／または組成物は、そこに含有されるｍＲＮＡの徐放性に好適となるよう製剤化する。このような徐放性組成物は、投与間隔を長くして被検体に好都合に投与されうる。例えば、一実施形態では、本発明の組成物を１日２回、連日または隔日で被検体に投与する。好ましい実施形態では、本発明の組成物を、週２回、週１回、７日に１回、１０日に１回、１４日に１回、２８日に１回、３０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、または、さらに好ましくは、４週間に１回、月１回、６週間に１回、８週間に１回、２か月に１回、３か月に１回、４か月に１回、６か月に１回、８か月に１回、９か月に１回、若しくは毎年、被検体に投与する。長期間にわたりｍＲＮＡを送達または放出させるためにデポー投与（例えば、筋肉内、皮下、硝子体内）用に製剤化された組成物及びリポソームも意図される。好ましくは、使用する徐放性手段を、安定性を高めるためにｍＲＮＡに行った修飾と組み合わせる。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、用語「治療的有効量」は、主として、本発明の医薬組成物に含有される治療剤の総量に基づき決定される。一般に、治療的有効量は、被検体にとって意義のある利益（例えば、ＡＳＤの治療、調節、治癒、予防及び／または改善）を達成するのに十分である。例えば、治療的有効量は、所望の治療的及び／または予防的効果を達成するのに十分な量であり得る。一般に、治療剤（例えば、ＡＳＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ）を必要とする被検体に投与されるその治療剤の量はその被検体の特徴により異なることになる。このような特徴には、その被検体の病態、疾患の重症度、全体的健康状態、年齢、性別及び体重が挙げられる。当業者は、これら及び他の関連因子に応じて適切な用量を容易に決定できるであろう。さらに、客観的評価法及び主観的評価法を任意選択で用いて至適用量範囲を確認してよい。
【０１３７】
治療的有効量は、複数の単位用量を含み得る投与レジメンにおいて一般的に投与される。任意の特定の治療タンパク質の場合、治療的有効量（及び／または効果的投与レジメンの範囲内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の医薬製剤との併用に応じて異なり得る。また、任意の特定の患者に対する具体的な治療的有効量（及び／または単位用量）は、治療される障害及びその障害の重症度；使用する特定の製剤の活性；使用する特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的健康状態、性別及び食事；使用する特定のタンパク質の投与時間、投与経路、及び／または排泄速度若しくは代謝速度；治療期間；並びに、医療分野において周知の同様の因子を含む、多種多様な因子に依存し得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、治療的有効用量の範囲は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜４００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜３００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜９０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜８０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜７０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜６０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜４０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約１．０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約３ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約５ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約１０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約１５ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約２０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約３０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約４０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約５０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約６０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約７０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約８０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約９０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約１００ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約１５０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約２００ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約２５０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約３００ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約４００ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約４５０ｍｇ／ｋｇ体重より大きい、約５００ｍｇ／ｋｇ体重より大きい。
【０１４０】
本明細書では、本明細書に開示するリポソーム１種以上を含む凍結乾燥医薬組成物、及び、例えば、２０１１年６月８日出願の米国仮出願Ｎｏ．６１／４９４，８８２に開示されるような組成物の使用に関連する方法も意図され、その教示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、本発明の凍結乾燥医薬組成物は、投与前に調製してよく、または、ｉｎ  ｖｉｖｏで調製可能である。例えば、凍結乾燥医薬組成物は、適切な剤形に製剤化可能であり（例えば、ディスク、ロッドまたは膜のような皮内投与剤形）、その剤形が個人の体液によりｉｎ  ｖｉｖｏで経時的に再水和されるよう投与可能である。
【０１４１】
提供リポソーム及び組成物は、任意の所望の組織に投与してよい。いくつかの実施形態では、提供するリポソームまたは組成物で送達されたｍＲＮＡは、そのリポソーム及び／または組成物を投与した組織に発現する。いくつかの実施形態では、送達されるｍＲＮＡは、リポソーム及び／または組成物を投与した組織とは異なる組織に発現する。送達されたｍＲＮＡが送達され得、かつ／または発現し得る例示的な組織には、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、及び／または脳脊髄の流体が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１４２】
本発明によれば、治療的有効用量は、一定の間隔で投与した場合、肝臓中ＡＳＳ１量の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、一定の間隔で投与した場合、治療前ベースラインの血清中シトルリン量に比べ血清中シトルリン量の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、一定の間隔で投与した場合、治療前ベースラインの血清中アンモニア濃度と比べ血清中アンモニア濃度の低下をもたらす。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、提供組成物を投与すると、肝臓のＡＳＳ１タンパク質の発現量が治療前ベースライン時の量より増加する。いくつかの実施形態では、提供組成物を投与すると、肝臓総タンパク質量中のＡＳＳ１タンパク質量は約３０００ｎｇ／ｍｇ以上、約２０００ｎｇ／ｍｇ以上、約１０００ｎｇ／ｍｇ以上、約５００ｎｇ／ｍｇ以上、約４００ｎｇ／ｍｇ以上、約２００ｎｇ／ｍｇ以上または約１００ｎｇ／ｍｇ以上になる。特定の実施形態では、提供組成物を投与すると、肝臓総タンパク質量中のＡＳＳ１タンパク質量は１２０ｎｇ／ｍｇ以上になる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、提供組成物を投与すると、血漿中または血清中のＡＳＳ１タンパク質量が治療前ベースラインの量より増加する。いくつかの実施形態では、提供組成物を投与すると、血漿中または血清中のＡＳＳ１タンパク質量が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％、治療前ベースラインの量より増加する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、組成物を投与すると、被検体のシトルリン及び／またはアンモニアの濃度が治療前ベースラインの濃度より減少する。典型的に、ベースラインの量は、治療直前に測定する。典型的に、シトルリン及び／またはアンモニアの濃度は生体試料中で測定する。好適な生体試料には、例えば、全血、血漿、血清、尿または脳脊髄液が含まれる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、組成物を投与すると、生体試料（例えば、血清試料、血漿試料、または尿試料）中のシトルリン量が、治療直前のベースラインのシトルリン量より少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％減少する。いくつかの実施形態では、組成物を投与すると、血漿中シトルリン量が約２０００μＭ、１５００μＭ、１０００μＭ、７５０μＭ、５００μＭ、２５０μＭ、１００μＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、６０μＭ、５０μＭ、４０μＭ、または３０μＭより少ない量まで減少する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、組成物を投与すると、生体試料（例えば、血清試料、血漿試料、または尿試料）中のアンモニア濃度が、治療直前のベースラインの濃度より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、提供組成物を投与すると、血漿中または血清中のアンモニア濃度が、治療直前のベースラインのアンモニア濃度より減少する。いくつかの実施形態では、提供組成物を投与すると、血漿中または血清中のアンモニア濃度が、未治療の被検体のアンモニア濃度に比して減少する。いくつかの実施形態では、組成物を投与すると、血漿中または血清中のアンモニア濃度が約３０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２７５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約２５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２２５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約２０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１７５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約１５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１２５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約１０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約７５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約１００μｍｏｌ／Ｌ以下、または約５０μｍｏｌ／Ｌ以下まで減少する。特定の実施形態では、組成物を投与すると、血漿中または血清中のアンモニア濃度が約５０μｍｏｌ／Ｌ以下まで減少する。
【０１４９】
さまざまな実施形態によれば、送達されたｍＲＮＡの発現時期は、特定の医療のニーズに合うよう調整可能である。いくつかの実施形態では、送達されたｍＲＮＡによりコードされたタンパク質の発現は、提供するリポソーム及び／または組成物を投与してから１、２、３、６、１２、２４、４８、７２、及び／または９６時間後に検出可能である。いくつかの実施形態では、送達されたｍＲＮＡによりコードされたタンパク質の発現は、投与してから１週間後、２週間後、及び／または１か月後に検出可能である。
【実施例】
【０１５０】
本発明の特定の化合物、組成物及び方法は、特定の実施形態にしたがい具体的に記載してきたが、以下の実施例はあくまでも本発明の化合物の例示のためであり、それらを限定することを意図するものではない。
【０１５１】
実施例１．ＡＳＳ１  ｍＲＮＡを送達及び発現させるための例示的リポソーム製剤
本実施例では、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡＳＳ１  ｍＲＮＡを効果的に送達及び発現させるための例示的リポソーム製剤を提供する。
【０１５２】
脂質物質
本明細書に記載する製剤は、ｍＲＮＡ  ＡＳＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを封入するよう設計された、１種以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質及び／またはコレステロール系脂質）及びＰＥＧ化脂質を異なる比で使用する、複数成分脂質混合物を含む。カチオン性脂質には、（非限定的に）ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．「Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」  Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉＮ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．「Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．「Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７，１８６４−１８６９）、ｃＫＫ−Ｅ１２（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＩＣＥ、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、グアニジニウム系などが挙げられる。ヘルパー脂質には、（非限定的に）ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、コレステロールなどが挙げられる。ＰＥＧ化脂質には、（非限定的に）鎖長Ｃ６−Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合している鎖長が最高５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖が挙げられる。
【０１５３】
コドンが最適化された、ヒトのアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）メッセンジャーＲＮＡを、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡの鋳型からｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写して合成し、その後、それに５’末端キャップ構造（キャップ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．「Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００５，８６，１２３９−１２４９）、及び、ゲル電気泳動で測定した約２５０ヌクレオチドの長さの３’ポリ（Ａ）テール（配列番号１２）を付加した。各ｍＲＮＡ産物内にある５’及び３’の非翻訳領域を、それぞれ、Ｘ及びＹとして表し、記載の通り定義した（下記参照）。
コドンが最適化された、ヒトのアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡの例構成体設計：
Ｘ−配列番号３−Ｙ、
Ｘ−配列番号１３−Ｙ、
Ｘ−配列番号１４−Ｙ；及び
Ｘ−配列番号１５−Ｙ。
５’及び３’ＵＴＲ配列
Ｘ（５’ＵＴＲ配列）＝
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣ
ＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧ
ＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵ
ＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ［配列番号４］
Ｙ（３’ＵＴＲ配列）＝
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧ
ＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣ
ＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ［配列番号５］
または
ＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧ
ＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵ
ＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ（配列番号６）
【０１５４】
コドンが最適化された、ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡ配列の例には、発明を実施するための形態の項に記載の配列番号３、及び下記配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５が挙げられる：
配列番号１３
ＡＵＧＡＧＣＵＣＡＡＡＧＧＧＡＵＣＵＧＵＧＧＵＧＣＵＧＧＣＡＵＡＣＵＣＧＧＧＧＧ
ＧＡＵＵＧＧＡＣＡＣＵＵＣＡＵＧＣＡＵＡＣＵＵＧＵＣＵＧＧＵＵＧＡＡＧＧＡＡＣＡ
ＧＧＧＣＵＡＣＧＡＣＧＵＧＡＵＣＧＣＣＵＡＣＣＵＧＧＣＵＡＡＣＡＵＣＧＧＵＣＡＡ
ＡＡＧＧＡＧＧＡＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＣＵＧＡＡＧＣ
ＵＧＧＧＣＧＣＧＡＡＧＡＡＡＧＵＧＵＵＣＡＵＣＧＡＧＧＡＣＧＵＧＵＣＣＣＧＧＧＡ
ＡＵＵＵＧＵＧＧＡＡＧＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＧＣＣＣＧＣＣＡＵＣＣＡＡＡＧＣＡＧＣ
ＧＣＡＣＵＧＵＡＣＧＡＧＧＡＵＡＧＡＵＡＣＣＵＣＣＵＣＧＧＡＡＣＡＵＣＣＣＵＵＧ
ＣＣＣＧＧＣＣＡＵＧＵＡＵＵＧＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＧＧＡＡＡＵＣＧＣＣＣＡ
ＧＣＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＣＡＡＡＵＡＣＧＵＧＵＣＣＣＡＣＧＧＧＧＣＧＡＣＣＧＧＡ
ＡＡＧＧＧＧＡＡＣＧＡＣＣＡＡＧＵＧＣＧＣＵＵＣＧＡＧＣＵＧＵＣＧＵＧＣＵＡＣＵ
ＣＣＣＵＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＡＵＵＡＡＧＧＵＣＡＵＣＧＣＧＣＣＧＵＧＧＡＧＡＡＵ
ＧＣＣＵＧＡＡＵＵＣＵＡＣＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＡＡＣＧＡＵＣＵＧ
ＡＵＧＧＡＡＵＡＣＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＧＣＡＵＣＣＣＧＡＵＣＣＣＣＧＵＧＡ
ＣＣＣＣＵＡＡＧＡＡＣＣＣＵＵＧＧＵＣＡＡＵＧＧＡＣＧＡＧＡＡＵＣＵＧＡＵＧＣＡ
ＣＡＵＣＡＧＣＵＡＣＧＡＡＧＣＧＧＧＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＵ
ＣＡＡＧＣＵＣＣＧＣＣＣＧＧＡＣＵＧＵＡＣＡＣＵＡＡＧＡＣＵＣＡＧＧＡＵＣＣＣＧ
ＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＣＡＣＵＣＣＵＧＡＵＡＵＵＵＵＧＧＡＡＡＵＣＧＡＡＵＵ
ＣＡＡＧＡＡＧＧＧＵＧＵＣＣＣＡＧＵＧＡＡＧＧＵＣＡＣＣＡＡＣＧＵＧＡＡＧＧＡＣ
ＧＧＣＡＣＵＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＵＣＧＣＵＧＧＡＡＣＵＧＵＵＵＡＵＧＵＡＵＣ
ＵＧＡＡＣＧＡＧＧＵＧＧＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＵＧＧＡＧＵＣＧＧＣＡＧＡＡＵＣＧＡ
ＵＡＵＵＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＡＵＵＧＧＣＡＵＧＡＡＧＵＣＣＡＧＧＧＧＧ
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（配列番号１３）、
配列番号１４
ＡＵＧＡＧＣＵＣＡＡＡＡＧＧＡＵＣＧＧＵＧＧＵＧＣＵＧＧＣＡＵＡＣＵＣＧＧＧＡＧ
ＧＡＵＵＧＧＡＣＡＣＵＵＣＡＵＧＵＡＵＵＣＵＵＧＵＣＵＧＧＣＵＣＡＡＧＧＡＡＣＡ
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（配列番号１４）、
配列番号１５
ＡＵＧＡＧＣＵＣＧＡＡＡＧＧＡＵＣＣＧＵＧＧＵＵＵＵＧＧＣＡＵＡＣＵＣＣＧＧＵＧ
ＧＡＣＵＵＧＡＣＡＣＵＵＣＡＵＧＣＡＵＵＵＵＧＧＵＵＵＧＧＣＵＣＡＡＡＧＡＡＣＡ
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ＧＡＧＵＡＣＣＡＵＣＧＧＣＵＧＣＡＧＵＣＣＡＡＧＧＵＣＡＣＣＧＣＧＡＡＧＵＡＧ
（配列番号１５）。
【０１５５】
コドンが最適化された、ヒトのアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）メッセンジャーＲＮＡ完全長配列の一例を下記に示す：
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣ
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ＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡ
ＡＧＣＵ（配列番号７）。
【０１５６】
別の実施例では、コドンが最適化された、ヒトのアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）メッセンジャーＲＮＡ完全長配列を下記に示す：
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣ
ＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧ
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ＡＣＣＵＧＧＣＣＡＡＣＡＵＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＣ
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ＣＣＵＧＧＡＧＣＵＧＵＵＣＡＵＧＵＡＣＣＵＧＡＡＣＧＡＧＧＵＧＧＣＣＧＧＣＡＡＧ
ＣＡＣＧＧＣＧＵＧＧＧＣＣＧＣＡＵＣＧＡＣＡＵＣＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡ
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ＡＣＣＡＵＧＧＡＣＣＧＣＧＡＧＧＵＧＣＧＣＡＡＧＡＵＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＵＧＧ
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ＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＵＧＣＧＡＧＵＵＣＧＵＧＣＧＣＣＡＣＵＧＣＡＵＣＧＣＣＡＡＧ
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ＧＡＧＣＣＵＧＵＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＧＣＵＧＧＵＧＡＧＣＡＵＧＡＡＣＧＵＧＣＡＧ
ＧＧＣＧＡＣＵＡＣＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＵＵＣＡＵＣＡＡＣＡ
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ＣＡＡＧＧＵＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＵＧＡＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣ
ＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧ
ＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡ
ＡＧＣＵ（配列番号８）。
【０１５７】
例示的製剤プロトコル
Ａ．ｃＫＫ−Ｅ１２
ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの各エタノール溶液５０ｍｇ／ｍＬの分注を混合し、エタノールで希釈して最終容積を３ｍＬとした。別に、原液１ｍｇ／ｍＬからＡＳＳ１  ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４.５）を調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液にすばやく注入し、撹拌して２０％エタノールに最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７.４）でダイアフィルトレーション後、濃縮し、２〜８℃で保存した。最終濃度＝０．６４ｍｇ／ｍＬ  ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ（封入）。Ｚａｖｅ＝７８ｎＭ（Ｄｖ（５０））＝４６ｎＭ；Ｄｖ（９０）＝９６ｎＭ）。
【０１５８】
Ｂ．Ｃ１２−２００
Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの各エタノール溶液５０ｍｇ／ｍＬの分注を混合し、エタノールで希釈して最終容積を３ｍＬとした。別に、原液１ｍｇ／ｍＬからＡＳＳ１  ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４.５）を調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液にすばやく注入し、撹拌して２０％エタノールに最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７.４）でダイアフィルトレーション後、濃縮し、２〜８℃で保存した。最終濃度＝０．８２ｍｇ／ｍＬ  ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ（封入）。Ｚａｖｅ＝８６ｎＭ（Ｄｖ（５０）＝５０ｎＭ；Ｄｖ（９０）＝１０１ｎＭ）。
【０１５９】
Ｃ．ＨＧＴ４００３
ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの各エタノール溶液５０ｍｇ／ｍＬの分注を混合し、エタノールで希釈して最終容積を３ｍＬとした。別に、原液１ｍｇ／ｍＬからＡＳＳ１  ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４.５）を調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液にすばやく注入し、撹拌して２０％エタノールに最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７.４）でダイアフィルトレーション後、濃縮し、２〜８℃で保存した。最終濃度＝０．８２ｍｇ／ｍＬ  ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ（封入）。Ｚａｖｅ＝８６ｎＭ（Ｄｖ（５０）＝５０ｎＭ；Ｄｖ（９０）＝１０１ｎＭ）。
【０１６０】
Ｄ．ＩＣＥ
ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの各エタノール溶液５０ｍｇ／ｍＬの分注を混合し、エタノールで希釈して最終容積を３ｍＬとした。別に、原液１ｍｇ／ｍＬからＡＳＳ１  ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４.５）を調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液にすばやく注入し、撹拌して２０％エタノールに最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７.４）でダイアフィルトレーション後、濃縮し、２〜８℃で保存した。最終濃度＝０．９１ｍｇ／ｍＬ  ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ（封入）。Ｚａｖｅ＝８１ｎＭ（Ｄｖ（５０）＝４８ｎＭ；Ｄｖ（９０）＝９６ｎＭ）。
【０１６１】
Ｅ．ＨＧＴ５００１
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの各エタノール溶液５０ｍｇ／ｍＬの分注を混合し、エタノールで希釈して最終容積を３ｍＬとした。別に、原液１ｍｇ／ｍＬからＡＳＳ１  ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４.５）を調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液にすばやく注入し、撹拌して２０％エタノールに最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７.４）でダイアフィルトレーション後、濃縮し、２〜８℃で保存した。最終濃度＝０．２０ｍｇ／ｍＬ  ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ（封入）。Ｚａｖｅ＝８７．０ｎＭ（Ｄｖ（５０）＝７５ｎＭ；Ｄｖ（９０）＝１０３ｎＭ）。
【０１６２】
Ｆ．ＨＧＴ５０００
ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの各エタノール溶液５０ｍｇ／ｍＬの分注を混合し、エタノールで希釈して最終容積を３ｍＬとした。別に、原液１ｍｇ／ｍＬからＡＳＳ１  ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４.５）を調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液にすばやく注入し、撹拌して２０％エタノールに最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７.４）でダイアフィルトレーション後、濃縮し、２〜８℃で保存した。最終濃度＝０．２０ｍｇ／ｍＬ  ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ（封入）。Ｚａｖｅ＝８１ｎＭ（Ｄｖ（５０）＝６７ｎＭ；Ｄｖ（９０）＝９７ｎＭ）。
【０１６３】
Ｇ．ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ
ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの各エタノール溶液５０ｍｇ／ｍＬの分注を混合し、エタノールで希釈して最終容積を３ｍＬとした。別に、原液１ｍｇ／ｍＬからＡＳＳ１  ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４.５）を調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液にすばやく注入し、撹拌して２０％エタノールに最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７.４）でダイアフィルトレーション後、濃縮し、２〜８℃で保存した。最終濃度＝０．２０ｍｇ／ｍＬ  ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ（封入）。Ｚａｖｅ＝７８ｎＭ（Ｄｖ（５０）＝６０ｎＭ；Ｄｖ（９０）＝９２ｎＭ）。
【０１６４】
Ｈ．ＤＯＤＡＰ
ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの各エタノール溶液５０ｍｇ／ｍＬの分注を混合し、エタノールで希釈して最終容積を３ｍＬとした。別に、原液１ｍｇ／ｍＬからＡＳＳ１  ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４.５）を調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液にすばやく注入し、撹拌して２０％エタノールに最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７.４）でダイアフィルトレーション後、濃縮し、２〜８℃で保存した。最終濃度＝０．２０ｍｇ／ｍＬ  ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ（封入）。Ｚａｖｅ＝８４ｎＭ（Ｄｖ（５０）＝６２ｎＭ；Ｄｖ（９０）＝９２ｎＭ）。
【０１６５】
Ｉ．ＤＯＤＭＡ
ＤＯＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの各エタノール溶液５０ｍｇ／ｍＬの分注を混合し、エタノールで希釈して最終容積を３ｍＬとした。別に、原液１ｍｇ／ｍＬからＡＳＳ１  ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４.５）を調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液にすばやく注入し、撹拌して２０％エタノールに最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７.４）でダイアフィルトレーション後、濃縮し、２〜８℃で保存した。最終濃度＝０．２０ｍｇ／ｍＬ  ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ（封入）。Ｚａｖｅ＝８６ｎＭ（Ｄｖ（５０）＝６９ｎＭ；Ｄｖ（９０）＝９８ｎＭ）。
【０１６６】
実施例２．ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載リポソームナノ粒子の投与
本実施例では、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載リポソームナノ粒子の投与方法及びｉｎ  ｖｉｖｏのさまざまな標的組織で発現したタンパク質の解析方法を例示的に説明する。
【０１６７】
すべての試験は、各実験開始時の週齢が約６〜８週齢の雄ＣＤ−１マウスを使用して実施した。試料は、封入ＡＳＳ１ｍＲＮＡ総投与量１．０ｍｇ／ｋｇ（または他の指定量）に相当する量を尾静脈注射の単回ボーラス投与により導入した。マウスを屠殺し、指定された時点で生理食塩水による灌流を行った。
【０１６８】
各マウスの肝臓、脾臓、腎臓及び心臓などの組織を回収し、個々の部分に分け、１０％中性緩衝ホルマリンまたは瞬間凍結して保存し、分析用に−８０℃で保存した。
【０１６９】
全動物は、用量投与後（±５％）の指定された時点でＣＯ２で窒息させて安楽死させ、開胸し、最終心血を採取した。安楽死させた動物に心臓穿刺をして全血（採取可能最大量）を血清分離管に採取し、室温で少なくとも３０分間凝固させてから、２２℃±５℃、９３００ｇで１０分間遠心分離にかけた後、血清を抽出した。中間血液採取は、顔面の静脈穿刺または尾部の切断により全血を約４０〜５０μＬ採取した。未処置動物から採取した試料は、試験動物と比較するためのＡＳＳ１量ベースラインとして使用した。
【０１７０】
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）分析−ヒトＡＳＳ１  ＥＬＩＳＡ
捕捉抗体にマウス抗ＡＳＳ１  ２Ｄ１−２Ｅ１２  ＩｇＧを、二次抗体（検出用）にウサギ抗ＡＳＳ１  ＃３２８５  ＩｇＧを用いてＥＬＩＳＡの標準的手順にしたがった（Ｓｈｉｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合体化させたヤギ抗ウサギＩｇＧを使用して３，３'，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を活性化させた。２０分後、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を使用して反応を停止させた。モレキュラーデバイス製ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ装置で吸光度（４５０ｎＭ）検出値を監視した。未処置マウスの血清及び臓器並びにヒトＡＳＳ１タンパク質を、それぞれ、陰性対照及び陽性対照として使用した。
【０１７１】
実施例３．ＡＳＳ１タンパク質の効率的ｉｎ  ｖｉｖｏ発現
本実施例では、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡの投与により、タンパク質が良好に産生され、ｉｎ  ｖｉｖｏの臨床上の有効性がもたらされることを示す。
【０１７２】
コドンが最適化されたｈＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子によるヒトＡＳＳ１タンパク質の産生を、単回ボーラス静脈内注射した場合についてＣＤ−１マウスで試験した。図１は、さまざまな用量のヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子でマウスを処置した場合の、ＥＬＩＳＡで検出されたヒトＡＳＳ１タンパク質量を表す。注射してから２４時間後にマウスを屠殺し臓器を回収した（上記のとおり）。
【０１７３】
図１に示すように、肝臓のヒトＡＳＳ１タンパク質量を測定したところ、はっきりとした用量反応が得られた。用量範囲は、封入ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡ０．１０〜２．０ｍｇ／ｋｇであった。これらのデータは、脂質ナノ粒子が肝臓中で蓄積し、搭載ｍＲＮＡを放出し、肝臓が翻訳を介してこの外因性ｍＲＮＡを処理しヒトＡＳＳ１タンパク質を産生することができることを示している。ＥＬＩＳＡ解析で測定したヒトＡＳＳ１タンパク質の生の数値（図１に図示）を下記表１に示す。
【表１−３】
2019163322.tif 000011
コドンが最適化されたヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡをｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子を介して送達した。用量は、封入ＡＳＳ１  ｍＲＮＡに基づいている。数値は、肝臓中総タンパク質量（ミリグラム）あたりのヒトＡＳＳ１タンパク質量をナノグラムで示している。ＢＬＤ＝ＥＬＩＳＡ検出下限。
【０１７４】
ＥＬＩＳＡでは低値での感度に限界があるが、ウェスタンブロット解析では、低用量でも（０．３０ｍｇ／ｋｇ）ヒトＡＳＳ１タンパク質が明瞭に表示できる（図２Ａ〜２Ｄ）。
【０１７５】
ＡＳＳ１  ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子が、選択臓器（肝臓）へのｍＲＮＡ送達を促進する能力をさらに理解するために、我々は、１週間の間の肝臓中のヒトＡＳＳ１タンパク質量を監視する薬物動態試験を行った。図３は、ヒトＡＳＳ１搭載脂質ナノ粒子（ｃＫＫ−Ｅ１２）投与後のさまざまな測定時点で検出された肝臓中のヒトＡＳＳ１タンパク質の量を示す。これは、静脈内に単回投与（封入ｍＲＮＡ１．０ｍｇ／ｋｇ）を行った場合に得られた結果である。
【０１７６】
この例では、投与から約２４〜４８時間後にヒトＡＳＳ１タンパク質の最大血清濃度が観察された。測定可能な量のタンパク質が投与から１週間後もなお、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットの双方で観察された（それぞれ、図３及び４Ａ−４Ｅ）。
【０１７７】
Ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に基づいた方法を使用して、処置マウスのそれぞれの肝臓中の医薬活性成分（ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ）を直接検出した。図５Ａ〜５Ｉに示されるように、外因性ヒトＡＳＳ１メッセンジャーＲＮＡは、試験の最初の測定時点（３０分）で高濃度で検出可能であり、そのシグナルの強さは投与から４８時間後まで変わらなかった。さらに、ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡは投与７日後もなお検出可能であった。
【０１７８】
ＩＳＨのほかに、免疫組織化学的（ＩＨＣ）手段を用いて、先に得られたヒトＡＳＳ１タンパク質の検出を行った。特異的結合にマウスモノクローナル抗体（０２Ｄ２−２Ｅ１２）を用いたところ、処置を受けた肝臓肝細胞の細胞質に標的ヒトＡＳＳ１タンパク質がすぐに観察された。シグナルは、最初、処置を受けた肝臓に投与後３０分以内にかすかに認められたが、投与後３時間以内に明瞭に認められた。図６Ａ〜６Ｉは、投与後の処置マウス肝臓中のヒトＡＳＳ１タンパク質染色を経時的に示している。
【０１７９】
さらに、ヒトＡＳＳ１タンパク質が類洞壁細胞並びに標的肝細胞の両方で肝臓全体にわたり広範囲で分布している様子が強く検出されているのが認められる。図７Ａ〜７Ｂは、投与後２４時間のヒトＡＳＳ１タンパク質の陽性ＩＨＣ染色の呈色を低倍率で表したものである。
【０１８０】
ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡの送達とそれに続くタンパク産生は単一の脂質ナノ粒子系に限定されるものではない。幾つかのカチオン性脂質系ナノ粒子系を、それらがｍＲＮＡを送達し所望のタンパク質を産生する能力について探索した。選択すべき分析対象物としてヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡを使用して異なる１０種類のカチオン性脂質系のスクリーニング調査をした。各製剤用のカチオン性脂質成分は表２に一覧が示され、また、図８に示されている。単回静脈内注射で投与し、肝臓試料を投与から２４時間後に採取した。
【０１８１】
製剤の用量はいずれも封入ｍＲＮＡに基づき１．０ｍｇ／ｋｇとした。数値は、投与後２４時間の肝臓試料に基づいている。
【表２】
2019163322.tif 000012
ＥＬＩＳＡ解析で測定したさまざまなカチオン性脂質系ナノ粒子系のヒトＡＳＳ１タンパク質の生の数値（図９に図示）。用量はいずれも１．０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。タンパク質の数値は、肝臓総タンパク質（ミリグラム）あたりのヒトＡＳＳ１タンパク質量をナノグラムで示している。ｃＫＫ−Ｅ１２（１）は、ＰＥＧ脂質の割合がｃＫＫ−Ｅ１２（２）よりも低い（ＰＥＧ脂質：３％対５％）。
【０１８２】
ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子によるタンパク質産生は検出可能ではあるが、我々は、得られたタンパク質が活性であるのか、また、それが適切に機能し得るのかどうかさらに検討した。そのために、１４Ｃシトルリン添加により細胞タンパク質への１４Ｃアルギニンの取り込みを測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性試験を行った。放射性シトルリンは、活性ＡＳＳ１タンパク質の存在下、１４Ｃ−アルギニノコハク酸に変換され、その後、１４Ｃ−アルギニン変換された。ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡをトランスフェクションした細胞と未処置細胞とを比較して、それぞれの外因性ｍＲＮＡ由来ＡＳＳ１タンパク質の活性を測定することができた。図９は、細胞タンパク質への１４Ｃアルギニンの取り込みを１分あたりの放射線量計測数で表している。ヒトＡＳＳ１  ｍＲＮＡをトランスフェクションしたＳＫ（−）細胞（ＡＳＳ１タンパク質ノックアウト細胞株）を枯渇培地（アルギニンまたはロイシン未含）に曝露させたところ、放射線観測値は未処置ＳＫ（−）細胞より高くなった。トランスフェクションを行ったこれらの細胞で測定された活性は、安定してトランスフェクションされた陽性ＡＳＳ１細胞株（ＳＫ（＋））の活性に匹敵するものであった。
【０１８３】
実施例４．ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子による治療後のヒトＡＳＳ１タンパク質量
本実施例では、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡの投与により、ＡＳＳ１タンパク質が肝臓中で良好に産生されることを示す。
【０１８４】
雄ＣＤ−１マウスは、脂質ナノ粒子（ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子）１．０ｍｇ／ｋｇを静脈内に単回投与したマウス、または、上記実施例２のような未処置（すなわち、対照）マウスであった。マウスを屠殺し、その臓器を投与２４時間後に採取した。肝臓中のヒトのアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）タンパク質量をＥＬＩＳＡで測定した。これらのデータは、対照と比較して多量のＡＳＳ１タンパク質量が検出されたこと、及び、その産生タンパク質は、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡが経静脈送達によるものであることを示している（図１０）。
【０１８５】
実施例５：ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子による治療後のアンモニア血漿濃度
本実施例では、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡの投与により、アンモニア血漿濃度が良好に低下したことを示す。
【０１８６】
ＡＳＳ１ノックアウトマウスに、ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子（ＡＳＳ１  ｍＲＮＡ搭載ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子）または空の脂質ナノ粒子１．０ｍｇ／ｋｇを１４日に１回、３０日間、上記実施例２のとおり投与した。空の脂質ナノ粒子を投与したマウスはビヒクル対照として使用した。さらなる対照群に、未処置野生型マウス及び未処置ＡＳＳ１ノックアウトマウスを含めた。第１、１５及び２９日の各投与に先立ち、血漿試料を採取した（すなわち、投与前）。血漿試料は、第２、１６及び３０日の各投与後２４時間以内にも採取した。さらなる血漿試料を第８日及び２２日に採取した。全試料のアンモニア血漿濃度を定量したところ、処置後少なくとも２４時間は、アンモニア血漿濃度が野生型マウスで観察された濃度に近い濃度まで低下し再現性があることが示された。
【０１８７】
等価物
当業者は、慣用となっている実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物について認識または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の「発明を実施するための形態」に限定されるものではなく、むしろ、以下の請求項に記載されている。
【図１】
2019163322.tif 000013
【図２Ａ】
2019163322.tif 000014
【図２Ｂ】
2019163322.tif 000015
【図２Ｃ】
2019163322.tif 000016
【図２Ｄ】
2019163322.tif 000017
【図３】
2019163322.tif 000018
【図４Ａ】
2019163322.tif 000019
【図４Ｂ】
2019163322.tif 000020
【図４Ｃ】
2019163322.tif 000021
【図４Ｄ】
2019163322.tif 000022
【図４Ｅ】
2019163322.tif 000023
【図５Ａ】
2019163322.tif 000024
【図５Ｂ】
2019163322.tif 000025
【図５Ｃ】
2019163322.tif 000026
【図５Ｄ】
2019163322.tif 000027
【図５Ｅ】
2019163322.tif 000028
【図５Ｆ】
2019163322.tif 000029
【図５Ｇ】
2019163322.tif 000030
【図５Ｈ】
2019163322.tif 000031
【図５Ｉ】
2019163322.tif 000032
【図６Ａ】
2019163322.tif 000033
【図６Ｂ】
2019163322.tif 000034
【図６Ｃ】
2019163322.tif 000035
【図６Ｄ】
2019163322.tif 000036
【図６Ｅ】
2019163322.tif 000037
【図６Ｆ】
2019163322.tif 000038
【図６Ｇ】
2019163322.tif 000039
【図６Ｈ】
2019163322.tif 000040
【図６Ｉ】
2019163322.tif 000041
【図７Ａ】
2019163322.tif 000042
【図７Ｂ】
2019163322.tif 000043
【図８】
2019163322.tif 000044
【図９】
2019163322.tif 000045
【図１０】
2019163322.tif 000046
【図１１】
2019163322.tif 000047
【配列表】
2019163322000001.app
【外国語明細書】
2019163322000001.pdf