(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリメラーゼ貯蔵緩衝液における使用、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸合成または増幅反応における使用のための組成物、キット、及び方法における新規化合物の提供。【解決手段】式Iの化合物。2019163255.tif 000021式中、Ｒ１がＣ１２アルキルである、前記化合物。Ｒ２及びＲ４はＨである。Ｒ３は、Ｒ５と一緒になって、５員環を形成した下記の化合物である。2019163255.tif 000022【選択図】図１
2019163255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物であって、
【化１】
2019163255.tif 000019
式中、
Ｒ１がＣ１２アルキルである、前記化合物。特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ４はＨである。特定の実施形態では、Ｒ３は、Ｒ５と一緒になって、５員環を形成し、各ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０を含むがこれらに限定されない任意の正の整数である。
【請求項２】
以下の構造を有する化合物：
【化２】
2019163255.tif 000020
。
【請求項３】
ポリメラーゼ及び請求項２に記載の前記化合物を含む、組成物。
【請求項４】
前記ポリメラーゼが熱安定性である、請求項３に記載の前記組成物。
【請求項５】
ａ）少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸
ｂ）ＤＴＴ
ｃ）ＫＣｌ
ｄ）ＭｇＣｌ２
ｅ）Ｋａｔｈｏｎ
ｆ）ＥＤＴＡ
ｇ）ゼラチン
ｈ）トリス
ｉ）グリセロール
ｊ）ＢＳＡ
のうちの１つ以上を含む、請求項３に記載の前記組成物。
【請求項６】
ポリメラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項３に記載の前記組成物。
【請求項７】
前記ポリメラーゼ阻害剤が、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド阻害剤である、請求項６に記載の前記組成物。
【請求項８】
前記ポリメラーゼ阻害剤が、少なくとも１つの抗体阻害剤である、請求項６に記載の前記組成物。
【請求項９】
前記ポリメラーゼが、少なくとも約１ヶ月〜約３年間安定している、請求項３に記載の前記組成物。
【請求項１０】
ポリメラーゼ及び請求項２に記載の前記化合物を含む貯蔵または反応組成物を含む、キット。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼが、熱安定性である、請求項１０に記載の前記キット。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼが、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼから単離されたポリメラーゼである、請求項１１に記載の前記キット。
【請求項１３】
ポリメラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項１１に記載の前記キット。
【請求項１４】
ポリメラーゼの効率を増加させるための方法であって、
ａ）標的核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、及び請求項２に記載の前記化合物と混合するステップと、
ｂ）前記標的核酸を増幅するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記増加した効率が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときと同一の効率である、請求項１４に記載の前記方法。
【請求項１６】
前記増加した効率が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときの効率より大きい、請求項１４に記載の前記方法。
【請求項１７】
前記化合物の有効濃度が、従来の界面活性剤に必要とされるものより少なくとも１〜１０倍低い、請求項１４に記載の前記方法。
【請求項１８】
前記従来の界面活性剤が、ＮＰ−４０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０である、請求項１７に記載の前記方法。
【請求項１９】
試料中の標的核酸を検出するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、請求項２に記載の前記化合物、及び検出可能な標識を含む、反応混合物を形成するステップと、
ｂ）前記標的核酸を増幅するステップと、
ｃ）前記試料中の前記標的核酸の存在及び／または量を示す、前記検出可能な標識から生成されるシグナルを検出するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２０】
熱サイクリングプロセスにおけるポリメラーゼの不活性化を阻害するための方法であって、前記熱サイクリングプロセス中に前記ポリメラーゼを請求項２に記載の前記化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２１】
ポリメラーゼ不活性化の前記阻害が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ不活性化の阻害と同一である、請求項２０に記載の前記方法。
【請求項２２】
ポリメラーゼ不活性化の前記阻害が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ不活性化の阻害より大きい、請求項２０に記載の前記方法。
【請求項２３】
ポリメラーゼ活性を有する酵素の前記ポリメラーゼ活性が安定化するような条件下で前記酵素と請求項２に記載の前記化合物とを組み合わせて混合物を形成することを含む、方法。
【請求項２４】
前記安定化が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ活性の安定化と同一である、請求項２３に記載の前記方法。
【請求項２５】
前記安定化が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ活性の安定化より大きい、請求項２３に記載の前記方法。
【請求項２６】
前記ポリメラーゼが、熱安定性である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項２７】
ａ）少なくとも１つのポリメラーゼと、
ｂ）ｄＮＴＰと、
ｃ）請求項２に記載の前記化合物と
を含む、核酸増幅反応混合物。
【請求項２８】
少なくとも１つのプライマーをさらに含む、請求項２７に記載の前記核酸増幅反応混合物。
【請求項２９】
前記ポリメラーゼが、熱安定性である、請求項２７または２８に記載の前記核酸増幅反応混合物。
【請求項３０】
少なくとも１つの抗体をさらに含む、請求項２７に記載の前記核酸増幅反応混合物。
【請求項３１】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドポリメラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項２７に記載の前記核酸増幅反応混合物。
【請求項３２】
標的核酸を重合するための方法であって、
ａ）反応混合物中で、前記標的核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ及び請求項２に記載の前記化合物と組み合わせるステップと、
ｂ）前記標的核酸を重合するステップと
を含む、前記方法。
【請求項３３】
標的核酸を増幅するための方法であって、
ａ）反応混合物の一部として、前記標的核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ及び請求項２に記載の前記化合物と組み合わせるステップと、
ｂ）前記標的核酸を重合するステップと
を含む、前記方法。
【請求項３４】
前記反応混合物が、少なくとも１つの核酸プライマー及び／またはｄＮＴＰをさらに含む、請求項３２または３３に記載の前記方法。
【請求項３５】
前記標的核酸の重合または増幅が検出される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項３６】
検出可能な標識を使用して、前記標的核酸の重合または増幅が検出される、請求項３５に記載の前記方法。
【請求項３７】
前記検出可能な標識が、プライマーまたはプローブの一部である、請求項３６に記載の前記方法。
【請求項３８】
前記標的核酸の前記重合または増幅が定量される、請求項３５に記載の前記方法。
【請求項３９】
前記ポリメラーゼが、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物のミトコンドリアのＤＮＡポリメラーゼγ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩＩ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩＶ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＶ、真核生物のポリメラーゼα、真核生物のポリメラーゼβ、真核生物のポリメラーゼγ、真核生物のポリメラーゼδ、真核生物のポリメラーゼε、真核生物のポリメラーゼη、真核生物のポリメラーゼζ、真核生物のポリメラーゼι、真核生物のポリメラーゼκ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニット、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩεサブユニット、大腸菌ポリメラーゼＩＶ、大腸菌ポリメラーゼＶ、サーマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼＩ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、ユリ古細菌門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）ポリメラーゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ポリメラーゼ４、損傷乗り越え合成ポリメラーゼ、逆転写酵素、熱安定性ポリメラーゼ、及びテロメラーゼからなる群から選択される、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項４０】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＶｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、低下した３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼ、活性部位突然変異Ｆ６６７Ｙを有するポリメラーゼ、活性部位Ｆ６６７Ｙの等価物を有するポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａq（登録商標）ＦＳ、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、ターミネーターＩ、ターミネーターＩＩ、ターミネーターＩＩＩ、ターミネーターγ、それらの誘導体、及びそれらの断片からなる群から選択される、請求項３９に記載の前記方法。
【請求項４１】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４０に記載の前記方法。
【請求項４２】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４０に記載の前記方法。
【請求項４３】
試料中の標的核酸を検出するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、及び請求項２に記載の前記化合物、ならびに検出可能な標識を含む、反応混合物を形成することと、
ｂ）前記標的核酸を増幅することと、
ｃ）前記標的核酸前記試料の存在を示す、前記検出可能な標識から生成されるシグナルを検出することと
を含む、前記方法。
【請求項４４】
ホットスタート技法の使用を含む、請求項１４、１９、２０、２３、３２、３３、及び４３のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項４５】
前記ホットスタート技法が、オリゴヌクレオチドベースのシステム、抗体ベースのシステム、化学ベース型システム、及び二重ホットスタートシステムからなる群から選択される、請求項４４に記載の前記方法。
【請求項４６】
修飾界面活性剤を生成するための方法であって、
ａ）ＢｒｉｊＬ−２３を活性化してＢｒｉｊＬ−２３−メソレート（Ｍｅｓｏｌａｔｅ）を生成することと、
ｂ）ＢｒｉｊＬ−２３−メソレート（Ｍｅｓｏｌａｔｅ）からＢｒｉｊＬ−２３−ヨージドを調製することと、
ｃ）ＢｒｉｊＬ−２３−ヨージドからＢｒｉｊＬ−２３−プロリン−ｔ−ブチルエステルを調製することと、
ｄ）ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン−ｔ−ブチルエステルを加水分解して、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを生成することと
を含む、前記方法。
【請求項４７】
生成物を中和することをさらに含む、請求項４６に記載の前記方法。
【請求項４８】
前記生成物が、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）を使用して中和される、請求項４７に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、例えば、ポリメラーゼ貯蔵緩衝液における、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの反応におけるような核酸合成に関する組成物及び方法を含む、様々な組成物、キット、及び方法において使用するための新規化合物に関する。修飾化合物を調製するための方法も記載する。
【背景技術】
【０００２】
多くの周知の組換えＤＮＡ技法は、ＤＮＡを複製もしくは重合及び／または増幅することを伴う。かかる一例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲの間、反応は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素の存在下で２つの温度、すなわち低温と高温（例えば、５５℃及び９５℃）の間を繰り返し循環する。一連の反応にわたって高温で経過した合計時間は、サイクルの合計数、各サイクルの高温ステップの持続時間、及びランプ速度（すなわち、サーモサイクラーが１つの温度から別の温度に変化する速度）に依存する。ＰＣＲにおいて使用されるＤＮＡポリメラーゼが、高い熱安定性であっても、それらは、時間が経つにつれ、高温で不活性になる傾向にある。さらに、これらのポリメラーゼはまた、補助因子の最適に満たない濃度を伴うか、または最適に満たないｐＨレベルを有するか、または化学もしくは生物学阻害剤の存在を含む、反応混合物環境に導入されることによって、不活性になり得る。
【０００３】
かかる条件下で酵素を安定化する１つの方法は、サーファクタント（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）などの安定化剤を添加することである。界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などのサーファクタントは、酵素の活性型とその液体環境との間の界面を安定化する界面活性化合物である。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性は、ＮＰ−４０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｂａｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（５）：１３０９（１９９０）（非特許文献１））などの非イオン性界面活性剤の添加によって安定化された。しかしながら、いくつかの用途では、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０安定化ＤＮＡポリメラーゼは、増幅の低効率を有するか、または非特異的産物の増幅をもたらす。加えて、いくつかの界面活性剤は、高濃度を必要とする。さらに、いくつかの界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０）は、有害特性を有することでも知られている。したがって、溶液中の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの安定性を改善する化合物、及び特に、現在使用される界面活性剤の不利益のうちのいずれも与えることなく酵素安定性を改善する化合物の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂａｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（５）：１３０９（１９９０）
【発明の概要】
【０００５】
種々の組成物、キット、及び方法のための新規化合物を本明細書に提供する。かかる用途は、貯蔵緩衝液、及び核酸合成または増幅反応においての使用を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、適切な出発材料を化学修飾することによって合成されたイオン性及び双性イオン性界面活性剤化合物が提供される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、かかる新規化合物は、熱安定性ポリメラーゼと共に組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、かかる組成物は、安定化された熱安定性酵素組成物である。一実施形態では、酵素は、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼから精製されたＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、酵素は、組換え手法によって生成されたＤＮＡポリメラーゼである。別の実施形態では、酵素は、該ポリメラーゼを可逆的に阻害することができる抗体（複数可）及び／またはオリゴヌクレチドと組み合わされたＤＮＡポリメラーゼである。
【０００７】
本明細書において提供される新規化合物は、種々の用途で使用され得、かつ例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅反応など様々な組成物中に含まれ得る。
【０００８】
特定の実施形態では、修飾化合物は、以下の構造式を有する。
【化１】
2019163255.tif 000003
式中、
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ３０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）置換アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）ヘテロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）置換ヘテロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、フェニル、置換フェニルであり、置換アリールまたは置換フェニルは、少なくとも１つの（Ｃ１−Ｃ３０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）置換アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）ヘテロアルキル、または（Ｃ１−Ｃ３０）置換ヘテロアルキルで置換される。
Ｒ２及び／またはＲ３はそれぞれ、独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、またはＣ（ＣＨ３）３であり、
Ｒ４及び／またはＲ５はそれぞれ、独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、Ｃ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５ＯＨ、ＣＨ２Ｃ＝ＣＨ  ＮＨ（Ｃ６Ｈ５）、ＣＨ２Ｃ＝ＣＨＮ＝ＣＨＮＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２、（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＳＨ、（ＣＨ２）ｎＮＨ、（ＣＨ２）ｎＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、（ＣＨ２）３ＮＨＣ（ＮＨ２）＝ＮＨであり、または代替的には、Ｒ３は、Ｒ５と一緒になって、任意選択で、少なくとも１つの（Ｃ１−Ｃ３０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）置換アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）ヘテロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）置換ヘテロアルキルで置換される５もしくは６員環を形成し、
また、
各ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０を含むがこれらに限定されない任意の正の整数である。
【０００９】
特定の実施形態では、Ｒ１はＣ８アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ１はＣ１２アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１はＣ１６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ２及び／またはＲ３はそれぞれ、独立して、Ｈ及びＣＨ３から選択される。特定の実施形態では、Ｒ４及び／またはＲ５はそれぞれ、独立して、Ｈ、（ＣＨ２）ｎＮＨ、（ＣＨ２）ｎＮであり、または代替的には、Ｒ３は、Ｒ５と一緒になって、５もしくは６員環を形成する。
【００１０】
特定の実施形態では、式１の新規化合物が提供される。いくつかの実施形態では、以下の構造式
【化２】
2019163255.tif 000004
を有する新規化合物ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン及び／またはその誘導体が提供される。
【００１１】
標的核酸を少なくとも１つのポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、及び少なくとも１つの式Ｉの新規化合物と混合することと、標的核酸を重合及び／または増幅することと、を含む核酸を重合及び／または増幅するための方法も提供される。かかる方法のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのプライマーが用いられる。特定の実施形態では、少なくとも１つのポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、少なくとも１つのプライマー、及び少なくとも１つの式Ｉの新規化合物を含む核酸増幅反応混合物が提供される。いくつかの実施形態では、反応混合物は、検出可能な標識をさらに含み得る。特定の実施形態では、本方法は、検出可能な標識を検出して、増幅された核酸を定量するための１つ以上のステップをさらに含む。特定の実施形態では、そこに式Ｉの新規界面活性剤を含むことによって、熱サイクリングプロセス中のポリメラーゼの不活性化を阻害するための方法が提供される。特定の実施形態では、ポリメラーゼ活性を有する酵素及び少なくとも１つの式Ｉの新規界面活性剤を提供し、かつ、酵素のポリメラーゼ活性が安定化するような条件下でそれを組み合わせて混合物を形成するための方法が提供される。特定の実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性である。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば、ＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０などの従来の（例えば、既知）界面活性剤の存在下にあるときの増幅効率と同様であるか（例えば、およそ同一）、または増加した増幅効率を有する増幅反応を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される新規化合物は、例えば、貯蔵緩衝液または増幅反応において、ＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（例えば、マスターミックスまたは予混合された組成物の一部として提供されるような）の代わりとなり得る。
【００１２】
特定の実施形態では、組成物または反応混合物中の本明細書に記載される少なくとも１つの新規化合物の有効濃度は、ＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０などの従来の界面活性剤で必要とされるものと同等であるか、またはそれより少ない。いくつかのかかる実施形態では、反応混合物中の少なくとも１つの新規化合物（複数可）の有効濃度は、ＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０などの従来の界面活性剤（複数可）で必要とされるものより、最大で、約、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍低い可能がある。いくつかの実施形態では、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンなどの少なくとも１つの新規化合物の有効濃度は、０．０００１％〜１０％である。例えば、いくつかの実施形態では、組成物または反応混合物中のＢｒｉｊＬ−２３−プロリンの濃度は、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、または１０％である。いくつかの好ましい実施形態では、該組成物または反応混合物中のＢｒｉｊＬ−２３−プロリンの濃度は、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、及び５％などの０．０１％〜５％である。
【００１３】
新規化合物を生成するための方法も提供される。
【００１４】
特定の実施形態では、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンなどの式Ｉの新規化合物のうちの少なくとも１つを含む組成物が本明細書において提供される。特定の実施形態では、少なくとも１つのポリメラーゼ及びＢｒｉｊＬ−２３−プロリンなどの式Ｉの新規化合物のうちの少なくとも１つを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性である。かかる方法を実行するため、またはかかる混合物を調製するために必要なかかる化合物及び同類のものを含む試薬を含むキットも提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本明細書に示される全ての増幅プロットは、サイクル数（ｘ軸）の関数としてΔＲｎ（ｙ軸）として標的核酸増幅をグラフで表す。
【００１６】
【図１】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って増幅された１Ｋｂ及び３ＫｂのＰＣＲ産物を使用する、異なる濃度での新規化合物Ｄｔ１及びＤｔ２の滴定。
【図２】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従う新規化合物Ｄｔ１及びＤｔ２の存在下でのロドプシン遺伝子の増幅。
【図３】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って増幅された０．１〜１ＫｂのＰＣＲ産物に対する、ＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と比較した０．００４％及び０．０００２％での新規化合物Ｄｔ２の比較。
【図４】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って増幅された１〜２ＫｂのＰＣＲ産物に対する、ＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と０．００４％及び０．００２％での新規化合物Ｄｔ２の比較。
【図５】ＰＣＲ活性：本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って増幅されたロドプシン遺伝子産物に対する、Ｂｒｉｊ−５８単独と新規化合物Ｄｔ２の比較。
【図６】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って増幅されたＲｈｏｄ−１０４３標的配列を使用する、新規化合物Ｄｔ２及びＤｔ４の滴定。
【図７】Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とＤｔ４の比較：本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従うβ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、大型リボソームタンパク質（ＲＰＬＰＯ）、及びグルクロニダーゼβ（ＧＵＳＢ）の増幅。
【図８】Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ログスケール）とＤｔ４の比較：本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従うＢ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＲＰＬＰＯ、及びＧＵＳＢの増幅。
【図９】Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とＤｔ４の比較：本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従ってＣｑによって表される通りの様々なＰＣＲ産物の増幅効率。
【図１０】Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とＤｔ１、Ｄｔ３、Ｄｔ５、Ｄｔ６、及びＤｔ７の比較；本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って実行された増幅。
【図１１】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従ってＢｒｉｊ−５８及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．００１％及び０．０００８％のそれぞれ）とＤｔ４の活性を比較する、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）の増幅反応の増幅プロット。
【図１２】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従ってＢｒｉｊ−５８及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．０００６％及び０．０００４％のそれぞれ）とＤｔ４の活性を比較する、ＨＰＲＴ１の増幅反応の増幅プロット。
【図１３】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従ってＢｒｉｊ−５８及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．００１％及び０．０００８％のそれぞれ）とＤｔ４の活性を比較する、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）の増幅反応の増幅プロット。
【図１４】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従ってＢｒｉｊ−５８及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．０００６％及び０．０００４％のそれぞれ）とＤｔ４の活性を比較する、ＰＰＩＡの増幅反応の増幅プロット。
【図１５】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従ってＢｒｉｊ−５８及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．０００２％及び０．０００１％のそれぞれ）とＤｔ４の活性を比較する、ＰＰＩＡの増幅反応の増幅プロット。
【図１６】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って、０．００２％のＤｔ４と、０．０１％及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０との活性を比較する、Ｂ２Ｍの増幅反応の増幅プロット。
【図１７】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って、０．００２％のＤｔ４と、０．０１％及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０との活性を比較する、ＧＡＰＤＨの増幅反応の増幅プロット。
【図１８】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って、０．００２％のＤｔ４と、０．０１％及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０との活性を比較する、ＲＰＬＰＯの増幅反応の増幅プロット。
【図１９】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って５Ｘ緩衝液（ＡＣＴＢ（アクチン−β）、ＧＡＰＤＨ、ＰＰＩＡ、及びＲＰＬＰＯの増幅反応）におけるポリメラーゼの安定性を実証する、２ヶ月にわたっておよそ１週間間隔で取られた増幅反応（Ｃｑ）のグラフ表示。
【図２０】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って２ヶ月にわたって５Ｘ緩衝液（ＡＣＴＢ（アクチン−β）、ＧＡＰＤＨ、ＰＰＩＡ、及びＲＰＬＰＯの増幅反応）におけるポリメラーゼの安定性を実証する、およそ１週間間隔で取られた増幅反応（δＲｎ）のグラフ表示。
【図２１】Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と２つの異なるＤｔ４ロット（Ｃｑ、ＲＰＬＰＯ、ＡＣＴＢ、ＰＰＩＡ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ１）、Ｂ２Ｍ、ＧＵＳＢ、及びＨＰＲＴ１の増幅反応）の比較。本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って５Ｘ緩衝液（ＡＣＴＢ（アクチン−β）、ＧＡＰＤＨ、ＰＰＩＡ、及びＲＰＬＰＯの増幅反応）におけるポリメラーゼの安定性を実証する、２ヶ月にわたるおよそ１週間間隔で取られた増幅反応（Ｃｑ）のグラフ表示。
【図２２】Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と２つの異なるＤｔ４ロット（δＲｎ、ＲＰＬＰＯ、ＡＣＴＢ、ＰＰＩＡ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ１）、Ｂ２Ｍ、ＧＵＳＢ、及びＨＰＲＴ１の増幅反応）の比較。本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って５Ｘ緩衝液（ＡＣＴＢ（アクチン−β）、ＧＡＰＤＨ、ＰＰＩＡ、及びＲＰＬＰＯの増幅反応）におけるポリメラーゼの安定性を実証する、２ヶ月にわたるおよそ１週間間隔で取られた増幅反応（Ｃｑ）のグラフ表示。
【図２３】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従う種々のＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにわたるＤｔ４増幅の比較。
【図２４】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従う市販のプラチナＴａｑ（１）、新規化合物ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン（２）を含むように配合されたプラチナＴａｑ、及びＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（３）を含むように配合されたプラチナＴａｑを使用する、様々な標的（パネル１〜４４）のＰＣＲ増幅の比較。各パネルは、上で記載された様々な酵素配合物（１、２、または３）を比較する反応混合物を使用して増幅された特定の標的配列（１から４４）を表す。
【図２５】本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従ってＢｒｉｊＬ−２３−プロリンまたはＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むように配合されたプラチナＴａｑ及びｒＴａｑの感度。ゲノムＤＮＡは、５０ｎｇ、５ｎｇ、５００ｐｇ、または５０ｐｇのＤＮＡを含む反応物を使用して増幅された。増幅反応は、記載されたものなどの様々な配合物を使用して実行された。「Ｆｍ．Ｐｌａ．Ｔａｑ」は、ＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むプラチナＴａｑ（１０ｕ／μｌ）の配合物である。「Ｃａｔａｌｏｇ  Ｐｌａ．Ｔａｑ」は、市販のプラチナＴａｑの配合物である。「Ｐｌａ．Ｔａｑ７７６」は、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを含むプラチナＴａｑ（１０ｕ／μｌ）の配合物である。「Ｆｍ．Ｔａｑ」は、ＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を含むｒＴａｑ（５ｕ／μｌ）の配合物である。「Ｃａｔａｌｏｇ  Ｔａｑ」は、市販のｒＴａｑの配合物である。「Ｔａｑ７７６」は、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを含むｒＴａｑ（５ｕ／μｌ）の配合物である。
【図２６】市販のプラチナＴａｑ（１）、市販のｒＴａｑ（Ａ）、本明細書に開示される方法及び組成物の特定の例示的な実施形態に従って、新規化合物ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを含むように配合されたプラチナＴａｑ（２）、新規化合物ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを含むように配合されたｒＴａｑ（Ｂ）、ＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むように配合されたプラチナＴａｑ（３）、及びＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むように配合されたｒＴａｑ（Ｃ）を使用して増幅されたＰＣＲ産物のＴＯＰＯ−ＴＡクローニングの比較。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
安定した酵素貯蔵ならびに／または核酸重合及び／もしくは増幅反応のために使用される組成物においての用途を含むがこれらに限定されない種々の用途のための新規化合物が本明細書において提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼの貯蔵のため及び標的核酸を増幅するための組成物、方法、及びキットが提供される。いくつかの実施形態では、イオン性及び双性イオン性界面活性剤は、出発化合物（例えば、単純な化合物）を化学的に用いて合成され、提供される。いくつかの実施形態では、Ｄｔ１、Ｄｔ２、Ｄｔ３、Ｄｔ４、Ｄｔ５、Ｄｔ６、Ｄｔ７、Ｄｔ８、Ｄｔ９、Ｄｔ１０、Ｄｔ１１、及びＤｔ１２（以下に記載）などの新規化合物が、提供される。いくつかの実施形態では、新規化合物ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンが、提供される。これらの新規化合物は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸重合及び／または増幅反応を含む種々の手順において使用され得る。いくつかの実施形態では、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンなどの式Ｉの新規化合物のうちの１つ以上の存在は、組成物もしくは反応混合物内のポリメラーゼを安定化し得、組成物もしくは反応混合物内のポリメラーゼの阻害を減少させ得、ならびに／または反応混合物内のポリメラーゼの重合及び／もしくは増幅効率を増加させ得る。このため、少なくとも１つのポリメラーゼ及びＢｒｉｊＬ−２３−プロリンなどの式Ｉの新規化合物のうちの少なくとも１つを含む組成物及び反応混合物が、提供される。かかる組成物または反応混合物は、１つ以上のｄＮＴＰ及び少なくとも１つの核酸増幅プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、かかる組成物はまた、トリス、ＥＤＴＡ、グリセロール、ＤＴＴ、ＫＣｌ、Ｍｇ２＋、ゼラチン（例えば、魚ゼラチン）、Ｋａｔｈｏｎ、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの１つ以上の構成成分を含み得る。
【００１８】
特定の実施形態では、式Ｉの新規化合物のうちの少なくとも１つを含む組成物が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、少なくとも１つのポリメラーゼ及び式Ｉの新規化合物のうちの少なくとも１つを含む組成物が、提供される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性である。かかる反応混合物の構成成分、及び任意選択で、かかる方法を実行するか、またはかかる混合物を調製するために必要な他の試薬も含むキットも提供される（別個または予混合された配合物としてのいずれかで）。
【００１９】
新規化合物、及びそれを調製し、かつ使用する方法が、本明細書に記載される。「新規化合物」という用語は、典型的には、式Ｉの化合物を指す。特定の実施形態では、「界面活性剤」という用語は、任意選択で１つ以上の「従来の界面活性剤」を含む１つ以上の新規化合物を指し得る。本明細書で使用される場合、「従来の界面活性剤」という用語は、式Ｉ下で本明細書に記載されたもの以外の既知の化合物及び／または任意の化合物を指し得る。いくつかの実施形態では、「新規化合物」という用語は、新規化合物のみ、または１つ以上の新規化合物と界面活性剤などの１つ以上の従来の添加剤との組み合わせを指し得る。同様に、「少なくとも１つの新規化合物」という用語の使用は、１つ以上の新規化合物単独、別の新規化合物を伴う、及び／または界面活性剤などの１つ以上の従来の添加剤を伴うことを指し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物及び／または反応混合物は、例えば、これらに限定されないが、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ−５８、ＣＨＡＰＳ、ｎ−ドデシル−ｂ−Ｄ−マルトシド、ＮＰ−４０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１５、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−３５、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−４５、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１６５、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−３０５、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−４０５、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−７０５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び／またはＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）などの１つ以上の従来の界面活性剤をさらに含み得る。当業者によって決定され得るような他の界面活性剤も好適であり得る（例示的な界面活性剤については、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１４５９１０号、米国特許出願公開第２００８／００６４０７１号、米国特許第６，２４２，２３５号、米国特許第５，８７１，９７５号、及び米国特許第６，１２７，１５５号を参照、その全ては、ここにその全容において参照により、本明細書に組み込まれる。）当業者によって決定されるであろうが、追加の界面活性剤も好適であり得る。
【００２０】
特定の実施形態では、新規化合物は、以下の構造式
【化３】
2019163255.tif 000005
を有し、式中、
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ３０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）置換アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）ヘテロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）置換ヘテロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、フェニル、置換フェニルであり、置換アリールまたは置換フェニルは、少なくとも１つの（Ｃ１−Ｃ３０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）置換アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）ヘテロアルキル、または（Ｃ１−Ｃ３０）置換ヘテロアルキルで置換される。
Ｒ２及び／またはＲ３はそれぞれ、独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、またはＣ（ＣＨ３）３であり、
Ｒ４及び／またはＲ５はそれぞれ、独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、Ｃ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５ＯＨ、ＣＨ２Ｃ＝ＣＨ  ＮＨ（Ｃ６Ｈ５）、ＣＨ２Ｃ＝ＣＨＮ＝ＣＨＮＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２、（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＳＨ、（ＣＨ２）ｎＮＨ、（ＣＨ２）ｎＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、（ＣＨ２）３ＮＨＣ（ＮＨ２）＝ＮＨであり、または代替的には、Ｒ３は、Ｒ５と一緒になって、任意選択で、少なくとも１つの（Ｃ１−Ｃ３０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）置換アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）ヘテロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）置換ヘテロアルキルで置換される５もしくは６員環を形成し、
また、
各ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０を含むがこれらに限定されない任意の正の整数である。
【００２１】
特定の実施形態では、Ｒ１はＣ８アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ１はＣ１２アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１はＣ１６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ２及び／またはＲ３はそれぞれ、独立して、Ｈ及びＣＨ３から選択される。特定の実施形態では、Ｒ４及び／またはＲ５はそれぞれ、独立して、Ｈ、（ＣＨ２）ｎＮＨ、（ＣＨ２）ｎＮであり、または代替的には、Ｒ３は、Ｒ５と一緒になって、５もしくは６員環を形成する。
【００２２】
特定の実施形態では、Ｒ１はＣ１２アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ４はＨである。特定の実施形態では、Ｒ３は、Ｒ５と一緒になって、５員環を形成し、各ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０を含むがこれらに限定されない任意の正の整数である。
【００２３】
特定の実施形態では、新規化合物は、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン及び／またはその誘導体である。特定の実施形態では、新規化合物は、以下の構造式を有する。
【化４】
2019163255.tif 000006
【００２４】
式Ｉの化合物は、単純な出発化合物材料を用いて、新たな及び／または改善された化合物（例えば、サーファクタントまたは界面活性剤）ならびにそこへのその特性を提供することによって調製され得る。いくつかの実施形態では、中間体は、ＬＣ−ＭＳ分析を使用して分析され得、かつ精製なしで使用されて次の合成ステップを実施し得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される新規化合物、及び酵素を含む安定した酵素組成物が、提供される。いくつかの実施形態では、酵素は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、酵素は、熱安定性である。いくつかの実施形態では、酵素は精製される。いくつかの実施形態では、酵素は、天然である。いくつかの実施形態では、酵素は組換え型である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアティクスから単離される。いくつかの実施形態では、酵素は、融合ポリメラーゼなどの融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される新規化合物及び酵素は、緩衝液中に提供される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＭｇＣｌ２＋、ＤＴＴ、ＥＤＴＡ、トリス、グリセロール、ＫＣｌ、ゼラチン、及びＫａｔｈｏｎなどの１つ以上の構成成分を含む。いくつかの好ましい実施形態では、該ヌクレオチド三リン酸の濃度は、約０．１５ｍＭ〜２ｍＭ（例えば、０．４ｍＭ）のそれぞれのμＭである。いくつかの好ましい実施形態では、該ＭｇＣｌ２＋の濃度は、約１〜１５ｍＭ（例えば、３ｍＭ）である。いくつかの好ましい実施形態では、該ＤＴＴの濃度は、約０．５〜５ｍＭ（例えば、１ｍＭ）である。いくつかの好ましい実施形態では、該ＥＤＴＡの濃度は、約０．０５〜１ｍＭ（例えば、０．１ｍＭまたは０．１５ｍＭ）である。いくつかの好ましい実施形態では、該トリスの濃度は、約５ｍＭ〜５００ｍＭ（例えば、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、２００ｍＭ、または３００ｍＭ）である。いくつかの好ましい実施形態では、該トリスのｐＨは、約７．５〜８．５である。いくつかの好ましい実施形態では、該グリセロールの濃度は、約１０％〜６０％（例えば、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％）である。いくつかの好ましい実施形態では、該ＫＣｌの濃度は、約５０ｍＭ〜１０００ｍＭ（例えば、１００ｍＭまたは５００ｍＭ）である。いくつかの好ましい実施形態では、該ゼラチンの濃度は、約０．０２％〜１％（例えば、０．０５％または０．５％）である。いくつかの好ましい実施形態では、該Ｋａｔｈｏｎの濃度は、約０．０１５％〜０．０５％（例えば、０．０１６％または０．０４％）である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるものなどの酵素阻害剤が、さらに提供される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素は、本明細書に記載される新規化合物（例えば、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン）を含む組成物中に貯蔵される。いくつかの実施形態では、酵素は、長期間安定している。例えば、いくつかの実施形態では、酵素は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１６、２４、３０、または３６ヶ月間、本明細書に記載される新規化合物を含む組成物中に貯蔵される。いくつかの実施形態では、酵素は、約−７０℃〜約周囲温度（例えば、２５℃）で、本明細書に記載される新規化合物を含む組成物中に貯蔵される。いくつかの実施形態では、酵素は、約４℃、−４℃、または−２０℃で、本明細書に記載される新規化合物を含む組成物中に貯蔵される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される新規の化合物を調製するための方法が、提供される。いくつかの実施形態では、かかる方法は、順次、化合物Ａ（プロセス１で示される通り）（例えば、１当量）、メチルトリフェノキシホスホニウムヨージド（例えば、４当量）、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）（例えば、６ｍＬ）をアルミニウムホイルで被覆された丸底フラスコ（例えば、５０ｍＬ）に組み合わせることを含み得る。次いで、反応物を十分な時間（例えば、３日）、適した雰囲気（例えば、アルゴン）下で、適した温度（例えば、室温）で撹拌する。十分な時間の後（例えば、３日）、反応の進行が、監視され得る（例えば、分析液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）を使用して）。中間体生成物パターンの出現は、改質界面活性剤の形成を確認し得る。この予期される中間体生成物（中間体Ｂ）は、単離されても、されなくてもよい（典型）。この中間体生成物に、アミノ酸エステル塩酸塩（例えば、２当量）及びＥｔ３Ｎ（例えば、２当量）が、添加され得る。反応混合物は、適した温度（例えば、６５℃）で、適した時間（例えば、３〜４日）加熱され得る。分析ＬＣ−ＭＳを使用して、反応の進行が監視され得る。次いで、反応混合物は、典型的には、適した温度（例えば、室温）に冷却され、適した容量（例えば、およそ２ｍＬ）に濃縮される（例えば、ロトベイバー（ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）で）。次いで、濃縮された粗混合物は、分取ＨＰＬＣによって精製され得る。次いで、所望の画分がプール及び濃縮されて（例えば、ロトベイバー（ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）で）、所望の生成物を提供し得る（例えば、プロセス１において、化合物Ｄｔ１、Ｄｔ３、Ｄｔ５、Ｄｔ７、Ｄｔ９、Ｄｔ１１、及びＤｔ１２を生成するように）。次いで、この生成物は加水分解反応を受け得る（例えば、２Ｎ  ＮａＯＨを使用して）。次いで、反応混合物は、分析ＬＣ−ＭＳによって決定される通り、全ての出発材料が消費されるまで、撹拌され得る（例えば、室温で、）。この後に中和（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅで）が続いて、最終陽イオン性生成物（例えば、Ｄｔ１、Ｄｔ３、Ｄｔ５、Ｄｔ７、Ｄｔ９、Ｄｔ１１、及びＤｔ１２）、双性イオン性生成物（例えば、Ｄｔ２、Ｄｔ４、Ｄｔ６、Ｄｔ１０）、または陰イオン性生成物（Ｄｔ８）を生成し得る。
【００２８】
したがって、式Ｉの新規化合物の開発のための例示的な方法が、以下に示される。
【化５】
2019163255.tif 000007
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びｎは、本明細書の上に記載された通りであり、Ｘは、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、及びＣ（ＣＨ３）３からなる群から選択される。式Ｉの新規化合物は、例えば、イオン性（例えば、陽イオン性、陰イオン性、双性イオン性）であり得る。プロセス１を使用して作製された例示的な新規化合物が、以下に示される。
【化６】
2019163255.tif 000008
式中、ｎは、本明細書の上に記載された通りである。特定の実施形態では、各ｎは、独立して、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または３０である。
【００２９】
プロセス２を使用する新規化合物の開発の例示的な方法が、以下に示される。
【化７】
2019163255.tif 000009
プロセス２を使用して作製された式Ｉの例示的な新規化合物、すなわちＢｒｉｊＬ−２３−プロリンが、最終生成物として上に示される（ボックス中の化合物参照）。
【００３０】
プロセス２の反応物及び中間体、ならびにそれによって調製された新規化合物に関する追加の情報が、表１に示される。
【００３１】
【表１】
2019163255.tif 000010
【００３２】
特定の実施形態では、標的核酸を少なくとも１つのポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、及び少なくとも１つの式Ｉの新規化合物と混合することと、標的核酸を重合及び／または増幅することと、を含む核酸を重合及び／または増幅するための方法が、提供される。特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのプライマーを含み得る。特定の実施形態では、少なくとも１つのポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、少なくとも１つのプライマー、及びＢｒｉｊＬ−２３−プロリンなどの少なくとも１つの式Ｉの新規化合物を含む核酸増幅反応混合物が提供される。特定の実施形態では、組成物及び／または反応混合物は、検出可能な標識をさらに含み得る。特定の実施形態では、本方法は、検出可能な標識を検出及び／または定量して、増幅された核酸を検出及び／または定量するための１つ以上のステップを含む。
【００３３】
特定の実施形態では、そこに式Ｉの新規化合物を含むことによって、貯蔵及び／または熱サイクリングプロセス中のポリメラーゼの不活性化を阻害するための方法が提供される。特定の実施形態では、ポリメラーゼ活性を有する酵素及び少なくとも１つの式Ｉの新規化合物を提供し、かつ、酵素のポリメラーゼ活性が安定化するような条件下でそれを組み合わせて混合物を形成するための方法が提供される。特定の実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性である。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば、ＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０などの従来の（例えば、既知）界面活性剤の存在下にあるときの酵素安定性と同様である（例えば、およそ同一）、または増加した酵素安定性を有する組成物を提供する。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば、ＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０などの従来の（例えば、既知）界面活性剤の存在下にあるときの増幅効率と同様であるか（例えば、およそ同一）、または増加した増幅効率を有する増幅反応を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される新規化合物は、貯蔵緩衝液、マスターミックス、及び／または増幅反応においてＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の代わりとなり得る。
【００３４】
特定の実施形態では、反応混合物中の少なくとも１つの式Ｉの新規化合物（例えば、Ｄｔ１、Ｄｔ２、Ｄｔ３、Ｄｔ４、Ｄｔ５、Ｄｔ６、Ｄｔ７、Ｄｔ８、Ｄｔ９、Ｄｔ１０、Ｄｔ１１、Ｄｔ１２、及び／またはＢｒｉｊＬ−２３−プロリン）の「有効濃度」（例えば、ＰＣＲなどの増幅反応を支持するであろう量）は、従来の界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）で必要とされるものより高いか、同一であるか、または低い可能性がある。いくつかのかかる実施形態では、反応混合物中の少なくとも１つの新規化合物（複数可）（例えば、Ｄｔ４及び／またはＢｒｉｊＬ−２３−プロリン）の有効濃度は、ＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０などの従来の界面活性剤（複数可）で必要とされるものより、最大で、約、または少なくとも１、２，３、４、５、６、７、８、９、または１０倍低い可能がある。例えば、ＮＰ−４０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０は、典型的には、約０．０１％以下で（例えば、保存溶液から反応混合物への希釈によって決定されるような）反応物中に含まれる。本明細書に記載される新規化合物は、特定の実施形態では、従来の界面活性剤（例えば、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と比較して、Ｄｔ４では０．００２％、図１１〜１８）より低い濃度（例えば、割合（すなわち、ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）として）で使用され得る。
【００３５】
特定の実施形態では、対象の核酸（例えば、標的核酸）を少なくとも１つのポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、及び少なくとも１つの式Ｉの新規化合物と混合することと、標的核酸を重合及び／または増幅することと、を含む核酸を重合及び／または増幅するための方法が、提供される。特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのプライマーを含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、少なくとも１つのプライマー、及び少なくとも１つの式Ｉの修飾化合物を含む核酸増幅反応混合物（複数可）が提供される。他の実施形態では、かかる混合物（複数可）を使用するための方法が、提供される。標的核酸は、種々の反応及びシステムのうちのいずれかを使用して増幅され得る。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「増幅」、「核酸増幅」、または「増幅する」という用語は、核酸鋳型の複数のコピーの生成、または核酸鋳型を相補する複数の核酸配列コピーの生成を指す。用語（「重合する」という用語を含む）はまた、核酸鋳型を伸長すること（例えば、重合によって）を指し得る。増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのポリメラーゼ媒介伸長反応であり得る。しかしながら、既知の増幅反応のうちのいずれかが、本明細書に記載される通りの使用に好適であり得る。「指数関数」を典型的に指す「増幅」という用語は、核酸の選択標的配列の数の直線的及び指数関数的増加の両方を記載するために本明細書において使用され得る。
【００３７】
「増幅反応混合物」及び／または「マスターミックス」という用語は、標的核酸を増幅するために使用される様々な（一部または全ての）試薬を含む水溶液を指し得る。かかる反応はまた、固相担体（例えば、アレイ）を使用して実施され得る。反応はまた、使用者によって所望される通りの単一または多重フォーマットにおいて実施され得る。これらの反応は、典型的には、酵素、水性緩衝液、塩、増幅プライマー、標的核酸、及びヌクレオシド三リン酸を含む。状況に応じて、混合物は、完全または不完全増幅反応混合物であり得る。標的核酸を増幅するために使用される方法は、当業者に利用可能な任意のものであり得る。核酸の標的配列のコピーを増やすための任意のインビトロ手法が用いられ得る。これらは、線形、対数、及び／または任意の他の増幅方法を含む。本開示は、概して、核酸増幅反応として、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）及びエンドポイントＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）を含むＰＣＲを考察し得るが、本明細書に記載される改質界面活性剤は、ポリメラーゼ媒介増幅反応（ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、及びローリング連鎖増幅（ＲＣＡ）など）、ならびにリガーゼ媒介増幅反応（リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、及びそれぞれのギャップバージョンなど）の両方、及びＬＤＲ及びＰＣＲなどの核酸増幅反応の組み合わせを含む他の種類の核酸増幅反応において有効であるべきであることが予期される（例えば、米国特許第６，７９７，４７０号参照）。例えば、修飾化合物は、例えば、連結プローブが、ＰＣＲプライマーとは対照的に用いられる場合、例えば、様々な連結媒介反応において使用され得る。追加の例示的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，９６５，１８８号、及び／または同第５，０３５，９９６号参照）、等温手順（１つ以上のＲＮＡポリメラーゼを使用して（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０８１２２２号参照）、鎖置換（例えば、米国特許第ＲＥ３９００７Ｅ号参照）、プライマー分子の部分的破壊（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０８７５７４号参照））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４：５６０−５６９（１９９０））、及び／またはＢａｒａｎｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８９−１９３（１９９１）参照）、Ｑβ  ＲＮＡレプリカーゼシステム（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９４／０１６１０８号参照）、ＲＮＡ転写ベースのシステム（例えば、ＴＡＳ、３ＳＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、米国特許第５，８５４，０３３号、米国特許出願公開第２００４／２６５８９７号、Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２（１９９８）、及び／またはＢａｎeｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２６：５０７３−５０７８（１９９８）参照）、及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｌｉｔｔｌｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：７７７−７８４（１９９９））などを含む。当業者に利用可能な多くの他のシステムに加えて、これらのシ���テムは、本明細書に記載される使用のために標的核酸を重合及び／または増幅するのに使用するのに好適であり得る。
【００３８】
「増幅効率」は、定量されて、コピー数を決定し得る任意の産物を指し得る（例えば、その用語は、ＰＣＲアンプリコン、ＬＣＲ連結産物、及び／または同様の産物を指し得る）。特定の増幅反応において所望される通りの特定の化合物機能が、少なくとも２つの別々の増幅反応を実行することによって決定されるかどうか、各反応は、各反応において起こる増幅を定量する化合物の不在下及び存在下それぞれで、実行される。化合物の様々な濃度または組み合わせがまた、別々の反応混合物中で試験されて、増幅効率に対する影響を決定し得る。増幅及び／または重合効率は、較正希釈曲線及び勾配計算の決定、Ｈｅｌｌｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ８：Ｒ１９（２００７）に記載される通りｑベースソフトウェアを使用する決定、Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ２５：４０２（２００１）によって、またはＰｆａｆｆｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：ｅ４５（２００１）によって記載される通りの方法によって記載される通りδδＣｑ（ΔΔＣｑ）計算を使用する決定を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の様々な方法によって決定され得、その全ては、その全容において参照により本明細書に組み込まれる。
【００３９】
核酸を重合及び／または増幅するための例示的な方法は、例えば、ポリメラーゼ媒介伸長反応を含む。例えば、ポリメラーゼ媒介伸長反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり得る。他の実施形態では、核酸増幅反応は、多重反応である。例えば、本明細書に記載した通りの使用に好適な核酸を重合及び／または増幅及び検出するための例示的な方法は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）として市販される（例えば、米国特許第４，８８９，８１８号、同第５，０７９，３５２号、同第５，２１０，０１５号、同第５，４３６，１３４号、同第５，４８７，９７２号、同第５，６５８，７５１号、同第５，２１０，０１５号、同第５，４８７，９７２号、同第５，５３８，８４８号、同第５，６１８，７１１号、同第５，６７７，１５２号、同第５，７２３，５９１号、同第５，７７３，２５８号、同第５，７８９，２２４号、同第５，８０１，１５５号、同第５，８０４，３７５号、同第５，８７６，９３０号、同第５，９９４，０５６号、同第６，０３０，７８７号、同第６，０８４，１０２号、同第６，１２７，１５５号、同第６，１７１，７８５号、同第６，２１４，９７９号、同第６，２５８，５６９号、同第６，８１４，９３４号、同第６，８２１，７２７号、同第７，１４１，３７７号、及び／または同第７，４４５，９００号を参照、それらの全ては、ここでその全容において参照により本明細書に組み込まれる）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、典型的には、標的ポリヌクレオチドに核酸増幅を実施することによって実行され、５’〜３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、該標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成することができるプライマー、及び該プライマーに対して該標的ポリヌクレオチド３’とハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用する。オリゴヌクレオチドプローブは、典型的には、検出可能な標識（例えば、蛍光レポーター分子）及び該レポーター分子の蛍光をクエンチすることができるクエンチャー分子を含む。典型的には、検出可能な標識及びクエンチャー分子は、単一プローブの一部である。増幅が進むにつれ、ポリメラーゼは、プローブを消化して、検出可能な標識をクエンチャー分子から分離させる。検出可能な標識（例えば、蛍光）は、反応中監視され、標識の検出は、核酸増幅の発生に対応する（例えば、シグナルが高いほど増幅の量が多い）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのバリエーション（例えば、ＬＮＡ（商標）添加ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ）は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される方法における使用に好適である。
【００４０】
本明細書に記載される通りの使用に好適な別の例示的なシステムは、置換ハイブリッド形成法において二本鎖プローブを用いる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８：２３１−２４４（１９８９）；及び／またはＬｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０（２，ｅ５）（２００２）参照）。かかる方法では、プローブは、典型的には、異なる長さの２つの相補オリゴヌクレオチドを含み、一方は検出可能な標識を含み、他方はクエンチャー分子を含む。標的核酸に結合していないとき、クエンチャーは、検出可能な標識からのシグナルを抑制する。プローブは、標的核酸での置換ハイブリッド形成の際に検出可能になる。それぞれが異なる検出可能な標識を含む複数のプローブが、使用され得、その結果、複数の標的核酸が、単一反応において問い合わせられ得る。
【００４１】
本明細書に記載される通りの使用に好適な標的核酸を重合及び／または増幅及び検出するための追加の例示的な方法は、一本鎖ヘアピン形状オリゴヌクレオチドプローブである「分子ビーコン」を伴う。標的配列の存在下では、プローブは、シグナル（例えば、蛍光）を展開、結合、及び発する。分子ビーコンは、典型的には、少なくとも４つの構成成分を含む。１）「ループ」、標的配列を相補する１８〜３０ヌクレオチド領域、２）ループのいずれかの末端に見出され、かつ互いに相補する２つの５〜７ヌクレオチド「ステム」、３）５’末端での検出可能な標識、及び４）プローブが閉ループ形状（例えば、標的核酸に結合されていない）であるとき、検出可能な標識がシグナルを発するのを防止する３’末端でのクエンチャー部分。したがって、相補標的の存在下では、ビーコンの「ステム」部分は、分離し、プローブが標的とハイブリッド形成する結果となる。他の種類の分子ビーコンも既知であり、本明細書に記載される方法における使用に好適であり得る。分子ビーコンは、種々のアッセイシステムで使用され得る。１つのかかるシステムは、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ（登録商標））、温度サイクリングを伴わずにＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに重合及び／または増幅するための単一ステップ等温プロセスである。ＮＡＳＢＡ反応は、典型的には、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、逆転写酵素（ＲＴ）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、及び２つのオリゴヌクレオチドプライマーを必要とする。増幅後、増幅された標的核酸は、分子ビーコンを使用して検出され得る。分子ビーコンの他の使用は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される方法における使用に好適である。
【００４２】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）システムは、本明細書に記載される方法において使用され得る別の例示的なアッセイフォーマットである。Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）プライマーは、二官能分子であり、プライマーは、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）及び検出可能な標識の蛍光をクエンチする検出不可能なクエンチャー部分に加えて、プローブに共有結合する。標的核酸の存在下では、検出可能な標識及びクエンチャーは分離して、それは、検出可能な標識から発せられるシグナルの増加をもたらす。典型的には、増幅反応で使用されるプライマーは、ヘアピンループの開始の「ＰＣＲブロッカー」要素（例えば、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）モノマー（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：８０４−８０７（１９９９））に加えて、５’末端にプローブ要素を含む。プローブは、典型的には、一方の末端に検出可能な標識及び他方にクエンチャーを有する自己相補的ステム配列を含む。初期増幅サイクル（例えば、ＰＣＲ）では、プライマーは、標的とハイブリッド形成し、伸長が、ポリメラーゼの活動のため起こる。Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）システムは、プローブを区別するために異なるタグを付けられ得る複数のプローブを使用して、点突然変異を検査及び識別するために使用され得る。ＰＣＲを一例として使用して、１伸長サイクルが完了した後、新たに合成された標的領域は、プローブと同一の鎖に付着される。変性及びアニーリングの第２のサイクル後に、プローブ及び標的がハイブリッド形成する。次いで、ヘアピン配列が、新たに生成されたＰＣＲ産物の一部とハイブリッド形成する。これは、クエンチャーからの検出可能な標識の分離をもたらし、シグナルの送出を引き起こす。かかる標識プローブの他の使用は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される方法における使用に好適である。
【００４３】
本明細書において提供される新規化合物は、一連の特定の条件下（例えば、特定の温度またはｐＨ）で、核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害または実質的に阻害する組成物及び／または反応混合物中でも使用され得る。ポリメラーゼ活性の阻害は、「ホットスタート」技法などにおける所望されない第２の増幅産物の形成を低減するために使用され得る。いくつかのホットスタート技法では、ＤＮＡポリメラーゼ活性（例えば、二価イオン及び／またはＤＮＡポリメラーゼ自体）に必須の構成成分は、混合物の温度が、非特異的プライマーアニーリングを防止するのに十分高くなるまで、反応混合物に添加されない可能性がある。例示的なホットスタート技法は、例えば、オリゴヌクレオチドベースのシステム、抗体ベースのシステム、化学ベースのシステム、及び／またはこれらのうちのいずれかの組み合わせ（例えば、二重、三重、四重などのホットスタートシステム）を含み得る。例えば、マグネシウムまたはＤＮＡポリメラーゼは、反応温度が増加すると融解するワックスビーズにおいて隔離され得、高温でのみ隔離された構成成分を放出する。他の技法によると、ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの可逆的化学修飾、抗体（複数可）のＤＮＡポリメラーゼへの結合、またはＤＮＡポリメラーゼに結合するオリゴヌクレオチド分子によって可逆的に不活性化もしくは修飾される。いくつかの実施形態では、化学修飾は、逆転されて、あるいは、抗体分子（複数可）またはオリゴヌクレオチド分子（複数可）は、高い反応温度で変性され、官能性ＤＮＡポリメラーゼを放出する二重ホットスタート反応システムは、典型的には、一連の特定の条件下（例えば、特定の温度またはｐＨ）で、核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害または実質的に阻害する少なくとも２つの異なるホットスタート機構を含む。かかる温度依存ホットスタート機構は、抗体または低温でＤＮＡポリメラーゼ活性をブロックする抗体の組み合わせ、低温でＤＮＡポリメラーゼ活性をブロックするオリゴヌクレオチド、高温で解離するＤＮＡポリメラーゼの可逆的化学修飾、低温で低下した活性を提供するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定ＤＮＡ結合ドメイン及びトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼを阻害する温度依存リガンド、低温でプライマーを隔離する一本鎖結合タンパク質、特定の温度で構造を変化させる可逆的修飾プライマー及び／または修飾ｄＮＴＰを含むがこれらに限定されない。これらなどの方法は、例えば、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１７１７−１７２３（１９９２）、Ｄａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：２６８（１９９６）、Ｄ’Ａｑｕｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３７４９（１９９１）、米国特許第５，３３８，６７１号、米国特許第５，５８７，２８７号、米国特許第５，６７７，１５２号、米国特許第５，７７３，２５８号、米国特許第８，４７０，５３１号、及び／または米国特許公開第２０１０−０３１７０６２Ａ１号を含む様々な参考文献において詳細が記載され、その全ては、ここにその全容においてこの開示に組み込まれる。他のホットスタート技��も当該技術分野において既知であり、当業者には理解されるであろうが、本明細書に記載される新規化合物との使用に好適であり得る。
【００４４】
開示された核酸増幅反応において用いられ得る核酸ポリメラーゼは、例えば、原核生物、真菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物、及び／または真核生物の核酸ポリメラーゼを含む所望の反応を実行する働きをする任意のものであり得る。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、鋳型として核酸鎖を使用して、新規にＤＮＡ鎖を合成する酵素を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成のための鋳型として現存するＤＮＡまたはＲＮＡを使用し、読み取れる鋳型鎖に沿ってデオキシリボヌクレオチドの重合に触媒作用を及ぼす。新たに合成されたＤＮＡ鎖は、鋳型鎖を相補する。ＤＮＡポリメラーゼは、新たに形成している鎖の３’−ヒドロキシル末端にのみ遊離ヌクレオチドを付加し得る。それは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）から成長するオリゴヌクレオチド鎖の３’−ヒドロキシル基へのヌクレオシド一リン酸の転移を介して、オリゴヌクレオチドを合成する。これは、５’〜３’方向への新たな鎖の伸長をもたらす。ＤＮＡポリメラーゼは、既存の３’−ＯＨ基上にヌクレオチドのみを付加して、ＤＮＡ合成反応を開始することができるので、ＤＮＡポリメラーゼは、第１のヌクレオチドを付加することができるプライマーを必要とする。好適なプライマーは、ＲＮＡもしくはＤＮＡのオリゴヌクレオチド、またはそれらのキメラ（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ化学プライマー）を含み得る。ＤＮＡポリメラーゼは、天然に起こるＤＮＡポリメラーゼまたは上述の活性を有する天然酵素の変異体であり得る。例えば、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、またはエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含み得る。
【００４５】
好適な核酸ポリメラーゼは、ホロ酵素、ホロ酵素の官能部分、キメラポリメラーゼ、または核酸分子の合成を果たすことができる任意の修飾ポリメラーゼも含み得る。この開示内で、ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、及び／またはポリヌクレオチドホスホリラーゼも含み得る。ポリメラーゼの非限定例は、例えば、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物のミトコンドリアのＤＮＡポリメラーゼγ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、及び／もしくはＶ；真核生物のポリメラーゼα、β、γ、δ、ε、η、ζ、ι、及び／もしくはκ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ；大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩα及び／もしくはεサブユニット；大腸菌ポリメラーゼＩＶ、大腸菌ポリメラーゼＶ；サーマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼＩ；バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ；ユリ古細菌門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）ポリメラーゼ；ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）；出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ポリメラーゼ４；損傷乗り越え合成ポリメラーゼ；逆転写酵素；ならびに／またはテロメラーゼを含み得る。使用され得る好適な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの限定例は、Ｔａｑ、Ｔｆｌ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、及びＶｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、任意の遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼ、低下したまたはわずかな３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有する任意のもの（例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ）、及び／または遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼ（例えば、活性部位突然変異Ｆ６６７ＹまたはＦ６６７Ｙの等価物を有するもの（例えば、Ｔｔｈにおいて）、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＦＳ、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標））、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ターミネーターＩ、ターミネーターＩＩ、ターミネーターＩＩＩ、ターミネーターγ（全てＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから入手可能）、及び／またはそれらの任意の誘導体及び断片を含む。当業者には理解されるであろうが、他の核酸ポリメラーゼも、好適であり得る。
【００４６】
別の態様では、本開示は、対象の核酸配列（例えば、標的配列）を重合及び／または増幅するための反応混合物を提供する。いくつかの実施形態では、反応混合物は、検出可能な標識をさらに含み得る。本方法は、検出可能な標識を検出して、増幅された核酸を定量するための１つ以上のステップも含み得る。本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」という用語は、増幅を示す種々のシグナル伝達分子のうちのいずれかを指す。例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ及び他のＤＮＡ結合色素は、検出可能な標識である。かかる検出可能な標識は、例えば、核酸インターカレート剤もしくは非インターカレート剤を含み得るか、または核酸インターカレート剤もしくは非インターカレート剤であり得る。本明細書で使用される場合、インターカレート剤は、二本鎖核酸分子の積み重ね塩基対の間の非共有挿入を可能にする薬剤または部分である。非インターカレート剤は、二本鎖核酸分子内に挿入しないものである。核酸結合剤は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生成し得る。シグナルは、例えば、蛍光及び／もしくは吸光度を直接使用するか、または例えば、二本鎖核酸に近いことによって検出可能な程度に影響される任意の部分もしくはリガンドを間接的に使用して検出可能であり得、好適であり、例えば核酸結合剤に付着した置換標識部分もしくは結合リガンド。典型的には、核酸結合剤が、同じ薬剤が溶液中にあるか、または一本鎖核酸に結合するときに生成されるシグナルとは区別することができる二本鎖核酸に結合するときの検出可能なシグナルを生成することが必要である。例えば、臭化エチジウムなどのインターカレート剤は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、または溶液中に結合するときよりも二本鎖ＤＮＡ内にインターカレートするときにより激しく蛍光を発する（例えば、米国特許第５，９９４，０５６号、同第６，１７１，７８５号、及び／または同第６，８１４，９３４号参照）。同様に、アクチノマイシンＤは、一本鎖核酸に結合するときにＵＶ／ＶＩＳスペクトルの赤色部分において蛍光を発し、二本鎖核酸に結合するときにＵＶ／ＶＩＳスペクトルの緑色部分において蛍光を発する。また別の例では、光反応性ソラレン４−アミノメチル−４−５’，８−トリメチルソラレン（ＡＭＴ）は、長波長で減少した吸収及び二本鎖ＤＮＡ内へのインターカレーションの際の蛍光を示すと報告された（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．＆Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，３３：７８５−７９１（１９８１）。例えば、米国特許第４，２５７，７７４号は、ＤＮＡへの蛍光インターカレーターの直接結合を記載する（例えば、エチジウム塩、ダウノマイシン、メパクリン及びアクリジンオレンジ、４’，６−ジアミジノ−α−フェニルインドール）。非インターカレート剤（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ジスタマイシン、ネトロプシンなどの本明細書に記載される通りの小溝結合剤）も使用に好適であり得る。例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｓｅａｒｌｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（１３）：３７５３−３７６２（１９９０））は、増加した量の標的を有する変化した蛍光を示す。小溝結合剤は、本明細書の別の場所により詳細が記載される。
【００４７】
他のＤＮＡ結合色素は、当業者には利用可能であり、単独、または他の薬剤及び／もしくはアッセイシステムの構成成分と組み合わせて使用され得る。例示的なＤＮＡ結合色素は、例えば、アクリジン（例えば、アクリジンオレンジ、アクリフラビン）、アクチノマイシンＤ（Ｊａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６８：２１（１９７２））、アントラマイシン、ＢＯＢＯ（商標）−１、ＢＯＢＯ（商標）−３、ＢＯ−ＰＲＯ（商標）−１、クブロモマイシン、ＤＡＰＩ（Ｋａｐｕｓｅｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６（１１２）：３５１９（１９７９））、ダウノマイシン、ジスタマイシン（例えば、ジスタマイシンＤ）、米国特許第７，３８７，８８７号に記載される色素、エリプチシン、エチジウム塩（例えば、臭化エチジウム）、フルオロクマニン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、米国特許第４，２５７，７７４号に記載される通りの蛍光インターカレーター、ＧｅｌＳｔａｒ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍｅ．）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｓｅａｒｌｅ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｅｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３７５３−３７６２（１９９０））、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、ホミジウム、ＪＯ−ＰＲＯ（商標）−１、ＬＩＺ色素、ＬＯ−ＰＲＯ（商標）−１、メパクリン、ミトラマイシン、ＮＥＤ色素、ネトロプシン、４’，６−ジアミジノ−α−フェニルインドール、プロフラビン、ＰＯＰＯ（商標）−１、ＰＯＰＯ（商標）−３、ＰＯ−ＰＲＯ（商標）−１、プロピジウムヨージド、ルテニウムポリピリジル、Ｓ５、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ（米国特許第５，４３６，１３４号及び同第５，６５８，７５１号）、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩＩ、ＳＹＴＯＸ（登録商標）ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ（登録商標）ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ（登録商標）４３、ＳＹＴＯ（登録商標）４４、ＳＹＴＯ（登録商標）４５、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｂｌｕｅ、ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−１、ＳＹＴＯ（登録商標）１１、ＳＹＴＯ（登録商標）１３、ＳＹＴＯ（登録商標）１５、ＳＹＴＯ（登録商標）１６、ＳＹＴＯ（登録商標）２０、ＳＹＴＯ（登録商標）２３、チアゾールオレンジ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、ＴＯＴＯ（商標）−３、ＹＯ−ＰＲＯ（登録商標）−１、及びＹＯＹＯ（登録商標）−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）などを含み得る。ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ（例えば、米国特許第５，４３６，１３４号、同第５，６５８，７５１号、及び／または同第６，５６９，９２７号参照）は、例えば、ＰＣＲ反応を監視するために使用された。当業者には理解されるであろうが、他のＤＮＡ結合色素も、好適であり得る。
【００４８】
本明細書に記載される通りの使用では、１つ以上の検出可能な標識及び／またはクエンチング剤は、１つ以上のプライマー及び／またはプローブ（例えば、検出可能な標識）に付着され得る。検出可能な標識は、遊離しているときか、または標的核酸のうちの１つに結合しているときにシグナルを発し得る。検出可能な標識はまた、別の検出可能な標識に近接しているときにもシグナルを発し得る。検出可能な標識はまた、シグナルが、クエンチャー分子に十分近接していないときに検出可能であるようにクエンチャー分子と共に使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、アッセイシステムは、検出可能な標識をクエンチング分子から遊離させ得る。いくつかの検出可能な標識のうちのいずれかを使用して、本明細書に記載される方法で使用されるプライマー及びプローブを標識し得る。上述した通り、いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、プローブに付着され得、それは、プライマー内に組み込まれ得るか、またはさもなければ、増幅された標的核酸（例えば、インターカレートもしくは非インターカレート色素などの検出可能な核酸結合剤）に結合し得る。２つ以上の検出可能な標識を使用するとき、それぞれは、標識が互いに区別できるようにか、または一緒に検出可能な標識が、いずれの検出可能な標識単独によって発せられないシグナルを発するようにそのスペクトル特性が異なるべきである。例示的な検出可能な標識は、例えば、蛍光色素またはフルオロフォア（例えば、光によって刺激されて蛍光またはリン光を発し得る化学基）、蛍光ドナー色素から蛍光シグナルをクエンチすることができる「アクセプター色素」などを含む。好適な検出可能な標識は、例えば、フルオロセイン（例えば、５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン；５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）；５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＡＴ）；６−ＪＯＥ；６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）；ＦＩＴＣ；６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）；６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）；６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）フルオロフォア（例えば、３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０）；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）フルオロフォア（例えば、４９２／５１５、４９３／５０３、５００／５１０、５０５／５１５、５３０／５５０、５４２／５６３、５５８／５６８、５６４／５７０、５７６／５８９、５８１／５９１、６３０／６５０−Ｘ、６５０／６６５−Ｘ、６６５／６７６、ＦＬ、ＦＬ  ＡＴＰ、ＦＩ−セラミド、Ｒ６Ｇ  ＳＥ、ＴＭＲ、ＴＭＲ−Ｘ抱合体、ＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、ＴＲ、ＴＲ  ＡＴＰ、ＴＲ−Ｘ  ＳＥ）、クマリン（例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン、ＡＭＣ、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｓ、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＡＢＱ、ＣＰＭメチルクマリン、クマリンファロイジン、ヒドロキシクマリン、ＣＭＦＤＡ、メトキシクマリン）、��ルセイン、カルセインＡＭ、カルセインブルー、カルシウム色素（例えば、カルシウムクリムゾン、カルシウムグリーン、カルシウムオレンジ、カルコフロールホワイト）、カスケードブルー、カスケードイエロー；Ｃｙ（商標）色素（例えば、３、３．１８、３．５、５、５．１８、５．５、７）、シアンＧＦＰ、環状ＡＭＰフルオロセンサー（ＦｉＣＲｈＲ）、蛍光タンパク質（例えば、グリーン蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ．ＥＧＦＰ）、ブルー蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ）、イエロー蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、シトリン、ビーナス、ＹＰｅｔ）、ＦＲＥＴドナー／アクセプター対（例えば、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ダブシル、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、フルオレセイン／ＱＳＹ７及びＱＳＹ９）、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）及びＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）（例えば、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−２２、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｂｌｕｅ−Ｗｈｉｔｅ  ＤＰＸ、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｙｅｌｌｏｗ  ＨＣＫ−１２３、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−１６７、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−１８９、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−１５３、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−１６０、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ  １０，０００  ＭＷデキストラン）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（例えば、４８８、４８８−Ｘ、５００、５１４）；ローダミン（例えば、１１０、１２３、Ｂ、Ｂ２００、ＢＢ、ＢＧ、Ｂエクストラ、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５ＧＬＤ、６−カルボキシローダミン６Ｇ、リサミン、リサミンローダミンＢ、ファリシジン（Ｐｈａｌｌｉｃｉｄｉｎｅ）、ファロイジン、レッド、Ｒｈｏｄ−２、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、スルホローダミンＢ  ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＧエクストラ、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ＷＴ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ、ＶＩＣ、ならびに、例えば、当業者に既知である通り、米国特許出願公開第２００９／０１９７２５４号（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）などに記載される他の標識を含み得る。当業者に既知である通り、他の検出可能な標識も使用され得る（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１９７２５４号（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。これらのシステム及び検出可能な標識のうちのいずれか、ならびに多くの他のものを使用して、増幅された標的核酸を検出し得る。
【００４９】
いくつかの検出可能な標識は、配列に基づく（本明細書において「遺伝子座特異の検出可能な標識」とも称される）、例えば５’−ヌクレアーゼプローブであり得る。かかるプローブは、１つ以上の検出可能な標識を含み得る。様々な検出可能な標識は、当該技術分野において既知であり、例えば（本明細書に記載されるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）も参照）様々なステム−ループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号及び同第５，９２５，５１７号、及びＴｙａｇｉ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：３０３−３０８（１９９６）参照）、ステムのないまたは線形ビーコン（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２１８８１号、米国特許第６，４８５，９０１号参照）、ＰＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ（商標）（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号及び同第６，５９３，０９１号参照）、線形ＰＮＡビーコン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＰＩＥ４２６４：５３−５８（２００１）参照）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号参照）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（登録商標）／Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）プローブ（米国特許第６，５４８，２５０号）、ステム−ループ及びｄｕｐｌｅｘ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）プローブ（Ｓｏｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：Ｅ９６（２００１）及び米国特許第６，５８９，７４３号）、バルジループプローブ（米国特許第６，５９０，０９１号）、シュードノットプローブ（米国特許第６，５８９，２５０号）、サイクリコン（ｃｙｃｌｉｃｏｎ）（米国特許第６，３８３，７５２号）、ＭＧＢ  Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（米国特許第６，５９６，４９０号）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ライトアッププローブ（Ｓｖａｎｖｉｋ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ２８１：２６−３５（２００１））、自己組織化ナノ粒子プローブ、例えば、米国特許第６，４８５，９０１号；Ｍｈｌａｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ２５：４６３−４７１（２００１）；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：８０４−８０７（１９９９）；Ｉｓａｃｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ．１４：３２１−３２８（２０００）；Ｓｖａｎｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：２６−３５（２０００）；Ｗｏｌｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７６６：７６９−７７１（２００１）；Ｔｓｏｕｒｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３０：４２０８−４２１５（２００２）；Ｒｉｃｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ３０：４０８８−４０９３（２００２）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）．３４：３２９−３３２（２００２）；Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃ��ｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９６０６−９６１２（２００２）；Ｂｒｏｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２４９−５６（２００２）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５：１１８−１２６（２００２）；及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１４：１１１５５−１１１６１（２００１）に記載されるフェロセン修飾プローブ；ＱｕａｎｔｉＰｒｏｂｅｓ（登録商標）（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）、ＨｙＢｅａｃｏｎｓ（登録商標）（Ｆｒｅｎｃｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １５：３６３−３７４（２００１））、置換プローブ（Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ５（２００２））、Ｈｙｂプローブ（Ｃａｒｄｕｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８７９０−８７９４（１９８８））、ＭＧＢ警報（ｗｗｗ．ｎａｎｏｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｑ−ＰＮＡ（Ｆｉａｎｄａｃａ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：６０９−６１１（２００１））、Ｐｌｅｘｏｒ（登録商標）（ｗｗｗ．Ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ）、ＬＵＸ（商標）プライマー（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ３７（２００２））、ＤｚｙＮＡプライマー（Ｔｏｄｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６：６２５−６３０（２０００））。検出可能な標識はまた、例えば、ブラックホールクエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）クエンチャー（ＩＤＴ）、ＱＳＹクエンチャー（分子プローブ）、ならびにダブシル及びダブシル（Ｄａｂｓｙｌ  ａｎｄ  Ｄａｂｃｙｌ）スルホネート／カルボキシレートクエンチャー（Ｅｐｏｃｈ）を含む検出可能な標識の蛍光をクエンチする検出不可能なクエンチャー部分を含み得る。検出可能な標識はまた、例えば、フルオロフォアが一方のプローブ上にあり、クエンチャーが他方の上にある２つのプローブを含み得、標的上で２つのプローブを一緒にハイブリッド形成することは、シグナルをクエンチするか、または標的上のハイブリッド形成は、蛍光の変化を介してシグナルサインを変更する。例示的なシステムは、ＦＲＥＴ、サリシレート／ＤＴＰＡリガンドシステム（例えば、Ｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｎｇｌ．２９（１０）：１１６７（１９９０）参照）、置換ハイブリッド形成、相同的プローブ、ならびに／または欧州特許第ＥＰ０７０６８５号及び／もしくは米国特許第６，２３８，９２７号に記載されるアッセイも含み得る。検出可能な標識は、カルボキシレート基の代わりにＳＯ３を有するフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホラミダイト形態、Ｃｙ５のホスホラミダイト形態（例えばＡｍｅｒｓｈａｍで入手可能）も含むことができる。上に列挙された全ての参考文献は、その全容において参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
他の実施形態は、式Ｉの新規化合物をそこに含むことによって、熱サイクリングプロセス中にポリメラーゼの不活性化を阻害するための方法を提供する。ポリメラーゼ活性を有する酵素及び少なくとも１つの式Ｉの新規化合物を提供し、かつ、酵素のポリメラーゼ活性が安定化するような条件下でそれを組み合わせて混合物を形成するための方法も提供される。ポリメラーゼは、本明細書に記載されるものを含むがこれらに限定されない当業者に利用可能な任意のものであり得る。特定の実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性である。
【００５１】
本明細書に記載される新規化合物及び方法は、試験試料から種々の標的核酸を検出及び／または定量するのに有用であり得る。標的核酸は、アッセイシステムが、存在している（もしくはしていない）として識別もしくは検出し、かつ／または試験試料において定量する任意の核酸である。かかる核酸は、例えば、感染病原体のもの（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫など）、例えば癌、糖尿病などの病気のプロセスを含んで、または免疫応答を測定し得る。例示的な「試験試料」は、生体試料などの様々な種類の試料を含む。例示的な生体試料は、例えば、体液（例えば、血液、唾液、脊髄液）、組織試料、食料（例えば、肉）または飲料（例えば、牛乳）製品などを含む。発現核酸は、例えば、発現（またはその欠損）が、感染症（例えば、細菌、ウイルス、真菌、原虫感染）または癌などの病状に関連する遺伝子を含み得る。本明細書に記載される方法はまた、医薬製品、食料品、または飲料製品中の汚染菌（例えば、細菌、ウイルス、真菌、及び／または原虫）を検出するために使用され得る。本明細書に記載される方法はまた、野生型対立遺伝子の存在下でまれな対立遺伝子（例えば、１０６〜１０９野生型対立遺伝子の存在下での１つの突然変異遺伝子）を検出するのに使用され得る。本方法は、例えば、微小残存病変（例えば、寛解中のまれな残存癌細胞、特にｐ５３遺伝子もしくは腫瘍内に以前に認識された他の腫瘍抑制遺伝子における突然変異）を検出し、かつ／または突然変異荷重（例えば、血液もしくは尿などの正常な組織中に存在する特異的体細胞突然変異の頻度）を測定するのに有用である。
【００５２】
本明細書に記載される方法を実施するためのキットも提供される。本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、包装された一組の関連する構成成分、典型的には、１つ以上の化合物または組成物を指す。キットは、試料から少なくとも１つの標的核酸を重合及び／もしくは増幅するための一対のオリゴヌクレオチド、１つ以上の新規化合物（例えば、及び／または従来の界面活性剤、もしくはそのうちのいずれかを含む混合物）、生体触媒（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）、ならびに／または検出可能な標識で標識された対応する１つ以上のプローブを含み得る。キットは、対照反応において使用される予め決められた標的核酸を含有する試料も含み得る。キットは、任意選択で、増幅反応を完了するために使用され得る保存溶液、緩衝液、酵素、検出可能な標識または検出に必要な試薬、チューブ、膜なども含み得る。いくつかの実施形態では、複数のプライマーの組が含まれる。一実施形態では、キットは、例えば、緩衝液（例えば、トリス）、１つ以上の塩（例えば、ＫＣｌ）、グリセロール、ｄＮＴＰ（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＵ）、組換えＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、色素（例えば、ＲＯＸパッシブリファレンス色素）、１つ以上の界面活性剤（例えば、Ｄｔ４）、１つ以上のホットスタートＰＣＲ機構、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、及び／またはゼラチン（例えば、魚またはウシ原料）のうちの１つ以上を含み得る。当業者によって理解されるであろう特定のシステム及びキットの他の実施形態もまた、意図される。
【００５３】
本開示は、以下の新規化合物ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン（式１の）に関する：
【化８】
2019163255.tif 000011
熱安定性ポリメラーゼなどのポリメラーゼ、及びＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、この化合物を含む貯蔵緩衝液が提供される。例えば、熱安定性ポリメラーゼまたは逆転写酵素などの酵素のための貯蔵緩衝液は、この化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、熱安定性ポリメラーゼなどのポリメラーゼ、及びＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを含む貯蔵または反応組成物を含むキットも提供される。いくつかの実施形態では、熱安定性ポリメラーゼなどのポリメラーゼの効率を増加させるための方法、該方法は、標的核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、及びＢｒｉｊＬ−２３−プロリンと混合するステップと、該標的核酸を増幅するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、核酸合成の増加した効率は、該化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときの核酸合成効率と同一であるか、またはそれより大きい。特定の実施形態では、該化合物の有効濃度は、従来の界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）に必要とされるものより少なくとも約１〜約１０倍低い。いくつかの実施形態では、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンは、標準安定性試験プロトコル（例えば、以下の実施例２における通り）を使用して測定されたとき、少なくとも約１ヶ月〜約３年間緩衝液（例えば、５Ｘ緩衝液）中で安定している。反応混合物（例えば、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン、及び検出可能な標識を含む）を形成すること、標的核酸を増幅すること、ならびに試料中の該標的核酸の存在及び／または量を示す検出可能な標識から生成されるシグナルを検出することによって試料中の標的核酸を検出するための方法も提供される。熱サイクリングプロセス中にポリメラーゼをＢｒｉｊＬ−２３−プロリンと接触させることによって、熱サイクリングプロセスにおける該ポリメラーゼの不活性活化を阻害するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ不活性化の阻害は、ポリメラーゼが、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンの代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ不活性化の阻害と同一であるか、またはそれより大きい。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ活性を有する酵素（例えば、熱安定性ポリメラーゼ）の該ポリメラーゼ活性が安定化するような条件下で、該酵素とＢｒｉｊＬ−２３−プロリンとを組み合わせて混合物を形成することによって、ポリメラーゼの安定化した活性を提供するための方法。特定の実施形態では、熱安定性ポリメラーゼなどの安定性酵素、及びＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、熱安定性ポリメラーゼなどの安定性酵素、及びＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを含む貯蔵緩衝液が提供される。特定の実施形態では、安定化の程度は、ポリメラーゼが、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンの代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ活性の安定化と同一であるか、またはそれより大きい。少なくとも１つのポリメラーゼ（例えば、熱安定性ポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ、及びＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを含む核酸増幅反応混合物も提供される。反応混合物中で、標的核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ（例えば、熱安定性ポリメラーゼ）及びＢｒｉｊＬ−２３−プロリンと組み合わせること、及び標的核酸を重合することによって、標的核酸を増幅するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、反応混合物（例えば、ｄＮＴＰ及び／または他の試薬をさらに含む）の一部として、前記標的核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ及びＢｒｉｊＬ−２３−プロリンと組み合わせること、及び標的核酸を重合することによって、標的核酸を増幅するための方法も提供される。特定の実施形態では、標的核酸の重合または増幅が、検出され得る（例えば、プライマーまたはプローブの、例えば、一部であり得る検出可能な標識を使用する）。標的核酸のかかる重合及び／または増幅も定量され得る。本明細書に記載される通り使用され得る例示的な熱安定性ポリメラーゼは、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物のミトコンドリアのＤＮＡポリメラーゼγ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩＩ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩＶ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＶ、真核生物のポリメラーゼα、真核生物のポリメラーゼβ、真核生物のポリメラーゼγ、真核生物のポリメラーゼδ、真核生物のポリメラーゼε、真核生物のポリメラーゼη、真核生物のポリメラーゼζ、真核生物のポリメラーゼι、真核生物のポリメラーゼκ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニット、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩεサブユニット、大腸菌ポリメラーゼＩＶ、大腸菌ポリメラーゼＶ、サーマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼＩ、バチルス・ステアロサーモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩ、ユリ古細菌門ポリメラーゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、出芽酵母ポリメラーゼ４、損傷乗り越え合成ポリメラーゼ、逆転写酵素、熱安定性ポリメラーゼ、テロメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＶｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、低下した３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼ、活性部位突然変異Ｆ６６７Ｙを有するポリメラーゼ、活性部位Ｆ６６７Ｙの等価物を有するポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＦＳ、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、ターミネーターＩ、ターミネーターＩＩ、ターミネーターＩＩＩ、及び／もしくはターミネーターγ、ならびに／またはそれらの誘導体、ならびに／またはそれらの断片もしくは誘導体を含み得るが、これらに限定されない。本明細書に提供される他の方法は、例えば、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン、及び検出可能な標識を含む反応混合物を形成するステップ、該標的核酸を増幅するステップ、ならびに該��的核酸該試料の存在及び／または量を示す該検出可能な標識から生成されるシグナルを検出するステップによって該標的核酸該試料を検出するための方法を含む。特定の方法は、例えば、オリゴヌクレオチドベースのシステム、抗体ベースのシステム、化学ベースのシステム、及び／またはこれらのホットスタート機構のうちの任意の２つ以上の組み合わせ（例えば、抗体ベース及びオリゴヌクレオチドベースのホットスタート）などの１つ以上のホットスタート技法を用い得る。ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを調製するための方法はまた、ＢｒｉｊＬ−２３を活性化してＢｒｉｊＬ−２３−メソレート（Ｍｅｓｏｌａｔｅ）を生成するステップ、ＢｒｉｊＬ−２３−メソレート（Ｍｅｓｏｌａｔｅ）からＢｒｉｊＬ−２３−ヨージドを調製するステップ、ＢｒｉｊＬ−２３−ヨージドからＢｒｉｊＬ−２３−プロリン−ｔ−ブチルエステルを調製するステップ、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン−ｔ−ブチルエステルを加水分解して、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを生成するステップ、及び任意選択で、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）を使用して）を中和するステップなどによって、提供される。当業者には明らかであろうが、本明細書に記載される他の実施形態も本明細書において意図される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを含む組成物が提供される。特定の実施形態では、かかる組成物は、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、１５％、２０％、または３０％の濃度でＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンは、０．００１％〜１０％の濃度でかかる組成物中に存在する。いくつかのより好ましい実施形態では、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンは、．０１〜１％の濃度でかかる組成物中に存在する。
【００５５】
本開示の主題を明らかかつ簡潔に記載及び指摘するために、以下の定義が、以下の記載及び添付の特許請求の範囲に使用される特定の用語のために提供される。明細書全体を通して、特定の用語の例証は、非限定例と考えられるべきである。
【００５６】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに述べない限り複数の指示対象を含む。近似の言語は、明細書及び特許請求の範囲を通してここで使用される場合、関連する基本的機能の変化をもたらすことなく、許容範囲で変わり得る任意の定量的表現を修飾するために適用され得る。その結果、「約」などの用語によって修飾された値は、特定された正確な値に制限されない。必要であれば、範囲が与えられ、それらの範囲はその間の全ての部分範囲を含む。
【００５７】
本開示では、単数形の使用は、別途特に述べられない限り、または本開示の点から見て、当業者には理解されるであろうが、単数形が関数の実施形態のみでない限り、複数形を含み得る。したがって、例えば、「ａ」は、２つ以上を意味し得、「一実施形態」は、記載が複数の実施形態に適用することを意味し得る。「及び／または」という句は、特定の組み合わせが組み合わされて、及び代替では、別々であることを示す簡略表記法を示す。
【００５８】
少し及びわずかな偏差は、本明細書における本教示の範囲内であるように、本教示において考察される温度、濃度、時間などの前に暗黙の「約」が存在することを理解されたい。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）、（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）、（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定されることを意図しない。前述の概要及び詳細な説明の両方は、単に例示的かつ説明的であり、本発明を限定するものではないことを理解されたい。
【００５９】
上の明細書に特に示されない限り、様々な構成要素「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ことを列挙する上の明細書における実施形態はまた、列挙された構成要素「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」として意図される。様々な構成要素「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」ことを列挙する上の明細書における実施形態はまた、列挙された構成要素「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」として意図される。様々な構成要素「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」ことを列挙する上の明細書における実施形態はまた、列挙された構成要素「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」として意図される（この交換可能性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」または「ヌクレオチド塩基」という用語は、ヌクレオシドリン酸を指す。それは、天然ヌクレオチド、合成ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または代理の置換部分もしくは一般的なヌクレオチド（例えば、イノシン）を含むがこれらに限定されない。ヌクレオシドリン酸は、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシドニリン酸、またはヌクレオシド三リン酸であり得る。ヌクレオシドリン酸中の糖部分は、リボースなどのペントース糖であり得、リン酸塩エステル化部位は、ヌクレオシドのペントース糖のＣ−５位に付着したヒドロキシル基に対応し得る。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）であり得るが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、アルファベット文字（文字記号表示）を使用して表され得る。例えば、Ａは、アデノシン（すなわち、ヌクレオベース、アデニンを含有するヌクレオチド）を示し、Ｃはシトシンを示し、Ｇはグアノシンを示し、Ｔはチミジンを示し、Ｕはウラシルを示し、及びＩはイノシンを示す。Ｎは、任意のヌクレオチド（例えば、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、またはＩのうちのいずれかであり得る。）を表す。例えば、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−メチルシトシン、Ｎ４−メチルシトシン、５，Ｎ４−エセンシトシン（ｅｔｈｅｎｃｙｔｏｓｉｎｅ）、４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、及び６−アミノ−４−ヒドロキシ［３，４−ｄ］ピリミジンなどを含む天然に起こる及び合成類似体も使用され得る。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位は、架橋機能（例えば、アルキル化剤）も有し得る。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのオリゴマーまたはその誘導体を指す。オリゴマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの類似体（例えば、ホスホロチオエート類似体）であり得る。オリゴマーは、修飾塩基、及び／または主鎖（例えば、修飾リン酸塩結合または修飾糖部分）も含み得る。オリゴマーに安定性及び／または他の利点を与える合成主鎖の非限定例は、ホスホロチオエート結合、ペプチド核酸、ロックド核酸（Ｓｉｎｇｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４：４５５−４５６（１９９８））、キシロース核酸、及び／またはそれらの類似体を含み得る。オリゴヌクレオチドは、任意の長さ「ｎ」であり得る。例えば、ｎは、１、２、４、６、８、１２、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０などの数のヌクレオチドのうちのいずれかであり得る。ポリヌクレオチド構造（Ｎ）ｎは、ｎ数のヌクレオチドＮ（例えば、（Ｉ）８は、配列ＩＩＩＩＩＩＩＩを有するオリゴヌクレオチドを表すか、または（Ａ）１２は、配列ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡを有するオリゴヌクレオチドを表す）から成るオリゴヌクレオチドを表す。他の種類のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはまた、本開示から当業者には理解されるであろう通りの使用に好適であり得る。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、ヌクレオチドのポリマーまたはその誘導体を指す。本明細書で使用される場合、「標的核酸」という用語は、核酸増幅反応において増幅されることが所望される核酸を指す。例えば、標的核酸は、核酸鋳型を含む。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「配列」という用語は、オリゴヌクレオチドまたは核酸のヌクレオチド配列を指す。明細書全体を通して、オリゴヌクレオチド／核酸が、文字の配列によって表されるときはいつでも、ヌクレオチドは、左から右に５’から３’の順番である。例えば、ｎ＝１、２、３、４などである配列（Ｉ）ｎ（Ａ）ｎによって表されるオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチド（複数可）がイノシンであり、３’末端ヌクレオチド（複数可）がアデノシンであるオリゴヌクレオチドを表す。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「反応混合物」という用語は、化学分析またはバイオアッセイを実行するのに使用される試薬または試薬溶液の組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、反応混合物は、核酸（ＤＮＡ）合成／増幅反応を実行するために全ての必要な構成成分を含む。上に記載される通り、かかる反応混合物は、対象の核酸配列を重合及び／または増幅するのに好適な少なくとも１つの増幅プライマー対及び少なくとも１つの界面活性剤を含み得る。上に記載される通り、好適な反応混合物は、増幅反応を実施するのに必要な構成成分（例えば、典型的には、プライマー対を含まない）を含有する「マスターミックス」も含み得る。マスターミックスは、１つ以上の界面活性剤と組み合わされて、反応混合物を形成し得る。反応混合物の他の実施形態がまた、当業者には理解されるであろうが、本明細書において意図される。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「試薬溶液」または「ＤＮＡ合成反応を実施するのに好適な溶液」という用語は、増幅反応またはＤＮＡ合成を実施するのに典型的に使用される任意または全ての溶液を指す。これらは、ＤＮＡ増幅法において使用される溶液、ＰＣＲ増幅反応において使用される溶液などを含むがこれらに限定されない。ＤＮＡ合成反応に好適な溶液は、緩衝液、塩、及び／またはヌクレオチドを含み得る。それは、プライマー及び／または増幅されるＤＮＡ鋳型をさらに含み得る。１つ以上の試薬溶液が、典型的には、本明細書に記載される反応混合物またはマスターミックス中に含まれる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「プライマー」または「プライマー配列」という用語は、標的核酸配列（例えば、増幅されるＤＮＡ鋳型）にハイブリッド形成して、核酸合成反応を刺激する短い線形オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、またはキメラ配列（例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む）であり得る。プライマーは、天然、合成、または修飾ヌクレオチドを含有し得る。プライマープライマーの長さの上限及び下限の両方は、経験的に決定される。プライマーの長さの下限は、核酸増幅反応条件下で標的核酸とのハイブリッド形成時に安定した二重鎖を形成するために必要な最低限の長さである。大変短いプライマー（通常、３ヌクレオチド長未満）は、そのようなハイブリッド形成条件下では標的核酸と共に熱力学的に安定した二重鎖を形成しない。上限は多くの場合、標的核酸中の所定の核酸配列以外の領域における二重鎖形成を有する可能性によって決定される。概して、好適なプライマーの長さは、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、（など）ヌクレオチド長のおよそいずれかの範囲である。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、任意選択で直鎖状または分岐状であり、かつ完全に飽和しているか、一不飽和であるか、または多価不飽和である可能性がある、炭化水素を指す。さらに、「アルキル」という用語は、本明細書で使用される場合、炭化水素鎖断片の１つ以上の炭素原子での１つ以上の置換をさらに含む。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「アリール」は、そのそれぞれが、Ｈ、ハロゲン、シアノ、アジド、スルホン酸、スルホン酸のアルカリまたはアンモニウム塩、カルボン酸、カルボン酸の生体適合性塩、ニトロ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはアルキルアミドで、任意選択でかつ独立して置換される単一環または複数の縮合環を有する芳香族部分を指す。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「置換」は、１つ以上の水素原子が、１つ以上の非水素原子、官能基、または部分と置き換えられる分子を指す。例えば、非置換窒素は-ＮＨ２であるが、一方で置換窒素は-ＮＨＣＨ３である。例示的な置換基は、ハロ、例えば、フッ素及び塩素、アルキル、アルケン、アルキン、硫酸塩、スルホン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環芳香族、及びヘテロ環を含むがこれらに限定されない。
【００７０】
特定の実施形態は、以下の実施例においてさらに記載される。これらの実施形態は、単に例として提供され、決して特許請求の範囲を制限することを意図しない。
【実施例】
【００７１】
実施例１
新規化合物の開発
新規化合物Ｄｔ１、Ｄｔ２、Ｄｔ３、Ｄｔ４、Ｄｔ５、Ｄｔ６、Ｄｔ７、Ｄｔ８、Ｄｔ９、Ｄ１０、Ｄｔ１１、及びＤｔ１２を以下に記載のプロセス１を使用して開発した。
【化９】
2019163255.tif 000012
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びｎは、本明細書の上に記載された通りであり、Ｘは、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、及びＣ（ＣＨ３）３からなる群から選択される。式Ｉの新規化合物は、例えば、イオン性（例えば、陽イオン性、陰イオン性、双性イオン性）であり得る。
【００７２】
プロセス１に示される通り、化合物Ａ（１当量）、メチルトリフェノキシホスホニウムヨージド（４当量）、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）を、順次、５０ｍＬのアルミニウムホイルで被覆された丸底フラスコに添加した。次いで、反応物を、室温で、アラゴン雰囲気下で３日間、撹拌させた。３日後、反応の進行を、分析ＬＣ−ＭＳを使用して監視した。中間体生成物パターンの出現がその形成を確認する。この予期される中間体生成物（中間体Ｂ）は単離されなかった。前のステップからこの中間体生成物を得るために、アミノ酸エステル塩酸塩（２当量）及びＥｔ３Ｎ（２当量）を添加した。反応混合物を、６５℃で３〜４日間加熱した。反応の進行を、分析ＬＣ−ＭＳを使用して監視した。反応混合物を、室温に冷却し、次いで、ロトベイバー（ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）でおよそ２ｍＬに濃縮した。濃縮された粗混合物を、分取ＨＰＬＣによって精製した。全ての所望の画分をプールし、かつロトベイバー（ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）で濃縮して、所望の生成物（イオン性化合物Ｄｔ１、Ｄｔ３、Ｄｔ５、Ｄｔ７、Ｄｔ９、Ｄｔ１１、Ｄｔ１２）を提供した。次いで、この生成物は、２Ｎ  ＮａＯＨを使用して加水分解反応を受けた。反応混合物は、全ての出発材料が、分析ＬＣ−ＭＳで観察される通り消費されるまで、室温で撹拌され、続いて、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）で中和されて、以下に示される通り、最終陽イオン性化合物（例えば、Ｄｔ１、Ｄｔ３、Ｄｔ５、Ｄｔ７、Ｄｔ９、Ｄｔ１１、及びＤｔ１２）、双性イオン性化合物（例えば、Ｄｔ２、Ｄｔ４、Ｄｔ６、Ｄｔ１０）、または陰イオン性化合物（Ｄｔ８）を提供した。
【化１０】
2019163255.tif 000013
式中、ｎは、本明細書の上に記載された通りである。特定の実施形態では、各ｎは、独立して、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または３０である。
【００７３】
Ｄｔ１及びＤｔ２を、ポリメラーゼによって核酸増幅を支持するそれらの能力について試験した。１ｋｂ及び３ｋｂ（Ｒｈｏｄ−１０４３及びＲｈｏｄ−３６３７それぞれ）の２つの異なる核酸標的を、０．１％のＮＰ−４０及び０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（対照反応）、Ｄｔ１、またはＤｔ２の存在下で、Ｔａｑポリメラーゼを使用してＰＣＲによって増幅した。図１に示される通り、Ｄｔ１及びＤｔ２の両方は、ＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０に相当する方式で増幅反応を支持した。Ｄｔ１は、０．００８％〜０．０００６％の濃度で、５０μｌの反応物中に含まれるとき、１ｋｂのアンプリコン（Ｒｈｏｄ−１０４３）及び３Ｋｂのアンプリコン（Ｒｈｏｄ−３６３７）の増幅を支持した。Ｄｔ２は、０．０４％〜０．０００１％（いくつかの増幅は０．０００８％で観察された）の濃度で、５０μｌの反応物中に含まれるとき、１ｋｂのアンプリコン（Ｒｈｏｄ−１０４３）及び３Ｋｂのアンプリコン（Ｒｈｏｄ−３６３７）の増幅を支持した。
【００７４】
Ｄｔ１はまた、ロドプシン遺伝子プライマーを使用して試験して、およそ４  Ｋｂのアンプリコン（Ｒｈｏｄ−３９２０、Ｒｈｏｄ−４１８１、及びＲｈｏｄ−４０８９）（図２、「貯蔵Ｂ」：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、蒸留水）を増幅した。ＰＣＲ条件は、２分間９４℃であり、９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で４分３０秒の３５サイクル、７２℃で１０分間の延長であった。Ｄｔ１は、０．００８％〜０．００１％の濃度で、５０μｌの反応物中に含まれるとき、Ｒｈｏｄ−３９２０及びＲｈｏｄ−４１８１の増幅を支持した。Ｄｔ１は、０．００８％〜０．００１％の濃度で、５０μｌの反応物中に含まれるとき、Ｒｈｏｄ−４０８９の増幅を支持した。
【００７５】
図３は、０．００４％及び０．００２％のＤｔ１が、０．１〜１Ｋｂのアンプリコンを増幅することにおいて０．００４％のＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０に相当することを示す。図４は、０．００４％及び０．００２％のＤｔ１が、１〜２ｋｂのアンプリコンを増幅することにおいて０．００４％のＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０に相当することを示す。
【００７６】
図５は、Ｂｒｉｊ−５８とＤｔ１との比較を提供する。その中で示される通り、Ｄｔ１（０．０４％〜０．００６％）は、Ｂｒｉｊ−５８（０．０４％〜０．０００４％）またはＮＰ４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．００２％）に相当する方式で増幅を支持する。データは、修飾のために使用されるＢｒｉｊ−５８出発材料の混入に起因しないことを示す。
【００７７】
図６は、Ｄｔ１とＤｔ２の活性を比較する。その中で示される通り、両方の修飾化合物は、増幅を支持する。Ｄｔ１は、０．０４％〜０．００１％の濃度で反応混合物中に含まれるとき、増幅を支持することが示される。Ｄｔ２は、０．０４〜０．００６％の濃度で反応混合物中に含まれるとき、増幅を支持することが示される。
【００７８】
図７及び８は、４つの異なる標的（Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＲＰＬＰＯ、及びＧＵＳＢ）を増幅することにおけるＤｔ４とＴｗｅｅｎ（登録商標）２０との比較を提供する。その中で示される通り、０．０１％のＤｔ４または０．０１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下における増幅は同様の結果を提供した。
【００７９】
図９は、様々な異なる標的を増幅することにおけるＤｔ４とＴｗｅｅｎ（登録商標）２０との比較を提供する。その中で示される通り、Ｄｔ４またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下における増幅は同様の結果を提供した。
【００８０】
図１０は、Ｄｔ１、Ｄｔ３、Ｄｔ５、Ｄｔ６、及びＤｔ７の存在下における増幅の結果を例証する。その中で示される通り、増幅は、これらの実験の反応条件下でも、最高レベルで各界面活性剤、Ｄｔ４、続いてＤｔ１によって支持された。Ｄｔ５及びＤｔ７は、同様の活性を示し、続いてＤｔ６であった。
【００８１】
図１１〜１５は、増幅ＨＰＲＴ１またはＰＰＩＡを増幅することにおいて様々な濃度でＤｔ４とＢｒｉｊ−５８及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の活性を比較する増幅プロットを示す。その中で示される通り、Ｄｔ４は、試験された全ての濃度（０．００１％〜０．０００１％）で、Ｂｒｉｊ−５８及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の両方に相当する方式で、増幅反応を支持する。
【００８２】
図１６〜１８は、Ｄｔ４が、様々な反応において（例えば、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と比較して０．００２％のＤｔ４）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０より低い濃度で使用され得ることを例証する。
【００８３】
図１９及び２０は、Ｄｔ４が、「５Ｘ」緩衝液（トリス（ｐＨ８．０）、ＫＣｌ、及びＢＳＡ）中で少なくとも２ヶ月間安定している（例えば、増幅を支持する能力を保持する）ことを実証する。
【００８４】
図２１及び２２は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と比較して、様々な標的の増幅を支持するための２つのＤｔ４の異なるロットの能力の比較を提供する。
【００８５】
図２３は、Ｄｔ４が、種々のＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにわたって増幅を支持することを例証する。
【００８６】
実施例２
ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンの開発及び使用
式Ｉの別の化合物を以下に示す。
【化１１】
2019163255.tif 000014
ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを、以下に示される通りのプロセス２を使用して調製し得る。
【化１２】
2019163255.tif 000015
簡潔に、プロセス２のステップ１は、ＢｒｉｊＬ−２３を活性化すること、ＢｒｉｊＬ−２３−メソレート（Ｍｅｓｏｌａｔｅ）を後処理すること、及びそれを一晩乾燥させることを含む。ステップ２では、ＢｒｉｊＬ−２３−ヨージドを形成し、後処理し、かつ一晩乾燥させる。ステップ３は、一晩の反応でアミンを形成し、続いて、生成物の精製、生成物を含有する画分のプール、ロータリーエバポレーターを使用する蒸発、及び一晩の乾燥。次いで、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン−ｔ−ブチルエステルのＨＣｌとの加水分解を約８時間実行する。ロータリーエバポレーターを使用する蒸発及び一晩の乾燥は、最終新規化合物ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを残す。
【００８７】
ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンで促進及び実時間安定性試験を実施した。ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを−２０℃で貯蔵した。促進老化安定性実験を４２℃及び２４℃（周囲温度）で実行した。修飾アレニウス式を使用する促進老化時間変換結果を、表２に示す。
【００８８】
【表２】
2019163255.tif 000016
＊Ｔ０＝−２０℃で０日からの試料
【００８９】
ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン（２パイロット）生成物の異なるロットを、促進老化安定性試験のために使用した。材料を、光から保護されたガラスバイアル中で、指定された温度（２４℃及び４２℃）でインキュベートした。２４℃の試料採取点では、各パイロットロットからの１つの試薬バイアルをインキュベーターから除去し、チューブを直ぐに−２０℃の冷凍庫で貯蔵する。２４℃から全ての試料採取時間点（Ｔ１〜Ｔ８）を収集した後、全ての促進老化試料（２４℃及び４２℃）を、試料を液体溶液に変換した後に、ＬＣＭＳ  ＱＣ法によって検査した。２４℃の実験を７週間実行した。その結果を表３中に表す。実時間安定性試験の結果を表４中に表す。
【００９０】
【表３】
2019163255.tif 000017
【００９１】
【表４】
2019163255.tif 000018
＊＊＊ｒＴａｑまたはプラチナＴａｑを、新規界面活性剤ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン中に配合し、−２０℃で４ヶ月間貯蔵し、機能及び貯蔵緩衝液の透明度のため試験した。
【００９２】
促進及び実時間安定性試験の両方の下で、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンは沈殿せず、その化学的同一性を維持することが見出された。
【００９３】
ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを、ポリメラーゼによって核酸増幅を支持するその能力のために試験した。４４の核酸標的を、０．１％のＮＰ−４０及び０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（対照反応）、またはＢｒｉｊＬ−２３−プロリン（２μｌの界面活性剤／５０μｌの反応、３５サイクル）の存在下で、Ｔａｑポリメラーゼを使用して、ＰＣＲによって増幅した。図２４に示される通り、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンは、市販のプラチナＴａｑ及びＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中に配合されるプラチナＴａｑに相当する方式で４４の異なる増幅反応を支持した。
【００９４】
ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンまたはＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中に配合されたプラチナＴａｑ及びｒＴａｑの感度をまた、試験した（５０ｎｇ、５ｎｇ、５００ｐｇ、５０ｐｇの１．２ｋｂのアンプリコン、１μｌポリメラーゼを使用する５０μｌ反応）。図２５に示される通り、配合物の感度は、１．２ｋｂのアンプリコンと同等であった。
【００９５】
市販のプラチナＴａｑ（１）、市販のｒＴａｑ（Ａ）、新規界面活性剤ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン中に配合されたプラチナＴａｑ（２）、新規界面活性剤ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン中に配合されたｒＴａｑ（Ｂ）、ＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中に配合されたプラチナＴａｑ（３）、またはＮＰ−４０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｃ）中に配合されたＴａｑを使用して増幅された７５０ｂｐのＰＣＲ産物のＴＯＰＯ−ＴＡクローニングも比較した。図２６に示される通り、異なる組成物の間の同等のクローニング性能が観察された。
【００９６】
本開示内に列挙された全ての参考文献は、その全容において参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態が、好ましい実施形態に関して記載されたが、変形及び修正が起こることが当業者には理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、以下の特許請求の範囲内である全てのかかる同等の変形を網羅することが意図される。
【図１】
2019163255.tif 000023
【図２】
2019163255.tif 000024
【図３】
2019163255.tif 000025
【図４】
2019163255.tif 000026
【図５】
2019163255.tif 000027
【図６】
2019163255.tif 000028
【図７】
2019163255.tif 000029
【図８】
2019163255.tif 000030
【図９】
2019163255.tif 000031
【図１０】
2019163255.tif 000032
【図１１】
2019163255.tif 000033
【図１２】
2019163255.tif 000034
【図１３】
2019163255.tif 000035
【図１４】
2019163255.tif 000036
【図１５】
2019163255.tif 000037
【図１６】
2019163255.tif 000038
【図１７】
2019163255.tif 000039
【図１８】
2019163255.tif 000040
【図１９】
2019163255.tif 000041
【図２０】
2019163255.tif 000042
【図２１】
2019163255.tif 000043
【図２２】
2019163255.tif 000044
【図２３】
2019163255.tif 000045
【図２４】
2019163255.tif 000046
【図２５】
2019163255.tif 000047
【図２６】
2019163255.tif 000048
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月18日(2019.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で表される化合物であって、
【化１】
2019163255.tif 000049
式中、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５から選択される正の整数である、前記化合物。
【請求項２】
ポリメラーゼ及び請求項１に記載の前記化合物を含む、組成物。
【請求項３】
前記ポリメラーゼが熱安定性である、請求項２に記載の前記組成物。
【請求項４】
ａ）少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸
ｂ）ＤＴＴ
ｃ）ＫＣｌ
ｄ）ＭｇＣｌ２
ｅ）Ｋａｔｈｏｎ
ｆ）ＥＤＴＡ
ｇ）ゼラチン
ｈ）トリス
ｉ）グリセロール
ｊ）ＢＳＡ
のうちの１つ以上を含む、請求項２に記載の前記組成物。
【請求項５】
ポリメラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項２に記載の前記組成物。
【請求項６】
前記ポリメラーゼ阻害剤が、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド阻害剤である、請求項５に記載の前記組成物。
【請求項７】
前記ポリメラーゼ阻害剤が、少なくとも１つの抗体阻害剤である、請求項５に記載の前記組成物。
【請求項８】
前記ポリメラーゼが、少なくとも約１ヶ月〜約３年間安定している、請求項２に記載の前記組成物。
【請求項９】
ポリメラーゼ及び請求項１に記載の前記化合物を含む貯蔵用組成物または反応組成物を含む、キット。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼが、熱安定性である、請求項９に記載の前記キット。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼが、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼから単離されたポリメラーゼである、請求項１０に記載の前記キット。
【請求項１２】
ポリメラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項１０に記載の前記キット。
【請求項１３】
ポリメラーゼの効率を増加させるための方法であって、
ａ）標的核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、及び請求項１に記載の前記化合物と混合するステップと、
ｂ）前記標的核酸を増幅するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１４】
前記増加した効率が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときと同一の効率である、請求項１３に記載の前記方法。
【請求項１５】
前記増加した効率が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときの効率より大きい、請求項１３に記載の前記方法。
【請求項１６】
前記化合物の有効濃度が、従来の界面活性剤に必要とされるものより少なくとも１〜１０倍低い、請求項１３に記載の前記方法。
【請求項１７】
前記従来の界面活性剤が、ＮＰ−４０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０である、請求項１６に記載の前記方法。
【請求項１８】
試料中の標的核酸を検出するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、請求項１に記載の前記化合物、及び検出可能な標識を含む、反応混合物を形成するステップと、
ｂ）前記標的核酸を増幅するステップと、
ｃ）前記試料中の前記標的核酸の存在及び／または量を示す、前記検出可能な標識から生成されるシグナルを検出するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１９】
熱サイクリングプロセスにおけるポリメラーゼの不活性化を阻害するための方法であって、前記熱サイクリングプロセス中に前記ポリメラーゼを請求項１に記載の前記化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２０】
ポリメラーゼ不活性化の前記阻害が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ不活性化の阻害と同一である、請求項１９に記載の前記方法。
【請求項２１】
ポリメラーゼ不活性化の前記阻害が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ不活性化の阻害より大きい、請求項１９に記載の前記方法。
【請求項２２】
ポリメラーゼ活性を有する酵素の前記ポリメラーゼ活性が安定化するような条件下で前記酵素と請求項１に記載の前記化合物とを組み合わせて混合物を形成するための方法。
【請求項２３】
前記安定化が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ活性の安定化と同一である、請求項２２に記載の前記方法。
【請求項２４】
前記安定化が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ活性の安定化より大きい、請求項２２に記載の前記方法。
【請求項２５】
前記ポリメラーゼが、熱安定性である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項２６】
ａ）少なくとも１つのポリメラーゼと、
ｂ）ｄＮＴＰと、
ｃ）請求項１に記載の前記化合物と
を含む、核酸増幅反応混合物。
【請求項２７】
少なくとも１つのプライマーをさらに含む、請求項２６に記載の前記核酸増幅反応混合物。
【請求項２８】
前記ポリメラーゼが、熱安定性である、請求項２６または２７に記載の前記核酸増幅反応混合物。
【請求項２９】
少なくとも１つの抗体をさらに含む、請求項２６に記載の前記核酸増幅反応混合物。
【請求項３０】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドポリメラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項２６に記載の前記核酸増幅反応混合物。
【請求項３１】
標的核酸を重合するための方法であって、
ａ）反応混合物中で、前記標的核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ及び請求項１に記載の前記化合物と組み合わせるステップと、
ｂ）前記標的核酸を重合するステップと
を含む、前記方法。
【請求項３２】
標的核酸を増幅するための方法であって、
ａ）反応混合物の一部として、前記標的核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ及び請求項１に記載の前記化合物と組み合わせるステップと、
ｂ）前記標的核酸を重合するステップと
を含む、前記方法。
【請求項３３】
前記反応混合物が、少なくとも１つの核酸プライマー及び／またはｄＮＴＰをさらに含む、請求項３１または３２に記載の前記方法。
【請求項３４】
前記標的核酸の重合または増幅が検出される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項３５】
検出可能な標識を使用して、前記標的核酸の重合または増幅が検出される、請求項３４に記載の前記方法。
【請求項３６】
前記検出可能な標識が、プライマーまたはプローブの一部である、請求項３５に記載の前記方法。
【請求項３７】
前記標的核酸の前記重合または増幅が定量される、請求項３４に記載の前記方法。
【請求項３８】
前記ポリメラーゼが、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物のミトコンドリアのＤＮＡポリメラーゼγ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩＩ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩＶ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＶ、真核生物のポリメラーゼα、真核生物のポリメラーゼβ、真核生物のポリメラーゼγ、真核生物のポリメラーゼδ、真核生物のポリメラーゼε、真核生物のポリメラーゼη、真核生物のポリメラーゼζ、真核生物のポリメラーゼι、真核生物のポリメラーゼκ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニット、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩεサブユニット、大腸菌ポリメラーゼＩＶ、大腸菌ポリメラーゼＶ、サーマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼＩ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、ユリ古細菌門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）ポリメラーゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ポリメラーゼ４、損傷乗り越え合成ポリメラーゼ、逆転写酵素、熱安定性ポリメラーゼ、及びテロメラーゼからなる群から選択される、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項３９】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＶｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、低下した３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼ、活性部位突然変異Ｆ６６７Ｙを有するポリメラーゼ、活性部位Ｆ６６７Ｙの等価物を有するポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａq（登録商標）ＦＳ、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、ターミネーターＩ、ターミネーターＩＩ、ターミネーターＩＩＩ、ターミネーターγ、それらの誘導体、及びそれらの断片からなる群から選択される、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４０】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３９に記載の前記方法。
【請求項４１】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３９に記載の前記方法。
【請求項４２】
試料中の標的核酸を検出するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、及び請求項１に記載の前記化合物、ならびに検出可能な標識を含む、反応混合物を形成することと、
ｂ）前記標的核酸を増幅することと、
ｃ）前記標的核酸前記試料の存在を示す、前記検出可能な標識から生成されるシグナルを検出することと
を含む、前記方法。
【請求項４３】
ホットスタート技法の使用を含む、請求項１３、１８、１９、２２、３１、３２、及び４２のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項４４】
前記ホットスタート技法が、オリゴヌクレオチドベースのシステム、抗体ベースのシステム、化学ベース型システム、及び二重ホットスタートシステムからなる群から選択される、請求項４３に記載の前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
特定の実施形態では、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンなどの式Ｉの新規化合物のうちの少なくとも１つを含む組成物が本明細書において提供される。特定の実施形態では、少なくとも１つのポリメラーゼ及びＢｒｉｊＬ−２３−プロリンなどの式Ｉの新規化合物のうちの少なくとも１つを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性である。かかる方法を実行するため、またはかかる混合物を調製するために必要なかかる化合物及び同類のものを含む試薬を含むキットも提供される。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
式Ｉの化合物であって、
［化１］
2019163255.tif 000050
式中、
Ｒ１がＣ１２アルキルである、前記化合物。特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ４はＨである。特定の実施形態では、Ｒ３は、Ｒ５と一緒になって、５員環を形成し、各ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０を含むがこれらに限定されない任意の正の整数である。
［２］
以下の構造を有する化合物：
［化２］
2019163255.tif 000051
。
［３］
ポリメラーゼ及び［２］の前記化合物を含む、組成物。
［４］
前記ポリメラーゼが熱安定性である、［３］の前記組成物。
［５］
ａ）少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸
ｂ）ＤＴＴ
ｃ）ＫＣｌ
ｄ）ＭｇＣｌ２
ｅ）Ｋａｔｈｏｎ
ｆ）ＥＤＴＡ
ｇ）ゼラチン
ｈ）トリス
ｉ）グリセロール
ｊ）ＢＳＡ
のうちの１つ以上を含む、［３］の前記組成物。
［６］
ポリメラーゼ阻害剤をさらに含む、［３］の前記組成物。
［７］
前記ポリメラーゼ阻害剤が、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド阻害剤である、［６］の前記組成物。
［８］
前記ポリメラーゼ阻害剤が、少なくとも１つの抗体阻害剤である、［６］の前記組成物。
［９］
前記ポリメラーゼが、少なくとも約１ヶ月〜約３年間安定している、［３］の前記組成物。
［１０］
ポリメラーゼ及び［２］の前記化合物を含む貯蔵または反応組成物を含む、キット。
［１１］
前記ポリメラーゼが、熱安定性である、［１０］の前記キット。
［１２］
前記ポリメラーゼが、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼから単離されたポリメラーゼである、［１１］の前記キット。
［１３］
ポリメラーゼ阻害剤をさらに含む、［１１］の前記キット。
［１４］
ポリメラーゼの効率を増加させるための方法であって、
ａ）標的核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、及び［２］の前記化合物と混合するステップと、
ｂ）前記標的核酸を増幅するステップと
を含む、前記方法。
［１５］
前記増加した効率が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときと同一の効率である、［１４］の前記方法。
［１６］
前記増加した効率が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときの効率より大きい、［１４］の前記方法。
［１７］
前記化合物の有効濃度が、従来の界面活性剤に必要とされるものより少なくとも１〜１０倍低い、［１４］の前記方法。
［１８］
前記従来の界面活性剤が、ＮＰ−４０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０である、［１７］の前記方法。
［１９］
試料中の標的核酸を検出するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、［２］の前記化合物、及び検出可能な標識を含む、反応混合物を形成するステップと、
ｂ）前記標的核酸を増幅するステップと、
ｃ）前記試料中の前記標的核酸の存在及び／または量を示す、前記検出可能な標識から生成されるシグナルを検出するステップと
を含む、前記方法。
［２０］
熱サイクリングプロセスにおけるポリメラーゼの不活性化を阻害するための方法であって、前記熱サイクリングプロセス中に前記ポリメラーゼを［２］の前記化合物と接触させることを含む、前記方法。
［２１］
ポリメラーゼ不活性化の前記阻害が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ不活性化の阻害と同一である、［２０］の前記方法。
［２２］
ポリメラーゼ不活性化の前記阻害が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ不活性化の阻害より大きい、［２０］の前記方法。
［２３］
ポリメラーゼ活性を有する酵素の前記ポリメラーゼ活性が安定化するような条件下で前記酵素と［２］の前記化合物とを組み合わせて混合物を形成することを含む、方法。
［２４］
前記安定化が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ活性の安定化と同一である、［２３］の前記方法。
［２５］
前記安定化が、前記ポリメラーゼが、前記化合物の代わりにＮＰ−４０及び／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下にあるときのポリメラーゼ活性の安定化より大きい、［２３］の前記方法。
［２６］
前記ポリメラーゼが、熱安定性である、［１９］〜［２５］のいずれかの前記方法。
［２７］
ａ）少なくとも１つのポリメラーゼと、
ｂ）ｄＮＴＰと、
ｃ）［２］の前記化合物と
を含む、核酸増幅反応混合物。
［２８］
少なくとも１つのプライマーをさらに含む、［２７］の前記核酸増幅反応混合物。
［２９］
前記ポリメラーゼが、熱安定性である、［２７］または［２８］の前記核酸増幅反応混合物。
［３０］
少なくとも１つの抗体をさらに含む、［２７］の前記核酸増幅反応混合物。
［３１］
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドポリメラーゼ阻害剤をさらに含む、［２７］の前記核酸増幅反応混合物。
［３２］
標的核酸を重合するための方法であって、
ａ）反応混合物中で、前記標的核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ及び［２］の前記化合物と組み合わせるステップと、
ｂ）前記標的核酸を重合するステップと
を含む、前記方法。
［３３］
標的核酸を増幅するための方法であって、
ａ）反応混合物の一部として、前記標的核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ及び［２］の前記化合物と組み合わせるステップと、
ｂ）前記標的核酸を重合するステップと
を含む、前記方法。
［３４］
前記反応混合物が、少なくとも１つの核酸プライマー及び／またはｄＮＴＰをさらに含む、［３２］または［３３］の前記方法。
［３５］
前記標的核酸の重合または増幅が検出される、［３２］〜［３４］のいずれかの前記方法。
［３６］
検出可能な標識を使用して、前記標的核酸の重合または増幅が検出される、［３５］の前記方法。
［３７］
前記検出可能な標識が、プライマーまたはプローブの一部である、［３６］の前記方法。
［３８］
前記標的核酸の前記重合または増幅が定量される、［３５］の前記方法。
［３９］
前記ポリメラーゼが、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物のミトコンドリアのＤＮＡポリメラーゼγ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩＩ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＩＶ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼＶ、真核生物のポリメラーゼα、真核生物のポリメラーゼβ、真核生物のポリメラーゼγ、真核生物のポリメラーゼδ、真核生物のポリメラーゼε、真核生物のポリメラーゼη、真核生物のポリメラーゼζ、真核生物のポリメラーゼι、真核生物のポリメラーゼκ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニット、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩεサブユニット、大腸菌ポリメラーゼＩＶ、大腸菌ポリメラーゼＶ、サーマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼＩ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、ユリ古細菌門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）ポリメラーゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ポリメラーゼ４、損傷乗り越え合成ポリメラーゼ、逆転写酵素、熱安定性ポリメラーゼ、及びテロメラーゼからなる群から選択される、［３２］〜［３８］のいずれかの前記方法。
［４０］
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＶｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、低下した３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼ、活性部位突然変異Ｆ６６７Ｙを有するポリメラーゼ、活性部位Ｆ６６７Ｙの等価物を有するポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａq（登録商標）ＦＳ、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、ターミネーターＩ、ターミネーターＩＩ、ターミネーターＩＩＩ、ターミネーターγ、それらの誘導体、及びそれらの断片からなる群から選択される、［３９］の前記方法。
［４１］
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである、［４０］の前記方法。
［４２］
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼである、［４０］の前記方法。
［４３］
試料中の標的核酸を検出するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、及び［２］の前記化合物、ならびに検出可能な標識を含む、反応混合物を形成することと、
ｂ）前記標的核酸を増幅することと、
ｃ）前記標的核酸前記試料の存在を示す、前記検出可能な標識から生成されるシグナルを検出することと
を含む、前記方法。
［４４］
ホットスタート技法の使用を含む、［１４］、［１９］、［２０］、［２３］、［３２］、［３３］、及び［４３］のいずれかの前記方法。
［４５］
前記ホットスタート技法が、オリゴヌクレオチドベースのシステム、抗体ベースのシステム、化学ベース型システム、及び二重ホットスタートシステムからなる群から選択される、［４４］の前記方法。
［４６］
修飾界面活性剤を生成するための方法であって、
ａ）ＢｒｉｊＬ−２３を活性化してＢｒｉｊＬ−２３−メソレート（Ｍｅｓｏｌａｔｅ）を生成することと、
ｂ）ＢｒｉｊＬ−２３−メソレート（Ｍｅｓｏｌａｔｅ）からＢｒｉｊＬ−２３−ヨージドを調製することと、
ｃ）ＢｒｉｊＬ−２３−ヨージドからＢｒｉｊＬ−２３−プロリン−ｔ−ブチルエステルを調製することと、
ｄ）ＢｒｉｊＬ−２３−プロリン−ｔ−ブチルエステルを加水分解して、ＢｒｉｊＬ−２３−プロリンを生成することと
を含む、前記方法。
［４７］
生成物を中和することをさらに含む、［４６］の前記方法。
［４８］
前記生成物が、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）を使用して中和される、［４７］の前記方法。