(57)【要約】【課題】ピンチドフローフラクショネーション（ＰＦＦ）において、粒子をより精度のよい分離を実現することで、ナノ〜マイクロレベルの粒子を連続的に分離可能な装置及びその方法を提供すること。【解決手段】サンプル液側の狭窄流路壁面と、サンプル液側の拡大流路壁面とを接続する角度を調整することで、前記課題を解決する。【選択図】図６ａ−ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一方の末端側に流体導入口を備え、もう一方の末端側において他の分岐流路と合流する２以上の分岐流路、
当該２以上の分岐流路が合流して形成される狭窄流路、及び
狭窄流路のもう一方の末端に接続し、流路幅が拡大され、少なくとも１の回収口が備えられた拡大流路
を含む、粒子分離装置であって、
１の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入し、もう一方の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含まない流体を導入した場合に、狭窄流路の壁面に沿って粒子が滑流し、前記拡大流路の壁面のうち、粒子が滑流する壁面側に向けて流路幅は拡大せず、粒子が滑流しない壁面側に向けて流路幅が拡大することを特徴とする、
前記粒子分離装置。
【請求項２】
粒子が滑流しない壁面側に向けて、拡大流路の流路幅が拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の角度２４ｂが６５°以上であるすることを特徴とする、請求項１に記載の粒子分離装置。
【請求項３】
粒子が滑流しない壁面側に向けて拡大流路の流路幅が拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の角度２４ｂが９０°以上であることを特徴とする、請求項１に記載の粒子分離装置。
【請求項４】
粒子が滑粒しない壁面側に向けて拡大流路の流路幅が拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の拡大する角度２４ｂが１３５°以上であることを特徴とする、請求項１に記載の粒子分離装置。
【請求項５】
一方の末端に流体導入口を備え、もう一方の末端において他の分岐流路と合流する２以上の分岐流路、
当該２以上の分岐流路が合流して形成される狭窄流路、及び
狭窄流路のもう一方の末端に接続され、流路幅が拡大され、少なくとも１の回収口が備えられた拡大流路
を含み、拡大流路の壁面のうち、粒子が滑流する壁面側に向けて流路幅は拡大せず、粒子が滑流しない壁面側に向けて流路幅が拡大する粒子分離装置を用いた粒子分離方法であって、
１の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入し、もう一方の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含まない流体を導入して、それにより合流して形成される流路の壁面に沿って粒子を滑流させる工程を含む、前記方法。
【請求項６】
粒子が滑粒しない壁面側に向けて拡大流路の流路幅が拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の角度２４ｂが６５°以上であることを特徴とする、請求項５に記載の粒子分離方法。
【請求項７】
粒子が滑粒しない壁面側に向けて拡大流路の流路幅が拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の角度２４ｂが９０°以上であることを特徴とする、請求項５に記載の粒子分離方法。
【請求項８】
粒子が滑粒しない壁面側に向けて拡大流路の流路幅が拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の角度２４ｂが１３５°以上であることを特徴とする、請求項５に記載の粒子分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子分離装置及び粒子分離方法に関する。より具体的に、本発明は、流体中に含まれる粒子の分離装置及び前記装置を用いた流体中に含まれる粒子を操作する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、幅広い分野で産業応用されているものの一つとして粒子が挙げられる。一般に、粒子はその形状、材質、大きさなど種々の物理量により分類される。しかしながら、近年では、例えば、ある材質の粒子の大きさをナノレベルまで小さくした場合に、他の材質では見られない光学的特性の変化が現れるといった現象が判明しており（非特許文献１）、粒子の物理量によって一義に分類できないほど、その種類は多岐にわたっている。粒子を産業利用するためには、目的の粒子の物理的性質を鑑み、それに適した手法で製造するか、または自然界から分離して回収する必要がある。前者の場合、目的とする粒子を均一にかつ高純度で製造することは、産業化という観点で技術やコスト面で容易ではないため、一度製造したものから分離、回収し、製造物中の濃度や純度を上げるケースが大半である。よって、粒子を用いた製品の産業化においては、目的とする粒子の分離技術は極めて重要なものとして位置づけられ、古くから世界中で研究、開発されてきている。例えば、粒子の大きさを利用した分離方法としてフィルター分離法（篩分級も含む）、重力分級法、遠心分離法、サイクロン分離法などが挙げられるほか、密度勾配、電場、磁場を用いた手法なども多く存在する。
【０００３】
生物学の分野においても、より精密に粒子を分離する技術の開発が求められており、マイクロメートルレベルでの分解能が必要となってきている。例えば、胎児の出生前診断に用いられる末梢血中の有核赤血球は、直径、厚みが数マイクロメートルレベルである（非特許文献２）。また、癌転移に関連するといわれる血中循環癌細胞は、１０マイクロメートル前後の白血球から分離する必要がある（非特許文献３）。これらの血球細胞を分離するため、フィルターを用いてサイズ分離を行う例もある。しかしながら、細胞は機械的強度が低いため、フィルターで捕捉された細胞が送液圧力により破裂することがあるという欠点がある。
【０００４】
そこで微細加工技術を用いて作製された、幅や高さがサブミクロン〜数百ミクロンの微小な流路構造（マイクロ流路）を用いて精密に細胞を分離する技術の開発がこれまでに進められてきており、水力学的作用（非特許文献４）、決定論的分離作用（非特許文献５）、慣性力（非特許文献６）を用いた例などが報告されている。
【０００５】
一方で近年、マイクロメートルサイズの細胞よりもさらに小さい数十〜数百ナノメートル（サブビジブル）サイズの粒子を分離する研究が進められている。こうした研究では、細胞から分泌される細胞外小胞（エクソソーム）や、抗体医薬品の製造時に生じる不溶性の抗体凝集体といった粒子が、分離対象としてあげられる。エクソソームは、細胞内の新たなシグナル伝達手段として近年研究が進められている。例えば、癌の転移において、エクソソームが他の臓器をより転移しやすい環境へと変化させるモデルが提唱されていることから（非特許文献７）、癌の早期診断への応用が近年期待されている。また、母乳中に存在するエクソソームは乳児の免疫獲得を助ける作用があると報告されており、エクソソームの機能解明とその臨床的応用に多くの研究者が期待している。抗体凝集体は、抗体の産生及び精製過程を経て得られた抗体を含む溶液中に含まれることがある。医薬品用途で用いる抗体は通常、前記抗体を発現可能な細胞を培養後、得られた培養液を遠心分離、濾過、カラムクロマトグラフィーなどの精製操作を行なうことで製造されるが、こうして得られた抗体溶液中にも抗体凝集体が含まれうる。抗体凝集体は免疫原性を有する可能性があるため、特に医薬品用途で用いる場合、抗体凝集体を精度よく検出し、抗体を含む溶液中に凝集体が極力含まれないように製造する必要がある。一般に、抗体凝集体の評価はサイズ排除クロマトグラフィーや光遮蔽粒子計数法で評価されているが、サブビジブル凝集体と言われる粒径が０．１から２μｍ程度の凝集体は、これらの手法では検出できない。
【０００６】
以上のように、近年数十ナノメートルから数マイクロメートルサイズの粒子の検出、分離技術が必要とされている。検出技術に関しては、動的光散乱法、レーザー回折・散乱法、共振式質量測定法、Ｎａｎｏ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓなどの手法が存在するものの、それぞれ測定粒径範囲が狭い、データ再現性がよくない、異なる径の粒子サンプルでは正確さが失われるなどの短所があり、ゴールデンスタンダードとなる手法はないのが現状である。分離技術に関しては、Ｆｉｅｌｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（以下ＦＦＦと記載）などの技術が存在するものの、精密な流量調整が必要なため、データ再現性を取るのが難しく、またサンプルをインジェクションして分離を行う機構であるため、連続的な分離は難しく、極めて微量なサンプルを分離することしかできない。
【０００７】
連続的な分離を可能にする技術として、前述のマイクロ流路を用いたピンチドフローフラクショネーション（Ｐｉｎｃｈｅｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）（以下ＰＦＦと記載）という手法が報告されている。この手法の利点としては、光学系・情報処理系などの複雑な機器・装置を必要とせず、連続的な微粒子分離を容易に可能とする点があげられる。また、粒子径という一つの要因を利用した分離ではあるものの複数のフラクションへの分離が可能であり、つまり、例えば大きさで分離する場合、大きいものと小さいものという２段階だけではなく、大きさによる３グループ以上の集団へと分離することができる点、さらに、流路の並列化などを行うことで、大量・高速な微粒子や細胞の分離が可能である点なども利点としてあげられる。
【０００８】
ＰＦＦは、径が部分的に細くなっている流路（以下、狭窄流路とする）に複数の分岐から流体を導入し、流れに対して垂直な方向における粒子の位置を制御し、その後、相対的に径が太い流路（以下、拡大流路とする）に粒子が流れる際に、狭窄流路内における粒子の位置に応じて流れが粒子に与える力の方向が異なることに着目した分離方法であり、連続的にかつ精密に分離が可能な技術である。ＰＦＦでは、特許文献１に記載のように、２つのインレットを持つ構造を用いることができ、例えば一方のインレットから目的の粒子を含む液、他方のインレットから目的の粒子を含まない液を流すことで実施することができる。しかしながらＰＦＦのようなマイクロ流路を用いて、サブビジブル粒子程度の大きさの物質を分離した例はこれまでになく、またマイクロサイズの流路を用いて、０．１〜２マイクロメートルサイズの粒子を、その大きさという要素だけを用いて分離した例についても報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−２０５３８７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｐｒａｓｈａｎｔ  Ｋ．Ｊａｉｎ．ｅｔ  ａｌ、Ｐｌａｓｍｏｎｉｃｓ、Ｖｏｌｕｍｅ  ２、Ｉｓｓｕｅ  ３、ｐｐ１０７−１１８（２００７）
【非特許文献２】Ｒ．Ｈｕａｎｇ．ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、２８（１０）、ｐｐ８９２−８９９（２００８）
【非特許文献３】Ｂｅｅ  Ｌｕａｎ  Ｋｈｏｏ．ｅｔ  ａｌ、Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ、Ｖｏｌｕｍｅ  ９、Ｉｓｓｕｅ  ７、ｅ９９４０９（２０１４）
【非特許文献４】Ｍａｓｕｍｉ  Ｙａｍａｄａ．ｅｔ  ａｌ、Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ、５、１２３３−１２３９（２００５）
【非特許文献５】Ｋｅｉｔｈ  Ｊ．  Ｍｏｒｔｏｎ．ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｖｏｌ．１０５、Ｎｏ２１、ｐｐ．７４３４−７４３８（２００８）
【非特許文献６】Ｍｅｈｄｉ  Ｒａｆｅｉｅ．ｅｔ  ａｌ、Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ、１６、２７９１−２８０２（２０１６）
【非特許文献７】Ｙｕ  Ｆｕｊｉｔａ．ｅｔ  ａｌ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌｕｍｅ  ２１、Ｉｓｓｕｅ  ９、ｐｐ５３３−５４２（２０１５）
【非特許文献８】Ｊｕｎｙａ  Ｔａｋａｇｉ．ｅｔ  ａｌ、Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，５，７７８-７８４（２００５）
【非特許文献９】Ｇｉｂｓｏｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９３，２０５（１９１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、流路の構造を工夫することによってナノ〜マイクロメートルサイズの粒子を連続的に分離できる粒子分離装置、及び粒子分離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を鑑み、ＰＦＦの原理を利用した流路構造を種々検討した結果、拡大流路の内壁１７ａが狭窄流路の内壁１６ａに対して、粒子が滑流する壁面側に向けて流路幅が拡大しないように接続された構造とすることで、ナノ〜マイクロメートルサイズの粒子が分離可能になることを見出した。すなわち、拡大流路の内壁１７ａが狭窄流路の内壁１６ａに対して、粒子含有サンプル液を導入するポート１４ａ側に拡大しないように構成される。
【００１３】
さらに、粒子が滑流する壁面側の狭窄流路の内壁１６ａと、同じ側（粒子が滑流する壁面側）の拡大流路の内壁１７ａとが平面的に接続することで、より精度よく粒子が分離可能になる。さらに、粒子が滑流しない壁面側に向けて流路幅を漸増させることで、つまり狭窄流路１６の壁面と拡大流路１７の壁面との間に出来るだけ角を設けないようにすることで、さらに粒子の分離精度が良くなることを見出した。
【００１４】
一般に、マイクロ流路内は慣性力よりも粘性力が支配的な空間であり、レイノルズ数が２３００以上となるような乱流条件で流体を流すことは簡単ではないため、マイクロ流路内での流体は層流で流れることが前提となる。これはレイノルズ数が２３００以上となるように流体を流す場合、数ｍ／ｓｅｃ以上の高流速で流体をマイクロ流路内へ流す必要があるため、圧力損失が数ＭＰａをはるかに超える値となり、送液ポンプへの圧力負荷や流路の破断などが問題となり送液が困難になるためである。したがって、理論に限定されることを意図するものではないが、ＰＦＦを用いる流路内でも、流体は基本的に層流で流れるため、本発明の効果はマイクロ流路内での乱流の発生によるものではないことが考察される。
【００１５】
一方でＰＦＦでは、粒子が狭窄流路から拡大流路へ侵入した際、流路の幅が大きく変わるために、狭窄流路側の拡大流路の入り口では流速分布が著しく変化する。従って本発明では、この著しい流速分布変化により、流路内で、特に流路幅が変化する拡大領域入り口付近の壁面近傍で渦流が発生している可能性を見いだした。そこで、理論に限定されることを意図するものではないが、この渦流を可能な限り低減することで、壁面近傍へ整列された粒子が渦流の影響で拡散が抑制され、より微小な粒子の分離が可能になったものと考えられる。
【００１６】
一般に、急拡大流路での渦流の発生は、流れ場が剥離することに起因する。流れが剥離する限界角度は、実験により検証されているが（非特許文献９）、断面が矩形の流路の広がり角度が１１°以上（２４ｂ＝１６９°以下）となると、流れの剥離によるエネルギー損失が支配的となることが知られている。しかしながら発明者らが鋭意検討した結果、矩形流路の広がり角度が１１°以上であっても流量により渦流が発生しない条件を見出した。
【００１７】
したがって、前記観点において、本発明は以下のものに関する：
一方の末端に流体導入口を備え、もう一方の末端において他の分岐流路と合流する２以上の分岐流路、当該２以上の分岐流路が合流して形成される狭窄流路、及び狭窄流路のもう一方の末端に接続され、流路幅が拡大され、少なくとも１の回収口が備えられた拡大流路を含む、粒子分離装置であって、１の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入し、もう一方の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含まない流体を導入した場合に、狭窄流路の壁面に沿って粒子が滑流し、前記拡大流路の壁面のうち、粒子が滑流する壁面側に向けて流路幅は拡大せず、粒子が滑流しない壁面側に向けて流路幅が拡大することを特徴とする、前記粒子分離装置。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明はかかる粒子分離装置を用いた粒子分離方法であって、
少なくとも１の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入し、その他の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有しない流体を導入し、それにより合流して形成される流路の壁面に沿って、粒子を滑流させる工程を含む、粒子分離方法にも関する。粒子分離方法は、さらに拡大流路の回収口から、粒子を回収する工程を含んでもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、より精度よく目的の粒子を分離、回収する事ができ、加えてこれまで困難であったナノ〜マイクロレベルの微小な粒子をその大きさ毎に連続的に分離及び／又は回収することが可能となる。また、バッチ処理の分離技術と比較して、大量の粒子の処理が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＰＦＦの原理を模式的に示した図である。２つの分岐から導入された流体の挙動と粒子の分離の様子が示される。
【図２】図２（ａ）〜（ｃ）は、ＰＦＦの原理を利用した連続粒子分級方法を実施するための、従来技術のマイクロチップ１０を示す。図２（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図２（ｂ）におけるＡ矢視図である。図２（ｂ）は図２（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり、図２（ｃ）は図２（ａ）における領域２１の拡大図である。
【図３ａ−ｃ】図３（ａ）〜（ｃ）は、本発明による連続粒子分級方法を実施するための実施形態を備えたマイクロチップ１０を示す。図３（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図３（ｂ）におけるＡ矢視図である。図３（ｂ）は図３（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり、図３（ｃ）は図３（ａ）における領域２１の拡大図である。
【図３ｄ−ｇ】図３（ｄ）〜（ｇ）は、図３（ａ）〜（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図３（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図３（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図３（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図３（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【図４ａ−ｃ】図４（ａ）〜（ｃ）は、従来技術のマイクロチップ１０を示しており、本発明に係る図３のマイクロチップ１０の比較として示す。図４（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図４（ｂ）におけるＡ矢視図である。図４（ｂ）は図４（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり、図４（ｃ）は図４（ａ）における領域２１の拡大図である。
【図４ｄ−ｇ】図４（ｄ）〜（ｇ）は、図４（ａ）〜（ｃ）に示した従来技術のマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図４（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図４（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図４（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図４（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【図５ａ−ｃ】図５（ａ）〜（ｃ）は、本発明による連続粒子分級方法を実施するための実施形態を備えた図４のマイクロチップ１０において、拡大流路の拡大する壁面が逆になるように設計された比較のためのマイクロチップ１０を示す。図５（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図５（ｂ）におけるＡ矢視図である。図５（ｂ）は図５（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり、図５（ｃ）は図５（ａ）における領域２１の拡大図である。
【図５ｄ−ｇ】図５（ｄ）〜（ｇ）は、図５（ａ）〜（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図５（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図５（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図５（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図５（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【図６ａ−ｃ】図６（ａ）〜（ｃ）は、本発明による連続粒子分級方法を実施するための実施形態を備えたマイクロチップ１０を示す。図６（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図６（ｂ）におけるＡ矢視図である。図６（ｂ）は図６（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり、図６（ｃ）は図６（ａ）における領域２１の拡大図である。図６（ｃ）に示すように拡大流路の流路幅が徐々に拡大するように構成されている。
【図６ｄ−ｇ】図６（ｄ）〜（ｇ）は、図６（ａ）〜（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図６（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図６（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図６（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図６（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【図７ａ−ｃ】図７（ａ）〜（ｃ）は、本発明による連続粒子分級方法を実施するための実施形態を備えた図６のマイクロチップ１０において、拡大流路の拡大する壁面が逆になるように設計された比較のためのマイクロチップ１０を示す。図７（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図７（ｂ）におけるＡ矢視図である。図７（ｂ）は図７（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり、図７（ｃ）は図７（ａ）における領域２１の拡大図である。
【図７ｄ−ｇ】図７（ｄ）〜（ｇ）は、図７（ａ）〜（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図７（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図７（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図７（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図７（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【図８ａ−ｄ】図８（ａ）〜（ｄ）は、本発明による連続粒子分級方法を実施するための実施形態を備えたマイクロチップ１０を示す。図８（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図８（ｂ）におけるＡ矢視図である。図８（ｂ）は図８（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり、図８（ｃ）は図８（ａ）における領域２１の拡大図である。図８（ｄ）は、狭窄流路１６と拡大流路１７との接続点（拡大開始点）をさらに拡大して示した図である。図８（ｄ）に示すようにスロープ部分４０に、流路壁面４１ａ、４１ｂ（共に長さ５０μｍ）により構成される部分的な凹部を有する。
【図８ｅ−ｈ】図８（ｅ）〜（ｈ）は、図８（ａ）〜（ｄ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図８（ｅ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図８（ｆ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図８（ｇ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図８（ｈ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【図９】図９は、図６のマイクロチップ１０において、狭窄流路１６の幅と、流路１３の深さのみを変更したマイクロチップ１０を用いて、０．１μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図９（ａ）は分離された０．１μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図９（ｂ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。
【図１０】図１０は、本発明による連続粒子分級方法を実施するための実施形態を備えた図３のマイクロチップ１０において、複数のアウトレット１５ａ、１５ｂ、及び１５ｃを備えるように改良されたマイクロチップ１０を示す。図１０（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図１０（ｂ）におけるＡ矢視図である。図１０（ｂ）は図１０（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり、図１０（ｃ）は図１０（ａ）における領域２１の拡大図である。
【図１１】図１１（ａ）〜（ｃ）は、本発明による連続粒子分級方法を実施するための実施形態を備えた図３のマイクロチップ１０の拡大流路に対して、分離能に影響を与えないと考えられる変更を加えたマイクロチップ１０を示す。
【図１２ａ−ｃ】図１２（ａ）〜（ｃ）は、本発明による連続粒子分級方法を実施するための実施形態を備えた図３のマイクロチップ１０において、拡大流路壁面１７ａが１７ｂ側へ伸びるように設計された比較のためのマイクロチップ１０を示す。図１２（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図１２（ｂ）におけるＡ矢視図である。図１２（ｂ）は図１２（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり、図１２（ｃ）は図１２（ａ）における領域２１の拡大図である。
【図１２ｄ−ｇ】図１２（ｄ）〜（ｇ）は、図１２（ａ）〜（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図１２（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図１２（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図１２（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図１２（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【図１３ａ−ｃ】図１３（ａ）〜（ｃ）は、本発明による連続粒子分級方法を実施するための実施形態を備えた図３のマイクロチップ１０において、拡大流路の壁面１７ａ、１７ｂが徐々に拡大するように設計された比較のためのマイクロチップ１０を示す。図１３（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図１３（ｂ）におけるＡ矢視図である。図１３（ｂ）は図１３（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり、図１３（ｃ）は図１３（ａ）における領域２１の拡大図である。
【図１３ｄ−ｇ】図１３（ｄ）〜（ｇ）は、図１３（ａ）〜（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図１３（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図１３（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図１３（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図１３（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【図１４】図１４（ａ）〜（ｄ）は、角度２４ｂを６５°とした図６（ａ）〜（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図１４（ａ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図１４（ｂ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図１４（ｃ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図１４（ｄ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【図１５】図１５（ａ）〜（ｄ）は、角度２４ｂを９０°とした図６（ａ）〜（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図１５（ａ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図１５（ｂ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図１５（ｃ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図１５（ｄ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【図１６】図１６（ａ）〜（ｄ）は、角度２４ｂを１１２°とした図６（ａ）〜（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図１６（ａ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図１６（ｂ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図１６（ｃ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図１６（ｄ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【図１７】図１７（ａ）〜（ｄ）は、角度２４ｂを１２４°とした図６（ａ）〜（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図１７（ａ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図１７（ｂ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図１７（ｃ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図１７（ｄ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【図１８】図１８（ａ）〜（ｄ）は、角度２４ｂを１３５°とした図６（ａ）〜（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図１８（ａ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図１８（ｂ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図１８（ｃ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図１８（ｄ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための形態について、図面を用いて詳細に説明する。但し本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるものでは無い。
【００２２】
まず、図１をもとに、ピンチドフローフラクショネーション（Ｐｉｎｃｈｅｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ：ＰＦＦ）の原理についての詳細を説明する。図１は図２や図４のマイクロチップにおける分岐流路１８ａ、１８ｂが合流して形成される狭窄流路１６、及び狭窄流路１６のもう一方の末端に接続され、流路幅が拡大された拡大流路１７を示している。具体的には、図２（ａ）における領域２１の拡大図である。また、流体１００Ｐと、斜線で示した流体１００Ｎは、それぞれ粒子を含む流体と、粒子を含まない流体であり、粒子３００ａ、３００ｂは、それぞれ相対的に大きな粒子と相対的に小さな粒子を示している。図１において、矢印２００は、狭窄流路１６と拡大流路１７の境界における流線のプロファイルを示しており、矢印２１０ａ、２１０ｂは、それぞれ大きな粒子３００ａと小さな粒子３００ｂの運動ベクトルを示している。
【００２３】
粒子を含む流体１００Ｐおよび粒子を含まない流体１００Ｎを、シリンジポンプなどを用いて２つのインレット（流体導入口）１４ａ、１４ｂからそれぞれ連続的に供給する。この時、狭窄流路１６内では、それぞれの流体が安定な層流を保ちながら流れる。そして、粒子を含む流体１００Ｐおよび粒子を含まない流体１００Ｎの流量を調節することで、狭窄流路１６における流体１００Ｐの幅（粒子が滑流する壁面１６ａから、流体１００Ｐと流体１００Ｎの界面までの距離）が、分離対象とする最小の粒子の粒径よりも小さくなるようにする。この操作により、分離対象とする全ての粒子は、狭窄流路の内壁１６ａに沿って滑流するようになり、粒子が滑流する内壁１６ａの壁面に対して垂直方向における粒子の位置を、粒子の大きさによって一定にすることができる。
【００２４】
そして狭窄流路１６と拡大流路１７の境界（拡大開始点１９）において、流線はプロファイル２００に示されているように広がるため、狭窄流路１６における任意の流線間の距離は、拡大流路１７においてより拡大される。したがって、狭窄流路１６における流れと垂直な方向における粒子の位置は、粒子の大きさによってそれぞれ異なるため、狭窄流路１６と拡大流路１７の境界において、大きい粒子３００ａの運動ベクトル２１０ａと小さい粒子３００ｂの運動ベクトル２１０ｂの方向に差が生じ、拡大流路１７において、粒子の大きさごとの位置差が拡大され、分級が可能となる。
【００２５】
なお、分離した粒子を拡大流路１７における検出ライン２０に沿って、適当な検出系を用いて観察することで、粒子の粒径と粒子群の粒径分布を調べることが可能となる。また、拡大流路１７にはアウトレット１５は複数設けてもよい。また流路終端を分岐してアウトレットを複数設けることで、分離された目的の粒子を回収することができる。さらに、「非対称ピンチドフローフラクショネーション（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｐｉｎｃｈｅｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（ＡｓＰＦＦ））」（非特許文献８）の原理に基づいて、一部のアウトレットに多量の流体を流すことで分離能を向上させることもできる。より具体的には、流路の抵抗値を適切に設計し、また、狭窄流路１６の流路幅および粒子径の関係から、ある特定のサイズの粒子を、特定のアウトレットにのみ導入できる、という原理である。
【００２６】
複数のアウトレットを有する連続粒子分離装置及びその方法の場合、流路ネットワーク全体を抵抗回路のアナロジーとしてみなし、適切な設計を行うことで、任意の流量分配比を達成することができるため、そのような考えに基づいた設計を行うことが望ましい。例えば、前述のＡｓＰＦＦの原理に基づいて、図３、４に示すように、大半の流体が流れるように拡大流路１７の一部にドレイン流路２２を設計し、ドレイン用のアウトレット２３を設けてもよい。その場合も、目的物をアウトレット１５、または図１０（ａ）のアウトレット１５ａ、１５ｂ、１５ｃのように複数設けたアウトレットの任意のアウトレットから回収するようにしてもよい。特に、複数の大きさをもつ物質を含むサンプルから特定の大きさの粒子を分離し回収しようとする場合、アウトレット１５の数は目的に応じて任意の数に設定されるが、回収するという点で少なくとも２以上に設定されることが好ましい。一方で、分離した後に回収せず、例えば分離された粒子を検出するのみでよい場合は、検出ライン２０で蛍光や明視野像の検出系等を用いて検出すればよく、この場合、アウトレットの数は１つであってもよい。
【００２７】
図３には、本発明による連続分級方法の実施形態を備えたマイクロチップ１０が示されており、図３（ａ）は図３（ｂ）におけるＡ矢視図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図である。図３におけるマイクロチップ１０の流路１３は、どの地点においても断面形状が矩形であり、流路深さは均一である。このように断面形状は、粒子を断面においてその大きさによって分離するために、また、流路構造の作製上の容易さから、矩形であることが望ましいが、円形や楕円形、多角形などの断面であってもよく、また部分的に矩形以外の形状であってもよい。狭窄流路の壁面に沿って粒子を滑流させる観点から粒子が滑流する壁面は平面であることが好ましい。同様に流路構造の深さはその作製上の容易さから一定であることが好ましいが、部分的に深さが異なっていてもよい。
【００２８】
このマイクロチップ１０は、粒子をその大きさにより分離し、適当な検出系を用いることにより、粒径と粒径分布を測定するためのマイクロチップであり、例えば、ＰＤＭＳなどの高分子（ポリマー）材料により形成された、２枚の平板状の基板１１と基板１２により形成された平板状の構造を有していてよい。
【００２９】
マイクロチップ１０を作製する場合に用いる技術としては、例えば、モールディングやエンボッシングといった鋳型を用いる作製技術は、流路構造を正確かつ容易に作製可能であるという点において好ましいが、その他にも、フォトリソグラフィー、ソフトリソグラフィー、ウェットエッチング、ドライエッチング、ナノインプリンティング、レーザー加工、電子線直接描画、機械加工等の作製技術を用いることも可能である。
【００３０】
また、マイクロチップ１０を作製する場合の材質としては、ＰＤＭＳ、アクリル等の各種ポリマー材料、ガラス、シリコーン、セラミクス、ステンレスなどの各種金属、などを用いることができ、また、これらの材料のうち、任意の２種類の基板を組み合わせて用いることも可能である。ただし、流路自体を安価に作製し、ディスポーザブルな装置を提供するためには、少なくとも部分的にポリマー材料を用いることが好ましい。
【００３１】
そして、基板１１の下面１１ａには、基板１２と重ね合わせた場合に、分岐流路１８、狭窄流路１６、及び拡大流路１７を含む流路１３が形成されるように加工されており、各流路の幅、深さは、それぞれ１０ｎｍから１ｃｍまでの任意の値に設定することが可能である。作製の容易さから、各流路の幅、深さは、それぞれ、サブミクロンから数百μｍの値に設定することが好ましい。特にナノ〜マイクロレベル程度の大きさをもつものを分離する場合、各流路の幅、深さはサブミクロンから数十μｍの値に設定することが好ましい。
【００３２】
流路１３は、インレット１４ａ、１４ｂおよびアウトレット１５、１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、２３を有し、インレット１４ａ、１４ｂは、それぞれ測定対象の粒子を含む流体と測定対象の粒子を含まない流体の流体導入口であり、アウトレット１５、１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、２３は流体の出口である。インレット及びアウトレットは、それぞれ、基板１１又は１２を貫通することで、基板上面又は下面からの流体の導入又は排出を可能にする。なお、測定対象の粒子を含む流体は、インレット１４ａ、１４ｂ何れかから導入されることが好ましいが、インレット１４ａから導入されることが好ましい。また、測定対象の粒子を含まない流体は、インレット１４ａ、１４ｂ何れかから導入されることが好ましいが、インレット１４ｂから導入されることが好ましい。
【００３３】
また、流路１３は、インレット側に少なくとも２つの分岐流路１８ａ、１８ｂ、中央部に分岐流路１８ａ、１８ｂが合流して形成される狭窄流路１６、アウトレット側に流路幅が拡大された拡大流路１７から構成されている。分岐流路の数は、狭窄流路において層流を達成できる限りにおいて、任意の数であってよい。また、分岐流路は、少なくとも２の分岐流路が合流すれば、任意の形状であってよいが、合流して形成される狭窄流路において層流を達成する観点から、図３（ａ）に示されるように、分岐流路間の角度を鋭角に形成することが好ましく、合流して形成される狭窄流路を、その優角側に形成することが好ましい。狭窄流路１６と拡大流路１７の接続部を拡大開始点１９ということができ、図１〜８、１０、及び１１で表されるように拡大開始点において流路幅が変わる。拡大流路１７は、狭窄流路１６よりも流路幅が大きくなれば任意の形状であってよい。ここで、分岐流路１８ａ、１８ｂは、それぞれインレット１４ａ、１４ｂへ接続されており、また拡大流路１７はアウトレット１５、１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、２３へ接続されている。
【００３４】
流路１３の全体の長さ、つまり、インレット１４ａ、１４ｂのある一方の端から、アウトレット１５、２３のあるもう一方の端までの長さは１μｍ以上の任意の値に設定することが可能であるが、流路作製の容易さと圧力損失の観点から数μｍ〜数十ｍｍ程度に設定することが好ましい。
【００３５】
また狭窄流路１６、拡大流路１７の長さは、１０ｎｍ以上の任意の値に設定することが可能であるが、流路作製の容易さと圧力損失の観点からサブミクロン〜数十ｍｍ程度に設定することが好ましい。また、粒子の整列を達成する観点から、長さの下限が１００ｎｍ以上であることが好ましく、１μｍ以上がさらに好ましく、長さの上限が１０ｍｍ以下であることが好ましく、５００μｍ以下がさらに好ましい。
【００３６】
狭窄流路１６の流路幅は、内壁１６ａの壁面に対して垂直方向の流路の長さをいう。狭窄流路１６の流路幅は、拡大流路１７の幅未満であるという条件を満たす限り、１０ｎｍ以上の任意の値に設定することが可能である。また、粒子の整列を達成する観点から、流路幅の下限が１００ｎｍ以上であることが好ましく、５００ｎｍ以上がさらに好ましい。また流路幅の上限は１００μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以下がさらに好ましい。
【００３７】
また、流路内部における流量条件を達成するための導入量の調節方法として、導入口からシリンジポンプ等を用いて溶液を導入することが操作上簡便であり好ましいが、ペリスタポンプ等の他のポンプを用いる手法、ボンベ、圧力装置等を用いた定圧送液方法、液面差を用いる方法、電気浸透流や遠心力等を用いた送液方法などを用いることも可能である。また、アウトレットから陰圧を付す圧力装置を用いることもできる。
【００３８】
なお、粒子の安定的かつ効率的な分離を達成するためには、流路内で安定な層流が保たれることが望ましく、具体的には、レイノルズ数が２３００以下になる条件下で送液操作を行うことが好ましく、１０００以下になる条件がさらに好ましい。
【００３９】
また分岐流路１８ａ、１８ｂの幅は、それぞれが同じ幅である必要はなく、またそれぞれ１０ｎｍ以上の任意の値に設定することが可能である。なお、分岐流路は２つ以上あってもよい。
【００４０】
分離を行う粒子としては、直径１００ｎｍ〜５μｍの蛍光ポリスチレンビーズを用いたが、目的に応じて、ポリスチレン等のポリマー粒子、金属微粒子、セラミックス粒子、またはそれらの表面に物理的あるいは化学的な処理を施した粒子を用いることができる。また、本発明の粒子分離装置では、粒子にかかる外圧や変形を及ぼす力が少ないため、従来の分離方法であるフィルターなどでは、破裂や破壊が生じてしまう微粒子や細胞、その構成要素であるオルガネラなどの生物粒子、ウイルス、細菌、エクソソーム等の細胞外小胞、タンパク質、タンパク質凝集体を処理できる、という優れた効果を発揮する。分級対象とする粒子の最大直径は流路１３における狭窄流路１６の幅以下であれば、任意の大きさの粒子を分離することができる。例えば、狭窄流路１６の幅が１００ｎｍ〜１０μｍである流路を用いる場合、分離される粒子の直径は、１ｎｍ〜９．９μｍであり、５ｎｍ〜９μｍがさらに好ましく、１０ｎｍ〜５μｍが最も好ましい。
【００４１】
粒子を懸濁させた流体としては、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０水溶液を用いたが、任意の液体または気体を用いることができ、目的に応じて様々な溶液を用いることができる。例えば、粒子としてポリマー粒子や金属粒子を用いる場合には、各種化学物質を含む水溶液の他、有機溶液、イオン性流体等を用いることができる。さらに、粒子として細胞等の生物粒子を用いる場合には、細胞培養液や生理緩衝液などの細胞と等張の水溶液を用いるのが好ましい。ただし、例えばバクテリアや植物細胞のような比較的低張あるいは高張溶液に対し耐性をもつ細胞の場合には、必ずしも等張である必要はない。また、操作の都合上、溶液の密度と粒子の密度の差が大きくない系がより好ましい。サンプル液、シース液の粘度に関しては、これらの粘度における差が小さい系がより好ましいが、粒子の処理を可能とするシステムであれば、粘度に差があってもよい。なお、粒子を含む流体と粒子を含まない流体は、どちらも同じ流体から構成されていてもよく、また、それぞれ２種類以上の異なる流体から構成されていてもよい。
【００４２】
流路１３内に導入された粒子は、流れに乗って下流方向に移動するが、この時、２つのインレット１４ａ、１４ｂから導入された流体の流量を適切に調節することで、流路１３における狭窄流路１６において、内壁１６ａの壁面に対して垂直方向における粒子の位置を粒子の大きさによって制御することができる。このように壁面に対して整列された粒子は、壁面に沿って滑流する。粒子が壁面に沿って滑流するとは、粒子が壁面付近を流れることをいい、必ずしも壁面に接触していることを意図するものではない。また、粒子は壁面付近で回転や跳躍する場合も含まれるものとする。サンプル液とシース液の流量は、粒子を狭窄流路のサンプル液側の壁面１６ａへ整列させる観点で、シース液流量の方が大きい方が好ましく、２倍以上大きい方がさらに好ましく、１０倍以上大きい場合が最も好ましい。
【００４３】
狭窄流路１６と拡大流路１７が接続する構造は、図３に示すように拡大開始点で、流路幅が段状に拡大してもよいし、図６に示すように流路幅が徐々に拡大するように構成してもよい。流路幅が徐々に拡大する場合、拡大流路の壁面１７ｂが直線を描くように拡大して、スロープ４０を形成してもよいし、曲線を描くように拡大してもよい。拡大流路１７の流路幅が、段状に拡大するか又は直線的に拡大する場合、狭窄流路の壁面１６ａ、１６ｂと、当該壁面に続く拡大流路１７の壁面１７ａ、１７ｂとの間の角度２４ａ、２４ｂにより、拡大流路を規定することができる。例えば、段状に拡大する場合の角度２４ａ、２４ｂは９０°である。拡大流路１７の壁面が、徐々に直線的に拡大する場合、角度２４ａ、２４ｂは、９０°〜１８０°で表される。拡大流路の壁面は、狭窄流路の流路幅に比較して拡大していればよい。壁面１７ｂが段状に拡大している場合や、その角度２４ｂが９０°に近い場合に、角度２４ａは１８０°を超えてもよく、例えば２１０°、２２５°であってもよい（図１２）。一の態様では、拡大領域の壁面の角度２４ａ、２４ｂは、独立に９０°〜１８０°の間の任意の角度をとることができ、一例として、１２０°、１３５°、１５０°、１８０°をとることができる。別の態様において、狭窄流路壁面１６ｂに対する拡大流路壁面１７ｂの角度２４ｂは９０°またはそれ未満の場合であっても、それが部分的な構造で、実質的には徐々に拡大していくような構造であれば、大半の流体は徐々にアウトレット２３の方向へ流れることから、渦流の影響はほとんど受けないため、このような構造を用いてもよい（図１１ａを参照）。また別の実施形態において、例えば図６（ａ）〜（ｃ）で示される粒子分離装置を用いる場合に、粒子の分離が良好に行われる限り、狭窄流路壁面１６ｂに対する拡大流路壁面１７ｂの角度２４ｂは９０°またはそれ未満であってもよい。一例として、６５°以上９０°未満であり得る。拡大流路の壁面１７ｂが曲線を描くように拡大する場合、渦流を防止する観点から、拡大開始点におけるその接平面が、狭窄流路の壁面と一致することが好ましい。
【００４４】
本発明の特徴は、上述のマイクロチップ１０などの粒子分離装置において、拡大流路１７の壁面のうち、狭窄流路１６における粒子が滑流する壁面１６ａ側に向けて流路幅は拡大せず、狭窄流路１６における粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて流路幅が拡大することを特徴としている。粒子が滑流する壁面側に向けて流路幅が拡大しない観点から、角度２４ａ、２４ｂのうち、粒子が滑流する壁面側の角度２４ａは１８０°又はそれ以上（最大で２７０°未満）であり、好ましくは１８０°である一方で、もう一方の壁面の角度２４ｂは６５°〜１８０°の任意の角度、例えば６５°、９０°、１１２°、１２０°、１２４°、１３５°、１５０°、１８０°である。このように構成することにより、狭窄流路の出口と拡大流路の入り口部分での渦流の発生を抑制することができる。
【００４５】
拡大流路の壁面１７ａや１７ｂは、図８（ｄ）、図１１（ａ）−（ｃ）点線部に示すように、壁面１７ａや１７ｂに対して垂直方向に凹部や凸部があったとしても、これが流体中の粒子の流れへ大きく影響しないのであれば、凹部や凸部が存在しても分離に影響はない。またマイクロチップ１０の製造上の欠陥の様な不規則な形状を持つものであっても、同様に流体中の粒子の流れへ大きく影響しないのであれば、そのような構造をとっても問題はなく、そのような構成を排除するものではない。
【００４６】
狭窄流路１６において粒子が滑流する壁面１６ａを、サンプル液側狭窄流路壁面１６ａと言うこともでき、狭窄流路１６における粒子が滑流しない壁面１６ｂを、シース液側狭窄流路壁面１６ｂと言うこともできる。また、サンプル液側狭窄流路壁面１６ａ側の拡大流路壁面を、サンプル液側拡大流路壁面１７ａ、またシース液側狭窄流路壁面１６ｂ側の拡大流路壁面をシース液側拡大流路壁面１７ｂということができる。
【００４７】
また、狭窄流路壁面と拡大流路壁面は、それぞれ直線同士で結合しているものを図１に示したが、何れか一方または両方が曲線であってもよい。ただし、前記狭窄流路と拡大流路の壁面の接続構造は、サンプル液側、シース液側壁面共に効果が十分見られるものの、粒子をサンプル液側に整列させるＰＦＦの原理からも推察されるように、粒子が滑流する壁面を直線的に接続する方が、より精度よく粒子分離が可能となり、さらにシース液側壁面の構造を前述の通り改良することで、さらに粒子の分離精度があがる。
【００４８】
ドレイン流路２２は、ＡｓＰＦＦにより粒子を分離する場合に用いてもよく、拡大流路１７へ流れる流体の少なくとも一部がドレイン流路２２へ流れるよう、ドレイン流路の幅、高さ、長さを設計することが好ましい。さらに好ましくは同程度の流体がドレイン流路２２へ流れるよう設計することが好ましく、２倍以上の流体が流れるよう設計することが最も好ましい。
【００４９】
また、図３に示したドレイン流路２２は、狭窄流路１６中を流体が流れていく方向に対して、垂直な方向に設計したものを示しているが、平行な方向に設計してもよく、任意の角度に設定してもよい。ドレイン流路を、狭窄流路１６中を流体が流れていく方向に対して、垂直方向のシース液側壁面１７ｂに設計する場合、拡大流路の拡大開始点にドレイン流路を配置してもよいし（図３（ｃ））、ドレイン流路を拡大開始点からは離して配置してもよい（図６（ｃ））。平行な方向に設計した場合、狭窄流路１６中を高流速で流れてきた粒子が、拡大領域で低流速に急激に変化するため、慣性力の影響で粒子はその質量に応じた力を受ける。この時、この慣性力により整列したはずの粒子の位置がばらつき、分離の精度が悪くなる。従って、ドレイン流路２２は、狭窄流路１６中を流体が流れていく方向に対して、垂直な方向に設計したものがより好ましい。
【００５０】
以下、添付の書類に基づいて、本発明による連続粒子分級方法の実施の形態を詳細に説明するものとする。
【実施例】
【００５１】
製造実施例：粒子分離装置の製造
本発明による連続分級方法の実施形態を備えたマイクロチップ１０は、一般的なフォトリソグラフィーとソフトリソグラフィー技術を用いて作製した。具体的な手順を以下の通り示す。
４インチベアシリコンウェハ（株式会社フィルテック）上へ、フォトレジストＳＵ−８  ３００５（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を滴下後、スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ社）を用いてフォトレジスト薄膜を形成した。マスクアライナー（ウシオ電機社）と、任意のパターンを形成したクロムマスクを用いて流路パターンをフォトレジスト膜へ形成し、ＳＵ−８Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を用いて流路パターンを現像することで、用いたい流路の鋳型を作製した。
続いて、作製した鋳型へ、ＳＹＬＧＡＲＤ  ＳＩＬＩＣＯＮＥ  ＥＬＡＳＴＯＭＥＲ  ＫＩＴ（東レ・ダウコーニング社）を用いて調整した未硬化のシロキサンモノマーと重合開始剤の混合物（重量比１０：１）を流し込み、８０℃で２時間加熱することで、流路の形状を転写されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を作製した。硬化したＰＤＭＳを鋳型から慎重に剥がし、カッターで任意の大きさに成形後、パンチャーを用いて流路の入り口側ポート、アウトレットを形成した。剥離したＰＤＭＳとスライドガラス（松浪ガラス社）を酸素プラズマ発生装置（メイワフォーシス社）で表面処理後、ＰＤＭＳとスライドガラスを貼り合わせることでマイクロチップを作製した。
【００５２】
分離観察実施例：粒子の分離及び蛍光画像の取得
製造実施例に記載の手順で作製したマイクロチップを用いて、直径０．２μｍ及び直径０．５μｍの粒子を用いて分離を検証した。０．２μｍ粒子として、蛍光ポリスチレンビーズＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅＤＧ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製；吸収極大波長４８０ｎｍ、蛍光極大波長；５２０ｎｍ）、０．５μｍ粒子として蛍光ポリスチレンビーズＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅＢＢ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製；吸収極大波長３６０ｎｍ、蛍光極大波長；４０７ｎｍ）を用いた。分離対象の粒子を含有する流体１００Ｐとしては、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０水溶液を用い、直径０．２μｍの蛍光ポリスチレン粒子を３．３ｎｇ／ｍＬ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子を７．５ｎｇ／ｍＬになるように調製した。分離対象の粒子を含有しない流体１００Ｎとしては０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０水溶液を用いた。ここで、用いた０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０水溶液は実験前にポアサイズ０．４５μｍのシリンジフィルター（メルクミリポア社製）を用いて異物除去を行ってから用いた。シリンジポンプ（ＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により流量を調節し、流体１００Ｐをインレット１４ａから、流体１００Ｎをインレット１４ｂから、それぞれ５、９０μL／ｈの流量で送液した。なお、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用した。各流体をマイクロチップ１０に導入し、導入しながら、それぞれ対応する波長の光で別々に蛍光画像を取得した。蛍光画像は、倒立型顕微鏡ＩＸ７１（オリンパス社）を用いて水銀ランプで所定の励起光を観察領域へ照射し、デジタルＣＭＯＳカメラＯＲＣＡ−ＦＬＡＳＨ（浜松ホトニクス社）で画像取得エリア３０を２秒間にわたり撮影することで取得した。０．２μｍの粒子及び０．５μｍの粒子でそれぞれ蛍光画像を作成後、検出ライン２０の蛍光プロファイルを解析した。蛍光プロファイルの横軸は検出ライン２０上の座標であり、縦軸は座標ごとの相対蛍光輝度を示している。なお、検出ライン２０は分岐点３１からアウトレット１５の方向へ２００μｍ下流地点に設定し、座標０を拡大領域壁面１７ａ側とした。また画像取得エリア３０は検出ライン２０が取得画像内に収まるよう設定した。
【００５３】
実施例１：粒子が滑流する壁面１６ａ側に向けて流路幅は拡大せず、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて、段状に流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大開始点１９にドレイン流路が配置された粒子分離装置
図３（ａ）〜（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作成した。図３（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図３（ｂ）におけるＡ矢視図である。図３（ｂ）は図３（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり、図３（ｃ）は図３（ａ）における領域２１の拡大図である。
基板１１の下面１１ａには、基板１２を重ね合わせた際に流路１３を形成するように、加工を行った。流路１３の深さはすべて３．５μｍとした。流路１３の端部に、基板１１の上面に貫通するインレット１４ａ、１４ｂ、アウトレット１５、２３（それぞれ穴の径１．５ｍｍ）を設けた。また流路１３は、分岐流路１８ａ（幅２０μｍ、長さ１．５ｍｍ）、分岐流路１８ｂ（幅４０μｍ、長さ５００μｍ）、狭窄流路１６（幅３．３μｍ、長さ２０μｍ）、拡大流路１７（幅２１５μｍ、長さ６．１５ｍｍ）、ドレイン流路２２（幅３００μｍ、長さ１．３ｍｍ）の流路からなった。
【００５４】
上述の図３（ａ）〜（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を用いて、分離観察実施例にしたがって、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像を得た（図３（ｄ）及び（ｅ））。直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０における蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図３（ｆ）、図３（ｇ）に示す。これらの結果から直径０．２、０．５μｍの粒子がほぼ完全に分離している様子が確認できた。
【００５５】
比較例１：粒子が滑流する壁面１６ａ側に向けて流路幅が段状に拡大し、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて、段状に流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大開始点１９にドレイン流路が配置された粒子分離装置
図４（ａ）〜（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例１のマイクロチップ１０と比較して、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａ、２４ｂが９０°で、狭窄流路壁面１６ａから拡大流路壁面１７ａまでの幅が５０μｍとなる点のみが実施例２と異なるよう設計したものを用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ５、８０μＬ／ｈとなるよう設定した点以外は実施例１と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例１と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
【００５６】
直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図４（ｄ）、図４（ｅ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図４（ｆ）、図４（ｇ）に示す。これらの結果から、本比較例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離は、部分的に重複が見られるため、性能が実施例１と比べて劣っていることがわかる。
【００５７】
比較例２：粒子が滑流する壁面１６ａ側に向けて段状に流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大開始点１９にドレイン流路２２が配置され、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて流路幅は拡大しない粒子分離装置
図５（ａ）〜（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例１のマイクロチップ１０と比較して、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａが９０°、２４ｂが１８０°となるよう設計した点以外は実施例１と同様のマイクロチップ１０を用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ５、８０μL／ｈとなるよう設定した点以外は実施例１と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例１と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。また、角度２４ａを９０°、２４ｂを１８０°としたため、拡大流路１７が狭窄流路に対して垂直方向に、ドレイン流路２２が狭窄流路に対して平行方向に位置する流路構造をもつマイクロチップ１０を用いた。つまり、本比較例は実施例１の狭窄流路１６と拡大流路１７の接続部分の構造を、上下反転したもので比較を行っているものである。ここで、拡大流路１７を狭窄流路１６に対して平行方向に、つまり実施例１と同じ方向に配置し、ドレイン流路２２が垂直方向で、実施例１とは上下反転した位置に配置した流路構造とした場合、大半の流体が流れるドレイン流路２２へ粒子が流れた。すなわち、この配置の場合、ドレイン流路２２による分離能向上の効果を得ることが出来なかった。そこで、実施例１と同じ粒子分離能をもつ流路構造とするため、図５（ａ）〜（ｃ）に示す流路構造とした。
【００５８】
直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図５（ｄ）、図５（ｅ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図５（ｆ）、図５（ｇ）に示す。これらの結果から、本比較例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離は、部分的に重複が見られ、性能が実施例１と比べて大きく劣り、比較例１と比べても劣っていることがわかる。
【００５９】
実施例２：粒子が滑流する壁面１６ａ側に向けて流路幅は拡大せず、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて、徐々に流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大終了点にドレイン流路２２が配置された粒子分離装置
図６（ａ）〜（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例１のマイクロチップ１０と比較して、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａが１８０°、２４ｂが１３５°で、拡大領域のスロープ部分４０の長さが１／√２ｍｍで、アウトレット１５と２３へ流れる流体の比が実施例１と同等になるよう、ドレイン流路の長さを５００μｍとした点以外は実施例２と同じ構造をもつマイクロチップ１０を用い、また、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ３、９０μＬ／ｈとなるよう設定した点以外は実施例１と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例１と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
【００６０】
直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図６（ｄ）、図６（ｅ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図６（ｆ）、図６（ｇ）に示す。これらの結果から、本実施例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離は、完全な分離が確認でき、分離性能が実施例１よりも優れていることがわかる。
【００６１】
比較例３：粒子が滑流する壁面１６ａ側に向けて徐々に流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大終了点にドレイン流路２２が配置され、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて流路幅は拡大しない、粒子分離装置
図７（ａ）〜（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例２のマイクロチップ１０と比較して、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａが１３５°、２４ｂが１８０°となるよう設計した点以外は実施例２と同様のマイクロチップ１０を用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ３、９５μＬ／ｈとなるよう設定した点以外は実施例３と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例２と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。また、角度２４ａを１３５°、２４ｂを１８０°としたため、拡大流路１７が狭窄流路１６に対して垂直方向に、ドレイン流路２２が狭窄流路１６に対して平行方向に位置する流路構造をもつマイクロチップ１０を用いた。つまり、本比較例は実施例２の狭窄流路１６と拡大流路１７の接続部分の構造を、上下反転したもので比較を行っているものである。ここで、拡大流路１７を狭窄流路１６に対して平行方向に、つまり実施例２と同じ方向に配置し、ドレイン流路２２が垂直方向で、実施例１とは上下反転した位置に配置した流路構造とした場合、大半の流体が流れるドレイン流路２２へ粒子が流れることになった。すなわち、この配置の場合、ドレイン流路２２による分離能向上の効果を得ることが出来なかった。そこで、実施例２と同じ粒子分離能をもつ流路構造とするため、図７（ａ）〜（ｃ）に示す流路構造とした。
【００６２】
直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図７（ｄ）、図７（ｅ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図７（ｆ）、図７（ｇ）に示す。これらの結果から、本比較例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離は、不完全なものであることが確認でき、分離性能が実施例２よりも劣っていることがわかる。
【００６３】
実施例３：実施例２の粒子分離装置のスロープ部分４０に、凹部を有する粒子分離装置
図８（ａ）〜（ｄ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。このマイクロチップ１０は、実施例２とほぼ同じ構造であるが、拡大領域のスロープ部分４０の一部には、狭窄流路１６と拡大流路１７の接続部分の拡大図を示す図８（ｄ）に示すように、シース液側狭窄流路壁面１６ｂとスロープ部分４０との間に、流路壁面４１ａ、４１ｂ（共に長さ５０μｍ）により構成される部分的な凹部をもつマイクロチップ１０を用い、その他の実験条件は実施例３と同じになるよう設定し、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例２と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
【００６４】
直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図８（ｅ）、図８（ｆ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図８（ｇ）、図８（ｈ）に示す。これらの結果から、本比較例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離は、完全な分離が確認でき、分離性能が実施例２とほぼ同等であることがわかる。
【００６５】
ここまでの結果から、シース液側の狭窄流路壁面１６ｂと拡大流路壁面１７ｂとの角度２４ｂは、９０°よりも大きくすることが好ましいといえるが、たとえ９０°、またはそれ以下の角度であっても、それが部分的な凹部構造であって、かつその凹部構造が拡大流路やドレイン流路の幅よりも小さいのであれば、ＰＦＦによる粒子分離の観点からいえば、実質的にはシース液側の狭窄流路壁面１６ｂの下流側にスロープ部分４０のみが存在する場合と流体の流れはほぼ等価であるとみなすことができ、同等の分離性能を発揮できるといえる。
【００６６】
実施例４：実施例２の粒子分離装置の狭窄流路幅、流路１３の深さを変更した粒子分離装置
狭窄流路１６の幅を２μｍ、流路１３の深さを２μｍへ変更した点以外は同じ構造をもつマイクロチップ１０を粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。このマイクロチップ１０を用いて、０．１と０．２μｍ粒子の分離を検証した。分離する粒子としては、直径０．２μｍの蛍光ポリスチレンビーズＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅＤＧ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製；吸収極大波長４８０ｎｍ、蛍光極大波長；５２０ｎｍ）と、直径０．１μｍの蛍光ポリスチレンビーズＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅＢＢ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製；吸収極大波長３６０ｎｍ、蛍光極大波長；４０７ｎｍ）を用い、直径０．２μｍの蛍光ポリスチレン粒子は３．３ｎｇ／ｍＬに希釈し、直径０．１μｍの蛍光ポリスチレン粒子は６７ｎｇ／ｍＬに希釈し実験に用いた。また、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ０．５、７５μＬ／ｈとなるよう設定した。なお、実施例２と同様に各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
【００６７】
直径０．１μｍ、直径０．２μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図９（ａ）、図９（ｂ）に示す。直径０．１μｍの粒子がアウトレット１５へ流れる拡大流路１７へ、０．２μｍの粒子がアウトレット２３へ流れるドレイン流路２２へそれぞれ流れる様子を観察し、１００ｎｍ程度の微小な粒子においても、本発明記載の内容で分離、回収可能であることを確認した。
【００６８】
実施例５：拡大流路壁面１７ａが１７ｂへ向けて縮小し、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて、段状に流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大開始点１９にドレイン流路が配置された粒子分離装置
図１２（ａ）〜（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例１のマイクロチップ１０と比較して、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａが２１０°、２４ｂが９０°となるよう設計した点以外は実施例２と同様のマイクロチップ１０を用い、送液ポンプとしてプレッシャーポンプＰ−ＰｕｍｐＢａｓｉｃ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社）を用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ１０９０、１２００ｍｂａｒとなるよう設定した点以外は実施例２と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例２と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
【００６９】
直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図１２（ｄ）、図１２（ｅ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図１２（ｆ）、図１２（ｇ）に示す。これらの結果から、本実施例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離が可能であることが確認できた。本結果から、拡大流路壁面１７ａは拡大させないことが好ましいことが示唆された。
【００７０】
比較例４：拡大流路壁面１７ａ、１７ｂが共に拡大し、かつ拡大流路１７の拡大終了点にドレイン流路２２が配置された粒子分離装置
図１３（ａ）〜（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例１のマイクロチップ１０と比較して、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａ、２４ｂが１６５°となるよう設計した点以外は実施例２と同様のマイクロチップ１０を用い、送液ポンプとしてプレッシャーポンプを用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ１０７０、１２００ｍｂａｒとなるよう設定した点以外は実施例２と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例２と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
【００７１】
直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図１３（ｄ）、図１３（ｅ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図１３（ｆ）、図１３（ｇ）に示す。これらの結果から、本比較例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離が不完全であることが確認できた。本結果からも、拡大流路壁面１７ａは拡大させないことが好ましいことが示唆された。
【００７２】
実施例６：粒子が滑流する壁面１６ａ側に向けて流路幅は拡大せず、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて、流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大終了点にドレイン流路２２が配置された粒子分離装置における、角度２４ｂが及ぼす分離性能への影響評価
マイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例１のマイクロチップ１０と比較して、流路１３の深さをすべて３．２μｍ、狭窄流路１６の幅を３．０μｍとし、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａを１８０°、角度２４ｂをθとした場合に、拡大領域のスロープ部分４０の長さを２１２／ｔａｎθμｍとなるよう設計し、アウトレット１５と２３へ流れる流体の比が実施例１と同等になるよう設計した。また、送液ポンプとしてプレッシャーポンプＰ−ＰｕｍｐＢａｓｉｃ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社）を用いてサンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ５、９０μＬ／ｈとなるよう設定した点以外は実施例１と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。本実施例では、角度２４ｂを６５°、９０°、１１２°、１２４°、１３５°へと変更した場合の直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離性能評価をＲｓ値により行った。
【表１】
2019136691.tif 000003
Ｒｓ値は、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフにおいて、直径０．２μｍ蛍光ポリスチレン粒子のピーク位置をＰ（０．２）、ピーク幅の半値をｗ（０．２）、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子ピーク位置をＰ（０．５）、ピーク幅の半値をｗ（０．５）、ピーク幅とした場合にＲｓ＝（Ｐ（０．５）―Ｐ（０．２））／（ｗ（０．２）＋ｗ（０．５））で表されるものとし、値が大きいほど分離性能が高いことを示すこととする。
【００７３】
各角度２４ｂにおける直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像、検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフを図１４〜図１８に示す。また各角度２４ｂにおけるＲｓ値を表１に示す。角度２４ｂが大きくなるにつれて分離性能が高くなることがわかる。
【符号の説明】
【００７４】
１０    マイクロチップ
１１    基板
１１ａ    基板下面
１２    基板
１３    流路
１４ａ、１４ｂ    インレット
１５    アウトレット
１５ａ、１５ｂ、１５ｃ    アウトレット
１６    狭窄流路
１６ａ    サンプル液側狭窄流路壁面
１６ｂ    シース液側狭窄流路壁面
１７    拡大流路
１７ａ    サンプル液側拡大流路壁面
１７ｂ    シース液側狭拡大路壁面
１８ａ、１８ｂ    分岐流路
１９    拡大開始点
２０    検出ライン
２１    領域
２２    ドレイン流路
２３    アウトレット
２４ａ、２４ｂ    角度
３０    画像取得エリア
３１    分岐点
４０    スロープ部分
４１ａ、４１ｂ    流路壁面
１００Ｐ    流体
１００Ｎ    流体
【図１】
2019136691.tif 000004
【図２】
2019136691.tif 000005
【図３ａ−ｃ】
2019136691.tif 000006
【図３ｄ−ｇ】
2019136691.tif 000007
【図４ａ−ｃ】
2019136691.tif 000008
【図４ｄ−ｇ】
2019136691.tif 000009
【図５ａ−ｃ】
2019136691.tif 000010
【図５ｄ−ｇ】
2019136691.tif 000011
【図６ａ−ｃ】
2019136691.tif 000012
【図６ｄ−ｇ】
2019136691.tif 000013
【図７ａ−ｃ】
2019136691.tif 000014
【図７ｄ−ｇ】
2019136691.tif 000015
【図８ａ−ｄ】
2019136691.tif 000016
【図８ｅ−ｈ】
2019136691.tif 000017
【図９】
2019136691.tif 000018
【図１０】
2019136691.tif 000019
【図１１】
2019136691.tif 000020
【図１２ａ−ｃ】
2019136691.tif 000021
【図１２ｄ−ｇ】
2019136691.tif 000022
【図１３ａ−ｃ】
2019136691.tif 000023
【図１３ｄ−ｇ】
2019136691.tif 000024
【図１４】
2019136691.tif 000025
【図１５】
2019136691.tif 000026
【図１６】
2019136691.tif 000027
【図１７】
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【図１８】
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