(57)【要約】【課題】外因性オピオイドペプチドを分解する酵素を提供する。【解決手段】外因性オピオイドペプチドを分解する、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物由来のペプチダーゼに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性オピオイドペプチドを分解する、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物由来のペプチダーゼ。
【請求項２】
外因性オピオイドペプチドがＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｐｒｏ−Ｘ３のアミノ酸配列を有し、ここで、
Ｘ１はＰｈｅ、またはＧｌｎであり、
Ｘ２はＧｌｙ、またはＧｌｎであり、
Ｘ３はＩｌｅ、またはＰｈｅである、
請求項１に記載のペプチダーゼ。
【請求項３】
外因性オピオイドペプチドが、β−カゾモルフィン７、β−カゾモルフィン５、またはグリアドルフィンである、
請求項１または２に記載のペプチダーゼ。
【請求項４】
外因性オピオイドペプチド中のＰｒｏのＮ末端側を切断する、
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチダーゼ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチダーゼを含む、外因性オピオイドペプチド分解酵素剤。
【請求項６】
乳製品原料に請求項５に記載の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤を添加することにより、外因性オピオイドペプチドの含有量を低減させる工程を含む、乳製品の製造方法。
【請求項７】
麦加工食品原料に請求項５に記載の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤を添加することにより、外因性オピオイドペプチドの含有量を低減させる工程を含む、麦加工食品の製造方法。
【請求項８】
麦加工食品がパンである、請求項７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外因性オピオイドペプチドを分解する、ストレプトマイセス属由来のペプチダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
オピオイドペプチドは、脳内のオピオイド受容体に結合する短いアミノ酸配列である。オピオイドペプチドは体内で生産されるほか、食品の部分分解物としても体内に吸収される。食品に由来する外因性オピオイドペプチドとして、乳製品に由来するβ−カゾモルフィン、グルテン由来のグリアドルフィンが知られている。β−カゾモルフィンやグリアドルフィンがオピオイド受容体に結合すると、自閉症などの精神疾患や、脳機能障害が進行する。特に小児は体内でβ−カゾモルフィンやグリアドルフィンを分解することができない。食品による精神疾患や脳機能障害のリスクを低減するために、食品中に含まれるオピオイドペプチドを低減することが求められている。
【０００３】
特許文献１は、乳酸菌由来のＸ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼを乳タンパク質に作用させることにより、乳タンパク中のβ−カゾモルフィンを低減したことを記載している。当該酵素は、プロリン残基のＣ末端側のペプチド結合を切断し、Ｎ末端側からジペプチドを遊離している。
【０００４】
特許文献２は、ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物、またはアスペルギルス・メレウスからの酵素調製物により小麦グルテン由来のグリアドルフィン、およびカゼイン由来のカゾモルフィンを分解したことを記載している。ただし、グリアドルフィン、およびカゾモルフィンをほぼ完全に分解するためには、これら３種の酵素剤、およびパパインを混合して使用する必要がある。また、オピオイドペプチドの分解様式は不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１７−４６６６０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１３／０４７０８２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
食品に由来する外因性オピオイドペプチドを分解する酵素を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、検討の結果、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物由来のペプチダーゼが外因性オピオイドペプチドを分解できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、外因性オピオイドペプチドを分解する、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物由来のペプチダーゼに関する。
【０００９】
外因性オピオイドペプチドは、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｐｒｏ−Ｘ３のアミノ酸配列を有し、ここで、
Ｘ１はＰｈｅ、またはＧｌｎであり、
Ｘ２はＧｌｙ、またはＧｌｎであり、
Ｘ３はＩｌｅ、またはＰｈｅであることが好ましい。
【００１０】
外因性オピオイドペプチドが、β−カゾモルフィン７、β−カゾモルフィン５、またはグリアドルフィンであることが好ましい。
【００１１】
外因性オピオイドペプチド中のＰｒｏのＮ末端側を切断することが好ましい。
【００１２】
また、本発明は、前記ペプチダーゼを含む、外因性オピオイドペプチド分解酵素剤に関する。
【００１３】
また、本発明は、乳製品原料に前記外因性オピオイドペプチド分解酵素剤を添加することにより、外因性オピオイドペプチドの含有量を低減させる工程を含む、乳製品の製造方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、麦加工食品原料に前記外因性オピオイドペプチド分解酵素剤を添加することにより、外因性オピオイドペプチドの含有量を低減させる工程を含む、麦加工食品の製造方法に関する。前記麦加工食品は、パンであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のペプチダーゼは単独で、外因性オピオイドペプチドをほぼ完全に分解できる。また、本発明のペプチダーゼは外因性オピオイドペプチド中のＰｒｏ（プロリン）のＮ末端側を切断するという新規な性質を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１〜２および比較例１におけるＨＰＬＣの結果を示す。
【図２】実施例３〜４および比較例２におけるＨＰＬＣの結果を示す。
【図３】実施例５〜６および比較例３におけるＨＰＬＣの結果を示す。
【図４】実施例７〜８および比較例４におけるＬＣ−ＭＳの結果（吸光度）を示す。
【図５】実施例７〜８および比較例４におけるＬＣ−ＭＳの結果（イオン強度）を示す。
【図６】実施例９〜１０および比較例５におけるＬＣ−ＭＳの結果（吸光度）を示す。
【図７】実施例９〜１０および比較例５におけるＬＣ−ＭＳの結果（イオン強度）を示す。
【図８】実施例１１〜１２および比較例６におけるＬＣ−ＭＳの結果（吸光度）を示す。
【図９】実施例１１〜１２および比較例６におけるＬＣ−ＭＳの結果（イオン強度）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、外因性オピオイドペプチドを分解する、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物由来のペプチダーゼに関する。以下に、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
＜外因性オピオイドペプチド＞
外因性オピオイドペプチドは、脳内のオピオイド受容体に結合するペプチドのうち、食品の部分分解物として体内に吸収されるものを指す。外因性オピオイドペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて下記のアミノ酸配列（１）を有するものであることが好ましい。
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｐｒｏ−Ｘ３  （１）
【００１９】
アミノ酸配列（１）において、Ｘ１はＰｈｅ、Ｇｌｎが好ましい。Ｘ２はＧｌｙ、Ｇｌｎが好ましい。Ｘ３はＩｌｅ、Ｐｈｅが好ましい。
【００２０】
外因性オピオイドペプチドの前記配列（１）のＮ末端側には任意のアミノ酸配列が付加していてもよい。このようなアミノ酸配列としては、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕが挙げられる。Ｎ末端側に付加されるアミノ酸配列の長さは４アミノ酸以下であることが好ましく、２アミノ酸以下であることがより好ましく、１アミノ酸以下であることがさらに好ましい。外因性オピオイドペプチドの前記配列（１）のＣ末端側にも、任意のアミノ酸配列が付加していてもよく、付加されるアミノ酸配列およびその長さは、Ｎ末端側に付加されるアミノ酸配列と同様である。
【００２１】
外因性オピオイドペプチドの全長は４〜１１アミノ酸であることが好ましく、５〜９アミノ酸であることがより好ましく、７〜９アミノ酸であることがさらに好ましい。
【００２２】
外因性オピオイドペプチドの具体例としては、β−カゾモルフィン７、β−カゾモルフィン５、グリアドルフィン、グルテン−エキソルフィンＣ、が挙げられる。
【００２３】
β−カゾモルフィン７は、乳タンパク質であるカゼインに由来する外因性オピオイドペプチドであり、Ｎ末端からＣ末端にかけて下記のアミノ酸配列（２）を有する。
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ   （２）
【００２４】
β−カゾモルフィン５は、乳タンパク質であるカゼインに由来する外因性オピオイドペプチドであり、Ｎ末端からＣ末端にかけて下記のアミノ酸配列（３）を有する。
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ  （３）
【００２５】
グリアドルフィンは、小麦等のグルテンに由来する外因性オピオイドペプチドであり、Ｎ末端からＣ末端にかけて下記のアミノ酸配列（４）を有する。
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ  （４）
【００２６】
グルテン−エキソルフィンＣは、小麦等のグルテンに由来する外因性オピオイドペプチドであり、Ｎ末端からＣ末端にかけて下記のアミノ酸配列（５）を有する。
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ  （５）
【００２７】
＜ペプチダーゼ＞
本発明のペプチダーゼとしては、外因性オピオイドペプチド中のペプチド結合を加水分解できるものであれば特に限定されないが、エキソペプチダーゼ、エンドペプチダーゼが挙げられる。エキソペプチダーゼとしては、エキソアミノペプチダーゼ、エキソカルボキシペプチダーゼが挙げられる。この中でもＰｒｏのＮ末端側で切断されたペプチドを遊離させるペプチダーゼが好ましい。
【００２８】
本発明のペプチダーゼは、外因性オピオイドペプチド中のＰｒｏのＮ末端側を切断するペプチダーゼであることが好ましい。ＰｒｏのＮ末端側を切断する本発明のペプチダーゼにより処理した場合、前記アミノ酸配列（２）を有するβ−カゾモルフィン７からはＴｙｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅのアミノ酸が遊離し、前記アミノ酸配列（３）を有するβ−カゾモルフィン５からはＴｙｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅのアミノ酸が遊離し、前記アミノ酸配列（４）を有するグリアドルフィンからはＴｙｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎのアミノ酸が遊離する。
【００２９】
本発明のペプチダーゼはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物に由来することを特徴とする。ストレプトマイセス属微生物としては、ストレプトマイセス  ビオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）、ストレプトマイセス  セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス  シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトマイセス  エバミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）などが挙げられ、なかでもストレプトマイセス  ビオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）が好ましい。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物由来のペプチダーゼの具体例として、デナチームＸＰＯ  ＤＵＥＴ（ナガセケムテックス株式会社製）および／またはデナチームＸＰＯ  ＤＵＥＴ  Ｈ（ナガセケムテックス株式会社製）が挙げられる。
【００３０】
＜外因性オピオイドペプチド分解酵素剤＞
本発明は、また、前記ペプチダーゼを含む、外因性オピオイドペプチド分解酵素剤に関する。外因性オピオイドペプチド分解酵素剤中の前記ペプチダーゼの含有量は限定されないが、外因性オピオイドペプチド分解酵素剤１ｇあたり、９０００Ｕ〜１７５０万Ｕであることが好ましく、１万Ｕ〜１５００万Ｕであることがより好ましく、５万Ｕ〜１２５０万Ｕであることが更に好ましく、１０万Ｕ〜１０００万Ｕであることが更により好ましく、１５万Ｕ〜７５０万Ｕであることが一層好ましく、１７．５万Ｕ〜５００万Ｕであることがより一層好ましく、１８．５万Ｕ〜２５０万Ｕであることが更に一層好ましく、１９．５万Ｕ〜２０５万Ｕであることが最も好ましい。ここで、前記ペプチダーゼの活性は、ペプチダーゼを合成ペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡに作用させ、生成ペプチドＰｒｏ−ｐＮＡを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量することにより、測定できる。酵素活性の単位は、１分間に０．００１μｍｏｌの生成ペプチドＰｒｏ−ｐＮＡを生成する酵素量を１Ｕとする。
【００３１】
本発明の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤は、ペプチダーゼのみで構成されていてもよいし、ペプチダーゼ以外に、本発明の効果を阻害しない程度において、酵素製剤が通常含有し得る他の成分を含有していてもよい。このような成分として、賦形剤、ｐＨ調整剤、保存料が挙げられる。
【００３２】
賦形剤としては、当業者が適宜選択し、必要に応じて複数種を組み合わせて用いることができる。賦形剤の例としては、例えば、デキストリンやトレハロースが挙げられるがこれに限定されない。
【００３３】
ｐＨ調整剤としては、例えば、アスコルビン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、乳酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、リンゴ酸、およびアジピン酸、ならびにこれらの有機酸のナトリウム（Ｎａ）塩、カルシウム（Ｃａ）塩、およびカリウム（Ｋ）塩ならびに炭酸、リン酸、およびピロリン酸、ならびにこれらの無機酸のＮａ塩およびＫ塩が挙げられる。
【００３４】
保存料としては、例えば、プロピオン酸、プロピオン酸塩、亜硫酸塩、安息香酸塩、ソルビン酸、ソルビン酸塩などが挙げられる。塩としては、ナトリウム（Ｎａ）塩、カルシウム（Ｃａ）塩、およびカリウム（Ｋ）塩などが挙げられる。
【００３５】
＜食品の品質改良組成物＞
本発明の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤を、必要に応じて、食品に許容される他の成分と組み合わせて、食品の品質改良組成物を製造することもできる。
【００３６】
食品の品質改良組成物に含まれ得る、外因性オピオイドペプチド分解酵素剤以外の成分としては、例えば、酵素、増粘多糖類、乳化剤、乳化剤と無機塩類との混合物、エキス類、糖質、甘味料、発酵風味料、卵、無機塩類などが挙げられる。食品の品質改良組成物に含有される外因性オピオイドペプチド分解酵素剤以外の成分の含有量は特に限定されず、当業者によって任意の量が選択され得る。
【００３７】
酵素としては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、グルカン１，４−α−マルトトリオヒドロラーゼ、グルカン１，４−α−マルトヘキサオヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ホスホリパーゼ、ガラクトリパーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ぺルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルタチオンデヒドロゲナーゼ、トランスグルタミナーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、β−グルカナーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、キチナーゼなどが挙げられる。
【００３８】
増粘多糖類としては、例えば、加工澱粉、ガム類、アルギン酸、アルギン酸誘導体、ペクチン、カラギーナン、カードラン、プルラン、ゼラチン、セルロース誘導体、寒天、タマリンド、サイリウム、グルコマンナンなどが挙げられる。
【００３９】
乳化剤としては、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、レシチン、酵素分解レシチン、サポニンなどが挙げられる。
【００４０】
エキス類としては、例えば、酵母エキス、モルトエキスなどが挙げられる。
【００４１】
糖質としては、例えば、グルコース、果糖などの単糖；砂糖、マルトース、イソマルトース、トレハロース、ラクトース、ラクツロース、セロビオースなどの二糖；マルトトリオース以上のマルトオリゴ糖、ラフィノース、パノース、スタキオース、グルコオリゴ糖、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、大豆オリゴ糖、ゲンチオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、ラクトスクロースなどの直鎖もしくは分岐オリゴ糖；異性化糖、水あめ、粉あめ、はちみつなどの糖混合物；澱粉、加工澱粉、デキストリン、水酸化ヘミセルロースなどの多糖；還元水あめ、マルチトール、ラクチトール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、パラチニット、エリスリトール、オリゴ糖還元物などの糖アルコールなどが挙げられる。二糖類、オリゴ糖類、澱粉、加工澱粉類、デキストリンは賦形剤としても用いられる。
【００４２】
甘味料としては、例えば、ステビア、アスパルテーム、グリチルリチン、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテームなどが挙げられる。
【００４３】
発酵風味料としては、乳酸菌発酵液、酵母発酵液などが挙げられる。
【００４４】
無機塩類としては、例えば、食塩、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、重合リン酸塩などが挙げられる。
【００４５】
食品の品質改良組成物の形状は特に限定されず、粉末状、顆粒状、液体状、ペースト状、固形状が挙げられる。
【００４６】
食品の品質改良組成物における外因性オピオイドペプチド分解酵素剤の含有量は特に限定されず、当業者によって任意の量が選択され得るが、０．１〜１０重量％が好ましく、０．５〜８重量％がより好ましく、１〜６重量％がさらに好ましく、１．５〜５重量％がさらにより好ましく、２〜３重量％が最も好ましい。
【００４７】
＜乳製品の製造方法＞
本発明の乳製品の製造方法は、乳製品原料に前記外因性オピオイドペプチド分解酵素剤または前記食品の品質改良組成物を添加することにより、外因性オピオイドペプチドの含有量を低減させる工程を含む。製造された乳製品では外因性オピオイドペプチドの含有量が低減されており、乳製品の摂取による精神疾患や脳機能障害のリスクを低減できる。
【００４８】
乳製品原料としては生乳、牛乳、成分調整牛乳、低脂肪牛乳、無脂肪牛乳、加工乳が挙げられる。
【００４９】
製造される乳製品としては牛乳、ヨーグルト、チーズ、バター、粉ミルク、ミルクジャムの練乳、クリームが挙げられる。
【００５０】
乳製品原料に対する外因性オピオイドペプチド分解酵素剤の含有量は、０．０１〜２．０重量％が好ましく、０．０２〜１．８重量％がより好ましく、０．０３〜１．５重量％がさらに好ましく、０．０４〜１．０重量％がさらにより好ましく、０．０５〜０．５％が最も好ましい。
【００５１】
外因性オピオイドペプチドの含有量を低減させる工程における温度は、２０〜４０℃が好ましく、２２〜３８℃がより好ましく、２４〜３７℃がさらに好ましく、２７〜３６℃がさらにより好ましく、３０〜３５℃が最も好ましい。
【００５２】
外因性オピオイドペプチドの含有量を低減させる工程におけるｐＨは、ｐＨ６．５〜９．５が好ましく、ｐＨ６．７〜９．３がより好ましく、ｐＨ６．９〜９．１がさらに好ましく、ｐＨ７．２〜８．８がさらにより好ましく、ｐＨ７．５〜８．５が最も好ましい。
【００５３】
＜麦加工食品の製造方法＞
本発明の麦加工食品の製造方法は、麦加工食品原料に前記外因性オピオイドペプチド分解酵素剤または前記食品の品質改良組成物を添加することにより、外因性オピオイドペプチドの含有量を低減させる工程を含む。製造された麦加工食品では外因性オピオイドペプチドの含有量が低減されており、麦加工食品の摂取による精神疾患や脳機能障害のリスクを低減できる。
【００５４】
麦加工食品の原料としては、小麦粉（薄力粉、中力粉、強力粉、全粒粉、グラハム粉など）、大麦（大麦粉、麦芽など）、ライ麦（ライ麦粉など）などが挙げられる。その他、麦加工食品に含まれ得る材料としては、イースト（例えば、生イースト、ドライイースト、インスタントドライイーストなど）、糖分（例えば、上白糖、グラニュー糖、三温糖、黒糖などの砂糖、異性化糖、粉飴、水あめ、糖アルコール、オリゴ糖、トレハロースなど）、食塩、乳成分（例えば、牛乳、クリーム、全粉乳、脱脂粉乳、乳タンパク質、濃縮乳など）、油脂（例えば、ショートニング、マーガリン、バター、液状油、乳化油脂など）、水、卵（全卵、卵黄、卵白、乾燥卵、凍結卵など）、ベーキングパウダーなどが挙げられる。
【００５５】
製造される麦加工食品としては、パン、洋菓子、麺類、醤油、味噌、マカロニ、餃子の皮、ピザ生地などが挙げられる。パンとしては、例えば、食パン、健康パン、菓子パン、ロールパン、フランスパン、蒸しパン、調理パン、コッペパン、フルーツブレッド、コーンブレッド、バターロール、バンズ、サンドイッチ、クロワッサン、デニッシュペーストリー、乾パン、ベーグルおよびプレッツェルが挙げられる。洋菓子としては、例えば、クッキー、ケーキなどが挙げられる。麺類としては、例えば、うどん、ラーメン、パスタ、マカロニなどが挙げられる。
【００５６】
麦加工食品原料に対する外因性オピオイドペプチド分解酵素剤の含有量、反応温度、反応ｐＨは、乳製品の製造方法に関して上述した内容と同じである。
【００５７】
麦加工食品としてパンを製造する際には、前記外因性オピオイドペプチド分解酵素剤または前記食品の品質改良組成物をパン生地またはパンに含有させる方法は特に限定されない。本発明の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤または食品の品質改良組成物は、パン製造の混捏工程の前、間または後のいずれにおいても、添加もしくは配合することができる。パン製造原料と外因性オピオイドペプチド分解酵素剤または食品の品質改良組成物とが混捏されることが好ましい。この場合、外因性オピオイドペプチド分解酵素剤または食品の品質改良組成物は、混捏前または間のいずれで添加してもよい。外因性オピオイドペプチド分解酵素剤または食品の品質改良組成物をパン製造原料のいずれかに直接加えてもよく、水などの液体に予め溶解させておいてパン製造原料に加えてもよい。また、外因性オピオイドペプチド分解酵素剤または食品の品質改良組成物は、パン製造原料の全体に加えて混合してもよいし、パン製造原料の一部分、例えば穀物粉に加えて混合した後に、その他のパン製造原料を加えて混合してもよい。例えば、本発明の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤または食品の品質改良組成物が粉末状の場合、粉体原料と粉末混合（好ましくは混合して篩がけする）してもよい。本発明の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤または食品の品質改良組成物は、必要に応じて糖と共に水に溶解（粉末状の場合）もしくは希釈（液状の場合）させてもよい。本発明の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤または食品の品質改良組成物は、必要に応じてマーガリンなどの油脂に予め配合もしくは分散溶解させてから、使用してもよい。製パン法としては特に限定されず、ストレート法、中種法など通常用いられるいずれの製パン法でもよい。
【実施例】
【００５８】
（実施例１〜２、比較例１）
ストレプトマイセス属微生物由来のペプチダーゼによる外因性オピオイドペプチド（β−カゾモルフィン７）の分解試験を行い、反応後の外因性オピオイドペプチドをＨＰＬＣにより解析した。
【００５９】
ペプチダーゼとしては、実施例１ではデナチームＸＰＯ  ＤＵＥＴ（ナガセケムテックス株式会社製）、実施例２ではデナチームＸＰＯ  ＤＵＥＴ  Ｈ（ナガセケムテックス株式会社製）を用いた。なお、デナチームＸＰＯ  ＤＵＥＴ  Ｈには、デナチームＸＰＯ  ＤＵＥＴと同種類の酵素および賦形剤が含まれるが、酵素濃度はデナチームＸＰＯ  ＤＵＥＴの約１０倍である。比較例１ではペプチダーゼを使用しなかった。
【００６０】
使用した外因性オピオイドペプチドは下記の通りである。
β−Ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ−７（Ｂｏｖｉｎｅ）
ペプチド研究所製、Ｃｏｄｅ：４０７８−ｖ
アミノ酸配列：Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ
分子量：７８９．９２
組成式：Ｃ４１Ｈ５５Ｎ７Ｏ９
【００６１】
上記外因性オピオイドペプチドを緩衝液（５０ｍＭ  ＫＰＢ  ｐＨ７．０）により６．０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製して基質溶液とした。また、上記ペプチダーゼを緩衝液（５０ｍＭ  ＫＰＢ  ｐＨ  ７．０）により１００ｍｇ／ｍＬの濃度に調製して酵素溶液とした。基質溶液５０μＬと酵素溶液５０μＬを混合し、３０℃で１．５時間反応を行った。その後、１００℃で１０分間保温し、反応停止させた。反応液を濾過し、ＨＰＬＣにより反応後の外因性オピオイドペプチドを解析した。ＨＰＬＣ測定条件は下記の通りである。ＨＰＬＣの測定結果を図１に示す。
【００６２】
ＨＰＬＣ条件：
島津ＨＰＬＣシステム
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー）４．６ｍｍ×１５０ｍｍ
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
カラム温度：３０℃
検出波長：２１０ｎｍ
移動相：Ａ：アセトニトリル：水：ＴＦＡ＝５：９５：０．１％
Ｂ：アセトニトリル：水：ＴＦＡ＝９５：５：０．１％
溶出条件：０−５ｍｉｎ      Ｂ：０％
５−２０ｍｉｎ    Ｂ：０％→１００％
２０−２１ｍｉｎ  Ｂ：１００％→０％
２１−２５ｍｉｎ  Ｂ：０％
【００６３】
（実施例３〜４、比較例２）
外因性オピオイドペプチドとして、β−カゾモルフィン７に代えて下記のβ−カゾモルフィン５を用いた以外は、実施例１〜２、比較例１と同じ操作を行い、ＨＰＬＣにより反応後の外因性オピオイドペプチドを解析した。反応条件およびＨＰＬＣ測定条件は実施例１〜２、比較例１と同様である。ＨＰＬＣによる測定結果を図２に示す。
【００６４】
β−Ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ−５（Ｂｏｖｉｎｅ）
ペプチド研究所製、Ｃｏｄｅ：４０７９
アミノ酸配列：Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ・２Ｈ２Ｏ
分子量：５７９．６４・３６．０３
組成式：Ｃ３０Ｈ３７Ｎ５Ｏ７・２Ｈ２Ｏ
【００６５】
（実施例５〜６、比較例３）
外因性オピオイドペプチドとして、β−カゾモルフィン７に代えて下記のグリアドルフィンを用いた以外は、実施例１〜２、比較例１と同じ操作を行い、ＨＰＬＣにより反応後の外因性オピオイドペプチドを解析した。反応条件およびＨＰＬＣ測定条件は実施例１〜２、比較例１と同様である。ＨＰＬＣによる測定結果を図３に示す。
【００６６】
Ｇｌｉａｄｏｒｐｈｉｎ−７  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ  ｓａｌｔ
ＢＡＣＨＥＭ製、Ｃｏｄｅ：Ｈ−６７１２．０００５
アミノ酸配列：Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ・ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ  ｓａｌｔ
分子量：８７５．９８
組成式：Ｃ４３Ｈ５７Ｎ９Ｏ１１
【００６７】
図１〜３に示すように、比較例１〜３では未分解の外因性オピオイドペプチドのピークが最も高いシグナル強度で観察された。実施例１〜６では外因性オピオイドペプチドがペプチダーゼにより分解され、未分解の外因性オピオイドペプチドのピークは低下した。実施例２、４および６においては、１．５時間の反応により外因性オピオイドペプチドのピークは完全に消失し、外因性オピオイドペプチドが完全に分解されたことが確かめられた。
【００６８】
（実施例７〜８、比較例４）
ストレプトマイセス属微生物由来のペプチダーゼによる外因性オピオイドペプチドの分解試験を行い、反応液に含まれるペプチドの成分をＬＣ−ＭＳにより解析した。外因性オピオイドペプチドとして実施例１〜２と同じβ−カゾモルフィン７を使用し、分解反応は実施例１〜２、比較例１と同じ条件で行った。ＨＰＬＣ測定条件は下記の通りである。
【００６９】
ＨＰＬＣ条件：
アジレントＨＰＬＣシステム
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー）４．６ｍｍ×１５０ｍｍ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１μＬ
カラム温度：３０℃
検出波長：２１０ｎｍ
移動相：Ａ：アセトニトリル：水：ギ酸＝５：９５：０．１％
Ｂ：アセトニトリル：水：ギ酸＝９５：５：０．１％
溶出条件：０−５ｍｉｎ      Ｂ：  ０％
５−２０ｍｉｎ    Ｂ：  ０％→１００％
２０−２１ｍｉｎ  Ｂ：  １００％→０％
２１−２５ｍｉｎ  Ｂ：  ０％
【００７０】
保持時間と２１０ｎｍにおける吸光度との関係を表すクロマトグラフィーを図４に示す。また、保持時間とイオン強度（ＥＳＩ  ＴＩＣ）との関係を表すクロマトグラフィーを図５に示す。これらのクロマトグラフィーから予測分子量で抽出し、分解物の分子組成式を予測した。その結果を表１に示す。
【００７１】
【表１】
2019041651.tif 000002
【００７２】
実施例７〜８では、ペプチダーゼの処理により、β−カゾモルフィン７がＯＤ２１０ｎｍで検出されないレベルまで分解された。その分解物には、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅのほか、ジペプチドとしてＰｒｏ−Ｉｌｅ、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、オリゴペプチドとしてＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅのように、Ｎ末端にＰｒｏを持つペプチド種が多く見られた。
【００７３】
（実施例９〜１０、比較例５）
外因性オピオイドペプチドとして、β−カゾモルフィン７に代えて実施例３〜４と同じβ−カゾモルフィン５を用いた以外は、実施例７〜８、比較例４と同じ条件でストレプトマイセス属微生物由来のペプチダーゼによる外因性オピオイドペプチドの分解試験を行い、反応液に含まれるペプチドの成分をＬＣ−ＭＳにより解析した。
【００７４】
ＬＣ−ＭＳの保持時間と２１０ｎｍにおける吸光度との関係を表すクロマトグラフィーを図６に示す。また、ＬＣ−ＭＳの保持時間とイオン強度（ＥＳＩ  ＴＩＣ）との関係を表すクロマトグラフィーを図７に示す。これらのクロマトグラフィーから予測分子量で抽出し、分解物の分子組成式を予測した。その結果を表２に示す。
【００７５】
【表２】
2019041651.tif 000003
【００７６】
実施例９〜１０では、ペプチダーゼの処理により、β−カゾモルフィン５がＯＤ２１０ｎｍで検出されないレベルまで分解された。その分解物には、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅのほか、ジペプチドとしてＰｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、オリゴペプチドとしてＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙのような、Ｎ末端にＰｒｏを持つペプチド種が多く見られた。
【００７７】
（実施例１１〜１２、比較例６）
外因性オピオイドペプチドとして、β−カゾモルフィン７に代えて実施例５〜６と同じグリアドルフィンを用いた以外は、実施例７〜８、比較例４と同じ条件でストレプトマイセス属微生物由来のペプチダーゼによる外因性オピオイドペプチドの分解試験を行い、反応液に含まれるペプチドの成分をＬＣ−ＭＳにより解析した。
【００７８】
ＬＣ−ＭＳの保持時間と２１０ｎｍにおける吸光度との関係を表すクロマトグラフィーを図８に示す。また、ＬＣ−ＭＳの保持時間とイオン強度（ＥＳＩ  ＴＩＣ）との関係を表すクロマトグラフィーを図９に示す。このクロマトグラフィーから予測分子量で抽出し、分解物の分子組成式を予測した。その結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
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【００８０】
実施例１１〜１２では、ペプチダーゼの処理により、グリアドルフィンがＯＤ２１０ｎｍで検出されないレベルまで分解された。その分解物には、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎのほか、ジペプチドＰｒｏ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、オリゴペプチドとしてＰｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅのような、Ｎ末端にＰｒｏを持つペプチド種が多く見られた。
【００８１】
また、実施例７〜１２の結果を合わせて考察すると、ストレプトマイセス属由来のペプチダーゼによりＮ末端がＰｒｏのペプチド種が多く生成された。ブランク（比較例４〜６）に存在するＮ末端がＰｒｏではないペプチドの多くは分解された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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