(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリマー基板に、溶解した検体が吸着することを回避するための、ポリマー基板にコーティングを適用する方法の提供。【解決手段】ポリマー基板にコーティングを適用するための単一工程の方法であって、ポリマー基板の存在下で水性溶媒光反応性化合物およびポリマー化合物を紫外線照射に晒して、光反応性化合物およびポリマー化合物の反応生成物を含んで成る共有結合させたコーティングをポリマー基板上に得ることを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー基板にコーティングを適用するための単一工程の方法であって、
前記ポリマー基板の存在下で水性溶媒に溶解した光反応性化合物およびポリマー化合物を紫外線照射に晒して、光反応性化合物およびポリマー化合物の反応生成物を含んで成る共有結合させたコーティングをポリマー基板上に得ることを含む、方法。
【請求項２】
前記光反応性化合物は、紫外線照射に反応して前記ポリマー化合物と反応可能な官能部分および前記基板に共有結合形成可能な潜在的官能基を含んで成る水溶性化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光反応性化合物の前記官能部分は、−（ＣＨ２）０−４−ＮＨＲ、−（ＣＨ２）０−４−ＣＯＯＲ、および−（ＣＨ２）０−４−Ｏ−（ＣＨ２）０−４−Ｒから成る群から選択される部分であり、ＲはＨ又はＣ１−４−アルキルである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
共有結合形成可能な前記光反応性化合物の前記潜在的官能基は、フェニル−Ｃ（＝Ｏ）−、キノイドＣ＝Ｏ、およびチオキサンテンＣ＝Ｏから成る群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記光反応性化合物は、ベンゾフェノン誘導体、アセトフェノン誘導体、アントラキノン誘導体、チオキサントン誘導体、およびケトクマリン誘導体から成る群から選択される芳香族ケトンであり、好ましくは、前記光反応性化合物は、４−ベンゾイルベンジルアミン、２−アミノベンゾフェノン、３−アミノベンゾフェノン、４−アミノベンゾフェノン、３，４−ジアミノベンゾフェノン、４，４’−ジアミノベンゾフェノン、２−ベンゾイル安息香酸、４−ベンゾイル安息香酸、２−アミノアセトフェノン、２’−アミノアセトフェノン、２−アミノベンゾフェノン−２’−カルボン酸、４−ヒドロキシベンゾフェノン、２，２’，４，４’−テトラヒドロキシベンゾフェノン、２−アセチル安息香酸、４−アセチル安息香酸、２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオン酸、アントラキノン−２−カルボン酸、１−アミノアントラキノン、１，４−ジアミノアントラキノン、２−アミノ−７−メチル−９Ｈ−チオキサンテン−９−オン、２−カルボキシ−９Ｈ−チオキサンテン−９−オン、および２−（３−スルホプロポキシ）−９Ｈ−チオキサンテン−９−オン、またはこれらの無機塩又は有機塩から成る群から選択され、好ましくは４−ベンゾイルベンジルアミン又は４−ベンゾイルベンジルアミン塩酸塩である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマー化合物は、炭素に結合した水素を含み、および光反応性化合物の前記官能部分と反応可能な官能部分を有するポリマーである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマー化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡＭ）、デキストラン、およびポリ（オキサゾリン）化合物、並びにエステル、アミン、酸、スクシンイミジル修飾酸、マレイミド、ビオチン化エステル、ビオチン化アミン、ビオチン化酸、およびこれらのビオチン化マレイミドから成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマー化合物は、ＯＭｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（アルファ−メトキシ−オメガ−カルボン酸スクシンイミジルエステルポリ（エチレングリコール））、ＯＰＳＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（アルファ−[３−（ｏ−ピリジルジスルフィド）プロパノイルアミド]−オメガ−カルボン酸スクシンイミジルエステルポリ（エチレングリコール））、およびビオチン−ＰＥＧ−ＮＨＳ（アルファ−ビオチン−オメガ−カルボン酸スクシンイミジルエステルポリ（エチレングリコール））から成る群から選択され、好ましくはＯＭｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒は、水、１つ以上の無機塩又は有機塩の水性溶液、無機酸の水性溶液、およびアンモニアから成る群から選択され、好ましくは、溶媒は、炭酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、および塩化カリウムから成る群から選択される少なくとも１つの塩の水性溶液であり、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
紫外線照射の曝露は、２５０〜４００ｎｍ、好ましくは３３０〜３８０ｎｍ、例えば３６０〜３７０ｎｍの波長の放射線を用いて行われる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
紫外線照射の曝露は、１〜３００Ｊ/ｃｍ２、好ましくは１０〜２００Ｊ/ｃｍ２、例えば２０〜１００Ｊ/ｃｍ２の放射線量で行われる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
水性溶媒中の光反応性化合物の濃度は、２〜５０ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、例えば１０〜１５ｍＭである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
水性溶媒中のポリマー化合物の濃度は、０．５〜５０ｍＭ、好ましくは１〜１５ｍＭ、例えば２〜１０ｍＭである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ポリマー基板は、ポリスチレン（ＰＳ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、エポキシ、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ（オキシメチレン）（ＰＯＭ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリエステル、ポリウレタン（ＰＵＲ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリイソプレン、ポリ（ブタジエン）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパリン、アルギン酸塩、アガロース、コラーゲン、ゼラチン、並びにこれらのコポリマーおよびブレンドおよび架橋材から成る群から選択される材料、好ましくはポリスチレンを含んで成る、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法により得ることが可能な、ポリマー基板に共有結合させるために適したコーティング。
【請求項１６】
ポリマー基板に溶解した検体の吸着を減じるため、好ましくはポリマー基板への疎水性分子および/もしくは親油性分子並びに/または両親媒性分子の吸着を制限するための請求項１５に記載のコーティングの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー基板に対する検体（又は分析物;analyte）の吸着（又は吸収;adsorption）を回避するためにポリマー基板にコーティングを適用する（又は施す又は塗布する;apply）ための方法に関する。より具体的には、本発明は、適用されるコーティングの特性と同様の特性を基板に与えることで基板に対する溶解した検体の吸着を減じるポリマー基板にコーティングを適用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの分析システムは、ポリマー材から形成されたチャネルを介して又は表面にわたって関心のある水性検体を導く。ほとんどの有機検体、特に強固な疎水性分子および/もしくは親油性分子並びに/または両親媒性分子は、ポリマー表面に接触時に非特異的に吸着される。つまり、分析のポイントに到達する前に検体溶液濃度の大変相当な減少がもたらされ、それによって、著しく誤った分析結果となってしまう。非特異的な吸着は、表面対体積の比が大きいためマイクロ流体システムで際立つ。これは、検知システムで薬品（又は薬剤又はドラッグ;drug）の有効性の著しい過小評価につながる。
【０００３】
ある例として、自動パッチクランプシステムのためのマイクロシステムがあり、薬品パネルの抑制濃度（ＩＣ５０）が、ポリマー表面への検体の低減により、疎水性薬品の分子の１０倍を上回って非常に高くなることが最近報告されている（ジャーナル薬理および毒物学的方法５２号（２００５年）１２３〜１３５頁のグオＬらによる“電位のＱＴ延長のための薬品の前臨床評価での自動電気生理学”）。
【０００４】
表面コーティング又は検体溶液への界面活性剤の追加を含む検体の吸着を制限するための異なる方法が開発されている（ジャーナル膜科学（２０１０年）のシェンＣらによる“薬品吸着および肝細胞の自己組織化に耐えるためのポリエチレングリコールによるポリスルホン膜の化学修飾”）；ジャーナル生物医学および生命科学８９３〜８９４（２０１２年）１３４〜１４３頁のシルベスターＳらによるクロマトグラフィＢ分析技術の“人の尿サンプルのＡＺＤ９１６４の非特異的な吸着問題の克服：生物学的分析および代謝産物分析の同定手法の考察”）。多くの分析では、界面活性剤の添加が感度を妨げ細胞分析で有毒となり得る。
【０００５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた表面コーティングはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はフィブリノゲン等のタンパク質の吸着を著しく制限することが以前より示されている（Ｊ．ビオムド．マーター．レス１９９２年２６号７７９〜７９０頁のバーグストロームＫらによるＰＥＧで被覆されたポリスチレン表面上におけるフィブリノゲン吸着の低減）
【０００６】
シェンらは、上記に示すようにポリスルホン−ＰＥＧコポリマーから作られた膜からμＭレベルで薬品の吸着を制限するためのＰＥＧの能力を開示している。しかしながら、当該コポリマーの使用は異なるポリマー材に低結合をもたらすために容易に活用されない。更に、多くの薬品はμＭの範囲に代えてｎＭの範囲のＩＣ５０又はエフェクター濃度（ＥＣ５０）を有し、シェンらの結果では、疎水性薬品の低結合特性をｎＭの形態にまで及ばすことは期待され得なかった。
【０００７】
ＰＥＧコーティングは、典型的にはまずメタノール又はアセトン中のベンゾフェノンを表面にスピンコーティングし、次いでＵＶ光と共にＰＥＧモノアクリレート（ＰＥＧＡ）を追加する多工程（又は多段階）の手順で光化学反応を通じて形成される（ジャーナル膜科学１１５号（１９９６年）３１〜４７頁のウルブリヒトＭらの“親水性および低タンパク質の吸着限外ろか膜形成のための光誘起グラフト重合表面修飾”）。
【０００８】
ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）フィルムは、外気でＵＶ照射下でアセトン中のスピンコートされたマクロモノマー、ポリエチレングリコールモノアクリレート（ＰＥＧＡ）の溶液を結び付けることで表面修飾されており、ベンゾフェノンはＰＭＭＡフィルムの表面でポリマーラジカルを発生させるために光増感剤として使用される（サーフ．インターフェースアナル２００８年４０号３８６〜３９０頁のイグアーブＯらの“ＢＳＡ吸着を抑制するためポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）フィルム上へのポリエチレングリコールモノアクリレート（ＰＥＧＡ）のグラフト重合”）。
【０００９】
上記の従来の方法は、例えば幅広く使用されるポリスチレン等の多くのポリマー材を溶解させ又は大きくすることができる低極性の有機溶媒の使用、および当該有機溶媒の炭素原子自体がベンゾフェノンと反応する傾向があることによる望ましくない副反応を含む欠点を抱えている。また、形成されるコーティングは、典型的にはマイクロ流体用に問題のある厚みである。更に、多工程手順はコーティングの複雑さおよびコストを増大させる。
【００１０】
シリコーンゴムは、タンパク質吸着、細胞粘着、およびシリコーンゴムに対する異物反応を回避するために光化学固定化技術を通じて被覆される。コーティング試薬は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ｍＰＥＧ−アミン（メトキシＰＥＧ−アミン）、ＰＡＡｍ（ポリアクリルアミド）、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、ＧＶＧＶＰ（グリシン−バリン−グリシン−バリン−プロリン）、ＣＬ−ＧＶＧＶＰ（ガンマ照射を通じて架橋されたＧＶＧＶＰ）およびＨＡ（ヒアルロン酸）等の異なるポリマーに結合された光反応性部分として４−ベンゾイル安息香酸（;4-benzoylbenzoic acid）（ＢＢＡ）で合成された（ジャーナル生物医学材料調査１９９９年４４巻第３号２９８〜３０７頁のデファイフＫ．Ｍらによる“タンパク質吸着、細胞粘着およびシリコーンゴムに対する異物反応での光化学固定化ポリマーコーティングの効果”）。
【００１１】
ＷＯ９０/００８８７には、ポリマー分子により運搬された潜在的反応基の外部活性を通じてポリマー分子をポリマー表面に共有結合させることによるポリマー表面の形成が開示されている。
【００１２】
ＵＳ２００９/０２２６６２９Ａ１には、ディスプレイ基板の製造方法が開示されており、アライメントフィルムで基板を被覆し、次いで、光反応モノマー材層でアライメントフィルムを被覆し、続いて光反応モノマー材層の第１領域にＵＶ光照射を選択的に行う旨が開示されている。
【００１３】
ＷＯ２００９/０９１２２４Ａ２は、液晶アライメント層のための組成物、当該組成物を使用して液晶アライメントを形成する方法、および液晶アライメント層を含んで成る光学フィルムに関する。
【００１４】
ＷＯ２００５/０４０２９４Ａ１には、（ｉ）少なくとも１つのオルガノアルコキシシラン、（ｉｉ）少なくとも１つのアミノアルキルアルコキシシラン、（ｉｉｉ）少なくとも１つのポリオール、（ｉｖ）任意には別のアルコキシシランまたはアルコキシシロキサン、および（ｖ）任意には少なくとも１つのナノ又はマイクロスケールの半金属酸化物若しくは金属酸化物、半金属酸化物水酸化物若しくは金属酸化物水酸化物、又は半金属水酸化物若しくは金属水酸化物、および/又は（ｖｉ）少なくとも１つの凝縮体、および/または（ｖｉｉ）加水分解条件下で生成される反応生成物、および（ｖｉｉｉ）有機溶媒を含んで成る、ガスのためのバリア層を生成するためのオルガノシラン系組成物に関する。
【００１５】
ＷＯ０３/０９３３２９Ａ１には、ＵＶ照射による架橋に耐性があり、また熱可塑性ポリマーから形成された容器の外部保護に特に適していると言われているガスバリア特性を有したマルチコーティングシステムに関する。
【００１６】
ＤＥ１０１４９５８７Ｂ４は、別々に形成されたマトリックス膜に基づき、表面が官能化されている、光反応被覆された複合膜に関する。少なくとも１つの官能モノマーを含む反応混合物は、２つの異なる反応条件を用いて２つの異なるポリマー層構造を形成するために使用されている。
【００１７】
ＥＰ０２７４５９６Ａ２は、（ｉ）少なくとも１つの多官能性アクリレートモノマー、（ｉｉ）少なくとも１つのアセトフェノン光開始剤、および（ｉｉｉ）ベンゾトリアゾ−ル、シアノアクリレート、およびヒドロキシベンゾフェノン又はこれらの混合物から選択される少なくとも１つの活性紫外線照射吸着体から成る、プラスチック基板のための紫外線照射で硬化可能なコーティング組成物に関する。
【００１８】
しかしながら、薄いコーティングをもたらし、開放又は閉鎖ボリューム（例えばチャネルシステム）のいずれにおいても有機溶媒を使用することなく１つの工程で実施し得、また巨視的および微視的な長さスケールで被覆層をパターン可能な、ポリマー基板をコーティングする単純な方法のための必要性がまだある。
【発明の概要】
【００１９】
本発明の目的は、コーティングが検体、特に疎水性分子および/もしくは親油性分子並びに/または両親媒性分子の吸着を効率的に回避し、またコーティングが単純で信頼できる方法を通じてポリマー基板に適用され得る、ポリマー基板にコーティングを適用する（又は施す又は塗布する;apply）ための方法を供することである。
【００２０】
本発明者らは、有機溶媒を使用することなく単一工程（又は一工程又は単一段階又は単一ステップ;single step）の方法によりポリマー基板に低吸着性のコーティングを供することができることを見出した。
【００２１】
第１態様においては、本発明は、ポリマー基板にコーティングを適用する（又は施す又は塗布する;apply）ための単一工程の方法であって、ポリマー基板の存在下で水性溶媒に溶解させた光反応性化合物およびポリマー化合物を紫外線照射に晒して、光反応性化合物およびポリマー化合物の反応生成物を含んで成る共有結合させたコーティングをポリマー基板上に得ることを含む、方法に関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、本発明の方法により得ることができる、ポリマー基板に共有結合するために適したコーティングに関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、ポリマー基板に溶解した検体の吸着を減じるための本発明によるコーティングの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、３０分間ＵＶ照射を行った修飾ポリスチレン（Ａ）又はＵＶ照射を行っていない修飾ポリスチレン（Ｂ）のＸＰＳ表面分析結果を示す。
【図２】図２は、０、２、１０又は５０ｍＭの濃度でＢｚおよびＮＨＳ−ＰＥＧの全ての組合せを用いた３０分間の光活性反応後の処理済みポリスチレン表面上の酸素濃度のＸＰＳ分析結果を示す。
【図３】図３は、ＰＢＳ中の１０ｍＭのＢｚおよび１０ｍＭのＮＨＳ−ＰＥＧを用いたＵＶ照射時間に応じた窒素および酸素表面濃度のＸＰＳ分析結果を示す。
【図４】図４は、ガラス、Ｂｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧ被覆されたポリスチレン又は未処理のポリスチレン上の１００ｎＭの薬液の培養結果を示す。
【図５】図５は、修飾ポリスチレンと未修飾ガラスおよびポリスチレン上の１００ｎＭのアミオダロンの培養結果を示す。
【図６】図６は、１０ｍＭのＢｚ＋１０ｍＭのＮＨＳ−ＰＥＧで修飾されたポリスチレン表面上の３日間のアステミゾールの吸着結果を示す。
【図７】図７は、窒素含有ＢＳＡで４時間培養前後の異なるポリマータイプでのタンパク質（ＢＳＡ）吸着のＸＰＳ分析結果を示す。
【図８】図８は、４時間修飾又は未修飾ポリスチレン上の変化する濃度での（Ａ）小から大のタンパク質と（Ｂ）＋（Ｃ）ＤＮＡの吸着のＸＰＳ分析結果を示す。吸着量は（タンパク質の）窒素又は（ＤＮＡの）窒素およびリンの表面濃度で決定される。
【図９】図９は、１０ｍＭのＢｚ＋１０ｍＭのＮＨＳ−ＰＥＧを用いたＵＶ照射時間に応じたＩｇＧ（０．１ｍｇ/ｍＬ；４時間）の吸着結果を示す。
【図１０】図１０は、（Ａ）３０分間ＵＶ照射後の修飾ポリスチレン基板のＸＰＳ分析結果；（Ｂ）ＢＳＡ（０．１ｍｇ/ｍＬ；４時間）を用いた培養後の修飾ポリスチレン基板のＸＰＳ分析結果を示す。
【図１１】図１１は、６０分間ＵＶ照射後のＮＨＳ−ＰＥＧ（７．５ｍｇ/ｍＬ）と共に異なるタイプのベンゾフェノンで修飾されたポリスチレン基板のＸＰＳ分析結果を示す。
【図１２】図１２は、水溶性バッファーで３０分間ＵＶ照射後の異なるポリマーと共にベンゾフェノンで修飾されたポリスチレン基板のＸＰＳ分析結果を示す。括弧内の数は濃度をｍｇ/ｍｌで特定したものである。
【図１３】図１３は、コーティング無し、ＰＥＧコーティング有り又はガラスコーティング有りのポリプロピレンプレートに１時間設置後のアステミゾールのＩＣ５０値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（定義付け）
本明細書において、用語“光反応性化合物”とは紫外線照射等の電磁照射の追加により反応する化合物を意味する。
【００２６】
本明細書において、用語“水溶性化合物”とは水に少なくとも１０ｇ/Ｌ、例えば少なくとも２０ｇ/Ｌ、より好ましくは少なくとも３０ｇ/Ｌの溶解性を有する化合物を意味する。
【００２７】
本明細書において、用語“検体（又は分析物;analyte）”とは任意の溶解した化合物又は分子を意味し、その存在を分析することができる。検体としては、限定されるものではないが、低分子薬品、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび抗体が挙げられる。
【００２８】
本明細書において、“ベンゾフェノン誘導体”等の用語“誘導体”とは、親化合物の骨格（又は主鎖;backbone）を有するが、１つ以上の置換基を有する化合物を意味する。
【００２９】
（本発明の具体的態様）
本発明の態様では、光反応性化合物は、紫外線照射に反応してポリマー化合物と反応可能な官能部分（又は官能部又は官能基;functional moiety）および上記基板に共有結合形成可能な潜在的（又は潜在性又は潜在;latent）官能基を含んで成る水溶性化合物である。
【００３０】
本発明の態様では、光反応性化合物の官能部分は、−（ＣＨ２）０−４−ＮＨＲ、−（ＣＨ２）０−４−ＣＯＯＲ、−（ＣＨ２）０−４−Ｏ−（ＣＨ２）０−４−Ｒから成る群から選択され、ＲはＨ又はＣ１−４−アルキルである。
【００３１】
本発明の態様では、共有結合形成可能な光反応性化合物の潜在的官能基は、フェニル−Ｃ（＝Ｏ）−、キノイドＣ＝Ｏ、およびチオキサンテンＣ＝Ｏから成る群から選択される。
【００３２】
つまり、官能部分は、光反応性化合物とポリマー化合物との間の共有結合の形成を容易にすることに加えて、水性媒体での光反応性化合物の溶解性を高めることが分かっている。潜在的官能基は、多くの異なるポリマー基板との共有結合を形成することが分かっている。
【００３３】
本発明の態様では、光反応性化合物は、ベンゾフェノン誘導体、アセトフェノン誘導体、アントラキノン誘導体、チオキサントン誘導体、およびケトクマリン誘導体から成る群から選択される芳香族ケトンである。
【００３４】
本発明の態様では、光反応性化合物は、４−ベンゾイルベンジルアミン、２−アミノベンゾフェノン、３−アミノベンゾフェノン、４−アミノベンゾフェノン、３，４−ジアミノベンゾフェノン、４，４’−ジアミノベンゾフェノン、２−ベンゾイル安息香酸（;2-benzoyl benzoic acid）、４−ベンゾイル安息香酸（;4-benzoyl benzoic acid）、２−アミノアセトフェノン、２’−アミノアセトフェノン、２−アミノベンゾフェノン−２’−カルボン酸、４−ヒドロキシベンゾフェノン、２，２’，４，４’−テトラヒドロキシベンゾフェノン、２−アセチル安息香酸（;2-acetylbenzoic acid）、４−アセチル安息香酸（;4-acetylbenzoic acid）、２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオン酸、アントラキノン−２−カルボン酸、１−アミノアントラキノン、１，４−ジアミノアントラキノン、２−アミノ−７−メチル−９Ｈ−チオキサンテン−９−オン、２−カルボキシ−９Ｈ−チオキサンテン−９−オン、及び２−（３−スルホプロポキシ）−９Ｈ−チオキサンテン−９−オン、またはこれらの無機塩又は有機塩から成る群から選択され、好ましくは４−ベンゾイルベンジルアミン又は４−ベンゾイルベンジルアミン塩酸塩である。
【００３５】
つまり、上記の化合物は水性媒体で有利な溶解性を有し、ポリマー化合物に対して共有結合を形成することができると分かっている。特に、４−ベンゾイルベンジルアミンは水性媒体に高い溶解性を有し、４−ベンゾイルベンジルアミンのアミン官能性により光反応性化合物がポリマー化合物へ共有結合できることが分かっている。
【００３６】
本発明のある態様では、ポリマー化合物は、炭素に結合した水素を含み、光反応性化合物の官能部分と反応可能な官能部分を有するポリマーである。
【００３７】
本発明のある態様では、ポリマー化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化合物、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡＭ）、デキストラン、およびポリ（オキサゾリン）化合物、およびエステル、アミン、酸、スクシンイミジル修飾酸、マレイミド、ビオチン化エステル、ビオチン化アミン、ビオチン化酸、およびこれらのビオチン化マレイミドから成る群から選択される。
【００３８】
本発明のある態様では、ポリマー化合物は、ＯＭｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（アルファ−メトキシ−オメガ−カルボン酸スクシンイミジルエステルポリ（エチレングリコール））、ＯＰＳＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（アルファ−[３−（ｏ−ピリジルジスルフィド）プロパノイルアミド]−オメガ−カルボン酸スクシンイミジルエステルポリ（エチレングリコール））、およびビオチン−ＰＥＧ−ＮＨＳ（アルファ−ビオチン−オメガ−カルボン酸スクシンイミジルエステルポリ（エチレングリコール））から成る群から選択され、好ましくはＯＭｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳである。
【００３９】
つまり、ポリマー基板に対するＰＥＧ化合物の反応性が、例えばアミン−ＰＥＧと比べてＰＥＧ鎖の端部でＮＨＳエステル等の特定のアミノ反応基を有することで増えることが分かっている。
【００４０】
本発明のある態様では、溶媒は、水、１つ以上の無機塩又は有機塩の水性溶液、無機酸の水性溶液、およびアンモニアから成る群から選択される。
【００４１】
本発明のある態様では、溶媒は、炭酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、および塩化カリウムから成る群から選択される少なくとも１つの塩の水性溶液であり、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００４２】
本発明のある態様では、曝露のために使用される紫外線照射は、２５０〜４００ｎｍ、好ましくは３３０〜３８０ｎｍ、例えば３６０〜３７０ｎｍの波長を有する。
【００４３】
本発明のある態様では、紫外線照射曝露は１〜３００Ｊ/ｃｍ２、好ましくは１０〜２００Ｊ/ｃｍ２、例えば２０〜１００Ｊ/ｃｍ２の照射線量で行われる。
【００４４】
照射線量は、本発明のある態様では、長時間低照射速度で例えば１８Ｊ/ｃｍ２の照射線量を得るために３０分間１０ｍＷ/ｃｍ２で、又は本発明の別の態様では、短時間高照射速度で例えば２００Ｊ/ｃｍ２の照射線量を得るために１秒間２００Ｗ/ｃｍ２で紫外線照射曝露からもたらされ得る。つまり、照射速度および紫外線照射曝露時間は特定の状況に応じて変わり、上記に示すように、照射線量は、概してポリマー基板に満足いく結合を得るのに十分である。
【００４５】
本発明のある態様では、水性溶媒中の光反応性化合物の濃度は２〜５０ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、例えば１０〜１５ｍＭである。
【００４６】
本発明のある態様では、水性溶媒中のポリマー化合物の濃度は０．５〜５０ｍＭ、好ましくは１〜１５ｍＭ、例えば２〜１０ｍＭである。
【００４７】
本発明のある態様では、ポリマー基板は、ポリスチレン（ＰＳ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、エポキシ、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ（オキシメチレン）（ＰＯＭ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリエステル、ポリウレタン（ＰＵＲ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリイソプレン、ポリ（ブタジエン）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパリン、アルギン酸塩、アガロース、コラーゲン、ゼラチン、およびこれらのコポリマーおよびブレンドおよび架橋材から成る群から選択される材料、好ましくはポリスチレンを含んで成る。
【００４８】
本発明のある態様は、ポリマー基板上にコーティングを適用する（又は施す又は塗布する;apply）ための方法であって、水性溶媒中の光反応性化合物およびポリマー化合物を反応させて、光反応性化合物およびポリマー化合物の反応生成物を得ること、および、ポリマー基板の存在下でＵＶ照射に反応生成物を晒して共有結合したコーティングをポリマー基板上に得ることを含む、方法である。
【００４９】
本発明のある態様では、本発明は、ポリマー基板への疎水性分子および/もしくは親油性分子並びに/または両親媒性分子の吸着を制限するために使用される。
【００５０】
本発明のある態様では、コーティングを有するポリマー基板に吸着される溶解した分子種の量は、コーティング無しのポリマー基板に吸着される量の５０％未満に、例えば４０％、３０％、２０％および１０％未満に、好ましくはコーティング無しのポリマー基板に吸着される量の５％未満にまで減じられる。
【００５１】
下記の非制限的な例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【００５２】
（材料および方法）
ポリスチレン（ＰＳ、ＢＡＳＦグレード１５８Ｋ）をＮｕｎｃ（デンマーク）から入手したφ５ｃｍのペトリ皿で使用した。グレード６０１３の環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）箔をトーパスアドバンスポリマー社（ドイツ）から入手した。グレードＵＬＴＲＡＬＡＭ３０００の液晶ポリマー（ＬＣＰ）箔をロジャー社（ＡＺ）から入手した。４−ベンゾイルベンジルアミン塩酸塩（Ｂｚ）をフルオロケム（ＵＫ）から入手した。Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、酢酸、テルフェナジン、アステミゾール、ドフェチリド、アミオダロン、ソタロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、非特異的ヒトＩｇＧ、ヒトインスリン、サケの精巣からのＤＮＡナトリウム塩、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（７５０Ｄａ、ＰＥＧ）、デキストラン（６ｋＤａ）、ポリ（ビニルピロリドン）（１０ｋＤａ、ＰＶＰ）、およびポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（５ｋＤａ、ＰＥＯＸＡ）をシグマアルドリッチ社から入手した。ＯＭｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（７５０Ｄａ、ＰＥＧ１１６６．０００１、ＮＨＳ−ＰＥＧ）をアイリスバイオテク（ドイツ）から入手した。６ｎｍの細孔サイズを有するＹＭＣパックの５μｍジオールＨＰＬＣカラム（８×５００ｍｍ）をミクロラボアーフス（デンマーク）から入手した。Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）を、調査又は高分解能スペクトルのためそれぞれ２００ｅｖ又は５０ｅｖのパスエネルギーで４００μｍのワイド単色化ＡｌＫａＸ線スポットを用いるＫ−アルファスペクトロメータ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ＵＫ）で行った。
【００５３】
エレクトロスプレーイオン化質量分光法（ＥＳＩ−ＭＳ）はアジレント６１００シリーズのシングルクアドＬＣ／ＭＳシステムを用いて実施した。
【００５４】
接触角を製造業者のＳＣＡ−２０ソフトウェアを実行するデータフィジックス社のＯＣＡ２０ゴニオメーター（ドイツ）を用いて決定した。静的前進および後退接触角を表面に５μＬの水滴を適用した後に測定した。
【００５５】
（ポリマー表面のコーティングのための一般的手順）
ポリマー表面のコーティング
ＮＨＳ−ＰＥＧ、Ｂｚ−ＰＥＧ、ＰＥＧおよびＢｚを５０ｍＭ以下の濃度でＰＢＳに溶解させ、デキストラン、ＰＶＰおよびＰＥＯＸＡを２．５ｍｇ/ｍＬの濃度のＢｚと共に７．５ｍｇ/ｍＬの固定濃度でＰＢＳに溶解させた。その反応溶液をポチスチレン容器内のポリマーフィルムに加え、その表面を、１８ｍＷ/ｃｍ２の照度で最大３３０〜３８０ｎｍの広範囲の照明の（フィリップスクレオＳ−Ｒ８０蛍光管）を有する特注の光反応器を使用してＵＶ光に晒した。晒したサンプルを水およびエタノールで３回洗い流した。
【００５６】
ＢＳＡ、インスリン、ＩｇＧ又はＤＮＡの吸着
ＢＳＡ、インスリン、ＩｇＧおよびＤＮＡを１ｍｇ/ｍＬ以下の濃度でＰＢＳに各々溶解させ、ポリスチレン容器に加えた。被覆した又は被覆させていないフィルムのサンプルは水よりも小さな質量密度を有しており、被覆側がテスト溶液と面するよう水相に浮かばせて当該サンプルをテスト溶液に晒した。培養を室温で４時間行った。サンプルを５回水で注意深く洗い、次いでＸＰＳ分析で吸着量を定量化する前に乾燥した。
【００５７】
薬品の吸着
異なる濃度の薬品を５０％アセトニトリル/５０％Ｈ２Ｏの０．５ｍＭのストック溶液から２ｍＬのＨ２Ｏに溶解させ、被覆したポリスチレン容器又は被覆していないポリスチレン容器、および参照材料として作用するガラス容器に加えた（２ｍＬの溶液を径３３ｍｍの円形の容器にそれぞれ加えた）。２５０ｎｍ以下の薬品濃度を調査した。異なる時間で２５０μＬの上澄液を分析のため採取した。各サンプルを、内部標準として２００ｎＭのソタロール又はドフェチリドを含む２５０μＬの９９．８％ＭｅＯＨ/０．２％酢酸と混合した。５０％Ｈ２Ｏ/５０％ＭｅＯＨ/０．１％酢酸ランニング緩衝液（０．１ｍＬ/分）を用いてＥＳＩ−ＭＳによりサンプルを分析した。
【００５８】
調合例１
ベンゾフェノンへのＮＨＳ−ＰＥＧの結合
ＮＨＳ−ＰＥＧ（１２６ｍｇ、１５１μモル）、Ｂｚ（３５ｍｇ、１４１μモル）およびＥＤＣ−ＨＣｌ（１３８ｍｇ、７２０μモル）６０を０．５ｍＬＰＢＳに加えて、室温で２４時間反応させることでＢｚ−ＰＥＧを合成した。その生成物を、６ｎｍの細孔サイズを有した５μｍのジオールカラムを使用し、また５０ｍＭＮａＣｌの５０％ＭｅＯＨ/５０％Ｈ２Ｏのランニング緩衝液（１ｍＬ/分）を使用するＨＰＬＣで純化した。１ｍＬのＨ２Ｏに溶解する前に純化した生成物を集め、溶媒濃縮した。Ｂｚ−ＰＥＧの濃度を９９μＬのＨ２Ｏに溶解させて、ＨＰＬＣに注入した１μＬのサンプルから決定した。
【実施例】
【００５９】
実施例１
ＵＶ光照射前にＰＢＳ中のベンゾフェノンアミン（Ｂｚ）およびＮＨＳ−ＰＥＧ（７５０Ｄａ）を異なるポリマー表面に加える１工程で表面コーティングを行った（図表１：図で“Ｂｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧ”と示す）。
【００６０】
2019163462.tif 000002
【００６１】
活性ＮＨＳエステル基を介した結合の意義を、（図で“Ｂｚ＋ＰＥＧ”と示されている）Ｂｚおよび末端ＮＨＳエステルが無い同一の大きさのＰＥＧを使用して別の一式の実験で調査した。また、ＢｚおよびＮＨＳ−ＰＥＧをアミド結合を通じて第１に共有結合させてＢｚ−ＰＥＧを形成する２工程（又は２段階）方法を調査した。Ｂｚ−ＰＥＧ生成物をＨＰＬＣで純化し、次いでＵＶ光照射前に異なるポリマー表面に加えた（“Ｂｚ−ＰＥＧ”と示す）。２つの方法による表面コーティングは、有機溶媒を通常使用することに代えて水性緩衝液で行うという利点を有し、光活性化ベンゾフェノンと反応することができる。更に、実際の光活性化コーティングは単一工程で行われる。“Ｂｚ”と示す結果は溶解したベンゾフェノンのみの反応を示している。全ての化合物を１０ｍＭの濃度でＰＢＳに溶解させた。“ブランク”は純ＰＢＳで処理した。ポリスチレン表面を一式の異なる手順を用いてＵＶ照射で光活性し又は光活性することなく処理した。反応後十分にサンプルを洗浄し、物理吸着した試薬を取り除いた。乾燥したサンプルのＸＰＳ分析結果では、（図１Ｂ）のＵＶ光無しの場合と比べて（図１Ａ）のＢｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧサンプルでの酸素（１４．７原子％）および窒素（３．４原子％）の濃度が大きく増加していることを示していた。ＰＥＧ無しのＢｚによる光活性化コーティングは酸素（３．４原子％）および窒素（１．０原子％）の量がかなり低くなっていた。この事はＮＨＳ−ＰＥＧが光活性化されたＢｚを含む処理で表面に結合されたことを示唆している。Ｂｚ＋ＰＥＧサンプル（７．６原子％）およびＢｚ−ＰＥＧサンプル（７．３原子％）は酸素濃度を増加させることを示し、ＰＥＧがわずかながらこれらのサンプルに付いたことを示していた。ＵＶ照射無しの全ての操作は大変低い酸素および窒素表面濃度となり、光活性がポリスチレン表面を修飾するために必要であることを示していた。
【００６２】
実施例２
反応度におけるＢｚおよびＮＨＳ−ＰＥＧの影響を、３０分間のＵＶ照射で０〜５０ｍＭで２つの濃度を変えることで調査した（図２参照）。１４原子％の最大酸素濃度を１０ｍＭＢｚおよび２ＭｍＮＨＳ−ＰＥＧで処理したサンプルで測定した。
【００６３】
実施例３
ＵＶ照射時間の影響をＢｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧ反応において調査した（図３）。酸素および窒素表面濃度は最大６０分の照射時間と共に増加し（１８．９原子％の酸素および４．８原子％の窒素）、その照射時間は調査した最も長い時間であった。
【００６４】
実施例４
薬品の吸着
低結合のＢｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧコーティングの有効性を、幅広い疎水性を有する１００ｎＭ溶液での被覆されたおよび被覆されていないポリスチレンの拡張された培養により調べた。ガラス表面をポリスチレンと呼ぶことに含めた。培養液の上澄みを異なる時間で採取し、内部標準の追加後エレクトロスプレーイオン化質量分光法（ＥＳＩ−ＭＳ）により薬品濃度を決定した。
【００６５】
最初に追加した薬品濃度に対する上澄み中の薬品濃度の比で回収率を算出した。Ｂｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧ（各化合物は１０ｍＭ）により修飾されたポリスチレン表面は、殆どの疎水性薬品（ｃＬｏｇＰがそれぞれ８．９５、６．５および５．７であるアミオダロン、テルフェナジンおよびアステミゾール）において修飾されていないポリスチレンよりもかなり高い回収率を示した（図４）。疎水性の高い薬品であるドフェチリドおよびソタロール（ｃＬｏｇＰがそれぞれ１．９９および０．２３である）は全ての表面で高い回収率を示した。
【００６６】
最も高い疎水性薬品であるアミオダロンはガラス表面でさえ高い吸着性を示した。しかしながら、図４では、実際の薬品測定を行う前に最大３日間採取した上澄みの保存のためにガラスバイアルを使用した。そのため、測定結果は、保存用のガラスバイアルへの後の吸着によりテスト表面に吸着した量をおそらく多く見積もっている。別の一連の実験は、異なる表面コーティング方法の低結合の質のため好感度の測定としてアミオダロンを使用し、サンプリング後１時間以内に薬品濃度を測定することでガラスバイアルでの吸着の問題を最小にした（図５）。ガラスは予想通り最小の薬品吸着を示した。しかしながら、Ｂｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧで被覆されたポリスチレンは１時間後に７６％の高い回収率、５時間後に５０％の回収率、および１週間後に１３％の回収率を示し、後者はガラスに相当する。それに比べて、初期のアミオダロンの３％未満が被覆されていないポリスチレンに５時間後に溶解したままであった。
【００６７】
濃度が１０ｎＭ〜２５０ｎＭの疎水性の低いアステミゾールを用いた３日間のＢｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧで被覆したポリスチレンの培養は、最小濃度でさえ２０％を超える回収率を示し、薬品濃度が高くなるにつれて回収率も増えた（図６）。対して、被覆していないポリスチレンはテストした全ての薬品濃度でゼロに近い回収率を示した。
【００６８】
実施例５
ポリスチレン、環状オレフィンコポリマー、液晶ポリマーおよびポリイミドを含む微量分析システムに関連する幅広いポリマーでのタンパク質吸着を減じるＢｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧコーティングの有効性をテストした。修飾および未修飾のポリマー表面を４時間ＰＢＳ中で０〜１ｍｇ/ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に培養した。十分に洗浄した後、培養した表面をＸＰＳで分析した（図７）。
【００６９】
ＢＳＡを用いた培養前後の窒素表面濃度の違いをポリイミドが分子構造に窒素を含んでいるという暫定特許を用いて吸着したタンパク質の量の測定値であるとした。ＢＳＡ吸着後窒素の大きな増加（最大７原子％）を、被覆していないサンプルおよび全てのテストしたポリマー材のためＢｚ被覆したサンプルで観察した。対して、Ｂｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧ又はＢｚ−ＰＥＧを使用して修飾したポリマー表面はわずかに窒素濃度が増えたことを示し（＜０．６原子％）、これらのＰＥＧで被覆したサンプル上でのＢＳＡ吸着量が低いことを示した。Ｂｚ＋ＰＥＧで処理されたポリマー表面は、ＢＳＡで培養後全てのポリマー材上の表面窒素濃度が高くなっていることから明らかなように、Ｂｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧで修飾した材料よりも劣った小さなタンパク質結合特性を示した。
【００７０】
実施例６
Ｂｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧで被覆した又は被覆していないポリスチレン表面上の幅広い分子量にわたる異なる種類のタンパク質の吸着を分析した（図８Ａ）。表面のコーティングは小さいサイズのタンパク質および中間サイズのタンパク質（それぞれインスリンおよびＢＳＡに対応）の吸着を強力に制限した。大きなサイズのタンパク質（ＩｇＧ）に関しては、０．１ｍｇ/ｍＬ以下の濃度で同じ効果を観察し、最も高いテストしたＩｇＧ濃度である１ｍｇ/ｍＬでは少しその効果を示した。
【００７１】
実施例７
ＤＮＡは多くの異なる材料表面に吸着することが示されている。１ｍｇ/ｍＬ以下の濃度のサケの精巣からのＤＮＡを用いて培養した後のＤＮＡ吸着を減じるためのＢｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧコーティングの能力をポリスチレン表面上でテストした。吸着は、図８Ｂおよび図８Ｃにそれぞれ示すように、ヌクレオチドからの窒素の表面濃度の増加およびＤＮＡ骨格からのリンの増加を生じさせる。リンのシグナルはＤＮＡの吸着量のより一貫したマーカーになることが分かっている。２つの高い濃度（１ｍｇ/ｍＬおよび０．１ｍｇ/ｍＬ）では、ポリスチレン表面に１原子％を上回るリンをもたらし多くの吸着があった一方、０．０１ｍｇ/ｍＬのＤＮＡを用いた培養では０．３原子％のリンをもたらした（図８Ｃ）。対して、Ｂｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧにより被覆されたポリスチレン上で培養されたＤＮＡ溶液は検出限界近傍の大変低いリン濃度（０．１原子％未満）をもたらした。つまり、ＤＮＡの吸着は表面修飾後強力に減じられる。
【００７２】
実施例８
最終のＰＥＧコーティングの密度および厚さを図３に示すようにＵＶリアクターでの照射時間を制御することで制御することができる。異なる照射時間で形成したサンプルを４時間ＰＢＳ中の０．１ｍｇ/ｍＬのＩｇＧを用いて培養し、タンパク質の吸着量をＸＰＳを用いて分析して、窒素および硫黄の表面濃度を調べた（図９）。タンパク質の吸着は５分以下のＵＶ照射により形成したサンプルで高く、一方１０分を超える照射時間では照射時間の増加と共にタンパク質の吸着が減じられた。０．０８原子％の最小窒素濃度および０．０７原子％の最小硫黄濃度はそれぞれ最長照射時間である６０分で観察された。この事は、ＵＶ照射時間およびおそらくＵＶ線量がＰＥＧコーティング量を制御し、それによって表面の低結合の質を制御するための重要なパラメーターであることを示している。
【００７３】
実施例９
デキストラン、ＰＶＰおよびＰＥＯＸＡをポリマー表面に対するタンパク質の吸着を減じるためのＰＥＧに代えて使用することができる。ポリスチレン基板を、デキストラン、ＰＶＰ又はＰＥＯＸＡのいずれかを有するＢｚの溶液を用いて３０分間ＵＶ照射により表面修飾した。得られた表面をＸＰＳで分析し、制御したサンプルにわたって酸素および窒素の両方の表面濃度が増えていることを示していた（図１０Ａ）。続いて４時間０．１ｍｇ/ｍＬのＢＳＡを用いた培養では、制御したサンプルに比べて全ての修飾基板上でタンパク質の吸着が減じられていることを示していた（図１０Ｂ）。
【００７４】
実施例１０
ポリスチレン基板を、アミン反応官能部分、カルボン酸スクシンイミジルエステルを有するＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、又はアミンの少ない反応官能部分、修飾されていないカルボン酸を有する同等のＰＥＧ（ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）のいずれかで表面修飾した。修飾基板の分析結果は、より高密度表面コーティングを示すＨＯＯＣ−ＰＥＧ修飾面（８．３原子％）上の酸素濃度よりもＮＨＳ−ＰＥＧ修飾面（１０．５原子％）上の酸素濃度が高いことを示した。続いて４時間０．１ｍｇ/ｍＬのＢＳＡを用いた培養結果は、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ被覆基板の吸着（３．０５原子％の窒素；０．１３原子％の硫黄）よりもＮＨＳ−ＰＥＧ被覆基板上のタンパク質の吸着（０．９５原子％の窒素；０．０１原子％の硫黄）がかなり低いことを示していた。この結果は、光反応性化合物の官能部分と共有反応可能なポリマー化合物における官能部分はタンパク質吸着の低いコーティングを生じさせることを示している。
【００７５】
実施例１１
取り付けられる異なる反応基を有するベンゾフェノンは異なる表面反応性を有する。下記のタイプのベンゾフェノンを水性緩衝液中のポリスチレン表面にＮＨＳ−ＰＥＧを取り付けるための能力のため評価を行った：４−ベンゾイルベンジルアミン塩酸塩（ＢＺ）、２，２’，４，４’−テトラヒドロキシベンゾフェノン（４ｘＯＨ−Ｂｚ）、４−ヒドロキシベンゾフェノン（１ｘＯＨ−Ｂｚ）、２−アミノベンゾフェノン−２’−カルボン酸（１ｘＮＨ２−１ｘＣＯＯＨ−Ｂｚ）、３，４−ジアミノベンゾフェノン（２ｘＮＨ２−Ｂｚ）、２−ベンゾイル安息香酸（;2-benzoylbenzoic acid）（１ｘＣＯＯＨ−Ｂｚ）、２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオン酸（１ｘＣＯＯＨ−ＣＨ２−Ｂｚ）。図１１は、６０分のＵＶ処理後のポリスチレン上のＮＨＳ−ＰＥＧ（７．５ｍｇ/ｍｌ）と共に異なる種類のベンゾフェノン（２．５ｍｇ/ｍｌ）の処理後、結合したベンゾフェノンおよびＮＨＳ−ＰＥＧから生じる酸素および窒素の量を示している。酸素および窒素の量は、サンプルに相当量のＰＥＧと結びついていない他のタイプのベンゾフェノンと比べて、Ｂｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧおよび１ｘＣＯＯＨ−ＣＨ２−Ｂｚ＋ＮＨＳ−ＰＥＧを有したサンプルにおいて著しく多かった。これらの結果は、ベンゾフェノンアミン（Ｂｚ）は、水性溶媒中で他の変異型のベンゾフェノンと比べてポリマー表面にＰＥＧを取り付けることが好ましいことを示していた。
【００７６】
実施例１２
ベンゾフェノン（Ｂｚ）はポリマー表面に異なるポリマーを取り付けるために使用することができる。図１２は、水性媒体中でＢｚと共に３０分ＵＶ照射した後のポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡＭ）およびデキストランのＸＰＳ分析結果を示している。低分子量（５ｋＤａ）又は高分子量（１５ｋＤａ）のＰＡＡを用いた結合反応では、ＵＶ曝露後において酸素および窒素の量が増大したが、ＵＶ曝露無しでは酸素および窒素を検出できなかった。この事はＰＡＡの光化学の取り付けが有効であることを示していた。ＰＶＰおよびＰＡＡＭを用いた結合反応は高い効率性ではないがＵＶ照射が共有表面結合に左右していることに従い、ＵＶ照射後にポリマー表面に中間量の酸素および窒素を示し、ＵＶ照射無しでは少量の酸素および窒素を示した。
【００７７】
実施例１３
ポリプロピレンから成る化合物マイクロタイタープレートを水中でＮＨＳ−ＰＥＧ（７．５ｍｇ/ｍｌ）およびＢｚ（２．５ｍｇ/ｍｌ）を用いてＰＥＧで被覆し、ＵＶ光に晒した。薬品のアステミゾールをＰＥＧ被覆したプレート、被覆していないプレート、およびガラス被覆したプレートに異なる濃度で加え、１時間保存した。続けて保存した薬液を自動化パッチクランプシステムを用いて調査した。ｈＥＲＧイオンチャネルでの薬品の影響をイオン電流を測定し、算出したＩＣ５０値の結果により分析した。被覆していないプレートに保管した薬液は、ＰＥＧ被覆したプレート又はガラス被覆したプレートに保管した薬液と比べてＩＣ５０値が高いという結果になり、ＰＥＧ被覆したプレートから得られるＩＣ５０値は参照のガラス被覆したプレートで得られる値と殆ど同じであった。高く算出されたＩＣ５０値、すなわち溶液中の低い有効薬品濃度は、被覆されていないポリプロピレンプレートの表面に相当に薬品化合物が吸着したことによるものである。この結果は、そのような望ましくない薬品吸着をプレートの事前のＰＥＧコーティングにより強力に減じることができることを示していた。
【００７８】
文献リスト
・ジャーナル薬理および毒物学的方法５２号（２００５年）１２３〜１３５頁のグオＬらによる“電位のＱＴ延長のための薬品の前臨床評価での自動電気生理学”
・ジャーナル膜科学（２０１０年）のシェンＣらによる“薬品吸着および肝細胞の自己組織化に耐えるためのポリエチレングリコールによるポリスルホン膜の化学修飾”）
・ジャーナル生物医学および生命科学８９３〜８９４（２０１２年）１３４〜１４３頁のクロマトグラフィＢ分析技術のシルベスターＳらによる“人の尿サンプルのＡＺＤ９１６４の非特異的な吸着問題の克服：生物学的分析および代謝産物分析の同定手法の考察”
・Ｊ．ビオムド．マーター．レス１９９２年２６号７７９〜７９０頁のバーグストロームＫらによるＰＥＧで被覆されたポリスチレン表面上におけるフィブリノゲン吸着の低減
・ジャーナル膜科学１１５号（１９９６年）３１〜４７頁のウルブリヒトＭらの“親水性および低タンパク質の吸着限外ろか膜形成のための光誘起グラフト重合表面修飾”
・サーフ．インターフェースアナル２００８年４０号３８６〜３９０頁のイグアーブＯらの“ＢＳＡ吸着を抑制するためポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）フィルム上へのポリエチレングリコールモノアクリレート（ＰＥＧＡ）のグラフト重合”
・ジャーナル生物医学材料調査１９９９年４４巻第３号２９８〜３０７頁のデファイフＫ．Ｍらによる“タンパク質吸着、細胞粘着およびシリコーンゴムに対する異物反応での光化学固定化ポリマーコーティングの効果”
・ＷＯ９０/００８８７
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月26日(2019.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー基板にコーティングを適用するための単一工程の方法であって、
前記ポリマー基板の存在下で水性溶媒に溶解した光反応性化合物およびポリマー化合物を紫外線照射に晒して、光反応性化合物およびポリマー化合物の反応生成物を含んで成る共有結合させたコーティングをポリマー基板上に得ることを含み、
前記光反応性化合物は、ベンゾフェノン誘導体、アセトフェノン誘導体、アントラキノン誘導体、チオキサントン誘導体、およびケトクマリン誘導体から成る群から選択される芳香族ケトンであり、好ましくは、前記光反応性化合物は、４−ベンゾイルベンジルアミン、２−アミノベンゾフェノン、３−アミノベンゾフェノン、４−アミノベンゾフェノン、３，４−ジアミノベンゾフェノン、４，４’−ジアミノベンゾフェノン、２−ベンゾイル安息香酸、４−ベンゾイル安息香酸、２−アミノアセトフェノン、２’−アミノアセトフェノン、２−アミノベンゾフェノン−２’−カルボン酸、４−ヒドロキシベンゾフェノン、２，２’，４，４’−テトラヒドロキシベンゾフェノン、２−アセチル安息香酸、４−アセチル安息香酸、２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオン酸、アントラキノン−２−カルボン酸、１−アミノアントラキノン、１，４−ジアミノアントラキノン、２−アミノ−７−メチル−９Ｈ−チオキサンテン−９−オン、２−カルボキシ−９Ｈ−チオキサンテン−９−オン、および２−（３−スルホプロポキシ）−９Ｈ−チオキサンテン−９−オン、またはこれらの無機塩又は有機塩から成る群から選択され、並びに、
前記ポリマー化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡＭ）、デキストラン、およびポリ（オキサゾリン）化合物、並びにエステル、アミン、酸、スクシンイミジル修飾酸、マレイミド、ビオチン化エステル、ビオチン化アミン、ビオチン化酸、およびこれらのビオチン化マレイミドから成る群から選択される、方法。
【請求項２】
前記光反応性化合物は、４−ベンゾイルベンジルアミン又は４−ベンゾイルベンジルアミン塩酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマー化合物は、ＯＭｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（アルファ−メトキシ−オメガ−カルボン酸スクシンイミジルエステルポリ（エチレングリコール））、ＯＰＳＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（アルファ−[３−（ｏ−ピリジルジスルフィド）プロパノイルアミド]−オメガ−カルボン酸スクシンイミジルエステルポリ（エチレングリコール））、およびビオチン−ＰＥＧ−ＮＨＳ（アルファ−ビオチン−オメガ−カルボン酸スクシンイミジルエステルポリ（エチレングリコール））から成る群から選択され、好ましくはＯＭｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶媒は、水、１つ以上の無機塩又は有機塩の水性溶液、無機酸の水性溶液、およびアンモニアから成る群から選択され、好ましくは、該溶媒は、炭酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、および塩化カリウムから成る群から選択される少なくとも１つの塩の水性溶液であり、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
紫外線照射の曝露は、２５０〜４００ｎｍ、好ましくは３３０〜３８０ｎｍ、例えば３６０〜３７０ｎｍの波長の放射線を用いて行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
紫外線照射の曝露は、１〜３００Ｊ/ｃｍ２、好ましくは１０〜２００Ｊ/ｃｍ２、例えば２０〜１００Ｊ/ｃｍ２の放射線量で行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
水性溶媒中の光反応性化合物の濃度は、２〜５０ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、例えば１０〜１５ｍＭである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
水性溶媒中のポリマー化合物の濃度は、０．５〜５０ｍＭ、好ましくは１〜１５ｍＭ、例えば２〜１０ｍＭである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ポリマー基板は、ポリスチレン（ＰＳ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、エポキシ、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ（オキシメチレン）（ＰＯＭ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリエステル、ポリウレタン（ＰＵＲ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリイソプレン、ポリ（ブタジエン）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパリン、アルギン酸塩、アガロース、コラーゲン、ゼラチン、並びにこれらのコポリマーおよびブレンドおよび架橋材から成る群から選択される材料、好ましくはポリスチレンを含んで成る、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ポリマー基板に溶解した検体の吸着を減じるため、好ましくはポリマー基板への疎水性分子および/もしくは親油性分子並びに/または両親媒性分子の吸着を制限するための請求項１〜９のいずれかに記載の方法により作製されたコーティングの使用。
【請求項１１】
前記検体は水性溶液中にある、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記検体は、低分子薬品、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび抗体から成る群から選択され、好ましくは低分子薬品である、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記コーティングを有するポリマー基板に吸着される溶解した検体の量は、該コーティングを有さないポリマー基板に吸着される量の５０％未満に、例えば４０％、３０％、２０％および１０％未満に、好ましくは５％未満にまで減じられる、請求項１０〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
ポリマー基板に溶解した検体の吸着を減じるための方法であって、
単一工程の方法で前記ポリマー基板にコーティングを適用することを含んで成り、
前記ポリマー基板の存在下で水性溶媒に溶解した光反応性化合物およびポリマー化合物を紫外線照射に晒して、光反応性化合物およびポリマー化合物の反応生成物を含んで成る共有結合させたコーティングをポリマー基板上に得ることを含み、
前記光反応性化合物は、ベンゾフェノン誘導体、アセトフェノン誘導体、アントラキノン誘導体、チオキサントン誘導体、およびケトクマリン誘導体から成る群から選択される芳香族ケトンであり、並びに、
前記ポリマー化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡＭ）、デキストラン、およびポリ（オキサゾリン）化合物、並びにエステル、アミン、酸、スクシンイミジル修飾酸、マレイミド、ビオチン化エステル、ビオチン化アミン、ビオチン化酸、およびこれらのビオチン化マレイミドの形態を有する前記ポリマー化合物の誘導体から成る群から選択される、方法。
【請求項１５】
前記検体は水性溶液中にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記検体は、低分子薬品、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび抗体から成る群から選択され、好ましくは低分子薬である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記コーティングを有するポリマー基板に吸着される溶解した検体の量は、該コーティングを有さないポリマー基板に吸着される量の５０％未満に、例えば４０％、３０％、２０％および１０％未満に、好ましくは５％未満にまで減じられる、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【外国語明細書】
2019163462000001.pdf