(57)【要約】【課題】試料中の微量の核酸を回収する技術を提供する。【解決手段】試料中の核酸を配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体と接触させ、前記核酸と前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体との複合体を形成する工程と、前記複合体を回収する工程と、を備える、前記核酸の回収方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の核酸を配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体と接触させ、前記核酸と前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体との複合体を形成する工程と、
前記複合体を回収する工程と、
を備える、前記核酸の回収方法。
【請求項２】
前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体が固相に結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体が、低分子塩基性核酸結合タンパク質若しくはヒストン様タンパク質又はそれらの誘導体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記配列非特異的核酸結合タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記配列非特異的核酸結合タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記配列非特異的核酸結合タンパク質の誘導体は、２以上の前記配列非特異的核酸結合タンパク質を、スペーサーを介して、又はスペーサー介さずに結合させたものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体を備える、核酸回収用キット。
【請求項８】
前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体が固相に結合されている、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体が、低分子塩基性核酸結合タンパク質若しくはヒストン様タンパク質又はそれらの誘導体である、請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
前記配列非特異的核酸結合タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
前記配列非特異的核酸結合タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
前記配列非特異的核酸結合タンパク質の誘導体は、２以上の前記配列非特異的核酸結合タンパク質を、スペーサーを介して、又はスペーサー介さずに結合させたものである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の回収方法及び核酸回収用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床診断や基礎研究等において、試料中の核酸を回収する場合がある。例えば、特許文献１には、核酸を含有する出発材料から核酸を単離するための方法であって、出発材料、カオトロピック物質及び核酸結合性固相を混合し、核酸が結合した固相を液体から分離し、その後、こうして得られた固相−核酸複合体を洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体から溶離することを特徴とする方法が記載されている。この他にも、例えば、減圧環境下で試料中の溶媒を除去することにより、試料中の核酸を濃縮して回収することも行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平２−２８９５９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、試料中の核酸がごく微量の場合、核酸を十分に回収できないことがある。また、試料中の溶媒を除去して核酸を回収する方法では、核酸を確実に回収することができるものの、不純物の混在が問題となる場合がある。そこで、本発明は、試料中の微量の核酸を回収する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下の態様を含む。
［１］試料中の核酸を配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体と接触させ、前記核酸と前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体との複合体を形成する工程と、前記複合体を回収する工程と、を備える、前記核酸の回収方法。
［２］前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体が固相に結合されている、［１］に記載の方法。
［３］前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体が、低分子塩基性核酸結合タンパク質若しくはヒストン様タンパク質又はそれらの誘導体である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記配列非特異的核酸結合タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記配列非特異的核酸結合タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記配列非特異的核酸結合タンパク質の誘導体は、２以上の前記配列非特異的核酸結合タンパク質を、スペーサーを介して、又はスペーサー介さずに結合させたものである、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体を備える、核酸回収用キット。
［８］前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体が固相に結合されている、［７］に記載のキット。
［９］前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体が、低分子塩基性核酸結合タンパク質若しくはヒストン様タンパク質又はそれらの誘導体である、［７］又は［８］に記載のキット。
［１０］前記配列非特異的核酸結合タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［７］〜［９］のいずれかに記載のキット。
［１１］前記配列非特異的核酸結合タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［７］〜［１０］のいずれかに記載のキット。
［１２］前記配列非特異的核酸結合タンパク質の誘導体は、２以上の前記配列非特異的核酸結合タンパク質を、スペーサーを介して、又はスペーサー介さずに結合させたものである、［７］〜［１１］のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、試料中の微量の核酸を回収する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】（ａ）は、実験例１におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例１におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。（ｃ）は、実験例１で調製した配列非特異的核酸結合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［核酸の回収方法］
１実施形態において、本発明は、試料中の核酸を配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体と接触させ、前記核酸と前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体との複合体を形成する工程と、前記複合体を回収する工程と、を備える、前記核酸の回収方法を提供する。
【０００９】
実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、試料中の核酸がごく微量であっても回収することができる。また、本実施形態の方法は、配列非特異的に核酸を回収できることから、例えば、生物のゲノムＤＮＡ等長い核酸を回収する場合も、高いカバー率を得ることができる。すなわち、特定の塩基配列の領域のみでなく、ゲノムＤＮＡの全長にわたって回収することが可能である。
【００１０】
（試料）
本実施形態の方法において、回収対象の核酸が含まれる可能性がある限り、試料は特に限定されない。本発明によれば、回収対象の核酸が微量にしか含まれない試料であってもよい。具体的な試料としては、例えば、臨床診断において感染症患者の原因菌を特定すること等を目的とする場合には、感染症患者由来の体液又は体液由来のサンプル（血液、血清、血漿、汗、唾液、尿等）や患部の拭い液等が挙げられる。あるいは、環境ＤＮＡの解析等を目的とする場合には、河川の水、海水等が挙げられる。
【００１１】
（核酸）
本実施形態の方法において、核酸はＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、核酸アナログであってもよい。また、核酸は一本鎖核酸であってもよく、二本鎖核酸であってもよい。
【００１２】
より具体的な核酸としては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等が挙げられる。核酸の長さは、特に限定されず、例えば１０塩基〜１０１２塩基であってもよく、１０塩基〜１０１０塩基であってもよく、１０塩基〜１０７塩基であってもよい。
【００１３】
（配列非特異的核酸結合タンパク質）
本明細書において、配列非特異的核酸結合タンパク質とは、試料中の核酸に、当該核酸の塩基配列に依存せずに結合するタンパク質を意味する。実施例において後述するように、本実施形態の方法では、配列非特異的核酸結合タンパク質を用いることにより、試料中の微量の核酸を偏りなく回収することができる。
【００１４】
配列非特異的核酸結合タンパク質としては、低分子塩基性核酸結合タンパク質、ヒストン様タンパク質等を用いることができる。なお、低分子塩基性核酸結合タンパク質及びヒストン様タンパク質は一部重複する場合がある。本明細書においては、低分子塩基性核酸結合タンパク質及びヒストン様タンパク質の双方に分類されるタンパク質は、低分子塩基性核酸結合タンパク質として取り扱うものとする。
【００１５】
具体的な低分子塩基性核酸結合タンパク質又はヒストン様タンパク質としては、例えば、スルホロブス・ソルファタリカス（ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＳｓｏ７ｄタンパク質、Ｓｓｏ７ｄタンパク質の類似体（例えば、Ｓｓｈ７ｂ、ＲｉｂｏＰ３、Ｓｔｏ７ｅ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、Ｓａｃ７ａ）、ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ（ＨＭＧＢ）ファミリータンパク質、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）タンパク質、ポリアルギニンモチーフを有するタンパク質、ディノコッカス・ラディオデュランスのＰｐｒＡタンパク質、ディノコッカス・ラディオデュランスのＤｄｒＡタンパク質、結核菌由来のＫｕタンパク質、Ｍａｆ転写因子、Ｍａｆ癌原遺伝子ファミリーにコードされるタンパク質、ヌクレオリン、塩基性ポリペプチド、レトロウィルスヌクレオキャプシドタンパク質、原核生物ヒストン様タンパク質、古細菌ＨＭｆ様タンパク質、ヒストン、これらの相同体、これらの誘導体等が挙げられる。
【００１６】
本明細書において、配列非特異的核酸結合タンパク質の相同体とは、基準となるタンパク質との配列同一性が高いアミノ酸配列を有するタンパク質であって、試料中の核酸に、当該核酸の塩基配列に依存せずに結合するタンパク質を意味する。相同体のアミノ酸配列は、基準アミノ酸配列との配列同一性が７０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更に好ましく、９５％以上であることが特に好ましい。相同体のアミノ酸配列は、基準となるタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００１７】
ここで、基準アミノ酸配列に対する、対象アミノ酸配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列をアラインメントする。ここで、各アミノ酸配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列において、一致したアミノ酸の数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致したアミノ酸の数／対象アミノ酸配列の総アミノ酸数×１００  …（１）
【００１８】
より具体的な配列非特異的核酸結合タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列非特異的核酸結合能を有するタンパク質、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、配列番号２に記載のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列非特異的核酸結合能を有するタンパク質等が挙げられる。
【００１９】
ここで、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、スルホロブス・ソルファタリカスのＳｓｏ７ｄタンパク質のＮ末端から５４アミノ酸のアミノ酸配列（Ｓｓｏ７ｄタンパク質のＣ末端の１０アミノ酸を除いたアミノ酸配列）である。配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質も野生型のＳｓｏ７ｄタンパク質と同様の立体構造を維持し、核酸結合能を有することが知られている。したがって、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するタンパク質は配列非特異的核酸結合能を有しており、本実施形態の方法に好適に利用することができる。
【００２０】
また、配列番号２に記載のアミノ酸配列は、スルホロブス・ソルファタリカスのＳｓｏ７ｄタンパク質の全長である６４アミノ酸からなるアミノ酸配列である。したがって、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するタンパク質は配列非特異的核酸結合能を有しており、本実施形態の方法に好適に利用することができる。
【００２１】
（配列非特異的核酸結合タンパク質の誘導体）
本明細書において、配列非特異的核酸結合タンパク質の誘導体は、配列非特異的核酸結合能を有する限り、上述した配列非特異的核酸結合タンパク質の一部であってもよく、上述した配列非特異的核酸結合タンパク質の相同体の一部であってもよく、上述した配列非特異的核酸結合タンパク質の相同体であってもよく、上述した配列非特異的核酸結合タンパク質の相同体の一部を２分子以上結合させたもの（以下、「結合体」という場合がある。）であってもよい。更に、配列非特異的核酸結合タンパク質の誘導体は、配列非特異的核酸結合能を有する限り、付加的なペプチド領域を有していてもよい。
【００２２】
また、結合体は、一種類の配列非特異的核酸結合タンパク質を結合したものであってもよく、複数種類の配列非特異的核酸結合タンパク質を結合したものであってもよい。また、結合体において、配列非特異的核酸結合タンパク質同士はスペーサーを介して結合していてもよく、スペーサーを介さずに結合していてもよい。
【００２３】
スペーサー（リンカー）は、例えば３〜２０個程度のアミノ酸からなるペプチドであってもよいし、化学リンカーであってもよい。化学リンカーとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリエステル、ポリウレタン、多糖類、これらのコポリマー等が挙げられる。
【００２４】
スペーサーがペプチドである場合、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号３）、ＳＧＧＧＧ（配列番号４）等のアミノ酸配列を有するペプチド等を用いることができる。スペーサーは、ＧＧＧＧＳ又はＳＧＧＧＧを２個以上連結したものであってもよく、１つ以上のＳ（セリン）に代えてＴ（スレオニン）を用いてもよい。また、配列非特異的核酸結合タンパク質が、スペーサーとの連結部にＳ又はＴを有する場合、スペーサーの末端のＳ又はＴを省略してもよい。
【００２５】
また、３分子以上の配列非特異的核酸結合タンパク質が結合している結合体の場合、１つの結合体の内部にスペーサーを介した結合とスペーサーを介さない結合の双方が含まれていてもよい。
【００２６】
また、結合体において、配列非特異的核酸結合タンパク質の結合様式は特に限定されず、例えば、直列に結合していてもよいし、樹状に結合していてもよいし、星状（放射状）に結合していてもよい。また、結合体は環を形成していてもよい。
【００２７】
実施例において後述するように、具体的な結合体としては、例えば、スルホロブス・ソルファタリカスのＳｓｏ７ｄタンパク質を、間にフレキシブルなリンカーを挟んで３分子直列に連結したタンパク質等が挙げられる。フレキシブルなリンカーとしては、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６）等が挙げられる。
【００２８】
（核酸の回収方法）
以下、本実施形態の方法における各工程を説明する。上述したように、本実施形態の核酸の回収方法は、試料中の核酸を配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体と接触させ、前記核酸と前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体との複合体を形成する第１工程と、前記複合体を回収する第２工程とを備える。
【００２９】
《第１工程》
第１工程では、試料中の核酸を配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体と接触させ、前記核酸と前記配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体との複合体を形成する。
【００３０】
試料としては、上述したものを用いることができる。試料は、生化学実験用のチューブ等の容器に収容されていると操作しやすい。試料中の核酸を配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体と接触させるためには、試料が収容された容器に、上述した配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体を添加するとよい。更に、試料が収容された容器に、上述した配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体を添加した後、容器を振とうする等して十分に撹拌することが好ましい。
【００３１】
ここで、配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体は固相に結合されていることが好ましい。これにより、試料中の核酸を回収することが容易になる。
【００３２】
固相としては、粒子、磁性粒子、メンブレン、繊維、基板、容器の表面コート等が挙げられるがこれらに限定されない。また、配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体を固相に結合させる方法は特に限定されず、例えば非特異吸着による方法、化学リンカーを用いた方法等が挙げられる。
【００３３】
試料中の核酸を配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体と接触させた結果、核酸と配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体との複合体が形成される。
【００３４】
《第２工程》
第２工程では、第１工程で形成された、核酸と配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体との複合体を回収する。
【００３５】
第２工程は、配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体が固相に結合されていると容易に行うことができる。例えば、固相が粒子である場合には、遠心分離等により固相及び固相に結合した複合体を回収することができる。特に、粒子が磁性粒子である場合には、マグネティックスタンド等を用いて複合体を回収することができる。
【００３６】
また、固相がメンブレンや繊維である場合には、当該メンブレンや繊維を回収することにより複合体を回収することができる。また、固相が容器の表面コートである場合には、容器の内容物を除去することにより、容器の表面に結合した複合体を回収することができる。
【００３７】
複合体には、試料中に含まれていた核酸が含まれている。したがって、複合体を回収することにより、試料中に微量に含まれていた核酸を回収することができる。複合体ごと回収された核酸は、適当な緩衝液に再懸濁することにより、複合体から溶出させてもよい。また、複合体ごと回収された核酸を増幅反応液に懸濁し、そのまま増幅反応に供することもできる。
【００３８】
複合体の再懸濁は、公知の方法にしたがって行うことができる。例えば、固相として磁性粒子を用いた場合、容器の外側に磁石を配置して磁性粒子を捕捉しながら溶液を除去し、再懸濁用の溶液を容器に加えることによって複合体を再懸濁することができる。
【００３９】
［核酸回収用キット］
１実施形態において、本発明は、配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体を備える、核酸回収用キットを提供する。
【００４０】
本実施形態のキットを用いることにより、上述した核酸の回収方法を好適に実施することができる。
【００４１】
本実施形態のキットにおいて、配列非特異的核酸結合タンパク質、配列非特異的核酸結合タンパク質の誘導体は上述したものと同様であり、低分子塩基性核酸結合タンパク質であってもよく、低分子塩基性核酸結合タンパク質の誘導体であってもよく、ヒストン様タンパク質であってもよく、ヒストン様タンパク質の誘導体であってもよい。ここで、低分子塩基性核酸結合タンパク質、ヒストン様タンパク質、誘導体については上述したものと同様である。
【００４２】
本実施形態のキットにおいて、より具体的な配列非特異的核酸結合タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列非特異的核酸結合能を有するタンパク質、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、配列番号２に記載のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列非特異的核酸結合能を有するタンパク質等が挙げられる。
【００４３】
本実施形態のキットにおいて、前記配列非特異的核酸結合タンパク質の誘導体は、上述したものと同様であり、２分子以上の前記配列非特異的核酸結合タンパク質を、スペーサーを介して、又はスペーサー介さずに結合させた、結合体であってもよい。ここで、スペーサー、結合体、結合体の結合様式は上述したものと同様である。
【００４４】
本実施形態のキットにおいて、配列非特異的核酸結合タンパク質又はその誘導体は固相に結合されていることが好ましい。ここで、固相、固相との結合様式については上述したものと同様である。
【００４５】
本実施形態のキットは、さらに、核酸溶出液、再懸濁用緩衝液、増幅反応液、反応容器等、核酸回収に用いられる試薬、緩衝液、器具等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００４６】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４７】
［実験例１］
（配列非特異的核酸結合タンパク質の調製１）
配列非特異的核酸結合タンパク質として、古細菌の一種である、スルホロブス・ソルファタリカス由来のタンパク質であるＳｓｏ７ｄタンパク質を使用した。本実験例では、Ｓｓｏ７ｄタンパク質を３分子連結した三量体を調製した。
【００４８】
まず、スルホロブス・ソルファタリカスのＳｓｏ７ｄタンパク質を、間にフレキシブルなリンカー（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ、配列番号６）を挟んで３分子直列に連結したタンパク質（以下、「（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質」という場合がある。）を設計した。設計した（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００４９】
続いて、（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質をコードする塩基配列をＥｕｒｏｆｉｎ社のウェブサイトで設計した。設計した塩基配列は、大腸菌での発現効率が高まるようコドン頻度を最適化した。続いて、設計した塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ断片の合成を外注（Ｅｕｒｏｆｉｎ社）し、設計した遺伝子配列を含むプラスミドを得た。
【００５０】
続いて、得られたプラスミドの制限酵素処理し、設計した塩基配列を有するＤＮＡ断片を切り出した。続いて、切り出したＤＮＡ断片をＴＡＧｚｙｍｅ  ｐＱＥ−２ベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）に導入し、大腸菌株であるＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。この結果、得られた大腸菌は、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培地に添加することにより、Ｎ末端側にヒスチジンタグ（ＭＫＨＨＨＨＨＨＨＭ、配列番号８）を有する（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質が発現誘導されるものとなった。作製した（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号９に示す。
【００５１】
図１（ａ）は、ＩＰＴＧを培地に添加して（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質を発現誘導した大腸菌の菌体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色した結果を示す写真である。図１（ａ）中、レーン１は発現誘導前の菌体の結果であり、レーン２は発現誘導後の菌体の結果であり、レーン３は発現誘導後の菌体破砕液を遠心分離した上清の結果であり、レーン４は発現誘導後の菌体破砕液を遠心分離した沈殿の結果である。
【００５２】
また、図１（ｂ）は、大腸菌の菌体をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ヒスチジンタグ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質の発現を検出した結果を示す写真である。図１（ｂ）中、レーン１は発現誘導前の菌体の結果であり、レーン２は発現誘導後の菌体の結果である。
【００５３】
その結果、ＩＰＴＧによる発現誘導後に、（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質の発現が確認された。また、（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質は、菌体破砕液を遠心分離した沈殿に最も大量に含まれることが明らかとなった。この結果は、（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質が大腸菌の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）中に存在することを示す。
【００５４】
そこで、塩酸グアニジン溶液を用いた変性条件下で大腸菌を破砕し、ニッケルセファロースカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質を精製した。
【００５５】
図１（ｃ）は精製した（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。
【００５６】
［実験例２］
（配列非特異的核酸結合タンパク質の磁性粒子表面への固定１）
実験例１で調製した（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質を、磁性粒子であるＦＧビーズ（型式「ＴＡＳ８８４８Ｎ１１５０」、多摩川精機社）の表面に固定化し、（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質で修飾された磁性粒子を調製した。
【００５７】
具体的には、まず（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質５０μｇと磁性粒子１ｍｇとを混合し、３７℃で２０時間反応させた。その後、１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中で、３７℃、２０時間撹拌することにより磁性ビーズをマスキングした。この結果、（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質で修飾された磁性粒子（以下、「（Ｓｓｏ７ｄ）３磁性粒子」という場合がある。）が得られた。
【００５８】
［実験例３］
（ゲノムＤＮＡの回収１）
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）のゲノムＤＮＡを様々な濃度に希釈した試料を用意し、各試料からＭＲＳＡのゲノムＤＮＡの回収を行った。
【００５９】
まず、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５株を培養し、ゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、ゲノムＤＮＡを下記表１に示す濃度となるように１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するリン酸バッファー（ＰＢＳ）で希釈し、サンプル１〜５を調製した。
【００６０】
続いて、各サンプル０．２ｍＬが入ったチューブに、実験例２で調整した（Ｓｓｏ７ｄ）３磁性粒子を５μＬずつ添加して混合した。続いて、各チューブをチューブシェーカーで振とうしながら、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、マグネティックスタンドを用いて各チューブ中の磁性粒子をそれぞれ回収し、上清を除去した。続いて、各チューブにＰＢＳを２．５μＬずつ添加して（Ｓｓｏ７ｄ）３磁性粒子を再懸濁した。
【００６１】
続いて、市販のキット（型式「ＴｒｕｅＰｒｉｍｅ  ＲＣＡ  ｋｉｔ」、ＳＹＧＮＩＳ社）を用いたローリングサークル（Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＲＣＡ）増幅法により、各チューブ内のＤＮＡを増幅した。なお、使用したキットは、プライマーの代わりにＴｔｈ  ＰｒｉｍＰｏｌプライマーゼと呼ばれるＤＮＡプライマーゼを使用し、プライマー由来のバイアスを生じることなく鋳型ＤＮＡを均一に増幅するものであった。
【００６２】
その後、各チューブ内で増幅された増幅産物の濃度を市販のキット（型式「Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ」、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）を用いて測定した。測定された増幅産物の濃度を下記表１に示す。
【００６３】
【表１】
2019106938.tif 000002
【００６４】
その結果、サンプル４から回収したＭＲＳＡのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅産物が得られたことが明らかとなった。この結果は、（Ｓｓｏ７ｄ）３磁性粒子を用いることにより、１コピー／０．２ｍＬという低濃度の場合にもＭＲＳＡのゲノムＤＮＡを回収することができたことを示す。
【００６５】
［実験例４］
（配列非特異的核酸結合タンパク質の調製２）
本実験例では、Ｓｓｏ７ｄタンパク質の単量体を調製した。まず、実験例１で作製した、（Ｓｓｏ７ｄ）３タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを制限酵素処理し、Ｓｓｏ７ｄタンパク質の単量体をコードするＤＮＡ断片を切り出した。続いて、切り出したＤＮＡ断片をＴＡＧｚｙｍｅ  ｐＱＥ−２ベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）に導入し、大腸菌株であるＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。この結果、得られた大腸菌は、ＩＰＴＧを培地に添加することにより、Ｎ末端側にヒスチジンタグ（ＭＫＨＨＨＨＨＨＨＭ、配列番号８）を有するＳｓｏ７ｄタンパク質が発現誘導されるものとなった。作製したＳｓｏ７ｄタンパク質（単量体）のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。続いて、実験例１と同様にして、大腸菌にＳｓｏ７ｄタンパク質の単量体を発現させ、精製した。
【００６６】
［実験例５］
（配列非特異的核酸結合タンパク質の磁性粒子表面への固定２）
実験例４で調製したＳｓｏ７ｄタンパク質の単量体を、磁性粒子であるＦＧビーズ（型式「ＴＡＳ８８４８Ｎ１１５０」、多摩川精機社）の表面に固定化し、Ｓｓｏ７ｄタンパク質で修飾された磁性粒子を調製した。
【００６７】
具体的には、まずＳｓｏ７ｄタンパク質５０μｇと磁性粒子１ｍｇとを混合し、３７℃で２０時間反応させた。その後、１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中で、３７℃、２０時間撹拌することにより磁性ビーズをマスキングした。この結果、Ｓｓｏ７ｄタンパク質の単量体で修飾された磁性粒子（以下、「Ｓｓｏ７ｄ磁性粒子」という場合がある。）が得られた。
【００６８】
［実験例６］
（ゲノムＤＮＡの回収２）
実験例２と同様にして調製した（Ｓｓｏ７ｄ）３磁性粒子（三量体）及び実験例５で調製したＳｓｏ７ｄ磁性粒子（単量体）を用いて、ＭＲＳＡのゲノムＤＮＡを希釈した試料から、ゲノムＤＮＡの回収を行った。
【００６９】
まず、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５株を培養し、ゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、ゲノムＤＮＡを下記表２に示す濃度となるように１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するリン酸バッファー（ＰＢＳ）で希釈したサンプルを調製した。
【００７０】
続いて、サンプル０．１ｍＬが入ったチューブに、（Ｓｓｏ７ｄ）３磁性粒子（三量体）又はＳｓｏ７ｄ磁性粒子（単量体）をそれぞれ５μＬずつ添加して混合した。続いて、各チューブをチューブシェーカーで振とうしながら、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、マグネティックスタンドを用いて各チューブ中の磁性粒子をそれぞれ回収し、上清を除去した。続いて、各チューブにＰＢＳを２．５μＬずつ添加して（Ｓｓｏ７ｄ）３磁性粒子を再懸濁した。
【００７１】
続いて、市販のキット（型式「ＴｒｕｅＰｒｉｍｅ  ＲＣＡ  ｋｉｔ」、ＳＹＧＮＩＳ社）を用いたローリングサークル（Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＲＣＡ）増幅法により、各チューブ内のＤＮＡを増幅した。
【００７２】
その後、各チューブ内で増幅された増幅産物の濃度を市販のキット（型式「Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ」、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）を用いて測定した。測定された増幅産物の濃度を下記表２に示す。
【００７３】
【表２】
2019106938.tif 000003
【００７４】
その結果、Ｓｓｏ７ｄ磁性粒子（単量体）を用いた場合においても、（Ｓｓｏ７ｄ）３磁性粒子（三量体）を用いた場合と同様に、試料中の微量の核酸を回収できたことが明らかとなった。
【００７５】
［実験例７］
（回収したゲノムＤＮＡのカバー率の検討）
実験例３でローリングサークル増幅法により増幅した増幅産物の塩基配列を、次世代シークエンサー（型式「Ｍｉｓｅｑ」、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてシークエンスした。続いて、得られたコンティグデータをアセンブルし、データベースに登録されているＭＲＳＡ  Ｍ３１５株の全ゲノム配列と比較し、カバー率を算出した。結果を下記表３に示す。
【００７６】
【表３】
2019106938.tif 000004
【００７７】
その結果、ゲノムＤＮＡを１０コピー以上含む試料（サンプル１〜３）から、（Ｓｓｏ７ｄ）３磁性粒子を用いて回収したＤＮＡは、ＭＲＳＡ  Ｍ３１５株の全ゲノムの９０％以上のカバー率を示すことが明らかとなった。
【００７８】
この結果は、（Ｓｓｏ７ｄ）３磁性粒子を用いて回収することにより、核酸断片の塩基配列によらず、偏りなく核酸を回収することができることを示す。
【００７９】
また、ゲノムＤＮＡを１コピー含む試料（サンプル４）から（Ｓｓｏ７ｄ）３磁性粒子を用いて回収したＤＮＡ中は、ＭＲＳＡ  Ｍ３１５株が保有する薬剤耐性遺伝子である、ｓｐｃ＿１、ｂｌａＺ＿３４、ｍｅｃＡ、ｅｒｍ（Ａ）を含み、更に黄色ブドウ球菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡも含むことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明によれば、試料中の微量の核酸を回収する技術を提供することができる。
【図１】
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【配列表】
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