(57)【要約】      （修正有）【課題】広範囲の粒子を個々にかつ連続的に検出できる粒子検出装置、及び粒子検出方法を提供する。【解決手段】粒子がその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離される、粒子分離流路１１０と、粒子分離流路１１０に分岐して接続された２以上の粒子回収流路１０２ａ、１０２ｂとを含む粒子検出装置であって、粒子回収流路１０２ａ、１０２ｂが、アパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部１０３ａ、１０３ｂを備えることを特徴とする。【選択図】図１
2019117064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子がその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離される粒子分離流路と、前記粒子分離流路に分岐して接続された２以上の粒子回収流路とを含む粒子検出装置であって、前記粒子回収流路がアパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部を備えることを特徴とする、前記粒子検出装置。
【請求項２】
各粒子回収流路にある粒子検出部のアパーチャで検出できる粒子径範囲が互いに異なることを特徴とする、請求項１に記載の粒子検出装置。
【請求項３】
各粒子回収流路にある粒子検出部のアパーチャで検出できる粒子径範囲の一部が、互いに重複していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の粒子検出装置。
【請求項４】
前記粒子回収流路の、本数、分岐部の形状、幅、高さ、長さのうち少なくとも１つのパラメーターが調整され、ある一定以上の大きさの粒子が混入しない流路構造であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の粒子検出装置。
【請求項５】
前記粒子分離流路に粒子拡散流路又はピンチドフローフラクショネーションの原理を利用した流路を形成することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の粒子検出装置。
【請求項６】
流体中に含まれる粒子を検出する方法であって、
粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離し、
分離された粒子を２以上の流路に分断し、
前記流路に設置されたアパーチャを挟んで配置された電極を含む電気検出器で前記粒子を検出することを
特徴とする、前記方法。
【請求項７】
前記電気検出器の検出できる粒子径範囲が設置している流路によって異なることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記電気検出器の検出できる粒子径範囲の一部が設置している流路によって互いに重複していることを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記流路の本数、分岐部の形状、幅、高さ、長さのうち少なくとも１つのパラメーターが調整され、ある一定以上の大きさの粒子が混入しない流路構造とすることで、粒子を２以上の流路に分断することを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離工程が、ピンチドフローフラクショネーションの原理を利用して、粒子を分離することを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子検出装置及び粒子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
粒子を個々に１つずつ測定することで、マイノリティーな粒子群を正確に検出可能な技術として、電気的検出を用いるコールター法（電気的検知帯法；以下ＥＳＺ）（例えば、非特許文献１参照）が知られている。この手法は、各検出手段から得られる情報（シグナル）が、各粒子に対して１対１で対応しているため粒子個々の評価をすることが可能であり、数的に含まれる割合の少ない粒子でも正確に測定が可能となるが、測定できる粒子径範囲（ダイナミックレンジ）が比較的狭いという課題がある。例えば、ＥＳＺではアパーチャと呼ばれる小さい穴に粒子を通過させた際に発生する電気的シグナルを用いて粒子径を算出するが、一般にそのダイナミックレンジはアパーチャ径の２〜６０％といわれている。また、ＥＳＺでは、アパーチャよりも大きい粒子が存在した場合、その粒子によりアパーチャが閉塞し、その後測定ができなくなるため、アパーチャ径以下の口径を持つフィルターにより大きい粒子を除去してからの測定が必要となる。しかしながら、フィルタリング操作では、フィルター基材への粒子の吸着が少なからず発生するため、サンプルの一部のロスが懸念される。また、この時点で定量的な結果を得られる可能性が減ってしまうという課題もあるため、サンプル中の粒子径分布を正確に測定した場合は、フィルタリング操作を行うことは望ましくない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｒ．Ｗ．Ｄｅ  Ｂｌｏｉｓ．ｅｔ  ａｌ、Ｔｈｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｖｏｌｕｍｅ  ４１、Ｎｕｍｂｅｒ  ７、ｐｐ９０９−９１６（１９７０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、広範囲の粒子を個々にかつ連続的に検出できる粒子検出装置、及び粒子検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題に鑑み、粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離した後、検出器で検出することで広範な分布を持つ粒子試料測定が可能となることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、粒子がその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離される粒子分離流路と、前記粒子分離流路に分岐して接続された２以上の粒子回収流路とを有する粒子検出装置であって、前記粒子回収流路が、アパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部を備えることを特徴とする、粒子検出装置に関する。
【０００７】
また、本発明において、各粒子回収流路にある粒子検出部のアパーチャで検出できる粒子径範囲は互いに異なっていてもよく、アパーチャで検出できる粒子径範囲の一部が互いに重複していてもよい。
【０００８】
さらに、本発明において、前記粒子回収流路の本数、分岐部の形状、幅、高さ、長さのうち少なくとも１つのパラメーターが調整され、ある一定以上の大きさの粒子が混入しない流路構造とする。これにより、アパーチャの詰まりを避けることができる。また、これらのパラメーターを調整することで、各粒子回収流路のアパーチャにより検出可能な粒子径の粒子を粒子回収流路へと流入させることができる。
【０００９】
さらに、本発明において、前記粒子分離流路は、ピンチドフローフラクショネーションの原理を利用した流路構造としてもよい。具体的に粒子分離流路に、ピンチドフローフラクショネーションの原理を利用した流路構造を形成することができる。これにより、流体の流れに対して、垂直方向に粒子径に応じて粒子の分離が可能となる。
【００１０】
また、本発明の別の態様として、流体中に含まれる粒子を検出する方法であって、
粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離し、
分離された粒子を２以上の流路に分断し、
前記流路に設置されたアパーチャを挟んで配置された電極を含む電気検出器で前記粒子を検出することを特徴とする方法も挙げられる。
【００１１】
前記方法において、前記電気検出器の検出できる粒子径範囲が設置している流路によって異なっていてもよく、検出できる粒子径範囲の一部が設置している流路によって互いに重複していてもよい。また、本数、分岐部の形状、幅、高さ、長さのうち少なくとも１つのパラメーターを調整し、ある一定以上の大きさの粒子が混入しない流路構造とすることで、粒子を２以上の流路に分断したり、ピンチドフローフラクショネーションの原理を利用して粒子を分離してもよい。本発明の方法は、一例として本発明の粒子検出装置を駆動することにより実施される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、より広範な粒子径分布を持つサンプルを精度よく連続的に検出する事ができ、バッチ処理の分離技術と比較して、大量な粒子サンプルの測定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１（ａ）（ｂ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０へ水力学的ろ過（Hydrodynamic Filtration：ＨＤＦ）を応用したものを示す。図１（ａ）は、マイクロチップ１０の上面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）における領域１９０の拡大図である。
【図２】図２（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子検出部１０３を直列に２つ配置した場合の態様を示す。図２（ｂ）は、２つの粒子検出部１０３を１つの粒子が連続的に通過した場合の、測定している電流値の経時変化の様子を模式的に示した図で、上側のグラフが上流側の粒子検出部１０３により測定されたもので、下側のグラフが下流側の粒子検出部１０３により測定されたことを示す。ここで、便宜上、２つの粒子検出部１０３のグラフの縦軸の位置をずらしたが、実際は粒子が通過しないときのベースラインとなる電流値はほぼ同一である。
【図３】図３（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、アパーチャを直列に２つ配置した場合であり、図２とは異なり、電極を１対のみ用いた場合の態様を示す。図３（ｂ）は、２つのアパーチャを粒子が連続的に通過した場合の測定している電流値の経時変化の様子を模式的に示した図である。
【図４】図４（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、１つの粒子回収流路１０２に対して複数の粒子検出部１０３が並列に設置された場合の態様を示す。図４（ｂ）は、図４（ａ）の等価回路を示す。
【図５】図５（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、１つの粒子回収流路１０２に対して複数の粒子検出部１０３が並列に設置された場合の態様を示し、複数の粒子検出部１０３が、流体的に下流側の電極から電圧を印加することで、複数の粒子検出部１０３間での電気的干渉を低減する態様を示す。図５（ｂ）は、図５（ａ）の等価回路を示し、複数の粒子回収流路１０２が独立していることを示す。
【図６】図６は、本発明の一実施形態を示す図であり、１つの粒子回収流路１０２に対して複数のアパーチャが並列に設置され、より低コストな装置として利用できる態様を示す。
【図７】図７は、中継流路６０と電極挿入口５９を用いた、より安価に粒子検出部１０３を作製するための態様を示している。
【図８】図８（ａ）〜（ｃ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０でＨＤＦを応用した態様を示す。図８（ａ）は、粒子回収流路１０２が２つのものを示し、図８（ｂ）は、粒子回収流路１０２が３つのものを示し、図８（ｃ）は、粒子回収流路１０２が３つで粒子分離流路１１０に分岐流路１０５をもつものを示す。
【図９】図９（ａ）は、図８（ｂ）の分岐部１１０Ａでの流体の流れを示す図であり、図９（ｂ）は、図９（ａ）の直線流路部分の拡大図を示す。
【図１０】図１０（ａ）は、層流条件下における直線流路内での粒子の流れを示す図であり、図１０（ｂ）は、粒子拡散流路１１０Ｂでの粒子の流れの軌道を示す。
【図１１】図１１（ａ）〜（ｃ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０でＰＦＦを応用した態様を示す。図１１（ａ）は、粒子回収流路１０２が２つのものを示し、図１１（ｂ）は、粒子回収流路１０２が３つのものを示し、図１１（ｃ）は、図１１（ａ）（ｂ）の領域２１の拡大図を示す。
【図１２】図１２（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０で非対称ＰＦＦを応用した態様を示す。図１２（ｂ）及び（ｃ）は、図１２（ａ）の領域２１の拡大図を示す。
【図１３】図１３（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０で非対称ＰＦＦを応用し、拡大流路１７の狭窄流路壁面１６ｂ側の壁面が徐々に拡大する場合の態様を示す。図１３（ｂ）は、図１３（ａ）の領域２１の拡大図を示す。
【図１４】図１４は、本発明の一実施形態を示す図であり、２つのアパーチャで粒子検出部１０３が構成され、それぞれのアパーチャの下流がアウトレットへ接続されており、各アウトレットが電極挿入口５９としても機能するようにした態様を示す。
【図１５】図１５（ａ）は、実施例１で用いたマイクロチップ１０の概要図を示す。図１５（ｂ）は、図１５（ａ）の領域２１の拡大図を示す。
【図１６】図１６は、実施例１において粒子検出部１０２ａで検出された、０．１、０．２μｍ粒子の電気的シグナルの一例を示した図である。
【図１７】図１７は、実施例１において粒子検出部１０２ｃで検出された、０．２、０．５μｍ粒子の電気的シグナルの一例を示した図である。
【図１８】図１８（ａ）（ｂ）は、実施例１において粒子検出部１０２ｂで検出された、０．５、１．０、２．０μｍ粒子の電気的シグナルの一例を示した図であり、図１８（ａ）は０．５、１．０μｍ粒子を、図１８（ｂ）は２．０μｍ粒子の電気的シグナルを示している。
【図１９】図１９は、実施例１における測定結果から作成された、混合粒子サンプルの粒度分布を示す。
【図２０】図２０は、比較例１における測定結果から作成された、混合粒子サンプルの粒度分布を示す。
【図２１】図２１は、実施例２における測定結果から作成された、抗体凝集体サンプルの粒度分布を示す。
【図２２】図２２（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０でＨＤＦによる粒子分離後に、３つの粒子回収流路と、各粒子回収流路に２つ設置された粒子検出部を備える態様を示す。図２２（ｂ）は、領域２１の拡大図を示す。
【図２３】図２３は、実施例３における測定結果から作成された、混合粒子サンプルの粒度分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態について、図面を用いて詳細に説明する。但し本発明は異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるものでは無い。
【００１５】
本発明による粒子検出装置の装置構成の一実施例を示す模式図である図１をもとに本発明の実施形態についての詳細を説明する。マイクロチップ１０における流路の断面は、流路構造の作製上の容易さから、矩形であることが望ましいが、円形や楕円形、多角形などの断面であってもよく、また部分的に矩形以外の形状であってもよい。また、流路高さは作製の容易さから均一であることが好ましいが、部分的に深さが異なっていてもよい。
【００１６】
粒子を含むサンプルは、インレット１４から導入され、送液部によって流路下流へと送液され、粒子導入流路１０１、粒子分離流路１１０、粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂ、それぞれ対応する粒子検出部１０３ａまたは１０３ｂを通過して、アウトレット１０４ａまたは１０４ｂへ流出する。粒子分離流路１１０において、粒子径に応じて粒子が流体の流れに対して垂直方向へ分離され、分離された粒子が、粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂへと流れる。粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂを経て到達した粒子検出部１０３ａ、１０３ｂにおいて、電気的検出が行われる。この時、粒子検出部１０３ａ、１０３ｂの内部は電解質を含む溶液で満たされ、電極５４ａ、５４ｂにそれぞれ接続された導線５５を介して電気測定器５６、電源５７に接続されている。粒子検出時は、電源５７により任意の値の電流が流れており、アパーチャ５３を介した閉回路ができている。さらに電気測定器５６は解析部６１に接続されており、電気測定器５６から得られた検出シグナルを解析部６１で計算し、粒子径分布を作成する。
【００１７】
粒子を含むサンプルは、測定対象とする粒子を含んだ流体である。本発明における粒子とは、粒径が１ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１０μｍの範囲にあり、例えば、核酸、タンパク質、小胞、細胞外小胞、無機粉末、金属コロイド、高分子粒子、ウイルス、細胞、細胞塊、タンパク質凝集体などが含まれる。また本発明における流体は、導電性の流体であり、好ましくは電解質を含む水溶液であるが、導電性のオイルや油を用いることもできる。
【００１８】
インレット１４は、粒子を含むサンプルを保持できる構造であればよく、凹型構造であることが好ましい。また材質としては、溶出物が少ない金属やガラス、セラミクスを用いてもよいが、安価に製造するために高分子材料で形成されることが好ましい。粒子導入流路１０１は、インレット１４と、粒子分離流路１１０との間に形成される。粒子導入流路１０１は、粒子分離流路１１０における粒子の分離を補助するために配置されるが、マイクロチップ１０を小型化するために省いてもよい。
【００１９】
送液部は、シリンジポンプやペリスタポンプ、圧送ポンプ等の圧力勾配により送液させる方法を用いてもよいし、マイクロチップ１０の流路断面における不均一な速度分布を抑制するために電気浸透流ポンプを用いてもよい。この場合、ポンプから接続された配管はインレット１４へ直接接続することでインレット１４内に保持されているサンプルへ圧力を印加することで送液する。また、アウトレットへ配管を介してポンプを接続し、陰圧をかけることによりマイクロチップ１０の流路内の流体を吸引させることで送液してもよい。さらに、インレット１４の液面を、アウトレット１０４ａまたはアウトレット１０４ｂの液面よりも高くすることで、液面差により送液してもよく、この場合送液部は不要となる。より定量的な測定をするためには圧力勾配により粒子を通過させた方が好ましく、脈動がより少ない圧送ポンプで送液する態様が最も好ましい。
【００２０】
送液部の流量は、流路の断面積やアパーチャの断面積により任意の値に設定することが好ましく、一例として、０．１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの間に設定することが好ましい。
【００２１】
粒子回収流路１０２は、測定可能粒子径範囲（ダイナミックレンジ）を拡げる観点で２以上設ける。ここで、粒子検出部１０３は粒子回収流路１０２の内部または下流に設けられており、粒子回収流路１０２へ流入してきた粒子を検出するために用いられる。１つの粒子回収流路１０２に対して少なくとも１つの粒子検出部１０３が設けられている必要があり、２以上の粒子検出部１０３が設けられていてもよい（図２〜６）。また、測定可能粒子径範囲を外れる粒子を回収する流路をさらに設けることもできる。１つの粒子回収流路１０２に対して２以上の粒子検出部１０３が設けられた態様においては、前記２以上の粒子検出部１０３は直列に配置されてもよい（図２、３）。例えば２つの粒子検出部１０３が直列に配置された場合、２つの粒子検出部１０３を通過した同一の粒子から生成されたシグナルの間隔から、流路内の粒子の通過速度を算出することができ、粒子の通過速度は回収流路１０２の流量に一般に比例するため、回収流路内の流体の流量を見積もることが可能となる。この時、図２に示す通り電極に印加する電圧は、上流側のアパーチャ５３’の上流側の電極と、下流側のアパーチャ５３’’の下流側の電極から印加する態様が好ましい。上流側のアパーチャ５３’の下流側の電極５４ｂ’または下流側のアパーチャ５３’’の上流側の電極５４ａ’’から電圧を印加した場合、前記２つの電極間で電圧降下が生じ、一方のアパーチャの電流値変化が、他方のアパーチャの電流値へと影響を及ぼすため、それらの影響を考慮しながら測定する必要がある。従って、２つまたは２つ以上のアパーチャを含む粒子検出部１０３を用いる場合、図３に示す通り上流側のアパーチャ５３’の上流側の電極５４ａ’と、下流側のアパーチャ５３’’の下流側の電極５４ｂ’’のみを用いて測定してもよい。なお、図７に示すように、粒子検出流路の上流と下流それぞれへ、中継流路６０を介して流体的かつ電気的にアパーチャと接続している電極挿入口５９を設け、ここへ電極５４を浸漬させることでＥＳＺによる粒子検出を行ってもよい。
【００２２】
また、１つの粒子回収流路１０２に対して２つ以上の粒子検出部１０３が設けられた態様において、前記２以上の粒子検出部１０３は並列に配置されてもよい（図４〜６）。本態様により粒子検出部１０３の並列化された数に比例して処理量が増加するという優れた効果が得られる。この時、電気的に検出するための電極５４は、各アパーチャを挟むように配置され、粒子検出部１０３の数の２倍あれば測定は可能である。一方で、図６に示したように、各アパーチャに対して上流側に１本、下流側に粒子検出部１０３の数の分だけ電極を配置した態様でも測定は可能であり、電極の数を減らすことによる低コスト化という観点からは、こちらの態様の方が好ましい。ここで、粒子検出部１０３を並列化し、各アパーチャへ同時に電圧を印加した場合、各アパーチャを挟むように配置される複数の電極対へ電圧を同時に印加すると、図４（ａ）に示すように、等価回路は複雑なものとなり、あるアパーチャの電流値変化が、他のアパーチャの電流値へと影響を及ぼすため、それら影響を考慮する必要がある。一方で、電圧を各アパーチャで個々に印加し、それぞれ個別に検出したい場合、測定しないアパーチャをグラウンド、シャーシへ接続せず、開回路の状態にすることで実施可能であり、前述の他のアパーチャへの影響はなくなる。この時、開回路の状態にするために、電極５４と電源５７の間にスイッチング回路を用いてもよく、リレー方式やフォトモス方式によるもので開回路の状態にしてもよい。粒子検出部１０３は、測定時に電磁ノイズが極力影響しない測定系を構築する方が好ましく、この点でスイッチング回路には、電磁石を用いるリレー方式よりも、フォトモスセンサーのような光電流を用いた方式の方が好ましい。但し、図５の通り、アパーチャの下流側の電極から上流側へ向けて電圧を印加した場合、あるアパーチャの電流値変化が、他のアパーチャの電流値へと影響を及ぼさないため、本態様を用いてもよい。
【００２３】
粒子検出部１０３は、アパーチャ５３と電気検出器とを含む。アパーチャ５３は、流路内に形成された流路直径よりも小さい穴を指し、粒子検出流路６２とアパーチャ形成構造５２により規定される。アパーチャの断面形状は、その製造工程によって種々の形状をとってもよく、エッチングやレーザー照射による加工では円、楕円の形状をとり、フォトリソグラフィーとソフトリソグラフィーによるポリジメチルシロキサン（以下ＰＤＭＳ）等の高分子材料による成形の場合は矩形となる。アパーチャの断面積は、測定する粒子よりも大きければよいが、一般にＥＳＺで測定可能な粒子径範囲は、アパーチャ断面積の２〜６０％といわれているため、流入してくると想定される粒子の大きさに応じて設計する必要がある。また、図２、３及び１４に示すように、２つのアパーチャで粒子検出部１０３が構成されてもよい。また、図４〜６に示すように、複数の粒子検出部を備えることで複数のアパーチャを構成し、それぞれのアパーチャの下流がアウトレットへ接続されており、各アウトレットが電極挿入口５９としても機能するようにした構成としてもよい。この場合、アパーチャの体積が凡そ同一であれば各アパーチャから得られるシグナルは凡そ同一となる。すなわち、各アパーチャ上流の回収流路へ流れてきた粒子全てを検出することが可能であり、濃度の定量的な測定という観点で好ましい態様といえる。ＥＳＺによる粒子検出の感度は、アパーチャと電極までの間の流路抵抗に比例して低下するため、得られたシグナルから粒子径を算出する場合は、このシグナル低下を加味する必要がある（式（１）参照）。
【数１】
2019117064.tif 000003
粒子検出部１０３の電気検出器は、電極５４、電極５４に導線５５を介して接続される電気測定器５６、及び電源５７から主に構成される。２つの電極５４は、アパーチャ５３を挟んで配置される。電気測定器５６は、電気的特性を検知するものであればよく、電流測定器、電圧測定器、抵抗測定器、電荷量測定器が挙げられ、ＥＳＺの測定においては電流測定器を用いるのが最も好ましい。また、ＩＶアンプを用いて、電流電圧変換後に利得を上げて、微小な電流値変化を検出することが、より微小な粒子を検出する上で好ましい。またアパーチャ内を通過した粒子を取りこぼしなく検出するために、電気測定器５６のサンプリング時間間隔は、粒子がアパーチャを通過するのに要する時間よりも十分短いことが好ましく、１秒間に１万回以上サンプリングすることが好ましく、１秒間に２万回以上サンプリングすることがさらに好ましい。
【００２４】
解析部６１では、測定結果を演算するための演算装置と、測定結果又はそれに由来する演算結果を記録するための記録媒体とを具備することができる。あるいは、これらの演算装置及び記録媒体は、電気測定器５６と一体化していてよいし、電気測定器５６に対して接続可能な外部装置であってもよい。記録媒体に記録されるデータには、サンプリングした電流値と、粒子が通過した際に発生する電流値変化、またその電流値変化から算出される粒子径、粒子数、粒子濃度、検出時間又は測定開始時からの経過時間が含まれる。
【００２５】
粒子分離流路１１０で用いる分離手法において水力学的ろ過（Hydrodynamic Filtration：ＨＤＦ）を用いる場合、粒子分離流路１１０の上流部の末端が粒子導入流路１０１と接続しており、流体が流出する下流部の末端の分岐部１１０Ａを介して粒子回収流路１０２へと接続していればよい（図８）。この時、分岐部１１０Ａは、粒子を分離するために少なくとも２つ以上の粒子回収流路１０２へと流体的に接続されている必要があり、粒子回収流路を含む下流の流体力学的抵抗を考慮して、各流路やアパーチャの断面積、体積を設定する必要がある。例えば、図８（ｂ）、図９の通り回収流路１０２を３つ設けた場合、各回収流路へ流れる流量をＱａ、Ｑｂ、Ｑｃとすると、各流量の比は流路の幅ｗ、高さｈ、長さＬから算出され、具体的にはハーゲンポアズイユの式から直線流路内における流量は式（２）に従い計算される。
【数２】
2019117064.tif 000004
【００２６】
また、拡大図９（ｂ）の通り、層流条件下でのマイクロチップの流路内の速度分布は放物線となり、一般に式（３）中のｕ（ｒ）で表される（この時、ｗ０は円管の半径、ｒは円管中心からの距離、μは粘度、Ｌは円管の長さ、ΔＰは圧力損失を示す。）。
【数３】
2019117064.tif 000005
【００２７】
流路壁面からの任意の距離ｗ１とｗ２で区切られる放物線内の面積Ｓａ、Ｓｂ、Ｓｃの比は、各回収流路へ流れる流量Ｑａ、Ｑｂ、Ｑｃの比と等しくなる。この時、流路内に存在する粒子のうち、その粒子の中心または重心位置がｗ１よりも流路壁面近くに存在している粒子が回収流路１０２ａへ流入し、ｗ２よりも流路壁面近くに存在している粒子が回収流路１０２ｂへ流入し、ｗ１とｗ２の間に存在する粒子は、回収流路１０２ｃへ流入する。従って、回収流路１０２ａ、１０２ｂへ流れる最も大きい粒子の半径はそれぞれｗ１、ｗ２となるため、アパーチャの断面形状が円形の場合は、アパーチャの半径をｗ１またはｗ２以上とする必要があり、アパーチャの断面形状が略円形や楕円形の場合は、略円形または楕円形の中心または重心を通る最小半径をｗ１またはｗ２以上とする必要がある。また、アパーチャの断面形状が矩形の場合、２組の対向する辺それぞれがｗ１またはｗ２の２倍以上の長さである必要がある。加えてアパーチャの断面形状が多角形の場合、その内接円の半径をｗ１またはｗ２以上とする必要がある。
【００２８】
ここで、粒子分離流路１１０の末端以外の箇所に分岐部１１０Ａ（図８に図示されていない）を複数設け、１以上の分岐流路１０５を設ける態様をとってもよい（図８（ｃ））。分岐流路１０５は一方の流路壁面側のみに設けてもよいし、流路壁面の両側へ設けてもよい。また１以上の分岐流路１０５は、下流の回収流路１０２において同時に合流してもよく、徐々に合流する態様をとってもよい。
【００２９】
さらに、粒子分離流路１１０の分岐部１１０Ａ（図１０に図示されていない）の流体的に上流側に、粒子拡散流路１１０Ｂを形成してもよい（図１０（ｂ））。粒子拡散流路１１０Ｂの流体的な上流側が粒子導入流路１０１へと接続されており、流体的な下流側が分岐部１１０Ａへと接続している。また、粒子導入流路１０１を用いない態様の場合は、粒子拡散流路１１０Ｂの流体的な上流側が直接インレットへと接続される。
【００３０】
粒子拡散流路１１０Ｂは、流体的な上流側から下流側へ向けて、流路の幅または高さ、もしくは両方が拡大していく構造をとることが好ましい。これは、粒子回収流路が、粒子拡散流路１１０Ｂの流路幅方向に複数存在するのか、高さ方向に複数存在するのかで好ましい態様が異なるが、一般的なフォトリソグラフィーとソフトリソグラフィーによるマイクロチップの流路形成技術を用いる場合、その作製の容易さという点で、流路の幅が拡大していく構造が好ましい。
【００３１】
この粒子拡散流路１１０Ｂでは、単位時間当たりの粒子のブラウン運動、つまり拡散距離がその粒子径の平方根に反比例することを利用し、粒子拡散流路１１０Ｂを粒子が流れていく際に、その粒子径に応じて粒子が流路の拡大する方向へ拡散するため、拡大した流路壁面付近では、粒子径の小さい粒子の存在確率が高くなり、濃縮効果が得られる。ここで、図１０の流路壁面ａと粒子拡散流路壁面ａの接続する角度θａ、流路壁面ｂと粒子拡散流路壁面ｂの接続する角度θｂは、流路幅を拡大させる点で１８０°未満である必要がある。また、流路壁面ａ、流路壁面ｂで囲まれる流路内の流速１ｍ／秒以上となるような高流量の条件では、拡大部分での渦流れの発生が懸念されるため、１ｍ／秒未満となるような比較的低流量な条件で送液をするか、角度θａ、θｂを９０°よりも大きくすることが好ましい。一方で、粒子拡散流路１１０Ｂへ粒子が流入した際、粒子はその重さに応じて粒子が流れてきた方向（流体力学的な下流方向で、分岐部１１０Ａが存在する方向）に慣性力を受ける。つまり、粒子の密度が同じ場合、粒子径の大きい粒子ほど流路中央に近づく方向に慣性力を受けるため、より流路壁面では粒子径の小さい粒子の存在割合が高くなり、ＨＤＦにおける更なる分離能向上へと寄与する。また、角度θａ、θｂは非対称でも良く、一方の壁面を略直線に接続し、対向する他方の壁面のみを１８０°未満の角度で拡大させて接続してもよい。
【００３２】
粒子分離流路１１０で用いる分離手法においてＨＤＦを用いた場合、図８における粒子検出部１０３ａ、１０３ｂで検出できる粒子径範囲は、それぞれ全く同一でもよいが、広範な粒子径範囲を持つサンプルを測定するために異なる粒子径範囲を測定できるよう設定することが好ましく、その一部がお互いに重複している方が、分離しきれなかった粒子を検出でき、よりロバストな結果を得られる点でさらに好ましい。図８（ａ）に示したように、粒子回収流路１０２が２本の場合、粒子検出部１０３ａ、１０３ｂで検出できる粒子径範囲は、粒子検出部１０３ａを大きい粒子径範囲にし、粒子検出部１０３ｂを小さい粒子径範囲に設定してもよく、その逆でも問題はない。但しＨＤＦの理論に基づき、アパーチャが粒子により閉塞されないよう設定する必要がある。
【００３３】
粒子のカウント数からの濃度換算においては、各粒子回収流路１０２へ流れる流量は設定した送液部の流量と式（１）を用いて算出されるため、測定時間当たりの粒子のカウント数をこれで割ることにより、粒子濃度を算出する。
【００３４】
続いて、粒子分離流路１１０においてピンチドフローフラクショネーション（ＰＦＦ）の原理を利用した流路を用いる場合の構成の一例を図１１に示した。ＰＦＦの原理を利用した流路を用いる場合、粒子分離流路１１０は、分岐流路１８ａ、分岐流路１８ｂ、狭窄流路１６、及び拡大流路１７を含む。粒子を含む流体１００Ｐおよび粒子を含まない流体１００Ｎを保持するインレット１４ａ、１４ｂはそれぞれ分岐流路１８ａ、分岐流路１８ｂと流体的に接続している。分岐流路１８ａ、分岐流路１８ｂはその下流で合流し、狭窄流路１６の上流側へと流体的に接続される。その後、ＰＦＦの原理に基づいて狭窄流路１６の下流と接続している拡大流路１７で粒子分離がされる。拡大流路１７の流路幅は、所定の位置で一定となり、拡大流路１７の下流で流体的に接続される回収流路１０２ａ、１０２ｂで粒子が回収され、回収流路の下流で接続される検出部１０３ａ、１０３ｂで粒子が検出される。ここで、回収流路は何本設置してもよいが、流路の小型化、低コスト化の観点で５本以下にすることが好ましく、３本以下が最も好ましい。
【００３５】
また、非対称ＰＦＦの原理に基づいて、拡大流路１７を形成してもよい。この場合、図１２及び１３に示される通り、拡大流路１７にドレイン流路２２を設置してもよく、粒子の分離能を向上させる点では、この態様がより好ましい。ドレイン流路２２は、アウトレット２３と接続されており、流体が排出又は回収される。ドレイン流路へは５０％以上の流体が流れるよう設計することが好ましく、７０％以上の流体が流れるよう設計することがさらに好ましい。
【００３６】
さらに、狭窄流路１６と拡大流路１７が接続する構造は、図１２（ｃ）に示すように拡大開始点で、流路幅が段状に拡大してもよいし、図１１（ｃ）や図１３（ｂ）に示すように流路幅が徐々に拡大するように構成してもよい。流路幅が徐々に拡大する場合、拡大流路の壁面１７ｂが直線を描くように拡大して、スロープ４０を形成してもよいし、曲線を描くように拡大してもよい。拡大流路１７の流路幅が、段状に拡大するか又は直線的に拡大する場合、狭窄流路の壁面１６ａ、１６ｂと、当該壁面に続く拡大流路１７の壁面１７ａ、１７ｂとの間の角度２４ａ、２４ｂにより、拡大流路を規定することができる。例えば、段状に拡大する場合の角度２４ａ、２４ｂは９０°である。拡大流路１７の壁面が、徐々に直線的に拡大する場合、角度２４ａ、２４ｂは、９０°〜１８０°で表される。拡大領域の壁面の角度２４ａ、２４ｂは、独立に９０°〜１８０°の間の任意の角度をとることができ、一例として、１２０°、１３５°、１５０°、１８０°をとることができる。ただし、狭窄流路壁面１６ｂに対する拡大流路壁面１７ｂの角度２４ｂは９０°またはそれ未満の場合であっても、それが部分的な構造で、実質的には徐々に拡大していくような構造であれば、大半の流体は徐々にアウトレット２３の方向へ流れることから問題ない。
【００３７】
拡大流路１７の下流に接続する複数の粒子回収流路１０２は、少なくとも２つ設けられる必要があり、測定したい粒子径範囲に応じてその数を任意に増やすことが好ましい。各粒子回収流路１０２は、少なくとも１つの粒子検出部１０３があり、複数を設けてもよい。
【００３８】
拡大流路１７は、ＨＤＦの項で記載した粒子拡散流路１１０Ｂとしての機能も持たせることで、さらに粒子の分離能を促進させる機能を付与させてもよいが、この場合は、拡大流路の長さは、粒子が拡散できる十分な長さを持つ必要があり、少なくとも１μｍ以上は必要となる。拡大流路１７の流路長さは、拡大する流路幅と角度２４ａ、２４ｂにより任意の値に決定される。
【００３９】
また、拡大流路を用いず、狭窄流路１６の下流に直接複数の粒子回収流路１０２を設けてもよい。
【００４０】
粒子分離流路１１０にＰＦＦの原理を利用した流路を用いた場合、粒子は狭窄流路壁面１６ａ側から１６ｂ側へ向けて存在しうる粒子の直径が大きくなっていくため、例えば図１１（ａ）の場合、粒子検出部１０３ａが小径粒子を検出し、粒子検出部１０３ｂが大径粒子を検出するようにアパーチャの断面積を設定すること好ましい。また、図１１（ｃ）の場合、粒子検出部１０３ａが小径粒子を検出し、粒子検出部１０３ｃが中径粒子を検出し、粒子検出部１０３ｂが大径粒子を検出するようにアパーチャの断面積を設定することが好ましい。つまり、狭窄流路壁面１６ａに近い粒子検出部１０３ほど、小さい粒子を検出できるようアパーチャの断面積を設定することが好ましい。例えば、０．１〜２．０μｍの粒子を検出しようとする場合、図１１（ｃ）、図１２、図１３の場合、粒子検出部１０３ａでは直径０．１〜０．３μｍの粒子を検出するためにアパーチャ断面積が０．４μｍ＾２（幅１μｍ、高さ０．４μｍの矩形状のもの、または半径０．３６μｍの円形状のもの）のものを設置し、粒子検出部１０３ｃでは直径０．２〜０．８μｍの粒子を検出するためにアパーチャ断面積が２μｍ＾２（幅２μｍ、高さ１μｍの矩形状のもの、または半径０．８μｍの円形状のもの）のものを設置し、粒子検出部１０３ｂでは直径０．４〜２．０μｍの粒子を検出するためにアパーチャ断面積が１４μｍ＾２（幅３．５μｍ、高さ４μｍの矩形状のもの、または半径２．１μｍの円形状のもの）のものを設置してもよい。
【００４１】
また粒子分離流路１１０でＰＦＦの原理を利用した流路を用いる場合、送液部により設定される流量は、０．１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの間に設定することが好ましく、粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００Ｐよりも２倍以上多いことが好ましい。粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００Ｐよりも何倍以上であることが好ましいかについては、狭窄流路１６の流路幅と分離したい粒子の直径に依存し、例えば、分離したい粒子の直径が狭窄流路１６の流路幅の１／４であった場合、粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００Ｐよりも３倍以上であることが好ましく、分離したい粒子の直径が狭窄流路１６の流路幅の１／１０であった場合、粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００Ｐの流量よりも９倍以上であることが好ましい。つまり、ＰＦＦの原理に基づいて分離したい粒子の直径に対して、狭窄流路１６の流路幅がＮ倍であった場合、粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００ＰよりもＮ-１倍以上多いことが好ましい。前記流量比であれば、分離したい粒子は狭窄流路の壁面１６ａを滑流することになるため、ＰＦＦの原理に基づいた粒子分離が可能となる。
【００４２】
さらに、粒子分離流路１１０でＰＦＦの原理を利用した流路を用いる場合において、粒子を含む流体１００Ｐに含まれる粒子全てを狭窄流路壁面１６ａに滑流させる必要はなく、相対的に大きい粒子径を持つ粒子のみを狭窄流路壁面１６ａに滑流させてもよい。例えば図１１（ｂ）、図１２、図１３の場合、小粒径の粒子を検出する粒子検出部１０３ａで検出できる最大粒子径以下の粒子を、狭窄流路壁面１６ａへ滑流させれば、最大粒子径以下の粒子が狭窄流路壁面１６ａに整列されなかったとしても、粒子検出部１０３ａでその分布をＥＳＺの原理に基づいて作成することができる。すなわち、ＰＦＦで分離しきれなかった粒子がいたとしても、粒子検出部でその粒子径分布が作成できるため、ＥＳＺがＰＦＦの分離能を補完するという優れた効果が得られる。
【００４３】
また、小粒径の粒子を検出する粒子検出部１０３ａで検出できる最大粒子径以上の粒子までしか狭窄流路壁面１６ａへ滑流させられない流量条件下であっても、前述のＨＤＦの理論に基づき、粒子検出部１０３ａのアパーチャが閉塞する粒子径の粒子が流入しないよう流路抵抗を設定することで、本発明の目的としている広範な粒子径分布を持つサンプルの測定が可能となる。すなわち、ＰＦＦによる中粒径、大粒径粒子の分離と、ＨＤＦによる小粒径粒子の分離と、ＥＳＺによる精密な粒子径分布の作成により、広範な粒子径分布を持つサンプルの測定が可能になるという優れた効果が得られる。この時、ＰＦＦにおける拡大流路１７が、前述の粒子拡散流路１１０Ｂの役割も併せて果たすため、単位時間あたりの拡散距離の大きい小粒径粒子の分離を促進させるという優れた効果が得られる。またこの態様において、小粒径粒子は粒子検出部１０３ｃにも流入し、場合によっては粒子検出部１０２ｂにも流入するため、粒子検出部１０３ａへ流入してくる小粒径粒子は粒子サンプルを含む流体１００Ｐの一部となる。その流入量は、粒子拡散流路１１０Ｂの役割を果たす拡大流路１７の長さが、小粒径粒子が拡散するのに十分な距離であれば、粒子回収流路１０２ａとその下流の流路構造から算出される流量に比例するため、その算出された値から定量することができる。ここで、拡大流路１７の長さにおける「小粒径粒子が拡散するのに十分な距離」とは、粒子を含まない流体１００Ｎの流量と粒子を含む流体１００Ｐの流量の和が０．１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの範囲であれば、１μｍ以上が好ましく、より好ましくは１００μｍ以上が好ましい。
【実施例】
【００４４】
製造実施例：粒子検出装置の製造
本発明による粒子検出装置の実施形態を備えたマイクロチップ１０は、一般的なフォトリソグラフィーとソフトリソグラフィー技術を用いて作製した。具体的な手順を以下の通り示す。
【００４５】
４インチベアシリコンウェハ（株式会社フィルテック）上へ、フォトレジストＳＵ−８  ３００５（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を滴下後、スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ社）を用いてフォトレジスト薄膜を形成した。この時、目的膜厚に応じて、ＳＵ−８  ３００５へ希釈剤Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｎｅ（東京応化工業社）を添加した。続いて、マスクアライナー（ウシオ電機社）と、任意のパターンを形成したクロムマスクを用いて流路パターンをフォトレジスト膜へ形成し、ＳＵ−８Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を用いて流路パターンを現像することで、用いたい流路の鋳型を作製した。
【００４６】
続いて、作製した鋳型へ、未硬化のＬＳＲ７０７０ＦＣ（モメンティブパフォーマンス社）を流し込み、８０℃で２時間加熱することで、流路の形状を転写されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を作製した。硬化したＰＤＭＳを鋳型から慎重に剥がし、カッターで任意の大きさに成形後、パンチャーを用いて流路のインレット、アウトレットを形成した。剥離したＰＤＭＳとスライドガラス（松浪ガラス社）を酸素プラズマ発生装置（メイワフォーシス社）で表面処理後、ＰＤＭＳとスライドガラスを貼り合わせることでマイクロチップ１０を作製した。
【００４７】
電気検出実施例：ＥＳＺによる粒子の電気的検出
作製したマイクロチップ１０は、基板上へ載置され、マイクロチップ１０内の複数の粒子検出部１０３へ電極を接続した。電極は一対の白金線より構成され、一方の電極は導線を介してプログラマブル電流増幅器ＣＡ５３５０（エヌエフ回路社）へ接続され、ＡＤコンバーターを介してＰＣへと接続され、送信されてきたデジタルの信号をＬａｂＶｉｅｗにより解析した。また粒子検出部１０３へ接続される電極のもう一方は９Ｖの乾電池へ導線を介して接続した。
【００４８】
各インレットは、テフロンチューブを介してプレッシャーポンプＰ-ＰｕｍｐＢａｓｉc（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社）へ接続し、一定の流量で送液した。
【００４９】
サンプル調製実施例：標準粒子を用いた場合
分離対象の粒子を含有する流体１００Ｐ中の粒子として標準粒子を用いる場合、
０．１μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３１００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）０．２μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３２００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
０．５μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３５００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
１．０μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子４００９Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
２．０μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子４２０２Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
を用いた。分離対象の粒子を含有する流体１００Ｐとしては、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液（リン酸緩衝液）を用いた。０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液は、実験前にポアサイズ０．１μｍのシリンジフィルター（メルクミリポア社製）を用いて異物除去を行ってから用いた。
【００５０】
サンプル調製実施例：抗体凝集体を用いた場合
独自に作製したマウスモノクローナル抗体を、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液により０．６６ｍｇ／ｍＬへ調製し、乾燥機にて摂氏９０度で１５分加熱させることで人為的に抗体凝集体を作製した。
【００５１】
実施例１：ＡｓｙＰＦＦによる粒子分離後に、３つの粒子回収流路と、各粒子回収流路に２つ設置された粒子検出部により粒子検出を行う粒子検出装置による、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子混合サンプルの検出
図１５で示されるマイクロチップ１０を、粒子検出流路として上述の製造実施例に基づき作製し、上述のサンプル調製実施例に基づき調製した。０．１、０．２、０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子は、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液により、それぞれ５μｇ／ｍＬの濃度となるよう調製した。従って、サンプル中に含まれるポリスチレン粒子全体の濃度は２５μｇ／ｍＬとなるよう調製した。
この時、マイクロチップ１０の各流路について、流路１３の高さは粒子検出部１０３ａ、粒子検出部１０３ｃ以外すべて４．５μｍとし、流路１３の端部に、基板１１の上面に貫通するインレット１４ａ、１４ｂ、アウトレット１０４ａ、１０４ａ’、１０４ｂ、１０４ｂ’、１０４ｃ、１０４ｃ’、２３（それぞれ穴の径２ｍｍ）を設けた。また流路１３は、分岐流路１８ａ（幅２０μｍ、長さ１．５ｍｍ）、分岐流路１８ｂ（幅４０μｍ、長さ５００μｍ）、狭窄流路１６（幅６μｍ、長さ２０μｍ）、拡大流路１７（拡大角度１３５度、最大拡大時流路幅６００μｍ、長さ０．５ｍｍ）、ドレイン流路２２（幅５００μｍ、長さ１．７ｍｍ）、粒子回収流路１０２ａ（幅７５μｍ、長さ４ｍｍ）、粒子回収流路１０２ｃ（幅１４０μｍ、長さ７．５ｍｍ）、粒子回収流路１０２ｂ（幅５１２μｍ、長さ３．７５ｍｍ）とした。また、粒子検出部１０２ａの２つのアパーチャは、どちらも幅１μｍ、高さ０．４μｍ、長さ１０μｍとし、粒子検出部１０２ｃの２つのアパーチャは、どちらも幅２μｍ、高さ０．８μｍ、長さ１０μｍとし、粒子検出部１０２ｂの２つのアパーチャは、どちらも幅３．５μｍ、高さ４．５μｍ、長さ２０μｍとした。各粒子検出部の形状は図１４と同様であり、また式（１）において算出されるｋ値は、アパーチャ抵抗と、アパーチャから電極が挿入されているアウトレットまでの流路の抵抗比から、２．６とした。
【００５２】
上述のマイクロチップ１０を用い、インレット１４ａへ調製した粒子懸濁液を２．５μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液し、インレット１４ｂへ０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳを１０μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき３つの各粒子回収流路１０２へ流入した粒子を１分間検出した。この時の、粒子回収流路１０２ａの粒子検出部１０３ａの電流値変化の測定の様子の一部を図１６に示し、粒子回収流路１０２ｃの粒子検出部１０３ｃの電流値変化の測定の様子の一部を図１７に示し、粒子回収流路１０２ｂの粒子検出部１０３ｂの電流値変化の測定の様子の一部を図１８に示した。図１６より粒子検出部１０３ａでは０．１、０．２μｍ標準粒子が、図１７より粒子検出部１０３ｃでは０．２、０．５μｍ標準粒子が、図１８より粒子検出部１０３ｂでは１．０、２．０μｍ標準粒子の電流値変化が確認された。
【００５３】
また、測定結果１つのヒストグラムへまとめると図１９の通りとなり、混合粒子でもピークが分離することを確認した。また、測定結果から得られた０．１μｍ標準粒子の濃度は、５．４１μｇ／ｍＬであり、０．２μｍ標準粒子の濃度は、３．５２μｇ／ｍＬであり、０．５μｍ標準粒子の濃度は、６．２９μｇ／ｍＬであり、１．０μｍ標準粒子の濃度は、５．０２μｇ／ｍＬであり、２．０μｍ標準粒子の濃度は、５．９２μｇ／ｍＬであった。また、測定結果から得られた０．１μｍ標準粒子の平均粒径は、０．１０７μｍであり、０．２μｍ標準粒子の平均粒径は、０．１９２μｍであり、０．５μｍ標準粒子の平均粒径は、０．５２μｍであり、１．０μｍ標準粒子の平均粒径は、０．９８μｍであり、２．０μｍ標準粒子の平均粒径は、２．０５μｍであった。
以上から、本発明を用いて、複数の断面積の異なるアパーチャ、すなわち複数の検出可能粒子径範囲をもつ粒子検出部１０３を用いて、０．１〜２μｍという広範な分布を持つサンプルでも、正確な粒子径測定が可能であること確認した。
【００５４】
比較例１：レーザー回折散乱法（ＬＤ）による粒子検出装置を用いた０．１、０．２、０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子混合サンプルの検出
実施例１と同様にして混合粒子サンプルを調製し、ＡｇｇｒｅｇａｔｅｓＳｉｚｅｒ（島津製作所社）により測定を行った。
測定結果を示す図２０の通り、０．２と２μｍのピークが消失し、０．１μｍのピークが増大していることから、混合粒子サンプルでの正確な測定は難しいことが確認された。
【００５５】
実施例２：ＡｓｙＰＦＦによる粒子分離後に、３つの粒子回収流路と、各粒子回収流路に２つ設置された粒子検出部により粒子検出を行う粒子検出装置による、抗体凝集体サンプルの検出
実施例１と同じマイクロチップ１０を用い、サンプル調製実施例に基づいて作製した抗体凝集体を同様に測定した。
測定結果を示す図２１の通り、抗体凝集体においても測定が可能であることを確認した。
【００５６】
実施例３：ＨＤＦによる粒子分離後に、３つの粒子回収流路と、各粒子回収流路に２つ設置された粒子検出部により粒子検出を行う粒子検出装置による、０．１、０．５、２．０μｍ標準粒子混合サンプルの検出
図２２で示されるマイクロチップ１０を、粒子検出流路として上述の製造実施例に基づき作製し、上述のサンプル調製実施例に基づき調製した。０．１、０．５、２．０μｍ標準粒子は、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液により、それぞれ５μｇ／ｍＬの濃度となるよう調製した。従って、サンプル中に含まれるポリスチレン粒子全体の濃度は１５μｇ／ｍＬとなるよう調製した。
【００５７】
この時、マイクロチップ１０の各流路について、流路１３の高さは粒子検出部１０３ａ、粒子検出部１０３ｃ以外すべて４．０μｍとし、流路１３の端部に、基板１１の上面に貫通するインレット１４ａ、アウトレット１０４ａ、１０４ａ’、１０４ｂ、１０４ｂ’、１０４ｃ、１０４ｃ’、２３（それぞれ穴の径２ｍｍ）を設けた。また流路１３は、粒子導入流路１０１（幅２０μｍ、長さ１．５ｍｍ）、狭窄流路１６（幅６μｍ、長さ２０μｍ）、拡大流路１７（拡大角度１３５度、最大拡大時流路幅８００μｍ、長さ０．５ｍｍ）、粒子回収流路１０２ａ（幅７５μｍ、長さ４ｍｍ）、粒子回収流路１０２ｃ（幅１４０μｍ、長さ７．５ｍｍ）、粒子回収流路１０２ｂ（幅５１２μｍ、長さ３．７５ｍｍ）とした。また、粒子検出部１０２ａの２つのアパーチャは、どちらも幅１μｍ、高さ０．４μｍ、長さ５μｍとし、粒子検出部１０２ｃの２つのアパーチャは、どちらも幅３μｍ、高さ１．２μｍ、長さ５μｍとし、粒子検出部１０２ｂの２つのアパーチャは、どちらも幅３．５μｍ、高さ４.０μｍ、長さ２０μｍとした。各粒子検出部の形状は図１４と同様であり、また式（１）において算出されるｋ値は、アパーチャ抵抗と、アパーチャから電極が挿入されているアウトレットまでの流路の抵抗比から、３．０とした。
【００５８】
上述のマイクロチップ１０を用い、インレット１４ａへ調製した粒子懸濁液を２．５μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液し、インレット１４ｂへ０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳを４μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき３つの各粒子回収流路１０２へ流入した粒子を１分間検出した。この時の、粒子回収流路１０２ａの粒子検出部１０３ａの電流値変化の測定の様子は図１６と同様に０．１μｍ標準粒子が確認され、粒子回収流路１０２ｃの粒子検出部１０３ｃの電流値変化の測定の様子は図１７と同様に０．５μｍ標準粒子が確認され、粒子回収流路１０２ｂの粒子検出部１０３ｂの電流値変化の測定の様子は図１８と同様に２．０μｍ標準粒子が確認された。
【００５９】
また、測定結果を１つのヒストグラムへまとめると図２３の通りとなり、混合粒子でもピークが分離することを確認した。また、測定結果から得られた０．１μｍ標準粒子の濃度は、４．４１μｇ／ｍＬであり、０．５μｍ標準粒子の濃度は、３．６６μｇ／ｍＬであり、２．０μｍ標準粒子の濃度は、６．０８μｇ／ｍＬであった。また、測定結果から得られた０．１μｍ標準粒子の平均粒径は、０．１１２μｍであり、０．５μｍ標準粒子の平均粒径は、０．４７０μｍであり、２．０μｍ標準粒子の平均粒径は、２．０９μｍであった。
以上から、本発明を用いて、複数の断面積の異なるアパーチャ、すなわち複数の検出可能粒子径範囲をもつ粒子検出部１０３を用いて、０．１〜２μｍという広範な分布を持つサンプルでも、正確な粒子径測定が可能であることを確認した。
【符号の説明】
【００６０】
１０    マイクロチップ
１１    基板
１１ａ    基板
１１ｂ    下面
１３    流路
１４、１４ａ、１４ｂ    インレット
１６    狭窄流路
１６ａ    サンプル液側狭窄流路壁面
１６ｂ    シース液側狭窄流路壁面
１７    拡大流路
１７ａ    サンプル液側拡大流路壁面
１７ｂ    シース液側狭拡大路壁面
１８ａ、１８ｂ    入口側分岐流路
１９    拡大開始点
２１    領域
２２    ドレイン流路
２３    アウトレット
２４ａ、２４ｂ    角度
２５ａ、２５ｂ    角度
４０    スロープ部分
５０    粒子
５１    粒子の流れる方向
５２    アパーチャ形成構造
５３    アパーチャ
５４、５４ａ、５４ｂ    電極
５５    導線
５６    電気測定器
５７    電源
５８    導電性溶液
５９    電極挿入口
６０    中継流路
６１    解析部
６２    粒子検出流路
１００    流体
１００Ｐ    流体
１００Ｎ    流体
１０１    粒子導入流路
１０２ａ〜ｃ    粒子回収流路
１０３ａ〜ｃ    粒子検出部
１０４ａ〜ｃ    アウトレット
１１０    粒子分離流路
１１０Ａ    分岐部
１１０Ｂ    粒子拡散流路
【図１】
2019117064.tif 000006
【図２】
2019117064.tif 000007
【図３】
2019117064.tif 000008
【図４】
2019117064.tif 000009
【図５】
2019117064.tif 000010
【図６】
2019117064.tif 000011
【図７】
2019117064.tif 000012
【図８】
2019117064.tif 000013
【図９】
2019117064.tif 000014
【図１０】
2019117064.tif 000015
【図１１】
2019117064.tif 000016
【図１２】
2019117064.tif 000017
【図１３】
2019117064.tif 000018
【図１４】
2019117064.tif 000019
【図１５】
2019117064.tif 000020
【図１６】
2019117064.tif 000021
【図１７】
2019117064.tif 000022
【図１８】
2019117064.tif 000023
【図１９】
2019117064.tif 000024
【図２０】
2019117064.tif 000025
【図２１】
2019117064.tif 000026
【図２２】
2019117064.tif 000027
【図２３】
2019117064.tif 000028