(57)【要約】【課題】顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能なサンプルを容易に作製するとともに、サンプルの作製の自動化を容易にする。【解決手段】少なくとも１つのスフェロイドＳを内包しゲル化時または固体化時に略透明である媒質溶液Ａの表面に、この媒質溶液Ａをゲル化または固体化させる液体Ｂを霧状、泡状またはその媒質溶液Ａよりも小さな体積の液滴状で接触させて、媒質溶液Ａをゲル化または固体化させる顕微鏡観察用サンプルの作製方法を提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの観察対象物を内包しゲル化時または固体化時に略透明である媒質溶液の表面に、該媒質溶液をゲル化または固体化させる液体を霧状、泡状または前記媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させて、前記媒質溶液をゲル化または固体化させる顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【請求項２】
超音波の照射または加圧により前記液体を霧化させる請求項１に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【請求項３】
前記液体を接触させる前記媒質溶液の表面を露出させて基材により前記媒質溶液を支持させる請求項１または請求項２に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【請求項４】
前記基材が、棒状、カップ状、ウエル状、リング状、綿棒状、平坦もしくは表面に凹凸を有する板状、スポンジ状、または、多孔質状の形態を有する請求項３に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【請求項５】
前記基材により該基材の表面に前記観察対象物を内包した前記媒質溶液を水滴状に付着させた状態に支持させる請求項３に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【請求項６】
前記基材により前記観察対象物を内包した前記媒質溶液の液滴を吊り下げた状態に支持させる請求項３に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【請求項７】
前記観察対象物が、細胞、細胞凝集塊、細胞組織、スフェロイドまたはオルガノイドからなる生物由来材料である請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【請求項８】
前記観察対象物が、蛍光、発光、りん光または色素を有する非生物由来材料である請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【請求項９】
前記媒質溶液に内包させた前記生物由来材料が観察のための形態になるまで待機した後に、前記媒質溶液をゲル化または固体化させる請求項７に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【請求項１０】
前記媒質溶液が、アルギン酸ナトリウムを含み前記生物由来材料を育成可能な培地であり、
前記液体が、２価金属イオンを含む水溶液である請求項７または請求項９に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【請求項１１】
前記媒質溶液を前記観察対象物の周辺近傍までゲル化または固体化させる請求項１から請求項９のいずれかに記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【請求項１２】
前記媒質溶液の前記液体が接触する露出した表面のみをゲル化または固体化させる請求項１から請求項９のいずれかに記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【請求項１３】
媒質溶液を観察対象物を内包させた状態で支持する基材と、
該基材により支持されている前記媒質溶液の表面に、該媒質溶液をゲル化または固体化させる液体を霧状、泡状または前記媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させる液体接触手段とを備えるサンプル作製キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、スフェロイドやオルガノイドなど３次元的に培養した細胞凝集塊の顕微鏡観察が注目されている。細胞凝集塊の作製としては、例えばシャーレの蓋の内面に培養液とともに細胞を液滴として分注し、この液滴を反転させてハンギングドロップを形成させ、ハンギングドロップの曲面に沿う方向に、重力の分力による助けを借りてハンギングドロップ内部で細胞凝集を引き起こさせる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、この方法は、ハンギングドロップの正確なアレイ配列がなされないので、細胞凝集塊の作製の自動化に適さないのは明らかである。
【０００３】
特許文献１の技術を改善し、自動化に適するハンギングドロップを形成可能なマルチウエルプレートの構造が知られている（例えば、特許文献２参照。）。特許文献２に記載のマルチウエルプレートは、分注器から排出される液を受ける窪み部と、ハンギングドロップが形成されて保持されるハンギングドロップ形成区画と、これらに通じる導管との組がアレイ状に配列されて構成されている。特許文献２に記載のマルチウエルプレートは、特許文献１に記載の方法のように液滴を反転させる必要が無く、細胞や培養液等の分注をアレイ配列フォーマットに従ってマルチウエルプレートの上方から行うだけでハンギングドロップを形成可能としたことで、ハンギングドロップでの細胞凝集塊の作製の自動化を容易にしている。しかしながら、特許文献２は、顕微鏡での高精細の観察方法については特許文献１と同様になんら言及していない。
【０００４】
特許文献２の技術を更に発展させ、顕微鏡による精細な観察や撮像を行えるようにした技術が知られている（例えば、特許文献３参照。）。特許文献３に記載の技術は、作製したハンギングドロップ内の細胞凝集塊をハンギングドロップとともに、底面が平面で透明なマルチウエルプレートのウエルに落下させ、細胞凝集塊が発する光をウエルの底面を介して倒立型顕微鏡の対物レンズで集光して観察や撮像を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】独国特許発明第１０３６２００２号明細書
【特許文献２】特許第５４９０８０３号公報
【特許文献３】国際公開第２０１７／００１６８０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献３の技術では、細胞凝集塊がウエルの側面に接するように位置する場合は、ウエルの底面と側面との境界である稜線部分が対物レンズで受光されるべき光束に干渉し、顕微鏡が本来有する光学性能を発揮できない。特にライトシート顕微鏡による観察では、細胞凝集塊に対して側面から励起光を照射するため、細胞凝集塊がウエルの側面に接している部分の観察が非常に困難である。このため、ウエルの底面と細胞凝集塊とが接しないように固定する必要がある。
【０００７】
また、より高精細な観察のため、細胞凝集塊が含まれるハンギングドロップをゲル化し、ハンギングドロップと同等の屈折率を有する液中にハンギングドロップを配置して細胞凝集塊を観察することが望まれているところ、２液以上の溶液を単純に混合させてハンギングドロップをゲル化させる方法では、ハンギングドロップの溶液全体をゲル化させるため、ハンギングドロップ内部の流動性が失われてしまう。また、溶液としてアルギン酸ナトリウムを用いたハンギングドロップに対してピペットによりゲル化液（カルシウムイオンを含む溶液。）を入れる方法では、ピペット先端で溶液が直ちにゲル化してしまうため、ゲル化液をハンギングドロップ全体に撹拌させることが困難という問題がある。さらに、これらの方法では、分注器やロボットを用いた自動化は非常に困難という問題がある。
【０００８】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能なサンプルを容易に作製することができるとともに、自動化が容易な顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キットを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１態様は、少なくとも１つの観察対象物を内包しゲル化時または固体化時に略透明である媒質溶液の表面に、該媒質溶液をゲル化または固体化させる液体を霧状、泡状または前記媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させて、前記媒質溶液をゲル化または固体化させる顕微鏡観察用サンプルの作製方法である。
【００１０】
本態様によれば、霧状、泡状または媒質溶液よりも小さな体積の液滴状の液体が観察対象物を内包した媒質溶液の表面に接触して、媒質溶液がゲル化または固体化することで、略透明な媒質溶液内に観察対象物が収容されたサンプルが作製される。
【００１１】
これにより、このサンプルの観察対象物から発せられる光をゲル状または固体状の媒質溶液の外部で検出し、観察対象物を高精細に観察することができる。また、液体を霧状、泡状または媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で媒質溶液の表面に接触させることで、媒質溶液が液体に混ざって散るのを防ぐことができる。そして、観察対象物を内包させた媒質溶液の表面に液体を接触させるだけの簡易な作業なので、サンプルの作製を自動化することができる。したがって、顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能なサンプルを容易に作製することができるとともに、サンプルの作製の自動化も容易にすることができる。
【００１２】
上記態様においては、超音波の照射または加圧により前記液体を霧化させることとしてもよい。
このように構成することで、一般的な方法で液体を簡易に霧状にすることができる。
【００１３】
上記態様においては、前記液体を接触させる前記媒質溶液の表面を露出させて基材により前記媒質溶液を支持させることとしてもよい。
このように構成することで、基材により媒質溶液を安定した姿勢に維持して液体と接触させることができる。
【００１４】
上記態様においては、前記基材が、棒状、カップ状、ウエル状、リング状、綿棒状、平坦もしくは表面に凹凸を有する板状、スポンジ状、または、多孔質状の形態を有することとしてもよい。
【００１５】
上記態様においては、前記基材により該基材の表面に前記観察対象物を内包した前記媒質溶液を水滴状に付着させた状態に支持させることとしてもよい。
このように構成することで、簡易な形状の基材を用いて、表面張力を利用して媒質溶液を維持することができる。
【００１６】
上記態様においては、前記基材により前記観察対象物を内包した前記媒質溶液の液滴を吊り下げた状態に支持させることとしてもよい。
このように構成することで、媒質溶液の液滴をウエル等から離間させた状態に維持しつつ、重力によって媒質溶液の液滴内で観察対象物の位置を安定させることができる。
【００１７】
上記態様においては、前記観察対象物が、細胞、細胞凝集塊、細胞組織、スフェロイドまたはオルガノイドからなる生物由来材料であってもよいし、前記観察対象物が、蛍光、発光、りん光または色素を有する非生物由来材料であってもよい
【００１８】
上記態様においては、前記媒質溶液に内包させた前記生物由来材料が観察のための形態になるまで待機した後に、前記媒質溶液をゲル化または固体化させることとしてもよい。
このように構成することで、観察に適した形態になった生物由来材料を観察対象物として観察することができる。
【００１９】
上記態様においては、前記媒質溶液が、アルギン酸ナトリウムを含み前記生物由来材料を育成可能な培地であり、前記液体が、２価金属イオンを含む水溶液であることとしてもよい。
このように構成することで、安価で入手し易い媒質溶液を用いて、容易にゲル化または固体化させるとともに、生物由来材料を育成しながら観察することができる。また、育成させた生物由来材料を移し替える必要がなく、スループットを向上して、安価にスクリーニングを行うことができる。
【００２０】
上記態様においては、前記媒質溶液を前記観察対象物の周辺近傍までゲル化または固体化させることとしてもよい。
このように構成することで、ゲル化または固体化した略透明な媒質溶液内で観察対象物の位置が固定されたサンプルを作製することができる。
【００２１】
上記態様においては、前記媒質溶液の前記液体が接触する露出した表面のみをゲル化または固体化させることとしてもよい。
このように構成することで、観察対象物を内包した媒質溶液がこぼれたり乾燥したりするのを防ぐことができる。
【００２２】
本発明の第２態様は、媒質溶液を観察対象物を内包させた状態で支持する基材と、該基材により支持されている前記媒質溶液の表面に、該媒質溶液をゲル化または固体化させる液体を霧状、泡状または前記媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させる液体接触手段とを備えるサンプル作製キットである。
【００２３】
本態様によれば、観察対象物を内包させた媒質溶液を基材により支持して、液体接触手段によりその表面に霧状、泡状または媒質溶液よりも小さな体積の液滴状の液体を接触させるだけで、媒質溶液を容易かつ確実にゲル化または固体化させて、略透明な媒質溶液内に観察対象物が収容されたサンプルを作製することができる。したがって、顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能なサンプルを容易に作製することができるとともに、サンプルの作製の自動化も容易にすることができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キットによれば、顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能なサンプルを容易に作製することができるとともに、サンプルの作製の自動化を容易にすることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法を説明するフローチャートである。
【図２】図１の顕微鏡観察用サンプルの作製方法で用いるハンギングドロップ形成器具の縦断面図である。
【図３】図２のハンギングドロップ形成器具により支持されている媒質溶液の液滴にこれをゲル化させる液体を霧状で接触させる様子を示す図である。
【図４】図１の顕微鏡観察用サンプルの作製方法で用いるゲル化装置の一例を示す平面図である。
【図５】（ａ）はハンギングドロップ形成器具により支持された状態でゲル化させたハンギングドロップを横倒して撮影した図であり、（ｂ）は（ａ）のスフェロイド近傍の拡大図であり、（ｃ）は（ｂ）のスフェロイドを蛍光観察した図であり、（ｄ）は（ｂ）のスフェロイドを蛍光観察した別の図である。
【図６】ハンギングドロップ形成器具により支持されたゲル状のハンギングドロップに内包されているスフェロイドに励起光を照射して蛍光を発生させる様子を示す縦断面図である。
【図７】（ａ）はマイクロウエルに媒質溶液を貯留した様子を示す縦断面図であり、（ｂ）は（ａ）の媒質溶液にこれをゲル化させる液体を霧状で接触させる様子を示す縦断面図であり、（ｃ）は（ｂ）の媒質溶液の露出する表面をゲル化させた様子を示す縦断面図である。
【図８】（ａ）はスライドグラスに媒質溶液を水滴状に付着させた様子を示す縦断面図であり、（ｂ）は（ａ）の媒質溶液の水滴にこれをゲル化させる液体を霧状で接触させる様子を示す縦断面図であり、（ｃ）は（ｂ）の露出する媒質溶液の水滴の表面をゲル化させた様子を示す縦断面図である。
【図９】（ａ）はスライドグラスに媒質溶液を含むシート状の生体サンプルを配置した様子を示す縦断面図であり、（ｂ）は（ａ）の生体サンプルに媒質溶液をゲル化させる液体を霧状で接触させる様子を示す縦断面図であり、（ｃ）は（ｂ）の生体サンプルの表面をゲル化させた様子を示す縦断面図である。
【図１０】（ａ）は細胞培養用スポンジに媒質溶液を染み込ませた様子を示す縦断面図であり、（ｂ）は（ａ）の媒質溶液にこれをゲル化させる液体を霧状で接触させる様子を示す縦断面図であり、（ｃ）は（ｂ）の媒質溶液の液滴をゲル化させた様子を示す縦断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キットについて、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法は、図１のフローチャート、図２および図３に示すように、ゲル化時または固体化時に透明な媒質溶液Ａの液滴に少なくとも１つのスフェロイド（観察対象物、生物由来材料）Ｓを内包させて、媒質溶液Ａの液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップＤを形成するステップＳ１と、ハンギングドロップＤの表面に媒質溶液Ａをゲル化または固体化させる液体Ｂを霧状で接触させて、化学反応によりハンギングドロップＤをゲル化または固体化させるステップＳ２とを含んでいる。
【００２７】
この顕微鏡観察用サンプルの作製方法は、例えば、図４に示すように、ハンギングドロップＤを形成して支持するハンギングドロップ形成器具（基材）１と、ハンギングドロップ形成器具１を支持する支持具９と、液体Ｂを貯留する容器１１と、ハンギングドロップＤに液体Ｂを接触させる超音波霧化装置（液体接触手段）１３とを備えるゲル化装置１５を用いて行うようになっている。これらハンギングドロップ形成器具１および超音波霧化装置１３により、サンプルを作製するためのサンプル作製キット１７が構成される。
【００２８】
ハンギングドロップ形成器具１は、図２および図３に示すように、媒質溶液Ａが注入される窪み部３と、窪み部３に注入された媒質溶液Ａの液滴をスフェロイドＳを内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画５と、これら窪み部３とハンギングドロップ形成区画５とを繋ぐ細い導管７とを備えている。
【００２９】
窪み部３は、導管７とは反対側に開口する開口部３ａを有し、開口部３ａからテーパ状に細くなって導管７に繋がる略円錐形状を有している。
ハンギングドロップ形成区画５は、導管７から次第に径方向外方に拡がる略円錐形状を有している。このハンギングドロップ形成区画５は、媒質溶液Ａの液滴をその下部の表面を露出させて支持するようになっている。
導管７は、窪み部３からハンギングドロップ形成区画５に貫通する貫通孔７ａを有している。
【００３０】
このハンギングドロップ形成器具１は、支持具９により、窪み部３が鉛直方向上方でハンギングドロップ形成区画５が鉛直方向下方となる向きで支持されて、容器１１内で液体Ｂのやや上方に配置されるようになっている。以下、鉛直方向をＺ方向とし、Ｚ方向に直交しかつ互いに直交する方向をＸ方向およびＹ方向とする。
【００３１】
支持具９は、ハンギングドロップ形成器具１を把持する器具ばさみ１９と、鉛直方向に沿って延びるスタンド２１と、スタンド２１から鉛直方向に交差する方向に延び器具ばさみ１９を把持するクランプ２３とを備えている。
超音波霧化装置１３は、容器１１の液体Ｂ内に配置されており、超音波を発生して液体Ｂを微細な霧状にし、発生した霧状の液体Ｂを容器１１内に充満させることができるようになっている。
【００３２】
媒質溶液Ａとしては、例えば、アルギン酸ナトリウムを含む生物由来材料を育成可能な培地が用いられる。媒質溶液Ａはゲル化時に透明である。アルギン酸塩であればナトリウム塩に限られない。また、アルギン酸ナトリウムは重量％で０．５％以上が好ましいが、これに限定されるものではない。この媒質溶液Ａは比重が１であり、スフェロイドＳの比重よりも小さい。
【００３３】
液体Ｂとしては、例えば、２価の金属イオン（カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム等）を含む水溶液である塩化カルシウム水溶液等が用いられる。塩化カルシウムはモル濃度で１００ｍＭ以上が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３４】
このように構成された顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キット１７の作用について説明する。
本実施形態に係る作製方法およびサンプル作製キット１７により顕微鏡観察用サンプルを作製するには、まず、ハンギングドロップ形成器具１の窪み部３に上方から媒質溶液Ａを分注する。窪み部３に分注された媒質溶液Ａは、重力によって導管７の貫通孔７ａを通って下方に移動し、ハンギングドロップ形成区画５により液滴が吊り下げられた状態に支持される。
【００３５】
そして、ハンギングドロップ形成区画５により吊り下げられた状態に支持されている媒質溶液Ａの液滴の下部からその液滴内にスフェロイドＳを挿入する。これにより、図２に示すように、スフェロイドＳを内包して、媒質溶液Ａの液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップＤが形成される（ステップＳ１）。
【００３６】
ハンギングドロップＤを構成する媒質溶液ＡはスフェロイドＳよりも比重が小さいので、スフェロイドＳは、重力によりハンギングドロップＤの界面に沿って移動してハンギングドロップＤの最下点近傍に落ち着く。したがって、窪み部３に分注する媒質溶液Ａの量を決めておくことにより、液滴内でのスフェロイドＳのＸ，Ｙ方向の位置だけでなくＺ方向の位置も一定にすることができる。また、ハンギングドロップ形成器具１を用いることで、ハンギングドロップＤを形成するために媒質溶液Ａの液滴を反転させる必要もない。
【００３７】
次に、図４に示すように、ハンギングドロップＤを形成したハンギングドロップ形成器具１を支持具９により支持して容器１１内の液体Ｂの上方に配置し、超音波霧化装置１３を作動させて液体Ｂを霧化させる。そして、容器１１内に霧状の液体Ｂを充満させて、図３に示すように、ハンギングドロップＤの表面に液体Ｂを霧状で接触させる。
【００３８】
そのまま霧状の液体Ｂ内にハンギングドロップＤを３０分静置させ、ハンギングドロップＤの露出する下部の表面から内部に液体Ｂを浸透させて、スフェロイドＳの周辺近傍までハンギングドロップＤをゲル化させる（ステップＳ２）。これにより、例えば、図５（ａ）〜（ｄ）に示すように、略透明なハンギングドロップＤ内でスフェロイドＳが最下部の位置に固定されたサンプルが作製される。
【００３９】
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キット１７によれば、スフェロイドＳを内包させた媒質溶液Ａの液滴をハンギングドロップ形成器具１により支持して、超音波霧化装置１３によりその液滴の表面に霧状の液体Ｂを接触させるだけで、媒質溶液Ａの液滴を容易かつ確実にゲル化させて、略透明な液滴内にスフェロイドＳが収容されたサンプルを作製することができる。
【００４０】
そして、このサンプルのスフェロイドＳから発せられる光をその液滴の外部で検出し、スフェロイドＳを高精細に観察することができる。また、例えば、媒質溶液Ａの液滴を液体Ｂの溶液内に浸漬させると、媒質溶液Ａの液滴が液体Ｂに混ざって散ってしまうが、液体Ｂを霧状で媒質溶液Ａの液滴の表面に接触させることで、媒質溶液Ａの液滴が液体Ｂに混ざって散るのを防ぎ、ハンギングドロップＤの形状を維持したまま媒質溶液Ａの液滴をゲル化させることができる。また、スフェロイドＳを内包させた媒質溶液Ａの液滴の表面に液体Ｂを接触させるだけの簡易な作業なので、サンプルの作製を自動化することができる。したがって、顕微鏡によるスフェロイドＳの高精細な観察および撮像が可能なサンプルを容易に作製することができるとともに、サンプルの作製の自動化も容易にすることができる。
【００４１】
なお、ゲル化されたハンギングドロップＤに内包されているスフェロイドＳの観察は、例えば、ライトシート顕微鏡（図示略）により行うことができる。この場合、図６に示すように、鉛直方向に直交する平面に沿う平面状に集光させた励起光をハンギングドロップＤの側方から入射させてスフェロイドＳに照射することとすればよい。そして、スフェロイドＳにおいて発生した蛍光の内、ハンギングドロップＤの下部から鉛直方向下方に放射される蛍光を対物レンズ（図示略）により集光して検出することとすればよい。ここで、スフェロイドＳにおける励起光の焦点位置と検出光軸とを一致させるとともに、励起光の入射平面に対物レンズの焦点面を一致させることにより、対物レンズの焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を対物レンズにより１度に集光して、スフェロイドＳにおける観察部位の鮮明な蛍光画像を容易に取得することができる。
【００４２】
本実施形態においては、基材として、窪み部３、ハンギングドロップ形成区画５および導管７の組が１つからなる単体のハンギングドロップ形成器具１を例示して説明したが、これら窪み部３、ハンギングドロップ形成区画５および導管７の組がアレイ状に配列されて構成されるマルチウエルプレートを採用することとしてもよい。このようなマルチウエルプレートを採用することにより、自動分注が容易であり、スクリーニングを目的とした大量のスフェロイドＳの撮像を高スループットで行うことができる。
【００４３】
また、本実施形態においては、例えば、媒質溶液Ａの液滴に生物由来材料である細胞（図示略）を内包させて、ハンギングドロップＤ内でその細胞が観察のための形態になるまで待機した後に、媒質溶液Ａの液滴をゲル化または固体化させることとしてもよい。
【００４４】
この場合、例えば、ステップＳ１により、媒質溶液Ａの液滴に少なくとも１つの細胞を内包させてハンギングドロップＤを形成した後、媒質溶液Ａの液滴内で細胞を培養させてスフェロイドＳが形成させ、その後、ステップＳ２により、ハンギングドロップＤの表面に液体Ｂを霧状で接触させて、ハンギングドロップＤをゲル化または固体化させることとしてもよい。
【００４５】
このようにすることで、観察に適した形態になったスフェロイドＳを観察対象物として観察することができる。また、ハンギングドロップＤ内で細胞Ｓを培養してスフェロイドＳを形成することで、スフェロイドＳを移し替える必要がなく、スループットを向上して、安価にスクリーニングを行うことができる。
【００４６】
また、本実施形態においては、液体接触手段として、超音波霧化装置１３を例示して説明したが、液体Ｂを霧化できるものであればよく、例えば、超音波や加圧により液体Ｂを霧化させるネブライザー装置等、これに限定されるものではない。また、液体Ｂを霧化させることに代えて、例えば、液体Ｂを泡状やスプレーのように媒質溶液Ａの液滴よりも小さな体積の液滴状にして媒質溶液Ａの液滴の表面に接触させることとしてもよい。この場合、例えば、液体接触手段として、スプレー装置、スパッタリング装置またはポンプ等を採用することとしてもよい。
【００４７】
また、本実施形態においては、観察対象物として、スフェロイドＳを例示して説明したが、これに代えて、例えば、細胞、細胞凝集塊、細胞組織またはオルガノイド等からなる生物由来材料を採用してもよい。細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコなど脊椎動物由来の細胞、ショウジョウバエ、カイコなど無脊椎動物由来の細胞、酵母、大腸菌など菌類、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞等の幹細胞などが挙げられる。また、観察対象物として、蛍光、発光、りん光または色素を有する非生物由来材料を採用してもよい。
【００４８】
また、本実施形態においては、基材として、ハンギングドロップ形成器具１を例示して説明したが、液体Ｂを接触させる媒質溶液Ａの表面を露出させてハンギングドロップＤを支持することができるものであればよく、例えば、棒状、カップ状、ウエル状、リング状、綿棒状、平坦もしくは表面に凹凸を有する板状、スポンジ状、または、多孔質状の形態を有するものであってもよい。特に、媒質溶液Ａを付着させて支持し易いよう表面加工されているものが好ましい。
【００４９】
また、基材は、例えば、ガラス等を含む無機物質、または、合成ゴム、ジメチルシロキサン、シリコーン樹脂、天然ゴム、フッ素化ポリマー、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、リオレフィンポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、ポリシロキサン系ポリマー、ポリメチルアクリレート、ポリメチルハイドロゲンシロキサン、ポリメチルメタクリレート、メチルハイドロジェンシロキサンなど類似物質、誘導体、フレンドなどを含む有機物質によって製作されるものとすればよい。これらの原料を単一もしくは複数使用して作製されるものでもよい。
【００５０】
本実施形態は以下のように変形することができる。
第１変形例としては、例えば、図７（ａ）〜（ｃ）に示すように、基材として、容積が小さいウエル状の形態を有する容器、例えばマイクロウエル２５を採用することとしてもよい。この場合、ハンギングドロップＤを形成するステップＳ１に代えて、図７（ａ）に示すように、マイクロウエル２５にスフェロイドＳと一定量の媒質溶液Ａを注ぎ、マイクロウエル２５の開口から媒質溶液Ａの表面を露出させることとすればよい。
【００５１】
次いで、ハンギングドロップＤをゲル化または固体化させるステップＳ２に代えて、図７（ｂ）に示すように、マイクロウエル２５内の媒質溶液Ａに霧状の液体Ｂを吹き付け、媒質溶液Ａの露出している表面に液体Ｂを霧状で接触させて、図７（ｃ）に示すように、露出している媒質溶液Ａの表面をゲル化させることとすればよい。このようにすることで、マイクロウエル２５内の媒質溶液Ａの液こぼれや乾燥を防止することができる。
【００５２】
第２変形例としては、例えば、図８（ａ）〜（ｃ）に示すように、基材として、平坦もしくは表面に凹凸を有する板状のスライドグラス（疎水性コートが望ましい。）２７を採用することとしてもよい。この場合、ステップＳ１に代えて、図８（ａ）に示すように、スライドグラス２７の一表面に媒質溶液Ａを滴下して水滴状に付着させ、その水滴にスフェロイドＳを内包させるとともに水滴の表面を露出させることとすればよい。
【００５３】
次いで、ステップＳ２に代えて、図８（ｂ）に示すように、スライドグラス２７上の媒質溶液Ａに霧状の液体Ｂを吹き付け、媒質溶液Ａの露出している表面に液体Ｂを霧状で接触させて、図８（ｃ）に示すように、露出している媒質溶液Ａの表面をゲル化させることとすればよい。このようにすることで、スライドグラス２７上に付着させた媒質溶液Ａの水滴の液こぼれや乾燥を防止することができる。
【００５４】
本変形例においては、スライドグラス２７の上面に媒質溶液Ａを水滴状に付着させた状態でゲル化させることとしたが、これに代えて、媒質溶液Ａを水滴状に付着させたスライドグラス２７をひっくり返し、スライドグラス２７の下面にスフェロイドＳを内包しつつ付着した状態の媒質溶液Ａの水滴に液体Ｂを霧状で接触させてゲル化させることとしてもよい。
【００５５】
また、本変形例においては、例えば、図９（ａ）に示すように、媒質溶液Ａを含むシート状の生体サンプル（観察対象物）Ｓ´をスライドグラス２７上に配置し、図９（ｂ）に示すように、スライドグラス２７上の生体サンプルＳ´に霧状の液体Ｂを吹き付けることとしてもよい。このようにすることで、図９（ｃ）に示すように、シート状の生体サンプルＳ´の表面をゲル化させ、スライドグラス２７に生体サンプルＳ´を固定することができる。
【００５６】
第３変形例としては、例えば、図１０（ａ）〜（ｃ）に示すように、基材として、スポンジ状または多孔質状の形態を有するものやコラーゲンゲルで作製したものを採用することとしてもよい。この場合、ステップＳ１に代えて、図１０（ａ）に示すように、細胞培養用スポンジ（基材）２９に細胞（観察対象物、図示略。）を含んだ媒質溶液Ａを染み込ませることとしてもよい。
【００５７】
次いで、ステップＳ２に代えて、図１０（ｂ）に示すように、細胞培養用スポンジ２９に霧状の液体Ｂを吹き付けて、細胞培養用スポンジ２９内の媒質溶液Ａの表面に液体Ｂを霧状で接触させることとしてもよい。このようにすることで、図１０（ｃ）に示すように、細胞培養用スポンジ２９に染み込んでいる媒質溶液Ａをゲル化させ、細胞培養用スポンジ２９内に細胞を固定することができる。
【００５８】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【００５９】
また、例えば、上記実施形態およびその変形例においては、媒質溶液Ａとしてアルギン酸ナトリウムを含む水溶液を採用し、液体Ｂとして２価の金属イオンを含む水溶液を例示して説明したが、媒質溶液Ａ，液体Ｂとしてそれぞれ他の水溶液を採用し、その媒質溶液Ａの表面に液体Ｂを接触させることで観察および測定に適した粘弾性を与えることができればよく、これに限定されるものではない。例えば、媒質溶液Ａの表面に媒質溶液Ａをゲル化または固体化する液体Ｂを霧状、泡状または媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させて、媒質溶液Ａをゲル化または固体化させることとしてもよい。
【符号の説明】
【００６０】
１                ハンギングドロップ形成器具（基材）
１３              超音波霧化装置（液体接触手段）
１７              サンプル作製キット
２５              マイクロウエル（基材）
２７              スライドグラス（基材）
２９              細胞培養用スポンジ（基材）
Ａ                媒質溶液
Ｂ                液体
Ｓ                スフェロイド（観察対象物）
Ｓ´              細胞（観察対象物）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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