(57)【要約】【課題】ヒトＮＡＳＨに類似した背景肝から肝がんを発症するＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物を提供する。ヒトＮＡＳＨに類似した背景肝から肝がんを発症するＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物を簡便に得られるＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットを提供する。【解決手段】ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、ＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより得られる非ヒト動物である。ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットは、ＬＸＲαアゴニストと、フリーラジカル発生剤と、高脂肪食と、を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物であって、
ＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより得られるＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物。
【請求項２】
前記ＬＸＲαアゴニストがＴ０９０１３１７である請求項１に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物。
【請求項３】
前記フリーラジカル発生剤が四塩化炭素である請求項１又は２に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物。
【請求項４】
前記高脂肪食が、脂肪を４０ｋｃａｌ％以上８０ｋｃａｌ％以下含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物。
【請求項５】
前記ＬＸＲαアゴニストを、投与量として１回あたり１．０ｍｇ／ｋｇ体重以上３．０ｍｇ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜４回、及び、投与期間として１０週間以上３０週間以下投与してなる請求項１〜４のいずれか一項に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物。
【請求項６】
前記フリーラジカル発生剤を、投与量として１回あたり０．０５ｍＬ／ｋｇ体重以上１．０ｍＬ／ｋｇ体重未満、投与回数として１週間あたり１〜４回、及び、投与期間として１０週間以上３０週間以下投与してなる請求項１〜５のいずれか一項に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物。
【請求項７】
前記非ヒト動物の肝臓が、以下の（ａ１）〜（ｃ１）に示す病理学的形態を有する請求項１〜６のいずれか一項に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物。
（ａ１）肝細胞核内でのクロマチンの凝集
（ｂ１）肝細胞核の大小不同
（ｃ１）類洞構造の廃絶
【請求項８】
前記非ヒト動物が哺乳動物である請求項１〜７のいずれか一項に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物。
【請求項９】
前記哺乳動物が齧歯類である請求項８に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物。
【請求項１０】
ＬＸＲαアゴニストと、
フリーラジカル発生剤と、
高脂肪食と、を備えるＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット。
【請求項１１】
前記ＬＸＲαアゴニストがＴ０９０１３１７である請求項１０に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット。
【請求項１２】
前記フリーラジカル発生剤が四塩化炭素である請求項１０又は１１に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット。
【請求項１３】
前記高脂肪食が、脂肪を４０ｋｃａｌ％以上８０ｋｃａｌ％以下含む請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット。
【請求項１４】
ＮＡＳＨモデル非ヒト動物を更に備え、
前記ＮＡＳＨモデル非ヒト動物は、前記ＬＸＲαアゴニスト及び前記フリーラジカル発生剤を投与し、前記高脂肪食を用いて飼育することにより得られる非ヒト動物である請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット。
【請求項１５】
前記ＮＡＳＨモデル非ヒト動物が、前記ＬＸＲαアゴニストを、投与量として１回あたり１．０ｍｇ／ｋｇ体重以上３．０ｍｇ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜４回、及び、投与期間として１週間以上１５週間以下投与してなる請求項１４に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット。
【請求項１６】
前記ＮＡＳＨモデル非ヒト動物が、前記フリーラジカル発生剤を、投与量として１回あたり０．０５ｍＬ／ｋｇ体重以上１．０ｍＬ／ｋｇ体重未満、投与回数として１週間あたり１〜４回、及び、投与期間として１週間以上１５週間以下投与してなる請求項１４又は１５に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット。
【請求項１７】
前記ＮＡＳＨモデル非ヒト動物は、インスリン抵抗性を示し、且つ、肝臓が、以下の（ａ２）〜（ｄ２）に示す病理学的形態を有する請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット。
（ａ２）大滴性脂肪
（ｂ２）肝細胞の風船様変性
（ｃ２）炎症性細胞の浸潤
（ｄ２）線維化
【請求項１８】
以下の工程（Ａ１）及び（Ｂ１）を備える肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法。
（Ａ１）請求項１〜９のいずれか一項に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程
（Ｂ１）肝がんに対する治療効果を評価する工程
【請求項１９】
以下の工程（Ａ２）〜（Ｃ２）を備える肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法。
（Ａ２）ＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより、ＮＡＳＨモデル非ヒト動物を作製する工程
（Ｂ２）前記ＮＡＳＨモデル非ヒト動物をＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育しながら、被検物質を投与する工程
（Ｃ２）肝がんの発症有無を評価する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物及びその使用に関する。具体的には、本発明は、ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物、ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット及び肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「脂肪肝」は、飲酒によって発症するアルコール性脂肪肝（ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ；ＡＦＬ）と、飲酒によらず発症する非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ；ＮＡＦＬ）とに分類される。ＮＡＦＬの発症による肝臓の脂肪化に伴い、炎症や線維化が進行した状態が非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である。このＮＡＦＬ及びＮＡＳＨは合わせて、非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）と呼ばれる。ＮＡＦＬＤは、日本国において１０００万人の患者が存在し、そのうち２００万人はＮＡＳＨであると推定されている（例えば、非特許文献１参照）。ＮＡＳＨは肝硬変を経て、肝癌に移行することが知られている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、ＮＡＳＨから肝癌を発症するメカニズムについては、未だ明らかになっていない。
【０００３】
現在、ＮＡＳＨモデルとして研究に用いられている実験動物としては、遺伝子改変モデル動物（例えば、特許文献１参照）、遺伝子改変−食事誘導性モデル動物（例えば、特許文献２参照）、食事誘導性モデル動物（例えば、非特許文献３参照）、食事−薬物誘導性モデル動物（例えば、特許文献３参照）等が挙げられる（例えば、非特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第６０２０７９１号公報
【特許文献２】特開２０１７−００６０２２号公報
【特許文献３】特開２０１４−２０９８４９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kojima S, et al., “Increase in the prevalence of fatty liver in Japan over the past 12 years: analysis of clinical background.”, J Gastroenterology, Vol. 38, p. 954-961, 2003.
【非特許文献２】Cohen JC, et al., “Human Fatty Liver Disease: Old Questions and New Insights.”, Science, Vol. 332, No. 6037, p. 1519-1523, 2011.
【非特許文献３】Leclercq IA, et al., “CYP2E1 and CYP4A as microsomal catalysts of lipid peroxides in murine nonalcoholic steatohepatitis.”, J Clin Invest., Vol. 105, No. 8, p. 1067-1075, 2000.
【非特許文献４】Charrez B, et al., “Hepatocellular carcinoma and non-alcoholic steatohepatitis: The state of play.”, World J Gastroenterol., Vol. 22, No. 8, p. 2494-2502, 2016.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の従来のＮＡＳＨモデル動物のうち、ヒトＮＡＳＨに準じたインスリン抵抗性及び病理組織像を併せ持つモデル動物は存在せず、さらに、ＮＡＳＨから肝細胞がんを発症するモデル動物も存在しなかった。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ヒトＮＡＳＨに類似した背景肝から肝がんを発症するＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物を提供する。また、ヒトＮＡＳＨに類似した背景肝から肝がんを発症するＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物を簡便に得られるＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットを提供する。また、肝がんの治療用又は予防用化合物を簡便に得られる肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係るＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、ＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより得られる非ヒト動物である。
【０００９】
前記ＬＸＲαアゴニストがＴ０９０１３１７であってもよい。
前記フリーラジカル発生剤が四塩化炭素であってもよい。
前記高脂肪食が、脂肪を４０ｋｃａｌ％以上８０ｋｃａｌ％以下含んでもよい。
【００１０】
上記第１態様に係るＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、前記ＬＸＲαアゴニストを、投与量として１回あたり１．０ｍｇ／ｋｇ体重以上３．０ｍｇ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜４回、及び、投与期間として１０週間以上３０週間以下投与してなってもよい。
【００１１】
上記第１態様に係るＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、前記フリーラジカル発生剤を、投与量として１回あたり０．０５ｍＬ／ｋｇ体重以上１．０ｍＬ／ｋｇ体重未満、投与回数として１週間あたり１〜４回、及び、投与期間として１０週間以上３０週間以下投与してなってもよい。
【００１２】
前記非ヒト動物の肝臓は、以下の（ａ１）〜（ｃ１）に示す病理学的形態を有してもよい。
（ａ１）肝細胞核内でのクロマチンの凝集
（ｂ１）肝細胞核の大小不同
（ｃ１）類洞構造の廃絶
【００１３】
前記非ヒト動物が哺乳動物であってもよい。
前記哺乳動物が齧歯類であってもよい。
【００１４】
本発明の第２態様に係るＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットは、ＬＸＲαアゴニストと、フリーラジカル発生剤と、高脂肪食と、を備える。
【００１５】
前記ＬＸＲαアゴニストがＴ０９０１３１７であってもよい。
前記フリーラジカル発生剤が四塩化炭素であってもよい。
前記高脂肪食が、脂肪を４０ｋｃａｌ％以上８０ｋｃａｌ％以下含んでもよい。
【００１６】
上記第２態様に係るＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットは、ＮＡＳＨモデル非ヒト動物を更に備え、前記ＮＡＳＨモデル非ヒト動物は、前記ＬＸＲαアゴニスト及び前記フリーラジカル発生剤を投与し、前記高脂肪食を用いて飼育することにより得られる非ヒト動物であってもよい。
【００１７】
前記ＮＡＳＨモデル非ヒト動物は、前記ＬＸＲαアゴニストを、投与量として１回あたり１．０ｍｇ／ｋｇ体重以上３．０ｍｇ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜４回、及び、投与期間として１週間以上１５週間以下投与してなってもよい。
【００１８】
前記ＮＡＳＨモデル非ヒト動物は、前記フリーラジカル発生剤を、投与量として１回あたり０．０５ｍＬ／ｋｇ体重以上１．０ｍＬ／ｋｇ体重未満、投与回数として１週間あたり１〜４回、及び、投与期間として１週間以上１５週間以下投与してなってもよい。
【００１９】
前記ＮＡＳＨモデル非ヒト動物は、インスリン抵抗性を示し、且つ、肝臓は、以下の（ａ２）〜（ｄ２）に示す病理学的形態を有してもよい。
（ａ２）大滴性脂肪
（ｂ２）肝細胞の風船様変性
（ｃ２）炎症性細胞の浸潤
（ｄ２）線維化
【００２０】
本発明の第３態様に係る肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法は、以下の工程（Ａ１）及び（Ｂ１）を備える方法である。
（Ａ１）請求項１〜９のいずれか一項に記載のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程
（Ｂ１）肝がんに対する治療効果を評価する工程
【００２１】
本発明の第４態様に係る肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法は、以下の工程（Ａ２）〜（Ｃ２）を備える方法である。
（Ａ２）ＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより、ＮＡＳＨモデル非ヒト動物を作製する工程
（Ｂ２）前記ＮＡＳＨモデル非ヒト動物をＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育しながら、被検物質を投与する工程
（Ｃ２）肝がんの発症有無を評価する工程
【発明の効果】
【００２２】
上記態様のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、ヒトＮＡＳＨに類似した背景肝から肝がんを発症する非ヒト動物であり、ＮＡＳＨから肝がんを発症するメカニズムの解明に役立てることができる。また、上記態様のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットによれば、簡便にヒトＮＡＳＨに類似した背景肝から肝がんを発症するＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物を得ることができる。上記態様の肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法によれば、肝がんの治療又は予防に有効な化合物を簡便にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】上は、実施例１におけるＮＡＳＨ肝発がんモデルマウスの作製方法のプロトコールを示す図である。下は、ヒトの正常肝臓がＮＡＦＬ及びＮＡＳＨのうち少なくともいずれかを発症し、さらに肝硬変及び肝細胞がんのうち少なくともいずれかを発症する流れを示す図である。
【図２Ａ】実施例１における飼育開始から１２週目のマウスの肝臓のＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色像である。スケールバーは１００μｍを表す。
【図２Ｂ】実施例１における飼育開始から１２週目のマウスの肝臓の鍍銀染色像である。スケールバーは１００μｍを表す。
【図２Ｃ】実施例１における飼育開始から１２週目のマウスの肝臓のＯｉｌ−ｒｅｄ染色像である。スケールバーは１００μｍを表す。
【図３】実施例１における飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の割面肉眼写真である。
【図４Ａ】実施例１における飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部のＨＥ染色像である。左右の画像におけるスケールバーはそれぞれ５００μｍ及び１００μｍを示す。
【図４Ｂ】実施例１における飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部の鍍銀染色像である。左右の画像におけるスケールバーはそれぞれ５００μｍ及び１００μｍを示す。
【図５Ａ】実施例１における飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部及び非腫瘍部での各タンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより検出した画像である。
【図５Ｂ】実施例１における飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部及び非腫瘍部でのＥｒｋ総量（ｔ−Ｅｒｋ）に対するリン酸化Ｅｒｋ（ｐ−Ｅｒｋ）の割合を示すグラフである。
【図５Ｃ】実施例１における飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部及び非腫瘍部でのＡｋｔ総量（ｔ−Ａｋｔ）に対するリン酸化Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）の割合を示すグラフである。
【図５Ｄ】実施例１における飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部及び非腫瘍部でのＳＴＡＴ３総量（ｔ−ＳＴＡＴ３）に対するリン酸化ＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ３）の割合を示すグラフである。
【図６Ａ】実施例１における飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部及び非腫瘍部での各タンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより検出した画像である。
【図６Ｂ】実施例１における飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部及び非腫瘍部でのＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１の発現量を示すグラフである。
【図６Ｃ】実施例１における飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部及び非腫瘍部でのＪＮＫ総量（ｔ−ＪＮＫ）に対するリン酸化ＪＮＫ（ｐ−ＪＮＫ）の割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
≪ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物≫
本発明の一実施形態に係るＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、ＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより得られる非ヒト動物である。また、本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）から肝細胞がんを発症した非ヒト動物である。
【００２５】
従来の作製方法では、インスリン抵抗性及びヒトＮＡＳＨ病理像を有するＮＡＳＨモデル非ヒト動物から肝細胞がんを発症するＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物を作製できなかった。
これに対し、本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物では、非ヒト動物に高脂肪食を摂取させ、ＬＸＲαアゴニストを投与することにより肝臓における脂肪の蓄積が誘発される。また、フリーラジカル発生剤を投与することにより、肝臓シトクロムＰ４５０２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）においてフリーラジカルを発生させて酸化ストレスが生じ、肝臓の線維化及び炎症が誘発される。さらに、この肝臓の炎症によりインスリン抵抗性が誘発される。以上のことから、肝臓における脂肪の蓄積、肝臓の線維化、炎症及びインスリン抵抗性が誘発されることで、インスリン抵抗性を示し、且つ、ヒトＮＡＳＨ病理像を有するＮＡＳＨを発症した非ヒト動物（ＮＡＳＨモデル非ヒト動物）が得られる。さらに、このＮＡＳＨモデル非ヒト動物に、高脂肪食、ＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を継続的に与えることで、ＮＡＳＨから肝細胞がんを発症したＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物が得られる。得られたＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物において、後述の実施例に示すように、肝細胞がんを発症していることはその病理学的形態から確認されている。
【００２６】
なお、本明細書において、「ヒトＮＡＳＨ病理像」とは、肝臓における以下の（ａ２）〜（ｄ２）に示す病理学的形態を意味する。
（ａ２）大滴性脂肪
（ｂ２）肝細胞の風船様変性
（ｃ２）炎症性細胞の浸潤
（ｄ２）線維化
【００２７】
ここで、肝細胞の風船様変性について、風船様腫大が生じる場所は特に制限はない。中でも、風船様腫大が生じる場所としては、ヒトＮＡＳＨの症状により類似しているという点から、中心静脈周囲に生じていることが好ましい。
また、肝臓の線維化を生じているＮＡＳＨモデル非ヒト動物は、ＮＡＳＨの診断基準としてよく知られているＭａｔｔｅｏｎｉらの分類のＮＡＳＨ（Ｔｙｐｅ  ４）によく合致しており、より病態が進んだＮＡＳＨモデルの非ヒト動物となり得る。また、線維化が生じる場所に特に制限はないが、ヒトＮＡＳＨの症状に類似しているという点から、線維化は中心静脈周囲に生じていることが好ましい。
【００２８】
また、非ヒト動物におけるインスリン抵抗性については、血清生化学的検査を行うことで判断することができる。具体的には、例えば、非ヒト動物から採取した血液から血清を分離し、血清中のグルコース濃度（特に、空腹時の血糖）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ（ＧＯＴ））、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ（ＧＰＴ））、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）及び中性脂肪（ＴＧ）からなる群から選ばれる１以上が通常飼料で飼育された非ヒト動物に比べて高い場合、インスリン抵抗性を有すると判断することができる。
より具体的には、例えば、グルコース濃度（空腹時の血糖）は、２００ｍｇ／ｄＬ以上であってよく、３００ｍｇ／ｄＬ以上であってよく、４００ｍｇ／ｄＬ以上であってよい。例えば、ＡＳＴは、２００Ｕ／Ｌ以上であってよく、５００Ｕ／Ｌ以上であってよく、１０００Ｕ以上であってよい。例えば、ＡＬＴは、３００Ｕ／Ｌ以上であってよく、８００Ｕ／Ｌ以上であってよく、１２００Ｕ／Ｌ以上であってよい。例えば、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）は１０００μＥｑ／Ｌ以上であってよく、１２００μＥｑ／Ｌ以上であってよい。中性脂肪は２０ｍｇ／ｄＬ以上であってよく、３０ｍｇ／ｄＬ以上であってよい。
ヒトＮＡＳＨ患者においても、上記の指標が健常人に比べて高いことが報告されており、本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、その飼育過程において、ヒトＮＡＳＨの症状に類似した病態を示すものである。
【００２９】
本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、その飼育過程において、上記のヒトＮＡＳＨ病理像として示された病理学的形態の少なくとも一つ（好ましくは全て）を有し、且つ、インスリン抵抗性を有する。このことから、本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、ヒトＮＡＳＨに類似した背景肝を有するＮＡＳＨモデル非ヒト動物から肝がんを発症したものであると判断できる。
【００３０】
また、一般に「肝がん」とは、肝臓にできた「原発性肝がん」と別の臓器から転移した「転移性肝がん」に大別される。本明細書における「肝がん」としては、原発性肝がんを意味する。
また、一般に、「原発性肝がん」には、肝臓の細胞ががんになる「肝細胞がん」、胆汁を十二指腸に流す役割を担う胆管の細胞ががんになる「胆管細胞がん」、小児の肝がんである肝細胞芽腫、成人での肝細胞及び胆管細胞混合がん、未分化がん、胆管嚢胞腺がん、神経内分泌腫瘍等が存在する。本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物が発症する肝がんとしては、特に肝細胞がんを意味する。
【００３１】
また、本明細書における「肝細胞がんの病理学的形態」とは、肝臓における以下の（ａ１）〜（ｃ１）に示す形態を意味する。
（ａ１）肝細胞核内でのクロマチンの凝集
（ｂ１）肝細胞核の大小不同
（ｃ１）類洞構造の廃絶
【００３２】
本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、上記肝細胞がんの病理学的形態として示された形態の少なくとも一つ（好ましくは全て）を有する。このことから、本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、肝細胞がんを発症していると判断できる。また、本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、従来の作製方法（例えば、発癌物質の投与）によって得られたＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物と上記肝細胞がんの病理学的形態を示す点において構造的に区別される。
【００３３】
本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物として用いられる動物は、ヒト以外の動物であって、通常、実験動物として一般的に使用される動物であれば特に制限されず、非ヒト脊椎動物であることが好ましく、非ヒト哺乳動物であることがより好ましく、齧歯類であることがさらに好ましい。
実験動物として具体的には、例えば、サル、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられる。
実験動物としてマウスを用いる場合、通常のマウスであればよく、雑種でも系統種でもよいが、実験動物として用いられているマウスが好ましい。実験動物として用いられているマウスとして具体的には、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系マウス、Ｃ３Ｈ系マウス、ＩＣＲ系マウス、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス等が挙げられる。
【００３４】
＜ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の作製方法＞
本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、以下に示す投与条件にてＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより作製することができる。換言すると、以下に示す投与条件にてＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育して得られる非ヒト動物は、ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物として使用することができる。
【００３５】
［ＬＸＲαアゴニスト］
ＬＸＲαアゴニストとしては、核内転写因子である肝臓Ｘ受容体α（Ｌｉｖｅｒ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α；ＬＸＲα）に結合し、直接的又は間接的に肝臓における脂肪の蓄積を誘導するものであれば、特に制限されない。ＬＸＲαアゴニストとして具体的には、例えば、Ｔ０９０１３１７、ＧＷ３９６５  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、２７−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＷＡＹ  ２５２６２３等が挙げられる。中でも、ＬＸＲαアゴニストとしては、Ｔ０９０１３１７であることが好ましい。
【００３６】
ＬＸＲαアゴニストの投与手段は、特に制限されず、例えば、腹腔投与、静脈投与、経口投与、皮下投与等が挙げられる。中でも、投与手段としては、腹腔投与が好ましい。
【００３７】
ＬＸＲαアゴニストの投与量としては、腹腔投与である場合、１回あたり１．０ｍｇ／ｋｇ体重以上３．０ｍｇ／ｋｇ体重以下であることが好ましく、１回あたり１．５ｍｇ／ｋｇ体重以上２．５ｍｇ／ｋｇ体重以下であることがより好ましく、１回あたり２．０ｍｇ／ｋｇ体重以上２．５ｍｇ／ｋｇ体重以下であることがさらに好ましい。
投与量が上記下限値以上であることにより、非ヒト動物の肝臓での脂肪の蓄積を誘導し、より高効率でヒトＮＡＳＨに類似した背景肝から肝細胞がんを発症させることができる。一方、上記上限値以下であることにより、非ヒト動物の生存期間をより長く保つことができる。
【００３８】
ＬＸＲαアゴニストの投与回数としては、上記範囲の投与量によって適宜調整すればよい。ＬＸＲαアゴニストの投与回数として具体的には、１週間あたり１〜４回であることが好ましく、１週間あたり１〜３回であることがより好ましく、１週間あたり１〜２回であることがさらに好ましい。
【００３９】
ＬＸＲαアゴニストの投与期間としては、ヒトＮＡＳＨと類似した背景肝から肝細胞がんを発症させるのに必要な期間であればよく、特に制限されず、上記投与量及び上記投与回数に応じて適宜調整すればよい。ＬＸＲαアゴニストの投与期間として具体的には、１０週間以上３０週間以下であることが好ましく、１２週間以上２８週間以下であることがより好ましく、１５週間以上２５週間以下であることがさらに好ましい。
【００４０】
すなわち、本発明のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の好ましい実施形態としては、ＬＸＲαアゴニストを、投与量として１回あたり１．０ｍｇ／ｋｇ体重以上３．０ｍｇ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜４回、及び、投与期間として１０週間以上３０週間以下投与してなるものである。
本発明のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物のより好ましい実施形態としては、ＬＸＲαアゴニストを、投与量として１回あたり１．５ｍｇ／ｋｇ体重以上２．５ｍｇ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜３回、及び、投与期間として１２週間以上３８週間以下投与してなるものである。
本発明のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物のさらに好ましい実施形態としては、ＬＸＲαアゴニストを、投与量として１回あたり２．０ｍｇ／ｋｇ体重以上２．５ｍｇ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜２回、及び、投与期間として１５週間以上２５週間以下投与してなるものである。
【００４１】
［フリーラジカル発生剤］
フリーラジカル発生剤としては、肝臓においてフリーラジカルを発生させ、直接的又は間接的に肝臓における酸化ストレスを誘導するものであれば、特に制限されない。フリーラジカル発生剤として具体的には、例えば、四塩化炭素、（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＡＡ）、ジエチルニトロソアミン（Ｄｉｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ；ＤＥＮ）、２−アセチルアミノフルオレン（２−Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｎｅ：２−ＡＡＦ）、Ｎ−ニトロソモルホリン（Ｎ−Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｐｈｏｌｉｎｅ：ＮＭＯＲ）、１，２−ジクロロエタン（１，２−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｎｅ；ＤＣＥ）等が挙げられる。中でも、フリーラジカル発生剤としては、四塩化炭素であることが好ましい。
【００４２】
フリーラジカル発生剤の投与手段は、特に制限されず、例えば、腹腔投与、静脈投与、経口投与、皮下投与等が挙げられる。中でも、投与手段としては、腹腔投与が好ましい。
【００４３】
フリーラジカル発生剤の投与量としては、通常の酸化ストレスによる肝障害を生じさせる量である１．０ｍｌ／ｋｇ体重／よりも低用量であることが、ヒトＮＡＳＨに類似した背景肝から肝細胞がんを発症させるために重要である。フリーラジカル発生剤の投与量として具体的には、腹腔投与である場合、１回あたり０．０５ｍＬ／ｋｇ体重以上１．０ｍＬ／ｋｇ体重未満であることが好ましく、１回あたり０．０５ｍＬ／ｋｇ体重以上０．５ｍＬ／ｋｇ体重以下であることがより好ましく、１回あたり０．１ｍＬ／ｋｇ体重以上０．２５ｍＬ／ｋｇ体重以下であることがさらに好ましい。
投与量が上記下限値以上であることにより、非ヒト動物の肝臓での酸化ストレスを誘導し、より高効率でヒトＮＡＳＨに類似した背景肝から肝細胞がんを発症させることができる。一方、上記上限値以下であることにより、非ヒト動物の肝臓において肝細胞がんを発症させる前に、より高効率でヒトＮＡＳＨに類似した背景肝とすることができる。
【００４４】
フリーラジカル発生剤の投与回数としては、上記範囲の投与量によって適宜調整すればよい。フリーラジカル発生剤の投与回数として具体的には、１週間あたり１〜４回であることが好ましく、１週間あたり１〜３回であることがより好ましく、１週間あたり１〜２回であることがさらに好ましい。
なお、ＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤は、非ヒト動物に同時に投与してもよく、同日又は別日に異なるタイミングで投与してもよい。
【００４５】
フリーラジカル発生剤の投与期間としては、ヒトＮＡＳＨと類似した背景肝から肝細胞がんを発症させるのに必要な期間であればよく、特に制限されず、上記投与量及び上記投与回数に応じて適宜調整すればよい。フリーラジカル発生剤の投与期間として具体的には、１０週間以上３０週間以下であることが好ましく、１２週間以上２８週間以下であることがより好ましく、１５週間以上２５週間以下であることがさらに好ましい。
【００４６】
すなわち、本発明のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の好ましい実施形態としては、フリーラジカル発生剤を、投与量として１回あたり０．０５ｍＬ／ｋｇ体重以上１．０ｍＬ／ｋｇ体重未満、投与回数として１週間あたり１〜４回、及び、投与期間として１０週間以上３０週間以下投与してなるものである。
本発明のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物のより好ましい実施形態としては、フリーラジカル発生剤を、投与量として１回あたり０．０５ｍＬ／ｋｇ体重以上０．５ｍＬ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜３回、及び、投与期間として１２週間以上３８週間以下投与してなるものである。
本発明のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物のさらに好ましい実施形態としては、フリーラジカル発生剤を、投与量として１回あたり０．１ｍＬ／ｋｇ体重以上０．２５ｍＬ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜２回、及び、投与期間として１５週間以上２５週間以下投与してなるものである。
【００４７】
［高脂肪食］
高脂肪食としては、脂肪を３０ｋｃａｌ％以上含有する食餌であればよく、４０ｋｃａｌ％以上８０ｋｃａｌ％以下含有する食餌であることが好ましく、５０ｋｃａｌ％以上７０ｋｃａｌ％以下含有する食餌であることがより好ましく、６０ｋｃａｌ％含有する食餌であることがさらに好ましい。ここで脂肪としては、動物性脂肪、植物性脂肪にかかわらず、あらゆる種類の脂肪を用いることができる。脂肪として具体的には、例えば、コーン油、大豆油、なたね油、牛脂、豚脂等を挙げられる。中でも、脂肪としては、牛脂又は豚脂が好ましい。また高脂肪食中の脂肪以外の成分は、通常の食餌成分であればよく、例えば、タンパク質、炭水化物、ミネラル等を含んでもよい。
高脂肪食としてより具体的には、例えば、研究用動物飼料として市販されているＨｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ３２（日本クレア社製）、Ｄ１２４９２（リサーチダイエット社製）等が挙げられる。
【００４８】
高脂肪食の摂取期間としては、肥満が生じるのに必要な期間であればよく、特に制限されない。高脂肪食の摂取期間として具体的には、１週間以上が好ましく、４週間以上がより好ましく、１０週間以上３０週間以下がさらに好ましく、１２週間以上２８週間以下であることが特に好ましく、１５週間以上２５週間以下であることが最も好ましい。また、高脂肪食は、動物に毎日自由摂取させればよい。なお、上記ＬＸＲαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与期間中も高脂肪食は摂取し続けることが好ましい。
【００４９】
すなわち、本発明のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の好ましい実施形態としては、高脂肪食を１週間以上摂取させた後、高脂肪食の摂取を続けつつ、上記ＬＸＲαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤を上記投与条件（投与量、投与回数及び投与期間）にて投与してなるものである。
【００５０】
また、非ヒト動物への上記ＬＸＲαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与、並びに、上記高脂肪食の摂取を開始するタイミングとしては、非ヒト動物がマウスである場合、２週齢以上１０週齢以下であることが好ましく、４週齢以上８週齢以下であることがより好ましく、６週齢以上７週齢以下であることがさらに好ましい。また、上記ＬＸＲαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与、並びに、上記高脂肪食の摂取を同時に行ってもよい。又は、上記高脂肪食の摂取を１週間以上前に開始して飼育した後に、上記ＬＸＲαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与を開始してもよい。
【００５１】
≪ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット≫
本発明の一実施形態に係るＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットは、ＬＸＲαアゴニストと、フリーラジカル発生剤と、高脂肪食と、を備える。
【００５２】
本実施形態の製造キットによれば、簡便にヒトＮＡＳＨに類似した背景肝から肝がんを発症するＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物を得ることができる。
【００５３】
本実施形態の製造キットが備えるＬＸＲαアゴニスト、フリーラジカル発生剤及び高脂肪食としては、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。
中でも、ＬＸＲαアゴニストとしては、Ｔ０９０１３１７であることが好ましい。フリーラジカル発生剤としては、四塩化炭素であることが好ましい。高脂肪食としては、脂肪を２０ｋｃａｌ％以上含有する食餌であればよく、４０ｋｃａｌ％以上８０ｋｃａｌ％以下含有する食餌であることが好ましく、５０ｋｃａｌ％以上７０ｋｃａｌ％以下含有する食餌であることがより好ましく、６０ｋｃａｌ％含有する食餌であることがさらに好ましい。
【００５４】
また、本実施形態の製造キットを用いて、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物に記載の投与条件にて非ヒト動物を飼育して得られた非ヒト動物は、ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物として使用することができる。
なお、本実施形態の製造キットが適用される非ヒト動物としては、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００５５】
本実施形態の製造キットを用いて、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の作製方法に記載の投与条件にて非ヒト動物を飼育することで、非ヒト動物の正常な肝臓にＮＡＳＨを発症させ、さらに肝細胞がんを発症させて、ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物を作製することができる。
【００５６】
また、本実施形態の製造キットは、ＮＡＳＨモデル非ヒト動物を更に備えてもよい。
このＮＡＳＨモデル非ヒト動物は、上記ＬＸＲαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤を投与し、上記高脂肪食を用いて飼育することにより得られる非ヒト動物である。
また、本実施形態の製造キットが備えるＮＡＳＨモデル非ヒト動物は、インスリン抵抗性を示し、且つ、ヒトＮＡＳＨ病理像を有するものである。ここでいう「ヒトＮＡＳＨ病理像」とは、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物において記載してものと同様のものである。
本実施形態の製造キットは、ＮＡＳＨモデル非ヒト動物を更に備えることで、より短期間でＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物を作製することができる。
【００５７】
＜ＮＡＳＨモデル非ヒト動物の作製方法＞
本実施形態の製造キットが備えるＮＡＳＨモデル非ヒト動物は、以下に示す投与条件にてＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより作製することができる。換言すると、以下に示す投与条件にてＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育して得られる非ヒト動物は、ＮＡＳＨモデル非ヒト動物として使用することができる。
【００５８】
ＬＸＲαアゴニストとしては、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００５９】
ＬＸＲαアゴニストの投与手段、投与量及び投与回数としては、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００６０】
ＬＸＲαアゴニストの投与期間としては、ヒトＮＡＳＨ特有の病理像が現れるのに必要な期間であればよく、特に制限されず、上記投与量及び上記投与回数に応じて適宜調整すればよい。ＬＸＲαアゴニストの投与期間として具体的には、１週間以上１５週間以下であることが好ましく、５週間以上１４週間以下であることがより好ましく、１０週間以上１２週間以下であることがさらに好ましい。
【００６１】
すなわち、本発明の製造キットが備えるＮＡＳＨモデル非ヒト動物の好ましい実施形態としては、ＬＸＲαアゴニストを、投与量として１回あたり１．０ｍｇ／ｋｇ体重以上３．０ｍｇ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜４回、及び、投与期間として１週間以上１５週間以下投与してなるものである。
本発明の製造キットが備えるＮＡＳＨモデル非ヒト動物のより好ましい実施形態としては、ＬＸＲαアゴニストを、投与量として１回あたり１．５ｍｇ／ｋｇ体重以上２．５ｍｇ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜３回、及び、投与期間として５週間以上１４週間以下投与してなるものである。
本発明の製造キットが備えるＮＡＳＨモデル非ヒト動物のさらに好ましい実施形態としては、ＬＸＲαアゴニストを、投与量として１回あたり２．０ｍｇ／ｋｇ体重以上２．５ｍｇ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜２回、及び、投与期間として１０週間以上１２週間以下投与してなるものである。
【００６２】
フリーラジカル発生剤としては、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００６３】
フリーラジカル発生剤の投与手段、投与量及び投与回数としては、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。
なお、ＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤は、非ヒト動物に同時に投与してもよく、同日又は別日に異なるタイミングで投与してもよい。
【００６４】
フリーラジカル発生剤の投与期間としては、ヒトＮＡＳＨ特有の病理像が現れるのに必要な期間であればよく、特に制限されず、上記投与量及び上記投与回数に応じて適宜調整すればよい。ＬＸＲαアゴニストの投与期間として具体的には、１週間以上１５週間以下であることが好ましく、５週間以上１４週間以下であることがより好ましく、１０週間以上１２週間以下であることがさらに好ましい。
【００６５】
すなわち、本発明の製造キットが備えるＮＡＳＨモデル非ヒト動物の好ましい実施形態としては、フリーラジカル発生剤を、投与量として１回あたり０．０５ｍＬ／ｋｇ体重以上１．０ｍＬ／ｋｇ体重未満、投与回数として１週間あたり１〜４回、及び、投与期間として１週間以上１５週間以下投与してなるものである。
本発明の製造キットが備えるＮＡＳＨモデル非ヒト動物のより好ましい実施形態としては、フリーラジカル発生剤を、投与量として１回あたり０．０５ｍＬ／ｋｇ体重以上０．５ｍＬ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜３回、及び、投与期間として５週間以上１４週間以下投与してなるものである。
本発明の製造キットが備えるＮＡＳＨモデル非ヒト動物のさらに好ましい実施形態としては、フリーラジカル発生剤を、投与量として１回あたり０．１ｍＬ／ｋｇ体重以上０．２５ｍＬ／ｋｇ体重以下、投与回数として１週間あたり１〜２回、及び、投与期間として１０週間以上１２週間以下投与してなるものである。
【００６６】
高脂肪食としては、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００６７】
高脂肪食の摂取期間としては、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００６８】
すなわち、本発明の製造キットが備えるＮＡＳＨモデル非ヒト動物の好ましい実施形態としては、高脂肪食を１週間以上摂取させた後、高脂肪食の摂取を続けつつ、上記ＬＸＲαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤を上記投与条件（投与量、投与回数及び投与期間）にて投与してなるものである。
【００６９】
また、非ヒト動物への上記ＬＸＲαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与、並びに、上記高脂肪食の摂取を開始するタイミングとしては、非ヒト動物がマウスである場合、２週齢以上１０週齢以下であることが好ましく、４週齢以上８週齢以下であることがより好ましく、６週齢以上７週齢以下であることがさらに好ましい。また、上記ＬＸＲαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与、並びに、上記高脂肪食の摂取を同時に行ってもよい。又は、上記高脂肪食の摂取を１週間以上前に開始して飼育した後に、上記ＬＸＲαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与を開始してもよい。
【００７０】
≪肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法≫
＜第１実施形態＞
本発明の一実施形態に係る肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法は、以下の工程（Ａ１）及び（Ｂ１）を備える方法である。
（Ａ１）上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程
（Ｂ１）肝がんに対する治療効果を評価する工程
【００７１】
本実施形態のスクリーニング方法によれば、肝がんの治療又は予防に有効な化合物をスクリーニングすることができる。また、特に、本実施形態のスクリーニング方法によれば、発症した肝細胞がんの進行を抑制する、又は、肝細胞がんのみを死滅させて治療するために有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【００７２】
［工程（Ａ１）］
工程（Ａ１）は、ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程である。
ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、非ヒト動物を上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の作製方法に記載の投与条件にて飼育することで作製することができる。
【００７３】
本実施形態のスクリーニング方法に用いられる被検物質としては、特に制限はない。被検物質として具体的には、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。
【００７４】
ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物への被検物質の投与方法としては、特に制限はない。被検物質の投与方法として具体的には、例えば、腹腔投与、静脈投与、経口投与、皮下投与等が挙げられる。被検物質がタンパク質である場合には、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物へ該遺伝子を導入することも可能である。
【００７５】
［工程（Ｂ１）］
工程（Ｂ１）は、被検物質の肝がんに対する治療効果を評価する工程である。
具体的には、ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の呈する病理学的形態を検討することにより、肝細胞がんが改善しているか否かを判定することができる。より具体的には、例えば、被検物質が投与されたモデル動物において、肝細胞がんが消失している、又は、類洞構造が保たれている場合には、被検物質は肝細胞がんへの治療効果を有するものと判定される。
肝細胞がんの病理学的形態としては、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物に記載のものと同様のものが挙げられる。
また、本明細書における「肝細胞がんの改善」とは、肝細胞がんの増殖を抑制している、肝細胞がんのみが死滅している、又は、肝細胞がんの症状が緩和していることを指す。当業者であれば、本明細書に記載された肝細胞がんの病理学的形態を指標に、モデル非ヒト動物について適宜肝細胞がんが改善しているか否かを判定することができる。
【００７６】
工程（Ｂ１）において、改善効果を示す被検物質を肝細胞がんの治療用又は予防用物質として選択することができる。
【００７７】
＜第２実施形態＞
本発明の他の実施形態に係る肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法は、以下の工程（Ａ２）〜（Ｃ２）を備える肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法。
（Ａ２）ＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデル非ヒト動物を作製する工程
（Ｂ２）前記ＮＡＳＨモデル非ヒト動物をＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育しながら、被検物質を投与する工程
（Ｃ２）肝がんの発症有無を評価する工程
【００７８】
本実施形態の肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法によれば、肝がんの治療又は予防に有効な化合物をスクリーニングすることができる。また、特に、本実施形態のスクリーニング方法によれば、ＮＡＳＨからの肝細胞がんの発症を抑制する、又は、ＮＡＳＨを改善することで肝細胞がんの発症を予防するために有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【００７９】
［工程（Ａ２）］
工程（Ａ２）は、ＮＡＳＨモデル非ヒト動物を作製する工程である。
具体的な作製方法としては、上述のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットに記載の方法と同様の方法が挙げられる。
【００８０】
［工程（Ｂ２）］
工程（Ｂ２）は、（Ａ２）で得られたＮＡＳＨモデル非ヒト動物をＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育しながら、被検物質を投与する工程である。
上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物において説明したように、工程（Ｂ２）において、ＮＡＳＨモデル非ヒト動物を、被検物質を投与せずに、ＬＸＲαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育し続けることで、ＮＡＳＨから肝細胞がんの発症を誘導することができる。
被検物質及びその投与方法としては、上記第１実施形態に例示されたものと同様のものが挙げられる。また、被検物質を投与するタイミングとしては、上記ＬＸＲαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与と同じであってもよく、異なっていてもよい。
【００８１】
［工程（Ｃ２）］
工程（Ｃ２）は、モデル非ヒト動物における肝がんの発症有無を評価する工程である。
具体的には、モデル非ヒト動物の呈する病理学的形態を検討することにより、肝がんの発症有無を判定することができる。より具体的には、例えば、被検物質が投与されたモデル動物において、ＮＡＳＨ（の病理学的形態）が改善している、又は、肝細胞がんの病理学的形態を呈さない場合には、被検物質は肝細胞がんへの治療効果を有するものと判定される。
ＮＡＳＨ及び肝細胞がんの病理学的形態としては、上記ＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物に記載のものと同様のものが挙げられる。
また、本明細書における「ＮＡＳＨの改善」とは、ＮＡＳＨの症状が正常な状態へ回復している、又は、症状が緩和していることを指す。当業者であれば、本明細書に記載された病理学的形態を指標に、モデル非ヒト動物について適宜ＮＡＳＨの症状が改善しているか否かを判定することができる。
【００８２】
工程（Ｃ２）において、肝細胞がんの病理学的形態を呈さない被検物質を肝細胞がんの治療用又は予防用物質として選択することができる。また、ＮＡＳＨの症状に対する改善効果を示す被検物質はＮＡＳＨの治療用又は予防用物質としても有用である。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８４】
［実施例１］
（１）ＮＡＳＨモデルマウスの作製
７週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス１２個体に対して、高脂肪食（脂肪含有量：６０ｋｃａｌ％、ラード含有、Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社製）を自由摂取させ、四塩化炭素（０．１ｍＬ／ｋｇ体重、和光純薬工業株式会社製）を週に２回腹腔内投与した。また、ＬＸＲアゴニストであるＴ０９０１３１７（２．５ｍｇ／ｋｇ体重、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  Ｍｉｃｈｉｇａｎ． ＵＳＡ）を週に２回腹腔内投与した。なお、四塩化炭素及びＴ０９０１３１７は同日に投与した。
【００８５】
（２）ＮＡＳＨモデルマウスの病理組織学的観察
（２−１）Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色
飼育開始から１２週目の一部のマウス（３個体）から肝臓を常法により切り出し、パラフィンで包埋した。次いで、パラフィンブロックを約４μｍの厚さに薄切りし、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色キット（ヘマトキシリン：メルク社製、硫酸カリウムアルミニウム：和光純薬工業株式会社製、グリセリン：和光純薬工業株式会社製、ヨウ素酸ナトリウム：小宗化学薬品株式会社製）を用いて、ＨＥ染色を施した。次いで、光学顕微鏡（ＨＳ  オールインワン蛍光顕微鏡  ＢＺ−９０００、Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）にて観察した（倍率：４００倍）。結果を図２Ａに示す。図２Ａにおいて、矢印はマロリー小体を示し、矢頭は風船様細胞を示している。なお、ここでいう「マロリー小体」とは、肝細胞の核の周辺部に出現する、ユビキチン化タンパク質、中間径フィラメントであるケラチン８及１８、ｐ６２等が不定形の構造物として蓄積した好酸性細胞質内封入体を意味する。マロリー小体は脂肪肝、肝がんや肝硬変を発症した肝細胞にて観察されることが知られている。
【００８６】
（２−２）鍍銀染色
（２−１）で得られたパラフィンブロックを約４μｍの厚さに薄切りし、銀アンモニア錯体（硝酸銀、水酸化カリウム、アンモニア水：全て和光純薬工業株式会社製）を用いて鍍銀染色を施した。次いで、光学顕微鏡（ＨＳ  オールインワン蛍光顕微鏡  ＢＺ−９０００、Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）にて観察した（倍率：１００倍）。結果を図２Ｂに示す。図２Ｂにおいて、「ＣＶ」は中心静脈（ｃｅｎｔｒａｌ ｖｅｉｎ）を示し、「Ｇ」はグリソン鞘（小葉間結合組織、Ｇｌｉｓｓｏｎ  ｓｈｅａｔｈ）を示す。また、矢印は、橋渡しするような線維化構造を示している。
【００８７】
（２−３）Ｏｉｌ−ｒｅｄ染色
（２−１）で得られたパラフィンブロックを約４μｍの厚さに薄切りし、オイルレッド（Ｏｉｌ−ｒｅｄ）Ｏ染色キット（オイルレッドＯ：クローマ社製、２−プロパノール：和光純薬工業株式会社製）を用いてＯｉｌ−ｒｅｄ染色を施した。次いで、光学顕微鏡（ＨＳ  オールインワン蛍光顕微鏡  ＢＺ−９０００、Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）にて観察した（倍率：２００倍）。結果を図２Ｃに示す。
【００８８】
（２−４）観察結果
図２Ａから、マロリー小体及び風船様細胞が観察された。また、類洞内好中球浸潤が確認され、炎症性細胞の浸潤が目立っていた。
図２Ｂから、グリソン鞘の周囲等に線維化が観察され、また、橋渡しするように線維化が認められた。
図２Ｃから、大滴性の脂肪滴が観察された。脂肪滴が小葉面積の３０％以上を占めていた。
以上のことから、飼育開始から１２週目のマウスの肝臓では、ＮＡＳＨの病理学的診断基準（参考文献１：Matteoni CA, et al., “Nonalcoholic fatty liver disease: a spectrum of clinical and pathological severity.”, Gastroenterology, Vol. 116, Issue 6, p1413-1419, 1999.）である、大滴性脂肪、肝細胞の風船様変性、炎症性細胞の浸潤及び線維化の全てが観察された。すなわち、飼育開始から１２週目のマウスの肝臓は、ヒトＮＡＳＨの病理像を有することが確かめられた。
【００８９】
（３）ＮＡＳＨ肝発がんモデルマウスの作製
さらに、（１）に示した条件と同じ条件にて、飼育開始から２４週目までマウスを飼育した。なお、飼育開始から２４週目まで生き残ったのは４個体であった。
【００９０】
（４）ＮＡＳＨ肝発がんモデルマウスの病理組織学的観察
（４−１）ＨＥ染色
飼育開始から２４週目のマウス（４個体）から肝臓を常法により切り出したところ、全ての個体において多発性腫瘤を形成していた（図３参照、矢印は腫瘍部を示している）。次いで、摘出した肝臓の腫瘍部をパラフィンで包埋した。次いで、腫瘍部のパラフィンブロックを約４μｍの厚さに薄切りし、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色キット（ヘマトキシリン：メルク社製、硫酸カリウムアルミニウム：和光純薬工業株式会社製、グリセリン：和光純薬工業株式会社製、ヨウ素酸ナトリウム：小宗化学薬品株式会社製）を用いて、ＨＥ染色を施した。次いで、光学顕微鏡（ＨＳ  オールインワン蛍光顕微鏡  ＢＺ−９０００、Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）にて観察した（倍率：１００倍（左）、２００倍（右））。結果を図４Ａに示す。図４Ａにおいて、「ＣＶ」は中心静脈（ｃｅｎｔｒａｌ ｖｅｉｎ）を示し、「Ｇ」はグリソン鞘（小葉間結合組織、Ｇｌｉｓｓｏｎ  ｓｈｅａｔｈ）を示す。また、矢印は、クロマチンが凝集した細胞核を示しており、矢頭は風船様細胞を示している。
【００９１】
（４−２）鍍銀染色
（４−１）で得られた腫瘍部のパラフィンブロックを約４μｍの厚さに薄切りし、銀アンモニア錯体（硝酸銀、水酸化カリウム、アンモニア水：全て和光純薬工業株式会社製）を用いて鍍銀染色を施した。次いで、光学顕微鏡（ＨＳ  オールインワン蛍光顕微鏡  ＢＺ−９０００、Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）にて観察した（倍率：１００倍（左）、４００倍（右））。結果を図４Ｂに示す。図４Ｂにおいて、「ＣＶ」は中心静脈（ｃｅｎｔｒａｌ ｖｅｉｎ）を示し、「Ｇ」はグリソン鞘（小葉間結合組織、Ｇｌｉｓｓｏｎ  ｓｈｅａｔｈ）を示す。
【００９２】
（４−３）観察結果
図４Ａから、腫瘍部において正常構造は破壊され、門脈域や類洞構造が不明瞭となっていた。また、細胞のサイズばらつきがあり、核の大小不同が観察された。また、クロマチンが凝集している細胞核が散見された。さらに、脂肪による空胞が目立っていた。
図４Ｂから、腫瘍部では、類洞構造の廃絶が認められた。
以上のことから、飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部では、ＮＡＳＨから発症した肝細胞がんの病理学的所見である、細胞核におけるクロマチンの凝集、細胞核の大小不同及び類洞構造の廃絶が観察された。すなわち、飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部は、ヒトＮＡＳＨを背景肝とした肝細胞がんの病理像を有することが確かめられた。また、飼育開始から２４週目のマウス４個体全てにおいて、腫瘍が形成されており、ヒトＮＡＳＨを背景肝とした肝細胞がんの病理像を有していた。
【００９３】
（５）ＮＡＳＨ肝発がんモデルマウスの肝細胞中のタンパク質発現の評価
まず、飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部及び非腫瘍部を用いて、細胞破砕液を調製した。次いで、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ３系、ＰＩ３−Ｋ／Ａｋｔ系及びＭＡＰＫ／Ｅｒｋ系に関与するタンパク質（具体的には、リン酸化Ｅｒｋ、Ｅｒｋ総量、リン酸化Ａｋｔ、Ａｋｔ総量、リン酸化ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ３総量、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、リン酸化ＪＮＫ及びＪＮＫ総量）をウエスタンブロッティングにより検出した。また、ＧＡＰＤＨはローディングコントロールである。結果を図５Ａ及び図６Ａに示す。さらに、ウエスタンブロッティングにおける各タンパク質の検出輝度から、Ｅｒｋ総量に対するリン酸化Ｅｒｋの割合（ｐ−Ｅｒｋ／ｔ−Ｅｒｋ）（図５Ｂ）、Ａｋｔ総量に対するリン酸化Ａｋｔの割合（ｐ−Ａｋｔ／ｔ−Ａｋｔ）（図５Ｃ）、ＳＴＡＴ３総量に対するリン酸化ＳＴＡＴ３の割合（ｐ−ＳＴＡＴ３／ｔ−ＳＴＡＴ３）（図５Ｄ）、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１の発現量（図６Ｂ）及びＪＮＫ総量に対するリン酸化ＪＮＫの割合（ｐ−ＪＮＫ／ｔ−ＪＮＫ）（図６Ｃ）を算出した。
【００９４】
図５Ａ〜図５Ｄ及び図６Ａ〜図６Ｃから、腫瘍部では、各増殖シグナル系に関与するタンパク質のリン酸化の上昇が認められた。また、腫瘍部では非腫瘍部と比較して、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１の発現量が有意に上昇していた。
【００９５】
ヒトの肝細胞がんでは、Ｅｒｋ、Ａｋｔ、ＭＥＫ、ｃｍｙｃ、ＢＣＬ及びＳＴＡＴ３のリン酸化の上昇することが知られている。また、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１の発現量が上昇することが知られている。
以上のことから、飼育開始から２４週目のマウスの肝臓の腫瘍部は、ヒトＮＡＳＨを背景肝とした肝細胞がんのタンパク質発現を再現していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物は、ヒトＮＡＳＨに類似した背景肝から肝がんを発症する非ヒト動物であり、ＮＡＳＨから肝がんを発症するメカニズムの解明に役立てることができる。また、本実施形態のＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットによれば、簡便にヒトＮＡＳＨに類似した背景肝から肝がんを発症するＮＡＳＨ肝発がんモデル非ヒト動物を得ることができる。本実施形態の肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法によれば、肝がんの治療又は予防に有効な化合物を簡便にスクリーニングすることができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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