(57)【要約】【課題】本発明は、高い分化能を保持したヒト脂肪組織由来体性幹細胞を、再生医療に実用できる程度に多くの量を得ることを目的とする。【解決手段】ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法であって、固体相に付着したヒト脂肪組織由来の細胞を、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とに分離し、分離した剥離しやすい細胞を７％の酸素濃度下で低酸素培養することで、高い分化能を保持したヒト脂肪組織由来体性幹細胞を、再生医療に実用できる程度に多くの量を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法であって、製造過程において固体相に付着したヒト脂肪組織由来の細胞を、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とに分離し、分離した剥離しやすい細胞を低酸素培養する工程を含むことを特徴とし、細胞内における低酸素誘導因子の発現量が所定の値を超えないことを指標として前記低酸素培養の条件が設定された製造方法。
【請求項２】
ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の低酸素培養の条件において、酸素濃度を７％程度に設定する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法であって、固体相に付着したヒト脂肪組織由来の細胞を、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とに分離し、分離した剥離しやすい細胞を７％程度の酸素濃度下で低酸素培養する工程を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項４】
固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞との分離が、ヒト脂肪組織由来の細胞が付着した固体相に細胞剥離剤を添加して、付着した細胞を部分的に剥離させ、剥離した細胞を取得することによって行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】再生医療に用いられる幹細胞として、体性幹細胞がある。体性幹細胞は、生体内から採取されるものであり、安全性が高いと考えられている。【０００３】体性幹細胞は、生体内の様々な部位から採取され、脂肪組織から採取することができる。ヒト脂肪組織から採取された体性幹細胞は、ヒト脂肪組織由来体性幹細胞などと呼ばれる。ヒト脂肪組織由来体性幹細胞は、他の組織由来の体性幹細胞とは異なり、内胚葉、中胚葉、および外肺葉からなる三胚葉への分化能を備えているといわれ、高い汎用性が期待される。従来、ヒト脂肪組織由来体性幹細胞は、各種の方法で調製されてきた。しかしながら、従来の方法では、ヒト脂肪組織由来体性幹細胞を培養しても、十分な量を得る前に老化が起こって増殖が停止し、高い分化能が維持されず、ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の再生医療への実用化は困難であると考えられていた。【０００４】細胞を人工的に培養する条件として、低酸素培養が知られている。低酸素培養は、生体内における生理的酸素条件を模倣したものといわれており、低酸素培養によって幹細胞の分化能力や増殖能力が向上するといわれている。しかしながら、これらの先行技術において、分化能力または増殖能力に対する低酸素培養の影響は、数倍程度の増強であり、微弱であった。ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の場合、従来の数倍程度の数の細胞が得られても、再生医療への実用化は難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】本発明は、高い分化能を保持したヒト脂肪組織由来体性幹細胞を、再生医療に実用できる程度に多くの量を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】本発明者らは、固体相に付着したヒト脂肪組織由来の細胞のうち、固体相から剥離しやすい細胞からなる細胞集団が、低酸素条件下では、極めて長期間にわたって高い分化能を維持したまま老化せずに効率よく増殖を続けるため、このような増殖を製造工程に含めることによって、再生医療に実用できる程度の多量の細胞が得られることを見出した。固体相に付着した細胞を剥離しやすい細胞と剥離しにくい細胞とに分離せずに用いる従来の方法の場合には、低酸素条件で培養しても、このような顕著な結果は観察されなかったため、この知見は、全く意外である。低酸素条件は、剥離しやすい細胞に対して、特異的な影響を有することが推測される。【０００７】すなわち、本発明は、ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法であって、固体相に付着したヒト脂肪組織由来の細胞を、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とに分離し、分離した剥離しやすい細胞を低酸素培養する工程を含むことを特徴とする、製造方法を提供する。【０００８】また、本発明は、細胞内における低酸素誘導因子の発現量が所定の値を超えないことを指標として、低酸素培養の条件が設定される、上記の製造方法を提供する。【０００９】また、本発明は、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞との分離が、ヒト脂肪組織由来の細胞が付着した固体相に細胞剥離剤を添加して、付着した細胞を部分的に剥離させ、剥離した細胞を取得することによって行われる、上記の製造方法を提供する。【００１０】また、本発明は、上記の製造方法によって製造されたヒト脂肪由来体性幹細胞を提供する。【００１１】本発明の製造方法においては、固体相に付着したヒト脂肪組織由来の細胞が用いられる。【００１２】固体相に付着したヒト脂肪組織由来の細胞は、ヒト脂肪組織由来の細胞を固体相に加え、増殖させて、固体相に付着させて得る。固体相に加えるヒト脂肪組織由来の細胞は、脂肪組織を液体中に分散させ、遠心分離を行い、ペレットなどで回収することによって得る。脂肪組織を分散させる液体は、外来性のコラゲナーゼなどのタンパク質分解酵素を含む。脂肪組織は、ヒト、マウス等の哺乳類に由来するものである。脂肪組織からヒト脂肪組織由来の細胞を得る工程は、赤血球を除く工程を含んでいる。赤血球を除く工程は、密度勾配遠心または比重法を用いる。ヒト脂肪組織由来の細胞を付着させる固体相は、培養容器であってもよい。ヒト脂肪組織由来の細胞を固体相に加えた後の増殖は、低グルコース培地で二酸化炭素存在下、および通常酸素濃度条件下で行う。低グルコース培地中のグルコース濃度は、例えば、１〜５ｇ／Ｌである。増殖の際の二酸化炭素の濃度は、例えば、３〜１０％である。増殖の際の酸素濃度は、例えば、１５〜３０％である。ヒト脂肪組織由来の細胞を固体相に付着させたのち、固体相の洗浄を行い、付着しなかった細胞を除去する。【００１３】本発明の製造方法においては、固体相に付着したヒト脂肪組織由来の細胞を、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とに分離し、分離した剥離しやすい細胞が用いられる。【００１４】固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とを分離して、分離した剥離しやすい細胞を取得するためには、ヒト脂肪組織由来の細胞を付着させた固体相に細胞剥離剤を添加して、付着した細胞を部分的に剥離させ、剥離した細胞を取得してもよい。添加する細胞剥離剤は、培養細胞を容器から剥離させるための薬剤であり、エチレンジアミン四酢酸を含む溶液であってもよい。エチレンジアミン四酢酸を含む溶液は、溶質としてエチレンジアミン四酢酸のみを含む溶液であってもよい。溶液中のエチレンジアミン四酢酸の濃度は、例えば、０．１〜１．５ｇ／Ｌである。細胞剥離剤の添加後に剥離した細胞の取得は、細胞剥離剤の添加の後に、固体相から浮遊した細胞を取得することによって行う。【００１５】本発明の製造方法においては、分離した剥離しやすい細胞が低酸素培養される。【００１６】分離した細胞の低酸素培養は、分離した細胞を、培地を含む容器中で５０００〜２５０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、低酸素培養することによって行う。培養に用いられる容器は、フィブロネクチン等の糖タンパク質が被覆されていてもよい。フィブロネクチンは、細胞接着分子であり、細胞外マトリクスを形成する生体物質である。培養に用いられる培地は、ペプチドホルモンを含む細胞増殖促進剤、合成副腎皮質ホルモン、酸化防止剤、成長因子、血清等を含む。低酸素培養における酸素の濃度は、例えば、７％程度である。細胞の低酸素培養は、二酸化炭素存在下で行う。二酸化炭素の濃度は、例えば、４〜１０％である。低酸素培養における培養温度は、例えば、３３〜３９℃である。【００１７】低酸素誘導因子の発現量は、低酸素条件下で増大する傾向にあることが知られている。しかしながら、本発明の製造方法は、細胞内における低酸素誘導因子の発現量が増大しない程度の低酸素条件において、より高い増殖度を実現することが明らかになった。したがって、本発明の製造方法における低酸素培養の条件は、細胞内における低酸素誘導因子の発現量が所定の値を超えないことを指標として設定することが好ましい。これにより、より確実に多量の細胞を得ることができる。設定する培養条件は、たとえば、培養時間や培養時の酸素濃度である。【００１８】低酸素誘導因子とは細胞に対する酸素供給が不足状態に陥った際に誘導されてくるタンパク質であり、転写因子として機能する因子のことである。【００１９】細胞内における低酸素誘導因子の発現量は、たとえば、低酸素培養中の細胞の一部を分離して、分離した細胞についてウェスタンブロッティング法などを用いて低酸素誘導因子を検出することによって測定することができる。測定する低酸素誘導因子は、好ましくは、低酸素誘導因子のタンパク質である。発現量の測定は、低酸素誘導因子に付した標識をもとにして行う。【００２０】低酸素培養条件を設定するための指標である所定の値は、発現量を測定する実験系や、細胞を取得する目的などに応じて適宜設定すればよい。たとえば、当該所定の値は、通常酸素条件（たとえば、２５％）における発現量や、２％以下の低酸素培養条件における発現量などを参照して設定される。【００２１】低酸素培養の条件は、細胞の増殖過程において経時的に測定する低酸素誘導因子の発現量に基づき、経時的に調整してもよい。この場合、より繊細に条件を設定することができ、これにより、一層多量の細胞を得ることができる。
【発明の効果】
【００２２】本発明によれば、高い分化能を保持したヒト脂肪組織由来体性幹細胞を、再生医療に実用できる程度に多量に取得することができる。