(57)【要約】【課題】骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカインのパイエル板での産生の亢進作用を有する新規な多糖組成物を提供すること。【解決手段】大豆から得られる多糖を含有する多糖組成物であって、当該多糖は、アラビノガラクタンを主成分とし、かつピーク分子量が２０，０００〜１８０，０００の範囲内である、多糖組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆から得られる多糖を含有する多糖組成物であって、
前記多糖は、アラビノガラクタンを主成分とし、かつ２０，０００〜１８０，０００の範囲内にピーク分子量を有する、多糖組成物。
【請求項２】
前記多糖は、全構成糖に占めるアラビノースの割合が２５〜４８モル％、ガラクトースの割合が２０〜４５モル％、及びガラクツロン酸の割合が１〜１９モル％である、請求項１に記載の多糖組成物。
【請求項３】
前記多糖は、非還元末端アラビノースの割合が５〜３０モル％、４又は５結合のアラビノースの割合が５〜２５モル％、非還元末端ガラクトースの割合が１〜１８モル％、及び３，６−分岐ガラクトースの割合が５〜２５モル％である、請求項１又は２に記載の多糖組成物。
【請求項４】
前記アラビノガラクタンは、β−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原との反応性を示す構造を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多糖組成物。
【請求項５】
大豆水溶性高分子画分を含み、
前記大豆水溶性高分子画分が、大豆の水性溶媒エキスのエタノール沈殿物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多糖組成物。
【請求項６】
大豆水溶性高分子画分を含み、
前記大豆水溶性高分子画分が、大豆の水性溶媒エキスのタンパク質除去かつエタノール沈殿物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多糖組成物。
【請求項７】
医薬組成物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多糖組成物。
【請求項８】
食品組成物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多糖組成物。
【請求項９】
飼料組成物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多糖組成物。
【請求項１０】
パイエル板活性化用である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多糖組成物。
【請求項１１】
腸管免疫調節用である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の多糖組成物。
【請求項１２】
パイエル板におけるサイトカイン産生促進用である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多糖組成物。
【請求項１３】
大豆原料を水性溶媒に浸漬し、大豆の水性溶媒エキスを得る工程と、
得られた水性溶媒エキスをエタノールと混合し、エタノール沈殿物を得る工程と、
を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多糖組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大豆から得られる多糖を含有する多糖組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パイエル板は上部腸管に存在する高度に機能化されたリンパ濾胞組織である。パイエル板は、抗原特異的・非特異的分泌型ＩｇＡ産生形質芽細胞、抗原特異的・非特異的エフェクター及び制御性のＴ及びＢリンパ球、抗原特異的Ｔｈ１７リンパ球などの誘導のための重要な出発点である誘導組織の１つとなっている。パイエル板は、腸管免疫系と呼ばれる局所粘膜免疫系、及び全身免疫系での生体防御に関わる免疫機構、並びに食物抗原及び自己抗原などの無害な抗原に対する免疫寛容に関わる免疫応答において重要な働きを担っていることが知られている。例えば、パイエル板のリンパ球は常時ホーミング現象により他の局所粘膜免疫系及び全身免疫系付属組織及び造血組織などにリクルートされ、免疫情報を伝搬させ、これらの生体機構を調節する機能を有する。
【０００３】
パイエル板免疫機能調節活性の一つとして、骨髄細胞増殖促進因子（例えば、サイトカイン）のパイエル板での産生が挙げられる。このような骨髄細胞増殖促進因子として、例えば、パイエル板で産生されるサイトカインであるＩＬ−６及びＧＭ−ＣＳＦが知られている（非特許文献１及び非特許文献２）。
【０００４】
一方、これまでに、キク科ホソバオケラ（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ  ｌａｎｃｅａ  ＤＣ．）の根茎から得られた多糖、マメ科ナイモウオウギ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ  Ｂｕｎｇｅ）の地上部から得られた多糖、及びユリ科チモ（Ａｎｅｍａｒｒｈｅｎａ  ａｓｐｈｏｄｅｌｏｉｄｅｓ  Ｂｕｎｇｅ）の根茎から得られた多糖にパイエル板免疫機能調節活性があることが報告されている（非特許文献２及び非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔ．Ｈｏｎｇ、Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｈ．Ｋｉｙｏｈａｒａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｙａｍａｄａ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈｅｓ  ｂｙ  ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋａｍｐｏ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｈｅｒｂａｌ）  ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ、‘Ｊｕｚｅｎ−ｔａｉｈｏ−ｔｏ’、Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、５巻、３５３〜３６０頁（１９９８年）
【非特許文献２】Ｈｉｒｏａｋｉ  Ｋｉｙｏｈａｒａ、Ｔｏｓｈｉａｋｅ  Ｍａｔｓｕｚａｋｉ、Ｈａｒｕｋｉ  Ｙａｍａｄａ：Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈ−ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｍａｎｎａｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｈｉｚｏｍｅｓ  ｏｆ  Ａｎｅｍａｒｒｈｅｎａ  ａｓｐｈｏｄｅｌｏｉｄｅｓ  Ｂｕｎｇｅ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９６巻、３３７〜３４６頁（２０１３年）
【非特許文献３】Ｈｉｒｏａｋｉ  Ｋｉｙｏｈａｒａ、Ｔｏｓｈｉａｋｅ  Ｍａｔｓｕｚａｋｉ、Ｔｓｕｋａｓａ  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｔａｋａｙｕｋｉ  Ｎａｇａｉ、Ｈａｒｕｋｉ  Ｙａｍａｄａ：Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ、１２８巻、５号、７０９〜７１９頁（２００８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
マメ科ダイズ属の一年草であるダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）の種子（以下、「大豆」ともいう。）に由来する機能性成分はイソフラボン及びソヤサポニン類を主としてこれまでにいくつか知られているものの、パイエル板免疫機能調節活性を有する成分、例えば、骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカインのパイエル板での産生の亢進作用（以下、本作用を「パイエル板活性化作用」ともいう。）を有する成分、はこれまで知られていない。
【０００７】
パイエル板免疫機能調節を人為的に可能とすれば、腸管免疫系を通じて全身での生体防御及び免疫寛容に関わる免疫機構の調節が可能となり有益である。上述の通り、パイエル板免疫機能調節活性を有する物質がこれまでにいくつか知られている。しかし、需要者の多様なニーズに応えるためには未だ充分なレパートリーがあるとは言えない。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑み、骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカインのパイエル板での産生の亢進作用を有する新規な多糖組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、大豆ミールから得られた大豆水溶性多糖画分、及び当該大豆水溶性多糖画分から精製されたアラビノガラクタン画分が、骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカインのパイエル板での産生の亢進作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、大豆から得られる多糖を含有する多糖組成物であって、当該多糖は、アラビノガラクタンを主成分とし、かつ２０，０００〜１８０，０００の範囲内にピーク分子量を有する、多糖組成物を提供する。
【００１１】
本発明の多糖組成物は、骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ）のパイエル板での産生の亢進作用を少なくとも有する。したがって、パイエル板での上記サイトカイン産生の調節により、パイエル板免疫機能調節活性を発揮することができる。また、大豆は古来より食品として使用されているものの一つであるため、本発明の多糖組成物はより安全性が高い。
【００１２】
本明細書において「分子量分布曲線」とは、被験試料の分子量を、高速ゲルろ過クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）で分析したときに得られる分布曲線を意味する。分子量は、例えば、標準多糖（ｐｕｌｌｕｌａｎ  Ｐ−１６００、Ｐ−８００、Ｐ−４００、Ｐ−２００、Ｐ−１００、Ｐ−５０、Ｐ−２０、Ｐ−１０及びＰ−５、昭和電工）のＨＰＳＥＣでの保持時間より分子量対保持時間係数（Ｋａｖ）の検量線を作成し、被験試料の保持時間から算出することができる。また、ＨＰＳＥＣの条件は、例えば、以下のように設定することができる。
カラム：Ａｓａｈｉ−ｐａｋ  ＧＳ５２０ＨＱ及びＡｓａｈｉ−ｐａｋ  ＧＳ３２０ＨＱ（各０．７５ｉ．ｄ．×３０ｃｍ）（昭和電工）の連結カラム
送液装置：ＪＡＳＣＯ  ＰＶ−９８０（日本分光）
検出器：Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ  ＳＥ−６２（昭和電工）（感度：×２）
溶出液：０．２Ｍ  ＮａＣｌ（０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
【００１３】
本明細書において「ピーク分子量」とは、上述の「分子量分布曲線」におけるピークのピークトップに対応する分子量を意味する。
【００１４】
上記多糖は、全構成糖に占めるアラビノースの割合が２５〜４８モル％、ガラクトースの割合が２０〜４５モル％、及びガラクツロン酸の割合が１〜１９モル％であってもよい。これにより、より優れたパイエル板活性化作用を発揮することができる。
【００１５】
上記多糖はまた、非還元末端アラビノースの割合が５〜３０モル％、４又は５結合のアラビノースの割合が５〜２５モル％、非還元末端ガラクトースの割合が１〜１８モル％、及び３，６−分岐ガラクトースの割合が５〜２５モル％であってもよい。これにより、より一層優れたパイエル板活性化作用を発揮することができる。
【００１６】
上記アラビノガラクタンは、β−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原との反応性を示す構造を有するものであってよい。
【００１７】
本発明の多糖組成物は、大豆水溶性高分子画分を含むものであってもよい。大豆水溶性高分子画分は、上述した大豆から得られる多糖を含有するものである。大豆水溶性高分子画分は、大豆の水性溶媒エキスのエタノール沈殿物であってよく、また大豆の水性溶媒エキスのタンパク質除去かつエタノール沈殿物であってもよい。
【００１８】
本発明の多糖組成物は、パイエル板活性化作用を有することから、医薬組成物として好適に使用することができる。医薬組成物は、例えば、パイエル板活性化用医薬組成物（パイエル板活性化剤）、腸管免疫調節用医薬組成物（腸管免疫亢進剤等の腸管免疫調節剤）、パイエル板におけるサイトカイン産生促進用医薬品組成物（パイエル板におけるサイトカイン産生促進剤）、又はパイエル板の活性化により治療又は予防される疾患又は障害の治療薬又は予防薬であってもよい。
【００１９】
また、本発明の多糖組成物は、食品組成物又は飼料組成物として使用してもよい。食品組成物又は飼料組成物は、例えば、パイエル板活性化用食品組成物又は飼料組成物（パイエル板活性化剤）、腸管免疫調節用食品組成物又は飼料組成物（腸管免疫亢進剤等の腸管免疫調節剤）、パイエル板におけるサイトカイン産生促進用食品組成物又は飼料組成物（パイエル板におけるサイトカイン産生促進剤）であってもよい。
【００２０】
本明細書において、「パイエル板活性化」とは、パイエル板活性化作用（骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカインのパイエル板での産生の亢進作用）を介して、パイエル板における免疫調節機能を高めることを意味する。「パイエル板活性化」には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（キラーＴ細胞）、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）及び制御性Ｔリンパ球の増殖及び活性化、ＮＫ細胞の増殖、分化及び活性化、単球・マクロファージの活性化、抗ウイルス効果、ＮＫ細胞、ＣＴＬ及びマクロファージの細胞障害活性の増強、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の促進、Ｔｈ２細胞の抑制によるＩｇＥ抗体産生抑制、並びにＢ細胞の発生及び分化促進から選ばれる少なくとも１つが含まれる。
【００２１】
本発明はまた、大豆原料を水性溶媒に浸漬し、大豆の水性溶媒エキスを得る工程と、得られた水性溶媒エキスをエタノールと混合し、エタノール沈殿物を得る工程と、を含む、上記多糖組成物の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカインのパイエル板での産生の亢進作用を有する新規な多糖組成物が提供される。本発明によれば、大豆から得られる多糖（例えば、大豆水溶性多糖画分、アラビノガラクタン画分）を有効成分として含有する多糖組成物を哺乳動物に投与（例えば、経口投与）することにより、例えば、パイエル板でのサイトカイン（例えば、骨随細胞増殖促進因子としてのＩＬ−６など）産生の亢進作用を奏することができる。これにより、例えば、腸管免疫亢進を通じて、生体防御に関わる免疫機構を亢進させることが可能である。
【００２３】
また、本発明の多糖組成物は、古来よりヒトが食してきた大豆に由来するものであるため、ヒト又はヒトが食用とする家畜若しくは家禽などの産業動物の健康を害することもなく、安全である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１におけるパイエル板活性化作用試験の結果を示すグラフである。
【図２】製造例２のカラムクロマトグラフィーにおけるアラビノガラクタン画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）の溶出パターンを示すグラフである。
【図３】実施例２におけるアラビノガラクタン画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）の分子量分布の測定結果を示すＨＰＳＥＣチャートである。
【図４】実施例３におけるパイエル板活性化作用試験の結果を示すグラフである。
【図５】実施例４におけるマウスへの多糖組成物の経口投与によるパイエル板活性化作用試験の結果を示すグラフである。
【図６】実施例５におけるマウスへの多糖組成物の経口投与による脾臓免疫細胞活性化作用試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２６】
〔多糖組成物〕
本実施形態の多糖組成物は、大豆から得られる多糖を含有する。当該多糖は、アラビノガラクタンを主成分とし、かつ２０，０００〜１８０，０００の範囲内にピーク分子量を有するものである。
【００２７】
多糖のピーク分子量は、上述の「分子量分布曲線」におけるピークのピークトップに対応する分子量を意味する。多糖のピーク分子量は、２０，０００〜１８０，０００の範囲内にあればよく、１１０，０００〜１５０，０００、２０，０００〜５０，０００、又は１４０，０００〜１８０，０００の範囲内にあるのが好ましい。
【００２８】
本発明における多糖は、全構成糖に占めるアラビノースの割合が２５〜４８モル％、ガラクトースの割合が２０〜４５モル％、及びガラクツロン酸の割合が１〜１９モル％であってもよい。これにより、より優れたパイエル板活性化作用を発揮することができる。
【００２９】
全構成糖に占めるアラビノースの割合は、３０〜４５モル％であってもよく、３８〜４８モル％であってもよく、２５〜３５モル％であってもよい。全構成糖に占めるガラクトースの割合は、３０〜４０モル％であってもよく、３５〜４５モル％であってもよく、２０〜３０モル％であってもよい。全構成糖に占めるガラクツロン酸の割合は、１〜５モル％であってもよく、９〜１９モル％であってもよい。
【００３０】
また、本発明における多糖は、構成糖として、キシロース又はマンノースを含んでいてもよい。
【００３１】
本発明における多糖は、非還元末端アラビノースの割合が５〜３０モル％、４又は５結合のアラビノースの割合が５〜２５モル％、非還元末端ガラクトースの割合が１〜１８モル％、及び３，６−分岐ガラクトースの割合が５〜２５モル％であってもよい。これにより、より一層優れたパイエル板活性化作用を発揮することができる。
【００３２】
多糖における非還元末端アラビノースの割合は、１０〜２０モル％であってもよく、２０〜３０モル％であってもよく、５〜１５モル％であってもよい。多糖における４又は５結合のアラビノースの割合は、１０〜２５モル％であってもよく、５〜１５モル％であってもよい。多糖における非還元末端ガラクトースの割合は、６〜１８モル％であってもよく、１〜１０モル％であってもよく、１〜１２モル％であってもよい。
【００３３】
また、本発明における多糖は、３結合ガラクトース、３，６分岐ガラクトース、又はガラクツロン酸を含んでいてもよい。さらに、本発明における多糖がガラクツロン酸を含む場合、ガラクツロン酸の主要結合は４結合であってよく、場合により３，４分岐ガラクツロン酸、又は２，４分岐ガラクツロン酸を含んでいてもよい。
【００３４】
本発明における多糖の主成分であるアラビノガラクタンは、β−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原との反応性を示す構造を有するものであってよい。また、本発明における多糖は、β−Ｄ−グルコシルヤリブ抗原にて検出されるアラビノ−３，６−ガラクタン構造と総称される糖鎖を主要な糖鎖構造（２０〜１００重量％）として含有していてもよい。
【００３５】
（大豆水溶性高分子画分）
本実施形態の多糖組成物は、大豆水溶性高分子画分を含むものであってよい。大豆水溶性高分子画分は、本発明における多糖を含有する。大豆水溶性高分子画分は、大豆原料から後述する製造方法により製造することができる。大豆水溶性高分子画分は、例えば、大豆の水性溶媒エキスのエタノール沈殿物（エタノール沈殿画分）、大豆の水性溶媒エキスのタンパク質除去物（タンパク質除去画分）、大豆の水性溶媒エキスのタンパク質除去かつエタノール沈殿物（大豆水溶性多糖画分）、又は大豆の水性溶媒エキスの陰イオン交換樹脂精製物（アラビノガラクタン画分）であってもよい。
【００３６】
エタノール沈殿画分は、大豆の水性溶媒エキスをエタノール沈殿して得られる沈殿物である。エタノール沈殿画分は、得られた沈殿物から透析又は膜処理により低分子量の物質を除去して得られる画分であってもよい。
【００３７】
タンパク質除去画分は、大豆の水性溶媒エキスからタンパク質を除去して得られるものである。タンパク質の除去は、酸沈殿により行ってもよく、タンパク質分解酵素で処理することにより行ってもよく、又はこれらを組み合わせて行ってもよい。タンパク質除去画分は、タンパク質の除去後、透析又は膜処理により低分子量の物質を除去して得られる画分であってもよい。
【００３８】
大豆水溶性多糖画分は、大豆の水性溶媒エキスをエタノール沈殿して得られる沈殿物からタンパク質を除去して得られるものであってもよく、大豆の水性溶媒エキスからタンパク質を除去して得られる溶液をエタノール沈殿して得られる沈殿物であってもよい。大豆水溶性多糖画分は、更に透析又は膜処理により低分子量の物質を除去して得られる画分であってもよい。
【００３９】
アラビノガラクタン画分は、大豆の水性溶媒エキス（好ましくは、エタノール沈殿画分、タンパク質除去画分、又は大豆水溶性多糖画分）を、担体として陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、陰イオン交換樹脂に対し吸着した成分を低〜高イオン強度の溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分、又はそれを更にゲルろ過して得られる画分であってよい。アラビノガラクタン画分は、例えば、上述したエタノール沈殿画分、タンパク質除去画分、又は大豆水溶性多糖画分から中性多糖が除去されたものであってよい。
【００４０】
アラビノガラクタン画分は、例えば、エタノール沈殿画分、タンパク質除去画分、又は大豆水溶性多糖画分を、担体として水で平衡化した陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、上記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を、０．１１Ｍ  ＮａＣｌで溶出した後に、０．３０９Ｍ  ＮａＣｌで溶出して得られる各溶出画分、又は得られた溶出画分を更に分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムに通液して得られる溶出液であって、該ゲルろ過ＨＰＬＣによる分析において、上述のピーク分子量の範囲の多糖成分が溶出する溶出容積に相当する画分であってもよい。
【００４１】
（大豆水溶性高分子画分の製造方法）
大豆水溶性高分子画分の製造方法は、大豆原料から水性溶媒エキスを得る工程（水性溶媒エキス取得工程）を含む。当該製造方法は、更に水性溶媒エキスのエタノール沈殿物を得る工程（エタノール沈殿画分取得工程）、水性溶媒エキスのタンパク質除去物を得る工程（タンパク質除去画分取得工程）、水性溶媒エキスのタンパク質除去かつエタノール沈殿物を得る工程（大豆水溶性多糖画分取得工程）、又は水性溶媒エキスの陰イオン交換樹脂精製物を得る工程（アラビノガラクタン画分取得工程）を含むものであってよい。
【００４２】
＜大豆原料＞
大豆原料は、水溶性高分子を含むものであれば特に制限されず、例えば、大豆（丸大豆）、大豆ミール（脱脂大豆）、大豆ペプチドの製造工程で得られるペプチドを除去した後の抽出物であってよい。本明細書において、「大豆」は、食用に付される大豆であれば特に限定されるものではなく、加熱処理を行ったものであってもよく、非加熱のものであってもよい。大豆ミールは、大豆油を搾った後に残る搾り粕である。大豆油の製造法には圧搾法と抽出法が用いられ、前者は生の大豆を圧搾してダイズ油を製造する方法である。一方、抽出法はヘキサンなどの有機溶剤を用い、大豆を処理することにより種子の油分を抽出する方法である。これらのいずれの方法により得られた大豆ミールにもパイエル板活性化作用を有する多糖画分が含まれることから、本発明における大豆水溶性高分子画分は、いずれの製造法により得られた大豆ミールを用いても製造することができる。
【００４３】
大豆は通常トリプシンインヒビター、アミラーゼインヒビター、レクチンなどの有害成分を含むため、加熱したものを使用するが、本発明の大豆水溶性高分子画分は、非加熱の大豆から製造することもできる。また、ダイズはアジアを原産とするが、現在では世界中で栽培されている。主要産地は米国、ブラジル、アルゼンチン、中国、インド、パラグアイ、カナダ、ボリビア、ウクライナ、ウルグアイ、インドネシア、ロシア、ナイジェリア、南アフリカ、イタリアなどで、本発明にはいずれの産地の大豆も用いることができる。
【００４４】
＜水性溶媒エキス取得工程＞
水性溶媒エキス取得工程は、大豆原料から水性溶媒エキスを得る工程である。水性溶媒エキス取得工程は、例えば、大豆原料を水性溶媒に浸漬することで、水性溶媒エキスを得るステップを含むものであってよい。水性溶媒としては、例えば、水（例えば、飲料用水、工業用水、純水、超純水）、含水の炭素原子数１〜３の低級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール）、及びこれらの混合溶媒であってよい。
【００４５】
水性溶媒エキスを得る際の水性溶媒の温度は、特に制限されず、低温又は室温であってもよいが、水性溶媒エキスの抽出効率を高める観点から、水性溶媒を加熱するのが好ましい。例えば、大豆原料を水性溶媒に浸漬し、水性溶媒が約半量になるまで直火で煎出してもよい。水性溶媒エキスは、大豆原料の水抽出物（冷水抽出物、熱水抽出物等）であるのが好ましい。大豆の加熱調製物や豆腐の製造工程で排出される煮汁は大豆ホエーと呼ばれる。該大豆ホエー中にもパイエル板活性化作用を有する多糖画分が含まれることから、本発明における水性溶媒エキスとして、大豆ホエーを用いることもできる。
【００４６】
水性溶媒エキス取得工程は、大豆原料を水性溶媒に浸漬することで、水性溶媒エキスを得るステップの後、必要に応じて、ろ紙等を用いてろ過するステップ、減圧濃縮するステップを含むものであってもよい。ろ過するステップにより、不溶性の固形成分を除去することができる。減圧濃縮するステップにより、以後の工程に要する装置等をコンパクト化することができる。
【００４７】
＜エタノール沈殿画分取得工程＞
エタノール沈殿画分取得工程は、水性溶媒エキスのエタノール沈殿物を得る工程である。エタノール沈殿画分取得工程は、例えば、大豆の水性溶媒エキスにエタノールを加えて、エタノール沈殿させ、沈殿を得るステップを含むものであってよい。エタノール沈殿は常法に従って実施することができる。
【００４８】
エタノール沈殿画分取得工程は、沈殿を得るステップの後、得られた沈殿から透析又は膜処理により低分子量の物質を除去するステップを含むものであってもよい。透析には、一般に脱塩に用いられる透析膜を用いることができる。また、膜処理には、脱塩及び単糖類除去などに用いられるＵＦ膜を用いることができる。
【００４９】
＜タンパク質除去画分取得工程＞
タンパク質除去画分取得工程は、水性溶媒エキスのタンパク質除去物を得る工程である。大豆の水性溶媒エキス中には、酸性条件にて不溶化するタンパク質等のタンパク質が多量に含まれているため、タンパク質を除去することが好ましい。タンパク質の除去は、例えば、酸沈殿による方法、タンパク質分解酵素で処理する方法、又はこれらを組み合わせる方法により実施することができる。酸沈殿は、例えば、大豆の水性溶媒エキスのｐＨを４〜５付近に調整することで、タンパク質を不溶化させて沈殿させることにより行うことができる。生じた沈殿は自然沈降、遠心分離又はろ過などの公知の方法を用いて除去できる。タンパク質分解酵素処理は、例えば、緩衝液（ｐＨ８．０）中、タンパク質分解酵素（例えば、プロナーゼＡＣ並びにアクチナーゼＥ）を添加して３７℃で１〜７日間インキュベートすることにより行うことができる。必要に応じて、更に、タンパク質分解酵素処理後のサンプルを沸騰水浴中で５分間加熱後、氷水中で急冷して、タンパク質分解酵素を失活させてもよい。
【００５０】
タンパク質除去画分取得工程は、例えば、酸沈殿、タンパク質分解処理及びこれらの組み合わせからなる群より選択される方法により、水性溶媒エキスを処理し、タンパク質を除去するステップを含むものであってよい。タンパク質除去画分取得工程は、タンパク質を除去するステップの後、処理物から透析又は膜処理により低分子量の物質を除去するステップを含むものであってもよい。透析には、一般に脱塩に用いられる透析膜を用いることができる。また、膜処理には、脱塩及び単糖類除去などに用いられるＵＦ膜を用いることができる。透析は、例えば、精製水を用いて３〜１７日間行ってもよい。
【００５１】
＜大豆水溶性多糖画分取得工程＞
大豆水溶性多糖画分取得工程は、水性溶媒エキスのタンパク質除去かつエタノール沈殿物を得る工程である。大豆水溶性多糖画分取得工程は、水性溶媒エキスのタンパク質除去物を得るステップと、得られたタンパク質除去物のエタノール沈殿物を得るステップとを含む工程であってもよく、水性溶媒エキスのエタノール沈殿物を得るステップと、得られたエタノール沈殿物のタンパク質除去物を得るステップとを含む工程であってもよい。すなわち、水性溶媒エキスに対して、エタノール沈殿とタンパク質除去を実施する順番は任意である。
【００５２】
大豆水溶性多糖画分取得工程における、水性溶媒エキス又はエタノール沈殿物のタンパク質除去物を得るステップは、タンパク質除去画分取得工程に準じて実施することができる。同様に、大豆水溶性多糖画分取得工程における、水性溶媒エキス又はタンパク質除去物のエタノール沈殿物を得るステップは、エタノール沈殿画分取得工程に準じて実施することができる。
【００５３】
水性溶媒エキスに対して、エタノール沈殿とタンパク質除去を実施して得られる画分を、本明細書では「大豆水溶性多糖画分」と呼ぶ。
【００５４】
＜アラビノガラクタン画分取得工程＞
アラビノガラクタン画分取得工程は、水性溶媒エキスの陰イオン交換樹脂精製物を得る工程である。大豆の水性溶媒エキスには、強いパイエル板活性化作用を有する画分（後述の画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）が含まれる。アラビノガラクタン画分取得工程は、画分Ａ、画分Ｂ及び／又は画分Ｃを陰イオン交換樹脂精製物として得る工程であってもよく、画分Ａ、画分Ｂ及び／又は画分Ｃを含む画分を陰イオン交換樹脂精製物として得る工程であってもよい。本明細書では、画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ、並びに画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃを含む陰イオン交換樹脂精製物としての画分を総称して「アラビノガラクタン画分」と呼ぶ。
【００５５】
アラビノガラクタン画分取得工程は、例えば、原料溶液を、担体として陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、陰イオン交換樹脂に対し吸着した成分を低〜高イオン強度の溶出溶媒で溶出して溶出画分を得るステップを含むものであってよい。また、得られた溶出画分を更にゲルろ過してろ過画分を得るステップを含んでいてもよい。
【００５６】
原料溶液は、上述した大豆の水性溶媒エキス、エタノール沈殿画分、タンパク質除去画分又は大豆水溶性多糖画分であってよいが、大豆水溶性多糖画分を用いることが好ましい。以下、原料溶液として大豆水溶性多糖画分を用いる場合を例にとり、アラビノガラクタン画分の精製方法を説明する。
【００５７】
まず、大豆水溶性多糖画分の水溶液を、担体として陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、成分を吸着させる。陰イオン交換樹脂としては弱イオン交換樹脂が好ましい。例えば、ＤＥＡＥ基を有する樹脂を用いることができる。このような担体を備えるカラムの具体例としては、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＦＦ）等を挙げることができる。これらの樹脂担体は、水で平衡化しておくことが好ましい。例えば、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの場合、２Ｍの塩化ナトリウムに浸漬することによりＤＥＡＥ基を活性化させ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに共有結合させた３級アミノ基にカウンターイオンの塩素イオンを結合させる、すなわちＣｌ−型にする）、次いで水で洗浄することにより残存する塩化ナトリウムを除去した後、水での懸濁状態（水で平衡化）にする。
【００５８】
次に、上記担体に吸着された成分を段階的にイオン強度が高くなるように溶出溶媒を通液し、溶出する。溶出溶媒としては、ＮａＣｌ、ＮＨ４ＨＣＯ３又はＨＣＯＯＮＨ４など、陰イオンの塩を溶解した水溶液を用いることが好ましい。
【００５９】
アラビノガラクタン画分は、低〜高イオン強度の溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分から得ることができる。低イオン強度の溶出溶媒としては、例えば、陰イオンとしてＣｌ−を用いた場合、当該陰イオンの濃度が１００〜２００ｍＭである溶出溶媒を用いることができ、１００〜１２０ｍＭである溶出溶媒がより好ましい。また、中イオン強度の溶出溶媒としては、当該陰イオンの濃度が２００ｍＭから３５０ｍＭである溶出溶媒を用いることができ、３００〜３５０ｍＭである溶出溶媒がより好ましい。さらに、高イオン強度の溶出溶媒としては、当該陰イオンの濃度が４００ｍＭから５５０ｍＭである溶出溶媒を用いることができ、４５０ｍＭ〜５００ｍＭである溶出溶媒がより好ましい。
【００６０】
アラビノガラクタン画分は、例えば、陰イオン濃度が１１０ｍＭ〜１２０ｍＭの溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分（画分ａ）、陰イオン濃度が３００ｍＭ〜３５０ｍＭの溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分（画分ｂ）、及び陰イオン濃度が４９０ｍＭ〜５１０ｍＭである溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分（画分ｃ）とに分けて精製した後、これらを組み合わせたものとして得ることもできる。
【００６１】
アラビノガラクタン画分はまた、陰イオン交換樹脂に成分を吸着させた後、まず、水を通液して中性成分を溶出させて除去し、次いで陰イオン濃度が５００ｍＭ以上の溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分として得ることもできる。当該溶出画分は、酸性画分を一括して溶出させた酸性アラビノガラクタン画分である。
【００６２】
得られた溶出画分（画分ａ、画分ｂ、画分ｃ又は酸性アラビノガラクタン画分）は、更に精製工程に付することもできる。得られた溶出画分は、必要に応じて、透析膜（例えば、Ｖｉｓｋｉｎｇ  ｔｕｂｅ、分子量カットオフ：１２，０００−１４，０００）を用いて透析した後、透析内液を凍結乾燥してから次の工程に用いてもよい。
【００６３】
アラビノガラクタン画分は、必要に応じて、上記溶出画分をゲルろ過カラムを用いて分子量により分画したアラビノガラクタン画分として得てもよい。例えば、画分ａについて、分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムを用い、ゲルろ過ＨＰＬＣによる分析でピーク分子量が１２５，０００を示すピークが流出する画分（画分Ａ）を得てもよい。また、画分ｂについて、分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムを用い、ゲルろ過ＨＰＬＣによる分析でピーク分子量が３３，０００を示すピークが流出する画分（画分Ｂ）を回収してもよい。また、画分ｃについて、例えば、分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムを用い、ゲルろ過ＨＰＬＣによる分析でピーク分子量が１５６，０００を示すピークが溶出する画分（画分Ｃ）を回収してもよい。また、ゲルろ過の際の溶出画分について、糖（４９２ｎｍ）、ウロン酸（５２０ｎｍ）及び２８０ｎｍでのＵＶ吸収に基づいて溶出パターンを作成し、上記画分ａ及び画分ｂの当該分子量画分（画分Ａ及び画分Ｂ）を回収してもよい。また、同様の操作により上記画分ｃの当該分子量画分（画分Ｃ）を回収してもよい。
【００６４】
分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムとしては、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２等を用いることができる。
【００６５】
アラビノガラクタン画分としては、画分ａ、画分ｂ、及び画分ｃからゲルろ過して得られたそれぞれの画分（画分Ａ、画分Ｂ、及び画分Ｃ）を個々に用いることができ、または、これらを組み合わせて用いることもできる。得られたアラビノガラクタン画分は更に常法に従い透析した後、凍結乾燥してもよい。
【００６６】
本実施形態の多糖組成物は、上述した大豆水溶性高分子画分を含むものであることが好ましい。本実施形態の多糖組成物は、上述した大豆水溶性高分子画分のみからなるものであってもよく、また上述した大豆水溶性高分子画分に加えて、添加物を含むものであってもよい。
【００６７】
添加物としては、特に制限されることなく、多糖組成物の用途等に応じて、適宜選択することができる。具体的には、例えば、食品、医薬部外品又は医薬品に許容される成分を添加してもよい。食品、医薬部外品又は医薬品に許容される成分としては、特に制限されるものではないが、例えば、アミノ酸、タンパク質、炭水化物、油脂、甘味料、ミネラル、ビタミン、香料、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等が挙げられる。
【００６８】
〔医薬組成物、食品組成物及び飼料組成物〕
本発明の多糖組成物は、医薬組成物、食品組成物又は飼料組成物として使用することができる。
【００６９】
本実施形態の医薬組成物、食品組成物又は飼料組成物の形状は特に限定されないが、液状又は粉末状でもよく、又は通常用いられる製剤用担体を使用し固形製剤若しくは液体製剤としてもよい。これらの製剤化の方法は公知である。このようにして得られた医薬組成物、食品組成物又は飼料組成物は、液状又は粉末状で保存することができる。保存は、特に液状の場合、冷蔵保存が好ましい。
【００７０】
本実施形態の医薬組成物、食品組成物又は飼料組成物が固形製剤である場合、例えば有効成分である本発明の大豆から得られる多糖、又は大豆水溶性高分子画分にデキストリン、コーンスターチ又は脱脂米糠を混和し調製してもよい。これらの製剤化の方法は公知である。
【００７１】
本実施形態の医薬組成物は、例えば、静脈内投与用、点滴剤などの形態の非経口投与用医薬組成物、又は経口投与用医薬組成物として調製することができる。本実施形態の医薬組成物は、薬理学的に許容される担体（製剤用添加物）を含有していてもよい。医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、又は医薬組成物の製造方法は、医薬組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。
【００７２】
本実施形態の医薬組成物は、パイエル板活性化作用を有することから、例えば、パイエル板活性化用医薬組成物（パイエル板活性化剤）、腸管免疫亢進用医薬組成物（腸管免疫亢進剤）、腸管免疫調節用医薬組成物（腸管免疫調節剤）、腸管感染症改善用医薬組成物（腸管感染症改善剤）、抗炎症用医薬組成物（抗炎症剤）、ウイルス感染症改善用医薬組成物（ウイルス感染症改善剤）、細菌感染症改善用医薬組成物（細菌感染症改善剤）、糖尿病改善用医薬組成物（糖尿病改善剤）、肥満症改善用医薬組成物（肥満症改善剤）、気分障害改善用医薬組成物（気分障害改善剤）又はそれらの疾患の予防用医薬組成物（予防剤）等として使用することもできる。
【００７３】
本実施形態の医薬組成物は、パイエル板の活性化により治療又は予防される疾患又は障害の治療薬又は予防薬として使用することもできる。当該疾患又は障害としては、感染症、炎症性疾患、又は自己免疫疾患を挙げることができる。ある疾患又は障害が、パイエル板の活性化により治療又は予防される疾患又は障害であるかどうかは、例えば、Ｓｐｉ−Ｂ遺伝子の発現抑制により増悪化する疾患若しくは障害であるか、又はＲＡＮＫＬの投与により改善する疾患又は障害（Ｋａｎａｙａ  Ｔら，  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１２  ；１３（８）：７２９−７３６）であれば、パイエル板の活性化により治療又は予防される疾患又は障害であるとして確認することができる。
【００７４】
本実施形態の医薬組成物は、腸管免疫亢進作用を通じて、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４又はＩＬ−５が関与する疾患又は障害の予防又は治療に用いることができる。
【００７５】
本実施形態の医薬組成物は、本発明の多糖組成物に含まれる大豆から得られる多糖を唯一の有効成分として含有していてもよく、また当該多糖に加えて、他の有効成分を更に含有していてもよい。
【００７６】
本実施形態の医薬組成物の投与時期は、特に限定されない。本実施形態の医薬組成物の投与量は、製剤形態、対象とするヒト又は非ヒト動物の種類、健康状態、年齢及び成長の度合いなどにより異なるため、特に限定されない。例えば、有効成分である上記多糖に換算して体重１ｋｇ当たり１日に１〜１，０００ｍｇを投与することができる。
【００７７】
本実施形態の医薬組成物の投与形態は特に限定されないが、例えば経口、経腸及び経鼻の方法で投与することができる。また、口腔内に貯留しやすい形状（チューインガムなども含む）にて投与することもできる。
【００７８】
投与される対象は、哺乳動物であれば特に限定されないが、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマを含み、好ましくは、ヒトである。
【００７９】
本実施形態の食品組成物又は飼料組成物の投与時期、投与形態及び投与対象等は、食品用途及び飼料用途に応じて、上述した本実施形態の医薬組成物の投与時期、投与形態及び投与対象等に準じて適宜設定することができる。
【００８０】
以上説明した本発明は、例えば、パイエル板活性化用等の医薬組成物の製造のための、本発明の大豆から得られる多糖の使用と捉えることもできる。また、パイエル板活性化等の用途に使用するための、本発明の大豆から得られる多糖と捉えることもできる。さらに、有効量の本発明の大豆から得られる多糖をそれを必要とする対象に投与することを含む、パイエル板の活性化方法、又はパイエル板の活性化により治療若しくは予防される疾患の治療方法若しくは予防方法と捉えることもできる。さらにまた、本発明の大豆から得られる多糖のパイエル板を活性化するための使用と捉えることもできる。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例及び製造例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例及び製造例に限定されるものではない。なお、本明細書全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【００８２】
＜統計学的検定＞
実施例及び製造例における全ての結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では平均値±Ｓ．Ｄ．、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では平均値±Ｓ．Ｅ．で示した。対照及び被験試料間の統計学的有意差は、ＡＮＯＶＡの検定後、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤにより検定した。
【００８３】
〔製造例１：大豆水溶性多糖画分の調製〕
（１）大豆の水性溶媒エキスのエタノール沈殿画分の調製
大豆ミール（２００ｇ）に精製水（４Ｌ）を加えて、液量が半量になるまで煎出した。煎出後、減圧ろ過により抽出液を得た。抽出残渣に対して再度同条件で煎出を繰り返した。得られた抽出液を合わせて大豆の水性溶媒エキスとした。大豆由来水性溶媒エキスを１Ｌになるまで減圧濃縮した後、攪拌しながら４倍量のエタノール（４０００ｍＬ）を徐々に加え、室温にて一晩撹拌した。生じた沈殿を遠心分離（６，０００ｒｐｍ，４℃，３０分間）により分取し、水に再溶解させた後、精製水を用いて７日間透析（分子量カットオフ：１２，０００−１４，０００）を行った。得られた透析内液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ，４℃，３０分間）することにより、不溶解物を除去した後、上清を凍結乾燥することにより、大豆の水性溶媒エキスのエタノール沈殿画分を得た。
【００８４】
（２）大豆水溶性多糖画分の調製
（２−１）エタノール沈殿画分の酸沈殿によるタンパク質の除去
上記（１）で調製したエタノール沈殿画分（１０ｇ）を精製水５０ｍＬに溶解させ、攪拌しながら濃塩酸を用いてｐＨ４．５に調製した。生じた沈殿を遠心分離（６，０００ｒｐｍ，４℃，３０分間）により除去し、上清を回収した。精製水を用いて上清を７日間透析（分子量カットオフ：１２，０００−１４，０００）し、得られた透析内液を凍結乾燥することにより除タンパク大豆水溶性高分子画分（収量：２ｇ、収率：２０％）を得た。
【００８５】
（２−２）除タンパク大豆水溶性高分子画分のタンパク質分解酵素処理
（２−２−１）少量調製（アクチナーゼＥ処理）
上記（２−１）で調製した除タンパク大豆水溶性高分子画分（１００ｍｇ）を１０ｍＭ塩化カルシウム及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０，１０ｍＬ）に溶解させた後、アクチナーゼＥ（５ｍｇ、科研製薬）を加え、３７℃にて３日間タンパク質分解酵素処理を行った。次いで、反応溶液を濃塩酸を用いて中和した後、沸騰水浴中で５分間加熱することによりタンパク質分解酵素を失活させた。本反応液を精製水を用いて７日間透析（分子量カットオフ：１２，０００−１４，０００）した。透析内液を減圧濃縮した後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃，３０分間）を行い、得られた上清を凍結乾燥することで大豆水溶性多糖画分（除タンパク大豆水溶性高分子画分アクチナーゼＥ処理物）（収量：３２．７ｍｇ、収率：３１．８％）を得た。
【００８６】
（２−２−２）少量調製（プロナーゼＡＣ処理）
タンパク質分解酵素として、アクチナーゼＥに代えてプロナーゼＡＣ（５ｍｇ、科研製薬）を使用したこと以外は、（２−２−１）と同様の方法により、大豆水溶性多糖画分（除タンパク大豆水溶性高分子画分プロナーゼＡＣ処理物）（収量：２０．８ｍｇ、収率：２０．６％）を得た。
【００８７】
（２−２−３）大量調製
上記（２−１）で調製した除タンパク大豆水溶性高分子画分（１１．１８ｇ）を１０ｍＭ塩化カルシウム及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０，１１１８ｍＬ）に溶解させた後、アクチナーゼＥ（５５５ｍｇ、科研製薬）を加え、３７℃にて３日間タンパク質分解酵素処理を行った。次いで、反応溶液を濃塩酸を用いて中和した後、沸騰水浴中で５分間加熱することによりタンパク質分解酵素を失活させた。本反応液を精製水を用いて７日間透析（分子量カットオフ：１２，０００−１４，０００）した。透析内液を減圧濃縮した後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ，４℃，３０分間）を行い、得られた上清を凍結乾燥することで大豆水溶性多糖画分（収量：３．３９ｇ、収率：３０．３％）を得た。
【００８８】
〔実施例１：大豆水溶性多糖画分によるパイエル板活性化作用試験〕
（１）マウスパイエル板細胞の調製及び培養
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスをイソフルラン（エスカイン吸入麻酔薬、マイラン製薬）を用いて安楽死後、眼科用ハサミを用いて小腸よりパイエル板を切り出した。このパイエル板を氷冷した５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２ｍＬ）を加えた滅菌シャーレにとり、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）上で５ｍＬのディスポーサブル注射器の内筒のゴムラバー部を用いて圧砕することでパイエル板細胞を遊離させた。遊離細胞の懸濁液を５０ｍＬファルコンチューブに移し、ボルテックスミキサーで短時間撹拌した。次いで、細胞懸濁液をステンレスメッシュ（１５０ｍｅｓｈ）によりろ過後、遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４℃、７分間）し、培地をデカンテーションすることによりパイエル板細胞を得た。得られた細胞について５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍＬ）を用いて計４回同様の操作を繰り返すことにより細胞を洗浄後、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）によりろ過した。この細胞懸濁液（２０μＬ）を用いてセルカウンターで細胞数を計数後、５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて１〜２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのパイエル板細胞懸濁液を調製した。
【００８９】
得られたパイエル板細胞懸濁液（１８０μＬ／ｗｅｌｌ）、及び製造例１の（２−２−１）及び（２−２−２）で調製した大豆水溶性多糖画分（除タンパク大豆水溶性高分子画分アクチナーゼＥ処理物、及び除タンパク大豆水溶性高分子画分プロナーゼＡＣ処理物）（２０μＬ／ｗｅｌｌ、大豆水溶性多糖画分終濃度：〜１００μｇ／ｍＬ）を９６穴培養プレート（３０７２、ＦＡＬＣＯＮ）に添加し、５％ＣＯ２−９５％空気下、３７℃で２〜６日間培養した。培養上清を別の９６穴培養プレートに移し、−２０℃にて使用まで保存した。大豆水溶性多糖画分の代わりに注射用水（２０μＬ／ｗｅｌｌ）を加えて培養することにより得た培養上清を対照として用いた。また、ナイモウオウギから得られた多糖画分（ＡＭＯＬ−１：Ｋｉｙｏｈａｒａ，Ｈ．ら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７１，２８０−２９３，２０１０）を加えて培養することにより得た培養上清を陽性対照として用いた。
【００９０】
（２）マウス骨髄細胞の調製
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（７週齢、雌）をイソフルランを用いて安楽死させた後、大腿骨を摘出した。骨髄細胞は、２３Ｇ注射針を装着した５ｍＬ注射器を用いて５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（５ｍＬ）を大腿骨に注入して押し出すことにより採取した。得られた骨髄細胞をボルテックスミキサーにより分散後、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）でろ過し、次いで遠心分離（１，２００ｒｐｍ、４℃、７分間）を行うことにより骨髄細胞を回収した。同様の操作を３回繰り返して細胞を洗浄後、骨髄細胞を５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍＬ）に懸濁し、セルカウンターで細胞数を計数後、５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて骨髄細胞懸濁液（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を調製した。
【００９１】
（３）パイエル板活性化作用試験
上記（１）で得た培養上清（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、上記（２）で得た骨髄細胞懸濁液（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１００μＬ／ｗｅｌｌ）、及び５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を９６穴培養プレートに加えて、５％ＣＯ２−９５％空気下、３７℃にて６日間培養した。培養した骨髄細胞培養懸濁液にＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（２０μＬ／ｗｅｌｌ、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を添加し、５％ＣＯ２−９５％空気下、３７℃で６〜２４時間培養後、生じた蛍光物質量を蛍光プレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００、Ｔｅｃａｎ、励起波長：５４４ｎｍ、測定波長：５９０ｎｍ）にて測定し、得られた相対蛍光強度としての増殖骨髄細胞数を骨髄細胞増殖促進因子量とした。
【００９２】
（４）結果
図１に、大豆水溶性多糖画分（除タンパク大豆水溶性高分子画分アクチナーゼＥ処理物、及び除タンパク大豆水溶性高分子画分プロナーゼＡＣ処理物）のパイエル板活性化作用試験の結果を示す。骨髄細胞増殖促進因子量をパイエル板活性化作用として示した。異なるタンパク分解酵素で調製した大豆水溶性多糖画分には、いずれもパイエル板活性化作用が認められた（図１）。
【００９３】
〔製造例２：大豆由来のアラビノガラクタン画分の調製〕
（１）大豆水溶性多糖画分の分画
試験例１の（２−２−３）で調製した大豆水溶性多糖画分（１．００２ｇ）を精製水１００ｍＬで溶解後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｃｌ−型）カラム（５．５×４８ｃｍ）に添加し、未吸着画分を除去した。次いで、吸着画分を０．１１４Ｍ  ＮａＣｌ（２Ｌ、画分ａ）、及び０．３０９Ｍ  ＮａＣｌ（２Ｌ、画分ｂ）で順次溶出し、各吸着画分を得た。各吸着画分を透析膜（分子量カットオフ：１２，０００〜１４，０００）を用いて透析した後、透析内液を凍結乾燥して、画分ａ（収量：１１８．０４ｍｇ、収率：１１．８％）、及び画分ｂ（収量：３３６．９７ｍｇ、収率：３３．７％）を得た。
【００９４】
（２）アラビノガラクタン画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）の調製
得られた画分ａ（１１８．０４ｍｇ）及び画分ｂ（３３６．９７ｍｇ）を各々０．２Ｍ  ＮａＣｌ水溶液で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００（内径２．６ｃｍ×９５ｃｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に添加し、同水溶液で溶出させた。溶出画分について、波長５２０ｎｍ（ウロン酸）、４９２ｎｍ（糖）及び２８０ｎｍの吸光度を分析した（図２）。図２（Ａ）は、画分ａの溶出パターンを示し、図２（Ｂ）は、画分ｂの溶出パターンを示す。溶出パターンに従い、画分ａから画分Ａ及び画分Ｂを分取した（図２（Ａ）参照）。また、画分ｂから画分Ｃを分取した（図２（Ｂ）参照）。分取した画分は各々精製水を用いて常法に従い透析（分子量カットオフ：１２，０００−１４，０００）した。次いで、透析内液を凍結乾燥して、アラビノガラクタン画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）を得た。画分Ａは４６．８９ｍｇ（収率：３９．７％）、画分Ｂは４７．７８ｍｇ（収率：４０．５％）、画分Ｃは１１８．１２ｍｇ（収率：３３．２％）であった。
【００９５】
〔実施例２：アラビノガラクタン画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）の分析〕
（１）分子量分布の測定
製造例２で得られたアラビノガラクタン画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）の分子量分布を、Ａｓａｈｉ−ｐａｋ  ＧＳ５２０ＨＱ及びＡｓａｈｉ−ｐａｋ  ＧＳ３２０ＨＱ（各０．７５  ｉ．ｄ．×３０ｃｍ）（昭和電工）の連結カラムを用いた高速ゲルろ過クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により分析した。分子量は、標準多糖（ｐｕｌｌｕｌａｎ  Ｐ−１６００、Ｐ−８００、Ｐ−４００、Ｐ−２００、Ｐ−１００、Ｐ−５０、Ｐ−２０、Ｐ−１０及びＰ−５、昭和電工）のＨＰＳＥＣでの保持時間より分子量対保持時間係数（Ｋａｖ）の検量線を作成し、被験試料の保持時間から算出した。
ＨＰＳＥＣの条件は以下の通りである。
送液装置；ＪＡＳＣＯ  ＰＶ−９８０（日本分光）
検出器；Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ  ＳＥ−６２（昭和電工）（感度：×２）
溶出液；０．２Ｍ  ＮａＣｌ（０．８−１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
【００９６】
（２）比色定量
全糖量はフェノール−Ｈ２ＳＯ４法、ウロン酸量はｍ−ヒドロキシビフェニル法、タンパク質量はブラッドフォード法を用いて測定した。標品としては、フェノール−Ｈ２ＳＯ４法にはガラクトースを、ｍ−ヒドロキシビフェニル法にはガラクツロン酸を、ブラッドフォード法はウシガンマグロブリン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。
【００９７】
（３）β−Ｄ−（１→３，６）−ガラクタン含量の測定
アラビノガラクタン画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）中のβ−Ｄ−（１→３，６）−ガラクタン含量は、Ｈｏｌｓｔ及びＣｌａｒｋｅにより報告されたβ−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原を用いた一元ゲル拡散法を用いて測定した。
１％アガロース、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、及び１０μｇ／ｍＬのβ−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を含むアガロースゲル（７ｍＬ）を７．６×５．１ｃｍのスライドグラス上に重層後、モイスチャーチャンバー内で冷却し、固化させた。ゲルに直径約２ｍｍの穴を作成後、被験試料水溶液（１ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ）を加え、モイスチャーチャンバー内で室温にて１晩インキュベーションした。ゲルをろ紙を用いて乾固させ、生じた赤色沈降リングの直径を計測した。標準β−Ｄ−（１→３，６）−ガラクタンとしてアカシアアラビノガラクタン（１ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を用いて同様の操作を行い、β−Ｄ−（１→３，６）−ガラクタン（１０μｇ）にて形成される赤色沈降リングの直径を計測した。検量線は標準β−Ｄ−（１→３，６）−ガラクタンにより形成された赤色沈降リング直径の２乗値とβ−Ｄ−（１→３，６）−ガラクタン量（１０μｇ）から作成し、被験試料のβ−Ｄ−（１→３，６）−ガラクタン量を算出した。
【００９８】
（４）構成糖分析
アラビノガラクタン画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）の構成糖分析は、ＴＭＳメチルグリコシド法により行った。
単糖の標準品混合物（Ｇｌｃ、Ｇａｌ、ＧｌｃＡ、ＧａｌＡ、Ａｒａ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎ、Ｒｈａ、各５μｇ）及び被験試料（各５０〜１００μｇ）を１３ｍｍネジ口試験管に分取し、さらにｍｙｏ−イノシトール（内部標準：２０μｇ）を加えた。各試験管に１Ｍ  ＨＣｌ−ＭｅＯＨ溶液（１００〜３００μＬ、和光純薬工業）を加え、密封下メタノリシス（８０℃、１５時間）を行った。反応溶液にｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ（５μＬ）を加え窒素気流下（４０℃）で溶媒を留去した後、Ｔｒｉ−Ｓｉｌ試薬（１００μＬ、Ｐｉｅｒｃｅ）を加えて密封下反応（８０℃、２０分間）させた。試薬を窒素気流下（４０℃）で留去した後、反応生成物にヘキサン（２ｍＬ）を加え数秒間超音波処理することによりＴＭＳ誘導体を抽出した。抽出物中の不溶物を遠心分離（２，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により除去後、溶媒を窒素気流下（４０℃）で留去し、得られたＴＭＳ誘導体のヘキサン溶液をガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）により分析した。各単糖誘導体の同定は標準品の誘導体の保持時間との比較から行い、含有率比（モル％）はピーク面積と各実験毎に得られる各単糖誘導体のＦＩＤ検出器に対する応答係数から算出した。
ＧＬＣの条件は以下の通りである。
機器：ＨＰ５８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）
カラム：ＤＢ−１  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ（０．２５ｍｍ  ｉ．ｄ．×３０ｍ、液膜厚０．２５μｍ、Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）
キャリアガス：Ｈｅ（総流量：８０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム入口圧：２１ｐｓｉ、ガス純度：９９．９９９９％）
注入口温度：２５０℃
検出器温度：２８０℃
オーブン温度プログラム：６０℃（１分間）、６０℃→１７０℃（３０℃／ｍｉｎ）、１７０℃→１９０℃（１℃／ｍｉｎ）、１９０℃→３００℃（３０℃／ｍｉｎ）、３００℃（５分間）
【００９９】
（５）メチル化分析
糖結合様式解析のためのメチル化分析は以下に示すように箱守法とＷａｅｇｈｅらの方法を改変した方法に従って行った。
【０１００】
（メチルスルフィニルカルバニオンナトリウムを用いる多糖のメチル化）
被験試料（５００μｇ）をネジ口試験管（１５  ｉ．ｄ．×１００ｍｍ）にとり、一晩デシケーター中で減圧乾燥させた後、無水ジメチルスルホキシド（ｄｒｙ  ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）を加え、窒素気流下密封条件で１５分間超音波処理し、試料が完全に溶解するまで（数時間〜一昼夜）５０〜６０℃で加温した。試料溶液に常法にて自家調製したメチルスルフィニルカルバニオンナトリウム（５００μＬ）を加え、窒素気流下１時間超音波処理を行った後、３時間室温で反応させた。反応後、少量の反応液（５〜１０μＬ）を用い、トリフェニルメタン試薬（和光純薬工業）により、過剰のメチルスルフィニルカルバニオンナトリウムの残存を確認した。メチルスルフィニルカルバニオンナトリウムが不十分の場合、さらにメチルスルフィニルカルバニオンナトリウムを追加し、上記操作をメチルスルフィニルカルバニオンナトリウムの過剰量が残存するまで繰り返した。反応混合液を凍結後に、ＣＨ３Ｉ（ヨードメタン、柳島製薬株式会社、特級、１ｍＬ）を加え、窒素気流下で密封条件にて１５分間超音波処理を行い、室温で４時間以上反応させた。反応終了後、反応液中のＣＨ３Ｉを減圧留去し、氷冷下凍結させ、使用したジメチルスルホキシド及びメチルスルフィニルカルバニオンの総容量と等容量の精製水を加え、残存するメチルスルフィニルカルバニオンを分解し、反応を停止させた。さらに、反応液にその黄色が消えるまで飽和チオ硫酸ナトリウム（約２５０μＬ〜）を加えた。
【０１０１】
（完全メチル化多糖の回収）
Ｓｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（１ｍＬ、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅ  Ｉｎｃ．）を蒸留エタノール（１０ｍＬ×４回）、次いで水（２ｍＬ×３回）を用いて洗浄後、上記メチル化反応混合液を本カートリッジへ通過させ、メチル化多糖をカートリッジに吸着させた。カートリッジを５０％ジメチルスルホキシド（２ｍＬ×５回）、次いで水（２ｍＬ×５回）により洗浄後、蒸留エタノール（２ｍＬ×３回）を用いてメチル化多糖を溶出後、減圧乾固することにより完全メチル化多糖を得た。
【０１０２】
（メチル化多糖中のウロン酸のカルボキシル基の還元）
完全メチル化多糖中のウロン酸残基のカルボキシルメチルエステル基は以下に示した方法により、重水素化一級アルコールに還元した。すなわち、完全メチル化多糖試料を９５％エタノール（０．２１ｍＬ）及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、０．５１ｍＬ）で溶解後、重水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＤ４、１．８ｍｇ）を加えて混和した後１８時間以上室温で反応させ、さらに７０℃で１時間加温させることによりカルボキシメチルエステル基を還元した。反応液を酢酸を用いて中和し、さらに７〜８滴の酢酸を加えて反応を停止させた。反応溶液を減圧乾固後、生成したホウ酸を除去するため、反応生成物に蒸留メタノール（１ｍＬ）を加えて減圧乾固する操作を少なくとも４回繰り返した。本反応混合物の５０％ジメチルスルホキシド溶液について、（完全メチル化多糖の回収）欄に記載した方法と同様の操作によりカルボキシル還元完全メチル化多糖を回収した。
【０１０３】
（完全メチル化多糖から部分メチル化アルジトールアセテート体への誘導体化と分析）
得られたカルボキシル還元完全メチル化多糖をネジ口試験管（１５  ｉ．ｄ．×１００ｍｍ）中、２Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１ｍＬ）を用いて密封下１２１℃で１時間加熱することにより加水分解を行った。反応終了後、室温に冷却した反応溶液を減圧乾固し、さらにデシケーターで３０分間減圧乾燥することにより残存するトリフルオロ酢酸を除去した。得られた加水分解物を９５％エタノール（蒸留、１ｍＬ）に溶解させ、２５％アンモニア水を７〜８滴添加しアンモニアアルカリ性にした後、過剰の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を加え室温で４時間以上反応させた。反応液に酢酸溶液を滴加し、残存する水素化ホウ素ナトリウムを分解した後、さらに７〜８滴加え、溶媒を減圧乾固により留去した。反応生成物にメタノール（１ｍＬ）を加え、減圧乾固する操作を４回繰り返すことにより生成したホウ酸を除去した。反応生成物をデシケーター中で１時間減圧乾燥後、無水酢酸を加え、密封下１２１℃、３時間加熱反応させることによりアセチル化を行った。反応溶液を室温になるまで放置した後、トルエン（１ｍＬ）を加えて混和し、４０℃で空気気流下、無水酢酸を除去した。反応生成物に水（１ｍＬ）及びクロロホルム（ＣＨＣｌ３、２ｍＬ）を加え液−液分配し、遠心分離（４℃、２，５００ｒｐｍ、５分間）した後、上層の水層を吸引除去した。さらにクロロホルム層は水（１ｍＬ）を用いて４〜５回程洗浄後、クロロホルムを減圧留去し、部分メチル化アルジトールアセテート誘導体を得た。本誘導体は以下に示す条件によりガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）及びガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＬＣ−ＭＳ）を用いて分析した。メチル化アルジトールアセテートの同定は標品のフラグメントイオンとの比較及び２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−ＯＭｅ−１，５−ｄｉ−ＯＡｃ−ガラクチトールに対する相対保持時間との比較により行った。メチル化糖の構成モル比（％）はピーク面積と水素炎イオン検出器（ＦＩＤ）に対する応答係数により求めた。
ＧＬＣ：
装置：ＨＰ５８９０  ＳｅｒｉｅｓＩＩ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｇｈ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）
キャピラリカラム：ＳＰ−２３８０  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ（０．２５ｍｍｉ．ｄ．×３０ｍ、液膜厚０．２５μｍ、ＳＰＥＬＣＯ／ＡＬＤＲＩＣＨ）
キャリアガス：Ｈｅ（総流量：８０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム入口圧：１０ｐｓｉ、ガス純度：９９．９９９９％）
注入口温度：２５０℃
検出器：２５０℃
オーブン温度：６０℃（１ｍｉｎ）、６０℃→１５０℃（３０℃／ｍｉｎ）、１５０℃→２５０℃（１．５℃／ｍｉｎ）、２５０℃（１ｍｉｎ）
ＭＳ：
Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＨＰ５９７０Ｂ  Ｍａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（７０ｅＶ、２８０℃）
【０１０４】
（６）結果
アラビノガラクタン画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）の化学的性状を表１に、糖結合様式を表２に示す。また、アラビノガラクタン画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）の分子量分布の測定結果を図３に示す。
【０１０５】
【表１】
2019156759.tif 000002
【０１０６】
【表２】
2019156759.tif 000003
【０１０７】
表１及び図３に示すように、画分Ａは、ピーク分子量が１２５，０００であり、分子量が３０，０００〜１６０，０００の範囲に分布していた。画分Ｂは、ピーク分子量が３３，０００であり、分子量が１０，０００〜４０，０００の範囲に分布していた。画分Ｃは、ピーク分子量が１５６，０００であり、分子量が３０，０００〜３００，０００の範囲に分布していた。画分Ａは、構成糖に占めるアラビノース、マンノース、及びガラクトースの割合は、それぞれ約３８モル％、１２モル％、及び３６モル％であった。画分Ｂは、構成糖に占めるアラビノース、及びガラクトースの割合は、それぞれ約４３モル％、及び４１モル％であった。また、画分Ｃは、構成糖に占めるアラビノース、ラムノース、キシロース、ガラクツロン酸、及びガラクトースの割合は、それぞれ約３０モル％、８モル％、１２モル％、１４モル％、及び２７モル％であった。これらのアラビノガラクタン画分のうち、画分Ｃは中性糖とウロン酸からなる糖を主成分として含有する多糖画分であり、画分Ａ及び画分Ｂは中性糖からなる糖を主成分とする多糖画分であった。
【０１０８】
表２に示すように、画分Ａは、非還元末端のアラビノフラノース（約１４モル％）、４又は５結合のアラビノース（約１８モル％）、非還元末端ガラクトース（約１３モル％）、及び３，６分岐ガラクトース（約１１モル％）を多く含むという特徴があった。また、画分Ｂは、非還元末端のアラビノフラノース（約２５モル％）、４又は５結合のアラビノース（約１８モル％）、及び３，６分岐ガラクトース（約２０モル％）を多く含むという特徴があった。さらに画分Ｃは、非還元末端アラビノフラノース（約１０モル％）、４又は５結合のアラビノース（約１０モル％）、３，４又は３，５分岐アラビノース（約９モル％）、４結合のキシロース（約１２モル％）、及び４結合のガラクツロン酸（約１０モル％）を多く含むという特徴があった。加えて、表１に示すように、画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃは、β−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原で検出可能なβ−Ｄ−（１→３、６）−ガラクタン構造を、それぞれ約５８％、１００％、及び２５％含む特徴を有していた。
【０１０９】
〔実施例３：アラビノガラクタン画分によるパイエル板活性化作用試験〕
製造例２で調製したアラビノガラクタン画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）を用い、実施例１と同様にパイエル板活性化作用試験を行った。また、注射用水（２０μＬ／ｗｅｌｌ）を加えて培養することにより得た培養上清を対照として用いた。さらに、ナイモウオウギから得られた多糖画分（ＡＭＯＬ−１）を加えて培養することにより得た培養上清、及び製造例１の（３−３）で得られた大豆水溶性多糖画分を加えて培養することにより得た培養上清をそれぞれ陽性対照として用いた。
【０１１０】
図４にパイエル板活性化作用試験の結果を示す。骨髄細胞増殖促進因子量をパイエル板活性化作用として示した。アラビノガラクタン画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）はいずれも対照群と比較して有意に強いパイエル板活性化作用を示し、大豆水溶性多糖画分と比較して同程度又は強いパイエル板活性化作用を示した。
【０１１１】
〔実施例４：大豆水溶性多糖画分の経口投与によるパイエル板活性化作用試験〕
（１）マウスへの大豆水溶性多糖画分の投与
ＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢、雌、日本ＳＬＣ）にＦＴＹ７２０水溶液（１．２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を３日間経口投与し、パイエル板からのリンパ球の遊出を阻害した。ＦＴＹ７２０処置マウスにＦＴＹ７２０投与３時間以上後に、製造例１の（２−２−３）で得られた大豆水溶性多糖画分（２５，５０又は１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を３日間経口投与した。対照群として、ＦＴＹ７２０処置マウスに水を同期間経口投与した。投与開始４日目にマウスをイソフルラン（マイラン製薬）麻酔下、安楽死後、眼科用ハサミを用いて小腸からパイエル板を採取した。
【０１１２】
（２）マウスパイエル板細胞の調製及び培養
得られたパイエル板を氷冷した５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２ｍＬ）を加えた滅菌シャーレにとり、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）上で５ｍＬのディスポーサブル注射器の内筒のゴムラバー部を用いて圧砕することでパイエル板細胞を遊離させた。遊離細胞の懸濁液を５０ｍＬファルコンチューブに移し、ボルテックスミキサーで短時間撹拌した。次いで、細胞懸濁液をステンレスメッシュ（１５０ｍｅｓｈ）によりろ過後、遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４℃、７分間）し、培地をデカンテーションすることによりパイエル板細胞を得た。得られた細胞について５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍＬ）を用いて計４回同様の操作を繰り返すことにより細胞を洗浄後、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）によりろ過した。この細胞懸濁液（２０μＬ）を用いてセルカウンターで細胞数を計数後、５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのパイエル板細胞懸濁液を調製した。
【０１１３】
２４穴培養プレート（３０４７、ＦＡＬＣＯＮ）に上記で得たパイエル板細胞懸濁液（５００μＬ／ｗｅｌｌ）及びコンカナバリンＡ（５０μｇ／ｍＬ、５０μＬ、終濃度：５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＴリンパ球刺激条件下で、５％ＣＯ２−９５％空気下、３７℃にて３日間培養した。培養上清を別の２４穴培養プレートに移し、−２０℃にて使用まで保存した。
【０１１４】
（３）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−６）の測定
ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）に５０ｍＭ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍＬに希釈した抗マウスサイトカイン一次抗体（抗ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４又はＩＬ−６抗体、１００μＬ／ｗｅｌｌ）を分注し、４℃で一昼夜インキュベーションした。本プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄後、１％スキムミルク（ＳＭ）含有ＰＢＳＴ（ＳＭ−ＰＢＳＴ）（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を用いて３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で４回洗浄後、１％ＳＭ−ＰＢＳＴ（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加えて１０分間室温にてプレインキュベーションし、次いで、パイエル板培養上清（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、４℃で１晩インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄し、１％ＳＭ−ＰＢＳＴ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を用いて１０分間室温にてプレインキュベーションした。さらにプレートに１％ＳＭ−ＰＢＳＴで希釈した一次抗体に対応するビオチン標識抗サイトカイン二次抗体（１：１０００、５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え３７℃で１時間インキュベーション後、ＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄した。プレートを１％ＳＭ−ＰＢＳＴ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を用いて１０分間室温にてプレインキュベーション後、１％ＳＭ−ＰＢＳＴで希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（１：１０００、１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で５回洗浄後、基質溶液［ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムの１０％ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）溶液（１ｍｇ／ｍＬ、１５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、室温でインキュベーションした。発色した黄色をマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＪＸ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いて測定した（測定波長：４０５ｎｍ、ブランク波長：４９２ｎｍ）。
【０１１５】
（４）結果
図５に、ＦＴＹ７２０処置マウスへの大豆水溶性多糖画分の経口投与によるパイエル板Ｔリンパ球からのＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−６の産生変化についての試験結果を示す。２５，５０又は１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量の大豆水溶性多糖画分の経口投与により、パイエル板Ｔリンパ球からのＩＬ−６の産生は用量依存的に顕著に増強されていた（図５（Ｃ））。また、ＩＦＮ−γでは５０及び１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で産生が有意に増強され、５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量での増強作用が最も顕著であった（図５（Ａ））。ＩＬ−４では５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で産生が有意に増強された（図５（Ｂ））。ＩＬ−６及びＩＦＮ−γは感染防御に関与する液性因子として報告されている。このことから、大豆水溶性多糖画分に含まれるアラビノガラクタンが、パイエル板でのこれらのサイトカイン産生に関与するＴリンパ球を誘導することにより、これらのサイトカインの関与する病態の改善につながると考えられる。
【０１１６】
〔実施例５：大豆水溶性多糖画分の経口投与による脾臓免疫細胞活性化作用試験〕
パイエル板で活性化されたリンパ球はホーミング（帰巣）受容体依存的にパイエル板外の種々の免疫・非免疫組織に移送され、移送先の組織内のリンパ球、マクロファージ及び繊維芽細胞等と相互作用し、これらの免疫細胞の機能を調節することが知られている。大豆水溶性多糖画分の経口投与で誘導されたパイエル板リンパ球によるパイエル板外の組織（脾臓）における免疫学的変化を解析した。
【０１１７】
（１）マウスへの大豆水溶性多糖画分の投与
ＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢、雌、日本ＳＬＣ）に、製造例１の（２−２−３）で得られた大豆水溶性多糖画分（２５，５０又は１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１３日間経口投与した。対照群としては、マウスに水を同期間経口投与した。投与開始１４日目にマウスをイソフルラン（マイラン製薬）麻酔下、安楽死後、眼科用ハサミを用いて脾臓を採取した。
【０１１８】
（２）マウス脾臓細胞の調製及び培養
得られた脾臓を氷冷した１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２ｍＬ）を加えた滅菌シャーレにとり、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）上で５ｍＬのディスポーサブル注射器の内筒のゴムラバー部を用いて圧砕することで脾臓細胞を遊離させた。遊離細胞の懸濁液をステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）により５０ｍＬファルコンチューブ内へろ過後、遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４℃、７分間）し、培地をデカンテーションすることにより脾臓細胞を得た。得られた細胞について混入する赤血球を低浸透破壊後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（各１０ｍＬ）を用いて上記と同様の操作を３回繰り返すことにより細胞を洗浄し、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）によりろ過した。この細胞懸濁液（２０μＬ）を用いてセルカウンターで細胞数を計数後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの脾臓細胞懸濁液を調製した。
【０１１９】
２４穴培養プレート（３０４７、ＦＡＬＣＯＮ）に上記で得た脾臓細胞懸濁液（５００μＬ／ｗｅｌｌ）を添加し、更にコンカナバリンＡ（５０μｇ／ｍＬ、５０μＬ、終濃度：５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＴリンパ球刺激条件下、又はＬＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ、２．５μＬ、終濃度：５μｇ／ｍＬ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１２７：Ｂ８、Ｓｉｇｍａ）を添加したＢリンパ球／マクロファージ刺激条件下で、５％ＣＯ２−９５％空気下、３７℃にて３日間培養した。培養上清を別の２４穴培養プレートに移し、−２０℃にて使用まで保存した。
【０１２０】
（３）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるサイトカイン（ＩＬ−６）の測定
ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）に５０ｍＭ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍＬに希釈した抗マウスＩＬ−６一次抗体（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を分注し、４℃で一昼夜インキュベーションした。本プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄後、１％スキムミルク（ＳＭ）含有ＰＢＳＴ（ＳＭ−ＰＢＳＴ）（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を用いて３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で４回洗浄後、１％ＳＭ−ＰＢＳＴ（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加えて１０分間室温にてプレインキュベーションし、次いで、脾臓細胞培養上清（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、４℃で１晩インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄し、１％ＳＭ−ＰＢＳＴ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を用いて１０分間室温にてプレインキュベーションした。さらにプレートに１％ＳＭ−ＰＢＳＴで希釈したビオチン標識抗マウスＩＬ−６二次抗体（１：１０００、５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え３７℃で１時間インキュベーション後、ＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄した。プレートを１％ＳＭ−ＰＢＳＴ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を用いて１０分間室温にてプレインキュベーション後、１％ＳＭ−ＰＢＳＴで希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（１：１０００、１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で５回洗浄後、基質溶液［ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムの１０％ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）溶液（１ｍｇ／ｍＬ、１５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、室温でインキュベーションした。発色した黄色をマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＪＸ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いて測定した（測定波長：４０５ｎｍ、ブランク波長：４９２ｎｍ）。
【０１２１】
（４）結果
図６に、ＢＡＬＢ／ｃマウスへの大豆水溶性多糖画分の経口投与による脾臓Ｔリンパ球又はＢリンパ球／マクロファージからのＩＬ−６の産生変化についての試験結果を示す。２５，５０又は１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量の大豆水溶性多糖画分の経口投与により、脾臓Ｔリンパ球からのＩＬ−６の産生は顕著に増強されていた（図６（Ａ））。また、ＬＰＳ刺激条件でＢリンパ球／マクロファージからのＩＬ−６の産生も１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの大豆水溶性多糖画分の投与により著明に増加した（図６（Ｂ））。ＩＬ−６は感染防御やＢリンパ球の増殖、若しくは造血系活性化に関与する液性因子として報告されている。このことから、大豆水溶性多糖画分に含まれるアラビノガラクタンが、パイエル板リンパ球を活性化し、パイエル板外の末梢組織や造血組織においてＩＬ−６の産生を誘導することにより、ＩＬ−６産生低下に基づく病態の改善につながると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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