(57)【要約】【課題】本発明の目的は、菌従属栄養ラン科植物の発芽から結実までを可能とする人工栽培方法を提供することである。【解決手段】菌従属栄養ラン科植物の育成方法は、培地として、自生地の腐植進行中の原木と複数の腐植進行中の球果を敷き詰める。培地がある室内環境を温度１５℃〜３０℃、かつ湿度7０％以上にする。【選択図】図１
2019041692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌従属栄養ラン科植物の培地として、腐植進行中の原木と複数の腐植進行中の球果を用い、
前記培地がある室内環境を温度１５℃〜３０℃、かつ湿度７０％以上にする、菌従属栄養ラン科植物の育成方法。
【請求項２】
請求項１に記載の育成方法を用いて培養したヤツシロラン。
【請求項３】
請求項１に記載の育成方法を用いて培養したオニノヤガラ。
【請求項４】
ヤツシロランの塊茎から抽出したガストロジン（英名Ｇａｓｔｒｏｄｉｎ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌従属栄養ラン科植物の人工栽培に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、菌従属栄養ラン科植物の人工栽培方法が知られている（例えば、特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２４５３３２号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５３３３号公報
【特許文献３】特開２０１７−６６１１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献１、２には、シナノショウキランの人工培養方法が記載されているが、シナノショウキランの人工培養するために環境を無菌にしなければならない。また、特許文献３には、ラン科植物の共生菌との共生を促進するための方法が記載されているが、ラン科植物の発芽を促進するために、ジベレリン阻害剤、サリチル酸、およびサリチル酸誘導体からなる群より選択される物質を含む剤を用いる必要があり、共生発芽系においては、特定の菌（ツラネスラ属の菌）を用いなければならない。また、特許文献３に示す発明では、菌従属栄養ラン科植物の発芽を促進することが可能であるものの、開花や結実までの育成が可能であるかは不明である。さらに付言すると、これまでに、菌従属栄養ラン科植物のオニノヤガラ属のヤツシロラン（例えば、クロヤツシロラン、アキザキヤツシロラン、ハルザキヤツシロラン）の開花・結実を可能とする人工栽培方法は確立されていない。
【０００５】
本発明の目的は、菌従属栄養ラン科植物の発芽から結実までを可能とする人工栽培方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的は、菌従属栄養ラン科植物の培地として、腐植進行中の原木と複数の腐植進行中の球果を用い、前記培地がある室内環境を温度１５℃〜３０℃、湿度７０％以上にする、菌従属栄養ラン科植物の育成方法、によって達成される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、菌従属栄養ラン科植物の人工栽培が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の実施形態による菌従属栄養ラン科植物の人工栽培方法に用いる育成キット１００を説明する図である。
【図２】本発明の実施形態による菌従属栄養ラン科植物の人工栽培方法に用いて栽培したヤツシロラン類（クロヤツシロラン、アキザキヤツシロラン、ハルザキヤツシロラン）の栽培結果を示す写真である。
【図３】本発明の実施形態による菌従属栄養ラン科植物の人工栽培方法に用いて栽培したクロヤツシロランとアキザキヤツシロランの共生を説明するための栽培結果を示す写真である。
【図４】本発明の実施形態による菌従属栄養ラン科植物の人工栽培方法に用いて栽培したヤツシロラン類（クロヤツシロラン、アキザキヤツシロラン）のプロトコームと育成キット１００の培地より同定した菌根菌の表である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態による菌従属栄養ラン科植物の人工栽培方法を説明する。
【００１０】
図１を用いて、菌従属栄養ラン科植物のオニノヤガラ属のヤツシロラン類（クロヤツシロラン、アキザキヤツシロラン、ハルザキヤツシロラン）の人工培養を行うための育成キット１００を説明する。図１（ａ）は、育成キット１００の側面図であり、図１（ｂ）は、育成キット１００の正面図である。
【００１１】
育成キット１００は、半透明のプラスチックケース１１（蓋１１ａ、筺体１１ｂで構成される）に、筺体１１ｂの中央に腐植進行中の丸太２０を配置し、丸太２０の周辺には腐葉土４０と腐植進行中の杉の葉にできる球果３０を敷き詰め、筺体１１ｂの開口部を被うように水分吸収材１３（本実施の形態では、ガーゼを使用）とビニール１２を被せ、蓋１１ａを閉め密閉状態となるように構成される。
【００１２】
育成キット１００内に配置される丸太２０、球果３０、および／または腐葉土４０上にヤツシロラン（クロヤツシロラン、アキザキヤツシロラン、ハルザキヤツシロラン）の種子をまんべんなく広がるように播種する。播種は、ヤツシロランの産地の培地（丸太２、球果３０、腐葉土４０）と種子を組み合わせるのが好適であるが、ヤツシロランの産地の培地と種子を組み合わせない場合があってもよい。なお、本発明の実施形態による菌従属栄養ラン科植物の人工栽培方法の有効性を確認する実験として、クロヤツシロランの種子を神奈川県、および静岡県、ハルザキヤツシロランの種子を徳島県、アキザキヤツシロランの種子を静岡県の各自生地より採取し、もしくは実験室内で自家受粉させて採取した。また、丸太２０、球果３０、腐葉土４０は、クロヤツシロランの人工栽培において神奈川県の自生地より採取し、アキザキヤツシロランの人工栽培において高知県と神奈川県の自生地より採取し、ハルザキヤツシロランの人工栽培において徳島県の自生地より採取した。クロヤツシロランの人工栽培における丸太２０は、腐植進行中の杉を採用し、球果３０は、腐植進行中の杉の球果を採用し、腐葉土４０は、杉の腐葉土を採用した。アキザキヤツシロランの人工栽培における丸太２０は、腐植進行中のモウソウチクを採用し、球果３０は、腐植進行中の杉の球果を採用し、腐葉土４０は、モウソウチクの腐葉土を採用した。また、ハルザキヤツシロランの人工栽培における丸太２０は、腐植進行中のスダジイを採用し、球果３０は、腐植進行中の杉の球果を採用し、腐葉土４０は、スダジイ林腐葉土を採用した。なお、丸太２０、球果３０、腐葉土４０は、上記以外を採用する場合があってもよい。また、丸太２０のみで培地を構成してもよいし、球果３０のみで培地を構成してもよいし、腐葉土４０のみで培地を構成してもよいし、丸太２０と球果３０で培地を構成してもよいし、丸太２０と腐葉土４０で培地を構成してもよいし、球果３０と腐葉土４０で培地を構成してもよい。なお、球果３０は、杉の球果を採用するのが好ましいが、杉以外の針葉樹（例えば、ヒノキ科、イヌマキ科、コウヤマキ科、またはマツ科）の球果であってもよい。
【００１３】
育成キット１００を用いたヤツシロランの人工栽培は、育成キット１００内の室内温度を１５℃〜３０℃、室内湿度を７０％以上に保ち、花茎抽出までは育成キット１００に段ボールをかぶせて育成キット１００内を暗黒条件下にし、花茎抽出後は、育成キット１００内を光条件下（昼間は明るく夜間は暗くする）に移行することで行われる。湿度を７０％以上に保つたに、天然水もしくは蒸留水を定期的に噴霧器にて湿度状態を確認しながら適宜散水する。なお、育成キット１００内の室内温度を好ましくは１８℃〜２７℃、さらに好ましくは２０℃〜２５℃、室内湿度を好ましくは７５％〜９０％、さらに好ましくは８０％〜８５％に保つ。温度を２０℃〜２５℃、湿度を８０％〜８５％にすることで、ヤツシロラン類の生育や共生菌の活動を最も活発にし、１個体から年３回開花・結実を可能にするなど短期間に発芽生育が可能となった。なお、ヤツシロランの花茎抽出までは育成キット１００内を暗黒条件にするのが好ましいが、育成キット１００内を光条件下としても、ヤツシロランの育成が可能であることを確認した。
【００１４】
＜クロヤツシロランの人工栽培＞
クロヤツシロランの人工栽培の結果を図２に示す。クロヤツシロランの種子は発芽しプロトコームを形成した。塊茎原基はプロトコーム形成後、ボール状になったプロトコームの頂上部より苞を形成し、それが割れて形成された。根もプロトコームの左右両サイドより発達した。開花後も根の一つは優先的に連続的に伸長した。塊茎は播種後４か月ほどで発育をストップし、シュート形成が起こる。抽苔後一か月で開花し、さく果は自然条件下で開花後約２０−３０日後成熟し裂開する。詳細は、クロヤツシロランは杉培地で播種から発芽まで１７日〜約２か月を要し、プロトコーム、塊茎原基、根、開花、結実は播種後それぞれ、２０−６５日、２５−８０日、３０−８２日、１５４−２９９日、１９４−３２１日を要した。クロヤツシロランの花の中には播種後１５４日で咲くものもあった。人工培養法では、生育開花促進効果がみられ、大きな塊茎個体では年三回開花・結実するものもみられた。これら発育スピードは１年に１回咲く自然条件下と比較してかなりの効果的なスピードアップとなった。さらに栄養条件や生育環境が悪い場合、開花に数年、もしくは開花しない、塊茎が消失、菌と出会えず発芽しないこともあることから画期的な培養システムといえる。
【００１５】
＜アキザキヤツシロランの人工栽培＞
アキザキヤツシロランの人工栽培の結果を図２に示す。アキザキヤツシロランは杉、モウソウチク培地で、播種後から発芽まで８−３６日、その後プロトコーム、塊茎原基、根、開花、結実は播種後それぞれ、３３−５３日、４４−７９日、５０−８３日、１５４−３４０日、２４５日を要した。杉培地は開花・結実に有効であった。また、アキザキとクロヤツシロランは同じ培地で共に生育することが可能であることが確認された（図３参照）。アキザキヤツシロランはプロトコーム時にクロヤツシロラン塊茎と同じ菌糸を共有することが確認された（図３に示す黒矢印：  クロヤツシロラン、白矢印：アキザキヤツシロラン）。また、クロヤツシロランとアキザキヤツシロランは同じ培地で同じような生育スピードを示すことも確認された。このことは菌根菌とヤツシロラン類の種特異性が低いことを示しているものと思われる。
【００１６】
＜ハルザキヤツシロランの人工栽培＞
ハルザキヤツシロランの人工栽培の結果を図２に示す。ハルザキヤツシロランは杉培地・スダジイ培地では播種から発芽まで１３−３０日要し、プロトコーム、塊茎原基、根形成は播種後それぞれ、１５−３２日、３０−４５日、３０−４５日を要した。なお、発芽は自然条件下よりも早いことを確認した。
【００１７】
＜培地と種子の産地＞
さらに、本実施形態による人工栽培方法を用いて以下のような実験結果を得た。
（ア）神奈川県で採取した培地（杉の丸太２０、杉の球果３０、杉の腐葉土４０）にて、神奈川県（培地と同じ場所）で採取したクロヤツシロランと静岡県（培地と異なる場所）で採取したクロヤツシロランの人工栽培が可能であることを確認した。
（イ）徳島県で採取した培地（スダジイの丸太２０、杉の球果３０、スダジイの腐葉土４０）にて、徳島県（培地と同じ場所）で採取したハルザキヤツシロランと静岡県（培地と異なる場所）で採取したアキザキヤツシロランの人工栽培が可能であることを確認した。
（ウ）高知県で採取した培地（モウソウチクの丸太２０、杉の球果３０、モウソウチクの腐葉土４０）にて、静岡県（培地と異なる場所）で採取したアキザキヤツシロランの人工栽培が可能であることを確認した。
【００１８】
＜ヤツシロラン類の菌根菌の同定＞
プロトコームを用いてＣＴＡＢ法でゲノムを抽出した。菌が保持するｒＤＮＡ中ＩＴＳ領域をＩＴＳ１Ｆ−ＩＴＳ４ＢプライマーおよびＴａｋａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  キットを用いて増幅した。ＰＣＲ反応液は、ＤＮＡ抽出物２μｌ、  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．０５μｌ、  各プライマー  １０μＭ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  ０．２５μＭ、１０ｘ  ｂｕｆｆｅｒ  を収量１０μｌになるように調整した。反応液をｉｃｙｃｌｅｒによりサイクル前の熱変性を９４℃で５分、熱変性を９４℃で３０秒、アニーリングを５５℃で３０秒、伸長反応を７２℃で１分のサイクルを３０回行ったのち、最後の伸長を７２℃で７分間行った。ＰＣＲ産物は、ＥｃｏｎｏＳｐｉｎを用いて精製した。精製したＰＣＲ産物でダイレクトシークエンスを行った。得られたＤＮＡ配列はＢＬＡＳＴ検索を行った。ＧｅｎｅＢａｎｋより得られた複数の配列に基づいてＣｌｕｓｔａｌＸで系統樹を作成した。
【００１９】
＜菌根菌の分子レベルでの同定＞
本研究における人工培養方を用いて、オニノヤガラ属のヤツシロラン類の菌根菌同定を試みた。ＩＴＳ領域から得た配列に基づき菌根菌の同定を行った。図４は、クロヤツシロラン（神奈川県）およびハルザキヤツシロラン（徳島県）のプロトコームと育成キット１００の培地より同定した菌根菌のテーブルである。クロヤツシロラン（神奈川県）およびハルザキヤツシロラン（徳島県）のプロトコームから得られたＩＴＳ配列は、それぞれ学名（Ｄｉｐｌｏｍｉｔｏｐｏｒｕｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ）と学名（Ｔｈｅｌｅｐｕｒｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｕｓ）と９９％以上の相同率で一致した。これらの菌根菌は、それぞれのスギ培地およびスダジイ培地からも同様の結果が検出された。この結果は、人工培養方を用いることでオニノヤガラ属のヤツシロラン類の生長に必要な菌を同定するためにも効率的であることがわかった。学名（Ｄｉｐｌｏｍｉｔｏｐｏｒｕｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ）および学名（Ｔｈｅｌｅｐｏｒｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｕｓ）のそれぞれの菌根菌は、いずれもＰｏｌｙｐｏｒａｌｅｓタマチョレイタケ目の一種であることに共通性がある。したがって、これらの菌根菌の名前をＮＣＢＩから検索して同種の登録されているＩＴＳ領域のゲノム配列を比較させてＣｌａｓｔａｌＷで解析しＮＪｐｌｏｔで系統樹の作成を行った。その結果は、これら２種はあまり近い関係にあるわけではないことがわかった。また、菌根菌の同定において、他種の菌も検出された。アキザキヤツシロランおよびハルザキヤツシロランのプロトコームから得られたＩＴＳ配列において、学名（Ｔｒｅｃｈｉｓｐｏｒａ）、学名（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ）、学名（Ｍｙｃｅｎａ  ｓｐｐ）の菌根菌も検出された。しかし、検出されたこれらの菌種とは相同性が低かったため、オニノヤガラ属のヤツシロラン類の生育において依存した関係性があることを見出すことはできなかった。しかし、これらをもってオニノヤガラ属のヤツシロラン類が生長を良好に行う上で非特異的に複数の菌根菌との共生関係を保持しているということが示唆された。
【００２０】
以上のことから、育成キット１００を用いたオニノヤガラ属のヤツシロラン類の人工栽培において次の結果が得られた。
・クロヤツシロラン
杉培地にて人工栽培に成功し、同一個体で年３回の開花・結実が可能であることが確認された。また、菌根菌の一つは、学名（Ｄｉｐｌｏｍｉｔｏｐｏｒｕｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ）であることが確認された。
・アキザキヤツシロラン
杉培地、モウチク培地にて人工栽培に成功した。また、菌根菌の一つは、学名（Ｇｅｒｒｏｎｅｍａ  ｓｔｒｏｎｂｏｄｅｓ）であることが確認された。
・ハルザキヤツシロラン
杉培地、スダジイ培地にて人工栽培に成功した。また、菌根菌の一つは、学名（Ｔｈｅｌｅｐｏｒｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｕｓ）であることが確認された。
【００２１】
上記の実験結果より、スギの腐植球果が菌根菌の繁殖及びヤツシロランの生育に好影響を与えたことが確認された。杉の球果の中には多種多様な菌糸が発達しているものが多くみられ、共生菌にとって杉の球果の複雑な３−Ｄ構造が、菌にとって適度な湿度と気相を兼ね備えた良い生育環境であり、杉球果を培地に加えることが共生菌の生育活動を活発化させ本人工栽培について好影響を与えたことが確認された。また、ガーゼを天井面に設置したことが過剰な結露と結露の落下を防ぎ程よい湿度が保たれ、人工栽培に好影響を与えたことも確認された。また、育成キット１００内の室温を２０〜２５℃付近に保ち、かつ育成キット１００内の湿度を８０〜８５％付近に保つことで、ヤツシロラン類の生育や共生菌の活動を活発にすることも確認された。なお、ヤツシロランは複数の共生菌と各生長過程で異なる菌根菌と共生することを示唆する結果も得られた。
【００２２】
また、上記の実験結果より得られたヤツシロランの塊茎から、ガストロジン（英名Ｇａｓｔｒｏｄｉｎ）が発見された。以下にヤツシロランの塊茎からガストロジンを抽出した方法を示す。
（ア）ヤツシロランの塊茎に適量の５０％メタノールを加え、乳鉢で破砕する（塊根１ｇ当たり、メタノール１０ｍｌ使用）。
（イ）破砕後の塊根と抽出液をナスフラスコに移し、８０℃の熱水中で還流しながら、１０分程度抽出を行う。
（ウ）所定の濾紙を用いて抽出液を濾過し、粗抽出液とする。
（エ）粗抽出液に等量の石油エーテルを加え、分液漏斗を用いて分画し、水層を分液する（本例では３回繰り返す）。
（オ）水層に等量の酢酸エチルを加え、分液漏斗を用いて分画し、水層を分液する（本例では３回繰り返す）。
（カ）得られた水層をエバポレーターにより濃縮させる。
（キ）５０％メタノールで再懸濁し、粗精製液とする。
以上の方法によって、ヤツシロランの塊茎からガストロジンを抽出した。また、開花直前の塊茎から、最も高濃度のガストロジン抽出液を取り出すことができた。なお、上記以外の方法でガストロジンを抽出する場合があってもよい。
また、本実施形態による菌従属栄養ラン科植物の人工栽培方法は、オニノヤガラの人工栽培においても有効であることも確認した。
【００２３】
これまでは、グループの菌が菌従属栄養植物の共生者とみなされており、例えばラン科シンビジウム属において、もっとも近縁の独立栄養植物と菌従属栄養植物でそれぞれが共生する菌の多様性を比較した結果、菌従属栄養植物の共生菌の多様性は格段に低くなり、菌従属ラン科植物と共生菌との間の種特異性は高いと考えられてきた。しかしながら、クロヤツシロランの根菌とアキザキヤツシロラン、ハルザキヤツシロランの根菌がアキザキヤツシロランと、またＧａｌｅｏｌａ  ｈｙｄｒａの根菌がＧａｌｅｏｌａ  ｓｐとそれぞれ共生関係を樹立したとされ、これらの結果に共通するのは、根菌と共生したランが、根菌の分離元のランとそれぞれ同属であることであること、また、３種の同じオニノヤガラ属のヤツシロラン類の共生菌は、Ｍｙｃｅｎａｃｅａｅ  Ｍａｒａｓｍｉａｃｅａｅの割合が多いものの、多種多様な菌Ｃｅｒａｔｏｂａｓｉｄｉａｃｅａｅ、  Ｐｏｌｙｐｏｒａｃｅａｅ等が検出されており、本実施の形態による人工栽培方法の効果を確認する実験結果からも３種の同属のランに共通の共生関係を樹立するパートナーの根菌ＭｙｃｅｎａｃｅａｅもしくはＰｏｌｙｐｏｒａｃｅａｅの存在が確認され、これら３種のランについての根菌共生に関する種の特異性は低く、進化の途中で様々なリスク（例えば植物病原菌の犯されてしまう等）を冒しつつも将来に向けての様々の共生菌とのパートナーシップの関係性構築の模索中の過程である可能性が示された。よって、本実施の形態による人工栽培方法においては、特に特定の菌を抽出し種子を接種しなくても自生地周辺の腐葉土や腐植木を採取しその中に存在する多様な菌根菌を利用すれば菌従属栄養ラン科植物の人工栽培が十分栽培が可能であることが確認された。また、同じオニノヤガラ属のオニノヤガラについては漢方薬の薬効が知られており、栽培法については数多くの報告があるが、その他のオニノヤガラ属のラン科については無菌発芽については報告があるものの、その他栽培法に関する報告は全くない。また、本実施の形態による人工栽培方法による育成キット１００を用いることで、短期間に大量の栽培が可能であることは、今までにない画期的増殖法でもある。オニノヤガラではナラタケと共生することで有名であるが、しかしこれは生育が進んでからの事で、発芽から実生の初期はクヌギタケ属の菌としか共生しないと報告されており、シュンラン属でも生育ステージごとに共生する菌の種類の組み合わせが変わるとされ、ヤツシロラン類においても生育ステージごとに最適な菌のパートナーがシフトする。したがって、共生菌の同定と単離培養、そして最適な菌の組み合わせを行い、本実施の形態による人工栽培方法に応用することで、単に園芸的な栽培利用の目的のみならず、絶滅危惧植物の増殖、さらには現地での播種や移植による生物多様性の保全、薬効成分のある菌従属栄養植物の医学分野への利用、地下部の形態を破壊せずに観察可能であること等から生物教育分野への教材として利用等の様々な可能性に道が開かれる。またこの方法ではヤツシロラン類の種子を３か月で入手できるためモデルプランツとして知られるアラビドプシスに相当するモデルプランツとしての役割の期待もあり、この方法で遺伝的に均一な個体���作出や開花期の調節、オニノヤガラ属間の交配も可能である。さらには自家受粉によるインブリード交配も可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明は、絶滅に瀕している生物多様性の保全や、医学分野や園芸分野、さらには生物教育における教材化等における様々な分野において広く利用可能である。
【符号の説明】
【００２５】
１００  育成キッド
１１ａ  蓋
１１ｂ  筺体
１２  ビニール
１３  水分吸収材
２０  丸太
３０  球果
４０  腐葉土
【図１】
2019041692.tif 000003
【図２】
2019041692.tif 000004
【図３】
2019041692.tif 000005
【図４】
2019041692.tif 000006