(57)【要約】      （修正有）【課題】ニンニクなどのネギ属植物を原料とする組成物等において、特に加齢・老化の問題をターゲットとして、新規なる特性を備えた組成物、およびその製造方法の提供。【解決手段】ＡＧＥｓ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ、終末糖化産物）の生成を阻害する作用Ｆ１、もしくはその中間体の生成を阻害する作用Ｆ２、またはＡＧＥｓのＲＡＧＥ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥｓ、ＡＧＥｓ受容体）への接着を阻害する作用Ｆ３の少なくともいずれかを有することを特徴とする、ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物１０。【選択図】図１
2019041760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＧＥｓ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ、終末糖化産物）もしくはその中間体の生成を阻害する作用、またはＡＧＥｓのＲＡＧＥ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥｓ、ＡＧＥｓ受容体）への接着を阻害する作用（以下、まとめて「ＡＧＥｓ等阻害性」という。）の少なくともいずれかを有することを特徴とする、ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項２】
前記ＡＧＥｓ等阻害性の少なくとも一つが、ＡＧＥｓ産生阻害作用に係ることを特徴とする、請求項１に記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項３】
前記ＡＧＥｓ等阻害性の少なくとも一つが、３−ＤＧ（３−デオキシグルコソン）産生阻害作用に係ることを特徴とする、請求項１または２に記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項４】
前記ＡＧＥｓ等阻害性の少なくとも一つが、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ接着阻害作用に係ることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項５】
飲食品であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項６】
固体状または液体状のエキス（抽出物）であることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項７】
前記ネギ属植物は下記＜Ａ＞のいずれかであることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
＜Ａ＞タマネギ、エシャロット、ニンニク、ラッキョウ、ツリーオニオン、アサツキ、ネギ（ナガネギ、青ネギ）、ワケギ、チャイブ、ニラ、ヤグラネギ、白ネギ、リーキ、ノビル、ギョウジャニンニク
【請求項８】
前記ネギ属植物は発酵処理またはメイラード反応処理の少なくともいずれかの処理済みネギ属植物であることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項９】
前記ネギ属植物は発酵処理またはメイラード反応処理の少なくともいずれかの処理済みニンニクであり、「黒」、「琥珀」、「発酵」または「熟成」の少なくともいずれかの語を「ニンニク」の語に付した表示が付されていることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項１０】
固形分として原料ネギ属植物以外のものが含まれていないことを特徴とする、請求項１ないし９のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項１１】
有効成分としてＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎが含有されていることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項１２】
有効成分として５−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｒｆｕｒａｌ（５−ＨＭＦ）が含有されていることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項１３】
ＡＧＥｓ生成阻害用であることを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項１４】
ＡＧＥｓの中間体の生成阻害用であることを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項１５】
ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害用であることを特徴とする、請求項１ないし１４のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項１６】
飲食品用組成物であることを特徴とする、請求項１ないし１５のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物、または請求項１１ないし１３のいずれかに記載の方法により得られるＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物であって、下記＜Ｄ１＞〜＜Ｄ４＞の少なくともいずれかの旨の表示が付されていることを特徴とする、ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
＜Ｄ１＞  ＡＧＥｓ生成阻害用である旨
＜Ｄ２＞  ＡＧＥｓの中間体の生成阻害用である旨
＜Ｄ３＞  ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害用である旨
＜Ｄ４＞  固形分として原料とするネギ属植物以外のものが含まれていない旨
【請求項１８】
請求項１ないし１７のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物を製造する方法であって、原料ネギ属植物を発酵処理またはメイラード反応処理の少なくともいずれかの処理をし、その後濃縮処理を行なうことを特徴とする、ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物製造方法。
【請求項１９】
前記濃縮処理後、乾燥処理を行なうことを特徴とする、請求項１８に記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物製造方法。
【請求項２０】
前記乾燥処理は任意の乾燥方法（ただし、スプレードライを除く）により行なうことを特徴とする、請求項１９に記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物製造方法。
【請求項２１】
請求項１ないし１７のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物、または請求項１８ないし２０のいずれかに記載の方法により得られるＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物を用いた、飲食品。
【請求項２２】
請求項２１に記載の飲食品であって、下記＜Ｄ１＞〜＜Ｄ４＞の少なくともいずれかの内容の表示が付されていることを特徴とする、飲食品。
＜Ｄ１＞  ＡＧＥｓ生成阻害用である旨
＜Ｄ２＞  ＡＧＥｓの中間体の生成阻害用である旨
＜Ｄ３＞  ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害用である旨
＜Ｄ４＞  固形分として原料とするネギ属植物以外のものが含まれていない旨
【請求項２３】
下記＜Ｎ１＞〜＜Ｎ３＞の少なくともいずれかに用いられることを特徴とする、ＡＧＥｓ阻害用Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎ。
＜Ｎ１＞  ＡＧＥｓ生成阻害用
＜Ｎ２＞  ＡＧＥｓの中間体の生成阻害用
＜Ｎ３＞  ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害用
【請求項２４】
ネギ属植物由来であることを特徴とする、請求項２３に記載のＡＧＥｓ阻害用Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニンニクなどのネギ属植物を原料とする組成物・飲食品における新たな機能および用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ニンニクを発酵処理やメイラード反応（アミノカルボキシル反応）処理して製造する黒ニンニク、琥珀ニンニク等（以下、単に「黒ニンニク」とも言う）については従来、さまざまな技術的提案もなされている。たとえば後掲特許文献１には、ニンニク原料の湿度管理等を要しない簡便な手段で高生理活性物質（Ｓ−アリルシステイン、シクロアリイン等）が保持された黒ニンニクエキスを製造する技術として、ニンニク原料（乾燥ニンニク、生ニンニク等）を水抽出して得られる抽出物を、９０℃以上の温度で加熱熟成させる方法が開示されている。
【０００３】
また特許文献２には、生ニンニクが本来有していないミネラル成分を含有した黒ニンニクを、食味を損うことなく製造する技術として、生ニンニクを６０℃の温泉水に６時間以内、より好ましくは略３時間浸漬させて温泉水処理生ニンニクとし、これを発酵させて黒ニンニクを得る方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−４５６９３号公報「黒ニンニクエキスの製造およびその用途」
【特許文献２】特開２０１７−２３００３号公報「黒にんにくの製造方法」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
さて、黒ニンニクには上述の通り高生理活性物質が含有されており、黒ニンニクは健康増進に効果のある食品として取り扱われている。しかし従来の研究のほとんどは、黒ニンニクにおける抗酸化性や抗炎症作用をターゲットとした研究に留まっており、それ以外のアプローチがなされていない現状である。たとえば、加齢・老化の問題をターゲットとした黒ニンニクの研究は未だなされていない。もし、かかる研究において一定の成果が得られた場合には、それは黒ニンニクのさらなる普及拡大に資するのみならず、広くニンニク以外のネギ属植物に敷衍できる可能性もある。
【０００６】
そこで本発明が解決しようとする課題は、このような従来技術の状況を踏まえ、黒ニンニクを初めとする、ニンニクなどのネギ属植物を原料とする組成物等において、特に加齢・老化の問題をターゲットとして、従来未知の機能・作用が存在しないか否かを研究によって明らかにし、それに基づいて、何某かの新規なる特性を備えた組成物、およびその製造方法を提供することである。また、本発明の課題はさらに、かかる研究を通して、黒ニンニクを初めとするニンニクなどのネギ属植物を原料とする組成物等における新たな用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者は上記課題について検討した。具体的には、黒ニンニクからエキスを製造し、そのエキスにおけるＡＧＥｓ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ、終末糖化産物）産生阻害活性の有無等について研究を行ったのであるが、その経緯について簡単に述べる。
【０００８】
加齢・老化の原因としては、プログラム説、エラーカタストロフ説、さらに細胞機能低下、フリーラジカルによる体内酸化、ホルモンレベルの低下、免疫力の低下、遺伝子異変などさまざまに提唱されており、また、老化進展要因の一つとして近年、カルボニルストレスにおける糖化反応が注目されている。カルボニルストレスとは、生体が活性酸素種（ＲＯＳ）などによる酸化ストレスにさらされた際に生成されるアルデヒド基やカルボニル基を有する物質の量が生体の消去能力を超えて増加した状態をいう。これは生体内タンパク糖化反応であり、広義のメイラード反応であると考えられている。
【０００９】
ＡＧＥｓは、タンパク質の糖化反応すなわちメイラード反応（アミノカルボキシル反応）によって生成される、数十種類におよぶ生成物の総称であり、種々の老化、加齢性疾患に関与する物質とされている。ＡＧＥｓは、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、慢性腎不全、悪性腫瘍、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪肝炎）、高血圧症、歯周病、日光性弾性線維症（ｓｏｌａｒ  ｅｌａｓｔｏｓｉｓ）、骨強度低下、加齢性筋肉減弱現象（サルコペニア）、認知症等の疾患に関連し、また糖尿病の血管系合併症の原因であり、活性酸素による細胞障害を加速して機能を変化させる。
【００１０】
特に糖尿病合併症について述べると、糖尿病性細小血管症（腎症、神経症、網膜症）では、血流障害、内皮細胞障害、血管透過性亢進、成長因子・サイトカイン増加、血管新生といった各症状に関連する。また、糖尿病性大血管症（脳卒中、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症、収縮期高血圧）では、リポ蛋白変性、内皮細胞障害、マクロファージ泡沫化、血液凝固能亢進、成長因子・サイトカイン増加、血管平滑筋の増殖といった各症状に関連する。
【００１１】
さて、黒ニンニクは、主としてメイラード反応によりニンニクから製造されるため、ＡＧＥｓを大量に含有している。そうすると、黒ニンニクの摂取はむしろカルボニルストレスを誘発し、ＡＧＥｓ関連疾患への影響が懸念されるようにも思われる。
【００１２】
しかし発明者は、外因性ＡＧＥｓに富む黒ニンニクの摂取は体内ＡＧＥｓ量を増加させることになり、逆に、恒常性を維持するために生体内ではＡＧＥｓの産生機構を抑制させる可能性があることに想到した。それは、ＡＧＥｓ関連疾患は外因性のＡＧＥｓではなく内因性のＡＧＥｓにより誘発されると考えられること、および、異物を摂取すると体内のＡＤＭＥ（吸収・分布・代謝・排泄）の恒常性を維持するための機能変化（活性化または抑制）が機能すると考えられることに基づく。黒ニンニク摂取がカルボニルストレスを抑制できれば、それはＡＧＥｓ関連疾患の予防・治療にも繋がる。
【００１３】
こうして立てた仮説に基づき、本研究を行なった。その結果、黒ニンニクエキスは、優れたＡＧＥｓ生成阻害作用、ＡＧＥｓの中間体の生成阻害作用、およびＡＧＥｓのＲＡＧＥ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥｓ、ＡＧＥｓ受容体）への接着阻害作用を有することを明らかにすることができた。かかるＡＧＥｓの産生阻害作用等を黒ニンニクが有するという知見は画期的なものであった。さらなる研究の末、黒ニンニク含有成分の分画・精製の結果、複数の化合物の構造決定に至り、このうちＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎにおいてＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性を確認する等の成果も得られ、これらを基に本願発明は完成された。すなわち、上記課題を解決するための手段として本願で特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は、以下の通りである。
【００１４】
〔１〕  ＡＧＥｓ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ、終末糖化産物）もしくはその中間体の生成を阻害する作用、またはＡＧＥｓのＲＡＧＥ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥｓ、ＡＧＥｓ受容体）への接着を阻害する作用（以下、まとめて「ＡＧＥｓ等阻害性」という。）の少なくともいずれかを有することを特徴とする、ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
〔２〕  前記ＡＧＥｓ等阻害性の少なくとも一つが、ＡＧＥｓ産生阻害作用に係ることを特徴とする、〔１〕に記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
〔３〕  前記ＡＧＥｓ等阻害性の少なくとも一つが、３−ＤＧ（３−デオキシグルコソン）産生阻害作用に係ることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
〔４〕  前記ＡＧＥｓ等阻害性の少なくとも一つが、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ接着阻害作用に係ることを特徴とする、〔１〕ないし〔３〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
〔５〕  飲食品であることを特徴とする、〔１〕ないし〔４〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【００１５】
〔６〕  固体状または液体状のエキス（抽出物）であることを特徴とする、〔１〕ないし〔５〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
〔７〕  前記ネギ属植物は下記＜Ａ＞のいずれかであることを特徴とする、〔１〕ないし〔６〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
＜Ａ＞タマネギ、エシャロット、ニンニク、ラッキョウ、ツリーオニオン、アサツキ、ネギ（ナガネギ、青ネギ）、ワケギ、チャイブ、ニラ、ヤグラネギ、白ネギ、リーキ、ノビル、ギョウジャニンニク
〔８〕  前記ネギ属植物は発酵処理またはメイラード反応処理の少なくともいずれかの処理済みネギ属植物であることを特徴とする、〔１〕ないし〔７〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
〔９〕  前記ネギ属植物は発酵処理またはメイラード反応処理の少なくともいずれかの処理済みニンニクであり、「黒」、「琥珀」、「発酵」または「熟成」の少なくともいずれかの語を「ニンニク」の語に付した表示が付されていることを特徴とする、〔１〕ないし〔７〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
〔１０〕  固形分として原料ネギ属植物以外のものが含まれていないことを特徴とする、〔１〕ないし〔９〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【００１６】
〔１１〕  有効成分としてＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎが含有されていることを特徴とする、〔１〕ないし〔１０〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
〔１２〕  有効成分として５−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｒｆｕｒａｌ（５−ＨＭＦ）が含有されていることを特徴とする、〔１〕ないし〔１１〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
〔１３〕  ＡＧＥｓ生成阻害用であることを特徴とする、〔１〕ないし〔１２〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
〔１４〕  ＡＧＥｓの中間体の生成阻害用であることを特徴とする、〔１〕ないし〔１３〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
〔１５〕  ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害用であることを特徴とする、〔１〕ないし〔１４〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
【００１７】
〔１６〕  飲食品用組成物であることを特徴とする、〔１〕ないし〔１５〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
〔１７〕  〔１〕ないし〔１６〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物、または請求項１１ないし１３のいずれかに記載の方法により得られるＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物であって、下記＜Ｄ１＞〜＜Ｄ４＞の少なくともいずれかの旨の表示が付されていることを特徴とする、ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物。
＜Ｄ１＞  ＡＧＥｓ生成阻害用である旨
＜Ｄ２＞  ＡＧＥｓの中間体の生成阻害用である旨
＜Ｄ３＞  ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害用である旨
＜Ｄ４＞  固形分として原料とするネギ属植物以外のものが含まれていない旨
〔１８〕  〔１〕ないし〔１７〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物を製造する方法であって、原料ネギ属植物を発酵処理またはメイラード反応処理の少なくともいずれかの処理をし、その後濃縮処理を行なうことを特徴とする、ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物製造方法。
〔１９〕  前記濃縮処理後、乾燥処理を行なうことを特徴とする、〔１８〕に記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物製造方法。
〔２０〕  前記乾燥処理は任意の乾燥方法（ただし、スプレードライを除く）により行なうことを特徴とする、〔１９〕に記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物製造方法。
〔２１〕  〔１〕ないし〔１７〕のいずれかに記載のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物、または〔１８〕ないし〔２０〕のいずれかに記載の方法により得られるＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物を用いた、飲食品。
〔２２〕  〔２１〕に記載の飲食品であって、下記＜Ｄ１＞〜＜Ｄ４＞の少なくともいずれかの内容の表示が付されていることを特徴とする、飲食品。
＜Ｄ１＞  ＡＧＥｓ生成阻害用である旨
＜Ｄ２＞  ＡＧＥｓの中間体の生成阻害用である旨
＜Ｄ３＞  ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害用である旨
＜Ｄ４＞  固形分として原料とするネギ属植物以外のものが含まれていない旨
〔２３〕  下記＜Ｎ１＞〜＜Ｎ３＞の少なくともいずれかに用いられることを特徴とする、ＡＧＥｓ阻害用Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎ。
＜Ｎ１＞  ＡＧＥｓ生成阻害用
＜Ｎ２＞  ＡＧＥｓの中間体の生成阻害用
＜Ｎ３＞  ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害用
〔２４〕  ネギ属植物由来であることを特徴とする、〔２３〕に記載のＡＧＥｓ阻害用Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎ。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物、その製造方法、飲食品等は上述のように構成されるため、これらによれば、ＡＧＥｓ生成阻害作用、ＡＧＥｓの中間体の生成阻害作用、またはＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害作用の少なくともいずれかを備えた高機能の黒ニンニクおよびその加工品、飲食品等を提供することができる。また本発明によれば、黒ニンニクおよびその加工品、飲食品等において、ＡＧＥｓ生成阻害用、ＡＧＥｓの中間体の生成阻害用、またはＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害用といった新たな用途を提供することができる。
【００１９】
本発明により特に、黒ニンニクがカルボニルストレスを抑制できること、それによりＡＧＥｓ関連疾患の予防・治療に効果が期待できることが確認された。したがって本発明は、ＡＧＥｓ関連疾患の効果的な予防・治療を実現できるとともに、黒ニンニクの付加価値向上、普及拡大に資することができる。また以上の効果は、広くニンニクなどのネギ属植物を原料とする組成物等に敷衍できると考えられ、ネギ属植物の付加価値向上、普及拡大に資することも期待される。さらに、黒ニンニク含有成分の構造決定を通して、ＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎにおけるＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性を初めて確認できたことは、かかる黒ニンニク等の付加価値や可能性のさらなる拡大、および普及拡大に大きな効果を及ぼすとともに、ＡＧＥｓ阻害というＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎの新たな用途を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物の基本構成を示す概念図である。
【図２】３−ＤＧを中間体とするＡＧＥｓ産生メカニズムを示す説明図である。
【図３】本発明のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物製造方法の基本構成を示すフロー図である。
【図４】本発明のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物製造方法の別の構成を示すフロー図である。  以下は実施例に係る図である。
【図５】グルコースおよび牛血清アルブミンにおけるメイラード反応において産生するＡＧＥｓに対する黒ニンニクエキスの阻害作用検討結果を示すグラフである。
【図６】ＡＧＥｓ産生経路における中間体である３−ＤＧに対する黒ニンニクエキスの阻害作用検討結果を示すグラフである。
【図７】黒ニンニクエキスのＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性に対する阻害作用検討結果を示すグラフである。
【図８】分液ロートによる分画操作後の黒ニンニクエキス分画図である。
【図９】黒ニンニクエキスのエーテル層における分画・精製図である。
【図１０】黒ニンニクエキスの酢酸エチル層における分画・精製図である。
【図１１】黒ニンニクエキスのブタノール層および水層における分画・精製図である。
【図１２】同定された５−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｒｆｕｒａｌの構造式である。
【図１３】同定された５−ＨＭＦＡ（５−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２−ｆｕｒａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の構造式である。
【図１４】同定されたＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎ（６，７−Ｄｉｈｙｄｏｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−１（３Ｈ）−ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｏｎｅ）の構造式である。
【図１５】５−ＨＭＦに関して１Ｈ−ＮＭＲから得られたスペクトルを示すグラフである。
【図１６】５−ＨＭＦＡに関して１Ｈ−ＮＭＲから得られたスペクトルを示すグラフである。
【図１７】Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎに関して１３Ｃ−ＮＭＲから得られたスペクトルを示すグラフである。
【図１８】Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎに関してＥＩ−ＭＳによる解析結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎに関して１Ｈ−ＮＭＲから得られたスペクトルを示すグラフである。
【図２０】Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎに関してＮＯＥ−１Ｈ−ＮＭＲから得られたスペクトルを示すグラフである
【図２１】ＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎのＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性に対する阻害作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、図面により本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物の基本構成を示す概念図である。図示するように本発明ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物１０は、ＡＧＥｓの生成（産生）を阻害する作用Ｆ１、ＡＧＥｓの中間体の生成（産生）を阻害する作用Ｆ２、またはＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着を阻害する作用Ｆ３、といったＡＧＥｓ等阻害性のうち、少なくともいずれかを有することを、主たる構成とする。備えるＡＧＥｓ等阻害性は、ＡＧＥｓ産生阻害作用Ｆ１、ＡＧＥｓ中間体産生阻害作用Ｆ２、またはＡＧＥ−ＲＡＧＥ接着阻害作用Ｆ３のいずれであっても、またこれらの二つであっても、また全てであっても、本発明に該当する。
【００２２】
本発明ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物１０において、ＡＧＥｓ中間体産生阻害作用Ｆ２は、３−ＤＧ（３−デオキシグルコソン）産生阻害作用とすることができる。なお、図２に、３−ＤＧを中間体とするＡＧＥｓ産生メカニズムを示す。本発明ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物１０は上述のように構成されるため、これを摂取することにより、ＡＧＥｓ産生阻害作用Ｆ１、ＡＧＥｓ中間体産生阻害作用Ｆ２、またはＡＧＥ−ＲＡＧＥ接着阻害作用Ｆ３というＡＧＥｓ等阻害性による作用の少なくともいずれかが、あるいは二つが、または全てが、生体内でなされる。かかる作用により、ＡＧＥｓ産生が阻害されたり、またはＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着が阻害され、生体内でのカルボニルストレスが抑制され、それによりＡＧＥｓ関連疾患の予防・治療の効果が得られる。
【００２３】
本ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物１０の形態は、飲食品、または固体状もしくは液体状のエキス（抽出物）であるものとすることができる。エキスは食品であるものを含む。ニンニクを原料とする場合、飲食品としては、黒ニンニク（これに、琥珀ニンニク等が含まれることは、背景技術記載の通りである）、飲料を含む黒ニンニクの二次加工品が広く含まれる。
【００２４】
また、本発明に係るネギ属植物としては、下記＜Ａ＞に列挙したものがいずれも含まれる。後述する実施例はニンニクについての例だが、ネギ属植物全般に広く該当すると考えられるからである。
＜Ａ＞  タマネギ、エシャロット、ニンニク、ラッキョウ、ツリーオニオン、アサツキ、ネギ（ナガネギ、青ネギ）、ワケギ、チャイブ、ニラ、ヤグラネギ、白ネギ、リーキ、ノビル、ギョウジャニンニク、その他のネギ属植物
【００２５】
また、本発明に係る原料ネギ属植物としては、発酵処理またはメイラード反応処理の少なくともいずれかの処理済みのものを用いることとする。ニンニクの場合、黒ニンニクがこれに該当する。上記各処理の少なくともいずれかがなされたネギ属植物を原料とすることにより、その中には外因性のＡＧＥｓが多く含有されることになり、したがって本発明の効果を十分に得られるからである。
【００２６】
本発明の、エキス、飲食品またはその他の製品形態をとるＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物には、発酵処理またはメイラード反応処理の少なくともいずれかの処理済みニンニク（すなわち、黒ニンニク）であって、「黒」、「琥珀」、「発酵」または「熟成」の少なくともいずれかの語を「ニンニク」の語に付した表示が付されているものも該当する。また本ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物は、固形分として原料とするネギ属植物以外のものが含まれていない特徴を備えた構成とすることもできる。
【００２７】
図３は、本発明のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物製造方法の基本構成を示すフロー図である。図示するように本方法は、以上述べたＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物３１０を製造する方法であって、原料ネギ属植物３１を発酵処理過程Ｐ１またはメイラード反応処理過程Ｐ２の少なくともいずれかの処理過程に供し、その後濃縮処理過程Ｐ３に供することを、主たる構成とする。
【００２８】
かかる構成により本製法では、原料ネギ属植物３１に発酵処理過程Ｐ１における発酵処理、またはメイラード反応処理過程Ｐ２におけるメイラード反応処理の少なくともいずれかの処理がなされ、その後濃縮処理過程Ｐ３に供されることによって濃縮され、最終的にＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物３１０が製造される。
【００２９】
図４は、本発明のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物製造方法の別の構成を示すフロー図である。図示するように本発明製造方法は、図３に示した構成に加え、濃縮処理過程Ｐ３の後に乾燥処理過程Ｐ４を設けたフローとすることができる。かかるフローによれば、原料ネギ属植物４１は濃縮処理過程Ｐ３までの各過程による処理を経た後、乾燥処理過程Ｐ４にて乾燥処理され、最終的にＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物４１０が製造される。
【００３０】
乾燥処理過程Ｐ４における乾燥処理としては、温風乾燥、熱風乾燥、フリーズドライ（凍結乾燥処理）など任意の乾燥方法を用いることができるが、スプレードライ（噴霧乾燥処理）は除外するものとすることができる。スプレードライではシクロデキストリン等のホスト分子を用いてゲスト分子であるＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物を包摂する必要があり、その分純度が低くなってしまう。そこで、この乾燥法を用いないことで、純度の高い、あるいは固形分として原料ネギ属植物以外を含まない組成物４１０を得ることができる。
【００３１】
以上説明した通り、本発明によれば、
・ＡＧＥｓ生成阻害用ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物
・ＡＧＥｓの中間体の生成阻害用ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物
・ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害用ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物
の各飲食品用途発明に係る組成物を得ることができる。もちろん、これら各用途のうちの二つの用途、または全ての用途を持つＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物であってもよい。また、これらの組成物を用いてなる飲食品もまた、本発明の範囲内である。
【００３２】
さらに、以上説明したＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物（上記製造方法によるものを含む）や、それを用いた飲食品であって、下記＜Ｄ１＞〜＜Ｄ４＞のうち、少なくともいずれかの旨の表示が付されているものも、本発明の範囲内である。
＜Ｄ１＞  ＡＧＥｓ生成阻害用である旨
＜Ｄ２＞  ＡＧＥｓの中間体の生成阻害用である旨
＜Ｄ３＞  ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害用である旨
＜Ｄ４＞  固形分として原料とするネギ属植物以外のものが含まれていない旨
【００３３】
なお、以上説明した全てのＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物発明、ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物製造方法、および飲食品発明において、ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物中の有効成分としてＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎ、または５−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｒｆｕｒａｌ（５−ＨＭＦ）の一方、または双方が含有されているものも、本発明の範囲内である。また、
＜Ｎ１＞  ＡＧＥｓ生成阻害用
＜Ｎ２＞  ＡＧＥｓの中間体の生成阻害用
＜Ｎ３＞  ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着阻害用
の少なくともいずれかに用いるためのＡＧＥｓ阻害用Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎも本発明の範囲内であり、このＡＧＥｓ阻害用Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎは、黒ニンニク等のネギ属植物由来のものとすることができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明がかかる実施例に限定されるものではない。なお、本発明完成に至る研究過程の一部を説明することによって、実施例に替える。
研究テーマ：黒ニンニクに含まれるＲＡＧＥ阻害活性成分の検索
第１章  黒ニンニクエキスのＡＧＥｓ産生阻害活性の検討
第１節  黒ニンニクエキスのＡＧＥｓ産生阻害活性の検討
（１）  黒ニンニクエキスの抽出と結果
黒ニンニク２００ｇにエタノール５００ｍＬを加え、黒ニンニクが浸る状態で２４時間冷浸を行った後、ろ過および濃縮した。この操作を３回繰り返した後、ろ過、濃縮し乾燥させたものを黒ニンニクエキスとした。この時黒ニンニクエキスは６２．４６ｇ得られ、収率は６２．４６ｇ／２００ｇ×１００＝３１．２％であった。
（２）  実験方法
Ｄ−グルコース（Ｇｌｕ、和光純薬株式会社）および牛血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，ＬＴＤ．）を各々１０％、１％となるように１ｘＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水  ｐＨ７．０）に溶解したものをＢＳＡ−Ｇｌｕ溶液とした。また、１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）含有１ｘＰＢＳにて４８３μｇ／μＬ、４８．３μｇ／μＬ、４．８３μｇ／μＬ、０．４８３μｇ／μＬに調製した黒ニンニクエキスを試料とした。無菌操作下において、ＢＳＡ−Ｇｌｕ溶液９００μＬとサンプル溶液１００μＬを混合し、６０℃、湿度１００％にて４週間インキュベーションした。
【００３５】
産生されたＡＧＥｓ量は蛍光強度法（励起波長：３７５ｎｍ、吸収波長：４４０ｎｍ）にて、１０倍希釈した混合溶液を１週間ごとに測定し、下記の計算式により阻害率を算出した。
阻害率（％）＝［１−（Ｆsample−Ｆsample Blank）／（Ｆcontrol−Ｆnormal）］ｘ１００
Ｆcontrol：ＰＢＳ
Ｆsample：試料溶液を加えたｇｌｕｃｏｓｅ−ＢＳＡ溶液
Ｆsample Blank：試料溶液（インキュベーション無し）
Ｆnormal：Ｇｌｕｃｏｓｅ−ＢＳＡ溶液（インキュベーション無し）
【００３６】
（３）結果・考察
グルコースおよび牛血清アルブミンにおけるメイラード反応において産生するＡＧＥｓに対する黒ニンニクエキスの阻害作用について検討した結果を図５に示す。これは、黒ニンニクエキスのＡＧＥｓ産生阻害活性の阻害率推移を吸光度により示したグラフである。図示するように、陽性対照薬として用いた３００μＭケルセチンの抑制作用は、反応開始時から添加していた場合、１週間後では４．２％、２週間後では１３．９％、３週間後では１２．４％、４週間後では１３．４％の阻害作用を認めた。一方、かかる対照群のＡＧＥｓ産生量に比較して、黒ニンニクエキス４８３μｇ／μＬを反応開始時から添加していた場合には、反応開始の１週間後で８３％、２週間後からは１００％の極めて強いＡＧＥｓ産生阻害作用が認められた。
【００３７】
この阻害作用は用量依存的であり、４８．３μｇ／μＬでは反応開始１週間後で３７％、２週間後からは５０％程度の阻害作用を認めたが、４．８３μｇ／μＬでは反応開始１週間後では抑制は認められなかった。そして反応開始２週間後で１６％の阻害作用が認められたが、反応開始３週間後からは阻害作用はほとんど認められなかった。また、０．４８３μｇ／μＬではいずれの測定時間においても阻害は認められなかった。以上の通り、黒ニンニクエキスは用量依存的にＡＧＥｓ産生に対する強い阻害活性があることが認められた。
【００３８】
第２節  黒ニンニクエキスの３−デオキシグルコソン産生阻害活性の検討＿ＨＰＬＣによる中間生成物３−デオキシグルコソンの定量
（１）  試料調製方法
上記第１節と同様の反応条件において、各濃度に調整した黒ニンニクエキス試料１００μおよびＰＢＳ９００μＬに内標準物質として０．００５％  ２，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｎｅ（ジアセチル）５μＬを加えた後、３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）を誘導体化するために、０．１％ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）１０μＬを加え、４℃で１４時間反応させた。これに酢酸エチル４ｍＬを加えて、１５分間振とう、静置させて反応生成物を抽出、上清３．５ｍＬを蒸発乾固した後、メタノール１５０μＬにて再溶解したものをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）サンプルとした。
【００３９】
（２）装置および分析条件
検出器；  ＳＰＤ−２０ＡＤ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）
送液ポンプ；  ＬＣ−２０ＡＤ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）
脱気ユニット；  ＤＧＵ−２０Ａ３Ｒ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）
カラム；  ＣＯＳＵＭＯＳＩＬ  ５ＰＥ−ＭＳ  ４．６×２５０ｍｍ（Ｎａｋａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）
移動相；  アセトニトリル：メタノール：５０ｍＭリン酸水溶液＝２０：２０：６０  
流速；  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長；  ２６８ｎｍ
【００４０】
（３）結果・考察
グルコースおよび牛血清アルブミンにおけるメイラード反応において産生するＡＧＥｓ産生経路における中間体である３−ＤＧに対する黒ニンニクエキスの阻害作用について検討した結果を図６に示す。これは、３−ＤＧ産生阻害活性を、３−ＤＧ産生量の推移により示したグラフである。図示するように、黒ニンニクエキス無添加の対照群では反応開始１週間後に１２７μＭの３−ＤＧの生成が認めらたのに対し、黒ニンニクエキス４８３μｇ／μＬを反応開始時から添加していた場合には、反応開始の１週間後で０．０８μＭ、２週間後からは１．０μＭ以下の極めて強いＡＧＥｓ産生阻害作用が認められた。
【００４１】
この阻害作用は用量依存的であり、４８．３μｇ／μＬでは反応開始１週間後で２６．５μＭ、２週間後からは１６μＭ程度の阻害作用を認めた。また、４．８３μｇ／μＬおよび０．４８３μｇ／μＬでは反応開始１週間後で約８０μＭ程度の産生量であった。しかし、反応開始４週間後には対照群での３−ＤＧ産生量は低下してきたため、用量依存的な阻害は認められなかった。これは、３−ＤＧは反応開始１週間後をピークとし産生されるが、その後、反応中間体として消費されてＡＧＥｓに変換されたためと考えられる。本結果は、第１節で得られた阻害率の結果とも相関性が認められたため、黒ニンニクエキスには３−ＤＧの産生を抑制することでＡＧＥｓの生成を阻害する作用があると結論付けられた。
【００４２】
第３節  黒ニンニクエキスのＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性＿ＥＬＩＳＡ法によるＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性の検討
ＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性を測定するにあたり、コスモバイオ社（ＣＯＳＭＯ  ＢＩＯ  Ｃｏ．，ＬＴＤ．）製の「Ａｇｉｎｇ／Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  Ｓｅｒｉｅｓ，ＲＡＧＥ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ＡＧＥｓ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ」を使用した。
【００４３】
（１）  実験方法
（ｉ）  試料の調製
付属の検体希釈液を用いて試料を溶解し、０．４５μｍメンブランフィルター（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ．Ｉｎｃ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてろ過した後、検体希釈液で黒ニンニクエキスは４８３μｇ／μＬ、４８．３μｇ／μＬ、４．８３μｇ／μＬ、０．４８３μｇ／μＬに、陽性対照薬であるアミノグアニジンは２０ｍＭに調製した。
【００４４】
（ｉｉ）  洗浄液の調製
付属の洗浄液を超純水にて１０倍希釈して使用した。
（ｉｉｉ）  発色液の調製
発色用タブレット１個を発色液調製用緩衝液５ｍＬに入れ、完全に溶解させた。なお、この操作は発色液添加直前に調製を行った。
【００４５】
（ｉｖ）  ＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓの測定
１）．２０ｍＭアミノグアニジン溶液、および試験試料液（ｃｏｎｔｒｏｌは検体希釈液）を５０μＬ／ｗｅｌｌ用いた。
２）．１００ｍＭグリセルアルデヒド（ＧＡ）溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、ＢＳＡ固層化プレートにシールし密封した。
３）．湿潤状態下の３７℃インキュベーターにて２４時間静置し固相化ＢＳＡ  を糖化させた。
４）．反応溶液を捨て、洗浄液２００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。
５）．ブロッキング液１００μＬ／ｗｅｌｌを添加して室温にて１時間静置した。
６）．ブロッキング液を捨て、洗浄液２００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。
【００４６】
７）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｆ  ＡＧＥｓ  Ｆｃ（ＲＡＧＥ−ＦＣ）溶液５０μＬ／ｗｅｌｌを添加して室温にて１時間静置した。
８）．ＲＡＧＥ−ＦＣ溶液を捨て、洗浄液２００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。
９）．ＡＬＰ標識プロテインＡ／Ｇを５０μＬ／ｗｅｌｌを添加して室温にて１時間静置した。
１０）．ＡＬＰ標識プロテインＡ／Ｇを捨て、洗浄液２００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。
１１）．発色液を１００μＬ／ｗｅｌｌを添加して３０分間室温にて静置後、波長４０５ｎｍにて吸光度を測定（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍｉｎｉ  ＮＪ−２３００，  ＢＩＯ  ＴＥＫ，ＬＴＤ．）した。
（ｖ）  統計処理
有意差の検定は、Ｓｉｇｍａ  Ｓｔａｔ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒ．２．０３（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて行った。測定値は平均値±標準誤差で示し、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ＡＮＯＶＡ  Ｒａｎｋ  Ｔｅｓｔ（ｐ＜０．０５）により有意差を検討した。
【００４７】
（２）結果・考察
黒ニンニクエキスのＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性に対する阻害作用について検討した結果を、図７に示す。これは、ＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ産生量を吸光度により示したグラフである（＊Ｐ＝０．００２）。図示するように、対照群でのＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ産生量は０．５５４であったが、陽性対照薬のアミノグアニジンではその産生量は０．４４２であり、約２０％の阻害を認めた。一方、黒ニンニクエキス４８３μｇ／μＬでは、その産生量は０．３３５であり、約４０％の強い阻害が認められ、陽性対照薬のアミノグアニジンに比較して２倍もの強い阻害活性が認められた。
【００４８】
この阻害作用は用量依存的であり、４８．３μｇ／μＬではＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓの産生量は０．５０９５であって阻害は約１０％と減弱し、４．８３μｇ／μＬでも同様の結果であった。以上の結果より、黒ニンニクエキスはＡＧＥｓとＲＡＧＥの結合を阻害することを介して、もしくはグリセルアルデヒドがタンパク質中のアミノ酸残基との結合を阻害することを介して、ＡＧＥｓ産生を抑制し、結合を抑制するという機序が考えられた。
【００４９】
第２章  黒ニンニクエキスの分画と精製
（１）  実験方法
第１章第１節で述べた黒ニンニクエキスの調製方法にて得られた黒ニンニクエキス５９．２３ｇを精製水２００ｍＬに溶解した。この溶液を分液ロートに入れ、ジエチルエーテル２００ｍＬを加えた後、１５分間振とうし、得られたエーテル溶液を黒ニンニクエーテル層分画（収率：３．９９％）とした。この操作を順番に酢酸エチル、ブタノールでも繰り返し行い、各々得られた分画を黒ニンニク酢酸エチル層分画（収率：１．９０％）、黒ニンニクブタノール層分画（収率：２．３６％）とし、最終的に残った水溶液を黒ニンニク水層分画（収率：９１．７３％）とした。図８に分液ロートによる分画操作後の黒ニンニクエキス分画図を示す。得られた各サンプルは、濃縮し乾燥させた。また、４層に分画したものを各移動相で順次ＨＰＬＣを用いて分離・精製（パックドカラム５Ｃ１８−ＡＲ−II：コスモシール株式会社，Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＧＰ２５０−１０：  関東化学株式会社，Ｃ３０−ＵＧ：野村化学株式会社，ＴＯＳＯＨ−ＯＤＳ１２０−Ｔ：東ソー株式会社）した。
【００５０】
（２）結果・考察
図９、１０、１１には、それぞれエーテル層、酢酸エチル層、ブタノール層および水層における、各分画・精製図を示す。これらに示す通り、ＡＧＥｓ産生阻害活性成分の探索を目的として、黒ニンニク原末から１９３のフラクションを得た。
【００５１】
第３章  黒ニンニク含有成分の同定
（１）実験方法
各種分析方法、すなわち、１Ｈ−ＮＭＲ（プロトン各磁気共鳴）、１３Ｃ−ＮＭＲ（炭素１３各磁気共鳴）、ＥＩ−ＭＳ（電子イオン化質量分析）、ＮＯＥ（オーバーハウザー効果差スペクトル）を用いて、各種サンプルの重さを測定後調製し、計測した（重メタノール、重クロロホルム等を使用した）。
【００５２】
（２）結果・考察
今回の分画により得た化合物群について、ＡＧＥｓ産生阻害活性によりスクリーニングを行い、活性が認められた画分を単離・精製し、構造決定を行った。このうち、同定できた化合物は下記の３つであった。
５−ＨＭＦ（５−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｒｆｕｒａｌ）  （図１２）
５−ＨＭＦＡ（５−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ−ｌ−２−ｆｕｒａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）  （図１３）
Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎ（６，７−Ｄｉｈｙｄｏｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−１（３Ｈ）−ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｏｎｅ）  （図１４）
以下、順に構造決定方法について考察した。
【００５３】
初めに、１Ｈ−ＮＭＲデータを参考に比較することで、化学構造の基本構造について推定した。図１５は、５−ＨＭＦに関して１Ｈ−ＮＭＲから得られたスペクトルを示すグラフである（２７０．０５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）。図示するように、９．５２ｐｐｍからアルデヒド基を同定、δ７．３７３から７．３６０ｐｐｍ、およびδ６．５７５から６．５６１ｐｐｍにかけて見られる１Ｈ分のｓｉｎｇｌｅｔシグナルが２つ観測されていることからフラン環を同定、４．５９８ｐｐｍからメチレン基を同定し、５−ＨＭＦに代表的な構造が同定された。これらの結果とマススペクトルによる分子量等の結果とを合わせて、下記２文献における文献値を比較し、５−ＨＭＦであると決定した。
文献：
・ Liang T., Wei F., Lu Y., Kodani Y., Nakada M., Miyakawa T., Tanokura M., J. Agric. Food. Chem., 63, 683-691 (2015).
・Matsui T., Kudo A., Tokuda S., Matsumoto K., Hosoyama H., J. Agric. Food. Chem. 58, 10876-10879 (2010).
【００５４】
次に、図１６は、５−ＨＭＦＡ（５−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２−ｆｕｒａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）に関して１Ｈ−ＮＭＲから得られたスペクトルを示すグラフである（３９９．６５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）。図示する構造と下記文献の文献値を比較し、これが５−ＨＭＦに類似の構造であり、図１５に示したグラフと比較して９．５２ｐｐｍのアルデヒド基特有のピークがなくなったことから、５−ＨＭＦが酸化されたことにより生成した５−ＨＭＦＡ（５−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２−ｆｕｒａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）であると決定した。
文献：
・Murai N., Yonaga M., Tanaka K., Org. Lett., 14, 1278-1281 (2014).
【００５５】
最後に、図１７は、Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎ（６，７−Ｄｉｈｙｄｏｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−１（３Ｈ）−ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｏｎｅ）に関して１３Ｃ−ＮＭＲから得られたスペクトルを示すグラフである（６７．８０ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）。図示するように、ＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎについてはＭＳスペクトルを用いて解析を行なった結果、ピークがｍ／ｚ１６６に観測された。このことから、推定した化合物の分子量は１６６であり，ＭＳスペクトルの結果と合致した。
【００５６】
また、図１８は、Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎに関してＥＩ−ＭＳによる解析結果を示すグラフである（Ｌｏｗ，ＭｅＯＨ）。図示するように、炭素数は８個であり、１７２．９ｐｐｍのピークからエステル基、また、７０．７ｐｐｍのピークからメチレン基の構造があることがわかり、フタリド骨格を有する化合物であることが推定された。
【００５７】
次に、図１９は、Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎに関して１Ｈ−ＮＭＲから得られたスペクトルを示すグラフである（２７０．０５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）。図示するように、芳香族領域に認められるδ７．１４２から７．１１３、δ６．８３７から６．８０８、の２Ｈ分のｄｏｕｂｌｅｔシグナルが８Ｈｚでカップリングしたことから、これらがオルト位の関係にあることがわかった。
【００５８】
最後に、図２０は、Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎに関してＮＯＥ−１Ｈ−ＮＭＲから得られたスペクトルを示すグラフである（２７０．０５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）。図示するように、５．２ｐｐｍ付近に照射して測定したところ、６位にプロトンが付くことがわかった。以上より、下記各文献の文献値と比較して、Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎ（６  ，７−Ｄｉｈｙｄｏｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−１（３Ｈ）−  ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｏｎｅ）であると決定した。
文献：
・Andrew M., Norma T., Mark F., Scott C., David M., J. Am. Chem. Soc., 119, 6084-6094 (1997).
・Thomas P., Olof T . Acta. Chem. Scand., B30, 397-402 (1976)
【００５９】
第４章  黒ニンニク含有成分のＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性の検討
（１）実験方法
同定された黒ニンニク含有成分について、第１章第３節（ＥＬＩＳＡ法によるＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性の検討）における「（ｉｖ）ＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓの測定」に示した方法の通りに検討した。
【００６０】
（２）結果・考察
ＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎのＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性に対する阻害作用について検討した。図２１は、ＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎのＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性に対する阻害作用を示すグラフである（＊Ｐ＝０．０４３）。同一濃度にて陽性対照薬の１０ｍＭアミノグアニジンとＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎとを比較した。その結果、図示するように対照群での吸光度は０．３９であった。それに対して陽性対照薬１０ｍＭアミノグアニジンでは０．３１となり、対照群よりも強い阻害作用、対照群と比較して２０％の阻害作用が確認された。
【００６１】
一方、１０ｍＭ  Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎでは０．２７であり、陽性対照薬の１０ｍＭアミノグアニジンよりも強い阻害作用、対照群と比較して３０％の阻害作用が認められた。すなわちＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎの阻害作用は、１０ｍＭアミノグアニジンの１．５倍であった。以上より、黒ニンニクエキスがＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性を示す活性本体のうちの一つが、Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎであることが明らかとなった。
【００６２】
ＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎのＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性を示した機序について考察する。本化合物は、フタリド骨格により非常に安定な構造であることに加え、分子内に窒素原子を含んでいないことから、グリセルアルデヒドとの直接的な求核反応等によりクロスリンカー的役割を果たし、それによって活性を示す、という機序は考えにくい。しかし、カテコール骨格を部分構造に含んでいることから、一般的にフェノール類よりも酵素やたんぱく質との吸着、結合性が強い傾向にある。このため、ＲＡＧＥのリガンド結合部位やサブユニット中の疎水性ポケット等と相互作用することで、受容体のコンフォメーション変化を起こし、そのことがＡＧＥｓとの結合を阻害する機序となっている可能性がある。また、タンパク質中のアミノ酸残基とＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎの構造に含まれるヒドロキシ基や酸素原子との相互作用により、グリセルアルデヒドとの結合が円滑に進行しない環境を作り出すことで、反応を抑制するという可能性も考えられる。
【００６３】
第５章  総括
蛍光強度法によるＡＧＥｓ産生阻害活性、および３−ＤＧの定量の結果から、黒ニンニクエキスは、３−ＤＧ産生を用量依存的に産生阻害することでＡＧＥｓ産生を抑制すると考えられた。加えて、ＥＬＩＳＡ法によるＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性の結果より、黒ニンニクエキスは用量依存的な阻害作用を示し、陽性対象薬のアミノグアニジンよりも強い阻害作用を示したことから、ＲＡＧＥとの結合を阻害できた、もしくはＡＧＥｓとグリセルアルデヒドのアミノ酸残基との結合を阻害した可能性もある。
【００６４】
また、黒ニンニク含有成分の分画・精製を行い、構造決定に至った３つの化合物のうち、ＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎにおいてＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性が認められた。このことから、本化合物は黒ニンニクエキスに含まれるＲＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性を示す活性本体の１つであることが分かった。その他、５−ＨＭＦについては、ＰＩ３−Ａｃｔ系（ＰＩ３Ｋ  ／  Ａｋｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＰＩ３Ｋ  ／  Ａｋｔ  シグナル伝達系）の活性化によるｅＮＯＳ（内皮型一酸化窒素合成酵素）の産生に続くＮＯ（一酸化窒素）産生に起因する血管拡張作用も報告されている（下記文献）が、これは、黒ニンニクに期待される冷え、肩こり、疲労回復効果を示す活性物質の一つであると考えられる。
文献：
・O'Donnell G., Poeschl R., Zimhony O., Gunaratnam M., Moreira JB., Neidle S., Evangelopoulos D., Bhakta S., Malkinson JP., Boshoff HI., Lenaerts A., Gibbons S.,  J . Nat. Prod., 72, 360-365 (2009).
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明のＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物、その製造方法、飲食品、およびＡＧＥｓ阻害用Ｎｏｒｍｅｃｏｎｉｎによれば、特に、黒ニンニクがカルボニルストレスを抑制できること、それによりＡＧＥｓ関連疾患の予防・治療に効果が期待できる。したがって本発明は、ＡＧＥｓ関連疾患の効果的な予防・治療を実現できるとともに、黒ニンニクの付加価値向上、普及拡大に資することができる。また以上の効果は、広くニンニクなどのネギ属植物を原料とする組成物等に敷衍できると考えられ、ネギ属植物の付加価値向上、普及拡大に資することも期待される。さらに、黒ニンニク含有成分の一つがＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎにであることを明らかにし、そのＡＧＥ反応性ＡＧＥｓ阻害活性を初めて確認できたことにより、黒ニンニク等の付加価値等拡大のみならず、ＡＧＥｓ阻害というＮｏｒｍｅｃｏｎｉｎの新たな用途を提供するものでもある。したがって本発明は、農産加工分野、食品製造分野、健康産業分野、その他関連する全分野において、産業上利用性が高い発明である。
【符号の説明】
【００６６】
１０、３１０、４１０…ＡＧＥｓ等阻害性ネギ属植物製組成物
３１、４１…原料ネギ属植物
Ｆ１…ＡＧＥｓの生成（産生）を阻害する作用（ＡＧＥｓ産生阻害作用）
Ｆ２…ＡＧＥｓの中間体の生成（産生）を阻害する作用（ＡＧＥｓ中間体産生阻害作用）
Ｆ３…ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの接着を阻害する作用（ＡＧＥ−ＲＡＧＥ接着阻害作用）
Ｐ１…発酵処理過程
Ｐ２…メイラード反応処理過程
Ｐ３…濃縮処理過程
Ｐ４…乾燥処理過程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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