(57)【要約】【課題】試料を非染色で回折限界を上回る空間分解能で観察可能な超解像顕微鏡を提供する。【解決手段】対物レンズ１４を経て波長の異なる複数の照明光の少なくとも一部を空間的及び時間的に重畳して試料Ｓに照射する照明部１０と、複数の照明光の試料Ｓへの照射に起因して、試料Ｓから発生する信号光を検出する検出部５０と、を備える。複数の照明光は、試料Ｓに対して第１の非線形光学過程を誘導する第１照明光（ω１光、ω２光）と、第１の非線形光学過程を抑制する第２の非線形光学過程を誘導する第２照明光（ωｑ光）と、を含む。第２の非線形光学過程の非線形感受率は、第１の非線形光学過程の非線形感受率よりも大きい。【選択図】図１
2019117217.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズを経て波長の異なる複数の照明光の少なくとも一部を空間的及び時間的に重畳して試料に照射する照明部と、
前記複数の照明光の前記試料への照射に起因して、該試料から発生する信号光を検出する検出部と、を備え、
前記複数の照明光は、前記試料に対して第１の非線形光学過程を誘導する第１照明光と、前記第１の非線形光学過程を抑制する第２の非線形光学過程を誘導する第２照明光と、を含み、
前記第２の非線形光学過程の非線形感受率は、前記第１の非線形光学過程の非線形感受率よりも大きい、
超解像顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の超解像顕微鏡において、
前記第２照明光は、前記第１照明光よりも波長が短い、
超解像顕微鏡。
【請求項３】
請求項２に記載の超解像顕微鏡において、
前記第１照明光及び前記第２照明光は、前記対物レンズの集光面における強度分布が異なる、
超解像顕微鏡。
【請求項４】
請求項３に記載の超解像顕微鏡において、
前記第２照明光は、前記集光面における強度分布に極小値を有する、
超解像顕微鏡。
【請求項５】
請求項４に記載の超解像顕微鏡において、
前記第１照明光は、前記集光面における強度分布に極大値を有する、
超解像顕微鏡。
【請求項６】
請求項５に記載の超解像顕微鏡において、
前記第１の非線形光学過程及び前記第２の非線形光学過程の各々は、２次非線形光学過程、３次非線形光学過程、４次非線形光学過程、５次非線形光学過程のいずれかを含み、
前記２次非線形光学過程は、
第２高調波発生（ＳＨＧ: second harmonic generation）、
２次和周波発生（ＳＦＧ: sum frequency generation）、
差周波発生（ＤＦＧ: difference frequency generation）、
光パラメトリック過程（optical parametric process）
のいずれかであり、
前記３次非線形光学過程は、
第３高調波発生（ＴＨＧ: third harmonic generation）、
３次和周波発生（ＴＳＦＧ: third-order sum frequency generation）、
コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ: coherent anti-Stokes Raman scattering）、
誘導ラマン散乱（ＳＲＳ: stimulated Raman scattering (ＳＲＧ: stimulated Raman gain, ＳＲＬ: stimulated Raman loss)）、
光学カー効果（ＯＫＥ: optical Kerr effect）、
ラマン誘導カー効果（ＲＩＫＥ: Raman induced Kerr effect）、
誘導レイリー散乱（stimulated Rayleigh scattering）、
誘導ブリルアン散乱（ＳＢＳ: stimulated Brillouin scattering）、
誘導カー散乱（stimulated Kerr scattering）、
誘導Rayleigh-Bragg散乱（stimulated Rayleigh-Bragg scattering）、
誘導 Mie散乱（stimulated Mie scattering）、
自己位相変調（ＳＰＭ: self phase modulation）、
相互位相変調（ＸＰＭ: cross phase modulation）、
二光子吸収（two-photon absorption）
光場複屈折（optical-field induced birefringence）、
電界誘起ＳＨＧ（electric-field induced ＳＨＧ）
のいずれかであり、
前記４次非線形光学過程は、
４光波混合（ＦＷＭ: four-wave mixing）であり、
前記５次非線形光学過程は、
二光子蛍光（ＴＰＥＦ: two-photon excitation fluorescence）
ハイパーラマン散乱（hyper-Raman scattering）、
ハイパーレイリー散乱（hyper-Rayleigh scattering）、
コヒーレント・アンチストークス・ハイパーラマン散乱（coherent anti-Stokes hyper-Raman scattering）
のいずれかである、
超解像顕微鏡。
【請求項７】
請求項６に記載の超解像顕微鏡において、
前記第１照明光及び前記第２照明光はそれぞれコヒーレント光であり、
前記照明部は、前記第２照明光の位相又は電場ベクトルの空間分布を変調する空間変調素子を備える、
超解像顕微鏡。
【請求項８】
請求項７に記載の超解像顕微鏡において、
前記第１照明光の前記極大値と前記第２照明光の前記極小値とが、前記集光面において同軸で重なる、
超解像顕微鏡。
【請求項９】
請求項８に記載の超解像顕微鏡において、
前記検出部は、前記信号光として前記試料からの前方散乱光又は非線形光学過程における生成光を検出する、
超解像顕微鏡。
【請求項１０】
請求項９に記載の超解像顕微鏡において、
前記第２の非線形光学過程は、前記第１の非線形光学過程よりも低次数の非線形光学過程を含む、
超解像顕微鏡。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
前記第１照明光は、波長の異なる少なくとも２色の照明光を含む、
超解像顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超解像顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
超解像顕微鏡として、例えば、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ分子を含む試料を、回折限界を超える高い空間分解能で観察可能な蛍光顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。
【０００３】
特許文献１、２に開示の蛍光顕微鏡は、試料中の分子を安定状態、例えば基底状態から第１量子状態に励起するためのポンプ光と、分子を更に他の量子状態に遷移させるためのイレース光とを一組として、回折限界以下に収縮した蛍光スポットにより試料面を空間走査する。そして、各計測点の蛍光信号をコンピュータ上で２次元的に配列して画像処理することにより、回折限界の空間分解能を上回る解像度を有する蛍光画像を得ている。
【０００４】
その代表例として、蛍光色素分子を含む試料にポンプ光を照射して、蛍光色素分子を第１量子状態に励起する。さらに、試料にイレース光を照射して蛍光色素分子を他の量子状態に強制遷移させることで、第１量子状態の分子をクエンチする。その結果として、第１量子状態からの蛍光緩和を抑制する。対物レンズによりポンプ光と中空状のイレース光とを試料に同時に照射すれば、蛍光色素で染色された試料面に形成される蛍光スポットは、中心部を残し回折限界以下に収縮される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−１００１０２号公報
【特許文献２】特開２０１０−１５０２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述した従来の超解像顕微鏡においは、試料を蛍光色素分子で染色する必要がある。そのため、特に、生きた生物試料を観察する場合に、色素分子が生物試料の代謝現象などに影響を与えて、生物試料の本来の生命現象を捉えることができない場合がある。
【０００７】
したがって、かかる観点に鑑みてなされた本発明の目的は、試料を非染色で回折限界を上回る空間分解能で観察可能な超解像顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成する本発明に係る超解像顕微鏡は、
対物レンズを経て波長の異なる複数の照明光の少なくとも一部を空間的及び時間的に重畳して試料に照射する照明部と、
前記複数の照明光の前記試料への照射に起因して、該試料から発生する信号光を検出する検出部と、を備え、
前記複数の照明光は、前記試料に対して第１の非線形光学過程を誘導する第１照明光と、前記第１の非線形光学過程を抑制する第２の非線形光学過程を誘導する第２照明光と、を含み、
前記第２の非線形光学過程の非線形感受率は、前記第１の非線形光学過程の非線形感受率よりも大きい。
【０００９】
前記第２照明光は、前記第１照明光よりも波長が短いとよい。
【００１０】
前記第１照明光及び前記第２照明光は、前記対物レンズの集光面における強度分布が異なるとよい。
【００１１】
前記第２照明光は、前記集光面における強度分布に極小値を有するとよい。
【００１２】
前記第１照明光は、前記集光面における強度分布に極大値を有するとよい。
【００１３】
前記第１の非線形光学過程及び前記第２の非線形光学過程の各々は、２次非線形光学過程、３次非線形光学過程、４次非線形光学過程、５次非線形光学過程のいずれかを含み、
前記２次非線形光学過程は、
第２高調波発生（ＳＨＧ: second harmonic generation）、
２次和周波発生（ＳＦＧ: sum frequency generation）、
差周波発生（ＤＦＧ: difference frequency generation）、
光パラメトリック過程（optical parametric process）
のいずれかであり、
前記３次非線形光学過程は、
第３高調波発生（ＴＨＧ: third harmonic generation）、
３次和周波発生（ＴＳＦＧ: third-order sum frequency generation）、
コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ: coherent anti-Stokes Raman scattering）、
誘導ラマン散乱（ＳＲＳ: stimulated Raman scattering (ＳＲＧ: stimulated Raman gain, ＳＲＬ: stimulated Raman loss)）、
光学カー効果（ＯＫＥ: optical Kerr effect）、
ラマン誘導カー効果（ＲＩＫＥ: Raman induced Kerr effect）、
誘導レイリー散乱（stimulated Rayleigh scattering）、
誘導ブリルアン散乱（ＳＢＳ: stimulated Brillouin scattering）、
誘導カー散乱（stimulated Kerr scattering）、
誘導Rayleigh-Bragg散乱（stimulated Rayleigh-Bragg scattering）、
誘導 Mie散乱（stimulated Mie scattering）、
自己位相変調（ＳＰＭ: self phase modulation）、
相互位相変調（ＸＰＭ: cross phase modulation）、
二光子吸収（two-photon absorption）、
光場複屈折（optical-field induced birefringence）、
電界誘起ＳＨＧ（electric-field induced ＳＨＧ）
のいずれかであり、
前記４次非線形光学過程は、
４光波混合（ＦＷＭ: four-wave mixing）であり、
前記５次非線形光学過程は、
二光子蛍光（ＴＰＥＦ: two-photon excitation fluorescence）、
ハイパーラマン散乱（hyper-Raman scattering）、
ハイパーレイリー散乱（hyper-Rayleigh scattering）、
コヒーレント・アンチストークス・ハイパーラマン散乱（coherent anti-Stokes hyper-Raman scattering）
のいずれかである、
とよい。
【００１４】
前記第１照明光及び前記第２照明光はそれぞれコヒーレント光であり、
前記照明部は、前記第２照明光の位相又は電場ベクトルの空間分布を変調する空間変調素子を備えるとよい。
【００１５】
前記第１照明光の前記極大値と前記第２照明光の前記極小値とは、前記集光面において同軸で重なるとよい。
【００１６】
前記検出部は、前記信号光として前記試料からの前方散乱光又は非線形光学過程における生成光を検出するとよい。
【００１７】
前記第２の非線形光学過程は、前記第１の非線形光学過程よりも低次数の非線形光学過程を含むとよい。
【００１８】
前記第１照明光は、波長の異なる少なくとも２色の照明光を含むとよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、試料を非染色で回折限界を上回る空間分解能で観察可能な超解像顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図２】空間変調素子の第１の例を示す概略構成図である。
【図３】空間変調素子の第２の例を示す概略構成図である。
【図４】空間変調素子の第３の例を示す概略構成図である。
【図５】空間変調素子の第４の例を示す概略構成図である。
【図６】空間変調素子の第５の例を示す概略構成図である。
【図７】空間変調素子の第６の例を示す概略構成図である。
【図８】空間変調素子の第７の例を示す概略構成図である。
【図９】図１の超解像顕微鏡における励起ダイアグラムを示す図である。
【図１０】第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図１１Ａ】ライン発振のレーザ光を用いた場合のクエンチ光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。
【図１１Ｂ】スーパーコンティニュアム光源からの白色レーザ光を用いた場合のクエンチ光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００２２】
本発明の一実施の形態においては、第１の非線形光学過程と同時に第２の非線形光学過程を強制的に誘導して、第１の非線形光学過程により発生する信号光の強度を、第２の非線形光学過程により部分的に抑制する。そのため、例えば、第１の非線形光学過程を誘導する照明光（刺激光）と、第２の非線形光学過程を誘導するクエンチ光とを、同軸で試料に照射する。その際、刺激光は光軸中心に強度ピークを持つガウシアンスポットとして試料に集光させる。一方、クエンチ光は、光軸上に強度極小値を持つように整形して試料に集光させる。
【００２３】
この場合、刺激光とクウェンチ光とが重なり合った領域では、第１の非線形光学過程が抑制される。その結果、信号光を生成する領域は、光軸中心部となって回折限界よりも小さなスポットとなる。したがって、このスポットで試料を空間走査すれば、回折限界を上回る空間分解能で試料を観察することが可能となる。
【００２４】
空間分解能を向上させるための必要条件は、刺激光とクエンチ光とが重なり合った領域の信号光の発生を、いかに確実かつ効率的に抑制することにある。
【００２５】
ここで、非線形光学過程による発生するある時刻、ある地点での信号光（強さ）は、下式（１）に示す試料媒質中の巨視的分極で与えられる（例えば、日本分光学会測定法シリーズ「非線型光学計測」、小林孝嘉編、（株）学会出版センター、１９９６年１２月２０日初版、参照）。
【００２６】
2019117217.tif 000003
【００２７】
本発明の一実施の形態においては、複数の波長の照明光を試料に集光して、複数の非線形光学過程を同時に誘導し、そのうち選択した第１の非線形光学過程（信号発生過程）による応答信号を信号光とし、この信号光を他過程の第２の非線形光学過程（抑制過程）により抑制する。その際、信号発生過程よりも抑制過程を効率的に誘導できるようにするため、抑制過程の非線形感受率をｘｑ、信号発生過程の非線形感受率をｘｓとするとき、
ｘｑ＞ｘｓ            （６）
とする。
【００２８】
原子物理学の理論によれば、非線形感受率は、高次になるほど小さくなることが知られている。具体的には、２次の非線形感受率ｘ２は１０−７ｅｓｕのオーダであり、３次の非線形感受率ｘ３は１０−１４ｅｓｕのオーダである。また、５次の非線形感受率ｘ５に至っては１０−２１ｅｓｕのオーダとなる。以下、次数が増える毎に桁違いに減少する。したがって、一般的には、抑制過程には信号発生過程よりも低次の非線形光学過程を用いると効果的であると言える。
【００２９】
しかし、同じ次数であっても、関わる分子の振動準位によって非線形感受率は大きく異なる。例えば、同じ３次のＣＡＲＳ（Coherent anti-Stokes Raman scattering）過程であっても、ＣＨ基は分子の指紋領域のＣ＝Ｃ基と比較すると、１桁も大きいことが知られている。
【００３０】
この場合、抑制過程にＣＨ基が関与するＣＡＲＳ過程を用い、信号発生過程にＣ＝Ｃ基が関与するＣＡＲＳ過程を用いれば、低い強度のクエンチ光で効果的に信号光の発生を抑制することができる。一般に、ＣＡＲＳ過程の場合、高振動数のＣＨ基やＯＨ基は、低振動数の分子の指紋領域の非線形感受率が高くなるので、抑制過程として適している。
【００３１】
一般に、非線形感受率は可視光又は紫外光による電子遷移に伴う吸収端に近いほど高くなる。したがって、同じ次数の過程で応答光を抑制する場合は、高振動数の非線形光学過程を抑制過程に用いると有利ある。
【００３２】
本発明の一実施の形態では、化学組成分析で抱負な情報を提供できる分子の指紋領域のＣＡＲＳ過程を用いる。ＣＡＲＳ過程は、振動分光手法として近年最も広く使われている代表的な３次の非線形光学過程である。特に、分子の指紋領域（波数１３００〜６５０ｃｍ−１）には細かい吸収が多数みられ、そのパターンは物質に固有のものとなる。したがって、この領域の吸収を既知試料やスペクトルデータベースと照合することで、その物質が何かを同定することが可能となる。
【００３３】
具体的には、分子の指紋領域におけるＣＡＲＳ過程でのＣＡＲＳ光を信号光とし、その信号光を別のＣＡＲＳ過程の誘導により抑制する。より詳細には、これらのＣＡＲＳ過程が競合したときに、信号発生効率の高いＯＨ基を由来とするＣＡＲＳ過程を抑制過程とする。
【００３４】
ＣＡＲＳ過程では、一般に角振動数の異なる２つのレーザ光（ω１光、ω２光）が用いられる。これら２つの入射光の角振動数差ω１−ω２が、試料分子の持つ振動モードの角振動数と一致すると、多数の試料分子の振動モードが同時に励振される。
【００３５】
このようにして生じた分子振動（振動コヒーレンス）は、分子が３つ目のレーザ光（ω３光）と相互作用することで和周差光が発生し、３次の非線形分極に由来するωＣＡＲＳ光（ＣＡＲＳ光）として取り出される。ＣＡＲＳ過程では、エネルギー保存則から、ωＣＡＲＳ＝ω１−ω２＋ω３の条件を満たす。また、ＣＡＲＳ光は、位相整合条件から、ｋＣＡＲＳ＝ｋ１−ｋ２＋ｋ３の方向に発生する。ここで、ｋｘはωｘ光の波数ベクトルある。
【００３６】
ＣＡＲＳ過程では、多くの場合、ω３光としてω１光が用いられる。すなわち、ω１光とω２光との２色でＣＡＲＳ過程を誘導して、角振動数（２ω１−ω２）のＣＡＲＳ光の信号光を発生させる。つまり、ωＣＡＲＳ光の信号強度は、ω１光の強度に対して非線形に増大する。また、位相整合条件から、ＣＡＲＳ過程により指向性のよいラマン散乱光（ＣＡＲＳ光）を得ることができる。特に、前方への散乱光は強度が強い特徴をもっているので、速い計測速度で画像が取得できる。
【００３７】
ＣＡＲＳ過程の優れているところは、観察しようとする分子の振動準位に起因した散乱光を検出するので、染色を行うことなく同分子の存在を検出することができる。これは、生きた試料を薬品処理することなく、そのままの姿で、生物試料の生体分子を検出する際に好都合である。
【００３８】
（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を示す図である。図１に示す超解像顕微鏡は、ＣＡＲＳ顕微鏡を構成するもので、照明部１０と検出部５０とを備える。本実施の形態では、例えば波数１０００ｃｍ−１近傍に存在する「分子の指紋領域」のバンドに由来するＣＡＲＳ光を信号光とする。また、抑制過程には、例えば波数３２００ｃｍ−１近傍に存在すＯＨ基に由来するＣＡＲＳ過程を用いる。
【００３９】
照明部１０は、第１光源１１と、マルチバンドパスフィルタ１２と、ビームコンバイナ１３と、対物レンズ１４と、第２光源１５と、１／４波長板１６と、空間変調素子１７とを備える。
【００４０】
第１光源１１は、１台のスーパーコンティニュアム光源を有し、該スーパーコンティニュアム光源からの射出光から、第１照明光となるコヒーレントなω１光及びω２光を生成する。スーパーコンティニュアム光源１１は、例えば波長１０６４ｎｍのフェムト秒のパルス光を射出するファイバレーザ２１と、該ファイバレーザ２１の射出光をシード光として白色のレーザ光を射出するフォトニック結晶ファイバ２２とを有する。
【００４１】
フォトニック結晶ファイバ２２から射出される白色のレーザ光は、マルチバンドパスフィルタ１２に入射されて、ω１光及びω２光が分光して取り出される。本実施の形態では、ω１光として波長１１９０ｎｍの光を利用し、ω２光としてファイバレーザ２１からフォトニック結晶ファイバ２２に入射される波長１０６４ｎｍのシード光を利用する。
【００４２】
マルチバンドパスフィルタ１２から取り出されるω１光及びω２光は、ビームコンバイナ１３を経て対物レンズ１４に入射されて試料Ｓに集光される。ここで、試料Ｓに集光されるω１光及びω２光は、ガウスビームで、集光面における強度分布に極大値を有する。これにより、信号発生過程が誘導されて、試料Ｓ中の特定の有機分子の「分子の指紋領域」に起因するＣＡＲＳ光が選択的に誘導される。
【００４３】
第２光源１５は、ＣＡＲＳ過程の誘導を抑制する第２照明光となるωｑ光（以下、クエンチ光とも言う）を射出する。第２光源１５は、例えば波長可変のフェムト秒レーザであるＴｉサファイアレーザを用い、波長７９４ｎｍ（波数１２５９８ｃｍ−１）のコヒーレント光をクエンチ光として利用する。第２光源１５から射出されるクエンチ光は、１／４波長板１６で円偏光に変換された後、空間変調素子１７を経てビームコンバイナ１３に入射され、ここで第１照明光（ω１光、ω２光）と同軸に合成されて、対物レンズ１４により試料Ｓに集光される。
【００４４】
空間変調素子１７は、例えば図２又は図３に示すように構成される。図２に示す空間変調素子１７は、クエンチ光の位相を、光軸を中心とする１周回で０から２π（又はその整数倍）まで連続的に変化させるものである。図３に示す空間変調素子１７は、光軸の周りに独立した４領域を有し、クエンチ光の位相を光軸中心に０から２π（又はその整数倍）までπ／２（又はその整数倍）ずつ段階的に変化させるものである。
【００４５】
図２又は図３に示した空間変調素子１７をクエンチ光が透過すると、クエンチ光の位相は、光軸を中心とする対称点で位相が反転する。したがって、このクエンチ光を対物レンズ１４で集光すると、集光面において強度分布に極小値を有する中空状のビームスポットが形成される（例えば、”Formation of a doughnut laser beam for super-resolving microscopy using a phase spatial light modulator”: T. Watanabe, Y. Igasaki, N. Fukuchi, M. Sakai, S. Ishiuchi, M. Fujii, T. Omatsu, K. Yamamoto and Y. Iketaki, Opt. Eng., 43(2004) 1136.参照）。
【００４６】
空間変調素子１７は、例えば図４又は図５に示すように構成してもよい。図４に示す空間変調素子１７は、クエンチ光の光軸を中心として複数（図４では２つ）の同心状（輪帯状）の領域を有し、隣接する領域においてクエンチ光の位相の符号を動径方向で反転させるものである。図５に示す空間変調素子１７は、図４と同様に、クエンチ光の位相の符号を同心状の隣接する領域において動径方向で反転させる他、各領域においてクエンチ光の位相を、図２と同様に光軸を中心とする１周回で０から２π又はその整数倍変化させるものである。
【００４７】
図４又は図５に示した空間変調素子１７をクエンチ光が透過すると、クエンチ光の位相が動径方向に反転するので、このクエンチ光を対物レンズ１４で集光すると、図２及び図３の場合と同様に、集光面において強度分布に極小値を有する中空状のビームスポットが形成される。しかも、この場合は、クエンチ光の電場が３次元的に相殺されるので、焦点とその近傍のみで光が当たらない３次元的な微小空間が生成される（例えば、ＷＯ２００５０３８４４１Ａ１参照）。
【００４８】
図２乃至図５に示した空間変調素子１７は、構造が簡単で、例えば光学薄膜やエッチング等を用いて作製することができる（例えば、“Three-dimensional super-resolution microscope using two-color annular phase plate”: Y. Iketaki, Appl. Phys. Express, 3 (2010) 085203、 ”New Design Method for a Phase Plate in Super-Resolution Fluorescence Microscopy”: N. Bokor and Y. Iketaki, Appl. Spectroscopy. 68(2014) 353、”Generation of a doughnut -shaped beam using a spiral phase plate”: T. Watanabe, M. Fujii,Y. Watanabe, N. Nobuhito and Y. Iketaki, Rev. Sci. Instrum. 75(2004) 5132参照）。
【００４９】
空間変調素子１７は、上述したクエンチ光の位相を変調する場合に限らず、クエンチ光の偏光を変調しても、同様に集光面における強度分布に極小値を有する中空状のビームスポットを形成することが可能である。図６乃至図８は、クエンチ光の偏光を変調する空間変調素子１７の構成を示す概略図である。図６及び図７に示す空間変調素子１７は、クエンチ光の電場ベクトルの方向を、光軸を中心とする対称位置で反転させるように構成したものである。図８に示す空間変調素子１７は、クエンチ光の光軸を中心として複数（図８では２つ）の同心状の領域を有し、隣接する領域においてクエンチ光の電場ベクトルの方向を反転させるように構成したものである。図６乃至図８の空間変調素子１７は、波長板を張り合わすことによって容易に作製することができる。
【００５０】
図１において、試料Ｓは、対物レンズ１４の光軸方向であるｚ方向と、ｚ方向と直交する面内で直交するｘ方向及びｙ方向との３次元方向に移動可能な試料ステージ４０上に載置される。
【００５１】
検出部５０は、コレクタレンズ５１と、集光レンズ５２と、共焦点ピンホール５３と、分光器５４と、分光器スリット５５と、検出器５６とを備える。検出器５６は、例えば光電子増倍管や半導体検出器等を用いて構成される。コレクタレンズ５１は、試料Ｓの前方散乱光を入射して平行光に変換する。コレクタレンズ５１で平行光に変換された前方散乱光は、集光レンズ５２により集光されて、共焦点ピンホール５３を経て分光器５４に入射される。そして、分光器５４で分光されて、所望の波長成分のＣＡＲＳ光（信号光）が分光器スリット５５により取り出されて検出器５６で検出される。ここで、共焦点ピンホール５３は、空間フィルタとして機能するだけでなく、ＣＡＲＳ光の単色性を向上させる機能も持ち合わせている。
【００５２】
上記構成において、ω１光、ω２光及びクエンチ光が、空間的及び時間的に重畳されて対物レンズ１４により試料Ｓに集光されると、超解像でＣＡＲＳ光を誘導することが可能となる。すなわち、中空状に集光されるクエンチ光の輪帯部では、ω１光及びω２光によるＣＡＲＳ過程が阻害されるので、ＣＡＲＳ光が発生する領域は、ω１光及びω２光の回折限界サイズの集光スポットよりも小さくなる。
【００５３】
したがって、ω１光、ω２光及びクエンチ光に対して試料Ｓを空間走査すれば、回折限界を上回る空間分解能で試料ＳからのＣＡＲＳ光を画像化することが可能となる。具体的には、試料ステージ４０を空間走査しながら、検出器５６で検出される試料ＳからのＣＡＲＳ信号をマッピングする。例えば、平面走査を行えば、超解像の顕微鏡画像が得られる。また、本実施の形態では、共焦点ピンホール５３を有しているので、試料ステージ４０をｚ方向に移動させながらｘｙ方向に空間走査すれば、３次元的な超解像顕微鏡像が得られる。
【００５４】
図９は、本実施の形態に係る超解像顕微鏡による分子の励起プロセスを示す。図９において、ω２光は、波長１０６４ｎｍ（波数９３９８ｃｍ−１）の光で、マルチバンドパスフィルタ１２で分光されるフォトニック結晶ファイバ２２のシード光である。また、ω１光は、「分子の指紋領域」の振動を誘起するため、ω２光より波数が約１０００ｃｍ−１低い光、例えば波数７８９８ｃｍ−１の光が利用される。このω１光は、マルチバンドパスフィルタ１２で分光される波長１１９０ｎｍの光に対応する。
【００５５】
図９に示すように、ω１光とω２光とが試料Ｓに照射されると、それらの差周波光（ω２−ω１）により分子の指紋領域に振動状態が生成される。そして、この状態から放射される差周波光とω２光とが結合して、新たな和周波光（２ω２−ω１）が分子の指紋領域のＣＡＲＳ信号として生成される。
【００５６】
さらに、波数１２５９８ｃｍ−１（波長７９４ｎｍ）のωｑ光が試料Ｓに照射されると、その瞬間にこれらの光の結合スキームが大きく変化する。すなわち、ω２光とωｑ光の差周波光（ωｑ−ω２）によりＯＨ基の分子振動が誘起される。一般に、ＯＨ基の振動数は、分子の指紋領域の振動数と比較して光学的振動強度が大きく、分子の指紋領域の振動状態よりも、ＯＨ基の振動状態が圧倒的な確立で生成される。
【００５７】
言い換えると、ω２光はω１光よりもωｑ光とカップリングし易く、分子の指紋領域のＣＡＲＳ信号の生成に必要な分子の指紋領域の振動状態のポピュレーションが減少する。その結果、ＣＡＲＳ信号に相当する周波数（２ω２−ω１）の信号が低下する。その代わり、ＯＨ基に由来する周波数（ω２＋ωｑ―ω１）のＣＡＲＳ信号が増大する。このＣＡＲＳ信号は、波数１４０９８ｃｍ−１で、波長７０９ｎｍの光に対応する。
【００５８】
これは、ＯＨ基に由来するＣＡＲＳ過程が抑制過程となり、ωｑ光がクエェンチ光として機能することを意味している。定量的には、信号発生過程である分子の指紋領域のＣＡＲＳ過程の非線形感受率よりも抑制過程の非線形感受率が大きいので、強度の弱いクエンチ光で信号発生過程を抑制できる。したがって、光源装置の選択の幅を広げ、分光学的には高いＳ／Ｎを担保することができる。
【００５９】
波数２５００ｃｍ−１以上の帯域には、ＯＨ基以外にもＣＨ基、ＮＨ基等の振動子強度が高く、ＣＡＲＳ過程の非線形感受率が高い共鳴バンドが存在するので、これらに由来するＣＡＲＳ過程は効率的な抑制過程として利用できる。加えて、これらの化学基は、各種の分子の分子構造に多量に含まれているので、より効率的に信号発生過程を抑制することが可能となる。
【００６０】
また、本実施の形態では、スーパーコンティニュアム光源１１の射出光からω１光及びω２光を得ている。ここで、スーパーコンティニュアム光源１１は、連続波長帯域の高輝度のコヒーレント光を生成できる。したがって、このようなブロードな帯域にクエンチ光を照明すれば、様々な抑制過程を同時に発生できるので、さらに効果的に信号発生過程を抑制することができる。
【００６１】
（第２実施の形態）
図１０は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を示す図である。図１０に示す超解像顕微鏡は、図２と同様にＣＡＲＳ顕微鏡を構成するもので、照明部１１０と検出部１５０とを備える。照明部１１０は、光源１１１と、コリメータレンズ１１２と、マルチバンドパスフィルタ１１３と、ガルバノミラー光学系１１４と、瞳投影レンズ１１５と、空間変調素子１１６と、対物レンズ１１７とを備える。
【００６２】
光源１１１は、複数のスーパーコンティニュアム光源を備える。スーパーコンティニュアム光源は、原理的には、フォトニック結晶ファイバ内で非線形光学効果により発生する白色光をファイバ端面より取り出して、分散光学素子（例えば、回折格子、分光ファイルタ等）により必要な波長の照明光を取り出すようにしている。本実施の形態では、複数のスーパーコンティニュアム光源のフォトニック結晶ファイバ端を束ねてマルチファイババンドル１２０を形成し、該マルチファイババンドル１２０の射出端を複数の光源点として、該複数の光源点から白色光のマルチビームを射出させる。
【００６３】
マルチファイババンドル１２０の複数の光源点から射出される白色光のマルチビームは、コリメータレンズ１１２により同軸で平行光に変換された後、マルチバンドパスフィルタ１１３に入射される。マルチバンドパスフィルタ１１３は、入射する白色光から第１照明光となるω１光及びω２光と、第２照明光となるωｑ光（クエンチ光）との３色の照明光を取り出す。
【００６４】
マルチバンドパスフィルタ１１３から取り出される３色の照明光は、ガルバノミラー光学系１１４により２次元方向に偏向走査されて、瞳投影レンズ１１５及び空間変調素子１１６を経て対物レンズ１１７により試料Ｓにマルチスポットで集光される。空間変調素子１１６は、例えば図３に示したように構成され、試料Ｓに形成されるマルチスポットの各々に対して、ω１光及びω２光はガウシアン状に集光され、クエンチ光は中空状に集光されるように、偏光状態又は位相状態を変調する。これにより、試料Ｓに形成されるマルチスポットの各々は、クエンチ光の中空中心の光強度の極小値と、ω１光及びω２光の光強度の極大値とが一致する。
【００６５】
検出部１５０は、捕集レンズ１５１と、分光フィルタ１５２と、集光レンズ１５３と、２次元検出器１５４とを備える。捕集レンズ１５１は、試料Ｓのマルチスポットからの前方散乱光であるＣＡＲＳ光を捕集して平行光に変換する。捕集レンズ１５１で平行光に変換されたＣＡＲＳ光は、分光フィルタ１５２により所望の波長成分が取り出されて集光レンズ１５３により２次元検出器１５４にマルチスポットして集光される。２次元検出器１５４は、試料Ｓに形成されるマルチスポット数よりも多い画素数を有する例えば高感度ＣＣＤ（Charge Coupled Device）センサを用いて構成される。
【００６６】
本実施の形態によると、試料Ｓに形成されるマルチスポットをガルバノミラー光学系１１４により対物レンズ１１７の集光面内で２次元方向に走査して、マルチスポットからのＣＡＲＳ光を２次元検出器１５４で検出するので、試料Ｓを超解像で超高速計測が可能となり、生命現象のライブ観察が可能となる。
【００６７】
また、本実施の形態では、スーパーコンティニュアム光源を用いてω１光、ω２光及びクエンチ光を得るので、試料Ｓを効率的に照明することができる。しかも、スーパーコンティニュアム光源の射出光から取出されるクエンチ光がブロードバンドであっても、空間変調素子１１６で空間変調することで、試料Ｓ上に良好な中空スポットを形成することができる。
【００６８】
図１１Ａは、ライン発振のレーザ光を用いた場合のクエンチ光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。図１１Ｂは、スーパーコンティニュアム光源からの白色レーザ光を用いた場合のクエンチ光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。図１１Ａは、クエンチ光の波長λｑが、６４６ｎｍ＜λｑ＜６４７ｎｍの場合である。図１１Ｂは、波長λｑの中心波長が６４７ｎｍで、帯域幅が約３０ｎｍである６３４ｎｍ＜λｑ＜６６０ｎｍの場合である。なお、いずれの場合も、図４に示した構成の空間変調素子で変調して、共通の対物レンズにより集光したシミュレーション結果を示す。
【００６９】
図１１Ｂから明らかなように、スーパーコンティニュアム光源から射出される白色レーザ光からブロードな帯域のクエンチ光を分光して使用する場合でも、焦点面に集光されるクエンチ光の中心部の強度はゼロとなる。したがって、超解像顕微鏡のクエンチ光として十分使用することができ、スーパーコンティニュアム光源の特徴を生かして、試料Ｓを効率的に照明することができる。
【００７０】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、第１実施の形態において、試料Ｓのｘｙ方向の２次元走査は、第２実施の形態と同様にガルバノミラー光学系を用いて行ってもよい。また、第２実施の形態において、試料Ｓを対物レンズ１１７の光軸方向に移動させて３次元的な超解像顕微鏡像を得るようにしてもよい。この場合、ガルバノミラー光学系１１４に代えて、試料Ｓを第１実施の形態の場合と同様に、３次元方向に移動可能な試料ステージ上に載置してもよい。
【００７１】
また、上記実施の形態では、３色の照明光を試料に集光するので、それらの照明光の組合せによる様々な２次及び／又は３次の和周波の発生過程等も競合する。上記実施の形態においては、このような２次及び／又は３次の和周波の発生過程等も、ＣＡＲＳ光を抑制することに利用できるので、より広い超解像顕微鏡法の実施が可能となる。また、本発明は、４次又は５次の非線形効果などで発生する信号光についても、上記以外の波長のクエンチ光により競合過程を人為的に誘導できれば、有効に適用することができる。
【００７２】
また、上記実施の形態では、ＣＡＲＳ過程の非線形光学過程を利用するため、クエンチ光を含めて３色のレーザ光を用いたが、例えばＳＨＧ光子発生過程の非線形光学過程を利用する場合は、第１照明光及び第２照明光をそれぞれ１色とする合計２色のレーザ光を用いて超解像顕微鏡観察を行うことができる。したがって、本発明において、非線形光学過程は、例えば、２次非線形光学過程、３次非線形光学過程、４次非線形光学過程、５次非線形光学過程のいずれかの過程で生じるものであってよい。
【００７３】
２次非線形光学過程には、例えば、第２高調波発生（ＳＨＧ: second harmonic generation）、２次和周波発生（ＳＦＧ: sum frequency generation）、差周波発生（ＤＦＧ: difference frequency generation）、光パラメトリック過程（optical parametric process）のいずれかが含まれる。
【００７４】
３次非線形光学過程には、例えば、第３高調波発生（ＴＨＧ: third harmonic generation）、３次和周波発生（ＴＳＦＧ: third-order sum frequency generation）、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ: coherent anti-Stokes Raman scattering）、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ: stimulated Raman scattering (ＳＲＧ: stimulated Raman gain, ＳＲＬ: stimulated Raman loss)）、光学カー効果（ＯＫＥ: optical Kerr effect）、ラマン誘導カー効果（ＲＩＫＥ: Raman induced Kerr effect）、誘導レイリー散乱（stimulated Rayleigh scattering）、誘導ブリルアン散乱（ＳＢＳ: stimulated Brillouin scattering）、誘導カー散乱（stimulated Kerr scattering）、誘導Rayleigh-Bragg散乱（stimulated Rayleigh-Bragg scattering）、誘導 Mie散乱（stimulated Mie scattering）、自己位相変調（ＳＰＭ: self phase modulation）、相互位相変調（ＸＰＭ: cross phase modulation）、二光子吸収（two-photon absorption）、光場複屈折（optical-field induced birefringence）、電界誘起ＳＨＧ（electric-field induced ＳＨＧ）のいずれかが含まれる。
【００７５】
４次非線形光学過程には、例えば、４光波混合（ＦＷＭ: four-wave mixing）が含まれる。
【００７６】
５次非線形光学過程には、例えば、二光子蛍光（ＴＰＥＦ: two-photon excitation fluorescence）、ハイパーラマン散乱（hyper-Raman scattering）、ハイパーレイリー散乱（hyper-Rayleigh scattering）、コヒーレント・アンチストークス・ハイパーラマン散乱（coherent anti-Stokes hyper-Raman scattering）のいずれかが含まれる。
【符号の説明】
【００７７】
Ｓ  試料
１０  照明部
１１  第１光源（スーパーコンティニュアム光源）
１２  マルチバンドパスフィルタ
１３  ビームコンバイナ
１４  対物レンズ
１５  第２光源
１６  １／４波長板
１７  空間変調素子
２１  ファイバレーザ
２２  フォトニック結晶ファイバ
５０  検出部
５１  コレクタレンズ
５２  集光レンズ
５３  共焦点ピンホール
５４  分光器
５５  分光器スリット
５６  検出器
１１０  照明部
１１１  光源
１１２  コリメータレンズ
１１３  マルチバンドパスフィルタ
１１４  ガルバノミラー光学系
１１５  瞳投影レンズ
１１６  空間変調素子
１１７  対物レンズ
１２０  マルチファイババンドル
１５０  検出部
１５１  捕集レンズ
１５２  分光フィルタ
１５３  集光レンズ
１５４  ２次元検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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