(57)【要約】【課題】試料を非染色で回折限界を上回る空間分解能で分析可能な試料分析装置を提供する。【解決手段】試料分析装置は、対物レンズ１４を経て波長の異なる複数の照明光の少なくとも一部を空間的及び時間的に重畳して試料Ｓに照射する照明部１０と、複数の照明光の試料Ｓへの照射に起因して、試料Ｓから発生する信号光を検出する検出部５０と、検出部５０の出力の時間領域における相関関数を演算する演算部１００と、を備える。複数の照明光は、少なくとも１つの照明光が他の照明光と波面又は偏光分布が異なる。検出部５０は、試料Ｓから発生する複数の照明光とは異なる波長の前方散乱光を信号光として検出する。【選択図】図２
2019117057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズを経て波長の異なる複数の照明光の少なくとも一部を空間的及び時間的に重畳して試料に照射する照明部と、
前記複数の照明光の前記試料への照射に起因して、該試料から発生する信号光を検出する検出部と、
前記検出部の出力の時間領域における相関関数を演算する演算部と、を備え、
前記複数の照明光は、少なくとも１つの照明光が他の照明光と波面又は偏光分布が異なるものであり、
前記検出部は、前記試料から発生する前記複数の照明光とは異なる波長の前方散乱光を前記信号光として検出する、
試料分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の試料分析装置において、
前記少なくとも１つの照明光は、前記対物レンズの集光面における強度分布に極小値を有する、
試料分析装置。
【請求項３】
請求項２に記載の試料分析装置において、
前記他の照明光は、前記集光面における強度分布に極大値を有する、
試料分析装置。
【請求項４】
請求項３に記載の試料分析装置において、
前記複数の照明光は、それぞれコヒーレント光である、
試料分析装置。
【請求項５】
請求項４に記載の試料分析装置において、
前記極小値と前記極大値とが前記集光面において同軸で重なる、
試料分析装置。
【請求項６】
請求項５に記載の試料分析装置において、
前記前方散乱光は、非線形光学過程で発生するものである、
試料分析装置。
【請求項７】
請求項６に記載の試料分析装置において、
前記非線形光学過程は、非線形ラマン過程、二次又は三次和周波発生過程、二次又は三次差周波発生過程である、
試料分析装置。
【請求項８】
請求項７に記載の試料分析装置において、
前記複数の照明光は、前記試料に同時に照射される照射時間帯を有するパルス光である、
試料分析装置。
【請求項９】
請求項８に記載の試料分析装置において、
前記少なくとも１つの照明光は、前記他の照明光よりもパルス幅が長い、
試料分析装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の試料分析装置において、
前記少なくとも１つの照明光のパルス幅は、前記検出器の応答時間より短い、
試料分析装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の試料分析装置において、
前記演算部は、前記他の照明光のパルス幅より長く、かつ、前記検出器の応答時間より短い時間帯に検出される前記信号光の出力の時間領域における相関関数を演算する、
試料分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
超解像顕微鏡として、例えば、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ分子を含む試料を、回折限界を超える高い空間分解能で観察可能な超解像蛍光顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。
【０００３】
特許文献１、２に開示の超解像蛍光顕微鏡は、試料中の分子を安定状態、例えば基底状態から第１量子状態に励起するためのポンプ光と、分子をさらに他の量子状態に遷移させるためのイレース光とを一組として、回折限界以下に収縮した蛍光スポットにより試料面を空間走査する。そして、各計測点の蛍光信号をコンピュータ上で２次元的に配列して画像処理することにより、回折限界の空間分解能を上回る解像度を有する蛍光画像を得ている。
【０００４】
その代表例として、蛍光色素分子を含む試料にポンプ光を照射して、蛍光色素分子を第１量子状態に励起する。さらに、試料にイレース光を照射して蛍光色素分子を他の量子状態に強制遷移させることで、第１量子状態の分子をクエンチする。その結果として、第１量子状態からの蛍光緩和を抑制する。対物レンズによりポンプ光と中空状のイレース光とを試料に同時に照射すれば、蛍光色素で染色された試料面に形成される蛍光スポットは、中心部を残し回折限界以下に収縮される。したがって、集光したポンプ光とイレース光とで試料を空間走査し、生成される蛍光スポット用いてコンピュータ上で画像化すれば、回折限界を上回る解像度をもつ観察画像を得ることができる。
【０００５】
特に、輪帯型の位相板、すなわちビーム中央の輪帯領域で位相反転できる位相板を通過したイレース光を集光すると、３次元的な中空をもつパターンが得られる。したがって、このような蛍光スポットを用いて試料を走査すれば、蛍光スポットが３次元的に収縮するので、３次元的に回折限界を上回る解像度を有する観察画像が得られる。
【０００６】
超解像蛍光顕微鏡は、他の分析方法、例えば蛍光相関法にも応用されている。蛍光相関法とは、溶液中の蛍光性の分子に励起光を集光し、試料から発光する蛍光強度に関して時間分解計測を行い、その強度の時間領域における相関関数を解析する手法である。
【０００７】
蛍光相関法では、励起光の集光スポット、すなわち蛍光スポット内に存在する分子の量、拡散速度、溶液の粘度等の多角的な物理情報が得られるので、細胞内における代謝現象の解明などに貢献することができる。特に、超解像蛍光顕微鏡を用いると蛍光スポットの空間サイズが小さくなるので、より空間精度が高い分析ができる（例えば、特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１００１０２号公報
【特許文献２】特開２０１０−１５０２６号公報
【特許文献３】特開２００５−１２１４３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
超解像蛍光顕微鏡は、極めて高い空間分解能を提供できる分析システムであるが、蛍光色素分子を染色する必要がある。そのため、特に生きた生物試料を観察する場合は、色素分子がその代謝現象などに影響を与えてしまい、生物試料の本来の生命現象を捉えることができない場合がある。
【００１０】
したがって、かかる観点に鑑みてなされた本発明の目的は、試料を非染色で回折限界を上回る空間分解能で分析可能な試料分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成する本発明に係る試料分析装置は、
対物レンズを経て波長の異なる複数の照明光の少なくとも一部を空間的及び時間的に重畳して試料に照射する照明部と、
前記複数の照明光の前記試料への照射に起因して、該試料から発生する信号光を検出する検出部と、
前記検出部の出力の時間領域における相関関数を演算する演算部と、を備え、
前記複数の照明光は、少なくとも１つの照明光が他の照明光と波面又は偏光分布が異なるものであり、
前記検出部は、前記試料から発生する前記複数の照明光とは異なる波長の前方散乱光を前記信号光として検出する。
【００１２】
前記少なくとも１つの照明光は、前記対物レンズの集光面における強度分布に極小値を有するとよい。
【００１３】
前記他の照明光は、前記集光面における強度分布に極大値を有するとよい。
【００１４】
前記複数の照明光は、それぞれコヒーレント光であるとよい。
【００１５】
前記極小値と前記極大値とが前記集光面において同軸で重なるとよい。
【００１６】
前記前方散乱光は、非線形光学過程で発生するものであるとよい。
【００１７】
前記非線形光学過程は、非線形ラマン過程、二次又は三次和周波発生過程、二次又は三次差周波発生過程であるとよい。
【００１８】
前記複数の照明光は、前記試料に同時に照射される照射時間帯を有するパルス光であるとよい。
【００１９】
前記少なくとも１つの照明光は、前記他の照明光よりもパルス幅が長いとよい。
【００２０】
前記少なくとも１つの照明光のパルス幅は、前記検出器の応答時間より短いとよい。
【００２１】
前記演算部は、前記他の照明光のパルス幅より長く、かつ、前記検出器の応答時間より短い時間帯に検出される前記信号光の出力の時間領域における相関関数を演算するとよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、試料を非染色で回折限界を上回る空間分解能で分析可能な試料分析装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＣＡＲＳ過程のエネルギーダイアグラムを示す図である。
【図２】一実施の形態に係る試料分析装置の概略構成を示す図である。
【図３】空間変調素子の第１の例を示す概略構成図である。
【図４】空間変調素子の第２の例を示す概略構成図である。
【図５】空間変調素子の第３の例を示す概略構成図である。
【図６】空間変調素子の第４の例を示す概略構成図である。
【図７】空間変調素子の第５の例を示す概略構成図である。
【図８】空間変調素子の第６の例を示す概略構成図である。
【図９】空間変調素子の第７の例を示す概略構成図である。
【図１０】図２の試料分析装置における励起ダイアグラムを示す図である。
【図１１Ａ】ライン発振のレーザ光を用いた場合のクエンチ光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。
【図１１Ｂ】試料中の測定対象粒子の動きの軌跡モデルを示す図である。
【図１２Ａ】測定経過時間τと相関関数Ｇ（τ）との関係を示す図である。
【図１２Ｂ】スーパーコンティニュアム光源からの白色レーザ光を用いた場合のクエンチ光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。
【図１３】輪帯型補正用光学素子の説明図である。
【図１４】位相シフトによる光軸方向の強度分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の一実施の形態では、非線形光学過程としてＣＡＲＳ過程を利用する。ＣＡＲＳ過程は、近年、振動分光手法として最も広く使われている非線形ラマン過程である。
【００２５】
図１は、ＣＡＲＳ過程のエネルギーダイアグラムを示す図である。ＣＡＲＳ過程では、一般に角振動数の異なる２つのレーザ光（ω１光、ω２光）を用いる。これら２つの入射光の角振動数差（ω１−ω２）が試料分子の持つ振動モードの角振動数Ωと一致すると、多数の試料分子の振動モードが同時に励振される。
【００２６】
このようにして生じた分子振動（振動コヒーレンス）は、分子が３つ目のレーザ光（ω３光）と相互作用することにより、３次の非線形分極に由来するωＣＡＲＳ光（ＣＡＲＳ光）として取り出される。ＣＡＲＳ過程では、エネルギー保存則から、ωＣＡＲＳ＝ω１−ω２＋ω３の条件を満たす。また、ＣＡＲＳ光は、位相整合条件から、ｋＣＡＲＳ＝ｋ１−ｋ２＋ｋ３の方向に発生する。ここで、ｋｘはωｘ光の波数ベクトルある。
【００２７】
ＣＡＲＳ過程では、多くの場合、ω３光としてω１光が用いられる。その場合、ＣＡＲＳ光の角振動数は、（２ω１−ω２）となる。また、ＣＡＲＳ光の信号強度は、ω１光の強度の２乗及びω２光の強度の一乗にそれぞれ比例する。つまり、ＣＡＲＳ光の信号強度は、ω１光の強度に対して非線形に増大する。また、位相整合条件から、ＣＡＲＳ過程により指向性のよいラマン散乱光（ＣＡＲＳ光）を得ることができる。
【００２８】
ＣＡＲＳ過程の優れているところは、観察しようとする分子の振動準位に起因した散乱光を検出できるので、染色を行うことなく同分子の存在を検出することができる。これは、生きた試料を薬品処理することなく、そのままの状態で、生物試料の生体分子を検出する際に好都合である。
【００２９】
図２は、本発明の一実施の形態に係る試料分析装置の概略構成を示す図である。図２に示す試料分析装置は、ＣＡＲＳ顕微鏡に応用したもので、照明部１０と、検出部５０と、演算部１００と、を備える。照明部１０は、第１光源１１と、マルチバンドパスフィルタ１２と、ビームコンバイナ１３と、対物レンズ１４と、第２光源１５と、１／４波長板１６と、空間変調素子１７とを備える。
【００３０】
第１光源１１は、１台のスーパーコンティニュアム光源を有し、該スーパーコンティニュアム光源からの射出光から、第１照明光となるω１光及びω２光を生成する。スーパーコンティニュアム光源１１は、例えば波長１５６０ｎｍのフェムト秒のパルス光を射出するファイバレーザ２１と、該ファイバレーザ２１の射出光をシード光として白色のレーザ光を射出するフォトニック結晶ファイバ２２とを有する。
【００３１】
フォトニック結晶ファイバ２２から射出される白色のレーザ光は、マルチバンドパスフィルタ１２に入射されて、ω１光及びω２光が分光して取り出される。本実施の形態では、ω１光としてファイバレーザ２１からフォトニック結晶ファイバ２２に入射される波長１５６０ｎｍのシード光であるパルス光を利用し、ω２光として波長２０２１ｎｍの光を利用する。
【００３２】
マルチバンドパスフィルタ１２から取り出されるω１光及びω２光は、ビームコンバイナ１３を経て対物レンズ１４に入射されて試料Ｓに集光される。ここで、試料Ｓに集光されるω１光及びω２光は、ガウスビームで集光面における強度分布に極大値を有する。これにより、試料Ｓ中の特定の有機分子のＣＨ化学基の基本振動に起因するＣＡＲＳ光を選択的に誘導することが可能となる。しかも、ω１光はスーパーコンティニュアム光源１１のシード光を利用することから、十分高い先頭値が得られるので、ＣＡＲＳ過程を効率的に誘導することが可能となる。
【００３３】
第２光源１５は、ＣＡＲＳ過程の誘導を抑制する第２照明光となるωｑ光（以下、クエンチ光とも言う）を射出する。第２光源１５は、例えば波長可変のフェムト秒レーザが用いられる。第２光源１５から射出されるクエンチ光は、１／４波長板１６で円偏光に変換された後、空間変調素子１７を経てビームコンバイナ１３に入射され、ここでω１光及びω２光と同軸に合成されて対物レンズ１４により試料Ｓに集光される。
【００３４】
空間変調素子１７は、例えば図３又は図４に示すように構成される。図３に示す空間変調素子１７は、クエンチ光の位相を、光軸を中心とする１周回で０から２π（又はその整数倍）まで連続的に変化させるものである。図４に示す空間変調素子１７は、光軸の周りに独立した４領域を有し、クエンチ光の位相を光軸中心に０から２π（又はその整数倍）までπ／２（又はその整数倍）ずつ段階的に変化させるものである。
【００３５】
図３又は図４に示した空間変調素子１７をクエンチ光が透過すると、クエンチ光の位相は、光軸を中心とする対称点で位相が反転する。したがって、このクエンチ光を対物レンズ１４で集光すると、集光面において強度分布に極小値を有する中空状のビームスポットが形成される（例えば、”Formation of a doughnut laser beam for super-resolving microscopy using a phase spatial light modulator”: T. Watanabe, Y. Igasaki, N. Fukuchi, M. Sakai, S. Ishiuchi, M. Fujii, T. Omatsu, K. Yamamoto and Y. Iketaki, Opt. Eng., 43(2004) 1136.参照）。
【００３６】
空間変調素子１７は、例えば図５又は図６に示すように構成してもよい。図５に示す空間変調素子１７は、クエンチ光の光軸を中心として複数（図５では２つ）の同心状（輪帯状）の領域を有し、隣接する領域においてクエンチ光の位相の符号を動径方向で反転させるものである。図６に示す空間変調素子１７は、図５と同様に、クエンチ光の位相の符号を同心状の隣接する領域において動径方向で反転させる他、各領域においてクエンチ光の位相を、図３と同様に光軸を中心とする１周回で０から２π又はその整数倍変化させるものである。
【００３７】
図５又は図６に示した空間変調素子１７をクエンチ光が透過すると、クエンチ光の位相が動径方向に反転するので、このクエンチ光を対物レンズ１４で集光すると、図３及び図４の場合と同様に、集光面において強度分布に極小値を有する中空状のビームスポットが形成される。しかも、この場合は、クエンチ光の電場が３次元的に相殺されるので、焦点とその近傍のみで光が当たらない３次元的な微小空間が生成される（例えば、ＷＯ２００５０３８４４１Ａ１参照）。
【００３８】
図３乃至図６に示した空間変調素子１７は、構造が簡単で、例えば光学薄膜やエッチング等を用いて作製することができる（例えば、“Three-dimensional super-resolution microscope using two-color annular phase plate”: Y. Iketaki, Appl. Phys. Express, 3 (2010) 085203、 ”New Design Method for a Phase Plate in Super-Resolution Fluorescence Microscopy”: N. Bokor and Y. Iketaki, Appl. Spectroscopy. 68(2014) 353、”Generation of a doughnut -shaped beam using a spiral phase plate”: T. Watanabe, M. Fujii,Y. Watanabe, N. Nobuhito and Y. Iketaki, Rev. Sci. Instrum. 75(2004) 5132参照）。
【００３９】
空間変調素子１７は、上述したクエンチ光の位相を変調する場合に限らず、クエンチ光の偏光を変調しても、同様に集光面における強度分布に極小値を有する中空状のビームスポットを形成することが可能である。図７乃至図９は、クエンチ光の偏光を変調する空間変調素子１７の構成を示す概略図である。図７及び図８に示す空間変調素子１７は、クエンチ光の電場ベクトルの方向を、光軸を中心とする対称位置で反転させるように構成したものである。図９に示す空間変調素子１７は、クエンチ光の光軸を中心として複数（図９では２つ）の同心状の領域を有し、隣接する領域においてクエンチ光の電場ベクトルの方向を反転させるように構成したものである。図７乃至図９の空間変調素子１７は、波長板を張り合わすことによって容易に作製することができる。
【００４０】
図２において、試料Ｓは、対物レンズ１４の光軸方向であるｚ方向と、ｚ方向と直交する面内で直交するｘ方向及びｙ方向との３次元方向に移動可能な試料ステージ４０上に載置される。
【００４１】
検出部５０は、コレクタレンズ５１と、集光レンズ５２と、共焦点ピンホール５３と、分光器５４と、分光器スリット５５と、検出器５６とを備える。検出器５６は、例えば光電子増倍管や半導体検出器等を用いて構成される。コレクタレンズ５１は、試料Ｓの前方散乱光を入射して平行光に変換する。コレクタレンズ５１で平行光に変換された前方散乱光は、集光レンズ５２により集光されて、共焦点ピンホール５３を経て分光器５４に入射される。そして、分光器５４で分光されて、所望の波長成分のＣＡＲＳ光（信号光）が分光器スリット５５により取り出されて検出器５６で検出される。ここで、共焦点ピンホール５３は、空間フィルタとして機能するだけでなく、ＣＡＲＳ光の単色性を向上させる機能も持ち合わせている。
【００４２】
演算部１００は、例えばデジタル相関器を有し、検出器５６の出力（ＣＡＲＳ信号）に基づいて、時間領域における相関関数を演算する。
【００４３】
上記構成において、ω１光、ω２光及びクエンチ光がビームコンバイナ１３で同軸に合成されて対物レンズ１４により試料Ｓに集光されると、超解像でＣＡＲＳ光を誘導することが可能となる。すなわち、中空状に集光されるクエンチ光の輪帯部では、ω１光及びω２光によるＣＡＲＳ過程が阻害されるので、ＣＡＲＳ光が発生する領域は、ω１光及びω２光の回折限界サイズの集光スポットよりも小さくなる。したがって、ω１光、ω２光及びクエンチ光に対して試料Ｓを空間走査すれば、回折限界を上回る空間分解能で試料ＳからのＣＡＲＳ光を画像化することが可能となる。
【００４４】
図１０は、本実施の形態に係る試料分析装置における励起ダイアグラムを示す図である。ＣＡＲＳ過程は、見方を変えると、振動準位ν１を中間準位とする２段階の励起過程と見なすことができる。まず、ω１光（波長：λ１）とω２光（波長：λ２）とのコヒーレントな重ね合わせにより発生する差周波成分（Δω）で、基底状態Ｓ０の分子を振動準位ν１に励起する。この中間状態の分子からのω１光の照射によるアンチストークス（ＣＡＲＳ）光は、角振動数がω１＋Δω（波長：λＣＡＲＳ）と見なせる。この過程においては、振動準位ν１の存在が大前提である。
【００４５】
ω１光の他に、別の波長のクエンチ光（角振動数：ωｑ、波長：λｑ）が入射されると、振動準位ν１の中間準位は、クエンチ光とカップリングして和周波光（角振動数：ωｑ＋Δω、波長：λｏｕｔ）を発生する。その結果、本来の角振動数（ω１＋Δω）で発生するＣＡＲＳ光と競合して、ＣＡＲＳ光強度が減少する。すなわち、振動準位ν１は、ＣＡＲＳ光と和周波光（角振動数：ωｑ＋Δω）とを分岐するのに利用される。
【００４６】
和周波光の強度はクエンチ光の強度に比例するので、その分ＣＡＲＳ光の強度は減少する。すなわち、ＣＡＲＳ光は、中空状のクエンチ光の辺縁部で抑制されるので、蛍光抑制型の超解像顕微鏡法と同様に、回折限界を超える分解能を得ることができる。これにより、試料Ｓに存在する分子振動状態や化学結合状態等の多角的な情報を、回折限界を上回る解像度で画像化することができる。
【００４７】
また、本実施の形態によると、演算部１００によりＣＡＲＳ信号の時間領域における相関関数を演算するので、動的光散乱法を用いて試料Ｓ中に存在する分子の挙動や分子が存在する環境に関する情報を１分子レベルで解析することができる。
【００４８】
動的光散乱法とは、ブラウン運動する粒子群からの光散乱強度を測定し、その強度の時間的変動から粒子径と分布とを求める方法である。特に、サブミクロン以下の微粒子を測定する方法として活用されている。
【００４９】
具体的には、演算部１００において、検出器５６の出力（前方散乱光強度）Ｉ（ｔ）を時系列に取得し、下式（１）に従って相関関数Ｇ（τ）を演算する。式（１）において、τは測定経過時間を示す。
【００５０】
【数１】
2019117057.tif 000003
【００５１】
図１１Ａは試料Ｓ中の測定対象粒子の動きの軌跡モデルを示し、図１１Ｂは測定経過時間τと相関関数Ｇ（τ）との関係を示す。式（１）によると、隣接する時間帯域では、測定対象の粒子が照明光の領域に存在するので、Ｇ（τ）は大きな値をもつ。しかし、時間間隔が開くと、粒子は照明領域から外れるので散乱信号が検出されず、Ｇ（τ）はゼロになる。
【００５２】
したがって、演算部１００で得られた相関関数Ｇ（τ）を解析すれば、試料Ｓの照明領域に存在する測定対象粒子の粒子数、大きさ、拡散速度、密度、粘度等の情報を得ることができる。
【００５３】
従来の顕微鏡を用いる動的光散乱法では、レーザ光の集光スポットが大きいことから、そのスポット形状を勘案した相関関数を算出するために、様々な散乱角における強度を測定して、空間的な散乱情報が反映された相関関数を演算している。しかし、非線型光学効果により発生される散乱光は、前方散乱光のみが強くなる。そのため、従来のように様々な散乱角における強度を測定するのは困難である。特に、レーザ光を集光すると、前方散乱光は光軸方向に広がった楕円形となり、相関関数はユーザが望む正確な情報を提供できない。
【００５４】
これに対し、本実施の形態によると、観測領域が光の回折限界よりも遥かに小さくなり、空間的に等方な球状となるので、前方散乱光の測定だけで信頼度の高い相関関数を得ることが可能となる。しかも、非染色で特定の分子の振動準位に共鳴した信号光を検出できるので、興味ある分子のみを選択して解析することが可能となる。
【００５５】
また、動的光散乱法では、観測領域おける１分子レベルの揺らぎ信号光を測定することが基本であることから、観測領域での試料の密度が高いと、相関関数は定常値になり解析不能となる。しかし、本実施の形態においては、観測領域自体を微小化することができるので、高密度の試料も解析できる。しかも、非染色であることから、褪色や照明中の光化学反応もない。したがって、対象分子を容易かつ安定して解析することが可能となる。加えて、立体分解能も高いので、例えば、細胞内のナノメータオーダのオルガネラの代謝機能も解析可能となる。
【００５６】
ここで、信頼度の高い相関関数を得るには、試料に対する照明光の集光条件を最適化する必要がある。そのため、本実施の形態では、照明光の照射タイミングが適切に設定されてされる。すなわち、非線形光学効果、本実施の形態ではＣＡＲＳ過程を誘導するため、試料Ｓに全ての光が同時に照射される。
【００５７】
照明光の照射タイミングは、具体的には介在する分子の振動準位の励起寿命に大きく依存ずる。すなわち、角振動数差（ω１−ω２）による励起の間にのみ、分子はω２光と相互作用して、和周差光（ＣＡＲＳ光）を発生する。この場合の励起寿命は、高々ピコ秒オーダーである。
【００５８】
そのため、本実施の形態では、この励起時間内に、ω１光及びω２光を時間的に少なくとも一部を重畳させている。さらに、クエンチ光は、これらの重畳時間帯よりも以前に発光を開始し、同時間帯よりも後に発光を完了させている。
【００５９】
以上の条件を満たすことにより、照明領域において観測に不必要な空間領域のＣＡＲＳ信号光を確実に抑制でき、分解能を向上させることができる。
【００６０】
また、ω１光及びω２光の重畳時間は、検出器５６の応答時間よりも短い方が望ましい。すなわち、検出器５６を構成する光電子増倍管や半導体検出器等は、光により感受面を光励起して電子に変換し、それを電気的に増幅して出力する。そのため、光が入射しつづけると検出効率が飽和する不感時間が発生して、検出効率が著しく低下し、Ｓ／Ｎが悪くなる。
【００６１】
例えば、代表的な光電子増倍管では、重なり合う電極を全て走行して、電極を通過するには１０ｎ程度の時間（走行時間）がかかる。その間は、増幅のために光電子が大量に発生して、新たな信号光が入射しても、それに対する検出効率が低下する。したがって、感度よく信号検出を行うためには、少なくとも走行時間分の時間間隔あけて、電極が完全に中和するまで待つ必要がある。さらには、検出器５６の出力を増幅する場合は、増幅回路の応答時間も考慮する必要がある。その場合には、光電子増倍管の走行時間よりも長い時間間隔を必要とずる。
【００６２】
また、本実施の形態では、観測領域が微小となるため、試料Ｓに強い照明光を集光させると、その散乱光が検出器に混入する確立が高くなる。特に、クエンチ光は他の照明光よりもパルス幅が長くなるので、その影響は大きい。そのため、演算部１００においては、信号光を発生させるω１光及びω２光の時間幅だけ電気的にゲートをかけるとよい。これにより、信号光発生時以外の迷光をカットでき、Ｓ／Ｎを向上させることができる。
【００６３】
このように、空間領域のみならず時間領域においても、照明光の重なり具合を確実にすることで、分析能力をさらに向上させることができる。例えば、ω１光の波長を１０６４ｎｍ、ω２光の波長を１２７４ｎｍ、クエンチ光の波長を７８０ｎｍに設定すると、ω１光とω２光との角振動数差は略１５４９ｃｍ−１となるので、例えば共役ポリエンのＣ＝Ｃ（βカロテンのＣ＝Ｃ）を選択的に検出することができる。
【００６４】
この場合、図２に示した空間変調素子１７として、例えば図５に示した構成のものを用いる場合は、石英基板の円形の中央部を２５７８ｎｍの深さでエッチングして空間変調素子１７を形成することができる。この空間変調素子１７は、石英基板の屈折率が波長７８０ｎｍで１．４５４、波長１１５９ｎｍで１．４４８なので、波長１１５９ｎｍの光が入射しても中央部で位相がλ（波長）だけシフトするので、ビーム位相面には何も変化を与えない。一方、波長７８０ｎｍのクエンチ光は、３／２λだけ位相シフトするので、位相が反転する。
【００６５】
ＣＡＲＳ信号光を生成するためのω１光及びω２光は、波長１１５９ｎｍを基準として、０．０９λしか離れていない。この差は、市販の光学研磨した石英基板の面精度よりも少ないので、ω１光及びω２光がこの空間変調素子１７を通過しても、ビーム位相面は変化せず、ガウシアンビームのままとなる。
【００６６】
したがって、ω１光及びω２光は、ガウシアンビームそして試料Ｓに集光されてＣＡＲＳ信号光を発生させ、クエンチ光は３次元的な中空構造を持つように試料Ｓに集光されて、ω１光及びω２光のガウシアンビームの集光点を３次元的に取り囲むようになる。このように、ω１光、ω２及びクエンチ光の３波長の光が、原理通りに空間的にオーバーラップすることにより、ＣＡＲＳ信号光の発生領域を空間的に微小化し、空間分析機能を向上させることができる。
【００６７】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、試料Ｓのｘｙ方向の２次元走査は、ガルバノミラー光学系を用いて行ってもよい。
【００６８】
また、より効果的にＣＡＲＳ光を抑制するため、分光学的な原理に基づく方法やレーザの機能に着目した方法を適用することも可能である。
【００６９】
分光学的な原理に基づく方法としては、クエンチ光の周波数を調整して、図１０において和周波光（ωｑ＋Δω）を試料分子の電子励起状態Ｓ１よりも高くする。これにより、和周波光を電子励起状態Ｓ１と共鳴させて、電子状態間の遷移を誘導する。すなわち、クエンチ光として、基底状態Ｓ０から電子励起状態Ｓ１の遷移エネルギーより大きい励起エネルギーに対応する振動数の光を照射する。このようにすれば、試料分子のクエンチ光の吸収断面積が大きくなるので、弱いクエンチ光の照射強度でＣＡＲＳ光を確実に抑制することができる（例えば、S. Koura, K. Inoue, T. Omari, M. Ishihara, M. Kikuchi, M. Fuji, and M. Sakai, Opt. Express, 18, 13402 (2010)、 M. Sakai, M. Fuji, Chem. Phys. Lett. 396 (2004) 298.参照）。
【００７０】
レーザの機能に着目した方法としては、図２においてクエンチ光を発生させる第２光源１５を、スーパーコンティニュアム光源を用いて構成する。スーパーコンティニュアム光源は、連続波長帯域の高輝度のコヒーレント光を生成できる。したがって、このようなブロードな帯域のクエンチ光を試料Ｓに照射すれば、様々な分岐比で和周波光を発生できるので、相対的にＣＡＲＳ光を抑制できる。
【００７１】
図１２Ａは、ライン発振のレーザ光を用いた場合のクエンチ光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。図１２Ｂは、スーパーコンティニュアム光源からの白色レーザ光を用いた場合のクエンチ光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。図１２Ａは、クエンチ光の波長λｑが、６４６ｎｍ＜λｑ＜６４７ｎｍの場合である。図１２Ｂは、クエンチ光の波長λｑが、中心波長６４７ｎｍで、帯域幅が約３０ｎｍである６３４ｎｍ＜λｑ＜６６０ｎｍの場合である。なお、いずれの場合も、図２に示した空間変調素子１７は、図５に示した構成のものとした。
【００７２】
図１２Ａ及び図１２Ｂの比較から明らかなように、白色レーザ光からブロードな帯域のクエンチ光を分光して使用する場合でも、焦点面に集光されるクエンチ光の中心部の強度はゼロとなる。したがって、超解像顕微鏡のクエンチ光として十分使用することができ、白色レーザ光の特徴を生かして、試料Ｓを効率的に照明することができる。
【００７３】
また、スーパーコンティニュアム光源を用いてクエンチ光を発生させるようにすれば、空間変調素子１７の作製誤差に応じて、試料Ｓ上でクエンチ光が理想的な中空ビームとなるようにクエンチ光の波長を容易に微調整することができる。
【００７４】
さらに、図１０に示した励起ダイアグラムからも明らかなように、クエンチ光をω２光として利用し、反対にω２光をクエンチ光として利用してもよい。
【００７５】
この場合、クエンチ光は、ビーム整形されず通常のガウスビームとして集光される。一方、ω２光は中空状に整形されて集光される。そして、集光スポット毎に和周波光（ωｑ＋Δω）を検出する。この場合、ω２光の強度が大きくなると、和周波光の強度が抑制されて超解像での分析が可能となる。
【００７６】
さらに、図２において、照明部１０に色収差がある場合には、輪帯型補正用光学素子を配置して色収差を補正してもよい。すなわち、一般に、照明光学系は色収差が発生する。例えば、対物レンズでは、種類によっては大きな色収差が発生する。そのため、多波長対応設計を適用した空間変調素子１７を用いても、ω１光及びω２光の集光点とクエンチ光の中空中心とが異なる場合がある。特に、光軸方向のシフトが大きい。
【００７７】
その場合は、照明部１０のω１光、ω２光及びクエンチ光の共通光路に輪帯型補正用光学素子を配置して、クエンチ光に対しては位相を正確に２πの整数倍だけ遅らせ、ω１及びω２光に対しては位相をδ分シフトさせるとよい。ＣＡＲＳ信号光を発生させるためのω１光及びω２光の波長は、通常極めて接近し、光学媒質の光学定数も略同一である。したがって、その特性を利用してこれらの集光点をクエンチ光の中空中心に一致させることができる。
【００７８】
一例として、最も単純な２重輪帯構造を有する輪帯型補正用光学素子を用いて、位相変調により焦点位置を自在に調整する方法について説明する。図１３に示すように、輪帯型補正用光学素子１１０は、円形の中央部１１１ａとその外側の輪帯部１１１ｂとを有し、瞳面に配置される。中央部１１１ａは、輪帯部１１１ｂと比較して、位相がδだけシフトしているものとする。
【００７９】
図１３に示す座標系を用いると、下式（２）乃至（６）で示すように、瞳面から焦点近傍に集光する光の強度分布Ｉ（ｘ、ｙ、ｚ）を計算することができる。なお、座標系は焦点距離で規格した。また、各変数は、以下のように定義した。
電場：Ｅ
磁場：Ｈ
波長：λ
瞳面座標：（ξ,η）
瞳面内動径ベクトル：φ
焦点面座標：（ｘ,ｙ）
光軸方向座標：ｚ
焦点より動径ベクトル先端を見込む角：θ
焦点より中央部外周を見込む角：θｉｎ
焦点より輪帯部外周を見込む角：α
輪帯部半径と中央部半径との比：２１／２：１
【００８０】
【数２】
2019117057.tif 000004
【００８１】
図１４は、位相シフトによる光軸方向の強度分布Ｉ（０,０,ｚ）を示す。縦軸は強度を示し、横軸は焦点位置からの光軸方向の距離を示す。図１４において、Ａは位相シフトδが−λ／７の場合、Ｂは位相シフトδが０の場合、Ｃは位相シフトδがλ／７の場合をそれぞれ示す。
【００８２】
図１４から明らかなように、Ａの場合の強度分布はＢの場合よりも手前にピークが位置し、Ｃの場合の強度分布はＢの場合よりも後方にピークが位置している。したがって、照明部１０における照明光学系の色収差に応じて位相シフトδを適切に調整することにより、ω１光及びω２光の集光点の位置をクエンチ光の焦点位置に一致させることができる。このような輪帯型補正用光学素子１１０は、光学膜（単層、多層膜）や偏光光学基板を用いて構成することができる。
【００８３】
また、上記実施の形態では、３色の照明光を試料に集光するので、それらの照明光の組合せによる様々な２次及び／又は３次の和周波の発生過程等も競合する。このような２次及び／又は３次の和周波の発生過程等も、ＣＡＲＳ光を抑制することに利用できるので、より広い超解像での分析が可能となる。
【００８４】
また、上記実施の形態では、ＣＡＲＳ過程の非線形光学過程を利用するため、クエンチ光を含めて３色のレーザ光を用いたが、例えばＳＨＧ光子発生過程の非線形光学過程を利用する場合は、第１照明光及び第２照明光をそれぞれ１色とする合計２色のレーザ光を用いて超解像顕微鏡観察を行うことができる。したがって、本発明において、非線形光学過程は、例えば、２次非線形光学過程、３次非線形光学過程、４次非線形光学過程、５次非線形光学過程のいずれかの過程で生じるものであってよい。
【００８５】
２次非線形光学過程には、例えば、第２高調波発生（ＳＨＧ: second harmonic generation）、２次和周波発生（ＳＦＧ: sum frequency generation）、差周波発生（ＤＦＧ: difference frequency generation）、光パラメトリック過程（optical parametric process）のいずれかが含まれる。
【００８６】
３次非線形光学過程には、例えば、第３高調波発生（ＴＨＧ: third harmonic generation）、３次和周波発生（ＴＳＦＧ: third-order sum frequency generation）、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ: coherent anti-Stokes Raman scattering）、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ: stimulated Raman scattering (ＳＲＧ: stimulated Raman gain, ＳＲＬ: stimulated Raman loss)）、光学カー効果（ＯＫＥ: optical Kerr effect）、ラマン誘導カー効果（ＲＩＫＥ: Raman induced Kerr effect）、誘導レイリー散乱（stimulated Rayleigh scattering）、誘導ブリルアン散乱（ＳＢＳ: stimulated Brillouin scattering）、誘導カー散乱（stimulated Kerr scattering）、誘導Rayleigh-Bragg散乱（stimulated Rayleigh-Bragg scattering）、誘導 Mie散乱（stimulated Mie scattering）、自己位相変調（ＳＰＭ: self phase modulation）、相互位相変調（ＸＰＭ: cross phase modulation）、二光子吸収（two-photon absorption）、光場複屈折（optical-field induced birefringence）、電界誘起ＳＨＧ（electric-field induced ＳＨＧ）のいずれかが含まれる。
【００８７】
４次非線形光学過程には、例えば、４光波混合（ＦＷＭ: four-wave mixing）が含まれる。
【００８８】
５次非線形光学過程には、例えば、二光子蛍光（ＴＰＥＦ: two-photon excitation fluorescence）、ハイパーラマン散乱（hyper-Raman scattering）、ハイパーレイリー散乱（hyper-Rayleigh scattering）、コヒーレント・アンチストークス・ハイパーラマン散乱（coherent anti-Stokes hyper-Raman scattering）のいずれかが含まれる。
【符号の説明】
【００８９】
Ｓ  試料
１０  照明部
１１  第１光源（スーパーコンティニュアム光源）
１２  マルチバンドパスフィルタ
１３  ビームコンバイナ
１４  対物レンズ
１５  第２光源
１６  １／４波長板
１７  空間変調素子
２１  ファイバレーザ
２２  フォトニック結晶ファイバ
５０  検出部
５１  コレクタレンズ
５２  集光レンズ
５３  共焦点ピンホール
５４  分光器
５５  分光器スリット
５６  検出器
１００  演算部
１１０  輪帯型補正用光学素子
【図１】
2019117057.tif 000005
【図２】
2019117057.tif 000006
【図３】
2019117057.tif 000007
【図４】
2019117057.tif 000008
【図５】
2019117057.tif 000009
【図６】
2019117057.tif 000010
【図７】
2019117057.tif 000011
【図８】
2019117057.tif 000012
【図９】
2019117057.tif 000013
【図１０】
2019117057.tif 000014
【図１１Ａ】
2019117057.tif 000015
【図１１Ｂ】
2019117057.tif 000016
【図１２Ａ】
2019117057.tif 000017
【図１２Ｂ】
2019117057.tif 000018
【図１３】
2019117057.tif 000019
【図１４】
2019117057.tif 000020