(57)【要約】【課題】本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、容器と、前記容器の底部から間隙を有するように配置されたポリマー多孔質膜載置部と、前記ポリマー多孔質膜載置部に載置されたポリマー多孔質膜と、前記ポリマー多孔質膜載置部の上部に設けられた培地供給手段と、前記容器の一部に設けられた、培地排出部とを備え、ここで、前記ポリマー多孔質膜載置部の少なくとも一部が、１以上の培地排出口を有し、ここで、前記ポリマー多孔質膜載置部が、前記容器の内径より小さい、及び／又は、前記ポリマー多孔質膜載置部が、少なくともその一部に、ポリマー多孔質膜が載置されない、流体通過口を有する、細胞培養装置を提供する。【選択図】図４
2019126299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器と、
前記容器の底部から間隙を有するように配置されたポリマー多孔質膜載置部と、
前記ポリマー多孔質膜載置部に載置されたポリマー多孔質膜と、
前記ポリマー多孔質膜載置部の上部に設けられた培地供給手段と、
前記容器の一部に設けられた、培地排出部と
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通するものであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜載置部の少なくとも一部が、１以上の培地排出口を有し、
ここで、前記ポリマー多孔質膜載置部が、前記容器の内径より小さい、及び／又は、前記ポリマー多孔質膜載置部が、少なくともその一部に、ポリマー多孔質膜が載置されない、流体通過口を有する、
細胞培養装置。
【請求項２】
前記ポリマー多孔質膜載置部を２以上備え、かつ、各前記ポリマー多孔質膜載置部が上下に平行に配置された、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記ポリマー多孔質膜載置部に、略垂直に配置された側部をさらに備え、
ここで前記側部が、１以上の培地流入部を有する、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記容器が、蛇腹状容器であって、ここで前記ポリマー多孔質膜載置部が、前記蛇腹状容器の凹部に配置された、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記培地排出部と一端部で連通した培地排出チューブと、
前記培地排出チューブの他端部と連通した培地貯槽と、
前記培地貯槽と一端部で連通した培地供給チューブと、
前記培地供給チューブに設けられたポンプと
をさらに備え、
ここで、前記培地供給チューブの他端部が、前記培地供給手段と連通されており、培地が循環することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記培地供給手段が、液滴化培地供給手段である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記ポリマー多孔質膜が、
ｉ）折り畳まれて、
ｉｉ）ロール状に巻き込まれて、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結されて、
ｉｖ）縄状に結まれて、及び／又は
ｖ）２以上が積層されて、
前記ポリマー多孔質膜載置部に載置されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものであって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、前記ポリマー多孔質膜載置部に載置されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１３に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項１３又は１４に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の細胞培養装置を使用する、細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置に関する。また、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を使用した細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、治療やワクチンに用いられる酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン、ウイルス（ウイルスタンパク質）等のタンパク質が培養細胞を用いて工業的に産生されている。しかし、こうしたタンパク質の生産技術は効率面に課題を抱えており、そのことが、持続的かつ広範な供給が不可欠であるバイオ医薬品のタイムリーな安定供給に影響を及ぼしている。そのため、効率的、安定かつ迅速なタンパク質の生産方法の確立に向けて、高密度に細胞を培養する技術や、高効率連続生産法などの、タンパク質の産生量を増大させるような革新的かつ簡便な技術が求められていた。
【０００３】
タンパク質を産生する細胞として、培養基材に接着する足場依存性の接着細胞が用いられることがある。こうした細胞は、足場依存的に増殖するため、シャーレ、プレート又はチャンバーの表面に接着させて培養する必要がある。従来、こうした接着細胞を大量に培養するためには、接着するための表面積を大きくする必要があった。ところが、培養面積を大きくするには、空間を必然的に増大させる必要があり、それが効率的生産や製造量の改善に課題を生じる要因となっていた。
【０００４】
培養空間を小さくしつつ、接着細胞を大量に培養する方法として、微小多孔を有する担体、特に、マイクロキャリアを用いた培養法が開発されている（例えば、特許文献１）。マイクロキャリアを用いた細胞培養系は、マイクロキャリアが互いに凝集しないようにするために十分に攪拌・拡散される必要がある。そのため、マイクロキャリアを分散させた培地を十分に攪拌・拡散することができるだけの容積が必要となるため、培養できる細胞の密度には上限がある。また、マイクロキャリアと培地とを分離するためには、細かな粒子を分別できるフィルターで分離させる必要があり、それが装置の複雑化や煩雑な作業を招き、方法論の伝播や効率的な実施を妨げる原因ともなっていた。こうした状況から、高密度の細胞を培養する革新的な細胞培養の方法論が希求されていた。
【０００５】
＜ポリイミド多孔質膜＞
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献２〜４は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。
【０００６】
細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００３／０５４１７４号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０３８８７３号
【特許文献３】特開２０１１−２１９５８５号公報
【特許文献４】特開２０１１−２１９５８６号公報
【特許文献５】国際公開第２０１５／０１２４１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を提供することを目的とする。また、本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を使用した細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、所定の構造を有するポリマー多孔質膜が、細胞を大量に培養可能な最適な空間を提供するのみならず、乾燥に強い湿潤環境を提供することを見出し、細胞を気相暴露して培養する装置及びそれを使用する培養方法を完成させた。すなわち、限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
【００１０】
［１］  容器と、
前記容器の底部から間隙を有するように配置されたポリマー多孔質膜載置部と、
前記ポリマー多孔質膜載置部に載置されたポリマー多孔質膜と、
前記ポリマー多孔質膜載置部の上部に設けられた培地供給手段と、
前記容器の一部に設けられた、培地排出部と
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通するものであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜載置部の少なくとも一部が、１以上の培地排出口を有し、
ここで、前記ポリマー多孔質膜載置部が、前記容器の内径より小さい、及び／又は、前記ポリマー多孔質膜載置部が、少なくともその一部に、ポリマー多孔質膜が載置されない、流体通過口を有する、
細胞培養装置。
［２］  前記ポリマー多孔質膜載置部を２以上備え、かつ、各前記ポリマー多孔質膜載置部が上下に平行に配置された、［１］に記載の細胞培養装置。
［３］  前記ポリマー多孔質膜載置部に、略垂直に配置された側部をさらに備え、
ここで前記側部が、１以上の培地流入部を有する、［１］又は［２］に記載の細胞培養装置。
［４］  前記容器が、蛇腹状容器であって、ここで前記ポリマー多孔質膜載置部が、前記蛇腹状容器の凹部に配置された、［１］又は［２］に記載の細胞培養装置。
［５］  前記培地排出部と一端部で連通した培地排出チューブと、
前記培地排出チューブの他端部と連通した培地貯槽と、
前記培地貯槽と一端部で連通した培地供給チューブと、
前記培地供給チューブに設けられたポンプと
をさらに備え、
ここで、前記培地供給チューブの他端部が、前記培地供給手段と連通されており、培地が循環することを特徴とする、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［６］  前記培地供給手段が、液滴化培地供給手段である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［７］  前記ポリマー多孔質膜が、
ｉ）折り畳まれて、
ｉｉ）ロール状に巻き込まれて、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結されて、
ｉｖ）縄状に結まれて、及び／又は
ｖ）２以上が積層されて、
前記ポリマー多孔質膜載置部に載置されている、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［８］  前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものであって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、前記ポリマー多孔質膜載置部に載置されている、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［９］  前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１０］  前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１１］  前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１２］  前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１３］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１４］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［１３］に記載の細胞培養装置。
［１５］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［１３］又は［１４］に記載の細胞培養装置。
［１６］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【００１１】
［１７］  ［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の細胞培養装置を使用する、細胞の培養方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、細胞培養担体としてポリマー多孔質膜を用いることにより、培養スペースを削減可能である。また、本発明の細胞培養装置を採用することにより、培地の量が少ない条件下でも、簡便かつ効率的な細胞培養を可能とする。さらに、本発明で使用されるポリマー多孔質膜は微親水性の多孔質特性を有し、ポリマー多孔質膜内に安定的に液を保持することができるため、乾燥に強い湿潤環境を提供する。そのため、従来の細胞培養装置と比較しても極めて少量の培地でも、細胞の生存及び増殖を達成することができる。さらにまた、ポリマー多孔質膜の一部又はすべてが空気に露出した状態であっても培養が可能であり、細胞に対して効率的に酸素を供給することが可能であり、大量の細胞の培養に適している。
【００１３】
本発明の細胞培養装置を採用すれば、用いる培地の量を極めて少なくすることができる。また、本発明の細胞培養装置に使用されるポリマー多孔質膜は、気相中に露出させながら培養可能であるため、ポリマー多孔質膜に担持された細胞への酸素供給は拡散によって十分に行われる。したがって、本発明の細胞培養装置は、別途酸素供給手段を必要としない。さらにまた、本発明の細胞培養装置は、任意の方向から液滴化した培地をポリマー多孔質膜へ供給するための供給手段を有しているため、ポリマー多孔質膜や細胞培養モジュールの任意の部位に存在する細胞に対し均質な培地を供給する事ができる。さらにまた、本発明は、ポリマー多孔質載置部が、容器の内径より小さい、及び／又は、ポリマー多孔質膜が、少なくともその一部に、ポリマー多孔質膜が載置されない、流体通過口を有することにより、ポリマー多孔質膜全体に細胞を均質に播種することが可能ととなり、また、細胞に効率的に酸素を供給することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、一実施形態における細胞培養措置のポリマー多孔質膜載置部を示す図である。（Ａ）複数のポリマー多孔質膜載置部を積層した細胞培養ユニットを斜め上からみた斜視図、（Ｂ）ポリマー多孔質膜載置部の平面図、（Ｃ）複数のポリマー多孔質膜載置部を積層した細胞培養ユニットを斜め下からみた斜視図を示す。
【図２】図２は、一実施形態におけるポリマー多孔質膜載置部と容器とを組み合わせた細胞培養装置の構成例を示す。容器の一部は内部構造を視認するために除去されている。
【図３】図３は、一実施形態における細胞培養装置の構成例を示す図である。図２に、ポリマー多孔質膜載置部の上部に培地拡散手段及びさらに培地供給手段を有する蓋部を組み合わせている。
【図４】図４は、一実施形態における細胞培養装置の構成例を示す図である。図２に、さらに培地供給手段を有する蓋部を組み合わせた構成を示す。
【図５】図５は、一実施形態におけるポリマー多孔質膜載置部の構成例を示す平面図である。
【図６】図６は、一の実施形態における細胞培養装置を示す。（Ａ）細胞培養装置の正面図を示す。（Ｂ）（Ａ）の断面図を示す。
【図７】図７は、一実施形態における細胞培養装置を示す。図６の細胞培養装置を形態変化させた後の細胞培養装置を示す。（Ａ）細胞培養装置の正面図を示す。（Ｂ）（Ａ）の断面図を示す。
【図８】図８は、一実施形態の細胞培養装置の使用態様を示す図である。
【図９】図９は、一実施形態における、細胞培養装置に適用されるモジュール化ポリイミド多孔質膜を示す平面図である。
【図１０】図１０は、一実施形態における、細胞培養装置に適用されるモジュール化ポリイミド多孔質膜を示す断面図である。図５のＢ−Ｂ断面を示している。
【図１１】図１１は、一実施形態における細胞培養装置の断面図を示す。
【図１２】図１２は、一実施形態の細胞培養装置を用いて細胞培養した時の抗体産生量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照しながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。
【００１６】
１．ポリマー多孔質膜
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１〜１５０μｍ、０．０１〜１００μｍ、０．０１〜５０μｍ、０．０１μｍ〜４０μｍ、０．０１μｍ〜３０μｍ、０．０１μｍ〜２５μｍ、０．０１μｍ〜２０μｍ、又は０．０１μｍ〜１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ〜２５μｍである。
【００１７】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ〜１００μｍ、２５μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜１００μｍ、３５μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、又は６０μｍ〜１００μｍであり、好ましくは、３０μｍ〜１００μｍである。
【００１８】
本明細書において、ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は面積平均孔径である。面積平均孔径は、以下の（１）及び（２）に従って求めることができる。なお、ポリマー多孔質膜表面以外の部位の平均孔径も同様にして求めることができる。
（１）多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真から、２００点以上の開孔部について孔面積Ｓを測定し、該孔面積を真円と仮定して式Ｉからそれぞれの孔径ｄを求める。
【数１】
2019126299.tif 000003
（２）上記式Ｉによって求められた全ての孔径を以下の式ＩＩに適用し、孔の形状が真円であるとした際の面積平均孔径ｄａを求める。
【数２】
2019126299.tif 000004
【００１９】
表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０１〜２０μｍである。
【００２０】
ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０〜５００μｍであり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは、０．０１〜２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。
【００２１】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜表面の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。
【００２２】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
【００２３】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。
【００２４】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式ＩＩＩに従って求めることができる。
【数３】
2019126299.tif 000005
（式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは総膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
【００２５】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜２５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。
【００２６】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
【００２７】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド多孔質膜、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である。
【００２８】
１−１．ポリイミド多孔質膜
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
【００２９】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。
【００３０】
一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００３１】
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
【００３２】
ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。
【００３３】
ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。
【００３４】
本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
【００３５】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。
【００３６】
着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。
【００３７】
炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。
【００３８】
また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００３９】
着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。
【００４０】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００４１】
これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
【００４２】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
【００４３】
これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
【００４４】
これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
【００４５】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
【００４６】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
【００４７】
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜２５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。
【００４８】
例えば、国際公開第２０１０／０３８８７３号、特開２０１１−２１９５８５号公報、又は特開２０１１−２１９５８６号公報に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。
【００４９】
１−２．ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
【００５０】
アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。
【００５１】
二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’−ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。
【００５２】
ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。
【００５３】
ポリエーテルスルホンの対数粘度は、多孔質ポリエーテルスルホン膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。
【００５４】
また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。
【００５５】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
対数粘度０．５〜１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％〜６０質量％と有機極性溶媒４０質量％〜９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、もしくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
【００５６】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ〜５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ〜５００μｍであり、かつ空孔率が５０％〜９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。
【００５７】
本発明の細胞培養装置に用いられる、細胞培養担体としての上述のポリマー多孔質膜は、微親水性の多孔質特性を有するため、ポリマー多孔質膜内に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境が保たれる。そのため、従来の細胞培養担体を用いる細胞培養装置と比較して、極めて少量の培地でも細胞の生存及び増殖を達成することができる。また、ポリマー多孔質膜の一部又はすべてが空気に露出した状態であっても培養が可能であるため、細胞に対して効率的な酸素供給を行うことができ、大量の細胞を培養することができる。
【００５８】
本発明によれば、用いる培地の量が極めて少なく、また、培養担体であるポリマー多孔質膜を気相に露出することができるため、細胞への酸素供給は拡散によって十分に行われる。したがって、本発明では特に酸素供給装置を必要としない。
【００５９】
２．細胞培養装置
本発明は、
容器と、
前記容器の底部から間隙を有するように配置されたポリマー多孔質膜載置部と、
前記ポリマー多孔質膜載置部に載置されたポリマー多孔質膜と、
前記ポリマー多孔質膜載置部の上部に設けられた培地供給手段と、
前記容器の一部に設けられた、培地排出部と
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通するものであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜載置部の少なくとも一部が、１以上の培地排出口を有し、
ここで、前記ポリマー多孔質膜載置部が、前記容器の内径より小さい、及び／又は、前記ポリマー多孔質膜載置部が、少なくともその一部に、ポリマー多孔質膜が載置されない、流体通過口を有する、細胞培養装置に関する。該細胞培養装置を、以下で、「本発明の細胞培養装置」とも呼ぶ。以下に本発明の細胞培養装置の実施態様について、図を示しながら説明する。
【００６０】
２−１．一実施形態における細胞培養装置
図１〜４は、一実施態様における本発明の細胞培養装置１を示す図である。ポリマー多孔質膜載置部２は、容器３内に収容され、容器３の底部３０から間隙を有するように配置されている。一実施態様において、ポリマー多孔質膜載置部２の縁部は、さらに略垂直に配置された側部２２を備え、ポリマー多孔質膜載置ユニット２０を形成している。ポリマー多孔質膜載置部２の少なくとも一部には、培地供給手段４から滴下された培地を排出するための培地排出口２１を１以上備えている。培地排出口２１の形状や数は、ポリマー多孔質膜９が脱落せず、かつ、培地を下段のポリマー多孔質膜載置部２へ排出する機能を有していればよい。本実施態様においては、大小複数の培地排出口２１を設けている。側部２２は、ポリマー多孔質膜載置部２に培地が供給されるように、１以上の培地流入部２３を有している。本実施態様において、培地流入部２３は、ポリマー多孔質膜載置部２に培地が供給されるように、側部２２の一部が除去された形態であればよく、図１のように凹形状であったり、窓形状であってもよい。培地流入部２３の位置、大きさ、形状は、目的に応じて適宜設計を変更してもよい。ポリマー多孔質膜載置部２の形状は、例えば図１のように円形であってもよく、三角形、四角形、五角形、多角形、楕円系など、任意の形態であってもよい。ポリマー多孔質膜載置ユニット２０は、図１のように２以上を上下に平行に配置して使用することがあるため、各ポリマー多孔質膜載置部２の形状が同一であることが好ましい。側部２２は、２以上のポリマー多孔質膜載置ユニット２０を積層して使用する場合、上段のポリマー多孔質膜載置２を支持する役割も果たす。
【００６１】
一実施形態において、図１のように、最下段のポリマー多孔質膜載置ユニット２０は、脚部２４を有している。脚部２４は、最下段のポリマー多孔質膜載置部２が、容器３の底部３０から隙間を形成する役割を果たす。これにより、最下段のポリマー多孔質膜載置部２にも効率的に酸素が供給されることとなる。また、脚部２４により、最下段のポリマー多孔質膜載置部２の培地排出口２１から滴下した培地が、容器３の培地排出部３１から効率的に排出される。
【００６２】
本明細書において、「培地」とは、細胞、特に動物細胞を培養するための細胞培養培地のことを指す。培地は、細胞培養液と同義の意味として用いられる。そのため、本発明において用いられる培地とは、液体培地のことを指す。培地の種類は、通常使用される培地を使用することが可能であり、培養する細胞の種類によって適宜決定される。
【００６３】
ポリマー多孔質膜載置部２には、ポリマー多孔質膜９が載置される。容器３本実施態様において、容器３は、積層したポリマー多孔質膜載置部２を収容する円筒形部分と、ポリマー多孔質膜載置部２の各段から滴下してきた培地を底部３０とから形成されている。培地排出部３１は、上部から滴下した培地を排出可能な機能を有するものであればよく、例えば、容器３の底部３０に設けられ、容器３の外部と連通した排出口や、容器３の外部から（例えば、蓋部４０から）導入されたチューブなどであってもよい。底部３０は、効率的に培地を集約する観点から、例えば、漏斗状であってもよい。容器３の形状は、上述のポリマー多孔質膜載置部２の形状に応じて適宜変更することが可能である。ポリマー多孔質膜載置部２の上部には、培地供給手段４が配置される。
【００６４】
培地供給手段４は、培地を液滴化培地として供給する液滴化培地供給手段が好ましい。本明細書において、「液滴化培地」とは、ミスト状化又は水滴化された培地をいい、本発明に用いられるポリマー多孔質膜９に噴射又は噴霧可能な状態の培地をいう。液滴化培地の径は限定されないが、例えば、重力によって自由落下せず、空気中に浮遊可能な程度に小さいミスト状の液滴化培地であってもよい。ミスト状の液滴化培地の径は、例えば、１μｍ〜１００μｍ程度であってもよく、さらに小さい径であってもよい。また、液滴化培地は、例えば、重力によって自由落下する水滴状の培地であってもよく、例えば、１００μｍ以上であってもよい。培地を液滴化する方法については、公知の手段により液滴化する方法を用いればよく、例えば、ミスト状ノズルやシャワーノズル等を用いて液滴化することができる。ただし、液滴化方法は、培地の成分を変化させない方法によって液滴化されなければならず、例えば、液滴化させる方法からは、蒸発させる方法は除かれる。
【００６５】
本発明の実施態様において、液滴化培地は、細胞を担持したポリマー多孔質膜９に供給される。液滴化した培地は、ポリマー多孔質膜９へ到達するまでの間に気相を通過し、培地中に酸素が溶け込むことになる。これにより、十分な量の酸素を有する培地が、継続的に供給されることとなり、細胞が虚血に陥ることなく、培養することが可能となる。また、ポリマー多孔質膜９が常に気相に暴露されているため、ポリマー多孔質膜９に付着している培地も常に酸素を取り込むことが可能となり、酸素を効率的に供給した培養が可能となる。
【００６６】
液滴化培地供給手段は、ポリマー多孔質膜載置部２の上部に配置されてもよく、ポリマー多孔質膜載置部２の側面側に配置されてもよく、ポリマー多孔質膜載置部２の下部に配置されてもよく、複数設けられても良い。本発明の実施形態において、液滴化培地供給手段は、密閉された容器３内に設けられてもよい。これにより、容器３の内部で、ミスト状の培地が充満し、細胞が担持されたポリマー多孔質膜９に一様に培地が供給されることとなる。
【００６７】
一実施態様において、培地供給手段４は、蓋部４０と一体となって提供される。蓋部４０は、容器３の上部に嵌まり、容器３を密閉する構造を有してもよい。一実施形態において、蓋部４０は、容器３の内部へ無菌的に酸素を供給するために、フィルター４２を有してもよい。
【００６８】
一実施態様において、さらに培地拡散手段２５を適用することにより、液滴をポリマー多孔質膜９全体に均質に供給することができる（図３参照）。培地拡散手段２５は、例えば、メッシュ構造を有するものであり、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼製のメッシュを用いることができるが、これに限定されない。培地拡散手段２５のメッシュ構造は、液滴の培地が適用された場合に、培地の表面張力によって培地拡散手段２５全体に拡散して、培地拡散手段２５の下面側に培地を供給できる程度の目開きを有していればよい。
【００６９】
一実施形態において、細胞培養装置１のポリマー多孔質膜載置部２は、容器３の内径より小さいことが好ましい。細胞培養装置１のポリマー多孔質膜載置部２が容器３の内径より小さく、クリアランス２６を有することにより、容器３が細胞を含む懸濁液で充填された場合に、細胞が容器３の内部で均質に拡散され、ポリマー多孔質膜載置部２に載置されたポリマー多孔質膜９に均質に細胞が播種されることとなる。また、クリアランス２６により、気体が容器３の内部に十分に拡散されることとなる。細胞培養装置１のポリマー多孔質膜載置部２の面積又は直径は、容器３の断面の面積又は直径より５％以上小さく、例えば、１０％以上、１５％以上、２０％、２５％以上、３０％以上小さい。
【００７０】
本発明の細胞培養装置１に、細胞を播種する場合、容器３に収容された全てのポリマー多孔質膜９が浸漬されるまで、細胞懸濁液を充填する。細胞懸濁液は、例えば、容器３の底部３０に設けられた培地排出部３１から供給される。細胞懸濁液は、泡が混入しない態様で供給されればよい。
【００７１】
図５は、細胞培養装置１のポリマー多孔質膜載置部２、及びポリマー多孔質膜載置部２に載置されたポリマー多孔質膜９の他の実施態様を示す。ポリマー多孔質膜載置部２の培地排出口２１は、図５（Ａ）のように、メッシュ構造を有してもよい。ポリマー多孔質膜載置部２に載置されたポリマー多孔質膜９は、図５（Ｂ）のように、膜状のポリマー多孔質膜９を載置してもよく、図５（Ｃ）のように、ケーシング９００にポリマー多孔質膜９が収容されたモジュール化ポリマー多孔質膜９０が載置されてもよい。膜状のポリマー多孔質膜９を用いる場合、ポリマー多孔質膜９は、ポリマー多孔質膜固定手段２７によって固定されることが好ましい。
【００７２】
２−２．他の実施形態における細胞培養装置
図６及び７は、他の実施態様における、細胞培養装置１’を示す図である。本発明の基本的な概念は、上記の細胞培養装置１と共通する。ここでは、上記細胞培養装置１で説明されていない構成について説明するが、本実施態様のみに適用されず、上記細胞培養装置１の各構成と組み合わせた態様であってもよい。
【００７３】
細胞培養装置１’の容器３’は、図６及び７に示すように、蛇腹状容器である。容器３’が、蛇腹構造を有することによって、必要な時に伸縮することができ、容器３’の容積を任意に変化させることが可能となる。例えば、細胞培養装置１’を使用しない場合は、容器３’を最小化させることにより、コンパクトに収容することが可能となる（図６参照）。また、細胞培養装置１’を使用する場合は、容器３’を拡張させて使用することができる（図７参照）。容器３’の蓋部４０’には吊り輪４３が設けられており、任意の場所に設けられたフック（図示しない）に引っかけることにより、使用することができる。
【００７４】
細胞培養装置１’の容器３’において、ポリマー多孔質膜載置部２’は、蛇腹状容器が括れている凹部に配置されている。ポリマー多孔質膜載置部２’は、例えば、図５に示されるように、その辺縁部２８に、１以上の流体通過口２９を有する。流体通過口２９を有することにより、容器３’に、細胞を含む懸濁液で充填された場合に、細胞が容器３’の内部に均質に拡散され、ポリマー多孔質膜載置部２’に載置されたポリマー多孔質膜９に均質に細胞を播種することができる。また、流体通過口２９により、気体が容器３’の内部に十分に拡散されることとなる。
【００７５】
容器３’は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼製によって形成されてもよく、これに限定されない。細胞培養装置１’の容器３’において、ポリマー多孔質膜載置部２’は、任意の数が設けられてよく、例えば、２段、３段、４段、５段、６段、７段、８段、９段、１０段、又はそれ以上の段数が設けられてもよい。
【００７６】
容器３’が、図６のように収縮できることにより、細胞懸濁液供給部４４から供給される細胞懸濁液が、少ない量で提供されてもよく、これによって、細胞密度が高めた細胞懸濁液が提供され、均質かつ効率的に、ポリマー多孔質膜９に細胞を播種することが可能となる。
【００７７】
細胞懸濁液供給部４４は、容器３’の上部に設けられた蓋部４０’に設けられており、細胞懸濁液供給部４４は、第１細胞懸濁液供給チューブ４４０が接続されている。第１細胞懸濁液供給チューブ４４０には、無菌接続継手４４２が設けられてもよい。無菌接続継手４４２により、細胞懸濁液を含む他の容器に接続された第２細胞懸濁液供給チューブ４４１と無菌的に接続することができる。無菌接続継手４４２は市販されているものを利用することができ、例えば、ザルトリウス社（ドイツ）やポール社（米国）などから入手し、使用することができる。
【００７８】
細胞培養装置１’の容器３’に設けられた培地排出部３１’には、さらにバルブ３３が設けられてもよい。バルブ３３を閉じることにより、容器３’に一時的に細胞懸濁液を溜めることができ、細胞がポリマー多孔質膜９に播種された後、バルブ３３を開くことにより、細胞懸濁液を排出することができる。
【００７９】
図８は、本発明の細胞培養装置１’のさらなる構成例を示す図である。培地排出部３１’は第１培地排出チューブ３２０の一端部と連通し、第１培地排出チューブ３２０の他端部は、第１培地貯槽７と連通している。第１培地貯槽７は、さらに、第１培地供給チューブ４１０の一端部と連通しており、第１培地供給チューブ４１０の他端部は培地供給手段４’と連通している。これにより、第１培地貯槽７は、細胞培養装置１’から排出された培地が貯留され、貯留された培地が再び細胞培養装置１’内に供給され、培地を循環させる。培地を循環させることで、ポリマー多孔質膜に担持された細胞によって産生されるタンパク質の濃度が高くなり、タンパク質回収効率を上げることが可能となる。第１培地貯槽７内に排出される培地を定期的に交換することで、新鮮な培地を供給することも可能である。あるいは、第１培地貯槽７へ新鮮な培地を供給する第２培地貯槽７０がさらに設けられてもよい。さらに、第１培地貯槽７から培地を排出する第３培地貯槽７００が設けられてもよい。各チューブの途中には、培地を汲み上げるためのポンプ８を備える。ポンプ８の種類は、特に限定されないが、例えばペリスタポンプ等が使用可能である。
【００８０】
２−３．細胞培養装置に適用されるポリマー多孔質膜の形態
本発明の実施形態で使用されるポリマー多孔質膜は、例えば、ｉ）折り畳んで、ｉｉ）ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、及び／又は、ｉｖ）縄状に結んで、ポリマー多孔質膜載置部（２、２’）上に適用されてもよい。また、本発明の実施形態で使用されるポリマー多孔質膜は、ｖ）２以上が積層されて、ポリマー多孔質膜載置部（２、２’）上に適用されてもよい。ｉ）〜ｖ）のように形状を加工することにより、一定容量の細胞培養培地中に多くのポリマー多孔質膜を入れることができる。
【００８１】
本発明の実施態様で使用されるポリマー多孔質膜は、モジュール化されたポリマー多孔質膜（以下、「モジュール化ポリマー多孔質膜」という。）が使用されてもよい。本明細書において「モジュール化ポリマー多孔質膜」とは、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜をいう。本明細書において、「モジュール化ポリマー多孔質膜」との記載は、単に「モジュール」と記載することができ、相互に変更しても同一のことを意味する。
【００８２】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜が備えるケーシングは、２以上の細胞培地流出入口を有し、該細胞培地流出入口によって培地がケーシングの内外へ流出入する。該ケーシングの細胞培地流出入口の径は、ケーシングの内部へ細胞が流入可能であるように、前記細胞の径よりも大きいことが好ましい。また、細胞培地流出入口の径が、該細胞培地流出入口よりポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さいことが好ましい。ポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい径は、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜の形状、大きさによって適宜選択可能である。例えば、ポリマー多孔質膜がひも状である場合、該ポリマー多孔質膜の短辺の幅より小さく、該ポリマー多孔質膜が流出しない適度の径であれば特に限定されない。該細胞培地流出入口の数は、細胞培地がケーシング内外へ供給及び／又は排出されやすいように、出来るだけ多く設けられていることが好ましい。好ましくは、５以上、好ましくは１０以上、好ましくは２０以上、好ましくは５０以上、好ましくは１００以上である。細胞培地流出入口は、ケーシングの一部又は全部が、メッシュ状の構造を有していてもよい。また、該ケーシング自体がメッシュ状であってもよい。本発明において、メッシュ形状の構造とは、例えば、縦、横、及び／又は斜めの格子状の構造を有するものであって、各目開きが、流体が通過出来る程度に細胞培地流出入口を形成するものであるが、これに限定されない。
【００８３】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜のケーシングは、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼などの金属などが挙げられるが、細胞の培養に影響を与えない素材であれば特に限定されない。
【００８４】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜は、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
該ケーシング内に収容されたものであって、該モジュール化ポリマー多孔質膜を細胞培養部２へ適用することが可能である。
【００８５】
本明細書において、「ケーシング内に２以上の独立した該ポリマー多孔質膜が集約されて収容されている」とは、互いに独立した２以上のポリマー多孔質膜が、ケーシングで囲まれた一定空間内に集約されて収容されている状態を指す。本発明において、２以上の独立した該ポリマー多孔質膜は、該ポリマー多孔質膜の少なくとも１カ所と該ケーシング内の少なくとも１カ所とを任意の方法によって固定され、該ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態に固定されたものであってもよい。また、２以上の独立したポリマー多孔質膜は、小片であってもよい。小片の形状は、例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形をとりうるが、好ましくは、ひも状、又は四角が好ましい。本発明において、小片の大きさは、任意の大きさをとりうるが、ひも状である場合、長さは任意の長さでよいが、幅は、８０ｍｍ以下がよく、好ましくは３０ｍｍ以下がよく、より好ましくは１０ｍｍ以下がよい。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止される。本発明において、ポリマー多孔質膜の小片が四角である場合、略正方形であることがより好ましく、その一辺の長さは、ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態となるように、ケーシングの内壁に沿って、又は内壁の一辺の長さより短く（例えば、０．１ｍｍ〜１ｍｍ程度短い）形成されたものであればよい。また、本発明において、ポリマー多孔質膜の小片が略正方形である場合、長さは任意の長さでよいが、例えば、８０ｍｍ以下がよく、好ましくは５０ｍｍ以下がよく、より好ましくは３０ｍｍ以下がよく、さらにより好ましくは２０ｍｍ以下がよく、１０ｍｍ以下であってもよい。
【００８６】
本明細書において、「折り畳まれたポリマー多孔質膜」とは、該ケーシング内にて折り畳まれていることで、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔質膜である。本明細書において、「折り畳まれた」とは、ポリマー多孔膜に折り目がついた状態であってもよく、折り目がついていない状態であってもよい。
【００８７】
本明細書において、「ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜」とは、ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔質膜をいう。また、本発明おいて、縄状に編み込まれたポリマー多孔質膜とは、例えば短冊状の複数のポリマー多孔質膜を、任意の方法によって縄状に編み込み、ポリマー多孔質膜同士の摩擦力によって互いに動かない状態のポリマー多孔質膜をいう。（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が集約されたポリマー多孔質膜、（ｉｉ）折り畳まれたポリマー多孔質膜、（ｉｉｉ）ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜、及び（ｉｖ）縄状に結ばれたポリマー多孔質膜、が、組み合わせられてケーシング内に収容されていてもよい。
【００８８】
本明細書において、「該ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態」とは、該モジュール化ポリマー多孔質膜を細胞培養培地中で培養する場合に、該ポリマー多孔質膜が継続的に形態変化しない状態になるようにケーシング内に収容されている状態をいう。換言すれば、該ポリマー多孔質膜自体が、流体によって、継続的に波打つ動きを行わないように抑制された状態である。ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態を保つため、ポリマー多孔質膜内で生育されている細胞にストレスが加えられることが防止され、細胞が死滅されることなく安定的に細胞が培養可能となる。
【００８９】
図９及び図１０では、一実施形態におけるモジュール化ポリマー多孔質膜９０の構造を示す。モジュール化ポリマー多孔質膜９０は、複数のポリマー多孔質膜９の積層体が、ケーシング９００に収容されている。積層されるポリマー多孔質膜９は小片であってもよく、その形状は例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形であってもよい。好ましくは、積層されるポリマー多孔質膜９の小片は略正方形である。小片の大きさは、任意の大きさをとり得る。小片が略正方形である場合、その長さは特に限定されないが、例えば、８０ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、２０ｍｍ以下又は１０ｍｍ以下である。
【００９０】
ケーシング９００に収容されるポリマー多孔質膜９が、複数のポリマー多孔質膜９の積層体である場合、好ましくは、２枚以上、３枚以上、４枚以上又は５枚以上であって、かつ１００枚以下、５０枚以下、４０枚以下、３０枚以下、２０枚以下、１５枚以下又は１０枚以下のポリマー多孔質膜の積層体であり、より好ましくは３〜１００枚の、より好ましくは５〜５０枚のポリマー多孔質膜の積層体である。
【００９１】
ケーシング９００に収容されるポリマー多孔質膜９が、複数のポリマー多孔性膜の積層体である場合、ポリマー多孔質膜９とポリマー多孔質膜９の間には中敷き９０１が設けられてもよい（図１０参照）。中敷き９０１が設けられることにより、積層されたポリマー多孔質膜９の間に効率的に培地を供給させることができる。中敷き９０１は、積層されたポリマー多孔質膜９の間に任意の空間を形成し、効率的に培地を供給させる機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、メッシュ構造を有する平面構造体を用いることができる。中敷き９０１の材質は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼製のメッシュを用いることができるが、これに限定されない。メッシュ構造を有する中敷き９０１を有する場合、積層されたポリマー多孔質膜９の間に培地を供給できる程度の目開きを有していればよく、適宜選択することができる。
【００９２】
３．細胞培養装置を使用した細胞培養方法
＜細胞をポリマー多孔質膜へ適用する工程＞
本発明で使用される細胞のポリマー多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
【００９３】
（Ａ）細胞を前記ポリマー多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
（Ｂ）前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞懸濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
（Ｃ）前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリマー多孔質膜に細胞懸濁液を装填し、そして、
細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
【００９４】
（Ａ）の態様は、ポリマー多孔質膜の表面に細胞、細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリマー多孔質膜を細胞懸濁液中に入れて、膜の表面から細胞培養液を浸潤させる態様も含む。
【００９５】
ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、ポリマー多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞はポリマー多孔質膜に接着する。ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。
【００９６】
（Ｂ）の態様において、ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞懸濁液を載せる。ポリマー多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませることにより、細胞懸濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリマー多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の細胞懸濁液が装填された箇所に細胞が吸い込まれて播種される。
【００９７】
あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリマー多孔質膜に細胞懸濁液を装填してもよい。この場合、細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。
【００９８】
例えば、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法（以後、これを「一点ウェット法」と記載する）を用いることができる。一点ウェット法は、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、ポリマー多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に細胞懸濁液を装填する方法も用いることができる（以後、これを「ウェット膜法」と記載する）。この場合、ポリマー多孔質膜の全体において、細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。
【００９９】
（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる。これにより細胞懸濁液中の細胞の濃度を濃縮する、細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。
【０１００】
（Ａ）の態様を「自然播種」（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。
【０１０１】
限定されるわけではないが、好ましくは、ポリマー多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の方法の好ましい実施形態において、生細胞が前記ポリマー多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。
【０１０２】
態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液もしくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、(+)及び(-)Dulbecco’s PBS 、(+)及び(-)Hank's Balanced Salt Solution等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。
【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
さらに、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、浮遊状態にある接着性細胞をポリマー多孔質膜と懸濁的に共存させることにより細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の方法において、細胞をポリマー多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリマー多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で存在する。ポリマー多孔質膜の性質から、細胞はポリマー多孔質膜に接着しうる。よって、生来浮遊培養に適さない接着性の細胞であっても、ポリマー多孔質膜を用いることにより、ポリマー多孔質膜に吸着させた状態で浮遊させながら培養することが可能となる。好ましくは、細胞は、ポリマー多孔質膜に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞がポリマー多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。
【０１０５】
上述した細胞のポリマー多孔質膜への適用は、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）〜（Ｃ）のうち、２つ以上の方法を組み合わせてポリマー多孔質膜に細胞を適用してもよい。細胞を担持させたポリマー多孔質膜を、上述の細胞培養装置における、ポリマー多孔質膜載置部へ適用して、培養することが可能である。
【０１０６】
その他、予め、ポリマー多孔質膜が載置されたポリマー多孔質膜載置部に、懸濁された細胞が含まれる培地を、細胞供給手段４より滴下して播種してもよい。
【０１０７】
あるいは、容器を、細胞が含まれた細胞懸濁液で充填することにより（例えば、細胞懸濁液面Ｌまで細胞懸濁液を充填する）、ポリマー多孔質膜載置部に載置されたポリマー多孔質膜９に、均質に細胞を播種することができる。これにより、ポリマー多孔質膜９に播種された細胞が、部分的にコンフルエントになることを防ぎ、効率よく増殖可能となり、好ましい。
【０１０８】
本明細書において、「懸濁された細胞」とは、例えば、トリプシン等のタンパク質分解酵素によって、接着細胞を強制的に浮遊させて培地中に懸濁して得られた細胞や、公知の馴化工程によって、培地中に浮遊培養可能となった接着細胞などを含んでいる。
【０１０９】
本発明に利用し得る細胞の種類は、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。動物細胞は、脊椎動物門に属する動物由来の細胞と無脊椎動物（脊椎動物門に属する動物以外の動物）由来の細胞とに大別される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。
【０１１０】
本発明に利用しうる動物細胞の種類は、限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及び生殖細胞からなる群から選択される。
【０１１１】
本明細書において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開第２００９／１２３３４９号（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
【０１１２】
「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。
【０１１３】
「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージもしくは巨核球の血球細胞から選択される。
【０１１４】
「生殖細胞」は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞を意味する。例えば、有性生殖のための配偶子、即ち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子などを含む。
【０１１５】
細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択してもよい。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌で、軟部肉腫、悪性骨腫瘍などを含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」とは、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ−６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）、ＢＨＫ細胞（新生児ハムスター腎臓細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児線維芽細胞由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する細胞株が存在する。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。
【０１１６】
本明細書において、「接着細胞」とは、一般に、増殖のために適切な表面に自身を接着させる必要がある細胞であって、付着細胞又は足場依存性細胞ともいわれる。本発明のいくつかの実施形態では、使用する細胞は接着細胞である。本発明に用いられる細胞は、接着細胞であって、より好ましくは、培地中に懸濁した状態でも培養可能な細胞である。懸濁培養可能な接着細胞とは、公知の方法によって、接着細胞を懸濁培養に適した状態へ馴化させることによって得ることが可能であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などや、これらの細胞から派生して得られた細胞株が挙げられる。
【０１１７】
本発明の細胞の培養方法では、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の細胞の培養方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の細胞を培養することが可能となる。例えば、ポリマー多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の細胞を長期にわたって培養することができる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。
【０１１８】
本明細書において、細胞を含まないポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリマー多孔質膜体積」と呼称する。そして、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、ポリマー多孔質膜の表面及び内部に細胞が担持された状態において、ポリマー多孔質膜、細胞、及びポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積」と呼称する。膜厚２５μｍのポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数のポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、細胞を担持した複数のポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。
【０１１９】
本発明の方法を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。
【０１２０】
つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する細胞の数を増やしたい場合は、積層するポリマー多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられるポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。
【０１２１】
本明細書において、細胞の大量培養とは、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数が、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、５．０×１０8個以上、１．０×１０9個以上、２．０×１０9個以上、または５．０×１０9個以上となるまで培養することをいう。
【０１２２】
なお、培養中または培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数を、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、ＣＣＫ８（次文参照）を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ  Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、ポリマー多孔質膜を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、細胞を適用し、培養したポリマー多孔質膜を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１〜３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４６０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。
【０１２３】
また、別の観点からは、細胞の大量培養とは、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後にポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０5個以上、２．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、または５．０×１０8個以上となるまで培養することをいう。ポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、セルカウンター等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。
【実施例】
【０１２４】
以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１２５】
以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は１９μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４２μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７４％であった。
【０１２６】
（実施例１）
筒型気相培養装置によるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法
【０１２７】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、９．９×１０６になるまで培養を継続した。振盪培養向け酸素透過バッグにモジュール１０個を入れ、ＣＯ２インキュベータ内で終夜振盪培養を行った。
【０１２８】
翌日、モジュールを取り出し、図１〜４に示す筒型気相培養装置の細胞培養部（各細胞培養部の培地排出口は平行の位置関係である）にモジュール１０個を設置し、液溜め（図８の第１培地貯槽７に相当）には、３５０ｍｌの培地（コージンバイオ製ＫＢＭ２７０）を貯留し同培地をチューブポンプ経由で毎分２０ｍｌの速度で循環させた。４日後に培養を終了した所、細胞密度２．５×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数５．０×１０７個の細胞が観察された。酸素供給装置を使用せず、コンパクトかつ簡便な設備で、大量の抗体産生細胞を培養出来る事実が示された。
【０１２９】
（実施例２）
筒型気相培養装置によるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法
【０１３０】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、２．４×１０６になるまで培養を継続した。ナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套（ケーシング）を形成し滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じたモジュール３０個を酸素透過型培養バッグに滅菌的に封入し、上記培養液３０ｍｌを注加した。ＣＯ２インキュベータ内で終夜放置した後、翌日、モジュールを取り出し、図１〜４に示す筒型気相培養装置の細胞培養部にモジュール３０個を設置し、液溜め（図８の第１培地貯槽７に相当）には、３００ｍｌの培地（コージンバイオ製ＫＢＭ２７０）を貯留し、同培地をチューブポンプ経由で毎分２０ｍｌの速度で循環させた。
【０１３１】
４日後に培養を終了した所、細胞密度７．１×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数５．８×１０７個の細胞が観察された。酸素供給装置を使用せず、コンパクトかつ簡便な設備で、大量の抗体産生細胞を培養出来る事実が示された。
【０１３２】
（実施例３）
液滴化培地供給手段を備えた細胞培養装置（以下、「ミスト及びシャワー型リアクター」という）によるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法
【０１３３】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、３．９×１０６になるまで培養を継続した。１０ｃｍ径シャーレ１枚に上記浮遊培養液を夫々１２ｍｌ注加した後、ナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套（ケーシング）を形成し滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じたモジュール１２個を同シャーレに加えた。モジュールを細胞懸濁液で湿潤した後、ＣＯ２インキュベータ内で終夜放置した。
【０１３４】
翌日、モジュールを取り出し、ミスト及びシャワー型リアクターの内部にモジュール１２個を設置し、培地貯槽には、２００ｍｌの培地を（ＦＢＳ２％を含むＩＭＤＭ）貯留し、同培地をチューブポンプ経由で毎分６０ｍｌの速度で循環させた。２日後に培養を終了した所、細胞密度３．４×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数８．２×１０６個の細胞が観察された。
【０１３５】
（実施例４）
ミスト及びシャワー型リアクターによるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法
【０１３６】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、９．９×１０６になるまで培養を継続した。振盪培養向け酸素透過バッグにモジュール１０個を入れ、ＣＯ２インキュベータ内で終夜振盪培養を行った。
【０１３７】
翌日、振盪バッグよりモジュールを取り出し、実施例３と同様の条件で、ミスト及びシャワー型リアクターによる細胞培養を行った。培地貯槽には、２００ｍｌの培地（コージンバイオ製ＫＢＭ２７０）を貯留し同培地をチューブポンプ経由で毎分６０ｍｌの速度で循環させた。４日後に培養を終了した所、細胞密度８．８×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数１．８×１０７個の細胞が観察された。
【０１３８】
（実施例５）
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が３．９８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、（総細胞数４．１１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率９７％）になるまで培養を継続した。図９及び１０に示す構造を有するモジュールを８０個用意し、希釈したミルトン（登録商標）（杏林製薬、日本）、超純水、７０％エタノール含有水にて洗浄した後、滅菌的に乾燥し、準備を完了した。各成分の経時変化を表２に示す。尚、モジュールで使用したポリイミド多孔質膜のサイズは、１．０×１．０ｃｍであり、ポリイミド多孔質膜総枚数は１６００枚、総面積は１６００ｃｍ２となる。３Ｄプリンターにて準備した気相バイオリアクター１（図３）を用意し、各段に１６個ずつ、合計８０個のモジュールを滅菌的に設置し、更に各層毎のモジュール群を滅菌的にメッシュで覆い、更に培地循環ポンプで上下流路を連結してバイオリアクター準備を完了した。
【０１３９】
上記にて準備した気相培養装置に、ＣＨＯ  ＤＰ−１２浮遊細胞培養液（総細胞数４．１１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞数３．９８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死細胞数１．２９×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率９７％）２４．０ｍＬと浮遊細胞用培地ＢａｌａｎＣＤ（登録商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）２４．０ｍＬ、及び、コージンバイオ株式会社製ＣＨＯ細胞単層培養培地ＫＢＭ２７０  ２３０．０ｍＬ、の混合液を添加し、ＣＯ２インキュベータ内で３時間静置して細胞吸着を実行した。３時間後に回収された培地には細胞は殆ど観察されず、細胞吸着率１００％であった。この時点での予想平均細胞密度は、６．００×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２であった。
【０１４０】
細胞吸着に用いた培地を排出し、コージンバイオ株式会社製ＣＨＯ細胞単層培養培地ＫＢＭ２７０  １２０ｍｌを気相培養装置内で循環させ培養を開始した。培地交換は毎日行い、培地中の一日当たりのグルコール消費量、乳酸産生量、乳酸脱水素酵素量および抗体の産生量をロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃｅｄｅｘ  Ｂｉｏを用いて５日間測定した。経時的にグルコース消費及び抗体・乳酸の産生が向上し、安定的な細胞培養が進展している事が観察された。結果を表２に示す。
【表２】
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【０１４１】
（実施例６）
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が３．３１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、（総細胞数３．３９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率９８％）になるまで培養を継続した。実施例１で用いたモジュールと同等の形態のモジュールを６０個用意し、希釈したミルトン（登録商標）（杏林製薬、日本）、超純水、７０％エタノール含有水にて洗浄した後、滅菌的に乾燥し、準備を完了した。各実験の構成を表１に示す。尚、モジュールに使用したポリイミド多孔質膜のサイズは、１．０×１．０ｃｍであり、ポリイミド多孔質膜総枚数は１０８０枚、総面積は１０８０ｃｍ２となる。
【０１４２】
シャーレ（φ５７．３ｍｍ、住友ベークライト株式会社製、浮遊細胞培養用シャーレ６０）のシャーレ本体（図１１：ポリマー多孔質膜載置ユニット上部２０ｂ）と、蓋部（図１１：ポリマー多孔質膜載置ユニット下部２０ｃ）とを反転し、図１１のように接着させた。その後、接着面に、縦φ６ｍｍ×横φ３ｍｍの楕円形状の穴（図１１：培地排出口２１ａ）を３列×５列×３列（計１１箇所）で等間隔に設けた。得られた構造体を５段積み重ねた（図１１）。各段に１２個ずつ、合計６０個のモジュールを滅菌的に設置して、それを容器３ａ内に設置した。更に培地循環ポンプで上下流路を連結してバイオリアクター準備を完了した（図１１参照）。
【０１４３】
上記にて準備した気相培養装置に、ＣＨＯ  ＤＰ−１２浮遊細胞培養液（総細胞数４．１１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞数３．９８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死細胞数１．２９×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率９７％）１９．６ｍＬと浮遊細胞用培地ＢａｌａｎＣＤ（登録商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）４０．４ｍＬ、及び、コージンバイオ株式会社製ＣＨＯ細胞単層培養培地ＫＢＭ２７０  １２０．０ｍＬ、の混合液を添加し、ＣＯ２インキュベータ内で３時間静置して細胞吸着を実行した。３時間後に回収された培地には細胞は殆ど観察されず、細胞吸着率１００％であった。この時点での予想平均細胞密度は、６．００×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２であった。
【０１４４】
細胞吸着に用いた培地を排出し、コージンバイオ株式会社製ＣＨＯ細胞単層培養培地ＫＢＭ２７０  ８０ｍｌを気相培養装置内で循環させ培養を開始した。培地交換は毎日行い、培地中の一日当たりのグルコール消費量、乳酸産生量、乳酸脱水素酵素量および抗体の産生量をロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃｅｄｅｘ  Ｂｉｏを用いて８日間測定した。経時的にグルコース消費及び抗体・乳酸の産生が向上し、安定的な細胞培養が進展している事が観察された。抗体産生結果を図１２に示す。抗体の安定かつ高効率な連続的産生が確認された。
【符号の説明】
【０１４５】
１、１’、１ａ    細胞培養装置
２    ポリマー多孔質膜載置部
２０、２０ａ    ポリマー多孔質膜載置ユニット
２０ｂ    ポリマー多孔質膜載置ユニット上部（シャーレ本体）
２０ｃ    ポリマー多孔質膜載置ユニット下部（シャーレ蓋部）
２１、２１ａ    培地排出口
２２    側部
２３    培地流入部
２４    脚部
２５    培地拡散手段
２６    クリアランス
２７    ポリマー多孔質膜固定手段
２８    辺縁部
２９    流体通過口
３、３’、３ａ    容器
３０、３０’    底部
３１、３１’、３１ａ    培地排出部
３１０    培地排出部孔
３２    培地排出部端部
３２０    第１培地排出チューブ
３３    バルブ
４、４’、４ａ    培地供給手段
４０、４０’    蓋部
４１    培地供給口
４１０    第１培地供給チューブ
４２    フィルター
４３    吊り輪
４４    細胞懸濁液供給部
４４０    第１細胞懸濁液供給チューブ
４４１    第２細胞懸濁液供給チューブ
４４２    無菌接続継手
７    第１培地貯槽
７０    第２培地貯槽
７００    第３培地貯槽
７０１    第２培地供給チューブ
７０２    第２培地排出チューブ
７１    培地
７４    フィルター
８    ポンプ
９    ポリマー多孔質膜
９０    モジュール化ポリマー多孔質膜
９００    ケーシング
Ｌ    細胞懸濁液面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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