(57)【要約】【課題】発現性に優れ、汎用性の高いプロモーターを提供する。【解決手段】本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡは、以下に示させるＤＮＡから選ばれる一種であり、ベクターはそのＤＮＡを有するもの、形質転換植物体はそのＤＮＡが導入されたものである。配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列のＤＮＡ、それらの塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ、それらの塩基配列の１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、それらの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、
プロモーター機能を有することを特徴とするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３７で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号３７で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３７で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを有するベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
【請求項４】
下記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、
プロモーター機能を有することを特徴とするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号３８で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号３８で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｇ）配列番号３８で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列番号３８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡを有するベクター。
【請求項６】
請求項４に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
【請求項７】
下記（ｉ）〜（ｌ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、
プロモーター機能を有することを特徴とするＤＮＡ。
（ｉ）配列番号３９で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｊ）配列番号３９で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｋ）配列番号３９で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｌ）配列番号３９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡを有するベクター。
【請求項９】
請求項７に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
【請求項１０】
下記（ｍ）〜（ｐ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、
プロモーター機能を有することを特徴とするＤＮＡ。
（ｍ）配列番号４０表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｎ）配列番号４０で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｏ）配列番号４０で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｐ）配列番号４０で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項１１】
請求項１０に記載のＤＮＡを有するベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
【請求項１３】
下記（ｑ）〜（ｔ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、
プロモーター機能を有することを特徴とするＤＮＡ。
（ｑ）配列番号４１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｒ）配列番号４１で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｓ）配列番号４１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｔ）配列番号４１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項１４】
請求項１３に記載のＤＮＡを有するベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
【請求項１６】
下記（ｕ）〜（ｙ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、
プロモーター機能を有することを特徴とするＤＮＡ。
（ｕ）配列番号４２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｖ）配列番号４２で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｗ）配列番号４２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｙ）配列番号４２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項１７】
請求項１６に記載のＤＮＡを有するベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒマの形質転換に使用可能なヒマ由来のプロモーター機能を有するＤＮＡ、前記ＤＮＡを有するベクター、前記ＤＮＡが導入された形質転換植物体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒマ（トウゴマの別名、学名：Ricinus communis L.）の種子は、毒性を有するため食用には不向きだが、種子に４０〜６０%含まれるヒマシ油が、例えばウレタン樹脂材料、潤滑油や各種油剤原料、塗料やインクやシーラント用添加剤等の工業用途で非常に有用視されている。そして、ヒマの形質転換に係る技術について提案等されている（特許文献１参照）。
また、ヒマについては、ドラフトゲノムのＤＮＡの解析結果が開示されている（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１１−５０５１６３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Agnes et.al. Draft genome sequence of the oilseed species Ricinus communis，NATURE BIOTECHNOLOGY，VOLUME 28，NUMBER 9，SEPTEMBER 2010:951-959
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ヒマについては、非特許文献１でドラフトゲノムのＤＮＡ解析がなされたが、形質転換で重要なプロモーター領域については、未だ有用な技術提案等がなされていない。
特に、形質転換系の技術は、標的配列のデザインの簡便化や実験手法の容易化等に関する進歩がめざましく、こうした新しい技術にも対応可能な汎用性の高いプロモーター機能を有するＤＮＡ（核酸）が要請されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記従来の問題点を解決する手段として、本発明は以下に示される。
１．下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、プロモーター機能を有することを特徴とするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３７で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号３７で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３７で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
２．上記１．に記載のＤＮＡを有するベクター。
３．上記１．に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
４．下記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、プロモーター機能を有することを特徴とするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号３８で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号３８で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｇ）配列番号３８で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列番号３８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
５．上記４．に記載のＤＮＡを有するベクター。
６．上記４．に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
７．下記（ｉ）〜（ｌ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、プロモーター機能を有することを特徴とするＤＮＡ。
（ｉ）配列番号３９で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｊ）配列番号３９で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｋ）配列番号３９で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｌ）配列番号３９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
８．上記７．に記載のＤＮＡを有するベクター。
９．上記７．に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
１０．下記（ｍ）〜（ｐ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、プロモーター機能を有することを特徴とするＤＮＡ。
（ｍ）配列番号４０表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｎ）配列番号４０で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｏ）配列番号４０で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｐ）配列番号４０で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
１１．上記１０．に記載のＤＮＡを有するベクター。
１２．上記１０．に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
１３．下記（ｑ）〜（ｔ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、プロモーター機能を有することを特徴とするＤＮＡ。
（ｑ）配列番号４１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｒ）配列番号４１で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｓ）配列番号４１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｔ）配列番号４１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
１４．上記１３．に記載のＤＮＡを有するベクター。
１５．上記１３．に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
１６．下記（ｕ）〜（ｙ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、プロモーター機能を有することを特徴とするＤＮＡ。
（ｕ）配列番号４２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｖ）配列番号４２で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｗ）配列番号４２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｙ）配列番号４２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
１７．上記１６．に記載のＤＮＡを有するベクター。
１８．上記１６．に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、発現性に優れ、汎用性の高いプロモーター機能を発揮するＤＮＡ（核酸）を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】プラスミドの組み換え反応を示す説明図。
【図２】蛍光タンパク質を導入したヒマの葉の蛍光写真を表す説明図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のＤＮＡ（プロモーター）は、植物体のヒマ（トウゴマの別名、学名：Ricinus communis L.）から調整したゲノムＤＮＡから得られたＤＮＡであり、Ｕ６ｓｎＲＮＡをコードすると予測される領域の上流域に存在するプロモーター領域を含むＤＮＡである。
本発明のＤＮＡは、プロモーター領域を含むＤＮＡであり、汎用性及び発現性に優れたプロモーター機能を有する。
尚、本明細書において、本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡを「プロモーターＤＮＡ」ともいう。
【００１０】
本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ（ＤＮＡ断片）は、以下の（１）〜（４）の態様で示されるＤＮＡのうちの一種である。
（１）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
（２）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ、
（３）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、
（４）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
また、本明細書において、本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡを「プロモーターＤＮＡ」ともいう。
【００１１】
上記態様（２）における、本発明におけるＤＮＡの塩基配列の同一性については、プロモ−ター機能を発揮すればよく、７０％以上の同一性を有する塩基配列であればよく、好ましくは８０％以上であるが、本発明では９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡである。また、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００１２】
塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Karlin S and Altschul SF (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268; (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 5873-5877）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えば、score = 100、wordlength = 12とする。
【００１３】
上記態様（３）における本発発明のＤＮＡは、本発明のプロモーター機能を有するものであれば、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡでも構わない。この場合、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列において、その３’末端に翻訳効率を上げる塩基配列などを含むものや、プロモーター活性を失うことなく、その５’末端を欠失したものも含まれる。
【００１４】
また、上記態様（４）におけるＤＮＡは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡである。この「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。そのような条件の例としては、配列番号1又は2の配列と相同性の高いＤＮＡが、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし、それより低い相同性のＤＮＡが相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズしない条件が挙げられる。本明細書でいう相同性が高いとは、相同性が７０%以上、より好ましくは８０%以上、さらに好ましくは９０%以上、特に好ましくは９５%以上を意味する。ストリンジェントな条件の具体例としては、６０℃−７０℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが挙げられる。
【００１５】
本発明におけるＤＮＡはプロモーター機能を有する。即ち、本発明のＤＮＡはプロモーター機能を発揮するプロモーター領域（配列）を有するものである。
プロモーター機能とは、当該ＤＮＡ配列の下流にある遺伝子の発現を促す機能であり、その測定方法は、プロモーターと考えられるＤＮＡ領域の下流にＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）やＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）等の蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を挿入した組み換え体を作成し、レポーター遺伝子産物の発現等を測定することにより調べることができる。
また、プロモーター領域とは、１又は複数のＤＮＡ配列の転写を調節するよう機能し、且つＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位及びプロモーター機能を制御するように相互作用するＤＮＡの領域（配列）を意味する。
【００１６】
プロモーター領域は、一般に転写開始部位の上流にある、転写を開始させるＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与するＤＮＡの領域のことである。プロモーター領域には、エンハンサー、リプレッサー等が含まれてもよい。
ここで、塩基配列における「上流」とは、５’側に存在する配列や位置を意味し、「下流」とは、３’側に存在する配列や位置を意味する。
【００１７】
プロモーターには、ＲＮＡポリメラーゼ IIIプロモーター（Ｐｏｌ IIIプロモーター）や、ＲＮＡポリメラーゼIIプロモーター（ＰｏｌIIプロモーター）等があるが、本発明におけるプロモーターは、Ｐｏｌ IIIプロモーターにおける、Ｕ６プロモーターであり、本発明のＤＮＡは、少なくともＵ６プロモーター領域を有する。
【００１８】
プロモーター領域は、導入する塩基配列の発現を推進することが可能であれば、導入する塩基配列に対する核酸内での配置について、特に限定されない。また、導入する塩基配列は、特に限定されず、タンパク質、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、マーカー、レポーター、酵素、シグナル伝達分子、あるいは脂肪酸の合成、分解、貯蔵、および／または調節に関与するタンパク質をコードする塩基配列、脂肪酸の合成、分解、貯蔵、および／または調節に関与するタンパク質をコードするＲＮＡに標的されたアンチセンスＲＮＡ、ならびに脂肪酸の合成、分解、貯蔵、および／または調節に関与するタンパク質をコードするＲＮＡに標的されたｓｉＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子が例示される。
【００１９】
本発明のＤＮＡは、ヒマ由来のＵ６ｓｎＲＮＡを発現させるプロモーター領域を有するＤＮＡであり、種々の形質転換等に利用する上で、導入する塩基配列の発現を強く推進することが可能であり、汎用性が高く、発現性に優れるプロモーターＤＮＡとして好適に用いることができる。
【００２０】
本発明のベクターは、本発明のＤＮＡを有するベクターである。上記ベクターとしては、本発明のＤＮＡを安定に保持するものであり、そのＤＮＡが有するプロモーター機能を好適に発現させることができるものであれば、その構造や種類等に特に制限はない。このようなベクターとして、例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ＹＡＣ等が挙げられるが、汎用性の観点からプラスミドが好適である。
ベクターは、周知の方法により、本発明のＤＮＡがベクターへ担持（挿入）されることで構築される。ベクターには、本発明のＤＮＡの他に、エンハンサー領域（配列）やターミネーター領域（配列）、薬剤耐性遺伝子や選択マーカー遺伝子等といった周知の要素が組み込まれていてもよい。
【００２１】
ベクターは、通常、好適に担持（挿入）された本発明のＤＮＡを、宿主細胞へ導入する場合に用いられる。
例えば、宿主に大腸菌を用いるのであれば、薬剤耐性遺伝子や選択マーカー遺伝子が組み込まれた市販のベクター（プラスミド）や、クローニング用ベクターとして市販されている種々のベクター（プラスミド）を利用することができる。
【００２２】
上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞が挙げられるが、作業性及び汎用性等から、大腸菌が好適である。
宿主細胞へのベクター導入は、塩化カルシウム水溶液等を使用して、カルシウム存在下で大腸菌（コンピテントセル）に取り込ませる方法や、その他、電気パルス穿孔法、リポフェクション法、マイクロインジェクション方法等の公知の方法で行うことができる。
【００２３】
また、植物体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のベクターを、例えば、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である。植物体内への投与は、ｅｘ ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。
【００２４】
本発明の形質転換植物体は、本発明のＤＮＡが導入されたものである。形質転換植物体の作製は、本発明のベクターやＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム等の手法を用い、本発明のＤＮＡを植物細胞に導入して、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることで行われる。この形質転換に要する期間は、従来のような交雑による遺伝子移入に比較して極めて短期間である。また、他の形質の変化を伴わない点で有利である。
【００２５】
また、形質転換植物体は、本発明のＤＮＡのプロモーター機能を利用して、導入した塩基配列の発現により、植物体（主にヒマ）を形質転換したものである。ＤＮＡに作動可能に連結されている塩基配列としては、特に制限されず、目的とする形質転換に適したものが適宜選択される。
形質転換の手法の一つとして、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、細菌のＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）システムが侵入したウィルスのＤＮＡをバラバラにしてその中で特定の塩基配列をもつ断片を細菌自身のゲノムに取り込み、記憶して、ウィルスの再侵入時には、記憶したＤＮＡから転写されたＲＮＡがウィルスのＤＮＡを照合して見つけ出し、ＲＮＡにガイドされた酵素（Ｃａｓタンパク質）が、ウィルスのＤＮＡを切断する仕組みを利用するものである。このようなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いた形質転換は、標的配列のデザインの簡便さや実験手法の容易さから、様々な生物の遺伝子を改変することを可能にしており、近年有用視されている。
上記植物細胞としては、主にヒマ（トウダイグサ科トウゴマ属）が用いられるが、本発明のＤＮＡを発現可能なものであれば、特に制限はなく、何れが用いられてもよい。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明をさらに具体化した実施例について説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２７】
１．ヒマの生育及びゲノムＤＮＡの調整
（１）ヒマの種子から種皮を残して外皮（果肉）を除去した後、種子滅菌液（０．５％次亜塩素酸ナトリウムと０．２％オクトキシノール（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００）の混合液）に浸し、５分間静置して、種子を滅菌した。
（２）滅菌した種子を純水で３回洗浄した後、純水で湿らせたペーパータオルの上に置き、２５℃の暗所で４日間培養して、種子を発芽させた。
（３）発芽後は、バーミキュライト（土壌改良材）、パーライト（土壌改良材）及び培養土（商品名：ＪＡニッピ園芸培土１号）がバーミキュライト：パーライト：培養土＝４５：４５：１０の比率になるように満たしたビニールポット（直径６ｃｍ）に移植し、１４日間生育した。
（４）生育後のヒマから本葉を５ｍｍ×５ｍｍ採取し、ＤＮＡ抽出キット（「ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ」（商品名）、Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、ヒマのゲノムＤＮＡを調整した。
【００２８】
２．ＤＮＡ断片の増幅及び単離
（１）Ｕ６ｓｎＲＮＡの塩基配列は他の植物とも共通する配列であることから、ヒマのモデル生物としてシロイヌナズナを選択し、シロイヌナズナのＵ６ｓｎＲＮＡの塩基配列を元に、非特許文献１に開示された解析済みのヒマのドラフトゲノムＤＮＡ（以下、「ドラフトＤＮＡ」と略）の塩基配列に対し、相同性検索を行った。その結果、ヒマのドラフトＤＮＡ上に、６つのＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子（ＲｃＵ６−１、ＲｃＵ６−２、ＲｃＵ６−３、ＲｃＵ６−４、ＲｃＵ６−５、ＲｃＵ６−６）を同定した。
（２）上記１．（４）で調整したゲノムＤＮＡについて、上記２．（１）で同定した６つのＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子のそれぞれの上流の領域を、表１に示した特異的プライマーセット（３’末端側のプライマーの塩基配列を配列番号１〜６とし、５’末端側のプライマーの塩基配列を配列番号７〜８とする。）と、ＤＮＡポリメラーゼ（「Prime STAR GXL」（商品名）、タカラバイオ社製）とを使用したＰＣＲ法により増幅した。そして、配列番号１３〜１８で示される、上記のＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子に対応する６種のＤＮＡ断片を単離した。
ここで、上記特異的プライマーセットについては、上記ドラフトＤＮＡ上でＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子の直近上流の塩基配列を、３’末端側のプライマーと同定し、次いで、３’末端側のプライマーから１６００ｂｐ〜２３００ｂｐ上流の塩基配列を、５’末端側のプライマーと同定した。ＰＣＲ法で用いたプライマー及び得られたＤＮＡ断片の関係を表１に示す。
上記ＰＣＲ法による増幅は、ＤＮＡ二本鎖解離を９５℃で１分、アニーリングを９８℃で１０秒と６０℃で１５秒と６８℃で３分とを１サイクルとして３０サイクル、ＤＮＡ合成を６８℃で５分、を条件として行った。
（３）単離したＤＮＡ断片の塩基配列を常法に従って解析した。
【００２９】
【表１】
2019041703.tif 000002
【００３０】
３．一過的発現実験（プロモーター機能の検証）
（１）上記２．（２）で単離した配列番号１３〜１８のＤＮＡ断片を、それぞれλファージの部位特異的組換えシステムを応用したＧａｔｅｗａｙテクノロジー手法（Thermo Fisher Scientific社開発）に従って、「ｐＤＯＮＲ Ｐ４-Ｐ１Ｒプラスミド（Thermo Fisher Scientific社製）」に導入した。
（２）細胞内小器官であるペルオシキソームの内部に輸送されるタンパク質が有するペルオキシソーム輸送配列 (PTS; Peroxisome targeting signal )のうちタンパク質のＣ末端に存在するＰＴＳ１を蛍光タンパク質（Ｖｅｎｕｓ）に融合させたＶｅｎｕｓ−ＰＴＳ１を、上記（１）と同様に、λファージの部位特異的組換えシステムを応用したＧａｔｅｗａｙテクノロジー手法に従って、「ｐＤＯＮＲ ２２１プラスミド（Thermo Fisher Scientific社製）」に導入した。
（３）配列番号１３〜１８のＤＮＡ断片を導入した「ｐＤＯＮＲ Ｐ４-Ｐ１Ｒプラスミド」と、上記Ｖｅｎｕｓ−ＰＴＳ１を導入した「ｐＤＯＮＲ ２２１プラスミド」と、薬剤（アミノグリコシド系抗生物質）耐性遺伝子を備えた「Ｒ４ｐＧＷＢ４０１プラスミド」（参考文献：Biosci. Biotechnol. Biochem. (2008) 72(2) 624-629）とを、「Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲクロナーゼII酵素ミックス（商品名）、Thermo Fisher Scientific社製」とともに、２５℃で１５時間反応させて、プラスミドの組換え反応（ＬＲ反応）を行った。そして、Ｒ４ｐＧＷＢ４０１プラスミド由来の、上記のＤＮＡ断片の下流域にＶｅｎｕｓ−ＰＴＳ１が融合された融合遺伝子を含むプラスミドを作成した（図１参照、なお図中で「ｐｒｏｍｏｔｅｒ」が導入したＤＮＡ断片であり、「ｃＤＮＡ」がＶｅｎｕｓ−ＰＴＳ１である）。
（４）組換え反応後のプラスミドを、サブクローニング用の大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞（「Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５アルファ」（商品名）、東洋紡社製）に取り込ませた後、５０μｇ／ｍｌの濃度でアミノグリコシド系抗生物質「スペクチノマイシン」（SIGMA社製）を含むＬＢ培地に塗布して、組換え反応が正しく行われたプラスミドを持つ大腸菌株を選抜した。その後、選抜した大腸菌株を通常の液体培地を使用して、液体培養した。
（５）次いで、上記の液体培養を行った大腸菌株の菌体から、プラスミド精製キット（「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System」（商品名）、プロメガ社製）を使用し、プラスミドを抽出した。この抽出したプラスミドは、常法に従ってシークエンシングにより組換え反応後のプラスミドと塩基配列の同一性を確認した。
（６）塩基配列を確認したプラスミドを濃縮して１μｇ／μｌの濃度に調整した後、その濃縮したプラスミドと金粒子とを混合し、パーティクルガン法（「Ｈｅｌｉｏｓ Ｇｅｎｅ Ｇｕｎシステム」、バイオラッド社製）を用いて、プラスミド（融合遺伝子）を上記１．で生育したヒマの本葉に導入した。
（７）その後、プラスミド（融合遺伝子）が導入された後のヒマの本葉は、インキュベーターで２２℃、１６時間静置した。次いで、プラスミド（融合遺伝子）が導入されたヒマの本葉について、共焦点レーザー顕微鏡（LSM510META、ツァイス社製、アルゴン２レーザーの５１４ｎｍで励起、吸収フィルターＢＰ５３５−５９０）を使用し、上記の蛍光タンパク質の発現による細胞内の蛍光を観察した。
観察の結果、配列番号１３〜１８の全てのＤＮＡ断片（配列番号１３〜１８）で、蛍光タンパク質の発現を確認することができ、配列番号１３〜１８のＤＮＡ断片がプロモーター機能を有することがわかった。
【００３１】
４−１．プロモーター領域の絞り込み（１）
（１）５００ｂｐ〜６２０ｂｐのＤＮＡ
プロモーター領域を絞り込むため、上記２．（２）プロモーター領域の増幅における特異的プライマーセットにおいて、３’末端側のプライマーは、そのまま使用すると共に、３’末端側のプライマーから５００ｂｐ〜６２０ｂｐ上流の配列を５’末端側のプライマーと同定し、上記２．（２）と同様にして、上記のＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子に対応する６種のＤＮＡ断片を単離した。これのＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２５〜３０に示す。
また、ＰＣＲ法で用いたプライマー及び得られたＤＮＡ断片の関係を表２に示す。
そして、単離したＤＮＡ断片の塩基配列を常法に従って解析した。
【００３２】
【表２】
2019041703.tif 000003
【００３３】
（２）上記のとおり、単離した配列番号２５〜３０の各ＤＮＡ断片について、上記３．一過的発現実験（プロモーター機能の検証）を同様に行った。その結果、配列番号２５〜３０の各ＤＮＡ断片は、プロモーター機能を有することがわかった。
【００３４】
４−２．プロモーター領域の絞り込み（２）
（１）２８０ｂｐ〜３４０ｂｐのＤＮＡ
更に、プロモーター領域を絞り込むため、上記２．（２）プロモーター領域の増幅における特異的プライマーセットにおいて、３’末端側のプライマーは、そのまま使用すると共に、３’末端側のプライマーから２８０ｂｐ〜３４０ｂｐ上流の配列を５’末端側のプライマーと同定し、上記２．（２）と同様にして、上記のＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子に対応する６種のＤＮＡ断片を単離した。これのＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号３７〜４２に示す。
また、ＰＣＲ法で用いたプライマー及び得られたＤＮＡ断片の関係を表３に示す。
そして、単離したＤＮＡ断片の塩基配列を常法に従って解析した。
【００３５】
上記のとおり、単離した配列番号３７〜４２の各ＤＮＡ断片について、上記３．３．一過的発現実験（プロモーター機能の検証）を同様に行った。その結果、配列番号３７〜４２の全てのＤＮＡ断片が、プロモーター機能を有していることが分かった。
このときの共焦点レーザー顕微鏡による蛍光写真を図２に示す。なお、図２中で「Ｆｌｕｏ」は蛍光画像、「ＤＩＣ」は微分干渉画像、「Ｍｅｒｇｅ」は蛍光画像と微分干渉画像を重ね合わせた画像である。
以上の結果から、単離した配列番号３７〜４２の各ＤＮＡ断片は、プロモーター機能を有することが示された。
【００３６】
【表３】
2019041703.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明のヒマ由来核酸は、汎用性の高いプロモーター領域を含み、形質転換に有用であるから、産業上利用可能である。
【図１】
2019041703.tif 000005
【図２】
2019041703.tif 000006
【配列表】
2019041703000001.app