(57)【要約】【課題】糖加熱縮合物を原料にして水溶性食物繊維の純度の高められた組成物を得ることができる、水溶性食物繊維組成物の製造方法を提供する。【解決手段】糖加熱縮合物をバチルス（Bacillus）属細菌又はゲオバチルス（Geobacillus）属細菌に資化させる工程を含む、水溶性食物繊維組成物の製造方法である。また、その製造方法で得られた水溶性食物繊維組成物を飲食品原料に添加する工程を含む、飲食品の製造方法である。前記微生物による前記糖加熱縮合物の資化は４０〜９５℃で行うことが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖加熱縮合物をバチルス（Bacillus）属細菌又はゲオバチルス（Geobacillus）属細菌に資化させる工程を含む、水溶性食物繊維組成物の製造方法。
【請求項２】
前記バチルス属細菌がバチルス スミシー（Bacillus smithii）であり、又は、前記ゲオバチルス属細菌がゲオバチルス サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）である請求項１記載の水溶性食物繊維組成物の製造方法。
【請求項３】
前記バチルス属細菌がバチルス スミシー１５０１株（受領番号ＡＰ−０２５４２）又はバチルス スミシー２７０１株（受領番号ＡＰ−０２５４１）であり、又は、前記ゲオバチルス属細菌がゲオバチルス サーモグルコシダシウス６５８０１株（受領番号ＡＰ−０２５３３）である請求項１記載の水溶性食物繊維組成物の製造方法。
【請求項４】
前記バチルス（Bacillus）属細菌又は前記ゲオバチルス（Geobacillus）属細菌による前記糖加熱縮合物の資化を４０℃〜９５℃の範囲に属する温度環境で行う請求項１〜３のいずれか１項に記載の水溶性食物繊維組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法で得られた水溶性食物繊維組成物を飲食品原料に添加する工程を含む、飲食品の製造方法。
【請求項６】
バチルス スミシー１５０１株（受領番号ＡＰ−０２５４２）。
【請求項７】
バチルス スミシー２７０１株（受領番号ＡＰ−０２５４１）。
【請求項８】
ゲオバチルス サーモグルコシダシウス６５８０１株（受領番号ＡＰ−０２５３３）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖加熱縮合物を原料にして高純度の水溶性食物繊維を得る、水溶性食物繊維組成物の製造方法に関する。また、その製造方法により得られた水溶性食物繊維組成物を添加してなる飲食品の製造方法に関する。更に、その水溶性食物繊維組成物の製造方法に利用する新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
水溶性食物繊維素材は、ボディ感の付与や酸性乳飲料の安定化等の効果を有しており、低カロリー素材として幅広い食品に利用されている。また、整腸作用、食後血糖の急激な上昇を抑制する作用、血中の中性脂肪やコレステロールの低下作用等を有し、機能性食品素材としても広く利用されている（例えば、非特許文献１等参照）。
【０００３】
水溶性食物繊維素材の製法として、糖質を無触媒又は各種触媒存在下で加熱処理することで糖質を縮合反応させ、糖加熱縮合物として取得する手法が知られており、様々な製造方法が報告されている。例えば、澱粉に触媒として塩酸を添加し加熱縮合させることで焙焼デキストリンを製造し、更に酵素処理し必要に応じてクロマト分画することで難消化性デキストリンを得る、難消化性デキストリンの製造方法が知られている（例えば、特許文献１等参照）。また、グルコース及びソルビトールに触媒としてクエン酸を添加し加熱縮合させることで非カロリー性ポリデキストロースを得る、ポリデキストロースの製造方法が知られている（例えば、特許文献２等参照）。更に、糖質（グルコースシラップなど）に活性炭を触媒として添加し加熱縮合することで、効率良く着色度の低い糖加熱縮合物を得ることができることなども報告されている（例えば、特許文献３等参照）。
【０００４】
一方で、糖加熱縮合物の調製においては、その反応過程で無水糖（レボグルコサンなど）やゲンチオビオースなど、重合度２以下の低分子の糖質が生成し、苦味や甘味等の異味の原因ともなる。また、原料グルコース等が多少なりとも残存している。ここで、一般に、食物繊維とは、消化抵抗性を示す重合度３以上の難消化性糖を指す。このため、水溶性食物繊維の純度を増加させるためには、重合度２以下の低分子成分を除去する必要がある。また、異味を除去し食品添加剤としての価値を高める意味でも低分子成分の除去が求められる。
【０００５】
このような問題に対して、例えば、特許文献４には、逆浸透膜で処理することでレボグルコサン等の低分子画分を除去するポリデキストロースの製造方法が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】食品と開発, Vol.48, No.1, pp49-57 (2013)
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平０２−１５４６６４号公報
【特許文献２】特開昭５０−１４２６９９号公報
【特許文献３】特開２０１３−７６０４４号公報
【特許文献４】特開平０２−０６４１０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、クロマト分画や膜処理を工業レベルで実施するには、大規模な処理設備が必要である。また、取り除かれた低分子画分を全て廃棄若しくは付加価値の低い糖質として処理することが必要になる。このように、既存の方法は、製造効率、製造コスト、環境負荷などの点に課題を有していた。
【０００９】
上記従来技術に鑑み、本発明の目的は、糖加熱縮合物を原料にして水溶性食物繊維の純度の高められた組成物を得ることができる、水溶性食物繊維組成物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、糖加熱縮合物を特定の微生物に資化させることにより、レボグルコサン等の不要な低分子成分が取り除かれ、水溶性食物繊維の純度が高められることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の第１は、糖加熱縮合物をバチルス（Bacillus）属細菌又はゲオバチルス（Geobacillus）属細菌に資化させる工程を含む、水溶性食物繊維組成物の製造方法を提供するものである。
【００１２】
本発明の水溶性食物繊維組成物の製造方法においては、前記バチルス属細菌がバチルス スミシー（Bacillus smithii）であり、又は、前記ゲオバチルス属細菌がゲオバチルス サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）であることが好ましい。
【００１３】
また、前記バチルス属細菌がバチルス スミシー１５０１株（受領番号ＡＰ−０２５４２）又はバチルススミシー２７０１株（受領番号ＡＰ−０２５４１）であり、又は、前記ゲオバチルス属細菌がゲオバチルス サーモグルコシダシウス６５８０１株（受領番号ＡＰ−０２５３３）であることが好ましい。
【００１４】
また、前記バチルス（Bacillus）属細菌又は前記ゲオバチルス（Geobacillus）属細菌による前記糖加熱縮合物の資化を４０℃〜９５℃の範囲に属する温度環境で行うことが好ましい。
【００１５】
一方、本発明の第２は、上記製造方法で得られた水溶性食物繊維組成物を飲食品原料に添加する工程を含む、飲食品の製造方法を提供するものである。
【００１６】
更に、本発明の第３は、上記製造方法に好適に用いることができる、下記菌株を提供するものである。
【００１７】
バチルス スミシー１５０１株（受領番号ＡＰ−０２５４２）。
バチルス スミシー２７０１株（受領番号ＡＰ−０２５４１）。
ゲオバチルス サーモグルコシダシウス６５８０１株（受領番号ＡＰ−０２５３３）。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、糖加熱縮合物を特定の微生物に資化させることにより、レボグルコサン等の不要な低分子成分が取り除かれ、水溶性食物繊維の純度の高い組成物を得ることができる。また、比較的高温条件下での処理が可能であり、その資化処理時のコンタミリスクを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】試験例１において分離した１５０１株、２７０１株、及び６５８０１株を４０℃、５０℃、６０℃、又は７０℃で２４時間培養した後の様子を示す固体培養プレートの写真である。
【図２】試験例２において培養したときの各菌株の培養時間と培養物の濁度（ＯＤ６６０）の関係を示すグラフである。
【図３】試験例２において培養した各菌株の培養物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供した結果を示す図表である。
【図４】試験例４において資化処理したときの各菌株による資化処理時間と濁度（ＯＤ６６０）の関係を示すグラフである。
【図５】試験例４において資化処理したときの各菌株による資化処理物中のレボグルコサン（ＬＧ）濃度の変化を示すグラフである。
【図６】試験例４において資化処理したときの各菌株による資化処理物中のグルコース濃度の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、糖加熱縮合物を特定の微生物に資化させることを特徴にしている。
【００２１】
ここで「糖加熱縮合物」とは、糖質を、無触媒下又は各種触媒存在下で加熱処理して、糖縮合反応させてなる糖組成物をいう。また「糖縮合反応」とは、糖質同士を縮合させて糖縮合物を得る反応をいう。糖縮合反応により得られる糖組成物中には、その反応による糖残基の結合様式がランダムであるために、消化酵素により加水分解を受けにくく、水溶性食物繊維としての機能を有する糖縮合物が含まれている。一方で、加熱処理の副産物として、食物繊維としての機能を有しない無水糖（レボグルコサン（1,6-アンヒドロ-β-D-グルコピラノース）など）や糖加熱分解物などが含まれている。そこで「微生物に資化させる」とは、微生物がそれらの副産物を菌体内に取り込む等によって自己の生育に利用することにより、微生物の菌体外の溶液中等での濃度を下げることをいう。なお、水溶性食物繊維としての機能を有する、上記糖縮合物の構造や構成糖、分子量等は、特に厳密に特定され得るものではないが、通常の食品成分分析の手法に則って、組成物中の水溶性食物繊維の含有量や固形分当たりの濃度を分析・測定することができる。
【００２２】
具体的には、本明細書において、水溶性食物繊維含量は、平成29年3月28日消食表第169号（食品表示基準について）に記載の酵素-HPLC法の手法に則って測定することができる。より詳細には、以下の手法で測定することができる。
【００２３】
（水溶性食物繊維含量）
まず、サンプル1 gを精密に測り、0.08 mol/lリン酸緩衝液50 mlを加え、pH6.0±0.5であることを確認する。これに熱安定性α-アミラーゼ（Sigma社：EC3.2.1.1 Bacillus licheniformis由来）溶液0.1 mlを加え、沸騰水中に入れ、5分ごとに撹拌しながら30分間放置する。冷却後、水酸化ナトリウム溶液（1.1gの水酸化ナトリウムを水に溶解し、100 mlにメスアップ）を加えてpHを7.5±0.1に調整する。プロテアーゼ（Sigma社：EC.3.4.21.62 Bacillus licheniformis由来）溶液0.1 mlを加えて、60±2℃の水浴中で振とうしながら30分間反応させる。冷却後、0.325 mol/l塩酸を加え、pHを4.3±0.3に調整する。アミログルコシダーゼ（Sigma社：EC3.2.13  Aspergillus niger由来）溶液0.1 mlを加え、60±2℃の水浴中で振とうしながら30分間反応させる。以上の酵素処理終了後、直ちに沸騰水浴中で10分間加熱した後、冷却し、グリセリン溶液（10ｇのグリセリンを水と混合し、100 mlにメスアップ）を内部標準物質として5 ml加え、水で100 mlとし酵素処理液とする。
【００２４】
次に、酵素処理液50 mlをイオン交換樹脂（OH型：H型＝1：1）50 mlを充填したカラム（ガラス管20 mm×300 mm）に通液速度50 ml/時で通液し、さらに水を通して流出液の全量を200 mlとする。この溶液をロータリー・エバポレーターで濃縮し、全量を水で20 mlとする。孔径0.45 μｍのメンブレンフィルターでろ過し、検液とする。
【００２５】
次に、検液20 μlにつき、液体クロマトグラフィーを行い、検液のグリセリンおよび食物繊維画分のピーク面積値を測定する。なお、液体クロマトグラフィーの分析条件は、例えば、以下の通りとすることができる。
【００２６】
＜HPLC条件＞
検出器：示差屈折計
カラム：ULTRON PS-80N（φ8.0×300 mm、島津ジーエルシー）を二本連結
カラム温度：80℃
移動相：純水
流速：0.5 ml/分
【００２７】
食物繊維成分含量は以下の式から算出することができる。
【００２８】
食物繊維成分含量（%）＝［食物繊維成分のピーク面積／グリセリンのピーク面積］×f1×［内部標準グリセリン重量（mg）／秤取資料重量（mg）］×100
（上記式中、f1はグリセリンとブドウ糖のピーク面積の感度比（0.82）である。）
【００２９】
また、本明細書において、レボグルコサン含量は定量的HPLC分析等により、レボグルコサン（1,6-アンヒドロ-β-D-グルコピラノース）の標準品を指標にした検定に基づき、適宜当業者に周知の手法により、分析・測定することが可能である。
【００３０】
上記糖加熱縮合物の原料となる糖質としては、例えば、単糖（グルコース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、エリトロース、フラクトース、プシコース等）、オリゴ糖（マルトース、セロビオース、トレハロース、ゲンチオビオース、イソマルトース、ニゲロース、ソホロース、コージビオース、スクロース、ツラノース、ラクトース、キシロビオース、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、シクロデキストリン等）、多糖（澱粉、デキストリン、プルラン、デキストラン、セルロース、アラビノキシラン、ペクチン、イヌリン、フラクタン、ガラクタン、マンナン等）、糖誘導体（糖酸などの酸化物、糖アルコールなどの還元物、アミノ糖、エーテル化糖、ハロゲン化糖、リン酸化糖などの修飾物等）等が挙げられる。糖加熱縮合物の原料となる糖質は、１種を用いてもよく、２種以上を併用してもよい。例えば、糖質の２種以上を適宜混合した糖質組成物に対して、上記糖縮合反応のための加熱処理を施すなどしてもよい。なお、本発明で得られる水溶性食物繊維組成物を飲食品へ添加するような場合は、飲食品に用いることのできる糖質を、上記糖加熱縮合物の原料として用いるのが好ましい。
【００３１】
上記糖縮合反応のための加熱処理の方法は周知であり、例えば、常圧又は減圧条件下に１００℃〜３００℃で１分間〜１８０分間加熱するなどである。糖縮合反応を減圧条件下で実施した場合には反応生成物の着色度が低下するため有利である。また、その温度条件の下限としては、１００℃以上であることが好ましく、１７０℃以上であることがより好ましい。その温度条件の上限としては、３００℃以下であることが好ましく、２８０℃以下であることがより好ましい。また、反応時間は縮合反応の進行度合いに従って調整できるが、反応産物中の難消化性画分の割合が７５％以上となるように調整した場合には、例えば、反応温度１８０℃で５分間〜１８０分間、反応温度１９０℃で１分間〜１８０分間、反応温度２００℃で１分間〜１８０分間とすることができる。加熱処理の手段にも特に制限はなく、例えば、棚式熱風乾燥機、薄膜式蒸発器、フラッシュエバポレーター、減圧乾燥機、熱風乾燥機、スチームジャケットスクリューコンベヤー、ドラムドライヤー、エクストルーダー、ウォームシャフト反応機、ニーダー等の機器により、上記糖縮合反応のための加熱処理を行なうことができる。
【００３２】
上記糖縮合反応に用いることのできる触媒としては、糖縮合反応を促進することができればよく、特に制限はない。例えば、無機酸（塩酸、リン酸、硫酸、硝酸等）、有機酸（クエン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、酢酸等）、鉱物性物質（珪藻土、活性白土、酸性白土、ベントナイト、カオリナイト、タルク等）、活性炭（水蒸気炭、塩化亜鉛炭、スルホン化活性炭、酸化活性炭）等が挙げられる。得られる水溶性食物繊維素材の着色や安全性、更には味・臭いを考慮すると、触媒として活性炭を用いることが好ましい。触媒は、１種を用いてもよく、２種以上を組み合わせて使用することもできる。なお、触媒により糖縮合反応を促進することができるが、触媒を用いずに、上記糖縮合反応のための加熱処理を行ってもよいことは勿論である。
【００３３】
本発明に用いる糖加熱縮合物として、典型的なものを例示するとすれば、塩酸存在下で澱粉を加水分解・縮合反応させて得られる焙焼デキストリンや、その焙焼デキストリンを酵素処理し、分画することで得られる難消化性デキストリンや、グルコース及びソルビトールをクエン酸存在下で縮合させて得られるポリデキストロースや、ＤＥ７０〜ＤＥ１００の澱粉分解物を加熱縮合させて得られる難消化性グルカン等が挙げられる。ただし、これらに限らない。
【００３４】
一方、本発明による作用効果が、水溶性食物繊維を含む糖加熱縮合物から、レボグルコサン（1,6-アンヒドロ-β-D-グルコピラノース）などの低分子成分が除去されて、水溶性食物繊維を高純度に含む組成物が得られる、というものである点からは、糖加熱縮合物は、そのような副産物を生じやすい、グルコース及び／又はグルコース重合体を原料にして得られたものであることが好ましい。また、糖加熱縮合物の水溶性食物繊維含量は、固形分当たり３０質量％以上であることが好ましく、固形分当たり４５質量％以上であることがより好ましく、固形分当たり７０質量％以上であることが更により好ましい。また、糖加熱縮合物のレボグルコサン含量は、固形分当たり０．１〜８０質量％であることが好ましく、固形分当たり０．５〜５０質量％であることがより好ましく、固形分当たり１．０〜３０質量％であることが更により好ましい。すなわち、その下限としては、固形分当たり０．１質量％以上であることが好ましく、固形分当たり０．５質量％以上であることがより好ましく、固形分当たり１．０質量％以上であることが更により好ましい。その上限としては、固形分当たり８０質量％以下であることが好ましく、固形分当たり５０質量％以下であることがより好ましく、固形分当たり３０質量％以下であることが更により好ましい。
【００３５】
本発明に用いる微生物としては、上記糖縮合反応のための加熱処理の副産物として生成する、食物繊維としての機能を有しない無水糖（レボグルコサン（1,6-アンヒドロ-β-D-グルコピラノース）など）や糖加熱分解物などを資化することができる微生物であればよい。より詳細には、少なくともレボグルコサン（1,6-アンヒドロ-β-D-グルコピラノース）を資化することができる微生物であればよく、さらに好ましくは例えばセロビオサンなどの無水糖を含む二糖をも資化することができる微生物がよい。なお、糖加熱縮合物に含まれる水溶性食物繊維を分解等しないことが好ましいことは、勿論である。例えば、バチルス（Bacillus）属細菌やゲオバチルス（Geobacillus）属細菌などが挙げられる。なかでも、バチルス属細菌としてバチルス スミシー（Bacillus smithii）が好ましく、また、ゲオバチルス属細菌としてゲオバチルス サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）が好ましい。更に、バチルス スミシーとしてバチルス スミシー１５０１株又はバチルス スミシー２７０１株がより好ましく、また、ゲオバチルス サーモグルコシダシウスとしてゲオバチルスサーモグルコシダシウス６５８０１株がより好ましい。微生物は、公知の菌株バンクより菌株を適宜探索・選択することにより、入手してもよい。あるいは、レボグルコサンや例えばセロビオサンなどの無水糖を含む二糖の資化対象物を含む培地を用いた周知のスクリーニング手法により、本発明に使用可能な菌株を得ることもできる。この場合、例えば、４０℃〜９５℃の範囲に属する温度環境で菌株をスクリーニングすることが好ましく、５０℃〜６０℃の範囲に属する温度環境で菌株をスクリーニングすることがより好ましい。これによれば、一般の微生物の至適温度に比して、比較的高温に生育の至適温度を有する菌株を分離することができるので、その菌株を用いた資化処理の際のコンタミリスクを低減することができる。
【００３６】
なお、バチルス スミシー１５０１株は、平成２９年９月１日付けで、受領番号ＡＰ−０２５４２で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００３７】
また、バチルス スミシー２７０１株は、平成２９年９月１日付けで、受領番号ＡＰ−０２５４１で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００３８】
また、ゲオバチルス サーモグルコシダシウス６５８０１株は、平成２９年８月１８日付けで、受領番号ＡＰ−０２５３３で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００３９】
上記糖加熱縮合物を上記微生物に資化させる方法としては、適宜使用する微生物の生育のための培地に、その一部として上記糖加熱縮合物を配合したうえで、その生育培地中で微生物を所定時間生育させるようにするなどにより行うことができる。培地は、液体培地でもよく、固体培地でもよく、特に制限はなく、用いる微生物の性質に合わせた条件で常法の通りその微生物を生育させるようにすればよい。あるいは、微生物は常法により固定化した菌体を用いてもよい。資化処理のための微生物は、１種を用いてもよく、２種以上を組み合わせて使用することもできる。具体的には、例えば、液体培地（例えば、0.1質量%NH4Cl、0.3質量%K2HPO4、0.3質量%KH2PO4、0.05質量%MgSO4・7H2O、0.01質量%CaCl2・2H2O、0.1質量%Vitamin mixture、0.005質量%Trace elements、0.02質量%Tween 80）に糖加熱縮合物を添加し、糖加熱縮合物を１〜５０質量％、より好ましくは５〜４０質量％含有する溶液を調製し、必要に応じて酸又はアルカリによりｐＨ４．０〜１０．０、好ましくはｐＨ５．０〜９．０に調整した後、微生物を添加して、所定温度で１〜２００時間培養することなどにより、上記糖加熱縮合物の資化処理を行なうことができる。すなわち、その資化処理に供される糖加熱縮合物の溶液の該糖加熱縮合物の含有量の下限としては、１質量％以上であることが好ましく、５質量％以上であることがより好ましい。その上限としては、５０質量％以下であることが好ましく、４０質量％以下であることがより好ましい。また、資化処理のｐＨ環境の下限としては、ｐＨ４．０以上であることが好ましく、ｐＨ５．０以上であることがより好ましい。その上限としては、ｐＨ１０．０以下であることが好ましく、ｐＨ９．０以下であることがより好ましい。また、その資化処理時間の下限としては、２４時間以上であることが好ましく、４８時間以上であることがより好ましい。その資化処理時間の上限としては、２００時間以下であることが好ましく、１５０時間以下であることがより好ましい。
【００４０】
上記糖加熱縮合物を上記微生物に資化させる際の温度としては、適宜使用する微生物の性質に合わせて設定したり、調整したりすることができるが、比較的高温に生育の至適温度を有する菌株を使用して、例えば、その微生物による資化処理を４０℃〜９５℃の範囲に属する温度環境で行うことが好ましく、４０℃〜８０℃の範囲に属する温度環境で行うことがより好ましく、４０℃〜７０℃の範囲に属する温度環境で行うことがさらに好ましく、５０℃〜６０℃の範囲に属する温度環境で行うことが特に好ましい。すなわち、その温度条件の下限としては、４０℃以上であることが好ましく、５０℃以上であることがより好ましい。その温度条件の上限としては、９５℃以下であることが好ましく、８０℃以下であることがより好ましく、７０℃以下であることが更により好ましく、６０℃以下であることが最も好ましい。これによれば、一般の微生物の至適温度に比して、資化処理の温度環境を比較的高温に設定することができるので、資化処理の際のコンタミリスクを低減することができる。
【００４１】
上記資化処理においては、糖質原料から縮合反応を経て得られた上記糖加熱縮合物を、そのままの形態で、その後の工程（微生物による資化工程）に用いるようにしてもよく、すなわち、例えば、触媒の残存下やイオン成分の残存下で処理してもよく、若しくは、濾過、脱塩、脱臭、脱色等の処理であって、得られた糖加熱縮合物に実質的な影響を与えない処理のみを施した形態で、その後の工程（微生物による資化工程）に用いるようにしてもよく、あるいは、常法により酵素処理や還元処理等を施した後に、その後の工程（微生物による資化工程）に用いるようにしてもよい。更には、また、酵素処理や還元処理等を施すのと同時に微生物による資化処理を行ってもよい。
【００４２】
上記の資化処理は、糖加熱縮合物の水溶性食物繊維含量が、固形分当たり８５〜１００質量％となる程度に行うことが好ましく、固形分当たり９０〜１００質量％となる程度に行うことがより好ましく、固形分当たり９５〜１００質量％となる程度に行うことが更により好ましい。すなわち、その下限としては、固形分当たり８５質量％以上であることが好ましく、固形分当たり９０質量％以上であることがより好ましく、固形分当たり９５質量％以上であることが更により好ましい。その上限としては、固形分当たり１００質量％以下であることが好ましい。また、糖加熱縮合物のレボグルコサン含量が、固形分当たり１．５質量％以下となる程度に行うことが好ましく、固形分当たり１．０質量％以下となる程度に行うことがより好ましく、固形分当たり０．５質量％以下となる程度に行うことが更により好ましい。また、資化後に得られる糖加熱縮合物中の単糖及びレボグルコサンの含有量は、固形分基準で原料中の単糖及びレボグルコサンの含有量よりそれぞれ低減した量になる。具体的には、例えば、糖加熱縮合物中の単糖及びレボグルコサンの含有量は、固形分基準で原料中の単糖及びレボグルコサンの含有量のそれぞれ５０％以下に低減することができる。好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下とすることができる。
【００４３】
上記資化処理の後には、遠心分離や濾過等の手法により微生物（菌体）やその他不溶物を除去することができる。その後、脱塩、脱臭、脱色処理などの通常の精製処理を施してもよい。また、その精製処理の前又は後には、常法により酵素処理や還元処理を施してもよい。更に、得られた水溶性食物繊維組成物は、濃縮・希釈をおこない液体状としてもよく、スプレードライヤー等により粉末化して粉末状としてもよい。なお、本発明は、クロマト分画や膜分画等の通常の低分子成分除去手段を排除するものではなく、そのような手法による除去手段をいずれかの工程で行い、本発明による手法と併用して、糖加熱縮合物から低分子成分を除去するようにしてもよい。
【００４４】
本発明の製造方法で得られた水溶性食物繊維組成物は、高純度の水溶性食物繊維を含む点等において優れた水溶性食物繊維素材であり、例えば、食品添加剤の用途に好適に用いられ得る。すなわち、上記手法により、水溶性食物繊維を高純度に含む水溶性食物繊維組成物を製造した後、飲食品原料に、適宜添加することにより、水溶性食物繊維を含んでなる飲食品となしてもよい。飲食品へ添加するタイミングについて、特に制限はなく、飲食品の製造（加工・調理）前、製造中、製造後のいずれでもよい。
【００４５】
本発明の製造方法で得られた水溶性食物繊維組成物を添加してなる飲食品としては、その種類に特に制限はなく、例えば、各種調味料類、各種和菓子類、各種洋菓子類、各種氷菓、各種ペースト状食品、各種果物・野菜加工品、各種食肉加工品、各種乳製品、各種惣菜食品、各種瓶詰・缶詰類、各種ミックス粉類、各種炭水化物類、各種飲料等であってよい。本発明で得られた水溶性食物繊維組成物を用いることで食物繊維を効率的に付与することができ、また飲食品の種類によっては、その味質を改良する作用効果が得られる。ので特に、清涼飲料やノンアルコールビールなどの非アルコール系飲料やビールやチューハイなどアルコール系飲料に用いることが好ましい。また、上記飲食品としては、通常の飲食品に加え、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等）、健康食品、栄養補助食品、病者用食品、サプリメント等であってもよい。その形態としては、例えば、錠剤、液剤、カプセル（軟カプセル、硬カプセル）、粉末、顆粒、スティック、ゼリーなどが挙げられる。このような製剤化は、通常、食品の製造に用いられる方法に従って行うことができる。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例を挙げて本発明の詳細を説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下、単に％と記載した場合は、固形分当たりの質量％を意味する。
【００４７】
［試験例１］（レボグルコサン分解活性を有する菌株の分離）
様々な土壌よりサンプルを取得し、液体培養及び固体培養を行うことにより、レボグルコサン分解活性を有する菌株の分離を試みた。そのための液体培養培地としては、Yeast Nitrogen Base培地（BD社製）にレボグルコサンを固形分当たり１質量％となるように添加し、ｐＨ７．０に調整したものを用いた。また、固体培養培地としては、上記液体培養用の培地に１．５質量％Ａｇａｒを添加して調製した固体培養プレートを用いた。培養温度６０℃で生育する菌株の分離を試みた結果、特に良い生育を示す菌株が３株分離された。この３菌株をそれぞれ１５０１株、２７０１株、及び６５８０１株と命名した。
【００４８】
図１には、上記３菌株について、白金耳で上記固体培養プレート上にストリーク後、培養温度４０℃、５０℃、６０℃、又は７０℃で２４時間培養した後の様子を示す。
【００４９】
［試験例２］（レボグルコサン分解能の確認）
試験例１と同様の液体培地を用いて、１５０１株及び６５８０１株については培養温度６０℃にて、２７０１株については培養温度５０℃にて、それぞれ振とう培養（１００ｒｐm）を行った。菌株の生育は培養液の濁度（ＯＤ６６０）で確認した（図２）。また、レボグルコサンの減少は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて確認した。なお、ＴＬＣ条件としては、１−ブタノール:エタノール:水（５：３：２／ｖ：ｖ：ｖ（容量比））を用いて展開し、プレートをよく乾燥させた後、ナフトレゾシノール試薬を噴霧して、１２０℃で５分間加熱することにより、レボグルコサンを検出した（図３）。
【００５０】
その結果、図３に示されるように、１５０１株、２７０１株、及び６５８０１株のいずれにおいても経時的にレボグルコサンの減少がみられた。
【００５１】
［試験例３］（菌株の同定）
試験例１及び試験例２においてレボグルコサンを資化（分解）することが確認された３菌株について、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に基づく分子系統解析を行った。
【００５２】
【表１】
2019041702.tif 000002
【００５３】
その結果、表１に示されるように、１５０１株及び２７０１株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、いずれも、公知のデータベース収載のバチルス スミシー（Bacillus smithii）の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列と９９．９％の相同性を示し、６５８０１株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、公知のデータベース収載のゲオバチルス サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列と９９．９％の相同性を示し、それぞれ当該属種に属する微生物であると同定された。
【００５４】
なお、上記１５０１株は、バチルス スミシー１５０１株として、平成２９年９月１日付けで、受領番号ＡＰ−０２５４２で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した。また、上記２７０１株は、バチルス スミシー２７０１株として、平成２９年９月１日付けで、受領番号ＡＰ−０２５４１で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した。また、上記６５８０１株は、ゲオバチルス サーモグルコシダシウス６５８０１株は、平成２９年８月１８日付けで、受領番号ＡＰ−０２５３３で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した。
【００５５】
［試験例４］（糖加熱縮合物の資化処理）
触媒として活性炭の存在下にグルコースシラップを加熱処理することで得られた、難消化性グルカン（商品名「フィットファイバー＃８０」、日本食品化工株式会社製）を使用し、これを更に糖質分解酵素（α−アミラーゼ及びアミログルコシダーゼ）で処理したうえ、固形分濃度１０質量％に希釈し、ｐＨを約７．０に調整して、資化処理に供する対象物とした。
【００５６】
上記の溶液（糖加熱縮合物を含有する溶液）と、液体培地（0.2質量%NH4Cl、0.6質量%K2HPO4、0.6質量%KH2PO4、0.1質量%MgSO4・7H2O、0.02質量%CaCl2・2H2O、0.2質量%Vitamin mixture、0.01質量%Trace elements、0.04質量%Tween 80）とをそれぞれ滅菌し、１００ｍＬ容三角フラスコにて１０ｍＬずつ混合し、１５０１株、２７０１株、及び６５８０１株を、それぞれ植菌した。その後、恒温槽（５０℃、１２０−１４０ｒｐｍ）で所定期間資化処理（培養）を行った。菌株の生育は濁度（ＯＤ６６０）を測定して確認した（図４）。所定期間の資化処理（培養）後、各試料溶液を、０．４５μｍフィルター濾過と脱塩後に、以下のHPLC条件の分析に供して、各試料溶液中に含まれるのレボグルコサン濃度及びグルコース濃度を測定した（図５及び図６）。なお、資化処理に供された上記溶液中の糖加熱縮合物の三糖以上の糖質含量を以下の同じHPLC条件で分析したところ７８．４％であり、酵素-HPLC法による水溶性食物繊維含量は７８．０％であった。
【００５７】
＜HPLC条件＞
カラム： Ultron PS-80N・L (φ8.0 mm×500 mm) 
カラム温度：８０℃
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：水
検出器： Refractive index 
注入量：１０μＬ
【００５８】
その結果、図５及び図６に示されるように、それぞれの菌株において、経時的にグルコースやレボグルコサンの減少がみられ、最大で０％まで減少することが確認できた。また、その際、各試料溶液中の三糖以上の糖質含量を上記HPLC条件で分析したところ、１５０１株、２７０１株、及び６５８０１株において、それぞれ９２．３％、９８．１％、及び９１．７％まで増加することが確認された。なお、各培養物の食物繊維含量は測定していないが、用いた難消化性グルカン自体が酵素-HPLC法で用いられる糖質分解酵素（α−アミラーゼ及びアミログルコシダーゼ）で処理されたものであり、また、上述したとおり、HPLC分析における三糖以上の糖質含量は７８．４％であり、酵素-HPLC法による水溶性食物繊維含量は７８．０％であり、これらの値がほぼ一致していることから、各資化処理物の食物繊維含量も上記三糖以上の糖質含量と同程度と推察された。
【００５９】
［試験例５］（飲料試験）
糖類ゼロ設計の飲料試験を行うため、アセスルファムKは砂糖の２００倍、スクラロースは砂糖の６００倍の甘味として計算し、飲料（水溶液）全体の甘味度が９．６となるよう両者を質量比１：１で水に溶解し、水溶性食物繊維組成物および香料を添加し、飲料（水溶液）を調製した。水溶性食物繊維組成物は、試験例４で得られた資化処理物をフィルターろ過、脱色および脱塩処理したものを用い、食物繊維組含量が固形分あたり１．５ g/１００ mlとなるよう添加した。香料はグレープフルーツフレーバーを用いた。その結果、資化処理物（水溶性食物繊維組成物）を添加することで、水溶性食物繊維組成物未添加区よりもコクやボディ感といった味質が改善され、高甘味度甘味料特有の嫌味も低減することができた。
【図１】
2019041702.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月6日(2017.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖加熱縮合物をバチルス（Bacillus）属細菌又はゲオバチルス（Geobacillus）属細菌に資化させる工程を含む、水溶性食物繊維組成物の製造方法。
【請求項２】
前記バチルス属細菌がバチルス スミシー（Bacillus smithii）であり、又は、前記ゲオバチルス属細菌がゲオバチルス サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）である請求項１記載の水溶性食物繊維組成物の製造方法。
【請求項３】
前記バチルス属細菌がバチルス スミシー１５０１株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５４２）又はバチルス スミシー２７０１株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５４１）であり、又は、前記ゲオバチルス属細菌がゲオバチルス サーモグルコシダシウス６５８０１株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５３３）である請求項１記載の水溶性食物繊維組成物の製造方法。
【請求項４】
前記バチルス（Bacillus）属細菌又は前記ゲオバチルス（Geobacillus）属細菌による前記糖加熱縮合物の資化を４０℃〜９５℃の範囲に属する温度環境で行う請求項１〜３のいずれか１項に記載の水溶性食物繊維組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法で得られた水溶性食物繊維組成物を飲食品原料に添加する工程を含む、飲食品の製造方法。
【請求項６】
バチルス スミシー１５０１株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５４２）。
【請求項７】
バチルス スミシー２７０１株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５４１）。
【請求項８】
ゲオバチルス サーモグルコシダシウス６５８０１株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５３３）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
また、前記バチルス属細菌がバチルス スミシー１５０１株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５４２）又はバチルススミシー２７０１株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５４１）であり、又は、前記ゲオバチルス属細菌がゲオバチルス サーモグルコシダシウス６５８０１株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５３３）であることが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
バチルス スミシー１５０１株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５４２）。
バチルス スミシー２７０１株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５４１）。
ゲオバチルス サーモグルコシダシウス６５８０１株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５３３）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
なお、バチルス スミシー１５０１株は、平成２９年９月１日付けで、受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５４２で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
また、バチルス スミシー２７０１株は、平成２９年９月１日付けで、受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５４１で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
また、ゲオバチルス サーモグルコシダシウス６５８０１株は、平成２９年８月１８日付けで、受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５３３で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
なお、上記１５０１株は、バチルス スミシー１５０１株として、平成２９年９月１日付けで、受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５４２で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した。また、上記２７０１株は、バチルス スミシー２７０１株として、平成２９年９月１日付けで、受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５４１で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した。また、上記６５８０１株は、ゲオバチルス サーモグルコシダシウス６５８０１株は、平成２９年８月１８日付けで、受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０２５３３で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した。