(57)【要約】      （修正有）【課題】がん治療、診断または検査に用いられる放射線同位元素をウイルス用いて送達することで、優れたがん治療、診断または検査のための医薬組成物の提供。【解決手段】ホウ素クラスター脂質への放射線同位元素標識化法と標識化ホウ素クラスター脂質のウイルス粒子への導入方法、該方法で得られる放射線同位元素標識化ウイルス粒子、並びに該ウイルス粒子を用いた抗がん剤、診断剤または検査剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスエンベロープに取り込まれる脂質であって、放射線放出核種で標識された脂質。
【請求項２】
放射線放出核種として、α線放出核種、β線放出核種またはこれらの混合物を有することを特徴とする、請求項１に記載の脂質。
【請求項３】
前記放射線放出核種として、１２３Ｉ、１３１Ｉ、２１１Ａｔまたはこれらの混合物を有することを特徴とする、請求項２に記載の脂質。
【請求項４】
前記放射線放出核種が、ホウ素クラスター構造を介して前記脂質に結合している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の脂質。
【請求項５】
前記ホウ素クラスター構造と前記脂質がＣ１〜Ｃ６のアルキルリンカーを介して結合している、請求項４に記載の脂質。
【請求項６】
前記脂質がグリセロールとＣ１２〜Ｃ２０脂肪酸が結合した構造を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の脂質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の放射線放出核種で標識された脂質を含むウイルス粒子。
【請求項８】
前記脂質が、前記ウイルス粒子のエンベロープに含まれる、請求項７に記載のウイルス粒子。
【請求項９】
前記ウイルス粒子が、野生型ウイルス、組換え型ウイルス、または不活化ウイルスである、請求項７または８に記載のウイルス粒子。
【請求項１０】
前記ウイルス粒子が、ＨＶＪ−Ｅである、請求項７〜９のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載のウイルス粒子またはその組み合わせを含む、がん治療剤。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載のウイルス粒子またはその組み合わせを含む、がん診断剤または検査剤。
【請求項１３】
請求項１１のがん治療剤および請求項１２のがん診断剤または検査剤を含む、医薬組成物またはキット。
【請求項１４】
放射線放出核種で標識された脂質を製造する方法であって、ホウ素クラスター構造を介して放射線放出核種と脂質を結合させる工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記ホウ素クラスター構造を、Ｃ１〜Ｃ６アルキルリンカーを介して脂質と結合させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記放射線放出核種を酸化条件下で酸と混合した後に、前記脂質と混合する工程を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
放射線放出核種で標識化されたウイルス粒子を製造する方法であって、ウイルス粒子と請求項１〜６のいずれか一項に記載の放射線放出核種で標識化された脂質を混合する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホウ素クラスター脂質への放射線同位元素標識化法と標識化ホウ素クラスター脂質のウイルス粒子への導入方法、該方法で得られる放射線同位元素標識化されたウイルス粒子、並びに該ウイルス粒子を用いた抗がん剤、診断剤または検査剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、がんの治療法のひとつとして、放射線同位元素（ＲＩ）で標識された薬剤を体内に投与する核医学治療が知られている。例えばヨウ化ナトリウム（１３１Ｉ）は、古くから甲状腺がんの治療に汎用されてきた。ヨウ化物イオンは、体内で甲状腺及び甲状腺がんに特異的に集積する性質があるため、１３１Ｉが放出するβ線で腫瘍を内部から照射することにより治療することができる。しかしながら、１３１Ｉを用いる治療は患者の入院だけでなく、放射線管理のための特殊な病室への隔離を必要とし、また、再発に伴う複数回投与や薬剤耐性の出現に伴う治療中止が課題になっている。
【０００３】
一方、最近新たに注目されているＲＩのひとつに、アスタチン−２１１（２１１Ａｔ）がある。２１１Ａｔが放出するα線は、１３１Ｉが放出するβ線の約１００倍の細胞殺傷能力を有している。２１１Ａｔは７．２時間と比較的短い半減期を有しているが、その半減期は標識化合物を作成し、がん細胞を殺傷するには充分な時間である一方で、患者への負担を軽減することができることが期待され、新しい治療法として注目を浴びている。アスタチン標識化合物に関する動物実験ついての報告はいくつかあるものの、がん細胞特異的に２１１Ａｔを効率よく送達するための技術は、さらなる開発を必要としている。
【０００４】
遺伝子治療を目的とした生体内の遺伝子送達のために、様々なウイルスおよび合成ウイルス粒子が用いられている（非特許文献１、２）。例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）のゲノムを不活化して増殖能を喪失させたＨＶＪエンベロープ（ＨＶＪ‐Ｅ）は、がん細胞に速やかに取り込まれ、さらに他の分子をその中に封入することができる性質を有するウイルス様粒子であり、遺伝子等の生体機能分子のベクターとして利用するために開発がされてきた（特許文献１から３など）。また、ＨＶＪ‐Ｅはそれのみでも腫瘍特異的に細胞死を誘導することが知られている（特許文献４、５等）。
【０００５】
ホウ素原子・炭素原子・水素原子からなるクラスターであるカルボラン構造ならびにデカボランなどのホウ素原子・水素原子からなるクラスター構造を有するホウ素クラスター脂質は、リポソームなどの脂質二分子膜に速やかに取り込まれる性質を有し、生体内にホウ素をデリバリーするため等に使用し得ることが知られていた（特許文献６）。
【０００６】
しかながら、ヨウ素、アスタチンといった放射線放出同位体をウイルス様粒子によりがん組織に送達する技術は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−２８６２８２号公報
【特許文献２】国際公開０１／５７２０４号
【特許文献３】国際公開２００４／０３５７７９号
【特許文献４】特開２０１１−０５０２９２号公報
【特許文献５】国際公開２００５／０９４８７８号
【特許文献６】特開２００８−７４８１７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＲＣ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，Ｖｏｌ．２６０，Ｎｏ．５１１０，ｐｐ．９２６−９３２
【非特許文献２】Ｌｅｄｌｅｙ  ＦＤ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９５，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．９，ｐｐ．１１２９−１１４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、がん治療、診断または検査に用いられる放射線同位元素をウイルス粒子を用いて送達することで、優れたがん治療、診断または検査のための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、ヨウ素あるいはアスタチンといったＲＩ元素の水溶液を過酸化水素のような酸化剤の存在下で酸と混合した後、ホウ素クラスター脂質と混合・反応させることにより、ヨウ素標識あるいはアスタチン標識ホウ素クラスター脂質といったＲＩ標識化ホウ素クラスター脂質が得られることを見出した。さらに得られたＲＩ標識化ホウ素クラスター脂質と不活性化センダイウイルス（ＨＶＪ−Ｅ）のようなウイルス粒子を混合することにより、ヨウ素あるいはアスタチンなどでＲＩ標識したウイルス粒子が得られることも見出した。これら知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は一態様において以下を提供する。
［１］  ウイルスエンベロープに取り込まれる脂質であって、放射線放出核種で標識された脂質。
［２］放射線放出核種として、α線放出核種、β線放出核種またはこれらの混合物を有することを特徴とする、前記［１］に記載の脂質。
［３］前記放射線放出核種として、１２３Ｉ、１３１Ｉ、２１１Ａｔまたはこれらの混合物を有することを特徴とする、前記［２］に記載の脂質。
［４］前記放射線放出核種が、ホウ素クラスター構造を介して前記脂質に結合している、前記［１］〜［３］いずれかに記載の脂質。
［５］前記ホウ素クラスター構造と前記脂質がＣ１〜Ｃ６のアルキルリンカーを介して結合している、前記［４］に記載の脂質。
［６］前記脂質がグリセロールとＣ１２〜Ｃ２０脂肪酸が結合した構造を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の脂質。
［７］前記［１］〜［６］のいずれかに記載の放射線放出核種で標識された脂質を含むウイルス粒子。
［８］前記脂質が、前記ウイルス粒子のエンベロープに含まれる、前記［７］に記載のウイルス粒子。
［９］前記ウイルス粒子が、野生型ウイルス、組換え型ウイルス、または不活化ウイルスである、前記［７］または［８］に記載のウイルス粒子。
［１０］前記ウイルス粒子が、ＨＶＪ−Ｅである、  ［７］〜［９］のいずれかに記載のウイルス粒子。
［１１］前記［７］〜［１０］のいずれかに記載のウイルス粒子またはその組み合わせを含む、がん治療剤。
［１２］前記［７］〜［１０］のいずれかに記載のウイルス粒子またはその組み合わせを含む、がん診断剤または検査剤。
［１３］前記［１１］のがん治療剤および前記［１２］のがん診断剤または検査剤を含む、医薬組成物またはキット。
［１４］放射線放出核種で標識された脂質を製造する方法であって、ホウ素クラスター構造を介して放射線放出核種と脂質を結合させる工程を含む、前記方法。
［１５］前記ホウ素クラスター構造を、Ｃ１〜Ｃ６アルキルリンカーを介して脂質と結合させる、前記［１４］に記載の方法。
［１６］前記放射線放出核種を酸化条件下で酸と混合した後に、前記脂質と混合する工程を含む、前記［１４］または［１５］に記載の方法。
［１７］放射線放出核種で標識化されたウイルス粒子を製造する方法であって、ウイルス粒子と前記［１］〜［６］のいずれかに記載の放射線放出核種で標識化された脂質を混合する工程を含む、前記方法。  
【００１２】
また、別の態様において、本発明は放射線放出核種で標識化されたウイルス粒子を提供する。
【００１３】
また、別の態様において、本発明はウイルス粒子のエンベロープが放射線放出核種で標識化されている、前記ウイルス粒子を提供する。
【００１４】
また、別の態様において、本発明は放射線放出核種で標識化された脂質を外部から取り込むことでエンベロープが標識されている、前記ウイルス粒子を提供する。
【００１５】
また、別の態様において、本発明は前記脂質がホウ素クラスター構造を介して放射線放出核種で標識化されている、前記ウイルス粒子を提供する。
【００１６】
また、別の態様において、本発明は前記ホウ素クラスター構造と前記脂質がＣ１〜Ｃ６のアルキルリンカーを介して結合している、前記ウイルス粒子を提供する。
【００１７】
また、別の態様において、本発明は前記脂質がグリセロールとＣ１２〜Ｃ２０脂肪酸が結合した構造を有する、前記ウイルス粒子を提供する。
【００１８】
また、別の態様において、本発明は放射線放出核種として、α線放出核種、β線放出核種またはこれらの混合物を有することを特徴とする、前記ウイルス粒子を提供する。
【００１９】
また、別の態様において、本発明は前記放射線放出核種として、１２３Ｉ、１３１Ｉ、２１１Ａｔまたはこれらの混合物を有することを特徴とする、前記ウイルス粒子を提供する。
【００２０】
また、別の態様において、本発明は前記ウイルス粒子が、野生型ウイルス、組換え型ウイルス、または不活化ウイルスである前記ウイルス粒子を提供する。
【００２１】
また、別の態様において、本発明は前記ウイルス粒子が、ＨＶＪ−Ｅである、前記ウイルス粒子を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は放射線放出核種で標識されたホウ素クラスター脂質をＨＶＪ−Ｅ等のウイルス粒子に取り込ませることにより、放射線放出核種で標識されたウイルス粒子を提供する。放射線放出核種で標識されたウイルス粒子はがん組織に効率的に取りこまれ、より強力な抗腫瘍効果を発揮し、また、がん組織を画像化することができる。
【００２３】
また、２１１Ａｔのようなα線放射核種を用いる態様については、β線核医学治療に比較して、エネルギーの高いα線を利用するため、高い細胞殺傷能力を有し（β線の約１００倍）、また飛距離が短いため、より特異的な細胞殺傷能力を有することができ、周辺の正常細胞への悪影響が少ないという点で優れている。α線放出核種は極めて強力な細胞殺傷能力を有するため、がん細胞への特異的な集積が実用化の鍵となるが、上述のようにウイルス粒子を使用することによりがん細胞選択性を持たせることができる。ＨＶＪ−Ｅのようなウイルス粒子は細胞融合活性を有し、１０秒程度の短時間でがん細胞の細胞膜と融合する。
【００２４】
本発明の放射線標識ウイルス粒子、例えばα線標識ＨＶＪ−Ｅを患部に投与することにより、放射線照射による患部の治療と抗腫瘍免疫惹起による転移巣の治療が可能となるため、難治性がん、手術不応の進行がんへの核医学治療に有用である。特に、α線核種として２１１Ａｔを使用する態様については半減期が７．２時間と短く、投与後の放射能の消失が早いために入院期間の短縮が可能であり、患者のＱＯＬに貢献する点で優れている。
【００２５】
さらに、ウイルス粒子としてＨＶＪ−Ｅを使用する態様においては、ＨＶＪ−Ｅのみでも腫瘍特異的に細胞死を誘導するが、α線、β線の放射線放出核種で標識することにより、より強力な抗腫瘍活性が得られる。
【００２６】
また、表面上のヘマグルチニン（ＨＮ）を欠損させることで、正常細胞との相互作用を減らし、さらにはがん細胞をターゲティングする種々の分子をその表面上に提示可能であるという特徴を有している。これによって様々ながんを対象にできる。
【００２７】
また、ＨＶＪ−Ｅは抗腫瘍免疫を惹起できるため、同時に遠隔の転移巣の治療も可能である。
【００２８】
また、α線またはβ線放出核種で標識されたウイルス粒子と、γ線核種で標識された同種のウイルス粒子を併用することにより、がんの治療と同時に治療対象の癌組織の状態を可視化することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ホウ素クラスター脂質Ｃ３ＤＳＢＬをヨウ素標識化し、さらにこれをＨＶＪ−Ｅに取り込ませてヨウ素化ＨＶＪ−Ｅを作製する方法の概略を示す。
【図２】図２は、Ｃ３ＤＳＢＬおよびＮａＩ依存的にＨＶＪ−Ｅが効率的にヨウ素化されることを示す。
【図３】図３は、Ｃ３ＤＳＢＬを２１１Ａｔ標識化し、さらにこれをＨＶＪ−Ｅに取り込ませて２１１Ａｔ標識化ＨＶＪ−Ｅを作製する方法の概略を示す。
【図４】図４は、２１１Ａｔ標識化Ｃ３ＤＳＢＬ依存的に２１１ＡｔがＨＶＪ−Ｅに固定されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は単なる例示であり、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００３１】
（定義）
本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
【００３２】
本明細書において、「アルキル又はアルキル基」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜２０個（Ｃ１〜２０）、炭素数１〜１５個（Ｃ１〜１５）、炭素数１〜１０個（Ｃ１〜１０）であり得る。
【００３３】
アルキル基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。例えば、Ｃ１〜８アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等が含まれる。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
【００３４】
本明細書中において、「アルキレン」とは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素からなる二価の基を意味する。
【００３５】
本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００３６】
本明細書において、「ウイルス粒子」は細胞外におけるウイルスの状態であって、粒子構造を有するものを意味する。好ましくは、ウイルス粒子はエンベロープ構造を含む。
【００３７】
本明細書において、ウイルスの「エンベロープ」とは、ウイルス粒子の最も外側に位置する膜状の構造であり、ウイルスゲノムおよびカプシドタンパク質を覆う構造を意味する。好ましくは、エンベロープは脂質二重膜構造を有している。
【００３８】
本発明の「ウイルス粒子」は野生型ウイルス、組換えウイルス、不活性化ウイルスであってもよい。組換えウイルスおよび不活化ウイルスの製造は、当該技術分野で既知の方法により行うことができる。例えば、不活性化ウイルスは、ＵＶ処理またはアルキル化剤による処理によって、製造することができる。本明細書において、野生型ウイルス以外の組換えウイルスまたは不活化ウイルスを「ウイルス様粒子」と呼ぶことがある。
【００３９】
本発明においてウイルス粒子として使用されるウイルスは特に限定されないが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスを使用することができる。またこれらのウイルスを不活化したウイルス様粒子を使用することができる。好ましくは、パラミクソウイルス科のウイルスを使用することができ、より好ましくは、センダイウイルス（ＨＶＪ）およびこれ由来の組換えまたは不活性化ウイルスを使用することができる。最も好ましくは、ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ２００２，Ｖｏｌｕｍｅ  ６，Ｉｓｓｕｅ  ２，ｐｐ２１９‐２２６等に記載される、ＨＶＪ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｖｅｃｔｏｒ（ＨＶＪ−Ｅ）を使用することができる。
【００４０】
本発明のウイルス粒子は、さらに公知の方法により、がん細胞への標的化特異性を増強することができる。当該方法には、ウイルスエンベロープへのペプチド等のがん標的化物質の付与、ウイルス粒子内への組換え遺伝子の封入等を用いることができる。
【００４１】
ＨＶＪ−Ｅを用いる場合、さらに表面上のヘマグルチニン（ＨＮ）を欠損させることで、正常細胞との相互作用を減らすことができる。また、がん細胞をターゲティングする種々の分子をその表面上に提示させることにより、様々ながんを対象にすることができる。またＨＶＪ−Ｅは抗腫瘍免疫を惹起できるため、同時に遠隔の転移巣の治療も可能である。
【００４２】
本明細書において、「放射線放出核種」とは、α線またはβ線を放出する核種を意味し、これらを混合して使用することもできる。α線またはβ線を放出する核種としては、それぞれ２１１Ａｔおよび１３１Ｉを用いることが好ましい。
【００４３】
２１１Ａｔは、ハロゲンに属する元素であるアスタチン（Ａｔ）の放射性同位体である。当該２１１Ａｔは、細胞殺傷性である高エネルギーのα線を放出して、安定な鉛（２０７Ｐｂ）に壊変する。２１１Ａｔの半減期は７．２時間である。すなわち、２１１Ａｔは、短寿命かつ高い細胞殺傷性を有するため、効率的にがん組織を破壊することができる。
【００４４】
これらの放射線放出核種は、既知の方法を用いて製造することができる。例えば、２１１Ａｔは、サイクロトロン等の加速器を用いＢｉ−２０９をターゲット物質とする（α，２ｎ）核反応により製造され、乾式法（蒸留）で精製したのち、水に溶解して２１１Ａｔ水溶液として供給される。
【００４５】
本明細書において、「ホウ素クラスター脂質」とは、ホウ素原子・炭素原子・水素原子からなるクラスターであるカルボラン構造ならびにデカボランなどのホウ素原子・水素原子からなるクラスター構造を含む脂質を意味する。ホウ素クラスター構造としては特に限定されないが、ｎｉｄｏ型カルボラン、ｃlｏsｏ型カルボラン、硫黄置換型ウンデカヒドロドデカボレートなどを使用することができる。好ましくは、硫黄置換型ウンデカヒドロドデカボレートを使用することができる。
【００４６】
脂質としては、ウイルス粒子のエンベロープに取り込まれるものであれば特に限定されないが、好ましくは、コレステロール、スフィンゴ脂質、長鎖脂肪酸（例えば炭素数１２以上の脂肪酸）、高級アルコール（例えば炭素数６以上のアルコール）、またはグリセロールと１つ以上の脂溶性脂肪酸部分が結合した脂質を用いることができる。
スフィンゴ脂質は、スフィンゴイドに脂肪酸がアミド結合したセラミドを共通構造とする脂質であり、糖がグリコシド結合したスフィンゴ糖脂質並びにリン酸および塩基が結合したスフィンゴリン脂質を用いることができる。
グリセロールと結合する脂溶性脂肪酸部分としては、Ｃ１４〜Ｃ２４、Ｃ１６〜Ｃ２２またはＣ１８〜Ｃ２０の、置換されてもよいアルキル基を有する脂肪酸を用いることができ、そのアルキル基の一部はアルキレン構造に置換されていてもよい。脂溶性脂肪酸部分を２つ含む場合、好ましくは、同じ長さのアルキル基を有する脂溶性脂肪酸部分を含むことができる。より好ましくは、ジステアロイル基を有する脂質を用いることができる。
【００４７】
本発明のホウ素クラスター脂質において、ホウ素クラスター構造と脂質はリンカーを介して結合していてもよい。リンカーの構造は特に限定されないが、例えば、Ｃ１〜Ｃ１２のアルキル基、アルキレン基、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチドなどを用いることができる。より好ましくは、炭素数が１０、９、８、７、６、５、４、３または２のアルキル基もしくはアルキレン基、またはメチレン基を用いることができる。
【００４８】
本発明において特に好ましい放射線標識化脂質は、以下の構造を有する。
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【００４９】
（放射線放出核種で標識された脂質の合成方法）
本発明の放射線放出核種で標識された脂質は、適当な溶媒中に放射線同位元素を好ましくはイオン状態で含む溶液に酸化剤および酸を加えた溶液と、別に準備した適当な溶媒中に脂質を含む溶液とを混合し静置することで合成される。
【００５０】
好ましくは放射線同位元素を含む溶液は、放射線同位元素の金属塩を含み、金属としてアルカリ金属またはアルカリ土類金属を含むことができる。好ましくは金属としてナトリウムを含むことができる。
【００５１】
放射線同位元素を含む溶液の溶媒としては特に限定されないが、好ましくは、生理食塩水を使用することができる。
【００５２】
使用する酸化剤は特に限定されないが、例えばＨ２Ｏ２、クロラミンTなどを用いることができる。好ましくはＨ２Ｏ２を使用することができる。
【００５３】
使用する酸は特に限定されないが、例えば硫酸、過塩素酸、塩酸などを用いることができる。好ましくは塩酸を使用することができる。
脂質を含む溶液の溶媒としては特に限定されず、アルコール、エーテルなどの有機溶媒またはこれらと水の混合物を用いることができる。
【００５４】
放射線同位元素を含む溶液と脂質を含む溶液を混合したのち、好ましくは２０℃〜８０℃、３０℃〜７０℃または４０℃〜６０℃、最も好ましくは５０℃において、好ましくは５〜１２０分、１０〜１００分、２０〜８０分、４０〜６０分、最も好ましくは４０分間静置することで、放射線同位元素と脂質の結合反応を行うことができる。
【００５５】
放射線同位元素を含む溶液と脂質を含む溶液を混合する際には、好ましくはモル比で１００：１〜１：１、５０：１〜１：１、２０：１〜１：１、１０：１〜１：１、５：１〜１：１、２：１〜１：１、最も好ましくは６：１で混合することができる。
【００５６】
放射線放出核種で標識された脂質が合成されたことは、ＮＭＲなど公知の方法で確認することができる。
【００５７】
（放射線標識化脂質を含むウイルス粒子の製造方法）
本発明の放射線標識化脂質を含むウイルス粒子は、ウイルス粒子を含む溶液と、放射線標識化脂質を含む溶液を混合し、静置することで製造される。反応完了後、遠心分離等の操作により、放射線標識化脂質を含むウイルス粒子を単離する。
【００５８】
ウイルス粒子を含む溶液と、放射線標識化脂質を含む溶液を混合したのち、好ましくは５℃〜７０℃、１０℃〜６０℃または２０℃〜５０℃、３０〜４０℃、最も好ましくは３７℃において、好ましくは１〜６０分、２〜５０分、３〜４０分、４〜３０分、５〜２０分、最も好ましくは１０分間静置することで反応を行うことができる。
【００５９】
ウイルス粒子と放射線標識化脂質の量比は、１００００  ＨＡＵ／ｍＬのウイルス粒子に対して、放射線標識化脂質を好ましくは１．５〜２０ｍＭ、２．０〜１０ｍＭまたは２．５〜５ｍＭ、最も好ましくは、２．５ｍＭ反応させることができる。
【００６０】
なお、「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいい、１ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９６１、Ｖｏｌ．４、ｐｐ．２０９〜２１３）。ＨＡＵの値は、公知の方法で測定することができる。
【００６１】
以上で説明した本発明の放射線放出核種で標識された脂質およびこれを含むウイルス粒子の製造方法における各工程における溶媒や反応温度等の反応条件は、後述の実施例において代表的な例として詳細に記載するが、必ずしもそれらに限定されるわけではなく、当該技術分野における当業者であれば、一般的な知識に基づいてそれぞれ過度の試行錯誤を要することなく選択可能である。
【００６２】
（医薬組成物）
本発明の放射線標識化脂質を含むウイルス粒子は、抗がん剤またはがん可視化のための診断剤もしくは検査剤といった医薬組成物としても提供される。本発明の放射線標識化脂質を含むウイルス粒子を含む抗がん剤、診断剤または検査剤は、様々な固形癌、細胞癌の治療、診断または検査に有効であり、例えば、消化器系、泌尿器科系、神経系、結合組織における癌、皮膚癌等の癌、具体的には、甲状腺癌、メラノーマ、前立腺癌、大腸癌などの治療、診断または検査に適用することができる。
【００６３】
上記がんの治療は、原発性がんの進行抑制、退縮、排除、転移の抑制、再発の防止を含む。
【００６４】
上記がんの診断または検査は、生体内のがん細胞の有無の検出、がん組織の可視化、がん組織量の定量を含む。
【００６５】
本発明の放射線標識化脂質を含むウイルス粒子は、ヒトまたは他の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどに対して経口的または非経口的に投与することができる。
【００６６】
非経口的な投与としては特に限定されないが、血管内投与、皮下投与、筋肉内投与、直腸投与、経皮投与、点鼻投与などを用いることができる。
【００６７】
本発明の医薬組成物の剤型は特に限定されないが、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又は液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、若しくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。これらの製剤は常法に従って調製することができる。好ましくは、経口投与用又は注射用の液体製剤である。
【００６８】
本発明の医薬組成物を注射剤として提供する場合、本発明のウイルス粒子を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、エタノールなどのアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリアルコール、ポリソルベート８０などの非イオン界面活性剤等を併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。
【００６９】
本発明の放射線標識化ウイルス粒子を注射により投与する場合、腫瘍部位、またはその周辺部に直接注射により投与することができる。
【００７０】
経口投与のための組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００７１】
本発明の医薬組成物の投与量は、がんの大きさ、患者の年齢、体重、状態等を考慮して、医者または医療従事者が適宜決定することができる。
【００７２】
本発明の放射線標識化ウイルス粒子は、その目的に合わせて、異なる放射線放出核種によって標識されたウイルス粒子を組み合わせて用いることができる。
また、本発明の放射線標識化ウイルス粒子の機能を損なわない範囲で、他の抗がん剤もしくは他の治療剤と組合せて用いることができる。
本発明の放射線標識化ウイルス粒子と他の抗がん剤もしくは他の治療剤を組み合わせて用いる場合、これらの薬剤は単一の製剤に含まれていてもよく、また、別の製剤に含まれていてもよい。これらが別の製剤によって提供される場合、その製剤の組み合わせを含むキットの形態で提供されてもよく、また、それぞれ、他の製剤と組み合せるための単剤として提供されてもよい。これらの製剤は、同時に投与されてもよく、また、連続的に投与されてもよい。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００７４】
（アミノクロソドデカボレートのヨウ素化）
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ＮａＩ（２７０ｍｇ  １．８ｍｍｏｌ）を水３．７５ｍＬに溶かし、過酸化水素水溶液  ３ｍＬ（１．８ｍｍｏｌ）を加えたのち、ＨＣｌ水溶液３  ｍＬ（１．８ｍｍｏｌ）を混ぜた。溶液は速やかに赤褐色に変わりＩ２の生成が確認された。この溶液を、アミノクロソドデカボレート（Ｎａ［Ｂ１２Ｈ１１ＮＨ３］）を５６５ｍｇ（３．１２ｍｍｏｌ）溶かしたエタノール６．２５ｍＬと水２０ｍＬの混合溶液に滴下した。滴下後５０°Ｃで１時間攪拌後、溶媒を減圧下留去し、水と塩化メチレン混合溶液に溶かした。ＴＢＡＢｒ（３．２ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）を加え、混合溶液を室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧下留去後、塩化メチレンに溶かし飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液で洗い未反応のＩ２を除去した。テトラメチルアンモニウムクロリド（１．０９ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を溶かしたメタノール溶液５ｍＬを加え、混合溶液を室温１時間撹拌し、生成した白色沈殿を濾別した。得られた白色固体をアセトニトリル５ｍＬと水５ｍＬの混合溶液に溶かし、アンバーライト（Ｎａ＋）を加え室温で一晩撹拌した。アンバーライトを濾別後、溶媒を減圧下留去し、ヨウ素化体（Ｎａ［Ｂ１２Ｈ１０ＩＮＨ３］）を得た。（６３ｍｇ  ４ｓｔｅｐｓ  収率１１％）１１Ｂ  ＮＭＲ  （１６０ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）δ−６．１８，−１３．５９，−１５．４２，−１６．３０，−１７．４３，−１９．６５；ＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇａｔｉｖｅ）ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｂ１２Ｈ１３ＮＩ［Ｍ］‐：２８４．１３，  ｆｏｕｎｄ：２８４．１５．
【実施例２】
【００７５】
（ホウ素脂質のヨウ素化およびＨＶＪ−Ｅへの挿入）
実施例１で示したヨウ素化法を基に、下記ホウ素脂質（Ｃ３ＤＳＢＬ）のヨウ素化ならびにＨＶＪ−Ｅへの挿入を行った。概略を図１に示す。
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（１）Ｃ３ＤＳＢＬ  ３０ｍＭ  ５０％  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏを調整した。
（２）上記（１）とは別にＮａＩ水溶液（４８０ｍＭ、６２．５μＬ）、過酸化水素水溶液（２．０％、５０μＬ）、０．６Ｍ  ＨＣｌ水溶液（５０μＬ）を混合した。ＨＣｌ溶液は最後に加え、この際茶色の着色が観察された。
（３）上記（１）の溶液と（２）の溶液を１：１の体積比で混ぜ５０℃，４０ｍｉｎ静置し、インキュベートすることで、ヨウ素化Ｃ３ＤＳＢＬ（Ｉ−Ｃ３ＤＳＢＬ）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）d３．５９（ｍ，１Ｈ），３．５２（ｄｄ，Ｊ＝４．７，１１．０Ｈｚ，４Ｈ），３．４５（ｄｄ，Ｊ＝６．０，１１．０Ｈｚ，４Ｈ），２．４４−２．２５（ｍ，６Ｈ），１．９９−１．９５（ｍ，２Ｈ），１．６１−１．５１（ｎ，２Ｈ），１．４３−１．２８（ｍ，６０Ｈ），０．９３−０．８８（ｍ，６Ｈ）
比較対象としてＣ３ＤＳＢＬを加えない条件、ヨウ素化溶液（ＮａＩ）を加えない条件で調製した対照試料も作成した。
（４）上記（３）の溶液を最終濃度がＩ−Ｃ３ＤＳＢＬ  １ｍＭまたは２．５ｍＭの濃度になるように、１００００  ＨＡＵ／ｍＬのＨＶＪ−Ｅ溶液に混ぜ、３７℃、１０ｍｉｎ静置し、インキュベートした。
（５）１５０００ｘｇ，１５ｍｉｎ，４℃で遠心して上清を廃棄し、１ｘＴＢＳに再懸濁した。
（６）１５０００ｘｇ，１５ｍｉｎ，４℃で遠心して上清を廃棄し、ＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ１：１中で超音波を適用することで溶かし、マルチタイプＩＣＰ発光分光分析装置Ｔｈｅｒｍｏ  ｉＣＡｐ７０００ｓｅｒｉｅｓを用いてＩＣＰ測定した。 
【００７６】
上記実験の結果、Ｃ３ＤＳＢＬおよびＮａＩを使用して作成したＣ３ＤＳＢＬを用いることで、ＨＶＪ−Ｅを効率的にヨウ素化することができた。一方、Ｃ３ＤＳＢＬを含まないコントロールのＨＶＪ−Ｅはほとんどヨウ素化されなかった（図２）。
【００７７】
ＨＶＪ−Ｅ  １００００ＨＡＵ／ｍＬに対して、ヨウ素化Ｃ３ＤＳＢＬ  ２．５ｍＭでポストインサーションしたとき、１ＨＡＵ：１０７粒子とするとＢ１２  ｃｌｕｓｔｅｒ  ６．５ｘ１０５分子／粒子となり、粒子上のＩ／Ｂ１２  ｃｌｕｓｔｅｒの分子比は３．２であった。
【００７８】
上記実験において、ヨウ素化により脂質のＨＶＪ−Ｅへのポストインサーションが容易となることが観察された。理論に縛られるものではないが、この結果は脂溶性の増大が原因である可能性がある。
【００７９】
また、ＤＳＢＬで同様の実験を行ったところ、ホウ素クラスター部位がヨウ素化によって脱離し、ヨウ素化ホウ素脂質は得られなかった。
Ｎａ１２３ＩあるいはＮａ１３１Ｉ水溶液を用いることにより、同様の方法により、ＨＶＪ−Ｅを１２３Ｉあるいは１３１Ｉ標識化することができる。
【実施例３】
【００８０】
（ホウ素脂質の２１１Ａｔ標識化およびＨＶＪ−Ｅへの挿入）
図３に示すスキームにより、ホウ素脂質の２１１Ａｔ標識化およびＨＶＪ−Ｅへの挿入を行った。
【００８１】
具体的には、２１１Ａｔを含む生理食塩水１８μＬ（１８ＭＢｑ／ｍＬ）にＨ２Ｏ２水溶液６．２μＬ（２〜０．０２％）と０．６Ｍ  ＨＣｌ水溶液  ６．２μＬを加え、混合した。さらに、３０ｍＭ  Ｃ３ＤＳＢＬ溶液（５０％（ｗ／ｗ）エタノール溶液）２０μＬを加え、混合した後、５０℃で４０分間加温した。
【００８２】
ＨＶＪ−Ｅ（１００００  ＨＡＵ／ｍＬ）２００μＬ加え、３７℃で加温した。１０分間の加温の後、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離操作を行った後、上清を廃棄し、生理食塩水２００μＬを加え懸濁させた。再度、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離操作を行った後、上清廃棄し、生理食塩水２００μＬを加え懸濁させた．上記の操作を３回繰り返し、洗浄した。その後、懸濁液を２μＬ取り出し、高純度ゲルマニウム半導体検出器（Ｍｉｒｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （Ｃａｎｂｅｒｒａ）ＫＫ：ＢＥ２０２０）を用いて放射線量を測定し、２１１Ａｔ導入率を評価した。
【００８３】
図４に示すように、２１１Ａｔ標識化ホウ素脂質がＨＶＪ−Ｅへ挿入されたことが確認された。Ｃ３ＤＳＢＬを用いない試料では、洗浄にしたがって、２１１Ａｔが除去されたのに対して、Ｃ３ＤＳＢＬを用いた試料では、洗浄しても２１１Ａｔが除去されなかった。
【００８４】
以上具体例を用いて本発明を説明したが、本発明の範囲は上記具体例に限定されるものではない。当業者は本発明の要旨を逸脱することなくその他種々の構成を採り得ることを理解する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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