(57)【要約】【課題】  ＥＳＺによる粒子検出において、定量性を担保しながらより安価で使い捨て可能な粒子検出装置を提供する。【解決手段】  流体中に存在する粒子を検出する粒子検出装置であって、一端が流体導入口である導入流路と、前記導入流路に分岐して接続された、２以上の排出流路とを含み、前記排出流路が、アパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部を備え、前記粒子検出部より下流部に電極を配置した流体排出口を備えていることを特徴とする前記装置。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中に存在する粒子を検出する粒子検出装置であって、
一端が流体導入口である導入流路と、
前記導入流路に分岐して接続された、２以上の排出流路とを含み、
前記排出流路が、アパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部を備え、
前記粒子検出部より下流部に電極を配置した流体排出口を備えていることを特徴とする前記装置。
【請求項２】
２つの粒子検出部で粒子径の測定を行い、１つの粒子検出部で電気的な測定を行い、電気的な測定結果から前記粒子径を測定する前記２つの粒子検出部のうち、どちらを粒子が通過したかを判別することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記導入流路に設けた分岐流路が、電気的な測定を行う粒子検出部を備えることを特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記排出流路に設けた分岐流路にもアパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部を備え、前記粒子検出部より下流部に電極を配置した流体排出口を備えていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
各粒子検出部にある電気検出器のアパーチャの検出できる粒子径範囲が実質的に同じであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
各排出流路に備えた電気検出器のアパーチャの検出できる粒子径範囲の一部が互いに重複し、排出流路と当該排出流路に設けた分岐流路とに備えた電気検出器のアパーチャの検出できる粒子径範囲が実質的に同じであることを特徴とする請求項４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体中に含まれる粒子の検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
粒子を個々に１つずつ測定することで、マイノリティーな粒子群を正確に検出可能な技術として、電気的検出を用いるコールター法（電気的検知帯法；以下ＥＳＺ）（例えば、非特許文献１参照）が知られている。この手法は、各検出手段から得られる情報（シグナル）が、各粒子に対して１対１で対応しているため粒子個々の評価をすることが可能であり、数的に含まれる割合の少ない粒子でも正確に測定できる。
しかしながら、粒子検出を行う部分を使い回す必要があり、測定ごとに洗浄し、サンプルのキャリーオーバーがないよう管理する必要があり、操作が煩雑となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｒ．Ｗ．Ｄｅ  Ｂｌｏｉｓ．ｅｔ  ａｌ、Ｔｈｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｖｏｌｕｍｅ  ４１、Ｎｕｍｂｅｒ  ７、ｐｐ９０９−９１６（１９７０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、ＥＳＺによる粒子検出において、定量性を担保しながらより安価な粒子検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を鑑み、アパーチャを有した電気検出器からなる粒子検出部に電極を配置した流体排出口を接続することで、定量性を担保しながらより安価で使い捨て可能な粒子検出装置が製造可能になることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、
流体中に存在する粒子を検出する粒子検出装置であって、
一端が流体導入口である導入流路と、
前記導入流路に分岐して接続された、２以上の排出流路とを含み、
前記排出流路が、アパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部を備え、
前記粒子検出部より下流部に電極を配置した流体排出口を備えていることを特徴とする。
【０００７】
また、本発明の粒子検出装置は、２つの粒子検出部で粒子径の測定を行い、１つの粒子検出部で電気的な測定を行い、電気的な測定結果から前記粒子径を測定する前記２つの粒子検出部のうち、どちらを粒子が通過したかを判別できるようにしてもよい。また、電気的な測定を行う粒子検出部は、導入流路に設けた分岐流路が備えていてもよい。
【０００８】
さらに、本発明は、排出流路に設けた分岐流路にもアパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部を備え、前記粒子検出部より下流部に電極を配置した流体排出口を備えていてもよい。
【０００９】
さらに、本発明は、各粒子検出部にある電気検出器のアパーチャの検出できる粒子径範囲が実質的に同じであってもよい。また、排出流路に分岐流路を設けている場合は、各排出流路に備えた電気検出器のアパーチャの検出できる粒子径範囲の一部が互いに重複し、排出流路と当該排出流路に設けた分岐流路とに備えた電気検出器のアパーチャの検出できる粒子径範囲が実質的に同じであってもよい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ＥＳＺによる粒子検出において、定量性を担保しながらより安価な粒子検出装置を提供することができる。これにより、粒子検出装置を使い捨てで使用可能となり、洗浄などの煩雑な操作が不要となるほか、サンプル間のコンタミネーションの防止も可能となる。また、流体排出口へ電極を配置する構造であるため、様々な流路構造へと直列的な接続も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明を実施するためのマイクロチップ１０を示す。
【図２】図２は、本発明の概要を示した図であり、粒子５０をアパーチャ５３ａまたは５３ｂへ流入させ、２つの流体排出口に配置した電極５４ａ、５４ｂによりＥＳＺの原理に基づいた粒子検出を行う態様を示す図である。
【図３】図３は、本発明を実施するための別の態様のマイクロチップ１０を示す。図３（ａ）、（ｂ）は、マイクロチップ１０の上面図であり、図３（ｃ）はその等価回路を示す。
【図４】図４は本発明を実施するための別の態様のマイクロチップ１０を示す。図４（ａ）は、マイクロチップ１０の上面図であり、図４（ｂ）は粒子検出部の拡大図を示し、図４（ｃ）はその等価回路を示す。
【図５】実施例１における粒子検出部１０３の電流値変化の測定の様子の一部を示したものである。
【図６】実施例１の測定結果をヒストグラムにまとめたものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態について、図面を用いて詳細に説明する。但し本発明は異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるものでは無い。
【００１３】
本発明による粒子検出装置の装置構成の一実施例を示す模式図である図１、２をもとに本発明の実施形態についての詳細を説明する。マイクロチップ１０における流路の断面は、流路構造の作製上の容易さから、矩形であることが望ましいが、円形や楕円形、多角形などの断面であってもよく、また部分的に矩形以外の形状であってもよい。また、流路高さは作製の容易さから均一であることが好ましいが、部分的に深さが異なっていてもよい。
【００１４】
粒子を含むサンプルは、流体導入口であるインレット１４ａから導入され、送液部によって流路下流へと送液され、導入流路１０１、排出流路１０２ａまたは１０２ｂ、それぞれ対応する粒子検出部１０３ａまたは１０３ｂを通過して、流体排出口であるアウトレット１０４ａまたは１０４ｂへ流出する。導入流路１０１を流れる粒子は、粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂへと流れる。排出流路１０２ａまたは１０２ｂを経て到達した粒子検出部１０３ａ、１０３ｂにおいて、電気的検出が行われる。この時、粒子検出部１０３ａ、１０３ｂの内部と、アウトレット１０４ａ、１０４ｂは電解質を含む溶液で満たされ、アウトレット１０４ａ、１０４ｂには電極５４ａ、５４ｂが浸漬されている。さらに、電極５４ａ、５４ｂへは、それぞれに接続された導線５５を介して電気測定器５６、電源５７が接続されている。粒子検出時は、電源５７により任意の値の電流が流れており、アパーチャ５３を介した閉回路ができている。さらに電気測定器５６は解析部６１に接続されており、電気測定器５６から得られた検出シグナルを解析部６１で計算し、粒子径分布を作成する。
【００１５】
粒子を含むサンプルは、測定対象とする粒子を含んだ流体である。本発明における粒子とは、粒径が１ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１０μｍの範囲にあり、例えば、核酸、タンパク質、小胞、細胞外小胞、無機粉末、金属コロイド、高分子粒子、ウイルス、細胞、細胞塊、タンパク質凝集体などが含まれる。また本発明における流体は、導電性の流体であり、好ましくは電解質を含む水溶液であるが、電解質を含む有機溶媒、導電性のオイルや油を用いることもできる。
【００１６】
インレット１４ａは、粒子を含むサンプルを保持できる構造であればよく、凹型構造であることが好ましい。また材質としては、溶出物が少ない金属やガラス、セラミクスを用いてもよいが、安価に製造するために高分子材料で形成されることが好ましい。
【００１７】
送液部は、シリンジポンプやペリスタポンプ、圧送ポンプ等の圧力勾配により送液させる方法を用いてもよいし、マイクロチップ１０の流路断面における不均一な速度分布を抑制するために電気浸透流ポンプを用いてもよい。この場合、ポンプから接続された配管はインレット１４ａへ直接接続することでインレット１４ａ内に保持されているサンプルへ圧力を印加することで送液する。また、アウトレットへ配管を介してポンプを接続し、陰圧をかけることによりマイクロチップ１０の流路内の流体を吸引させることで送液してもよい。さらに、インレット１４ａの液面を、アウトレット１０４ａまたはアウトレット１０４ｂの液面よりも高くすることで、液面差により送液してもよく、この場合送液部は不要となる。より定量的な測定をするためには圧力勾配により粒子を通過させた方が好ましく、脈動がより少ない圧送ポンプで送液する態様が最も好ましい。
【００１８】
送液部の流量は、流路の断面積やアパーチャの断面積により任意の値に設定することが好ましく、一例として、０．１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの間に設定することが好ましい。
【００１９】
粒子検出部１０３は、アパーチャ５３と電気検出器とを含む。アパーチャ５３は、流路内に形成された流路直径よりも小さい穴を指し、粒子検出流路６２とアパーチャ形成構造５２により規定される。アパーチャの断面形状は、その製造工程によって種々の形状をとってもよく、エッチングやレーザー照射による加工では円、楕円の形状をとり、フォトリソグラフィーとソフトリソグラフィーによるポリジメチルシロキサン（以下ＰＤＭＳ）等の高分子材料による成形の場合は矩形となる。アパーチャの断面積は、測定する粒子よりも大きければよいが、一般にＥＳＺで測定可能な粒子径範囲は、アパーチャ断面積の２〜６０％といわれているため、流入してくると想定される粒子の大きさに応じて設計する必要がある。
【００２０】
粒子検出部１０３は少なくとも２以上配置される必要があり、それぞれの末端に流体排出口が接続されている。電極５４ａ、５４ｂは流体排出口内の電解質を含む溶液内にその先端が浸漬するようにして配置されており、電源から供給された電流は、一方の電極５４ａまたは５４ｂから、アパーチャ５３ａまたは５３ｂを通過し、分岐部１１０を通ってもう一方のアパーチャを通過し、他方の電極へと流れることになる。この場合、ＥＳＺによる粒子検出の感度は、アパーチャと電極までの間の流路抵抗に比例して低下するため、得られたシグナルから粒子径を算出する場合は、このシグナル低下を加味する必要がある（式（１）参照）。
【００２１】
【数１】
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【００２２】
複数の粒子検出部１０３のアパーチャ５３ａ、５３ｂの各々の断面積または体積が同じ場合、両アパーチャから得られるシグナルは凡そ同一となる。すなわち、両アパーチャへ流れてきた粒子全てを同様に検出することが可能であり、濃度の定量的な測定という観点で好ましい。
【００２３】
また、図３（ａ）に示すように導入流路１０１に分離流路１０１ｄを設けたり、図３（ｂ）に示すように排出流路を３本（１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃ）設け、その末端の流体排出口１０４ｃに電極をさらに１本配置してもよい。この場合、等価回路は図３（ｃ）に示す通りとなり、追加した電極は、アパーチャ５３ａに対して直列に、アパーチャ５３ｂに対して並列に接続されたことになる。従って、アパーチャ５３ａに粒子が通過した場合、追加した電極へ流れる電流値は減少するが、アパーチャ５３ｂに粒子が通過した場合は追加した電極へ流れる電流値は増大するため、追加した電極へも別の電気測定器５６’を接続しておき、電気測定器５６と同時に電気的測定をしておくことで、粒子がどちらのアパーチャを通過したのかを判別することが出来る。
【００２４】
電源５７は直流または交流電源を用いられるが、測定の際によりノイズが影響しにくいものを選択する方が好ましく、コスト面からは、例えば乾電池等の安価で低ノイズである直流電源を用いる方が好ましい。また、電極の材料は電気抵抗が小さい材質であれば制限はなく、金属、無機化合物、有機化合物を用いることができるが、耐久性とコストの面から金属であることが好ましい。
【００２５】
粒子検出部１０３の電気検出器は 、電極５４、電極５４に導線５５を介して接続される電気測定器５６、及び電源５７から主に構成される。電気測定器５６は、電気的特性を検知するものであればよく、電流測定器、電圧測定器、抵抗測定器、電荷量測定器が挙げられ、ＥＳＺの測定においては電流測定器を用いるのが最も好ましい。また、ＩＶアンプを用いて、電流電圧変換後に利得を上げて、微小な電流値変化を検出することが、より微小な粒子を検出する上で好ましい。またアパーチャ内を通過した粒子を取りこぼしなく検出するために、電気測定器５６のサンプリング時間間隔は、粒子がアパーチャを通過するのに要する時間よりも十分短いことが好ましく、１秒間に１万回以上サンプリングすることが好ましく、１秒間に２万回以上サンプリングすることがさらに好ましい。
【００２６】
解析部６１では、測定結果を演算するための演算装置と、測定結果又はそれに由来する演算結果を記録するための記録媒体とを具備することができる。あるいは、これらの演算装置及び記録媒体は、電気測定器５６と一体化していてもよいし、電気測定器５６に対して接続可能な外部装置であってもよい。記録媒体に記録されるデータには、サンプリングした電流値と、粒子が通過した際に発生する電流値変化、またその電流値変化から算出される粒子径、粒子数、粒子濃度、検出時間又は測定開始時からの経過時間が含まれる。
【００２７】
また、本発明は、排出流路に分岐流路を設け、当該分岐流路がアパーチャと電気検出器を含む粒子検出部を備え、粒子検出部より下流部に電極を配置した流体排出口を備えていてもよい。すなわち、図４に示すように排出流路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃがそれぞれ、分岐流路１０２ａ’、１０２ｂ’、１０２ｃ’を有し、それぞれ２つの粒子検出部１０３ａ１と１０３ａ２、１０３ｂ１と１０３ｂ２、１０３ｃ１と１０３ｃ２が配置されるような態様でもよい。この場合、粒子検出部１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの各電気検出器のアパーチャの検出できる粒子径範囲の一部は互いに重複していてもよいが、粒子検出部１０３ａ１（ｂ１、ｃ１）と粒子検出部１０３ａ２（ｂ２、ｃ２）の電気検出器のアパーチャの検出できる粒子径範囲は実質的に同じであることが好ましい。但し、この場合も同様に、図に示した等価回路の通り各アパーチャが並列に電気的に接続されることになるため、あるアパーチャの電流変化が他のアパーチャの電流値へも影響しうる。したがって、中継流路の抵抗を一定値以上にすることで、その影響がなくなるよう調整する必要がある。もしくは、各電流検出器５６を切替え、測定時は１対の電極のみで測定を行うようにする必要がある。また、測定しないアパーチャをグラウンド、シャーシへ接続せず、開回路の状態にすることでも実施可能であり、前述の他のアパーチャへの影響はなくなる。この時、開回路の状態にするために、電極５４と電源５７の間にスイッチング回路を用いてもよく、リレー方式やフォトモス方式によるもので開回路の状態にしてもよい。粒子検出部１０３は、測定時に電磁ノイズが極力影響しない測定系を構築する方が好ましく、この点でスイッチング回路には、電磁石を用いるリレー方式よりも、フォトモスセンサーのような光電流を用いた方式の方が好ましい。
【実施例】
【００２８】
製造実施例：粒子検出装置の製造
本発明による粒子検出装置の実施形態を備えたマイクロチップ１０は、一般的なフォトリソグラフィーとソフトリソグラフィー技術を用いて作製した。具体的な手順を以下の通り示す。
４インチベアシリコンウェハ（株式会社フィルテック）上へ、フォトレジストＳＵ−８  ３００５（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を滴下後、スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ社）を用いてフォトレジスト薄膜を形成した。この時、目的膜厚に応じて、ＳＵ−８  ３００５へ希釈剤Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｎｅ（東京応化工業社）を添加した。
続いて、マスクアライナー（ウシオ電機社）と、任意のパターンを形成したクロムマスクを用いて流路パターンをフォトレジスト膜へ形成し、ＳＵ−８Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を用いて流路パターンを現像することで、用いたい流路の鋳型を作製した。
続いて、作製した鋳型へ、未硬化のＬＳＲ７０７０ＦＣ（モメンティブパフォーマンス社）を流し込み、８０℃で２時間加熱することで、流路の形状を転写されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を作製した。硬化したＰＤＭＳを鋳型から慎重に剥がし、カッターで任意の大きさに成形後、パンチャーを用いて流路のインレット、アウトレットを形成した。剥離したＰＤＭＳとスライドガラス（松浪ガラス社）を酸素プラズマ発生装置（メイワフォーシス社）で表面処理後、ＰＤＭＳとスライドガラスを貼り合わせることでマイクロチップ１０を作製した。
【００２９】
電気検出実施例：ＥＳＺによる粒子の電気的検出
作製したマイクロチップ１０は、基板上へ載置され、マイクロチップ１０内の複数の粒子検出部１０３へ電極を接続した。電極は一対の白金線より構成され、一方の電極は導線を介してプログラマブル電流増幅器ＣＡ５３５０（エヌエフ回路社）へ接続され、ＡＤコンバーターを介してＰＣへと接続され、送信されてきたデジタルの信号をＬａｂＶｉｅｗにより解析した。また粒子検出部１０３へ接続される電極のもう一方は９Ｖの乾電池へ導線を介して接続した。
各インレットは、テフロンチューブを介してシリンジポンプ（ＫＤＳ社）へ接続し、一定の流量で送液した。
【００３０】
サンプル調製実施例：
検出対象の粒子を含有する流体１００Ｐ中の粒子としては以下の標準粒子を用いた。
０．１μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３１００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
０．２μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３２００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
０．５μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３５００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
１．０μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子４００９Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
２．０μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子４２０２Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
分離対象の粒子を含有する流体１００Ｐとしては、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液（リン酸緩衝液）を用いた。０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液は、実験前にポアサイズ０．１μｍのシリンジフィルター（メルクミリポア社製）を用いて異物除去を行ってから用いた。
【００３１】
実施例１：粒子検出部による、０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子混合サンプルの検出
図１で示されるマイクロチップ１０を、上述の製造実施例に基づき作製し、上述のサンプル調製実施例に基づき調製した。０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子は、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液により、それぞれ５μｇ／ｍＬの濃度となるよう調製した。従って、サンプル中に含まれるポリスチレン粒子全体の濃度は１５μｇ／ｍＬとなるよう調製した。
この時、マイクロチップ１０の各流路について、流路の高さはすべて４．５μｍとし、流路の端部に、基板１１の上面に貫通するインレット１４ａ、流体排出口１０４ａ、１０４ｂ（それぞれ穴の直径２ｍｍ）を設けた。また、粒子検出部１０２の２つのアパーチャは、どちらも幅３．５μｍ、長さ２０μｍとした。また、式（１）において算出されるｋ値は、アパーチャ抵抗と、アパーチャから電極が挿入されているアウトレットまでの流路の抵抗比から、２．６とした。
【００３２】
上述のマイクロチップ１０を用い、インレット１４ａへ調製した粒子懸濁液を２．５μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき各アパーチャへ流入した粒子を１分間検出した。この時の、粒子検出部１０３の電流値変化の測定の様子の一部を図５に示した。図５の通り、０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子の電流値変化が確認された。
また、測定結果をヒストグラムへまとめると図６の通りとなり、混合粒子でもピークが分離することを確認した。また、測定結果から得られた０．５μｍ標準粒子の濃度は、５．２４μｇ／ｍＬであり、１．０μｍ標準粒子の濃度は、４．３８μｇ／ｍＬであり、２．０μｍ標準粒子の濃度は、７．８６μｇ／ｍＬであった。また、測定結果から得られた０．５μｍ標準粒子の平均粒径は、０．５１１μｍであり、１．０μｍ標準粒子の平均粒径は、０．９９１μｍであり、２．０μｍ標準粒子の平均粒径は、２．１４５μｍであった。
【００３３】
以上から、本発明を用いて、流路内に電極をパターニングすることなく、正確な粒子径測定が可能であること確認した。
【符号の説明】
【００３４】
１０      マイクロチップ
１１      基板
１４ａ    インレット
５０      粒子
５１      粒子の流れる方向
５２      アパーチャ形成構造
５３      アパーチャ
５４      電極
５５      導線
５６      電気測定器
５７      電源
６１      解析部
６２      粒子検出流路
１０１    導入流路
１０１ｄ  分岐流路
１０２    排出流路
１０２ａ’分岐流路
１０３    粒子検出部
１０４    アウトレット
１１０    分岐部
【図１】
2019117050.tif 000004
【図２】
2019117050.tif 000005
【図３】
2019117050.tif 000006
【図４】
2019117050.tif 000007
【図５】
2019117050.tif 000008
【図６】
2019117050.tif 000009