(57)【要約】【課題】スクアレンを効率よく製造できる組み換え体及びスクアレンの製造方法を提供すること。【解決手段】サッカロマイセス・セルビシエの組み換え体であって、SER1、LSC1、AAT2、LEU9、DPP1、LSC2、PYC1、MAE1、SRY1、PNP1、PDE2、ALT2、GPP2、NQM1、FRD1、及びADH4から成る群から選択される１以上の遺伝子がノックアウトされ、tHMGRが導入された組み換え体。前記組み換え体を培養し、培養した前記組み換え体からスクアレンを抽出するスクアレンの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロマイセス・セルビシエの組み換え体であって、
SER1、LSC1、AAT2、LEU9、DPP1、LSC2、PYC1、MAE1、SRY1、PNP1、PDE2、ALT2、GPP2、NQM1、FRD1、及びADH4から成る群から選択される１以上の遺伝子がノックアウトされ、tHMGRが導入された組み換え体。
【請求項２】
請求項１に記載の組み換え体であって、
サッカロマイセス・セルビシエの野生株よりもスクアレンの生産量が多い組み換え体。
【請求項３】
サッカロマイセス・セルビシエ BY4742株の組み換え体であって、
SER1、LSC1、AAT2、LEU9、DPP1、LSC2、PYC1、MAE1、SRY1、PNP1、PDE2、ALT2、GPP2、NQM1、FRD1、及びADH4から成る群から選択される１以上の遺伝子がノックアウトされ、tHMGRが導入され、
サッカロマイセス・セルビシエのBY4742株よりもスクアレンの生産量が多い組み換え体。
【請求項４】
SER1、LSC1、AAT2、LEU9、DPP1、LSC2、PYC1、MAE1、SRY1、PNP1、PDE2、ALT2、GPP2、NQM1、FRD1、及びADH4から成る群から選択される１以上の遺伝子がノックアウトされ、tHMGRが導入されたサッカロマイセス・セルビシエの組み換え体を培養し、培養した前記組み換え体からスクアレンを抽出するスクアレンの製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載のスクアレンの製造方法であって、
ＳＣ培地を用いて前記組み換え体を培養するスクアレンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は組み換え体及びスクアレンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スクアレンは脂質の一種である。スクアレンは、潤滑性に優れる。また、スクアレンは、流動点及び凝固点が低く、引火点が高い。また、スクアレンは、生分解性が高い。そのため、スクアレンは商業上重要な物質である。現在、スクアレンは、オリーブ油、又は、寒冷水域に生息するサメの肝油から抽出する方法で製造されている。この製造方法では、スクアレンの製造コストが高くなってしまう。
【０００３】
酵母を用いてスクアレンを製造する方法が検討されている。例えば、特許文献１には、酵母において、スクアレン合成にかかわる酵素の過剰発現や高活性化を行うこと、及び、スクアレンから他の物質に変換する酵素の活性を低減することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１７−６１２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１記載の方法では、スクアレンを効率よく製造することは困難であった。本開示は、スクアレンを効率よく製造できる組み換え体及びスクアレンの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の一局面は、サッカロマイセス・セルビシエの組み換え体であって、SER1、LSC1、AAT2、LEU9、DPP1、LSC2、PYC1、MAE1、SRY1、PNP1、PDE2、ALT2、GPP2、NQM1、FRD1、及びADH4から成る群から選択される１以上の遺伝子がノックアウトされ、tHMGRが導入された組み換え体である。本開示の一局面である組み換え体によれば、スクアレンを効率よく製造できる。
本開示の別の局面は、サッカロマイセス・セルビシエ BY4742株の組み換え体であって、SER1、LSC1、AAT2、LEU9、DPP1、LSC2、PYC1、MAE1、SRY1、PNP1、PDE2、ALT2、GPP2、NQM1、FRD1、及びADH4から成る群から選択される１以上の遺伝子がノックアウトされ、tHMGRが導入され、サッカロマイセス・セルビシエのBY4742株よりもスクアレンの生産量が多い組み換え体である。本開示の別の局面である組み換え体によれば、スクアレンを効率よく製造できる。
【０００７】
本開示の別の局面は、SER1、LSC1、AAT2、LEU9、DPP1、LSC2、PYC1、MAE1、SRY1、PNP1、PDE2、ALT2、GPP2、NQM1、FRD1、及びADH4から成る群から選択される１以上の遺伝子がノックアウトされ、tHMGRが導入されたサッカロマイセス・セルビシエの組み換え体を培養し、培養した前記組み換え体からスクアレンを抽出するスクアレンの製造方法である。本開示の別の局面であるスクアレンの製造方法によれば、スクアレンを効率よく製造できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＳＣ培地の組成を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示の実施形態を説明する。
１．組み換え体
本開示の組み換え体は、サッカロマイセス・セルビシエの組み換え体である。サッカロマイセス・セルビシエは出芽酵母の一種である。サッカロマイセス・セルビシエは、Saccharomyces cerevisiaeである。
【００１０】
本開示の組み換え体では、SER1、LSC1、AAT2、LEU9、DPP1、LSC2、PYC1、MAE1、SRY1、PNP1、PDE2、ALT2、GPP2、NQM1、FRD1、及びADH4から成る群から選択される１以上の遺伝子がノックアウトされている。
【００１１】
本開示の組み換え体は、tHMGRが導入されている。tHMGRとは、膜タンパク質の膜貫通部位を削除することにより、細胞質内でHMG1の酵素を機能させる遺伝子である。tHMGRとして、例えば、tHMG1（配列番号１）等が挙げられる。
【００１２】
２．スクアレンの製造方法
本開示のスクアレンの製造方法では、組み換え体を培養し、培養した組み換え体からスクアレンを抽出する。組み換え体は、前記「１．組み換え体」の項に記載したものである。
【００１３】
培養の条件は適宜設定することができる。培養に用いる培地は、例えば、公知の培地の中から適宜選択することができる。培養に用いる培地として、例えば、ＳＣ培地が挙げられる。
【００１４】
スクアレンを抽出する方法は、公知の抽出方法の中から適宜選択することができる。抽出方法として、例えば、後述する実施例で用いた方法等が挙げられる。
３．実施例
（１）組み換え体の製造
市販のサッカロマイセス・セルビシエのノックアウトクローンを用意した。用意したノックアウトクローンを表１に示す。
【００１５】
【表１】
2019041712.tif 000002
これらのノックアウトクローンは、それぞれ、サッカロマイセス・セルビシエにおいて、１つの遺伝子がノックアウトされたものである。表１に、それぞれのノックアウトクローンにおいてノックアウトされた遺伝子を示す。表１に示すノックアウトクローンのうち、YGR244Cは、Dharmacon社製の商品名Yeast Mat alpha  Knock Out Strainである。その他のノックアウトクローンは、transOMIC Technologies社製の商品名Yeast Knockout Collection Haploid Mat-alphaである。表１に示す遺伝子は、周知のデータベースであるKEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)やSGD（Saccharomyces Genome Database）に登録されたものである。
【００１６】
それぞれのノックアウトクローンに、tHMGRを導入した。その方法は以下の方法である。制限酵素サイトを付加したプライマーとして、tHMG1 SalI_fw（配列番号２）と、tHMG1 NotI_rv（配列番号３）とを用意した。tHMG1 SalI_fw及びtHMG1 NotI_rvを用い、出芽酵母のゲノムをテンプレートとしたPCRによりtHMG1（配列番号１）を複製した。tHMG1は、tHMGRに対応する。
【００１７】
遺伝子発現用プラスミドpAT425を、HMG1 SalI_fw及びtHMG1 NotI_rvを用いて制限酵素処理した。次に、複製したtHMG1を、DNA Ligation Kit (Takara) を用いて、遺伝子発現用プラスミドpAT425に挿入し、tHMG1発現用プラスミドを構築した。なお、pAT425は、公知文献（Ishii et al., FEMS Yeast Res 14, 399 (2014)）に開示されている。
【００１８】
次に、酢酸リチウム法を用い、ノックアウトクローンへのtHMG1発現用プラスミドの形質転換を行った。なお、酢酸リチウム法は、公知文献（Gietz and Woods, Methods in Mol Biool, 313, 107 (2002)）に開示されている。
【００１９】
具体的には、まず、冷凍酵母ストックをYPD寒天培地に塗布し、３０℃で２日間培養した。次に、寒天培地上の単一コロニーを、試験管内のYPD液体培地５ｍＬに植菌し、３０℃で１日間振盪培養した。
【００２０】
次に、上記のYPD液体培地５００μＬを遠心分離し、ペレット化した菌体を得た。次に、ペレット化した菌体を滅菌水で２回洗浄した。次に、ペレット化した菌体に、２４０μＬの５０w/v％ポリエチレングリコール、３６μＬの１．０Ｍ酢酸リチウム溶液、５０μＬのサケ精子DNA、及び３４μＬのプラスミドを加え、懸濁し、４２℃で１時間インキュベートした。上記のポリエチレングリコールの分子量は３３５０である。上記のサケ精子DNAの濃度は２ｍｇ／ｍＬである。上記のプラスミドの量は１μｇである。
【００２１】
インキュベート後、遠心分離し、形質転換溶液を捨て、ペレット化した菌体を得た。ペレット化した菌体に１００μＬの滅菌水を加えて懸濁し、SC (-Leu)選択寒天培地に塗布した。菌体を塗布した寒天培地を３０℃で３〜５日間静置培養し、コロニーを得た。得られたコロニーをテンプレートとしてPCRすることで、ノックアウトクローンへのtHMG1の導入を確認した。以上の工程により、組み換え体が製造された。
（２）スクアレンの製造  
それぞれの組み換え体を用いて、スクアレンを製造した。その方法を以下に示す。まず、組み換え体を下記の条件で培養した。以下では、この培養を１回目の培養とする。
【００２２】
培地の種類：ＳＣ培地
培地の量：５ｍＬ
培地の振盪条件：１５０ｒｐｍ
培地の温度：３０℃
培養時間：４８時間
使用したＳＣ培地は、図１に示す組成を有する。次に、１回目の培養後の培地を別の培地に植継ぎ、下記の条件で培養した。以下では、この培養を２回目の培養とする。２回目の培養の初期において、培地における組み換え体の濃度はＯＤ６００＝０．０５であった。
【００２３】
培地の種類：ＳＣ培地
培地の量：５ｍＬ
培地の振盪条件：１５０ｒｐｍ
培地の温度：３０℃
培養時間：７２時間
２回目の培養後、組み換え体を回収した。次に、組み換え体から脂質成分を抽出した。抽出方法は以下のとおりである。
【００２４】
培養液２ｍＬを２ｍＬエッペンチューブに移し、１５０００ｇで１５秒間遠心分離し、上清を捨てた。上記のエッペンチューブに１ｍＬの脱イオン水を加え、懸濁後、同じ条件で遠心分離し、上清を捨てた。その結果、ペレット化した菌体が得られた。ペレット化した菌体に、10μg/mlのコレステロールを内部標準として含む50%(v/v)エタノールに溶解した20%(w/v)水酸化カリウム溶液（20% (w/v) KOH in 50% (v/v) ethanol containing 10 μg/ml cholesterol (internal standard)）を０．４ｍＬ加え懸濁し、沸騰した湯で１０分間加熱した。
【００２５】
サンプルを流水で冷却後、０．４ｍＬのドデカンを加え、恒温振とう培養器（Deep Well Maximizer Bioshaker、タイテック株式会社製)を用い、２５℃、１８０ｒｐｍの条件で１時間振盪することで、脂質成分をドデカンに抽出した。抽出された脂質成分にはスクアレンが含まれる。以上の工程により、スクアレンを製造することができた。
【００２６】
次に、サンプルを３０００gで５分間遠心分離後、ドデカン層 (上層) を０．１ｍＬ取り出し、ＣＧ−ＭＳを用いて分析した。そして、脂質成分に含まれるスクアレンの量を定量した。コントロールについても、上記と同様に培養し、脂質成分を抽出し、スクアレンの量を定量した。コントロールは、ＢＹ４７４２株にtHMGRを導入したものである。ＢＹ４７４２株は、いずれの遺伝子もノックアウトされていないサッカロマイセス・セルビシエである。コントロールは野生株に対応する。
【００２７】
上記表１に、それぞれの組み替え体を用いて製造したスクアレンの量の平均値と、スクアレンの量の標準偏差とを示す。スクアレンの量は、コントロールが製造したスクアレンの量１を１とする相対値である。表１に示すように、組み換え体は、コントロールに比べて、スクアレンを効率よく製造することができた。
【００２８】
４．他の実施形態
以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示は上述の実施形態に限定されることなく、種々変形して実施することができる。
【００２９】
（１）実施例で使用する組み換え体は、SER1、LSC1、AAT2、LEU9、DPP1、LSC2、PYC1、MAE1、SRY1、PNP1、PDE2、ALT2、GPP2、NQM1、FRD1、及びADH4のうち、２以上の遺伝子がノックアウトされたものであってもよい。この場合も同様の効果を奏することができる。
【００３０】
（２）実施例において、ノックアウトクローンに導入するtHMGR は、tHMG1以外のものであってもよい。この場合でも同様の効果を奏する。
（３）上記実施形態における１つの構成要素が有する複数の機能を、複数の構成要素によって実現したり、１つの構成要素が有する１つの機能を、複数の構成要素によって実現したりしてもよい。また、複数の構成要素が有する複数の機能を、１つの構成要素によって実現したり、複数の構成要素によって実現される１つの機能を、１つの構成要素によって実現したりしてもよい。また、上記実施形態の構成の一部を省略してもよい。また、上記実施形態の構成の少なくとも一部を、他の上記実施形態の構成に対して付加又は置換してもよい。なお、特許請求の範囲に記載した文言から特定される技術思想に含まれるあらゆる態様が本開示の実施形態である。
【００３１】
（４）上述した組み換え体の他、当該組み換え体を構成要素とするシステム、組み換え体の製造方法等、種々の形態で本開示を実現することもできる。  
【図１】
2019041712.tif 000003
【配列表】
2019041712000001.app