(57)【要約】      （修正有）【課題】広範囲の粒子を個々にかつ連続的に検出できる粒子検出装置、及び粒子検出方法を提供する。【解決手段】ＤＬＤ、電場、磁場、ディーン力、慣性力又は音響泳動のいずれかの原理を１以上利用して、粒子がその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離される粒子分離流路１１０と、粒子分離流路１１０に分岐して接続された２以上の粒子回収流路１０２ａ、１０２ｂとを含む粒子検出装置であって、粒子回収流路１０２ａ、１０２ｂがアパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部１０３ａ、１０３ｂを備えることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＬＤ、電場、磁場、ディーン力、慣性力又は音響泳動のいずれかの原理を１以上利用して、粒子がその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離される粒子分離流路と、
前記粒子分離流路に分岐して接続された２以上の粒子回収流路とを
含む粒子検出装置であって、
前記粒子回収流路がアパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部を備えることを特徴とする前記粒子検出装置。
【請求項２】
各粒子回収流路にある粒子検出部のアパーチャで検出できる粒子径範囲が互いに異なることを特徴とする、請求項１に記載の粒子検出装置。
【請求項３】
各粒子回収流路にある粒子検出部のアパーチャで検出できる粒子径範囲の一部が互いに重複していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の粒子検出装置。
【請求項４】
流体中に含まれる粒子を検出する方法であって、
ＤＬＤ、電場、磁場、ディーン力、慣性力又は音響泳動のいずれかの原理を１以上利用して、粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離し、
分離された粒子を２以上の流路に分断し、
前記流路に設置されたアパーチャを挟んで配置された電極を含む電気検出器で前記粒子を検出することを特徴とする前記方法。
【請求項５】
前記電気検出器の検出できる粒子径範囲が設置している流路によって異なることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記電気検出器の検出できる粒子径範囲の一部が設置している流路によって互いに重複していることを特徴とする請求項４又は５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子検出装置及び粒子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
粒子を個々に１つずつ測定することで、マイノリティーな粒子群を正確に検出可能な技術として、電気的検出を用いるコールター法（電気的検知帯法；以下ＥＳＺ）（例えば、非特許文献１参照）が知られている。この手法は、各検出手段から得られる情報（シグナル）が、各粒子に対して１対１で対応しているため粒子個々の評価をすることが可能であり、数的に含まれる割合の少ない粒子でも正確に測定が可能となるが、測定できる粒子径範囲（ダイナミックレンジ）が比較的狭いという課題がある。例えば、ＥＳＺではアパーチャと呼ばれる小さい穴に粒子を通過させた際に発生する電気的シグナルを用いて粒子径を算出するが、一般にそのダイナミックレンジはアパーチャ径の２〜６０％といわれている。また、ＥＳＺでは、アパーチャよりも大きい粒子が存在した場合、その粒子によりアパーチャが閉塞し、その後測定が出来なくなるため、アパーチャ径以下の口径を持つフィルターにより大きい粒子を除去してからの測定が必要となる。しかしながら、フィルタリング操作では、フィルター基材への粒子の吸着が少なからず発生するため、サンプルの一部のロスが懸念される。また、この時点で定量的な結果を得られる可能性が減ってしまうという課題もあるため、サンプル中の粒子径分布を正確に測定した場合は、フィルタリング操作を行うことは望ましくない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｒ．Ｗ．Ｄｅ  Ｂｌｏｉｓ．ｅｔ  ａｌ、Ｔｈｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｖｏｌｕｍｅ  ４１、Ｎｕｍｂｅｒ  ７、ｐｐ９０９−９１６（１９７０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、広範囲の粒子を個々にかつ連続的に検出できる粒子検出装置、及び粒子検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題に鑑み、粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離した後、検出器で検出することで広範な分布を持つ粒子試料測定が可能となることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、
決定論的横置換法（ＤＬＤ）、電場、磁場、ディーン力、慣性力又は音響泳動のいずれかの原理を１以上利用して、粒子がその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離される粒子分離流路と、
前記粒子分離流路に分岐して接続された２以上の粒子回収流路とを
含む粒子検出装置であって、
前記粒子回収流路がアパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部を備えることを特徴とする前記粒子検出装置に関する。
【０００７】
また、本発明において、各粒子回収流路にある粒子検出部のアパーチャで検出できる粒子径範囲は互いに異なっていてもよく、アパーチャで検出できる粒子径範囲の一部が互いに重複していてもよい。
【０００８】
また、本発明の別の態様として、流体中に含まれる粒子を検出する方法であって、
決定論的横置換法（ＤＬＤ）、電場、磁場、ディーン力、慣性力又は音響泳動のいずれかの原理を１以上利用して、粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離し、
分離された粒子を２以上の流路に分断し、
前記流路に設置されたアパーチャを挟んで配置された電極を含む電気検出器で前記粒子を検出することを特徴とする方法も挙げられる。
【０００９】
前記方法は、前記電気検出器の検出できる粒子径範囲が設置している流路によって異なっていてもよく、検出できる粒子径範囲の一部が設置している流路によって互いに重複していてもよい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、より広範な粒子径分布を持つサンプルを精度よく連続的に検出する事ができ、バッチ処理の分離技術と比較して、大量な粒子サンプルの測定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１（ａ）、（ｂ）は、本発明の一実施形態を示す図である。図１（ａ）は、マイクロチップ１０の上面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）における領域１９０の拡大図である。
【図２】図２（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子検出部１０３を直列に２つ配置した場合の態様を示す。図２（ｂ）は、２つの粒子検出部１０３を１つの粒子が連続的に通過した場合の、測定している電流値の経時変化の様子を模式的に示した図で、上側のグラフが上流側の粒子検出部１０３により測定されたもので、下側のグラフが下流側の粒子検出部１０３により測定されたことを示す。ここで、便宜上、２つの粒子検出部１０３のグラフの縦軸の位置をずらしたが、実際は粒子が通過しないときのベースラインとなる電流値はほぼ同一である。
【図３】図３（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、アパーチャを直列に２つ配置した場合であり、図２とは異なり、電極を１対のみ用いた場合の態様を示す。図３（ｂ）は、２つのアパーチャを粒子が連続的に通過した場合の測定している電流値の経時変化の様子を模式的に示した図である。
【図４】図４（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、１つの粒子回収流路１０２に対して複数の粒子検出部１０３が並列に設置された場合の態様を示す。図４（ｂ）は、図４（ａ）の等価回路を示す。
【図５】図５（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、１つの粒子回収流路１０２に対して複数の粒子検出部１０３が並列に設置された場合の態様を示し、複数の粒子検出部１０３が、流体的に下流側の電極から電圧を印加することで、複数の粒子検出部１０３間での電気的干渉を低減する態様を示す。図５（ｂ）は、図５（ａ）の等価回路を示し、複数の粒子回収流路１０２が独立していることを示す。
【図６】図６は、本発明の一実施形態を示す図であり、１つの粒子回収流路１０２に対して複数のアパーチャが並列に設置され、より低コストな装置として利用出来る態様を示す。
【図７】図７は、中継流路６０と電極挿入口５９を用いた、より安価に粒子検出部１０３を作製するための態様を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態について、図面を用いて詳細に説明する。但し本発明は異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるものでは無い。
【００１３】
本発明による粒子検出装置の装置構成の一実施例を示す模式図である図１をもとに本発明の実施形態についての詳細を説明する。マイクロチップ１０における流路の断面は、流路構造の作製上の容易さから、矩形であることが望ましいが、円形や楕円形、多角形などの断面であってもよく、また部分的に矩形以外の形状であってもよい。また、流路高さは作製の容易さから均一であることが好ましいが、部分的に深さが異なっていてもよい。
【００１４】
粒子を含むサンプルは、インレット１４から導入され、送液部によって流路下流へと送液され、粒子導入流路１０１、粒子分離流路１１０、粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂ、それぞれ対応する粒子検出部１０３ａまたは１０３ｂを通過して、アウトレット１０４ａまたは１０４ｂへ流出する。粒子分離流路１１０において、粒子径に応じて粒子が流体の流れに対して垂直方向へ分離され、分離された粒子が、粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂへと流れる。粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂを経て到達した粒子検出部１０３ａ、１０３ｂにおいて、電気的検出が行われる。この時、粒子検出部１０３ａ、１０３ｂの内部は電解質を含む溶液で満たされ、電極５４ａ、５４ｂにそれぞれ接続された導線５５を介して電気測定器５６、電源５７に接続されている（図７参照）。粒子検出時は、電源５７により任意の値の電流が流れており、アパーチャ５３を介した閉回路ができている。さらに電気測定器５６は解析部６１に接続されており、電気測定器５６から得られた検出シグナルを解析部で計算し、粒子径分布を作成する。
【００１５】
粒子を含むサンプルは、測定対象とする粒子を含んだ流体である。本発明における粒子とは、粒径が１ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１０μｍの範囲にあり、例えば、核酸、タンパク質、小胞、細胞外小胞、無機粉末、金属コロイド、高分子粒子、ウイルス、細胞、細胞塊、タンパク質凝集体などが含まれる。また、本発明における流体は、導電性の流体であり、好ましくは電解質を含む水溶液であるが、導電性のオイルや油を用いることもできる。
【００１６】
インレット１４は、粒子を含むサンプルを保持できる構造であればよく、凹型構造であることが好ましい。また、材質としては、溶出物が少ない金属やガラス、セラミクスを用いてもよいが、安価に製造するために高分子材料で形成されることが好ましい。粒子導入流路１０１は、インレット１４と、粒子分離流路１１０との間に形成される。粒子導入流路１０１は、粒子分離流路１１０における粒子の分離を補助するために配置されるが、マイクロチップ１０を小型化するために省いてもよい。
【００１７】
送液部は、シリンジポンプやペリスタポンプ、圧送ポンプ等の圧力勾配により送液させる方法を用いてもよいし、マイクロチップ１０の流路断面における不均一な速度分布を抑制するために電気浸透流ポンプを用いてもよい。この場合、ポンプから接続された配管はインレット１４へ直接接続することでインレット１４内に保持されているサンプルへ圧力を印加することで送液する。また、アウトレットへ配管を介してポンプを接続し、陰圧をかけることによりマイクロチップ１０の流路内の流体を吸引させることで送液してもよい。さらに、インレット１４の液面を、アウトレット１０４ａまたはアウトレット１０４ｂの液面よりも高くすることで、液面差により送液してもよく、この場合送液部は不要となる。より定量的な測定をするためには圧力勾配により粒子を通過させた方が好ましく、脈動がより少ない圧送ポンプで送液する態様が最も好ましい。
【００１８】
送液部の流量は、流路の断面積やアパーチャの断面積により任意の値に設定することが好ましく、一例として０．１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの間に設定することが好ましい。
【００１９】
粒子回収流路１０２は、測定可能粒子径範囲（ダイナミックレンジ）を拡げる観点で２以上設ける。ここで、粒子検出部１０３は粒子回収流路１０２の内部または下流に設けられており、粒子回収流路１０２へ流入してきた粒子を検出するために用いられる。１つの粒子回収流路１０２に対して少なくとも１つの粒子検出部１０３が設けられている必要があり、２以上の粒子検出部１０３が設けられていてもよい（図２〜６）。また  測定可能粒子径範囲を外れる粒子を回収する流路をさらに設けることもできる。１つの粒子回収流路１０２に対して２以上の粒子検出部１０３が設けられた態様においては、前記２以上の粒子検出部１０３は直列に配置されてもよい（図２、３）。例えば、２つの粒子検出部１０３が直列に配置された場合、２つの粒子検出部１０３を通過した同一の粒子から生成されたシグナルの間隔から、流路内の粒子の通過速度を算出することができ、粒子の通過速度は回収流路１０２の流量に一般に比例するため、回収流路内の流体の流量を見積もることが可能となる。この時、図２に示す通り電極に印加する電圧は、上流側のアパーチャ５３’の上流側の電極と、下流側のアパーチャ５３’’の下流側の電極から印加する態様が好ましい。上流側のアパーチャ５３’の下流側の電極５４ｂ’または下流側のアパーチャ５３’’の上流側の電極５４ａ’’から電圧を印加した場合、前記２つの電極間で電圧降下が生じ、一方のアパーチャの電流値変化が、他方のアパーチャの電流値へと影響を及ぼすため、それらの影響を考慮しながら測定する必要がある。従って、２つまたは２つ以上のアパーチャを含む粒子検出部１０３を用いる場合、図３に示す通り上流側のアパーチャ５３’の上流側の電極５４ａ’と、下流側のアパーチャ５３’’の下流側の電極５４ｂ’’のみを用いて測定してもよい。なお、図７に示すように、粒子検出流路の上流と下流それぞれへ、中継流路６０を介して流体的かつ電気的にアパーチャと接続している電極挿入口５９を設け、ここへ電極５４を浸漬させることでＥＳＺによる粒子検出を行ってもよい。
【００２０】
また、１つの粒子回収流路１０２に対して２つ以上の粒子検出部１０３が設けられた態様において、前記２以上の粒子検出部１０３は並列に配置されてもよい（図４〜６）。本態様により粒子検出部１０３の並列化された数に比例して処理量が増加するという優れた効果が得られる。この時、電気的に検出するための電極５４は、各アパーチャを挟むように配置され、粒子検出部１０３の数の２倍あれば測定は可能である。一方で、図６に示したように、各アパーチャに対して上流側に１本、下流側に粒子検出部１０３の数の分だけ電極を配置した態様でも測定は可能であり、電極の数を減らすことによる低コスト化という観点からは、こちらの態様の方が好ましい。ここで、粒子検出部１０３を並列化し、各アパーチャへ同時に電圧を印加した場合、各アパーチャを挟むように配置される複数の電極対へ電圧を同時に印加すると、図４（ａ）に示すように、等価回路は複雑なものとなり、あるアパーチャの電流値変化が、他のアパーチャの電流値へと影響を及ぼすため、それら影響を考慮する必要がある。一方で、図５（ａ）に示すように、電圧を各アパーチャで個々に印加し、測定しないアパーチャをグラウンド、シャーシへ接続せず、開回路の状態にすることでそれぞれ個別に検出することが可能であり、前述の他のアパーチャへの影響はなくなる。この時、開回路の状態にするために、電極５４と電源５７の間にスイッチング回路を用いてもよく、リレー方式やフォトモス方式によるもので開回路の状態にしてもよい。粒子検出部１０３は、測定時に電磁ノイズが極力影響しない測定系を構築する方が好ましく、この点でスイッチング回路には、電磁石を用いるリレー方式よりも、フォトモスセンサーのような光電流を用いた方式の方が好ましい。但し、図５の通り、アパーチャの下流側の電極から上流側へ向けて電圧を印加した場合、あるアパーチャの電流値変化が、他のアパーチャの電流値へと影響を及ぼさないため、本態様を用いてもよい。
【００２１】
粒子検出部１０３は、アパーチャ５３と電気検出器とを含む。アパーチャ５３は、流路内に形成された流路直径よりも小さい穴を指し、粒子検出流路６２とアパーチャ形成構造５２により規定される。アパーチャの断面形状は、その製造工程によって種々の形状をとってもよく、エッチングやレーザー照射による加工では円、楕円の形状をとり、フォトリソグラフィーとソフトリソグラフィーによるポリジメチルシロキサン（以下ＰＤＭＳ）等の高分子材料による成形の場合は矩形となる。アパーチャの断面積は、測定する粒子よりも大きければよいが、一般にＥＳＺで測定可能な粒子径範囲は、アパーチャ断面積の２〜６０％といわれているため、流入してくると想定される粒子の大きさに応じて設計する必要がある。また、図２及び３に示すように、２つのアパーチャで粒子検出部１０３が構成されてもよい。また、図４〜６に示すように、複数の粒子検出部を備えることで複数のアパーチャを構成し、それぞれのアパーチャの下流がアウトレットへ接続されており、各アウトレットが電極挿入口５９としても機能するようにした構成としてもよい。この場合、アパーチャの体積が凡そ同一であれば各アパーチャから得られるシグナルは凡そ同一となる。すなわち、各アパーチャ上流の回収流路へ流れてきた粒子全てを検出することが可能であり、濃度の定量的な測定という観点で好ましい態様といえる。粒子検出部１０３の電気検出器は、電極５４、電極５４に導線５５を介して接続される電気測定器５６、及び電源５７から主に構成される。２つの電極５４は、アパーチャ５３を挟んで配置される。電気測定器５６は、電気的特性を検知するものであればよく、電流測定器、電圧測定器、抵抗測定器、電荷量測定器が挙げられ、ＥＳＺの測定においては電流測定器を用いるのが最も好ましい。また、ＩＶアンプを用いて、電流電圧変換後に利得を上げて、微小な電流値変化を検出することが、より微小な粒子を検出する上で好ましい。またアパーチャ内を通過した粒子を取りこぼしなく検出するために、電気測定器５６のサンプリング時間間隔は、粒子がアパーチャを通過するのに要する時間よりも十分短いことが好ましく、１秒間に１万回以上サンプリングすることが好ましく、１秒間に２万回以上サンプリングすることがさらに好ましい。
【００２２】
解析部６１では、測定結果を演算するための演算装置と、測定結果又はそれに由来する演算結果を記録するための記録媒体とを具備することができる。あるいは、これらの演算装置及び記録媒体は、電気測定器５６と一体化していてよいし、電気測定器５６に対して接続可能な外部装置であってもよい。記録媒体に記録されるデータには、サンプリングした電流値と、粒子が通過した際に発生する電流値変化、またその電流値変化から算出される粒子径、粒子数、粒子濃度、検出時間又は測定開始時からの経過時間が含まれる。
【００２３】
粒子分離流路１１０で用いる分離手法において、ＤＬＤ、ディーン力または慣性力による粒子分離の原理を用いる場合、粒子導入流路１０１は少なくとも１本が必要であり、より安定した分離を行うために複数本導入し、そのうちの１つから粒子を含むサンプルを導入し、残りの粒子導入流路１０１から粒子を含まない流体を導入させてもよい。
【００２４】
粒子分離流路１１０で用いる分離手法において、電場による粒子分離を行う場合、分離流路内に、流体の流れに対して垂直方向に一対の電極を配置した流路構造とすることが好ましい。この時、粒子はその大きさだけでなく、流体中での表面電荷も分離の要素に入るため、粒子回収流路１０２内またはその下流の粒子検出部１０３はそれを考慮した設計とする必要がある。
【００２５】
粒子分離流路１１０で用いる分離手法において、磁場による粒子分離を行う場合、分離流路内または分離流路外に、流体の流れに対して垂直方向に一対の磁場発生部品、また磁場発生装置を配置する構成とすることが好ましい。この時、粒子はその大きさだけでなく、粒子の磁性も分離の要素に入るため、粒子回収流路１０２内またはその下流の粒子検出部１０３はそれを考慮した設計とする必要がある。
【００２６】
粒子分離流路１１０で用いる分離手法において、音響泳動による粒子分離を行う場合、分離流路内または分離流路外に、流体の流れに対して垂直方向に一対の音響トランスデューサ―を配置した流路構造とすることが好ましい。この時、粒子はその大きさだけでなく、粒子の剛性や密度も分離の要素に入るため、粒子回収流路１０２内またはその下流の粒子検出部１０３はそれを考慮した設計とする必要がある。
【符号の説明】
【００２７】
１０    マイクロチップ
１１    基板
１４    インレット
５０    粒子
５１    粒子の流れる方向
５２    アパーチャ形成構造
５３    アパーチャ
５４、５４ａ、５４ｂ    電極
５５    導線
５６    電気測定器
５７    電源
５８    導電性溶液
５９    電極挿入口
６０    中継流路
６１    解析部
６２    粒子検出流路
１００    流体
１０１    粒子導入流路
１０２    粒子回収流路
１０３    粒子検出部
１０４    アウトレット
１１０    粒子分離流路
１９０    拡大領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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