(57)【要約】【課題】m/z範囲が重なっている複数の脂質成分を簡便な作業により分離し、成分同定が容易なマススペクトルを取得する。【解決手段】被検者の指先１１を試料プレート１０上に押し付けて指先１１の皮膚表面成分（主として脂質）をウェル１０ａに付着させる。そのあと分析担当者は試料が付着しているウェル１０ｂに所定の溶媒（ヘキサン、エタノール等）を滴下し、ピペッティングしたあと溶媒を他のウェル１０ａに移動させる。これにより、溶媒の極性に応じて、脂質成分は該溶媒に不溶な成分と可溶な成分とに分離される。そして、各ウェル１０ａ、１０ｂに付着している試料からサンプルを調製し、それに対してLDI-MS装置による質量分析を実施してマススペクトルを取得する。【選択図】図２
2019117115.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の体表に付着している成分を含む試料を質量分析する生体試料の質量分析方法において、
a)試料プレート上の所定の部位に試料を付着させる転写ステップと、
b)前記試料プレート上で該プレートに付着している前記試料に所定の溶媒を滴下して撹拌し、それにより該試料の一部の成分が溶解した溶出液を該試料プレート上の別の部位に移動させる成分分離ステップと、
c)前記成分分離ステップにより溶出液が移動されたあとの前記試料プレート上の試料の残留物、及び、該移動された溶出液について、レーザ光を用いたイオン化法による質量分析のためのサンプルを調製するサンプル調製ステップと、
を実施することを特徴とする生体試料の質量分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の生体試料の質量分析方法であって、
前記被検体はヒトであり、試料に含まれる主たる成分は脂質であることを特徴とする生体試料の質量分析方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の生体試料の質量分析方法であって、
前記溶媒として水を用いることを特徴とする生体試料の分析方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の生体試料の質量分析方法であって、
前記溶媒として有機溶媒を用いることを特徴とする生体試料の質量分析方法。
【請求項５】
請求項４に記載の生体試料の質量分析方法であって、
前記溶媒としてエタノールを用いることを特徴とする生体試料の質量分析方法。
【請求項６】
請求項４に記載の生体試料の質量分析方法であって、
前記溶媒としてヘキサンを用いることを特徴とする生体試料の質量分析方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体試料の質量分析方法であって、
前記成分分離ステップでは、極性の相違する複数種の溶媒を、それぞれ別の部位に付着させた同一の試料に対して適用し、異なる成分が溶出した溶出液をさらに別の部位にそれぞれ移動させることを特徴とする生体試料の質量分析方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体試料の質量分析方法であって、
前記イオン化法はマトリクスを使用しないレーザ脱離イオン化法又は表面支援レーザ脱離イオン化法のいずれかであることを特徴とする生体試料の質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体試料を質量分析する方法に関し、さらに詳しくは、例えばヒトの指先の皮膚表面に存在する成分を質量分析するのに好適な生体試料の質量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの指先の皮膚表面には、被検者の体内から滲出した脂肪酸、コレステロール、中性脂肪といった様々な成分（化合物）が付着している。こうした成分は被検者の健康状態を把握したり疾患の程度を判断したりするうえで、或いはそうした疾患の治療の効果を確認するうえで、重要な成分である。一般的な健康診断では、こうした生体由来の成分の含有量などの確認は被検者から採取した血液の分析によって行われている。しかしながら、被検者の指先の皮膚の表面成分からそうした診断が的確に行えれば、被検者の身体への負担も軽減され、高い頻度での診断が可能となる。
【０００３】
被検者の指先の皮膚表面に存在する成分を分析する方法として、次のように試料を採取したうえで質量分析を行う方法が従来知られている。
即ち、まず、専用のサンプルプレートの表面に被検者の指先を押し当て、該プレートの表面に被検者の皮膚表面の成分を転写する。そのあと、サンプルプレート上における皮膚表面成分の転写箇所に、2, 5-ジヒドロキシ安息香酸 (2, 5-dihydroxybenzoic acid、以下「ＤＨＢ」と略す）やα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid、以下「ＣＨＣＡ」と略す）などのマトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）用のマトリクス液を滴下し、サンプルを調製する。そのサンプルをＭＡＬＤＩ質量分析装置により質量分析することでマススペクトル等のデータを収集する。そして、このデータを解析することで、成分を同定したりその含有量を推算したりする。
【０００４】
非特許文献１には、指先の皮膚表面の成分を転写するためのサンプルプレートとして、表面支援レーザ脱離イオン化（ＳＡＬＤＩ＝Surface Assisted Laser Desorption Ionization）法用として作製された酸化鉄ナノ粒子加工プレートを用いることが記載されている。また、こうした特殊なサンプルプレートではなく、ＭＡＬＤＩ法等に用いられる標準的なステンレス製のサンプルプレートを用いて皮膚表面の成分を転写して分析を行った報告もなされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】草野 麻衣子（M. Kusano）、ほか７名、「レーザ・デソープション／イオナイゼイション・マス・スペクトロメトリー（LDI-MS）・オブ・リピッズ・ウィズ・アイアン・オキサイド・ナノパーティクル-コーテッド・ターゲッツ（Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry (LDI-MS) of Lipids with Iron Oxide Nanoparticle-Coated Targets）」、Mass Spectrometry、Vol.3、No.1、2014年、A0026
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般に、指先の皮膚表面の脂質をＭＡＬＤＩ−ＭＳ（又はＬＤＩ−ＭＳ）で質量分析することで得られたマススペクトルにおいては、m/z ２００−１０００の範囲に主な分子イオンピークが検出される。指先の皮膚表面において観測される脂質としては、遊離脂肪酸、コレステロール、ワックスエステル、リン脂質、中性脂肪であるジグリセリド（ＤＧ）やトリグリセリド（ＴＧ）、セラミドなどがある。これらの中で遊離脂肪酸とコレステロールはm/z ２００〜４００の範囲に、ワックスエステルやリン脂質、中性脂肪の断片（フラグメントイオン）はm/z ４００〜７５０の範囲に、中性脂肪はm/z ７５０〜１０００にピークが現れる。また、セラミド由来のピークの多くは、その質量から、中性脂肪と重複するm/z ７００〜１０００の範囲に分布する。
【０００７】
指先の表面（指の腹）などの無毛皮膚には、手の甲や顔などの有毛皮膚と異なり脂腺がない。そのため、無毛皮膚では脂腺由来の脂質分泌は起こらない。脂腺由来の脂質には、ワックスエステルやトリグリセリドがある。脂腺がない指先表面から取得したサンプルに対するマススペクトルでは、m/z７５０〜１０００の範囲にトリグリセリド由来と推定されるピークが多数観測される場合があるが、これらは指先で他の皮膚（手の甲や顔など）に触れたことで、成分が転写したと考えるのが妥当である。
【０００８】
一方、指先の皮膚表面における主な内在性の脂質は、遊離脂肪酸、コレステロール、及びセラミドである。特にセラミドは、皮膚表面の保湿や水分のバリア機能といった重要な役割があり、皮膚におけるセラミドの量的及び質的な分布特性が、アトピー性皮膚炎などの皮膚疾患と深い関係があるといわれている。しかしながら、上述したようにセラミド由来の主たるピークはm/z７５０〜１０００の範囲に分布し、これは上述したトリグリセリド由来のピークと重なる。 そのため、指先の皮膚表面の成分をサンプルプレートに転写しＭＡＬＤＩ−ＭＳやＬＤＩ−ＭＳで分析した場合、トリグリセリドとセラミドのm/z範囲が重複してしまうために、セラミド由来のピークを特定してその化合物を同定するのは困難である。
【０００９】
もちろん、上記のような皮膚表面から取得された試料に含まれる様々な脂質成分を液体クロマトグラフ（ＬＣ）やガスクロマトグラフ（ＧＣ）で分離して質量分析することは技術的には可能であるものの、装置が大掛かりになり、コストも手間も掛かる。
【００１０】
本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、m/z範囲が重なる異なる種類の脂質を簡便に分離して高い感度で分析することができる、生体試料の質量分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために成された本発明は、生体の体表に付着している成分を含む試料を質量分析する生体試料の質量分析方法において、
a)試料プレート上の所定の部位に試料を付着させる転写ステップと、
b)前記試料プレート上で該プレートに付着している前記試料に所定の溶媒を滴下して撹拌し、それにより該試料の一部の成分が溶解した溶出液を該試料プレート上の別の部位に移動させる成分分離ステップと、
c)前記成分分離ステップにより溶出液が移動されたあとの前記試料プレート上の試料の残留物、及び、該移動された溶出液について、レーザ光を用いたイオン化法による質量分析のためのサンプルを調製するサンプル調製ステップと、
を実施することを特徴としている。
【００１２】
本発明に係る生体試料の質量分析方法において、「被検体の体表に付着している成分」は特定の成分に限らないが、被検体がヒトである場合、上記成分は主として脂質として包括される各種の成分である。
【００１３】
本発明に係る生体試料の質量分析方法において、例えば被検体がヒトであって、ヒトの指先に付着している各種成分を分析したい場合、転写ステップでは、被検体（被検者）の指先を試料プレート上の所定の部位に押し付けることで試料を該プレート上に付着させる。この場合、試料に含まれる成分は主として脂質である。
【００１４】
脂質として包括される様々な成分の中には、その質量は互いに近いものの極性の大きさが異なる複数の成分がある。そのため、成分分離ステップにおいて、所定の極性溶媒又は非極性溶媒を試料プレート上の試料に滴下して撹拌すると、その溶媒の極性と成分の極性との関係から、一部の成分は溶出し、そのほかの成分は溶出せずに残留する。即ち、試料に含まれる多数の成分が複数に分離されることになる。そこで、サンプル調製ステップでは、成分が粗くつまりは複数のグループに分離された状態である試料プレートを乾燥させることでサンプルを調製する。こうして調製されたサンプルを保持する試料プレートを質量分析装置にセットし、個々のサンプルに対してレーザ光を照射することで各サンプルに含まれる成分由来のイオンを生成し、その生成されたイオンを質量分析すればよい。
【００１５】
こうして本発明に係る生体試料の質量分析方法では、試料プレート上で、即ち、オンターゲットで、試料に含まれる複数の成分の粗分離を行うことができる。使用する溶媒の種類は、分析対象である成分の種類等に応じて適宜に選択すればよいが、例えば、水やエタノール、ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒を利用することができる。
【００１６】
また、本発明に係る生体試料の質量分析方法では、好ましくは、極性の相違する複数種の溶媒を、それぞれ別の部位に付着させた同一の試料に対して適用して、異なる成分が溶出した溶出液をさらに別の部位に移動させるとよい。
これにより、試料に含まれる多数の成分をその極性の違いを利用して複数のグループに分離して調製したサンプルをそれぞれ質量分析することができる。
【００１７】
なお、本発明に係る生体試料の質量分析方法では、イオン化法としてＭＡＬＤＩ法を用いても構わないが、一般にＭＡＬＤＩ法に用いられるマトリクス由来のピークは比較的低いm/z範囲に現れ、脂質に多い成分とm/z範囲が重なり易い。そのため、イオン化法としてマトリクスを用いないＬＤＩ法又はＳＡＬＤＩ法が好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る生体試料の質量分析方法によれば、試料プレート上での簡便な作業により、生体試料に含まれる複数の成分、例えば脂質として包括される成分を、適度に分離してそれぞれ質量分析することができる。m/z範囲が重なる複数の成分を分離して質量分析することで、マススペクトル上で観測されるピークの重なりが軽減されて成分同定が行い易くなるほか、イオン化の際に異なる成分同士の電荷の奪い合い、つまりはイオン化の競合が軽減できるため、各成分のイオン効率を増加させて高感度の分析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明に係る生体試料の質量分析方法の一実施例である脂質分析方法の手順を示すフローチャート。
【図２】本実施例の脂質分析方法の手順を説明するための概念図。
【図３】本実施例の脂質分析方法を実施することで得られたマススペクトルの一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明に係る生体試料の質量分析方法の一実施例である脂質分析方法について、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例の脂質分析方法の手順を示すフローチャート、図２は本実施例の脂質分析方法の手順を説明するための概念図である。
【００２１】
本実施例の脂質分析方法は、被検者の手の指先の皮膚表面に付着している主として脂質を分析対象の試料とし、その試料に含まれる脂質として包括される様々な成分を質量分析により同定することを分析の目的としている。
【００２２】
分析に際して、まず被検者は、指先１１の汚れなどを不織布等で拭き取ったあと、図２（ａ）、（ｂ）に示すように、その指先１１を試料プレート１０の所定部位（ウェル１０ａ）に押し当てる。これにより、指先１１の皮膚表面に付着している成分を試料プレート１０上に転写する（ステップＳ１）。ここで試料プレート１０としては、ＭＡＬＤＩ用に一般的に用いられているステンレス製のサンプルプレートを用いればよい。図２（ａ）、（ｂ）の例では、試料プレート１０上に二次元的に配列されている多数のウェル１０ａの中で、隣接する４個のウェル１０ａに指先１１を押し当てて皮膚表面成分を転写させている。図２（ｃ）では、皮膚表面成分が転写された、つまりは試料が付着したウェルの符号を１０ｂで示している。
【００２３】
なお、説明の便宜上、上記４個のウェル１０ａ（１０ｂ）を含む隣接する６個のウェル１０ａ（１０ｂ）について、図２（ｅ）に示すように、横方向にＡ、Ｂ、Ｃ、縦方向に１、２の符号を与え、各ウェル１０ａ（１０ｂ）の位置を例えばＡ１、Ｂ１として示すこととする。
【００２４】
次に、分析担当者は、図２（ｄ）に示すように、試料が付着しているＢ１のウェル１０ｂに溶媒として１μLのヘキサンをピペット１２で滴下する。そして、素早くピペッティングした後に、試料中の一部の成分が溶け出した溶媒をピペット１２で吸引し、隣接するＡ１のウェル１０ａに移動させる（ステップＳ２）。指先１１の皮膚表面成分である脂質に無極性であるヘキサンが滴下されると、脂質の中の一部の特定の成分がヘキサンに溶出する。そのため、この溶出した可溶成分が、隣接するＡ１のウェル１０ａに移動される。一方、上記脂質の中でヘキサンに溶けない不溶成分は元のＢ１のウェル１０ｂにそのまま残留する。
【００２５】
続いて、分析担当者は、試料が付着しているＢ２のウェル１０ｂに、強い極性を有する溶媒として１μLのエタノールをピペット１２で滴下し、ステップＳ２と同様に、素早くピペッティングした後に、試料中の一部の成分が溶け出した溶媒を吸引して隣接するＡ２のウェル１０ａに移動させる（ステップＳ３）。ここでは、エタノールに溶出した可溶成分が隣接するＡ２のウェル１０ａに移動される。一方、上記脂質の中でエタノールに溶けない不溶成分は元のＢ２のウェル１０ｂにそのまま残留する。なお、元のＣ１、Ｃ２のウェル１０ｂには転写された、つまりは付着した脂質成分がそのまま残った状態となる。
【００２６】
ヘキサンとエタノールはいずれも有機溶媒であるが、エタノールは強い極性を有する一方、ヘキサンは無極性であり、極性が極端に相違する。一般に、高極性の成分は高極性の溶媒に溶解し易いが、低極性の又は無極性の溶媒には溶解しにくい。逆に低極性の成分は低極性の又は無極性の溶媒には溶解し易いが、高極性の溶媒には溶解しにくい。脂質成分の中で、リン脂質や糖脂質は高極性であり、一方、脂肪酸、トリグリセリド（中性脂肪）、ワックスエステル、コレステロールなどは低極性又は無極性である。そのため、前者の脂質成分はエタノールには比較的溶解し易いが、ヘキサンには比較的溶解しにくい。一方、後者の脂質成分はヘキサンには比較的溶解し易いが、エタノールには比較的溶解しにくい。したがって、Ｂ１、Ｂ２のウェル１０ｂにそれぞれ残る不溶成分は少なくとも一部が互いに相違し、Ｃ１、Ｃ２のウェル１０ａにそれぞれ移動された可溶成分も少なくとも一部が互いに相違する。即ち、様々な脂質成分はその極性によって、複数のウェルに分離されることになる。
【００２７】
上記ステップＳ３の実行後、分析担当者は、上述したように６個のウェル１０ａ、１０ｂに皮膚表面成分の全て又は一部を含む試料が付着した試料プレート１０を乾固させることで、質量分析用のサンプルを調製する（ステップＳ４）。ここでは、質量分析の際にマトリクスなしのＬＤＩ法によるイオン化を行うので、サンプル調製の際にマトリクスは添加しない。そして、調製されたサンプルをＬＤＩ−ＭＳ装置にセットして各ウェルについての質量分析を実行し、質量分析結果としてマススペクトルを取得する（ステップＳ５）。なお、ＬＤＩ−ＭＳ装置としては一般的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置を用い、照射するレーザ光のパワー等の条件を適切に設定すればよい。
【００２８】
図３は、本実施例の脂質分析方法を実施することで、６個の各ウェルについて実際に得られたマススペクトルの一例を示す図である。ヘキサン可溶成分、ヘキサン不溶成分、エタノール可溶成分、及び、エタノール不溶成分にそれぞれ対応する四つのマススペクトルには、異なる質量電荷比を有する特徴的なピークが観測されている。これは、上記ステップＳ２、Ｓ３のような簡便な作業によって、脂質成分の極性の相違に応じてその成分が分離されていることを示している。こうして、質量が近い場合であっても極性の相違によって脂質成分を分離したマススペクトルを取得することができる。そうしたマススペクトルでは異なる成分由来のピークの重なりの影響を軽減できるので、該マススペクトル上で観測されるピークの質量電荷比に基づいて成分の同定精度を向上させることができる。
【００２９】
溶媒は適宜に選択することができるが、上記実施例のように複数種の溶媒を用いる場合には、高極性と低極性又は無極性というように、極性に大きな差がある溶媒を用いることが望ましい。もちろん、３種類以上の溶媒を用い、各溶媒への可溶成分、不溶成分がそれぞれ付着されるウェルの数を増やしてもよい。
【００３０】
また、指先を試料プレート１０に押し付けたときに皮膚表面成分を良好に付着させるためには、該試料プレート１０は平板状であることが望ましいが、その場合、溶媒は或る程度粘性が高い又は表面張力が大きいものであることが好ましい。即ち、溶媒を試料プレート１０上に滴下したときに、その溶媒が試料プレート１０上で広く拡がらずに凸状に留まるものであることが好ましい。
【００３１】
さらにまた、上記実施例は本発明の一例であり、本発明の趣旨の範囲で適宜変形や修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは明らかである。
【００３２】
例えば、上記実施例では、試料プレートとしてＭＡＬＤＩ用の一般的なサンプルプレートを使用したが、ＳＡＬＤＩ用の特殊なサンプルプレートを用いてもよい。
【００３３】
また、分析対象の試料はヒトの指先から採取したものに限らず、指先以外の体表に試料プレート１０を接触させて該体表に付着している成分を該プレート１０に転写してもよい。また、ヒトに限らず、実験動物、家畜、ペット等の動物から試料を採取する場合にも本発明を適用することができる。
【符号の説明】
【００３４】
１０…試料プレート
１０ａ、１０ｂ…ウェル
１１…指先
１２…ピペット
【図１】
2019117115.tif 000003
【図２】
2019117115.tif 000004
【図３】
2019117115.tif 000005