(57)【要約】【課題】第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを細胞表面で共発現する細胞であって、各ＣＡＲが、（ｉ）抗原結合ドメイン（ｉｉ）スペーサー（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｖ）エンドドメインを含み、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、第１のＣＡＲのスペーサーが第２のＣＡＲのスペーサーとは異なり、第１のＣＡＲまたは第２のＣＡＲの一方が活性化エンドドメインを含む活性化ＣＡＲであり、他方のＣＡＲがライゲーション・オフ阻害性エンドドメインを含む阻害性ＣＡＲである細胞を提供すること。【解決手段】本発明者らは、Ｔ細胞などの細胞により発現されたとき、少なくとも２つの標的抗原の特定の発現パターンを検出することができる「論理ゲート」キメラ抗原受容体対のパネルを開発した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞に関するものである。該細胞は、標的細胞による２またはそれより多くの抗原の発現（または非発現）パターンに差異がある故に、該標的細胞を特異的に認識することができるものであり得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
若干の免疫治療剤が、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫コンジュゲートｍＡｂ、放射性コンジュゲートｍＡｂおよび二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを含め、がん処置での使用について記載されている。
【０００３】
典型的には、これらの免疫治療剤は、単一の抗原を標的とし、例えば、リツキシマブであればＣＤ２０を標的とし、ミエロタルグであればＣＤ３３を標的とし、そしてアレムツズマブであればＣＤ５２を標的とする。
【０００４】
しかしながら、がんに関し有効な形での単一の抗原の存在（または非存在）について記載されるのは比較的まれであることから、特異性が欠如することになり得る。
【０００５】
ほとんどのがんは、単一抗原に基づいた正常組織からは分化され得ない。このため、相当な「標的に対するが、腫瘍外の（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｏｆｆ−ｔｕｍｏｕｒ）」毒性が生じることにより、正常組織は該治療により損傷をうける。例えば、リツキシマブでＣＤ２０を標的としてＢ細胞リンパ腫を処置していると、正常なＢ細胞区画全体が枯渇し、ＣＤ５２を標的として慢性リンパ性白血病を処置していると、リンパ系区画全体が枯渇し、ＣＤ３３を標的として急性骨髄性白血病を処置していると、骨髄系区画全体が損傷をうけるなどである。
【０００６】
予想された「ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｏｆｆ−ｔｕｍｏｕｒ」毒性の問題は、臨床試験により確証されている。例えば、ＥＲＢＢ２を標的とする手法は、肺および肝臓への転移がある結腸がんの患者に死をもたらした。ＥＲＢＢ２は、一部の患者では結腸がんで過剰発現されているが、心臓および正常な脈管構造を含むいくつかの正常組織でも発現されている。
【０００７】
一部のがんについては、２つのがん抗原の存在を標的とする方が、１つを標的とするよりも選択性が高く、したがって、より有効であり得る。例えば、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、現行ではＣＤ１９を標的とすることにより処置されるよくある白血病である。これによりリンパ腫は処置されるが、Ｂ細胞区画全体が枯渇するため、該処置は、相当な毒性作用を有することになる。Ｂ−ＣＬＬは、ＣＤ５およびＣＤ１９が共発現するという点で異常な表現型を有する。ＣＤ５およびＣＤ１９を発現する細胞のみを標的とすることにより、ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｏｆｆ−ｔｕｍｏｕｒ毒性をかなり低減させることが可能となる。
【０００８】
したがって、標的指向性を高めて多くのがんと関連するマーカー発現の複雑なパターンを反映させることができる免疫治療剤が要望されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に結び付けるタンパク質である。キメラ抗原受容体の通常形態は、抗原認識性アミノ末端、スペーサー、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインにすべて連結された膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である（図１Ａ参照）。
【００１０】
これらの分子の最も一般的な形態は、シグナル伝達エンドドメインにスペーサーおよび膜貫通ドメインを介して融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合体である。上記分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がかかるＣＡＲを発現すると、Ｔ細胞はその標的抗原を発現する標的細胞を認識し、殺す。いくつかのＣＡＲが腫瘍関連抗原に対して開発されており、かかるＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いる養子移入手法は、現在様々ながんの処置についての臨床試験にかけられている。
【００１１】
しかしながら、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の使用はまた、ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ−ｔｕｍｏｕｒ毒性と関連している。例えば、炭酸脱水酵素（ｃａｒｂｏｘｙ  ａｎｙｈｙｄｒａｓｅ）ＩＸ（ＣＡＩＸ）を標的として腎細胞癌を処置するＣＡＲに基づく手法は、胆管上皮細胞に対する特異チャレンジにより引き起こされると考えられる肝臓毒性をもたらした（Ｌａｍｅｒｓら（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１：９０４−９１２）。
【００１２】
二重標的化ＣＡＲ手法
「ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ−ｔｕｍｏｕｒ」毒性の問題に取り組むため、二重抗原特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｔｙ）をもつＣＡＲ  Ｔ細胞が開発された。この「二重標的化」手法では、２つの相補的ＣＡＲが同じＴ細胞集団で共発現され、それぞれ離れた腫瘍標的に指向され、相補的シグナルを提供すべく操作が加えられている。
【００１３】
Ｗｌｉｋｉｅら（２０１２  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：１０５９−１０７０）は、ＥｒｂＢ２特異的ＣＡＲおよびＭＵＣ１特異的ＣＡＲが共発現される二重標的化手法を記載している。ＥｒｂＢ２特異的ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナルのみを提供し、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲはＣＤ２８共刺激シグナルのみを提供した。相補的シグナル伝達は両抗原の存在下で行われ、ＩＬ−２産生を招くことが見出された。しかしながら、シグナル伝達が、融合されたＣＤ２８＋ＣＤ３ζエンドドメインにより送達される対照ＣＡＲ操作Ｔ細胞と比較すると、ＩＬ−２産生は控えめであった。
【００１４】
類似した手法がＫｌｏｓｓら（２０１３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：７１−７５）により記載されており、その手法では、ＰＳＭＡに特異的なキメラ共刺激受容体と組み合わせてＣＤ３ζ媒介活性化シグナルを提供するＣＤ−１９特異的ＣＡＲを使用した。この「共ＣＡＲ（ｃｏ−ＣＡＲ）」設計によると、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、一方の抗原をもつ標的細胞との遭遇のときには活性化シグナルを、および他方の抗原をもつ標的細胞との遭遇のときには共刺激シグナルを受信し、両抗原をもつ標的細胞と遭遇すると活性化（ａｃｔｉｖａｔｏｒｙ）シグナルおよび共刺激シグナルの両方を受信するだけである。
【００１５】
この手法は、２つの抗原をもつ標的細胞のみにＣＡＲ活性を限定する初期の試みを代表する。しかしながら、この手法は制限されている：ＣＡＲ  Ｔ細胞活性は両抗原を発現する標的に対して非常に大きくなるが、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、依然として活性化ＣＡＲにより認識された抗原のみを発現する標的を殺す；さらに、共刺激の結果、標的細胞の放出後長く続くＴ細胞に対する作用が延長される。このため、ダブル陽性Ｔ細胞に対する活性と同等であるシングル抗原陽性Ｔ細胞に対する活性は、例えばシングル陽性組織がダブル陽性腫瘍からの遊走路に隣接しているかまたは該遊走路中にある状況では可能であり得る。
【００１６】
したがって、Ｔ細胞活性化が全面的に両抗原を発現する標的細胞に限定されている、ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｏｆｆ−ｔｕｍｏｕｒ毒性が低減された、改善されたＣＡＲに基づく治療手法が要望されている。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
Ｔ細胞であって、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを該細胞表面で共発現し、各ＣＡＲが、
（ｉ）抗原結合ドメイン
（ｉｉ）スペーサー
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、および
（ｉｖ）エンドドメイン
を含み、該第１のＣＡＲおよび該第２のＣＡＲの該抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、該第１のＣＡＲの該スペーサーが該第２のＣＡＲの該スペーサーとは異なり、該第１のＣＡＲまたは該第２のＣＡＲの一方が活性化エンドドメインを含む活性化ＣＡＲであり、他方のＣＡＲがライゲーション・オフ阻害性エンドドメインを含む阻害性ＣＡＲのいずれかである、Ｔ細胞。
（項目２）
前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲがそれらのそれぞれの標的抗原と結合したとき、該第１のＣＡＲおよび該第２のＣＡＲが前記Ｔ細胞膜上で空間的に分離されるように、該第１のＣＡＲの前記スペーサーが、該第２のＣＡＲの前記スペーサーとは異なる長さおよび／または電荷および／またはサイズおよび／または立体配置および／またはグリコシル化を有する、項目１に記載のＴ細胞。
（項目３）
第１の前記スペーサーまたは第２の前記スペーサーのいずれかがＣＤ８ストークを含み、他方のスペーサーがＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、項目２に記載のＴ細胞。
（項目４）
前記第１のＣＡＲまたは前記第２のＣＡＲの一方が、活性化エンドドメインを含む活性化ＣＡＲであり、他方のＣＡＲが、ライゲーション・オフ阻害性エンドドメインを含む阻害性ＣＡＲであり、その阻害性ＣＡＲが、阻害性ＣＡＲライゲーションの非存在下では該活性化ＣＡＲによるＴ細胞活性化を阻害するが、該阻害性ＣＡＲがライゲーションされたときには、該活性化ＣＡＲによるＴ細胞活性化を有意に阻害しない、項目２または３に記載のＴ細胞。
（項目５）
前記阻害性エンドドメインが、ＣＤ１４８またはＣＤ４５からのエンドドメインの全部または一部を含む、項目４に記載のＴ細胞。
（項目６）
前記第１のＣＡＲの前記抗原結合ドメインがＣＤ５と結合し、前記第２のＣＡＲの前記抗原結合ドメインがＣＤ１９と結合する、項目４または５に記載のＴ細胞。
（項目７）
２つより多くの抗原の区別可能なパターンを担持する、Ｔ細胞などの細胞により特異的に刺激されるような、先行する項目に記載のＣＡＲを２つより多く含むＴ細胞。
（項目８）
項目１〜７のいずれかに記載の前記第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および前記第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の両方をコードする核酸配列。
（項目９）
次の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｂＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの前記抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、該第１のＣＡＲの前記スペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、該第１のＣＡＲの前記膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、該第１のＣＡＲの前記エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり；
ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの前記抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、該第２のＣＡＲの前記スペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、該第２のＣＡＲの前記膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、該第２のＣＡＲの前記エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し、Ｔ細胞で発現されるときに、該第１のＣＡＲおよび該第２のＣＡＲが該Ｔ細胞表面で共発現されるような、切断部位で切断されるポリペプチドをコードする、項目８に記載の核酸配列。
（項目１０）
ｃｏｅｘｐｒが、自己切断性ペプチドを含む配列をコードする、項目９に記載の核酸配列。
（項目１１）
相同組換えを回避するため、代替的コドンが、同じかまたは類似したアミノ酸配列をコードする配列の領域で使用される、項目９または１０に記載の核酸配列。
（項目１２）
（ｉ）項目１〜７のいずれかに記載の前記第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列であって、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１
（ここで、
ＡｇＢ１は、該第１のＣＡＲの前記抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、該第１のＣＡＲの前記スペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、該第１のＣＡＲの前記膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、該第１のＣＡＲの前記エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する核酸配列；および
（ｉｉ）項目１〜７のいずれかに記載の前記第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸配列であって、以下の構造：
ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ＡｇＢ２は、該第２のＣＡＲの前記抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、該第２のＣＡＲの前記スペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、該第２のＣＡＲの前記膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、該第２のＣＡＲの前記エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する核酸配列
を含む、キット。
（項目１３）
項目１２に記載の前記第１の核酸配列を含む第１のベクターおよび項目１２に記載の該第１の核酸配列を含む第２のベクターを含む、キット。
（項目１４）
前記ベクターが組込み型ウイルスベクターまたはトランスポゾンである、項目１３に記載のキット。
（項目１５）
項目８〜１１のいずれかに記載の核酸配列を含むベクター。
（項目１６）
項目１５によるレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
（項目１７）
項目８〜１１のいずれかに記載の核酸配列；項目１２に記載の第１の核酸配列および第２の核酸配列；および／または項目１３に記載の第１のベクターおよび第２のベクターまたは項目１５または１６に記載のベクターを、Ｔ細胞に導入する工程を含む、項目１〜７のいずれかに記載のＴ細胞を製造する方法。
（項目１８）
前記Ｔ細胞が被験体から単離された試料に由来する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
項目１〜７のいずれかに記載の複数のＴ細胞を含む医薬組成物。
（項目２０）
項目１９に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、疾患を処置および／または予防する方法。
（項目２１）
次の工程：
（ｉ）被験体からのＴ細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）項目８〜１１のいずれかに記載の核酸配列；項目１２に記載の第１の核酸配列および第２の核酸配列；項目１３または１４に記載の第１のベクターおよび第２のベクターまたは項目１５または１６に記載のベクターでの該Ｔ細胞の形質導入またはトランスフェクション；ならびに
（ｉｉｉ）該被験体に（ｉｉ）からの該Ｔ細胞を投与すること
を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記疾患ががんである、項目２０または２１に記載の方法。
（項目２３）
疾患の処置および／または予防で使用するための項目１９に記載の医薬組成物。
（項目２４）
疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における項目１〜７のいずれかに記載のＴ細胞の使用。
（項目２５）
第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを細胞表面で共発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であって、各ＣＡＲが、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）スペーサー；
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および
（ｉｖ）エンドドメイン
を含み、該第１のＣＡＲおよび該第２のＣＡＲの該抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、該第１のＣＡＲの該スペーサーが該第２のＣＡＲの該スペーサーとは異なり、該第１のＣＡＲまたは該第２のＣＡＲの一方が、活性化エンドドメインを含む活性化ＣＡＲであり、他方のＣＡＲが、ライゲーション・オフ阻害性エンドドメインを含む阻害性ＣＡＲである、ナチュラルキラー細胞。
（項目２６）
前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲをコードする核酸により血液試料を生体外で形質導入することにより作製される、項目１に記載のＣＡＲ発現Ｔ細胞および／または項目２５に記載のＣＡＲ発現ＮＫ細胞を含む細胞組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１（ａ）は、ＣＡＲの一般化構造である：結合ドメインは抗原を認識し；スペーサーは細胞表面から結合ドメインを持ち上げ；膜貫通ドメインはタンパク質を膜につなぎ留め、エンドドメインはシグナルを伝達する。図１（ｂ）〜（ｄ）は、ＣＡＲエンドドメインの異なる世代および並べ替えを示す：（ｂ）最初の設計はＦｃεＲ１−γまたはＣＤ３ζエンドドメインのみを通じてＩＴＡＭシグナルを伝達し、後の設計は、シス配列で（ｃ）さらに１つまたは（ｄ）さらに２つの共刺激シグナルを伝達した。
【図２】図２は、本発明を説明する概略図である。  本発明は、標的細胞抗原発現の論理的規則に応じるようにＴ細胞を操作することに関する。これについては、仮想的ＦＡＣＳ散布図で十分説明されている。標的細胞集団は、抗原「Ａ」および「Ｂ」の両方または片方を発現するかまたはどちらも発現しない。種々の標的集団（赤色で印を付している）は、異なるゲートにより連結された一対のＣＡＲで形質導入されたＴ細胞により殺される。ＯＲゲート受容体では、シングル陽性細胞およびダブル陽性細胞の両方が殺される。ＡＮＤゲート受容体では、ダブル陽性標的細胞のみが殺される。ＡＮＤ  ＮＯＴゲーティングでは、ダブル陽性標的は保存され、シングル陽性標的は
【図３】図３は、標的細胞集団の作製を示す。  ＳｕｐＴ１細胞を標的細胞として使用した。これらの細胞に対しＣＤ１９、ＣＤ３３のどちらかまたはＣＤ１９およびＣＤ３３の両方を発現するように形質導入を行った。標的細胞を適切な抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。
【図４】図４は、ＯＲゲートについてのカセット設計である。  単一のオープンリーディングフレームにより、枠内ＦＭＤ−２Ａ配列をもつ両ＣＡＲが提供され、２つのタンパク質をもたらす。シグナル１は、ＩｇＧ１に由来するシグナルペプチドである（ただし、任意の有効なシグナルペプチドであり得る）。ｓｃＦｖ１は、ＣＤ１９を認識する１本鎖可変セグメントである（ただし、ｓｃＦｖまたはペプチドループまたはリガンドまたは事実上、所望のいかなる随意の標的でも認識する任意のドメインであってもよい）。ＳＴＫは、ＣＤ８ストークであるが、任意の適切な細胞外ドメインであり得る。ＣＤ２８ｔｍは、ＣＤ２８膜貫通ドメインであるが、任意の安定したＩ型タンパク質膜貫通ドメインであり得（ｃａｎ  ｂｙ）、ＣＤ３ＺはＣＤ３ゼータエンドドメインであるが、ＩＴＡＭを含む任意のエンドドメインであり得る。シグナル２は、ＣＤ８に由来するシグナルペプチドであるが、シグナル１とはＤＮＡ配列が異なる任意の有効なシグナルペプチドであり得る。ｓｃＦＶはＣＤ３３を認識するが、ｓｃＦｖ１については定まっていない。ＨＣ２ＣＨ３は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３であるが、第１のＣＡＲで使用されるスペーサーと交差対合することのない任意の細胞外ドメインであり得る。ＣＤ２８ｔｍ’およびＣＤ３Ｚ’は、ＣＤ２８ｔｍおよびＣＤ３Ｚと同じタンパク質配列をコードするが、相同組換えを防止するためコドンのゆらぎを呈する。
【図５】図５は、ＯＲゲートについてのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の概略図である。Ｎ末端Ａ）抗ＣＤ１９ｓｃＦｖドメイン、続いてヒトＣＤ８の細胞外ヒンジ領域またはＢ）抗ＣＤ３３ｓｃＦｖドメイン、続いてヒトＩｇＧ１の細胞外ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３（ＦｃＲ結合を低減するためｐｖａａ変異を含む）領域のどちらかで構成される刺激性ＣＡＲが構築された。両受容体ともヒトＣＤ２８膜貫通ドメインおよびヒトＣＤ３ゼータ（ＣＤ２４７）細胞内ドメインを含む。「Ｓ」はジスルフィド結合の存在を示す。
【図６】図６は、１つのＴ細胞の表面における両ＣＡＲの共発現を示す発現データである。
【図７】図７は、ＯＲゲートの機能分析である。  ＯＲゲート構築物を発現するエフェクター細胞（５×１０４細胞）を、様々な数の標的細胞と共インキュベーションし、ＩＬ−２を１６時間後ＥＬＩＳＡにより分析した。グラフは、３複製物から得た、エフェクター細胞単独の化学的刺激（ＰＭＡおよびイオノマイシン）からの平均最大ＩＬ−２分泌および刺激を一切伴わないエフェクター細胞からの平均バックグラウンドＩＬ−２を示す。
【図８】図８は、両ＡＮＤゲートを発現するのに使用されるカセットの両バージョンを示すカートゥーンである。  ＦＭＤ−２Ａ配列を用いて活性化ＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを再度共発現させた。シグナル１は、ＩｇＧ１に由来するシグナルペプチドである（ただし、任意の有効なシグナルペプチドであり得る）。ｓｃＦｖ１は、ＣＤ１９を認識する１本鎖可変セグメントである（ただし、ｓｃＦｖまたはペプチドループまたはリガンドまたは事実上、所望のいかなる随意の標的でも認識する任意のドメインであり得る）。ＳＴＫは、ＣＤ８ストークであるが、任意の嵩高くない細胞外ドメインであってもよい。ＣＤ２８ｔｍは、ＣＤ２８膜貫通ドメインであるが、任意の安定したＩ型タンパク質膜貫通ドメインであり得、ＣＤ３ＺはＣＤ３ゼータエンドドメインであるが、ＩＴＡＭを含む任意のエンドドメインであり得る。シグナル２は、ＣＤ８に由来するシグナルペプチドであるが、シグナル１とはＤＮＡ配列が異なる任意の有効なシグナルペプチドであり得る。ｓｃＦＶはＣＤ３３を認識するが、ｓｃＦｖ１については定まっていない。ＨＣ２ＣＨ３は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３であるが、任意の嵩高い細胞外ドメインであり得る。ＣＤ４５およびＣＤ１４８は、それぞれＣＤ４５およびＣＤ１４８の膜貫通およびエンドドメインであるが、この種のタンパク質のいずれかに由来するものであってもよい。
【図９】図９は、ＡＮＤゲートについてのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のタンパク質構造の概略図である。  刺激性ＣＡＲはＮ−末端抗ＣＤ１９ｓｃＦｖドメイン、次いでヒトＣＤ８の細胞外ストーク領域、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメインおよびヒトＣＤ３ゼータ（ＣＤ２４７）細胞内ドメインから成る。２つの阻害性ＣＡＲを試験した。これらは、Ｎ−末端抗ＣＤ３３ｓｃＦｖドメイン、次いでヒトＩｇＧ１の細胞外ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３（ＦｃＲ結合を低減するためｐｖａａ変異を含む）領域、次いでヒトＣＤ１４８またはＣＤ４５のどちらかの膜貫通および細胞内ドメインから成る。「Ｓ」は、ジスルフィド結合の存在を示す。
【図１０】図１０は、活性化ＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲの共発現を示す。  ＢＷ５１４７細胞をエフェクター細胞として使用し、形質導入することにより、活性化抗ＣＤ１９ＣＡＲおよび阻害性抗ＣＤ３３ＣＡＲの１つを共に発現させた。エフェクター細胞をＣＤ１９マウスＦｃおよびＣＤ３３ウサギＦｃおよび適切な二次抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。
【図１１】図１１は、ＡＮＤゲートの機能分析である。  活性化抗ＣＤ１９ＣＡＲおよびＡ）ＣＤ１４８またはＢ）ＣＸＤ４５細胞内ドメインをもつ阻害性抗ＣＤ３３  ＣＡＲを発現するエフェクター細胞（５×１０４細胞）を、様々な数の標的細胞と共インキュベーションし、ＩＬ−２を１６時間後ＥＬＩＳＡにより分析した。グラフは、３複製物から得た、エフェクター細胞単独の化学的刺激（ＰＭＡおよびイオノマイシン）からの最大ＩＬ−２分泌および刺激を一切伴わないエフェクター細胞からのバックグラウンドＩＬ−２を示す。
【図１２】図１２は、ＡＮＤ  ＮＯＴゲートを生成させるのに使用されるカセットの３つのバージョンを示すカートゥーンである。  ＦＭＤ−２Ａ配列を用いて活性化ＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを再度共発現させた。シグナル１は、ＩｇＧ１に由来するシグナルペプチドである（ただし、任意の有効なシグナルペプチドであり得る）。ｓｃＦｖ１は、ＣＤ１９を認識する１本鎖可変セグメントである（ただし、ｓｃＦｖまたはペプチドループまたはリガンドまたは事実上、所望のいかなる随意の標的でも認識する任意のドメインであり得る）。ＳＴＫは、ヒトＣＤ８ストークであるが、任意の嵩高くない細胞外ドメインであってもよい。ＣＤ２８ｔｍは、ＣＤ２８膜貫通ドメインであるが、任意の安定したＩ型タンパク質膜貫通ドメインであり得、ＣＤ３ＺはＣＤ３ゼータエンドドメインであるが、ＩＴＡＭを含む任意のエンドドメインであり得る。シグナル２は、ＣＤ８に由来するシグナルペプチドであるが、シグナル１とはＤＮＡ配列が異なる任意の有効なシグナルペプチドであり得る。ｓｃＦＶはＣＤ３３を認識するが、ｓｃＦｖ１については定まっていない。ｍｕＳＴＫはマウスＣＤ８ストークであるが、ただし、共局在するが、活性化ＣＡＲのスペーサーと交差対合することのない任意のスペーサーであり得る。ｄＰＴＰＮ６は、ＰＴＰＮ６のホスファターゼドメインである。ＬＡＩＲ１は、ＬＡＩＲ１の膜貫通およびエンドドメインである。２Ａｗは、ＦＭＤ−２Ａ配列のゆらぎコドンバージョンである。ＳＨ２−ＣＤ１４８は、ＣＤ１４８のホスファターゼドメインと融合したＰＴＰＮ６のＳＨ２ドメインである。
【図１３】図１３は、ＮＯＴ  ＡＮＤゲートについてのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の概略図である。  Ａ）Ｎ末端抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖドメイン、次いでヒトＣＤ８のストーク領域、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメインおよびヒトＣＤ２４７細胞内ドメインから成る刺激性ＣＡＲ。Ｂ）Ｎ末端抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖドメイン、次いでマウスＣＤ８のストーク領域、マウスＣＤ８の膜貫通領域およびＰＴＰＮ６のホスファターゼドメインから成る阻害性ＣＡＲ。Ｃ）Ｎ末端抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖドメイン、次いでマウスＣＤ８のストーク領域およびＬＡＩＲ１の膜貫通および細胞内セグメントから成る阻害性ＣＡＲ。Ｄ）ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインおよびＣＤ１４８ホスファターゼドメインの融合タンパク質と共発現されること以外は先行のＣＡＲと同一である阻害性ＣＡＲ。
【図１４】図１４は、ＮＯＴ  ＡＮＤゲートの機能分析である。  Ａ）完全長ＳＨＰ−１またはＢ）ＳＨＰ−１の先端切除形態を発現するエフェクター細胞（５×１０４細胞）を、様々な数の標的細胞と共インキュベーションし、ＩＬ−２を１６時間後ＥＬＩＳＡにより分析した。グラフは、３複製物から得た、エフェクター細胞単独の化学的刺激（ＰＭＡおよびイオノマイシン）からの平均最大ＩＬ−２分泌および刺激を一切伴わないエフェクター細胞からの平均バックグラウンドＩＬ−２を示す。
【図１５】図１５は、ＯＲゲートのアミノ酸配列である。
【図１６】図１６は、ＣＤ１４８およびＣＤ１４５に基づくＡＮＤゲートのアミノ酸配列である。
【図１７】図１７は、２つのＡＮＤ  ＮＯＴゲートのアミノ酸配列である。
【図１８】図１８は、ＡＮＤゲート機能を詳細に吟味したものである。  Ａ．プロトタイプのＡＮＤゲートが右側に図示されており、ＣＤ１９シングル、ＣＤ３３シングルおよびＣＤ１９、ＣＤ３３ダブルの陽性標的に応じたその機能が左側に示されている。Ｂ．ｓｃＦＶを交換すると、活性化エンドドメインはＣＤ３３により発動され、阻害性エンドドメインはＣＤ１９により活性化される。このＡＮＤゲートは、ｓｃＦｖ交換にもかかわらず機能的なままである。Ｃ．阻害性ＣＡＲのスペーサーにおけるＣＤ８マウスストーク置換Ｆｃ。この修飾により、ゲートは、ＣＤ１９シングル陽性標的にもＣＤ１９、ＣＤ３３ダブル陽性標的にも応答できなくなる。
【図１９】図１９は、人工標的細胞上における標的抗原の発現を示す。  Ａは、ＳｕｐＴ１細胞から誘導された人工標的細胞のオリジナルセットのフローサイトメトリー散布図ＣＤ１９対ＣＤ３３を示す。左から右へ：ダブル陰性ＳｕｐＴ１細胞、ＣＤ１９に陽性、ＣＤ３３に陽性、ならびにＣＤ１９およびＣＤ３３の両方に陽性のＳｕｐＴ１細胞。Ｂは、ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＧＤ２ゲートを試験するために生成された人工標的細胞のフローサイトメトリー散布図ＣＤ１９対ＧＤ２を示す。左から右へ：陰性ＳｕｐＴ１細胞、ＣＤ１９を発現するＳｕｐＴ１細胞、ＧＤ２陽性となるＧＤ２およびＧＭ３シンターゼベクターで形質導入されたＳｕｐＴ１細胞および、ＧＤ２およびＣＤ１９の両方に陽性であるＣＤ１９ならびにＧＤ２およびＧＭ３シンターゼで形質導入されたＳｕｐＴ１細胞。Ｃは、ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＥＧＦＲｖＩＩＩゲートを試験するために生成された人工標的のＣＤ１９対ＥＧＦＲｖＩＩＩのフローサイトメトリー散布図を示す。左から右へ：陰性ＳｕｐＴ１細胞、ＣＤ１９を発現するＳｕｐＴ１細胞、ＥＧＦＲｖＩＩＩで形質導入されたＳｕｐＴ１細胞ならびにＣＤ１９およびＥＧＦＲｖＩＩＩの両方で形質導入されたＳｕｐＴ１細胞。Ｄは、ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＣＤ５ゲートを試験するために生成された人工標的のＣＤ１９対ＣＤ５のフローサイトメトリー散布図を示す。左から右へ：陰性２９３Ｔ細胞、ＣＤ１９で形質導入された２９３Ｔ細胞、ＣＤ５で形質導入された２９３Ｔ細胞、ＣＤ５およびＣＤ１９ベクターの両方で形質導入された２９３Ｔ細胞。
【図２０】図２０は、ＡＮＤゲートの一般化可能性である。  Ａ．改変されたＡＮＤゲートのカートゥーンであり、第２のＣＡＲの特異性はＣＤ３３の元の特異性から変更されており、３つの新たなＣＡＲ：ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＧＤ２、ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＣＤ５が生成される。Ｂ．ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＧＤ２  ＡＮＤゲート：左：ＡＮＤゲートの発現について、ＣＤ１９  ＣＡＲについての組換えＣＤ１９−Ｆｃ染色（ｘ軸）対ＧＤ２  ＣＡＲについての抗ヒトＦｃ染色（ｙ軸）が示されている。右：シングル陽性およびダブル陽性標的への応答における機能。Ｃ．ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＡＮＤゲート：左：ＡＮＤゲートの発現について、ＣＤ１９  ＣＡＲについての組換えＣＤ１９−Ｆｃ染色（ｘ軸）対ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲについての抗ヒトＦｃ染色（ｙ軸）が示されている。右：シングル陽性およびダブル陽性標的への応答における機能。Ｄ．ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＣＤ５  ＡＮＤゲート：左：ＡＮＤゲートの発現について、ＣＤ１９  ＣＡＲについての組換えＣＤ１９−Ｆｃ染色（ｘ軸）対ＣＤ５  ＣＡＲについての抗ヒトＦｃ染色（ｙ軸）が示されている。右：シングル陽性およびダブル陽性標的への応答における機能。
【図２１】図２１は、ＡＮＤ  ＮＯＴゲートの機能である。  ３回実施のＡＮＤ  ＮＯＴゲートの機能を示す。試験したゲートのカートゥーンが右側に示され、シングル陽性およびダブル陽性標的への応答における機能が左側に示されている。Ａ．ＰＴＰＮ６に基づいたＡＮＤ  ＮＯＴゲートであり、第１のＣＡＲは、ＣＤ１９を認識し、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよびＩＴＡＭ含有活性化エンドドメインを有し；ＣＤ３３を認識し、マウスＣＤ８ストークスペーサーを有し、ＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインを含むエンドドメインを有する第２のＣＡＲと共発現される。Ｂ．エンドドメインがＬＡＩＲ１からのエンドドメインにより置換されたこと以外、ＩＴＩＭに基づくＡＮＤ  ＮＯＴゲートはＰＴＰＮ６ゲートと同一である。Ｃ．ＰＴＰＮ６  ＳＨ２およびＣＤ１４８のエンドドメイン間のさらなる融合が発現されること以外、ＣＤ１４８ブーストＡＮＤ  ＮＯＴゲートはＩＴＩＭに基づくゲートと同一である。３つのゲートはすべて、ＣＤ１９およびＣＤ３３両方への応答ではなくＣＤ１９への応答での活性化により予想された通りに機能する。
【図２２】図２２は、ＰＴＰＮ６に基づくＡＮＤ  ＮＯＴゲート機能の詳細な吟味である。  元のＰＴＰＮ６に基づくＡＮＤ  ＮＯＴゲートを、モデルを示すべく幾つかの対照と比較する。試験したゲートのカートゥーンを右側に示し、シングル陽性およびダブル陽性標的への応答における機能を左側に示す。Ａ．元のＡＮＤ  ＮＯＴゲートであり、第１のＣＡＲは、ＣＤ１９を認識し、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよびＩＴＡＭ含有活性化エンドドメインを有し；ＣＤ３３を認識し、マウスＣＤ８ストークスペーサーを有し、ＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインを含むエンドドメインを有する第２のＣＡＲと共発現される。Ｂ．改変されたＡＮＤ  ＮＯＴゲートであり、マウスＣＤ８ストークスペーサーがＦｃスペーサーにより置き換えられている。Ｃ．ＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインがＣＤ１４８からのエンドドメインで置き換えられるように改変されたＡＮＤ  ＮＯＴゲート。元のＡＮＤ  ＮＯＴゲート（Ａ．）は、ＣＤ１９およびＣＤ３３の両方への応答ではなく、ＣＤ１９への応答での発動により予想された通りに機能する。Ｂ．でのゲートは、ＣＤ１９単独またはＣＤ１９およびＣＤ３３の両方に応答して発動する。Ｃ．でのゲートが、一方または両方の標的に応答して発動することはない。
【図２３】図２３は、ＬＡＩＲ１に基づくＡＮＤ  ＮＯＴゲートの詳細な吟味である。  ＣＤ１９陽性標的、ＣＤ３３陽性標的およびＣＤ１９、ＣＤ３３ダブル陽性標的に対する機能的活性を示す。Ａ．元のＩＴＩＭに基づくＡＮＤ  ＮＯＴゲートの構造および活性。このゲートは、２つのＣＡＲにより構成される：第１のＣＡＲは、ＣＤ１９を認識し、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよびＩＴＡＭ含有エンドドメインを有し、第２のＣＡＲはＣＤ３３を認識し、マウスＣＤ８ストークスペーサーおよびＩＴＩＭ含有エンドドメインを有する。Ｂ．マウスＣＤ８ストークスペーサーがＦｃドメインにより置き換えられている対照ＩＴＩＭに基づくゲートの構造および活性。このゲートは、２つのＣＡＲにより構成される：第１のＣＡＲは、ＣＤ１９を認識し、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよびＩＴＡＭ含有エンドドメインを有し、第２のＣＡＲはＣＤ３３を認識し、ＦｃスペーサーおよびＩＴＩＭ含有エンドドメインを有する。両ゲートとも、ＣＤ１９シングル陽性標的に応答し、元のゲートのみがＣＤ１９およびＣＤ３３ダブル陽性標的への応答において不活性である。
【図２４Ａ】図２４は、ＣＡＲ論理ゲートの動力学的分離モデルである。  ＡＮＤゲート、ＮＯＴ  ＡＮＤゲートおよび対照の動力学的分離および行動のモデル。ＣＡＲはＣＤ１９またはＣＤ３３のいずれかを認識する。免疫学的シナプスは、標的細胞膜を表す青線とＴ細胞膜を表す赤線の間にあると想像され得る。「４５」は、Ｔ細胞上に存在する天然ＣＤ４５タンパク質である。「Ｈ８」は、スペーサーとしてヒトＣＤ８ストークを伴うＣＡＲエクトドメインである。「Ｆｃ」は、スペーサーとしてヒトＨＣＨ２ＣＨ３を伴うＣＡＲエクトドメインである。「Ｍ８」は、スペーサーとしてネズミＣＤ８ストークを伴うＣＡＲエクトドメインである。「１９」は、標的細胞表面上のＣＤ１９を表す。「３３」は、標的細胞表面上のＣＤ３３を表す。記号
【数１】
2019041775.tif 000002
は、ＩＴＡＭを含有する活性化エンドドメインを表す。記号
【数２】
2019041775.tif 000003
は、緩慢な動態を有するホスファターゼ−ＰＴＰＮ６またはＩＴＩＭの触媒ドメインを含むものなどの「ライゲーション・オン」エンドドメインを表す。記号
【数３】
2019041775.tif 000004
は、速い動態を有するホスファターゼ−ＣＤ４５またはＣＤ１４８のエンドドメインなどの「ライゲーション・オフ」エンドドメインを表す。この記号を図面で拡大することにより、その強力な活性を強調する。
（ａ）は、一組のＣＡＲを含む機能的ＡＮＤゲートの仮定される行動を示すもので、第１のＣＡＲは、ＣＤ１９を認識し、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよび活性化エンドドメインを有し、第２のＣＡＲは、ＣＤ３３を認識し、ＦｃスペーサーおよびＣＤ１４８エンドドメインを有する；
（ｂ）は、対照ＡＮＤゲートの仮定される行動を示す。ここで、第１のＣＡＲは、ＣＤ１９を認識し、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよび活性化エンドドメインを有し、第２のＣＡＲは、ＣＤ３３を認識するが、マウスＣＤ８ストークスペーサーおよびＣＤ１４８エンドドメインを有する；
（ｃ）は、一組のＣＡＲを含む機能的ＡＮＤ  ＮＯＴゲートの行動を示すもので、第１のＣＡＲは、ＣＤ１９を認識し、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよび活性化エンドドメインを有し、第２のＣＡＲは、ＣＤ３３を認識し、マウスＣＤ８ストークスペーサーおよびＰＴＰＮ６エンドドメインを有する；
（ｄ）は、一組のＣＡＲを含む対照ＡＮＤ  ＮＯＴゲートの仮定される行動を示すもので、第１のＣＡＲは、ＣＤ１９を認識し、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよび活性化エンドドメインを有し、第２のＣＡＲは、ＣＤ３３を認識するが、ＦｃスペーサーおよびＰＴＰＮ６エンドドメインを有する；
１列目では、標的細胞は、ＣＤ１９およびＣＤ３３の両方に陰性である。２列目では、標的は、ＣＤ１９陰性およびＣＤ３３陽性である。３列目では、標的細胞は、ＣＤ１９陽性およびＣＤ３３陰性である。４列目では、標的細胞はＣＤ１９およびＣＤ３３の両方に陽性である。
【図２４Ｂ】同上
【図２５】図２５は、ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲの設計である。  ｓｃＦＶが、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩおよびプロテオグリカンと相互作用して（ｉｎｔｅｒａｃｔｓ    ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ）、抗原結合ドメインとして作用する、Ａ増殖誘導性リガンド（ＡＰＲＩＬ）の改変形態で置き換えられるようにＣＡＲ設計を改変した。プロテオグリカン結合性アミノ末端が存在しないように、ＡＰＲＩＬの先端を切除した。次いで、シグナルペプチドを先端切除ＡＰＲＩＬアミノ末端に結合して、タンパク質を細胞表面に指向させた。このＡＰＲＩＬに基づく結合ドメインをもつ３つのＣＡＲを生成した：Ａ．第１のＣＡＲでは、ヒトＣＤ８ストークドメインをスペーサードメインとして使用した。Ｂ．第２のＣＡＲでは、ＩｇＧ１からのヒンジをスペーサードメインとして使用した。Ｃ．第３のＣＡＲでは、Ｆｃ受容体結合を低減するためにＨｏｍｂａｃｈら（２０１０  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７：１２０６−１２１３）により記載されたｐｖａ／ａ変異で改変されたヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを、スペーサーとして使用した（以後、Ｆｃ−ｐｖａａと称す）。全ＣＡＲにおいて、これらのスペーサーをＣＤ２８膜貫通ドメイン、次いでＣＤ２８、ＯＸ４０およびＣＤ３−ゼータエンドドメインの融合体を含む３連エンドドメイン（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）に連結した（Ｐｕｌｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，２００５：１２巻；５号；９３３−４１頁）。
【図２６】図２６は、上記３つのＡＰＲＩＬ−ＣＡＲの注釈付きアミノ酸配列である。  Ａは、ＣＤ８ストークＡＰＲＩＬ  ＣＡＲの注釈付きアミノ酸配列を示し；Ｂは、ＡＰＲＩＬ  ＩｇＧ１ヒンジに基づくＣＡＲの注釈付きアミノ酸配列を示し；Ｃは、ＡＰＲＩＬ  Ｆｃ−ｐｖａａに基づくＣＡＲの注釈付きアミノ酸配列を示す。
【図２７】図２７は、異なるＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲの発現およびリガンド結合を示す。  Ａ．受容体を、レトロウイルス遺伝子ベクターにおけるマーカー遺伝子先端切除ＣＤ３４と共発現させた。形質導入された細胞におけるマーカー遺伝子の発現により、形質導入の確認が可能となる。Ｂ．Ｔ細胞に対し、ＣＤ８ストークスペーサー、ＩｇＧ１ヒンジまたはＦｃスペーサーのどちらかを伴うＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲで形質導入した。これらの受容体を細胞表面で安定して発現させることができるかどうかを試験するため、次にＴ細胞を抗ＡＰＲＩＬ−ビオチン／ストレプトアビジンＡＰＣおよび抗ＣＤ３４で染色した。フローサイトメトリー分析を行った。ＡＰＲＩＬが３つのＣＡＲにおける細胞表面で等しく検出されたことから、それらが等しく安定して発現されていることが示唆された。Ｃ．次に、ＣＡＲがＴＡＣＩおよびＢＣＭＡを認識する能力を決定した。形質導入されたＴ細胞を、抗マウス二次抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）および抗ＣＤ３４と一緒にマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ融合体に融合された組換えＢＣＭＡまたはＴＡＣＩのどちらかで染色した。３つの受容体フォーマットは全て、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの両方への結合性を示した。驚くべき発見は、ＢＣＭＡへの結合性がＴＡＣＩへの結合性より大きくみえることであった。さらなる驚くべき発見は、３つのＣＡＲは全て等しく発現されるが、ＣＤ８ストークおよびＩｇＧ１ヒンジＣＡＲは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを認識する点でＦｃスペーサーを伴うものより優れているようであることであった。
【図２８】図２８は、異なるＣＡＲ構築物の機能を示す。  機能アッセイを、３つの異なるＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲにより実施した。非形質導入（ＮＴ）であるか、または異なるＣＡＲを発現するように形質導入された正常ドナーの末梢血Ｔ細胞。等しい力価の上清を用いて、形質導入を実施した。次いで、これらのＴ細胞を、ＣＤ５６を除去して非特異的ＮＫ活性を枯渇させ、エフェクターとして使用した。非形質導入（ＮＴ）ＳｕｐＴ１細胞またはＢＣＭＡまたはＴＡＣＩを発現するように形質導入されたＳｕｐＴ１細胞を、標的として用いた。示されたデータは、５回の独立実験からの平均値および標準偏差である。Ａ．ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ発現Ｔ細胞の特異的致死を、クロム放出を用いて決定した。Ｂ．また、インターフェロン−μ放出を決定した。標的およびエフェクターを１：１の割合で共培養した。２４時間後、上清中のインターフェロンμを、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。Ｃ．また、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖／生存を、さらに６日間インキュベーションした同じ共培養におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の数を数えることにより決定した。３つのＣＡＲは全て、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ発現標的に対する応答を指令する。ＢＣＭＡへの応答は、ＴＡＣＩの場合より大きかった。
【図２９】図２９は、初代細胞におけるＡＮＤゲートの機能である。  ＰＢＭＣを血液から単離し、ＰＨＡおよびＩＬ−２を用いて刺激した。２日後、細胞を、レトロネクチン被覆プレート上でＣＤ１９：ＣＤ３３  ＡＮＤゲート構築物を含むレトロウイルスにより形質導入した。５日目、ＡＮＤゲート構築物により翻訳された２つのＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーにより評価し、細胞からＣＤ５６＋細胞（主にＮＫ細胞）を枯渇させた。６日目、ＰＢＭＣを１：２のエフェクター対標的細胞比で標的細胞との共培養中に置いた。８日目、上清を集め、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−ガンマ分泌について分析した。
【図３０】図３０は、サイズの増加を伴う可能なスペーサードメインの選択／ヒエラルキーを示す。ＣＤ３−ゼータのエクトドメインは、最も短い可能なスペーサーとして示唆されており、それに（ｂ）ＩｇＧ１ヒンジが続く。（ｃ）ネズミまたはヒトＣＤ８ストークおよびＣＤ２８エクトドメインは、サイズが中間であると考えられ、共分離する。（ｄ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、より大きく、かさ高であり、（ｅ）ＩｇＭのヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインは、さらに大きい。標的分子の特性、および前記標的分子上の結合ドメインのエピトープを考慮すれば、スペーサーのこのヒエラルキーを用いて、シナプス形成の際に共分離または別個に分離するＣＡＲシグナル伝達系を作製することが可能である。
【図３１】図３１は、論理ゲートＣＡＲ  Ｔ細胞を構築するための設計規則である。  上部に標的細胞、下部にＴ細胞、中間にシナプスとしたカートゥーンフォーマットでＯＲ、ＡＮＤ  ＮＯＴおよびＡＮＤゲートＣＡＲを示す。標的細胞は、任意の標的抗原ＡおよびＢを発現する。  Ｔ細胞は、抗Ａ認識ドメインおよび抗Ｂ認識ドメイン、スペーサーおよびエンドドメインを含む２つのＣＡＲを発現する。ＯＲゲートは、（１）単に抗原認識およびＣＡＲ活性化を可能にするスペーサー、ならびに（２）活性化エンドドメインを有するための両ＣＡＲを必要とする；ＡＮＤ  ＮＯＴゲートは、（１）両抗原の認識の際に両ＣＡＲの共分離をもたらすスペーサーならびに（２）活性化エンドドメインを伴う一方のＣＡＲ、およびエンドドメインが弱いホスファターゼを含むかまたはリクルートする他方のＣＡＲを必要とする；ＡＮＤゲートは、（１）両抗原の認識の際に免疫学的シナプスの異なる部分への両ＣＡＲの分離をもたらすスペーサーならびに（２）活性化エンドドメインを伴う一方のＣＡＲ、およびエンドドメインが強力なホスファターゼを含む他方のＣＡＲを必要とする。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の態様の概要）
本発明者らは、Ｔ細胞などの細胞により発現されたとき、少なくとも２つの標的抗原の特定の発現パターンを検出することができる「論理ゲート」キメラ抗原受容体対のパネルを開発した。少なくとも２つの標的抗原が抗原Ａおよび抗原Ｂとして任意に示されるならば、３つの可能な選択肢は以下のようになる：
「ＯＲゲート」−抗原Ａまたは抗原Ｂのどちらかが標的細胞上に存在するときＴ細胞が発動する。
「ＡＮＤゲート」−抗原Ａおよび抗原Ｂの両方が標的細胞上に存在するときのみＴ細胞が発動する。
「ＡＮＤ  ＮＯＴゲート」−抗原Ａが標的細胞上に単独で存在するならば、Ｔ細胞は発動するが、抗原Ａおよび抗原Ｂの両方が標的細胞上に存在するときには発動しない。
【００１９】
これらのＣＡＲの組み合わせを発現する操作されたＴ細胞は、それらの２またはそれより多くのマーカーの特定の発現（または発現の欠如）に基づき、がん細胞に極めて特異的になるように調整され得る。
【００２０】
したがって、第１の態様では、本発明は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを細胞表面で共発現する細胞であって、各ＣＡＲが、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）スペーサー；
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および
（ｉｖ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）
を含み、
第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、第１のＣＡＲのスペーサーが第２のＣＡＲのスペーサーとは異なることにより、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲがヘテロダイマーを形成することはないものとし、さらに第１のＣＡＲまたは第２のＣＡＲの一方が活性化細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む活性化ＣＡＲであり、他方のＣＡＲが「ライゲーション・オフ」（本明細書で定義されるとおりの）阻害性細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む阻害性ＣＡＲである、細胞を提供する。
【００２１】
該細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞であり得る。Ｔ細胞に関して本明細書で挙げた特徴は、ＮＫ細胞などの他の免疫エフェクター細胞にも等しく当てはまる。
【００２２】
第１のＣＡＲのスペーサーは、第２のＣＡＲのスペーサーとは異なる長さおよび／または電荷および／または形状および／または立体配置および／またはグリコシル化を有し得るため、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲがそれらのそれぞれの標的抗原と結合したとき、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲはＴ細胞上で空間的に離れることになる。第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのそれらのそれぞれの抗原へのライゲーションにより、それらは免疫学的シナプスにおいて一緒に、または別々に区画化されることになり、その結果、活性化が制御される。このことについては、Ｔ細胞活性化の動力学的分離モデルについて考慮すると、理解され得る（下記参照）。
【００２３】
第１のスペーサーまたは第２のスペーサーは、ＣＤ８ストークを含み得、もう一方のスペーサーは、ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み得る。
【００２４】
「ＡＮＤ」ゲートに関する本発明では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの一方は活性化エンドドメインを含む活性化ＣＡＲであり、他方のＣＡＲは阻害性エンドドメインを含む「ライゲーション・オフ」阻害性ＣＡＲである。ライゲーション・オフ阻害性ＣＡＲは、阻害性ＣＡＲライゲーションの非存在下で活性化ＣＡＲによるＴ細胞活性化を阻害するが、阻害性ＣＡＲがライゲーションされているときには活性化ＣＡＲによるＴ細胞活性化を有意に阻害しない。第１のＣＡＲのスペーサーは、第２のＣＡＲのスペーサーとは異なる長さおよび／または電荷および／または形状および／または立体配置および／またはグリコシル化を有するため、両方のＣＡＲがライゲーションされたとき、それらは分離する。この結果、阻害性ＣＡＲが活性化ＣＡＲから空間的に離されることになるため、Ｔ細胞活性化がおこり得る。したがって、Ｔ細胞活性化は、もっぱら両方の同種抗原をもつ標的細胞に応答しておこる。
【００２５】
阻害性エンドドメインは、ＣＤ１４８またはＣＤ４５など、受容体様チロシンホスファターゼからのエンドドメインの全部または一部を含み得る。
【００２６】
第１のＣＡＲの抗原結合ドメインはＣＤ５と結合し得、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインはＣＤ１９と結合し得る。このことは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を標的とするのに有用である。この疾患については、ＣＤ１９を単独で標的をすることにより処置することができるが、全Ｂ細胞区画を枯渇させるという犠牲を払うことになり得る。ＣＬＬ細胞は、ＣＤ５およびＣＤ１９を共発現するという点で異常である。ＡＮＤゲートでこの抗原対を標的とすることにより、特異性を高め、毒性を低減させる。
【００２７】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様で定義したとおりの第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲの両方をコードする核酸配列を提供する。
【００２８】
したがって（ａｃｃｏｒｄｉｎｇ）、この核酸配列は、次の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
を有し得、
ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、２つのＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列（例えば、切断部位）であり；
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
該核酸配列は、Ｔ細胞で発現されるときに、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲがＴ細胞表面で共発現されるような、切断部位で切断されるポリペプチドをコードする。
【００２９】
２つのＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列は、自己切断性ペプチドまたは２つのＣＡＲを共発現する代替的手段を可能にする配列、例えば内部リボソーム進入配列または第２プロモーターまたは当業者が同じベクターから２種のタンパク質を発現させることができるような他の手段を可能にする配列をコードし得る。
【００３０】
代替コドンは、相同組換えを回避するために、同一または類似アミノ酸配列をコードする配列の領域で使用されてもよい。
【００３１】
第３の態様において、本発明は、
（ｉ）本発明の第１の態様で定義した第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列であって、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する核酸配列；および
（ｉｉ）本発明の第１の態様で定義した第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸配列であって、以下の構造：
ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する核酸配列
を含むキットを提供する。
【００３２】
第４の態様において、本発明は、上記で定義した第１の核酸配列を含む第１のベクターおよび上記で定義した第１の核酸配列を含む第２のベクターを含むキットを提供する。
【００３３】
これらのベクターは、プラスミドベクター、レトロウイルスベクターまたはトランスポゾンベクターであり得る。これらのベクターはレンチウイルスベクターであり得る。
【００３４】
第５の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による核酸配列を含むベクターを提供する。このベクターはレンチウイルスベクターであり得る。
【００３５】
該ベクターは、プラスミドベクター、レトロウイルスベクターまたはトランスポゾンベクターであり得る。
【００３６】
第６の態様において、本発明は、２つより多い抗原の複合パターン（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐａｔｔｅｒｎ）が標的細胞上で認識されることができるやり方で２つより多いＣＡＲを共発現させることを含む。
【００３７】
第７の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるＴ細胞を作製する方法であって、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする１つもしくはそれより多くの核酸配列（複数も可）または上記で定義した１つもしくはそれより多くのベクター（複数も可）をＴ細胞に導入する工程を含む方法を提供する。
【００３８】
Ｔ細胞は、患者、関連もしくは非関連造血系移植ドナー、完全に無関係のドナーから単離された試料に由来するか、臍帯血に由来するか、胚性細胞株から分化されるか、誘導性前駆細胞株から分化されるか、または形質転換Ｔ細胞株から誘導され得る。
【００３９】
第８の態様において、本発明は、本発明の第１の態様による複数のＴ細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００４０】
第９の態様において、本発明は、疾患を処置および／または予防する方法であって、被験体に本発明の第８の態様による医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００４１】
該方法は、以下の工程：
（ｉ）上記で列挙したＴ細胞の単離；
（ｉｉ）第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする１つもしくはそれより多くの核酸配列（複数も可）または上記核酸配列（複数も可）を含む１つもしくはそれより多くのベクター（複数も可）でのＴ細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）被験体に（ｉｉ）からのＴ細胞を投与すること
を含み得る。
【００４２】
該疾患はがんであり得る。
【００４３】
第１０の態様において、本発明は、疾患の処置および／または予防で使用するための本発明の第８の態様による医薬組成物を提供する。
【００４４】
該疾患はがんであり得る。
【００４５】
第１１の態様において、本発明は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における本発明の第１の態様によるＴ細胞の使用を提供する。
【００４６】
該疾患はがんであり得る。
本発明はまた、
ａ）第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のヌクレオチド配列；
ｂ）第２のＣＡＲをコードする第２のヌクレオチド配列；
ｃ）２つのＣＡＲが別々の実体として発現されるように、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間に配置された自己切断性ペプチドをコードする配列；
を含む核酸配列を提供する。
【００４７】
代替コドンは、同一または類似アミノ酸配列（複数も可）をコードする領域における第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列の１つまたはそれより多くの部分（複数も可）で使用されてもよい。
【００４８】
本発明はまた、上記の核酸を含むベクターおよび細胞を提供する。
【００４９】
本発明の動力学的分離に基づくＡＮＤゲートは、先に記載した「共ＣＡＲ」、すなわち活性化シグナルまたは共刺激シグナルのいずれかをＴ細胞に供給する２つのＣＡＲにより２つの抗原が認識される二重標的化手法に著しい技術的利益を提供する。
【００５０】
共ＣＡＲ手法によると、非常に高い活性が両抗原をもつ標的細胞に対して予想され得るが、活性化ＣＡＲにより認識される抗原のみをもつ組織に対するかなりの活性が予想され得る。この活性は、少なくとも第一世代ＣＡＲの活性であると予想され得る。第一世代ＣＡＲは、かなりの毒性をもたらし、例えば、予想外にも胆管上皮で発現される炭酸脱水酵素ＩＸを認識する第一世代ＣＡＲの臨床試験では胆管毒性が観察された（Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ参考文献）。特に、最終分化エフェクターは、共刺激シグナルを必要とせず、またはそれに応答することもないため、最終分化ＣＡＲ  Ｔ細胞はいずれも、共刺激ＣＡＲシグナルが存在しないにもかかわらず、最大限に作用することになる。
【００５１】
さらに、共刺激シグナルは、Ｔ細胞集団に対する長期にわたる作用をもたらす。これらの作用は、Ｔ細胞／標的シナプス相互作用を長期間にわたり存続させる。したがって、腫瘍内で十分に活性化され、遊走するＣＡＲ  Ｔ細胞は、単一抗原担持正常組織に対して最大限に強い活性を有することができる。この「流出（ｓｐｉｌｌ−ｏｖｅｒ）」作用は、腫瘍内、腫瘍付近または腫瘍から排出する組織において非常に著しいものであり得る。事実、ＣＡＲ活性化ではなく、別個の受容体を通して結びつけられた共刺激シグナルにより高められる第一世代ＣＡＲの活性の概念に基づく戦略が、提案され、試験された（Ｒｏｓｓｉｇ，Ｂｌｏｏｄ．２００２年３月１５日；９９（６）：２００９−１６）。
【００５２】
このため、共ＣＡＲ手法は、単一抗原発現正常組織の向かう毒性を廃するのではなく、せいぜい低減させる程度であることが予想され得る。本発明は、Ｔ細胞／標的細胞間に形成された免疫学的シナプスでの動力学的分離を使用することにより、Ｔ細胞発動自体を調節する。したがって、第２の抗原の非存在下における発動の堅固な絶対的制御が達成される。このため、Ｔ細胞活性化の全体は、両抗原を発現する標的細胞に制限され、ＡＮＤゲートは当然エフェクター細胞型または分化状態とは関係なく機能することになり、ＡＮＤゲートＴ細胞活性化の「流出」作用の可能性は無い。
【００５３】
（本発明のさらなる態様）
本発明はまた、以下の番号を付した項に列挙した態様に関するものである：
１．第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを細胞表面で共発現するＴ細胞であって、各ＣＡＲが、
（ｉ）抗原結合ドメイン
（ｉｉ）スペーサー
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、および
（ｉｖ）エンドドメイン
を含み、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、第１のＣＡＲのスペーサーが第２のＣＡＲのスペーサーとは異なり、第１のＣＡＲまたは第２のＣＡＲの一方が活性化エンドドメインを含む活性化ＣＡＲであり、他方のＣＡＲが、活性化エンドドメインを含む活性化ＣＡＲまたはライゲーション・オンもしくはライゲーション・オフ阻害性エンドドメインを含む阻害性ＣＡＲのどちらかである、Ｔ細胞。
【００５４】
２．第１のＣＡＲのスペーサーが、第２のＣＡＲのスペーサーとは異なる長さおよび／または電荷および／またはサイズおよび／または立体配置および／またはグリコシル化を有するため、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲがそれらのそれぞれの標的抗原を結合したとき、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲがＴ細胞膜上で空間的に離されることになる、項１に記載のＴ細胞。
【００５５】
３．第１のスペーサーおよび第２のスペーサーのどちらか一方がＣＤ８ストークを含み、他方のスペーサーがＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、項２に記載のＴ細胞。
【００５６】
４．第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの両方が活性化ＣＡＲである、項１に記載のＴ細胞。
【００５７】
５．一方のＣＡＲがＣＤ１９と結合し、他方のＣＡＲがＣＤ２０と結合する、項４に記載のＴ細胞。
【００５８】
６．第１のＣＡＲまたは第２のＣＡＲの一方が、活性化エンドドメインを含む活性化ＣＡＲであり、他方のＣＡＲが、ライゲーション・オフ阻害性エンドドメインを含む阻害性ＣＡＲであり、この阻害性ＣＡＲは阻害性ＣＡＲライゲーションの非存在下での活性化ＣＡＲによるＴ細胞活性化を阻害するが、阻害性ＣＡＲがライゲーションしたときには活性化ＣＡＲによるＴ細胞活性化を有意に阻害しない、項２または３に記載のＴ細胞。
【００５９】
７．阻害性エンドドメインが、ＣＤ１４８またはＣＤ４５からのエンドドメインの全部または一部を含む、項６に記載のＴ細胞。
【００６０】
８．第１のＣＡＲの抗原結合ドメインがＣＤ５と結合し、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインがＣＤ１９と結合する、項６または７に記載のＴ細胞。
【００６１】
９．第１のスペーサーと第２のスペーサーが、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの交差対合を防止するほど十分に異なるが、ライゲーション後に第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの共局在化をもたらすほど十分に類似している、項１に記載のＴ細胞。
【００６２】
１０．第１のＣＡＲまたは第２のＣＡＲの一方が、活性化エンドドメインを含む活性化ＣＡＲであり（ｉｎ  ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＣＡＲ）、他方のＣＡＲが、ライゲーション・オン阻害性エンドドメインを含む阻害性ＣＡＲであり、この阻害性ＣＡＲは、阻害性ＣＡＲライゲーションの非存在下での活性化ＣＡＲによるＴ細胞活性化を有意に阻害しないが、阻害性ＣＡＲがライゲーションしたときには活性化ＣＡＲによるＴ細胞活性化を阻害する、項９に記載のＴ細胞。
【００６３】
１１．ライゲーション・オン阻害性エンドドメインが、ホスファターゼの少なくとも一部を含む、項１０に記載のＴ細胞。
【００６４】
１２．ライゲーション・オン阻害性エンドドメインが、ＰＴＰＮ６の全部または一部を含む、項１１に記載のＴ細胞。
【００６５】
１３．ライゲーション・オン阻害性エンドドメインが、少なくとも１つのＩＴＩＭドメインを含む、項１０に記載のＴ細胞。
【００６６】
１４．ライゲーション・オン阻害性エンドドメインの活性が、ＰＴＰＮ６−ＣＤ４５融合タンパク質またはＰＴＰＮ６−ＣＤ１４８融合タンパク質の共発現により増強される、項１３に記載のＴ細胞。
【００６７】
１５．活性化エンドドメインを含むＣＡＲが、ＣＤ３３と結合する抗原結合ドメインを含み、ライゲーション・オン阻害性エンドドメインを含むＣＡＲが、ＣＤ３４と結合する抗原結合ドメインを含む、項１０〜１４のいずれかに記載のＴ細胞。
【００６８】
１６．２つより多くの抗原の区別可能なパターンを担持する、Ｔ細胞などの細胞により特異的に刺激されるような、先行する項に記載のＣＡＲを２つより多く含むＴ細胞。
【００６９】
１７．項１〜１６のいずれかに記載の第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の両方をコードする核酸配列。
【００７０】
１８．以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｂＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり；
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し、Ｔ細胞で発現されるときに、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲがＴ細胞表面で共発現されるような、切断部位で切断されるポリペプチドをコードする、項１７に記載の核酸配列。
【００７１】
１９．ｃｏｅｘｐｒが、自己切断性ペプチドを含む配列をコードする、項１８に記載の核酸配列。
【００７２】
２０．代替コドンが、相同組換えを回避するために、同一または類似アミノ酸配列をコードする配列の領域で使用される、項１８または１９に記載の核酸配列。
【００７３】
２１．
（ｉ）項１〜１６のいずれかで記載した第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列であって、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する核酸配列；および
（ｉｉ）項１〜１６のいずれかで記載した第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸配列であって、以下の構造：
ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する核酸配列
を含むキット。
【００７４】
２２．項２１に記載の第１の核酸配列を含む第１のベクター、および項２１に記載の第１の核酸配列を含む第２のベクターを含むキット。
【００７５】
２３．ベクターが、組込み型ウイルスベクターまたはトランスポゾンである、項２２に記載のキット。
【００７６】
２４．項１７〜２０のいずれかに記載の核酸配列を含むベクター。
【００７７】
２５．項２４に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
【００７８】
２６．項１７〜２０のいずれかに記載の核酸配列；項２１に記載の第１の核酸配列および第２の核酸配列；および／または項２２に記載の第１のベクターおよび第２のベクターまたは項２４もしくは２５に記載のベクターをＴ細胞へ導入する工程を含む、項１〜１６のいずれかに記載のＴ細胞を作製する方法。
【００７９】
２７．Ｔ細胞が被験体から単離された試料に由来する、項２４に記載の方法。
【００８０】
２８．項１〜１６のいずれかに記載の複数のＴ細胞を含む医薬組成物。
【００８１】
２９．被験体に項２８に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、疾患を処置および／または予防する方法。
【００８２】
３０．以下の工程：
（ｉ）被験体からのＴ細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）項１７〜２０のいずれかに記載の核酸配列；項２１に記載の第１の核酸配列および第２の核酸配列；項２２もしくは２３に記載の第１のベクターおよび第２のベクターまたは項２４もしくは２５に記載のベクターでのＴ細胞の形質導入またはトランスフェクション；ならびに
（ｉｉｉ）被験体に（ｉｉ）からのＴ細胞を投与すること
を含む、項２９に記載の方法。
【００８３】
３１．疾患ががんである、項２９または３０に記載の方法。
【００８４】
３２．疾患の処置および／または予防で使用するための項２８に記載の医薬組成物。
【００８５】
３３．疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における項１〜１６のいずれかに記載のＴ細胞の使用。
【００８６】
（詳細な説明）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１で概略的に示されているＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に結び付けるキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことも可能である。スペーサードメインは、通常膜からバインダーを単離し、好適な配向をもたせるのに必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原によっては、ＣＤ８αからのストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジ単独でも十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜にタンパク質をつなぎ止め、スペーサーをエンドドメインに結び付ける。
【００８７】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖のどちらかの細胞内部分から誘導されたエンドドメインを有していた。したがって、これらの第一世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達するもので、同種標的細胞のＴ細胞による致死を誘発するのに十分ではあったが、Ｔ細胞を十分に活性化して増殖および生存をもたらすことはなかった。この限界を克服するため、複合エンドドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分の融合により、抗原認識後活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第二世代受容体がもたらされる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、Ｔ細胞増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。また、生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢなど、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む一部の受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにいっそう強力な第三世代ＣＡＲが現在記載されている。
【００８８】
ＣＡＲエンコード核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを用いてＴ細胞に移入され得る。レンチウイルスベクターも使用され得る。こうして、多数のがん特異的Ｔ細胞が、養子細胞移入のために生成され得る。ＣＡＲが標的抗原と結合したとき、これにより、活性化シグナルの、それが発現されるＴ細胞への伝達がもたらされる。すなわち、ＣＡＲは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に向けたＴ細胞の特異性および細胞傷害性を誘導する。
【００８９】
本発明の第１の態様は、真理値表：表１、２および３で詳述した論理ゲートの方式でＴ細胞が標的細胞上の所望の発現パターンを認識できるように第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを共発現するＴ細胞に関するものである。
【００９０】
第１および第２の両ＣＡＲ（および所望により後続のＣＡＲ）は、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）スペーサー；
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および
（ｉｉｉ）細胞内ドメイン
を含む。
【表１】
2019041775.tif 000005
【００９１】
【表２】
2019041775.tif 000006
【００９２】
【表３】
2019041775.tif 000007
【００９３】
本発明のＴ細胞の第１および第２のＣＡＲは、切断部位と一緒に両ＣＡＲを含むポリペプチドとして産生され得る。
【００９４】
配列番号１〜５は、かかるポリペプチドの例を示しており、その各々は２つのＣＡＲを含む。したがって、ＣＡＲは、単一ＣＡＲに対応する、以下のアミノ酸配列の１つまたは他の部分を含み得る。
配列番号１は、ＣＤ１９  ＯＲ  ＣＤ３３を認識するＣＡＲ  ＯＲゲートである。
配列番号２は、ＣＤ１４８ホスファターゼを用いるＣＤ１９  ＡＮＤ  ＣＤ３３を認識するＣＡＲ  ＡＮＤゲートである。
配列番号３は、ＣＤ４５ホスファターゼを用いるＣＤ１９  ＡＮＤ  ＣＤ３３を認識するＣＡＲ  ＡＮＤゲートの代替的実現形態である。
配列番号４は、ＰＴＰＮ６ホスファターゼに基づいたＣＤ１９  ＡＮＤ  ＮＯＴ  ＣＤ３３を認識するＣＡＲ  ＡＮＤ  ＮＯＴゲートである。
配列番号５は、ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＮＯＴ  ＣＤ３３を認識し、ＬＡＩＲ１からのＩＴＩＭ含有エンドドメインに基づくＣＡＲ  ＡＮＤ  ＮＯＴゲートの代替的実現形態である。
配列番号６は、ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＮＯＴ  ＣＤ３３を認識し、ＩＴＩＭ含有エンドドメインへＰＴＰＮ６−ＣＤ１４８融合タンパク質をリクルートするＣＡＲ  ＡＮＤ  ＮＯＴゲートのさらなる代替的実現形態である。
【化１】
2019041775.tif 000008
【化２】
2019041775.tif 000009
【化３−１】
2019041775.tif 000010
【化３−２】
2019041775.tif 000011
【化４−１】
2019041775.tif 000012
【化４−２】
2019041775.tif 000013
【化５】
2019041775.tif 000014
【化６−１】
2019041775.tif 000015
【化６−２】
2019041775.tif 000016
【００９５】
ＣＡＲは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号１、２、３、４、５または６として示された配列のＣＡＲエンコード部分の変異型を含み得るが、ただし、変異型の配列は要求される特性を有するＣＡＲであるものとする。
【００９６】
配列アラインメントの方法は、当技術分野では周知であり、好適なアラインメントプログラムを用いて遂行される。配列同一性％は、２つの配列を最適な形で並列させたときにその２つの配列において同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチド残基のパーセンテージをいう。ヌクレオチドおよびタンパク質の配列相同性または同一性は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで公的に入手可能である、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などの標準アルゴリズムを用いて決定され得る。配列同一性または相同性を決定するための他のアルゴリズムには次のものがある：ＬＡＬＩＧＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｌａｌｉｇｎ／およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｌａｌｉｇｎ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌ）、ＡＭＡＳ（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｙ  Ａｌｉｇｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ａｍａｓ／ａｍａｓ．ｈｔｍｌ）、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、ＳＩＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｉｍ／）、およびＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌ）。
【００９７】
ＣＡＲ論理ＯＲゲート
この実施形態では、本発明の第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、両ＣＡＲとも、活性化エンドドメインを含む。両ＣＡＲとも、２種の異なる受容体の交差対合を防止するために異なるスペーサードメインを有する。このため、Ｔ細胞に対し、抗原の一方または両方の認識の際に活性化するように操作することができる。このことは、Ｇｏｌｄｉｅ−Ｃｏｌｄｍａｎによる仮説により示されているように腫瘍学の分野で有用である：単一抗原を標的化するだけでは、ほとんどのがんに固有の高い変異率故に前記抗原のモジュレーションにより腫瘍エスケープが起こり得る。２つの抗原を同時に標的化することにより、かかるエスケープの確率（ｐｒｏｂａｂｌｙ）は指数関数的に低減される。
【００９８】
様々な腫瘍関連抗原が下記表４に示されているとおり公知である。所与の疾患について、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、その疾患に関連する２つの異なるＴＡＡに結合し得る。この方法では、第２の抗原も標的とされるため、単一抗原をモジュレートすることによる腫瘍エスケープは防止される。例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍を標的とするとき、ＣＤ１９およびＣＤ２０を両方とも同時に標的化することができる。この実施形態では、２つのＣＡＲがヘテロダイマーを形成しないことが重要である。
【表４】
2019041775.tif 000017
【００９９】
動力学的分離モデル
ＡＮＤゲートおよびＡＮＤ  ＮＯＴゲートを生成するためのＣＡＲの後続的対合は、Ｔ細胞活性化の動力学的分離モデル（ＫＳ）に基づく。これは、いかにしてＴ細胞受容体による抗原認識が下流の活性化シグナルに変換されるかを説明する、実験データに裏付けられた機能モデルである。簡単に述べると、基底状態では、Ｔ細胞膜上のシグナル伝達成分は、動的ホメオスタシスにあり、脱リン酸化ＩＴＡＭは、リン酸化ＩＴＡＭより好適である。これは、膜貫通ＣＤ４５／ＣＤ１４８ホスファターゼの活性が、ｌｃｋなどの膜連結キナーゼよりも大きいためである。Ｔ細胞が、同種抗原のＴ細胞受容体（またはＣＡＲ）認識を通して標的細胞と結び付いたとき、堅固な免疫学的シナプスが形成される。Ｔ細胞および標的膜のこの近接した並置により、ＣＤ４５／ＣＤ１４８は、シナプスへ適合できないそれらの大きなエクトドメイン故に排除される。ホスファターゼの非存在下での、シナプスにおける高濃度のＴ細胞受容体関連ＩＴＡＭおよびキナーゼの分離は、リン酸化ＩＴＡＭの方が有利にはたらく状態をもたらす。ＺＡＰ７０は、閾値のリン酸化ＩＴＡＭを認識し、Ｔ細胞活性化シグナルを伝搬する。本発明では、Ｔ細胞活性化に対するこの進歩した理解を活用する。特に、本発明は、いかにして異なる長さおよび／またはかさおよび／または電荷および／または立体配置および／またはグリコシル化を有するエクトドメインがシナプス形成の際に特異的な分離（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）をもたらすかについての理解に基づいている。
【０１００】
ＣＡＲ論理ＡＮＤゲート
この実施形態では、１つのＣＡＲが活性化エンドドメインを含み、１つのＣＡＲが阻害性エンドドメインを含むことにより、阻害性ＣＡＲは構成的に第１の活性化ＣＡＲを阻害するが、その同種抗原の認識の際にその活性化ＣＡＲ阻害を解除する。このように、標的細胞が両同種抗原を発現する場合のみ発動するようにＴ細胞は操作され得る。この行動は、ＩＴＡＭドメイン含有活性化エンドドメイン、例えばＣＤ３−ゼータのエンドドメインを含む活性化ＣＡＲ、およびＩＴＡＭを脱リン酸化できるホスファターゼ（例えば、ＣＤ４５またはＣＤ１４８）からのエンドドメインを含む阻害性ＣＡＲにより達成される。重大なことに、両ＣＡＲのスペーサードメインは、サイズおよび／または形状および／または電荷などが有意に異なる。活性化ＣＡＲのみがライゲーションされたとき、阻害性ＣＡＲはＴ細胞表面上で溶解状態にあり、活性化ＣＡＲを阻害するシナプスの内外で拡散することができる。両ＣＡＲがライゲーションされたとき、スペーサー特性が異なる故に、活性化ＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲは特異的に分離され、活性化ＣＡＲに、阻害性ＣＡＲにより妨害されないＴ細胞活性化を誘発させ得る。
【０１０１】
これは、がん治療分野でかなりの有用性を示す。目下、免疫療法は、典型的には単一抗原を標的とする。ほとんどのがんは、単一抗原に基づく正常組織からは分化され得ない。このため、かなりの「ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｏｆｆ−ｔｕｍｏｕｒ」毒性が生じることにより、正常組織はその治療により損傷を被る。例えば、リツキシマブでＢ細胞リンパ腫を処置するためＣＤ２０を標的としている間に、全正常Ｂ細胞区画は枯渇に至る。例えば、慢性リンパ性白血病を処置するためＣＤ５２を標的としている間に、全リンパ区画は枯渇に至る。例えば、急性骨髄性白血病を処置するためＣＤ３３を標的としている間に、全骨髄区画が損傷を被るなど。活性を一組の抗原に制限することにより、より精巧を極めた標的化、したがってより毒性の低い治療を開発することができる。実践例は、ＣＤ５およびＣＤ１９の両方を発現するＣＬＬの標的化である。両抗原を発現する正常Ｂ細胞の比率はわずかな比率に過ぎないため、論理ＡＮＤゲートでの両抗原の標的化のオフターゲット毒性は、各抗原を個々に標的化する場合より実質的に低い。
【０１０２】
本発明の設計は、Ｗｉｌｋｉｅら（（２０１２）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２、１０５９−１０７０）により記載され、次いでインビボで試験された（Ｋｌｏｓｓら（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，７１−７５）ように、先行実現形態にかなりの改良を加えたものである。この実現形態では、第１のＣＡＲは活性化エンドドメインを含み、第２のＣＡＲは共刺激性ドメインを含む。かくして、Ｔ細胞のみが、両抗原が存在するときに活性化および共刺激シグナルを受信する。しかしながら、Ｔ細胞はなお、単なる第１の抗原の存在下で活性化し、オフターゲット毒性についての可能性をもたらす。さらに、本発明の実現形態は多重複合リンク型ゲート（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｌｉｎｋｅｄ  ｇａｔｅ）を可能にするもので、細胞は抗原の複合パターンを解釈することができる。
【表５】
2019041775.tif 000018
【０１０３】
ＣＡＲ論理ＡＮＤ  ＮＯＴゲート
この実現形態では、１つのＣＡＲが活性化エンドドメインを含み、１つのＣＡＲが阻害性エンドドメインを含み、その結果この阻害性ＣＡＲがその同種抗原を認識したときのみ活性である。このため、このように操作されたＴ細胞は、第１の抗原の存在のみに応答して活性化されるが、両抗原が存在するときには活性化されない。本発明は、第１のＣＡＲと共局在するスペーサーを伴う阻害性ＣＡＲにより実現されるが、阻害性ＣＡＲのホスファターゼ活性は、当然阻害性ＣＡＲが溶解状態で阻害するほど強力ではないか、または阻害性ＣＡＲがその同種標的を認識したときのみ阻害性エンドドメインは実際にホスファターゼをリクルートするかのいずれかである。かかるエンドドメインは、本明細書では「ライゲーション・オン」または半阻害性と呼ぶ。
【０１０４】
本発明は、腫瘍を腫瘍関連抗原の存在および正常組織で発現された抗原の喪失により正常組織と識別することができるとき、標的化を精巧なものにするのに有用である。ＡＮＤ
ＮＯＴゲートは、正常細胞であって、ただし活性化エンドドメインを含むＣＡＲにより認識される抗原も発現する正常細胞により発現される抗原の標的化を可能にするため、腫瘍学分野でかなりの有用性がある。かかる抗原の一例は、正常幹細胞および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞により発現されるＣＤ３３である。ＣＤ３４は、幹細胞で発現されるが、典型的にはＡＭＬ細胞からは発現されない。ＣＤ３３  ＡＮＤ  ＮＯＴ  ＣＤ３４を認識するＴ細胞は、白血病細胞の破壊をもたらすが、正常幹細胞を残存させる。
【０１０５】
ＡＮＤ  ＮＯＴゲートで使用するための潜在的抗原対を表６に示す。
【表６】
2019041775.tif 000019
【０１０６】
複合ゲート
上記成分を伴う動力学的分離モデルにより、複合ゲート、例えば２つより多くの標的抗原のパターンに応答して発動するＴ細胞が作製され得る。例えば、３つの抗原が存在するときのみ（Ａ  ＡＮＤ  Ｂ  ＡＮＤ  Ｃ）発動するＴ細胞を作製することが可能である。ここで、細胞は３つのＣＡＲを発現し、それぞれ抗原Ａ、ＢおよびＣを認識する。１つのＣＡＲは興奮性であり、２つのＣＡＲは阻害性であり、各ＣＡＲは、特異的分離をもたらすスペーサードメインを有する。３つ全てがライゲーションされたときのみ、Ｔ細胞は活性化する。さらなる例（Ａ  ＯＲ  Ｂ）ＡＮＤ  Ｃ：ここで、抗原ＡおよびＢを認識するＣＡＲは、活性型であり、共局在するスペーサーを有し、抗原Ｃを認識するＣＡＲは阻害性であり、異なる共分離をもたらすスペーサーを有する。さらなる例（Ａ  ＡＮＤ  ＮＯＴ  Ｂ）ＡＮＤ  Ｃ：ここで、抗原Ａに対するＣＡＲは、活性化エンドドメインを有し、条件的阻害性エンドドメインを有する抗原Ｂに対するＣＡＲと共局在する。抗原Ｃに対するＣＡＲは、ＡまたはＢとは異なる形で分離するスペーサーを有し、阻害性である。事実、より複合的なブール論理でも、任意の数のＣＡＲおよびスペーサーを伴う本発明のこれらの単純な成分でプログラム化することができる。
【０１０７】
シグナルペプチド
本発明のＴ細胞のＣＡＲはシグナルペプチドを含み得、その結果、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞の内側で発現されるとき、新生タンパク質を小胞体、それに続いて細胞表面へと指向させ、そこで発現される。
【０１０８】
シグナルペプチドのコアは、単一アルファ−へリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、アミノ酸の短い正に荷電したストレッチから始まり得、これが転位中におけるポリペプチドの適切なトポロジーを強化する助けとなる。シグナルペプチドの末端に、典型的にはシグナルペプチダーゼにより認識され、切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、転位中または転位完了後に切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成させ得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼにより消化される。
【０１０９】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に位置し得る。
【０１１０】
シグナルペプチドは、配列番号７、８もしくは９または５、４、３、２もしくは１のアミノ酸変異（挿入、置換または付加）を有するその変異型を含み得るが、ただし、シグナルペプチドは、依然としてＣＡＲの細胞表面発現を誘発するべく機能するものとする。
【０１１１】
配列番号７：ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＧ
配列番号７のシグナルペプチドは、小型であり高効率である。末端グリシンの後約９５％切断を与えることから、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去をもたらすと予測される。
【０１１２】
配列番号８：ＭＳＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
配列番号８のシグナルペプチドは、ＩｇＧ１から誘導される。
【０１１３】
配列番号９：ＭＡＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ
配列番号９のシグナルペプチドは、ＣＤ８から誘導される。
【０１１４】
第１のＣＡＲについてのシグナルペプチドは、第２のＣＡＲのシグナルペプチド（ならびに第３のＣＡＲおよび第４のＣＡＲなど）とは異なる配列を有し得る。
【０１１５】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの部分である。抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものを含め、多数の抗原結合ドメインが当技術分野では知られている。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対する十分な親和力をもつペプチド；単一ドメイン抗体；Ｄａｒｐｉｎ（設計されたアンキリン反復タンパク質）などの人工単一バインダー；またはＴ細胞受容体から誘導された単鎖を含み得る。
【０１１６】
抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合部位に基づかないドメインを含み得る。例えば、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞表面受容体についての可溶性リガンド（例えば、サイトカインまたはケモカインなどの可溶性ペプチド）であるタンパク質／ペプチドに基づくドメイン；または膜結合リガンドもしくは結合対のカウンターパートを腫瘍細胞で発現させるための受容体の細胞外ドメインを含み得る。
【０１１７】
実施例１１〜１３は、ＢＣＭＡと結合するＣＡＲに関するものであり、抗原結合ドメイン（ｄｏａｉｍｎ）は、ＢＣＭＡについてのリガンドであるＡＰＲＩＬを含む。
【０１１８】
抗原結合ドメインは、抗原の天然リガンドに基づき得る。
【０１１９】
抗原結合ドメインは、コンビナトリアルライブラリーからの親和性ペプチドまたは新たに設計された親和性タンパク質／ペプチドを含み得る。
【０１２０】
スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと連結し、空間的に抗原結合ドメインをエンドドメインから分離させるためのスペーサー配列を含む。可撓性スペーサーは、抗原結合ドメインを異なる方向で配向させることにより、結合を促進し得る。
【０１２１】
本発明のＴ細胞では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、異なるスペーサー分子を含む。例えば、スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストークまたはマウスＣＤ８ストークを含み得る。あるいは、スペーサーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似した長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替的リンカー配列を含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合性モチーフを除去するために改変され得る。
これらのスペーサーについてのアミノ酸配列の例を以下に示す：
【化７】
2019041775.tif 000020
【０１２２】
ＣＡＲは典型的にはホモダイマーであるため（図１ａ参照）、交差対合がヘテロダイマー性キメラ抗原受容体を生じさせ得る。これは、例えば以下の様々な理由により望ましくない：（１）エピトープは、標的細胞上で同じ「レベル」にはないことがあり得、その結果、交差対合したＣＡＲは１つの抗原に結合できるのみであり得る；（２）２つの異なるｓｃＦｖからのＶＨおよびＶＬは、取り換え可能であるが、標的を認識できないか、またはなお悪いことには予想外で予測外の抗原を認識することがあり得る。「ＯＲ」ゲートおよび「ＡＮＤ  ＮＯＴ」ゲートの場合、第１のＣＡＲのスペーサーは、交差対合を回避するため第２のＣＡＲのスペーサーとは十分に異なる。第１のスペーサーのアミノ酸配列は、第２のスペーサーとはアミノ酸レベルで５０％、４０％、３０％または２０％より低い同一性を共有し得る。
【０１２３】
本発明の他の実施態様（例えばＡＮＤゲートについて）では、動力学的分離モデルにより予測されるところによると、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの両方がそれらの標的抗原と結合したとき、スペーサーの電荷または寸法の差異により、２タイプのＣＡＲが膜の異なる部分へと空間的に分離されて活性化をもたらすように、第１のＣＡＲのスペーサーは、異なる長さおよび／または電荷および／または形状および／または立体配置および／またはグリコシル化を有することが重要である。これらの実施態様では、スペーサーの異なる長さ、形状および／または立体配置は、同種標的を認識する際に特異的分離が可能となるように標的抗原上でのサイズおよび標的抗原上の結合エピトープを考慮に入れて注意深く選択される。例えば、ＩｇＧ１ヒンジ、ＣＤ８ストーク、ＩｇＧ１  Ｆｃ、ＣＤ３４のエクトドメイン、ＣＤ４５のエクトドメインが、特異的に分離すると予想される。
【０１２４】
特異的に分離することから、ＡＮＤゲートでの使用に好適であるスペーサー対の例を、下表に示す：
【表７】
2019041775.tif 000021
【０１２５】
本発明の他の実施態様（例えばＡＮＤ  ＮＯＴゲート）では、スペーサーは、交差対合を防止することに関して十分異なるが、共局在することに関して十分類似していることが重要である。オーソロガススペーサー配列の対が使用され得る。例は、ネズミおよびヒトＣＤ８ストーク、または、あるいはモノマー性であるスペーサードメイン、例えばＣＤ２のエクトドメインである。
【０１２６】
共局在することから、ＡＮＤ  ＮＯＴゲートでの使用に好適であるスペーサー対の例を下表に示す：
【表８】
2019041775.tif 000022
【０１２７】
上記で挙げたスペーサードメインはすべてホモダイマーを形成する。しかしながら、この機構は、ホモダイマー受容体を使用する場合に限定されるわけではなく、スペーサーが十分に堅固である限りモノマー受容体でも当然機能する。かかるスペーサーの一例は、ＣＤ２または先端切除ＣＤ２２である。
【０１２８】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にわたるＣＡＲの配列である。
【０１２９】
膜貫通ドメインは、膜において熱力学的に安定しているいかなるタンパク質構造であってよい。これは、典型的には幾つかの疎水性残基で構成されるアルファ・へリックスである。いかなる膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインでも、本発明の膜貫通部分を供給するのに使用され得る。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および範囲は、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を用いて当業者により決定され得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造、すなわち膜にわたるのに十分な長さを有する疎水性アルファへリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列であるとすれば、人工的に設計されたＴＭドメインもまた使用され得る（米国特許第７０５２９０６Ｂ１号は、合成膜貫通成分について記載している）。
【０１３０】
膜貫通ドメインは、ＣＤ２８から誘導され得、良好な受容体安定性を与える。
【０１３１】
活性化エンドドメイン
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。抗原認識後、受容体がクラスター形成し、天然ＣＤ４５およびＣＤ１４８は、シナプスから排除され、シグナルは細胞へ伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ゼータのエンドドメイン成分である。これは、抗原が結合された後、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない可能性があるので、追加の共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、ＣＤ３−ゼータと併用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得るか、または３つ全部が一緒に使用され得る。
【０１３２】
本発明のＴ細胞が活性化エンドドメインを伴うＣＡＲを含む場合、該細胞は、ＣＤ３−ゼータエンドドメイン単独、ＣＤ２８またはＯＸ４０どちらかのエンドドメインと共にＣＤ３−ゼータエンドドメインまたはＣＤ２８エンドドメインならびにＯＸ４０およびＣＤ３−ゼータエンドドメインを含み得る。
【０１３３】
ＩＴＡＭモチーフを含むエンドドメインであれば、いずれも本発明における活性化エンドドメインとして作用し得る。幾つかのタンパク質が、１つまたはそれより多くのＩＴＡＭモチーフを伴うエンドドメインを含むことが知られている。かかるタンパク質として少し例を挙げれば、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖およびＣＤ３デルタ鎖が挙げられる。ＩＴＡＭモチーフは、サインＹｘｘＬ／Ｉを与える、任意の２つの他のアミノ酸によりロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンとして容易に認識され得る。常というわけではないが、典型的には、これらのモチーフの２つが、分子（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６−８）ＹｘｘＬ／Ｉ）のテイルにおける６〜８個の間のアミノ酸により分離される。このため、当業者であれば、活性化シグナルを伝達するための１つまたはそれより多くのＩＴＡＭを含む既存のタンパク質を容易に見出すことができる。さらに、モチーフが単純であり、複合２次構造が要求されないと仮定すると、当業者であれば、活性化シグナルを伝達するための人工ＩＴＡＭを含むポリペプチドを設計できる（合成シグナル伝達分子に関する、国際公開第２００００６３３７２号参照）。
【０１３４】
活性化エンドドメインを伴うＣＡＲの膜貫通および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）は、配列番号１５、１６または１７に示された配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【０１３５】
【化８】
2019041775.tif 000023
【０１３６】
変異型配列が、有効な膜貫通ドメインおよび有効な細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを提供するものと仮定すれば、該配列は、配列番号１５、１６または１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
【０１３７】
「ライゲーション・オフ」阻害性エンドドメイン
ＡＮＤゲートとして上記で示した実施形態では、阻害性ＣＡＲが、阻害性ＣＡＲライゲーションの非存在下では活性化ＣＡＲによるＴ細胞活性化を阻害するが、阻害性ＣＡＲがライゲーションされたとき活性化ＣＡＲによるＴ細胞活性化を有意に阻害することのないように、ＣＡＲの１つは阻害性エンドドメインを含む。これは、「ライゲーション・オフ」阻害性エンドドメインと呼ばれる。
【０１３８】
この場合、両受容体がライゲーションされたとき、スペーサー寸法の差異が、免疫学的シナプスの異なる膜区画において活性化ＣＡＲと阻害性ＣＡＲの単離をもたらし、その結果、活性化エンドドメインが阻害性エンドドメインによる阻害から解放されるように、阻害性ＣＡＲのスペーサーは、活性化ＣＡＲのスペーサーとは異なる長さ、電荷、形状および／または立体配置および／またはグリコシル化のスペーサーである。
【０１３９】
したがって、ライゲーション・オフ阻害性ＣＡＲで使用するための阻害性エンドドメインは、同じ膜区画にあるとき（すなわち、阻害性ＣＡＲについての抗原の非存在下で）活性化ＣＡＲによるＴ細胞シグナル伝達を阻害するが、膜の別々の部分で阻害性ＣＡＲから単離されたときにはＴ細胞シグナル伝達を有意に阻害しない任意の配列を含み得る。
【０１４０】
ライゲーション・オフ阻害性エンドドメインは、受容体様チロシンホスファターゼなどのチロシンホスファターゼであり得るかまたはこれを含み得る。阻害性エンドドメインは、刺激性受容体のみがライゲーションされたときＴＣＲシグナル伝達を阻害することができる任意のチロシンホスファターゼであり得るかまたはこれを含み得る。阻害性エンドドメインは、刺激性受容体のみがライゲーションされたときＴＣＲシグナル伝達を阻害することができるリン酸化ＩＴＡＭについての十分に速い触媒速度を有する任意のチロシンホスファターゼであり得るかまたはこれを含み得る。
【０１４１】
例えば、ＡＮＤゲートの阻害性エンドドメインは、ＣＤ１４８またはＣＤ４５のエンドドメインを含み得る。ＣＤ１４８およびＣＤ４５は、ＴＣＲシグナル伝達の上流でのリン酸化チロシンに対して自然に作用することが示されている。
【０１４２】
ＣＤ１４８は、ＰＬＣγ１およびＬＡＴのリン酸化および機能を妨げることによりＴＣＲシグナル伝達を負に調節する受容体様プロテインチロシンホスファターゼである。
【０１４３】
全造血細胞に存在するＣＤ４５は、同じくＰＬＣγ１をリン酸化することにより、シグナル伝達および機能的応答を調節することができるプロテインチロシンホスファターゼである。
【０１４４】
阻害性エンドドメインは、受容体様チロシンホスファターゼの全部または一部（ａｌｌ
ｏｆ  ｐａｒｔ）を含み得る。ホスファターゼは、ＰＬＣγ１および／またはＬＡＴなどのＴ細胞シグナル伝達に関与するエレメントのリン酸化および／または機能を妨げ得る。
【０１４５】
ＣＤ４５およびＣＤ１４８の膜貫通およびエンドドメインを、それぞれ配列番号１８および１９に示す。
【化９】
2019041775.tif 000024
【０１４６】
阻害性ＣＡＲは、配列番号１８または１９の全部または一部を含み得る（例えば、それは、エンドドメインのホスファターゼ機能を含み得る）。変異型が活性化ＣＡＲによるＴ細胞シグナル伝達を基本的に阻害する能力を保持している限り、阻害性ＣＡＲは少なくとも８０％の配列同一性を有する配列またはその一部の変異型を含み得る。
【０１４７】
他のスペーサーおよびエンドドメインは、例えば本明細書で具体的に示したモデル系を用いて試験され得る。ＳｕｐＴ１細胞系などの好適な細胞系に単独に、または二重に形質導入を行って、両抗原について陰性である細胞（野生型）、いずれか一方に陽性および両方に陽性である細胞（例えば、ＣＤ１９−ＣＤ３３−、ＣＤ１９＋ＣＤ３３−、ＣＤ１９−ＣＤ３３＋およびＣＤ１９＋ＣＤ３３＋）を確立することにより標的細胞集団を作製することができる。活性化の際にＩＬ−２を放出するマウスＴ細胞系ＢＷ５１４７などのＴ細胞に、ＣＡＲの対で形質導入を行い、それらが論理ゲートで機能する能力を、ＩＬ−２放出の測定により（例えばＥＬＩＳＡにより）測定してもよい。例えば、ＣＤ１４８およびＣＤ４５エンドドメインは両方とも、ＣＤ３−ゼータエンドドメインを含む活性化ＣＡＲとの組み合わせで阻害性ＣＡＲとして機能することができることが実施例４に示されている。これらのＣＡＲは、ＡＮＤゲーティングを達成するため、一方のＣＡＲ上の短い／嵩高くないＣＤ８ストークスペーサーおよび他方のＣＡＲ上の嵩高いＦｃスペーサーに依拠する。両受容体がライゲーションされたとき、スペーサー寸法の差異により、異なる膜区画における異なる受容体が単離され、ＣＤ３−ゼータ受容体はＣＤ１４８またはＣＤ４５エンドドメインによる阻害から解放される。かくして、一旦両受容体が活性化されると、活性化のみが起こる。このモジュール系が、代替的スペーサー対および阻害性エンドドメインを試験するのに使用され得ることは容易に見出すことができる。スペーサーが両受容体のライゲーション後に単離を達成しないならば、阻害は解除されず、したがって活性化も起こらない。試験されている阻害性エンドドメインが非有効性であるならば、活性化は、阻害性ＣＡＲのライゲーション状態とは関係なく活性化ＣＡＲのライゲーションの存在下で予測される。
【０１４８】
「ライゲーション・オン」エンドドメイン
ＡＮＤ  ＮＯＴゲートとして上記で示された実施形態では、ＣＡＲの一方は、阻害性ＣＡＲが、阻害性ＣＡＲライゲーションの非存在下で活性化ＣＡＲによるＴ細胞活性化を有意に阻害することはないが、阻害性ＣＡＲがライゲーションされたときには、活性化ＣＡＲによるＴ細胞活性化を阻害するように「ライゲーション・オン」阻害性エンドドメインを含む。
【０１４９】
「ライゲーション・オン」阻害性エンドドメインは、刺激性受容体のみがライゲーションされたとき、ＴＣＲシグナル伝達を阻害することができないチロシンホスファターゼであり得るかまたはこれを含み得る。
【０１５０】
「ライゲーション・オン」阻害性エンドドメインは、刺激性受容体のみがライゲーションされたときＴＣＲシグナル伝達を阻害することはできないが、シナプスで濃縮されたときにはＴＣＲシグナル伝達応答を阻害することができるリン酸化ＩＴＡＭにとって触媒速度が十分に遅いチロシンホスファターゼであり得るかまたはこれを含み得る。シナプスでの濃縮は、阻害性受容体ライゲーションを通して達成される。
【０１５１】
チロシンホスファターゼが、「ライゲーション・オン」阻害性エンドドメインにとって速すぎる触媒速度を有するならば、点変異などの修飾および短いリンカー（立体障害を誘発する）によりホスファターゼの触媒速度を落として調整することにより「ライゲーション・オン」阻害性エンドドメインに対して好適なものとすることが可能である。
【０１５２】
この第１の実施形態では、エンドドメインは、活性化エンドドメインおよび阻害性エンドドメインが共局在するときにＩＴＡＭのみの有意な脱リン酸化が起こるように、ＣＤ４５またはＣＤ１４８よりもかなり活性が低いホスファターゼであり得るかまたはこれを含み得る。多くの好適な配列が当技術分野では知られている。例えば、ＮＯＴ  ＡＮＤゲートの阻害性エンドドメインは、ＰＴＰＮ６などのプロテインチロシンホスファターゼの全部または一部を含み得る。
【０１５３】
プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）は、細胞の成長、分化、有糸分裂周期および発がん性形質転換を含む様々な細胞プロセスを調節するシグナル伝達分子である。このＰＴＰのＮ末端部分は、２つのタンデムＳｒｃホモログ（ＳＨ２）ドメインを含み、これらはタンパク質ホスホ−チロシン結合ドメインとして作用し、このＰＴＰとその基質との相互作用を媒介する。このＰＴＰは、主として造血細胞で発現され、造血細胞における多重シグナル伝達経路の重要な調節因子として機能する。
【０１５４】
阻害剤ドメインは、ＰＴＰＮ６（配列番号２０）の全部またはホスファターゼドメイン（配列番号２１）のみを含み得る。
【化１０】
2019041775.tif 000025
【０１５５】
ライゲーション・オン阻害性エンドドメインの第２の実施形態は、ＣＤ２２、ＬＡＩＲ−１、キラー阻害性受容体ファミリー（ＫＩＲ）、ＬＩＬＲＢ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡなどに由来するものなどのＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ）含有エンドドメインである。リン酸化されたとき、ＩＴＩＭはそのＳＨ２ドメインを通して内因性ＰＴＰＮ６をリクルートする。ＩＴＡＭ含有エンドドメインと共局在するならば、脱リン酸化が起こり、活性化ＣＡＲは阻害される。
【０１５６】
ＩＴＩＭは、免疫系の多くの阻害性受容体の細胞質テイルから見出されるアミノ酸の保存配列（Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ）である。当業者であれば、ＩＴＩＭを含有するタンパク質ドメインを容易に見出すことができる。ヒト候補ＩＴＩＭ含有タンパク質のリストは、プロテオームワイド走査法（ｐｒｏｔｅｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｃａｎ）（Ｓｔａｕｂら（２００４）Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．１６、４３５−４５６）により作製された。さらに、コンセンサス配列は周知であり、２次構造が要求されることはほとんどないようであるため、当業者であれば、人工的ＩＴＩＭを生成することができる。
ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＫＩＲ３ＤＬ３からのＩＴＩＭエンドドメインを、それぞれ配列番号２２〜３１に示す。
【化１１】
2019041775.tif 000026
【化１２】
2019041775.tif 000027
【０１５７】
ライゲーション・オン阻害性エンドドメインの第３の実施形態は、融合タンパク質と共発現されるＩＴＩＭ含有エンドドメインである。融合タンパク質は、プロテインチロシンホスファターゼの少なくとも一部および受容体様チロシンホスファターゼの少なくとも一部を含み得る。この融合体は、プロテインチロシンホスファターゼからの１つまたはそれより多くのＳＨ２ドメインを含み得る。例えば、この融合体は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインとＣＤ４５エンドドメインとの間またはＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインとＣＤ１４８エンドドメインとの間にあり得る。リン酸化されたとき、ＩＴＩＭドメインは、融合タンパク質をリクルートして、非常に強力なＣＤ４５またはＣＤ１４８ホスファターゼを活性化エンドドメインへの近位に導き、活性化を遮断する。
融合タンパク質の配列を３２および３３に列挙する。
【化１３−１】
2019041775.tif 000028
【化１３−２】
2019041775.tif 000029
【化１４】
2019041775.tif 000030
【０１５８】
ライゲーション・オン阻害性ＣＡＲは、配列番号２０または２１の全部または一部を含み得る。それは、配列番号２２〜３１の全部または一部を含み得る。それは、配列番号３２または３３のどちらかと共発現される配列番号２２〜３１の全部または一部を含み得る。それは、変異型が阻害性ＣＡＲのライゲーションの際に活性化ＣＡＲによるＴ細胞シグナル伝達を阻害する能力を保持している限り、少なくとも８０％の配列同一性を有する配列またはその一部の変異型を含み得る。
【０１５９】
上記のとおり、代替的スペーサーおよびエンドドメインは、例えば本明細書で例証したモデル系を用いて試験され得る。実施例５には、ＰＴＰＮ６エンドドメインが、ＣＤ３−ゼータエンドドメインを含む活性化ＣＡＲと組み合わせた形で半阻害性ＣＡＲとして機能することができることが示されている。これらのＣＡＲは、一方のＣＡＲ上のヒトＣＤ８ストークスペーサーおよび他方のＣＡＲ上のマウスＣＤ８ストークスペーサーに依拠する。オーソロガス配列は、交差対合を防止する。しかしながら、両受容体がライゲーションされたとき、スペーサー間の類似性により、同じ膜区画における異なる受容体の共単離がもたらされる。これにより、ＰＴＰＮ６エンドドメインによるＣＤ３−ゼータ受容体の阻害が生じる。活性化ＣＡＲのみがライゲーションされたとき、ＰＴＰＮ６エンドドメインは、Ｔ細胞活性化を防止するほど十分に活性でない。かくして、活性化ＣＡＲがライゲーションされ、阻害性ＣＡＲがライゲーションされないならば（ＡＮＤ  ＮＯＴゲーティング）、活性化のみが起こる。このモジュール系を用いて、代替的スペーサー対および阻害性ドメインを試験することができることは、容易に確かめることができる。スペーサーが両受容体のライゲーション後に共分離を達成しないならば、阻害は有効ではなく、したがって活性化が起こる。試験されている半阻害性エンドドメインが非有効性であるならば、半阻害性ＣＡＲのライゲーション状態とは関係無く活性化ＣＡＲのライゲーションの存在下で活性化が予想される。
【０１６０】
共発現部位
本発明の第２の実施態様は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする核酸に関する。
【０１６１】
核酸は、切断部位により連結された２つのＣＡＲ分子を含むポリペプチドを生成し得る。切断部位は、ポリペプチドが産生されるとき、外部の切断活性を一切必要とせずに第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲへと直ちに切断されるように、自己切断性であり得る。
配列番号３４として示された配列を有する、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２ａ自己切断性ペプチドを含む、様々な自己切断性部位が知られている：
配列番号３４
ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ。
【０１６２】
共発現配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）であり得る。共発現配列は、内部プロモーターであり得る。
【０１６３】
細胞
本発明の第１の実施態様は、細胞表面で第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを共発現する細胞に関する。
【０１６４】
該細胞は、免疫学的細胞など、細胞表面でＣＡＲを発現することができる任意の真核生物細胞であってよい。
特に、細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞であり得る。
【０１６５】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的役割を演じるリンパ球のタイプである。それらは、細胞表面におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球とは区別することができる。下記で概説する通り、様々なタイプのＴ細胞がある。
【０１６６】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスで他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。これらの細胞は、種々のサイトカインを分泌することにより、種々のタイプの免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、幾つかのサブタイプのうちの１つに分化し得る。
【０１６７】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植拒絶でも関与する。ＣＴＬは、それらの表面でＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全有核細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに随伴する抗原に結合することにより標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活化され得、実験的自己免疫脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防止する。
【０１６８】
記憶Ｔ細胞は、感染の消散後長期にわたって持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原に再曝露されると、迅速に多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、過去の感染に対する「記憶」をもつ免疫系を提供する。記憶Ｔ細胞は、３つのサブタイプ：セントラル記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０１６９】
以前にはサプレッサーＴ細胞として知られていた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に非常に重要である。それらの主たる役割は、免疫反応の終末に向けてＴ細胞媒介性免疫を制止し、胸腺での負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０１７０】
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞については記載されている。
【０１７１】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は、胸腺で生じ、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により他のＴ細胞からは区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞の発達を防止し得るため、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされ得る。
【０１７２】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られている）は、正常な免疫応答中に生じ得る。
【０１７３】
本発明のＴ細胞は、上記で挙げたＴ細胞タイプのいずれでもよいが、特にＣＴＬであり得る。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の一部を形成する細胞溶解性細胞の１タイプである。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的にウイルス感染細胞からの内生シグナルに対して、迅速な応答を提供する。
【０１７４】
ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生じる共通のリンパ性前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺で分化および成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。
【０１７５】
本発明のＣＡＲ細胞は、上記で挙げた細胞タイプのいずれでもよい。
【０１７６】
ＣＡＲ発現ＴまたはＮＫ細胞などのＣＡＲ発現細胞は、患者自身の末梢血から（第１団）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（第２団）、または非関連ドナーからの末梢血（第３団）から生体外で作製され得る。
【０１７７】
本発明はまた、本発明によるＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞を含む細胞組成物を提供する。該細胞組成物は、本発明による核酸での血液試料の生体外形質導入またはトランスフェクションにより作製され得る。
【０１７８】
あるいは、ＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞などの関連する細胞タイプへの誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の生体外分化から誘導され得る。あるいは、溶解機能を保持し、治療薬として作用することができるＴ細胞系などの不死化細胞系も使用され得る。
【０１７９】
これらのすべての実施形態において、ＣＡＲ細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つによりＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより生成される。
【０１８０】
本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、被験体由来の生体外Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料から得てもよい。Ｔ細胞は、ＣＡＲエンコード核酸で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理により活性化および／または拡大され得る。
【０１８１】
本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、
（ｉ）被験体または上記で挙げた他の供給源からのＴ細胞含有試料の単離；および
（ｉｉ）第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする１つまたはそれより多くの核酸配列（複数も可）によるＴ細胞の形質導入またはトランスフェクション
により作製され得る。
【０１８２】
次いで、Ｔ細胞は精製され得、例えば、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの共発現に基づいて選択され得る。
【０１８３】
核酸配列
本発明の第２の実施態様は、本発明の第１の実施態様で記載した第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする１つまたはそれより多くの核酸配列（複数も可）に関する。
核酸配列は、以下の配列のうちの１つ、またはその変異型を含み得る：
配列番号３５  ＯＲゲート
ＣＤ４５を用いる配列番号３６  ＡＮＤゲート
ＣＤ１４８を用いる配列番号３７  ＡＮＤゲート
エンドドメインとしてＰＴＰＮ６を用いる配列番号３８  ＡＮＤ  ＮＯＴゲート
ＬＡＩＲ１エンドドメインを用いる配列番号３９  ＡＮＤ  ＮＯＴゲート
ＣＤ１４８ホスファターゼとのＬＡＩＲ１およびＰＴＰＮ６  ＳＨ２融合体を用いる配列番号４０  ＡＮＤ  ＮＯＴゲート。
【化１５−１】
2019041775.tif 000031
【化１５−２】
2019041775.tif 000032
【化１６−１】
2019041775.tif 000033
【化１６−２】
2019041775.tif 000034
【化１６−３】
2019041775.tif 000035
【化１６−４】
2019041775.tif 000036
【化１７−１】
2019041775.tif 000037
【化１７−２】
2019041775.tif 000038
【化１７−３】
2019041775.tif 000039
【化１８−１】
2019041775.tif 000040
【化１８−２】
2019041775.tif 000041
【化１９−１】
2019041775.tif 000042
【化１９−２】
2019041775.tif 000043
【化１９−３】
2019041775.tif 000044
【化２０−１】
2019041775.tif 000045
【化２０−２】
2019041775.tif 000046
【化２０−３】
2019041775.tif 000047
【０１８４】
該核酸配列は、配列番号３５、３６、３７、３８、３９または４０によりコードされるものと同じアミノ酸配列をコードし得るが、遺伝コードの縮重故に、異なる核酸配列を有し得る。該核酸配列は、それが本発明の第１の実施態様に定義した第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードするかぎり、配列番号３５、３６、３７、３８、３９または４０に示された配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の同一性を有し得る。
【０１８５】
ベクター
本発明はまた、１つまたはそれより多くのＣＡＲエンコード核酸配列（複数も可）を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。かかるベクターは、宿主細胞へ核酸配列（複数も可）を導入するのに使用され得、それにより、その宿主細胞が第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを発現する。
【０１８６】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンに基づくベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０１８７】
本ベクターは、Ｔ細胞に対しトランスフェクションまたは形質導入を行うことができるものであればよい。
【０１８８】
医薬組成物
本発明はまた、本発明の第１の実施態様によるＴ細胞またはＮＫ細胞などの複数のＣＡＲ発現細胞を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、所望により１種またはそれより多くのさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含んでいてもよい。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であり得る。
【０１８９】
処置方法
本発明のＴ細胞は、がん細胞などの標的細胞を殺すことができるものであればよい。標的細胞は、抗原発現の特定パターン、例えば抗原Ａ  ＡＮＤ  抗原Ｂの発現；抗原Ａ  ＯＲ  抗原Ｂの発現；または抗原Ａ  ＡＮＤ  ＮＯＴ  抗原Ｂの発現またはこれらのゲートの複合的反復により認識可能であり得る。
【０１９０】
本発明のＴ細胞は、ウイルス感染症などの感染症の処置に使用され得る。
【０１９１】
本発明のＴ細胞はまた、例えば自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片対宿主拒絶における、病的免疫応答の制御に使用され得る。
【０１９２】
本発明のＴ細胞は、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮体がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がんおよび甲状腺がんなどのがん性疾患の処置に使用され得る。
【０１９３】
それは、良好な選択的単一標的の利用可能性が限定される固形腫瘍の処置に特に適している。
【０１９４】
本発明のＴ細胞は、舌、口および咽頭のがんを含む口腔および咽頭のがん；食道がん、胃がんおよび結腸直腸がんを含む消化器系のがん；肝細胞癌および胆管癌を含む肝臓および胆道系のがん；気管支原性がんおよび喉頭のがんを含む呼吸器系のがん；骨肉腫を含む骨および関節のがん；メラノーマを含む皮膚のがん；乳がん；女性における子宮がん、卵巣がんおよび子宮頸がん、男性における前立腺がんおよび精巣がんを含む生殖器のがん；腎細胞癌および尿管（ｕｔｔｅｒｅｒ）もしくは膀胱の移行上皮癌を含む腎臓系（ｒｅｎａｌ  ｔｒａｃｔ）のがん；神経膠腫、多形神経膠芽腫および髄芽腫（ｍｅｄｕｌｌｏｂａｓｔｏｍａ）を含む脳がん；甲状腺がん、副腎癌および多発性内分泌腫瘍症候群に随伴するがんを含む内分泌系のがん；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；多発性骨髄腫および形質細胞腫；急性および慢性の両方の、骨髄性またはリンパ性の白血病；ならびに神経芽細胞腫を含む他の部位および非特定部位のがんを処置するのに使用され得る。
【０１９５】
本発明のＴ細胞による処置は、標準的手法で起こることが多い腫瘍細胞のエスケープまたは放出を防止するのを助け得る。
【０１９６】
以下、実施例により本発明をさらに記載するが、これは、本発明を実施する上で当業者を助ける役割を果たすことを意味するもので、本発明の範囲をいかなる意味にせよ限定する意図はない。
【実施例】
【０１９７】
実施例１−標的細胞集団の作製
本発明の原理を証明する目的で、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３３に基づく受容体を任意選択した。レトロウイルスベクターを用いて、ＣＤ１９およびＣＤ３３をクローン化した。これらのタンパク質の先端を切除した結果、それらはシグナルを発さず、長期間にわたって安定して発現させることができた。次に、これらのベクターを用いて、ＳｕｐＴ１細胞系に対し単独に、または二重に形質導入を行い、両抗原に陰性の細胞（野生型）、どちらか一方に陽性の細胞および両方に陽性の細胞を確立した。発現データを図３に示す。
【０１９８】
実施例２−ＯＲゲートの設計および機能
ＯＲゲートを構築するため、ＣＤ１９およびＣＤ３３を認識する１対の受容体を共発現させた。異なるスペーサーを用いることにより、交差対合を防止した。両受容体とも、表面安定性を改善するためのＣＤ２８由来の膜貫通ドメインおよび単純な活性化シグナルを提供するためのＣＤ３−ゼータのものから誘導されたエンドドメインを有していた。かくして、１対の独立した第一世代ＣＡＲを共発現させた。配列を共発現させるのに使用されたレトロウイルスベクターカセットは、口蹄疫２Ａ（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ２Ａ）自己切断性ペプチドを利用することにより、両受容体の１：１共発現を可能にした。カセット設計を図４に、タンパク質構造を図５に示す。相同性領域のヌクレオチド配列をコドンゆらぎ状態としてレトロウイルスベクター逆転写の間の組換えを防止した。
【０１９９】
実施例３−ＯＲゲートの試験
両ＣＡＲの発現を、Ｆｃに融合させた同種抗原で染色することによりＴ細胞表面上で試験した。異なる種（ＣＤ１９にはマウスおよびＣＤ３３にはウサギ）のＦｃドメインを用いることにより、両ＣＡＲの共発現を、異なるフルオロフォアでコンジュゲートした異なる２次抗体で染色することにより細胞表面上で決定した。これを図６に示す。
【０２００】
次いで、マウスＴ細胞系ＢＷ５１４７を用いて機能試験を実施した。この細胞系は、活性化の際にＩＬ−２を放出するため、単純な定量的読出しが可能となる。これらのＴ細胞を、漸増量の上記人工標的細胞と共培養した。Ｔ細胞は、ＥＬＩＳＡにより測定されたＩＬ−２放出により示されるとおり、いずれかの抗原を発現する標的細胞に応答した。両ＣＡＲとも、細胞表面上で発現されることが示され、Ｔ細胞は一方または両方の抗原に応答することが示された。これらのデータを図７に示す。
【０２０１】
実施例４−ＡＮＤゲートの設計および機能
ＡＮＤゲートでは、単純な活性化受容体を、基本的には活性を阻害するが、一旦受容体がライゲーションされると、その阻害が止められてしまう受容体と組み合わせる。これは、短い／嵩高くないＣＤ８ストークスペーサーおよびＣＤ３−ゼータエンドドメインをもつ標準的第一世代ＣＡＲを、そのエンドドメインがＣＤ１４８エンドドメインまたはＣＤ４５エンドドメインのいずれかを含む嵩高いＦｃスペーサーをもつ第２の受容体と組み合わせることにより達成された。両受容体がライゲーションされたとき、スペーサー寸法の差異により、異なる膜区画において異なる受容体が単離され、ＣＤ３−ゼータ受容体をＣＤ１４８またはＣＤ４５エンドドメインによる阻害から解放させる。かくして、一旦両受容体が活性化されると、活性化のみが起こる。ＣＤ１４８およびＣＤ４５は、本来この様式で機能するため、それらをこのために選択した：例えば、非常に嵩高いＣＤ４５エクトドメインは、免疫学的シナプスから受容体全体を排除する。発現カセットを図８に、後続のタンパク質を図９に示す。
【０２０２】
異なる特異性についての表面染色は、両受容体対が、図１０に示されたように細胞表面で有効に発現され得ることを示した。ＢＷ５１４７における機能は、両抗原の存在下ではＴ細胞が活性化されるだけであることを示す（図１１）。
【０２０３】
実施例５：ＡＮＤゲートの一般化可能性の実証
観察結果がＣＤ１９／ＣＤ３３および使用されていたそれらのバインダーのいくらかの特異的な特徴の発現ではなかったことを確証するため、ここでは、活性化（ＩＴＡＭ）シグナルがＣＤ１９ではなくＣＤ３３の認識の際に伝達され、また阻害性（ＣＤ１４８）シグナルがＣＤ３３ではなくＣＤ１９の認識の際に伝達されるように、２つの標的化ｓｃＦｖを交換した。ＣＤ４５エンドドメインおよびＣＤ１４８エンドドメインは、機能的に類似していると考えられるため、ＣＤ１４８エンドドメインを伴うＡＮＤゲートに実験を制限した。これにより、当然機能的ＡＮＤゲートが依然としてもたらされる。新しい論理ゲートを発現するＴ細胞を、ＣＤ１９またはＣＤ３３のいずれか一方または両方を担持する標的でチャレンジした。Ｔ細胞は、ＣＤ１９およびＣＤ３３の両方を発現する標的に応答したが、これらの抗原の一方のみを発現するかまたはどちらも発現しない標的には応答しなかった。これは、ＡＮＤゲートが依然としてこのフォーマットで機能性であることを示す（図１８Ｂ）。
【０２０４】
同じ系において、本発明者らのＡＮＤゲートがいかに一般化可能であるかを確立しようと努めた：ＡＮＤゲートは、種々の標的全体にわたって一般化可能であるべきである。相対的抗原密度、同種ｓｃＦｖ結合速度論およびｓｃＦｖ結合エピトープの正確な距離が与えられたゲートの忠実度は多かれ少なかれあり得るが、広範なセットの標的およびバインダーをもついくらかのＡＮＤゲート発現を見出すことが予想される。これを試験するため、３つの追加的ＡＮＤゲートを生成した。今回もまた、ＡＮＤゲートのＣＤ１４８バージョンに実験を制限した。元のＣＤ１４８  ＡＮＤゲートからの第２のｓｃＦｖを、抗ＧＤ２  ｓｃＦｖ  ｈｕＫ６６６（配列番号４１および配列番号４２）、または抗ＣＤ５  ｓｃＦｖ（配列番号４３および配列番号４４）、または抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖ  ＭＲ１．１（配列番号４５および配列番号４６）で置き換えて、以下のＣＡＲ  ＡＮＤゲート：ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＧＤ２；ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＣＤ５；ＣＤ１９  ＡＮＤ  ＥＧＦＲｖＩＩＩを生成した。また、以下の人工抗原発現細胞系が生成された：ＳｕｐＴ１、および本発明者らのＳｕｐＴ１．ＣＤ１９をＧＭ３およびＧＤ２シンターゼで形質導入することにより、ＳｕｐＴ１．ＧＤ２およびＳｕｐＴ１．ＣＤ１９．ＧＤ２が生成された。ＳｕｐＴ１およびＳｕｐＴ１．ＣＤ１９を、ＥＧＦＲｖＩＩＩをコードするレトロウイルスベクターで形質導入することにより、ＳｕｐＴ１．ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＳｕｐＴ１．ＣＤ１９．ＥＧＦＲｖＩＩＩが生成された。ＣＤ５はＳｕｐＴ１細胞で発現されるため、異なる細胞系を用いて標的細胞を生成させた：ＣＤ１９単独、ＣＤ５単独およびＣＤ５およびＣＤ１９の両方を合わせて発現する２９３Ｔ細胞を生成させた。発現をフローサイトメトリーにより確認した（図１９）。３つの新たなＣＡＲ  ＡＮＤゲートを発現するＴ細胞を、ＳｕｐＴ１．ＣＤ１９およびそれぞれ同種のダブル陽性およびシングル陽性標的細胞でチャレンジした。３つのＡＮＤゲートは全て、シングル陽性標的との比較におけるダブル陽性細胞系による活性化の低減を証明した（図２０）。これは、任意標的および同種バインダーに対するＡＮＤゲート設計の一般化可能性を実証する。
【０２０５】
実施例６：ＣＡＲ  ＡＮＤゲートの動力学的分離モデルの実験的証明
この目的は、異なるスペーサーにより誘発される特異的分離が、これらの論理ＣＡＲゲートを生成する能力の背後の中心機構であることを証明することであった。このモデルは、活性化ＣＡＲのみがライゲーションされれば、強力な阻害性「ライゲーション・オフ」型ＣＡＲが膜において溶解状態であり、活性化ＣＡＲを阻害することができるということである。一旦両ＣＡＲがライゲーションされると、両ＣＡＲスペーサーが十分に異なれば、それらはシナプス内で分離し、共局在することはない。このため、重要な必要条件は、スペーサーが十分に異なることである。このモデルが正しければ、両スペーサーが、両受容体がライゲーションされたとき、共局在するほど十分に類似していれば、ゲートは、機能し得ない。これを試験するため、元のＣＡＲにおける「嵩高い」Ｆｃスペーサーを、本発明者らはネズミＣＤ８スペーサーで置き換えた。これがヒトＣＤ８と類似した長さ、かさおよび電荷を有するが、当然それと交差対合するものではないことが予測された。このため、新しいゲートは、ＣＤ１９を認識し、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよび活性化エンドドメインを有する第１のＣＡＲ；同時に、ＣＤ３３を認識し、マウスＣＤ８ストークスペーサーおよびＣＤ１４８エンドドメインを有する第２のＣＡＲを有した（図１８Ｃ）。Ｔ細胞に対し、この新しいＣＡＲゲートを発現するように形質導入した。次いで、これらのＴ細胞を、ＣＤ１９単独、ＣＤ３３単独またはＣＤ１９およびＣＤ３３の両方を発現するＳｕｐＴ１細胞でチャレンジした。Ｔ細胞は、元のＡＮＤゲートのとおりにいずれかの抗原のみを発現するＳｕｐＴ１細胞には応答しなかった。しかしながら、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、両抗原を発現するＳｕｐＴ１細胞には応答し得なかったことから、このモデルが確認された（図１８Ｃ）。機能的ＡＮＤゲートは、両ＣＡＲが免疫学的シナプス内で共局在することがないようにそれらが十分に異なるスペーサーを有することを要求する（図２３ＡおよびＢ）。
【０２０６】
実施例７−ＡＮＤ  ＮＯＴゲートの設計および機能
ＣＤ４５およびＣＤ１４８などのホスファターゼは、非常に強力であるため、免疫学的シナプスに少量入っただけでも、ＩＴＡＭ活性化を阻害することができる。これは、論理ＡＮＤゲートの阻害の基礎である。他のクラスのホスファターゼ、例えばＰＴＰＮ６および関連ホスファターゼは、それほど強力ではない。少量のＰＴＰＮ６が拡散によりシナプスに入っても活性化を阻害することはないと予測された。加えて、阻害性ＣＡＲが活性化ＣＡＲと十分に類似したスペーサーを有するならば、両ＣＡＲがライゲーションされると、シナプス内で共局在することができると予測された。この場合、大量の阻害性エンドドメインであれば、両抗原が存在するときＩＴＡＭが活性化するのを止めるのに十分である。かくして、ＡＮＤ  ＮＯＴゲートを作製することができた。
【０２０７】
ＮＯＴ  ＡＮＤゲートの場合、第２のシグナルは、活性化を「拒否する（ｖｅｔｏ）」必要がある。これは、阻害性シグナルを免疫学的シナプスにもたらすことにより、例えばＰＴＰＮ６などの酵素ホスファターゼをもたらすことにより行われる。このため、本発明者らは、最初のＡＮＤ  ＮＯＴゲートを以下の通り生成した：２つのＣＡＲを共発現させ、それにより、第１のＣＡＲはヒトＣＤ８ストークスペーサーおよび活性化エンドドメインを有してＣＤ１９を認識し；マウスＣＤ８ストークスペーサーおよびＰＴＰＮ６の触媒ドメインを含むエンドドメインを伴う抗ＣＤ３３  ＣＡＲと共発現させる（配列番号３８、図１３ＡとＢ）。好適なカセットを図１２に示し、予備的機能データを図１４に示す。
【０２０８】
加えて、ＡＮＤ  ＮＯＴゲートを生成するための代替的戦略を開発した。免疫チロシナーゼ阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）は、ホスファターゼが集合および排除されるとＩＴＩＭがｌｃｋによりリン酸化されるという点で、ＩＴＡＭと類似した様式で活性化される。ＺＡＰ７０と結合することにより活性化を誘発する代わりに、リン酸化ＩＴＩＭは、それらの同種ＳＨ２ドメインを通してＰＴＰＮ６などのホスファターゼをリクルートする。ＩＴＩＭは、活性化ＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲ上のスペーサーが共局在し得る限り、阻害性エンドドメインとして機能することができる。この構築物を生成するため、ＡＮＤ  ＮＯＴゲートを以下の通り生成した：２つのＣＡＲを共発現させた−第１のＣＡＲは、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよび活性化エンドドメインを有してＣＤ１９を認識し；マウスＣＤ８ストークスペーサーおよびＬＡＩＲ１のものに由来するＩＴＩＭ含有エンドドメインを有する抗ＣＤ３３  ＣＡＲと共発現させる（配列番号３９、図１３ＡおよびＣ）。
【０２０９】
また、さらなるより複合的なＡＮＤ  ＮＯＴゲートを開発し、それによると、ＩＴＩＭは、追加的キメラタンパク質：ＰＴＰＮ６のＳＨ２ドメインおよびＣＤ１４８のエンドドメインの細胞内融合体の存在により高められる。この設計では、３つのタンパク質が発現される−第１のタンパク質は、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよび活性化エンドドメインを有してＣＤ１９を認識し；マウスＣＤ８ストークスペーサーおよびＬＡＩＲ１のものに由来するＩＴＩＭ含有エンドドメインを有する抗ＣＤ３３  ＣＡＲと共発現させる。さらなる２Ａペプチドは、ＰＴＰＮ６−ＣＤ１４８融合体の共発現を可能にする（配列番号４０、図１３ＡおよびＤ）。これらのＡＮＤ  ＮＯＴゲートは、異なる範囲の阻害：ＰＴＰＮ６−ＣＤ１４８＞ＰＴＰＮ６＞＞ＩＴＩＭを有すると予測された。
【０２１０】
これらのゲートでＴ細胞の形質導入を行い、ＣＤ１９またはＣＤ３３のいずれか一方、またはＣＤ１９およびＣＤ３３の両方を一緒に発現する標的でチャレンジした。３つのゲートは全て、ＣＤ１９のみを発現する標的に応答したが、ＣＤ１９およびＣＤ３３の両方を一緒に発現する標的には応答しなかった（図２１）ことから、３つのＡＮＤ  ＮＯＴゲートは全て機能的であることが確認された。
【０２１１】
実施例８：ＰＴＰＮ６に基づくＡＮＤ  ＮＯＴゲートの動力学的分離モデルの実験的証明
ＡＮＤ  ＮＯＴゲートのモデルは、両ＣＡＲで使用されるスペーサーの性質が、ゲートの正確な機能にとって重要であるという事実を軸として展開する。ＰＴＰＮ６を伴う機能的ＡＮＤ  ＮＯＴゲートでは、両ＣＡＲスペーサーは十分に類似しており、両ＣＡＲがライゲーションされたとき、両方がシナプス内で共局在し、高濃度であるため弱いＰＴＰＮ６でさえ活性化を阻害するのに十分である。スペーサーが異なったならば、シナプスにおける分離は、活性化を可能にするＩＴＡＭからＰＴＰＮ６を離すことになり、ＡＮＤ  ＮＯＴゲートを破壊する。これを試験するため、ネズミＣＤ８ストークスペーサーをＦｃのそれで置き換えて対照を生成した。この場合、試験ゲートは２つのＣＡＲで構成された。第１のＣＡＲは、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよびＩＴＡＭエンドドメインを有してＣＤ１９を認識し；一方、第２のＣＡＲは、ＦｃスペーサーおよびＰＴＰＮ６からのホスファターゼを含むエンドドメインを有してＣＤ３３を認識する。このゲートは、ＣＤ１９に応答して活性化するが、同じくＣＤ１９およびＣＤ３３の両方に応答して活性化する（図２２Ｂ、この図では、このゲートの機能を、元のＡＮＤ  ＮＯＴゲートおよび実施例６に記載の対照ＡＮＤゲート変異型の機能と比較する）。この実験データは、ＰＴＰＮ６を伴う機能的ＡＮＤ  ＮＯＴゲートの場合、共局在するスペーサーが必要とされるモデルを証明している。
【０２１２】
実施例９：ＩＴＩＭに基づくＡＮＤ  ＮＯＴゲートの動力学的分離モデルの実験的証明
ＰＴＰＮ６に基づくＡＮＤ  ＮＯＴゲートと同様に、ＩＴＩＭに基づくゲートもまた、ＡＮＤ  ＮＯＴゲートとして機能するために免疫学的シナプスにおける共局在を要求する。この仮説を証明するため、対照ＩＴＩＭに基づくゲートを以下の通り生成した：２つのＣＡＲを共発現させた−第１のＣＡＲは、ヒトＣＤ８ストークスペーサーおよび活性化エンドドメインを有してＣＤ１９を認識し；ＦｃスペーサーおよびＬＡＩＲ１のものに由来するＩＴＩＭ含有エンドドメインを有する抗ＣＤ３３  ＣＡＲと共発現させる。このゲートの活性を、元のＩＴＩＭに基づくＡＮＤ  ＮＯＴゲートの活性と比較した。この場合、改変されたゲートは、ＣＤ１９を発現する標的に応答して活性化したが、同じくＣＤ１９およびＣＤ３３の両方を発現する細胞に応答して活性化した。これらのデータは、ＩＴＩＭに基づくＡＮＤ  ＮＯＴゲートが動力学的分離に基づくモデルに従うこと、および機能ゲートを作製するためには正確なスペーサーが選択されなければならないことを示す（図２３Ｂ）。
【０２１３】
実施例１０：動力学的分離により生成されたＣＡＲ論理ゲートのモデルの概要
現時点での動力学的分離モデルについての理解および本明細書記載の実験データに基づき、２−ＣＡＲゲートについてのモデルの概要を図２４に提示する。この図は、それぞれ異なる抗原を認識する、２つのＣＡＲを発現する細胞を示す。一方または両方のＣＡＲが細胞上の標的抗原を認識すると、シナプスが形成され、もともとあったＣＤ４５およびＣＤ１４８は、それらのエクトドメインがかさ高い故にシナプスから排除される。これがＴ細胞活性化のためのステージを設定する。標的細胞が唯一の同種抗原をもつ場合、同種ＣＡＲがライゲーションされ、同種ＣＡＲはシナプスへと分離する。ライゲーションされていないＣＡＲはＴ細胞膜上で溶解状態のままであるため、シナプスの内外へと拡散することができ、その結果、低濃度のライゲーションされていないＣＡＲを伴う高局所濃度のライゲーションされたＣＡＲの領域が形成する。この場合、ライゲーションされたＣＡＲがＩＴＡＭを有し、ライゲーションされていないＣＡＲが、「ライゲーション・オフ」型阻害性エンドドメイン、例えばＣＤ１４８のそれを有するならば、ライゲーションされていないＣＡＲの量は、活性化を阻害するのに十分であり、ゲートはオフである。対照的に、この場合、ライゲーションされたＣＡＲがＩＴＡＭを有し、ライゲーションされていないＣＡＲが、ＰＴＰＮ６などの「ライゲーション・オン」型阻害性エンドドメインを有するならば、ライゲーションされていないＣＡＲの量は、阻害するには不十分であり、ゲートはオンである。両同種抗原をもつ標的細胞によりチャレンジされると、両同種ＣＡＲがライゲーションされ、免疫学的シナプスの一部を形成する。重要なことに、ＣＡＲスペーサーが十分に類似しているならば、両ＣＡＲはシナプスに共局在するが、ＣＡＲスペーサーが十分に異なるならば、両ＣＡＲはシナプス内で分離する。この後者の場合、一方のＣＡＲは高濃度で存在するが、他方のＣＡＲは存在しない膜の領域が形成される。この場合、分離は完全であるため、阻害性エンドドメインが「ライゲーション・オフ」型であるとしても、ゲートはオンである。前者の場合、両ＣＡＲが高濃度で共に混ざった膜の領域が形成される。この場合、両エンドドメインが濃縮されるため、阻害性エンドドメインが「ライゲーション・オン」型であるとしても、ゲートはオフである。スペーサーおよびエンドドメインの正しい組み合わせを選択することにより、論理をＣＡＲ  Ｔ細胞にプログラム化することができる。
【０２１４】
上記の本発明者らの作業に基づき、本発明者らは、論理ゲートＣＡＲの生成を可能にする一連の設計規則を確立した（図３１で概説）。「抗原Ａ  ＯＲ  抗原Ｂ」ゲートＣＡＲ
Ｔ細胞を生成するため、（１）各ＣＡＲが、ＣＡＲが機能するように単に抗原接近およびシナプス形成を可能にするスペーサーを有し、そして（２）各ＣＡＲが活性化エンドドメインを有するように、抗Ａおよび抗ＢのＣＡＲを生成しなければならない。「抗原Ａ  ＡＮＤ  ＮＯＴ  Ｂ」ゲートＣＡＲ  Ｔ細胞を生成するため、（１）両ＣＡＲが、交差対合することはないが、標的細胞上で両同種抗原を認識したとき、ＣＡＲを共分離させるようにするスペーサーを有し、そして（２）一方のＣＡＲが活性化エンドドメインを有し、同時に、他方のＣＡＲが弱いホスファターゼ（例えば、ＰＴＰＮ６）を含むかまたはリクルートするエンドドメインを有するように、抗Ａおよび抗ＢのＣＡＲを生成しなければならない。（３）「抗原Ａ  ＡＮＤ  抗原Ｂ」ゲートＣＡＲ  Ｔ細胞を生成するため、（１）両ＣＡＲが標的細胞上で両同種抗原を認識したとき、両ＣＡＲが共分離することのないように、一方のＣＡＲが他方のＣＡＲとは十分に異なるスペーサーを有し、（２）一方のＣＡＲが活性化エンドドメインを有し、他方のＣＡＲが、強力なホスファターゼ（例えば、ＣＤ４５またはＣＤ１４８のもの）を含むエンドドメインを有するように、抗Ａおよび抗ＢのＣＡＲを生成しなければならない。所望の効果を達成するための正確なスペーサーは、既知サイズ／形状などをもつスペーサーのセットから、ならびに標的抗原のサイズ／形状など（例えば図３０参照）および標的抗原上の同種エピトープの場所を考慮に入れて選択され得る。
【化２１−１】
2019041775.tif 000048
【化２１−２】
2019041775.tif 000049
【化２２−１】
2019041775.tif 000050
【化２２−２】
2019041775.tif 000051
【化２３】
2019041775.tif 000052
【化２４−１】
2019041775.tif 000053
【化２４−２】
2019041775.tif 000054
【化２４−３】
2019041775.tif 000055
【化２５】
2019041775.tif 000056
【化２６−１】
2019041775.tif 000057
【化２６−２】
2019041775.tif 000058
【０２１５】
実施例１１：ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲの設計および構築
ＡＰＲＩＬの天然形態は、分泌ＩＩ型タンパク質である。ＣＡＲのためのＢＣＭＡ結合ドメインとしてのＡＰＲＩＬの使用は、このＩＩ型分泌タンパク質のＩ型膜結合タンパク質への変換を必要とし、このタンパク質が安定しており、この形態でＢＣＭＡへの結合性を保持するためにも必要である。候補分子を生成するため、ＡＰＲＩＬのアミノ末端先端部を欠失させて、プロテオグリカンへの結合性を除去した。次に、シグナルペプチドを付加することにより、新生タンパク質を小胞体、およびそれゆえ細胞表面へと向かわせた。また、使用されるスペーサーの性質は、ＣＡＲの機能を変更することができるため、３つの異なるスペーサードメインを試験した：（ｉ）Ｆｃ結合モチーフを除去するように改変されたヒトＩｇＧ１スペーサー；（ｉｉ）ＣＤ８ストーク；および（ｉｉｉ）ＩｇＧ１ヒンジ単独を含む、ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが生成された（図２５におけるカートゥーンおよび図２６におけるアミノ酸配列）。これらのＣＡＲは、マーカータンパク質−先端切除ＣＤ３４が好都合なマーカー遺伝子として共発現され得るようにバイシストロニックレトロウイルスベクターで発現された（図２７Ａ）。
【０２１６】
実施例１２：ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲの発現および機能
この研究の目的は、構築されたＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが細胞表面で発現されるかどうか、およびＡＰＲＩＬが折り畳まれて天然タンパク質を形成するかどうかを試験することであった。Ｔ細胞を、これらの異なるＣＡＲ構築物で形質導入し、マーカー遺伝子についての染色と一緒に、市販されている抗ＡＰＲＩＬ  ｍＡｂを用いて染色し、フローサイトメトリーにより分析した。この実験の結果を、ＡＰＲＩＬ結合性がマーカー遺伝子の蛍光に対してプロットしている図２７Ｂに示す。これらのデータは、このフォーマットで、ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが細胞表面で発現され、ＡＰＲＩＬが抗ＡＰＲＩＬ  ｍＡｂにより認識されるほど十分に折り畳まれていることを示す。
【０２１７】
次に、このフォーマットのＡＰＲＩＬがＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを認識できるかどうかを決定した。組換えＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを、マウスＩｇＧ２ａ−Ｆｃとの融合体として生成した。これらの組換えタンパク質を、形質導入したＴ細胞とインキュベーションした。この後、細胞を洗浄し、抗マウスフルオロフォアコンジュゲート抗体および異なるフルオロフォアにコンジュゲートしたマーカー遺伝子を検出するための抗体で染色した。細胞をフローサイトメトリーにより分析し、結果を図２７Ｃに提示する。種々のＣＡＲは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの両方と結合することができた。驚くべきことに、ＣＡＲは、ＴＡＣＩよりもＢＣＭＡと良好に結合することができた。また、驚くべきことに、ＣＤ８ストークまたはＩｇＧ１ヒンジスペーサーをもつＣＡＲは、ＦｃスペーサーをもつＣＡＲよりＢＣＭＡおよびＴＡＣＩと良好に結合することができた。
【０２１８】
実施例１３：ＡＰＲＩＬに基づくキメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡ発現細胞に対して活性である
正常ドナーからのＴ細胞を、種々のＡＰＲＩＬ  ＣＡＲで形質導入し、野生型、またはＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞のどちらかに対して試験した。幾つかの異なるアッセイを使用して、機能を決定した。古典的クロム放出アッセイを実施した。ここでは、標的細胞（ＳｕｐＴ１細胞）を、５１Ｃｒで標識し、異なる比率でエフェクター（形質導入Ｔ細胞）と混合した。共培養上清中の５１Ｃｒを数えることにより、標的細胞の溶解を決定した（図２８Ａは、累積データを示す）。
【０２１９】
加えて、ＳｕｐＴ１細胞と１：１で培養したＴ細胞からの上清を、インターフェロン−ガンマについてＥＬＩＳＡによりアッセイした（図２８Ｂは累積データを示す）。また、１週間のＳｕｐＴ１細胞との共培養後のＴ細胞拡大の測定を実施した（図２８Ｃ）。Ｔ細胞を、カウントビーズで較正したフローサイトメトリーにより計数した。これらの実験データは、ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが、ＢＣＭＡ発現標的を殺すことができることを示す。さらに、これらのデータは、ＣＤ８ストークまたはＩｇＧ１ヒンジに基づくＣＡＲが、Ｆｃ−ｐｖａａに基づくＣＡＲよりも良好に動作したことを示す。
【０２２０】
実施例１４；初代細胞におけるＡＮＤゲートの機能分析
ＰＢＭＣを血液から単離し、ＰＨＡおよびＩＬ−２を用いて刺激した。２日後、細胞を、レトロネクチン被覆プレート上でＣＤ１９：ＣＤ３３  ＡＮＤゲート構築物を含むレトロウイルスにより形質導入した。５日目、ＡＮＤゲート構築物により翻訳された２つのＣＡＲの発現レベルを、フローサイトメトリーにより評価し、細胞からＣＤ５６＋細胞（主としてＮＫ細胞）を枯渇させた。６日目、ＰＢＭＣを、１：２のエフェクター対標的細胞比で標的細胞との共培養物に入れた。８日目、上清を集め、ＩＦＮ−ガンマ分泌についてＥＬＩＳＡにより分析した（図２９）。
【０２２１】
これらのデータは、ＡＮＤゲートが初代細胞において機能することを実証する。
【０２２２】
上記の明細書で挙げた出版物は全て、参照により本明細書に援用する。本発明の記載された方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載したが、請求されている本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、分子生物学、細胞生物学または関連分野における専門家にとって明白な、本発明を実施するために記載された方法の様々な修飾も以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【図１】
2019041775.tif 000059
【図２】
2019041775.tif 000060
【図３】
2019041775.tif 000061
【図４】
2019041775.tif 000062
【図５】
2019041775.tif 000063
【図６】
2019041775.tif 000064
【図７】
2019041775.tif 000065
【図８】
2019041775.tif 000066
【図９】
2019041775.tif 000067
【図１０】
2019041775.tif 000068
【図１１】
2019041775.tif 000069
【図１２】
2019041775.tif 000070
【図１３】
2019041775.tif 000071
【図１４】
2019041775.tif 000072
【図１５】
2019041775.tif 000073
【図１６】
2019041775.tif 000074
【図１７】
2019041775.tif 000075
【図１８】
2019041775.tif 000076
【図１９】
2019041775.tif 000077
【図２０】
2019041775.tif 000078
【図２１】
2019041775.tif 000079
【図２２】
2019041775.tif 000080
【図２３】
2019041775.tif 000081
【図２４Ａ】
2019041775.tif 000082
【図２４Ｂ】
2019041775.tif 000083
【図２５】
2019041775.tif 000084
【図２６】
2019041775.tif 000085
【図２７】
2019041775.tif 000086
【図２８】
2019041775.tif 000087
【図２９】
2019041775.tif 000088
【図３０】
2019041775.tif 000089
【図３１】
2019041775.tif 000090
【配列表】
2019041775000001.app
【外国語明細書】
2019041775000001.pdf