(57)【要約】【課題】免疫組織染色に適した抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の提供。【解決手段】免疫染色用に処理されたがん組織のヒトＣＤ２６及び免疫染色用に処理された正常組織のヒトＣＤ２６の両者に結合する抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫染色用に処理されたがん組織のヒトＣＤ２６及び免疫染色用に処理された正常組織のヒトＣＤ２６の両者に結合する抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項２】
重鎖ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号４若しくは配列番号７で示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号５若しくは配列番号８で示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号６若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項１記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項３】
重鎖ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号４又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号５又は配列番号８で示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号６又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる請求項１記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項４】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１８として寄託されたハイブリドーマ又は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１９として寄託されたハイブリドーマによって産生される請求項１又は３記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含有するヒトＣＤ２６免疫染色用組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を使用することを特徴とする、固定組織標本中のヒトＣＤ２６免疫染色方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変性ヒトＣＤ２６への結合親和性が極めて高い性質を有する、免疫染色に有用な抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ２６はヒト末梢血リンパ球ではメモリーＴ細胞上に強く発現している。静止期にあるヒトＴ細胞上のＣＤ２６の発現をフローサイトメトリーで検討すると、その発現強度は３相性のパターンを示し、ＣＤ２６を高発現する集団（ＣＤ２６high又はＣＤ２６brightという）と、ＣＤ２６を中程度に発現する集団（ＣＤ２６int又はＣＤ２６intermediateという）と、ＣＤ２６を発現しない集団（ＣＤ２６negativeという）との３つの集団に分けることができる。ここで、ＣＤ２６highの集団が免疫応答において特に重要な役割を果たしていると考えられている。ＣＤ２６highの集団はＣＤ４５ＲＯを発現するメモリーＴ細胞に属し、破傷風トキソイドのようなメモリー抗原に反応するほか、Ｂ細胞の抗体産性を誘導し、ＭＨＣクラスＩ特異的なキラーＴ細胞の誘導活性をも有する。ＣＤ２６陽性Ｔ細胞はＩＬ−２、ＩＦＮ−γ等のサイトカインを分泌するＴH１型の細胞である。この細胞は血管内皮細胞間の遊走能を有し、炎症部位への移動、集積を起こし、炎症局所で重要な役割を果たしていると考えられている。
【０００３】
また、本発明者らは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞においても、ＣＤ２６共刺激によって細胞障害活性が制御されていることを発見した。さらに、本発明者らは、ヒト末梢血単核球をＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒγnullマウス（ＮＯＧマウス）に移植して異種ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）を発症するモデルを用いて、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体によるＴ細胞の活性化制御が、ＧＶＨＤの予防や治療に極めて有効であることを発見した（非特許文献１）。ＣＤ２６は、様々ながん、例えば、悪性中皮腫、腎がん、大腸がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、Ｔ細胞性悪性リンパ腫、グリオーマ等にも発現している（非特許文献２）。ＣＤ２６陽性の消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、大腸がん、甲状腺がん、尿路上皮がん患者では予後が非常に悪いことも報告されている（非特許文献３）。また、ＣＤ２６は、悪性中皮腫、大腸がん、慢性骨髄性白血病等ではがん幹細胞のマーカーとも報告されている（非特許文献３）。
本発明者らは、悪性中皮腫、腎がん、悪性リンパ腫等においてＣＤ２６抗体が極めて有効な抗腫瘍効果を発揮することを報告し、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０を開発して、フランスにて、ＣＤ２６陽性悪性中皮腫及びその他のＣＤ２６陽性腫瘍をターゲットとした第I相臨床試験を行い、安全性が確認された（抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体療法）（特許文献１、非特許文献４）。その結果を踏まえ、現在、日本国内でもＣＤ２６陽性悪性中皮腫をターゲットとした第I／II相臨床試験を行っている。
【０００４】
近年、治療薬の有効性や副作用を予測するために、治療薬とセットで使われる診断薬（いわゆる「コンパニオン診断薬」ともいう）を、治療薬とともに早期から開発する動きが活発化している。コンパニオン診断薬は、標的分子の発現や変異の有無、薬剤代謝酵素の遺伝子多型等の診断に利用することができる。抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体を用いた治療に関しても、例えば、治療適用患者の選択や治療効果の追跡等のために、がん組織や免疫組織等におけるヒトＣＤ２６の発現の解析等を行うことが望ましい。かかる解析等を可能にする、免疫染色に用いることも可能な、抗ヒトＣＤ２６抗体の開発の必要性が存在する。
【０００５】
しかしながら、本発明者らがこれまでに開発したマウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体４Ｇ８、１Ｆ７、５Ｆ８、２Ｆ９、１６Ｄ４Ｂ、９Ｃ１１は、免疫染色に用いることはできない。
また、研究用試薬として市販されている抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体２３クローンを用いて免疫染色を検討したところ、ほとんどがホルマリン固定パラフィン包埋された病理組織中のヒトＣＤ２６を検出することができず、ＭＢＬ社のマウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体クローン４４−４（カタログ番号Ｄ０６８−１）で免疫染色を行っても、明瞭な染色性は示さず、染色される箇所のバラツキが大きいことから、信頼できるものではなかった。
一方、市販されている抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体５製品を用いて免疫染色を検討した結果、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ１１８０； http://www.rndsystems.com/Products/AF1180）及びＮｏｖｕｓ社のウサギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体（カタログ番号ＮＢ１００−５９０２１；http://www.novusbio.com/CD26-Antibody_NB100-59021.html）は、病理組織の臨床診断に耐え得る明瞭な染色性を示すことが判明した。しかしながら、これらの抗ヒトＣＤ２６抗体はポリクローナル抗体であるため、ロット差と安定供給性が一番の問題となる。すなわち、ポリクローナル抗体では、異なるロットの抗体で染色すると、染色強度や染色パターンに違いが生じるおそれがあることから、例えば安定した結果が常に必要とされる臨床診断薬に、ポリクローナル抗体を用いることは適切ではない。また、市販のポリクローナル抗体は突然製造中止になることがよくあり、その点からもポリクローナル抗体を臨床診断薬に用いることは適切ではない。
本発明者らは、免疫染色に使用可能な抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体としてクローン１９（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６４２）、クローン１８（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６４３）、クローン１６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６４４）の作製に成功し、特許出願した（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／１１４８７６号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０１６２６７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hatano R, Ohnuma K, Yamamoto J, Dang NH, Yamada T, Morimoto C (2013) Prevention of acute graft-versus-host disease by humanized anti-CD26 monoclonal antibody. Br J Haematol. 2013; 162: 263-277
【非特許文献２】Havre PA, Abe M, Urasaki Y, Ohnuma K, Morimoto C, Dang NH (2008) The role of CD26/dipeptidyl peptidase IV in cancer. Front Biosci. 2008; 13: 1634-1645.
【非特許文献３】Hatano R, Ohnuma K, Yamada T, Okamoto T, Komiya E, Otsuka H, Itoh T, Yamazaki H, Iwao N, Kaneko Y, Dang NH, Morimoto C. The use of the humanized anti-CD26 monoclonal antibody YS110 as a novel targeted therapy for refractory cancers and immune disorders. Advances in Medicine and Biology. 2018; Volume 129: Chapter 1: 1-44.
【非特許文献４】Angevin E, Isambert N, Trillet-Lenoir V, You B, Alexandre J, Zalcman G, Vielh P, Farace F, Valleix F, Podoll T, Kuramochi Y, Miyashita I, Hosono O, Dang NH, Ohnuma K, Yamada T, Kaneko Y, Morimoto C. First-in-Human phase 1 of YS110, a monoclonal antibody directed against CD26 in advanced CD26-expressing cancers. Br J Cancer. 2017; 116: 1126-1134.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記特許文献２記載のモノクローナル抗体を使用して免疫染色を行うべく、正常組織及びがん組織の固定組織標本を作製して免疫染色してきたところ、正常組織では十分な染色性が得られた一方で、がん組織ではがん細胞に非特異的な染色が見られることがあり、がん組織におけるヒトＣＤ２６発現の正確な臨床診断を行うには、さらに良好な染色性を示すモノクローナル抗体が必要であることが判明した。
従って、本発明の課題は、がんの病理組織の臨床診断に耐え得る明瞭な染色性を示す新たな抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者らは、さらに新たな抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を見出すべく、種々検討したところ、免疫染色用に処理されたがん組織のヒトＣＤ２６及び免疫染色用に処理された正常組織のヒトＣＤ２６の両者を明瞭に染色することができる抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の作製に成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。
【００１１】
〔１〕免疫染色用に処理されたがん組織のヒトＣＤ２６及び免疫染色用に処理された正常組織のヒトＣＤ２６の両者に結合する抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔２〕重鎖ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号４若しくは配列番号７で示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号５若しくは配列番号８で示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号６若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる〔１〕記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔３〕重鎖ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号４又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号５又は配列番号８で示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号６又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる〔１〕記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔４〕受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１８として寄託されたハイブリドーマ又は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１９として寄託されたハイブリドーマによって産生される〔１〕又は〔３〕記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含有するヒトＣＤ２６免疫染色用組成物。
〔６〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を使用することを特徴とする、固定組織標本中のヒトＣＤ２６免疫染色方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原性断片を用いれば、免疫染色用に処理されたがん組織のヒトＣＤ２６及び免疫染色用に処理された正常組織のヒトＣＤ２６の両者が明瞭に免疫染色でき、実際の病理組織（ホルマリン処理や、パラフィン包埋された固定組織標本）を臨床診断することができる。従って、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原性断片を用いれば、ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体の投与の適合性を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】本発明に用いたヒトＣＤ２６陽性／陰性がん細胞株の、ヒトＣＤ２６ｍＲＮＡ発現量を示す図である。ＣＤ２６を発現していない（ＣＤ２６陰性の）ヒト悪性胸膜中皮腫株ＭＳＴＯ（ＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ）に、ＣＤ２６を遺伝子導入したＭＳＴＯ−ＣＤ２６、及び、ＣＤ２６を発現している（ＣＤ２６陽性の）ヒト悪性胸膜中皮腫株ＪＭＮに、ｓｈＲＮＡを導入してＣＤ２６の発現をノックダウンしたＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈＲＮＡと、ＣＤ２６の発現には影響しない対照ｓｈＲＮＡを導入したＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡ、ＣＤ２６陰性のヒト肺がん株Ａ５４９、ＣＤ２６陰性のヒトＴ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ ｐａｒｅｎｔ）に、ＣＤ２６を遺伝子導入したＪｕｒｋａｔ−ＣＤ２６をそれぞれ溶解し、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した後、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。その後、ＣＤ２６の遺伝子配列に特異的なプライマーとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素の存在下でＰＣＲ反応を行い、蛍光強度から細胞ごとのＣＤ２６ｍＲＮＡ量の定量をした。図はそれぞれの細胞の、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）１に対するＣＤ２６の相対発現量の結果を示した。
【図１Ｂ】本発明に用いたヒトＣＤ２６陽性／陰性細胞株の、細胞膜上のヒトＣＤ２６タンパク質の発現を示す図である。ヒトＣＤ２６を発現している（ＣＤ２６陽性の）がん細胞株（ＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡ、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６）、及び、ヒトＣＤ２６を発現していない（ＣＤ２６陰性の）がん細胞株（ＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ、ＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈＲＮＡ、Ａ５４９、Ｊｕｒｋａｔ ｐａｒｅｎｔ）を市販のＰＥ標識抗ヒトＣＤ２６マウスＩｇＧ抗体、または、ＰＥ標識アイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ）抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した。横軸が各細胞のＰＥの蛍光強度を示しており、蛍光強度が高いほど、一つの細胞あたりにヒトＣＤ２６抗体がたくさん結合していることを意味する。縦軸はいずれも染色していない色素の蛍光強度を示している。
【図２Ａ】各ハイブリドーマクローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分、又はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社の精製抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体を用いた、細胞ブロックの免疫染色の結果を示す図である。ホルマリン固定パラフィン包埋した、ヒトＣＤ２６を発現しているがん細胞株（ＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈ）、及び、ヒトＣＤ２６を発現していないがん細胞株（ＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ、ＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈ、Ａ５４９）の各細胞ブロック標本に対して、精製抗体を用いて免疫染色を行った結果である。
【図２Ｂ】各ハイブリドーマクローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分を用いた、細胞ブロックの免疫染色（吸収試験）の結果を示す図である。ホルマリン固定パラフィン包埋した、ヒトＣＤ２６を発現しているがん細胞株（ＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈ）の各細胞ブロック標本に対して、過剰量のヒトＣＤ２６タンパク質と一晩反応させた精製抗体を用いて免疫染色を行った結果である。
【図２Ｃ】各ハイブリドーマクローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分、又はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社の精製抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体を用いた、病理組織の免疫染色の結果を示す図である。ホルマリン固定パラフィン包埋した、ヒトＣＤ２６を発現しているヒト正常組織（肝臓、腎臓、前立腺）、及び、悪性中皮腫の各組織標本に対して、精製抗体を用いて免疫染色を行った結果である。
【図２Ｄ】各ハイブリドーマクローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分、又はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社の精製抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体を用いた、病理組織の免疫染色の結果を示す図である。ホルマリン固定パラフィン包埋した、ヒトＣＤ２６を発現している肝細胞がん、腎細胞がん、前立腺がん、大腸腺がん、肺腺がんの各組織標本に対して、精製抗体を用いて免疫染色を行った結果である。
【図２Ｅ】各ハイブリドーマクローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分、又はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社の精製抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体を用いた、病理組織の免疫染色の結果を示す図である。ホルマリン固定後に脱灰操作を行い、パラフィン包埋した、ヒトＣＤ２６を発現しているヒト正常骨および骨髄の組織標本に対して、精製抗体を用いて免疫染色を行った結果である。
【図３】各ハイブリドーマクローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分、又はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社の精製抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体を用いた、ウェスタンブロットの結果を示す図である。ヒトＣＤ２６を発現しているがん細胞株（ＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡ、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６）、及び、ヒトＣＤ２６を発現していないがん細胞株（ＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ、ＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈＲＮＡ、Ａ５４９、Ｊｕｒｋａｔ ｐａｒｅｎｔ）をそれぞれ氷上でＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒで溶解し、還元剤（ＤＴＴ）を含むＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを添加して、煮沸処理を行った各サンプルに対して、精製抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果である。各サンプル等量のタンパク質が泳動・転写されていることの確認として、ＣＤ２６の検出を行った後、同じメンブレンを用いてβ−ａｃｔｉｎで再ブロットを行った。
【図４】各ハイブリドーマクローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分、又はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社の精製抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体を用いた、フローサイトメトリーの結果を示す図である。ヒトＣＤ２６を発現しているがん細胞株（ＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡ、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６）、及び、ヒトＣＤ２６を発現していないがん細胞株（ＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ、ＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈＲＮＡ、Ａ５４９、Ｊｕｒｋａｔ ｐａｒｅｎｔ）を市販のＰＥ標識抗ヒトＣＤ２６マウスＩｇＧ抗体、または、ＰＥ標識アイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ）抗体で染色、若しくは未標識の抗ヒトＣＤ２６精製抗体を添加して結合させ、次いで、二次抗体（ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体、又は抗ヤギＩｇＧ抗体）で染色し、フローサイトメーターで解析した。図は、各種抗ヒトＣＤ２６抗体のヒトＣＤ２６への結合をヒストグラムで示したもので、横軸が各細胞のＰＥの蛍光強度を示しており、蛍光強度が高いほど、一つの細胞あたりにヒトＣＤ２６抗体がたくさん結合していることを意味する。縦軸は細胞数を示している。なお、ＭＦＩは平均蛍光強度の略語であり、データとして取り込んだ全細胞それぞれの蛍光強度の総和を全細胞数で割った値（＝平均値）を示しており、値が高いほど一つの細胞に抗体がたくさん結合していること、すなわち発現が高いことを意味する。
【図５】各ハイブリドーマクローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分、又はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社の精製抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体を用いた、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す図である。非変性の可溶性ヒトＣＤ２６（「ｓＣＤ２６」ともいう）、及び、煮沸処理を施した変性可溶性ヒトＣＤ２６を、ＥＬＩＳＡ用プレートにそれぞれ濃度をふって固相化し、各種抗ヒトＣＤ２６精製抗体を添加して結合させた。次いで、二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体、又は抗ヤギＩｇＧ抗体）を反応させ、プレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光値（吸収波長）を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体は、抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体であり、免疫染色用に処理されたがん組織のヒトＣＤ２６、及び免疫染色用に処理された正常組織のヒトＣＤ２６の両者に結合する抗体である。
【００１５】
本発明において、モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体のポピュレーションから得られる抗体を意味する。すなわち、そのポピュレーションに含まれる個々の抗体は、若干存在し得る可能性のある天然の突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対するものであり、非常に特異的である。さらに、異なる抗原や異なるエピトープを標的とする典型的なポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープを標的とするものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体ポピュレーションから得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして限定的に解されるべきではない。
【００１６】
抗原結合性断片は、当該抗体の機能的、構造的断片であって、当該抗体が結合可能な抗原に対する結合性を保持しているものであれば特に限定されない。抗原結合性断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の修飾構造体等が挙げられる。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ（又はこれらのサブクラス）等の任意のクラスであってよく、特定のクラスに限定されない。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスに分類される。５つの主な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２というサブクラス（アイソタイプ）にさらに細分化され得る。異なるクラスの免疫グロブリンの対応する重鎖の定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれている。
一態様において、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、ＩｇＧ抗体であり、例えば、ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ２抗体等であってよい。
【００１７】
抗体の可変領域は、抗体軽鎖の可変領域及び／又は抗体重鎖の可変領域を意味してよい。重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結される４つのフレームワーク領域(ＦＲ)からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより、近傍に保持されており、他方の鎖におけるＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するための技術としては、限定はされないが、例えば、（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ(例えば、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)；及び（２）抗原−抗体複合体の結晶構造学的研究に基づくアプローチ(Al-lazikani et al., 1997 J. Molec. Biol. 273:927-948)が挙げられる。これらの２つのアプローチを組合せて用いてもよい。
抗体の定常領域は、抗体軽鎖の定常領域及び／又は抗体重鎖の定常領域を意味してよい。
【００１８】
「特異的に結合する」という用語は、当該技術分野において当業者に周知の用語であり、抗体等の、抗原やエピトープに対する特異的な結合を決定するための方法も周知である。例えば、特異的にＣＤ２６のエピトープに結合する抗体又はその抗原結合性断片は、他のエピトープ又は非エピトープ部分に結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より迅速に、及び/又は、より長時間持続して、このＣＤ２６エピトープに結合可能であると理解される。しかしながら、第１の標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片は、第２の標的に特異的に結合することを排除しない。
【００１９】
免疫染色（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）とは、抗体又はその断片を用いて、組織標本中の抗原を検出する組織学（組織化学）的手法を指し、特定の抗原を認識する抗体を用いて可視化し、その局在を光学顕微鏡又は電子顕微鏡等を用いて観察する染色法である。本明細書において、用語「免疫染色」は、免疫組織染色又は免疫組織化学（ＩＨＣ）と互換的に用いられてもよい。
【００２０】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ等）の抗体、又は、それらの抗原結合性断片であってよく、一態様においては、非ヒト哺乳動物の抗体であるのが好ましい。キメラ抗体は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の可変領域だけを取ってきて、ヒト抗体の定常領域に導入した抗体であって、可変領域は非ヒト由来、定常領域はヒト由来の抗体を指してよい。ヒト化抗体は、抗原と直接結合する部分である超可変領域（相補性決定領域ともいう）だけを非ヒト（例えば、マウス）型にした抗体を指してよい。ヒト抗体は、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン遺伝子をノックアウトした非ヒト動物（例えば、マウス）と、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入した非ヒト動物どうしを交配させて、ヒト免疫グロブリンだけを産生する非ヒト動物を作製し、かかるヒト免疫グロブリンを産生する非ヒト動物から調製した抗体を指してよい。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、場合により、単量体、二量体又は多量体の形態であってよい。
【００２１】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、免疫染色用に処理されたがん組織のヒトＣＤ２６及び免疫染色用に処理された正常組織のヒトＣＤ２６の両者に特異的に結合し、明瞭な免疫染色像が得られる点に特徴がある。
【００２２】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の好ましい具体例は、可変鎖域中のＣＤＲがそれぞれ配列番号１〜９のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合性断片である。具体的には、重鎖ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり；重鎖ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり；重鎖ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり；軽鎖ＣＤＲ１が配列番号４若しくは配列番号７で示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり；軽鎖ＣＤＲ２が配列番号５若しくは配列番号８で示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり；軽鎖ＣＤＲ３が配列番号６若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものである抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。
またさらに、重鎖ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなり；重鎖ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなり；重鎖ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列からなり；軽鎖ＣＤＲ１が配列番号４又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなり；軽鎖ＣＤＲ２が配列番号５又は配列番号８で示されるアミノ酸配列からなり；軽鎖ＣＤＲ３が配列番号６又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものである抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片がさらに好ましい。
【００２３】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の具体例としては、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１８として寄託されたハイブリドーマ（Ｕ３８−８）又は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１９として寄託されたハイブリドーマ（Ｕ１６−３）によって産生されるモノクローナル抗体が好ましい。これらのハイブリドーマは、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００２４】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、種々の方法で製造することができる。モノクローナル抗体の製造方法は当該技術分野で当業者に周知である（例えばSambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照）。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、当業者に周知の、例えば、「Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495」に記載されるようなハイブリドーマ法を使用して製造してよい。ハイブリドーマ法においては、例えば、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を、抗原である（ヒト）ＣＤ２６又はその断片等で免疫する（感作する）ことにより、当該宿主動物に、当該抗原に特異的に結合する抗体を産生する細胞（抗体産生細胞）を作らせてよい。抗体力価を高めるために、例えば、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、脂質系アジュバント、グルカン多糖系アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、又は、合成コポリマー系アジュバント等を添加してもよい。抗体産生細胞は脾臓に多く存在するため、一般的には、脾臓から脾細胞を取り出した後に、脾細胞を腫瘍細胞（例えば、ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）酵素を欠損した９−アザグアニン耐性株であるミエローマ細胞）と細胞融合させることで不死化させて、ハイブリドーマを作製する。細胞融合は、センダイウイルス、ポリエチレングリコール又は電気刺激等により行ってよい。ハイブリドーマを作製後、例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地で培養することにより、脾細胞と腫瘍細胞のハイブリドーマを選択できる。選択したハイブリドーマを１個／ウェルで播種し直すことで、抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。培養上清は、さらに、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、又は、プロテインＡ／Ｇクロマト法等を用いて精製することで、例えば、ＩｇＧ画分（ＩｇＧ抗体）へと精製してもよい。
免疫に用いる抗原（ＣＤ２６又はその断片等）に関して、ヒトＣＤ２６は７６６のアミノ酸よりなり、Ｎ末端の６つのアミノ酸残基のみが細胞質内に存在することから、かかる細胞質内に存在するアミノ酸残基を少なくとも全て削除した変異タンパク質（例えば、ヒトＣＤ２６のＮ末端側３番目から９番目のアミノ酸残基を削除したもの）を作製することで、ヒトＣＤ２６を可溶性としてもよい。当該変異タンパク質（可溶性ヒトＣＤ２６）は、当該変異タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んで、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、又は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等に遺伝子導入することで、培養上清中に分泌させた後に、適宜、クロマトグラフィー等で精製することができる。
一態様において、精製した可溶性ヒトＣＤ２６は、例えばウレアバッファー（例えば、８Ｍ  ウレア、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ）、グアニジン塩（例えば、６Ｍ  塩酸グアニジン）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（例えば、１％ＳＤＳ）等の変性剤で、５〜８時間、例えば、４℃〜３７℃で変性処理させた後に、免疫に用いてもよい。当業者は、変性に必要な時間、条件等を適宜設定することができる。ウレアバッファーによる抗原の変性処理に関しては、例えば、「Torigoe T. at al., (2012) Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: usually high frequency of down-regulation in breast cancer tissue. Pathology International 62; 303-308」を参照してもよい。
【００２５】
あるいは、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような、遺伝子組換え技術により作製されてもよい。あるいは、ファージディスプレイ技術を用いて作製してもよい（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；第５，５８０，７１７号；第５，７３３，７４３号及び第６，２６５，１５０号）。本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードするＤＮＡは、モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用といった、従来的な方法を使用することで、単離し、配列決定することができる。当該ＤＮＡを単離後に発現ベクターに組み込んで、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は、当該発現ベクターが導入されない限り免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞に遺伝子導入することにより、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を産生させてもよい。
【００２６】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の抗原結合性断片は、当該抗体の機能的、構造的断片であって、当該抗体が結合可能な抗原に対する結合性を保持しているものであれば特に限定されない。抗原結合性断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、二重特異性抗体、及び、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の修飾構造体等が挙げられる。これらは、当業者に公知の製造方法に基づいて、遺伝子組換え技術又は化学合成技術等により製造してもよい。
例えば、抗原結合性断片は、完全体の抗体のタンパク質消化を介して得ることができ（例えば、Morimoto et al., 1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117等）、又は組換え宿主細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞等の真核生物、又は、大腸菌等の原核生物）により直接産生させてもよい。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させることによってＦ（ａｂ’）2断片を形成させてもよい（Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167）。また、Ｆ（ａｂ’）2は、Ｆ（ａｂ’）2分子の組み立てを促進するロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成させてもよい。また、ｓｃＦｖを化学合成技術で生産する場合には、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖを遺伝子組換え技術で生産する場合には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、適切な宿主細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞等の真核生物、又は、大腸菌等の原核生物）に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の周知の操作により作製してもよい。その結果生じるｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を使用して単離してもよい。
【００２７】
一実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、その他の抗体、好ましくは抗ＣＤ２６抗体とセットで（すなわち、同時又は異時に組み合わせて）用いてよい。
また、競合的アッセイを用いて、２つの抗体（抗体の一方は、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用い、抗体の他方は、比較しようとしている抗体を用いてよい。）が同一又は立体的に重複するエピトープを認識することにより同じエピトープに結合するかどうかを決定することができる。例えば、抗原であるＣＤ２６をマルチウェルプレート上に固定し、非標識抗体が標識抗体の結合を遮断する性能を測定してもよい。そのような競合的アッセイのための一般的な標識は、放射性標識、蛍光色素標識又は酵素標識であってよい。さらに、当業者に周知のエピトープマッピング技術を用いることにより、抗体が結合するエピトープを決定することができる。
【００２８】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、当業者に公知の方法に従って、精製又は単離されてよい。精製又は単離の方法の例としては、電気泳動的、分子生物学的、免疫学的又はクロマトグラフィー的手法等が挙げられ、具体的には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、又は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、あるいは、等電点電気泳動等が挙げられる。
【００２９】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、又は、それを含む本発明のヒトＣＤ２６を検出するための組成物を適用する（例えば、接触させる）対象は、限定はされないが、哺乳動物（ヒト、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等）；非哺乳動物（例えば、魚類、爬虫類、両生類又は鳥類））、植物、昆虫、細菌、又はそれらに由来する（生物）試料（すなわち、細胞（培養細胞を含む）、組織、器官、臓器、それらの断片又はそれらを含む物質）であってよい。あるいは、当該対象は、人工的な環境（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応系等）であってもよい。本発明における対象は、哺乳動物、特にはヒト、に由来する試料であるのが好ましい。一態様において、かかる試料は、ＣＤ２６を発現している腫瘍細胞又は免疫細胞等の組織を含むか、含んでいたか、又は、含む疑いを有することが好ましい。
【００３０】
本発明のヒトＣＤ２６を検出するための組成物は、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含み、かつ、ＣＤ２６を検出し得る組成物であれば、特に限定されない。本明細書において、ＣＤ２６（の発現）を検出するとは、定性的にＣＤ２６を検出してもよいし、又は、定量的にＣＤ２６を検出する（すなわち、ＣＤ２６の発現量を測定する）ことを意味してもよい。
一態様において、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片はＣＤ２６の過剰発現を検出できるのが望ましい。ＣＤ２６の過剰発現とは、ＣＤ２６を通常は発現している細胞又は組織に関して、それらの細胞又は組織内での通常のＣＤ２６の発現量と比較してＣＤ２６の発現量が増加していること、及び、ＣＤ２６を通常は発現していない組織又は細胞内でＣＤ２６が発現していることの両方が含まれると理解される。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、又は、それを含むヒトＣＤ２６を検出するための組成物は、一態様において、
ＣＤ２６の対象内の動態（分布）、発現、局在性等の検出又は解析；
ＣＤ２６の発現量の変化又は異常(例えば、対照群である正常組織と比較しての、ＣＤ２６の発現量の増加又は減少)の検出又は解析；
ヒトＣＤ２６関連疾患を同定する指標となる情報の検出又はそれに基づく診断；
治療用抗体である抗ヒトＣＤ２６抗体（抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体であるのが好ましく、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０であるのがさらに好ましい。）を用いたヒトＣＤ２６関連疾患の治療に適し得る患者（好ましくはヒト）の選択；又は、
治療用抗体である抗ヒトＣＤ２６抗体（抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体であるのが好ましく、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０であるのがさらに好ましい。）を用いたヒトＣＤ２６関連疾患の治療中又は治療後の治療効果（例えば、経過観察、治療有効性の確認、又は、患者（例えば再発例や抗体治療無効例）におけるヒトＣＤ２６の発現評価）の追跡；
等に利用できる。
例えば、対照群である正常組織におけるＣＤ２６の発現量に比べて、試料においてＣＤ２６が高発現している場合、当該試料の由来となる対象（好ましくはヒト）がヒトＣＤ２６関連疾患に罹患しているか、又は、ヒトＣＤ２６関連疾患への罹患リスクが高いと決定、診断され得る。また、例えば治療用抗体を用いてヒトＣＤ２６関連疾患に罹患する患者を治療中又は治療後に、治療の対象となる病変部位を採取して、ＣＤ２６の発現量の推移を測定、観察することにより、当該ヒトＣＤ２６関連疾患の進行度や悪性度を判定する、もしくは当該治療抗体による治療の有効性の指標とすることができる。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、又は、それを含む本発明のヒトＣＤ２６を検出するための組成物は、ＣＤ２６を標的とした治療方針や治療結果ヘの影響に関して安定した結果が求められる、臨床診断薬又は患者層別マーカーとして有利に用いることができる。
【００３１】
本発明のヒトＣＤ２６を検出するための組成物を調製するために、必要に応じて、例えば、薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、可溶化剤、溶剤、ゲル化剤、防腐剤等を添加してよい。これらの添加剤は、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の活性を阻害せず、検出対象となる抗原ＣＤ２６と非反応性であるのが好ましい。添加剤は、当業者に標準的なものを用いてよく、限定はされないが、例えば、生理的食塩水、トリス緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、水、又は、アルブミン製剤、油/水エマルジョン等のエマルジョン等であってよい。
【００３２】
また、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトＣＤ２６の検出方法に用いることができ、具体的には、上述のようなＣＤ２６の検出、発現量の解析又は追跡、患者の選択等に用いることができる。例えば、本発明のヒトＣＤ２６の検出方法は、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、対象由来の試料に接触させるステップ、及び、前記試料に含まれ得るヒトＣＤ２６を、免疫染色によって検出するステップを含んでよい。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体である抗ヒトＣＤ２６抗体（抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体であるのが好ましく、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０であるのがさらに好ましい。）の投与前又は投与開始後に、対象由来の試料に接触させることで、ＣＤ２６の発現を検出してもよい。例えば、当該治療用抗体を複数回投与することを意図している場合には、治療用抗体の投与間隔、投与回数を適宜調整してよく、治療の合間に、１回又は複数回、ヒトＣＤ２６関連疾患を罹患しているか、又は、その疑いのある患者の対象由来の試料におけるヒトＣＤ２６の発現を検出してもよい。本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が認識（結合）するエピトープが、当該治療用抗体が認識（結合）するエピトープと異なる場合には、結合の競合を示さない（交叉反応が生じない）ことから、当該治療用抗体の投与開始後にも、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて、ＣＤ２６を正確に検出、評価し得るので有利である。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の必要量や濃度、検出する対象由来の試料の調製の条件、当該試料と抗体との接触条件、検出条件等は、目的に応じて、当業者が適宜、選択しかつ決定することができる。
【００３３】
また、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトＣＤ２６関連疾患を罹患しているか、又は、その疑いのある患者への、ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体の投与の適合性の判定方法に用いることができる。例えば、当該判定方法は、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、対象由来の試料に接触させるステップ、及び、当該試料に含まれ得るヒトＣＤ２６を、免疫染色によって検出するステップを含んでよく、場合により、当該免疫染色におけるヒトＣＤ２６の検出の程度に応じて、ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体の投与の適合性を判定するステップをさらに含んでよい。「ヒトＣＤ２６の検出の程度に応じて」という用語は、治療用抗体の投与の適合性の判定基準と関係し、その判定基準を、当業者は目的に応じて任意に設定することができる。例えば、試料においてＣＤ２６が検出された場合にヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体の適用を肯定的に判断し、一方、検出されなかった場合には否定的に判断するという判定基準を設けてもよい。ヒトＣＤ２６関連疾患を罹患しているか、又は、その疑いのある患者とは、好ましくはヒト患者であって、ヒトＣＤ２６関連疾患を現在罹患しているか、過去に罹患していたか、又は、現在もしくは将来、ヒトＣＤ２６関連疾患に罹患する可能性がある患者を意味してよい。ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体は、抗ヒトＣＤ２６抗体であってよく、好ましくは抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体であってよく、さらに好ましくは抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０であってよい。
【００３４】
本発明において、ヒトＣＤ２６関連疾患とは、ＣＤ２６の発現が関連する疾患又は状態を指してよく、ＣＤ２６が発現している細胞の増殖が関連する疾患又は状態であってもよい。ヒトＣＤ２６関連疾患は、限定はされないが、例えば、がん、免疫病、ウイルス性疾患、代謝疾患、又は、炎症性疾患であってよい。
当該がんとしては、限定はされないが、良性腫瘍、あるいは、原発性又は転移性の、かつ、浸潤性又は非浸潤性の、癌、肉腫、中皮腫等が挙げられる。当該がんは、例えば、悪性中皮腫、肝臓がん、腎がん、前立腺がん、大腸がん、肺がん、甲状腺がん、尿路上皮がん、Ｔ細胞性悪性リンパ腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、グリオーマ、又は、ＣＤ２６の発現を伴うその他の悪性腫瘍であってよい。
当該免疫病は、例えば、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、又は、バセドー病）、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、又は、ＣＤ２６の発現を伴うその他の免疫病であってよい。なお、自己免疫疾患とは、限定はされないが、異物を認識し排除するための役割を持つ免疫系が、自分自身の正常な細胞や組織に対しても過剰に反応し攻撃を加えることで生じる疾患又は状態を意味してよい。
当該ウイルス性疾患は、例えば、コロナウイルスに起因する疾患であってよい。
当該代謝疾患は、例えば、糖尿病、又は、メタボリックシンドロームであってよい。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いてヒトＣＤ２６を検出するのに用いる対象由来の試料とは、ＣＤ２６を発現する、上述のヒトＣＤ２６関連疾患を有するか、有していたか、有する可能性のある細胞、組織、器官、臓器、それらの断片又はそれらを含む物質であるのが好ましい。
【００３５】
抗体又はその抗原結合性断片の、ＣＤ２６への結合親和性を決定する方法は、当該技術分野において当業者に公知の方法を用いてよい。例えば、結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー、ＫｉｎＥｘＡバイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫測定法（ＩＧＥＮ社）、フローサイトメトリー、蛍光消光、蛍光転移、酵母ディスプレイ、及び/又は、免疫染色を使用して決定してよい。さらに、結合親和性は、適切なバイオアッセイを用いてスクリーニングしてもよい。ＣＤ２６への結合親和性が高い抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を選択するために、これらの方法を単独又は組み合わせて、検出量（ＣＤ２６の発現量）が高いものをスクリーニングし、絞り込んでもよい。
好ましい一実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ＣＤ２６（有利には、ヒトＣＤ２６）を検出するのに用いることができ、免疫染色に適しているのが特に好ましい。
【００３６】
本発明のモノクローナル抗体を用いれば、ウエスタンブロッティングにより、細胞または臓器のヒトＣＤ２６タンパク質発現量を評価することができる。
【００３７】
一実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いたＣＤ２６の免疫染色は、評価の対象とする標本を固定して作製した、固定組織標本に対して行われるのが好ましい。「固定」とは、標本を、自己融解や腐敗による劣化から保護するための化学処理を意味してよい。かかる固定により、生化学反応が停止し、場合により物理的強度や化学的安定性が向上することも期待される。
【００３８】
固定は、主には、研究、検査を目的として、生物試料の変性、劣化等を防いで、できるだけその形態を天然の状態に近いまま維持することを目的として行われてよい。固定により、生物試料中の内在性の生体分子、特にタンパク質分解酵素を不活化させ；外来性の損傷から保護し；場合により、細菌等の微生物に対して毒性を示すか、又は、生物試料を微生物が栄養にしにくい形態に化学的に修飾し；及び／又は、生物組織自体の強度や安定性を向上させることが好ましい。
固定の種類（固定剤の選択等）や条件（固定する標本の大きさ、標本の切片作製手段、標本の変形防止手段、固定剤の量、固定時間、固定に使用する容器、固定の温度、時間、ｐＨ等）を、目的に応じて当業者は適宜選択することができる。生物試料中の内在性の生体分子の不活化の手段として、例えば、それらの生体分子を変性させてもよい。また、ゲルやゾルの状態にある生物試料を完全に固体とすることで形態を固定化して安定化させてもよい。このような固定には、温度や圧力による物理的な変性（例えば、煮沸やマイクロウェーブ照射による熱凝固、又は、凍結等）を利用してもよいが、固定剤による化学的な処理が好ましい。固定剤（固定液）は、単独で、又は、組み合わせて用いてもよく、適宜、ｐＨ変化を和らげる緩衝剤、浸透圧又は粘性を調節する塩や糖などと組み合わせて用いてよい。
固定液は、限定はされないが、例えば、アルデヒド系固定液、酸を含む固定液、金属塩を含む固定液、又は、脱水剤・有機溶媒系固定液等が挙げられる。アルデヒド系固定液としては、限定はされないが、１０〜２５％ホルマリン（ホルムアルデヒド飽和水溶液）固定液を用いてよく、場合により、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、酢酸ナトリウム、臭化アンモニウム、塩化カルシウム又は硫酸亜鉛等を添加物として加えてもよい。あるいは、１０％リン酸緩衝ホルマリン固定液、４％パラホルムアルデヒド固定液、又は、１〜５％グルタルアルデヒド固定液等を用いてもよい。酸を含む固定液としては、限定はされないが、例えば、ブアン固定液（例えば、ピクリン酸飽和水溶液：ホルマリン：氷酢酸＝１５：５：１で含む）、ザンボニ固定液、又は、２％オスミウム液固定液（四酸化オスミウムを用いる）等が挙げられる。金属塩を含む固定液としては、限定はされないが、例えば、亜鉛固定液又はＨｏｌｌａｎｄｅ固定液等が挙げられる。脱水剤・有機溶媒系固定液としては、限定はされないが、例えば、アルコール（エタノール等）固定液、アルコール・ホルマリン混合液、ＦＡＡ固定液（例えば、ホルマリン：氷酢酸：５０％エタノール＝１：１：１８で含む）、又は、アセトン固定液等が挙げられる。好ましい固定液としては、１０〜２５％ホルマリン固定液、２〜５％パラホルム固定液、８０〜１００％エタノール、８０〜１００％メタノール又は１００％アセトン等が挙げられる。
固定する標本の大きさとしては、組織片は薄く、小さい方が、固定剤（固定液）が浸透しやすいので一般には好ましく、標本の表面積が大きい方が好ましい。一態様において、標本の厚さは、１．５ｃｍ以下が好ましく、５ｍｍ以下であることがより好ましい。固定剤の量としては、特に限定はされないが、標本に対して十分量があればよく、例えば、５倍〜１０倍以上あればよい。固定時間は、固定剤の種類、標本の大きさや性質により異なり得る。固定が不十分な場合、組織収縮、細部構造の崩壊が生じ得、一方、固定が過剰な場合、組織片の脆弱化による組織収縮や膨化が生じ得る。当業者は、適宜、固定の最適な時間を決定でき、例えばそれは、６時間〜４８時間であってよい。固定の温度は、例えば、４℃又は室温であってよい。高温である場合、固定時間は短くなり得るが、温度が高すぎると標本が硬化するおそれが生じ得る。
固定するための手法としては、生物試料を固定液に浸けておく浸漬法の他に、十分量の固定液を心臓等に注入し血流に乗せる灌流法が挙げられ、後者は、例えば、マウス等を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ病態モデル実験で用いてもよい。
【００３９】
一実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いたＣＤ２６の免疫染色は、評価の対象とする組織片に骨あるいは石灰化組織が含まれている場合は、固定組織に脱灰操作を行って作製した、脱灰組織標本に対して行われるのが好ましい。「脱灰」とは、組織片に石灰が含まれる骨、歯、石灰化した病変などから石灰を除去する操作を意味してよい。かかる脱灰操作により、組織内の石灰（炭酸カルシウム）を酸などでカルシウム塩にし、組織の薄切を容易にすることが期待される。
【００４０】
脱灰は、石灰が含まれる骨や歯などの組織片や、石灰化した病変から組織の薄切を可能にするために、石灰の物理的強度を軟らかくすることを目的として行われてよい。脱灰操作により、生物試料中の石灰（炭酸カルシウム）を酸などでカルシウム塩にし、物理的強度を低下させることで、組織の薄切を容易にすることが期待される。
脱灰液の種類や条件（脱灰する標本の大きさ、標本の切片作製手段、標本の変形防止手段、脱灰液の量、脱灰操作時間、脱灰操作の温度、時間等）を、目的に応じて当業者は適宜選択することができる。脱灰液は、単独で、又は、組み合わせて用いてもよい。
脱灰液は、限定はされないが、例えば、塩酸・硝酸などの無機酸、蟻酸・三塩化酢酸などの有機酸を希釈して単独で用いる方法（酸性脱灰液）と、無機酸と有機酸を混合したプランク・リュクロ液を用いる方法（酸性脱灰液）、又は、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤を用いる方法（中性脱灰液）が一般的である。
脱灰する標本の大きさとしては、組織片は薄く、小さい方が、脱灰液が浸透しやすいので一般には好ましく、標本の表面積が大きい方が好ましい。一態様において、標本の厚さは、１．５ｃｍ以下が好ましく、５ｍｍ以下であることがより好ましい。脱灰液の量としては、特に限定はされないが、標本に対して十分量があればよく、例えば、５倍〜１０倍以上あればよい。脱灰時間は、脱灰液の種類、標本の大きさや性質により異なり得る。脱灰操作が不十分な場合、組織を薄切することが難しく、一方、脱灰操作が過剰な場合、脱灰による組織の膨化、収縮、溶解などの組織障害や、組織の染色性の低下が生じ得る。当業者は、適宜、脱灰操作の最適な時間を決定でき、例えばそれは、蟻酸液中に室温で２４時間〜７２時間、又は、エチレンジアミン四酢酸液中に室温で３日〜７日であってよい。
脱灰操作により、抗原の変性も加わるため、脱灰操作を行う必要のない固定組織標本と比較して、脱灰操作を行う脱灰組織標本の方が、発現評価に十分な染色性を得ることが一般的に難しいと言える。
【００４１】
固定された生物試料は標本として保存することができ、あるいは、さらに、例えば、切り出し、脱水、包埋、薄切、及び／又は染色等を行った後に、例えば光学顕微鏡等で観察することができる。
切り出しは、標本のサイズが大きい場合に顕微鏡で観察できるサイズに標本を小さくし、あるいは、標本中の病変部や正常部が観察しやすくなるように行ってよく、適宜、標本を切断してよい。
顕微鏡で標本を観察できるように、又は、標本中に存在する中空部位を埋めて標本の変形を防ぐために、適当な包埋剤（例えば、パラフィン、セロイジン等）中に標本を包埋して標本に強度を与えてよい。包埋の手法としては、限定はされないが、例えば、パラフィン包埋法、セロイジン包埋法、ＯＣＴコンパウンド包埋法、ゼラチン包埋法、又は、合成樹脂包埋法等が挙げられ、これらのすべてが当業者に公知である。一態様において、パラフィン包埋法が好ましい。包埋を行う際に、水分が標本中に存在すると、その部分に包埋剤が浸透しないので、アルコール（エタノール等）を用いて当該水分を除去してもよい。
例えば、パラフィン包埋法を用いる場合には、脱水過程で標本中に浸透したアルコールを除去するために、キシレン又はクロロホルム等による透徹を行うことが好ましい。次いで、パラフィンを標本中に浸透させてパラフィンのみが含まれるようにしたら、冷却して標本を硬化させ、パラフィンブロックを作製してよい。
標本を薄切にするためにはミクロトームを用いてもよい。
顕微鏡下での標本の観察を容易にするために、薄い組織切片にした標本を染色する（抗原ＣＤ２６を認識する抗体を用いた抗原抗体反応を可視化する。）ことが好ましい（以下、可視化に関して、当該抗体は、場合により、抗原結合性断片であってもよいことが当業者には理解される。）。
【００４２】
また、例えば、パラフィン包埋法を用いてパラフィンブロックを作製した場合には、例えば、キシレン、アルコール（エタノール等）を用いて脱パラフィンを行った後、場合により、標本中の目的抗原（ＣＤ２６）を賦活化することで、染色を強化してよい。
例えば、ホルマリンで固定しパラフィンに包埋させた標本では、その標本作製過程において組織や細胞中に存在する抗原をマスキングする架橋結合が生じ、抗原の免疫原性が失われ、これによって、抗体による抗原認識が阻害され得る。したがって、かかる免疫原性の低下を防ぐために、抗原賦活化処理を行ってよい。抗原賦活化の方法としては、特に限定はされないが、例えば、ペプシン、トリプシン、プロナーゼ又はプロテインキナーゼＫ等のタンパク質分解酵素処理；マイクロウェーブ、オートクレーブ又は煮沸等による加熱処理；アルカリや酸（例えば塩酸又はギ酸）による処理等が挙げられる。賦活化の方法、抗原賦活溶液の種類、ｐＨ、濃度、賦活時間、賦活温度等を、目的に応じて、当業者は適宜選択し決定することができる。例えば、加熱処理により抗原を賦活化する場合には、限定はされないが、ｐＨ６．０〜７．０のクエン酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．０のトリス塩酸緩衝液、トリスＥＤＴＡ緩衝液、ＥＤＴＡ溶液、尿素、又は、市販の種々の抗原賦活溶液を使用することができ、例えば、９０℃〜１３０℃で１０分間〜１時間加熱してよい。タンパク質分解酵素処理により抗原を賦活化する場合には、タンパク質分解酵素の濃度を当業者は適宜決定してよく、例えば、４℃〜３７℃で、５分間〜数時間程度、酵素処理してもよい。
【００４３】
抗原抗体反応を可視化する方法（染色方法）としては、抗体に特定の酵素を標識しておき、後で、基質を反応させて形成された色素生成物の呈色を光学顕微鏡等で観察する酵素抗体法を用いてよい。光学顕微鏡で観察する場合、例えば、染色される部分（シグナル部分）と染色されない部分（ノイズ部分）のコントラスト（シグナル／ノイズ比）を、目視で観察してもよい。また、バーチャルスライドを作成し、染色部位の定量的解析を行う事で、染色部分を評価してもよい。
酵素抗体法は、大まかには、抗原に直接反応する抗体（一次抗体）を標識し、抗原抗体反応を１度しか行わない直接法と、標識していない一次抗体を用いて１度目の抗原抗体反応を行い、一次抗体自体を抗原とする別の抗体（二次抗体）を標識して、さらに反応させて２回以上（多くは２回、場合により３回）抗原抗体反応を行う間接法とが挙げられる。また、間接法の変法として、ペルオキシダーゼ・抗ペルオキシダーゼ抗体の可溶性免疫複合体（ＰＡＰ）を用いるＰＡＰ法（Sternberger LA et al. (1970).“The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry: preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase-antihorseradish peroxidase) and its use in identification of spirochetes”. J Histochem Cytochem 18 (5): 315-33. PMID 4192899.）、ＬＡＢ（Linked Avidin-Biotin）法、アビジン・ビオチン複合体を用いるＡＢＣ法（Hsu SM, Raine L, Fanger H (1981). “Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures”. J Histochem Cytochem 29 (4): 577-80.）、ストレプトアビジンを用いるＬＳＡＢ(Linked Streptavidin-Biotin)法、ＴＳＡ（tyramide signal amplification）法、又は、ＣＡＲＤ（catalyzed reporter deposition）法等を用いてもよい。
酵素抗体法での発色方法としては、限定はされないが、例えば、標識酵素としてペルオキシダーゼ（西洋ワサビパーオキシダーゼ等）を発色基質のジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と反応させるＤＡＢ法（褐色に染色）（Graham RC Jr, Karnovsky MJ. (1966). “The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique”. J Histochem Cytochem 14 (4): 291-302）；ニッケルイオン存在下でＤＡＢ法を行う、より高感度の、ニッケルＤＡＢ法；ペルオキシダーゼを発色基質のアミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）と反応させる方法（赤色に染色）；あるいは、標識酵素としてアルカリホスファターゼを、発色基質のＢＣＩＰ／ＮＢＴと反応させる方法（青紫色に染色）、発色基質のＦａｓｔ  Ｒｅｄと反応させる方法（赤色に染色）、又は、発色基質のＦａｓｔ  Ｂｌｕｅと反応させる方法（青色に染色）等を挙げてもよい。
一実施態様において、染色方法がＤＡＢ法である場合、染色前に、抗原賦活化した標本を、例えば過酸化水素水含有メタノール等に浸すことで、標本中の内在性ペルオキシダーゼの不活化を行なうことが好ましい。
染色の手法、温度、染色時間等の各種条件を、当業者は目的に応じて、適宜、選択し、決定することができる。染色は、例えば、一次抗体として、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を標本に添加して、例えば、４℃〜室温で１時間から一晩反応させた後に当該一次抗体を洗浄し、次いで、二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗体又はアルカリホスファターゼ標識抗体を添加して、例えば、４℃〜室温で３０分間から一晩反応させた後に当該二次抗体を洗浄してから、発色させてもよい。あるいは、検出感度を高めるために、ＡＢＣ法を利用してもよい。あるいは、検出感度を高めるために、標識していない一次抗体（本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片）を用いて１度目の抗原抗体反応を行い、次いで、一次抗体自体を抗原とする標識していない二次抗体を用いて２度目の抗原抗体反応を行い、次いで、二次抗体自体を抗原とする、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで標識した三次抗体を添加し、例えば、４℃〜室温で１時間から一晩反応させた後に、当該三次抗体を洗浄してから発色させてもよい。
【００４４】
あるいは、抗原抗体反応を可視化する方法としては、上述の抗原抗体反応の他に、抗体に放射性同位元素を結合（「標識」という）しておき、後で印画紙に感光させるオートラジオグラフィー法；金粒子等の可視物質に抗体を結合させておき、電子顕微鏡等で観察する金コロイド法；又は、抗体に蛍光色素を標識しておき、抗原抗体反応の後で励起波長を当てて蛍光発色させ蛍光顕微鏡で観察する蛍光抗体法を用いてもよい。
【実施例】
【００４５】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００４６】
１．実験方法
（１）細胞
ヒト悪性中皮腫細胞株ＭＳＴＯ−２１１Ｈ（ＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ）、ヒト肺がん細胞株Ａ５４９、ヒトＴ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ ｐａｒｅｎｔ）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ, ＭＤ，ＵＳＡ）より購入した。ＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ細胞にヒトＣＤ２６完全長を安定的に遺伝子導入したＭＳＴＯ−ＣＤ２６は、本発明者らが以前作製した(Yamamoto J et al., 2014 Br. J. Cancer. 110: 2232-45)。ヒト悪性中皮腫細胞株ＪＭＮは、Ｄｒ．Ｂｒｅｎｄａ  Ｇｅｒｗｉｎ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｒｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）の好意により提供された。ＪＭＮ細胞にｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスを安定的に形質導入してヒトＣＤ２６の発現をノックダウンしたＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈＲＮＡと、ＣＤ２６の発現には影響しない対照ｓｈＲＮＡを導入したＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡは、本発明者らが以前作製した(Yamazaki H et al., 2012 Biochem. Biophys. Res. Commun. 419: 529-536)。Ｊｕｒｋａｔ ｐａｒｅｎｔ細胞にヒトＣＤ２６完全長を安定的に遺伝子導入したＪｕｒｋａｔ−ＣＤ２６は、本発明者らが以前作製した(Tanaka T et al., 1992 J. Immunol. 149: 481-6)。全ての細胞株の培養は、１０％ ＦＢＳ（ウシ胎児血清）（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、５％ ＣＯ２、３７℃の環境で行った。
【００４７】
（２）実験に用いた抗体
新たに樹立した抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の比較対照として、本発明者らがこれまでに開発したマウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体である、
（ｉ）ヒトＣＤ２６の１〜２４７アミノ酸に結合する１９−３２、
（ｉｉ）ヒトＣＤ２６の２４８〜３５８アミノ酸に結合する１Ｆ７、
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ２６の３５８アミノ酸周辺に結合する５Ｆ８、
及び、市販されているＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ, ＣＡ, ＵＳＡ）のＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体（クローン：Ｍ−Ａ２６１, カタログ番号：５５５４３７）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体（カタログ番号：ＡＦ１１８０）を用いた。
１９−３２に関しては、本発明者らが免疫染色用モノクローナル抗体として開発した抗体で、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、正常組織の免疫染色が可能である(Hatano R et al., 2014 Diagn. Pathol. 9: 30)。詳細は、例えば、特許文献２を参照されたい（特許文献２中、クローン１９は１９−３２を意味する）。
１Ｆ７、５Ｆ８に関しては、細胞膜上のＣＤ２６や血清中の可溶性ＣＤ２６など立体構造が維持されたｎａｔｉｖｅなＣＤ２６への結合性に優れた抗体で、これまでに本発明者らがフローサイトメトリーやＥＬＩＳＡに多く用いてきたモノクローナル抗体である(Morimoto C et al., 1989 J. Immunol. 143: 3430-9., Torimoto Y et al., 1992 Mol. Immunol. 29: 183-92., Ohnuma K et al., 2015 J. Clin. Lab. Anal. 29: 106-11.)。ホルマリン固定パラフィン包埋した組織の免疫染色、及び、ウェスタンブロットのような変性ＣＤ２６の検出には適していない。
ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のモノクローナル抗体（クローン：Ｍ−Ａ２６１）は、フローサイトメトリーによる細胞膜上のＣＤ２６の検出に優れた抗体で、発明者らもこれまでに多く用いてきた抗体である（Hatano R et al., 2013 Immunology. 138: 165-72., Ohnuma K et al., 2015 J. Immunol. 194: 3697-712.）この抗体は、ヒトＣＤ２６の２４８〜３５８アミノ酸に結合する１Ｆ７と同様の部位に結合する抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０と、ＣＤ２６への結合がフローサイトメトリーで完全に競合することから、１Ｆ７やＹＳ１１０と類似した部位に結合すると考えられる（Hatano R et al., 2013 Br. J. Haematol. 162: 263-77.）。この抗体も、ホルマリン固定パラフィン包埋した組織の免疫染色、及び、ウェスタンブロットのような変性ＣＤ２６の検出には適していない。
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体は、本発明者らがこれまでに検討した市販されている抗ヒトＣＤ２６抗体のなかで、免疫染色、及び、ウェスタンブロットに最も適していると考えている抗体で、これまでの本発明者らのＣＤ２６研究にも用いてきた（Okamoto T et al., 2014 PLoS One. 9: e86671., Hatano R et al., 2014 Diagn. Pathol. 9: 30., Yamamoto J et al., 2014 Br. J. Cancer. 110: 2232-45., Komiya E et al., 2014 Biochem. Biophys. Res. Commun. 447: 609-15., Angevin E et al., 2017 Br. J. Cancer. 116: 1126-1134.）。
アイソタイプ対照抗体として、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰＥ標識マウスＩｇＧ1,κモノクローナル抗体（クローン：ＭＯＰＣ−２１, カタログ番号：５５５７４９）、未標識マウスＩｇＧ1,κモノクローナル抗体（クローン：ＭＯＰＣ−２１, カタログ番号：５５４１２１）、及び、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社の未標識正常ヤギＩｇＧポリクローナル抗体（カタログ番号：ＡＢ−１０８−Ｃ）を用いた。
【００４８】
（３）マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウス、♀は日本クレア（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。すべてのマウスは特定病原体除去施設においてマイクロアイソレーターケージ内で飼育した。マウスへの免疫は６週齢から開始した。動物実験は施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）で承認されたプロトコルに従って行った。
【００４９】
（４）免疫抗原（ヒトＣＤ２６タンパク質）の調製
本発明者らが作製した可溶性ヒトＣＤ２６（ヒトＣＤ２６のＮ末端側３番目から９番目のアミノ酸残基を削除したもの）を発現するプラスミドをＣＨＯ細胞株に遺伝子導入し、ヒトＣＤ２６を安定して分泌するＣＨＯ細胞株をクローン化した（Tanaka T et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 3082-6）。可溶性ヒトＣＤ２６が分泌された培養上清を、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を固定化したセファロースカラムに通すことで、可溶性ヒトＣＤ２６のアフィニティー精製を行った（同上文献）。精製した可溶性ヒトＣＤ２６をウレアバッファー（８Ｍ  ウレア、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ）中で５〜８時間、室温で緩やかに撹拌することにより、変性化したヒトＣＤ２６タンパク質を調製した。
【００５０】
（５）マウスへの免疫とハイブリドーマの作製
ウレアで変性化した可溶性ヒトＣＤ２６の溶媒をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で置換した後、１００μｇ／５０μＬの濃度に調整し、合成コポリマー系アジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ  ＵＳＡ, Ｎｏｒｃｒｏｓｓ, ＧＡ, ＵＳＡ）５０μＬと混合して、１匹あたり１００μＬ／ｄｏｓｅでＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射した。２週間ごとに合計７回皮下注射を行い、最後に尾静脈に上記の半量である５０μＬを静脈注射した。３日後にマウスを解剖して得た粗精製脾細胞と、Ｐ３Ｕ１ミエローマ細胞とを、１：１で混合し、ポリエチレングリコールで細胞融合してハイブリドーマを作製した。細胞を洗浄した後、５％ ＢｒｉＣｌｏｎｅ（ＮＩＣＢ, Ｄｕｂｌｉｎ, Ｉｒｅｌａｎｄ, カタログ番号：ＢＲＢＲ００１）、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｃａｒｌｓｂａｄ, ＣＡ, ＵＳＡ）含有、無血清ＧＩＴ培地（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）に当該細胞を懸濁してから、９６ウェル平底プレートに播種した。生育したハイブリドーマの培養上清を回収し、１次スクリーニングとしてＥＬＩＳＡによって、マウスＩｇＧの産生量が多いハイブリドーマのスクリーニングを行い、陽性であったハイブリドーマを選出した後、免疫染色の検討を行った。免疫染色可能であったハイブリドーマを９６ウェル平底プレートに１個／ウェルで播種し直し、複数の単クローンを選出した。目的の抗体を含む細胞培養上清から、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＩｇＧ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ, Ｒｏｃｋｆｏｒｄ, ＩＬ, ＵＳＡ）を用いてＩｇＧ画分を精製した。
【００５１】
（６）１次スクリーニング（マウスＩｇＧのＥＬＩＳＡ）
ＨＡＴ含有培地中で生育してきたハイブリドーマの中から、マウスＩｇＧの産生量が多いものをスクリーニングするために、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ｔｏｔａｌ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ, Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ, ＵＳＡ, カタログ番号：８８−５０４００）を用いて、ＥＬＩＳＡによる１次スクリーニングを行った。ＰＢＳで抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体を希釈し、イムノプレート（ＮＵＮＣ, Ｒｏｓｋｉｌｄｅ, Ｄｅｎｍａｒｋ）に５０μＬ／ウェルで添加して４℃で一晩静置した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、２×Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａを１２５μＬ／ウェルで添加して、室温で２時間静置することでプレートをブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、一次抗体として１×Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａで１０倍に希釈したハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェルで添加し、続いて、１×Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａで希釈したＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を２５μＬ／ウェルで添加して、よく混合した後、穏やかに振盪しながら室温で３時間恒温放置した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＴＭＢ基質溶液を５０μＬ／ウェルで添加して発色させた後、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェルで添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ, Ｈｅｒｃｕｌｅｓ, ＣＡ, ＵＳＡ）で４５０ｎｍの吸収波長と５７０ｎｍのレファレンス波長とを測定した。得られたデータをＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  ６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で解析した。
【００５２】
（７）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
本発明に用いた細胞株のヒトＣＤ２６のｍＲＮＡの発現量を解析するために、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ, Ｖａｌｅｎｃｉａ, ＣＡ, ＵＳＡ）を用いて、各種細胞株からＴｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出を行った。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ, Ｓｈｉｇａ, Ｊａｐａｎ）とｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いて、ｃＤＮＡの合成を行った。ｍＲＮＡの定量には、ＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘと７５００  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ, ＣＡ, ＵＳＡ）を用いた。得られたデータを７５００  Ｓｙｓｔｅｍ  ＳＤＳ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）を不変対照として用い、各種細胞株のヒトＨＰＲＴ１  ｍＲＮＡ量に対するヒトＣＤ２６  ｍＲＮＡの相対量を算出した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーの配列を下記に示す。
Human CD26: Forward primer 5’-GTACACAGAACGTTACATGGGTCTC-3’（配列番号１３）
Reverse primer 5’-TCAGCTCTGCTCATGACTGTTG-3’（配列番号１４）
Human HPRT1: Forward primer 5’-CAGTCAACAGGGGACATAAAAG-3’（配列番号１５）
Reverse primer 5’-CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3’（配列番号１６）
【００５３】
（８）２次スクリーニング（細胞ブロックの免疫染色）
１次スクリーニングで選別したマウスＩｇＧ産生量が高いハイブリドーマの培養上清を用いて、ヒトＣＤ２６陽性がん細胞株、及び、ヒトＣＤ２６陰性がん細胞株の免疫染色の検討（２次スクリーニング）を行った。各種細胞株の細胞ペレットを、１０〜２５％ ホルマリン固定液、又は、アルコール系固定液等で固定し、パラフィンに包埋させた切片から５μｍ厚の標本を準備し、パラフィンを溶かした後、抗原の賦活化処理を行った。抗原賦活化処理は、
（１）ｐＨ６．０ １０ｍＭ  クエン酸緩衝液中で、１２０℃で２０分間オートクレーブ、
（２）ｐＨ６．０ １０ｍＭ  クエン酸緩衝液中で、１００℃で１０分間煮沸、
（３）０．０１〜０．１％ トリプシンで、室温又は３７℃で５〜６０分間処理、
又は、
（４）０．０１〜０．０４％ プロテイナーゼＫで、室温又は３７℃で５〜３０分間処理、
のいずれかの方法で行った。図２Ａ及び図２Ｂの結果は、（１）の賦活化の方法で行った。
その後、賦活化した標本を０．３％ 過酸化水素水含有メタノールに室温で１０分間浸して、内在性ペルオキシダーゼの不活化を行い、２．５％ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ, ＣＡ, ＵＳＡ）に室温で１０分間浸して、ブロッキングを行った。その後、当該標本に、一次抗体として各ハイブリドーマの培養上清を１００μＬ／サンプル、あるいは、ハイブリドーマの培養上清から精製したＩｇＧ抗体又はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体を０．２％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＰＢＳで最適濃度に希釈した溶液を１００μＬ／サンプルで添加し、４℃又は室温で１時間から一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ結合ウマ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体、又は、ＨＲＰ結合ウマ抗ヤギＩｇＧポリクローナル抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬ／サンプルで添加し、４℃又は室温で３０分から一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｋｕｍａｍｏｔｏ, Ｊａｐａｎ）と過酸化水素で発色させた。ヘマトキシリンで核の対比染色を行い、Ａｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅ．Ａ１光学顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ, Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ, Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察、写真撮影を行った。
ＣＤ２６陽性がん細胞株、ＣＤ２６陰性がん細胞株を明瞭に染め分けることができた抗体に関しては、ヒトＣＤ２６への結合の特異性を確認するために、吸収試験を行った。ＰＢＳ１００μＬ中に、新たに樹立した抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を終濃度１０μｇ／ｍＬ、可溶性ヒトＣＤ２６タンパク質を終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように調整し、穏やかに回転させながら４℃で一晩反応させた。遠心後の上清を一次抗体として用い、以降の実験は上記と同様に行った。
ヒトＣＤ２６の染色結果に関する評価は、病理専門医２名で行い、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体で染色した場合とそれぞれ比較することで、ＣＤ２６抗原に対する特異性の評価を行った。
【００５４】
（９）３次スクリーニング（ヒト正常組織、がん組織、及び、脱灰標本の免疫染色）
１次スクリーニング、２次スクリーニングにより、がん細胞株上のヒトＣＤ２６を明瞭に染色することができ、非特異的な結合も見られないマウスＩｇＧ抗体を産生し、且つ、その産生量も高いハイブリドーマを選別した。選別したハイブリドーマの培養情上清、及び、培養上清から精製したＩｇＧ抗体を用いて、ヒト正常組織とがん組織の免疫染色を行った。また、固定したヒト正常骨および骨髄組織を１０％蟻酸で脱灰して作製した脱灰組織標本の免疫染色も検討した。上記（８）に記載した方法と同様に組織を固定し、パラフィンに包埋させた切片から５μｍ厚の標本を準備し、パラフィンを溶かした後、抗原の賦活化処理を行った。抗原賦活化処理は、上記（８）に記載した（１）〜（４）のいずれかの方法で行った。図２Ｃ及び図２Ｄの結果は、（１）の賦活化の方法で行った。その後の染色と観察も（８）に記載した方法と同様に行った。
ヒトＣＤ２６の染色結果に関する評価は、病理専門医２名で行い、ヒトＣＤ２６を発現
しているヒト正常組織（肝臓、腎臓、前立腺、骨および骨髄）、及び、ヒトがん組織（悪性中皮腫、肝細胞がん、腎細胞がん、前立腺がん、大腸腺がん、肺腺がん）の染色パターンを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体で染色した場合とそれぞれ比較することで、ＣＤ２６抗原に対する特異性の評価を行った。
【００５５】
（１０）ウェスタンブロット法
新たに樹立した抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体が、ＣＤ２６に対して特異的な抗体であることを確認するために、各種細胞株の細胞ペレットに、２％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）含有ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、氷上で溶解した。細胞全体を溶解した液に、還元剤（ＤＴＴ）含有ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、９５℃で５分間煮沸処理を行った。各種細胞株の溶解物をそれぞれ２０μｇずつ調製し、４−２０％ Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分子量ごとに分離した。その後、アクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜へタンパク質を転写し、５％スキムミルクに浸して穏やかに振盪しながら室温で４５分間恒温放置することでメンブレンをブロッキングした。０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄後、本発明者らが開発したマウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体（１９−３２：５．０μｇ／ｍＬ，Ｕ１６−３：０．２μｇ／ｍＬ，Ｕ３８−８：０．５μｇ／ｍＬ）、及び、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体（１．０μｇ／ｍＬ）を５％スキムミルクで上記の濃度に希釈した一次抗体液に浸し、穏やかに振盪しながら４℃で一晩反応させた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、ＨＲＰ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ, Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ, ＵＫ, カタログ番号：ＮＡ９３１−１ＭＬ）、及び、ＨＲＰ結合ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ, ＣＡ, ＵＳＡ, カタログ番号：ｓｃ−２０２０）を５％スキムミルクで５０００倍に希釈した二次抗体液に浸し、穏やかに振盪しながら室温で１時間恒温放置した。ＴＢＳ−Ｔ及びＰＢＳで洗浄後、化学発光基質Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ−ＥＣＬ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ，カタログ番号：ＮＥＬ１０４００１ＥＡ）をメンブレンに添加して、画像を撮影した。画像撮影後、Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎにメンブレンを浸して抗体を剥がし、上記と同様に再度ブロッキングをした後、マウス抗ヒトβ−ａｃｔｉｎモノクローナル抗体（クローン：ＡＣ−１５）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号：Ａ５４４１）を５％スキムミルクで５０００倍に希釈した一次抗体液に浸し、穏やかに振盪しながら４℃で一晩反応させ、再プローブした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、上記と同様に、ＨＲＰ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を結合させ、化学発光基質を添加して反応させた。画像は、ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ＬＡＳ ４０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で撮影し、得られたデータをｉｍａｇｅ  ｒｅａｄｅｒ  ＬＡＳ ４０００、及び、Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で解析した。
【００５６】
（１１）フローサイトメトリー
各種細胞株を用いて、生細胞膜上のヒトＣＤ２６への樹立した抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の結合を検討した。染色できることが既に確認されている方法として、蛍光色素が抗体に直接標識されたＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体（クローン：Ｍ−Ａ２６１）、または、ＰＥ標識アイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ）抗体を１％ ＦＢＳ、０．１％ アジ化ナトリウム（Ｗａｋｏ）含有ＰＢＳ（ＦＣＭバッファー）で４０倍に希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）を５０μＬ／サンプルで添加し、４℃で３０分間静置した。若しくは、一次抗体として未標識のマウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体（クローン１９−３２、Ｕ１６−３、Ｕ３８−８）、及び、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体、未標識のアイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ、及び、ヤギＩｇＧ）抗体をそれぞれＦＣＭバッファーで１０μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／サンプルで添加し、４℃で３０分間静置した。細胞を氷冷ＦＣＭバッファー１ｍＬで２回洗浄した後、二次抗体としてＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号：５５０５８９）をＦＣＭバッファーで４００ｎｇ／ｍＬに希釈した溶液、又は、ＰＥ標識ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カタログ番号：ｓｃ−３７４３）をＦＣＭバッファーで２μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／サンプルで添加し、４℃で３０分間静置した。細胞を氷冷ＦＣＭバッファー１ｍＬで１回洗浄した後、フローサイトメーターであるＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定を行い、得られたデータをＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）で解析した。
【００５７】
（１２）非変性、及び、変性ヒトＣＤ２６に対するＥＬＩＳＡ
精製した可溶性ヒトＣＤ２６（非変性ヒトＣＤ２６）又はＰＢＳ中で９５℃で１０分間煮沸処理を行った可溶性ヒトＣＤ２６（変性ヒトＣＤ２６）を炭酸塩／重炭酸塩バッファー（ＣＢＢ）で４．０，２．０，１．０，０．５，０．２５μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（ＮＵＮＣ）に５０μＬ／ウェルで添加して４℃で一晩静置した。陰性コントロールとしてＣＢＢのみを添加し、可溶性ヒトＣＤ２６をコートしない群を用意した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、２％ＢｌｏｃｋＡｃｅ（ＤＳ  Ｐｈａｒｍａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を１００μＬ／ウェルで添加して室温で１時間静置することでプレートをブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、一次抗体としてマウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体（クローン５Ｆ８、１Ｆ７、１９−３２、Ｕ１６−３、Ｕ３８−８）、及び、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体をそれぞれ１％ ＢｌｏｃｋＡｃｅで２μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号：５５４００２）を１％ ＢｌｏｃｋＡｃｅで５００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）、又は、ＨＲＰ結合ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, カタログ番号：ｓｃ−２０２０）を１％ ＢｌｏｃｋＡｃｅで１６０ｎｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を５０μＬ／ウェルで添加して発色させた後、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を２５μＬ／ウェルで添加して反応を停止させた。測定及びデータ解析は、（６）に記載した方法と同様に行った。
【００５８】
２．結果
（１）本発明に用いたヒトＣＤ２６陽性／陰性がん細胞株のＣＤ２６の発現解析
本発明で新たに樹立した抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体が、ヒトＣＤ２６に特異的に結合し、ＣＤ２６以外のタンパク質に対して非特異的に結合しないことを示すために、ＣＤ２６陰性のヒト悪性中皮腫細胞株ＭＳＴＯ、及び、ヒトＴ細胞性白血病細胞株ＪｕｒｋａｔにヒトＣＤ２６完全長を安定的に遺伝子導入した細胞株を作製した。また、ＣＤ２６陽性のヒト悪性中皮腫細胞株ＪＭＮにｓｈＲＮＡを安定的に形質導入してヒトＣＤ２６の発現をノックダウンした細胞株を作製した。まず、これらのヒトＣＤ２６陽性がん細胞株、及び、ヒトＣＤ２６陰性がん細胞株のｍＲＮＡレベルでのＣＤ２６発現を解析した。図１Ａに示すように、ヒトＣＤ２６のｍＲＮＡ発現は、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６が最も高く、次いで、ＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡの順に発現レベルは高かった。ＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ、ＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈＲＮＡ、Ｊｕｒｋａｔ ｐａｒｅｎｔ、並びに、ＣＤ２６陰性のヒト肺がん細胞株Ａ５４９は、いずれもヒトＣＤ２６のｍＲＮＡ発現が極わずかに検出されたが、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡと比較しても遥かに低い発現量であることが示された（図１Ａ）。
次に、生細胞膜上のヒトＣＤ２６のタンパク質発現についても解析を行った。図１ＡのｍＲＮＡレベルと強く相関して、細胞膜上のヒトＣＤ２６のタンパク質発現も、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６、ＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡの順に高かった（図１Ｂ）。ＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ、ＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈＲＮＡ、Ａ５４９、Ｊｕｒｋａｔ ｐａｒｅｎｔに関しては、細胞全体の約９９％はＣＤ２６陰性だが、１％程度の極わずかな細胞集団に、非常に弱い発現強度ながら発現が見られた（図１Ｂ）。これらのヒトＣＤ２６陽性／陰性がん細胞株を用いて、以降の解析を行った。
【００５９】
（２）ハイブリドーマ培養上清及び精製ＩｇＧ抗体による細胞ブロックの免疫染色
上述の通り、ウレアバッファーで変性処理を行った可溶性ヒトＣＤ２６を免疫したマウスの粗精製脾細胞とＰ３Ｕ１ミエローマ細胞とを細胞融合させ、生育したハイブリドーマの培養上清を回収して、一次スクリーニングを行った。本発明者らは以前、免疫染色に使用可能な抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の作製に成功し、特許出願したが、その際はヒトＣＤ２６陽性／陰性細胞を用いたフローサイトメトリーによる１次スクリーニングと、可溶性ヒトＣＤ２６に対するＥＬＩＳＡによる２次スクリーニングを行うことで、抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマの絞り込みを行った後、３次スクリーニングとして組織の免疫染色を選択した（特許文献２参照）。しかしながら、フローサイトメトリーで検出する生細胞膜上のヒトＣＤ２６ならびにＥＬＩＳＡで検出する可溶性ヒトＣＤ２６は、立体構造が維持されたｎａｔｉｖｅなＣＤ２６であることが予想されるが、それらのスクリーニング方法ではｎａｔｉｖｅなＣＤ２６に対する結合親和性は低いながら、変性ヒトＣＤ２６に対する結合親和性は高い抗体を除外してしまう可能性があることを考慮し、本発明では１次スクリーニングとしてマウスＩｇＧのＥＬＩＳＡを行い、マウスＩｇＧ抗体を高産生しているハイブリドーマクローンの選択を行うことにした。
ヒトがん組織上のＣＤ２６の発現を免疫染色で正確に評価するためには、ＣＤ２６陽性がん細胞を明瞭に染色できること、ＣＤ２６陰性がん細胞に対して非特異的な染色が全く見られないこと、の両方が求められる。そこで、１次スクリーニングで得られた４２９のハイブリドーマクローンの培養上清を用いて、上述のヒトＣＤ２６陽性／陰性がん細胞株の免疫染色を検討した。本発明者らが以前作製した、免疫染色に使用可能な抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体１９−３２は、ヒト正常組織のＣＤ２６の染色を行えること、また、がん組織においても全ての症例でがん細胞が染まるわけではなくＣＤ２６陰性症例もあることを確認していたが、図２Ａに示すように、ヒトＣＤ２６をほとんど発現していないＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ、ＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈＲＮＡ、Ａ５４９のいずれも、ヒトＣＤ２６を発現しているＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡと同様に褐色に染色され、非特異的な結合が観察された。新たな４２９クローンを検討した結果、ＣＤ２６陽性／陰性がん細胞株を染め分けられる５クローンを得た。中でも特に優れた染色性を示した２クローン（Ｕ１６−３、Ｕ３８−８）の免疫染色の結果を図２Ａに示す。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体と比較しても、ＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡの両細胞株で明瞭な染色が観察され、一方で、ＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ、ＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈＲＮＡ、Ａ５４９のいずれもバックグラウンドが非常に低く、非特異的な染色は見られなかった。このことから、この２クローンはヒトＣＤ２６陽性／陰性がん細胞株の細胞ブロックの染め分けをすることができ、シグナル・ノイズ比が極めて優れていることが示された。さらに、この２クローンの培養上清から精製したＩｇＧ抗体を用いて、免疫染色の最適濃度を検討した結果、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体が１〜２μｇ／ｍＬであったのに対し、Ｕ１６−３は０．１〜０．２μｇ／ｍＬ、Ｕ３８−８は０．５μｇ／ｍＬとＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のポリクローナル抗体よりもさらに低濃度の抗体量で染色が可能であった（データ未掲載）。
この２クローンがヒトＣＤ２６タンパク質に対して特異的に結合することをさらに確認するために、吸収試験を行った。過剰量の可溶性ヒトＣＤ２６タンパク質と４℃で一晩反応させたこの２クローンの精製抗体を、一次抗体として用いた結果、図２Ｂに示すように、Ｕ１６−３、Ｕ３８−８のどちらもＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡ両細胞株に対する明瞭な染色が、可溶性ＣＤ２６によって完全に阻害された。
【００６０】
（３）新規精製ＩｇＧ抗体によるヒト正常組織、がん組織、及び、脱灰標本の免疫染色
２次スクリーニングで得られた、がん細胞株の細胞ブロックでヒトＣＤ２６を明瞭に染色できる２クローンの精製ＩｇＧ抗体を用いて、ヒト正常組織、及び、がん組織の免疫染色を検討した。図２Ｃに示すように、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体と同様に、Ｕ１６−３、Ｕ３８−８のどちらも肝臓の毛細胆管、近位尿細管の刷子縁、前立腺の管腔側等に、ヒトＣＤ２６の明瞭な染色が認められ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体と比較しても、染色パターン、染色の明瞭性、バックグラウンドの低さ、いずれも極めて優秀であることが示された。さらに、ヒトＣＤ２６陽性腫瘍である悪性中皮腫、肝細胞がん、腎細胞がん、前立腺がん、大腸腺がん、肺腺がんの免疫染色を検討した結果、いずれのがん組織に対しても、Ｕ１６−３、Ｕ３８−８のどちらもＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体と同様、若しくは、それ以上の明瞭な染色性を示すことが観察された（図２Ｃ、図２Ｄ）。これらの結果から、本発明で新たに樹立した抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体Ｕ１６−３とＵ３８−８は、ホルマリン固定パラフィン包埋処理によって変性したヒトＣＤ２６に対する結合特異性・結合親和性が非常に高い抗体であることが示された。
そのうえ、ヒト正常骨および骨髄組織を脱灰して作製した脱灰標本の免疫染色も検討した結果、Ｕ１６−３、Ｕ３８−８はどちらもＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体では描出できない細線維構造に対しても明瞭な染色性を示すことが観察された（図２Ｅ）。脱灰標本に対しても明瞭な染色性を示す抗体は非常に貴重であり、今後、脱灰操作が必要な骨、骨髄、歯、石灰化をともなう全ての正常組織あるいは病変組織におけるヒトＣＤ２６の発現局在の同定や、骨転移、骨髄転移、石灰化をともなう全ての腫瘍や炎症・変性疾患におけるヒトＣＤ２６の発現評価にも、これらの新規抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は極めて有用であることが示された。
【００６１】
（４）ウェスタンブロットによるヒトＣＤ２６に対する結合特異性の解析
本発明で新たに樹立した抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体Ｕ１６−３とＵ３８−８のヒトＣＤ２６に対する結合特異性をさらに解析するために、上述のヒトＣＤ２６陽性／陰性がん細胞株を用いてウェスタンブロットを行った。ウェスタンブロットのサンプルを調製する際、ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒで細胞全体を溶解した細胞溶解液に、ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、９５℃で５分間煮沸処理を行うことで、ヒトＣＤ２６タンパク質の立体構造が変性する。これまでに本発明者らが検討した結果、免疫染色と同様に、変性ヒトＣＤ２６に結合する必要があるウェスタンブロットに適した市販されている抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体はなく、ＣＤ２６研究ではウェスタンブロットにもＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体を用いてきた。図３に示すように、１９−３２ではヒトＣＤ２６の発現が一番高いＪｕｒｋａｔ−ＣＤ２６のみ分子量１１０ｋＤａの位置にＣＤ２６のバンドが検出されるが、ＭＳＴＯ−ＣＤ２６ではＣＤ２６のバンドが弱く検出され、また、ヒトＣＤ２６をほとんど発現していないＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ、ＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈＲＮＡ、Ａ５４９、Ｊｕｒｋａｔ ｐａｒｅｎｔでも同様に、様々な分子量のタンパク質に対する非特異的な結合が弱いながら観察された。このことから、１９−３２は少なくともがん細胞株のウェスタンブロットには適していないことが示された。一方で、Ｕ１６−３とＵ３８−８はどちらもＪｕｒｋａｔ−ＣＤ２６が最も発現が高く、次いで、ＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡの順に、分子量１１０ｋＤａの位置にＣＤ２６のバンドが検出され、且つ、分子量１１０ｋＤａ以外に非特異的なバンドも検出されないことが示された（図３）。さらに、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体と比較しても、同じ化学発光基質を用い、同じ露出時間で画像撮影を行った結果、Ｕ１６−３とＵ３８−８はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のポリクローナル抗体よりも低い抗体濃度でも、検出感度が遥かに高いことが示された（図３）。このことから、Ｕ１６−３とＵ３８−８はウェスタンブロットにおいても変性ヒトＣＤ２６への結合特異性・結合親和性が極めて高い抗体であることが示された。
【００６２】
（５）フローサイトメトリーによる生細胞膜上のｎａｔｉｖｅヒトＣＤ２６の検出
本発明者らはこれまでに、ヒトＣＤ２６完全長やヒトＣＤ２６部分欠損変異体、ヒト・ラットｓｗａｐ変異体を遺伝子導入した細胞を用いて、開発した抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体のエピトープの同定を、フローサイトメトリーにより行ってきた（Dong RP et al., 1998 Mol. Immunol. 35: 13-21., Hatano R et al., 2014 Diagn. Pathol. 9: 30.）。そこで、新たに樹立したＵ１６−３とＵ３８−８についても同様に、エピトープを同定するためにフローサイトメトリーを行った。図４に示すように、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体（クローン：Ｍ−Ａ２６１）、１９−３２、及び、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体では、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６が細胞膜上のヒトＣＤ２６の発現が最も高く、次いで、ＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡの順に検出され、ＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ、ＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈＲＮＡ、Ａ５４９、Ｊｕｒｋａｔ ｐａｒｅｎｔではいずれも発現がほとんど検出されなかった。これらの結果は、図１ＡのｍＲＮＡ発現レベル、図３のウェスタンブロットでのタンパク質発現レベルの解析結果と完全に相関していた。しかしながら一方で、Ｕ１６−３とＵ３８−８を用いた場合では、ＭＳＴＯ ｐａｒｅｎｔ、ＪＭＮ ＣＤ２６−ｓｈＲＮＡ、Ａ５４９、Ｊｕｒｋａｔ ｐａｒｅｎｔと同様に、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６、ＭＳＴＯ−ＣＤ２６、ＪＭＮ ｃｔｒｌ−ｓｈＲＮＡのいずれも細胞膜上のヒトＣＤ２６が検出されなかった（図４）。これらの結果から、Ｕ１６−３とＵ３８−８は、生細胞膜上の立体構造が維持されたｎａｔｉｖｅなヒトＣＤ２６タンパク質には結合できないことが強く示唆された。
【００６３】
（６）ＥＬＩＳＡによる可溶性ヒトＣＤ２６の検出
新たに樹立したＵ１６−３とＵ３８−８がフローサイトメトリーによるｎａｔｉｖｅなヒトＣＤ２６タンパク質の検出に使用できなかったため、ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡにてエピトープが既にわかっている各種抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体との競合阻害実験を行うことで、Ｕ１６−３とＵ３８−８のエピトープの同定を試みた。これまでに本発明者らが開発したエピトープが異なる抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体６クローンを、ＥＬＩＳＡプレートに固相化し、可溶性ヒトＣＤ２６タンパク質を結合させた後、Ｕ１６−３またはＵ３８−８を検出抗体として用いた結果、Ｕ１６−３もＵ３８−８もいずれの固相化抗体との組み合わせでも可溶性ヒトＣＤ２６を全く検出できなかった。Ｕ１６−３またはＵ３８−８をＥＬＩＳＡプレートに固相化し、エピトープが異なる抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体６クローンを検出抗体として用いた場合でも同様に、いずれの組み合わせでも可溶性ヒトＣＤ２６を全く検出できなかった（データ未掲載）。これらの結果から、Ｕ１６−３もＵ３８−８もｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡではｎａｔｉｖｅなヒトＣＤ２６タンパク質に結合できないことが示された。
しかしながら、驚いたことに、可溶性ヒトＣＤ２６タンパク質をＥＬＩＳＡプレートに固相化した場合では、Ｕ１６−３もＵ３８−８も可溶性ヒトＣＤ２６量依存的に高感度で検出することが可能であった（図５）。さらに、興味深いことに、煮沸処理を行った変性可溶性ヒトＣＤ２６タンパク質を固相化した場合では、本発明者らが以前開発した抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体５Ｆ８、１Ｆ７、１９−３２はいずれも、非変性可溶性ヒトＣＤ２６と比較して結合性が著しく低下した。一方、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体は、変性可溶性ヒトＣＤ２６に対しても非変性可溶性ヒトＣＤ２６と同等の結合性を示し、Ｕ１６−３とＵ３８−８は非変性可溶性ヒトＣＤ２６よりもむしろ変性可溶性ヒトＣＤ２６への結合性の方が高く、少量のヒトＣＤ２６を固相化した際に著明な差が認められた（図５）。
以上の免疫染色、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡの検討から、本発明者らが新たに樹立したＵ１６−３とＵ３８−８は、ヒトＣＤ２６を発現していないがん細胞中のタンパク質に対して非特異的に結合することなく、変性ヒトＣＤ２６への結合親和性が極めて高い性質を有する抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体であり、がんの病理組織の臨床診断（免疫染色によるヒトＣＤ２６の発現評価）に耐え得る明瞭な染色性を示す新たな抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体であることが強く期待される。さらに、今後のヒトＣＤ２６の基礎研究分野においても適用がおおいに期待できる。
【００６４】
（７）Ｕ１６−３及びＵ３８−８のＣＤＲ配列解析
ハイブリドーマＵ１６−３及びＵ３８−８を溶解し、ＤＮａｓｅＩ処理を行った後、全ＲＮＡの精製を行った。調製した全ＲＮＡを鋳型として、マウス抗体（ＩｇＧ）重鎖に特異的なＰｒｉｍｅｒと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。同様に、調製した全ＲＮＡを鋳型として、マウス抗体の軽鎖に特異的なＰｒｉｍｅｒと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。
重鎖に特異的なＰｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡを鋳型として、マウス抗体（ＩｇＧ）重鎖定常領域に特異的なＰｒｉｍｅｒと、逆転写反応でｃＤＮＡの５′端に付加されたオリゴヌクレオチドに対するＰｒｉｍｅｒ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ反応を行った。同様に、軽鎖に特異的なＰｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡを鋳型として、軽鎖定常領域に特異的なＰｒｉｍｅｒと、逆転写反応でｃＤＮＡの５′端に付加されたオリゴヌクレオチドに対するＰｒｉｍｅｒ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ反応を行った。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、想定の大きさのＰＣＲ産物をゲルから切り出し、精製を行った。制限酵素を用いてプラスミドベクターにＰＣＲ産物をＬｉｇａｔｉｏｎし、得られたベクターを用いて常法により形質転換を行った。ベクターが遺伝子導入されたコロニーをクローニングし、塩基配列解析用Ｐｒｉｍｅｒを用いてＳｅｑｕｅｎｃｅ反応を行い、プラスミド領域の片側から目的遺伝子配列を含む塩基配列の解析を行った。得られた塩基配列情報からアミノ酸配列を取得した。
得られたＵ１６−３及びＵ３８−８のＶＨアミノ酸配列を配列番号１０に示す（両者のアミノ酸配列は同じであった）。Ｕ１６−３のＶＬアミノ酸配列を配列番号１１に示す。Ｕ３８−８のＶＬアミノ酸配列を配列番号１２に示す。また、Ｕ１６−３及びＵ３８−８の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３を配列番号１〜３にそれぞれ示す。Ｕ１６−３の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を配列番号４〜６にそれぞれ示す。Ｕ３８−８の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を配列番号７〜９にそれぞれ示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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