(57)【要約】  【課題】ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬ解析により、そのＱＴＬの指標となるマーカー等を特定し、それを利用したニワトリの生産・育種方法を提供する。  【解決手段】ニワトリのＺ染色体上のＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０および／またはｒｓ３１７４３６６２２の塩基の情報は、前記ＱＴＬの指標とすることができる。その情報を利用したマーカーアシスト育種により、歯ごたえのある胸肉を生産するニワトリを育種することができるようになる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリ（Gallus gallus var. domesticus）のＺ染色体上のＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０および／またはｒｓ３１７４３６６２２の塩基の情報を、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの指標として利用する方法。
【請求項２】
前記情報が、前記ＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０の塩基がＡかＧか、および／または前記ＳＮＰマーカーｒｓ３１７４３６６２２の塩基がＣかＴか、の情報である、請求項１に記載の利用方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法を利用したニワトリの鑑定方法であって、
鑑定の対象とするニワトリ（以下「被験ニワトリ」と呼ぶ。）における前記ＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０および／またはｒｓ３１７４３６６２２の塩基の情報と、所定の胸肉の剪断力価を有するニワトリ（以下「基準ニワトリ」と呼ぶ。）における対応するＳＮＰマーカーの塩基の情報と、一致するか否かを判定する工程を含む、鑑定方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法を利用したニワトリの鑑定方法であって、
被験ニワトリにおける前記ＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０の塩基が基準ニワトリの当該ＳＮＰマーカーの塩基Ａと一致するか否か、および／または被験ニワトリにおける前記ＳＮＰマーカーｒｓ３１７４３６６２２の塩基が基準ニワトリの当該ＳＮＰマーカーの塩基Ｃと一致するか否か、を判定する工程を含む、鑑定方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の鑑定方法により選抜された、基準ニワトリとＳＮＰマーカーの塩基が一致する被験ニワトリ、またはその後代を、交配に用いる、ニワトリの生産方法。
【請求項６】
請求項５に記載のニワトリの生産方法を複数回行うことを含む、ニワトリの育種方法。
【請求項７】
前記基準ニワトリが日本鶏である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記被験ニワトリが、日本鶏とその他のニワトリとの交配種、またはその後代である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の方法を利用した、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与する遺伝子の特定方法であって、
基準ニワトリにおける、前記ＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０およびｒｓ３１７４３６６２２の間の領域に存在する遺伝子に関連する塩基配列を、基準ニワトリとは異なる胸肉の剪断力価を有するニワトリ（以下「参照ニワトリ」と呼ぶ。）における、対応する部位の塩基配列と比較する工程を含む、特定方法。
【請求項１０】
前記２つのＳＮＰマーカーの間の領域に存在する前記遺伝子が、ＭＡＳＴ４（microtubule associated serine/threonine kinase family member 4）、ＣＤ１８０（CD180 molecule）、ＬＯＣ１０１７５０２１６、ＬＯＣ１０７０５１８９７およびＰＩＫ３Ｒ１（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1）からなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項９に記載の特定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリ胸肉の剪断力価に関与する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）およびその利用方法に関する。より詳しくは、本発明は、ニワトリ胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの指標として利用できるＳＮＰマーカー、当該ＳＮＰマーカーを利用したニワトリの生産・育種方法、およびニワトリ胸肉の剪断力価に関与する遺伝子などに関する。
【背景技術】
【０００２】
今日流通している鶏肉のほとんどは、「ブロイラー肉」と呼ばれる、白色コーニッシュ雄と白色プリマスロック雌を交配して得られる雑種第一世代（Ｆ１）の肉である。この一般ブロイラーは、成長速度が極めて速く３９〜５６日齢で出荷されるため、安価かつ大量に供給が可能である。わが国では１９６０年代より導入され漸次その利用量が増加して来た。しかし、成長速度に特化した育種改良の結果、肉質は水っぽく、締りや旨みが少ないといった欠点が目立つ。そこで１９８０年代より「歯ごたえとコク」のある高品質な鶏肉の需要が高まり、特殊肉用鶏の作出が全国各地で行われ始めた。しかし、特殊肉用鶏のほとんどは、日本在来品種と外国品種との交配により作出した雑種を利用しているに過ぎず、「歯ごたえとコク」については一定の評価を得ているものの、成長スピードや飼料効率については既存の一般ブロイラーには遠く及ばない。「歯ごたえとコク」のある肉を産出するニワトリの真の育種改良を考える場合、成長スピード、産肉量および「旨さ」を兼ね備えた純粋品種もしくは系統の作出、あるいは雑種生産用の種鶏となる品種や系統の作出が必要になる。
【０００３】
鶏肉の「歯ごたえ」、すなわち鶏肉における「硬さ（弾力）」は、美味しさを決める要因の一つであり、その評価には剪断力価が広く用いられている。剪断力価は連続的な変異を示すため、体重や産卵量と同様に、量的形質であると考えられる。量的形質は、飼育場の形状や飼料の種類、あるいは飼育温度といった環境要因によって、その形質発現に影響を受ける。量的形質は複数の遺伝子座によって支配されており、その遺伝子座を量的形質遺伝子座（Quantitative Trait Loci：ＱＴＬ）と呼ぶ。
【０００４】
統計遺伝学の発達ならびにコンピューターの性能の発達により、近年では、環境要因の補正を行い遺伝能力のみを評価し選抜するBest Linear Unbiased Prediction（ＢＬＵＰ）法を用いることが選抜育種の主流になっている。このＢＬＵＰ法の登場により、環境要因の予測が可能になり遺伝能力の推定が可能になりはしたが、この方法は家畜の測定値（表現型値）を利用するものであって、家畜の生産形質に関与する優良遺伝子そのものの情報を利用するわけではない。選抜育種はより正確であることが望ましい。従って、表現型値だけに頼るのではなく、形質に関連する優良遺伝子の情報も選抜育種に利用できれば、より正確に家畜の育種改良を行うことができる。
【０００５】
優良遺伝子の発見に先立ち、まずその遺伝子が染色体上のどこに存在するか把握する必要がある。この位置を把握するための解析法としてＱＴＬ解析がある。ＱＴＬ解析を行い、優良遺伝子の染色体上の位置が明らかになれば、そのＱＴＬ近傍のＤＮＡマーカーを利用することにより、表現型値にとらわれないマーカーアシスト育種（さらに解析を進めた場合には、ジーンアシスト育種）が可能になる。
【０００６】
ニワトリに関係するＱＴＬとして、特許文献１には卵殻強度の改善に関連するＱＴＬについて記載されており、特許文献２には、鶏肉および／または鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸の含量の向上に関連するＱＴＬについて記載されている。非特許文献１には、大シャモとホワイトレグホンを交配させて、肉の色に関連するＱＴＬのマッピングを行ったことが記載されている。
【０００７】
一方、鶏肉の剪断力価の評価や比較については、現在、特殊肉用鶏を中心に日本各地で研究が行われているが（非特許文献２〜５）、剪断力価を支配しているＱＴＬの染色体上の位置については世界的に報告例がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開２００９／１４４８０９号
【特許文献２】特開２０１４−５０３２９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Yoshida et al., Journal of Poultry Science, 50(3), 198-205, 2013.
【非特許文献２】作田 敦, 垪和 靖俊, 生井 和夫, 御幡 壽 (2003) 高品質特殊鶏肉生産技術確立試験  茨城県畜産センター研究報告 35: 105-109.
【非特許文献３】宮腰雄一, 本間紀之, 鈴木ひろみ (2005) 蜀鶏を活用した「にいがた地鶏」の作出. 新潟県畜産研究センター研究報告第 15.
【非特許文献４】松井 繁幸, 池谷 守司 (2012) 新銘柄地鶏「フジ小軍鶏」の肉質評価. 静岡県畜産技術研究所中小家畜研究センター研究報告 5: 14-19.
【非特許文献５】小嶋禎夫, 三枝弘育 (2013) 烏骨鶏肉の理化学特性−肉用鶏との比較. 東京農総研研報 8: 11-18.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬ解析により、そのＱＴＬの指標となるマーカー、さらにはＱＴＬに関与する遺伝子を特定し、それらを利用して歯ごたえのある胸肉を生産するニワトリを生産・育種する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、Ｚ染色体上のＳＮＰ（一塩基多型）マーカーとして知られている「ｒｓ１６７６１８１０」および「ｒｓ３１７４３６６２２」の塩基が、ニワトリの胸肉の剪断力価がそれぞれ高い品種および低い品種の代表である、大シャモおよび白色プリマスロックの間で相違していることなどから、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの指標の一つとして利用できることなどを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は下記の事項を包含する。
［１］
ニワトリ（Gallus gallus var. domesticus）のＺ染色体上のＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０および／またはｒｓ３１７４３６６２２の塩基の情報を、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの指標として利用する方法。
［２］
前記情報が、前記ＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０の塩基がＡかＧか、および／または前記ＳＮＰマーカーｒｓ３１７４３６６２２の塩基がＣかＴか、の情報である、項１に記載の利用方法。
［３］
項１に記載の方法を利用したニワトリの鑑定方法であって、
鑑定の対象とするニワトリ（以下「被験ニワトリ」と呼ぶ。）における前記ＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０および／またはｒｓ３１７４３６６２２の塩基の情報と、所定の胸肉の剪断力価を有するニワトリ（以下「基準ニワトリ」と呼ぶ。）における対応するＳＮＰマーカーの塩基の情報と、一致するか否かを判定する工程を含む、鑑定方法。
［４］
項２に記載の方法を利用したニワトリの鑑定方法であって、
被験ニワトリにおける前記ＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０の塩基が基準ニワトリの当該ＳＮＰマーカーの塩基Ａと一致するか否か、および／または被験ニワトリにおける前記ＳＮＰマーカーｒｓ３１７４３６６２２の塩基が基準ニワトリの当該ＳＮＰマーカーの塩基Ｃと一致するか否か、を判定する工程を含む、鑑定方法。
［５］
項３または４に記載の鑑定方法により選抜された、基準ニワトリとＳＮＰマーカーの塩基が一致する被験ニワトリ、またはその後代を、交配に用いる、ニワトリの生産方法。
［６］
項５に記載のニワトリの生産方法を複数回行うことを含む、ニワトリの育種方法。
［７］
前記基準ニワトリが日本鶏である、項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
［８］
前記被験ニワトリが、日本鶏とその他のニワトリとの交配種、またはその後代である、項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
［９］
項１または２に記載の方法を利用した、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与する遺伝子の特定方法であって、
基準ニワトリにおける、前記ＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０およびｒｓ３１７４３６６２２の間の領域に存在する遺伝子に関連する塩基配列を、基準ニワトリとは異なる胸肉の剪断力価を有するニワトリ（以下「参照ニワトリ」と呼ぶ。）における、対応する部位の塩基配列と比較する工程を含む、特定方法。
［１０］
前記２つのＳＮＰマーカーの間の領域に存在する前記遺伝子が、ＭＡＳＴ４（microtubule associated serine/threonine kinase family member 4）、ＣＤ１８０（CD180 molecule）、ＬＯＣ１０１７５０２１６、ＬＯＣ１０７０５１８９７およびＰＩＫ３Ｒ１（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1）からなる群より選ばれる少なくとも一つである、項９に記載の特定方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により特定された２つのＳＮＰマーカーを利用し、胸肉の剪断力価に優れた品種と同じ塩基を有するかどうかを判定することにより、歯ごたえのある旨い胸肉を生産するための遺伝的因子を保有するニワトリの個体を効率的に選抜することが可能となる。そのようにして選抜された個体を、成長速度や産肉量など他の形質に優れた個体と交配することにより、既存のものよりも肉質に優れた品種を育成することができるようになる。また、ＳＮＰマーカーを利用したマーカーアシスト育種に加え、将来的にはより効率的なジーンアシスト育種も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明により特定されたＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０のゲノムマップ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/より）。
【図２】本発明により特定されたＳＮＰマーカーｒｓ３１７４３６６２２のゲノムマップ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/より）。
【図３】実施例により特定された２つのＳＮＰの間の領域にある、５つの遺伝子を示すゲノムマップ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/より）。
【図４】実施例で造成した、ニワトリの胸肉剪断力価に関するＱＴＬ解析のための、大シャモ（ＯＳ）および白色プリマスロック（ＷＰＲ）に基づくＦ２資源家系の家系図。括弧書きの数字は個体番号を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明では、ＳＮＰマーカー「ｒｓ１６７６１８１０」および／または「ｒｓ３１７４３６６２２」のＳＮＰ塩基の情報を、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの指標として利用する。ニワトリの性染色体はＺＷ型で、雄はホモ（ＺＺ）、雌はヘテロ(ＺＷ)であるが、ｒｓ１６７６１８１０およびｒｓ３１７４３６６２２はＺ染色体上の１３７ｃＭの位置、それぞれ２１０１１７２７番目および約２１６２３８８０番目の塩基におけるＳＮＰマーカーである。これらの２つのＳＮＰマーカーの情報は公開されており、例えば米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供する情報にアクセスすることができる（図１、図２参照）。本明細書において、上記２つのＳＮＰマーカーを「本発明のＳＮＰマーカー」、それらの塩基を「本発明のＳＮＰ塩基」と呼ぶことがある。
【００１６】
ｒｓ１６７６１８１０およびｒｓ３１７４３６６２２は、ニワトリの品種間で、特に胸肉の剪断力価が相違する品種間で、塩基の相違が見られる。ｒｓ１６７６１８１０は、塩基Ａ／Ｇの多型であり、胸肉の剪断力価が高い品種はこの塩基がＡである頻度が高く、胸肉の剪断力価が低い品種はこの塩基がＧである頻度が高い、という傾向にある。例えば、前者の代表である大シャモの雄は、ゲノム中の２つのＺ染色体におけるｒｓ１６７６１８１０がＡのホモであり（遺伝子型Ａ／Ａ）、後者の代表である白色プリマスロックの雌は、ゲノム中の１つのＺ染色体におけるｒｓ１６７６１８１０がＧである（遺伝子型Ｇ／−）。
【００１７】
ｒｓ３１７４３６６２２は、塩基Ｃ／Ｔの多型であり、胸肉の剪断力価が高い品種はこの塩基がＣである頻度が高く、胸肉の剪断力価が低い品種はこの塩基がＴである頻度が高い、という傾向にある。例えば、前者の代表である大シャモの雄は、ゲノム中の２つのＺ染色体におけるｒｓ３１７４３６６２２がＣのホモであり（Ｃ／Ｃ）、後者の代表である白色プリマスロックの雌は、ゲノム中の１つのＺ染色体におけるｒｓ３１７４３６６２２がＴである（Ｔ／−）。
【００１８】
このような相関性から、２つのＳＮＰマーカーのいずれか一方または両方を、具体的にはｒｓ１６７６１８１０の塩基がＡかＧか（Ｚ染色体をホモで持つ雄のニワトリについては、Ａ／Ａか、Ａ／Ｇか、Ｇ／Ｇか；Ｚ染色体をヘテロで持つ雌のニワトリについては、Ａ／−か、Ｇ／−か）、および／またはｒｓ３１７４３６６２２の塩基がＣかＴか（Ｚ染色体をホモで持つ雄のニワトリについては、Ｃ／Ｃか、Ｃ／Ｔか、Ｔ／Ｔか；Ｚ染色体をヘテロで持つ雌のニワトリについては、Ｃ／−か、Ｔ／−か）、の情報を、胸肉の剪断力価に関するＱＴＬの指標として利用することができる。
【００１９】
本発明のＳＮＰ塩基の情報をニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの指標として利用することにより、目的に応じた様々な方法への応用が可能となる。応用方法は特に限定されるものではないが、例えば、第１の応用として「ニワトリの鑑定方法」が挙げられ、第２の応用として「ニワトリの胸肉の剪断力価に関与する遺伝子の特定方法」が挙げられる。
【００２０】
本発明によるニワトリの鑑定方法（本発明のＳＮＰ塩基の情報の第１の応用）は、鑑定の対象とするニワトリ（本明細書において「被験ニワトリ」と称する。）における本発明のＳＮＰ塩基の情報と、所定の胸肉の剪断力価を有するニワトリ（本明細書において「基準ニワトリ」と称する。）における本発明のＳＮＰ塩基の情報とを比較する工程を含む方法である。上記比較において両方の情報が一致すれば、被験ニワトリは基準ニワトリと同じ、胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬ、すなわち胸肉の剪断力価に関与する遺伝子を含むＤＮＡ領域（本発明のＳＮＰマーカーに隣接する、または２つのそれらに挟まれた領域）を保有していると推定することができる。例えば、胸肉の剪断力価が高いことが知られている大シャモを基準ニワトリとして選択した場合、その基準ニワトリと同じ遺伝子型を有する被験ニワトリは、胸肉の剪断力価を向上させるのに適した遺伝的因子を保有していると推定できる。「所定の胸肉の剪断力価を有するニワトリ」は、典型的には、ニワトリの品種間で比較したときに相対的に高い剪断力価を有する品種のニワトリであるが、目的によっては、相対的に低い剪断力価を有する品種のニワトリ、または中間の剪断力価を有する品種のニワトリであってもよい。
【００２１】
被験ニワトリおよび基準ニワトリの品種は、ニワトリ（Gallus gallus var. domesticus）に含まれる様々な品種の中から選択することができ、特に限定されるものではない。ニワトリは一般的に、用途によって肉用種、卵用種および卵肉兼用種に分類することができるが、本発明は鶏肉のおいしさに影響する胸肉の剪断力価のＱＴＬに関係するものであることから、被験ニワトリおよび／または基準ニワトリとして、肉用種または卵肉兼用種を用いることが好ましい。肉用種の例には、軍鶏、白色コーニッシュ、ブラマ、コーチンなどが挙げられる。卵肉兼用種の例には、横斑プリマスロック、白色プリマスロック、ロードアイランドレッド、ニューハンプシャーレッド、名古屋などが挙げられる。
【００２２】
基準ニワトリとしては、例えば、日本で作出され、日本を原産とする品種で、通常は昭和初期くらいまでに作出されたものを指す「日本鶏」（日本在来鶏）を用いることができる。日本鶏は、「観賞用品種」（肉質に優れる品種も含まれている）と「実用品種」に大別でき、観賞用品種は「天然記念物」（１５品種＋２グループ）および「天然記念物以外」に分類できる。観賞用品種のうち天然記念物としては、例えば、次の１５品種と、「地鶏グループ」（４品種）および「軍鶏グループ」（７品種）の２グループ、合計２６品種が挙げられる：１５品種＝声良鶏、比内鶏、蜀鶏、蓑曳鶏、河内奴鶏、小国鶏、矮鶏、烏骨鶏、黒柏鶏、土佐のオナガドリ、東天紅鶏、蓑曳矮鶏、鶉矮鶏、地頭鶏、薩摩鶏；地鶏グループ＝土佐地鶏、三重地鶏、岐阜地鶏、岩手地鶏；軍鶏グループ＝大軍鶏（大シャモ）、小軍鶏、八木戸鶏、大和軍鶏、金八鶏、南京軍鶏、越後南京軍鶏。観賞用品種のうち天然記念物以外としては、例えば次の品種が挙げられる：会津地鶏、愛媛地鶏、雁鶏、久連子鶏、佐渡髭地鶏、芝鶏、徳地地鶏、チャーン。実用品種としては、例えば次の品種が挙げられる：土佐九斤、宮地鶏、名古屋、三河、出雲、熊本。
【００２３】
被験ニワトリとしては、基準ニワトリと同様のニワトリ、または基準ニワトリと「その他のニワトリ」との交配種、あるいはその後代を用いることができる。
【００２４】
「その他のニワトリ」は、胸肉の剪断力価以外の形質に優れた品種、例えば成長スピードと産肉量に優れている白色プリマスロックなどであり、育種の目的に応じて選択することができる。
【００２５】
基準ニワトリまたは被験ニワトリとしては、日本在来鶏由来の血液百分率が５０％以上の国産銘柄鶏（地鶏、特殊肉用鶏）を用いることもできる。そのような国産銘柄鶏としては、例えば次のものが挙げられる〔https://ja.wikipedia.org/wiki/地鶏〕（国産銘柄鶏ガイドブック2007:2012）：北海地鶏（北海道）、中札内地鶏（北海道）、桜姫鶏（北海道）、青森シャモロック（青森県）、南部かしわ（岩手県）、やまがた地鶏（山形県）、川俣シャモ（福島県）、にいがた地鶏（新潟県）、奥久慈しゃも（茨城県）、やさとしゃも（茨城県）、筑波地鶏（茨城県）、栃木しゃも（栃木県）、上州地鶏（群馬県）、タマシャモ（埼玉県）、房総地どり（千葉県）、甲州地どり（山梨県）、信州黄金シャモ（長野県）、美濃地鶏（岐阜県）、奥美濃古地鶏（郡上地鶏）（岐阜県）、一黒シャモ（静岡県）、駿河シャモ（静岡県）、純系名古屋コーチン（愛知県）、熊野地どり（三重県）、松阪地どり（三重県）、伊勢二見ヶ浦夫婦地鶏（三重県）、近江しゃも（滋賀県）、京地どり（京都府）、地鶏  丹波黒どり（京都府）、京赤地どり（京都府）、葵之地鶏（大阪府）、丹波地どり（兵庫県）、松風地どり（兵庫県）、播州地どり（兵庫県）、但馬地どり（兵庫県）、大和肉鶏（奈良県）、紀州地鶏（和歌山県）、鳥取産大山地どり（大山シャモ）（鳥取県）、鳥取地どり ピヨ（鳥取県）、おかやま地どり（岡山県）、岡山桃太郎地どり（岡山県）、長州黒かしわ（山口県）、阿波尾鶏（徳島県）、讃岐コーチン（香川県）、地鶏  瀬戸赤どり（香川県）、伊予赤どり（愛媛県）、伊予路しゃも（愛媛県）、媛っこ地鶏（愛媛県）、奥伊予地鶏（愛媛県）、道後地鶏（愛媛県）、土佐はちきん地鶏（高知県）、土佐ジロー（高知県）、はかた地どり（福岡県）、つしま地どり（長崎県）、天草大王（熊本県）、熊本コーチン（熊本県）、豊のしゃも（大分県）、おおいた冠地どり（大分県）、みやざき地頭鶏（宮崎県）、さつま地鶏（鹿児島県）、さつま若しゃも（鹿児島県）。
【００２６】
例えば、大シャモと白色プリマスロックとの間では、本発明のＳＮＰ塩基が相違している。それらの２品種を交配させて生まれた個体（Ｆ１）、またはその後代（Ｆ２以降）のＳＮＰ塩基が、大シャモと白色プリマスロックのどちらのＳＮＰ塩基と同じであるかを調べることによって、どちらの品種に由来する遺伝的因子を保有しているかを判定することができる。言い換えれば、上記Ｆ１等を被験ニワトリ、大シャモを基準ニワトリとし、それらの間でＳＮＰ塩基が一致するか否か、つまりＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０の塩基がＡであるか否か、および／または被験ニワトリにおける当該ＳＮＰマーカーｒｓ３１７４３６６２２の塩基がＣであるか否かを判定し、少なくとも一方のＳＮＰ塩基、好ましくは両方のＳＮＰ塩基が一致する被験ニワトリを、大シャモに由来する遺伝的因子を保有している個体として選抜することができる。そのような判定により選抜された個体を交配に用いることにより、大シャモに由来する、胸肉の剪断力価を高めるのに適した遺伝的因子を保有するニワトリを産生し、さらにはそのような優れた遺伝的因子を備えた新たな品種を育成することができる。
【００２７】
具体的には、例えばＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０を利用する実施形態において、遺伝子型Ａ／Ａの大シャモの雄（基準ニワトリ）と、遺伝子型Ｇ／−の白色プリマスロックの雌を交配すると、生まれてくるＦ１には、遺伝子型Ａ／Ｇの雄と、遺伝子型Ａ／−の雌が生まれる。この具体例の場合、全てのＦ１が少なくとも１つのＡをゲノム中に必ず有する。このＦ１の雄（Ａ／Ｇ）と、白色プリマスロックの雌（Ｇ／−）を交配（戻し交配）した場合、生まれてくるＢ１には、遺伝子型Ａ／Ｇの雄、遺伝子型Ｇ／Ｇの雄、遺伝子型Ａ／−の雌および遺伝子型Ｇ／−の雌が含まれる。Ｂ１を被験ニワトリとし、そのｒｓ１６７６１８１０の塩基の遺伝子型を調べ、遺伝子型がＡ／Ｇである、つまり基準ニワトリと同じ塩基（Ａ）を有していると判定された被験ニワトリを選抜する。その選抜されたＢ１（Ａ／Ｇ）と、白色プリマスロックの雌（Ｇ／−）を用いて、再び戻し交配をし、遺伝子型Ａ／Ｇの雄のＢ２を選抜する。このように、Ｚ染色体としてＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０の塩基が基準ニワトリと同じＡであるものを保有しているかどうかに基づいて、個体の選抜と、それを用いた戻し交配とを複数回繰り返す。最終的に、Ｂｎ−１同士で、遺伝子型Ａ／Ｇの雄と、遺伝子型Ａ／−の雌を交配し、生まれたＢｎの中から、遺伝子型Ａ／Ａの雄と遺伝子型Ａ／−の雌を選抜すると、これらから生まれるＢｎ＋１は雄も雌も必ず、少なくとも１つの、基準ニワトリ（大シャモ）に由来するＳＮＰ塩基（Ａ）を有する。このような育種方法により、胸肉の剪断力価を高める大シャモに由来する遺伝的因子を保有しつつ、それ以外の形質、例えば成長スピードや産肉量に関する遺伝的背景についてはほぼ白色プリマスロックと同じものを保有する、新たなニワトリの系統を作出することができる。もう一方のＳＮＰマーカーｒｓ３１７４３６６２２を用いた場合も、または両方のＳＮＰマーカーを用いた場合も、上記と同様にして、本発明の育種方法を実施することができる。
【００２８】
本発明では２つの所定のＳＮＰ塩基の情報を、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの指標として利用するが、将来的にニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの他の指標（例えば本発明の所定の２つ以外のＳＮＰマーカー、マイクロサテライトマーカーまたはその他のＤＮＡマーカー）が発見されれば、そのような新たな指標と本発明による指標とを組み合わせることで、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するより精度の高いＱＴＬを提供できる可能性がある。
【００２９】
本発明によるニワトリの胸肉の剪断力価に関与する遺伝子の特定方法（本発明のＳＮＰ塩基の情報の第２の応用）は、基準ニワトリにおける２つの所定のＳＮＰマーカーｒｓ１６７６１８１０およびｒｓ３１７４３６６２２の間の領域に存在する遺伝子に関連する塩基配列を、基準ニワトリとは異なる（統計学的に有意差のある）胸肉の剪断力価を有するニワトリ（本明細書において「参照ニワトリ」と呼ぶ。）における、対応する部位の塩基配列と比較する工程を含む方法である。比較の結果、一つまたは複数の変異箇所が見つかれば、その変異が、遺伝子が発現するタンパク質のアミノ酸配列（すなわちタンパク質の作用の強さや機能）、発現量、その他の特性によって、胸肉の剪断力価に影響を及ぼしているかどうかを検証する。影響が確認されれば、その遺伝子を、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するものと特定することができる。このような方法により特定される遺伝子を用いることにより、２つのＳＮＰマーカーよりも直接的に、胸肉の剪断力価に関連する遺伝的因子を保有しているかどうかを判定することが可能となる。
【００３０】
変異の有無を検出する対象となる「遺伝子に関連する塩基配列」は、遺伝子の転写領域、特にタンパク質を構成するエキソンの部分であってもよいし、非転写領域、特にタンパク質の発現量に大きく関係するプロモーターの部分であってもよい。「変異」は、塩基の置換、挿入、欠失などのいずれであってもよい。
【００３１】
「参照ニワトリ」としては、例えば、前述した被験ニワトリの説明において基準ニワトリと交配させる「その他のニワトリ」として挙げた白色プリマスロックなどが挙げられる。
【００３２】
本発明の２つのＳＮＰマーカーの間の領域には、microtubule associated serine/threonine kinase family member 4（ＭＡＳＴ４）、CD180 molecule（ＣＤ１８０）、ＬＯＣ１０１７５０２１６、ＬＯＣ１０７０５１８９７およびphosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1（ＰＩＫ３Ｒ１）の５つの遺伝子が存在する（図３参照）。これらの５つの遺伝子の情報も公開されており、例えば米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供する情報にアクセスすることができる。ｒｓ１６７６１８１０はＭＡＳＴ４のイントロン領域に位置しており、ｒｓ３１７４３６６２２はＰＩＫ３Ｒ１のイントロン領域に位置している。上記５つの遺伝子は本発明の２つのＳＮＰマーカーと連鎖しており、前述した２つのＳＮＰマーカーと胸肉の剪断力価との相関性から、上記５つの遺伝子のうちの少なくとも１つがニワトリの胸肉の剪断力価に関与しているものと推測される。本明細書において、上記５つの遺伝子を「本発明の候補遺伝子」と呼ぶことがある。
【００３３】
本発明における所定のＳＮＰマーカーおよび所定の候補遺伝子の塩基（配列）は、ニワトリ（被験ニワトリ、基準ニワトリ、参照ニワトリ）から採取された試料に由来するＤＮＡから決定することができる。試料は、ニワトリのＤＮＡの塩基配列を決定するための公知のものであればよいが、例えば、ニワトリの体細胞を含む臓器、組織、血液等の体液、鶏卵などが挙げられ、好ましくは血液である。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡでも、ｃＤＮＡでもよい。ｃＤＮＡは、常法に従って、試料からｍＲＮＡを抽出、精製後、逆転写酵素によって合成することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡは、当業者に公知の方法、例えばフェノール・クロロホルム法、市販のゲノムＤＮＡ抽出キット、ＲＮＡ抽出キット等を用いて抽出することができる。
【００３４】
ＳＮＰマーカーおよび候補遺伝子の塩基（配列）を決定するための方法は特に限定されたものではなく、従来公知の方法を適用できるが、例えば、ＭＡＭＡ法（アレル特異的増幅法）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型法）法、ＰＣＲＤＧＧＥ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＣＲ−ＲＤ法、ＰＣＲ−ＭＰＨ法、シークエンス法、ミニシークエンシング法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、一塩基伸長法、ＳＮａＰ  ｓｈｏｔＴＭ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙ法等が挙げられる。
【００３５】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、検出したい変異部位を含む遺伝子領域をＰＣＲ法により増幅し、変異部位を認識する制限酵素でそのＰＣＲ産物を消化し、電気泳動にかけ、制限酵素による切断の有無から変異の有無を検出する方法である。まず、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型にしてＳＮＰを含むＤＮＡ領域の増幅を行う。例えば、上記ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片にハイブリダイズするプライマーを用いて、ＤＮＡ試料を鋳型としたＰＣＲを実施する。ＰＣＲ法は、鋳型となるＤＮＡとその両端において相補的であり優先的にハイブリダイズする２個のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＤＮＡ鎖の熱変性、プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼによる相補鎖の合成からなるプライマー伸長合成を行うサイクルを１０〜８０回繰り返す工程を含む。これらの操作は、通常、反応液及び耐熱性ポリメラーゼを含む市販の試薬キット、及び市販のＰＣＲ装置等を利用して簡便に実施できる。ＰＣＲ反応条件、試薬、プライマー、制限酵素等の条件についても、装置のマニュアル、実験又は経験によって、最適なものを容易に選定することができる。
【００３６】
ＭＡＭＡ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）法では、一方のプライマーを多型部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを、多型部位を含まない領域に対合できるように設計し、設計されたプライマーペアを用いてＤＮＡ増幅法を実施する。ＤＮＡ試料中に多型に該当するいずれかのアレルが存在すると増幅産物が得られ、これが存在しないと増幅産物が得られない。従って、増幅産物の有無を検出することによって、特定のアレルの有無を判定できる。
【００３７】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などにおいて、所定の領域の塩基配列を増幅させるために用いられるプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）は、本発明のＳＮＰマーカーおよびその近傍の塩基配列や、本発明の候補遺伝子およびその近傍の塩基配列に関する情報は公開されているから、当業者であれば容易に、適切な長さおよび塩基配列を有するものを設計して作成し、適切な反応条件下で用いることができる。
【実施例】
【００３８】
ＱＴＬ解析を行うためには、解析用の資源家系を造成し、資源家系の各個体より表現型値および遺伝子型情報を収集する必要がある。資源家系とは、親世代、Ｆ１世代およびＦ２（もしくは戻し交配）世代から構成される１セットのことである。本実施例では、両親品種（親世代）に大シャモおよび白色プリマスロックを選定した。大シャモは代表的な日本鶏の１つであり、古くから闘鶏用に改良された品種である。闘鶏用品種のため筋肉質であり、その肉も極めて美味であるとの定評がある。そのため、特殊肉用鶏作出の際に雄系種鶏として頻用されている。一方、白色プリマスロックはアメリカ合衆国原産の本来卵肉兼用種であるが、肉用に特化した系統が作出され、一般ブロイラー生産やわが国での特殊肉養鶏の作出のための雌系種鶏として頻用されている。両品種は、外貌および性質が大きく異なっている（すなわち、両者の遺伝的背景は大きく異なっている）ため、この２品種を用いることにより、ＱＴＬ解析に用いるＤＮＡマーカーがより多く得られることが期待される。
【００３９】
［方法］
Ｆ２資源家系
本実施例では、独立行政法人家畜改良センター兵庫牧場より導入した大シャモ８３１系統（ＯＳ）ならびに同センター由来の白色プリマスロック１３系統（ＷＰＲ）を用いた。資源家系は、ＯＳ雄１個体、ＷＰＲ雌４個体に基づき造成された。親世代の雄１個体に対して雌４個体をそれぞれ交配させることによりＦ１世代個体を得た。その後、Ｆ１世代個体（雄４個体、雌１６個体）を全きょうだい交配することによりＦ２世代２１５個体を作出した。本実施例で造成したＦ２資源家系の家系図を図４に示す。
【００４０】
動物飼育条件
孵化させた雛を常時点灯、不断給餌、自由給水の条件のもと、育雛機内で育成した。育雛機は温源部と非温源部で構成されており、温源部を３０℃に設定し、雛が自由に移動できる環境下で飼育した。孵化時から７週齢まで市販の初生雛用飼料（ＣＰ：２２％，ＭＥ：２９００Ｋｃａｌ／ｋｇ）を与えた。
【００４１】
剪断力価測定
７週齢個体をＣＯ２ガスで深麻酔した後、片側の頸動脈を切断し、放血屠殺を行った（１０分間）。放血後の個体を７５℃で３０秒間湯浸し、脱毛器（ＮＳ−１，南部工業株式会社）を用いて脱毛した。右側の胸肉を４℃の条件下で４８時間保存し、皮を剥ぎ取った後に、繊維方向と平行に６．０ｍｍコルクボウラーを用いて試料を採取した。この試料に対し、インストロン（５９４２型試験機，インストロン社）を用いて剪断力価を測定した。
【００４２】
統計処理
ＪＭＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １１．２．０を用い、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ検定によって、大シャモ、白色プリマスロック、Ｆ１世代ならびにＦ２世代の４群における剪断力価を比較した。また、ＱＴＬ解析に先立ち、環境要因を排除するために、孵化日、性およびＦ１雌親に関し、Ｆ２世代が示した表現型値（剪断力価）の補正を行った。
【００４３】
ＤＮＡマーカータイピング（遺伝子型情報の収集）
本研究では、全Ｆ２世代個体２１５個体の内、剪断力価上位３０個体および下位３０個体についてマーカータイピングを行った（selective genotyping; Lebowitz et al., 1987; Lander and Botstein, 1989）。ＤＮＡマーカーには、Restriction-site associated DNA sequence（ＲＡＤ−ｓｅｑ）法（Miller et al., 2007）により得られた、一塩基多型（Single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）マーカーを用いた。Ｆ２個体の遺伝子型（ＳＮＰ）の判定は、資源家系の親個体である大シャモおよび白色プリマスロックの遺伝子型（ＳＮＰ）が完全に異なるものについて行った。また、遺伝子型（ＳＮＰ）が判定できなかった個体の割合が、１マーカー当たり２０％を上回ったマーカーは解析には用いなかった。最終的に、ＱＴＬ解析には６９９個のＳＮＰマーカーを用いた。
【００４４】
連鎖地図の作製およびＱＴＬ解析
Ｍａｐ  Ｍａｎａｇｅｒ  ＱＴＸ２０ｂ  ソフトウェア（Manly et al., 2001）を用いて、コサンビの地図関数（Kosambi, 1943）に基づき、６９９個のＳＮＰマーカーからなる遺伝連鎖地図を作製した。次いで、Ｒ／ｑｔｌソフトウェア（Broman et al., 2003）を用いてsimple interval mapping法によりＱＴＬ解析を行った。有意差の閾値はpermutation testを２，０００回行うことにより求めた（Broman and Sen, 2009）。
【００４５】
［結果］
表現型値の比較
大シャモ、白色プリマスロック、Ｆ１およびＦ２世代における胸肉の剪断力価を表１に示した。両親品種および各世代間で比較した場合、白色プリマスロックおよびＦ２世代が同等の値を示し、その値は大シャモに対して有意に小さかった（Ｐ＜０．０５）。また、Ｆ１世代の値は両親品種の中間の値を示した。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
ＱＴＬ解析
ＱＴＬ解析の結果、Ｚ染色体上の１３７ｃＭの位置に、雄に特異的なｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ＱＴＬが検出された。このＱＴＬの寄与率は４１．８％で相加効果は−０．９０９９７であった。本ＱＴＬが検出された領域はＳＮＰのｒｓ３１７４３６６２２（２１．０１Ｍｂ）とｒｓ１６７６１８１０（２１．６２Ｍｂ）の間であり、この領域に存在する遺伝子はmicrotubule associated serine/threonine kinase family member 4（ＭＡＳＴ４）、CD180 molecule（ＣＤ１８０）、ＬＯＣ１０１７５０２１６、ＬＯＣ１０７０５１８９７およびphosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1（ＰＩＫ３Ｒ１）の５つである（図３）。ＭＡＳＴ４遺伝子は、微小管関連セリン／スレオニンキナーゼファミリーに属し、この遺伝子が支配するタンパク質は微小管の足場タンパク質（ｓｃａｔｆｏｌｄ）の調節に関与している（Hibar et al., 2017）。本遺伝子は、マウスの筋肉中において発現が認められている一方で、脳の海馬においてその発現が増加すると発作様の行動が発動されるという報告もある（French et al., 2001; Garland et al., 2007）。ＣＤ１８０遺伝子はトール様受容体ファミリーの一つであり、自然免疫反応におけるシグナル伝達に関与している（Medzhitov et al., 1997; Rock et al., 1998）。ヒトにおいては、β細胞中で最も発現している（Egli et al., 2015）。ＰＩＫ３Ｒ１遺伝子は、ＰＩ３キナーゼのサブユニットを調節する役割があり、そのシグナル経路はインスリン代謝において重要な働きがある（Winnay et al., 2017）。マウスにおいては、ＰＩＫ３Ｒ１が過剰発現すると筋管および肝細胞におけるインスリンシグナル伝達を低下させる報告がある（Kuo et al., 2012; Barbour et al., 2005; Draznin, 2006; Taniguchi et al., 2007）。ＬＯＣ１０１７５０２１６およびＬＯＣ１０７０５１８９７は、機能が解明されていない未知の遺伝子である。
【００４８】
本実施例の結果、ニワトリ胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの一つが発見され、所定のＳＮＰマーカーを用いたマーカーアシスト育種を行える可能性が示された。また、このＱＴＬ近傍のＳＮＰマーカーに挟まれた領域には５つの遺伝子が存在している。将来的に、ＱＴＬが検出された領域に存在する各遺伝子についてｍＲＮＡを用いた発現解析を行うことで、ニワトリ胸肉の剪断力価に関与する候補遺伝子が明らかになれば、マーカーアシスト育種に止まらず、より正確なジーンアシスト育種も可能になると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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