(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中に存在する極微量の標的核酸を、より高効率かつ再現性良く（高精度に）増幅し検出するための方法、および当該方法を利用した試薬の提供。【解決手段】ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、ＲＮＡポリメラーゼ、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一および第二のプライマー、および、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む前記標的核酸の増幅試薬（ただし、前記第一および第二のプライマーのいずれかの５’末端側には前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加）、および、前記試薬を用いた標的核酸増幅法。【選択図】図１
2019106986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（ｉｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（ｉｉｉ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素、
（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（ｖ）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一のプライマー、および
（ｖｉ）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマー
を含む前記標的核酸の増幅試薬（ただし、（ｖ）第一のプライマーおよび（ｖｉ）第二のプライマーのいずれか一方には、その５’末端側に（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）であって、
（ｖｉｉ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレア
ーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
をさらに含む、前記増幅試薬。
【請求項２】
（ｉｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さない酵素である、請求項１に記載の増幅試薬。
【請求項３】
（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、（ｉｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、および（ｉｉｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素である、請求項１又は２に記載の増幅試薬。
【請求項４】
鎖置換酵素をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の増幅試薬。
【請求項５】
ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を５’末端側に付加したプライマーに対して、標的核酸において５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマーをさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の増幅試薬。
【請求項６】
（ｖｉｉ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素が、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈ）またはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１から５のいずれかに記載の増幅試薬。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の増幅試薬と、標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブと、を含む前記標的核酸の検出試薬。
【請求項８】
以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法（ただし、第一のプライマー
および第二のプライマーのいずれか一方には、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性
を有する酵素のプロモータ配列を付加している）。
（１）標的ＲＮＡの一部と相補的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから当該ＲＮＡに相補的なｃ
ＤＮＡを合成する工程
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮ
Ａ二本鎖のＲＮＡを分解する工程
（３）標的ＲＮＡの一部と相同的な配列を有する第二のプライマー、および３’→５’エ
キソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記（２）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡから、５
’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮ
Ａを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前
記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）前記（４）の工程で合成したＲＮＡ転写産物の一部と相補的な配列を有するプライ
マー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産
物に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解
する工程
（７）前記（６）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成
する工程
【請求項９】
以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標
的核酸の一部と相補的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＤＮＡから、当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡを合
成する工程
（２）少なくとも鎖置換活性を有する酵素および／または５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性を有さないＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（１）
の工程で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的ＤＮＡの一部と相同的な配列を有する第二のプライマー、および３’→５’エ
キソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記（２）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡから、５
’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮ
Ａを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前
記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用
いて、前記（４）の工程で合成したＲＮＡ転写産物から、標的ＤＮＡに相補的なｃＤＮＡ
を合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮ
Ａ二本鎖のＲＮＡを分解する工程
（７）（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
【請求項１０】
以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標
的核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＤＮＡの相補鎖から、当該ＤＮＡに相同的なＤ
ＮＡを合成する工程
（２）少なくとも鎖置換活性を有する酵素および／または５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性を有さないＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（１）
の工程で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的ＤＮＡの一部と相補的な配列を有する第一のプライマー、および３’→５’エ
キソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記（２）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡから、５
’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮ
Ａを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前
記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用
いて、前記（４）の工程で合成したＲＮＡ転写産物から、標的ＤＮＡに相補的なｃＤＮＡ
を合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮ
Ａ二本鎖のＲＮＡを分解する工程
（７）前記（６）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成
する工程
【請求項１１】
（２）の工程が、鎖置換活性を有する酵素および／または５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ならびに５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマーを用いて、（１）の工程で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程である、請求項９または１０に記載の増幅方法。
【請求項１２】
（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、（ｉｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、（ｉｉｉ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素、（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、（ｖ）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一のプライマー、（ｖｉ）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマー、および（ｖｉｉ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を含み、塩類は含まない第一の増幅試薬（ただし、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方には、その５’末端側に（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）、ならびに前記塩類を含む第二の増幅試薬を反応開始温度に温調する工程、
温調された各増幅試薬を反応が起こらないように混じった状態にする工程、
前記混じった状態の反応液と混和しない非混和性液体とを接触させる工程、
前記混じった状態の反応液を前記非混和性液体と接触させる直前または後に撹拌を行なう工程、
を含む、標的核酸を増幅する方法。
【請求項１３】
請求項８から１２のいずれかに記載の増幅方法で得られたＲＮＡ転写産物を、当該転写産物の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する、標的核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合物中に含まれると予想される、標的核酸の増幅方法および増幅試薬に関する。さらに本発明は、前記標的核酸を増幅し、定性的または定量的に検出する方法および検出試薬に関する。本発明は遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用であり、検体から直接、標的核酸を増幅・検出できることから、病気の迅速診断およびその治療に役立つだけでなく、前記病気が微生物に起因する場合、当該微生物の迅速かつ高感度な同定や、薬剤耐性遺伝子の検出にも有用である。
【背景技術】
【０００２】
臨床診断で用いられる遺伝子検査では、臨床試料中に含まれる標的核酸が極微量であることが多いため、当該試料中に含まれる標的核酸を増幅して信号強度を向上することで、高感度かつ良好な再現性のある測定を実現している。
【０００３】
標的核酸の増幅方法としては、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法があげられる。この方法は、標的核酸中の特定ＤＮＡ配列の両末端部に相補的なプライマーおよび相同なプライマーからなる一組のプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、熱変性、アニーリング、伸長反応からなる３ステップのサイクルを繰り返すことで、前記特定ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを増幅できる。一方、標的核酸がＲＮＡの場合は、ＰＣＲ法を実施する前に、鋳型となるＲＮＡから逆転写酵素によってｃＤＮＡを合成する必要がある。すなわち、ｃＤＮＡ合成工程およびＰＣＲ反応工程の２つの工程を要するため、操作が煩雑である。またＰＣＲ法は、急激な昇温、降温を必要とするため、特殊なインキュベーターを必要とし、大量処理を目的とした自動化への適用は容易ではない。さらに熱変性、アニーリング、伸長反応からなる３ステップのサイクルを繰り返し行なう必要があるため、迅速化にも限界がある。なお逆転写反応およびＰＣＲ反応を用いて簡便に標的ＲＮＡから特定の二本鎖ＤＮＡを増幅する方法として、特許文献１では、逆転写反応で得られた一本鎖ＤＮＡから３’→５’エキソヌクレアーゼ活性および鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡを取得する方法を開示している。
【０００４】
一方、標的ＲＮＡの簡便な増幅方法として、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特許文献２および３、非特許文献１）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特許文献４）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（特許文献５および非特許文献２）などが報告されている。これらの方法は、標的ＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマーと、逆転写酵素およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）を用いて、プロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡを生成し、ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列を含むＲＮＡを生成し、以後は、当該生成されたＲＮＡを、前記プロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とする連鎖反応を行なうものである。これらの方法でＲＮＡを増幅する際、ＲＮＡに対する相補ＤＮＡ鎖を合成するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解するＲＮａｓｅ  Ｈ活性、およびｃＤＮＡに対する相補ＤＮＡ鎖を合成するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、ＡＭＶ逆転写酵素がよく用いられる。これらの増幅方法は、比較的低温（例えば４０℃から５０℃）の一定温度下でのＲＮＡ増幅が可能なため、自動化への適用が容易である。また鎖置換活性を有する酵素を添加することで、比較的低温の一定温度下でのＤＮＡ増幅も可能である（特許文献６）。なお特許文献６では、前記鎖置換活性を有する酵素として、９６−７  ＤＮＡポリメラーゼを用いている。
【０００５】
前述した方法で増幅した標的核酸の検出は通常、当該標的核酸中の一部と特異的に結合可能な蛍光色素で標識されたプローブを接触させ、増幅産物と結合した前記プローブ由来の蛍光を検出して行なう。この際、Ｓ／Ｎ比（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）とも呼ばれる、蛍光強度比が大きいことが、精度良い検出ができる点で好ましい。また測定項目によっては検出時間が早いほど好ましい。しかしながら前記標的核酸の検出において、Ｓ／Ｎ比の向上と検出時間は必ずしも相関しない。これは、検出時間が早いほど、増幅産物が連鎖反応に使用されてしまい、蛍光強度が大きく上がらないためと考えられる。したがって標的核酸を高精度に検出する際は、検出時間の早さだけでなく、蛍光強度比の大きさも重要である。
【０００６】
試料中に含まれる標的核酸を定量する方法として、リアルタイムＰＣＲが知られている。しかしながら、ＰＣＲによる増幅効率および正確さは、処理温度、前記核酸の塩基配列、反応溶液成分の濃度や種類等の様々な要因によって左右される。そのため標的核酸量（濃度）をＰＣＲ最終産物の濃度測定またはＰＣＲ過程におけるリアルタイム測定によって正確に決定することは、困難であった。
【０００７】
近年、この問題を解決し、微量な標的ＤＮＡを正確に定量する技術として、デジタルＰＣＲが開発された（非特許文献３）。デジタルＰＣＲでは、標的ＤＮＡを含む溶液を、多数の微小区画に分配して、個々の微小区画で同時並行にＰＣＲが行なわれる。１つまたは複数のターゲット分子を含む微小区画もあれば、ターゲット分子を全く含まない微小区画も存在するが、ＰＣＲ終了後に微小区画毎にＰＣＲ増幅の有無を検出し、ポアソンモデルを用いることで、標的ＤＮＡの濃度が定量できる。また微量な標的ＲＮＡを正確に定量する方法としては、あらかじめ逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、前述したデジタルＰＣＲを用いる方法や、増幅方法をＮＡＳＢＡ法に置き換えたデジタルＮＡＳＢＡ（特許文献７、非特許文献３）を用いる方法があげられる。
【０００８】
デジタルＰＣＲやデジタルＮＡＳＢＡなどのデジタル核酸増幅で得られた標的核酸の増幅産物を検出する際、各微小区画の蛍光強度（シグナル）等に基づき陽性または陰性と判定するが、微弱なシグナルの微小区画も検出されるため、反応条件や検出時の陽性と陰性を判断するシグナル値の閾値の設定が課題となっている。したがってデジタルで核酸増幅・検出する場合でも、試料中に存在する極微量の特定ＲＮＡ配列をより高感度に、偽陽性なく検出するためには、Ｓ／Ｎ比が重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／１３１６４５号
【特許文献２】特開平２−００５８６４号公報
【特許文献３】特表平４−５０３４５１号公報
【特許文献４】特表平４−５００７５９号公報
【特許文献５】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献６】特開２０１５−１１６１３６号公報
【特許文献７】米国公開２０１４／０１４１５０２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ｄｅ  Ｂａａｒ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ．ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３９，１８９５−１９０２（２００１）
【非特許文献２】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【非特許文献３】Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６，９２３６−９２４１（１９９９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、標的核酸の増幅・検出方法において、試料中に存在する極微量の標的核酸を、より高効率かつ再現性良く（高精度に）増幅し検出するための方法、および当該方法を利用した試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の態様は以下の通り例示できる。
【００１４】
［１］
（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（ｉｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（ｉｉｉ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素、
（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（ｖ）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一のプライマー、および
（ｖｉ）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマー
を含む前記標的核酸の増幅試薬（ただし、（ｖ）第一のプライマーおよび（ｖｉ）第二のプライマーのいずれか一方には、その５’末端側に（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）であって、
（ｖｉｉ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
をさらに含む、前記増幅試薬。
【００１５】
［２］
（ｉｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さない酵素である、［１］に記載の増幅試薬。
【００１６】
［３］
（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、（ｉｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、および（ｉｉｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素である、［１］又は［２］に記載の増幅試薬。
【００１７】
［４］
鎖置換酵素をさらに含む、［１］から［３］のいずれかに記載の増幅試薬。
【００１８】
［５］
ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を５’末端側に付加したプライマーに対して、標的核酸において５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマーをさらに含む、［１］から［４］のいずれかに記載の増幅試薬。
【００１９】
［６］
（ｖｉｉ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素が、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈ）またはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼである、［１］から［５］のいずれかに記載の増幅試薬。
【００２０】
［７］
［１］から［６］のいずれかに記載の増幅試薬と、標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブと、を含む前記標的核酸の検出試薬。
【００２１】
［８］
以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法（ただし、第一のプライマーおよび第二のプライマーのいずれか一方には、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）。
（１）標的ＲＮＡの一部と相補的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから当該ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程
（３）標的ＲＮＡの一部と相同的な配列を有する第二のプライマー、および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記（２）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）前記（４）の工程で合成したＲＮＡ転写産物の一部と相補的な配列を有するプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程
（７）前記（６）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
［９］
以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＤＮＡから、当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成する工程
（２）少なくとも鎖置換活性を有する酵素および／または５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（１）の工程で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的ＤＮＡの一部と相同的な配列を有する第二のプライマー、および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記（２）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）の工程で合成したＲＮＡ転写産物から、標的ＤＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程
（７）（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
［１０］
以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＤＮＡの相補鎖から、当該ＤＮＡに相同的なＤＮＡを合成する工程
（２）少なくとも鎖置換活性を有する酵素および／または５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（１）の工程で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的ＤＮＡの一部と相補的な配列を有する第一のプライマー、および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記（２）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）の工程で合成したＲＮＡ転写産物から、標的ＤＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程
（７）前記（６）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
［１１］
（２）の工程が、鎖置換活性を有する酵素および／または５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ならびに５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマーを用いて、（１）の工程で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程である、［９］または［１０］に記載の増幅方法。
【００２２】
［１２］
（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、（ｉｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、（ｉｉｉ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素、（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、（ｖ）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一のプライマー、（ｖｉ）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマー、および（ｖｉｉ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を含み、塩類は含まない第一の増幅試薬（ただし、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方には、その５’末端側に（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）、ならびに前記塩類を含む第二の増幅試薬を反応開始温度に温調する工程、
温調された各増幅試薬を反応が起こらないように混じった状態にする工程、
前記混じった状態の反応液と混和しない非混和性液体とを接触させる工程、
前記混じった状態の反応液を前記非混和性液体と接触させる直前または後に撹拌を行なう工程、
を含む、標的核酸を増幅する方法。
【００２３】
［１３］
［８］から［１２］のいずれかに記載の増幅方法で得られたＲＮＡ転写産物を、当該転写産物の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する、標的核酸の検出方法。
【００２４】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２５】
＜１＞本発明の増幅試薬
本発明の増幅試薬は、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった比較的低温（例えば、４０℃から５０℃）の一定温度で一本鎖ＲＮＡを増幅可能な方法で用いる酵素およびプライマーに加え、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをさらに加えることを特徴としている。本発明の増幅試薬が、標的ＲＮＡを増幅する試薬である場合の一態様として、以下の（Ａ）から（Ｉ）の成分を含む試薬があげられる。なお以下の（Ａ）および（Ｂ）のいずれか一方には、その５’末端側に以下の（Ｇ）のプロモータ配列を付加している。また一般的に使用される増幅反応に必要という理由以外の理由で、より好ましい別の成分を添加してもよく、一方、下記が増幅反応に必須な試薬を必ずしも網羅しているわけではない。
（Ａ）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチド（第一のプライマー）、
（Ｂ）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二の一本鎖オリゴヌクレオチド（第二のプライマー）、
（Ｃ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（Ｄ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、
（Ｅ）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素、
（Ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（Ｇ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（Ｈ）リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰｓ）、
（Ｉ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、
本発明の増幅試薬で増幅される増幅核酸は、他の核酸から区別し得る程度に特異的な配列部分を（Ａ）および（Ｂ）に含んでいる限り、任意に決定できる。
【００２６】
前述したように（Ａ）および（Ｂ）のいずれか一方は、その５’末端側に以下の（Ｇ）のプロモータ配列を付加している。なお付加するプライマーと前記プロモータ配列との間に、数から数十ヌクレオチドからなるエンハンサー配列を挿入してもよい。
【００２７】
（Ａ）から（Ｉ）の成分のうち、（Ｃ）、（Ｅ）および（Ｆ）の成分は、それぞれ異なる酵素を用いてもよいし、一部または全部を共通の酵素としてもよい。中でも、トリ筋芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、（Ｃ）、（Ｅ）および（Ｆ）の成分を全て包含する酵素であり、本発明の増幅試薬として特に好ましい態様である。
【００２８】
（Ｆ）の成分は、一本鎖ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを合成可能な酵素であれば特に限定はないが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さない酵素を用いると好ましい。前記酵素の一例として、９６−７  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニッポンジーン社製）、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  Ｌａｒｇｅ  （Ｋｌｅｎｏｗ）  Ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｍｉｎｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔといった３’→５’エキソヌクレアーゼ活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有していない酵素や、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ，Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）といった３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は有しており５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さない酵素があげられる。なお前述したＡＭＶ逆転写酵素も５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さない酵素である。
【００２９】
（Ｇ）の成分の一例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼがあげられる。なお（Ａ）および（Ｂ）のいずれか一方に付加させるプロモータ配列は、（Ｇ）で用いる成分（ポリメラーゼ）に対応した配列を付加させればよい。
【００３０】
本発明の増幅試薬の特徴は（Ｉ）の成分を含むことである。（Ｉ）の成分の一例として、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）やＢｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）があげられる。なお（Ｆ）の成分が（Ｉ）の機能も有している場合、当該（Ｆ）の成分を含むことにより（Ｉ）の成分を含むとみなせる。（Ｉ）の機能を有した（Ｆ）の成分の一例として、ＨＩＶ逆転写酵素があげられる。
【００３１】
５’末端側に（Ｇ）のプロモータ配列を付加したプライマーが（Ａ）の場合、本態様の増幅試薬による標的ＲＮＡの増幅は、以下の工程で進行する。
（ａ−１）（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）によって、標的ＲＮＡから当該ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（ａ−２）（Ｅ）によって、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程
（ａ−３）（Ｂ）、（Ｄ）および（Ｉ）によって、（ａ−２）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（ａ−４）（Ａ）で付加したプロモータ配列に対応した（Ｇ）および（Ｈ）によって、（ａ−３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（ａ−５）（Ｂ）、（Ｃ）もしくは（Ｉ）および（Ｄ）によって、（ａ−４）のＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（ａ−６）（Ｅ）によって、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程
（ａ−７）（ａ−６）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｇ）および（Ｈ）によって、連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
一方、５’末端側に（Ｇ）のプロモータ配列を付加したプライマーが（Ｂ）の場合、本態様の増幅試薬による標的ＲＮＡの増幅は、以下の工程で進行する。
（ｂ−１）（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）によって、標的ＲＮＡから当該ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（ｂ−２）（Ｅ）によって、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程
（ｂ−３）（Ｂ）、（Ｄ）および（Ｉ）によって、（ｂ−２）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（ｂ−４）（Ｂ）で付加したプロモータ配列に対応した（Ｇ）および（Ｈ）によって、（ｂ−３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（ｂ−５）（Ａ）、（Ｃ）もしくは（Ｉ）および（Ｄ）によって、（ｂ−４）のＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ−６）（Ｅ）によって、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程
（ｂ−７）（ｂ−６）の工程で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｇ）および（Ｈ）によって、連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
本発明の増幅試薬を用いて標的ＲＮＡの増幅を行なう場合、例えば、前述した（Ａ）から（Ｉ）の試薬を、標的ＲＮＡを含むと予想される試料に前述した工程に従い成分を順次添加してもよいし、前述した複数の工程に対応した成分をまとめて添加してもよいし、一度に全ての成分を添加してもよい。
【００３２】
なお本発明の増幅試薬を標的ＤＮＡの増幅に適用する場合、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった比較的低温（例えば、４０℃から５０℃）の一定温度で一本鎖ＲＮＡを増幅可能な方法で用いる酵素およびプライマー、ならびに３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに加え、以下の（Ｊ）から（Ｌ）に示すいずれかの成分を添加すればよい。ただし以下の（Ｋ）の成分添加は、（Ｆ）がＡＭＶ逆転写酵素など５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さない酵素である場合のみ有効である。
（Ｊ）鎖置換酵素
（Ｋ）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマー
（Ｌ）（Ｊ）および（Ｋ）の成分
なお（Ｋ）または（Ｌ）の成分を添加した本発明の増幅試薬を用いて、標的ＤＮＡの増幅を行なう場合は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さない酵素や鎖置換酵素による反応と（Ｉ）による反応とが競合するため、前者の反応が優勢に働くよう、酵素量を調製する必要がある。
本発明の反応開始温度とは、４０℃から５０℃が好ましく、より好ましくは、４１℃から４６℃の範囲である。
【００３３】
＜２＞微小区画化方法
本発明の増幅試薬を用いて、標的核酸をデジタル核酸増幅させる場合は、本発明の増幅試薬を微小区画化する必要がある。微小区画化する方法として、微細孔をもった特殊なプレートを用いて、その微細孔に反応液を分配する方法（微細孔分配方式）や、反応液を特別な乳化剤やマイクロ流路チップを用いて多数の微小の液滴（ドロップレット）に分割する方法（ドロップレット方式）があげられる。微小区画のサイズは、５ｎＬ以下であることが好ましく、より好ましくは２ｎＬ以下であり、さらに好ましくは１ｎＬ以下である。微細孔分配方式で微小区画化する装置として、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３ＤデジタルＰＣＲシステム、ＪＮ  Ｍｅｄｓｙｓ社製Ｃｌａｒｉｔｙ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲシステムが市販されている。また、ドロップレット方式で微小区画化する装置として、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製ＱＸ２００ＴＭ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲシステム、ＲａｉｎＤａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＲａｉｎＤｒｏｐ  Ｐｌｕｓ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲシステムが市販されている。
【００３４】
＜３＞デジタル核酸増幅法
＜２＞で微小区画化した試薬を用いてデジタル核酸増幅を行なう際に、２液を混合して増幅反応を開始してもよい。例えば、マイクロ流路チップを用いて、Ｙ字路により分散相の２液並行流を形成した直後に、連続相のシースフローによる流体抵抗力で液滴を生成（微小区画化）させる方法がある。またＳｌｉｐＣｈｉｐを用いて、互いに対向する２つの表面（複数の第一の微小区画領域を有する第一の表面および複数の第二の微小区画領域を有する第二の表面）をスリップさせて、前記複数の第一の微小区画領域と、前記複数の第二の微小区画領域とを、１：１で連結させることで、各微小領域内の液を混合できる。
【００３５】
また、２以上の反応液を保持する反応液保持部と、前記反応液とは混和しない非混和性液体を保持する液体保持部と、各反応液保持部で保持された反応液同士を層流状態で合流させた後、前記液体保持部で保持された前記非混和性液体と接触させて液滴を形成させるための流路と、前記液滴を保持する液滴保持部と、反応液合流地点と非混和性液体接触地点との間または流路出口と前記液滴保持部の間に設けられた撹拌部と、前記液滴保持部に設けられた排出口と、を有するマイクロ流路チップと、前記マイクロ流路チップと近接する温調装置とを備えた、反応装置（一例として、図２から４に示す装置）を用いてデジタル核酸増幅を行なってもよい。本発明の増幅試薬を前記反応装置に適用する場合、例えば、単独では反応が起こらない２以上の反応液（一例として、前記（Ａ）から（Ｉ）の成分を含み、塩類は含まない第一の反応液と、前記塩類を含む第二の反応液）を反応液保持部に導入し、反応開始温度に温調後、温調された各反応液を反応が起きないよう層流状態で合流させ（混じった状態とし）、非混和性液体と接触させることで液滴を形成後、当該液滴を撹拌部で撹拌することで（混合した状態）核酸増幅反応を開始すればよい。なお、本発明の反応が起こらないように混じった状態とは、デバイス内部での状態を詳細に表した状態であり、２つの反応液が界面を作った状態で並行に進む層流の場合には混じった状態だが反応はしない。その後撹拌されて混合した状態ではじめて反応が開始される。
【００３６】
＜４＞検出方法
本発明の増幅試薬で増幅した標的核酸は、あらかじめまたは増幅反応後に検出用成分を添加し、当該成分由来の蛍光や化学発光強度を測定することで、標的核酸を検出すればよい。検出用成分の好ましい態様として、標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブがあげられる。
【００３７】
前記プローブの一例として、標的核酸の一部と相補的または相同的な配列を有するインターカレーター性蛍光色素を結合したＤＮＡがあげられる。前記ＤＮＡ部分の配列は、標的核酸中に存在する配列であって、標的核酸以外の核酸と十分に区別可能な部分と相補的な配列である必要がある。前記ＤＮＡ部分の長さは、標的核酸の特異的分析のため、６から１００ヌクレオチド、さらに好ましくは１０から３０ヌクレオチドとすることが好ましい。なお前記ＤＮＡ部分は、増幅した標的核酸と相補結合を形成した場合に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による３’末端からの伸長が生じないように、当該３’末端が標的核酸と非相補的な配列が付加されているか、または、その３’末端が化学的に修飾（例えばアミノ化）されていることが好ましい。
【００３８】
インターカレーター性蛍光色素は、前述したＤＮＡ部分が他の核酸と相補結合を形成すると二本鎖部分にインターカレーションして蛍光特性が変化するものである。この目的のためには、例えば、インターカレーター性蛍光色素を、二本鎖部分へのインターカレーションを妨げない程度の適当な分子長リンカーを介してＤＮＡと結合すればよい。かかるリンカーとしては、インターカレーター性蛍光色素が二本鎖部分にインターカレーションすることを妨げない分子であれば特に制限はない。特に両末端に官能基を有する二官能性炭化水素から選択されるリンカー分子は、オリゴヌクレオチドへの修飾を行なう上で簡便で好ましい。また市販の試薬セット（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ）を使用してもよい。
【００３９】
インターカレーター性蛍光色素としては、二本鎖にインターカレーションすることで、例えば発する蛍光波長が変動したりする等、その蛍光特性が変化するものであれば特に制限はないが、測定の容易さ等の観点からインターカレーションにより蛍光強度が増加する性質を有するものが特に好ましい。具体的には、蛍光強度の変化が特に著しい、チアゾールオレンジやオキサゾールイエロー、ならびにそれらの誘導体が、好ましいインターカレーター性蛍光色素として例示できる。
【００４０】
インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介してＤＮＡ部分に結合させる位置は、当該ＤＮＡ部分の５’末端、３’末端又は中央部等、インターカレーター性蛍光色素の二本鎖へのインターカレーションが妨げられず、かつ、ＤＮＡ部分とＲＮＡとの相補結合を阻害しない限り特に制限はない。
【００４１】
標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブの別の例として、モレキュラービーコンがあげられる。モレキュラービーコンは、標的核酸の一部と相補的または相同的な配列を有するＤＮＡであり、その両端に蛍光色素とクエンチャーを有するステムループ構造になっている。ステムループ構造の状態では、蛍光色素の蛍光がクエンチャーにより抑制されているが、ループ配列中に存在する標的ＲＮＡに相補的な領域が反応中に生じた増幅産物とハイブリダイズするとステム部分が開裂し発光を発する。ステムの形成は、分子内でＤＮＡの二本鎖を形成し、会合能の高い蛍光色素（Ｃｙ３など）とクエンチャー（アゾ化合物など）のペアをＤＮＡに導入することで形成できる。
【００４２】
標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブのさらに別の例として、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）プローブがあげられる。この場合、標的核酸の配列において、増幅に用いた第一および第二のプライマーの内側に設計された２本のプローブを使用する。２本のプローブのうち、一方のプローブの３’末端にはドナー蛍光色素を、もう一方のプローブの５’末端にはアクセプター蛍光色素を、それぞれ修飾する。２本のプローブのＤＮＡ配列をハイブリダイゼーションするとドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素が近接するように設計することで、２本のプローブが反応中に生じた増幅産物とハイブリダイゼーションすることにより生じるＦＲＥＴ現象により検出できる。
【００４３】
標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブのさらにまた別の例として、ＴａｑＭａｎプローブがあげられる。この場合、標的核酸の配列において、増幅に用いた第一および第二のプライマーの内側に設計された１本のプローブを使用する。ＴａｑＭａｎプローブの５’末端には蛍光色素（レポーター色素）を、３’末端にはクエンチャーを、それぞれ標識する。レポーター色素の蛍光はクエンチャーにより抑制されているが、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長反応時に、標的ＲＮＡにプローブがハイブリダイズしていると、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解され、リポーター色素が遊離することで生じる蛍光により検出できる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明の標的核酸増幅試薬は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、を含む試薬（ただし、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方には、その５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）であって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含むことを特徴としている。
【００４５】
本発明によれば、比較的低温の一定温度下での、試料中に含まれる標的核酸の増幅反応において、増幅効率を飛躍的に向上させることができる。したがって、試料中に存在する極微量の標的核酸を、従来の方法より、高効率かつ再現性良く（高精度に）増幅し検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】実施例３の結果を示した図（蛍光プロファイル）。
【図２】実施例５および比較例１で用いた反応装置を示す図（平面図）である。
【図３】図２に示す反応装置のＡ−Ａ’断面図（正面図）である。
【図４】図２のうち点線四角で囲まれた部分を拡大した図である。
【図５】実施例５および比較例１における、液滴保持部に保持された液滴の様子を示す図である。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１  ＤＮＡポリメラーゼの追加によるＲＮＡ検出への影響（その１）
一定温度で１本鎖ＲＮＡを増幅可能な系（ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法など）に、種々のＤＮＡポリメラーゼをさらに添加することによる、ＲＮＡ検出への影響を評価した。
【００４９】
（１）Ｃ型肝炎ウイルス標準ＲＮＡ（以下、単に標準ＲＮＡとも表記する）遺伝子が挿入されたプラスミドから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、前記標準ＲＮＡ（配列番号１）を調製した。当該標準ＲＮＡを注射用水を用いて１０３コピー／２μＬとなるように希釈し、これをＲＮＡ試料とした。
【００５０】
（２）以下の組成からなる反応液１０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、前記ＲＮＡ試料２μＬを添加した。なお標準ＲＮＡ検出用プローブであるＩＮＡＦプローブ（配列番号２）は、当該配列の１０番目のＣと１１番目のＧとの間にリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローを結合し、かつ３’末端をビオチン修飾したオリゴヌクレオチドプローブである。また第一のプライマー（配列番号３）は、標準ＲＮＡの相補鎖の一部（具体的には配列番号１の１２５番目から１４５番目まで：配列番号５）の５’末端側にＴ７プロモーター配列（配列番号６）を付加したオリゴヌクレオチドである。またＤＮＡポリメラーゼは、表１に示すいずれかのＤＮＡポリメラーゼであり、その添加量は各ポリメラーゼで濃度（Ｕ／μＬ）が異なるため、濃度に関係なく一律２μＬとした。
【００５１】
反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３６）
各０．３３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
３．３ｍＭ  ＩＴＰ
１２２．２ｍＭ  トレハロース
５０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（標準ＲＮＡの相同鎖の一部［配列番号１の１０７番目から１２３番目まで］：配列番号２）
１．０μＭ  第一のプライマー（配列番号３）
１．０μＭ  第二のプライマー（標準ＲＮＡの相同鎖の一部［配列番号１の１番目から１６番目まで］：配列番号４）
４．３Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
９５Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
２μＬ  追加ＤＮＡポリメラーゼまたは注射用水
（３）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、以下の組成からなる開始剤８μＬを添加した。
【００５２】
開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
１８．４ｍＭ  塩化マグネシウム
９０．０ｍＭ  塩化カリウム
０．１％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０（１０％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製）を注射用水で１０倍希釈）
９．０％（ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００５３】
開始剤添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。２０分以内に陽性判定となった場合を（＋）、陽性判定とならなかった（陰性判定）場合を（−）とした。結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
今回検討したＤＮＡポリメラーゼのうち、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩおよびＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ，Ｌａｒｇｅ  （Ｋｌｅｎｏｗ）  Ｆｒａｇｍｅｎｔ）は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の有無にかかわらず陰性判定となり、検出を大きく阻害することがわかった。そのため、一定温度で１本鎖ＲＮＡを増幅する系に添加するＤＮＡポリメラーゼとして、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは好ましくないことが判明した。
【００５６】
実施例２  ＤＮＡポリメラーゼの追加によるＲＮＡ検出への影響（その２）
実施例１で陽性判定となった、追加ＤＮＡポリメラーゼのうち、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔおよび９６−７  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを選択し、標準ＲＮＡを検出した。
【００５７】
（１）以下の組成からなる反応液１０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、実施例１（１）で調製したＲＮＡ試料２μＬを添加した。
【００５８】
反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３６）
各０．３３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
３．３ｍＭ  ＩＴＰ
９６．３ｍＭ  トレハロース
５０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号２）
１．０μＭ  第一のプライマー（配列番号３）
１．０μＭ  第二のプライマー（配列番号４）
１２．８Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１６６Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
追加ＤＮＡポリメラーゼまたは注射用水（添加量は表２に記載）
（２）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、以下の組成からなる開始剤８μＬを添加した。
【００５９】
開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
１８．４ｍＭ  塩化マグネシウム
９０．０ｍＭ  塩化カリウム
０．１％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０
９．０％（ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ
（３）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００６０】
開始剤添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
2019106986.tif 000004
【００６２】
結果、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈを用いたときは１０Ｕ／ｔｅｓｔが、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを用いたときは１．６Ｕ／ｔｅｓｔが、９６−７  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは８Ｕ／ｔｅｓｔが、それぞれ最適添加量であった。なお前記最適添加量でのＲＮＡ試料（標準ＲＮＡ：１０３コピー／ｔｅｓｔ）の検出時間は５．５分から５．７分と、ＤＮＡポリメラーゼを追加しない系（注射用水を添加した系）での検出時間（６．２分）よりも０．５分から０．７分向上した。一般的にＴＲＣ法による核酸増幅では、１分の検出時間短縮は１０倍の高感度化に相当することから、今回検討したＤＮＡポリメラーゼの添加により感度が約３倍から５倍向上していることがわかる。
【００６３】
実施例３  ＤＮＡポリメラーゼの追加による蛍光強度比への影響
実施例２で決定した、追加ＤＮＡポリメラーゼ添加量を最適化した系で、標準ＲＮＡを検出し、得られた蛍光プロファイルを比較した。
【００６４】
（１）以下の組成からなる反応液１０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、実施例１（１）で調製したＲＮＡ試料２μＬを添加した。
【００６５】
反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３６）
各０．３３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
３．３ｍＭ  ＩＴＰ
９６．３ｍＭ  トレハロース
５０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号２）
１．０μＭ  第一のプライマー（配列番号３）
１．０μＭ  第二のプライマー（配列番号４）
１２．８Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１６６Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
追加ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈ、１．６Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔおよび８Ｕ  ９６−７  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのいずれか）または注射用水
（２）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、以下の組成からなる開始剤８μＬを添加
した。
【００６６】
開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
１８．４ｍＭ  塩化マグネシウム
９０．０ｍＭ  塩化カリウム
０．１％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０
９．０％（ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ
（３）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００６７】
開始剤添加時を０分として、各測定時間における反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）をプロットした図（蛍光プロファイル）を図１に、蛍光強度比の最大値をまとめた結果を表３に、それぞれ示す。なお図１に示す通り、最も高い値が測定された後は、蛍光強度比はほぼプラトーになるため、前記蛍光強度比の最大値を、エンドポイントなどで検出する場合のＳ／Ｎ比として考えてよい。
【００６８】
【表３】
2019106986.tif 000005
【００６９】
本実施例で検討した追加ＤＮＡポリメラーゼのうち、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈ）を用いたときの蛍光強度比の最大値（Ｓ／Ｎ比）は４．７倍と、ＤＮＡポリメラーゼを追加しない系（注射用水を添加した系）（５．０倍）ほぼ同等であった。以上の結果から、一定温度で１本鎖ＲＮＡを増幅可能な系（ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法など）に、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼをさらに添加することで、添加前と同等の精度（Ｓ／Ｎ比）を維持しつつ、検出時間（感度）を向上できることがわかる。
【００７０】
一方、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有さないＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔおよび９６−７  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いたときのＳ／Ｎ比は、ＤＮＡポリメラーゼを追加しない系よりも低下していた（ともに３．４倍）。
【００７１】
実施例４  マイクロ流路チップの作製
本発明の増幅試薬をデジタル核酸増幅に適用するにあたり、デジタル核酸増幅のためのマイクロ流路チップを作製した。具体的には、フォトリソグラフィーおよびソフトリソグラフィー技術を用いて、図２から４に示すマイクロ流路チップ１００を作製した。作製手順を以下に示す。
【００７２】
（１）４インチベアシリコンウェハ（フィルテック社）上へ、フォトレジストＳＵ−８  ３０５０（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を滴下後、スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ社）を用いてフォトレジスト薄膜を形成した。
【００７３】
（２）マスクアライナー（ウシオ電機社）とマイクロ流路チップ１００の流路パターンを形成したクロムマスクとを用いて、前記流路パターンをフォトレジスト膜へ形成後、ＳＵ−８  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を用いて流路パターンを現像することで、マイクロ流路チップ１００を構成する流路の鋳型を作製した（流路の高さ８０μｍ）。
【００７４】
（３）ＳＵ−８への吸着を抑えるために、Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ−ｏｃｔｙｌ）ｓｉｌａｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）による蒸着表面処理を行なった。
【００７５】
（４）（３）の処理を行なった鋳型へ、ＳＹＬＧＡＲＤ  ＳＩＬＩＣＯＮＥ  ＥＬＡＳＴＯＭＥＲ  ＫＩＴ（東レ・ダウコーニング社）を用いて調製した未硬化のシロキサンモノマーと重合開始剤との混合物（重量比１０：１）を流し込み、８０℃で２時間加熱することで、流路の形状が転写されたポリマー（ＰＤＭＳ）基板１０１を作製した。
【００７６】
（５）ポリマー基板１０１を鋳型から慎重に剥がし、カッターで成形後、パンチャーを用いて反応液１０および非混和性液体２０の導入口、ならびに排出口８０を形成した。
【００７７】
（６）導入口及び吸引口を形成したポリマー基板１０１並びにカバーガラス１０２（松浪硝子社）を酸素プラズマ発生装置（メイワフォーシス社）で表面処理後、ＰＤＭＳ基板１０１パターン面とカバーガラス１０２とを貼り合わせた。
【００７８】
（７）２％  Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ−ｏｃｔｙｌ）ｓｉｌａｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）含有エタノールを流路に導入し、３０分間放置することで、流路壁面の表面を修飾後、エタノールを用いて流路内を洗浄し、風乾することでマイクロ流路チップ１００を作製した。作製したチップは真空デシケーター内に保存した。
【００７９】
作製したマイクロ流路チップ１００は、縦２４ｍｍ×横６０ｍｍの大きさであり、反応液保持部１０ａ／１０ｂ並びに液体保持部２０への導入口としてφ４ｍｍの穴を、排出口８０としてφ１．５ｍｍの穴を、それぞれ設けている。
【００８０】
反応液保持部１０ａ／１０ｂから反応液合流部３０に至るまでの流路１１ａ／１１ｂは幅１００μｍ×長さ４７ｍｍの蛇行流路であり、液体保持部２０から液滴形成部４０に至るまでの流路２１ａ／２１ｂは屈曲部を二箇所有した幅１００μｍ×長さ２２ｍｍの直線流路である。反応液合流部３０は反応液流路１１ａと反応液流路１１ｂとが合流角度９０度で合流し、幅２００μｍから幅１００μｍまで角度１０度の割合で流路が狭窄される。液滴形成部４０は、前記狭窄後の流路（幅１００μｍ×長さ１５０μｍ）と流路２１ａ／２１ｂとが角度９０度で十字に交差することで合流した反応液と非混和性液体とを接触させ、液滴生成流路（交差部から幅８０μｍ×長さ１００μｍ）内で合流した反応液の液滴を形成する。液滴形成部４０で形成した液滴は、流路出口５０（幅２００μｍ×長さ８００μｍ）を経て、分岐部６０に流れる。分岐流路６０は、二方向に、角度９０度で、それぞれ５回分岐した構造となっており、１回目の分岐では幅２００μｍ×長さ４ｍｍ、２回目の分岐では幅２００μｍ×長さ２ｍｍ、３回目の分岐では幅２００μｍ×長さ１．３ｍｍ、４回目の分岐では幅２００μｍ×長さ１ｍｍ、５回目の分岐では幅２７０μｍ×長さ５００μｍである。分岐流路６０で３２分割した後は、液滴保持部７０（幅１５ｍｍ×長さ４０ｍｍ）に導入され、液滴が保持される。
【００８１】
実施例５  ＤＮＡポリメラーゼの追加によるデジタル核酸増幅における検出率の向上
実施例４で作製したマイクロ流路デバイス１００を備えた反応装置１（図２および３）を用いて、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ（配列番号１）のデジタル等温核酸増幅に適用した。
【００８２】
（１）ＨＣＶ遺伝子が挿入されたプラスミドから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によりＨＣＶ標準ＲＮＡ（配列番号１）を調製した。当該標準ＲＮＡを注射用水を用いて１０７コピー／２μＬとなるように希釈し、これをＲＮＡ試料とした。
【００８３】
（２）１０μＬ中に 以下の組成を含む水溶液を調製し、これを標準ＲＮＡを含む反応液とした。なおモレキュラービーコンプローブ（配列番号７）は、標準ＲＮＡの相同鎖の５’末端側および３’末端側に、当該標準ＲＮＡと相補的二本鎖を形成しないときにはステムループ構造を形成できるようなオリゴヌクレオチドを、それぞれ６塩基付加しており（５’側の１塩基のみ重複している）、さらに５’末端側にはＦＡＭを、３’末端側にはＩＤＴ社製ＩｏｗａＢｌａｃｋＦＱをそれぞれ結合させている。
【００８４】
１３２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３６）
５．０％（ｖ／ｖ）  グリセロール
各０．６６ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各４．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
６．６ｍＭ  ＩＴＰ
１９２．５ｍＭ  トレハロース
１００ｎＭ  モレキュラービーコンプローブ（標準ＲＮＡの相同鎖の一部［配列番号１の１０７番目から１２３番目まで］を含む：配列番号７）
２．０μＭ  第一のプライマー（配列番号３）
２．０μＭ  第二のプライマー（配列番号４）
２．５Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈ
１２．８Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１６６Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
１０４コピー  標準ＲＮＡ
（３）１０μＬ中に以下の組成を含む水溶液を調製し、これを開始液とした。
【００８５】
３６．８ｍＭ  塩化マグネシウム
１８０．０ｍＭ  塩化カリウム
０．２％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０
１８．０％（ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ
２．５％（ｖ／ｖ）  グリセロール
１００ｎＭ  モレキュラービーコンプローブ（配列番号７）
（４）実施例４で作製したマイクロ流路チップ１００を温調ブロック２００（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｎｅｘｕｓ  ｆｌａｔ  ｅｃｏ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）の上に固定して、４６℃に加熱した。
【００８６】
（５）マイクロ流路チップ１００内にオイルを充填後 、液体保持部２０にオイルを１００μＬ滴下した。
【００８７】
（６）反応液保持部１０ａ／１０ｂ内のオイルを取り除いてから、反応液保持部１０ａには（２）で作製した反応液を、反応液保持部１０ｂには（３）で作製した開始液を、それぞれ液温４６℃の条件下で３０μＬ滴下した。
【００８８】
（７）ポンプ３００を用いて排出口８０からオイルを吸引した。吸引開始後１から２分で反応合流部３０付近は層流となり、液滴形成部４０で反応液と開始液とが概ね１：１の液滴生成が開始された。
【００８９】
（８）吸引開始後３から５分後に当該吸引を停止し、そのまま４６℃で２０分間放置することで、液滴内等温増幅反応を完了させた。
【００９０】
（９）（８）の反応終了後のマイクロ流路チップ１００を倒立型顕微鏡ＩＸ７１（オリンパス社）に載置し、デジタルＣＭＯＳカメラ（ＯＲＣＡ−ＦＬＡＳＨ、浜松フォトニクス社）を用いて、液滴保持部７０に保持された液滴の蛍光画像を取得した。
【００９１】
（１０）画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を利用して、前記蛍光画像から、液滴の平均直径および陽性液滴（陰性液滴の平均蛍光強度に対し、蛍光強度比２．５倍以上の液滴）の個数割合を測定した。液滴の平均直径は、蛍光画像からランダムに抽出した９個の液滴の直径の平均値とした。陽性液滴の個数割合は、まず液滴が４００から７００個含まれる画像をランダムに選定し、これら画像中の全液滴数と陽性液滴数を測定後、当該測定結果を足し合わせることで、計３０００から６０００個の液滴に対する陽性液滴の個数割合を測定した。
【００９２】
（１１）（１０）で得られた液滴の平均直径（Ｄ［μｍ］）から下記（式１）を用いて、
液滴の平均直径（Ｖ［ｎＬ］）を算出後、（１０）で得られた陽性液滴の個数割合（ＰＰ
ｏｓｉｔｉｖｅ）および平均直径Ｖからポアソン分布による近似（式２）を用いて標準ＲＮＡ濃度（Ｃ［コピー／μＬ）を算出し、添加した標準ＲＮＡ（５×１０２コピー／μＬ）に対する検出率を算出した。
【００９３】
Ｖ＝（４／３）×π×（Ｄ／２）３×１０−６      （式１）
Ｃ＝−ｌｎ（１−ＰＰｏｓｉｔｉｖｅ）×（１０３／Ｖ）×２０      （式２）
比較例１
実施例５（２）においてＢｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈを添加しない以外は、実施例５と同様な方法で蛍光画像を取得し、検出率を算出した。
【００９４】
実施例５および比較例１で取得した蛍光画像を図５に示し、検出率を算出した結果を表４に示す。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈ）を添加する（実施例５）ことで、添加しないとき（比較例１）と比較し、検出率が向上していることがわかる（実施例５：６２．９％、比較例１：５４．０％）。
【００９５】
【表４】
2019106986.tif 000006
【符号の説明】
【００９６】
１：反応装置
１００：マイクロ流路チップ
１０１：ポリマー基板
１０２：カバーガラス（ガラス基板）
１０：反応液保持部
１１、２１：流路
２０：液体保持部
３０：反応液合流部
４０：液滴形成部
５０：流路出口
６０：分岐流路
７０：液滴保持部
８０：排出口
２００：温調ブロック
３００：ポンプ
【図１】
2019106986.tif 000007
【図２】
2019106986.tif 000008
【図３】
2019106986.tif 000009
【図４】
2019106986.tif 000010
【図５】
2019106986.tif 000011
【配列表】
2019106986000001.app