(57)【要約】      （修正有）【課題】粥状動脈硬化や糖尿病を発症させたり、バリア機能低下や炎症など肌状態を悪化させたりする脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）５産生抑制作用を有する組成物の提供。【解決手段】チンピエキス及び／又はキッピエキスやブロッコリー抽出物に含まれるノビレチン、ナリンギン、スルフォラファン、ホモオリエンチン、ジャスモン酸メチルから選択される１以上の物質を有効成分として含むＦＡＢＰ５産生抑制用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノビレチン、ナリンギン、スルフォラファン、ホモオリエンチン、ジャスモン酸メチルから選択される１以上の物質を有効成分として含むＦＡＢＰ５産生抑制用組成物。
【請求項２】
ノビレチンを含む組成物が柑橘類の果皮抽出物である請求項１に記載のＦＡＢＰ５産生抑制用組成物。
【請求項３】
柑橘類の果皮抽出物がチンピエキス及び／又はキッピエキスである請求項２に記載のＦＡＢＰ５産生抑制用組成物。
【請求項４】
スルフォラファンを含む組成物がブロッコリー抽出物である請求項１に記載のＦＡＢＰ５産生抑制用組成物。
【請求項５】
ブロッコリー抽出物がブロッコリースプラウト抽出物である請求項４に記載のＦＡＢＰ５産生抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体のＦＡＢＰ５の産生を抑制するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年脂肪酸結合タンパク質（Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＦＡＢＰ）と呼ばれるファミリータンパク質が注目を集めている。特に精神疾患と多価不飽和脂肪酸をつなぐ「分子」としての機能が分かってきた。ＦＡＢＰは、１４〜１５ｋＤａの低分子量タンパク質で、主に細胞質に存在し、脂肪酸の取り込みや輸送、核内受容体と複合体を形成して他の遺伝子の発現調節に関わると言われている（非特許文献１）。
哺乳類では９種類のＦＡＢＰが知られており、一般には脂肪酸の代謝活性が高い組織、心筋、骨格筋、腸、肝臓、脂肪細胞などにＦＡＢＰが豊富に存在する。ＦＡＢＰは最初に単離された組織あるいは細胞の名称を冠して、心臓型（Ｈ−）、脳型（Ｂ−）、肝臓型（Ｌ−）、腸型（Ｉ−）などと命名されているが、各ＦＡＢＰは多様な組織や細胞に発現することから，最近はＦＡＢＰ３（Ｈ−ＦＡＢＰ）、ＦＡＢＰ５（Ｅ−ＦＡＢＰ）、ＦＡＢＰ７（Ｂ−ＦＡＢＰ）など番号で示されるようになっている。本願明細書においてもこの名称にしたがうものとする。
【０００３】
ＦＡＢＰ５は表皮において最初に報告されたＦＡＢＰである。ＦＡＢＰ５は、シワ形成マーカー（特許文献１）やニキビ肌評価マーカー（特許文献２）、神経系の変性疾患に共通するバイオマーカー（特許文献３）として利用されている。特許文献４では同じく疲労状態及びストレス状態の評価のための多数のマーカーの一つとして利用している。
【０００４】
ＦＡＢＰ５は、遺伝的変異又はノックアウトマウスにおいて、粥状動脈硬化や糖尿病の発症が抑制されることから、これらの疾患の原因となるのではないかと予想されているが、ヒトではまだ明らかになっていない。
また、皮膚において脂肪酸自体が肌にダメージを与え、炎症を起こすが、これは皮膚上に多く存在するＦＡＢＰ５が核内受容体を介してバリア機能低下や炎症など肌状態を悪化させるためである。過剰な脂肪酸の存在は、皮膚上のＦＡＢＰ５を増加させ、皮膚の炎症を増強させることが分かっている。炎症を惹起させる脂肪酸としてパルミチン酸、ラウリン酸、オレイン酸が、このような挙動を示すことも分かっている。
【０００５】
ＦＡＢＰ５を抑制する物質として、特許文献５には、ＦＡＢＰ５発現又は活性抑制作用を有するトリアゾロピリミジノン誘導体（５−（（３−ｃｈｌｏｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ）−２−ｐｈｅｎｙｌ−［１，２，４］ｔｒｉａｚｏｌｏ［１，５−α］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７（４Ｈ）−ｏｎｅを例示している。この化合物及び誘導体はＦＡＢＰ５を抑制すること、毛成長抑制作用を有することが特許文献５には、そしてＦＡＢＰ５を指標とする毛成長抑制剤の評価方法が記載されている。
特許文献６には、小豆の水抽出物や、これを吸着剤や担体に吸着させて、メタノール、エタノール等の溶媒で溶出して得たものを有効成分として、癌の転移抑制剤やＦＡＢＰ５遺伝子活性抑制剤、癌の増殖抑制剤等の抗癌剤として利用する発明が記載されている。
【０００６】
特許文献７には、ＧＩＰを分泌する腸細胞にＦＡＢＰ４及びＦＡＢＰ５が発現していること、ＦＡＢＰ４／５を阻害することによって血中ＧＩＰ濃度が低下すること、ＦＡＢＰ４／５を阻害する物質がＧＩＰ上昇抑制剤として有用であることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−１６４４０４号公報
【特許文献２】特開２０１６−９５１８５号公報
【特許文献３】特開２０１４−０７１０１６号公報
【特許文献４】特開２０１３−１５０５５８号公報
【特許文献５】特開２０１６−２１４０８５号公報
【特許文献６】特開２０１７−１５５０１２号公報
【特許文献７】特開２０１７−２１５３３６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nature Reviews Drug Discovery,2008,7:489-503
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、天然物由来の化合物ライブラリーを探索源としてＦＡＢＰ５産生を抑制する化合物を探索し、ＦＡＢＰ５産生抑制活性を有する化合物を見いだした。また植物抽出物についても同様の探索を行い、複数の植物抽出物であって、特定の化合物を含有する抽出物に、強いＦＡＢＰ５産生抑制作用が存在することを見いだした。
すなわち、本発明は、ＦＡＢＰ５産生抑制作用を有する組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）ノビレチン、ナリンギン、スルフォラファン、ホモオリエンチン、ジャスモン酸メチルから選択される１以上の物質を有効成分として含むＦＡＢＰ５産生抑制用組成物。
（２）ノビレチンを含む組成物が柑橘類の果皮抽出物である（１）に記載のＦＡＢＰ５産生抑制用組成物。
（３）柑橘類の果皮抽出物がチンピエキス及び／又はキッピエキスである（２）に記載のＦＡＢＰ５産生抑制用組成物。
（４）スルフォラファンを含む組成物がブロッコリー抽出物である（１）に記載のＦＡＢＰ５産生抑制用組成物。
（５）ブロッコリー抽出物がブロッコリースプラウト抽出物である（４）に記載のＦＡＢＰ５産生抑制用組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の組成物は、ヒト細胞のＦＡＢＰ５の産生を抑制する作用を有している。本発明の組成物は、皮膚に多く存在するＦＡＢＰ５の産生を抑制することができるため、皮膚の脂肪酸に由来する炎症反応を抑制することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ノビレチンのＦＡＢＰ５産生抑制試験の結果を示すグラフである。
【図２】ナリンギンのＦＡＢＰ５産生抑制試験の結果を示すグラフである。
【図３】スルフォラファンのＦＡＢＰ５産生抑制試験の結果を示すグラフである。
【図４】ホモオリエンチンのＦＡＢＰ５産生抑制試験の結果を示すグラフである。
【図５】ジャスモン酸メチルのＦＡＢＰ５産生抑制試験の結果を示すグラフである。
【図６】チンピエキスのＦＡＢＰ５産生抑制試験の結果を示すグラフである。
【図７】ブロッコリースプラウトのＦＡＢＰ５産生抑制試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ノビレチン、ナリンギン、スルフォラファン、ホモオリエンチン、ジャスモン酸メチルから選択される１以上の物質を有効成分として含むＦＡＢＰ５産生抑制用組成物に関する。
本願明細書において使用する「ＦＡＢＰ５」なる用語は、Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ５の略語であって、脂肪酸結合性タンパク質５を意味する。
またＦＡＢＰ５産生抑制とは、ＦＡＢＰ５遺伝子の転写抑制、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制、ＦＡＢＰ５のタンパク質量及び／又はＦＡＢＰ５活性の抑制を意味している。
【００１４】
１．ノビレチン
ノビレチン（Ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ）は、ポリメトキシフラボノイド（Ｏ−メチル化フラボノイド）であり、柑橘類の果皮等に多く含まれている。下記化学式１で表される構造を有しており、柑橘類の果皮や果汁から抽出したものを本発明に用いることができる。
ノビレチンのＩＵＰＡＣ名称は、２−（３，４−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５，６，７，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｏｘｙｃｈｒｏｍｅｎ−４−ｏｎｅ、ＣＡＳ番号が４７８−０１−３である化合物として特定できる。
【００１５】
【化１】
2019156743.tif 000002
（化学式１）
【００１６】
本発明において、ノビレチンは、高純度に精製されたものであっても良いし、他のフラボノイド成分を含む柑橘類からの抽出物であっても良い。このような抽出物としてはチンピ・キッピエキスを例示することができる。また市販されているエキスであっても良い。市販されている製品としては、チンピエキスＫ６５Ｂ（日油株式会社）を例示できる。
【００１７】
２．ナリンギン
ナリンギン (Ｎａｒｉｎｇｉｎ) は、グレープフルーツやはっさくなどの果実の果皮付近に多く含まれるフラバノンの配糖体で、柑橘類の苦味や刺激感の元になっている。
ナリンギン（ナリンジンとも呼ばれることがある）は、下記化学式２で表される構造を有しており、柑橘類の果皮や果汁から抽出したものを本発明に用いることができる。
【００１８】
【化２】
2019156743.tif 000003
（化学式２）
【００１９】
本発明において、ナリンギンは、高純度に精製されたものであっても良いし、他のフラボノイド成分を含む柑橘類からの抽出物であっても良い。このような抽出物としては温州みかんの果皮の抽出物であるチンピエキス及び橘の果皮抽出物であるキッピエキスを例示することができる。ナリンギンは、ＩＵＰＡＣ名称４’，５−ジヒドロキシ−７−［（２−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］フラバン−４−オン、ＣＡＳ番号が１０２３６−４７−２の化合物として特定できる。
【００２０】
３．スルフォラファン
スルフォラファン（Ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ）は、イソチオシアネートの一種でアブラナ科野菜に多く含まれており、中でもブロッコリーには多く含まれている。下記化学式３で表される構造を有しており、ブロッコリー又はブロッコリーの新芽（ブロッコリースプラウト）から抽出したものを本発明に用いることができる。
スルフォラファンのＩＵＰＡＣ名称は、１−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏ−４−（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌ）−ｂｕｔａｎｅ、ＣＡＳ番号が４４７８−９３−７である化合物として特定できる。
【００２１】
【化３】
2019156743.tif 000004
（化学式３）
【００２２】
本発明において、スルフォラファンは、高純度に精製されたものであっても良いし、他の成分を含む抽出物であっても良い。また化学的に合成されたものであっても良い。スルフォラファンのブロッコリー又はブロッコリースプラウトからの抽出方法は、特表２００８−５３９２６１号公報に開示されており、この方法で精製したものを用いることができる。このような抽出物として市販されているものとしては、ブロッコリースプラウトエキスＰＣ（オリザ油化株式会社）を例示することができる。ブロッコリースプラウトエキスＰＣは、発芽状態のブロッコリー (アブラナ科  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．  ｉｔａｌｉｃａ) より抽出されたエキスで、スルフォラファンを２．０質量％以上含有している組成物である。
【００２３】
４．ホモオリエンチン
ホモオリエンチン（Ｈｏｍｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）は、別名をイソオリエンチンとも言う。パッションフルーツの花エキス中に含有されていることが知られている化合物である。下記化学式４で表すことができる。ＩＵＰＡＣ名称は、２−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ、ＣＡＳ番号が４２６１−４２−１の化合物として特定できる。
【００２４】
【化４】
2019156743.tif 000005
（化学式４）
【００２５】
本発明において、ホモオリエンチンは、高純度に精製されたものであっても良いし、他の成分を含む抽出物であっても良い。また化学的に合成されたものであっても良い。ホモオリエンチンはトケイソウの花エキス（パッションフラワーエキス）から常法で抽出することができる。また市販されているトケイソウの花エキスを使用しても良い。市販されているものとして、「パッションフラワーエキス−ＰＣ」、「パッションフラワーエキス−ＷＳＰＣ」（いずれもオリザ油化株式会社製）を例示できる。
【００２６】
５．ジャスモン酸メチル
ジャスモン酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ  ｊａｓｍｏｎａｔｅ）は、植物防御や、種子発芽、根の伸長、開花、果実の熟成、老化といった種々の発生経路において、植物ホルモンとして用いられる揮発性有機化合物の一つである。ジャスミン油から香気成分として単離されている化合物であり、下記化学式５で表すことができる。ＩＵＰＡＣ名称は、Ｍｅｔｈｙｌ（１Ｒ，２Ｒ）−３−Ｏｘｏ−２−（２Ｚ）−２−ｐｅｎｔｅｎｙｌ−ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｅａｃｅｔａｔｅ、ＣＡＳ番号が３９９２４−５２−２の化合物として特定できる。
【００２７】
【化５】
2019156743.tif 000006
（化学式５）
【００２８】
ジャスモン酸メチルは高純度に精製されたものであっても良いし、他の成分を含む抽出物であっても良い。また化学的に合成されたものであっても良い。ジャスモン酸メチルは、ジャスミンの花から水蒸気蒸留した精油中に含有されており、これを本発明に用いることができる。
【００２９】
本発明の組成物は、食品、医薬品、化粧品等として使用できる。食品としては、通常の食品の他、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等として使用しても良く、例えば、ジュースのような飲料に配合することもできる。  
【００３０】
医薬品用途において、投与に関しては、有効成分を経口摂取、非経口摂取の場合、直腸内投与、注射等の、投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。形態としては、例えば、粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤、外用剤等が挙げられる。これらの製剤は常套手段により調製することが可能である。外用剤とすることが好ましい。上記の医薬品用担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチレンデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の添加剤を適宜添加することも可能である。
【００３１】
本発明の組成物を化粧品とする場合、本発明の効果を損なわない範囲で、通常化粧料に常用される、各種の成分を適宜配合することができる。このような配合可能なその他の成分としては、本発明の目的を妨げない限り特に限定されず、例えば、油分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、色材、アルコール類、紫外線防止剤、アミノ酸類、ビタミン類、美白剤、有機酸、無機塩類、酵素、酸化防止剤、安定剤、防腐剤、殺菌剤、皮膚賦活剤、血行促進剤、抗脂漏剤、抗炎症剤等の薬剤、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤、収斂剤、清涼剤、香料、色素、水が挙げられる。
【００３２】
本発明の組成物を含む化粧料の形態は特に限定されず、例えば、化粧水、乳液、クリーム、美容液、ファンデーション等の形態でスキンケア化粧料やメーキャップ化粧料、マッサージ化粧料、パック化粧料に用いることができる。また、本発明の皮膚外用組成物は、薬事法の言う化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれる製品とすることができる。乳液、クリーム、ローションのようなスキンケア製品、軟膏等に用いられる。特に限定されるものではないが、その剤型は水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水―油２層系、水―油―粉末３層系等、幅広い剤型を取り得る。
【００３３】
本発明の組成物の投与量は、対象者の年齢、体重、症状、投与経路、投与スケジュール、製剤形態等により、適宜選択決定される。経口投与の場合、１日あたり０．００１〜１００ｇが好ましい。外用の場合、０．００１〜１質量％を含む組成物を１日あたり、複数回投与する。  
【実施例】
【００３４】
以下に試験例を示し、本発明を具体的に説明する。
１．天然化合物ライブラリーを用いた１次スクリーニング試験
出願人保有の天然化合物ライブラリーの４８０化合物を対象に試験を行った。
【００３５】
（１）試験方法
１）試験に用いた細胞
正常ヒト表皮角化細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：ＮＨＥＫ  ｐａｓｓａｇｅ４ / Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【００３６】
２）細胞の培養条件
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加した培地ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／１１９９５−０７３）を用いた。通常培養には７５ｃｍフラスコに細胞を播種し８０〜９０％コンフルエント時に０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて細胞を剥離し、継代を行った。
【００３７】
３）試験試料
ライブラリーの化合物は、１００％ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ)に０．４ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解させて試験を行った。
【００３８】
４）ＦＡＢＰ産生刺激
２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＮＨＥＫ細胞を４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種し、２４時間前培養を行った。そして試験試料の添加は１００％ＤＭＳＯに溶解させた溶液を、培地により最終濃度が０．１〜１μｇ／ｍｌになるように希釈して添加した。
【００３９】
５）タンパク質の抽出
細胞をＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、２０分間振とうした後、細胞溶解液を回収した。回収した細胞溶解液はＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｔを用いてタンパク質量を測定した。なおタンパク質量の測定は、キット添付のプロトコールに従った。
【００４０】
６）ＦＡＢＰ５の測定
９６ｗｅｌｌ  ＥＩＡ／ＲＩＡ  ｐｌａｔｅにＰＢＳで希釈した抗ＦＡＢＰ５抗体（Ｂｉｏ  Ｖｅｎｄｅｒ）１００μｌを添加し、４℃で保存し、抗体を固定化させた。
翌日３００μｌ  Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、次いで余分な液を除き、Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｒ＆Ｄ）を添加し、２５℃で１時間ブロッキングを行った。３００μｌのＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）で３回洗浄し、余分な液を除いた後、Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈したＦＡＢＰ５（フナコシ株式会社）と試験試料を各１００μｌ添加した。
３７℃で１．５時間反応させた後、３００μｌのＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）で３回洗浄し、次いで余分な液を除き、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）で希釈した抗ＦＡＢＰ５抗体（Ｒ＆Ｄ）を１００μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。
反応終了後３００μｌのＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）で３回洗浄し、余分な液を除き、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）で希釈した抗Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ２を１００μｌ添加し、３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。３００μｌのＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）で３回洗浄し、余分な液を除き、ＴＭＢ  Ｏｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐｒｏｍｅｇａ）を１００μｌ添加し、色が変わるまで室温で反応させた。次いで、２Ｎ硫酸（和光純薬工業株式会社）を５０μｌ添加し、反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。予め作成した検量線と対比してＦＡＢＰ５の産生量を測定した。得られたＦＡＢＰ５の測定値を細胞タンパク量で除して標準化し、ＦＡＢＰ５の生産量とした。
【００４１】
（２）試験結果
上記の４８０化合物のうち、ＦＡＢＰ５産生が無添加の場合と比較して変動が観察されたものは、次の表１に示す１２化合物であった。
【００４２】
【表１】
2019156743.tif 000007
【００４３】
２．ＦＡＢＰ５産生抑制試験
１次試験で陽性（ＦＡＢＰ５の産生を変動させた）となった化合物について、ＬＰＳと脂肪酸刺激によるＦＡＢＰ５の産生を抑制する機能を評価した。
【００４４】
（１）試験方法
１）細胞の培養条件
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加した培地ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／１１９９５−０７３）を用いた。通常培養には７５ｃｍフラスコに細胞を播種し８０〜９０％コンフルエント時に０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて細胞を剥離し、継代を行った。
【００４５】
２）試験試料
１次スクリーニングと同様に、試験試料は、いずれもジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ)に溶解させて試験を行った。
【００４６】
３）ＬＰＳと脂肪酸によるＦＡＢＰ５産生刺激
２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＮＨＥＫを４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種し、２４時間前培養を行った。そして、１０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（リポポリサッカリド  大腸菌０２６：Ｂ６由来：Ｓｉｇｍａ  Ａｒｄｒｉｃｈ）を添加した培地で８時間培養した。その後、パルミチン酸４００μＭ、またはオレイン酸８００μＭを添加した培地に試験試料を加え２０時間培養を行った。試験試料の添加は１００％ＤＭＳＯに溶解させた溶液を、培地により最終濃度がノビレチンは４０μｇ／ｍｌ、ナリンギンは０．２５μｇ／ｍｌ、スルフォラファンは０．０２５μｇ／ｍｌ、ホモオリエンチンは２．５μｇ／ｍｌ、ジャスモン酸メチルは１μｇ／ｍｌになるように希釈して添加した。
【００４７】
４）タンパク質の抽出
細胞をＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、２０分間振とうした後、細胞溶解液を回収した。回収した細胞溶解液はＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｔを用いてタンパク質量を測定した。なおタンパク質量の測定は、キット添付のプロトコールに従った。
【００４８】
５）ＦＡＢＰ５の測定
９６ｗｅｌｌ  ＥＩＡ／ＲＩＡ  ｐｌａｔｅにＰＢＳで希釈した抗ＦＡＢＰ５抗体（Ｂｉｏ  Ｖｅｎｄｅｒ）１００μｌを添加し、４℃で保存し、抗体を固定化させた。
翌日３００μｌ  Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、次いで余分な液を除き、Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｒ＆Ｄ）を添加し、２５℃で１時間ブロッキングを行った。３００μｌのＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）で３回洗浄し、余分な液を除いた後、Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈したＦＡＢＰ５（フナコシ株式会社）と試験試料を各１００μｌ添加した。
３７℃で１．５時間反応させた後、３００μｌのＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）で３回洗浄し、次いで余分な液を除き、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）で希釈した抗ＦＡＢＰ５抗体（Ｒ＆Ｄ）を１００μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。
反応終了後３００μｌのＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）で３回洗浄し、余分な液を除き、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）で希釈した抗Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ２を１００μｌ添加し、３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。３００μｌのＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）で３回洗浄し、余分な液を除き、ＴＭＢ  Ｏｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐｒｏｍｅｇａ）を１００μｌ添加し、色が変わるまで室温で反応させた。次いで、２Ｎ硫酸（和光純薬工業株式会社）を５０μｌ添加し、反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。予め作成した検量線と対比してＦＡＢＰ５の産生量を測定した。得られたＦＡＢＰ５の測定値を細胞タンパク量で除して標準化し、ＦＡＢＰ５の生産量とした。
【００４９】
（２）試験結果
上記の１２試料のうち、ＦＡＢＰ５産生を抑制した化合物は、ノビレチン、ナリンギン、スルフォラファン、ホモオリエンチン、ジャスモン酸メチルの５試料であった。
ＦＡＢＰ５産生を抑制できる最低濃度を確認した試験結果を図１〜５に示す。
図１〜図５に示すように、ノビレチンは４０μｇ／ｍｌ、ナリンギンは０．２５μｇ／ｍｌ、スルフォラファンは０．０２５μｇ／ｍｌ、ホモオリエンチンは２．５μｇ／ｍｌ、ジャスモン酸メチルは１μｇ／ｍｌの濃度でＦＡＢＰ５の産生を抑制した。
【００５０】
３．抽出物を用いたＦＡＢＰ５産生抑制試験
ノビレチンを含む抽出物としてタチバナ果皮エキス（「チンピエキスＫ６５Ｂ」日油株式会社）、スルフォラファンを含む抽出物として発芽ブロッコリー抽出物（「ブロッコリースプラウトエキスＰＣ」オリザ油化株式会社）を用いて、１．の試験と同様に試験を行った。なおチンピエキスは、ノビレチンを０．８％含有しているものを用いた。またブロッコリー抽出物は、スルフォラファンを２％含有しているものを用いた。
【００５１】
試験結果を図６、図７に示す。
チンピエキスは０．４μｇ／ｍｌ、ブロッコリースプラウトエキスは０．０００２５％以上の濃度でＦＡＢＰ５の産生を抑制することがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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