(57)【要約】【課題】フローセルを流れる複数の細胞を含む画像をより高品質に生成することが可能な細胞撮像方法、細胞撮像装置を提供する【解決手段】細胞撮像装置１０は、複数の細胞を含む試料を流すためのフローセル４０と、光源２０と、光源２０から出射された光から、ライトシート１１をフローセル４０に対し形成するための照射光学系３０と、被写界深度を拡大させる素子を有し、フローセル４０を流れる複数の細胞から生じた光を集光するための集光光学系５０と、集光光学系５０により集光された複数の細胞から生じた光を受光し、複数の細胞を撮像するための撮像素子６０と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ライトシートをフローセルに対して形成し、
前記フローセルに複数の細胞を含む測定試料を流し、
前記ライトシートを通過する複数の細胞から生じた光を、被写界深度を拡大する素子を介して撮像素子で受光し、前記複数の細胞を撮像する、細胞撮像方法。
【請求項２】
前記ライトシートを、試料の流れ方向に対して垂直でなく傾けて形成する、請求項１に記載の細胞撮像方法。
【請求項３】
複数の細胞を前記ライトシートに同時に通過させ、前記複数の細胞から生じた光を撮像素子で受光する、請求項１または２に記載の細胞撮像方法。
【請求項４】
前記被写界深度を拡大する素子は、点像分布関数を変調する位相変調素子である、請求項１ないし３の何れか一項に記載の細胞撮像方法。
【請求項５】
前記点像分布関数は、スパイラル点像分布関数である、請求項４に記載の細胞撮像方法。
【請求項６】
前記点像分布関数は、シングルヘリックス点像分布関数である、請求項４に記載の細胞撮像方法。
【請求項７】
撮像した前記複数の細胞を含む画像に対し、前記位相変調素子により生じる撮像画像の歪みを補正する、請求項１ないし６の何れか一項に記載の細胞撮像方法。
【請求項８】
前記撮像画像の歪みを補正する工程において、前記撮像画像を構成する画像要素を、それぞれ、前記点像分布関数に基づく位置ずれを補正する位置へと移動させる、請求項７に記載の細胞撮像方法。
【請求項９】
前記撮像画像の歪みを補正する工程において、前記画像要素を取得した撮像面上の位置と前記ライトシートとの距離に基づいて、前記画像要素を移動させる、請求項７に記載の細胞撮像方法。
【請求項１０】
前記撮像画像の歪みを補正する工程において、前記画像要素を取得した撮像面上の位置と前記ライトシートとの距離に応じた方向および距離で、前記画像要素を移動させる、請求項９に記載の細胞撮像方法。
【請求項１１】
前記画像要素は、画素ごとに取得される画像要素である、請求項８ないし１０の何れか一項に記載の細胞撮像方法。
【請求項１２】
前記撮像画像の歪みを補正する工程において、前記ライトシートとの距離が同じ画素列により取得された前記画像要素を、前記画素列と前記ライトシートとの距離に応じた方向および距離で移動させる、請求項１１に記載の細胞撮像方法。
【請求項１３】
複数の細胞を含む画像を複数撮像し、
撮像した複数の画像から前記複数の細胞の３次元画像を含む画像を生成する、請求項１ないし１２の何れか一項に記載の細胞撮像方法。
【請求項１４】
前記画像を生成する工程は、撮像面における前記細胞の像の位置を補正する工程を含み、
前記位置を補正する工程において、少なくとも前記フローセルにおける前記細胞の移動量と前記試料の流れ方向に対する前記ライトシートの角度とに基づいて、撮像面における前記細胞の像の移動量を算出し、
算出した前記移動量と、前記細胞の移動に伴い取得した一連の前記撮像画像とに基づいて、前記３次元画像を生成する、請求項１３に記載の細胞撮像方法。
【請求項１５】
前記画像を生成する工程は、撮像面における前記細胞の像の大きさを補正する工程を含み、
前記大きさを補正する工程において、前記試料の流れ方向に対する前記ライトシートの角度に基づいて、前記撮像画像の大きさを補正し、
大きさが補正された画像に基づいて、前記細胞の前記３次元画像を生成する、請求項１３または１４に記載の細胞撮像方法。
【請求項１６】
複数の細胞を含む試料を流すためのフローセルと、
光源と、
前記光源から出射された光からライトシートを前記フローセルに対し形成するための照射光学系と、
被写界深度を拡大させる素子を有し、前記フローセルを流れる複数の前記細胞から生じた光を集光するための集光光学系と、
前記集光光学系により集光された前記複数の細胞から生じた光を受光し、前記複数の細胞を撮像するための撮像素子と、を備える、細胞撮像装置。
【請求項１７】
前記被写界深度を拡大する素子は、点像分布関数を変調する位相変調素子である、請求項１６に記載の細胞撮像装置。
【請求項１８】
前記位相変調素子は、前記撮像素子の撮像面にスパイラル点像分布関数を形成する、請求項１６または１７に記載の細胞撮像装置。
【請求項１９】
前記スパイラル点像分布関数は、シングルヘリックス点像分布関数である、請求項１８に記載の細胞撮像装置。
【請求項２０】
前記撮像素子により取得された撮像画像を処理する処理部を備え、
前記処理部は、前記位相変調素子により生じる前記撮像画像の歪みを補正する処理を実行し、歪み補正後の前記撮像画像に基づいて、前記複数の細胞を含む画像を生成する、請求項１６ないし１９の何れか一項に記載の細胞撮像装置。
【請求項２１】
前記処理部は、前記撮像画像を構成する画像要素を、それぞれ、前記点像分布関数に基づく位置ずれを補正する位置へと移動させることにより、前記撮像画像の歪みを補正する、請求項２０に記載の細胞撮像装置。
【請求項２２】
前記処理部は、前記撮像画像を構成する画像要素を、前記画像要素を取得した撮像面上の位置と前記ライトシートとの距離に基づいて移動させることにより、前記撮像画像の歪みを補正する、請求項２１に記載の細胞撮像装置。
【請求項２３】
前記処理部は、前記画像要素を取得した撮像面上の位置と前記ライトシートとの距離に応じた方向および距離で、前記画像要素を移動させることにより、前記撮像画像の歪みを補正する、請求項２２に記載の細胞撮像装置。
【請求項２４】
前記画像要素は、前記撮像素子の画素ごとに取得される画像要素である、請求項２１ないし２３の何れか一項に記載の細胞撮像装置。
【請求項２５】
前記処理部は、前記ライトシートとの距離が同じ画素列により取得された前記画像要素を、前記画素列と前記ライトシートとの距離に応じた方向および距離で移動させることにより、前記撮像画像の歪みを補正する、請求項２４に記載の細胞撮像装置。
【請求項２６】
前記点像分布関数は、マルチヘリックス点像分布関数であり、
前記処理部は、前記点像分布関数により組となる複数の画像要素を、これら画像要素の中間位置に移動させることにより、前記撮像画像の歪みを補正する、請求項２０ないし２５の何れか一項に記載の細胞撮像装置。
【請求項２７】
前記位相変調素子は、空間光変調器、デフォーマブルミラーまたは位相板である、請求項１６ないし２６の何れか一項に記載の細胞撮像装置。
【請求項２８】
前記撮像素子により取得された撮像画像を処理する処理部を備え、
前記処理部は、前記撮像画像に基づいて、前記複数の細胞の３次元画像を含む画像を生成する、請求項１６ないし２７の何れか一項に記載の細胞撮像装置。
【請求項２９】
前記処理部は、
少なくとも前記フローセルにおける前記細胞の移動量と前記試料の流れ方向に対する前記ライトシートの角度とに基づいて、前記撮像素子の撮像面における前記細胞の像の移動量を算出し、
算出した前記移動量と、前記細胞の移動に伴い取得した一連の前記撮像画像とに基づいて、前記３次元画像を生成する、請求項２８に記載の細胞撮像装置。
【請求項３０】
前記処理部は、前記試料の流れ方向に対する前記ライトシートの角度に基づいて、前記撮像画像の大きさを補正し、大きさが補正された画像に基づいて、前記複数の細胞を含む前記３次元画像を生成する、請求項２８または２９に記載の細胞撮像装置。
【請求項３１】
前記ライトシートのシート面は、前記フローセルの外側面に対して垂直である、請求項１６ないし３０の何れか一項に記載の細胞撮像装置。
【請求項３２】
前記集光光学系の光軸は、前記試料の流れ方向に対して垂直である、請求項１６ないし３１の何れか一項に記載の細胞撮像装置。
【請求項３３】
前記照射光学系の光軸と前記集光光学系の光軸とが互いに垂直である、請求項１６ないし３２の何れか一項に記載の細胞撮像装置。
【請求項３４】
前記照射光学系は、
第１方向における光の収束と、前記第１方向と交わる第２方向における光の収束とが異なるように前記光源から出射された光を収束させる光学レンズと、
前記光学レンズにおける前記照射光学系の光軸を中心に前記光学レンズを回転させる回転機構部と、を備える、請求項１６ないし３３の何れか一項に記載の細胞撮像装置。
【請求項３５】
ライトシートをフローセルに対して形成し、
前記フローセルを流れる粒子から生じた光を、点像分布関数を変調する位相変調素子を介して撮像し、
前記位相変調素子により生じる撮像画像の歪みを補正する、粒子撮像方法。
【請求項３６】
粒子を含む試料を流すためのフローセルと、
光源と、
前記光源から出射された光から、ライトシートを前記フローセルに対し形成するための照射光学系と、
被写界深度を拡大させる位相変調素子を有し、前記フローセルを流れる前記粒子から生じた光を集光するための集光光学系と、
前記集光光学系により集光された光を受光するための撮像素子と、
前記位相変調素子により生じる撮像画像の歪みを補正する処理部と、を備える、粒子撮像装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞撮像方法、細胞撮像装置、粒子撮像方法および粒子撮像装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、フローセルを流れる試料の流れに対してライトシートのシート面を傾けることにより、粒子の断面画像を撮像可能な粒子撮像装置が記載されている。すなわち、図２０（ａ）、（ｂ）示すように、粒子撮像装置３００は、光源３０１と、照射光学系３０２と、フローセル３０３と、集光光学系３０４と、撮像素子３０５とを備える。光源３０１から出射された光が照射光学系３０２によって収束されてライトシート３１０が形成される。ライトシート３１０のシート面は、フローセル３０３の外側面３０３ａに対して垂直であり、且つ、フローセル３０３を流れる試料の流れ方向に対して所定の角度で傾いている。粒子３２０から生じた蛍光が、対物レンズ３０４ａを含む集光光学系３０４によって、撮像素子３０５の撮像面３０５ａに集光される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１７−５８３５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞の撮像においては、スループットを高めて、単時間あたりに、なるべく多くの細胞画像を取得できることが好ましい。この要求は、特に、試料に含まれる希少な細胞を撮像する場合に顕著である。この場合、ライトシートを同時に横切る複数の細胞を同時に撮像することで、単位時間に取得可能な細胞画像の数を高め得る。しかし、この場合、対物レンズの焦点位置から大きく外れた位置を流れる細胞は、フォーカスずれにより撮像画像が不鮮明となる。
【０００５】
また、培養幹細胞の評価においては、複数の細胞が凝集した凝集塊を撮像し分析することが有用である。この場合、単一細胞に比べて凝集塊が大きいため、凝集塊は、対物レンズの光軸方向に比較的大きな幅を有する。このため、凝集塊の部位によっては、対物レンズの焦点位置から大きく外れ、撮像画像のこの部位に対応する部分が不鮮明となってしまう。
【０００６】
かかる課題に鑑み、本発明は、フローセルを流れる複数の細胞を含む画像をより高品質に生成することが可能な細胞撮像方法、細胞撮像装置、粒子撮像方法および粒子撮像装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、細胞撮像方法に関する。この態様に係る細胞撮像方法は、ライトシート（１１）をフローセル（４０）に対して形成し（Ｓ１１）、フローセル（４０）に複数の細胞を含む測定試料を流し（Ｓ１２）、ライトシート（１１）を通過する複数の細胞から生じた光を、被写界深度を拡大する素子（５５）を介して撮像素子（６０）で受光し（Ｓ１３）、複数の細胞を含む画像を撮像する（Ｓ１４）。
【０００８】
「被写界深度」とは、集光光学系の光軸方向における、撮像素子が撮像する画像の焦点が合っているようにみえる測定対象側の距離の範囲のことである。
【０００９】
本態様に係る細胞撮像方法によれば、フローセルを流れる複数の細胞から生じた光が被写界深度を拡大する素子を介して撮像されるため、フローセルを流れる細胞の位置にかかわらず細胞の明瞭な断面画像を取得できる。よって、複数の細胞を含む画像を高品質に生成できる。
【００１０】
本態様に係る細胞撮像方法において、ライトシート（１１）は、試料の流れ方向に対して垂直でなく傾けて形成され得る。こうすると、複数の細胞から生じた光をフローセル（４０）の側方から撮像できる。
【００１１】
本態様に係る細胞撮像方法においては、複数の細胞をライトシート（１１）に同時に通過させ、複数の細胞から生じた光を撮像素子（６０）で受光する。こうすると、複数の細胞を同時に撮像でき、複数の細胞の断面画像を含む画像を取得できる。
【００１２】
本態様に係る細胞撮像方法において、被写界深度を拡大する素子（５５）は、点像分布関数を変調する位相変調素子（５５）を用い得る。
【００１３】
この場合、点像分布関数は、スパイラル点像分布関数とされ得る。これにより、被写界深度を効果的に拡大できる。
【００１４】
「スパイラル点像分布関数」とは、１つの起点から生じた光を、当該起点の深さ位置に応じた像面上の回転位置に結像させる点像分布関数のことである。
【００１５】
ここで、点像分布関数は、シングルヘリックス点像分布関数とされ得る。こうすると、細胞断面の各部から生じた光が分離しないため、良好な撮像画像に取得できる。
【００１６】
「シングルヘリックス点像分布関数」とは、スパイラル点像分布関数の１種であり、１つの起点から生じた光を１つの焦点に結像させる点像分布関数のことである。
【００１７】
本態様に係る細胞撮像方法は、撮像した複数の細胞を含む画像に対し、位相変調素子（５５）により生じる撮像画像の歪みを補正する工程（Ｓ２１）を含み得る。このように、位相変調素子の作用により生じる撮像画像の歪みを補正することにより、高品質の細胞画像を取得できる。
【００１８】
たとえば、撮像画像の歪みを補正する工程（Ｓ２１）において、撮像画像を構成する画像要素を、それぞれ、点像分布関数に基づく位置ずれを補正する位置へと移動させる。このように画像要素を個別に移動させることにより、撮像画像全体の歪を適正に補正できる。
【００１９】
具体的には、撮像画像の歪みを補正する工程（Ｓ２１）において、画像要素を取得した撮像面（６１）上の位置とライトシート（１１）との距離に基づいて、画像要素を移動させる。こうすると、撮像画像の歪みを適切に補正できる。
【００２０】
より詳細には、撮像画像の歪みを補正する工程（Ｓ２１）において、画像要素を取得した撮像面（６１）上の位置とライトシート（１１）との距離に応じた方向および距離で、画像要素を移動させる。こうすると、簡易な処理により、撮像画像の歪みを適切に補正できる。
【００２１】
この場合、画像要素は、画素ごとに取得される画像要素とされ得る。このように補正対象の画像要素を、最小撮像単位である画素から取得される画像要素に設定することにより、撮像画像の歪を高精細に補正できる。
【００２２】
なお、「画像要素」とは、撮像画像を所定の単位ブロックで区切った場合の各単位ブロックに含まれる画像部分のことであり、上記のような１画素分の画像部分の他、上下に所定数の画素からなる単位ブロックに含まれる画像部分であってもよい。
【００２３】
また、前記撮像画像の歪みを補正する工程（Ｓ２１）では、ライトシート（１１）との距離が同じ画素列（ＰＬ１〜ＰＬｎ）により取得された画像要素を、画素列（ＰＬ１〜ＰＬｎ）とライトシート（１１）との距離に応じた方向および距離で移動させる処理が行われ得る。こうすると、極めて簡易な処理により、撮像画像の歪みを適切に補正できる。
【００２４】
本態様に係る細胞撮像方法は、複数の細胞を含む画像を複数撮像し、撮像した複数の画像から複数の細胞の３次元画像を含む画像を生成する処理が行われ得る。これにより、複数の細胞に対して高品質の３次元画像を取得できる。
【００２５】
本態様に係る細胞撮像方法において、画像を生成する工程（Ｓ１５）は、撮像面（６１）における細胞の像の位置を補正する工程（Ｓ２３）を含み、位置を補正する工程（Ｓ２３）において、少なくともフローセル（４９）における細胞の移動量と試料の流れ方向に対するライトシート（１１）の角度とに基づいて、撮像面（６１）における細胞の像の移動量を算出し、算出した前記移動量と、細胞の移動に伴い取得した一連の撮像画像とに基づいて、３次元画像を生成する処理を行い得る。このように、撮像面における画像の移動量を考慮して複数の細胞の３次元画像を生成することにより、より高品質の３次元画像を取得できる。
【００２６】
また、画像を生成する工程（Ｓ２１）は、撮像面（６１）における細胞の像の大きさを補正する工程（Ｓ２２）を含み、大きさを補正する工程（Ｓ２２）において、試料の流れ方向に対するライトシート（１１）の角度に基づいて、撮像画像の大きさを補正し、大きさが補正された画像に基づいて、細胞の３次元画像を生成する。このように、撮像画像の大きさを補正することにより、より高品質の３次元画像を取得できる。
【００２７】
本発明の第２の態様は、細胞撮像装置に関する。この態様に係る細胞撮像装置は、複数の細胞を含む試料を流すためのフローセル（４０）と、光源（２０）と、光源（２０）から出射された光からライトシート（１１）をフローセル（４０）に対し形成するための照射光学系（３０）と、被写界深度を拡大させる素子（５５）を有し、フローセル（４０）を流れる複数の細胞から生じた光を集光するための集光光学系（５０）と、集光光学系（５０）により集光された複数の細胞から生じた光を受光し、複数の細胞を撮像するための撮像素子（６０）と、を備える。
【００２８】
本態様に係る細胞撮像方法によれば、フローセルを流れる複数の細胞から生じた光が被写界深度を拡大する素子を介して撮像されるため、フローセルを流れる細胞の位置にかかわらず細胞の明瞭な断面画像を取得できる。よって、複数の細胞を含む画像を高品質に生成できる。
【００２９】
本態様に係る細胞撮像装置において、被写界深度を拡大する素子（５５）は、点像分布関数を変調する位相変調素子（５５）とされ得る。
【００３０】
この場合、位相変調素子（５５）は、撮像素子（６０）の撮像面（６１）にスパイラル点像分布関数を形成するよう構成され得る。これにより、被写界深度を効果的に拡大できる。
【００３１】
ここで、スパイラル点像分布関数は、シングルヘリックス点像分布関数とされ得る。こうすると、細胞断面の各部から生じた光が分離しないため、良好な撮像画像に取得できる。
【００３２】
本態様に係る細胞撮像装置は、撮像素子（６０）により取得された撮像画像を処理する処理部（８１）を備え、処理部（８１）は、位相変調素子（５５）により生じる撮像画像の歪みを補正する処理を実行し、歪み補正後の撮像画像に基づいて、複数の細胞を含む画像を生成するよう構成され得る。このように、位相変調素子の作用により生じる撮像画像の歪みを補正することにより、高品質の細胞画像を取得できる。
【００３３】
たとえば、処理部（８１）は、撮像画像を構成する画像要素を、それぞれ、点像分布関数に基づく位置ずれを補正する位置へと移動させることにより、撮像画像の歪みを補正するよう構成され得る。このように画像要素を個別に移動させることにより、撮像画像全体の歪を適正に補正できる。
【００３４】
具体的には、処理部（８１）は、撮像画像を構成する画像要素を、画像要素を取得した撮像面（６１）上の位置とライトシート（１１）との距離に基づいて移動させることにより、撮像画像の歪みを補正するよう構成され得る。こうすると、撮像画像の歪みを適切に補正できる。
【００３５】
より詳細には、処理部（８１）は、画像要素を取得した撮像面（６１）上の位置とライトシート（１１）との距離に応じた方向および距離で、画像要素を移動させることにより、撮像画像の歪みを補正するよう構成され得る。こうすると、簡易な処理により、撮像画像の歪みを適切に補正できる。
【００３６】
この場合、画像要素は、撮像素子（６０）の画素ごとに取得される画像要素とされ得る。このように補正対象の画像要素を、最小撮像単位である画素から取得される画像要素に設定することにより、撮像画像の歪を高精細に補正できる。
【００３７】
処理部（８１）は、ライトシート（１１）との距離が同じ画素列（ＰＬ１〜ＰＬｎ）により取得された画像要素を、画素列（ＰＬ１〜ＰＬｎ）とライトシート（１１）との距離に応じた方向および距離で移動させることにより、撮像画像の歪みを補正するよう構成され得る。こうすると、極めて簡易な処理により、撮像画像の歪みを適切に補正できる。
【００３８】
また、点像分布関数は、マルチヘリックス点像分布関数とされ得る。この場合、処理部（８１）は、点像分布関数により組となる複数の画像要素を、これら画像要素の中間位置に移動させることにより、撮像画像の歪みを補正するよう構成され得る。このように、組となる複数の画像要素を重ね合わせることにより、明るい撮像画像を生成できる。
【００３９】
「マルチヘリックス点像分布関数」とは、スパイラル点像分布関数の１種であり、１つの起点から生じた光を複数の焦点に結像させる点像分布関数のことである。
【００４０】
本態様に係る細胞撮像装置において、位相変調素子（５５）は、空間光変調器、デフォーマブルミラーまたは位相板とされ得る。
【００４１】
本態様に係る細胞撮像装置において、処理部（８１）は、撮像画像に基づいて、複数の細胞の３次元画像を含む画像を生成するよう構成され得る。これにより、複数の細胞に対して高品質の３次元画像を取得できる。
【００４２】
この場合、処理部（８１）は、少なくともフローセル（４０）における細胞の移動量と試料の流れ方向に対するライトシート（１１）の角度とに基づいて、撮像素子（６０）の撮像面（６１）における細胞の像の移動量を算出し、算出した移動量と、細胞の移動に伴い取得した一連の撮像画像とに基づいて、３次元画像を生成するよう構成され得る。このように、撮像面における画像の移動量を考慮して複数の細胞の３次元画像を生成することにより、より高品質の３次元画像を取得できる。
【００４３】
また、処理部（８１）は、試料の流れ方向に対するライトシート（１１）の角度に基づいて、撮像画像の大きさを補正し、大きさが補正された画像に基づいて、複数の細胞を含む３次元画像を生成するよう構成され得る。このように、撮像画像の大きさを補正することにより、より高品質の３次元画像を取得できる。
【００４４】
ライトシート（１１）のシート面（１１ａ）は、フローセル（４０）の外側面（４０ａ）に対して垂直とされ得る。これにより、フローセルに入射する光がフローセルによって屈折することが抑制されるため、フローセルを通過して細胞に照射されるビーム形状が崩れにくくなる。したがって、適正な形状のライトシートを細胞に照射できるため、高精度な画像を撮像できる。
【００４５】
集光光学系（５０）の光軸は、試料の流れ方向に対して垂直とされ得る。これにより、撮像素子は、フローセルによって略屈折せずにフローセルの外側に出た光を受光するため、撮像面に照射される光のビーム形状が崩れにくくなる。よって、撮像素子により高精度な画像を撮像できる。
【００４６】
照射光学系（３０）の光軸と集光光学系（５０）の光軸とが互いに垂直とされ得る。こうすると、撮像素子は、粒子の断面から生じた光を正面側から撮像できる。これにより、撮像した画像を試料の流れに垂直な方向に補正するといった処理が不要になる。
【００４７】
照射光学系（３０）は、第１方向（Ｄ１）における光の収束と、第１方向（Ｄ１）と交わる第２方向（Ｄ２）における光の収束とが異なるように光源（２０）から出射された光を収束させる光学レンズ（３１）と、光学レンズ（３１）における照射光学系（３０）の光軸を中心に光学レンズ（３１）を回転させる回転機構部（３０）と、を備えるよう構成され得る。この構成によれば、光学レンズの回転角度を調整することにより、粒子の一連の断面画像を良好に取得しながら、バックグラウンドノイズを抑えた高精度な画像を撮像できる。
【００４８】
本発明の第３の態様は、粒子撮像方法に関する。この態様に係る粒子撮像方法は、ライトシート（１１）をフローセル（４０）に対して形成し（Ｓ１１）、フローセル（４０）を流れる粒子から生じた光を、点像分布関数を変調する位相変調素子（５５）を介して撮像し（Ｓ１３）、位相変調素子（５５）により生じる撮像画像の歪みを補正する（Ｓ２１）。
【００４９】
本態様に係る粒子撮像方法によれば、集光光学系が位相変調素子を備えることにより、集光光学系の被写界深度を拡大でき、集光光学系の光軸方向の位置にかかわらず粒子の明瞭な断面画像を取得できる。さらに、位相変調素子の作用により生じる撮像画像の歪みが処理部により補正されるため、高品質の粒子画像を取得できる。このように、本態様に係る粒子撮像装置によれば、フローセルを流れる粒子の位置に拘わらず、より高品質の粒子画像を生成できる。
【００５０】
本発明の第４の態様は、粒子撮像装置に関する。この態様に係る粒子撮像装置は、粒子を含む試料を流すためのフローセル（４０）と、光源（２０）と、光源（２０）から出射された光から、ライトシート（１１）をフローセル（４０）に対し形成するための照射光学系（３０）と、被写界深度を拡大させる位相変調素子（５５）を有し、フローセル（４０）を流れる粒子から生じた光を集光するための集光光学系（５０）と、集光光学系（５０）により集光された光を受光するための撮像素子（６０）と、撮像素子（６０）により取得された撮像画像の歪みを補正する処理部（８１）と、を備える。
【００５１】
本態様に係る粒子撮像装置によれば、第３の態様と同様の効果が奏され得る。
【発明の効果】
【００５２】
本発明によれば、フローセルを流れる複数の細胞を含む画像をより高品質に生成できる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、実施形態１に係る細胞撮像装置の構成を示す図である。
【図２】図２（ａ）は、実施形態１に係る光学レンズの構成を示す図である。図２（ｂ）は、実施形態１に係る光学レンズが傾いている状態を示す図である。図２（ｃ）は、実施形態１に係るフローセルおよびライトシートの流路における断面をＸ軸負方向に見た場合の模式図である。図２（ｄ）は、実施形態１に係るライトシートおよびフローセルの断面を第１方向に見た場合の模式図である。
【図３】図３（ａ）は、実施形態１に係るライトシートおよびフローセルの断面を第２方向に見た場合の模式図である。図３（ｂ）〜（ｄ）は、実施形態１の変更例に係るライトシートおよびフローセルの断面を第２方向に見た場合の模式図である。
【図４】図４（ａ）は、実施形態１に係るライトシートのシート面とフローセルの外側面との関係を示す模式図である。図４（ｂ）は、実施形態１の変更例に係るライトシートのシート面とフローセルの外側面との関係を示す模式図である。
【図５】図５（ａ）は、実施形態１に係る空間光変調器の位相変調パターンを示す図である。図５（ｂ）は、実施形態１に係る位相板の構成を模式的に示す図である。
【図６】図６は、実施形態１に係る、位相変調素子としてデフォーマブルミラーを用いた場合の撮像部の構成を示す図である。
【図７】図７（ａ）は、集光光学系に光変調素子を配置しなかった場合の、撮像素子における像の結像状態を示す図である。図７（ｂ）は、実施形態１に係る、撮像素子における像の結像状態を示す図である。
【図８】図８は、実施形態１に係る、位相変調素子の作用により生じる像の歪みを模式的に示す図である。
【図９】図９は、実施形態１に係る、位相変調素子の作用により生じる照射位置の移動を模式的に示す図である。
【図１０】図１０（ａ）〜（ｃ）は、実施形態１に係る位相変調素子の作用を示す図である。
【図１１】図１１（ａ）は、実施形態１に係る、撮像素子の各画素列における画像要素の補正処理を説明する図である。図１１（ｂ）は、実施形態１に係る補正ベクトルの内容を示すテーブルである。
【図１２】図１２（ａ）、（ｂ）は、実施形態１に係る撮像素子により取得した画像を重ね合わせる際のアスペクト比の補正および位置調整について説明するための図である。
【図１３】図１３（ａ）、（ｂ）は、実施形態１に係るライトシートの傾きと撮像精度との関係について説明するための図である。
【図１４】図１４（ａ）は、実施形態１に係るノイズ成分を抑えながら全ての断面を取得可能な角度の条件について説明するための図である。図１４（ｂ）は、実施形態１に係る最適な角度を細胞撮像装置に適用するための処理を示すフローチャートである。
【図１５】図１５は、実施形態１に係る３次元画像を生成する処理を示すフローチャートである。
【図１６】図１６は、実施形態１に係る画像生成処理の内容を示すフローチャートである。
【図１７】図１７は、実施形態１に係る複数細胞が凝集した３次元画像の例を示す図である。
【図１８】図１８は、実施形態２に係る位相変調素子による作用を説明するための図である。
【図１９】図１９は、実施形態２に係る断面画像の補正方法を説明するための図である
【図２０】図２０（ａ）は、関連技術の構成を説明するための図である。図２０（ｂ）は、関連技術の構成においてフローセルと撮像素子の部分を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
＜実施形態１＞
実施形態１は、光の照射により細胞から生じた蛍光を撮像して複数の画像を取得し、取得した複数の画像に基づいて細胞の３次元画像を生成する細胞撮像装置に本発明を適用したものである。撮像対象の細胞は、たとえば、血中循環腫瘍細胞（CTC：Circulating Tumor Cell）、血管内皮細胞（CEC：Circulating Endothelial Cell）、血管内皮前駆細胞（EPC：Endothelial Progenitor Cell）、間葉系幹細胞（MSC：Mesenchymal Stem Cell）、造血幹細胞（HSC：Hematopoietic Stem Cell）、抗原特異的Ｔ細胞等の細胞が挙げられる。
【００５５】
実施形態１では、撮像対象の細胞中の核の蛍光画像が取得される。
【００５６】
図１に示すように、細胞撮像装置１０は、撮像部１０ａと情報処理装置１０ｂを備える。撮像部１０ａは、光源２０と、照射光学系３０と、フローセル４０と、集光光学系５０と、撮像素子６０と、回転制御部７０と、を備える。図１には、撮像部１０ａの各部の配置を説明するためにＸＹＺ軸が示されている。ＸＹＺ軸は、互いに直交する。以下の図に示すＸＹＺ軸も、それぞれ図１に示すＸＹＺ軸に対応する。
【００５７】
照射光学系３０は、光学レンズ３１と、回転機構部３２と、対物レンズ３３と、を備える。集光光学系５０は、対物レンズ５１と、光学フィルタ５２と、集光レンズ５３、５４、５６と、位相変調素子５５を備える。ここでは、透過型の位相変調素子５５が想定されている。
【００５８】
光源２０は、Ｘ軸正方向に光を出射して、フローセル４０を流れる試料に光を照射する。光源２０は、たとえば半導体レーザ光源である。光源２０から出射される光の波長は、細胞を染色している蛍光色素から、蛍光を励起させるための光の波長に設定される。光学レンズ３１は、光源２０から出射された光を後述するように収束させる。回転機構部３２は、光学レンズ３１を回転可能に支持している。回転機構部３２は、光源２０から出射された光の中心軸を中心に、すなわち、光学レンズ３１における照射光学系３０の光軸を中心に、光学レンズ３１を回転させる。
【００５９】
図２（ａ）に示すように、光学レンズ３１は、シリンドリカルレンズである。光学レンズ３１のＸ軸正側は平坦な面になっており、光学レンズ３１のＸ軸負側は曲面となっている。光学レンズ３１は、Ｘ軸正側の面がＸ軸に垂直となり、光学レンズ３１に入射する光の中心軸が光学レンズ３１の母線３１ａと交わるよう、回転機構部３２に支持される。光学レンズ３１は、上記のように、平坦な面がＸ軸正側に位置付けられ、曲面がＸ軸負側に位置付けられるように配置されるのが望ましいが、曲面がＸ軸正側に位置付けられ、平坦な面がＸ軸負側に位置付けられるように配置されてもよい。
【００６０】
光学レンズ３１は、第１方向Ｄ１に対する光の収束と、第１方向Ｄ１と交わる第２方向Ｄ２における光の収束とが異なるように、光源２０から出射された光を収束させる。具体的には、第１方向Ｄ１は、母線３１ａとＸ軸に垂直な方向であり、第２方向Ｄ２は、母線３１ａに平行な方向である。光学レンズ３１は、光源２０から出射された光を、第２方向Ｄ２に収束させず、第１方向Ｄ１にのみ収束させる。光学レンズ３１により第１方向Ｄ１に収束された光は、対物レンズ３３の瞳近傍に集光する。
【００６１】
図２（ｂ）に示すように、光学レンズ３１は、回転機構部３２によりＸ軸を中心に回転され、母線３１ａのＹ軸に対する角度が所定の角度θとなる回転位置に位置付けられる。これにより、光学レンズ３１は、光源２０から出射された光を、図２（ｂ）に示すようにＺ軸に対して傾いた第１方向Ｄ１にのみ収束させる。
【００６２】
図１に戻り、対物レンズ３３は、光学レンズ３１を透過した光をフローセル４０の流路４１に集光させる。具体的には、対物レンズ３３は、図２（ｂ）に示した第２方向Ｄ２における収束位置がフローセル４０の流路４１に位置付けられるように、光学レンズ３１を透過した光を収束させる。また、対物レンズ３３は、光学レンズ３１を透過した光の、図２（ｂ）に示した第１方向Ｄ１における広がりを平行にする。これにより、対物レンズ３３を透過した光は、フローセル４０の流路４１において扁平なビームとなる。
【００６３】
対物レンズ３３は省略することもできる。この場合、光学レンズ３１は、図２（ｂ）に示す状態からＸ軸を中心に９０°回転された回転位置に位置付けられる。そして、光源２０から出射された光が光学レンズ３１によって一方向にのみ収束されることにより、フローセル４０の流路４１において扁平なビームが形成される。
【００６４】
このように、照射光学系３０は、光学レンズ３１と対物レンズ３３により、光源２０から出射された光を、フローセル４０の流路４１の位置におけるＹＺ平面に平行な断面において、直線状となるように集光させる。すなわち、照射光学系３０は、光源２０から出射された光から、フローセル４０に対しライトシート１１を形成する。
【００６５】
光学レンズ３１は、第１方向Ｄ１に対する光の収束と第２方向Ｄ２に対する光の収束とが異なるレンズでもよい。光学レンズ３１は、位相板やホログラフィエレメントでもよい。また、照射光学系３０は、円錐レンズなどによりベッセルビームを形成し、形成したベッセルビームをスキャニングミラー等によって高速に一方向に走査することで、ライトシート１１を形成してもよい。この場合、スキャニングミラー等の走査方向は、ＹＺ平面内において、Ｙ軸方向およびＺ軸方向以外の方向とされる。
【００６６】
フローセル４０は、Ｚ軸方向に延びた形状を有しており、Ｚ軸方向に見て正方形の外形の断面を有する。フローセル４０は、Ｚ軸方向に見て正方形以外の矩形の外形の断面を有してもよい。フローセル４０の外側面４０ａ、４０ｂ、４０ｃ、４０ｄは平坦な面となっている。特に、照射光学系３０からの光が入射する外側面４０ａ、および、後述する集光光学系５０によって集光される蛍光が通過する外側面４０ｂは、平坦な面であるのが望ましい。実施形態１では、フローセル４０のＸ軸正側の外側面４０ｃおよびＸ軸負側の外側面４０ａは、ＹＺ平面に平行であり、フローセル４０のＹ軸正側の外側面４０ｂおよびＹ軸負側の外側面４０ｄは、ＸＺ平面に平行である。
【００６７】
フローセル４０の内部には、Ｚ軸方向に延びた流路４１が形成されている。フローセル４０は、細胞を含む試料を流路４１に流す。流路４１に流される試料は、被検者から採取された細胞に基づいて、あらかじめ調製されたものである。実施形態１では、試料の調製において、細胞内の核が蛍光染色される。核は、核を特異的に染色可能な蛍光色素により染色される。核を染色している染色色素は、光源２０から出射された光が照射されると、互いに異なる波長の蛍光が励起される。自家蛍光によって生じた蛍光を撮像する場合には、必ずしも細胞が蛍光染色されなくてもよい。
【００６８】
図２（ｃ）に示すように、流路４１をＸ軸負方向に見た場合、ライトシート１１の長手方向は、試料の流れ方向に対して垂直でなく所定角度で傾いている。すなわち、ライトシート１１は、第１方向Ｄ１に延び、第２方向Ｄ２に幅が狭い形状となっている。ライトシート１１は、長鎖線で模式的に示されている。試料に含まれる細胞１２は、フローセル４０の流路４１内をＺ軸正方向に流れる。このとき、細胞１２内の核１２ａも、流路４１内をＺ軸正方向に流れる。細胞１２がライトシート１１を横切ると、細胞１２の蛍光染色された部分から蛍光が生じる。
【００６９】
図２（ｃ）に示す断面Ｃ１―Ｃ２を第１方向Ｄ１に見ると、断面は図２（ｄ）に示すようになる。図２（ｄ）に示すように、照射光学系３０からフローセル４０に入射する光は、フローセル４０において、第１方向Ｄ１の幅は絞らずに平行光となっているが、第２方向Ｄ２の幅は絞られ薄くなっている。ライトシート１１とは、光源２０から照射された光のうち、第２方向Ｄ２の幅が細胞に対して十分に小さい領域のことである。ライトシート１１のシート面１１ａとは、ライトシート１１において、ライトシート１１の中心軸と第１方向Ｄ１とによって規定される平面のことである。図２（ｃ）、（ｄ）において、シート面１１ａは、点線で模式的に示されている。
【００７０】
図２（ｃ）に戻り、ライトシート１１のシート面１１ａは、光学レンズ３１の傾きに対応して、Ｚ軸に対して角度θだけ傾いている。シート面１１ａのＺ軸に対する傾きは、略垂直でないように設定される。これにより、細胞１２の断面画像をフローセル４０の周囲から取得しやすくなる。また、シート面１１ａは、Ｚ軸と平行でないように設定される。これにより、細胞１２の蛍光染色された部分について複数の異なる断面画像を取得できるようになる。このように、シート面１１ａは、試料の流れ方向であるＺ軸方向に対して、略垂直ではなく所定の角度で傾けられる。これにより、蛍光色素から生じた蛍光をフローセル４０の周囲から取得しやすくなり、かつ、異なる複数の細胞断面を取得できるようになる。角度θは、光学レンズ３１をＸ軸まわりに回転させることにより設定できる。
【００７１】
ここで、照射光学系３０の光軸は、試料の流れ方向であるＺ軸方向に対して垂直である。言い換えれば、対物レンズ３３の光軸は、Ｚ軸に対して垂直であり、照射光学系３０から出てフローセル４０に入射する光の中心軸は、Ｚ軸に対して垂直である。図２（ｃ）に示す断面Ｃ３―Ｃ４を第２方向Ｄ２に見ると、断面は図３（ａ）に示すようになる。図３（ａ）に示すように、ライトシート１１のシート面１１ａは、光源２０から出射された光が入射するフローセル４０の外側面４０ａに対して垂直となる。これにより、フローセル４０に入射する光がフローセル４０によって屈折することが抑制されるため、フローセル４０を通過して核１２ａに照射されるビーム形状が崩れにくくなる。したがって、適正な形状のライトシート１１を細胞に照射できるため、後述する撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。
【００７２】
なお、核１２ａの一部についてのみ３次元画像が生成されればよい場合、図３（ｂ）に示すように、ライトシート１１が撮像対象である核１２ａの一部にのみ掛かるように、ライトシート１１の第１方向Ｄ１の幅が設定されてもよい。この場合、核１２ａ一部について断面画像が取得され、取得された核１２ａの一部の断面画像に基づいて３次元画像が生成される。
【００７３】
照射光学系３０の光軸は、試料の流れ方向に対して垂直な状態からずれていてもよい。この場合、図２（ｃ）に示す断面Ｃ３―Ｃ４を第２方向Ｄ２に見ると、断面は図３（ｃ）に示すようになる。図３（ｃ）では、照射光学系３０の光軸は試料の流れ方向に対して垂直ではないものの、図３（ａ）と同様、シート面１１ａは、光源２０から出射された光が入射するフローセル４０の外側面４０ａに対して垂直となっている。この場合、ライトシート１１は、外側面４０ａによって、第１方向Ｄ１において屈折することになるが、第２方向Ｄ２において屈折することがない。したがって、ライトシート１１の第２方向Ｄ２における厚みは、フローセル４０の外側面４０ａによる影響を受けにくくなる。よって、図３（ａ）の場合と同様、核１２ａに照射されるビーム形状が崩れにくくなるため、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。
【００７４】
なお、核１２ａの一部についてのみ３次元画像が生成されればよい場合、図３（ｄ）に示すように、ライトシート１１が撮像対象である核１２ａの一部にのみ掛かるように、ライトシート１１の第１方向Ｄ１の幅が設定されてもよい。
【００７５】
シート面１１ａは、外側面４０ａに対して垂直な状態から僅かにずれていてもよい。シート面１１ａが、外側面４０ａに対して略垂直であれば、細胞１２に照射されるビーム形状が崩れることが抑制され、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。
【００７６】
図４（ａ）、（ｂ）を参照して、ライトシート１１のシート面１１ａが外側面４０ａに対して垂直となっている状態について、詳細に説明する。
【００７７】
実施形態１では、照射光学系３０の光軸がＸ軸に平行であり、フローセル４０の外側面４０ａはＹＺ平面に平行である。これにより、図４（ａ）に示すように、外側面４０ａに入射する光の中心軸９０は、外側面４０ａに対して垂直となり、ライトシート１１のシート面１１ａは、外側面４０ａに対して垂直となる。この場合、図３（ａ）を参照して説明したように、ライトシート１１の第２方向Ｄ２における厚みが外側面４０ａによる影響を受けにくくなるため、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。
【００７８】
ただし、外側面４０ａに入射する光の中心軸９０は、外側面４０ａに対して垂直でなくてもよい。具体的には、図４（ａ）の中心軸９０が、第１方向Ｄ１において傾けられてもよい。これにより、図４（ｂ）に示すように、外側面４０ａに入射する光の中心軸９０は、外側面４０ａに対して垂直ではないものの、ライトシート１１のシート面１１ａは、外側面４０ａに対して垂直となる。この場合も、図３（ｃ）を参照して説明したように、ライトシート１１の第２方向Ｄ２における厚みが外側面４０ａによる影響を受けにくくなるため、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。
【００７９】
図１に戻り、集光光学系５０は、細胞１２から生じた蛍光を、フローセル４０のＹ軸正側で集光する。集光光学系５０は、細胞１２から生じた蛍光を、フローセル４０のＹ軸負側で集光してもよい。対物レンズ５１は、細胞１２から生じた蛍光を集光する。光学フィルタ５２は、細胞１２から生じる側方散乱光等の不要な光を遮断して、撮像したい蛍光のみを透過させる。不要な光が問題とならない場合、光学フィルタ５２を省略することもできる。集光レンズ５３は、光学フィルタ５２を透過した蛍光を集光する。対物レンズ５１の仕様によっては、集光レンズ５３を省略することもできる。
【００８０】
集光レンズ５４、５６は、集光光学系５０においてフーリエ面を形成する。フーリエ面は、集光レンズ５６と位相変調素子５５の間に、さらに偶数枚のレンズが設置されることにより形成されてもよい。
【００８１】
位相変調素子５５は、集光光学系５０のフーリエ面に配置され、光の位相を変調することで、拡大された被写界深度（Extended Depth of Focus : EDoF）を実現する。位相変調素子５５は、拡大された被写界深度を得るための点像分布関数（Point Spread Function : PSF）を形成する。すなわち、位相変調素子５５は、被写界深度の拡大が可能となるように、ＰＳＦを変調する作用を有する。位相変調素子５５は、スパイラル点像分布関数を形成する位相変調素子である。
【００８２】
位相変調素子５５は、１つの点から生じた光が１つの焦点に結像されるＰＳＦを形成する。このようなＰＳＦは、ＳＨ−ＰＳＦ（Single-Helix Point Spread Function）と呼ばれる。位相変調素子５５により形成されるスパイラル点像分布関数は、シングルヘリックス点像分布関数である。位相変調素子５５の構成は、追って、図５（ａ）、（ｂ）を参照して説明する。
【００８３】
撮像素子６０は、集光光学系５０により集光された蛍光を撮像面６１において受光する。撮像素子６０は、蛍光の２次元画像を撮像し、撮像した２次元画像を出力する。撮像される２次元画像は、細胞１２の断面画像である。撮像素子６０は、たとえばカラーＣＣＤにより構成される。実施形態１では、核１２ａから所定波長の蛍光が生じるため、撮像素子６０は、少なくとも当該波長の光を識別可能に構成される。細胞が複数種類の蛍光色素によって染色される場合、撮像素子６０は、異なる波長の光を識別可能に構成される。なお、カラーＣＣＤでは必要な感度が不足する場合には、フローセル４０を流れる試料の速度を十分落とす等の調整を行えばよい。
【００８４】
集光光学系５０において各波長帯域の蛍光を波長帯域ごとに分離して、分離した蛍光ごとに、１つの波長帯域の光のみを識別可能な撮像素子またはカラーＣＣＤからなる撮像素子により受光してもよい。この場合、複数の撮像素子で取得された同じタイミングにおける画像が、互いに重ね合わせられることにより１つの断面画像が生成される。細胞１２から１つの波長帯域の蛍光のみが生じる場合、撮像素子６０は、１つの波長帯域の光のみを識別可能に構成されればよい。
【００８５】
ここで、集光光学系５０の光軸は、試料の流れ方向であるＺ軸方向に対して垂直である。言い換えれば、対物レンズ５１の光軸は、Ｚ軸に対して垂直である。これにより、撮像素子６０は、細胞１２から生じた蛍光のうち、フローセル４０によって略屈折せずにフローセル４０の外側に出た蛍光を受光するため、撮像面６１に照射される蛍光のビーム形状が崩れにくくなる。したがって、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。
【００８６】
集光光学系５０の光軸は、試料の流れ方向に対して垂直な状態から僅かにずれていてもよい。集光光学系５０の光軸が、試料の流れ方向に対して略垂直であれば、撮像面６１に照射される蛍光のビーム形状が崩れることが抑制され、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。
【００８７】
照射光学系３０の光軸と集光光学系５０の光軸とは、互いに垂直である。これにより、撮像素子６０は、細胞１２の断面から生じた蛍光を正面側から撮像できる。すなわち、撮像素子６０は、細胞１２の断面に対してＸ軸方向にずれた位置ではなく、細胞１２の断面を含むＹＺ平面内で蛍光を撮像する。これにより、撮像した画像をＸ軸方向に補正するといった処理が不要になる。
【００８８】
照射光学系３０の光軸と集光光学系５０の光軸とは、互いに垂直な状態から僅かにずれていてもよい。照射光学系３０の光軸と集光光学系５０の光軸とが互いに略垂直であれば、撮像素子６０は、細胞１２の断面から生じた蛍光を略正面側から撮像できるため、撮像した画像をＸ軸方向に補正するといった処理が略不要になる。
【００８９】
回転制御部７０は、回転機構部３２に接続されており、回転機構部３２の回転を制御する。回転制御部７０による制御については、追って図１４（ａ）、（ｂ）を参照して説明する。
【００９０】
情報処理装置１０ｂは、処理部８１と、記憶部８２と、表示部８３と、入力部８４と、インターフェース８５と、を備える。処理部８１は、たとえばＣＰＵにより構成される。記憶部８２は、たとえばＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードディスクにより構成される。処理部８１は、インターフェース８５を介して、情報処理装置１０ｂ内の各部を制御するとともに、撮像素子６０と回転制御部７０を制御する。
【００９１】
処理部８１は、撮像素子６０により取得された画像に基づいて３次元画像を生成する。具体的には、撮像素子６０は、１つの細胞から取得した複数の断面画像を重ね合わせて３次元画像を生成する。表示部８３は、処理部８１による処理結果等を表示するためのディスプレイである。入力部８４は、オペレータによる指示の入力を受け付けるためのキーボードとマウスである。
【００９２】
次に、位相変調素子５５の構成について説明する。
【００９３】
位相変調素子５５は、透過する蛍光に対して位相変調を与える。位相変調素子５５として、たとえば、液晶パネルを用いた透過型の空間光変調器を用い得る。空間光変調器は、たとえば、１画素につき２５６階調で位相変調が可能である。シングルヘリックスＰＳＦを形成するための位相変調パターンは、たとえば、図５（ａ）に示すように設定される。位相変調パターンとは、全ての画素について設定された階調のパターン分布のことである。
【００９４】
図５（ａ）において、階調が０の画素は黒で示されており、階調が２５５の画素は白で示されている。階調が０の画素は、入射する蛍光の位相を変調しない。階調が２５５の画素に入射する蛍光の位相は、階調が０の画素に入射する蛍光の位相に対して２πだけずれる。
【００９５】
図５（ｂ）に示すように、位相変調素子５５として、位相板を用いることもできる。位相板は、アクリル樹脂等の透明な部材から構成される。位相板を構成する部材は、必ずしも透明でなくてもよく、光を透過できればよい。位相板の厚みＴ１１が変化すると、透過する蛍光の位相が変化する。図５（ａ）の位相変調パターンと同様の位相変調が生じるように、位相板の各部の厚みＴ１１が調整される。
【００９６】
この他、位相変調素子５５として、デフォーマブルミラーを用いることもできる。位相変調素子５５としてデフォーマブルミラーが用いられる場合、撮像部１０ａの構成は、図６のように変更される。この場合も、位相変調素子５５は、集光光学系５０のフーリエ面に配置される。対物レンズ５１で集光された蛍光は、位相変調素子５５で反射されることにより、位相変調を受ける。これにより、撮像素子６０の撮像面６１にシングルヘリックスのＰＳＦが形成される。図６の構成では、位相変調素子５５として、反射型の空間光変調器が用いられてもよい。この場合、たとえば、対物レンズ５１と光学フィルタ５２の間に偏光子が配置される。
【００９７】
このように、集光光学系５０に位相変調素子５５を配置することにより、集光光学系５０の被写界深度を拡大できる。
【００９８】
図７（ａ）には、集光光学系５０に位相変調素子５５が配置されていない場合の撮像状況が模式的に示されている。ここでは、３つの細胞１２が、フローセル４０の流路４１を流れている。フローセル４０の流路４１は、複数の細胞が幅方向の位置を同時に流れるのに十分な広さを有する。ライトシート１１は、少なくとも流路４１の全てをカバーする広さとなっている。撮像素子６０は、少なくとも、流路４１に含まれるライトシート１１の領域からの光を受光できる広さを有する。３つの細胞１２は、同時にライトシート１１を横切る。３つの細胞１２の核１２ａをライトシート１１が切断する断面が、撮像素子６０によって同時に撮像される。
【００９９】
これら３つの細胞１２の流れる位置がＹ軸方向に互いにずれている。上下の細胞１２は、中央の細胞１２に対して、距離ΔＳ１、ΔＳ２だけＹ軸方向にずれている。集光光学系５０のフォーカス位置が、Ｙ軸方向における流路４１の中央位置に設定されている場合、中央の細胞１２は、核１２ａの断面画像が良好に撮像される。しかし、上下の細胞１２については、集光光学系５０のフォーカス位置からずれているため、核１２ａの断面画像を良好に撮像できない。図７（ａ）の右端には、３つの細胞１２について取得された核１２ａの断面画像が模式的に示されている。
【０１００】
これに対し、上記のように集光光学系５０に対して、スパイラルＰＳＦを形成する位相変調素子５５が配置された場合、集光光学系５０の被写界深度が拡大する。このため、図７（ｂ）に示すように、上下の細胞１２の位置が、Ｙ軸方向、すなわち、集光光学系５０の光軸方向に流路４１の中央位置からずれていても、これら細胞１２の核１２ａの断面画像を良好に取得できる。これにより、ライトシート１１を同時に横切る複数の細胞１２について、核１２ａの断面画像を高品質に取得できる。
【０１０１】
なお、１つの細胞１２においても、ライトシート１１による核１２ａの断面と撮像素子６０の撮像面との距離は、切断面のＺ軸正側が短く、Ｚ軸負側が長くなる。このため、集光光学系５０に位相変調素子５５が配置されていない場合、１つの核１２ａの断面画像内においても、部分的にフォーカスずれが生じることが起こり得る。これに対し、集光光学系５０に位相変調素子５５が配置された場合は、上記のように集光光学系５０の被写界深度が拡大するため、１つの核１２ａの断面画像内において部分的にフォーカスずれが生じることがない。よって、良好な核１２ａの断面画像が取得され得る。
【０１０２】
しかし、集光光学系５０に位相変調素子５５が配置された場合、位相変調素子５５における位相変調作用によって、核１２ａの断面画像に歪みが生じる。
【０１０３】
図８は、この歪みを模式的に示している。ここでは、便宜上、１つの核１２ａが流路４１の流れに沿ってライトシート１１を横切る場合を例に、断面画像の歪みを説明する。この場合、核１２ａの移動に伴い、ライトシート１１によって切断される核１２ａの断面の位置が、Ｙ軸方向に変化する。すなわち、核１２ａが位置１０１にあるときに比べて、核１２ａが位置１０２にあるときの方が、断面の位置がＹ軸負方向に変位する。また、核１２ａが位置１０２にあるときに比べて、核１２ａが位置１０３にあるときの方が、断面の位置がＹ軸負方向にさらに変位する。より厳密には、ライトシート１１による核１２ａの断面は、断面内の各部位と撮像素子６０の撮像面との距離が、断面のＺ軸方向の位置に応じて変化する。
【０１０４】
位相変調素子５５が集光光学系５０に配置されていない場合、これら断面から生じた蛍光は、それぞれ、撮像素子６０の撮像面６１において、破線で示す照射領域１１１、１１２、１１３に照射される。しかし、位相変調素子５５が集光光学系５０に配置されている場合は、位相変調素子５５による位相変調作用によって、各断面からの蛍光が、実線で示す照射領域１２１、１２２、１２３に照射される。照射領域１２１、１２２、１２３は、照射領域１１１、１１２、１１３に対して、図８の矢印の方向に変位しつつ変形する。この歪みは、核１２ａの断面内の各部位が、シングルヘリックスＰＳＦによる作用により、各部位と撮像面６１との距離に応じた方向に移動することにより生じる。すなわち、このような歪みは、位相変調素子５５がシングルヘリックスＰＳＦを形成する作用に基づくものである。
【０１０５】
図９に示すように、位相変調素子５５が集光光学系５０に配置されていない場合、核１２ａの断面の一部から生じた蛍光は、たとえば、照射領域１１１中の位置Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１３に照射される。これに対し、位相変調素子５５が集光光学系５０に配置された場合、核１２ａの断面の一部から生じた蛍光は、照射領域１２１中の位置Ｐ２１、Ｐ２２、Ｐ２３に照射される。このように、位相変調素子５５が集光光学系５０に配置された場合は、位相変調素子５５が集光光学系５０に配置されていない場合に対して、核１２ａの断面の各部から生じた蛍光の照射位置が移動する。
【０１０６】
図１０（ａ）〜（ｃ）に示すように、位相変調素子５５がシングルヘリックスＰＳＦを形成する場合、位相変調素子５５が配置されなかった場合の撮像面６１における蛍光の照射位置Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１３と、位相変調素子５５が配置された場合の撮像面６１における蛍光の照射位置Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３との位置関係が、撮像面６１と蛍光の起点との距離に応じて変化する。
【０１０７】
図１０（ａ）に示すように、蛍光の起点が撮像面６１から最も離れた位置にある場合、すなわち、流路４１内に含まれるライトシート１１の最もＹ軸負側から蛍光が生じた場合、撮像面６１における蛍光の照射位置Ｆ２１は、たとえば、位相変調素子５５が配置されなかった場合の照射位置Ｆ１１に対して、所定距離だけＺ正方向にずれる。
【０１０８】
図１０（ｃ）に示すように、蛍光の起点が撮像面６１から最も接近した位置にある場合、すなわち、流路４１内に含まれるライトシート１１の最もＹ軸正側から蛍光が生じた場合、撮像面６１における蛍光の照射位置Ｆ２３は、たとえば、位相変調素子５５が配置されなかった場合の照射位置Ｆ１３に対して、所定距離だけＺ負方向にずれる。
【０１０９】
図１０（ｂ）に示すように、蛍光の起点が、Ｙ軸方向において、図１０（ａ）の起点位置と図１０（ｃ）の起点位置との中間の位置にある場合、すなわち、流路４１内に含まれるライトシート１１のＹ軸方向の中間位置から蛍光が生じた場合、撮像面６１における蛍光の照射位置Ｆ２２は、たとえば、位相変調素子５５が配置されなかった場合の照射位置Ｆ１２に対して、所定距離だけＸ正方向にずれる。
【０１１０】
このように、位相変調素子５５が配置された場合の蛍光の照射位置Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１３と位相変調素子５５が配置されなかった場合の蛍光の照射位置Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３とをそれぞれ直線で繋ぐと、この直線は、撮像面６１と蛍光の起点との距離に応じてＸ−Ｚ平面に平行に回転する。
【０１１１】
このような光学作用により、図９に示した照射位置の移動が生じる。ここで、Ｘ軸方向に平行なラインＬ１１、Ｌ１２、Ｌ１３を撮像面６１上に設定すると、ラインＬ１１上の全ての位置とライトシート１１との間のＹ軸方向との距離は一定であり、ラインＬ１２上の全ての位置とライトシート１１との間のＹ軸方向との距離は一定であり、ラインＬ１３上の全ての位置とライトシート１１との間のＹ軸方向との距離は一定である。
【０１１２】
このため、位相変調素子５５が配置されていない場合にラインＬ１１に照射される蛍光は、全て、位相変調素子５５の作用によって、同じ方向に同じ距離だけ移動し、位相変調素子５５が配置されていない場合にラインＬ１２に照射される蛍光は、全て、位相変調素子５５の作用によって、同じ方向に同じ距離だけ移動し、位相変調素子５５が配置されていない場合にラインＬ１３に照射される蛍光は、全て、位相変調素子５５の作用によって、同じ方向に同じ距離だけ移動する。
【０１１３】
したがって、位相変調素子５５が配置されない場合の照射領域１１１内の位置Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１３に照射される蛍光は、それぞれ、位相変調素子５５が配置された場合の照射領域１２１内の位置Ｐ２１、Ｐ２２、Ｐ２３に照射される。ここで、位置Ｐ１１から位置Ｐ２１への移動ベクトル、位置Ｐ１２から位置Ｐ２２への移動ベクトル、および、位置Ｐ１３から位置Ｐ２３への移動ベクトルは、ラインＬ１１、Ｌ１２、Ｌ１３とライトシート１１との間のＹ軸方向の距離が相違するため、図１０（ａ）〜（ｃ）で説明した光学作用から、互いに相違する。このため、位相変調素子５５が配置された場合の照射領域１２１は、位相変調素子５５が配置されていない場合の照射領域１１１に対して、変形しつつ移動することになる。これにより、照射領域１２１に歪みが生じる。
【０１１４】
図８に示した照射領域１２２、１２３についても、位相変調素子５５の光学作用により、照射領域１１１に対して変形しつつ移動し、これにより、照射領域１２２、１２３に歪みが生じる。ここで、これら照射領域１２１、１２２、１２３にそれぞれ対応する核１２ａの断面はＹ軸方向の位置が互いに異なるため、照射領域１２１、１２２、１２３の歪みは互いに相違する。このため、照射領域１２１、１２２、１２３の画像をそのまま核１２ａの３次元画像の生成に用いた場合、３次元画像の品質の低下に繋がる。
【０１１５】
そこで、実施形態１では、核１２ａの断面画像に対し歪みを解消する補正が行われ、補正後の断面画像を用いて核１２ａの３次元画像が生成される。これにより、３次元画像の品質を高めることができる。歪み補正は、図１の処理部８１によって行われる。
【０１１６】
この補正において、処理部８１は、断面画像を構成する画像要素を、それぞれ、ＰＳＦに基づく位置ずれを補正する位置へと移動させる。たとえば、処理部８１は、図９に示した照射領域１２１内の各照射位置において撮像素子６０により取得された画像要素を、照射領域１１１内の各照射位置に対応する位置に移動させる処理を行う。具体的には、処理部８１は、位置Ｐ２１、Ｐ２２、Ｐ２３から取得された画像要素を、位置Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１３に対応する位置に移動させる処理を行う。処理部８１は、同様の処理を、照射領域１２１内の全ての照射位置から取得された画像要素に対して行う。このように画像要素を個別に移動させる処理を行うことにより、撮像画像全体の歪を適正に補正できる。
【０１１７】
実施形態１において、画像要素は、撮像素子６０において画素ごとに取得される画像部分とされる。このように補正対象の画像要素を、撮像素子６０の最小撮像単位である画素から取得される画像要素に設定することにより、撮像画像の歪を高精細に補正できる。
【０１１８】
なお、歪み補正の処理単位とされる画像要素は、必ずしも、撮像素子６０の画素ごとに設定されなくともよく、所定のブロック単位に含まれる複数の画素から取得された画像部分が処理単位の画像要素とされてもよい。
【０１１９】
歪み補正の具体的処理は、以下のとおりである。
【０１２０】
図１１（ａ）に示すように、撮像素子６０の撮像面６１には、Ｘ軸方向に並ぶ画素の列が存在する。最上段の画素列ＰＬ１から最下段の画素列ＰＬｎまでｎ個の画素列が存在する。図８に示すように、ライトシート１１は、撮像面６１に平行な状態からＹ−Ｚ平面に平行な方向に所定の角度だけ傾いている。このため、画素列ＰＬ１上の各画素とライトシート１１との間のＹ軸方向の距離は一定である。その他の画素列についても、１つの画素列上の各画素とライトシート１１との間のＹ軸方向の距離は一定である。また、画素列とライトシート１１との間のＹ軸方向の距離は、画素列ごとに異なる。
【０１２１】
したがって、同じ画素列上の各画素には、撮像面６１からＹ軸方向に同じ距離だけ離れたライトシート１１上の位置から生じた蛍光が入射する。たとえば、図９において、２つの位置Ｐ２１にそれぞれ入射した蛍光は同じ画素列の画素に入射し、２つの位置Ｐ２２にそれぞれ入射した蛍光は同じ画素列の画素に入射し、２つの位置Ｐ２３にそれぞれ入射した蛍光は同じ画素列の画素に入射する。
【０１２２】
処理部８１は、各画素列に、図９に矢印で示したベクトルと逆向きのベクトルを補正ベクトルとして割り当てる。そして、処理部８１は、１つの画素列中の各画素から取得された画像要素を、当該画素列に設定された補正ベクトルで移動させる。処理部８１は、この処理を全ての画素列に対して実行する。これにより、断面画像中の各画像要素が、それぞれ、位相変調素子５５が配置されなかった場合の位置へと移動する。こうして、断面画像の歪みが補正される。
【０１２３】
この補正において、処理部８１は、たとえば、撮像面６１上の全ての画素から取得した画素値をメモリにマッピングし、マッピングした画素値をメモリ上において補正ベクトルに応じてシフトさせる処理を実行する。あるいは、この補正において、処理部８１は、各画素列の画素から取得された画素値を、画素列ごとにレジスタに保持し、各レジスタに保持した画素値を、それぞれ、画素列に割り当てられた補正ベクトルに応じてメモリ上に展開する処理を実行する。
【０１２４】
図１１（ａ）には、各画素列に割り当てられた補正ベクトルが矢印で模式的に示されている。具体的には、図１１（ｂ）に示すようなテーブルで各画素列の補正ベクトルが表現される。Ｘ補正値は、Ｘ軸方向の補正値であり、Ｘ軸正方向が正である。Ｚ補正値は、Ｚ軸方向の補正値であり、Ｚ軸正方向が正である。処理部８１は、このように規定された補正ベクトルによって、画素列の各画素から取得された画像要素、すなわち、画素値を移動させる。
【０１２５】
以上のように、処理部８１は、集光光学系５０の光軸方向において同一の位置から生じた蛍光を受光する画素列から取得された各画像要素を、この蛍光の起点の位置に応じた方向および距離、すなわち補正ベクトルに応じて移動させて、核１２ａの断面画像の歪みを解消する。これにより、断面画像の歪みを、簡易かつ適切に解消できる。
【０１２６】
なお、実施形態１では、図１０（ａ）〜（ｃ）に示したとおり、撮像面６１上における照射位置のずれ方向が、Ｚ軸正方向からＺ軸負方向までの１８０度の範囲に設定されたが、照射位置のずれ方向の範囲は、必ずしも、これに限られるものではない。ただし、照射位置のずれ方向の範囲が１８０度を超えると、撮像面６１からの距離が互いに異なるライトシート１１上の位置から生じた蛍光が、一部の画素列に同時に入射することが起こり得る。これにより、断面画像に対する歪み補正の精度が低下してしまう。したがって、位相変調素子５５におけるＰＳＦは、撮像面６１上における照射位置のずれ方向が、Ｚ軸正方向からＺ軸負方向までの１８０度の範囲内に収まるように設定することが好ましい。
【０１２７】
次に、歪み補正後の断面画像を重ね合わせる際のアスペクト比の補正および位置調整について説明する。
【０１２８】
図８に示すように、細胞１２内の核１２ａが、フローセル４０の流路４１をＺ軸正方向に流れる。このとき、核１２ａがライトシート１１を通過すると、ライトシート１１が照射された核１２ａの断面から蛍光が生じ、生じた蛍光が、撮像素子６０の撮像面６１に照射される。図８において、核１２ａは、便宜上、球として図示されている。核１２ａが、順に流路４１の位置１０１〜１０３に位置付けられるとすると、位置１０１〜１０３に位置付けられた核１２ａから生じる蛍光は、それぞれ、撮像面６１上における照射領域１２１〜１２３に照射される。これらの照射領域１２１〜１２３は、上記歪み補正によって、実質的に、位相変調素子５５が配置されない場合の照射領域１１１〜１１３に修正される。
【０１２９】
ライトシート１１はＺ軸方向に対して傾いているため、撮像面６１における照射領域のＺ軸方向の長さは、ライトシート１１が照射された断面の第１方向Ｄ１における長さに比べて小さくなる。具体的には、撮像面６１における照射領域のＺ軸方向の長さは、ライトシート１１が照射された断面の第１方向Ｄ１における長さに、ｃｏｓθを乗算したものとなっている。したがって、照射領域のＺ軸方向の長さに１／ｃｏｓθを乗算することにより、歪み補正後の照射領域を、実際の断面形状を反映した適正なアスペクト比に補正できる。
【０１３０】
核１２ａが位置１０２にあるとき、ライトシート１１が核１２ａの中心に照射されるとする。このとき、核１２ａのＺ軸上における位置を０とすると、照射領域１１２のＺ軸上における位置も０となる。しかしながら、核１２ａが位置１０２とは異なる位置にあるとき、ライトシート１１が核１２ａの中心に照射されない。この場合、核１２ａの位置と歪み補正後の照射領域の位置とがずれることになる。
【０１３１】
ここで、位置１０３にある核１２ａのＺ軸上における位置をｘ１とし、照射領域１１３のＺ軸上における位置をｘ２とする。すなわち、フローセル４０の流路４１における核１２ａの移動量をｘ１、撮像面６１における核１２ａの像の移動量をｘ２とする。試料の流れ方向に対するライトシート１１の傾き角度をθとすると、ｘ２は以下の式（１）により算出される。
【０１３２】
ｘ２＝ｘ１（１−ｓｉｎ２θ）  …  （１）
【０１３３】
図１２（ａ）に示すように、位置１０２〜１０３にある核１２ａに基づいて、歪み補正後の画像２０１〜２０３が取得されたとする。画像２０１〜２０３には、それぞれ、核１２ａに対応する歪み補正後の照射領域１１２〜１１４が含まれている。
【０１３４】
画像２０１〜２０３を重ね合わせるには、たとえば、Ｚ軸上の照射領域の位置が０である画像２０１が撮像されたタイミングが、基準時間に設定される。基準時間から撮像間隔Δｔだけ経過したときの核１２ａの移動量ｘ１１は、Δｔに試料の流れ速度を乗算することにより取得できる。このとき、照射領域１１３の位置ｘ２１は、上記式（１）のｘ１にｘ１１を代入することにより取得できる。同様に、基準時間から撮像間隔２Δｔだけ経過したときの核１２ａの移動量ｘ１２は、２Δｔに試料の流れ速度を乗算することにより取得できる。このとき、照射領域１１４の位置ｘ２２は、上記式（１）のｘ１にｘ１２を代入することにより取得できる。そして、画像２０２において、照射領域１１３が、Ｚ軸上の位置０に近付く方向にｘ２１だけ移動される。同様に、画像２０３においても、照射領域１１４が、Ｚ軸上の位置０に近付く方向にｘ２２だけ移動される。
【０１３５】
撮像素子６０により撮像された画像は、記憶部８２に順次記憶されている。情報処理装置１０ｂの処理部８１は、記憶した複数の画像のうち、１つの核１２ａに対して取得された最初の断面画像から最後の断面画像までの全ての歪み補正後の画像をグループ化する。歪み補正後の画像のグループ化において、核１２ａに対する最初の歪み補正後の画像より前の歪み補正後の画像と、核１２ａに対する最後の歪み補正画像より後の歪み補正後の画像もグループに含められてもよい。なお、１つの細胞について撮像される画像の枚数が２枚〜１００枚程度となるように、撮像素子６０による撮像間隔が、流路４１を流れる試料の速度、細胞の大きさ、ライトシート１１の第２方向Ｄ２の厚み等によって決められる。
【０１３６】
たとえば、図１２（ｂ）の左側に示すように、処理部８１は、歪み補正後の画像２０１〜２０７をグループ化する。処理部８１は、グループ化した歪み補正後の画像２０１〜２０７に対して、上述したように画像上の照射領域のアスペクト比を補正する。そして、処理部８１は、アスペクト比の補正を行った画像２０１〜２０７に対して、上述したように画像上の照射領域の位置調整を行う。これにより、図１２（ｂ）の右側に示すように、上述の歪み補正とともにさらにアスペクト比の補正および照射領域の中心位置の調整が行われた画像２１１〜２１７が取得される。
【０１３７】
こうして、処理部８１は、さらにアスペクト比の補正と位置調整とを施した画像２１１〜２１７を重ね合わせることにより、１つの核１２ａについての適正な３次元画像を生成する。これにより、高品質の３次元画像を取得できる。
【０１３８】
３次元画像を生成する際のアスペクト比の補正と位置調整は、上記のような方法に限られない。たとえば、以下のような方法でもよい。
【０１３９】
蛍光ビーズなどの球体粒子を含む試料をフローセル４０に流し、撮像素子６０により画像を撮像する。撮像された画像において、粒子断面の流れ方向における中心座標を取得し、粒子断面の中心座標を一致させるために各画像をどの程度ずらせばよいかを、位置ずれ補正のパラメータとして算出する。また、何れか１つの画像において、粒子断面を真円にするために画像を流れ方向にどの程度伸ばせば良よいかを、アスペクト比の補正のパラメータとして算出する。こうして得られた２つのパラメータは、記憶部８２に記憶される。
【０１４０】
実際の試料に基づいて３次元画像を生成する際には、処理部８１は、記憶部８２に記憶した２つのパラメータを用いて、歪み補正後の各画像に対してアスペクト比の補正と位置調整を行う。そして、処理部８１は、アスペクト比の補正および位置調整が行われた各画像を重ね合わせることにより３次元画像を生成する。こうすると、細胞撮像装置１０の光学系等の実際の状態に応じて、アスペクト比の補正と位置調整を行うことができるため、高精度な３次元画像を生成できる。なお、このような２つのパラメータは、１つのビーズに基づいて取得されてもよいが、複数のビーズに基づいて取得されたパラメータを平均することにより取得されるのが望ましい。
【０１４１】
次に、ライトシート１１の傾きと撮像精度との関係について説明する。
【０１４２】
図１３（ａ）、（ｂ）に示すように、ライトシート１１は、光学レンズ３１の回転位置に応じた第２方向Ｄ２に、所定の厚みを有する。ここで、核１２ａの中心にライトシート１１が照射されると、集光光学系５０の光軸方向、すなわちＹ軸方向におけるライトシート１１の厚みは幅ｄとなる。この場合、核１２ａの中心だけでなく、幅ｄの範囲に含まれる核１２ａの部分から蛍光が生じる。このため、核１２ａの中心を撮像しようとする場合に、核１２ａの中心以外の部分から生じた蛍光がノイズ成分となってしまう。このようなノイズ成分は、撮像される画像のバックグラウンドノイズとなるため、できるだけ小さい方が好ましい。
【０１４３】
ここで、幅ｄは、図１３（ａ）に示すように、シート面１１ａのＺ軸に対する傾き角度θが９０°に近付くにつれて大きくなる。一方、幅ｄは、図１３（ｂ）に示すように、シート面１１ａのＺ軸に対する傾き角度θが０°に近付くにつれて小さくなる。したがって、ノイズ成分を小さくするために、角度θは小さい方が好ましい。ただし、上述したように、角度θが０°になると、複数の異なる断面画像を取得できなくなるため、角度θは、少なくとも０°より大きくする必要がある。
【０１４４】
次に、ノイズ成分を抑えながら全ての断面を取得可能な角度θの条件について説明する。
【０１４５】
図１４（ａ）に示すように、核１２ａの直径をＡ１とし、流路４１における結像視野の大きさ、すなわち撮像可能な流路４１のＺ軸方向の幅をＢ１とする。ノイズ成分を抑えるために角度θを小さくしながら、核１２ａの全ての断面を取得するためには、結像視野の上端に位置付けられた核１２ａの一方の端と、結像視野の下端に位置付けられた核１２ａの他方の端とにライトシート１１が掛かればよい。このことから、最適な角度θは、以下の式（２）により算出される。
【０１４６】
ｔａｎθ＝Ａ１／Ｂ１  …  （２）
【０１４７】
式（２）を満たすように角度θが設定されると、核１２ａの全ての断面画像を取得しながら、バックグラウンドノイズを抑えた高精度な画像を撮像できる。
【０１４８】
次に、上記のような最適な角度θを細胞撮像装置１０に適用するための処理について説明する。
【０１４９】
図１４（ｂ）に示すように、ステップＳ１において、処理部８１は、入力部８４を介してユーザが入力した数値を受け付けて、受け付けた数値を撮像対象の平均的な大きさ、すなわち集光光学系５０の光軸方向における撮像対象の平均的な幅として回転制御部７０に設定する。実施形態１では、ユーザは核１２ａの平均的な直径を入力する。
【０１５０】
ステップＳ１において、処理部８１は、撮像対象の一覧を表示部８３に表示し、入力部８４を介してユーザが選択した撮像対象を受け付けてもよい。この場合、処理部８１は、ユーザから受け付けた撮像対象に対応する大きさを、予め記憶部８２に記憶した対応表から読み出し、読み出した大きさを回転制御部７０に設定する。また、ステップＳ１において、処理部８１は、予め撮像素子６０により撮像した画像に基づいて撮像対象の大きさを算出し、算出した大きさを回転制御部７０に設定してもよい。
【０１５１】
ステップＳ２において、処理部８１は、入力部８４を介してユーザが入力した視野の大きさを受け付けて、受け付けた視野の大きさを回転制御部７０に設定する。視野の大きさは、集光光学系５０の対物レンズ５１の倍率や、撮像素子６０の画素数などに応じて変化する。
【０１５２】
ステップＳ２において、処理部８１は、対物レンズ５１と撮像素子６０の一覧を表示部８３に表示し、入力部８４を介してユーザが選択した対物レンズ５１と撮像素子６０を受け付けてもよい。この場合、処理部８１は、ユーザから受け付けた対物レンズ５１の倍率と撮像素子６０の画素数を、予め記憶部８２に記憶した対応表から読み出し、読み出した倍率と画素数に基づいて視野の大きさ計算し、算出した視野の大きさを回転制御部７０に設定してもよい。
【０１５３】
ステップＳ３において、回転制御部７０は、処理部８１によって設定された撮像対象の大きさと視野の大きさを上記式（２）に代入し、ライトシート１１の傾き角度θを算出する。処理部８１が、ライトシート１１の傾き角度θを算出し、算出した角度θを回転制御部７０に送信してもよい。
【０１５４】
ステップＳ４において、回転制御部７０は、ライトシート１１の傾きがステップＳ３で算出された角度θとなるよう、回転機構部３２を介して光学レンズ３１を回転させる。こうして、撮像対象の全ての断面画像を取得でき、バックグラウンドノイズを抑えた高精度な画像を撮像できるよう、ライトシート１１の傾きが設定される。
【０１５５】
回転制御部７０は、必ずしも必要ではなく、省略されてもよい。この場合、たとえば、オペレータが、光学レンズ３１の角度がθとなるよう、手動で回転機構部３２を回転させる。また、回転機構部３２に代えて、光学レンズ３１が固定されたホルダが、光学レンズ３１の複数の角度に対応して複数準備されてもよい。この場合、角度θが算出されると、算出された角度θに対応するホルダが選択され、選択されたホルダが装置内に設置されることにより、光学レンズ３１の角度が変更される。このようなホルダの設置は、手動で行われても良く、自動で行われてもよい。
【０１５６】
次に、３次元画像を生成する処理について説明する。
【０１５７】
図１５に示すように、ステップＳ１１において、ユーザは、光源２０から光を出射させることにより、試料にライトシート１１を照射させる。光源２０がインターフェース８５に接続されてもよい。この場合、ステップＳ１１において、処理部８１が、光源２０を制御して、試料にライトシート１１を照射させる。
【０１５８】
ステップＳ１２において、ユーザは、複数の細胞を含む試料をフローセル４０の流路４１に流す。ここでは、複数の細胞が同時にライトシート１１を横切るように試料が調製される。撮像部１０ａは、調製した試料を貯留するための貯留部と、貯留部に貯留された試料をフローセル４０に送るための移送部とを備えてもよい。この場合、ステップＳ１１において、処理部８１が、貯留部に貯留された試料を、フローセル４０に流すよう、細胞撮像装置１０の移送部を制御する。
【０１５９】
ステップＳ１３において、処理部８１は、複数の細胞１２内の核１２ａから生じた蛍光の画像を、撮像素子６０により撮像させる。具体的には、蛍光の画像が、撮像素子６０のフレームレートに基づいて連続的に撮像され、記憶部８２に順次記憶される。ステップＳ１４において、処理部８１は、撮像素子６０により撮像された複数の画像に基づいて、複数の細胞の３次元画像を含む画像を生成する。ステップＳ１４においては、図１６に示す処理が行われる。
【０１６０】
ステップＳ２１において、処理部８１は、撮像素子６０により撮像された複数の画像に対して、図１１（ａ）、（ｂ）を参照して説明したように歪み補正を行う。さらに、処理部８１は、ステップＳ２２、Ｓ２３において、歪み補正後の複数の画像に対して、図８および図１２（ａ）を参照して説明したように、アスペクト比の補正と位置調整を行う。すなわち、処理部８１は、１つの核１２ａについて取得した複数の歪み補正後の画像について、上記式（１）に基づいて撮像面６１における核１２ａの移動量を算出し、アスペクト比の補正を行う。ステップＳ２４において、処理部８１は、算出した移動量と、アスペクト比の補正を行った画像とに基づいて、図１２（ｂ）を参照して説明したように、画像の重ね合わせを行う。こうして、処理部８１は、複数の核１２ａの３次元画像を含む画像を生成する。
【０１６１】
複数の細胞が凝集した凝集塊がライトシート１１を横切った場合、図１５および図１６に示した処理により、たとえば、図１７に示すような３次元画像が取得され得る。ここでは、４つの核１２ａの３次元画像を含む画像が取得されている。
【０１６２】
＜実施形態２＞
実施形態２の集光光学系５０は、位相変調素子５５が、ダブルヘリックスＰＳＦを形成する位相変調素子に置き換えられている。「ダブルヘリックスＰＳＦ」とは、スパイラル点像分布関数の１種であり、１つの起点から生じた光を２つの焦点に結像させる点像分布関数のことである。実施形態２では、図５（ａ）に示した位相変調パターンが、ダブルヘリックスＰＳＦを形成する位相変調パターンに置き換えられる。実施形態２のその他の構成は、実施形態１と同様である。
【０１６３】
図１８に示すように、Ｙ軸方向において位置の異なる点から生じた蛍光は、撮像素子６０の撮像面６１上で２つの焦点に結像される。このとき、２つの焦点は、Ｙ軸方向における蛍光の起点の位置に応じて、撮像面６１上で回転する。つまり、２つの焦点を結ぶ直線と、基準となる直線とがなす角が、Ｙ軸方向における蛍光の起点の位置に応じて、撮像面６１上において変化する。
【０１６４】
図１９に示すように、位相変調素子５５が配置されなかった場合は、細胞断面の１つの輝点から生じた蛍光が照射領域１１１において撮像面６１に照射される。これに対し、ダブルヘリックスＰＳＦを形成する位相変調素子５５が配置されると、図１９に示すように、細胞断面の１つの輝点から生じた蛍光が、２つの照射領域１２１に照射される。この場合、位相変調素子５５が配置されなかった場合に照射領域１１１内の照射位置Ｐ４１に照射された蛍光は、２つに分割されて、２つの照射領域１２１内の照射位置Ｐ４２に照射される。
【０１６５】
したがって、ダブルヘリックスのＰＳＦを形成する位相変調素子５５を用いた場合には、照射領域１１１から２つの照射領域１２１にそれぞれ向かうベクトルと逆向きのベクトル、すなわち、図１９に実線で示したベクトルを補正ベクトルとして用いることにより、２つの照射領域１２１から取得された画像要素を、照射領域１１１に移動させ得る。
【０１６６】
歪み補正処理において、処理部８１は、撮像面６１上の蛍光が照射された画素について、組となる２つの画素を探索する。処理部８１は、たとえば、最上段から順番に１つの画素列を選択し、選択した画素列において、蛍光が照射された画素を特定する。そして、処理部８１は、特定した画素に対して、図１８に示した２つの焦点の位置関係から組となる他の画素列の画素を特定し、この画素に蛍光が照射されている場合に、これら２つの画素を、組となる画素として取得する。図１８に示したように、２つの焦点の位置関係は、選択した画素列ごとに、すなわち、撮像面と蛍光の起点との間の距離に応じて、相違する。したがって、各画素列の各画素には、ダブルヘリックスＰＳＦの作用により組となる他の画素列の画素が対応付けられている。処理部８１は、この対応関係に基づいて、蛍光が照射される２つの画像を組となる画素として取得する。こうして、処理部８１は、全ての画素列の画素に対して、組となる画素を取得する。
【０１６７】
その後、処理部８１は、組となる画素から取得した画像要素を、これら画素間の中間の画素位置に重ねる。処理部８１は、この処理を、全ての画素の組に対して行う。これにより、細胞断面から取得された全ての組の画像要素が互いに重ねられる。こうして、処理部８１は、歪みが補正された細胞の断面画像を取得する。歪み補正後の処理は、上記実施形態１と同様である。
【０１６８】
実施形態２の構成によっても、歪みが補正された断面画像を取得できる。よって、実施形態１と同様、高品質の細胞画像を取得できる。
【０１６９】
ただし、実施形態２の構成では、１つの輝点から生じた蛍光が２つに分かれて撮像面６１に照射されるため、撮像面６１上の各画素から取得された画像要素の組が特定可能に、細胞の断面から生じた蛍光が撮像面６１上において分離している必要がある。実施形態２は、このような状態で蛍光が分離し得るような細胞に用いられ得る。たとえば、細胞の形状が小さく、且つ、フローセル４０を流れる細胞の密度が低い場合に、細胞の断面から生じた各輝点の蛍光が組み合わせを特定可能に撮像面６１上において分離する。実施形態２の構成は、このような場合に用いられ得る。
【０１７０】
これに対し、実施形態１では、シングルヘリックスＰＳＦを形成する位相変調素子５５が用いられるため、細胞断面の各部から生じた蛍光は分離しない。このため、どのような細胞についても、撮像画像に生じた歪を円滑に補正できる。
【０１７１】
なお、図１９に示した２つの照射領域１２１の何れか一方についてのみ、画像要素を補正ベクトルによって移動させて、歪み補正後の断面画像を取得してもよい。ただし、この場合は、上記のように、２つの照射領域１２１の画像要素を重ねる場合に比べて、歪み補正後の断面画像が暗くなる。実施形態２では、組となる画像要素を重ね合わせることにより、明るい断面画像を取得できる。
【０１７２】
また、位相変調素子５５として、トリプルヘリックス以上のマルチヘリックスＰＳＦを形成する位相変調素子が用いられてもよい。「マルチヘリックスＰＳＦ」とは、スパイラル点像分布関数の１種であり、１つの起点から生じた光を複数の焦点に結像させる点像分布関数のことである。この場合も、組となる画像要素の中間位置に各画像要素を重ねればよい。これにより、明るい断面画像を取得できる。たとえば、位相変調素子５５として、トリプルヘリックス以上のＰＳＦを形成する位相変調素子が用いられる場合は、組となる３つの画像要素の中間位置、すなわち、３つの画像要素の重心位置に、各画像要素を重ねればよい。
【０１７３】
実施形態１、２では、撮像素子６０が撮像する光は蛍光であったが、撮像素子６０が撮像する光は、撮像対象の細胞からフローセル４０の側方に生じた光、たとえば側方散乱光でもよい。
【０１７４】
実施形態１、２では、フローセル４０は、Ｚ軸方向に見て正方形形状の外形を有したが、Ｚ軸方向に見て円形形状の外形を有してもよい。たとえば、フローセル４０が円柱形状に構成される場合、フローセル４０はＺ軸方向に見て円形形状の外形を有し、フローセル４０の外側面は曲面となる。フローセル４０が円柱形状に構成される場合、ライトシート１１は、外側面の接平面に垂直とされる。こうすると、フローセル４０に入射するライトシート１１が外側面により屈折することが抑制されるため、細胞１２に照射されるライトシート１１の形状が崩れにくくなる。したがって、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。
【０１７５】
＜変更例＞
上記実施形態１、２では、複数の細胞を同時に撮像する構成について説明したが、撮像画像の歪み補正について発明を抽出することも可能である。この場合、必ずしも、複数の細胞が同時に撮像されなくともよく、１つの細胞のみがライトシート１１を横切るように試料がフローセル４０に流されてもよい。
【０１７６】
また、撮像対象の粒子は、細胞に限られず、細胞以外の粒子であってもよい。たとえば、撮像対象の粒子は、細胞以外の生体由来の粒子や、蛍光ビーズなどの光を透過する粒子等であってもよい。すなわち、撮像対象の粒子は、透光性を有し光の照射によってフローセルの外側に向けて光を生じる粒子であればよい。また、核１２ａとともに、ＨＥＲ２遺伝子、および１７番染色体のセントロメア領域であるＣＥＰ１７の蛍光画像が取得されてもよい。これに限らず、他の遺伝子、核酸、細胞質、タンパク質、細胞内小器官等、細胞内の他の部分の蛍光画像を取得してもよい。
【０１７７】
本変更例に係る粒子撮像装置は、上記実施形態１、２に係る細胞撮像装置１０と同様の構成とされ得る。また、本変更例に係る粒子撮像方法も、上記実施形態１、２における図１５および図１６の処理と同様とされ得る。本変更例において、撮像画像の歪み補正は、上記実施形態１、２のステップＳ２１と同様に行われ得る。また、図１６のステップＳ２２、２３の処理も同様に行われ得る。
【０１７８】
なお、核１２ａとともにＨＥＲ２遺伝子とＣＥＰ１７を撮像対象とする場合、ＨＥＲ２遺伝子とＣＥＰ１７から生じた蛍光は、核１２ａの照射領域内に輝点として投影されるため、核１２ａの断面画像に、ＨＥＲ２遺伝子とＣＥＰ１７も含まれることになる。また、上記のような歪み補正と、アスペクト比の補正および位置調整により、ＨＥＲ２遺伝子とＣＥＰ１７についても歪みの補正と、アスペクト比の補正および位置調整が行われる。したがって、本変更例では、断面画像を重ね合わせて構成される核１２ａの３次元画像に、ＨＥＲ２遺伝子とＣＥＰ１７の輝点が含まれることになる。このように、変更例によれば、核１２ａのような所定の大きさを有する部分だけでなく、ＨＥＲ２遺伝子とＣＥＰ１７などの微小な部分についても、撮像素子６０によって取得される複数の画像に基づいて、３次元における分布状態を反映した３次元画像を取得できる。
【０１７９】
なお、被写界深度を拡大する素子（５５）は、位相変調素子に限られず、可変焦点レンズを用い被写界深度を拡大してもよい。
【符号の説明】
【０１８０】
１０  粒子撮像装置
１１  ライトシート
１１ａ  シート面
２０  光源
３０  照射光学系
３１  光学レンズ
３２  回転機構部
４０  フローセル
４０ａ、４０ｃ  外側面
４１  流路
５０  集光光学系
５５  位相変調素子
６０  撮像素子
６１  撮像面
８１  処理部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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