(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳動物細胞で組換えタンパク質を高生産可能な新規なプロモーターおよびそれを含む発現ベクターを作製し、組換えタンパク質を生産する。【解決手段】ヒト成長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターの一部配列を欠損させたポリヌクレオチドからなるプロモーターおよびタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで哺乳動物細胞を形質転換して得られる形質転換体を培養することにより組換えタンパク質を生産し、得られた培養物から生産された前記組換えタンパク質を回収する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１２に記載のヌクレオチド配列から、少なくとも６２１番目のグアニンから７９８番目のグアニンまでの領域が欠損した、ポリヌクレオチド又はそれと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１８に記載のヌクレオチド配列からなる、又はそれと８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるプロモーター。
【請求項４】
請求項３に記載のプロモーターおよびタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
タンパク質が抗体のＨ鎖またはＬ鎖である、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載のベクターで哺乳動物細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項７】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６または７に記載の形質転換体を培養することにより組換えタンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記組換えタンパク質を回収する工程とを含む、組換えタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞を宿主として組換えタンパク質を生産するための新規なプロモーターおよびそれを含む発現ベクターに関する。より詳しくは、ヒト成長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターを改良することにより得られた新規プロモーターおよびそれを含む発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、組換えタンパク質は幅広い分野で使用されている。近年のバイオ医薬品の成長によりその重要性はさらに高まっている。組換えタンパク質は主に大腸菌、酵母、昆虫細胞を宿主として作られている。これら宿主を用いると短時間に大量の組換えタンパク質を得ることができる一方、発現させた組換えタンパク質が、正しい立体構造をとらなかったり、糖鎖付加といった翻訳後修飾等の理由から本来の機能を有しなかったりする問題があった。
前記問題を解決するため、哺乳動物細胞を宿主として用いた組換えタンパク質発現系を用いる例が増えている。特にチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞）を用いて造られた組換えタンパク質は医薬品として使用できる安全性が確認されており、現在、一般的な手法となっている。そのため哺乳動物細胞を用いた組換えタンパク質製造の生産性の向上は、製造のコスト削減ひいてはバイオ医薬品の価格低下による医療費の抑制の面から非常に重要である。しかしながら現時点では、哺乳動物細胞を宿主とした組換えタンパク質の生産性は十分に高いとは言い難い。
【０００３】
哺乳動物細胞を宿主として組換えタンパク質を発現させるためには、プロモーターと、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ポリアデニル鎖（以下、ポリＡとも表記）とを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、培養する必要がある。そのため組換えタンパク質の生産には、プロモーターやポリＡの配列、遺伝子組換え細胞の培養条件など様々な因子が関与している。その中でも特にプロモーターは、組換えタンパク質の生産性に影響を与えるため重要である。
【０００４】
哺乳動物細胞を宿主とした発現系のプロモーターは、従来よりシミアンウイルス由来のプロモーターであるＳＶ４０プロモーター（以下、ＳＶ４０ｐｒｏとも表記）、サイトメガロウイルス由来のプロモーターであるＣＭＶプロモーター（以下、ＣＭＶｐｒｏとも表記）（特許文献１）およびヒト成長因子由来のプロモーターであるＥＦ１αプロモーター（以下、ＥＦ１ａｐｒｏとも表記）（特許文献２）などが用いられている。また近年では、ヒトＣＭＶエンハンサーにニワトリのβアクチンプロモーターを組み合わせたＣＡＧプロモーター（以下、ＣＡＧｐｒｏとも表記）（特許文献３）や、ヒトＣＭＶエンハンサーにヒトＥＦ１αプロモーターを組み合わせたＣＥＦプロモーター（非特許文献１）など、従来よりも強力な発現プロモーターも作られている。しかしながら、哺乳動物細胞を宿主とした組換えタンパク質製造の生産性向上のためには、前述したプロモーターよりもさらに強力なプロモーターが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許５１６８０６２号公報
【特許文献２】特開平２−２４２６８７号公報
【特許文献３】特開平３−１６８０８７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４７、１７９−１８１（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、哺乳動物細胞で組換えタンパク質を高生産可能な新規なプロモーターおよびそれを含む発現ベクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒト成長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターの一部の配列を欠損させて得られた新規なプロモーターを含む発現ベクターを用いた組換えタンパク質発現系を構築することで、哺乳動物細胞による組換えタンパク質生産をより高効率に行なえることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本願は以下に記載の態様を包含する。
（１）  配列番号１２に記載のヌクレオチド配列から、少なくとも６２１番目のグアニンから７９８番目のグアニンまでの領域が欠損した、ポリヌクレオチド又はそれと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド。
（２）  配列番号１８に記載のヌクレオチド配列からなる、又はそれと８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなる、（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）  （１）または（２）に記載のポリヌクレオチドからなるプロモーター。
（４）  （３）に記載のプロモーターおよびタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
（５）  タンパク質が抗体のＨ鎖またはＬ鎖である、（４）に記載のベクター。
（６）  （４）または（５）に記載のベクターで哺乳動物細胞を形質転換して得られる形質転換体。
（７）  哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞である、（６）に記載の形質転換体。
（８）  （６）または（７）に記載の形質転換体を培養することにより組換えタンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記組換えタンパク質を回収する工程とを含む、組換えタンパク質の製造方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列から、少なくとも６２１番目のグアニンから７９８番目のグアニンまでの領域が欠損した、ポリヌクレオチド又はそれと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。このとき、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列からなる、又はそれと８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。またそれらの配列と９０％以上の相同性を有することがさらに好ましい。
【００１１】
本発明のプロモーターはヒトＥＦ１αプロモーターの一部を欠損させることで、哺乳動物細胞における組換えタンパク質の生産性が向上するプロモーターである。具体的には、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列からなるヒトＥＦ１αプロモーターのうち、少なくとも６２１番目のグアニンから７９８番目のグアニン（以下、領域Ａとも表記）までが欠損したプロモーターである。なお本発明のプロモーターは、哺乳動物細胞における組換えタンパク質の生産性向上という本発明のプロモーターの特徴を有している限り、領域Ａの５’末端側および／または３’末端側に隣接する領域をさらに欠損させてもよい。一方で後述の実施例より、ヒトＥＦ１αプロモーターを用いて組換えタンパク質を発現させるためには、当該プロモーター中の領域Ａよりも３’末端側領域が必要であることから、前記さらなる欠損は、領域Ａよりも３’末端側の全領域を欠損させることはできない。また本発明のプロモーターは、領域Ａの５’末端側及び／又は３’末端側であって、領域Ａに隣接しない領域に欠損を有していてもよい。本発明のプロモーターの具体例として、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列からなるヒトＥＦ１αプロモーターのうち、６２１番目のグアニンから７９８番目のグアニンまでを欠損させた、配列番号１８に記載の配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。
【００１２】
本発明のプロモーターを用いて、哺乳動物細胞における組換えタンパク質の生産性を向上させるには、本発明のプロモーターおよび当該組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（以下、単に本発明の発現ベクターとも表記する）を作製するのが好ましい。本発明の発現ベクターには、本発明のプロモーターおよび組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドの他にも、ポリＡ、組換えタンパク質の分泌発現に必要な分泌シグナルや、遺伝子増幅マーカー遺伝子、宿主選択に用いる抗生物質耐性遺伝子、哺乳動物細胞以外の宿主での複製開始点、等をさらに含んでもよい。
【００１３】
前記ポリＡはターミネーションシグナルを含んでいれば特に制限はなく、一例として、発現させるタンパク質由来のポリＡ、ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のポリＡ、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのポリＡ、ウシ成長ホルモン由来のポリＡ、ウサギのβ−グロビン遺伝子由来のポリＡがあげられる。
【００１４】
前記分泌シグナルの一例としては、発現させる組換えタンパク質由来の分泌シグナル、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌シグナル（配列番号７５）、アズロシジン前駆体の分泌シグナル（配列番号６９）、ヒト血清アルブミンの分泌シグナル（配列番号７２）があげられる。例えば抗体を発現させる際には、後述の実施例よりアズロシジン前駆体の分泌シグナル配列を用いると、抗体発現量が多く好ましい。
【００１５】
前記遺伝子増幅マーカー遺伝子は、遺伝子増幅させる方法に適した遺伝子を用いればよい。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）／メトトレキサート（ＭＴＸ）法を用いる場合はｄｈｆｒ遺伝子を、グルタミン合成酵素（ＧＳ）／メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）法を用いる場合はＧＳ遺伝子を、それぞれ用いればよい。
【００１６】
前記抗生物質耐性遺伝子は、宿主選択に用いる抗生物質に対応した耐性遺伝子を選択すればよく、一例として、宿主が大腸菌の場合はアンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子が、宿主が哺乳動物細胞の場合はＧ４１８耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子が、それぞれあげられる。
【００１７】
前記複製開始点は、哺乳動物細胞以外の宿主が大腸菌である場合、大腸菌内でのコピー数が高くプラスミドＤＮＡの収量が多い、ＣｏｌＥ１が例示できる。
【００１８】
また本発明の発現ベクターには、プロモーターの働きを強めるためのエンハンサーをさらに含んでいてもよい。使用するエンハンサーに特に制限はなく、発現させる組換えタンパク質や宿主を考慮し、適宜選択すればよい。一例としてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のエンハンサーがあげられる。
【００１９】
また宿主に導入した遺伝子が発現しやすくするために、本発明の発現ベクターにＬｏｘＰ遺伝子をさらに含ませてもよい。ゲノム中にＬｏｘＰ遺伝子を含んだ宿主細胞へ前記発現ベクターを導入する際に、Ｃｒｅリコンビナーゼによる相同組換えを行うことで宿主と前期発現ベクター中にあるＬｏｘＰ遺伝子が相同組換えを起こすことで宿主細胞のゲノムへ部位特異的に組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することができる。
【００２０】
本発明のベクターのサイズ（塩基長）は、大きくなると宿主である哺乳動物細胞への遺伝子導入効率が低下するため、できる限り小さいほうがよく、好ましくは４０００塩基以上８０００塩基以下である。
【００２１】
本発明の発現ベクターを用いて哺乳動物細胞で発現させる組換えタンパク質に特に制限はない。一例として、抗体（イムノグロブリン）、各種酵素、ヒト由来の受容体タンパク質があげられる。組換えタンパク質が抗体である場合の具体例として、由来からは哺乳動物である、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ヒトが、構造からは相補性決定領域（ＣＤＲ）以外を異なる宿主由来の抗体に変えた組換え抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ＶＬおよびＶＨ領域を合成リンカーによって合体させたｓｃＦｖ等の小型化抗体が、それぞれあげられる。
【００２２】
本発明の発現ベクターを用いて組換えタンパク質を発現させるために用いる哺乳動物細胞の一例として、ＣＨＯ細胞（Ｋ１株、ＤＧ４４株、ＤＸＢ１１株）、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ細胞）、ヒト白血病細胞由来細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト子宮頸癌由来細胞（ＨｅＬａ細胞）およびアフリカミドリザルの腎細胞由来細胞（ＣＯＳ細胞）などが例示できる。中でも本発明の発現ベクターは、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞を宿主とした組換えタンパク質発現系に好ましいベクターである。
【００２３】
本発明の発現ベクターで哺乳動物細胞を形質転換させるには、エレクトロポレーションやカチオニックリポソームを用いたリポフェクションなど、当業者が通常用いる形質転換法の中から、宿主として使用する哺乳動物細胞に合わせて適宜選択すればよい。
【００２４】
本発明の発現ベクターで哺乳動物細胞を形質転換して得られる、組換えタンパク質を生産可能な形質転換体を培養し、得られた培養物から生産された前記組換えタンパク質を回収することで、前記組換えタンパク質を高効率に製造することができる。前記形質転換体の培養物から前記組換えタンパク質を回収する際、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによる精製操作を組み合わせてもよく、当該操作により前記組換えタンパク質を高効率かつ高純度に回収できる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のプロモーターはヒト成長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターの一部配列を欠損させたポリヌクレオチドであり、本発明のプロモーターを発現ベクターに含ませることで哺乳動物細胞における組換えタンパク質の生産性が向上する。そのため前記組換えタンパク質を低コストで製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例１で作製したプラスミドｐＥＦｄの概略を示す図である。
【図２】プロモーターとして、ヒトＥＦ１αプロモーター全長（ＥＦ１ａｐｒｏ）を用いたときと、前記プロモーターの一部を欠損させたプロモーター（ＥＦｄｐｒｏ、ＥＦＳ１ｐｒｏ、ＥＦＳ２ｐｒｏ）を用いたときとで、ＣＨＯ細胞Ｋ１株での抗体発現量を比較した結果を示す図である。
【図３】プロモーターとして、ヒトＥＦ１αプロモーター全長（ＥＦ１ａｐｒｏ）を用いたときと、前記プロモーターの一部を欠損させたプロモーター（ＥＦｄｐｒｏ、ＥＦＳ１ｐｒｏ、ＥＦＳ２ｐｒｏ）を用いたときとで、ＣＯＳ細胞での抗体発現量を比較した結果を示す図である。
【図４】プロモーターとして、ヒトＥＦ１αプロモーター全長（ＥＦ１ａｐｒｏ）を用いたときと、本発明のプロモーター（ＥＦｄｐｒｏ）を用いたときと、従来のプロモーター（ＳＶ４０ｐｒｏ、ＣＭＶｐｒｏおよびＣＡＧｐｒｏ）を用いたときとで、ＣＨＯ細胞Ｋ１株での抗体発現量を比較した結果を示す図である。
【図５】プロモーターとして、ヒトＥＦ１αプロモーター全長（ＥＦ１ａｐｒｏ）を用いたときと、本発明のプロモーター（ＥＦｄｐｒｏ）を用いたときと、従来のプロモーター（ＳＶ４０ｐｒｏ、ＣＭＶｐｒｏおよびＣＡＧｐｒｏ）を用いたときとで、ＣＯＳ細胞での抗体発現量を比較した結果を示す図である。
【図６】本発明のプロモーター（ＥＦｄｐｒｏ）と分泌シグナルとの組合せによる、ＣＨＯ細胞Ｋ１株での抗体発現量を比較した結果を示す図である。
【図７】本発明のプロモーター（ＥＦｄｐｒｏ）と分泌シグナルとの組合せによる、ＣＯＳ細胞での抗体発現量を比較した結果を示す図である。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例および比較例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１  ヒト成長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターを含むプラスミドの作製
以下に示す方法で、ヒトＥＦ１αプロモーターを含むプラスミドを作製した。
【００２９】
（１）配列番号１に記載のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＨＦＲ）コードするポリヌクレオチドおよびＳＶ４０のポリＡに制限酵素ＳａｃＩＩ認識配列（ＣＣＧＣＧＧ）を付加したポリヌクレオチドを全合成し、プラスミドにクローニングした（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に委託）。
【００３０】
（２）（１）で作製したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミドを抽出した後、制限酵素ＳａｃＩＩで消化することで、ｄｈｆｒ遺伝子とＳＶ４０ポリＡが連結したポリヌクレオチドを調製した（ｄｈｆｒ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ−Ｐと命名）。
【００３１】
（３）ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、配列番号２（５’−ＴＣＣ［ＣＣＧＣＧＧ］ＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＧＡＣＣＧ−３’）および配列番号３（５’−ＴＣＣ［ＣＣＧＣＧＧ］ＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＳａｃＩＩ認識配列）として、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で３０秒間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、ｐＩＲＥＳベクターのうちネオマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した（ｐＩＲＥＳ−Ｐと命名）。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
（４）作製したＰＣＲ産物ｐＩＲＥＳ−Ｐを精製後、制限酵素ＳａｃＩＩで消化し、（２）で調製したｄｈｆｒ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ−Ｐとライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでｄｈｆｒ遺伝子を含んだプラスミドｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒを得た。
【００３４】
（５）（４）で作製したｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒを鋳型として、配列番号４（５’−ＡＧＡＴＣＴＡＧＡ［ＣＴＣＧＡＧ］ＧＡＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＣＴＴＧＧ−３’）および配列番号５（５’−ＡＴＣＡＧＡＴＣＡＧＡＣＴＧＴＴＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＸｈｏＩ認識配列）として、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で２分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、ＳＶ４０プロモーター、ＤＨＦＲおよびＳＶ４０のポリＡ遺伝子領域を増幅した。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない得られたＰＣＲ産物をｄｈｆｒ−Ｐと命名した。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
（６）市販のｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を鋳型として、配列番号６（５’−ＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧ−３’）および配列番号７（５’−ＡＧＡ［ＴＣＴＡＧＡ］ＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＸｂａＩ認識配列）として、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で２分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）および大腸菌での複製起点（ＣｏｌＥ１）遺伝子領域を増幅した。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない得られたＰＣＲ産物をＡｍｐ＋ＣｏｌＥ１−Ｐと命名した。
【００３７】
（７）ｐＥＣＥ−ｄｈｆｒ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８、６７３−６７６（１９９０））を鋳型とし、配列番号８（５’−ＡＧＡ［ＴＣＴＡＧＡ］ＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＡＧＴＴＡＧＧＧ−３’）および配列番号９（５’−［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＴＴ＜ＧＡＡＴＴＣ＞ＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（配列番号８の角かっこ内は制限酵素ＸｂａＩ認識配列、配列番号９の角かっこ内は制限酵素ＮｏｔＩの認識配列、配列番号９の山かっこ内はＥｃｏＲＩの認識配列）として、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、ＳＶ４０プロモーター（ＳＶ４０ｐｒｏ）遺伝子領域を増幅した。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない得られたＰＣＲ産物をＳＶ４０−Ｐと命名した。
【００３８】
（８）（４）で作製したｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒを鋳型とし、配列番号１０（５’−［ＧＡＡＴＴＣ］ＡＡＡ＜ＧＣＧＧＣＣＧＣ＞ＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧ−３’）および配列番号１１（５’−ＴＡＡ［ＣＴＣＧＡＧ］ＴＴＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（配列番号１０の角かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列、配列番号１０の山かっこ内はＮｏｔＩの認識配列、配列番号１１の角かっこ内は制限酵素ＸｈｏＩの認識配列）として、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で２分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、ＳＶ４０ポリＡ領域を増幅した。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない得られたＰＣＲ産物をＳＶ４０ｐｏｌｙＡ−Ｐと命名した。
【００３９】
（９）（５）で作製したＰＣＲ産物ｄｈｆｒ−Ｐと（６）で作製したＰＣＲ産物Ａｍｐ＋ＣｏｌＥ１−Ｐとはオーバーラップする領域を含んでいる。そこでこれらを鋳型とし、配列番号４および配列番号７に記載の配列からなるポリヌクレオチドをプライマーとして、それぞれ用いて表３に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で２分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、ｄｈｆｒ−ＰおよびＡｍｐ＋ＣｏｌＥ１−Ｐを１つの遺伝子として合成し増幅した。その後アガロースゲル抽出による精製を行ない、得られたＰＣＲ産物をｄｈｆｒ−Ａｍｐ−Ｐと命名した。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
（１０）（７）で作製したＰＣＲ産物ＳＶ４０−Ｐと（８）で作製したＰＣＲ産物ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ−Ｐとはオーバーラップする領域を含んでいる。そこでこれらを鋳型とし、配列番号８および配列番号１１に記載の配列からなるポリヌクレオチドをプライマーとして、それぞれ用いて表３に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、ＳＶ４０−ＰおよびＳＶ４０ｐｏｌｙＡ−Ｐを１つの遺伝子として合成し増幅した。その後アガロースゲル抽出による精製を行ない、得られたＰＣＲ産物をＳＶ４０ｐｒｏｐｏｌｙＡ−Ｐと命名した。
【００４２】
（１１）（９）で作製したｄｈｆｒ−Ａｍｐ−Ｐおよび（１０）で作製したＳＶ４０ｐｒｏｐｏｌｙＡ−Ｐを、それぞれ制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製後、ライゲーションした。ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで哺乳動物細胞用発現ベクターであるｐＳＶ４０を得た。
【００４３】
（１２）配列番号１２に記載の配列からなるヒト成長因子１α（ＥＦ１α）のプロモーター領域（以下、ＥＦ１ａｐｒｏとも表記）のポリヌクレオチドを全合成し、プラスミドにクローニングした（ＧＥＮＥＷＩＺ社に委託）。前記プラスミドを鋳型とし、配列番号１３（５’−ＡＧＡ［ＴＣＴＡＧＡ］ＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣ−３’）および配列番号１４（５’−［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＴＴ＜ＧＡＡＴＴＣ＞ＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（配列番号１３の角かっこ内は制限酵素ＸｂａＩの認識配列、配列番号１４の角かっこ内は制限酵素ＮｏｔＩの認識配列、配列番号１４の山かっこ内はＥｃｏＲＩの認識配列）として、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、ＥＦ１ａｐｒｏ遺伝子領域を増幅し、その後、アガロースゲル抽出によりＰＣＲ産物を精製した。
【００４４】
（１３）（１１）で作製したｐＳＶ４０および（１２）で得られたＰＣＲ産物をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製後、ライゲーションした。ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで哺乳動物細胞用発現ベクターであるｐＥＦｄを得た。
【００４５】
（１４）（１３）で作製したベクターのヌクレオチド配列を、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖｅｒ．３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて解析を行なった。なおシークエンス用プライマーとして、配列番号６から９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５（５’−ＣＴＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＡＧＣＣ−３’）、配列番号１６（５’−ＣＴＣＴＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡ−３’）および配列番号１７（５’−ＡＴＴＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＴＴＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
【００４６】
配列解析の結果、（１２）で得られたＰＣＲ産物（すなわちＥＦ１ａｐｒｏ、配列番号１２）のうち、６２１番目のグアニンから７９８番目のグアニンまでの１７８ヌクレオチドが欠損していた（配列番号１８、以降ＥＦｄｐｒｏと命名する）。なお他の領域は設計通りのヌクレオチド配列であった。本実施例で作製したプラスミドｐＥＦｄの概略を図１に示す。
【００４７】
実施例２  抗体発現ベクターの作製（その１）
実施例１で作製したプラスミドｐＥＦｄに、抗体（イムノグロブリン）をコードするポリヌクレオチドを導入し、抗体発現用ベクターを作製した。
【００４８】
（１）抗体重鎖遺伝子を含むプラスミドの作製
（１−１）配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなる、抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（ＶＨ領域）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）およびＮｈｅＩ認識配列（ＧＣＴＡＧＣ）を付加したポリヌクレオチドを全合成し、プラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）。
【００４９】
（１−２）（１−１）で作製したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミド抽出後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化することで、ＶＨ領域をコードするポリヌクレオチドを調製しＶＨ−Ｐと命名した。
【００５０】
（１−３）ヒトＩｇＧ１の定常領域を含んだｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化後、アガロースゲル抽出にて精製し、（１−２）で作製したＶＨ−Ｐとライゲーションした。ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体のＨ鎖をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＦＵ−ｈＧ１を得た。
【００５１】
（２）抗体軽鎖遺伝子を含むプラスミドの作製
（２−１）配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなる、抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（ＶＬ領域）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２２）に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）およびＢｓｉＷＩ認識配列（ＣＧＴＡＣＧ）を付加したポリヌクレオチドを全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）。
【００５２】
（２−２）作製したＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換体をからプラスミド抽出後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化することで、ＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドを調製しＶＬ−Ｐと命名した。
【００５３】
（２−３）ヒトκ鎖の定常領域を含んだｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化後、アガロースゲル抽出にて精製しＶＬ−Ｐとライゲーションした。ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体のＬ鎖をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＦＵ−ｈＬを得た。
【００５４】
（３）（１）で作製したｐＦＵ−ｈＧ１および（２）で作製したｐＦＵ−ｈＬを、実施例１（１４）と同様な方法でヌクレオチド配列を確認した。なおシークエンス用プライマーとして、配列番号２３（５’−ＣＧＴＴＡＣＡＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。結果、導入したポリヌクレオチド配列が設計通りであることを確認した。
【００５５】
（４）（１）で作製したｐＦＵ−ｈＧ１を鋳型とし、配列番号２４（５’−ＧＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧ−３’）および配列番号２５（５’−ＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＮｏｔＩの認識配列）として、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行なった。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない得られた抗ヒトｇｐ１３０受容体のＨ鎖全長をコードするＰＣＲ産物をＡＨ−Ｐと命名した。
【００５６】
【表４】
2019106976.tif 000006
【００５７】
（５）（２）で作製したｐＦＵ−ｈＬを鋳型とし、配列番号２６（５’−ＣＡＴＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣ−３’）および配列番号２７（５’−ＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＮｏｔＩの認識配列）として、それぞれ用いて表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行なった。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない得られた抗ヒトｇｐ１３０受容体のＬ鎖全長ＰＣＲ産物をＡＬ−Ｐと命名した。
【００５８】
（６）（４）で作製したＡＨ−Ｐを鋳型とし、配列番号２８に記載のシグナル配列ＡＨ（ＭＧＷＳＷＩＦＬＦＦＬＳＧＴＡＧＶＬＳ）をコードするポリヌクレオチドである配列番号２９（５’−ＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴ−３’）に記載の配列からなるポリヌクレオチドをシグナルＤＮＡとし、配列番号３０（５’−ＣＴＡ［ＧＡＡＴＴＣ］ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧ−３’）および配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列）として、表５に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、シグナル配列ＡＨを付加したＨ鎖をコードするポリヌクレオチドを増幅した。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない、得られたＰＣＲ産物をｓＡＨ−Ｐと命名した。
【００５９】
【表５】
2019106976.tif 000007
【００６０】
（７）（５）で作製したＡＬ−Ｐを鋳型とし、配列番号３１に記載のシグナル配列ＡＬ（ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＭＳＡＳＶＩＭＳＲＧ）をコードするポリヌクレオチドである配列番号３２（５’−ＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧＧ−３’）に記載の配列からなるポリヌクレオチドをシグナルＤＮＡとし、配列番号３３（５’−ＣＴＡ［ＧＡＡＴＴＣ］ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧ−３’）および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列）として、表５に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、シグナル配列ＡＬを付加したＬ鎖をコードするポリヌクレオチドを増幅した。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない、得られたＰＣＲ産物をｓＡＬ−Ｐと命名した。
【００６１】
（８）（６）で作製したｓＡＨ−Ｐ、（７）で作製したｓＡＬ−Ｐおよび実施例１で作製したプラスミドｐＥＦｄをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化、精製後ライゲーションした。ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体のＨ鎖発現ベクターｐＥＦｄ−ＡＨｓＨおよび抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体のＬ鎖発現ベクターｐＥＦｄ−ＡＬｓＬを得た。
【００６２】
（９）（８）で得られた発現ベクターｐＥＦｄ−ＡＨｓＨおよびｐＥＦｄ−ＡＬｓＬのうち、クローニングしたシグナル配列および抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖（ｐＥＦｄ−ＡＨｓＨ）またはＬ鎖（ｐＥＦｄ−ＡＬｓＬ）周辺のヌクレオチド配列を実施例１（１４）と同様の方法で解析した。なおｐＥＦｄ−ＡＨｓＨ用シークエンスプライマーとして、配列番号３４（５’−ＧＡＧＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＡＣ−３’）、配列番号３５（５’−ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣ−３’）および配列番号３６（５’−ＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、ｐＥＦｄ−ＡＬｓＬ用シークエンスプライマーとして、配列番号３３および配列番号３７（５’−ＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＴＧＴＡＣＴＴＴＧＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた。
【００６３】
配列解析の結果、ポリヌクレオチド配列が設計通りであることを確認した。シグナル配列ＡＨおよび抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖のアミノ酸配列を配列番号３８に、シグナル配列ＡＨおよび抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３９に、シグナル配列ＡＬおよび抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖のアミノ酸配列を配列番号４０に、シグナル配列ＡＬおよび抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４１に、それぞれ示す。なお配列番号３８の１番目のメチオニンから１９番目のセリンまでがシグナル配列ＡＨであり、２０番目のグルタミンから４６９番目のリジンまでが抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖のアミノ酸配列である。また配列番号４０の１番目のメチオニンから２２番目のグリシンまでがシグナル配列ＡＬであり、２３番目のアスパラギン酸から２３５番目のシステインまでが抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖のアミノ酸配列である。
【００６４】
比較例１  抗体発現ベクターの作製（その２）
実施例１で作製したプラスミドｐＥＦｄに挿入されているプロモーターＥＦｄｐｒｏは、ヒトＥＦ１αプロモーターの一部が欠損した態様であるため、改めてヒトＥＦ１αプロモーター（ＥＦ１ａｐｒｏ）全長を含む発現ベクターを作製した。
【００６５】
（１）実施例１（１２）で合成したＥＦ１ａｐｒｏを含むプラスミドを鋳型とし、配列番号１３および配列番号１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で１０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、ＥＦ１ａｐｒｏ全長を増幅した。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない、得られたＰＣＲ産物をＥＦ１α−Ｐと命名した。
【００６６】
【表６】
2019106976.tif 000008
【００６７】
（２）（１）で作製したＥＦ１α−Ｐ、ならびに実施例２で作製したｐＥＦｄ−ＡＨｓＨおよびｐＥＦｄ−ＡＬｓＬを、それぞれ制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、精製後、ＥＦ１α−ＰとｐＥＦｄ−ＡＨｓＨ、ならびにＥＦ１α−ＰとｐＥＦｄ−ＡＬｓＬをライゲーションした。
【００６８】
（３）ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、全長のＥＦ１ａｐｒｏを含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体のＨ鎖発現ベクターｐＥＦ１α−ＡＨｓＨおよび抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体のＬ鎖発現ベクターｐＥＦ１α−ＡＬｓＬを得た。
【００６９】
（４）クローニングした領域のヌクレオチド配列を実施例１（１４）と同様の方法で解析した。なおシークエンス用プライマーとして配列番号１４、１５、３４および３９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
【００７０】
配列解析の結果、ポリヌクレオチド配列が設計通りであることを確認した。ｐＥＦ１α−ＡＨｓＨにおけるプロモーター、シグナル配列および抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４４に、ｐＥＦ１α−ＡＬｓＬにおけるプロモーター、シグナル配列および抗ヒトｇｐ１３０抗体受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４５に、それぞれ示す。なお配列番号４４および４５において、１番目から１１８４番目までがプロモーターＥＦ１ａｐｒｏ全長のヌクレオチド配列であり１１９７番目のアデニン以降がシグナル配列および抗体各鎖をコードするポリヌクレオチドの配列である。
【００７１】
比較例２  抗体発現ベクターの作製（その３）
ヒトＥＦ１αプロモーターの一部配列が欠損したポリヌクレオチドを含む抗体発現ベクターを作製した。
【００７２】
（１）配列番号１２に記載のヌクレオチド配列からなるＥＦ１ａｐｒｏのうち、１番目から６１９番目までのポリヌクレオチド（以下、ＥＦＳ１とも表記）を増幅した。実施例１（１２）で合成したＥＦ１ａｐｒｏを含むプラスミドを鋳型とし、配列番号１３および配列番号４２（５’−ＡＡＴ［ＧＡＡＴＴＣ］ＣＣＧＴＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列）として、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で１０秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、ＥＦＳ１を増幅した。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない、得られたＰＣＲ産物をＥＦＳ１−Ｐと命名した。
【００７３】
（２）配列番号１２に記載のＥＦ１ａｐｒｏの１番目から３６６番目までのポリヌクレオチド（以下、ＥＦＳ２とも表記）を増幅した。実施例１（１２）で合成したＥＦ１ａｐｒｏを含むプラスミドを鋳型とし、配列番号１３および配列番号４３（５’−ＡＡＴ［ＧＡＡＴＴＣ］ＣＣＣＡＣＣＣＡＣＴＴＣＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列）として、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で１０秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、ＥＦＳ２を増幅した。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない、得られたＰＣＲ産物をＥＦＳ２−Ｐと命名した。
【００７４】
（３）（１）で作製したＥＦＳ１−Ｐ、（２）で作製したＥＦＳ２−Ｐ、ならびに実施例２で作製したｐＥＦｄ−ＡＨｓＨおよびｐＥＦｄ−ＡＬｓＬを、それぞれ制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、精製後、ＥＦＳ１−ＰとｐＥＦｄ−ＡＨｓＨ、ＥＦＳ１−ＰとｐＥＦｄ−ＡＬｓＬ、ＥＦＳ２−ＰとｐＥＦｄ−ＡＨｓＨ、ならびにＥＦＳ２−ＰとｐＥＦｄ−ＡＬｓＬ、をそれぞれライゲーションした。
【００７５】
（４）ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、ＥＦＳ１を含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体のＨ鎖およびＬ鎖発現ベクターｐＥＦＳ１−ＡＨｓＨおよびｐＥＦＳ１−ＡＬｓＬ、ならびにＥＦＳ２を含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体のＨ鎖およびＬ鎖発現ベクターｐＥＦＳ２−ＡＨｓＨおよびｐＥＦＳ２−ＡＬｓＬを得た。
【００７６】
（５）クローニングした領域のヌクレオチド配列を実施例１（１２）と同様の方法で解析した。
【００７７】
配列解析の結果、ポリヌクレオチド配列が設計通りであることを確認した。ｐＥＦＳ１−ＡＨｓＨにおけるプロモーター、シグナル配列および抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４６に、ｐＥＦＳ１−ＡＬｓＬにおけるプロモーター、シグナル配列および抗ヒトｇｐ１３０抗体受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４７に、ｐＥＦＳ２−ＡＨｓＨにおけるプロモーター、シグナル配列および抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４８に、ｐＥＦＳ２−ＡＬｓＬにおけるプロモーター、シグナル配列および抗ヒトｇｐ１３０抗体受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４９に、それぞれ示す。なお配列番号４６および４７において、１番目から６１９番目までがクローニングしたＥＦＳ１のヌクレオチド配列であり、６３２番目のアデニン以降がシグナル配列および抗体各鎖をコードするポリヌクレオチドの配列である。また配列番号４８および４９において１番目から３６６番目までがクローニングしたＥＦＳ２のヌクレオチド配列であり、３７９番目のアデニン以降がシグナル配列および抗体各鎖をコードするポリヌクレオチドの配列である。
【００７８】
実施例３  抗体発現量比較（その１）
実施例２ならびに比較例１および２で作製した抗体発現ベクターによる、抗体発現量の比較を行なった。
【００７９】
（１）ＣＨＯ細胞Ｋ１株を１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎児血清および５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含んだＲＰＭ１６４０培地（Ｗａｋｏ社製）にて２４穴プレート（ＢＤ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００８０】
（２）ＣＯＳ細胞を１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎児血清および５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含んだＤ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）にて２４穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００８１】
（３）細胞がコンフルエントになった後、各ウェルの培地を０．３ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に交換した。
【００８２】
（４）実施例２で作製したｐＥＦｄ−ＡＨｓＨおよびｐＥＦｄ−ＡＬｓＬ、比較例１で作製したｐＥＦ１α−ＡＨｓＨおよびｐＥＦ１α−ＡＬｓＬ、比較例２で作製したｐＥＦＳ１−ＡＨｓＨおよびｐＥＦＳ１−ＡＬｓＬ、ならびにｐＥＦＳ２−ＡＨｓＨおよびｐＥＦＳ２−ＡＬｓＬを用い、Ｈ鎖発現ベクターおよびＬ鎖発現ベクターを各２５０ｎｇならびに１μＬのＰ３０００  Ｒｅａｇｅｎｔを５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに加え、さらに１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含んだ５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを加えて、室温で１０分間静置後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに培地交換されたＣＨＯ細胞Ｋ１株またはＣＯＳ細胞が入ったウェルに全量加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件で３日間培養した。
【００８３】
（５）発現した抗体の発現量を以下に示すＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）によって測定した。
（５−１）抗ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製）のウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化し（４℃で一晩）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ  ＭＩＬＫ（ＢＤ社製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（５−２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、発現した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体と固相の抗ヒトＩｇＧ−Ｆａｂとを反応させた（３０℃で１時間）。
（５−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したペルオキシターゼで標識された抗マウス抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（５−４）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５−５）濃度既知の標準抗体（シグマ社製）を用いて（５−１）から（５−４）と同様な測定を行ない得られた吸光度に基づき、検量線を作成し、当該検量線から抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体の発現量を求めた。
【００８４】
ＣＨＯ細胞Ｋ１株を宿主に用いたときの結果を図２に、ＣＯＳ細胞を宿主に用いたときの結果を図３に、それぞれ示す。いずれの宿主を用いた場合も、プロモーターとして本発明のプロモーターであるＥＦｄｐｒｏ（ＥＦ１ａｐｒｏ（配列番号１２）のうち６２１番目のグアニンから７９８番目のグアニンまでのヌクレオチドが欠損）を用いたとき抗体発現量が最も高かった。なおＥＦｄと同様、ＥＦ１ａｐｒｏの一部を欠損させたポリヌクレオチドであるＥＦＳ１ｐｒｏ（ＥＦ１ａｐｒｏのうち６２０番目のグアニン以降のヌクレオチドが欠損）やＥＦＳ２ｐｒｏ（ＥＦ１ａｐｒｏのうち３６７番目のアデニン以降のヌクレオチドが欠損）では殆ど抗体を発現しなかった。このことから、ヒトＥＦ１αプロモーターを用いて組換えタンパク質を発現させるためには、当該プロモーターの３’末端側領域が必要であることがわかる。
【００８５】
比較例３  抗体発現ベクターの作製（その４）
一般に哺乳動物細胞によるタンパク質発現で用いられるプロモーター（ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＣＡＧ）を含む抗体発現ベクターを作製した。
【００８６】
（１）ＳＶ４０プロモーターを含む抗体発現ベクターの作製
（１−１）実施例１（７）で作製したＳＶ４０−Ｐを制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル抽出を用いて精製した。該ＳＶ４０−Ｐは配列番号５０に記載のＳＶ４０プロモーターを含んでいる。
（１−２）実施例２で作製したｐＥＦｄ−ＡＨｓＨおよびｐＥＦｄ−ＡＬｓＬを制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル抽出による精製により、ＥＦｄｐｒｏを除去したプラスミドをそれぞれ調製した。
（１−３）（１−１）で得られた制限酵素消化産物と、（１−２）で調製したＥＦｄｐｒｏを除いた各プラスミドとをライゲーションした。ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、ＳＶ４０ｐｒｏを含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖発現ベクターｐＳＶ４０−ＡＨｓＨ、およびＳＶ４０ｐｒｏを含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＳＶ４０−ＡＬｓＬを得た。
【００８７】
（２）ＣＭＶプロモーターを含む抗体発現ベクターの作製
（２−１）配列番号５１に記載の配列からなるＣＭＶプロモーター領域（ＣＭＶｐｒｏ）のポリヌクレオチドを全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）。
（２−２）（２−１）で合成したプラスミドを鋳型として、配列番号５２（５’−ＡＧＡ［ＴＣＴＡＧＡ］ＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ−３’）および配列番号５３（５’−［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＴＴ＜ＧＡＡＴＴＣ＞ＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＡＣＣＴＣＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（配列番号５２の角かっこ内は制限酵素ＸｂａＩの認識配列、配列番号５３の角かっこ内は制限酵素ＮｏｔＩの認識配列、配列番号５３の山かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列）として、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ないＣＭＶプロモーターを増幅した。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない得られたＰＣＲ産物をＣＭＶ−Ｐと命名した。
（２−３）（２−２）で作製したＣＭＶ−Ｐを制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル抽出を用いて精製した。
（２−４）（２−３）で得られた制限酵素消化産物と、（１−３）で調製したＥＦｄｐｒｏを除いた各プラスミドとをライゲーションした。ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、ＣＭＶｐｒｏを含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖発現ベクターｐＣＭＶ−ＡＨｓＨ、およびＣＭＶｐｒｏを含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＣＭＶ−ＡＬｓＬを得た。
【００８８】
（３）ＣＡＧプロモーターを含む抗体発現ベクターの作製
（３−１）配列番号５４に記載の配列からなるＣＡＧプロモーター領域（ＣＡＧｐｒｏ）のポリヌクレオチドを全合成しプラスミドにクローニングした（ＧＥＮＥＷＩＺ社に委託）。
（３−２）（３−１）で合成したプラスミドを鋳型として、配列番号５５（５’−ＡＧＡ［ＴＣＴＡＧＡ］ＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣ−３’）および配列番号５６（５’−［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＴＴ＜ＧＡＡＴＴＣ＞ＧＣＣＧＣＣＧＧＴＣＡＣＡＣＧＣＣＡＧＡＡＧＣＣ−３’）に記載のポリヌクレオチドをプライマー（配列番号５５の角かっこ内は制限酵素ＸｂａＩの認識配列、配列番号５６の角かっこ内は制限酵素ＮｏｔＩの認識配列、配列番号５６の山かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列）として表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、ＣＡＧプロモーターを増幅した。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない得られたＰＣＲ産物をＣＡＧ−Ｐと命名した。
（３−３）（３−２）で作製したＣＡＧ−Ｐを制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル抽出を用いて精製した。
（３−４）（３−３）で得られた制限酵素消化産物と、（１−３）で調製したＥＦｄｐｒｏを除いた各プラスミドとをライゲーションした。ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、ＣＡＧｐｒｏを含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖発現ベクターｐＣＡＧ−ＡＨｓＨ、およびＣＡＧｐｒｏを含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＣＡＧ−ＡＬｓＬを得た。
【００８９】
（４）（１）から（３）で得られた抗体発現ベクター（計６種類）を、実施例１（１４）と同様の方法で配列解析を行なった。なおシークエンス用プライマーとして、ｐＳＶ４０−ＡＨｓＨ、ｐＣＭＶ−ＡＨｓＨの場合は配列番号１５および３４を、ｐＣＡＧ−ＡＨｓＨの場合は配列番号１５、３４および５７（５’−ＣＧＴＡＣＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＡＧＣＣＧＧ−３’）を、ｐＳＶ４０−ＡＬｓＬ、ｐＣＭＶ−ＡＬｓＬの場合は配列番号１５および３７を、ｐＣＡＧ−ＡＬｓＬの場合は配列番号１５、３７および５７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
【００９０】
配列解析の結果、前記抗体発現ベクターはいずれも設計通りのプロモーターを含んでいることを確認した。
【００９１】
実施例４  抗体発現量比較（その２）
抗体発現ベクターとして、実施例２で作製したｐＥＦｄ−ＡＨｓＨおよびｐＥＦｄ−ＡＬｓＬ、比較例１で作製したｐＥＦ１α−ＡＨｓＨおよびｐＥＦ１α−ＡＬｓＬ、比較例３で作製したｐＳＶ４０−ＡＨｓＨおよびｐＳＶ４０−ＡＬｓＬ、ｐＣＭＶ−ＡＨｓＨおよびｐＣＭＶ−ＡＬｓＬ、ならびにｐＣＡＧ−ＡＨｓＨおよびｐＣＡＧ−ＡＬｓＬを用いた他は、実施例３と同様の方法で３日間培養後の抗体の発現量をＥＬＩＳＡにて比較した。
【００９２】
ＣＨＯ細胞Ｋ１株を宿主に用いたときの結果を図４に、ＣＯＳ細胞を宿主に用いたときの結果を図５に示す。いずれの宿主を用いた場合も、プロモーターとして本発明のプロモーターであるＥＦｄｐｒｏ（ＥＦ１ａｐｒｏ（配列番号１２）のうち６２１番目のグアニンから７９８番目のグアニンまでのヌクレオチドが欠損）を用いることで、従来のプロモーター（ＳＶ４０ｐｒｏ、ＣＭＶｐｒｏ、ＣＡＧｐｒｏ）と比較し抗体発現量が向上していることがわかる。
【００９３】
実施例５  抗体発現ベクターの作製（その５）
実施例２で作製した抗体発現ベクターｐＥＦｄ−ＡＨｓＨおよびｐＥＦｄ−ＡＬｓＬの分泌シグナル配列を変更したものを作製した。
【００９４】
（１）実施例２（１）で作製したｐＦＵ−ｈＧ１を鋳型とし、配列番号５８（５’−ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＡＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧ−３’）、配列番号５９（５’−ＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧ−３’）、配列番号６０（５’−ＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＡＣＴＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧ−３’）および配列番号６１（５’−ＣＴＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＴＣＧＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧ−３’）のいずれかに記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、アガロースゲル抽出による精製を行なった。得られたＰＣＲ産物のうち、配列番号５８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとしたときに得られたＰＣＲ産物をＢＨ−Ｐと命名し、配列番号５９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとしたときに得られたＰＣＲ産物をＣＨ−Ｐと命名し、配列番号６０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとしたときに得られたＰＣＲ産物をＤＨ−Ｐと命名し、配列番号６１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとしたときに得られたＰＣＲ産物をＥＨ−Ｐと命名した。
【００９５】
（２）実施例２（２）で作製したｐＦＵ−ｈＬを鋳型とし、配列番号６２（５’−ＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣ−３’）、配列番号６３（５’−ＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣ−３’）、配列番号６４（５’−ＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＡＣＴＣＴＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣ−３’）および配列番号６５（５’−ＣＴＴＧＴＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣ−３’）のいずれかに記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、アガロースゲル抽出による精製を行なった。得られたＰＣＲ産物のうち、配列番号６２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとしたときに得られたＰＣＲ産物をＢＬ−Ｐと命名し、配列番号６３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとしたときに得られたＰＣＲ産物をＣＬ−Ｐと命名し、配列番号６４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとしたときに得られたＰＣＲ産物をＤＬ−Ｐと命名し、配列番号６５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとしたときに得られたＰＣＲ産物をＥＬ−Ｐと命名した。
【００９６】
（３）各シグナル配列を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドを作製した。
【００９７】
（３−１）シグナル配列ＢＨ（配列番号６６）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチド
（１）で作製したＢＨ−Ｐを鋳型とし、配列番号６６に記載のシグナル配列ＢＨ（ＭＫＣＳＷＶＩＦＦＬＬＡＶＶＴＧＶＮＳ）をコードするポリヌクレオチドである配列番号６７（５’−ＡＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＧＧＧＴＣＡＡＴＴＣＡ−３’）に記載の配列からなるポリヌクレオチドをシグナルＤＮＡとし、配列番号６８（５’−ＣＴＡ［ＧＡＡＴＴＣ］ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧ−３’）および配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列）として、表５に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行ない、シグナル配列ＢＨを付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドを増幅した。その後、アガロースゲル抽出による精製を行ない得られたＰＣＲ産物をＢＨｓ−Ｐと命名した。
【００９８】
（３−２）シグナル配列Ｃ（配列番号６９）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチド
（１）で作製したＣＨ−Ｐを鋳型とし、配列番号６９に記載のシグナル配列Ｃ（ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ）をコードするポリヌクレオチドである、配列番号７０（５’−ＡＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣ−３’）に記載の配列からなるポリヌクレオチドをシグナルＤＮＡとし、配列番号７１（５’−ＣＴＡ［ＧＡＡＴＴＣ］ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣ−３’）および配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列）として、（３−１）と同様にＰＣＲおよび精製した。得られたＰＣＲ産物である、シグナル配列Ｃを付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドをＣＨｓ−Ｐと命名した。
【００９９】
（３−３）シグナル配列Ｄ（配列番号７２）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチド
（１）で作製したＤＨ−Ｐを鋳型とし、配列番号７２に記載のシグナル配列Ｄ（ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ）をコードするポリヌクレオチドである、配列番号７３（５’−ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＡＣＴＣＴ−３’）に記載の配列からなるポリヌクレオチドをシグナルＤＮＡとし、配列番号７４（５’−ＣＴＡ［ＧＡＡＴＴＣ］ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣ−３’）および配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列）として、（３−１）と同様にＰＣＲおよび精製した。得られたＰＣＲ産物である、シグナル配列Ｄを付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドをＤＨｓ−Ｐと命名した。
【０１００】
（３−４）シグナル配列Ｅ（配列番号７５）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチド
（１）で作製したＥＨ−Ｐを鋳型とし、配列番号７５に記載のシグナル配列Ｅ（ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ）をコードするポリヌクレオチドである、配列番号７６（５’−ＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＴＣＧ−３’）に記載の配列からなるポリヌクレオチドをシグナルＤＮＡとし、配列番号７７（５’−ＣＴＡ［ＧＡＡＴＴＣ］ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣ−３’）および配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列）として、（３−１）と同様にＰＣＲおよび精製した。得られたＰＣＲ産物である、シグナル配列Ｅを付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドをＥＨｓ−Ｐと命名した。
【０１０１】
（４）各シグナル配列を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドを作製した。
【０１０２】
（４−１）シグナル配列ＢＬ（配列番号７８）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチド
（２）で作製したＢＬ−Ｐを鋳型とし、配列番号７８に記載のシグナル配列ＢＬ（ＭＥＳＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ）をコードするポリヌクレオチドである、配列番号７９（５’−ＡＴＧＧＡＧＴＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＴＧＧＴ−３’）に記載の配列からなるポリヌクレオチドをシグナルＤＮＡとし、配列番号８０（５’−ＣＴＡ［ＧＡＡＴＴＣ］ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＡＧＡＣＡＣ−３’）および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（角かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列）として、（３−１）と同様にＰＣＲおよび精製した。得られたＰＣＲ産物である、シグナル配列ＢＬを付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドをＢＬｓ−Ｐと命名した。
【０１０３】
（４−２）シグナル配列Ｃ（配列番号６９）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチド
（２）で作製したＣＬ−Ｐを鋳型とし、配列番号７０に記載の配列からなる、シグナル配列Ｃ（配列番号６９）をコードするポリヌクレオチドをシグナルＤＮＡとし、配列番号７１および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、（３−１）と同様にＰＣＲおよび精製した。得られたＰＣＲ産物である、シグナル配列Ｃを付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドをＣＬｓ−Ｐとした。
【０１０４】
（４−３）シグナル配列Ｄ（配列番号７２）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチド
（２）で作製したＤＬ−Ｐを鋳型とし、配列番号７３に記載の配列からなる、シグナル配列Ｄ（配列番号７２）をコードするポリヌクレオチドをシグナルＤＮＡとし、配列番号７３および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、（３−１）と同様にＰＣＲおよび精製した。得られたＰＣＲ産物である、シグナル配列Ｄを付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドをＤＬｓ−Ｐとした。
【０１０５】
（４−４）シグナル配列Ｅ（配列番号７５）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチド
（２）で作製したＥＬ−Ｐを鋳型とし、配列番号７６に記載の配列からなる、シグナル配列Ｅ（配列番号７５）をコードするポリヌクレオチドをシグナルＤＮＡとし、配列番号７７および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、（３−１）と同様にＰＣＲおよび精製した。得られたＰＣＲ産物である、シグナル配列Ｅを付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドをＥＬｓ−Ｐとした。
【０１０６】
（５）（３）で作製したＢＨｓ−Ｐ、ＣＨｓ−Ｐ、ＤＨｓ−ＰおよびＥＨｓ−Ｐ、ならびに実施例１で作製したｐＥＦｄを、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、精製した。制限酵素処理したｐＥＦｄに対して、制限酵素処理したＢＨｓ−Ｐ、ＣＨｓ−Ｐ、ＤＨｓ−ＰまたはＥＨｓ−Ｐをライゲーションした。
【０１０７】
（６）（５）で得られたライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、シグナル配列ＢＨを付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む抗体発現ベクターｐＥＦｄ−ＢＨｓＨ、シグナル配列Ｃ（配列番号６９：アズロシジン前駆体の分泌シグナル）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む抗体発現ベクターｐＥＦｄ−ＣｓＨ、シグナル配列Ｄ（配列番号７２：ヒト血清アルブミンの分泌シグナル）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む抗体発現ベクターｐＥＦｄ−ＤｓＨ、ならびにシグナル配列Ｅ（配列番号７５：ヒトＩＬ−２の分泌シグナル）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む抗体発現ベクターｐＥＦｄ−ＥｓＨ、をそれぞれ得た。
【０１０８】
（７）（４）で作製したＢＬｓ−Ｐ、ＣＬｓ−Ｐ、ＤＬｓ−ＰおよびＥＬｓ−Ｐ、ならびに実施例１で作製したｐＥＦｄを、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し精製した。制限酵素処理したｐＥＦｄに対して、制限酵素処理したＢＬｓ−Ｐ、ＣＬｓ−Ｐ、ＤＬｓ−ＰまたはＥＬｓ−Ｐをライゲーションした。
【０１０９】
（８）（７）で得られたライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、シグナル配列ＢＬを付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む抗体発現ベクターｐＥＦｄ−ＢＬｓＬ、シグナル配列Ｃ（配列番号６９：アズロシジン前駆体の分泌シグナル）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む抗体発現ベクターｐＥＦｄ−ＣｓＬ、シグナル配列Ｄ（配列番号７２：ヒト血清アルブミンの分泌シグナル）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む抗体発現ベクターｐＥＦｄ−ＤｓＬ、ならびにシグナル配列Ｅ（配列番号７５：ヒトＩＬ−２の分泌シグナル）を付加した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む抗体発現ベクターｐＥＦｄ−ＥｓＬ、をそれぞれ得た。
【０１１０】
実施例６  抗体発現量比較（その３）
分泌シグナル配列の違いによる抗体発現量の違いを検討した。
【０１１１】
抗体発現ベクターとして、実施例２で作製したｐＥＦｄ−ＡＨｓＨおよびｐＥＦｄ−ＡＬｓＬ、実施例５で作製したｐＥＦｄ−ＢＨｓＨおよびｐＥＦｄ−ＢＬｓＬ、ｐＥＦｄ−ＣｓＨおよびｐＥＦｄ−ＣｓＬ、ｐＥＦｄ−ＤｓＨおよびｐＥＦｄ−ＤｓＬ、ならびにｐＥＦｄ−ＥｓＨおよびｐＥＦｄ−ＥｓＬを用いた他は、実施例３と同様の方法で３日間培養後の抗体の発現量をＥＬＩＳＡにて比較した。
【０１１２】
ＣＨＯ細胞Ｋ１株を宿主に用いたときの結果を図６に、ＣＯＳ細胞を宿主に用いたときの結果を図７に示す。いずれの宿主を用いた場合も、分泌シグナルとしてシグナル配列Ｃ（配列番号６９：アズロシジン前駆体の分泌シグナル）を用いたときが最も抗体発現量が多く、以下、シグナル配列Ｂ（Ｈ鎖：配列番号６６、Ｌ鎖：配列番号７８）、シグナル配列Ａ（Ｈ鎖：配列番号２８、Ｌ鎖：配列番号３１）、シグナル配列Ｄ（配列番号７２：ヒト血清アルブミンの分泌シグナル）、シグナル配列Ｅ（配列番号７５：ヒトＩＬ−２の分泌シグナル）の順に抗体発現量が多かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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