(57)【要約】【課題】霊芝の抽出物に由来するノイラミニダーゼ阻害剤、これを利用した食品、化粧料および医薬品（抗インフルエンザ剤）、ならびに該ノイラミニダーゼ阻害剤の製造方法の提供。【解決手段】霊芝(Ganoderma lingzhi)からの有機系溶媒抽出物もしくはこれに含まれるトリペノイド類、または霊芝からの水系溶媒抽出物を含み、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）の活性を阻害する作用を有するノイラミニダーゼ阻害剤、これを含有する食品、化粧料および医薬品（抗インフルエンザ剤）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊芝(Ganoderma lingzhi)から有機系溶媒または水系溶媒で抽出することにより得られる抽出成分を含むことを特徴とするノイラミニダーゼ阻害剤。
【請求項２】
ノイラミニダーゼ阻害剤の有効成分として前記有機系溶媒の抽出物に含まれるトリペノイド類を含み、
該トリペノイド類が、
ガノデリックアシッドＺ(Ganoderic acid Z)、ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）、ガノデリックアシッドＦ（Ganoderic acid F）、ガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、ガノデリックアシッドＬＭ２（Ganoderic acid LM2）、ガノデリックアシッドＤＭ（Ganoderic acid ＤＭ）、ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、ガノデリックアシッドＤ（Ganoderic acid D）、ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）、ガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）、ガノルシド酸Ａ（Ganolucidic acid A）、ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）、ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）、ガノデロールＡ（Ganoderol A）、ガノデロールＢ（Ganoderol B）、ガノデリオールF（Ganoderiol F）、ルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）、ルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）、ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）、ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）、ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）、ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）、ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）、およびガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）からなる群から選択された１種または２種以上の化合物であることを特徴とする、請求項１に記載のノイラミニダーゼ阻害剤。
【請求項３】
ガノデリックアシッドＺ(Ganoderic acid Z)、ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）、ガノデリックアシッドＦ（Ganoderic acid F）、ガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、ガノデリックアシッドＬＭ２（Ganoderic acid LM2）、ガノデリックアシッドＤＭ（Ganoderic acid ＤＭ）、ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、ガノデリックアシッドＤ（Ganoderic acid D）、ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）、ガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）、ガノルシド酸Ａ（Ganolucidic acid A）、ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）、ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）、ガノデロールＡ（Ganoderol A）、ガノデロールＢ（Ganoderol B）、ガノデリオールF（Ganoderiol F）、ルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）、ルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）、ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）、ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）、ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）、ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）、ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）、およびガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）からなる群から選択された１種または２種以上の該トリペノイド類を含むことを特徴とするノイラミニダーゼ阻害剤。
【請求項４】
前記水系溶媒が熱水であり、前記抽出成分が熱水抽出物であることを特徴とする請求項１に記載のノイラミニダーゼ阻害剤。
【請求項５】
霊芝(Ganoderma lingzhi)から有機系溶媒または水系溶媒で抽出された抽出物（エキス）を、有機系溶媒抽出物（エキス）換算量で、４００μｇ／ｍＬ以上の量で、また、水系溶媒抽出物（エキス）換算量で、１６００μｇ／ｍＬ以上の量で含む請求項１に記載のノイラミニダーゼ阻害剤。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載のノイラミニダーゼ阻害剤を含む、インフルエンザの感染予防あるいは症状の進行の抑制または軽減のための食品(健康補助食品)または抗インフルエンザ剤。
【請求項７】
前記症状が肺炎、急性脳症やライ症候群、心合併症、急性筋炎、中耳炎、結膜炎、副鼻腔炎、心筋炎の予防）である請求項６に記載の抗インフルエンザ剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のノイラミニダーゼ阻害剤を含有する苦味料。
【請求項９】
霊芝(Ganoderma lingzhi) から、有機系溶媒または水系溶媒を用いてノイラミニダーゼ阻害能を有する成分を抽出処理する工程を含むことを特徴とする、抗インフルエンザ作用を有する抗インフルエンザ剤の製造方法。
【請求項１０】
前記水系溶媒が熱水であることを特徴とする請求項９に記載の抗インフルエンザ剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、霊芝(Ganoderma lingzhi)、特にその子実体の抽出物を含有するノイラミニダーゼ阻害剤、これを含有した抗インフルエンザ剤、食品および薬剤、並びにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
霊芝（Ganoderma lingzhi）は、昔から東アジアの国々、特に中国及び日本において健康増進および様々な病気の治療に用いられてきた。
研究により、霊芝（Ganoderma lingzhi）中の主な生理活性成分の一つとして、トリテルペノイドが含まれていることが明らかとなった。ここ数年の単離技術の進歩や最新の分析機器の利用により、霊芝（Ganoderma lingzhi）中から新たに１５０種類以上のトリテルペノイドが発見された。そのうち、５０種類のトリテルペノイドが霊芝（Ganoderma lingzhi）に特有のものであることが分かった。そして、それらトリテルペノイドの生理活性については、大抵、抗腫瘍活性および免疫調節活性に焦点を当てて個別に解析されているに留まる。特許文献１には、せんだん葉エキス粉末、霊芝エキス粉末（熱水抽出物）および霊芝黒焼粉末を所定重量比率で混合したものがインフルエンザ薬として有用であることが開示されている。しかしながら、特許文献１には霊芝、特に有機溶媒で抽出した成分に含まれる化学物質について言及はされていない。したがって、霊芝中のトリテルペノイドの抗ウイルス活性、特に抗インフルエンザウイルス活性については殆ど調べられていない。
【０００３】
さらに、特許文献２には、レイシ属等から得られる五量体プロシアニジンフラボノイド等を有効成分とする抗ウイルス製剤が開示されている。
毎年世界中で成人の５〜１０％、子供の２０〜３０％が季節性のインフルエンザに感染すると言われている。Ａ型のインフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）の２つのコートタンパク質を有し、このうちＨＡは、ヒトの気道等の細胞表面に存在するシアル酸に結合する。この結合により、インフルエンザウイルスが細胞膜に囲われて細胞内に取り込まれ、細胞内にインフルエンザウイルスを内包した小胞（エンドソーム）が形成される。インフルエンザウイルスを内包した小胞内側のｐＨが低下すると、小胞内のインフルエンザウイルスのコートタンパク質部分が小胞の内壁と融合し、インフルエンザウイルスのゲノム部分が細胞内に放出される。その後、該ゲノムに基づいて細胞が有する複製機能が働いて該細胞内でインフルエンザウイルスが大量に生産される。次に、大量生産されたインフルエンザウイルスが該細胞から放出されるが、この際に、該インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）部分が該インフルエンザウイルスのＨＡ部分と該細胞の糖タンパク質のシアル酸類との結合を切断する。この切断により前記インフルエンザウイルスが前記細胞から放出されることから、インフルエンザウイルス表面のノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、ヒトの気道等の細胞からインフルエンザウイルスが放出されるのに必須の酵素である。そのため、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）部分は抗インフルエンザ剤の特別な標的分子とされている。
【０００４】
一般に抗インフルエンザ剤として知られている「リレンザ」（登録商標）や「タミフル」（登録商標）は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）の活性を阻害することによりインフルエンザウイルスがヒトの気道等の(宿主)細胞から放出されるのを阻止することにより、他の細胞や、他のヒトに移りさらに拡散・増殖することを抑える。
【０００５】
もしも、上記「リレンザ」や「タミフル」などと同様に、ノイラミニダーゼの活性を阻害等できる物質（ノイラミニダーゼ阻害剤）が新たに見出されれば、既存の抗インフルエンザ薬に耐性を持つインフルエンザ（例：タミフル耐性のＡソ連型Ｈ１Ｎ１等）に対しても有効性が期待でき、また、例えばタミフル等の公知の抗インフルエンザ剤により副作用が生じる等の特異体質のヒトやそれ以外の動物に対しても使用可能な抗インフルエンザ剤の選択肢が広がり、抗インフルエンザ剤の多様化に寄与する観点からも有益である。したがって、様々な抗インフルエンザ剤が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１３２１号公報
【特許文献２】特表２０１１−５３０６０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、リレンザ（登録商標）やタミフル（登録商標）を用いてインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）活性を阻害した場合の阻害モデルを用いて、霊芝（Ganoderma lingzhi）中に含まれる３３種類のトリテルペノイド類がインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）を阻害するか等を検討したところ、一部のトリテルペノイド類についてＮＡ阻害能を有することを見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、霊芝(Ganoderma lingzhi) 中に含まれるトリテルペノイド類を有効成分として含有し、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）の活性を阻害または抑制することができるノイラミニダーゼ阻害剤、これを含有した抗インフルエンザ剤、食品および薬剤、並びにそれらの製造方法の提供をすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明により、以下のノイラミニダーゼ阻害剤等が提供される。
［１］  霊芝(Ganoderma lingzhi)から有機系溶媒または水系溶媒で抽出することにより得られるトリペノイド類を有効成分として含むことを特徴とするノイラミニダーゼ阻害剤。
【００１０】
［２］  ノイラミニダーゼ阻害剤の有効成分として前記有機系溶媒の抽出物に含まれるトリペノイド類を含み、該トリペノイド類が、下記化合物（１）〜（３３）からなる群から選択された１種または２種以上の化合物であることを特徴とする、［１］に記載のノイラミニダーゼ阻害剤（なお、附番（１）〜（３３）は本発明の説明の便宜上付与した。）。
（１）ガノデリックアシッドＺ(Ganoderic acid Z)、
（３）ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）、
（４）ガノデリックアシッドＦ（Ganoderic acid F）、
（５）ガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、
（６）ガノデリックアシッドＬＭ２（Ganoderic acid LM2）、
（７）ガノデリックアシッドＤＭ（Ganoderic acid DM）、
（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、
（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、
（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、
（１２）ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）、
（１３）ガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）、
（１４）ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）、
（１５）ガノルシド酸Ａ（Ganolucidic acid A）、
（１６）ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）、
（１７）ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）、
（１８）ガノデロールＡ（Ganoderol A）、
（１９）ガノデロールＢ（Ganoderol B）、
（２０）ガノデリオールF（Ganoderiol F）、
（２１）ルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）、
（２２）ルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）、
（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、
（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、
（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、
（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、
（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、
（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）、
（２９）ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）、
（３０）ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）、
（３１）ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）、
（３２）ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）、
（３３）ガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）。
【００１１】
［３］  （１）ガノデリックアシッドＺ(Ganoderic acid Z)、（２）ガノデリックアシッドＮ(Ganoderic acid N)、（３）ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）、（４）ガノデリックアシッドＦ（Ganoderic acid F）、（５）ガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、（６）ガノデリックアシッドＬＭ２（Ganoderic acid LM2）、（７）ガノデリックアシッドＤＭ（Ganoderic acid DM）、（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、（１１）ガノデリックアシッドＤ（Ganoderic acid D）、（１２）ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）、（１３）ガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）、（１４）ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）、（１５）ガノルシド酸Ａ（Ganolucidic acid A）、（１６）ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）、（１７）ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）、（１８）ガノデロールＡ（Ganoderol A）、（１９）ガノデロールＢ（Ganoderol B）、（２０）ガノデリオールF（Ganoderiol F）、（２１）ルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）、（２２）ルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）、（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）、（２９）ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）、（３０）ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）、（３１）ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）、（３２）ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）、（３３）ガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）からなる群から選択された１種または２種以上の該トリペノイド類を含むであることを特徴とするノイラミニダーゼ阻害剤。（［３］では、該トリペノイド類は、霊芝由来のものであるか、合成したものであるかを問わない。）
【００１２】
［４］前記水系溶媒が熱水であり、前記抽出成分が熱水抽出物であることを特徴とする[１]に記載のノイラミニダーゼ阻害剤。
【００１３】
[５] 霊芝(Ganoderma lingzhi)から有機系溶媒または水系溶媒で抽出された抽出物（エキス）を、有機系溶媒抽出物（エキス）換算量で、４００μｇ／ｍＬ以上の量で、また、水系溶媒抽出物（エキス）換算量で、１６００μｇ／ｍＬ以上の量で含む[１]に記載のノイラミニダーゼ阻害剤。
【００１４】
[６][１]〜[５]のいずれかに記載のノイラミニダーゼ阻害剤を含む、インフルエンザの感染予防あるいは症状の進行の抑制または軽減のための食品(健康補助食品)または抗インフルエンザ剤。
【００１５】
［７］  前記症状が肺炎、急性脳症やライ症候群、心合併症、急性筋炎、中耳炎、結膜炎、副鼻腔炎、心筋炎の予防）である[６]に記載の抗インフルエンザ剤。
【００１６】
［８］  [１]〜[５]のいずれかに記載のノイラミニダーゼ阻害剤を含有する苦味料。
【００１７】
［９］  霊芝(Ganoderma lingzhi) から、有機系溶媒または水系溶媒を用いてノイラミニダーゼ阻害作用を有する成分を抽出処理する工程を含むことを特徴とする、抗インフルエンザ作用を有する抗インフルエンザ剤の製造方法。
【００１８】
[１０]  前記水系溶媒が熱水であることを特徴とする[９]に記載の抗インフルエンザ剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、（霊芝(Ganoderma lingzhi)由来あるいは合成した）特定のトリテルペノイド類を有効成分として含有し、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）の活性を阻害または抑制することができるノイラミニダーゼ阻害剤、これを含む抗インフルエンザ剤、食品および薬剤、並びにそれらの効率的な製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ノイラミニダーゼ活性測定の原理を利用したノイラミニダーゼ阻害剤の阻害活性の測定方法の原理を説明した図である。図１においてＭＵＮＡＮＡ（4-メチルウンベリフェリル-N-アセチル-α-D-ノイラミン酸）は、ノイラミニダーゼの作用により蛍光体である４−ＭＵ（４−メチルウンベリフェロン）に変換される。４−ＭＵは、波長３６０ｎｍ付近の紫外光の照射を受けて、波長４５０ｎｍ付近にピークを有する青白い蛍光を発する物質である。生成された４−ＭＵの波長４５０ｎｍの蛍光強度（Ｆ）を定量し、この蛍光強度からノイラミニダーゼ（ＮＡ）の活性を定量することができる。図１の反応系に、阻害剤を添加することで、添加した阻害剤のＮＡ阻害能に応じてノイラミニダーゼの活性が阻害されて上記４−ＭＵの生成量が低減することから、各阻害剤についてノイラミニダーゼに対する阻害能を定量することができる。
【図２】図２（Ａ）および（Ｂ）は、抗インフルエンザ剤（ＮＡ阻害剤）として知られているタミフルについて、ノイラミニダーゼ(Ｈ１Ｎ１)に対する阻害剤濃度（ｎＭ）−阻害率（ＩＲ（％））のグラフを示した図である。図２（Ｂ）の近似式からタミフルのＩＣ50（最大阻害率の半分（５０％）を得るために必要な阻害剤の濃度）は２６０ｎＭであることが分かる。なお、この図２（Ａ）および（Ｂ）は、本発明に係るノイラミニダーゼ阻害剤のＮＡ阻害能とタミフルのＮＡ阻害能とを相対比較するための図である。
【図３】図３は、上記図１の阻害剤として、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１）に対して、（３）ガノデリックアシッドＳ、（９）ガノデリックアシッドＡＭ１、（１３）ガノデリックアシッドＴＮ、（１４）ガノデリックアシッドＴ-Ｑ、（１９）ガノデロールＢ、（２１）ルシルアルデヒドＡ、（２２）ルシルアルデヒドＢ、（２７）ガノデリックアシッドＫ、（２８）ガノデリックアシッドＴＲ、（２９）ガノデレン酸Ａおよび（３０）ガノデレン酸Ｃを各濃度（０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ）で用いた場合に生成される４−ＭＵの蛍光強度（ブランク値を差し引いた蛍光強度、単位：ＲＦＵ）をそれぞれ示した図である。図３によれば、各阻害剤濃度２５μＭから少なくとも２００μＭまでは、上記各阻害剤の濃度と阻害能に正の相関があるといえる(ＮＡ阻害剤の有効成分である霊芝由来の化合物（３）等の濃度が増大するとＮＡ阻害能が高まる。)。なお、図３中、霊芝由来の化合物の濃度が０μＭの場合は、該化合物が無添加であることを意味する。
【図４】図４は、試験例１でＮＡ阻害能の有無を検討した各トリテルペノイド（各化合物（１）〜（３３））を、その骨格構造に基づいて３つのグループに分け、各グループの骨格構造について説明した図である。図４中、例えば、「Δ7,8」のΔは炭素−炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）を意味し、添え字「７，８」は二重結合の存在する炭素（Ｃ）の位置番号を意味する。また、「＋ＣＯＯＨ」「＋ＯＨ」等は、（主要な）官能基の種類を示す。
【図５−１】図５−１（Ａ）は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対するタミフルの結合状態をリボンモデルで表した図である。図５−１（Ａ）では、宿主細胞となる細胞とインフルエンザウイルスとの結合は、細胞のシアル酸部位と、ウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）の結合部位が内在するポケットを含む半径１０オングストロームの球状空間にタミフルが入り込んでいることが示されている。図５−１（Ｂ）は、（Ａ）のノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対するタミフルの結合状態を空間充填モデルで表した図である。
【図５−２】図５−２（Ａ）は、ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１）にガノデリックアシッドＴＲが結合した状態をリボンモデルで表した図である。ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１）は基質が結合する結合部位が内在したポケットを有し、該ポケットを含む半径１０オングストロームの球状空間にガノデリックアシッドＴＲが入り込んでいることが示されている。図５−２（Ｂ）は、図５−２（Ａ）に示したノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１）に対するガノデリックアシッドＴＲの結合状態を空間充填モデルで表した図である。
【図６】図６は、各化合物（１），（３）〜（３３）を図１の阻害剤として終濃度２００μＭ（ガノデリックアシッドＤＭについてのみ終濃度１００μＭ）としてノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１，Ｎ２９５Ｓ）に対してＮＡ阻害能を解析した結果を示す図である。図６は、いずれの化合物についてもＮＡ（Ｈ３Ｎ１、Ｎ２９５Ｓ）に対して阻害能を有することを示している。なお、「Ｎ２９５Ｓ」とは、ノイラミニダーゼの第２９５番目のアスパラギンがセリンに置換されていることを示す。
【図７】図７は、各化合物（１），（３）〜（３３）を図１の阻害剤として終濃度２００μＭ（ガノデリックアシッドＤＭについてのみ終濃度１００μＭ）で用いた場合のノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１）に対する各化合物のＮＡ阻害能を解析した結果を示す図である。図７は、各化合物（１），（３）〜（３３）がノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１）に対して阻害能を有することを示している。
【図８】図８は、各化合物（１），（３）〜（３３）を図１の阻害剤として終濃度２００μＭ（ガノデリックアシッドＤＭについてのみ終濃度１００μＭ）で用いた場合のノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２，Ｅ１１９Ｖ）に対する各化合物のＮＡ阻害能を解析した結果を示す図である。図８は、各化合物（１），（３）〜（３３）がＮＡ（Ｈ３Ｎ２，Ｅ１１９Ｖ）に対して阻害能を有することを示している。
【図９】図９は、各化合物（１），（３）〜（３３）を図１の阻害剤として終濃度２００μＭ（ガノデリックアシッドＤＭについてのみ終濃度１００μＭ）で用いた場合のノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９）に対する各化合物のＮＡ阻害能を解析した結果を示す図である。図９は、各化合物（１），（３）〜（３３）がノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９）に対して阻害能を有することを示している。
【図１０】図１０（Ａ）は、霊芝（Ganoderma lingzhi）のクロロホルム抽出物（前記霊芝をクロロホルムに浸漬して室温3日間振とう抽出し油相から溶媒除去して精製したもの）と熱水抽出物（前記霊芝をオートクレーブ（121℃、20分）による熱水抽出をして抽出液をエバポレータデシケータにて濃縮・乾固したもの）、エタノール抽出物（Ethanol-Ex.；霊芝を９９％エタノールで４８時間振盪抽出後、吸引濾過し、濾液をエバポレータデシケータにて濃縮・乾固したもの）、３０％エタノール抽出物（霊芝粉末を３０％エタノールで４８時間振盪抽出後、吸引濾過し、濾液をエバポレータで濃縮し、濃縮液を凍結乾燥したもの）をそれぞれＤＭＳＯに溶解して各終濃度（０μｇ／ｍＬ，４００μｇ／ｍＬ，８００μｇ／ｍＬ，１６００μｇ／ｍＬ）で図１の阻害剤として用い、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１，Ｎ２９５Ｓ）に対して、ノイラミニダーゼの活性を測定した結果を示す図である。図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）から算出した各抽出物の各濃度における該ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１，Ｎ２９５Ｓ）に対する阻害率を示すグラフである。
【図１１】図１１（Ａ）は、図１０（Ａ）のノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２，Ｎ２９５Ｓ）の代わりにノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２，Ｅ１１９Ｖ）を用いた場合に、ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２，Ｅ１１９Ｖ）の活性がどの程度阻害されるかを調べた結果を示すグラフである。図１１（Ｂ）は、図１１（Ａ）の結果から算出した各抽出物の各濃度における該ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２，Ｅ１１９Ｖ）に対する阻害率を示すグラフである。
【図１２】図１２（Ａ）は、図１０（Ａ）のノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１，Ｎ２９５Ｓ）の代わりにノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１）を用いた場合に、ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１）の活性がどの程度阻害されるかを調べた結果を示すグラフである。図１２（Ｂ）は、図１２（Ａ）の結果から算出した各抽出物の各濃度における該ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１）に対する阻害率を示すグラフである。
【図１３】図１３（Ａ）は、図１０（Ａ）のノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２，Ｎ２９５Ｓ）の代わりノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９）を用いた場合に、ノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９）の活性がどの程度阻害されるかを調べた結果を示すグラフである。図１３（Ｂ）は、図１３（Ａ）の結果から算出した各抽出物の各濃度における該ノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９）に対する阻害率を示すグラフである。
【図１４】図１２（Ａ）〜（Ｄ）は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）の活性部位のポケットと公知の薬剤の化学構造の各部位との相互作用を説明した概念図である。いずれも公知の薬剤のカルボキシル基やグアニジン基等がポケットに臨むノイラミニダーゼの部位と相互作用していることがわかる。
【図１５】図１５は、霊芝（Ganoderma lingzhi）のクロロホルム抽出物（前記霊芝をクロロホルムに浸漬して室温3日間振とう抽出し油相から溶媒除去して精製したもの）と熱水抽出物（前記霊芝をオートクレーブ（121℃20分）による熱水抽出をして抽出液を乾燥したもの）とをＤＭＳＯに溶解して各終濃度（０μｇ／ｍＬおよび１６００μｇ／ｍＬ）で図１の阻害剤として用い、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１）を用いて、ＮＡ活性の測定をした結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、ノイラミニダーゼ阻害剤、これを含有した抗インフルエンザ剤、食品および薬剤、並びにそれらの製造方法、ならびに上述したノイラミニダーゼ阻害剤の有効成分としての霊芝トリペノイド化合物とその物性、効果および用途等について説明する。
【００２２】
《ノイラミニダーゼ阻害剤（ＮＡ阻害剤）》
本発明に係るノイラミニダーゼ阻害剤（ＮＡ阻害剤）は、霊芝(Ganoderma lingzhi)から有機系溶媒または水系溶媒で抽出することにより得られる抽出成分を含むものを含む。また、前記抽出成分にはノイラミニダーゼを阻害する作用を有するトリテルペノイド類（化合物（１）〜（３３）（後述））が含まれているので、本発明に係るノイラミニダーゼ阻害剤（ＮＡ阻害剤）には、これら化合物（１）〜（３３）のいずれか１種または２種以上を含むものも含まれる。
【００２３】
（抽出）
抽出素材としての霊芝(Ganoderma lingzhi)は、採取した霊芝をそのまま原料として用いてもよいが、抽出効率等の点からは、採取した天然物(霊芝)を乾燥、破砕等の加工処理に供して調製したものが好ましい。前記抽出素材を粉砕する場合、ロール式粉砕機、フードプロセッサー、ボールミル粉砕機、またはハンマー式粉砕機等による粉砕を例示することができる。
【００２４】
（抽出溶媒）
抽出用の有機系溶媒は、ノイラミニダーゼを阻害する作用を有する、霊芝のトリテルペノイド類等の成分を効率よく抽出する観点から、該溶媒として有機溶媒を１０％以上含有する溶媒が好ましく、有機溶媒を５０％以上含有する溶媒（有機系溶媒）がさらに好ましい。なお、有機系溶媒中に含まれる有機溶媒の量は、溶媒全量に対して、通常１０％以上、さらには３０〜９９％程度であることが望ましい。
【００２５】
前記有機系溶媒の例としては、ハロゲン化アルキル（例：クロロホルム等）、アルコール類（例：メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等、Ｃ1〜10程度の1価の脂肪族アルコール、あるいはエチレングリコールやグリセリンなどの多価アルコール）、炭化水素（例：ｎ−ヘキサンなど、Ｃ1〜10程度の脂肪族炭化水素）、エーテル（例：ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジエチルエーテル等の式「Ｒ1−Ｏ−Ｒ2(Ｒ1、Ｒ2はＣ1〜5程度のアルキル基）」で示される鎖状エーテル；フラン、ジベンゾフラン、テトラヒドロフラン等の脂肪族又は芳香族系の環状エーテル；エステル（例：酢酸エチル等、1価〜多価カルボン酸のＣ１〜５程度のアルキルエステル）の有機溶媒；又は水とこれらの有機溶媒との混合物を挙げることができる。
【００２６】
特に、前記アルコール類としてメタノール、エタノール、イソプロピルアルコールが好ましいが、抽出成分中に残存しても人体に悪影響が少ない観点からエタノールまたは含水エタノールが特に好ましい。含水エタノールとしては、例えば、エタノール濃度が５〜９９.5％の含水エタノールを用いることができる。
【００２７】
抽出用の水系溶媒として、ノイラミニダーゼの活性を阻害することができる抽出物が好適に得られる観点から、例えば、水、緩衝液（例えばＰＢＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、３０％〜５０％エタノール水溶液等を挙げることができる。
【００２８】
ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１，Ｎ２９５Ｓ）の阻害剤を調製するための好適な抽出溶媒としては、ＮＡ阻害能の高い粗精製物が得られる観点から、好ましい順に、９９％〜５０％エタノール、熱水｛例えば、圧力０．１〜１０気圧、温度９０℃〜２００℃、時間１分〜１００)分間にわたり、水蒸気及び／又はお湯で加熱・加圧。以下同様。｝、５０％〜１％エタノール、クロロホルム等を挙げることができる。
【００２９】
ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２，Ｅ１１９Ｖ）の阻害剤を調製するための好適な抽出溶媒としては、ＮＡ阻害能の高い粗精製物が得られる観点から、好ましい順に、９９％〜５０％エタノール、熱水（上記熱水の条件と同じ。）、クロロホルム、５０％〜１％エタノール等を挙げることができる。
【００３０】
ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１）の阻害剤を調製するための好適な抽出溶媒としては、ＮＡ阻害能の高い粗精製物が得られる観点から、好ましい順に、クロロホルム、熱水（上記熱水の条件と同じ。）、９９％〜５０％エタノール、５０％〜１％エタノール等を挙げることができる。
【００３１】
ノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９）の阻害剤を調製するための好適な抽出溶媒としては、ＮＡ阻害能の高い粗精製物が得られる観点から、好ましい順に、９９％〜５０％エタノール、５０％〜１％エタノール、熱水（上記熱水の条件と同じ。）、クロロホルム等を挙げることができる。
【００３２】
（抽出処理）
抽出処理は、特に制限されないが、例えば、山野より採取した天然物や人工栽培の霊芝を、必要に応じて乾燥または粉砕した後、抽出溶媒に浸漬し放置することにより所望の成分を抽出する浸漬法（冷浸法、温浸法）、及びソックスレー抽出器を用いた加熱還流によるソックスレー抽出法等の公知の抽出法を適用することができる。このように抽出された抽出液は、必要に応じて、例えばスプレードライ法等により溶媒を蒸発させて濃縮または乾固してもよく、固体又はその粉末の形態として調製することができる。
【００３３】
抽出温度は、霊芝からＮＡ阻害剤の有効成分を抽出させることができ、用いられる抽出溶媒が凍結・固化しない限り特に制限はなく、有機系溶媒による抽出の場合は例えば０℃〜１００℃である。水系溶媒の場合は、例えば３０℃〜１２５℃、好ましくは８０℃〜１２５℃、最も好ましくは１２１℃前後（１１５℃〜１２５℃）である。
【００３４】
また、抽出時間は、所望の成分（前記トリペノイド類）を抽出できれば特に制限はなく例えば１時間〜３日間である。抽出処理の圧力も、特に制限はなく、例えば常圧〜５気圧である。
【００３５】
また、有機系溶媒または水系溶媒の抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相分取液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などの各種クロマトグラフィーに供して分画操作を繰り返し、抽出成分の含有量及び純度を高めてもよい。
【００３６】
（抽出成分）
霊芝(Ganoderma lingzhi)から上記有機系溶媒または水系溶媒で抽出することにより得られる成分(霊芝有機系溶媒抽出物)として下記トリペノイド類（化合物（１）〜（３３））が含まれる。これらのトリテルペノイド類が抽出物に含まれていることは、例えばＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（島津製作所「ＬＣＭＳ−２０２０」）等を用いたＬＣＭＳ分析(液体クロマトグラフ質量分析)により確認することができる。
【００３７】
本発明者らは、これらのトリペノイド類の化合物（１）〜（３３）について阻害能に高低はあるものの、少なくとも各種のノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１型、Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）型、Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型、Ｈ５Ｎ１型、Ｈ７Ｎ９型）に対して阻害作用を有することを見出している。
【００３８】
したがって、本発明に係るノイラミニダーゼ阻害剤（ＮＡ阻害剤）には、上記水系溶媒（熱水、５０％未満〜０．１％以上エタノール等）または有機系溶媒（９９％〜５０％エタノール、クロロホルム等）で抽出した抽出物を含むもの、さらには、化合物（１）〜（３３）からなる群から選択されたいずれか１種または２種以上を含むものが含まれる。
【００３９】
ここで、ノイラミニダーゼの種類（Ｈ１Ｎ１等の型）によって、各抽出物や各化合物のＮＡ阻害能が異なることから、各種類のノイラミニダーゼに対して好適な有効成分としての粗抽出物や化合物も異なる（表４、図６〜図１３参照：ＩＣ50値、ＲＦＵ値がより低い化合物ほどＮＡ阻害能がより高いことを示す）。
【００４０】
《ＮＡ（Ｈ１Ｎ１型》
インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１型）はヒトまたは豚に感染するインフルエンザとして知られている。このインフルエンザ由来のノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１型）に対して阻害作用するNA阻害剤としては、熱水抽出物またはクロロホルム抽出物のいずれかを１６００μｇ／ｍL以下含むものを例示することができる。
【００４１】
また、このインフルエンザ由来のノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１型）に対して好適なＮＡ阻害剤または抗インフルエンザ剤としては、ＮＡ阻害活性を有する観点から（図３、表３〜表５参照）、有効成分として、好ましくは、ガノデリックアシッドＳ（３）、ガノデリックアシッドＡＭ１（９）、ガノデリックアシッドＢ（１０）、ガノデリックアシッドＴ-Ｎ（１３）、ガノデリックアシッドＴ-Ｑ（１４）、ガノデロールＢ（１９）、ルシルアルデヒドＡ（２１）、ルシルアルデヒドＢ（２２）、ガノデリックアシッドＣ１（２３）、ガノデリックアシッドＣ６（２５）、ガノデリックアシッドＨ（２６）、ガノデリックアシッドＫ（２７）、ガノデリックアシッドＴＲ（２８）、ガノデリン酸Ｃ（３０）、ガノデリン酸Ｄ（３１）、ガノデレン酸Ｆ（３２）およびガノデレン酸Ｈ（３３）からなる群から選択される１種または２種を含有するＮＡ阻害剤または抗インフルエンザ剤が挙げられる。
【００４２】
さらに好ましくは前記ＩＣ５０値が１００μＭ以下となる化合物（１４）および（２７）からなる群から選択される１種または２種を含有するＮＡ阻害剤または抗インフルエンザ剤が挙げられる。
【００４３】
《ＮＡ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）型》
インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）型）はヒトまたは豚に感染しタミフル耐性のインフルエンザウイルスとして知られている。このインフルエンザ由来のノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１（N２９５S）型）に対して阻害作用するNA阻害剤としては、好ましい順に霊芝からのエキス抽出に用いた液のエタノール濃度が９９％以下〜５０％以上のエタノール抽出物(以下、単に、「９９％以下〜５０％以上のエタノール抽出物」ともいう。他の濃度でも同様。)、霊芝からのエキス抽出に用いた液のエタノール濃度が５０％未満〜３０％以上のエタノール抽出物、熱水抽出物、クロロホルム抽出物が挙げられるが、これらのいずれか１種または２種以上を、好ましくは４００μｇ／ｍL以上〜１６００μｇ／ｍL以下、より好ましくは８００μｇ／ｍL以上〜１６００μｇ／ｍL以下含むものを例示することができる（図１０参照）。
【００４４】
このインフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ））に対して好適なＮＡ阻害剤または抗インフルエンザ剤としては、各化合物の２００μＭの阻害率（％）（後述）の高さの観点から、好ましくは、有効成分として、該阻害率が３０％以上のガノデリックアシッドＳ（３）、ガノデリックアシッドＴＱ（１４）およびガノデリックアシッドＴＲ（２８）からなる群から選択される１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤または抗インフルエンザ剤が挙げられ、より好ましくは前記阻害率が４０％以上となるガノデリックアシッドＴＱ（１４）およびガノデリックアシッドＴＲ（２８）からなる群から選択された１種または２種を含有するＮＡ阻害剤または抗インフルエンザ剤が挙げられる（表１０参照）。
【００４５】
《ＮＡ（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型》
インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２（E１１９Ｖ）型）は、主にヒトや豚に感染するタミフル耐性のインフルエンザウイルスとして知られている。
【００４６】
このインフルエンザ由来のノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２（E１１９Ｖ）型）に対して阻害作用するNA阻害剤としては、好ましい順に霊芝からのエキス抽出に用いた液のエタノール濃度が９９％以下〜５０％以上のエタノール抽出物、熱水抽出物、霊芝からのエキス抽出に用いた液のエタノール濃度が５０％未満〜３０％以上のエタノール抽出物、クロロホルム抽出物のいずれか１種または２種以上を、好ましくは４００μｇ／ｍL以上〜１６００μｇ／ｍL以下、より好ましくは８００μｇ／ｍL以上〜１６００μｇ／ｍL以下含むものを例示することができる（図１１参照）。
【００４７】
上記ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型）に対するＮＡ阻害剤または抗インフルエンザ剤としては、各化合物の２００μＭの阻害率（％）の高さの観点から、好ましくは、有効成分として、該阻害率が何れも３０％以上であるガノデリックアシッドＳ（３）、ガノデリックアシッドＡ（８）、ガノデリックアシッドＡＭ１（９）、ガノデリックアシッドＢ（１０）、ガノデリックアシッドＴＮ（１３）、ガノデリックアシッドＴＱ（１４）、ガノデリンマノンジオール（１７）、ルシルアルデヒドＢ（２２）、ガノデリックアシッドＣ１（２３）、ガノデリックアシッドＣ２（２４）、ガノデリックアシッドＫ（２７）、ガノデリックアシッドＴＲ（２８）、ガノデリン酸Ｃ（３０）、ガノデリン酸Ｄ（３１）、およびガノデリン酸Ｈ（３３）からなる群から選択される１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤または抗インフルエンザ剤が挙げられる。より好ましくは、前記阻害率が何れも４０％以上であるガノデリックアシッドＳ（３）、ガノデリックアシッドＴ-Ｎ（１３）、ガノデリックアシッドＴ-Ｑ（１４）、ルシルアルデヒドＢ（２２）、ガノデリックアシッドＣ２（２４）およびガノデリックアシッドＴＲ（２８）からなる群から選択された１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤または抗インフルエンザ剤が挙げられる。特に好ましくは、前記阻害率が何れも５０％以上であるガノデリックアシッドＴＱ（１４）およびガノデリックアシッドＴＲ（２８）からなる群から選択された１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤または抗インフルエンザ剤が挙げられる（表１０参照）。
【００４８】
《ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１型）》
インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１型）はトリ、ヒト、その他多くの動物においてインフルエンザを引き起こすものである。
【００４９】
このインフルエンザ由来のノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１型）に対して阻害作用するNA阻害剤としては、好ましい順に、霊芝からのエキス抽出に用いた液のエタノール濃度が９９％以下〜５０％以上のエタノール抽出物、霊芝からのエキス抽出に用いた液のエタノール濃度が５０％未満〜３０％以上のエタノール抽出物、熱水抽出物、クロロホルム抽出物が挙げられ、これらのうちのいずれか１種または２種以上を、好ましくは４００μｇ／ｍL以上〜１６００μｇ／ｍL以下、より好ましくは８００μｇ／ｍL以上〜１６００μｇ／ｍL以下含むものが例示することができる（図１２参照）。
【００５０】
このインフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１型）に対するＮＡ阻害剤または抗インフルエンザ剤としては、各化合物の２００μＭの阻害率（％）の高さの観点から、好ましくは、該阻害率が何れも３０％以上である、ガノデリックアシッドＳ（３）、ガノデリックアシッドＦ（４）、ガノデリックアシッドＬＭ２（６）、ガノデリックアシッドＤＭ（７）、ガノデリックアシッドＡ（８）、ガノデリックアシッドＡＭ１（９）、ガノデリックアシッドＹ（１２）、ガノデリックアシッドＴＮ（１３）、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）、ガノルシド酸Ａ（１５）、ガノデルマノントリオール（１６）、ガノデルマノンジオール（１７）、ガノデロールＡ（１８）、ガノデロールＢ（１９）、ガノデリオールＦ（２０）、ルシアルデヒドＡ（２１）、ルシアルデヒドＢ（２２）、ガノデリックアシッドＣ１（２３）、ガノデリックアシッドＣ２（２４）、ガノデリックアシッドＨ（２６）、ガノデリックアシッドＫ（２７）、ガノデリックアシッドＴＲ（２８）、ガノデレン酸Ａ（２９）、ガノデレン酸Ｃ（３０）、ガノデレン酸Ｄ（３１）、ガノデレン酸Ｆ（３２）、ガノデレン酸Ｈ（３３）からなる群から選択された１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤、抗インフルエンザ剤が挙げられる。より好ましくは、前記阻害率がいずれも４０％以上である上記化合物（３）、（４）、（６）、（７）、（９）、（１２）、（１３）〜（１９）、（２１）〜（２４）、（２６）〜（２８）、（３１）〜（３３）からなる群から選択された１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤が挙げられる。さらに好ましくは、阻害率が何れも５０％以上となる上記化合物（３）、（６）、（７）、（９）、（１２）〜（１９）、（２１）〜（２４）、（２６）〜（２８）、（３１）〜（３３）からなる群から選択された１種または２種以上を有効成分として含有するＮＡ阻害剤、抗インフルエンザ剤が挙げられる（表１０参照）。
【００５１】
同様に、阻害率６０％以上，７０％以上，８０％以上の各グループに含まれる化合物の１種または２種以上を有効成分として含有するＮＡ阻害剤、抗インフルエンザ剤が好ましいが、特に阻害率９０％以上の非常に強力なＮＡ阻害能を有する化合物（ガノデリックアシッドＴＮ（１３）、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）、ガノデリックアシッドＴＲ（２８）からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含むＮＡ阻害剤、抗インフルエンザ剤が、公知の抗インフルエンザ剤（タミフル）に匹敵する程度にインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１型）に対して有効であり、望ましいことが分かる（表１０参照）。
【００５２】
（４）ノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９型）に対する阻害能
インフルエンザウイルス(H7N9型)は、主として鳥に感染し、中国においてヒトに感染したとの報告がされているウイルスである。このインフルエンザ由来のノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９型）に対して阻害作用するNA阻害剤としては、好ましい順に霊芝からのエキス抽出に用いた液のエタノール濃度が９９％以下〜５０％以上のエタノール抽出物、霊芝からのエキス抽出に用いた液のエタノール濃度が５０％未満〜３０％以上のエタノール抽出物、熱水抽出物、クロロホルム抽出物が挙げられ、これらのうちのいずれか１種または２種以上を、好ましくは４００μｇ／ｍL以上〜１６００μｇ／ｍL以下、より好ましくは８００μｇ／ｍL以上〜１６００μｇ／ｍL以下含むものが例示することができる（図１３参照）。
【００５３】
上記ノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９型）に対するＮＡ阻害剤または抗インフルエンザ剤としては、各化合物の２００μＭの阻害率（％）の高さの観点から、好ましくは、阻害率（％）が何れも２０％以上となるガノデリックアシッドＳ（３）、ガノデリックアシッドＤＭ（７）、ガノデリックアシッドＴＮ（１３）、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）、ガノデルマノンジオール（１７）、ガノデロールＢ（１９）、ガノデリオールＦ（２０）、ルシルアルデヒドＡ（２１）、ルシルアルデヒドＢ（２２）、ガノデリックアシッドＣ１（２３）、ガノデリックアシッドＣ２（２４）、ガノデリックアシッドＣ６（２５）、ガノデリックアシッドＨ（２６）、ガノデリックアシッドＫ（２７）、ガノデリックアシッドＴＲ（２８）、ガノデレン酸（２９）、ガノデレン酸Ｃ（３０）、ガノデレン酸Ｄ（３１）、ガノデレン酸Ｆ（３２）およびガノデレン酸Ｈ（３３）からなる群から選択されたいずれか１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤、抗インフルエンザ剤が挙げられる。より好ましくは、前記阻害率（％）が何れも３０％を超える有効成分として、ガノデリックアシッドＳ（３）、ルシルアルデヒドＢ（２２）、ガノデレン酸Ｄ（３１）、ガノデレン酸Ｆ（３２）およびガノデレン酸（３３）からなる群から選択された１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤、抗インフルエンザ剤が挙げられる。
【００５４】
これらのトリテルペノイド類の化合物は、霊芝由来の化合物として各メーカー(Quality Phytochemicals LLC，American Custom Chemicals Corporation，AK scientific，BOC Sciences，Cheminstock，Chromadex，ChemFaces、BioBioPha 等)により市販されているため、これを購入して用いてもよい。また、これらのトリテルペノイド類の化合物は、霊芝由来に限定されず、合成物でもよい。
【００５５】
【化１】
2019163292.tif 000002
（１）ガノデリックアシッドＺ(Ganoderic acid Z)、
【００５６】
【化２】
2019163292.tif 000003
（２）ガノデリックアシッドＮ(Ganoderic acid N)、
【００５７】
【化３】
2019163292.tif 000004
（３）ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）
【００５８】
【化４】
2019163292.tif 000005
（４）ガノデリックアシッドＦ（Ganoderic acid F）
【００５９】
【化５】
2019163292.tif 000006
（５）ガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、
【００６０】
【化６】
2019163292.tif 000007
（６）ガノデリックアシッドＬＭ２（Ganoderic acid LM2）
【００６１】
【化７】
2019163292.tif 000008
（７）ガノデリックアシッドＤＭ（Ganoderic acid ＤＭ）
【００６２】
【化８】
2019163292.tif 000009
（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）
【００６３】
【化９】
2019163292.tif 000010
（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）
【００６４】
【化１０】
2019163292.tif 000011
（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）
【００６５】
【化１１】
2019163292.tif 000012
（１１）ガノデリックアシッドＤ（Ganoderic acid D）
【００６６】
【化１２】
2019163292.tif 000013
（１２）ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）
【００６７】
【化１３】
2019163292.tif 000014
（１３）ガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）
【００６８】
【化１４】
2019163292.tif 000015
（１４）ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）
【００６９】
【化１５】
2019163292.tif 000016
（１５）ガノルシド酸Ａ（Ganolucidic acid A）
【００７０】
【化１６】
2019163292.tif 000017
（１６）ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）
【００７１】
【化１７】
2019163292.tif 000018
（１７）ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）
【００７２】
【化１８】
2019163292.tif 000019
（１８）ガノデロールＡ（Ganoderol A）
【００７３】
【化１９】
2019163292.tif 000020
（１９）ガノデロールＢ（Ganoderol B）
【００７４】
【化２０】
2019163292.tif 000021
（２０）ガノデリオールF（Ganoderiol F）
【００７５】
【化２１】
2019163292.tif 000022
（２１）ルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）
【００７６】
【化２２】
2019163292.tif 000023
（２２）ルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）
【００７７】
【化２３】
2019163292.tif 000024
（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）
【００７８】
【化２４】
2019163292.tif 000025
（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）
【００７９】
【化２５】
2019163292.tif 000026
（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）
【００８０】
【化２６】
2019163292.tif 000027
（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）
【００８１】
【化２７】
2019163292.tif 000028
（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）
【００８２】
【化２８】
2019163292.tif 000029
（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）
【００８３】
【化２９】
2019163292.tif 000030
（２９）ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）
【００８４】
【化３０】
2019163292.tif 000031
（３０）ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）
【００８５】
【化３１】
2019163292.tif 000032
（３１）ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）
【００８６】
【化３２】
2019163292.tif 000033
（３２）ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）
【００８７】
【化３３】
2019163292.tif 000034
（３３）ガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）
【００８８】
（塩、エステル）
（霊芝より抽出した、あるいは合成した）化合物（１）〜（３３）をアルコールと反応させてエステル化したり、または塩基と反応させて塩を形成してもよい。これら化合物（１）〜（３３）のエステルとして、メチルエステル等、炭素数１〜１１を有する直鎖または分岐状のアルキルエステルを挙げることができる。これら化合物（１）〜（３３）の塩としては、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。
【００８９】
本発明に係るノイラミニダーゼ阻害剤に含まれる有効成分の濃度は、インフルエンザウイルスが感染する部位（罹患部位）であるところの咽喉（上気道）の粘膜上皮細胞にノイラミニダーゼ阻害剤が達したときにＮＡ阻害剤中の上記有効成分の濃度が各種のノイラミニダーゼを阻害しうる濃度であることを限度として特に制限されず、例えば、喉等の上記上皮細胞における有効成分の濃度が０．１〜２００μＭとなるように、ノイラミニダーゼ阻害剤１００重量％中、剤型、用法、用量に合わせて０．１〜１００重量％の範囲から適宜設定することができる。
【００９０】
例えば、霊芝(Ganoderma lingzhi)由来の各種の抽出物（霊芝からのエキス抽出に用いた液のエタノール濃度が９９％のエタノール抽出物、熱水抽出物、３０％エタノール抽出物、クロロホルム抽出物）を有効成分として含有するＮＡ阻害剤の場合、インフルエンザウイルスが感染しうる咽喉部の粘膜細胞において１〜１６００μｇ／ｍＬの濃度となるように調製されたＮＡ阻害剤や抗インフルエンザ剤を例示することができる。ここで、例えば、唾液などにより有効成分濃度が希釈されてしまう場合には、希釈された後の濃度が１〜１６００μｇ／ｍＬの濃度となるように調製してもよい。具体的には、唾液などで粘膜に到達したときに有効成分の濃度が１／２となる場合には、例えば上記上皮細胞での濃度となるように調製する場合２〜３２００μｇ／ｍＬの濃度で上記抽出物のいずれか１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤や抗インフルエンザ剤を例示することができる。
【００９１】
（ノイラミニダーゼ阻害剤の評価）
従来、タミフル（登録商標）（オセルタミビル）、リレンザ（登録商標、別名：ザナミビル）、ラピアクタ（ペラミビル）、ラニナミビルの各種ノイラミニダーゼ阻害剤が存在し、タミフルは下記化学構造（Ａ１）を有し、リレンザは下記化学構造（Ａ２）を有し、ザナミビルは下記化学構造（Ａ３）を有し、ラニナミビルは下記化学構造（Ａ４）を有する。
【００９２】
タミフル（登録商標）は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）の活性部位に結合して新たな疎水性のポケットを形成し、該ノイラミニダーゼ（ＮＡ）が基質と結合しようとした際に、両分子の疎水基同士の親和性により結合することでノイラミニダーゼの活性を阻害する。一方、リレンザ、ベラミビルまたはラニナミビルは、その化学構造にカルボキシル基とグリセロールを有するだけでなく、グアニジン基［H2N-C(=NH)-NH-］を有する。タミフル等にはグアニジン基があるが、このグアニジン基は、インフルエンザウイルスが持っているノイラミニダーゼ（ＮＡ）と電気的に結合し、ＮＡの構造変化を起こさずに酵素活性を阻害する。この電気的結合の際には、上記タミフルのグアニジン基は、ＮＡのポケットの底に存在する活性部位にあり、負に荷電したアミノ酸残基と電気的に結合している（図１４）。
【００９３】
従って、ノイラミニダーゼの阻害性能は、（i）阻害剤分子中に活性中心の各部位と相互作用しうる化学構造を有しているか（ドッキングスコア値のエネルギー値等）、（ii）ＩＣ50値で判断することができる。
【００９４】
【化３４】
2019163292.tif 000035
【００９５】
【化３５】
2019163292.tif 000036
【００９６】
【化３６】
2019163292.tif 000037
【００９７】
【化３７】
2019163292.tif 000038
【００９８】
（トリテルペノイドの構造）
本発明に係るＮＡ阻害剤の有効成分としてのＮＡ阻害能を有するトリテルペノイド類（化合物（１）〜（３３））のうちの多くはカルボキシル基を有しており（後述）、このカルボキシル基は公知のＮＡ阻害剤のカルボキシル基に相当する官能基として機能している可能性が高い。また、化合物（１）〜（３３）のステロイド骨格の疎水性化学構造部分が、タミフルの疎水基に相当する化学構造部分として機能している可能性もある。
【００９９】
また、化合物（１）〜（３３）は、ステロイド骨格を基本骨格とする分子であるが、分子サイズが公知のＮＡ阻害剤と同程度であり、構造活性相関解析（Streucute-activity relationship analysis；ＳＡＲ）の結果、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）、ガノデリックアシッドＴＲ（２８）については、各種のインフルエンザウイルス（H1N1,H3N2,H5N1,H7H9,H1N1(N295S)）のノイラミニダーゼドッキングスコア（Kcal/mol）がタミフル等の公知のＮＡ阻害剤と同様にマイナスの値となったことから、少なくともガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）、ガノデリックアシッドＴＲ（２８）は、いずれの種類のノイラミニダーゼの活性中心のポケットの中にポケットと衝突をせずに入り込むことができるものである（表１２参照）。
【０１００】
ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）やガノデリックアシッドＴＲ（２８）は、公知のＮＡ阻害剤（タミフル等）の代替品となりうる程度のＮＡ阻害能を有している。ＮＡ阻害能の指標であるＩＣ５０値について、ガノデリックアシッドＴ−Ｑを公知のＮＡ阻害剤であるタミフルと比べると、ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１）に対してはタミフルの１２０倍程度、ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１，Ｎ２９５Ｓ）に対しては２０倍前後、ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２，Ｅ１１９Ｖ）に対しては１４．５倍、ノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９）に対しては４２０倍以上であり、タミフルと比べてやや劣る程度である。驚くべきことに、ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１）に対しては、ガノデリックアシッドＴ−ＱのＩＣ５０値がタミフルのＩＣ５０値の０．５１倍であり、ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１）に対しては、ガノデリックアシッドＴ−Ｑはタミフルを上回るＮＡ阻害能を有している。
【０１０１】
一方、ＩＣ５０値について、ガノデリックアシッドＴ−Ｒを公知のＮＡ阻害剤であるタミフルと比べると、ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１）に対してはタミフルの１７７倍程度、ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１，Ｎ２９５Ｓ）に対してはタミフルの２０倍前後、ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２，Ｅ１１９Ｖ）に対してはタミフルの１１．３倍程度、ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１）に対してはタミフルの６倍程度であり、ノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９）に対してはタミフルの４２５倍以上、タミフルと比べてやや劣る程度である。
【０１０２】
よって、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）やガノデリックアシッドＴ−Ｒ（２８）はタミフル等の代替品として使用できる程度のＮＡ阻害能を有している。
また、図６〜９に示すように、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）やガノデリックアシッドＴＲ（２８）以外の他のトリテルペノイド類（化合物（１）〜（１３）、（１５）〜（２７）、（２９）〜（３３））もＮＡ阻害能に高低はあるものの、公知のＮＡ阻害剤（タミフル等）の代替品として使用しうるトリテルペノイド類であることが分かる。
【０１０３】
したがって、このようなトリテルペノイド類を有効成分として含む本発明に係るＮＡ阻害剤は、タミフル等と同様にノイラミニダーゼ（NA）の阻害活性を有し、抗インフルエンザ剤として非常に有用である。
【０１０４】
【表１】
2019163292.tif 000039
【０１０５】
上述したように、本発明に係るＮＡ阻害剤は抗インフルエンザ剤として有用であることから、公知の抗インフルエンザ剤の多様化に寄与している。この抗インフルエンザ剤の多様化は、公知の抗インフルエンザ剤に耐性のインフルエンザウイルスが蔓延したときに非常に有利となる。実際、オセタミフルやベラミビルの公知の抗インフルエンザ剤（ＮＡ阻害剤）に対して薬剤耐性を有するインフルエンザウイルスが報告されている（下記表参照、ＮＩＩＤ；「抗インフルエンザ剤耐性株サーベイランス 2014年7月11日」より引用）。
【０１０６】
仮に、下記表１の公知の抗インフルエンザ剤の全てまたは多くのものに耐性のインフルエンザウイルスが出現した場合、公知の抗インフルエンザ剤では質的および／または量的に対処できなくなる。また、公知の抗インフルエンザ剤により副作用が顕著に生じてしまう体質等、特異体質のヒトやそれ以外の動物に対しても使用可能な抗インフルエンザ剤の選択肢の拡大にも寄与できる。それらの意味でも、本発明に係るＮＡ阻害剤は、インフルエンザ剤の選択肢の多様化に貢献している点で非常に意義がある。
【０１０７】
【表２】
2019163292.tif 000040
【０１０８】
（阻害率）
本発明に係る抗インフルエンザ剤（ＮＡ阻害剤）のノイラミニダーゼに対する阻害率は、従来公知の方法により測定することができる。該阻害率は、ノイラミニダーゼの活性を測定する反応系に阻害剤を加えることにより、本来のノイラミニダーゼの活性がどの程度低下したかで表すことができる。
【０１０９】
ノイラミニダーゼ活性の測定方法自体は、例えば、図１において阻害剤を除いて行う測定方法をＮＡ活性測定の方法として例示することができる。この例示の方法によれば、ノイラミニダーゼが基質としての４−ＭＵＮＡＮＡ（メチルウンバリフェリ-α-D-N-アセチルノイラミン酸）を加水分解して4-メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を生成する。ここで、生成される4-メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）は波長365nmで励起されて波長450nmの蛍光を発する物質であるため、４−ＭＵの生成量を光学的に定量することによりノイラミニダーゼ（ＮＡ）の活性を定量することができる。なお、このときの活性の量は前記生成された４−ＭＵ全量の相対蛍光強度（ＲＦＵ）として表すことができる。ここで、４−ＭＵ以外の図１の反応系に含まれる他の化合物からも４５０ｎｍの波長の光を僅かに発する場合もあり、これがノイズとして含まれることもあることから、上記相対蛍光強度（ＲＦＵ）からバックグラウンドのノイズの蛍光量を差し引くことが望ましい。
【０１１０】
ここで、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）の活性測定の反応系にＮＡ阻害剤を加えると４−ＭＵの生成量が低下することから、生成される４−ＭＵ由来の相対蛍光強度（ＲＦＵ）も低下する。したがって、ＮＡ阻害剤が全く存在しない本来のノイラミニダーゼの活性の量に対して、ＮＡ阻害剤の添加により低下したノイラミニダーゼ活性の量を求めることで、本来のノイラミニダーゼの活性が阻害剤の添加によりどの程度低下したか割合（％）として表すことができ、これが阻害率（ＩＲ（％））となる。なお、下記式[I]では、各ＲＦＵが、バックグラウンドのノイズの蛍光量を差し引いたものとして表されている。
【０１１１】
【数１】
2019163292.tif 000041
上述したノイラミニダーゼ（NA)の活性測定には、例えば、市販のノイラミニダーゼの活性を測定するためのキット（例；「NA-Fluor Influenza Neurminidase Assay Kit」（Life Technologies社））を用いることができる。
【０１１２】
（ＩＣ50）
ノイラミニダーゼの活性を５０％阻害する（＝阻害率５０％とする）ために必要な阻害剤の濃度（ＩＣ50）は、ＮＡ阻害剤が全く存在しない場合に最終産物として生成される発色体（上記例では４−MU）の量を１００％とした場合に、NA阻害剤を添加して該発色体の生成量が５０％となる場合のＮＡ阻害剤の濃度である。
【０１１３】
ＩＣ50は、次の方法で決定することができる。例えば、前述した図１のノイラミニダーゼ（ＮＡ）の活性測定において、阻害剤として化合物（１）〜（３３）等を異なる終濃度（例；５００μＭ、２５０μＭ、１２５μＭ、６２．５μＭ、３１．２５μＭ、１５．１２５μＭ）でそれぞれ添加し、NA阻害剤の濃度別にノイラミニダーゼに対する阻害率を決定する。次に決定した各阻害率の値をNA阻害剤の濃度（横軸）−阻害率（％）（縦軸）のグラフとしてプロットし、該プロットの近似線を作成する。最後に該近似線から阻害率が５０％となるNA阻害剤の濃度を得ることで、該濃度をＩＣ50として特定することができる。
【０１１４】
（ＮＡ阻害活性に寄与するトリテルペノイドの化学構造）
（骨格構造Ａ）
本発明に係るＮＡ阻害剤の有効成分として好ましいものは以下の骨格構造Ａまたは骨格構造Ｂを有するトリテルペノイドであるが、その他のトリテルペノイドとして骨格構造Ｃを有するものがある。なお、以下の説明で、例えば、「Δ7,8」の「Δ」は二重結合を意味し、右肩の添え字「７，８」は炭素（C）の位置を示す。
【０１１５】
【化３８】
2019163292.tif 000042
【０１１６】
【表３】
2019163292.tif 000043
（骨格構造Ｂ）
【０１１７】
【化３９】
2019163292.tif 000044
【０１１８】
【表４】
2019163292.tif 000045
（骨格構造Ｃ）
【０１１９】
【化４０】
2019163292.tif 000046
【０１２０】
【表５】
2019163292.tif 000047
【０１２１】
（骨格構造Ａ）
骨格構造Aは２つの２重結合（Δ7,8、Δ9,11）をテトラサイクリック環に有しており、また、カルボキシル基を有する分岐鎖を有しているものである。この骨格構造Ａを有するトリテルペノイドとして、（３）ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）、（５）ガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、（１２）ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）、（１３）ガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）、（１４）ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）、（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）が挙げられる。
【０１２２】
（骨格構造Ｂ）
骨格構造Bは、１つの二重結合（Δ8,9）をテトラサイクリック環に有しており、また、カルボキシル基を有する分岐鎖を有しているものである。この骨格構造Ｂを有するトリテルペノイド類として、（８）ガノデリックアシッドＡ、（２９）ガノデリン酸Ａ、（２４）ガノデリックアシッドＣ２、（９）ガノデリックアシッドＡＭ１、（２７）ガノデリックアシッドＫ、（３３）ガノデリン酸Ｈ、（２６）ガノデリックアシッドＨ、（１０）ガノデリックアシッドＢ、（３２）ガノデリン酸Ｆ、（３０）ガノデリン酸Ｃ、（３１）ガノデリン酸Ｄ、（２５）ガノデリックアシッドＣ６、（２３）ガノデリックアシッドＣ１、（２）ガノデリックアシッドＮ、（７）ガノデリックアシッドＤＭ、（１５）ガノルシド酸Ａ、（１１）ガノデリックアシッドＤ、（１）ガノデリックアシッドＺ、（６）ガノデリックアシッドＬＭ２、（４）ガノデリックアシッドＦ、（２２）ルシアルデヒドＢが挙げられる。
【０１２３】
（骨格構造Ｃ）
骨格構造Cは、２つの二重結合（Δ7,8、Δ9,11）をテトラサイクリック環に有しており、また、分岐鎖にカルボキシル基を有していないものである。この骨格構造Ｂを有するトリテルペノイド類として、（１６）ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）、（１７）ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）、（１８）ガノデロールＡ（Ganoderol A）、（１９）ガノデロールＢ（Ganoderol B）、（２０）ガノデリオールF（Ganoderiol F）、（２１）ルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）が挙げられる。
【０１２４】
トリテルペノイド類(1)~(33)のうち、ノイラミニダーゼ活性の阻害能を有するトリテルペノイド類の多くは骨格構造Ａまたは骨格構造Ｂを有し、これらの骨格構造Ａ，Ｂはカルボキシル基を有している。ここで、タミフル等の公知のＮＡ阻害剤は、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有しており、図１４に示すように、このカルボキシル基は公知のＮＡ阻害剤がＮＡの活性中心のポケットに入り込んで活性中心のポケットと相互作用していると考えられる。したがって、霊芝由来の上記各種トリテルペノイド類（すなわち、上記化合物（１）〜（３３）」）の化学構造中のカルボキシル基は、公知のＮＡ阻害剤のカルボキシル基と同様の機能を果たしていると考えられる。トリテルペノイド類の中からＮＡ阻害剤の有効成分となりうる化合物を探索する場合に上記カルボキシル基を有しているものを選択するスクリーニングを行ってもよい。
【０１２５】
（ドッキングシミュレーション）
トリテルペノイド類のノイラミニダーゼに対するドッキングシミュレーションを行うことで、トリテルペノイド類がノイラミニダーゼの活性中心のポケットの中に入り込んでノイラミニダーゼの本来の基質（例：ヒトの喉粘膜表面にあり、インフルエンザが感染する宿主細胞表面のシアル酸の糖鎖）と競合してノイラミニダーゼを阻害するのか否か等の阻害様式やトリテルペノイド類のノイラミニダーゼに対する結合のしやすさを調べることができる。この際に、トリテルペノイド類とノイラミニダーゼとの結合エネルギーを示すドッキングスコアがマイナスであればトリテルペノイド類がノイラミニダーゼの活性中心のポケットに入り込んでいることを意味し、プラスであれば、何らかの衝突を起こしてトリテルペノイド類が前記ノイラミニダーゼの活性中心のポケット内には入り込んでいないことを意味し、その絶対値の大小はマイナスの場合は結合力の大小を、プラスの場合は反発力の大小を意味する。
【０１２６】
ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）とガノデリックアシッドＴＲ（２８）とを、インフルエンザウイルスの異なるサブタイプ（Ｈ１Ｎ１／Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）／Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）／Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９）に由来する５つのノイラミニダーゼの３次元構造とドッキングさせた場合に得られるドッキングスコアは、いずれも公知のＮＡ阻害剤（タミフル等）と同程度のマイナス値であることから（表１３参照）、タミフル等と同じようにノイラミニダーゼの基質と競合してノイラミニダーゼの活性部位のポケットの中に入り込んでノイラミニダーゼ(ＮＡ)を阻害する。そのため、本願発明に係るノイラミニダーゼは、タミフル等の公知のＮＡ阻害剤と同様に競合的にＮＡを阻害する抗インフルエンザ剤として用いることができる。
【０１２７】
トリテルペノイド類の各種ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１／Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）／Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）／Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９）に対するドッキングスコアは、これらのトリテルペノイド類が各種ノイラミニダーゼに対してどの程度結合しやすいかを示していることから、トリテルペノイドについてＮＡ阻害剤として有用であるか否か判別する際に、該トリテルペノイドの化学構造を用いて各種ノイラミニダーゼに対してドッキングシミュレーションを行い、そのドッキングスコアに基づいて公知の阻害剤と近いドッキングスコアを有するトリテルペノイドのみをＮＡ阻害剤の有効成分として選択することとしてもよい。
【０１２８】
（ＮＡ阻害剤の細胞送達）
ヒト、豚、鳥等に感染するインフルエンザウイルスの種類も含めると、２０１４年７月時点において、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの表面抗原の種類は１６種類（Ｈ１〜Ｈ１６）、ノイラミニダーゼは９種類（Ｎ１〜Ｎ９）が確認されている。このヘマグルチニンとノイラミニダーゼとの組合せによりインフルエンザウイルスのタイプ（例；Ｈ７Ｎ９等）が分けられており、インフルエンザウイルスの抗原はタイプ別にそれぞれにより異なる。
【０１２９】
また、ヒトへの感染過程でインフルエンザウイルスは、特に気管，気管支，細気管支までの上皮細胞のウイルス受容体に結合するが、ヒトのインフルエンザウイルスは、上皮細胞が有するα2−6位にガラクトースが結合したシアル酸をウイルス受容体と認識して結合し、トリインフルエンザウイルスは、上皮細胞が有するα2−3位にガラクトースが結合したシアル酸をウイルス受容体として認識して結合する。したがって、インフルエンザウイルスや上皮細胞が持つ特定の抗原をターゲットとして、特異的にＮＡ阻害剤を送達することができれば、より効率的にＮＡ阻害、ひいてはインフルエンザウイルスの症状の進行抑制、インフルエンザの感染拡大防止につなげることができる。
【０１３０】
具体的には、上記化合物（１）〜（３３）の少なくともいずれか１種、好ましくは例えば各種ノイラミニダーゼに対して阻害能が高い順に選択される各化合物のうち第１〜３番目の化合物のいずれかに対する抗体(Ａ)を作製し、抗原として上記ウイルス受容体や上記の抗体(Ｂ)を作製し、各化合物と上記抗体との複合体（以下「抗体薬物複合体」という）を形成し、これを本発明に係るＮＡ阻害剤を含むＤＤＳ製剤（ドラッグデリバリーシステムを利用して特定の細胞にのみ所定の薬剤を送達するように構成した薬剤）として用いることが考えられる。なお、ＤＤＳ製材は混合して上記化合物を２種以上同時に用いてもよい。
【０１３１】
ここで、抗体（Ａ）は各化合物（１）〜（３３）を特異的に保持する機能を有し、抗体（Ｂ）は特定の細胞（気管，気管支，細気管支までの上皮細胞やウイルス）のみに発現している特定のタンパク質（ウイルス受容体やウイルスのコートタンパク質のＨＡ部分等）に特異的に結合する機能を有し、また、抗体（Ａ），（Ｂ）の複合体（上記抗体薬物複合体））は、これら双方の機能を有するため、各化合物（１）〜（３３）をインフルエンザウイルスや該インフルエンザウイルスが感染している宿主細胞に特異的に送達させることができる。
【０１３２】
この場合、各化合物（１）〜（３３）と上記抗体との間は、選択的に切断可能なリンカー（例えば特定のプロテアーゼで選択的に切断可能なタンパク質配列を含むシアトルジェネティクス社等のリンカーなど）で連結される。この抗体薬物複合体は血中では安定であるので、インフルエンザウイルスが感染した気管，気管支，細気管支までの上皮細胞に選択的に作用し、血管上皮細胞内に取り込まれた後、該細胞由来のタンパク質分解酵素によりリンカーが切断されて各化合物（１）〜（３３）を放出させることができる。その結果、各化合物（１）〜（３３）が特定の細胞に送達されて、該細胞（血管上皮細胞等）において特異的にノイラミニダーゼ（ＮＡ）の阻害を起こすこととなる。
【０１３３】
《ＮＡ阻害剤の用途》
本発明に係るＮＡ阻害剤は、食品（サプリメント、食品添加物等）、化粧料、医薬品（抗インフルエンザ剤）、研究試薬等として用いることができる。これら食品等は、上記有機系溶媒抽出物、水系溶媒抽出物、上記トリペノイド化合物（１）〜（３３）のいずれか１種または２種以上を優れたノイラミニダーゼ（ＮＡ）阻害活性能、(ヒトや動物のインフルエンザの予防・治療)などの点で含有しているものである。
【０１３４】
〔食品〕
本発明に係る食品は、上述したように、上記有機系溶媒抽出物（例；霊芝の９９％〜５０％エタノール抽出物、クロロホルム抽出物）、水系溶媒抽出物（例；霊芝からのエキス抽出に用いた液のエタノール濃度が５０％〜１％のエタノール抽出物、熱水抽出物）、または上記有機系溶媒抽出物に高濃度で含まれるＮＡ阻害剤の有効成分としての上記化合物（１）〜（３３）のいずれか１種または２種以上を含むものである。
【０１３５】
さらに、各種のノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１，Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）型，Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型、Ｈ５Ｎ１型およびＨ７Ｎ９型）に対して各化合物（１）〜（３３）のＮＡ阻害能が異なることから、ノイラミニダーゼの種類に応じて、ＮＡ阻害能が高い化合物を選択し（例えば、各種ノイラミニダーゼについて２００μＭにおけるＮＡ阻害率（％）またはＩＣ５０（μＭ）を基準に仕分けをして形成した前述の化合物の群のうち、最もＮＡ阻害能が高い群から１種または２種以上の化合物を選択し）、該化合物を含む食品を製造してもよい。また、２番目や３番目にＮＡ阻害能が高い群から選択されるいずれか１種または２種以上の化合物を含む食品を製造してもよい。
【０１３６】
前記食品を摂取したヒト等における血中濃度で、上記化合物（１）〜（３３）のいずれか１種以上のいずれか１種以上の合計の濃度が０．０１〜１００μＭとなる分量で食品に含有させて製造することが好ましい。例えば、成人（体重６０ｋｇ）に対して、化合物（１）〜（３３）のいずれか１種以上または上記抽出物を０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜５００ｍg／ｋｇ／日の態様で摂取する例が挙げられる。また、例えば、食品（ドリンク、ゼリー、サプリメント等）の１回の摂取量に含まれる有効成分（各化合物）の量を、抗インフルエンザ剤について後述するように、タミフル錠（７５ｍｇ）相当量以上〜最小中毒量の範囲、またはタミフル錠（７５ｍｇ）相当量未満〜０．１ｍｇ以上となるように調節しても良い。
【０１３７】
本発明に係る食品の剤型として、上記有機系溶媒抽出物、水系溶媒抽出物、または、化合物（１）〜（３３）のうちのいずれか１種または２種以上を、そのまま食品として調製したものか、他の食品に添加したもの、あるいは、ゼリー（例；スティック状）、ドリンク、カプセル、錠剤等、食品または健康食品の形態としたもの等、通常用いられる任意の食品形態を例示することができる。
【０１３８】
また、本発明に係るＮＡ阻害剤（の有効成分）を食品に配合して、ヒトやその他動物が摂取する場合、該食品中に、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等をＮＡ阻害剤と共に適宜添加することができる。その場合、本発明に係るＮＡ阻害剤を食品およびこれら任意成分と混合し、用途に応じて、その剤型を粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。特に、トリテルペノイドは非常に苦みを呈するので、甘味成分等を含めて摂取しやすくすることが望ましい。さらには、ＮＡ阻害剤を食品原料中に混合して食品を調製し、機能性食品として製品化することができる。
【０１３９】
（ドリンク）
ドリンクとして本発明に係る食品を製造する場合、ドリンク自体は短い時間で摂食・嚥下されドリンクに含まれる有効成分が唾液等で薄まりにくいため、上記各種の抽出物（９９％％エタノール抽出物、熱水抽出物、クロロホルム抽出物、３０％エタノールの抽出物）を阻害効果が確実に得られる濃度範囲である、例えば、４００〜２５００００μｇ／３０ｃｃボトル（１３．３μｇ〜１００００μｇ／ｍＬ）の濃度に調整して製造することができる。
【０１４０】
（ゼリー（スティック状））
ゼリーとして本発明に係る食品を製造する場合、食道等の咽喉部の粘膜に到達するまでにゼリーが口の中で咀嚼されて唾液により薄まってしまうため、唾液量で薄まる量を考慮して、咽喉の粘膜に達したときにＮＡ阻害剤として有効に各種ノイラミニダーゼを阻害しうる濃度となるように食品中の有効成分の濃度を決定してもよい。
【０１４１】
（サプリメント）
本発明に係るＮＡ阻害剤は、サプリメントとして用いることができる。サプリメントとする場合は、例えば、前述の有機系溶媒抽出物、水系溶媒抽出物、又は、化合物（１）〜（３３）のいずれか１種または２種以上、若しくは、好ましくは前述したようにノイラミニダーゼの種類毎に異なる好適な化合物の群（例；ＮＡ阻害能が最も高い化合物の群）から１種または２種以上の化合物を原料とし、公知の賦形剤を用いて常法により顆粒状・粉末状・ゲル状・カプセル状・ペースト状または錠剤にして用いることができる。このうち、ペースト状にする場合、ＮＡ阻害剤の有効成分で上記化合物（１）〜（３３）等をサイクロデキストリンの空孔に内包させても良い。
【０１４２】
サプリメント中の霊芝トリペノイド（化合物（１）〜（３３））のいずれか１種または２種以上の合計の含有量は特に制限はないが、霊芝１００ｇ中には２００ｍｇ程度のガノデリン酸が含まれ、通常１回の摂取で霊芝２５〜３０ｇを用いることから、これと同様に、例えば、サプリメント１粒（１ｇ）中に、化合物（１）〜（３３）のいずれか１種以上、あるいは化合物（３）等のいずれか１種以上が合計として５ｍｇ〜６０ｍｇ程度含有されていることが好ましい。
【０１４３】
（飼育動物や家禽類の餌）
ヒト、トリ、豚等の宿主動物間で感染可能なインフルエンザウイルスが異なるので、宿主動物の種類に応じてＮＡ阻害剤や抗インフルエンザ剤の有効成分を選択（化合物（１）〜（３３）の中から選択）して、これを含有する食品を調製することとしてもよい。例えば、後述するように主としてトリに感染するインフルエンザ（Ｈ７Ｎ９型やＨ５Ｎ１型）等のトリ等への感染を防止する効果を有する家禽類の餌を調製する際に、前述したところのＮＡ（Ｈ７Ｎ９型やＨ５Ｎ１型）を阻害するのに好適な化合物の群から１種または２種以上の化合物を選択し、これを含有する家禽類の餌を調製することが望ましい。豚の餌についても、豚に感染しうる上記インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１型、Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）、Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）、Ｎ５Ｎ１型）のノイラミニダーゼの阻害に有効な成分として前述した好ましいトリテルペノイド類の群（阻害率（％）やＩＣ５０を基準にした上記化合物の群）から選択される１種又は２種以上の化合物を公知の餌（豚等の餌）に含有させて本発明に係る家畜類の餌を製造してもよい。
【０１４４】
家禽類や家畜類の餌に含まれる前記有効成分の好適な濃度は上述した通りであり、例えば、家禽類や家畜類の喉の粘膜上皮細胞に該餌が達した状態において、該餌に含まれる有効成分の濃度が水系溶媒抽出物あるいは有機系溶媒抽出物の場合では４００μｇ／ｍＬ〜１６００μｇ／ｍＬとなるように調製、化合物の場合には１〜２００μＭとなるように調製する例が挙げられる。また、例えば、１回の摂取量分としての有効成分（各化合物）の量を、抗インフルエンザ剤について後述するように、タミフル錠（７５ｍｇ）相当量以上〜最小中毒量の範囲、またはタミフル錠（７５ｍｇ）相当量未満〜０．１ｍｇ以上となるように調節しても良い。後者の場合は感染予防効果が期待できる。
【０１４５】
鳥インフルエンザのノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１型，Ｈ７Ｎ９型）に対しては、これらのノイラミニダーゼの阻害に好適な上述の化合物を有効成分するＮＡ阻害剤、抗インフルエンザ剤を含む食品（餌）が非常に有効であり、該餌を与えて家禽類を飼育する家禽類の飼育をすれば、例えばインフルエンザ（Ｈ７Ｎ９型やＨ５Ｎ１型）がトリからヒトに感染するのを未然に防ぐことができる。したがって、該ＮＡ阻害剤等を含む食品（餌）を家禽類（ニワトリ、アヒル、エミュー、ガチョウ、インドクジャク、コブハクチョウ、ダチョウ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、コウライキジ、キンケイ、レア、ウズラ等）や愛玩（ペット）用の鳥類（インコ（セキセイインコ等）、アヒル、オウム、ブンチョウ、九官鳥、カナリア、ジュウシマツ、オナガドリ、チャボ等）の餌として好適に用いることができる。
【０１４６】
（食品添加物）
化合物（１）〜（３３）は、強い苦味を呈することから、食品添加物（苦味料）として苦味が許容される清涼飲料水、酒精飲料等に用いることができる。化合物（１）〜（３３）は、基本的にセスキテルペン等の公知の苦味料と同様に取り扱うことが可能である。
【０１４７】
逆に、化合物（１）〜（３３）の苦味を抑えることも可能であり、その場合は、苦味マスキング剤（花王「ベネコート  ＢＭＩ−４０」等）により苦味をマスキング等した上で、上記効能（ＮＡ阻害に基づくインフルエンザ予防、インフルエンザの感染が原因で引き起こされる肺炎、急性脳症やライ症候群、心合併症、急性筋炎、中耳炎、結膜炎、副鼻腔炎、心筋炎の予防）を期待し、かかる機能を有する食品添加物として用いてもよい。
【０１４８】
化合物（１）〜（３３）を上記食品添加物として用いる場合、安全性の点で許可されている以下の別の食品添加物を併用して水溶性または油溶性にして用いてもよい。この別の食品添加物としては、一価アルコール(エタノールなど)、多価アルコール（例：エチレングリコール、グリセリンなど）、動植物油(例：グリセリンのモノ、ジ、トリ-脂肪酸エステルに代表される多価アルコールの脂肪酸エステル等)などの公知の溶媒、公知の界面活性剤または公知の乳化剤｛例：シュガーエステル、ソルビタン脂肪酸エステル（ソルビタンエステル),プロピレングリコール脂肪酸エステル(PGエステル)、レシチン）｝などを挙げることができる。
【０１４９】
また、化合物（１）〜（３３）を、水・天然ガム質および多糖類などの高分子物質とともに常用の溶剤または乳化剤を用いて乳化し、油性食品（マヨネーズ等）、水性食品（清涼飲料等）に含めてもよい。
【０１５０】
食品添加物中の化合物（１）〜（３３）のいずれか１種以上の合計の含有量は、特に制限はないが、６０ｋｇの成人を想定すれば、１日のガノデリン酸の最小中毒量：３００００ｍｇであるので、例えば、上記食品添加物（１日分）中に合計で０．１ｍｇ以上〜２００００ｍｇ未満で含有されていることが好ましい。この例の場合、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ含むｍｇ錠のサプリメントとして製造してもよいし、上記有効成分の化合物（３）等を顆粒状で合計１００ｍｇ〜２００００ｍｇ含むように製造してもよい。また、例えば、１回の摂取量分としての有効成分（各化合物）の量を、抗インフルエンザ剤について後述するように、タミフル錠（７５ｍｇ）相当量以上〜最小中毒量の範囲、またはタミフル錠（７５ｍｇ）相当量未満〜０．１ｍｇ以上となるように調節しても良い。
【０１５１】
〔化粧料〕
本発明に係る化粧料（薬用化粧品）は、前述の有機系溶媒抽出物または水系溶媒抽出物、霊芝トリペノイド化合物（１）〜（３３）のいずれか１種または２種以上を含有するものである。霊芝トリペノイドの化合物（１）〜（３３）は、ステロイドの基本骨格を有するため、細胞の脂質と化合物（１）〜（３３）との間の脂質間相互作用により皮膚から細胞に取り込まれやすく、化粧料として用いることが好ましい。上記化粧料の剤型として、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、ジェル、ミスト、スプレー、ムース、ロールオン、スティックなどの他、不織布などのシートに含浸ないし塗布したものなどを挙げることができるが、特に咽喉や鼻腔の中（特に奥）に塗布しやすいスプレーやミストが好ましい。
【０１５２】
上記化粧料は、例えば、鼻腔、口蓋扁桃、咽喉、気管、気管支，細気管支、食道の粘膜にスプレー等の方法で塗布することで、該粘膜の上皮細胞における本発明に係るＮＡ阻害剤がターゲットとするＡ型のインフルエンザの予防やその症状の軽減等を図ることができるため、これら用途において有用である。スプレーで塗布する場合は、例えば、１回の押下でスプレーのノズルから送出される有効成分量（各化合物の量）を後述するような抗インフルエンザ剤で示される量となるように調節してもよい。例えば、スプレーの１回の押下でノズルから送出される有効成分（各化合物）の量がタミフル錠（７５ｍｇ）相当量以上〜最小中毒量の範囲、またはタミフル錠（７５ｍｇ）相当量未満〜０．１ｍｇ以上となるように調節しても良い。
【０１５３】
（化粧料中の有効成分濃度について）
化粧料であれば、経口摂取により投薬するサプリメントや抗インフルエンザ剤とは異なり、インフルエンザが感染する鼻腔や咽喉等の上皮細胞に対してピンポイントで施薬することができることから、化粧料中に含有させる上記化合物（１）〜（３３）のいずれか１種以上、特に化合物（３）等のいずれか１種以上の合計の用量は経口摂取の場合と比べて非常に少量で済む上に、より高濃度で含有させることができる。
【０１５４】
したがって、化粧料であれば、化粧料中にＮＡ阻害剤の有効成分である上記化合物（１）〜（３３）、好ましくは化合物（３）等のいずれか１種以上を合計でＮＡの阻害率が５０％以上となる高濃度（例;４０μＭ〜３００μＭ）で含有させて上記鼻腔、口蓋扁桃、咽喉、気管、気管支，細気管支、食道の粘膜に塗布することができる点から非常に好ましい。これに限らず、化粧料中に上記化合物（１）〜（３３）の１種以上、あるいは化合物（３）等のいずれか１種以上を合計でＮＡ阻害率が例えば０．１％〜１００％となる濃度（例えば０．１μＭから３００μＭ）で含有させることができる。また、例えば、１回の摂取量分としての有効成分（各化合物）の量を、抗インフルエンザ剤について後述するように、タミフル錠（７５ｍｇ）相当量以上〜最小中毒量の範囲、またはタミフル錠（７５ｍｇ）相当量未満〜０．１ｍｇ以上となるように調節しても良い。
【０１５５】
この場合、肌（特に粘膜の上皮細胞）に塗られた抽出成分を細胞内へと効率よく浸透させるために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、イオン活性剤、エタノール，プロピレングリコール、脂肪酸，脂肪酸エステル等の浸透促進剤（経皮吸収促進剤）を化粧料の成分として含有させてもよい。このうち、ＤＭＳＯを用いる場合、化粧料全体に対して１０重量％以下含有させることが好ましい。エタノールを使用して上述した抽出を行う場合には、再度エタノールを化粧料の成分として含有させることとなるため、抽出に用いたエタノールを溶媒除去しなくともよい点で有利である。
【０１５６】
本発明では、化合物（１）〜（３３）のいずれか１種以上、あるいは化合物（３）等のいずれか１種以上に、植物油などの油脂類、ラノリンやミツロウなどのロウ類、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、エステル類、各種界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物や動物の抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防腐剤、殺菌剤などを適宜配合して化粧料を製造してもよい。
【０１５７】
〔医薬品（抗インフルエンザ剤）〕
本発明に係る抗インフルエンザ剤は、前述の有機系溶媒抽出物または水系溶媒抽出物、前述のトリテルペノイドの化合物（１）〜（３３）のいずれか１種以上、あるいは化合物（３）等のいずれか１種以上を含有しているものである。
【０１５８】
上記抗インフルエンザ剤の剤型としては、液剤、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、注射剤、トローチ剤、リモナーデ剤、流エキス剤等であるが、鼻腔、口蓋扁桃、咽喉、気管、気管支，細気管支、食道に適用することができる観点から、液剤、シロップ剤、トローチ剤、流エキス剤が特に好ましい。
【０１５９】
［用量］（Ｈ５Ｎ１型用の抗インフルエンザ剤）
タミフルの投与量は１日７５ｍｇであり、成人（体重６０ｋｇ）の場合、投与量は１．２５ｍｇタミフル／ｋｇ／日となり、これを基準に抗インフルエンザ剤中の上記化合物の量を決定してもよい。
【０１６０】
前述したインフルエンザ（Ｈ５Ｎ１型）に対するＩＣ50値から、１日のタミフル投与量に相当するトリテルペノイド類（化合物（１）〜（３３））の量を算出すると以下のようになる（下記表６参照）。ここで、ガノデリン酸の１日の最小中毒量は５００ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０１６１】
したがって、本発明に係る抗インフルエンザ剤（Ｈ５Ｎ１型用；１日分）中の化合物（１）〜（３３）のいずれか１種の含有量を、下記表と上記最小中毒量に基づいて、「各化合物（１）〜（３３）のいずれかの１日の投与量（ｍｇ／ｋｇ／日）×６０ｋｇ×１日（単位：ｍｇ）」以上〜「最小中毒量５００ｍｇ／ｋｇ／日×６０ｋｇ×１日（単位；ｍｇ）」以下の範囲で設定することが好ましい。例えば、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ(Ganoderic acid T-Q(14)であれば、抗インフルエンザ剤（Ｈ５Ｎ１型用；１日分）中のガノデリックアシッドＴ−Ｑの含有量は６６．０ｍｇ以上〜３００００ｍｇ未満の範囲で設定することが好ましいことになる。
【０１６２】
しかし、タミフルと同程度の効果が得られれば良いと考えられることから、抗インフルエンザ剤（Ｈ５Ｎ１型；１日分）中の有効成分としての化合物の量を、一般に医師から処方されるタミフル錠（７５ｍｇ）に相当する有効成分量に近い量（例；±０％〜±５％、１０％、１５％、２０％、３０％）となるように設定することが好ましい。例えば、ガノデリックアシッドＴ−Ｑの場合、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ６６．０ｍｇでタミフル７５ｍｇに相当するので、例えば、その±１０％の量、具体的には、抗インフルエンザ剤（Ｈ５Ｎ１型用；１日分）中にガノデリックアシッドＴ−Ｑを59.4ｍｇ〜72.6ｍｇ含有させたものを好適な例として示すことができる。
【０１６３】
ここで、インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１型）の予防を目的とする場合では、好ましい例として、本発明に係る抗インフルエンザ剤（Ｈ５Ｎ１型用；１日分）中の化合物（１）〜（３３）のいずれか１種の含有量をタミフル錠（７５ｍｇ）相当未満に設定する例が挙げられる。例えばガノデリックアシッドＴＱを１ｍｇ〜６６．０ｍｇ含有する抗インフルエンザ剤（Ｈ５Ｎ１；予防用）の例を挙げることができる（他の化合物についても同様である）。
【０１６４】
なお、ガノデリックアシッドＤ等の下記表に示されていない化合物は解析中でありデータが存在しないが、ＩＣ５０値からタミフルの１日の投与量に相当する量を算出して該量〜最小中毒量（５００ｍｇ）の範囲の量を抗インフルエンザ剤（Ｈ５Ｎ１型）に含有させてもよい。また、下記表において不等号が付されている化合物については、ＩＣ５０値が厳密には決定されていないものである。例えば、ガノデリックアシッドＳ（３）については「ＩＣ５０（μＭ）＜１００」であり未満となることが判明している状態を意味している。
【０１６５】
【表６】
2019163292.tif 000048
【０１６６】
（Ｈ１Ｎ１型用の抗インフルエンザ剤）
Ｈ５Ｎ１の場合と同様に、１日に投与されるタミフルの用量（１．２５ｍｇ／ｋｇ／日）に相当する各化合物の１日の投与量を下記表７に示す。下記表７に示すように、本発明に係る抗インフルエンザ剤（Ｈ１Ｎ１用；１日分）に含まれる各化合物の含有量としては、「各化合物（１）〜（３３）のいずれかの１日の投与量（ｍｇ／ｋｇ／日）×６０ｋｇ×１日（単位：ｍｇ）」以上〜「最小中毒量５００ｍｇ／ｋｇ／日×６０ｋｇ×１日（単位；ｍｇ）」以下の範囲で設定することが好ましい。例えば、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ(Ganoderic acid T-Q(14)であれば、抗インフルエンザ剤（Ｈ１Ｎ１型用；１日分）中のガノデリックアシッドＴ−Ｑの含有量は１４．６ｇ以上〜３０．０ｇ未満の範囲で設定することが好ましいことになる。
【０１６７】
しかし、タミフルと同程度の効果が得られれば良いと考えられることから、抗インフルエンザ剤（Ｈ１Ｎ１型；１日分）中の有効成分としての化合物の量を、一般に医師から処方されるタミフル錠（７５ｍｇ）に相当する有効成分量に近い量（例；±０％〜±５％、１０％、１５％、２０％、３０％）となるように設定することが好ましい。例えば、ガノデリックアシッドＴ−Ｑの場合、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ１４．５６ｇでタミフル７５ｍｇに相当するので、例えば、その±１０％の量、具体的には、抗インフルエンザ剤（Ｈ１Ｎ１型用；１日分）中にガノデリックアシッドＴ−Ｑを１３.１ｇ〜１６．０ｇ含有させたものを好適な例として示すことができる。
【０１６８】
ここで、インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１型）の予防を目的とする場合では、好ましい例として、本発明に係る抗インフルエンザ剤（Ｈ１Ｎ１型用；１日分）中の化合物（１）〜（３３）のいずれか１種の含有量をタミフル錠（７５ｍｇ）相当未満に設定する例が挙げられる。例えばガノデリックアシッドＴＱを１ｍｇ〜１３．１ｇ含有する抗インフルエンザ剤（Ｈ１Ｎ１；予防用）の例を挙げることができる（他の化合物についても同様である）。
【０１６９】
なお、ガノデリックアシッドＤ等の下記表に示されていない化合物は解析中でありデータが存在しないが、ＩＣ５０値からタミフルの１日の投与量に相当する量を算出して該量〜最小中毒量（５００ｍｇ）の範囲の量を抗インフルエンザ剤（Ｈ１Ｎ１型）に含有させてもよい。また、下記表において不等号が付されている化合物については、ＩＣ５０値が厳密には決定されていないものである。例えば、ガノデリックアシッドＳ（３）については「ＩＣ５０（ｎＭ）＜１００」であり未満となることが判明している状態を意味している。
【０１７０】
【表７】
2019163292.tif 000049
【０１７１】
（その他のＮＡ用の抗インフルエンザ剤）
Ｈ５Ｎ１の場合と同様に、１日に投与されるタミフルの用量（１．２５ｍｇ／ｋｇ／日）に相当する各化合物の１日の投与量を下記表７Ａに示す。下記表７Ａに示すように、本発明に係る抗インフルエンザ剤（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）用；１日分、Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）用；１日分、ＮＡ（Ｈ７Ｎ９）；１日分）にそれぞれ含まれる各化合物の含有量としては、「各化合物（１４）、（２８）のいずれかの１日の投与量（ｍｇ／ｋｇ／日）×６０ｋｇ×１日（単位：ｍｇ）」以上〜「最小中毒量５００ｍｇ／ｋｇ／日×６０ｋｇ×１日（単位；ｍｇ）」以下の範囲で設定することが好ましい。
【０１７２】
例えば、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ(Ganoderic acid T-Q(14)であれば、抗インフルエンザ剤（１日分）中のガノデリックアシッドＴ−Ｑの含有量は、ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ））用の抗インフルエンザ剤では２．４５ｇ以上〜３０．０ｇ未満の範囲で設定することが好ましく、ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ））用の抗インフルエンザ剤では、１．７８ｇ以上〜３０．０ｇ未満の範囲で設定することが好ましいことになる。
【０１７３】
ガノデリックアシッドＴＲ（２８）についても同様であり、抗インフルエンザ剤（１日分）中のガノデリックアシッドＴＲ（２８）の含有量は、ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ））用の抗インフルエンザ剤では２．２５ｇ以上〜３０ｇ未満の範囲で設定することが好ましく、ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ））用の抗インフルエンザ剤では、１．２８ｇ以上〜３０．０ｇ未満の範囲で設定することが好ましいことになる。
【０１７４】
しかし、タミフルと同程度の効果が得られれば良いと考えられることから、抗インフルエンザ剤（Ｈ１Ｎ１型；１日分）中の有効成分としての化合物の量を、一般に医師から処方されるタミフル錠（７５ｍｇ）に相当する有効成分量に近い量（例；±０％〜±５％、１０％、１５％、２０％、３０％）となるように設定することが好ましい。
【０１７５】
ガノデリックアシッドＴ−Ｑの場合、例えば、ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ））用の抗インフルエンザ剤では、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ１．７８２ｇでタミフル７５ｍｇに相当するので、例えば、その±１０％の量、具体的には、抗インフルエンザ剤（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型用；１日分）中にガノデリックアシッドＴ−Ｑを１．６０ｇ〜１．９６ｇ含有させたものを好適な例として示すことができる。
【０１７６】
ここで、インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１型）の予防を目的とする場合では、好ましい例として、本発明に係る抗インフルエンザ剤（Ｈ１Ｎ１型用；１日分）中の化合物（１）〜（３３）のいずれか１種の含有量をタミフル錠（７５ｍｇ）相当未満に設定する例が挙げられる。例えばガノデリックアシッドＴＱを１ｍｇ以上〜１．６０ｇ未満含有する抗インフルエンザ剤（Ｈ１Ｎ１；予防用）の例を挙げることができる（他の化合物についても同様である）。これらのことは、ガノデリックアシッドＴＲについても同様である。
【０１７７】
【表７Ａ】
2019163292.tif 000050
【０１７８】
〔研究試薬〕
霊芝由来のトリペノイド類の化合物（１）〜（３３）は、その化学構造の相違によりＮＡ阻害活性が相違するため、各化合物（１）〜（３３）はそれぞれＮＡとの結合の態様及びＮＡ阻害活性の発現機構が異なると考えられるが、その詳細は現在不明である。したがって、ＮＡ阻害活性の程度が異なる化合物（１）〜（３３）を、霊芝(Ganoderma lingzhi)由来のトリテルペノイド類がＮＡを阻害する機構を解明するための研究試薬として用いることができる。
【０１７９】
また、各化合物（１）〜（３３）は、後述するように、化学構造が相違するため、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）との結合様式やＮＡ阻害活性が相違する。したがって、これら化合物（１）〜（３３）に基づいて、さらに高いＮＡ阻害活性を有するＮＡ阻害剤を予測して開発することも可能であり、このための研究試薬としても用いることができる。
【実施例】
【０１８０】
以下、各試験例で共通して使用する試薬等について入手方法等を説明する。
《各種ノイラミニダーゼ》
代表的な組換えのノイラミニダーゼの以下５つのサブタイプをSino Biological Inc.から購入した。
・NA（A/California/04/2009/(H1N1)）（ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１））
・NA(A/California/04/2009(H1N1)(N295S)（ノイラミニダーゼ（Ｎ２９５Ｓ）
・NA(A/Babol/36/2005(H3N2)(E119V)（ノイラミニダーゼ（Ｅ１１９Ｖ））
・NA(A/Hubei/1/2011(H5N1) （ノイラミニダーゼ（Ｎ５Ｎ１））
・NA(A/Hangzhou/1/2013(H7N9))（ノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９））
《ノイラミニダーゼ活性アッセイキット》
「Neuraminidase (NA) Recombinant Viral Protein, N-His Tag」、製品番号：11058-V07B-50、ライフテクノロジー社）から購入した。また、4−メチルウンベリフェロンナトリウム（製品名「4-メチルウンベリフェロン ナトリウム塩」、製品番号M1508、シグマ社）を分析システムの最適化に用いた。
【０１８１】
《霊芝由来の各種トリテルペノイド》
霊芝(Ganoderuma lingzhi)由来の３３種類のトリテルペノイド（純度＞９８％）については、Chemfaces社（武漢市、湖北省、中国）およびQuality Phytochemicals社（LLC、ニュージャージー州、アメリカ合衆国）から購入した。これらのトリテルペノイド類（１）〜（３３）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に２５ｍＭ〜２．５ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解した。
【０１８２】
《公知のＮＡ阻害剤》
タミフル（登録商標）のリン酸塩である「リン酸オセルタミビル」（製品番号：1479304）は、シグマ社から購入した。
【０１８３】
［試験例１］
霊芝(Ganoderuma lingzhi)由来の３３種類のトリテルペノイド類について、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１）の阻害活性を調べるとともに、各トリテルペノイドの化合物（１）〜（３３）の種々の濃度における阻害率及びＩＣ50を求めた。
【０１８４】
（材料）
また、霊芝（Ganoderma lingzhi）からのクロロホルム抽出物および熱水抽出物（各抽出物についての調製方法はそれぞれ後述する抽出方法による。）をそれぞれジメチルスルホキシド（DMSO）に０μｇ／ｍL〜１６００μｇ／ｍLで溶解した。また、タミフル（登録商標）のリン酸塩である「リン酸オセルタミビル」（製品番号：1479304、シグマ社）（２０ｍＭ〜2．５ｍＭ）をポジティブコントロールとして使用した。
【０１８５】
（方法）
（１）NA阻害活性の測定
ノイラミニダーゼ（NA）の阻害活性の測定原理を図１に示した。上述した霊芝由来のトリテルペノイド類（化合物（１）〜（３３））について、ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１型）およびノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１型）に対する阻害活性の解析を「NA-Fluor Influenza Neurminidase Assay Kit」の製品説明書に記載の手順に基づいて以下のように若干変更を加えて行った。
【０１８６】
（試薬とＮＡ組換体溶液の準備）
上記キットに含まれる「２×ＮＡ−ＦlourTM Assay Buffer」（６６．６ｍＭの２−〔Ｎ−morpholino〕ethanesulfonic acid[MES]buffer、8mMCaCl2、pH6.5）と蒸留水とを容量比１：１で混合してウイルス希釈用の１×分析用緩衝液を２０ｍＬ調製した。また、１×分析用緩衝液を溶媒としてＮＡ組換体を３００ｎｇ／ｍLで含有する溶液を調製した。
【０１８７】
《手順》
以下のとおりに各ノイラミニダーゼに対する阻害率（％）およびＩＣ50（μＭ）の特定を行った。
【０１８８】
Ｉ）ＤＭＳＯに溶解した各化合物（１）〜（３３）（濃度０μM，２５μM，５０μM，１００μM，２００μM ）１μＬを、前記濃度の別にそれぞれ１×分析用緩衝液２４μＬと混合し、さらにノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１型）の溶液（３００ｎｇ／ｍＬ）２５μＬと混合し、合計５０μＬの混合液を前記濃度別に調製した。
【０１８９】
一方、ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１型）の溶液についても同様に合計５０μＬの混合液をそれぞれ濃度別に調整した。
また、上記各ノイラミニダーゼの溶液（３００ｎｇ／ｍＬ）２５μＬの代わりに１×分析用緩衝液２５μＬを用いてＮＡ組換体を含まないネガティブコントロールの混合液を調製した。
調整した上記混合液をそれぞれ９６ウェルプレートの各ウェルに格納して３７℃で２０分間振とうした。
【０１９０】
II）振とうした後の上記混合液に対して、５０μMの４−MUNANA（４−〔methylumbelliferyl〕-N-acetylneuraminic acid）の溶液（6.1mgの４−MUNANAを5mLの１×分析用緩衝液に溶解したもの）を５０μＬ加えて合計１００μＬの混合液を得た。その後、該１００μＬの混合液をさらに３７℃で６０分間振とうした。
【０１９１】
III）６０分間振とうした後の上記混合液に対して、１００μLの停止溶液（０．２ＭのＮａＣＯ3溶液）を加えることにより図１に示す反応を停止した。その後、該混合液を波長３５５ｎｍの励起光下に置いて、上記混合液から発する蛍光（４６０ｎｍ）を測定した。
【０１９２】
IV）複数のネガティブコントロールについて測定した上記蛍光量を平均して、ネガティブコントロールの相対蛍光単位（RFU；Relative Fluorescent Unit）の平均値（RFUbackground）を算出した。
【０１９３】
V）次に、各化合物（１）〜（３３）について測定したRFU値からネガティブコントロールのRFU平均値を差し引くことでブランク値を引いたRFU値（RFU-minus-backgroundsample）を算出した。これらの値を用いて以下の式により阻害率IR（％）を算出した。
阻害率IRは、次式を用いて算出した。IR(％)＝(1−(RFU-minus-backgroundsample／RFU−minus-backgroundDMSO))×100（％）
【０１９４】
次に、化合物（１）〜（３３）のそれぞれについて濃度別（濃度：０μM、２５μM、５０μM、１００μM、２００μM）に算出した阻害率（IR）をプロットして化合物（化合物（１）〜（３３））別に３３個のグラフ（阻害剤濃度−阻害率のグラフ、横軸：阻害剤濃度、縦軸：阻害率（％））を作成した。該グラフからＮＡの活性を５０％阻害する濃度（IC50）を化合物（化合物（１）〜（３３））別に算出した。
【０１９５】
また、ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１）のタミフル(登録商標)の阻害率ＩＲと上記化合物（１）〜（３３）の阻害率ＩＲとに基づいて、各化合物（１）〜（３３）（５０μM）と等価のタミフル濃度（nM OE）を算出して下記表８に示した。
【０１９６】
【化４１】
2019163292.tif 000051
【０１９７】
【表８】
2019163292.tif 000052
【０１９８】
Δ２４，２５は二重結合の位置を示し、（Ｅ）は２重結合の立体配座が異なることを示し、（Ｚ）や（Ｒ）は２重結合の立体配座が同じであることを示す（簡単な例では（Ｅ）はトランス型、（Ｚ）や（Ｒ）はシス型を意味する）。
【０１９９】
（結果・考察）
ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１型）の各活性に与える各化合物（１）〜（３３）の影響を調べるために、本試験例１では、各化合物（１）〜（３３）を段階的な濃度（０μM，２５μM，５０μM，１００μM、２００μM）で使用して阻害率（％）を特定した（表８および図３参照（図３では一部不図示））。なお、図３の縦軸は図１の生成物（４−ＭＵ）のＲＦＵ値（＝ＮＡ阻害能の程度）を示す。同様に、各化合物（１）〜（３３）のにノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１型）に対するＩＣ50についてもそれぞれ特定した（表８参照）。
【０２００】
なお、図２（Ａ）及び（Ｂ）は、ポジティブコントロールとして用いたタミフルの濃度を変化させた場合に示すノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１型）に対するタミフルの阻害率の変遷を示すグラフである。
【０２０１】
（結果と考察）
化合物（１）〜（３３）の全ての阻害率（％）およびＩＣ50を上記表８に示した。この結果は霊芝（Ganoderma lingzhi）由来の特定のトリテルペノイドが特定のインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１型、Ｈ５Ｎ１型）に対して阻害能を有していることを示している。ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）及びガノデリックアシッドＴＲ（２８）は、それらトリテルペノイド類のうち、特に、生成される４−ＭＵ（図１）のＲＦＵ値が低くNA阻害能が特に高いものである。
【０２０２】
（１）ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）型）に対する阻害能
表８に示すように、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１）に対して、化合物（３）、（９）、（１０）、（１３）、（１４），（１９）、（２２）〜（２９）、（３０）〜（３３）が阻害能を有していることが明らかとなった。したがって、化合物（３）、（９）、（１０）、（１３）、（１４），（１９）、（２２）〜（２９）、（３０）〜（３３）のいずれか１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）に対し有効であることが分かる。
【０２０３】
さらに、上記化合物のうち、ＩＣ50が１００μＭ以下となる化合物としては、化合物（１４）および（２７）であり、これら化合物（１４）および（２７）からなる群から選択される１種または２種を有効成分として含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）に対して特に有効であることが分かる。
【０２０４】
［試験例２］
特定のインフルエンザのノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１型）に対して、特に強いＮＡ阻害能を示したガノデリックアシッドＴＱとガノデリックアシッドＴＲについてさらに他のインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ（Ｈ１Ｎ１，Ｎ２９５Ｓ）、ＮＡ（Ｈ３Ｎ２，Ｅ１１９Ｖ）、ＮＡ（Ｈ７Ｎ９））に対するＮＡ阻害能について試験例１と同様にＩＣ50を調べた。この結果を下記表９に示す。
【０２０５】
【表９】
2019163292.tif 000053
【０２０６】
（結果・考察）
この試験の結果、ガノデリックアシッドＴＱおよびガノデリックアシッドＴＲがこれらノイラミニダーゼのサブタイプ(表9に示すカッコ内の型)の全てを阻害することが明らかとなった。ターゲットとするノイラミニダーゼの種類によっては阻害能が変化することがわかる。ガノデリックアシッドＴＱについては、ノイラミニダーゼ（Ｎ５Ｎ１型）に対して、タミフルと同等かそれ以上のＮＡ阻害能を発揮した。なお、表９に示すように、ノイラミニダーゼ（ＮＡ（Ｈ１Ｎ１，Ｎ２９５Ｓ）、ＮＡ（Ｈ３Ｎ２，Ｅ１１９Ｖ））に対するタミフルのＩＣ50の値が高いことから、試験例２の解析系が信頼できるものであることが分かる。
【０２０７】
［試験例３］
霊芝由来の化合物の一部（ガノデリックアシッドＴＱ，ガノデリックアシッドＴＲ）にノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１）に対する阻害能が確認された試験例２の結果を踏まえて、残りの化合物（１）〜（１３）、（１５）〜（２７）、（２９）〜（３３）についても、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）のサブタイプ（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９）に対するＮＡ阻害能等を試験例１のＮＡ阻害能の評価方法を用いて同様に調べた。なお、上記の各化合物は、図１に示す阻害剤として終濃度２００μＭで用いた。試験例３の結果を図６〜図９および下記表１０に示す。
【０２０８】
【表１０】
2019163292.tif 000054
【０２０９】
（結果・考察）
（２）ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）型）に対する阻害能
表１０及び図６に示すように、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ））に対して、化合物（１），（３）〜（３３）の全てが阻害能を有していることが明らかとなった。なお、「Ｎ２９５Ｓ」は、ノイラミニダーゼの第２９５番目のアミノ酸がアスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）に置換していることを示す。
【０２１０】
したがって、化合物（１），（３）〜（３３）のいずれか１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ））に対し有効であることが分かる。
【０２１１】
上記化合物のうち、インフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）型）のノイラミニダーゼに対して阻害率３０％を上回る化合物としては、ガノデリックアシッドＳ（３）、ガノデリックアシッドＴＱ（１４）およびガノデリックアシッドＴＲ（２８）であり（一部不図示）、これら化合物（３）、（１４）および（２８）からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）型）に対して特に有効であることが分かる。
【０２１２】
さらに、阻害率４０％、５０％を上回る化合物としては、ガノデリックアシッドＴＱ（１４）およびガノデリックアシッドＴＲ（２８）であり、該化合物（１４），（２８）からなる群から選択された１種または２種を有効成分として含む抗インフルエンザ剤が、インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型（Ｎ２９５Ｓ））に対して極めて有効であることが分かる。
【０２１３】
（３）ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型）に対する阻害能
表１０及び図８に示すように、ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ））に対して、化合物（１），（３）〜（３３）の全てが阻害能を有していることが明らかとなった。したがって、化合物（１），（３）〜（３３）のいずれか１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ））に対して有効であることが分かる。
【０２１４】
また、上記化合物のうち、インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型）のノイラミニダーゼに対して阻害率３０％を上回る有用な化合物としては、ガノデリックアシッドＳ（３）、ガノデリックアシッドＡ（８）、ガノデリックアシッドＡＭ１（９）、ガノデリックアシッドＢ（１０）、ガノデリックアシッドＴＮ（１３）、ガノデリックアシッドＴＱ（１４）、ガノデリンマノンジオール（１７）、ルシルアルデヒドＢ（２２）、ガノデリックアシッドＣ１（２３）、ガノデリックアシッドＣ２（２４）、ガノデリックアシッドＫ（２７）、ガノデリックアシッドＴＲ（２８）、ガノデリン酸Ｃ（３０）、ガノデリン酸Ｄ（３１）、ガノデリンサンＨ（３３）であり、これらの化合物の１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ））に対して特に有効であることが分かる。
【０２１５】
さらに、阻害率４０％を上回る非常に有用な化合物としては、ガノデリックアシッドＳ（３）、ガノデリックアシッドＴＮ（１３）、ガノデリックアシッドＴＱ（１４）、ルシルアルデヒドＢ（２２）、ガノデリックアシッドＣ２（２４）およびガノデリックアシッドＴＲ（２８）であり、これら化合物を１種または２種以上含むＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ））に対して非常に有効であることが分かる。
【０２１６】
さらに、阻害率５０％を上回る極めて有用な化合物としては、ガノデリックアシッドＴＱ（１４）およびガノデリックアシッドＴＲ（２８）であり、これら化合物を１種または２種含むＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ））に対して極めて有効であることが分かる。
【０２１７】
（４）ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１型）に対する阻害能
表１０及び図７に示すように、ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１型）に対しては、霊芝(Ganoderma lingzhi)由来のトリテルペノイドである化合物（１）、（３）〜（３３）のうち、化合物（３），（４），（６）〜（１０）、（１２）〜（３３）が阻害能を有していることが明らかとなった。したがって、化合物（３），（４），（６）〜（１０）、（１２）〜（３３）のいずれか１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１型）に対して有効であることが分かる。
【０２１８】
さらに阻害能が確認された上記化合物のうち、インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１型）のノイラミニダーゼに対して阻害率３０％を上回る化合物としては、化合物（５）、（１０）、（１１）および（２５）を除いたすべての化合物であり、化合物（３），（４），（６）〜（９），（１２）〜（２４），（２６）〜（３３）の１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１型）に対して特に有効であることが分かる。
【０２１９】
さらに、阻害率４０％を上回る非常に有用な化合物としては、ガノデリックアシッドＳ（３）、ガノデリックアシッドＦ（４）、ガノデリックアシッドＬＭ２（６）、ガノデリックアシッドＤＭ（７）、ガノデリックアシッドＡＭ１（９）、ガノデリックアシッドＹ（１２）、ガノデリックアシッドＴＮ（１３）、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）、ガノルシシド酸Ａ（１５）、ガノデルマノントリオール（１６）、ガノデルマノンジオール（１７）、ガノデロールＡ（１８）、ガノデロールＢ（１９）、ルシルアルデヒドＡ（２１）、ルシルアルデヒドＢ（２２）、ガノデリックアシッドＣ１（２３）、ガノデリックアシッドＣ２（２４）、ガノデリックアシッドＨ（２６）、ガノデリックアシッドＫ（２７）、ガノデリックアシッドＴＲ（２８）、ガノデレン酸Ｄ（３１）、ガノデレン酸Ｆ（３２）およびガノデレン酸Ｈ（３３）であり、これらの化合物の１種または２種以上を有効成分として含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１型）に対して非常に有効であることが分かる。
【０２２０】
さらに、阻害率５０％を上回る極めて有用な化合物としては、化合物（３），（６），（７），（９），（１２）〜（１４），（１６）〜（１９）、（２１），（２２），（２４），（２６）〜（２８），（３１）〜（３３）であり、これらの化合物の１種または２種以上を有効成分として含有する抗インフルエンザ剤がインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１型）に対して極めて有用であることが分かる。同様に、阻害率６０％以上，７０％以上，８０％以上の各グループに含まれる化合物の１種または２種以上を有効成分として含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１型）に対して格別に有効であることが分かるが、特に阻害率９０％以上の非常に強力なＮＡ阻害能を有する化合物（ガノデリックアシッドＴＮ（１３）、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）、ガノデリックアシッドＴＲ（２８）の１種または２種以上を有効成分として含むＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤として、公知の抗インフルエンザ剤（タミフル）に匹敵する程度にインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１型）に対して有効であることが分かる。
【０２２１】
（５）ノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９型）に対する阻害能
表１０及び図９に示すよう、ノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９）に対して、化合物（１），（３）〜（３３）の全てが阻害能を有していることが明らかとなった。したがって、化合物（１），（３）〜（３３）のいずれか１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ７Ｎ９型）に対して有効であることが分かる。
【０２２２】
さらに阻害能が確認された上記化合物のうち、インフルエンザウイルス（Ｈ７Ｎ９型）のノイラミニダーゼに対して阻害率３０％を上回る化合物としては、ガノデリックアシッドＳ（３）、ルシルアルデヒドＢ（２２）、ガノデレン酸Ｄ（３１）、ガノデレン酸Ｆ（３２）およびガノデレン酸（３３）であり、これら化合物の１種または２種以上を含有するＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ７Ｎ９型）に対して特に有効であることが分かる。
【０２２３】
（マルチターゲット性）
より多種類のノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対して阻害能を発揮するということはＮＡ阻害剤や抗インフルエンザ剤の有効成分としての価値が高いといえる。表１０に示すように、例えば、ガノデリックアシッドＳ（３）、ガノデリックアシッドＤＭ（７）、ガノデリックアシッドＴＮ（１３）、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）、ガノデルマノンジオール（１７）、およびガノデリックアシッドＴＲ（２８）、等は、４種類のノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）型、Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型、Ｈ５Ｎ１型、Ｈ７Ｎ９型）のすべてに対して阻害能が高く優れており、化合物（３）、（７）、（１３），（１４）、（１７）および（２８）からなる群のいずれか１種または２種以上を有効成分として含むＮＡ阻害剤や抗インフルエンザ剤は、広範囲のインフルエンザに作用する非常に有用なＮＡ阻害剤、抗インフルエンザ剤であるといえる。
【０２２４】
同様に、例えば、ルシルアルデヒドＢ（２２）、ガノデリックアシッドＣ２（２４）、ガノデレン酸Ｄ（３１）、ガノデレン酸Ｆ（３２）およびガノデレン酸Ｈ（３３）からなる群のいずれか１種または２種以上を含むＮＡ阻害剤、抗インフルエンザ剤は、３種類のノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型、Ｈ５Ｎ１型、Ｈ７Ｎ９型）に対して有効に作用する優れたＮＡ阻害剤、抗インフルエンザ剤であることが分かる。
【０２２５】
［試験例４］（粗抽出物について）
霊芝（Ganoderma lingzhi）の粗抽出物のノイラミニダーゼに対する阻害効果を確かめるために、霊芝から各溶媒（クロロホルム、水、９９.５％エタノールおよび３０％エタノール）を用いて４種類の抽出物（クロロホルム抽出物、熱水抽出物、９９.５％エタノール抽出物および３０％エタノール抽出物）を調製した。
【０２２６】
（各抽出物の調製）
・クロロホルム抽出物(Chloroform-Ex.) 
クロロホルム抽出物の調製は、霊芝（Ganoderma lingzhi）のパウダー３２０ｇをクロロホルム（純度＞９９．９％、和光純薬）９．６Ｌに浸漬して３日間振盪し、振盪後のクロロホルムの溶液から溶媒のクロロホルム（沸点６１℃）を脱気とボイル（溶液温度＞６１℃）により除去することで、クロロホルム抽出物(Chloroform-Ex.)３．５８５ｇを調製した（収率１．１２％）。これをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に各濃度（１６０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬ）で溶解した。
【０２２７】
・熱水抽出物（水抽出物；Water-Ex.）
熱水抽出物の調製は、霊芝（Ganoderma lingzhi）３０ｇを蒸留水２００ｍＬに浸漬してオートクレーブ処理（２気圧の水蒸気により１２１℃で２０分間処理）し、オートクレーブ後に成分が抽出された水溶液から溶媒の水（沸点１００℃）をボイル（溶液温度；１００℃）により除去することで、熱水抽出物(Ｗater-Ex.)１．３５１ｇを調製した（収率：４．５％）。これをＤＭＳＯに各濃度（１６０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬ）で溶解した。
【０２２８】
・99.５％エタノール抽出物（Ethanol-Ex.）
99.５％エタノール抽出物（Ethanol-Ex.）の調製は、霊芝（Ganoderma lingzhi）５．０４７ｇを９９．５％エタノール（純度：９９．５％）１００ｍＬに浸漬して４８時間振盪抽出し、浸漬した液を吸引濾過し濾液を得た。この濾液から、溶媒であるエタノール（沸点７８．３７℃）を脱気とボイル（＞７９℃）により除去することで、エタノール抽出物(Ethanol-Ex.)を調製した。これをＤＭＳＯに各濃度（１６０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬ）で溶解した。
【０２２９】
・３０％エタノール抽出物（30%Ethanol-Ex.）
３０％エタノール抽出物（30%Ethanol-Ex.）の調製は、上記９９．５％エタノールから蒸留水を用いて３０％エタノールを調製し、霊芝（Ganoderma lingzhi）５．０３５ｇを前記３０．０％エタノール１００ｍＬに浸漬して４８時間振盪し、振盪後のエタノール溶液から溶媒の水およびエタノール（各沸点：１００℃、７８．３７℃）を脱気とボイル（＞１００℃）により除去することで、エタノール抽出物(Ethanol-Ex.)を調製した。これをＤＭＳＯに各濃度（１６０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬ）で溶解した。
【０２３０】
（ＮＡ阻害アッセイ）
各抽出物を図１の阻害剤として各種終濃度（４００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、１６００μｇ／ｍＬ）で用いることにより、各抽出物について試験例１と同様に各ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）型、Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型、Ｈ５Ｎ１型、Ｈ７Ｎ９型、Ｈ１Ｎ１型）に対する阻害アッセイ（図１参照）を行い、各抽出物の各種ノイラミニダーゼに対する阻害率（％）およびＩＣ50を算出し決定した。この結果を図１０〜図１３、図１５および表１１に示す。
【０２３１】
【表１１】
2019163292.tif 000055
【０２３２】
（結果・考察）
（１）ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）型）に対する阻害能
図１０に示すように、図１の阻害剤として用いた４種類の抽出物（クロロホルム抽出物（Chloroform-Ex.）、熱水抽出物(Water-Ex.)、９９.５％エタノール抽出物(Ethanol-Ex.)）および３０％エタノール抽出物(30%Ethanol-Ex.)）のいずれにもＤＭＳＯよりも相対蛍光強度（ＲＦＵ）が低い値となり、ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１、Ｎ２９５Ｓ）を阻害した。したがって、上記４種類の抽出物のいずれか１種または２種以上を含むＮＡ阻害剤,抗インフルエンザ剤はインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）に対する抗インフルエンザ剤として有用である。また、表１１に示すように、ノイラミニダーゼ（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ））に対しては９９．５％エタノール抽出物についてのＩＣ50値が最も低いことから、９９．５％エタノール抽出物を有効成分とするＮＡ阻害剤、或いは抗インフルエンザ剤がインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）型）に対して特に有効であることが分かる。
【０２３３】
（２）ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型）に対する阻害能
図１１に示すように、図１の阻害剤として用いた４種類の抽出物（クロロホルム抽出物（Chloroform-Ex.）、熱水抽出物(Water-Ex.)、９９.５％エタノール抽出物(Ethanol-Ex.)）のいずれにもＤＭＳＯよりも相対蛍光強度（ＲＦＵ）が低い値となり、ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ））を阻害した。したがって、上記４種類の抽出物のいずれか１種または２種以上を含むＮＡ阻害剤はインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型）に対する抗インフルエンザ剤として有用である。また、表１１に示すように、ノイラミニダーゼ（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型）に対しては水抽出物（熱水抽出物）と９９．５％エタノール抽出物についてのＩＣ50値が他に比べて低いことから、水抽出物（熱水抽出物）と９９．５％エタノール抽出物のいずれか１種または２種を有効成分とするＮＡ阻害剤、或いは抗インフルエンザ剤がインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）型）に対して特に有効であることが分かる。
【０２３４】
（３）ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１型）に対する阻害能
図１２に示すように、図１の阻害剤として用いた４種類の抽出物（クロロホルム抽出物（Chloroform-Ex.）、熱水抽出物(Water-Ex.)、９９.５％エタノール抽出物(Ethanol-Ex.)）のいずれにもＤＭＳＯよりも相対蛍光強度（ＲＦＵ）が非常に低い値となり、ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１）を強く阻害した。したがって、上記４種類の抽出物のいずれか１種または２種以上を含むＮＡ阻害剤はインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１型）に対する抗インフルエンザ剤として有用である。また、表１１に示すように、ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１）に対しては水抽出物（熱水抽出物）と９９．５％エタノール抽出物についてのＩＣ50値が他に比べて低いことから（ＩＣ５０＜５０μｇ／ｍＬ）、水抽出物（熱水抽出物）と９９．５％エタノール抽出物のいずれか１種または２種を有効成分とするＮＡ阻害剤、或いは抗インフルエンザ剤がインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１型）に対して特に有効であることが分かる。ここで、３０％エタノール抽出物のＩＣ５０値も５０μｇ／ｍＬであり、十分にＩＣ５０値が低いことから、水抽出物（熱水抽出物）、９９．５％エタノール抽出物および３０％エタノール抽出物のいずれか１種または２種以上を含むＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤として有用であることも分かる。
【０２３５】
（４）ノイラミニダーゼ（Ｈ７Ｎ９型）に対する阻害能
図１３に示すように、図１の阻害剤として用いた４種類の抽出物（クロロホルム抽出物、熱水抽出物、９９.５％エタノール抽出物および３０％エタノール抽出物）のいずれにもＤＭＳＯよりも相対蛍光強度（ＲＦＵ）が低い値となり、ＮＡ（Ｈ７Ｎ９）を阻害した。したがって、上記４種類の抽出物のいずれか１種または２種以上を含むＮＡ阻害剤はインフルエンザ（Ｈ７Ｎ９）に対する抗インフルエンザ剤として有用である。また、表１１に示すように、ＮＡ（Ｈ７Ｎ９）に対しては９９．５％エタノール抽出物と３０％エタノール抽出物についてのＩＣ50値が他に比べて低いことから、９９．５％エタノール抽出物と３０％エタノール抽出物のいずれか１種または２種を有効成分とするＮＡ阻害剤が抗インフルエンザ剤としてインフルエンザウイルス（Ｈ７Ｎ９型）に対して特に有効であることが分かる。
【０２３６】
（マルチターゲット性）
より多種類のノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対して阻害能を発揮するということはＮＡ阻害剤や抗インフルエンザ剤の有効成分としての価値が高いといえる。表１２に示すように、熱水抽出物（水抽出物）と９９．５％エタノール抽出物とが、ノイラミニダーゼ（NA(H1N1,N295S) 、NA(H3N2,E119V) 、NA(H5N1) 、NA(H7N9)）のすべてに対して阻害能が高く優れており、熱水抽出物と９９．５％エタノール抽出物のいずれか１種または２種以上を有効成分として含むＮＡ阻害剤や抗インフルエンザ剤は、広範囲のインフルエンザに作用する非常に有用なＮＡ阻害剤、抗インフルエンザ剤であるといえる。
【０２３７】
［試験例６］（ドッキングシミュレーション）
以下に示すように、インフルエンザウイルスに存在する異なるタイプのノイラミニダーゼ（H1N1型、H3N2型、H5N1型、H7N9型およびH1N1(N295S)型）の各ノイラミニダーゼ）の活性部位に対して演算機上(In Silico)で各化合物（１）〜（３３）をドッキングさせるドッキングシミュレーションを行った。
【０２３８】
このドッキングシミュレーションにより、化合物（１）〜（３３）のそれぞれについて各ノイラミニダーゼの活性部位への結合のしやすさ、阻害形式（拮抗阻害、非競合的阻害および不拮抗阻害のいずれの阻害形式であるか）を判別することができる。
【０２３９】
阻害剤のドッキング対象であるＡ型のインフルエンザウイルスの各ノイラミニダーゼ（H1N1型、H3N2型、H5N1型、H7N9型およびH1N1(N295S)型）の３次元構造を蛋白質構造データバンク（プロテインデータバンク：http://pdbj.org/）から取得した。
ドッキングシミュレーションには、ＰＣソフトウェア「CLC Drug Discovery Workbench」（CLC bio社）を用いた。
【０２４０】
＜構造活性相関解析（Streucute-activity relationship analysis）＞
（霊芝由来の）３３種類のトリテルペノイド（化合物（１）〜（３３））をその骨格構造の違いに基づいて３つのグループ（骨格構造Ａ〜Ｃ）に分けた。骨格構造Aは２つの２重結合（第７番目の炭素と第８番目の炭素との間の二重結合（Δ7,8）、第９番目の炭素と第１１番目の炭素との間の二重結合（Δ9,11））をテトラサイクリック環に有しており、また、カルボキシル基を有する分岐鎖を有しているものである。骨格構造Bは、１つの二重結合（第８番目の炭素と第９番目の炭素との間の二重結合（Δ8,9））をテトラサイクリック環に有しており、また、カルボキシル基を有する分岐鎖を有しているものである。骨格構造Cは、２つの二重結合（Δ7,8、Δ9,11）をテトラサイクリック環に有しており、また、分岐鎖にカルボキシル基を有していないものである。これら骨格構造Ａ〜Ｃおよびそれらの化合物のＮＡ阻害能を比較・解析した。
【０２４１】
【化４２】
2019163292.tif 000056
【０２４２】
化合物（１）〜（３３）並びに臨床的に使用されているタミフル（登録商標）、リレンザ（登録商標）及びラミナミビルの各３次元構造を、インフルエンザウイルスの５つのサブタイプが有するノイラミニダーゼ（H1N1型、H3N2型、H5N1型、H7N9型およびH1N1(N295S)型の各ノイラミニダーゼ）の３次元構造（水不存在下における３次元構造）に対してドッキングさせるシミュレーションを行った。なお、該シミュレーションでは、タミフルとノイラミニダーゼとの共結晶からノイラミニダーゼと基質とが結合する際にノイラミニダーゼ(ＮＡ)上の基質結合部位のポケットを特定し、その結合部位となるポケットを含む半径１０オングストロームの球状部位を阻害剤（化合物（１）〜（３３）、リレンザ等）の結合ターゲットとして選択した。
【０２４３】
（結果と考察）
ドッキングシミュレーションで行った構造活性相関解析（Structure-activity relationship analysis；SAR）の結果を図５−１〜図５−２および表１２に示した。構造活性相関解析の結果は明確ではないが、該結果からNA阻害にとって重要な化学構造についてのいくつかの知見が得られた。
【０２４４】
６つのトリテルペノイド（化合物（１４）、（２８）、（１３）、（３）、（２２）および（１７））のうち４つ（化合物（１４）、（２８）、（１３）、（３））が、骨格構造Aのグループに属していた。このことは、骨格構造Aがこれらのトリテルペノイドのノイラミニダーゼ阻害活性に必要であることを示唆している。骨格構造B、Cを有するグループについては、R１が酸素である場合に、殆どの場合でそれらは低いNA阻害活性を示すか活性を示さなかった。
【０２４５】
【表１２】
2019163292.tif 000057
【０２４６】
上記表１２にドッキングシミュレーションの結果をスコア（Kcal/mol）として示した。ここで、ドッキングスコアがマイナスで、その絶対値が大きいほど、リガンド（阻害剤）と標的蛋白質（ノイラミニダーゼ）との親和性が高いことを意味する（ノイラミニダーゼと阻害剤の２分子間で反発するエネルギーが小さく分子同士が強く結合しやすいことを意味する）。
【０２４７】
上記表６の結果は、ガノデリックアシッドＴ−ＱやガノデリックアシッドＴＲがタミフル等の公知のＮＡ阻害剤に近い、低いドッキングスコア（強い結合力）を有していることを示している。この事実は、ドッキングシュミレーション自体がタミフルとノイラミニダーゼ（NA）との結合部位と同じNA上の結合部位に、タミフルに代えてガノデリックアシッドＴ−ＱやガノデリックアシッドＴＲ等をドッキングさせて、そのドッキングスコア(Kcal/mol)を求めたものであるから、ガノデリックアシッドＴＱ（１４）やガノデリックアシッドＴＲ（２８）がタミフル等と同じ結合部位を介してノイラミニダーゼに結合していることを示唆している。すなわち、ガノデリックアシッドＴ−ＱやガノデリックアシッドＴＲもタミフル等と同様にノイラミニダーゼに対して基質と競合してノイラミニダーゼ（NA）の活性を阻害する競合的阻害をすることを示唆している。なお、阻害剤が結合部位（基質が酵素ノイラミニダーゼと結合するだけの酵素の部位）は、ノイラミニダーゼの活性部位（基質が結合し化学反応が進む酵素ノイラミニダーゼ上の部位）の中に存在する。
【０２４８】
ガノデリックアシッドTR（２８）は、インフルエンザウイルス（H３N２型、H５N１型、H７N９型およびタミフル耐性のH１N１型）由来の各ノイラミニダーゼに対して、低いドッキングスコアを有している。この結果は、ガノデリックアシッドTR（２８）がヒトや鳥類のインフルエンザについて有効であることを示唆しているだけでなく、ひいてはタミフル等の公知の薬剤に対して耐性のあるインフルエンザを含む他のインフルエンザのサブタイプについても有効である可能性があることを示唆している。
【０２４９】
［試験例７］
（各抽出物の用意）
・霊芝の熱水抽出物
上記試験例４と同じ霊芝の熱水抽出物を用いた。この霊芝（Ganoderma lingzhi）の熱水抽出物を溶媒ＤＭＳＯに溶解して、１６００μｇ／ｍＬの熱水抽出物の溶液をそれぞれ調製した。
・霊芝のクロロホルム抽出物
上記試験例４と同じ霊芝のクロロホルム抽出物を用いた。さらに、該クロロホルム抽出物を溶媒ＤＭＳＯに溶解して濃度１６００μｇ／ｍＬのクロロホルム抽出物の溶液をそれぞれ調製した。
【０２５０】
（方法）  試験例１で用いた「DMSOに溶解した各化合物（１）〜（３３）（濃度０μＭ，２５μＭ，５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ）１μL」の代わりに、上記熱水抽出物の溶液（濃度：１６００μｇ／ｍＬ）１μＬ、またはクロロホルム抽出物の溶液（濃度：１６００μｇ／ｍＬ）１μＬを用いて、試験例１と同様にそれぞれ熱水抽出物またはクロロホルム抽出物のＮＡ阻害率、ＩＣ50値の測定を行った。
【０２５１】
（結果・考察）
霊芝（Ganoderma lingzhi）の粗抽出物は、多くの成分を含んでいる。霊芝（Ganoderma lingzhi）のクロロホルム抽出物および熱水抽出物は、双方とも高濃度でノイラミニダーゼの活性に対してわずかに阻害効果を示した（図１５）。
【０２５２】
（結論）
ガノデリックアシッドT−QおよびガノデリックアシッドTRのノイラミニダーゼの阻害効果を確認することができた。上記抽出物はノイラミニダーゼ活性に対して弱い阻害効果を示したが、他のメカニズムを通じたインフルエンザの増殖等を防ぐ機構解明に用いることができるかもしれない。
【０２５３】
以上、本発明に係るノイラミニダーゼ阻害剤について、各試験例等に基づいて詳細に説明してきたが、本発明は上記実施形態等に限定されず、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨を逸脱しないかぎり、設計変更は許容される。
【図１】
2019163292.tif 000058
【図２】
2019163292.tif 000059
【図３】
2019163292.tif 000060
【図４】
2019163292.tif 000061
【図５−１】
2019163292.tif 000062
【図５−２】
2019163292.tif 000063
【図６】
2019163292.tif 000064
【図７】
2019163292.tif 000065
【図８】
2019163292.tif 000066
【図９】
2019163292.tif 000067
【図１０】
2019163292.tif 000068
【図１１】
2019163292.tif 000069
【図１２】
2019163292.tif 000070
【図１３】
2019163292.tif 000071
【図１４】
2019163292.tif 000072
【図１５】
2019163292.tif 000073
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月12日(2019.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される基本骨格構造を有するトリペノイド類を含むことを特徴とする、ノイラミニダーゼ阻害剤。
【化１】
2019163292.tif 000074
[ここでＲ１は＝Ｏまたは−ＯＨ、Ｒ５は−Ｈ、−ＯＣＯＣＨ3、または−ＯＨを示す]
【請求項２】
前記トリペノイド類は、ガノデリックアシッドＳ、ガノデリックアシッドＴＮ、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ、およびガノデリックアシッドＴＲからなる群から選択される少なくとも１種のトリペノイド類である、請求項１に記載のノイラミニダーゼ阻害剤。
【請求項３】
前記トリペノイド類と、ノイラミニダーゼとの構造活性相関解析によるドッキングスコア（Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）がマイナスの値である、請求項１または２に記載のノイラミニダーゼ阻害剤。
【請求項４】
前記トリペノイド類は、ガノデリックアシッドＴ−ＱおよびガノデリックアシッドＴＲから選択される少なくとも一種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のノイラミニダーゼ阻害剤。
【請求項５】
トリペノイド類としてガノデリックアシッドＤＭを含むことを特徴とする、ノイラミニダーゼ阻害剤。
【請求項６】
前記トリペノイド類が９８％を超える純度で含まれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のノイラミニダーゼ阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のノイラミニダーゼ阻害剤を有効成分とする、インフルエンザの感染予防、またはインフルエンザの症状の進行の抑制もしくは軽減のための抗インフルエンザ剤。
【請求項８】
前記症状が、肺炎、急性脳症、ライ症候群、心合併症、急性筋炎、中耳炎、結膜炎、副鼻腔炎、または心筋炎である、請求項７に記載の抗インフルエンザ剤
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
【化３８】
2019163292.tif 000075
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）とガノデリックアシッドＴＲ（２８）とを、インフルエンザウイルスの異なるサブタイプ（Ｈ１Ｎ１／Ｈ１Ｎ１（Ｎ２９５Ｓ）／Ｈ３Ｎ２（Ｅ１１９Ｖ）／Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９）に由来する５つのノイラミニダーゼの３次元構造とドッキングさせた場合に得られるドッキングスコアは、いずれも公知のＮＡ阻害剤（タミフル等）と同程度のマイナス値であることから（表１２参照）、タミフル等と同じようにノイラミニダーゼの基質と競合してノイラミニダーゼの活性部位のポケットの中に入り込んでノイラミニダーゼ(ＮＡ)を阻害する。そのため、本願発明に係るノイラミニダーゼは、タミフル等の公知のＮＡ阻害剤と同様に競合的にＮＡを阻害する抗インフルエンザ剤として用いることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
【化４１】
2019163292.tif 000076
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
【化４２】
2019163292.tif 000077
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2019163292.tif 000078