(57)【要約】【課題】可溶性生物製剤、治療薬およびイメージング剤をカプセル化するためのプロセスの提供。【解決手段】水性の可溶性種をコポリマーと共に、親水性の極性コアおよびより極性の低いシェルを有するナノ粒子として沈殿させる、「逆」沈殿経路が記載される。迅速な制御された沈殿を使用して水溶性分子をカプセル化する本発明の方法が提示される。ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、非生物製剤治療薬、多糖ベースの治療薬（例えば、トブラマイシン）およびイメージング剤を含む水溶性分子が、コポリマー安定剤により保護されているナノ粒子へと沈殿する。これらの粒子は共有結合的または非共有結合的に安定化され得る。上記粒子は、両親媒性ポリマーで被覆さてもよいし、または微粒子またはより大きいモノリスにプロセシングされてもよい。最終構築物へのポストプロセシングを行ってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
線形コポリマーのより極性の高い領域および水溶性物質を含むコア、ならびに
該線形コポリマーのより極性の低い領域を含むシェル
を含むナノ粒子であって、ここで、
該コア内の該コポリマーの該より極性の高い領域が架橋剤によって架橋されている、ナノ粒子。
【請求項２】
請求項１に記載のナノ粒子であって、
コーティングをさらに含み、
該コーティングが、内側領域および外側領域を含み、
該内側領域が、両親媒性ポリマーの疎水性領域を含み、
該外側領域が、該両親媒性ポリマーの親水性領域を含む、
ナノ粒子。
【請求項３】
前記線形コポリマーがジブロックコポリマーである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記線形コポリマーが疎水性ブロックとカップリングした親水性ブロックからなる、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記線形コポリマーの前記より極性の高い領域がアニオン性のより極性の高い領域を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記アニオン性のより極性の高い領域が、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ヒアルロン酸、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、または組合せを含む、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記線形コポリマーの前記より極性の高い領域がカチオン性のより極性の高い領域を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記カチオン性のより極性の高い領域が、キトサン、ヒスタジン脂質、ヒスタミン、スペルマジン、ポリエチレンイミン、または組合せを含む、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記線形コポリマーのより極性の低い領域が、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、または組合せを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記線形コポリマーがポリ（アクリル酸）−ブロック−ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡ）である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記線形コポリマーがポリ（アクリル酸）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＡＡ−ｂ−ＰＥＧ）である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記線形コポリマーが生分解性である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
請求項１に記載のナノ粒子であって、
前記コポリマーがブロックコポリマーであり、
該コポリマーの前記より極性の高い領域がポリ（グルタミン酸）および／またはポリ（アスパラギン酸）からなり、そして
該コポリマーの前記より極性の低い領域がポリ（乳酸）（ＰＬＡ）またはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）からなる、
ナノ粒子。
【請求項１４】
少なくとも１００ｎｍの平均サイズを有する、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記コア内の前記コポリマーの前記より極性の高い領域が、非共有結合架橋によって架橋されている、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記コア内の前記コポリマーの前記より極性の高い領域が、キレート化架橋によって架橋されている、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記コア内の前記コポリマーの前記より極性の高い領域が、水素結合によって架橋されている、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
請求項１に記載のナノ粒子であって、
前記線形コポリマーの前記より極性の高い領域がアニオン官能性の部分を含み、そして
前記架橋剤が前記線形コポリマーの前記より極性の高い領域の前記アニオン官能性の部分を架橋する、
ナノ粒子。
【請求項１９】
前記架橋剤が、金属塩および金属ハロゲン化物からなる群から選択される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
前記架橋剤が、アルカリ土類金属ハロゲン化物、ハロゲン化マグネシウム、塩化マグネシウム、ハロゲン化カルシウム、塩化カルシウム、遷移金属ハロゲン化物、ハロゲン化鉄および臭化クロム（ＩＩＩ）からなる群から選択される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
前記架橋剤が塩化鉄（ＩＩＩ）である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
前記架橋剤が、金属酢酸塩、アルカリ土類酢酸塩、酢酸カルシウムおよび遷移金属酢酸塩からなる群から選択される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項２３】
前記架橋剤が酢酸クロム（ＩＩＩ）（塩基性酢酸クロム）である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項２４】
前記架橋剤がトブラマイシンである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項２５】
請求項１に記載のナノ粒子であって、
前記線形コポリマーの前記より極性の高い領域がカチオン官能性の部分を含み、そして
前記架橋剤が該コポリマーの該より極性の高い領域の該カチオン官能性の部分を架橋する、
ナノ粒子。
【請求項２６】
前記架橋剤が、ポリクエン酸、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸からなる群から選択される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項２７】
前記水溶性物質が、生物製剤材料、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、グルタチオン、トリプトファン、リゾチーム、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、水溶性小分子治療薬、トブラマイシン、バンコマイシン、イメージング剤、エオシン、エオシンＹ、タルトラジン、金属キレート、ガドリニウムキレート、およびガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸（ＧＤ−ＤＴＰＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項２８】
前記両親媒性ポリマーが、ブロックコポリマー、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、およびマルチブロックコポリマーからなる群から選択される、請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項２９】
前記両親媒性ポリマーが、ポリスチレン−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（乳酸）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（カプロラクトン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ）、およびポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＰＯ−ｂ−ＰＥＯ）からなる群から選択される、請求項２に記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年６月２４日に出願された米国仮出願第６２／０１６，３６３号の利益を主張する。その明細書は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、親水性コアを有するナノ粒子を作製するプロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
タンパク質およびペプチド治療薬は、医薬品市場における成長中の部分である。２００１年から２０１２年までの１１年間で、医薬生物製剤治療薬（生物製剤）の世界的規模の販売額は、３６０億ドルから１６３０億ドルへと３倍超になった。同期間において、上位１０種の市販の医薬品のうち生物製剤によりもたらされた収入は７％から７１％に増大した（S.  Peters、Biotech  Products  in  Big  Pharma  Clinical  Pipelines  Have  Grown  Dramatically、Tufts  CSDD  Impact  Report  １５巻（２０１３年）１頁）。これらは、その特異性のため、がんおよびＡＩＤＳを含む様々な疾患の治療のための理想的な治療薬となっている。この特異性は、治療薬として使用される生物製剤の強さである構造的複雑さと、それらを製剤化し送達しようとする挑戦の結果として生じたものである（S.  Mitragotri、P.A.  Burke、R.  Langer、Overcoming  the  challenges  in  administering  biopharmaceuticals:  formulation  and  delivery  strategies、Nat  Rev  Drug  Discov.  １３巻（２０１４年）６５５〜６７２頁）。
【０００４】
ヒト化抗体は長期にわたり循環し得るが、タンパク質およびペプチドは腎クリアランスまたは酵素的分解によってわずか数分で血流から取り除かれる可能性がある（A.K.  Sato、M.  Viswanathan、R.B.  Kent、C.R.  Wood、Therapeutic  peptides:  technological
advances  driving  peptides  into  development、Curr.  Opin.  Biotechnol.  １
７巻（２００６年）６３８〜６４２頁）。したがって、送達および放出の延長は、生物製剤のナノキャリア（ＮＣ）またはミクロキャリア（ＭＣ）中へのカプセル化を必要とする可能性がある。ＮＣは、注射可能な製剤として見込みのあるものとなる４００ｎｍ未満のサイズを有すると定義することができ、ＭＣは、デポー送達に適するように１〜１０ミクロンを超えるサイズを有すると定義することができる。ＮＣおよびＭＣに求められることは、高ローディング、高いカプセル化効率、および生物製剤治療薬の適正な放出プロファイルである。
用語「生物製剤」は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチド抗生物質、タンパク質、および抗体を含む幅広い治療薬を包含することができる。例えば、ペプチドは１〜４０のアミノ酸の配列を含み得る。最近、生物製剤の経口送達に関して有望な進歩があったが、粘液層を通り、さらにＧＩ（胃腸）管上皮層を通過してＮＣを移動させる際の困難さのため、この分野は非経口投与ほど開発されていない。しかしながら、ＮＣ製剤に関する原理は経口または非経口のＮＣに等しく当てはまる。キャリアの例としては、水溶性のポリマーで構成されるヒドロゲルキャリアおよび疎水性または固体のマトリックスで構成される非膨潤性キャリアが挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】S.  Peters、Biotech  Products  in  Big  Pharma  Clinical  Pipelines  Have  Grown  Dramatically、Tufts  CSDD  Impact  Report  １５巻（２０１３年）１頁
【非特許文献２】S.  Mitragotri、P.A.  Burke、R.  Langer、Overcoming  the  challenges  in  administering  biopharmaceuticals:  formulation  and  delivery  strategies、Nat  Rev  Drug  Discov.  １３巻（２０１４年）６５５〜６７２頁
【非特許文献３】A.K.  Sato、M.  Viswanathan、R.B.  Kent、C.R.  Wood、Therapeutic  peptides:  technological  advances  driving  peptides  into  development、Curr.  Opin.  Biotechnol.  １７巻（２００６年）６３８〜６４２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
迅速な制御された沈殿を使用して水溶性分子をカプセル化するための本発明の方法が提示される。ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、非生物製剤治療薬、多糖ベースの治療薬（例えば、トブラマイシン）およびイメージング剤を含む水溶性分子は、コポリマー安定剤により保護されたナノ粒子内に沈殿する。これらの粒子は共有結合的または非共有結合的に安定化され得る。粒子は、両親媒性ポリマーで被覆されてもよいし、または微粒子もしくはより大きいモノリス（monolith）にプロセシングされてもよい。最終構築物へのポストプロセシングを行ってもよい。
【０００７】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法は、水溶性物質およびコポリマーを極性のプロセス溶媒に溶解して第１のプロセス溶液を形成することを含む。第１のプロセス溶液を非プロセス溶媒と連続的に混合し、混合溶液を形成して、それからナノ粒子を集合させ、沈殿させることができる。コポリマーはより極性の高い少なくとも１つの領域およびより極性の低い少なくとも１つの領域を含むことができる。非プロセス溶媒は、極性のプロセス溶媒より極性が低いかまたはそれより極性が低くなければならない。ナノ粒子はコアおよびシェルを含むことができる。コアは、コポリマーのより極性の高い領域および水溶性物質を含むことができる。シェルはコポリマーのより極性の低い領域を含むことができる。混合により、極性のプロセス溶媒の２０容量パーセント以下を相分離させることができる。
【０００８】
本発明の方法において、水溶性物質は、生物製剤材料、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、グルタチオン、トリプトファン、リゾチーム、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、小分子治療薬、トブラマイシン、バンコマイシン、イメージング剤、エオシンＹ、タルトラジン、金属キレート、ガドリニウムキレート、ガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸（ＧＤ−ＤＴＰＡ）、または組合せであることができる。
【０００９】
例えば、コポリマーは、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、マルチブロックコポリマー、または櫛形分岐コポリマーであることができる。例えば、コポリマーは、少なくとも１つのより極性の高い領域（極性がより高い領域）を含むことができる。コポリマーの少なくとも１つのより極性の高い領域は少なくとも１つのアニオン性のより極性の高い領域を含むことができる。例えば、このアニオン性のより極性の高い領域はアニオン性残基（ユニットまたはモノマー）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ヒアルロン酸、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、または組合せを含むことができる。
【００１０】
例えば、コポリマーの少なくとも１つのより極性の高い領域は少なくとも１つのカチオン性のより極性の高い領域を含むことができる。例えば、このカチオン性のより極性の高い領域は、キトサンポリマードメイン、ヒスタジン（histadine）脂質、ヒスタミン、スペルマジン（spermadine）、ポリエチレンイミン、または組合せのようなカチオン性残基を含み得る。例えば、コポリマーは、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、脂質もしくはリン脂質グラフト化単位、もしくはコレステロールグラフト化単位、または組合せを含む少なくとも１つのより極性の低い領域（極性がより低い領域）を含むことができる。例えば、コポリマーはポリ（アクリル酸）−ブロック−ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡ）であることができる。
【００１１】
本発明の方法において、極性のプロセス溶媒は、水、アルコール、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、または組合せであることができる。
【００１２】
本発明の方法において、非プロセス溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン、アルカン、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトン、または組合せであることができる。例えば、非プロセス溶媒はクロロホルム、アセトン、または組合せであることができる。例えば、極性のプロセス溶媒および非プロセス溶媒は混和性であることができる。
【００１３】
本発明の方法において、プロセス溶液を非プロセス溶媒と混合する時間は、ナノ粒子の集合時間より短い。例えば、水溶性物質およびコポリマーは、１０〜１０，０００の範囲の溶液中過飽和レベルを有することができる。例えば、ナノ粒子は約４０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲のサイズを有することができる。
【００１４】
本発明の方法は、コポリマーの架橋によってナノ粒子コアを安定化することを含む。例えば、ナノ粒子は、ナノ粒子の集合中に架橋されてもよい。例えば、ナノ粒子は、ナノ粒子の集合後に架橋されてもよい。架橋は共有結合性架橋であることができる。架橋は非共有結合、イオン性、キレート化、酸−塩基、または水素結合架橋であることができる。
【００１５】
架橋剤が添加されて、コポリマーが架橋されてもよい。例えば、架橋剤が添加されて、コポリマーのアニオン官能性の部分が架橋されてもよい。例えば、架橋剤はアルカリ土類ハロゲン化物、ハロゲン化マグネシウム、塩化マグネシウム、ハロゲン化カルシウム、塩化カルシウム、遷移金属ハロゲン化物、ハロゲン化鉄、塩化鉄（ＩＩＩ）、スペルミン、または組合せであることができる。例えば、架橋剤は金属酢酸塩、アルカリ土類酢酸塩、遷移金属酢酸塩、酢酸カルシウム、または組合せであることができる。例えば、架橋剤は酢酸クロム（ＩＩＩ）、または別のクロム（ＩＩＩ）塩であることができる。例えば、水溶性物質はトブラマイシンを含むことができ、トブラマイシンはコポリマーを架橋することができる。他の生体適合性の多カチオン性水溶性物質を架橋剤として使用して、例えばコポリマーのアニオン性セクションを架橋することができる。
【００１６】
極性物質がカチオン性の官能基を含む場合、架橋はポリ−アニオン性の成分の添加によって達成され得る。これらの例はポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ヒアルロン酸、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、クエン酸、ポリクエン酸、アニオン性オリゴヌクレオチド、および多価アニオンである。
【００１７】
本発明の方法は、ナノ粒子を両親媒性ポリマーでコーティングすることを含み、両親媒性ポリマーは、少なくとも１つの親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域を含む。両親媒性ポリマーを水混和性有機溶媒に溶解して、第２のプロセス溶液を形成することができる。ナノ粒子は、第２のプロセス溶液に溶解させる、懸濁させる、またはその他の方法で含ませることができる。第２のプロセス溶液を水性溶媒と連続的に混合し、第２の混合溶液を形成して、それから被覆されたナノ粒子を集合させ、沈殿させることができる。被覆されたナノ粒子は、コア、シェル、およびコーティングを含むことができる。コーティングは、内側領域および外側領域を含むことができる。内側領域は、両親媒性ポリマーの少なくとも１つの疎水性領域を含むことができる。外側領域は、両親媒性ポリマーの少なくとも１つの親水性領域を含むことができる。
【００１８】
両親媒性ポリマーは、ランダムコポリマー、グラフトコポリマー、ブロックコポリマー、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、またはマルチブロックコポリマーであることができる。例えば、両親媒性ポリマーは、ポリスチレン−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（乳酸）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（カプロラクトン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＰＯ−ｂ−ＰＥＯ）、またはポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブチレンオキシド）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＯ−ｂ−ＰＥＯ）であることができる。
【００１９】
水混和性有機溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および／またはアセトンを含むことができ、水性溶媒は水であることができる。
【００２０】
本発明のある実施形態では、ナノ粒子は、コポリマーのより極性の高い領域および水溶性物質およびコポリマーのより極性の低い領域を含むシェルを含むことができる。コア中のコポリマーのより極性の高い領域は架橋することができる。ナノ粒子はまたコーティングも含むことができる。コーティングは、内側領域および外側領域を含むことができる。内側領域は両親媒性ポリマーの疎水性領域を含むことができる。外側領域は両親媒性ポリマーの親水性領域を含むことができる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
水溶性物質をカプセル化する方法であって、
該水溶性物質およびコポリマーを極性のプロセス溶媒に溶解して第１のプロセス溶液を形成すること、および
該第１のプロセス溶液を非プロセス溶媒と連続的に混合し、混合溶液を形成して、それからナノ粒子を集合させ、沈殿させること
を含み、
該コポリマーは、より極性の高い少なくとも１つの領域およびより極性の低い少なくとも１つの領域を含み、
該非プロセス溶媒は、該極性のプロセス溶媒より極性が低く、
該ナノ粒子は、コアおよびシェルを含み、
該コアは、該コポリマーの該より極性の高い領域および該水溶性物質を含み、
該シェルは、該コポリマーの該より極性の低い領域を含み、
該混合により、該極性のプロセス溶媒の２０容量パーセント以下が該混合溶液から相分離する、方法。
（項目２）
前記水溶性物質が、生物製剤材料、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、グルタチオン、トリプトファン、リゾチーム、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、小分子治療薬、トブラマイシン、バンコマイシン、イメージング剤、エオシン、エオシンＹ、タルトラジン、金属キレート、ガドリニウムキレート、およびガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸（ＧＤ−ＤＴＰＡ）からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記コポリマーが、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、マルチブロックコポリマー、および櫛形分岐コポリマーからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記コポリマーの前記少なくとも１つのより極性の高い領域が、少なくとも１つのアニオン性のより極性の高い領域を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記少なくとも１つのアニオン性のより極性の高い領域が、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ヒアルロン酸、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、または組合せを含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記コポリマーの前記少なくとも１つのより極性の高い領域が、少なくとも１つのカチオン性のより極性の高い領域を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記少なくとも１つのカチオン性のより極性の高い領域が、キトサン、ヒスタジン脂質、ヒスタミン、スペルマジン、ポリエチレンイミン、または組合せを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記コポリマーの前記少なくとも１つのより極性の低い領域が、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、または組合せを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記コポリマーが、ポリ（アクリル酸）−ブロック−ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡ）である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記極性のプロセス溶媒が、水、アルコール、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、および組合せからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記極性のプロセス溶媒が、メタノール、ＤＭＳＯ、水、および組合せからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記非プロセス溶媒が、クロロホルム、ジクロロメタン、アルカン、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトン、および組合せからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記非プロセス溶媒が、クロロホルム、アセトン、および組合せからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記極性のプロセス溶媒および前記非プロセス溶媒が混和性である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記プロセス溶液を前記非プロセス溶媒と混合する時間が、前記ナノ粒子の集合時間未満である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記水溶性物質および前記コポリマーが、１０〜１０，０００の範囲の溶液中過飽和レベルを有する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲のサイズを有する、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記コポリマーを架橋することによって前記ナノ粒子のコアを安定化することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記ナノ粒子が、該ナノ粒子の集合中に架橋される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ナノ粒子が、該ナノ粒子の集合後に架橋される、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記架橋が、共有結合性架橋である、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記架橋が、非共有結合、イオン性、キレート化、酸−塩基、または水素結合架橋である、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
架橋剤が添加されて、前記コポリマーのアニオン官能性の部分が架橋され、
前記架橋剤が、アルカリ土類ハロゲン化物、ハロゲン化マグネシウム、塩化マグネシウム、ハロゲン化カルシウム、塩化カルシウム、遷移金属ハロゲン化物、ハロゲン化鉄、塩化鉄（ＩＩＩ）、スペルミン、および組合せからなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
架橋剤が添加されて、前記コポリマーのアニオン官能性の部分が架橋され、
該架橋剤が、金属酢酸塩、アルカリ土類酢酸塩、遷移金属酢酸塩、および酢酸カルシウムからなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
架橋剤が添加されて、前記コポリマーのアニオン官能性の部分が架橋され、
該架橋剤が酢酸クロム（ＩＩＩ）である、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
前記水溶性物質がトブラマイシンを含み、
該トブラマイシンが前記コポリマーを架橋する、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
架橋剤が添加されて、前記コポリマーのカチオン官能性の部分が架橋され、
該架橋剤が、ポリクエン酸、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、多価アニオン、および組合せからなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２８）
前記ナノ粒子を両親媒性ポリマーでコーティングすることをさらに含み、
該両親媒性ポリマーが、少なくとも１つの親水性領域および少なくとも１つの疎水性領域を含む、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記両親媒性ポリマーを溶解し、前記ナノ粒子を水混和性有機溶媒に懸濁して、第２のプロセス溶液を形成すること、
該第２のプロセス溶液を水性溶媒と連続的に混合し、第２の混合溶液を形成して、それから被覆されたナノ粒子を集合させ、沈殿させること
を含み、
該被覆されたナノ粒子が、コア、シェル、およびコーティングを含み、
該コーティングが、内側領域および外側領域を含み、
該内側領域が、該両親媒性ポリマーの該少なくとも１つの疎水性領域を含み、
該外側領域が、該両親媒性ポリマーの該少なくとも１つの親水性領域を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記両親媒性ポリマーが、ランダムコポリマー、グラフトコポリマー、ブロックコポリマー、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、およびマルチブロックコポリマーからなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記両親媒性ポリマーが、ポリスチレン−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（乳酸）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（カプロラクトン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ）、およびポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＰＯ−ｂ−ＰＥＯ）からなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記水混和性有機溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および／またはアセトンを含み、
前記水性溶媒が水である、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
コポリマーのより極性の高い領域および水溶性物質を含むコア、ならびに
該コポリマーのより極性の低い領域を含むシェル
を含み、
該コア内の該コポリマーの該より極性の高い領域が架橋されている、ナノ粒子。
（項目３４）
コーティングをさらに含み、
該コーティングが、内側領域および外側領域を含み、
該内側領域が、両親媒性ポリマーの疎水性領域を含み、
該外側領域が、該両親媒性ポリマーの親水性領域を含む、項目３３に記載のナノ粒子。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明によるナノ粒子の生成におけるステップを示す。「逆」ナノ粒子は、水溶性物質を含む親水性コアおよびより極性の低いシェルを有するナノ粒子２０１に集合するコポリマーから形成することができる。コアを架橋して、架橋されたコアを有する「逆」ナノ粒子３０１を形成することができる。「逆」ナノ粒子を両親媒性ポリマーで被覆して、水性溶液中で安定な構造体４０１を生成することができる。
【００２２】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄは、フラッシュナノ沈殿（Ｆｌａｓｈ  ＮａｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）プロセスにおけるパラメーターの変動が形成されるナノ粒子の直径をどのように制御することができるかを示す。
【図２Ｃ−Ｄ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄは、フラッシュナノ沈殿（Ｆｌａｓｈ  ＮａｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）プロセスにおけるパラメーターの変動が形成されるナノ粒子の直径をどのように制御することができるかを示す。
【００２３】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄは、種々の水溶性物質をカプセル化して形成されたナノ粒子のセットごとの粒径分布を示す。
【図３Ｃ−Ｄ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄは、種々の水溶性物質をカプセル化して形成されたナノ粒子のセットごとの粒径分布を示す。
【００２４】
【図４】図４は、被覆されてない粒子のクロロホルム（ＣＨＣｌ３）中における、被覆されてない粒子のメタノール（ＭｅＯＨ）中における、および被覆された粒子の水中における粒径分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。実施形態を記載する際に、明確にする目的で特定の専門用語を用いる。しかしながら、本発明はそのように選択された特定の専門用語に限定されることを意図しない。本発明の本質と範囲から逸脱することなく、他の等価な部品を用いることができ、他の方法を開発できることが当業者には認識されるものとする。本明細書中で引用される参考文献は全て、参照により、各々が個別に組み込まれているかのように組み込まれる。
【００２６】
ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡを含む可溶性の治療薬および生物製剤のカプセル化および送達は難題である。生物製剤は低い安定性、迅速なクリアランス時間、免疫認識、高コストを示す可能性がある。可溶性の治療薬を制御された様式で放出することができ、その治療薬を分解、クリアランス、および免疫認識から保護するナノ粒子、微粒子、およびより大きいモノリスが望まれている。現在、生物製剤は一般に注射により送達されており、したがって制御された放出は薬物投与の頻度を低下させ、患者のコンプライアンスを上昇させ得る。
【００２７】
米国特許第８，１３７，６９９Ｂ２号に記載されている迅速な沈殿プロセスによってナノ粒子を作製することは可能であった。しかしながら、これら以前の例では、混合の際に水相の外に沈殿する疎水性コア材料を含んだ。プロセスを完全に逆転させ、水溶性の化合物を疎水性の溶液中に沈殿させることができるとは予想されなかった。極性の成分が粒子のコアの内部に配向され、疎水性のより極性の低い成分がより極性の低い溶液相中に配向されて、結果として安定な粒子が得られるように、反対の方法でコポリマーを使用することができるとは予想されなかった。
【００２８】
本明細書では、用語「ナノ粒子」、「粒子」、および「ナノキャリア」は、文脈により区別が示されない限り互換的に使用される。親水性またはより極性の高いコアを有する本発明による粒子は、疎水性またはより極性の低いコアを有する粒子と対照させるために「逆粒子」と呼ばれることがある。しかしながら、簡潔にするために、本発明による親水性またはより極性の高いコアを有する粒子が論じられていることが文脈により示されるとき、これらは単に「粒子」または「ナノ粒子」と呼ばれることもある。
【００２９】
生物製剤の長期にわたる放出のための注射可能なポリマー性デポーの開発は、生物製剤の安定性、カプセル化効率、ローディング、および放出プロファイル、ならびに製造の容易さおよびスケーラビリティーを最適化する複雑な工学的課題である。すなわち、生物製剤のための送達系は生物製剤を保護し、その放出を延長し、そのクリアランス時間を短縮し、かつその投与の頻度を低減し、また目的の組織（複数可）を標的とするべきである。ヒドロゲルベースの送達系における水性のプロセシング条件および疎水性界面の欠如のため、これらはタンパク質の安定性を維持するのに適している。しかしながら、これらの系からの拡散制御された放出のため、数ヶ月またはそれより長い期間にわたって生物製剤を放出することができる分解性の注射可能なゲルを生成するのは困難になる。疎水性の足場はより長期にわたる放出に適合しているが、製剤化方法はほとんどの大きいタンパク質にとって厳し過ぎる可能性がある。ナノキャリアを形成するための二重エマルション方法において、別のパラメーターに負の影響を及ぼすことなく、ローディング、カプセル化効率、タンパク質の安定性を上昇させ、または放出プロファイルを最適化することは困難である。新しい製剤化方法を設計するためにこれらの欠陥を理解することは重要である。例えば、多孔性のＰＬＧＡに後でローディングするという新しく調査された手法は、バースト放出中の微粒子表面の細孔の閉鎖に関する基礎研究ならびにＰＬＧＡ壁からのタンパク質脱着が放出速度を制御する際に重要な役割を果たすという以前の観察を利用する。究極的に、タンパク質およびペプチド治療薬は各々が特定の物理的特徴およびプロセシングの必要性を有する広範な分子を包含しており、単一のポリマー性デポーがあらゆる生物製剤の送達に適することはありそうもない。
【００３０】
ポリマー系からの、タンパク質およびペプチド治療薬のような物質（agent）または他
の生物製剤の送達は、モノリス（浸食性の移植可能なデバイスを含む）からの放出、または微粒子もしくはナノ粒子からの放出によって可能である。モノリスは浸食性の移植可能なデバイスを含む。微粒子およびナノ粒子は、全身送達されてもよいし、または局所デポーで送達されてもよい。
【００３１】
ポリマー系からの治療薬の放出は、２つの方法のうちの１つで制御され得る。第１の方法では、治療薬を足場のポリマー性材料とコンジュゲートさせる。治療薬は、足場から切断されると放出される。これは、最も一般的にヒドロゲルを用いて行われる。コンジュゲーションは新しい化学結合の形成を伴うので、系はより厳しいＦＤＡの承認の対象になり、したがって一般に望ましくない。第２の方法では、可溶性の治療薬を不溶性であるが浸食性のマトリックス内にカプセル化する。浸食性のマトリックスは疎水性であり、疎水性の有機溶媒で処理しなければならない。この方法は、治療薬に対する化学修飾がないので好ましい可能性がある。
【００３２】
可溶性材料は、（１）材料を有機溶媒中で直接足場材料（例：ＰＬＧＡ）と混合すること、または（２）エマルションを形成することによって、化学修飾なしにカプセル化することができる。方法（１）において、親水性材料は有機溶媒中で凝集することが多い。溶媒が除去されると、低いローディングであっても、これらの凝集体は浸透経路（percolating  pathway）を生成する結果、カプセル化された材料の都合の悪いバースト放出が起こる。放出プロファイルを改善するために、プロセス（２）を使用することができる。可溶性材料は、疎水性の足場材料を含有する外側の不混和性有機溶媒内にカプセル化された水相に含有される。浸透が防止され、エマルションは小分子またはポリマー性界面活性剤を使用することによって安定化される。エマルションプロセスはバッチ中で完了するが、これは大規模の生成に最適ではない。さらに、乳化プロセスが関与する高い剪断速度はタンパク質を変性させ、ＤＮＡを切断する可能性がある。
【００３３】
フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）は、疎水性コアおよび親水性安定化シェルを有するナノ粒子（Johnson,  B.  K.ら、AIChE  Journal（２００３年）４９巻：２２６４〜２２８２頁）を作製するために先に特許されているプロセス（米国特許第８，１３７，６９９号（本明細書では、「‘６９９特許」）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）である。このプロセスは、疎水性材料の高いローディングを可能にし、安定化材料のミセルサイズから数百ナノメートルまでのサイズの範囲の粒子を再現性よく生成することができる。現在、ＦＮＰの使用は高いｌｏｇＰ値を有する（疎水性の）コア材料のカプセル化に限定されている。フラッシュナノ沈殿技術は、高いカプセル化効率および７５ｗｔ％を超えるローディングで生物製剤をカプセル化することができる。
【００３４】
本発明による方法において、ポリマーで保護されたコアシェルナノ粒子は迅速な沈殿により作製され、結果として得られる粒子はそのコアに親水性材料を、そして有機溶媒可溶性（より親水性の低い）シェルを含有する。親水性コアおよびより親水性の低いシェルを有するこれらのナノ粒子は、疎水性コアと親水性シェルを有する‘６９９特許のナノ粒子と対比して「逆」ナノ粒子と名付けることができる。
【００３５】
これらの「逆」粒子は、粒子を共有結合的または非共有結合的に安定化し、安定化材料の第２のコーティングを添加し（層毎のＦＮＰ）、および／またはより大きいモノリスまたは微粒子内に取り込むことによりプロセシングされ得る。
【００３６】
ナノ粒子の形成
フラッシュナノ沈殿プロセス
フラッシュナノ沈殿プロセスを使用して、親水性ペプチドのような親水性コアおよび／またはカプセル化された水溶性物質を有する「逆」粒子を作り出すことができる。プロセスを図１に図示する。コポリマー１０２を極性のプロセス溶媒中に少なくとも０．１重量％の濃度で溶解して第１のプロセス溶液を形成することができるが、好ましくはコポリマーの濃度は少なくとも０．２重量％である。ある実施形態では、コポリマーは極性のプロセス溶媒中に約０．１ｗｔ％、０．２ｗｔ％、０．５ｗｔ％、１ｗｔ％、２ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、または２０ｗｔ％から約０．２ｗｔ％、０．５ｗｔ％、１ｗｔ％、２ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２０ｗｔ％、または４０ｗｔ％までの範囲の濃度で溶解することができる。プロセスの経済学のような要因が、濃度の下限を限定することがあり（can  limit  the  constrain）、プロセス溶液の粘度または極性のプロセス溶媒中のコポリマーの溶解限度のような要因が、濃度の上限に制約を加える可能性があることが当業者には理解されるものとする。例えば、第１のプロセス溶液の粘度が非プロセス溶媒の粘度よりずっと高いと、第１のプロセス溶液と非プロセス溶媒の混合は阻害され得る。コポリマーの分子量およびコポリマーの組成のような要因は粘度が高くなりすぎる前にポリマー溶液で達成することができる最大濃度に影響する可能性があることが当業者には理解されるものとする。
【００３７】
コポリマーの例としては、限定されることはないが、同じコポリマー内に異なる溶媒溶解度を有する領域を含有するブロックコポリマー、グラフトコポリマー、およびランダムコポリマーが挙げられる。例えば、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）−ブロック−ポリ（アクリル酸）（ＰＢＡ−ｂ−ＰＡＡ）ジブロックコポリマーを使用することができる。プロセス溶媒の例としては、限定されることはないが、水、アルコール、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、およびこれらの混合物が挙げられる。プロセス溶媒は、溶媒中のコポリマーの溶解特徴に応じて、コポリマーの溶解を促進するために加熱もしく加圧または両方をすることができる。
【００３８】
コポリマーを含有するプロセス溶媒をより極性の低い非プロセス溶媒と微小混合１０３すると、コポリマーの領域または部分の非類似の溶解度特徴が顕在化され、コポリマーのより極性の高い部分はもはや可溶性の状態で存在することができず、結果として「逆」ナノ粒子２０１が沈殿する。
【００３９】
ある実施形態では、追加の水溶性標的分子１０１、例えば親水性ペプチドをプロセス溶媒中のコポリマー１０２に添加することができる。該コポリマーを用いてナノ粒子２０１を作り出す際、追加の標的分子１０１はナノ粒子内に取り込まれる。非プロセス溶媒に溶け難い追加の標的分子１０１はコポリマー１０２の保護コロイドによって被覆され、カプセル化され、または微粒子コアとして閉じ込められ、立体的に安定化される。ナノ粒子は非プロセス溶媒中で小さく安定なサイズを維持する。
【００４０】
別の実施形態（図１には示していない）では、標的材料およびコポリマーは別々のプロセス溶媒流に溶解する。コポリマーおよび標的材料を溶解するのに使用されるプロセス溶媒は同じであってもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。これらの流れは非プロセス溶媒と同時に混合される。別の実施形態では、標的材料およびコポリマーは単一のプロセス溶媒流に溶解する。この流れは次に非プロセス溶媒と迅速に混合される。
【００４１】
プロセス溶液と非プロセス溶媒の激しい微小混合１０３は任意の数の幾何的配置（geometry）で行うことができる。本質的な概念は、高速入口流が、乱流および中心キャビティーで起こる混合を生じさせることである。プロセス溶媒／非プロセス溶媒の混合時間はナノ粒子の集合時間より迅速である。限定するわけではないが、２つのかかる幾何的配置は先に記載され分析されている：閉じ込め衝突ジェットミキサー（Confined  Impinging  Jet  mixer）（ＣＩＪ）（Johnson,  B.K.、Prud'homme,  R.K.  Chemical  processing  and  micromixing  in  confined  impinging  jets.  AIChE  Journal  ２００３年、４９巻、２２６４〜２２８２頁；Liu,  Y.、Fox,  R.O.  CFD  predictions  for  chemical  processing  in  a  confined  impinging-jets  reactor.  AIChE  Journal  ２００６年、５２巻、７３１〜７４４頁）またはマルチインレットボルテックスミキサー（multi-inlet  vortex  mixer）（ＭＩＶＭ）（Liu,  Y.、Cheng,  C.、Liu,  Y.、Prud’homme,  R.K.、Fox,  R.O.  Mixing  in  a  multi-inlet  vortex  mixer  (MIVM)  for  flash  nano-precipitation.  Chemical  Engineering  Science  ２００８年、６３巻、２８２９〜２８４２頁）。これらの例は限定または包括的なものではなく例示であることを意味する。
【００４２】
このプロセスに含まれる速い混合および高いエネルギー散逸は、粒子の核生成および成長のためのタイムスケールより短い混合タイムスケールをもたらし、このため他の技術では得られない活性物質（active  agent）のローディング含有量およびサイズ分布を有す
るナノ粒子が形成される。フラッシュナノ沈殿によってナノ粒子を形成するとき、混合は、凝集の開始前に全成分の、例えば１０，０００もの高い過飽和レベルに到達することができるほど十分速く起こる。過飽和レベルは、溶媒中の材料、例えばコポリマーの実際の濃度とその溶媒中におけるその材料の飽和濃度との比である。例えば、過飽和レベルは、少なくとも約１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、または３０００より大きい可能性があり、最大でも約３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００、または１０，０００である可能性がある。標的材料の凝集のタイムスケールとコポリマーの自己集合とは釣り合いがとれている。したがって、標的材料およびポリマーは同時に沈殿し、広く使用されている遅い溶媒交換に基づく技法（例えば、透析）で見られる低い活性物質の取り込みおよび凝集の制限を克服する。フラッシュナノ沈殿プロセスは、成分の化学的特異性に対して感受性でなく、普遍的なナノ粒子形成技法となる。
【００４３】
このプロセスで得られるナノ粒子のサイズは、それらを作り出すのに使用される混合速度、プロセス溶媒中のコポリマーおよび標的分子の総質量濃度、プロセス溶媒および非プロセス溶媒、コポリマーと標的分子の比、ならびに非プロセス溶媒と混合する際の標的分子およびコポリマーの不溶性部分の過飽和を制御することによって制御することができる。すなわち、ナノ粒子のサイズを制御するために使用することができるいくつかの「手段」がある。例えば、標的分子としてリゾチームを含む粒子の形成において、ナノ粒子の直径は、図２Ａに示されているように総質量濃度と共に、図２Ｂに示されているように標的分子リゾチームの質量パーセント（リゾチーム＋コポリマーに対するリゾチームの質量パーセント）と共に、図２Ｃに示されているように非プロセス溶媒（貧溶媒（antisolvent
））中のアセトンの体積分率（アセトン＋クロロホルムに対するアセトンの分率）と共に（ここで、アセトンは親水性リゾチームに対してクロロホルムより貧しい溶媒である）、かつ図２Ｄに示されているように極性のプロセス溶媒中におけるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の水（Ｈ２Ｏ）の体積分率と共に変化することができる。この情報が得られた実験条件を下記表１に示す。
【表１】
2019163341.tif 000002
【００４４】
理論に縛られることはないが、例えば、総質量濃度が増大すると（図２Ａ）、タンパク質凝集速度はポリマーの自己集合の核生成速度より速く増す可能性がある。リゾチームのより低い質量百分率では、リゾチームの質量百分率が増大すると（図２Ｂ）、サイズは最初減少する。理論に縛られることはないが、これはより速い核生成速度のためであり得、すなわち、核生成部位がより多いと、より小さいがより多くの粒子が存在するからである。あるいは、これはＰＡＡブロックのより良好なパッキングのためであり得、すなわち、ＰＡＡの負の電荷が反発し、水および／または他のコア材料がこの効果を遮蔽することができるからである。リゾチームのより高い質量百分率では、リゾチームの質量百分率が増大すると、サイズが増大する。理論に縛られることはないが、これは、高い百分率では、小さい粒子より高い体積対表面積比を有するという理由で大きい粒子が形成するからであり得る。非プロセス溶媒（貧溶媒）中でのアセトンの体積分率が増大すると（図２Ｃ）、非プロセス溶媒は極性がより低くなる。より低いアセトン濃度では、アセトン濃度が増大すると、コポリマーの核生成速度が増大し、これが形成される粒子のサイズを支配し、すなわち、核生成部位がより多くなるが、より小さい粒子が形成されるので、形成される粒子の直径が減少する。より高いアセトン濃度では、アセトン濃度が増大すると、リゾチームタンパク質の凝集の速度が増強され、これが形成される粒子のサイズを支配する。水の体積分率が増大すると（図２Ｄ）、プロセス溶媒は極性がより高くなる。より低い水濃度では、水濃度が増大すると、水が核生成部位として作用し、ナノ粒子のコアをより堅くパックするのを助ける、その結果、ナノ粒子のサイズは減少する。より高い水濃度では、水濃度が増大すると、水がコア内に組み込まれるようになって、その結果、ナノ粒子のサイズは増大する。
【００４５】
直径４０ｎｍほどの小さいナノ粒子は５０％のローディング（ローディングは水溶性物質＋コポリマーに対する水溶性物質の百分率である）で得ることができる。安定なナノ粒子は７５％のローディングで得ることができるが、ナノ粒子の直径は動的光散乱（ＤＳＬ）を使用して測定するには大きくなり過ぎた。
【００４６】
ナノ粒子は、標的材料が添加されていないプロセス溶媒に溶解するコポリマーから生成することができる。
【００４７】
本発明による方法を使用して、１５ｎｍ〜１０５００ｎｍの範囲のサイズ、２０ｎｍ〜６０００ｎｍの範囲のサイズ、２０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲のサイズ、３５ｎｍ〜４００ｎｍの範囲のサイズ、または４０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲のサイズを有する粒子を作製することができる。サイズは動的光散乱によって決定することができる。例えば、少なくとも約１５ｎｍ、２０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、１０００ｎｍ、２０００ｎｍ、４０００ｎｍ、または６０００ｎｍのサイズを有し、最大でも約２０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、１０００ｎｍ、２０００ｎｍ、４０００ｎｍ、６０００ｎｍ、または１０５００ｎｍのサイズを有する粒子を作製することができる。本明細書中で報告され引用されるサイズはＭａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｚｅｒデコンボリューションプログラムによって決定される強度平均の報告値である。他の強度重みを付けたデコンボリューション法を使用してナノ粒子のサイズを決定することができる。
【００４８】
カプセル化される材料
カプセル化される材料（標的分子）はより極性の低い非プロセス溶媒中で迅速に沈殿するほど十分に極性でなければならない。これらの判定基準に合わない分子は、その水溶性、および有機の非プロセス溶媒中で沈殿する傾向が増大するように化学修飾され得る。カプセル化され得る生物製剤材料の例には、限定されることはないが、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、ならびにこれらの誘導体、コンジュゲート、および／またはアナログが挙げられる。例えば、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）をカプセル化し得る。小分子の水溶性治療薬およびイメージング剤もカプセル化され得る。可溶性の安定剤を粒子内にカプセル化して、その使用のため、またはその後のプロセシングステップで使用するための安定性を粒子に提供し得る。また、これらの材料のいずれかを単一の粒子内に共沈殿させてもよい。ポストプロセシング中の粒子に安定性を加えるという唯一の目的で親水性材料をカプセル化してもよい。例えば、１００〜１０，０００，０００ダルトン（Ｄａ）の間の分子量を有する材料をカプセル化し得る。２５０〜１０，０００，０００Ｄａの間の分子量を有する材料をカプセル化し得る。１００〜１，０００，０００Ｄａの間の分子量を有する材料をカプセル化し得る。２５０〜１，０００，０００Ｄａの間の分子量を有する材料をカプセル化し得る。１００〜２００，０００Ｄａの間の分子量を有する材料をカプセル化し得る。
【００４９】
ある特定のカプセル化される材料は多官能性であり得る。例えば、トブラマイシンはカチオン性であり、それ自体がコポリマーと共に架橋され得る。
【００５０】
カプセル化される材料はある範囲のローディングで粒子中に取り込むことができる。例えば、カプセル化される材料の質量はコポリマーの質量より大きくてもまたは等しくてもよい。例えば、カプセル化される材料の第１のプロセス溶液中の濃度は約０．１ｗｔ％、０．２ｗｔ％、０．５ｗｔ％、１ｗｔ％、２ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、または２０ｗｔ％から約０．２ｗｔ％、０．５ｗｔ％、１ｗｔ％、２ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２０ｗｔ％、または４０ｗｔ％までであり得る。
【００５１】
溶媒
ナノ粒子の形成にはプロセス溶媒および非プロセス溶媒流を必要とする。プロセス溶媒および非プロセス溶媒は純粋な（すなわち、単一の）液体化合物または２種もしくはそれ超の純粋な液体化合物の混合物であり得る。流れの溶媒品質を補助する他の非液体化合物を添加してもよく、これも溶媒の一部と考えられる。これらの賦形剤化合物は、最終生成物の要件に応じて、最終のナノ粒子または微粒子構築物中に存在してもしなくてもよい。
【００５２】
コポリマーを含有する極性のプロセス溶媒は、コポリマーが分子状に溶解するように選択される。これには、プロセス溶媒がコポリマーの全ての部分を可溶化する必要がある。存在する場合、カプセル化される材料を含有するプロセス溶媒も、材料が分子状に溶解するように選択される。これらのプロセス溶媒は同じであってもよいが、必ずしも同じでなくてもよい。場合によっては、コポリマーおよびカプセル化される材料は両方がプロセス溶媒の単一の溶液に溶解してもよい。カプセル化される水溶性材料を溶解するために、プロセス溶媒は非プロセス溶媒より極性が高い。プロセス溶媒の例としては、限定されることはないが、水、アルコール、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、アセトン、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、およびこれらの混合物が挙げられる。酸、塩基、および塩は、コポリマーおよびカプセル化された材料のプロセス溶媒への可溶化を補助するために使用され得る添加剤の数例である。
【００５３】
コポリマーおよびカプセル化される材料を含有するプロセス溶媒の溶液は非プロセス溶媒と混合される。非プロセス溶媒はコポリマーの局所分子環境を変化させ、ポリマーのより極性の高いセクションの局所沈殿を起こさせることができなければならない。非プロセス溶媒は、コポリマーのより極性の高いセクションが迅速に沈殿し、コポリマーのより非極性の（極性がより低い）セクションが可溶化されたままでいるように選択される。したがって、コポリマーは非プロセス溶媒中でミセルまたは他の構造体に自己集合する。非プロセス溶媒は、カプセル化される標的材料が最終混合物中で迅速に沈殿するように選択される。ほとんどの場合、プロセス溶媒および非プロセス溶媒は最終組成物で十分に混和性であるのが好ましい。場合によっては、プロセス溶媒の２０容量パーセント以下が最終組成物中で相分離してもよい。一般にこれは、相分離した溶媒が粒子のコアまで進み、巨視的な分離がないときにのみ許容できる。非プロセス溶媒としては、限定されることはないが、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサンのようなアルカン、ジエチルエーテルのようなエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトン、およびこれらの混合物が挙げられる。酸、塩基、および塩は、カプセル化された材料およびコポリマーのセクションの沈殿を補助するために使用され得る添加剤の数例である。溶媒の選択は、コポリマーおよびカプセル化される材料の溶解度に基づいて行われる。１つの系のプロセス溶媒が別の系の非プロセス溶媒としてうまく機能し得ることに留意することが重要であり、したがって、プロセス溶媒および非プロセス溶媒について上に挙げた例ははっきりと区別できると考えるべきではない。
【００５４】
コポリマー
安定化ポリマーはより非極性の（より極性の低い）ブロックとカップリングしたより極性の高いブロックのコポリマーであることができる。用語「ブロック」は、単一の分子組成を有する区別できるドメインと解釈することができるか、または主としてより極性の高い領域およびより低い極性である他の領域を有するポリマー鎖の領域を意味することができる。極性は、ポリマー主鎖を構成するモノマーまたは主要なポリマー主鎖に付着したグラフト化ペンダント基もしくは鎖によって付与され得る。例えば、コポリマーは両親媒性であってもよい（より非極性のブロックは水溶性ではない）が、これは必要条件ではなく、ブロックの溶解度が非プロセス溶媒中で十分有意に異なる限り、コポリマーは完全に水溶性であっても、完全に非水溶性であってもよい。コポリマーは非プロセス溶媒中で自己集合するべきであり、より極性の高いブロックは沈殿し、より非極性のブロックは可溶性のままである。粒子を作製するためにＦＮＰプロセスで使用されたとき、より極性の高いブロックは粒子のコアまで進み、より非極性のブロックは立体的に保護性のシェルを形成する。立体的に保護性のシェルは粒子の凝集を防止し、カプセル化された材料のポストプロセシングステップ中の浸透を防止する。
【００５５】
開示されているプロセスにより形成されるナノ粒子は、グラフト、ブロック、またはランダムコポリマーを用いて形成することができる。例えば、これらのコポリマーは約１０００ｇ／モル〜約１，０００，０００ｇ／モルの間、または約３０００ｇ／モル〜約２５，０００ｇ／モルの間、または少なくとも約２０００ｇ／モルの分子量を有することができる。
【００５６】
コポリマーは、異なる溶解度特徴を有する繰り返し単位またはブロックから構成される。通例、これらの繰り返し単位は所与の特性のブロックを含む少なくとも２つの群にある。合成の方法に応じて、これらのブロックは全てが同じ繰り返し単位であるか、またはブロック全体に分散した異なる繰り返し単位を含有することができるが、それでも極性およびより非極性の部分を有するコポリマーのブロックを生じる。これらのブロックは、一連の２ブロック（ジブロック）または３ブロック（トリブロック）、またはより多く（マルチブロック）に配列されて、ブロックコポリマーの主鎖を形成することができる。さらに、ポリマー鎖は主鎖に共有結合的に付着またはグラフトした化学的部分を有することができる。かかるポリマーはグラフトポリマーである。コポリマーを構成するブロック単位は一定の間隔で存在することができるか、またはランダムに存在してランダムコポリマーを作製することができる。さらに、グラフトした側鎖はポリマー主鎖に沿って一定の間隔で存在するか、またはランダムにグラフトしたコポリマーをランダムに作製することができる。グラフトポリマーにおいて、極性ブロックが非極性のポリマー上にグラフトしてもよい。より一般的に、非極性ブロックが、より極性の高いポリマー鎖にグラフトする。グラフトコポリマーにおいて、グラフトした部分の長さは変化することができる。好ましくは、グラフトしたセグメントは長さが２〜２２のエチレン単位と同等である。加えて、ポリマー主鎖のグラフト化は溶媒和またはナノ粒子の安定化特質を増強するのに有用である可能性がある。
【００５７】
本発明の組成物および方法に使用されるコポリマーは少なくとも２つの繰り返し単位または少なくとも２５のエチレン単位と同等の最小の輪郭長を有するブロックから構成され得る。輪郭長はポリマー主鎖の線形和であり、その分子の寸法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Polymer  Handbook、第４版、J.  Brandrup、E.H.  Immergut
、およびE.A.  Grulke編、A.  Abe、D.R.  Bloch共編、１９９９年、New  York,  John  Wiley  &  Sonsを使用して概算することができる。
【００５８】
コポリマー中の適切な非極性ブロックの例として、限定されることはないが、次のものが挙げられる：アクリレート、例えばアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル（ＢＡ）、アクリル酸イソブチル、アクリル酸２−エチル、およびアクリル酸ｔ−ブチル；メタクリレート、例えばメタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−ブチル、およびメタクリル酸イソブチル；アクリロニトリル；メタクリロニトリル；ビニル、例えば酢酸ビニル、ビニルバーサテート（vinylversatate）、プロピオン酸ビニル、ビニルホルムアミド、ビニルアセトアミド、ビニルピリジン、ビニルフェノールおよびビニルイミダゾール（vinyllimidazole）；アミノアルキル、例えばアミノアル
キルアクリレート、アミノアルキルメタクリレート（aminoalkylsmethacrylate）、およ
びアミノアルキル（メタ）アクリルアミド；スチレン；酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（アルキルカーボネート）およびポリ（オルトエステル）、ポリエステル、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリジオキサノン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ酸無水物、ポリホスファゼン、ポリ（アミノ酸）、乳酸、カプロラクトン、グリコール酸、ならびにこれらのコポリマー（一般に、Illum,  L.、Davids,  S.S.（編）Polymers  in  Controlled  Drug  Delivery  Wright、Bristol、１９８７年；Arshady、J.  Controlled  Release  １７巻：１〜２２頁、１９９１年；Pitt、Int.  J.  Phar.  ５９巻：１７３〜１９６頁、１９９０
年；Hollandら、J.  Controlled  Release  ４巻：１５５〜０１８０頁、１９８６年参照）；ポリ（Ｌ−アミノ酸）に基づく疎水性ペプチドベースポリマーおよびコポリマー（Lavasanifar,  A.ら、Advanced  Drug  Delivery  Reviews（２００２年）５４巻：１６９
〜１９０頁）、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）（「ＥＶＡ」）コポリマー、シリコーンゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリジエン（ポリブタジエン、ポリイソプレンおよびこれらのポリマーの水素化形態）、ビニルメチルエーテルおよび他のビニルエーテルの無水マレイン酸コポリマー、ポリアミド（ナイロン６，６）、ポリウレタン、ポリ（エステルウレタン）、ポリ（エーテルウレタン）、ポリ（エステル尿素）。例えば、ポリマー性ブロックには、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（Ｌ−乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ酸無水物、ポリ（カプロラクトン）またはポリ（乳酸）のコポリマーが含まれる。生物学的に関連のない用途の場合、ポリマー性ブロックには、例えば、ポリスチレン、ポリアクリレート、およびブタジエンが含まれ得る。
【００５９】
ポリマーの非極性の部分として作用するのに十分な疎水性を有する天然産物には：疎水性ビタミン（例えばビタミンＥ、ビタミンＫ、およびＡ）、カロテノイド、およびレチノール（例えば、ベータカロテン、アスタキサンチン、トランスおよびシスレチナール、レチノイン酸、葉酸、ジヒドロフォレート、酢酸レチニル、パルミチン酸レチニル（retinyl  palmintate））、コレカルシフェロール、カルシトリオール、ヒドロキシコレカルシ
フェロール、エルゴカルシフェロール、アルファ−トコフェロール、酢酸アルファ−トコフェロール、ニコチン酸アルファトコフェロール、およびエストラジオールが含まれる。例えば、天然産物は、活性種（active  species）上のアミンおよびヒドロキシルに対す
る官能化を促進する、コハク酸ビタミンＥとして容易に得ることができるビタミンＥである。
【００６０】
ブロックコポリマーである両親媒性ポリマー中の適切な極性ブロックの例には、限定されることはないが、次のものが挙げられる：カルボン酸、例えばアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、およびマレイン酸；ポリオキシエチレンまたはポリエチレンオキシド；ポリアクリルアミドおよびそのジメチルアミノエチルメタクリレートとのコポリマー、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウム（vinylbenzylthrimethylammonium）クロリド、アクリル酸、メタクリル酸、２−アクリルアミド
−２−メチルプロパンスルホン酸（2-crrylamideo-2-methylpropane  sulfonic  acid）
およびスチレンスルホネート、ポリビニル（polyvincyl）ピロリドン、デンプンおよびデンプン誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体；ポリペプチド、例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸；ポリヒアルロン酸、アルギン酸、ポリラクチド、ポリエチレンイミン、ポリイオネン、ポリアクリル酸、およびポリイミノカルボキシレート、ゼラチン、および不飽和エチレン系モノまたはジカルボン酸。アニオン性のコポリマーを調製するには、アクリル酸、メタクリル酸、および／またはポリアスパラギン酸ポリマーを使用することができる。カチオン性のコポリマーを生成させるには、ＤＭＡＥＭＡ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）、ポリビニルピリジン（ＰＶＰ）、および／またはジメチルアミノエチルアクリルアミド（ＤＭＡＭＡＭ）を使用することができる。適切な極性の水溶性ポリマーの列挙はHandbook  of  Water-Soluble  Gums  and  Resins、R.  Davidson、McGraw-Hill（１９８０年）に見出すことができ
る。
【００６１】
非極性および極性ポリマーの上記リストは互いに排他的であると考えるべきではない。単一のリスト内の所与の２種のポリマーのコポリマーは、このプロセスで使用するのに十分な、所与の非プロセス溶媒への溶解度の差を有し得る。実例として、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（アクリル酸）はいずれも極性ポリマーのリストに入っている。しかしながら、ポリ（エチレンオキシド）はクロロホルムおよびアセトンに可溶性であるのに、ポリ（アクリル酸）はそうではない。したがって、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（アクリル酸）のコポリマーは非プロセス溶媒としてクロロホルムまたはアセトンを用いるこのプロセスに使用することができる。
【００６２】
ナノ粒子プロセシング
粒子の安定化
粒子が形成され、有機の非プロセス溶媒中で安定である。ほとんどの用途で、最終構築物は設定された無視できない量の時間、水性環境中で安定であることが要求される。粒子を水性環境中にプロセシングするためには、粒子の安定化が必要とされる。安定化なしでは、粒子は、溶解し、凝集し、および／または水溶性の標的材料をコアから放出し得る。
【００６３】
本発明によるある実施形態では、粒子のコアのセクションが安定化され得る。コアとは、コポリマーおよびカプセル化された材料のより極性の高いセクションを指す。材料は特に粒子の安定化の目的でコア中に取り込まれ得る。例えば、コア内のコポリマーの部分を架橋させて２０３、架橋されたコアを有する粒子３０１を形成し得る。別の実施形態では、粒子のシェルを安定化してもよい。シェルとは、非プロセス溶媒に可溶性であるコポリマーのより非極性のセクションを指す。
【００６４】
安定化は新しい共有結合の形成を含むことができる。例えば、粒子のコアのコポリマー（および、場合によっては、カプセル化された材料）を新しい共有結合の形成によって架橋し得る。結合は、コポリマー上の基間に直接形成され得る。共有結合は、コア内のポリマーを架橋するという特定の目的で架橋性材料（crosslinking  material）をコアに添加することによって形成され得る。架橋性材料（安定化材料）はＦＮＰプロセス中に粒子のコアに添加され得る。例えば、架橋性材料をプロセス溶媒に含ませることができる。別の例として、架橋性材料は非プロセス溶媒に含ませることができる。
【００６５】
あるいは、架橋性材料は、粒子が形成された後に溶液に添加してもよい。例えば、粒子を金属塩のような架橋性材料と共に「インキュベート」してもよく、架橋性材料は、例えばイオン性および／またはキレート化効果によってコポリマー、例えばＰＡＡのより極性の高い部分と相互作用し得る。実現される架橋の程度は、その後、コポリマーのより極性の高い部分に対する良溶媒中に粒子を懸濁させることによって特徴づけることができる。堅い（密な）架橋を有する粒子は、最小の膨潤を示す可能性があり、親水性コア中への高レベルの金属分配（metal  partitioning）とポリマーのより極性の高い部分との強い金
属相互作用を伴う可能性がある。緩い架橋を有する粒子は、高レベルの膨潤を示す可能性があり、親水性コア中への低レベルの金属分配とポリマーのより極性の高い部分との弱い金属相互作用を伴う可能性がある。金属のコア中への分配が非常に低度であり、および／またはポリマーのより極性の高い部分との金属の相互作用が非常に弱いならば、粒子は上記溶媒中で分解し溶解する可能性がある。
【００６６】
粒子が形成された後に架橋性材料を添加する場合、架橋は拡散限界になり、コアの外側層上のみで起こり得る。粒子が形成された後に架橋性材料を溶液に添加する場合、コアが溶媒で膨潤されるかまたは架橋性材料がコア全体に拡散するほど十分に小さければ、粒子はコア全体で架橋され得る。粒子のシェルは新しい共有結合の形成によって架橋され得る。結合はコポリマー上の基間で直接、または追加の架橋性材料の添加によって形成され得る。
【００６７】
使用できる共有結合的化学反応の例としては、限定されることはないが、カルボン酸のアルコールへのまたはカルボン酸のアミンへのカルボジイミドカップリング、活性化エステルのアルコールまたはアミンへのカップリング、マレイミド−チオール化学反応、マイケル（Micheal）付加、アジドアルキン「クリック」化学反応、ＵＶもしくは光活性化化
学反応、および／またはジスルフィド形成が挙げられる。
【００６８】
安定化は非共有結合での相互作用によって得ることができる。粒子のコアは非共有結合での相互作用によって架橋することができる。相互作用はコポリマー上の基間で直接であってもよい。非共有結合での相互作用は、コア中のポリマーを架橋するという特定の目的で架橋性材料をコアに添加することによって形成され得る。この架橋性材料はＦＮＰプロセス中に粒子のコアに添加してもよい。あるいは、この架橋性材料は、粒子が形成された後に溶液に添加してもよい。粒子が形成された後に架橋性材料が添加される場合、架橋は拡散限界になり、コアの外側層上のみで起こり得る。粒子が形成された後に架橋性材料が溶液に添加される場合、粒子は、コアが溶媒で膨潤されるかまたは架橋性材料がコア全体に拡散するほど十分に小さければ、コア全体で架橋され得る。粒子のシェルは非共有結合での相互作用によって架橋され得る。相互作用はコポリマー上の基間で直接、または追加の架橋性材料の添加によって形成され得る。
【００６９】
使用できる非共有結合での相互作用の例としては、限定されることはないが、イオン性相互作用、酸−塩基相互作用、金属キレート化、ポリヒスチジンとニッケルのような金属との間の相互作用、および／または強い水素結合が挙げられる。非共有結合での粒子安定化の例はＣｒ（ＩＩＩ）を使用してナノ粒子のポリ（アクリル酸）コアを安定化するものである。例えば、酢酸クロム（ＩＩＩ）および／または臭化クロム（ＩＩＩ）を架橋性材料として使用することができる。架橋はリガンド交換を通して進行し得る。使用される溶媒はリガンドとして作用することができる。例えば、架橋性の塩内のカチオンの相互作用は、塩内のアニオンとよりも、コア内で架橋されるコポリマーのより極性の高い部分との方が強いはずである。
【００７０】
非共有結合性架橋を誘導するのに使用することができる他の架橋性材料（架橋剤）には、アルカリ土類ハロゲン化物、ハロゲン化マグネシウム、ハロゲン化カルシウム、金属ハロゲン化物、遷移金属ハロゲン化物、およびハロゲン化鉄が含まれる。金属塩を使用することができる。使用することができる追加の架橋性材料は金属酢酸塩、アルカリ土類酢酸塩、遷移金属酢酸塩、および酢酸カルシウムである。所与のカチオン（例えば、金属）の架橋能力は付随するアニオンに依存する。架橋性材料、例えば塩の架橋能力は、使用されるプロセス溶媒および非プロセス溶媒に左右され得る。架橋性材料として、生物学的に興味深いまたは機能的またはその他有用な金属を挙げることができる。例えば、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃａ（ＩＩ）、およびＺｎ（ＩＩ）カチオンは生体適合性である。Ｇｄ（ＩＩＩ）（ガドリニウム（ＩＩＩ））は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で活性であり、したがって、トレーサーとして有用であることができる。
【００７１】
ナノ粒子の形成中、例えばＦＮＰプロセス中に架橋を行うときにうまく機能する一部の架橋性材料には、スペルミンのようなポリアミン、ならびに塩化マグネシウム、塩化カルシウム、および塩化鉄（ＩＩＩ）のようなある特定の塩化物塩が含まれる。例えば、かかる架橋性材料はＰＢＡ−ｂ−ＰＡＡコポリマーと共に、メタノール、ジメチルスルホキシド、および／または水をプロセス溶媒として、ならびにアセトンおよび／またはクロロホルムを非プロセス溶媒として使用することができる。架橋を生じさせるためにプロセス溶媒中に幾らかの水を含ませる必要があり得る。一部の系では、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、およびスペルミンは弱いクロスリンカーとして作用し得る。塩化鉄（ＩＩＩ）のような鉄（ＩＩＩ）塩は強い架橋を誘導し得る。
【００７２】
複数の種類の安定化化学反応（stabilization  chemistry）を所与の粒子内に用い得る。安定化はコア内、シェル内、界面、または所与の粒子内の複数の位置で起こることができる。
【００７３】
多くの用途では、粒子の分解およびカプセル化された材料の放出が必要とされる。使用する安定化化学反応の種類、および架橋した網目構造の密度は、粒子の分解動態に影響を及ぼし得る。使用する安定化化学反応の種類、および架橋した網目構造の密度は同様に、または代わりに、カプセル化された材料の、粒子のコアからの放出動態に影響を及ぼし得る。
【００７４】
一部の用途では、カプセル化された材料が化学修飾されないことが必要とされる。これらの場合、非共有結合での相互作用を使用して粒子を安定化するべきである。しかしながら、共有結合性架橋は、その化学反応がコポリマーに対して特異的であり、カプセル化された材料を修飾しない限り、該共有結合性架橋を使用してもよい。
【００７５】
架橋後、コポリマーのより非極性のブロックが水溶性であれば、粒子は直接水性環境に配置することができる。粒子のシェルは立体安定化を提供する。一例は、非プロセス溶媒としてクロロホルムを用い、ポリ（アクリル酸）コアを架橋するためにＣｒ（ＩＩＩ）を使用して形成されるポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）から構成される粒子である。粒子が架橋されたら、それを水性環境内に配置することができ、ポリ（エチレンオキシド）が立体安定化を提供し、粒子の凝集を防止する。
【００７６】
架橋後、コポリマーのより非極性のブロックが短く、粒子のコアが帯電しているならば、粒子を水性環境中に配置することができる。これには、コアの帯電したパッチがコポリマーの非極性ブロックによりもはや保護されなくなるように、コアが水性環境に十分に膨潤することが必要とされる。これらのパッチは、粒子が凝集しないように十分に大きく、帯電していなければならない（電荷で安定化されている）。
【００７７】
粒子のコーティング−層毎のフラッシュナノ沈殿
粒子の安定化後、両親媒性ポリマー３０２の第２の層を粒子３０１の表面上に被覆３０３して、コーティングを有するナノ粒子４０１を形成することができる（図１参照）。この両親媒性ポリマー３０２の第２の層は「コーティング」と呼ぶことができる。このコーティングは、水性環境中で安定になるように粒子の表面特質を改変するために行われ得る。例えば、これは、粒子のシェル、すなわち、コポリマーのより非極性のセクションが水溶性でない場合に有用であり得る。安定化の両親媒性ポリマー３０２による粒子のコーティングは第２のフラッシュナノ沈殿ステップ３０３によって達成され得る。粒子３０１は、被覆する前に、コーティングプロセスに耐えることができるように十分に安定化されなければならない。
【００７８】
安定化の両親媒性ポリマー３０２は疎水性ブロックとカップリングした親水性ブロックのコポリマーであることができる。開示されているプロセスによって被覆されるナノ粒子はグラフト、ブロック、またはランダムの両親媒性コポリマーで被覆することができる。これらの両親媒性ポリマーは約１０００ｇ／モル〜約５０，０００ｇ／モルの間、約３０００ｇ／モル〜約２５，０００ｇ／モルの間、または少なくとも２０００ｇ／モルの分子量を有することができる。ブロックコポリマーである両親媒性ポリマー中の適切な疎水性ブロックの例として、限定されることはないが、次のものが挙げられる：アクリレート、例えばアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル（ＢＡ）、アクリル酸イソブチル、アクリル酸２−エチル、およびアクリル酸ｔ−ブチル；メタクリレート、例えばメタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−ブチル、およびメタクリル酸イソブチル；アクリロニトリル；メタクリロニトリル；ビニル、例えば酢酸ビニル、ビニルバーサテート、プロピオン酸ビニル、ビニルホルムアミド、ビニルアセトアミド、ビニルピリジン、ビニルフェノールおよびビニルイミダゾール；アミノアルキル、例えばアミノアルキルアクリレート、アミノアルキルメタクリレート、およびアミノアルキル（メタ）アクリルアミド；スチレン；酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（アルキルカーボネート）およびポリ（オルトエステル）、ポリエステル、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリジオキサノン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ酸無水物、ポリホスファゼン、ポリ（アミノ酸）ならびにこれらのコポリマー（一般に、Illum,  L.、Davids,  S.S.（編）Polymers  in  Controlled  Drug  Delivery  Wright、Bristol、１９８７年；Arshady,  J.  Controlled  Release  １７巻：１〜２２頁、１９９１年；Pitt、Int.  J.  Phar.  ５９巻：１７３〜１９６頁、１９９０年；Hollandら、J.  Controlled  Release  ４巻：１５５〜０１８０頁、１９８６年参照）；疎水性ペプチドベースのポリマーおよびポリ（Ｌ−アミノ酸）に基づくコポリマー（Lavasanifar,  A.ら、Advanced  Drug  Delivery  Reviews（２００２年）５４巻：１６９〜１９０頁）、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）（「ＥＶ
Ａ」）コポリマー、シリコーンゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリジエン（ポリブタジエン、ポリイソプレン、およびこれらのポリマーの水素化形態）、ビニルメチルエーテルおよび他のビニルエーテルの無水マレイン酸コポリマー、ポリアミド（ナイロン６，６）、ポリウレタン、ポリ（エステルウレタン）、ポリ（エーテルウレタン）、およびポリ（エステル尿素）。例えば、ポリマー性ブロックには、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（Ｌ−乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ酸無水物、ポリ（カプロラクトン）またはポリ（乳酸）のコポリマーが含まれる。例えば、生物学的に関連のない用途の場合、ポリマー性ブロックはポリスチレン、ポリアクリレート、およびブタジエンを含むことができる。
【００７９】
両親媒性ポリマーの疎水性部分として作用するのに十分な疎水性を有する天然産物としては、例えば、疎水性ビタミン（例えば、ビタミンＥ、ビタミンＫ、およびビタミンＡ）、カロテノイドおよびレチノール（例えばベータカロテン、アスタキサンチン、トランスおよびシスレチナール、レチノイン酸、葉酸、ジヒドロフォレート、酢酸レチニル、パルミチン酸レチニル）、コレカルシフェロール、カルシトリオール、ヒドロキシコレカルシフェロール、エルゴカルシフェロール、アルファ−トコフェロール、酢酸アルファ−トコフェロール、ニコチン酸アルファ−トコフェロール、およびエストラジオールが挙げられる。好ましい天然産物は、活性種上のアミンおよびヒドロキシルに対する官能化を促進する、コハク酸ビタミンＥとして容易に得ることができるビタミンＥである。
【００８０】
両親媒性ポリマー中の適切な親水性ブロックの例としては、限定されることはないが、次のものが挙げられる：カルボン酸、例えばアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、およびマレイン酸；ポリオキシエチレンまたはポリエチレンオキシド；ポリアクリルアミドおよびそのジメチルアミノエチルメタクリレートとのコポリマー、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリル酸、メタクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびスチレンスルホネート、ポリビニルピロリドン、デンプンおよびデンプン誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体；ポリペプチド、例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸；ポリヒアルロン酸、アルギン酸、ポリラクチド、ポリエチレンイミン、ポリイオネン、ポリアクリル酸、およびポリイミノカルボキシレート、ポリ（エチレングリコール）、ゼラチン、および不飽和エチレン系モノまたはジカルボン酸。例えば、親水性ブロックはポリ（エチレングリコール）のものであることができる。例えば、親水性ブロックは、中性ブロックを調製するためにポリ（エチレンオキシド）およびポリヒドロキシルプロピルアクリルアミドおよびメタクリルアミドのものであることができる。これらの材料は現在医学用途で認可されているからである。アニオン性のコポリマーを調製するには、アクリル酸およびメタクリル酸およびポリアスパラギン酸ポリマーを使用することができる。カチオン性の両親媒性ポリマーを生成させるには、ＤＭＡＥＭＡ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）、ポリビニルピリジン（ＰＶＰ）またはジメチルアミノエチルアクリルアミド（ＤＭＡＭＡＭ）を使用することができる。
【００８１】
例えば、ブロックはジブロック、トリブロック、またはマルチブロックの繰り返しであることができる。好ましくは、ブロックコポリマーはポリスチレン、ポリエチレン、ポリブチルアクリレート、ポリブチルメタクリレート、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）およびＰＬＧＡコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリアクリル酸、ポリオキシエチレンおよびポリアクリルアミドのブロックを含むことができる。適切な親水性ポリマーの列挙はHandbook  of  Water-Soluble  Gums  and  Resins、R.  Davidson、McGraw-Hill（１９８０年）に見出すことができる。
【００８２】
例えば、両親媒性ポリマーはポリスチレン−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（乳酸）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（カプロラクトン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ）、または上に挙げたジブロックコポリマーのトリブロック形態であることができる。さらに、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＰＯ−ｂ−ＰＥＯ）またはポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブチレンオキシド）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＯ−ｂ−ＰＥＯ）のようなトリブロックコポリマーを使用してもよい。
【００８３】
グラフトコポリマーである両親媒性ポリマーにおいて、グラフトした部分の長さは変化し得る。例えば、グラフトしたセグメントは４〜２２個の炭素のアルキル鎖であるかまたは２〜１１個のエチレン単位の長さと同等であることができる。グラフトした基はまた脂質、リン脂質またはコレステロールを含んでいてもよい。ポリマー主鎖のグラフト化は溶媒和またはナノ粒子安定化特質を増強するのに有用である可能性がある。ポリエチレンおよびポリエチレングリコールのジブロックコポリマーの疎水性の主鎖上にグラフトしたブチル基はポリエチレンブロックの溶解性を増大するはずである。コポリマーのブロック単位にグラフトした適切な化学的部分はアミド、イミド、フェニル、カルボキシ、アルデヒド、またはアルコール基のような種を含有するアルキル鎖を含む。
【００８４】
ナノ粒子をコーティングする方法は、Johnsonらにより既に記載されている通り、「フ
ラッシュナノ沈殿」（ＦＮＰ）と称される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるJohnson,  B.  K.ら、AIChE  Journal（２００３年）４９巻：２２６４〜２２８２頁および米国特許第８，１３７，６９９号）。ＦＮＰは迅速な単一ステップのブロックコポリマー指向沈殿プロセスである。粒子を処理してクロロホルムのような残留する溶媒を除去することができる。粒子および両親媒性ブロックコポリマーは水混和性有機溶媒に溶解される。許容できる溶媒としては、限定されることはないが、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、アセトン、メタノールおよびエタノールのような低分子量アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはこれらの混合物が挙げられる。溶媒品質は、水または水性緩衝液または混合物に対して微小混合して１０，０００もの高い過飽和レベルを生じさせて迅速な沈殿を推進することによって迅速に低下する。ここで、混合する時間はナノ粒子の凝集より速く、ブロックコポリマーの自己集合のタイムスケールと平衡している。このプロセスは制御されたサイズの、ポリマーで安定化され保護されたナノ粒子を生成することができる。
【００８５】
フラッシュナノ沈殿コーティング技法は初期のＦＮＰプロセスで生成したナノ粒子の凝集を停止させた両親媒性ジブロックコポリマーに基づく。良溶媒に溶解した両親媒性ジブロックコポリマーは１つのブロックに対する溶媒品質が低下するとミセルを形成することができる。激しい微小混合は任意の数の幾何的配置で行うことができる。本質的な概念は、高速入口流が、乱流および中心キャビティーで起こる混合を生じさせることである。溶媒／貧溶媒の混合時間はナノ粒子の集合時間より迅速である。限定するわけではないが、２つのかかる幾何的配置は先に記載され分析されている：閉じ込め衝突ジェットミキサー（ＣＩＪ）またはマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）。これらの例は限定または包括的なものではなく例示を意味し、先に説明した。
【００８６】
ボルテックスミキサーは、溶解したジブロックコポリマーおよびＴＨＦ、アセトン、または混合物のような水混和性溶媒に懸濁した粒子を含有する１つのジェット流が、ナノ粒子シェルおよびコポリマーの疎水性ブロックに対する貧溶媒である水を含有する別のジェット流と高速で混合される閉じ込められた容量チャンバーからなる。このプロセスに関与する速い混合および高いエネルギー散逸は、粒子の核生成および成長のタイムスケールより短いタイムスケールをもたらし、結果として、他の技術では得られない活性物質ローディング含有量およびサイズ分布を有するナノ粒子が形成する。フラッシュナノ沈殿によってナノ粒子をコーティングすると、混合は、凝集の開始前に全成分の高い過飽和レベルに到達できるほど十分速く起こる。したがって、粒子およびポリマーは同時に沈殿し、遅い溶媒交換（例えば、透析）に基づく広く使用されている技法で見られる低い活性物質の取り込みおよび凝集の制限を克服する。フラッシュナノ沈殿プロセスは成分の化学的特異性に対して感受性でなく、普遍的なナノ粒子コーティング技法となる。
【００８７】
両親媒性ポリマーにより形成されるコーティングは内側領域および外側領域を有することができる。内側領域は両親媒性コポリマーの疎水性領域を含むことができ、外側領域は両親媒性コポリマーの親水性領域を含むことができる。
【００８８】
コーティングプロセスで使用される濃度、両親媒性ポリマー、および溶媒は、個々の粒子が被覆されるか、または粒子が被覆される前に所望のサイズに凝集するように最適化することができる。例えば、粒子自体のコポリマーの量に対して、濃縮されたナノ粒子を被覆するのに使用する両親媒性ポリマーの量を増大すると、より小さい粒子の直径を得ることができる。濃縮されたナノ粒子をコーティングすると、１つより多くのナノ粒子を両親媒性ポリマーの安定化シェルに取り込むことができる。
【００８９】
低濃度のナノ粒子をコーティングする場合、粒子自体のコポリマーの量に対する両親媒性ポリマーの量は、得られる粒子の直径にほとんど効果がないか、または全く効果がない。
【００９０】
粒子をコーティングすると粒子の表面の化学的性質が変更される。粒子をコーティングすると水性媒体中での粒子の安定性および分解動態が変化し得る。粒子をコーティングするとカプセル化された材料の放出動態が変化し得る。
【００９１】
カプセル化された材料としてグルタチオン（ＧＳＨ）、リゾチーム、バンコマイシン、またはトブラマイシンを有する被覆されたナノ粒子が形成されている。
【００９２】
微粒子およびモノリスへの粒子の取り込み
粒子は微粒子またはより大きいモノリスに取り込まれ得る。疎水性のポリマーブロックは浸透を防止することができ、カプセル化された材料の高いローディング、プロセシング中の安定化、および制御された放出を可能にする。
【００９３】
粒子が粒子コアに対する貧溶媒中でプロセシングされた疎水性の足場に取り込まれていれば、粒子はプロセシング前に、より極性の低いポリマーブロックによって的確に安定化され得る。
【００９４】
親水性の活性化合物または生物製剤化合物（biologic  compound）は、疎水性のプロセス溶媒中への最初のプロセシングステップにより形成された粒子の内部に捕獲される。疎水性のプロセス溶媒に可溶性の有機ポリマーは粒子分散液に添加され得る。添加してもよいポリマーには生体適合性および／または生分解性のポリマーが含まれる。これらのポリマーの非限定例には：アクリレート、例えばアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル（ＢＡ）、アクリル酸イソブチル、アクリル酸２−エチル、およびアクリル酸ｔ−ブチル；メタクリレート、例えばメタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−ブチル、およびメタクリル酸イソブチルならびにこれらのアクリレートのコポリマー；アクリロニトリル；メタクリロニトリル；ビニル、例えば酢酸ビニル、ビニルバーサテート、プロピオン酸ビニル、ビニルホルムアミド、ビニルアセトアミド、ビニルピリジン、ビニルフェノールおよびビニルイミダゾール；アミノアルキル、例えばアミノアルキルアクリレート、アミノアルキルメタクリレート、およびアミノアルキル（メタ）アクリルアミド；スチレン；酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリ（Ｄ，Ｌラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（アルキルカーボネート）およびポリ（オルトエステル）、ポリエステル、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリジオキサノン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ酸無水物、ポリホスファゼン、ポリ（アミノ酸）ならびにこれらのコポリマー（一般に、Illum,  L.、Davids,  S.S.（編）Polymers  in  Controlled  Drug  Delivery  Wright、Bristol、１９８７年；Arshady、J.  Controlled
Release  １７巻：１〜２２頁、１９９１年；Pitt、Int.  J.  Phar.  ５９巻：１７３〜１９６頁、１９９０年；Hollandら、J.  Cotrolled  Release  ４巻：１５５〜０１８
０頁、１９８６年を参照）；疎水性ペプチドベースのポリマーおよびポリ（Ｌ−アミノ酸）に基づくコポリマー（Lavasanifar,  A.ら、Advanced  Drug  Delivery  Reviews（２
００２年）５４巻：１６９〜１９０頁）、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）（「ＥＶＡ」）コポリマー、シリコーンゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリジエン（ポリブタジエン、ポリイソプレンおよびこれらのポリマーの水素化形態）、ビニルメチルエーテルおよび他のビニルエーテルの無水マレイン酸コポリマー、ポリアミド（ナイロン６，６）、ポリウレタン、ポリ（エステルウレタン）、ポリ（エーテルウレタン）、ポリ（エステル尿素）が挙げられる。ポリマー性ブロックの例として、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（Ｌ−乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ酸無水物、ポリ（カプロラクトン）またはポリ（乳酸）のコポリマーが挙げられる。生物学的に関連のない用途の場合、特に好ましいポリマー性ブロックにはポリスチレン、ポリアクリレート、およびブタジエンが含まれる。
【００９５】
これらのポリマーまたはそれらの混合物の添加後得られる、疎水性の有機溶液相を含有するポリマー中に分散した生物製剤粒子は、当分野で周知の技法により所望の微粒子またはモノリスに形成されることができる。これらには、Domb（米国特許第５，５７８，３２５号）もしくはGibson（米国特許第６，２９１，０１３Ｂ１号）により記載されているエマルション−ストリッピング技法、噴霧乾燥、または成形が含まれ、生物製剤のようなカプセル化された親水性活性剤を含有する固体のマトリックスを形成する。マトリックスを噴霧乾燥、汎乾燥（pan  drying）、または成形プロセスによって乾燥して、カプセル化
された活性剤または生物製剤を含有する固体の最終マトリックスを得ることができる。その後、マトリックス相の溶解、浸食、または膨潤により放出を行う。このカプセル化および続くマトリックスの形成により、先に文献に記載されている単純な二重エマルション技法で達成することができるよりもずっと高い、親水性の活性剤または生物製剤のローディングが可能である。これらの二重エマルション経路では、マトリックス製剤中活性剤の高いローディングでバースト放出が起こる。
【００９６】
ポストプロセシング
他のポストプロセシングステップを粒子に対して行ってもよい。リガンドを粒子の表面にコンジュゲートし得る。被覆されてない粒子の場合、リガンドはコポリマーのより非極性のブロックにコンジュゲートされる。リガンドのサイズに応じて、コンジュゲーションは粒子の形成の前または後に行うことができる。被覆された粒子の場合、リガンドはコーティングする両親媒性コポリマーの親水性ブロックにコンジュゲートされる。リガンドのサイズに応じて、コンジュゲーションは粒子のコーティングの前または後に行うことができる。
【００９７】
粒子を安定な粉末形態に凍結乾燥してもよい。粒子を溶液から遠心分離し、粒子がやはり安定でいられる新しい溶媒中に再懸濁してもよい。粒子を透析して、粒子が懸濁される溶媒を変えるか、または小分子を除去してもよい。
【００９８】
粒子は様々な様式のいずれか１つまたは様々な様式の組合せにより患者に投与することができる。例えば、粒子は経口、経鼻、腹腔内、または非経口で、静脈内に、筋肉内に、局所に、または皮下経路で、または注射により組織内へ投与することができる。粒子は薬学的に許容されるビヒクルまたはキャリア中で投与され得る。
【実施例】
【００９９】
（実施例１）
粒子の集合および形態学
親水性の化合物を含有する粒子を生成するために、最初にポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）７．５ｋＤａ−ｂ−ポリ（アクリル酸）５．５ｋＤａ（ＰＢＡ−ｂ−ＰＡＡ）および生物製剤をＤＭＳＯまたはメタノールのような極性の有機溶媒に溶解した。ＦＮＰプロセスにおいて、この流れをＣＩＪミキサーでクロロホルム（ＣＨＣｌ３）またはアセトンのようなより極性の低い非プロセス溶媒と迅速に混合した。この非溶媒が生物製剤を沈殿させた。この沈殿を、成長する粒子の表面上でのＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡの親水性のＰＡＡブロックの自己集合により停止させた。最終の粒子を疎水性のＰＢＡブロックによって非溶媒中で立体的に安定化させた。得られたナノ粒子はコア−シェル構造を有していた。
【０１００】
このプロセスを、モデルのタンパク質としてのリゾチーム（１４．３ｋＤａ）、環状ペプチド抗生物質バンコマイシン（１．４５ｋＤａ）、モデルの７−アミノ酸長のペプチド（グリシン−アルギニン−ロイシン−グリシン−トリプトファン−セリン−フェニルアラニン（ＧＲＬＧＷＳＦ）、８２２Ｄａ）、染料エオシンＹ（６９２Ｄａ）およびタルトラジン（５３４Ｄａ）、ＭＲＩコントラスト剤ガドペンテト酸（５４８Ｄａ）、アミノグリコシド抗生物質トブラマイシン（４６８Ｄａ）、グルタチオン（３０７Ｄａ）、およびトリプトファン（２０４Ｄａ）を含む様々な分子量を有するモデルの親水性物質の集まりに適用した。各製剤化により、５０ｗｔ％の最小ローディングにおいて低い多分散度を有するナノ粒子が得られた。
【０１０１】
（実施例２）
ナノ粒子のローディングおよびサイズの制御
ＦＮＰで生成する粒子のサイズは、コア材料の沈殿のタイムスケール、およびポリマーの自己集合のタイムスケールによって制御することができる。これらのタイムスケールは材料濃度によっておよび非プロセス溶媒の選択によって調節される。
【０１０２】
コア材料の百分率を増大するにはより大きい粒子の形成が必要であった。リゾチームとバンコマイシンの両方では、粒子のサイズは、生物製剤を添加すると、最初はブロックコポリマーのミセルのサイズと比べて減少した。これは、コア材料の添加により、電荷遮蔽効果のためＰＡＡをより堅くパックすることができるからであり得る。リゾチームおよびバンコマイシンの両方の非常に高いローディングが得られた。リゾチームの７５ｗｔ％もの高いローディングが大きい沈殿物を形成することなく得られたが、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して分析するには粒子は大き過ぎた。９０ｗｔ％までのバンコマイシンローディングでは安定な粒子が得られ、１００ｎｍ未満の粒子は８０ｗｔ％未満のローディングで観察された。これらのローディングは、その高い水溶性および乏しいクロロホルム溶解性に関わらず、バンコマイシンが十中八九その芳香族基により表面を安定化する役割を果たしたことを示した。
【０１０３】
粒子のサイズに影響を及ぼすことが判明した追加のプロセス変量には、ＤＭＳＯ流中のポリマーおよび生物製剤の総質量濃度、クロロホルム流中のアセトンの体積分率、およびＤＭＳＯ流中の水の体積分率が含まれた。ＤＭＳＯ流への５ｖｏｌ％の水の添加により、５０％ロードしたリゾチーム粒子のサイズが１２５ｎｍから４５ｎｍに低減した。適切な製剤化パラメーターで、５０ｗｔ％より高いローディングおよび１００ｎｍ未満の直径を有するナノ粒子はＦＮＰプロセスによって容易に達成できた。生物製剤がごくわずかに可溶性である非プロセス溶媒を選択することによって、粒子は非常に高い（＞９０％）カプセル化効率を有することができる。
【０１０４】
（実施例３）
さらなるプロセシングのためのナノ粒子の安定化
水性環境中のナノ粒子を安定化し、プロセシングステップ中のカプセル化された材料の損失を低減するため、ＰＡＡシェルを架橋してゲルを形成する方法を調査した。イオン性の架橋は、カプセル化された物質を共有結合的に修飾するリスクを低減するのでこれに着目した。アニオン性のＰＡＡ側基は多価金属カチオンまたはポリアミンのいずれかで架橋することができる（S.  Bontha、A.V.  Kabanov、T.K.  Bronich、Polymer  micelles  with  cross-linked  ionic  cores  for  delivery  of  anticancer  drugs、J.  Controlled  Release.  １１４巻（２００６年）１６３〜１７４頁；T.K.  Bronich、A.V.  Kabanov、V.A.  Kabanov、K.  Yu、A.  Eisenberg、Soluble  Complexes  from  Poly(ethylene  oxide)-block-polymethacrylate  Anions  and  N-Alkylpyridinium  Cations,  Macromolecules.  ３０巻（１９９７年）３５１９〜３５２５頁；T.K.  Bronich、P.A.  Keifer、L.S.  Shlyakhtenko、A.V.  Kabanov、Polymer  Micelle  with  Cross-Linked  Ionic  Core、J.  Am.  Chem.  Soc.  １２７巻（２００５年）８２３６〜８２３７頁；R.T.  Patil、T.J.  Speaker、Retention  of  trypsin  activity  in  spermine  alginate  microcapsules、J.  Microencapsul.  １４巻（１９９７年）４６９〜４７４頁）。ナノ粒子は、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、またはＦｅ３＋の塩化物塩を非プロセス溶媒流に含ませることによって首尾よく安定化された。２つの第一級アミンおよび２つの第二級アミンを含有するスペルミン、ならびに正に帯電した抗生物質トブラマイシンも粒子を安定化させた。イオン性のゲル化剤をＦＮＰプロセスの後ナノ粒子溶液に添加することができる。
【０１０５】
３：１の比の酸基対鉄で含ませた塩化鉄ＩＩＩはとりわけ効果的な架橋剤であった。５０ｗｔ％のバンコマイシンをロードし、鉄で架橋した粒子は、ＣＨＣｌ３中の７２ｎｍから非架橋ナノ粒子を溶解するメタノール中の７９ｎｍまでで最小に膨潤した。最小の膨潤は、カプセル化された生物製剤の放出を遅くするのに必要な小さいメッシュサイズを示した。例えば、メタノール中での最小の膨潤は堅い架橋を示した。鉄は、ナノ粒子のＴＥＭイメージングを可能にするほどに十分な電子コントラストを提供した。２０〜４０ｎｍの粒子コアのＴＥＭ顕微鏡写真は、測定がＰＢＡシェルを含んでいたのでより大きいサイズを示したＤＬＳデータを支持した。
【０１０６】
（実施例４）
ＰＥＧによるナノ粒子のコーティング：層毎のＦＮＰ
水性媒体中で立体的に安定化されたナノ粒子を生成するために、鉄で安定化された５０ｗｔ％バンコマイシン粒子をＰＥＧで被覆した。粒子を１質量当量のポリスチレン１．６ｋＤａ−ｂ−ポリ（エチレングリコール）５ｋＤａ（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）と共にアセトン中に懸濁した。この流れを第２のＦＮＰステップで水と迅速に混合した。ＰＳ−ｂ−ＰＥＧのＰＳブロックは粒子の崩壊したＰＢＡ表面上に集合した。ＰＥＧがないと、バンコマイシンナノ粒子の崩壊した疎水性のＰＢＡ表面は粒子を水中に凝集させた。最終のＰＥＧ安定化粒子は８５ｎｍであり、目に見える凝集体はなく、ほぼ中性のゼータ電位であった。最終のナノ粒子構造体は堅く架橋したヒドロゲルで、内部が疎水性の界面に被覆され、ＰＥＧブラシにより立体的に安定化されていた。
【０１０７】
ＰＥＧで被覆された粒子はカプセル化効率４０％（高圧液体クロマトグラフィーで決定）および最終のバンコマイシンローディング１１．５ｗｔ％を有していた。バンコマイシンはクロロホルムおよびアセトンに溶け難く、したがって材料の損失はおそらくコーティングステップで起こった。バンコマイシンはクロロホルム中で粒子表面を安定化する役割を果たす疎水性のセクションを有するので、鉄−ＰＡＡメッシュでは十分に捕捉されなかった可能性がある。
【０１０８】
（実施例５）
様々なカプセル化された材料と共に形成されたナノ粒子
カプセル化された親水性モデルの活性医薬品（ＡＰＩ）を含むナノ粒子（ＮＰ）を、先に記載した閉じ込め衝突ジェットミキサー（ＣＩＪ）を使用するフラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）を使用して作り出した。一般に、安定化ポリマー（ＰＢＡ−ｂ−ＰＡＡ）およびＡＰＩを、通例ＭｅＯＨまたはＤＭＳＯからなるより極性の高い有機溶媒に溶解させた。この流れを、通例ＣＨＣｌ３またはアセトンからなる等しい体積流のより非極性の貧溶媒と等しい流量で迅速に混合した。ＣＩＪの出口流を、最終のナノ粒子溶液が９０ｖｏｌ％の貧溶媒となるように貧溶媒の撹拌浴に集めた。この研究で使用した製剤の概要（outlines
the  formulations  used  in  this  study）。
【０１０９】
架橋されたＮＰのためには、電荷比（ＰＡＡ上の酸基と架橋剤の正電荷との比）が１：１となるように架橋剤を貧溶媒流に含ませた。
【０１１０】
小分子タルトラジン、エオシンＹ、およびガドリニウム−ジエチレントリアミン五酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）をカプセル化した親水性コアを有するナノ粒子（「逆」ナノ粒子）を形成した。これらのカプセル化された材料と共に形成された粒子のセットごとの粒径分布を図３Ａに示す。
【０１１１】
生物製剤抗生物質トブラマイシンおよびバンコマイシンをカプセル化した親水性コアを有するナノ粒子を形成した。これらのカプセル化された材料と共に形成された粒子のセットごとの粒径分布を図３Ｂに示す。
【０１１２】
小分子生物製剤グルタチオンおよびトリプトファンをカプセル化した親水性コアを有するナノ粒子を形成した。これらのカプセル化された材料と共に形成された粒子のセットごとの粒径分布を図３Ｃに示す。
【０１１３】
より大きい生物製剤リゾチームおよび「ペプチドＩ」（グリシン−アルギニン−ロイシン−グリシン−トリプトファン−セリン−フェニルアラニン（ＧＲＬＧＷＳＦ））をカプセル化した親水性コアを有するナノ粒子を形成した。これらのカプセル化された材料と共に形成された粒子のセットごとの粒径分布を図３Ｄに示す。
【０１１４】
上記カプセル化系に使用した実験条件を下記表２に示す。
【表２】
2019163341.tif 000003
【０１１５】
これらのカプセル化された材料のうち、最も小さいカプセル化された分子は１８６Ｄａの分子量を有し、最も大きいカプセル化された分子はほぼ二桁大きい分子量１４ｋＤａを有し、このプロセスの汎用性を実証した。カプセル化された粒子はまた幅広い電荷を有しており、例えば、タルトラジンは負に帯電し、一方トブラマイシンは正に帯電している。
【０１１６】
材料をカプセル化するための系を最適化して、最もよい極性のプロセス溶媒（例えば、ＤＭＳＯ対ＭｅＯＨ、任意選択で添加剤を含む）、非プロセス溶媒（貧溶媒）（例えば、アセトン、ＣＨＣｌ３、トルエン、またはＤＣＭ）、ポリマー／コア材料比、および／または溶媒流の含水量を決定することができることが当業者には理解されるものとする。
【０１１７】
（実施例６）
ＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡナノ粒子
ポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（１２ｋＤａ−ｂ−３ｋＤａ）をメタノールに濃度２０ｍｇ／ｍＬで溶解した。塩基性酢酸クロムをメタノールに質量濃度９０ｍｇ／ｍＬで溶解した。溶液を容量で１容（one  part）のポリマー溶液対１容
のクロム溶液として混合した。混合物を調製した直後に、手持ちの閉じ込め衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサーでクロロホルム流に対して１：１で混合した。ＣＩＪミキサーの流出液を、最終の溶媒組成が容量で１容のメタノール対９容のクロロホルムとなるようにクロロホルムの急速撹拌浴に集めた。粒子を４日間混合してクロムカチオンにポリ（アクリル酸）を架橋させた。得られた粒子はクロロホルム中で１３５ｎｍであり、多分散度指数（ＰＤＩ）は０．１未満であった。メタノール中に膨潤すると、得られた粒子は１９０ｎｍで、ＰＤＩは０．１未満であった。粒子直径はＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを通常の分析モードで使用して動的光散乱によって測定した。
【０１１８】
（実施例７）
ＰＳ−ｂ−ＰＥＧによるＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡナノ粒子のコーティング
実施例６からの粒子をアセトンで希釈し、１５０００ｒｃｆで１５分間溶液から遠心分離した。上清をデカントし、ペレットをアセトンに再懸濁した。粒子を二度目に１５０００ｒｃｆで１５分間溶液から遠心分離した。上清をデカントし、ペレットをアセトン中に最終質量濃度６ｍｇ／ｍＬまで再懸濁した。ポリスチレン−ｂ−ポリ（エチレングリコール）（１．６ｋＤａ−ｂ−５ｋＤａ）をＴＨＦに質量濃度１２ｍｇ／ｍＬで溶解した。粒子溶液とブロックコポリマー溶液を容量で１対１に混合し、次いで、手持ちの閉じ込め衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサーで脱イオン水流に対して１：１で混合した。脱イオン水中で、得られた粒子は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを通常の分析モードで使用して動的光散乱によって測定して、直径１９５ｎｍであり、ＰＤＩは０．１であった。
【０１１９】
（実施例８）
グルタチオンを含むＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡナノ粒子
ポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（１２ｋＤａ−ｂ−３ｋＤａ）をメタノールに濃度４０ｍｇ／ｍＬで溶解した。還元グルタチオン（ＧＳＨ）を水とメタノールの１：４混合物（容量対容量）に質量濃度２０ｍｇ／ｍＬで溶解した。塩基性酢酸クロムをメタノールに質量濃度９０ｍｇ／ｍＬで溶解した。溶液を容量で１容のポリマー溶液対１容のクロム溶液対２容のグルタチオン溶液として混合した。混合物を調製した直後に、手持ちの閉じ込め衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサーでクロロホルム流に対して１：１で混合した。ＣＩＪミキサーの流出液を、最終の溶媒組成が容量で１容の水対９容のメタノール対９０容のクロロホルムとなるようにクロロホルムの急速撹拌浴に集めた。粒子を４日間混合してクロムカチオンにポリ（アクリル酸）を架橋させた。得られた粒子はクロロホルム中で１１０ｎｍであり、ＰＤＩは０．１未満であった。メタノール中に膨潤させると、得られた粒子は１３０ｎｍであり、ＰＤＩは０．１未満であった。粒子直径はＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを通常の分析モードで使用して動的光散乱によって測定した。
【０１２０】
（実施例９）
グルタチオンを含有するＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡナノ粒子のＰＳ−ｂ−ＰＥＧによるコーティング
実施例８からの粒子をアセトンで希釈し、１５０００ｒｃｆで１５分間溶液から遠心分離した。上清をデカントし、ペレットをアセトンに再懸濁した。粒子を二度目に１５０００ｒｃｆで１５分間溶液から遠心分離した。上清をデカントし、ペレットをアセトン中に最終質量濃度６ｍｇ／ｍＬまで再懸濁した。ポリスチレン−ｂ−ポリ（エチレングリコール）（１．６ｋＤａ−ｂ−５ｋＤａ）をＴＨＦに質量濃度１２ｍｇ／ｍＬで溶解した。粒子溶液とブロックコポリマー溶液を容量で１対１に混合し、次いで、手持ちの閉じ込め衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサーで脱イオン水流に対して１：１で混合した。脱イオン水中で、得られた粒子は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを通常の分析モードで使用して動的光散乱によって測定して、直径１６０ｎｍで、ＰＤＩは０．１であった。
【０１２１】
（実施例１０）
グルタチオンを含むＰＡＡ−ｂ−ＰＥＧナノ粒子
ポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）（５ｋＤａ−ｂ−５ｋＤａ）をメタノールに濃度４０ｍｇ／ｍＬで溶解した。還元グルタチオンを水とメタノールの１：４混合物（容量対容量）に質量濃度２０ｍｇ／ｍＬで溶解した。塩基性酢酸クロムをメタノールに質量濃度５６ｍｇ／ｍＬで溶解した。溶液を容量で１容のポリマー溶液対１容のクロム溶液対２容のグルタチオン溶液として混合した。混合物を調製した直後に、手持ちの閉じ込め衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサーでクロロホルム流に対して１：１で混合した。ＣＩＪミキサーの流出液を、最終の溶媒組成が容量で１容の水対９容のメタノール対９０容のクロロホルムとなるようにクロロホルムの急速撹拌浴に集めた。粒子を４日間混合してクロムカチオンにポリ（アクリル酸）を架橋させた。粒子をアセトンに希釈し、１５０００ｒｃｆで１５分間溶液から遠心分離した。上清をデカントし、ペレットをアセトンに再懸濁した。粒子を二度目に１５０００ｒｃｆで１５分間溶液から遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを脱イオン水に再懸濁した。得られた粒子は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを通常の分析モードで使用して動的光散乱により測定して、直径が２４５ｎｍであり、ＰＤＩが０．３５またはそれ未満であった。
【０１２２】
（実施例１１）
シラン処理したバイアルに、アセトン中ＰＳ−ｂ−ＰＥＧの溶液を添加し、バンコマイシンをカプセル化するＰＢＡ−ｂ−ＰＡＡナノ粒子を、溶液中の質量比が２：１：１のＰＳ−ｂ−ＰＥＧ対ＰＢＡ−ｂ−ＰＡＡ対バンコマイシンとなるように被覆した。この溶液を総質量濃度５ｍｇ／ｍＬまで回転蒸発させた（rotovapped）。次いで、ナノ粒子溶液をアセトンで１０倍に希釈し、次いで５回回転蒸発させて質量濃度５ｍｇ／ｍＬに戻し、全てのクロロホルムを確実に除去した。
【０１２３】
ナノ粒子とＰＳ−ｂ−ＰＥＧ溶液を１：１の容量比でＣＩＪにおいてＭｉｌｌｉ−Ｑ精製水（ＭＱ）と混合し、流出流を、最終溶液が９０ｖｏｌ％のＭＱとなるようにＭＱの撹拌浴に集めた。プロセス流は５００μＬの５０ｖｏｌ％ＤＭＳＯ、４５ｖｏｌ％ＭｅＯＨ、および５ｖｏｌ％ＭＱを、５ｍｇ／ｍＬのバンコマイシンおよび５ｍｇ／ｍＬのポリマーと共に含んでいた。非プロセス流は６００μＬのＣＨＣｌ３および５０μＬのＦｅＣｌ３（架橋剤）をＭｅＯＨ中に含んでいた。浴は４．５ｍＬのＣＨＣｌ３を含んでいた。
【０１２４】
得られた粒子のサイズを、ＣＨＣｌ３中の被覆されてない粒子、ＭｅＯＨ中の被覆されてない粒子、および水中の被覆された粒子について図４に示す。
【０１２５】
疎水性のポリマー足場、例えばＰＬＧＡをベースとするものは、１ヶ月より長いタイムスケールにわたってペプチドおよびタンパク質を放出することが可能な粒子を生成することができる。高いローディング、高いカプセル化効率、および制御された放出を有するＰＬＧＡ微粒子を生成するには、高濃度の生物製剤を含有する非常に微細で安定な一次エマルションの形成を必要とする可能性がある。ＦＮＰは、ほとんどの二重エマルション方法で生成する細孔よりずっと小さい直径１００ｎｍ未満のナノ粒子中に５０ｗｔ％より高いローディングの生物製剤をカプセル化するのに使用することができる。ＦＮＰプロセスはスケーラブルで調整可能であり、４０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の粒子が生成した。得られる粒子は疎水性のポリマーシェルによって極性の有機溶媒中で立体的に安定化される。アニオン性コアは多価カチオンにより、およびポリアミンにより架橋されている。これらの粒子はナノ複合材を形成するためにＰＬＧＡ足場中に取り込むことができる。架橋されたヒドロゲルコアは、最終乳化ステップ中、外側の水相への活性医薬品成分（ＡＰＩ）の損失を低減することによって全体のカプセル化効率を上昇させることができると共に、追加の障壁を提供して治療薬の放出を延長し、バースト放出を低下させることができる。密な疎水性のポリマーブラシは合体を防止し、チャネル形成を低減し、最終のＰＬＧＡ微粒子の曲がりを増大することができる。ＰＡＡブロックは細孔内のＰＬＧＡ表面への吸着から生物製剤を保護することができる。形成されるゲルはナノ−スケールである。
【０１２６】
ＦＮＰは薬物送達用のポリマー性粒子中に生物製剤を製剤化するのに使用することができる。送達系を適合させてその生体適合性を最適化することができる。例えば、安定化材料はＰＬＡを（ＰＢＡの代わりに）、生体適合性のアニオン性ポリマーを（ＰＡＡの代わりに）含むことができる。ヒアルロン酸、ポリ（アスパラギン酸）、およびポリ（グルタミン酸）は全てＰＡＡに対する可能な生分解性の代替物である。プロセスは、より感受性の、高レベルの構造を有する生物製剤の安定性を維持するように最適化することができる。
【０１２７】
本明細書中で引用した参考文献は、本明細書に十分に記載されているかのように、参照によりその全体が組み込まれる。
【０１２８】
本明細書中で例示し説明した実施形態は、本発明を実施し使用するために、本発明者らが知る最良の方法を当業者に教示することのみを意図したものである。本明細書に記載のいかなる事項も本発明の範囲を限定するとみなされないものとする。提示した実施例は全て代表例であり、限定するものではない。本発明の上記の実施形態は、上記教示に照らして当業者により認められる程度に本発明から逸脱することなく改変または変更することができる。したがって、本発明は、特許請求の範囲およびそれに等価なものの範囲内で、具体的に記載したのとは異なって実施することができることが理解されるものとする。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４】
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