(57)【要約】【課題】テロメアおよびテロメアの一本鎖突出部の短縮を効果的に抑制することができるアンチエイジング剤を提供する。【解決手段】幹細胞培養上清を有効成分として含有し、テロメアおよびテロメアの一本鎖突出部であるＧテールの少なくとも一方の長さの短縮を抑制するアンチエイジング剤を調製する。上記幹細胞培養上清液は、歯髄幹細胞から調製されることが好ましく、上記歯髄幹細胞は、乳歯歯髄幹細胞であることが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞培養上清を有効成分として含有することを特徴するアンチエイジング剤。
【請求項２】
テロメアおよびテロメアの一本鎖突出部であるＧテールの少なくとも一方の長さの短縮を抑制することを特徴する請求項１に記載のアンチエイジング剤。
【請求項３】
前記幹細胞培養上清は、歯髄幹細胞から調製されることを特徴とする請求項１又は２に記載のアンチエイジング剤。
【請求項４】
前記歯髄幹細胞は、乳歯歯髄幹細胞であることを特徴とする請求項３に記載のアンチエイジング剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアンチエイジング剤に関する。より詳細には、加齢等によるテロメアおよびテロメアの一本鎖突出部（以下、「Ｇテール」という。）の短縮を効果的に抑制することができるアンチエイジング剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの染色体の末端は、５’―ＴＴＡＧＧＧ−３’の繰り返し配列からなる二本鎖ＤＮＡである。この部分は、テロメアと呼ばれ、細胞分裂を繰り返して、テロメアの長さは短くなる。テロメアの長さは、加齢や遺伝子の強さ等と関連し、テロメアの長さが短い方が、加齢により増加する様々な疾患にかかりやすいことが明らかになっている。
テロメアの最末端には、３’末端が突出した一本鎖突出部であるＧテールがある。テロメアに結合するテロメア結合タンパク質としては、TRF1(Telomere  repeat  binding  factor)およびTRF2が知られている。癌細胞では、TRF2がないと、Ｇテールのループが形成されず、Ｇテールの短縮が生じることが明らかになっている。この場合、テロメア全長は変化しないが、Ｇテールが短縮し、染色体末端の融合が生じる。
また、正常細胞でも、TRF2の機能を細胞内で消失させるとＧテールの短縮がおこり細胞増殖が停止して、老化することが非特許文献１等に記載されている。このとき、テロメア全長は変化しないことから、Ｇテールの短縮が老化の引き金になっていると考えられている。
特許文献１には、テロメアおよびＧテールの長さを測定する方法が記載されている。そして、この方法により測定したテロメアおよびＧテールの長さより、「遺伝子の疲労度」を検査する方法も報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５５１４４０１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ファン・スティーンセル・ビィ，スモゴルゼウスカ・エイ及びデ・ラン ジェ・ティ．（van  Steensel  B，Smogorzewska  A  and  de  Lange  T.），92(1998) ，Cell  :401-13.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、テロメアおよびＧテール短縮を効果的に抑制できるアンチエイジング剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題に鑑み、鋭意研究の結果、本発明者は、幹細胞上清を投与することにより、テロメアおよびＧテールの短縮が効果的に抑制されることを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明では、幹細胞培養上清を含有するアンチエイジング剤を提供する。
本発明のアンチエイジング剤は、テロメアおよびテロメアの一本鎖突出部であるＧテールの少なくとも一方の長さの短縮を抑制することを特徴する。
また、本発明のアンチエイジング剤に含有される幹細胞培養上清は、歯髄幹細胞を培養して調整することが好ましい。
さらに、上記歯髄幹細胞は、乳歯歯髄幹細胞であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のアンチエイジング剤により、テロメアおよびＧテールの短縮が抑制され、加齢に伴う老化現象を改善、防止又は遅延させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】幹細胞培養上清を投与した患者と投与していない患者のテロメア検査遺伝子強度を測定した結果を示す図である。
【図２】幹細胞培養上清を投与した患者と投与していない患者のテロメア年齢を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．幹細胞培養上清
幹細胞培養上清は、乳歯や永久歯の歯髄、骨髄、脂肪、臍帯などの幹細胞を培養する際に生成される上澄み液（培養上清液）である。これらの中には、サイトカインやケモカイン、エクソソームタンパク等と呼ばれる情報伝達物質が含有されている。そして、幹細胞の種類により含まれる成分および組成比が異なる。幹細胞培養上清の中でも、乳歯歯髄幹細胞から調製された培養上清液（乳歯歯髄幹細胞培養上清液（ＳＨＥＤ−ＣＭ））には、５００種類以上のサイトカインやケモカイン、エクソソームタンパク等が含まれていることが確認されている。
本発明の幹細胞培養上清としては、特に限定されず、乳歯や永久歯の歯髄、骨髄、脂肪、臍帯などの幹細胞の培養上清を用いることができるが、乳歯歯髄幹細胞培養上清を用いることが好ましい。
【００１０】
また、本発明の幹細胞培養上清の製造方法は、特に限定されず、公知の方法を適用することができる。以下に乳歯歯髄幹細胞培養上清の製造方法を示すが、この方法に限定されるものではない。
ステップ（１）
以下の（ａ）〜（ｃ）により、歯髄細胞から、接着性細胞である歯髄幹細胞を選抜する。
【００１１】
（ａ）歯髄の採取
自然に脱落した乳歯（又は抜歯した乳歯、或いは永久歯）をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液で消毒した後、歯冠部を分割し歯科用リーマーにて歯髄組織を回収する。
【００１２】
（ｂ）酵素処理
採取した歯髄組織を基本培地（10%ウシ血清・抗生物質含有ダルベッコ変法イーグル培地）に懸濁し、2mg/mlのコラゲナーゼ及びディスパーゼで37℃、１時間処理する。５分間遠心分離（5000回転／分）を行い酵素処理後の歯髄細胞を回収する。セルストレーナーによる細胞選別はSHEDやDPSCの神経幹細胞分画の回収効率を低下させるので、使用しない。
【００１３】
（ｃ）接着性細胞の選抜
細胞を4cc基本培地で再懸濁し、直径6cmの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。培養液（例えば、10%FCS含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium））を添加した後、5%CO2、37℃に調整したインキュベータにて２週間程度培養する。培養液を除去した後、PBS等で細胞を1回又は数回洗浄する。この操作（培養液の除去及び細胞の洗浄）に代えて、コロニーを形成した接着性細胞（歯髄幹細胞）を回収することにしてもよい。この場合には例えば、0.05%トリプシン・EDTAにて5分間、37℃で処理し、ディッシュから剥離した細胞を回収する。
【００１４】
ステップ（２）
選抜した接着性細胞を培養する。具体的な方法を以下に示すが、これに限定されるものではない。
細胞を付着性細胞培養用ディッシュに播種し、5%CO2、37℃に調整したインキュベータで培養する。必要に応じて継代培養を行う。例えば、肉眼で観察してサブコンフルエント（培養容器の表面の約70％を細胞が占める状態）又はコンフルエントに達したときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を１〜８回行い、必要な細胞数（例えば約1×107個/ml）まで増殖させる。尚、培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。以上の培養の後、細胞を回収して保存することにしてもよい（保存条件は例えば-198℃）。様々なドナーから回収した細胞を歯髄幹細胞バンクの形態で保存することにしてもよい。
【００１５】
培養液としては、基本培地、或いは基本培地に血清等を添加したもの等を使用することができる。但し、血清を含まない「歯髄幹細胞の培養上清」を調製するためには、全過程を通して或いは最後又は最後から数回の継代培養についは無血清培地を使用するとよい。なお、基本培地としてはDMEMの他、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）（GIBCO社等）、ハムF12培地（HamF12）（SIGMA社、GIBCO社等）、RPMI1640培地等を用いることができる。また、二種以上の基本培地を併用してもよい。混合培地としては、IMDMとHamF12を等量混合した培地（例えば商品名：IMDM/HamF12（GIBCO社）として市販される）等を挙げることができる。また、培地に添加可能な成分としては、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)等）、ウシ血清アルブミン（BSA）、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラル等を挙げることができる。
【００１６】
ステップ（３）
選抜・培養した歯髄幹細胞の培養上清液を回収する。
具体的には、スポイトやピペットなどで培養液を吸引して回収することができる。回収した培養上清はそのまま或いは一以上の処理を経た後に本発明のアンチエイジング剤の有効成分として使用される。ここでの処理としては、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存（例えば、4℃、-80℃）等を挙げることができる。
【実施例】
【００１７】
図１に示す性別および年齢の患者４名に対し、幹細胞培養上清を投与し、遺伝子強度の経時変化を検査した（左図）。また、比較として、幹細胞培養上清を投与しない患者の遺伝子強度の経時変化を確認した結果も示す（右図）。
なお、遺伝子強度は、株式会社ミルテルのミルテル検査により、テロメアおよびＧテールの長さより算出した。
図１に示すように、幹細胞培養上清を投与しない患者では、遺伝子強度が低下するのに対し、幹細胞培養上清を投与した患者では、遺伝子強度が上昇することがすることがわかった。このことから、幹細胞培養上清が、テロメアおよびＧテールの短縮に対する優れた抑制効果を有し、アンチエイジング剤として有効なことが確認された。
【００１８】
図２に示す性別および年齢の患者４名に対し、幹細胞培養上清を投与し、テロメア年齢の経時変化を検査した（左図）。また、比較として、幹細胞培養上清を投与しない患者のテロメア年齢の経時変化を確認した結果も示す（右図）。
なお、テロメア年齢も、株式会社ミルテルのミルテル検査により、テロメアおよびＧテールの長さより算出した。
図２に示すように、幹細胞培養上清を投与しない患者では、テロメア年齢が上昇するのに対し、幹細胞培養上清を投与した患者では、テロメア年齢が低下することがわかった。このことからも、幹細胞培養上清が、テロメアおよびＧテールの短縮に対する優れた抑制効果を有し、アンチエイジング剤として有効なことが確認された。
【図１】
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【図２】
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