(57)【要約】      （修正有）【課題】操作が煩雑である従来の抗体によるＴＮＦ−α分析法に代わる、前記ＴＮＦ−αに結合する新たな核酸分子を用いた分析法の提供。【解決手段】下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む核酸分子を、ＴＮＦ−αに結合する核酸分子とする分析法。（ａ）特定の塩基配列或いは、特定の部分配列からなるポリヌクレオチド。（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記ＴＮＦ−αに結合するポリヌクレオチド。【選択図】図２
2019041672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ＴＮＦ−αに結合する核酸分子。
（ａ）配列番号１または２の塩基配列もしくは配列番号１または２の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＴＮＦ−αに結合するポリヌクレオチド
ＴＮＦ−ＫＳ９Ｒ８ｍ１（配列番号１）
GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAAACTAGCCCGTAACCTTTCACCATCAATTCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC
ＴＮＦ−ＫＳ９ｒａｎｋ１（配列番号２）
GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGACAAACTAAGCCCCCTCTGGAAATTAACAGCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC
【請求項２】
前記配列番号１の塩基配列の部分配列が、配列番号３の塩基配列である、請求項１記載の核酸分子。
ＴＮＦ−ＫＳ９Ｒ８ｍ１ｓ６１ｓ１５（配列番号３）
ACCTCGCCGTTTATGAAACTAGCCCGTAACCTTTCACCATCAATTCCTAAGG
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のチミンが、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンである、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドにおいて、チミンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記各塩基配列における下線部で示されるチミンが、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記修飾チミンにおける修飾基が、アデニン残基である、請求項３から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、ＴＮＦ−αの検出試薬。
【請求項９】
さらに、標識物質を有し、
前記標識物質が、前記核酸分子に結合されている、請求項８記載の検出試薬。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項８または９に記載の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のＴＮＦ−αと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、ＴＮＦ−αの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＮＦ−αに結合する核酸分子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、炎症や免疫応答に関連する生理活性物質であり、神経、内分泌、免疫系等のホメオスタシス維持機構において、種々の細胞間での情報伝達を担っている。ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α）は、炎症性サイトカインとして知られており、近年、ＴＮＦ−αを、炎症関連疾患のバイオマーカーとして、診断、リスク層別化、予後予測、治療経過判定等に用いる研究が進められている。（非特許文献１および２）
【０００３】
ＴＮＦ−αの分析方法として、ＴＮＦ−αを抗原とする抗体を使用した分析方法が知られている。しかし、抗体は、タンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい。また、電気泳動やニトロセルロース膜へのブロッティング等が必要であり、操作が煩雑である。このため、近年、抗体に代えて、抗原と特異的に結合する核酸分子が注目されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】保健学研究  28  pp37-45  (2016)
【非特許文献２】尾上ほか  日本内科学会雑誌  第103巻  第2号  345-352  (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の目的は、ＴＮＦ−αに結合する新たな核酸分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の核酸分子は、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ＴＮＦ−αに結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１または２の塩基配列もしくは配列番号１または２の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＴＮＦ−αに結合するポリヌクレオチド
【０００７】
本発明のＴＮＦ−αの検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明のＴＮＦ−αの検出方法は、前記本発明の核酸分子、または前記本発明の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のＴＮＦ−αと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の核酸分子は、ＴＮＦ−αに結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、試料中のＴＮＦ−αとの結合の有無によって、ＴＮＦ−αを検出できる。したがって、本発明の核酸分子は、例えば、医薬等の分野において、ＴＮＦ−αの検出に、極めて有用なツールといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の実施例１における、アプタマー１〜３の推定二次構造である。
【図２】図２は、本発明の実施例１における、ＴＮＦ−αに対するアプタマー１〜３の結合性を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例１における、ＴＮＦ−αに対するアプタマー１〜３の結合性を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例２における、ＴＮＦ−αに対するアプタマー１〜３の結合性を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例３における、プルダウンアッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（１）核酸分子
本発明の核酸分子は、前述のように、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ＴＮＦ−αに結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１または２の塩基配列もしくは配列番号１または２の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＴＮＦ−αに結合するポリヌクレオチド
【００１２】
本発明において、ターゲットは、ＴＮＦ−αである。ＴＮＦ−α（ＵｎｉＰｒｏｔＩＤ：Ｐ０１３７５）は、２５ｋＤａの膜結合型タンパク質として産生され、切断により、１７ｋＤａの可溶性タンパク質となる。ＴＮＦ−αは、例えば、前記膜結合型タンパク質でもよいし、前記可溶性タンパク質でもよい。本発明の核酸について、例えば、結合能を確認するためのＴＮＦ−αとして、市販のＴＮＦ−αが使用でき、具体例として、ＴＮＦ−α（Human,  Recombinant、PeproTech、#300-01A）が例示できる。ＴＮＦ−αは、例えば、ヒト由来ＴＮＦ−αである。ＴＮＦ−αは、例えば、変性が生じていない未変性タンパク質でもよいし、加熱等による変性が生じた変性タンパク質でもよい。
【００１３】
本発明の核酸分子は、前述のように、ＴＮＦ−αに結合可能である。本発明において、「ＴＮＦ−αに結合する」とは、例えば、ＴＮＦ−αに対する結合性を有している、または、ＴＮＦ−αに対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子とＴＮＦ−αとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（商品名、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）が使用できる。本発明の核酸分子は、ＴＮＦ−αに結合することから、例えば、ＴＮＦ−αの検出に使用できる。
【００１４】
本発明の核酸分子は、ＴＮＦ−αに対する結合力を示す解離定数が、例えば、２０ｎＭ以下、１７ｎＭ以下、１１ｎＭ以下、１０ｎＭ以下である。
【００１５】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子、またはＤＮＡアプタマーともいう。本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
【００１６】
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、前述のように、前記配列番号１または２のいずれかの塩基配列または前記配列番号１または２のいずれかの塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチドである。前記配列番号１および２のポリヌクレオチドを以下に示す。
【００１７】
ＴＮＦ−ＫＳ９Ｒ８ｍ１（配列番号１）
GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAAACTAGCCCGTAACCTTTCACCATCAATTCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC
ＴＮＦ−ＫＳ９ｒａｎｋ１（配列番号２）
GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGACAAACTAAGCCCCCTCTGGAAATTAACAGCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC
【００１８】
前記部分配列は、特に制限されないが、例えば、前記配列番号１の塩基配列の部分配列として、配列番号３の塩基配列があげられる。
【００１９】
ＴＮＦ−ＫＳ９Ｒ８ｍ１ｓ６１ｓ１５（配列番号３）
ACCTCGCCGTTTATGAAACTAGCCCGTAACCTTTCACCATCAATTCCTAAGG
【００２０】
前記（ｂ）において、「同一性」は、特に制限されず、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、ＴＮＦ−αに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００２１】
本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ＴＮＦ−αに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＴＮＦ−αに結合するポリヌクレオチド
【００２２】
前記（ｃ）において、「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、特に制限されず、例えば、前記（ａ）の塩基配列に対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００２３】
前記（ｃ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００２４】
前記（ｄ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ）のポリヌクレオチドが、ＴＮＦ−αに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）の塩基配列において、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１または２個である。
【００２５】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよいが、好ましくは同じである。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上であり、好ましくは２〜１２であり、より好ましくは２〜６であり、さらに好ましくは２である。
【００２６】
前記リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドがあげられ、その構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２４塩基長であり、好ましくは１２〜２４塩基長であり、より好ましくは１６〜２４塩基長であり、さらに好ましくは２０〜２４塩基長である。
【００２７】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【００２８】
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドであり、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
【００２９】
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【００３０】
本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記核酸分子の長さは、特に制限されず、その下限は、例えば、１５塩基長であり、好ましくは７５塩基長または８０塩基長であり、その上限は、例えば、１０００塩基長であり、好ましくは２００塩基長、１００塩基長または９０塩基長である。
【００３１】
前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜３個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜３塩基」との記載は、「１、２、３塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００３２】
前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド残基における塩基として、天然塩基を含んでもよいし、修飾塩基を含んでもよい。前記天然塩基（非人工塩基）は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられ、好ましくは、シトシン（ｃ）、およびチミン（ｔ）である。
【００３３】
前記ポリヌクレオチドが前記修飾塩基を有する場合、その部位および個数は、特に制限されない。前記（ａ）のポリヌクレオチドまたはその部分配列が前記修飾塩基を有する場合、配列番号１−３のポリヌクレオチドにおいて、例えば、下線部のチミンの一部または全部が、修飾塩基である。前記修飾塩基は、チミン塩基が修飾された修飾チミンであることが好ましい。
【００３４】
前記修飾塩基は、例えば、塩基が修飾基で修飾されたものである。前記修飾基により修飾される塩基（被修飾塩基）は、例えば、前記天然塩基である。前記天然塩基は、例えば、プリン塩基、ピリミジン塩基等があげられる。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、修飾ウラシルがあげられる。
【００３５】
前記修飾塩基は、例えば、前記被修飾塩基が、直接、前記修飾基で修飾されてもよいし、前記被修飾塩基が、間接的に、前記修飾基で修飾されてもよい。後者の場合、例えば、前記被修飾塩基が、リンカーを介して、前記修飾基で修飾される形態があげられる。前記リンカーは、特に制限されない。
【００３６】
前記被修飾塩基の前記修飾基による修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられ、７位が好ましい。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられ、５位が好ましい。前記ピリミジン塩基の５位が修飾される場合、チミンは、５位の炭素にメチル基を有することから、例えば、５位の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよいし、５位の炭素に結合したメチル基の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよい。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「−ＣＨ３」または「−Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
【００３７】
前記修飾塩基が修飾チミンである場合、前記修飾基は、アデニン残基が好ましい。すなわち、前記修飾塩基は、例えば、塩基が前記アデニン残基で修飾されている。前記アデニン残基が前記被修飾塩基を修飾する部位は、特に制限されず、例えば、前記アデニン残基における６位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記アデニン残基で修飾される前記被修飾塩基は、特に制限されないが、例えば、チミンが好ましく、チミンの５位の炭素に結合したメチル基の炭素が、前記アデニン残基で修飾されていることが好ましい。
【００３８】
前記ポリヌクレオチドにおける前記アデニン残基で修飾されたチミジンヌクレオチド残基の具体例として、例えば、下記化学式（１）に示す残基（以下、「ＫＳ９」ともいう）、があげられる。なお、本発明は、これには限定されない。
【００３９】
【化１】
2019041672.tif 000003
【００４０】
前記配列番号１−３のポリヌクレオチドにおいて、例えば、下線部のチミンが、前記ＫＳ９のヌクレオチド残基であることが好ましい。
【００４１】
本発明の核酸分子が、例えば、前記チミジンヌクレオチド残基を有する場合、前記ポリヌクレオチドの合成には、例えば、下記化学式（２）に示すヌクレオチド三リン酸（以下、「ＫＳ９モノマー」ともいう）を、モノマー分子として使用することができる。前記ポリヌクレオチドの合成において、例えば、前記モノマー分子は、ホスホジエステル結合により、他のヌクレオチド三リン酸と結合する。
【００４２】
【化２】
2019041672.tif 000004
【００４３】
前記修飾基としては、この他に、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、ベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、トリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
【００４４】
前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’−デアザアデニン等があげられ、前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’−デアザグアニン等があげられ、前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’−メチルシトシン等があげられ、前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルチミン、５’−トリプタミノカルボニルチミン、５’−イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられ、前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’−イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。例示した前記修飾ウラシルは、チミンの修飾塩基ということもできる。
【００４５】
前記ポリヌクレオチドは、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
【００４６】
前記修飾塩基の個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の個数は、例えば、１個以上である。前記修飾塩基は、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、特に好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２０個であり、また、全ての塩基が、前記修飾塩基でもよい。前記修飾塩基の個数は、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基の個数であってもよいし、２種類以上の前記修飾塩基の個数の合計であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基も、特に制限されず、例えば、１〜８０個、１〜５０個、１〜２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
【００４７】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の割合は、特に制限されない。前記修飾塩基の割合は、前記ポリヌクレオチドの全塩基数のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基の割合も、特に制限されず、前述の範囲と同様である。ここで、前記全塩基数は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおける天然塩基の個数と前記修飾塩基の個数の合計である。前記修飾塩基の割合を分数で示すが、これを満たす全塩基数と修飾塩基数とは、それぞれ正の整数である。
【００４８】
前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾チミンの場合、前記修飾チミンの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然チミンは、前記修飾チミンに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの個数は、例えば、１個以上である。前記修飾チミンは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、特に好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２１個であり、また、全てのチミンが、前記修飾チミンでもよい。
【００４９】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの割合は、特に制限されない。前記修飾チミンの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾チミンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。
【００５０】
本発明の核酸分子は、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
【００５１】
前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
【００５２】
前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
【００５３】
前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、特に好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２１個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１〜８０個、１〜５０個、１〜２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
【００５４】
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、特に好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２１個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記人工核酸モノマー残基も、特に制限されず、例えば、１〜８０個、１〜５０個、１〜２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
【００５５】
本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
【００５６】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長であり、好ましくは１〜５０塩基長であり、より好ましくは１〜２５塩基長、さらに好ましくは１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
【００５７】
本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することができる。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記付加配列を介して、前記担体に固定化する。前記担体は、例えば、ビーズ、プレート、フィルター、カラム、基板、容器等があげられる。
【００５８】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに標識物質を有してもよく、具体的には、前記核酸分子に前記標識物質が結合してもよい。前記標識物質が結合した前記核酸分子は、例えば、本発明の核酸センサということもできる。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合させてもよい。前記標識物質による標識化は、例えば、結合でもよいし、化学修飾でもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、酵素、蛍光物質、色素、同位体、薬物、毒素および抗生物質等があげられる。前記酵素は、例えば、ルシフェラーゼ、ＳＡ−Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、ポリヌクレオチドのリンカー等である。
【００５９】
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法、遺伝子工学的手法等の公知の方法等により合成できる。
【００６０】
本発明の核酸分子は、前述のように、ＴＮＦ−αに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、ＴＮＦ−αへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、ＴＮＦ−αに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
【００６１】
本発明の核酸分子によれば、ＴＮＦ−αを検出できる。ＴＮＦ−αの検出方法は、特に制限されず、ＴＮＦ−αと前記核酸分子との結合を検出することによって行える。
【００６２】
（２）検出試薬およびキット
本発明の検出試薬は、前述のように、ＴＮＦ−αの検出試薬であって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出試薬を使用すれば、前述のように、例えば、ＴＮＦ−αの検出等を行うことができる。本発明の検出試薬は、例えば、ＴＮＦ−αへの結合剤ともいえる。
【００６３】
本発明の検出試薬は、例えば、さらに、標識物質を有し、前記標識物質が、前記核酸分子に結合されてもよい。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子における説明を援用できる。また、本発明の検出試薬は、例えば、担体を有し、前記担体に前記核酸分子が固定化されてもよい。前記担体は、例えば、前記本発明の核酸分子における説明を援用できる。
【００６４】
本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子または前記本発明の検出試薬を含む。本発明の検出キットは、例えば、さらに、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記試料を調製するための緩衝液、使用説明書等があげられる。また、後述する本発明の検出方法に示す、前記核酸分子に標識物質であるルシフェラーゼを結合させた核酸センサと、標識化担体とを用いる方法の場合、本発明の検出キットは、例えば、前記核酸センサと、ＴＮＦ−α標識化担体とを含むキットとすることができる。
【００６５】
本発明の検出試薬および検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の説明を援用でき、また、その使用方法についても、前記本発明の核酸分子および後述する前記本発明の検出方法を援用できる。
【００６６】
（３）検出方法
本発明のＴＮＦ−αの検出方法は、前述のように、前記本発明の核酸分子、または前記本発明の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のＴＮＦ−αと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子または前記検出試薬を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。以下、本発明の核酸分子の使用を例にあげて説明するが、本発明の核酸分子は、本発明の検出試薬と読み替え可能である。
【００６７】
本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、ＴＮＦ−αに特異的に結合することから、例えば、ＴＮＦ−αと、前記核酸分子または前記検出試薬との結合を検出することによって、試料中のＴＮＦ−αを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のＴＮＦ−αの量を分析可能であることから、定性分析または定量分析も可能といえる。
【００６８】
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、だ液、尿、血液等があげられる。
【００６９】
前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００７０】
本発明の検出方法について、本発明の核酸分子として、標識物質で標識化された本発明の核酸センサを使用し、ＴＮＦ−αを検出する方法を例にあげて説明する。なお、本発明は、これらの例示には制限されない。
【００７１】
前記検出工程は、例えば、さらに、前記複合体の検出結果に基づいて、前記試料中のＴＮＦ−αの有無または量を分析する工程を含む。
【００７２】
前記複合体形成工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００７３】
前記複合体形成工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分であり、好ましくは３０〜６０分である。
【００７４】
前記複合体形成工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子（固相担体）でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前者の場合、前記担体は、特に制限されず、例えば、プレート、フィルター、カラム、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
【００７５】
前記検出工程は、前述のように、前記試料中のＴＮＦ−αと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のＴＮＦ−αの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のＴＮＦ−αの量を分析（定量）できる。
【００７６】
ＴＮＦ−αと前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ等があげられる。
【００７７】
そして、ＴＮＦ−αと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にＴＮＦ−αは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にＴＮＦ−αが存在すると判断できる。また、予め、ＴＮＦ−αの濃度と結合量との相関関係を求めておき、前記相関関係に基づいて、前記結合量から、前記試料中のＴＮＦ−αの濃度を分析することもできる。
【００７８】
ＴＮＦ−αと前記核酸分子との結合の検出について、一例として、前記核酸分子に標識物質であるルシフェラーゼを結合させた核酸センサと、ＴＮＦ−α標識化担体とを用いる方法を、以下に示す。
【００７９】
まず、前記核酸センサと前記試料とを混合する。これにより、前記試料中にＴＮＦ−αが存在する場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、ターゲットであるＴＮＦ−αと結合する。他方、前記試料中にＴＮＦ−αが存在しない場合、前記核酸センサにおける核酸分子は、ターゲットと未結合の状態となる。
【００８０】
つぎに、前記混合物を、前記ＴＮＦ−α標識化担体に接触させた後、前記ＴＮＦ−α標識化担体を除去する。前記担体は、例えば、ビーズがあげられる。前記混合物において、前記核酸センサがＴＮＦ−αと結合している場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記ＴＮＦ−α標識化担体におけるＴＮＦ−αとは結合できない。このため、前記ＴＮＦ−α標識化担体を除去した画分に対して、ルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を行った場合、前記核酸センサにおけるルシフェラーゼの触媒反応によって、発光が生じる。他方、前記混合物において、前記核酸センサがＴＮＦ−αと結合していない場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記ＴＮＦ−α標識化担体におけるＴＮＦ−αと結合する。このため、前記ＴＮＦ−α標識化担体の除去により、前記核酸センサも、前記ＴＮＦ−α標識化担体に結合した状態で除去されることになる。このため、前記ＴＮＦ−α標識化担体を除去した画分に対して、ルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を行った場合、前記核酸センサが存在していないことから、ルシフェラーゼの触媒反応による発光は生じない。このため、発光の有無によって、試料中のＴＮＦ−αの有無を分析（定性分析）することができる。また、試料中のＴＮＦ−αの量と、前記ＴＮＦ−α標識化担体を除去した後の前記画分に残存する前記核酸センサの量とは、相関関係を有するため、発光の強弱によって、試料中のＴＮＦ−αの量も分析（定量分析）することができる。
【実施例】
【００８１】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
【００８２】
［実施例１］
本発明のアプタマーについて、ＴＮＦ−αに対する結合性を、ＳＰＲ解析により確認した。
【００８３】
（１）アプタマー
下記ポリヌクレオチドのアプタマー１〜３を、実施例のアプタマーとして合成した。アプタマー３は、アプタマー１の小型化アプタマーである。下記ポリヌクレオチドの下線部において、「Ｔ」は、全て、天然チミン（Ｔ）に代えて、前記ＫＳ９とした。
【００８４】
アプタマー１：ＴＮＦ−ＫＳ９Ｒ８ｍ１（配列番号１）
GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAAACTAGCCCGTAACCTTTCACCATCAATTCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC
アプタマー２：ＴＮＦ−ＫＳ９ｒａｎｋ１（配列番号２）
GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGACAAACTAAGCCCCCTCTGGAAATTAACAGCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC
アプタマー３：ＴＮＦ−ＫＳ９Ｒ８ｍ１ｓ６１ｓ１５（配列番号３）
ACCTCGCCGTTTATGAAACTAGCCCGTAACCTTTCACCATCAATTCCTAAGG
【００８５】
アプタマー１〜３の推定二次構造を、それぞれ、図１（Ａ）〜（Ｃ）に示す。ただし、これには限定されない。
【００８６】
前記アプタマーは、その３’末端に、２０塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。前記ポリｄＡ付加アプタマーは、９５℃、５分の条件で熱変性させたものを使用した。
【００８７】
（２）試料
ＴＮＦ−α（Human,  Recombinant、PeproTech、#300-01A）を、ＳＢ１Ｔバッファーに懸濁し、一晩溶解させた後、遠心（１２，０００ｒｐｍ、１５分、室温）し分離した。前記分離した上清を、ＴＮＦ−αを含む抽出液として得た。これをＴＮＦ−α試料とした。前記ＳＢ１Ｔバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．５とした。
【００８８】
また、前記アプタマーの交差反応の確認のため、前記ＴＮＦ−α試料と同様にして、以下に示す材料から、α−アミラーゼ試料およびｓ−ＩｇＡ試料を調製した。
α−アミラーゼ（Lee  Biosolutions社製、#120-10）
ｓ−ＩｇＡ（IgA(Secretory),  Human、MP  Biomedicals,  LLC-Cappel  Products社製、#55905）
【００８９】
（３）ＳＰＲによる結合性の解析
結合性の解析には、ProteON  XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。
【００９０】
まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名  ProteOn  NLC  Sensor  Chip、BioRad社）を、前記ProteON  XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＴをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）が飽和するまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＴは、２０塩基長のデオキシチミジンの５’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＢ１Ｔバッファーを用いて、２００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が飽和するまで結合させた。続いて、所定のタンパク質濃度（４００ｎｍｏｌ／Ｌ）の前記試料を、それぞれ、ＳＢ１Ｔバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＢ１Ｔバッファーを３００秒間流して、洗浄を行った。前記試料のインジェクション後、シグナル強度を測定し、前記試料のインジェクション開始を０秒として、１１５〜１２５秒におけるシグナル強度（ＲＵ）の平均値（ＲＵ１１５−１２５）を求めた。そして、前記ビオチン化ポリｄＴに前記ポリｄＡ付加アプタマーを結合させた時におけるＲＵ値（ＲＵｉｍｍｏｂ）とＲＵ１１５−１２５との比（ＲＵ１１５−１２５／ＲＵｉｍｍｏｂ）を算出した。
【００９１】
これらの結果を図２および図３に示す。図２は、４００ｎｍｏｌ／ＬのＴＮＦ−αに対するアプタマー１〜３の結合性を示すグラフであり、横軸は、アプタマー１〜３における、各試料を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。横軸において、左から順に、ＴＮＦ−α試料、α−アミラーゼ試料、およびｓ−ＩｇＡ試料を示す。図２に示すように、アプタマー１〜３は、ＴＮＦ−αに対して、結合性を示した。また、アプタマー１の小型化アプタマーであるアプタマー３は、アプタマー１と比較して、ＴＮＦ−αに対して、より高い結合性を示した。一方、アプタマー１〜３は、α−アミラーゼ試料、およびｓ−ＩｇＡ試料に対しては、いずれも、シグナル強度が約０以下であり、結合性を示さなかった。この結果から、アプタマー１〜３は、ＴＮＦ−αに対して優れた特異性で結合することがわかった。
【００９２】
図３は、４００ｎｍｏｌ／ＬのＴＮＦ−αに対するアプタマー１〜３の結合性を示すグラフであり、（Ａ）は、アプタマー１、（Ｂ）は、アプタマー２、（Ｃ）は、アプタマー３の結果を示す。横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図３に示すように、アプタマー１〜３は、ＴＮＦ−αに対して、結合性を示した。一方、α−アミラーゼ試料、およびｓ−ＩｇＡ試料に対しては、いずれも、シグナル強度が約０以下であり、結合性を示さなかった。この結果から、アプタマー１〜３は、ＴＮＦ−αに対して優れた特異性で結合することがわかった。
【００９３】
以上の結果から、本発明のアプタマーは、ＴＮＦ−αに結合し、それを測定により検出できることがわかった。
【００９４】
［実施例２］
本発明のアプタマーについて、ＴＮＦ−αに対する解離定数を求めた。
【００９５】
アプタマーとして、前記アプタマー１〜３を使用し、前記試料におけるＴＮＦ−αの濃度を、２５、５０、１００、２００、および４００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は実施例１と同様にして、結合性の解析を行った。
【００９６】
この結果を図４に示す。図４は、ＴＮＦ−αに対するアプタマー１〜３の結合性を示すグラフであり、（Ａ）は、アプタマー１、（Ｂ）は、アプタマー２、（Ｃ）は、アプタマー３の結果を示す。横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図４に示すように、アプタマー１〜３は、ＴＮＦ−αの濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加した。
【００９７】
さらに、前記図４のＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータを算出した。この結果、アプタマー１は、ＴＮＦ−αに対する解離定数（ＫＤ）が、１０．４×１０−９ｍｏｌ／Ｌであり、アプタマー２は、ＴＮＦ−αに対する解離定数（ＫＤ）が、１６．７×１０−９ｍｏｌ／Ｌであり、アプタマー３は、ＴＮＦ−αに対する解離定数（ＫＤ）が、１０．０×１０−９ｍｏｌ／Ｌであり、優れた結合性であることがわかった。
【００９８】
［実施例３］
本発明のアプタマーについて、プルダウンアッセイを行い、ＴＮＦ−αに対する結合性を確認した。
【００９９】
前記アプタマー１の相補鎖に、５’末端がビオチン化された５’−ビオチン化フォワードプライマーを結合させ、前記修飾塩基を含むバッファー中で伸長させることにより、前記相補鎖と５’末端がビオチン化された前記アプタマー１との二本鎖を作製した。前記二本鎖を、ストレプトアビジンビーズに結合させ、その後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨで処理して前記相補鎖を除去することにより、アプタマー結合ビーズを作製した。また、前記アプタマーに代えて、前記プライマーを前記ストレプトアビジンビーズに結合させた以外は同様にして、コントロールビーズを作製した。
【０１００】
つぎに、３０ｐｍｏｌの前記アプタマー結合ビーズを、２μｇのＴＮＦ−αを含むＳＢ１Ｔバッファーと混合した。そして、前記混合液を、１０００ｒｐｍで振盪しながら常温で１時間インキュベートし、ＴＮＦ−αを前記アプタマー結合ビーズに結合させた。前記ビーズを、ＳＢ１Ｔバッファーで３回洗浄した後、２％のＳＤＳを含むＳＢ１Ｔバッファーと混合し、前記混合液を室温で１０分間振盪することにより、前記ビーズに結合したタンパク質を溶出させた。前記溶出したタンパク質を、ＳＤＳバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２％  ＳＤＳ、５％  Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．００２％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ、１％  ２−Ｍｅｌｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）と混合し、９５度、１０分の条件で、加熱処理した。その後、氷冷し、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥＬ  Ｃ５２０Ｌ、ＡＴＴＯ社製）による電気泳動に供した。泳動バッファーは、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％  ＳＤＳとした。電気泳動後、前記ゲルを、染色液（Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、#24594)を用いて常温で３０分間染色した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で撮影した。また、ＳＢ１Ｔバッファーに代えて、９０％のだ液を含むＳＢ１Ｔバッファー（だ液／ＳＢ１Ｔバッファー）を用いた以外は同様にして、実験を行った。
【０１０１】
この結果を図５に示す。図５は、プルダウンアッセイの結果を示す電気泳動写真であり、レーン１は、アプタマー結合ビーズのＳＢ１Ｔバッファー中プルダウン、レーンＣ１は、コントロールビーズのＳＢ１Ｔバッファー中プルダウン、レーン２は、アプタマー結合ビーズのだ液／ＳＢ１Ｔバッファー中プルダウン、レーンＣ２は、コントロールビーズのだ液／ＳＢ１Ｔバッファー中プルダウンの結果を示す。同図において、レーンＭは電気泳動のマーカーであり、レーンＴＮＦ−αは、ＴＮＦ−αのポジティブコントロールである。また、同図において、１５ｋＤａ付近のゲル上の矢印は、ＴＮＦ−αのバンドを示す。
【０１０２】
図５のレーン１および２における矢印に示すように、アプタマー１結合ビーズを用いた場合、ＳＢ１Ｔバッファー中およびだ液／ＳＢ１Ｔバッファー中プルダウンにおいて、ＴＮＦ−αのバンドが検出された。すなわち、アプタマー１は、ＴＮＦ−αに結合した。一方、図５のレーンＣ１およびＣ２に示すように、コントロールビーズを用いた場合、ＳＢ１Ｔバッファー中およびだ液／ＳＢ１Ｔバッファー中プルダウンにおいて、ＴＮＦ−αのバンドは検出されなかった。
【０１０３】
以上の結果から、本発明のアプタマーは、バッファー中およびだ液中において、ＴＮＦ−αに結合することがわかった。
【０１０４】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
【０１０５】
上記の実施形態の一部または全部は、以下の付記のようにも記載しうるが、以下には限定されない。
【０１０６】
（付記１）
下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ＴＮＦ−αに結合する核酸分子。
（ａ）配列番号１または２の塩基配列もしくは配列番号１または２の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＴＮＦ−αに結合するポリヌクレオチド
（付記２）
付記１記載の核酸分子を含むことを特徴とする、ＴＮＦ−αの検出試薬。
（付記３）
さらに、標識物質を有し、
前記標識物質が、前記核酸分子に結合されている、付記２記載の検出試薬。
（付記４）
前記標識物質が、酵素である、付記３記載の検出試薬。
（付記５）
前記酵素が、ルシフェラーゼである、付記４記載の検出試薬。
（付記６）
付記１記載の核酸分子、または付記２から５のいずれかに記載の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のＴＮＦ−αと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、ＴＮＦ−αの検出方法。
（付記７）
前記検出が、定性分析または定量分析である、付記６記載の検出方法。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の核酸分子は、ＴＮＦ−αに結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、試料中のＴＮＦ−αとの結合の有無によって、ＴＮＦ−αを検出できる。このため、本発明の核酸分子は、例えば、医薬等の分野において、例えば、ＴＮＦ−αの検出に、極めて有用なツールといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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