(57)【要約】      （修正有）【課題】口腔衛生において使用するための組成物の提供。【解決手段】ラクトバチルス・ヘルベチクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）株を含有する。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株、特にラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０をさらに含有する組成物。ラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０およびラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０の組み合わせは、齲蝕に対して有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔衛生において使用するための組成物であって、口腔衛生に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・ヘルベチクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）株を含む、前記組成物。
【請求項２】
ラクトバチルス・ヘルベチクス株が、ラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０、ラクトバチルス・ヘルベチクスＲ００５２またはその混合物である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ラクトバチルス・ヘルベチクス株が、ラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
プロバイオティクスが、別のプロバイオティクス細菌をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
プロバイオティクスが、１つのまたはそれより多いラクトバチルス属をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
プロバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
プロバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクス株およびラクトバチルス・プランタルム株から本質的になる、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクス株およびラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０から本質的になる、請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０およびラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０から本質的になる、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクスＲ００５２およびラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０から本質的になる、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
プロバイオティクスが、１つのまたはそれより多いビフィドバクテリウム属をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０およびビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＳＤ５８４６から本質的になる、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
齲蝕を治療するかまたは予防する際に使用するための組成物であって、齲蝕の予防に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０を含む、前記組成物。
【請求項１５】
プロバイオティクスが、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）をさらに含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
プロバイオティクスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８をさらに含む、請求項１４または１５記載の組成物。
【請求項１７】
プロバイオティクスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２をさらに含む、請求項１４から１６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
プロバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０およびストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８から本質的になる、請求項１４記載の組成物。
【請求項１９】
齲蝕を治療するかまたは予防する際に使用するための組成物であって、齲蝕を予防するために有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがビフィドバクテリウム・ロングムＳＤ５８４６である、前記組成物。
【請求項２０】
再ミネラル化剤をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１】
再ミネラル化剤が、カゼインリン酸ペプチド−非結晶性リン酸カルシウムを含む、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
プレバイオティクスをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２３】
キャリアー、希釈剤、賦形剤またはそのいずれかの混合物をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２４】
対象において、口腔状態または疾患を治療するかまたは予防する方法であって、請求項１〜２３のいずれか一項に定義するような組成物を、対象に経口投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２５】
対象がヒト、イヌ、ネコまたはウマである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
組成物が、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト、食品または菓子として処方される、請求項２４または２５記載の方法。
【請求項２７】
組成物が、歯磨き粉、チューインガムまたは発泡錠として処方される、請求項２４または２５記載の方法。
【請求項２８】
口腔状態または疾患が、齲蝕、口臭、歯肉炎、口腔内潰瘍、アフタ性口内炎、カンジダ症および／または歯周病を含む、請求項２４〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
齲蝕を治療するかまたは予防するための請求項２４〜２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
対象における口腔衛生のためのラクトバチルス・ヘルベチクス株の使用。
【請求項３１】
対象における口腔衛生のための請求項１〜２３のいずれか一項に定義するような組成物の使用。
【請求項３２】
対象における口腔衛生用の薬剤調製のための、請求項１〜２３のいずれか一項に定義するような組成物の使用。
【請求項３３】
組成物が、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト、食品または菓子として処方される、請求項３１〜３２のいずれか一項記載の使用。
【請求項３４】
組成物が、歯磨き粉、チューインガムまたは発泡錠として処方される、請求項３１〜３２のいずれか一項記載の使用。
【請求項３５】
対象が、ヒト、イヌ、ネコまたはウマである、請求項３０〜３４のいずれか一項記載の使用。
【請求項３６】
口腔衛生が、齲蝕、口臭、歯肉炎、口腔内潰瘍、アフタ性口内炎、カンジダ症および／または歯周病を予防するかまたは治療することを含む、請求項３０〜３５のいずれか一項記載の使用。
【請求項３７】
齲蝕を治療するかまたは予防するための、請求項３０〜３６のいずれか一項記載の使用。
【請求項３８】
ラクトバチルス・ヘルベチクス株、および対象における口腔衛生においてそれを使用するための説明書を含む、商業的パッケージ。
【請求項３９】
請求項１〜２３のいずれか一項に定義するような組成物、および対象における口腔衛生においてそれを使用するための説明書を含む、商業的パッケージ。
【請求項４０】
組成物が、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト、食品または菓子として処方される、請求項３９記載の商業的パッケージ。
【請求項４１】
組成物が、歯磨き粉、チューインガムまたは発泡錠として処方される、請求項３９記載の商業的パッケージ。
【請求項４２】
対象が、ヒト、イヌ、ネコまたはウマである、請求項３８〜４１のいずれか一項記載の商業的パッケージ。
【請求項４３】
口腔衛生が、齲蝕、口臭、歯肉炎、口腔内潰瘍、アフタ性口内炎、カンジダ症および／または歯周病を予防するかまたは治療する工程を含む、請求項３８〜４２のいずれか一項記載の商業的パッケージ。
【請求項４４】
口腔衛生が、齲蝕を治療するかまたは予防する工程を含む、請求項３５〜４０のいずれか一項記載の商業的パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、２０１３年７月５日に提出された米国仮特許出願ＵＳＳＮ  ６１/８４３，
１５８の利益を主張し、該文献の全内容は、本明細書に援用される。
【０００２】
分野
本発明は、経口投与のためのプロバイオティクス組成物に関する。特に、本発明は、改善された健康、特に改善された口腔の健康、などの有益な効果を持つプロバイオティクス組成物に、そして該組成物を投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
口腔、例えば口は、多くのそして多様な微生物フローラを保護する。平衡が損なわれ、そして常在性細菌間で不均衡が見られる際、病態、例えば、齲蝕または歯周炎が起こりうる。プロバイオティクスは宿主に健康上の利点を与えうる生存微生物である。プロバイオティクス療法の有益な効果は、部分的に、宿主に関連する現存微生物フローラの調節を通じて達成され、こうしてバランスが取れ、そして健康的な微生物−宿主関係を達成する。口腔に関連して、プロバイオティクス組成物は、バランスが取れた細菌集団の回復を補助し、それによって口腔の健康を改善する。
【０００４】
齲蝕は、典型的には、小児期に世話する人から伝染する普遍的な感染性疾患であり、生涯に渡って、または完全に歯を失うまで、存在し続ける。齲蝕は、主に、歯磨きまたはフロスなどの抗微生物予防的アプローチを通じて管理され、これらはその抗微生物作用のために、広く有効である。齲蝕学における近年の進展によって、齲蝕形成の、より広いミクロ生態学的な背景のよりよい理解が導かれてきており、これは、齲蝕管理において適用される、微生物に基づく新規の予防治療戦略および技術に関する機会を提示する。
【０００５】
齲蝕に関与する開始病原性細菌の感染は、ミュータンス菌群の細菌、最も注目すべきはストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）であり、該細菌はスクロースから自己生成される不溶性エクソ多糖のバイオフィルム内に被包される。この接着性歯垢は生態的ニッチを提供し、ここで病原性細菌が育ち、そして炭水化物から多様な有機酸を産生し、これが進行性に歯のミネラルを溶解する。
【０００６】
齲蝕発展のより現代的な理解には、現在、微生物、生態、および環境要因の背景が含まれ、ここでミクロフローラの生態の改変または不均衡によって、齲蝕形成が起こりやすくなる。この目的を達成するため、プロバイオティクス療法は、Ｓ．ミュータンスおよび口腔微生物フローラを制御する有効な手段である潜在能力を有すると示唆されてきており（Ｃａｇｌａｒ  ２００５ａ；Ｓａｈａ  ２０１２；Ｔａｇｇ  ２００３）、そして個々の株のプロバイオティクスとしての潜在的使用に関するかなりの臨床的研究がなされてきている（Ｎａｅｓｅ  ２００１；Ｔａｉｐａｌｅ  ２０１２；Ｋｅｌｌｅｒ  ２０１１；Ｓｔｅｃｋｓｅｎ−Ｂｌｉｃｋｓ  ２００９；Ｂｕｒｔｏｎ  ２０１３；Ｃａｇｌａｒ  ２００８；Ｃａｇｌａｒ  ２００６；Ｃａｇｌａｒ  ２００５ｂ）。
【０００７】
多様な株が齲蝕と闘うことによる表面上の機構は、症例ごとに多様である。例えば、いくつかの株は、Ｓ．ミュータンスと凝集することによって、抗Ｓ．ミュータンス活性を有し、一方、他の株は、特定のバクテリオシンを分泌することによって、Ｓ．ミュータンスを直接殺すかまたは阻害し、そして他のものは、さらに歯垢でコロニーを形成し、そして生態学的なニッチに関して、Ｓ．ミュータンスと競合する。したがって、これらの機構を
組み合わせた相補的相乗的効果に関する潜在能力が存在する。別の例では、２つのプロバイオティクス株が異なるバクテリオシンを分泌することも可能であり、こうしたバクテリオシンは、Ｓ．ミュータンス内で多様な生化学的ターゲットを有するため、いずれか単独の場合よりも、組み合わされてより強いＳ．ミュータンス殺傷効果を有する可能性もある。
【０００８】
プロバイオティクス組成物はまた、特定の状況において、組成物へのプレバイオティクスの添加を通じて増進されうる。プレバイオティクスは、有益な細菌下位集団を増進させるように、微生物フローラに「給餌し」；プロバイオティクスは、微生物フローラ集団に有益な培養物を添加する。用語「シンバイオティクス」は、プレバイオティクスおよびプロバイオティクスの両方を含有する組成物を指し、例えばフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）（プレバイオティクス）およびビフィドバクテリウム属（プロバイオティクス）の両方を含有するものである。この分野の研究は、相補的プレバイオティクス成分の存在によって、プロバイオティクスの増殖および生存がどのように増進されうるのかよりよい理解を得るため、成分タイプ間の相乗効果に注力されている。
【０００９】
非常に多数のプロバイオティクス組成物が知られているが、各組成物は、ユニークな特性および特定の健康上の利点を有する。口腔の健康のために利点を有するプロバイオティクス組成物の一例は、共同所有された、２０１２年７月２２日出願の米国仮出願ＵＳＳＮ
６１/６７４，３９０に記載され、該文献は、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）Ｋ１２（登録商標）（ＢＬＩＳ  Ｋ１２（登録商標））および少なくとも５つのラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｖａｃｉｌｌｕｓ）細菌を含むプロバイオティクスの組み合わせを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国仮出願ＵＳＳＮ  ６１/６７４，３９０
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｃａｇｌａｒ  ２００５ａ
【非特許文献２】Ｓａｈａ  ２０１２
【非特許文献３】Ｔａｇｇ  ２００３
【非特許文献４】Ｎａｅｓｅ  ２００１
【非特許文献５】Ｔａｉｐａｌｅ  ２０１２
【非特許文献６】Ｋｅｌｌｅｒ  ２０１１
【非特許文献７】Ｓｔｅｃｋｓｅｎ−Ｂｌｉｃｋｓ  ２００９
【非特許文献８】Ｂｕｒｔｏｎ  ２０１３
【非特許文献９】Ｃａｇｌａｒ  ２００８
【非特許文献１０】Ｃａｇｌａｒ  ２００６
【非特許文献１１】Ｃａｇｌａｒ  ２００５ｂ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、プロバイオティクス組成物の改善された製剤、特に改善された口腔の健康、改善された口腔コロニー形成、改善された有効性、改善された保存期間、異なるおよび特定の口腔疾患に関する有効性、ならびにさらなる改善の１つまたはそれより多くをもたらす製剤、ならびにその投与法または使用に関する必要性が常にある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の１つの側面において、口腔衛生において使用するための組成物であって、口腔
衛生に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・ヘルベチクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）株を含む、前記組成物を提供する。
【００１４】
本発明の第二の側面において、口腔衛生において使用するための組成物であって、口腔衛生に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・ヘルベチクス株およびラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株を含む、前記組成物を提供する。
【００１５】
本発明の第三の側面において、口腔衛生において使用するための組成物であって、口腔衛生に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・ヘルベチクス株およびビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｌｏｎｇｕｍ）ＳＤ５８４６を含む、前記組成物を提供する。
【００１６】
本発明の第四の側面において、齲蝕を治療するかまたは予防する際に使用するための組成物であって、齲蝕の予防に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０を含む、前記組成物を提供する。
【００１７】
本発明の第五の側面において、齲蝕を治療するかまたは予防する際に使用するための組成物であって、齲蝕を予防するために有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがビフィドバクテリウム・ロングムＳＤ５８４６を含む、前記組成物を提供する。
【００１８】
本発明の第六の側面において、口腔衛生のための前述のプロバイオティクスの使用を提供する。
【００１９】
本発明の第七の側面において、口腔衛生用の薬剤調製のための、前述のプロバイオティクスの使用を提供する。
【００２０】
本発明の第八の側面において、対象において、口腔状態または疾患を治療するかまたは予防する方法であって、前述のプロバイオティクスを、対象に経口投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２１】
本発明の第九の側面において、前述のプロバイオティクス、および口腔衛生においてそれを使用するための説明書を含む、商業的パッケージを提供する。
【００２２】
プロバイオティクスは、ラクトバチルス・ヘルベチクス株を含むかまたは該株から本質的になる。プロバイオティクスは、ラクトバチルス・ヘルベチクス株、および１つのまたはそれより多い他のプロバイオティクス細菌、好ましくはラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属および／またはストレプトコッカス属からの細菌、より好ましくは１つのまたはそれより多い他のラクトバチルス属、さらにより好ましくは１つの他のラクトバチルス属を含むか、またはこれらから本質的になることも可能である。プロバイオティクスは、ラクトバチルス・ヘルベチクス株およびラクトバチルス・プランタルム株、特にラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０（商業的には、ラクトバチルス・プランタルムＬｐ−２００１として知られる）の両方を含むかまたはこれらから本質的になってもよい。句「から本質的になる」は、他のプロバイオティクス細菌が存在しないか、または重要でない量で存在することを示す。ラクトバチルス・ヘルベチクス株は、好ましくは、ラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０、ラクトバチルス・ヘルベチクスＲ００５２またはその混合物を含む。ラクトバチルス・ヘルベチクス株は、より好ましくは、ラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０を含む。
【００２３】
特に、齲蝕を治療するかまたは予防するため、プロバイオティクスは、あるいは、ラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０またはビフィドバクテリウム・ロングムＳＤ５８４６を含むことも可能である。プロバイオティクスは、好ましくは、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８およびストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２の一方または両方と組み合わせて、ラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０を含む。好ましくは、プロバイオティクスは、ラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０から本質的になるか、あるいはラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０、ならびにストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８およびストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２の一方または両方から本質的に構成され、他のプロバイオティクス細菌は存在しないか、または重要でない量で存在する。
【００２４】
口腔衛生は、口腔の状態または疾患の予防または治療を含む。こうした状態または疾患には、例えば、齲蝕（虫歯）、口臭、歯肉炎、アフタ性口内炎（口内炎）を含む口腔内潰瘍、カンジダ症ならびに歯周病が含まれる。本発明の１つの側面において、口腔中のストレプトコッカス・ミュータンス集団は抑制され、よりよい口腔健康に導く。特に好ましい態様において、齲蝕は予防される。本発明が有用である対象には、例えば哺乳動物が含まれる。対象には、霊長類、ヒトまたは家畜動物が含まれる。家畜動物のいくつかの例は、イヌ、ネコおよびウマである。
【００２５】
組成物は、組成物の総重量に基づいて、約０．０００１重量％〜約１００重量％のプロバイオティクスを含むことが可能である。場合によって、プロバイオティクスは、組成物の約０．００１重量％〜約５０重量％、または約０．００１重量％〜約１０重量％、または約０．００１重量％〜約５重量％であることが可能である。組成物中のプロバイオティクスの口腔衛生に有効な量は、ある程度、対象の年齢、プロバイオティクス細菌のタイプ、投与頻度、投与形態、投与法、および対象の共生口腔ミクロフローラにおける変動性に依存する。例えば、約１０７〜１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）の範囲のプロバイオティクスの投与量が、一般的に適切であり；特にロゼンジ剤に関して、ロゼンジ剤あたり約１０８〜１０１０ＣＦＵの範囲のプロバイオティクスの投与量が好ましく、最適な量は、組成物中の単数または複数の株のプロバイオティクスおよび投与頻度に応じ、これは１日あたり１〜４個のロゼンジ剤と多様であることが可能である。プロバイオティクスの投与は、任意の好適な時点で、例えば歯磨き中または後、あるいは食事中または後であることが可能である。
【００２６】
組成物は、プロバイオティクスを含み、そして当該技術分野に一般的に知られる他の成分、例えば１つのまたはそれより多い再ミネラル化剤、プレバイオティクス、キャリアー、希釈剤、賦形剤等を含むことが可能である。他の成分は、好ましくは薬学的に許容可能である、または少なくとも口腔における使用のために許容可能である。
【００２７】
Ｓ．ミュータンスは、ミネラルであるカルシウムおよびリン酸塩を溶解する酸の分泌を通じて、歯のマトリックスを崩壊させるように機能する。酸分泌が数ヶ月続いた後、脱ミネラル化は、次いで、エナメルに、そして最終的に象牙質にまで広がるであろう。この時点では可逆性であるが、さらに進行すると空洞が形成され、そして歯の修復を必要とする。唾液は、有害な酸に対する天然の緩衝剤としてだけでなく、歯の再ミネラル化のためのカルシウムおよびリン酸塩供給源としても重要な役割を果たし、天然に病状を抑止するかまたは逆転させさえもする。次いで、齲蝕形成は、病原性細菌による脱ミネラル化および再ミネラル化の動的平衡である。介入および予防的治療は、しばしば、この効果のために剤を添加することによって、再ミネラル化に向けて平衡を傾けることに重点を置く。再ミネラル化剤には、例えば、カゼインリン酸ペプチド−非結晶性リン酸カルシウム（ＣＰＰ−ＡＣＰ）、β−リン酸三カルシウム、非結晶性リン酸カルシウムナノ粒子（ＮＡＣＰ）
、ヒドロキシアパタイト、グリセロリン酸カルシウム、またはカルシウムおよびリン酸の他のバリアントが含まれる。再ミネラル化剤を、組成物の１〜１０重量％、好ましくは１〜４重量％の量で添加してもよい。フッ化物もまた、多くのデンタルケア製品に添加されるが、これはフッ化物が再ミネラル化の有効な触媒であり、そして結晶構造内に取り込まれて、元来のものよりも耐性である歯の表面をもたらすためである。顕著なことに、カゼインリン酸ペプチド−非結晶性リン酸カルシウム（ＣＰＰ−ＡＣＰ）（その開示が本明細書に援用される、米国特許７，４９１，６９４を参照されたい）は、特に有効であり、これは、ミルクタンパク質由来の結合ペプチドが結合し、そしてリン酸カルシウムを可溶性非結晶質内に安定化させ、ここから容易に生体利用可能であるためである。再ミネラル化剤、特にＣＰＰ−ＡＣＰを伴う、脱ミネラル化を予防するプロバイオティクス製剤の組み合わせは、齲蝕の予防的治療においてより大きな有効性を有すると期待されるであろう。
【００２８】
組成物中にプレバイオティクスを含めると、特定の状況において、プロバイオティクス有効性が増進する。プレバイオティクスは、主に、微生物フローラにフィードするように機能する。用語「シンバイオティクス」は、プレバイオティクスおよびプロバイオティクスの両方を含有する組成物を記載する。本発明において有用でありうるプレバイオティクスのいくつかの例には、例えば、単糖、二糖およびオリゴ糖、例えばマンノース・フルクタンス、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、キシロオリゴ糖（ＸＯＳ）、ポリデキストロースおよびガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、ラクツロース、タガトース、イヌリン、マルトデキストリン、ラクチトールおよびその混合物が含まれる。一般的に、用いるプレバイオティクスの量は、プロバイオティクスの量よりはるかに多く、例えばミリグラム量のプロバイオティクスに対して、グラム量のプレバイオティクスが使用可能である。
【００２９】
経口組成物用のキャリアー、希釈剤および賦形剤が、当該技術分野に一般的に知られ、そしてこれには、例えば、吸収剤、酸化剤、アルカリ化剤、結合剤、緩衝剤、コーティング剤、着色剤、徐放剤、徐放キャリアー、希釈剤、崩壊剤、発泡剤、フレーバー、流動促進剤、滑沢剤、可塑剤、溶解度向上剤、湿潤剤、界面活性剤、保存剤、甘味剤、矯味矯臭剤等が含まれる。いくつかの特定の例には、ラクトース、デキストロース、フルクトース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース（例えば微結晶性セルロース）、水シロップ、水、水／エタノール、水／グリコール、水／ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルまたは脂肪性物質、例えば固い脂肪、あるいはその適切な混合物が含まれる。
【００３０】
特に好ましい種類の賦形剤は代替糖であり、これらは甘味料として機能するが、血糖レベルに与える影響が減少しているかまたは無視できる。好ましくは、代替糖は、非齲蝕性である。こうした代替糖には、例えば、糖アルコール（例えばイソマルト）、ステビア、アスパルテーム、スクラロース、ネオテーム、アセスルファムカリウムおよびサッカリンが含まれる。ステビアおよびイソマルトが特に注目される。ステビアは、ステビオール配糖体に基づき、植物、ステビア・リバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）の抽出物を含む。イソマルトは、２つの二糖の等モル濃度混合物であり、二糖は各々、２つの糖、グルコースおよびマンニトール（α−Ｄ−グルコピラノシド−１，６−マンニトール）、そしてまたグルコースおよびソルビトール（α−Ｄ−グルコピラノシド−１，６−ソルビトール）で構成される。イソマルトは、特に、本発明の組成物の安定性を改善する。特定の代替糖（例えばイソマルト）はまた、プレバイオティクスと見なされることも可能である。
【００３１】
本発明の組成物を、経口または局所投与形態で、対象に経口投与することも可能である
。適切な投与形態には、例えば、錠剤（例えば発泡錠および／または多層錠）、丸剤、粉末、ロゼンジ剤（多層ロゼンジ剤を含む）、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト（例えば歯磨き粉）、食品および菓子（例えばチューインガム）が含まれる。こうした投与形態の処方は、当該技術分野に周知である。本発明の組成物は、少なくとも２４ヶ月の期間に渡って、さらに少なくとも３０ヶ月の期間に渡って、室温（２０〜２５℃）で、プロバイオティクス株の有効なＣＦＵカウントを維持する、優れた安定性を有する。保存期間は、特定の保存条件（例えば２〜８℃の冷蔵条件）下で、そして／または多様な送達系、例えばサシェ剤／粉末スティックで、３６ヶ月を超えるまで延長可能である。
【００３２】
組成物は、口腔衛生のための組成物の使用のための説明書とともに、商業的パッケージの形で、市場に提供されることも可能である。商業的パッケージには、例えば、瓶、ジャー、ブリスターパック、箱等が含まれる。説明書は、例えば視覚型または聴覚型、例えば書面で、図で、音声および／またはビデオ記録媒体上に、あるいはその組み合わせで、提供されることも可能である。
【００３３】
本発明のさらなる特徴は、以下の詳細な説明の経過中に記載されるか、または明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
本発明がより明らかに理解可能になるように、ここで、付随する図に言及しながら、その態様を例としてより詳細に記載するであろう：
【図１】図１は、細菌スワブゾーン、および阻害ゾーン（ＺＯＩ）をどのように決定するかを示す、培養プレートの模式図を示す。
【図２】図２は、Ｓ．ミュータンス染色体の種特異的ＤＮＡセグメントのＰＣＲアンプリコンの１．５％アガロースゲルを示す。基準株Ｓ．ミュータンス２５１７５を陽性対照として用いた。
【図３】図３は、Ｓ．ミュータンス２５１７５に対する、個々で、そして２つのすべてのありうる組み合わせでのプロバイオティクスの繰延アンタゴニズム（ｄｅｆｅｒｒｅｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）実験の定量化を示すグラフを示す。０．１％ＣａＣＯ３でｐＨを平衡化したＢＨＩ寒天を用いて、実験を少なくとも４回反復した。
【図４】図４は、新鮮に単離したＳ．ミュータンス１３に対する、個々で、そして２つのすべてのありうる組み合わせでのプロバイオティクスの繰延アンタゴニズム実験の定量化を示すグラフを示す。０．１％ＣａＣＯ３でｐＨを平衡化したＢＨＩ寒天を用いて、実験を少なくとも４回反復した。
【図５】図５は、新鮮に単離したＳ．ミュータンス１４に対する、個々で、そして２つのすべてのありうる組み合わせでのプロバイオティクスの繰延アンタゴニズム実験の定量化を示すグラフを示す。０．１％ＣａＣＯ３でｐＨを平衡化したＢＨＩ寒天を用いて、実験を少なくとも４回反復した。
【図６】図６は、新鮮に単離したＳ．ミュータンス１５に対する、個々で、そして２つのすべてのありうる組み合わせでのプロバイオティクスの繰延アンタゴニズム実験の定量化を示すグラフを示す。０．１％ＣａＣＯ３でｐＨを平衡化したＢＨＩ寒天を用いて、実験を少なくとも４回反復した。
【図７】図７は、抗微生物特性を持つ異なる組み合わせのプロバイオティクス株に関する、Ｓ．ミュータンスの株に対する相乗的アンタゴニズムを示す表を示す。少なくとも４回の個々に反復した実験からのデータを用い、一元配置ＡＮＯＶＡによって、構成要素株に対する比較を個々に行った。
【図８】図８は、プロバイオティクス株の過酸化水素の相対的産生の比較を示す表を示す。＋＋＋２４時間以内、＋＋４８時間以内、＋７２時間以内、および−産生なし。
【図９】図９は、ヒト気管支上皮細胞株１６ＨＢＥ１４ｏ−に対する、多様なプロバイオティクス株およびＳ．ミュータンス株の接着を示すグラフを示す。
【図１０】図１０は、Ｓ．ミュータンス２５１７５と多様なプロバイオティクス株の凝集の比較を示すグラフを示す。ボンフェローニ事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡによって、比較を行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本明細書全体を通じて、属名／種名および菌株表示に言及する。生物の分類は時々変化し、そして任意の所定の生物が、異なる名称および／または菌株表示に割り当てられる可能性もある。本明細書に言及したプロバイオティクス生物は、生物の名称および／または菌株表示が変化してもしなくても同じままである、特定のゲノムを有する。該ゲノムから、当業者は、任意の生物が伴う名称および／または菌株表示に関わらず、本説明に含まれるかどうかを容易に決定可能である。
【実施例】
【００３６】
実施例１：Ｓ．ミュータンス単離およびＤＮＡ抽出
４人の異なる被験者から、無菌プローブを用いて歯垢を収集し、そしてミティス・サリバリウス−バシトラシンＳ．ミュータンス選択寒天上に直接スプレッドし、そして次いで微好気性条件下で、３７℃で４８時間インキュベーションした。次いで、個々のコロニーをＢＨＹＥプレート上に四分円でストリークし、そして次いで、微好気性条件下で、３７℃で４８時間、再びインキュベーションした。続いて、単離されたコロニーに対して遺伝子型決定を行い、種を確認した。ＩｎｓｔａＧｅｎｅマトリックス（ＢｉｏＲａｄ）を用い、製造者の説明書と同様に、細菌ＤＮＡを抽出した。簡潔には、単一コロニーを摘み取り、そして１ｍＬの無菌Ｈ２Ｏ中に分散させた。次いで、この混合物を１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、そして上清を廃棄した。ペレットに、２００μＬのＩｎｔａＧｅｎｅマトリックスを添加し、試料を迅速にボルテックスし、そして水槽中、５５℃で２０分間インキュベーションした。次いで、試料を取り除き、そして沸騰した水槽で３０分間インキュベーションした。次いで、試料を再びボルテックスし、そして次いで、１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を収集し、そしてＰＣＲのために使用するまで、−２０℃で保存した。
【００３７】
すべてのＰＣＲ試薬をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。抽出されたＤＮＡの試料を、１×ＰＣＲ緩衝液、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１０μＭ  ＭＵＴ−Ｆプライマー、１０μＭ  ＭＵＴ−Ｒプライマー、５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０μＬのＤＮＡテンプレート、および最終体積５０μＬまでのｄｄＨ２Ｏを含有する反応混合物中でＰＣＲに供した。プライマーは、Ｓ．ミュータンスのｇｔｆＢ細胞外グルコシルトランスフェラーゼをコードする、５１７ｂｐ  ＤＮＡ領域を増幅する（Ｏｈｏ
２０００）。
【００３８】
【化１】
2019163308.tif 000003
【００３９】
熱サイクル条件は、最初の変性が９５℃で１分間であり、その後、９５℃で３０秒間の変性、５９℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長の３０サイクルが続いた。７２℃５分間の最終伸長工程が含まれた。次いで、ＰＣＲ産物をＤＮＡ装填緩衝液と混合し、そして０．０５％ＥｔＢｒを含む１．５％アガロースゲルで、１００Ｖ４５分間で分離し、そしてＵＶ光励起下で画像化した。
【００４０】
実施例２：繰延アンタゴニズム
Ｓ．ミュータンスに対するプロバイオティクスのアンタゴニズムを試験するため、本質的にＴａｇｇおよびＢａｎｎｉｓｔｅｒ（Ｔａｇｇ  １９７９）によって以前実行されたように、繰延アンタゴニズムを行った。液体培養物を、ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属のいずれかに関してはＭＲＳに、そしてストレプトコッカス属に関してはＢＨＹＥに接種し、そして次いで微好気性条件下で、３７℃で一晩インキュベーションした。図１を参照すると、次いで、無菌コットンスワブを用いて、測定された１ｃｍ幅のストリークで、０．１％（ｗ／ｖ）ＣａＣＯ３を含むＢＨＩまたはＣＢプレート上に、一晩の懸濁物をスワブした。ＢＨＩプレートは、１８．５μｇのブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ、Ｄｉｆｃｏ）、７．５ｇ寒天（Ｆｉｓｈｅｒ）および１ｇ  ＣａＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）を含有した。ＣＢプレートは、２２ｇのコロンビア血液（Ｄｉｆｃｏ）、７．５ｇ寒天（Ｆｉｓｈｅｒ）および１ｇ  ＣａＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）を含有した。次いで、プレートを微好気性条件下、３７℃でインキュベーションした。４８時間後、細菌増殖物をガラス顕微鏡スライドで掻き取り、そしてプレートをクロロホルム蒸気で２０分間再滅菌した。次いで、基準株Ｓ．ミュータンスＡＴＣＣ２５１７５の一晩の懸濁物および４つの新鮮な単離体を垂直にストリークし、そしてプレートを再度インキュベーションした。４８時間後、細菌増殖の２つの領域間の距離からプロバイオティクスを直接プレーティングした部分の１ｃｍを減じたものとして、阻害ゾーン（ＺＯＩ）を計算した。Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、統計を行った。一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、特定のプロバイオティクスおよびプロバイオティクスの組み合わせの間を比較した。個々の処置の合計を組み合わせ処置で割った相乗指数として、相乗作用を計算した。＞１の値は組み合わせの相乗作用を示す（Ｗａｎｇ  ２０１２）。
【００４１】
齲蝕において、プロバイオティクス潜在能力を持つ株を決定するため、プロバイオティクスの多くの商業的株に関して、Ｓ．ミュータンス・アンタゴニズム・スクリーニングを行った。まず、実施例１に記載するように、４人の個体からの歯垢試料をＳ．ミュータンス選択ミティス・サリバリウス−バシトラシン寒天プレート上にプレーティングすることによって、病原体の新鮮な単離体を得た。Ｓ．ミュータンス特異的マーカー配列の存在に関してコロニーを遺伝子型決定し、これを基準株Ｓ．ミュータンスＡＴＣＣ２５１７５に対して比較した（図２）。４つの単離体を選択した（被験者あたり１つ）。
【００４２】
これらの４つの単離体およびＳ．ミュータンス２５１７５に対する繰延アンタゴニズムアッセイを２つの培地タイプ上で行い、何らかのアンタゴニズムを持つプロバイオティクス株を迅速にスクリーニングした。表１は、これらの実験においてアッセイした、何らかの複製物に関する、および任意の５つの株に関する、阻害ゾーン（ＺＯＩ）の存在または非存在を示す。株、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０、Ｌ．ヘルベチクスＲ００５２、およびビフィドバクテリウム・ロングムＳＤ５８４６（商業的にはビフィドバクテリウム・ロングムＢｌ−０５として知られる）は、両方の寒天タイプ上でアンタゴニズムを有することが観察され、一方、ラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０のアンタゴニズムは、ＢＨＩ寒天上でのみ見られた。したがって、続く定量的繰延アンタゴニズム実験ではＢＨＩ寒天を用いた。アンタゴニズムを定量化するため、少なくとも４回、そして最多で８回の別個の実験で、各プロバイオティクス細菌に関して実験を反復し、そして阻害ゾーンを明確に測定した。ありうる２つの組み合わせすべてで、すべてのプロバイオティクス細菌株の等しい混合物を評価して、潜在的な相乗効果に関して試験した。５つの病原性株のＺＯＩを測定し、そして４回の実験に渡って平均を取った。結果を図３〜図６に示す。
【００４３】
一般的に、Ｓ．ミュータンスの培養保存株は、新鮮な単離体に比較して、プロバイオテ
ィクスによって分泌されるアンタゴニスト因子に、はるかにより耐性であることが証明された（図３）。例えば、単一プロバイオティクス実験においては、Ｓ．ミュータンス２５１７５に関してアンタゴニズムはまったく観察されず、一方、Ｓ．ミュータンス１３に関しては、６つのプロバイオティクスのうち、Ｂ．ロングムＳＤ５８４６を除いて、すべてがアンタゴニスト性であった。単一株として、Ｌ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０およびＬ．ヘルベチクスＲ００５２は、４つの新鮮に単離されたＳ．ミュータンスすべてにアンタゴナイズ可能であったが、Ｓ．サリバリウスＫ１２、およびＬ．プランタルムＳＤ５８７０は、４つのうち３つにアンタゴナイズした。Ｓ．サリバリウスＭ１８は、４つの病原性単離体のうち２つにアンタゴナイズし、そしてＢ．ロングムＳＤ５８４６は１つのみにアンタゴナイズし、そしてこれらに関する平均ＺＯＩは、すべての場合で、他のプロバイオティクス株よりも比較的弱かった。
【００４４】
表１
５つのＳ．ミュータンス株に対する繰延アンタゴニズムアッセイの定性的観察に基づく、ＺＯＩの存在または非存在
【００４５】
【表１】
2019163308.tif 000004
【００４６】
平均ＺＯＩは多くの場合、２つの株を等量でともに組み合わせた場合により大きく、そして特定の細菌は、他のものよりもよりよい組み合わせであるようであった。例えば、単離体Ｓ．ミュータンス１５に関しては（図６）、２つの株のありうる１５の組み合わせのうち、７つが、個々のプロバイオティクスで最も阻害性であるＬ．ヘルベチクスＲ００５２のＺＯＩより大きかった。これらの７つの組み合わせのうち、６つは、Ｌ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０またはＬ．プランタルムＳＤ５８７０のいずれかを含有した。これは、すべての病原性株に渡って当てはまることが立証され；Ｓ．ミュータンス単離体１３、１４、１５、および１７を阻害する各々の場合、またはＳ．ミュータンス２５１７５を阻害する場合であっても、４つの最大ＺＯＩは常に、Ｌ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０またはＬ．プランタルムＳＤ５８７０のいずれかを含有する組み合わせであった。
【００４７】
図７は、アンタゴニズムの計算された相乗作用とともに、平均の阻害ゾーン（ＺＯＩ）を示す。構成要素株と個々に比較した、組み合わせに関する一元配置Ａｎｏｖａによって計算されるようなＺＯＩの有意差を示す。相乗指数（ＳＱ）は、プロバイオティクスの組
み合わせに関するＺＯＩを、個々に測定した構成要素ＺＯＩの合計によって割ることにより、相対相乗作用を示す。５０％相乗作用よりも大きい（ＳＱ＞１．５）組み合わせを太字で示す。ＮＡはアンタゴニズムなしを示し、一方、ＵＳは、アンタゴニズムが組み合わせで観察されるのみであるため、決定されない相乗作用を示す。Ｌ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０とＢ．ロングムＳＤ５８４６の組み合わせ、およびＬ．プランタルムＳＤ５８７０とＬ．ヘルベチクスＲ００５２の組み合わせは、どちらも、個々の構成要素よりも、Ｓ．ミュータンスの株に対して、有意によりアンタゴニスト性であった。Ｌ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０とＢ．ロングムＳＤ５８４６の組み合わせは、Ｓ．ミュータンス株２５１７５、１３、１４、１５、および１７に対して試験した際、それぞれ、ＵＳ、１．８、３．７、２．４、および２．２で非常に相乗的であった。Ｌ．プランタルムＳＤ５８７０とＬ．ヘルベチクスＲ００５２もまた相乗的であり、それぞれ、ＮＡ、３．３、１．５、１．８、および１．６のＳＱを示した。
【００４８】
しかし、興味深いことに、これらの２つの相乗的組み合わせ各々からの構成要素細菌（Ｌ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０およびＬ．プランタルムＳＤ５８７０）は、特に強い活性、およびともに組み合わせた際の相乗作用を生じた。これらの２つの株を組み合わせたＺＯＩは、Ｓ．ミュータンスのすべての５つの株に関して有意なマージンで最高のアンタゴニズムであった。Ｌ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０およびＬ．プランタルムＳＤ５８７０に関するＺＯＩは、実際、Ｓ．ミュータンスのすべての株に関して、個別の２つの株に関するＺＯＩを合計したものよりも高く、これは、一元配置ＡＮＯＶＡによって非常に有意であると立証された。Ｓ．ミュータンス２５１７５に関しては、個別のプロバイオティクス株いずれによってもまったく阻害はなかったが、２つの株をともに組み合わせた際、非常に有意な阻害（約２０ｍｍ）があった。これは、プロバイオティクス間の相乗活性を強く示唆し、そして実際、相乗指数は、Ｓ．ミュータンス２５１７５、１３、１４、１５、および１７の株に関して、それぞれ、ＵＳ、３．４、３．９、４．２および４．２であった。
【００４９】
実施例３：過酸化水素産生
過酸化水素産生を試験するため、Ｋａｎｇらによって最近用いられたもの（Ｋａｎｇ  ２０１１）と非常に類似の、一般的に用いられる方法論を使用した。本質的には、標準的寒天増殖培地（ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属のいずれかに関してはＭＲＳ、およびストレプトコッカス属に関してはＢＨＹＥ）を、０．２５ｍｇ／ｍＬ  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）および０．１ｎｇ／ｍＬペルオキシダーゼの添加によって改変した。簡潔には、０．１２５ｇのＴＭＢおよび５ｍｇのペルオキシダーゼを１ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および水にそれぞれ溶解した。０．２μｍシリンジフィルターを用いてこれらの溶液を滅菌し、そしてオートクレーブ後、冷却して＜５０℃になったら直ちに、０．５Ｌの液体寒天培地に添加した。次いで、プレートに注いだ。プロバイオティクスの個々のコロニーをストックプレートから摘み取り、そして接種ループを用いて、ＴＭＢ／ペルオキシダーゼ寒天および標準的寒天対照プレート上に直接ストリークした。次いで、プレートを３７℃で微好気性条件下に７２時間放置した。正常ＭＲＳまたはＢＨＹＥストリーク対照プレートと比較することによって、２４時間ごとに、青または赤いずれかへの色の任意の変化に関して、コロニーおよび周囲の寒天を評価した。実験を３回反復した。
【００５０】
多くのラクトバチルス属は、周囲の細菌に対するアンタゴニスト剤として、過酸化水素を産生するため、株の過酸化水素産生をアッセイした。試験した１１のラクトバチルス属株のうち、１０がある程度の過酸化水素を産生することが確認された。Ｓ．サリバリウスは産生しなかったが、２つのＳ．サーモフィルス（Ｓ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）および５つのビフィドバクテリウム属すべてが、多様な度合いのＨ２Ｏ２を産生した（図８）。Ｓ．ミュータンス・アンタゴニズムを有することが観察された株すべてが、Ｓ．サー
モフィルスを例外として、最も迅速にＨ２Ｏ２を産生する中にすべてあり、プレーティング２４時間以内に産生することが観察されてきている。
【００５１】
実施例４：細胞表面接着
別に述べない限り、細胞培養試薬をＧＩＢＣＯから得た。不死化ヒト気管支上皮細胞株１６ＨＢＥ１４ｏ−を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＭＥＭ培地中で増殖させ、そして３７℃および５％ＣＯ２で、標準細胞培養法を用いて維持した。細胞を、１×１０５細胞／ウェルの濃度で、組織培養処理２４ウェルプレートのウェル中に植え付け、そして集密まで増殖を可能にした（約４８時間、およそ５×１０５細胞／ウェル）。次いで、細胞培地を吸引し、そして多様な安定期細菌細胞懸濁物の１００倍希釈を含有する５００μＬの新鮮な培地と交換し、これをＭＲＳ（ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属）またはＢＨＹＥ（ストレプトコッカス属）中で一晩増殖させた。次いで、プレートを３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションした。５時間後、培地を吸引し、そして単層をＰＢＳで３回よく洗浄して、しっかり（ｎｏｎ−ｌｏｏｓｅｌｙ）接着している細菌を除去した。次いで、最終濃度０．１％までＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００を添加することによって、真核細胞を破壊した。次いで、溶解懸濁物中に含有される残った接着ＣＦＵの計数を、ドロップ・プレート法によって行った。１０−６までの連続希釈を１０倍段階で９６ウェルプレート中で行い、１０μＬの多様な希釈を次いで、３つ組で適切な寒天（ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属に関してはＭＲＳ、そしてストレプトコッカス属に関してはＢＨＹＥ）上にスポッティングした。寒天プレートを、微好気性条件下、３７℃で２４時間インキュベーションし、その後、ＣＦＵを計数した。１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞の細菌不含対照ウェルの細胞カウントによって決定されるようなウェル中の気管支細胞数によって総ＣＦＵを割ったものとして、接着を報告した。
【００５２】
その効果を送達するため、細菌は、口腔内で、Ｓ．ミュータンスと共局在する必要がある。プロバイオティクス細菌が、口腔内に留まる潜在能力を試験するため、結合アフィニティアッセイを行った（図９）。該アッセイは、口腔上皮細胞と細胞系譜を共有し、そして表現型が似ている、１６ＨＢＥ１４ｏ−ヒト気管支上皮細胞の単層への細菌の接着を試験した。細菌をＭＥＭ培地内に植え付け、そして遊離細菌を洗い流す前に５時間増殖させ、そして残りの破壊された真核および細菌細胞混合物でＣＦＵを計数した。一般的に、Ｓ．ミュータンス病原体は、細胞によくは接着せず、そして試験したラクトバチルス属も接着しないことが見出された（図９）。しかし、元来、ヒトの喉から単離されたＳ．サリバリウスは、比較すると非常に緊密に接着した。
【００５３】
実施例５：Ｓ．ミュータンスとの共凝集
多様なプロバイオティクス細菌またはＳ．ミュータンスを、ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属いずれかの場合は１ｍＬの液体ＭＲＳ、あるいはストレプトコッカス属の場合はＢＨＹＥに接種し、そして次いで、微好気性条件下で、３７℃で一晩インキュベーションした。次いで、試験管を２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を吸引し、そして次いで、１ｍＬ  ＰＢＳ中で再懸濁した。この工程を３回反復した。次いで、懸濁した細胞を１００μＬ  ＰＢＳ中に、２倍連続希釈工程で１２８倍まで、９６ウェルプレート中で、連続希釈した。ＥＯＮマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて、６００ｎｍでプレートから吸光度を読み取った。生じたデータから、希釈に対する吸光度の曲線を生成し、そして０．３の吸光度に関する希釈を、試験した各細菌に関して外挿した。２００μＬの懸濁細菌を含有する３つ組ウェルを、外挿にしたがって、９６ウェルプレート中で直接希釈した。各細菌に関して、１００μＬの同じ希釈物をまた、１００μＬの希釈したＳ．ミュータンスと一緒に添加した。マルチチャネルピペットでウェルを上下にピペッティングすることによって、混合物を均一に分散させた。次いで、無菌透明プラスチックフィルムでプレートを密封し、そして次いで、ＰＢＳブランクとともに、マイクロプレートリーダー中で、直ちに３７℃でインキュベーションした。６時間後、
ウェルを６００ｎｍで読み取った。
【００５４】
株が接着し、そしてＳ．ミュータンスと直接相互作用する潜在能力もまた、凝集アッセイを通じて評価した（図１０）。個々の株、およびまたＳ．ミュータンスとの等量の混合物を、３７℃でインキュベーションした際、６００ｎｍの吸光度変化に関して、アッセイした。いずれかの株と個々に比較した際、上昇した吸光度は、凝集の結果としてのより速い沈降（ｆａｓｔｅｒ  ｓｅｔｔｌｉｎｇ）を示した。実験は、Ｓ．ミュータンスがバイオフィルムなしでは自己凝集しないことを示す。しかし、Ｌ．ヘルベチクスのいずれかの株（ＬＡＦＴＩ  Ｌ１０またはＲ００５２）の添加は、いずれかの細菌単独と比較して、有意に増加した吸光度を導いた。
【００５５】
実施例６：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果の考察
細菌の特定の株のユニークな特性が、口腔健康状態の回復、および齲蝕を引き起こすＳ．ミュータンスの減少に向けて、口腔微生物フローラ環境を改変する潜在能力を有することが、本明細書で立証されてきている。この結論は、種、Ｌ．ヘルベチクス（ＬＡＦＴＩ
Ｌ１０およびＲ００５２）が、齲蝕の治療においてよく確立された株であるＳ．サリバリウスＭ１８およびＬ．ラムノスス（Ｌ．  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧを含めて、試験したすべての株よりも、優れて病原体Ｓ．ミュータンスを阻害するという明確な知見によって補強される。
【００５６】
第二に、新鮮に単離されたＳ．ミュータンスの５つの株、ならびに非常に病原性であるＳ．ミュータンス株を阻害する、組み合わせた能力において、株Ｌ．プランタルムＳＤ５８７０およびＬ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０の間の実質的でそして有意な相乗効果がある。Ｌ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０とＳ．ミュータンスのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの共凝集は、さらに、口腔においてその効果を局在させそして送達する強い潜在能力をさらに強調する。最後に、プロバイオティクスの組み合わせは、齲蝕のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、ともに組み合わされた際、Ｓ．ミュータンスを相乗的に減少させる潜在能力を有することが示された。本発明者らは、２つのまたはそれより多い異なるプロバイオティクスの組み合わせが、通常は、任意の１つのプロバイオティクス単独よりも劣った阻害をもたらすことを以前観察してきたため、この知見は予期せぬものである。組み合わせは、組み合わせ中の異なるプロバイオティクスが、互いに競合し、同時に互いに阻害する可能性があるため、一般的には劣った阻害を導く可能性がある。単一のプロバイオティクスと比較した際、同じレベルで阻害が維持されることでさえ予期できないことであり、プロバイオティクスの組み合わせの間の相乗作用の発見は言うまでもない。
【００５７】
いくつかの細菌株は、多様な機構を通じて齲蝕病原体に影響を及ぼすことが、確実に立証されてきている。顕著には、Ｓ．サリバリウスＭ１８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび臨床研究の両方で、抗Ｓ．ミュータンス活性を有することが示された。また、プロバイオティクス、ラクトバチルス・ラムノススＧＧが短期および長期研究において、抗齲蝕効果を有することを立証する、かなりの臨床的研究関心もあった。本発明において、Ｓ．ミュータンス・アンタゴニズムにおいて、プロバイオティクス細菌のいくつかの株が、これらのプロバイオティクスを超えることが立証された。Ｌ．ラムノススＧＧを用いると、Ｓ．ミュータンス株のアンタゴニズムはまったく観察されなかったが、Ｓ．サリバリウスＭ１８を用いると、かなりのアンタゴニズムが観察された。しかし、Ｌ．プランタルムＳＤ５８７０、およびＢ．ロングムＳＤ５８４６を含む、試験したプロバイオティクスのいくつかの株、ならびに関連株Ｓ．サリバリウスＫ１２は、すべて、Ｓ．ミュータンスの少なくとも１つの株に対して、Ｓ．サリバリウスＭ１８よりも大きいアンタゴニズムを有することが観察されたが、一方、研究した２つのＬ．ヘルベチクス株（ＬＡＦＴＩ  Ｌ１０およびＲ００５２）は、実際、試験したすべての株に関して、より大きいかまたは等しいアンタゴニズムを有した。
【００５８】
最も興味深いのは、株Ｌ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０をＬ．プランタルムＳＤ５８７０と組み合わせた際、試験した５つの病原体すべてに関して、強い抗Ｓ．ミュータンス相乗作用が観察されたことである。観察されたアンタゴニズムは、任意の他の個々のプロバイオティクス株または試験した組み合わせに関するよりも、この組み合わせに関してより強く、そして２つの個々のプロバイオティクスを合計するよりも、Ｓ．ミュータンス株の５つすべてに関して、アンタゴナイズするのに少なくとも３倍有効であった。
【００５９】
どのような代謝機構が相乗作用の根底にあるかは知られていないが、Ｌ．ヘルベチクスのいくつかの株は、ヘルベチシンＪおよびヘルベチシンＶ−１８２９のようなバクテリオシンを分泌し、そして同様に、Ｌ．プランタルムの株は、多様なバクテリオシン、およびｐｌｎ遺伝子座にコードされる他の抗菌性物質を有し、これらの分泌は、クオラム機構を通じて制御されることが知られている。Ｌ．プランタルムＳＤ５８７０が何らかの抗菌性因子を発現するかどうかは未知であるが、多様ではあるが、これらの発現は、Ｌ．プランタルムの株の間で比較的一般的であると考えられる。Ｓ．ミュータンスにアンタゴナイズする抗微生物ペプチドは、２つのプロバイオティクスによって分泌された際、相補的に致死性である組み合わせで、特に有効である可能性もある。
【００６０】
Ｓ．ミュータンス・アンタゴニズムを有する４つの非ストレプトコッカス属の株が、すべて、最強のＨ２Ｏ２産生株の中にあったことは興味深い。Ｓ．サリバリウスＫ１２およびＭ１８は、特定のバクテリオシンの分泌を通じて、抗Ｓ．ミュータンス活性を発揮する可能性があるが、Ｌ．プランタルムＳＤ５８７０およびラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０は、少なくとも部分的に、Ｈ２Ｏ２の分泌を通じて活性を発揮するようである。Ｓ．ミュータンスは、過酸化水素を産生しそして分解する能力の両方を有すると報告されるが、にもかかわらず、やはり、おそらく閾値濃度で、過酸化水素に容易に感受性である。Ｓ．ミュータンスの周囲に局在する過酸化水素のレベルは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、Ｌ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０とＳ．ミュータンスで観察される直接凝集によってさらに増加する可能性もあり、そしてそれによって、高い度合いのアンタゴニズムが達成されるさらなる要因として作用する。
【００６１】
本明細書における知見は、Ｌ．ヘルベチクスが、Ｓ．ミュータンスに対して有意なアンタゴニズムを有し、そしてさらに、Ｌ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０およびＬ．プランタルムＳＤ５８７０の特定の組み合わせが、相乗的に作用して、口腔健康状態のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、Ｓ．ミュータンスの増殖にアンタゴナイズし、そしてこれを阻害するという結論を支持する。これらの知見は、齲蝕の微生物学に基づく治療戦略に重要な意味を持つ。
【００６２】
実施例７：ｉｎ  ｖｉｖｏ効果
ｉｎ  ｖｉｖｏ効果は以下のように決定可能である。群あたり３０〜４０人の被験者で、ランダム化二重盲検プラセボ対照臨床試験を行う。被験者を、２８〜３０日の期間、歯磨きの後に、最低１０億ＣＦＵの等用量のＬ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  ｌ１０およびＬ．プランタルムＳＤ５８７０で１日２回、プロバイオティクス・ロゼンジ剤で処置した。高感度周波数領域赤外線光熱放射測定（ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｒａｄｉｏｍｅｔｒｙ）および調節された発光を用いて決定した際、＞２０％の齲蝕前（ｐｒｅｃａｒｉｏｕｓ）脱ミネラル化表面積の検出の減少が予期される可能性がある。Ｓ．ミュータンスおよび歯垢レベルの減少もまた予期される。
【００６３】
カゼインリン酸ペプチド−非結晶性リン酸カルシウム（ＣＰＰ−ＡＣＰ）または他の再ミネラル化剤の添加は、以下のように著しいｉｎ  ｖｉｖｏ効果を立証するであろうと予
期される。群あたり、３０〜４０人の被験者で、ランダム化二重盲検プラセボ対照臨床試験を行う。研究は、以下のように、４つのアームを含むであろう：被験者を最低１０億ＣＦＵの等用量のＬ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  ｌ１０およびＬ．プランタルムＳＤ５８７０で処置する第一の処置群；被験者を１０億ＣＦＵのＬ．ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  ｌ１０およびＬ．プランタルムＳＤ５８７０の組み合わせ、ならびに有効用量のＣＰＰ−ＡＣＰまたは他の再ミネラル化剤で処置する第二の処置群；被験者を有効用量のＣＰＰ−ＡＣＰまたは他の再ミネラル化剤で処置する第三の処置群；ならびに被験者をプラセボ対照で処置する第四の処置群。研究は、２８〜３０日の期間、歯磨きの後に、プロバイオティクス・ロゼンジ剤で１日２回の用量を続けるであろう。高感度周波数領域赤外線光熱放射測定および調節された発光を用いて決定した際、＞２０％の齲蝕前脱ミネラル化表面積の検出の減少が予期される可能性がある。Ｓ．ミュータンスおよび歯垢レベルの減少もまた予期される。
【００６４】
実施例８−ロゼンジ製剤および安定性
７／１６インチ丸形のロゼンジ剤を、表２にしたがって処方する。
【００６５】
表２
【００６６】
【表２】
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【００６７】
ロゼンジ剤の密封パッケージを、６０〜６５％の周囲湿度、室温（２０〜２５℃）で保存する。産業標準選択スプレッドプレート法にしたがって、定義された時点で、細菌をロゼンジ剤から培養する。したがって、ロゼンジ剤を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解し、連続希釈し、そしてＳ．サリバリウス（ＣＡＢＫ１２）に対する選択的寒天上およびラクトバチルス属（Ｒｏｇｏｓａ）寒天プレート上に３つ組でプレーティングする。微好気性条件下、３７℃で４８時間インキュベーションした後、ＣＦＵカウントを行う
。２７ヶ月後であっても、少なくとも約４×１０８ＣＦＵ／ロゼンジ剤でなお実質的に生存するプロバイオティクス株がある。プロバイオティクスの健康上の利点を送達するための、実質的でそして適切な数の生存細菌がある。
【００６８】
実施例９−先行技術製品における繰延アンタゴニズム
上述のような繰延アンタゴニズムアッセイで、商業的に入手可能なプロバイオティクス製品を試験した。表３は、各製品に関するプロバイオティクス細菌組成物を提供する。
【００６９】
表３
【００７０】
【表３】
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【００７１】
簡潔には、無菌条件下で、３７℃で２時間振盪することによって、各製品の１つのロゼンジ剤を５ｍＬの１ＸＰＢＳ中に溶解した。次いで、コットンスワブの補助で、溶解物をＢＨＩおよびＣａＣＯ３を補充したＢＨＩの寒天プレートの直径に渡って、１ｃｍ幅以内のストリークでスプレッドした。これらのプレートを微好気性条件下、３７℃で４８時間インキュベーションし、次いで、増殖した細菌を取り除き、そして寒天を滅菌した。その後、Ｓ．ミュータンスの５つの異なる株（ＡＴＣＣ株およびＩｎｔｅｇｒａの単離体１３、１４、１５および１７）を、プロバイオティクス・ストリークと垂直に、プレートにスワブし、そしてさらに４８時間増殖させた。この処置を２回反復し、これらは各々、各条件に関して３つ組を用いた。本発明の組成物とは異なり、試験した商業的に入手可能なプロバイオティクス製品いずれに関しても、各条件の６つの複製物いずれに関しても、増殖阻害はまったく観察されなかった。
【００７２】
実施例８に記載するような、本発明のロゼンジ剤を２７ヶ月保存した後の、約４×１０８ＣＦＵ／ロゼンジ剤のプロバイオティクス細菌カウントは、試験した先行技術製品と比較して非常に好ましく、そして試験した先行技術製品の半数以上より、相当優れていることにもまた、注目すべきである。
【００７３】
参考文献：各々の全内容が、本明細書に援用される。
【００７４】
【化２−１】
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【００７５】
【化２−２】
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【００７６】
【化２−３】
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【００７７】
本発明の新規特徴は、本発明の詳細な説明を調べた際、当業者には明らかとなるであろう。しかし、請求項の範囲は、実施例に示す好ましい態様に限定されるべきではなく、全体として明細書と一致した最も広い解釈を与えられるべきであることを理解しなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月26日(2019.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
齲蝕を治療するかまたは予防する際に使用するための組成物であって、齲蝕の予防に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０を含む、前記組成物。
【請求項２】
プロバイオティクスが、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）をさらに含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
プロバイオティクスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８をさらに含む、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
プロバイオティクスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
プロバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０およびストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８から本質的になる、請求項１から３のいずれか一項記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本明細書は以下の発明の開示を包含する。
［１］口腔衛生において使用するための組成物であって、口腔衛生に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・ヘルベチクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）株を含む、前記組成物。
［２］ラクトバチルス・ヘルベチクス株が、ラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０、ラクトバチルス・ヘルベチクスＲ００５２またはその混合物である、［１］に記載の組成物。
［３］ラクトバチルス・ヘルベチクス株が、ラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０である、［１］に記載の組成物。
［４］プロバイオティクスが、別のプロバイオティクス細菌をさらに含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］プロバイオティクスが、１つのまたはそれより多いラクトバチルス属をさらに含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］プロバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株をさらに含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の組成物。
［７］プロバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０をさらに含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の組成物。
［８］プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクス株およびラクトバチルス・プランタルム株から本質的になる、［１］〜［７］のいずれかに記載の組成物。
［９］プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクス株およびラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０から本質的になる、［１］〜［８］のいずれかに記載の組成物。
［１０］プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０およびラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０から本質的になる、［１］に記載の組成物。
［１１］プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクスＲ００５２およびラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０から本質的になる、［１］に記載の組成物。
［１２］プロバイオティクスが、１つのまたはそれより多いビフィドバクテリウム属をさらに含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物。
［１３］プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクスＬＡＦＴＩ  Ｌ１０およびビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＳＤ５８４６から本質的になる、［１］に記載の組成物。
［１４］齲蝕を治療するかまたは予防する際に使用するための組成物であって、齲蝕の予防に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０を含む、前記組成物。
［１５］プロバイオティクスが、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）をさらに含む、［１４］に記載の組成物。
［１６］プロバイオティクスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８をさらに含む、［１４］または［１５］に記載の組成物。
［１７］プロバイオティクスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２をさらに含む、［１４］から［１６］のいずれかに記載の組成物。
［１８］プロバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルムＳＤ５８７０およびストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８から本質的になる、［１４］に記載の組成物。
［１９］齲蝕を治療するかまたは予防する際に使用するための組成物であって、齲蝕を予防するために有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがビフィドバクテリウム・ロングムＳＤ５８４６である、前記組成物。
［２０］再ミネラル化剤をさらに含む、［１］〜［１９］のいずれかに記載の組成物。
［２１］再ミネラル化剤が、カゼインリン酸ペプチド−非結晶性リン酸カルシウムを含む、［２０］に記載の組成物。
［２２］プレバイオティクスをさらに含む、［１］〜［２１］のいずれかに記載の組成物。
［２３］キャリアー、希釈剤、賦形剤またはそのいずれかの混合物をさらに含む、［１］〜［２２］のいずれかに記載の組成物。
［２４］対象において、口腔状態または疾患を治療するかまたは予防する方法であって、［１］〜［２３］のいずれか一項に定義するような組成物を、対象に経口投与する工程を含む、前記方法。
［２５］対象がヒト、イヌ、ネコまたはウマである、［２４］に記載の方法。
［２６］組成物が、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト、食品または菓子として処方される、［２４］または［２５］に記載の方法。
［２７］組成物が、歯磨き粉、チューインガムまたは発泡錠として処方される、［２４］または［２５］に記載の方法。
［２８］口腔状態または疾患が、齲蝕、口臭、歯肉炎、口腔内潰瘍、アフタ性口内炎、カンジダ症および／または歯周病を含む、［２４］〜［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］齲蝕を治療するかまたは予防するための［２４］〜［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］対象における口腔衛生のためのラクトバチルス・ヘルベチクス株の使用。
［３１］対象における口腔衛生のための［１］〜［２３］のいずれか一項に定義するような組成物の使用。
［３２］対象における口腔衛生用の薬剤調製のための、［１］〜［２３］のいずれか一項に定義するような組成物の使用。
［３３］組成物が、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト、食品または菓子として処方される、［３１］〜［３２］のいずれかに記載の使用。
［３４］組成物が、歯磨き粉、チューインガムまたは発泡錠として処方される、［３１〜３２のいずれかに記載の使用。
［３５］対象が、ヒト、イヌ、ネコまたはウマである、［３０］〜［３４］のいずれかに記載の使用。
［３６］口腔衛生が、齲蝕、口臭、歯肉炎、口腔内潰瘍、アフタ性口内炎、カンジダ症および／または歯周病を予防するかまたは治療することを含む、［３０］〜［３５］のいずれかに記載の使用。
［３７］齲蝕を治療するかまたは予防するための、［３０］〜［３６］のいずれかに記載の使用。
［３８］ラクトバチルス・ヘルベチクス株、および対象における口腔衛生においてそれを使用するための説明書を含む、商業的パッケージ。
［３９］［１］〜［２３］のいずれか一項に定義するような組成物、および対象における口腔衛生においてそれを使用するための説明書を含む、商業的パッケージ。
［４０］組成物が、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト、食品または菓子として処方される、［３９］に記載の商業的パッケージ。
［４１］組成物が、歯磨き粉、チューインガムまたは発泡錠として処方される、［３９記載の商業的パッケージ。
［４２］対象が、ヒト、イヌ、ネコまたはウマである、［３８］〜［４１］のいずれかに記載の商業的パッケージ。
［４３］口腔衛生が、齲蝕、口臭、歯肉炎、口腔内潰瘍、アフタ性口内炎、カンジダ症および／または歯周病を予防するかまたは治療する工程を含む、［３８］〜［４２］のいずれかに記載の商業的パッケージ。
［４４］口腔衛生が、齲蝕を治療するかまたは予防する工程を含む、［３５］〜［４０］のいずれかに記載の商業的パッケージ。
本発明の１つの側面において、口腔衛生において使用するための組成物であって、口腔衛生に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・ヘルベチクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）株を含む、前記組成物を提供する。
【外国語明細書】
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