(57)【要約】【課題】骨密度改善用食品組成物、前駆骨芽細胞増殖用食品組成物、骨分化促進用食品組成物、骨強化用食品組成物及び抗骨粗鬆症用食品組成物を提供する。【解決手段】ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨密度改善用食品組成物、前駆骨芽細胞増殖用食品組成物、骨分化促進用食品組成物、骨強化用食品組成物及び抗骨粗鬆症用食品組成物である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨密度改善用食品組成物。
【請求項２】
前記ユーグレナ水性溶媒抽出物は、ユーグレナ水抽出物、ユーグレナ熱水抽出物及びユーグレナエタノール抽出物を含む群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の骨密度改善用食品組成物。
【請求項３】
ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨密度改善剤。
【請求項４】
ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする前駆骨芽細胞増殖用食品組成物。
【請求項５】
ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨分化促進用食品組成物。
【請求項６】
ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨強化用食品組成物。
【請求項７】
ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗骨粗鬆症用食品組成物。
【請求項８】
ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする前駆骨芽細胞増殖剤。
【請求項９】
ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨分化促進剤。
【請求項１０】
ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨強化剤。
【請求項１１】
ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗骨粗鬆症剤。
【請求項１２】
ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、
前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナ水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする骨密度改善剤の製造方法。
【請求項１３】
前記分散液調製工程の後、前記抽出工程の前に、前記分散液を加熱する加熱工程を行うことを特徴とする請求項１０記載の骨密度改善剤の製造方法。
【請求項１４】
前記水性溶媒は、水、熱水及びエタノールを含む群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の骨密度改善剤の製造方法。
【請求項１５】
ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、
前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナ水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする前駆骨芽細胞増殖剤の製造方法。
【請求項１６】
ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、
前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナ水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする骨分化促進剤の製造方法。
【請求項１７】
ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、
前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナ水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする骨強化剤の製造方法。
【請求項１８】
ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、
前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナ水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする抗骨粗鬆症剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨密度改善用食品組成物、骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖用食品組成物、骨分化促進用食品組成物、骨強化用食品組成物、抗骨粗鬆症用食品組成物、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤、抗骨粗鬆症剤、骨密度改善剤の製造方法、前駆骨芽細胞増殖剤の製造方法、骨分化促進剤の製造方法、骨強化剤の製造方法及び抗骨粗鬆症剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、中高年層における骨粗鬆症の増加や、若年層における骨折率の増加など、各種骨疾患の増加が社会的な課題となっている。骨粗鬆症に起因する大腿骨頸部の骨折、脊椎の圧迫骨折などによって、寝たきりの状態となってしまうことがある。加齢とともに骨密度が低下して骨粗鬆症を発症することを予防する観点からも、骨を強化することや骨量を増加させることが重要である。
【０００３】
従来、骨を強化する方法としては、食事によるカルシウムの摂取、運動、薬物療法などが行われてきた。食事によるカルシウムの摂取では、乳製品、小魚、緑黄色野菜などを摂取することが推奨されているが、摂取する食事の量には限界がある。また、散歩やウォーキングなどの運動については、体が弱っている高齢者や、寝たきりの者にとっては困難なものであった。薬物療法については、薬物を服用する必要があるが、副作用などの観点から、注意が必要である。
【０００４】
天然素材を使用した骨強化剤として、亜鉛を強化した牡蠣エキスを主成分とするもの（特許文献１）、卵黄タンパク質加水分解物を有効成分とするもの（特許文献２）が知られている。
【０００５】
一方で、食糧、飼料、燃料等としての利用が有望視されている生物資源として、ユーグレナ（属名：Ｅｕｇｌｅｎａ、和名：ミドリムシ）が注目されている。
ユーグレナは、ビタミン，ミネラル，アミノ酸，不飽和脂肪酸など、人間が生きていくために必要な栄養素の大半に該当する５９種類もの栄養素を備え、多種類の栄養素をバランスよく摂取するためのサプリメントとしての利用や、必要な栄養素を摂取できない貧困地域での食糧供給源としての利用の可能性が提案されている。
【０００６】
ユーグレナは、食物連鎖の第一次生産者に位置し、捕食者により捕食されることや、光、温度条件、撹拌速度などの培養条件が他の微生物に比べて難しいなどの理由から、大量培養が難しいとされてきたが、近年、本発明者らの鋭意研究によって、大量培養技術が確立され、ユーグレナ及びユーグレナから抽出されるパラミロン等、ユーグレナ由来物質の大量供給の途が開かれた。
ユーグレナは、鞭毛運動をする動物的性質をもちながら、同時に植物として葉緑体を持ち光合成を行うユニークな生物であり、ユーグレナ自体やユーグレナ由来の物質に、多くの機能性があることが期待されている。
そのため、大量供給可能となったユーグレナ及びユーグレナ由来物質の利用法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−８０３８０号公報
【特許文献２】特許５２１３３３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、日常的に継続して摂取することができる骨密度改善用食品組成物、骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖用食品組成物、骨分化促進用食品組成物、骨強化用食品組成物、抗骨粗鬆症用食品組成物、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ユーグレナに骨密度を改善する（増加させる、向上させる）作用、前駆骨芽細胞を増殖させる作用、骨分化を促進する作用、骨を強化する作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
従って、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨密度改善用食品組成物により解決される。
このとき、前記ユーグレナ水性溶媒抽出物は、ユーグレナ水抽出物、ユーグレナ熱水抽出物及びユーグレナエタノール抽出物を含む群から選択される少なくとも１種であるとよい。
【００１１】
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナ由来物質、例えば、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有する、骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖用食品組成物、骨分化促進用食品組成物、骨強化用食品組成物、抗骨粗鬆症用食品組成物、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤、抗骨粗鬆症剤により解決される。
【００１２】
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナ水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする骨密度改善剤及び骨密度改善剤の製造方法により解決される。
このとき、前記分散液調製工程の後、前記抽出工程の前に、前記分散液を加熱する加熱工程を行うとよい。
このとき、前記水性溶媒は、水、熱水及びエタノールを含む群から選択される少なくとも１種であるとよい。
【００１３】
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナ水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする骨分化促進剤の製造方法により解決される。
【００１４】
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナ水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする骨強化剤の製造方法により解決される。
【００１５】
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナ水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする抗骨粗鬆症剤の製造方法により解決される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、新規な骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖用食品組成物、前駆骨芽細胞増殖用食品組成物、骨分化促進用食品組成物、骨強化用食品組成物、抗骨粗鬆症用食品組成物、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤を提供することができる。
本発明に係る骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖用食品組成物、前駆骨芽細胞増殖用食品組成物、骨分化促進用食品組成物、骨強化用食品組成物、抗骨粗鬆症用食品組成物、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤は、これまでに副作用の報告がなく、食品衛生法に合致する水準の安全性を備えたユーグレナを有効成分としているため、長期間の継続投与および継続摂取が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本実施形態の骨密度改善剤の製造方法、前駆骨芽細胞増殖剤の製造方法、骨分化促進剤の製造方法、骨強化剤の製造方法及び抗骨粗鬆症剤の製造方法を示すフロー図である。
【図２】試験１において検証を行った、実施例１のユーグレナ水抽出物の前駆骨芽細胞増殖試験の結果を示すグラフである。
【図３】試験１において検証を行った、実施例２のユーグレナ熱水抽出物の前駆骨芽細胞増殖試験の結果を示すグラフである。
【図４】試験１において検証を行った、実施例３のユーグレナエタノール抽出物の前駆骨芽細胞増殖試験の結果を示すグラフである。
【図５】試験２において検証を行った、実施例１のユーグレナ水抽出物の骨分化促進試験の結果を示すグラフである。
【図６】試験２において検証を行った、実施例２のユーグレナ熱水抽出物の骨分化促進試験の結果を示すグラフである。
【図７】試験２において検証を行った、実施例３のユーグレナエタノール抽出物の骨分化促進試験の結果を示すグラフである。
【図８】試験３において検証を行った、ユーグレナの摂取がヒトの骨に与える影響の検討の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態について、図１乃至８を参照しながら説明する。
本実施形態は、ユーグレナ由来物質を有効成分として含有する骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖用食品組成物、前駆骨芽細胞増殖用食品組成物、骨分化促進用食品組成物、骨強化用食品組成物、抗骨粗鬆症用食品組成物、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤、抗骨粗鬆症剤、骨密度改善剤の製造方法、前駆骨芽細胞増殖剤の製造方法、骨分化促進剤の製造方法、骨強化剤の製造方法及び抗骨粗鬆症剤の製造方法に関するものである。
【００１９】
＜骨芽細胞の分化＞
本明細書において、骨前駆細胞（osteoprogenitor cell）とは、骨芽細胞への分化能を獲得した細胞のことを言い、前駆骨芽細胞（preosteoblast）とは、前骨芽細胞ともいい、骨芽細胞と同様の能を持つが、増殖期にある細胞を言い、骨芽細胞（osteoblast）とは、骨形成能を有するが、増殖はしない細胞を言い、骨芽細胞様細胞（osteoblast-like cell）とは、骨芽細胞と同様の能力を持つ細胞株のことを言う。
【００２０】
骨芽細胞は、間葉系幹細胞から分化する。間葉系幹細胞は、骨芽細胞以外に、軟骨細胞や、筋細胞、脂肪細胞などに分化するが、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化は、ホルモン・サイトカインや、細胞外マトリックスなどの刺激によって誘導されることが知られている。
【００２１】
間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell）は、骨前駆細胞（osteoprogenitor cell）、前骨芽細胞（preosteoblast）、骨芽細胞（osteoblast）の順番に分化し、成熟した骨芽細胞が最終的に骨細胞（bone cell、osteocyte）へと変化する。成熟骨芽細胞は、オステオカルシンを多量に分泌するようになり、細胞外マトリックスの石灰化によって強固な骨マトリックスが形成される（松口徹也、「骨芽細胞分化とＪＮＫシグナル」、生化学、第８１巻、第８号、７０３〜７０７頁）。
【００２２】
＜骨粗鬆症＞
骨粗鬆症は、骨折リスクが増大した状態である。世界保健機関（ＷＨＯ）では、「骨粗鬆症は、低骨量と骨組織の微細構造の異常を特徴とし、骨の脆弱性が増大し、骨折の危険性が増大する疾患である」と定義し、骨粗鬆症は疾患であり、骨折を生じるにいたる病的過程であり、骨折は結果として生じる合併症の一つであるとしている（骨粗鬆症の予防と治療ガイドライン作成委員会編、「骨粗鬆症の予防と治療ガイドライン２０１５年版」、２頁）。
【００２３】
骨粗鬆症の診断は、腰背痛などの有症者などを対象に、原発性骨粗鬆症の診断基準にしたがって、医療面接、身体診察、画像診断、血液・尿検査を行い、ついで骨評価（骨密度測定及び脊椎エックス線撮影）後、鑑別診断、原発性骨粗鬆症の診断基準を適用して確定する（骨粗鬆症の予防と治療ガイドライン作成委員会編、「骨粗鬆症の予防と治療ガイドライン２０１５年版」、１８頁）。
【００２４】
＜ロコモティブシンドローム＞
ロコモティブシンドローム（ｌｏｃｏｍｏｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）とは、日本整形外科学会によれば、骨、関節、軟骨、椎間板、筋肉といった運動器のいずれか、あるいは複数に障害が起こり、「立つ」、「歩く」といった機能が低下している状態であると定義されている（非特許文献２）。
ロコモティブシンドロームは、ロコモと略されたり、ロコモティブ症候群、運動器症候群などと呼ばれることもある。
以下、ロコモティブシンドロームの診断基準について説明する（吉村典子、「ロコモティブシンドロームの臨床診断値と有病率」、日本老年医学会雑誌５２巻４号、３５０−３５３頁（２０１５））。
【００２５】
（ロコモ度テスト）
ロコモティブシンドロームの診断基準の一つとなるロコモ度テストは、（１）立ち上がりテスト、（２）２ステップテスト、（３）ロコモ２５からなる。
（１）立ち上がりテストは、１０ｃｍ、２０ｃｍ、３０ｃｍ、４０ｃｍの４つの高さの台を準備して、片脚または両脚で立ち上がれるかどうかで脚力を測るテストである。
（２）２ステップテストは、できるかぎり大股で２歩歩き、２歩分の歩幅を測定し、身長で除して２ステップ値を算出する。２ステップ値により，下肢の筋力、バランス能力、柔軟性などを含めた歩行能力を評価する。
（３）ロコモ２５は、過去１カ月の間に体の痛みや日常生活の困難がなかったかどうかについて２５項目の問診票で評価する。
【００２６】
ロコモ度テストによる判断は、ロコモ度１とロコモ度２の２つからなる。
ロコモ度１の臨床判断値は以下の通りである。
１）立ち上がりテスト：どちらか一方の片脚で４０ｃｍの高さから立ち上がれない
２）２ステップテスト：２ステップ値が１．３未満
３）ロコモ２５：ロコモ２５の結果が７点以上
上記１）〜３）のいずれかひとつでもあてはまる場合は「ロコモ度１」と判定され、移動機能の低下が始まっている状態と判断される。
【００２７】
ロコモ度２の臨床判断値は以下の通りである。
１）立ち上がりテスト：両脚で２０ｃｍの高さから立ち上がれない
２）２ステップテスト：２ステップ値が１．１未満
３）ロコモ２５：ロコモ２５の結果が１６点以上
上記１）〜３）のいずれかひとつでもあてはまる場合は「ロコモ度２」と判定され、移動機能の低下が進行している状態と判断される。
【００２８】
＜ユーグレナ＞
実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Euglena）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Euglenaceae）の近縁種を含む。
ここで、ユーグレナ属（Euglena）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。
【００２９】
ユーグレナ属に含まれる種として、具体的には、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena mutabilis、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridisなどが挙げられる。
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis），特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のE. gracilis var. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Astasia longa等のその他のユーグレナ類であってもよい。
【００３０】
ユーグレナ属は、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離して使用しても良く、また、既に単離されている任意のユーグレナ属を使用してもよい。
ユーグレナ属は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え、形質導入、形質転換等により得られたものも含有される。
【００３１】
ユーグレナ細胞の培養において、培養液としては、例えば、窒素源，リン源，ミネラルなどの栄養塩類を添加した培養液、例えば、改変Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４  １．０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４  １．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／ｌ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／ｌ，Ｆｅ２（ＳＯ２）３・７Ｈ２Ｏ  ３ｍｇ／ｌ，ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １．８ｍｇ／ｌ，ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．５ｍｇ／ｌ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．４ｍｇ／ｌ，Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／ｌ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／ｌ，チアミン塩酸塩（ビタミンＢ１）  ０．１ｍｇ／ｌ，シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、（ｐＨ３．５））を用いることができる。なお、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４は、（ＮＨ４）２ＳＯ４やＮＨ３ａｑに変換することも可能である。また、そのほか、ユーグレナ  生理と生化学（北岡正三郎編、（株）学会出版センター）の記載に基づき調製される公知のＨｕｔｎｅｒ培地，Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地を用いてもよい。
【００３２】
培養液のｐＨは好ましくは２以上、また、その上限は、好ましくは６以下、より好ましくは４．５以下である。ｐＨを酸性側にすることにより、光合成微生物は他の微生物よりも優勢に生育することができるため、コンタミネーションを抑制できる。
ユーグレナ細胞の培養は、太陽光を直接利用するオープンポンド方式、集光装置で集光した太陽光を光ファイバー等で送り、培養槽で照射させ光合成に利用する集光方式等により行っても良い。
また、ユーグレナ細胞の培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養、回分培養法、半回分培養法（流加培養法）、連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行っても良い。
ユーグレナ細胞の分離は、例えば培養液の遠心分離，濾過又は単純な沈降によって行われる。
【００３３】
（ユーグレナ藻体）
本実施形態では、ユーグレナ藻体として、遠心分離，濾過又は沈降等によって分離したユーグレナ生細胞をそのまま用いることができる。ユーグレナ生細胞は、培養槽から収穫後そのままの状態で使用することもできるが、水若しくは生理食塩水で洗浄するのが好ましい。また、ユーグレナ藻体が水などの液体に分散した分散液の状態で用いてもよい。本実施形態において、ユーグレナ生細胞を凍結乾燥処理やスプレー乾燥処理して得たユーグレナの乾燥藻体をユーグレナ藻体として用いると好適である。
更に、ユーグレナ生細胞を超音波照射処理や、ホモゲナイズ等の機械処理を行うことにより得た藻体の機械的処理物をユーグレナ藻体として用いてもよい。また、機械的処理物に乾燥処理を施した機械的処理物乾燥物をユーグレナ藻体として用いてもよい。
【００３４】
（ユーグレナ水性溶媒抽出物）
本実施形態において、「ユーグレナ水性溶媒抽出物」とは、水性溶媒を用いてユーグレナから抽出される抽出物を意味し、特に、水性溶媒として水を用い、５℃〜６００℃で、数秒〜数十時間抽出したユーグレナの水抽出物又は熱水抽出物を用いることが好ましい。
抽出に使用する水は、必ずしも蒸留水や、純水、又は超純水である必要はなく、例えば、水道水や不純物を含むものであってもよいが、活性成分の抽出を妨げる成分を含まない水が好ましい。
【００３５】
本実施形態において、「水抽出物」とは、０〜５０℃（０℃を除く。）の水による抽出物を意味する。
ここで、「水」とは、０〜５０℃（０℃を除く。）の水を意味する。
水の温度は、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分に抽出できる範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくは１〜４０℃、より好ましくは５〜３５℃、特に好ましくは１０〜３０℃である。
【００３６】
本実施形態において、「熱水抽出物」とは、５０℃よりも高い温度の水による抽出物を意味し、「温水抽出物」とも呼ぶことができる。
ここで、「熱水」とは、５０℃よりも高温の水を意味し、「熱湯」も含む概念であり、沸騰状態にある水も含まれる。また、液体状態の熱水に限定されることなく、気体状態及び超臨界状態の熱水も含まれる。
熱水の温度は、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分に抽出できる範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５０℃より高く１２０℃以下、より好ましくは５０℃より高く１００℃以下である。
【００３７】
抽出に使用する水のｐＨは、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分抽出できる範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくはｐＨ４〜１０、より好ましくはｐＨ５〜９、特に好ましくはｐＨ６〜８であるとよい。
【００３８】
なお、本実施形態では、水性溶媒として、水を単独で用いるが、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分抽出できるものであって、通常、抽出に用いることができる溶媒を１種または２種以上選択して用いてもよい。例えば、水、アルコール類、グリコール類などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。アルコール類としては、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール等が挙げられる。グリコール類としては、ブチレングリコール及びプロピレングリコール等が挙げられる。その他の水性溶媒としては、アセトン等が挙げられる。これらの溶媒は単独或いは水溶液として用いても良く、任意の２種または３種以上の混合溶媒として用いてもよい。
【００３９】
抽出に用いる水性溶媒の温度は、例えば、０℃以上であり、活性成分に影響を与えないのであれば特に限定されることはない。沸騰状態又は超臨界状態にある水性溶媒を使用することもできるが、５℃〜６００℃の水性溶媒を使用するのが好ましく、１０℃〜２００℃の水性溶媒を使用するのがより好ましい。
したがって、抽出用の水性溶媒とは、沸騰状態や超臨界状態にある水性溶媒も含むものである。抽出に使用する水性溶媒の量は、ユーグレナ中に含まれる水溶性活性成分を十分に溶解することができる量であることが好ましい。
【００４０】
抽出方法も特に限定されず、例えば、以下に示す方法により抽出を行うことができるが、これに限定されることなく、通常の抽出方法を自由に選択して用いることができる。例えば、ユーグレナの藻体乾燥粉末を水性溶媒に所定時間浸漬した後に遠心分離又は濾過する方法、ユーグレナの藻体乾燥粉末を水性溶媒に加えて震盪して均一に分散させた後に遠心分離又は濾過する方法、などが挙げられる。
また、抽出を促進するために、ユーグレナを添加後の水性溶媒を加熱することも可能である。
【００４１】
ユーグレナの水抽出は、以下に示すような通常の方法で行うことができるが、これに限定されるものではない。例えば、ユーグレナ組織及び水を容器に入れ、適宜攪拌又は震盪しながら所定時間静置し、得られた抽出液は、そのまま水抽出物として使用可能である。また、例えば、そのような抽出液を遠心して得られる上清を水抽出物として使用することもできる。また、そのような抽出液又は上清を濃縮、乾燥して水分を除去し、これを水抽出物として使用することもできる。水抽出は、抽出効率を上げて抽出時間を短縮するために、水に、少量、例えば、１０質量％以下のアルコール、好ましくはエタノールを添加して行ってもよい。
水抽出を行う場合の抽出時間は、活性成分が抽出される時間であれば特に限定されず、数秒〜数十時間の範囲で、抽出の温度に応じて適宜設定することができる。
【００４２】
熱水による抽出は、以下に示すような、通常用いられている方法で行なうことができるが、これに限定されるものではない。ユーグレナを、通常用いられる抽出器に水とともに導入した後に、加熱することで抽出を行う。沸騰水または超臨界状態にある水を使用して抽出する場合には、水の蒸気圧に耐え得る抽出器を使用する必要がある。抽出時の圧力は１〜５０００気圧に設定することができ、６０〜４００気圧に設定するのが好ましい。
高温高圧下で抽出を行なう場合には、抽出時間が長す過ぎると活性成分が分解したり、化学反応を起こすことがある。従って、高温高圧下で抽出を行なうときには、抽出時間を短時間、例えば、３分以内とするのが好ましく、１分以内とするのがより好ましく、３０秒以内とすることが特に好ましい。
【００４３】
抽出したユーグレナ抽出物は、そのままでも本実施形態に係る前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤、抗骨粗鬆症剤の有効成分として用いることができるが、当該抽出物を更に、適当な分離手段（例えば、分配抽出、ゲル濾過法、シリカゲルクロマトグラフィー、逆相若しくは順相の高速液体クロマトグラフィーなど）により活性の高い画分を分画して用いることも可能である。
また、ユーグレナ抽出物やその画分を、濃縮、乾燥して水性溶媒を除去し、これを水性溶媒抽出物として使用することもできる。
【００４４】
＜前駆骨芽細胞増殖剤＞
本実施形態に係る前駆骨芽細胞増殖剤は、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分とする前駆骨芽細胞増殖剤である。
本実施形態に係る前駆骨芽細胞増殖剤は、骨芽細胞へと分化する前駆骨芽細胞の増殖を促進するものである。
【００４５】
＜骨分化促進剤＞
本実施形態に係る骨分化促進剤は、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分とする骨分化促進剤である。
本実施形態に係る骨分化促進剤は、骨芽細胞の分化過程において、骨の分化を促進するものである。
具体的には、本実施形態に係る骨分化促進剤は、前駆骨芽細胞から骨芽細胞への分化を促進する。
【００４６】
＜骨密度改善剤、骨強化剤＞
「骨強化剤」とは、骨を強化する剤のことをいう。骨の強化は、例えば、骨の強度（骨密度や骨量）や骨の質（骨質）などの指標によって評価することができるがこれらの指標に限定されるものではない。
「骨密度改善剤（骨密度向上剤）」とは、骨密度を改善、具体的には、骨密度を向上させる剤のことをいう。骨密度は、例えば、腰椎にあたるＬ１−Ｌ４の骨密度によって評価することが一般的であるが、この指標に限定されるものではない。
本実施形態に係る骨密度改善剤、骨強化剤は、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物による前駆骨芽細胞の増殖作用や、骨分化促進作用によって、骨密度を増加させ、骨を強化するものである。
【００４７】
＜抗骨粗鬆症剤＞
「抗骨粗鬆症剤」とは、骨粗鬆症を予防したり、改善したり、治療するための剤のことをいう。
本実施形態に係る抗骨粗鬆症剤は、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物による骨密度の改善作用、前駆骨芽細胞の増殖作用や、骨分化促進作用、骨強化作用によって、骨粗鬆症を予防したり、改善したり、治療するものである。
【００４８】
＜ロコモティブシンドローム予防剤、ロコモティブシンドローム治療剤＞
本実施形態に係る骨密度の改善剤、骨強化剤は、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有し、ロコモティブシンドロームを予防又は治療するためのロコモティブシンドローム予防剤、ロコモティブシンドローム治療剤としても用いることができる。
「ロコモティブシンドロームを治療する」とは、本実施形態の骨密度の改善剤、骨強化剤の有効成分であるユーグレナ水性溶媒抽出物を摂取する前の状態と比べて、ロコモティブシンドロームの症状が軽減することをいう。
【００４９】
＜用途＞
実施形態に係る骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤は、骨密度の低下及び／又は骨粗鬆症の確定診断を受けた患者に投与される。
また、本実施形態の骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤は、医薬組成物、健康食品等として構成され、骨粗鬆症の自覚症状を発現した者や、骨密度が減少傾向にある者や、遺伝的に又は生活環境から考慮して骨粗鬆症に罹患する可能性の高い者等、骨粗鬆症予備軍の者に、予防的に投与される。
【００５０】
ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物は、食品としても摂取可能で副作用がないため、骨密度の低下や骨粗鬆症の確定診断を受ける前であっても、投与可能である。また、確定診断を受ける前から、確定診断を受けた後の任意の時点、例えば、骨の強度（骨密度や骨量）が所定の基準（骨密度が若年成人平均値（ＹＡＭ）の７０％以下またはー２．５ＳＤ以下）まで減少した時点、他の骨強化剤に切り替える時点などまで、継続して投与可能である。
【００５１】
一般的に、骨粗鬆症は、食生活、運動不足、加齢、遺伝的要因など、様々な要因によって引き起こされることが知られている。
よって、本実施形態の骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤を、食生活や、運動不足、加齢、遺伝的要因など要因により、骨粗鬆症に罹患する可能性の高い環境にある人、例えば、食生活の乱れた家庭の人、家族に骨粗鬆症を罹患している人などに対して、長期間継続投与できる。
【００５２】
さらに、本実施形態に係るユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤を投与する対象は、上記症状又は状態の者や、ヒト以外の動物に限定されるものではない。
【００５３】
例えば、骨粗鬆症の罹患率が高いことが報告されている閉経後の女性に対して、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤を投与し、又は摂取させることができる。
閉経後の女性においては、閉経による女性ホルモンの減少が骨吸収を促進させ、骨粗鬆症の誘因となっているため、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物が備える、骨密度の改善作用、前駆骨芽細胞の増殖作用、骨分化促進作用、骨強化作用により、骨を強化したり、骨密度を増加させたりすることで骨粗鬆症を予防することができる。
【００５４】
また、骨の強度が十分ではない、２０歳未満のヒトのうち、骨の強度（骨密度や骨量）が所定の基準以下であるヒトに、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤を投与し、又は摂取させることができる。
２０歳未満のヒト、例えば、乳幼児期や思春期の年齢のヒトは、骨密度が増加する途中にあるが、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物が備える、骨密度の改善作用、前駆骨芽細胞の増殖作用、骨分化促進作用、骨強化作用により、骨を強化したり、骨密度を増加させたりすることができる。
【００５５】
ここで、「乳児期」とは、生後から１歳未満の期間であり、「幼児期」とは、１歳以上から６歳未満の期間である。
また、「思春期」とは、二次性徴が始まり、成熟して、身長発育が最終的に停止するまでの期間である。男性に関しては、概ね１２歳〜１７歳の期間であるが、女性に関し、日本産科婦人科学会の定義によれば、「性機能の発育（乳房発育・恥毛発育など）に始まり、初経を経て第二次性徴の完成と月経周期がほぼ順調になるまでの期間で、現在の日本人の場合、平均的には８、９歳から１７、１８歳の間とする」と定義される。ＷＨＯ（世界保健機関）によれば１０〜１９歳と定義されるように、性別や個人差によって、幅を有する概念であるが、８〜１９歳の期間である。
【００５６】
また、３０歳以上の年齢のヒトに、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤を投与することができる。
３０歳以上のヒトは、骨密度の改善作用、前駆骨芽細胞の増殖作用、骨分化促進作用、骨強化作用により、骨密度の減少を抑制することができる。
【００５７】
また、本実施形態に係るユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤は、薬理学的に許容され得る添加剤を加え、医薬組成物、化粧料組成物、食品組成物等の組成物等として用いることができる。
【００５８】
（医薬組成物）
本実施形態の骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤は、医薬組成物として利用することができる。
本実施形態の骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤は、医薬の分野では、骨密度の改善作用、前駆骨芽細胞の増殖作用、骨分化促進作用、骨強化作用、抗骨粗鬆症作用を有効に発揮できる量のユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物と共に、薬学的に許容される担体や添加剤を配合することにより、当該作用を有する医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、医薬品であっても医薬部外品であってもよい。
当該医薬組成物は、内用的に適用されても、また外用的に適用されても良い。従って、当該医薬組成物は、内服剤、静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射及び／又は腹腔内注射等の注射剤、経粘膜適用剤、経皮適用剤等の製剤形態で使用することができる。
当該医薬組成物の剤型としては、適用の形態により、適当に設定できるが、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末剤、散剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤などの液状製剤、軟膏剤、またはゲル剤等の半固形剤が挙げられる。
【００５９】
本実施形態に係る医薬組成物には、薬学的に許容される添加剤を１種または２種以上自由に選択して含有させることができる。
例えば、本実施形態に係る医薬組成物を経口剤に適用させる場合、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、保存剤、着色剤、矯味剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。また、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用して、徐放性製剤等にすることもできる。
【００６０】
本実施形態に係る医薬組成物には、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物以外に、骨強化作用があることが知られているカルシウム、マグネシウム、ビタミンＤ、ビタミンＫ、大豆イソフラボン、β―クリプトキサンチン、乳塩基性タンパク質（ＭＢＰ）などの物質を１種以上添加することも可能である。
【００６１】
（食品組成物）
また、本実施形態のユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物は、食品にも用いることが可能である。
本実施形態の骨密度改善用食品組成物、前駆骨芽細胞増殖用食品組成物、骨分化促進用食品組成物、骨強化用食品組成物、抗骨粗鬆症用食品組成物は、食品の分野では、骨密度の改善作用、前駆骨芽細胞の増殖作用、骨分化促進作用、骨強化作用、抗骨粗鬆症作用を有効に発揮できる量のユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物を食品素材として、各種食品に配合することにより、当該作用を有する食品組成物を提供することができる。
すなわち、本発明は、食品の分野において、骨強化用等と表示された食品の食品組成物を提供することができる。当該食品組成物としては、一般の食品のほか、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、病院患者用食品、サプリメント等が挙げられる。また、食品添加物として用いることもできる。
当該食品組成物としては、例えば、調味料、畜肉加工品、農産加工品、飲料（清涼飲料、アルコール飲料、炭酸飲料、乳飲料、果汁飲料、茶、コーヒー、栄養ドリンク等）、粉末飲料（粉末ジュース、粉末スープ等）、濃縮飲料、菓子類（キャンディ（のど飴）、クッキー、ビスケット、ガム、グミ、チョコレート等）、パン、シリアル等が挙げられる。また、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の場合、カプセル、トローチ、シロップ、顆粒、粉末等の形状であっても良い。
【００６２】
ここで、特定保健用食品とは、生理学的機能等に影響を与える保健機能成分を含む食品であって、消費者庁長官の許可を得て特定の保健の用途に適する旨を表示可能なものである。本発明においては、特定の保健用途として「骨代謝の働きを助けることにより骨の健康維持に役立つ」、「骨の成分を維持する働きによって、骨の健康に役立つ」、「骨の成分の維持に役立つ」、「骨代謝のはたらきを助けることにより、骨の健康維持をサポートする」、などと表示して販売される食品となる。
また、栄養機能食品とは、栄養成分（ビタミン、ミネラル）の補給のために利用される食品であって、栄養成分の機能を表示するものである。栄養機能食品として販売するためには、一日当たりの摂取目安量に含まれる栄養成分量が定められた上限値、下限値の範囲内にある必要があり、栄養機能表示だけでなく注意喚起表示等もする必要がある。
また、機能性表示食品とは、事業者の責任において、科学的根拠に基づいた機能性を表示した食品である。販売前に安全性及び機能性の根拠に関する情報などが消費者庁長官へ届け出られたものである。
【００６３】
本実施形態に係る食品組成物には、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物に加え、通常食品組成物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。例えば、各種調味料、保存剤、乳化剤、安定剤、香料、着色剤、防腐剤、ｐＨ調整剤などの、食品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
【００６４】
本実施形態に係る食品組成物には、ユーグレナ藻体又はユーグレナ水性溶媒抽出物以外に、骨強化作用があることが知られているカルシウム、マグネシウム、ビタミンＤ、ビタミンＫ、大豆イソフラボン、β―クリプトキサンチン、乳塩基性タンパク質（ＭＢＰ）などの物質を１種以上添加することも可能である。
【００６５】
＜用法・用量＞
本実施形態の骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤の用法としては、例えば、粉末剤、カプセル剤、錠剤、顆粒、液剤又はシロップ等によって経口投与すると良い。
本実施形態の骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤の投与量や投与形態は、対象、病態やその進行状況、その他の条件によって適宜選択すればよい。例えば、ユーグレナ水性溶媒抽出物として、ユーグレナ水抽出物を選択し、ヒト（成人）を対象に骨強化作用を得ることを目的として経口投与する場合や、ユーグレナ藻体を経口投与する場合には、一般に、原料としてユーグレナを乾燥重量で１日当たり１〜５０００ｍｇ、好ましくは１００〜３０００ｍｇ、さらに好ましくは５００〜２０００ｍｇ程度を用いて得られたユーグレナ水抽出物を、１日に１〜２回程度（朝と晩）、週に５回以上となる割合で継続的に投与するとよい。
【００６６】
＜骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤の製造方法＞
本実施形態の骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤は、以下の方法で製造される。
まず、ユーグレナに、水性溶媒を加えて撹拌及び／又は振盪して分散液を得る分散液調製工程を行う。この分散液調製工程においてユーグレナとして、ユーグレナ粉末（ユーグレナ藻体の乾燥品）を用いるとよい。
次いで、分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水性溶媒抽出物として得る抽出工程を行う。
【００６７】
また、分散液調製工程の後、抽出工程の前に、高圧蒸気滅菌器等の加熱手段を用いて分散液を加熱して、加熱工程を行ってもよい。
具体的には、まず、ユーグレナに、水性溶媒を加えて撹拌及び／又は振盪して分散液を得る分散液調製工程を行う。
次いで、加熱手段を用いて分散液を加熱して、加熱抽出する加熱工程を行う。
さらに、分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水性溶媒抽出物として得る抽出工程を行う。
【００６８】
加熱工程において、加熱手段の設定温度を、室温以上、例えば２０℃以上５０℃以下、５０℃以上８０℃以下、８０℃以上１００℃以下、１００℃以上１２０℃以下、１２０℃以上１５０℃以下、１５０℃以上２００℃以下とすることができる。
【００６９】
加熱工程において、ユーグレナ水性溶媒分散液が密閉容器に入れられている場合、加熱手段の設定温度が、ユーグレナ水性溶媒分散液の温度に一致する。
また、加熱工程において、ユーグレナ水性溶媒分散液を開放容器に入れられている場合、開放容器周囲の雰囲気の気圧に応じて、ユーグレナ水性溶媒分散液の温度が決まるが、大気圧の場合、最高で約１００℃となる。
【００７０】
加熱工程において、ユーグレナ水性溶媒分散液が開放容器に入れられている場合には、加熱工程と、ユーグレナ水性溶媒抽出物の濃縮工程が同時に行われることになる。
【００７１】
なお、分散液を遠心分離する代わりに、一般的な分離方法によって、ユーグレナの水性溶媒抽出物を得てもよい。例えば、分散液を濾過することで得られる濾液をユーグレナの水性溶媒抽出物を得てもよい。
さらに、遠心分離や濾過等を行うことなく、水性溶媒を加えて振盪して得られる分散液をそのままユーグレナ水性溶媒抽出物とすることも可能である。
【００７２】
得られたユーグレナ水性溶媒抽出物を更に、適当な分離手段（例えば、分配抽出、ゲル濾過法、シリカゲルクロマトグラフィー、逆相若しくは順相の高速液体クロマトグラフィーなど）により活性の高い画分を分画して得る分画工程を行ってもよい。
また、得られたユーグレナ水性溶媒抽出物又は画分を濃縮する濃縮工程及び／又は、水性溶媒を蒸発させ乾燥する乾燥工程を行ってもよい。
【００７３】
以上により得られたユーグレナの水性溶媒抽出物を、本実施形態の骨密度改善剤、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤及び抗骨粗鬆症剤として用いることができる。
【実施例】
【００７４】
以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の実施例では、原料としてユーグレナ粉末を用い、水性溶媒として、水、熱水、エタノールを用いて抽出を行い、ユーグレナ水性溶媒抽出物が前駆骨芽細胞の増殖や骨分化に与える影響の検討を行った。また、ユーグレナ藻体の経口摂取がヒトの骨に与える影響を検討した。
【００７５】
＜実施例１＞
原料として、ユーグレナ・グラシリス粉末（ユーグレナ藻体、（株）ユーグレナ製）を用いた、水性溶媒として水を用いてユーグレナ水抽出物を調製した。
ユーグレナ粉末（ユーグレナ・グラシリス、Ｌｏｔ．ＥＵ−１６１８９、（株）ユーグレナ製）０．５ｇに、超純水１ｍｌを加え震盪し、均一に分散した後、室温（２５℃）で１０分間抽出した。遠心分離（３０００ｒｐｍ、３分、２５℃）により得られた上清を分取し、０．４５μｍ滅菌フィルターにて濾過することで、ユーグレナ水抽出物を調製した。
【００７６】
＜実施例２＞
原料として、ユーグレナ・グラシリス粉末（ユーグレナ藻体、（株）ユーグレナ製）を用いた、水性溶媒として熱水を用いてユーグレナ熱水抽出物を調製した。
ユーグレナ粉末（ユーグレナ・グラシリス、Ｌｏｔ．ＥＵ−１６１８９、（株）ユーグレナ製）０．５ｇに、超純水１ｍｌを加え震盪し、均一に分散した後、乾熱滅菌器を用いて加熱抽出（１００℃、１０分間）した。遠心分離（３０００ｒｐｍ、３分、２５℃）により得られた上清を分取し、０．４５μｍ滅菌フィルターにて濾過することで、ユーグレナ熱水抽出物を調製した。
【００７７】
＜実施例３＞
原料として、ユーグレナ・グラシリス粉末（ユーグレナ藻体、（株）ユーグレナ製）を用いた、水性溶媒としてエタノール（ＥｔＯＨ）を用いてユーグレナエタノール抽出物を調製した。
ユーグレナ粉末（ユーグレナ・グラシリス、Ｌｏｔ．ＥＵ−１６１８９、（株）ユーグレナ製）０．５ｇに、エタノール１ｍｌを加え震盪し、均一に分散した後、室温（２５℃）で１０分間抽出した。遠心分離（３０００ｒｐｍ、３分、２５℃）により得られた上清を分取し、０．４５μｍ滅菌フィルターにて濾過することで、ユーグレナエタノール抽出物を調製した。
【００７８】
＜試験１  前駆骨芽細胞増殖試験＞
（試験方法）
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（前駆骨芽細胞）に実施例１〜３の各抽出物を、MEM−α（０．１％FBS、１％Penicillin-Streptomycin Solution、no ascorbic acid）培地に終濃度５μg/mL、または５０μg/mLとなるように添加し、２４時間後にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて細胞増殖率を測定した。
コントロール（ｃｏｎｔ）として、抽出物を添加しないMEM−α（0.1％FBS、１％Penicillin-Streptomycin Solution、no ascorbic acid）を用いて同様の手順で細胞増殖率を測定した。
【００７９】
（試験１の結果）
結果を図２乃至４に示す。
実施例１〜３の抽出物を添加することで、コントロールに対して有意に高い細胞増殖率を示した。つまり、ユーグレナの水性溶媒抽出物が、前駆骨芽細胞に対する細胞増殖活性を示すことがわかった。
また、いずれの抽出物においても、抽出物の濃度が高くなると細胞増殖率が有意に向上した。
【００８０】
＜試験２  骨分化（石灰化）促進試験＞
（試験方法）
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（前駆骨芽細胞）をコンフルエントにしたのち、実施例１〜３の各抽出物を培地１ｍＬあたり５０μｇ添加した骨分化誘導培地に添加した。２１日間培養後、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ法を用いてカルシウムを染色し、Ｉｍａｇｅ  Ｊにて画像解析を行った。
コントロール（ｃｏｎｔ）として、抽出物を添加しない骨分化誘導培地を用いて同様の手順で解析を行った。
【００８１】
（試験２の結果）
結果を図５乃至７に示す。
実施例１〜３の各抽出物を添加することで、コントロールに対して有意に高いカルシウム沈着を示した。つまり、ユーグレナの水性溶媒抽出物が、前駆骨芽細胞の分化（石灰化）を促進する作用を示すことがわかった。
【００８２】
＜試験１及び２のまとめ＞
試験１及び２の結果から、ユーグレナ水性溶媒抽出物が、前駆骨芽細胞の増殖活性および骨分化促進作用を有することが明らかとなった。
したがって、ユーグレナ水性溶媒抽出物を、前駆骨芽細胞増殖剤、骨分化促進剤、骨強化剤、抗骨粗鬆症剤として用いることができることがわかった。
【００８３】
＜試験３  ユーグレナの摂取がヒトの骨に与える影響の検討＞
試験３では、ユーグレナ・グラシリス粉末（ユーグレナ藻体、（株）ユーグレナ製）の経口摂取がヒトの骨に与える影響を検討した。
【００８４】
（試験方法）
年齢が５０歳以上、７０歳未満の健康上問題のない閉経後女性を対象に、ユーグレナ・グラシリス粉末又はプラセボ食品を２４週間継続摂取することによる、骨密度に与える影響を検討した。具体的には、１回４カプセル（１ｇ）を１日３回、合計３ｇのユーグレナ・グラシリス粉末又はプラセボ食品を摂取した。
【００８５】
試験は二重盲検比較試験にて実施し、ＤＥＸＡ（Ｄｕａｌ−Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）法を用いて、摂取前と摂取２４週間後の骨密度を比較した。
【００８６】
（試験３の結果）
図８に示すように、腰椎にあたるＬ１−Ｌ４の骨密度の値が、ユーグレナ・グラシリス粉末を摂取した場合に、摂取２４週間後（半年後）の変化量が＋０．００６０３であった。プラセボ食品を摂取した場合には、摂取２４週間後（半年後）の変化量が−０．００３９０となり、ユーグレナの摂取により、統計学的に有意に骨密度の低下が抑制された（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【００８７】
試験３の結果から、ユーグレナ・グラシリス粉末（ユーグレナ藻体）が、骨密度の低下を抑制する作用を有していることが示された。この骨密度の低下を抑制する作用は、試験１及び試験２の結果から、ユーグレナの前駆骨芽細胞増殖作用、骨分化促進用作用に基づくものであることが推測される。
【００８８】
したがって、ユーグレナ藻体やユーグレナ水性溶媒抽出物を、骨強化、抗骨粗鬆症、前駆骨芽細胞増殖、骨分化促進などの用途に用いることが可能であることが示された。このとき、骨密度の低下を抑制するためや骨密度を改善したり、骨密度を増加（向上）させたりするためにユーグレナ藻体やユーグレナ水性溶媒抽出物を用いることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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