(57)【要約】      （修正有）【課題】試料の測定中に検出レンジの切り替えが発生した場合でも、正しいクロマトグラムと定量結果を提供する。【解決手段】測定中に検出器の検出レンジの切り替えが行われたクロマトグラムの処理方法であって、測定開始時の検出レンジをＲ０とし、Ｒ０より大きくなるように切り替えた検出レンジをＲとし、検出レンジがＲである時の信号値群をそれぞれ、Ｒ／Ｒ０で乗じて信号値を補正する工程と、検出レンジ切り替え前後の任意の信号値群を除去する工程と、前記除去された信号値群を数学的処理で補間する工程、を含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定中に検出器の検出レンジの切り替えが行われたクロマトグラムの処理方法であって、
測定開始時の検出レンジをＲ０とし、
Ｒ０より大きくなるように切り替えた検出レンジをＲとし、
検出レンジがＲである時の信号値群をそれぞれ、Ｒ／Ｒ０で乗じて信号値を補正する工程と、
検出レンジ切り替え前後の任意の信号値群を除去する工程と、
前記除去された信号値群を数学的処理で補間する工程、
を含むことを特徴とする前記処理方法。
【請求項２】
検出レンジの切り替えを、信号値がＲ０内に入らないと判断した場合に、検出レンジの切り替えを自動的に行う又は操作者が決定することを特徴とする請求項１に記載の処理方法。
【請求項３】
検出レンジ切り替え前後の任意の信号値群を除去する工程において、除去する信号値群の範囲を自動で決定する又は操作者が決定することを特徴とする請求項１又は２に記載の処理方法。
【請求項４】
前記除去された信号値群を数学的処理で補間する工程において、２次以上の非線形関数を用いて関数近似を行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定中に検出器の検出レンジの切り替えが行われたクロマトグラムの処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィでは、検出器の検出感度を向上させるために、検出器の検出レンジを制限して使用することが多いが、検出レンジを超過する強度の信号は、検出レンジを変更しない限り、正しく信号取得することができない。これを防止するために予め検出レンジを広くする対応が考えられるが、検出レンジを制限していた場合に検出レンジを超過していた強度の信号は正しく定量可能となる一方で、検出器のノイズレベルに近い強度の微小信号は、検出レンジを広くすることで検出器のノイズに埋もれ、信号が正しく取得できない問題がある。
【０００３】
このため従来法では、１つのクロマトグラムに微小ピークと巨大ピークが出現し、どちらのピークも定量計算を行う場合は、異なるレンジで分析を２回以上行う必要がある。そのため、分析回数増加に伴う分析時間の増加や、サンプルや溶離液の使用量増大が問題となる。
【０００４】
また、微小ピークと巨大ピークが混在するクロマトグラムの場合、微小ピークが出現する時間領域と、巨大ピークが出現する時間領域で異なるレンジで測定する手法もとられることがある。この場合、前述の課題は解決されるものの、予め異なる時間領域に対して適切なレンジを設定する必要があり、操作性に欠く方式である。これらを解決するため、測定途中で信号が検出レンジを超過する場合、自動で検出レンジを切り替えることも成されるが、検出レンジ切り替えにより、クロマトグラムに急峻な段差が生じてしまい、定量計算を行えないという欠点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、試料の測定中に検出レンジの切り替えが発生した場合でも、正しいクロマトグラムと定量結果を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち本発明は、
測定中に検出器の検出レンジの切り替えが行われたクロマトグラムの処理方法であって、
測定開始時の検出レンジをＲ０とし、
Ｒ０より大きくなるように切り替えた検出レンジをＲとし、
検出レンジがＲである時の信号値群をそれぞれ、Ｒ／Ｒ０で乗じて信号値を補正する工程と、
検出レンジ切り替え前後の任意の信号値群を除去する工程と、
前記除去された信号値群を数学的処理で補間する工程、
を含むことを特徴とする前記処理方法に関するものである。
【０００８】
本発明について
検出レンジをＲ０からＲに切り替えた点をレンジ拡大点、
検出レンジをＲからＲ０に切り替えた点をレンジ縮小点、
検出レンジをＲ０に設定している時間領域をレンジ基準領域、
検出レンジをＲに設定している時間領域をレンジ拡大領域、
として以下、詳細に説明する。
【０００９】
まず、「検出レンジの切り替え」とは、クロマトグラムを取得中に、検出器の検出レンジを変更することを示す。検出レンジの切り替えは、信号が検出レンジＲ０を超過した場合に検出レンジをＲに変更する検出レンジ拡大と、信号が検出レンジＲよりも十分小さく検出感度を向上させるために検出レンジをＲ０に変更する検出レンジ縮小がある。検出レンジの変更は、操作者が手動で行っても良いが、装置が信号値を参照することにより信号が検出レンジＲ０を超過した場合に検出レンジ拡大を行う、レンジ拡大領域中の信号が検出レンジＲ０で十分足りる場合に検出レンジ縮小を行うといったように自動で検出レンジの変更を行うことが望ましい。なお、検出レンジＲ０は分析条件やベースラインに含まれているノイズレベルを考慮して、当業者が適宜決定すればよい。また、自動で検出レンジの変更を行う場合、検出レンジＲは検出レンジＲ０の２〜１０倍程度としておけば問題ない。
【００１０】
図１に、擬似クロマトグラムを用いた検出レンジ切り替えの例を示す。最大３２００の信号出力がある正規分布の擬似クロマトグラムの場合、検出レンジＲ０が１０００のとき、クロマトグラム中で検出レンジＲ０を超過する時間領域が出現する。このとき、信号が検出レンジＲ０を超過したときに検出レンジを４０００に拡大し（検出レンジＲに切り替える）、また、検出レンジ４０００のとき、信号値が１０００を下回ったときに検出レンジを１０００に縮小する（検出レンジＲ０に切り替える）と図１のようなクロマトグラムが得られる。図１のように１つのクロマトグラムに巨大ピークが１つ出現する場合、検出レンジ拡大、検出レンジ縮小の順で１度ずつ行うことが基本となるが、巨大ピークの数やクロマトグラムの形状によって、検出レンジ拡大と検出レンジ縮小を複数回実施してもよく、その順序や、検出レンジの拡大量や縮小量に制限は特にない。また、検出レンジＲを複数設定してもよく、例えば、Ｒ０を１０００、Ｒを２０００（Ｒ１）、４０００（Ｒ２）の２つ設定しておき、Ｒ０→Ｒ１→Ｒ２→Ｒ０、Ｒ０→Ｒ１→Ｒ０→Ｒ２、Ｒ０→Ｒ２→Ｒ１→Ｒ０のように、検出レンジを変えても問題はない。
【００１１】
次に、信号値を補正する工程について説明する。図１において検出レンジが拡大され４０００となった時間領域をレンジ拡大領域とするが、レンジ拡大領域は、レンジ基準領域と比較して検出レンジを拡大した比率の分だけ見かけの信号値は小さい信号値となる。ここで、レンジ拡大領域の信号値群に、検出レンジＲを検出レンジＲ０で除算した値（４０００／１０００＝４）を乗じることで、レンジ拡大領域の信号値群をレンジ基準領域の検出レンジで取得した値に補正することができる（図２参照）。
【００１２】
次に、信号値群を除去する工程について説明する。クロマトグラム取得中に検出器の検出レンジ切り替えが発生した場合、検出器の種類に依らず一般的にはレンジ切り替えに伴うノイズが発生する。このノイズにより検出レンジ切り替え前後の信号値は正しい値を取得できていない場合がある。このとき、正しい信号値を取得できていない可能性のある時間領域の信号値群を除去する（図３参照）。すなわち、レンジ拡大点及びレンジ縮小点の前後数点（例えば、レンジ切り換えを行った時点から前後±１．０秒の信号値群）を除去する。
【００１３】
次に、除去された信号値群を補間する工程について説明する。除去した信号値群を、除去した信号値群の前後の信号を用いた数学的処理によって補間することにより、レンジ切り替えに伴うノイズのないクロマトグラムを取得することができる（図４参照）。なお、数学的処理は一次式、あるいは多項式を用いた最小二乗法近似のほか、関数を用いた波形予想を例示することができるが、クロマトグラム中の除去した信号値群を補間できればよく、特に手法に制限はない。補間をするために必要な除去した信号値群の前後の信号の点数は、操作者が時間範囲や信号点数などの基準で決定してもよく、またサンプリングピッチなどの測定条件を参照し自動で決定してもよいが、クロマトグラムの定量精度を担保するためには、除去した信号値群と同程度の点数以上を用いることが望ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、従来法では困難だった微小ピークと巨大ピークが同時に出現するクロマトグラムにおいて、一度の測定で、どちらのピークの定量精度も犠牲にすることないクロマトグラムを取得することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】測定中に検出レンジ拡大と検出レンジ縮小を実施した場合のクロマトグラムを示した図である。
【図２】レンジ拡大領域の信号をもとに、信号を補正したクロマトグラムを示した図である。
【図３】補正したクロマトグラム中の検出レンジ切り替えに伴い発生するノイズ部分の信号除去を示した図である。
【図４】信号除去部を補間したクロマトグラムを示した図である。
【図５】実施例１で用いたクロマトグラフィシステムを示した図である。
【図６】紫外可視吸光度検出器の検出レンジを１ＡＢＵ／Ｖと４ＡＢＵ／Ｖに設定した場合に、試料を測定し得られたクロマトグラムを重ねて表示した図である。
【図７】測定中に検出レンジ拡大と検出レンジ縮小を実施した際の試料Ｘを測定し得られたクロマトグラムを表示した図である。
【図８】図７のクロマトグラムに対して本発明手法を用いて処理したクロマトグラムである。
【図９】本発明手法を用いた処理クロマトグラムから得られた検量線を示した図である。
【図１０】実施例２で用いたクロマトグラフィシステムを示した図である。
【図１１】電気伝導度検出器の検出レンジを０．１μＳ／ｍＶと１．０μＳ／ｍＶに設定した場合に、試料を測定し得られたクロマトグラムを重ねて表示した図である。
【図１２】測定中に検出レンジ拡大と検出レンジ縮小を実施した際の試料を測定し得られたクロマトグラムを表示した図である。
【図１３】図１２のクロマトグラムに対して本発明手法を用いて処理したクロマトグラムである。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例によって本発明を具体的に示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００１７】
（実施例１）
本発明の効果を、実際のクロマトグラムを用いて検証を行った。
【００１８】
図５に示す、液体クロマトグラムシステムを使用し、実際の測定を行った。システムは、溶離液および溶離液ボトル１、溶媒脱気装置２、送液ポンプ３、試料注入部４、カラムオーブン６、紫外可視吸光度検出器７、廃液ボトル８、及びデータ処理プログラム９で構成した。分析カラム５としては、東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｚ（粒子径５μｍ、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５．０ｃｍ）を使用し、下記試料のうち試料Ｘを未知試料とし、原液Ｙを希釈した試料Ｙ１〜Ｙ４を用いて作成した検量線を用いて試料Ｘの定量を行った。その他の条件は下記の通りである。
注入量：３０μＬ、カラム温度：４０℃、流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：８０％  アセトニトリル水溶液
検出器波長：２５４ｎｍ
試料Ｘ：０．００６７ｍｇ／ｍＬ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ブチル  ＋  ０．１９００ｍｇ／ｍＬ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ヘキシル
原液Ｙ：０．０１００ｍｇ／ｍＬ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ブチル  ＋  ０．２８５０ｍｇ／ｍＬ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ヘキシル
試料Ｙ１：原液Ｙを２倍に希釈したもの
試料Ｙ２：原液Ｙを４倍に希釈したもの
試料Ｙ３：原液Ｙを８倍に希釈したもの
試料Ｙ４：原液Ｙを１６倍に希釈したもの
以下、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ブチルを「Ｃ４」、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ヘキシルを「Ｃ６」と略する。
【００１９】
次に、本発明の効果について検証を行った。
【００２０】
紫外可視吸光度検出器の検出レンジを１ＡＢＵ／Ｖおよび４ＡＢＵ／Ｖに設定し、試料Ｘを未知試料として測定し得られたクロマトグラムを重ねたものを図６に示す。１１．４分付近に出現するＣ６ピークは、１ＡＢＵ／Ｖの検出レンジではピーク信号が１０００．０ｍＶを超過するため正常に信号取得できていないが、４ＡＢＵ／Ｖの検出レンジでは正しく取得できている。一方、８．０分付近に出現するＣ４ピークはどちらの検出レンジでも正しく取得できているが、４ＡＢＵ／Ｖの検出レンジではピーク信号がかなり小さくなっていることがわかる。４ＡＢＵ／Ｖの検出レンジでの分析は、１ＡＢＵ／Ｖの検出レンジと比較して、より検出下限値が高くなり、微量成分の定量が実施しづらくなることは当業者にはよく知られている。このように濃度が大きく異なる複数のピークを正しく定量しようとした場合、異なる検出レンジを設定した複数の測定から、複数のクロマトグラムを得る必要がある。
【００２１】
次に、試料測定の途中で検出レンジを切り替えたクロマトグラムを取得後に、本発明手法を用いてクロマトグラムを処理した。図７には、測定の途中で、手動で検出レンジを切り替えた場合のクロマトグラムを示す。なお、検出レンジは１１．３０分で１ＡＢＵ／Ｖ（検出レンジＲ０）から４ＡＢＵ／Ｖ（検出レンジＲ）に切り替え（検出レンジ拡大）、１１．６３分で４ＡＢＵ／Ｖから１ＡＢＵ／Ｖに切り替え（検出レンジ縮小）を実施した。
【００２２】
図７に示したクロマトグラムに対して、まず、レンジ拡大領域１１．３０〜１１．６３分の信号を、Ｒ／Ｒ０＝４で乗じることにより信号値を補正する。次に、検出レンジ切り替えによってノイズが含まれる、レンジ拡大点、レンジ縮小点から±１．０秒に相当する信号を除去した。そして、除去した信号に相当する領域を、信号除去した領域の前後±１．０秒の信号について、３次曲線を用いた最小二乗近似を行い、信号除去した領域を補間することにより、図８に示すクロマトグラムを得ることができた。
【００２３】
次に、試料Ｙ１〜Ｙ４を用いて検量線を作成し、試料Ｘの定量計算を実施した。試料Ｙ１のみ、Ｃ６のピーク信号取得中にレンジ切り替えを実施し、本発明手法でクロマトグラムを処理した。Ｃ４、Ｃ６の検量線を図９に示す。検量線の決定係数は一次式を用いる場合、Ｃ４の検量線で０．９９９８、Ｃ６の検量線で１．００００となり、高い直線性を有していることがわかった。本発明手法を用いて作成した検量線を用いて、未知試料Ｘを定量した結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
2019105499.tif 000002
【００２５】
この結果から、本発明を標準試料および未知試料の測定によって得られたクロマトグラムへ適用し、検量線の取得および定量計算を実施した場合、定量計算の結果得られた未知試料の濃度と、実際の濃度の誤差が極めて少ないことから、本手法が未知試料の定量計算だけではなく、検量線作成に対しても非常に有用であることが確認できた。
【００２６】
（実施例２）
図１０に示す、イオンクロマトグラムシステムを使用し、実際の測定を行った。システムは、溶離液および溶離液ボトル１１、溶媒脱気装置１２、送液ポンプ１３、試料注入部１４、カラムオーブン１６、電気伝導度検出器１７、廃液ボトル１８、及びデータ処理プログラム１９で構成した。分析カラム１５としては、東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  ＩＣ−Ａｎｉｏｎ−ＰＷＸＬ  ＰＥＥＫ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×７．５ｃｍ）を使用し、濃度３０００ｐｐｍの硝酸ナトリウム水溶液を試料として分離を行った。その他の条件は下記の通りである。
注入量：３０μＬ、カラム温度：４０℃、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：５．８ｍｍｏｌ／Ｌ  ホウ酸  ＋  １．５ｍｍｏｌ／Ｌ  四ほう酸ナトリウム１０水和物  ＋  １．５ｍｍｏｌ／Ｌ  グルコン酸カリウム  ＋  ０．５％  グリセリン  ＋  ４％  アセトニトリル  ＋  ３％  １−ブタノール
次に、本発明の効果について検証を行った。
【００２７】
電気伝導度検出器の検出レンジを０．１μＳ／ｍＶと１．０μＳ／ｍＶに設定し、試料を測定し得られたクロマトグラムを重ねたもの、さらに６．５分付近に出現する硝酸イオンのピーク部分を拡大したものを図１１に示す。検出レンジ０．１μＳ／ｍＶに設定した場合は、硝酸イオンの巨大なピークが途中で検出レンジを超過しているために正しく取得できていないが、４．８分付近に出現している不明ピークは正しく取得できている。一方で、検出レンジを１．０μＳ／ｍＶに設定した場合は、硝酸イオンのピーク全体像は正しく取得できているが不明ピークは不明瞭となっている。このように出力が大きく異なる複数のピークを正しく定量しようとした場合、異なる検出レンジを設定した複数の測定から、複数のクロマトグラムを得る必要がある。
【００２８】
次に、試料測定の途中で検出レンジを切り替えたクロマトグラムを取得後に、本発明手法を用いてクロマトグラムを処理した。図１２には、測定の途中、手動で検出レンジを切り替えた場合のクロマトグラムを示す。なお、検出レンジは５．７６分で０．１μＳ／ｍＶ（検出レンジＲ０）から１．０μＳ／ｍＶ（検出レンジＲ）に切り替え（検出レンジ拡大）、７．２６分で１．０μＳ／ｍＶ（検出レンジＲ）から０．１μＳ／ｍＶ（検出レンジＲ０）に切り替え（検出レンジ縮小）を実施した。
【００２９】
図１２に示したクロマトグラムに対して、まず、レンジ拡大領域５．７６〜７．２６分の信号を、Ｒ／Ｒ０＝１０で乗じることにより信号値を補正する。次に、検出レンジ切り替えによってノイズが含まれる、レンジ拡大点、レンジ縮小点から±２．０秒に相当する信号を除去した。そして、除去した信号に相当する領域を、信号除去した領域の前後±２．０秒の信号について、３次曲線を用いた最小二乗近似を行い、信号除去した領域を補間することにより、図１３に示す復元したクロマトグラムを得ることができた。
【００３０】
検出レンジ０．１μＳ／ｍＶおよび１．０μＳ／ｍＶで取得したクロマトグラムと、本発明手法で処理した復元クロマトグラムにおける硝酸イオンのピーク面積値を表２に示す。
【００３１】
【表２】
2019105499.tif 000003
【００３２】
この結果から、本発明手法で処理したクロマトグラムの硝酸イオン面積値である１９５９３．５２７は、検出レンジ１．０μＳ／ｍＶの硝酸イオン面積値１８８８．７４９に対して１０３．７３８％の面積値となっており、本発明手法を用いて処理したクロマトグラムの面積値は、広い検出レンジで測定したクロマトグラムと比較すると、高い相関性を有していることがわかる。このため、従来異なるレンジで複数回測定することにより複数のクロマトグラムを取得していたが、本発明手法である測定中に検出レンジを切り替える手法により、１度の測定で微小な成分の定量精度を犠牲とすることなく、高いダイナミックレンジを持つクロマトグラムを取得できることがわかる。
【符号の説明】
【００３３】
１．溶離液
２．脱気装置
３．送液ポンプ
４．試料注入バルブ
５．分析カラム
６．カラムオーブン
７．紫外可視吸光度検出器
８．廃液ボトル
９．システム制御及びデータ処理装置
１１．溶離液
１２．脱気装置
１３．送液ポンプ
１４．試料注入バルブ
１５．分析カラム
１６．カラムオーブン
１７．電気伝導度検出器
１８．廃液ボトル
１９．システム制御及びデータ処理装置
【図１】
2019105499.tif 000004
【図２】
2019105499.tif 000005
【図３】
2019105499.tif 000006
【図４】
2019105499.tif 000007
【図５】
2019105499.tif 000008
【図６】
2019105499.tif 000009
【図７】
2019105499.tif 000010
【図８】
2019105499.tif 000011
【図９】
2019105499.tif 000012
【図１０】
2019105499.tif 000013
【図１１】
2019105499.tif 000014
【図１２】
2019105499.tif 000015
【図１３】
2019105499.tif 000016