(57)【要約】【課題】シートに標識物質をとらえる過程において、第二の認識物質の反応速度特性によらない相互作用検出方法を提供する。【解決手段】ａ）標識された第一の認識物質、ｂ）セルロース繊維に固定化された第二の認識物質、及びｃ）検出対象物質（但し、第一の認識物質と第二の認識物質は、いずれも検出対象物質と結合しうるものである）を分散状態で接触させ、上述のａ，ｂ，及びｃが結合した複合体を形成させ、当該複合体と、結合しなかったａとを、セルロース膜を通過させることで分離し、得られた当該複合体の標識を検出する。【選択図】図１
2019027831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）標識された第一の認識物質、
ｂ）セルロース繊維に固定化された第二の認識物質、及び
ｃ）検出対象物質
（但し、第一の認識物質と第二の認識物質は、いずれも検出対象物質と結合しうるものである）
を分散状態で接触させ、
上述のａ，ｂ，及びｃが結合した複合体を形成させ、
当該複合体と、結合しなかったａとを、セルロース膜を通過させることで分離し、
得られた当該複合体の標識を検出することを特徴とする、検出対象物質の検出方法。
【請求項２】
認識物質が検出対象物に対する抗体である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースを分子間相互作用の検出に利用する検出系に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原と抗体の相互作用検出に、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）が多く用いられる。ＥＬＩＳＡにおけるサンドイッチアッセイは一般的に、抗体を固相化した水に不溶の担体を用い、固相抗体と抗原を反応させた後、固相抗体と異なる部位を認識する酵素標識抗体を反応させ、未反応の酵素標識抗体を洗浄（Ｂ／Ｆ分離）し、酵素反応基質を加えることで、酵素反応由来の基質生成物を検出する方法である。ＥＬＩＳＡにおいてバックグランドシグナルを低減させるためのＢ／Ｆ分離工程は欠かせないものであるが、洗浄・分離の工程は複雑であり、洗浄廃液も生じるため簡易的な測定にＥＬＩＳＡを用いることは困難であった。
【０００３】
煩雑なＢ／Ｆ分離工程を必要としない簡易的なアッセイ方法として、フロースルーアッセイが知られている（特許文献１参照）。フロースルーアッセイは第一の認識物質が固定化された着色粒子と分析対象物の混合物を、第二の認識物質が固定化されたシートを通過させることにより、分析対象物の濃度に応じてシートを呈色させる方法である。フロースルーアッセイでは、シートに固定化された第二の認識物質と分析対象物間の反応は固液反応になるため、液相内で行われるホモジニアスな反応に比べ反応速度が遅くなる。そのため、第二の認識物質の反応速度特性がアッセイ全体の反応速度に大きな影響を与える測定系であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−３４４４０８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、シートに標識物質をとらえる過程において、第二の認識物質の反応速度特性によらない相互作用検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
ａ）標識された第一の認識物質、
ｂ）セルロース繊維に結合された第二の認識物質、及び
ｃ）検出対象物質
（但し、第一の認識物質と第二の認識物質は、いずれも検出対象物質と結合しうるものである）
を分散状態で接触させ、
上述のａ，ｂ，及びｃが結合した複合体を形成させ、
当該複合体と、結合しなかったａとを、セルロース膜を通過させることで分離し、
得られた当該複合体の標識を検出することを特徴とする、検出対象物質の検出方法。
また、認識物質は検出対象物に対する抗体であることが好ましい。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
（１）セルロース繊維
本発明で用いるセルロース繊維はグルコース分子がグリコシド結合により重合したもの、もしくはその誘導体であればよく、特に限定されない。セルロース繊維は溶液中で分散可能な繊維長であればよく、長さは特に限定されない。セルロース誘導体は具体的には、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ＴＥＭＰＯ酸化セルロースなどがあげられる。
セルロース繊維への認識物質の固定化方法も特に限定されない。例えば、ＣＭＣに認識物質を固定化する際は、ＣＭＣ中に存在するカルボキシ基を利用して、ＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩）／ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）により官能基を活性エステルへと変化し、認識物質に存在するアミノ基と反応させればよい。
【０００９】
（２）認識物質
本発明で用いる認識物質は、検出対象物質を認識する物質であればよく特に限定されない。認識物質としては、例えば、クラウンエーテルやシクロデキストリンなどの包接分子、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、レクチン、抗体などのタンパクが例示できるが、特に本発明では抗体を用いることが好ましい。本発明では、第一の認識物質と第二の認識物質とを用いるが、それらが検出対象物質に対して同時に結合状態をとりうる限り、それらは同一であっても異なっていてもよい。
【００１０】
（３）標識
本発明における標識は、例えば、金コロイド、色素、蛍光色素、微粒子、蛍光微粒子、酵素などをあげることができる。
【００１１】
（４）検出対象物質
検出対象物質に関しても、特に限定されない。例えば、抗原、タンパク質系の物質や低分子有機化合物、ウイルス、細菌、細胞等を例示することができるが、これらに限定されたものではない。
【００１２】
（５）セルロース膜
本発明におけるセルロース膜は、セルロース繊維と相互作用可能なセルロース膜であればよく、特に限定されない。具体的には、綿繊維で作製されたフィルターペーパー、ろ過膜などを用いればよい。
【００１３】
（６）膜の通過
本発明における膜の通過方法は、特に限定されない。例えば、自然ろ過、減圧ろ過、加圧ろ過、遠心ろ過等の方法を例示することができる。
【００１４】
（７）検出
本発明における検出は第一の認識物質の標識方法に応じて適宜適当なものを選択すればよい。例えば、第一の認識物質が酵素で標識してある場合、酵素基質を添加し酵素反応生成物を検出すればよい。検出は測定機器を用いて定量的に行ってもよいし、目視による定性的な検出を行ってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、セルロース繊維を用いる検出方法は、シートに標識物質をとらえる過程において、第二の認識物質の反応速度特性の影響を受けない相互作用検出方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ろ過後のセルロース膜の様子を示したものである。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例によって具体的に示すが、本発明はこれに限定されない。
【００１８】
（実施例１）  金コロイド標識抗体と抗体結合セルロース繊維でのＢＮＰ検出
第一の認識物質としてＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端を認識する抗体（ＢＣ２３−１１、特許第５８１０５１４号公報に記載）を用い、金コロイドを用いて標識を行った。ＢＣ２３−１１の金コロイド標識方法を以下に示す。金コロイドは、ワインレッドケミカル社製の直径６０ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＨ１−６０ＮＭ）を用いた。
（１）２５０μＬの金コロイド溶液にｐＨ９．２の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を２５０μＬ添加しｐＨを調整した。
（２）０．１ｍｇ／ｍＬのＢＣ２３−１１溶液（ｐＨ９．２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を５００μＬ添加し、１５分間静置した。
（３）２５０ｍＭのＭｅｔｈｙｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳ２４−Ｅｓｔｅｒ（ＴｈｅｒｏｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）のＤＭＳＯ溶液１０μＬを添加し、３０分静置した。
（４）ＢＳＡとポリエチレングリコール２０，０００（和光純薬社製）の混合液を１０００μＬ添加し、１５分静置した。
（５）８，０００ｇで９分間の遠心操作を行い、金コロイドを沈殿させ、透明になった上清を廃棄した。
（６）ＢＳＡとポリエチレングリコール２０，０００の混合液を１０００μＬ添加し、（５）の操作を繰り返した。
（７）金コロイド保存用の緩衝液を用いＯＤ５２０＝６．０となるよう沈殿を懸濁させた。
【００１９】
第二の認識物質としてＢＮＰの環状部位を認識する抗体（ＢＭ３３−２８、特開２０１２−１４０３３１号公報に記載）を用いた。ＢＭ３３−２８のＣＭＣへの固定化方法を以下に記載する。
（１）ＣＭＣ（スギノマシン社製、ＢｉＮＦｉ−ｓ  ＣＭＣ）１ｍｇを１ｍＬのＰＢＳに懸濁させ、ＥＤＣ（ナカライテスク社製）４．８ｍｇ、ＮＨＳ（ナカライテクス社製）５７．５ｍｇを添加し、室温で３０分反応させ、ＣＭＣ中のカルボニル基を活性エステル基へと変換した。
（２）１００Ｋカットの限外ろ過膜（ミリポア社製、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を用いて、未反応のＥＤＣ、ＮＨＳを除去した。
（３）１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）１ｍＬ中に（２）のＣＭＣを懸濁し、さらに、定法によりＦａｂ’化したＢＭ３３−２８を１ｍｇ添加し、室温で２．５時間反応させた。
（４）次にエタノールアミンを２０μＬ添加し、未反応の活性エステルに反応させた。（室温１５分）。
（５）１００Ｋカットの限外ろ過膜（ミリポア社製、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を用いて、未反応のＦａｂ’及びエタノールアミンを除去すると同時に、濃縮を行い２８０ｎｍの吸光度が３００ｍＡｂｓとなるようＰＢＳで濃度を調整した。
【００２０】
上記のＢＣ２３−１１標識金コロイド及び、ＢＭ３３−２８Ｆａｂ’固定化ＣＭＣを用いて、ＢＮＰの測定を以下のように行った。まず、上記抗体固定化ＣＭＣ溶液２０μＬと、上記抗体標識金コロイド溶液２０μＬ及び、濃度既知ＢＮＰ溶液（０、２４２０ｐｇ／ｍＬ）２１０μＬを混合し、５分静置した。次にセルロース膜（バイオラッド社製、バイオドットＳＦフィルターペーパー）の上に二ロトセルロースメンブレン（０．１μｍ、ＧＥ社製）を重ねたろ過膜を通過させ、セルロース膜上に残った金コロイドによる呈色を確認した。ニトロセルロースメンブレンはろ過速度調整のために用いた。ろ過にはバイオドットＳＦ装置（ＢＩＯＲＡＤ社製）を用いた吸引ろ過を行った。ろ過後のセルロース膜の様子を図１に示す。図１からＢＮＰの濃度に応じて金コロイド由来の呈色強度が強くなることが確認できた。
【００２１】
以上の結果から、セルロース膜を用いた本発明の測定方法により検出対象を検出可能であることが確認された。
【図１】
2019027831.tif 000003