(57)【要約】【課題】尿中代謝物のバイオマーカーを探索するための改善方法を提供すること。【解決手段】（a）尿検体を液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）に供し、該尿検体中の尿中代謝物を解析するステップ、（b）前記尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップ、（c）前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップ、（d）前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップを含む、尿中代謝物マーカーを探索する方法。【選択図】図１
2019105456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）尿検体を液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）に供し、該尿検体中の尿中代謝物を解析するステップ、
（b）前記尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップ、
（c）前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップ、
（d）前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップ
を含む、尿中代謝物マーカーを探索する方法。
【請求項２】
ステップ（b）において、前記尿中代謝物の解析データを用いて、健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物をウィルコクソンの順位和検定により絞り込んだ上で、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記判別分析法がOPLS判別分析法又はカーネル判別分析法である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（c）において、前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法による検査モデルを構築する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記判別分析の結果に基づいて、バイオマーカー数の異なる複数の検査モデルを構築するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
特定の疾患又は状態が、がんの有無、がんの種類、がんの進行度、がんの悪性度、がんのステージ、がんの予後、がんに対する治療効果、及び抗がん剤に対する感受性からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データが入力される計数部と、
前記尿中代謝物の解析データを用いて数値解析を行う算出部と、
前記解析の結果により尿中代謝物を選択する及び／又は尿中代謝物をマーカー候補として決定する判定部と、
前記判定部による判定結果を出力のために処理する出力処理部と
を備え、
前記算出部は、前記尿中代謝物の解析データを用いてランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価する、及び前記尿中代謝物の解析データを用いた判別分析法を行い、
前記判定部は、前記ランダムフォレスト法による評価の結果に基づいて重要度の高い尿中代謝物を選択し、前記判別分析法の結果に基づいて尿中代謝物をマーカー候補として決定する、尿中代謝物マーカーを探索するためのシステム。
【請求項８】
前記算出部が、前記尿中代謝物の解析データを用いてウィルコクソンの順位和検定を行い、
前記判定部が、前記ウィルコクソンの順位和検定の結果に基づいて、健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物を絞り込むものである、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記判別分析法がOPLS判別分析法又はカーネル判別分析法である、請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
前記算出部が、前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法を行い、
前記判定部が、前記判別分析法による検査モデルを構築する、請求項７に記載のシステム。
【請求項１１】
尿中代謝物マーカーが、がんの有無、がんの種類、がんの進行度、がんの悪性度、がんのステージ、がんの予後、がんに対する治療効果、及び抗がん剤に対する感受性からなる群より選択される少なくとも1つの特定の疾患又は状態に関連するものである、請求項７に記載のシステム。
【請求項１２】
コンピュータに、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップと、
前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップと、
前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップと
を実行させる、尿中代謝物マーカーを探索するためのプログラム。
【請求項１３】
重要度の高い尿中代謝物を選択するステップが、前記尿中代謝物の解析データを用いて、健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物をウィルコクソンの順位和検定により絞り込んだ上で、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するものである、請求項１２に記載のプログラム。
【請求項１４】
前記判別分析法がOPLS判別分析法又はカーネル判別分析法である、請求項１２に記載のプログラム。
【請求項１５】
コンピュータに、前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法による検査モデルを構築するステップをさらに実行させるものである、請求項１２に記載のプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿中代謝物マーカーを探索するための方法、システム及びプログラムに関する。具体的には、本発明は、特定の疾患又は状態、特にがんと関連した尿中代謝物マーカーを探索するための方法、システム及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のがんの検査法として、例えば患者由来の代謝物を使用したがんの検査方法（特許文献１）の報告があり、これは、血液中の代謝物の変動を解析することによって、がん検査を迅速かつ容易に行うというものである。具体的な工程は、(1)質量分析（MS）解析にて患者由来の代謝物のマススペクトルデータを取得する工程、(2)患者由来の代謝物、外科的切除後の患者由来の代謝物のマススペクトルデータを比較してマススペクトルの変動を検出する工程、(3)変動の検出より、患者由来の試料ががん患者由来の試料であるかを判定する工程、からなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2010-266386号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来法の特徴は、がんの検査法が1つのバイオマーカーによるものではなく、マルチマーカーによる検査を主体としたものであり、患者の病態をより詳しく反映しようとしている。マススペクトルデータの解析法では、得られたマススペクトルデータ中における特定のマススペクトルの消失、出現時間、保持時間、ピーク強度の上昇若しくは減少を解析することによってがんの判定を行う。この場合の解析モデルは、OPLS-DA等の多変量解析によって求めるとしている。
【０００５】
一般的に、液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS: Liquid Chromatograph/Mass Spectrometer）による尿中代謝物解析のワークフローでは、まず、複数の分析モードによるLC/MSにより尿中代謝物の網羅的解析を行い、その中から群間（例えば、健常者とがん患者）で有意差のある代謝物を抽出する。複数の分析モードは、液体クロマトグラフにおける逆相モードと親水性相互作用モード、質量分析計における正負イオン化モードを組み合わせとなる。
【０００６】
LC/MSにより得られるデータは、液体クロマトグラフにおける各代謝物の溶出時間、質量分析計における各代謝物のイオンの質量とイオン強度の3次元データである（図２の上段参照）。これらのデータを前処理後、2群間（例えば、健常者とがん患者）で有意な差がある代謝物を検定で確認しながら、多変量解析（主成分解析法（PCA: Principal Component Analysis）、部分最小二乗判別法(PLS判別法: PLS-DA: Partial Least Squares Discriminant Analysis)、OPLS判別分析法(OPLS-DA: Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis)、カーネル判別分析法など）を実施して、2群を識別するのに有効なバイオマーカー候補を抽出し、（がん）検査モデルを構築するというものである。このような方法により、これまで、農作物や食品の甘味成分や機能性成分の解析、あるいは血液を用いた大腸がん検査などに有用なバイオマーカーが見出されている。
【０００７】
しかしながら、例えば、尿中代謝物を用いたがん検査の場合、OPLS判別分析法を用いても、バイオマーカーの抽出に有効でない場合がある。一般に、OPLS判別分析法によるバイオマーカーの抽出では、Sプロットを用いる。Sプロットは、LC/MSによる網羅的解析により検出された代謝物について、横軸に群間におけるピーク強度差の絶対値（値が大きいほど群間で差が大きく、バイオマーカー候補となる）、縦軸に信頼性（繰り返し精度、群間の差と群内誤差の相関係数で、1に近いほど個体差がなく群間で差がある）としてプロットされた図で、バイオマーカー候補探索によく使用される。がんの解析の場合、尿中代謝物では、群間の強度差がそれほど大きくなく、群内誤差も大きい場合があり、加えて、バイオマーカー候補の代謝物が数千にものぼり構造も多岐にわたるので、Sプロットでバイオマーカー候補を絞り込むことは非常に難しい。
【０００８】
したがって、本発明は、尿中代謝物のバイオマーカーを探索するための改善方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を踏まえ、尿検体を用いたがん検査モデル構築におけるワークフローの変更を検討した。すなわち、OPLS判別分析法のSプロットにより重要なバイオマーカー候補を直接抽出するのではなく、以下の解析フローとする：
(a) LC/MSによる網羅的解析結果について、場合によりウィルコクソンの順位和検定により、健常者に対してがん患者で有意な差がある尿中代謝物に対して、p値による絞込みを行う。通常、このときの有意水準は5％とする。
(b) 上記の検定では重要なバイオマーカー候補の代謝物の絞込みは行うことができるものの定量的な評価が難しいため、絞り込んだ代謝物に対して、機械学習のひとつであるランダムフォレスト（RF：Random Forest）法を用いて、代謝物の重要度の評価を定量的に行う。重要度という数値が高いほど重要な代謝物となり、上位にランク付けされる。
(c) 抽出したバイオマーカー群を用いて、判別分析法（例えばOPLS/カーネル判別分析法）により健常者とがん患者を識別するための判別式を計算し、がん検査モデルを構築する。
(d) 場合によっては、バイオマーカー数を変えた複数のがん検査モデルを準備する。例えば、重要度の高い順から、バイオマーカーを2個、10個、30個とするがん検査モデルを構築する。
【００１０】
一態様において、本発明は、
（a）尿検体を液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）に供し、該尿検体中の尿中代謝物を解析するステップ、
（b）前記尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップ、
（c）前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップ、
（d）前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップ
を含む、尿中代謝物マーカーを探索する方法を提供する。
【００１１】
一態様において、本発明は、
（a）尿検体を液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）に供し、該尿検体中の尿中代謝物を解析するステップ、
（b）前記尿中代謝物の解析データに基づいて、場合により健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物をウィルコクソンの順位和検定により絞り込んだ上で、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップ、
（c）前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして、判別分析法による検査モデルを構築するステップ、
（d）場合により、前記判別分析結果に基づいて、バイオマーカー数の異なる複数の検査モデルを構築するステップ
を含む、尿中代謝物マーカーを探索する方法を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データが入力される計数部と、
前記尿中代謝物の解析データを用いて数値解析を行う算出部と、
前記解析の結果により尿中代謝物を選択する及び／又は尿中代謝物をマーカー候補として決定する判定部と、
前記判定部による判定結果を出力のために処理する出力処理部と
を備え、
前記算出部は、前記尿中代謝物の解析データを用いてランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価する、及び前記尿中代謝物の解析データを用いた判別分析法を行い、
前記判定部は、前記ランダムフォレスト法による評価の結果に基づいて重要度の高い尿中代謝物を選択し、前記判別分析法の結果に基づいて尿中代謝物をマーカー候補として決定する、尿中代謝物マーカーを探索するためのシステムを提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データが入力される計数部と、
前記尿中代謝物の解析データを用いて数値解析を行う算出部と、
前記解析の結果により尿中代謝物を選択する及び／又は尿中代謝物をマーカー候補として決定する判定部と、
前記判定部による判定結果を出力のために処理する出力処理部と
を備え、
前記算出部は、前記尿中代謝物の解析データを用いて、場合によりウィルコクソンの順位和検定によりバイオマーカー候補を絞り込んだ上で、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価する、及び前記尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法を行い、
前記判定部は、前記ランダムフォレスト法による評価の結果に基づいて重要度の高い尿中代謝物を選択し、前記判別分析法の結果に基づいて尿中代謝物をマーカー候補として決定し、場合により判別分析法により検査モデルを構築する、尿中代謝物マーカーを探索するためのシステムを提供する。
【００１４】
また別の態様において、本発明は、
コンピュータに、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップと、
前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップと、
前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップと
を実行させる、尿中代謝物マーカーを探索するためのプログラムを提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、
コンピュータに、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データに基づいて、場合により健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物をウィルコクソンの順位和検定により絞り込んだ上で、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップと、
前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法による検査モデルを構築するステップと、
場合により、前記判別分析結果に基づいて、バイオマーカー数の異なる複数の検査モデルを構築するステップと
を実行させる、尿中代謝物マーカーを探索するためのプログラムを提供する。
【００１６】
本発明に関連する更なる特徴は、本明細書の記述及び添付図面から明らかになるものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、尿中代謝物バイオマーカーの探索において、バイオマーカー候補の絞り込みを効果的に行うことができ、特定の疾患又は状態と有意に関連性のある尿中代謝物を迅速かつ確実に決定することができる。そのため、本発明は、疾患の検査モデル、特にがん検査モデルの構築に有用である。また本発明は、疾患又は状態の早期発見、治療薬の開発などの分野にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の解析フローの一例を示す。
【図２】図１に示した解析フローと得られる結果の表示例を示す。
【図３】本発明の解析システムの一例を示す。
【図４】本発明の解析フローを詳細に示す。構造未知代謝物に対する解析プロセスと併せて示している。
【図５】本発明の解析システムにおけるデータベース構造の一例を示す。
【図６】本発明の解析システムにおける総代謝物データベース構造の一例を示す。
【図７】ウィルコクソンの順位和検定テーブルの一例を示す。代謝物をp値の順に並べてある。
【図８】ランダムフォレスト法による重要度評価の一例を示すグラフである。
【図９】ランダムフォレスト法による重要代謝物の一例を示す。重要度が高い順に代謝物を並べてある。
【図１０】LC/MSにより検出された総代謝物数の表示例を示す。
【図１１】ウィルコクソンの順位和検定により絞り込まれた総代謝物数の表示例を示す。
【図１２】1個のバイオマーカーを用いた場合のOPLS判別分析結果の一例を示す。
【図１３】1個のバイオマーカーを用いた場合の判別結果の一例を示す。
【図１４】6個のバイオマーカーを用いた場合のOPLS判別分析結果の一例を示す。
【図１５】6個のバイオマーカーを用いた場合の判別結果の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、尿中代謝物のバイオマーカーを探索するための方法、システム及びプログラムを提供する。本発明の解析フローの一例を図１に示す。図１の解析フローで得られる結果の表示例を図２に示す。また、図４に、がん検査モデルのための詳細な解析フロー（上側）を、構造未知代謝物に対する解析プロセス（下側）と併せて示す。解析フローでは、液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の網羅的解析のあと、データ前処理を実施し、場合によりウィルコクソンの順位和検定によりバイオマーカー候補を絞り込んだ上で、ランダムフォレスト法により重要度を定量的に評価し、上位に位置するバイオマーカーを用いて、多変量解析のひとつである判別分析法（例えばOPLS判別分析法又はカーネル判別分析法）により、特定の疾患又は状態を識別するための予測式を計算し、検査モデルを構築する。そして特定の疾患又は状態に関連した尿中代謝物をバイオマーカー候補として決定する。このとき、バイオマーカー数の異なる複数の検査モデルを構築し、検査精度と価格の点から、どの検査モデルを使用するか選択できるようにすることも好ましい。
【００２０】
したがって、本開示の尿中代謝物マーカーを探索する方法は、
（a）尿検体を液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）に供し、該尿検体中の尿中代謝物を解析するステップ、
（b）前記尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップ、
（c）前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップ、
（d）前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップ
を含む。
【００２１】
より具体的な実施形態において、本開示の尿中代謝物マーカーを探索する方法は、
（a）尿検体を液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）に供し、該尿検体中の尿中代謝物を解析するステップ、
（b）前記尿中代謝物の解析データに基づいて、場合により健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物をウィルコクソンの順位和検定により絞り込んだ上で、ランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップ、
（c）前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして、判別分析法による検査モデルを構築するステップ、
（d）場合により、前記判別分析結果に基づいて、バイオマーカー数の異なる複数の検査モデルを構築するステップ
を含む。
【００２２】
まず、図１及び４に示されるように、尿検体を液体クロマトグラフ質量分析計に供し、網羅的に解析する。尿検体とは、対象から採取した尿、及び当該尿を処理して得られるサンプル（例えば、メタノールによる除蛋白したもの、あるいはトルエン、キシレン、塩酸などの保存料添加した尿）を意味する。尿検体が由来する対象は、特定の疾患又は状態を有する対象、健常対象、過去に特定の疾患又は状態を有していたが現在は健常である対象、特定の疾患又は状態となるリスクの高い（家族歴のある）対象などを含む。また対象となる種は、ヒト、及びその他の哺乳動物、例えば霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、ウサギなど）などであり、ヒトが好ましい。
【００２３】
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）の解析は、慣用的な液体クロマトグラフ質量分析装置を使用して行うことができる。分析モードは特に限定されるものではなく、液体クロマトグラフにおける逆相モード又は親水性相互作用モード、そして質量分析計における正負イオン化モードのいずれを使用してもよい。複数の分析モードで網羅的解析を行うことで、尿中代謝物を網羅的に検出することができる。
【００２４】
この解析から、尿中代謝物の解析データを取得する。解析データには、例えば、各尿中代謝物において測定された、マススペクトル（液体クロマトグラフにおける保持時間、質量、イオン強度、ピークの面積値など）、各尿検体が由来する対象の診療情報が含まれる。さらに、尿中代謝物に関する情報（構造未知と構造既知代謝物）、LC/MSによる測定条件（分析モード）に関する情報などが含まれてもよい。この解析データは、グラフ（例えば図２の上段）や表（例えば図６）などの形式で表示されてもよい。
【００２５】
得られた解析データは、後続のステップのために前処理することが好ましい。例えば、LC/MSにより測定されたイオン強度を考えた場合、まず欠損値を各物質データ内の最小値で代替し、測定日が複数に渡る場合は各代謝物の中央値を基準として測定日間差を修正する。その後凝固点降下法による浸透圧値を用いて尿濃縮による検体間差を標準化し、中央値を1.0として物質間のデータ分布差を規格化する、などである。また、尿検体は対象の身体状況によってその濃度が異なることが予想される。これを補正するため、尿中クレアチニンの定量による補正法、又は凝固点降下により測定された尿中溶質の濃度による補正法、例えばオスモラリティ計測を利用した補正法を適用し得る。上記補正により、正規化済みの解析データを取得し得る。
【００２６】
続いて、尿中代謝物について判別分析法を行う前に、尿中代謝物の絞込みを行う。すべての代謝物をランダムフォレスト法に供し、その重要度を定量的に評価するということも可能ではあるが、計算の負荷を軽減するために、ウィルコクソンの順位和検定を行って、代謝物を絞り込むことは有効である。この検定法は、得られた群間のデータに有意差があるかどうかについて検定する方法であるが、有意水準を5％（p < 0.05）とすることが多い。この検定結果は、尿中代謝物とそのp値を示す表（例えば図７）などの形式で表示されてもよい。これにより、特定の疾患又は状態と関連して有意に変化する尿中代謝物を選択して、尿中代謝物を絞り込んでから、次のステップであるランダムフォレスト法による評価に進むことができる。
【００２７】
ランダムフォレスト（Random Forest：RF）法は、機械学習法の一種で特徴量の重要度が計算できることが大きな特徴となっている。この評価データは、重要度の順に示したグラフ（例えば図８）や表（例えば図９）などの形式で表示されてもよい。重要度という数値が高い代謝物、すなわち解析結果で上位にある代謝物がバイオマーカーとなる可能性が大きい。
【００２８】
選択したバイオマーカーを用いて判別分析法により判別式を計算する。判別分析法として、例えばOPLS判別分析法、カーネル判別分析法などを利用することができる。OPLS判別分析法は、特定の疾患又は状態に応じて群間の差を識別する場合に有効で、各検体をひとつの点としてプロットしたスコアプロットでは、横軸で分離されていればグループ間で差があることを示し（縦軸ではグループ内の差を表す）、視覚的理解を大いに助ける（例えば図２の下に示すグラフ）。
【００２９】
本明細書では、OPLS判別分析法を中心に説明するが、これは線形なデータ解析を行う方法である。しかし、臨床例が多くなってデータが複雑になってくると、カーネル判別分析法のように、高次元の特徴空間に移してから線形解析を行う方法が有効な場合もあり、OPLS判別分析法に限定されるものではない。
【００３０】
特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別式を計算する場合、選択するバイオマーカー数により、その判別式は異なる。バイオマーカーは1個選択してもよいし、複数を組み合わせて選択してもよい。複数組み合わせることで、特定の疾患又は状態の識別力が高まり、結果として検査の精度が高まる。このようにして、特定の疾患又は状態についての検査モデルが構築される。ここまでの解析データ、分析結果、検査モデルなどは纏めて表形式で表示されてもよい（例えば図５）。
【００３１】
ここで、特定の疾患又は状態は、バイオマーカーを探索しようとする疾患又は状態、すなわち診断、判定、リスク判定などが望まれる疾患又は状態であれば特に限定されるものではない。好ましくは、疾患又は状態はがんである。がんとは、悪性腫瘍又は悪性新生物とも呼ばれる疾患を意味し、自律性増殖、浸潤と転移、及び悪液質を特徴としている。がんとしては、特に限定されるものではないが、固形がん（乳がん、大腸がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、腎臓がん、卵巣がん、食道がん、肝臓がん、胆道がん、膀胱がん、小児がんなど）、肉腫（骨肉腫、軟骨肉腫など）、血液のがん（白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫など）が挙げられる。がんには、原発性、転移性、再発性のものがあり、がんの種類によって悪性度が異なり、またその進行度と広がりの程度からステージに分類されている。この原発性、転移性又は再発性の違いや、悪性度・ステージの違いに応じて、またがんの種類に応じて、必要な処置（治療方法）も異なる。そのため、特定のがんの種類及び／又は状態に関連した尿中代謝物マーカーを探索できれば、尿中代謝物マーカーを利用して必要な処置を決定したり、早期診断を行うことが可能となる。特定の疾患又は状態としては、がんの有無、がんの種類、がんの進行度、がんの悪性度、がんのステージ、がんの予後、がんに対する治療効果、及び抗がん剤に対する感受性が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３２】
また、上述したような尿中代謝物マーカーを探索する方法は、適当なシステム又はプログラムを用いて簡便かつ効率的に実施することができる。本開示の尿中代謝物マーカーを探索するためのシステムは、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データが入力される計数部と、
前記尿中代謝物の解析データを用いて数値解析を行う算出部と、
前記解析の結果により尿中代謝物を選択する及び／又は尿中代謝物をマーカー候補として決定する判定部と、
前記判定部による判定結果を出力のために処理する出力処理部と
を備え、
前記算出部は、前記尿中代謝物の解析データを用いてランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価する、及び前記尿中代謝物の解析データを用いた判別分析法を行い、
前記判定部は、前記ランダムフォレスト（RF）法による評価の結果に基づいて重要度の高い尿中代謝物を選択し、前記判別分析法の結果に基づいて尿中代謝物をマーカー候補として決定するものである。
【００３３】
より具体的な実施形態において、本開示の尿中代謝物マーカーを探索するためのシステムは、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データが入力される計数部と、
前記尿中代謝物の解析データを用いて数値解析を行う算出部と、
前記解析の結果により尿中代謝物を選択する及び／又は尿中代謝物をマーカー候補として決定する判定部と、
前記判定部による判定結果を出力のために処理する出力処理部と
を備え、
前記算出部は、前記尿中代謝物の解析データを用いて、場合によりウィルコクソンの順位和検定によりバイオマーカー候補を絞り込んだ上で、ランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価する、及び前記尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法を行い、
前記判定部は、前記ランダムフォレスト（RF）法による評価の結果に基づいて重要度の高い尿中代謝物を選択し、前記判別分析法の結果に基づいて尿中代謝物をマーカー候補として決定し、場合により判別分析法により検査モデルを構築するものである。
【００３４】
本開示のシステムにおいて、
前記算出部は、前記尿中代謝物の解析データを用いてウィルコクソンの順位和検定を行い、
前記判定部は、前記ウィルコクソンの順位和検定の結果に基づいて、健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物を絞り込むものであってもよい。
【００３５】
また本開示のシステムにおいて、
前記算出部は、前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法を行い、
前記判定部は、前記判別分析法による検査モデルを構築するものであってもよい。
【００３６】
本開示のシステムは、好ましくは、上述したような方法を実施することができるように、メモリにおいて上記の計数部、算出部、判定部及び出力処理部が互いに動作可能なように連結された又は通信接続されたシステムである。本開示のシステムは、通信装置、入力装置、出力装置、及び／又は記憶装置と連結又は通信接続されていてもよい。具体的な解析システムの構成例を図３に示す。
【００３７】
計数部には、液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データが入力される。解析データは、連結された入力装置を介して入力されてもよいし、通信装置を介して入力されてもよい。あるいは、液体クロマトグラフ質量分析計に連結されて、そこから解析データが入力されてもよい。入力される解析データは、液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）により測定された尿中代謝物のマススペクトル（液体クロマトグラフにおける保持時間、質量、イオン強度、ピークの面積値など）、各尿検体が由来する対象の診療情報を含む。解析データはさらに尿中代謝物に関する情報（構造未知と構造既知代謝物）、LC/MSによる測定条件（分析モード）などを含んでもよい。この解析データは、出力装置を介してグラフ（例えば図２の上段）や表（例えば図６）などの形式で表示されてもよい。またこの解析データは、記憶装置に総代謝物テーブルとして格納されてもよい（図３）。
【００３８】
算出部は、計数部に入力された又は記憶装置から読み出された解析データを処理する。具体的には、尿中代謝物の解析データを用いて、場合によりウィルコクソンの順位和検定によりバイオマーカー候補を絞り込んだ上で、ランダムフォレスト（RF）法により重要度を定量的に評価する及び／又は判別分析法を行う。また、ランダムフォレスト法により重要度を定量的に評価し抽出したバイオマーカーにより特定の疾患又は状態を識別するために、判別分析法により、バイオマーカー数の異なる判別式を複数計算する。これらの結果は、出力装置を介してグラフや表などの形式で表示されてもよい。またこれらの結果は、記憶装置にそれぞれランダムフォレスト（RF）テーブル、判別分析結果（テーブル）、及び検定テーブルとして格納されてもよい（図３）。
【００３９】
判定部は、算出部で行われた解析の結果に基づいて、尿中代謝物を選択する及び／又は尿中代謝物をマーカー候補として決定する。算出部においてウィルコクソンの順位和検定を行う場合には、判定部は、ウィルコクソンの順位和検定の結果に基づいて尿中代謝物を絞り込むものであってもよい。さらに判定部は、未知試料に対して、前記判別式により計算された予測値が設定された閾値より高いか低いかによって、特定の疾患又は状態について（例えば、特定の疾患又は状態の有無について）判定することが可能である。
【００４０】
出力処理部は、判定部による判定結果を出力のために処理する。例えば、選択した尿中代謝物、及び／又はマーカー候補として決定した尿中代謝物、及び／又は構築した検査モデルを、ディスプレイなどの出力装置に視覚的表示するために処理される。具体的には、表やグラフの形式に処理される（例えば、図８、９、１２及び１４）。あるいは、スピーカーなどの出力装置に音声出力するために処理されてもよい。
【００４１】
記憶装置には、総代謝物テーブル（各解析にて検出された代謝物一覧）、検定テーブル（ウィルコクソンの順位和検定による検定結果で、p値によりランク付けされている）、RFテーブル（重要度の高い順に並べた代謝物テーブル）、判別分析結果（スコアプロット）、及び検査モデル（判別分析法により求められた判別式）のうち1以上が格納される。どのような検査を行うか、すなわちどの疾患又は状態について判定する検査を行うかで、どの検査モデルを用いるかが決まる。なお、スコアプロットは、2グループ間を横軸で最大限に分離するもので、横軸で分離されていれば2グループ間に差があることを示し、一方縦軸はグループ内の差となる（例えば図２の下に示したグラフ）。
【００４２】
さらに本開示の尿中代謝物マーカーを探索するためのプログラムは、
コンピュータに、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップと、
前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップと、
前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップと
を実行させる。
【００４３】
具体的な実施形態において、本開示の尿中代謝物マーカーを探索するためのプログラムは、
コンピュータに、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データに基づいて、場合により健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物をウィルコクソンの順位和検定により絞り込んだ上で、ランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップと、
前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法による検査モデルを構築するステップと、
場合により、前記判別分析結果に基づいて、バイオマーカー数の異なる複数の検査モデルを構築するステップと
を実行させる。
【００４４】
本開示のプログラムにおいて、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップは、前記尿中代謝物の解析データを用いて、健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物をウィルコクソンの順位和検定により絞り込んだ上で、ランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するものであってもよい。
【００４５】
本開示のプログラムは、コンピュータに、前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法による検査モデルを構築するステップをさらに実行させるものであってもよい。
【００４６】
本開示のプログラムは、コンピュータにおいて読み出されて実行されると、尿中代謝物マーカーを探索する方法を実施することができ、また尿中代謝物マーカーを探索するためのシステムを動作させることができる。
【００４７】
プログラムは、例えば磁気記録媒体（ハードディスクドライブ）、CD-ROM、CD-R、RAMなどのコンピュータ可読媒体に格納されてコンピュータに供給することができ、あるいは有線又は無線通信を介してコンピュータに供給することができる。
【００４８】
以下に実施例を例示し、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のために提供するものであり、本発明の範囲を限定したり制限したりするものではない。
【００４９】
[実施例１]
本発明の尿中代謝物の探索方法を適用した具体的な計算例を示す（図６〜１５）。
これは、コーカソイドの健常者（15例）及び乳がん患者（15例）由来の尿検体を用いた結果である。まず、LC/MSにより尿中代謝物の網羅的解析を行う。例えば、LC/MSにより尿中代謝物を解析すると、図１０に示すような結果が得られる。すなわち、脂肪酸、リン脂質、糖、アミノ酸、ペプチド、アミン、有機酸、核酸など、構造既知、構造未知を含めて1325種の代謝物が検出される。ここで、構造未知代謝物というのは、公共データベースを用いたマススペクトル検索でヒットしなかった代謝物である。解析結果は、総代謝物データベース構造例（図６）に示すように表示することができる。
【００５０】
これらすべての代謝物をランダムフォレスト法に供し、その重要度を定量的に評価するということも可能ではあるが、ランダムフォレスト法における計算の負荷を軽減するために、ウィルコクソンの順位和検定を行って、代謝物を絞り込むことは有効である。この検定法は、得られた群間のデータ（この解析では、健常者と乳がん患者に対応）に有意差があるかどうかについて検定する方法であるが、有意水準を5％とする場合、374種に絞り込むことができる（図１１）。通常、この検定結果は、図７に示すような尿中代謝物とp値の表で提示される。
【００５１】
しかし、まだ数が多く、しかも検定だけでは個々の代謝物の重要性が定量的に評価できないので、ランダムフォレスト法による重要度の評価を実施する。ランダムフォレスト法は、機械学習法の一種で特徴量の重要度が計算できることが大きな特徴となっている。ランダムフォレスト法による解析結果を図８に示す。図８の横軸は重要度であるが、縦軸は個々の代謝物に相当し、その対応表を図９に示す。図９の中でXとあるのは構造未知代謝物を示している。図９で示す代謝物がバイオマーカー候補であるが、外因性物質（例えば薬）の代謝物はバイオマーカー候補から排除することが望ましい。例えば、マススペクトルから判断して、上位3種はグルクロナイドという抱合体であることがわかるので、最有力バイオマーカーはXCとなる。
【００５２】
次に、バイオマーカーを用いてOPLS判別分析法により判別式を算出する。OPLS判別分析法は、特定の疾患又は状態に応じて群間の差を識別する場合に有効な方法である。以上の考察をもとに、XCをバイオマーカーとして、OPLS判別分析法による1次元のスコアプロットを行うと、図１２に示すようになる。グラフの左15例が健常者で、右15例が乳がん患者である。スコアにおける健常者と乳がん患者を識別するための閾値を0.65とした場合の判別結果を図１３に示す。健常者15例を健常者と推定できるのが14例でこのときの誤り率が6.7％であるのに対し、乳がん患者15例を乳がんと推定できるのが15例で誤り率は0％である。これは、図１に示す解析フローにより、有力なバイオマーカーが抽出できていることを示している。
【００５３】
加えて、例えば、ランダムフォレスト法における結果で上位4位、5位、8位、9位及び11位の代謝物（XC、XD、XH、XE、XI、XG）を用いて同様な解析を行ってみると、図１４に示すような結果となる。スコアにおける健常者と乳がん患者を識別するための閾値を0.5とすると、健常者15例を健常者と推定できるのが15例、乳がん患者15例を乳がんと推定できるのが15例で、ともに誤り率は0％と解析精度は上がる。尿中代謝物によるがん検査は、最終的にマルチバイオマーカーにすることができることが大きな特徴でありメリットでもある。このマルチバイオマーカーも図１に示す解析フローにより簡単に抽出できる。
【００５４】
最終的に、シングルバイオマーカーにするか、マルチバイオマーカーにするかは、検査側が解析コストと解析精度の双方のデータを提示して、被験者側が選択することになる。
【００５５】
このがん検査モデルを使用して、未知の尿検体について網羅的解析を行い、学習データで求めた判別式（バイオマーカーに相当するイオンの強度にある係数をかけた数値の和（定数を含む））の数値を判定することによって、その未知の尿検体が健常者由来かがん患者由来かについて判別することになる。あるいは、特にがん患者と健常者で有意差のある尿中代謝物をバイオマーカーとして用いて、尿中代謝物のLC/MS解析データから、尿検体が健常者由来かがん患者由来かについて判別することも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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