(57)【要約】      （修正有）【課題】クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及びＢに対する免疫反応を誘導するための、免疫原性組成物又はワクチン組成物の提供。【解決手段】a)特定のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド、又はb)該特定のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する単離ポリペプチドであって、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及びＢに対する免疫反応を誘導することができる、前記単離ポリペプチドを含む、免疫原性組成物又はワクチン組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド、又は
b)配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する単
離ポリペプチドであって、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及びＢに対する免疫反
応を誘導することができる、前記単離ポリペプチド
を含む、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及びＢに対する免疫反応を誘導するため
の、免疫原性組成物又はワクチン組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、致死用量の１０２、１０３および１０４のクロストリジウム・デ
ィフィシル芽胞の胃内投与後における、前記単離ポリペプチドをワクチン接種されたハム
スターの１００％生存率をもたらす、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＡのＣ末端ドメインから
得られる１９反復単位を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＢのＣ末端ドメインから
得られる２３反復単位を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号４に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する、請
求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
アジュバントをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記アジュバントがａｌｕｍを含む、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）の予防および治療における使用のための、請求
項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防における使用のための、請求項
８記載の組成物。
【請求項１０】
ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の
対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投
与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ
）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けてい
る、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）長期介護を受けている、もしくは受ける予
定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とす
る共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である、請求項９記載
の組成物。
【請求項１１】
Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）の予防および治療における使用のための単離ポ
リペプチドであって、
a)該単離ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するか、又は
b)該単離ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％
の配列同一性を有し、かつ、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％
の配列同一性を有する該ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及びＢ
に対する免疫反応を誘導することができる、
前記単離ポリペプチド。
【請求項１２】
ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防における使用のための、請求項
１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の
対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投
与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ
）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けてい
る、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）長期介護を受けている、もしくは受ける予
定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とす
る共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である、請求項１２記
載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの受容体結合ドメイン
を含有する単離ポリペプチド、ならびにそのワクチンとしての使用に関する。この単離ポ
リペプチドは、両毒素に対する抗毒素免疫を提供する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・ディフィシルは、院内感染抗生物質関連下痢の主要な原因であり、
病院、養護施設および他の介護施設における大きな健康問題となっている。病院に対する
費用は、欧州において２０億ドル、米国において３２億ドルと見積もられている。
【０００３】
原因物質は、環境全体に一般的に見られるが、健常成人人口の２〜３％の腸管にも存在
する、グラム陽性芽胞形成性嫌気性細菌である。Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）
は、通常は抗生物質投与の結果である正常な結腸細菌叢の破壊により誘導される。環境中
のＣ．ディフィシル芽胞への暴露後、生物は腸粘膜においてコロニー形成する可能性があ
り、そこで疾患原因毒素の産生がＣＤＡＤをもたらし得る。疾患は、軽度の合併症を伴わ
ない下痢から、重度の偽膜性大腸炎および中毒性巨大結腸症まで様々となり得る。
【０００４】
ＣＤＡＤは、医療環境においてますます問題となってきている。最近の研究では、抗生
物質を与えられた入院患者の３１％においてＣ．ディフィシルがコロニー形成し、コロニ
ー形成したそれらの患者の５６％が、続いてＣＤＡＤを発症することが報告されている。
概して、Ｃ．ディフィシルは、全ての抗生物質関連下痢の１０〜２５％、抗生物質関連大
腸炎の５０〜７５％、および抗生物質関連偽膜性大腸炎の９０〜１００％の原因である。
ＣＤＡＤの治療には、原因抗生物質の停止と、それに続くメトロニダゾールまたはバンコ
マイシンによる処置が伴う。抗生物質治療が停止された後の再発は、患者の約２０％に生
じ、これは多くの場合Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によるコロニー再形
成の結果である。
【０００５】
２００３年、カナダのケベック州におけるＣ．ディフィシルの発生は、Ｎｏｒｔｈ  Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  １／０２７（ＮＡＰ１）として知られるＣ．ディ
フィシルのより毒性の強い株の出現を示した。ＮＡＰ１は、以前の株と比較して、より高
い毒性、より低い転帰、ならびにより高い疾病率および死亡率に関連している。この株の
出現は、ＣＤＡＤの発生の阻止の試みにおいてすでに生じている問題を増大させる。
【０００６】
再発性疾患の予防のためのフィダキソマイシン（Ｄｉｆｉｃｉｄ（登録商標））は、狭
域大環状抗生物質の新たなクラスにおいて最初の物質である（Ｒｅｖｉｌｌ，Ｐ．；Ｓｅ
ｒｒａｄｅｌｌ，Ｎ．；Ｂｏｌｏｓ，Ｊ．（２００６）．”Ｔｉａｃｕｍｉｃｉｎ  Ｂ：
ｍａｃｒｏｌｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃ．ｄｉｆｆ
ｉｃｉｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉａｒｒｈｅａ”．Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  
Ｆｕｔｕｒｅ  ３１  （６）：４９４-４９７）．これは、放線菌ダクチロスポランギウ
ムアウランチアクム（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）
亜種ハムデネシス（ｈａｍｄｅｎｅｓｉｓ）から得られる発酵産物である。フィダキソマ
イシンは、非全身性、つまり血流への吸収が極僅かであり、殺菌性であり、また、病原性
クロストリジウム・ディフィシルの選択的根絶を示し、正常な健康腸細菌叢を構成する複
数種の細菌に対する破壊が極僅かである。結腸における正常な生理学的状態の維持は、ク
ロストリジウム・ディフィシル感染症再発の可能性を低減し得る（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓｔ
ｕａｒｔ（２００９−０６）．”Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆ
ｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ
ｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ”．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎ
ｆｅｃｔｉｏｎ  ５８（６）：４０３−４１０）。この新たなクラスの抗生物質の導入は
ＣＤＡＤの治療を改善することが考えられるが、特に高齢者および免疫力のない患者等の
高リスク患者においては、まだ予防薬の医学的必要性が存在する。
【０００７】
ＣＤＡＤは、Ｃ．ディフィシルにより産生される２つの外毒素、毒素Ａおよび毒素Ｂ（
それぞれＣＴＡおよびＣＴＢとも呼ばれる）の作用の結果である。それらの毒素は共に、
複数の官能性ドメインを有する高分子量（〜３００ｋＤａ）の分泌タンパク質である（Ｖ
ｏｔｈ  ＤＥ  ａｎｄ  Ｂａｌｌａｒｄ  ＪＤ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １８：２４７−２６３（２００５））。両毒素のＮ末端ドメイ
ンは、Ｒｈｏ様ＧＴＰａｓｅを修飾するＡＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を含
有する。この修飾は、アクチン重合の損失および細胞骨格の変化を引き起こし、結腸上皮
密着結合の破壊をもたらす。これは、結腸への過度の流体滲出、および結果として下痢を
もたらす。中央ドメインは、疎水性ドメインを含有し、膜輸送に関与すると推測される。
両毒素のＣ末端ドメインは、標的細胞への毒素結合に関与する反復単位（ＲＵ）と呼ばれ
る複数の相同領域を含有する（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  １０２：１８３７３−１８
３７８（２００５））。反復単位は、短鎖（２１〜３０アミノ酸）または長鎖（〜５０ア
ミノ酸）として分類される。反復単位は、組み合わさってクラスタを形成し、それぞれ、
通常１つの長鎖および３〜５個の短鎖反復単位を含有する。全長毒素Ａは、８個のクラス
タに組織化される３９個の反復単位（ＡＲＵ）を有し（Ｄｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅ
ｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８（１９９０）、一方全長毒素Ｂは、５個のク
ラスタに組織化される２４個の反復単位（ＢＲＵ）を含有する（Ｂａｒｒｏｓｏ  ｅｔ  
ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４００４（１９９０）；  Ｅｉｃｈ
ｅｌ−Ｓｔｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ９６：１０７−１１３    （１９９２
））。
【０００８】
動物モデルおよび臨床の両方からのいくつかの研究では、Ｃ．ディフィシル関連疾患か
らの保護における抗毒素抗体の役割が示されている。ホルマリン不活性化毒素Ａおよび毒
素Ｂで免疫化されたハムスターは、高レベルの抗毒素抗体を生成し、Ｃ．ディフィシル細
菌の致死的負荷から保護された（Ｇｉａｎｎａｓｃａ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｗａｒｎｙ  Ｍ，
Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：８４８−８５６（２００４））。さらに、マウス抗毒素抗体の受
動伝達は、用量依存的にハムスターを保護した。Ｋｙｎｅ  Ｌら（Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ
３５７：１８９−１９３  （２００１））は、ＣＤＡＤの初期発現時の抗毒素Ａ抗体反
応の発達が、疾患再発に対する保護と相関することを報告した。
【０００９】
保護的抗毒素抗体により認識される決定基は、受容体結合ドメインとして機能する反復
単位を含有するＣ末端ドメインに局在している。最初に、Ｌｙｅｒｌｙら（Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１  ：２９−３２  （１９９０））は、３３個の反復
単位を含有する毒素ＡのＣ末端ドメインが、中和抗毒素抗体の産生を誘導することができ
、Ｃ．ディフィシル感染から保護し得ることを明らかにした。この研究において、ハムス
ターには、細菌による負荷の前に精製組み換えポリペプチドが複数回皮下投与されたが、
部分的な保護しか達成されなかった。別の研究（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．６５：２９４１  −４９（１９９７））では、ＣＴＡのＣ末端からの７２０
アミノ酸残基を含有する単離ポリペプチド、および大腸菌溶血素Ａ（コレラ菌において発
現）の分泌シグナルが、ウサギＣＤＡＤモデルにおいて、少用量のＣＴＡに対して保護的
な全身性および粘膜免疫を誘導することが示された。
【００１０】
また、両毒素ＡおよびＢのＣ末端ドメインに対する抗体反応は、完全保護を達成するた
めに必要であることが報告された（Ｋｉｎｋ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｉｎｆｅｃｔ
．Ｉｍｍｕｎ．６６：２０１８−２５  （１９９８），Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７３
６，１３９（１９９８））。この研究は、各毒素のＣ末端ドメインが、毒素中和抗体の産
生において最も効果的であることを明らかにした。これは、ハムスター致死モデルにおい
てＣＴＡおよびＣＴＢのＣ末端ドメインに対して惹起された、経口送達トリ抗体（抗毒素
）の有効性を実証した。結果はまた、抗毒素が、人間におけるＣＤＡＤの治療および管理
において効果的となり得ることを示している。別の研究において、ヒト抗毒素ＡおよびＢ
モノクローナル抗体が、ハムスターにおけるＣ．ディフィシル誘導死に対する保護を付与
すると報告された（Ｂａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：
６３３９−６３４７（２００６））。いずれかの毒素の受容体結合ドメインに対する抗体
によってのみ保護が観察され、また両抗毒素ＡおよびＢ抗体による処置後に、向上した保
護が観察された。
【００１１】
一方、Ｗａｒｄら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５１２４−３２（１９９９））
は、アジュバント活性の研究のために、Ｃ．ディフィシル毒素Ａからの１４反復単位（１
４ＣＴＡ）を考慮した。反復単位は、Ｎ末端ポリヒスチジンタグでクローン化および発現
され（１４ＣＴＡ−ＨＩＳ）、または、破傷風毒素からの非毒性結合ドメインに融合され
た（１４ＣＴＡ−ＴＥＴＣ）。鼻腔内投与された両方の融合タンパク質は、マウスにおい
て抗毒素Ａ血清抗体を産生したが、粘膜表面における反応を示さなかった。大腸菌易熱性
毒素（ＬＴ）またはその突然変異型ＬＴＲ７２との併用投与後に、向上した全身性および
粘膜抗毒素Ａ反応が観察された。データに基づき、Ｗａｒｄらは、クロストリジウム病原
体に対するヒトワクチンにおける粘膜アジュバントとしての、非毒性１４ＣＴＡ−ＴＥＴ
Ｃ融合の使用を示唆した。
【００１２】
Ｃ．ディフィシル毒素の反復単位ドメインに対する最近の生化学的研究は、安定な三元
構造を形成するための最小配列要件に注目している（Ｄｅｍａｒｅｓｔ  Ｓ  Ｊ  ｅｔ  
ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３４６：１１９７−１２０６（２００５））。毒素Ａから
得られる１１反復単位ペプチドは、正しい三元構造を有するが、毒素ＡおよびＢからの６
および７反復単位はそれを有さないことが判明した。正しく折り畳まれた１１反復単位セ
グメントは、受容体結合特性を維持することが判明した。第２の研究は、６、１１または
１５反復単位を含有する毒素Ａ断片の機能的特性を検査した（Ｄｉｎｇｌｅ  Ｔ，Ｇｌｙ
ｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １８：６９８−７０６（２００８））。１１および１５反復単位の
みが、抗毒素Ａ抗体の毒素中和能力を競合的に阻害することができた。３つ全ての断片が
、赤血球凝集活性を有することが判明したが、より長い断片は、より短いものよりも高い
赤血球凝集活性を示した。データは、毒素受容体結合ドメイン構造および免疫原性が、１
１〜１４を超える反復を含有するドメイン断片において保持されることを示している。
【００１３】
また、Ｔｈｏｍａｓら（ＷＯ９７／０２８３６、米国特許第５，９１９，４６３号（１
９９９））は、粘膜アジュバントとしてのＣ．ディフィシル毒素Ａ、毒素Ｂおよびそのあ
る特定の断片（例えば、反復単位の一部または全てを含有するＣ末端ドメイン）を開示し
た。彼らは、ＣＴＡまたはＣＴＢの鼻腔内投与が、複数のマウス区画において、ヘリコバ
クター・ピロリウレアーゼ、オボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）等の異種抗原への粘膜免疫反応を大幅に向上させ、ヘリコバクターによる負荷
に対する保護に関連することを示した。さらに、毒素Ａ融合タンパク質のアジュバント活
性が評価され、ＡＲＵ（毒素Ａ反復単位）を含むＣＴＡの７９４Ｃ末端アミノ酸残基が、
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合し、結果的なポリペプチドＧＳ
Ｔ−ＡＲＵが大腸菌において発現した。この研究は、血清および粘膜分泌物における併用
投与された抗原に対するＧＳＴ−ＡＲＵによる免疫反応の著しい向上を実証した。
【００１４】
これらの研究は全て、Ｃ．ディフィシル毒素Ａもしくは毒素Ｂ、またはそれらの断片、
またはそれらの組み合わせを含む非毒性組み換えタンパク質の、ＣＤＡＤに対する活性ワ
クチンの生成のための潜在的な使用を示唆している。現在、Ｃ．ディフィシルに対するワ
クチンは市販されていないが、ホルマリン解毒全毒素ＡおよびＢからなる候補ワクチンが
、人間におけるフェーズＩおよびＩＩａ試験において評価されている。このワクチンによ
る非経口免疫化は、抗毒素ＩｇＧおよび毒素中和抗体反応を誘導することが報告されてい
る（Ｋｏｔｌｏｆｆ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：９８８−
９９５（２００１）；Ａｂｏｕｄｏｌａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ
．７１：１６０８−１６１０（２００３））。
【００１５】
文献は、さらに、Ｃ．ディフィシルの毒素ＡおよびＢ受容体結合ドメインの両方を含有
する組み換え融合タンパク質の構築が、全体またはその断片において、ワクチン開発のた
めの効率的および商業的に実行可能な手法であることを示している。そのような手法は、
Ｖａｒｆｏｌｏｍｅｅｖａらにより、毒素Ａの７００塩基対断片および毒素Ｂの１３００
塩基対断片の２つの部分からなる融合タンパク質として試みられている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ，Ｍｉｃｒｏｂ．ａｎｄ  Ｖｉｒｏｌ．３：６−１０（２００３））。この手
法はまた、ＢｅｌｙｉおよびＶａｒｆｏｌｏｍｅｅｖａ（ＦＥＭＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２
２５：３２５−９（２００３））により説明されており、３つの部分：Ｃ．ディフィシル
毒素Ａおよび毒素Ｂの反復単位で構成される２つのＣ末端ドメインに続く、ウェルシュ菌
エンテロトキシンＣｐｅの断片からなる組み換え融合タンパク質の構築を示している。融
合タンパク質は、大腸菌において発現されたが、生成物は封入体内に蓄積し、安定ではな
かった。さらに、この研究において達成された純粋な生成物の収量（培地１００ｍｌ当た
り５０μｇ）は、著しく低いものであった。
【００１６】
Ｗｉｌｋｉｎｓら（ＷＯ００／６１７６２、米国特許第６，７３３，７６０号（２０
０４））もまた、組み換えＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＢ反復単位（組み換えＡＲＵお
よび組み換えＢＲＵ）、ならびにＣＤＡＤに対するワクチンの調製のための多糖類複合体
の使用を説明している。得られる組み換えＡＲＵタンパク質は、８６７個のアミノ酸残基
を含み、一方組み換えＢＲＵタンパク質は、６２２個のアミノ酸の長さを含有している。
前に言及した研究とは異なり、この研究は、大腸菌における組み換えＡＲＵおよびＢＲＵ
可溶性タンパク質の高レベルの発現を実証した。組み換えＡＲＵおよび多糖類複合化組み
換えＡＲＵをワクチン接種されたマウスは、共に高レベルの中和抗毒素Ａ抗体を有し、ま
たＣ．ディフィシル毒素Ａによる致死的負荷から極めて保護された。さらに、Ｗｉｌｋｉ
ｎｓらは、ワクチン調製のための、ＡＲＵおよびＢＲＵの両方からなる組み換え融合タン
パク質の使用を示唆した。
【００１７】
ＣＤＡＤに対するワクチンの開発に関心が集まっている。ＡＲＵおよびＢＲＵからなる
組み換え融合タンパク質が、ワクチンとして潜在的に有用となり得る。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、Ｃ．ディフィシルからの毒素Ａおよび毒素Ｂの設計、生成および使用のため
の新たなツールおよび方法を提供する。本発明は、配列番号２（Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５）また
はその誘導体、配列番号４（Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１）を含む単離ポリペプチドＣ−ＴＡＢ
を提供する。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１は、毒素ＢのＣ末端ドメイン
の２３反復単位に融合した、毒素ＡのＣ末端ドメインの１９反復単位を含む。本発明はま
た、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む組成物および
製剤を含む。組成物または製剤は、単離ポリペプチド、追加の抗原、アジュバント、およ
び／または賦形剤を含有してもよい。代替として、組成物または製剤は、本質的に、アジ
ュバントまたは他の活性成分を含まない単離ポリペプチドからなってもよい（但し、担体
、緩衝剤および／または安定剤等の賦形剤を随意に含む）。さらに、本発明の組成物また
は製剤は、特に、例えば再発性ＣＤＡＤを有する対象、または頻繁および／もしくは長期
の抗生物質の使用を必要とする対象において、抗生物質等の他の薬物と併用して投与され
てもよい。
【００１９】
本発明はまた、本発明の単離ポリペプチドを含むワクチンを提供する。ワクチンは、さ
らに、アジュバント、例えば例えばａｌｕｍ、ＡＤＰ−リボシル化外毒素から得られるア
ジュバント、またはその他を含んでもよい。ワクチンは、単一投薬計画、２回投薬計画（
例えば最初の投薬から３日から２０日以内、例えば１０日から１５日後に投与される）、
３回投薬計画（例えば最初の投薬から約７日後および約２１日後に投与される）、または
４回以上の投薬計画、好ましくは２回または３回投薬計画で投与されてもよく、用量は、
２０μｇから２００μｇの量の本発明のポリペプチドを含む。
【００２０】
本発明は、それを必要とする対象に、本発明の単離ポリペプチドを投与することにより
、ＣＤＡＤ等の疾患の１つ以上の症状を予防、治療、または軽減する方法を提供する。Ｃ
−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、筋肉内または他の送達
経路により対象に投与され得る。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、例えば以下のプロファイルを有する対象等のＣＤＡＤ
のリスクを有する対象に、本発明の単離ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを含む組成
物を投与することにより、ＣＤＡＤ等の疾患を予防する方法を提供する：ｉ）より弱い免
疫系を有する対象、例えば高齢対象（例えば６５歳を超える対象）もしくは２歳未満の対
象等；ｉｉ）免疫力のない対象、例えばＡＩＤＳを有する対象等；ｉｉｉ）免疫抑制薬を
投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、も
しくは入院している対象；ｖ）集中治療（ＩＣＵ）を受けている、もしくは受ける予定が
ある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）養
護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、
および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；ｉｘ）上述
のプロファイルの２つ以上を有する対象である対象、例えば消化管手術を受ける予定があ
る高齢対象等；ｘ）炎症性大腸炎を有する対象；ならびに／またはｘｉ）再発性ＣＤＡＤ
を有する対象、例えばＣＤＡＤの１つ以上のエピソードを経験している対象等。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポ
リペプチドを生成する方法を提供する。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単
離ポリペプチドは、大腸菌発現系等の細菌発現系を使用して、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ
−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸から生成され得る。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポ
リペプチドを提供し、毒素Ａの１９反復単位が、少なくとも４、５、６、７、８、９、ま
たは１０個のアミノ酸残基からなるリンカーを介して、毒素Ｂの２３反復単位に接続して
いる。例として、本発明のリンカーは、配列ＲＳＭＨ（Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ
）（配列番号２または配列番号４のアミノ酸４３９〜４４２）を含んでもよい。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、例えばＡＲＵおよび／またはＢＲＵにおいて少なく
とも１つの突然変異（例えば、挿入、置換または欠失）を含む、単離ポリペプチドの変異
体を提供する。変異体の配列は、配列番号２に対する８５％、８６％、８７％、８８％、
８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
または９９％同一性を有してもよい。
【００２５】
本発明はまた、組み換えＤＮＡ操作、細菌発酵およびタンパク質精製により、Ｃ−ＴＡ
Ｂ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドまたはその変異体を生成するため
の方法を提供する。一実施形態において、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ
．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸を構築するための方法を提供する。別の実
施形態において、本発明は、大腸菌発現系等の細菌発現系を使用して、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５
またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを生成する方法を提供する。
【００２６】
本発明は、さらに、それを必要とする人間等の対象におけるＣＤＡＤを予防および治療
するための方法を提供する。この方法において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ
５．１は、対象に単独で投与されるか、またはａｌｕｍもしくはその他等の１種以上のア
ジュバントと併用投与される。対象は、Ｃ．ディフィシルへの暴露のリスクがある健常個
人、Ｃ．ディフィシル感染症の治療を受けた、もしくはそれから回復したが、Ｃ．ディフ
ィシルによる再感染のリスクがある人間対象、または、現在Ｃ．ディフィシルに感染して
おり、その状態がＣ．ディフィシル毒素中和抗体の誘導により改善され得る人間対象であ
ってもよい。
【００２７】
本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を含む免疫原性組成物を提供
する。免疫原性組成物は、さらに、抗原特異的免疫応答を向上させるアジュバントおよび
／または薬学的に許容される担体および／またはそれを必要とする対象への適用に好適な
製剤中の他の構成成分を含んでもよい。免疫原性組成物は、筋肉内（ＩＭ）送達、皮内（
ＩＤ）送達、皮下（ＳＣ）送達、腹腔内（ＩＰ）送達、経口送達、経鼻送達、口腔送達、
または直腸送達により送達され得る。
【００２８】
本発明の別の実施形態において、免疫原性組成物は、天然Ｃ．ディフィシル毒素に結合
してその細胞毒性活性を中和する抗体を生じさせ、そのようにしてＣ．ディフィシル関連
疾患（ＣＤＡＤ）に対する長期活性保護、および／または治療を提供する。
【００２９】
したがって、本発明は、それを必要とする対象におけるＣ．ディフィシル関連疾患の予
防または治療に有用な免疫原性組成物を提供する。
【００３０】
別の実施形態において、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１をコ
ードする核酸およびその断片または変異体を提供する。本発明はまた、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５
またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１に特異的な、
中和、ヒト化、モノクローナル、キメラおよびポリクローナル抗体等の抗体およびその断
片を提供する。抗体またはその断片は、毒素Ａおよび／または毒素Ｂを認識することがで
きる。
【００３２】
別の実施形態は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
含むワクチンを提供する。
【００３３】
本発明の別の実施形態は、本発明の核酸、ポリペプチドおよび／または抗体を含む診断
キットを提供する。
【００３４】
本発明の他の実施形態および利点は、以下の説明において部分的に記載され、また一部
は本説明から明らかとなり得るか、または本発明の実践から学習され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５単離ポリペプチド（配列番号１）をコードする核酸を示す図である。
【図１Ｂ】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５単離ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列を示す図である。毒素Ａと毒素Ｂとの間のアミノ酸リンカーに下線が引かれている。
【００３６】
【図２Ａ】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド（配列番号３）をコードする核酸を示す図である。
【図２Ｂ】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド（配列番号４）のアミノ酸配列を示す図である。毒素Ａと毒素Ｂとの間のアミノ酸リンカーに下線が引かれている。
【００３７】
【図３】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５の用量の増加およびａｌｕｍアジュバントとの併用送達による、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５ワクチン接種マウスにおける抗体産生の向上を示す表である。マウスは、ＩＭ注射により２回のワクチン接種を受けた。第１および第２の注射から２週間後に、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体のＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより評価した。
【００３８】
【図４】２回のＩＭ注射によりａｌｕｍあり、およびなしで増加用量のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５を受けたマウスにおける、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａ、および抗毒素Ｂ  ＩｇＧ誘導のグラフ表示である。
【００３９】
【図５】ａｌｕｍの存在下または非存在下でＣ−ＴＡＢ．Ｇ５で免疫化されたマウスにおける、片対数用量範囲にわたる抗体力価を示す表である。ＩｇＧ力価は、第２の免疫化から２週間後にＥＬＩＳＡにより評価した。データは、ａｌｕｍがワクチン接種マウスにおける抗体産生を大幅に増強することを示している。
【００４０】
【図６】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５をワクチン接種され（ａｌｕｍありおよびａｌｕｍなし）、次いで致死用量の毒素Ａまたは毒素Ｂに暴露されたマウスにおける保護効果を示す表である。２週間間隔で２回のワクチン接種（ＩＭ）を受けたマウスを、３週間後に負荷（ＩＰ）した。毒素Ａおよび毒素Ｂ中和抗体（ＴＮＡ）を、第２の注射から２週間後に評価し、致死的負荷後に生存した動物のパーセントを決定した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５の増加用量は、より高いＴＮＡ産生と共に、致死的負荷に対する増加した保護をもたらした。ａｌｕｍの存在はＴＮＡ産生をさらに増加させると共に、より低い用量でのより高い生存率をもたらした。
【００４１】
【図７】ワクチン接種幼若（６〜７週齢）および老齢（１８ヶ月齢）マウスにおける、抗体反応およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５の保護有効性の比較を示す表である。２週間間隔で２回のワクチン接種（ＩＭ）を受けたマウスに、３週間後に負荷した（ＩＰ）。抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体のＥＬＩＳＡ  ＩｇＧ力価、ＴＮＡ産生ならびに全体的な生存率を評価した。幼若マウスは、ａｌｕｍなしであってもより高い抗体反応を示し、両群とも、ａｌｕｍの存在下でワクチン接種された場合、改善された生存率を示した。
【００４２】
【図８】ワクチン接種幼若および老齢マウスにおける、抗Ｃ−ＴＡＢ  ＩｇＧ抗体増加の反応速度の比較を示すグラフである。幼若マウスは、より速い速度およびより早期のＩｇＧ産生を示し、両群とも、ａｌｕｍの存在下でワクチン接種された場合、改善された反応を示した。
【００４３】
【図９】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１またはトキソイドＡおよびＢ混合物（１：１）で免疫化されたマウスにおける、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体産生の比較を示す表である。マウスは、ＩＭ注射により２回のワクチン接種を受けた。第２の注射から２週間後に、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体のＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより評価した。トキソイドによる免疫化は、毒素分子のＮ末端部分に対する抗体を誘導し、一方で、Ｃ−ＴＡＢによる免疫化は、毒素分子のＣ末端部分に対する抗体を誘導する。
【００４４】
【図１０】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１またはトキソイドＡおよびＢ混合物により免疫化されたマウスにおける、ＴＮＡ産生および毒素ＡまたはＢによる負荷に対する保護の比較を示す表である。２週間間隔で２回のワクチン接種（ＩＭ）を受けたマウスに、３週間後に毒素Ａまたは毒素Ｂの致死用量を負荷した（ＩＰ）。
【００４５】
【図１１】ａｌｕｍありおよびなしでＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたハムスターにおける、抗Ｃ−ＴＡＢ（Ａ）、抗毒素Ａ（Ｂ）、および抗毒素Ｂ（Ｃ）ＩｇＧ産生を示す表である。ハムスターは、０日目および１４日目にＩＭ注射により３回のワクチン接種を受けた。１４、２８および３５日目に、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体のＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより評価した。
【００４６】
【図１２】ａｌｕｍありまたはなしでＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたハムスターにおける、抗Ｃ−ＴＡＢ  ＩｇＧ抗体増加のグラフ表示である。
【００４７】
【図１３】ａｌｕｍありまたはなしでＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたハムスターにおける、ＴＮＡおよび保護の比較を示す表である。第３のワクチン接種から２週間後、ハムスターは、ＩＰ注射により致死用量の毒素Ａまたは毒素Ｂを受けた。
【００４８】
【図１４】致死用量のＣ．ディフィシル芽胞の胃内投与後の、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１でワクチン接種されたハムスターの生存率を示すグラフである。生存率データは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率適合曲線としてプロットし、統計分析はログランク分析を使用して行った。全ての芽胞用量（１０２、１０３および１０４）において、ワクチン接種群内のハムスターの１００％生存率が観察され、プラセボ群と比較して生存率が有意に向上した。
【００４９】
【図１５】ａｌｕｍの存在下または非存在下でＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたカニクイザルにおける、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａ、および抗毒素Ｂ抗体産生を示す表である。サルの２つの群（各群３匹、４〜６歳）が、２５０μｇのａｌｕｍあり、またはなしで、２００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を受けた。試験の０、１４、２８および４２日目に、血液試料を採取した。ＥＬＩＳＡ法を使用して、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ  ＩｇＧ力価を評価した。
【００５０】
【図１６】ＰＢＳまたはヒスチジン緩衝液中１μｇ〜３０μｇの用量範囲にわたり送達されたＣ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性の比較を示すグラフである。マウスは、２週間間隔で２回のワクチン接種（ＩＭ）を受けた。第２の注射から２週間後に、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体のＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより評価した。ＰＢＳまたはヒスチジン緩衝液中で送達されたＣ−ＴＡＢ．Ｇ５とヒスチジン緩衝液中で送達されたＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１との間で、３つ全ての抗体力価は有意には異ならなかった（Ｔ−検定分析）。
【００５１】
【図１７】マウスにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５、Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢおよびＣ−ＴＡＤＣＴＢの免疫原性の比較を示す表である。マウスは、ＩＭ注射により、２週間間隔で各組み換えタンパク質の２回のワクチン接種を受けた。全ての免疫化は、ａｌｕｍアジュバントの非存在下で行った。第２の注射から２週間後に、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体のＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより評価した。３つ全ての融合タンパク質が、高い免疫原性を示す。
【００５２】
【図１８】マウスにおける天然毒素Ｂによる負荷に対する保護を示す表である。マウスは、図１７に関して示したように免疫化され、３週間後に、ＩＰ注射により致死用量の天然毒素Ｂを負荷された。
【００５３】
【図１９】ａｌｕｍの非存在下または存在下でＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１またはＣ−ＴＡＤＣＴＢをワクチン接種されたハムスターにおける、ＴＮＡおよび保護の比較を示す表である。第３のワクチン接種から２週間後、ハムスターは、ＩＰ注射により致死用量の毒素Ａまたは毒素Ｂを受けた。
【００５４】
【図２０】異なる計画においてＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたマウスにおける、ＴＮＡ産生および毒素Ａまたは毒素Ｂによる負荷に対する保護を示す表である。０、３および１４日目、または０、７および２１日目、または０、１４、および２８日目にＩＭ注射により３回ワクチン接種されたマウスの群の間の、ＴＮＡ産生および保護の比較。最後の注射から３週間後に、マウスに致死用量の毒素Ａまたは毒素Ｂを負荷した（パネルＡは表形式、パネルＢはグラフ形式である）。
【００５５】
【図２１】１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１および１２．５μｇのａｌｕｍ（１００μｌ中）の単回投与で免疫化されたマウスにおける、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（５５ｎｇ／マウス）での負荷に対する保護（生存率）を示すグラフである。前記負荷は、免疫化から２１日後、３５日後または４９日後に行われた。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
概説
本発明は、毒素Ａの１９反復単位（ＲＵ）および毒素Ｂの２３反復単位（ＲＵ）または
そのペプチド断片もしくは変異体を含む、単離ポリペプチドＣ−ＴＡＢ．Ｇ５（配列番号
２）またはその誘導体、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１（配列番号４）の使用を含む、Ｃ．ディフ
ィシル毒素ＡおよびＢに対する保護的および／または治療的免疫反応を誘導するための免
疫原性組成物を提供する。
【００５７】
本発明はまた、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを生成
する方法、ならびに哺乳動物におけるＣＤＡＤの予防および／または治療に有用な組成物
（例えばワクチン）を調製する方法を提供する。以下の説明は、組み換え単離ポリペプチ
ドの構築、発現、および精製、特異的免疫反応を誘導するため、および対象における保護
を評価するための抗原としてのその使用のさらなる詳細および例を提供する。対象は、動
物または人間であってもよい。
【００５８】
本発明の方法および組成物における使用のためのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．
Ｇ５．１単離ポリペプチドは、いくつかの標準的方法のいずれかを使用して調製され得る
。例えば、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１は、標準的組み換えＤＮＡ技術
を使用して生成されてもよく、好適な宿主細胞は、毒素コード核酸断片の一部を含有する
適切な発現ベクターにより形質転換される（例えば、Ｄｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−８（１９９０）、およびＢａｒｒｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ
．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：４００４（１９９０）を参
照されたい）。広範な発現系のいずれも、組み換えポリペプチドを生成するために使用さ
れ得る。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１は、原核宿主細胞（例えば、大腸
菌または桿菌等の細菌）または真核宿主細胞（例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば
、ＣＯＳ１、ＮＩＨ３Ｔ３、もしくはＪＥＧ３細胞）、または昆虫細胞（例えば、ヨトウ
ガ（ＳＦ９）細胞））において産生され得る。そのような細胞は、例えば、アメリカ培養
細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能である。形質転換およびトランスフェクショ
ンの方法、ならびに発現ベクターの選択は、選択される宿主系に依存する。形質転換およ
びトランスフェクションの方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＳＢＮ：
０４７１３２９３８Ｘにより説明されている。また、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ
．Ｇ５．１、特に短鎖断片は、化学合成により、例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ
Ｙｏｕｎｇ，Ｅｄｓ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ
，Ｉｌｌ．において説明されている方法、または標準的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳方法により
生成され得る。
【００５９】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１配列に加えて、本発明は、機能的に活性
で免疫原性であるその変異体を提供する。変異体は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ
．Ｇ５．１と同じレベルの免疫原性を有してもよい。変異体は、配列番号２または配列番
号４と比較してアミノ酸置換、欠失、または挿入を有してもよい。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５もし
くはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１またはその変異体をコードする遺伝子は、標準的方法を使用し
て作製され得る（以下を参照されたく、また、例えば  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，
上記参照も参照されたい）。
【００６０】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１配列に加えて、本発明は、追加的な反復
を含むＣ−ＴＡＢ．Ｇ５のさらなる誘導体を提供する。例として、融合タンパク質、Ｃ−
ＴＡＢＮＣＴＢ（配列番号１８、配列番号１７によりコードされる）は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ
５と同様に、ＣＴＡの１９反復単位（アミノ酸２２７２〜２７１０）、ＣＴＢの２３反復
単位（アミノ酸１８５０〜２３６６）、およびＣＴＢのＣ末端に融合したＣＴＢのさらな
る追加的な１０反復（アミノ酸１８３４〜２０５７）を含む。さらなる変異体、Ｃ−ＴＡ
ＤＣＴＢ融合タンパク質（配列番号２０、配列番号１９によりコードされる）は、Ｃ−Ｔ
ＡＢ．Ｇ５（ＣＴＡの１９反復およびＣＴＢの２３反復）、ならびにＣ−ＴＡＢ．Ｇ５の
Ｃ末端に融合したＣＴＢの追加的な２４反復単位（アミノ酸１８３４〜２３６６）を含む
。また、変異体は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５の追加的な複製またはその一部を含んでもよい。例
えば、Ｃ−ＴＡＤＣＴＢは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５に存在するＣＴＢの反復単位の二重部分を
含んでもよい。
【００６１】
本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１をコードする核酸を細菌宿主
細胞に導入すること、およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を発現させる
ことを含む、大腸菌等の細菌系における高レベル発現Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ
．Ｇ５．１のための方法を提供する。
【００６２】
さらに、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、
アジュバントに共有結合または架橋してもよい（例えば、Ｃｒｙｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａ
ｃｃｉｎｅ  １３：６７−７１（１９９４）；Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ  １４１：１４９５−５０１（１９８８）およびＣｚｅｒｋｉｎｓｋｙ  ｅ
ｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：１０７２−７７（１９８９）を参照され
たい）。
【００６３】
本発明は、ＣＤＡＤから保護し、それに対する治療を提供する、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５また
はＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含むワクチンを提供する。本発明のワクチン
は新規な抗体を含み、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、経口、経鼻、口腔
、または直腸経路で送達され得る。ワクチンは、免疫保護を提供するか、または受動免疫
化のための抗体を誘導し得る。
【００６４】
本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、ＣＤＡＤ
に対し免疫化するためのワクチンを提供する。本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡ
Ｂ．Ｇ５．１単離ポリペプチドまたはその変異体は、Ｃ．ディフィシル関連疾患、例えば
ＣＤＡＤに対する保護範囲を、これまで知られていない、または公開されていないレベル
まで拡大することを目標とする組合せワクチン候補である。Ｃ．ディフィシル関連疾患か
らの保護またはその重症度の低下を提供する単一ワクチンのこの概念は、世界規模での公
衆衛生管理、特に流行病の重症度の低減（例えば、養護施設、クルーズ船）における独特
の進歩を示す。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「毒素Ａタンパク質」または「毒素Ｂタンパク質」
とは、ＣＤＡＤの主な原因であるＣ．ディフィシルの毒性タンパク質を指す。毒素Ａおよ
び毒素Ｂは、Ｃ末端結合ドメインにおける免疫原性を担う複数の反復単位を含む。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「野生型」または「天然」とは、宿主細胞において
内因的に見られるような核酸またはアミノ酸配列を含む全長タンパク質を指す。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「クロストリジウム・ディフィシル関連疾患」、「
クロストリジウム・ディフィシル関係疾患」、「クロストリジウム・ディフィシル−関連
疾患」、「クロストリジウム・ディフィシル毒素媒介疾患」、「クロストリジウム・ディ
フィシル感染」および「ＣＤＡＤ」という用語は、直接的または間接的に、クロストリジ
ウム・ディフィシルの感染により引き起こされる疾患を指す。
【００６８】
「抗原」は、生物の免疫細胞に提示されると特定の免疫反応を誘導する物質を指す。例
えば、抗原は、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、炭水化物、
脂質、糖脂質、リポタンパク質、融合タンパク質、リン脂質、またはそれらの組合せの複
合体であってもよい。抗原は、Ｂ細胞受容体（すなわち、Ｂ細胞の膜上の抗体）またはＴ
細胞受容体により認識される、単一の免疫原性エピトープ、または複数の免疫原性エピト
ープを含んでもよい。抗原は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）または病原菌もしくは微生物全
体、例えば細菌もしくはビリオン等として提供されてもよい。抗原は、不活性または弱毒
化生ウイルスであってもよい。抗原は、細胞全体もしくは膜のみからの、抽出物もしくは
溶解物から得られてもよく、または、抗原は、化学合成または組み換え手段により生成さ
れてもよい。抗原は、単独で、またはアジュバントと共に投与され得る。単一の抗原分子
は、抗原およびアジュバント特性の両方を有してもよい。
【００６９】
「アジュバント」とは、おそらくは抗原提示細胞の活性化による抗原特異的免疫反応を
特異的または非特異的に増強するために使用される任意の物質を意味する。アジュバント
の例は、油エマルジョン（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）、Ｍｏｎ
ｔａｎｉｄｅ不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント、例えばＩＳＡ、水中油エマルジョンアジ
ュバント、例えばＲｉｂｉアジュバント系、ムラミールジペプチドを含有するシンタック
スアジュバント製剤、アルミニウム塩アジュバント（ＡＬＵＭ）、ポリカチオン性ポリマ
ー、特にポリカチオン性ペプチド、特にポリアルギニンまたは少なくとも２つのＬｙｓＬ
ｅｕＬｙｓモチーフを含有するペプチド、特にＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ、定義された塩基
コンテクスト内に非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含有する免
疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）（例えばＷＯ９６／０２５５５に記載）ま
たはイノシンおよびシチジンに基づくＯＤＮ（例えばＷＯ０１／９３９０３に記載）また
はデオキシイノシンおよび／もしくはデオキシウリジン残基を含有するデオキシ核酸（Ｗ
Ｏ０１／９３９０５およびＷＯ０２／０９５０２７に記載）、特にＯｌｉｇｏ（ｄＩｄＣ
）１３（ＷＯ０１／９３９０３およびＷＯ０１／９３９０５に記載）、神経活性化合物、
特にヒト成長ホルモン（ＷＯ０１／２４８２２に記載）、またはそれらの組み合わせ、ケ
モカイン（例えば、デフェンシン  １もしくは２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ
−２、インターロイキン−８、またはサイトカイン（例えば、インターロイキン−１β、
−２、−６、−１０もしくは−１２；インターフェロン−γ；腫瘍壊死因子−α；または
顆粒球単球コロニー刺激因子）（Ｎｏｈｒｉａ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎ，１９９４において
考察されている）、ムラミールジペプチド変異体（例えば、ムラブチド、トレオニル−Ｍ
ＤＰまたはムラミールトリペプチド）、ＭＤＰの合成変異体、熱ショックタンパク質また
は変異体、森林型熱帯リーシュマニアＬｅＩＦの変異体（Ｓｋｅｉｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，
１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：  １５２７−１５３７）、トリプシン切断部位
での変異体を含む細菌ＡＤＰ−リボシル化外毒素の非毒性変異体（ｂＡＲＥ）（Ｄｉｃｋ
ｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉ
ｍｍｕｎｉｔｙ  ６３  （５）：１６１７-１６２３）および／または作用性ＡＤＰ−リ
ボシル化（Ｄｏｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）または化学的解毒ｂＡＲＥ（トキソイ
ド）、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌｌ  Ａ、Ｎ−アセチルムラミール−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグ
ルタミル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓ−グリセロ−３−（ヒドロ
キシホスホリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）ならびに代謝可能な油および乳
化剤を含有する組成物を含む。アジュバントは、抗原の経路と同じ経路により、または抗
原の経路とは異なる経路により、抗原と共に投与されてもよく、または単独で投与されて
もよい。単一のアジュバント分子は、アジュバントおよび抗原特性の両方を有してもよい
。
【００７０】
「効果的な量」とは、抗原に関しては、抗原特異的免疫反応を誘導もしくは向上させる
、または薬物に関しては、状態を治療もしくは診断するのに十分な治療薬剤の量を意味す
る。免疫反応のそのような誘導は、例えば免疫保護、脱感作、免疫抑制、自己免疫疾患の
調整、癌の免疫学的監視の増強、または確立された感染性疾患に対する治療的ワクチン接
種等の治療を提供し得る。治療は、治癒、改善、または予防を含む。
【００７１】
「核酸」とは、単一のデオキシリボ核酸塩基もしくはリボ核酸、またはホスホジエステ
ル結合により繋がったその配列を意味する。
【００７２】
「治療薬剤」とは、疾患の処置、疾患の症状の軽減、疾患の予防、または疾患の診断に
おいて使用され得る任意の分子を意味する。例えば、治療薬剤は、抗原または薬物であっ
てもよい。
【００７３】
「対象」とは、動物を意味する。対象は、任意の脊椎動物を含む任意の動物であっても
よい。対象は、家畜、実験動物（ラット、ハムスター、スナネズミ、もしくはマウス等の
げっ歯類を含むがこれらに限定されない）またはペット動物であってもよい。一実施形態
において、動物は、哺乳動物であってもよい。哺乳動物の例は、人間、霊長類、有袋類、
イヌ、サル、げっ歯類、ネコ、類人猿、クジラ、イルカ、ウシ、ブタ、およびウマを含む
。対象は、疾患の処置を必要としていてもよく、または予防的処置を必要としていてもよ
い。
【００７４】
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原に特異的に結合
する能力を有する免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の断片を意味する。抗体
は、免疫学の分野における当業者に周知である。本明細書において使用される場合、「抗
体」という用語は、全長抗体分子だけでなく、抗原結合能力を保持する抗体分子の断片も
意味する。そのような断片はまた、当該技術分野において周知であり、通常ｉｎ  ｖｉｔ
ｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で使用される。具体的には、本明細書において使用され
る場合、「抗体」という用語は、全長免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性断片Ｆ
（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄ等の抗原結合活性断片も意味する。
【００７５】
本明細書において使用される場合、「変異体」は、野生型ポリペプチドとは異なるタン
パク質および／またはポリペプチドおよび／またはペプチドを含んでもよく、１つ以上の
残基が機能的に類似した残基で保存的に置換されており、さらにこれは、野生型ポリペプ
チドの実質的に同一の機能的特性を示す。保存的置換の例は、１つの非極性（疎水性）残
基の別の残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニン）別の残基と
の置換、１つの極性（親水性）残基の別の残基との置換（例えばアルギニンとリシンとの
間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間）、１つの塩基性残基の
別の残基（例えばリシン、アルギニンもしくはヒスチジン）との置換、または１つの酸性
残基の別の残基（例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸）との置換を含む。変異体
は、本明細書に記載のポリペプチドの機能的特性も示す、本発明のポリペプチドに実質的
に同一の三元構造を有する任意のポリペプチドを含んでもよい。変異体は、野生型ポリペ
プチドの突然変異であってもよい。
【００７６】
本明細書において使用される場合、「治療」は、個人または細胞の自然経過を改変する
試みにおいて使用される任意の種類の干渉を含み得る。治療は、例えば、単独の、または
当該技術分野において一般的に知られている他の治療法と組み合わせた薬学的組成物の投
与を含み得るが、これに限定されない。「治療」は、予防的に、または病理学的事象の開
始後に行われてもよい。
【００７７】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、活性成分と組み合
わされると、成分が生物活性を保持するのを可能にし、対象の免疫系と非反応性である任
意の材料を含み得る。薬学的に許容される担体および／または賦形剤は、緩衝剤、安定剤
、希釈剤、保存剤、および可溶化剤を含み得る。一般に、担体または賦形剤の性質は、使
用されている具体的な投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとし
て、水、生理食塩水、平衡塩溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等の薬学的およ
び生理学的に許容される流体を含む注射液を含む。固体組成物（例えば、粉末、ピル、錠
剤、またはカプセル形態）の場合、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードの
マンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生
物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、微量の非毒性補助物質、例え
ば湿潤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラ
ウリン酸ソルビタンを含有してもよい。
【００７８】
本明細書において使用される場合、「融合」は、本発明に従い配置される順番またはコ
ンテクストにおいて、互いに自然に関連して見られない配列を含む核酸およびポリペプチ
ドを示し得る。融合核酸またはポリペプチドは、核酸またはポリペプチドの自然配列全体
を含むとは限らない。融合タンパク質は、通常のペプチド結合により互いに結合した、２
つ以上のセグメントを有する。融合核酸は、通常のホスホジエステル結合により互いに結
合した、２つ以上のセグメントを有する。
単離ポリペプチド
【００７９】
本発明は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａの１９反復単位およびＣ．ディフィシル毒素Ｂの２
３反復単位を含む、それぞれ配列番号２および配列番号４に記載のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５また
はＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを提供する。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５のホモログ、例
えばＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のア
ミノ酸だけＣ−ＴＡＢ．Ｇ５と異なってもよい。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ポリペプチドは、
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５と同じ毒素ＢのＣ末端ドメインを含有するが、Ｃ．ディフィシル６３０
株から得られる対応するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５ポリペプチドのホモログであるＣ．ディフィシ
ルＶＰＩ−１０４６３株から得られる毒素ＡのＣ末端ドメインを含有しない融合タンパク
質であり、１５５〜１５６位において２個のアミノ酸だけ異なる。配列番号３に記載され
るＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１コード配列は、大腸菌宿主細胞内での改善された発現のためにコ
ドン最適化された。本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプ
チドは、Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの毒性作用の中和に効果的となり得る。
【００８０】
毒素Ａおよび毒素Ｂは、それぞれＣ．ディフィシル株６３０のｔｒｄＡ（配列番号５）
およびｔｒｄＢ（配列番号７）遺伝子によりコードされる。構造的には、Ｃ．ディフィシ
ル毒素は、ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼド
メイン、疎水性領域、および受容体結合領域を含む。Ｃ末端ドメインは、極めて反復的な
単位（ＲＵ）（組み合わせ反復オリゴペプチド（ＣＲＯＰＳ）としても知られる）を含有
する。ＲＵは、長鎖または短鎖オリゴペプチドであってもよく、反復するコンセンサスＹ
ＹＦモチーフを有する２０から５０個のアミノ酸を含み得る。ＲＵは、クラスタとしてグ
ループ化される。一例として、毒素Ａ、野生型ｔｒｄＡ遺伝子（配列番号５）によりコー
ドされた株６３０（配列番号６）は、３９個のＲＵを有する。３９個のＲＵは、８個のク
ラスタにグループ化される。毒素Ｂ、野生型ｔｒｄＢ遺伝子（配列番号７）によりコード
された株６３０（配列番号８）は、５個のクラスタにグループ化される２４個のＲＵを含
有する。以下の表１および２は、ｔｒｄＡ遺伝子およびｔｒｄＢ遺伝子によりコードされ
たＣ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素ＢにおけるＲＵのそれぞれのアミノ酸位置を示す。
【００８１】
表１：毒素Ａ反復単位（ＡＲＵ）
【表１】
2019163310.tif 000002
【００８２】
表２：毒素Ｂ反復単位（ＢＲＵ）
【表２】
2019163310.tif 000003
【００８３】
したがって、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、それ
ぞれ、Ｃ．ディフィシル毒素ＡのＣ末端ドメインからの１９ＲＵ、およびＣ．ディフィシ
ル毒素ＢのＣ末端ドメインからの２３ＲＵを含む。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．
Ｇ５．１は、配列番号８の毒素Ｂアミノ酸１８５０〜２３６６に融合した配列番号６の毒
素Ａアミノ酸２２７２〜２７１０を含む。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
単離ポリペプチドは、それぞれ、配列番号２および配列番号４に記載のアミノ酸配列を含
む。
【００８４】
また、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドにおける各ＲＵ
は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａまたは毒素Ｂの変異体からのものであってもよい。Ｃ−ＴＡ
Ｂ単離ポリペプチドにおけるこれらのＲＵはまた、Ｃ．ディフィシル毒素Ａまたは毒素Ｂ
の自然発生物または変異体の組み合わせであってもよい。
【００８５】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドにおけるＲＵは、長鎖
ＲＵおよび短鎖ＲＵを含み、長鎖ＲＵおよび短鎖ＲＵは、クラスタとして配列される。本
発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、Ｃ．ディフィ
シル毒素Ａの３個から５個の短鎖ＲＵに続く１個の長鎖ＲＵの４個のクラスタ、およびＣ
．ディフィシル毒素Ｂの３個から５個の短鎖ＲＵに続く１個の長鎖ＲＵの５個のクラスタ
を含む。
【００８６】
短鎖および長鎖ＲＵは、保存されたモチーフを含有する。短鎖反復単位は、１５、１６
、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６個のアミノ酸を
含んでもよい。各短鎖反復単位は、ＹＹＦ、ＦＹＦ、ＹＦＦ、ＦＹＩ、またはＨＹＦ等の
保存されたチロシンモチーフを含んでもよい。短鎖反復単位は、続く反復単位が長鎖反復
単位である場合、チロシンモチーフの前にアスパルテート／ヒスチジン残基をさらに含ん
でもよい。長鎖反復単位は、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または
３５個のアミノ酸を含んでもよい。各長鎖反復単位は、ＦＥＹＦ、ＦＫＹＦ、またはＹＫ
ＹＦ等のチロシン反復モチーフを含んでもよい。
【００８７】
本発明において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの毒
素Ａおよび毒素Ｂ部分は、直接互いに融合していてもよい。毒素Ａおよび毒素Ｂ部分は、
リンカー領域により隔てられていてもよい。リンカー領域は、１、２、３、４、５、６、
７、８、９、１０、１１から１５、２０から３０、４０、４５、または５０個のアミノ酸
を含んでもよい。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドにおけ
る各毒素反復単位が、その発現および折り畳まれた形状において、潜在的エピトープを最
適に暴露し、その免疫原性を保持するように位置付けられるように、リンカー領域は、毒
素Ａおよび毒素Ｂ部分の位置付けを改変するために適合されてもよいことが、当業者に認
識される。Ｃ−ＴＡＢ単離ポリペプチドにおけるＲＵおよびクラスタもまた、リンカーに
より隔てられていてもよい。一実施形態において、リンカーは、ペプチドＲＳＭＨ（配列
番号２または配列番号４の４３９〜４４２）を含む。
【００８８】
本発明のＣ−ＴＡＢ単離ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４と少なくとも８
５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または配列類似性を有しても
よい。当該技術分野において知られているように、２つのポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドの間の「類似性」は、１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのアミノ酸また
はヌクレオチド配列およびその保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸置換を、第２のポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較することにより決定される。また、２つ
のポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列の２つの鎖の間の照合の同一性により
決定される、そのような配列の間の配列関連性の程度を意味する「同一性」が、当該技術
分野において知られている。同一性および類似性は共に、容易に計算され得る（Ｃｏｍｐ
ｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ
．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；
Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊ
ｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙ
ｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄ
ａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．
，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅ
ｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  
Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，
Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同一性および類似性を測定するい
くつかの方法が存在するが、「同一性」および「類似性」という用語は、当業者に周知で
ある（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅ
ｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１
９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａ
ｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）。２つの配列の間の同一性また
は類似性を決定するために一般的に使用される方法は、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９４およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍ
ａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）に
おいて開示されるものを含むが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、免疫原性
である。例えば、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチ
ドは、対応する細菌毒素Ａの免疫活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、ま
たは９０％を有してもよく、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプ
チドは、対応する細菌毒素Ｂの免疫活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、
または９０％を有してもよい。本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単
離ポリペプチドは、ＣＤＡＤの症状の治療、予防、または軽減のためのワクチンとして使
用され得る。
【００９０】
また、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、そ
れぞれ配列番号２または配列番号４を有するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．
１単離ポリペプチドの変異体を含む。変異体は、単離ポリペプチドの活性、機能または形
状に対する影響が僅かである、または影響を有さないアミノ酸挿入、置換および／または
欠失を有してもよい。そのような置換の例は、１つの非極性残基の別の残基との置換、１
つの極性残基の別の残基との置換、１つの塩基性残基の別の残基との置換、または１つの
酸性残基の別の残基との置換を含む。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離
ポリペプチド変異体は、さらに、天然毒素Ａまたは毒素Ｂの細胞外ドメインのアミノ酸配
列と比較して、ポリペプチドの活性、機能および／または構造に対する影響が僅かである
アミノ酸の挿入、置換および／または欠失を含んでもよい。当業者には、非天然アミノ酸
が使用されてもよいことが認識される。非天然アミノ酸は、例えば、ベータ−アラニン（
ベータ−Ａｌａ）、または他のオメガ−アミノ酸、例えば３−アミノプロピオン酸、２，
３−ジアミノプロピオン酸（２，３−ｄｉａＰ）、４−アミノ酪酸等、アルファ−アミン
イソ酪酸（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉ
ｔ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メ
チルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、およびシクロヘキ
シルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）２−ナフチ
ルアラニン（２−Ｎａｌ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン
酸（Ｔｉｃ）；ベータ−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；ならびにメチオニンスルホキ
シド（ＭＳＯ）を含む。
【００９１】
本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列は、様々な宿主細胞における発現を向上させるようにコドン最適化され
てもよい。コドン最適化は、対象宿主細胞におけるタンパク質発現を向上させるために、
天然配列の１つ以上のコドンを、その宿主細胞の遺伝子、または細胞が由来する宿主の遺
伝子においてより頻繁に使用されるコドンで置き換えることにより、ヌクレオチド配列を
変更することを指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対する特定の偏
りを示す。本発明は、大腸菌における向上した発現のために、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離
ポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を提供する。
【００９２】
本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、任意の既
知の技術により調製され得る。例えば、単離ポリペプチドは、遺伝子操作により発現され
得る。例として、組み換えＤＮＡの翻訳である。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ
５．１単離ポリペプチドはまた、合成的に調製され得る。例として、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５ま
たはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ａｍ  Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）（参照により本明細書に組み入れられる）に
より最初に説明された固相合成技術を使用して合成され得る。他のポリペプチド合成技術
は、例えば、Ｋｅｎｔら（１９８５）のＳｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  
Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｅｄｓ．Ａｌｉｔａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２９５−３５８．において
見出すことができる。
【００９３】
本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、実質的に
純粋な形態で単離する、または得ることができる。実質的に純粋とは、タンパク質および
／またはポリペプチドおよび／またはペプチドが、自然またはｉｎ  ｖｉｖｏシステムに
おいて共に見出すことができる他の物質を、その使用目的のために現実的および適切な程
度まで実質的に含まないことを意味する。具体的には、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡ
Ｂ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、例えば、抗体生成、配列決定、または薬学的調製物の
生成において有用となるように、十分に純粋であり、宿主細胞の他の生物学的構成物質を
十分に含まない。当該技術分野において周知の技術により、実質的に純粋なポリペプチド
は、本明細書に開示される核酸およびアミノ酸配列に照らして生成され得る。本発明の実
質的に精製された単離ポリペプチドは、薬学的調製物中の薬学的に許容される担体と混合
され得るため、単離ポリペプチドは、調製物のある特定の重量パーセントのみを占めるこ
とができる。それにもかかわらず、単離ポリペプチドは、生体系内で関連し得る物質から
実質的に分離されているという点で、実質的に純粋である。
【００９４】
本発明は、さらに、追加的なポリペプチドを含む単離Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡ
Ｂ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを提供する。追加的なポリペプチドは、より大きなポリペ
プチドの断片であってもよい。一実施形態において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ
．Ｇ５．１単離ポリペプチドに融合した、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の追
加的なポリペプチドがある。いくつかの実施形態において、追加的なポリペプチドは、Ｃ
−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドのアミノ末端に対して融合
している。他の実施形態において、追加的なポリペプチドは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ
−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドのカルボキシル末端に対して融合している。さらな
る実施形態において、追加的なポリペプチドは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ
５．１単離ポリペプチドに隣接している。さらなる実施形態において、追加的なポリペプ
チドは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの毒素Ａ部分と
毒素Ｂ部分との間に分散している。
【００９５】
いくつかの実施形態において、追加的なポリペプチドは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−
ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの分泌または細胞内局在の誘導を補助する。そのよう
なポリペプチドは、「シグナル配列」と呼ばれる。分泌シグナルは、例えば、共に参照に
より全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２９１，２１２号および米国特許第
５，５４７，８７１号において説明されている。分泌シグナル配列は、分泌ペプチドをコ
ードする。分泌ペプチドは、細胞からのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の
分泌を誘導するように作用するアミノ酸配列である。分泌ペプチドは、一般に、疎水性ア
ミノ酸のコアを特徴とし、典型的には、新たに合成されたタンパク質のアミノ末端に見ら
れる（但しこれに限らない）。分泌ペプチドは、分泌中に、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−
ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドから切断されてもよい。分泌ペプチドは、分泌経路を
通過する際に成熟タンパク質からのシグナルペプチドの切断を可能とするプロセシング部
位を含有してもよい。プロセシング部位は、シグナルペプチド内にコードされてもよく、
または、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により、シグナルペプチドに追加されても
よい。分泌シグナル配列は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の分泌を可能
とするための複雑な一連の翻訳後プロセシングステップに必要となり得る。シグナル配列
は、開始コドンのすぐ後に続いてもよく、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
のアミノ末端部でシグナルペプチドをコードする。シグナル配列は、停止コドンに先行し
てもよく、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１のカルボキシ末端部でシグナル
ペプチドをコードする。ほとんどの場合、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ば
れる特定のプロテアーゼにより切断される。分泌シグナル配列の例は、ｏｍｐＡ、ｐｅｌ
Ｂ、およびＳＴ  ｐｒｅ−ｐｒｏを含むが、これらに限定されない。
【００９６】
いくつかの実施形態において、追加的なポリペプチドは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−
ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの安定化、構造および／または精製を補助する。いく
つかの実施形態において、追加的なポリペプチドは、エピトープを含んでもよい。他の実
施形態において、追加的なポリペプチドは、親和性タグを含んでもよい。例として、エピ
トープおよび／またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド
への親和性タグを含むポリペプチドの融合は、ポリペプチドの精製および／または同定を
補助し得る。例として、ポリペプチドセグメントは、Ｈｉｓ−タグ、ｍｙｃ−タグ、Ｓ−
ペプチドタグ、ＭＢＰタグ（マルトース結合タンパク質）、ＧＳＴタグ（グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ）、ＦＬＡＧタグ、チオレドキシンタグ、ＧＦＰタグ（緑色蛍光タ
ンパク質）、ＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシル担体タンパク質）、カルモジュリンタグ、
Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＳＶ−エピトープタグ、Ｖ５−エピトープタグ、およびＣＢＰタグで
あってもよい。そのようなエピトープおよび親和性タグの使用は、当業者に知られている
。
【００９７】
さらなる実施形態において、追加的なポリペプチドは、ポリペプチドの切断のための部
位を含むＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを提供し得る。
一例として、ポリペプチドは、ペプチド結合の加水分解により切断され得る。いくつかの
実施形態において、切断は、酵素により行われる。いくつかの実施形態において、切断は
、細胞内で生じる。他の実施形態において、切断は、切断酵素の人為的操作および／また
は人為的導入により生じる。例として、切断酵素は、ペプシン、トリプシン、キモトリプ
シン、トロンビン、および／または第Ｘａ因子を含み得る。切断は、ポリペプチドからの
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの容易な単離を可能とす
る。切断は、さらに、毒素Ｂ部分からの毒素Ａ部分の分離を可能とし得る。切断はまた、
例えば発現タンパク質を精製するために使用されるエピトープの切断により、ポリペプチ
ドに融合したＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの他のポリ
ペプチドからの単離を可能とし得る。
【００９８】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、さらに、同じ有機
合成ペプチドと共有しない追加の構造的変化、例えばアデニル化、カルボキシル化、グリ
コシル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化またはミリスチル化を有してもよい。こ
れらの追加の構造的変形は、さらに、組み換え発現系の適切な選択により、選択または優
先されてもよい。一方、融合ポリペプチドは、その配列が、有機合成の原理および慣習に
より延長されてもよい。
【００９９】
本発明はまた、Ｃ．ディフィシル毒素Ａから得られるポリペプチド部分およびＣ．ディ
フィシル毒素Ｂから得られるポリペプチド部分を含む、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡ
Ｂ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸を提供する。核酸は、デオキシリボヌク
レオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのポリマーの一本鎖もしくは二本鎖形態を含
んでもよい。本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド
をコードするリボ核酸を提供する。本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、Ｃ−Ｔ
ＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸およびその補
体にハイブリダイズする核酸を提供する。ストリンジェントな条件とは、プローブとフィ
ルタ結合核酸との間の相同性の程度を指し、ストリンジェンシーが高い程、プローブとフ
ィルタ結合核酸との間のパーセント相同性が高い。ストリンジェントな洗浄のための温度
は、核酸のＴｍに基づいて決定され得る（Ｇ／Ｃ含量に基づく）。ストリンジェントな条
件は、さらに、標準クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）等の緩衝液中の塩の濃度に影響され得
る。本発明は、配列番号１との約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列
類似性または配列同一性を有する核酸を提供する。
【０１００】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、さらに、リンカー
領域、例えば約５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、また
は１アミノ酸残基未満のリンカーを含んでもよい。リンカーは、毒素Ａから得られたポリ
ペプチド部分またはその一部、および毒素Ｂから得られたポリペプチド部分に、またはそ
れらの間に共有結合し得る。
【０１０１】
本発明は、それぞれ配列番号１または配列番号３に縮重するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ
−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸を提供する。遺伝子コードの縮重
は、毒素Ａタンパク質、毒素Ｂタンパク質および／または対象単離ポリペプチドのヌクレ
オチド配列の多様性を可能とするが、依然として天然ＤＮＡ配列によりコードされるポリ
ペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを生成する。「コドン最適化」（参
照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，５４７，８７１号に記載され
ている）として知られるこの手順は、そのような改変されたＤＮＡ配列を設計する手段を
提供する。コドン最適化遺伝子の設計は、生物におけるコドン使用頻度、最近接頻度、Ｒ
ＮＡ安定性、２次構造形成の可能性、合成経路、およびその遺伝子の意図される将来のＤ
ＮＡ操作を含む、様々な因子を考慮すべきである。特に、酵母発現系が使用される場合は
酵母により、または昆虫細胞発現系が使用される場合は昆虫細胞により最も容易に認識さ
れるコドンで所与の単離ポリペプチドをコードするコドンを改変するために、利用可能な
方法が使用され得る。また、遺伝子コードの縮重は、同じアミノ酸配列がコードされ、多
くの異なる様式で翻訳されることを可能にする。例えば、ロイシン、セリンおよびアルギ
ニンは、それぞれ６個の異なるコドンによりコードされるが、バリン、プロリン、トレオ
ニン、アラニンおよびグリシンは、それぞれ４個の異なるコドンによりコードされる。し
かしながら、そのような同義コドンの使用頻度は、真核生物および原核生物の間のゲノム
間で変動する。例えば、哺乳動物の間での同義コドン選択パターンは非常に類似している
が、酵母（例えばＳ．セレビシアエ）、細菌（例えば大腸菌）および昆虫（例えばキイロ
ショウジョウバエ）等の進化的に遠い生物は、明確に異なるゲノムコドン使用頻度パター
ンを示す（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，８
，４９−６２（１９８０）；Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄ  Ｒｅｓ．，９，４３−７４（１９８１）；Ｍａｒｏｙａｍａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１４，１５１−１９７（１９８６）；Ａｏｔａ，Ｓ．
，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１６，３１５−４０２（１９８８）；
Ｗａｄａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９  Ｓｕｐｐ．，１
９８１−１９８５（１９９１）；Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２
８５，１６５−１６９（１９９１））。コドン選択パターンのこれらの差は、ペプチド延
長速度の調整により、個々の遺伝子の全体的発現レベルに寄与するようである（Ｋｕｒｌ
ａｎｄ，Ｃ．Ｇ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２８５，１６５−１６９（１９９１）；Ｐｅ
ｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，２８９５−２８９８  （１９８４）；Ｓｏｒ
ｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０７，３６５−３７７（１９８９）
；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｌ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７
，３７５−３７９（１９８０）；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｙａｒｕｓ，Ｍ．，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０９，６５−７７（１９８９）；Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．，ｅ
ｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０，５４９−５７６（１９８４）、Ｖａｒｅ
ｎｎｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．，１８０，５４９−５７６（１９
８４）；Ｇａｒｅｌ，Ｊ．−Ｐ．，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，４３，２１１−２２５
（１９７４）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４６，１−２１（１
９８１）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５１，３８９−４０９（
１９８１））。
【０１０２】
合成遺伝子のための好ましいコドン使用頻度は、組み換えタンパク質発現に使用される
ことが意図される細胞／生物の抽出（または可能な限り密接に関連した）ゲノムから得ら
れる核遺伝子のコドン使用率を反映すべきである。
【０１０３】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される２つの配列の間の最大の一致を与
えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータプログラム
において体系化される。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコ
ンピュータプログラム方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳ
ＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２１５：４０３（１９９０））を含むが、これらに限定されない。上述の類似性また
は同一性の程度は、２つの配列間の同一性の程度として決定され、しばしば第２の配列か
らの第１の配列の誘導を示す。２つの核酸間の同一性の程度は、当該技術分野において知
られたコンピュータプログラム、例えばＧＣＧプログラムパッケージ内に提供されるＧＡ
Ｐを使用して決定され得る（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３  （１９７０））。本発明のために２つの核酸間の同一
性の程度を決定する目的で、ＧＡＰは、以下の設定で使用される：ＧＡＰ生成ペナルティ
５．０およびＧＡＰ伸長ペナルティ０．３。
【０１０４】
また、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコ
ードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターは、異なる生成環境の間の移送のため
、または宿主細胞における発現のための制限およびライゲーションにより、所望の配列が
挿入されてもよいいくつかの核酸のいずれであってもよい。ベクターは、典型的にはＤＮ
Ａで構成されるが、ＲＮＡベクターもまた利用可能である。ベクターは、プラスミドおよ
びファージミドを含むが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞内
で複製することができ、さらに１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を特徴とするベク
ターであり、その部位では、ベクターは、測定可能な様式で切断されてもよく、また、新
たな組み換えベクターが宿主細胞内で複製する能力を保持するように所望のＤＮＡ配列が
ライゲーションされてもよい。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、プラスミドが宿
主細菌内でコピー数の増加を示すと共に何回も、または宿主が有糸分裂により再生する前
に宿主当たり１回だけ生じ得る。ファージの場合、複製は、溶解段階の間能動的に、また
は溶原段階の間受動的に生じ得る。
【０１０５】
ベクターは、さらに、プロモーター配列を含有してもよい。プロモーターは、通常、核
酸の転写を開始するための部位を含有するコード領域の上流に位置する、非翻訳核酸を含
んでもよい。また、プロモーター領域は、遺伝子発現の調節因子として機能する他の要素
を含んでもよい。本発明のさらなる実施形態において、発現ベクターは、発現ベクターが
組み込まれた細胞の選択を補助するための追加的領域を含有する。プロモーター配列は、
多くの場合、転写開始部位によりその３’末端で境界され（包含的）、上流側（５’方向
）に伸長して、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するために必要
な最少数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内では、転写開始部位、およびＲＮ
Ａポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインが見られる。真核プロモーターは、
必ずではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多い
。
【０１０６】
ベクターは、さらに、ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞の同定お
よび選択における使用に好適な、１つ以上のマーカー配列を含有してもよい。マーカーは
、例えば、抗生物質または他の化合物に対する抵抗性または感受性を増加または低下させ
るタンパク質をコードする遺伝子、当該技術分野において知られている標準的アッセイに
よりその活性が検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファ
ターゼ）をコードする遺伝子、および、形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿
主、コロニーまたはプラークの表現型に明らかに影響する遺伝子を含む。好ましいベクタ
ーは、作用可能に結合したＤＮＡセグメント内に存在する構造遺伝子産物の自己複製およ
び発現が可能なベクターである。
【０１０７】
発現ベクターは、調節配列に作用可能に結合し、ＲＮＡ転写産物として表現され得るよ
うに、所望の核酸が制限およびライゲーションにより挿入され得るベクターである。発現
は、内在性遺伝子、導入遺伝子または細胞内のコード領域の転写および／または翻訳を指
す。
【０１０８】
コード配列および調節配列は、コード配列の発現または転写を調節配列の影響または制
御下に置くように共有結合している場合に、作用可能に結合している。コード配列が機能
タンパク質に翻訳されることが望ましい場合は、５’調節配列におけるプロモーターの誘
導がコード配列の転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（
１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさない、（２）コード配列の転写を誘導する
プロモーター領域の能力に干渉しない、または（３）タンパク質に翻訳される対応するＲ
ＮＡ転写産物の能力に干渉しない場合、２つのＤＮＡ配列は作用可能に結合していると言
われる。したがって、プロモーター領域が、得られる転写産物が所望のタンパク質または
ポリペプチドに翻訳され得るようにそのＤＮＡ配列の転写をもたらすことができる場合、
プロモーター領域はコード領域に作用可能に結合している。
【０１０９】
本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、宿主細胞
内にコード核酸を発現させることにより生成され得る。核酸は、宿主細胞に形質転換また
はトランスフェクトされ得る。したがって、本発明のいくつかの態様は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ
５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸の形質転換および／ま
たはトランスフェクションを含む。形質転換は、外来または異種核酸の原核細胞の内部へ
の導入である。トランスフェクションは、外来または異種核酸の真核細胞の内部への導入
である。形質転換またはトランスフェクト核酸は、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ
内に統合（共有結合）されてもよく、またはされていなくてもよい。例えば、原核細胞に
おいては、形質転換核酸は、プラスミドまたはウイルスベクター等のエピソーム要素上で
維持され得る。真核細胞に関しては、安定にトランスフェクトされた細胞は、トランスフ
ェクト核酸が染色体複製を通して娘細胞により遺伝されるように染色体内に統合された細
胞である。この安定性は、トランスフェクトされた核酸を含有する娘細胞の集団を含む細
胞株またはクローンを確立する真核細胞の能力により示される。
【０１１０】
高等真核細胞培養を使用して、脊椎動物または昆虫を含む無脊椎細胞から本発明のタン
パク質を発現させてもよく、その増殖手順は既知である（例えば、Ｋｒｕｓｅ  ｅｔ  ａ
ｌ．  （１９７３）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
を参照されたい）。
【０１１１】
また、核酸の複製およびコードされたＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単
離ポリペプチドの発現のための宿主細胞およびベクターも提供される。原核細胞または真
核細胞の任意のベクターまたは宿主細胞が使用され得る。そのような目的のための多くの
ベクターおよび宿主細胞が、当該技術分野において知られている。所望の用途のための適
切な組を選択することは、十分に当該技術の範囲内である。
【０１１２】
毒素Ａおよび毒素ＢをコードするＤＮＡ配列、またはその一部は、Ｃ．ディフィシル、
ならびに当該技術分野において知られている他の既知の毒素Ａおよび毒素Ｂ発現原核生物
から得られる、様々なゲノムまたはｃＤＮＡライブラリからクローニングされ得る。プロ
ーブベースの方法を使用してそのようなＤＮＡ配列を単離するための技術は、従来の技術
であり、当業者に周知である。そのようなＤＮＡ配列を単離するためのプローブは、公開
されたＤＮＡまたはタンパク質配列に基づいてもよい。代替として、Ｍｕｌｌｉｓら（米
国特許第４，６８３，１９５号）およびＭｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，２０２号
）（参照により本明細書に組み込まれる）により開示されているポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）法が使用されてもよい。ライブラリの選択およびそのようなＤＮＡ配列の単離の
ためのプローブの選択は、当該技術のレベルの範囲内である。
【０１１３】
好適な宿主細胞は、原核生物または真核生物から得ることができる。好適な原核宿主は
、シュードモナス属、例えば緑膿菌、大腸菌、ブドウ球菌属、例えば黄色ブドウ球菌およ
びＳ．エピデルミス、セラチア・マルセッセンス、桿菌属、例えば枯草菌および巨大菌、
クロストリジウム・スポロゲネス、エンテロコッカス・フェカリス、マイクロコッカス属
、例えばＭ．ルテウスおよびＭ．ロゼウス、ならびにプロテウス・ブルガリスを含む。高
等真核細胞において本発明のポリペプチドを発現させるための好適な宿主細胞は、酵母、
例えばサッカロマイセス（例えばＳ．セレビシアエ）；２９３（ヒト胎児腎臓）（ＡＴＣ
Ｃ  ＣＲＬ−１５７３）；２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）
；２９３Ｔおよび変異体２９３Ｔ／１７（２９３ｔｓＡ１６０９ｎｅｏおよび変異体ＡＴ
ＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）（ＳＶ４０  Ｔ抗原により形質転換されたヒト胎児腎臓）；
ＣＯＳ−７（ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ系）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１
）；ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０）；ＣＨＯ（チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞）；マウスセルトリ細胞；ＣＶＩ（サル腎臓細胞）（ＡＴＣＣ  
ＣＣＬ７０）；ＶＥＲＯ７６（アフリカミドリザル腎臓細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８
７）；ＨｅＬａ（ヒト子宮癌細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；ＭＤＣＫ（イヌ腎臓細胞）
（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；ＢＲＬ３Ａ（バッファローラット肝臓細胞）（ＡＴＣＣ  Ｃ
ＲＬ１４４２）；Ｗ１３８（ヒト肺細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ＨｅｐＧ２（ヒト
肝細胞）（ＨＢ８０６５）；ならびにＭＭＴ  ０６０６５２（マウス乳腺腫瘍）（ＡＴＣ
Ｃ  ＣＣＬ５１）を含む。
【０１１４】
他の実施形態において、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離
ポリペプチドを含む単離ポリペプチドならびに追加的なポリペプチドをコードする核酸を
提供する。融合ポリペプチドの産生のための真核発現系を構築するために有用なベクター
は、適切な転写活性化配列、例えばプロモーターおよび／またはオペレーターに作用可能
に結合した単離ポリペプチドをコードする核酸を含む。他の典型的な特徴は、適切なリボ
ソーム結合部位、停止コドン、エンハンサー、ターミネーター、またはレプリコン要素を
含み得る。これらの追加的な特徴は、従来のスプライス技術、例えば制限エンドヌクレア
ーゼ分解およびライゲーション等により、適切な部位（複数を含む）でベクターに挿入さ
れ得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、追加的な核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．
Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸に融合されてもよい。融合核酸は、Ｃ−ＴＡ
Ｂ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドのコドンリーディングフレームを
シフトさせずに、精製および／または免疫原性および／または安定性を補助し得るポリペ
プチドをコードしてもよい。融合核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
単離ポリペプチドから切断されてもよい、またはされなくてもよい分泌配列をコードして
もよい。融合核酸は、発現ポリペプチドを大きく延長しなくてもよい。融合核酸は、Ｃ−
ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドに対して、６０個未満の余分
なアミノ酸をコードしてもよい。いくつかの実施形態において、融合核酸は、Ｃ−ＴＡＢ
．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸に続く。他の実施
形態において、融合核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプ
チドをコードする核酸に先行する。他の実施形態において、融合核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ
５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸に隣接している。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、融合核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
．１単離ポリペプチドの精製を補助するポリペプチドをコードしてもよい。いくつかの実
施形態において、融合核酸は、エピトープおよび／または親和性タグをコードする。精製
を補助するポリペプチドの例は、Ｈｉｓ−タグ、ｍｙｃ−タグ、Ｓ−ペプチドタグ、ＭＢ
Ｐタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、チオレドキシンタグ、ＧＦＰタグ、ＢＣＣＰ、カル
モジュリンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＳＶ−エピトープタグ、Ｖ５−エピトープタグ、お
よびＣＢＰタグを含むが、これらに限定されない。他の実施形態において、融合核酸は、
切断へと誘導される、または切断されやすい部位を有するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−Ｔ
ＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードしてもよい。一実施形態において、融合核酸は
、酵素的切断の部位を含むポリペプチドをコードしてもよい。さらなる実施形態において
、酵素的切断は、さらに他のポリペプチドからのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ
５．１単離ポリペプチド、および他の融合ポリペプチドセグメントの単離を補助し得る。
例として、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする
核酸とエピトープとの間に配置される酵素的切断部位をコードする中間核酸が、発現され
たＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドおよびエピトープの後
の分離を可能としてもよい。そのような部位はまた、毒素Ａ部分と毒素Ｂ部分との間に存
在してもよい。
【０１１７】
また、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの発
現および提供を補助するように設計される発現系を提供する。発現系は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ
５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトラ
ンスフェクトされた宿主細胞を含んでもよい。宿主細胞は、原核生物であってもよい。原
核生物は、大腸菌であってもよい。宿主細胞は、真核細胞であってもよい。
【０１１８】
発現系は、さらに、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを
コードする核酸での形質転換またはトランスフェクトに成功した宿主細胞の選択を補助す
る薬剤を含んでもよい。例えば、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリ
ペプチドをコードする核酸は、さらに、抗生物質に抵抗する宿主細胞を補助する遺伝子、
例えばカナマイシンまたはゲンタマイシンまたはアンピシリンまたはペニシリンに抵抗す
る遺伝子を発現してもよい。そのような抵抗性遺伝子は、当業者に知られているように、
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸を適切
に組み込んだ宿主細胞の選択を可能とする。
【０１１９】
本発明の別の態様は、抗体の生成に関する。本発明に包含される抗体の例は、Ｃ−ＴＡ
Ｂ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドで対象を免疫化することにより生
成される抗体を含むが、これに限定されない。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ
５．１単離ポリペプチドでの免疫化により生成される抗体は、毒素Ａもしくは毒素Ｂに特
異的に結合することができ、または、それらはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ
５．１単離ポリペプチドと交差反応することができる。本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５または
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドにより生成される抗体は、当該技術分野において
周知の方法を使用して特性決定され得る。
【０１２０】
本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを使用するこ
とにより生成される抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例え
ば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ等）、キメラ抗体、二重特異性抗体
、重鎖のみの抗体、ヘテロ結合抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、その変異体
、抗体部分を含む単離ポリペプチド、ヒト化抗体、ならびに、抗体のグリコシル化変異体
、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合的に修飾された抗体を含む、必要な特性の
抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾構造を包含し得る。好ましい抗
体は、マウス、ラット、ヒト、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、ネ
コ、霊長類、または任意の他の源から得られる（キメラ、断片および／またはヒト化抗体
を含む）。
【０１２１】
他の実施形態において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチ
ドでの免疫化により生成された抗体は、次いで、当該技術分野において知られている方法
によりヒト化される。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンから得られる最小配列を含有
する免疫グロブリン分子である。さらに他の実施形態において、特定のヒト免疫グロブリ
ンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用することにより、完全ヒト
抗体が得られる。他の実施形態において、抗体は、キメラである。キメラ抗体は、２つの
異なる抗体からの特性を組み合わせた抗体である。キメラ抗体を調製する方法は、当該技
術分野において知られている。
【０１２２】
他の実施形態において、抗体をコードするヌクレオチド配列が得られ、次いで発現また
は増殖のためにベクターにクローニングされる。別の実施形態において、抗体は、当該技
術分野において知られている方法を使用して、組み換えにより作製および発現される。例
として、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、これらの技
術により組み換え抗体を単離するために、抗原として使用され得る。抗体は、宿主細胞内
で組み換えにより抗体を発現させるために、遺伝子配列を使用して組み換えにより作製さ
れ得る。抗体の変異体および組み換え抗体を作製するための方法は、当該技術分野におい
て知られている。
【０１２３】
他の実施形態において、抗体は、例えば天然毒素Ａもしくは毒素Ｂの単離もしくは精製
、または生物学的試料もしくは検体中の天然毒素Ａもしくは毒素ＢもしくはＣ．ディフィ
シルの検出における使用のために、当該技術分野における従来の方法により担体に結合さ
れる。
組成物および製剤
【０１２４】
本発明はまた、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む
組成物を提供する。組成物は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペ
プチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であってもよい。本発明の方法
において使用される組成物は、一般に、限定ではなく例として、効果的な量の本発明のＣ
−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド（例えば、免疫反応を誘
導するのに十分な量）、またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリ
ペプチドに対する抗体（例えば、感染症を緩和する、感染症の症状を軽減する、および／
もしくは感染症を予防するのに十分な量の中和抗体の量）を含む。薬学的組成物は、さら
に、当該技術分野において知られている薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤
を含んでもよい（一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，（２００５）Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  
ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。
【０１２５】
本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、ＣＤＡＤ
に罹患した人間および／または動物を免疫化または治療するための方法に使用され得る。
したがって、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、薬学的
組成物中で使用され得る。本発明の薬学的組成物は、さらに、薬学的に許容される担体お
よび／または賦形剤を包含し得る。本発明において有用な薬学的に許容される担体および
／または賦形剤は、従来のものであり、緩衝剤、安定剤、希釈剤、保存剤、および可溶化
剤を含み得る。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔ
ｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９７５）は、本明細書において開示される
ポリペプチドの薬学的送達に好適な組成物および製剤を説明している。一般に、担体また
は賦形剤の性質は、使用されている具体的な投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は
、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩溶液、デキストロース水溶液、グリセ
ロール等の薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射液を含む。固体組成物（例
えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセル形態）の場合、従来の非毒性固体担体は、例え
ば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネ
シウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、微量の
非毒性補助物質、例えば湿潤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナ
トリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。
【０１２６】
一実施形態において、薬学的組成物は、さらに、アジュバント等の免疫刺激性物質を含
んでもよい。アジュバントは、投与方法に基づいて選択することができ、鉱物油系アジュ
バント、例えばフロイント完全および不完全アジュバント、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ不完全Ｓ
ｅｐｐｉｃアジュバント、例えばＩＳＡ、水中油エマルジョンアジュバント、例えばＲｉ
ｂｉアジュバント系、ムラミールジペプチドを含有するシンタックスアジュバント製剤、
水酸化アルミニウムまたはアルミニウム塩アジュバント（ａｌｕｍ）、ポリカチオン性ポ
リマー、特にポリカチオン性ペプチド、特にポリアルギニンまたは少なくとも２つのＬｙ
ｓＬｅｕＬｙｓモチーフを含有するペプチド、特にＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ、定義された
塩基コンテクスト内に非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含有す
る免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）（例えば、ＷＯ９６／０２５５５に記
載）またはイノシンおよびシチジンに基づくＯＤＮ（例えばＷＯ０１／９３９０３に記載
）またはデオキシイノシンおよび／もしくはデオキシウリジン残基を含有するデオキシ核
酸（ＷＯ０１／９３９０５およびＷＯ０２／０９５０２７に記載）、特にＯｌｉｇｏ（ｄ
ＩｄＣ）１３（ＷＯ０１／９３９０３およびＷＯ０１／９３９０５に記載）、神経活性化
合物、特にヒト成長ホルモン（ＷＯ  ０１／２４８２２に記載）、またはそれらの組み合
わせを含み得る。そのような組み合わせは、例えば、ＷＯ０１／９３９０５、ＷＯ０２／
３２４５１、ＷＯ０１／５４７２０、ＷＯ０１／９３９０３、ＷＯ０２／１３８５７、Ｗ
Ｏ０２／０９５０２７およびＷＯ０３／０４７６０２に記載のものに従う。好ましくは、
アジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバントである。
【０１２７】
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、投与される用量および濃度で被投与者に対
し非毒性である。担体、賦形剤または安定剤は、さらに緩衝剤を含んでもよい。賦形剤の
例は、炭水化物（例えば単糖類および二糖類）、糖（例えばスクロース、マンニトール、
およびソルビトール）、ホスフェート、シトレート、酸化防止剤（例えば、アスコルビン
酸およびメチオニン）、保存剤（例えば、フェノール、ブタノール、ベンザノール；アル
キルパラベン、カテコール、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化
ヘキサメトニウム、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、塩化ベン
ザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、およびｍ−クレゾール）、低分子量ポリペプチド、
タンパク質（例えば、血清アルブミンまたは免疫グロブリン）、親水性ポリマーアミノ酸
、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、塩形成対イオン、金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質
錯体）、ならびに非イオン性界面活性剤（例えばＴＷＥＥＮ（商標）およびポリエチレン
グリコール）を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
本発明の薬学的組成物は、さらに、所望の効果を向上および／または補完するように作
用する追加的薬剤を含んでもよい。例として、サブユニットワクチンとして投与されてい
る本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの免疫原性を
向上させるために、薬学的組成物は、さらにアジュバントを含んでもよい。
【０１２９】
薬学的組成物の例は、免疫原性組成物であってもよい。本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５ま
たはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性
組成物は、さらに、哺乳動物における注射に好適な製剤中の薬学的に許容される担体もし
くは他の担体および／または賦形剤を含んでもよい。免疫原性組成物は、免疫原性組成物
が注射または別様に導入された場合に哺乳動物宿主において免疫反応を惹起する材料の任
意の組成物である。免疫反応は、液性、細胞性、またはその両方であってもよい。ブース
ター効果は、同じ免疫原性組成物に対する哺乳動物宿主の後の暴露後の、免疫原性組成物
に対する増加した免疫反応を指す。液性反応は、免疫原性組成物に対する暴露後の哺乳動
物宿主による抗体の産生をもたらす。
【０１３０】
本発明の免疫原性組成物は、人間および他の動物を含む哺乳動物宿主における免疫反応
を惹起する。免疫反応は、細胞依存的反応または抗体依存的反応またはその両方であって
もよく、さらに、反応は、哺乳動物宿主における免疫記憶またはブースター効果を提供し
得る。これらの免疫原性組成物は、ワクチンとして有用であり、Ｃ．ディフィシルの株に
よる感染に対する、哺乳動物対象または宿主による保護反応を提供し得る。
【０１３１】
本発明は、さらに、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを
コードする核酸を構築して、微生物宿主においてＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ
５．１単離ポリペプチド構成成分を発現させ、宿主の培養物からＣ−ＴＡＢ．Ｇ５または
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを回収し、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．
Ｇ５．１単離ポリペプチドを第２のタンパク質構成成分に複合化し、複合タンパク質およ
び多糖類構成成分を回収することにより、免疫原性組成物を生成するための方法を含む。
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸は、一
定および安定な選択的圧力により宿主の成長を通して維持され得る。発現ベクターの維持
は、選択的遺伝子型をコードする遺伝子配列の発現ベクターへの組込みによりもたらすこ
とができ、微生物宿主細胞におけるその発現は、選択的発現型をもたらす。また、選択的
遺伝子型配列は、条件致死突然変異を補完する遺伝子を含んでもよい。他の薬物耐性遺伝
子または致死突然変異を補完する遺伝子等の他の遺伝子配列が、発現ベクター内に組み込
まれてもよい。微生物宿主は、グラム陽性細菌、大腸菌等のグラム陰性細菌、酵母、糸状
菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または植物細胞を含み得る。
【０１３２】
また、本発明の方法は、約５０ｍｇ／リットル（培養物）を超えるレベル、約１００ｍ
ｇ／リットルを超えるレベル、約５００ｍｇ／リットルを超えるレベル、または約１ｇ／
リットルを超えるレベルの、宿主におけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
単離ポリペプチドの発現のレベルを提供する。本発明はまた、タンパク質が、硫酸アンモ
ニウム沈殿に続くイオン交換クロマトグラフィー等の、タンパク質の単離および回収の技
術分野における当業者に知られた任意の数の方法により回収され得ることを提供する。
【０１３３】
本発明は、さらに、アミド化反応等の当業者に知られたいくつかの手段のうちの１つに
より、タンパク質構成成分が第２のタンパク質構成成分に複合化されることを提供する免
疫原性組成物を調製するための方法を含む。
【０１３４】
また、本発明は、ＣＤＡＤを治療および予防するための、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−
ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤を提供する。一実施形態において、製剤は
、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド、アジュバン
ト、および薬学的に許容される担体を含んでもよい。別の実施形態において、製剤は、本
発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む、または
本質的に１つ以上の本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペ
プチドからなる。製剤は、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポ
リペプチドおよびアジュバントを含んでもよい。製剤は、さらに、追加的な抗体または薬
物を含んでもよい。さらに、製剤は、１つ以上の薬物を含んでもよく、また単離ポリペプ
チドおよび／またはアジュバントに加えて１つ以上の薬物を含んでもよい。
【０１３５】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は、液体ま
たは乾燥形態であってもよい。乾燥製剤は、容易に保存および輸送され得る。乾燥製剤は
、ワクチンの製造場所からワクチン接種が行われる地点までに必要なコールドチェーンを
打破する。代替として、製剤の乾燥活性成分自体が、抗体提示細胞により取り込まれ処理
される固体微粒子形態を提供することによる改善であってもよい。これらの可能なメカニ
ズムは、本発明またはその均等物の範囲を制限するように議論されず、本発明の作用に対
する洞察を提供し、免疫化およびワクチン接種における本製剤の使用をガイドするように
議論される。
【０１３６】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの乾燥製剤は、微細ま
たは顆粒粉末、凍結乾燥粉末、均一膜、ペレット、および錠剤等の様々な形態で提供され
得る。製剤には、空気乾燥、高温による乾燥、凍結乾燥、フリーズドライもしくは噴霧乾
燥、固体基板上へのコーティングもしくは噴霧後の乾燥、固体基板上への振り掛け、急速
冷凍に次ぐ真空下での低速乾燥、またはそれらの組み合わせが行われてもよい。異なる分
子が製剤の活性成分である場合、それらは、溶液中で混合されてから乾燥されてもよく、
または乾燥形態のみで混合されてもよい。
【０１３７】
液体または固体形態、例えば乾燥形態のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
単離ポリペプチドを含む製剤は、同じもしくは離れた部位において、または同時もしくは
頻繁な繰り返しの適用により１つまたはそれ以上のアジュバントが適用されてもよい。製
剤は、製剤の投与が複数の抗原に対する免疫反応を誘導するように、他の抗原を含んでも
よい。そのような場合、他の抗原は、異なる抗原に特異的な免疫反応を誘導するように、
異なる化学構造を有してもよい。投与前に、少なくとも１つの抗原および／またはアジュ
バントが乾燥形態で維持されてもよい。後の貯蔵部からの液体の放出または製剤の乾燥成
分を含有する貯蔵部への液体の進入は、少なくとも部分的にその成分を溶解する。
【０１３８】
また、固体（例えば、ナノメートルまたはマイクロメートル寸法の粒子）が製剤中に組
み込まれてもよい。固体形態（例えば、ナノ粒子またはマイクロ粒子）は、活性成分の分
散または可溶化を補助する、抗原提示細胞によりオプソニン化され得る基質への、アジュ
バント、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド、またはその
両方の結合点を提供する、あるいはそれらの組み合わせを提供することができる。シート
、ロッド、またはビーズとして形成された多孔質固体からの製剤の持続放出は、デポー製
剤として作用する。
【０１３９】
製剤の少なくとも１つの成分または構成成分（すなわち、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−
ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド、アジュバント、または薬物）は、製剤の投与前に乾
燥形態で提供されてもよい。この製剤はまた、従来の腸内、粘膜、または非経口免疫化技
術と併せて使用されてもよい。
【０１４０】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は、生物製
剤およびワクチンの適切な規制当局（例えば、食品医薬品局、ＥＭＥＡ）に認可される無
菌条件下で製造され得る。随意に、乾燥剤、賦形剤、安定剤、保湿剤、保存剤、またはそ
れらの組み合わせ等構成成分が、免疫学的に不活性であるとしても、製剤中に含まれても
よい。しかしながら、それらは、他の所望の特性または特徴を有し得る。
【０１４１】
薬学的製剤を製造するためのプロセスは周知である。製剤の構成成分は、薬学的に許容
される担体またはビヒクル、および随意の添加剤（例えば、希釈剤、結合剤、賦形剤、安
定剤、乾燥剤、保存剤、着色剤）の任意の組み合わせと組み合わされてもよい。固体担体
の使用、および乾燥構成成分または免疫原性もしくはアジュバント活性の安定剤の可溶化
を補助する賦形剤の添加が、好ましい実施形態である。一般に、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅ
ｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ 
Ｅｄ．（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ（Ｇｅｎｎａｒｏ，２０
０５，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇ
ｅ  Ｆｏｒｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．（様々な編集者、１９８９−１９９８，Ｍａｒｃｅｌ  
Ｄｅｋｋｅｒ）；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａ
ｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０
０５，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）を参照されたい。
【０１４２】
製薬産業において適正製造基準が知られており、政府機関（例えば食品医薬品局、ＥＭ
ＥＡ）により規制されている。無菌液体製剤は、製剤の意図される構成成分を十分な量の
適切な溶媒に溶解し、続いて汚染微生物を除去するための濾過により滅菌することにより
調製され得る。一般に、製剤の様々な滅菌された構成成分を、基本的分散媒を含有する無
菌ビヒクルに組み込むことにより、分散液が調製される。無菌であることが要求される固
体形態の生成には、真空乾燥またはフリーズドライが使用され得る。
【０１４３】
一般に、固体剤形（例えば、粉末、顆粒、ペレット、錠剤）は、製剤の少なくとも１つ
の活性成分または構成成分から作製され得る。
【０１４４】
好適な錠剤化手順が知られている。また、製剤は、少なくとも１つの活性成分の固体形
態をカプセル化する、または区画もしくはチャンバ内で液体から隔離することにより生成
されてもよい。各用量のサイズおよび対象への投薬の間隔を使用して、錠剤、カプセル、
区画またはチャンバの好適なサイズおよび形状を決定することができる。
【０１４５】
製剤は、人間または動物への投与に好適な薬学的に許容される組成物を提供するために
、担体または好適な量のビヒクルと共に、効果的な量の活性成分（例えば、薬物、抗原お
よびアジュバント）を含有する。
【０１４６】
用量内の活性成分の相対量、例えばＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離
ポリペプチドの量、および投薬スケジュールは、対象（例えば、動物または人間）に対す
る有効な投与のために、適切に調節され得る。この調節はまた、対象の具体的な疾患また
は状態、および治療または予防が意図されるかどうかに依存し得る。対象への製剤の投与
を単純化するために、各単位用量は、単一ラウンドの免疫化のための所定量の活性成分を
含有する。
【０１４７】
加水分解および変質を含むポリペプチドの不安定性または分解のいくつかの場合が存在
する。変質の場合、タンパク質の配置または三次元構造が乱され、タンパク質は、その通
常の球状構造から広がる。自然の配置へのリフォールディングではなく、疎水性相互作用
が分子同士の凝塊化（すなわち凝集）、または異常な配置へのリフォールディングを引き
起こし得る。これらの結果のいずれも、免疫原性またはアジュバント活性の減退または喪
失を伴い得る。そのような問題を低減または防止するために、安定剤が添加されてもよい
。
【０１４８】
製剤、またはその生成における任意の中間体は、保護薬剤（すなわち、抗凍結剤および
乾燥安定剤）で前処理され、次いで氷結晶形成を最小限化する冷却速度および最終温度に
供されてもよい。抗凍結薬剤の適切な選択および事前に選択された乾燥パラメータの使用
により、ほぼいずれの製剤も、好適な所望の最終用途のために凍結調製され得る。
【０１４９】
以下の議論において、賦形剤、安定剤、乾燥剤、および保存剤等の随意の添加剤は、そ
の機能により説明されることを理解されたい。したがって、特定の化学物質は、賦形剤、
安定剤、乾燥剤、および／または保存剤のある組み合わせとして作用し得る。そのような
化学物質は、直接的に免疫反応を誘導しないため、免疫学的に不活性であるが、抗原また
はアジュバントの免疫活性を向上させることにより、例えば、抗原もしくはアジュバント
の改質、または乾燥および溶解サイクル中の変質を低減することにより、反応を増加させ
る。
【０１５０】
安定剤は、シクロデキストリンおよびその変異体を含む（米国特許第５，７３０，９６
９号を参照されたい）。スクロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、デキ
ストラン、およびグリセリン等の好適な保存剤もまた、最終製剤を安定化するために添加
され得る（Ｈｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  １９８３）。非イオン性界面活性剤
、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルク
ロン酸の塩、トレハロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、およびそれらの
混合物から選択される安定剤が、製剤に添加されてもよい。随意に血清アルブミンを含む
アルカリ金属塩または塩化マグネシウムの添加は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．
Ｇ５．１単離ポリペプチドを安定化することができ、フリーズドライによりさらに安定性
が向上され得る。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドはまた
、デキストラン、コンドロイチン硫酸、デンプン、グリコーゲン、インスリン、デキスト
リン、およびアルギニン酸塩からなる群から選択されるサッカリドと接触させることによ
り安定化され得る。添加され得る他の糖は、単糖類、二糖類、糖アルコール、およびそれ
らの混合物（例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、スクロー
ス、マルトース、ラクトース、マンニトール、キシリトール）を含む。ポリオールは、ポ
リペプチドを安定化することができ、水混和性または水溶性である。好適なポリオールは
、マンニトール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチ
ルグリコール、ビニルピロリドン、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンノー
ス、マルトース、スクロース、およびそれらのポリマーを含む、ポリヒドロキシアルコー
ル、単糖類および二糖類であってもよい。血清アルブミン、アミノ酸、ヘパリン、脂肪酸
およびリン脂質、界面活性剤、金属、ポリオール、還元剤、金属キレート剤、ポリビニル
ピロリドン、加水分解ゼラチン、ならびに硫酸アンモニウムを含む様々な賦形剤もまた、
ポリペプチドを安定化し得る。
【０１５１】
一例として、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド製剤は、
賦形剤または安定剤の好適な選択により、スクロース、トレハロース、ポリ（乳酸）（Ｐ
ＬＡ）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア内で安定
化され得る（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。スクロース、またはトレハ
ロースは、非還元性サッカリドであり、したがってタンパク質等のアミノ基を有する物質
とアミノカルボニル反応を引き起こさないため、添加剤として有利に使用され得る。スク
ロースまたはトレハロースは、サッカリド等の他の安定剤と組み合わされてもよい。
【０１５２】
さらに、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は
、例えば麻酔薬、鎮痛剤、抗炎症剤、ステロイド、抗生物質、抗関節炎薬、食欲減退薬、
抗ヒスタミン剤、および抗新生物薬剤等の治療薬剤を含んでもよい。そのような治療薬剤
の例は、リドカインおよび非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む。別の実施形態
において、治療薬剤は、抗原およびアジュバントである。さらに別の実施形態において、
抗原および／またはアジュバントを含む製剤が、別個であるが、例えば麻酔薬、鎮痛剤、
抗炎症剤、ステロイド、抗生物質、抗関節炎薬、食欲減退薬、抗ヒスタミン剤、および抗
新生物薬剤等の他の治療薬剤と共に適用されてもよい。好ましい実施形態において、抗生
物質は、フィダキソマイシン、メトロニダゾールまたはバンコマイシンである。
【０１５３】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は、例えば
筋肉内等の様々な投与経路を介して送達され得る。
【０１５４】
ポリマーは、製剤に添加されてもよく、活性成分の賦形剤、安定剤、および／または保
存剤として作用すると共に、乾燥形態の活性成分を溶解するために使用される溶液を飽和
する活性成分の濃度を低減し得る。そのような低減は、ポリマーが、「空」の空間を充填
することにより溶液の有効体積を低減するために生じる。したがって、抗原／アジュバン
トの量は、飽和溶液の量を低減することなく保存され得る。重要な熱力学的考慮は、飽和
溶液中の活性成分が、より低濃度の領域に「駆動」されるという点である。溶液中では、
ポリマーもまた製剤の可溶化された成分の抗原／アジュバント活性を安定化および／また
は保存することができる。そのようなポリマーは、エチレンまたはプロピレングリコール
、ビニルピロリドン、ならびに０−シクロデキストリンポリマーおよびコポリマーを含む
。
【０１５５】
投与に好適なＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製
剤の単一または単位用量が提供される。単位用量のアジュバントおよび／またはＣ−ＴＡ
Ｂ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの量は、約０．００１μｇから
約１０ｍｇの広い範囲内のいずれかとなり得る。この範囲は、約０．１μｇから約１ｍｇ
であってもよく、より狭い範囲は、約５μｇから約５００μｇである。他の好適な範囲は
、約２０μｇから約２００μｇの間、例えば約２０μｇ、約７５μｇ、または約２００μ
ｇ等である。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの好ましい
用量は、約２０μｇから、または２００μｇ以下である。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−Ｔ
ＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドとアジュバントとの間の比は、約１：１または約１：１
．２５であってもよいが、より高い比が使用されてもよく（例えば、約１：１０以下）、
または、アジュバントに対するＣ−ＴＡＢ単離ポリペプチドのより低い比が使用されても
よい（例えば、約１０：１以上）。
【０１５６】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、抗原として使用さ
れてもよく、免疫細胞に提示されてもよく、抗原特異的免疫反応が誘導される。これは、
Ｃ．ディフィシル等の病原体による感染の前、間、または後に生じ得る。製剤の免疫原性
がアジュバント活性を必要としない程十分である場合は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−Ｔ
ＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドのみが必要で、追加的なアジュバントが必要でなくても
よい。製剤は、製剤の適用が複数の抗原に対して免疫反応を誘導する（すなわち多価であ
る）ように、追加的な抗原を含んでもよい。抗原特異的リンパ球が免疫反応に関与しても
よく、Ｂリンパ球が関与する場合、抗原特異的抗体が免疫反応の一端を担い得る。上述の
製剤は、当該技術分野において知られた乾燥剤、賦形剤、保湿剤、安定剤、および保存剤
を含んでもよい。
【０１５７】
本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は
、対象（例えば、疾患の予防、感染症の影響からの保護、ＣＤＡＤ等の疾患の症状の低減
もしくは軽減、またはそれらに組み合わせ等の治療を必要とする人間または動物）を治療
するために使用され得る。例えば、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．
１単離ポリペプチドを含む製剤は、例えば以下のプロファイルを有する対象等のＣＤＡＤ
のリスクを有する対象を治療するために使用され得る：ｉ）より弱い免疫系を有する対象
、例えば高齢対象（例えば６５歳を超える対象）もしくは２歳未満の対象等；ｉｉ）免疫
力のない対象、例えばＡＩＤＳを有する対象等；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、
もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院してい
る対象；ｖ）集中治療（ＩＣＵ）を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）
消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）養護施設等の長期介
護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは
長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；ｉｘ）上述のプロファイルの
２つ以上を有する対象である対象、例えば消化管手術を受ける予定がある高齢対象等；ｘ
）炎症性大腸炎を有する対象；ならびに／またはｘｉ）再発性ＣＤＡＤを有する対象、例
えばＣＤＡＤの１つ以上のエピソードを経験している対象等。
【０１５８】
治療は、病原体による感染に対して、または毒素分泌により引き起こされるもの等の病
原性作用に対して対象にワクチン接種してもよい。製剤は、既存の疾患を治療するため、
保護的に疾患を予防するため、疾患の重症度および／もしくは期間を低減するため、疾患
の症状を改善するため、またはそれらの組み合わせのために治療的に使用され得る。
【０１５９】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は、経口、
皮下、皮内、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内、胸腔内、腹腔内、心室内、およ
び／または舌下経路を含むがこれらに限定されない様々な投与経路により送達され得る。
【０１６０】
また、製剤は、１つ以上のアジュバントまたはアジュバントの組み合わせを含んでもよ
い。通常、アジュバントおよび製剤は、抗原への提示の前に混合されるが、代替として、
短い時間間隔内に別個に提示されてもよい。
【０１６１】
アジュバントは、例えば、油エマルジョン（例えば、完全または不完全フロイントアジ
ュバント）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント、例えばＩＳＡ、水中
油エマルジョンアジュバント、例えばＲｉｂｉアジュバント系、ムラミールジペプチドを
含有するシンタックスアジュバント製剤、水酸化アルミニウムまたはアルミニウム塩アジ
ュバント（ＡＬＵＭ）、ポリカチオン性ポリマー、特にポリカチオン性ペプチド、特にポ
リアルギニンまたは少なくとも２つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフを含有するペプチド、
特にＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ、定義された塩基コンテクスト内に非メチル化シトシン−グ
アニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含有する免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤ
Ｎ）（例えばＷＯ９６／０２５５５に記載）またはイノシンおよびシチジンに基づくＯＤ
Ｎ（例えばＷＯ０１／９３９０３に記載）またはデオキシイノシンおよび／もしくはデオ
キシウリジン残基を含有するデオキシ核酸（ＷＯ０１／９３９０５およびＷＯ０２／０９
５０２７に記載）、特にＯｌｉｇｏ（ｄＩｄＣ）１３（ＷＯ０１／９３９０３およびＷＯ
０１／９３９０５に記載）、神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン（ＷＯ０１／２４８
２２に記載）、またはそれらの組み合わせ、ケモカイン（例えば、デフェンシン  １もし
くは２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−２、インターロイキン−８、またはサイ
トカイン（例えば、インターロイキン−１β、−２、−６、−１０もしくは−１２；イン
ターフェロン−γ；腫瘍壊死因子−α；または顆粒球単球コロニー刺激因子）（Ｎｏｈｒ
ｉａ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎ，１９９４において考察されている）、ムラミールジペプチド
変異体（例えば、ムラブチド、トレオニル−ＭＤＰまたはムラミールトリペプチド）、Ｍ
ＤＰの合成変異体、熱ショックタンパク質または変異体、森林型熱帯リーシュマニアＬｅ
ＩＦの変異体（Ｓｋｅｉｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、トリプシン切断部位での変異
体を含む細菌ＡＤＰ−リボシル化外毒素の非毒性変異体（ｂＡＲＥ）（Ｄｉｃｋｅｎｓｏ
ｎ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，１９９５）および／または作用性ＡＤＰ−リボシル化（
Ｄｏｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）または化学的解毒ｂＡＲＥ（トキソイド）、ＱＳ
２１、Ｑｕｉｌｌ  Ａ、Ｎ−アセチルムラミール−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−
Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホ
リルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）ならびに代謝可能な油および乳化剤を含有
する組成物であって、油および乳化剤は、実質的に全てが１ミクロン未満の直径を有する
油滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在する組成物（例えば、ＥＰ０３９９８４３
を参照されたい）を含む。また、免疫化に有用な他のアジュバントに関して、Ｒｉｃｈａ
ｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）を参照されたい。
【０１６２】
アジュバントは、抗体もしくは細胞エフェクター、特定の抗体アイソタイプ（例えば、
ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、Ｉｇ
Ｇ３、および／もしくはＩｇＧ４）、または特定のＴ細胞サブセット（例えば、ＣＴＬ、
Ｔｈ１、Ｔｈ２および／もしくはＴＤＴＨ）（例えば、Ｍｕｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９
９０；Ｇｌｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５を参照されたい）を優先的に誘導するように
選択され得る。
【０１６３】
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドまたはモチーフは、Ｂ細胞およびマクロファージを活
性化することが知られている（Ｓｔａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ＤＮＡの他の
形態がアジュバントとして使用されてもよい。細菌ＤＮＡは、免疫系にその病原性の源を
認識させ、先天性免疫応答を刺激して適応免疫反応をもたらすパターンを有する構造のク
ラスに含まれる（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  ａｎｄ  Ｊａｎｅｗａｙ，１９９７，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１）：４−９）。これらの構造は、病原体関連分子パタ
ーン（ＰＡＭＰ）と呼ばれ、リポ多糖類、テイコ酸、非メチル化ＣｐＧモチーフ、二本鎖
ＲＮＡ、およびマンニン（ｍａｎｎｉｎ）を含む。ＰＡＭＰは、炎症反応を媒介し、Ｔ細
胞機能の共刺激因子として作用し、エフェクター機能を制御することができる内因性シグ
ナルを誘導する。これらの反応を誘導するＰＡＭＰの能力は、アジュバントとしての可能
性において役割を果たし、その標的は、マクロファージおよび樹枝状細胞等のＡＰＣであ
る。ＰＡＭＰはまた、異なる共刺激分子を誘導し、異なるエフェクター機能を制御して、
免疫反応、例えばＴｈ２からＴｈ１の反応をガイドするために、他のアジュバントと併せ
て使用されてもよい。
【０１６４】
本発明の他の態様は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド
のワクチン剤としての使用に関する。本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、効果的
な量の抗原を使用し得る。後のＣ．ディフィシルに対する暴露からの対象の保護をもたら
すように、対象に特定の十分な免疫反応を生成させる量の抗原が含まれる。抗原は、Ｃ−
ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドであってもよい。一実施形態
において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、単独で、
またはアジュバントと組み合わせて投与される。
【０１６５】
本発明の別の態様は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド
のサブユニットワクチンとしての使用を含む。サブユニットワクチンは、病原体の断片の
接種薬剤としての使用を指す。当業者には、サブユニットワクチンが、病原体の特定部分
または領域に対する抗体を生成する手段を提供することが分かる。
【０１６６】
ワクチン投与の投薬スケジュールおよびその有効性は、当該技術分野において知られて
いる方法により決定され得る。ワクチンの量および免疫化計画は、特定の抗原および使用
されるアジュバント、投与の様式および頻度、ならびに所望の効果（例えば、保護および
／または治療）に依存し得る。一般に、本発明のワクチンは、１μｇから１００ｍｇの間
、例えば６０μｇから６００μｇの間等の範囲の量で投与され得る。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５ま
たはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含むワクチンの単一用量は、約１μｇから
約１ｍｇ、好ましくは約５μｇから約５００μｇ、より好ましくは約２０μｇから約２０
０μｇの範囲内であってもよい。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリ
ペプチドとａｌｕｍ等のアジュバントとの間の比は、約１：１、例えば１：１．２５等で
あってもよいが、より高い比が使用されてもよく（例えば、約１：１０以下）、またはよ
り低い比が使用されてもよい（例えば、約１０：１以上）。一実施形態において、Ｃ−Ｔ
ＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含むワクチンにおいて、アジ
ュバントである水酸化アルミニウムが、約５０μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬの範囲
内、好ましくは約１２５μｇ／ｍＬ（最終製剤）の量で使用される。
【０１６７】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含むワクチンは、経
口、静脈内、皮下、動脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内、胸腔内、腹腔内、心室内、および
／または舌下により投与され得る。
【０１６８】
免疫化計画は、当該技術分野において知られている方法により決定され得る。ワクチン
の投与は、当業者により必要に応じて決定されるように繰り返されてもよい。例えば、準
備用量に続いて１回、２回、３回、またはより多くのブースター用量が、１週間毎、２週
間毎または１月毎の間隔で投与されてもよい。本発明の一実施形態において、準備用量に
続いて１回または２回のブースター投与が、約７日から約１４日の間隔で、例えば初回投
薬から７日後および２１日後等に投与される。好ましい実施形態において、治療上効果的
な量のワクチンが、２回または３回、１４日＋／−１、２または３日（２週間毎）の間隔
で対象に投与される。本発明の一実施形態において、治療上効果的な量のワクチンが１回
投与される。
【０１６９】
さらに別の態様は、本発明に従い治療され得る集団に関する。一実施形態において、集
団は、Ｃ．ディフィシルへの暴露のリスクを有する健常個人、特に入院または介護施設で
の滞在間際の個人、ならびに病院、養護施設および他の介護施設内の者を含む。別の実施
形態において、集団は、抗生物質治療の停止後に再発した以前に感染していた患者、また
は抗生物質治療が効果的でない患者を含む。
【０１７０】
本発明の１つのさらなる実施形態において、集団は、少なくとも１８歳以上の個人を含
む。１つの好ましい実施形態において、人間対象は、１８歳から６５歳である。別の好ま
しい実施形態において、人間対象は、６５歳を超える高齢者である。後者の年齢群は、Ｃ
．ディフィシル感染を受ける最も脆弱な集団である。いくつかのさらなる実施形態におい
て、人間対象は、１８歳より若い。
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの使用方法
【０１７１】
本発明はまた、単離ポリペプチドを使用する方法を提供する。例えば、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ
５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、Ｃ．ディフィシルに関連した疾患を
予防または治療するために使用され得る。例として、本発明の単離ポリペプチドを対象の
免疫系に導入することは、対象が単離ポリペプチドに対する抗体を産生することを含む免
疫反応を誘導し得る。そのような抗体は、Ｃ．ディフィシルの認識に有用である。
【０１７２】
本発明は、単離ポリペプチドを対象に送達する方法であって、単離ポリペプチドを対象
に投与することを含む方法を提供する。単離ポリペプチドは、液体または固体として投与
され得る。単離ポリペプチドは、さらに、薬学的に許容される担体を含んでもよい。
【０１７３】
また、本発明は、毒素Ａおよび／または毒素Ｂを認識しそれに結合する抗体の可変ドメ
インを識別および単離するための方法であって、免疫反応を生成するためのＣ−ＴＡＢ．
Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの使用と、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ
−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドに応答して生成された抗体を精製し、次いで特性決
定することとを含む方法を提供する。識別されたエピトープは、さらなる抗体またはその
断片のクローニングに使用され得る。
【０１７４】
本発明の一態様は、１つには、Ｃ．ディフィシルの治療、予防、および検出に関する。
いくつかの実施形態において、動物等の対象は、Ｃ．ディフィシルの治療および／または
予防および／または検出を受ける。他の実施形態において、動物は人間である。例えば、
本発明のポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣ．ディフィシルに対する抗体を惹起するた
めに使用され得る。さらなる例として、本発明のポリペプチドは、対象がＣ．ディフィシ
ルに対する抗体を生成するかどうかを決定するために使用され得る。いくつかの実施形態
において、ポリペプチドは、抗体を単離するために使用され得る。例として、ポリペプチ
ドは、親和性マトリックスに結合され得る。
【０１７５】
さらなる例として、本発明の核酸は、細胞を形質転換および／またはトランスフェクト
して、本発明のポリペプチドおよび／または抗体を組み換えにより生成するために使用さ
れ得る。本発明の核酸はまた、例えば、対象がＣ．ディフィシルに感染しているかどうか
を決定するために使用され得る。例として、これは、放射性標識ハイブリダイゼーション
の方法を使用して達成され得る。
【０１７６】
さらなる例として、本発明の抗体は、Ｃ．ディフィシルによる感染を認識するために使
用され得る。例として、抗体は、天然毒素Ａおよび／または毒素Ｂを抗原として認識し得
る。本発明の抗体はまた、Ｃ．ディフィシルによる感染と闘うために使用され得る。例と
して、ヒト化抗体または抗体断片またはモノクローナル抗体は、Ｃ．ディフィシル感染に
対する対象自身の免疫反応を使用し得る。さらなる例として、本発明の抗体は、サイトカ
インまたは毒素または酵素またはマーカーと結合して、感染症の治療および検出を補助し
得る。
【０１７７】
本発明のさらなる態様は、診断アッセイに関する。本発明は、当該技術分野において知
られた多くのアッセイと共に使用される。当業者には、本発明のポリペプチド、核酸およ
び抗体の、広範な研究ベースの使用が認識される。本発明のポリペプチド、抗体および核
酸は、例えば、放射性、化学発光性、蛍光性および／または染色分子等で標識化され得る
。本発明の抗体、核酸およびポリペプチドは、ＤＮＡアッセイ（例えばサザンブロット法
）、ＲＮＡアッセイ（例えばノーザンブロット法）、タンパク質アッセイ（例えばウェス
タンブロット法）、クロマトグラフィー分析（例えばガス、液体、ＨＰＬＣ、サイズ排除
）、免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ）、ならびに構造アッセイ（例えば結晶学およびＮＭ
Ｒ分光法）等のアッセイにおける使用に役立つ。本発明の抗体、ポリペプチドおよび核酸
は、さらに、プローブとして使用され得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイ
もまた、当業者に知られている。
キット
【０１７８】
本発明は、例として、これらに限定されないが、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ
．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．
Ｇ５．１単離ポリペプチド、および／またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
．１単離ポリペプチドに対する抗体を含むキットを提供する。キットは、１つ以上の容器
と、本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従う使用のための説明とを含んでもよい
。本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドおよび／ま
たは抗体は、Ｃ．ディフィシルを検出するための免疫測定法を含む様々なアッセイにおい
て使用され得る。一実施形態において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単
離ポリペプチドは、生体試料中の抗体の検出を目的とした抗原として機能するように役立
つ。容器は、単位用量、大量包装（例えば、複数用量包装）または副次的単位用量であっ
てもよい。本発明のキットは、好適な包装内にある。また、特定のデバイス、例えば吸入
器、経鼻投与デバイス、または注入デバイスと組み合わせた使用のための包装も企図され
る。キットは、無菌アクセスポートを有してもよい。容器もまた、無菌アクセスポートを
有してもよい。キットは、随意に、緩衝剤等の追加的構成成分および解釈情報を提供し得
る。
【０１７９】
キットは、Ｃ．ディフィシルの存在を検出するために、またはＣ．ディフィシルに関連
した疾患、例えばＣＤＡＤを検出するために使用され得る。また、キットは、Ｃ．ディフ
ィシルに関連した疾患を予防または治療するために使用され得る。また、本発明のキット
は、Ｃ．ディフィシルに関連した疾患の症状を軽減するために使用され得る。
【０１８０】
さらなる説明なしに、当業者は、上記説明および以下の例示的な実施例を使用して、請
求される発明を作製および利用することができると考えられる。したがって、以下の実施
例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであり、決して本開示の残りを
制限するものとして解釈されるべきではない。本出願を通して参照される全ての論文、出
版物、特許および文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１８１】
実施例１：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの調製。
本実施例は、大腸菌細胞における発現のためのＣ．ディフィシル毒素Ａ（ＣＴＡ）およ
びＢ（ＣＴＢ）の一部を含む単離ポリペプチドの調製を説明する。後述の方法は、ＣＴＡ
およびＣＴＢを含む様々な単離ポリペプチドを作製するために使用され得る。一例として
、ＣＴＡのＣ末端ドメインの一部およびＣＴＢのＣ末端ドメインの一部を含む単離ポリペ
プチドが説明される。
実施例１．１：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１遺伝子コンストラクトのク
ローニング。
【０１８２】
Ｃ末端ドメインのアミノ酸２０２６から２７１０をコードするＣＴＡ遺伝子（Ａｃｃｅ
ｓｓｉｏｎ番号ＹＰ−００１０８７１３７）の一部を、以下のプライマーを使用して、Ｃ
．ディフィシル株６３０（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１３８２）のゲノムＤＮＡからＰＣＲによ
り増幅した。
順方向：５’−ｃａｃｃＡＣＴＡＧＴａｔｇａａｃｔｔａｇｔａａｃｔｇｇａｔｇｇｃ−
３’（配列番号９）および
逆方向：５’−ＣＴＣＧＡＧｔｔａｇｃｃａｔａｔａｔｃｃｃａｇｇｇｇｃ−３’（配列
番号１０）。
順方向プライマーによる増幅は、ＳｐｅＩ部位を形成し、逆方向プライマーによる増幅は
、Ｘｈｏｌ部位を形成した。
【０１８３】
Ｃ末端ドメインのアミノ酸１８５０から２３６６をコードするＣＴＢ遺伝子（Ａｃｃｅ
ｓｓｉｏｎ番号：ＹＰ−００１０８７３５）の一部を、以下のプライマーを使用してＰＣ
Ｒにより増幅した。
順方向：５’−ｃａｃｃＡＴＧＣＡＴａｔｇａｇｔｔｔａｇｔｔａａｔａｇａａａａｃａ
ｇ−３’（配列番号１１）および
逆方向：５’−ｇｇｃＣＴＣＧＡＧｃｔａｔｔｃａｃｔａａｔｃａｃｔａａｔｔｇａｇｃ
−３’（配列番号１２）。
順方向プライマーによる増幅は、Ｎｓｉｌ部位を形成し、逆方向プライマーによる増幅は
、Ｘｈｏｌ部位を形成した。
【０１８４】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒ−Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して行
った。サイクル条件は、９５℃で２分、９５℃で４５秒、５５℃で５０秒、６８℃で８分
（３０サイクル）、および７２℃で１０分であった。ＰＣＲ生成物は、迅速遺伝子抽出キ
ット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で精製し、ＰＣＲ  ２．１  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ社）にライゲーションした。ライゲーション混合物を使用して、大腸菌Ｍ
ｅｃｈ−１細胞を熱ショックにより形質転換した。形質転換体をＩｍＭｅｄｉａ  Ａｍｐ
Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のプレート上に播種した。白色コロニーを採取し
、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する４ｍｌのＬＢ培地を有する１５ｍｌ管内で
培養した。培養物を３７℃で一晩インキュベートし、プラスミドを迅速プラスミドミニプ
レップキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で抽出した。
【０１８５】
ＰＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯ／ＴＡベクター中のＣＴＡ遺伝子断片をＳｐｅＩおよびＸｈ
ｏＩ，で分解させ、断片を、同じくＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを使用してＳｐｅＩおよ
びＸｈｏＩで分解させた中間ベクターにクローン化した。次いで、３つの制限部位（Ｂｇ
ＬＩＩ−ＮｓｉＩ−ＳａｃＩ）を含有するリンカーを、以下の合成プライマーの組を使用
して、ＰＣＲによりＣＴＡ遺伝子断片の３’端部に挿入した。
順方向：５’−ＡＧＡＴＣＴＡＴＧＣＡＴＧＡＧＣＴＣｃｔｃｇａｇｃｃｃａａａａｃｇ
ａａａｇｇｃｔｃａｇｃ−３’（配列番号１３）
逆方向：５’−ｃｇｇｔｃｃｇｇｇｇｃｃａｔａｔａｔｃｃｃａｇｇｇｇｃｔｔｔｔａｃ
ｔｃｃ−３’（配列番号１４）。
【０１８６】
ＰＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯ／ＴＢ中のＣＴＢ遺伝子断片を、Ｎｓｉｌ  およびＸｈｏｌ
で分解させ、分解されたＣＴＢ遺伝子断片を、同じくＮｓｉＩおよびＸｈｏＩで分解させ
たＣＴＡ遺伝子およびリンカーを含有する中間ベクターにライゲーションした。ＣＴＢ遺
伝子をリンカーに３’位で挿入し、コンストラクト配列５’−ＣＴＡ−リンカー−ＣＴＢ
−３’を形成した。この融合コンストラクトは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｖ１中間ベクターと呼ばれ
る。
【０１８７】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５遺伝子を、以下のプライマーを使用して、Ｃ−ＴＡＢ．Ｖ１中間ベク
ターからＰＣＲにより増幅した。
順方向：５’−ｃａｃｃＣＣＡＴＴＧａｔｇｇｔａａｃａｇｇａｇｔａｔｔｔａａａｇｇ
ａ（配列番号１５）  
逆方向：５’−ＣＴＣＧＡＧｃｔａｔｔｃａｃｔａａｔｃａｃｔａａｔｔｇａｇｃｔｇ（
配列番号１６）。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して行っ
た。サイクル条件は、９５℃で２分、９５℃で４５秒、５５℃で５０秒、６８℃で４分（
３０サイクル）および７２℃で１０分であった。ＰＣＲ生成物は、迅速遺伝子抽出キット
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で精製し、ＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ社）にライゲーションした。ライゲーション混合物を使用して、大腸菌Ｍｅｃｈ
−１細胞を熱ショックにより形質転換した。形質転換体をＩｍＭｅｄｉａ  Ａｍｐ  Ｂｌ
ｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のプレート上に播種した。白色コロニーを採取し、１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する４ｍｌのＬＢ培地を有する１５ｍｌ管内で培養し
た。培養物を３７℃で一晩インキュベートし、プラスミドを迅速プラスミドミニプレップ
キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で抽出した。ＰＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯＴＡベクター
中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５融合遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ  制限酵素で分解させた。
これらのＣ−ＴＡＢ断片を、同じ制限酵素で分解させたｐＥＴ２８発現ベクターにライゲ
ーションした。この得られたコンストラクトは、アミノ酸１８５１から２３６６からの毒
素ＢのＣ末端ドメインに融合した、アミノ酸２２７２から２７１０からの毒素ＡのＣ末端
ドメインをコードする。ｐＥＴ２８／Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５コンストラクトを、発現のために
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５融合遺伝子を含有する５つ
のコロニーを、分析のために選択した。
【０１８８】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１コード配列は、大腸菌宿主細胞内での改善された発現のためのコ
ドン最適化により得られた。コドン使用量は、大腸菌遺伝子のコドンバイアスに基づいて
適合させた。さらに、ｍＲＮＡ半減期を延長するようにＧＣ含量を調節し、非常に高い（
＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域を回避した。したがって、最適
化された遺伝子は、大腸菌における高く安定な発現率を可能とする。コドン最適化された
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１遺伝子は、ｉｎ  ｓｉｔｕで合成し、発現ベクターｐＥＴ−２８ｂ
（＋）にサブクローニングした。
【０１８９】
ＤＮＡ配列決定：ｄ−ローダミン染色によるダイターミネーターサイクル配列決定化学
を使用して、プラスミドＤＮＡ配列を確認した。Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈソフトウェアを使用
して配列決定データを分析した。
実施例１．２：大腸菌における組み換えＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融
合タンパク質の発現
【０１９０】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１遺伝子コンストラクトの発現は、大腸菌
における発現のための標準的手順を使用して行うことができる。
【０１９１】
組み換えＣ−ＴＡＢ融合タンパク質の発現のためのコロニーのスクリーニング：スクリ
ーニングのために、コロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む４ｍｌのＬ
Ｂ培地を有する１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ管内で成長させた。管を２５０ｒｐｍで混合しな
がら３７℃で一晩培養した。初期成長期の後、各管からの１ｍｌの培養物を２４ウェル組
織培養プレートに移し、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクト−プラノシド
（ＩＰＴＧ）で３０℃で３時間発現を誘導した。微小遠心分離機での１２，０００ｇで１
分間の遠心分離により、細胞ペレットを回収した。細胞ペレット溶解物を調製し、可溶性
分画をＣ−ＴＡＢ融合タンパク質の発現に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロ
ット分析により分析した。陽性クローンをさらなる評価のために選択した。
【０１９２】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５発現のための回分発酵：それぞれ３０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加
した１５０ｍｌのＳｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ培地を含有する５００ｍｌの振とうフラスコ内
で、種培養物を成長させた。ＯＤ６００が２〜２．５に達するまで、培養物を２７５ｒｐ
ｍで連続撹拌しながら２８℃で１２時間成長させた。振とうフラスコを使用して、１０Ｌ
のＳｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈを含有する発酵槽を植菌した。ＯＤ６００＝３．５〜４となる
まで、培養物を３７℃で約４．５時間成長させた。生成物発現の誘導のため、０．１ｍＭ
のＩＰＴＧを添加し、２５℃でさらに４時間成長を継続させた。次いで、遠心分離により
細胞を回収し、細胞ペーストを−７０℃で凍結保存した。この発酵プロセスにより達成さ
れた典型的な生成物特異的発現速度は、約２００ｍｇ／ｍｌであった。
【０１９３】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１調製のための流加回分発酵：５００μｌの一定量の種バンクのグ
リセロールストック（−７５℃で保存）を使用して、１Ｌ振とうフラスコ内の３０μｇ／
ｍｌカナマイシンを添加した１００ｍｌの前培養培地を植菌した。前培養物を、ＯＤ６０
０＝１．０〜２．０に達するまで、約１５０ｒｐｍでの一定撹拌下で３７℃で約７時間イ
ンキュベートした。流加回分発酵を行うことができるプロセス制御システムを装備した標
準的産業用１５Ｌ発酵槽内で、２５ｍＬの前培養物を使用して７Ｌの回分発酵培地を植菌
した。グルコースが枯渇するまで、７Ｌの回分培養段階を３７℃で１２時間実行した（Ｏ
Ｄ６００＝１２〜１５）。次いで、急激供給モードにより、特定の成長速度定数μ＝０．
２５／時間で３７℃で６時間（ＯＤ６００＝４０〜５０）、グルコース供給段階（バイオ
マス生成）を開始した。一定供給段階への切り替えおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧ（生成物生成
）の最終濃度での誘導の１時間前に、温度を３０℃に低下させて、封入体形成のリスクを
低減した。３０℃における一定供給での生成物発現段階をさらに５時間継続し（ＯＤ６０
０＝約１００）、２３時間の全発酵プロセス時間および約８．２Ｌの最終培養物体積を得
た。遠心分離により約１．２ｋｇの湿潤細胞バイオマスを回収し、−７０℃以下で保存し
た。そのような流加回分発酵により達成された典型的な生成物特異的発現速度は、最大１
．３ｇ／Ｌであった。
実施例１．３：組み換えＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質の
精製。
【０１９４】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５分析試料の精製：凍結細胞ペーストを解凍して、ｐＨ５．６の１０ｍ
Ｍクエン酸／ＮａＯＨ緩衝液中に再懸濁し、細胞スラリーを５５０バールでホモジナイザ
（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉホモジナイザ）に２回通過させた。懸濁液を２回、つま
り１３５００ｒｐｍで３０分を１回、および２回目に超遠心分離機内で１８０００ｒｐｍ
で１時間遠心分離した。上澄みをプールし、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３）でｐＨを
５．６に調節した。浄化された細胞溶解物を、ｐＨ５．６の１０ｍＭクエン酸／ＮａＯＨ
緩衝液と共にＳＰ急速流動カラムに通過させた。タンパク質を、２０ｍＭ  ＮａＰｉ中０
ｍＭから５００ｍＭに増加する塩化ナトリウムの線形勾配で溶出した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５
を含有する分画をプールした。蒸留Ｈ２Ｏにより伝導度を５ｍＳ／ｃｍまで下方調節した
。２５ｍＭの最終濃度までトリスを添加した。プールした分画をＤＥＡＥ急速流動カラム
に通過させた。タンパク質を、２５ｍＭトリス中５０ｍＭから５００ｍＭに増加する塩化
ナトリウムの線形勾配で溶出した。再び、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５を含有する分画をプールし、
０．４Ｍの最終濃度まで１．５Ｍクエン酸Ｎａ（ｐＨ７．５）を添加した。Ｃ−ＴＡＢ．
Ｖ１プールを、２５ｍＭトリス、０．４Ｍクエン酸Ｎａ（ｐＨ  ７．５）で平衡化された
フェノールセファロースＨＰカラムに投入した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５融合タンパク質を、５
ｍＭトリス（ｐＨ７．５）を使用して線形勾配で低下する塩濃度で溶出した。全てのカラ
ムを、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅクロマトグラフィーシステムにより監視した。精製されたＣ
−ＴＡＢ融合タンパク質を、５０Ｋ膜を使用してＰＢＳに緩衝液交換した。
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１バルク調製物の精製：バイオマスを、処理まで−８０℃で保存した
。４５０ｇの凍結細胞ペースト（２．９０Ｌの発酵槽に相当）を、４体積の溶解緩衝液（
２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、約０．６ｍＳ／ｃｍ）で希釈し（例えば４５０ｇの
ペースト＋１８００ｍＬの緩衝液）、このようにして約１時間±０．５時間、機械的撹拌
下で解凍した。随意の残りの塊を、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを使用して（例えば８０００
ｒｐｍで５分間）再懸濁することができる。細胞溶解は、Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ  Ｐａｎ
ｄａ高ホモジナイザで行う（６４０±２５バール、３サイクル）。熱交換器を使用して溶
解物を１０℃未満まで冷却し、遠心分離までこの温度で維持する。粗細胞溶解物を、１４
０００ｒｐｍ（３００００ｇ）で４℃で３０分間、バッチ遠心分離ステップ（Ｂｅｃｋｍ
ａｎｎ  Ａｖａｎｔｉ  ＪＬＡ  ６０．２５）に供する。上澄みを回収してプールする。
濾過ステップの詰まりのリスクを低減するために、ペレットの半液体部分も廃棄する。次
いで、プールされた上澄みをＳｕｐｅｒｃａｐ  ＰＤＨ４  １００／５インチ深さのフィ
ルタカプセル（Ｐａｌｌ社）（２５０ｃｍ2有効濾過面積）を通して濾過する。フィルタ
ハウジング内の残りの溶解物を、溶解緩衝液で洗い流す。浄化後、１Ｍトリス原液（ｐＨ
７．５）の一定量を、２５ｍＭ．の最終濃度まで溶解物に添加する。最終溶解物の緩衝組
成物は、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５、伝導度約６ｍＳ／ｃｍ）
である。溶解物は濾過後もまだ若干混濁している可能性があるが、これはその後の捕捉ス
テップに影響しない。捕捉ステップは、直径５０ｍｍ、充填層高さ２０ｃｍ、充填層体積
約４００ｍＬの寸法を有するＸＫ５０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に
おいて、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で室温
で行う。投入密度は、約０．８ｇから１．２ｇバイオマス／ｍＬゲルである。プロセスは
、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により行い、
２８０ｎｍで監視する。平衡化は、１００ｃｍ／時間で、約５ＣＶの２５ｍＭトリス、２
０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５、伝導度約５ｍＳ／ｃｍ）を用い
て、ｐＨ、伝導度および２８０ｎｍ吸光度が安定するまで行う。溶解物を７５ｃｍ／時間
でカラムに投入し、通過物を廃棄する。全ての濾過された溶解物を投入したら、２８０ｎ
ｍ吸光度が安定化するまで、流動を約５ＣＶの平衡化緩衝液で再開する。５ＣＶの２５ｍ
Ｍトリス、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５、伝導度１９ｍＳ／ｃｍ）による洗浄ステ
ップ２の間に不純物をカラムから除去する。３ＣＶの２５ｍＭトリス、３７５ｍＭ  Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ７．５、伝導度３６ｍＳ／ｃｍ）での段階的溶出により、Ｃ−ＴＡＢタンパク
質をカラムから溶出する。２８０ｎｍ吸光度が増加し始めたら（通常１ＣＶ後）、Ｃ−Ｔ
ＡＢ含有分画の回収を開始し、約０．５ＣＶから１．０ＣＶの間継続する。Ｃ−ＴＡＢを
含有するプールされた分画は、２〜８℃で一晩保存することができる。中間精製ステップ
は、直径５０ｍｍ、充填層高さ２０ｃｍ、充填層体積約４００ｍＬの寸法を有するＸＫ５
０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）において、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で室温で行う。最大投入密度は、約４〜５ｍｇ
Ｃ−ＴＡＢ／ｍＬゲルである。プロセスは、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（Ｇ
Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により行い、２８０ｎｍで監視する。平衡化、洗浄および
線形勾配溶出ステップを、過度の背圧（＞４バール）により妨げられない限り、２００ｃ
ｍ／時間（６５ｍＬ／分）の最大流速で行う。ｐＨ、伝導度および２８０ｎｍ吸光度が安
定となるまで、約５〜１０ＣＶの緩衝液Ｇで２００ｃｍ／時間で平衡化を行う。投入前に
、ＳＰ−ＦＦ樹脂上へのＣ−ＴＡＢの結合を可能とするようにＤＥＡＥプールを調節する
必要がある。最終伝導度が３．５ｍＳ／ｃｍ（ｐＨ５．５±０．１）以下となるまで、Ｓ
Ｐ−ＦＦ平衡化緩衝液（１０ｍＭクエン酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ５．５±０．１、伝
導度約２ｍＳ／ｃｍ））でＤＥＡＥプールを２５倍希釈する。必要な場合は、所望の伝導
度を達成するために追加のＭｉｌｌｉＱ水を添加する。ＳＰ−ＦＦ上へのＣ−ＴＡＢの結
合を可能とするためには、低い伝導度が極めて重要であることに留意されたい。試料を１
５０ｃｍ／時間でカラムに投入し、通過物を廃棄する。試料の投入後、２８０ｎｍ吸光度
が安定化するまで、流動を約５ＣＶの平衡化緩衝液で２００ｃｍ／時間で再開する。０％
平衡化緩衝液から、１０ＣＶを超える３０％  ２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ  
ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）まで、１００ｃｍ／時間の線形勾配により溶出を行う。分画を回
収し、ＵＶ２８０ｎｍ吸光度によりプールを行う。プールは、ピーク最大値の１５％で開
始し、ピーク最大値の１５％で終了する。１．５Ｍクエン酸原液（ｐＨ８．０）を使用し
て、プールをすぐに４００ｍＭのクエン酸（最終ｐＨ７、約４９ｍＳ／ｃｍ）まで調節す
る。調節されたＳＰＦＦプールは、ｐＨ７および約４９ｍＳ／ｃｍを有するべきであり、
２〜８℃で一晩保存される。
【０１９５】
ポリッシングクロマトグラフィーステップは、直径５０ｍｍ、充填層高さ１５ｃｍ、充
填層体積約３００ｍＬの寸法を有するＸＫ５０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ社）において、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ社）で室温で行う。投入密度は、約４〜５ｍｇ  Ｃ−ＴＡＢ／ｍＬゲルである。プロセ
スは、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により行
い、２８０ｎｍで監視する。平衡化、投入、洗浄および溶出ステップを、過度の背圧（＞
４バール）により妨げられない限り、１００ｃｍ／時間（３３ｍＬ／分）の最大流速で行
う。そのような場合、流速を低下させる必要がある。平衡化は、１００ｃｍ／時間で、約
５〜１０ＣＶの２５ｍＭトリス、４００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５、４６ｍＳ
／ｃｍ）を用いて、ｐＨ、伝導度および２８０ｎｍ吸光度が安定するまで行う。試料を１
００  ｃｍ／時間でカラムに投入し、通過物を廃棄する。試料の投入後、２８０ｎｍ吸光
度が安定化するまで、流動を約５ＣＶの平衡化緩衝液で１００ｃｍ／時間で再開する。１
００％平衡緩衝液／０％  ５ｍＭトリス（ｐＨ７．５、０．５ｍＳ／ｃｍ）から、２０Ｃ
Ｖを超える１００％  ５ｍＭトリス（ｐＨ７．５、０．５ｍＳ／ｃｍ）まで、１００ｃｍ
／時間の線形勾配により溶出を行う。分画を回収し、ＵＶ２８０ｎｍ吸光度によりプール
を行う。プールは、ピーク最大値の約１０〜１５％で開始し、ピーク最大値の約２０％で
終了する。調節されたプールを、２〜８℃で一晩保存する。最終Ｃ−ＴＡＢ原薬タンパク
質溶液の調製は、室温で操作される３０ｋＤａカットオフ接線流濾過（ＴＦＦ、Ｐｅｌｌ
ｉｃｏｎ  ２膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により達成される。タンパク質溶液は、透過物ｐ
Ｈが６．５±０．２と等しくなるまで、製剤緩衝液（２０ｍＭヒスチジン、７５ｍＭ  Ｎ
ａＣｌ、５％スクロース、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ｐＨ６．５））
に対して膜分離される。
【０１９６】
２８０ｎｍでのＵＶ測定に従い、Ｃ−ＴＡＢ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬ、１ｃｍキ
ュベット）の２８０ｎｍにおける比吸光係数として１．５６６を使用して、最終タンパク
質濃度を２ｍｇ／ｍＬに調製する。
【０１９７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析：全細胞溶解物および精製Ｃ−ＴＡＢ
．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質を、ベータ−メルカプトエタノールを
含有するＮｕ−Ｐａｇｅ試料緩衝液中に再懸濁し、１０分間煮沸した。試料（２５μｌ）
を３〜８％トリス−アセテートゲル上に投入した。電気泳動（１５０Ｖで１時間）後、単
純に青色染色によりゲルを染色することによりタンパク質を可視化し、またはウェスタン
ブロット分析に使用した。
【０１９８】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１特異的発現を、毒素特異的抗体を使用し
たウェスタンブロット分析により決定した。１０％メタノール中の１×トランスファー緩
衝液を使用して、タンパク質を２３Ｖで６０分間ＰＶＤＦ膜に移した。リン酸緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）中０．５％のカゼインで、膜を室温で１時間ブロックした。毒素Ｂに対す
るモノクローナル抗体（ＧｅｎＷａｙ；クローンＢ４２６Ｍ）または独自に得た毒素Ａに
対するモルモットポリクローナル抗体（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｓ）と
共に、トランスファー膜を室温で２時間インキュベートした。洗浄した膜を、ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ複合化抗モルモットＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧと共にインキ
ュベートした。ブロットを洗浄し、ＡＥＣ基質を添加した。ブロットを穏やかに混合しな
がら５〜１０分間インキュベートした。ブロットを水で濯ぎ、発色を停止させた。
【０１９９】
ＲＢＣ血球凝集：毒素Ｂではなく毒素Ａの細胞結合ドメインは、ウサギ赤血球（ＲＢＣ
）を凝集することができることが示されている。凝集プロセスは、毒素Ａ  がウサギＲＢ
Ｃに対する血液抗体において見られるグリカン配列に結合した結果である。試料（Ｃ−Ｔ
ＡＢ．Ｇ５および天然毒素Ａ）を、ＰＢＳ中で１００μｇ／ｍｌに希釈する。Ｖ字底マイ
クロタイタープレート内で、２倍連続希釈物をプレートにわたり２回調製し、１００μｇ
／ｍｌから開始して５０μｌの希釈物を各ウェルに残す。５０マイクロリットルの０．７
５％ウサギＲＢＣ／ＰＢＳ懸濁液をマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、プレ
ートを室温で１時間インキュベートする。プレート底部でのＲＢＣペレット形成の失敗に
より、血球凝集が示される。試料の血球凝集力価は、ＲＢＣペレットが観察されない最大
試料希釈物を有するウェル内に存在するタンパク質の濃度により表現される。
実施例２：マウスにおけるａｌｕｍの存在下および非存在下での組み換えＣ−ＴＡＢ．Ｇ
５融合タンパク質の用量力価測定。
【０２００】
本試験は、Ｃ−ＴＡＢ有効性アッセイとしての、ａｌｕｍアジュバントあり、およびな
しでのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５のｉｎ  ｖｉｖｏ用量力価測定の実現可能性を決定するためのも
のであった。使用したａｌｕｍは、Ａｌｙｄｒａｇｅｌ（水酸化ａｌｕｍ、Ｂｒｅｎｎｔ
ａｇ社）であった。８週から９週齢の間のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒ
ｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ．）を、免疫化に使用した。全ての動物は、０日目に右大腿筋への筋
肉内（ＩＭ）注射（５０μｌ）による第１の免疫化を受けた。第２の免疫化は、１４日目
に左大腿筋へのＩＭ注射により行った。全部で７２匹のマウスを、以下のようにワクチン
接種された１２の群に分割した。
・群１：ＰＢＳのみ
・群２：１００（１５４）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群３：３００（４６２）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群４：１，０００（１，５４０）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群５：３，０００（４，６２０）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群６：１０，０００（１５，４００）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群７：５０μｇのａｌｕｍを含むＰＢＳ
・群８：５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨを含む１０．０（１５．４）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群９：５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨを含む３０．０（４６．２）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群１０：５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨを含む１００（１５４）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群１１：５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨを含む３００（４６２）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群１２：５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨを含む１，０００（１，５４０）ｎｇのＣ−ＴＡＢ
．Ｇ５
【０２０１】
本試験では、まず、標準プロトコルＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に従い、タンパク質濃度を測定した
。後に、実施例１．３に記載の手順に従い、２８０ｎｍでのＵＶ測定によりタンパク質濃
度（括弧内に示す）を再び測定した。追跡調査では、ＵＶ法によりタンパク質濃度を測定
した。
【０２０２】
第１の免疫化から２週間後（試験１４日目）、および第２の免疫化から２週間後（試験
２８日目）に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した
。
【０２０３】
血清ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１（Ｃ−ＴＡ
Ｂと呼ばれる）、毒素Ａおよび毒素Ｂまたはそのトキソイドに対し惹起された血清抗体を
、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）において評価した。簡潔に述べると、１．０μｇ／ｍｌ
の毒素Ａ、毒素ＢまたはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５単離ポリペプチドの原液を、ＰＢＳ中で調製し
、１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。４℃で一晩のインキュベーショ
ン後、プレートを洗浄し、０．５％カゼインブロック緩衝液でブロックした。プレートを
再び洗浄し、試験血清の連続２倍希釈物をプレートに加えた。第２の４℃で一晩のインキ
ュベーション後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ複合化抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
と共にインキュベートした。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを再び洗浄
し、ペルオキシダーゼ基質（２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−
スルホネート）を添加し、室温で２時間発色させた。５０μｌの２％ＳＤＳをウェルに添
加することにより、反応を停止させた。プレートを４０５ｎｍの吸収でＥＬＩＳＡプレー
トリーダーで読み出した。血清抗体力価は、ＥＬＩＳＡ単位の幾何平均として報告される
が、これは、１．０のＯＤ  ４０５ｎｍ読み出しをもたらす血清希釈である。陰性対照と
して、第１の免疫化の前にプレブリードされた動物から得られた事前免疫化血清のプール
試料を使用して、抗体反応を評価した。
【０２０４】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５を与えられた動物は、抗体力価の用量依存的な増加を示し、ａｌｕｍ
アジュバントは、より低いＣ−ＴＡＢ．Ｇ５の用量で大幅に改善された抗体力価を可能に
した。図３は、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ  ＩｇＧの力価を示す。図４は、
ａｌｕｍの存在下または非存在下での抗体力価のグラフ比較を示す。
実施例３：マウスにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５の免疫原性および保護効果
【０２０５】
本試験は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａまたは毒素Ｂの致死的負荷を受けたワクチン接種マ
ウスにおける、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５の免疫原性および保護効果を評価するためのものであっ
た。６〜７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ．）
を本試験に使用した。全ての動物は、０日目に右大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μ
ｌ）による第１のワクチン接種を受けた。第２のワクチン接種は、１４日目に左大腿筋へ
のＩＭ注射により行った。１１６匹のマウスを、以下のようにワクチン接種された群に分
割した。
・群１：ＰＢＳのみ
・群２：３μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群３：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群４：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群５：３μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
・群６：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
・群７：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
・群８：ＰＢＳのみ
・群９：３μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５ 
・群１０：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群１１：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群１２：３μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
・群１３：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
・群１４：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
【０２０６】
第２の免疫化から２週間後（試験２８日目）に、全ての動物から血液試料を回収した。
分析まで血清を−２０℃で保存した。次いで、Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する
血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として報告した。
【０２０７】
図５は、第２の免疫化から２週間後（試験２８日目）に評価された、マウスにおけるＣ
−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価を示す。本試験は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ
５融合タンパク質がマウスにおいて極めて免疫原性であり、アジュバントを添加しなくて
も、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に対して強い抗体反応を誘導し得ることを示した。Ｃ−Ｔ
ＡＢ．Ｇ５免疫原性は、水酸化ａｌｕｍとの併用送達により大きく増強され得る（１対数
超）。ａｌｕｍあり、またはなしでＣ−ＴＡＢ．Ｇ５を与えられた動物は、片対数用量範
囲にわたり抗体反応の２倍の増加を示した。
【０２０８】
抗体力価の評価に加えて、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５による免疫化により生成された抗体を、ｉ
ｎ  ｖｉｔｒｏ毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）において、天然毒素ＡおよびＢを中和する能
力に関して評価した。
【０２０９】
毒素中和抗体アッセイ（ＴＮＡ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析のために、１２５μｌの毒素
Ａ（５ｎｇ／ｍｌ）または毒素Ｂ（１ｎｇ／ｍｌ）を、免疫化マウスから得られた抗血清
の１２５μｌの連続希釈物と共にインキュベートした。３７℃で１時間のインキュベーシ
ョン後、毒素：血清混合物を、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）を含有するマイクロタイタ
ーウェルに加え、マイクロタイタープレートを１８時間インキュベートした。毒素Ａまた
はＢおよびＶｅｒｏ細胞のインキュベーションは、細胞形態の変化、および非接着性細胞
の除去後の毒素処理細胞の中性赤色染色により測定される細胞接着の喪失をもたらした。
血清の毒素中和力価は、毒素活性の５０％低減をもたらす血清希釈として報告される。
【０２１０】
ＴＮＡアッセイの結果を図６に示す。データは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５のみでの免疫化後に
生成された抗体が、天然毒素Ａの毒性活性を中和することができるが、毒素Ｂは中和でき
ないことを示している。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５がａｌｕｍと併用送達された場合、ＴＮＡ力価
は、抗毒素Ａ  ＴＮＡにおいて約６倍の増加を伴って増強され、抗毒素Ｂ  ＴＮＡにおい
てはわずかに２分の１低い力価であった。このデータは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５単離ポリペプ
チドが、天然毒素中に存在する抗体認識抗原エピトープを保持するだけでなく、機能的毒
素中和抗体の生成に必要とされる重要な抗原エピトープも含むことを示している。このよ
うに、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの毒性作用の中和に効
果的であり、したがってワクチン接種に有用である。
【０２１１】
抗体反応の評価に加えて、マウスを天然毒素の致死的負荷から保護するＣ−ＴＡＢ．Ｇ
５免疫化の能力を決定した。第２のワクチン接種から３週間後（試験３５日目）に、ワク
チン接種および非ワクチン接種群（Ｎ＝８）内の動物は、２５ｎｇの毒素Ａまたは５０ｎ
ｇの毒素Ｂの致死用量を腹腔内（ＩＰ）投与により受けた。マウスの生存率をその後９日
間にわたり監視したが、その結果を図６に示す。本実験は、ａｌｕｍアジュバントの非存
在下でのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５によるマウスの免疫化が、天然毒素Ａによる致死的負荷に対し
１００％の保護、および毒素Ｂ負荷に対する５０％の保護を付与することができることを
実証した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５のＡｌｕｍとの併用送達は、毒素Ｂに対する保護免疫を１０
０％保護まで向上させた。このデータは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５ワクチン接種が、致死的負荷
モデルにおいて、マウスを毒素Ａおよび毒素Ｂの両方の毒性作用から保護するのに十分な
免疫反応を誘導することを示している。
実施例４：幼若および老齢マウスにおける、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５の免疫原性および保護効果
の評価。
【０２１２】
本試験は、幼若および老齢マウスにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５に対する免疫反応を比較す
るためのものであった。それぞれ６〜７週齢および１８ヶ月齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス
（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ．）を本試験に使用した。全ての動物は、０日
目に右大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μｌ）による第１のワクチン接種を受けた。
第２のワクチン接種は、１４日目に左大腿筋へのＩＭ注射により行った。１９２匹のマウ
スを、以下のようにワクチン接種された群に分割した。
−群１：幼若マウスへのＰＢＳ
−群２：老齢マウスへのＰＢＳ
−群３：幼若マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５ 
−群４：幼若マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５ 
−群５：老齢マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５ 
−群６：老齢マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５ 
−群７：幼若マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群８：幼若マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群９：老齢マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群１０：老齢マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群１１：幼若マウスへのＰＢＳ
−群１２：老齢マウスへのＰＢＳ
−群１３：幼若マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５ 
−群１４：幼若マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
−群１５：老齢マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
−群１６：老齢マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ  ５ｔｈ  
−群１７：幼若マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群１８：幼若マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋  ５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群１９：老齢マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群２０：老齢マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
【０２１３】
第２のワクチン接種から３週間後（試験３５日目）に、ワクチン接種および非ワクチン
接種群（Ｎ＝６）内の動物は、２５ｎｇの毒素Ａまたは５０ｎｇの毒素Ｂの腹腔内（ＩＰ
）注射により致死的負荷を受けた。マウスの生存率をその後９日間にわたり監視した。
【０２１４】
第１の免疫化から２週間後（試験１４日目）、および第２の免疫化から２週間後（試験
２８日目）に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した
。次いで、Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより
測定し、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として報告した。毒素Ａおよび毒素Ｂ中和抗体（ＴＮＡ
）を、細胞毒性量の組み換え毒素Ａおよび毒素Ｂで処理されたＶｅｒｏ細胞を使用して決
定した。
【０２１５】
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５ワクチンを与えられた幼若動物は、老齢動物と比較してより大幅に高
いレベルの試験した全ての抗体を示した。水酸化ａｌｕｍの存在下でＣ−ＴＡＢ．Ｇ５を
ワクチン接種された幼若マウスにおいて特に高い抗体力価が得られた（図７）。毒素Ｂ  
ＴＮＡ力価において特に顕著な改善が達成された。同時に、毒素Ａおよび毒素Ｂ負荷に耐
える能力において、幼若マウスと老齢マウスとの間に大きな差はなかった。しかしながら
、両群とも、ａｌｕｍの存在下でワクチン接種された場合、改善された保護率を示した。
図７は、幼若マウス対老齢マウスにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５免疫原性および保護効果の比
較を示す。図８は、幼若および老齢マウスにおける抗Ｃ−ＴＡＢ抗体増加の反応速度を示
す。
実施例５：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ならびにとトキソイドＡおよびＢの免疫原性および保護
効果の比較。
【０２１６】
本試験は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１対トキソイドＡ／Ｂの免疫原性および保護効果を比較
するためのものであった。使用したトキソイドＡ／Ｂは、等量（１：１）のトキソイドＡ
（ロット＃１００９１３２）およびトキソイドＢ（ロット＃１００９１３３）の混合物で
あった。トキソイドは、ホルマリン固定により調製され、ＴｅｃｈＬａｂにより提供され
た。６〜７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ．）
を本試験に使用した。全ての動物は、０日目に右大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μ
ｌ）による第１のワクチン接種を受けた。第２のワクチン接種は、１４日目に左大腿筋へ
のＩＭ注射により行った。１８０匹のマウスを、以下のようにワクチン接種された群に分
割した。
−群１：ＰＢＳのみ
−群２：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
−群３：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
−群４：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群５：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群６：３０μｇのトキソイドＡ／Ｂ
−群７：１０μｇのトキソイドＡ／Ｂ
−群８：３０μｇのトキソイドＡ／Ｂ＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群９：３０μｇのトキソイドＡ／Ｂ＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群１０：ＰＢＳ
−群１１：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
−群１２：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
−群１３：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群１４：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群１５：１０μｇトキソイドＡ／Ｂ
−群１６：３０μｇのトキソイドＡ／Ｂ
−群１７：１０μｇのトキソイドＡ／Ｂ＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
−群１８：３０μｇのトキソイドＡ／Ｂ＋５０μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
【０２１７】
第２のワクチン接種から３週間後（試験３５日目）に、ワクチン接種および非ワクチン
接種群（Ｎ＝６）内の動物は、２８ｎｇの毒素Ａまたは５０ｎｇの毒素Ｂの腹腔内（ＩＰ
）注射により致死的負荷を受けた。マウスの生存率をその後９日間にわたり監視した。
【０２１８】
第１の免疫化から２週間後（試験１４日目）、および第２の免疫化から２週間後（試験
２８日目）に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した
。次いで、Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより
測定し、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として報告した。毒素Ａおよび毒素Ｂ中和抗体（ＴＮＡ
）を、細胞毒性量の組み換え毒素Ａおよび毒素Ｂで処理されたＶｅｒｏ細胞を使用して決
定した。
【０２１９】
本研究は、２回のワクチン接種後のマウスにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１およびトキソ
イドＡ／Ｂの免疫原性および保護効果を実証する。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を与えられた動
物は、トキソイドＡ／Ｂを与えられた動物と比較して、より低いが有意な抗Ｃ−ＴＡＢ抗
体力価を示した。また、ａｌｕｍの併用送達は、全ての試験された抗体反応を大きく増強
した。結果として、ａｌｕｍの存在下でＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１またはトキソイドＡ／Ｂで
免疫化された動物において達成された抗Ｃ−ＴＡＢおよび抗毒素Ａ抗体のレベルは、同様
である。マウスがＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化された場合、トキソイドＡ／Ｂで免疫化
されたマウスと比較して、抗毒素Ｂ抗体は僅かにより低い抗体力価が観察された。注目す
べきことに、毒素分子のＣ末端部分におけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１認識エピトープに対し
て生成された抗体とは異なり、トキソイド免疫化により誘導された抗体は、毒素分子のＮ
末端部分に特異的であり、これは抗毒素ＥＬＩＳＡにおいて読み出された。したがって、
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１およびトキソイドＡ／Ｂで免疫化されたマウスにおいて生成された
抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体は、異なる特異性の抗体であり、したがって直接比較するこ
とはできない。しかしながら、データは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１免疫化に対する抗体反応
が、トキソイドによる免疫化の場合と同様に著しく高いことを示している。さらに、毒素
負荷試験は、マウスを致死的負荷から保護するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１免疫化の能力が、ト
キソイドＡおよびＢの保護効果に匹敵することを実証した。図９は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．
１およびトキソイドＡ／Ｂの免疫原性の比較を示す。図１０は、トキソイドＡ／Ｂで免疫
化されたマウスと比較して、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたマウスに対する毒素中
和および保護データを示す。
実施例５．１：異なる免疫化計画におけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の抗体力価および保護効
果の比較。
【０２２０】
本研究は、異なる免疫化計画で３回のワクチン投薬を受けたマウスにおける、Ｃ−ＴＡ
Ｂ．Ｇ５．１の免疫原性および保護効果を比較するためのものであった。６〜７週齢の雌
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ．）を本試験に使用した
。１３５匹のマウスを、１４の群に分割した。群番号２〜１３における全ての動物は、以
下に示す日に、右大腿筋または左大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μｌ）により、３
回のワクチン接種を受けた。群１および８内のマウスは、ワクチン接種を受けず、陰性対
照として役立った。以下のように免疫化を行った。
【０２２１】
【表３】
2019163310.tif 000004
【０２２２】
試験０、３、７、１４、２１、２８、３５および４２日目に、全ての動物から血液試料
を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した。Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対
する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として報告した
。試験４２日目に、毒素Ａおよび毒素Ｂ中和抗体（ＴＮＡ）を、細胞毒性量の組み換え毒
素Ａおよび毒素Ｂで処理されたＶｅｒｏ細胞を使用して決定した。
【０２２３】
最後のワクチン接種から３週間後（試験４９日目）に、ワクチン接種および非ワクチン
接種群（Ｎ＝８）内の動物は、２８ｎｇの毒素Ａまたは５０ｎｇの毒素Ｂの腹腔内（ＩＰ
）注射により致死的負荷を受けた。マウスの生存率をその後９日間にわたり監視した。
【０２２４】
本試験は、第３のワクチン接種から２週間後または試験３５および４２日目に測定され
た全ての抗体力価が、全ての免疫計画において同等であるが、０／１４／２８の免疫化計
画が最良の免疫反応を示すことを実証している。第２のワクチン接種から２週間後に測定
された抗体力価を比較すると、０／１４／２８の免疫化計画が、０／７／２１の免疫化計
画よりも良好であり、０／３／１４の免疫化計画よりもはるかに良好である。本試験によ
り、抗原が水酸化アルミニウムと併用注射された場合、抗毒素Ａ／Ｂ抗体力価が大幅に向
上することが確認された（データは示さず）。試験はまた、ａｌｕｍと共に２回のワクチ
ン投薬が２週間の間隔をおいて行われた場合でも、３回のワクチン投薬後に得られるレベ
ルに匹敵する高い抗体レベルを惹起し得ることを示している。
【０２２５】
毒素Ａ／Ｂ中和抗体のレベルは、０／７／２１および０／１４／２８の免疫化計画にお
いて、０／３／１４の免疫化計画よりもはるかに高い。
【０２２６】
毒素Ａによる負荷に対する完全な保護は、０／７／２１および０／１４／２８の免疫化
計画においてａｌｕｍを必要としないが、０／３／１４においては必要とする。ａｌｕｍ
ありでの０／１４／２８の免疫化計画は、毒素Ｂ負荷に対して最も高いレベルの保護（８
７．５％）を誘導し、一方０／７／２１の免疫化計画は、３７．５％の保護を提供し、０
／３／１４は、２８．６％の保護を示す。本試験の結果を図２０に示す。
実施例６：ハムスターにおける組み換えＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質の免疫原性
および保護効果の評価。
【０２２７】
本試験は、異なる動物モデルにおける、アジュバントあり、またはなしで投与された組
み換え融合タンパク質Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性をさらに評価するためのものであ
った。
【０２２８】
７週齢を超える体重８０ｇから９０ｇの雌ハムスター（Ｈａｒｌａｎ社）を本試験に使
用した。全ての動物は、０日目に右大腿筋へのボーラス（５０μｌ）筋肉内（ＩＭ）注射
による第１のワクチン接種を受けた。第２のワクチン接種は１４日目に左大腿筋へのＩＭ
注射により行われ、第３のワクチン接種は２８日目にＩＭ注射により行われた。ハムスタ
ーを群（Ｎ＝６）に分割し、以下のようにワクチン接種した。
・群１：製剤緩衝液のみ
・群２：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
・群３：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１００μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
・群４：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
・群５：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１００μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
・群６：１００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
・群７：１００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１００μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
・群１０：製剤緩衝液のみ
・群１１．１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
・群１２．１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１００μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
・群１３．３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
・群１４．３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１００μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
・群１５．１００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
・群１６．１００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１００μｇのａｌｕｍ  ＯＨ
【０２２９】
第３のワクチン接種から２週間後（試験４２日目）に、ワクチン接種および非ワクチ
ン接種群（Ｎ＝６）内の動物は、７５ｎｇの毒素Ａまたは１２５ｎｇの毒素Ｂの腹腔内（
ＩＰ）注射により致死的負荷を受けた。４４日目に毒素Ａまたは毒素Ｂ負荷の用量力価測
定にさらに１２匹のハムスターを使用した。ハムスターの生存率をその後８日間にわたり
監視した。
【０２３０】
第１の免疫化から２週間後（試験１４日目）、第２の免疫化から２週間後（試験２８日
目）、および第３の免疫化から２週間後（試験３５日目）に、全ての動物から血液試料を
回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した。次いで、Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素
Ｂに対する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として報
告した。毒素Ａおよび毒素Ｂ中和抗体（ＴＮＡ）を、細胞毒性量の組み換え毒素Ａおよび
毒素Ｂで処理されたＶｅｒｏ細胞を使用して決定した。
【０２３１】
本試験は、ハムスターが、マウスと同様に、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチン接種に肯定
的に反応することを実証した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を与えられた動物は、全ての試験さ
れた抗体力価において用量依存的な増加を示し、一方ａｌｕｍアジュバントは、Ｃ−ＴＡ
Ｂ．Ｇ５の全ての用量において抗体力価を大幅に改善した。最大の抗体力価は、第２の投
与から２週間後（試験２８日目）に観察された。図１１（Ａ〜Ｃ）は、免疫化されたハム
スターの各群に対する抗体力価を示す。図１２は、水酸化ａｌｕｍの存在下または非存在
下でのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５で免疫化されたハムスターにおける抗Ｃ−ＴＡＢ抗体増加の反応
速度を示す。
【０２３２】
ＴＮＡアッセイの結果を図１３に示す。これらの結果は、マウスに対して得られたもの
と同様であり、ハムスターにおいてＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質に対して生成さ
れた抗体が、Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの毒性作用の中和に効果的であること
を示している。
【０２３３】
また、図１３は、致死的毒素負荷後のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたハムスター
における保護データを示す。アジュバントの非存在下でのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１によるワ
クチン接種でも、高い保護が達成された。ワクチンにａｌｕｍを添加することにより、保
護レベルは１００％まで改善された。
実施例７：クリンダマイシン処理ハムスターにおけるＣ．ディフィシル芽胞負荷に対する
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質の保護効果。
【０２３４】
抗生物質治療後、Ｃ．ディフィシルは、消化管にコロニー形成する可能性があり、毒素
を生じる場合は、抗生物質関連下痢を引き起こし得る。人間のＣ．ディフィシル関連疾患
（ＣＤＡＤ）は、動物をコロニー形成、下痢および死亡し易くするために、通常は毒素産
生株での植菌から数日以内にクリンダマイシンを使用してハムスターにおいてモデル化さ
れる。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチン有効性を評価するために、ワクチン接種および非ワ
クチン接種ハムスターにクリンダマイシンおよびＣ．ディフィシル株６３０を負荷した。
１００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を、１２５μｇの水酸化ａｌｕｍアジュバントと混合
した。体重約１００ｇの雌成体ハムスターが、０、１４および２８日目に筋肉内（ＩＭ）
注射により３回のワクチン接種を受けた。プラセボはＰＢＳであった。４８匹のハムスタ
ーを、以下のようにワクチン接種される８匹の群に分割した。
群１：ＰＢＳのみ＋１０２芽胞負荷
群２：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１０２芽胞負荷
群３：ＰＢＳのみ＋１０３芽胞負荷
群４：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１０２芽胞負荷
群５：ＰＢＳのみ＋１０４芽胞負荷
群６：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１０４芽胞負荷
【０２３５】
４２日目に、全ての群内の全ての動物は、１０ｍｇリン酸クリンダマイシン／ｋｇ体重
の経口投薬を受けた。４３日目に、全ての群内の全ての動物に、Ｃ．ディフィシル株６３
０の洗浄芽胞を強制経口投与により投薬した。３つのレベルの芽胞負荷を使用した（約１
０２、１０３および１０４）。治療を行わずに観察を５４日目まで継続した。試験の終了
時に、全ての生存動物は、５日間以上疾患を有さなかった。
【０２３６】
０、１４、２８、４２および５４日目（試験終了）に、血液試料を採取して、血清学的
試験のための血清を得た。１日目および４２日目に、ハムスターの肛門から直接、または
必要に応じて寝床の中から糞便を回収した。
【０２３７】
結果を、ハムスターにおける芽胞負荷後の生存率曲線を示す図１４に示す。生存率デー
タは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率適合曲線としてプロットし、統計分析はログラン
ク分析を使用して行った。全ての芽胞用量において、ワクチン接種群内のハムスターの１
００％生存率が観察され、プラセボ群と比較して生存率が有意に向上した：１０２芽胞で
ｐ＝０．０２４５、１０３芽胞でｐ＝０．０００６、１０４芽胞でｐ＜０．０００１。
実施例８：サルにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性および保護効果。
【０２３８】
本試験は、カニクイザルにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性および保護を評価す
るためのものであった。４歳から６歳の間の年齢および２ｋｇから４ｋｇの間の体重の６
匹の雌のカニクイザルを、本試験に使用した。３匹のサルの２つの群を準備し、第１の群
（群１）に２００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を与え、第２の群（群２）に２００μｇの
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１および２５０μｇのａｌｕｍを与えた。ａｌｕｍアジュバントとし
て、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ（Ｒｅｈｅｉｓ社、ロット＃５３４４０１、ＰＢＳ中で２ｍｇ
／ｍｌに希釈）を使用した。血液採取または免疫化の前に、（必要に応じて）動物を剃毛
した。
【０２３９】
第１（試験０日目）および第３（試験２８日目）の免疫化は左腕（三角筋）に施し、第
２の免疫化（試験１４日目）は右腕（三角筋）に施した。群１には、０．５ｍｌ  １×Ｐ
ＢＳ中の２００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１のみをＩＭ注射により与え、群２には、０．
５ｍｌ  １×ＰＢＳ中の２００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１および２５０μｇのａｌｕｍ
をＩＭ注射により与えた。
【０２４０】
確立された時点（試験０、１４、２８および４２日目）に、標準的方法により得た２〜
３ｍＬの全血を血清分離管に採取した。血清試料を約−２０℃で凍結した。次いで、ＥＬ
ＩＳＡ法を使用して、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ  ＩｇＧ力価を評価した。
抗体力価は、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）で示された。
【０２４１】
図１５は、増加用量のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１が、３つ全てのタンパク質を認識する抗体
産生の増加をもたらし、一方ａｌｕｍの存在が抗体レベルを大幅に改善したことを示して
いる。最大抗体力価は、４２日目の２回のワクチン接種において観察された。これらのデ
ータは、それを必要とする対象のワクチン接種のための組み換えＣ−ＴＡＢ．Ｇ５または
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質の使用の実現可能性を明確に示している。
実施例９：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性の比較。
【０２４２】
本試験は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性、ならびにＣ−Ｔ
ＡＢが供給される２つの異なる緩衝液の効果を比較するためのものであった。８週から９
週齢の間のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ．）を免疫
化に使用した。全ての動物は、０日目に右大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μｌ）に
よる第１の免疫化を受けた。第２の免疫化は、１４日目に左大腿筋へのＩＭ注射により行
った。全部で７２匹のマウスを、以下のようにワクチン接種された１２の群に分割した。
群１：１μｇのＰＢＳ中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群２：３μｇのＰＢＳ中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群３：１０μｇのＰＢＳ中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群４：３０μｇのＰＢＳ中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５  
群５：１μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群６：３μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群７：１０μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群８：３０μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群９：１μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
群１０：３μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
群１１：１０μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
群１２：３０μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
【０２４３】
第２の免疫化から２週間後（試験２８日目）に、全ての動物から血液試料を回収した。
分析まで血清を−２０℃で保存した。Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体
力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、ＥＬＩＳＡ単位として報告した。
【０２４４】
図１６は、全ての抗体力価（抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ）が、３つのワク
チン製剤において１〜３０μｇの容量範囲にわたって有意に異ならなかったことを示して
いる（Ｔ−検定分析により明らかなように）。ＰＢＳと比較して、ヒスチジン緩衝液中の
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５製剤において、若干高い抗体産生が達成された。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およ
びＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ヒスチジン製剤での免疫化の間では有意な差は観察されなかった
。したがって、本試験は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１コンストラクト
の同等の免疫原性を実証した。
実施例１０：代替Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢおよびＣ−ＴＡＤＣＴＢ融合タンパク質の調製およ
び評価。
【０２４５】
本実施例は、Ｃ．ディフィシル  ＶＰＩ−１０４６３株から得られたＣＴＡのＣ末端ド
メインの１つの部分およびＣＴＢのＣ末端ドメインの２つの部分を含む２つの他の融合タ
ンパク質の調製について説明する。Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢ融合タンパク質（配列番号１８）
は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５と同様に、ＣＴＡの１９反復単位（アミノ酸２２７２〜２７１０）
、ＣＴＢの２３反復単位（アミノ酸１８５０〜２３６６）、およびＣＴＢのＣ末端に融合
したＣＴＢのさらなる追加的な１０反復（アミノ酸１８３４〜２０５７）を含む。Ｃ−Ｔ
ＡＤＣＴＢ融合タンパク質（配列番号２０）は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５配列（ＣＴＡの１９反
復およびＣＴＢの２３反復）、ならびにＣ−ＴＡＢ．Ｇ５のＣ末端に融合したＣＴＢの追
加的な２４反復単位（アミノ酸１８３４〜２３６６）を含む。したがって、Ｃ−ＴＡＤＣ
ＴＢは、ＣＴＢの反復単位の二重部分を含む。Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢおよびＣ−ＴＡＤＣＴ
Ｂ遺伝子コンストラクトのクローニングは、実施例１．１に記載のものと同様の様式で行
った。組み換え融合タンパク質は、大腸菌細胞において発現され、実施例１．２に記載の
ような標準的手順を使用して精製した。単離ポリペプチドを、動物における免疫原性およ
び保護試験において評価した。
実施例１０．１：マウスにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５、Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢおよびＣ−ＴＡ
ＤＣＴＢの免疫原性および保護効果の比較。
【０２４６】
本試験は、２対数範囲にわたる５回の抗原投薬でワクチン接種されたマウスにおける、
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５、Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢおよびＣ−ＴＡＤＣＴＢの免疫原性および保護効
果を比較するためのものであった。６〜７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅ
ｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ．）を本試験に使用した。全ての動物は、２回のワクチン接種
を受け、第１のワクチン接種は、０日目に右大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μｌ）
により行われた。第２のワクチン接種は、１４日目に左大腿筋へのＩＭ注射により行った
。全ての免疫化は、ａｌｕｍの非存在下で行った。第２の免疫化から２週間後（試験２８
日目）に、血液試料を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した。Ｃ−ＴＡＢ、毒素
Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、図１７に示されるＥ
ＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として報告した。
【０２４７】
本試験は、代替融合タンパク質Ｃ−ＴＡＤＣＴＢおよびＣ−ＴＡＢＮＣＴＢ、ならびに
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５が、極めて免疫原性であり、アジュバントを添加しなくても毒素Ａおよ
び毒素Ｂの両方に対する強い抗体反応を誘導することができることを実証した。
【０２４８】
抗体反応の評価に加えて、マウスを天然毒素Ｂの致死的負荷から保護するＣ−ＴＡＤＣ
ＴＢおよびＣ−ＴＡＢＮＣＴＢ免疫化の能力を決定した。第２のワクチン接種から３週間
後（試験３５日目）に、ワクチン接種および非ワクチン接種群（Ｎ＝６）内の動物は、５
０ｎｇの毒素Ｂの致死用量を腹腔内（ＩＰ）投与により受けた。マウスの生存率をその後
９日間にわたり監視したが、その結果を図１８に示す。本実験は、ａｌｕｍの非存在下で
の３３μｇのＣ−ＴＡＤＣＴＢによるマウスの免疫化は、天然毒素Ｂによる致死的負荷に
対する１００％の保護を付与することができるが、一方同じ用量のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５およ
びＣ−ＴＡＢＮＣＴＢは、部分的な保護のみを誘導することを実証した。このデータは、
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５と同様に、２つの他の融合タンパク質Ｃ−ＴＡＤＣＴＢおよびＣ−ＴＡ
ＢＮＣＴＢが、天然毒素による致死的負荷に対して保護的となり得ることを示している。
実施例１０．２：ハムスターにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１およびＣ−ＴＡＤＣＴＢの免
疫原性および保護効果の比較。
【０２４９】
本試験は、異なる動物モデルにおける、ａｌｕｍアジュバントあり、またはなしで投与
された代替融合タンパク質Ｃ−ＴＡＤＣＴＢの免疫原性をさらに評価するためのものであ
った。
【０２５０】
試験は、実施例６において説明される通りに設計された：雌ハムスターを、１００μｇ
の水酸化ａｌｕｍの存在下または非存在下で、ＩＭ注射により３回ワクチン接種した（試
験０、１４および２８日目）。第３のワクチン接種から２週間後（試験４２日目）に、全
ての動物は、７５ｎｇの毒素Ａまたは１２５ｎｇの毒素Ｂの腹腔内（ＩＰ）注射により致
死的負荷を受けた。試験１４、２８および３５日目に血液試料を回収し、Ｃ−ＴＡＢ、毒
素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価をＥＬＩＳＡにより決定した。毒素Ａおよび毒素
Ｂ中和抗体（ＴＮＡ）を３５日目の血清において測定した。ハムスターの生存率を監視し
、保護の％として報告した。
【０２５１】
本試験は、融合タンパク質Ｃ−ＴＡＤＣＴＢが、マウスと同様に、ハムスターにおいて
抗毒素抗体反応を誘導し得ることを実証した。ａｌｕｍアジュバントは、全ての試験され
た抗体力価を大幅に改善した。図１９に示されるＴＮＡアッセイの結果は、Ｃ−ＴＡＤＣ
ＴＢに対して生成された抗体が、Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの毒性作用の中和
において効果的であることを示している。図１９はまた、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１またはＣ
−ＴＡＤＣＴＢで免疫化されたハムスターに対する保護データの比較を示す。両方の組み
換え融合タンパク質でのワクチン接種により、高い保護が達成された。
実施例１１：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を含む薬学的組成物の安全性、免疫原性および用量反
応を評価する非盲検第１相試験
【０２５２】
３つの異なる用量：Ａｌ（ＯＨ）３（ａｌｕｍ）ありで２０μｇ、それぞれＡｌ（ＯＨ
）３ありまたはなしで７５μｇおよび２００μｇで、筋肉内（ＩＭ）注射により、０、７
および２１日目の３回のワクチン接種で投与される、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１、切断された
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ディフィシル）毒素Ａおよび毒素Ｂからなる組み
換え融合タンパク質を含む薬学的組成物。
試験目的
主目的：
・第３のワクチン接種から６か月後までの、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を含む薬学的組成物の
安全性および忍容性を調査すること。
副次的目的：
・最適な用量および製剤の第１の指標を得るための、第１のワクチン接種後０、７、１４
、２１、２８、１１３、２０１日目における、３つの異なる用量および２種の製剤に対す
るワクチン抗原Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ならびにＣ．ディフィシルの天然毒素ＡおよびＢに
対して測定される免疫反応を調査すること。
・Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢをｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
ワクチン誘導ＩｇＧ抗体の能力を調査すること。
試験デザイン
【０２５３】
本試験は、１８歳以上６５歳未満の健常成人におけるパートＡ、および６５歳以上の健
常高齢者におけるパートＢからなる、非盲検部分無作為化用量増加第１相試験であり、後
者の年齢群は、Ｃ．ディフィシル感染を受ける最も脆弱な集団である。パートＡは、アジ
ュバントありの２０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチン、およびそれぞれアジュバント
ありまたはなしの７５μｇおよび２００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチンの安全性お
よびそれに対する用量反応を試験するために、１２人の健常成人対象の５つの治療群にお
いて、０、７および２１日目のワクチン接種スケジュールで行う。安全性および免疫原性
は、パートＡの全ての成人対象が第３のワクチン接種を受けた後に分析され、全ての安全
性データは、パートＢからの対象の参加の前に、Ｄａｔａ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏ
ｒｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ（ＤＳＭＢ）により見直される。中間解析の間に安全性のない、ま
たは効果のない治療群（すなわち、有意なＩｇＧ反応を誘導しない用量）が特定された場
合、これらの治療群は中止され、パートＢに持ち込まれることはない。
試験のパートＢは、高齢集団における用量確定を探求するものである。したがって、パー
トＢは、群当たり２０名の高齢健常対象の５つの治療群において行う。０、７および２１
日目のワクチン接種スケジュールを適用する。本試験デザインにより、成人および高齢者
の両方における用量反応の比較が可能となる。後者の年齢群は、Ｃ．ディフィシルワクチ
ンの主要な標的集団であり、年齢に基づく、または年齢−リスクに基づく予防ワクチン接
種手法において、Ｃ．ディフィシルワクチンの発達経路における２つの標的指標、すなわ
ち再発性Ｃ．ディフィシル下痢の予防および原発性Ｃ．ディフィシル感染症の予防に対し
最も脆弱な集団を示す。しかしながら、高齢対象は、若年成人よりもワクチン接種に対し
反応性が低い可能性があり、したがって、早期発達段階からの高齢標的集団における用量
確定が必要である。パートＡからの全ての成人がワクチン接種された後の中間解析によっ
て、高齢群内の対象を、ワクチンの潜在的に安全でない、または効果のない用量（例えば
最低用量）および／または製剤（例えば非アジュバント製剤）に暴露するリスクを軽減す
るために、安全でない、または成人において有意なＩｇＧ反応を誘導しない用量／製剤を
中止することができる。
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチンは、標準的方法により生成された、２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチ
ジン、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％スクロース、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８
０（ｐＨ６．５）中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の水溶液である。
配列：
【表４】
2019163310.tif 000005
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2019163310.tif 000007
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好ましい態様：
好ましいポリペプチドおよびその使用：
１．配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、より好ましくは少な
くとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同
一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
２．配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、より好ましくは少な
くとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同
一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
３．クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＡのＣ末端ドメインから得られる１９反復
単位、およびクロストリジウム・ディフィシルの毒素ＢのＣ末端ドメインから得られる２
３反復単位を含む、態様１または２に記載の単離ポリペプチド。
４．配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、態様１に記載の単離ポリペプチド。
５．配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、態様１に記載の単離ポリペプチド。
６．配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、より好ましくは少な
くとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同
一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
７．前記単離ポリペプチドをワクチン接種されたハムスターは、全ての芽胞用量（１０
２、１０３および１０４）において、致死用量のＣ．ディフィシル芽胞の胃内投与に対し
生存する、態様６に記載のポリペプチド。
８．クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＡのＣ末端ドメインから得られる１９反復
単位を含む、態様６または７に記載のポリペプチド。
９．クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＢのＣ末端ドメインから得られる２３、３
３または４７反復単位を含む、態様６から８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１０．配列番号２、配列番号４、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２、配列
番号４、配列番号１８または配列番号２０のいずれかと９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％同一であるポリペプチドからなる群から選択される、態様６から９のいずれか１
つに記載のポリペプチド。
１１．単離されている、態様６から１０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１２．医薬品における使用のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプ
チド。
１３．ＣＤＡＤの予防および治療のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポ
リペプチド。
１４．ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防のための、態様６から１
１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１５．ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防のための、態様６から１
１のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は
、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉ
ｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の
予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受けている、もしくは受け
る予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖ
ｉｉ）養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）
頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；ま
たはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である、ポリペプチド。
１６．医薬品における使用のための医薬の製造のための、態様６から１１のいずれか１
つに記載のポリペプチドの使用。
１７．ＣＤＡＤの予防および治療のための医薬の製造のための、態様６から１１のいず
れか１つに記載のポリペプチドの使用。
１８．ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防のための医薬の製造のた
めの、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用。
１９．ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防のための医薬の製造のた
めの、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用であって、ＣＤＡＤの
リスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）
ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定
がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を
受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは
受ける予定がある対象；ｖｉｉ）養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予
定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とす
る共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である、使用。
２０．態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドを含む、対象におけるＣ．
ディフィシル感染を検出するための診断キット。
好ましい核酸：
１ａ．態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドのいずれかをコードするヌ
クレオチド配列を含む核酸。
２ａ．態様１から１１のいずれか１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列か
ら本質的になる、態様１ａに記載の核酸。
３ａ．配列番号１、配列番号３、配列番号１７および配列番号１９の群から選択される
ヌクレオチド配列を含む、態様１ａまたは２ａに記載の核酸。
４ａ．配列番号１、配列番号３、配列番号１７および配列番号１９の群から選択される
ヌクレオチド配列から本質的になる、態様１ａまたは２ａに記載の核酸。
好ましい薬学的組成物：
１ｃ．態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは態様１ａから４ａの
いずれか１つに記載の核酸、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的
組成物。
２ｃ．Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢの両方を中和する抗体を惹起する、態様１ｃに
記載の薬学的組成物。
３ｃ．Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢに対する、対象における防御免疫反応を惹起す
る、態様１ｃまたは態様２ｃに記載の薬学的組成物。
４ｃ．アジュバントをさらに含む、態様１ｃから３ｃのいずれか１つに記載の薬学的組
成物。
５ｃ．アジュバントが、ａｌｕｍを含む、態様４ｃに記載の薬学的組成物。
６ｃ．追加的な抗原または薬物をさらに含む、態様１ｃから５ｃのいずれか１つに記載
の薬学的組成物。
好ましい抗体：１ｄ．態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドに対する抗体
であるが、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（配列番号６）およびＢ（配列番号８）のいずれかま
たは両方を認識しない抗体。
好ましい方法
１ｅ．態様１から１０のいずれか１つに記載のポリペプチドを生成するための方法であ
って、宿主細胞内に、ポリペプチドをコードする核酸を導入することと、ポリペプチドの
発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養することと、ポリペプチドを単離することとを
含む方法。
２ｅ．宿主細胞は、大腸菌である、態様１ｅに記載の方法。
３ｅ．対象におけるＣ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）を治療および／または予防
する方法であって、それを必要とする対象に、態様１から１１のいずれか１つに記載の単
離ポリペプチドを投与することを含む方法。
４ｅ．対象においてＣ．ディフィシルの毒素ＡおよびＢの両方に対する特異的免疫反応
を誘導する方法であって、態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドを対象に
、または態様１ｃから６ｃのいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む方
法。
５ｅ．対象におけるＣ．ディフィシル感染により引き起こされる原発性疾患を予防する
方法であって、態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドを対象に、または態
様１ｃから６ｃのいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む方法。
６ｅ．Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）のリスクを有する対象における  Ｃ．デ
ィフィシル感染により引き起こされる原発性疾患を予防する方法であって、ＣＤＡＤのリ
スクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）Ａ
ＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定が
ある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受
けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受
ける予定がある対象；ｖｉｉ）養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定
がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする
共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象であり、前記方法は、態
様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドを前記対象に、または態様１ｃから６
ｃのいずれか１つの薬学的組成物を投与することを含む方法。 ７ｅ．ポリペプチドまた
は薬学的組成物は、対象に、筋肉内、皮内、皮下、経口、経鼻、または経直腸投与、好ま
しくは筋肉内投与される、態様１ｅから６ｅのいずれか１つに記載の方法。
８ｅ．ポリペプチドまたは薬学的組成物は、短い間隔（１週間毎または２週間毎）に少
なくとも２回以内の投薬で対象に投与される、態様１ｅから７ｅのいずれか１つに記載の
方法。
９ｅ．生体試料中のＣ．ディフィシルを検出する方法であって、生体試料を態様１から
１１のいずれか１つに記載のポリペプチドと接触させることと、生体試料に対するポリペ
プチドの結合を検出することとを含み、ポリペプチドの結合は、生体試料中のＣ．ディフ
ィシルの存在を示す方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
2019163310.tif 000028
【図１１Ｂ−Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
2019163310.tif 000039
【図２１】
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【配列表】
2019163310000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月13日(2019.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５%の配列同一性を有する単離ポリペプチドであって、クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＢのＣ末端ドメインから得られる２３反復単位を含む、前記単離ポリペプチド。
【請求項２】
クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＡのＣ末端ドメインから得られる１９反復単位を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０%の配列同一性を有する、請求項１または２記載のポリペプチド。
【請求項４】
天然クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及び／またはＢに結合してそれらの細胞毒性活性を中和する抗体を生じさせることができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドをワクチン接種されたハムスターの、１０２、１０３及び１０４の芽胞用量の致死用量のクロストリジウム・ディフィシル芽胞の胃内投与後の生存をもたらす、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及びＢに対する免疫反応を誘導するための免疫原性組成物。
【請求項７】
クロストリジウム・ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）の予防及び／または治療において使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、請求項６記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防であって、前記対象が、ｉ）高齢対象（６５歳超）、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である前記予防において使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、請求項６記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、請求項６記載の免疫原性組成物を製造するための方法であって、宿主細胞内に、前記ポリペプチドをコードする核酸を導入することと、前記ポリペプチドの発現を可能とする条件下で前記宿主細胞を培養することと、前記ポリペプチドを単離することとを含む、前記方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月13日(2019.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５３】
本試験は、１８歳以上６５歳未満の健常成人におけるパートＡ、および６５歳以上の健常高齢者におけるパートＢからなる、非盲検部分無作為化用量増加第１相試験であり、後者の年齢群は、Ｃ．ディフィシル感染を受ける最も脆弱な集団である。パートＡは、アジュバントありの２０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチン、およびそれぞれアジュバントありまたはなしの７５μｇおよび２００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチンの安全性およびそれに対する用量反応を試験するために、１２人の健常成人対象の５つの治療群において、０、７および２１日目のワクチン接種スケジュールで行う。安全性および免疫原性は、パートＡの全ての成人対象が第３のワクチン接種を受けた後に分析され、全ての安全性データは、パートＢからの対象の参加の前に、Ｄａｔａ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ（ＤＳＭＢ）により見直される。中間解析の間に安全性のない、または効果のない治療群（すなわち、有意なＩｇＧ反応を誘導しない用量）が特定された場合、これらの治療群は中止され、パートＢに持ち込まれることはない。
試験のパートＢは、高齢集団における用量確定を探求するものである。したがって、パートＢは、群当たり２０名の高齢健常対象の５つの治療群において行う。０、７および２１日目のワクチン接種スケジュールを適用する。本試験デザインにより、成人および高齢者の両方における用量反応の比較が可能となる。後者の年齢群は、Ｃ．ディフィシルワクチンの主要な標的集団であり、年齢に基づく、または年齢−リスクに基づく予防ワクチン接種手法において、Ｃ．ディフィシルワクチンの発達経路における２つの標的指標、すなわち再発性Ｃ．ディフィシル下痢の予防および原発性Ｃ．ディフィシル感染症の予防に対し最も脆弱な集団を示す。しかしながら、高齢対象は、若年成人よりもワクチン接種に対し反応性が低い可能性があり、したがって、早期発達段階からの高齢標的集団における用量確定が必要である。パートＡからの全ての成人がワクチン接種された後の中間解析によって、高齢群内の対象を、ワクチンの潜在的に安全でない、または効果のない用量（例えば最低用量）および／または製剤（例えば非アジュバント製剤）に暴露するリスクを軽減するために、安全でない、または成人において有意なＩｇＧ反応を誘導しない用量／製剤を中止することができる。
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチンは、標準的方法により生成された、２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％スクロース、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ｐＨ６．５）中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の水溶液である。
配列：
【表４】
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好ましい態様：
好ましいポリペプチドおよびその使用：
１．配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
２．配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
３．クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＡのＣ末端ドメインから得られる１９反復単位、およびクロストリジウム・ディフィシルの毒素ＢのＣ末端ドメインから得られる２３反復単位を含む、態様１または２に記載の単離ポリペプチド。
４．配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、態様１に記載の単離ポリペプチド。
５．配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、態様１に記載の単離ポリペプチド。
６．配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
７．前記単離ポリペプチドをワクチン接種されたハムスターは、全ての芽胞用量（１０２、１０３および１０４）において、致死用量のＣ．ディフィシル芽胞の胃内投与に対し生存する、態様６に記載のポリペプチド。
８．クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＡのＣ末端ドメインから得られる１９反復単位を含む、態様６または７に記載のポリペプチド。
９．クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＢのＣ末端ドメインから得られる２３、３３または４７反復単位を含む、態様６から８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１０．配列番号２、配列番号４、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２、配列番号４、配列番号１８または配列番号２０のいずれかと９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるポリペプチドからなる群から選択される、態様６から９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１１．単離されている、態様６から１０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１２．医薬品における使用のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１３．ＣＤＡＤの予防および治療のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１４．ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１５．ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である、ポリペプチド。
１６．医薬品における使用のための医薬の製造のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用。
１７．ＣＤＡＤの予防および治療のための医薬の製造のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用。
１８．ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防のための医薬の製造のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用。
１９．ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防のための医薬の製造のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用であって、ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である、使用。
２０．態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドを含む、対象におけるＣ．ディフィシル感染を検出するための診断キット。
好ましい核酸：
１ａ．態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
２ａ．態様１から１１のいずれか１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から本質的になる、態様１ａに記載の核酸。
３ａ．配列番号１、配列番号３、配列番号１７および配列番号１９の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、態様１ａまたは２ａに記載の核酸。
４ａ．配列番号１、配列番号３、配列番号１７および配列番号１９の群から選択されるヌクレオチド配列から本質的になる、態様１ａまたは２ａに記載の核酸。
好ましい薬学的組成物：
１ｃ．態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは態様１ａから４ａのいずれか１つに記載の核酸、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物。
２ｃ．Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢの両方を中和する抗体を惹起する、態様１ｃに記載の薬学的組成物。
３ｃ．Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢに対する、対象における防御免疫反応を惹起する、態様１ｃまたは態様２ｃに記載の薬学的組成物。
４ｃ．アジュバントをさらに含む、態様１ｃから３ｃのいずれか１つに記載の薬学的組成物。
５ｃ．アジュバントが、ａｌｕｍを含む、態様４ｃに記載の薬学的組成物。
６ｃ．追加的な抗原または薬物をさらに含む、態様１ｃから５ｃのいずれか１つに記載の薬学的組成物。
好ましい抗体：１ｄ．態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドに対する抗体であるが、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（配列番号６）およびＢ（配列番号８）のいずれかまたは両方を認識しない抗体。
好ましい方法
１ｅ．態様１から１０のいずれか１つに記載のポリペプチドを生成するための方法であって、宿主細胞内に、ポリペプチドをコードする核酸を導入することと、ポリペプチドの発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養することと、ポリペプチドを単離することとを含む方法。
２ｅ．宿主細胞は、大腸菌である、態様１ｅに記載の方法。
３ｅ．対象におけるＣ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）を治療および／または予防する方法であって、それを必要とする対象に、態様１から１１のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを投与することを含む方法。
４ｅ．対象においてＣ．ディフィシルの毒素ＡおよびＢの両方に対する特異的免疫反応を誘導する方法であって、態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドを対象に、または態様１ｃから６ｃのいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む方法。
５ｅ．対象におけるＣ．ディフィシル感染により引き起こされる原発性疾患を予防する方法であって、態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドを対象に、または態様１ｃから６ｃのいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む方法。
６ｅ．Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）のリスクを有する対象における  Ｃ．ディフィシル感染により引き起こされる原発性疾患を予防する方法であって、ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象であり、前記方法は、態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドを前記対象に、または態様１ｃから６ｃのいずれか１つの薬学的組成物を投与することを含む方法。 ７ｅ．ポリペプチドまたは薬学的組成物は、対象に、筋肉内、皮内、皮下、経口、経鼻、または経直腸投与、好ましくは筋肉内投与される、態様１ｅから６ｅのいずれか１つに記載の方法。
８ｅ．ポリペプチドまたは薬学的組成物は、短い間隔（１週間毎または２週間毎）に少なくとも２回以内の投薬で対象に投与される、態様１ｅから７ｅのいずれか１つに記載の方法。
９ｅ．生体試料中のＣ．ディフィシルを検出する方法であって、生体試料を態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドと接触させることと、生体試料に対するポリペプチドの結合を検出することとを含み、ポリペプチドの結合は、生体試料中のＣ．ディフィシルの存在を示す方法。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
a)配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド、又は
b)配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する単離ポリペプチドであって、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及びＢに対する免疫反応を誘導することができる、前記単離ポリペプチド
を含む、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及びＢに対する免疫反応を誘導するための、免疫原性組成物又はワクチン組成物。
（構成２）
前記ポリペプチドが、致死用量の１０２、１０３および１０４のクロストリジウム・ディフィシル芽胞の胃内投与後における、前記単離ポリペプチドをワクチン接種されたハムスターの１００％生存率をもたらす、構成１に記載の組成物。
（構成３）
前記ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＡのＣ末端ドメインから得られる１９反復単位を含む、構成１または２に記載の組成物。
（構成４）
前記ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＢのＣ末端ドメインから得られる２３反復単位を含む、構成１から３のいずれか一項に記載の組成物。
（構成５）
前記ポリペプチドが、配列番号４に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する、構成１から４のいずれか一項に記載の組成物。
（構成６）
アジュバントをさらに含む、構成１から５のいずれか一項に記載の組成物。
（構成７）
前記アジュバントがａｌｕｍを含む、構成６記載の組成物。
（構成８）
Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）の予防および治療における使用のための、構成１から７のいずれか一項に記載の組成物。
（構成９）
ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防における使用のための、構成８記載の組成物。
（構成１０）
ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である、構成９記載の組成物。
（構成１１）
Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）の予防および治療における使用のための単離ポリペプチドであって、
a)該単離ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するか、又は
b)該単離ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する該ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及びＢに対する免疫反応を誘導することができる、
前記単離ポリペプチド。
（構成１２）
ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防における使用のための、構成１１記載のポリペプチド。
（構成１３）
ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である、構成１２記載のポリペプチド。