(57)【要約】【課題】生理機能がより良好な状態にある細胞を培養により獲得するための技術を提供する。【解決手段】細胞の培養方法は、腎臓細胞２４を基材１２の培養面１２ａに播種する工程と、基材１２上で腎臓細胞２４を培養して、細胞のコンフルエントな単層を形成する工程と、単層が形成された状態で１６日以上６０日以下の期間培養する工程とを含む。【選択図】図３
2019041714.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓細胞を基材の培養面に播種する工程と、
前記基材上で前記腎臓細胞を培養して、細胞のコンフルエントな単層を形成する工程と、
前記単層が形成された状態で１６日以上６０日以下の期間培養する工程と、
を含むことを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項２】
前記単層における前記細胞の密度は、２５０００個／ｃｍ２以上７５０００個／ｃｍ２以下である請求項１に記載の細胞の培養方法。
【請求項３】
前記播種する工程における前記腎臓細胞の播種密度は、１００００個／ｃｍ２以上３０００００個／ｃｍ２以下である請求項１又は２に記載の細胞の培養方法。
【請求項４】
ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤を、前記培養面に塗布する工程をさらに含み、
前記播種する工程では、前記コーティング剤を塗布した前記培養面に前記腎臓細胞を播種する請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項５】
基材と、前記基材の培養面に積層される培養細胞のコンフルエントな単層と、を備える細胞支持複合体の製造方法であって、
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の細胞の培養方法によって前記基材に前記単層を形成する工程を含むことを特徴とする細胞支持複合体の製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の細胞の培養方法によって作製されることを特徴とする培養細胞。
【請求項７】
基材と、
前記基材の培養面に積層される、請求項６に記載の培養細胞のコンフルエントな単層と、
を備えることを特徴とする細胞支持複合体。
【請求項８】
前記培養面を被覆する、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤層をさらに備える請求項７に記載の細胞支持複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞及び細胞支持複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腎不全患者の腎機能を代替するバイオ人工腎臓として、中空糸膜等のポリマー膜と近位尿細管上皮細胞等の腎臓細胞（腎機能を有する細胞）をハイブリッド化したモジュールの開発が進められている。特に、バイオ人工腎臓の製造や供給、使用を考慮すると、数週間以上にわたって腎機能を維持できるバイオ人工腎臓が必要になる。
【０００３】
また、生体に投与された薬剤は、生体内で作用した後、近位尿細管で血液から尿中に排出される。このため、近位尿細管細胞は、薬剤の影響を受けやすく、薬剤の毒性によって損傷する可能性がある。このため、新薬開発において、近位尿細管細胞に対する候補物質の毒性や、薬物の代謝を予測するモジュールの開発は非常に有用である。上述したポリマー膜と尿細管上皮細胞のハイブリッドモジュールは、この薬物評価モジュールとしても好適に採用し得る。
【０００４】
バイオ人工腎臓や薬物評価モジュールに用いられる近位尿細管上皮細胞に関して、特許文献１には、細胞周期制御因子の遺伝子発現を抑制することで、十分な数の近位尿細管上皮細胞が得られるように当該細胞の分裂寿命を延長する培養技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−５０３５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、近位尿細管上皮細胞等の腎臓細胞の培養技術について鋭意研究を重ねた結果、従来の培養技術では、培養により腎臓細胞の生理機能が低下してしまい、このためバイオ人工腎臓や薬物評価モジュールへ利用可能な培養細胞の作製が困難であることを見出した。
【０００７】
本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的の１つは、生理機能がより良好な状態にある細胞を培養により獲得するための技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明のある態様は細胞の培養方法である。当該培養方法は、腎臓細胞を基材の培養面に播種する工程と、基材上で腎臓細胞を培養して、細胞のコンフルエントな単層を形成する工程と、単層が形成された状態で１６日以上６０日以下の期間培養する工程とを含む。この態様によれば、生理機能がより良好な状態にある細胞を獲得することができる。
【０００９】
上記態様において、単層における細胞の密度は、２５０００個／ｃｍ２以上７５０００個／ｃｍ２以下であってもよい。また、播種する工程における腎臓細胞の播種密度は、１００００個／ｃｍ２以上３０００００個／ｃｍ２以下であってもよい。また、培養方法はラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤を、培養面に塗布する工程をさらに含み、播種する工程では、コーティング剤を塗布した培養面に腎臓細胞を播種してもよい。
【００１０】
本発明の別の態様は、細胞支持複合体の製造方法である。当該製造方法は、基材と、基材の培養面に積層される培養細胞のコンフルエントな単層と、を備える細胞支持複合体の製造方法であって、上記いずれかの態様の細胞の培養方法によって基材に細胞のコンフルエントな単層を形成する工程を含む。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、培養細胞である。当該培養細胞は、上記いずれかの態様の細胞の培養方法によって作製される。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、細胞支持複合体である。当該細胞支持複合体は、基材と、基材の培養面に積層される、上記態様の培養細胞のコンフルエントな単層とを備える。
【００１３】
上記態様において、細胞支持複合体は、培養面を被覆する、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤層をさらに備えてもよい。
【００１４】
なお、以上の構成要素の任意の組み合わせや、本発明の構成要素や表現を方法、装置、システムなどの間で相互に置換したものもまた、本発明の態様として有効である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、生理機能がより良好な状態にある細胞を培養により獲得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１（Ａ）及び図１（Ｂ）は、参考例に係る細胞支持複合体の構造を模式的に示す図である。
【図２】図２（Ａ）〜図２（Ｃ）は、実施の形態に係る培養細胞と、この培養細胞を含む細胞支持複合体の構造を模式的に示す図である。
【図３】図３（Ａ）〜図３（Ｄ）は、実施の形態に係る細胞の培養方法及び細胞支持複合体の製造方法の工程図である。
【図４】図４（Ａ）〜図４（Ｆ）は、実施の形態に係る細胞支持複合体の採用例を模式的に示す図である。
【図５】ヒト近位尿細管上皮細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。
【図６】図６（Ａ）は、培養１０，２０，６０日の細胞の光学顕微鏡画像である。図６（Ｂ）は、接着分子の種類と好ましいコーティング濃度とを示す図である。
【図７】細胞単層の状態で培養した際のヒト近位尿細管上皮細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。
【図８】図８（Ａ）は、ＡＱＰ１抗体で免疫染色した細胞単層の蛍光顕微鏡画像である。図８（Ｂ）は、ＬＴＬ抗体で免疫染色した細胞単層の蛍光顕微鏡画像である。
【図９】細胞単層における経上皮電気抵抗値の経時変化を示す図である。
【図１０】細胞単層を挟んだ２つのＨＢＳＳにおけるＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの濃度変化の遷移を示す図である。
【図１１】細胞単層を挟んだ２つのＨＢＳＳにおけるグルコース濃度差の経時変化を示す図である。
【図１２】図１２（Ａ）は、ＡＱＰ１抗体で免疫染色した細胞単層の蛍光顕微鏡画像である。図１２（Ｂ）は、ＬＴＬ抗体で免疫染色した細胞単層の蛍光顕微鏡画像である。
【図１３】培養２０，３０，６０，６５日の細胞単層の光学顕微鏡画像である。
【図１４】細胞密度の経時変化を示す図である。
【図１５】播種密度を異ならせて７日間培養した細胞の光学顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者は、腎臓細胞の培養技術について考察し、以下のような認識を得た。すなわち、腎臓から酵素処理により単離された近位尿細管上皮細胞等の腎臓細胞（初代培養細胞）は、生体内環境の消失や、シャーレ上での二次元培養といった培養環境により、脱分化して機能が徐々に消失する。このため、腎臓細胞を単に培養するだけでは、生理機能が不十分な細胞が増えるだけである。脱分化した細胞を用いてバイオ人工腎臓を製造した場合、血漿中の有用成分の再吸収機能が十分に高くないものとなる可能性がある。また、脱分化した細胞を用いて薬物評価モジュールを製造した場合、高い精度で薬物動態や毒性反応を示さない可能性がある。これに対し本発明者は、一旦機能が低下しても所定の状態で所定の長期間培養を継続することで、脱分化した腎臓細胞の生理機能を回復させられるという、驚くべき事実を見出した。
【００１８】
また、腎臓から単離された近位尿細管上皮細胞は、本来の円柱状の細胞構造を維持できず、扁平形状に変化する。さらに、近位尿細管上皮細胞をシャーレや人工膜上に播種すると、単層上皮構造を消失して細胞間に隙間が生じたり、細胞が重層化したりする。このような現象が生じることで、バイオ人工腎臓において有用成分の再吸収機能が劣化し得る。また、薬物評価モジュールの精度が低下し得る。これに対し本発明者は、生理機能が回復した近位尿細管上皮細胞を用いて、基材上に安定した単層上皮構造を形成する技術を見出した。実施の形態は、このような思索に基づいて案出されたものである。
【００１９】
以下、本発明を好適な実施の形態をもとに図面を参照しながら説明する。実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。各図面に示される同一又は同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、各図に示す各部の縮尺や形状は、説明を容易にするために便宜的に設定されており、特に言及がない限り限定的に解釈されるものではない。また、本明細書または請求項中に「第１」、「第２」等の用語が用いられる場合には、この用語はいかなる順序や重要度を表すものでもなく、ある構成と他の構成とを区別するためのものである。
【００２０】
図１（Ａ）及び図１（Ｂ）は、参考例に係る細胞支持複合体の構造を模式的に示す図である。図１（Ａ）には、一般的なコーティング剤を用いた場合の細胞支持複合体が図示されている。図１（Ｂ）には、コーティング剤を用いない場合の細胞支持複合体が図示されている。図１（Ａ）に示すように、従来公知の一般的なコーティング剤１０２をコーティングした人工膜等の基材１０４に、近位尿細管上皮細胞１０６を播種して得られる細胞支持複合体１００ａでは、近位尿細管上皮細胞１０６が重層化したり、細胞間に隙間が空いてしまうことがあった。図１（Ｂ）に示すように、コーティング剤１０２を塗布していない基材１０４に近位尿細管上皮細胞１０６を播種して得られる細胞支持複合体１００ｂにおいても同様に、近位尿細管上皮細胞１０６の重層化や隙間の発生があった。
【００２１】
近位尿細管上皮細胞１０６が重層化した領域では、細胞頂端膜側から細胞基底膜側への、トランスポーターを介した有用物質の移動が妨げられ得る（矢印Ｐ）。また、隣り合う近位尿細管上皮細胞１０６の隙間において、基材１０４を介した濃度依存性の物質移動が生じ得る（矢印Ｑ）。
【００２２】
図２（Ａ）〜図２（Ｃ）は、実施の形態に係る培養細胞と、この培養細胞を含む細胞支持複合体の構造を模式的に示す図である。図２（Ａ）には、水透過性を有する基材、言い換えれば水透過性が相対的に高い基材を用いた場合の細胞支持複合体が図示されている。図２（Ｂ）には、水透過性を有しない基材、言い換えれば水透過性が相対的に低い基材を用いた場合の細胞支持複合体であって、短時間経過した状態が図示されている。図２（Ｃ）には、水透過性を有しない基材を用いた場合の細胞支持複合体であって、長時間経過した状態が図示されている。本実施の形態に係る細胞支持複合体１０は、基材１２と、コーティング剤層１４と、培養細胞の単層１５（以下では適宜、細胞単層１５と称する）とを備える。
【００２３】
［基材］
基材１２は、例えば人工材料で構成される。基材１２は、細胞が播種される培養面１２ａを有する。培養面１２ａは、例えば、平面又は曲面を有する基材１２の少なくとも１つの表面を意味する。基材１２が平板状である場合には、培養面１２ａは、例えば平板の少なくとも一方の主表面を意味する。基材１２が円筒状である場合には、培養面１２ａは、例えば円筒の内側面又は外側面の少なくとも一方を意味する。
【００２４】
図２（Ａ）に示すように、基材１２は、水や各種イオンに対する透過性を有する。また、基材１２は、糖や低分子タンパク質に対する透過性も有することが好ましい。このような基材１２を備える細胞支持複合体１０は、例えばバイオ人工腎臓として利用することができる。細胞頂端膜側に存在する有用物質５０は、細胞単層１５を構成する培養細胞１６が備える細胞頂端膜側のトランスポーター１８及び細胞基底膜側のトランスポーター２０と、基材１２とを介して細胞支持複合体１０を通過し、細胞基底膜側に移動する。
【００２５】
各種の物質に対する透過性を持たせるために、基材１２には、例えば孔が設けられる。基材１２に設けられる孔の平均孔径は、好ましくは５μｍ以下である。平均孔径を５μｍ以下とすることで、培養細胞１６が基材１２を通過するおそれを低減することができる。このような基材１２として、例えばＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社：平均孔径０．４μｍ又は３．０μｍ）を用いることができる。
【００２６】
また、図２（Ｂ）及び図２（Ｃ）に示すように、基材１２は、水や各種イオンに対する透過性を有しなくてもよい。このような基材１２を備える細胞支持複合体１０は、例えば、薬物の代謝（培養細胞１６による薬物の取込量等）や毒性を評価する薬物評価モジュールとして利用することができる。基材１２には、水透過性を有しないシャーレやウェルプレート等を用いることができる。細胞頂端膜側に存在する有用物質５０は、培養細胞１６のトランスポーター１８を介して培養細胞１６の内部に取り込まれる。使用開始から短時間のうちは、培養細胞１６のトランスポーター２０を介した有用物質５０の細胞基底膜側への移動が少ないため、図２（Ｂ）に示すように細胞単層１５に変形は生じない。一方、長時間経過すると、トランスポーター２０を介した有用物質５０の移動量が増えるが、有用物質５０は基材１２を通過できないため、図２（Ｃ）に示すように細胞単層１５が浮き上がってドーム２２が形成される。
【００２７】
基材１２を構成する素材としては、特に限定されないが、例えばポリスチレン、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）、ポリエチレン、ポリスルホン（ＰＳｆ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）等が例示される。また、基材１２の形態としては、特に限定されないが、例えば培養ウェルプレート、培養シャーレ、中空糸膜、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、平膜等の人工膜や、微細流路チップ、中実粒子、中空粒子等が例示される。
【００２８】
［コーティング剤層］
コーティング剤層１４は、コーティング剤で構成される層である。コーティング剤層１４は、少なくとも基材１２の培養面１２ａを被覆する。コーティング剤層１４は、基材１２の培養面１２ａに接着して基材１２に固定される。コーティング剤層１４を設けることで、培養細胞１６の重層化や隙間の発生をより確実に抑制することができる。つまり、細胞単層１５をより確実に形成することができる。コーディング剤は、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上の接着分子を含む。
【００２９】
（ラミニン分子）
ラミニン分子は、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ１本ずつ持つヘテロ三量体構造をとる。現時点では５種類のα鎖、３種類のβ鎖、３種類のγ鎖が同定されている。ラミニン分子は、これらの組合せによって少なくとも１２種類のアイソフォームを形成することが知られている。本実施の形態では、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３１１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、ラミニン５２１及びこれらの断片のうち１つ以上から選択される。
【００３０】
なお、ラミニン分子には、上述したアイソフォームの１か所以上に所定の修飾基が付加された、ラミニンの改変体（改変ラミニン）も含まれる。改変体には、遺伝子組み換え体、すなわち組み換え遺伝子から得られたタンパク質に変異を導入したタンパク質や、遺伝子組み換え体の部分タンパク質、遺伝子組み換え体由来のペプチドを有するタンパク質も含まれる。ラミニン分子のアイソフォームのうち、ラミニン３１１、ラミニン５１１及びラミニン５２１は、細胞間のバリア機能の指標である電気抵抗値がラミニン１１１よりも高いため、より好ましい。また、ラミニン５１１及びラミニン５２１は、例えばラミニン１１１と比較してコストが安いため、より好ましい。
【００３１】
コーティング剤におけるラミニン分子の濃度と、基材１２に対するラミニン分子の接着量とは、細胞支持複合体１０が実用期間の間その性能を維持できるように、適宜調整される。ラミニン分子の接着量は、コーティング剤におけるラミニン分子の濃度を調整することで、制御することができる。細胞支持複合体１０の実用期間は、好ましくは細胞単層１５が形成されてから１６日以上である。基材１２に対するラミニン分子の接着量は、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。例えば、ラミニン分子を含むコーティング剤が基材１２に塗布された後、４℃にて一晩静置することでコーティング剤層１４が形成される。そして、基材１２に接着したラミニン分子の量が、例えば２−Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて定量される。
【００３２】
ラミニン１１１の場合、基材１２への接着量を０．１５μｇ／ｃｍ２以上とすることが好ましい。ラミニン２１１の場合、基材１２への接着量を０．４５μｇ／ｃｍ２以上とすることが好ましい。ラミニン２２１の場合、基材１２への接着量を０．３０μｇ／ｃｍ２以上とすることが好ましい。ラミニン３３２の場合、基材１２への接着量を０．９０μｇ／ｃｍ２以上とすることが好ましい。ラミニン４２１の場合、基材１２への接着量を０．５０μｇ／ｃｍ２以上とすることが好ましい。ラミニン３１１の場合、基材１２への接着量を０．０７μｇ／ｃｍ２以上とすることが好ましい。ラミニン５１１の場合、基材１２への接着量を０．０５μｇ／ｃｍ２以上とすることが好ましい。ラミニン５２１の場合、基材１２への接着量を０．３３μｇ／ｃｍ２以上とすることが好ましい。これらにより、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、細胞単層１５の構造をより確実に維持することができる。
【００３３】
なお、各ラミニン分子の市販品の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度では処理が煩雑となり、またコストがかかる。このため各ラミニン分子の濃度は、１００μｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。ラミニン分子として改変ラミニンが使用される場合、修飾基は、例えば増殖因子結合分子又は細胞接着分子である。このような改変ラミニンを用いた場合にも、改変されていないラミニン分子と同様の作用効果を奏することができる。
【００３４】
コーティング剤に含有させる接着因子として、ラミニン分子の断片が用いられてもよい。ラミニン分子の断片としては、例えば完全長ラミニンのうちドメインＩの細胞接着部位（インテグリン結合部位）を含むＥ８領域の改変体（ラミニン＊＊＊−Ｅ８と表記する）が例示される。このような改変体として、例えばラミニン１１１−Ｅ８、ラミニン２１１−Ｅ８、ラミニン４１１−Ｅ８及びラミニン５２１−Ｅ８が挙げられる。なかでもラミニン５２１−Ｅ８が好ましい。これらの分子量は、いずれも完全長ラミニンの１／５程度である。
【００３５】
ラミニン分子の断片としてラミニン５１１のＥ８領域の改変体（ラミニン５１１−Ｅ８）が使用される場合、市販のラミニン５１１−Ｅ８（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１：株式会社ニッピ）の濃度を考慮すると、基材１２への接着量を０．１５μｇ／ｃｍ２以上とすることが好ましい。これにより、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、細胞単層１５の構造をより確実に維持することができる。
【００３６】
ラミニン分子の断片としては、Ｅ８領域の改変体だけでなく、細胞接着活性を有するラミニンペプチド、あるいは細胞活性部位のみをペプチド合成したものを用いることもできる。このようなラミニンペプチドとしては、例えばβ鎖のドメインＩＩＩに由来するＹＩＧＳＲ含有ペプチド、β鎖のドメインＩＩＩに由来するＰＤＳＧＲ含有ペプチド、β鎖のドメインＩＩＩに由来するＲＹＶＶＬＰＲ含有ペプチド、α鎖のドメインＩＩＩに由来するＲＧＤ含有ペプチド、γ鎖のドメインＩに由来するＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ含有ペプチド、α鎖のドメインＩに由来するＩＫＶＡＶ含有ペプチド及びβ鎖のドメインＩに由来するＬＲＥ含有ペプチド等が例示される。ラミニンペプチドの濃度は、例えば約０．５〜約５００μｇ／ｍｌである。なお、ラミニン分子の断片の大きさは、特に制限されない。
【００３７】
ラミニン分子の断片を用いる場合、完全長のラミニン分子に比べて分子量が小さいため、より安定したコーティングが可能となる。また、微細領域に対してコーティングしやすくなる。また、接着分子の凝集が生じにくくなるため、コーティング斑の形成を抑制することができる。これらにより、細胞単層１５の構造が不均一になることを抑制することができる。また、ラミニン分子の断片を用いることで、高濃度且つ高密度にて接着分子をコーティングすることができる。さらに、リコンビナントタンパク質は、分子量が小さいほど生産効率及び精製効率が上昇する。このため、ラミニン分子の断片を用いることで、細胞支持複合体１０の製造コストをより低下させることができる。
【００３８】
完全長ラミニン分子とラミニン分子の断片とはそれぞれ、複数のアイソフォームが混合されて用いられてもよい。また、完全長ラミニン分子とラミニン分子の断片とが混合されて用いられてもよい。また、異なる種類の完全長ラミニン及び／又はラミニン分子の断片を含む複数のコーティング剤を基材１２に塗布して、含有するラミニン種の異なる複数のコーティング剤層１４が積層されてもよい。
【００３９】
（基底膜マトリックス混合物）
基底膜マトリックス混合物は、マウス肉腫から抽出された細胞外マトリックスタンパク質の混合物である。基底膜マトリックス混合物は、ラミニンと、コラーゲンＩＶと、エンタクチンとを主な構成成分として含む。基底膜マトリックス混合物としては、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）が例示される。
【００４０】
Ｍａｔｒｉｇｅｌとは、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含むＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された、可溶性の基底膜マトリックスをいう。本実施の形態において、Ｍａｔｒｉｇｅｌには、成長因子を含む通常のＭａｔｒｉｇｅｌに加えて、このＭａｔｒｉｇｅｌと比べて成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌ（Growth Factor Reduced Matrigel Matrix）も含まれる。以下では適宜、通常のＭａｔｒｉｇｅｌを第１Ｍａｔｒｉｇｅｌと称し、成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌを第２Ｍａｔｒｉｇｅｌと称する。第１Ｍａｔｒｉｇｅｌ及び第２Ｍａｔｒｉｇｅｌは、例えばＣｏｒｎｉｎｇ社から入手することができる。第１Ｍａｔｒｉｇｅｌは、ラミニンを約５６％、コラーゲンＩＶを約３１％、エンタクチンを約８％含む。一方、第２Ｍａｔｒｉｇｅｌは、ラミニンを約６１％、コラーゲンＩＶを約３０％、エンタクチンを約７％含む。
【００４１】
また、基底膜マトリックス混合物としては、ラミニンと、コラーゲンＩＶと、エンタクチンとが約５６〜約６１：約３０〜約３１：約７〜約８の質量比にて混合された混合物を用いることもできる。
【００４２】
コーティング剤における基底膜マトリックス混合物の濃度と、基材１２に対する基底膜マトリックス混合物の接着量とは、細胞支持複合体１０が実用期間の間その性能を維持できるように、適宜調整される。基底膜マトリックス混合物の接着量は、コーティング剤における基底膜マトリックス混合物の濃度を調整することで、制御することができる。
【００４３】
Ｍａｔｒｉｇｅｌの基材１２への接着量は、１．３６μｇ／ｃｍ２超（より好ましくは１．４μｇ／ｃｍ２以上）約３０．６μｇ／ｃｍ２以下とすることが好ましい。Ｍａｔｒｉｇｅｌの接着量を約１．３６μｇ／ｃｍ２超とすることで、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、細胞単層１５の構造をより確実に維持することができる。また、Ｍａｔｒｉｇｅｌの接着量を３０．６μｇ／ｃｍ２以下とすることで、Ｍａｔｒｉｇｅｌがゲル化して培養細胞１６が凝集化するおそれを低減することができる。上述の接着量は、第１Ｍａｔｒｉｇｅｌ及び第２Ｍａｔｒｉｇｅｌが併用される場合には、両者の合計量である。
【００４４】
コーティング剤に含有させる接着因子として、基底膜マトリックス混合物の断片が用いられてもよい。基底膜マトリックス混合物の断片とは、ラミニンの断片、コラーゲンＩＶの断片及びエンタクチンの断片の少なくとも１つが混合されたものを意味する。また、基底膜マトリックス混合物の完全体と断片とはそれぞれ、複数種が混合されて用いられてもよい。また、完全体と断片とが混合されて用いられてもよい。また、異なる種類の完全体及び／又は断片を含む複数のコーティング剤を基材１２に塗布して、含有する混合物種の異なる複数のコーティング剤層１４が積層されてもよい。
【００４５】
（コラーゲン分子）
コラーゲン分子としては、コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＶ等が例示される。これらは、例えば新田ゼラチン株式会社から入手することができる。コーティング剤におけるコラーゲン分子の濃度と、基材１２に対するコラーゲン分子の接着量とは、細胞支持複合体１０が実用期間の間その性能を維持できるように、適宜調整される。コラーゲン分子の接着量は、コーティング剤におけるコラーゲン分子の濃度を調整することで、制御することができる。
【００４６】
コラーゲンＩの場合、基材１２への接着量を５０μｇ／ｃｍ２以上（より好ましくは５０μｇ／ｃｍ２超）１３８μｇ／ｃｍ２以下とすることが好ましい。コラーゲンＩＶの場合、基材１２への接着量を１９μｇ／ｃｍ２以上（より好ましくは１９．２μｇ／ｃｍ２超）１２１μｇ／ｃｍ２以下とすることが好ましい。各コラーゲンの接着量をそれぞれの下限値以上とすることで、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、細胞単層１５の構造をより確実に維持することができる。また、各コラーゲンの接着量をそれぞれの上限値以下とすることで、各コラーゲンの高い粘性に起因してコーティング剤の均一な塗布が困難になることを、より確実に回避することができる。
【００４７】
コーティング剤に含有させる接着因子として、コラーゲン分子の断片が用いられてもよい。また、コラーゲン分子の完全体と断片とはそれぞれ、複数種が混合されて用いられてもよい。また、完全体と断片とが混合されて用いられてもよい。また、異なる種類の完全体及び／又は断片を含む複数のコーティング剤を基材１２に塗布して、含有するコラーゲン種の異なる複数のコーティング剤層１４が積層されてもよい。
【００４８】
上述したラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらの断片は、それぞれ単独で、又は２種以上を混合して用いられてもよい。また、コーティング剤には、ゼラチン等の他の接着タンパク質がさらに混合されてもよい。
【００４９】
［細胞単層］
細胞単層１５は、基材１２の培養面１２ａに積層される、培養細胞１６のコンフルエントな単層である。培養細胞１６は、コーティング剤層１４を介して基材１２の培養面１２ａに付着する。すなわち、培養細胞１６は、コーティング剤層１４によって基材１２に固定される。培養細胞１６は、細胞頂端膜側に位置するトランスポーター１８と、細胞基底膜側に位置するトランスポーター２０とを有する。
【００５０】
培養細胞１６は、本実施の形態に係る細胞の培養方法によって作製される。具体的には、培養細胞１６は、腎臓細胞を培養面１２ａ上で培養することで培養細胞１６のコンフルエントな単層を形成し、この状態で１６日以上６０日以下（すなわち３８４時間以上１４４０時間以下）の期間培養することで作製される。培養細胞１６は、細胞支持複合体１０に使用される上で、腎臓細胞の生理機能を保持している必要がある。一方で、腎臓細胞を生体内環境とは異なる環境で培養すると、脱分化して生理機能が低下していく。これに対し、上述のように培養細胞１６をコンフルエント且つ単層の状態で１６日以上６０日以下の期間培養することで、腎臓細胞の低下した生理機能を回復させることができる。細胞の培養方法については後に詳細に説明する。なお、培養により低下した生理機能が少しでも改善されていれば、本実施の形態における「回復」に含まれる。
【００５１】
培養細胞１６の基になる腎臓細胞には、組織由来の腎臓細胞や、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞由来の腎臓細胞が含まれる。また、腎臓細胞には、例えば近位尿細管系、遠位尿細管系及び集合管系の上皮細胞の少なくとも１つが含まれる。より具体的には、腎臓細胞としては、例えば腎臓から採取、単離したヒト近位尿細管上皮細胞、ヒト遠位尿細管上皮細胞及びヒト集合管上皮細胞や、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞から分化誘導した近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞及び集合管上皮細胞が例示される。より好ましくは、腎臓細胞は、近位尿細管上皮細胞である。また、腎臓細胞には、上述した腎臓細胞の不死化細胞、株化細胞（ＨＫ−２細胞等）、特定のトランスポーター等のタンパク質を発現させるために腎臓細胞に遺伝子導入した形質転換細胞が含まれる。さらに、腎臓細胞としては、ヒト由来の腎臓細胞に代えて、他動物種由来の細胞（ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ＪＴＣ−１２細胞等）を用いることもできる。
【００５２】
前記「単層」は、好ましくは培養細胞１６の重層化が全く生じていない層である。しかしながら、前記「単層」には、重層化による物質の移動効率の低下が問題とならない程度に一部が重層化した構造（実質的な単層）も含めることができる。また、前記「コンフルエント」とは、好ましくは観察画像の全面積に対する観察画像内の培養細胞１６の占有領域の面積が１００％の状態である。例えば、前記「コンフルエント」とは、培養面１２ａ全体に対して細胞の占める面積の割合が１００％であること、すなわち培養面１２ａいっぱいに隙間なく細胞が増殖した状態を意味する。しかしながら、前記「コンフルエント」には、隣り合う細胞の隙間における濃度依存性の物質移動の発生が問題とならない程度に一部に隙間を有する状態（実質的なコンフルエント）も含めることができる。単層か否か及びコンフルエントか否かは、当業者であれば容易に判断することができる。
【００５３】
（細胞の培養方法及び細胞支持複合体の製造方法）
図３（Ａ）〜図３（Ｄ）は、実施の形態に係る細胞の培養方法及び細胞支持複合体の製造方法の工程図である。本実施の形態に係る細胞の培養方法は、上述した腎臓細胞を基材１２の培養面１２ａに播種する工程と、基材１２上で腎臓細胞を培養して、細胞のコンフルエントな単層を形成する工程と、単層が形成された状態で１６日以上６０日以下の期間培養する工程とを含む。当該培養方法により、生理機能を有する状態にある培養細胞１６を作製することができる。また、本実施の形態に係る細胞の培養方法は、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤を、培養面１２ａに塗布する工程をさらに含む。したがって、腎臓細胞を播種する工程では、コーティング剤を塗布した培養面１２ａ、言い換えればコーティング剤層１４に腎臓細胞が播種される。
【００５４】
また、本実施の形態に係る細胞支持複合体の製造方法は、本実施の形態に係る細胞の培養方法によって基材１２に細胞単層１５を形成する工程を含む。つまり、本実施の形態では、腎臓細胞の培養に用いる基材１２を、細胞支持複合体１０の基材１２として利用している。
【００５５】
具体的には、図３（Ａ）に示すように、基材１２の培養面１２ａにコーディング剤を塗布する。これにより、培養面１２ａ上にコーティング剤層１４が形成される。基材１２及びコーティング剤層１４は、最終的に得られる細胞支持複合体１０の一部を構成する。
【００５６】
続いて、図３（Ｂ）に示すように、基材１２の培養面１２ａに腎臓細胞２４を播種する。本実施の形態では培養面１２ａ上にコーティング剤層１４が形成されているため、腎臓細胞２４はコーティング剤層１４上に播種される。腎臓細胞２４は、従来公知の方法により入手することができる。あるいは、腎臓細胞２４の市販品を使用してもよい。
【００５７】
腎臓細胞２４の播種密度は、好ましくは１００００個／ｃｍ２以上３０００００個／ｃｍ２以下である。播種密度を１００００個／ｃｍ２以上とすることで、細胞単層１５をより確実に形成することができる。また、細胞単層１５が形成されるまでの時間が著しく長期化することを抑制することができる。また、播種密度を３０００００個／ｃｍ２以下とすることで、腎臓細胞２４がコーティング剤層１４に接着せずに凝集することを抑制することができる。
【００５８】
そして、図３（Ｃ）に示すように、培養面１２ａに播種された腎臓細胞２４を培養する。培養面１２ａには、培地が添加される。培地としては従来公知の培地、例えばＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）、ＥｐｉＣＭ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）、ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等を用いることができる。また、細胞培養に必要な従来公知の材料を適宜使用することができる。培養条件は、例えば３７℃、５％ＣＯ２である。培養期間中、培地は定期的に交換することが好ましい。例えば、培地は毎日あるいは２日毎に交換される。
【００５９】
その結果、図３（Ｄ）に示すように、培養細胞１６のコンフルエントな単層、つまり細胞単層１５が得られる。細胞単層１５は、腎臓細胞２４を基材１２に播種した日から、通常１日以内（すなわち２４時間以内）に形成される。続いて、細胞単層１５が形成された状態で、１６日以上６０日以下の期間、より好ましくは１６日以上２１日以下の期間培養する。これにより、生体内環境の消失等によって脱分化した腎臓細胞２４の生理機能を回復させることができる。つまり、細胞単層１５が形成された直後の培養細胞１６よりも生理機能の高い発現状態にある培養細胞１６を得ることができる。また、以上の工程により、基材１２に細胞単層１５が積層された構造を有する細胞支持複合体１０を得ることができる。
【００６０】
培養期間を１６日以上とすることで、生理機能が回復した培養細胞１６をより確実に得ることができる。また、より幅広く生理機能を回復させることができる。また、培養期間を６０日以下とすることで、細胞単層１５の構造、すなわち培養細胞１６のコンフルエントで且つ重層化していない状態を、より確実に維持することができる。さらに、培養期間を２１日以下とすることで、より確実に、生理機能の発現を維持したまま培養細胞１６を継代培養することが可能となる。
【００６１】
細胞単層１５における培養細胞１６の密度は、好ましくは２５０００個／ｃｍ２以上７５０００個／ｃｍ２以下である。細胞密度を２５０００個／ｃｍ２以上とすることで、細胞単層１５をより確実に形成することができる。また、細胞単層１５における細胞同士の十分な接着状態を得ることができる。これにより、生理機能が回復した培養細胞１６をより確実に形成することができる。また、細胞密度を７５０００個／ｃｍ２以下とすることで、培養細胞１６の凝集体の形成を抑制することができる。当該凝集体の形成を抑制することで、凝集体の周囲に隙間が生じることを抑制でき、よって細胞単層１５の構造をより確実に維持することができる。また、細胞単層１５の構造を維持できることで、基材１２、コーティング剤層１４及び細胞単層１５の積層体を、そのまま細胞支持複合体１０として用いることができる。さらには、上記細胞密度の条件を満たすことで、生理機能がより一層回復した培養細胞１６を得ることができる。
【００６２】
［細胞支持複合体が用いられた装置］
図４（Ａ）〜図４（Ｆ）は、実施の形態に係る細胞支持複合体の採用例を模式的に示す図である。なお、図４（Ａ）〜図４（Ｆ）では、細胞支持複合体が組み込まれた構造の一部を図示している。本実施の形態に係る細胞支持複合体１０は、様々な装置に適用することができる。
【００６３】
例えば、図４（Ａ）は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ３２を備える第１装置３４に細胞支持複合体１０が組み込まれた様子を図示している。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ３２の構造は従来公知であるため、詳細な説明は省略する。第１装置３４では、細胞単層１５が配置された側に、所定物質を含む第１液体３６が供給される。第１液体３６中の所定物質は、培養細胞１６に取り込まれて細胞支持複合体１０を通過し、細胞支持複合体１０を挟んで第１液体３６とは反対側に位置する第２液体３８に移動する。第１装置３４は例えば、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。
【００６４】
図４（Ｂ）は、基材１２として中空糸膜が用いられた細胞支持複合体１０が第２装置４０に組み込まれた様子を図示している。第２装置４０では、基材１２としての中空糸膜の管腔内にコーティング剤層１４と細胞単層１５とが形成されている。第２装置４０は、中空糸膜の管腔内に液体を流すことによって、この液体中にある所定物質を培養細胞１６で取り込んで、中空糸膜の管腔外へ移動させることができる。第２装置４０は例えば、血液濾過器で濾過した血漿成分中から有用物質を回収するバイオ人工腎臓モジュールとして使用可能である。
【００６５】
図４（Ｃ）は、微細流路チップ４２に細胞支持複合体１０が組み込まれた様子を図示している。微細流路チップ４２では、基材１２が微細流路を構成している。そして、微細流路の内壁にコーティング剤層１４と細胞単層１５とが形成されている。微細流路チップ４２では、流路内、すなわち培養細胞１６が配置された側に微量の液体が流される。そして、液体中の所定物質が培養細胞１６に取り込まれる。微細流路チップ４２は例えば、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。
【００６６】
図４（Ｄ）は、細胞支持複合体１０が中空マイクロキャリア４４を構成している様子を図示している。また、図４（Ｅ）は、細胞支持複合体１０が中実マイクロキャリア４６を構成している様子を図示している。中空マイクロキャリア４４及び中実マイクロキャリア４６では、基材１２がキャリア本体を構成している。そして、基材１２の外表面にコーティング剤層１４及び細胞単層１５が形成されている。中空マイクロキャリア４４及び中実マイクロキャリア４６では、培養細胞１６が配置された側に微量の液体が流される。そして、液体中の所定物質が培養細胞１６に取り込まれる。中空マイクロキャリア４４及び中実マイクロキャリア４６は例えば、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。
【００６７】
図４（Ｆ）は、ウェルプレート４８に細胞支持複合体１０が組み込まれた様子を図示している。ウェルプレート４８では、細胞支持複合体１０がウェル底面に配置される。この状態で、細胞単層１５はウェルの上側を向く。ウェルプレート４８では、ウェル内に微量の液体４９が注入される。そして、液体４９中の所定物質が培養細胞１６に取り込まれる。ウェルプレート４８は例えば、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。なお、ウェルプレート４８に代えて、培養ディッシュ（シャーレ等）に細胞支持複合体１０が組み込まれてもよい。
【００６８】
上述の、細胞支持複合体１０を組み込んだモジュールは、第２装置４０のように適宜カートリッジに収容されて使用される。
【００６９】
以上説明したように、本実施の形態に係る細胞の培養方法は、腎臓細胞２４を基材１２の培養面１２ａに播種する工程と、基材１２上で腎臓細胞２４を培養して細胞単層１５を形成する工程と、細胞単層１５が形成された状態で１６日以上６０日以下の期間培養する工程とを含む。このように、培養細胞１６をコンフルエント且つ単層の状態で１６日以上６０日以下の期間培養することで、培養により低下した腎臓細胞２４の生理機能を回復させることができる。つまり、本実施の形態の培養方法では、脱分化して生理機能を消失した腎臓細胞２４を、コンフルエント且つ単層の状態で長期間培養することで、生理機能を再獲得、言い換えれば再分化させている。したがって、本実施の形態の培養方法によれば、生理機能が従来に比べて良好な状態にある培養細胞１６を獲得することができる。
【００７０】
また、本実施の形態に係る細胞支持複合体１０の製造方法は、本実施の形態に係る細胞の培養方法によって基材１２に細胞単層１５を形成する工程を含む。このように、本実施の形態に係る細胞の培養方法によって得られる高機能細胞を用いて細胞支持複合体１０を製造することで、高性能なバイオ人工臓器やインビトロ評価系を提供することができる。
【００７１】
また、本実施の形態の培養方法では、細胞単層１５における細胞密度が２５０００個／ｃｍ２以上７５０００個／ｃｍ２以下である。これにより、細胞単層１５をより確実に形成し維持することができる。この結果、生理機能が回復した培養細胞１６をより確実に形成することができる。また、細胞単層１５の構造を維持できるため、基材１２に細胞単層１５が積層された構造を、そのまま細胞支持複合体１０として用いることができる。つまり、培養細胞１６の作製方法を、そのまま細胞支持複合体１０の製造方法と解釈することができる。
【００７２】
また、本実施の形態の培養方法では、腎臓細胞２４の播種工程における播種密度が１００００個／ｃｍ２以上３０００００個／ｃｍ２以下である。これにより、細胞単層１５をより確実に形成し維持することができる。この結果、生理機能が回復した培養細胞１６をより確実に形成することができる。また、細胞単層１５における細胞密度をより確実に好ましい範囲に収めることができる。
【００７３】
また、本実施の形態の培養方法は、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤を、培養面１２ａに塗布する工程をさらに含む。したがって、腎臓細胞２４は、培養面１２ａに積層されたコーティング剤層１４に播種される。これにより、基材１２上に細胞単層１５を安定的に形成することができる。よって、生理機能が回復した培養細胞１６をより確実に形成することができる。また、細胞単層１５の安定性が向上するため、培養細胞１６が基材１２上でコンフルエントに達したことを、顕微鏡観察により確認する手間を省くことができる。よって、所望形状の細胞支持複合体１０を容易に製造することができる。また、同一構造の細胞支持複合体１０を大量に製造することができる。
【００７４】
なお、基材として、ヒト、ヒツジ、ブタ等の小腸粘膜下組織を脱細胞化した生物学的足場を用いることも考えられる。しかしながら、このような生物学的足場は、生体由来であるため同一構造のものを大量に製造することが困難である。このため、人工腎臓等の臨床用途に不向きである。また、小腸粘膜下組織は、動物種差あるいは個体差により、個々に形状が異なる。このため、細胞の播種面積も個々に変化し得る。よって、播種細胞数の制御が難しい。また、形状が複雑であり、また透明素材でもないため、細胞の観察が困難である。よって、細胞の観察が必要な薬物評価システムへの利用に不向きである。
【００７５】
本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、当業者の知識に基づいて各種の設計変更などの変形を加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態も本発明の範囲に含まれるものである。上述の実施の形態と以下の変形例との組合せによって生じる新たな実施の形態は、組み合わされる実施の形態及び変形例それぞれの効果をあわせもつ。
【実施例】
【００７６】
［遺伝子発現量の経時変化解析：試験１］
試験１により、近位尿細管上皮細胞における生理機能の低下を確認した。まず、ヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）を、ゼラチン溶液（シグマ社）でコーティングした６０ｍｍシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１０００００個播種した。そして、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００７７】
RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、播種直後（すなわち０時間）と培養４日（すなわち９６時間）の近位尿細管上皮細胞からｍＲＮＡを抽出し、精製した。続いて、QuantiTect Reverse Transcription Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、Thermal Cycler Dice Real Time System I（タカラバイオ株式会社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＡＱＰ１、ＣＤ１３、ＳＧＬＴ２、Ｎａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅ、ＰＥＰＴ１、ＭＤＲ１、ＯＡＴ１、ＯＣＴＮ２、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＺＯ−１の各遺伝子の発現量を測定した。
【００７８】
これらの遺伝子は、腎臓細胞の生理機能に関連する遺伝子、すなわち腎臓細胞のマーカーである。具体的には、ＡＱＰ１（aquaporin 1）は、水の輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＣＤ１３（alanyl aminopeptidase）は、タンパク質のペプチド化に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＳＧＬＴ２（sodium glucose cotransporter 2）は、ナトリウム及びグルコースの輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。Ｎａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅは、イオンの輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＰＥＰＴ１（peptide transporter 1）は、ペプチドの輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＭＤＲ１（multiple drug resistance 1）、ＯＡＴ１（organic anion transporter 1）及びＯＣＴＮ２（organic cation transporter novel 1）は、薬剤の輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＺＯ−１（zonula occludens-1）は、細胞間結合に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００７９】
各遺伝子について、播種直後の発現量に対する培養４日の発現量の比率（ｄａｙ４／ｄａｙ０）を算出した。結果を図５に示す。図５は、ヒト近位尿細管上皮細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。図５に示すように、全ての遺伝子において比率は１を下回っていた。すなわち、培養４日の各遺伝子の発現量は、培養直後に比べて低下していた。この結果から、近位尿細管上皮細胞は、シャーレでの二次元培養によって遺伝子発現量が低下すること、すなわち脱分化することが示された。なお、播種直後であっても、近位尿細管上皮細胞の生理機能はある程度低下していると推察される。
【００８０】
［培養による細胞量の経時変化解析：試験２］
試験２により、培養にともなって近位尿細管上皮細胞が増加する様子を観察した。まず、ポリスチレン製の２４ウェルプレート（ＣＥＬＬＳＴＡＲ、ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ社）の培養面を、２０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５２１溶液（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）でコーティングし、４℃にて一晩静置した。これにより、接着分子コーティングプレートを得た。比較例として、ラミニン５２１溶液でコーティングしていない２４ウェルプレート（接着分子非コーティングプレート）も用意した。また、試験１と同様にして脱分化させたヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）の懸濁液を調製した。細胞懸濁液における細胞の濃度は、２０００００個／ｍｌとした。
【００８１】
接着分子コーティングプレート及び接着分子非コーティングプレートのそれぞれに、細胞懸濁液１ｍｌを滴下して、細胞を播種した。したがって、細胞の播種数は２．０×１０５個（播種密度は１０５０００個／ｃｍ２）である。そして、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。
【００８２】
各プレートにおける、播種から培養１０，２０，６０日（すなわち播種から２４０，４８０，１４４０時間）の細胞の光学顕微鏡画像（倍率×１０）を図６（Ａ）に示す。図６（Ａ）は、培養１０，２０，６０日の細胞の光学顕微鏡画像である。図６（Ａ）に示すように、ラミニン５２１をコーティングしたプレートでは、播種後培養１０日でヒト近位尿細管上皮細胞の単層（細胞単層）が形成されることが確認された。また、播種後培養６０日でも細胞単層を確実に維持できることが確認された。なお、本発明者は、播種密度が１．０×１０５個／ｃｍ２以上では、ほぼ１日のうちにコンフルエントに達することを確認した。したがって、播種密度が１．０×１０５個／ｃｍ２以上の場合は、播種からの培養期間を細胞単層形成日からの培養期間と捉えることができる。また、遅くとも培養７日で細胞単層が形成されることが望ましい。
【００８３】
また、ラミニン５２１以外の接着分子で培養面をコーティングしたプレートを用いて、同様の培養試験を実施した。具体的には、接着分子としてラミニン３１１、ラミニン５１１、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩ及びＭａｔｒｉｇｅｌを用いた。これらの接着分子を用いた場合でも、培養６０日で細胞単層を維持できることが確認された。
【００８４】
さらに、各接着分子（コーティング物質）の好ましいコーティング濃度を検証した。結果を図６（Ｂ）に示す。図６（Ｂ）は、接着分子の種類と好ましいコーティング濃度とを示す図である。図６（Ｂ）に示すように、ラミニン３１１の好ましいコーティング濃度は、０．０７μｇ／ｃｍ２以上であった。また、ラミニン５１１の好ましいコーティング濃度は、０．０５μｇ／ｃｍ２以上であった。ラミニン５２１の好ましいコーティング濃度は、０．３３μｇ／ｃｍ２以上であった。コラーゲンＩＶの好ましいコーティング濃度は、１９μｇ／ｃｍ２以上であった。コラーゲンＩの好ましいコーティング濃度は、５０μｇ／ｃｍ２以上であった。Ｍａｔｒｉｇｅｌの好ましいコーティング濃度は、１．４μｇ／ｃｍ２以上であった。
【００８５】
［遺伝子発現量の経時変化解析：試験３］
試験３により、遺伝子発現量の変化から、近位尿細管上皮細胞の長期培養による生理機能の回復を確認した。まず、試験１と同様にして脱分化させたヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）の懸濁液を調製した。また、１２ウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の培養面を、２０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５１１−Ｅ８溶液（ニッピ社）でコーティングした。このＴｒａｎｓｗｅｌｌに、調製した細胞懸濁液を滴下した。細胞の播種数は２０００００個（播種密度は１７９０００個／ｃｍ２）とした。培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、細胞単層を形成した。そして、細胞単層が形成された日から５６日間培養した。培地は２日毎に交換した。
【００８６】
細胞単層が形成された直後（すなわち０時間）の近位尿細管上皮細胞と、単層形成日から培養４，１０，１６，５６日（すなわち９６，２４０，３８４，１３４４時間）の近位尿細管上皮細胞とから、RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｍＲＮＡを抽出し、精製した。続いて、QuantiTect Reverse Transcription Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、Thermal Cycler Dice Real Time System I（タカラバイオ株式会社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＡＱＰ１、ＳＧＬＴ２、Ｎａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅ、ｍｅｇａｌｉｎ、ＭＤＲ１、ＯＡＴ１、ＯＣＴ２及びＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの各遺伝子の発現量を測定した。なお、ｍｅｇａｌｉｎ及びＯＣＴ２の両遺伝子は、近位尿細管上皮細胞のマーカーである。具体的には、ｍｅｇａｌｉｎは、タンパク質の再吸収に関与する受容体タンパク質をコードする遺伝子である。ＯＣＴ２（organic cation transporter 2）は、薬剤の輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００８７】
各遺伝子について、細胞単層が形成された直後の発現量に対する培養Ｍ日（Ｍ＝４，１０，１６，５６）の発現量の比率（ｄＭ／ｄ０）を算出した。結果を図７に示す。図７は、細胞単層の状態で培養した際のヒト近位尿細管上皮細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。
【００８８】
図７に示すように、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎを除く各遺伝子は、培養１０日までに比べて培養１６日で急激に発現量が上昇することが確認された。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子についても、培養１６日で高い発現量であった。このことから、ヒト近位尿細管上皮細胞がコンフルエントな単層を形成している状態で１６日以上培養することで、生理機能の改善された細胞が得られることが確認された。また、培養５６日においても、ほとんどの遺伝子について、高い発現量が維持されていることが確認された。したがって、培養５６日においても、生理機能の改善された細胞が得られることが確認された。
【００８９】
［タンパク質発現量の経時変化解析：試験４］
試験４により、試験３とは異なる方法で、近位尿細管上皮細胞の長期培養による生理機能の回復を確認した。まず、試験１と同様にして脱分化させたヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）の懸濁液を調製した。また、２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の培養面を、２０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５１１−Ｅ８溶液（ニッピ社）でコーティングした。このプレートに、調製した細胞懸濁液を滴下した。細胞の播種数は３０００００個（播種密度は１５７０００個／ｃｍ２）とした。培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、ヒト近位尿細管上皮細胞の細胞単層を形成した。そして、細胞単層が形成された日から２８日間培養した。培地は２日毎に交換した。
【００９０】
培養１日〜２８日のそれぞれにおける細胞単層をパラホルムアルデヒド（和光純薬社）で固定した。近位尿細管細胞のマーカーであるＡＱＰ１抗体（サンタクルズ社）及びＬＴＬ抗体（サンタクルズ社）を用いて、各細胞単層を免疫染色した。そして、免疫染色した各細胞単層を蛍光顕微鏡ＢＺ−Ｘ７１０（ＫＥＹＥＮＣＥ社）を用いて観察した。結果を図８（Ａ）及び図８（Ｂ）に示す。図８（Ａ）は、ＡＱＰ１抗体で免疫染色した細胞単層の蛍光顕微鏡画像である。図８（Ｂ）は、ＬＴＬ抗体で免疫染色した細胞単層の蛍光顕微鏡画像である。
【００９１】
図８（Ａ）に示すように、ＡＱＰ１タンパク質は、細胞単層が形成された日から培養１６日（ｄ１６）で発現量が上昇することが確認された。また、図８（Ｂ）に示すように、ＬＴＬタンパク質は、細胞単層が形成された日から培養１４日（ｄ１４）で発現量が上昇することが確認された。このことから、ヒト近位尿細管上皮細胞がコンフルエントな単層を形成している状態で１６日以上培養することで、生理機能の改善された細胞がより確実に得られることが確認された。また、ＡＱＰ１及びＬＴＬの各タンパク質は、少なくとも培養２８日まで高発現の状態を維持することが確認された。
【００９２】
［経上皮電気抵抗値の経時変化解析：試験５］
試験５により、経上皮電気抵抗値の変化から、長期培養にともなう細胞単層の状態の変化を確認した。まず、試験１と同様にして脱分化させたヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）の懸濁液を調製した。細胞懸濁液における細胞の濃度は、３０００００個／ｍｌとした。また、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（製造コード３４６０：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の培養面を、接着量が２．０μｇ／ｃｍ２となるように調整したラミニン５１１−Ｅ８溶液（ニッピ社）でコーティングした。このＴｒａｎｓｗｅｌｌに、調製した細胞懸濁液を５００μｌ滴下した。したがって、細胞の播種数は１．５×１０５個（播種密度は１３７０００個／ｃｍ２）である。培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、ヒト近位尿細管上皮細胞の細胞単層を形成した。そして、細胞単層が形成された日から２９日間培養した。培地は毎日交換した。
【００９３】
細胞単層が形成された日から培養３，７，１２，１６，２４，２９日（すなわち７２，１６８，２８８，３８４，５７６，６９６時間）のそれぞれにおける細胞単層について、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＥＲＳ−２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ：Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を測定した。経上皮電気抵抗値は、細胞のバリア機能の指標である。結果を図９に示す。図９は、細胞単層における経上皮電気抵抗値の経時変化を示す図である。
【００９４】
図９に示すように、ヒト近位尿細管上皮細胞のコンフルエントな単層を培養すると、ＴＥＥＲ値が上昇していくことが確認された。特に、培養１６日に大きく上昇することが確認された。このことから、ヒト近位尿細管上皮細胞がコンフルエントな単層を形成している状態で１６日以上培養することで、強い細胞間結合が得られること、言い換えれば良好な細胞単層を有する細胞支持複合体が得られることが確認された。
【００９５】
［蛍光体透過量の経時変化解析：試験６］
試験６により、試験５とは異なる方法で、長期培養にともなう細胞単層の状態の変化を確認した。まず、試験１と同様にして脱分化させたヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）の懸濁液を調製した。細胞懸濁液における細胞の濃度は、３０００００個／ｍｌとした。また、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（製造コード３４６０：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の培養面を、接着量が２．０μｇ／ｃｍ２となるように調整したラミニン５１１−Ｅ８溶液（ニッピ社）でコーティングした。このＴｒａｎｓｗｅｌｌに、調製した細胞懸濁液を５００μｌ滴下した。したがって、細胞の播種数は１．５×１０５個（播種密度は１３７０００個／ｃｍ２）である。培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、ヒト近位尿細管上皮細胞の細胞単層を形成した。そして、細胞単層が形成された日から２９日間培養した。培地は毎日交換した。
【００９６】
細胞単層が形成された日から培養３，７，１２，１６，２１，２９日（すなわち７２，１６８，２８８，３８４，５０４，６９６時間）のそれぞれにおける細胞単層について、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上段にＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗを含有する平衡塩溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＨＢＳＳ）を添加した。Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの濃度は、０．１μｇ／ｍｌとした。また、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの下段にＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗを含有しない１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＨＢＳＳを添加した。そして、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で静置した。１時間静置した後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上段及び下段のＨＢＳＳを回収した。そして、マイクロプレートリーダーＡＲＶＯ  ＭＸ−ｆｌａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて、各ＨＢＳＳの蛍光強度（励起波長４３５ｎｍ／蛍光波長５２５ｎｍ）を測定した。これにより、各培養日数の細胞単層におけるＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの移動量（濃度変化）を測定した。具体的には、計算式（１）により、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの濃度変化を算出した。
計算式（１）：Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの透過率（％）＝｛Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ下段の蛍光強度／（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上段の蛍光強度＋Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ下段の蛍光強度）｝×１００
結果を図１０に示す。図１０は、細胞単層を挟んだ２つのＨＢＳＳにおけるＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの濃度変化の遷移を示す図である。
【００９７】
図１０に示すように、ヒト近位尿細管上皮細胞のコンフルエントな単層を培養すると、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの濃度変化が減少していくことが確認された。特に、培養１６日で濃度変化が１０％程度となり、細胞単層を透過するＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの量がほぼ最低となった。このことから、ヒト近位尿細管上皮細胞がコンフルエントな単層を形成している状態で１６日以上培養することで、強い細胞間結合が得られること、言い換えれば良好な細胞単層を有する細胞支持複合体が得られることが確認された。
【００９８】
［グルコース移動量の経時変化解析：試験７］
試験７により、グルコース移動量の変化から、近位尿細管上皮細胞の長期培養による生理機能の回復を確認した。まず、試験１と同様にして脱分化させたヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）の懸濁液を調製した。細胞懸濁液における細胞の濃度は、３０００００個／ｍｌとした。また、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（製造コード３４６０：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の培養面を、接着量が２．０μｇ／ｃｍ２となるように調整したラミニン５１１−Ｅ８溶液（ニッピ社）でコーティングした。このＴｒａｎｓｗｅｌｌに、調製した細胞懸濁液を５００μｌ滴下した。したがって、細胞の播種数は１．５×１０５個（播種密度は１３７０００個／ｃｍ２）である。培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、ヒト近位尿細管上皮細胞の細胞単層を形成した。そして、細胞単層が形成された日から５６日間培養した。培地は毎日交換した。
【００９９】
細胞単層が形成された日から培養３，１２，１６，２８，５６日（すなわち７２，２８８，３８４，６７２，１３４４時間）の細胞単層について、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上段に、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍｇ／ｄｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅを含有するＨＢＳＳを添加した。また、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの下段に、０．５％ＦＢＳ、１００ｍｇ／ｄｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅを含有するＨＢＳＳを添加した。そして、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で静置した。２４時間静置した後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上段及び下段のＨＢＳＳを回収した。そして、グルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬社）を用いて、各ＨＢＳＳ中のグルコース量を定量した。これにより、各培養日数における、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上段から下段へのグルコースの移動量（濃度差）を測定した。具体的には、計算式（２）により、グルコースの濃度差を算出した。
計算式（２）：グルコース濃度差（ｍｇ／ｄｌ）＝Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ下段のグルコース濃度（ｍｇ／ｄｌ）−Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上段のグルコース濃度（ｍｇ／ｄｌ）
そして、濃度差１０ｍｇ／ｄｌ未満を評価「−」とし、濃度差１０〜４０ｍｇ／ｄｌを評価「＋」とし、濃度差４０ｍｇ／ｄｌ超を評価「＋＋」とした。結果を図１１に示す。図１１は、細胞単層を挟んだ２つのＨＢＳＳにおけるグルコース濃度差の経時変化を示す図である。
【０１００】
図１１に示すように、ヒト近位尿細管上皮細胞をコンフルエントな単層の状態で培養すると、グルコースの移動量が増加していくことが確認された。特に、培養１６日でグルコースの移動量が大きく上昇することが確認された。このことから、ヒト近位尿細管上皮細胞がコンフルエントな単層を形成している状態で１６日以上培養することで、生理機能の改善された細胞がより確実に得られることが確認された。また、グルコースの移動量は、少なくとも培養２８日まで高い状態が維持されることが確認された。
【０１０１】
［近位尿細管上皮細胞の継代培養：試験８］
試験８により、継代培養による近位尿細管上皮細胞の状態の変化を確認した。まず、試験１と同様にして脱分化させたヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）の懸濁液を調製した。また、６ｃｍシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の培養面を、２０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５１１−Ｅ８溶液（ニッピ社）でコーティングした。このシャーレに、調製した細胞懸濁液を滴下した。細胞の播種数は５０００００個（播種密度は２５０００個／ｃｍ２）とした。培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、ヒト近位尿細管上皮細胞の細胞単層を形成した。培地は２日毎に交換した。
【０１０２】
そして、細胞単層が形成された日から２１日間培養した後、０．０１％トリプシン溶液（Ｌｏｎｚａ社）で細胞を剥離し、回収した。回収した近位尿細管上皮細胞を、２０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５１１−Ｅ８溶液（ニッピ社）で培養面がコーティングされた２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種した。細胞の播種数は３０００００個（播種密度は１５８０００個／ｃｍ２）とした。培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、ヒト近位尿細管上皮細胞の細胞単層を形成した。そして、細胞単層が形成された日から２１日間培養（継代培養）した。培地は２日毎に交換した。
【０１０３】
細胞単層形成日から培養１，７，１４，２１日の各細胞単層と、継代培養における細胞単層形成日から培養１，７，１４，２１日の各細胞単層とを、パラホルムアルデヒド（和光純薬社）で固定した。近位尿細管細胞のマーカーであるＡＱＰ１抗体（サンタクルズ社）及びＬＴＬ抗体（サンタクルズ社）を用いて、各細胞単層を免疫染色した。そして、免疫染色した各細胞単層を蛍光顕微鏡ＢＺ−Ｘ７１０（ＫＥＹＥＮＣＥ社）を用いて観察した。結果を図１２（Ａ）及び図１２（Ｂ）に示す。図１２（Ａ）は、ＡＱＰ１抗体で免疫染色した細胞単層の蛍光顕微鏡画像である。図１２（Ｂ）は、ＬＴＬ抗体で免疫染色した細胞単層の蛍光顕微鏡画像である。図１２（Ａ）及び図１２（Ｂ）における括弧内の数値は、細胞単層の状態での培養日数の積算値である。
【０１０４】
図１２（Ａ）及び図１２（Ｂ）に示すように、２１日間の長期培養でＡＱＰ１タンパク質及びＬＴＬタンパク質の発現が回復したヒト近位尿細管上皮細胞は、継代培養によってもその機能を消失せずに維持できることが確認された。このことから、少なくとも細胞単層の培養期間が２１日以下であれば、生理機能が改善された状態を保持したまま細胞を継代培養できることが確認された。
【０１０５】
［細胞単層の形態の経時変化観察：試験９］
試験９により、培養にともなう細胞単層の形態変化を確認した。まず、試験１と同様にして脱分化させたヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）の懸濁液を調製した。細胞懸濁液における細胞の濃度は、３０００００個／ｍｌとした。また、２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の培養面を、接着量が２．０μｇ／ｃｍ２となるように調整したラミニン５１１−Ｅ８溶液（ニッピ社）でコーティングした。このプレートに、調製した細胞懸濁液を５００μｌ滴下した。したがって、細胞の播種数は１．５×１０５個（播種密度は８００００個／ｃｍ２）である。培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、ヒト近位尿細管上皮細胞の細胞単層を形成した。そして、細胞単層が形成された日から６５日間培養した。培地は２日毎に交換した。
【０１０６】
細胞単層形成日から２０，３０，６０，６５日（すなわち単層形成から４８０，７２０，１４４０，１５６０時間）における細胞単層の光学顕微鏡画像（倍率×１００）を図１３に示す。図１３は、培養２０，３０，６０，６５日の細胞単層の光学顕微鏡画像である。図１３に示すように、培養６０日まではヒト近位尿細管上皮細胞のコンフルエントな単層を維持できることが確認された。なお、培養６０日では、ポア（隙間）が発生する兆候が見られた（図１３において矢印で示す位置）。しかしながら、このポアの兆候は、ポアを介した濃度依存性の物質移動が発生しないか、発生したとしても問題とならない程度のものであった。一方、培養６５日ではポアのサイズが大きく、細胞単層が崩壊していた。このことから、ヒト近位尿細管上皮細胞がコンフルエントな単層を形成している状態での培養期間を６０日以下とすることで、細胞単層の構造をより確実に維持できることが確認された。
【０１０７】
［細胞単層における細胞密度の解析：試験１０］
試験１０により、細胞単層における細胞密度の経時変化を解析した。まず、ポリスチレン製の４８ウェルプレート（ＣＥＬＬＳＴＡＲ、ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ社）の培養面を、２０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５１１−Ｅ８溶液（ニッピ社）でコーティングし、４℃にて一晩静置した。これにより、接着分子コーティングプレートを得た。比較例として、ラミニン５１１−Ｅ８溶液でコーティングしていない４８ウェルプレート（接着分子非コーティングプレート）も用意した。また、試験１と同様にして脱分化させたヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）の懸濁液を調製した。細胞懸濁液は、細胞の濃度が４０００個／ｍｌ、２００００個／ｍｌ、３００００個／ｍｌのものを用意した。
【０１０８】
接着分子コーティングプレート及び接着分子非コーティングプレートのそれぞれに、各細胞濃度の細胞懸濁液を５００μｌ滴下して、細胞を播種した。したがって、細胞の播種数はそれぞれ０．２×１０４個、１．０×１０４個、１．５×１０４個（播種密度は０．２×１０４個／ｃｍ２、１．０×１０４個／ｃｍ２、１．５×１０４個／ｃｍ２）である。そして、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。
【０１０９】
各プレートにおける、播種から培養３，７，１４，２１，２８，６０日（すなわち播種から７２，１６８，３３６，５０４，６７２，１４４０時間）の細胞について、細胞数を計測した。具体的には、０．１％トリプシン溶液で細胞を剥離して回収した後、ＴＣ２０全自動セルカウンター（バイオラッド社）を用いて、３ウェルについて細胞数を計測し、その平均値を各培養日数における細胞数とした。そして、得られた細胞数から細胞密度を算出した。結果を図１４に示す。図１４は、細胞密度の経時変化を示す図である。図１４において、黒色ドットは接着分子コーティングプレートが用いられたことを示し、白色ドットは接着分子非コーティングプレートが用いられたことを示す。また、四角形ドットは播種数０．２×１０４個の結果を示し、三角形ドットは播種数１．０×１０４個の結果を示し、丸形ドットは播種数１．５×１０４個の結果を示す。
【０１１０】
実験の結果、接着分子コーティングプレートでヒト近位尿細管上皮細胞を培養した場合、播種後１〜５日で細胞単層が形成され、少なくとも播種から培養６０日までは細胞単層の構造が維持されることが確認された。また、図１４に示すように、細胞単層における細胞密度は、２５０００個／ｃｍ２以上７５０００個／ｃｍ２以下の範囲に維持されることが確認された。一方、接着分子非コーティングプレートでヒト近位尿細管上皮細胞を培養した場合、細胞密度が８００００個／ｃｍ２以上となり、細胞の凝集塊が形成された。このことから、細胞単層における細胞密度を２５０００個／ｃｍ２以上７５０００個／ｃｍ２以下とすることで、細胞単層の構造をより確実に維持できることが確認された。
【０１１１】
なお、本発明者は本試験において、播種密度が２０００個／ｃｍ２以上１００００個／ｃｍ２未満の場合は、コンフルエントに到達するまでに７日以上の長期間を要する場合があることを確認した。このため、播種密度は１００００個／ｃｍ２以上であることが好ましい。播種密度を１００００個／ｃｍ２以上とすることで、培養７日未満でコンフルエント単層をより確実に形成することができる。特に、ディッシュやプレートよりも細胞の増殖が遅いＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜上で培養する場合に、培養期間の長期化を抑制することができる。また、播種密度を１００００個／ｃｍ２以上とすることで、細胞単層における細胞密度を好ましい高密度とすることができる。
【０１１２】
［近位尿細管上皮細胞の播種密度の解析：試験１１］
試験１１により、近位尿細管上皮細胞の播種密度と細胞単層の構造との関係を解析した。まず、試験１と同様にして脱分化させたヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）の懸濁液を調製した。また、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（製造コード３４６０：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の培養面を、接着量が２．０μｇ／ｃｍ２となるように調整したラミニン５１１−Ｅ８溶液（ニッピ社）でコーティングした。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌに、調製した細胞懸濁液を滴下して細胞を播種した。このとき、播種密度の異なる複数のウェルを作製した。具体的には、播種密度を２０００個／ｃｍ２、５０００個／ｃｍ２、１００００個／ｃｍ２、２００００個／ｃｍ２、５００００個／ｃｍ２、１０００００個／ｃｍ２、３０００００個／ｃｍ２、４０００００個／ｃｍ２、５０００００個／ｃｍ２とした。そして、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７日間培養した。培地は毎日交換した。
【０１１３】
各ウェルにおける、播種から培養７日（すなわち播種から１６８時間）の細胞の光学顕微鏡画像（倍率×１００）を図１５に示す。図１５は、播種密度を異ならせて７日間培養した細胞の光学顕微鏡画像である。図１５に示すように、播種密度を１００００個／ｃｍ２以上とすることで、比較的短期間のうちに細胞単層を形成できることが確認された。また、播種密度を３０００００個／ｃｍ２以下とすることで、ヒト近位尿細管上皮細胞の凝集体（図１５において矢印で示す位置）が形成されることをより確実に抑制できることが確認された。また、本発明者は、播種密度を３０００００個／ｃｍ２とした場合に、細胞単層の状態で６０日培養しても単層を維持できることを確認している。このことから、播種密度を１００００個／ｃｍ２以上３０００００個／ｃｍ２以下とすることで、細胞単層をより確実に形成し維持できることが確認された。
【符号の説明】
【０１１４】
１０  細胞支持複合体、  １２  基材、  １２ａ  培養面、  １４  コーティング剤層、  １５  細胞単層、  １６  培養細胞、  ２４  腎臓細胞。
【図１】
2019041714.tif 000003
【図２】
2019041714.tif 000004
【図３】
2019041714.tif 000005
【図４】
2019041714.tif 000006
【図５】
2019041714.tif 000007
【図６】
2019041714.tif 000008
【図７】
2019041714.tif 000009
【図８】
2019041714.tif 000010
【図９】
2019041714.tif 000011
【図１０】
2019041714.tif 000012
【図１１】
2019041714.tif 000013
【図１２】
2019041714.tif 000014
【図１３】
2019041714.tif 000015
【図１４】
2019041714.tif 000016
【図１５】
2019041714.tif 000017