(57)【要約】      （修正有）【課題】食品中におけるＤＮＡを含む物質が受けた加熱処理の強度を判定する方法、及び食品に混入した異物の混入時期を推定する方法を提供する。【解決手段】加熱処理食品に含まれるＤＮＡを含有する物質が受けた加熱処理の強度を判定する方法であって、該物質に含まれるＤＮＡをクロマトグラフィー分析すること、該分析で得られたクロマトグラムに基づいて、該物質が受けた加熱処理の強度を判定すること、を含む。また、加熱処理食品中に含まれるＤＮＡを含有する異物の混入時期を推定する方法であって、該異物に含まれるＤＮＡをクロマトグラフィー分析すること、該分析で得られたクロマトグラムに基づいて、該異物が受けた加熱処理の強度を判定すること、判定された加熱処理の強度に基づいて、該異物の混入時期を推定すること、を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱処理食品に含まれるＤＮＡを含有する物質が受けた加熱処理の強度を判定する方法であって、
該物質に含まれるＤＮＡをクロマトグラフィー分析すること、
該分析で得られたクロマトグラムに基づいて、該物質が受けた加熱処理の強度を判定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記クロマトグラフィーが逆相クロマトグラフィーである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡを含有する物質がＤＮＡを含有する異物である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記加熱処理の強度の判定が、断片化されたＤＮＡの画分のピーク及び／又は断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークに基づいて行われる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記断片化されたＤＮＡの画分のピーク及び／又は前記断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークから、検量線に基づいて、前記物質が受けた加熱処理の強度を判定する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記断片化されたＤＮＡの画分のピーク及び／又は前記断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークを対照のピークと比較した結果に基づいて、前記物質が受けた加熱処理の強度を判定する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
加熱処理食品中に含まれるＤＮＡを含有する異物の混入時期を推定する方法であって、
該異物に含まれるＤＮＡをクロマトグラフィー分析すること、
該分析で得られたクロマトグラムに基づいて、該異物が受けた加熱処理の強度を判定すること、
判定された加熱処理の強度に基づいて、該異物の混入時期を推定すること、
を含む、方法。
【請求項９】
前記クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記クロマトグラフィーが逆相クロマトグラフィーである、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
前記加熱処理の強度の判定が、断片化されたＤＮＡの画分のピーク及び／又は断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークに基づいて行われる、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記断片化されたＤＮＡの画分のピーク及び／又は前記断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークから、検量線に基づいて、前記異物が受けた加熱処理の強度を判定する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記断片化されたＤＮＡの画分のピーク及び／又は前記断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークを対照のピークと比較した結果に基づいて、前記異物が受けた加熱処理の強度を判定する、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中の物質が受けた加熱処理の強度を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品製造分野において、食品への異物の混入は重大な問題である。食品製造工場の衛生管理の観点から、食品への異物の混入時期を調べ、異物が工場の製造ラインで混入したのか、又はその後の流通や保存の過程で混入したのかを判定することは重要である。
【０００３】
製造過程で加熱処理された加熱処理食品の場合、食品中の異物が加熱処理を受けているか否かは異物混入時期の判定のための重要な判断材料である。例えば、食品が加工されるに従って、熱、ｐＨ変化、物理的な力等によって、それに含まれるＤＮＡが断片化することが知られている。特許文献１には、食品から採取したＤＮＡを特定のプライマーを用いて増幅させ、増幅産物の生成効率を算出することで該食品の加工の程度を評価する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−０３５９７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、食品中におけるＤＮＡを含む物質が受けた加熱処理の強度を判定する方法、及び食品に混入した異物の混入時期を推定する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、工場での加工食品の製造工程で施されるような強い加熱を受けたＤＮＡと、家庭での加工食品の再加熱で施されるようなより強くない加熱を受けたＤＮＡとが、クロマトグラフィーにより異なるピークとして分離されて検出されることを見出した。さらに本発明者らは、当該加熱強度に依存したＤＮＡのクロマトグラムの違いを利用すれば、加熱処理食品に混入した、ＤＮＡを含む異物が受けた加熱処理の強度を判定することができ、さらにはその結果に基づいて該異物の混入時期を推定することができることを見出した。
【０００７】
したがって、本発明は、加熱処理食品に含まれるＤＮＡを含有する物質が受けた加熱処理の強度を判定する方法であって、
該物質に含まれるＤＮＡをクロマトグラフィー分析すること、
該分析で得られたクロマトグラムに基づいて、該物質が受けた加熱処理の強度を判定すること、
を含む、方法を提供する。
また本発明は、加熱処理食品中に含まれるＤＮＡを含有する異物の混入時期を推定する方法であって、
該異物に含まれるＤＮＡをクロマトグラフィー分析すること、
該分析で得られたクロマトグラムに基づいて、該異物が受けた加熱処理の強度を判定すること、
判定された加熱処理の強度に基づいて、該異物の混入時期を推定すること、
を含む、方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、食品中の物質が受けた加熱処理の強度を判定し、かつ該加熱処理が家庭等で行われたものか、又は工場での食品の製造過程で行われたものかを評価することができる。本発明は、加熱処理食品への異物の混入時期の推定に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】９０℃で０、１０、２０、３０、６０及び１２０分加熱処理したサケ白子ＤＮＡのＨＰＬＣクロマトグラム。
【図２】７０℃で加熱処理したサケ白子ＤＮＡからのＨＰＬＣクロマトグラムのピーク面積の平均値（Ｎ＝３）の、加熱処理時間に対するプロット。Ａ：第１ピーク、Ｂ：第２ピーク。
【図３】８０℃で加熱処理したサケ白子ＤＮＡからのＨＰＬＣクロマトグラムのピーク面積の平均値（Ｎ＝３）の、加熱処理時間に対するプロット。Ａ：第１ピーク、Ｂ：第２ピーク。
【図４】９０℃で加熱処理したサケ白子ＤＮＡからのＨＰＬＣクロマトグラムのピーク面積の平均値（Ｎ＝３）の、加熱処理時間に対するプロット。Ａ：第１ピーク、Ｂ：第２ピーク。
【図５】９５℃で加熱処理したサケ白子ＤＮＡからのＨＰＬＣクロマトグラムのピーク面積の平均値（Ｎ＝３）の、加熱処理時間に対するプロット。Ａ：第１ピーク、Ｂ：第２ピーク。
【図６】９０℃で０、１０、２０、３０、６０及び１２０分加熱処理した小麦ＤＮＡのＨＰＬＣクロマトグラム。
【図７】９０℃で加熱処理した小麦ＤＮＡからのＨＰＬＣクロマトグラムのピーク面積の平均値（Ｎ＝３）の、加熱処理時間に対するプロット。Ａ：第１ピーク、Ｂ：第２ピーク。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、加熱処理食品に含まれるＤＮＡを含有する物質が受けた加熱処理の強度を判定する方法を提供する。また本発明は、加熱処理食品中に含まれるＤＮＡを含有する異物の混入時期を推定する方法を提供する。
【００１１】
本発明において、加熱処理食品とは、製造過程で加熱処理を施されて製造された食品である。該加熱処理食品の例としては、焼き、揚げ、茹で、蒸し、煮込み等の加熱調理をされた食品、ならびにレトルトパウチ食品、缶詰食品、瓶詰食品等の加圧加熱殺菌処理食品などが挙げられる。
【００１２】
本発明において加熱処理の強度の判定の対象とする物質は、該加熱処理食品に含まれるＤＮＡを含有する物質であれば、その種類は特に限定されない。例えば、該対象物質は、該加熱処理食品に含まれる食品成分（例えば、肉類、魚介類、野菜類、穀物類、それらの加工物等の細胞を含む成分）であってもよく、又は該加熱処理食品に混入したＤＮＡを含有する異物であってもよい。本発明が対象とする異物としては、ＤＮＡを含有する物質であればその種類は特に限定されないが、例えば、ヒトやヒト以外の動物の毛、爪もしくは組織片、植物やその破片、ならびに昆虫等の虫の体やその破片などを挙げることができる。好ましくは、本発明による加熱処理強度の判定における対象物質は、加熱処理食品に混入したＤＮＡを含有する異物である。
【００１３】
当該食品成分や異物からのＤＮＡの抽出は、組織や細胞中のＤＮＡの抽出又は精製に通常用いられる方法に従って行うことができる。例えば、フェノールクロロホルム法、市販のＤＮＡ抽出キット（例えば、Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ、和光純薬工業、ＴＯＹＯＢＯ、タカラバイオ等から入手可能）等を用いることができる。
【００１４】
本発明においては、当該対象物質から抽出されたＤＮＡをクロマトグラフィーで分析する。好ましくは、該クロマトグラフィーは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。該クロマトグラフィー用のカラムとしては、ＤＮＡ分離に使用できる種類のものであればよく、好ましくは逆相カラムである。よって好ましくは、該クロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィーであり、さらに好ましくは逆相ＨＰＬＣである。逆相カラムの例としては、例えばＤＮＡＰａｃTM ＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
当該クロマトグラフィー分析の手順は、使用するカラムや機器のマニュアルに従って行うことができる。例えば、カラムからのＤＮＡの溶出のための溶離液としては、水、メタノール、アセトニトリル、イソプロピルアルコール、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ヘキサフルオロプロパノール（ＨＦＩＰ）、ＴＥＡ−ＨＦＩＰ、それらの混合液などを用いることができる。好ましくは、該溶出はグラジエント溶出である。グラジエントの例としては、ＴＥＡ−ＨＦＩＰと、ＴＥＡ−ＨＦＩＰ／メタノール（５０／５０）との０：１００〜１００：０グラジエントが挙げられる。クロマトグラフィー検出シグナルの測定波長は、好ましくは２００〜３００ｎｍである。当該クロマトグラフィー分析により、対象物質に含まれるＤＮＡについてのクロマトグラムが得られる。
【００１６】
上記分析で得られたクロマトグラムには、断片化されたＤＮＡの画分のピークと、断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークが含まれる。該断片化されたＤＮＡの画分のピークは、１つのピークからなるものであっても、２つ以上のピークからなるものであってもよい。また、該断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークも、１つのピークからなるものであっても、２つ以上のピークからなるものであってもよい。いずれの場合も、該断片化されたＤＮＡの画分と断片化が進んでいないＤＮＡの画分は、クロマトグラム上で保持時間の異なる互いに分離された２つの画分として現れる。また通常、これら２つの画分は、クロマトグラム上で最も顕著な２つの画分として現れる。したがって当業者は、クロマトグラム上のピークの中から、該断片化されたＤＮＡの画分のピークと断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークとをそれぞれ選別することができる。画分の選別は、クロマトグラフィー分析の条件等を考慮して、保持時間に基づいて行えばよい。あるいは、対象物質由来の加熱処理強度が既知であるＤＮＡ（例えば、非加熱のＤＮＡや、ＤＮＡが十分に断片化する程度に加熱したＤＮＡ）のクロマトグラムを基準として、断片化されたＤＮＡの画分と断片化が進んでいないＤＮＡの画分をそれぞれ選別することができる。
【００１７】
当該クロマトグラムにおける断片化されたＤＮＡの画分のピークと断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークは、対象物質中のＤＮＡの受けた加熱の強さを反映する指標となる。より詳細には、後述の実施例に示すとおり、断片化されたＤＮＡの画分のピークの高さ及び面積は、対象物質中のＤＮＡが受けた加熱強度の強さに従って増大する。逆に、断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークの高さ及び面積は、対象物質中のＤＮＡが受けた加熱強度の強さに従って減少する。したがって、対象物質に含まれるＤＮＡのクロマトグラフィー分析で得られたクロマトグラムにおける断片化されたＤＮＡの画分のピーク又は断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークに基づいて、該ＤＮＡ（又はそれを含む物質）が受けた加熱処理の強度を判定することができる。
【００１８】
例えば、当該断片化されたＤＮＡの画分のピークと断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークのいずれか１つ以上のピークの高さ又は面積に基づいて、該ＤＮＡ又はそれを含む物質が受けた加熱処理の強度を判定することができる。好ましくは、本発明で測定されるピークの高さとは、各画分の１つもしくは２つ以上のピークのうちの最も高いピークの高さであるか、又は該１つもしくは２つ以上のピークの高さの合計もしくはその平均値である。また好ましくは、本発明で測定されるピーク面積とは、各画分の１つもしくは２つ以上のピークの面積の合計もしくはその平均値である。
【００１９】
好ましくは、当該断片化されたＤＮＡの画分と断片化が進んでいないＤＮＡの画分のいずれか一方又は両方のピークの面積に基づいて、該ＤＮＡ又はそれを含む物質が受けた加熱処理の強度が判定される。後述の実施例に示すとおり、該２つの画分のピークの面積はいずれも、ＤＮＡが受けた加熱処理の強度と相関する。
【００２０】
本発明における加熱処理強度の判定は、検量線を用いて、又は対照との比較によって行うことができる。例えば、分析したＤＮＡについての当該２つの画分のうちのいずれかのピークの高さ又は面積、あるいは該２つの画分のピーク高さ又はピーク面積の比率を、予め作成した各画分のピークの高さもしくは面積、又はそれらの画分間での比率と加熱処理強度に関する検量線にあてはめることによって、該ＤＮＡ又はそれを含む物質が受けた加熱処理の強度を判定することができる。また例えば、分析したＤＮＡについての各画分のピーク高さもしくは面積、又はそれらの画分間での比率を、対照（加熱処理強度が既知の同種の物質由来のＤＮＡ）から得られたデータと比較することによって、該ＤＮＡ又はそれを含む物質が受けた加熱処理の強度を判定することができる。当該加熱処理強度の判定は、定量的であっても定性的であってもよい。本発明において、加熱処理強度の定量的評価とは、例えば、該加熱処理で負荷された熱量（例えば、加熱温度と時間の推定、例えば８０℃で３０分間又は９０℃で１０分間に相当する熱量が加えられたか、など）を測定することであり得る。また本発明において、加熱処理強度の定性的評価とは、所定の強度以上（もしくは以下）の加熱処理、又は所定の条件の加熱処理を受けたか否かを判定することであり得る。
【００２１】
例として、当該断片化されたＤＮＡの画分と断片化が進んでいないＤＮＡの画分との間でのピークの大きさの比較に基づいた、本発明による加熱処理強度の判定について詳述する。ＤＮＡがより強い強度の加熱を受けているほど、熱によるＤＮＡ断片化が進むため、該断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークの高さ又は面積に対する、断片化されたＤＮＡの画分のピークの高さ又は面積の比は大きくなる。したがって、対象物質のＤＮＡについて測定した当該比の値を、同じ種類の物質について予め分析した結果をもとに設定した基準値と比較することによって、該対象物質やそのＤＮＡの受けた加熱処理の強度を判定することができる。例えば、工場での加熱処理食品の製造工程で施されるような相対的に強い強度の加熱処理（以下「強い加熱処理」という）を受けた物質や、家庭での加熱処理食品の再加熱で施されるような相対的により強くない強度の加熱処理（以下「弱い加熱処理」という）を受けた物質について、上述したクロマトグラフィー分析を行って、該断片化されたＤＮＡの画分と断片化が進んでいないＤＮＡの画分とのピークの高さ又は面積の比を算出し、それに基づいて比の基準値を設定しておく。対象物質についての同じ分析から得られた比を該基準値と比較すれば、対象物質又はそれに含まれるＤＮＡが、当該強い加熱処理を受けているか否かを判定することができる。より具体的には、対象物質について算出された比（[断片化されたＤＮＡの画分のピークの高さ又は面積]／[断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークの高さ又は面積]）が該基準値よりも大きければ、該対象物質又はそれに含まれるＤＮＡは、当該強い加熱処理を受けていると判定され得、一方、当該算出された比が該基準値よりも小さければ、該対象物質又はそれに含まれるＤＮＡは、当該強い加熱処理を受けていないと判定され得る。該[断片化されたＤＮＡの画分のピークの高さ又は面積]／[断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークの高さ又は面積]比の代わりに、（[断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークの高さ又は面積]／[断片化されたＤＮＡの画分のピークの高さ又は面積]）比を用いることもできる。この場合、ＤＮＡがより強い強度の加熱を受けているほど、比の値は小さくなる。
【００２２】
またあるいは、当該２つの画分のピークを比較したときに、当該断片化されたＤＮＡの画分のピークの高さ又は面積が、当該断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークと比べて所定の割合以上（例えば、断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピークの高さ又は面積の２５％以上、５０％以上、７５％以上、又は１００％以上）であれば、対象物質又はそれに含まれるＤＮＡは当該強い加熱処理を受けていると判定され得る。一方、該断片化されたＤＮＡの画分のピークの高さ又は面積が、該断片化が進んでいないＤＮＡの画分ピークと比べて当該所定の割合以下であれば、対象物質又はそれに含まれるＤＮＡは当該強い加熱処理を受けていないと判定され得る。
【００２３】
本発明における「強い加熱処理」（工場での加熱処理食品の製造工程で施されるような条件での加熱処理）としては、例えば、通常行われる食品の加熱調理（例えば、焼き調理、揚げ調理、又は１０分以上の茹で、蒸しもしくは煮込み調理等）における加熱処理、レトルト殺菌等の通常の加圧加熱殺菌処理における加熱処理（例えば、１２１℃３０分）、あるいはチルド食品（パウチ惣菜）の殺菌で行われる加熱処理（例えば、９０℃３０分）など、又はこれらと同等以上の熱量を負荷する加熱処理が挙げられる。また本発明における「弱い加熱処理」（家庭での加熱処理食品の再加熱で施されるような条件での加熱処理）としては、例えば、電子レンジによる再加熱、数分程度の茹でや蒸し、湯煎等、又はこれらと同等以下の熱量を負荷する加熱処理が挙げられる。
【００２４】
本発明において、加熱処理強度の判定の対象物質が加熱処理食品中に混入した異物である場合、その判定の結果は、該異物が、工場での加熱処理食品の製造工程で施されるような強い強度の加熱処理を受けた経験を有するか否かについての情報を与える。すなわち、該異物が当該強い加熱処理を受けていると判定された場合は、該異物は、工場での製造過程における加熱処理を受けているものであるから、該加熱処理食品の製造過程で混入したと推定される。一方で、該異物が当該強い加熱処理を受けていないと判定された場合は、該異物は、該加熱処理食品の製造後、少なくとも該加熱処理よりも後の段階で混入したと推定される。
【００２５】
したがって、本発明はまた、加熱処理食品中に含まれるＤＮＡを含有する異物の混入時期を推定する方法を提供する。当該方法では、上述した異物が受けた加熱処理の強度を判定する方法と同様に、該異物に含まれるＤＮＡのクロマトグラフィー分析により該異物が受けた加熱処理の強度を判定し、次いで判定された加熱処理の強度に基づいて、該異物の混入時期を推定する。混入時期推定の基準は上記のとおりである。
【実施例】
【００２６】
次に本発明をさらに具体的に説明するために実施例を掲げるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００２７】
１）試薬及びサンプルＤＮＡ
・アセトニトリル（ＨＰＬＣ用）
・トリエチルアミン（ＴＥＡ）（特級）
・ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）（ＨＰＬＣ用）
・メタノール（特級）
・サケ白子ＤＮＡ（Ｓａｌｍｏｎ  Ｓｐｅｒｍ，Ｓｏｎｉｃａｔｅｄ、ＤＮＡ濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）
・小麦ＤＮＡ（小麦種子からＤｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出、ＤＮＡ濃度：３００ｎｇ／μＬ）
【００２８】
２）ＨＰＬＣ分析条件
機器：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ３０Ａ
カラム：ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＤＮＡＰａｃ  ２．１ｍｍ×５０ｍｍ×４μｍ
カラム温度：５５℃
カラム流量：０．３０ｍＬ
測定波長：２６０ｎｍ
溶離液：Ａ：１５ｍＭ  ＴＥＡ−４００ｍＭ  ＨＦＩＰ
Ｂ：（１５ｍＭ  ＴＥＡ−４００ｍＭ  ＨＦＩＰ）／メタノール（５０／５０）
グラジエント：Ａ：Ｂ＝４２：５８（０分）→５：９５（１５分）→５：９５（２５分）→４２：５８（２５．１分）→４２：５８（３５分）
【００２９】
実施例１  ＤＮＡ加熱処理によるクロマトグラムの変化
１）サケ白子ＤＮＡの分析
サケ白子ＤＮＡをサンプルとした。サンプルＤＮＡを水で１０００倍に希釈し、１ｍＬずつにわけ、７０、８０、９０、及び９５℃に設定した湯浴でそれぞれ０、１０、２０、３０、６０又は１２０分加熱した。加熱処理したサンプルＤＮＡをＨＰＬＣで測定した。得られたクロマトグラムから、断片化されたＤＮＡの画分及び断片化が進んでいないＤＮＡの画分（それぞれ、クロマトグラム上で最も顕著な２つの画分のうち、保持時間のより短い画分及びより長い画分）を選択し、選択した各画分のピークの面積を求めた。ピーク面積は、クロマトグラフィーにおけるＵＶ検出値に基づいて算出した。加熱処理条件毎に各ピーク面積の平均値を求めた（Ｎ＝３）。
【００３０】
９０℃で加熱処理したサンプルＤＮＡについてのクロマトグラムを図１に示す。２つの主なピークが検出された（図１中の矢印で示したピーク）。これら２つのピークのうち、断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピーク（保持時間がより長いピーク；図１の右矢印）の高さ及び面積は、加熱処理の時間が長くなるに従って減少した。一方、断片化されたＤＮＡの画分のピーク（保持時間がより短いピーク；図１の左矢印）の高さ及び面積は、加熱処理の時間が長くなるに従って増加した。他の温度で加熱処理したサンプルについても、同様の結果が得られた。すなわち、図１と同様に２つの主なピークが検出され、それらのピークの高さ及び面積は加熱処理の時間に従って変化した。
【００３１】
検出された２つの画分のピークの面積と加熱処理条件との関係を調べた。表１〜２は、各加熱処理条件における、該２つの画分のピークそれぞれの面積の平均値を示す。検出された２つの画分のピークのうちの、保持時間がより長い断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピーク（以下、第１ピークと称する）の結果を表１に、保持時間がより短い断片化されたＤＮＡの画分のピーク（以下、第２ピークと称する）の結果を表２に示す。第１ピークの面積は、加熱温度の上昇、又は加熱時間の延長とともに減少した。第２ピークの面積は、加熱温度の上昇、又は加熱時間の延長とともに増加した。温度条件ごとの第１及び第２ピークの面積の加熱時間に対するプロットを図２〜５に示す。第１ピークの面積は、特に３０分間以上の加熱に対して、加熱時間による影響を受けて変動した。第２ピークの面積は、短時間の加熱によっても変動した。いずれの温度条件においても、ピークの面積と加熱時間との間に高い相関性（Ｒ2＞０．９９）がみられた。
【００３２】
【表１】
2019027966.tif 000002
【００３３】
【表２】
2019027966.tif 000003
【００３４】
２）小麦ＤＮＡの分析
小麦ＤＮＡをサンプルとした。サンプルＤＮＡを水で１００倍に希釈し、０．５ｍＬずつにわけ、９０℃に設定した湯浴でそれぞれ０、１０、２０、３０、６０又は１２０分加熱した。上記１）と同様の手順で、加熱処理したサンプルＤＮＡをＨＰＬＣで測定し、得られたクロマトグラムから第１ピーク及び第２ピークの面積を求めた。加熱処理条件毎に各ピーク面積の平均値を求めた（Ｎ＝３）。
【００３５】
サンプルＤＮＡのクロマトグラムを図６に示す。サケ白子ＤＮＡと同様に、２つの主なピークが検出された。これら２つのピークのうち、保持時間がより長い断片化が進んでいないＤＮＡの画分のピーク（第１ピーク；図６の右矢印）の高さ及び面積は、加熱処理の時間が長くなるに従って減少した。一方、保持時間がより短い断片化されたＤＮＡの画分のピーク（第２ピーク；図６の左矢印）の高さ及び面積は、加熱処理の時間が長くなるに従って増加した。表３に示すとおり、加熱時間の延長とともに、第１ピークの面積は減少し、第２ピークの面積は増加した。第１及び第２ピークの面積の加熱時間に対するプロットを図７に示す。第１及び第２ピークともピーク面積と加熱時間との間に高い相関性（Ｒ2＞０．９９）がみられた。
【００３６】
【表３】
2019027966.tif 000004
【００３７】
以上の結果から、ＤＮＡのクロマトグラムのピークの高さ及び面積が、該ＤＮＡに負荷された加熱処理の強度を反映することが示された。
【００３８】
実施例２  クロマトグラムに基づくＤＮＡ加熱処理条件の定量
サケ白子ＤＮＡをサンプルとし、実施例１と同様の条件で加熱処理した。ただし温度は９０℃、加熱時間は１５、２５、３５及び４５分とした（Ｎ＝１）。実施例１と同様の手順で、加熱処理したサンプルＤＮＡをＨＰＬＣで測定し、得られたクロマトグラムから第１ピークの面積を求めた。求めたピーク面積を図４に記載した第１ピークの近似式にあてはめて加熱時間を推定したところ、実際の加熱時間とほぼ一致した（表４）。したがって、クロマトグラムのピークに基づいて、ＤＮＡに負荷された加熱処理時間を定量可能であることが示された。
【００３９】
【表４】
2019027966.tif 000005
【図１】
2019027966.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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