(57)【要約】      （修正有）【課題】分離及び精製が容易であり、分離及び精製のために用いられた融合パートナーを効果的に除去することで、融合パートナーによる免疫反応誘発及びＴＬＲ５との結合阻害可能性を最小化させたＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法を提供する。【解決手段】ある特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、別のある特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質にユビキチンが結合されていることを特徴とする、融合タンパク質。【選択図】図１
2019163283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質にユビキチンが結合されていることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質は、
配列番号２に記載のアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが配列番号６に記載のリンカーを媒介として結合されたことを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ユビキチンは、
ＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質のアミノ末端に結合されていることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ユビキチンは、
ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ユビキチンは、
ユビキチンの一部分であり、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ユビキチン切断酵素は、
ＵＳＰまたはＵＣＨであることを特徴とする、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記融合タンパク質は、
ユビキチンのアミノ末端に精製用タグがさらに結合されていることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記精製用タグは、
ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）またはリシン（ｌｙｓｉｎｅ）が６個連続的に結合して形成されたリシンタグであることを特徴とする、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質を暗号化する遺伝子に、ユビキチンを暗号化する遺伝子が結合されており、前記ユビキチン暗号化遺伝子に精製用タグを暗号化する遺伝子が結合されて形成された融合遺伝子を含むベクターを製造するステップ（ａ）；
前記製造したベクターでホストを形質転換した後、前記融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を生産するステップ（ｂ）；
前記融合タンパク質に融合されている精製用タグが結合するカラムに、前記で生産された融合タンパク質を結合させて融合タンパク質を回収するステップ（ｃ）；及び
前記回収した融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理し、ユビキチンが結合した部位を切断した後、ＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質を回収するステップ（ｄ）；を含むことを特徴とする、ＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１０】
前記ＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質は、
配列番号２に記載のアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが配列番号６に記載のリンカーを媒介として結合されたことを特徴とする、請求項９に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１１】
前記ユビキチンを暗号化する遺伝子は、ＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質を暗号化する遺伝子の５’末端に結合し、
前記精製用タグを暗号化する遺伝子は、前記ユビキチンを暗号化する遺伝子の５’末端に結合することを特徴とする、請求項９に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１２】
前記ホストは、
大腸菌であることを特徴とする、請求項９に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ｄ）のユビキチン切断酵素の処理は、
融合タンパク質をカラムに結合させた状態で処理することを特徴とする、請求項９に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１４】
前記ステップ（ｄ）のユビキチン切断酵素の処理は、
融合タンパク質をカラムから溶離（ｅｌｕｔｉｏｎ）させた後、処理することを特徴とする、請求項９に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１５】
前記融合遺伝子は、
配列番号７の核酸配列を有することを特徴とする、請求項９に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１６】
前記ユビキチンは、
ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項９に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１７】
前記ユビキチンは、
ユビキチンの一部分であり、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項９に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１８】
前記精製タグは、
ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）またはリシン（ｌｙｓｉｎｅ）が６個連続的に結合したリシンタグであることを特徴とする、請求項９に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１９】
前記ステップ（ｃ）は、
生産された融合タンパク質をアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）した後、カラムに結合させてリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）することで融合タンパク質を回収することを特徴とする、請求項９に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項２０】
前記ステップ（ｃ）は、
生産された融合タンパク質をアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）し、リフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）した後、カラムに結合させて融合タンパク質を回収することを特徴とする、請求項９に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項２１】
前記ユビキチン切断酵素は、
ＵＳＰまたはＵＣＨであることを特徴とする、請求項９に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法に関し、さらに詳細には、生物工程を通して生産された後、容易に分離精製が可能であり、さらに融合パートナーが効果的に除去され得るＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エントリモド（ｅｎｔｏｌｉｍｏｄ）は、アメリカ国防総省の支援を受けてクリーブランド・バイオラボ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で開発された放射線被ばく治療剤である。本発明においては、既に開発されたエントリモドを一部変更した「改良型エントリモド（ＫＭＲＣ０１１）」をＴＬＲ５アゴニストとして生産しようとするものである。
【０００３】
エントリモドは、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）のフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）タンパク質に由来し、ＴＬＲ５（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−５）との結合及び活性化を通して放射能暴露による細胞死を止めることが確認されている。実際、チェルノブイリ原子力発電所事故現場に投入された消防士がさらされた放射線量と近似した程度をサルにさらした後、エントリモドを投与した結果、約６７％が生存し、物質を投与していないサルの生存率は、約２５％に留まったという報告もある。
【０００４】
エントリモドは、計４個のドメイン（Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）で構成されたサルモネラ・エンテリカのフラジェリンタンパク質のうち、ＴＬＲ５と直接的に結合するＤ０ドメイン及びＤ１ドメインのみから構成されており、精製及び切断のための６−ヒスチジンタグ及びエンテロキナーゼ認識配列を含む３４個のアミノ酸残基（ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＤＬＹＤＤＤＤＫＤＰＭ）がアミノ末端に含まれている。
【０００５】
ところが、既存のエントリモドは、アミノ末端に結合された前記３４個のアミノ酸残基により免疫反応の誘発及びＴＬＲ５との結合阻害可能性があるので、除去される必要がある。
【０００６】
しかし、エントリモドは、内部アミノ酸配列がプロテアーゼに脆弱な構造を有するため、プロテアーゼの一種であるエンテロキナーゼを処理する場合、その構造が破壊される問題が伴い得る。
従って、新たな概念のエントリモド及びその生産方法が開発される必要がある。
【０００７】
一方、大韓民国特許登録番号第１０−１２８７９０５号（登録日：２０１３年０７月１５日）には、フラジェリンを用いた放射線からの保護方法であって、患者にＮＦ−ｋＢを誘発する試薬の薬学的に受容可能な量を含有する組成物を投与することを含む、アポトーシスを誘発する一つ以上の治療から患者を保護する方法が記載されている。
【０００８】
また、大韓民国特許公開番号第１０−２０１２−０１０４１７７号（公開日：２０１２年０９月２０日）には、ガンを治療するためのＴＬＲ５及び効能剤の用途であって、フラジェリンのようなＴＬＲ５効能剤を提供し、ガンと感染性疾患を治療する方法と薬剤に関するものが記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記のような問題点を解決しようとするものであって、分離及び精製が容易であり、分離及び精製のために用いられた融合パートナーを効果的に除去することで、融合パートナーによる免疫反応誘発及びＴＬＲ５との結合阻害可能性を最小化させたＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質にユビキチンが結合されていることを特徴とする融合タンパク質を提供する。
【００１１】
本発明のＴＬＲ５アゴニストは、細胞の受容体であるＴＬＲ５と特異的に結合して細胞内先天免疫を活性化させる作用をすることで、放射線被ばくによる細胞損傷を制御することができる。
【００１２】
微生物を用いた生物工程でＴＬＲ５アゴニストタンパク質を生産するためには、「生産されたＴＬＲ５アゴニストタンパク質」を分離精製するための考慮をしなければならない。このような必要によりクリーブランド・バイオラボ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）では、サルモネラ・エンテリカのフラジェリンタンパク質のうち、ＴＬＲ５と直接的に結合するＤ０ドメイン及びＤ１ドメインに、精製及び切断のための６−ヒスチジンタグ及びエンテロキナーゼ認識配列を含む３４個のアミノ酸残基（ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＤＬＹＤＤＤＤＫＤＰＭ）を付加させてエントリモドを生産したことがある。
【００１３】
ところが、融合パートナーで結合された前記３４個のアミノ酸配列は、免疫反応誘発及びＴＬＲ５との結合阻害可能性があるため、除去されることが好ましいが、Ｄ０ドメイン及びＤ１ドメインが構造的にプロテアーゼに脆弱な特性があり、エンテロキナーゼ認識配列があるにもかかわらず、これを処理して前記融合パートナー（３４個のアミノ酸配列）を除去できていないまま用いているのが実情である。
【００１４】
本発明においては、このような問題点を解決しようと案出されたものであって、本発明において融合パートナーとして用いたユビキチンは、ユビキチン切断酵素（一例として、ＵＳＰ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）またはＵＣＨ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ））により切断され得るが、ユビキチン切断酵素は、基質特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）が非常に高く、タンパク質（エントリモド）内の他の部位は切断せず、ユビキチンが結合された部位だけを選択的に切断できる長所がある。本発明は、前記のようなユビキチンの特性を利用して、融合パートナーがきれいに除去されたＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質（以下、「改良型エントリモド」ともいう）を生産し、本発明を完成したものである。
【００１５】
ユビキチンは、目的タンパク質の発現を助ける発現誘導体として知られているタンパク質であり、精製工程中、ユビキチン切断酵素（一例として、ＵＳＰまたはＵＣＨ）により切断されて除去され得る。本発明において、ユビキチンは、全体シーケンスの他に一部のシーケンスだけを用いることもできる。
【００１６】
本発明の融合タンパク質において、前記ＴＬＲ５アゴニストタンパク質は、一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが配列番号６に記載のリンカーを媒介として結合されたものであってよい。配列番号２に記載のポリペプチド及び配列番号４に記載のポリペプチドは、その結合により折りたたまれることで、ＴＬＲ５と直接的に結合できるＤ０ドメイン及びＤ１ドメインが形成される。このとき、配列番号２に記載のポリペプチドと配列番号４に記載のポリペプチドとは、リンカーにより結合され得るが、そのリンカーは、一例として、配列番号６に記載のアミノ酸配列のポリペプチドであってよい。
【００１７】
本発明の融合タンパク質において、前記ユビキチンは、好ましくは、ＴＬＲ５アゴニストタンパク質のアミノ末端に結合されていることが良い。
【００１８】
本発明の融合タンパク質において、前記ユビキチンは、好ましくは、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることが良い。ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を有していれば、ユビキチン全体ではなく、一部であるとしても本発明において用いることができる。
【００１９】
本発明の融合タンパク質において、前記ユビキチン切断酵素は、様々なものがあるが、一例として、ＵＳＰまたはＵＣＨであってよい。
【００２０】
本発明の融合タンパク質において、前記融合タンパク質は、好ましくは、ユビキチンのアミノ末端に精製用タグがさらに結合されていることが良いが、精製用タグが結合されている場合、分離精製を容易にできる長所がある。このとき、前記精製用タグは、当業界に知られている様々な精製用タグを用いることができるが、一例としては、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）またはリシン（ｌｙｓｉｎｅ）が６個連続的に結合して形成されたリシンタグを用いることができる。
【００２１】
一方、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質を暗号化する遺伝子に、ユビキチンを暗号化する遺伝子が結合されており、前記ユビキチン暗号化遺伝子に精製用タグを暗号化する遺伝子が結合されて形成された融合遺伝子を含むベクターを製造するステップ（ａ）；前記製造したベクターでホストを形質転換した後、前記融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を生産するステップ（ｂ）；前記融合タンパク質に融合されている精製用タグが結合するカラムに、前記で生産された融合タンパク質を結合させて融合タンパク質を回収するステップ（ｃ）；及び、前記回収した融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理してユビキチンが結合した部位を切断した後、ＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質を回収するステップ（ｄ）；を含むことを特徴とするＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法を提供する。以下、下記においては、前記各ステップを細分化してさらに具体的に説明する。
【００２２】
＜ステップ（ａ）：融合遺伝子を含むベクターの製造＞
本ステップは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質を暗号化する遺伝子に、ユビキチンを暗号化する遺伝子が結合されており、前記ユビキチン暗号化遺伝子に精製用タグを暗号化する遺伝子が結合されて形成された融合遺伝子を含むベクターを製造するステップである。遺伝子の結合及びベクター製造などは、当業界に広く知られている技術が利用できるので、これについての具体的な記載は省略する。
【００２３】
本ステップにおいて、前記ＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）タンパク質は、一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが配列番号６に記載のリンカーを媒介として結合されたものであってよい。
【００２４】
本ステップにおいて、前記ユビキチンを暗号化する遺伝子は、好ましくは、ＴＬＲ５アゴニストタンパク質を暗号化する遺伝子の５’末端に結合し、前記精製用タグを暗号化する遺伝子は、好ましくは、前記ユビキチンを暗号化する遺伝子の５’末端に結合することが良い。
本ステップにおいて、前記融合遺伝子は、一例として、配列番号７の核酸配列を有するものであってよい。
【００２５】
本ステップにおいて、前記ユビキチンは、好ましくは、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることが良いが、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいるものであれば、ユビキチンの一部分も使用可能である。
本ステップにおいて、前記精製用タグは、様々な精製用タグを用いることができ、一例としては、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）またはリシン（ｌｙｓｉｎｅ）が６個連続的に結合して形成されたリシンタグを用いることができる。
【００２６】
＜ステップ（ｂ）：融合タンパク質の生産＞
本ステップは、前記で製造したベクターでホストを形質転換した後、前記融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を生産するステップである。
【００２７】
本ステップにおいて、前記ホストは、前ステップで構築したベクターが導入され、ベクター中に導入された遺伝子が発現され得るホスト、即ち、遺伝工学的にホスト−ベクターシステム（ｈｏｓｔ−ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）が構築されているホストであれば、いずれも用いることができるが、一例としては、最も広く知られている大腸菌を用いることができる。このとき、誘導プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を用いるベクターを利用する場合、融合タンパク質の発現のために誘導物質を用いることもできる。
【００２８】
＜ステップ（ｃ）：融合タンパク質の回収＞
本ステップは、融合タンパク質に融合されている精製用タグが結合するカラムに、前記で生産された融合タンパク質を結合させて融合タンパク質を回収するステップである。
【００２９】
前記で生産された融合タンパク質は、ホスト内に存在するか、またはホストの外部に分泌され得るが、いずれの場合であっても融合タンパク質を細胞内／外のタンパク質またはその他の物質から分離する工程が要求される。
本ステップにおいては、融合タンパク質の融合されている精製用タグを利用して分離精製を遂行することができるが、精製用タグが結合するカラム（レジン）を用いて目的とする融合タンパク質だけを結合させ、残りの物質は溶出させて分離精製が可能なものである。
【００３０】
一方、本ステップは、好ましくは、生産された融合タンパク質をアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）した後、カラムに結合させてリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）することで融合タンパク質を回収することができる。また、本ステップは、生産された融合タンパク質をアンフォールディングし、リフォールディングした後、カラムに結合させて融合タンパク質を回収することができる。
【００３１】
生産された融合タンパク質が内包体形態（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）で発現される場合、この形態では生物学的活性を期待するのは難しいため、固有の形態（ｆｏｒｍ）に戻すための工程が要求されるが、これをアンフォールディング及びリフォールディング過程という。アンフォールディング及びリフォールディング過程は、公知の技術を用いて遂行可能であるため、これについての具体的な記載は省略する。
【００３２】
＜ステップ（ｄ）：ＴＬＲ５アゴニストタンパク質の回収＞
本ステップは、前記で回収した融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理し、ユビキチンが結合した部位を切断した後、ＴＬＲ５アゴニストタンパク質を回収するステップである。
【００３３】
免疫反応誘発及びＴＬＲ５との結合阻害可能性を最小化させるためには、融合タンパク質に結合した融合パートナーを除去しなければならない。本ステップは、ユビキチン切断酵素を用いて融合パートナーを除去するものである。
本ステップにおいて、前記ユビキチン切断酵素の処理は、一例として、融合タンパク質をカラムに結合させた状態で処理することができ、また、融合タンパク質をカラムから溶離（ｅｌｕｔｉｏｎ）させた後、処理することもできる。
本ステップにおいて、前記ユビキチン切断酵素は、様々なものがあるが、一例として、ＵＳＰまたはＵＣＨであってよい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明による場合、ＴＬＲ５アゴニストタンパク質を生物工学的に生産した後、容易に分離及び精製することができ、特に、分離及び精製のために用いられた融合パートナーを効果的に除去することで、融合パートナーによる免疫反応誘発及びＴＬＲ５との結合阻害可能性を最小化させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の遺伝子配列模式図である。
【図２】Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１遺伝子の塩基配列である。
【図３】Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１のアミノ酸配列である。
【図４】ｐＡＰ−Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１プラスミド模式図である。
【図５】大腸菌で発現されたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の発現水準及び溶解度分析結果である。
【図６】固相リフォールディングされたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図７】固相リフォールディングされたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１のＵＳＰ１による切断分析結果である。
【図８】カラム上（ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）切断を通したＴＬＲ５アゴニストタンパク質の分離及び精製結果である。
【図９】様々なユビキチン切断酵素適用によるＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の切断分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明の内容を下記実施例及び実験例を通してさらに詳細に説明する。ただし、本発明の権利範囲は、下記実施例にのみ限定されるものではなく、それと等価の技術的思想の変形までを含む。
【００３７】
［実施例１：Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１発現大腸菌の作製］
（１）Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の遺伝子合成
配列番号２のアミノ酸配列（配列番号１の核酸配列により暗号化）を有するポリペプチドと、配列番号４のアミノ酸配列（配列番号３の核酸配列により暗号化）を有するポリペプチドとは、配列番号６のアミノ酸配列（配列番号５により暗号化）を有するポリペプチド（リンカー）を媒介として結合された後、折りたたまれるようになると、ＴＬＲ５に結合できるＤ０ドメイン及びＤ１ドメインを形成することとなる。
【００３８】
本実施例においては、配列番号１に記載の核酸配列及び配列番号３に記載の核酸配列が配列番号５に記載の核酸配列（リンカー）を媒介として形成された、いわゆる「ＴＬＲ５アゴニストタンパク質（ＫＭＲＣ０１１）暗号化遺伝子」にリシン（ｌｙｓｉｎｅ）６個が連続的に結合されたリシンタグ（Ｋ６）を暗号化する遺伝子及びユビキチン（Ｕｂ）を暗号化する遺伝子を結合させて融合遺伝子、「Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１」を合成するために、１次重合酵素連鎖反応を利用してＫ６Ｕｂ部分とＫＭＲＣ０１１部分を分けて増幅し、２次重合酵素連鎖反応を通してＫ６Ｕｂ部分とＫＭＲＣ０１１部分を連結して、Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の全体遺伝子を合成した（図１参照）。
【００３９】
Ｋ６Ｕｂ部分は、プライマーＫ６Ｕｂ−ＮｄｅＩ−Ｆ及びＫＭＲＣ０１１−Ｒ２とＫ６Ｕｂ遺伝子を含有しているプラスミドｐＵＣ１８−Ｋ６Ｕｂを鋳型として利用して増幅し、ＫＭＲＣ０１１部分は、プライマーＫＭＲＣ０１１−Ｆ２及びＫＭＲＣ０１１−ＢａｍＨＩ−Ｒ２と配列番号１、配列番号３及び配列番号５の遺伝子を含有しているプラスミドｐＵＣ５７−ＫＭＲＣ０１１を鋳型として利用して増幅した（下記表１参照）。
【００４０】
【表１】
2019163283.tif 000003
【００４１】
Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の全体遺伝子は、プライマーＫ６Ｕｂ−ＮｄｅＩ−Ｆ及びＫＭＲＣ０１１−ＢａｍＨＩ−Ｒと１次重合酵素連鎖反応のＫ６Ｕｂ及びＫＭＲＣ０１１産物を鋳型としてオーバーラップ−エクステンション（ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲを通して合成した。合成されたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１遺伝子の核酸配列及び核酸配列から類推されたアミノ酸配列を、それぞれ下記図２（配列番号７）と図３（配列番号８）に示した。
【００４２】
（２）Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１発現プラスミドの作製
増幅されたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１遺伝子を、ＩＰＴＧにより発現調節され、ｔａｃプロモーターを含有しているｐＡＰ（ＡＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社保有）発現プラスミドのＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素位置に挿入して、ｐＡＰ−Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１プラスミドを作製した（図４参照）。
【００４３】
（３）Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の発現大腸菌の作製
ｐＡＰ−Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１プラスミドで大腸菌ＴＧ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＧ１）を形質転換して、Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１を発現する大腸菌ＴＧ１／ｐＡＰ−Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＧ１／ｐＡＰ−Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１）を最終的に作製した。
【００４４】
［実施例２：実施例１において作製した組換え大腸菌を利用したＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の生産］
前記実施例において作製した大腸菌ＴＧ１／ｐＡＰ−Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１を利用してＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の生産能を確認することを試みた。培養のために、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ組成の培地を利用した。５００ｍＬバッフル付きフラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ  ｆｌａｓｋ）を利用して、３７℃、２００ｒｐｍで６００ｎｍの吸光度が０．５〜１．０になるまで培養した後、ＩＰＴＧを１ｍＭになるように添加してＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の発現を誘導後、４時間培養した。
【００４５】
６００ｎｍの吸光度１５に補正された前記Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１が発現された大腸菌を超音波破砕機を利用して破砕した後、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離の条件で可溶性及び非可溶性分画に分けた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）分析を通してＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の発現水準及び可溶性を確認した。
【００４６】
発現されたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の細胞内発現水準は、デンシトメータ（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）分析を通して約２１％と確認された（図５参照）。Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１は、ほとんど不溶性分画で観察され、大腸菌で発現されたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１は、不溶性内包体であることが分かった。
【００４７】
［実施例３：実施例２において生産したＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の固相リフォールディング方法］
大腸菌で発現されたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１は、不溶性内包体で発現されたので、生物学的活性回復のために固相リフォールディング（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を遂行した。超音波破砕機で破砕された大腸菌を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）した後、得られたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の内包体を緩衝液Ａ（ｐＨ７．０、５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、８Ｍ  ｕｒｅａ）で可溶化させ、その後、緩衝液Ａで平衡化されたカチオン交換樹脂ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が充填されたカラムに仕込んで、可溶化されたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１が静電気的引力によりカチオン交換樹脂に結合されるようにした。緩衝液Ｂ（ｐＨ７．０、５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を前記カラムに仕込んで尿素（ｕｒｅａ）を除去することにより、カチオン交換樹脂に結合されたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１のリフォールディングを誘導した。緩衝液Ｃ（ｐＨ７．０、５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１Ｍ  ＮａＣｌ）を前記カラムに仕込んで、リフォールディングＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１がカチオン交換樹脂から溶出され得るようにし、各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図６参照）。
【００４８】
溶出されたリフォールディングＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１は、全て可溶性形態であると確認され、ＵＳＰ１（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  １）による切断有無を確認するために、ＵＳＰ１を１０ｍｇ／Ｌとなるように溶出されたリフォールディングＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１に添加し、３７℃で１２時間の間反応させた。
【００４９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析の結果、ほとんどのリフォールディングされたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１は、ＵＳＰ１により切断され、Ｋ６ＵｂとＫＭＲＣ０１１とに分離されることを確認した（図７参照）。このとき、ＵＳＰ１処理によりＫＭＲＣ０１１タンパク質の内部構造が分解されないことを確認することもできた。
また、分離されたＫＭＲＣ０１１タンパク質のＮ−末端配列を「Ｎ−末端シークエンシング」を通して確認した結果、ＫＭＲＣ０１１タンパク質のＮ−末端アミノ酸配列「Ａ−Ｑ−Ｖ−Ｉ−Ｎ」が完全に維持されたままＫ６Ｕｂが分離されて離れることを確認することができた。
【００５０】
以上の結果から、ユビキチン切断酵素であるＵＳＰ１の処理により、本発明ＫＭＲＣ０１１タンパク質が分解されず、さらにＮ−末端が完全に維持されたまま、Ｋ６Ｕｂが分離されることを確認することができた。
目的タンパク質から融合パートナーを除去する場合は、除去に用いられた酵素が目的タンパク質の構造に影響してはならないが、本発明においてユビキチン切断酵素は、目的タンパク質であるＫＭＲＣ０１１の構造に全く影響を与えないことが確認された。
【００５１】
［実施例４：実施例３において固相リフォールディングされたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１からＫＭＲＣ０１１を分離精製する方法−ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ］
固相リフォールディングされたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１を溶出せず、カチオン交換樹脂に静電気的結合された状態でＵＳＰ１溶液（１０ｍｇ／Ｌ）を循環させることで、ＫＭＲＣ０１１のみ分離及び精製することを試みた（図８参照）。
【００５２】
分離精製されたＫＭＲＣ０１１は、アミノ末端配列分析でＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳと確認され、ＵＳＰ１により正確にＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１のＫ６Ｕｂの後ろが切断されたＫＭＲＣ０１１のみ分離精製されたことを確認することができた。
【００５３】
［実施例５：様々なユビキチン分解酵素適用によるＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の切断分析結果］
本実施例においては、前記実施例３に記載のＵＳＰ１の他に様々な種類のユビキチン切断酵素をＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１に適用し、目的タンパク質であるＫＭＲＣ０１１が完全にＫ６Ｕｂから分離されるかを確認することを試みた。
【００５４】
実施例３で得られた可溶性形態のリフォールディングＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１に、下記表２に記載の様々なユビキチン切断酵素を１０ｍｇ／Ｌとなるように添加し、３７℃で１２時間反応させた。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
実験結果は、図９のように示された。図９は、様々なユビキチン切断酵素適用によるＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１の切断分析結果である。図９において、ｌａｎｅ  １：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｗ  ｓｉｚｅ  ｍａｒｋｅｒ、ｌａｎｅ  ２：Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１、ｌａｎｅ  ３：Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１＋ＵＳＰ１、ｌａｎｅ  ４：Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１＋ＵＳＰ２、ｌａｎｅ  ５：Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１＋ＵＳＰ１０、ｌａｎｅ  ６：Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１＋ＵＣＨ−Ｌ３、ｌａｎｅ  ７：Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１＋ＵＣＨ−Ｌ５／ＵＣＨ３７である。
【００５７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である図９から見られるように、リフォールディングされたＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１は、表２に記載のユビキチン切断酵素により切断され、Ｋ６ＵｂとＫＭＲＣ０１１とに正確に分離されることを確認することができた。このとき、これらの酵素の処理によりＫＭＲＣ０１１タンパク質の内部構造が分解されないことも確認することができた。
【００５８】
また、分離されたＫＭＲＣ０１１タンパク質のＮ−末端配列を「Ｎ−末端シークエンシング」を通して確認した結果、実施例３と同様に、ＫＭＲＣ０１１タンパク質のＮ−末端アミノ酸配列「Ａ−Ｑ−Ｖ−Ｉ−Ｎ」が完全に維持されたままＫ６Ｕｂが分離されて離れることを確認することができた。
【００５９】
上記で検討したように、本実験に用いた全てのユビキチン切断酵素が、Ｋ６ＵｂＫＭＲＣ０１１のＫ６Ｕｂの後ろを正確に切断することを確認することができた。また、実施例３のＵＳＰ１だけでなく、ＵＳＰ系列及びＵＣＨ系列のユビキチン切断酵素もＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１のＫ６Ｕｂの後ろを正確に切断し、ＫＭＲＣ０１１を損傷することなく分離できることを確認した。
【００６０】
また、以上の様々な実験結果から、全ての系列のユビキチン切断酵素がＫ６ＵｂＫＭＲＣ０１１のＫ６Ｕｂの後ろを正確に切断し、ＫＭＲＣ０１１を損傷することなく分離できるものと結論付けることができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月19日(2019.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたＴＬＲ５アゴニストタンパク質を暗号化する遺伝子に、ユビキチンを暗号化する遺伝子が結合されており、前記ユビキチン暗号化遺伝子に精製用タグを暗号化する遺伝子が結合されて形成された融合遺伝子を含むベクターを製造するステップ（ａ）、
前記製造したベクターでホストを形質転換した後、前記融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を生産するステップ（ｂ）、
前記融合タンパク質に融合されている精製用タグが結合するカラムに、前記で生産された融合タンパク質を結合させて融合タンパク質を回収するステップ（ｃ）及び
前記回収した融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理し、ユビキチンが結合した部位を切断した後、ＴＬＲ５アゴニストタンパク質の内部が分解されることなく、該ＴＬＲ５アゴニストタンパク質を回収するステップ（ｄ）を含むことを特徴とするＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項２】
前記ＴＬＲ５アゴニストタンパク質は、
配列番号２に記載のアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとを配列番号６に記載のリンカーを媒介として結合させる請求項１に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項３】
前記ユビキチンを暗号化する遺伝子は、ＴＬＲ５アゴニストタンパク質を暗号化する遺伝子の５’末端に結合し、
前記精製用タグを暗号化する遺伝子は、前記ユビキチンを暗号化する遺伝子の５’末端に結合する請求項１又は２に記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項４】
前記ホストを、大腸菌とする請求項１〜３のいずれか１つに記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項５】
前記ステップ（ｄ）のユビキチン切断酵素の処理は、
融合タンパク質をカラムに結合させた状態で処理する請求項１〜４のいずれか１つに記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項６】
前記ステップ（ｄ）のユビキチン切断酵素の処理は、
融合タンパク質をカラムから溶離させた後、処理する請求項１〜５のいずれか１つに記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項７】
前記融合遺伝子は、
配列番号７の核酸配列を有する請求項１〜６のいずれか１つに記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項８】
前記ユビキチンは、
ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいる請求項１〜７のいずれか１つに記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項９】
前記ユビキチンは、
ユビキチンの一部分であり、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいる請求項１〜８のいずれか１つに記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１０】
前記精製タグは、
ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）またはリシンが６個連続的に結合したリシンタグである請求項１〜９のいずれか１つに記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ｃ）は、
生産された融合タンパク質をアンフォールディングした後、カラムに結合させてリフォールディングすることにより融合タンパク質を回収する請求項１〜１０のいずれか１つに記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ｃ）は、
生産された融合タンパク質をアンフォールディングし、リフォールディングした後、カラムに結合させて融合タンパク質を回収する請求項１〜１０のいずれか１つに記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１３】
前記ユビキチン切断酵素は、
ＵＳＰまたはＵＣＨである請求項１〜１２のいずれか１つに記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。
【請求項１４】
ステップ（ｄ）で、Ｎ−末端アミノ酸配列が完全に維持されたままＴＬＲ５アゴニストタンパク質を回収する請求項１〜１３のいずれか１つに記載のＴＬＲ５アゴニストタンパク質の生産方法。