(57)【要約】【課題】遺伝子や薬剤の導入後の細胞の生存率を高めることができる遺伝子または薬剤導入方法、および、遺伝子または薬剤導入剤を提供する。【解決手段】ピペラジンの１位および４位の窒素に、ヒドロキシル基および／またはスルホ基を含む置換基が結合したアミン化合物を含む溶液に対して、プラズマを照射して活性種を発生させ、その活性種を含む活性種含有溶液を製造する。遺伝子または薬剤と、その遺伝子または薬剤を導入する細胞とを含む分散溶液に対して、製造した活性種含有溶液を加えることにより、細胞に遺伝子または薬剤を導入する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピペラジンの１位および４位の窒素に、ヒドロキシル基および／またはスルホ基を含む置換基が結合したアミン化合物を含む溶液に対して、プラズマを照射して活性種を発生させ、前記活性種を含む活性種含有溶液を製造し、
遺伝子または薬剤と、その遺伝子または薬剤を導入する細胞とを含む分散溶液に対して、前記活性種含有溶液を加えることにより、前記細胞に前記遺伝子または前記薬剤を導入することを
特徴とする遺伝子または薬剤導入方法。
【請求項２】
前記アミン化合物は、ピペラジンの１位の窒素に、ヒドロキシル基を含む置換基が結合していることを特徴とする請求項１記載の遺伝子または薬剤導入方法。
【請求項３】
前記アミン化合物は、ピペラジンの４位の窒素に、スルホ基を含む置換基が結合していることを特徴とする請求項２記載の遺伝子または薬剤導入方法。
【請求項４】
前記アミン化合物は、ピペラジンの１位および４位の窒素に、異なる置換基が結合していることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の遺伝子または薬剤導入方法。
【請求項５】
前記アミン化合物は、少なくともＨＥＰＥＳおよびＨＥＰＰＳＯのいずれか１つから成ることを特徴とする請求項１記載の遺伝子または薬剤導入方法。
【請求項６】
前記活性種含有溶液は、Ｏ２−とＯＮＯＯ−とを含むことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の遺伝子または薬剤導入方法。
【請求項７】
前記アミン化合物を含む前記溶液は、生理食塩水であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の遺伝子または薬剤導入方法。
【請求項８】
前記プラズマは、大気圧非平衡プラズマであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の遺伝子または薬剤導入方法。
【請求項９】
ピペラジンの１位および４位の窒素に、ヒドロキシル基および／またはスルホ基を含む置換基が結合したアミン化合物と、Ｏ２−と、ＯＮＯＯ−と、を含む溶液から成ることを特徴とする遺伝子または薬剤導入剤。
【請求項１０】
前記アミン化合物は、ピペラジンの１位の窒素に、ヒドロキシル基を含む置換基が結合していることを特徴とする請求項９記載の遺伝子または薬剤導入剤。
【請求項１１】
前記アミン化合物は、ピペラジンの４位の窒素に、スルホ基を含む置換基が結合していることを特徴とする請求項１０記載の遺伝子または薬剤導入剤。
【請求項１２】
前記アミン化合物は、ピペラジンの１位および４位の窒素に、異なる置換基が結合していることを特徴とする請求項９乃至１１のいずれか１項に記載の遺伝子または薬剤導入剤。
【請求項１３】
前記アミン化合物は、少なくともＨＥＰＥＳおよびＨＥＰＰＳＯのいずれか１つから成ることを特徴とする請求項９記載の遺伝子または薬剤導入剤。
【請求項１４】
前記溶液は、生理食塩水であることを特徴とする請求項９乃至１３のいずれか１項に記載の遺伝子または薬剤導入剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子または薬剤導入方法、および、遺伝子または薬剤導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞への治療用遺伝子や抗がん剤等の薬剤の導入方法として、遺伝子が導入される細胞の病気感染の危険性をなくすとともに、遺伝子の導入効率を高めるために、細胞を低温ガスプラズマで処理することにより、細胞の近傍に存在する遺伝子を細胞内に導入する方法が開発されている（例えば、特許文献１、２、非特許文献１参照）。また、さらに遺伝子導入効率を高めるために、遺伝子とその遺伝子を導入する細胞とを含む遺伝子分散溶液にプラズマを直接当てる方法が、本発明者等により開発されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００３】
また、本発明者等により、プラズマを照射したリン酸緩衝生理食塩水を細胞に加えることにより、プラズマ照射により発生した数分程度で効果が消失する短寿命活性種（例えば、Ｏ２−；スーパーオキシドアニオン）が、細胞外から細胞内への薬剤模擬物質（ＹＯＹＯ−１）の流入を誘発することが確認されている（例えば、非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０２／０６４７６７号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００４／０１５１０１号
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１４／２０８４２５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Y. Ogawa, N. Morikawa, A. Ohkubo-Suzuki, et al., “An epoch-making application of discharge plasma phenomenon to gene-transfer”, Biotechnol. Bioeng., 30 December 2005, Volume 92, Issue 7, p.865-870
【非特許文献２】S. Sasaki, M. Kanzaki, Y. Hokari, K. Tominami, T. Mokudai, H. Kanetaka, T. Kaneko, “Roles of charged particles and reactive species on cell membrane permeabilization induced by atmospheric-pressure plasma irradiation”, Jpn. J. Appl. Phys., 2016, Vol. 55, No. 7S2, pp. 07LG04-1-5
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１乃至３および非特許文献１に記載の遺伝子導入方法は、細胞や細胞を含む溶液に直接プラズマを照射するため、プラズマにより細胞に障害が発生したり、細胞が死滅したりする危険性があり、遺伝子導入後の細胞の生存率が低下してしまうという課題があった。また、非特許文献２に記載の遺伝子導入方法は、４℃の低温で行っているが、これを体温に相当する３７℃で行うと、Ｏ２−が１秒以下で消失するため、遺伝子導入効率が著しく低下してしまうという課題があった。
【０００７】
本発明は、このような課題に着目してなされたもので、遺伝子や薬剤の導入後の細胞の生存率および導入効率を高めることができる遺伝子または薬剤導入方法、および、遺伝子または薬剤導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明に係る遺伝子または薬剤導入方法は、ピペラジンの１位および４位の窒素に、ヒドロキシル基および／またはスルホ基を含む置換基が結合したアミン化合物を含む溶液に対して、プラズマを照射して活性種を発生させ、前記活性種を含む活性種含有溶液を製造し、遺伝子または薬剤と、その遺伝子または薬剤を導入する細胞とを含む分散溶液に対して、前記活性種含有溶液を加えることにより、前記細胞に前記遺伝子または前記薬剤を導入することを特徴とする。
【０００９】
本発明に係る遺伝子または薬剤導入方法で、前記アミン化合物は、ピペラジンの１位の窒素に、ヒドロキシル基を含む置換基が結合していることが好ましく、さらに、前記アミン化合物は、ピペラジンの４位の窒素に、スルホ基を含む置換基が結合していることが好ましい。また、前記アミン化合物は、ピペラジンの１位および４位の窒素に、異なる置換基が結合していることが好ましい。特に、前記アミン化合物は、少なくともＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid）およびＨＥＰＰＳＯ（3-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-hydroxypropanesulfonic Acid）のいずれか１つから成ることが好ましい。
【００１０】
本発明に係る遺伝子または薬剤導入方法で、前記活性種含有溶液は、Ｏ２−（スーパーオキシドアニオン）とＯＮＯＯ−（ペルオキシナイトライト）とを含むことが好ましい。また、前記アミン化合物を含む前記溶液は、生理食塩水であることが好ましい。また、前記プラズマは、大気圧非平衡プラズマであることが好ましい。
【００１１】
本発明に係る遺伝子または薬剤導入剤は、ピペラジンの１位および４位の窒素に、ヒドロキシル基および／またはスルホ基を含む置換基が結合したアミン化合物と、Ｏ２−と、ＯＮＯＯ−と、を含む溶液から成ることを特徴とする。
【００１２】
本発明に係る遺伝子または薬剤導入剤で、前記アミン化合物は、ピペラジンの１位の窒素に、ヒドロキシル基を含む置換基が結合していることが好ましく、さらに、前記アミン化合物は、ピペラジンの４位の窒素に、スルホ基を含む置換基が結合していることが好ましい。また、前記アミン化合物は、ピペラジンの１位および４位の窒素に、異なる置換基が結合していることが好ましい。特に、前記アミン化合物は、少なくともＨＥＰＥＳおよびＨＥＰＰＳＯのいずれか１つから成ることが好ましい。また、本発明に係る遺伝子または薬剤導入剤で、前記溶液は、生理食塩水であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、遺伝子や薬剤の導入後の細胞の生存率および導入効率を高めることができる遺伝子または薬剤導入方法、および、遺伝子または薬剤導入剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法により製造された活性種含有溶液（Plasma＋HEPES）、および単純に１μＭ  Ｏ２−を供給したもの（Ｏ２− alone）の、保持時間ｔｒに対するＯ２−の供給量を示すグラフである。
【図２】本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法により製造された活性種含有溶液の、保持時間ｔｒに対するＯＮＯＯ−の供給量を示すグラフである。
【図３】本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法により製造された活性種含有溶液の、保持時間ｔｒに対するＨＥＰＥＳ由来ラジカル量を示すグラフである。
【図４】本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法により製造された活性種含有溶液の、保持時間ｔｒに対する過酸化水素の濃度（ＣＨ２Ｏ２）を示すグラフである。
【図５】（ａ）プラズマ照射をしていない緩衝液を、分散溶液に加えたもの（control）のＹＯＹＯ−１の蛍光を示す顕微鏡写真、（ｂ）本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法により製造された、保持時間ｔｒ＝３０秒の活性種含有溶液を使用したときのＹＯＹＯ−１の蛍光を示す顕微鏡写真、（ｃ）本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法により製造された活性種含有溶液の、各保持時間ｔｒに対するＹＯＹＯ−１の導入量を示すグラフ、（ｄ）本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法により製造された、保持時間ｔｒ＝３０秒の活性種含有溶液を使用してＹＯＹＯ−１の導入を行ったときの、各プラズマ照射時間ｔｉでの細胞の生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、各種試験および実施例に基づいて、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法は、まず、ピペラジンの１位および４位の窒素に、ヒドロキシル基および／またはスルホ基を含む置換基が結合したアミン化合物を含む緩衝液に対して、大気圧非平衡プラズマを照射して活性種を発生させ、その活性種を含む活性種含有溶液を製造する。遺伝子または薬剤と、その遺伝子または薬剤を導入する細胞とを含む分散溶液に対して、製造された活性種含有溶液を加えることにより、細胞に遺伝子または薬剤を導入する。なお、活性種としてＯ２−とＯＮＯＯ−とを含む活性種含有溶液が、本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入剤を成している。また、置換基は、例えば、アルキル基や、二重結合を含む官能基、三重結合を含む官能基を介して、ヒドロキシル基やスルホ基が結合したものであってもよい。
【００１６】
［Ｏ２−の供給量の測定］
本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法に従って、ＨＥＰＥＳを添加した緩衝液に対して、大気圧非平衡プラズマを照射して活性種を発生させ、その活性種を含む活性種含有溶液を製造した。このとき、プラズマ照射時間（ｔｉ）を３００秒、プラズマ発生時の印加電圧（Ｖｐｐ）を６ｋＶ、プラズマガス（ヘリウムガス）の供給量を３ｓｌｍとした。プラズマ照射後の各経過時間（保持時間；ｔｒ）でのＨＥＰＥＳ由来ラジカル量を計測することにより、溶液中で副次的に生成されるＯ２−の量（供給量）を推定した。その結果を、図１に示す。なお、図１には、比較のため、単純に１μＭのＯ２−を供給した後の、Ｏ２−の量の時間変化も示す。
【００１７】
室温における１μＭ  Ｏ２−の半減期は数秒程度であるが、図１に示すように、ＨＥＰＥＳを添加した緩衝液にプラズマを照射することにより、プラズマ照射から数百秒経過するまで、Ｏ２−が供給され続けることが確認された。これは、次の反応に示すように、ＨＥＰＥＳのラジカル化に伴うＯ２−の供給により、ＯＮＯＯ−を介して、ＨＥＰＥＳ由来ラジカルとＯ２−が生成され続けるためであると考えられる。
【００１８】
【化１】
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【００１９】
これに対し、図１に示すように、ＨＥＰＥＳを添加せずにＯ２−を供給した場合には、Ｏ２−は短時間で消失することが確認された。これは、次の反応によるものと考えられる。
【００２０】
【化２】
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【００２１】
［ＯＮＯＯ−の供給量の測定］
本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法に従って、ＨＥＰＥＳを添加した緩衝液に対して、大気圧非平衡プラズマを照射して活性種を発生させ、その活性種を含む活性種含有溶液を製造した。このとき、プラズマ照射時間（ｔｉ）を３０秒、プラズマ発生時の印加電圧（Ｖｐｐ）を６ｋＶ、プラズマガス（空気）の供給量を３ｓｌｍとした。ニトロ化ストレス検出用蛍光試薬のＮｉＳＰＹ−３を用いて、プラズマ照射後の各経過時間（保持時間；ｔｒ）での、活性種含有溶液のＯＮＯＯ−の量（供給量）を測定した。その結果を、図２に示す。なお、図２には、参考のために、プラズマ照射を行わないときの、緩衝液中のＯＮＯＯ−の量（図中の破線」）を示している。
【００２２】
ＯＮＯＯ−の室温での半減期は数秒程度であるが、図２に示すように、ＨＥＰＥＳを添加した緩衝液にプラズマを照射することにより、プラズマ照射から１００秒程度経過するまで、ＯＮＯＯ−が供給され続けることが確認された。これは、図１の結果から、ＨＥＰＥＳ由来ラジカル生成を介した持続的なＯ２−の生成により、そのＯ２−が溶液中のＮＯと結合して、ＯＮＯＯ−を持続的に生成し続けるためであると考えられる。
【００２３】
［Ｏ２−放出の検討］
本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法に従って、ＨＥＰＥＳを添加した緩衝液に対して、大気圧非平衡プラズマを照射して活性種を発生させ、その活性種を含む活性種含有溶液を製造した。このとき、プラズマ照射時間（ｔｉ）を３００秒、プラズマ発生時の印加電圧（Ｖｐｐ）を６ｋＶ、プラズマガス（ヘリウムガス）の供給量を３ｓｌｍとした。緩衝液のｐＨは、７．４である。ＥＳＲ（電子スピン共鳴）法により、プラズマ照射後の各経過時間（保持時間；ｔｒ）での、活性種含有溶液のＨＥＰＥＳ由来ラジカル量を測定した。その結果を、図３に示す。また、プラズマ照射時間を２秒としたとき、（株）共立理化学研究所製「パックテスト」により、プラズマ照射後の各経過時間（保持時間；ｔｒ）での、活性種含有溶液の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の濃度（ＣＨ２Ｏ２）を定量評価した。その結果を、図４に示す。
【００２４】
図３に示すように、ＨＥＰＥＳを添加した緩衝液にプラズマを照射することにより、プラズマ照射から３００秒程度経過するまで、ＨＥＰＥＳ由来ラジカル量が増加することが確認された。これは、プラズマ照射後も、ＨＥＰＥＳからＨＥＰＥＳ由来ラジカルとＯ２−とが生成され続けるためであり、ＨＥＰＥＳ由来ラジカル量の増加がＯ２−の放出を示していると考えられる。
【００２５】
また、図４に示すように、ＨＥＰＥＳを添加した緩衝液にプラズマを照射することにより、プラズマ照射から３００秒程度経過するまで、過酸化水素の濃度が増加することが確認された。これは、ｐＨ７．４において、プラズマ照射後も生成され続けるＯ２−が、水素イオン（２Ｈ＋）と結合して、酸素（Ｏ２）と過酸化水素とが生成され続けるためであり、過酸化水素濃度の増加がＯ２−の放出を示していると考えられる。
【００２６】
［ピペラジン骨格を有する様々なアミン化合物によるＯ２−放出の検討］
本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法に従って、４種類の緩衝液に対して、それぞれ大気圧非平衡プラズマを照射して活性種を発生させ、その活性種を含む活性種含有溶液を製造した。このとき、プラズマ照射時間（ｔｉ）を１秒、プラズマ発生時の印加電圧（Ｖｐｐ）を６ｋＶ、プラズマガス（空気）の供給量を３ｓｌｍとした。また、各緩衝液として、150mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10mM Good’ buffer に、以下に示すピペラジン骨格を有するＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯをそれぞれ添加したものを使用した。各緩衝液のｐＨは、７．４である。
【００２７】
【化３】
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【００２８】
（株）共立理化学研究所製「パックテスト」により、プラズマ照射後の経過時間（保持時間；ｔｒ）が３０秒および６００秒のときの、各活性種含有溶液の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の濃度（ＣＨ２Ｏ２）を定量評価した。その結果を、表１に示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
表１に示すように、ＨＥＰＥＳおよびＨＥＰＰＳＯを添加した緩衝液にプラズマを照射したものは、保持時間ｔｒ＝３０秒よりｔｒ＝６００秒の方が、過酸化水素濃度が増えている（ΔＣＨ２Ｏ２＞０）ことが確認された。これは、プラズマ照射後、少なくとも６００秒までＯ２−が生成され続け、そのＯ２−が水素イオン（２Ｈ＋）と結合して、酸素（Ｏ２）と過酸化水素とが生成され続けるためであり、過酸化水素濃度の増加がＯ２−の放出を示していると考えられる。これに対し、ＰＩＰＥＳおよびＰＯＰＳＯを添加した緩衝液にプラズマを照射したものは、保持時間ｔｒ＝３０秒よりｔｒ＝６００秒の方が、過酸化水素濃度が減少している（ΔＣＨ２Ｏ２＜０）ことが確認された。
【００３１】
表１の結果から、プラズマ照射によりＯ２−の持続的な放出が起こるアミン化合物の条件として、ピペラジンの１位の窒素に、ヒドロキシル基を含む置換基が結合している構造が重要である可能性が考えられる。あるいは、ピペラジンの１位および４位の窒素に、異なる置換基が結合している構造、すなわち、ピペラジン骨格に対して対称的な構造でないことが重要である可能性も考えられる。
【実施例１】
【００３２】
本発明の実施の形態の遺伝子または薬剤導入方法に従って、導入試験を行った。まず、ＨＥＰＥＳを添加した緩衝液に対して、大気圧非平衡プラズマを照射して活性種を発生させ、その活性種を含む活性種含有溶液を製造した。このとき、プラズマ照射時間（ｔｉ）を１秒、プラズマ発生時の印加電圧（Ｖｐｐ）を６ｋＶ、プラズマガス（空気）の供給量を３ｓｌｍとした。次に、遺伝子または薬剤と、その遺伝子または薬剤を導入する細胞とを含む分散溶液に対して、製造した活性種含有溶液を加えた。使用した細胞は、マウス繊維芽細胞の３Ｔ３Ｌ１細胞（接着状態）である。また、試験では、遺伝子や薬剤の代わりに、細胞中のＤＮＡに付着すると発光するＹＯＹＯ−１を使用した。
【００３３】
試験では、プラズマ照射後の経過時間（保持時間；ｔｒ）が３０秒、３００秒、６００秒の活性種含有溶液を、それぞれ分散溶液に加え、３０分経過後のＹＯＹＯ−１の導入量を測定した。また、比較のため、プラズマ照射をしていない緩衝液を、分散溶液に加えたもの（以下、「control」という）についても、ＹＯＹＯ−１の導入量を測定した。
【００３４】
試験結果として、controlのＹＯＹＯ−１の蛍光を示す顕微鏡写真を図５（ａ）に、保持時間ｔｒ＝３０秒の活性種含有溶液を使用したときのＹＯＹＯ−１の蛍光を示す顕微鏡写真を図５（ｂ）に、活性種含有溶液の各保持時間ｔｒに対するＹＯＹＯ−１の導入量を図５（ｃ）に示す。図５（ｃ）のＹＯＹＯ−１の導入量は、controlの結果を基準としている。
【００３５】
また、プラズマ照射時間（ｔｉ）を変えてプラズマ照射を行い、保持時間ｔｒ＝３０秒の活性種含有溶液を使用してＹＯＹＯ−１の導入を行ったときの、各照射時間ｔｉでの細胞の生存率を測定し、その結果を図５（ｄ）に示す。細胞の生存率は、細胞の代謝能を評価するＡｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して測定した。
【００３６】
図５（ａ）よりも図５（ｂ）の方が、多くの細胞にＹＯＹＯ−１の蛍光が認められており、緩衝液にプラズマ照射を行った活性種含有溶液を使用することにより、ＹＯＹＯ−１が導入されることが確認された。また、図５（ｃ）に示すように、保持時間ｔｒ＝３０秒のときがＹＯＹＯ−１の導入量が最も多く、保持時間ｔｒ＝３００秒でもＹＯＹＯ−１の導入が認められることが確認された。これに対し、保持時間ｔｒ＝６００秒では、ＹＯＹＯ−１の導入がほとんど認められないことが確認された。
【００３７】
図５（ｄ）に示すように、プラズマ照射時間ｔｉが長くなっても、ＹＯＹＯ−１導入後の細胞の生存率は全く低下していないことが確認された。これは、細胞や分散溶液にプラズマを直接照射しないためであると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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