(57)【要約】【課題】保護基部分の構造変化を利用して増幅の有無又は増幅量の制御を行うこと、及び保護基部分の構造変化を利用して検出対象物質の有無又は存在量について検出すること。【解決手段】保護基を含有する核酸に対して保護基作用物質を接触させることにより保護基部分に構造変化を起こさせる工程と、前記工程で得られた核酸を用いて核酸増幅する工程とを含む核酸増幅方法、得られた増幅産物を検出する工程をさらに含む核酸検出方法及び物質検出方法、並びに保護基を含有する核酸を含む物質検出用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）保護基を含有する核酸に対して保護基作用物質を接触させることにより保護基部分に構造変化を起こさせる工程と、
（２）前記（１）の工程で得られた核酸を用いて核酸増幅する工程と
を含む核酸増幅方法。
【請求項２】
前記保護基作用物質が過酸化水素である、請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
前記保護基が、ｐ−ジヒドロキシボリルベンジルオキシカルボニル基若しくはその誘導体である請求項１又は請求項２に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
前記保護基部分の構造変化が脱保護である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
保護基作用物質生産物質から前記保護基作用物質を生産する工程（Ａ）をさらに含む、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
前記工程（Ａ）が、前記保護基作用物質生産物質に酵素を作用させて前記保護基作用物質を生産する工程である、請求項５に記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の核酸増幅方法により核酸を増幅する工程、及び得られた増幅産物を検出する工程、を含む核酸検出方法。
【請求項８】
前記増幅産物を検出する工程が、前記増幅産物の量を測定することを含む、請求項７に記載の核酸検出方法。
【請求項９】
前記核酸を増幅する工程における核酸増幅を蛍光物質で標識したプライマーを用いて行い、増幅産物から発せられる蛍光を測定することにより増幅産物を検出する、請求項７又は請求項８に記載の核酸検出方法。
【請求項１０】
核酸増幅産物と反応して発色する色素を利用して増幅産物を検出する、請求項７又は請求項８に記載の核酸検出方法。  
【請求項１１】
請求項７〜請求項１０のいずれか１項に記載の核酸検出方法を用いることにより、前記保護基作用物質及び保護基作用物質生産物質のうち少なくとも一方を検出することを含む、物質検出方法。
【請求項１２】
保護基を含有する核酸であって保護基作用物質と接触することにより保護基部分が構造変化する核酸を含有し、検出対象物質が前記保護基作用物質及び前記保護基作用物質を生産する物質のうち少なくとも一方である、物質検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、核酸増幅方法、核酸検出方法、物質検出方法及び物質検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の生化学研究の進歩から、生物における生命活動の情報を与える物質や、生活環境に影響を与える物質、生命活動そのものに影響を与える物質が、数多く同定されてきている。生物の体液には各種低分子化合物やペプチド、核酸が含まれているが、この中にも生命活動の情報を与える物質が含まれている。例えば血中に含まれる乳酸やアンモニアは、ヒトの疲労度を示す指標となる（非特許文献１参照）。また、汗に含まれるノネナールやペラルゴン酸は体臭の指標とされている（非特許文献２参照）。
【０００３】
非特許文献３は、核酸を連結した抗体（若しくはその抗体に結合させる二次抗体）を用い、抗原となる対象物質と抗体（および二次抗体）を結合させて、抗体と核酸の結合体を精製（洗浄）して分離したのち、核酸を抽出して、ＰＣＲ法等で核酸を増幅し、物質を検出するイムノＰＣＲ技術を記載している。また、非特許文献４は、核酸や核酸アプタマーと結合する分子を、等温遺伝子増幅法と組み合わせて検出するSignal Amplification by Ternary Initiation Complexes (SATIC) 法を記載している。非特許文献５は細胞内の過酸化水素を可視化する種々のプローブ分子を記載している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】バイオメカニズム学会誌，1997，Vol. 21，No. 2，ｐ．58-64
【非特許文献２】Anti-Aging Medicine，2010，Vol. 7，No. 6，ｐ．60-65
【非特許文献３】Sano, T.，Science, 1992，Vol. 258, p. 120-122
【非特許文献４】Anal. Chem.，2016，Vol. 88, p. 7137-7144
【非特許文献５】The Science And Engineering Review of Doshisha University, April 2014, Vol. 55, No. 1, p. 1-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、一実施形態においては、保護基部分の構造変化を利用して増幅の有無又は増幅量の制御を行うことができる核酸増幅方法を提供すること、該核酸増幅方法により増幅された核酸を検出する核酸検出方法を提供すること、保護基部分の構造変化を利用して検出対象物質の有無又は存在量について検出する物質検出方法を提供すること及び保護基部分の構造変化を利用して検出対象物質の有無又は存在量について検出するための物質検出用キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は以下の態様を含む。
＜１＞  （１）保護基を含有する核酸に対して保護基作用物質を接触させることにより保護基部分に構造変化を起こさせる工程と、
（２）前記（１）の工程で得られた核酸を用いて核酸増幅する工程と
を含む核酸増幅方法。
【０００７】
＜２＞  前記保護基作用物質が過酸化水素である、＜１＞に記載の核酸増幅方法。
＜３＞  前記保護基が、ｐ−ジヒドロキシボリルベンジルオキシカルボニル基若しくはその誘導体である＜１＞又は＜２＞に記載の核酸増幅方法。
【０００８】
＜４＞  前記保護基部分の構造変化が脱保護である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の核酸増幅方法。
＜５＞  保護基作用物質生産物質から前記保護基作用物質を生産する工程（Ａ）をさらに含む、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の核酸増幅方法。
【０００９】
＜６＞  前記工程（Ａ）が、前記保護基作用物質生産物質に酵素を作用させて前記保護基作用物質を生産する工程である、＜５＞に記載の核酸増幅方法。
＜７＞  ＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の核酸増幅方法により核酸を増幅する工程、及び得られた増幅産物を検出する工程、を含む核酸検出方法。
【００１０】
＜８＞  前記増幅産物を検出する工程が、前記増幅産物の量を測定することを含む、＜７＞に記載の核酸検出方法。
＜９＞  前記核酸を増幅する工程における核酸増幅を蛍光物質で標識したプライマーを用いて行い、増幅産物から発せられる蛍光を測定することにより増幅産物を検出する、＜７＞又は＜８＞に記載の核酸検出方法。
【００１１】
＜１０＞  核酸増幅産物と反応して発色する色素を利用して増幅産物を検出する、＜７＞又は＜８＞に記載の検出方法。  
＜１１＞  ＜７＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載の核酸検出方法を用いることにより、前記保護基作用物質及び保護基作用物質生産物質のうち少なくとも一方を検出することを含む、物質検出方法。
【００１２】
＜１２＞  保護基を含有する核酸であって保護基作用物質と接触することにより保護基部分が構造変化する核酸を含有し、検出対象物質が前記保護基作用物質及び前記保護基作用物質を生産する物質のうち少なくとも一方である、物質検出用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本開示によれば、保護基部分の構造変化を利用して増幅の有無又は増幅量の制御を行うことができる核酸増幅方法及び該核酸増幅方法により増幅された核酸を検出する核酸検出方法が提供される。また、保護基部分の構造変化を利用して検出対象物質の有無又は存在量について検出する物質検出方法、及び保護基部分の構造変化を利用して検出対象物質の有無又は存在量について検出するための物質検出用キットも提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例におけるｐ−ジヒドロキシボリルベンジルオキシカルボニル基の脱保護による核酸増幅への影響を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜核酸増幅方法＞
本開示に係る核酸増幅方法は、
（１）保護基を含有する核酸に対して保護基作用物質を接触させることにより前記保護基部分に構造変化を起こさせる工程と、
（２）前記（１）の工程で得られた核酸を用いて核酸増幅する工程と、
を含む方法である。
【００１６】
従来、同じ配列を有し、混合して存在する核酸分子の中から特定の核酸分子のみを増幅しようとした場合には、当該特定の核酸分子を他の核酸分子からまず単離する必要があった。配列が同じである以上、プライマーの設計等により増幅対象とする核酸分子を限定することができないためである。
【００１７】
本発明者は、驚くべきことに、核酸分子に保護基を導入し、当該保護基部分に構造変化を起こさせることにより保護基を有する核酸分子の増幅効率を制御することが可能であることを見いだした。これにより、本開示においては、核酸分子の構造に基づいて当該核酸分子の増幅効率を簡便に制御できる核酸増幅方法が提供される。このような増幅効率の制御は、後述するように物質検出において使用された場合に微量の検出対象物質の簡便な検出を可能にする。
【００１８】
以下、本開示に係る核酸増幅方法についてより具体的に説明する。なお、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。また、本明細書において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００１９】
（ａ）保護基
本開示に係る核酸増幅方法において核酸に含有される保護基とは、ヌクレオチドポリマーからなる核酸本体部分（以下、単に核酸本体とも称する）に結合して核酸増幅反応を阻害する保護基である。より具体的には、保護基は、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の核酸ポリメラーゼとしての働きを阻害するものであってもよい。このような保護基は、例えば、核酸上の保護基存在部分への核酸ポリメラーゼの結合を部分的に又は完全に阻害するものであってもよい。あるいは、保護基は核酸ポリメラーゼによる鎖伸長反応が保護基存在部分より先に進むのを部分的に又は完全に阻害するものであってもよい。保護基は、例えば、嵩高い基（例えば、基を構成する水素原子以外の原子数が３以上、又は５以上、又は８以上、又は１０以上、又は１５以上である基）である。このような嵩高い基が存在すると、核酸の鎖に結合しようとする核酸ポリメラーゼの結合が妨げられ、あるいは核酸の鎖上を進行してきた核酸ポリメラーゼの進行が妨げられる。保護基としては、環構造（例えばベンゼン環などの芳香環、非芳香族の炭素環、又は芳香族若しくは非芳香族のヘテロ環）を含むものが挙げられる。保護基は、例えば、核酸塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシル）のＮ原子又は糖若しくはリン酸のＯ原子に結合した嵩高い基（例えば、基を構成する水素原子以外の原子数が３以上、又は５以上、又は８以上、又は１０以上である基）である。保護基は、例えば、以下の構造を有するｐ−ジヒドロキシボリルベンジルオキシカルボニル基（p-dihydroxyborylbenzyloxycarbonyl基；以後、Dobz基ともいう）又はその誘導体であってもよい。あるいは、保護基は非特許文献５（The Science And Engineering Review of Doshisha University, April 2014, Vol. 55, No. 1, p. 1-4）に記載される保護基であってもよく、また、例えばアクリジニウム（aclidinium）基であってもよい。後述するように、保護基は特定の物質（保護基作用物質）と接触すると構造変化して、保護基による核酸増幅に対する阻害は解除される。したがって、使用する保護基作用物質の種類に応じて、保護基作用物質により構造変化する保護基を選択して用いればよい。Dobz基やアクリジニウム基は過酸化水素と接触するとそのような構造変化を起こすが、保護基作用物質は過酸化水素以外の物質、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）等の補酵素、でもよいので、当該物質に応じた保護基を選択して使用すればよい。
【００２０】
【化１】
2019136013.tif 000002
【００２１】
式中、波線は核酸分子中の酸素原子又は窒素原子などの結合部位を表す。Dobz基の誘導体としては以下の式（Ｄ）の構造を有する基が挙げられる。
【００２２】
【化２】
2019136013.tif 000003
【００２３】
式（Ｄ）中、波線は核酸分子中の酸素原子又は窒素原子などの結合部位を表す。また、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子又は任意の置換基を表し、Ｒ１とＲ２とは互いに結合して環を形成していてもよい。Ｒ１又はＲ２で表される置換基の例としては、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数６〜１５のアリール基、炭素数５〜１５の複素環基（ヘテロアリール基を含む）、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基などが挙げられる。また、Ｒ１とＲ２とが結合して形成する環の例としては、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキレン基を表す場合に形成される環が挙げられ、より具体的には、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ置換されていてもよいメチレン基を表す場合に形成される環が挙げられる。アルキレン基及びメチレン基上の置換基の例としては、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数６〜１５のアリール基、炭素数５〜１５の複素環基（ヘテロアリール基を含む）、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基などが挙げられる。
Ｒ３〜Ｒ６は、それぞれ独立に水素原子又は任意の置換基を表す。Ｒ３とＲ４は互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ５とＲ６は互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５又はＲ６によって表される置換基の例としては、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数６〜１５のアリール基、炭素数５〜１５の複素環基（ヘテロアリール基を含む）、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基などが挙げられる。また、Ｒ３とＲ４、又はＲ５とＲ６が互いに結合して形成する環の例としては、炭素数６〜２０の芳香族炭素環、炭素数６〜２０の芳香族ヘテロ環、炭素数５〜２０の非芳香族炭素環、炭素数２〜２０の非芳香族ヘテロ環などが挙げられる。ただし、式（Ｄ）の構造はDobz基の誘導体であるため、Ｒ１〜Ｒ６のうち全てが水素原子であることはない。
【００２４】
Dobz基の誘導体に該当する基のより具体的な例としては以下の基が挙げられる。
【００２５】
【化３】
2019136013.tif 000004
【００２６】
式中、波線は核酸分子中の酸素原子又は窒素原子などの結合部位を表す。
【００２７】
保護基が核酸増幅反応を阻害するものである場合は、核酸増幅反応を行った場合に、保護基を含有する核酸の核酸増幅効率は、保護基を含有しない以外は同じ構造の核酸と比較して、低下する。核酸増幅効率の低下は、核酸増幅反応を所定サイクル又は所定時間行った後の増幅量の差として、あるいは所定の増幅量（例えば、コピー数又は重量）に達するまでに必要な増幅サイクル数又は増幅時間の差として確認することができる。核酸増幅効率の低下は核酸ポリメラーゼの働きの阻害により生じるため、核酸増幅効率の低下を確認するために用いる核酸増幅方法は特に限定されないが、例えば等温遺伝子増幅方法であってもよく、例えばＬＡＭＰ法又はＲＣＡ法を標準的なプロトコールに従って行うものであってもよい。
【００２８】
保護基は、存在する核酸分子の全てに含まれていることは必須ではない。しかし、保護基が含まれない核酸分子が存在すると、核酸増幅反応を行ったときに保護基部分の構造変化の有無に関わらず核酸分子が増幅されてしまうため、核酸分子の総数中における保護基を含む核酸分子の数の割合は高い方が好ましく、例えば８０％以上であり、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、一層好ましくは９９％以上であり、さらにより好ましくは１００％である。
【００２９】
核酸分子中において保護基は核酸分子中の官能基（例えば、アミノ基、水酸基、カルボニル基、リン酸基、等）に結合している。核酸分子中における保護基の結合位置は、リン酸部分でもよく、核酸塩基中のＮ原子あってもよく、あるいは糖（リボース又はデオキシリボース）中のＯＨ基であってもよい。保護基は、例えば、アデニン、グアニン又はシトシン塩基中の−ＮＨ２基に結合していてもよいし、５’末端の糖における５’位の−ＣＨ２ＯＨ基に結合していてもよい。
【００３０】
核酸分子中において保護基の結合位置の核酸鎖全体における相対位置は特に限定されない。一つの実施形態においては、保護基は核酸分子の５’末端のヌクレオチド中に存在する。この実施形態においては、５’末端において保護基が核酸ポリメラーゼの結合を阻害又は鎖伸長反応を阻害するため、保護基による阻害が有効に働く。なお、本明細書中において「阻害」の用語は、特に断りの無い限り、部分的な阻害及び完全な阻害（言い換えれば遮断）の両方を包含する意味で用いられる。別の実施形態においては、保護基は核酸分子の５’末端ではなく、より下流のヌクレオチド中に存在する。この実施形態においては、鎖伸長反応は保護基の存在位置までは進行し、鋳型となる核酸分子の長さよりは短い核酸鎖が形成されるが、この場合でもプライマー設計を適切に行うことでそのような短い核酸鎖は次の鎖伸長反応の鋳型とならないようにすることができる。このように、保護基の存在位置は３’末端からある程度の距離（例えば５ヌクレオチド以上、又は１０ヌクレオチド以上）離れているものであれば限定はされないが、ノイズを低減する観点からは、保護基は５’末端に近い位置（例えば５’末端から１０ヌクレオチド以内、又は５ヌクレオチド以内）に存在するヌクレオチドに結合していることが好ましく、５’末端のヌクレオチドに結合していることがより好ましい。
【００３１】
一つの核酸分子中に含まれる保護基の数は１つでも複数であってもよい。しかし、一つの核酸分子中に複数の保護基が存在すると、保護基による核酸増幅阻害を解除するためには複数の保護基の全てが構造変化を起こさなければならなくなり、核酸増幅阻害を解除するためにより多くの保護基作用物質が必要となる。このため、一つの核酸分子中に含まれる保護基の数は１つであることが好ましい。例えば、１つの保護基を有する核酸分子の数の、全核酸分子数に対する割合が９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９９％以上であることがさらに好ましく、１００％であることが一層好ましい。また、前記保護基は、各核酸分子の５’末端のヌクレオチド又は５’末端に近い一のヌクレオチドに結合していることが好ましい。
【００３２】
（ｂ）核酸
本開示に係る核酸増幅方法で用いられる核酸（以下、対象核酸とも称する）は、核酸増幅法で増幅可能な核酸であればよく、その例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、およびそれらの誘導体が挙げられる。対象核酸の配列に特に制限はない。ただし、保護基作用物質に環境中に存在する核酸がコンタミネーションしていることがあるので、対象核酸の配列はこのような環境中の核酸が存在する場合でも選択的に増幅可能であることが望ましい。例えば、環境中の核酸には結合しない配列を有するプライマーを用いて増幅可能であることが望ましい。対象核酸は１本鎖であっても２本鎖であってもよい。対象核酸は直鎖状であっても環状であってもよい。対象核酸を構成する塩基数に制限はないが、望ましくは１０〜１００００塩基、さらに望ましくは２０〜１０００塩基、さらに望ましくは３０〜２００塩基である。対象核酸が短すぎるとプライマーがアニーリングしにくくなる傾向があり、また、染色などによる検出が可能な重量まで増幅するのにより多くの時間又はサイクルを要する傾向がある。対象核酸が長すぎると、増幅の際の鎖伸長に必要な時間が増加する傾向がある。
【００３３】
保護基で保護された核酸は、核酸に保護基を結合させることで作製してもよいし、あるいは保護基が結合したヌクレオチドを用いて核酸を化学合成することで作製してもよい。核酸に保護基を結合させる際には、保護基の供給物質と核酸上の官能基（アミノ基、水酸基、カルボニル基、リン酸基等）を一般的な手法に従って反応させればよい。保護基の供給物質は、例えば、ハロゲン化アシル（例えば塩化アシル）であってもよく、ハロゲン化アシルは核酸上のアミノ基や水酸基と容易に反応する。例えば、上述したDobz基誘導体の場合、例えば以下に示すハロゲン化物を核酸中の例えばアデニンのアミノ基と反応させて、Dobz基誘導体が結合した核酸を作製することができる。反応は適切な溶媒、例えば水とジクロロメタンとの混合溶媒中で、例えば４０℃〜７０℃で行うことができる。ボロン酸部分を常法に従って脱保護してボロン酸のヒドロキシル基を再生すればDobz基が結合した核酸を作製することもできる。
【００３４】
【化４】
2019136013.tif 000005
【００３５】
核酸に保護基を結合させることで保護基を含有する核酸を作製する場合は、核酸中のどのヌクレオチド残基に保護基が結合するかを厳密に制御することは難しい。このため、保護基が結合したヌクレオチドを用いて核酸を化学合成することで保護基を含有する核酸を作製してもよい。例えば５’末端のヌクレオチドに保護基が結合した核酸を作製したい場合には、核酸を、例えばＤＮＡシンセサイザーを用いて化学合成してもよい。この場合には、例えば最初のヌクレオチド残基を固相に結合させるためのヌクレオチドに、上記のようなやり方であらかじめ保護基を結合させておけばよい。
【００３６】
（ｃ）保護基部分の構造変化
本開示に係る核酸増幅方法において、保護基部分とは、保護基自体及び保護基と核酸本体との結合を意味する。保護基部分の構造変化とは、保護基部分の構造が変化し、保護基による核酸増幅反応に対する阻害が部分的に又は完全に解除されることである。保護基部分の構造変化の例としては、保護基の開裂、保護基の脱離（つまり脱保護）、保護基中の開環などがあるが、阻害の解除の観点からは脱離が好ましい。なお、本明細書中においては、特に断りの無い限り、「阻害の解除」の語は阻害の部分的な解除及び阻害の完全な開示を包含する意味で用いられる。保護基が脱離した場合、核酸の構造は保護基の結合前の構造に戻るため、保護基による核酸増幅反応に対する阻害が解除される。また、構造変化が生じて保護基による核酸増幅反応に対する阻害が解除された核酸分子数が多ければ、増幅された核酸の量も増加するため、これを指標にして上記核酸分子数を求めることができ、さらに、保護基作用物質の量を推定することが可能である。
【００３７】
（ｄ）保護基作用物質
保護基作用物質は、保護基部分に接触することで保護基部分に構造変化を起こさせて、保護基による核酸増幅反応に対する阻害を解除できる物質である。保護基作用物質の例としては、酸化還元性物質、求核／求電子試薬、酸／アルカリ物質、補酵素類などが挙げられる。保護基作用物質のより具体的な例としては、過酸化水素、補酵素類（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ピロロキノリンキノン、フラビンアデニンジヌクレオチド、ピリドキサールリン酸、フラビンモノヌクレオチド、アデノシン三リン酸、ビオチン、パントテン酸、葉酸、等）が挙げられる。保護基の種類に応じて、保護基部分に構造変化を生じさせるのに適切な保護基作用物質を選べばよい。保護基作用物質は、望ましくは過酸化水素である。あるいは、保護基作用物質の種類に応じて、それによって構造変化を生じることが可能な保護基を選択すればよい。保護基と当該保護基を例えば脱離させる（脱保護）ための物質及び条件については当業界で周知であり、このような選択は当業者が容易に行うことができるものである。同様に、保護基に例えば開裂などの構造変化を生じさせるための物質及び条件についても当業界で周知である。
【００３８】
例えば、保護基としてのｐ−ジヒドロキシボリルベンジルオキシカルボニル基（Dobz基）に過酸化水素が作用すると、ボロン酸部分が酸化的に分解され、最終的に保護基が脱離する（つまり、核酸本体が脱保護される）。その結果、核酸は保護前の構造に戻り、核酸増幅反応に対する阻害が解除される。過酸化水素に接触して構造変化を起こす保護基としては、Dobz基及びその誘導体に加えて、さらに、非特許文献５（The Science And Engineering Review of Doshisha University, April 2014, Vol. 55, No. 1, p. 1-4）に記載される保護基などが挙げられ、たとえば、アクリジニウム基およびその誘導体が挙げられる。
【００３９】
（ｅ）保護基部分に構造変化を起こさせる工程
本開示に係る核酸増幅方法における、保護基を含有する核酸に対して保護基作用物質を接触させることにより保護基部分に構造変化を起こさせる工程（以降、保護基部分に構造変化を起こさせる工程とも称する）は、例えば、適切な溶媒中に保護基を含有する核酸と保護基作用物質とを共存させて接触させる工程であってもよい。適切な溶媒としては、水が挙げられるが、溶媒はさらに緩衝剤（例えばＰＢＳ、ＨＥＰＥＳなど）を含んでいてもよい。また、保護基部分に構造変化を起こさせるのにさらに必要な物質があれば、溶媒中にそれらをさらに含ませればよい。保護基部分に構造変化を起こさせる工程は、構造変化を起こさせるのに必要な条件で行えばよい。保護基部分に構造変化を起こさせる工程は、保護基作用物質と保護基との組み合わせの種類によっては、熱の付与やｐＨ調整を行うことをさらに含む場合があり、また、触媒の存在下で行う場合もある。保護基部分に構造変化を起こさせる工程は、例えば、０℃〜９０℃、１０℃〜５０℃、又は１５℃〜３０℃の温度で行ってもよく、例えば室温で行うことができる。保護基の種類に応じて、保護基部分に構造変化（例えば脱離させる（脱保護））ための反応条件については当業界で周知であり、これに従えばよい。
【００４０】
例えば、Dobz基又はその誘導体を含有する核酸に対して過酸化水素を接触させることによりDobz基又はその誘導体を脱離させる場合は、保護基部分に構造変化を起こさせる工程は、Dobz基又はその誘導体を含有する核酸を含む水溶液に過酸化水素を添加し、例えば１０℃〜４０℃（例えば室温、例えば２５℃）で例えば５分から１２０分静置する工程であってもよい。保護基作用物質一分子によって構造変化を生じる保護基部分（反応式によるが、例えば１個）の数が決まっているため、核酸分子集団中における、保護基部分が構造変化した核酸分子の数（元々保護基を有していた核酸分子のうち、未だ構造変化していない保護基部分を有しない核酸分子の数）は、保護基作用物質の存在数に応じた（例えば比例した）数となる。
【００４１】
（ｆ）核酸を増幅する工程
本開示に係る核酸増幅方法における、核酸を増幅する工程は核酸増幅技術を用いて、保護基部分に構造変化を起こさせる工程の結果得られた核酸を増幅する工程である。保護基部分に構造変化を起こさせる工程の結果得られた核酸は鋳型として核酸増幅に用いられる。核酸増幅技術は、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を増幅させる任意の方法でよく、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction） 、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR） 、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-based Amplification）、ＴＲＣ(Transcription Reverse-transcription Concerted Reaction)、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Reverse Transcription-LAMP）、ＩＣＡＮ(Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification of Nucleic  Acids)、ＲＣＡ（Rolling Cycle Amplification）、Ｓｍａｒｔ  Ａｍｐ(Smart Amplification Process)、 ＴＭＡ（Transcription-mediated Amplification）、ＴＡＳ（Transcription Amplification System）、３ＳＲ（Self-sustained Sequence Replication System）などが挙げられる。等温遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ法又はＲＣＡ法が簡便性の点から望ましい。等温遺伝子増幅の場合、熱サイクルを行わなくても核酸増幅反応が室温でも進行するため、増幅用の機器は必ずしも必要とされず、必要な試薬（プライマー、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ若しくは鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、Ｍｇ２＋イオン、硫酸アンモニウムなどの塩類、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの緩衝物質など）を核酸と混合するだけで核酸増幅を進行させることができる。核酸増幅は各方法における標準的なプロトコールに従って行えばよい。例えば等温遺伝子増幅の場合、機器を必要しない観点からは核酸増幅を常温（環境温度）で行うことが好ましい。
【００４２】
プライマーは、使用する核酸増幅方法に適した設計をしたプライマーを使用すればよい。各プライマーは後述するように蛍光物質で標識されていてもよい。例えば、ＰＣＲ法の場合は、前記核酸の二本鎖の各鎖にそれぞれ相補的な配列を有するプライマーペアを使用すればよく、プライマーの長さは１０〜５０ヌクレオチド程度、あるいは１５〜４０ヌクレオチド程度であってもよく、また、５’端に、非相補的配列を含んでいてもよい。各核酸増幅方法に適したプライマー設計は当業界で知られており、これに従ってプライマーを設計すればよい。
【００４３】
核酸分子集団中における、保護基部分が構造変化した核酸分子の分子数（元々保護基を有していた核酸分子のうち、未だ構造変化していない保護基部分を有しない核酸分子の分子数）は、保護基作用物質の存在数に応じた（例えば比例した）数となり、また、核酸増幅工程によって得られる増幅産物の量は保護基部分が構造変化した核酸分子の数に応じた（例えば比例した）数となるため、核酸増幅工程によって得られる増幅産物の量は保護基作用物質の分子数を反映した量（保護基作用物質の分子数により決定される量）となる。
【００４４】
保護基が核酸増幅反応を完全に阻害する場合は、保護基を含有する（保護基部分は未だ構造変化していない）核酸と保護基部分が構造変化した核酸とが共存する場合に核酸増幅反応を行うと、保護基部分が構造変化した核酸のみが増幅される（以後、選択的増幅とも称する）。保護基が核酸増幅反応を部分的に阻害する場合は、保護基を含有する（保護基部分は未だ構造変化していない）核酸と保護基部分が構造変化した核酸とが共存する場合に核酸増幅反応を行うと、保護基部分が構造変化した核酸がより高い効率で増幅される（以後、優先的増幅とも称する）。
【００４５】
核酸増幅反応は、所定のサイクル数又は所定の時間で増幅を終了させてもよい。例えば、等温遺伝子増幅の場合、熱サイクルが必要とされないため、所定の時間で増幅を終了させる。核酸増幅反応は、核酸増幅反応がプラトーに達する前の指数関数的な増幅期に増幅を終了させることが好ましい。保護基による核酸増幅反応の阻害が完全ではない場合、あるいは一部の核酸鎖に保護基が結合していない場合でも、指数関数的な増幅期に増幅を終了させれば、増幅産物の量を基にして保護基作用物質による保護基部分の構造変化の有無又は程度を求めることができる。しかし、核酸増幅反応をプラトーに達するまで進行させてしまうと、増幅産物の量を基にして保護基作用物質による保護基部分の構造変化の有無や程度を求めることが難しくなる傾向がある。また、それら以外の場合であっても、指数関数的な増幅期に増幅を終了させた方が増幅産物の量の測定の精度が向上する傾向にある。
【００４６】
本開示に係る核酸増幅方法は、保護基作用物質生産物質から保護基作用物質を生産する工程をさらに含んでいてもよい。これにより生産された保護基作用物質が、保護基を含有する核酸と接触することとなる。保護基作用物質生産物質とは、条件を整えることにより保護基作用物質に変化することが可能な物質をいう。この際に、保護基作用物質生産物質に加えて保護基作用物質生産物質以外の反応物も必要としても構わないし、保護基作用物質に加えて保護基作用物質以外の副生成物が生じても構わない。この反応においても、保護基作用物質生産物質一分子から生産される保護基作用物質の分子の数が反応式により決まっているため、核酸増幅によって得られる増幅産物の量は、保護基作用物質生産物質の分子数を反映した量（保護基作用物質生産物質の分子数により決定される量）となる。
【００４７】
例えば保護基作用物質が過酸化水素である場合、保護基作用物質生産物質の例としては乳酸が挙げられる。乳酸を乳酸オキシダーゼにより酸素と反応させる（酸化する）ことにより、ピルビン酸と過酸化水素が得られる。この反応では１分子の乳酸から１分子の過酸化水素が生じ、存在する乳酸の分子数は生じる過酸化水素の分子数に反映される。この場合、過酸化水素は乳酸分子数を保護基部分が構造変化した核酸の分子数に変換するための媒介物（メディエーター）として働いているともいえる。
【００４８】
保護基作用物質生産物質から保護基作用物質を生産する工程は、例えば、水、有機溶媒又はこれらの混合溶媒などの溶媒中において、保護基作用物質生産物質から保護基作用物質を生産する反応を起こさせることにより行うことができる。この際には、保護基作用物質生産物質に加えて、反応の必要性に応じて保護基作用物質生産物質以外の反応物及び／又は補酵素を存在させても構わない。また、反応の必要に応じて反応系を加熱したり、酸又はアルカリを加えてｐＨ調整を行ってもよい。ただし、簡便な核酸増幅を可能にする観点からは、特別な機器を必要としない条件で反応させることが好ましい。保護基作用物質生産物質から保護基作用物質を生産する反応は、例えば酸化還元反応である。保護基作用物質生産物質から保護基作用物質を生産する工程は、保護基を含有する核酸と保護基作用物質とを接触させる前に行ってもよいし、保護基作用物質生産物質から保護基作用物質を生産する工程と保護基を含有する核酸と保護基作用物質とを接触させる工程とは時間的に一部又は全部が重複していてもよい。保護基作用物質生産物質から保護基作用物質を生産する工程で生産された保護基作用物質が保護基を含有する核酸と接触させられることになる。
【００４９】
保護基作用物質生産物質から保護基作用物質を生産する工程は、保護基作用物質生産物質に酵素を作用させて保護基作用物質を生産する工程であってもよい。酵素は例えば酸化還元酵素であり、この場合、保護基作用物質生産物質としては、酵素と反応して酸化還元される官能基を有する任意の化合物を用いることができる。例えば、酸化還元酵素と反応して過酸化水素を生成する化合物であれば、上記の乳酸と同様にして用いることができる。酸化還元酵素と反応して酸化される官能基の例としては、アミノ基、ヒドロキシ基、アルデヒド基などが挙げられ、酸化還元酵素と反応して還元される官能基の例としてはカルボキシ基、アルデヒド基、ケト基、ニトロ基などが挙げられる。
【００５０】
酸化還元酵素には多くのバリエーションが報告されている。EC番号の命名法では 1.X.X.Xが酸化還元酵素に相当する。BRENDAデータベース（https://www.brenda-enzymes.org/）によると、現時点で８２８３種の酸化還元酵素が記載されている。このように多くの酸化還元酵素が存在しており、種々の基質を酸化又は還元し、過酸化水素などの、保護基部分の構造変化を起こさせるのに用いることができる物質を生産する。したがって、用いようとする保護基作用物質生産物質を基質とする酸化還元酵素を選択して使用することができる。
【００５１】
保護基作用物質生産物質から保護基作用物質を生産する工程を有することにより、保護基作用物質生産物質の有無（存在若しくは非存在）又は保護基作用物質生産物質の存在量によって核酸の増幅量を制御することが可能となる。
【００５２】
上記で説明したように、本開示に係る核酸増幅方法を用いれば、保護基部分の構造変化を利用して増幅の有無又は増幅量の制御を行うことができる。本開示に係る核酸増幅方法は、核酸の増幅の制御における新たな手法を提供するものであり、このような核酸増幅方法は、保護基部分の構造変化が生じる原因となった保護基作用物質（又はそれを生産した保護基作用物質生産物質）の存在量を求める目的などに用いることができる。
【００５３】
＜核酸検出方法＞
次に本開示に係る核酸検出方法について説明する。本開示に係る核酸検出方法は、本開示に係る核酸増幅方法により核酸を増幅すること、及び得られた増幅産物を検出すること、を含む核酸検出方法である。
ここで、得られた増幅産物とは核酸増幅方法により得られた増幅された核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）である。増幅産物の検出は、光学的に行うことができ、あるいは放射線測定により行うこともできる。例えば、増幅産物に核酸染色色素を結合させて、生じた色を測定することによって行ってもよいし、核酸増幅工程において用いるプライマーを蛍光物質又は放射性同位体で標識して、増幅産物から発せられる蛍光又は放射線を測定することによって行ってもよい。特殊なプライマーの作製が不要な点では、核酸染色色素を用いることが好ましく、目視で検出できることが好ましい。
【００５４】
核酸染色色素とは、核酸増幅産物と反応して発色する色素であってもよいし、核酸増幅産物に結合したりインターカレートした状態で発色する（蛍光強度が強くなることも含む）色素であってもよい。核酸増幅産物と反応して発色する色素とは、核酸の増幅産物若しくは増幅工程の副産物（ピロリン酸等）に接触して発色（可視光吸収又は蛍光発光）する物質であれば特に限定されない。核酸染色色素は、励起光を照射して蛍光を検出するものであってもよく、可視光で直接色素の色を検出できる色素であってもよい。可視光で色調検出できる色素であることが、検出に機器を必要としない観点からは好ましい。可視光で色調検出できる核酸染色色素としては、たとえば国際公開公報第２０１２−０３９４２２号に記載のロイコ型色素が挙げられる。蛍光で検出できる核酸染色色素としては、エチジウムブロマイド、SYBR green、hoechst33342、DAPI等が挙げられる。検出を簡便に行う観点からは、目視での検出が可能である核酸反応型ロイコ色素の使用が好ましい。例えば、核酸反応型ロイコ色素である１，１−トリス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−Ｎ−アミノプロパンは、ＤＮＡとの反応により無色から青紫色へと変化し（つまり発色し）、シグナルは例えば波長５９０ｎｍでの吸光度を測定することにより測定することができる（国際公開公報第２０１２−０３９４２２号参照）。また、例えばＤＡＰＩの場合、紫外線（吸収極大波長３５８ｎｍ）を吸収して青色の蛍光（発光極大波長４６１ｎｍ）を発する。このような核酸染色色素は、例えば、検出用基材、例えば紙又は不織布などの基材、の中に含浸させておくこともでき、あるいはマイクロカプセル中に格納して検出用基材に含ませてもよい。これらの場合、核酸増幅産物が検出用基材上の核酸染色色素含有部位に接触することで発色する。核酸染色色素が可視光域で発色するものであれば、検出用基材における発色を目視で直接観察できる。なお、マイクロカプセルの場合は、例えば増幅産物を含む水溶液に接触することでマイクロカプセル壁が溶解して核酸染色色素が放出されるようにしてもよい。マイクロカプセルは、位置を指定して検出用基材に付与することが容易である。
【００５５】
増幅産物の検出は、核酸を増幅する工程における核酸増幅を蛍光物質で標識したプライマーを用いて行い、増幅産物の検出を増幅産物から発せられる蛍光を測定することによって行ってもよい。蛍光物質で標識したプライマーとしては、発する蛍光により検出可能な蛍光物質で標識されたプライマーであれば何でもよい。本発明に利用可能な蛍光物質は、登録商標又は商品名として、BODIPYシリーズ、DYシリーズ、Alexa Fluorシリーズ、Dy Lightシリーズ、ATTOシリーズ、Oysterシリーズ、HiLyte Fluorシリーズ、 TAMRA、Texas Red、Acridine、Green-X、Edans、Coumarin、DANSYL、FAN、Oregon Green、Marina Blue、Pacific Blue、Rhodamine Red-X、Rhodamine NBD-X、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、R6G、Cy3、Redmond Red、ROX、Cal Red、LC Red 640、Cy5、LC Red 705などが挙げられる。例えば、Ｃｙ５の場合、励起波長を６４３ｎｍ、発光波長を６６７ｎｍとして使用できる。
【００５６】
核酸染色色素又は蛍光物質などから発せられる色や蛍光といったシグナルの強度は、増幅産物の量を反映したものとなるため、シグナルの強度の測定により増幅産物の有無だけでなく量についての情報を得ることも可能である。このため、本開示における核酸検出方法は、増幅産物の有無だけでなく、増幅産物の量も測定する方法であってもよい。
【００５７】
本開示に係る核酸検出方法を用いることにより、増幅産物の検出を通じて、保護基作用物質による核酸増幅効率の制御の程度について求めることができる。本開示に係る核酸検出方法は、例えば、保護基作用物質の存在量を求めるために使用することができる。また、保護基作用物質生産物質から生産された保護基作用物質を核酸中の保護基部分の構造変化を起こすために用いた場合には、本開示に係る核酸検出方法は保護基作用物質及び／又は保護基作用物質生産物質の存在量を求めるためにも使用することができる。
【００５８】
＜物質検出方法＞
次に本開示に係る物質検出方法について説明する。本開示に係る物質検出方法は、本開示に係る核酸検出方法を用いることにより、前記保護基作用物質及び前記保護基作用物質生産物質のうち少なくとも一方を検出することを含む、物質検出方法である。上述のように、本開示に係る核酸検出方法を用いることによって得られた増幅産物の有無は保護基作用物質の有無により決定される。保護基作用物質が保護基作用物質生産物質から生産される場合には、保護基作用物質の有無は保護基作用物質生産物質の有無によって決定されるため、増幅産物の有無は保護基作用物質生産物質の有無によって決定される。また、本開示に係る核酸検出方法を用いることによって得られた増幅産物の量は保護基作用物質の存在量により決定される。保護基作用物質が保護基作用物質生産物質から生産される場合には、保護基作用物質の存在量は保護基作用物質生産物質の存在量によって決定されるため、増幅産物の存在量は保護基作用物質生産物質の存在量によって決定される。このため、増幅産物の有無を基に保護基作用物質の有無を決定することができ、また、保護基作用物質が保護基作用物質生産物質から生産される場合には、増幅産物の有無を基に保護基作用物質生産物質の有無も決定することができる。また、増幅産物の存在量を基に保護基作用物質の存在量を決定することができ、保護基作用物質が保護基作用物質生産物質から生産される場合には、増幅産物の存在量を基に保護基作用物質生産物質の存在量も決定することができる。本開示における物質検出方法は、検出対象物質（保護基作用物質及び／又は保護基作用物質生産物質）の有無だけでなく、検出対象物質の量も測定する方法であってもよい。
【００５９】
特定の検出対象物質の存在を検出することが求められる場合、従来から精密測定機器を使用した種々の方法による検出が行われてきた。しかし、精密測定機器を使用した測定の場合、高価な機器が必要とされ、測定を実行できる場所は機器が設置されている場所に限定され、測定に時間を要するため、簡便ではない。特定の検出対象物質の存在を検出するための簡便な方法として、当該検出対象物質の分子を媒介物質に変換し、当該媒介物質を発色性色素と直接反応させて、反応による発色（色合い）を目視で確認して当該検出対象物質の分子の存在を検出する方法がある。しかしながら、このような方法では通常ｍＭ単位の検出対象物質が存在しないと検出ができず、感度が高いとは言い難い。前記方法の感度が低い理由の一つとしては、前記方法では通常は、化学量論的に検出対象物質の濃度以上の色素を形成できないことが挙げられる。例えば、検査対象物質の濃度を１等量とした場合、１等量の媒介物質に変換して、それから発色性色素を反応させると、基本的に１等量までの色素しか発色させることができない。色素の発色には基本的にｍＭオーダーの色素量が必要とされるため、必然的にｍＭオーダーの検出対象物質が必要となる。したがって、通常の発色方法を用いる場合、ｍＭ単位の検出対象物質が必要で、それ以下の微量の検出対象物質を検出することは困難である。
【００６０】
環境中の微量成分や、生体が有するバイオマーカー類は、ほとんどが低濃度なものばかりで、上述した媒介物質を発色性色素と直接反応させる従来の方法で定量できるものは限られる。従来、これらの微量成分は、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーといった方法で特定の成分を分離して光学的に測定し電気化学的にシグナルを増幅するといった方法で測定されていたが、このような測定には高価な装置が必要で、操作の手間もかかった。
【００６１】
一方、生化学分野においては、物質を特異的に複製して増幅する技術として、核酸増幅技術が存在する。これは、数個〜数万個からなるＤＮＡ（若しくはＲＮＡ）の配列をコピーして、指数関数的に増幅させる技術である。核酸増幅技術の増幅効率は極めて高く、1つの核酸分子を何億倍にも増幅することも可能である。例えば、1回のサイクルで２倍に増幅させる反応を３０回繰り返すと、核酸は２３０＝約１０億倍に増幅できる計算になる。また、この反応は特異性が高く、適切な条件を設定すれば、まったく同一な構造の配列が最後まで増幅され続ける。
【００６２】
核酸増幅法を利用した物質検出技術はいくつか存在する。例えば、前述した非特許文献３（Sano, T.，Science, 1992，Vol. 258, p. 120-122）に記載のイムノＰＣＲ法がある。しかしながらこの方法では、検出対象物質が抗体と結合する物質に限定される、検出対象物質と核酸とを結合させてから残存する核酸を洗浄して除去する必要がある、といった理由から、汎用性や利便性の面で改善の余地がある。また、Sigma-Aldrich社からはDuolink Proximity Ligtation Assay法が報告されている。しかしながらこの方法では、検出対象物質が抗体と結合する物質に限定され、プローブとなる核酸をライゲーションさせて環状化させる手間がかかり、測定前に洗浄の手間がかかり、やはり汎用性や利便性の面で改善の余地がある。また、前述した非特許文献４（Anal. Chem.，2016，Vol. 88, p. 7137-7144）に記載のＳＡＴＩＣ法では、特定の物質との結合が報告されている核酸アプタマーのバリエーションが少ない、特異性の高いアプタマーの設計が難しい、といった点で改善の余地がある。
【００６３】
本開示に係る一実施形態においては、上述のとおり、核酸増幅技術を利用して、物質のシグナルを化学量論的に増やし、検出対象物質を高感度に検出できる。この実施形態では、保護基作用物質と接触することにより構造変化する保護基を含有する核酸を核酸増幅に供することで、保護基作用物質の存在により核酸増幅のスイッチが入り、その増幅産物を検出することで、高感度に検出対象物質の有無を検出し、及び所望により検出対象物質の存在量を定量できる。検出対象物質は保護基作用物質そのものでもよいが、保護基作用物質とは異なる物質であってもよい。この場合は、検出対象物質に過酸化水素等の保護基作用物質を放出する化学反応を起こさせる酵素を利用すれば、上記と同様にして検出対象物質の有無を検出し、及び所望により検出対象物質の存在量を定量できる。つまり、上述の保護基作用物質生産物質を検出対象物質とすることができる。この場合も、検出対象物質の存在のシグナルとなる物質（保護基作用物質）が化学量論的に増幅されるため、シグナルを直接検出するより高感度に検出することが可能となる。
【００６４】
また、前記酵素が例えば酸化還元酵素である場合、検出対象物質そのものを基質として反応する酸化還元酵素が知られていない場合であっても、類似した構造の基質と反応する酵素から検出対象物質を基質として反応する酸化還元酵素を探索してもよい。若しくは、検出対象物質を基質とする酸化還元酵素を新たに環境中から探索してもよい。基本的に酸化還元可能な官能基を有する化合物であれば、当該化合物を基質とする酸化還元酵素を自然界から探索可能であり、幅広いバリエーションの化合物を検出対象とすることが可能である。したがって、種々の酸化還元酵素が反応する基質が多岐にわたることにより、検出対象物質を選ぶ際の自由度が高い。検出対象物質が保護基作用物質としては機能しない場合であっても、酵素の基質特異性を利用して、検出対象物質を特異性高く保護基作用物質に変換できるという点で、保護基作用物質生産物質から保護基作用物質を生産させる工程を含むことは有用である。なお、上記の説明では酵素によって保護基作用物質生産物質から保護基作用物質を生産する反応を行わせているが、基質特異性を有する触媒であれば同様に用いることができる。例えば、アプタマーを酵素の代わりに用いることができる。アプタマーは、例えば核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）アプタマーである。
【００６５】
一例として、保護基作用物質生産物質が乳酸であり、保護基作用物質が過酸化水素であり、酸化還元酵素が乳酸オキシダーゼであり、保護基がDobz基であり、核酸増幅をLAMP法により行い、増幅産物の検出を核酸反応型ロイコ色素で行う場合の処理例を説明する。乳酸を含む可能性のあるサンプル、例えば体液（汗、血液等）を、Dobz基含有核酸及び乳酸オキシダーゼを含む水溶液に添加し、酸素存在下で反応させる。乳酸の酸化により生じた過酸化水素はDobz基含有核酸と反応してDobz基を核酸本体から脱離させる。これにより、サンプル中の乳酸量に応じた割合で脱保護された核酸分子が生じる。次に、反応後の溶液をLAMP法による核酸増幅に供する。これにより、Dobz基による核酸増幅反応の阻害が完全なものであるとすれば、脱保護された核酸分子だけが増幅される。核酸増幅を所定時間で終了させ、得られた増幅産物を核酸反応型ロイコ色素と接触させると、無色（又は淡色）だった核酸反応型ロイコ色素が発色する。発色の程度を目視又は吸光光度計で測定する。発色の程度あるいは吸光度は、増幅産物の量に応じた強度となる。増幅産物が検出されないことは、サンプル中に乳酸が含まれないことを意味し、増幅産物の量が多いほど、サンプル中における乳酸量が多かったことが分かる。なお、乳酸濃度既知の濃度勾配サンプル群を測定して検量線を作成しておくことが望ましい。
【００６６】
一つの実施形態では、
測定対象サンプルを保護基を含有する核酸と接触させる工程と、
前記接触後の核酸に対して核酸増幅プロセスを行うことと、
増幅産物を検出することと、
を含み、
前記核酸中の保護基部分は保護基作用物質と接触すると構造変化して前記保護基による前記核酸に対する核酸増幅阻害が解除され、
前記増幅産物が検出されることは、前記測定対象サンプル中に前記保護基作用物質が存在することを示す、
サンプル中における保護基作用物質の有無を検出する方法を提供する。逆に、前記増幅産物が検出されないことは、前記測定対象サンプル中に前記保護基作用物質が存在しないか、又は存在しても検出限界以下の量しか存在しないことを示す。
この方法の一例においては、前記増幅産物を検出することは前記増幅産物の量を測定することを含み、前記増幅産物の量は、前記測定対象サンプル中における前記保護基作用物質の存在量を示す。
【００６７】
さらなる実施形態では、
測定対象サンプルを、検出対象物質から保護基作用物質を生産する反応条件に供して、処理サンプルを得る工程と、
前記処理サンプルを保護基を含有する核酸と接触させる工程と、
前記接触後の核酸に対して核酸増幅プロセスを行うことと、
増幅産物を検出することと、
を含み、
前記核酸中の保護基部分は前記保護基作用物質と接触すると構造変化して前記保護基による前記核酸に対する核酸増幅阻害が解除され、
前記増幅産物が検出されることは、前記検出対象サンプル中に前記検出対象物質が存在することを示す、
サンプル中における検出対象物質の有無を検出する方法を提供する。逆に、前記増幅産物が検出されないことは、前記測定対象サンプル中に前記検出対象物質が存在しないか、又は存在しても検出限界以下の量しか存在しないことを示す。この場合の検出対象物質とは、上述の保護基作用物質生産物質である。
前記検出対象物質（保護基作用物質生産物質）から保護基作用物質を生産する反応条件とは、上述のとおりであるが、例えば、反応に必要な基質（反応に必要な補酵素を含む）及び反応に必要な酸化還元酵素の存在、及び必要に応じて熱や特定のｐＨを含む条件である。
この方法の一例においては、前記増幅産物を検出することは前記増幅産物の量を測定することを含み、前記増幅産物の量は、前記測定対象サンプル中における前記検出対象物質である保護基作用物質生産物質の存在量を示す。
【００６８】
（物質検出用キット）
本開示に係る物質検出用キットは、保護基を含有する核酸であって保護基作用物質と接触することにより保護基部分が構造変化する核酸を含有し、検出対象物質が前記保護基作用物質及び前記保護基作用物質を生産する物質のうち少なくとも一方である、物質検出用キットである。前記物質検出用キットは、さらに核酸増幅試薬を含んでいてもよい。核酸増幅試薬は等温遺伝子増幅用試薬であってもよい。
一つの実施形態では、前記物質検出用キットは保護基作用物質生産物質から前記保護基作用物質を生産するために必要な保護基作用物質生産反応用試薬（例えば反応に必要な酵素、基質、又はその両方）をさらに含む。
【００６９】
前記保護基を含有する核酸は、本開示に係る核酸増幅方法において説明したとおりの保護基含有核酸である。前記核酸増幅試薬は、典型的には、ｄＮＴＰ混合物（ＤＮＡ合成の場合、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ；ＲＮＡ合成の場合、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）、プライマー、核酸ポリメラーゼ、Ｍｇ２＋イオン、硫酸アンモニウムなどの塩類及びＴｒｉｓ−ＨＣｌなどの緩衝物質を含む。核酸ポリメラーゼの種類は使用する核酸増幅法に応じたものを選択すればよく、例えば、ＲＣＡ法の場合はｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡＭＰ法の場合は鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いればよい。
【００７０】
前記物質検出用キットにおいて、前記核酸増幅試薬は、蛍光物質で標識されたプライマーを含むものであってもよい。あるいは、前記物質検出用キットは、さらに核酸検出用試薬、例えば前述のロイコ色素などの核酸染色色素を含有するものであってもよい。
【００７１】
前記保護基を含有する核酸、場合によって含まれる前記核酸増幅試薬、場合によって含まれる前記核酸検出用試薬、及び場合によって含まれる前記保護基作用物質生産反応用試薬は、それぞれ、例えば水溶液の状態でプラスチックチューブなどの容器に保持してもよく、水溶液の状態でカプセル内に保持してもよく、あるいは紙又は不織布等の基材に含浸させてもよい。上記の核酸、場合によって含まれる核酸増幅用試薬、場合によって含まれる核酸検出用試薬及び場合によって含まれる保護基作用物質生産反応用試薬のうち２つ以上を同じ容器又はカプセルなどに含ませるようにしてもよい。
上記のカプセルはマイクロカプセルとして、紙又は不織布等の基材中に含まれるようにしてもよい。このようにすることで、使用者がその場で簡易に物質測定を行うことも可能になる。
【００７２】
前記物質検出キットの一使用例について説明する。この例では、保護基作用物質生産物質としての検出対象物質から保護基作用物質を生産する反応に必要な基質（反応物）及び酵素並びに保護基含有核酸を含むマイクロカプセルを分散させた不織布基材からなる検出用基材を使用する。検出用基材には、核酸と接触すると可視光域で発色する核酸染色色素からなる核酸染色試薬を含む溶液を格納した微小容器（例えば微小な袋）が埋め込まれている。検出用基材上に検出対象物質を含む可能性があるサンプル溶液を所定量スポットする。サンプル溶液と接触したマイクロカプセルが溶解し、サンプル溶液中に検出対象物質が含まれる場合には、当該検出対象物質から酵素により保護基作用物質が生産される。生産された保護基作用物質は保護基含有核酸と反応して保護基部分が構造変化（例えば脱保護）を起こすことで核酸増幅反応に対する阻害が解除される。サンプル溶液中に検出対象物質が含まれない場合には、上記の反応は起こらず、保護基部分には構造変化は生じない。使用者が核酸染色試薬を含む微小容器の部分を押圧すると、微小容器が破裂し、核酸染色試薬を含む溶液が不織布基材に放出され、核酸が存在する領域まで移動する。押圧から所定時間経過後に、使用者は検出用基材の色を観察する。サンプル溶液中に検出対象物質が含まれる場合は、核酸増幅産物と核酸染色試薬が反応して、発色（例えば青色に発色）する。サンプル溶液に検出対象物質が含まれない場合には、核酸増幅産物が存在しない又は検出限界以下しか存在しないので、検出用基材は元々の色（例えば白色）のままである。上記の発色の有無によって、使用者はサンプル溶液中における検出対象物質の有無を知ることができる。また、サンプル中に含まれる検出対象物質の量が多いほど核酸増幅産物の量も多くなり、発色が濃くなるため、使用者はあらかじめ作成された発色濃度−検出対象物質量の換算表又は換算グラフを参照して、サンプル中における検出対象物質の量も知ることができる。
【００７３】
サンプルとしては、例えば体液（汗、血液、尿）などとすることができ、これらに含まれる検出対象物質としての微量成分（例えば悪臭成分、疾患マーカー、特定の生理活性物質など）の存在を検出することができる。また、所望により、これら検出対象物質のサンプル中における量も測定することができる。
【００７４】
本開示に係る物質検出用キットを用いることにより、保護基含有核酸の保護基部分の構造変化を利用して検出対象物質の有無又は存在量について高感度に検出することができる。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例により実施形態を更に説明するが、本開示は以下の実施例によって何等限定されるものではない。また、実施例の組成物における含有成分量を示す「％」は、特に断らない限り質量基準である。
【００７６】
(Dobz基誘導体含有塩化物の合成)
窒素気流下、三口フラスコにトリホスゲン（２．２ｇ，７．４ｍｍｏｌ）を添加した。次に、窒素気流下において、トルエン（１５ｍＬ）を前記三口フラスコに添加した。氷浴中で冷却したのち、窒素気流下で、Ｎａ２ＣＯ３（３．５ｇ，３３ｍｍｏｌ）の粉を直接前記三口フラスコに添加した。それから、氷浴中で０．５時間撹拌した。窒素気流化、二口フラスコに４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジルアルコール（０．８７ｇ，３．７ｍｍｏｌ）とトルエン（５ｍＬ）を添加した。氷浴を外して、前記三口フラスコ内の溶液を１７時間室温で撹拌した。Ｎａ２ＣＯ３をろ別して、氷水３０ｍＬ、続いて５％ＮａＨＣＯ３水溶液３０ｍＬ、さらに続いて氷水３０ｍＬでトルエン層を洗浄した。トルエン層を回収してＭｇＳＯ４で乾燥させたのち、エバポレーションにより溶媒を減圧留去した。デシケータ内で２時間減圧して得られた産物をクロロホルメート１とした。クロロホルメート１の１Ｈ  ＮＭＲデータは以下のとおりである：
１Ｈ  ＮＭＲ(CDCl3, 400 MHz): δ 7.86 (d, J = 8.1 Hz, 2H)， 7.40 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 5.31 (s, 2H), 1.35 (s, 12H)
クロロホルメート１には不純物が含まれており、１Ｈ  ＮＭＲにおける、δ＝５．３１のピークが２本に割れるので、低磁場側のピークをクロロホルメート１として、実濃度を計算した。
【００７７】
（ＤＮＡの調製）
反応液中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２１；ヒト由来）に対して、逆転写プライマー（アプライドバイオシステムズ社，Ｔａｑｍａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ，ＲＴプライマー，ｈｓａ−ｍｉｒ−２１，カタログ番号４４２７９７５）および逆転写酵素（アプライドバイオシステムズ社，Ｔａｑｍａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ＲＴ  ｋｉｔ）を用いて、製造業者の指示に従って逆転写反応を行った。１０μＬのＲＮＡサンプルを用い、液量が１５μＬになるよう調製した。この逆転写反応の温度プロフィールは、１６℃で３０分の変性、続いて４２℃で３０分保持及び８５℃で５分保持からなるステップを含んでいた。
【００７８】
（核酸の定量）
次に、この逆転写反応溶液を用い、製造業者の指示に従ってリアルタイムＰＣＲ反応を行った。２μＬの逆転写反応溶液を用い、液量が２０μＬになるよう調製した。この逆転写反応の温度プロフィールは、９５℃１５秒および６０℃１分からなるサイクルを４０サイクル含んでいた。Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  プライマー（アプライドバイオシステムズ社，Ｔａｑｍａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ，Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  プライマー，ｈｓａ−ｍｉｒ−２１，カタログ番号４４２７９７５）およびリアルタイムＰＣＲ用マスターミックス（アプライドバイオシステムズ社，ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ, ｗ／ＵＮＧ）を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ リアルタイムＰＣＲシステムにより、リアルタイムＰＣＲ反応を行い、所定核酸量になるまでに要するサイクル数を、マイクロＲＮＡ量の対数値と所定核酸量になるまでに要するサイクル数（Ｃｔ値）との関係を示す検量線と比較することにより、逆転写に寄与したｍｉＲ−２１量を定量した。なお、このマイクロＲＮＡの検量線は、種々の量の合成ｍｉＲ−２１（シグマアルドリッチ社製、保護基による保護はされていない）を含む既知濃度のＲＮＡサンプルを用いて上記と同様に逆転写及びリアルタイムＰＣＲを行うことにより作成した。つまり、逆転写に寄与したｍｉＲ−２１量とは、既知濃度の上記の非保護合成ｍｉＲ−２１を含むＲＮＡサンプル中における非保護合成ｍｉＲ−２１濃度の対数値とＣｔ値との間の関係を示す検量線上における、試験対象のＲＮＡサンプルを用いた場合に得られたＣｔ値に対応する非保護合成ｍｉＲ−２１濃度を意味する。
【００７９】
＜実施例１＞
（Dobz基誘導体で保護されたＲＮＡの調製）
合成したクロロホルメート１をテトラヒドロフランに溶解し、１００ｍＭに調製した。また、ＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン）をテトラヒドロフランに溶解し、５００ｍＭに調製した。調製したクロロホルメート１溶液１０μＬに対し、ｐＨ試験紙が中性になるまでＤＭＡＰ溶液をゆっくり混合した（実施した際はＤＭＡＰ溶液を２０μＬ添加した）。白色沈殿が生じたところで、溶液をエッペンドルフチューブに移し、１４，０００Ｇで軽くスピンダウンして沈殿を除去し、中和クロロホルメート溶液とした。
【００８０】
５０ｎＭ  ｍｉＲ−２１水溶液１μＬをガラスバイアルに添加し、脱気瓶中で脱気して乾燥させた。そこに１００μＬのジクロロメタンを添加した。それから、前記中和クロロホルメート溶液を５μＬ添加し、キャップをしたのち、５５℃で１時間反応させた。それから、脱気瓶中で脱気して、溶媒を蒸発させた。そこにＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）を５００μＬ添加し、軽くボルテックスを行った。このＰＢＳ溶液を限外ろ過膜（アミコンウルトラ０．５、３Ｋフィルター）に添加し、１４，０００Ｇで５分遠心した。それから、ろ液を除去したのち、フィルター上に５００μＬのＰＢＳを添加し、再度１４，０００Ｇで５分遠心した。その後、フィルター上の液を回収し、Dobz基誘導体で保護されたｍｉＲ−２１（以下、Dobz誘導体保護ｍｉＲ−２１とも称する）とした。なお、このDobz基誘導体は、以下の式で表される誘導体である。
【００８１】
【化５】
2019136013.tif 000006
【００８２】
（Dobz誘導体保護ＲＮＡを用いた過酸化水素の定量）
１０μＬのDobz誘導体保護ｍｉＲ−２１をＰＣＲチューブに添加し、さらに１μＬの１０μＭ過酸化水素を添加して、２５℃で１時間インキュベートした。その後、９０μＬの純水を添加して希釈し、１０μＬをＲＮＡサンプルとして用いて上記の「ＤＮＡの調製」の欄に記載した方法により逆転写を行い、さらに上記の「核酸の定量」の欄に記載した方法によりリアルタイムＰＣＲを行って、検量線との比較により逆転写に寄与したｍｉＲ−２１量を定量した。
【００８３】
＜比較例１＞
（過酸化水素を添加しない場合の増幅産物量）
実施例１と同じ条件で、Dobz誘導体保護ｍｉＲ−２１を準備した。１０μＬのDobz誘導体保護ｍｉＲ−２１をＰＣＲチューブに添加し、過酸化水素水の代わりに１μＬの純水を添加して、以降は実施例１と同様の処理を行い、逆転写に寄与したｍｉＲ−２１量を定量した。
【００８４】
（結果）
実施例１と比較例１のデータを図１に示す。過酸化水素を添加しない場合と比較して、過酸化水素を添加すると、逆転写されたｍｉＲ−２１量が増加したことが示された。これにより、過酸化水素の有無を利用して核酸増幅を制御できたことが示された。また、核酸増幅産物量を基に、過酸化水素の有無を検出できることが示された。
【図１】
2019136013.tif 000007