(57)【要約】【課題】単一細胞のマルチプレックス核酸分析のための方法、組成物およびキットを提供すること。方法、組成物およびシステムは、大規模並列単一細胞配列決定のために使用することができる。方法、組成物およびシステムを使用して、数千個の細胞を一斉に分析することができる。この数千個の細胞は、細胞の混合集団（例えば、異なる型またはサブタイプ、異なるサイズの細胞）を含み得る。【解決手段】本発明の方法は、（ａ）複数の細胞を含む試料を得るステップと、（ｂ）上記複数の細胞の第１の細胞および上記複数の細胞の第２の細胞由来の２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の少なくとも一部を、標識で標識するステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）複数の細胞を含む試料を得るステップと、
（ｂ）前記複数の細胞の第１の細胞および前記複数の細胞の第２の細胞由来の２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の少なくとも一部を、以下：
（ｉ）前記第１の細胞に特異的な第１の同じ細胞標識および前記第２の細胞に特異的な第２の同じ細胞標識、ならびに
（ｉｉ）前記２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物のそれぞれに特異的な分子標識
で標識するステップと
を含む、方法であって、
前記第１の細胞由来の前記２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の各分子標識が、互いに対して特有であり、
前記第２の細胞由来の前記２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の各分子標識が、互いに対して特有である
方法。
【請求項２】
前記２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の少なくとも一部を配列決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配列決定するステップからの配列データを分析して、前記細胞のうち特定の１個における前記ポリヌクレオチドのうち多数の個々の分子を同定するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、がん細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、ウイルスポリヌクレオチドに感染している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、細菌または真菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記配列決定するステップが、少なくとも１００塩基のリード長で配列決定するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記配列決定するステップが、少なくとも５００塩基のリード長で配列決定するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド分子が、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡであり、前記その相補体およびその反応産物が、前記ｍＲＮＡまたは前記マイクロＲＮＡの相補体および反応産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記分子標識が、ビーズ上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
個々の細胞に特異的な前記標識が、ビーズ上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
個々の細胞に特異的な前記標識および前記分子標識が、ビーズ上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも一部はエマルション中で行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも一部はアレイのウェルまたはマイクロウェル中で行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
疾患または状態に関連するポリヌクレオチドの存在が検出される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患または前記状態が、がんである、請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
マイクロＲＮＡ、その相補体またはその反応産物の少なくとも一部が検出される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患または前記状態が、ウイルス感染症である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルス感染症が、エンベロープを有するウイルス由来である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルス感染症が、エンベロープを有さないウイルス由来である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスが、二本鎖であるウイルスＤＮＡを含有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスが、一本鎖であるウイルスＤＮＡを含有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルスが、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヘパドナウイルス、パポバウイルス、ポリオーマウイルスおよびこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の細胞が、疾患も状態も有さない人物由来であり、前記第２の細胞が、前記疾患または前記状態を有する人物由来である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記人物が異なる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記人物が同じであるが、細胞が異なる時点で採取される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の細胞が、前記疾患または前記状態を有する人物由来であり、前記第２の細胞が、同じ人物由来である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料における前記細胞が、組織または臓器由来の細胞を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料における前記細胞が、胸腺由来の細胞、白血球細胞、赤血球細胞、肝臓細胞、脾臓細胞、肺細胞、心臓細胞、脳細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、胃細胞、口腔由来の細胞、鼻腔由来の細胞、結腸細胞、小腸細胞、腎臓細胞、腺由来の細胞、脳細胞、神経細胞、グリア細胞、眼細胞、生殖器細胞、膀胱細胞、配偶子細胞、ヒト細胞、胎児細胞、羊膜細胞またはこれらのいずれかの組合せを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
細胞性標識および分子標識をそれぞれ含む複数のオリゴヌクレオチドを含む固体支持体であって、前記複数のオリゴヌクレオチドの各細胞性標識が同じであり、前記複数のオリゴヌクレオチドの各分子標識が異なり、ここで、
（ａ）前記固体支持体は、ビーズであり、
（ｂ）前記細胞性標識は、前記固体支持体に特異的であり、
（ｃ）前記固体支持体は、三次元デカルト座標系の中心に配置されたときに、８つのオクタントのうち少なくとも７つへと伸長するオリゴヌクレオチドを有し、または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組合せである
固体支持体。
【請求項３１】
前記複数のオリゴヌクレオチドが、以下：
（ａ）試料標識
（ｂ）ユニバーサル標識、および
（ｃ）標的核酸結合領域
のうち少なくとも１種をさらに含む、請求項３０に記載の固体支持体。
【請求項３２】
前記固体支持体が、前記標的核酸結合領域を含み、前記標的核酸結合領域が、遺伝子特異的配列、オリゴｄＴ配列、ランダムマルチマーおよびこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される配列を含む、請求項３１に記載の固体支持体。
【請求項３３】
標的核酸またはその相補体をさらに含む、請求項３１または３２に記載の固体支持体。
【請求項３４】
（ａ）生物のトランスクリプトームの転写物もしくはその相補体の約０．０１％〜約１００％、または
（ｂ）生物のゲノムの遺伝子もしくはその相補体の約０．０１％〜約１００％
を含む複数の標的核酸またはその相補体を含む、請求項３３に記載の固体支持体。
【請求項３５】
（ａ）前記複数のオリゴヌクレオチドの前記細胞性標識が、第１の標識連結配列によって第２のランダム配列に接続された第１のランダム配列を含み、そして
（ｂ）前記複数のオリゴヌクレオチドの前記分子標識が、ランダム配列を含む、
請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項３６】
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）固体支持体、ポリスチレン固体支持体、ガラス固体支持体、ポリプロピレン固体支持体、アガロース固体支持体、ゼラチン固体支持体、磁性固体支持体、プルロニック固体支持体およびこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項３７】
（ａ）前記複数のオリゴヌクレオチドが、リンカー官能基を含むリンカーを含み、
（ｂ）前記固体支持体が、固体支持体官能基を含み、
前記固体支持体官能基および前記リンカー官能基は互いに接続する、
請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項３８】
前記リンカー官能基および前記固体支持体官能基が、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン（複数可）、アルデヒド（複数可）、ケトン（複数可）およびこれらのいずれかの組合せからなる群から個々に選択される、請求項３７に記載の固体支持体。
【請求項３９】
前記複数のオリゴヌクレオチドの分子標識が、少なくとも１５個のヌクレオチドを含む、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項４０】
請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の固体支持体と、使用説明書とを含むキット。
【請求項４１】
ウェルをさらに含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記ウェルが、アレイ中に含まれる、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記ウェルが、マイクロウェルである、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４４】
バッファーをさらに含む、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４５】
請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の固体支持体を含むエマルション。
【請求項４６】
ウェルと、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の固体支持体とを含む組成物。
【請求項４７】
細胞と、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の固体支持体とを含む組成物。
【請求項４８】
細胞をさらに含む、請求項４５に記載のエマルションまたは請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
前記細胞が、単一細胞である、請求項４７または４８のいずれか一項に記載の組成物またはエマルション。
【請求項５０】
前記ウェルが、マイクロウェルである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５１】
前記マイクロウェルが、約１，０００μｍ3〜約１２０，０００μｍ3に及ぶ容積を有する、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
以下：
（ａ）試料を請求項３０〜３２または３５〜３９のいずれか一項に記載の固体支持体と接触させるステップと、
（ｂ）複数のオリゴヌクレオチドの１オリゴヌクレオチドに前記試料由来の標的核酸をハイブリダイズさせるステップと
を含む、方法。
【請求項５３】
（ｃ）前記標的核酸またはその相補体を増幅するステップ
をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
（ｄ）前記標的核酸またはその相補体を配列決定するステップであって、前記標的核酸またはその相補体が結合される前記オリゴヌクレオチドの分子標識を配列決定することを含む、ステップ
をさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
（ｅ）前記標的核酸またはその相補体の量を決定するステップであって、前記ステップは、以下：
（ｉ）前記標的核酸またはその相補体のレベルを定量化すること、
（ｉｉ）同じ分子標識を含む配列の数を計数すること、あるいは
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せ
を含む、ステップをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
いずれかの同じ分子標識またはいずれかの同じ細胞性標識を整列するステップを含まない、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記増幅するステップが、前記標的核酸を逆転写するステップを含む、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記増幅するステップが、ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲおよびこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される方法を用いる、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記増幅するステップが、以下：
（ａ）前記固体支持体上で直接的に、
（ｂ）前記固体支持体から転写された鋳型上で、または
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組合せで
行われる、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記試料が、細胞を含む、請求項５２〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が、単一細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記接触させるステップを、ウェル中で行う、請求項５２〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ウェルが、マイクロウェルであり、マイクロウェルのアレイ中に含有される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
複数のマイクロウェルを含むデバイスであって、前記複数のマイクロウェルの各マイクロウェルが、約１，０００μｍ3〜約１２０，０００μｍ3に及ぶ容積を有する、デバイス。
【請求項６５】
前記複数のマイクロウェルの各マイクロウェルが、約２０，０００μｍ3の容積を有する、請求項６４に記載のデバイス。
【請求項６６】
前記複数のマイクロウェルが、約９６個〜約２００，０００個のマイクロウェルを含む、請求項６４または６５に記載のデバイス。
【請求項６７】
前記マイクロウェルが、材料の層中に含まれる、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６８】
前記マイクロウェルの少なくとも約１０％が、細胞をさらに含む、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６９】
請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の固体支持体をさらに含む、請求項６４〜６９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７０】
請求項６４〜６９のいずれか一項に記載のデバイスと、液体ハンドラーとを含む装置。
【請求項７１】
前記液体ハンドラーが、約１秒間で複数のマイクロウェルに液体を送達する、請求項７０に記載の装置。
【請求項７２】
前記液体ハンドラーが、単一の入力ポートから前記複数のマイクロウェルに液体を送達する、請求項７０または７１に記載の装置。
【請求項７３】
磁石をさらに含む、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７４】
入口ポート、出口ポート、ポンプ、弁、ベント、リザーバー、試料収集チャンバー、温度制御装置またはこれらのいずれかの組合せのうち少なくとも１種をさらに含む、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７５】
前記試料収集チャンバーを含む、請求項７４に記載の装置であって、前記試料収集チャンバーが、前記装置から着脱可能である、装置。
【請求項７６】
光学撮像器をさらに含む、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７７】
前記光学撮像器が、前記液体ハンドラーの制御に使用される出力シグナルを生成する、請求項７６に記載の装置。
【請求項７８】
オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うように構成された熱サイクリング機構をさらに含む、請求項７０〜７７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７９】
臨床診断検査結果を生成する方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）請求項７０〜７８のいずれか一項に記載のデバイスもしくは装置、
（ｂ）請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の固体支持体、
（ｃ）請求項１〜２９もしくは５２〜６３のいずれか一項に記載の方法、または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組合せ
により前記臨床診断検査結果を生成するステップを含む、方法。
【請求項８０】
前記臨床診断検査結果が、通信媒体を介して伝達される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の固体支持体を作製する方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）固体支持体に、以下：
（ｉ）細胞性標識の第１の部分、および
（ｉｉ）第１のリンカー
を含む第１のポリヌクレオチドを付着させるステップと、
（ｂ）以下：
（ｉ）前記細胞性標識の第２の部分、
（ｉｉ）前記第１のリンカーに相補的な配列、および
（ｉｉｉ）分子標識
を含む第２のポリヌクレオチドを接触させるステップと
を含む、方法。
【請求項８２】
第３のポリヌクレオチドが、標的核酸結合領域をさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
パッケージ中に含有される、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８４】
前記パッケージが、箱である、請求項８３に記載のキット。
【請求項８５】
前記パッケージまたは前記箱が、２立方フィートまたはそれに満たない容積を有する、請求項８３または８４に記載のキット。
【請求項８６】
前記パッケージまたは前記箱が、１立方フィートまたはそれに満たない容積を有する、請求項８３または８４に記載のキット。
【請求項８７】
エマルション、マイクロウェルまたはウェルが、１個の細胞のみを含有する、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
１〜２，０００，０００個のエマルション、マイクロウェルまたはウェルがそれぞれ、１個の細胞のみを含有する、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
各エマルション、マイクロウェルまたはウェルに最大でも１個の細胞を分布させるステップを含む、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
単一の固体支持体および単一細胞が、エマルション、マイクロウェルまたはウェルに分布される、請求項１〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
１〜２，０００，０００個のエマルション、マイクロウェルまたはウェルにそれぞれ、１個の細胞および１個の固体支持体が分布されている、請求項１〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
エマルション、マイクロウェルまたはウェル１個当たり最大でも１個の固体支持体を分布させるステップを含む、請求項１〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
１〜２，０００，０００個のマイクロウェル、エマルションまたはウェルのそれぞれに１個の固体支持体および１個の細胞を分布させるステップを含む、請求項１〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
細胞分布が、ランダムまたは非ランダムである、請求項１〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
細胞分布が、確率論的である、請求項１〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
細胞が、細胞選別機によって分布される、請求項１〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
１個または複数のウェル、マイクロウェルまたはエマルションに最大でも１個の細胞が分布されるように、希釈された細胞の希釈溶液と前記１個または複数のウェル、マイクロウェルまたはエマルションを接触させることにより、細胞が分布される、請求項１〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
標的特異的領域、前記複数のオリゴヌクレオチドの標的特異的領域または前記２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子の標的特異的領域が、標的パネルの２種またはそれを超える標的に相補的な配列を含む、請求項１〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記標的パネルの前記２種またはそれを超える標的が、バイオマーカーである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記バイオマーカーが、疾患または状態のバイオマーカーである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記疾患または前記状態が、がん、感染症、ウイルス感染症、炎症性疾患、神経変性疾患、真菌疾患、細菌感染症またはこれらのいずれかの組合せである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記パネルが、２〜５０，０００、２〜４０，０００、２〜３０，０００、２〜２０，０００、２〜１０，０００、２〜９０００、２〜８，０００、２〜７，０００、２〜６，０００、２〜５，０００、２〜１，０００、２〜８００、２〜７００、２〜６００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２〜７５、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０または２〜５種のバイオマーカーを含む、請求項９８〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１４年６月１３日に出願された米国仮出願第６２／０１２，２３７号、２０１４年３月１２日に出願された米国仮出願第６１／９５２，０３６号および２０１３年８月２８日に出願された米国仮出願第６１／８７１，２３２号（これらの出願の各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
組織および腫瘍等、多細胞塊は、不均質性の細胞状況を含み得る。このような複雑な細胞環境は、多くの場合、複数の遺伝子型を示し得る複数の表現型を呈する場合がある。多細胞の複雑さを抜き取って単一細胞の変動性とすることは、多細胞の不均質性の理解に重要な様相である。この理解は、複数の抵抗性遺伝子型を有する疾患に立ち向かうための治療レジメンの開発において重要なものとなり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
提供されている一態様は、複数の細胞を含む試料を得るステップと、複数の細胞の第１の細胞および複数の細胞の第２の細胞由来の２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の少なくとも一部を、第１の細胞に特異的な第１の同じ細胞標識および第２の細胞に特異的な第２の同じ細胞標識、ならびに２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物のそれぞれに特異的な分子標識で標識するステップとを含み、第１の細胞由来の２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の各分子標識が、互いに対して特有であり、第２の細胞由来の２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の各分子標識が、互いに対して特有である方法である。一部の実施形態では、方法は、２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の少なくとも一部を配列決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、配列決定するステップからの配列データを分析して、細胞のうち特定の１個におけるポリヌクレオチドのうち多数の個々の分子を同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、がん細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ウイルスポリヌクレオチドに感染している。一部の実施形態では、細胞は、細菌または真菌である。一部の実施形態では、配列決定するステップは、少なくとも１００塩基のリード長で配列決定するステップを含む。一部の実施形態では、配列決定するステップは、少なくとも５００塩基のリード長で配列決定するステップを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡであり、その相補体およびその反応産物は、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡの相補体および反応産物である。一部の実施形態では、分子標識は、ビーズ上にある。一部の実施形態では、個々の細胞に特異的な標識は、ビーズ上にある。一部の実施形態では、個々の細胞に特異的な標識および分子標識は、ビーズ上にある。一部の実施形態では、方法は、少なくとも一部はエマルション中で行われる。一部の実施形態では、方法は、少なくとも一部はアレイのウェルまたはマイクロウェル中で行われる。一部の実施形態では、疾患または状態に関連するポリヌクレオチドの存在が検出される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ、その相補体またはその反応産物の少なくとも一部が検出される。一部の実施形態では、疾患または状態は、ウイルス感染症である。一部の実施形態では、ウイルス感染症は、エンベロープを有するウイルス由来である。一部の実施形態では、ウイルス感染症は、エンベロープを有さないウイルス由来である。一部の実施形態では、ウイルスは、二本鎖であるウイルスＤＮＡを含有する。一部の実施形態では、ウイルスは、一本鎖であるウイルスＤＮＡを含有する。一部の実施形態では、ウイルスは、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹（ｖｅｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ）ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヘパドナウイルス、パポバウイルス、ポリオーマウイ���スおよびこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、第１の細胞は、疾患も状態も有さない人物由来であり、第２の細胞は、疾患または状態を有する人物由来である。一部の実施形態では、人物は異なる。一部の実施形態では、人物は同じ人物であるが、細胞は異なる時点で採取される。一部の実施形態では、第１の細胞は、疾患または状態を有する人物由来であり、第２の細胞は、同じ人物由来である。一部の実施形態では、試料における細胞は、組織または臓器由来の細胞を含む。一部の実施形態では、試料における細胞は、胸腺由来の細胞、白血球細胞、赤血球細胞、肝臓細胞、脾臓細胞、肺細胞、心臓細胞、脳細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、胃細胞、口腔由来の細胞、鼻腔由来の細胞、結腸細胞、小腸細胞、腎臓細胞、腺由来の細胞、脳細胞、神経細胞、グリア細胞、眼細胞、生殖器細胞、膀胱細胞、配偶子細胞、ヒト細胞、胎児細胞、羊膜細胞またはこれらのいずれかの組合せを含む。
【０００４】
提供されている一態様は、それぞれ細胞性標識および分子標識を含む複数のオリゴヌクレオチドを含む固体支持体であって、複数のオリゴヌクレオチドの各細胞性標識が同じであり、複数のオリゴヌクレオチドの各分子標識が異なり、固体支持体がビーズであり、細胞性標識が、固体支持体に特異的であり、固体支持体が、三次元デカルト座標系の中心に配置されたときに、８つのオクタントのうち少なくとも７つへと伸長するオリゴヌクレオチドを有し、またはこれらのいずれかの組合せである固体支持体である。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、試料標識、ユニバーサル標識、および標的核酸結合領域のうち少なくとも１種をさらに含む。一部の実施形態では、固体支持体は、標的核酸結合領域を含み、標的核酸結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴｄＴ配列、ランダムマルチマーおよびこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される配列を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、標的核酸またはその相補体をさらに含む。一部の実施形態では、固体支持体は、生物のトランスクリプトームの転写物もしくはその相補体の約０．０１％〜約１００％、または生物のゲノムの遺伝子もしくはその相補体の約０．０１％〜約１００％を含む複数の標的核酸またはその相補体を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドの細胞性標識は、第１の標識連結配列によって第２のランダム配列に接続された第１のランダム配列を含み、複数のオリゴヌクレオチドの分子標識は、ランダム配列を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）固体支持体、ポリスチレン固体支持体、ガラス固体支持体、ポリプロピレン固体支持体、アガロース固体支持体、ゼラチン固体支持体、磁性固体支持体、プルロニック固体支持体およびこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、リンカー官能基を含むリンカーを含み、固体支持体は、固体支持体官能基を含み、固体支持体官能基およびリンカー官能基は互いに接続する。一部の実施形態では、リンカー官能基および固体支持体官能基は、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン（複数可）、アルデヒド（複数可）、ケトン（複数可）およびこれらのいずれかの組合せからなる群から個々に選択される。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドの分子標識は、少なくとも１５個のヌクレオチドを含む。
【０００５】
提供されている一態様は、本明細書に記載されている固体支持体のいずれかと、使用説明書とを含むキットである。一部の実施形態では、キットは、ウェルをさらに含む。一部の実施形態では、ウェルは、アレイ中に含まれる。一部の実施形態では、ウェルは、マイクロウェルである。一部の実施形態では、キットは、バッファーをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、パッケージ中に含有される。一部の実施形態では、パッケージは、箱である。一部の実施形態では、パッケージまたは箱は、２立方フィートまたはそれに満たない容積を有する。一部の実施形態では、パッケージまたは箱は、１立方フィートまたはそれに満たない容積を有する。
【０００６】
提供されている一態様は、本明細書に記載されている固体支持体のいずれかを含むエマルションである。
【０００７】
提供されている一態様は、ウェルと、本明細書に記載されている固体支持体のいずれかとを含む組成物である。
【０００８】
提供されている一態様は、細胞と、本明細書に記載されている固体支持体のいずれかとを含む組成物である。
【０００９】
一部の実施形態では、エマルションまたは組成物は、細胞をさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、単一細胞である。一部の実施形態では、ウェルは、マイクロウェルである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、約１，０００μｍ3〜約１２０，０００μｍ3に及ぶ容積を有する。
【００１０】
提供されている一態様は、試料を本明細書に開示されているいずれかの固体支持体と接触させて、試料由来の標的核酸を複数のオリゴヌクレオチドの１オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップを含む方法である。一部の実施形態では、方法は、標的核酸またはその相補体を増幅するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、標的核酸またはその相補体を配列決定するステップであって、標的核酸またはその相補体が結合されるオリゴヌクレオチドの分子標識を配列決定することを含む、ステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、標的核酸またはその相補体の量を決定するステップであって、標的核酸またはその相補体のレベルを定量化するステップ、同じ分子標識を含む配列の数を計数するステップ、またはこれらの組合せを含むステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、いずれかの同じ分子標識またはいずれかの同じ細胞性標識を整列するステップを含まない。一部の実施形態では、増幅するステップは、標的核酸を逆転写するステップを含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲおよびこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される方法を用いる。一部の実施形態では、増幅するステップは、固体支持体上で直接的に、固体支持体から転写された鋳型上で、またはこれらの組合せで行われる。一部の実施形態では、試料は、細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、単一細胞である。一部の実施形態では、接触させるステップは、ウェル中で行う。一部の実施形態では、ウェルは、マイクロウェルであり、マイクロウェルのアレイ中に含有される。
【００１１】
提供されている一態様は、複数のマイクロウェルを含み、複数のマイクロウェルの各マイクロウェルが、約１，０００μｍ3〜約１２０，０００μｍ3に及ぶ容積を有するデバイスである。一部の実施形態では、複数のマイクロウェルの各マイクロウェルは、約２０，０００μｍ3の容積を有する。一部の実施形態では、複数のマイクロウェルは、約９６〜約２００，０００個のマイクロウェルを含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、材料の層中に含まれる。一部の実施形態では、マイクロウェルの少なくとも約１０％は、細胞をさらに含む。一部の実施形態では、デバイスは、本明細書に記載されている固体支持体のいずれかをさらに含む。
【００１２】
提供されている一態様は、本明細書に記載されているデバイスのいずれかと、液体ハンドラーとを含む装置である。一部の実施形態では、液体ハンドラーは、約１秒間で複数のマイクロウェルへと液体を送達する。一部の実施形態では、液体ハンドラーは、単一の入力ポートから複数のマイクロウェルへと液体を送達する。一部の実施形態では、装置は、磁石をさらに含む。一部の実施形態では、装置は、入口ポート、出口ポート、ポンプ、弁、ベント、リザーバー、試料収集チャンバー、温度制御装置またはこれらのいずれかの組合せのうち少なくとも１種をさらに含む。一部の実施形態では、装置は、試料収集チャンバーを含み、試料収集チャンバーは、装置から着脱可能である。一部の実施形態では、装置は、光学撮像器をさらに含む。一部の実施形態では、光学撮像器は、液体ハンドラーの制御に使用される出力シグナルを生成する。一部の実施形態では、装置は、オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うように構成された熱サイクリング機構をさらに含む。
【００１３】
提供されている一態様は、本明細書に記載されているいずれかのデバイスもしくは装置、本明細書に記載されているいずれかの固体支持体、本明細書に記載されているいずれかの方法、またはこれらのいずれかの組合せにより臨床診断検査結果を生成するステップを含む、臨床診断検査結果を生成する方法である。一部の実施形態では、臨床診断検査結果は、通信媒体を介して伝達される。
【００１４】
提供されている一態様は、細胞性標識の第１の部分および第１のリンカーを含む第１のポリヌクレオチドを固体支持体に付着させるステップと、細胞性標識の第２の部分、第１のリンカー（ｌｉｋｅｒ）に相補的な配列および分子標識を含む第２のポリヌクレオチドを接触させるステップとを含む、本明細書に記載されている固体支持体のいずれかを作製する方法である。一部の実施形態では、第３のポリヌクレオチドは、標的核酸結合領域をさらに含む。
【００１５】
一部の実施形態では、エマルション、マイクロウェルまたはウェルは、１個の細胞のみを含有する。一部の実施形態では、１〜２，０００，０００個のエマルション、マイクロウェルまたはウェルはそれぞれ、１個の細胞のみを含有する。一部の実施形態では、方法は、各エマルション、マイクロウェルまたはウェルに最大でも１個の細胞を分布させるステップを含む。一部の実施形態では、単一の固体支持体および単一細胞が、エマルション、マイクロウェルまたはウェルに分布される。一部の実施形態では、１〜２，０００，０００個のエマルション、マイクロウェルまたはウェルにそれぞれ、１個の細胞および１個の固体支持体が分布されている。一部の実施形態では、方法は、エマルション、マイクロウェルまたはウェル１個当たり最大でも１個の固体支持体を分布させるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、１〜２，０００，０００個のマイクロウェル、エマルションまたはウェルのそれぞれに１個の固体支持体および１個の細胞を分布させるステップを含む。一部の実施形態では、細胞分布は、ランダムまたは非ランダムである。一部の実施形態では、細胞分布は、確率論的である。一部の実施形態では、細胞は、細胞選別機によって分布される。一部の実施形態では、１個または複数のウェル、マイクロウェルまたはエマルションに最大でも１個の細胞が分布されるように、希釈された細胞の希釈溶液と１個または複数のウェル、マイクロウェルまたはエマルションを接触させることにより、細胞が分布される。
【００１６】
一部の実施形態では、標的特異的領域、複数のオリゴヌクレオチドの標的特異的領域または２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子の標的特異的領域は、標的パネルの２種またはそれを超える標的に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、標的パネルの２種またはそれを超える標的は、バイオマーカーである。一部の実施形態では、バイオマーカーは、疾患または状態のバイオマーカーである。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、感染症、ウイルス感染症、炎症性疾患、神経変性疾患、真菌疾患、細菌感染症またはこれらのいずれかの組合せである。一部の実施形態では、パネルは、２〜５０，０００、２〜４０，０００、２〜３０，０００、２〜２０，０００、２〜１０，０００、２〜９０００、２〜８，０００、２〜７，０００、２〜６，０００、２〜５，０００、２〜１，０００、２〜８００、２〜７００、２〜６００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２〜７５、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０または２〜５種のバイオマーカーを含む。
【００１７】
参照による援用
本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により援用されていると特にかつ個々に示されているのと同じ程度まで、ここに参照により援用される。
【００１８】
本発明の新規特色は、添付の特許請求の範囲に特に表記されている。本発明の特色および利点のより十分な理解は、本発明の原理が利用されている説明的な実施形態を表記する次の詳細な説明と、次に示す添付の図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、例示的なオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした例示的な固体支持体を描写する。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｃは、分割−プール合成を使用した、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを合成するための例示的なワークフローを描写する。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｃは、分割−プール合成を使用した、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを合成するための例示的なワークフローを描写する。
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｃは、分割−プール合成を使用した、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを合成するための例示的なワークフローを描写する。
【図３】図３は、例示的なオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを描写する。
【図４】図４は、マイクロウェルアレイの例示的な実施形態を説明する。
【図５】図５は、マイクロウェルアレイにおける固体支持体の例示的な分布を描写する。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｃは、マイクロウェルアレイにおける例示的な分布細胞を示す。図６Ａは、Ｋ５６２細胞（大型の細胞サイズ）の分布を示す。図６Ｂは、Ｒａｍｏｓ細胞（小型の細胞サイズ）の分布を示す。図６Ｃは、マイクロウェルアレイにおけるＲａｍｏｓ細胞およびオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズの分布を示し、実線矢印は、Ｒａｍｏｓ細胞を指し示し、破線矢印は、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを指し示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｃは、マイクロウェルアレイにおける例示的な分布細胞を示す。図６Ａは、Ｋ５６２細胞（大型の細胞サイズ）の分布を示す。図６Ｂは、Ｒａｍｏｓ細胞（小型の細胞サイズ）の分布を示す。図６Ｃは、マイクロウェルアレイにおけるＲａｍｏｓ細胞およびオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズの分布を示し、実線矢印は、Ｒａｍｏｓ細胞を指し示し、破線矢印は、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを指し示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜図６Ｃは、マイクロウェルアレイにおける例示的な分布細胞を示す。図６Ａは、Ｋ５６２細胞（大型の細胞サイズ）の分布を示す。図６Ｂは、Ｒａｍｏｓ細胞（小型の細胞サイズ）の分布を示す。図６Ｃは、マイクロウェルアレイにおけるＲａｍｏｓ細胞およびオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズの分布を示し、実線矢印は、Ｒａｍｏｓ細胞を指し示し、破線矢印は、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを指し示す。
【図７】図７は、マイクロウェル容積、固体支持体容積および溶解から得られる生物学的材料の量の例示的な統計を示す。
【図８】図８Ａ〜図８Ｃは、ビーズキャップ封着の例示的な実施形態を説明する。図８Ａ〜図８Ｂは、マイクロアレイウェルのウェル内に細胞およびオリゴヌクレオチドビーズが分布し、より大型のセファデックスビーズがウェルの封着に使用された、マイクロアレイウェルの画像を示す。点線矢印は、細胞を指し示し、破線矢印は、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを指し示し、実線矢印は、セファデックスビーズを指し示す。図８Ｃは、セファデックスビーズを使用してウェルを封着した、ウェル内に沈着した細胞およびオリゴヌクレオチドビーズ（例えば、オリゴビーズ）の模式図を描写する。
【図９】図９は、マイクロウェルおよびチューブから増幅されたＧＡＰＤＨおよびＲＰＬ１９の増幅効率を比較する棒グラフを描写する。灰色バーは、マイクロウェルのデータを表す。白色バーは、チューブのデータを表す。
【図１０】図１０は、直接的に固体支持体における３種の異なる遺伝子の増幅特異性を比較するアガロースゲルを描写する。
【図１１−１】図１１Ａ〜図１１Ｉは、配列決定結果のグラフによる表現を示す。
【図１１−２】図１１Ａ〜図１１Ｉは、配列決定結果のグラフによる表現を示す。
【図１１−３】図１１Ａ〜図１１Ｉは、配列決定結果のグラフによる表現を示す。
【図１１−４】図１１Ａ〜図１１Ｉは、配列決定結果のグラフによる表現を示す。
【図１１−５】図１１Ａ〜図１１Ｉは、配列決定結果のグラフによる表現を示す。
【図１２−１】図１２Ａ〜図１２Ｃは、それぞれＫ５６２のみの試料、Ｒａｍｏｓのみの試料およびＫ５６２＋Ｒａｍｏｓ混合物試料の配列決定結果のヒストグラムを示す。
【図１２−２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、それぞれＫ５６２のみの試料、Ｒａｍｏｓのみの試料およびＫ５６２＋Ｒａｍｏｓ混合物試料の配列決定結果のヒストグラムを示す。
【図１２−３】図１２Ｄ〜図１２Ｅは、それぞれＲａｍｏｓのみの細胞試料およびＫ５６２のみの細胞試料に関する、表３に列挙される遺伝子のコピー数のグラフを示す。
【図１２−４】図１２Ｆ〜図１２Ｉは、個々の遺伝子のコピー数を示す。
【図１２−５】図１２Ｆ〜図１２Ｉは、個々の遺伝子のコピー数を示す。
【図１２−６】図１２Ｊ〜図１２Ｍは、１００種の特有のバーコード組合せを有するビーズに対する、遺伝子１種当たりの特有の分子の数（ｙ軸）のグラフを示す。
【図１２−７】図１２Ｊ〜図１２Ｍは、１００種の特有のバーコード組合せを有するビーズに対する、遺伝子１種当たりの特有の分子の数（ｙ軸）のグラフを示す。
【図１２−８】図１２Ｊ〜図１２Ｍは、１００種の特有のバーコード組合せを有するビーズに対する、遺伝子１種当たりの特有の分子の数（ｙ軸）のグラフを示す。
【図１２−９】図１２Ｊ〜図１２Ｍは、１００種の特有のバーコード組合せを有するビーズに対する、遺伝子１種当たりの特有の分子の数（ｙ軸）のグラフを示す。
【図１２−１０】図１２Ｎ〜図１２Ｏは、２種の細胞型の遺伝子発現プロファイルの全般的パターンを描写する、２個のビーズの拡大したグラフを示す。
【図１２−１１】図１２Ｐは、Ｋ５６２＋Ｒａｍｏｓ混合物試料由来のビーズ１個当たり＞３０種の分子を有する７６８個のビーズの遺伝子発現プロファイルの主成分分析に基づく結果の散布図を示す。
【図１２−１２】図１２Ｑ〜図１２Ｒは、それぞれＫ５６２様細胞（図１２Ｐに基づく第１の主成分の左側のビーズ）およびＲａｍｏｓ様細胞（図１２Ｐに基づく第１の主成分の右側のビーズ）に関する、ビーズ１個当たりのアンプリコン１種当たりのコピー数のヒストグラムを示す。
【図１２−１３】図１２Ｑ〜図１２Ｒは、それぞれＫ５６２様細胞（図１２Ｐに基づく第１の主成分の左側のビーズ）およびＲａｍｏｓ様細胞（図１２Ｐに基づく第１の主成分の右側のビーズ）に関する、ビーズ１個当たりのアンプリコン１種当たりのコピー数のヒストグラムを示す。
【図１２−１４】図１２Ｓ〜図１２Ｔは、それぞれＫ５６２様細胞（図１２Ｐに基づく第１の主成分の左側のビーズ）およびＲａｍｏｓ様細胞（図１２Ｐに基づく第１の主成分の右側のビーズ）に関する、個々の遺伝子のビーズまたは単一細胞１個当たりのコピー数を示す。
【図１２−１５】図１２Ｓ〜図１２Ｔは、それぞれＫ５６２様細胞（図１２Ｐに基づく第１の主成分の左側のビーズ）およびＲａｍｏｓ様細胞（図１２Ｐに基づく第１の主成分の右側のビーズ）に関する、個々の遺伝子のビーズまたは単一細胞１個当たりのコピー数を示す。
【図１３−１】図１３Ａは、マウスおよびＲａｍｏｓ細胞の全般的遺伝子発現パターンを描写する。
【図１３−２】図１３Ｂ〜図１３Ｃは、それぞれ高密度試料および低密度試料の遺伝子発現プロファイルの主成分分析に基づく結果の散布図を示す。
【図１３−３】図１３Ｄ〜図１３Ｅは、それぞれ高密度試料由来のＲａｍｏｓ様細胞およびマウス様細胞に関する、バーコード（ｂｃ）組合せ１種当たりのリード（ｙ軸）  対  ｂｃ組合せ１種当たりの分子の総数によって選別される特有のバーコード組合せ（ｘ軸）のグラフを描写する。
【図１３−４】図１３Ｆ〜図１３Ｇは、それぞれ高密度試料由来のＲａｍｏｓ様細胞およびマウス様細胞に関する、バーコード（ｂｃ）組合せ１種当たりの分子の数（ｙ軸）  対  ｂｃ組合せ１種当たりの分子の総数によって選別される特有のバーコード組合せ（ｘ軸）のグラフを描写する。
【図１３−５】図１３Ｈ〜図１３Ｉは、それぞれ低密度試料由来のＲａｍｏｓ様細胞およびマウス様細胞に関する、バーコード（ｂｃ）組合せ１種当たりのリード（ｙ軸）  対  バーコード組合せ１種当たりの分子の総数によって選別される特有のバーコード組合せ（ｘ軸）のグラフを描写する。
【図１３−６】図１３Ｈ〜図１３Ｉは、それぞれ低密度試料由来のＲａｍｏｓ様細胞およびマウス様細胞に関する、バーコード（ｂｃ）組合せ１種当たりのリード（ｙ軸）  対  バーコード組合せ１種当たりの分子の総数によって選別される特有のバーコード組合せ（ｘ軸）のグラフを描写する。
【図１３−７】図１３Ｊ〜図１３Ｋは、それぞれ低密度試料由来のＲａｍｏｓ様細胞およびマウス様細胞に関する、バーコード組合せ１種当たりの分子の数（ｙ軸）  対  バーコード組合せ１種当たりの分子の総数によって選別される特有のバーコード組合せ（ｘ軸）のグラフを描写する。
【図１３−８】図１３Ｊ〜図１３Ｋは、それぞれ低密度試料由来のＲａｍｏｓ様細胞およびマウス様細胞に関する、バーコード組合せ１種当たりの分子の数（ｙ軸）  対  バーコード組合せ１種当たりの分子の総数によって選別される特有のバーコード組合せ（ｘ軸）のグラフを描写する。
【図１４】図１４は、Ｘ軸における遺伝子およびリードの数のｌｏｇ１０を描写するグラフを示す。
【図１５】図１５Ａは、３部構成（ｔｈｒｅｅ−ｐａｒｔ）細胞標識（例えば、細胞バーコード）１種当たりの検出される遺伝子の分布のグラフを示す。図１５Ｂは、ビーズ１個当たりの検出される特有の分子の分布のグラフを示す（遺伝子パネルを発現）。
【図１６】図１６は、細胞バーコードに関連する遺伝子に基づく細胞クラスターを描写する。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｄは、単球特異的マーカーの分析を示す。図１７Ｅは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｂは、Ｔ細胞特異的マーカーの分析を示す。図１８Ｃは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞特異的マーカーの分析を示す。図１９Ｃは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。
【図２０】図２０Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞特異的マーカーの分析を示す。図２０Ｂは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｄは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的マーカーの分析を示す。図２０Ｅは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。
【図２２】図２２Ａ〜図２２Ｅは、Ｂ細胞特異的マーカーの分析を示す。図２２Ｆは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｆは、Ｔｏｌｌ様受容体の分析を示す。Ｔｏｌｌ様受容体は、単球および一部のＢ細胞によって主に発現される。図２３Ｇは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。
【図２４】図２４は、遺伝子  対  リードの数のｌｏｇ１０のグラフを描写する。
【図２５−１】図２５Ａ〜図２５Ｄは、２種の遺伝子に関する、分子バーコード  対  リードの数またはリードの数のｌｏｇ１０のグラフを示す。
【図２５−２】図２５Ａ〜図２５Ｄは、２種の遺伝子に関する、分子バーコード  対  リードの数またはリードの数のｌｏｇ１０のグラフを示す。
【図２６−１】図２６Ａは、細胞バーコード１種当たりの発現されるパネルにおける遺伝子の数  対  特有の細胞バーコードの数／単一細胞のグラフを示す。図２６Ｂは、ビーズ１個当たりの検出される特有の分子の数  対  所定の数の分子を保有する特有の細胞バーコード１種当たりの細胞の数の頻度のヒストグラムを示す。図２６Ｃは、ビーズ１個当たりの検出される特有のＧＡＰＤＨ分子の数  対  細胞数の頻度／所定の数の分子を保有する特有の細胞バーコードのヒストグラムを示す。
【図２６−２】図２６Ａは、細胞バーコード１種当たりの発現されるパネルにおける遺伝子の数  対  特有の細胞バーコードの数／単一細胞のグラフを示す。図２６Ｂは、ビーズ１個当たりの検出される特有の分子の数  対  所定の数の分子を保有する特有の細胞バーコード１種当たりの細胞の数の頻度のヒストグラムを示す。図２６Ｃは、ビーズ１個当たりの検出される特有のＧＡＰＤＨ分子の数  対  細胞数の頻度／所定の数の分子を保有する特有の細胞バーコードのヒストグラムを示す。
【図２７】図２７は、８５６個の細胞の散布図を示す。
【図２８】図２８は、上位１００個（検出される分子の総数の観点から）の発現のヒートマップを示す。
【図２９】図２９は、実施例１２のためのワークフローを示す。
【図３０】図３０は、実施例１３のためのワークフローを示す。
【図３１−１】図３１Ａ〜図３１Ｃは、２種の明確に異なる細胞型を含有する制御された混合物における単一細胞のクラスタリングを示す。Ａ．１２種の遺伝子の発現の主成分分析による、Ｋ５６２およびＲａｍｏｓ細胞の１：１混合物のクラスタリング。バイプロットは、２種の明確に異なるクラスターを示し、一方のクラスターは、Ｒａｍｏｓ特異的遺伝子を発現し、他方は、Ｋ５６２特異的遺伝子を発現する。Ｂ．１１１種の遺伝子のパネルを使用した、健康な個体由来の初代Ｂ細胞のバックグラウンドにおいて少ないパーセンテージのＲａｍｏｓ細胞を含有する混合物の主成分分析。各データ点の色は、遺伝子パネル全体にわたって検出される特有の転写物分子の総数を示す。１１９８個の細胞のうち１８個の細胞のセット（丸く囲む）は、明確に異なる遺伝子発現プロファイルを呈し、さらにより高い転写レベルを有する。Ｃ．遺伝子パネルにおける検出される転写物分子の総数によってランク付けされた、図３１Ｂの試料における上位１００個の細胞における各遺伝子の発現レベルを示すヒートマップ。遺伝子は、相関の観点から階層的クラスタリングにより順序付けされる。水平赤色バーによって示される上位１８個の細胞は、垂直赤色バーによって示される、濾胞性リンパ腫と関連することが公知の遺伝子のセットを優先的に発現した。
【図３１−２】図３１Ａ〜図３１Ｃは、２種の明確に異なる細胞型を含有する制御された混合物における単一細胞のクラスタリングを示す。Ａ．１２種の遺伝子の発現の主成分分析による、Ｋ５６２およびＲａｍｏｓ細胞の１：１混合物のクラスタリング。バイプロットは、２種の明確に異なるクラスターを示し、一方のクラスターは、Ｒａｍｏｓ特異的遺伝子を発現し、他方は、Ｋ５６２特異的遺伝子を発現する。Ｂ．１１１種の遺伝子のパネルを使用した、健康な個体由来の初代Ｂ細胞のバックグラウンドにおいて少ないパーセンテージのＲａｍｏｓ細胞を含有する混合物の主成分分析。各データ点の色は、遺伝子パネル全体にわたって検出される特有の転写物分子の総数を示す。１１９８個の細胞のうち１８個の細胞のセット（丸く囲む）は、明確に異なる遺伝子発現プロファイルを呈し、さらにより高い転写レベルを有する。Ｃ．遺伝子パネルにおける検出される転写物分子の総数によってランク付けされた、図３１Ｂの試料における上位１００個の細胞における各遺伝子の発現レベルを示すヒートマップ。遺伝子は、相関の観点から階層的クラスタリングにより順序付けされる。水平赤色バーによって示される上位１８個の細胞は、垂直赤色バーによって示される、濾胞性リンパ腫と関連することが公知の遺伝子のセットを優先的に発現した。
【図３１−３】図３１Ｄは、初代Ｂ細胞とスパイクインされたＲａｍｏｓ細胞のＰＣＡ分析を示す。各データ点（単一細胞）の色は、特定の遺伝子に関して各細胞が保有する、転写物分子の数のｌｏｇを示す。上位７列：Ｒａｍｏｓ細胞である可能性が高い１８個の細胞のサブセットによって優先的に発現される遺伝子。第１列遺伝子は（左から右に）、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＬ１Ａ、ＭＫＩ６７およびＢＣＬ６を含む。第２列遺伝子は（左から右に）、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ３、ＣＤ８１およびＧＮＡＩ２を含む。第３列の遺伝子は（左から右に）、ＩＧＢＰ１、ＣＤ２０、ＢＬＮＫおよびＤＯＣＫ８を含む。第４列の遺伝子は（左から右に）、ＩＲＦ４、ＣＤ２２、ＩＧＨＭおよびＡＵＲＫＢを含む。第５列の遺伝子は（左から右に）、ＣＤ３８、ＣＤ１０、ＬＥＦ１およびＡＩＣＤＡを含む。第６列の遺伝子は（左から右に）、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＩＬ４ＲおよびＰＲＫＣＤを含む。第７列の遺伝子は（左から右に）、ＲＧＳ１、ＭＣＬ１、ＣＤ７９ａおよびＨＬＡ−ＤＲＡを含む。最後の列：初代Ｂ細胞のサブセットによって優先的に発現されるが、これら１８個の細胞においては特に濃縮されない遺伝子。最後の列における遺伝子は（左から右に）、ＩＬ６、ＣＤ２３ａ、ＣＣＲ７およびＣＸＣＲ５を含む。
【図３２】図３２は、ＧＡＰＤＨの発現を示す。色は、細胞１個当たりの観察される特有の転写物分子の数の自然対数を示す。
【図３３−１】図３３Ａ〜図３３Ｆは、単球関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３３Ａは、ＣＤ１６のＰＣＡを示す。図３３Ｂは、ＣＣＲｖａｒＡのＰＣＡを示す。図３３Ｃは、ＣＤ１４のＰＣＡを示す。図３３Ｄは、Ｓ１００Ａ１２のＰＣＡを示す。図３３Ｅは、ＣＤ２０９のＰＣＡを示す。図３３Ｆは、ＩＦＮＧＲ１のＰＣＡを示す。
【図３３−２】図３３Ａ〜図３３Ｆは、単球関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３３Ａは、ＣＤ１６のＰＣＡを示す。図３３Ｂは、ＣＣＲｖａｒＡのＰＣＡを示す。図３３Ｃは、ＣＤ１４のＰＣＡを示す。図３３Ｄは、Ｓ１００Ａ１２のＰＣＡを示す。図３３Ｅは、ＣＤ２０９のＰＣＡを示す。図３３Ｆは、ＩＦＮＧＲ１のＰＣＡを示す。
【図３４】図３４Ａ〜図３４Ｂは、汎Ｔ細胞マーカー（ＣＤ３）の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３４Ａは、ＣＤ３ＤのＰＣＡを示し、図３４Ｂは、ＣＤ３ＥのＰＣＡを示す。
【図３５−１】図３５Ａ〜図３５Ｅは、ＣＤ８  Ｔ細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３５Ａは、ＣＤ８ＡのＰＣＡを示す。図３５Ｂは、ＥＯＭＥＳのＰＣＡを示す。図３５Ｃは、ＣＤ８ＢのＰＣＡを示す。図３５Ｄは、ＰＲＦ１のＰＣＡを示す。図３５Ｅは、ＲＵＮＸ３のＰＣＡを示す。
【図３５−２】図３５Ａ〜図３５Ｅは、ＣＤ８  Ｔ細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３５Ａは、ＣＤ８ＡのＰＣＡを示す。図３５Ｂは、ＥＯＭＥＳのＰＣＡを示す。図３５Ｃは、ＣＤ８ＢのＰＣＡを示す。図３５Ｄは、ＰＲＦ１のＰＣＡを示す。図３５Ｅは、ＲＵＮＸ３のＰＣＡを示す。
【図３５−３】図３５Ａ〜図３５Ｅは、ＣＤ８  Ｔ細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３５Ａは、ＣＤ８ＡのＰＣＡを示す。図３５Ｂは、ＥＯＭＥＳのＰＣＡを示す。図３５Ｃは、ＣＤ８ＢのＰＣＡを示す。図３５Ｄは、ＰＲＦ１のＰＣＡを示す。図３５Ｅは、ＲＵＮＸ３のＰＣＡを示す。
【図３６−１】図３６Ａ〜図３６Ｃは、ＣＤ４  Ｔ細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３６Ａは、ＣＤ４のＰＣＡを示す。図３６Ｂは、ＣＣＲ７のＰＣＡを示す。図３６Ｃは、ＣＤ６２ＬのＰＣＡを示す。
【図３６−２】図３６Ａ〜図３６Ｃは、ＣＤ４  Ｔ細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３６Ａは、ＣＤ４のＰＣＡを示す。図３６Ｂは、ＣＣＲ７のＰＣＡを示す。図３６Ｃは、ＣＤ６２ＬのＰＣＡを示す。
【図３７−１】図３７Ａ〜図３７Ｆは、Ｂ細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３７Ａは、ＣＤ２０のＰＣＡを示す。図３７Ｂは、ＩＧＨＤのＰＣＡを示す。図３７Ｃは、ＰＡＸ５のＰＣＡを示す。図３７Ｄは、ＴＣＬ１ＡのＰＣＡを示す。図３７Ｅは、ＩＧＨＭのＰＣＡを示す。図３７Ｆは、ＣＤ２４のＰＣＡを示す。
【図３７−２】図３７Ａ〜図３７Ｆは、Ｂ細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３７Ａは、ＣＤ２０のＰＣＡを示す。図３７Ｂは、ＩＧＨＤのＰＣＡを示す。図３７Ｃは、ＰＡＸ５のＰＣＡを示す。図３７Ｄは、ＴＣＬ１ＡのＰＣＡを示す。図３７Ｅは、ＩＧＨＭのＰＣＡを示す。図３７Ｆは、ＣＤ２４のＰＣＡを示す。
【図３７−３】図３７Ａ〜図３７Ｆは、Ｂ細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３７Ａは、ＣＤ２０のＰＣＡを示す。図３７Ｂは、ＩＧＨＤのＰＣＡを示す。図３７Ｃは、ＰＡＸ５のＰＣＡを示す。図３７Ｄは、ＴＣＬ１ＡのＰＣＡを示す。図３７Ｅは、ＩＧＨＭのＰＣＡを示す。図３７Ｆは、ＣＤ２４のＰＣＡを示す。
【図３８−１】図３８Ａ〜図３８Ｃは、ナチュラルキラー細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３８Ａは、ＫＩＲ２ＤＳ５のＰＣＡを示す。図３８Ｂは、ＣＤ１６のＰＣＡを示す。図３８Ｃは、ＣＤ６２ＬのＰＣＡを示す。
【図３８−２】図３８Ａ〜図３８Ｃは、ナチュラルキラー細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３８Ａは、ＫＩＲ２ＤＳ５のＰＣＡを示す。図３８Ｂは、ＣＤ１６のＰＣＡを示す。図３８Ｃは、ＣＤ６２ＬのＰＣＡを示す。
【図３９】図３９は、ＣｙｔｏＳｅｑ細胞によってアッセイされる８１種の遺伝子のＰＣＡ分析によるヒトＰＢＭＣ試料（６３２細胞）における主要細胞型の同時同定を示し、高度に相関する発現プロファイルを同様の色でコードする。
【図４０Ａ】図４０Ａ〜図４０Ｂは、ＰＢＭＣ試料の単一細胞遺伝子発現プロファイルの相関分析を示す。４０Ａ．試料における６３２細胞にわたるペアワイズ相関係数を示すマトリクス。高度に相関する遺伝子発現プロファイルを有する細胞が共に群分けされるように、細胞を順序付ける。４０Ｂ．各細胞による各遺伝子の発現を示すヒートマップ。上述の相関マトリクスと同じ様式で細胞（段）を順序付ける。細胞にわたり高度に同様の発現パターンを共有する遺伝子が共に群分けされるように、遺伝子（列）を順序付ける。細胞の各クラスターの細胞型は、細胞が同時発現する遺伝子の群により同定することができる。各主要細胞クラスター内において、遺伝子発現の観点から、相当な程度の不均質性が存在する。
【図４０Ｂ】図４０Ａ〜図４０Ｂは、ＰＢＭＣ試料の単一細胞遺伝子発現プロファイルの相関分析を示す。４０Ａ．試料における６３２細胞にわたるペアワイズ相関係数を示すマトリクス。高度に相関する遺伝子発現プロファイルを有する細胞が共に群分けされるように、細胞を順序付ける。４０Ｂ．各細胞による各遺伝子の発現を示すヒートマップ。上述の相関マトリクスと同じ様式で細胞（段）を順序付ける。細胞にわたり高度に同様の発現パターンを共有する遺伝子が共に群分けされるように、遺伝子（列）を順序付ける。細胞の各クラスターの細胞型は、細胞が同時発現する遺伝子の群により同定することができる。各主要細胞クラスター内において、遺伝子発現の観点から、相当な程度の不均質性が存在する。
【図４１】図４１は、同じドナーに由来するＰＢＭＣ試料の再現実験から得られる７３１細胞のデータを表す。同様の遺伝子発現プロファイル（相関係数を使用した階層的クラスタリングに基づく）を有する細胞を同様の色でプロットする。
【図４２】図４２は、遺伝子間の遺伝子発現プロファイルにおける相関を実証するヒートマップを示す。
【図４３】図４３は、ＣｙｔｏＳｅｑを描写する。Ａ．ＣｙｔｏＳｅｑの実験手順。Ｂ．ビーズに付着させたオリゴヌクレオチドの構造。
【図４４Ａ】図４４は、ＣＤ３＋Ｔ細胞の亜集団の精査を示す。Ａ．ドナー１無刺激試料のＰＣＡは、細胞の２種の主要ブランチ（ｂｒａｎｃｈ）を明らかにする。各細胞内の特定の遺伝子の発現レベル（特有の転写物分子のｌｏｇ）を色で示す。ヘルパーＴ細胞関連サイトカインおよびエフェクター遺伝子は、下部（ｌｏｗｅｒ）ブランチにおける細胞において濃縮されるが、細胞傷害性Ｔ細胞関連遺伝子は、上部（ｕｐｐｅｒ）ブランチにおいて濃縮される。代表的な遺伝子をここに示す。第１列は、ヘルパーＴ細胞関係遺伝子を示し、（左から右に）ＣＤ４、ＳＥＬＬおよびＣＣＲ７を含む。第２列は、細胞傷害性Ｔ細胞関係遺伝子を示し、（左から右に）ＣＤ８Ａ、ＮＫＧ２ＤおよびＥＯＭＥＳを含む。Ｂ．ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞を表す２種の主なブランチの一方に対する表示遺伝子の発現の濃縮を示す、ドナー１抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激試料のＰＣＡ。これらの遺伝子は、無刺激試料において少量存在する。最初の２列は、活性化Ｔ細胞に関連することが公知の遺伝子を示し、（左から右に）第１列はＩＲＦ４、ＣＤ６９およびＭＹＣを、第２列はＧＡＰＤＨ、ＴＮＦおよびＩＦＮＧを含む。第３列は、活性化ヘルパーＴ細胞に関連することが公知の遺伝子を示し、（左から右に）ＩＬ２、ＬＴＡおよびＣＤ４０ＬＧを含む。第４列は、活性化細胞傷害性Ｔ細胞に関連することが公知の遺伝子を示し、（左から右に）ＣＣＬ４、ＣＣＬ３およびＧＺＭＢを含む。Ｃ．集約データにおける無刺激試料と刺激試料を比較する場合の、大幅の倍数変化を呈する遺伝子の全体的発現レベルに寄与する細胞の数。数種のサイトカイン（赤色矢印）に関して、少数の細胞のみの寄与は、集団全体における大幅な全体的遺伝子発現変化の原因となる。
【図４４Ｂ】図４４は、ＣＤ３＋Ｔ細胞の亜集団の精査を示す。Ａ．ドナー１無刺激試料のＰＣＡは、細胞の２種の主要ブランチ（ｂｒａｎｃｈ）を明らかにする。各細胞内の特定の遺伝子の発現レベル（特有の転写物分子のｌｏｇ）を色で示す。ヘルパーＴ細胞関連サイトカインおよびエフェクター遺伝子は、下部（ｌｏｗｅｒ）ブランチにおける細胞において濃縮されるが、細胞傷害性Ｔ細胞関連遺伝子は、上部（ｕｐｐｅｒ）ブランチにおいて濃縮される。代表的な遺伝子をここに示す。第１列は、ヘルパーＴ細胞関係遺伝子を示し、（左から右に）ＣＤ４、ＳＥＬＬおよびＣＣＲ７を含む。第２列は、細胞傷害性Ｔ細胞関係遺伝子を示し、（左から右に）ＣＤ８Ａ、ＮＫＧ２ＤおよびＥＯＭＥＳを含む。Ｂ．ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞を表す２種の主なブランチの一方に対する表示遺伝子の発現の濃縮を示す、ドナー１抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激試料のＰＣＡ。これらの遺伝子は、無刺激試料において少量存在する。最初の２列は、活性化Ｔ細胞に関連することが公知の遺伝子を示し、（左から右に）第１列はＩＲＦ４、ＣＤ６９およびＭＹＣを、第２列はＧＡＰＤＨ、ＴＮＦおよびＩＦＮＧを含む。第３列は、活性化ヘルパーＴ細胞に関連することが公知の遺伝子を示し、（左から右に）ＩＬ２、ＬＴＡおよびＣＤ４０ＬＧを含む。第４列は、活性化細胞傷害性Ｔ細胞に関連することが公知の遺伝子を示し、（左から右に）ＣＣＬ４、ＣＣＬ３およびＧＺＭＢを含む。Ｃ．集約データにおける無刺激試料と刺激試料を比較する場合の、大幅の倍数変化を呈する遺伝子の全体的発現レベルに寄与する細胞の数。数種のサイトカイン（赤色矢印）に関して、少数の細胞のみの寄与は、集団全体における大幅な全体的遺伝子発現変化の原因となる。
【図４４Ｃ】図４４は、ＣＤ３＋Ｔ細胞の亜集団の精査を示す。Ａ．ドナー１無刺激試料のＰＣＡは、細胞の２種の主要ブランチ（ｂｒａｎｃｈ）を明らかにする。各細胞内の特定の遺伝子の発現レベル（特有の転写物分子のｌｏｇ）を色で示す。ヘルパーＴ細胞関連サイトカインおよびエフェクター遺伝子は、下部（ｌｏｗｅｒ）ブランチにおける細胞において濃縮されるが、細胞傷害性Ｔ細胞関連遺伝子は、上部（ｕｐｐｅｒ）ブランチにおいて濃縮される。代表的な遺伝子をここに示す。第１列は、ヘルパーＴ細胞関係遺伝子を示し、（左から右に）ＣＤ４、ＳＥＬＬおよびＣＣＲ７を含む。第２列は、細胞傷害性Ｔ細胞関係遺伝子を示し、（左から右に）ＣＤ８Ａ、ＮＫＧ２ＤおよびＥＯＭＥＳを含む。Ｂ．ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞を表す２種の主なブランチの一方に対する表示遺伝子の発現の濃縮を示す、ドナー１抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激試料のＰＣＡ。これらの遺伝子は、無刺激試料において少量存在する。最初の２列は、活性化Ｔ細胞に関連することが公知の遺伝子を示し、（左から右に）第１列はＩＲＦ４、ＣＤ６９およびＭＹＣを、第２列はＧＡＰＤＨ、ＴＮＦおよびＩＦＮＧを含む。第３列は、活性化ヘルパーＴ細胞に関連することが公知の遺伝子を示し、（左から右に）ＩＬ２、ＬＴＡおよびＣＤ４０ＬＧを含む。第４列は、活性化細胞傷害性Ｔ細胞に関連することが公知の遺伝子を示し、（左から右に）ＣＣＬ４、ＣＣＬ３およびＧＺＭＢを含む。Ｃ．集約データにおける無刺激試料と刺激試料を比較する場合の、大幅の倍数変化を呈する遺伝子の全体的発現レベルに寄与する細胞の数。数種のサイトカイン（赤色矢印）に関して、少数の細胞のみの寄与は、集団全体における大幅な全体的遺伝子発現変化の原因となる。
【図４５Ａ】図４５は、２名のドナーにおける抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３ビーズによる刺激を受けたＴ細胞試料および相当する無刺激試料のＰＣＡプロットを示し、無刺激試料におけるヘルパーまたは細胞傷害性サブセットのいずれかにおける優先的発現を明らかに示す遺伝子の発現を強調する。各データ点（単一細胞）の色は、表示遺伝子に対する細胞１個当たりのｌｏｇ（特有の転写物分子の数）を示す。各ドナーにおける刺激および無刺激グラフのペア毎に、色範囲は、同じになるように調整されている。Ａ．ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞の両方に関連することが公知の遺伝子。Ｂ．細胞傷害性Ｔ細胞に関連することが公知の遺伝子。Ｃ．ヘルパーＴ細胞に関連することが公知の遺伝子。
【図４５Ｂ】図４５は、２名のドナーにおける抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３ビーズによる刺激を受けたＴ細胞試料および相当する無刺激試料のＰＣＡプロットを示し、無刺激試料におけるヘルパーまたは細胞傷害性サブセットのいずれかにおける優先的発現を明らかに示す遺伝子の発現を強調する。各データ点（単一細胞）の色は、表示遺伝子に対する細胞１個当たりのｌｏｇ（特有の転写物分子の数）を示す。各ドナーにおける刺激および無刺激グラフのペア毎に、色範囲は、同じになるように調整されている。Ａ．ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞の両方に関連することが公知の遺伝子。Ｂ．細胞傷害性Ｔ細胞に関連することが公知の遺伝子。Ｃ．ヘルパーＴ細胞に関連することが公知の遺伝子。
【図４５Ｃ】図４５は、２名のドナーにおける抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３ビーズによる刺激を受けたＴ細胞試料および相当する無刺激試料のＰＣＡプロットを示し、無刺激試料におけるヘルパーまたは細胞傷害性サブセットのいずれかにおける優先的発現を明らかに示す遺伝子の発現を強調する。各データ点（単一細胞）の色は、表示遺伝子に対する細胞１個当たりのｌｏｇ（特有の転写物分子の数）を示す。各ドナーにおける刺激および無刺激グラフのペア毎に、色範囲は、同じになるように調整されている。Ａ．ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞の両方に関連することが公知の遺伝子。Ｂ．細胞傷害性Ｔ細胞に関連することが公知の遺伝子。Ｃ．ヘルパーＴ細胞に関連することが公知の遺伝子。
【図４６Ａ】図４６Ａ〜図４６Ｄは、２名のドナーにおける抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３ビーズによる刺激を受けたＴ細胞試料および相当する無刺激試料のＰＣＡプロットを示し、刺激試料において発現されるが、無刺激試料においては低または検出不能レベルである遺伝子の発現を強調する。各データ点（単一細胞）の色は、表示遺伝子に対する細胞１個当たりのｌｏｇ（特有の転写物分子の数）を示す。各ドナーにおける刺激および無刺激グラフのペア毎に、色範囲は、同じになるように調整されている。４６Ａおよび４６Ｄ．活性化により細胞の両方のブランチによって発現される遺伝子。４６Ｂ．活性化により上部ブランチにおける細胞によって優先的に発現される遺伝子。これらの遺伝子は、活性化細胞傷害性Ｔ細胞に関連することが公知である。４６Ｃ．活性化により下部ブランチにおける細胞によって優先的に発現される遺伝子。これらの遺伝子は、活性化ヘルパーＴ細胞に関連することが公知である。
【図４６Ｂ】図４６Ａ〜図４６Ｄは、２名のドナーにおける抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３ビーズによる刺激を受けたＴ細胞試料および相当する無刺激試料のＰＣＡプロットを示し、刺激試料において発現されるが、無刺激試料においては低または検出不能レベルである遺伝子の発現を強調する。各データ点（単一細胞）の色は、表示遺伝子に対する細胞１個当たりのｌｏｇ（特有の転写物分子の数）を示す。各ドナーにおける刺激および無刺激グラフのペア毎に、色範囲は、同じになるように調整されている。４６Ａおよび４６Ｄ．活性化により細胞の両方のブランチによって発現される遺伝子。４６Ｂ．活性化により上部ブランチにおける細胞によって優先的に発現される遺伝子。これらの遺伝子は、活性化細胞傷害性Ｔ細胞に関連することが公知である。４６Ｃ．活性化により下部ブランチにおける細胞によって優先的に発現される遺伝子。これらの遺伝子は、活性化ヘルパーＴ細胞に関連することが公知である。
【図４６Ｃ】図４６Ａ〜図４６Ｄは、２名のドナーにおける抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３ビーズによる刺激を受けたＴ細胞試料および相当する無刺激試料のＰＣＡプロットを示し、刺激試料において発現されるが、無刺激試料においては低または検出不能レベルである遺伝子の発現を強調する。各データ点（単一細胞）の色は、表示遺伝子に対する細胞１個当たりのｌｏｇ（特有の転写物分子の数）を示す。各ドナーにおける刺激および無刺激グラフのペア毎に、色範囲は、同じになるように調整されている。４６Ａおよび４６Ｄ．活性化により細胞の両方のブランチによって発現される遺伝子。４６Ｂ．活性化により上部ブランチにおける細胞によって優先的に発現される遺伝子。これらの遺伝子は、活性化細胞傷害性Ｔ細胞に関連することが公知である。４６Ｃ．活性化により下部ブランチにおける細胞によって優先的に発現される遺伝子。これらの遺伝子は、活性化ヘルパーＴ細胞に関連することが公知である。
【図４６Ｄ】図４６Ａ〜図４６Ｄは、２名のドナーにおける抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３ビーズによる刺激を受けたＴ細胞試料および相当する無刺激試料のＰＣＡプロットを示し、刺激試料において発現されるが、無刺激試料においては低または検出不能レベルである遺伝子の発現を強調する。各データ点（単一細胞）の色は、表示遺伝子に対する細胞１個当たりのｌｏｇ（特有の転写物分子の数）を示す。各ドナーにおける刺激および無刺激グラフのペア毎に、色範囲は、同じになるように調整されている。４６Ａおよび４６Ｄ．活性化により細胞の両方のブランチによって発現される遺伝子。４６Ｂ．活性化により上部ブランチにおける細胞によって優先的に発現される遺伝子。これらの遺伝子は、活性化細胞傷害性Ｔ細胞に関連することが公知である。４６Ｃ．活性化により下部ブランチにおける細胞によって優先的に発現される遺伝子。これらの遺伝子は、活性化ヘルパーＴ細胞に関連することが公知である。
【図４７】図４７は、ドナー１の無刺激ＣＤ３＋Ｔ細胞のデータのクラスタリングが、ＣＤ４およびＣＤ８細胞、ならびにグランザイムＫおよびグランザイムＡを発現するがＣＤ８をほとんど発現しない細胞の群の分離を示すことを示す。上：細胞の各ペア間の相関を示すヒートマップ。高度に相関する細胞を共に群分けする。下：各細胞の各遺伝子の発現レベルを示すヒートマップ。細胞および遺伝子を双方向性階層的クラスタリングにより順序付ける。
【図４８】図４８は、ドナー１の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激ＣＤ３＋Ｔ細胞試料のデータを示す以外は図４７と同様の図を示す。上：細胞の各ペア間の相関を示すヒートマップ。高度に相関する細胞を共に群分けする。下：各細胞の各遺伝子の発現レベルを示すヒートマップ。細胞および遺伝子を双方向性階層的クラスタリングにより順序付ける。
【図４９−１】図４９Ａ〜図４９Ｃは、ドナー１において、無刺激試料と比較して、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３刺激試料において様々なサイトカインの大幅な全体的倍数変化が観察されたことを示す。Ａ〜Ｂ：これらのサイトカインの大幅な倍数変化は、数個の単一細胞のみによって大部分は寄与された（四角または丸に囲まれたドット）。多数のこれらのサイトカインは、同じ少数の細胞によって寄与された。Ｃ：これらのサイトカインの同時発現パターンは、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２およびＴｈ１７サブセットのシグネチャーサイトカインの組合せと一致する。
【図４９−２】図４９Ａ〜図４９Ｃは、ドナー１において、無刺激試料と比較して、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３刺激試料において様々なサイトカインの大幅な全体的倍数変化が観察されたことを示す。Ａ〜Ｂ：これらのサイトカインの大幅な倍数変化は、数個の単一細胞のみによって大部分は寄与された（四角または丸に囲まれたドット）。多数のこれらのサイトカインは、同じ少数の細胞によって寄与された。Ｃ：これらのサイトカインの同時発現パターンは、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２およびＴｈ１７サブセットのシグネチャーサイトカインの組合せと一致する。
【図５０Ａ】図５０Ａ〜図５０Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団の精査を示す。Ａ．ＣｙｔｏＳｅｑデータのクラスタリングは、ＣＤ８＋細胞の２種の主要群を定義する  −  一方の群は、セントラルメモリー／ナイーブ細胞によって共有される遺伝子を発現し、他方の群は、エフェクターメモリー／エフェクター細胞によって共有される遺伝子を発現する。ドナー２の無刺激試料のデータをここに示す。上：細胞の各ペア間の相関を示すヒートマップ。下：各細胞における各遺伝子の発現レベルを示すヒートマップ。細胞および遺伝子を双方向性階層的クラスタリングにより順序付ける。Ｂ．ＣＭＶペプチドプールによる刺激後の２名のドナー由来のＣＤ８＋Ｔ細胞における、ガンマインターフェロン（ＩＦＮＧ）の発現による稀な抗原特異的Ｔ細胞の同定。各細胞を２Ｄ主成分空間にプロットする。ＩＦＮＧを発現する細胞（丸く囲む）は通常、パネルにおける大部分の検出された総転写物を有する細胞内のものである（色で示す）。ドナー２において、上位の発現細胞（四角）は、ＩＦＮＧを生成しないが、サイトカインＩＬ６およびＩＬ１Ｂを発現する。各丸の隣の数は、該細胞に検出される特有の転写物分子の総数の降順のランクを示す。
【図５０Ｂ】図５０Ａ〜図５０Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団の精査を示す。Ａ．ＣｙｔｏＳｅｑデータのクラスタリングは、ＣＤ８＋細胞の２種の主要群を定義する  −  一方の群は、セントラルメモリー／ナイーブ細胞によって共有される遺伝子を発現し、他方の群は、エフェクターメモリー／エフェクター細胞によって共有される遺伝子を発現する。ドナー２の無刺激試料のデータをここに示す。上：細胞の各ペア間の相関を示すヒートマップ。下：各細胞における各遺伝子の発現レベルを示すヒートマップ。細胞および遺伝子を双方向性階層的クラスタリングにより順序付ける。Ｂ．ＣＭＶペプチドプールによる刺激後の２名のドナー由来のＣＤ８＋Ｔ細胞における、ガンマインターフェロン（ＩＦＮＧ）の発現による稀な抗原特異的Ｔ細胞の同定。各細胞を２Ｄ主成分空間にプロットする。ＩＦＮＧを発現する細胞（丸く囲む）は通常、パネルにおける大部分の検出された総転写物を有する細胞内のものである（色で示す）。ドナー２において、上位の発現細胞（四角）は、ＩＦＮＧを生成しないが、サイトカインＩＬ６およびＩＬ１Ｂを発現する。各丸の隣の数は、該細胞に検出される特有の転写物分子の総数の降順のランクを示す。
【図５１】図５１は、本図のデータがドナー２のＣＭＶ刺激試料のデータを表すことを除いて図５０Ａと同様の図を示す。Ａ．ＣｙｔｏＳｅｑデータのクラスタリングは、ＣＤ８＋細胞の２種の主要群を定義する  −  一方の群は、セントラルメモリー／ナイーブ細胞によって共有される遺伝子を発現し、他方の群は、エフェクターメモリー／エフェクター細胞によって共有される遺伝子を発現する。ドナー２の無刺激試料のデータをここに示す。上：細胞の各ペア間の相関を示すヒートマップ。下：各細胞における各遺伝子の発現レベルを示すヒートマップ。細胞および遺伝子を双方向性階層的クラスタリングにより順序付ける。
【図５２−１】図５２は、データが、主成分空間においてプロットされることを示す。色は、特定の遺伝子のｌｏｇ（検出される特有の転写物分子の数）を示す。Ａ．ＣＭＶペプチドプールによる刺激により、より大きな比率の細胞によって発現されると考えられる遺伝子。Ｂ．細胞の一方のブランチに濃縮される遺伝子。これらの遺伝子は、ナイーブおよびセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞に関連することも公知である。Ｃ．細胞の他方のブランチに濃縮される遺伝子。これらの遺伝子は、エフェクターおよびエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞に関連することが公知である。Ｄ．グランザイムＫ発現細胞は、ＰＣ空間におけるナイーブ／セントラルメモリーおよびエフェクター／エフェクターメモリー細胞の間の領域を占有する。Ｅ．ＨＬＡ−ＤＲＡ発現細胞は、特殊なサブセットを構成する。Ｆ．細胞の両方のブランチにおいて発現される遺伝子。
【図５２−２】図５２は、データが、主成分空間においてプロットされることを示す。色は、特定の遺伝子のｌｏｇ（検出される特有の転写物分子の数）を示す。Ａ．ＣＭＶペプチドプールによる刺激により、より大きな比率の細胞によって発現されると考えられる遺伝子。Ｂ．細胞の一方のブランチに濃縮される遺伝子。これらの遺伝子は、ナイーブおよびセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞に関連することも公知である。Ｃ．細胞の他方のブランチに濃縮される遺伝子。これらの遺伝子は、エフェクターおよびエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞に関連することが公知である。Ｄ．グランザイムＫ発現細胞は、ＰＣ空間におけるナイーブ／セントラルメモリーおよびエフェクター／エフェクターメモリー細胞の間の領域を占有する。Ｅ．ＨＬＡ−ＤＲＡ発現細胞は、特殊なサブセットを構成する。Ｆ．細胞の両方のブランチにおいて発現される遺伝子。
【図５２−３】図５２は、データが、主成分空間においてプロットされることを示す。色は、特定の遺伝子のｌｏｇ（検出される特有の転写物分子の数）を示す。Ａ．ＣＭＶペプチドプールによる刺激により、より大きな比率の細胞によって発現されると考えられる遺伝子。Ｂ．細胞の一方のブランチに濃縮される遺伝子。これらの遺伝子は、ナイーブおよびセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞に関連することも公知である。Ｃ．細胞の他方のブランチに濃縮される遺伝子。これらの遺伝子は、エフェクターおよびエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞に関連することが公知である。Ｄ．グランザイムＫ発現細胞は、ＰＣ空間におけるナイーブ／セントラルメモリーおよびエフェクター／エフェクターメモリー細胞の間の領域を占有する。Ｅ．ＨＬＡ−ＤＲＡ発現細胞は、特殊なサブセットを構成する。Ｆ．細胞の両方のブランチにおいて発現される遺伝子。
【図５２−４】図５２は、データが、主成分空間においてプロットされることを示す。色は、特定の遺伝子のｌｏｇ（検出される特有の転写物分子の数）を示す。Ａ．ＣＭＶペプチドプールによる刺激により、より大きな比率の細胞によって発現されると考えられる遺伝子。Ｂ．細胞の一方のブランチに濃縮される遺伝子。これらの遺伝子は、ナイーブおよびセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞に関連することも公知である。Ｃ．細胞の他方のブランチに濃縮される遺伝子。これらの遺伝子は、エフェクターおよびエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞に関連することが公知である。Ｄ．グランザイムＫ発現細胞は、ＰＣ空間におけるナイーブ／セントラルメモリーおよびエフェクター／エフェクターメモリー細胞の間の領域を占有する。Ｅ．ＨＬＡ−ＤＲＡ発現細胞は、特殊なサブセットを構成する。Ｆ．細胞の両方のブランチにおいて発現される遺伝子。
【図５３】図５３は、データが、無刺激対照のデータを表すことを除いて図５０Ｂと同じ図を示す。ドナー１の試料における細胞のいずれもＩＦＮＧを発現しなかったが、ドナー２の試料における１個の細胞は、遺伝子パネル全体にわたり全体的に低い発現であったが（ランク１０６９）、ＩＦＮＧを発現した。色目盛は、刺激試料のそれぞれのグラフにマッチするように調整された。
【図５４】図５４は、ドナー１および２のＣＭＶ刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ガンマインターフェロン（ＩＦＮＧ）を発現する細胞における遺伝子パネルの不均質性発現を示すヒートマップを示す。ドナー２において検出される大部分の総転写物を保有する細胞も示す。この特定の細胞は、ＩＦＮＧを発現しないが、ＩＬ６、ＩＬ１ＢおよびＣＣＬ４を強く発現する。細胞および遺伝子を相関に基づく双方向性階層的クラスタリングにより順序付ける。細胞ＩＤは、遺伝子パネルの検出された転写物の総数におけるランクを指し、図５０のＰＣＡプロットにおいて示される。
【図５５】図５５は、増幅スキームを示す。第１のＰＣＲは、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プライマー１配列に対するプライマーを使用して、ビーズに付着させた分子を増幅する。第２のＰＣＲは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プライマー２配列に隣接するネステッド遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プライマー１配列に対するプライマーを使用して、第１のＰＣＲ産物を増幅する。第３のＰＣＲは、Ｐ５ならびにＰ７および試料指標を付加して、ＰＣＲ産物をＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリーとする。１５０ｂｐ×２配列決定は、リード１における細胞標識および分子の標識、リード２における遺伝子、ならびに指標１リードにおける試料指標を明らかにする。
【図５６】図５６は、試料由来の分子を分析するためのワークフローの模式図を描写する。
【図５７】図５７は、試料由来の分子を分析するためのワークフローの模式図を描写する。
【図５８】図５８Ａ〜図５８Ｂは、ＰＣＲ産物のアガロースゲルを描写する。
【図５９】図５９は、複数の遺伝子の配列決定リードのプロットを描写する。
【図６０−１】図６０Ａ〜図６０Ｄは、それぞれＬｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｈｒおよびＤａｐスパイクイン（ｓｐｉｋｅ−ｉｎ）対照に関する、検出される標識１種当たりの観察されるリード（ＲＰＬＤ）のプロットを描写する。図６０Ｅは、リード  対  入力のプロットを描写する。
【図６０−２】図６０Ａ〜図６０Ｄは、それぞれＬｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｈｒおよびＤａｐスパイクイン対照に関する、検出される標識１種当たりの観察されるリード（ＲＰＬＤ）のプロットを描写する。図６０Ｅは、リード  対  入力のプロットを描写する。
【図６０−３】図６０Ａ〜図６０Ｄは、それぞれＬｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｈｒおよびＤａｐスパイクイン対照に関する、検出される標識１種当たりの観察されるリード（ＲＰＬＤ）のプロットを描写する。図６０Ｅは、リード  対  入力のプロットを描写する。
【図６１】図６１は、様々な遺伝子に関する、検出される標識１種当たりの観察されるリード（ＲＰＬＤ）のプロットを描写する。
【図６２】図６２は、様々な遺伝子に関する、検出される標識１種当たりの観察されるリード（ＲＰＬＤ）のプロットを描写する。
【図６３】図６３は、様々な遺伝子に関する総リード（標識）  対  ｒｐｌｄのプロットを描写する。
【図６４】図６４は、未検出遺伝子のＲＰＫＭのプロットを描写する。
【図６５】図６５は、分子バーコードの合成のための模式図を描写する。
【図６６−１】図６６Ａ〜図６６Ｃは、分子バーコードの合成のための模式図を描写する。
【図６６−２】図６６Ａ〜図６６Ｃは、分子バーコードの合成のための模式図を描写する。
【図６７】図６７は、核酸を確率論的に標識するためのワークフローの模式図を示す。
【図６８】図６８は、核酸を確率論的に標識するためのワークフローの模式図である。
【図６９】図６９は、その中にマイクロウェルアレイ基材をクランプすることにより、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化／分子指標化実験を行うために試料および試薬をピペットで出し入れすることができる反応チャンバーまたはウェルを形成することができる機械的治具を説明する。上部：治具の上部および下部ならびにマイクロウェルアレイ基材と漏れ止め封着を形成するためのエラストマーガスケットを示す分解組立図。下部：治具の分解側面図。
【図７０】図７０は、マイクロウェルアレイ基材が治具内にクランプされると、２個の反応チャンバーまたはウェルを作製する機械的治具を説明する。
【図７１】図７１は、図６９および図７０に説明されている機械的治具による使用のためのエラストマー（例えば、ポリジメチルシロキサン）ガスケットの２例を説明する。エラストマーガスケットは、マイクロウェルアレイ基材に漏れ止め封着を提供して、マイクロウェルアレイの周りに試薬ウェルを作製する。ガスケットは、試薬ウェルを作製するための１個（上部）、２個（下部）またはそれを超える開口部を含有することができる。
【図７２】図７２は、その中にマイクロウェルアレイがパッケージされるカートリッジの一実施形態を描写する。左：（下から上に）マイクロウェルアレイ基材、フローセルまたはアレイチャンバーを画定するガスケット、予めロードされたアッセイ試薬を含有するまたは消費した試薬を貯蔵する区画を画定するための試薬および／または廃棄物リザーバー成分、ならびに該試薬および廃棄物リザーバーを封着し、試料入口および出口ポートを画定するためのカバーを説明するカートリッジの分解組立図。右：外部磁石をマイクロウェルアレイに極めて接近させるためのレリーフを説明するカートリッジ設計の一実施形態を組み立てた図。
【図７３】図７３は、パッケージされたマイクロウェルアレイと共に搭載型アッセイ試薬を含むように設計されたカートリッジの一実施形態を描写する。
【図７４】図７４は、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化／分子指標化アッセイを行うための機器システムの模式図説明を提供する。機器システムは、種々の制御および分析能力を提供することができ、個々のモジュールまたは完全に統合されたシステムとしてパッケージされ得る。マイクロウェルアレイは、システムの固定された成分であるもしくは着脱可能であるフローセルと統合することができる、または予めロードされたアッセイ試薬リザーバーおよび他の機能性をさらに含む着脱可能なカートリッジ内にパッケージされ得る。
【図７５】図７５は、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化／分子指標化アッセイを行うための自動システムによって行われるプロセスステップの一実施形態を説明する。
【図７６】図７６は、ここに開示されているアッセイシステムに機器制御およびデータ分析能力を提供するためのコンピュータシステムまたはプロセッサの一実施形態を説明する。
【図７７】図７７は、本開示のアッセイシステムの例としての実施形態に関連して使用され得るコンピュータシステムアーキテクチャの一例を説明するブロック図を示す。
【図７８】図７８は、本開示のアッセイシステムの例としての実施形態と共に使用され得る複数のコンピュータシステム、携帯電話、パーソナルデータアシスタントおよびネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）によるネットワークを示す図表を描写する。
【図７９】図７９は、本開示のアッセイシステムの例としての実施形態と共に使用され得るマルチプロセッサコンピュータシステムのブロック図を描写する。
【図８０】図８０は、被験試料の分析および該被験試料から得られる検査結果の通信媒体を介した通信の図表を描写する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
複数の試料における分子を分析するための方法、キットおよび組成物が本明細書に開示されている。一般に、方法、キットおよび組成物は、（ａ）２種またはそれを超える試料における分子を分子バーコードで確率論的に標識して、標識された分子を生成するステップと、（ｂ）標識された分子を検出するステップとを含む。分子バーコードは、１種または複数の標的特異的領域、標識領域、試料指標領域、ユニバーサルＰＣＲ領域、アダプター、リンカーまたはこれらの組合せを含み得る。標識された分子は、ａ）分子領域と、ｂ）試料指標領域と、ｃ）標識領域とを含み得る。分子領域は、それに本来は付着させていた分子バーコード由来の分子の少なくとも一部を含み得る。分子領域は、それに本来は付着させていた分子バーコード由来の分子の断片を含み得る。試料指標領域を使用して、分子領域の供給源を決定することができる。試料指標領域を使用して、その試料から、起源をもつ分子領域を決定することができる。試料指標領域を使用して、２種またはそれを超える異なる試料由来の分子領域を区別することができる。標識領域を使用して、同じ供給源に起源をもつ同一分子領域に、特有の同一性を付与することができる。標識領域を使用して、同じ試料に起源をもつ同一分子領域に、特有の同一性を付与することができる。
【００２１】
複数の試料における分子を分析するための方法は、ａ）ｉ）複数の核酸を含む第１の試料を複数の第１の試料タグと接触させて、複数の第１の試料タグが付いた核酸を生成し、ｉｉ）複数の核酸を含む第２の試料を複数の第２の試料タグと接触させて、複数の第２の試料タグが付いた核酸を生成することにより、複数の試料タグが付いた核酸を生成するステップであって、複数の第２の試料タグは、第１の試料タグとは異なるステップと、ｂ）複数の試料タグが付いた核酸を複数の分子識別子標識と接触させて、複数の標識された核酸を生成するステップと、ｃ）標識された核酸の少なくとも一部を検出し、これにより、複数の試料における複数の核酸の計数を決定するステップとを含み得る。複数の試料は、単一細胞を含み得る。
【００２２】
あるいは、複数の試料における分子を分析するための方法は、ａ）ｉ）第１の試料を第１の複数の試料タグと接触させるステップであって、第１の複数の試料タグが、同一核酸配列を含むステップと、ｉｉ）第１の試料を、異なる核酸配列を含み得る第１の複数の分子識別子標識と接触させるステップであって、第１の試料と第１の複数の試料タグまたは第１の複数の分子識別子標識との接触が、同時にまたは逐次的に起こって、複数の第１の標識された核酸を生成するステップと、ｉｉｉ）第２の試料を第２の複数の試料タグと接触させるステップであって、第２の複数の試料タグが、同一核酸配列を含み得るステップと、ｉｖ）第２の試料を、異なる核酸配列を含み得る第２の複数の分子識別子標識と接触させるステップであって、第２の試料と第２の複数の試料タグまたは第２の複数の分子識別子標識との接触が、同時にまたは逐次的に起こって、複数の第２の標識された核酸を生成するステップとを含む、複数の標識された核酸を生成するステップであって、複数の標識された核酸が、複数の第１の標識された核酸および第２の標識された核酸を含み得るステップと、ｂ）多数の異なる標識された核酸を決定し、これにより、複数の試料における複数の核酸の計数を決定するステップとを含み得る。
【００２３】
複数の試料における分子を分析するための方法は、ａ）２種またはそれを超える異なる核酸を含み得る複数の試料を、複数の試料タグおよび複数の分子識別子標識と接触させて、複数の標識された核酸を生成するステップであって、ｉ）複数の標識された核酸が、２種またはそれを超える試料タグおよび２種またはそれを超える分子識別子標識に付着させた２種またはそれを超える核酸を含み得、ｉｉ）複数の試料の第１の試料由来の核酸に付着させた試料タグが、複数の試料の第２の試料由来の核酸分子に付着させた試料タグとは異なり、ｉｉｉ）同じ試料における２種またはそれを超える同一核酸を、２種またはそれを超える異なる分子識別子標識に付着させるステップと、ｂ）標識された核酸の少なくとも一部を検出し、これにより、複数の試料における２種またはそれを超える異なる核酸の計数を決定するステップとを含み得る。
【００２４】
図５６は、試料におけるＲＮＡ分子の定量化のための例示的なワークフローを描写する。図５６のステップ１に示す通り、ＲＮＡ分子のポリＡテイル領域への分子識別子標識（１１５）のセットの確率論的ハイブリダイゼーションにより、ＲＮＡ分子（１１０）を逆転写してｃＤＮＡ分子（１０５）を生成することができる。分子識別子標識（１１５）は、オリゴｄＴ領域（１２０）、標識領域（１２５）およびユニバーサルＰＣＲ領域（１３０）を含み得る。分子識別子標識のセットは、９６０種の異なる種類の標識領域を含有することができる。図５６のステップ２に示す通り、標識されたｃＤＮＡ分子（１７０）を精製して、過剰な分子識別子標識（１１５）を除去することができる。精製は、Ａｍｐｕｒｅビーズ精製を含み得る。図５６のステップ３に示す通り、標識されたｃＤＮＡ分子（１７０）を増幅して、標識されたアンプリコン（１８０）を生成することができる。増幅は、マルチプレックスＰＣＲ増幅を含み得る。増幅は、単一の反応容積における９６種のマルチプレックスプライマーによるマルチプレックスＰＣＲ増幅を含み得る。増幅は、カスタム（ｃｕｓｔｏｍ）プライマー（１３５）およびユニバーサルプライマー（１４０）を含み得る。カスタムプライマー（１３５）は、標識されたｃＤＮＡ分子（１７０）のｃＤＮＡ（１０５）部分内の領域にハイブリダイズすることができる。ユニバーサルプライマー（１４０）は、標識されたｃＤＮＡ分子（１７０）のユニバーサルＰＣＲ領域（１３０）にハイブリダイズすることができる。ステップ４に示す通り、標識されたアンプリコン（１８０）は、ネステッドＰＣＲによりさらに増幅することができる。ネステッドＰＣＲは、単一の反応容積における９６種のマルチプレックスプライマーによるマルチプレックスＰＣＲを含み得る。ネステッドＰＣＲは、カスタムプライマー（１４５）およびユニバーサルプライマー（１４０）を含み得る。カスタムプライマー（１３５）は、標識されたアンプリコン（１８０）のｃＤＮＡ（１０５）部分内の領域にハイブリダイズすることができる。ユニバーサルプライマー（１４０）は、標識されたアンプリコン（１８０）のユニバーサルＰＣＲ領域（１３０）にハイブリダイズすることができる。ステップ５に示す通り、１種または複数のアダプター（１５０、１５５）は、標識されたアンプリコン（１８０）に付着させて、アダプターで標識されたアンプリコン（１９０）を生成することができる。１種または複数のアダプターは、ライゲーションにより標識されたアンプリコン（１８０）に付着させることができる。ステップ６に示す通り、１種または複数のアダプター（１５０、１５５）を使用して、アダプターで標識されたアンプリコン（１９０）において１種または複数の追加的なアッセイを実行することができる。１種または複数のアダプター（１５０、１５５）は、１種または複数のプライマー（１６０、１６５）にハイブリダイズすることができる。１種または複数のプライマー（１６０、１６５）は、ＰＣＲ増幅プライマーとなり得る。１種または複数のプライマー（１６０、１６５）は、配列決定プライマーとなり得る。１種または複数のアダプター（１５０、１５５）は、アダプターで標識されたアンプリコンのさらなる増幅のために使用することができる。１種または複数のアダプター（１５０、１５５）は、アダプターで標識されたアンプリコンを配列決定するために使用することができる。
【００２５】
図５７は、２種またはそれを超える試料由来の核酸を分析するためのワークフローの例示的な模式図を描写する。図５７に示す通り、２種またはそれを超える試料由来の核酸を分析するための方法は、分析のための２種またはそれを超える遺伝子を選択するステップと、選択された遺伝子（２１０）に基づきカスタムプライマーを設計するステップとを含み得る。方法は、核酸（例えば、ＲＮＡ）を含む１種または複数の試料に、１種または複数のスパイクイン対照（２２０）を補充するステップをさらに含み得る。試料における核酸は、分子バーコード（または試料タグまたは分子識別子標識）およびカスタムプライマーによるマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ（２３０）により増幅して、標識されたアンプリコンを生成することができる。標識されたアンプリコンを１種または複数の配列決定アダプターでさらに処理して、アダプターで標識されたアンプリコン（２４０）を生成することができる。アダプターで標識されたアンプリコンを分析することができる（２５０）。図５７に示す通り、標識されたアンプリコン（２５０）の分析は、（１）ユニバーサルＰＣＲプライマーｓｅｑ、ポリＡおよび／または分子バーコード（または試料タグ、分子識別子標識）の検出、（２）アダプターおよび／またはバーコード（例えば、分子バーコード、試料タグ、分子識別子標識）に付着させていないアダプターで標識されたアンプリコン（例えば、９６種の遺伝子およびスパイクイン対照）の末端におけるマップリード、ならびに（３）異なるアダプターで標識されたアンプリコンの数の計数および／または要約のうち１種または複数を含み得る。
【００２６】
図６７は、分子バーコード（１２２０）で核酸を確率論的に標識するためのワークフローの模式図を示す。図６７のステップ１に示す通り、ＲＮＡ分子は、分子バーコード（１２２０）のセットで確率論的に標識することができる。分子バーコード（１２２０）は、標的結合領域（１２２１）、標識領域（１２２２）、試料指標領域（１２２３）およびユニバーサルＰＣＲ領域（１２２４）を含み得る。場合によっては、標的結合領域は、ＲＮＡ分子におけるポリＡ配列にハイブリダイズするオリゴｄＴ配列を含む。標識領域（１２２２）は、２種またはそれを超える異なる分子バーコードの識別に使用することができる特有の配列を含有することができる。分子バーコードが、ＲＮＡ分子にハイブリダイズする際に、標識領域を使用して、同一ＲＮＡ分子に特有の同一性を付与することができる。試料指標領域（１２２３）は、分子バーコードのセットに対し同一となり得る。試料指標領域（１２２３）を使用して、異なる試料から標識された核酸を識別することができる。ユニバーサルＰＣＲ領域（１２２４）は、標識された分子の増幅のためのプライマー結合部位として機能することができる。ＲＮＡ分子が、分子バーコードで標識されると、ＲＮＡ分子を逆転写して、ＲＮＡ分子のｃＤＮＡコピー（１２１０）および分子バーコード（１２２０）を含有する標識されたｃＤＮＡ分子（１２３０）を生成することができる。
【００２７】
図６７のステップ２に示す通り、過剰なオリゴ（例えば、分子バーコード）は、Ａｍｐｕｒｅビーズ精製により除去することができる。図６７のステップ３に示す通り、標識されたｃＤＮＡ分子は、マルチプレックスＰＣＲにより増幅することができる。標識されたｃＤＮＡ分子のマルチプレックスＰＣＲは、単一の反応容積においてフォワードプライマー（Ｆ１、図６７における１２３５）およびユニバーサルプライマー（１２４０）の第１のセットを使用して、標識されたアンプリコン（１２４５）を生成することにより行うことができる。図６７のステップ４に示す通り、標識されたアンプリコンは、ネステッドプライマーを使用したマルチプレックスＰＣＲによりさらに増幅することができる。標識されたアンプリコンのネステッドプライマー増幅は、単一の反応容積においてフォワードプライマー（Ｆ２、図６７における１２５０）およびユニバーサルプライマー（１２４０）の第２のセットを使用して、標識されたネステッドＰＣＲアンプリコンを生成することにより行うことができる。場合によっては、Ｆ２プライマー（１２５０）は、アダプター（１２５１）および標的結合領域（１２５２）を含有する。Ｆ２プライマーの標的結合領域（１２５２）は、標識されたアンプリコンにハイブリダイズすることができ、標識されたアンプリコンの増幅をプライミングする（ｐｒｉｍｅ）ことができる。ネステッドＰＣＲアンプリコンのアダプター（１２５１）およびユニバーサルＰＣＲ領域（１２２４）は、標識されたネステッドＰＣＲアンプリコンの配列決定において使用することができる。アンプリコンは、ＭｉＳｅｑにより配列決定することができる。あるいは、アンプリコンは、ＨｉＳｅｑにより配列決定することができる。
【００２８】
図６８は、核酸を確率論的に標識するためのワークフローの模式図を示す。図６８のステップ１に示す通り、ＲＮＡ分子（１３０５）は、分子バーコード（１３２０）のセットで確率論的に標識することができる。分子バーコードは、標的結合領域（１３２１）、標識領域（１３２２）およびユニバーサルＰＣＲ領域（１３２３）を含み得る。分子バーコードを、ＲＮＡ分子に付着させると、ＲＮＡ分子（１３０５）を逆転写して、ＲＮＡ分子のｃＤＮＡコピー（１３１０）および分子バーコード（１３２０）を含む標識されたｃＤＮＡ分子（１３２５）を生成することができる。図６８のステップ２に示す通り、標識されたｃＤＮＡ分子は、Ａｍｐｕｒｅビーズ精製により精製して、過剰なオリゴ（例えば、分子バーコード）を除去することができる。図６８のステップ３に示す通り、標識されたアンプリコンは、マルチプレックスＰＣＲにより増幅することができる。標識されたｃＤＮＡ分子のマルチプレックスＰＣＲは、単一の反応容積においてフォワードプライマー（Ｆ１、図６８における１３３０）およびユニバーサルプライマー（１３３５）の第１のセットを使用して、標識されたアンプリコン（１３６０）を生成することにより行うことができる。図６７のステップ４に示す通り、標識されたアンプリコンは、ネステッドプライマーを使用してマルチプレックスＰＣＲによりさらに増幅することができる。標識されたアンプリコンのネステッドプライマー増幅は、単一の反応容積においてフォワードプライマー（Ｆ２、図６８における１３４０）および試料指標プライマー（１３５０）の第２のセットを使用して、標識されたネステッドＰＣＲアンプリコンを生成することにより行うことができる。場合によっては、Ｆ２プライマー（１３４０）は、アダプター（１３４１）および標的結合領域（１３４２）を含有する。Ｆ２プライマーの標的結合領域（１３４２）は、標識されたアンプリコンにハイブリダイズすることができ、標識されたアンプリコンの増幅をプライミングすることができる。試料指標プライマー（１３５０）は、ユニバーサルプライマー領域（１３５１）、試料指標領域（１３５２）およびアダプター領域（１３５３）を含み得る。図６８のステップ４に示す通り、試料指標プライマーのユニバーサルプライマー領域（１３５１）は、標識されたアンプリコンのユニバーサルＰＣＲ領域にハイブリダイズすることができる。試料指標プライマーの試料指標領域（１３５２）を使用して、２種またはそれを超える試料を識別することができる。アダプター領域（１３４１、１３５３）を使用して、標識されたネステッドＰＣＲアンプリコンを配列決定することができる。アンプリコンは、ＭｉＳｅｑにより配列決定することができる。あるいは、アンプリコンは、ＨｉＳｅｑにより配列決定することができる。
【００２９】
１種または複数のライブラリーを生成する方法が本明細書にさらに開示されている。１種または複数のライブラリーは、複数の標識された分子を含み得る。１種または複数のライブラリーは、複数の標識されたアンプリコンを含み得る。１種または複数のライブラリーは、複数の濃縮された分子またはその誘導体（例えば、標識された分子、標識されたアンプリコン）を含み得る。一般に、１種または複数のライブラリーを生成する方法は、（ａ）２種またはそれを超える試料由来の複数の分子を確率論的に標識して、複数の標識された分子を生成するステップであって、標識された分子が、分子領域、試料指標領域および標識領域を含むステップと、（ｂ）複数の標識された分子から１種または複数のライブラリーを生成するステップであって、（ｉ）１種または複数のライブラリーが、２種またはそれを超える異なる標識された分子を含み、（ｉｉ）２種またはそれを超える異なる標識された分子が、分子領域、試料指標領域、標識領域またはこれらの組合せによって異なる、ステップとを含む。
【００３０】
１種または複数のライブラリーを生成するための方法は、ａ）ｉ）複数の核酸を含む第１の試料を複数の第１の試料タグと接触させて、複数の第１の試料タグが付いた核酸を生成し、ｉｉ）複数の核酸を含む第２の試料を複数の第２の試料タグと接触させて、複数の第２の試料タグが付いた核酸を生成することにより、複数の試料タグが付いた核酸を生成するステップであって、複数の第１の試料タグが、第２の試料タグとは異なるステップと、ｂ）複数の試料タグが付いた核酸を複数の分子識別子標識と接触させて、複数の標識された核酸を生成し、これにより、標識された核酸ライブラリーを生成するステップとを含み得る。
【００３１】
試料への接触は、ランダムまたは非ランダムとなり得る。例えば、試料タグと試料との接触は、ランダムまたは非ランダム接触となり得る。一部の実施形態では、試料は、試料タグとランダムに接触される。一部の実施形態では、試料は、試料タグと非ランダムに接触される。複数の核酸への接触は、ランダムまたは非ランダムとなり得る。例えば、試料タグと複数の核酸との接触は、ランダムまたは非ランダム接触となり得る。一部の実施形態では、複数の核酸は、試料タグとランダムに接触される。一部の実施形態では、複数の核酸は、試料タグと非ランダムに接触される。
【００３２】
標識されたビーズの１または複数のセットを生成する方法が本明細書にさらに開示されている。標識されたビーズの１または複数のセットを生成する方法は、１個または複数のビーズに１種または複数の核酸を付着させ、これにより、標識されたビーズの１または複数のセットを生成するステップを含み得る。１種または複数の核酸は、１種または複数の分子バーコードを含み得る。１種または複数の核酸は、１種または複数の試料タグを含み得る。１種または複数の核酸は、１種または複数の分子識別子標識を含み得る。１種または複数の核酸は、ａ）プライマー領域；ｂ）試料指標領域；およびｃ）リンカーまたはアダプター領域を含み得る。１種または複数の核酸は、ａ）プライマー領域；ｂ）標識領域；およびｃ）リンカーまたはアダプター領域を含み得る。１種または複数の核酸は、ａ）試料指標領域；およびｂ）標識領域を含み得る。１種または複数の核酸は、プライマー領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、標的特異的領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、リンカー領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、アダプター領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、試料指標領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、標識領域をさらに含み得る。
【００３３】
１種または複数のカスタムプライマーを選択するための方法が本明細書にさらに開示されている。複数の試料における分子を分析するためにカスタムプライマーを選択する方法は、ａ）選ばれたプライマーが、ｉ）３個以下の逐次的グアニン、３個以下の逐次的シトシン、４個以下の逐次的アデニンおよび４個以下の逐次的チミン、ｉｉ）グアニンまたはシトシンである少なくとも３、４、５または６個のヌクレオチド、ならびにｉｉｉ）ヘアピン構造を容易に形成しない配列を含み得る、第１のパスと、ｂ）ｉ）全転写物の高い被覆度（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を有する複数の配列を選ぶ第１のラウンド、ならびにｉｉ）残る転写物の最高被覆度および４以下の他の選ばれた配列との相補的スコアを有する配列を選択する１回または複数の後続ラウンドを含む第２のパスと、ｃ）被覆度が飽和するまたはカスタマープライマーの総数が約９６未満もしくはそれに等しくなるまで、選定されたセットへの配列の付加とを含み得る。
【００３４】
２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子の分析における使用のためのキットが本明細書にさらに開示されている。キットは、（ａ）（ｉ）分子バーコードの第１のセットの分子バーコードが、試料指標領域および標識領域を含み、（ｉｉ）分子バーコードの第１のセットの２種またはそれを超えるバーコードの試料指標領域が同じであり、（ｉｉｉ）分子バーコードの第１のセットの２種またはそれを超えるバーコードの標識領域が異なる分子バーコードの第１のセットを含む第１の容器と、（ｂ）（ｉ）分子バーコードの第２のセットの分子バーコードが、試料指標領域および標識領域を含み、（ｉｉ）分子バーコードの第２のセットの２種またはそれを超えるバーコードの試料指標領域が同じであり、（ｉｉｉ）分子バーコードの第２のセットの２種またはそれを超えるバーコードの標識領域が異なり、（ｉｖ）分子バーコードの第２のセットのバーコードの試料指標領域が、分子バーコードの第１のセットのバーコードの試料指標領域とは異なり、（ｖ）分子バーコードの第２のセットの２種またはそれを超えるバーコードの標識領域が、分子バーコードの第１のセットの２種またはそれを超えるバーコードの標識領域と同一である、分子バーコードの第２のセットを含む第２の容器とを含み得る。
【００３５】
あるいは、キットは、ａ）複数のビーズのうち１個または複数のビーズが、複数の核酸のうち少なくとも１種を含み得、複数の核酸のうち少なくとも１種が、ｉ）複数の核酸のうち少なくとも１種のプライマー配列が、複数のビーズに対し同じである、少なくとも１種のプライマー配列と、ｉｉ）複数の核酸のうちいずれか１種のビーズ特異的配列が同じであり、ビーズ特異的配列が、複数のビーズのうちいずれか１個に対し異なる、ビーズ特異的配列と、ｉｉｉ）複数の核酸のうちいずれか１種に対し異なる、確率論的配列とを含み得る、複数のビーズと、ｂ）プライマー配列に相補的な配列を含み得るプライマーと、ｃ）核酸増幅に適した１種または複数の増幅剤とを含む。
【００３６】
あるいは、キットは、ａ）（ｉ）試料タグの第１のセットの試料タグが、試料指標領域を含み、（ｉｉ）試料タグの第１のセットの試料タグの試料指標領域が、少なくとも約８０％同一である、試料タグの第１のセットを含む第１の容器と、ｂ）（ｉ）分子識別子標識の第１のセットの分子識別子標識が、標識領域を含み、（ｉｉ）分子識別子標識の第１のセットの総分子識別子標識の標識領域の少なくとも約３０％が異なる、分子識別子標識の第１のセットを含む第２の容器とを含む。
【００３７】
本方法、キットおよび組成物をより詳細に記載する前に、記載されている特定の方法、キットまたは組成物は当然ながら変動することから、本発明が、そのようなものに限定されないことを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用されている用語法は、単に特定の実施形態を記載することが目的であり、限定を目的としていないことも理解されたい。例は、本発明を作製および使用する仕方の完全な開示および記載を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが自分の発明として考慮するものの範囲を限定することを目的とせず、後述する実験が、行われた全てまたは唯一の実験であることを表すことも目的としない。使用された数値（例えば、量、温度等）に関する精度を保証する試みが為されたが、ある程度の実験誤差および偏差が説明されるべきである。他に断りがなければ、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度はセ氏温度で表され、圧力は大気圧またはその付近である。
【００３８】
複数の試料または複合的核酸調製物における核酸の確率論的標識化のための方法、キットおよび組成物が提供される。このような方法、キットおよび組成物は、細胞応答、分化またはシグナル伝達の機構の解明、および多種多様な臨床測定の実行における使用が見出される。より完全に後述されている方法、キットおよび組成物の詳細を読むことにより、本発明の上述および他の目標、利点および特色は、当業者に明らかとなるであろう。
【００３９】
本明細書に開示されている方法は、１種または複数の分子バーコード、試料タグおよび／または分子識別子標識を、２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子に付着させるステップを含む。分子バーコード、試料タグおよび／または分子識別子標識は、１種または複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。場合によっては、分子への分子バーコード、試料タグおよび／または分子識別子標識の付着は、分子の確率論的標識化を含む。分子を確率論的に標識するための方法は、例えば、米国特許出願第１２／９６９，５８１号および同第１３／３２７，５２６号に見出すことができる。一般に、確率論的標識化方法は、１種または複数の分子への複数のタグおよび標識オリゴヌクレオチドのランダムな付着を含む。分子バーコード、試料タグおよび／または分子識別子標識は、標識しようとする１種または複数の分子を超過して提供される。確率論的標識化において、標識しようとする個々の分子はそれぞれ、複数の分子バーコード、試料タグおよび／または分子識別子標識に付着する個々の確率を有する。標識しようとする個々の分子それぞれが特定の分子バーコード、試料タグおよび／または分子識別子標識に付着する確率は、標識しようとする他のいずれかの個々の分子とほぼ同じものとなり得る。したがって、場合によっては、試料における分子のいずれがタグおよび標識のいずれかを見出す確率も等しいと仮定され、これは試料における分子の数を推定する数学的計算において使用することができる仮定である。一部の状況では、付着する確率は、例えば、該分子バーコード、試料タグおよび／または分子識別子標識と個々の分子との結合効率を増加または減少し得る異なる特性を有するタグおよび標識を選出することにより操作することができる。タグおよび標識は、数が変動されて、特定の分子バーコード、試料タグおよび／または分子識別子標識が、確率論的標識化の際に結合パートナーを見出す確率を変更することができる。例えば、ある一標識は、標識のプールにおいて大きな比率を占め、これにより、この大きな比率を占めた標識は、少なくとも１個の結合パートナーを見出す機会を増加させる。
【００４０】
本明細書に開示されている方法は、２種またはそれを超える試料を組み合わせるステップをさらに含み得る。本明細書に開示されている方法は、２種またはそれを超える試料由来の１種または複数の分子を組み合わせるステップをさらに含み得る。例えば、本明細書に開示されている方法は、第１の試料および第２の試料を組み合わせるステップを含む。２種またはそれを超える試料は、１種または複数の確率論的標識化手順を実行した後に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子に分子バーコードの１または複数のセットを付着させた後に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子に試料タグの１または複数のセットを付着させた後に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子に分子識別子標識の１または複数のセットを付着させた後に組み合わせることができる。例えば、第１および第２の試料は、複数の分子識別子標識との接触前に組み合わされる。
【００４１】
あるいは、２種またはそれを超える試料は、１種または複数の確率論的標識化手順を実行する前に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子に分子バーコードの１または複数のセットを付着させる前に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子に試料タグの１または複数のセットを付着させる前に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子に分子識別子標識の１または複数のセットを付着させる前に組み合わせることができる。
【００４２】
２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子またはその誘導体（例えば、標識された分子、アンプリコン）において１種または複数のアッセイを実行した後に組み合わせることができる。１種または複数のアッセイは、１種または複数の増幅反応を含み得る。１種または複数のアッセイは、１種または複数の濃縮アッセイを含み得る。１種または複数のアッセイは、１種または複数の検出アッセイを含み得る。例えば、第１および第２の試料は、標識された核酸を検出した後に組み合わされる。
【００４３】
２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子またはその誘導体（例えば、標識された分子、アンプリコン）において１種または複数のアッセイを実行する前に組み合わせることができる。１種または複数のアッセイは、１種または複数の増幅反応を含み得る。１種または複数のアッセイは、１種または複数の濃縮アッセイを含み得る。１種または複数のアッセイは、１種または複数の検出アッセイを含み得る。例えば、第１および第２の試料は、標識された核酸を検出する前に組み合わされる。
【００４４】
支持体
本開示は、単一細胞からのマルチプレックス配列分析のための組成物および方法を含む。本開示の方法および組成物は、固体支持体の使用を提供する。場合によっては、本明細書に開示されている方法、キットおよび組成物は、支持体を含む。
【００４５】
用語「支持体」、「固体支持体」、「半固体支持体」および「基材」は、互換的に使用することができ、硬質または半硬質表面（単数または複数）を有する材料または材料群を指すことができる。支持体は、溶液から溶液へと移動可能である、またはオリゴヌクレオチドに基づくアッセイを実行するための構造を形成するいずれかの表面を指すことができる。支持体または基材は、固体支持体となり得る。あるいは、支持体は、非固体支持体である。支持体は、不溶性、半可溶性または不溶性材料を指すことができる。支持体は、そこにリンカー、足場、構成要素または他の反応性部分が付着している場合、「官能化されている（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）」と称され得るが、一方、固体支持体は、そこにかかる反応性部分を付着させていない場合、「非官能化」状態となり得る。支持体は、マイクロタイターウェルフォーマット等、溶液において遊離させて；カラム等、フロースルーフォーマットにおいて；またはディップスティックにおいて用いることができる。
【００４６】
支持体または基材は、膜、紙、プラスチック、コーティングされた表面、平坦な表面、ガラス、スライド、チップまたはこれらのいずれかの組合せを含み得る。多くの実施形態では、支持体の少なくとも一表面は、実質的に平坦となり得るが、一部の実施形態では、例えば、ウェル、隆起した領域、ピン、エッチングされた溝その他により、異なる化合物に対し合成領域を物理的に分けることが望ましくなり得る。他の実施形態によれば、固体支持体（複数可）は、樹脂、ゲル、マイクロスフェアまたは他の幾何的構成の形を採ることができる。あるいは、固体支持体（複数可）は、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子、プレートおよびアレイを含む。固体支持体は、ビーズ（例えば、シリカゲル、制御されたポアガラス、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｗａｎｇ樹脂；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂、セファデックス／セファロースビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ等）、キャピラリー、ガラス繊維フィルター等の平坦な支持体、ガラス表面、金属表面（鋼、金、銀、アルミニウム、シリコンおよび銅）、ガラス支持体、プラスチック支持体、シリコン支持体、チップ、フィルター、膜、マイクロウェルプレート、スライドその他を含み得、マルチウェルプレートもしくは膜を含むプラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリフッ化ビニリデンでできた）、ウエハ、コーム、ピンもしくは針（例えば、コンビナトリアル合成または分析に適したピンのアレイ）またはウエハ（例えば、シリコンウエハ）等の平坦な表面のピットもしくはナノリットルウェルのアレイにおけるビーズ、フィルター底部ありもしくはなしのピットを有するウエハを含み得る。
【００４７】
ポリマー（タンパク質を含む）アレイ合成に適用可能な方法および技法は、全てここに参照によりそれらの内容全体をあらゆる目的のために援用する、米国特許公開第２００５００７４７８７号、ＷＯ００／５８５１６、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，２４２，９７４号、同第５，２５２，７４３号、同第５，３２４，６３３号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４５１，６８３号、同第５，４８２，８６７号、同第５，４９１，０７４号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５５０，２１５号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６３１，７３４号、同第５，７９５，７１６号、同第５，８３１，０７０号、同第５，８３７，８３２号、同第５，８５６，１０１号、同第５，８５８，６５９号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９６８，７４０号、同第５，９７４，１６４号、同第５，９８１，１８５号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１３６，２６９号、同第６，２６９，８４６号および同第６，４２８，７５２号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／３６７６０およびＷＯ０１／５８５９３に記載されている。特異的な実施形態における合成技法について記載する特許は、米国特許第５，４１２，０８７号、同第６，１４７，２０５号、同第６，２６２，２１６号、同第６，３１０，１８９号、同第５，８８９，１６５号および同第５，９５９，０９８号を含む。核酸アレイは、上述の特許の多くに記載されているが、同技法の多くは、ポリペプチドアレイに適用することができる。追加的な例示的な基材は、米国特許第５，７４４，３０５号ならびに米国特許公開第２００９０１４９３４０号および同第２００８００３８５５９号に開示されている。
【００４８】
支持体への標識された核酸の付着は、アミン−チオール架橋、マレイミド架橋、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、ＺｅｎｏｎまたはＳｉｔｅＣｌｉｃｋを含み得る。支持体への標識された核酸の付着は、複数の標識された核酸へのビオチンの付着と、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ）による１個または複数のビーズのコーティングを含み得る。
【００４９】
場合によっては、固体支持体は、分子足場を含み得る。例示的な分子足場は、抗体、抗原、親和性試薬、ポリペプチド、核酸、細胞小器官その他を含み得る。分子足場は、一体に連結することができる（例えば、固体支持体は、複数の接続された分子足場を含み得る）。分子足場は、アミノ酸リンカー、核酸リンカー、小分子連結（例えば、ビオチンおよびアビジン）および／またはマトリクス連結（例えば、ＰＥＧまたはグリセロール）により一体に連結することができる。連結は、非共有結合となり得る。連結は、共有結合となり得る。場合によっては、分子足場は、連結されていない場合もある。本開示の方法において、複数の個々の分子足場を使用することができる。
【００５０】
場合によっては、支持体は、ナノ粒子を含み得る。ナノ粒子は、ニッケル、金、銀、炭素、銅、シリケート（ｓｉｌｉｃａｔｅ）、コバルト白金、酸化亜鉛、二酸化ケイ素結晶および／または銀ナノ粒子となり得る。それに代えてまたはそれに加えて、ナノ粒子は、多孔性酸化マンガンに包埋された金ナノ粒子となり得る。ナノ粒子は、鉄ナノ粒子となり得る。ナノ粒子は、炭素のナノ粒子を散りばめたナノテトラポッドとなり得る。
【００５１】
支持体は、ポリマーを含み得る。ポリマーは、マトリクスを含み得る。マトリクスは、１個または複数のビーズをさらに含み得る。ポリマーは、ＰＥＧ、グリセロール、多糖またはこれらの組合せを含み得る。ポリマーは、プラスチック、ゴム、ナイロン、シリコーン、ネオプレンおよび／またはポリスチレンとなり得る。ポリマーは、天然ポリマーとなり得る。天然ポリマーの例として、セラック、琥珀、羊毛、絹、セルロースおよび天然ゴムが挙げられるがこれらに限定されない。ポリマーは、合成ポリマーとなり得る。合成ポリマーの例として、合成ゴム、フェノールホルムアルデヒド樹脂（またはＢａｋｅｌｉｔｅ）、ネオプレン、ナイロン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣまたはビニル）、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ＰＶＢおよびシリコーンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５２】
支持体は、半固体支持体となり得る。支持体は、ゲル（例えば、ヒドロゲル）を含み得る。用語「ヒドロゲル」、「ゲル」その他は、本明細書において互換的に使用され、易流動性液体ではなく、固体でもないが、重量で０．５％またはそれを超え、好ましくは４０％未満のゲル形成溶質材料および９５％またはそれに満たず、好ましくは５５％を超える水で構成されるゲルである材料を指すことができる。本発明のゲルは、好ましくは合成溶質であり（ただし、例えばゼラチン形成のために天然溶質となり得る）、水に結合、捕捉、吸収および／または他の仕方で保持し、これにより、結合および非結合水を含む水と組み合わせたゲルを作製する相互接続されたセルを形成する溶質の使用によって形成することができる。ゲルは、本発明のヒドロゲルパッチの基礎構造となることができ、酵素および塩等、ゲル形成溶質材料および水を越えた追加的な成分を含み、このような成分は、本明細書にさらに記載されている。ゲルは、ポリマーゲルとなり得る。
【００５３】
固体支持体は、構造化されたナノ構造を含み得る。例えば、構造化されたナノ構造は、細胞および／または細胞の内容物を捕捉するためのオリゴヌクレオチドを含み得る捕捉容器（例えば、小型化されたハニカム）を含み得る。場合によっては、構造化されたナノ構造は、外因性試薬の添加を必要としない場合もある。
【００５４】
場合によっては、支持体は、ビーズを含む。ビーズは、核酸を固定化し得る（例えば、共有結合または非共有結合により）プラスチック、セラミック、金属またはポリマー材料で構成された固体または中空の球、ボール、ベアリング、シリンダーまたは他の同様の構成のいずれかの種類を包含することができる。ビーズは、ナイロン弦（単数または複数）を含み得る。ビーズは、球状の形状となり得る。ビーズは、非球状の形状となり得る。ビーズは研磨加工されていなくてよい、または研磨加工されている場合、研磨加工されたビーズは、処理前（例えば、アルキル化剤による）に粗面化されていてよい。ビーズは、球状（例えば、マイクロスフェア）となり得るまたは不規則な形状を有し得る別々の粒子を含み得る。ビーズは、常磁性材料、セラミック、プラスチック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロンその他等が挙げられるがこれらに限定されない、種々の材料を含み得る。ビーズは、１種または複数の支持体に付着させるまたはその中に包埋することができる。ビーズは、ゲルまたはヒドロゲルに付着させることができる。ビーズは、ゲルまたはヒドロゲルの中に包埋することができる。ビーズは、マトリクスに付着させることができる。ビーズは、マトリクスの中に包埋することができる。ビーズは、ポリマーに付着させることができる。ビーズは、ポリマーの中に包埋することができる。支持体（例えば、ゲル、マトリクス、足場またはポリマー）内におけるビーズの空間的ポジションは、位置アドレスとして機能するビーズに存在するオリゴヌクレオチドを使用して同定することができる。ビーズの例として、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体がコンジュゲートしたビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡがコンジュゲートしたビーズ、プロテインＧがコンジュゲートしたビーズ、プロテインＡ／Ｇがコンジュゲートしたビーズ、プロテインＬがコンジュゲートしたビーズ、オリゴｄＴがコンジュゲートしたビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズおよびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシ末端の磁性ビーズが挙げられるがこれらに限定されない。ビーズの直径は、約５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍまたは５０μｍとなり得る。ビーズは、ＤＮＡおよびＲＮＡ等、生物学的粒子および高分子の固定化のための表面積増加をもたらし得るいずれかの三次元構造を指すことができる。
【００５５】
支持体は、多孔性となり得る。支持体は、透過性または半透性となり得る。支持体は、固体となり得る。支持体は、半固体となり得る。支持体は、可鍛性となり得る。支持体は、可撓性となり得る。場合によっては、支持体は、ある形状に成形することができる。例えば、支持体を物体の上に置くことができ、この支持体は、この物体の形状を採ることができる。場合によっては、支持体は、臓器の上に置かれ、臓器の形状を採る。場合によっては、支持体は、３Ｄ印刷により生成される。
【００５６】
支持体（例えば、ビーズ、ナノ粒子）は、少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、１００、５００、１０００もしくは２０００マイクロメートルまたはそれを超える直径となり得る。固体支持体（例えば、ビーズ）は、最大でも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、１００、５００、１０００もしくは２０００マイクロメートルまたはそれを超える直径となり得る。ビーズの直径は、約２０ミクロンとなり得る。
【００５７】
場合によっては、固体支持体は、デンドリマーを含む。デンドリマーは、ビーズよりも小さくなることができる。デンドリマーは、細胞未満（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）となり得る。デンドリマーは、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１ミクロン未満の直径となり得る。デンドリマーは、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３または０．０１ミクロン未満の直径となり得る。デンドリマーは、３種の主要な部分、コア、内殻および外殻を含み得る。デンドリマーは、これらの部分のそれぞれにおいて異なる機能性を有するように合成することができる。デンドリマーの部分の異なる機能性は、特定の適用のための溶解性、熱安定性および化合物の付着等、特性を制御することができる。デンドリマーは、合成により加工することができる。デンドリマーは、分岐的合成（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）により合成することができる。分岐的合成は、一連の反応によって外向きに伸長される多機能性コアからデンドリマーを組み立てることを含み得る。分岐的合成は、一連のマイケル反応を含み得る。あるいは、デンドリマーは、収束的合成により合成することができる。収束的合成は、最終的に球の表面となる小分子からのデンドリマーの建設を含み得、反応は、内向きに進むことができ、コアに最終的に付着する。デンドリマーは、クリックケミストリーにより調製することもできる。クリックケミストリーは、ディールス・アルダー反応、チオール−イン反応、アジド−アルキン反応またはこれらの組合せを含み得る。デンドリマーの例として、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ＰＥＧ−コアデンドリマー（ｄｅｎｄｅｒｉｍｅｒ）、亜リン酸デンドリマー、ポリプロピレンイミンデンドリマーおよびポリリシンデンドリマーが挙げられるがこれらに限定されない。デンドリマーは、キラルデンドリマーとなり得る。あるいは、デンドリマーは、アキラルデンドリマーとなり得る。
【００５８】
固体支持体は、デンドリマーの一部を含み得る。デンドリマーの部分は、デンドロンを含み得る。デンドロンは、焦点において複数の末端基および単一の反応官能基を有する単分散楔型デンドリマーセクションを含み得る。固体支持体は、ポリエステルデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｍ）を含み得る。デンドロンの例として、ポリエステル−８−ヒドロキシル−１−アセチレンビス−ＭＰＡデンドロン、ポリエステル−１６−ヒドロキシル−１−アセチレンビス−ＭＰＡデンドロン、ポリエステル−３２−ヒドロキシル−１−アセチレンビス−ＭＰＡデンドロン、ポリエステル−８−ヒドロキシル−１−カルボキシルビス−ＭＰＡデンドロン、ポリエステル−１６−ヒドロキシル−１−カルボキシルビス−ＭＰＡデンドロンおよびポリエステル−３２−ヒドロキシル−１−カルボキシルビス−ＭＰＡデンドロンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
固体支持体は、超分岐ポリマー（ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）を含み得る。超分岐ポリマーは、デンドリマー様特性を保持する多分散樹状高分子を含み得る。多くの場合、超分岐ポリマーは、単一の合成重合ステップにおいて調製される。超分岐ポリマーは、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸（ビス−ＭＰＡ）モノマーに基づくことができる。超分岐ポリマーの例として、超分岐ビス−ＭＰＡポリエステル−１６−ヒドロキシル、超分岐ビス−ＭＰＡポリエステル−３２−ヒドロキシルおよび超分岐ビス−ＭＰＡポリエステル−６４−ヒドロキシルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６０】
固体支持体は、アレイまたはマイクロアレイとなり得る。固体支持体は、別々の領域を含み得る。固体支持体は、アドレス可能なアレイとなり得る。場合によっては、アレイは、固体表面に固定された複数のプローブを含む。複数のプローブは、固体表面への標識された分子および／または標識されたアンプリコンのハイブリダイゼーションを可能にする。複数のプローブは、標識された分子および／または標識されたアンプリコンの少なくとも一部に相補的な配列を含む。場合によっては、複数のプローブは、試料タグ、分子識別子標識、核酸またはこれらの組合せの少なくとも一部に相補的な配列を含む。他の事例では、複数のプローブは、核酸への試料タグまたは分子識別子標識の付着によって形成される接合部に相補的な配列を含む。
【００６１】
アレイは、１種または複数のプローブを含み得る。プローブは、種々のフォーマットのものとなり得る。アレイは、標的核酸の少なくとも一部に相補的な配列および試料タグまたは分子識別子標識の特有の識別子領域に相補的な配列を含むプローブを含み得、試料タグまたは分子識別子標識は、オリゴヌクレオチドを含む。標的核酸の少なくとも一部に相補的な配列は、アレイに付着させることができる。特有の識別子領域に相補的な配列は、アレイに付着させることができる。アレイは、標的核酸の少なくとも一部に相補的な配列を含む第１のプローブと、特有の識別子領域に相補的な第２のプローブとを含み得る。確率論的に標識された核酸をアレイにハイブリダイズさせることができる様々な仕方がある。例えば、特有の識別子領域および確率論的に標識された核酸の標的核酸の接合部は、アレイにおけるプローブにハイブリダイズすることができる。アレイにおけるプローブにハイブリダイズし得る確率論的に標識された核酸の領域にはギャップが存在し得る。確率論的に標識された核酸の異なる領域は、アレイにおける２種またはそれを超えるプローブにハイブリダイズすることができる。よって、アレイプローブは、多くの異なるフォーマットのものとなり得る。アレイプローブは、特有の識別子領域に相補的な配列、標的核酸に相補的な配列またはこれらの組合せを含み得る。アレイへの確率論的に標識された核酸のハイブリダイゼーションは、種々の仕方で起こり得る。例えば、確率論的に標識された核酸の２個またはそれを超えるヌクレオチドは、アレイにおける１種または複数のプローブにハイブリダイズすることができる。プローブにハイブリダイズする確率論的に標識された核酸の２個またはそれを超えるヌクレオチドは、連続的ヌクレオチド、非連続的ヌクレオチドまたはこれらの組合せとなり得る。プローブにハイブリダイズされる確率論的に標識された核酸は、本技術分野において公知のいずれかの方法によって検出することができる。例えば、確率論的に標識された核酸は、直接的に検出することができる。確率論的に標識された核酸の直接的検出は、フルオロフォア、ハプテンまたは検出可能な標識の検出を含み得る。確率論的に標識された分子は、間接的に検出することができる。確率論的に標識された核酸の間接的検出は、ライゲーションまたは他の酵素によるもしくは酵素によらない方法を含み得る。
【００６２】
アレイは、種々のフォーマットのものとなり得る。例えば、アレイは、１６−、３２−、４８−、６４−、８０−、９６−、１１２−、１２８−、１４４−、１６０−、１７６−、１９２−、２０８−、２２４−、２４０−、２５６−、２７２−、２８８−、３０４−、３２０−、３３６−、３５２−、３６８−、３８４−または４００−フォーマットのものとなり得る。あるいは、アレイは、８×６０Ｋ、４×１８０Ｋ、２×４００Ｋ、１×１Ｍフォーマットのものである。他の事例では、アレイは、８×１５Ｋ、４×４４Ｋ、２×１０５Ｋ、１×２４４Ｋフォーマットのものである。
【００６３】
アレイは、単一のアレイを含み得る。単一のアレイは、単一の基材上にあり得る。あるいは、アレイは、複数の基材上にあり得る。アレイは、複数のフォーマットを含み得る。アレイは、複数のアレイを含み得る。複数のアレイは、２個またはそれを超えるアレイを含み得る。例えば、複数のアレイは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のアレイを含み得る。場合によっては、複数のアレイのうち少なくとも２個のアレイは同一である。あるいは、複数のアレイのうち少なくとも２個のアレイは異なる。
【００６４】
場合によっては、アレイは、対称的なチャンバーを有する区域を含む。例えば、アレイは、０．５×０．５ミリメートル（ｍｍ）、１×１ｍｍ、１．５×１．５ｍｍ、２×２ｍｍ、２．５×２．５ｍｍ、３×３ｍｍ、３．５×３．５ｍｍ、４×４ｍｍ、４．５×４．５ｍｍ、５×５ｍｍ、５．５×５．５ｍｍ、６×６ｍｍ、６．５×６．５ｍｍ、７×７ｍｍ、７．５×７．５ｍｍ、８×８ｍｍ、８．５×８．５ｍｍ、９×９ｍｍ、９．５×９．５ｍｍ、１０×１０ｍｍ、１０．５×１０．５ｍｍ、１１×１１ｍｍ、１１．５×１１．５ｍｍ、１２×１２ｍｍ、１２．５×１２．５ｍｍ、１３×１３ｍｍ、１３．５×１３．５ｍｍ、１４×１４ｍｍ、１４．５×１４．５ｍｍ、１５×１５ｍｍ、１５．５×１５．５ｍｍ、１６×１６ｍｍ、１６．５×１６．５ｍｍ、１７×１７ｍｍ、１７．５×１７．５ｍｍ、１８×１８ｍｍ、１８．５×１８．５ｍｍ、１９×１９ｍｍ、１９．５×１９．５ｍｍまたは２０×２０ｍｍのチャンバーを有する区域を含む。場合によっては、アレイは、６．５×６．５ｍｍのチャンバーを有する区域を含む。あるいは、アレイは、非対称的なチャンバーを有する区域を含む。例えば、アレイは、６．５×０．５ｍｍ、６．５×１ｍｍ、６．５×１．５ｍｍ、６．５×２ｍｍ、６．５×２．５ｍｍ、６．５×３ｍｍ、６．５×３．５ｍｍ、６．５×４ｍｍ、６．５×４．５ｍｍ、６．５×５ｍｍ、６．５×５．５ｍｍ、６．５×６ｍｍ、６．５×６．５ｍｍ、６．５×７ｍｍ、６．５×７．５ｍｍ、６．５×８ｍｍ、６．５×８．５ｍｍ、６．５×９ｍｍ、６．５×９．５ｍｍ、６．５×１０ｍｍ、６．５×１０．５ｍｍ、６．５×１１ｍｍ、６．５×１１．５ｍｍ、６．５×１２ｍｍ、６．５×１２．５ｍｍ、６．５×１３ｍｍ、６．５×１３．５ｍｍ、６．５×１４ｍｍ、６．５×１４．５ｍｍ、６．５×１５ｍｍ、６．５×１５．５ｍｍ、６．５×１６ｍｍ、６．５×１６．５ｍｍ、６．５×１７ｍｍ、６．５×１７．５ｍｍ、６．５×１８ｍｍ、６．５×１８．５ｍｍ、６．５×１９ｍｍ、６．５×１９．５ｍｍまたは６．５×２０ｍｍのチャンバーを有する区域を含む。
【００６５】
アレイは、少なくとも約１ミクロン（μｍ）、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１２５μｍ、１５０μｍ、１７５μｍ、２００μｍ、２２５μｍ、２５０μｍ、２７５μｍ、３００μｍ、３２５μｍ、３５０μｍ、３７５μｍ、４００μｍ、４２５μｍ、４５０μｍ、４７５μｍまたは５００μｍのスポットを含み得る。場合によっては、アレイは、７０μｍのスポットを含む。
【００６６】
アレイは、少なくとも約１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１２５μｍ、１５０μｍ、１７５μｍ、２００μｍ、２２５μｍ、２５０μｍ、２７５μｍ、３００μｍ、３２５μｍ、３５０μｍ、３７５μｍ、４００μｍ、４２５μｍ、４５０μｍ、４７５μｍ、５００μｍ、５２５μｍ、５５０μｍ、５７５μｍ、６００μｍ、６２５μｍ、６５０μｍ、６７５μｍ、７００μｍ、７２５μｍ、７５０μｍ、７７５μｍ、８００μｍ、８２５μｍ、８５０μｍ、８７５μｍ、９００μｍ、９２５μｍ、９５０μｍ、９７５μｍ、１０００μｍの特色ピッチを含み得る。場合によっては、アレイは、１６１μｍの特色ピッチを含む。
【００６７】
アレイは、１種または複数のプローブを含み得る。場合によっては、アレイは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００種のプローブを含む。あるいは、アレイは、少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００種のプローブを含む。アレイは、少なくとも約３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００または１００００種のプローブを含み得る。場合によっては、アレイは、少なくとも約９６０種のプローブを含む。あるいは、アレイは、少なくとも約２７８０種のプローブを含む。プローブは、複数のオリゴヌクレオチドタグに特異的となり得る。プローブは、複数のオリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部に特異的となり得る。プローブは、複数のオリゴヌクレオチドタグの総数の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％または１００％に特異的となり得る。あるいは、プローブは、複数のオリゴヌクレオチドタグの異なるオリゴヌクレオチドタグの総数の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％または１００％に特異的である。プローブは、オリゴヌクレオチドとなり得る。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長となり得る。他の事例では、プローブは、非特異的プローブである。例えば、プローブは、標識された分子に付着させた検出可能な標識に特異的となり得る。プローブは、ストレプトアビジンとなり得る。
【００６８】
アレイは、印刷されたアレイとなり得る。場合によっては、印刷されたアレイは、基材に付着させた１種または複数のオリゴヌクレオチドを含む。例えば、印刷されたアレイは、エポキシシラン基材に付着させた５’アミン修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【００６９】
あるいは、アレイは、１個または複数のウェルを有するスライドを含む。スライドは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のウェルを含み得る。あるいは、スライドは、少なくとも約１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００個のウェルを含む。場合によっては、スライドは、１６個のウェルを含む。あるいは、スライドは、９６個のウェルを含む。他の事例では、スライドは、少なくとも約８０、１６０、２４０、３２０、４００、４８０、５６０、６４０、７２０、８００、８８０または９６０個のウェルを含む。
【００７０】
場合によっては、固体支持体は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ３Ｋタグアレイ、Ａｒｒａｙｊｅｔ非接触印刷されたアレイまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｉｎｃ（ＡＭＩ）アレイである。あるいは、支持体は、接触プリンタ、インパクトプリンタ、ドットプリンタまたはピンプリンタを含む。
【００７１】
固体支持体は、マイクロウェルにおいて自己集合するビーズの使用を含み得る。例えば、固体支持体は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＢｅａｄＡｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを含む。あるいは、固体支持体は、Ａｂｂｏｔｔ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＢｅａｄ  Ａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＡｐｐｌｉｅｄ  ＭｉｃｒｏａｒｒａｙのＦｌｅｘｉＰｌｅｘ（商標）システムを含む。
【００７２】
他の事例では、固体支持体は、プレートである。プレートの例として、ＭＳＤマルチアレイプレート、ＭＳＤ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ（登録商標）プレート、マイクロプレート、ＰｒｏｔｅＯｎマイクロプレート、ＡｌｐｈａＰｌａｔｅ、ＤＥＬＦＩＡプレート、ＩｓｏＰｌａｔｅおよびＬｕｍａＰｌａｔｅが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
方法は、複数の標識された核酸のうち少なくとも１種を支持体に付着させるステップをさらに含み得る。支持体は、複数のビーズを含み得る。支持体は、アレイを含み得る。支持体は、スライドガラスを含み得る。
【００７４】
スライドガラスは、１個または複数のウェルを含み得る。１個または複数のウェルは、スライドガラス上にエッチングされ得る。１個または複数のウェルは、少なくとも９６０個のウェルを含み得る。スライドガラスは、１種または複数のプローブを含み得る。１種または複数のプローブは、スライドガラス上に印刷することができる。１個または複数のウェルは、１種または複数のプローブをさらに含み得る。１種または複数のプローブは、１個または複数のウェル内に印刷することができる。１種または複数のプローブは、９６０種の核酸を含み得る。
【００７５】
本明細書に開示されている方法およびキットは、マイクロウェルプレートにおいて複数の第１の試料タグ、複数の第２の試料タグ、複数の分子識別子標識またはこれらのいずれかの組合せを分布させるステップをさらに含み得る。本明細書に開示されている方法およびキットは、マイクロウェルプレートにおいて１個または複数のビーズを分布させるステップをさらに含み得る。本明細書に開示されている方法およびキットは、マイクロウェルプレートの複数のウェルにおいて複数の試料を分布させるステップをさらに含み得る。複数の試料のうち１種または複数は、複数の細胞を含み得る。複数の試料のうち１種または複数は、複数の核酸を含み得る。方法は、１個またはそれより少ない細胞を複数のウェルに分布させるステップをさらに含み得る。複数の細胞は、マイクロウェルプレートにおいて溶解することができる。方法は、マイクロウェルプレートにおいてｃＤＮＡを合成するステップをさらに含み得る。ｃＤＮＡの合成は、ｍＲＮＡの逆転写を含み得る。マイクロウェルプレートは、ソフトリソグラフィーによりＰＤＭＳにおいて製作された、シリコンウエハにおいてエッチングされた、スライドガラスにおいてエッチングされた、スライドガラスにおいてパターン形成されたフォトレジストまたはこれらの組合せであるマイクロウェルプレートを含み得る。マイクロウェルは、マイクロキャピラリープレートに孔を含み得る。マイクロウェルプレートは、油中水型エマルションを含み得る。マイクロウェルプレートは、少なくとも１個または複数のウェルを含み得る。マイクロウェルプレートは、少なくとも約６個のウェル、１２個のウェル、４８個のウェル、９６個のウェル、３８４個のウェル、９６０個のウェルまたは１０００個のウェルを含み得る。
【００７６】
方法およびキットは、チップをさらに含み得る。マイクロウェルプレートは、チップに付着させることができる。チップは、少なくとも約６個のウェル、１２個のウェル、４８個のウェル、９６個のウェル、３８４個のウェル、９６０個のウェル、１０００個のウェル、２０００個のウェル、３０００個のウェル、４０００個のウェル、５０００個のウェル、６０００個のウェル、７０００個のウェル、８０００個のウェル、９０００個のウェル、１０，０００個のウェル、２０，０００個のウェル、３０，０００個のウェル、４０，０００個のウェル、５０，０００個のウェル、６０，０００個のウェル、７０，０００個のウェル、８０，０００個のウェル、９０，０００個のウェル、１００，０００個のウェル、２００，０００個のウェル、５００，０００個のウェルまたは百万個のウェルを含み得る。ウェルは、少なくとも約３００ミクロン2、４００ミクロン2、５００ミクロン2、６００ミクロン2、７００ミクロン2、８００ミクロン2、９００ミクロン2、１０００ミクロン2、１１００ミクロン2、１２００ミクロン2、１３００ミクロン2、１４００ミクロン2、１５００ミクロン2の面積を含み得る。方法は、チップに約１０，０００〜３０，０００種の間の試料を分布させるステップをさらに含み得る。
【００７７】
官能化された表面およびオリゴヌクレオチド
ビーズは、官能化された表面を含み得る。官能化された表面は、官能基を含む固体支持体の表面を指すことができる。官能基は、別の官能基との付着を形成することができる基となり得る。例えば、官能基は、ストレプトアビジン（別の官能基）との付着を形成することができるビオチンとなり得る。例示的な官能基として、アルデヒド、ケトン、カルボキシ基、アミノ基、ビオチン、ストレプトアビジン、核酸、小分子（例えば、クリックケミストリーのため）、ホモおよびヘテロ二官能性試薬（例えば、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、ジマレイミド、ジチオ−ビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド（ｍａｆｅｉｍｉｄｏ）メチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）および６−ヒドラジノニコチミド（ＨＹＮＩＣ）ならびに抗体を挙げることができるがこれらに限定されない。場合によっては、官能基は、カルボキシ基（例えば、ＣＯＯＨ）である。
【００７８】
オリゴヌクレオチド（例えば、核酸）は、官能化された固体支持体に付着させることができる。固体支持体または同様の構造上の固定化されたオリゴヌクレオチドは、核酸プローブとして機能することができ、ハイブリダイゼーションアッセイを実行することができ、複合生物学的試料において特異的な標的核酸を検出することができる。
【００７９】
オリゴヌクレオチドの固定化のために、固体支持体（例えば、ビーズ）を官能化することができる。オリゴヌクレオチドは、固体支持体およびオリゴヌクレオチドの間に形成される共有結合性アミド結合により固体支持体にコンジュゲートすることができる。
【００８０】
支持体は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも約１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００もしくは１０００００００、１００００００００、５００００００００、１０００００００００種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも約１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００もしくは１０００００００、１００００００００、５００００００００、１０００００００００種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも百万種のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも１千万種のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも２千５百万種のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも５千万種のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも１億種のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも２億５千万種のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも５億種のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも７億５千万種のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも約１０億、２０億、３０億、４０億、５０億、６０億、７０億、８０億、９０億、１００億、１１０億、１２０億、１３０億、１４０億または１５０億種のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも１０億種のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。支持体は、少なくとも５０億種のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。
【００８１】
オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して支持体（例えば、ビーズ、ポリマー、ゲル）に付着させることができる。コンジュゲーションは、共有結合または非共有結合による付着を含み得る。コンジュゲーションは、ビーズおよび核酸の間に可変スペーサーを導入することができる。支持体およびオリゴヌクレオチドの間のリンカーは、切断可能となり得る（例えば、光切断可能連結、酸に不安定なリンカー、感熱性リンカーおよび酵素により切断可能なリンカー）。
【００８２】
支持体に分子をコンジュゲートするための使用のための架橋剤は、固体支持体の表面に存在する官能基および分子に存在する官能基と反応することができる薬剤を含み得る。かかる反応性となり得る試薬は、アルデヒド、ケトン、カルボキシ基、アミノ基、ビオチン、ストレプトアビジン、核酸、小分子（例えば、クリックケミストリーのため）、ホモおよびヘテロ二官能性試薬（例えば、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、ジマレイミド、ジチオ−ビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）および６−ヒドラジノニコチミド（ＨＹＮＩＣ）を含み得る。
【００８３】
ビーズは、カルボキシ官能基で官能化することができ、オリゴヌクレオチドは、アミノ官能基で官能化することができる。
【００８４】
支持体は、滑らかとなり得る。それに代えてまたはそれに加えて、支持体は、窪み（ｄｉｖｅｔ）、隆線またはウェルを含み得る。支持体は、マイクロウェルアレイを含み得る。マイクロウェルアレイは、オリゴヌクレオチドの付着を容易にする官能基で官能化することができる。マイクロウェルアレイにおける官能基は、マイクロウェルアレイにおける異なるポジションに対し異なり得る。マイクロウェルアレイにおける官能基は、マイクロウェルアレイの全領域に対し同じになることができる。
【００８５】
アッセイシステム成分
マイクロウェルアレイ
上述の通り、マイクロウェルアレイは、画定された容積の小型の反応チャンバー内における単一細胞およびビーズ（細胞１個当たり１個のビーズ）の捕捉に使用される。各ビーズは、細胞の溶解により放出される細胞ｍＲＮＡ分子の総量全体の確率論的標識化およびデジタル計数における使用のためのオリゴヌクレオチドプローブのライブラリーを含む。本開示の一実施形態では、マイクロウェルアレイは、アッセイシステムの消費可能な成分である。他の実施形態では、マイクロウェルアレイは、再利用可能となり得る。いずれの場合でも、マイクロウェルアレイは、手動によるアッセイの実行における使用のためのスタンドアロン型デバイスとして使用されるように構成することができる、またはアッセイ手順の完全もしくは部分的な自動化をもたらす機器の着脱可能なもしくは固定された成分を含むように構成することができる。
【００８６】
アレイのマイクロウェルは、各ウェルにおける単一細胞およびビーズの捕捉効率を最適化するために選ばれる種々の形状およびサイズで製作することができる。適切なウェル幾何学として、円柱状、円錐体、半球状、矩形または多角体（例えば、いくつかの平面で構成された三次元的幾何学、例えば、六角柱、八角柱、逆三角錐、逆四角錐、逆五角錐、逆六角錐または逆角錐台）が挙げられるがこれらに限定されない。マイクロウェルは、これらの幾何学のうち２種またはそれ超を組み合わせた形状を含み得る。例えば、一実施形態では、これは、部分的に円柱状となり、残りが逆円錐の形状を有し得る。別の実施形態では、これは、円柱の全長（深さ）にわたり延在する垂直チャネル（即ち、円柱軸に平行な）により接続された、一方が他方よりも大きい直径の２個の並列した円柱を含み得る。一般に、各マイクロウェルの開口端（または口）は、マイクロウェルアレイの上表面に位置するであろうが、一部の実施形態では、開口部は、アレイの下表面に位置してもよい。一般に、マイクロウェルの閉口端（または底部）は、平坦となるであろうが、湾曲した表面（例えば、凸面または凹面）も可能である。一般に、マイクロウェルの形状（およびサイズ）は、マイクロウェルに捕捉しようとする細胞および／またはビーズの種類に基づき決定されるであろう。
【００８７】
マイクロウェル寸法は、ウェルの直径および深さの観点から特徴付けることができる。本明細書において、マイクロウェルの直径は、マイクロウェル幾何学の平面断面内に刻むことができる最大の丸を指す。本開示の一実施形態では、マイクロウェルの直径は、マイクロウェル内に捕捉しようとする細胞および／またはビーズの直径の約０．１〜約５倍に及び得る。他の実施形態では、マイクロウェル直径は、マイクロウェル内に捕捉しようとする細胞および／またはビーズの直径の少なくとも０．１倍、少なくとも０．５倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍または少なくとも５倍である。さらに他の実施形態では、マイクロウェル直径は、マイクロウェル内に捕捉しようとする細胞および／またはビーズの直径の最大でも５倍、最大でも４倍、最大でも３倍、最大でも２倍、最大でも１倍、最大でも０．５倍または最大でも０．１倍である。一実施形態では、マイクロウェル直径は、マイクロウェル内に捕捉しようとする細胞および／またはビーズの直径の約２．５倍である。当業者であれば、マイクロウェル直径が、上述の値のいずれかによって画定されたいずれかの範囲内に収まり得ることを認めるであろう（例えば、マイクロウェル内に捕捉しようとする細胞および／またはビーズの直径の約０．２倍〜約３．５倍）。あるいは、マイクロウェルの直径は、絶対的寸法の観点から特定することができる。本開示の一実施形態では、マイクロウェルの直径は、約５〜約５０ミクロンに及び得る。他の実施形態では、マイクロウェル直径は、少なくとも５ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも１５ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも２５ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも３５ミクロン、少なくとも４０ミクロン、少なくとも４５ミクロンまたは少なくとも５０ミクロンである。さらに他の実施形態では、マイクロウェル直径は、最大でも５０ミクロン、最大でも４５ミクロン、最大でも４０ミクロン、最大でも３５ミクロン、最大でも３０ミクロン、最大でも２５ミクロン、最大でも２０ミクロン、最大でも１５ミクロン、最大でも１０ミクロンまたは最大でも５ミクロンである。一実施形態では、マイクロウェル直径は、約３０ミクロンである。当業者であれば、マイクロウェル直径が、上述の値のいずれかによって画定されたいずれかの範囲内に収まり得ることを認めるであろう（例えば、約２８ミクロン〜約３４ミクロン）。
【００８８】
マイクロウェル深さは、ウェル内に含有されるアッセイバッファーおよび他の試薬の効率的な交換も達成しながら、細胞およびビーズの捕捉効率を最適化するように選ばれる。本開示の一実施形態では、マイクロウェルの深さは、マイクロウェル内に捕捉しようとする細胞および／またはビーズの直径の約０．１〜約５倍に及び得る。他の実施形態では、マイクロウェル深さは、マイクロウェル内に捕捉しようとする細胞および／またはビーズの直径の少なくとも０．１倍、少なくとも０．５倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍または少なくとも５倍である。さらに他の実施形態では、マイクロウェル深さは、マイクロウェル内に捕捉しようとする細胞および／またはビーズの直径の最大でも５倍、最大でも４倍、最大でも３倍、最大でも２倍、最大でも１倍、最大でも０．５倍または最大でも０．１倍である。一実施形態では、マイクロウェル深さは、マイクロウェル内に捕捉しようとする細胞および／またはビーズの直径の約２．５倍である。当業者であれば、マイクロウェル深さが、上述の値のいずれかによって画定されたいずれかの範囲内に収まり得ることを認めるであろう（例えば、マイクロウェル内に捕捉しようとする細胞および／またはビーズの直径の約０．２倍〜約３．５倍）。あるいは、マイクロウェルの直径は、絶対的寸法の観点から特定することができる。本開示の一実施形態では、マイクロウェルの深さは、約１０〜約６０ミクロンに及び得る。他の実施形態では、マイクロウェル深さは、少なくとも１０ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも２５ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも３５ミクロン、少なくとも４０ミクロン、少なくとも５０ミクロンまたは少なくとも６０ミクロンである。さらに他の実施形態では、マイクロウェル深さは、最大でも６０ミクロン、最大でも５０ミクロン、最大でも４０ミクロン、最大でも３５ミクロン、最大でも３０ミクロン、最大でも２５ミクロン、最大でも２０ミクロンまたは最大でも１０ミクロンである。一実施形態では、マイクロウェル深さは、約３０ミクロンである。当業者であれば、マイクロウェル深さが、上述の値のいずれかによって画定されたいずれかの範囲内に収まり得ることを認めるであろう（例えば、約２４ミクロン〜約３６ミクロン）。
【００８９】
マイクロウェルアレイのウェルは、一次元、二次元または三次元アレイに配置され、三次元アレイは、例えば、一連の２個またはそれを超える二次元アレイを積み重ねることにより（即ち、マイクロウェルアレイを含む２個またはそれを超える基材を積み重ねることにより）達成することができる。ウェル間のパターンおよびスペーシングは、各ウェルに単一細胞およびビーズを捕捉する効率を最適化すると共に、アレイの単位面積当たりのウェルの数を最大化するように選ばれる。ウェルは、種々のランダムもしくは非ランダムパターンに従って分布されてよく、例えば、アレイ基材の表面にわたって全体的にランダムに分布されてよい、または正方格子、矩形格子もしくは六角格子状に配置されてよい。本開示の一実施形態では、ウェル間の中心間距離（またはスペーシング）は、約１５ミクロン〜約７５ミクロンに変動し得る。他の実施形態では、ウェル間のスペーシングは、少なくとも１５ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも２５ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも３５ミクロン、少なくとも４０ミクロン、少なくとも４５ミクロン、少なくとも５０ミクロン、少なくとも５５ミクロン、少なくとも６０ミクロン、少なくとも６５ミクロン、少なくとも７０ミクロンまたは少なくとも７５ミクロンである。さらに他の実施形態では、マイクロウェルスペーシングは、最大でも７５ミクロン、最大でも７０ミクロン、最大でも６５ミクロン、最大でも６０ミクロン、最大でも５５ミクロン、最大でも５０ミクロン、最大でも４５ミクロン、最大でも４０ミクロン、最大でも３５ミクロン、最大でも３０ミクロン、最大でも２５ミクロン、最大でも２０ミクロンまたは最大でも１５ミクロンである。一実施形態では、マイクロウェルスペーシングは、約５５ミクロンである。当業者であれば、マイクロウェル深さが、上述の値のいずれかによって画定されたいずれかの範囲内に収まり得ることを認めるであろう（例えば、約１８ミクロン〜約７２ミクロン）。
【００９０】
マイクロウェルアレイは、ウェルへと細胞およびビーズをガイドすることに役立つならびに／またはウェル間の表面に沈降することを防ぐように設計されたマイクロウェル間の表面特色を含み得る。適した表面特色の例として、ウェルを取り囲むおよび／またはウェル間の表面にまたがるドーム、隆線またはピークがある表面特色が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９１】
マイクロウェルアレイにおけるウェルの総数は、ウェルのパターンおよびスペーシングならびにアレイの全体的寸法により決定される。本開示の一実施形態では、アレイにおけるマイクロウェルの数は、約９６〜約５，０００，０００個またはそれ超に及び得る。他の実施形態では、アレイにおけるマイクロウェルの数は、少なくとも９６、少なくとも３８４、少なくとも１，５３６、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも７５，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも１，０００，０００または少なくとも５，０００，０００個である。さらに他の実施形態では、アレイにおけるマイクロウェルの数は、最大でも５，０００，０００、最大でも１，０００，０００、最大でも７５，０００、最大でも５０，０００、最大でも２５，０００、最大でも１０，０００、最大でも５，０００、最大でも１，５３６、最大でも３８４または最大でも９６ウェルである。一実施形態では、アレイにおけるマイクロウェルの数は、約９６個である。別の実施形態では、マイクロウェルの数は、約１５０，０００個である。当業者であれば、アレイにおけるマイクロウェルの数が、上述の値のいずれかによって画定されたいずれかの範囲内に収まり得ることを認めるであろう（例えば、約１００〜３２５，０００個）。
【００９２】
マイクロウェルアレイは、当業者に公知の多数の製作技法のいずれかを使用して製作することができる。使用することができる製作方法の例として、フォトリソグラフィーおよび湿式化学エッチング、プラズマエッチングまたはディープ反応性イオンエッチング等、バルク微細加工技法；マイクロ成形およびマイクロエンボス加工；レーザー微細加工；３Ｄ印刷または硬化性材料を使用した他の直接書き込み製作プロセス；ならびに同様の技法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９３】
マイクロウェルアレイは、当業者に公知の多数の基材材料のいずれかから製作することができ、材料の選択は典型的に、製作技法の選択に依存し、その逆もまた同じである。適した材料の例として、シリコン、石英ガラス、ガラス、ポリマー（例えば、アガロース、ゼラチン、ヒドロゲル、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；エラストマー）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリイミド、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）およびエポキシ樹脂）、金属または金属フィルム（例えば、アルミニウム、ステンレス鋼、銅、ニッケル、クロムおよびチタン）その他が挙げられるがこれらに限定されない。典型的には、マイクロウェルアレイの製作には親水性材料が望ましいが（湿潤性を増強し、細胞および他の生物学的材料の非特異的結合を最小化するために）、処理またはコーティングすることができる（例えば、酸素プラズマ処理またはポリエチレンオキシド表層のグラフトによる）疎水性材料を使用することもできる。デバイス中に捕捉された気泡のキャピラリーウィッキング／放出を容易にするために、マイクロウェルアレイの製作のための多孔性親水性材料の使用が望ましくなり得る。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイは、光学接着剤により製作される。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイは、プラズマまたはコロナ処理された材料により製作される。プラズマまたはコロナ処理された材料の使用は、材料を親水性にすることができる。一部の実施形態において、親水性材料等、プラズマまたはコロナ処理された材料は、処理されていない材料よりも安定的になることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイは、単一の材料から製作される。他の実施形態では、マイクロウェルアレイは、一体に結合されたまたは機械的に連結された２種またはそれを超える異なる材料を含み得る。
【００９４】
種々の表面処理および表面修飾技法を使用して、マイクロウェルアレイ表面の特性を変更することができる。例として、疎水性材料表面をより親水性にするための酸素プラズマ処理、ガラスおよびシリコン表面を滑面化（または粗面化）するためのウェットまたはドライエッチング技法の使用、より親水性にし、生体分子および細胞が非特異的吸着する傾向を少なくする基材表面へのポリエチレンオキシドまたは他のポリマー層の吸着および／またはグラフト、他の方法で不活性なシリコンおよびガラス表面へと化学的反応性官能基をグラフトするためのシラン反応の使用等が挙げられるがこれらに限定されない。光脱保護技法を使用して、アレイ構造の特異的な位置における化学的反応性官能基を選択的に活性化することができ、例えば、マイクロウェルの内壁における第一級アミンまたはカルボキシル基等、化学的反応性官能基の選択的付加または活性化を使用して、マイクロウェルの壁にオリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド、タンパク質または他の生体分子を共有結合によりカップリングすることができる。一般に、利用されている表面処理または表面修飾の選択は、所望の表面特性の種類およびマイクロウェルアレイを作製する材料の種類の両方に依存するであろう。
【００９５】
一部の実施形態では、例えば、細胞溶解ステップの際にマイクロウェルの開口部を封着して、隣接マイクロウェル間の標的核酸のクロスハイブリダイゼーションを防ぐことが有利になり得る。マイクロウェルは、固体支持体またはビーズ等、キャップを使用して封着することができ、その場合、ビーズの直径は、マイクロウェルの直径よりも大きい。例えば、キャップとして使用されるビーズは、マイクロウェルの直径よりも少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％大きくなり得る。あるいは、キャップは、マイクロウェルの直径よりも最大でも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％大きくなり得る。
【００９６】
キャップとして使用されるビーズは、架橋されたデキストランビーズ（例えば、セファデックス）を含み得る。架橋されたデキストランは、約１０マイクロメートル〜約８０マイクロメートルに及び得る。ビーズキャップの架橋されたデキストランは、２０マイクロメートル〜約５０マイクロメートルとなり得る。キャップは、例えば、無機ナノポア膜（例えば、酸化アルミニウム）、透析膜、スライドガラス、カバーガラスおよび／または親水性プラスチックフィルム（例えば、溶解バッファーで湿潤化したアガロースの薄膜でコーティングされたフィルム）を含み得る。
【００９７】
一部の実施形態では、キャップは、ウェルからの高分子（例えば、核酸）の移動を防ぎつつ、マイクロウェルからバッファーを出し入れすることができる。少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個またはそれを超えるヌクレオチドの高分子は、キャップにより、マイクロウェルから出入りする移動を妨害され得る。最大でも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個またはそれを超えるヌクレオチドの高分子は、キャップにより、マイクロウェルから出入りする移動を妨害され得る。
【００９８】
一部の実施形態では、封着されたマイクロウェルアレイは、マイクロウェルの頂部に単一の層のビーズを含み得る。一部の実施形態では、封着されたマイクロウェルアレイは、マイクロウェルの頂部に複数の層のビーズを含み得る。封着されたマイクロウェルアレイは、約１、２、３、４、５もしくは６つまたはそれを超える層のビーズを含み得る。
【００９９】
機械的治具
マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化／分子指標化アッセイを手動で行う場合、機械的治具にマイクロウェルアレイを搭載して、反応チャンバーを作製し、アレイへの細胞懸濁液およびアッセイ試薬のピペッティングまたは分注を容易にすることが簡便である（図６９および図７０）。図６９において説明される例では、治具は、１ｍｍ厚基材上に製作されたマイクロウェルアレイを受け入れ、１６ｍｍ幅×３５ｍｍ長さ×およそ４ｍｍ深さの反応チャンバーにアッセイ試薬を限局するためのシリコーンガスケットの形態の機械的支持体をもたらし、これにより、８００マイクロリットル〜１ミリリットルの細胞懸濁液およびビーズ懸濁液（ビーズに基づくオリゴヌクレオチド標識を含む）の使用を可能にして、アッセイを行う。
【０１００】
治具は、硬質の機械加工された頂部および底部プレート（例えば、アルミニウム）と、チャンバーまたはウェルの壁を作製するための圧縮性の（例えば、シリコーン、ポリジメチルシロキサン）ガスケットからなる。設計特色は、次のものを含む：（ｉ）必要に応じて顕微鏡対物レンズを回転してポジションに出し入れするための（異なる拡大率でマイクロウェルアレイを見るため）、面取りしたアパーチャ縁および隙間。（ｉｉ）マイクロウェルアレイ基材との漏れ止め封着の均一で反復可能な形成を保証するための、シリコーンガスケットの制御された圧縮。（ｉｉｉ）簡便な操作のためのキャプティブファスナ。（ｉｖ）アレイの確実かつ反復可能なポジショニングのための位置クランプ機構。（ｖ）リンスステップにおけるアレイの除去のための簡便な解体。
【０１０１】
頂部および底部プレートは、種々の材料（例えば、アルミニウム、陽極処理アルミニウム、ステンレス鋼、テフロン（登録商標）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）または同様の硬質ポリマー材料）を使用して、種々の技法（例えば、従来の機械加工、ＣＮＣ機械加工、射出成形、３Ｄ印刷等）のいずれかを使用して製作することができる。
【０１０２】
対照および実験（または再現実験もしくは複数の独立的実験）を並行して行うために、シリコーン（ポリジメチルシロキサン；ＰＤＭＳ）ガスケットは、複数のチャンバーを作製するように構成することができる（図７１を参照）。ガスケットは、優れた放出特徴をもたらすための垂直ガスケット壁のための抜き勾配を含むテフロン（登録商標）金型を使用して、ＰＤＭＳまたは同様のエラストマー材料から成形される。あるいは、金型は、アルミニウムまたは他の材料（例えば、黒デルリン、ポリエーテルイミド（ウルテム）等）から機械加工し、必要であればテフロン（登録商標）でコーティングして、優れた放出特徴をもたらすことができる。ガスケット金型設計は反転されている、即ち、成形部分の頂部表面（即ち、注型の際に金型を覆うために使用されるスライドガラスまたはシリコンウエハとの接触面側の表面）が、使用の際にマイクロウェルアレイ基材との封着を作製するための表面になり、これにより、金型表面の粗さおよび滑らかなガスケット表面を作製する（アレイ基材との漏れ止め封着を保証するため）際の表面汚染に伴う潜在的な問題を回避し、また、基材材料の柔軟な選択および注型の際に基礎としてマイクロウェルアレイ基材を使用することにより予め組み立てる選択肢をもたらすことができる。ガスケット金型設計は、ウェル面積の境界に力を集中させる隆線（ｆｏｒｃｅ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｒｉｄｇｅ）を含むこともできる、即ち、充填後に金型の頂部に置かれたカバーが、正確な位置における小さい接触面積に配置されるように、金型における中央メサ（複数可）（ウェル（複数可）を形成する）は、ウェル（複数可）の周囲長となる位置に隆起した隆線を有し、優れた縁プロファイルが、使用の際のガスケットおよび基材の間における漏れ止め封着の形成に重要である。
【０１０３】
機器システム
本開示は、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化／分子指標化アッセイの自動化を支持するための機器システムおよび消耗品も含む。かかるシステムは、フローセルと一体化されたマイクロウェルアレイを取り込む消費可能なカートリッジと共に、（ｉ）フルイディクス制御、（ｉｉ）温度制御、（ｉｉｉ）細胞および／またはビーズ分布および収集機構、（ｉｖ）細胞溶解機構、（ｖ）イメージング能力ならびに（ｖｉ）画像処理等、制御および分析機能性の提供に必要な器具類を含み得る。一部の実施形態では、システムのための入力は、細胞試料を含み、出力は、試料タグ、細胞タグおよび分子指標化タグを取り込むオリゴヌクレオチドを付着させたビーズを含むビーズ懸濁液を含む。他の実施形態では、システムは、ＰＣＲ増幅を行うための熱サイクリング能力等、追加的な機能性を含み得、この場合、システムのための入力は、細胞試料を含み、出力は、本来はビーズに付着させていた試料タグ、細胞タグおよび分子指標化タグを取り込むオリゴヌクレオチドの増幅に起因するオリゴヌクレオチドライブラリーを含む。さらに他の実施形態では、システムは、オリゴヌクレオチド増幅の必要ありまたはなしの、配列決定能力を含むこともでき、この場合、システムのための入力は、細胞試料であり、出力は、目的の標的配列に関連した全試料タグ、細胞タグおよび分子指標化タグの配列をさらに含むデータセットを含む。
【０１０４】
マイクロウェルアレイフローセル
自動アッセイシステムの多くの実施形態では、マイクロウェルアレイ基材は、流体取り扱いシステムの残りとの便利なインターフェイスをもたらし、マイクロウェルアレイへと送達される流体、例えば、細胞およびビーズ懸濁液、溶解バッファー、リンスバッファー等の交換を容易にするフローセル内にパッケージされるであろう。設計特色は、（ｉ）細胞試料、ビーズ懸濁液および／または他のアッセイ試薬を導入するための１個または複数の入口ポート、（ｉｉ）戻り渦（ｂａｃｋ  ｅｄｄｙ）またはデッドゾーンを最小化しつつ、均一な充填および効率的な流体交換をもたらすように設計された１個または複数のマイクロウェルアレイチャンバー、ならびに（ｉｉｉ）試料収集ポイントおよび／または廃棄物リザーバーへと流体を送達するための１個または複数の出口ポートを含み得る。一部の実施形態では、フローセルの設計は、１種または複数の細胞試料を並行して処理できるように複数のマイクロウェルアレイとインターフェイスする複数のマイクロアレイチャンバーを含み得る。一部の実施形態では、フローセルの設計は、均一な流動速度プロファイルを作製するための特色をさらに含み得る、即ち、例えば、「流動拡散器」として、チャンバー入口近くおよびマイクロウェルアレイの上流に位置する多孔性障壁を使用することにより、または各アレイチャンバーを、同じ総アレイ面積をまとめて覆うが分割された入口流体ストリームが並行して流動する数個のサブセクションに分割することにより、マイクロウェルへの細胞およびビーズのより均一な送達をもたらすための、アレイチャンバー幅にわたる「栓流」である。一部の実施形態では、フローセルは、２個以上のマイクロウェルアレイ基材を包囲または取り込むことができる。一部の実施形態では、統合されたマイクロウェルアレイ／フローセルアセンブリは、システムの固定された成分を構成することができる。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイ／フローセルアセンブリは、機器から着脱可能となり得る。
【０１０５】
一般に、フローセル設計における流体チャネルおよびアレイチャンバー（複数可）の寸法は、（ｉ）マイクロウェルアレイへと細胞およびビーズの均一な送達をもたらし、（ｉｉ）試料および試薬消費を最小化するように最適化されるであろう。一部の実施形態では、流体チャネルの幅は、５０ミクロン〜２０ｍｍの間となるであろう。他の実施形態では、流体チャネルの幅は、少なくとも５０ミクロン、少なくとも１００ミクロン、少なくとも２００ミクロン、少なくとも３００ミクロン、少なくとも４００ミクロン、少なくとも５００ミクロン、少なくとも７５０ミクロン、少なくとも１ｍｍ、少なくとも２．５ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも１０ｍｍまたは少なくとも２０ｍｍとなり得る。さらに他の実施形態では、流体チャネルの幅は、最大でも２０ｍｍ、最大でも１０ｍｍ、最大でも５ｍｍ、最大でも２．５ｍｍ、最大でも１ｍｍ、最大でも７５０ミクロン、最大でも５００ミクロン、最大でも４００ミクロン、最大でも３００ミクロン、最大でも２００ミクロン、最大でも１００ミクロンまたは最大でも５０ミクロンとなり得る。一実施形態では、流体チャネルの幅は、約２ｍｍである。当業者であれば、流体チャネルの幅が、上述の値のいずれかによって画定されたいずれかの範囲内に収まり得ることを認めるであろう（例えば、約２５０ミクロン〜約３ｍｍ）。
【０１０６】
一部の実施形態では、流体チャネルの深さは、５０ミクロン〜１０ｍｍの間となるであろう。他の実施形態では、流体チャネルの深さは、少なくとも５０ミクロン、少なくとも１００ミクロン、少なくとも２００ミクロン、少なくとも３００ミクロン、少なくとも４００ミクロン、少なくとも５００ミクロン、少なくとも７５０ミクロン、少なくとも１ｍｍ、少なくとも１．２５ｍｍ、少なくとも１．５ｍｍ、少なくとも１．７５ｍｍ、少なくとも２ｍｍ、少なくとも２．５ｍｍ、少なくとも３ｍｍ、少なくとも３．５ｍｍ、少なくとも４ｍｍ、少なくとも４．５ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも５．５ｍｍ、少なくとも６ｍｍ、少なくとも６．５ｍｍ、少なくとも７ｍｍ、少なくとも７．５ｍｍ、少なくとも８ｍｍ、少なくとも８．５ｍｍ、少なくとも９ｍｍまたは少なくとも９．５ｍｍとなり得る。他の実施形態では、流体チャネルの深さは、最大でも１０ｍｍ、最大でも９．５ｍｍ、最大でも９ｍｍ、最大でも８．５ｍｍ、最大でも８ｍｍ、最大でも７．５ｍｍ、最大でも７ｍｍ、最大でも６．５ｍｍ、最大でも６ｍｍ、最大でも５．５ｍｍ、最大でも５ｍｍ、最大でも４．５ｍｍ、最大でも４ｍｍ、最大でも３．５ｍｍ、最大でも３ｍｍ、最大でも２ｍｍ、最大でも１．７５ｍｍ、最大でも１．５ｍｍ、最大でも１．２５ｍｍ、最大でも１ｍｍ、最大でも７５０ミクロン、最大でも５００ミクロン、最大でも４００ミクロン、最大でも３００ミクロン、最大でも２００ミクロン、最大でも１００ミクロンまたは最大でも５０ミクロンとなり得る。一実施形態では、流体チャネルの深さは、約１ｍｍである。当業者であれば、流体チャネルの深さが、上述の値のいずれかによって画定されたいずれかの範囲内に収まり得ることを認めるであろう（例えば、約８００ミクロン〜約１ｍｍ）。
【０１０７】
フローセルは、当業者に公知の種々の技法および材料を使用して製作することができる。一般に、フローセルは、別々の部分として製作され、その後、マイクロウェルアレイ基材に機械的にクランプまたは永続的に結合されるであろう。適した製作技法の例として、従来の機械加工、ＣＮＣ機械加工、射出成形、３Ｄ印刷、１つもしくは複数の層のレーザーもしくはダイカットポリマーフィルムの整列および積層、またはフォトリソグラフィーおよび湿式化学エッチング、ドライエッチング、ディープ反応性イオンエッチングもしくはレーザー微細加工等、多数の微細加工技法のいずれかが挙げられる。フローセル部分が製作されたら、例えば、これをマイクロウェルアレイ基材に対しクランプすることにより（ガスケットの使用ありまたはなし）、これをマイクロウェルアレイ基材に機械的に付着させることができる、あるいは当業者に公知の種々の技法（使用される材料の選択に依存して）のいずれかを使用して、例えば、陽極結合、熱結合、超音波溶接、またはエポキシに基づく、アクリルに基づく、シリコーンに基づく、ＵＶ硬化性、ポリウレタンに基づくもしくはシアノアクリレートに基づく接着剤を含む種々の接着剤もしくは接着フィルムのいずれかの使用により、これをマイクロウェルアレイ基材に直接的に結合させることができる。
【０１０８】
フローセルは、当業者に公知の種々の材料を使用して製作することができる。適した材料の例として、シリコン、石英ガラス、ガラス、種々のポリマーのいずれか、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；エラストマー）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリイミド、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、エポキシ樹脂、金属（例えば、アルミニウム、ステンレス鋼、銅、ニッケル、クロムおよびチタン）またはこれらの材料の組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０９】
カートリッジ
自動アッセイシステムの多くの実施形態では、フローセルを付着させたまたは付着させていないマイクロウェルアレイは、機器システムとインターフェイスし、追加的な機能性を取り込むことができる消費可能なカートリッジ内にパッケージされるであろう。カートリッジの設計特色は、（ｉ）機器との流体接続を作製するための、ならびに／または細胞試料、ビーズ懸濁液および／もしくは他のアッセイ試薬をカートリッジに手動で導入するための１個または複数の入口ポート、（ｉｉ）１個または複数のバイパスチャネル、即ち、細胞試料およびビーズ懸濁液を自己計量して、過充填および／または逆流を回避するためのチャネル、（ｉｉｉ）その中にマイクロアレイ基材（複数可）がポジショニングされた、１個もしくは複数の統合されたマイクロウェルアレイ／フローセルアセンブリまたは１個もしくは複数のチャンバー、（ｉｖ）デバイスを通る流体の流れを制御するための、統合されたミニチュアポンプまたは他の流体作動機構、（ｖ）予めロードされた試薬を区画化するためおよび／またはデバイスを通る流体の流れを制御するための統合されたミニチュア弁、（ｖｉ）捕捉された空気のエスケープ通路を提供するためのベント、（ｖｉｉ）１個または複数の試料および試薬廃棄物リザーバー、（ｖｉｉｉ）機器との流体接続を作製するためおよび／または加工された試料収集ポイントを提供するための１個または複数の出口ポート、（ｉｘ）機器システムに関して、着脱可能で消費可能なカートリッジの再現性があるポジショニングを行い、外部磁石がマイクロウェルアレイと極めて接近できるようなアクセスを提供するための、機械的インターフェイス特色、（ｘ）機器システムとの優れた熱接触を提供するための、統合された温度制御成分および／または熱インターフェイス、ならびに（ｘｉ）マイクロウェルアレイの光学照合における使用のための光学インターフェイス特色、例えば、透明窓を含み得る。一部の実施形態では、カートリッジは、２種以上の試料を並行して処理するように設計される。デバイスの一部の実施形態では、カートリッジは、スタンドアロンＰＣＲサーマルサイクラーおよび／または配列決定機器とのインターフェイスに適した１個または複数の着脱可能な試料収集チャンバー（複数可）をさらに含み得る。デバイスの一部の実施形態では、カートリッジそれ自体が、スタンドアロンＰＣＲサーマルサイクラーおよび／または配列決定機器とのインターフェイスに適している。
【０１１０】
デバイスの一部の実施形態では、カートリッジは、マイクロウェル間の相互汚染を最小化するために、大型分子の拡散を防ぐ（またはその経路長および拡散時間を増加させる）物理的および／または化学的障壁を作製するように設計された成分をさらに含み得る。かかる障壁の例として、マイクロウェルアレイへの細胞およびビーズの送達に使用される蛇行チャネルのパターン、溶解もしくはインキュベーションステップにおいてマイクロウェルアレイ基材の表面との接触にプレスされる収納できるプラテンもしくは変形可能な膜、マイクロウェルの開口部を遮断するための、以前に記載されている通りのより大型のビーズ、例えば、セファデックスビーズの使用、またはアレイにおける各マイクロウェルを有効に分離および区画化するための、溶解もしくはインキュベーションステップにおけるカートリッジ内のリザーバーからの不混和性の疎水性流体の放出が挙げられるがこれらに限定されない。これらの障壁のいずれかもしくは全て、またはかかる障壁のない実施形態は、例えば、グリセロールまたはポリエチレングリコール等の溶液成分の添加による、マイクロウェルにおけるおよびそれに隣接した溶液の粘性の上昇と組み合わせることができる。
【０１１１】
一般に、カートリッジ設計における流体チャネルおよびアレイチャンバー（複数可）の寸法は、（ｉ）マイクロウェルアレイへの細胞およびビーズの均一な送達をもたらし、（ｉｉ）試料および試薬消費を最小化するように最適化されるであろう。一部の実施形態では、流体チャネルの幅は、５０ミクロン〜２０ｍｍの間となるであろう。他の実施形態では、流体チャネルの幅は、少なくとも５０ミクロン、少なくとも１００ミクロン、少なくとも２００ミクロン、少なくとも３００ミクロン、少なくとも４００ミクロン、少なくとも５００ミクロン、少なくとも７５０ミクロン、少なくとも１ｍｍ、少なくとも２．５ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも１０ｍｍまたは少なくとも２０ｍｍとなり得る。さらに他の実施形態では、流体チャネルの幅は、最大でも２０ｍｍ、最大でも１０ｍｍ、最大でも５ｍｍ、最大でも２．５ｍｍ、最大でも１ｍｍ、最大でも７５０ミクロン、最大でも５００ミクロン、最大でも４００ミクロン、最大でも３００ミクロン、最大でも２００ミクロン、最大でも１００ミクロンまたは最大でも５０ミクロンとなり得る。一実施形態では、流体チャネルの幅は、約２ｍｍである。当業者であれば、流体チャネルの幅が、上述の値のいずれかによって画定されたいずれかの範囲内に収まり得ることを認めるであろう（例えば、約２５０ミクロン〜約３ｍｍ）。
【０１１２】
一部の実施形態では、カートリッジ設計における流体チャネルの深さは、５０ミクロン〜１０ｍｍの間となるであろう。他の実施形態では、流体チャネルの深さは、少なくとも５０ミクロン、少なくとも１００ミクロン、少なくとも２００ミクロン、少なくとも３００ミクロン、少なくとも４００ミクロン、少なくとも５００ミクロン、少なくとも７５０ミクロン、少なくとも１ｍｍ、少なくとも１．２５ｍｍ、少なくとも１．５ｍｍ、少なくとも１．７５ｍｍ、少なくとも２ｍｍ、少なくとも２．５ｍｍ、少なくとも３ｍｍ、少なくとも３．５ｍｍ、少なくとも４ｍｍ、少なくとも４．５ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも５．５ｍｍ、少なくとも６ｍｍ、少なくとも６．５ｍｍ、少なくとも７ｍｍ、少なくとも７．５ｍｍ、少なくとも８ｍｍ、少なくとも８．５ｍｍ、少なくとも９ｍｍまたは少なくとも９．５ｍｍとなり得る。さらに他の実施形態では、流体チャネルの深さは、最大でも１０ｍｍ、最大でも９．５ｍｍ、最大でも９ｍｍ、最大でも８．５ｍｍ、最大でも８ｍｍ、最大でも７．５ｍｍ、最大でも７ｍｍ、最大でも６．５ｍｍ、最大でも６ｍｍ、最大でも５．５ｍｍ、最大でも５ｍｍ、最大でも４．５ｍｍ、最大でも４ｍｍ、最大でも３．５ｍｍ、最大でも３ｍｍ、最大でも２ｍｍ、最大でも１．７５ｍｍ、最大でも１．５ｍｍ、最大でも１．２５ｍｍ、最大でも１ｍｍ、最大でも７５０ミクロン、最大でも５００ミクロン、最大でも４００ミクロン、最大でも３００ミクロン、最大でも２００ミクロン、最大でも１００ミクロンまたは最大でも５０ミクロンとなり得る。一実施形態では、流体チャネルの深さは、約１ｍｍである。当業者であれば、流体チャネルの深さが、上述の値のいずれかによって画定されたいずれかの範囲内に収まり得ることを認めるであろう（例えば、約８００ミクロン〜約１ｍｍ）。
【０１１３】
カートリッジは、当業者に公知の種々の技法および材料を使用して製作することができる。一般に、カートリッジは、一連の別々の成分部分として製作され（図７２）、その後に多数の機械的組み立てまたは結合技法のいずれかを使用して組み立てられるであろう（図７２および図７３）。適した製作技法の例として、従来の機械加工、ＣＮＣ機械加工、射出成形、熱成形および３Ｄ印刷が挙げられるがこれらに限定されない。カートリッジ成分が製作されると、ネジ、クリップその他を使用して、これを機械的に組み立てることができる、あるいは種々の技法（使用される材料の選択に依存して）のいずれかを使用して、例えば、熱もしくは超音波結合／溶接、またはエポキシに基づく、アクリルに基づく、シリコーンに基づく、ＵＶ硬化性、ポリウレタンに基づくもしくはシアノアクリレートに基づく接着剤を含む種々の接着剤もしくは接着フィルムのいずれかの使用により、永続的に結合させることができる。
【０１１４】
カートリッジ成分は、シリコン、石英ガラス、ガラス、種々のポリマーのいずれか、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；エラストマー）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリイミド、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、エポキシ樹脂または金属（例えば、アルミニウム、ステンレス鋼、銅、ニッケル、クロムおよびチタン）が挙げられるがこれらに限定されない、多数の適した材料のいずれかを使用して製作することができる。
【０１１５】
上述の通り、カートリッジの入口および出口特色は、機器との便利な漏れ止め流体接続をもたらすように設計することができる、またはカートリッジに試料および試薬を手動ピペッティングで出し入れするための開放リザーバーとして機能することができる。入口および出口ポートコネクタのための便利な機械的設計の例として、ねじ付きコネクタ、加締コネクタ、ルアーロックコネクタ、ルアースリップまたは「スリップチップ（ｓｌｉｐ  ｔｉｐ）」コネクタ、プレスばめコネクタその他が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、カートリッジの入口および出口ポートは、カートリッジが機器にポジショニングされると開放または穿刺することができ、貯蔵の際に内部カートリッジ表面の汚染を防ぐように役立つ、および／またはカートリッジが機器から取り出される際に流体がこぼれることを防ぐ、キャップ、ばね荷重カバーもしくは閉鎖材、相変化材料、またはポリマー膜をさらに含み得る。上に示す通り、一部の実施形態では、カートリッジの１個または複数の出口ポートは、スタンドアロンＰＣＲサーマルサイクラーおよび／または配列決定機器とのインターフェイスに適した着脱可能な試料収集チャンバーをさらに含み得る。
【０１１６】
上に示す通り、一部の実施形態では、カートリッジは、デバイスを通る流体の流れの制御のための統合されたミニチュアポンプまたは他の流体作動機構を含み得る。適したミニチュアポンプまたは流体作動機構の例として、電気機械的にもしくは空気圧で作動されるミニチュアシリンジもしくはプランジャ機構、化学的推進剤、空気圧でもしくは外部ピストンにより作動される膜ダイヤフラムポンプ、空気圧で作動される試薬ポーチもしくは嚢または電気浸透ポンプが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１７】
上述の通り、一部の実施形態では、カートリッジは、予めロードされた試薬を区画化するためおよび／またはデバイスを通る流体の流れを制御するためのミニチュア弁を含み得る。適したミニチュア弁の例として、融解もしくは溶解され得るワックスもしくはポリマープラグまたは穿刺され得るポリマー膜を使用して製作されるワンショット「弁」；変形可能な膜を使用して構築されるピンチ弁、および変形可能な膜フラップを使用して構築される空気圧、水力、磁性、電磁気または電気機械的（ソレノイド）作動、一方向弁、およびミニチュアゲート弁が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１８】
上に示す通り、一部の実施形態では、カートリッジは、捕捉された空気のエスケープ通路を提供するためのベントを含み得る。ベントは、当業者に公知の種々の技法に従って、例えば、空気のキャピラリーウィッキングを可能にするが、水による浸透を遮断するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または他の疎水性材料の多孔性プラグを使用して構築することができる。ベントは、操作の際に使用される圧力ではアパーチャ壁の湿潤が生じないように疎水性障壁材料を通るアパーチャとして構築することもできる。
【０１１９】
一般に、カートリッジの機械的インターフェイス特色は、機器システムに対するカートリッジの容易に着脱可能であるが高度に正確かつ反復可能なポジショニングを提供する。適した機械的インターフェイス特色として、整列ピン、整列ガイド、機械的止め具その他が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、機械的設計特色は、外部装置、例えば、磁石または光学成分をマイクロウェルアレイチャンバーと極めて接近させるためのレリーフ特色を含むであろう（図７２）。
【０１２０】
一部の実施形態では、カートリッジは、外部温度制御モジュールに嵌合させるための温度制御成分または熱インターフェイス特色も含むであろう。適した温度制御要素の例として、抵抗性加熱要素、ミニチュア赤外放射光源、ペルチェ加熱または冷却デバイス、ヒートシンク、サーミスタ、熱電対その他が挙げられるがこれらに限定されない。熱インターフェイス特色は、典型的には、優れた熱導体（例えば、銅、金、銀、アルミニウム等）である材料から製作され、典型的には、外部加熱ブロックまたは冷却ブロックと優れた熱接触を生じることができる１個または複数の平坦な表面を含むであろう。
【０１２１】
多くの実施形態では、カートリッジは、マイクロウェルアレイの光学イメージングまたは分光学的照合における使用のための光学インターフェイス特色を含むであろう。典型的には、カートリッジは、光学的に透明な窓、例えば、マイクロウェルアレイの探索に使用されるイメージングまたは分光学的技法のためのスペクトル要件を満たす材料から製作された、マイクロウェル基材それ自体またはマイクロウェルアレイと対向するフローセルもしくはマイクロアレイチャンバーの側面を含むであろう。適した光学窓材料の例として、ガラス、石英ガラス、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）または環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）が挙げられるがこれらに限定されない。典型的には、カートリッジは、横断する、反射したまたは傾斜した照明配向性でマイクロウェルアレイを照明するために使用することができる、第２の光学的に透明または半透明な窓または領域を含むであろう。
【０１２２】
機器
本開示は、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化／分子指標化アッセイの自動化における使用のための機器も含む。上に示す通り、このような機器は、（ｉ）フルイディクス制御、（ｉｉ）温度制御、（ｉｉｉ）細胞および／またはビーズ分布および収集機構、（ｉｖ）細胞溶解機構、（ｖ）磁場制御、（ｖｉ）イメージング能力ならびに（ｖｉｉ）画像処理等、制御および分析機能性をもたらすことができる。一部の実施形態では、機器システムは、１個または複数のモジュールを含み得（その可能な一実施形態は、図７４に模式図により説明されている）、各モジュールは、システムに１種または複数の特異的機能的特色セットをもたらす。他の実施形態では、機器システムは、あらゆるシステム機能性が同じパッケージ内に存在するようにパッケージすることができる。図７５は、自動システムの一実施形態に含まれるプロセスステップの模式的説明を提示する。上に示す通り、一部の実施形態では、システムは、システムの統合された成分またはモジュラ成分のいずれかとして、ＰＣＲ増幅（または他の種類のオリゴヌクレオチド増幅技法）およびオリゴヌクレオチド配列決定を含むようにシステムの機能的能力を拡大する、追加的な機能的単位を含み得る。
【０１２３】
一般に、機器システムは、システムに接続された１個または複数のアッセイカートリッジ（複数可）内の１個または複数のマイクロアレイチャンバー（複数可）またはフローセル（複数可）へと試料および／または試薬を送達するためのフルイディクス能力をもたらすであろう。アッセイ試薬およびバッファーは、カートリッジ入口に接続されたボトル、試薬およびバッファーカートリッジまたは他の適した容器に貯蔵することができる。システムは、アッセイカートリッジ（複数可）下流の流体を収集するためのボトル、廃棄物カートリッジまたは他の適した廃棄物容器の形態の廃棄物リザーバーを含むこともできる。システムを通る流体の流れの制御は、典型的には、ポンプ（または他の流体作動機構）および弁の使用により行われるであろう。適したポンプの例として、シリンジポンプ、プログラム可能なシリンジポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプその他が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、システムを通る流体の流れは、試薬およびバッファー容器の１個もしくは複数の入口にまたはアッセイカートリッジ（複数可）の入口に正の空気圧を加えることによって制御することができる。一部の実施形態では、システムを通る流体の流れは、廃棄物リザーバーの１個もしくは複数の出口にまたはアッセイカートリッジ（複数可）の出口において真空吸引することによって制御することができる。適した弁の例として、逆止め弁、電気機械的二方または三方弁、空気圧式二方および三方弁その他が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、アッセイ洗浄／リンスステップの際に拍動流を加えて、１個または複数のマイクロウェルアレイフローセル（複数可）またはチャンバー（複数可）内における流体の完全かつ効率的な交換を容易にすることができる。
【０１２４】
上に示す通り、一部の実施形態では、機器システムは、マイクロウェルアレイにわたる細胞およびビーズの均一な分布をさらに容易にするための機構を含み得る。かかる機構の例として、振動、振盪、回旋、再循環流、低頻度揺動（ｌｏｗ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｇｉｔａｔｉｏｎ）（例えば、ロッカープレートを使用、またはチャンバーもしくは流体チャネル近辺の壁を形成する可撓性（例えば、シリコーン）膜のパルス適用による）または高頻度揺動（ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｇｉｔａｔｉｏｎ）（例えば、圧電変換器の使用による）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、これらの機構のうち１種または複数は、フローセルまたはアレイチャンバーの内壁における物理的構造または特色、例えば、中２階／最上階構造、シェブロンまたは隆線アレイと組み合わせて利用されて、混合を容易にするおよび／またはアレイチャンバー内における細胞もしくはビーズのプールを防ぐために役立つ。フローセルまたはアレイチャンバーの上または下表面における流動増強リブを使用して、流動速度プロファイルを制御し、マイクロウェル開口部にわたる剪断を低下させる（即ち、試薬交換およびリンスステップの際にマイクロウェルから細胞またはビーズが引き出されることを防ぐ）ことができる。
【０１２５】
一部の実施形態では、機器システムは、洗剤または他の試薬の使用の代替として機械的細胞溶解能力を含み得る。高周波圧電変換器を使用した超音波処理は、適した技法の一例である。
【０１２６】
一部の実施形態では、機器システムは、アッセイ結果の精度および再現性を容易にすることを目的とする温度制御機能性を含むであろう、例えば、マイクロウェルアレイフローセルまたはチャンバーの冷却は、マイクロウェル間の分子拡散の最小化に有利になり得る。機器システム設計に取り込むことができる温度制御成分の例として、抵抗性加熱要素、赤外光源、ペルチェ加熱または冷却素子、ヒートシンク、サーミスタ、熱電対その他が挙げられるがこれらに限定されない。システムの一部の実施形態では、温度制御器は、特定の時間間隔にわたりプログラム可能な温度変化をもたらすことができる。
【０１２７】
本開示の他の箇所に示す通り、開示されている方法の多くの実施形態は、アッセイの完了後にマイクロウェルからビーズを除去するための磁場を利用する。一部の実施形態では、機器システムは、マイクロウェルアレイフローセルまたはチャンバーへとまたはそれからビーズを輸送するための磁場の使用をさらに含み得る。磁場の制御をもたらすための適した手段の例として、カートリッジに対して固定されたポジション（複数可）における電磁石の使用、または必要に応じて機械的に再ポジショニングされた永久磁石の使用が挙げられるがこれらに限定されない。機器システムの一部の実施形態では、印加された磁場（複数可）の強度は、１個または複数の電磁石に印加された電流の量を変動させることにより変動されるであろう。機器システムの一部の実施形態では、印加された磁場の強度は、例えば、ステッパーモーター駆動線形アクチュエータ、サーボモーター駆動線形アクチュエータまたはカムシャフト機構を使用して、マイクロアレイチャンバー（複数可）のポジションに対して１個または複数の永久磁石のポジションを変化させることにより変動されるであろう。機器システムの一部の実施形態では、例えば、磁性ビーズのクラスタリングを防ぐために、パルス磁場の使用が有利となり得る。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイに対して少なくとも２個のポジションの間で、アレイまたはチャンバーに極めて接近した磁石を１回または複数回移動させることができる。磁石の運動は、マイクロウェル内のビーズを揺動させるために、マイクロウェルからのビーズの除去を容易にするために、または所望の位置における磁性ビーズを収集するために役立つことができる。
【０１２８】
上に示す通り、多くの実施形態では、機器システムは、光学イメージングおよび／または他の分光学的能力を含むであろう。かかる機能性は、例えば、アレイに細胞および／またはビーズが均一にかつ最適に配置されたか否か決定するためのマイクロウェルアレイ（複数可）の点検に有用となり得る。明視野、暗視野および蛍光／ルミネッセンスイメージングが挙げられるがこれらに限定されない、種々のイメージングモードのいずれを利用してもよい。イメージングモードの選択は、アレイ基材および／またはフローセルもしくはアレイチャンバーの反対側の壁が、目的のスペクトル範囲にわたり必然的に透明または半透明である必要があるという点において、マイクロウェルアレイ、フローセルおよびカートリッジチャンバーの設計に影響を与えるであろう。一部の実施形態では、各マイクロウェルアレイは、単一の画像内にその全体を画像化することができる。一部の実施形態では、一連の画像を「タイル表示して」、アレイ全体の高分解能画像を作製することができる。一部の実施形態では、アレイのサブセクションを表す単一の画像を使用して、アレイの全体としての特性、例えば、細胞またはビーズ分布を評価することができる。一部の実施形態では、二重波長励起および発光（または多重波長励起および／もしくは発光）イメージングを行うことができる。タングステンランプ、タングステン−ハロゲンランプ、アークランプ、レーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）またはレーザーダイオードが挙げられるがこれらに限定されない、種々の光源のいずれを使用して、イメージングおよび／または励起光を提供してもよい。フォトダイオードアレイ、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラまたはＣＭＯＳ画像センサーが挙げられるがこれらに限定されない、種々の画像センサーのいずれをイメージング目的に使用してもよい。光学システムは、典型的には、システムを通る光線を操縦する、形づくる、フィルターをかけるおよび／または焦点を合わせるための種々の光学成分を含むであろう。適した光学成分の例として、レンズ、鏡、プリズム、回折格子、色ガラスフィルター、狭帯域干渉フィルター、広帯域干渉フィルター、二色性反射鏡、光ファイバー、光導波路その他が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、機器システムは、マイクロウェルアレイへと励起光を送達するための導波路として光学的に透明なマイクロアレイ基材を使用することができる。イメージングモードの選択は、他の種類のアッセイの確率論的標識化／分子指標化アッセイと並行した実施の使用、例えば、明視野イメージングによるトリパンブルー生細胞／死細胞アッセイの使用、蛍光イメージングによる蛍光に基づく生細胞／死細胞アッセイの使用等を可能にすることもできる。関連するマイクロウェルにおける各ビーズに関連した細胞タグと、個々の細胞の生存率データの相関は、マルチプレックス化単一細胞アッセイのデータの分析における判別の追加的なレベルをもたらすことができる。あるいは、複数の細胞の統計の形態の生存率データは、アッセイの分析的能力および品質保証を増強するために用いることができる。
【０１２９】
一部の実施形態では、システムは、マイクロウェルアレイを探索するための非イメージングおよび／または非光学能力を含み得る。捕捉された気泡を検出するため、アレイにわたる細胞および／またはビーズ分布を決定するため等の非イメージングおよび／または非光学技法の例として、光散乱の測定、紫外／可視／赤外吸収測定（例えば、染色された細胞および／または色素を取り込むビーズを使用）、コヒーレントラマン散乱およびコンダクタンス測定（例えば、マイクロウェルアレイと一致する電極の微細加工されたアレイを使用）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３０】
システムプロセッサおよびソフトウェア
一般に、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化／分子指標化アッセイの自動化を支持するように設計された機器システムは、（ｉ）機器制御機能性、（ｉｉ）画像処理および分析能力、ならびに（ｉｉｉ）データストレージ、分析およびディスプレイ機能性を提供するためのソフトウェアと共に、プロセッサまたはコンピュータを含むであろう。
【０１３１】
多くの実施形態では、機器システムは、コンピュータ（またはプロセッサ）と、ユーザーインターフェイスならびに全システム機能の手動、半自動または全自動制御、即ち、フルイディクスシステム、温度制御システム、細胞および／またはビーズ分布機能、磁性ビーズ操作機能、ならびにイメージングシステムの制御を提供するためのコードを含むコンピュータ可読媒体とを含むであろう。機器制御ソフトウェアによって提供される流体制御機能の例として、容積測定的流体流量、流体流動速度、試料およびビーズ添加、試薬添加ならびにリンスステップのタイミングおよび持続時間が挙げられるがこれらに限定されない。機器制御ソフトウェアによって提供される温度制御機能の例として、温度セットポイント（複数可）の特定、ならびに温度変化のタイミング、持続時間およびランプ速度の制御が挙げられるがこれらに限定されない。機器制御ソフトウェアによって提供される細胞および／またはビーズ分布機能の例として、振幅、頻度および持続時間等、揺動パラメータの制御が挙げられるがこれらに限定されない。機器制御ソフトウェアによって提供される磁場機能の例として、印加された磁場（複数可）のタイミングおよび持続時間、電磁石の場合は、その上、磁場の強度が挙げられるがこれらに限定されない。機器制御ソフトウェアによって提供されるイメージングシステム制御機能の例として、オートフォーカス能力、照明および／または励起光露光時間および強度の制御、画像取得速度、露光時間の制御およびデータストレージオプションが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３２】
機器システムの一部の実施形態では、システムは、画像処理および分析能力を提供するためのコードを含むコンピュータ可読媒体をさらに含むであろう。ソフトウェアによって提供される画像処理および分析能力の例として、手動、半自動または全自動画像露出補正（例えば、ホワイトバランス、コントラスト補正、信号加算平均および他のノイズ低下能力等）、自動物体同定（即ち、画像における細胞およびビーズを同定するための）、自動統計分析（即ち、マイクロウェルアレイの単位面積当たりの同定される細胞および／もしくはビーズの数を決定するため、または２個以上の細胞もしくは２個以上のビーズを含有するウェルを同定するための）および手動測定能力（例えば、物体間の距離を測定するため等の）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、機器制御および画像処理／分析ソフトウェアは、別々のソフトウェアモジュールとして書き込まれるであろう。一部の実施形態では、機器制御および画像処理／分析ソフトウェアは、統合されたパッケージに取り込まれるであろう。一部の実施形態では、システムソフトウェアは、最適な細胞／ビーズ分布が達成されるまで細胞およびビーズ試料ロードステップを延長または反復できるように、統合されたリアルタイム画像分析および機器制御を提供することができる。
【０１３３】
機器システムの一部の実施形態では、システムは、配列データ分析を提供するためのコードを含むコンピュータ可読媒体を含むであろう。データ分析ソフトウェアによって提供され得る配列データ分析機能性の例として、（ｉ）アッセイ実施により作製されるオリゴヌクレオチドライブラリーの配列決定によってもたらされるデータに基づき、細胞１個当たりの遺伝子１種当たりのリードの数および細胞１個当たりの遺伝子１種当たりの特有の転写物分子の数を決定するためのアルゴリズム、（ｉｉ）配列決定データの統計分析、例えば、細胞１個当たりの遺伝子１種当たりの転写物分子の数の決定のための信頼区間を予測するための主成分分析等、（ｉｉｉ）公知の参照配列と遺伝子配列データの整列のための配列整列能力、（ｉｖ）試料バーコード、細胞バーコードおよび分子バーコードのデコード／逆マルチプレックス化（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）、ならびに（ｖ）増幅または配列決定誤差を補償するための分子標識の自動クラスタリングが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３４】
一般に、図７６に説明する通り、ここに開示されている機器システムに含まれるコンピュータまたはプロセッサは、媒体５１１、および／または媒体５１２が固定されたサーバー５０９に任意選択で接続することができるネットワークポート５０５から命令を読み取ることができる論理的装置としてさらに理解することができる。図７６に示すもの等、システム５００は、ＣＰＵ５０１と、ディスクドライブ５０３と、キーボード５１５および／またはマウス５１６等、任意選択の入力デバイスと、任意選択のモニタ５０７とを含み得る。データ通信は、表示の通信媒体により、ローカルまたは遠隔位置におけるサーバーに達成することができる。通信媒体は、データを伝達するおよび／または受け取るいずれかの手段を含み得る。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続またはインターネット接続となり得る。かかる接続は、ワールドワイドウェブにわたる通信を提供することができる。図７６に説明する通り、パーティー５２２による受信および／または検討のために、かかるネットワークまたは接続にわたって本開示に関するデータを伝達することができることが想定される。
【０１３５】
図７７は、本開示の例としての実施形態に関連して使用することができる、コンピュータシステム１００の第１の例としてのアーキテクチャを説明するブロック図である。図７７に描写する通り、例としてのコンピュータシステムは、命令を処理するためのプロセッサ１０２を含み得る。プロセッサの非限定例として、Ｉｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ（商標）プロセッサ、ＡＭＤ  Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサ、Ｓａｍｓｕｎｇ  ３２ビットＲＩＳＣ  ＡＲＭ  １１７６ＪＺ（Ｆ）−Ｓ  ｖ１．０（商標）プロセッサ、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｓ５ＰＣ１００（商標）プロセッサ、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ａｐｐｌｅ  Ａ４（商標）プロセッサ、Ｍａｒｖｅｌｌ  ＰＸＡ９３０（商標）プロセッサまたは機能的に均等なプロセッサが挙げられる。実行の複数のスレッドは、並列処理のために使用することができる。一部の実施形態では、単一のコンピュータシステム内であれ、クラスター内であれ、または複数のコンピュータ、携帯電話および／もしくはパーソナルデータアシスタントデバイスを含むネットワークによりシステムにわたり分布されているのであれ、複数のプロセッサまたは複数のコアを有するプロセッサを使用することもできる。
【０１３６】
図７７に説明する通り、高速キャッシュ１０４は、プロセッサ１０２に接続するまたはこれに取り込んで、プロセッサ１０２によって近年または頻繁に使用される命令またはデータのための高速メモリを提供することができる。プロセッサ１０２は、プロセッサバス１０８によってノースブリッジ（ｎｏｒｔｈ  ｂｒｉｄｇｅ）１０６に接続される。ノースブリッジ１０６は、メモリバス１１２によってランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）１１０に接続され、プロセッサ１０２によりＲＡＭ１１０へのアクセスを管理する。ノースブリッジ１０６は、チップセットバス（ｃｈｉｐｓｅｔ  ｂｕｓ）１１６によってサウスブリッジ（ｓｏｕｔｈ  ｂｒｉｄｇｅ）１１４にも接続される。続いてサウスブリッジ１１４は、周辺バス（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｕｓ）１１８に接続される。周辺バスは、例えば、ＰＣＩ、ＰＣＩ−Ｘ、ＰＣＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓまたは他の周辺バスとなり得る。ノースブリッジおよびサウスブリッジは、多くの場合、プロセッサチップセットと称され、周辺バス１１８におけるプロセッサ、ＲＡＭおよび周辺成分の間のデータ転送を管理する。一部の代替的アーキテクチャにおいて、別々のノースブリッジチップを使用する代わりに、ノースブリッジの機能性をプロセッサに取り込むことができる。
【０１３７】
一部の実施形態では、システム１００は、周辺バス１１８に付着させたアクセラレータカード１２２を含み得る。アクセラレータは、ある特定の処理を加速するためのフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または他のハードウェアを含み得る。例えば、アクセラレータは、適合性データ再構成または伸長されたセット処理において使用される代数式を評価するために使用することができる。
【０１３８】
ソフトウェアおよびデータは、外部ストレージ１２４において記憶され、プロセッサによる使用のためにＲＡＭ１１０および／またはキャッシュ１０４にロードすることができる。システム１００は、システムリソースを管理するためのオペレーティングシステムを含む；オペレーティングシステムの非限定例として、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）および他の機能的に均等なオペレーティングシステム、ならびにデータストレージを管理するためのオペレーティングシステムの上で実行するアプリケーションソフトウェアおよび本発明の例としての実施形態に従った最適化が挙げられる。
【０１３９】
この例では、システム１００は、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）および分布された並列処理に使用することができる他のコンピュータシステム等、外部ストレージへのネットワークインターフェイスを提供するための周辺バスに接続されたネットワークインターフェイスカード（ＮＩＣ）１２０および１２１も含む。
【０１４０】
図７８は、複数のコンピュータシステム２０２ａおよび２０２ｂ、複数の携帯電話およびパーソナルデータアシスタント２０２ｃ、ならびにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）２０４ａおよび２０４ｂを有するネットワーク２００を示す図表である。例としての実施形態では、システム２１２ａ、２１２ｂおよび２１２ｃは、データストレージを管理し、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）２１４ａおよび２１４ｂに記憶されたデータのためのデータアクセスを最適化することができる。数学的モデルは、データに使用し、コンピュータシステム２１２ａおよび２１２ｂならびに携帯電話およびパーソナルデータアシスタントシステム２１２ｃにわたる分布された並列処理を使用して評価することができる。コンピュータシステム２１２ａおよび２１２ｂならびに携帯電話およびパーソナルデータアシスタントシステム２１２ｃは、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）２１４ａおよび２１４ｂに記憶されたデータの適合性データ再構成のための並列処理を提供することもできる。図７８は、単なる例を説明し、多種多様な他のコンピュータアーキテクチャおよびシステムを、本発明の様々な実施形態と併せて使用することができる。例えば、ブレードサーバーを使用して、並列処理を提供することができる。プロセッサブレードは、バックプレーンにより接続して、並列処理を提供することができる。ストレージは、バックプレーンに、または別々のネットワークインターフェイスによるネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）として接続することもできる。
【０１４１】
一部の例としての実施形態では、プロセッサは、別々のメモリスペースを維持し、ネットワークインターフェイス、バックプレーンまたは他のプロセッサにより並列処理するための他のコネクタによりデータを伝達することができる。他の実施形態では、プロセッサの一部または全ては、共有されるバーチャルアドレスメモリスペースを使用することができる。
【０１４２】
図７９は、例としての実施形態に従った、共有されるバーチャルアドレスメモリスペースを使用したマルチプロセッサコンピュータシステム３００のブロック図である。システムは、共有されるメモリサブシステム３０４にアクセスすることができる複数のプロセッサ３０２ａ〜ｆを含む。システムは、メモリサブシステム３０４において複数のプログラム可能なハードウェアメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）３０６ａ〜ｆを取り込む。各ＭＡＰ３０６ａ〜ｆは、メモリ３０８ａ〜ｆおよび１個または複数のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）３１０ａ〜ｆを含み得る。ＭＡＰは、設定可能な機能的単位を提供し、特定のアルゴリズムまたはアルゴリズムの部分は、それぞれのプロセッサと密接に協調して処理するためにＦＰＧＡ３１０ａ〜ｆに提供され得る。例えば、ＭＡＰを使用して、データモデルに関する代数式を評価し、例としての実施形態における適合性データ再構成を行うことができる。この例では、各ＭＡＰは、これらの目的のために全プロセッサによりグローバルにアクセス可能である。一構成において、各ＭＡＰは、ダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用して、関連するメモリ３０８ａ〜ｆにアクセスし、これに、それぞれのマイクロプロセッサ３０２ａ〜ｆとは独立的かつ非同期的にタスクを実行させることができる。この構成において、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン化および並列実行のために、別のＭＡＰに直接的に結果をフィードすることができる。
【０１４３】
上述のコンピュータアーキテクチャおよびシステムは、単なる例であり、多種多様な他のコンピュータ、携帯電話ならびにパーソナルデータアシスタントアーキテクチャおよびシステムを、例としての実施形態に関連して使用することができ、一般的プロセッサ、コプロセッサ、ＦＰＧＡおよび他のプログラム可能な論理デバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）ならびに他の処理および論理要素のいずれかの組合せを使用したシステムが挙げられる。一部の実施形態では、ソフトウェアまたはハードウェアにおいて、コンピュータシステムの全体または部分を実行することができる。データストレージ媒体のいずれかの変種を、例としての実施形態に関連して使用することができ、ランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）ならびに他のローカルまたは分布されたデータストレージデバイスおよびシステムが挙げられる。
【０１４４】
例としての実施形態では、本開示のコンピュータサブシステムは、上述または他のコンピュータアーキテクチャおよびシステムのいずれかにおいて実行するソフトウェアモジュールを使用して実行することができる。他の実施形態では、システムの機能は、ファームウェア、図７９に参照されるフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）等のプログラム可能な論理デバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）または他の処理および論理要素において部分的にまたは完全に実行することができる。例えば、図７７に説明されているアクセラレータカード１２２等、ハードウェアアクセラレータカードの使用によるハードウェア加速により、Ｓｅｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを実行することができる。
【０１４５】
オリゴヌクレオチド（例えば、分子バーコード）
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数のオリゴヌクレオチドまたはその使用を含み得る。オリゴヌクレオチドは、本明細書に開示されている固体支持体に付着させることができる。固体支持体へのオリゴヌクレオチドの付着は、固体支持体およびオリゴヌクレオチドにおける官能基の対により起こり得る。オリゴヌクレオチドは、分子バーコードと称され得る。オリゴヌクレオチドは、標識（例えば、分子標識、細胞性標識）またはタグ（例えば、試料タグ）と称され得る。
【０１４６】
オリゴヌクレオチドは、ユニバーサル標識を含み得る。ユニバーサル標識は、試料における全オリゴヌクレオチドで同じものとなり得る。ユニバーサル標識は、オリゴヌクレオチドのセットにおけるオリゴヌクレオチドで同じものとなり得る。ユニバーサル標識は、オリゴヌクレオチドの２またはそれを超えるセットで同じものとなり得る。ユニバーサル標識は、配列決定プライマーにハイブリダイズすることができる核酸の配列を含み得る。配列決定プライマーは、ユニバーサル標識を含むオリゴヌクレオチドの配列決定に使用することができる。配列決定プライマー（例えば、ユニバーサル配列決定プライマー）は、ハイスループット配列決定プラットフォームに関連する配列決定プライマーを含み得る。ユニバーサル標識は、ＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることができる核酸の配列を含み得る。ユニバーサル標識は、配列決定プライマーおよびＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることができる核酸の配列を含み得る。配列決定および／またはＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることができるユニバーサル標識の核酸の配列は、プライマー結合部位と称され得る。ユニバーサル標識は、オリゴヌクレオチドの転写開始に使用することができる配列を含み得る。ユニバーサル標識は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の領域の伸長に使用することができる配列を含み得る。ユニバーサル標識は、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれを超えるヌクレオチドの長さとなり得る。ユニバーサル標識は、少なくとも約１０個のヌクレオチドを含み得る。ユニバーサル標識は、最大でも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれを超えるヌクレオチドの長さとなり得る。
【０１４７】
オリゴヌクレオチドは、細胞性標識を含み得る。細胞性標識は、いずれの細胞にオリゴヌクレオチドが接触されるかに関する情報を提供することができる核酸配列を含み得る（例えば、いずれの核酸がいずれの細胞に起源をもつかを決定する）。同じ固体支持体におけるオリゴヌクレオチドの少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％は、同じ細胞性標識を含み得る。同じ固体支持体におけるオリゴヌクレオチドの少なくとも６０％は、同じ細胞性標識を含み得る。同じ固体支持体におけるオリゴヌクレオチドの少なくとも９５％は、同じ細胞性標識を含み得る。同じ固体支持体における全オリゴヌクレオチドは、同じ細胞性標識を含み得る。第１の固体支持体におけるオリゴヌクレオチドの細胞性標識は、第２の固体支持体におけるオリゴヌクレオチドの細胞性標識とは異なり得る。
【０１４８】
細胞性標識は、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれを超えるヌクレオチドの長さとなり得る。細胞性標識は、最大でも約３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４個またはそれより少ないもしくはそれを超えるヌクレオチドの長さとなり得る。細胞性標識は、約５〜約２００個の間のヌクレオチドを含み得る。細胞性標識は、約１０〜約１５０個の間のヌクレオチドを含み得る。細胞性標識は、約２０〜約１２５個の間のヌクレオチドの長さを含み得る。
【０１４９】
オリゴヌクレオチドは、分子標識を含み得る。分子標識は、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる特異的核酸種に関する情報の同定を提供し得る核酸配列を含み得る。同じ固体支持体にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドは、異なる分子標識を含み得る。このようにして、分子標識は、異なるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする標的核酸の種類（例えば、遺伝子）を識別することができる。分子標識は、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれを超えるヌクレオチドの長さとなり得る。分子標識は、最大でも約３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４個またはそれより少ないヌクレオチドの長さとなり得る。
【０１５０】
オリゴヌクレオチドは、試料標識（例えば、試料指標）を含み得る。試料標識は、標的核酸がいずれに起源をもつかに関する情報を提供することができる核酸配列を含み得る。例えば、試料標識は、異なる実験において使用される異なる固体支持体において異なり得る。試料標識は、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれを超えるヌクレオチドの長さとなり得る。試料標識は、最大でも約３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４個またはそれより少ないヌクレオチドの長さとなり得る。
【０１５１】
オリゴヌクレオチドは、ユニバーサル標識、細胞性標識、分子標識および試料標識またはこれらのいずれかの組合せを含み得る。組合せにおいて、試料標識を使用して、試料間の標的核酸を識別することができ、細胞性標識を使用して、試料における異なる細胞由来の標的核酸を識別することができ、分子標識を使用して、細胞における異なる標的核酸を識別することができ（例えば、同じ標的核酸の異なるコピー）、ユニバーサル標識を使用して、標的核酸を増幅および配列決定することができる。
【０１５２】
ユニバーサル標識、分子標識、細胞性標識、リンカー標識および／または試料標識は、ヌクレオチドのランダム配列を含み得る。ヌクレオチドのランダム配列は、コンピュータで作成することができる。ヌクレオチドのランダム配列は、これに関連するパターンを持たなくてよい。ユニバーサル標識、分子標識、細胞性標識、リンカー標識および／または試料標識は、ヌクレオチドの非ランダム（例えば、ヌクレオチドは、パターンを含む）配列を含み得る。ユニバーサル標識、分子標識、細胞性標識、リンカー標識および／または試料標識の配列は、市販の配列となり得る。ユニバーサル標識、分子標識、細胞性標識、リンカー標識および／または試料標識の配列は、ランダマー（ｒａｎｄｏｍｅｒ）配列を含み得る。ランダマー配列は、所定の長さのランダマーのあらゆる可能な配列で構成されたオリゴヌクレオチド配列を指すことができる。それに代えてまたはそれに加えて、ユニバーサル標識、分子標識、細胞性標識、リンカー標識および／または試料標識は、ヌクレオチドの既定の配列を含み得る。
【０１５３】
図１は、ユニバーサル標識、細胞性標識および分子標識を含む、本開示の例示的なオリゴヌクレオチドを示す。
【０１５４】
図３は、オリゴヌクレオチド（３１２）にカップリングされた固体支持体（３０１）を含む、例示的なオリゴヌクレオチドがカップリングされた固体支持体を示す。オリゴヌクレオチド（３１２）は、化学基（５’アミン、３０２）、ユニバーサル標識（３０３）、細胞性標識（３１１）、分子標識（分子ＢＣ、３１１）および標的結合領域（オリゴｄＴ、３１０）を含む。この模式図において、細胞性標識（３１１）は、第１の細胞標識（ＣＬパート１、３０４）、第１のリンカー（リンカー１、３０５）、第２の細胞標識（ＣＬパート２、３０６）、第２のリンカー（リンカー２、３０７）、第３の細胞標識（ＣＬパート３、３０８）を含む。細胞性標識（３１１）は、固体支持体におけるオリゴヌクレオチド毎に共通である。２個またはそれを超えるビーズに対する細胞性標識（３１１）は、異なり得る。２個またはそれを超えるビーズに対する細胞性標識（３１１）は、細胞標識（例えば、ＣＬパート１（３０４）、ＣＬパート２（３０６）、ＣＬパート３（３０８））が異なり得る。２個またはそれを超えるビーズに対する細胞性標識（３１１）は、第１の細胞標識（３０４）、第２の細胞標識（３０６）、第３の細胞標識（３０８）またはこれらの組合せが異なり得る。細胞性標識（３１１）の第１および第２のリンカー（３０３、３０５）は、２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドがカップリングされた固体支持体で同一となり得る。ユニバーサル標識（３０３）は、２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドがカップリングされた固体支持体で同一となり得る。ユニバーサル標識（３０３）は、同じ固体支持体における２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドで同一となり得る。分子標識（３１１）は、固体支持体における少なくとも２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドで異なり得る。固体支持体は、１００種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドを含み得る。固体支持体は、１０００種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドを含み得る。固体支持体は、１００００種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドを含み得る。固体支持体は、１０００００種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドを含み得る。
【０１５５】
ユニバーサル標識、細胞性標識および分子標識に加えて、オリゴヌクレオチドは、標的結合領域を含み得る。標的結合領域は、標的核酸（例えば、分析しようとする細胞の核酸）に結合することができる核酸配列を含み得る。標的結合領域は、遺伝子特異的配列となり得る。例えば、標的結合領域は、特異的標的核酸の特異的位置に付着させる（例えば、ハイブリダイズする）ことができる核酸配列を含み得る。標的結合領域は、非特異的標的核酸配列を含み得る。非特異的標的核酸配列は、標的核酸の特異的配列とは独立的に、複数の標的核酸に結合することができる配列を指すことができる。例えば、標的結合領域は、ランダムマルチマー配列またはオリゴｄＴ配列（例えば、ｍＲＮＡのポリアデニル化テイルにハイブリダイズすることができるひと続きのチミジンヌクレオチド）を含み得る。ランダムマルチマー配列は、例えば、ランダムダイマー、トリマー、クアトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーまたはいずれかの長さのより高次のマルチマー配列となり得る。標的結合領域は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれを超えるヌクレオチドの長さとなり得る。標的結合領域は、最大でも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれを超えるヌクレオチドの長さとなり得る。
【０１５６】
オリゴヌクレオチドは、複数の標識を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７もしくは８種またはそれを超えるユニバーサル標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、最大でも約１、２、３、４、５、６、７もしくは８種またはそれを超えるユニバーサル標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７もしくは８種またはそれを超える細胞性標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、最大でも約１、２、３、４、５、６、７もしくは８種またはそれを超える細胞性標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７もしくは８種またはそれを超える分子標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、最大でも約１、２、３、４、５、６、７もしくは８種またはそれを超える分子標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７もしくは８種またはそれを超える試料標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、最大でも約１、２、３、４、５、６、７もしくは８種またはそれを超える試料標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７もしくは８種またはそれを超える標的結合領域を含み得る。オリゴヌクレオチドは、最大でも約１、２、３、４、５、６、７もしくは８種またはそれを超える標的結合領域を含み得る。
【０１５７】
オリゴヌクレオチドが、２種類以上の標識（例えば、２種以上の細胞性標識または２種以上の分子標識）を含む場合、標識は、リンカー標識配列が散在していてよい。リンカー標識配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれを超えるヌクレオチドの長さとなり得る。リンカー標識配列は、最大でも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれを超えるヌクレオチドの長さとなり得る。場合によっては、リンカー標識配列は、１２個のヌクレオチドの長さである。リンカー標識配列を使用して、図２Ａの図表に示されているようなオリゴヌクレオチドの合成を容易にすることができる。
【０１５８】
固体支持体にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドの数は、細胞における標的核酸の数よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍多くなり得る。場合によっては、オリゴヌクレオチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％が、標的核酸によって結合される。場合によっては、オリゴヌクレオチドの最大でも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％が、標的核酸によって結合される。場合によっては、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００種またはそれを超える異なる標的核酸が、固体支持体におけるオリゴヌクレオチドによって捕捉される。場合によっては、最大でも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００種またはそれを超える異なる標的核酸が、固体支持体におけるオリゴヌクレオチドによって捕捉される。
【０１５９】
ポリマーは、追加的な固体支持体を含み得る。例えば、ポリマーは、ビーズが点在し得る。ビーズは、ポリマーの異なる領域に空間的に位置し得る。本開示のオリゴヌクレオチドを含むビーズまたは支持体は、空間的にアドレスを指定することができる。ビーズまたは支持体は、ポリマーにおける空間的アドレスに相当するバーコードを含み得る。例えば、複数のビーズまたは支持体の各ビーズまたは支持体は、複数のマイクロウェルのアレイまたは特定のマイクロ壁におけるポジション等、ポリマーにおけるポジションに相当するバーコードを含み得る。空間的アドレスをデコードして、ビーズまたは支持体がポジショニングされた位置を決定することができる。例えば、バーコード等、空間的アドレスは、バーコードへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによりまたはバーコードの配列決定によりデコードすることができる。あるいは、ビーズまたは支持体は、空間的アドレスデコード目的のために、グラフィック特色、化学基、色、蛍光またはこれらのいずれかの組合せ等、他の種類のバーコードを有することができる。
【０１６０】
本明細書に開示されている方法およびキットは、分子バーコードの１または複数のセットを含み得る。１種または複数の分子バーコードは、試料指標領域および標識領域を含み得る。分子バーコードのセットの２種またはそれを超える分子バーコードは、同じ試料指標領域および２種またはそれを超える異なる標識領域を含み得る。分子バーコードの２またはそれを超えるセットの２種またはそれを超える分子バーコードは、２種またはそれを超える異なる試料指標領域を含み得る。分子バーコードのセット由来の２種またはそれを超える分子バーコードは、異なる標識領域を含み得る。分子バーコードの２またはそれを超えるセットの２種またはそれを超える分子バーコードは、同じ標識領域を含み得る。分子バーコードの２またはそれを超えるセット由来の分子バーコードは、それらの試料指標領域が異なり得る。分子バーコードの２またはそれを超えるセット由来の分子バーコードは、それらの標識領域に基づき同様となり得る。
【０１６１】
分子バーコードは、標的特異的領域、アダプター領域、ユニバーサルＰＣＲ領域、標的特異的領域またはこれらのいずれかの組合せをさらに含み得る。分子バーコードは、ユニバーサルＰＣＲ領域および標的特異的領域を含み得る。分子バーコードは、１種または複数の二次構造を含み得る。分子バーコードは、ヘアピン構造を含み得る。分子バーコードは、標的特異的領域および切断可能ステムを含み得る。
【０１６２】
本明細書に開示されている方法およびキットは、試料タグの１または複数のセットを含み得る。１種または複数の試料タグは、試料指標領域を含み得る。１種または複数の試料タグは、試料指標領域を含み得る。試料タグのセットの２種またはそれを超える試料タグは、同じ試料指標領域を含み得る。試料タグの２またはそれを超えるセットの２種またはそれを超える試料タグは、２種またはそれを超える異なる試料指標領域を含み得る。
【０１６３】
試料タグは、標的特異的領域、アダプター領域、ユニバーサルＰＣＲ領域、標的特異的領域またはこれらのいずれかの組合せをさらに含み得る。試料タグは、ユニバーサルＰＣＲ領域および標的特異的領域を含み得る。試料タグは、１種または複数の二次構造を含み得る。試料タグは、ヘアピン構造を含み得る。試料タグは、標的特異的領域および切断可能ステムを含み得る。
【０１６４】
本明細書に開示されている方法およびキットは、分子識別子標識の１または複数のセットを含み得る。１種または複数の分子識別子標識は、標識領域を含み得る。１種または複数の分子識別子標識は、標識領域を含み得る。分子識別子標識のセットの２種またはそれを超える分子識別子標識は、２種またはそれを超える異なる標識領域を含み得る。分子識別子標識の２またはそれを超えるセットの２種またはそれを超える分子識別子標識は、２種またはそれを超える同一標識領域を含み得る。分子識別子標識は、標的特異的領域、アダプター領域、ユニバーサルＰＣＲ領域、標的特異的領域またはこれらのいずれかの組合せをさらに含み得る。分子識別子標識は、ユニバーサルＰＣＲ領域および標的特異的領域を含み得る。分子識別子標識は、１種または複数の二次構造を含み得る。分子識別子標識は、ヘアピン構造を含み得る。分子識別子標識は、標的特異的領域および切断可能ステムを含み得る。
【０１６５】
分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチドまたは塩基対を含み得る。別の例では、試料タグまたは分子識別子標識は、少なくとも約１５００、２，０００；２５００、３，０００；３５００、４，０００；４５００、５，０００；５５００、６，０００；６５００、７，０００；７５００、８，０００；８５００、９，０００；９５００または１０，０００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。
【０１６６】
分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、マルチマー、例えば、ランダムマルチマーとなり得る。マルチマー配列は、例えば、非ランダムまたはランダムダイマー、トリマー、クアトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーまたはいずれかの長さのより高次のマルチマー配列となり得る。タグは、モノヌクレオチドのセットからランダムに作製することができる。タグは、モノヌクレオチドをランダムに取り込むことにより組み立てることができる。
【０１６７】
分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識を、無作為さがないように組み立て、ランダムに作製されていないが、方法の実施に十分な数の異なるタグを含む異なるタグのライブラリーを作製することもできる。
【０１６８】
一部の実施形態では、分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、標的核酸における削減を含み得る。削減は、例えば、標的核酸の一末端または両末端の酵素消化となり得る。削減は、付加された分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の付加と併せて使用することができる。削減および付加されたタグの組合せは、特定の出発分子に関する情報を含有することができる。検出が、ランダム削減および付加されたオリゴヌクレオチドの両方の決定を可能にする場合、分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識にランダム削減を付加することにより、付加されたタグのより小さい多様性が、標的核酸の数の計数に必要となり得る。
【０１６９】
分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、標的特異的領域を含み得る。標的特異的領域は、分子に相補的な配列を含み得る。場合によっては、分子は、ｍＲＮＡ分子であり、標的特異的領域は、ｍＲＮＡ分子のポリＡテイルに相補的なオリゴｄＴ配列を含む。標的特異的領域は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ合成のためのプライマーとして作用することもできる。例えば、標的特異的領域のオリゴｄＴ配列は、ｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡコピーの第１鎖合成のためのプライマーとして作用することができる。あるいは、標的特異的領域は、分子のいずれかの部分に相補的な配列を含む。他の事例では、標的特異的領域は、分子にハイブリダイズまたはライゲーションされ得るランダム配列を含む。標的特異的領域は、分子への試料タグまたは分子識別子標識の付着を可能にすることができる。試料タグまたは分子識別子標識の付着は、本明細書に開示されている方法（例えば、ハイブリダイゼーション、ライゲーション）のいずれかにより起こり得る。場合によっては、標的特異的領域は、１種または複数の制限酵素によって認識される配列を含む。標的特異的領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチドまたは塩基対を含み得る。別の例では、標的特異的領域は、少なくとも約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００または１００００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。好ましくは、標的特異的領域は、少なくとも約５〜１０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜３０、１５〜３０または２０〜３０ヌクレオチドまたは塩基対を含む。
【０１７０】
場合によっては、標的特異的領域は、特定の遺伝子または遺伝子産物に特異的である。例えば、標的特異的領域は、ｐ５３遺伝子または遺伝子産物の領域に相補的な配列を含む。したがって、試料タグおよび分子識別子標識は、ｐ５３特異的配列を含む分子に単に付着させることができる。あるいは、標的特異的領域は、複数の異なる遺伝子または遺伝子産物に特異的である。例えば、標的特異的領域は、オリゴｄＴ配列を含む。したがって、試料タグおよび分子識別子標識は、ポリＡ配列を含むいずれかの分子に付着させることができる。別の例では、標的特異的領域は、複数の異なる遺伝子または遺伝子産物に相補的なランダム配列を含む。よって、試料タグまたは分子識別子標識は、標的特異的領域に相補的な配列を有するいずれかの分子に付着させることができる。他の事例では、標的特異的領域は、制限部位オーバーハング（例えば、ＥｃｏＲＩ粘着末端オーバーハング）を含む。試料タグまたは分子識別子標識は、制限部位オーバーハングに相補的な配列を含むいずれかの分子にライゲーションすることができる。
【０１７１】
場合によっては、標的特異的領域は、特定のマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ産物に特異的である。例えば、標的特異的領域は、特異的マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ産物の領域に相補的な配列を含む。例えば、標的特異的領域は、マイクロＲＮＡの特異的パネルまたはマイクロＲＮＡ産物のパネルの領域に相補的な配列を含む。したがって、試料タグおよび分子識別子標識は、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｏＲＮＡ）特異的配列を含む分子に単に付着させることができる。あるいは、標的特異的領域は、複数の異なるマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ産物に特異的である。例えば、標的特異的領域は、共通配列を含有するマイクロＲＮＡのパネル等、２種またはそれを超えるマイクロＲＮＡに含まれる領域に相補的な配列を含む。したがって、試料タグおよび分子識別子標識は、共通マイクロＲＮＡ配列を含むいずれかの分子に付着させることができる。別の例では、標的特異的領域は、複数の異なるマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ産物に相補的なランダム配列を含む。よって、試料タグまたは分子識別子標識は、標的特異的領域に相補的な配列を有するいずれかのマイクロＲＮＡ分子に付着させることができる。他の事例では、標的特異的領域は、制限部位オーバーハング（例えば、ＥｃｏＲＩ粘着末端オーバーハング）を含む。試料タグまたは分子識別子標識は、制限部位オーバーハングに相補的な配列を含むいずれかのマイクロＲＮＡ分子にライゲーションすることができる。
【０１７２】
本明細書に開示されている分子バーコードまたは分子識別子標識は、多くの場合、標識領域を含む。標識領域を使用して、標的種の出現を特有に同定し、これにより、２種のそれ以外は同一またはほとんど同一の標的の間の識別に使用することができる識別子により各種をマークすることができる。複数の試料タグおよび分子識別子標識の標識領域は、異なる半導体ナノ結晶、金属化合物、ペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体、小分子、同位体、粒子またはそれに関連するもしくは包埋される異なる形状、色、バーコードもしくは回折パターンを有する構造、一連の数、タンパク質または核酸のランダム断片、異なる同位体、あるいはこれらのいずれかの組合せの収集を含み得る。標識領域は、縮重配列を含み得る。標識領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチドまたは塩基対を含み得る。別の例では、標識領域は、少なくとも約１５００；２，０００；２５００、３，０００；３５００、４，０００；４５００、５，０００；５５００、６，０００；６５００、７，０００；７５００、８，０００；８５００、９，０００；９５００または１０，０００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。好ましくは、標識領域は、少なくとも約１０〜３０、１５〜４０または２０〜５０ヌクレオチドまたは塩基対を含む。
【０１７３】
場合によっては、分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、ユニバーサルプライマー結合部位を含む。ユニバーサルプライマー結合部位は、標識された分子および／または標識されたアンプリコンへのユニバーサルプライマーの付着を可能にする。ユニバーサルプライマーは、本技術分野で周知であり、−４７Ｆ（Ｍ１３Ｆ）、ａｌｆａＭＦ、ＡＯＸ３’、ＡＯＸ５’、ＢＧＨ＿ｒ、ＣＭＶ＿−３０、ＣＭＶ＿−５０、ＣＶＭ＿ｆ、ＬＡＣｒｍｔ、ラムダｇｔ１０Ｆ、ラムダｇｔ  １０Ｒ、ラムダｇｔ１１Ｆ、ラムダｇｔ１１Ｒ、Ｍ１３  ｒｅｖ、Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ（−２０）、Ｍ１３Ｒｅｖｅｒｓｅ、ｍａｌｅ、ｐ１０ＳＥＱＰ＿ｐＱＥ、ｐＡ＿−１２０、ｐｅｔ＿４、ｐＧＡＰ  Ｆｏｒｗａｒｄ、ｐＧＬ＿ＲＶｐｒ３、ｐＧＬｐｒ２＿Ｒ、ｐＫＬＡＣ１＿４、ｐＱＥ＿ＦＳ、ｐＱＥ＿ＲＳ、ｐｕｃ＿Ｕ１、ｐｕｃ＿Ｕ２、ｒｅｖｅｒｓ＿Ａ、ｓｅｑ＿ＩＲＥＳ＿ｔａｍ、ｓｅｑ＿ＩＲＥＳ＿ｚｐｅｔ、ｓｅｑ＿ｏｒｉ、ｓｅｑ＿ＰＣＲ、ｓｅｑ＿ｐＩＲＥＳ−、ｓｅｑ＿ｐＩＲＥＳ＋、ｓｅｑ＿ｐＳｅｃＴａｇ、ｓｅｑ＿ｐＳｅｃＴａｇ＋、ｓｅｑ＿ｒｅｔｒｏ＋ＰＳＩ、ＳＰ６、Ｔ３−ｐｒｏｍ、Ｔ７−ｐｒｏｍおよびＴ７−ｔｅｒｍ＿Ｉｎｖが挙げられるがこれらに限定されない。ユニバーサルプライマー結合部位へのユニバーサルプライマーの付着は、標識された分子および／または標識されたアンプリコンの増幅、検出および／または配列決定に使用することができる。ユニバーサルプライマー結合部位は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチドまたは塩基対を含み得る。別の例では、ユニバーサルプライマー結合部位は、少なくとも約１５００；２，０００；２５００、３，０００；３５００、４，０００；４５００、５，０００；５５００、６，０００；６５００、７，０００；７５００、８，０００；８５００、９，０００；９５００または１０，０００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。好ましくは、ユニバーサルプライマー結合部位は、１０〜３０ヌクレオチドまたは塩基対を含む。
【０１７４】
分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、アダプター領域を含み得る。アダプター領域は、１種または複数のプローブのハイブリダイゼーションを可能にすることができる。アダプター領域は、１種または複数のＨＣＲプローブのハイブリダイゼーションを可能にすることができる。
【０１７５】
分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、１種または複数の検出可能な標識を含み得る。
【０１７６】
分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）のためのイニシエーターとして作用することができる。試料タグまたは分子識別子標識のアダプター領域は、ＨＣＲのためのイニシエーターとして作用することができる。ユニバーサルプライマー結合部位は、ＨＣＲのためのイニシエーターとして作用することができる。
【０１７７】
場合によっては、分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、一本鎖である。他の事例では、分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、二本鎖である。分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、直鎖状となり得る。あるいは、分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、二次構造を含む。本明細書において、「二次構造」は、三次、四次等…構造を含む。場合によっては、二次構造は、ヘアピン、ステム−ループ構造、内部ループ、バルジループ、分枝状構造もしくはシュードノット、複数のステムループ構造、クローバー型構造またはいずれかの三次元構造である。場合によっては、二次構造は、ヘアピンである。ヘアピンは、オーバーハング配列を含み得る。ヘアピンのオーバーハング配列は、ポリメラーゼ連鎖反応および／または逆転写反応のためのプライマーとして作用することができる。オーバーハング配列は、試料タグまたは分子識別子標識を付着させる分子に相補的な配列を含み、オーバーハング配列は、その分子にハイブリダイズする。オーバーハング配列は、その分子にライゲーションすることができ、ポリメラーゼ連鎖反応および／または逆転写反応のための鋳型として作用する。一部の実施形態では、分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、核酸および／または合成核酸および／または修飾された核酸を含む。
【０１７８】
場合によっては、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００種の異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）を含む。他の事例では、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）は、少なくとも約２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１，０００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；９，０００；または１００００種の異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）を含む。あるいは、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）は、少なくとも約２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；または１００，０００種の異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）を含む。
【０１７９】
複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の数は、多くの場合、標識しようとする分子の数を超過する。場合によっては、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の数は、標識しようとする分子の数よりも少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍多い。
【０１８０】
複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の数は、多くの場合、標識しようとする異なる分子の数を超過する。場合によっては、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の数は、標識しようとする異なる分子の数よりも少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍多い。
【０１８１】
場合によっては、分子の確率論的標識化は、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）を含み、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の濃度は、同じである。かかる事例では、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）は、等しい数の各異なる分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識を含む。
【０１８２】
場合によっては、分子の確率論的標識化は、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）を含み、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の濃度は、異なる。かかる事例では、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）は、異なる数の各異なる分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識を含む。
【０１８３】
場合によっては、一部の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）は、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における他の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）よりも高濃度で存在する。場合によっては、異なる濃度の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）による確率論的標識化は、使用される異なる標識の数を増加させることなく試料測定ダイナミックレンジを伸長させる。例えば、全て等濃度の１０種の異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）による３種の核酸試料分子の確率論的標識化を考慮してみる。３種の異なる標識の観察が予想される。次に、３種の核酸分子の代わりに、３０種の核酸分子を考慮してみると、全１０種の標識の観察が予想される。対照的に、１０種の異なる確率論的標識を同様に使用しつつ、標識の相対比を１：２：３：４…１０に変更した場合、３種の核酸分子を用いると、１〜３種の間の標識の観察が予想されるが、３０種の分子を用いると、およそ５種のみの標識の観察が予想され、よって、同数の確率論的標識による測定の範囲を伸長する。
【０１８４】
複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の相対比は、１：Ｘとなることができ、Ｘは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００である。あるいは、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における「ｎ」種の異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の相対比は、１：Ａ：Ｂ：Ｃ：…Ｚｎであり、Ａ、Ｂ、Ｃ…Ｚｎは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００である。
【０１８５】
場合によっては、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における２種またはそれを超える異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の濃度は、同じである。「ｎ」種の異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）に関して、少なくとも２、３、４、…ｎ種の異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の濃度は、同じである。あるいは、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における２種またはそれを超える異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の濃度は、異なる。「ｎ」種の異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）に関して、少なくとも２、３、４、…ｎ種の異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の濃度は、異なる。場合によっては、「ｎ」種の異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）に関して、少なくとも２、３、４、…ｎ種の異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の濃度の差は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００倍である。
【０１８６】
場合によっては、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％は、同じ濃度を有する。あるいは、複数の分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）における異なる分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％は、異なる濃度を有する。
【０１８７】
図６５に示す通り、分子バーコード（１００４）は、別々に合成することができる。分子バーコード（１００４）は、ユニバーサルＰＣＲ領域（１００１）、１種または複数の識別子領域（１００２）および標的特異的領域を含み得る。１種または複数の識別子領域は、試料指標領域、標識領域またはこれらの組合せを含み得る。１種または複数の識別子領域は隣接していてよい。１種または複数の識別子領域は、隣接していなくてよい。個々の分子バーコードをプールして、複数の異なる識別子領域を含む複数の分子バーコード（１００５）を生成することができる。試料タグは、図６５に描写されているものと同様の様式で合成することができ、１種または複数の識別子領域は、試料指標領域を含む。分子識別子標識は、図６５に描写されているものと同様の様式で合成することができ、１種または複数の識別子領域は、標識領域を含む。
【０１８８】
標的特異的領域を識別子領域にライゲーションして、標的特異的領域を含む分子バーコードを生成することができる。５’および３’エキソヌクレアーゼを反応に添加して、ライゲーションされていない産物を除去することができる。分子バーコードは、ユニバーサルプライマー結合部位、標識領域および標的特異的領域を含み得、５’および３’エキソヌクレアーゼに対し抵抗性となることができる。本明細書において、用語「ユニバーサルプライマー結合部位」および「ユニバーサルＰＣＲ領域」は、互換的に使用することができ、増幅反応のプライミングに使用することができる配列を指すことができる。ライゲーションされた識別子領域由来の３’リン酸基を除去して、３’リン酸基のない分子バーコードを生成することができる。３’リン酸基は、酵素により除去することができる。例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、３’リン酸基を除去することができる。
【０１８９】
分子バーコードを合成する別の方法は、図６６Ａに描写されている。図６６Ａに示す通り、分子バーコード（１１２８）は、２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチド断片（１１２１および１１２７）をライゲーションすることにより合成することができる。一方のオリゴヌクレオチド断片（１１２１）は、ユニバーサルプライマー結合部位（１１２２）、識別子領域（１１２３）および第１のスプリント（１１２３）を含み得る。他方のオリゴヌクレオチド断片（１１２８）は、第２のスプリント（１１２５）および標的特異的領域（１１２６）を含み得る。リガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）を使用して、２種のオリゴヌクレオチド断片（１１２１および１１２７）を連結して、分子バーコード（１１２８）を生成することができる。第１のスプリント（１１２４）および第２のスプリント（１１２５）の二本鎖ライゲーションは、ブリッジスプリント（１１２９）を有する分子バーコード（１１２８）を生成することができる。
【０１９０】
２種のオリゴヌクレオチド断片のライゲーションにより分子バーコードを合成する代替的方法は、図６６Ｂに描写されている。図６６Ｂに示す通り、分子バーコード（１１５８）は、２種のオリゴヌクレオチド断片（１１５０および１１５８）のライゲーションにより合成される。一方のオリゴヌクレオチド断片（１１５０）は、ユニバーサルプライマー結合部位（１１５１）、１種または複数の識別子領域（１１５２）およびライゲーション配列（１１５３）を含み得る。他方のオリゴヌクレオチド断片（１１５８）は、第１のオリゴヌクレオチド断片（１１５０）のライゲーション配列（１１５３）に相補的なライゲーション配列（１１５４）、標的特異的領域（１１５５）の相補体および標識（１１５６）を含み得る。オリゴヌクレオチド断片（１１５９）は、オリゴヌクレオチド断片の伸長を防ぐ３’リン酸を含むこともできる。図６６Ｂのステップ１に示す通り、２種のオリゴヌクレオチド断片のライゲーション配列（１１５３および１１５４）は、アニールすることができ、ポリメラーゼを使用して、第１のオリゴヌクレオチド断片（１１５０）の３’末端を伸長させて、分子バーコード（１１５８）を生成することができる。分子バーコード（１１５８）は、ユニバーサルプライマー結合部位（１１５１）、１種または複数の識別子領域（１１５２）、ライゲーション配列（１１５３）および標的特異的配列（１１５７）を含み得る。分子バーコード（１１５８）の標的特異的配列（１１５７）は、第２のオリゴヌクレオチド断片（１１５９）の標的特異的領域（１１５５）の相補体の相補体となり得る。標識（１１５６）を含むオリゴヌクレオチド断片は、分子バーコード（１１５８）から除去することができる。例えば、標識（１１５６）は、ビオチンを含み得、ビオチン標識（１１５６）を含むオリゴヌクレオチド断片（１１５９）は、ストレプトアビジン捕捉により除去することができる。別の例では、標識（１１５６）は、５’リン酸を含み得、５’リン酸（１１５６）を含むオリゴヌクレオチド断片（１１５９）は、エキソヌクレアーゼ（例えば、ラムダエキソヌクレアーゼ）により除去することができる。
【０１９１】
図６６Ｃに描写する通り、ユニバーサルプライマー結合部位（１１７１）、１種または複数の識別子領域（１１７２）、第１のライゲーション配列（１１７３）を含む第１のオリゴヌクレオチド断片（１１７０）は、第２のライゲーション配列（１１７４）および標的配列（１１７５）のＲＮＡ相補体を含む第２のオリゴヌクレオチド断片（１１７６）にアニールされる。ステップ１は、第１および第２のライゲーション配列（１１７３および１１７４）のアニーリングと、続く標的配列（１１７５）のＲＮＡ相補体の逆転写とによる、ユニバーサルプライマー結合部位（１１７１）、１種または複数の識別子領域（１１７２）、第１のライゲーション配列（１１７３）および標的特異的領域（１１７８）を含む分子バーコード（１１７７）の生成を含み得る。標的配列のＲＮＡ相補体を含むオリゴヌクレオチド断片は、ＲＮＡｓｅ処理により選択的に分解することができる。
【０１９２】
分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の配列は、分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）のダイマー形成を最小化するように最適化することができる。分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識ダイマーが増幅され、アンプリコンの各末端に２個のユニバーサルプライマー結合部位ならびに標的特異的領域および特有の識別子領域を含むアンプリコンの形成をもたらし得る。分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）の濃度は、ＤＮＡ鋳型の数よりもはるかに大きいため、このような分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識ダイマーは、増幅反応における標識されたＤＮＡ分子を凌駕することができる。増幅されないＤＮＡは、偽陰性を生じ、増幅された分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識ダイマーは、高い偽陽性を生じる。よって、分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）は、分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識ダイマー形成を最小化するように最適化することができる。あるいは、ダイマー形成する分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）は廃棄され、これにより、分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識ダイマー形成を排除する。
【０１９３】
あるいは、分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識ダイマー形成は、分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識配列に１種または複数の修飾を取り込むことにより排除または低下させることができる。ユニバーサルプライマー結合部位、特有の識別子領域、ならびにウラシルおよび３’リン酸基を含む標的特異的領域を含む分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識は、標的核酸にアニールされる。標的核酸は、制限エンドヌクレアーゼ消化断片となり得る。制限エンドヌクレアーゼは、認識部位を認識することができる。ＰＣＲ増幅は、１種または複数のフォワードプライマーおよび１種または複数のリバースプライマーを含み得る。ＰＣＲ増幅は、分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識のユニバーサルプライマー結合部位に特異的なフォワードプライマー、および分子バーコード、試料タグまたは分子識別子標識の標的特異的領域に特異的なフォワードプライマー、ならびに標的核酸に特異的なリバースプライマーによるネステッドＰＣＲを含み得る。標的核酸は、１個または複数のウラシルを含む鋳型を増幅することができないＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅することができる。よって、いかなるダイマー形成された分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標領域、試料標識）、細胞性標識および分子識別子標識（例えば、分子標識）も、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによって増幅することができない。
【０１９４】
オリゴヌクレオチド（例えば、分子バーコード）を合成する方法
オリゴヌクレオチドを合成することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、官能化された固体支持体のカルボキシル基へのオリゴヌクレオチドにおける５’アミノ基のカップリングにより（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドによる）合成することができる。
【０１９５】
カップリングしていないオリゴヌクレオチドは、複数の洗浄により反応混合物から除去することができる。固体支持体は、ウェル（例えば、９６ウェル）に分割することができる。各固体支持体は、異なるウェルに分割することができる。オリゴヌクレオチド合成は、合成の分割／プール方法を使用して行うことができる。分割／プール方法は、反応性部分（例えば、合成しようとするオリゴヌクレオチド）を含む固体支持体のプールを利用することができる。このプールは、固体支持体の多数の個々のプールに分割することができる。各プールは、プールのそれぞれにおける固体支持体に異なる修飾をもたらし得る第１の反応に付すことができる（例えば、オリゴヌクレオチドに付加された異なる核酸配列）。反応後に、固体支持体のプールは、組み合わせ、混合し、再度分割することができる。各分割プールは、再度プール毎に異なる第２の反応またはランダム化に付すことができる。プロセスは、標的化合物のライブラリーが形成されるまで継続させることができる。
【０１９６】
分割／プール合成を使用して、オリゴヌクレオチドに付加しようとする核酸配列は、プライマー伸長（例えば、クレノウ伸長）により取り込むことができる。オリゴヌクレオチドに付加しようとする核酸配列は、プライマー断片と称され得る。個々のプール毎の各プライマー断片は、異なる配列を含み得る（例えば、細胞性標識、分子標識、試料標識またはこれらのいずれかの組合せに）。プライマー断片は、オリゴヌクレオチド（例えば、固体支持体にカップリングされたオリゴヌクレオチド）のリンカー標識配列にハイブリダイズすることができる配列を含み得る。プライマー断片は、第２の細胞標識および第２のリンカー標識配列をさらに含み得る。プライマー伸長を使用して、固体支持体にカップリングされたオリゴヌクレオチドに第２の細胞標識配列および第２のリンカー標識配列を導入することができる（図２Ｂを参照）。プライマー伸長が新たな配列を取り込んだ後に、固体支持体を組み合わせることができる。組み合わせた固体支持体を加熱して、酵素を変性させることができる。組み合わせた固体支持体を加熱して、ハイブリダイゼーションを破壊することができる。組み合わせた固体支持体は、再度ウェルに分割することができる。このプロセスを反復して、固体支持体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドに追加的な配列を付加することができる。
【０１９７】
分割／プールプロセスは、少なくとも約１０００、１００００、１０００００、５０００００もしくは１００００００種またはそれを超える異なるオリゴヌクレオチドの作製をもたらし得る。このプロセスは、最大でも約１０００、１００００、１０００００、５０００００もしくは１００００００種またはそれを超える異なるオリゴヌクレオチドの作製をもたらし得る。
【０１９８】
分割プール合成は、化学合成を含み得る。異なるオリゴヌクレオチドは、個々の反応における固体支持体におけるＤＭＴ化学を使用して合成し、続いて合成のための反応へとプールすることができる。分割／プールプロセスは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える回数反復することができる。分割／プールプロセスは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれを超える回数反復することができる。分割／プールプロセスは、２またはそれを超える回数反復することができる。分割／プールプロセスは、３またはそれを超える回数反復することができる。分割／プールプロセスは、５またはそれを超える回数反復することができる。分割／プールプロセスは、１０またはそれを超える回数反復することができる。
【０１９９】
標識されたビーズ（例えば、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズ）の１または複数のセットを生成する方法が本明細書にさらに開示されている。標識されたビーズの１または複数のセットを生成する方法は、１個または複数のビーズに１種または複数の核酸を付着させ、これにより、標識されたビーズの１または複数のセットを生成するステップを含み得る。１種または複数の核酸は、１種または複数の分子バーコードを含み得る。１種または複数の核酸は、１種または複数の試料タグ（例えば、試料標識、試料指標領域）を含み得る。１種または複数の核酸は、１種または複数の細胞性標識を含み得る。１種または複数の核酸は、１種または複数の分子識別子標識（例えば、分子標識）を含み得る。１種または複数の核酸は、ａ）プライマー領域；ｂ）試料指標領域；およびｃ）リンカーまたはアダプター領域を含み得る。１種または複数の核酸は、ａ）プライマー領域；ｂ）標識領域（例えば、分子標識）；およびｃ）リンカーまたはアダプター領域を含み得る。１種または複数の核酸は、ａ）試料指標領域（例えば、試料タグ）；およびｂ）標識領域（例えば、分子標識）を含み得る。１種または複数の核酸は、ａ）試料指標領域；およびｂ）細胞性標識を含み得る。１種または複数の核酸は、ａ）細胞性標識；およびｂ）分子標識を含み得る。１種または複数の核酸は、ａ）試料指標領域；ｂ）細胞性標識；およびｃ）分子標識を含み得る。１種または複数の核酸は、プライマー領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、標的特異的領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、リンカー領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、アダプター領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、試料指標領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、標識領域をさらに含み得る。
【０２００】
あるいは、方法は、ａ）複数のウェル内に複数の第１の核酸を沈着させるステップであって、複数のウェルのうち２個またはそれを超える異なるウェルが、複数の核酸のうち２種またはそれを超える異なる核酸を含み得るステップと、ｂ）複数のウェルのうち１個または複数のウェルを１個またはそれより少ないビーズと接触させて、複数の単一の標識ビーズを生成するステップであって、複数の第１の標識されたビーズのうち単一の標識ビーズが、複数の第１の核酸の１核酸に付着させたビーズを含むステップと、ｃ）複数のウェル由来の複数の第１の標識されたビーズをプールして、第１の標識されたビーズのプールを生成するステップと、ｄ）第１の標識されたビーズのプールを後続の複数のウェルに分布させるステップであって、後続の複数のウェルのうち２個またはそれを超えるウェルが、複数の後続の核酸のうち２種またはそれを超える異なる核酸を含むステップと、ｅ）１個または複数の第１の標識されたビーズに複数の後続の核酸のうち１種または複数の核酸を付着させて、複数の特有に標識されたビーズを生成するステップとを含む。
【０２０１】
ライブラリー
分子ライブラリーを生成する方法が本明細書に開示されている。方法は、（ａ）２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子を確率論的に標識して、標識された分子を生成するステップであって、標識された分子が、（ｉ）２種またはそれを超える分子に基づくまたは由来する分子領域と、（ｉｉ）２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子の区別における使用のための試料指標領域と、（ｉｉｉ）単一の試料由来の２種またはそれを超える分子の区別における使用のための標識領域とを含むステップを含み得る。確率論的標識化は、分子バーコードの１または複数のセットの使用を含み得る。確率論的標識化は、試料タグの１または複数のセットの使用を含み得る。確率論的標識化は、分子識別子標識の１または複数のセットの使用を含み得る。
【０２０２】
２種またはそれを超える分子の確率論的標識化は、複数の試料タグおよび複数の分子特異的標識と２種またはそれを超える試料を接触させて、複数の標識された核酸を生成することを含み得る。接触は、ランダムとなり得る。方法は、標識された分子のうち１種または複数を増幅し、これにより、ライブラリーの標識された分子の濃縮された集団を生成するステップをさらに含み得る。方法は、２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子において１種または複数のアッセイを実行するステップをさらに含み得る。方法は、１種または複数のプルダウンアッセイを実行するステップをさらに含み得る。
【０２０３】
標識された核酸ライブラリーを生成する方法は、２種またはそれを超える試料に１種または複数の対照を加えるステップをさらに含み得る。１種または複数の対照を確率論的に標識して、標識された対照を生成することができる。１種または複数の対照を使用して、標識された分子を生成する効率を測定することができる。
【０２０４】
本明細書に開示されているライブラリーは、種々の適用において使用することができる。例えば、ライブラリーは、配列決定適用のために使用することができる。ライブラリーを貯蔵し、複数回使用して、分析のための試料を作製することができる。一部の適用は、例えば、多型の遺伝子型決定、ＲＮＡプロセシングの研究およびの配列決定を行うための代表的なクローン選択を含む。
【０２０５】
試料調製および適用
本明細書に開示されているオリゴヌクレオチド（例えば、分子バーコード、試料タグ、分子標識、細胞性標識）は、種々の方法において使用することができる。オリゴヌクレオチドは、核酸分析のための方法において使用することができる。核酸分析として、遺伝子型決定、遺伝子発現、コピー数変動および分子計数を挙げることができるがこれらに限定されない。
【０２０６】
本開示は、マルチプレックス核酸分析の方法を提供する。方法は、（ａ）支持体に付着させた１種または複数のオリゴヌクレオチドと細胞由来の１種または複数のオリゴヌクレオチドとを接触させるステップであって、支持体に付着させた１種または複数のオリゴヌクレオチドが、（ｉ）非ランダム配列によって接続された２種またはそれを超えるランダマー配列を含む細胞標識領域と、（ｉｉ）分子標識領域とを含むステップと、（ｂ）細胞由来の１種または複数のオリゴヌクレオチドにおいて１種または複数のアッセイを実行するステップとを含み得る。
【０２０７】
単一細胞核酸ライブラリーを生成する方法が本明細書にさらに開示されている。方法は、（ａ）支持体に付着させた１種または複数のオリゴヌクレオチドと細胞由来の１種または複数のオリゴヌクレオチドとを接触させるステップであって、支持体に付着させた１種または複数のオリゴヌクレオチドが、（ｉ）非ランダム配列によって接続された２種またはそれを超えるランダマー配列を含む細胞標識領域と、（ｉｉ）分子標識領域とを含むステップと、（ｂ）細胞由来の１種または複数のオリゴヌクレオチドにおいて１種または複数のアッセイを実行するステップとを含み得る。
【０２０８】
場合によっては、方法は、マイクロウェルアレイに１個または複数の細胞を添加するステップを含む。添加しようとする細胞の数は、計数から決定することができる。過剰なまたは非結合細胞は、バッファー（例えば、リン酸緩衝食塩水バッファー、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ）を使用して洗浄除去することができる。マイクロウェルアレイのウェルによって捕捉され得る細胞の数は、細胞のサイズに関係し得る。例えば、図６に描写する通り、マイクロウェルの設計に応じて、より大型の細胞は、より小型の細胞よりも容易に捕捉され得る。異なる細胞型を捕捉するために、異なるマイクロウェル（例えば、異なる寸法）を使用することができる。
【０２０９】
本明細書に記載されている方法は、配列決定または他の分子分析のための核酸となり得る配列の付加を可能にする。このような方法は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の集団に見出される核酸バリアント、変異体、多型、逆位、欠失、復帰変異および他の質的事象の検出を可能にすることができる。例えば、方法は、標的頻度（例えば、遺伝子発現または対立遺伝子分布）の同定を可能にすることができる。例えば、方法は、罹患または非罹患被験体等に由来するゲノムまたはトランスクリプトームにおける変異またはＳＮＰの同定も可能にする。方法は、細菌または真菌等、外来性生物またはウイルス等、被験体由来の生物学的試料における汚染または感染の存在または非存在の決定も可能にする。
【０２１０】
細胞は、いずれかの方法によってマイクロウェルに添加することができる。一部の実施形態では、細胞は、希釈された細胞試料としてマイクロウェルに添加される。一部の実施形態では、細胞は、マイクロウェルに添加され、重力によってマイクロウェルに沈降させられる。一部の実施形態では、細胞は、マイクロウェルに添加され、遠心分離を使用して、マイクロウェルに細胞を沈降する。一部の実施形態では、１個または複数のマイクロウェルに１個または複数の細胞を注射することにより、細胞は、マイクロウェルに添加される。例えば、マイクロウェルに単一細胞を注射することにより、単一細胞は、マイクロウェルに添加することができる。細胞の注射は、マイクロマニピュレーターの使用による等、いずれかのデバイスまたは方法の使用により行うことができる。一部の実施形態では、細胞は、磁石を使用してマイクロウェルに添加することができる。例えば、磁性マイクロ粒子または磁性ナノ粒子等、磁性粒子で細胞の表面をコーティングし、磁石または磁場を使用してマイクロウェルに添加することができる。
【０２１１】
細胞を含むマイクロウェルアレイは、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした固体支持体（例えば、ビーズ）と接触させることができる。捕捉されていないオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした固体支持体を除去することができる（例えば、バッファーによる洗浄除去）。図５は、捕捉された固体支持体を有するマイクロウェルアレイを描写する。マイクロウェルは、少なくとも１個の固体支持体を含み得る。マイクロウェルは、少なくとも２個の固体支持体を含み得る。マイクロウェルは、最大でも１個の固体支持体を含み得る。マイクロウェルは、最大でも２個の固体支持体を含み得る。マイクロウェルは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個またはそれを超える固体支持体を含み得る。マイクロウェルは、最大でも約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個またはそれを超える固体支持体を含み得る。図５に示す通り、マイクロウェルアレイのマイクロウェルの一部は、１個の固体支持体を含み得、マイクロウェルアレイのマイクロウェルの一部は、２個またはそれを超える固体支持体を含み得る。マイクロウェルは、本開示の方法のいずれかのために覆われる必要はない場合がある。言い換えれば、マイクロウェルは、方法の際に封着される必要はない場合がある。マイクロウェルが覆われて（例えば、封着されて）いない場合、あるマイクロウェルの内容物が別のマイクロウェルに拡散しないように、ウェルは離間することができる。
【０２１２】
それに代えてまたはそれに加えて、細胞は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体と接触される前に捕捉および／または精製することができる。細胞を捕捉および／または精製するための方法は、抗体、分子足場および／またはビーズの使用を含み得る。細胞は、フローサイトメトリーにより精製することができる。市販のキットを使用して、細胞を捕捉または精製することができる。例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用して、細胞を単離することができる。磁性単離を使用して、細胞を精製することができる。細胞は、遠心分離により精製することができる。
【０２１３】
細胞および支持体を含む懸濁液を作製することにより、細胞をオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体と接触させることができる。懸濁液は、ゲルを含み得る。細胞は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体と接触させる前に、支持体に固定化または溶液中に存在することができる。あるいは、細胞は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体を含む懸濁液に添加することができる。例えば、細胞は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体を包埋したヒドロゲルに添加することができる。
【０２１４】
単一細胞を、単一のオリゴヌクレオチドがカップリングされた固体支持体と接触させることができる。単一細胞を、複数のオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした固体支持体と接触させることができる。複数の細胞が、単一のオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした固体支持体と相互作用することができる。複数の細胞が、複数のオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした固体支持体と相互作用することができる。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした固体支持体は、細胞型特異的となり得る。あるいは、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体は、２種またはそれを超える異なる細胞型と相互作用することができる。
【０２１５】
溶解
マイクロウェルにおける細胞を溶解することができる。溶解は、機械的溶解、熱溶解、光学溶解および／または化学的溶解により行うことができる。化学的溶解は、プロテイナーゼＫ、ペプシンおよびトリプシン等、消化酵素の使用を含み得る。溶解は、マイクロウェルへの溶解バッファーの添加により行うことができる。溶解バッファーは、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌを含み得る。溶解バッファーは、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．５もしくは１Ｍまたはそれを超えるＴｒｉｓ  ＨＣｌを含み得る。溶解バッファーは、最大でも約０．０１、０．０５、０．１、０．５もしくは１Ｍまたはそれを超えるＴｒｉｓ  ＨＣＬを含み得る。溶解バッファーは、約０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌを含み得る。溶解バッファーのｐＨは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれを超えることができる。溶解バッファーのｐＨは、最大でも約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれを超えることができる。場合によっては、溶解バッファーのｐＨは、約７．５である。溶解バッファーは、塩（例えば、ＬｉＣｌ）を含み得る。溶解バッファーにおける塩の濃度は、少なくとも約０．１、０．５もしくは１Ｍまたはそれを超えることができる。溶解バッファーにおける塩の濃度は、最大でも約０．１、０．５もしくは１Ｍまたはそれを超えることができる。場合によっては、溶解バッファーにおける塩の濃度は、約０．５Ｍである。溶解バッファーは、洗剤（例えば、ＳＤＳ、ドデシル硫酸（ｓｕｆａｔｅ）Ｌｉ、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、ｔｗｅｅｎ、ＮＰ−４０）を含み得る。溶解バッファーにおける洗剤の濃度は、少なくとも約０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６もしくは７％またはそれを超えることができる。溶解バッファーにおける洗剤の濃度は、最大でも約０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６もしくは７％またはそれを超えることができる。場合によっては、溶解バッファーにおける洗剤の濃度は、約１％ドデシル硫酸Ｌｉである。溶解のための方法において使用される時間は、使用される洗剤の量に依存し得る。場合によっては、使用される洗剤が多いほど、溶解に必要とされる時間は少なくなる。溶解バッファーは、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）を含み得る。溶解バッファーにおけるキレート剤の濃度は、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５もしくは３０ｍＭまたはそれを超えることができる。溶解バッファーにおけるキレート剤の濃度は、最大でも約１、５、１０、１５、２０、２５もしくは３０ｍＭまたはそれを超えることができる。場合によっては、溶解バッファーにおけるキレート剤の濃度は、約１０ｍＭである。溶解バッファーは、還元試薬（例えば、ベータ−メルカプトエタノール、ＤＴＴ）を含み得る。溶解バッファーにおける還元試薬の濃度は、少なくとも約１、５、１０、１５もしくは２０ｍＭまたはそれを超えることができる。溶解バッファーにおける還元試薬の濃度は、最大でも約１、５、１０、１５もしくは２０ｍＭまたはそれを超えることができる。場合によっては、溶解バッファーにおける還元試薬の濃度は、約５ｍＭである。場合によっては、溶解バッファーは、約０．１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、約ｐＨ７．５、約０．５Ｍ  ＬｉＣｌ、約１％ドデシル硫酸リチウム、約１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび約５ｍＭ  ＤＴＴを含み得る。
【０２１６】
溶解は、約４、１０、１５、２０、２５または３０Ｃの温度で行うことができる。溶解は、約１、５、１０、１５もしくは２０分間またはそれを超えて行うことができる。溶解された細胞は、少なくとも約１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００もしくは７０００００種またはそれを超える標的核酸分子を含み得る。溶解された細胞は、最大でも約１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００もしくは７０００００種またはそれを超える標的核酸分子を含み得る。図７は、溶解から得ることができる標的核酸（即ち、ｍＲＮＡ）の濃度に関する例示的な統計を説明する。
【０２１７】
封着
マイクロウェルアレイのマイクロウェルは、溶解の際に封着することができる。封着は、隣接マイクロウェル間の標的核酸のクロスハイブリダイゼーションを防ぐために有用となり得る。図８Ａおよび図８Ｂに示す通り、マイクロウェルは、キャップを使用して封着することができる。キャップは、固体支持体となり得る。キャップは、ビーズを含み得る。ビーズの直径は、マイクロウェルの直径よりも大きくなることができる。例えば、キャップは、マイクロウェルの直径よりも少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％大きくなることができる。例えば、キャップは、マイクロウェルの直径よりも最大でも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％大きくなることができる。
【０２１８】
キャップは、架橋されたデキストランビーズ（例えば、セファデックス）を含み得る。架橋されたデキストランは、約１０マイクロメートル〜約８０マイクロメートルに及び得る。キャップの架橋されたデキストランは、２０マイクロメートル〜約５０マイクロメートルとなり得る。キャップは、例えば、ナノポア（ａｎｏｐｏｒｅ）無機膜（例えば、酸化アルミニウム）、透析膜、スライドガラス、カバーガラスおよび／または親水性プラスチックフィルム（例えば、溶解バッファーで湿潤化したアガロースの薄膜でコーティングされたフィルム）を含み得る。
【０２１９】
キャップは、バッファーがマイクロウェルを出入りすることを可能にするが、高分子（例えば、核酸）がウェルから移動することを防ぐことができる。少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個またはそれを超えるヌクレオチドの高分子は、キャップによってマイクロウェルを出入りする移動を妨害され得る。最大でも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個またはそれを超えるヌクレオチドの高分子は、キャップによってマイクロウェルを出入りする移動を妨害され得る。
【０２２０】
封着されたマイクロウェルアレイは、マイクロウェルの頂部に単一の層のビーズを含み得る。封着されたマイクロウェルアレイは、マイクロウェルの頂部に複数の層のビーズを含み得る。封着されたマイクロウェルアレイは、約１、２、３、４、５もしくは６またはそれを超える層のビーズを含み得る。
【０２２１】
固体支持体（例えば、マイクロウェルアレイ）におけるビーズまたは複数のビーズの沈着は、ランダムまたは非ランダムとなり得る。例えば、マイクロウェルアレイとビーズとの接触は、ランダムまたは非ランダム接触となり得る。一部の実施形態では、ビーズは、ランダムにマイクロウェルアレイと接触させられる。一部の実施形態では、ビーズは、非ランダムにマイクロウェルアレイと接触させられる。マイクロウェルアレイへの複数のビーズの沈着は、ランダムまたは非ランダムとなり得る。例えば、マイクロウェルアレイへの複数のビーズの接触は、ランダムまたは非ランダム接触となり得る。一部の実施形態では、複数のビーズは、ランダムにマイクロウェルアレイに接触させられる。一部の実施形態では、複数のビーズは、非ランダムにマイクロウェルアレイに接触させられる。
【０２２２】
分子の確率論的標識化
試料タグまたは分子識別子標識が、オリゴヌクレオチドである場合、核酸へのオリゴヌクレオチドの付着は、核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが挙げられるがこれに限定されない、種々の方法によって起こり得る。場合によっては、オリゴヌクレオチドは、標的特異的領域を含む。標的特異的領域は、標識しようとする分子の少なくとも一部に相補的な配列を含み得る。標的特異的領域は、分子にハイブリダイズし、これにより、標識された核酸を生成することができる。核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに続き、核酸伸長反応が行われ得る。核酸伸長反応は、逆転写となり得る。
【０２２３】
試料タグと複数の核酸との付着（あるいは接触とも称される）は、複数の核酸のうち１種または複数への試料タグのハイブリダイゼーションを含み得る。試料タグと複数の核酸との接触は、核酸伸長反応の実施を含み得る。核酸伸長反応は、逆転写反応となり得る。
【０２２４】
分子識別子標識と複数の核酸との接触は、複数の核酸のうち１種または複数への分子識別子標識のハイブリダイゼーションを含み得る。分子識別子標識と複数の核酸との接触は、核酸伸長反応の実施を含み得る。核酸伸長反応は、逆転写を含み得る。
【０２２５】
分子識別子標識と複数の核酸との接触は、複数の核酸のうち１種または複数への試料タグのハイブリダイゼーションを含み得る。分子識別子標識と複数の核酸との接触は、試料タグへの分子識別子標識のハイブリダイゼーションを含み得る。
【０２２６】
試料タグと複数の核酸との接触は、複数の核酸のうち１種または複数への分子識別子標識のハイブリダイゼーションを含み得る。試料タグと複数の核酸との接触は、分子識別子標識への試料タグのハイブリダイゼーションを含み得る。
【０２２７】
核酸への試料タグおよび／または分子識別子標識の付着は、ライゲーションによって起こり得る。試料タグと複数の核酸との接触は、複数の核酸のうちいずれか１種への試料タグのライゲーションを含み得る。分子識別子標識と複数の核酸との接触は、複数の核酸のうち１種または複数への分子識別子標識のライゲーションを含み得る。試料タグと複数の核酸との接触は、核酸のうち１種または複数への分子識別子標識のライゲーションを含み得る。分子識別子標識と複数の核酸との接触は、核酸のうち１種または複数への試料タグのライゲーションを含み得る。ライゲーション技法は、平滑末端ライゲーションおよび粘着末端ライゲーションを含む。ライゲーション反応は、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼ等、ＤＮＡリガーゼを含み得る。ライゲーション反応は、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩおよびＴ４  ＲＮＡリガーゼＩＩ等、ＲＮＡリガーゼを含み得る。
【０２２８】
ライゲーションの方法は、例えば、あらゆる目的のため、両者共にここに参照により援用するＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１年）およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  ｃａｔａｌｏｇに記載されている。方法は、平滑末端および粘着末端を有するデュプレックスＤＮＡまたはＲＮＡにおける並置された５’リン酸および３’ヒドロキシル末端の間のホスホジエステル結合の形成を触媒するＴ４  ＤＮＡリガーゼ；相補的標的ＤＮＡにハイブリダイズされた２本の隣接するオリゴヌクレオチドの並置された５’リン酸および３’ヒドロキシル末端の間のホスホジエステル結合の形成を触媒するＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ；付着末端を含有するデュプレックスＤＮＡにおける並置された５’−リン酸および３’−ヒドロキシル末端の間のホスホジエステル結合の形成を触媒するＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ；ならびに３’→５’ホスホジエステル結合の形成による、３’ヒドロキシル終端核酸アクセプターへの５’ホスホリル終端核酸ドナーのライゲーションを触媒するＴ４  ＲＮＡリガーゼの使用を含み、基質は、一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡならびにジヌクレオシドピロリン酸を含み；または本技術分野に記載されている他のいずれかの方法である。断片化ＤＮＡは、一末端または両末端にアダプターをライゲーションする前に、１種または複数の酵素、例えば、エンドヌクレアーゼで処理して、ライゲーションと適合する末端を作製することによりライゲーションを容易にすることができる。
【０２２９】
場合によっては、オリゴヌクレオチドの両末端は、分子に付着させる。例えば、オリゴヌクレオチドの両末端は、分子の１個または複数の末端にハイブリダイズおよび／またはライゲーションすることができる。場合によっては、分子の両末端へのオリゴヌクレオチドの両末端の付着は、環状化された標識された核酸の形成をもたらす。オリゴヌクレオチドの両末端は、分子の同じ末端に付着させることもできる。例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端は、分子の３’末端にライゲーションされ、オリゴヌクレオチドの３’末端は、分子の３’末端にハイブリダイズされ、一末端にヘアピン構造を有する標識された核酸をもたらす。場合によっては、オリゴヌクレオチドは、分子の中央に付着させる。
【０２３０】
場合によっては、核酸へのオリゴヌクレオチドの付着は、複数の核酸への１種または複数のオリゴヌクレオチドリンカーの付着を含む。方法は、試料タグが付いた核酸への１種または複数のオリゴヌクレオチドリンカーの付着をさらに含み得る。方法は、標識された核酸への１種または複数のオリゴヌクレオチドリンカーの付着をさらに含み得る。核酸、試料タグまたは分子識別子標識への１種または複数のオリゴヌクレオチドリンカーの付着は、核酸、試料タグまたは分子識別子標識への１種または複数のオリゴヌクレオチドリンカーのライゲーションを含み得る。１種または複数のリンカーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００個のヌクレオチドを含み得る。場合によっては、リンカーは、少なくとも約１０００個のヌクレオチドを含み得る。
【０２３１】
場合によっては、分子への分子バーコードの付着は、１種または複数のアダプターの使用を含む。本明細書において、用語「アダプター」および「アダプター領域」は、互換的に使用することができる。アダプターは、分子へのアダプターの付着を可能にする標的特異的領域と、アダプターへの分子バーコードの付着を可能にするオリゴヌクレオチド特異的領域とを含み得る。アダプターは、ユニバーサルプライマーをさらに含み得る。アダプターは、ユニバーサルＰＣＲ領域をさらに含み得る。アダプターは、ハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーションが挙げられるがこれらに限定されない方法によって分子および／または分子バーコードに付着させることができる。
【０２３２】
核酸の断片にアダプターをライゲーションするための方法は、周知である。アダプターは、二本鎖、一本鎖または部分的に一本鎖となり得る。一部の態様では、２種のオリゴヌクレオチドが共にハイブリダイズすると、二本鎖領域を形成することができるように、アダプターは、相補性の領域、例えば、約１０〜３０または約１５〜４０塩基の完全な相補性を有する２種のオリゴヌクレオチドから形成される。任意選択で、オリゴヌクレオチドのいずれか一方または両方は、他のオリゴヌクレオチドと相補的ではない領域を有することができ、アダプターの一末端または両末端に一本鎖オーバーハングを形成する。一本鎖オーバーハングは、約１〜約８塩基または約２〜約４となり得る。オーバーハングは、制限酵素による切断によって作製されたオーバーハングに相補的となり、「粘着末端」ライゲーションを容易にすることができる。アダプターは、プライマー結合部位および制限部位等、他の特色を含み得る。一部の態様では、制限部位は、ＥｃｏＰ１５１等、その認識配列の外側をカットするＩＩＳ型制限酵素または別の酵素のためのものとなり得る（Ｍｕｃｋｅら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００１年、３１２巻（４号）：６８７〜６９８頁およびここに参照によりその全体を援用する、ＵＳ５，７１０，０００を参照）。
【０２３３】
場合によっては、複数の試料における核酸のコピー数の確率論的計数は、アダプター、アダプターの相補体、アダプターの逆相補体またはこれらの一部を検出して、異なる標識された核酸の数を決定することを含む。アダプター、アダプターの相補体、アダプターの逆相補体またはこれらの一部の検出は、アダプター、アダプターの相補体、アダプターの逆相補体またはこれらの一部の配列決定を含み得る。
【０２３４】
分子バーコードは、分子のいずれかの領域に付着させることができる。例えば、分子バーコードは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の５’または３’末端に付着させることができる。例えば、分子バーコードの標的特異的領域は、分子の５’領域における配列に相補的な配列を含む。分子バーコードの標的特異的領域は、分子の３’領域における配列に相補的な配列を含むこともできる。場合によっては、分子バーコードは、遺伝子または遺伝子産物内の領域に付着させる。例えば、ゲノムＤＮＡを断片化し、試料タグまたは分子識別子標識を、断片化ＤＮＡに付着させる。他の事例では、ＲＮＡ分子が選択的スプライシングを受け、分子バーコードを、その選択的スプライシングを受けたバリアントに付着させる。別の例では、ポリヌクレオチドが消化され、分子バーコードを、消化されたポリヌクレオチドに付着させる。別の例では、分子バーコードの標的特異的領域は、分子内の配列に相補的な配列を含む。
【０２３５】
ヘアピンを含む分子バーコード、試料タグ（例えば、試料指標）、細胞性標識または分子識別子標識（例えば、分子標識）は、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）のためのプローブとして作用することができ、よって、ＨＣＲプローブと称され得る。ＨＣＲプローブは、ヘアピン構造を含む分子バーコードを含み得る。ＨＣＲプローブは、ヘアピン構造を含む試料タグを含み得る。ＨＣＲプローブは、ヘアピン構造を含む分子識別子標識を含み得る。ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）プローブにより１種または複数の核酸分子を確率論的に標識するステップであって、ＨＣＲプローブが、ヘアピンを含む分子バーコードを含み、１種または複数の核酸分子が、ハイブリダイゼーション連鎖反応のためのイニシエーターとして作用するステップを含む、確率論的標識に基づくＨＣＲ方法が本明細書にさらに開示されている。ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）プローブにより１種または複数の核酸分子を確率論的に標識するステップであって、ＨＣＲプローブが、ヘアピンを含む試料タグを含み、１種または複数の核酸分子が、ハイブリダイゼーション連鎖反応のためのイニシエーターとして作用するステップを含む、確率論的標識に基づくＨＣＲ方法が本明細書にさらに開示されている。ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）プローブにより１種または複数の核酸分子を確率論的に標識するステップであって、ＨＣＲプローブが、ヘアピンを含む分子識別子標識を含み、１種または複数の核酸分子が、ハイブリダイゼーション連鎖反応のためのイニシエーターとして作用するステップを含む、確率論的標識に基づくＨＣＲ方法が本明細書にさらに開示されている。
【０２３６】
ＨＣＲプローブは、オーバーハング領域を有するヘアピンを含み得る。ヘアピンのオーバーハング領域は、標的特異的領域を含み得る。オーバーハング領域は、オリゴｄＴ配列を含み得る。１種または複数の核酸分子を含む試料は、確率論的標識化前に１種または複数の制限ヌクレアーゼで処理することができる。オーバーハング領域は、制限酵素認識配列を含み得る。１種または複数の核酸分子を含む試料は、確率論的標識化前に１種または複数のアダプターと接触させて、アダプター−核酸分子ハイブリッドを生成することができる。オーバーハング領域およびステムは、１種または複数のアダプターに相補的となり得る。ＨＣＲプローブは、ループを有するヘアピンを含み得る。ＨＣＲプローブのループは、標識領域および／または試料指標領域を含み得る。
【０２３７】
核酸分子への第１のＨＣＲプローブのハイブリダイゼーションは、標識された核酸の形成をもたらすことができ、第１のＨＣＲプローブは、直鎖化されて、第１の直鎖化ＨＣＲプローブを生成する。標識された核酸の第１の直鎖化ＨＣＲプローブは、標識された核酸への第２のＨＣＲプローブのハイブリダイゼーションのためのイニシエーターとして作用して、２種の直鎖化ＨＣＲプローブを有する標識された核酸を生成することができる。第２の直鎖化ＨＣＲプローブは、別のハイブリダイゼーション反応のためのイニシエーターとして作用することができる。このプロセスは、複数回反復して、複数の直鎖化ＨＣＲプローブを有する標識された核酸を生成することができる。ＨＣＲプローブにおける検出可能な標識は、標識された核酸の検出を可能にすることができる。検出可能な標識は、いずれかの種類の標識（例えば、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅ）、発色団、小分子、ナノ粒子、ハプテン、酵素、抗体、磁石）となり得る。検出可能な標識は、単一の標識の断片を含み得る。検出可能な標識は、極めて接近する場合、検出可能なシグナルを生じることができる。ＨＣＲプローブがヘアピンである場合、検出可能な標識は、検出可能なシグナルを生成するには離れすぎていてよい。ＨＣＲプローブが直鎖化され、複数の直鎖化ＨＣＲプローブが共にハイブリダイズされる場合、検出可能な標識は、検出可能なシグナルを生じるために極めて十分に接近することができる。例えば、ＨＣＲプローブは、検出可能な標識として２個のピレン部分を含み得る。あるいは、検出可能な標識は、ナノ粒子となり得る。確率論的標識に基づくＨＣＲ方法は、標識された核酸への複数のヘアピンＨＣＲプローブの付着を可能にすることができ、これは、シグナル増幅をもたらすことができる。確率論的標識に基づくＨＣＲは、核酸分子の検出、分析および／または定量化の感度を増加させることができる。確率論的標識に基づくＨＣＲは、１種または複数の核酸分子の検出、分析および／または定量化の精度を増加させることができる。
【０２３８】
溶解後に、細胞の標的核酸は、固体支持体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。標的核酸は、オリゴヌクレオチドの標的結合領域にハイブリダイズすることができる。核酸は、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のいずれかの領域にハイブリダイズすることができる。
【０２３９】
場合によっては、全オリゴヌクレオチドが、標的核酸に結合できるとは限らない。これは、場合によっては、オリゴヌクレオチドの数が、標的核酸の数よりも多いことが理由である。固体支持体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの数は、細胞における標的核酸の数よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍多くなり得る。オリゴヌクレオチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％は、標的核酸によって結合され得る。オリゴヌクレオチドの最大でも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％は、標的核酸によって結合され得る。場合によっては、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００種またはそれを超える異なる標的核酸が、固体支持体におけるオリゴヌクレオチドによって捕捉され得る。場合によっては、最大でも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００種またはそれを超える異なる標的核酸が、固体支持体におけるオリゴヌクレオチドによって捕捉され得る。
【０２４０】
場合によっては、標的核酸のコピー数の少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％が、固体支持体におけるオリゴヌクレオチドに結合される。場合によっては、標的核酸のコピー数の最大でも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％が、固体支持体におけるオリゴヌクレオチドに結合される。
【０２４１】
回収
溶解後に、固体支持体を回収することができる。固体支持体の回収は、磁石を使用することにより行うことができる。固体支持体の回収は、マイクロウェルアレイを融解することおよび／または超音波処理により行うことができる。固体支持体の回収は、遠心分離を含み得る。固体支持体の回収は、サイズ排除を含み得る。場合によっては、固体支持体の少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、９５または１００％が、マイクロウェルから回収される。場合によっては、固体支持体の最大でも約５０、６０、７０、８０、９０、９５または１００％が、マイクロウェルから回収される。
【０２４２】
逆転写
本明細書に開示されている方法は、標識されたＲＮＡ分子を逆転写して、標識されたｃＤＮＡ分子を生成することをさらに含み得る。場合によっては、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、逆転写反応のためのプライマーとして作用する。オリゴヌクレオチドのオリゴｄＴ部分は、ｃＤＮＡ分子の第１鎖合成のためのプライマーとして作用し得る。
【０２４３】
場合によっては、標識されたｃＤＮＡ分子は、新たな確率論的標識化反応のための分子として使用することができる。標識されたｃＤＮＡは、逆転写前のＲＮＡへの付着由来の第１のタグまたはタグのセットと、ｃＤＮＡ分子に付着させた第２のタグまたはタグのセットを有することができる。これらの複数の標識化反応は、例えば、第１および第２のタグの付着、例えば、任意選択の増幅反応または逆転写反応の間に起こる事象の効率の決定に使用することができる。
【０２４４】
別の例では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分子の５’末端に付着させて、標識されたＲＮＡ分子を生成する。標識されたＲＮＡ分子の逆転写は、逆転写プライマーの添加によって起こり得る。場合によっては、逆転写プライマーは、オリゴｄＴプライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマーまたは標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーである。一般に、オリゴｄＴプライマーは、１２〜１８個のヌクレオチドの長さであり、哺乳動物ｍＲＮＡの３’末端における内在性ポリ（Ａ）＋テイルに結合する。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、種々の相補的部位においてｍＲＮＡに結合することができる。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、目的のｍＲＮＡを選択的にプライミングする。
【０２４５】
場合によっては、方法は、標識されたＲＮＡ分子を反復的に逆転写して、複数の標識されたｃＤＮＡ分子を生成するステップを含む。本明細書に開示されている方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回の逆転写反応を実行するステップを含み得る。方法は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００回の逆転写反応を実行するステップを含み得る。
【０２４６】
核酸合成（例えば、ｃＤＮＡ合成）は、回収された固体支持体上で行うことができる。核酸合成は、チューブ内および／または固体支持体の懸濁を維持するためのローター上で行うことができる。その結果得られる合成核酸は、後続の核酸増幅および／または配列決定技術において使用することができる。核酸合成は、固体支持体におけるオリゴヌクレオチドに付着させたＲＮＡにおけるｃＤＮＡコピーの作製を含み得る。ｃＤＮＡコピーの作製は、逆転写酵素（ＲＴ）またはＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用を含み得る。これは、一本鎖ｃＤＮＡ分子の生成をもたらし得る。核酸合成後に、未使用のオリゴヌクレオチドは、固体支持体から除去することができる。オリゴヌクレオチドの除去は、エキソヌクレアーゼ処理（例えば、ＥｘｏＩによる）によって起こり得る。
【０２４７】
一部の実施形態では、核酸は、化学的切断を使用して固体支持体から除去することができる。例えば、核酸に存在する化学基または修飾塩基を使用して、固体支持体からのその除去を容易にすることができる。例えば、酵素（ｅｚｙｍｅ）を使用して、固体支持体から核酸を除去することができる。例えば、核酸は、制限エンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｅｌａｓｅ）消化により固体支持体から除去することができる。例えば、ウラシル−ｄ−グリコシラーゼ（ＵＤＧ）によるｄＵＴＰまたはｄｄＵＴＰを含有する核酸の処理を使用して、固体支持体から核酸を除去することができる。例えば、核酸は、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼ等、塩基切除修復酵素等、ヌクレオチド切除を行う酵素（ｅｎｙｍｅ）を使用して、固体支持体から除去することができる。一部の実施形態では、核酸は、光切断可能基および光を使用して固体支持体から除去することができる。一部の実施形態では、切断可能リンカーを使用して、固体支持体から核酸を除去することができる。例えば、切断可能リンカーは、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、Ｉｇ−プロテインＡ、感光性リンカー、酸もしくは塩基に不安定なリンカー基またはアプタマーのうち少なくとも１種を含み得る。
【０２４８】
一部の実施形態では、核酸は、増幅されない。一部の実施形態では、核酸は、核酸（ｎｕｃｅｌｉｃ  ａｃｉｄ）の配列決定前に増幅されない。一部の実施形態では、固体支持体に付着させていない核酸は、事前の増幅なしに直接的に配列決定することができる。一部の実施形態では、核酸は、固体支持体に付着させた場合、増幅を行うことなく直接的に配列決定することができ、例えば、固体支持体に付着させた核酸は、固体支持体に付着させたまま直接的に配列決定することができる。一部の実施形態では、固体支持体から除去された核酸は、直接的に配列決定することができる。例えば、固体支持体から除去された核酸は、増幅を行うことなく直接的に配列決定することができる。増幅なしの配列決定の助けとなるいずれかの配列決定プラットフォームを使用して、配列決定を行うことができる。
【０２４９】
増幅
核酸が合成（例えば、逆転写）された後に、これを増幅することができる。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅されるマルチプレックス様式で行うことができる。増幅は、配列決定アダプターを核酸に加えることができる。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行うことができる。ＰＣＲは、ＤＮＡ相補鎖の同時プライマー伸長による特異的ＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅のための反応を指すことができる。ＰＣＲは、この反応の派生形を包含することができ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、マルチプレックス化ＰＣＲ、デジタルＰＣＲおよびアセンブリＰＣＲが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５０】
方法は、１回または複数の増幅反応を実行して、標識された核酸アンプリコンを生成するステップをさらに含み得る。標識された核酸を検出する前に、標識された核酸を増幅することができる。方法は、１回または複数の増幅反応を実行する前に、第１および第２の試料を組み合わせるステップをさらに含み得る。
【０２５１】
増幅反応は、試料タグの少なくとも一部の増幅を含み得る。増幅反応は、標識の少なくとも一部の増幅を含み得る。増幅反応は、試料タグ、標識、核酸またはこれらの組合せの少なくとも一部の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の核酸の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の増幅を含み得る。方法は、１回または複数のｃＤＮＡ合成反応を実行して、試料タグが付いた核酸または分子識別子標識が付いた核酸の１種または複数のｃＤＮＡコピーを生成するステップをさらに含み得る。
【０２５２】
標識された核酸の増幅は、ＰＣＲに基づく方法またはＰＣＲに基づかない方法を含み得る。標識された核酸の増幅は、標識された核酸の指数関数的増幅を含み得る。標識された核酸の増幅は、標識された核酸の線形増幅を含み得る。
【０２５３】
場合によっては、標識された核酸の増幅は、ＰＣＲに基づかない方法を含む。ＰＣＲに基づかない方法の例として、多置換増幅（ＭＤＡ）、転写増幅法（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅またはサークル対サークル（ｃｉｒｃｌｅ−ｔｏ−ｃｉｒｃｌｅ）増幅が挙げられるがこれらに限定されない。他のＰＣＲに基づかない増幅方法として、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を増幅するための複数サイクルのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ駆動型ＲＮＡ転写増幅またはＲＮＡ依存性ＤＮＡ合成および転写（ＷＯ８９／０１０５０；ＷＯ８８／１０３１５；ならびに米国特許第５，１３０，２３８号；同第５，４０９，８１８号；同第５，４６６，５８６号；同第５，５１４，５４５号；同第５，５５４，５１７号；同第５，８８８，７７９号；同第６，０６３，６０３号；および同第６，１９７，５５４号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、米国特許第４，７８６，６００号に記載されているＱβレプリカーゼ（Ｑβ）方法、パリンドロームプローブの使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを使用したオリゴヌクレオチド駆動増幅、伸長反応および増幅前にプライマーが核酸配列にハイブリダイズされてその結果得られるデュプレックスが切断される増幅方法、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼを使用した鎖置換増幅（米国特許第６，２１４，５８７号）、ローリングサークル増幅、ならびに分岐伸長増幅（ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＡＭ）（米国特許第５，９４２，３９１号）が挙げられる。
【０２５４】
標識された核酸の増幅は、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）に基づく方法を含み得る（ＤｉｒｋｓおよびＰｉｅｒｃｅ、ＰＮＡＳ、２００４年；Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、２０１２年）。ＨＣＲに基づく方法は、ＤＮＡに基づくＨＣＲを含み得る。ＨＣＲに基づく方法は、１種または複数の標識されたプローブを含み得る。１種または複数の標識されたプローブは、本明細書に開示されている１種または複数の試料タグもしくは分子識別子標識またはこれらの相補体を含み得る。
【０２５５】
場合によっては、本明細書に開示されている方法は、標識された核酸（例えば、標識されたＲＮＡ、標識されたＤＮＡ、標識されたｃＤＮＡ）においてポリメラーゼ連鎖反応を実行して、標識されたアンプリコンを生成するステップをさらに含む。標識されたアンプリコンは、二本鎖分子となり得る。二本鎖分子は、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子にハイブリダイズされたＲＮＡ分子を含み得る。二本鎖分子の鎖の一方または両方は、試料タグまたは分子識別子標識を含み得る。あるいは、標識されたアンプリコンは、一本鎖分子である。一本鎖分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組合せを含み得る。本発明の核酸は、合成または変更された核酸を含み得る。
【０２５６】
ポリメラーゼ連鎖反応は、ＰＣＲ、ＨＤ−ＰＣＲ、Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎ  ＰＣＲ、デジタルＲＴＡまたはこれらのいずれかの組合せ等の方法によって行うことができる。追加的なＰＣＲ方法として、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、Ａｌｕ  ＰＣＲ、アセンブリＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ドロップレットＰＣＲ、エマルションＰＣＲ、ヘリカーゼ依存性増幅ＨＤＡ、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ、線形後指数関数的（ＬＡＴＥ）−ＰＣＲ、ロングＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ヘミネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、単一細胞ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲまたはこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５７】
マルチプレックスＰＣＲ反応は、ネステッドＰＣＲ反応を含み得る。方法は、プライマー対を含み得、第１のプライマーが、複数の核酸のうちいずれか１種の３’末端から少なくとも３００〜４００ヌクレオチドにおいて複数の核酸のうちいずれか１種にアニールし、第２のプライマーが、複数の核酸のうちいずれか１種の３’末端から少なくとも２００〜３００ヌクレオチドにおいて複数の核酸のうちいずれか１種にアニールし、第１のプライマーおよび第２のプライマーが、複数の核酸のうちいずれか１種の３’末端に向かう相補的ＤＮＡ合成を生じる。
【０２５８】
場合によっては、ポリメラーゼ連鎖反応の実行は、標識された核酸への第１の標的特異的プライマーのアニーリングを含む。それに代えてまたはそれに加えて、ポリメラーゼ連鎖反応の実行は、試料タグまたは分子識別子標識のユニバーサルプライマー結合部位領域へのユニバーサルプライマーのアニーリングをさらに含み、試料タグまたは分子識別子標識は、標識された核酸または標識されたアンプリコン上にある。本明細書に開示されている方法は、標識された核酸および／または標識されたアンプリコンへの第２の標的特異的プライマーのアニーリングをさらに含み得る。
【０２５９】
場合によっては、方法は、標識された核酸を反復的に増幅して、複数の標識されたアンプリコンを生成するステップを含む。本明細書に開示されている方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回の増幅反応を実行するステップを含み得る。あるいは、方法は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００回の増幅反応を実行するステップを含む。
【０２６０】
他の適した増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４巻、５６０頁（１９８９年）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１巻、１０７７頁（１９８８年）ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅ８９巻：１１７頁（１９９０年））、転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８６巻、１１７３頁（１９８９年）およびＷ０８８／１０３１５）、自家持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻、１８７４頁（１９９０年）およびＷ０９０／０６９９５）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、同第５，８６１，２４５号）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、ＦｉｒｅおよびＸｕ、ＰＮＡＳ９２巻：４６４１頁（１９９５年）ならびにＬｉｕら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１１８巻：１５８７頁（１９９６年）ならびに米国特許第５，６４８，２４５号）、鎖置換増幅（ＬａｓｋｅｎおよびＥｇｈｏｌｍ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３年２１巻（１２号）：５３１〜５頁；Ｂａｒｋｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００４年、５月；１４巻（５号）：９０１〜７頁；Ｄｅａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００２年；９９巻（８号）：５２６１〜６頁；Ｗａｌｋｅｒら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０巻（７号）：１６９１〜６頁、１９９２年ならびにＰａｅｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４年；３２巻（９号）：ｅ７１頁を参照）、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号に記載されているＱベータレプリカーゼ、および核酸ベース配列増幅（ＮＡＢＳＡ）を含む（これらそれぞれここに参照により援用する、米国特許第５，４０９，８１８号、同第５，５５４，５１７号および同第６，０６３，６０３号を参照）。使用することができる他の増幅方法は、これらそれぞれここに参照により援用する、米国特許第６，５８２，９３８号、同第５，２４２，７９４号、同第５，４９４，８１０号、同第４，９８８，６１７号および米国公開第２００３０１４３５９９号に記載されている。ＤＮＡは、マルチプレックス遺伝子座特異的ＰＣＲによってまたはアダプターライゲーションおよび単一プライマーＰＣＲを使用して増幅することもできる（ＫｉｎｚｌｅｒおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、ＮＡＲ（１９８９年）１７巻：３６４５〜５３頁を参照）。バランスＰＣＲ（ｂａｌａｎｃｅｄ  ＰＣＲ）（Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓら（２００２年）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０巻、９３６〜９頁）等、他の利用できる増幅方法を使用することもできる。
【０２６１】
分子反転プローブ（「ＭＩＰ」）は、選択された標的の増幅のために使用することもできる。ＭＩＰは、プレサークルプローブの末端が、増幅しようとする領域に隣接する領域に相補的となるように作製することができる。ギャップは、標的の相補体が、閉鎖環を形成する末端のライゲーション前にＭＩＰに取り込まれるような、プローブの末端の伸長により閉じることができる。閉鎖環は、Ｈａｒｄｅｎｂｏｌら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１５巻：２６９〜２７５頁（２００５年）および米国特許第６，８５８，４１２号に以前に開示された通り、配列決定またはハイブリダイゼーションにより増幅および検出することができる。
【０２６２】
増幅は、複数の核酸を含む１種または複数の試料への１種または複数の対照核酸の添加をさらに含み得る。増幅は、複数の核酸への１種または複数の対照核酸の添加をさらに含み得る。対照核酸は、対照標識を含み得る。
【０２６３】
増幅は、１種または複数の非天然ヌクレオチドの使用を含み得る。非天然ヌクレオチドは、感光性および／または誘発可能なヌクレオチドを含み得る。非天然ヌクレオチドの例として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックト核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。非天然ヌクレオチドは、１または複数サイクルの増幅反応に添加することができる。非天然ヌクレオチドの添加を使用して、増幅反応における特異的サイクルまたは時点として産物を同定することができる。
【０２６４】
１回または複数の増幅反応の実行は、１種または複数のプライマーの使用を含み得る。１種または複数のプライマーは、１種または複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。１種または複数のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約７〜９個のヌクレオチドを含み得る。１種または複数のオリゴヌクレオチドは、１２〜１５個未満のヌクレオチドを含み得る。１種または複数のプライマーは、複数の標識された核酸の少なくとも一部にアニールすることができる。１種または複数のプライマーは、複数の標識された核酸の３’末端および／または５’末端にアニールすることができる。１種または複数のプライマーは、複数の標識された核酸の内部領域にアニールすることができる。内部領域は、複数の標識された核酸の３’末端から少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または１０００ヌクレオチドとなり得る。１種または複数のプライマーは、プライマーの固定されたパネルを含み得る。１種または複数のプライマーは、少なくとも１種または複数のカスタムプライマーを含み得る。１種または複数のプライマーは、少なくとも１種または複数の対照プライマーを含み得る。１種または複数のプライマーは、少なくとも１種または複数のハウスキーピング遺伝子プライマーを含み得る。１種または複数のオリゴヌクレオチドは、表２３における配列からなる群より選択される配列を含み得る。１種または複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含み得る。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニールすることができる。１種または複数のカスタムプライマーは、第１の試料タグ、第２の試料タグ、分子識別子標識、核酸またはこれらの産物にアニールすることができる。１種または複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーおよびカスタムプライマーを含み得る。カスタムプライマーは、１種または複数の標的核酸を増幅するように設計することができる。標的核酸は、１種または複数の試料における総核酸のサブセットを含み得る。標的核酸は、１種または複数の試料における標識された核酸全体のサブセットを含み得る。１種または複数のプライマーは、少なくとも９６種またはそれを超えるカスタムプライマーを含み得る。１種または複数のプライマーは、少なくとも９６０種またはそれを超えるカスタムプライマーを含み得る。１種または複数のプライマーは、少なくとも９６００種またはそれを超えるカスタムプライマーを含み得る。１種または複数のカスタムプライマーは、２種またはそれを超える異なる標識された核酸にアニールすることができる。２種またはそれを超える異なる標識された核酸は、１種または複数の遺伝子に相当することができる。
【０２６５】
ａ）選ばれたプライマーが、ｉ）３個以下の逐次的グアニン、３個以下の逐次的シトシン、４個以下の逐次的アデニンおよび４個以下の逐次的チミン、ｉｉ）グアニンまたはシトシンである少なくとも３、４、５または６個のヌクレオチド、ならびにｉｉｉ）ヘアピン構造を容易に形成しない配列を含み得る、第１のパスと、ｂ）ｉ）全転写物の高い被覆度を有する複数の配列を選ぶ第１のラウンド、ならびにｉｉ）残る転写物の最高被覆度および４以下の他の選ばれた配列との相補的スコアを有する配列を選択する１回または複数の後続ラウンドを含む第２のパスと、ｃ）被覆度が飽和するまたはカスタマープライマーの総数が約９６未満またはそれに等しくなるまでの、選定されたセットへの配列の付加をと含む、カスタムプライマーを選択する方法が本明細書に開示されている。
【０２６６】
カスタムプライマーを選択する方法は、１種または複数のｍＲＮＡ転写物、構造的ＲＮＡを含む非コード転写物、転写される偽遺伝子、ゲノムアノテーションプロセスによって提供されるモデルｍＲＮＡ、ゲノムコンティグに相当する配列、またはこれらのいずれかの組合せに基づき、少なくとも１種の共通プライマーを選択するステップをさらに含み得る。
【０２６７】
カスタムプライマーを選択する方法は、核酸の１種または複数のサブセットを濃縮するプライマー選択方法をさらに含み得る。１種または複数のサブセットは、低存在量ｍＲＮＡを含み得る。
【０２６８】
カスタムプライマーを選択する方法は、コンピューターによるアルゴリズムをさらに含み得る。方法において使用されるプライマーは、ユーザー定義入力配列に基づきプライマー配列を示唆するコンピュータプログラムであるＰｒｉｍｅｒ３の使用により設計することができる。他のプライマー設計を使用することもできる、またはプライマーは、コンピュータプログラムの助けなしで目測により選択することができる。プライマー設計を大部分の用途の目的に合わせるための、プログラムにより利用できる多くのオプションが存在する。Ｐｒｉｍｅｒ３は、オリゴ融解温度、長さ、ＧＣ含量、３’安定性、推定される二次構造、望ましくない配列（例えば、散在する反復）にアニーリングまたはこれを増幅する可能性、および同じプライマーの２コピー間のプライマーダイマー形成の可能性が挙げられるがこれらに限定されない、多くの因子を考慮することができる。プライマー対の設計において、Ｐｒｉｍｅｒ３は、産物サイズおよび融解温度、対となる２種のプライマー間のプライマーダイマー形成の可能性、プライマー融解温度間の差、ならびに回避するべき目的の特定の領域に対するプライマー位置を考慮することができる。
【０２６９】
本明細書に開示されている方法、組成物およびキットは、表２３〜２４に開示されている１種または複数のプライマーを含み得る。
【０２７０】
配列決定
一部の態様では、異なる標識された核酸の数の決定は、標識された核酸またはそのいずれかの産物（例えば、標識されたアンプリコン、標識されたｃＤＮＡ分子）の配列の決定を含み得る。場合によっては、増幅された標的核酸は、配列決定に付すことができる。標識された核酸またはそのいずれかの産物の配列の決定は、配列決定反応を実行して、試料タグ、分子識別子標識の少なくとも一部、標識された核酸の少なくとも一部、これらの相補体、これらの逆相補体、またはこれらのいずれかの組合せの配列を決定することを含み得る。場合によっては、試料タグまたは試料タグの一部のみが配列決定される。場合によっては、分子識別子標識または分子識別子標識の一部のみが配列決定される。
【０２７１】
標識された核酸またはそのいずれかの産物の配列の決定は、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ（商標）単一分子配列決定、ナノポアＤＮＡ配列決定、Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの大規模並列特徴配列決定（ＭＰＳＳ）、４５４ピロシーケンシング、単一分子リアルタイム（ＲＮＡＰ）配列決定、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Ｉｏｎ半導体配列決定、単一分子ＳＭＲＴ（商標）配列決定、Ｐｏｌｏｎｙ配列決定、ＤＮＡナノボール（ｎａｎｏｂａｌｌ）配列決定およびＶｉｓｉＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓアプローチ等、配列決定方法によって行うことができる。あるいは、標識された核酸またはそのいずれかの産物の配列の決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって提供されるゲノムアナライザーＩＩｘ、ＨｉＳｅｑおよびＭｉＳｅｑ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって提供されるＰａｃＢｉｏ  ＲＳシステム等の単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術、ならびにＳｏｌｅｘａシーケンサー、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）によって提供されるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）シーケンサー等のＴｒｕｅ単一分子配列決定（ｔＳＭＳ（商標））技術が挙げられるがこれらに限定されない、配列決定プラットフォームを使用することができる。
【０２７２】
一部の実施形態では、標識された核酸は、生物のゲノムの遺伝子の約０．０１％〜生物のゲノムの遺伝子の約１００％を表す核酸を含む。例えば、生物のゲノムの遺伝子の約０．０１％〜生物のゲノムの遺伝子の約１００％は、試料由来の相補的配列を含有する遺伝子を捕捉することにより、複数のマルチマーを含む標的相補的領域を使用して配列決定することができる。一部の実施形態では、標識された核酸は、生物のトランスクリプトームの転写物の約０．０１％〜生物のトランスクリプトームの転写物の約１００％を表す核酸を含む。例えば、生物のトランスクリプトームの転写物の約０．５０１％〜生物のトランスクリプトームの転写物の約１００％は、試料由来のｍＲＮＡを捕捉することにより、ポリＴテイルを含む標的相補的領域を使用して配列決定することができる。
【０２７３】
場合によっては、標識された核酸またはそのいずれかの産物の配列の決定は、ペアエンド配列決定（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ナノポア配列決定、ハイスループット配列決定、ショットガン配列決定、ダイターミネーター配列決定、複数プライマーＤＮＡ配列決定、プライマーウォーキング（ｐｒｉｍｅｒ  ｗａｌｋｉｎｇ）、サンガージデオキシ配列決定、Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、ピロシーケンシング、ｔｒｕｅ単一分子配列決定またはこれらのいずれかの組合せを含む。あるいは、標識された核酸またはそのいずれかの産物の配列は、電子顕微鏡法または化学的高感度電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍｉｃａｌ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｉｅｌｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイによって決定することができる。
【０２７４】
核酸（例えば、増幅された核酸、標識された核酸、標識された核酸のｃＤＮＡコピー等）の配列の決定は、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、定量的増加的蛍光ヌクレオチド付加配列決定（ＱＩＦＮＡＳ）、段階的ライゲーションおよび切断、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎレポータープローブ消化、ピロシーケンシング、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）、ＦＩＳＳＥＱビーズ、ゆらぎ配列決定、マルチプレックス配列決定、重合されたコロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定；ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）、対立遺伝子特異的オリゴライゲーションアッセイ（例えば、オリゴライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、ライゲーションされた直鎖状プローブおよびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）読み出し情報、ライゲーションされたパドロックプローブを使用した単一鋳型分子ＯＬＡ、ならびに／またはライゲーションされた環状パドロックプローブおよびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）読み出し情報を使用した単一鋳型分子ＯＬＡ）その他が挙げられるがこれらに限定されない、種々の配列決定方法を使用して行うことができる。Ｒｏｃｈｅ４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｏｌｅｘａ、ＡＢＩ−ＳＯＬｉＤ、ＩＯＮ  Ｔｏｒｒｅｎｔｓ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｅｌｉｃｏｓ、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒプラットフォーム等、プラットフォームを使用した環式アレイ配列決定等、ハイスループット配列決定方法を利用することもできる。配列決定は、ＭｉＳｅｑ配列決定を含み得る。配列決定は、ＨｉＳｅｑ配列決定を含み得る。配列決定は、本来のオリゴヌクレオチド上にあった細胞標識、分子標識および／または遺伝子を読み取ることができる。
【０２７５】
別の例では、標識された核酸またはそのいずれかの産物の配列の決定は、ＲＮＡ−ＳｅｑまたはマイクロＲＮＡ配列決定を含む。あるいは、標識された核酸またはそのいずれかの産物の配列の決定は、エドマン分解、ペプチド質量フィンガープリンティング、質量分析またはプロテアーゼ消化等、タンパク質配列決定技法を含む。
【０２７６】
配列決定反応は、ある特定の実施形態では、固体もしくは半固体支持体、ゲル、エマルション、表面、ビーズ、液滴、連続流、希釈物または１種もしくは複数の物理的に別々の容積において起こり得る。
【０２７７】
配列決定は、標識された核酸の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれを超えるヌクレオチドまたは塩基対の配列決定を含み得る。場合によっては、配列決定は、標識された核酸の少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれを超えるヌクレオチドまたは塩基対の配列決定を含む。他の事例では、配列決定は、標識された核酸の少なくとも約１５００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；９，０００；もしくは１０，０００またはそれを超えるヌクレオチドまたは塩基対の配列決定を含む。
【０２７８】
配列決定は、少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれを超える１ラン当たりの配列決定リードを含み得る。場合によっては、配列決定は、少なくとも約１５００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；９，０００；もしくは１０，０００またはそれを超える１ラン当たりの配列決定リードの配列決定を含む。配列決定は、約１，６００，０００，０００未満またはそれに等しい１ラン当たりの配列決定リードを含み得る。配列決定は、約２００，０００，０００未満またはそれに等しい１ラン当たりのリードを含み得る。
【０２７９】
異なる標識された核酸の数の決定は、１種または複数のアレイを含み得る。
【０２８０】
異なる標識された核酸の数の決定は、１種または複数のプローブと標識された核酸との接触を含み得る。
【０２８１】
本明細書に記載されているプローブは、標識された核酸または標識されたアンプリコンの少なくとも一部に相補的な配列を含み得る。複数のプローブは、固体支持体の別々の領域に配置することができ、固体支持体の別々の領域は、同一またはほとんど同一の配列のプローブを含む。場合によっては、固体支持体の２種またはそれを超える別々の領域は、オリゴヌクレオチドタグの２種の異なる特有の識別子領域の配列に相補的な配列を含む２種の異なるプローブを含む。
【０２８２】
場合によっては、複数のプローブは、アレイにハイブリダイズされる。複数のプローブは、アレイへの標識された分子のハイブリダイゼーションを可能にすることができる。複数のプローブは、確率論的標識オリゴｄＴに相補的な配列を含み得る。それに代えてまたはそれに加えて、複数のプローブは、分子に相補的な配列を含む。
【０２８３】
異なる標識された核酸の数の決定は、複数のプローブのアレイと標識された核酸との接触を含み得る。異なる標識された核酸の数の決定は、複数のプローブのスライドガラスと標識された核酸との接触を含み得る。
【０２８４】
異なる標識された核酸の数の決定は、標識されたプローブハイブリダイゼーション、標的特異的増幅、標的特異的配列決定、標的一塩基多型に特異的な標識されたヌクレオチドによる配列決定、制限酵素消化パターンに特異的な標識されたヌクレオチドによる配列決定、変異に特異的な標識されたヌクレオチドによる配列決定またはこれらの組合せを含み得る。
【０２８５】
異なる標識された核酸の数の決定は、配列特異的標識のフローサイトメトリー選別を含み得る。異なる標識された核酸の数の決定は、ビーズに付着させた標識された核酸の検出を含み得る。ビーズに付着させた標識された核酸の検出は、蛍光検出を含み得る。
【０２８６】
異なる標識された核酸の数の決定は、標的特異的プローブおよび標識された核酸または標的特異的な標識されたプローブの間の、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による複数の標識された核酸の計数を含み得る。
【０２８７】
標識された核酸の検出
本明細書に開示されている方法は、標識された核酸および／または標識されたアンプリコンの検出をさらに含み得る。標識された核酸および／または標識されたアンプリコンの検出は、表面、例えば、固体支持体への標識された核酸のハイブリダイゼーションを含み得る。方法は、核酸結合タンパク質による標的配列の免疫沈降をさらに含み得る。標識された核酸および／または標識されたアンプリコンの検出は、異なる標識された核酸の数の決定を可能にするまたは支援することができる。
【０２８８】
場合によっては、方法は、検出可能な標識と標識された核酸および／または標識されたアンプリコンと接触させて、検出可能な標識がコンジュゲートした標識された核酸を生成するステップをさらに含む。本明細書に開示されている方法は、検出可能な標識がコンジュゲートした標識された核酸を検出するステップをさらに含み得る。標識された核酸またはそのいずれかの産物（例えば、標識されたアンプリコン、検出可能な標識がコンジュゲートした標識された核酸）の検出は、試料タグもしくは分子識別子標識、分子、検出可能な標識、試料タグもしくは分子識別子標識の相補体、分子の相補体またはこれらのいずれかの組合せの少なくとも一部の検出を含み得る。
【０２８９】
標識された核酸またはそのいずれかの産物の検出は、エマルションまたは小液滴を含み得る。例えば、標識された核酸またはそのいずれかの産物は、エマルションまたは小液滴中に存在し得る。小液滴は、エマルションの連続相等、不混和性の第２の液体（および／またはより大きい小液滴）に被包された小容積の第１の液体となり得る。小液滴の容積および／またはエマルションにおける小液滴の平均容積は、例えば、とりわけ、約１マイクロリットル未満（または約１マイクロリットル〜１ナノリットルの間もしくは約１マイクロリットル〜１ピコリットルの間）、約１ナノリットル未満（または約１ナノリットル〜１ピコリットルの間）または約１ピコリットル未満（または約１ピコリットル〜１フェムトリットルの間）となり得る。小液滴（またはエマルションの小液滴）は、とりわけ、約１０００、１００もしくは１０マイクロメートル未満または約１０００〜１０マイクロメートルの直径（または平均直径）を有し得る。小液滴は、球状または非球状となり得る。約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００もしくは５００ミクロン、約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００もしくは５００ミクロン未満または約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００もしくは５００ミクロン超の平均直径を有する小液滴を作製することができる。小液滴は、約０．００１〜約５００、約０．０１〜約５００、約０．１〜約５００、約０．１〜約１００、約０．０１〜約１００または約１〜約１００ミクロンの平均直径を有することができる。小液滴は、単純小液滴または複合小液滴となり得る。用語、エマルションは、本明細書において、不混和性の液体（油と水等）の混合物を指すことができる。油相および／または油中水型エマルションは、水性小液滴内における反応混合物の区画化を可能にする。エマルションは、連続的油相内に水性小液滴を含み得る。本明細書に提供されているエマルションは、水中油型エマルションとなることができ、この場合、小液滴は、連続的水相内の油小液滴である。エマルションまたは小液滴を使用して、単一細胞を単離、例えば、空間的に単離する場合、固体支持体を使用しなくてもよい。よって、タグ付けおよび分析しようとする核酸は、固体支持体に結合されていなくてもよく、かかる事例では；細胞性標識は、タグ付けされた場合のエマルションまたは小液滴中に存在する単一細胞または細胞集団に相当し得る。よって、エマルションまたは小液滴は、単一細胞または複数の細胞でタグ付けまたは標識するステップを有効に単離することができ、細胞性標識を使用して、単一細胞または複数の細胞に由来する核酸を同定することができる。一部の実施形態では、小液滴は、例えば、マイクロウェルアレイへのビーズの適用と同様に、マイクロウェルに適用することができる。
【０２９０】
あるいは、標識された核酸またはそのいずれかの産物の検出は、１種または複数の溶液を含む。他の事例では、標識された核酸の検出は、１種または複数の容器を含む。
【０２９１】
標識された核酸またはそのいずれかの産物（例えば、標識されたアンプリコン、検出可能な標識がコンジュゲートした標識された核酸）の検出は、各標識された核酸またはその産物の検出を含み得る。例えば、本明細書に開示されている方法は、各標識された核酸の少なくとも一部を配列決定し、これにより、各標識された核酸を検出するステップを含む。
【０２９２】
場合によっては、標識された核酸および／または標識されたアンプリコンの検出は、電気泳動、分光法、顕微鏡法、ケミルミネッセンス、ルミネッセンス、蛍光、免疫蛍光、比色分析またはエレクトロケミルミネッセンス方法を含む。例えば、方法は、蛍光色素の検出を含む。標識された核酸またはそのいずれかの産物の検出は、比色分析方法を含み得る。例えば、比色分析方法は、比色計または比色分析リーダーの使用を含む。比色計および比色分析リーダーの非限定リストは、Ｓｅｎｓｏｖａｔｉｏｎの比色分析アレイイメージングリーダー（ＣＬＡＩＲ）、ＥＳＥＱｕａｎｔ側方流動イムノアッセイリーダー、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３４０ＰＣ  ３８、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０、ＶｅｒｓａＭａｘ、ＶＭａｘおよびＥＭａｘを含む。
【０２９３】
単独で、または標識された核酸および／もしくはアンプリコンを検出するための他の方法と組み合わせて使用される追加的な方法は、アレイ検出器、蛍光リーダー、非蛍光検出器、ＣＲリーダー、ルミノメータまたはスキャナの使用を含み得る。場合によっては、標識された核酸および／または標識されたアンプリコンの検出は、アレイ検出器の使用を含む。アレイ検出器の例として、ダイオードアレイ検出器、フォトダイオードアレイ検出器、ＨＬＰＣフォトダイオードアレイ検出器、アレイ検出器、ゲルマニウムアレイ検出器、ＣＭＯＳおよびＣＣＤアレイ検出器、ゲート式線形ＣＣＤアレイ検出器、ＩｎＧａＡｓフォトダイオードアレイシステムならびにＴＥ冷却ＣＣＤシステムが挙げられるがこれらに限定されない。アレイ検出器は、マイクロアレイ検出器となり得る。マイクロアレイ検出器の非限定例として、微小電極アレイ検出器、光学ＤＮＡマイクロアレイ検出プラットフォーム、ＤＮＡマイクロアレイ検出器、ＲＮＡマイクロアレイ検出器およびタンパク質マイクロアレイ検出器が挙げられる。
【０２９４】
場合によっては、蛍光リーダーを使用して、標識された核酸および／または標識されたアンプリコンを検出する。蛍光リーダーは、バイオチップ、スライドまたはマイクロプレートにおける１、２、３、４、５種もしくはそれを超える色の蛍光マイクロアレイまたは他の構造を読み取ることができる。場合によっては、蛍光リーダーは、Ｓｅｎｓｏｖａｔｉｏｎ蛍光アレイイメージングリーダー（ＦＬＡＩＲ）である。あるいは、蛍光リーダーは、Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳ蛍光マイクロプレートリーダー、Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＭ蛍光マイクロプレートリーダー、Ｆｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎフィルターに基づく蛍光マイクロプレートリーダー、ＰＨＥＲＡｓｔａｒマイクロプレートリーダー、ＦｌＵＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー、ＰＯＬＡＲｓｔａｒオメガマイクロプレートリーダー、ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡマルチモードマイクロプレートリーダーおよびＰＯＬＡＲｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡマルチモードマイクロプレートリーダー等、蛍光マイクロプレートリーダーである。蛍光リーダーの追加的な例として、ＰｈａｒｏｓＦＸ（商標）およびＰｈａｒｏｓＦＸ  Ｐｌｕｓシステムが挙げられる。
【０２９５】
場合によっては、標識された核酸および／または標識されたアンプリコンの検出は、マイクロプレートリーダーの使用を含む。場合によっては、マイクロプレートリーダーは、ｘＭａｒｋ（商標）マイクロプレート吸光度分光光度計、ｉＭａｒｋマイクロプレート吸光度リーダー、ＥｎＳｐｉｒｅ（登録商標）マルチモードプレートリーダー、ＥｎＶｉｓｉｏｎ多重標識プレートリーダー、ＶＩＣＴＯＲ  Ｘ多重標識プレートリーダー、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐａｒａｄｉｇｍ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ４、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２−Ｍ２ｅ、ＦｉｌｔｅｒＭａｘ  Ｆシリーズ、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬマイクロプレート蛍光光度計およびルミノメータ、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート蛍光光度計、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔマイクロプレートルミノメータ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸマイクロプレート光度計、Ｍｕｌｉｓｋａｎ  ＦＣマイクロプレート光度計ならびにＭｕｌｉｓｋａｎ  ＧＯマイクロプレート光度計である。場合によっては、マイクロプレートリーダーは、吸光度、蛍光、ルミネッセンス、時間分解蛍光、光散乱またはこれらのいずれかの組合せを検出する。一部の実施形態では、マイクロプレートリーダーは、動的光散乱を検出する。マイクロプレートリーダーは、場合によっては、静的光散乱を検出することができる。場合によっては、標識された核酸および／または標識されたアンプリコンの検出は、マイクロプレート撮像器の使用を含む。場合によっては、マイクロプレート撮像器は、ＶｉｅｗＬｕｘ  ｕＨＴＳマイクロプレート撮像器およびＢｉｏＲａｄマイクロプレートイメージングシステムを含む。
【０２９６】
標識された核酸および／またはその産物の検出は、ルミノメータの使用を含み得る。ルミノメータの例として、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌ、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−９６マイクロプレートルミノメータ、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−２０／２０単一チューブルミノメータ、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ＋とＩｎｓｔｉｎｃｔ（商標）ソフトウェア、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ  Ｊｒ単一チューブマルチモードリーダー、ＬＵＭＩｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ、ＬＥＡＤＥＲ  ＨＣ＋ルミノメータ、ＬＥＡＤＥＲ  ４５０ｉルミノメータおよびＬＥＡＤＥＲ  ５０ｉルミノメータが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２９７】
場合によっては、標識された核酸および／または標識されたアンプリコンの検出は、スキャナの使用を含む。スキャナは、Ｃａｎｎｏｎ、Ｅｐｓｏｎ、ＨＰ、ＦｕｊｉｔｓｕおよびＸｅｒｏｘによって提供されるフラットベッドスキャナ等、フラットベッドスキャナを含む。フラットベッドスキャナの追加的な例は、ＦＭＢＩＯ（登録商標）蛍光イメージングスキャナ（例えば、ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＩＩ  Ｐｌｕｓシステム）を含む。スキャナは、Ａｒｒａｙｉｔ  ＡｒｒａｙＰｉｘ（商標）マイクロアレイマイクロプレートスキャナ等、マイクロプレートスキャナを含み得る。場合によっては、スキャナは、Ｂｉｏ−ｒａｄによって提供されるＰｅｒｓｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（商標）（ＰＭＩ）システムである。
【０２９８】
標識された核酸の検出は、荷電粒子の質量対電荷比を測定する分析的技法、例えば、質量分析の使用を含み得る。一部の実施形態では、荷電粒子の質量対電荷比は、クロマトグラフィー分離技法と組み合わせて測定される。一部の実施形態では、配列決定反応は、荷電粒子測定の質量対電荷比と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、タグは、同位体を含む。一部の実施形態では、同位体の型または比は、タグライブラリーにおいて制御または操作される。
【０２９９】
標識された核酸またはそのいずれかの産物の検出は、小粒子および／または光散乱の使用を含む。例えば、増幅された分子（例えば、標識されたアンプリコン）は、ハプテンまたは直接的に小粒子に付着させ、アレイにハイブリダイズさせる。小粒子は、ナノメートルからマイクロメートル範囲のサイズとなり得る。その表面から光が散乱されると、粒子を検出することができる。
【０３００】
小粒子が着色された比色分析アッセイを使用することができる、または比色分析検出システムによりハプテンを染色することができる。場合によっては、フラットベッドスキャナを使用して、粒子から散乱された光または着色材料の発色を検出することができる。本明細書に開示されている方法は、光吸収材料の使用をさらに含み得る。光吸収材料を使用して、望ましくない光散乱または反射を遮断することができる。光吸収材料は、食品着色料または他の材料となり得る。場合によっては、標識された核酸またはそのいずれかの産物の検出は、軸外白色光（ｏｆｆ−ａｘｉｓ  ｗｈｉｔｅ  ｌｉｇｈｔ）と標識された核酸との接触を含む。
【０３０１】
一部の実施形態では、試料由来の２種またはそれを超える異なる種類の生物学的材料は、同時に検出することができる。例えば、試料由来の、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）、ヌクレオチド、タンパク質および炭水化物からなる群より選択される２種またはそれを超える異なる種類の生物学的材料は、同時に検出することができる。例えば、試料由来のＤＮＡおよびＲＮＡは、本明細書に記載されている方法を使用して同時に検出することができる。
【０３０２】
データ分析
配列決定データを使用して、細胞における標的核酸分子の数を計数することができる。例えば、細胞における複数コピーの標的核酸は、固体支持体における異なるオリゴヌクレオチドに結合することができる。複数の標的核酸は、増幅および配列決定される場合、異なる分子標識を含み得る。同じ標的核酸のための分子標識の数は、細胞における標的核酸のコピー数を示すことができる。標的核酸のコピー数の決定は、細胞における標的核酸の濃度を決定する際の増幅バイアスの除去に有用となることができる。
【０３０３】
配列決定データを使用して、被験体の遺伝子型を決定することができる。異なる細胞性標識を有する標的核酸を比較することにより、標的核酸のコピー数変動および／または濃度を決定することができる。異なる細胞性標識を有する標的核酸の濃度を比較することにより、配列決定データを使用して、細胞遺伝子型不均質性を決定することができる。例えば、試料の第１の細胞は、高濃度の標的核酸を含み得る一方、試料の第２の細胞は、標的核酸を含まなくてよい、または低濃度の標的核酸を含み得、これにより、細胞試料の不均質性を示す。
【０３０４】
細胞遺伝子型不均質性の決定は、疾患の処置経過の診断、予後および決定に有用となることができる。例えば、試料の第１の細胞が標的核酸を含むが、試料の第２の細胞が標的核酸を含まず、第２の標的核酸を含む場合、処置経過は、第１の遺伝子型を標的化する薬剤（例えば、薬物）および第２の遺伝子型を標的化する薬剤（例えば、薬物）を含み得る。
【０３０５】
一部の実施形態では、ある特定の配列型は、ＤＮＡまたはＲＮＡプロファイルに関連付けることができる。例えば、Ｔ細胞受容体および／またはＢ細胞受容体配列は、単一細胞等、試料の転写プロファイル、マイクロＲＮＡプロファイルまたはゲノム変異プロファイルに関連付けることができる。一部の実施形態では、ある特定の配列型は、抗原性またはタンパク質発現プロファイルに関連付けることができる。例えば、Ｔ細胞受容体および／またはＢ細胞受容体配列は、Ｔ細胞受容体および／またはＢ細胞受容体配列を含む抗体のタンパク質標的等、タンパク質を含む表面等、表面への抗体の結合により、抗原性またはタンパク質発現プロファイルに関連付けることができる。
【０３０６】
一部の実施形態では、ウイルス配列等、配列の存在または非存在は、ＤＮＡまたはＲＮＡプロファイルに関連付けることができる。例えば、ウイルス配列等、配列の存在または非存在は、単一細胞等、試料の転写プロファイル、マイクロＲＮＡプロファイルまたはゲノム変異プロファイルに関連付けることができる。
【０３０７】
キット
本開示は、本開示の方法を行うためのキットを提供する。キットは、マイクロウェルアレイ、オリゴヌクレオチドおよび固体支持体のうち１種または複数を含み得る。キットは、オリゴヌクレオチドおよび／または固体支持体を再構成および／または希釈するための試薬を含み得る。キットは、固体支持体にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートするための試薬を含み得る。キットは、１種または複数の追加的な試薬をさらに含み得、かかる追加的な試薬は、洗浄バッファー、対照試薬、標的核酸を増幅する（例えば、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行う）ための増幅剤、および固体支持体にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートするためのコンジュゲーション剤から選択することができる。対象キットの成分は、別々の容器内に存在しても、単一の容器内に組み合わせてもよい。
【０３０８】
キットは、対象方法を実施するためのキットの成分を使用するための説明書を含み得る。対象方法を実施するための説明書は、適した記録媒体に記録することができる。例えば、説明書は、紙またはプラスチック等の被印刷物に印刷することができる。したがって、説明書は、キット内に添付文書として、キットまたはその成分（即ち、パッケージングまたはサブパッケージングに付随）等の容器のラベルに存在することができる。一部の実施形態では、説明書は、適したコンピュータ可読ストレージ媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ等に存在する電子ストレージデータファイルとして存在することができる。一部の実施形態では、実際の説明書は、キット内に存在しなくてもよいが、例えばインターネットを介して遠隔供給源から説明書を得るための手段が提供される。例えば、キットは、説明書を閲覧することができるおよび／または説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含み得る。説明書と同様に、説明書を得るためのこのような手段は、適した担体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に記録される。
【０３０９】
２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子の分析において使用するためのキットが本明細書にさらに開示されている。本明細書に開示されているキットは、少なくとも約３８４種の試料の処理に十分な複数のビーズ、プライマーおよび増幅剤を含み得る。試料のうちいずれか１種は、単一細胞を含み得る。核酸増幅は、試料における約１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００種の標的化核酸の測定をもたらすことができる。核酸増幅は、試料における約１０００種の標的化核酸の測定をもたらすことができる。核酸増幅は、試料における約１００種の標的化核酸の測定をもたらすことができる。核酸増幅は、単一細胞における総核酸の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の測定をもたらすことができる。核酸増幅は、単一細胞における全核酸配列の網羅的測定をもたらすことができる。核酸増幅は、配列決定による単一細胞における標的化核酸配列の測定をもたらすことができる。核酸増幅は、アレイによる単一細胞における標的化核酸配列の測定をもたらすことができる。
【０３１０】
増幅剤は、プライマーの固定されたパネルを含み得る。増幅剤は、少なくとも一対のカスタムプライマーを含み得る。増幅剤は、少なくとも一対の対照プライマーを含み得る。増幅剤は、少なくとも一対のハウスキーピング遺伝子プライマーを含み得る。適した増幅剤は、ＰＣＲマスターミックスを含み得る。キットは、プライマー設計および最適化のための説明書をさらに含み得る。キットは、マイクロウェルプレートをさらに含み得、マイクロウェルプレートは、１個以下のビーズが分布された少なくとも１個のウェルを含み得る。キットは、１個または複数の追加的な容器をさらに含み得る。１個または複数の追加的な容器は、１種または複数の追加的な複数の試料タグを含み得る。１個または複数の追加的な容器内の複数の１種または複数の追加的な試料タグは、第１の容器内の第１の複数の試料タグとは異なる。１個または複数の追加的な容器は、１種または複数の追加的な分子識別子標識を含み得る。１個または複数の追加的な容器の１種または複数の追加的な分子識別子標識は、第２の容器の１種または複数の追加的な分子識別子標識と同じである。  
【０３１１】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１個または複数のピペットチップおよび／または容器（例えば、チューブ、バイアル、マルチウェルプレート、マイクロウェルプレート、エッペンドルフチューブ、スライドガラス、ビーズ）の使用を含み得る。場合によっては、ピペットチップは、低結合ピペットチップである。それに代えてまたはそれに加えて、容器は、低結合容器となり得る。低結合ピペットチップおよび低結合容器は、シリコーンに基づくチップおよび非低結合容器に伴う浸出および／または後続の試料分解を低減し得る。低結合ピペットチップおよび低結合容器は、非低結合ピペットチップおよび容器と比較して試料結合を低減し得る。低結合チップの例として、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤｅｃｋＷｏｒｋｓ（商標）低結合チップおよびＡｖａｎｔ  Ｐｒｅｍｉｕｍ低結合目盛り付きチップが挙げられるがこれらに限定されない。低結合容器の非限定リストは、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）低結合微量遠心分離チューブならびにＣｏｓｍｏｂｒａｎｄ低結合ＰＣＲチューブおよび微量遠心分離チューブを含む。
【０３１２】
本明細書に開示されているキットのいずれかは、ソフトウェアをさらに含み得る。例えば、キットは、バーコードまたは標的配列等、配列を分析するためのソフトウェアを含み得る。例えば、キットは、単一細胞由来の特有の標的分子等、特有の標的分子を計数するためのバーコードまたは標的配列等、配列を分析するためのソフトウェアを含み得る。例えば、キットは、単一細胞由来の遺伝子等、遺伝子由来の特有の標的分子等、特有の標的分子を計数するためのバーコードまたは標的配列等、配列を分析するためのソフトウェアを含み得る。
【０３１３】
マイクロウェルおよびマイクロウェルアレイ
場合によっては、本開示の方法は、コンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを含む固体支持体と細胞との接触を提供する。接触させるステップは、表面上で行うことができる。例示的な表面は、マイクロウェル、チューブ、フラスコおよびチップを含み得る。場合によっては、表面は、マイクロウェルを含む。場合によっては、マイクロウェルは、マイクロウェルアレイの一部である。
【０３１４】
マイクロウェルアレイのマイクロウェルは、マイクロウェル１個当たり少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個またはそれを超える細胞を含有することができるサイズおよび形状のものとなり得る。マイクロウェルは、マイクロウェル１個当たり最大でも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個またはそれを超える細胞を含有することができるサイズおよび形状のものとなり得る。マイクロウェルアレイのマイクロウェルは、マイクロウェル１個当たり少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個またはそれを超える固体支持体を含有することができるサイズおよび形状のものとなり得る。マイクロウェルは、マイクロウェル１個当たり最大でも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個またはそれを超える固体支持体を含有することができるサイズおよび形状のものとなり得る。マイクロウェルは、最大でも１個の細胞および１個の固体支持体を含み得る。マイクロウェルは、最大でも１個の細胞および２個の固体支持体を含み得る。マイクロウェルは、少なくとも１個の細胞および最大でも１個の固体支持体を含み得る。マイクロウェルは、少なくとも１個の細胞および最大でも２個の固体支持体を含み得る。
【０３１５】
マイクロウェルアレイにおけるマイクロウェルは、水平に配置することができる。マイクロウェルは、垂直に配置することができる。マイクロウェルは、等しいまたはほとんど等しいスペーシングで配置することができる。マイクロウェルアレイは、１個または複数のマイクロウェルに関連するマーカーを有することができる。例えば、マイクロウェルアレイのマイクロウェルは、それぞれ規定数のマイクロウェルで構成された群に分けることができる。これらの群は、基材の主表面に設置することができる。マーカーは、各群のポジションを決定することができるように設置することができる。マーカーは、肉眼で検出可能となり得る。マーカーは、観察のための光学機器を必要とするマーカーとなり得る（例えば、蛍光マーカー、発光マーカー、ＵＶマーカー）。
【０３１６】
マイクロウェルアレイは、少なくとも約９６、３８４、１０００、５０００、１００００、１５０００、１０００００、１５００００、５０００００、１００００００もしくは５００００００個またはそれを超えるマイクロウェルを含み得る。マイクロウェルアレイは、最大でも約９６、３８４、１０００、５０００、１００００、１５０００、１０００００、１５００００、５０００００、１００００００もしくは５００００００個またはそれを超えるマイクロウェルを含み得る。
【０３１７】
マイクロウェルの形状は、円柱状となり得る。マイクロウェルの形状は、複数の面で構成された多面体（例えば、平行六面体、六角柱または八角柱）、逆円錐、逆錐体（逆三角錐、逆四角錐、逆五角錐、逆六角錐または７個もしくはそれを超える角を有する逆多角錐）等、非円柱状となり得る。マイクロウェルは、これらの形状のうち２種またはそれ超を組み合わせた形状を含み得る。例えば、これは、部分的に円柱状となり、残り部分が逆円錐の形状を有することができる。マイクロウェルの形状は、逆円錐または逆錐体の頂部の一部が切り取られた形状となり得る。マイクロウェルの口は、マイクロウェルの頂部またはマイクロウェルの底部に存在し得る。マイクロウェルの底部は、平坦となり得るが、湾曲した表面（例えば、凸面または凹面）も可能である。マイクロウェルの形状およびサイズは、マイクロウェルに貯蔵しようとする細胞および／または固体基材の種類（例えば、形状、サイズ）を考慮して決定することができる。
【０３１８】
マイクロウェルの直径は、マイクロウェルの平面形状に刻まれ得る最大の丸を指すことができる。マイクロウェルの直径は、マイクロウェルに含有しようとする細胞および／または固体支持体の直径の少なくとも約０．１、０．５、１、２もしくは３倍またはそれを超えることができる。マイクロウェルの直径は、マイクロウェルに含有しようとする細胞および／または固体支持体の直径の最大でも約０．１、０．５、１、２もしくは３倍またはそれを超えることができる。マイクロウェルの直径は、固体支持体の直径の少なくとも約１０、２０、３０、４０もしくは５０％またはそれを超えることができる。マイクロウェルの直径は、固体支持体の直径の最大でも約１０、２０、３０、４０もしくは５０％またはそれを超えることができる。マイクロウェルの直径は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０またはそれを超えるマイクロメートルとなることができる。マイクロウェルの直径は、最大でも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０またはそれを超えるマイクロメートルとなることができる。マイクロウェルの直径は、約２５マイクロメートルである。場合によっては、マイクロウェルの直径は、約３０マイクロメートルである。場合によっては、マイクロウェルの直径は、約２８マイクロメートルである。
【０３１９】
マイクロウェル容積および固体支持体容積の間の差は、少なくとも約１×１０(-14)ｍ3、１．５×１０(-14)ｍ3、１．７×１０(-14)ｍ3、２．０×１０(-14)ｍ3、２．５×１０(-14)ｍ3もしくは３．０×１０(-14)ｍ3またはそれを超えることができる。マイクロウェル容積および固体支持体容積の間の差は、最大でも約１×１０(-14)ｍ3、１．５×１０(-14)ｍ3、１．７×１０(-14)ｍ3、２．０×１０(-14)ｍ3、２．５×１０(-14)ｍ3もしくは３．０×１０(-14)ｍ3またはそれを超えることができる。マイクロウェル容積および固体支持体容積の間の差は、少なくとも約１×１０(-11)Ｌ、１．５×１０(-11)Ｌ、１．７×１０(-11)Ｌ、２．０×１０(-11)Ｌ、２．５×１０(-11)Ｌもしくは３．０×１０(-11)Ｌまたはそれを超えることができる。マイクロウェル容積および固体支持体容積の間の差は、最大でも約１×１０(-11)Ｌ、１．５×１０(-11)Ｌ、１．７×１０(-11)Ｌ、２．０×１０(-11)Ｌ、２．５×１０(-11)Ｌもしくは３．０×１０(-11)Ｌまたはそれを超えることができる。図７は、マイクロウェル、固体支持体の容積、ならびにマイクロウェルおよび固体支持体容積の間の差に関する例示的な統計を説明する。
【０３２０】
マイクロウェルの深さは、マイクロウェルに含有しようとする細胞および／または固体支持体の直径の少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４もしくは５倍またはそれを超えることができる。マイクロウェルの深さは、マイクロウェルに含有しようとする細胞および／または固体支持体の直径の最大でも約０．１、０．５、１、２、３、４もしくは５倍またはそれを超えることができる。マイクロウェルの深さは、固体支持体の深さの少なくとも約１０、２０、３０、４０もしくは５０％またはそれを超えることができる。マイクロウェルの深さは、固体支持体の深さの最大でも約１０、２０、３０、４０もしくは５０％またはそれを超えることができる。マイクロウェルの深さは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０またはそれを超えるマイクロメートルとなることができる。マイクロウェルの深さは、最大でも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０またはそれを超えるマイクロメートルとなることができる。マイクロウェルの深さは、約３０マイクロメートルとなることができる。マイクロウェルの深さは、約２８マイクロメートルとなることができる。マイクロウェルは、平坦または実質的に平坦となることができる。
【０３２１】
マイクロウェルアレイは、ウェル間にスペーシングを含み得る。ウェル間のスペーシングは、少なくとも約５、１０、２５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０またはそれを超えるマイクロメートルとなることができる。ウェル間のスペーシングは、最大でも約５、１０、２５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０またはそれを超えるマイクロメートルとなることができる。ウェル間のスペーシングは、約１５マイクロメートルとなることができる。ウェル間のスペーシングは、約２５マイクロメートルとなることができる。
【０３２２】
マイクロウェルの内壁のいずれかのポジションにおける窪みおよび隆起の高さに差が存在し得る。滑らかにするよう処理されたウェルの内壁の一部に窪みおよび隆起を作製することにより、ウェルに機能性を加えることができる。マイクロウェルの内壁は、エッチングにより滑らかになり得る。エッチングデバイスにおける真空の程度、エッチングガスの種類、エッチングステップその他を適宜選択することができる。例えば、マイクロウェルの内壁の平滑化は、ウェットエッチングによりまたは高温酸化ステップをオキシドフィルムエッチングと組み合わせることにより実行することができる。マイクロウェルの内壁を官能化することができる（例えば、オリゴヌクレオチド、反応基、官能基で官能化）。
【０３２３】
マイクロウェルアレイは、シリコン、金属（例えば、アルミニウム、ステンレス鋼、銅、ニッケル、クロムおよびチタン）、ＰＤＭＳ（エラストマー）、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、プルロニック（ｐｌｕｏｒｏｎｉｃ）（例えば、プルロニックＦ１２７）、プラスチック（例えば、ＰＭＭＡ等、天然で親水性であるプラスチック）、疎水性であるが、親水性となるよう処理することができるプラスチック（例えば、ＰＰ、ＣＯＰ、ＣＯＣ）およびエラストマー（例えば、ＰＤＭＳ）、ヒドロゲル（例えば、ポリアクリルアミド、アルギネート）または樹脂（例えば、ポリイミド、ポリエチレン、塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリルおよびポリエチレンテレフタレート）から作製することができる。マイクロウェルアレイは、疎水性の材料から作製することができる。マイクロウェルアレイは、疎水性であるが、親水性となるようにコーティングされた（例えば、酸素プラズマ処理により）材料から作製することができる。マイクロウェルアレイは、親水性であるが、疎水性となるようにコーティングされた材料から作製することができる。
【０３２４】
マイクロウェルアレイを、組み立てることができる。マイクロウェルアレイアセンブリは、パターンを有するシリコンウエハ（例えば、ＳＵ８フォトレジストにより作製されたパターン化ポスト）を得ることと、これをＰＤＭＳ材料とインキュベートして、ソフトリソグラフィー（例えば、８０Ｃで数時間）によりウェルのアレイを作製することとを含み得る。例えば、未硬化ＰＤＭＳは、液体となり得る。未硬化ＰＤＭＳは、ポスト間のギャップを充填し得る。ＰＤＭＳは、熱により硬化されると固体となり、これにより、ウェルのアレイを作製することができる。光学接着剤（例えば、ＮＯＡ８１／ＮＯＡ６３）をＰＤＭＳ材料（例えば、ＵＶ光を使用）に適用して、ポストのアレイ（例えば、複数のアレイ）を作製することができる。適用は、少なくとも約１秒間、２秒間、３秒間、４秒間、５秒間、６秒間、７秒間、８秒間、９秒間、１０秒間または１分間、２分間、３分間、４分間もしくは５分間あるいはそれを超えて行うことができる。アガロースを含む層を光学接着剤に適用することができる。アガロース層は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％またはそれを超えるアガロースとなり得る。アガロース層は、最大でも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％またはそれを超えるアガロースとなり得る。アガロース層は、約５％アガロースとなり得る。アガロース層は、Ｇｅｌｂｏｎｄフィルムにまたはアガロースが接着し得るいずれかの親水性基材に設置することができる。光学表面におけるアガロース層のインキュベーションは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０分間またはそれを超えることができる。光学表面におけるアガロース層のインキュベーションは、最大でも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０分間またはそれを超えることができる。
【０３２５】
場合によっては、本開示の方法は、マイクロウェルを含まなくてよい表面を使用することができる。表面は、ガラス、プラスチック、金属となり得る。表面は、固体支持体、細胞外マトリクス、ポリマーでコーティングすることができる。表面は、ウェルを含まなくてよい。表面は、分子拡散を限定するように空間的に配置された固体支持体を含み得る。細胞および／または細胞内容物を捕捉する本開示の方法は、平坦な表面上で行われ得る。細胞および／または細胞内容物を捕捉する本開示の方法は、懸濁液中で行われ得る。
【０３２６】
細胞および試料
本開示の細胞は、動物（例えば、ヒト、ラット、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、マウス）由来の細胞となり得る。場合によっては、細胞は、ヒト細胞である。細胞は、胎児ヒト細胞となり得る。胎児ヒト細胞は、胎児を妊娠した母体から得ることができる。細胞は、妊婦由来の細胞となり得る。細胞は、脊椎動物、無脊椎動物、真菌、古細菌または細菌由来の細胞となり得る。細胞は、多細胞組織（例えば、臓器（例えば、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道および胃）、胚盤胞）に由来し得る。細胞は、細胞培養物由来の細胞となり得る。細胞は、ＨｅＬａ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、ハイブリドーマ、幹細胞、未分化細胞、分化細胞、循環細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞その他となり得る。
【０３２７】
場合によっては、細胞は、がん性細胞である。がん細胞の非限定例として、前立腺がん細胞、乳がん細胞、結腸がん細胞、肺がん細胞、脳がん細胞および卵巣がん細胞を挙げることができる。場合によっては、細胞は、がん（例えば、循環腫瘍細胞）由来である。がんの非限定例として、腺腫、腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、小細胞癌、大細胞未分化癌、軟骨肉腫および線維肉腫を挙げることができる。
【０３２８】
場合によっては、細胞は、稀な細胞である。稀な細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環上皮細胞（ＣＥＣ）、循環幹細胞（ＣＳＣ）、幹細胞、未分化幹細胞、がん幹細胞、骨髄細胞、前駆細胞、泡沫細胞、胎児細胞、間葉系細胞、循環内皮細胞、循環子宮内膜細胞、栄養膜、免疫系細胞（宿主またはグラフト）、結合組織細胞、細菌、真菌または病原体（例えば、細菌または原生生物）、マイクロ粒子、細胞断片、タンパク質および核酸、細胞小器官、他の細胞成分（例えば、ミトコンドリアおよび核）ならびにウイルスとなり得る。
【０３２９】
場合によっては、細胞は、腫瘍由来である。場合によっては、腫瘍は、良性または悪性である。腫瘍細胞は、転移性細胞を含み得る。場合によっては、細胞は、複数の異なる細胞型（例えば、異なる遺伝子型）を含む固形組織由来である。
【０３３０】
細胞は、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物を含み得る。ウイルスとして、ＤＮＡまたはＲＮＡ動物ウイルス（例えば、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス）、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ロタウイルス）、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、風疹ウイルス）、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、呼吸器多核体ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス）、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、狂犬病ウイルス）、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、ＢｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅおよびＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パピローマウイルス）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アデノウイルス）、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（例えば、単純ヘルペスウイルス）およびＰｏｘｖｉｒｉｄａｅ（例えば、痘瘡ウイルス））を挙げることができるがこれらに限定されない。
【０３３１】
本開示の方法において使用することができる例示的な細菌は、Ａｃｔｉｎｏｍｅｄｕｒａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅその他を含み得る。グラム陰性細菌として、Ａｆｉｐｉａ  ｆｅｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ａｅｇｙｐｔｉｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚｉａｅ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕｒｔｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓその他が挙げられるがこれらに限定されない。他の細菌は、Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｋａｒｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ���Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉその他を含み得る。
【０３３２】
本開示の方法において使用しようとする例示的な真菌として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ、Ｃａｎｄｉｄａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｉおよびこれらの組合せを挙げることができるがこれらに限定されない。
【０３３３】
本開示の方法において使用しようとする例示的な寄生生物として、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙａｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ  ｂｉｅｎｅｕｓｉ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｅ、台形（ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ）アメーバ、虫（例えば、蠕虫）、特に、Ｎｅｍａｔｏｄａ（回虫、例えば、鞭虫、鉤虫、蟯虫、ａｓｃａｒｉｄｓ、ｆｉｌａｒｉｄｓその他）、Ｃｅｓｔｏｄａ（例えば、条虫）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３３４】
本開示の試料は、動物（例えば、ヒト、ラット、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、マウス）由来の試料となり得る。場合によっては、試料は、ヒト試料である。試料は、胎児ヒト試料となり得る。胎児ヒト試料は、胎児を妊娠した母体から得ることができる。試料は、妊婦由来の試料となり得る。試料は、脊椎動物、無脊椎動物、真菌、古細菌または細菌由来の試料となり得る。試料は、多細胞組織（例えば、臓器（例えば、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道および胃）、胚盤胞）に由来し得る。試料は、細胞培養物由来の細胞となり得る。
【０３３５】
試料は、複数の細胞を含み得る。試料は、複数の同じ種類の細胞を含み得る。試料は、複数の異なる種類の細胞を含み得る。試料は、細胞周期および／または分化経路の同じポイントにおける複数の細胞を含み得る。試料は、細胞周期および／または分化経路の異なるポイントにおける複数の細胞を含み得る。試料は、複数の試料を含み得る。
【０３３６】
複数の試料は、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００種またはそれを超える試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００種またはそれを超える試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００種の試料、９０００もしくは１０，０００種の試料もしくは１００，０００種の試料もしくは１，０００，０００種またはそれを超える試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１０，０００種の試料を含み得る。
【０３３７】
第１の試料における１種または複数の核酸は、第２の試料における１種または複数の核酸とは異なり得る。第１の試料における１種または複数の核酸は、複数の試料における１種または複数の核酸とは異なり得る。１種または複数の核酸は、少なくとも約１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、１０個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、１０００個のヌクレオチド、２０００個のヌクレオチド、３０００個のヌクレオチド、４０００個のヌクレオチド、５０００個のヌクレオチド、１０，０００個のヌクレオチド、１００，０００個のヌクレオチド、１，０００，０００個のヌクレオチドの長さを含み得る。
【０３３８】
第１の試料は、１個または複数の細胞を含み得、第２の試料は、１個または複数の細胞を含み得る。第１の試料の１個または複数の細胞は、第２の試料の１個または複数の細胞と同じ細胞型のものとなり得る。第１の試料の１個または複数の細胞は、複数の試料の１個または複数の異なる細胞とは異なる細胞型のものとなり得る。細胞型は、軟骨細胞、破骨細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、幹細胞、内皮細胞または平滑筋細胞となり得る。細胞型は、免疫細胞型となり得る。免疫細胞型は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板、樹状細胞、好中球、マクロファージまたは単球となり得る。
【０３３９】
複数の試料は、１個または複数の悪性細胞を含み得る。１個または複数の悪性細胞は、腫瘍、肉腫または白血病に由来することができる。
【０３４０】
複数の試料は、少なくとも１種の体液を含み得る。体液は、血液、尿、リンパ液、唾液を含み得る。複数の試料は、少なくとも１種の血液試料を含み得る。
【０３４１】
複数の試料は、１種または複数の生物学的組織由来の少なくとも１個の細胞を含み得る。１種または複数の生物学的組織は、骨、心臓、胸腺、動脈、血管、肺、筋肉、胃、腸、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、胆嚢、甲状腺、副腎、乳腺、卵巣、前立腺、精巣、皮膚、脂肪、眼または脳となり得る。
【０３４２】
生物学的組織は、感染した組織、罹患した組織、悪性組織、石灰化した組織または健康な組織を含み得る。
【０３４３】
複数の試料は、１種または複数の供給源に由来し得る。複数の試料は、２種またはそれを超える供給源に由来し得る。複数の試料は、１種または複数の被験体に由来し得る。複数の試料は、２種またはそれを超える被験体に由来し得る。複数の試料は、同じ被験体に由来し得る。１種または複数の被験体は、同じ種に由来し得る。１種または複数の被験体は、異なる種に由来し得る。１種または複数の被験体は、健康となり得る。１種または複数の被験体は、疾患、障害または状態に罹患し得る。複数の試料は、哺乳動物、細菌、ウイルス、真菌または植物から選択される起源の細胞を含み得る。１種または複数の試料は、ヒト、ウマ、ウシ、ニワトリ、ブタ、ラット、マウス、サル、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、鳥類、魚類、カエルおよびショウジョウバエに由来し得る。
【０３４４】
複数の試料は、一斉に得ることができる。複数の試料は、同時に得ることができる。複数の試料は、逐次的に得ることができる。複数の試料は、１種または複数の異なる試料を得る数年間、１００年間、１０年間、５年間、４年間、３年間、２年間または１年間の経過にわたって得ることができる。１種または複数の試料は、１種または複数の異なる試料を得る約１年間以内に得ることができる。１種または複数の試料は、１種または複数の異なる試料を得る１２カ月間、１１カ月間、１０カ月間、９カ月間、８カ月間、７カ月間、６カ月間、４カ月間、３カ月間、２カ月間または１カ月間以内に得ることができる。１種または複数の試料は、１種または複数の異なる試料を得る３０日間、２８日間、２６日間、２４日間、２１日間、２０日間、１８日間、１７日間、１６日間、１５日間、１４日間、１３日間、１２日間、１１日間、１０日間、９日間、８日間、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間または１日間以内に得ることができる。１種または複数の試料は、１種または複数の異なる試料を得る約２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、２時間または１時間以内に得ることができる。１種または複数の試料は、１種または複数の異なる試料を得る約６０秒間、４５秒間、３０秒間、２０秒間、１０秒間、５秒間、２秒間または１秒間以内に得ることができる。１種または複数の試料は、１種または複数の異なる試料を得る１秒間未満内に得ることができる。
【０３４５】
標的分子
本明細書に開示されている方法およびキットは、分子の確率論的標識化において使用することができる。かかる分子として、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、プリンおよびピリミジン塩基あるいは他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然または誘導体化ヌクレオチド塩基を含む、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ロックト核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれかである、いずれかの長さのポリマー型のヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、単一のヌクレオチドまたは塩基対からなることができる。あるいは、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、２またはそれを超えるヌクレオチドまたは塩基対を含む。例えば、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。別の例では、ポリヌクレオチドは、少なくとも約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００または１００００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾もしくは置換糖もしくはリン酸基に典型的に見出され得る通りに、糖およびリン酸基を含み得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド等、修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。よって、用語、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドは、一般に、本明細書に記載されているアナログ等、アナログを含む。このようなアナログは、核酸またはオリゴヌクレオシド配列に取り込まれる際に、溶液における天然に存在する核酸配列とのハイブリダイゼーションを可能にするように、天然に存在するヌクレオシドまたはヌクレオチドと共通したいくつかの構造的特色を有する分子である。典型的には、このようなアナログは、塩基、リボースまたはホスホジエステル部分を置き換えるおよび／または修飾することによる、天然に存在するヌクレオシドおよびヌクレオチドに由来する。変化は、所望の通りに、ハイブリッド形成を安定化もしくは不安定化する、または相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションの特異性を増強するために調整されて作製され得る。場合によっては、分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである。分子は、一本鎖または二本鎖となり得る。場合によっては、分子は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ等、ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子は、ポリアデニル化され得る。あるいは、ｍＲＮＡ分子は、ポリアデニル化されていない。あるいは、分子は、ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡとなり得る。ＤＮＡ分子は、エクソン、イントロン、非翻訳領域またはこれらのいずれかの組合せを含み得る。場合によっては、分子は、分子のパネルである。
【０３４６】
本明細書に開示されている方法およびキットを使用して、同一もしくはほとんど同一の分子および／または異なる分子の個々の出現を確率論的に標識することができる。場合によっては、本明細書に開示されている方法およびキットを使用して、同一またはほとんど同一の分子（例えば、分子は、同一またはほとんど同一の配列を含む）を確率論的に標識することができる。例えば、標識しようとする分子は、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を含む。ほとんど同一の分子は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレオチドまたは塩基対未満が異なり得る。複数の試料のうち１種または複数の試料における複数の核酸は、２種またはそれを超える同一配列を含み得る。複数の試料のうち１種または複数における総核酸の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％は、同じ配列を含み得る。複数の試料のうち１種または複数の試料における複数の核酸は、少なくとも２種の異なる配列を含み得る。複数の試料のうち１種または複数における総核酸の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％は、少なくとも２種の異なる配列を含み得る。場合によっては、標識しようとする分子は、互いにバリアントである。例えば、標識しようとする分子は、一塩基多型または他の種類の変異を含有することができる。別の例では、標識しようとする分子は、スプライスバリアントである。場合によっては、少なくとも１種の分子が確率論的に標識される。他の事例では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の同一またはほとんど同一の分子が確率論的に標識される。あるいは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００種の同一またはほとんど同一の分子が確率論的に標識される。他の事例では、少なくとも１５００；２，０００；２５００；３，０００；３５００；４，０００；４５００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；９，０００；または１００００種の同一またはほとんど同一の分子が確率論的に標識される。他の事例では、少なくとも１５，０００；２０，０００；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，０００；４５，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；または１００，０００種の同一またはほとんど同一の分子が確率論的に標識される。
【０３４７】
他の事例では、本明細書に開示されている方法およびキットを使用して、異なる分子を確率論的に標識することができる。例えば、標識しようとする分子は、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の配列同一性を含む。異なる分子は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれを超えるヌクレオチドまたは塩基対が異なり得る。場合によっては、少なくとも１種の分子が確率論的に標識される。他の事例では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の異なる分子が確率論的に標識される。あるいは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００種の異なる分子が確率論的に標識される。他の事例では、少なくとも１５００；２，０００；２５００；３，０００；３５００；４，０００；４５００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；９，０００；または１００００種の異なる分子が確率論的に標識される。他の事例では、少なくとも１５，０００；２０，０００；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，０００；４５，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；または１００，０００種の異なる分子が確率論的に標識される。
【０３４８】
標識しようとする異なる分子は、試料中に異なる濃度または量で存在し得る。例えば、ある分子の濃度または量は、試料中の別の分子の濃度または量よりも大きい。場合によっては、試料中の少なくとも１種の分子の濃度または量は、試料中の他の少なくとも１種の分子の濃度または量よりも少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００倍またはそれを超えて大きい。場合によっては、試料中の少なくとも１種の分子の濃度または量は、試料中の他の少なくとも１種の分子の濃度または量よりも少なくとも約１０００倍またはそれを超えて大きい。別の例では、ある分子の濃度または量は、試料中の別の分子の濃度または量に満たない。試料中の少なくとも１種の分子の濃度または量は、試料中の他の少なくとも１種の分子の濃度または量よりも少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００倍またはそれを超えて少なくなり得る。試料中の少なくとも１種の分子の濃度または量は、試料中の他の少なくとも１種の分子の濃度または量よりも少なくとも約１０００倍またはそれを超えて少なくなり得る。
【０３４９】
場合によっては、標識しようとする分子は、１種または複数の試料中に存在する。標識しようとする分子は、２種またはそれを超える試料中に存在し得る。２種またはそれを超える試料は、異なる量または濃度の標識しようとする分子を含有し得る。場合によっては、１種の試料中の１種の分子の濃度または量は、異なる試料中の同じ分子の濃度または量よりも大きくなり得る。例えば、血液試料は、尿試料よりも多い量の特定の分子を含有し得る。あるいは、単一の試料は、２個またはそれを超える部分試料（ｓｕｂｓａｍｐｌｅ）に分けられる。部分試料は、異なる量または濃度の同じ分子を含有し得る。ある試料中の少なくとも１種の分子の濃度または量は、別の試料中の同じ分子の濃度または量よりも少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００倍またはそれを超えて大きくなり得る。あるいは、１種の試料中の１種の分子の濃度または量は、異なる試料中の同じ分子の濃度または量に満たなくなり得る。例えば、心臓組織試料は、肺組織試料よりも多い量の特定の分子を含有し得る。ある試料中の少なくとも１種の分子の濃度または量は、別の試料中の同じ分子の濃度または量よりも少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００倍またはそれを超えて少なくなり得る。場合によっては、２種またはそれを超える異なる試料中の異なる濃度または量の分子は、試料バイアスと称される。
【０３５０】
本明細書に開示されている方法およびキットは、２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子の分析のために使用することができる。２種またはそれを超える分子は、２種またはそれを超えるポリペプチドを含み得る。方法は、２種またはそれを超える標識されたポリペプチドの同一性を決定するステップを含み得る。２種またはそれを超える標識されたポリペプチドの同一性を決定するステップは、質量分析を含み得る。方法は、第１の試料の標識されたポリペプチドを、第２の試料の標識されたポリペプチドと組み合わせるステップをさらに含み得る。標識されたポリペプチドは、異なる標識されたポリペプチドの数を決定する前に組み合わせることができる。方法は、第１の試料タグが付いたポリペプチドおよび第２の試料タグが付いたポリペプチドを組み合わせるステップをさらに含み得る。第１の試料タグが付いたポリペプチドおよび第２の試料タグが付いたポリペプチドは、複数の分子識別子標識との接触前に組み合わせることができる。異なる標識されたポリペプチドの数の決定は、標識されたポリペプチドの少なくとも一部の検出を含み得る。標識されたポリペプチドの少なくとも一部の検出は、試料タグ、分子識別子標識、ポリペプチドまたはこれらの組合せの少なくとも一部の検出を含み得る。
【０３５１】
本明細書において、用語「ポリペプチド」は、少なくとも１種のペプチドを含む分子を指す。場合によっては、ポリペプチドは、単一のペプチドからなる。あるいは、ポリペプチドは、２種またはそれを超えるペプチドを含む。例えば、ポリペプチドは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００種のペプチドを含む。ポリペプチドの例として、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ホルモン、オリゴ糖、脂質、糖脂質、リン脂質、抗体、酵素、キナーゼ、受容体、転写因子およびリガンドが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３５２】
被験体
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の被験体由来の細胞または試料の使用を含み得る。被験体は、ヒトまたは非ヒト被験体となり得る。被験体は、生きていてよい。被験体は、死んでいてよい。被験体は、介護者（例えば、医療従事者）にケアされているヒトとなり得る。被験体は、疾患を有すると疑われ得る。被験体は、疾患を有し得る。被験体は、疾患の症状を有し得る。被験体は、１種または複数の試料を提供する被験体となり得る。被験体は、哺乳動物、爬虫類、両生類および／または鳥類となり得る。被験体は、非ヒト霊長類となり得る。
【０３５３】
酵素
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の酵素を含み得る。酵素の例として、リガーゼ、逆転写酵素、ポリメラーゼおよび制限ヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、分子へのオリゴヌクレオチドタグの付着は、１種または複数のリガーゼの使用を含む。リガーゼの例として、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼ、ならびにＴ４  ＲＮＡリガーゼＩおよびＴ４  ＲＮＡリガーゼＩＩ等のＲＮＡリガーゼが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３５４】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の逆転写酵素の使用をさらに含み得る。場合によっては、逆転写酵素は、ＨＩＶ−１逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素およびテロメラーゼ逆転写酵素である。場合によっては、逆転写酵素は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である。
【０３５５】
場合によっては、本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数のポリメラーゼの使用を含む。ポリメラーゼの例として、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼが挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素およびＤＮＡポリメラーゼＩＶである。市販のＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂｓｔ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎ（商標）ｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＯｎｅＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５（商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）γＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、末端転移酵素、Ｔｉｔａｎｉｕｍ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＡＰＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＫＡＰＡ  ＴａｑホットスタートＤＮＡポリメラーゼが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３５６】
あるいは、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ｐｈｉ６  ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ等、ＲＮＡポリメラーゼである。
【０３５７】
場合によっては、本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の制限酵素を含む。制限酵素は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型制限酵素を含む。場合によっては、Ｉ型酵素は、その認識配列から離れてランダムにＤＮＡをカットする、複合型、多サブユニット、組合せ制限・修飾酵素である。一般に、ＩＩ型酵素は、その認識配列近くのまたはその内部の定義されたポジションでＤＮＡをカットする。これは、別々の制限断片および明確に異なるゲルバンド形成パターンを生成することができる。ＩＩＩ型酵素も、大型の組合せ制限・修飾酵素である。これは多くの場合、その認識配列の外側を切断し、切断を達成するために、同じＤＮＡ分子内に対向する配向性の２種のかかる配列を必要とし得る；これは稀に、完全な消化物を生じる。場合によっては、ＩＶ型酵素は、修飾された、典型的にはメチル化ＤＮＡを認識し、Ｅ．ｃｏｌｉのＭｃｒＢＣおよびＭｒｒシステムによって例証され得る。
【０３５８】
追加的な試薬
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の試薬の使用を含み得る。試薬の例として、ＰＣＲ試薬、ライゲーション試薬、逆転写試薬、酵素試薬、ハイブリダイゼーション試薬、試料調製試薬、ならびに核酸精製および／または単離のための試薬が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３５９】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数のバッファーの使用を含み得る。バッファーの例として、洗浄バッファー、ライゲーションバッファー、ハイブリダイゼーションバッファー、増幅バッファーおよび逆転写バッファーが挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、ハイブリダイゼーションバッファーは、ＴＭＡＣ  Ｈｙｂ溶液、ＳＳＰＥハイブリダイゼーション溶液およびＥＣＯＮＯ（商標）ハイブリダイゼーションバッファー等、市販のバッファーである。本明細書に開示されているバッファーは、１種または複数の洗剤を含み得る。
【０３６０】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の担体の使用を含み得る。担体は、本明細書に開示されている１種または複数の反応（例えば、ライゲーション反応、逆転写、増幅、ハイブリダイゼーション）の効率を増強または改善することができる。担体は、分子またはそのいずれかの産物（例えば、標識された分子、標識されたｃＤＮＡ分子、標識されたアンプリコン）の非特異的損失を減少または防ぐことができる。例えば、担体は、表面への吸収による標識された分子の非特異的損失を減少させることができる。担体は、表面または基材（例えば、容器、エッペンドルフチューブ、ピペットチップ）に対する分子、標識された分子またはそのいずれかの産物の親和性を減少させることができる。あるいは、担体は、表面または基材（例えば、ビーズ、アレイ、ガラス、スライド、チップ）に対する分子またはそのいずれかの産物の親和性を増加させることができる。担体は、分解から分子またはそのいずれかの産物を保護することができる。例えば、担体は、リボヌクレアーゼからＲＮＡ分子またはそのいずれかの産物を保護することができる。あるいは、担体は、ＤＮａｓｅからＤＮＡ分子またはそのいずれかの産物を保護することができる。担体の例として、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ等の核酸分子、またはポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。ＤＮＡ担体の例として、プラスミド、ベクター、ポリアデニル化ＤＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡ担体の例として、ポリアデニル化ＲＮＡ、ファージＲＮＡ、ファージＭＳ２  ＲＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡ、酵母ＲＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、哺乳動物ＲＮＡ、哺乳動物ｔＲＮＡ、短いポリアデニル化合成リボヌクレオチドおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡ担体は、ポリアデニル化ＲＮＡとなり得る。あるいは、ＲＮＡ担体は、非ポリアデニル化ＲＮＡとなり得る。場合によっては、担体は、細菌、酵母またはウイルス由来である。例えば、担体は、細菌、酵母またはウイルスに由来する核酸分子またはポリペプチドとなり得る。例えば、担体は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するタンパク質である。別の例では、担体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来する核酸分子である。あるいは、担体は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ヤギ、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌまたはウサギ）、トリ、両生類または爬虫類に由来する核酸分子またはペプチドである。
【０３６１】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の対照薬剤の使用を含み得る。対照薬剤は、対照オリゴ、不活性酵素、非特異的競合因子を含み得る。あるいは、対照薬剤は、ｂｒｉｇｈｔハイブリダイゼーション、ｂｒｉｇｈｔプローブ対照、核酸鋳型、スパイクイン対照、ＰＣＲ増幅対照を含む。ＰＣＲ増幅対照は、陽性対照となり得る。他の事例では、ＰＣＲ増幅対照は、陰性対照である。核酸鋳型対照は、既知濃度のものとなり得る。対照薬剤は、１種または複数の標識を含み得る。
【０３６２】
スパイクイン対照は、反応または試料に添加される鋳型となり得る。例えば、スパイクイン鋳型は、増幅反応に添加することができる。スパイクイン鋳型は、第１の増幅サイクル後のいずれかの時点で増幅反応に添加することができる。場合によっては、スパイクイン鋳型は、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第２０、第２５、第３０、第３５、第４０、第４５または第５０の増幅サイクル後の増幅反応に添加することができる。スパイクイン鋳型は、最後の増幅サイクル前のいずれかの時点で増幅反応に添加することができる。スパイクイン鋳型は、１または複数のヌクレオチドまたは核酸塩基対を含み得る。スパイクイン鋳型は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらのいずれかの組合せを含み得る。スパイクイン鋳型は、１種または複数の標識を含み得る。
【０３６３】
検出可能な標識
本明細書に開示されている方法、キットおよび組成物は、検出可能な標識をさらに含み得る。用語「検出可能な標識」、「タグ」または「標識」は、互換的に使用することができ、分子に付着させたいずれかの化学的部分（例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドポリマーまたは核酸結合因子、分子バーコード）を指すことができる。化学的部分は、分子に共有結合により付着させていてよい。化学的部分は、分子に非共有結合により付着させてていてよい。分子バーコード、試料タグおよび分子識別子標識は、検出可能な標識、タグまたは標識をさらに含み得る。好ましくは、標識は、検出可能であり、ヌクレオチドまたはヌクレオチドポリマーを本発明の実施者に検出可能なものとする。本明細書に開示されている方法と組み合わせて使用することができる検出可能な標識は、例えば、蛍光標識、ケミルミネッセント標識、クエンチャー、放射性標識、ビオチン、ピレン部分、金またはこれらの組合せを含む。検出可能な標識の非限定例は、ルミネセント分子、蛍光色素、蛍光クエンチング剤、着色分子、放射性同位体またはシンチラントを含む。
【０３６４】
場合によっては、本明細書に開示されている方法は、分子バーコード、分子識別子標識、試料タグ、標識された核酸またはそのいずれかの産物（例えば、標識されたアンプリコン）に１種または複数の検出可能な標識を付着させるステップをさらに含む。方法は、分子バーコード、分子識別子標識、試料タグまたは標識された核酸に２種またはそれを超える検出可能な標識を付着させるステップを含み得る。あるいは、方法は、分子バーコード、分子識別子標識、試料タグまたは標識された核酸に少なくとも約３、４、５、６、７、８、９または１０種の検出可能な標識を付着させるステップを含む。場合によっては、検出可能な標識は、Ｃｙ（商標）標識である。Ｃｙ（商標）標識は、Ｃｙ３標識である。それに代えてまたはそれに加えて、検出可能な標識は、ビオチンである。一部の実施形態では、検出可能な標識は、分子バーコード、分子識別子標識、試料タグまたは標識された核酸に結合するプローブに付着させる。これは、例えば、核酸または標識された核酸がアレイにハイブリダイズされた後に行うことができる。一例では、核酸または標識された核酸は、アレイにおけるパートナーに結合される。結合後に、標識された核酸に結合し得るプローブは、アレイにおける分子に結合される。このプロセスを、複数のプローブおよび標識により反復して、シグナルが、アレイへの標識の非特異的結合または分子の非特異的結合の結果である可能性を減少させることができる。
【０３６５】
ドナーアクセプター対は、検出可能な標識として使用することができる。ドナーまたはアクセプターのいずれかを、核酸に結合するプローブに付着させることができる。プローブは、例えば、核酸または標識された核酸に結合し得る核酸プローブとなり得る。対応するドナーまたはアクセプターを加えて、シグナルを生じることができる。
【０３６６】
場合によっては、検出可能な標識は、Ｆｒｅｅｄｏｍ色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、Ｃｙ（商標）色素、フルオレセイン色素またはＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲＤｙｅｓ（登録商標）である。場合によっては、Ｆｒｅｅｄｏｍ色素は、フルオレセイン（６−ＦＡＭ（商標）、６−カルボキシフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ））、ＭＡＸ（ＮＨＳエステル）、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＥＸ６１５、ＴＹＥ（商標）６６５、ＴＹＥ７０５である。検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素となり得る。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素の例として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＮＨＳエステル）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２（ＮＨＳエステル）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６（ＮＨＳエステル）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（ＮＨＳエステル）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＮＨＳエステル）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０（ＮＨＳエステル）またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０（ＮＨＳエステル）が挙げられる。あるいは、検出可能な標識は、Ｃｙ（商標）色素である。Ｃｙ（商標）色素の例として、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、検出可能な標識は、フルオレセイン色素である。フルオレセイン色素の非限定例として、６−ＦＡＭ（商標）（アジド）、６−ＦＡＭ（商標）（ＮＨＳエステル）、フルオレセインｄＴ、ＪＯＥ（ＮＨＳエステル）、ＴＥＴ（商標）およびＨＥＸ（商標）が挙げられる。場合によっては、検出可能な標識は、５’ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、５’ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００またはＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（ＮＨＳエステル）等、ＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲＤｙｅｓ（登録商標）である。場合によっては、検出可能な標識は、ＴＹＥ（商標）５６３である。あるいは、検出可能な標識は、Ｃｙ３である。
【０３６７】
検出可能な標識は、ローダミン色素となり得る。ローダミン色素の例として、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（商標）−Ｘ（ＮＨＳエステル）、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）（ＮＨＳエステル）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ（商標）−Ｘ（ＮＨＳエステル）、ＲＯＸ（商標）（ＮＨＳエステル）および５’ＴＡＭＲＡ（商標）（アジド）が挙げられるがこれらに限定されない。他の事例では、検出可能な標識は、ＷｅｌｌＲＥＤ色素である。ＷｅｌｌＲＥＤ色素として、ＷｅｌｌＲＥＤ  Ｄ４色素、ＷｅｌｌＲＥＤ  Ｄ３色素およびＷｅｌｌＲＥＤ  Ｄ２色素が挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、検出可能な標識は、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−Ｘ（ＮＨＳエステル）、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）６４０（ＮＨＳエステル）またはＤｙ７５０（ＮＨＳエステル）である。
【０３６８】
場合によっては、検出可能な標識は、リンカー分子を含む。リンカー分子の例として、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ＨＲＰ、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはその断片、Ｇｒｂ２、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、検出可能な標識は、重金属、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、色素および熱量測定基質を含む。他の事例では、検出可能な標識は、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびルシフェラーゼ等、酵素を含む。
【０３６９】
質量の変化は、表面プラズモン共鳴検出の場合と同様に、検出可能な標識と考慮することができる。当業者であれば、本発明の操作において用いることができる、本明細書においては言及されていない有用な検出可能な標識を容易に認識するであろう。
【０３７０】
場合によっては、検出可能な標識は、プライマーと共に使用される。例えば、ユニバーサルプライマーは、検出可能な標識で標識される（例えば、Ｃｙ３標識されたユニバーサルプライマー、フルオロフォア標識されたユニバーサルプライマー）。あるいは、標的特異的プライマーは、検出可能な標識で標識される（例えば、ＴＹＥ５６３標識された標的特異的プライマー）。他の事例では、検出可能な標識は、試料タグまたは分子識別子標識と共に使用される。例えば、オリゴヌクレオチドタグは、検出可能な標識で標識される（例えば、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドタグ）。他の事例では、検出可能な標識は、核酸鋳型分子と共に使用される。検出可能な標識を使用して、標識された分子または標識されたアンプリコンを検出することができる。あるいは、検出可能な標識を使用して、核酸鋳型分子を検出する。
【０３７１】
場合によっては、検出可能な標識は、プライマー、分子バーコード、試料タグ、分子識別子標識、標識された分子、標識されたアンプリコン、プローブ、ＨＣＲプローブおよび／または標識されていない核酸に付着させる。プライマー、オリゴヌクレオチドタグ、標識された分子、標識されたアンプリコンおよび／または標識されていない核酸に検出可能な標識を付着させるための方法として、化学的標識化および酵素標識化が挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、検出可能な標識は、化学的標識化により付着させる。一部の実施形態では、化学的標識化技法は、化学的反応基を含む。反応基の非限定例として、ＮＨＳ−フルオレセインまたはＮＨＳ−ローダミン等のアミン反応性スクシンイミジルエステル、ＦＩＴＣを含むアミン反応性イソチオシアネート誘導体、およびフルオレセイン−５−マレイミド等のスルフヒドリル反応性マレイミド活性化蛍光（ｆｌｕｏｒ）が挙げられる。一部の実施形態では、これらの反応性色素のいずれかと別の分子との反応は、フルオロフォアならびにリンカーおよび／または薬剤の間に形成される安定的共有結合をもたらす。一部の実施形態では、反応基は、イソチオシアネートである。一部の実施形態では、標識は、リシン側鎖の第一級アミンを介して薬剤に付着させる。一部の実施形態では、化学的標識化は、ＮＨＳエステル化学方法を含む。
【０３７２】
あるいは、検出可能な標識は、酵素標識化によって付着させる。酵素標識化方法として、ビオチンアクセプターペプチド／ビオチンリガーゼ（ＡＰ／Ｂｉｒ  Ａ）、アシル担体タンパク質／ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＡＣＰ／ＰＰＴａｓｅ）、ヒトＯ６−アルキルグアニントランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）、Ｑ−タグ／トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）、アルデヒドタグ／ホルミルグリシン生成酵素、変異した原核生物デハロゲナーゼ（ＨａｌｏＴａｇ（商標））およびファルネシル化モチーフ／タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ（ＰＦＴａｓｅ）方法を挙げることができるがこれらに限定されない。親和性標識化として、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびＦＫ５０６結合タンパク質１２のＰｈｅ３６Ｖａｌ変異体（ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ））を利用する非共有結合方法、ならびに金属キレート化方法を挙げることができるがこれらに限定されない。
【０３７３】
架橋試薬を使用して、プライマー、オリゴヌクレオチドタグ、標識された分子、標識されたアンプリコンおよび／または標識されていない核酸に検出可能な標識を付着させることができる。場合によっては、架橋試薬は、グルタルアルデヒドである。グルタルアルデヒドは、いくつかの経路により、アミン基と反応して架橋を作製することができる。例えば、還元条件下で、グルタルアルデヒドの両末端におけるアルデヒドは、アミンとカップリングして、二級アミン連結を形成する。
【０３７４】
場合によっては、プライマー、オリゴヌクレオチドタグ、標識された分子、標識されたアンプリコンおよび／または標識されていない核酸への検出可能な標識の付着は、過ヨウ素酸塩活性化と、続く還元的アミノ化を含む。場合によっては、スルホ−ＳＭＣＣまたは他のヘテロ二官能性架橋剤を使用して、プライマー、オリゴヌクレオチドタグ、標識された分子、標識されたアンプリコンおよび／または標識されていない核酸に検出可能な標識をコンジュゲートする。例えば、スルホ−ＳＭＣＣを使用して、薬物に酵素をコンジュゲートする。一部の実施形態では、酵素は、１ステップで活性化および精製され、続いて第２のステップで薬物にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、架橋の方向性は、１種の特異的配向性に限定される（例えば、抗体におけるスルフヒドリル基に対する、酵素におけるアミン）。
【０３７５】
疾患／状態
被験体における疾患または状態の状況または転帰を診断、モニターおよび／または予後診断するための方法、キットおよび組成物が本明細書に開示されている。一般に、方法は、（ａ）２種またはそれを超える試料由来の２種またはそれを超える分子を確率論的に標識して、２種またはそれを超える標識された核酸を生成するステップと、（ｂ）２種またはそれを超える標識された核酸を検出および／または定量化するステップと、（ｃ）２種またはそれを超える標識された核酸の検出および／または定量化に基づき、被験体における疾患または状態の状況または転帰を診断、モニターおよび／または予後診断するステップとを含む。方法は、治療レジメンを決定するステップをさらに含み得る。試料のうち２種またはそれ超は、疾患または状態を患う被験体由来の１種または複数の試料を含み得る。２種またはそれを超える試料は、健康な被験体由来の１種または複数の試料を含み得る。２種またはそれを超える試料は、対照由来の１種または複数の試料を含み得る。
【０３７６】
疾患または状態のモニターは、治療レジメンのモニターをさらに含み得る。治療レジメンのモニターは、治療レジメンの有効性の決定を含み得る。場合によっては、治療レジメンのモニターは、治療レジメンの投与、終了、追加または変更を含む。治療レジメンの変更は、治療レジメンの投薬量、投薬頻度または投与モードの増大または低減を含み得る。治療レジメンは、１種または複数の治療薬を含み得る。治療薬は、抗がん薬、抗ウイルス薬、抗細菌薬、抗病原体薬またはこれらのいずれかの組合せとなり得る。
【０３７７】
がん
場合によっては、疾患または状態は、がんである。確率論的に標識しようとする分子は、がん性細胞または組織に由来し得る。場合によっては、がんは、肉腫、癌、リンパ腫または白血病である。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管または他の結合もしくは支持組織のがんである。肉腫として、骨がん、線維肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、両側性前庭シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫（例えば、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢肉腫（ｃｙｓｔｏｓａｒｃｏｍａ  ｐｈｙｌｌｏｉｄｅｓ）、皮膚線維肉腫、類腱腫、類上皮細胞肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮細胞腫、血管性肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫および滑膜肉腫）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３７８】
癌は、身体の表面を覆い、ホルモンを生成し、腺を形成する細胞である上皮細胞において始まるがんである。非限定例として、癌は、乳がん、膵がん、肺がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、腎臓がん、膀胱がん、胃がん、前立腺がん、肝臓がん、卵巣がん、脳がん、腟がん、外陰部がん、子宮がん、口腔がん、陰茎がん、精巣がん、食道がん、皮膚がん、卵管のがん、頭頸部がん、胃腸管間質性がん、腺癌、皮膚性または眼内メラノーマ、肛門領域のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、尿道のがん、腎盂のがん、尿管のがん、子宮内膜のがん、子宮頸部のがん、下垂体のがん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫および脊髄軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ  ａｘｉｓ  ｔｕｍｏｒ）を含む。場合によっては、がんは、基底細胞癌、扁平上皮癌、メラノーマ、非メラノーマまたは光線性（日光）角化症等、皮膚がんである。
【０３７９】
場合によっては、がんは、肺がんである。肺がんは、肺（気管支）または肺の小気嚢（肺胞）に供給する気管から分岐する気道において開始し得る。肺がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌および中皮腫（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍｉａ）を含む。ＮＳＣＬＣの例として、扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌が挙げられる。中皮腫は、肺および胸腔（胸膜）の裏層または腹部（腹膜）の裏層のがん性腫瘍となり得る。中皮腫は、アスベスト曝露によるものとなり得る。がんは、神経膠芽腫等、脳がんとなり得る。
【０３８０】
あるいは、がんは、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍となり得る。ＣＮＳ腫瘍は、神経膠腫または非神経膠腫として分類することができる。神経膠腫は、悪性神経膠腫、高悪性度神経膠腫、びまん性内在橋神経膠腫（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｐｏｎｔｉｎｅ  ｇｌｉｏｍａ）となり得る。神経膠腫の例として、星状細胞腫、乏突起神経膠腫（または乏突起神経膠腫および星状細胞腫（ａｓｔｏｃｙｔｏｍａ）要素の混合物）および上衣腫が挙げられる。星状細胞腫として、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形神経膠芽腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状細胞腫および上衣下巨細胞性星状細胞腫が挙げられるがこれらに限定されない。乏突起神経膠腫は、低悪性度乏突起神経膠腫（または乏突起星細胞腫）および低分化乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｉｏｇｌｉｏｍａｓ）を含む。非神経膠腫は、髄膜腫、下垂体腺腫、原発性ＣＮＳリンパ腫および髄芽腫を含む。場合によっては、がんは、髄膜腫である。
【０３８１】
白血病は、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病または慢性骨髄球性白血病となり得る。追加的な種類の白血病は、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄単球性白血病および若年性骨髄単球性白血病を含む。
【０３８２】
リンパ腫は、リンパ球のがんであり、ＢまたはＴリンパ球のいずれかから発生し得る。主要な２種類のリンパ腫は、ホジキン病として以前に知られていたホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫である。ホジキンリンパ腫は、リード・シュテルンベルク細胞の存在によってマークされる。非ホジキンリンパ腫は、ホジキンリンパ腫ではない全てのリンパ腫である。非ホジキンリンパ腫は、緩慢進行性リンパ腫および侵襲性リンパ腫となり得る。非ホジキンリンパ腫として、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小細胞リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾臓周辺帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性浸出液リンパ腫およびリンパ腫様肉芽腫症が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３８３】
病原性感染
場合によっては、疾患または状態は、病原性感染である。確率論的に標識しようとする分子は、病原体に由来し得る。病原体は、ウイルス、細菌、真菌または原生生物となり得る。場合によっては、病原体は、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ（例えば、Ａ．ａｓｔｒｏｎｙｘｉｓ、Ａ．ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ、Ａ．ｃｕｌｂｅｒｔｓｏｎｉ、Ａ．ｈａｔｃｈｅｔｔｉ、Ａ．ｐｏｌｙｐｈａｇａ、Ａ．ｒｈｙｓｏｄｅｓ、Ａ．ｈｅａｌｙｉ、Ａ．ｄｉｖｉｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｂｒａｃｈｉｏｌａ（例えば、Ｂ  ｃｏｎｎｏｒｉ、Ｂ．ｖｅｓｉｃｕｌａｒｕｍ）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ（例えば、Ｃ．ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ（例えば、Ｅ．ｃｕｎｉｃｕｌｉ、Ｅ．ｈｅｌｌｅｍ、Ｅ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ（例えば、Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ（例えば、Ｅ．ｂｉｅｎｅｕｓｉ）、Ｇｉａｒｄｉａ（例えば、Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ）、Ｉｓｏｓｐｏｒａ（例えば、Ｉ．ｂｅｌｌｉ）、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｃｅｙｌｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ（例えば、Ｎ．ｆｏｗｌｅｒｉ）、Ｎｏｓｅｍａ（例えば、Ｎ．ａｌｇｅｒａｅ、Ｎ．ｏｃｕｌａｒｕｍ）、Ｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ、Ｔｒａｃｈｉｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ（例えば、Ｔ．ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈｔｈｅｒａ、Ｔ．ｈｏｍｉｎｉｓ）およびＶｉｔｔａｆｏｒｍａ（例えば、Ｖ．ｃｏｒｎｅａｅ）等、原生生物となり得る。病原体は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、ＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓおよびＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ等、真菌となり得る。
【０３８４】
病原体は、細菌となり得る。例示的な細菌として、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、ＶｉｂｒｉｏまたはＹｅｒｓｉｎｉａが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３８５】
ウイルスは、逆転写ウイルスとなり得る。逆転写ウイルスの例として、一本鎖ＲＮＡ−ＲＴ（ｓｓＲＮＡ−ＲＴ）ウイルスおよび二本鎖ＤＮＡ−ＲＴ（ｄｓＤＮＡ−ＲＴ）ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルスの非限定例として、レトロウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、スプーマウイルス、メタウイルスおよびシュードウイルスが挙げられる。ｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルスの非限定例として、ヘパドナウイルスおよびカリモウイルスが挙げられる。ウイルスは、ＤＮＡウイルスとなり得る。ウイルスは、ＲＮＡウイルスとなり得る。ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスとなり得る。場合によっては、ｄｓＤＮＡウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはポックスウイルスである。アデノウイルスの例として、アデノウイルスおよび感染性イヌ肝炎ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。ヘルペスウイルスの例として、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン・バーウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。ポックスウイルスの非限定リストは、天然痘ウイルス、ウシポックスウイルス、ヒツジポックスウイルス、サルポックスウイルスおよびワクシニアウイルスを含む。ＤＮＡウイルスは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスとなり得る。ｓｓＤＮＡウイルスは、パルボウイルスとなり得る。パルボウイルスの例として、パルボウイルスＢ１９、イヌパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症およびミンク腸炎ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３８６】
ウイルスは、ＲＮＡウイルスとなり得る。ＲＮＡウイルスは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ウイルス、（＋）センス一本鎖ＲＮＡウイルス（（＋）ｓｓＲＮＡ）ウイルスまたは（−）センス一本鎖（（−）ｓｓＲＮＡ）ウイルスとなり得る。ｄｓＲＮＡウイルスの非限定リストは、レオウイルス、オルトレオウイルス、サイポウイルス、ロタウイルス、ブルータングウイルスおよびファイトレオウイルスを含む。（＋）ｓｓＲＮＡウイルスの例として、ピコルナウイルスおよびトガウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。ピコルナウイルスの例として、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス、カルジオウイルス、アフトウイルス、ポリオウイルス、パレコウイルス、エルボウイルス、コブウイルス、テッショウウイルスおよびコクサッキーが挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、トガウイルスは、風疹ウイルス、シンドビスウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、オニョンニョン（Ｏ’ｎｙｏｎｇ’ｎｙｏｎｇ）ウイルス、チクングニアまたはセムリキ森林ウイルスである。（−）ｓｓＲＮＡウイルスの非限定リストは、オルソミクソウイルスおよびラブドウイルスを含む。オルソミクソウイルスの例として、ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、イサウイルス（ｉｓａｖｉｒｕｓ）およびトゴトウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。ラブドウイルスの例として、サイトラブドイルス（ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ディコラブドウイルス（ｄｉｃｈｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、エフェメロウイルス（ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ）、リッサウイルス、ノビラブドウイルス（ｎｏｖｉｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）およびベジクロウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３８７】
胎児障害
場合によっては、疾患または状態は、妊娠である。本明細書に開示されている方法およびキットは、妊娠中の被験体における胎児状態を診断するステップを含み得る。本明細書に開示されている方法およびキットは、胎児変異または遺伝的異常を同定するステップを含み得る。確率論的に標識しようとする分子は、胎児細胞または組織に由来し得る。それに代えてまたはそれに加えて、標識しようとする分子は、妊娠中の被験体に由来し得る。
【０３８８】
本明細書に開示されている方法およびキットは、常染色体トリソミー（例えば、トリソミー１３、１５、１６、１８、２１または２２）の診断、予測またはモニターにおいて使用することができる。一部の事例では、トリソミーは、流産の機会増加に関連し得る（例えば、トリソミー１５、１６または２２）。他の事例では、検出されるトリソミーは、乳児が出生時欠損を持って生まれることを示し得る生産トリソミーである（例えば、トリソミー１３（パトー症候群）、トリソミー１８（エドワード症候群）およびトリソミー２１（ダウン症候群））。異常は、性染色体のものとなる場合もある（例えば、ＸＸＹ（クラインフェルター症候群）、ＸＹＹ（ヤコブ症候群）またはＸＸＸ（トリソミーＸ））。標識しようとする分子（複数可）は、次の染色体のうち１種または複数に存在するものとなり得る：第１３、第１８、第２１、ＸまたはＹ染色体。例えば、分子は、第２１染色体および／または第１８染色体および／または第１３染色体に存在する。
【０３８９】
本明細書に開示されている方法およびキットに基づき決定され得るさらなる胎児状態は、１種または複数の染色体のモノソミー（Ｘ染色体モノソミー、ターナー症候群としても公知）、１種または複数の染色体のトリソミー（第１３、第１８、第２１およびＸ）、１種または複数の染色体のテトラソミーおよびペンタソミー（ヒトでは性染色体において最も一般的に観察される、例えば、ＸＸＸＸ、ＸＸＹＹ、ＸＸＸＹ、ＸＹＹＹ、ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＹ、ＸＸＸＹＹ、ＸＹＹＹＹおよびＸＸＹＹＹ）、一倍性、三倍性（全染色体が３本、例えば、ヒトにおいては６９本の染色体）、四倍性（全染色体が４本、例えば、ヒトにおいては９２本の染色体）、五倍性ならびに多倍数性（ｍｕｌｔｉｐｌｏｉｄｙ）を含む。
【０３９０】
上述の方法のいずれかを含む、法医学的分析方法が本明細書にさらに開示されている。法医科学者は、犯罪現場で発見された様々な試料（例えば、血液、精液、皮膚、唾液、毛髪）における核酸を使用して、加害者等、現場におけるある個体の存在を同定することができる。このプロセスは、公式にＤＮＡプロファイリングと称されるが、「遺伝的フィンガープリンティング」と呼ぶこともできる。例えば、ＤＮＡプロファイリングは、様々な試料および人々における、短いタンデム反復およびミニサテライト等、反復性ＤＮＡの可変セクションの長さの測定および比較を含む。この方法は通常、ある人物由来のＤＮＡ試料を、犯罪現場で発見された試料におけるＤＮＡとマッチさせるための、極めて信頼できる技法である。しかし、現場が複数人のＤＮＡで汚染されている場合、同定は複雑化され得る。この場合、また、他の法医学的適用において、単一細胞または少数の細胞由来の核酸の絶対的定量化を得ることが有利になり得る。
【０３９１】
場合によっては、疾患または状態は、免疫障害である。免疫障害（ｄｉｏｒｄｅｒ）は、炎症性障害、自己免疫性障害、過敏性腸症候群または潰瘍性大腸炎となり得る。自己免疫性疾患の例として、クローン病（Ｃｈｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ループスおよびグレーブス病が挙げられる。
【０３９２】
場合によっては、疾患または障害は、神経学的（ｎｅｏｒｌｏｇｉｃａｌ）状態または障害である。神経学的状態または障害は、後天性てんかん様失語症、急性播種性脳脊髄炎、副腎白質ジストロフィー、脳梁無発育、失認、アイカルディ症候群、アレキサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（運動ニューロン疾患を参照）、無脳症、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、失語症、失行症、くも膜嚢胞、くも膜炎、アーノルド・キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、毛細血管拡張性運動失調症、注意欠陥多動性障害、自閉症、聴覚処理障害、自律神経機能不全、背部痛（Ｂａｃｋ  Ｐａｉｎ）、バッテン病、ベーチェット病、ベル麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性限局的筋萎縮症、良性頭蓋内圧亢進症、両側性前頭頭頂多小脳回、ビンスワンガー病、眼瞼痙攣、ブロッホ・ズルツベルガー症候群、腕神経叢傷害、脳膿瘍、脳損傷、脳傷害、脳腫瘍、ブラウン・セカール症候群、カナバン病、手根管症候群（ＣＴＳ）、灼熱痛、中枢痛症候群、橋中央ミエリン溶解、中心核ミオパチー、頭部障害、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、大脳萎縮症、脳性巨人症、脳性麻痺、シャルコー・マリー・トゥース病、キアリ奇形、舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性疼痛、慢性領域性疼痛症候群、コフィン・ローリー症候群、遷延性植物状態を含む昏睡、複合体Ｉ欠乏症候群、複合体Ｉ欠乏症候群、複合体ＩＩ欠乏症候群、複合体ＩＩＩ欠乏症候群、複合体ＩＶ／ＣＯＸ欠乏症候群、複合体Ｖ欠乏症候群、先天性両側顔面神経麻痺、皮質基底核変性症、頭部動脈炎、頭蓋骨癒合、クロイツフェルト・ヤコブ病、蓄積外傷疾患、クッシング症候群、巨細胞性封入体病（ＣＩＢＤ）、サイトメガロウイルス感染症、ダンディ・ウォーカー症候群、ドーソン病、複合体ＩのミトコンドリアＮＡＤＨ脱水素酵素成分の欠乏、ドモルシア症候群、デジェリーヌ・クルンプケ麻痺、デジェリーヌ・ソッタス病、睡眠相後退症候群、認知症、皮膚筋炎、神経学的統合運動障害、糖尿病性ニューロパチー、びまん性硬化症、自律神経障害、失算、書字障害、失読症、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エンプティセラ症候群、脳炎、脳ヘルニア、脳三叉神経領域血管腫症、大便失禁、てんかん、エルブ麻痺、皮膚紅痛症、本態性振戦、ファブリ病、ファール症候群、失神、家族性痙性麻痺、熱性けいれん、フィッシャー症候群、フリートライヒ運動失調、ＦＡＲＴ症候群、ゴーシェ病、ゲルストマン症候群、巨細胞動脈炎、巨細胞封入体病、球様細胞白質萎縮、異所性灰白質、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ−１関連ミエロパチー、ハラーホルデン・スパッツ病、頭部傷害、頭痛、片側顔面痙攣、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性多発神経炎性失調、耳帯状疱疹、帯状疱疹、平山症候群（Ｈｉｒａｙａｍａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、全前脳症、ハンチントン病、水無脳症、水頭症、副腎皮質ホルモン過剰症、低酸素症、免疫媒介性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、乳児フィタン酸蓄積症、乳児レフサム病、点頭痙攣、炎症性ミオパチー、頭蓋内嚢胞、頭蓋内圧亢進症、ジュベール症候群、カーンズ・セイヤー症候群、ケネディー病、キンスブルン症候群、クリッペル・ファイ��症候群、クラッベ病、クフォル・ラケブ症候群、クーゲルベルク・ヴェランダー病、クールー、ラフォラ病、ランバート・イートン筋無力症症候群、ランドウ・クレフナー症候群、延髄外側（ワレンベルク）症候群、学習障害、リー病、レノックス・ガストー症候群、レッシュ・ナイハン症候群、白質ジストロフィー、レビー小体認知症、脳回欠損、閉じ込め症候群、ルー・ゲーリック病、腰部椎間板疾患、ライム病−神経学的続発症、マシャド・ジョセフ病（脊髄小脳運動失調３型）、大脳症、メープルシロップ尿症、大脳髄症（Ｍｅｇａｌｅｎｃｅｐｈａｌｙ）、メルカーソン・ローゼンタール症候群、メニエール病、髄膜炎、メンケス病、異染性白質ジストロフィー、小頭症、片頭痛、ミラー・フィッシャー症候群、軽度の脳卒中（Ｍｉｎｉ−Ｓｔｒｏｋｅ）、ミトコンドリア病、ミトコンドリア機能障害、ミトコンドリアミオパチー、ミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉ欠乏、メビウス症候群、単肢筋萎縮症、運動ニューロン疾患、運動技能障害、もやもや病、ムコ多糖症、多発脳梗塞性認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、体位性低血圧による多系統萎縮症、筋ジストロフィー、筋痛性脳脊髄炎、重症筋無力症、ミエリン分解性びまん性硬化症（Ｍｙｅｌｉｎｏｃｌａｓｔｉｃ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、乳児のミオクローヌス性脳症（Ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｉｎｆａｎｔｓ）、ミオクローヌス、ミオパチー、筋細管ミオパチー、先天性ミオトニー、ＮＡＤＨ−補酵素Ｑ還元酵素欠乏、ＮＡＤＨ：Ｑ（１）酸化還元酵素欠乏、ナルコレプシー、神経線維腫症、神経弛緩薬性悪性症候群、ＡＩＤＳの神経学的症状発現、ループスの神経学的続発症、神経性筋強直症、神経セロイドリポフスチノーシス、神経細胞移動障害、ニーマン・ピック病、非２４時間睡眠・覚醒症候群（Ｎｏｎ  ２４−ｈｏｕｒ  ｓｌｅｅｐ−ｗａｋｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、非言語学習障害（Ｎｏｎｖｅｒｂａｌ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、オサリバン・マクラウド症候群、後頭神経痛、潜在性脊椎癒合不全配列（Ｏｃｃｕｌｔ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｄｙｓｒａｐｈｉｓｍ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、大田原症候群（Ｏｈｔａｈａｒａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、オリーブ橋小脳萎縮症、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、起立性低血圧、オーバーユース症候群（Ｏｖｅｒｕｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、酸化的リン酸化障害、反復視（Ｐａｌｉｎｏｐｓｉａ）、感覚異常、パーキンソン病、先天性パラミオトニー、傍腫瘍性疾患（Ｐａｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、発作性発作（Ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ  ａｔｔａｃｋ）、パリー・ロンベルク症候群（ロンベルク症候群としても公知）、ペリツェウス・メルツバッヘル病、周期性四肢麻痺、末梢性ニューロパチー、遷延性植物状態、広汎性神経学的障害（Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、光くしゃみ反射（Ｐｈｏｔｉｃ  ｓｎｅｅｚｅ  ｒｅｆｌｅｘ）、フィタン酸蓄積症、ピック病、圧迫神経（Ｐｉｎｃｈｅｄ  Ｎｅｒｖｅ）、下垂体腫瘍、ＰＭＧ、ポリオ、多小脳回、多発性筋炎、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛（ＰＨＮ）、感染後脳脊髄炎、体位性低血圧、プラダー・ウィリー症候群、原発性側索硬化症、プリオン病、ロンベルク症候群としても公知の進行性片側顔面萎縮症、進行性多巣性白質脳症、進行性硬化性ポリオジストロフィー、進行性核上性麻痺、偽脳腫瘍、ラムゼイ・ハント症候群（Ｉ型およびＩＩ型）、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、レフサム病、反復性運動障害（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｍｏｔｉｏｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、反復性ストレス傷害（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎｊｕｒｙ）、不穏下肢症候群、レトロウイルス関連ミエロパチー、レット症候群、ライ症候群、ロンベルク症候群、狂犬病、聖ウィトゥス舞踏病（Ｓａｉｎｔ  Ｖｉｔｕｓ  ｄａｎｃｅ）、サンドホフ病、統合失調症（Ｓｃｈｙｔｓｏｐｈｒｅｎｉａ）、シルダー病、脳裂、感覚統合機能障害（Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）、中隔視覚異形成症、揺さぶられっ子症候群、帯状疱疹、シャイ・ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、睡眠病、心的飽和（Ｓｎａｔｉａｔｉｏｎ）、ソトス症候群、痙縮、二分脊椎症、脊髄傷害、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊柱管狭窄、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、進行性核上性麻痺を参照、脊髄小脳運動失調、全身硬直症候群、脳卒中、スタージ・ウェーバー症候群、亜急性硬化性汎脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、表在性鉄沈着症、シデナム舞踏病、仮死、共感覚、脊髄空洞症、遅発性ジスキネジア、テイ・サックス病、側頭動脈炎、脊髄係留症候群、トムゼン病、胸郭出口症候群、疼痛性チック、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性脳虚血発作、伝達性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳傷害、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺、トリパノソーマ症、結節性硬化症、側頭動脈炎を含む血管炎、フォンヒッペル・リンダウ病（ＶＨＬ）、ビリウスク脳脊髄炎（Ｖｉｌｉｕｉｓｋ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）（ＶＥ）、ワレンベルク症候群、ウェルドニッヒ・ホフマン病（Ｗｅｒｄｎｉｇ−Ｈｏｆｆｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ウエスト症候群、むち打ち、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、Ｘ連鎖球脊髄性筋萎縮症またはツェルウェーガー症候群となり得る。
【０３９３】
定義
値の範囲が提示されている場合、介在する値のそれぞれが、文脈がそれ以外を明らかに指示するのでなければ下限の単位の１０分の１まで、該範囲の上限および下限の間も特に開示されていることを理解されたい。記述された範囲におけるいずれかの記述された値または介在する値と、該記述された範囲における他のいずれかの記述されたまたは介在する値との間のより小さい範囲のそれぞれが、本発明の内に包含される。このようなより小さい範囲の上限および下限は、この範囲内に独立的に含まれても除外されてもよく、このより小さい範囲内に上下限のいずれか一方、両方が含まれるまたはいずれも含まれない各範囲も、記述された範囲内のいずれかの特に除外された限界であることを条件として、本発明の内に包含される。記述された範囲が、上下限の一方または両方を含む場合、この含まれる上下限のいずれか一方または両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【０３９４】
他に規定がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意義を有する。本明細書に記載されているものと同様または均等のいずれかの方法および材料を、本発明の実施または検査において使用することができるが、いつくかの潜在的かつ好まれる方法および材料をここに記載する。本明細書に言及されているあらゆる刊行物は、ここに参照により援用して、この刊行物が引用されているものに関連する方法および／または材料を開示および記載する。本開示が、矛盾が存在する程度まで、援用されている刊行物のいかなる開示にも優先することを理解されたい。
【０３９５】
当業者であれば、本開示を読むことにより明らかとなるであろうが、本明細書に記載および説明されている個々の実施形態のそれぞれが、本発明の範囲または精神から逸脱することなく容易に分離することができるまたは他のいくつかの実施形態のいずれかの特色と組み合わせることができる、別々の成分および特色を有する。いずれかの列挙されている方法は、列挙されている事象の順序で、または論理的に可能な他のいずれかの順序で実行することができる。
【０３９６】
本明細書において、また、添付の特許請求の範囲において、文脈がそれ以外を明らかに指示するのでなければ、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」が、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。よって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」の言及は、複数のかかる細胞を含み、「ペプチド（ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」の言及は、１種または複数のペプチドおよび当業者に公知のその均等物、例えば、ポリペプチドの参照を含む、等々。
【０３９７】
本明細書において、用語「標識」は、相当する核酸塩基および／または核酸配列の同定を可能にすることができる特有のオリゴヌクレオチド配列を指すことができる。一部の実施形態では、核酸塩基および／または核酸配列は、より大きいポリヌクレオチド配列（例えば、ビーズに付着させたポリヌクレオチド）における特異的なポジションに位置することができる。
【０３９８】
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」は、２本の一本鎖ポリヌクレオチドが、非共有結合により結合して、安定的な二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指すことができる。用語「ハイブリダイゼーション」は、三本鎖ハイブリダイゼーションを指すこともできる。その結果得られる（通常）二本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」または「デュプレックス」である。
【０３９９】
本明細書において、「ヌクレオシド」は、２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシル型等、天然ヌクレオシドを含み得る。ヌクレオシドに関する「アナログ」は、修飾塩基部分および／または修飾糖部分その他を含む合成ヌクレオシドを含み得る。アナログは、ハイブリダイゼーションすることができる。アナログは、結合特性を増強し、複雑さを低下させ、特異性を増加させる等を行うように設計された合成ヌクレオシドを含み得る。例示的な種類のアナログは、オリゴヌクレオチドホスホロアミデート（本明細書において、「アミデート」と称される）、ペプチド核酸（本明細書において、「ＰＮＡ」と称される）、オリゴ−２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、Ｃ−５プロピニルピリミジンを含有するポリヌクレオチドおよびロックト核酸（ＬＮＡ）を含み得る。
【０４００】
本明細書において、用語「核酸分子」、「核酸配列」、「核酸断片」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド断片」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用することができ、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはこれらのアナログのいずれかの、様々な長さとなることができるポリマー型のヌクレオチドを含むことを意図し得るがこれらに限定されない。核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含み得る。異なる核酸分子は、異なる三次元構造を有することができ、様々な機能を行うことができる。核酸分子の非限定例として、遺伝子、遺伝子断片、ゲノムギャップ、エクソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（ヘテロクロマチンＤＮＡを限定することなく含む）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、配列の単離されたＤＮＡ、配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーを挙げることができる。
【０４０１】
オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより連結された天然または修飾ヌクレオシドモノマーの直鎖状ポリマーを指すことができる。「オリゴヌクレオチド断片」は、２種またはそれを超えるより小型のオリゴヌクレオチド配列に切断されたオリゴヌクレオチド配列を指す。オリゴヌクレオチドは、天然であっても合成であってもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドおよびこれらのアノマー型等、これらの非天然アナログ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）その他を含み得る。オリゴヌクレオチドは、ワトソン・クリック型の塩基対形成、塩基の積み重ね、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型の塩基対形成その他等、規則的パターンのモノマー対モノマー相互作用で、標的ゲノムに特異的に結合することができる場合がある。オリゴヌクレオチドおよび用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用することができる。
【０４０２】
オリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」等の文字配列で表される場合は常に、他に断りがなければ、ヌクレオチドは、左から右に５’から３’の順序であり、「Ａ」がデオキシアデノシンを表示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを表示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを表示し、「Ｔ」がデオキシチミジンを表示し、「Ｕ」がリボヌクレオシド、ウリジンを表示すると理解することができる。
【０４０３】
オリゴヌクレオチドは、１種または複数の非標準ヌクレオチド（複数可）、ヌクレオチドアナログ（複数可）および／または修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドの例として、ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン（ｘａｎｔｉｎｅ）、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｄ４６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、オリゴヌクレオチドホスホロアミデート（本明細書において、「アミデート」と称される）、ペプチド核酸（本明細書において、「ＰＮＡ」と称される）、オリゴ−２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、Ｃ−５プロピニルピリミジンを含有するポリヌクレオチド、ロックト核酸（ＬＮＡ）、２，６−ジアミノプリンその他を挙げることができるがこれらに限定されない。核酸分子は、塩基部分（例えば、典型的に相補的ヌクレオチドとの水素結合の形成に利用できる１個もしくは複数の原子および／または典型的に相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することができない１個もしくは複数の原子における）、糖部分またはリン酸骨格を修飾することもできる。
【０４０４】
本明細書において、「試料」は、単一細胞または多くの細胞を指すことができる。核酸分子は、１種または複数の試料から得ることができる。試料は、単一の細胞型または２種もしくはそれを超える細胞型の組合せを含み得る。試料は、例えば、組織に見られる機能等、同様の機能を行う細胞の収集物を含み得る。試料は、１種または複数の組織を含み得る。組織の例として、上皮組織（例えば、皮膚、腺、腸、皮膚および肝臓、肺、腎臓等の臓器の裏層）、内皮（例えば、血管およびリンパ管の裏層）、中皮（例えば、胸膜、腹膜および心膜空間の裏層）、間充織（例えば、脂肪、筋肉、骨、軟骨および腱細胞を含む、臓器間の空間を充填する細胞）、血液細胞（例えば、赤血球、顆粒球、好中球、好酸球、好塩基球、単球、Ｔリンパ球（Ｔ細胞としても公知）、Ｂリンパ球（Ｂ細胞としても公知）、プラズマ細胞、巨核球その他）、ニューロン、生殖細胞（例えば、精子、卵母細胞）、羊水細胞、胎盤、幹細胞その他を挙げることができるがこれらに限定されない。試料は、培養物における単一細胞、メタゲノム試料、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、がん試料、組織切片および生検材料のうち１種もしくは複数またはこれらのいずれかの組合せから得ることができる。
【０４０５】
本明細書において、用語「生物」として、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、スナネズミ、カエル、ヒキガエル、魚類（例えば、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）、回虫（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）およびこれらのいずれかのトランスジェニック種を挙げることができるがこれらに限定されない。用語「生物」として、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞、酵母四分子、酵母コロニー、細菌、細菌コロニー、ビリオン、ビロソーム、ウイルス様粒子および／またはこれらの培養物その他を挙げることができるがこれらに限定されない。
【０４０６】
本明細書において、用語「付着させる」、「コンジュゲートする」および「カップリングする」は、互換的に使用することができ、共有結合相互作用および非共有結合相互作用の両方を指すことができる。
【０４０７】
本発明の好まれる実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、当業者には、かかる実施形態が、単なる例として提示されていることが明らかとなるであろう。そこで、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変種、変化および置換を思い付くであろう。本発明の実施において、本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替物を用いることができることを理解されたい。次の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義し、これら特許請求の範囲内の方法および構造ならびにこれらの均等物が、これにより網羅されることが企図される。
【実施例】
【０４０８】
実施例１：酵素による分割−プール合成
本実施例では、酵素による分割−プール合成方法を使用して、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを生成した。図２Ａに示す通り、オリゴヌクレオチドのセットを第１のプレートの各ウェルに添加した。オリゴヌクレオチドのセットにおけるオリゴヌクレオチドは、５’アミン、ユニバーサル配列、細胞標識およびリンカーを含む。５’アミン、ユニバーサル配列およびリンカーは、オリゴヌクレオチドのセット毎に同じである。ユニバーサル配列およびリンカーは、互いに異なる。しかし、細胞標識は、オリゴヌクレオチドのセット毎に異なる。よって、各ウェルは、異なる細胞標識を有する。
【０４０９】
酵素による分割−プール合成のステップ１において、各ウェルに単一のビーズを添加し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）カップリング反応を行うことにより、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを合成した。ステップ１に起因するオリゴヌクレオチドビーズは、複数のオリゴヌクレオチドにカップリングされたビーズを含む。オリゴヌクレオチドは、５’−アミン、ユニバーサル配列、細胞性標識１およびリンカー１を含む（図２Ａを参照）。同じビーズにおけるオリゴヌクレオチドは同じである。しかし、第１のビーズにおけるオリゴヌクレオチドは、第２のビーズにおけるオリゴヌクレオチドとは異なる。
【０４１０】
酵素による分割−プール合成のステップ２において、複数回の洗浄を行って、カップリングされていないオリゴヌクレオチドを除去した。カップリングされていないオリゴヌクレオチドを除去したら、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズをプールした（図２Ａを参照）。ステップ２に起因するオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズは、複数の一本鎖オリゴヌクレオチドにカップリングされたビーズを含む。一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’アミン、ユニバーサル配列、細胞標識１およびリンカー１を含む。ビーズにおける各オリゴヌクレオチドは同一である。しかし、各ビーズは、異なるオリゴヌクレオチドを含む。異なるビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチドは、細胞標識１配列が異なる。
【０４１１】
図２Ｂに示す通り、オリゴヌクレオチドのセットを第２のプレートの各ウェルに添加した。オリゴヌクレオチドのセットにおけるオリゴヌクレオチドは、第１のリンカー、細胞標識および第２のリンカーを含む。第１および第２のリンカーは、オリゴヌクレオチドのセット毎に同じである。第１および第２のリンカーは、互いに異なる。しかし、細胞標識は、オリゴヌクレオチドのセット毎に異なる。よって、各ウェルは、異なる細胞標識を有する。
【０４１２】
酵素による分割−プール合成のステップ３において、ステップ２においてプールされたオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを、第２のプレートのウェルに分割した。第２のプレートのウェルにおけるオリゴヌクレオチドの第１のリンカーは、ビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチドのリンカーに相補的であるため、クレノウ大型断片を使用したプライマー伸長を行って、ステップ２由来のオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズに第２のプレート由来のオリゴヌクレオチドをカップリングした。ステップ３に起因するオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズは、複数の二本鎖オリゴヌクレオチドにカップリングされたビーズを含む。二本鎖オリゴヌクレオチドは、５’アミン、ユニバーサル配列、細胞標識１、リンカー１、細胞標識２およびリンカー２を含む（図２Ｂを参照）。
【０４１３】
酵素による分割−プール合成のステップ４において、複数回の洗浄を行って、カップリングされていないオリゴヌクレオチドおよびクレノウ大型断片酵素を除去した。第２のプレートを加熱して、二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させ、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズをプールした（図２Ｂを参照）。ステップ４に起因するオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズは、複数の一本鎖オリゴヌクレオチドにカップリングされたビーズを含む。一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’アミン、ユニバーサル配列、細胞標識１、リンカー１、細胞標識２およびリンカー２を含む。ビーズにおける各オリゴヌクレオチドは同一である。しかし、各ビーズは、異なるオリゴヌクレオチドを含む。異なるビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチドは、組み合わされた細胞標識配列が異なる。例えば、第１のビーズは、細胞標識Ａの第１の細胞標識および細胞標識Ｃの第２の細胞標識を含むオリゴヌクレオチドを含み得、第２のビーズは、細胞標識Ｃの第１の細胞標識および細胞標識Ｄの第２の細胞標識を含むオリゴヌクレオチドを含み得る。よって、第１のビーズおよび第２のビーズは、同じ細胞標識（この場合、細胞標識Ｃ）を含み得るが、第１のビーズおよび第２のビーズの組み合わされた細胞標識配列は異なる（例えば、第１のビーズに関して、組み合わされた細胞標識配列は、細胞標識Ａ＋細胞標識Ｃであり；第２のビーズに関して、組み合わされた細胞標識配列は、細胞標識Ｃ＋細胞標識Ａである）。他の事例では、２個のビーズは、異なる細胞標識を含むオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、第１のビーズは、細胞標識Ａおよび細胞標識Ｂを含むオリゴヌクレオチドを含み得、第２のビーズは、細胞標識Ｃおよび細胞標識Ｄを含むオリゴヌクレオチドを含み得る。この場合、第１のビーズの細胞標識の両方は、第２のビーズの細胞標識の両方とは異なる。
【０４１４】
図２Ｃに示す通り、オリゴヌクレオチドのセットを第３のプレートの各ウェルに添加した。オリゴヌクレオチドのセットにおけるオリゴヌクレオチドは、リンカー、細胞標識、分子標識およびオリゴｄＴを含む。リンカーおよびオリゴｄＴ配列は、オリゴヌクレオチドのセット毎に同じである。しかし、細胞標識は、オリゴヌクレオチドのセット毎に異なる。よって、各ウェルは、異なる細胞標識を有する。加えて、分子標識は、セット内のオリゴヌクレオチドに対し異なる。よって、単一のウェルは、同じ細胞標識を有するが異なる分子標識を有する複数のオリゴヌクレオチドを含有する。異なるウェル由来のオリゴヌクレオチドは、同じ分子標識を含有することができる。
【０４１５】
酵素による分割−プール合成のステップ５において、ステップ４においてプールされたオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを、第３のプレートのウェルに分割した。第２のプレートのウェルにおけるオリゴヌクレオチドのリンカーは、ビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチドの第２のリンカーに相補的であるため、クレノウ大型断片を使用したプライマー伸長を行って、ステップ４由来のオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズに第３のプレート由来のオリゴヌクレオチドをカップリングした。ステップ５に起因するオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズは、複数の二本鎖オリゴヌクレオチドにカップリングされたビーズを含む。二本鎖オリゴヌクレオチドは、５’アミン、ユニバーサル配列、細胞標識１、リンカー１、細胞標識２、リンカー２、細胞標識３、分子標識およびオリゴｄＴを含む（図２Ｃを参照）。
【０４１６】
酵素による分割−プール合成のステップ６において、複数回の洗浄を行って、カップリングされていないオリゴヌクレオチドおよびクレノウ大型断片酵素を除去した。第３のプレートを加熱して、二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させ、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズをプールした（図２Ｃを参照）。ステップ４に起因するオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズは、複数の一本鎖オリゴヌクレオチドにカップリングされたビーズを含む。一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’アミン、ユニバーサル配列、細胞標識１、リンカー１、細胞標識２、リンカー２、細胞標識３、分子標識およびオリゴｄＴを含む。単一のビーズにおける複数の一本鎖オリゴヌクレオチドは、分子標識によって区別することができる。単一のビーズにおける複数のオリゴヌクレオチドの細胞標識部分は同一である。各ビーズは、異なるオリゴヌクレオチドを含む。異なるビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチドは、細胞標識配列が異なる。異なるビーズ由来のオリゴヌクレオチドにおける分子標識は、同じものとなり得る。異なるビーズ由来のオリゴヌクレオチドにおける分子標識は、異なるものとなり得る。２種またはそれを超えるビーズは、組み合わされた細胞標識配列が異なり得る。例えば、第１のビーズは、細胞標識Ａ、細胞標識Ｂおよび細胞標識Ｃを含むオリゴヌクレオチドを含み得、第２のビーズは、細胞標識Ｂ、細胞標識Ｄおよび細胞標識Ａを含むオリゴヌクレオチドを含み得る。この場合、第１および第２のビーズは両者共に、細胞標識Ｂを含有するが、他の２種の細胞標識は異なる。よって、２個またはそれを超えるビーズは、少なくとも１種の細胞標識が異なるオリゴヌクレオチドを含み得る。２個またはそれを超えるビーズは、少なくとも２種の細胞標識が異なるオリゴヌクレオチドを含み得る。２個またはそれを超えるビーズは、少なくとも３種の細胞標識が異なるオリゴヌクレオチドを含み得る。しかし、ビーズは、２種またはそれを超える同一細胞標識を含むオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、ビーズは、細胞標識Ａ、細胞標識Ａおよび細胞標識Ｄを含むオリゴヌクレオチドを含み得る。ビーズは、少なくとも３種の同一細胞標識を含むオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、ビーズは、細胞標識Ａ、細胞標識Ａおよび細胞標識Ａを含むオリゴヌクレオチドを含み得る。ビーズは、３種の非同一細胞標識を含むオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、ビーズは、細胞標識Ａ、細胞標識Ｄおよび細胞標識Ｅを含むオリゴヌクレオチドを含み得る。ビーズは、少なくとも２種の異なる分子標識を含む少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、ビーズは、分子標識Ａを含む第１のオリゴヌクレオチドと、分子標識Ｄを含む第２のオリゴヌクレオチドとを含み得る。しかし、ビーズは、第１の分子標識を含むオリゴヌクレオチドの複数コピーを含み得る。よって、ビーズは、同じ分子標識を含む少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、ビーズは、分子標識Ａを含む第１のオリゴヌクレオチドと、分子標識Ａを含む第２のオリゴヌクレオチドとを含み得る。ビーズにおけるオリゴヌクレオチドの少なくとも３０％は、異なる分子標識を含み得る。ビーズにおけるオリゴヌクレオチドの少なくとも４０％は、異なる分子標識を含み得る。ビーズにおけるオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％は、異なる分子標識を含み得る。ビーズにおけるオリゴヌクレオチドの少なくとも６０％は、異なる分子標識を含み得る。ビーズにおけるオリゴヌクレオチドの３０％未満は、同じ分子標識を含み得る。ビーズにおけるオリゴヌクレオチドの２０％未満は、同じ分子標識を含み得る。ビーズにおけるオリゴヌクレオチドの１５％未満は、同じ分子標識を含み得る。ビーズにおけるオリゴヌクレオチドの１０％未満は、同じ分子標識を含み得る。ビーズにおけるオリゴヌクレオチドの５％未満は、同じ分子標識を含み得る。
【０４１７】
酵素による分割−プール合成技法を、複数のプレートまたはウェルの数がより多いプレート上で行って、より多数のオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを生成することができる。３種の別々の細胞標識部分の使用は、ビーズにおける総細胞標識部分の多様性を増加させることができる。細胞標識部分毎の９６種の異なる配列選択肢により、８８４，７３６種の異なる細胞標識組合せを作製することができる。
【０４１８】
実施例２：チューブおよびマイクロウェルにおける増幅の比較
本開示は、細胞を捕捉するための方法を提供する。約３０ミクロンの直径のマイクロウェルを含むマイクロウェルアレイに、約５，０００個のＲａｍｏｓ細胞を捕捉した。一部の細胞は、捕捉されなかった。この実験の対照は、チューブに捕捉された等しい数の細胞であった。チューブにおける細胞およびマイクロウェルアレイにおける細胞の両方を溶解した。核酸を、コンジュゲートされたビーズにハイブリダイズさせた。ＧＡＰＤＨおよびＲＰＬ１９遺伝子のリアルタイムＰＣＲを行った。
【０４１９】
図９は、リアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。マイクロウェルからの収量は、チューブにおける核酸からの収量よりも大きく、オリゴヌクレオチドへの核酸のハイブリダイゼーションが、チューブよりもマイクロウェルにおいてより有効であったことを示した（それぞれ灰色バーおよび白色バーを比較）。
【０４２０】
実施例３：第２の合成鎖の増幅およびビーズにおける合成の比較
実施例１に記載されている通り、細胞を得て、溶解した。ユニバーサルプライマーを使用して、固体支持体から離れて（ｏｆｆ）合成された第２鎖から離れて（ｏｆｆ）、または固体支持体において直接的に、ＲＰＬ１９、ＴＵＢＢおよびＧＡＰＤＨを増幅した。図１０は、固体支持体における直接的な増幅（図１０）が、固体支持体から離れて直接的ではない増幅よりも少ないオフターゲット増幅を生じたことを示す。ＧＡＰＤＨおよびＴＵＢＢ増幅は、方法にかかわらず正確なサイズの産物を生成した（図１０における各三つ組の左レーンは、チューブフォーマットにおける固体支持体プラスライセートに相当し、各三つ組の中央レーンは、マイクロウェル由来の固体支持体に相当し、各三つ組の右レーンは、固体支持体プラス精製された核酸に相当する）。ＲＰＬ１９産物は、最小オフターゲット増幅産物を有したが、精製された核酸を固体支持体と共に使用した場合、強い産物のみを生成した。これらの実験は、ビーズにおける直接的な増幅が、固体支持体から離れて合成された第２鎖を使用した増幅よりも少ないオフターゲット増幅産物を生成することを示す。
【０４２１】
実施例４：標的核酸のマルチプレックス分析
実施例１に記載されている通り、細胞を得て溶解する。標的核酸を、オリゴヌクレオチドを含む固体支持体にハイブリダイズさせる。複数コピーの標的核酸を、オリゴｄＴ配列を含む標的結合領域にハイブリダイズさせる。逆転写酵素を使用して、複数コピーの標的核酸を逆転写する。逆転写は、標的核酸のコピーがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの特色（例えば、分子標識、細胞性標識およびユニバーサル標識）を取り込む。ＰＣＲを使用して、複数コピーの標的核酸が増幅される。標的核酸の増幅されたコピーを配列決定する。配列決定された標的核酸を計数して、細胞における標的核酸のコピー数を決定する。標的核酸の同じ配列リードのそれぞれの異なる分子標識の数を計数することにより、計数を行う。このようにして、増幅バイアスを縮小することができる。
【０４２２】
実施例５：１種の細胞標識組合せのクローナルコピーを有するビーズを生成するための分割−プール合成の有効性の評価
本実施例では、１種の細胞標識組合せのクローナルコピーを有するビーズを生成するための分割−プール合成の有効性を評価した。実施例１に記載されている酵素による分割−プール合成方法により、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを合成した。２５，０００個の細胞に由来するＲＮＡに等しい、２５０ｎｇの全ＲＮＡをＲａｍｏｓ細胞から精製した。全ＲＮＡを、３５，０００個のオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズと接触させ、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズへのｍＲＮＡのハイブリダイゼーションをもたらした。オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズにハイブリダイズされたｍＲＮＡにおいてｃＤＮＡ合成を行った。さらなる分析のために、１８、１７５および１７５０個のビーズを含む試料を使用した。１８−、１７５−および１７５０−ビーズ試料由来のビーズに結合されたｃＤＮＡにおいて、ＧＡＰＤＨ特異的プライマーおよびＩＧＪ特異的プライマーを使用したＰＣＲ増幅反応を行った。ビーズに付着させたｃＤＮＡ分子を配列決定した。図１１Ａ〜図１１Ｉは、配列決定結果のグラフによる表現を示す。図１１Ａ〜図１１Ｃは、それぞれ１８−ビーズ、１７５−ビーズおよび１７５０−ビーズ試料に関して、ビーズ１個当たりのリードの数がｙ軸にプロットされ、特有のバーコード（例えば、細胞標識組合せ）がｘ軸にプロットされている。図１１Ｄ〜図１１Ｆは、それぞれ１８−ビーズ、１７５−ビーズおよび１７５０−ビーズ試料に関して、ビーズ１個当たりの特有の分子の数がｙ軸にプロットされ、特有のバーコード（例えば、細胞標識組合せ）がｘ軸にプロットされている。図１１Ｇ〜図１１Ｉは、それぞれ１８−ビーズ、１７５−ビーズおよび１７５０−ビーズ試料に関して、ビーズ１個当たりの特有の分子の数がｙ軸にプロットされ、特有のバーコードがｘ軸にプロットされている。図１１Ｇ〜図１１Ｉの結果は、分子の総数によって選別される。様々な試料に関するビーズ１個当たりの特有の分子の中位数を表１に示す。配列決定結果の数値を表２に示す。図１１Ｊ〜図１１Ｌは、それぞれ１７５０−ビーズ試料の細胞標識１、細胞標識２および細胞標識３に関して、指標を使用した特有のバーコード（ｂｃ）組合せの数がｙ軸にプロットされ、バーコード（ｂｃ）セグメント指標がｘ軸にプロットされている。バーコード（ｂｃ）は、細胞標識を指す（例えば、ｂｃセグメント１＝細胞標識パート１）。図１１Ｊ〜図１１Ｌに示す通り、各セグメント内のほぼ全ての９６種のバーコードの存在を配列決定により検出した。これらの結果は、１種の細胞標識組合せのクローナルコピーを有するビーズを生成するための酵素による分割−プール合成方法の成功を実証する。
【０４２３】
【表１】
2019106998.tif 000002
【０４２４】
【表２−１】
2019106998.tif 000003
【０４２５】
実施例６：オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを使用した単一細胞ＲＮＡ標識化
本実施例では、オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを使用した単一細胞ＲＮＡ標識化の有効性を評価した。３種の細胞試料を次の通りに調製した：
【０４２６】
【表２−２】
2019106998.tif 000004
【０４２７】
試料の細胞懸濁液をマイクロウェルの頂部に添加し、マイクロウェルアレイのウェルに細胞を沈降させた。マイクロウェルアレイによって捕捉されていない細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）バスにおいて洗浄除去した。実施例１に記載されている酵素による分割−プール合成方法によって調製されたオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを、このマイクロウェルアレイに添加した。オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズは、複数のオリゴヌクレオチドを有する磁性ビーズを含む。ビーズにおける各オリゴヌクレオチドは、５’アミン、ユニバーサル配列、細胞標識１、リンカー１、細胞標識２、リンカー２、細胞標識３、分子標識およびオリゴｄＴを含む。同じビーズにおけるオリゴヌクレオチド毎に、オリゴヌクレオチドの配列は、分子標識を除いて同一である。異なるビーズにおけるオリゴヌクレオチドに対し、細胞標識１、２および３の組合せが異なる。マイクロウェルアレイのウェル１個当たりおよそ５〜６個のビーズが添加される。場合によっては、１０個のウェル毎に、アレイ上に５０個のビーズを沈着させ、０〜２個のビーズが各ウェル内に入る。ビーズをウェルに沈降させ、捕捉されていないビーズをＰＢＳバスにおいて洗浄除去した。マイクロウェルアレイの下に磁石を置いた。冷溶解バッファーの添加により細胞を溶解させた。アレイおよび磁石を冷アルミニウムブロックに５分間置いた。溶解された細胞由来のｍＲＮＡを、ビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。過剰な溶解バッファーでアレイを洗浄して、非結合ｍＲＮＡを除去した。マイクロウェルアレイの頂部に磁石を置くことにより、ウェルからビーズを回収した。回収されたビーズを洗浄した。ローターにおいて５０℃で５０分間Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを使用して、ビーズにおいてｃＤＮＡ合成を行った。ローターにおいて３７℃で３０分間実行したＥｘｏＩ処理により、ビーズにおけるオリゴヌクレオチドから伸長されていないオリゴｄＴを除去した。ｃＤＮＡにおいて遺伝子特異的ＰＣＲ増幅を実行した。遺伝子特異的ＰＣＲのために選択された遺伝子は、細胞型特異的であり、表３に示す。ＰＣＲ増幅された産物を配列決定した。配列決定の統計を表４に示す。図１２Ａ〜図１２Ｃは、それぞれＫ５６２のみの試料、Ｒａｍｏｓのみの試料およびＫ５６２＋Ｒａｍｏｓ混合物試料の配列決定結果のヒストグラムを示す。図１２Ａ〜図１２Ｃに関して、バーコード１種当たりの特有の分子をｙ軸にプロットし、ｂｃ１種当たりのリードによって選別された特有のｂｃ組合せ指標をｘ軸にプロットする。
【０４２８】
【表３】
2019106998.tif 000005
【０４２９】
【表４】
2019106998.tif 000006
【０４３０】
単一細胞標識化を使用して、単一の細胞型試料（例えば、Ｋ５６２のみの試料、Ｒａｍｏｓのみの試料）に関するコピー数を決定した。図１２Ｄ〜図１２Ｅは、それぞれＲａｍｏｓのみの細胞試料およびＫ５６２のみの細胞試料に関する、表３に示す遺伝子のコピー数のグラフを示す。図１２Ｄ〜図１２Ｅに関して、バーコード（ｂｃ）組合せ１種当たりの分子の数をｙ軸にプロットし、ｂｃ組合せ１種当たりの分子の総数によって選別される特有のバーコード組合せをｘ軸にプロットする。図１２Ｄ〜図１２Ｅに示す結果は、＞３０総数の特有の分子を有するビーズ由来の配列決定データに基づいた。これらの結果は、ビーズ１個当たりのアンプリコン１種当たりの分子の比率が、細胞型の予想にマッチすることを実証する。Ｋ５６２のみの細胞試料に関して、分子数の歪みはより激しく、この細胞型において高度に豊富なＨＢＧ１が、可変コピー数を有することが考えられる。しかし、ビーズ１個当たりの分子の総数が歪んでいるとしても、ＧＡＰＤＨコピー数は、一定であると考えられる。個々の遺伝子のコピー数を図１２Ｆ〜図１２Ｉに示す。図１２Ｆ〜図１２Ｇに関して、コピー数は、それぞれＲａｍｏｓのみ細胞およびＫ５６２のみ細胞に関する、ビーズまたは単一細胞１個当たりのコピーとして表される。図１２Ｈ〜図１２Ｉに関して、コピー数は、それぞれＲａｍｏｓのみ細胞およびＫ５６２のみ細胞に関する、ビーズまたは単一細胞１個当たりの相対的存在量として表される。
【０４３１】
単一細胞標識化を使用して、Ｋ５６２＋Ｒａｍｏｓ混合物試料における単一細胞の細胞型を決定した。最も豊富な分子による１００種の特有のバーコード組合せの配列決定結果を分析して、単一細胞標識化の有効性を評価して、Ｋ５６２＋Ｒａｍｏｓ混合物試料における単一細胞の細胞型を決定した。図１２Ｊ〜図１２Ｍは、１００種の特有のバーコード組合せを有するビーズの、遺伝子１種当たりの特有の分子の数（ｙ軸）のグラフを示す。ｘ軸の数字は、遺伝子を指す（表３を参照）。図１２Ｊ〜図１２Ｍは、Ｋ５６２およびＲａｍｏｓ細胞の全般的遺伝子発現パターンを明らかに描写する。図１２Ｎ〜図１２Ｏは、２種の細胞型の遺伝子発現プロファイルの全般的パターンを描写する、２個のビーズの拡大グラフを示す。図１２Ｎは、Ｋ５６２様細胞の遺伝子発現プロファイルの全般的パターンを示し、図１２Ｏは、Ｒａｍｏｓ様細胞の遺伝子発現プロファイルの全般的パターンを示す。図１２Ｐは、Ｋ５６２＋Ｒａｍｏｓ混合物試料由来の、ビーズ１個当たり＞３０種の分子を有する７６８個のビーズの遺伝子発現プロファイルの主成分分析に基づく結果の散布図を示す。ｘ軸にプロットされた成分１は、２種の細胞型を分ける。ｙ軸にプロットされた成分２は、高および低ＨＢＧ１コピー数を有するＫ５６２細胞を分ける。散布図における各ドットは、１個のビーズまたは１個の細胞に等しい１種の特有のバーコード組合せを表す。主成分分析に基づき、４０９個のビーズは、Ｋ５６２細胞に相当し、３４７個のビーズは、Ｒａｍｏｓ細胞に相当した。Ｋ５６２様およびＲａｍｏｓ様細胞型に関して、表３の遺伝子のコピー数を決定した。図１２Ｑ〜図１２Ｒは、それぞれＫ５６２様細胞（図１２Ｐに基づく第１の主成分の左側のビーズ）およびＲａｍｏｓ様細胞（図１２Ｐに基づく第１の主成分の右側のビーズ）に関する、ビーズ１個当たりのアンプリコン１種当たりのコピー数のヒストグラムを示す。図１２Ｑ〜図１２Ｒに関して、ｂｃ組合せ１種当たりの数をｙ軸に、ｂｃ組合せ１種当たりの分子の総数によって選別される特有のバーコード組合せをｘ軸に示す。図１２Ｓ〜図１２Ｔは、それぞれＫ５６２様細胞（図１２Ｐに基づく第１の主成分の左側のビーズ）およびＲａｍｏｓ様細胞（図１２Ｐに基づく第１の主成分の右側のビーズ）に関する、個々の遺伝子のビーズまたは単一細胞１個当たりのコピー数を示す。表５は、単一細胞および混合物試料に関する、ビーズ１個当たりの平均コピー数を示す。
【０４３２】
【表５−１】
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【０４３３】
実施例７：ビーズ間のクロストークの評価
本実施例では、ビーズ間のクロストークを評価した。マウスＥＬ４細胞およびＲａｍｏｓ細胞の混合物を含む試料を次の通りに調製した：
【０４３４】
【表５−２】
2019106998.tif 000008
【０４３５】
試料の細胞懸濁液をマイクロウェルの頂部に添加し、マイクロウェルアレイのウェルに細胞を沈降させた。マイクロウェルアレイによって捕捉されていない細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）バスにおいて洗浄除去した。実施例１に記載されている酵素による分割−プール合成方法によって調製されたオリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズを、このマイクロウェルアレイに添加した。オリゴヌクレオチドがカップリングされたビーズは、複数のオリゴヌクレオチドを有する磁性ビーズを含む。ビーズにおける各オリゴヌクレオチドは、５’アミン、ユニバーサル配列、細胞標識１、リンカー１、細胞標識２、リンカー２、細胞標識３、分子標識およびオリゴｄＴを含む。同じビーズにおけるオリゴヌクレオチド毎に、オリゴヌクレオチドの配列は、分子標識を除いて同一である。異なるビーズにおけるオリゴヌクレオチドに対し、細胞標識１、２および３の組合せは異なる。マイクロウェルアレイのウェル１個あたりおよそ５〜６個のビーズが添加される。ビーズをウェルに沈降させ、捕捉されていないビーズをＰＢＳバスにおいて洗浄除去した。マイクロウェルアレイの下に磁石を置いた。冷溶解バッファーの添加により細胞を溶解させた。アレイおよび磁石を冷アルミニウムブロックに５分間置いた。溶解された細胞由来のｍＲＮＡを、ビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。過剰な溶解バッファーでアレイを洗浄して、非結合ｍＲＮＡを除去した。マイクロウェルアレイの頂部に磁石を置くことにより、ウェルからビーズを回収した。回収されたビーズを洗浄した。ローターにおいて５０℃で５０分間Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを使用して、ビーズにおいてｃＤＮＡ合成を行った。ローターにおいて３７℃で３０分間実行したＥｘｏＩ処理により、ビーズにおけるオリゴヌクレオチドから伸長されていないオリゴｄＴを除去した。ｃＤＮＡにおいて遺伝子特異的ＰＣＲ増幅を実行した。遺伝子特異的ＰＣＲのために選択された遺伝子は、細胞型特異的であり、表６に示す。
【０４３６】
【表６】
2019106998.tif 000009
【０４３７】
ＰＣＲ増幅された産物を配列決定した。配列決定統計を表７に示す。
【０４３８】
【表７】
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【０４３９】
高密度および低密度試料に関して、最も豊富な分子による１００種の特有のバーコード組合せの遺伝子発現プロファイルを決定した。配列決定結果に基づき遺伝子発現プロファイルを作製した。図１３Ａは、高密度試料由来の１００種の特有のバーコード組合せのうち３５種の遺伝子発現プロファイルのグラフを示す。図１３Ａに関して、特有の分子の数をｙ軸に、遺伝子参照番号をｘ軸に示す（遺伝子参照番号に相当する遺伝子に関しては表６を参照）。図１３Ａは、マウスおよびＲａｍｏｓ細胞の全般的遺伝子発現パターンを明らかに描写する。図１３Ｂ〜図１３Ｃは、それぞれ高密度試料および低密度試料の遺伝子発現プロファイルの主成分分析に基づく結果の散布図を示す。ｘ軸にプロットされた成分１は、２種の細胞型を分ける。ｙ軸にプロットされた成分２は、Ｒａｍｏｓ細胞集団内の遺伝子発現における変動性を示す。散布図における各ドットは、１個のビーズまたは１個の細胞に等しい１種の特有のバーコード組合せを表す。高密度試料の主成分分析に基づき、１４４個のビーズは、マウス細胞に相当し、１３２個のビーズは、Ｒａｍｏｓ細胞に相当した。低密度試料の主成分分析に基づき、５２個のビーズは、マウス細胞に相当し、２７個のビーズは、Ｒａｍｏｓ細胞に相当した。
【０４４０】
細胞型が決定されたら、異なる細胞型における表６の遺伝子を検出することにより、ビーズ間のクロストークを評価した。図１３Ｄ〜図１３Ｅは、それぞれ高密度試料由来のＲａｍｏｓ様細胞およびマウス様細胞に関する、バーコード（ｂｃ）組合せ１種当たりのリード（ｙ軸）  対  ｂｃ組合せ１種当たりの分子の総数によって選別される特有のバーコード組合せ（ｘ軸）のグラフを描写する。図１３Ｆ〜図１３Ｇは、それぞれ高密度試料由来のＲａｍｏｓ様細胞およびマウス様細胞に関する、ｂｃ組合せ１種当たりの分子の数（ｙ軸）  対  ｂｃ組合せ１種当たりの分子の総数によって選別される特有のバーコード組合せ（ｘ軸）のグラフを描写する。図１３Ｈ〜図１３Ｉは、それぞれ低密度試料由来のＲａｍｏｓ様細胞およびマウス様細胞に関する、バーコード（ｂｃ）組合せ１種当たりのリード（ｙ軸）  対  ｂｃ組合せ１種当たりの分子の総数によって選別される特有のバーコード組合せ（ｘ軸）のグラフを描写する。図１３Ｊ〜図１３Ｋは、それぞれ低密度試料由来のＲａｍｏｓ様細胞およびマウス様細胞に関する、ｂｃ組合せ１種当たりの分子の数（ｙ軸）  対  ｂｃ組合せ１種当たりの分子の総数によって選別される特有のバーコード組合せ（ｘ軸）のグラフを描写する。表８は、低および高密度試料に関する、特有の分子１種当たりの平均倍数被覆度またはリード冗長性を示す。
【０４４１】
【表８】
2019106998.tif 000011
【０４４２】
表８における結果は、特有の分子１種当たりの平均倍数被覆度が、Ｒａｍｏｓ細胞においてマウス遺伝子よりもヒト遺伝子に関してさらに高く、逆もまた同じであることを示す。
【０４４３】
対照として、マウスおよびヒト細胞の混合物をチューブにおいて溶解し、ビーズによりｃＤＮＡ合成に変換し、ｃＤＮＡを配列決定した。図４ＸＬは、配列決定結果のグラフによる表現を示す。予想される通り、多数の特有のバーコード（ｂｃ）組合せが観察され、大部分のビーズは、合計１〜２コピーしか持たなかった。
【０４４４】
これらの結果は、ビーズ間に最小のクロストークが存在し、クロストークをバイオインフォマティクスにより同定することができることを実証する。
【０４４５】
実施例８：単一細胞核酸ライブラリー生成
本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体を使用して、単一細胞核酸ライブラリーを生成することができる。本実施例では、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体を有する表面（例えば、格子）に細胞試料を添加することにより、単一細胞核酸ライブラリーが生成される。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体は、ビーズにコンジュゲートされた複数のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、（ａ）リンカーによって接続された、少なくとも２種の明確に異なる領域を含む細胞標識領域と、（ｂ）分子標識領域とを含む。ビーズにおける２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドは、同一細胞標識領域を含む。ビーズにおける２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドは、２種またはそれを超える異なる分子標識領域を含む。２個またはそれを超える異なるビーズにおける２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドは、２種またはそれを超える異なる細胞標識領域を含む。よって、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体に会合する各細胞は、異なる細胞標識領域を有する。細胞試料における細胞の濃度は、表面における１種のオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体への１個またはそれより少ない細胞の会合を可能にするように十分に希釈される。溶解バッファーを使用して、細胞を溶解する。細胞由来のｍＲＮＡをオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。よって、細胞由来の全ｍＲＮＡを、同一細胞標識領域を含むオリゴヌクレオチドで標識する。細胞由来の２種またはそれを超えるｍＲＮＡを、２種またはそれを超える異なる分子標識領域を含む２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドで標識する。磁石を表面に適用して、表面からオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした固体支持体を精製する。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした固体支持体は、表面から個々に精製することができる。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした固体支持体におけるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたｍＲＮＡを逆転写して、標識されたｃＤＮＡを生成する。標識されたｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの逆相補体およびｍＲＮＡがハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドのコピーを含む。標識されたｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅して、標識されたアンプリコンを生成する。標識されたｃＤＮＡおよび／または標識されたアンプリコンは、制限酵素消化によりビーズから除去することができる。標識されたアンプリコンから単一細胞由来の核酸のライブラリーを生成する。
【０４４６】
あるいは、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした固体支持体は、共に精製される。ｍＲＮＡの逆転写は、組み合わされたオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした固体支持体上で行うことができる。異なる細胞由来のｍＲＮＡは、異なる細胞標識領域を含むオリゴヌクレオチドで標識されるため、細胞標識領域を使用して、標識されたｃＤＮＡまたは標識されたアンプリコンがいずれの細胞に起源をもつか決定することができる。よって、複数の細胞由来の核酸のライブラリーを生成することができ、標識されたアンプリコンが起源をもつ細胞の同一性は、細胞標識領域により決定することができる。
【０４４７】
単一細胞核酸ライブラリーは、細胞の溶解前に薬剤と細胞を接触させることにより生成することもできる。薬剤は、抗原、薬物、細胞、毒素等となり得る。よって、特殊化された単一細胞核酸ライブラリーを生成することができる。核酸ライブラリーの分析を使用して、単一細胞薬物発現プロファイルを作製することができる。このような核酸ライブラリーから、単一細胞レベルのシグナル伝達経路を決定することもできる。核酸ライブラリーを使用して、特定の細胞型に対する抗原の影響を決定することもできる。
【０４４８】
実施例９：単一細胞発現プロファイリング
本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体を使用して、単一細胞の発現プロファイルを決定することができる。本実施例では、細胞の混合物を含む細胞試料を、複数の抗体と接触させる。フローサイトメトリーを使用して、細胞のサブセットを精製する。細胞のサブセットをマイクロウェルアレイに添加する。複数のオリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体をマイクロウェルアレイに添加する。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体は、ナノ粒子にカップリングされた複数のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、（ａ）２種の既定の配列によって接続された３種の明確に異なる配列を含む細胞標識領域と、（ｂ）分子標識領域とを含む。ナノ粒子における２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドは、同一細胞標識領域を含む。ナノ粒子における２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドは、２種またはそれを超える異なる分子標識領域を含む。２種またはそれを超える異なるナノ粒子における２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドは、２種またはそれを超える異なる細胞標識領域を含む。よって、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体に会合する各細胞は、異なる細胞標識領域を有する。
【０４４９】
マイクロウェルアレイに磁石を適用し、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートした支持体に会合しない細胞を洗浄除去する。溶解バッファーを含むスポンジをマイクロウェルアレイの頂部に置き、これにより、細胞を溶解する。
【０４５０】
溶解された細胞由来のｍＲＮＡを、ビーズにおけるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。ｍＲＮＡを逆転写して、標識されたｃＤＮＡを生成する。標識されたｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの逆相補体およびｍＲＮＡがハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドのコピーを含む。標識されたｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅して、標識されたアンプリコンを生成する。標識されたアンプリコンを配列決定する。一細胞由来の各ｍＲＮＡは同じ細胞標識で標識され、異なる細胞由来のｍＲＮＡは異なる細胞標識で標識されているため、標識されたアンプリコンの配列情報を使用して、単一細胞発現プロファイルを作製する。
【０４５１】
実施例１０：単一細胞配列決定による免疫表現型決定
被験体から血液試料を収集し、血液試料から末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を単離した。ＲＰＭＩ１６４０培地においてＰＭＢＣを培養し、インキュベーター内に一晩置いた。ＰＭＢＣをＰＢＳにおいて複数回洗浄して、血清を除去した。３２，４００個のウェルを有するマイクロウェルアレイに、およそ７０００個のＰＭＢＣを沈着させた。よって、マイクロウェルアレイにおける大部分のウェルは、細胞を含有せず、細胞におけるいくつかのウェルは、１個の細胞のみを含有した。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズをマイクロウェルアレイにアプライした。各オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズは、ビーズに付着させたおよそ１０億種のオリゴヌクレオチドを含有した。ビーズに付着させた各オリゴヌクレオチドは、５’アミン、ユニバーサル配列、３部構成細胞性標識（例えば、２個のリンカーによって接続された３個の細胞標識セクション）、分子標識およびオリゴｄＴを含有した。各ビーズは、３個の細胞標識セクションの特有の組合せの結果である、特有の３部構成細胞性標識を含有した。単一のビーズにおける全オリゴヌクレオチドは、同じ３部構成細胞性標識を含有した。異なるビーズ由来のオリゴヌクレオチドは、異なる３部構成細胞性標識を含有した。各ウェルは、１個またはそれより少ないオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズを含有した。細胞溶解試薬をマイクロウェルアレイにアプライし、細胞の溶解をもたらした。細胞由来のポリアデニル化分子（例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズ由来のオリゴヌクレオチドのオリゴｄＴ配列にハイブリダイズした。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズ由来のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたポリアデニル化分子を、４２℃で９０分間ローターにおいてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩにより逆転写した。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズ由来のオリゴヌクレオチドは、第１鎖ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして機能した。ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩが、末端に達すると、ｃＤＮＡの３’末端にＳＭＡＲＴオリゴ配列の相補体を付加できるように、ｃＤＮＡ合成にＳＭＡＲＴオリゴを取り込んだ。ｃＤＮＡ合成反応は、伸長されていないオリゴヌクレオチド（例えば、細胞由来のポリアデニル化分子に付着させていないオリゴヌクレオチド）および伸長されたオリゴヌクレオチド（例えば、ポリアデニル化分子に付着させ、かつポリアデニル化分子／ｃＤＮＡハイブリッドを含むオリゴヌクレオチド）がコンジュゲートしたビーズを生成する。
【０４５２】
ビーズを組み合わせ、ポリアデニル化分子／ｃＤＮＡハイブリッドを含むオリゴヌクレオチドを増幅した。マルチプレックスＰＣＲを行って、ビーズにおけるｃＤＮＡ由来の９８種の遺伝子（表９を参照）のパネルを増幅した。マルチプレックス化ＰＣＲのためのプライマーは、ｍＲＮＡの３’末端由来のおよそ５００塩基対を設置するように設計された第１の遺伝子特異的プライマーと、ｍＲＮＡの３’末端由来のおよそ３００塩基対を設置するように設計されたネステッド遺伝子特異的プライマーとを含んだ。マルチプレックスＰＣＲのためのプライマーを、パネルにおけるプライマーの最後の６塩基において有意な相補性を必要としないように設計した。マルチプレックスＰＣＲプライマーにおいて相補性が検出された場合、プライマーを手動で置き換えた。マルチプレックスＰＣＲ反応は、次のステップを含んだ：１）１５サイクルの第１の遺伝子特異的ＰＣＲ（ＫＡＰＡマルチプレックスミックス、５０ｎＭの各プライマー  −  第１の遺伝子特異的プライマーおよびオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズのユニバーサル配列に相補的なユニバーサルプライマー）、Ａｍｐｕｒｅクリーンアップ（０．７×ビーズ対鋳型比）、１５サイクルのネステッド遺伝子特異的ＰＣＲ（ＫＡＰＡマルチプレックスミックス、５０ｎＭの各プライマー  −  ネステッド遺伝子特異的プライマーおよびオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズのユニバーサル配列に相補的なユニバーサルプライマー）、Ａｍｐｕｒｅクリーンアップ（０．７×ビーズ対鋳型比）、全長Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター（ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＲｅａｄｙＭｉｘ）を加えるための８サイクルの最終ＰＣＲ、およびＡｍｐｕｒｅクリーンアップ（１×ビーズ対鋳型比）。
【０４５３】
【表９】
2019106998.tif 000012
【０４５４】
増幅された産物を配列決定した。Ｂｏｗｔｉｅ２を使用して、１５０ｂｐを有する配列リードを、表９に示す９８種の遺伝子のｍＲＮＡ配列全体に対し整列させた。配列整列の結果（表１０を参照）は、マルチプレックスＰＣＲ反応が、高度に特異的な産物をもたらしたことを実証する。図１４は、Ｘ軸の遺伝子と、リードの数のｌｏｇ１０を描写するグラフを示す。９８種の遺伝子のうち１６種の遺伝子は存在しなかった。これらの遺伝子の非存在は、遺伝子のいくつかが、この血液試料中に存在しない可能性がある稀な細胞を標的化するという事実によるものとなり得る。全体的には、９８遺伝子パネル由来の遺伝子のおよそ８４％が検出された。
【０４５５】
【表１０】
2019106998.tif 000013
【０４５６】
表１１は、全体的な配列決定統計の結果を示す。リード１に関して、総リード１マッチ判断基準は、３部構成細胞性標識（例えば、細胞バーコード）への完全なマッチと、リンカーへの最大でも１個のミスマッチを要求した。
【０４５７】
【表１１】
2019106998.tif 000014
【０４５８】
図１５Ａは、３部構成細胞標識（例えば、細胞バーコード）１種当たりの検出される遺伝子の分布のグラフを示す。図１５Ｂは、ビーズ１個当たりの検出される特有の分子の分布のグラフを示す（遺伝子パネルを発現）。
【０４５９】
細胞クラスタリング分析を行って、配列決定結果を使用して、細胞バーコードに基づき細胞集団を分析することができるか否かを決定した。ＳＰＡＤＥ（ＣｙＴＯＦデータのためにＮｏｌａｎ  ｌａｂによって開発された最小スパニングツリーアルゴリズム）を使用して、１７遺伝子の存在／非存在に基づき細胞をクラスター化した。存在すると考えられる遺伝子に関して、遺伝子（ｇｅｎ）の平均配列決定冗長性は、５倍よりも大きい必要がある。配列フィルタリング後に、２０種を超える特有の分子に関連するおよそ５００種の特有の細胞バーコード（例えば、細胞標識）が存在した。各特有の細胞バーコードは、単一細胞に相当する。特有の細胞バーコードに関連する遺伝子に基づき、細胞を細胞型にクラスター化した。表１２は、細胞型の確定的同定に使用することができる遺伝子のリストを示す。よって、ＣＤ２０、ＩＧＨＭ、ＴＣＬ１ＡおよびＣＤ２４に関連する細胞バーコードは、Ｂ細胞と指定され、一方、ＣＤ８Ａ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４およびＣＤ６２Ｌに関連する細胞バーコードは、Ｔ細胞と指定された。表９の残る遺伝子を細胞クラスターにマッピングした。図１６は、細胞バーコードに関連する遺伝子に基づく細胞クラスターを描写する。クラスターのサイズは、クラスターに割り当てられた細胞の数に比例する。図１６に示す結果は、細胞および分子バーコード化の組合せを使用して、単一細胞由来の分子のコピーを特有に標識することができることを実証し、これは、単一細胞配列決定による免疫表現型決定を可能にすることができる。表１２に示す遺伝子に基づく主要細胞型へのＰＭＢＣのクラスタリングに加えて、９８遺伝子パネルを使用して、主要細胞型のサブタイプのクラスターを同定することもできる。表１３は、単一細胞配列決定によって検出される各主要細胞型の頻度を示す。表１３に示す通り、ＣＤ８＋Ｔ細胞を除いて、各細胞型のパーセンテージは、正常細胞パーセンテージ範囲に相当した。ＰＭＢＣ試料において、僅かにより高いパーセンテージのＣＤ８＋Ｔ細胞が観察された。図１６に基づく細胞クラスターを使用して、９８遺伝子パネル由来の追加的な遺伝子の発現プロファイルを使用して、細胞クラスターをさらに分析した。
【０４６０】
【表１２】
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【０４６１】
【表１３】
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【０４６２】
図１７Ａ〜図１７Ｄは、単球特異的マーカーの分析を示す。図１７Ｅは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。図１７Ａは、単球特異的マーカーであるＣＤ１４の細胞発現プロファイルを示す。「暖色」（例えば、赤色）は、高い遺伝子発現を表し、「寒色」（例えば、青色）は、低い遺伝子発現を表す。図１７Ａに示す通り、ＣＤ１４は、単球集団において高度に発現され、他の細胞型においては低発現から発現なしであった。単球およびＮＫの両方に存在することが公知のＣＤ１６の細胞発現プロファイルを図１７Ｂに示す。図１７Ｂに示す通り、単球およびＮＫ細胞クラスターは、ＣＤ１６の高発現を有した一方、他の細胞型は、低発現から発現なしであった。ＣＣＲ２およびＳ１００Ａ１２は、単球において高度に発現されることが公知である。ＣＣＲ２およびＳ１００Ａ１２単球特異的発現も、それぞれ図１７Ｃおよび図１７Ｄに示す細胞発現プロファイルにおいて実証された。しかし、ＣＣＲ２およびＳ１００Ａ１２の発現は、単球細胞の２種のブランチに分かれた。他の細胞型は、ＣＣＲ２およびＳ１００Ａ１２の低発現から発現なしを示した。
【０４６３】
図１８Ａ〜図１８Ｂは、Ｔ細胞特異的マーカーの分析を示す。図１８Ｃは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。図１８Ａは、ＣＤ３分子の鎖であるＣＤ３Ｄの細胞発現プロファイルを示す。ＣＤ３は、汎Ｔ細胞マーカーである。図１８Ａは、ＣＤ３Ｄが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の２種のブランチにおいて高度に発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞の第３のブランチにおいて中等度に発現されることを示す。しかし、ＣＤ３Ｄは、ＣＤ４＋Ｔ細胞において高度に発現されない。また、他の細胞型は、ＣＤ３Ｄの低発現から発現なしである。図１８Ｂは、ＣＤ３分子の鎖であるＣＤ３Ｅの細胞発現プロファイルを示す。図１８Ｂは、ＣＤ３Ｄが、ＣＤ４＋Ｔ細胞において高度に発現されることを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞の異なるブランチは、ＣＤ３Ｄの高から中等度発現を示す。ＣＤ３Ｄの発現がほとんどない〜全くないことが、他の細胞型において観察される。
【０４６４】
図１９Ａ〜図１９Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞特異的マーカーの分析を示す。図１９Ｃは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。図１９Ａは、ＣＤ８分子の鎖であるＣＤ８Ａの細胞発現プロファイルを示す。図１９Ａに示す通り、ＣＤ８＋Ｔ細胞の異なるブランチは、様々なレベルのＣＤ８Ａ発現を有し、一部のブランチは、高発現を有し、他のブランチは、中等度発現を有し、１種のブランチは、ＣＤ８Ａの低発現から発現なしを示す。ＣＤ１６＋ＮＫ細胞のブランチにおいて、高いＣＤ８Ａ発現が観察された。文献において、ＮＫ細胞の最大８０％が、ＣＤ８を発現することが報告された。他の細胞型において、ＣＤ８Ａ発現がほとんどない〜全くないことが観察された。図１９Ｂは、ＣＤ８モデルの鎖であるＣＤ８Ｂの細胞発現プロファイルを示す。図１９Ｂに示す通り、ＣＤ８＋Ｔ細胞の異なるブランチは、様々なレベルのＣＤ８Ｂ発現を有し、１種のブランチは、高発現を有し、一部のブランチは、中等度発現を有し、２種のブランチは、ＣＤ８Ｂの低発現から発現なしを示す。ＣＤ１６＋ＮＫ細胞のブランチにおいて、高いＣＤ８Ｂ発現も観察された。他の細胞型において、ＣＤ８Ｂ発現がほとんどない〜全くないことが観察された。
【０４６５】
図２０Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞特異的マーカーの分析を示す。図２０Ｂは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。図２０Ａは、ＣＤ４の発現プロファイルを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターにおける細胞のサブセットにおいて、ＣＤ４の中等度発現が観察され、単球クラスターのブランチにおいて、ＣＤ４の高発現が観察された。文献において、単球もＣＤ４を発現することが以前に記述された。ＣＤ８＋Ｔ細胞のブランチおよびＮＫ細胞において、ＣＤ４の中等度発現から低発現が観察された。他の細胞型において、ＣＤ４の低発現から発現なしが観察された。
【０４６６】
図２１Ａ〜図２１Ｄは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的マーカーの分析を示す。図２０Ｅは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。図２０Ａは、ＫＩＲ２ＤＳ２の発現プロファイルを示す。全細胞型が、ＫＩＲ２ＤＳ２発現がほとんどない〜全くないことを示した。図２０Ｂは、ＫＩＲ２ＤＳ５の発現プロファイルを示す。キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）は、ＮＫ細胞およびＴ細胞サブセットにおいて発現されることが公知である。ＮＫ細胞の２種のブランチにおいて、ＫＩＲ２ＤＳ５の高発現が観察され、ＮＫ細胞の１種のブランチにおいて、ＫＩＲ２ＤＳ５の中等度発現から低発現が観察された。ＣＤ８＋Ｔ細胞の２種のブランチにおいて、ＫＩＲ２ＤＳ５の中等度発現から高発現が観察された。他の全細胞型において、ＫＩＲ２ＤＳ５の低発現から発現なしが観察された。ＯＳＢＰＬ５およびＩＧＦＢＰ７は、ＮＫ細胞において高度に発現されることが公知である。図２０Ｃは、ＯＳＢＰＬ５の発現プロファイルを示す。ＮＫ細胞の１種のブランチにおいて、ＯＳＢＰＬ５が高度に発現された。Ｂ細胞のブランチにおいて、ＯＳＢＰＬ５の中等度発現から低発現が観察された。他の全細胞型において、ＯＳＢＰＬ５の低発現から発現なしが観察された。図２０Ｄは、ＩＧＦＰＢＰ７の発現プロファイルを示す。ＮＫ細胞の２種のブランチおよび単球の１種のブランチにおいて、ＩＧＦＰＢＰ７の高発現が観察された。Ｂ細胞の１種のブランチにおいて、ＩＧＦＰＢＰ７の中等度発現が観察された。他の全細胞型において、ＩＧＦＰＢＰ７の低発現から発現なしが観察された。
【０４６７】
図２２Ａ〜図２２Ｅは、Ｂ細胞特異的マーカーの分析を示す。図２２Ｆは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。図２２Ａは、ＩＧＨＭ  ＣＨ４の発現プロファイルを示す。ＩＧＨＭ  ＣＨ４は、Ｂ細胞の１種のブランチにおいて高度に発現され、Ｂ細胞の第２のブランチにおいて中等度に発現された。他の全細胞型において、ＩＧＨＭ  ＣＨ４の低発現から発現なしが観察された。図２２Ｂは、ＰＡＸ５の発現プロファイルを示す。ＰＡＸ５は、Ｂ細胞の１種のブランチにおいて高度に発現された。他の全細胞型において、ＰＡＸ５の低発現から発現なしが観察された。図２２Ｃは、ＣＤ２０の発現プロファイルを示す。ＣＤ２０は、Ｂ細胞の１種のブランチにおいて高度に発現された。他の全細胞型において、ＣＤ２０の低発現から発現なしが観察された。図２２Ｄは、ＴＣＬ１Ａの発現プロファイルを示す。他の全細胞型において、ＴＣＬ１Ａの低発現から発現なしが観察された。図２２Ｅは、ＩＧＨＤ  ＣＨ２の発現プロファイルを示す。ＩＧＨＤ  ＣＨ２は、Ｂ細胞の１種のブランチにおいて高度に発現された。他の全細胞型において、ＩＧＨＤ  ＣＨ２の低発現から発現なしが観察された。
【０４６８】
図２３Ａ〜図２３Ｆは、Ｔｏｌｌ様受容体の分析を示す。Ｔｏｌｌ様受容体は、単球および一部のＢ細胞によって主に発現される。図２３Ｇは、図１６に描写される細胞クラスターを示す。図２３Ａは、ＴＬＲ１の発現プロファイルを示す。単球の１種のブランチは、ＴＬＲ１の高発現を示し、単球の２種のブランチは、ＴＬＲ１の中等度発現を示した。他の全細胞型において、ＴＬＲ１の低発現から発現なしが観察された。図２３Ｂは、ＴＬＲ４の発現プロファイルを示す。単球の１種のブランチは、ＴＬＲ４の高発現を示した。単球の２種のブランチおよびＮＫ細胞の１種のブランチにおいて、中等度ＴＬＲ４発現が観察された。他の全細胞型において、ＴＬＲ４の低発現から発現なしが観察された。図２３Ｃは、ＴＬＲ７の発現プロファイルを示す。単球の１種のブランチにおいて、ＴＬＲ７の高発現が観察され、ＮＫ細胞の１種のブランチにおいて、ＴＬＲ７の中等度発現が観察された。他の全細胞型において、ＴＬＲ７の低発現から発現なしが観察された。図２３Ｄは、ＴＬＲ２の発現プロファイルを示す。Ｂ細胞の１種のブランチにおいて、ＴＬＲ２の高発現が観察された。他の全細胞型において、ＴＬＲ２の低発現から発現なしが観察された。図２３Ｅは、ＴＬＲ３の発現プロファイルを示す。Ｂ細胞の１種のブランチにおいて、ＴＬＲ３の高発現が観察された。他の全細胞型において、ＴＬＲ３の低発現から発現なしが観察された。図２３Ｆは、ＴＬＲ８の発現プロファイルを示す。単球の３種のブランチにおいて、ＴＬＲ８の高発現が観察された。単球の２種のブランチおよびＮＫ細胞の１種のブランチにおいて、ＴＬＲ８の中等度発現から低発現が観察された。他の全細胞型において、ＴＬＲ８の低発現から発現なしが観察された。
【０４６９】
これらの結果は、大規模並列単一細胞配列決定が、ＰＭＢＣにおいて主要細胞型を成功裏に同定することができることを実証する。配列決定結果は、細胞型を同定するためにＦＡＣにおいて使用される一部の細胞マーカーが、高いｍＲＮＡ発現を為さない（例えば、ＮＫ細胞に対するＣＤ５６、Ｂ細胞に対するＣＤ１９）ことも決定した。加えて、遺伝子パネルにおける遺伝子の多くは、複数の細胞型にわたって発現された。このような発現プロファイルを使用して、主要細胞型（例えば、活性化された細胞  対  休止した細胞等）内に細胞をサブタイプ決定する（ｓｕｂｔｙｐｅ）ことができる。
【０４７０】
実施例１１：集団における稀な細胞の同定
本実験では、大規模並列単一細胞配列決定を使用して、がんおよび非がん細胞の混合物からがん細胞を同定する。Ｒａｍｏｓ（バーキットリンパ腫）細胞を、健康な個体から単離されたＣＤ１９＋Ｂ細胞の集団にスパイクした。混合集団におけるＲａｍｏｓ細胞の濃度は、約４〜５％であった。およそ７０００個の正常Ｂ細胞および３００個のＲａｍｏｓ細胞を、２５，２００個のウェルを有するマイクロウェルアレイに沈着させた。よって、マイクロウェルアレイにおける大部分のウェルは、細胞を含有せず、細胞におけるいくつかのウェルは、１個の細胞のみを含有した。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズをマイクロウェルアレイにアプライした。各オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズは、ビーズに付着させたおよそ１０億種のオリゴヌクレオチドを含有した。ビーズに付着させた各オリゴヌクレオチドは、５’アミン、ユニバーサル配列、３部構成細胞性標識（例えば、２個のリンカーによって接続された３個の細胞標識セクション）、分子標識およびオリゴｄＴを含有した。各ビーズは、３個の細胞標識セクションの特有の組合せの結果である、特有の３部構成細胞性標識を含有した。単一のビーズにおける全オリゴヌクレオチドは、同じ３部構成細胞性標識を含有した。異なるビーズ由来のオリゴヌクレオチドは、異なる３部構成細胞性標識を含有した。各ウェルは、１個またはそれより少ないオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズを含有した。細胞溶解試薬をマイクロウェルアレイにアプライし、細胞の溶解をもたらした。細胞由来のポリアデニル化分子（例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズ由来のオリゴヌクレオチドのオリゴｄＴ配列にハイブリダイズした。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズ由来のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたポリアデニル化分子を、４２℃で９０分間ローターにおいてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩにより逆転写した。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズ由来のオリゴヌクレオチドは、第１の鎖ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして機能した。ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩが、末端に達すると、ｃＤＮＡの３’末端にＳＭＡＲＴオリゴ配列の相補体を付加できるように、ｃＤＮＡ合成にＳＭＡＲＴオリゴを取り込んだ。ｃＤＮＡ合成反応は、伸長されていないオリゴヌクレオチド（例えば、細胞由来のポリアデニル化分子に付着させていないオリゴヌクレオチド）および伸長されたオリゴヌクレオチド（例えば、ポリアデニル化分子に付着させ、かつポリアデニル化分子／ｃＤＮＡハイブリッドを含むオリゴヌクレオチド）がコンジュゲートしたビーズを生成する。
【０４７１】
ビーズを組み合わせ、ポリアデニル化分子／ｃＤＮＡハイブリッドを含むオリゴヌクレオチドを増幅した。マルチプレックスＰＣＲを行って、ビーズにおけるｃＤＮＡ由来の１１１種の遺伝子のパネルを増幅した。１１１種の遺伝子は、Ｂ細胞の異なるサブセットのマーカーを表す。マルチプレックス化ＰＣＲのためのプライマーは、ｍＲＮＡの３’末端由来のおよそ５００塩基対を設置するように設計された第１の遺伝子特異的プライマーと、ｍＲＮＡの３’末端由来のおよそ３００塩基対を設置するように設計されたネステッド遺伝子特異的プライマーとを含んだ。マルチプレックスＰＣＲのためのプライマーを、パネルにおけるプライマーの最後の６塩基において有意な相補性を必要としないように設計した。マルチプレックスＰＣＲプライマーにおいて相補性が検出された場合、プライマーを手動で置き換えた。マルチプレックスＰＣＲ反応は、次のステップを含んだ：１）１５サイクルの第１の遺伝子特異的ＰＣＲ（ＫＡＰＡマルチプレックスミックス、５０ｎＭの各プライマー  −  第１の遺伝子特異的プライマーおよびオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズのユニバーサル配列に相補的なユニバーサルプライマー）、Ａｍｐｕｒｅクリーンアップ（０．７×ビーズ対鋳型比）、１５サイクルのネステッド遺伝子特異的ＰＣＲ（ＫＡＰＡマルチプレックスミックス、５０ｎＭの各プライマー  −  ネステッド遺伝子特異的プライマーおよびオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズのユニバーサル配列に相補的なユニバーサルプライマー）、Ａｍｐｕｒｅクリーンアップ（０．７×ビーズ対鋳型比）、全長Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター（ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＲｅａｄｙＭｉｘ）を加えるための８サイクルの最終ＰＣＲ、およびＡｍｐｕｒｅクリーンアップ（１×ビーズ対鋳型比）。
【０４７２】
増幅された産物を配列決定した。Ｂｏｗｔｉｅ２を使用して、１５０ｂｐを含む配列リードを１１１種の遺伝子（表１７）のｍＲＮＡ配列全体に対し整列させた。配列整列の結果（表１４を参照）は、マルチプレックスＰＣＲ反応が、高度に特異的な産物をもたらしたことを実証する。図２４は、遺伝子  対  リードの数のｌｏｇ１０のグラフを描写する。１１１種の遺伝子のうち２４種は存在しなかった。この遺伝子のうち少なくとも２種である、ＶＤＪ組換えに関与し、プレＢ細胞のみに存在するべきＲＡＧ１およびＲＡＧ２は、存在するはずはない。非存在遺伝子のうちいくつかは、凍結細胞においてごく稀に保存されるプラズマ細胞に特異的である。
【０４７３】
【表１４−１】
2019106998.tif 000017
【０４７４】
【表１４−２】
2019106998.tif 000018
【０４７５】
表１５は、全体的配列決定統計の結果を示す。リード１に関して、総リード１マッチ判断基準は、３部構成細胞性標識（例えば、細胞バーコード）への完全なマッチと、リンカーへの最大でも１個のミスマッチを要求した。
【０４７６】
【表１５】
2019106998.tif 000019
【０４７７】
図２５Ａ〜図２５Ｄは、２種の遺伝子に関する、分子バーコード  対  リードの数またはリードの数のｌｏｇ１０のグラフを示す。図２５Ａは、ＣＤ７９に関する分子バーコード（存在量によって選別）  対  リードの数のグラフを示す。図２５Ｂは、ＣＤ７９に関する分子バーコード（存在量によって選別）  対  リードの数のｌｏｇ１０のグラフを示す。図２５Ｃは、ＧＡＰＤＨに関する分子バーコード（存在量によって選別）  対  リードの数のグラフを示す。図２５Ｄは、ＧＡＰＤＨに関する分子バーコード（存在量によって選別）  対  リードの数のｌｏｇ１０のグラフを示す。
【０４７８】
分析のために８５６個の細胞を保持した。図２６Ａは、細胞バーコード１種当たりの発現されるパネルにおける遺伝子の数  対  特有の細胞バーコードの数／単一細胞のグラフを示す。図２６Ｂは、ビーズ１個当たりの検出される特有の分子の数  対  所定の数の分子を保有する特有の細胞バーコード１種当たりの細胞の数の頻度のヒストグラムを示す。細胞の小サブセットは、明確に異なってより多数のｍＲＮＡ分子および１１１遺伝子パネルから発現される遺伝子の数（図２６Ａ〜図２６Ｂの丸く囲まれたセクションを参照）を示した。図２６Ｃは、ビーズ１個当たりの検出される特有のＧＡＰＤＨ分子の数  対  細胞の数の頻度／所定の数の分子を保有する特有の細胞バーコードのヒストグラムを示す。
【０４７９】
主成分分析（ＰＣＡ）を使用して、細胞の散布図を作成した。図２７は、８５６個の細胞の散布図を示す。ＰＣＡは、細胞の大部分とは異なる遺伝子発現パターンを有する細胞の小サブセットを同定した。細胞のサブセットは、１８個の細胞を含有し、これは、分析した全細胞のおよそ２％である。このパーセンテージは、集団にスパイクされたＲａｍｏｓ細胞のパーセンテージと同様である。
【０４８０】
Ｒａｍｏｓ細胞は、濾胞性Ｂ細胞に由来し、Ｂ細胞分化マーカー、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ１０およびＢＣＬ６を強く発現する。Ｒａｍｏｓ細胞は、ＩｇＭも発現し、ｃ−ｍｙｃを過剰発現する。図２８は、上位１００種（検出された分子の総数の観点から）の発現のヒートマップを示す。さらにより高レベルのｍＲＮＡを発現する細胞のサブセット（１８個の細胞）も、Ｒａｍｏｓ細胞の公知マーカーである遺伝子（例えば、ＣＤ１０、Ｂｃｌ−６、ＣＤ２２、Ｃ−ｍｙおよびＩｇＭ）を強く発現する。
【０４８１】
これらの結果は、大規模並列単一細胞配列決定が、細胞懸濁液における異常細胞型の小サブセット（２％の少なさ）を成功裏に同定したことを実証する。大規模並列単一細胞配列決定は、がん診断（例えば、生検材料／循環腫瘍細胞）において使用することができる。がん細胞は、サイズがより大きく、より多くのｍＲＮＡを保有するため、正常細胞から容易に区別することができる。
【０４８２】
実施例１２：ＲＥＳＯＬＶＥを使用したｇＤＮＡ標的の大規模並列単一細胞全ゲノムおよびマルチプレックス増幅
図２９は、本実施例のワークフローを示す。図２９に示す通り、細胞懸濁液をマイクロウェルアレイにアプライする（２９０１）。マイクロウェルアレイへの細胞懸濁液のアプライが、１個またはそれより少ない細胞を含有するマイクロウェルアレイにおけるウェルをもたらすことができるように、細胞懸濁液における細胞の数は、マイクロウェルアレイにおけるウェルの数に満たない。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズ（２９０５）をマイクロウェルアレイにアプライする。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズ（２９０５）は、５’アミン（２９１５）、ユニバーサルプライマー配列（２９２０）、細胞標識（２９２５）、分子標識（２９３０）およびランダマー（２９３５）を含むオリゴヌクレオチドに付着させたビーズ（２９１０）を含有する。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズは、およそ１０億種のオリゴヌクレオチドを含有する。オリゴヌクレオチドは、５’アミン、ユニバーサルプライマー配列、細胞標識、分子標識およびランダマーを含有する。単一のビーズにおける各オリゴヌクレオチドは、同じ細胞標識を含有する。しかし、単一のビーズにおける２種またはそれを超えるオリゴヌクレオチドは、２種またはそれを超える異なる分子標識を含有することができる。ビーズは、同じ分子標識を含有するオリゴヌクレオチドの複数コピーを含有することができる。
【０４８３】
オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズをマイクロウェルアレイに添加した後に、細胞溶解バッファーをアレイ表面にアプライする。図２９に示す通り、細胞由来のゲノムＤＮＡ（２９４５）は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズ（２９４０）のランダマー配列（２９３５）にハイブリダイズする。中和バッファーをアレイ表面に添加する。ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｉ２９）およびｄＮＴＰをアレイ表面に添加する。ランダマー配列（２９３５）は、ゲノムＤＮＡの増幅のためのプライマーとして作用し、これにより、ｇＤＮＡがコンジュゲートしたビーズ（２５５５）を生成する。ｇＤＮＡがコンジュゲートしたビーズ（２９５５）は、５’アミン（２９１５）、ユニバーサルプライマー配列（２９２０）、細胞標識（２９２５）、分子標識（２９２５）、ランダマー（２９３５）およびゲノムＤＮＡのコピー（２９５５）を含むオリゴヌクレオチドを含有する。本来のゲノムＤＮＡ（２９４５）は、ランダマー（２９３５）およびゲノムＤＮＡのコピー（２９５５）にハイブリダイズされる。単一のビーズに関して、オリゴヌクレオチドに付着させた複数の異なるゲノムＤＮＡ分子が存在する。
【０４８４】
図２９に示す通り、ウェル由来のｇＤＮＡがコンジュゲートしたビーズ（２９５０）をエッペンドルフチューブ（２９６０）において組み合わせる。ランダマー、ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｉ２９）を含有するｇＤＮＡ  ＭＤＡミックスにおけるゲノムＤＮＡを、組み合わされたｇＤＮＡがコンジュゲートしたビーズを含有するエッペンドルフチューブに添加する。標識されたゲノムＤＮＡをさらに増幅して、溶液における標識されたアンプリコン（２９６５）を得る。標識されたアンプリコン（２９６５）は、ユニバーサルプライマー配列（２９２０）、細胞標識（２９２５）、分子標識（２９３０）、ランダマー（２９３５）およびゲノムＤＮＡのコピー（２９５５）を含む。標識されたアンプリコンを剪断して、およそ１ｋｂまたはそれに満たないさらなる小片とする。あるいは、標識されたアンプリコンは、Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ（Ｎｅｘｔｅｒａ）により断片化することができる。標識されたアンプリコンの剪断または断片化は、標識された断片（２９８０）および標識されていない断片（２９８５）をもたらす。標識された断片（２９８０）は、ユニバーサルプライマー配列（２９２０）、細胞標識（２９２５）、分子標識（２９３０）、ランダマー（２９３５）およびゲノムＤＮＡのコピーの断片（２９５５）を含有する。アダプター（２９７０、７９７５）を断片に付加する。ユニバーサルプライマー配列を使用して、ユニバーサルプライマー配列およびアダプター（２９７０、２９７５）の一方に対するプライマーを使用したハイブリダイゼーションプルダウンまたはＰＣＲにより、標識された断片（２９８０）を選択することができる。
【０４８５】
標識された断片を配列決定することができる。細胞標識、分子標識およびゲノム断片の配列を含む配列リードを使用して、細胞懸濁液から細胞集団を同定することができる。主成分分析を使用して、公知細胞マーカーに基づき細胞の散布図を作成することができる。それに代えてまたはそれに加えて、ＳＰＡＤＥを使用して、細胞クラスタープロットを生成することができる。コンピュータソフトウェアプログラムを使用して、細胞標識ならびに細胞標識に関連する分子標識およびゲノム断片を含むリストを作成することができる。
【０４８６】
実施例１３：不均質集団における細胞を同定するための大規模並列配列決定
本実施例の実験ワークフローを図３０に示す。図３０に示す通り、細胞の混合集団をマイクロウェルアレイに確率論的に撒布した。本実施例では、細胞の混合集団は、Ｒａｍｏｓ細胞およびＫ５６２細胞の混合物を含む。アレイにおける各マイクロウェルが、１個またはそれより少ない細胞を含有するように、細胞懸濁液は、低濃度の細胞を含む。細胞をマイクロウェルアレイにアプライした後に、複数のオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズをマイクロウェルアレイに確率論的に撒布した。オリゴヌクレオチドビーズは、５’アミン、ユニバーサルプライマー配列、細胞標識、分子標識およびオリゴｄＴを含む複数のオリゴヌクレオチドを含有する。単一のビーズ由来の複数のオリゴヌクレオチドの細胞標識は同一である。単一のビーズは、同じ分子標識を含む複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。加えて、単一のビーズは、異なる分子標識を含む複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。第１のビーズにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの細胞標識は、第２のビーズにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの細胞標識とは異なる。よって、細胞標識を使用して、２個またはそれを超えるオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズを区別することができる。細胞を溶解し、単一細胞由来のＲＮＡ分子を、同じウェルにおけるオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズに付着させた。図３０は、オリゴヌクレオチドのオリゴｄＴ配列へのＲＮＡのポリＡ配列の付着を示す。同じウェルにおけるオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズへの個々の細胞由来のＲＮＡ分子の付着後に、単一の試料においてビーズを組み合わせた。単一の試料中のビーズにおいて、ｃＤＮＡ合成反応を行った。図３０は、ｃＤＮＡ合成の産物が、オリゴヌクレオチドに付着させたビーズを含み、オリゴヌクレオチドが、５’アミン、ユニバーサルプライマー配列、細胞標識、分子標識、オリゴｄＴおよびＲＮＡ分子のコピーを含むことを示す。単純にするために、１種のオリゴヌクレオチドのみを図３０に描写するが、本実施例では、各オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズは、およそ１０億種のオリゴヌクレオチドを含む。図３０に示す通り、ユニバーサルプライマー配列にハイブリダイズしたユニバーサルプライマーと、ＲＮＡ分子のコピーにハイブリダイズした遺伝子特異的プライマーとを使用して、単一の試料におけるビーズにより、マルチプレックス化ＰＣＲを行った。表１６に示す遺伝子パネル由来のＲａｍｏｓ特異的遺伝子またはＫ５６２特異的遺伝子に結合するように、遺伝子特異的プライマーを設計した。対照として、マルチプレックス化ＰＣＲ反応において、ＧＡＰＤＨ遺伝子特異的プライマーも使用した。最後に、次世代配列決定を使用して、増幅された産物を配列決定した。配列決定リードは、細胞標識、分子標識および遺伝子に関係する情報を含んだ。主成分分析を使用して、細胞標識、分子標識および遺伝子に関係する配列決定情報に基づき細胞の散布図を構築した。ＦＡＣが細胞の選別に使用され、表面マーカーに基づく散布図が細胞の群分けに使用される仕方に類似して、細胞標識を使用して単一細胞由来の遺伝子を同定し、分子標識を使用して遺伝子の量を決定する。次に、この組み合わされた情報を使用して、個々の細胞の遺伝子発現プロファイルを関連付ける。図３１Ａに示す通り、細胞および分子標識による大規模並列単一細胞配列決定は、混合細胞集団における２種の細胞集団（Ｋ５６２およびＲａｍｏｓ細胞）を成功裏に同定することができた。
【０４８７】
【表１６】
2019106998.tif 000020
【０４８８】
実施例１４：主成分分析による大規模並列単一細胞配列決定
本実施例では、個々の細胞由来のｍＲＮＡ分子を、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズで並行して確率論的に標識した。血液からＰＢＭＣを単離し、ＲＰＭＩ１６４０プラスＦＢＳおよびＤＭＳＯにおいて８０℃で凍結した。ＰＭＢＣを解凍し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞型の混合物（４０００個の総細胞）を含むＰＢＭＣ試料をアガロースマイクロウェルアレイに確率論的にアプライした。アガロースマイクロウェルアレイは、３７，５００個の細胞を含有した。１５０，０００個のオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズの混合物を、マイクロウェルアレイを囲むＰＤＭＳガスケットによりマイクロウェルアレイに確率論的にアプライした。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズを図１に描写する。単純にするために、１種のオリゴヌクレオチドのみをビーズに付着させるように示すが、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズは、およそ１０億種のオリゴヌクレオチドを含有した。
【０４８９】
マイクロウェルアレイを冷ブロックに１０分間置き、アレイ表面に溶解バッファーをアプライすることにより、細胞を溶解した。ウェルにおける細胞が溶解したら、単一細胞由来のｍＲＮＡ分子を、オリゴｄＴ配列を介してオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしたビーズに付着させた。磁石をアレイに適用し、アレイを洗浄バッファーで２回洗浄した。
【０４９０】
ｍＲＮＡ分子を付着させたビーズを、エッペンドルフチューブにおいて組み合わせた。ビーズに付着させたｍＲＮＡ分子を逆転写して、ｃＤＮＡを生成した。次のｃＤＮＡ合成混合物を次の通りに調製した：
【０４９１】
【表１７−１】
2019106998.tif 000021
【０４９２】
ｍＲＮＡ分子を付着させたビーズを含有するエッペンドルフチューブに、ｃＤＮＡ合成混合物を添加した。ローターにおいて４０℃で９０分間、エッペンドルフチューブをインキュベートした。ｃＤＮＡ合成反応がビーズにおいて起こった。９０分後に、磁石をチューブに適用し、ｃＤＮＡミックスを除去し、次のＥｘｏＩ反応混合物に置き換えた：
【０４９３】
【表１７−２】
2019106998.tif 000022
【０４９４】
ローターにおいて３７℃で３０分間、チューブをインキュベートした。次に、チューブを１５分間８０℃のサーマルサイクラーに移した。チューブを８０℃で１５分間インキュベートした後に、７０マイクロリットルのＴＥ＋Ｔｗｅｅｎ２０をチューブに添加した。磁石をチューブに適用し、バッファーを除去した。次に、ビーズを５０マイクロリットルのＴＥ＋Ｔｗｅｅｎ２０に再懸濁した。
【０４９５】
次の増幅混合物を使用したリアルタイムＰＣＲにより、ビーズに付着させたｃＤＮＡを増幅した：
【０４９６】
【表１７−３】
2019106998.tif 000023
【０４９７】
標識されたｃＤＮＡアンプリコンを配列決定して、細胞標識、分子指標および遺伝子を検出した。配列決定リードを、細胞標識、次に遺伝子、最後に分子標識に対して整列した。４種もしくはそれを超える遺伝子に関連する細胞標識または１０種もしくはそれを超える特有の転写物分子（各特有の転写物分子は２回以上配列決定された）に関連する細胞標識を、細胞に指定した。検出された表９の全遺伝子による主成分分析を使用して、データにおける変動に対し最大の寄与を有した遺伝子のセットを同定した。主成分分析において６３２個の単一細胞を使用した。配列決定結果に基づき、９８種の遺伝子のうち８１種を検出した。
【０４９８】
図３２は、ＧＡＰＤＨ発現の主成分分析プロットを示す。図３２に示す通り、主成分空間の位置に基づき、２個の細胞クラスターが観察された。
【０４９９】
図３３Ａ〜図３３Ｆは、単球関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３３Ａは、ＣＤ１６のＰＣＡを示す。図３３Ｂは、ＣＣＲｖａｒＡのＰＣＡを示す。図３３Ｃは、ＣＤ１４のＰＣＡを示す。図３３Ｄは、Ｓ１００Ａ１２のＰＣＡを示す。図３３Ｅは、ＣＤ２０９のＰＣＡを示す。図３３Ｆは、ＩＦＮＧＲ１のＰＣＡを示す。
【０５００】
図３４Ａ〜図３４Ｂは、汎Ｔ細胞マーカー（ＣＤ３）の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３４Ａは、ＣＤ３ＤのＰＣＡを示し、図３４Ｂは、ＣＤ３ＥのＰＣＡを示す。
【０５０１】
図３５Ａ〜図３５Ｅは、ＣＤ８  Ｔ細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３５Ａは、ＣＤ８ＡのＰＣＡを示す。図３５Ｂは、ＥＯＭＥＳのＰＣＡを示す。図３５Ｃは、ＣＤ８ＢのＰＣＡを示す。図３５Ｄは、ＰＲＦ１のＰＣＡを示す。図３５Ｅは、ＲＵＮＸ３のＰＣＡを示す。
【０５０２】
図３６Ａ〜図３６Ｃは、ＣＤ４  Ｔ細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３６Ａは、ＣＤ４のＰＣＡを示す。図３６Ｂは、ＣＣＲ７のＰＣＡを示す。図３６Ｃは、ＣＤ６２ＬのＰＣＡを示す。
【０５０３】
図３７Ａ〜図３７Ｆは、Ｂ細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３７Ａは、ＣＤ２０のＰＣＡを示す。図３７Ｂは、ＩＧＨＤのＰＣＡを示す。図３７Ｃは、ＰＡＸ５のＰＣＡを示す。図３７Ｄは、ＴＣＬ１ＡのＰＣＡを示す。図３７Ｅは、ＩＧＨＭのＰＣＡを示す。図３７Ｆは、ＣＤ２４のＰＣＡを示す。
【０５０４】
図３８Ａ〜図３８Ｃは、ナチュラルキラー細胞関連遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３８Ａは、ＫＩＲ２ＤＳ５のＰＣＡを示す。図３８Ｂは、ＣＤ１６のＰＣＡを示す。図３８Ｃは、ＣＤ６２ＬのＰＣＡを示す。
【０５０５】
主成分分析に基づき、単球およびリンパ球は、ＰＣ１において２個の明確に異なるクラスターを形成した。Ｂ、ＴおよびＮＫ細胞は、ＰＣ２に沿ったクラスターにおける連続体として存在した別のクラスターを形成した。図３９は、細胞型および細胞サブタイプのアノテーション付きの、ＧＡＰＤＨ発現のＰＣＡ分析を示す。図４０は、細胞間の遺伝子発現プロファイルにおける相関を示すヒートマップを描写する。左上隅から始まる対角線に沿って、細胞は、単球、ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞である。図４１は、遺伝子発現および細胞型の間の相関を実証するヒートマップの別バージョンを示す。図４２は、遺伝子間の遺伝子発現プロファイルにおける相関を実証するヒートマップを示す。
【０５０６】
実施例１５：デジタル遺伝子発現サイトメトリーによる細胞不均質性の解明
次世代配列決定を単一細胞の確率論的バーコード化と組み合わせる、遺伝子発現サイトメトリーのためのアプローチを提示する。およそ１５０，０００個のマイクロウェルのアレイに、数千個の細胞をランダムに沈着させた。特有の細胞バーコードを有するビーズに並んで各細胞が分配されるように、細胞および転写物バーコード化捕捉プローブを有するビーズのライブラリーを添加する。細胞溶解後に、ｍＲＮＡをビーズにハイブリダイズさせ、逆転写、増幅および配列決定のためにプールした。バーコード化された転写物を計数し、起源の細胞に割り当てる場合、細胞毎のデジタル遺伝子発現プロファイルを再構築した。本発明者らは、細胞亜集団へとヒト造血系を精査し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に対する免疫細胞の不均質性応答を特徴付けるための技術を適用した。さらに、正常細胞の高バックグラウンドにおける抗原特異的Ｔ細胞および腫瘍細胞等、稀な細胞の検出により、方法の高感度を実証した。
【０５０７】
導入
細胞の大規模収集物における細胞の多様性および機能の理解は、個々の細胞によって発現される特異的遺伝子またはタンパク質の測定を必要とする。フローサイトメトリーは、単一細胞のタンパク質発現を測定するために十分に確立されているが、ｍＲＮＡ発現測定は、典型的には、バルク試料において実行され、個々の細胞の寄与は不明瞭である。マイクロタイタープレートまたは市販のマイクロ流体チップを使用した単一細胞ｍＲＮＡ発現測定が近年報告されたが（１〜５）、これらのアプローチは、極めてロースループットであり、拡大縮小が困難である。これらの限界により、現在までの大部分の試験は、調べられる細胞の数および探索される条件の数の両方において制限されている。
【０５０８】
そこで、本発明者らは、任意数の遺伝子にわたる数千個の単一細胞の慣用的なデジタル遺伝子発現プロファイリングを可能にする、高度に拡大縮小が可能（ｓｃａｌａｂｌｅ）なアプローチを開発した。マイクロスケールエンジニアリングおよびコンビナトリアル化学を使用して、大規模並列様式において特有の細胞バーコードで細胞における全ｍＲＮＡ分子を標識した。加えて、細胞内の各転写物コピーを分子バーコードでタグ付けし、絶対的デジタル遺伝子発現測定を可能にした（６）。全細胞由来のタグ付けされたｍＲＮＡ分子をプールし、増幅し、配列決定した。各配列における細胞および分子バーコードを使用して、各細胞のデジタル遺伝子発現プロファイルを再構築した。この高度に拡大縮小が可能な技術は、本発明者らがＣｙｔｏＳｅｑと呼ぶ遺伝子発現サイトメトリーを可能にする。本発明者らは、この技法を造血系のマルチパラメータ遺伝的分類に適用し、細胞不均質性を試験し、集団における稀な細胞を検出するためのその使用を実証した。
【０５０９】
結果
ＣｙｔｏＳｅｑ
図４３Ａに手順の概要を述べた。先ず細胞懸濁液を、最大１５０，０００個のマイクロウェルを有する微細加工された表面にロードした。各３０ミクロン直径マイクロウェルは、ほぼ２０ピコリットルの容積を有する。１０個またはそれを超えるウェルのうちほぼ１個のみが、細胞を受け入れることができるように、細胞の数を調整した。細胞は重力によりウェル内に沈降した。
【０５１０】
ウェル内の各細胞の部分的に頂部に、またはそれに隣接してビーズが位置するように、磁性ビーズを飽和するまでマイクロウェルアレイにロードした。各マイクロウェルが、１個のビーズのみを保持することができるように、ビーズの寸法を選んだ。各磁性ビーズは、図４３Ｂに概要を述べる構造を有するおよそ十億個のオリゴヌクレオチド鋳型を保有した。各オリゴヌクレオチドは、ユニバーサルプライミング部位と、続く細胞標識、分子標識およびオリゴ（ｄＴ）の捕捉配列を呈した。各ビーズにおける全オリゴヌクレオチドは、同じ細胞標識を有するが、多様な分子標識を含有する。本発明者らは、百万近くの多様性を有するビーズを合成するためのコンビナトリアル分割−プール方法を考案した。ウェルのほぼ１０％のみが単一細胞に占有されたため、同じ細胞標識によりタグ付けされた２個の単一細胞を有する確率は低かった（およそ１０-4）。同様に、単一のビーズにおける分子標識の多様性は、およそ１０4であり、同じ分子標識によりタグ付けされた同じ細胞における同じ遺伝子の２種の転写物分子の可能性も低かった。
【０５１１】
マイクロウェルアレイの表面に溶解バッファーをアプライし、マイクロウェルへと拡散させる。細胞から放出されたポリ（ｄＡ）テイル付きｍＲＮＡ分子は、ビーズにおけるオリゴヌクレオチドの３’末端におけるオリゴ（ｄＴ）にハイブリダイズする。細胞はビーズに隣接したため、溶解バッファーの高塩条件下および高い局所的濃度のｍＲＮＡ（数十ナノモル濃度）において、ｍＲＮＡ分子はビーズに捕捉された。
【０５１２】
溶解およびハイブリダイゼーション後に、磁石を使用して、マイクロウェルアレイからチューブへと全ビーズを収集した。これ以降、全反応を単一チューブ内で行った。従来のプロトコール（方法）を使用して、ビーズにおいてｃＤＮＡ合成を行った。各細胞に由来するｃＤＮＡ分子を、５’末端において細胞標識および分子標識でそれぞれタグ付けされたその相当するビーズに共有結合により付着させた。ネステッドマルチプレックスＰＣＲを行って、目的の遺伝子を増幅した（図５５）。各細胞由来のｍＲＮＡは、ビーズにおいてｃＤＮＡとしてコピーされているため、ビーズは、例えば、遺伝子の異なるセットのために、反復的に増幅および分析することができる。
【０５１３】
アンプリコンの配列決定は、細胞標識、分子標識および遺伝子同一性を明らかにした（図５５）。コンピューターによる分析は、細胞標識に基づきリードを群分けし、同じ分子標識および遺伝子配列を有するリードを単一のエントリーにまとめて（ｃｏｌｌａｐｓｅ）、あらゆる増幅バイアスを抑制した。分子標識の使用により、細胞１個当たりの遺伝子１種当たりの分子の絶対数の測定が可能になり、したがって、異なる深さの配列決定を行うことができる生物学的試料にわたる細胞発現レベルの直接的比較が可能になった。
【０５１４】
制御された細胞混合物における明確に異なる細胞型の同定
２種の細胞型を分ける方法の能力を測定するために、Ｋ５６２およびＲａｍｏｓ細胞のほぼ１：１混合物を、１０，０００個のウェルを有するマイクロウェルアレイにロードした。およそ６０００個の細胞を使用して、ほぼ１０００個の細胞を捕捉した。１２種の遺伝子のパネルを選択し、ビーズから増幅した。パネルは、Ｋ５６２（骨髄性白血病）細胞に特異的な５種の遺伝子、Ｒａｍｏｓ（濾胞性リンパ腫）細胞に特異的な６種の遺伝子およびハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（表１８）からなる。それぞれ単一のビーズを有する１０，０００ウェルアレイに捕捉されたおよそ１０００個の細胞により、ビーズの１０％のみが、ｍＲＮＡを保有する筈であり、理論上は、配列決定データにおいて最大で１０００種の特有の細胞標識のみが観察される筈である。実際、本発明者らは、データフィルタリング（判断基準のフィルタリングのための方法を参照）後に、有意な数のリードに関連した７６８種の細胞標識を見出した。比較として、同様の数の細胞およびビーズを有する微量遠心分離チューブにおいてバルク細胞溶解およびｍＲＮＡ捕捉を行ったところ、多数の細胞標識が観察され、大部分は１種のみのリードが、各細胞標識に関連した。この結果は、同じウェルにおけるビーズへの単一細胞由来のｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの限局化において、マイクロウェルアレイが有効であったことを実証する。
【０５１５】
主成分分析（ＰＣＡ）を使用して、７６８個の単一細胞のそれぞれの遺伝子発現プロファイルをクラスター化した（図３１Ａ）。第１の主成分（ＰＣ）は、単一細胞を細胞型に基づき２個の主要クラスターに明らかに分けた。第１の主成分のポジティブ面に寄与する遺伝子は、Ｒａｍｏｓに特異的な遺伝子であった一方、同じ主成分のネガティブ面に寄与する遺伝子は、Ｋ５６２に特異的な遺伝子であった。その特異的発現に基づく細胞から群へのこのようなクラスタリングの成功は、ウェル間汚染が、あるとしても無視できることを示した。第２の主成分は、以前に観察された（７）Ｋ５６２細胞内の胎児ヘモグロビン（ＨＢＧ１）における高度の変動性を強調した。
【０５１６】
【表１８】
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【０５１７】
別の実験では、本発明者らは、健康な個体由来の初代Ｂ細胞に、数パーセンテージのＲａｍｏｓ（バーキットリンパ腫）細胞をスパイクした。Ｂ細胞の異なる状況を表すように、１１１種の遺伝子のパネル（表２２）を設計した。１１９８個の単一細胞を分析した。１８個の単一細胞（集団のほぼ１．５％）を構成する集団の小群は、残りと比較して、明確に異なる遺伝子発現パターンを有することが判明した（図３１Ｂ）。この群によって優先的に発現された遺伝子は、ＭＹＣおよびＩｇＭ等、バーキットリンパ腫と関連することが公知であると共に、バーキットリンパ腫が起源をもつＢ細胞のサブセットである濾胞性Ｂ細胞によって特異的に発現されるＢ細胞分化マーカー（ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＬ６）である（図３１Ｃおよび図３１Ｄ）。加えて、この細胞群は、分子指標の分析に基づき検出される特有のｍＲＮＡ分子の総数によって決定される通り、より高レベルのＣＣＮＤ３およびＧＡＰＤＨならびに全体的により高いｍＲＮＡ含量を保有した（図３１Ｂ）。この知見は、リンパ腫細胞が、正常個体における初代Ｂ細胞よりも物理的に大きく、急速に増殖しより多量の転写物を生成するという事実と一致した。
【０５１８】
ヒトＰＢＭＣにおける複数の細胞型の同時同定
制御された実験は、細胞の２種の明確に異なる型の人為的な混合物を含んだが、大部分の天然に存在する生物学的試料は、遺伝子発現プロファイルにより軽微な差を有する、多数の細胞型および状況を有する多様な集団を含有する。顕著な例は血液である。本発明者らは、主要細胞型のそれぞれに特異的である９８種の遺伝子のパネル（表１９）の発現プロファイルを測定することにより、単球、ＮＫ細胞ならびに異なるＴおよびＢ細胞サブセットを含む、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるあらゆる主要細胞型を同時に同定することを目標とする実験を行った。大部分は表面タンパク質マーカーに限定される伝統的な免疫表現型決定とは異なり、本発明者らは、表面タンパク質に加えて、サイトカイン、転写因子および様々な細胞機能の細胞内タンパク質をコードする遺伝子を含めた。本発明者らは、ＰＣＡにより、存在する８１種の遺伝子を使用した６３２個の単一ＰＢＭＣのデジタル遺伝子発現プロファイルを分析した（図３２〜図３９）。第１の主成分は、一方のクラスターにおけるＣＤ１６ａ、ＣＤ１４、Ｓ１００Ａ１２およびＣＣＲ２ならびに他方におけるリンパ球関連遺伝子の発現によって証明される通り、単球およびリンパ球を２個の直交性クラスターへと明らかに分けた。リンパ球の異なるサブタイプは、第２の主成分に沿った連続体に位置し、Ｂ細胞（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＴＣＬ１Ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＰＡＸ５を発現）は一末端に、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌを発現）は中央に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＥＯＭＥＳ、ＰＲＦ１を発現）は他の一末端に位置する。キラー様免疫グロブリン受容体、ＣＤ１６ａおよびパーフォリン（ＰＲＦ１）を発現するナチュラルキラー細胞は、単球および細胞傷害性Ｔ細胞の間の空間に位置する。本発明者らは、細胞代謝の指標であるＧＡＰＤＨが、単球において最高レベルで、恐らく大部分は休止したＢ細胞において最低で発現されたことも観察した。細胞にわたる遺伝子発現プロファイルの相関分析は、ＰＣＡによる観察を反復し、各主要細胞型内における追加的なより小さい細胞サブセットを明らかにした（図４０Ａ〜図４０Ｂ）。７３１個の細胞を含む同じＰＢＭＣ試料の再現実験は、大部分は同様の分離および細胞型頻度を生じた（図４１）。
【０５１９】
【表１９−１】
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【０５２０】
【表１９−２】
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【０５２１】
【表１９−３】
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【０５２２】
【表１９−４】
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【０５２３】
【表１９−５】
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【０５２４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に対するヒトＴ細胞の応答の多様性の試験
バルク試料の遺伝子発現パターンを検査する場合、観察されるパターンは、試料の細胞組成および各細胞型またはサブタイプにおける各遺伝子の発現レベルの両方に寄与された。これら２種の効果は、バルク分析によって逆重畳することはできないが、大規模単一細胞分析によってのみ逆重畳が可能である。説明するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に対するヒトＴ細胞の応答の変動性を試験するために本発明者らのプラットフォームを利用した。
【０５２５】
本発明者らは、血液ドナーからネガティブ選択によりＣＤ３＋Ｔ細胞を精製し、これを抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３ビーズで６時間刺激し、刺激および無刺激細胞の別々のアリコートにより実験を行った。異なるＴ細胞サブセットによって発現される表面タンパク質、サイトカイン、ケモカインおよびエフェクター分子を包含した９３種の遺伝子のパネル（表２０）を設計した。それぞれ刺激および無刺激試料に関して、総計３５１７および１４７８個の単一細胞を分析した。
【０５２６】
【表２０−１】
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【０５２７】
【表２０−２】
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【０５２８】
無刺激試料において、ＰＣＡ分析は、細胞の２種の主要サブセットを明らかにした。各サブセットにおいて濃縮された遺伝子をより詳細に調べると、一方のサブセットは、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫおよびＥＯＭＥＳの発現を有するＣＤ８＋細胞を表し、他方のサブセットは、ＣＤ４、ＣＣＲ７およびＳＥＬＬの発現を有するＣＤ４＋細胞を表したことが示された（図４４Ａおよび図４５）。
【０５２９】
刺激試料において、細胞の２種のブランチが、ＰＣＡプロットにおいて直ちに明らかになった（図４４Ｂおよび図４６Ａ〜図４６Ｄ）。第１の主成分は、ＩＦＮＧ、ＴＮＦ、ＣＤ６９およびＧＡＰＤＨの発現の変動レベルの観点から、刺激薬に対する個々の細胞の応答の程度を表した。細胞傷害性Ｔ細胞に関連するサイトカインおよびエフェクター分子であるＣＣＬ３、ＣＣＬ４およびＧＺＭＢならびに消耗細胞に関連するマーカーであるＬＡＧ３の発現は、上部ブランチにおける細胞に局在化した。ヘルパーＴ細胞に関連するサイトカインであるＩＬ２、ＬＴＡ、ＣＤ４０ＬＧおよびＣＣＬ２０の発現は、下部ブランチに局在化した。ＺＢＥＤ２、ＩＬ４Ｒ、ＰＲＤＭ１、ＴＢＸ２１、ＭＹＣ、ＦＯＳＬ１、ＣＳＦ２、ＴＮＦＲＳＦ９、ＢＣＬ２およびＦＡＳＬＧを含む、活性化Ｔ細胞において上方調節されることが公知であった他の遺伝子は、より少数の細胞において様々な程度で発現された（図４６Ａ〜図４６Ｄ）。これらのサイトカイン、エフェクター分子および転写因子の大部分は、無刺激試料における細胞によって発現されなかったか、または非常に低レベルで発現された。刺激のこの短い期間内で応答した細胞の大部分は、恐らくメモリ細胞であったが、より低レベルのＩＬ２を生成したが他のサイトカインもエフェクター分子も生成しない、ナイーブ細胞を表すことができる細胞の小集団が観察された（図４４Ｂ、矢印）。
【０５３０】
応答における不均質性を十分に理解するために、本発明者らは、ペアワイズ相関係数に基づき細胞をクラスター化した。ＣＤ４およびＣＤ８細胞の２個の主要群は明らかであったが、発現される活性化された遺伝子の組合せおよびレベルの観点から、各セット内に相当な多様性があった（図４７および図４８）。
【０５３１】
無刺激試料と比較して、全体として刺激試料において数百倍またはそれを超えて上方調節されるが、試料における数個の細胞のみによって寄与される数種のサイトカイン、即ち、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１３、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ２２、ＬＩＦ、ＩＬ３およびＩＬ２１が存在することが観察された（図４４Ｃ）。これらのサイトカインのサブセットは、同じ細胞によって発現された（図４９Ａ〜図４９Ｃ）。例えば、同じ単一細胞は、Ｔｈ１７細胞のシグネチャーであるＩＬ１７ＦおよびＩＬ２２の計数の大部分に寄与した。別の７個の細胞は、Ｔｈ２細胞のシグネチャーであるＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１３の様々な組合せを発現し、これらの様々な組合せを発現した。かかる観察は、特に、全体的発現変化に対する寄与が、稀な亜集団に由来した場合、大規模単一細胞分析の重要性を強調する。
【０５３２】
第２の血液ドナー由来のＴ細胞により同じ刺激実験を反復し、それぞれ刺激および無刺激試料における６６９および５９５個の単一細胞のプロファイルを分析した。この個体における（恐らく、刺激に対する個体間変動性を示す）活性化の全体的レベルはより低かったが（発現変化の観点からより小さい規模）、刺激に対する個々の細胞の応答における不均質性と共に、ＰＣＡ分析における同じ傾向が観察された（図４８）。
【０５３３】
稀な抗原特異的Ｔ細胞の同定
ＣＤ８＋Ｔ細胞集団における抗原特異的細胞のモデルを使用して、稀な細胞を同定するための本発明者らのプラットフォームの有用性が実証された。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対してセロポジティブである同じ２名の血液ドナーの新鮮血を、ＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドプールに曝露した。各ドナーの別々の未処理血液アリコートを陰性対照とした。その後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、本発明者らのプラットフォームにおける刺激および無刺激細胞の応答を分析した。それぞれドナー２のＣＭＶ刺激および無刺激試料ならびにドナー１のＣＭＶ刺激および無刺激試料における２２７４個、２３３７個、５８１個および２５３個の細胞からデータを得た。
【０５３４】
クラスタリング分析において明らかなクラスターを形成する比較的少数の細胞を生じたドナー１の陰性対照を除いて、残りの試料は全て、細胞の２個の主要群を示した（図５０Ａ、図５１および図５２）。一方の群における細胞は、ナイーブ細胞およびセントラルメモリー関連マーカー、ＳＥＬＬ、ＣＣＲ７およびＣＤ２７を発現した一方、他方の群における細胞は、エフェクターメモリー細胞（ＣＣＬ４、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ３）およびエフェクター細胞関連遺伝子（ＥＯＭＥＳ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＴＢＸ２１、ＺＮＦ６８３）を発現した。２種のブランチの間の空間を占有し、グランザイムＫ（ＧＺＭＫ）を発現する細胞の明確に異なる小サブセットと共に、ＨＬＡ−ＤＲＡ発現細胞の別のサブセットが存在した。異なる種類のグランザイムの差次的発現が以前に報告された（８）。本発明者らの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による以前のＣｙＴＯＦ実験において観察された結果を再現した（９）。
【０５３５】
相当な比率の細胞が、ＣＤ６９およびＭＹＣの発現により抗原への曝露に応答すると思われたが（図５２）、本発明者らは、活性化された抗原特異的細胞のシグネチャーサイトカインであるＩＦＮＧを発現した数個の細胞のみを見出した。ＩＦＮＧ発現細胞の大部分は、活性細胞状況の兆候であり、エフェクターメモリー／エフェクター細胞クラスターに属する遺伝子パネルにおける全体で最も多く検出された転写物分子を保有した細胞の中にも存在した（図５０Ｂおよび図５３）。ＩＦＮＧ発現および全体的転写レベルに基づき、ＣＭＶ特異的である可能性があるそれぞれドナー１および２における５８１個のうち５個（０．８６％）および２２７４個のうち２個（０．０９％）の細胞を同定した。これらの細胞のうち、発現されるエフェクター分子（例えば、グランザイム）およびサイトカイン（例えば、ＩＦＮＧ、ＩＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＴＮＦ、ＣＳＦ２、ＩＬ４）の組合せおよびレベルの観点から相当量の不均質性が存在した（図５４）。興味深いことに、ドナー２における大部分の転写物を発現した単一細胞は、ＩＬ６およびＩＬ１Ｂの両方を発現したが、ＩＦＮＧを発現しなかった。
【０５３６】
考察
本実施例では、本発明者らは、単一細胞を単離し、細胞内容物を特有にバーコード化し、定量的分析のために個々の分子をバーコード化するために、再帰的ポアソン戦略を使用した高度に拡大縮小が可能なｍＲＮＡサイトメトリーを提示した。数千個の細胞を含有する試料における各細胞に属する転写物分子を同時に同定および計数することができることを示した。さらに、天然に存在する不均質系におけるその発現プロファイルに基づき個々の細胞を特徴付けるためのこの技法の使用および大きなバックグラウンド集団における稀な細胞の検出を実証した。
【０５３７】
ＣｙｔｏＳｅｑのスループットおよび単純さは、単一細胞の遺伝子発現の配列決定に基づく測定のためのマイクロタイタープレートまたはマイクロ流体チップに関与する既存のアプローチを上回る主要な進歩を提示する。実験手順が単純であり、細胞１個当たりの試薬消費が低いため（ナノリットル範囲内）、これは、複数の条件にわたり多数の細胞の単一細胞分析を容易に行うことができる。この試験単独で、本発明者らは、１２回の実験にわたり総計ほぼ１４，６００個の単一細胞の遺伝子発現プロファイリングを行ったが、これは、既存のアプローチによって行われた場合、コストおよび時間がかかるであろう。ＣｙｔｏＳｅｑによって測定した細胞の数は、コンビナトリアル合成によって容易に達成される、マイクロウェルアレイのサイズおよびバーコード化されたビーズのライブラリーサイズを増加させることにより、単純にさらにスケールアップすることができる。加えて、細胞サイズの均一性に制限はないため、事前に選別することなく本実施例に示すＰＢＭＣ等、種々の細胞サイズおよび形状を有する細胞を含有する複合的試料の直接的分析を可能にする。
【０５３８】
ＣｙｔｏＳｅｑデータは、フローサイトメトリー（ＦＣ）のデータに似ていたが、重要な差があった。先ず、ＣｙｔｏＳｅｑは、試験した遺伝子産物の数および種類の観点からさらなる多用途性をもたらす。少数の表面タンパク質に大部分は限局され、最適に結合する抗体を必要とするフローサイトメトリーとは異なり、ＣｙｔｏＳｅｑは、核酸増幅技法によるいずれかの転写されたｍＲＮＡの測定を可能にした。最適なプライマー設計およびアッセイ条件は、１００種またはそれを超える遺伝子の任意に選ばれたパネル（表２１）のマルチプレックスＰＣＲによるほぼ８８％のマッピング率を慣用的に達成させることができる。その上、試料における各単一細胞の全体的トランスクリプトームは、ビーズ結合ｃＤＮＡのユニバーサル増幅により測定することもできるが、一般的に使用されるユニバーサル増幅技法（７）の相対的に低い効率および数千個の細胞にわたる全トランスクリプトームの測定に必要とされる高い配列決定深度に注意深くなる必要がある。
【０５３９】
第２に、抗体結合の動態学に頼るフローサイトメトリーとは対照的に、ＣｙｔｏＳｅｑは、分子指標化による遺伝子発現レベルのデジタルの絶対的読み出し情報を提供する。稀な細胞に特異的な多数の遺伝子の同時発現によって検出が達成されるため、これは、単一の稀な細胞事象に対しより高い感度および特異性を有する。したがって、これは、ゲーティングのために信頼できるクラスターを形成するために、ある一定数の事象を必要とするフローサイトメトリーと比較して、はるかに少量の試料を消費する。
【０５４０】
本発明者らのデータは、単一細胞  対  バルク分析の重要性を説明する。例えば、本発明者らは、全体として数千個の細胞の試料における最も高度に発現される遺伝子が、１個または数個の細胞のみによって寄与されたシナリオを示した。最も重要なことに、本発明者らの実験は、以前のアプローチにおいて極めて限定的な能力である、単一細胞遺伝子発現試験における多数の細胞および多数の遺伝子の両方の検査の重要性を説明する。生物学的試料における数千個の単一細胞にわたる発現の慣用的測定のためのかかるツールの利用可能性は、複合的生物学的系の理解の加速に役立ち、循環腫瘍細胞分析および免疫応答モニタリング等、臨床診断における新規適用を駆動することができる。がん生物学および神経科学等の分野における単一細胞ゲノム不安定性を試験するために、本発明者らの大量平行単一細胞バーコード化レジメンを採用して、ゲノムをならびにゲノムおよびトランスクリプトームを同時に測定することもできることが想定される。
【０５４１】
【表２１】
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【０５４２】
ビーズライブラリーの合成
分割−プールコンビナトリアルアプローチを使用して、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．によってビーズを製造した。簡潔に説明すると、カルボキシル基で官能化した２０ミクロン磁性ビーズを、５’アミンと、続くユニバーサル配列、異なるチューブで異なる細胞標識の第１のパート、およびリンカー配列を有するオリゴを含有する９６本のチューブに分布させた。カルボジイミド化学によりビーズにオリゴを共有結合によりカップリングした。ビーズをプールし、５’末端における第２のリンカー配列と、続く異なるチューブで異なる細胞標識の第２のパート、および第１のリンカーに相補的な配列を有するオリゴを含有する９６本のチューブの第２のセットに分割した。第１のリンカーを介した溶液におけるオリゴへのハイブリダイゼーションの際に、ＤＮＡポリメラーゼによりビーズにおけるオリゴを伸長させた。ビーズをプールし、５’末端におけるオリゴ（ｄＡ）と、続く分子標識として機能するランダマー配列、細胞標識の第３のパート、および第２のリンカーに相補的な配列を有するオリゴを含有する９６本のチューブの第３のセットに分割した。第２のリンカーを介した溶液におけるオリゴへのハイブリダイゼーションの際に、ＤＮＡポリメラーゼによりビーズにおけるオリゴを伸長させた。最終ビーズライブラリーは、９６×９６×９６（８８４，７３６）細胞標識のサイズを有する。
【０５４３】
マイクロウェルアレイの製作
標準フォトリソグラフィーを使用して、マイクロウェルアレイを製作した。シリコンウエハ上のフォトレジストにおいて柱のアレイをパターン化した。ウエハにＰＤＭＳを注いで、マイクロウェルのアレイを作製した。ＰＤＭＳマイクロウェルアレイを鋳型として使用して、ＮＯＡ６３光学接着剤によりウエハのレプリカを作製した。各実験の前にＮＯＡ６３レプリカからアガロース（５％、ＩＸ−Ａ型、Ｓｉｇｍａ）マイクロウェルアレイを注型した。
【０５４４】
試料調製
１０％ＦＢＳおよび１×抗生物質−抗真菌薬を有するＲＰＭＩ−１６４０においてＫ５６２およびＲａｍｏｓ細胞を培養した。Ｓａｎｇｕｉｎｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから健康なドナー由来の初代Ｂ細胞を購入した。Ｓｔａｎｆｏｒｄ血液センターから取得したヘパリンナトリウムチューブにおける新鮮全血から、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ溶液（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して、健康なドナー由来のＰＢＭＣを単離した。
【０５４５】
Ｔ細胞刺激
２名のＣＭＶセロポジティブの血液ドナーのヘパリン処置した全血をＳｔａｎｆｏｒｄ血液センターから得た。ＣＭＶ刺激のため、最終濃度１．８１μｇ／ｍｌのＰＢＳ希釈ＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドプール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）中、６時間３７Ｃで１ｍｌの全血を刺激した。陰性対照としてＰＢＳと共に各ドナーの全血の別々のアリコートをインキュベートした。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐカクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用してＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、その後、マイクロウェルアレイに沈着させた。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激のため、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  Ｔ細胞濃縮カクテルを使用して、同じ２名のドナー由来のＴ細胞を全血から単離し、１０％ＦＢＳおよび１×抗生物質−抗真菌薬を有するＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁した。各ドナー由来の細胞の１種のアリコートを、ＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にほぼ１：１ビーズ対細胞比で３７Ｃにて６時間インキュベートした。各ドナー由来の細胞の別々のアリコートを刺激なしでインキュベーター内に置き、陰性対照とした。
【０５４６】
単一細胞捕捉
マイクロウェル１０個当たりほぼ１個の細胞の密度で、単一細胞懸濁液をピペットでマイクロウェルアレイに置いた。洗浄して、捕捉されていない細胞を除去した後に、ウェル１個当たりほぼ５個のビーズの密度で磁性ビーズをロードして、マイクロウェルアレイを飽和させた。洗浄して、過剰なビーズを除去した後に、冷溶解バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＬｉＣｌ、１％ＬｉＳＤＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ）をマイクロウェルアレイの表面上にピペットで置いた。スライド磁石における１０分間のインキュベーション後に、マイクロウェルアレイからビーズを回収した。微量遠心分離チューブにおいてビーズを収集し、洗浄Ａバッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２回、洗浄Ｂバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で１回洗浄した。これ以降、単一チューブ内で全反応を行った。
【０５４７】
ｃＤＮＡ合成
洗浄されたビーズを、ハイブリダイゼーションオーブン内のローターに置いた微量遠心分離チューブにおいて、温度５０Ｃで５０分間（Ｋ５６２およびＲａｍｏｓ細胞による初期実験のためにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを使用した場合）または４２Ｃで９０分間（残りの実験のためにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩを使用した場合）、４０μＬ  ＲＴミックス（１×第１鎖バッファー、１μＬ  ＳｕｐｅｒＲａｓｅ阻害剤、１μＬ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩまたはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ、３ｍＭ追加ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．２ｕｇ／μＬ  ＢＳＡ）に再懸濁した。ビーズを２０μＬの１×ＥｘｏＩバッファーにおける１μＬのＥｘｏＩ（ＮＥＢ）で３７℃にて３０分間、８０℃で１５分間、処理した。
【０５４８】
マルチプレックスＰＣＲおよび配列決定
各遺伝子パネルは、Ｐｒｉｍｅｒ３によって設計された２セットの遺伝子特異的プライマーを含有した。カスタムＭＡＴＬＡＢスクリプトを書き込んで、セット内のプライマーにわたって最小の３’末端相補性が存在するようにＰＣＲプライマーを選択した。各パネルにおけるプライマーを表２１に示す。増幅スキームを図５５に示す。容積１００μＬまたは２００μＬにおける第１のプライマーセットにおける各遺伝子特異的プライマー５０ｎＭおよび４００ｎＭユニバーサルプライマーを有するＫＡＰＡ  Ｆａｓｔマルチプレックスキットによるビーズにより、次のサイクリングプロトコールに従ってＰＣＲを行った：３分間９５Ｃ；１５サイクルの１５秒間９５Ｃ、６０秒間６０Ｃ、９０秒間７２Ｃ；５分間７２Ｃ。磁性ビーズを回収し、０．７×Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰによりＰＣＲ産物を精製した。同じＫＡＰＡキットおよびサイクリングプロトコールを使用した第２のプライマーセットによるネステッドＰＣＲの次のラウンドのために、精製産物の半分を使用した。０．７×Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰによるクリーンアップ後に、最終ＰＣＲ反応に産物の１／１０を入力し、それにより、全長Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを付属させた（１×ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ、２００ｎＭのＰ５、２００ｎＭのＰ７。９５Ｃ５分間；８サイクルの９８Ｃ１５秒間、６０Ｃ３０秒間、７２Ｃ３０秒間；７２Ｃ５分間）。
【０５４９】
データ分析
試料１種当たり１６０万リードのメジアン深度の１５０×２ｂｐ化学により、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器においてライブラリーの配列決定を行った。配列決定は、各リードの細胞標識、分子標識および遺伝子を明らかにした（図５５）。各リードの遺伝子の割り当てを整列ソフトウェア「ｂｏｗｔｉｅ」（ｒｅｆ）により行った。カスタムＭＡＴＬＡＢスクリプトを使用して、各リードの細胞および分子標識を分析した。先ず細胞標識により、次に遺伝子および分子標識によりリードを群分けした。細胞１個当たりの遺伝子１種当たりの特有の分子の数を計算するために、同じ細胞標識および遺伝子割り当てを有するリードの分子標識をクラスター化した。１塩基を超える編集距離を特有のクラスター、よって特有の転写物分子として考慮した。各細胞のデジタル遺伝子発現情報を含有する表を試料毎に構築した  −  表の各列は、特有の細胞標識を表し、各段は、遺伝子を表し、表の各エントリーは、細胞標識１種当たりの遺伝子内の特有の分子の計数を表した。１回のみ配列決定した特有の分子（即ち、冗長性＝１）が除去されるように、表にフィルターをかけた。その後、１０未満の特有の分子の和を有するまたはパネルにおける４種もしくはそれに満たない遺伝子の同時発現を有する細胞を除去した。次に、フィルターをかけた表をクラスタリング分析のために使用した。ＭＡＴＬＡＢにおける内蔵型機能により、ｌｏｇ変換された転写物計数（シュードカウント１を加えた）において主成分分析および階層的クラスタリングを行った。
【０５５０】
実施例１５に引用されている参考文献は全て、参照によりそれらの全体を援用する：
【０５５１】
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【０５５２】
実施例１６：単一細胞定量化プロトコールの開発
図５６は、試料におけるＲＮＡ分子の定量化のための全般的ワークフローを描写する。本実施例では、試料におけるＲＮＡ分子の総数は、単一細胞におけるＲＮＡ分子の総数に等しかった。図５６のステップ１に示す通り、ＲＮＡ分子のポリＡテイル領域への分子識別子標識（１１５）のセットの確率論的ハイブリダイゼーションにより、ＲＮＡ分子（１１０）を逆転写して、ｃＤＮＡ分子（１０５）を生成した。分子識別子標識（１１５）は、オリゴｄＴ領域（１２０）、標識領域（１２５）およびユニバーサルＰＣＲ領域（１３０）を含んだ。分子識別子標識のセットは、９６０種の異なる種類の標識領域を含有した。
【０５５３】
パートＩ．ＲＮＡ分子の逆転写および標識化
次のものを混合することにより、ＲＮＡ試料を調製した：
【０５５４】
【表２２−１】
2019106998.tif 000034
【０５５５】
エッペンドルフチューブにおいて次の通りに標識化ミックスを調製することにより、ＲＮＡ分子を標識した：
【０５５６】
【表２２−２】
2019106998.tif 000035
【０５５７】
注記：ｄＴオリゴプール（セット＃４）は、分子識別子標識のセットを指す。
【０５５８】
６５℃で５分間のインキュベーションにより、分子識別子標識をＲＮＡ分子にハイブリダイズさせた。標識化ミックスを氷上で少なくとも１分間貯蔵した。
【０５５９】
後述する逆転写ミックスの添加により、標識されたＲＮＡ分子を逆転写した：
【０５６０】
【表２２−３】
2019106998.tif 000036
【０５６１】
標識化ミックス反応物を含有するエッペンドルフチューブに逆転写ミックスを添加したら、試料を３７℃で５分間インキュベートし、続いて５０℃で３０分間インキュベーションを行い、最後に７５℃で１５分間インキュベーションを行うことにより逆転写反応を実行した。標識されたＲＮＡ分子の逆転写は、標識されたｃＤＮＡ分子（１７０）を生成した。
【０５６２】
ＲＮＡ分子を逆転写および標識したら、Ａｍｐｕｒｅビーズ精製により試料から過剰なオリゴを除去した（図１のステップ２）。逆転写され、かつ標識されたＲＮＡ分子を含有するエッペンドルフチューブに２０μＬのａｍｐｕｒｅビーズを添加し、室温で５分間チューブをインキュベートすることにより、Ａｍｐｕｒｅビーズ精製を行った。ビーズを７０％エタノールで２回洗浄して、過剰なオリゴを除去した。エタノール洗浄によって過剰なオリゴを除去したら、ビーズに結合した標識されたｃＤＮＡ分子を含有するチューブに２０μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓを添加した。
【０５６３】
図５６のステップ３に示す通り、標識されたｃＤＮＡ分子（１７０）をマルチプレックスＰＣＲにより増幅した。カスタムフォワードプライマー（Ｆ１、図１の１３５）およびユニバーサルＰＣＲプライマー（１４０）を使用することにより、標識されたｃＤＮＡ分子のカスタム増幅を行った。表２３は、単一の反応容積において標識されたアンプリコン（１８０）を生成するための、９６種の異なる遺伝子の増幅に使用された９６種の異なるカスタムフォワードプライマーを列挙する。
【０５６４】
マルチプレックスＰＣＲ反応を最適化するために、３種のマルチプレックスＰＣＲ反応混合物を調製した。マルチプレックスＰＣＲ反応１を次の通りに調製した：
【０５６５】
【表２２−４】
2019106998.tif 000037
【０５６６】
マルチプレックスＰＣＲ反応のための反応条件は、１サイクルの９４℃２分間と、続く２５サイクルの９４℃３０秒間、５７℃６０秒間および６８℃１分間、次に１サイクルの６８℃７分間と、４℃での１保持サイクルであった。
【０５６７】
マルチプレックスＰＣＲ反応２および３を次の通りに調製した：
【０５６８】
【表２２−５】
2019106998.tif 000038
【０５６９】
反応２および３のためのマルチプレックスＰＣＲ反応条件は、１サイクルの９５℃１５分間と、続く２５サイクルの９４℃３０秒間、５７℃９０秒間および７２℃１分間、次に１サイクルの６８℃７分間と、４℃での１保持サイクルであった。
【０５７０】
Ｆ１プライマープールは、次のプライマーを含有した：
【０５７１】
【表２２−６】
2019106998.tif 000039
【０５７２】
Ｋａｎ、ＰｈｅおよびＤａｐ対照遺伝子をネステッドＰＣＲにより選択的に増幅した。ネステッドＰＣＲ増幅反応を次の通りに調製した：
【０５７３】
【表２２−７】
2019106998.tif 000040
【０５７４】
注記：ＰＣＲ反応１、４および７に使用したマルチプレックスＰＣＲ反応は、マルチプレックスＰＣＲ反応＃１であった。ＰＣＲ反応２、５および８に使用したマルチプレックスＰＣＲ反応は、マルチプレックスＰＣＲ反応＃２であった。ＰＣＲ反応３、６および９に使用したマルチプレックスＰＣＲ反応は、マルチプレックスＰＣＲ反応＃３であった。
【０５７５】
ネステッドＰＣＲに使用したプライマーを次の通りに開示する：
【０５７６】
【表２２−８】
2019106998.tif 000041
【０５７７】
反応１〜９のためのＰＣＲ増幅反応条件は、１サイクルの９４℃２分間と、３０サイクルの９４℃２０秒間、５５℃２０秒間および７２℃２０秒間、次に１サイクルの７２℃４分間と、４℃での１保持サイクルであった。
【０５７８】
ＰＣＲ増幅反応１〜９の４μＬのＰＣＲ産物をアガロースゲルで泳動した。図５８Ａに示す通り、反応１〜３は、Ｋａｎ対照遺伝子の存在を示し、反応４〜６は、Ｐｈｅ対照遺
伝子の存在を示し、反応７〜９は、Ｄａｐ対照遺伝子の存在を示した。
【０５７９】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｉｎｃ．（ＡＭＩ）アレイへのハイブリダイゼーションのために、ＰＣＲ反応１〜９のＰＣＲ産物を調製した。ハイブリダイゼーション混合物を次の通りに調製した：
【０５８０】
【表２２−９】
2019106998.tif 000042
【０５８１】
それぞれＰＣＲ反応１〜９のＰＣＲ産物を含有する混合物に相当するハイブリダイゼーション混合物１〜９を９５℃で５分間変性させ、次に４℃に置いた。ハイブリダイゼーション混合物をＡＭＩアレイスライドに移し、一晩３７℃でインキュベートした。
【０５８２】
一晩のハイブリダイゼーション後に、ＡＭＩアレイスライドを洗浄し、続いてスキャンした。理論上および実際の測定値ならびにパーセント精度を下に描写する：
【０５８３】
【表２２−１０】
2019106998.tif 000043
【０５８４】
注記：理論上測定値は、Ｋａｎ、ＰｈｅおよびＤａｐ対照遺伝子の１００％の検出に基づく。
【０５８５】
反応２のＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅ精製により精製した。Ａｍｐｕｒｅ精製を次の通りに行った：
【０５８６】
【表２２−１１】
2019106998.tif 000044
【０５８７】
Ａｍｐｕｒｅ精製反応物を室温で５分間インキュベートし、続いて７０％エタノールにおいて洗浄した。精製されたＰＣＲ産物を３０μＬの水においてビーズから溶出させた。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光計によって決定されるＰＣＲ産物の濃度は、６ｎｇ／μＬであった。
【０５８８】
パートＩＩ：ライブラリー調製プロトコール
Ｘ０１試料２（実施例１を参照）から精製したＰＣＲ産物を使用して、ＤＮＡライブラリーを調製した。次のプライマーの混合からＦ２プライマープールを作製した：
【０５８９】
【表２２−１２】
2019106998.tif 000045
【０５９０】
次のものを混合することにより、Ｆ２プライマーミックスを調製した。
【０５９１】
【表２２−１３】
2019106998.tif 000046
【０５９２】
Ｆ２プライマーミックスを９５℃で３分間インキュベートし、続いて氷上で貯蔵した。次のライゲーションミックスをＦ２プライマーミックスに添加して、Ｆ２プライマーライゲーションミックスを生成した：
【０５９３】
【表２２−１４】
2019106998.tif 000047
【０５９４】
Ｆ２プライマーライゲーションミックスを３７℃で１時間インキュベートし、続いて６５℃で２０分間インキュベーションを行った。Ｆ２  ＰＣＲプライマーをエタノール沈殿し、プライマープールの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計により決定した。Ｆ２プライマープールを再懸濁して、最終濃度各１ｕＭ／合計１００ｕＭを生成した。
【０５９５】
図５６のステップ４に示す通り、標識されたアンプリコン（１８０）をマルチプレックスＰＣＲにより増幅した。９６種の異なるカスタムフォワードプライマー（Ｆ２、図１の１４５）およびユニバーサルＰＣＲプライマー（１４０）を使用して、単一の反応容積において標識されたアンプリコン（実施例１のＸ０１試料２）を増幅した。表２４は、９６種の異なるカスタムフォワードプライマーを列挙する。
【０５９６】
マルチプレックスＰＣＲ反応を次の通りに調製した：
【０５９７】
【表２２−１５】
2019106998.tif 000048
【０５９８】
マルチプレックスＰＣＲ条件は、１サイクルの９５℃１５分間と、続く１８サイクルの９４℃３０秒間、５７℃９０秒間および７２℃１分間、次に１サイクルの６８℃７分間と、４℃での１保持サイクルであった。マルチプレックス化アンプリコンをＡｍｐｕｒｅ精製により精製し、５０μＬの水により溶出させた。アンプリコンの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計により３０ｎｇ／μＬと決定した。５μＬのアンプリコンをアガロースゲルで泳動した（図５８Ｂ）。
【０５９９】
図５６のステップ５に示す通り、標識されたアンプリコン（１８０）にアダプター（１５０、１５５）をライゲーションして、アダプターで標識されたアンプリコン（１９０）を生成した。アダプターで標識されたアンプリコンを次の通りに生成した：
【０６００】
【表２２−１６】
2019106998.tif 000049
【０６０１】
アダプターミックスを１６℃で４時間インキュベートした。アダプターで標識されたアンプリコンをＡｍｐｕｒｅ精製により精製し、２０μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓにおいて溶出させた。
【０６０２】
精製されたアダプターで標識されたアンプリコンを次の通りにギャップ修復およびＰＣＲ増幅した：
【０６０３】
【表２２−１７】
2019106998.tif 000050
【０６０４】
ＰＣＲ条件は、１サイクルの７２℃２分間と、続く９４℃１分間、１２サイクルの９４℃１５秒間、６０℃１５秒間および７２℃３０秒間、１サイクルの７２℃４分間と、４℃での１保持サイクルであった。ＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅ精製により精製し、３０μＬのＴＥにおいて溶出させた。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光法によって決定される精製されたＰＣＲ産物の濃度は、２２ｎｇ／μＬ（８３ｎＭ）であった。５μＬのＰＣＲ精製産物を１％アガロースゲルで泳動した（図５８Ｂ）。
【０６０５】
パートＩＩＩ．アダプターで標識されたアンプリコンライブラリーの配列決定
ＭｉＳｅｑシーケンサーを使用して、アダプターで標識されたアンプリコンライブラリーを配列決定した。
【０６０６】
配列マッピング概要を下に示す：
【０６０７】
【表２２−１８】
2019106998.tif 000051
【０６０８】
上の配列マッピング概要に示す通り、ストリンジェントなポリＡマッチング判断基準により、多くのリードが失われた。図５９は、あらゆる検出された遺伝子にわたるリードおよび計数を示す。
【０６０９】
配列決定リードを使用して、特定の遺伝子を定量化もした。図６１〜図６２は、様々な遺伝子の検出される標識１種当たりの観察されるリード（ＲＰＬＤ）のプロットを描写する。図６１〜図６２に描写されるプロットにおいて、従来のｒｐｋｍ値も示す。図５９は、様々な遺伝子のＲＰＬＤおよびＲＰＫＭの比較を要約する。
【０６１０】
図６３は、様々な遺伝子の総リード（標識）  対  ｒｐｌｄのプロットを描写する。
【０６１１】
図４、７および８に表されるデータを同様に数的形式で表２５に示す。
【０６１２】
図６４は、未検出遺伝子のＲＰＫＭのプロットを描写する。
【０６１３】
アダプターで標識されたアンプリコンライブラリーにおけるスパイクイン対照の量をＭｉＳｅｑ配列決定により決定した。スパイクイン対照のＭｉＳｅｑ配列決定の結果を下の表に示す。
【０６１４】
【表２２−１９】
2019106998.tif 000052
【０６１５】
上の表において、入力Ｎは、スパイクイン対照の本来の数を指し；リードは、リード対の総数を指し；標識（Ｋ）は、配列決定によって検出される異なる標識の数を指す。図６０Ａ〜図６０Ｄは、それぞれＬｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｈｒおよびＤａｐスパイクイン対照の、検出される標識１種当たりの観察されるリード（ＲＰＬＤ）のプロットを描写する。図６０Ｅは、リード  対  入力のプロットを描写する。
【０６１６】
【表２３−１】
2019106998.tif 000053
【０６１７】
【表２３−２】
2019106998.tif 000054
【０６１８】
【表２４−１】
2019106998.tif 000055
【０６１９】
【表２４−２】
2019106998.tif 000056
【０６２０】
【表２５】
2019106998.tif 000057
【０６２１】
本発明の好まれる実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、当業者には、かかる実施形態が単なる例として提供されていることが明らかであろう。そこで、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変種、変化および置換を思い付くであろう。本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替物を本発明の実施において用いることができることを理解されたい。
【０６２２】
本明細書に記述されている刊行物は、単に本願の出願日に先立つその開示のために提供されている。本明細書におけるいかなる記述も、本発明が、先行発明のためにかかる刊行物に先行することに対する権利を与えられていないことの承認として解釈するべきではない。さらに、提供されている刊行物の日付は、実際の刊行物の日付とは異なる場合があり、独立的に確認する必要がある。
【０６２３】
実施形態
２種またはそれを超える試料における分子を分析するための方法が本明細書に開示されている。方法は、ａ）ｉ）複数の核酸を含む第１の試料を複数の第１の試料タグと接触させて、複数の第１の試料タグが付いた核酸を生成し、ｉｉ）複数の核酸を含む第２の試料を複数の第２の試料タグと接触させて、複数の第２の試料タグが付いた核酸を生成することにより、複数の試料タグが付いた核酸を生成するステップであって、複数の第２の試料タグが、第１の試料タグとは異なるステップと、ｂ）複数の試料タグが付いた核酸を複数の分子識別子標識と接触させて、複数の標識された核酸を生成するステップと、ｃ）標識された核酸のうち少なくとも１種を検出し、これにより、複数の試料における複数の核酸の計数を決定するステップとを含み得る。複数の試料のうち１種または複数は、単一細胞または細胞ライセートを含み得る。複数の試料のうち１種または複数は、単一細胞からなることができる。試料タグは、標識された核酸が起源をもつ細胞を同定する細胞性標識を含み得る。単一細胞からなる複数の試料は、１種または複数の供給源に由来し得る。試料タグは、単一細胞の供給源を同定する試料指標領域を含み得る。分子識別子標識は、分子標識と称することができる。複数の試料のうち１種または複数は、１，０００，０００個未満の細胞を含み得る。複数の試料のうち１種または複数は、１００，０００個未満の細胞を含み得る。複数の試料のうち１種または複数は、１０，０００個未満の細胞を含み得る。複数の試料のうち１種または複数は、１，０００個未満の細胞を含み得る。複数の試料のうち１種または複数は、１００個未満の細胞を含み得る。複数の試料のうち１種または複数は、細胞ライセートを含み得る。
【０６２４】
あるいは、複数の試料における分子を分析するための方法は、ａ）ｉ）第１の試料を第１の複数の試料タグと接触させるステップであって、第１の複数の試料タグが、同一核酸配列を含むステップと、ｉｉ）第１の試料を、異なる核酸配列を含む第１の複数の分子識別子標識と接触させて、これにより、複数の第１の標識された核酸を生成するステップと、ｉｉｉ）第２の試料を第２の複数の試料タグと接触させるステップであって、第２の複数の試料タグが、同一核酸配列を含むステップと、ｉｖ）第２の試料を、異なる核酸配列を含む第２の複数の分子識別子標識と接触させ、これにより、複数の第２の標識された核酸を生成するステップとを含む、複数の標識された核酸を生成するステップであって、複数の標識された核酸が、複数の第１の標識された核酸および第２の標識された核酸を含むステップと、ｂ）多数の異なる標識された核酸を決定し、これにより、複数の試料における複数の核酸の計数を決定するステップとを含み得る。試料タグは、標識された核酸が起源をもつ細胞を同定する細胞性標識を含み得る。試料タグは、単一細胞の供給源を同定する試料指標領域を含み得る。分子識別子標識は、分子標識と称することができる。
【０６２５】
あるいは、複数の試料における分子を分析するための方法は、ａ）２種またはそれを超える異なる核酸を含む複数の試料を複数の試料タグおよび複数の分子識別子標識と接触させて、複数の標識された核酸を生成するステップであって、ｉ）複数の標識された核酸が、２種またはそれを超える試料タグおよび２種またはそれを超える分子識別子標識に付着させた２種またはそれを超える核酸を含み、ｉｉ）複数の試料の第１の試料由来の核酸に付着させた試料タグが、複数の試料の第２の試料由来の核酸分子に付着させた試料タグとは異なり、ｉｉｉ）同じ試料における２種またはそれを超える同一核酸を、２種またはそれを超える異なる分子識別子標識に付着させるステップと、ｂ）標識された核酸の少なくとも一部を検出し、これにより、複数の試料における２種またはそれを超える異なる核酸の計数を決定するステップとを含み得る。試料タグは、標識された核酸が起源をもつ細胞を同定する細胞性標識を含み得る。試料タグは、単一細胞の供給源を同定する試料指標領域を含み得る。分子識別子標識は、分子標識と称することができる。
【０６２６】
ａ）複数の試料の第１の試料由来の第１の複数の分子を、分子バーコードの第１のセットと接触させて、第１の複数の標識された分子を生成するステップであって、第１の複数の分子バーコードの分子バーコードが、標識領域および試料指標領域を含むステップと、ｂ）複数の試料の第２の試料由来の第２の複数の分子を、分子バーコードの第２のセットと接触させて、第２の複数の標識された分子を生成するステップであって、第２の複数の分子バーコードの分子バーコードが、標識領域および試料指標領域を含み、第１の複数の分子バーコードおよび第２の複数の分子バーコードが、少なくとも分子バーコードの試料指標領域によって異なるステップと、ｃ）第１の複数の標識された分子の２種またはそれを超える分子のうち少なくとも一部および第２の複数の標識された分子の２種またはそれを超える分子のうち少なくとも一部を検出し、これにより、複数の試料における２種またはそれを超える分子の計数を決定するステップとを含む、複数の試料における分子を分析するための方法が本明細書にさらに開示されている。第１の複数の分子は、核酸分子を含み得る。第２の複数の分子は、核酸分子を含み得る。標識領域は、分子標識と称することができる。分子バーコードは、細胞性標識をさらに含み得る。複数の試料のうちの１試料が単一細胞からなる事例では、試料指標領域は、細胞性標識を指すことができる。
【０６２７】
ａ）選ばれたプライマーが、ｉ）３個以下の逐次的グアニン、３個以下の逐次的シトシン、４個以下の逐次的アデニンおよび４個以下の逐次的チミン、ｉｉ）グアニンまたはシトシンである少なくとも３、４、５または６個のヌクレオチド、ならびにｉｉｉ）ヘアピン構造を容易に形成しない配列を含む、第１のパスと、ｂ）ｉ）全転写物の高い被覆度を有する複数の配列を選ぶ第１のラウンド、ならびにｉｉ）残る転写物の最高被覆度および４以下の他の選ばれた配列との相補的スコアを有する配列を選択する１回または複数の後続ラウンドを含む第２のパスと、ｃ）被覆度が飽和するまたはカスタマープライマーの総数が約９６未満またはそれに等しくなるまで、選定されたセットへの配列の付加とを含む、カスタムプライマーを選択する方法が本明細書に開示されている。
【０６２８】
ａ）ｉ）複数の核酸を含む第１の試料を複数の第１の試料タグと接触させて、複数の第１の試料タグが付いた核酸を生成し、ｉｉ）複数の核酸を含む第２の試料を複数の第２の試料タグと接触させて、複数の第２の試料タグが付いた核酸を生成することにより、複数の試料タグが付いた核酸を生成するステップであって、複数の第１の試料タグが、第２の試料タグとは異なるステップと、ｂ）複数の試料タグが付いた核酸を複数の分子識別子標識と接触させて、複数の標識された核酸を生成し、これにより、標識された核酸ライブラリーを生成するステップとを含む、標識された分子ライブラリーを生成するための方法が本明細書にさらに開示されている。
【０６２９】
複数の試料における分子の分析における使用のためのキットが本明細書に開示されている。キットは、ａ）１種または複数の分子バーコードのセットの分子バーコードが、試料指標領域および標識領域を含み、（ｉ）分子バーコードのセットの分子バーコードの試料指標領域が同じであり、（ｉｉ）分子バーコードの第１のセットの試料指標領域が、分子バーコードの第２のセットの試料指標領域とは異なる、分子バーコードの２またはそれを超えるセットと、ｂ）複数のビーズとを含み得る。分子バーコードの２またはそれを超えるセットは、複数のビーズに付着させることができる。分子バーコードの２またはそれを超えるセットは、ビーズにコンジュゲートすることができる。標識領域は、分子標識と称することができる。分子バーコードは、細胞性標識をさらに含み得る。複数の試料のうちの１試料が単一細胞からなる事例では、試料指標領域は、細胞性標識を指すことができる。
【０６３０】
複数の試料における分子を分析するためのキットは、ａ）第１の複数の分子バーコードを含む第１の容器であって、（ｉ）分子バーコードが、試料指標領域および標識領域を含み、（ｉｉ）第１の複数の分子バーコードの分子バーコードの総数の少なくとも約８０％の試料指標領域が同一であり、（ｉｉｉ）第１の複数の分子バーコードの２種またはそれを超えるバーコードの標識領域が異なる第１の容器と、（ｂ）第２の複数の分子バーコードを含む第２の容器であって、（ｉ）分子バーコードが、試料指標領域および標識領域を含み、（ｉｉ）第１の複数の分子バーコードの分子バーコードの総数の少なくとも約８０％の試料指標領域が同一であり、（ｉｉｉ）第１の複数の分子バーコードの２種またはそれを超えるバーコードの標識領域が異なる第２の容器とを含み得、第１の複数の分子バーコードの試料指標領域は、第２の複数の分子バーコードの試料指標領域とは異なる。標識領域は、分子標識と称することができる。分子バーコードは、細胞性標識をさらに含み得る。複数の試料のうちの１試料が単一細胞からなる事例では、試料指標領域は、細胞性標識を指すことができる。
【０６３１】
あるいは、複数の試料における分子を分析するためのキットは、ａ）第１の複数の試料タグを含む第１の容器であって、複数の試料タグが、同じ核酸配列を含む第１の容器と、ｂ）第１の複数の分子識別子標識を含む第２の容器であって、複数の分子識別子標識が、２種またはそれを超える異なる核酸配列を含む第２の容器とを含む。標識領域は、分子標識と称することができる。複数の試料のうちの１試料が単一細胞からなる事例では、試料タグは、細胞性標識を指すことができる。キットは、第１の複数の細胞性標識を含む第３の容器をさらに含み得、複数の細胞性標識は、２種またはそれを超える異なる核酸配列を含む。
【０６３２】
本明細書に開示されているキットおよび方法は、分子バーコードの１または複数のセットを含み得る。本明細書に開示されているキットおよび方法は、１種または複数の分子バーコードを含み得る。分子バーコードは、試料指標領域、分子標識領域、細胞性標識領域またはこれらの組合せを含み得る。分子バーコードのセットの少なくとも２種の分子バーコードは、２種またはそれを超える異なる標識領域を含み得る。分子バーコードの２またはそれを超えるセットの２種またはそれを超える分子バーコードの標識領域は、同一となり得る。分子バーコードの２またはそれを超えるセットは、同じ標識領域を含む分子バーコードを含み得る。複数の試料のうちの１試料が単一細胞からなる事例では、試料タグは、細胞性標識を指すことができる。
【０６３３】
本明細書に開示されている分子バーコードは、試料指標領域を含み得る。分子バーコードの２またはそれを超えるセットの分子バーコードの試料指標領域は、異なり得る。試料指標領域は、１個または複数のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードの２種またはそれを超える異なるセットの試料指標領域の２種またはそれを超える配列は、約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満相同となり得る。分子バーコードの２種またはそれを超える異なるセットの試料指標領域の２種またはそれを超える配列は、約８０％未満相同となり得る。分子バーコードの２種またはそれを超える異なるセットの試料指標領域の２種またはそれを超える配列は、約６０％未満相同となり得る。分子バーコードの２種またはそれを超える異なるセットの試料指標領域の２種またはそれを超える配列は、約４０％未満相同となり得る。分子バーコードの２種またはそれを超える異なるセットの試料指標領域の２種またはそれを超える配列は、約２０％未満相同となり得る。
【０６３４】
本明細書に開示されている分子バーコードは、細胞性標識を含み得る。分子バーコードの２またはそれを超えるセットの分子バーコードの細胞性標識は、異なり得る。細胞性標識は、１個または複数のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードの２種またはそれを超える異なるセットの細胞性標識の２種またはそれを超える配列は、約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満相同となり得る。分子バーコードの２種またはそれを超える異なるセットの細胞性標識の２種またはそれを超える配列は、約８０％未満相同となり得る。分子バーコードの２種またはそれを超える異なるセットの細胞性標識の２種またはそれを超える配列は、約６０％未満相同となり得る。分子バーコードの２種またはそれを超える異なるセットの細胞性標識の２種またはそれを超える配列は、約４０％未満相同となり得る。分子バーコードの２種またはそれを超える異なるセットの細胞性標識の２種またはそれを超える配列は、約２０％未満相同となり得る。
【０６３５】
本明細書に開示されている分子バーコードは、ユニバーサルＰＣＲ領域をさらに含み得る。分子バーコードは、標的特異的領域をさらに含み得る。分子バーコードは、１個または複数のヌクレオチドを含み得る。標識領域は、１個または複数のヌクレオチドを含み得る。試料指標領域は、１個または複数のヌクレオチドを含み得る。ユニバーサルＰＣＲ領域は、１個または複数のヌクレオチドを含み得る。標的特異的領域は、１個または複数のヌクレオチドを含み得る。
【０６３６】
本明細書に開示されているキットおよび方法は、試料タグの１または複数のセットを含み得る。本明細書に開示されているキットおよび方法は、１種または複数の試料タグを含み得る。試料タグは、試料指標領域を含み得る。試料タグの第１のセットの試料タグの試料指標領域は、試料タグの第２のセットの試料タグの試料指標領域とは異なり得る。試料指標領域は、１個または複数のヌクレオチドを含み得る。試料タグの２種またはそれを超える異なるセットの試料指標領域の２種またはそれを超える配列は、約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満相同となり得る。試料タグの２種またはそれを超える異なるセットの試料指標領域の２種またはそれを超える配列は、約８０％未満相同となり得る。試料タグの２種またはそれを超える異なるセットの試料指標領域の２種またはそれを超える配列は、約６０％未満相同となり得る。試料タグの２種またはそれを超える異なるセットの試料指標領域の２種またはそれを超える配列は、約４０％未満相同となり得る。試料タグの２種またはそれを超える異なるセットの試料指標領域の２種またはそれを超える配列は、約２０％未満相同となり得る。
【０６３７】
本明細書に開示されているキットおよび方法は、分子識別子標識の１または複数のセットを含み得る。本明細書に開示されているキットおよび方法は、１種または複数の分子識別子標識を含み得る。分子識別子標識は、標識領域を含み得る。分子識別子標識のセットの２種またはそれを超える分子識別子標識の標識領域は、異なり得る。標識領域は、１個または複数のヌクレオチドを含み得る。分子識別子標識のセットの２種またはそれを超える分子識別子標識の標識領域の配列は、約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満相同となり得る。分子識別子標識のセットの２種またはそれを超える分子識別子標識の標識領域の配列は、約８０％未満相同となり得る。分子識別子標識のセットの２種またはそれを超える分子識別子標識の標識領域の配列は、約６０％未満相同となり得る。分子識別子標識のセットの２種またはそれを超える分子識別子標識の標識領域の配列は、約４０％未満相同となり得る。分子識別子標識のセットの２種またはそれを超える分子識別子標識の標識領域の配列は、約２０％未満相同となり得る。標識領域は、細胞性標識領域と称することができる。
【０６３８】
本明細書に開示されているキットおよび方法は、１種または複数のプライマーをさらに含み得る。１種または複数のプライマーは、ユニバーサルＰＣＲ領域に対し少なくとも部分的に相補的な配列を含み得る。１種または複数のプライマーは、ユニバーサルＰＣＲ領域に対し少なくとも約５０％相補的な配列を含み得る。１種または複数のプライマーは、ユニバーサルＰＣＲ領域に対し少なくとも約８０％相補的な配列を含み得る。
【０６３９】
本明細書に開示されているキットおよび方法は、１種または複数の増幅剤をさらに含み得る。増幅剤は、プライマーの固定されたパネルを含み得る。増幅剤は、１種または複数のカスタムプライマーを含み得る。増幅剤は、１種または複数の対照プライマーを含み得る。増幅剤は、１種または複数のハウスキーピング遺伝子プライマーを含み得る。増幅剤は、１種または複数のＰＣＲ試薬を含み得る。１種または複数のＰＣＲ試薬は、ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、バッファーまたはこれらの組合せを含み得る。
【０６４０】
本明細書に開示されているキットおよび方法は、１個または複数のビーズをさらに含み得る。分子バーコードは、１個または複数のビーズに付着させることができる。試料タグは、１個または複数のビーズに付着させることができる。分子識別子標識は、１個または複数のビーズに付着させることができる。
【０６４１】
ビーズの１または複数のセットを作製するための方法が本明細書にさらに開示されている。方法は、ａ）複数のウェル内に複数の第１の核酸を沈着させるステップであって、複数のウェルのうち２個またはそれを超える異なるウェルが、複数の核酸のうち２種またはそれを超える異なる核酸を含み得るステップと、ｂ）複数のウェルのうち１個または複数のウェルを１個またはそれより少ないビーズと接触させて、複数の単一の標識ビーズを生成するステップであって、複数の第１の標識されたビーズのうち単一の標識ビーズが、複数の第１の核酸の１核酸に付着させたビーズを含むステップと、ｃ）複数のウェル由来の複数の第１の標識されたビーズをプールして、第１の標識されたビーズのプールを生成するステップと、ｄ）第１の標識されたビーズのプールを後続の複数のウェルに分布させるステップであって、後続の複数のウェルのうち２個またはそれを超えるウェルが、複数の後続の核酸のうち２種またはそれを超える異なる核酸を含むステップと、ｅ）１個または複数の第１の標識されたビーズに複数の後続の核酸のうち１種または複数の核酸を付着させて、複数の特有に標識されたビーズを生成するステップとを含み得る。
【０６４２】
本明細書に開示されている方法およびキットを使用して、複数の核酸を分析することができる。本明細書に開示されている方法およびキットを使用して、約１００，０００，０００種未満の核酸を分析することができる。本明細書に開示されている方法およびキットを使用して、約１０，０００，０００種未満の核酸を分析することができる。本明細書に開示されている方法およびキットを使用して、約１，０００，０００種未満の核酸を分析することができる。複数のタンパク質を分析する方法が本明細書にさらに開示されている。方法は、ａ）ｉ）複数のポリペプチドを含む第１の試料を複数の第１の試料タグと接触させて、複数の第１の試料タグが付いたポリペプチドを生成し、ｉｉ）複数のポリペプチドを含む第２の試料を複数の第２の試料タグと接触させて、複数の第２の試料タグが付いたポリペプチドを生成することにより、複数の試料タグが付いたポリペプチドを生成するステップであって、複数の第１の試料タグが、複数の第２の試料タグとは異なるステップと、ｂ）複数の試料タグが付いたポリペプチドを複数の分子識別子標識と接触させて、複数の標識されたポリペプチドを生成するステップと、ｃ）標識されたポリペプチドの少なくとも一部を検出し、これにより、複数の試料における複数のポリペプチドの計数を決定するステップとを含み得る。
【０６４３】
複数の試料におけるポリペプチドを分析する方法は、１種または複数の標識されたポリペプチドの同一性を決定するステップをさらに含み得る。１種またはそれを超える標識されたポリペプチドの同一性を決定するステップは、質量分析を含み得る。方法は、第１の試料の標識されたポリペプチドを、第２の試料の標識されたポリペプチドと組み合わせるステップをさらに含み得る。標識されたポリペプチドは、異なる標識されたポリペプチドの数の決定前に組み合わせることができる。方法は、第１の試料タグが付いたポリペプチドおよび第２の試料タグが付いたポリペプチドを組み合わせるステップをさらに含み得る。第１の試料タグが付いたポリペプチドおよび第２の試料タグが付いたポリペプチドは、複数の分子識別子標識との接触前に組み合わせることができる。異なる標識されたポリペプチドの数の決定は、タグ付けされた標識されたポリペプチドの少なくとも一部の検出を含み得る。タグ付けされた標識されたポリペプチドの少なくとも一部の検出は、試料タグ、分子特異的タグ、ポリペプチドまたはこれらの組合せの少なくとも一部の検出を含み得る。
【０６４４】
本明細書に開示されている方法は、複数の試料を複数の試料タグおよび複数の分子識別子標識と接触させるステップを含み得る。複数の試料を複数の試料タグおよび複数の分子識別子標識と接触させるステップは、同時に行うことができる。複数の試料を複数の試料タグおよび複数の分子識別子標識と接触させるステップは、一斉に行うことができる。複数の試料を複数の試料タグおよび複数の分子識別子標識と接触させるステップは、逐次的に行うことができる。複数の試料を複数の試料タグと接触させるステップは、複数の試料を複数の分子識別子標識と接触させる前に行うことができる。複数の試料を複数の試料タグと接触させるステップは、複数の試料を複数の分子識別子標識と接触させた後に行うことができる。
【０６４５】
本明細書に開示されている方法は、第１の試料を第１の複数の試料タグおよび第１の複数の分子識別子標識と接触させるステップを含み得る。第１の試料を第１の複数の試料タグおよび第１の複数の分子識別子標識と接触させるステップは、同時に行うことができる。第１の試料を第１の複数の試料タグおよび第１の複数の分子識別子標識と接触させるステップは、一斉に行うことができる。第１の試料を第１の複数の試料タグおよび第１の複数の分子識別子標識と接触させるステップは、逐次的に行うことができる。第１の試料を第１の複数の試料タグと接触させるステップは、第１の試料を第１の複数の分子識別子標識と接触させる前に行うことができる。第１の試料を第１の複数の試料タグと接触させるステップは、第１の試料を第１の複数の分子識別子標識と接触させた後に行うことができる。
【０６４６】
本明細書に開示されている方法は、第２の試料を第２の複数の試料タグおよび第２の複数の分子識別子標識と接触させるステップを含み得る。第２の試料を第２の複数の試料タグおよび第２の複数の分子識別子標識と接触させるステップは、同時に行うことができる。第２の試料を第２の複数の試料タグおよび第２の複数の分子識別子標識と接触させるステップは、一斉に行うことができる。第２の試料を第２の複数の試料タグおよび第２の複数の分子識別子標識と接触させるステップは、逐次的に行うことができる。第２の試料を第２の複数の試料タグと接触させるステップは、第２の試料を第２の複数の分子識別子標識と接触させる前に行うことができる。第２の試料を第２の複数の試料タグと接触させるステップは、第２の試料を第２の複数の分子識別子標識と接触させた後に行うことができる。
【０６４７】
本明細書に開示されている方法およびキットは、２種またはそれを超える試料を組み合わせるステップをさらに含み得る。本明細書に開示されている方法およびキットは、第１の試料および第２の試料を組み合わせるステップをさらに含み得る。第１および第２の試料は、複数の分子識別子標識との接触前に組み合わせることができる。第１および第２の試料は、標識された核酸を検出する前に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料における２種またはそれを超える分子を確率論的に標識する前に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料における２種またはそれを超える分子を確率論的に標識した後に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料における２種またはそれを超える分子を検出する前に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料において２種またはそれを超える分子を検出した後に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料における２種またはそれを超える分子を分析する前に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料における２種またはそれを超える分子を分析した後に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料における２種またはそれを超える分子において１種または複数のアッセイを実行する前に組み合わせることができる。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える試料における２種またはそれを超える分子において１種または複数のアッセイを実行した後に組み合わせることができる。
【０６４８】
本明細書に開示されている方法およびキットは、試料における２種またはそれを超える分子において１種または複数のアッセイを実行するステップを含み得る。１種または複数のアッセイは、１回または複数の増幅反応を含み得る。本明細書に開示されている方法およびキットは、１回または複数の増幅反応を実行して、標識された核酸アンプリコンを生成するステップをさらに含み得る。標識された核酸は、標識された核酸を検出する前に増幅することができる。方法は、１回または複数の増幅反応を実行する前に第１および第２の試料を組み合わせるステップをさらに含み得る。
【０６４９】
増幅反応は、試料タグの少なくとも一部の増幅を含み得る。増幅反応は、標識の少なくとも一部の増幅を含み得る。増幅反応は、試料タグ、標識、核酸またはこれらの組合せの少なくとも一部の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の核酸の核酸の総数の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の核酸の核酸の総数の少なくとも約１％の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の核酸の核酸の総数の少なくとも約５％の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の標識された核酸の標識された核酸の総数の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の標識された核酸の標識された核酸の総数の少なくとも約１％の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の標識された核酸の標識された核酸の総数の少なくとも約５％の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の標識された核酸の標識された核酸の総数の少なくとも約１０％の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の核酸の核酸の総数の約９５％、９０％、８０％、７０％、６０％または５０％未満の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の核酸の核酸の総数の約５０％未満の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の核酸の核酸の総数の約２０％未満の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の核酸の核酸の総数の約１０％未満の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の標識された核酸の標識された核酸の総数の約９５％、９０％、８０％、７０％、６０％または５０％未満の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の標識された核酸の標識された核酸の総数の約４０％未満の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の標識された核酸の標識された核酸の総数の約２５％未満の増幅を含み得る。増幅反応は、複数の標識された核酸の標識された核酸の総数の約１０％未満の増幅を含み得る。
【０６５０】
１回または複数の増幅反応は、試料における約１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００種の標的化核酸の増幅をもたらすことができる。１回または複数の増幅反応は、試料における約２０００種の標的化核酸の増幅をもたらすことができる。１回または複数の増幅反応は、試料における約１０００種の標的化核酸の増幅をもたらすことができる。１回または複数の増幅反応は、約２０００種の標的化分子の増幅をもたらすことができる。１回または複数の増幅反応は、試料における約１００種の標的化核酸の増幅をもたらすことができる。
【０６５１】
増幅反応は、１回または複数のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含み得る。１回または複数のポリメラーゼ連鎖反応は、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、絶対的ＰＣＲ、ＨＤ−ＰＣＲ、Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎ  ＰＣＲ、デジタルＲＴＡまたはこれらのいずれかの組合せを含み得る。１回または複数のポリメラーゼ連鎖反応は、マルチプレックスＰＣＲを含み得る。１回または複数のポリメラーゼ連鎖反応は、ネステッドＰＣＲを含み得る。
【０６５２】
１回または複数の増幅反応の実行は、１種または複数のプライマーの使用を含み得る。１種または複数のプライマーは、１種または複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。１種または複数のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約７〜９個のヌクレオチドを含み得る。１種または複数のオリゴヌクレオチドは、１２〜１５個未満のヌクレオチドを含み得る。１種または複数のプライマーは、複数の標識された核酸の少なくとも一部にアニールすることができる。１種または複数のプライマーは、複数の標識された核酸の３’末端および／または５’末端にアニールすることができる。１種または複数のプライマーは、複数の標識された核酸の内部領域にアニールすることができる。内部領域は、複数の標識された核酸の３’末端から少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または１０００ヌクレオチドとなり得る。内部領域は、複数の標識された核酸の３’末端から少なくとも約２０００ヌクレオチドとなり得る。１種または複数のプライマーは、プライマーの固定されたパネルを含み得る。１種または複数のプライマーは、少なくとも１種または複数のカスタムプライマーを含み得る。１種または複数のプライマーは、少なくとも１種または複数の対照プライマーを含み得る。１種または複数のプライマーは、少なくとも１種または複数のハウスキーピング遺伝子プライマーを含み得る。１種または複数のオリゴヌクレオチドは、表１における配列からなる群より選択される配列を含み得る。１種または複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含み得る。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニールすることができる。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルＰＣＲ領域にアニールすることができる。１種または複数のカスタムプライマーは、試料タグの少なくとも一部にアニールすることができる。１種または複数のカスタムプライマーは、分子識別子標識の少なくとも一部にアニールすることができる。１種または複数のカスタムプライマーは、分子バーコードの少なくとも一部にアニールすることができる。１種または複数のカスタムプライマーは、第１の試料タグ、第２の試料タグ、分子識別子標識、核酸またはこれらの産物にアニールすることができる。１種または複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーおよびカスタムプライマーを含み得る。１種または複数のプライマーは、少なくとも約９６種またはそれを超えるカスタムプライマーを含み得る。１種または複数のプライマーは、少なくとも約９６０種またはそれを超えるカスタムプライマーを含み得る。１種または複数のプライマーは、少なくとも約９６００種またはそれを超えるカスタムプライマーを含み得る。１種または複数のカスタムプライマーは、２種またはそれを超える異なる標識された核酸にアニールすることができる。２種またはそれを超える異なる標識された核酸は、１種または複数の遺伝子に相当することができる。
【０６５３】
マルチプレックスＰＣＲ反応は、ネステッドＰＣＲ反応を含み得る。ネステッドＰＣＲ反応は、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むプライマー対を含み得る。第１のプライマーは、複数の核酸の１種または複数の核酸の領域にアニールすることができる。１種または複数の核酸の領域は、１種または複数の核酸の３’末端から少なくとも約３００〜４００ヌクレオチドとなり得る。第２のプライマーは、複数の核酸の１種または複数の核酸の領域にアニールすることができる。１種または複数の核酸の領域は、１種または複数の核酸の３’末端から少なくとも２００〜３００ヌクレオチドとなり得る。
【０６５４】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１回または複数のｃＤＮＡ合成反応を実行して、分子またはその誘導体（例えば、標識された分子）の１種または複数のｃＤＮＡコピーを生成するステップをさらに含み得る。１回または複数のｃＤＮＡ合成反応は、１回または複数の逆転写反応を含み得る。
【０６５５】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の試料を含み得る。本明細書に開示されている方法およびキットは、複数の試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００種またはそれを超える試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００種またはそれを超える試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００種の試料、９０００もしくは１０，０００種の試料もしくは１００，０００種の試料もしくは１，０００，０００種またはそれを超える試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１０，０００種の試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約２種の試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約５種の試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１０種の試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約５０種の試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１００種の試料を含み得る。
【０６５６】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１個または複数の細胞を含む１種または複数の試料を含み得る。本明細書に開示されている方法およびキットは、１個または複数の細胞を含む２種またはそれを超える試料を含み得る。第１の試料は、１個または複数の細胞を含み得る。第２の試料は、１個または複数の細胞を含み得る。第１の試料の１個または複数の細胞は、第２の試料の１個または複数の細胞と同じ細胞型のものとなり得る。
【０６５７】
本明細書に開示されている方法およびキットは、複数の試料を含み得る。複数の試料は、１種または複数の被験体に由来し得る。複数の試料は、２種またはそれを超える被験体に由来し得る。複数の試料は、同じ被験体に由来し得る。２種またはそれを超える被験体は、同じ種に由来し得る。２種またはそれを超える被験体は、異なる種に由来し得る。複数の試料は、１種または複数の供給源に由来し得る。複数の試料は、２種またはそれを超える供給源に由来し得る。複数の試料は、同じ被験体に由来し得る。２種またはそれを超える供給源は、同じ種に由来し得る。２種またはそれを超える供給源は、異なる種に由来し得る。
【０６５８】
複数の試料は、一斉に得ることができる。複数の試料は、逐次的に得ることができる。複数の試料は、２つまたはそれを超える期間にわたって得ることができる。２つまたはそれを超える期間は、１時間以上離すことができる。２つまたはそれを超える期間は、１日間以上離すことができる。２つまたはそれを超える期間は、１週間以上離すことができる。２つまたはそれを超える期間は、１カ月間以上離すことができる。２つまたはそれを超える期間は、１年間以上離すことができる。
【０６５９】
複数の試料は、１種または複数の体液、組織、細胞、臓器または筋肉に由来し得る。複数の試料は、１種または複数の血液試料を含み得る。
【０６６０】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の核酸を含む１種または複数の試料を含み得る。２種またはそれを超える試料は、１種または複数の核酸を含み得る。２種またはそれを超える試料は、２種またはそれを超える核酸を含み得る。第１の試料の１種または複数の核酸は、第２の試料の１種または複数の核酸とは異なり得る。第１の試料における核酸は、第２の試料における核酸と少なくとも約５０％同一となり得る。第１の試料における核酸は、第２の試料における核酸と少なくとも約７０％同一となり得る。第１の試料における核酸は、第２の試料における核酸と少なくとも約８０％同一となり得る。
【０６６１】
１種または複数の試料における複数の核酸は、２種またはそれを超える同一配列を含み得る。１種または複数の試料における総核酸の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％は、同じ配列を含み得る。１種または複数の試料における複数の核酸は、少なくとも２種の異なる配列を含み得る。１種または複数の試料における総核酸の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％は、異なる配列を含み得る。
【０６６２】
複数の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、低分子ＲＮＡ、非コードＲＮＡまたは細胞の他の核酸内容物を含み得る。複数の核酸は、ｍＲＮＡを含み得る。複数の核酸は、ＲＮＡを含み得る。複数の核酸は、ｍＲＮＡを含み得る。複数の核酸は、ＤＮＡを含み得る。
【０６６３】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の試料タグを含み得る。本明細書に開示されている方法およびキットは、１種またはそれより多い複数の試料タグを含み得る。試料タグは、試料指標領域を含み得る。第１の複数の試料タグの試料指標領域は、第２の複数の試料タグの試料指標領域とは異なり得る。試料タグは、１個または複数のヌクレオチドを含み得る。
【０６６４】
試料タグは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のヌクレオチドを含み得る。試料タグは、少なくとも約５個またはそれを超えるヌクレオチドを含み得る。試料タグは、少なくとも約１０個またはそれを超えるヌクレオチドを含み得る。試料タグは、約２００個未満のヌクレオチドを含み得る。試料タグは、約１００個未満のヌクレオチドを含み得る。試料タグは、約６０個未満のヌクレオチドを含み得る。
【０６６５】
試料タグは、ユニバーサルプライマー結合部位をさらに含み得る。試料タグは、ユニバーサルＰＣＲ領域をさらに含み得る。試料タグは、１種または複数のアダプター領域をさらに含み得る。試料タグは、１種または複数の標的特異的領域をさらに含み得る。
【０６６６】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の分子識別子標識を含み得る。本明細書に開示されている方法およびキットは、１種またはそれより多い複数の分子識別子標識を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、２種またはそれを超える異なる分子識別子標識を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、５０種またはそれを超える異なる分子識別子標識を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、９０種またはそれを超える異なる分子識別子標識を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、１００種またはそれを超える異なる分子識別子標識を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、３００種またはそれを超える異なる分子識別子標識を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、５００種またはそれを超える異なる分子識別子標識を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、９６０種またはそれを超える異なる分子識別子標識を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、１種または複数の分子識別子標識の複数コピーを含み得る。２種またはそれを超える複数の分子識別子標識は、１種または複数の同一分子識別子標識を含み得る。２種またはそれを超える複数の分子識別子標識は、１０種またはそれを超える同一分子識別子標識を含み得る。第１の複数の分子識別子標識の分子識別子標識は、第２の複数の分子識別子標識の分子識別子標識と少なくとも約３０％同一となり得る。第１の複数の分子識別子標識の分子識別子標識は、第２の複数の分子識別子標識の分子識別子標識と少なくとも約５０％同一となり得る。第１の複数の分子識別子標識の分子識別子標識は、第２の複数の分子識別子標識の分子識別子標識と少なくとも約８０％同一となり得る。
【０６６７】
分子識別子標識は、標識領域（例えば、分子標識領域、分子指標領域）を含み得る。第１の複数の分子識別子標識の２種またはそれを超える分子識別子標識の標識領域は、異なり得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、少なくとも約２０種の異なる標識領域を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、少なくとも約５０種の異なる標識領域を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、少なくとも約９６種の異なる標識領域を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、少なくとも約２００種の異なる標識領域を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、少なくとも約５００種の異なる標識領域を含み得る。１種またはそれより多い複数の分子識別子標識は、少なくとも約９６０種の異なる標識領域を含み得る。
【０６６８】
分子識別子標識は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるヌクレオチドを含み得る。分子識別子標識は、少なくとも約２０、３０、４０、５０個またはそれを超えるヌクレオチドを含み得る。分子識別子標識は、少なくとも約２１個のヌクレオチドを含み得る。
【０６６９】
分子識別子標識は、標的特異的領域をさらに含み得る。標的特異的領域は、オリゴｄＴ配列を含み得る。
【０６７０】
分子識別子標識は、１種または複数の色素標識をさらに含み得る。分子識別子標識は、Ｃｙ３色素をさらに含み得る。分子識別子標識は、Ｔｙｅ５６３色素をさらに含み得る。
【０６７１】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の標識された分子を含み得る。１種または複数の標識された分子は、複数の分子を複数の試料タグと接触させることにより生成することができる。１種または複数の標識された分子は、複数の核酸を複数の試料タグと接触させることにより生成することができる。複数の核酸を複数の試料タグと接触させることは、１種または複数の核酸への１種または複数の試料タグのライゲーションを含み得る。複数の核酸を複数の試料タグと接触させることは、１種または複数の核酸への１種または複数の試料タグのハイブリダイゼーションを含み得る。複数の核酸を複数の試料タグと接触させることは、１回または複数の核酸伸長反応の実施を含み得る。１回または複数の核酸伸長反応は、逆転写を含み得る。
【０６７２】
本明細書に開示されている方法およびキットは、複数の核酸に１種または複数のオリゴヌクレオチドリンカーを付着させるステップをさらに含み得る。方法およびキットは、試料タグが付いた核酸に１種または複数のオリゴヌクレオチドリンカーを付着させるステップをさらに含み得る。方法およびキットは、標識された核酸に１種または複数のオリゴヌクレオチドリンカーを付着させるステップをさらに含み得る。１種または複数のリンカーは、少なくとも約１０個のヌクレオチドを含み得る。
【０６７３】
本明細書に開示されている方法およびキットは、支持体に１種または複数の標識された核酸を付着させるステップをさらに含み得る。支持体は、固体支持体を含み得る。支持体は、ビーズを含み得る。支持体は、アレイを含み得る。支持体は、スライドガラスを含み得る。
【０６７４】
支持体への標識された核酸の付着は、アミン−チオール架橋、マレイミド架橋、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、Ｚｅｎｏｎ、ＳｉｔｅＣｌｉｃｋまたはこれらの組合せを含み得る。支持体への標識された核酸の付着は、１種または複数の標識された核酸へのビオチンの付着を含み得る。
【０６７５】
支持体は、１個または複数のビーズを含み得る。１個または複数のビーズは、コーティングされたビーズとなり得る。コーティングされたビーズは、ストレプトアビジンでコーティングすることができる。
【０６７６】
支持体は、アレイを含み得る。アレイは、１種または複数のプローブを含み得る。標識された核酸は、１種または複数のプローブに付着させることができる。１種または複数のプローブは、１種または複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。１種または複数のプローブは、標識された核酸の少なくとも一部に付着させることができる。１種または複数のプローブに付着させた標識された核酸の一部は、試料タグ、分子識別子標識、分子バーコード、核酸またはこれらの組合せの少なくとも一部を含み得る。
【０６７７】
支持体は、スライドガラスを含み得る。スライドガラスは、１個または複数のウェルを含み得る。１個または複数のウェルは、スライドガラス上にエッチングすることができる。１個または複数のウェルは、少なくとも９６０個のウェルを含み得る。スライドガラスは、１種または複数のプローブを含み得る。１種または複数のプローブは、スライドガラス上に印刷することができる。１個または複数のウェルは、１種または複数のプローブをさらに含み得る。１種または複数のプローブは、１個または複数のウェル内に印刷することができる。１種または複数のプローブは、９６０種の核酸を含み得る。核酸は、異なり得る。核酸は、同じになることができる。
【０６７８】
本明細書に開示されている方法およびキットを使用して、１種または複数の試料における１種または複数の分子の計数を決定することができる。１種または複数の分子の計数の決定は、異なる標識された核酸の数の決定を含み得る。異なる標識された核酸の数の決定は、標識された核酸の少なくとも一部の検出を含み得る。標識された核酸の少なくとも一部の検出は、試料タグ、分子識別子標識、分子バーコード、核酸またはこれらの組合せの少なくとも一部の検出を含み得る。
【０６７９】
異なる標識された核酸の数の決定は、配列決定を含み得る。配列決定は、ＭｉＳｅｑ配列決定を含み得る。配列決定は、ＨｉＳｅｑ配列決定を含み得る。異なる標識された核酸の数の決定は、アレイを含み得る。異なる標識された核酸の数の決定は、１種または複数のプローブと標識された核酸との接触を含み得る。
【０６８０】
異なる標識された核酸の数の決定は、アレイと標識された核酸との接触を含み得る。アレイは、複数のプローブを含み得る。異なる標識された核酸の数の決定は、複数のプローブのスライドガラスと標識された核酸との接触を含み得る。
【０６８１】
異なる標識された核酸の数の決定は、標識されたプローブハイブリダイゼーション、標的特異的増幅、標的特異的配列決定、標的一塩基多型に特異的な標識されたヌクレオチドによる配列決定、制限酵素消化パターンに特異的な標識されたヌクレオチドによる配列決定、変異に特異的な標識されたヌクレオチドによる配列決定またはこれらの組合せを含み得る。
【０６８２】
異なる標識された核酸の数の決定は、配列特異的標識のフローサイトメトリー選別を含み得る。異なる標識された核酸の数の決定は、ビーズに付着させた標識された核酸の検出を含み得る。ビーズに付着させた標識された核酸の検出は、蛍光検出を含み得る。
【０６８３】
異なる標識された核酸の数の決定は、標的特異的プローブおよび標識された核酸または標的特異的な標識されたプローブの間の、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による複数の標識された核酸の計数を含み得る。異なる標識された核酸の数の決定は、支持体への標識された核酸の付着を含み得る。
【０６８４】
本明細書に開示されている方法およびキットは、核酸結合タンパク質による標的配列の免疫沈降をさらに含み得る。
【０６８５】
本明細書に開示されている方法およびキットは、マイクロウェルプレートの複数のウェルへの複数の試料の分布をさらに含み得る。複数の試料のうち１種または複数は、複数の細胞を含み得る。複数の試料のうち１種または複数は、複数の核酸を含み得る。本明細書に開示されている方法およびキットは、複数のウェルへの１個またはそれより少ない細胞の分布をさらに含み得る。複数の細胞は、マイクロウェルプレートにおいて溶解させることができる。本明細書に開示されている方法およびキットは、マイクロウェルプレートにおけるｃＤＮＡの合成をさらに含み得る。ｃＤＮＡの合成は、ｍＲＮＡの逆転写を含み得る。
【０６８６】
本明細書に開示されている方法およびキットは、マイクロウェルプレートへ複数の第１の試料タグ、複数の第２の試料タグ、複数の分子識別子標識またはこれらのいずれかの組合せを分布させるステップをさらに含み得る。
【０６８７】
本明細書に開示されている方法およびキットは、マイクロウェルプレートにおいて１個または複数のビーズを分布させるステップをさらに含み得る。マイクロウェルプレートは、ソフトリソグラフィーによりＰＤＭＳにおいて製作された、シリコンウエハにおいてエッチングされた、スライドガラスにおいてエッチングされた、スライドガラスにおいてパターン形成されたフォトレジストまたはこれらの組合せであるマイクロウェルプレートを含み得る。マイクロウェルは、マイクロキャピラリープレートに孔を含み得る。マイクロウェルプレートは、油中水型エマルションを含み得る。マイクロウェルプレートは、少なくとも１個または複数のウェルを含み得る。マイクロウェルプレートは、少なくとも約６個のウェル、１２個のウェル、４８個のウェル、９６個のウェル、３８４個のウェル、９６０個のウェルまたは１０００個のウェルを含み得る。
【０６８８】
本明細書に開示されている方法およびキットは、チップをさらに含み得る。マイクロウェルプレートは、チップに付着させることができる。チップは、少なくとも約６個のウェル、１２個のウェル、４８個のウェル、９６個のウェル、３８４個のウェル、９６０個のウェル、１０００個のウェル、２０００個のウェル、３０００個のウェル、４０００個のウェル、５０００個のウェル、６０００個のウェル、７０００個のウェル、８０００個のウェル、９０００個のウェル、１０，０００個のウェル、２０，０００個のウェル、３０，０００個のウェル、４０，０００個のウェル、５０，０００個のウェル、６０，０００個のウェル、７０，０００個のウェル、８０，０００個のウェル、９０，０００個のウェル、１００，０００個のウェル、２００，０００個のウェル、５００，０００個のウェルまたは百万個のウェルを含み得る。ウェルは、少なくとも約３００ミクロン2、４００ミクロン2、５００ミクロン2、６００ミクロン2、７００ミクロン2、８００ミクロン2、９００ミクロン2、１０００ミクロン2、１１００ミクロン2、１２００ミクロン2、１３００ミクロン2、１４００ミクロン2、１５００ミクロン2の面積を含み得る。本明細書に開示されている方法およびキットは、チップに約１０，０００〜３０，０００種の間の試料を分布させるステップをさらに含み得る。
【０６８９】
本明細書に開示されている方法およびキットは、それを必要とする被験体における状態、疾患または障害の診断をさらに含み得る。
【０６９０】
本明細書に開示されている方法およびキットは、それを必要とする被験体における状態、疾患または障害の予後をさらに含み得る。本明細書に開示されている方法およびキットは、それを必要とする被験体における状態、疾患または障害の処置の決定をさらに含み得る。
【０６９１】
複数の試料は、疾患または状態を患う被験体由来の１種または複数の試料を含み得る。複数の試料は、健康な被験体由来の１種または複数の試料を含み得る。
【０６９２】
ａ）２種またはそれを超える試料における２種またはそれを超える分子を確率論的に標識して、２種またはそれを超える標識された分子を生成するステップと、ｂ）２種またはそれを超える標識された分子を検出するステップとを含む、法医学的分析の方法が本明細書にさらに開示されている。
【０６９３】
カスタムプライマーを選択する方法は、１種または複数の核酸に基づきカスタムプライマーを選択するステップをさらに含み得る。１種または複数の核酸は、ｍＲＮＡ転写物、構造的ＲＮＡを含む非コード転写物、転写された偽遺伝子、ゲノムアノテーションプロセスによって提供されるモデルｍＲＮＡ、ゲノムコンティグに相当する配列またはこれらのいずれかの組合せを含み得る。１種または複数の核酸は、ＲＮＡとなり得る。１種または複数の核酸は、ｍＲＮＡとなり得る。１種または複数の核酸は、１種または複数のエクソンを含み得る。カスタムプライマーを選択する方法は、核酸の１種または複数のサブセットを濃縮するステップをさらに含み得る。１種または複数のサブセットは、低存在量ｍＲＮＡを含む。カスタムプライマーを選択する方法は、コンピューターによるアルゴリズムをさらに含み得る。
【０６９４】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の対照の使用を含み得る。１種または複数の対照を対照にスパイクすることができる。１種または複数の対照は、核酸を含み得る。複数の核酸を含む１種または複数の試料は、１種または複数の対照核酸をスパイクすることができる。１種または複数の対照核酸を使用して、標識された核酸ライブラリーの生成の効率を測定することができる。
【０６９５】
本明細書に開示されている方法およびキットは、１種または複数の核酸ライブラリーの生成において使用することができる。１種または複数の核酸ライブラリーは、複数の標識された核酸またはその誘導体（例えば、標識されたアンプリコン）を含み得る。標識された核酸ライブラリーを生成する方法は、分子バーコードの２またはそれを超えるセットで、２種またはそれを超える試料における２種またはそれを超える核酸を確率論的に標識して、複数の標識された核酸を生成するステップを含み得る。標識された核酸ライブラリーを生成する方法は、２種またはそれを超える試料を複数の試料タグおよび複数の分子特異的標識と接触させて、複数の標識された核酸を生成するステップを含み得る。標識された核酸は、試料指標領域、標識領域および核酸領域を含み得る。試料指標領域を使用して、核酸に試料または部分試料同一性を付与することができる。試料指標領域を使用して、核酸の供給源を決定することができる。標識領域を使用して、核酸に特有の同一性を付与し、これにより、同じ試料または部分試料における２種またはそれを超える同一核酸の区別を可能にすることができる。
【０６９６】
核酸ライブラリーを生成する方法は、１種または複数の標識された核酸を増幅して、１種または複数の濃縮された標識された核酸を生成するステップをさらに含み得る。方法は、１種または複数の濃縮された標識された核酸の１種または複数のプルダウンアッセイを実行するステップをさらに含み得る。方法は、１種または複数の濃縮された標識された核酸を精製するステップをさらに含み得る。
【０６９７】
本明細書に開示されているキットは、複数のビーズ、プライマーおよび／または増幅剤を含み得る。１種または複数のキットは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００種またはそれを超える試料または部分試料の分析において使用することができる。１種または複数のキットは、少なくとも約９６種の試料の分析において使用することができる。１種または複数のキットは、少なくとも約３８４種の試料の分析において使用することができる。キットは、プライマー設計および最適化のための説明書をさらに含み得る。
【０６９８】
キットは、１種または複数のマイクロウェルプレートをさらに含み得る。１種または複数のマイクロウェルプレートは、１個または複数のビーズの分布に使用することができる。１種または複数のマイクロウェルプレートは、１種または複数の試料からの１種または複数の分子またはその誘導体（例えば、標識された分子、標識されたアンプリコン）の分布に使用することができる。
【０６９９】
キットは、１個または複数の追加的な容器をさらに含み得る。１個または複数の追加的な容器は、１種または複数の追加的な複数の試料タグを含み得る。１個または複数の追加的な容器における１種または複数の追加的な複数の試料タグは、第１の容器における第１の複数の試料タグとは異なり得る。１個または複数の追加的な容器は、１種または複数の追加的な複数の分子識別子標識を含み得る。１個または複数の追加的な容器の１種または複数の追加的な複数の分子識別子標識は、第２の容器の１種または複数の追加的な分子識別子標識と少なくとも約５０％同一となり得る。１個または複数の追加的な容器の１種または複数の追加的な複数の分子識別子標識は、第２の容器の１種または複数の追加的な分子識別子標識と少なくとも約８０％同一となり得る。１個または複数の追加的な容器の１種または複数の追加的な複数の分子識別子標識は、第２の容器の１種または複数の追加的な分子識別子標識と少なくとも約９０％同一となり得る。
【０７００】
標識されたビーズの１または複数のセットを生成する方法が本明細書にさらに開示されている。標識されたビーズの１または複数のセットを生成する方法は、１個または複数のビーズに１種または複数の核酸を付着させ、これにより、標識されたビーズの１または複数のセットを生成するステップを含み得る。１種または複数の核酸は、１種または複数の分子バーコードを含み得る。１種または複数の核酸は、１種または複数の試料タグを含み得る。１種または複数の核酸は、１種または複数の分子識別子標識を含み得る。１種または複数の核酸は、ａ）プライマー領域；ｂ）試料指標領域；およびｃ）リンカーまたはアダプター領域を含み得る。１種または複数の核酸は、ａ）プライマー領域；ｂ）標識領域；およびｃ）リンカーまたはアダプター領域を含み得る。１種または複数の核酸は、ａ）試料指標領域；およびｂ）標識領域を含み得る。１種または複数の核酸は、プライマー領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、標的特異的領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、リンカー領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、アダプター領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、試料指標領域をさらに含み得る。１種または複数の核酸は、標識領域をさらに含み得る。
【０７０１】
標識されたビーズのセットのための核酸のプライマー領域は、少なくとも約７０％同一となり得る。標識されたビーズのセットのための核酸のプライマー領域は、少なくとも約９０％同一となり得る。標識されたビーズのセットのための核酸のプライマー領域は、同じものとなり得る。
【０７０２】
標識されたビーズのセットのための核酸の試料指標領域は、少なくとも約７０％同一となり得る。標識されたビーズのセットのための核酸の試料指標領域は、少なくとも約９０％同一となり得る。標識されたビーズのセットのための核酸の試料指標領域は、同じものとなり得る。試料指標化ビーズ（ｓａｍｐｌｅ  ｉｎｄｅｘｅｄ  ｂｅａｄ）の２またはそれを超えるセットのための核酸の試料指標領域は、約４０％未満同一となり得る。試料指標化ビーズの２またはそれを超えるセットのための核酸の試料指標領域は、約５０％未満同一となり得る。試料指標化ビーズの２またはそれを超えるセットのための核酸の試料指標領域は、約６０％未満同一となり得る。試料指標化ビーズの２またはそれを超えるセットのための核酸の試料指標領域は、異なるものとなり得る。
【０７０３】
標識されたビーズの２またはそれを超えるセットのための核酸の標識領域は、少なくとも約７０％同一となり得る。標識されたビーズの２またはそれを超えるセットのための核酸の標識領域は、少なくとも約９０％同一となり得る。標識されたビーズの２またはそれを超えるセットのための核酸の標識領域は、同じものとなり得る。標識されたビーズのセットのための核酸の標識領域は、約４０％未満同一となり得る。標識されたビーズのセットのための核酸の標識領域は、約５０％未満同一となり得る。標識されたビーズのセットのための核酸の標識領域は、約６０％未満同一となり得る。標識されたビーズのセットのための２種またはそれを超える核酸の標識領域は、異なるものとなり得る。
【０７０４】
標識されたビーズのセットのための核酸のリンカーまたはアダプター領域は、少なくとも約７０％同一となり得る。標識されたビーズのセットのための核酸のリンカーまたはアダプター領域は、少なくとも約９０％同一となり得る。標識されたビーズのセットのための核酸のリンカーまたはアダプター領域は、同じものとなり得る。
【０７０５】
標的特定されたビーズの２またはそれを超えるセットのための核酸の標的特異的領域は、少なくとも約７０％同一となり得る。標的特定されたビーズの２またはそれを超えるセットのための核酸の標的特異的領域は、少なくとも約９０％同一となり得る。標的特定されたビーズの２またはそれを超えるセットのための核酸の標的特異的領域は、同じものとなり得る。標的特定されたビーズのセットのための核酸の標的特異的領域は、約４０％未満同一となり得る。標的特定されたビーズのセットのための核酸の標的特異的領域は、約５０％未満同一となり得る。標的特定されたビーズのセットのための核酸の標的特異的領域は、約６０％未満同一となり得る。標的特定されたビーズのセットのための２種またはそれを超える核酸の標的特異的領域は、異なるものとなり得る。
【０７０６】
標識されたビーズの１または複数のセットは、百万個またはそれを超える標識されたビーズを含み得る。標識されたビーズの１または複数のセットは、一千万個またはそれを超える標識されたビーズを含み得る。
【０７０７】
ビーズへの１種または複数の核酸の付着は、共有結合性付着を含み得る。ビーズへの１種または複数の核酸の付着は、コンジュゲーションを含み得る。ビーズへの１種または複数の核酸の付着は、イオン性相互作用を含み得る。
【０７０８】
ビーズは、コーティングされたビーズとなり得る。核酸は、１種または複数のタグに付着させることができる。ビーズは、ストレプトアビジンでコーティングすることができる。核酸は、ビオチンに付着させることができる。ビーズは、抗体または核酸でコーティングすることもでき、核酸は、かかる表面コーティングされた材料を介して間接的にビーズに付着させることができる。
【０７０９】
一態様では、本開示は、固体支持体を含む組成物を提供し、前記固体支持体は、複数のオリゴヌクレオチドを含み、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、細胞性標識および分子標識を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち前記少なくとも２種の前記細胞性標識は、同じであり、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち前記少なくとも２種の前記分子標識は、異なる。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、試料標識をさらに含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、標的結合領域をさらに含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、標的核酸にハイブリダイズするように適応された配列を含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、ランダムマルチマー、例えば、ランダムダイマー、トリマー、クアトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーもしくはいずれかの長さのより高次のマルチマー配列；遺伝子特異的プライマー；およびオリゴｄＴ；またはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される配列を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、ユニバーサル標識を含む。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、配列決定プライマーの結合部位を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、リンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、官能基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、前記オリゴヌクレオチドに対し５’に位置する。一部の実施形態では、リンカーは、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒドおよびケトンまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、固体支持体は、ポリスチレンで構成される。一部の実施形態では、固体支持体は、磁性である。一部の実施形態では、固体支持体は、ＰＤＭＳ固体支持体、ガラス固体支持体、ポリプロピレン固体支持体、アガロース固体支持体、ゼラチン固体支持体、磁性固体支持体およびプルロニック固体支持体またはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズを含む。一部の実施形態では、固体支持体は、約２０ミクロンの直径を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、約５ミクロン〜約４０ミクロンの直径を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、官能基を含む。一部の実施形態では、官能基は、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒドおよびケトンまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、細胞性標識は、複数の細胞性標識を含む。一部の実施形態では、複数の細胞性標識は、複数のリンカー標識配列が散在する。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、１０，０００〜１０億種のオリゴヌクレオチドを含む。
【０７１０】
一態様では、本開示は、第１のランダム配列、第２のランダム配列および第１のリンカー標識配列を含む第１の細胞性標識であって、前記第１のリンカー標識配列が、前記第１のランダム配列および前記第２のランダム配列を接続する第１の細胞性標識；ならびにランダム配列を含む第１の分子標識を含む第１のオリゴヌクレオチドと、第３のランダム配列、第４のランダム配列および第２のリンカー標識配列を含む第２の細胞性標識であって、前記第２のリンカー標識配列が、前記第３のランダム配列および前記第４のランダム配列を接続する第２の細胞性標識；ならびにランダム配列を含む第２の分子標識を含む第２のオリゴヌクレオチドとを含む固体支持体を提供し、前記第１の細胞性標識および前記第２の細胞性標識は同じであり、前記第１の分子標識および前記第２の分子標識は異なる。一部の実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、同一試料指標領域をさらに含む。一部の実施形態では、試料指標領域は、ランダム配列を含む。一部の実施形態では、試料指標領域は、４〜１２個のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、細胞標性識は、前記分子標識に直接的に付着させる。一部の実施形態では、細胞性標識および前記分子標識は、リンカー標識配列により付着させる。一部の実施形態では、前記細胞性標識のランダム配列は、４〜１２個のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、細胞性標識の定常配列は、少なくとも４個のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、細胞性標識は、少なくとも１２個のヌクレオチドの総計の長さを有する。一部の実施形態では、細胞性標識は、１種または複数の追加的なランダム配列をさらに含む。一部の実施形態では、細胞性標識は、１種または複数の追加的なリンカー標識配列をさらに含む。一部の実施形態では、１種または複数の追加的なリンカー標識配列は、１種または複数の追加的なランダム配列を接続する。一部の実施形態では、分子標識のランダム配列は、４〜１２個のヌクレオチドの長さである。
【０７１１】
一態様では、本開示は、固体支持体を含む組成物を提供し、前記固体支持体は、複数のオリゴヌクレオチドを含み、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、細胞性標識、分子標識；および標的結合領域；および複数の標的核酸を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち前記少なくとも２種の前記細胞性標識は同じであり、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち前記少なくとも２種の前記分子標識は異なる。一部の実施形態では、標的結合領域は、前記複数の標的核酸のうち少なくとも１種にハイブリダイズするように適応された配列を含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、ランダムマルチマー、例えば、ランダムダイマー、トリマー、クアトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーもしくはいずれかの長さのより高次のマルチマー配列；遺伝子特異的プライマー；およびオリゴｄＴ；またはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される配列を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、１０，０００〜１０億種のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、前記複数の標的核酸の標的核酸の数を超える多数のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数の標的核酸は、同じ標的核酸の複数コピーを含む。一部の実施形態では、複数の標的核酸は、異なる標的核酸の複数コピーを含む。一部の実施形態では、複数の標的核酸は、前記複数のオリゴヌクレオチドに結合される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、試料標識をさらに含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、ユニバーサル標識を含む。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、配列決定プライマーの結合部位を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、リンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、官能基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、前記オリゴヌクレオチドに対し５’に位置する。一部の実施形態では、官能基は、アミノ基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒドおよびケトンまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、固体支持体は、ポリスチレンで構成される。一部の実施形態では、固体支持体は、磁性である。一部の実施形態では、固体支持体は、ＰＤＭＳ固体支持体、ガラス固体支持体、ポリプロピレン固体支持体、アガロース固体支持体、ゼラチン固体支持体、磁性固体支持体およびプルロニック固体支持体またはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズを含む。一部の実施形態では、固体支持体は、約２０ミクロンの直径を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、約５ミクロン〜約４０ミクロンの直径を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、官能基を含む。一部の実施形態では、官能基は、カルボキシ基を含む。一部の実施形態では、官能基は、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒドおよびケトンまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、細胞性標識は、複数の細胞性標識を含む。一部の実施形態では、複数の細胞性標識は、複数のリンカー標識配列が散在する。
【０７１２】
一態様では、本開示は、第１の固体支持体であって、前記第１の固体支持体が、第１の複数のオリゴヌクレオチドを含み、前記第１の複数のオリゴヌクレオチドが、同じ第１の細胞性標識を含む第１の固体支持体と、第２の固体支持体であって、前記第２の固体支持体が、第２の複数のオリゴヌクレオチドを含み、前記第２の複数のオリゴヌクレオチドが、同じ第２の細胞性標識を含む第２の固体支持体と、使用説明書とを含むキットを提供し、前記第１の細胞性標識および前記第２の細胞性標識は異なる。一部の実施形態では、前記第１の複数のオリゴヌクレオチドおよび前記第２の複数のオリゴヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドは、分子標識を含む。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの分子標識は異なる。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの分子標識は同じである。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの一部の分子標識は異なり、一部は同じである。一部の実施形態では、前記第１の複数のオリゴヌクレオチドおよび前記第２の複数のオリゴヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドは、標的結合領域を含む。一部の実施形態では、キットは、マイクロウェルアレイをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、バッファーをさらに含む。一部の実施形態では、バッファーは、再構成バッファー、希釈バッファーおよび安定化バッファーまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。
【０７１３】
一態様では、本開示は、試料を固体支持体と接触させるステップであって、前記固体支持体は、複数のオリゴヌクレオチドを含み、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、細胞性標識および分子標識を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち前記少なくとも２種の前記細胞性標識は同じであり、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち前記少なくとも２種の前記分子標識は異なるステップと、前記複数のオリゴヌクレオチドの１オリゴヌクレオチドに前記試料由来の前記標的核酸をハイブリダイズさせるステップとを含む、標的核酸の量を決定するための方法を提供する。一部の実施形態では、試料は、細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、前記ハイブリダイズさせるステップ前に溶解される。一部の実施形態では、ハイブリダイズさせるステップは、前記複数のオリゴヌクレオチドに同じ標的核酸の複数コピーをハイブリダイズさせるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、前記標的核酸を増幅するステップをさらに含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、前記標的核酸を逆転写するステップを含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲおよびデジタルＰＣＲまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される方法を使用した増幅を含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、前記固体支持体上で直接的に行われる。一部の実施形態では、増幅するステップは、前記固体支持体から転写された鋳型上で行われる。一部の実施形態では、方法は、前記標的核酸を配列決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、配列決定するステップは、前記標的核酸および前記分子標識を配列決定するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、前記標的核酸の量を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、決定するステップは、前記標的核酸のレベルを定量化するステップを含む。一部の実施形態では、決定するステップは、前記標的核酸のための配列決定された分子標識の数を計数するステップを含む。一部の実施形態では、接触させるステップは、マイクロウェル中で行う。一部の実施形態では、マイクロウェルは、親水性プラスチック、プラスチック、エラストマーおよびヒドロゲルまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される材料から作製される。一部の実施形態では、マイクロウェルは、アガロースを含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、マイクロウェルアレイの１個のマイクロウェルである。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイは、少なくとも９０個のマイクロウェルを含む。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイは、少なくとも１５０，０００個のマイクロウェルを含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、ウェル１個当たり少なくとも１個の固体支持体を含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、ウェル１個当たり最大でも２個の固体支持体を含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、前記固体支持体の最大でも２個を収容するサイズのものである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、最大でも１個の固体支持体を収容するサイズのものである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、少なくとも２５ミクロンの深さである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、少なくとも２５ミクロンの直径である。
【０７１４】
一態様では、本開示は、固体支持体に試料を接触させるステップであって、前記固体支持体が、複数のオリゴヌクレオチドを含み、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種が、細胞性標識および分子標識を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち前記少なくとも２種の前記細胞性標識が同じであり、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち前記少なくとも２種の前記分子標識が異なるステップと、前記複数のオリゴヌクレオチドに前記試料由来の標的核酸をハイブリダイズさせるステップと、前記標的核酸を増幅するステップと、前記標的核酸を配列決定するステップであって、前記標的核酸および前記標的核酸が結合されている前記オリゴヌクレオチドの前記分子標識を配列決定するステップと、前記標的核酸の量を決定するステップとを含む、標的核酸の増幅バイアスを低下させる方法を提供する。一部の実施形態では、ハイブリダイズさせるステップは、前記複数のオリゴヌクレオチドに同じ標的核酸の複数コピーをハイブリダイズさせるステップを含む。一部の実施形態では、決定するステップは、同じ標的核酸のための多数の配列決定された分子標識を計数するステップを含む。一部の実施形態では、計数するステップは、前記同じ標的核酸のコピーの数を計数する。一部の実施形態では、試料は、細胞を含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、前記標的核酸を逆転写するステップを含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲおよびデジタルＰＣＲまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される方法を使用した増幅を含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、前記固体支持体上で直接的に行われる。一部の実施形態では、増幅するステップは、前記固体支持体から転写された鋳型上で行われる。
【０７１５】
一態様では、本開示は、マイクロウェル；細胞；および固体支持体を含む組成物を提供し、前記固体支持体は、複数のオリゴヌクレオチドを含み、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、細胞性標識および分子標識を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち前記少なくとも２種の前記細胞性標識は同じであり、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち前記少なくとも２種の前記分子標識は異なる。一部の実施形態では、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、試料標識をさらに含む。一部の実施形態では、前記複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、標的結合領域をさらに含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、ランダムマルチマー、例えば、ランダムダイマー、トリマー、クアトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーもしくはいずれかの長さのより高次のマルチマー配列；遺伝子特異的プライマー；およびオリゴｄＴ；またはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される配列を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、ユニバーサル標識を含む。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、配列決定プライマーの結合部位を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、ポリスチレンで構成される。一部の実施形態では、固体支持体は、磁性である。一部の実施形態では、固体支持体は、ＰＤＭＳ固体支持体、ガラス固体支持体、ポリプロピレン固体支持体、アガロース固体支持体、ゼラチン固体支持体、磁性固体支持体およびプルロニック固体支持体またはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズを含む。一部の実施形態では、固体支持体は、約２０ミクロンの直径を有する。一部の実施形態では、固体支持体は、約５ミクロン〜約４０ミクロンの直径を有する。一部の実施形態では、細胞性標識は、複数の細胞性標識を含む。一部の実施形態では、複数の細胞性標識は、複数のリンカー配列が散在する。一部の実施形態では、マイクロウェルは、親水性プラスチック、プラスチック、エラストマーおよびヒドロゲルまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される材料から作製される。一部の実施形態では、マイクロウェルは、アガロースを含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、マイクロウェルアレイのマイクロウェルである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、ウェル１個当たり少なくとも１個の固体支持体を含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、ウェル１個当たり最大でも２個の固体支持体を含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、前記固体支持体の少なくとも１個および前記細胞の少なくとも１個を収容するサイズのものである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、前記固体支持体の最大でも１個および前記細胞の少なくとも１個を収容するサイズのものである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、少なくとも２５ミクロンの深さである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、少なくとも２５ミクロンの直径である。一部の実施形態では、マイクロウェルは平坦である。
【０７１６】
一態様では、本開示は、第１のマイクロウェルアレイを含む第１の基材であって、前記第１のマイクロウェルアレイが、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うように構成された第１の既定の空間的配置で複数の第１のマイクロウェルを含む第１の基材を含むデバイスを提供する。
【０７１７】
一部の実施形態では、デバイスは、少なくとも第２のマイクロウェルアレイを含む第１の基材であって、前記少なくとも第２のマイクロウェルアレイが、少なくとも第２の既定の空間的配置で複数の少なくとも第２のマイクロウェルを含む第１の基材を含む。一部の実施形態では、第１のマイクロウェルおよび少なくとも第２のマイクロウェルは同じである。一部の実施形態では、第１のマイクロウェルおよび少なくとも第２のマイクロウェルは異なる。一部の実施形態では、第１の既定の空間的配置および少なくとも第２の既定の空間的配置は同じである。一部の実施形態では、第１の既定の空間的配置および少なくとも第２の既定の空間的配置は異なる。一部の実施形態では、既定の空間的配置は、一次元または二次元アレイパターンを含む。一部の実施形態では、二次元アレイパターンは、正方格子、矩形格子または六角格子を含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、円柱状幾何学、円錐体幾何学、半球状幾何学、矩形幾何学、多角体幾何学またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、マイクロウェルの直径は、約５ミクロン〜約５０ミクロンの間である。一部の実施形態では、マイクロウェルの深さは、約１０ミクロン〜約６０ミクロンの間である。一部の実施形態では、２個の隣接マイクロウェルの間の中心間スペーシングは、約１５ミクロン〜約７５ミクロンの間である。一部の実施形態では、第１または少なくとも第２のマイクロウェルアレイにおけるマイクロウェルの総数は、約９６〜約５，０００，０００の間である。一部の実施形態では、第１の基材は、シリコン、石英ガラス、ガラス、ポリマー、金属またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第１の基材は、アガロースまたはヒドロゲルをさらに含む。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイは、少なくとも１種の表面特色をさらに含み、前記表面特色は、１個もしくは複数の個々のマイクロウェルを囲むまたは個々のマイクロウェル間の表面にまたがり、前記表面特色は、ドーム、隆線またはピークがある。
【０７１８】
一態様では、本開示は、少なくとも第１のマイクロウェルアレイを含む第１の基材と、頂部プレート、底部プレートおよびガスケットを含む機械的治具とを含むデバイスを提供し、第１の基材および機械的治具が組み立てられた形態にある場合、第１の基材は、ガスケットおよび底部プレートの間にポジショニングされ、ガスケットは、第１の基材と漏れ止め封着を形成し、頂部プレートおよびガスケットは、細胞試料およびビーズに基づくオリゴヌクレオチド標識が少なくとも第１のチャンバー内に分注されて、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うことができるように、前記少なくとも第１のマイクロウェルアレイを包含する前記少なくとも第１のチャンバーを形成する。
【０７１９】
一部の実施形態では、少なくとも第１のマイクロウェルアレイは、本明細書に記載されているいずれかである。一部の実施形態では、ガスケットは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または同様のエラストマー材料から製作される。一部の実施形態では、頂部および底部プレートは、アルミニウム、陽極処理アルミニウム、ステンレス鋼、テフロン（登録商標）、ポリメタクリル酸メチル、ポリカーボネートまたは同様の硬質ポリマー材料から製作される。
【０７２０】
一態様では、本開示は、少なくとも１個のマイクロウェルアレイをさらに含む少なくとも１個の基材と、フローセルとを含むデバイスを提供し、フローセルは、前記少なくとも１個の基材を包囲するかまたはそれに付着され、前記マイクロウェルアレイへと流体を送達する目的の少なくとも１個の入口ポートおよび少なくとも１個の出口ポートを含み、デバイスは、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うように構成されている。
【０７２１】
一部の実施形態では、前記少なくとも１個の基材は、本明細書に記載されている少なくとも１個のマイクロウェルアレイを含む。一部の実施形態では、フローセルは、１種または複数の試料を並行して処理することができるように、複数のマイクロウェルアレイとインターフェイスする複数のマイクロアレイチャンバーをさらに含む。一部の実施形態では、フローセルは、少なくとも１個のマイクロウェルアレイへの細胞およびビーズのより均一な送達をもたらすための多孔性障壁または流動拡散器をさらに含む。一部の実施形態では、フローセルは、マイクロウェルアレイを含有する各チャンバーを、同じ総アレイ面積をまとめて覆うサブセクションに分割し、少なくとも１個のマイクロウェルアレイへの細胞およびビーズのより均一な送達をもたらす分割器をさらに含む。一部の実施形態では、デバイスに取り込まれる流体チャネルの幅は、約５０ミクロン〜２０ｍｍの間である。一部の実施形態では、デバイスに取り込まれる流体チャネルの深さは、約５０ミクロン〜約２ｍｍの間である。一部の実施形態では、フローセルは、シリコン、石英ガラス、ガラス、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；エラストマー）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリイミド、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、エポキシ樹脂、金属またはこれらの材料の組合せからなる群より選択される材料から製作される。一部の実施形態では、デバイスは、自動マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うように構成された機器システムの固定された成分を含む。一部の実施形態では、デバイスは、自動マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うように構成された機器システムの着脱可能な成分を含む。
【０７２２】
一態様では、本開示は、少なくとも第１のマイクロウェルアレイをさらに含む少なくとも第１の基材と、少なくとも第１のフローセルまたはマイクロウェルアレイチャンバーと、１種または複数の試料または試薬リザーバーとを含むカートリッジを提供し、カートリッジは、前記少なくとも第１のマイクロウェルアレイへと流体を送達する目的の、少なくとも１個の入口ポートおよび少なくとも１個の出口ポートをさらに含み、カートリッジは、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うように構成されている。
【０７２３】
一部の実施形態では、前記少なくとも第１の基材は、本明細書に記載されている少なくとも第１のマイクロウェルアレイを含む。一部の実施形態では、カートリッジは、複数のマイクロウェルアレイを含み、１種または複数の試料を並行して処理するように構成されている。一部の実施形態では、少なくとも第１のフローセルまたはマイクロウェルアレイチャンバーは、少なくとも第１のマイクロウェルアレイへの細胞およびビーズのより均一な送達をもたらすための多孔性障壁または流動拡散器をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも第１のフローセルまたはマイクロウェルアレイチャンバーは、少なくとも第１のフローセルまたはマイクロウェルアレイチャンバーを、同じ総アレイ面積をまとめて覆うサブセクションに分割し、マイクロウェルアレイへの細胞およびビーズのより均一な送達をもたらす分割器をさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの幅は、約５０ミクロン〜２００ミクロンの間である。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの幅は、約２００ミクロン〜２ｍｍの間である。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの幅は、約２ｍｍ〜１０ｍｍの間である。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの幅は、約１０ｍｍ〜２０ｍｍの間である。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの深さは、約５０ミクロン〜約２ｍｍの間である。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの深さは、約５００ミクロン〜１ｍｍの間である。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの深さは、約１ｍｍ〜約２ｍｍの間である。一部の実施形態では、１個または複数のフローセルまたはマイクロウェルアレイチャンバーは、シリコン、石英ガラス、ガラス、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；エラストマー）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリイミド、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、エポキシ樹脂、金属またはこれらの材料の組合せからなる群より選択される材料から製作される。一部の実施形態では、デバイスは、自動マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うように構成された機器システムの着脱可能な消費可能な成分を含む。一部の実施形態では、カートリッジは、カートリッジに分注または注射された細胞試料またはビーズ懸濁液の自己計量をもたらすためのバイパスチャネルまたは他の設計特色をさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、デバイスを通る流体の流れを制御するための統合されたミニチュアポンプをさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、予めロードされた試薬を区画化し、デバイスを通る流体の流れを制御するための統合されたミニチュア弁をさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、捕捉された空気のエスケープ通路を提供するためのベントをさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、経路長を有効に増加させ、マイクロウェル間の分子の拡散を防ぐまたは最小化する物理的または化学的障壁を作製するための設計要素をさらに含み、設計要素は、少なくとも第１のマイクロウェルアレイへの細胞およびビーズの送達のための蛇行チャネルのパターン、少なくとも第１のマイクロウェルアレイの表面との接触にプレスされる収納できるプラテンもしくは変形可能な膜、またはカートリッジ内のリザーバーからの不混和性の疎水性流体の放出からなる群より選択される。一部の実施形態では、カートリッジは、外部機器システムとの優れた熱接触を提供するための統合された温度制御成分または統合された熱インターフェイスをさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、少なくとも第１のマイクロウェルアレイの光学イメージングのための光学インターフェイスまたは窓をさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、スタンドアロンＰＣＲサーマルサイクラーおよび／または配列決定機器とインターフェイスするように構成された１個または複数の着脱可能な試料収集チャンバーをさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジそれ自体が、スタンドアロンＰＣＲサーマルサイクラーおよび／または配列決定機器と直接的にインターフェイスするように構成されている。
【０７２４】
一態様では、本開示は、少なくとも第１のマイクロウェルアレイをさらに含む少なくとも第１のフローセルまたはカートリッジと、流動制御器とを含む機器システムを提供し、流動制御器は、少なくとも第１のマイクロウェルアレイへの細胞試料、ビーズに基づくオリゴヌクレオチド標識化試薬および他のアッセイ試薬の送達を制御し、機器システムは、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うように構成されている。
【０７２５】
一部の実施形態では、少なくとも第１のマイクロウェルアレイは、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、少なくとも第１のフローセルは、システムの固定された成分である。一部の実施形態では、少なくとも第１のフローセルは、システムの着脱可能な消費可能な成分である。一部の実施形態では、少なくとも第１のカートリッジは、システムの着脱可能な消費可能な成分である。一部の実施形態では、細胞試料およびビーズに基づくオリゴヌクレオチド試薬は、ユーザーによってカートリッジに直接的に分注または注射される。一部の実施形態では、細胞試料以外のアッセイ試薬は、カートリッジに予めロードされている。一部の実施形態では、機器システムは、少なくとも第１のマイクロウェルアレイをイメージングするためのイメージングシステムをさらに含む。一部の実施形態では、機器システムは、少なくとも第１のマイクロウェルアレイにわたる細胞およびビーズの均一な分布を容易にするための細胞またはビーズ分布システムをさらに含み、前記分布システムの根底にある機構は、振動、振盪、回旋、再循環流、低頻度揺動または高頻度揺動からなる群より選択される。一部の実施形態では、機器システムは、細胞溶解システムをさらに含み、システムは、細胞を超音波処理するために高周波圧電変換器を使用する。一部の実施形態では、機器システムは、ユーザーが指定した温度を維持するため、または２種もしくはそれを超える指定された時間間隔にわたり２種もしくはそれを超える指定された温度間の温度に傾斜をつけるための温度制御器をさらに含む。一部の実施形態では、機器システムは、マイクロウェルからのビーズの溶出における使用のための磁場制御器をさらに含む。一部の実施形態では、機器システムは、ユーザーインターフェイスおよびシステム機能の制御をもたらすようにプログラムされたコンピュータまたはプロセッサをさらに含む。一部の実施形態では、機器システムは、リアルタイム画像分析能力を提供するためのプログラムコードをさらに含む。一部の実施形態では、最適な細胞／ビーズ分布が達成されるまで、細胞およびビーズ試料ロードステップを延長または反復することができるように、リアルタイム画像分析および機器制御機能はカップリングされる。一部の実施形態では、機器システムは、オリゴヌクレオチド標識の増幅のための統合されたＰＣＲサーマルサイクラーをさらに含む。一部の実施形態では、機器システムは、オリゴヌクレオチドライブラリーを配列決定し、これにより、試料収集から解答までの（ｓａｍｐｌｅ−ｔｏ−ａｎｓｗｅｒ）能力をもたらすための統合されたシーケンサーをさらに含む。一部の実施形態では、細胞試料は、患者試料を含み、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイの結果は、臨床診断適用に使用される。一部の実施形態では、細胞試料は、患者試料を含み、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイの結果は、ヘルスケア提供者によって使用されて、情報に基づくヘルスケア処置判断を下す。
【０７２６】
一態様では、本開示は、次の配列データ分析機能のうち１種または複数を行うようにプログラムされたコンピュータ可読媒体に存するソフトウェアを提供する：細胞１個当たりの遺伝子１種当たりのリードの数および細胞１個当たりの遺伝子１種当たりの特有の転写物分子の数の決定；細胞１個当たりの遺伝子１種当たりの転写物分子の数の決定のための信頼区間を予測するための主成分分析または他の統計分析；公知参照配列と遺伝子配列データの整列；試料バーコード、細胞バーコードおよび分子バーコードのデコード／逆マルチプレックス化；ならびに増幅または配列決定誤差を補償するための分子標識の自動クラスタリング；配列データは、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うことによって作成される。
【０７２７】
一態様では、本開示は、固体支持体を含む組成物を提供し、固体支持体は、複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、細胞性標識および分子標識を含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の細胞性標識は同じであり、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の分子標識は異なる。
【０７２８】
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、試料標識をさらに含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、標的結合領域をさらに含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、標的核酸にハイブリダイズするように適応された配列を含む。一部の実施形態では、標的核酸は、生物のトランスクリプトームの転写物の少なくとも０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を含む複数の標的核酸を含む。一部の実施形態では、標的核酸は、ＤＮＡである。一部の実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡである。一部の実施形態では、標的核酸は、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡは、剪断されている。一部の実施形態では、剪断されたゲノムＤＮＡは、生物のゲノムの遺伝子の少なくとも０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、ランダムマルチマー、例えば、ランダムダイマー、トリマー、クアトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーもしくはいずれかの長さのより高次のマルチマー配列；遺伝子特異的プライマー；およびオリゴｄＴ；またはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される配列を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、ユニバーサル標識を含む。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、配列決定プライマーの結合部位を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、リンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、官能基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、オリゴヌクレオチドに対し５’に位置する。一部の実施形態では、リンカーは、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒドおよびケトンまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、固体支持体は、ポリスチレンで構成される。一部の実施形態では、固体支持体は、磁性である。一部の実施形態では、固体支持体は、ＰＤＭＳ固体支持体、ガラス固体支持体、ポリプロピレン固体支持体、アガロース固体支持体、ゼラチン固体支持体、磁性固体支持体およびプルロニック固体支持体またはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズを含む。一部の実施形態では、固体支持体は、約２０ミクロンの直径を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、約５ミクロン〜約４０ミクロンの直径を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、官能基を含む。一部の実施形態では、官能基は、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒドおよびケトンまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、細胞性標識は、複数の細胞性標識を含む。一部の実施形態では、複数の細胞性標識は、複数のリンカー標識配列が散在する。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、１０，０００〜１０億種のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、１０，０００〜１０億種の標的結合領域を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、１０，０００〜１０億種の異なる標的結合領域を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、１０，０００〜１０億種の同じ標的結合領域を含む。一部の実施形態では、異なる標的結合領域は、生物のトランスクリプトームの転写物の少なくとも０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％にハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、異なる標的結合領域は、生物のトランスクリプトームの転写物の少なくとも０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％にハイブリダイズすることができる。
【０７２９】
一態様では、本開示は、固体支持体を含む組成物を提供し、固体支持体は、複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、細胞性標識および分子標識を含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の細胞性標識は同じであり、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の分子標識は異なる。
【０７３０】
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、試料標識をさらに含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、標的結合領域をさらに含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、標的核酸にハイブリダイズするように適応された配列を含む。一部の実施形態では、標的核酸は、生物のトランスクリプトームの転写物の少なくとも０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を含む複数の標的核酸を含む。一部の実施形態では、標的核酸は、剪断されたゲノムＤＮＡを含み、剪断されたゲノムＤＮＡは、生物のゲノムの遺伝子の少なくとも０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、オリゴｄＴを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドは、第１の細胞性標識および第１の分子標識を含み、第１の細胞性標識は、第１のランダム配列、第２のランダム配列および第１のリンカー標識配列を含み、第１のリンカー標識配列は、第１のランダム配列および第２のランダム配列を接続し、第１の分子標識は、ランダム配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、第２の細胞性標識および第２の分子標識を含み、第２の細胞性標識は、第３のランダム配列、第４のランダム配列および第２のリンカー標識配列を含み、第２のリンカー標識配列は、第３のランダム配列および第４のランダム配列を接続し、第２の分子標識は、ランダム配列を含み、第１の細胞性標識および第２の細胞性標識は同じであり、第１の分子標識および第２の分子標識は異なる。
【０７３１】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されているいずれかの組成物と、使用説明書とを含むキットを提供する。
【０７３２】
一態様では、本開示は、試料を固体支持体と接触させるステップであって、固体支持体が、複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種が、細胞性標識および分子標識を含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の細胞性標識が同じであり、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の分子標識が異なるステップと、複数のオリゴヌクレオチドの１オリゴヌクレオチドに試料由来の標的核酸をハイブリダイズさせるステップとを含む方法を提供する。
【０７３３】
一部の実施形態では、試料は、細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、ハイブリダイズさせるステップの前に溶解される。一部の実施形態では、ハイブリダイズさせるステップは、複数のオリゴヌクレオチドに同じ標的核酸の複数コピーをハイブリダイズさせるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、標的核酸を逆転写するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチド増幅を行うステップをさらに含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲおよびデジタルＰＣＲまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される方法を使用した増幅を含む。
【０７３４】
一態様では、本開示は、第１のランダム配列、第２のランダム配列および第１のリンカー標識配列を含む第１の細胞性標識であって、第１のリンカー標識配列が、第１のランダム配列および第２のランダム配列を接続する第１の細胞性標識；ならびにランダム配列を含む第１の分子標識を含む第１のオリゴヌクレオチドと、第３のランダム配列、第４のランダム配列および第２のリンカー標識配列を含む第２の細胞性標識であって、第２のリンカー標識配列が、第３のランダム配列および第４のランダム配列を接続する第２の細胞性標識；ならびにランダム配列を含む第２の分子標識を含む第２のオリゴヌクレオチドとを含む固体支持体を提供し、第１の細胞性標識および第２の細胞性標識は同じであり、第１の分子標識および第２の分子標識は異なる。一部の実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、同一試料指標領域をさらに含む。一部の実施形態では、試料指標領域は、ランダム配列を含む。一部の実施形態では、試料指標領域は、４〜１２個のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、細胞性標識は、分子標識に直接的に付着させる。一部の実施形態では、細胞性標識および分子標識は、リンカー標識配列により付着させる。一部の実施形態では、細胞性標識のランダム配列は、４〜１２個のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、細胞性標識の定常配列は、少なくとも４個のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、細胞性標識は、少なくとも１２個のヌクレオチドの総計の長さを有する。一部の実施形態では、細胞性標識は、１種または複数の追加的なランダム配列をさらに含む。一部の実施形態では、細胞性標識は、１種または複数の追加的なリンカー標識配列をさらに含む。一部の実施形態では、１種または複数の追加的なリンカー標識配列は、１種または複数の追加的なランダム配列を接続する。一部の実施形態では、分子標識のランダム配列は、４〜１２個のヌクレオチドの長さである。
【０７３５】
一態様では、本開示は、固体支持体を含む組成物を提供し、固体支持体は、複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、細胞性標識、分子標識；および標的結合領域；および複数の標的核酸を含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の細胞性標識は同じであり、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の分子標識は異なる。
【０７３６】
一部の実施形態では、標的結合領域は、複数の標的核酸のうち少なくとも１種にハイブリダイズするように適応された配列を含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、ランダムマルチマー、例えば、ランダムダイマー、トリマー、クアトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーもしくはいずれかの長さのより高次のマルチマー配列；遺伝子特異的プライマー；およびオリゴｄＴ；またはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される配列を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、１０，０００〜１０億種のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、複数の標的核酸の標的核酸の数を超える多数のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数の標的核酸は、同じ標的核酸の複数コピーを含む。一部の実施形態では、複数の標的核酸は、異なる標的核酸の複数コピーを含む。一部の実施形態では、複数の標的核酸は、複数のオリゴヌクレオチドに結合される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、試料標識をさらに含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、ユニバーサル標識を含む。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、配列決定プライマーの結合部位を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、リンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、官能基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、オリゴヌクレオチドに対し５’に位置する。一部の実施形態では、官能基は、アミノ基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒドおよびケトンまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、固体支持体は、ポリスチレンで構成される。一部の実施形態では、固体支持体は、磁性である。一部の実施形態では、固体支持体は、ＰＤＭＳ固体支持体、ガラス固体支持体、ポリプロピレン固体支持体、アガロース固体支持体、ゼラチン固体支持体、磁性固体支持体およびプルロニック固体支持体またはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズを含む。一部の実施形態では、固体支持体は、約２０ミクロンの直径を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、約５ミクロン〜約４０ミクロンの直径を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、官能基を含む。一部の実施形態では、官能基は、カルボキシ基を含む。一部の実施形態では、官能基は、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒドおよびケトンまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、細胞性標識は、複数の細胞性標識を含む。一部の実施形態では、複数の細胞性標識は、複数のリンカー標識配列が散在する。
【０７３７】
一態様では、本開示は、第１の固体支持体であって、第１の固体支持体が、第１の複数のオリゴヌクレオチドを含み、第１の複数のオリゴヌクレオチドが、同じ第１の細胞性標識を含む第１の固体支持体と、第２の固体支持体であって、第２の固体支持体が、第２の複数のオリゴヌクレオチドを含み、第２の複数のオリゴヌクレオチドが、同じ第２の細胞性標識を含む第２の固体支持体と、使用説明書とを含むキットを提供し、第１の細胞性標識および第２の細胞性標識は異なる。
【０７３８】
一部の実施形態では、第１の複数のオリゴヌクレオチドおよび第２の複数のオリゴヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドは、分子標識を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの分子標識は異なる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの分子標識は同じである。一部の実施形態では、一部のオリゴヌクレオチドの分子標識は異なり、一部は同じである。一部の実施形態では、第１の複数のオリゴヌクレオチドおよび第２の複数のオリゴヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドは、標的結合領域を含む。一部の実施形態では、キットは、マイクロウェルアレイをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、バッファーをさらに含む。一部の実施形態では、バッファーは、再構成バッファー、希釈バッファーおよび安定化バッファーまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。
【０７３９】
一態様では、本開示は、試料を固体支持体と接触させるステップであって、固体支持体は、複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、細胞性標識および分子標識を含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の細胞性標識は同じであり、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の分子標識は異なるステップと、複数のオリゴヌクレオチドの１オリゴヌクレオチドに試料由来の標的核酸をハイブリダイズさせるステップとを含む、標的核酸の量を決定するための方法を提供する。
【０７４０】
一部の実施形態では、試料は、細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、ハイブリダイズさせるステップの前に溶解される。一部の実施形態では、ハイブリダイズさせるステップは、複数のオリゴヌクレオチドに同じ標的核酸の複数コピーをハイブリダイズさせるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、標的核酸を増幅するステップをさらに含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、標的核酸を逆転写するステップを含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲおよびデジタルＰＣＲまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される方法を使用した増幅を含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、固体支持体上で直接的に行われる。一部の実施形態では、増幅するステップは、固体支持体から転写された鋳型上で行われる。一部の実施形態では、方法は、標的核酸を配列決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、配列決定するステップは、標的核酸および分子標識を配列決定するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、標的核酸の量を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、決定するステップは、標的核酸のレベルを定量化するステップを含む。一部の実施形態では、決定するステップは、標的核酸のための配列決定された分子標識の数を計数するステップを含む。一部の実施形態では、接触させるステップは、マイクロウェル中で行う。一部の実施形態では、マイクロウェルは、親水性プラスチック、プラスチック、エラストマーおよびヒドロゲルまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される材料から作製される。一部の実施形態では、マイクロウェルは、アガロースを含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、マイクロウェルアレイの１個のマイクロウェルである。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイは、少なくとも９０個のマイクロウェルを含む。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイは、少なくとも１５０，０００個のマイクロウェルを含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、ウェル１個当たり少なくとも１個の固体支持体を含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、ウェル１個当たり最大でも２個の固体支持体を含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、固体支持体の最大でも２個を収容するサイズのものである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、最大でも１個の固体支持体を収容するサイズのものである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、少なくとも２５ミクロンの深さである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、少なくとも２５ミクロンの直径である。
【０７４１】
一態様では、本開示は、固体支持体に試料を接触させるステップであって、固体支持体が、複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種が、細胞性標識および分子標識を含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の細胞性標識が同じであり、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の分子標識が異なるステップと、複数のオリゴヌクレオチドに試料由来の標的核酸をハイブリダイズさせるステップと、標的核酸またはその相補体を増幅するステップと、標的核酸またはその相補体を配列決定するステップであって、標的核酸またはその相補体、および標的核酸またはその相補体が結合されるオリゴヌクレオチドの分子標識を配列決定するステップと、標的核酸の量を決定するステップとを含む、標的核酸の増幅バイアスを低下させる方法を提供する。
【０７４２】
一部の実施形態では、ハイブリダイズさせるステップは、複数のオリゴヌクレオチドに同じ標的核酸の複数コピーをハイブリダイズするステップを含む。一部の実施形態では、決定するステップは、同じ標的核酸のための多数の配列決定された分子標識を計数するステップを含む。一部の実施形態では、計数するステップは、同じ標的核酸のコピーの数を計数する。一部の実施形態では、試料は、細胞を含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、標的核酸を逆転写するステップを含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲおよびデジタルＰＣＲまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される方法を使用した増幅を含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、固体支持体上で直接的に行われる。一部の実施形態では、増幅するステップは、固体支持体から転写される鋳型上で行われる。
【０７４３】
一態様では、本開示は、マイクロウェル；細胞；および固体支持体を含む組成物を提供し、固体支持体は、複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、細胞性標識および分子標識を含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の細胞性標識は同じであり、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の分子標識は異なる。
【０７４４】
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、試料標識をさらに含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、標的結合領域をさらに含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、ランダムマルチマー、例えば、ランダムダイマー、トリマー、クアトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーもしくはいずれかの長さのより高次のマルチマー配列；遺伝子特異的プライマー；およびオリゴｄＴ；またはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される配列を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、ユニバーサル標識を含む。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、配列決定プライマー（ｐｒｕｍｅｒ）のための結合部位を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、ポリスチレンで構成される。一部の実施形態では、固体支持体は、磁性である。一部の実施形態では、固体支持体は、ＰＤＭＳ固体支持体、ガラス固体支持体、ポリプロピレン固体支持体、アガロース固体支持体、ゼラチン固体支持体、磁性固体支持体およびプルロニック固体支持体またはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズを含む。一部の実施形態では、固体支持体は、約２０ミクロンの直径を有する。一部の実施形態では、固体支持体は、約５ミクロン〜約４０ミクロンの直径を有する。一部の実施形態では、細胞性標識は、複数の細胞性標識を含む。一部の実施形態では、複数の細胞性標識は、複数のリンカー配列が散在する。一部の実施形態では、マイクロウェルは、親水性プラスチック、プラスチック、エラストマーおよびヒドロゲルまたはこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される材料から作製される。一部の実施形態では、マイクロウェルは、アガロースを含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、マイクロウェルアレイのマイクロウェルである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、ウェル１個当たり少なくとも１個の固体支持体を含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、ウェル１個当たり最大でも２個の固体支持体を含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、固体支持体の少なくとも１個および細胞の少なくとも１個を収容するサイズのものである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、固体支持体の最大でも１個および細胞の少なくとも１個を収容するサイズのものである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、少なくとも２５ミクロンの深さである。一部の実施形態では、マイクロウェルは、少なくとも２５ミクロンの直径である。一部の実施形態では、マイクロウェルは平坦である。
【０７４５】
一態様では、本開示は、複数のマイクロウェルを含むデバイスを提供し、複数のマイクロウェルは、少なくとも２個のマイクロウェルを含み、複数のマイクロウェルの各マイクロウェルは、約１，０００μｍ3〜約１２０，０００μｍ3に及ぶ容積を有する。一部の実施形態では、複数のマイクロウェルの各マイクロウェルは、約２０，０００μｍ3の容積を有する。一部の実施形態では、複数のマイクロウェルは、約１，０００〜約５，０００，０００個のマイクロウェルを含む。一部の実施形態では、複数のマイクロウェルは、約１００，０００〜約２００，０００個のマイクロウェルを含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、材料の単一の層中に含まれる。一部の実施形態では、マイクロウェルの少なくとも約１０％は、細胞をさらに含む。一部の実施形態では、マイクロウェルの少なくとも約１０％は、複数のオリゴヌクレオチドを含む固体支持体をさらに含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種は、細胞性標識および分子標識を含み、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の細胞性標識は同じであり、複数のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２種の分子標識は異なる。一部の実施形態では、固体支持体は磁化されている。
【０７４６】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されているいずれかのデバイスと、液体ハンドラーとを含む装置を提供する。
【０７４７】
一部の実施形態では、液体ハンドラーは、約１秒間で複数のマイクロウェルに液体を送達する。一部の実施形態では、装置は、単一の入力ポートから複数のマイクロウェルに液体を送達する。一部の実施形態では、装置は、磁石をさらに含む。一部の実施形態では、装置は、入口ポート、出口ポート、ポンプ、弁、ベント、リザーバー、試料収集チャンバー、温度制御装置またはこれらのいずれかの組合せのうち少なくとも１種をさらに含む。一部の実施形態では、装置は、試料収集チャンバーを含み、試料収集チャンバーは、装置から着脱可能である。一部の実施形態では、装置は、光学撮像器をさらに含む。一部の実施形態では、光学撮像器は、液体ハンドラーの制御に使用される出力シグナルを生成する。一部の実施形態では、装置は、オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うように構成された熱サイクリング機構をさらに含む。
【０７４８】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されているいずれかのデバイスまたは装置により臨床診断検査結果を生成するステップを含む、臨床診断検査結果を生成する方法を提供する。一部の実施形態では、臨床診断検査結果は、通信媒体を介して伝達される。
【０７４９】
一態様では、本開示は、１個または複数のマイクロウェルアレイをさらに含む１個または複数の基材を含むデバイスを提供し、マイクロウェルアレイを使用して、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行う。
【０７５０】
一部の実施形態では、基材のマイクロウェルアレイは、一次元または二次元アレイパターンに配置されたマイクロウェルを含む。一部の実施形態では、マイクロウェルの二次元アレイパターンは、正方格子、矩形格子または六角格子を含む群より選択される。
【０７５１】
一部の実施形態では、マイクロウェルアレイのマイクロウェルは、円柱状、円錐体、半球状、矩形または多角体を含む群より選択されるウェル幾何学を使用して製作される。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイのマイクロウェルは、円柱状、円錐体、半球状、矩形または多角体を含む群より選択される２種またはそれを超える成分幾何学を含む全体的幾何学を使用して製作される。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイにおけるマイクロウェルの直径は、約５ミクロン〜約５０ミクロンの間である。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイにおけるマイクロウェルの深さは、約１０ミクロン〜約６０ミクロンの間である。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイにおけるマイクロウェル間の中心間スペーシングは、約１５ミクロン〜約７５ミクロンの間である。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイのそれぞれにおけるマイクロウェルの総数は、約９６〜約５，０００，０００個の間である。一部の実施形態では、１個または複数の基材は、シリコン、石英ガラス、ガラス、ポリマーまたは金属を含む群より選択される材料から製作される。一部の実施形態では、１個または複数の基材は、アガロースまたはヒドロゲルから製作される。一部の実施形態では、マイクロウェルアレイは、マイクロウェルを囲むまたはマイクロウェル間の表面にまたがるマイクロウェル間の表面特色をさらに含み、ドーム、隆線またはピークがある表面特色を含む群より選択される。
【０７５２】
一態様では、本開示は、１個または複数のマイクロウェルアレイをさらに含む基材と、頂部プレート、底部プレートおよびガスケットを含む機械的治具とを含むデバイスを提供し、組み立てられると、基材は、ガスケットおよび底部プレートの間にポジショニングされ、ガスケットは、基材と漏れ止め封着を形成し、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行う目的で、１種または複数の細胞試料およびビーズに基づくオリゴヌクレオチド標識をチャンバーに分注することができるように、頂部プレートおよびガスケットは、マイクロウェルアレイを包含する１個または複数のチャンバーを形成する。
【０７５３】
一部の実施形態では、基材は、本明細書に記載されているいずれか１個または複数のマイクロウェルアレイを含む。一部の実施形態では、ガスケットは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または同様のエラストマー材料から製作される。一部の実施形態では、頂部および底部プレートは、アルミニウム、陽極処理アルミニウム、ステンレス鋼、テフロン（登録商標）、ポリメタクリル酸メチル、ポリカーボネートまたは同様の硬質ポリマー材料から製作される。
【０７５４】
一態様では、本開示は、１個または複数のマイクロウェルアレイをさらに含む１個または複数の基材と、１個または複数のフローセルとを含むデバイスを提供し、１個または複数のフローセルは、１個または複数の基材を包囲するかまたはこれに付着され、マイクロウェルアレイに流体を送達する目的の少なくとも１個の入口ポートおよび少なくとも１個の出口ポートを含み、デバイスを使用して、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行う。
【０７５５】
一部の実施形態では、１個または複数の基材は、本明細書に記載されているいずれか１個または複数のマイクロウェルアレイを含む。一部の実施形態では、１個または複数のフローセルのそれぞれは、１種または複数の試料を並行して処理することができるように、複数のマイクロウェルアレイとインターフェイスする複数のマイクロアレイチャンバーをさらに含む。一部の実施形態では、１個または複数のフローセルは、マイクロウェルアレイへの細胞およびビーズのより均一な送達をもたらすための多孔性障壁または流動拡散器をさらに含む。一部の実施形態では、１個または複数のフローセルは、マイクロウェルアレイを含有するチャンバーを、同じ総アレイ面積をまとめて覆うサブセクションに分割し、マイクロウェルアレイへの細胞およびビーズのより均一な送達をもたらす分割器をさらに含む。一部の実施形態では、デバイスに取り込まれる流体チャネルの幅は、約５０ミクロン〜２０ｍｍの間である。一部の実施形態では、デバイスに取り込まれる流体チャネルの深さは、約５０ミクロン〜約２ｍｍの間である。一部の実施形態では、１個または複数のフローセルは、シリコン、石英ガラス、ガラス、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；エラストマー）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリイミド、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、エポキシ樹脂、金属またはこれらの材料の組合せからなる群より選択される材料から製作される。一部の実施形態では、デバイスは、自動マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うための機器システムの固定された成分を含む。一部の実施形態では、デバイスは、自動マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うための機器システムの着脱可能な成分を含む。
【０７５６】
一態様では、本開示は、１個または複数のマイクロウェルアレイをさらに含む１個または複数の基材；１個または複数のフローセルまたはマイクロウェルアレイチャンバー；１個または複数の試料または試薬リザーバーを含むカートリッジを提供し、カートリッジは、マイクロウェルアレイに流体を送達する目的の、少なくとも１個の入口ポートおよび少なくとも１個の出口ポートをさらに含み、カートリッジを使用して、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行う。
【０７５７】
一部の実施形態では、１個または複数の基材は、本明細書に記載されているいずれか１個または複数のマイクロウェルアレイを含む。一部の実施形態では、１個または複数のフローセルまたはマイクロウェルアレイチャンバーは、１種または複数の試料を並行して処理することができるように、複数のマイクロウェルアレイとインターフェイスする。一部の実施形態では、１個または複数のフローセルまたはマイクロウェルアレイチャンバーは、マイクロウェルアレイへの細胞およびビーズのより均一な送達をもたらすための多孔性障壁または流動拡散器をさらに含む。一部の実施形態では、１個または複数のフローセルまたはマイクロウェルアレイチャンバーは、フローセルまたはチャンバーを、同じ総アレイ面積をまとめて覆うサブセクションに分割し、マイクロウェルアレイへの細胞およびビーズのより均一な送達をもたらす分割器をさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの幅は、約５０ミクロン〜２００ミクロンの間である。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの幅は、約２００ミクロン〜２ｍｍの間である。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの幅は、約２ｍｍ〜１０ｍｍの間である。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの幅は、約１０ｍｍ〜２０ｍｍの間である。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの深さは、約５０ミクロン〜約１０ｍｍの間である。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの深さは、約５００ミクロン〜１ｍｍの間である。一部の実施形態では、カートリッジに取り込まれる流体チャネルの深さは、約１ｍｍ〜約２ｍｍの間である。一部の実施形態では、１個または複数のフローセルまたはマイクロウェルアレイチャンバーは、シリコン、石英ガラス、ガラス、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；エラストマー）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリイミド、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、エポキシ樹脂、金属またはこれらの材料の組合せからなる群より選択される材料から製作される。一部の実施形態では、デバイスは、自動マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うための機器システムの着脱可能な消費可能な成分を含む。一部の実施形態では、カートリッジは、カートリッジに分注または注射された細胞試料またはビーズ懸濁液の自己計量をもたらすためのバイパスチャネルまたは他の設計特色をさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、デバイスを通る流体の流れを制御するための統合されたミニチュアポンプをさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、予めロードされた試薬を区画化し、デバイスを通る流体の流れを制御するための統合されたミニチュア弁をさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、捕捉された空気のエスケープ通路を提供するためのベントをさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、経路長を有効に増加させ、マイクロウェル間の分子の拡散を防ぐまたは最小化する物理的または化学的障壁を作製するための設計要素をさらに含み、設計要素は、マイクロウェルアレイへの細胞およびビーズの送達のための蛇行チャネルのパターン、マイクロウェルアレイの表面との接触にプレスされる収納できるプラテンもしくは変形可能な膜、またはカートリッジ内のリザーバーからの不混和性の疎水性流体の放出からなる群より選択される。一部の実施形態では、カートリッジは、外部機器システムとの優れた熱接触を提供するための統合された温度制御成分または統合された熱インターフェイスをさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、１個または複数のマイクロウェルアレイの光学イメージングのための光学インターフェイスまたは窓をさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、スタンドアロンＰＣＲサーマルサイクラーおよび／または配列決定機器とインターフェイスするように構成された１個または複数の着脱可能な試料収集チャンバーをさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジそれ自体が、スタンドアロンＰＣＲサーマルサイクラーおよび／または配列決定機器と直接的にインターフェイスするように構成されている。
【０７５８】
一態様では、本開示は、１個または複数のマイクロウェルアレイをさらに含む１個または複数のフローセルまたはカートリッジと、流動制御器とを含む機器システムを提供し、流動制御器は、マイクロウェルアレイへの細胞試料、ビーズに基づくオリゴヌクレオチド標識化試薬および他のアッセイ試薬の送達を制御し、機器システムを使用して、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行う。
【０７５９】
一部の実施形態では、１個または複数のマイクロウェルアレイは、本明細書に記載されているいずれかである。一部の実施形態では、１個または複数のフローセルは、システムの固定された成分である。一部の実施形態では、１個または複数のフローセルは、システムの着脱可能な消費可能な成分である。一部の実施形態では、１個または複数のカートリッジは、システムの着脱可能な消費可能な成分である。一部の実施形態では、細胞試料およびビーズに基づくオリゴヌクレオチド試薬は、ユーザーによってカートリッジに直接的に分注または注射される。一部の実施形態では、細胞試料以外のアッセイ試薬は、カートリッジに予めロードされている。一部の実施形態では、機器システムは、マイクロウェルアレイをイメージングするためのイメージングシステムをさらに含む。一部の実施形態では、機器システムは、マイクロウェルアレイにわたる細胞およびビーズの均一な分布を容易にするための細胞またはビーズ分布システムをさらに含み、分布システムの根底にある機構は、振動、振盪、回旋、再循環流、低頻度揺動または高頻度揺動からなる群より選択される。一部の実施形態では、機器システムは、細胞溶解システムをさらに含み、システムは、細胞を超音波処理するための高周波圧電変換器を使用する。一部の実施形態では、機器システムは、ユーザーが指定した温度を維持するため、または２種もしくはそれを超える指定された時間間隔にわたり２種もしくはそれを超える指定された温度間の温度に傾斜をつけるための温度制御器をさらに含む。一部の実施形態では、機器システムは、マイクロウェルからのビーズの溶出における使用のための磁場制御器をさらに含む。一部の実施形態では、機器システムは、ユーザーインターフェイスおよびシステム機能の制御をもたらすようにプログラムされたコンピュータまたはプロセッサをさらに含む。一部の実施形態では、機器システムは、リアルタイム画像分析能力をもたらすためのプログラムコードをさらに含む。一部の実施形態では、最適な細胞／ビーズ分布が達成されるまで、細胞およびビーズ試料ロードステップを延長または反復することができるように、リアルタイム画像分析および機器制御機能はカップリングされる。一部の実施形態では、機器システムは、オリゴヌクレオチド標識の増幅のための統合されたＰＣＲサーマルサイクラーをさらに含む。一部の実施形態では、機器システムは、オリゴヌクレオチドライブラリーを配列決定し、これにより、試料収集から解答までの能力をもたらすための統合されたシーケンサーをさらに含む。一部の実施形態では、細胞試料は、患者試料を含み、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイの結果は、臨床診断適用に使用される。一部の実施形態では、細胞試料は、患者試料を含み、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイの結果は、ヘルスケア提供者によって使用されて、情報に基づくヘルスケア処置判断を下す。
【０７６０】
一態様では、本開示は、次の配列データ分析のうち１種または複数を行うようにプログラムされたコンピュータ可読媒体に存するソフトウェアを提供する：細胞１個当たりの遺伝子１種当たりのリードの数および細胞１個当たりの遺伝子１種当たりの特有の転写物分子の数の決定；細胞１個当たりの遺伝子１種当たりの転写物分子の数の決定のための信頼区間を予測するための主成分分析または他の統計分析；公知参照配列と遺伝子配列データの整列；試料バーコード、細胞バーコードおよび分子バーコードのデコード／逆マルチプレックス化；ならびに増幅または配列決定誤差を補償するための分子標識の自動クラスタリング；配列データは、マルチプレックス化単一細胞確率論的標識化および分子指標化アッセイを行うことによって作成される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１２−１０】
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【図１２−１１】
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【図１２−１２】
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【図１２−１３】
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【図１２−１４】
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【図１２−１５】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１】
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【図５２−１】
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【図５２−２】
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【図５２−３】
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【図５２−４】
2019106998.tif 000162
【図５３】
2019106998.tif 000163
【図５４】
2019106998.tif 000164
【図５５】
2019106998.tif 000165
【図５６】
2019106998.tif 000166
【図５７】
2019106998.tif 000167
【図５８】
2019106998.tif 000168
【図５９】
2019106998.tif 000169
【図６０−１】
2019106998.tif 000170
【図６０−２】
2019106998.tif 000171
【図６０−３】
2019106998.tif 000172
【図６１】
2019106998.tif 000173
【図６２】
2019106998.tif 000174
【図６３】
2019106998.tif 000175
【図６４】
2019106998.tif 000176
【図６５】
2019106998.tif 000177
【図６６−１】
2019106998.tif 000178
【図６６−２】
2019106998.tif 000179
【図６７】
2019106998.tif 000180
【図６８】
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【図６９】
2019106998.tif 000182
【図７０】
2019106998.tif 000183
【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
2019106998.tif 000187
【図７５】
2019106998.tif 000188
【図７６】
2019106998.tif 000189
【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【配列表】
2019106998000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月28日(2019.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体を含む組成物であって、前記固体支持体が、複数のオリゴヌクレオチドを含み、前記複数のオリゴヌクレオチドの各々が、細胞性標識と分子標識を有し、各細胞標識が同じであり、前記複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも１００個の前記分子標識が異なっており、前記固体支持体がビーズを含み、前記複数のオリゴヌクレオチドが標的結合領域を更に有する、前記組成物。
【請求項２】
前記複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも１００００個の前記分子標識が異なる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記複数のオリゴヌクレオチドの前記標的結合領域が、オリゴｄＴ配列、遺伝子特異的配列、ランダムマルチマー配列又はその組合せを有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記複数のオリゴヌクレオチドの前記細胞性標識及び／又は分子標識が、少なくとも６個のヌクレオチド及び／又はランダム配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記複数のオリゴヌクレオチドが、各々、試料標識配列、ユニバーサル標識又はその組合せを有し、ここで、前記ユニバーサル標識がプライマー結合部位を有していてもよい、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記複数のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ビーズが、磁性ビーズであるか又はヒドロゲルを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記複数のオリゴヌクレオチドが、官能基を介してビーズに結合している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
単一細胞又は前記単一細胞のライセートを更に含み、且つ、前記単一細胞は、稀な細胞、がん細胞、腫瘍細胞、免疫細胞、組織由来の細胞、ヒト細胞、ウイルスを含む細胞又はその組合せであってもよい、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記複数のオリゴヌクレオチドが、核酸伸長反応を介して、前記単一細胞又は前記単一細胞のライセートに付随する標的分子の個々の出現を標識することができ、ここで前記核酸伸長反応は逆転写であってよく、及び／又は、
前記複数のオリゴヌクレオチドが、前記単一細胞又は前記単一細胞のライセートに付随する標的分子の個々の出現にハイブリダイズすることができる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記標的分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子又はその組合せを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記標的分子中のある標的分子はポリペプチドに付随するものであり、ここで、前記ポリペプチドは抗体であってよい、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の固体支持体を含む、複数の粒子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の複数の粒子を含むキットであって、
前記複数の粒子は、少なくとも３８４個の粒子を含んでいてもよく、且つ
前記複数の粒子は、マイクロ粒子又はナノ粒子を含んでいてもよい、前記キット。
【請求項１５】
請求項１３に記載の複数の粒子を含む、複数の区画であって、
前記複数の区画は、マイクロウェル、小液滴又はその組合せを含んでいてもよく、
前記複数の区画の少なくとも約１０％の各々は、前記複数の粒子の粒子を含んでいてもよく、
前記複数の区画の少なくとも約１０％の各々は、単一細胞を含んでいてもよい、
前記複数の区画。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の第１の固体支持体と請求項１〜１２のいずれか１項に記載の第２の固体支持体とを含むキットであって、
前記第１の固体支持体は、第１の複数のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１の複数のオリゴヌクレオチドは、同じ第１の細胞性標識を有し、
前記第２の固体支持体は、第２の複数のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第２の複数のオリゴヌクレオチドは、同じ第２の細胞性標識を有し、
前記第１の細胞性標識及び前記第２の細胞性標識は異なるものである、前記キット。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の固体支持体を含む、１種以上の溶液及び／又は１種以上の容器であって、
前記１種以上の溶液及び／又は１種以上の容器は、１種以上のマイクロウェル、小液滴又はその組合せであってよく、
前記溶液及び／又は容器の少なくとも約１０％の各々は、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の固体支持体を含んでいてもよく、且つ
前記１種以上の溶液及び／又は１種以上の容器の少なくとも１０％の各々は、単一細胞を含んでいてもよい、前記１種以上の溶液及び／又は１種以上の容器。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の新規特色は、添付の特許請求の範囲に特に表記されている。本発明の特色および利点のより十分な理解は、本発明の原理が利用されている説明的な実施形態を表記する次の詳細な説明と、次に示す添付の図面を参照することにより得られるであろう。
例えば、本発明は、以下を提供する。
〔１〕
以下：
（ａ）複数の細胞を含む試料を得るステップと、
（ｂ）前記複数の細胞の第１の細胞および前記複数の細胞の第２の細胞由来の２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の少なくとも一部を、以下：
（ｉ）前記第１の細胞に特異的な第１の同じ細胞標識および前記第２の細胞に特異的な第２の同じ細胞標識、ならびに
（ｉｉ）前記２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物のそれぞれに特異的な分子標識
で標識するステップと
を含む、方法であって、
前記第１の細胞由来の前記２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の各分子標識が、互いに対して特有であり、
前記第２の細胞由来の前記２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の各分子標識が、互いに対して特有である
方法。
〔２〕
前記２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子、その相補体またはその反応産物の少なくとも一部を配列決定するステップをさらに含む、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記配列決定するステップからの配列データを分析して、前記細胞のうち特定の１個における前記ポリヌクレオチドのうち多数の個々の分子を同定するステップをさらに含む、〔２〕に記載の方法。
〔４〕
前記細胞が、がん細胞である、〔１〕に記載の方法。
〔５〕
前記細胞が、ウイルスポリヌクレオチドに感染している、〔１〕に記載の方法。
〔６〕
前記細胞が、細菌または真菌である、〔１〕に記載の方法。
〔７〕
前記配列決定するステップが、少なくとも１００塩基のリード長で配列決定するステップを含む、〔２〕に記載の方法。
〔８〕
前記配列決定するステップが、少なくとも５００塩基のリード長で配列決定するステップを含む、〔２〕に記載の方法。
〔９〕
前記ポリヌクレオチド分子が、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡであり、前記その相補体およびその反応産物が、前記ｍＲＮＡまたは前記マイクロＲＮＡの相補体および反応産物である、〔１〕に記載の方法。
〔１０〕
前記分子標識が、ビーズ上にある、〔１〕に記載の方法。
〔１１〕
個々の細胞に特異的な前記標識が、ビーズ上にある、〔１〕に記載の方法。
〔１２〕
個々の細胞に特異的な前記標識および前記分子標識が、ビーズ上にある、〔１〕に記載の方法。
〔１３〕
少なくとも一部はエマルション中で行われる、〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４〕
少なくとも一部はアレイのウェルまたはマイクロウェル中で行われる、〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１５〕
疾患または状態に関連するポリヌクレオチドの存在が検出される、〔１〕〜〔１４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１６〕
前記疾患または前記状態が、がんである、〔１５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１７〕
マイクロＲＮＡ、その相補体またはその反応産物の少なくとも一部が検出される、〔１〕〜〔１６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１８〕
前記疾患または前記状態が、ウイルス感染症である、〔１５〕に記載の方法。
〔１９〕
前記ウイルス感染症が、エンベロープを有するウイルス由来である、〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕
前記ウイルス感染症が、エンベロープを有さないウイルス由来である、〔１８〕に記載の方法。
〔２１〕
前記ウイルスが、二本鎖であるウイルスＤＮＡを含有する、〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕
前記ウイルスが、一本鎖であるウイルスＤＮＡを含有する、〔２０〕に記載の方法。
〔２３〕
前記ウイルスが、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヘパドナウイルス、パポバウイルス、ポリオーマウイルスおよびこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される、〔１８〕に記載の方法。
〔２４〕
前記第１の細胞が、疾患も状態も有さない人物由来であり、前記第２の細胞が、前記疾患または前記状態を有する人物由来である、〔１〕〜〔２３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２５〕
前記人物が異なる、〔２４〕に記載の方法。
〔２６〕
前記人物が同じであるが、細胞が異なる時点で採取される、〔２４〕に記載の方法。
〔２７〕
前記第１の細胞が、前記疾患または前記状態を有する人物由来であり、前記第２の細胞が、同じ人物由来である、〔１〕〜〔２３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２８〕
前記試料における前記細胞が、組織または臓器由来の細胞を含む、〔１〕〜〔２３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２９〕
前記試料における前記細胞が、胸腺由来の細胞、白血球細胞、赤血球細胞、肝臓細胞、脾臓細胞、肺細胞、心臓細胞、脳細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、胃細胞、口腔由来の細胞、鼻腔由来の細胞、結腸細胞、小腸細胞、腎臓細胞、腺由来の細胞、脳細胞、神経細胞、グリア細胞、眼細胞、生殖器細胞、膀胱細胞、配偶子細胞、ヒト細胞、胎児細胞、羊膜細胞またはこれらのいずれかの組合せを含む、〔１〕〜〔２８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３０〕
細胞性標識および分子標識をそれぞれ含む複数のオリゴヌクレオチドを含む固体支持体であって、前記複数のオリゴヌクレオチドの各細胞性標識が同じであり、前記複数のオリゴヌクレオチドの各分子標識が異なり、ここで、
（ａ）前記固体支持体は、ビーズであり、
（ｂ）前記細胞性標識は、前記固体支持体に特異的であり、
（ｃ）前記固体支持体は、三次元デカルト座標系の中心に配置されたときに、８つのオクタントのうち少なくとも７つへと伸長するオリゴヌクレオチドを有し、または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組合せである
固体支持体。
〔３１〕
前記複数のオリゴヌクレオチドが、以下：
（ａ）試料標識
（ｂ）ユニバーサル標識、および
（ｃ）標的核酸結合領域
のうち少なくとも１種をさらに含む、〔３０〕に記載の固体支持体。
〔３２〕
前記固体支持体が、前記標的核酸結合領域を含み、前記標的核酸結合領域が、遺伝子特異的配列、オリゴｄＴ配列、ランダムマルチマーおよびこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される配列を含む、〔３１〕に記載の固体支持体。
〔３３〕
標的核酸またはその相補体をさらに含む、〔３１〕または〔３２〕に記載の固体支持体。
〔３４〕
（ａ）生物のトランスクリプトームの転写物もしくはその相補体の約０．０１％〜約１００％、または
（ｂ）生物のゲノムの遺伝子もしくはその相補体の約０．０１％〜約１００％
を含む複数の標的核酸またはその相補体を含む、〔３３〕に記載の固体支持体。
〔３５〕
（ａ）前記複数のオリゴヌクレオチドの前記細胞性標識が、第１の標識連結配列によって第２のランダム配列に接続された第１のランダム配列を含み、そして
（ｂ）前記複数のオリゴヌクレオチドの前記分子標識が、ランダム配列を含む、
〔３０〕〜〔３４〕のいずれか一項に記載の固体支持体。
〔３６〕
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）固体支持体、ポリスチレン固体支持体、ガラス固体支持体、ポリプロピレン固体支持体、アガロース固体支持体、ゼラチン固体支持体、磁性固体支持体、プルロニック固体支持体およびこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される、〔３０〕〜〔３５〕のいずれか一項に記載の固体支持体。
〔３７〕
（ａ）前記複数のオリゴヌクレオチドが、リンカー官能基を含むリンカーを含み、
（ｂ）前記固体支持体が、固体支持体官能基を含み、
前記固体支持体官能基および前記リンカー官能基は互いに接続する、
〔３０〕〜〔３５〕のいずれか一項に記載の固体支持体。
〔３８〕
前記リンカー官能基および前記固体支持体官能基が、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン（複数可）、アルデヒド（複数可）、ケトン（複数可）およびこれらのいずれかの組合せからなる群から個々に選択される、〔３７〕に記載の固体支持体。
〔３９〕
前記複数のオリゴヌクレオチドの分子標識が、少なくとも１５個のヌクレオチドを含む、〔３０〕〜〔３８〕のいずれか一項に記載の固体支持体。
〔４０〕
〔３０〕〜〔３９〕のいずれか一項に記載の固体支持体と、使用説明書とを含むキット。
〔４１〕
ウェルをさらに含む、〔４０〕に記載のキット。
〔４２〕
前記ウェルが、アレイ中に含まれる、〔４１〕に記載のキット。
〔４３〕
前記ウェルが、マイクロウェルである、〔４０〕〜〔４２〕のいずれか一項に記載のキット。
〔４４〕
バッファーをさらに含む、〔４０〕〜〔４３〕のいずれか一項に記載のキット。
〔４５〕
〔３０〕〜〔３９〕のいずれか一項に記載の固体支持体を含むエマルション。
〔４６〕
ウェルと、〔３０〕〜〔３９〕のいずれか一項に記載の固体支持体とを含む組成物。
〔４７〕
細胞と、〔３０〕〜〔３９〕のいずれか一項に記載の固体支持体とを含む組成物。
〔４８〕
細胞をさらに含む、〔４５〕に記載のエマルションまたは〔４６〕に記載の組成物。
〔４９〕
前記細胞が、単一細胞である、〔４７〕または〔４８〕のいずれか一項に記載の組成物またはエマルション。
〔５０〕
前記ウェルが、マイクロウェルである、〔４６〕に記載の組成物。
〔５１〕
前記マイクロウェルが、約１，０００μｍ3〜約１２０，０００μｍ3に及ぶ容積を有する、〔５０〕に記載の組成物。
〔５２〕
以下：
（ａ）試料を〔３０〕〜〔３２〕または〔３５〕〜〔３９〕のいずれか一項に記載の固体支持体と接触させるステップと、
（ｂ）複数のオリゴヌクレオチドの１オリゴヌクレオチドに前記試料由来の標的核酸をハイブリダイズさせるステップと
を含む、方法。
〔５３〕
（ｃ）前記標的核酸またはその相補体を増幅するステップ
をさらに含む、〔５２〕に記載の方法。
〔５４〕
（ｄ）前記標的核酸またはその相補体を配列決定するステップであって、前記標的核酸またはその相補体が結合される前記オリゴヌクレオチドの分子標識を配列決定することを含む、ステップ
をさらに含む、〔５３〕に記載の方法。
〔５５〕
（ｅ）前記標的核酸またはその相補体の量を決定するステップであって、前記ステップは、以下：
（ｉ）前記標的核酸またはその相補体のレベルを定量化すること、
（ｉｉ）同じ分子標識を含む配列の数を計数すること、あるいは
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せ
を含む、ステップをさらに含む、〔５４〕に記載の方法。
〔５６〕
いずれかの同じ分子標識またはいずれかの同じ細胞性標識を整列するステップを含まない、〔５４〕または〔５５〕に記載の方法。
〔５７〕
前記増幅するステップが、前記標的核酸を逆転写するステップを含む、〔５３〕〜〔５６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５８〕
前記増幅するステップが、ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲおよびこれらのいずれかの組合せからなる群より選択される方法を用いる、〔５３〕〜〔５７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５９〕
前記増幅するステップが、以下：
（ａ）前記固体支持体上で直接的に、
（ｂ）前記固体支持体から転写された鋳型上で、または
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組合せで
行われる、〔５３〕〜〔５８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６０〕
前記試料が、細胞を含む、〔５２〕〜〔５９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６１〕
前記細胞が、単一細胞である、〔６０〕に記載の方法。
〔６２〕
前記接触させるステップを、ウェル中で行う、〔５２〕〜〔６１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６３〕
前記ウェルが、マイクロウェルであり、マイクロウェルのアレイ中に含有される、〔６２〕に記載の方法。
〔６４〕
複数のマイクロウェルを含むデバイスであって、前記複数のマイクロウェルの各マイクロウェルが、約１，０００μｍ3〜約１２０，０００μｍ3に及ぶ容積を有する、デバイス。
〔６５〕
前記複数のマイクロウェルの各マイクロウェルが、約２０，０００μｍ3の容積を有する、〔６４〕に記載のデバイス。
〔６６〕
前記複数のマイクロウェルが、約９６個〜約２００，０００個のマイクロウェルを含む、〔６４〕または〔６５〕に記載のデバイス。
〔６７〕
前記マイクロウェルが、材料の層中に含まれる、〔６４〕〜〔６６〕のいずれか一項に記載のデバイス。
〔６８〕
前記マイクロウェルの少なくとも約１０％が、細胞をさらに含む、〔６４〕〜〔６７〕のいずれか一項に記載のデバイス。
〔６９〕
〔３０〕〜〔３９〕のいずれか一項に記載の固体支持体をさらに含む、〔６４〕〜〔６９〕のいずれか一項に記載のデバイス。
〔７０〕
〔６４〕〜〔６９〕のいずれか一項に記載のデバイスと、液体ハンドラーとを含む装置。
〔７１〕
前記液体ハンドラーが、約１秒間で複数のマイクロウェルに液体を送達する、〔７０〕に記載の装置。
〔７２〕
前記液体ハンドラーが、単一の入力ポートから前記複数のマイクロウェルに液体を送達する、〔７０〕または〔７１〕に記載の装置。
〔７３〕
磁石をさらに含む、〔７０〕〜〔７２〕のいずれか一項に記載の装置。
〔７４〕
入口ポート、出口ポート、ポンプ、弁、ベント、リザーバー、試料収集チャンバー、温度制御装置またはこれらのいずれかの組合せのうち少なくとも１種をさらに含む、〔７０〕〜〔７３〕のいずれか一項に記載の装置。
〔７５〕
前記試料収集チャンバーを含む、〔７４〕に記載の装置であって、前記試料収集チャンバーが、前記装置から着脱可能である、装置。
〔７６〕
光学撮像器をさらに含む、〔７０〕〜〔７５〕のいずれか一項に記載の装置。
〔７７〕
前記光学撮像器が、前記液体ハンドラーの制御に使用される出力シグナルを生成する、〔７６〕に記載の装置。
〔７８〕
オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うように構成された熱サイクリング機構をさらに含む、〔７０〕〜〔７７〕のいずれか一項に記載の装置。
〔７９〕
臨床診断検査結果を生成する方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）〔７０〕〜〔７８〕のいずれか一項に記載のデバイスもしくは装置、
（ｂ）〔３０〕〜〔３９〕のいずれか一項に記載の固体支持体、
（ｃ）〔１〕〜〔２９〕もしくは〔５２〕〜〔６３〕のいずれか一項に記載の方法、または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組合せ
により前記臨床診断検査結果を生成するステップを含む、方法。
〔８０〕
前記臨床診断検査結果が、通信媒体を介して伝達される、〔７９〕に記載の方法。
〔８１〕
〔３０〕〜〔３９〕のいずれか一項に記載の固体支持体を作製する方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）固体支持体に、以下：
（ｉ）細胞性標識の第１の部分、および
（ｉｉ）第１のリンカー
を含む第１のポリヌクレオチドを付着させるステップと、
（ｂ）以下：
（ｉ）前記細胞性標識の第２の部分、
（ｉｉ）前記第１のリンカーに相補的な配列、および
（ｉｉｉ）分子標識
を含む第２のポリヌクレオチドを接触させるステップと
を含む、方法。
〔８２〕
第３のポリヌクレオチドが、標的核酸結合領域をさらに含む、〔８１〕に記載の方法。
〔８３〕
パッケージ中に含有される、〔４０〕〜〔４４〕のいずれか一項に記載のキット。
〔８４〕
前記パッケージが、箱である、〔８３〕に記載のキット。
〔８５〕
前記パッケージまたは前記箱が、２立方フィートまたはそれに満たない容積を有する、〔８３〕または〔８４〕に記載のキット。
〔８６〕
前記パッケージまたは前記箱が、１立方フィートまたはそれに満たない容積を有する、〔８３〕または〔８４〕に記載のキット。
〔８７〕
エマルション、マイクロウェルまたはウェルが、１個の細胞のみを含有する、〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８８〕
１〜２，０００，０００個のエマルション、マイクロウェルまたはウェルがそれぞれ、１個の細胞のみを含有する、〔１〕〜〔８７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８９〕
各エマルション、マイクロウェルまたはウェルに最大でも１個の細胞を分布させるステップを含む、〔１〕〜〔８８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９０〕
単一の固体支持体および単一細胞が、エマルション、マイクロウェルまたはウェルに分布される、〔１〕〜〔８９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９１〕
１〜２，０００，０００個のエマルション、マイクロウェルまたはウェルにそれぞれ、１個の細胞および１個の固体支持体が分布されている、〔１〕〜〔９０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９２〕
エマルション、マイクロウェルまたはウェル１個当たり最大でも１個の固体支持体を分布させるステップを含む、〔１〕〜〔９１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９３〕
１〜２，０００，０００個のマイクロウェル、エマルションまたはウェルのそれぞれに１個の固体支持体および１個の細胞を分布させるステップを含む、〔１〕〜〔９２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９４〕
細胞分布が、ランダムまたは非ランダムである、〔１〕〜〔９３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９５〕
細胞分布が、確率論的である、〔１〕〜〔９４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９６〕
細胞が、細胞選別機によって分布される、〔１〕〜〔９５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９７〕
１個または複数のウェル、マイクロウェルまたはエマルションに最大でも１個の細胞が分布されるように、希釈された細胞の希釈溶液と前記１個または複数のウェル、マイクロウェルまたはエマルションを接触させることにより、細胞が分布される、〔１〕〜〔９６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９８〕
標的特異的領域、前記複数のオリゴヌクレオチドの標的特異的領域または前記２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド分子の標的特異的領域が、標的パネルの２種またはそれを超える標的に相補的な配列を含む、〔１〕〜〔９７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９９〕
前記標的パネルの前記２種またはそれを超える標的が、バイオマーカーである、〔９８〕に記載の方法。
〔１００〕
前記バイオマーカーが、疾患または状態のバイオマーカーである、〔９９〕に記載の方法。
〔１０１〕
前記疾患または前記状態が、がん、感染症、ウイルス感染症、炎症性疾患、神経変性疾患、真菌疾患、細菌感染症またはこれらのいずれかの組合せである、〔１００〕に記載の方法。
〔１０２〕
前記パネルが、２〜５０，０００、２〜４０，０００、２〜３０，０００、２〜２０，０００、２〜１０，０００、２〜９０００、２〜８，０００、２〜７，０００、２〜６，０００、２〜５，０００、２〜１，０００、２〜８００、２〜７００、２〜６００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２〜７５、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０または２〜５種のバイオマーカーを含む、〔９８〕〜〔１０１〕のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2019106998000001.pdf