(57)【要約】【課題】Wnt/β-カテニンシグナルの活性化の異常に起因する又は異常を伴う疾患にして有効な治療手段を提供することを課題とする。【解決手段】ミアンセリン又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する治療薬が提供される。本発明の治療薬は例えば変形性関節症の治療に適用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミアンセリン又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、R-スポンジン2によるWnt/β-カテニンシグナル活性化の異常に起因する又は異常を伴う疾患の治療薬。
【請求項２】
有効成分がミアンセリン塩酸塩である、請求項１に記載の治療薬。
【請求項３】
前記疾患が、変形性関節症、大腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、乳癌、後縦靭帯骨化症、デュピュイトラン拘縮及び皮膚のケロイド形成からなる群より選択される疾患である、請求項１又は２に記載の治療薬。
【請求項４】
前記疾患が変形性関節症である、請求項１又は２に記載の治療薬。
【請求項５】
ミアンセリン又はその薬学的に許容される塩を治療上有効量、変形性関節症、大腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、乳癌、後縦靭帯骨化症、デュピュイトラン拘縮及び皮膚のケロイド形成の患者に投与するステップを含む、R-スポンジン2によるWnt/β-カテニンシグナル活性化の異常に起因する又は異常を伴う疾患の治療法。
【請求項６】
ミアンセリン又はその薬学的に許容される塩を治療上有効量、変形性関節症の患者に投与するステップを含む、変形性関節症の治療法。
【請求項７】
前記投与が、関節内又は関節周囲への投与である、請求項６に記載の治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、R-スポンジン2によるWnt/β-カテニンシグナル活性化を制御することによって治療効果を発揮する治療薬及びその用途（治療法等）に関する。本発明の治療薬は、R-スポンジン2によるWnt/β-カテニンシグナル活性化の異常に起因する又は異常を伴う各種疾患の治療／予防に利用される。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症（osteoarthritis、OA）は可動関節、特に膝関節等の荷重関節を侵す代表的な関節の変性疾患である（非特許文献１）。OAの典型的な病理像は、関節軟骨の変性及び破壊であり、これに修復反応と考えられる軟骨及び骨の増生が混在している。OAは主に高齢者において疼痛、関節機能障害による生活の質(quality of life)や日常生活動作(activity of daily life)の低下の原因となり、さらには死亡率の増加にも影響している（非特許文献２）。米国における患者数は2,700万人、治療コストは年間1855億ドルにのぼると推定されており、社会の高齢化に伴い患者数、治療コストとも増加し続けることが予想されている（非特許文献３）。
【０００３】
現在行われているOAの治療は非薬物療法、薬物療法及び手術療法に大別される。非薬物療法は運動療法、物理療法、減量、装具療法、歩行補助具の使用などである。薬物療法は非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）やアセトアミノフェンなどの内服薬とステロイドやヒアルロン酸などの関節内注射に大別される（非特許文献４）。
【０００４】
進行したOAは不可逆的であり、一生を自身の関節で活動する為にはOAの進行に伴う軟骨変性を抑制する必要がある。しかし、現在行われている薬物治療はいずれも対症療法として位置づけられており、疾患修飾性変形性関節症治療薬（disease modifying anti-osteoarthritis drugs；DMOADs）と呼べるような、OAの進行を抑制する効果が証明されている薬剤は存在しないのが現状である（非特許文献５）。
【０００５】
正常な関節軟骨は、II型コラーゲン(Col2a1)やアグリカン(Acan)を発現する静止軟骨細胞で占められるが、OAになるとX型コラーゲン(Col10a1）発現で示される軟骨細胞の肥大分化が見られ、肥大軟骨細胞から分泌されるMMP13やADAMTS5などのタンパク質分解酵素によって軟骨基質の変性が起こることがOAの引き金となると考えられている（非特許文献６）。近年、骨・軟骨代謝の強力な調節因子であるWnt/β-カテニンシグナルの異常活性化は軟骨細胞の肥大分化を促進し、OAの発症及び進行に関与していることが報告され（非特許文献７、８）、Wnt/β-カテニンシグナルの抑制はOAの治療ターゲットとして注目されている（非特許文献９〜１１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Creamer, P. & Hochberg, M. C. Osteoarthritis. Lancet 350, 503-508, doi:10.1016/S0140-6736(97)07226-7 (1997).
【非特許文献２】Kasai, T. et al. The impact of musculoskeletal diseases on mortality-comparison with internal diseases: A 15-year longitudinal study. J Orthop Sci 22, 1126-1131, doi:10.1016/j.jos.2017.06.014 (2017).
【非特許文献３】Kotlarz, H., Gunnarsson, C. L., Fang, H. & Rizzo, J. A. Insurer and out-of-pocket costs of osteoarthritis in the US: evidence from national survey data. Arthritis Rheum 60, 3546-3553, doi:10.1002/art.24984 (2009).
【非特許文献４】Zhang, W. et al. OARSI recommendations for the management of hip and knee osteoarthritis, Part II: OARSI evidence-based, expert consensus guidelines. Osteoarthritis Cartilage 16, 137-162, doi:10.1016/j.joca.2007.12.013 (2008).
【非特許文献５】Chevalier, X., Eymard, F. & Richette, P. Biologic agents in osteoarthritis: hopes and disappointments. Nat Rev Rheumatol 9, 400-410, doi:10.1038/nrrheum.2013.44 (2013).
【非特許文献６】van der Kraan, P. M. & van den Berg, W. B. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration? Osteoarthritis Cartilage 20, 223-232, doi:10.1016/j.joca.2011.12.003 (2012).
【非特許文献７】Blom, A. B. et al. Involvement of the Wnt signaling pathway in experimental and human osteoarthritis: prominent role of Wnt-induced signaling protein 1. Arthritis Rheum 60, 501-512, doi:10.1002/art.24247 (2009).
【非特許文献８】Zhu, M. et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. J Bone Miner Res 24, 12-21, doi:10.1359/jbmr.080901 (2009).
【非特許文献９】Takamatsu, A. et al. Verapamil protects against cartilage degradation in osteoarthritis by inhibiting Wnt/β-catenin signaling. PLoS One 9, e92699, doi:10.1371/journal.pone.0092699 (2014).
【非特許文献１０】Miyamoto, K. et al. Fluoxetine ameliorates cartilage degradation in osteoarthritis by inhibiting Wnt/β-catenin signaling. PLoS One 12, e0184388, doi:10.1371/journal.pone.0184388 (2017).
【非特許文献１１】Lin, Y. et al. Molecular hydrogen suppresses activated Wnt/β-catenin signaling. Sci Rep 6, 31986, doi:10.1038/srep31986 (2016).
【非特許文献１２】Kazanskaya, O. et al. R-Spondin2 is a secreted activator of Wnt/beta-catenin signaling and is required for Xenopus myogenesis. Dev Cell 7, 525-534, doi:10.1016/j.devcel.2004.07.019 (2004).
【非特許文献１３】Takegami, Y. et al. R-spondin 2 facilitates differentiation of proliferating chondrocytes into hypertrophic chondrocytes by enhancing Wnt/β-catenin signaling in endochondral ossification. Biochem Biophys Res Commun 473, 255-264, doi:10.1016/j.bbrc.2016.03.089 (2016).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Wnt/β-カテニンシグナルの活性化の異常に起因する又は異常を伴う疾患、特に変形性関節症にして有効な治療手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく研究を進める中、本発明者らはR-スポンジン2(Rspo2)に着眼した。Rspo2は細胞外に放出されるシグナル分泌タンパク質であり、Wnt/β-カテニンシグナルによりその発現が誘導され、このシグナル伝達経路を増強及び維持する正のフィードバック制御分子として機能する（非特許文献１２）。また、Rspo2は内軟骨性骨化においてWnt/β-カテニンシグナルを介して軟骨細胞の肥大分化を促進することが示されている（非特許文献１３）。これらの報告も踏まえ、「Rspo2はWnt/β-カテニンシグナルの活性化を介してOAの発生や進行に関与している」との仮説を立て、OAの治療に有効な治療薬を既認可薬の中から同定することを目指した。詳細な検討の結果、上記仮説を支持する実験データが得られた上に、OAに対して治療効果を発揮し得る治療薬「ミアンセリン」が同定された。即ち、上記仮説が実証されるとともに、OAに対する新たな治療手段を見出すことに成功した。また、ミアンセリンをOAの治療薬として臨床応用する上で重要且つ有益な情報も得られた。
【０００９】
ここで、Wnt/β-カテニンシグナルの異常活性化がOAの発症及び進行メカニズムの一因として注目されている一方で（非特許文献８）、Wnt/β-カテニンシグナルを抑制した場合も軟骨細胞のアポトーシスが誘導されOAが発生することが示されている（参考文献２１）ことからすれば、上記の仮説が実証されたこと自体、これまでの報告からは予想し難い、極めて大きな成果である。
【００１０】
同定された治療薬「ミアンセリン」は、Rspo2によるWnt/β-カテニンシグナルの活性化を抑制することにより薬効を発揮し得る（詳細は後述の実施例を参照）。一方、Rspo2は大腸癌（参考文献２４）や膵臓癌（参考文献２５）、肝細胞癌（参考文献２６）、乳癌（参考文献２７）といった悪性疾患、或いは後縦靭帯骨化症（参考文献２８、２９）やデュピュイトラン拘縮（参考文献３０）、皮膚のケロイド形成（参考文献３１）といった骨軟部組織疾患にも関与することが報告されている。これらの報告も合わせて考察すれば、OAに対する有効性が示唆されたミアンセリンは上記のごとき各種悪性疾患や各種骨軟部組織疾患にも治療効果を発揮することを合理的に期待できる。
【００１１】
以下の発明は上記の成果及び考察に基づく。
［１］ミアンセリン又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、R-スポンジン2によるWnt/β-カテニンシグナル活性化の異常に起因する又は異常を伴う疾患の治療薬。
［２］有効成分がミアンセリン塩酸塩である、［１］に記載の治療薬。
［３］前記疾患が、変形性関節症、大腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、乳癌、後縦靭帯骨化症、デュピュイトラン拘縮及び皮膚のケロイド形成からなる群より選択される疾患である、［１］又は［２］に記載の治療薬。
［４］前記疾患が変形性関節症である、［１］又は［２］に記載の治療薬。
［５］ミアンセリン又はその薬学的に許容される塩を治療上有効量、変形性関節症、大腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、乳癌、後縦靭帯骨化症、デュピュイトラン拘縮及び皮膚のケロイド形成の患者に投与するステップを含む、R-スポンジン2によるWnt/β-カテニンシグナル活性化の異常に起因する又は異常を伴う疾患の治療法。
［６］ミアンセリン又はその薬学的に許容される塩を治療上有効量、変形性関節症の患者に投与するステップを含む、変形性関節症の治療法。
［７］前記投与が、関節内又は関節周囲への投与である、［６］に記載の治療法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】膝OA患者の膝関節液中のRspo2タンパク質量とOA重症度との関係。＊p<0.05
【図２】TOPflash reporter assayの結果（Ａ、Ｂ）とWnt/β-カテニンシグナルの標的遺伝子の発現解析の結果（Ｃ−Ｅ）。＊p<0.05  ＊＊p<0.01
【図３】アルシアンブルー染色の結果（Ａ、Ｂ）とWnt/β-カテニンシグナル標的遺伝子（Axin2）、軟骨形成マーカー遺伝子（Sox9）、軟骨マーカー遺伝子（Col2a1、Acan）の発現解析の結果（Ｃ−Ｆ）。＊p<0.05  ＊＊p<0.01
【図４】ATDC5細胞における、β-カテニンタンパク質量（Ａ、Ｂ）及びLrp6のリン酸化（Ｃ、Ｄ）の評価。＊p<0.05
【図５】ミアンセリンの細胞毒性の評価（Ａ）とヒト関節軟骨由来細胞に対するミアンセリンの効果（Ｂ）。
【図６】In vivoラットOAモデルを用いた組織学的評価（Ａ、Ｂ）と免疫蛍光染色（Ｃ−Ｆ）。＊p<0.05  ＊＊p<0.01
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は特徴的な作用、即ち、R-スポンジン2（Rspo2）によるWnt/β-カテニンシグナルの活性化を制御する作用、によって治療効果を発揮する治療薬及びその用途に関する。「治療薬」とは、標的の疾病ないし病態に対する治療的又は予防的効果を示す医薬のことをいう。治療的効果には、標的疾患／病態に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。後者については、重症化を予防するという点において予防的効果の一つと捉えることができる。このように、治療的効果と予防的効果は一部において重複する概念であり、明確に区別して捉えることは困難であり、またそうすることの実益は少ない。尚、予防的効果の典型的なものは、標的疾患／病態に特徴的な症状の再発を阻止ないし遅延することである。尚、標的疾患／病態に対して何らかの治療的効果又は予防的効果、或いはこの両者を示す限り、標的疾患／病態に対する治療薬に該当する。
【００１４】
本発明は、ミアンセリンの新規な作用、即ち、Rspo2によるWnt/β-カテニンシグナルの活性化を抑制する作用を見出した成果に基づく。本発明の治療薬は当該薬理作用を利用するものであり、Rspo2によるWnt/β-カテニンシグナル活性化の異常に起因する又は異常を伴う疾患の治療又は予防に用いられる。後述の実施例の欄に示したように、ミアンセリンはRspo2経路を特異的に抑制する。したがって、ミアンセリン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とした本発明の治療薬によれば、Wnt/β-カテニンシグナルの異常活性化分のみが抑制され（換言すれば、過剰な抑制を回避できる）、副作用の少ない治療を実現可能といえる。
【００１５】
本発明の治療薬による治療又は予防の対象となる疾患（「標的疾患」と呼ぶ）は、Rspo2によるWnt/β-カテニンシグナル活性化の異常に起因するか、或いは当該活性化の異常を伴うものである。この条件を満たす限り、標的疾患は特に限定されない。標的疾患となり得る疾患の例として、変形性関節症（OA）、大腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、乳癌、後縦靭帯骨化症、デュピュイトラン拘縮、皮膚のケロイド形成を挙げることができる。特に好ましい標的疾患の一つはOAである。上述の通り、OAは可動関節、特に膝関節等の荷重関節を侵す代表的な関節の変性疾患である。非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）、アセトアミノフェン、ステロイド、ヒアルロン酸等を用いた薬物治療が行われているが、いずれも対症療法でありその効果は限定的である。本発明の治療薬はこのような現状に一石を投じるものであり、本発明の治療薬によればOAの進行を抑制する効果を期待できる。即ち、本発明の治療薬は、その登場が切望されている疾患修飾性変形性関節症治療薬になり得るものである。
【００１６】
本発明の治療薬はミアンセリン又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する。ミアンセリンは四環系抗うつ薬として臨床で使用されている。1966年に開発され、日本では1983年に上市された、使用実績の長い治療薬である。ミアンセリンは、シナプス前終末のα2受容体に拮抗し、ノルアドレナリンの遊離を促進する。ノルアドレナリンやセロトニンの再取り込み阻害作用はあまりない。抗コリン作用は三環系うつ薬より弱く、その一方で抗ヒスタミン作用は強い。また、催眠、鎮静効果は比較的強く、鎮痛作用は弱い（下行性疼痛抑制系の活性化）。尚、糖尿病性神経障害に対してミアンセリンが効果を示すことが報告されている（Eur J Pharmacol. 2015 Jun 5;756:92-106.）。
【００１７】
本発明の治療薬の有効成分として、ミアンセリンの薬理学的に許容される塩を用いてもよい。現在、抗うつ剤として使用されているミアンセリン製剤はミアンセリン塩酸塩の形で処方されている。そこで本発明においても、好ましくは塩酸塩を用いる。但し、「薬理学的に許容される塩」はこれに限定されるものではなく、様々な塩、例えば、酸付加塩、アミノ酸付加塩等の利用が想定される。酸付加塩の例としては塩酸塩の他、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩が挙げられる。アミノ酸付加塩の例としてはグリシン付加塩、フェニルアラニン付加塩、リジン付加塩、アスパラギン酸付加塩、グルタミン酸付加塩が挙げられる。
【００１８】
本発明の治療薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００１９】
製剤化する場合の剤形も特に限定されない。剤形の例は錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤である。本発明の治療薬はその剤形に応じて経口投与又は非経口投与（患部への局所注入、静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など）によって対象に適用される。また、全身的な投与と局所的な投与も対象により適応される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に局所注入等を行う等）。OAを標的疾患とした場合の好ましい投与経路の一つは患部への局所注入であり、関節内又は関節周囲（近傍）が典型的な注入部位となる。
【００２０】
本発明の治療薬には、期待される治療効果を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。本発明の治療薬中の有効成分量は一般に剤形によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.1重量％〜約99重量％の範囲内で設定する。
【００２１】
本発明の治療薬の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量の設定においては一般に症状、患者の年齢、性別、及び体重などが考慮される。当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。投与量の例を示すと、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量が関節内投与であれば0.01mg〜5mg、好ましくは0.01mg〜0.5mg、更に好ましくは0.01mg〜0.15mg、経口投与であれば1mg〜1000mg、好ましくは10mg〜600mg、更に好ましくは10mg〜90mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の病状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
【００２２】
本発明の治療薬による治療に並行して他の医薬（例えば既存の治療薬）による治療を行ったり、既存の治療手技に対して本発明の治療薬による治療を組み合わせたりしてもよい。
【００２３】
以上の記述から明らかな通り本願は、Rspo2によるWnt/β-カテニンシグナル活性化の異常に起因する又は異常を伴う疾患（変形性関節症、大腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、乳癌、後縦靭帯骨化症、デュピュイトラン拘縮、皮膚のケロイド形成等）の患者に対して本発明の治療薬を治療上有効量投与することを特徴とする治療法も提供する。典型的には、変形性関節症患者の関節内又は関節周囲（近傍）に投与される。
【実施例】
【００２４】
変形性関節症（OA）の新規治療法の開発を目標として各種実験を行った。具体的には、R-スポンジン2（Rspo2）に着眼し、「Rspo2はWnt/β-カテニンシグナルの活性化を介してOAの発生や進行に関与している」との仮説を立て、その検証を試みるとともに、OAの治療に有効な治療薬を既認可薬の中から同定すること（ドラッグ・リポジショニング）を目指した。ドラッグ・リポジショニングの最大のメリットの一つは臨床応用が容易なことである。
【００２５】
１．方法
（１）膝OA患者の膝関節液におけるRspo2タンパク質量の測定
Rspo2がOAと関与しているか否か調査するため、膝OA患者の膝関節液を採取し、この関節液を4℃ 3000 rpm、加えて4℃ 10000 rpmの条件で遠心して不溶性沈殿物を除いた後、関節液中のRspo2タンパク質量及び総タンパク質量を測定した。Rspo2タンパク質量は、Human R-Spondin 2(RSPO2) ELISA Kit (MyBioSource社）を用い、添付のプロトコールに沿って測定した。このキットに添付されているスタンダードRSPO2タンパク質を用いてスタンダードコントロールとし、450nmの吸光度をPowerScan4 (DS Parma Biomedical社)で測定することにより関節液中のRspo2タンパク質量を算出した。総タンパク質量は、タンパク質定量用アッセイキット(Pierce社）を用い、添付のプロトコールに沿って測定した。適切な濃度で溶解した牛血清アルブミン(SIGMA社）溶解液をスタンダード溶液とし、660nmの吸光度をPowerScan4 (DS Parma Biomedical社)で測定することにより関節液中の総タンパク質量を算出した。
【００２６】
最終的には、Rspo2タンパク質量を総タンパク質量と比較することで、総タンパク質量に対するRspo2タンパク質量を計算した。また、各患者のOAの重症度をKellgren-Lawrence(KL)分類で評価した（参考文献１４）。KL分類毎のRspo2タンパク質量/総タンパク質量を検討し、関節液中のRspo2タンパク質量とOA重症度の関連を評価した。
【００２７】
（２）Rspo2によるWnt/β-カテニンシグナルの活性化を抑制する薬剤のスクリーニング
OAの治療に有効な薬剤を同定することを目指し、1271種類のFDA認可薬（Prestwick社 Chemical library2014）をスクリーニングした。Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路の活性化状態を評価するため、ヒト軟骨様細胞株HCS-2/8細胞（参考文献１５）に、このシグナルに依存して応答するTOPflash firefly luciferase reporter vector(Addgene社)とコントロールとしてphRL-TK Renilla luciferase plasmid(Promega社)を、FuGENE6(Promega社)を用いて遺伝子導入した。各薬剤を濃度10μMとなるように添加した状態で、120ng/mlのリコンビナントヒトRspo2タンパク質(rhRspo2, R&D systems社)と20ng/mlリコンビナントヒトWnt3aタンパク質(rhWnt3a, R&D systems社)の併用添加又は90ng/mlのrhWnt3a単独添加によりWnt/β-カテニンシグナルを活性化させた。24時間経過後にDual Luciferase Reporter Assay System (Promega社)を用い、PowerScan MX (DS Parma Biomedical社)でluciferase活性を測定した。
【００２８】
（３）HCS-2/8細胞におけるTOPflash reporter assayによるミアンセリンのWnt/β-カテニンシグナル伝達経路の抑制効果
スクリーニングの際と同様の方法でミアンセリンのWnt/β-カテニンシグナル伝達経路の抑制効果を検証した。ミアンセリンの添加濃度を0-20μMとし、用量依存性を評価した。
【００２９】
（４）HCS-2/8細胞におけるTOPflash reporter assayによるミアンセリンのWnt/β-カテニンシグナル伝達経路の抑制効果
Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路の活性化状態を評価するため、ヒト軟骨様細胞株HCS-2/8細胞（参考文献１５）に、このシグナルに依存して応答するTOPflash firefly luciferase reporter vector(Addgene社)とコントロールとしてphRL-TK Renilla luciferase plasmid(Promega社)を、FuGENE6(Promega社)を用いて遺伝子導入した。ミアンセリン濃度が0-20μMとなるように添加した状態で、120ng/mlのリコンビナントヒトRspo2タンパク質(rhRspo2, R&D systems社)と20ng/mlリコンビナントヒトWnt3aタンパク質(rhWnt3a, R&D systems社)の併用添加又は90ng/mlのrhWnt3a単独添加によりWnt/β-カテニンシグナルを活性化させた。24時間経過後にDual Luciferase Reporter Assay System (Promega社)を用い、PowerScan MX (DS Parma Biomedical社)でluciferase活性を測定した。
【００３０】
（５）HCS-2/8細胞におけるリアルタイムPCRによるミアンセリンのWnt/β-カテニンシグナル標的遺伝子発現の抑制効果
HCS-2/8細胞に120ng/ml rhRspo2と20ng/ml rhWnt3aを添加した状態で、10μMのミアンセリンを加え24時間細胞培養を行った。Trizol(Life Technologies社)を用いてRNAを抽出し、oligo-dT primer(Thermo Fisher Scientific社)とReverTra Ace(Toyobo社)を用いてcDNAを作成した。このcDNAを用い、SYBR Green(Takara社)とWnt/β-カテニンシグナルの標的遺伝子であるAxin2、Cyclin D、C-mycに対する各プライマーを用いてLightCycler 480(Roche社)でリアルタイムPCRを施行し、各遺伝子のmRNAの発現量を測定した。
【００３１】
（６）ATDC5細胞におけるアルシアンブルー染色によるプロテオグリカン産生能の測定
マウス軟骨前駆細胞株ATDC5(理研バイオリソースセンター)の細胞培養液中にインスリン/トランスフェリン/セレン(ITS;Gibco社)を添加して2週間培養し軟骨分化誘導を行った。その後rhRspo2又はrhWnt3a添加下に、ミアンセリンが0-20μMになるように添加し48時間の培養を行った。細胞をメタノールで-20℃、30分間固定し、1NのHClに溶解した0.5% Alcian Blue 8 GX 溶液(Sigma-Aldrich社)を用いて染色を行い、200μlの6M guanidine HClにて室温で6時間溶解した。この溶解液の620nmの吸光度をPowerScan4 (DS Parma Biomedical社)を用いて測定した。
【００３２】
（７）ATDC5細胞におけるリアルタイムPCRによるmRNAの計測
2週間分化誘導を行ったATDC5細胞に対し、rhRspo2添加下にミアンセリンが0-20μMになるように添加し48時間の培養を行った。HCS-2/8細胞に対して施行した手法と同様の方法を用いリアルタイムPCRを施行した。Wnt/β-カテニンシグナルの標的遺伝子Axin2、軟骨形成マーカーSox9、軟骨マーカーCol2a1、Acanのプライマーを用いて各遺伝子のmRNAの発現量を評価した。
【００３３】
（８）ATDC5細胞におけるウエスタンブロットによるβ-カテニンタンパク質量の評価
2週間分化誘導を行ったATDC5細胞に対し、rhRspo2添加下に10μMのミアンセリンを添加後48時間の培養を行った。RIPA Lysis Buffer(Santa Cruz社)に0.1mM dithiothreitol、1mg/ml leupeptin、1mM phenylmethylsulfonyl fluoride、1mg/ml aprontininを添加した溶液を用い、細胞の総タンパク質を回収した。SDS-PAGEを用いた電気泳動により回収したタンパク質を分離し、メンブレンへ転写後に抗β-カテニン抗体(BD Transduction Laboratories社)、抗Lgr5抗体(abcam社)、抗Lrp6抗体(Santa Cruz社)及び抗β-アクチン抗体(Santa Cruz社)を用いてウエスタンブロットを行った。β-カテニン及びβ-アクチンのタンパク質量をImage J softwareを用いて定量した。
【００３４】
（９）ATDC5細胞におけるウエスタンブロットによるLrp6リン酸化の評価
Wnt受容体であるLrp6はRspo2添加後1-2時間以内の早期にリン酸化されることが知られている（参考文献１６）。2週間分化誘導を行ったATDC5細胞に対し、rhRspo2添加下に10μMのミアンセリンを添加後1.5時間の培養を行った。RIPA Lysis Buffer(Santa Cruz社)に0.1mM dithiothreitol、1mg/ml leupeptin、1mM phenylmethylsulfonyl fluoride、1mg/ml aprontininとPhosSTOPTMフォスファターゼ阻害剤溶液(SIGMA-Aldrich社）を添加した溶液を用い、リン酸化状態を維持したまま細胞の総タンパク質を回収した。前述と同様の手法で抗pLrp6抗体(Cell Signaling社)、抗Lrp6抗体(Santa Cruz社)及び抗β-アクチン抗体(Santa Cruz社)を用いてウエスタンブロットを行い、各タンパク質量を定量した。
【００３５】
（１０）OAC細胞におけるミアンセリンの細胞毒性評価
人工膝関節置換術時に採取したヒト変形性膝関節症由来軟骨細胞OAC(human osteoarthritic chondrocyte)を、96ウェル培養プレートに6×104細胞/ウェルずつまき、ミアンセリン濃度が0-800μMとなるように添加し2時間培養した。MTSアッセイ(Cell 96 AQueus One Solution Cell Proliferation Assay, Promega社) を用いて細胞増殖を定量し、ミアンセリンのOACに対する細胞毒性を評価した。尚、OACは、名古屋大学医学部付属病院における膝OA患者に対する人工膝関節置換術時に切除された大腿骨、脛骨及び膝蓋骨の軟骨表面をメスにて多数の小薄片へスライスカットし、得られた検体を3mg/mlの2型コラーゲン分解溶液(Worthington Biochemical社)に浸し、6時間後にナイロンメッシュのフィルターを通して回収し、この溶液をシャーレ上で培養することにより得た（参考文献１７）。
【００３６】
（１１）OAC細胞におけるウエスタンブロットによるβ-カテニンタンパク質量の評価
OAC細胞をrhRspo2添加下に、ミアンセリン濃度が0-20μMとなるように添加し48時間培養した。ATDC5細胞に施行した手法と同様の方法でウエスタンブロットを行い、β-カテニン及びβ-アクチンのタンパク質量を定量した。
【００３７】
（１２）In vivoラットOAモデルの作成と組織学的評価
10週齢のWister/ST雄ラットの右膝にmedial menisco-tibial ligamentを切除し内側半月板を不安定化させることによりOAを誘発する手術(destabilization of the medial meniscus; DMM surgery)を行い、ラットOAモデルを作成した（参考文献１８）。同じラットの左膝には皮膚及び関節包の切開のみを行いSham側とした。ミアンセリンをPBSに溶かして50μMとし、両膝に各50μlのミアンセリン溶解液又はPBSを週1回関節腔内投与した。手術から8週後に両膝関節を摘出し、4% パラホルムアルデヒドにて組織を固定した。その後、大腿骨内顆の中央を通る矢状断で切片を作成し、Safranin O and Fast-green染色をおこなった。OAの重症度をmodified Mankin histologic score（参考文献１９、２０）を用いて定量し、大腿骨側と脛骨側のスコアの和で評価した。
【００３８】
（１３）In vivoラットOAモデルにおけるβ-カテニンの免疫蛍光染色
免疫蛍光染色のために膝関節パラフィン切片を脱パラフィン及び再水和し、10 mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH6.0)を用いて抗原賦活化を行い、3% H2O2を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。5% ヤギ血清を含むTBS-Tで1時間ブロッキングを行い、一次抗体としてβ-カテニン抗体(BD Transduction Laboratories社)を加え4℃で一晩インキュベートした。続いて二次抗体としてAlexa 488-conjugated donkey anti-rabbit IgG (Invitrogen社)を加えて室温で1時間インキュベートし、diamidino-2-phenylindole(DAPI)を含むVectaShield (Vector Laboratories社)で封入し、A1Rsi蛍光顕微鏡(Nicon社)を用いて可視化した。
【００３９】
２．結果
（１）膝OA患者の膝関節液中のRspo2タンパク質量はKL2及びKL3で上昇する
KL分類毎のRspo2タンパク質量/総タンパク質量を評価したところ、図１で示すようにKL分類1では低値であったが、KL2、KL3と重症度が高くなるにつれて関節液中のRspo2タンパク質量は上昇した。一方、KL4ではRspo2タンパク質量は再び低値となった。KL2及び3は関節裂隙の狭小化や骨棘形成が進行する時期であり、Rspo2はこれらの現象と関与する可能性が示唆された。
【００４０】
（２）ミアンセリンはHCS-2/8細胞においてRspo2添加下で活性化されたWnt/β-カテニンシグナル伝達経路を抑制する
1271種類のFDA認可薬を対象としたスクリーニングの結果、有望な薬剤としてミアンセリンが同定された。HCS-2/8細胞においてTOPflash reporter assayでWnt/β-カテニンシグナル伝達経路の活性化状態を評価したところ、ミアンセリンはrhRspo2とrhWnt3aの併用添加下では用量依存性にWnt/β-カテニンシグナルを抑制した（図２Ａ）。一方、ミアンセリンはrhWnt3a単独添加下ではWnt/β-カテニンシグナルに変化を与えなかった（図２Ｂ）。以上の結果から、ミアンセリンはRspo2依存性にWnt/β-カテニンシグナルを抑制する薬剤であると考えられた。
【００４１】
（３）ミアンセリンはHCS-2/8細胞においてWnt/β-カテニンシグナルの標的遺伝子の発現を抑制する
HCS-2/8細胞においてrhRspo2及びrhWnt3aの併用添加によりWnt/β-カテニンシグナルの標的遺伝子であるAxin2、Cyclin D、C-mycの発現は上昇したが、ミアンセリン添加によりこれらの発現は抑制された（図２Ｃ−Ｅ）。
【００４２】
（４）ミアンセリンはATDC5細胞においてRspo2により誘導されるアルシアンブルー染色の低下をレスキューする
ATDC5細胞においてrhRspo2添加によりアルシアンブルーの染色性は低下したが、ミアンセリンは用量依存性にアルシアンブルーの染色性を上昇させた（図３Ａ）。一方、rhWnt3a添加により誘導されるアルシアンブルー染色の低下に対して、ミアンセリンは変化を与えなかった（図３Ｂ）。これらの結果はHCS-2/8細胞におけるTOPflash reporter assayの結果と一致し、ミアンセリンの効果がRspo2依存性であることがさらに裏付けられた。
【００４３】
（５）ミアンセリンはATDC5細胞においてRspo2により誘導されるAxin2の発現量増加を抑制し、Sox9、Col2a1及びAcanの発現量低下を上昇させる
ATDC5細胞においてrhRspo2添加によりWnt/β-カテニンシグナルの標的遺伝子であるAxin2の発現量は上昇したが、ミアンセリン添加によりその発現は用量依存性に抑制した（図３Ｃ）。また、rhRspo2添加によりSox9、Col2a1、Acanの発現量は低下したが、ミアンセリンは用量依存性にこれらの発現を上昇させた（図３Ｄ−Ｆ）。
【００４４】
（６）ミアンセリンはATDC5細胞においてβ-カテニンのタンパク質量を低下させる
ATDC5細胞においてrhRspo2添加後48時間でβ-カテニンのタンパク質量は増加したが、ミアンセリン添加によりβ-カテニンのタンパク質量は低下した（図４Ａ、Ｂ）。
【００４５】
（７）ミアンセリンはATDC5細胞においてRspo2添加後早期に生じるLrp6のリン酸化を抑制する
ATDC5細胞に対してrhRspo2添加後1.5時間でLrp6のリン酸化状態を評価したところ、Rspo2により誘導されるLrp6のリン酸化はミアンセリン添加により抑制されていた（図４Ｃ、Ｄ）。ミアンセリンはRspo2添加による早期反応を抑制することが示され、ミアンセリンの効果が直接的にRspo2経路に働いていることが示唆された。
【００４６】
（８）OAC細胞におけるミアンセリンの細胞毒性評価
OACを用いてミアンセリンのヒト関節軟骨由来細胞に対する細胞毒性を評価した。MTSアッセイで細胞増殖を評価したところ、ミアンセリンはOACに対して100-200μM以上の濃度では細胞増殖が抑制され、細胞毒性を有すると考えられた（図５Ａ）。
【００４７】
（９）OAC細胞においてミアンセリンはβ-カテニンのタンパク質量を低下させる
ヒト関節軟骨由来細胞に対するミアンセリンの効果を確認するため、OAC細胞にrhRspo2添加下にミアンセリンを添加したところ、ミアンセリンは用量依存性にβ-カテニンのタンパク質量を低下させた（図５Ｂ）。
【００４８】
（１０）ラットOAモデルにおいてミアンセリンはOAの進行を抑制する
DMM手術によりOAを誘発したOAモデルラットに対して、膝関節腔内に50μMのミアンセリンを毎週投与し8週経過後に組織学的評価を行ったところ、ミアンセリン投与によりOAの進行が抑制されることを確認した（図６Ａ，Ｂ）。またβ-カテニンに対する免疫蛍光染色を行ったところ、ミアンセリンはβ-カテニンの細胞内及び核内集積を抑制することを確認した（図６Ｃ−Ｆ）。尚、図６Ｃは図６Ａの黒い四角で囲まれた範囲の拡大像であり、同様に図６Ｄは図６Ｃの白い四角で囲まれた範囲の拡大像である。
【００４９】
３．考察
Wnt/β-カテニンシグナルの異常活性化がOAの発症及び進行メカニズムの一因として注目されている一方で（参考文献８）、Wnt/β-カテニンシグナルを抑制しても軟骨細胞のアポトーシスが誘導されOAが発生することが示されており（参考文献２１）、正常軟骨細胞の恒常性維持にはある一定のシグナル伝達の維持が必要と考えられている（参考文献２２）。Wnt/β-カテニンシグナルは細胞の増殖や分化、組織や器官の形成などさまざまな生命現象に関与しており、軟骨細胞においてこのシグナルを直接抑制することは過剰抑制により有害事象を生じる可能性がある。
【００５０】
Rspo2はWntタンパク質の受容体であるFrizzledをユビキチン化するRNF43/ZNRF3と結合し細胞膜上から除去することで、間接的にWnt/β-カテニンシグナルを活性化する作用を持つ（参考文献２３）。ミアンセリンはRspo2添加下ではWnt/β-カテニンシグナルを抑制するが、Wnt3a添加下ではそのシグナルを抑制する効果はなく、Rspo2経路に特異的に作用する薬剤であると考えられる。Rspo2はWnt/β-カテニンシグナルに対する正のフィードバック制御タンパク質と位置付けられており、Rspo2経路を特異的に抑制するミアンセリンはWnt/β-カテニンシグナルの異常活性化分のみを抑制し、過剰な抑制を避けることが期待できる。また、Rspo2は大腸癌（参考文献２４）や膵臓癌（参考文献２５）、肝細胞癌（参考文献２６）、乳癌（参考文献２７）といった悪性疾患、或いは後縦靭帯骨化症（参考文献２８、２９）やデュピュイトラン拘縮（参考文献３０）、皮膚のケロイド形成（参考文献３１）といった骨軟部組織疾患にも関与することが報告されている。これまでRspo2経路に特異的に作用する薬剤の報告はなく、ミアンセリンはRspo2の関与するOA以外の疾患に対しても効果を有する可能性を秘めている。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の治療薬は、R-スポンジン2によるWnt/β-カテニンシグナルの活性化を制御するという、ミアンセリンの新規な作用によって薬効を発揮する。ミアンセリンは抗うつ薬として長年にわたって安全に使用されてきた実績がある。この事実は、臨床応用上の大きなメリットとなる。変形性関節症はもとより、大腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、乳癌、後縦靭帯骨化症、デュピュイトラン拘縮、皮膚のケロイド形成等の治療・予防に本発明が適用されることが期待される。
【００５２】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【００５３】
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【図１】
2019156817.tif 000002
【図２】
2019156817.tif 000003
【図３】
2019156817.tif 000004
【図４】
2019156817.tif 000005
【図５】
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【図６】
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