(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞内エネルギーレベルが向上した組換え微生物、及び、その微生物を利用してＬ−アミノ酸を生産する方法の提供。【解決手段】鉄吸収システムを構成する特定のアミノ酸配列を有する３種類のタンパク質のうちから選択される１以上のタンパク質の活性が不活性化されており、非変形菌株に比べて上昇した細胞内ＡＴＰ濃度を有するエシェリキア属微生物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄吸収システムを構成する配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質のうち選択される１以上の活性が不活性化され、非変形菌株に比べて上昇した細胞内ＡＴＰ濃度を有するエシェリキア属微生物。
【請求項２】
前記エシェリキア属微生物は、配列番号５，６及び７のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性がいずれも不活性化されたものであることを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属微生物。
【請求項３】
前記微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属微生物。
【請求項４】
前記エシェリキア属微生物は、非変形菌株に比べて向上したＬ−アミノ酸生産能を有することを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属微生物。
【請求項５】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンであることを特徴とする、請求項４に記載のエシェリキア属微生物。
【請求項６】
請求項１ないし５のうちいずれか１項に記載のエシェリキア属微生物を培養する段階、及び得られた培養物からＬ−アミノ酸を分離する段階を含む、Ｌ−アミノ酸を生産する方法。
【請求項７】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞内エネルギーレベルが向上した組換え微生物、及びその微生物を利用してＬ−アミノ酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を利用した目的物質の生産のために、主に目的物質の生成に関与した酵素をコーディングする遺伝子の発現を増加させたり、不要な遺伝子を除去したりするような目的物質特異的接近方法が主に利用された。例えば、目的Ｌ−アミノ酸の生合成経路の強化によって、Ｌ−アミノ酸を高収率で生産することができる大腸菌を含んだ多数の有用な菌株が開発された。微生物を利用した有用な目的物質の高収率生産のためには、十分なエネルギーの生成及び維持が必要である。
【０００３】
生体内において、タンパク質、核酸のような物質を生合成するためには、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びＡＴＰ（adenosine-5’-triphosphate）の形態でエネルギーが保存されて利用される。特に、ＡＴＰは、代謝過程で生成された化学的エネルギーを、生物体の多様な活動に伝達するエネルギーキャリアである。
【０００４】
ＡＴＰは、主に微生物の代謝過程で生成される。解糖（glycolysis）過程を介して起こる基質レベルリン酸化反応（substrate level phosphorylation）や、解糖過程中に、ＮＡＤＨなどに蓄積された還元力を利用して、電子伝達系を介してＡＴＰを生成する酸化的リン酸化反応（oxidative phosphorylation）が、細胞内主要ＡＴＰ生成経路である。生成されたＡＴＰは、生合成、運動、信号伝逹及び細胞分裂のような生体内の活動で消費される。従って、有用な目的物質を生産するために利用される産業用微生物は、ＡＴＰに対する要求度が高い方である。そのために、有用な目的産物の大量生産時、細胞内エネルギーレベルを上昇させることによって生産性を向上させようとする研究が進められた（Biotechnol Adv (2009) 27: 94-101）。
【０００５】
鉄は、微生物の恒常性維持に必ず必要な元素のうちの一つであって、大腸菌の場合、多様な経路を介して細胞内で鉄を吸収する（Mol Microbiol (2006) 62: 120-131）。そのような鉄吸収経路のうち一つは、ＦｈｕＣ，ＦｈｕＤ及びＦｈｕＢタンパク質が形成するＦｈｕＣＤＢ複合体チャネルを介して鉄分を流入するものである。最近では、細胞内に、Ｌ−トリプトファンが過量存在するとき、Ｌ−トリプトファン生合成関連遺伝子の発現を調節するＴｒｐＲタンパク質とＬ−トリプトファンとが複合体を形成し、さらにその複合体が、ｆｈｕＣＤＢオペロンの調節部位に結合するという事実が明らかにされ、ＦｈｕＣＤＢタンパク質複合体を介した鉄分の流入が、Ｌ−トリプトファンの生合成と関連があるという可能性が提起されている。しかし、今のところＬ−トリプトファンの生合成において、ＦｈｕＣＤＢタンパク質複合体の機能、及びそれを介した鉄分の流入が及ぼず影響は、正確に知られていない（Nat Chem Biol (2012) 8: 65-71）。
【０００６】
本発明者らは、ＡＴＰレベルを向上させ、Ｌ−アミノ酸のような有用な目的物質の生産性を向上させる方法に係わる研究を進め、ｆｈｕＣＤＢ遺伝子の欠失によって、ＦｈｕＣＤＢタンパク質複合体の機能を不活性化させることによって、細胞内ＡＴＰレベルを向上させて、それによって、目的物質の生産性を上昇させることができるということを発見し、本開示を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示の目的は、細胞内ＡＴＰレベルが向上した微生物を提供することである。
【０００８】
本開示の他の目的は、細胞内ＡＴＰレベルが向上した微生物を利用して、目的物質を生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一様態において、本開示は、細胞内ＡＴＰレベルが向上した微生物を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本開示による非変形菌株に比べ、増加した細胞内ＡＴＰ濃度を有するエシェリキア属微生物、及びそれを利用した目的物質の生産方法を利用すれば、高い細胞内ＡＴＰ濃度が、遺伝子発現、生合成、物質輸送などを増進させるので、タンパク質、Ｌ−アミノ酸などを含んだ有用な目的物質を効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】非変形菌株対比で、本開示の一具体例による大腸菌の細胞内ＡＴＰレベルを示すグラフである。
【図２】非変形菌株対比で、本開示の一具体例による野生株由来のＬ−トリプトファン生産能を有する大腸菌の細胞内ＡＴＰレベルを示すグラフである。
【図３】非変形菌株対比で、本開示の一具体例によるＬ−トレオニン生産能を有する大腸菌の細胞内ＡＴＰレベルを示すグラフである。
【図４】非変形菌株対比で、本開示の一具体例によるＬ−トリプトファン生産能を有する大腸菌の細胞内ＡＴＰレベルを示すグラフである。
【図５】非変形菌株対比で、本開示の一具体例によるＬ−トレオニン生産能を有する大腸菌のＬ−トレオニン生産能を示すグラフである。
【図６】非変形菌株対比で、本開示の一具体例によるＬ−トリプトファン生産能を有する大腸菌のＬ−トリプトファン生産能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一様態において、本開示は、細胞内ＡＴＰレベルが向上した微生物を提供する。
【００１３】
本開示の一具体例において、前記微生物は、鉄吸収システム（ｆｈｕ system）を構成するタンパク質ＦｈｕＣ，タンパク質ＦｈｕＤ及びタンパク質ＦｈｕＢのうち選択される一つ以上の活性が不活性化され、非変形菌株に比べて増加した細胞内ＡＴＰ濃度を有する微生物でもある。
【００１４】
本明細書で使用された用語「ＦｈｕＣＤＢ」は、１つのオペロン内に配列された、ｆｈｕＡ、ｆｈｕＣ、ｆｈｕＤ及びｆｈｕＢの発現産物からなる鉄吸収システムの構成要素である。ｆｈｕＡは、フェリクローム鉄（ferrichrome-iron）、ファージ（phage）、バクテリア毒素及び抗生物質などの受容体として作用する多機能性ＯＭＰ ＦｈｕＡ（７９ｋＤａ）をコーディングする。ＦｈｕＡは、Ｆｅ３＋−フェリクロームに特異的であり、リガンド特異的依存性チャネル（ligand-specific gated channel）と作用する（Protein Sci 7, 1636-1638）。ｆｈｕシステムの残りのタンパク質、すなわち、ＦｈｕＤ、ＦｈｕＣ及びＦｈｕＢも、その鉄吸収システムの機能に必須である。周辺細胞質タンパク質であるＦｈｕＤと、細胞膜結合タンパク質であるＦｈｕＣ及びＦｈｕＢは、ＦｈｕＣＤＢ複合体を形成し、周辺細胞質から細胞膜を通過し、細胞質内にフェリクローム、及びその他Ｆｅ３＋−ヒドロキシサメート化合物（Ｆｅ３＋−アエロバクチン、Ｆｅ３＋−コプロゲン）を輸送させる機能を行う（J Bacteriol 169, 3844-3849）。ＦｈｕＣＤＢ複合体を介した鉄分の流入時、１分子のＡＴＰが消耗し、かような鉄吸収過程のために、タンパク質複合体ＴｏｎＢ−ＥｘｂＢ−ＥｘｂＤがエネルギーを提供する（FEBS Lett 274, 85-88）。
【００１５】
ＦｈｕＣは、２９ｋＤａの細胞膜結合タンパク質をコーディングし、ＦｈｕＤ及びＦｈｕＢと共に、鉄分流入のためのチャネルを形成する。ＦｈｕＣは、配列番号５のアミノ酸配列を有することができ、具体的な例として、配列番号１の塩基配列によってコーディングされる。
【００１６】
ＦｈｕＤは、３１ｋＤａの細胞膜結合タンパク質をコーディングし、ＦｈｕＣ及びＦｈｕＢと共に、鉄分流入のためのチャネルを形成する。ＦｈｕＤは、配列番号６のアミノ酸配列を有することができ、具体的な例として、配列番号２の塩基配列によってコーディングされる。
【００１７】
ＦｈｕＢは、４１ｋＤａの細胞膜結合タンパク質をコーディングし、ＦｈｕＣ及びＦｈｕＢと共に、鉄分流入のためのチャネルを形成する。ＦｈｕＢは、配列番号７のアミノ酸配列を有することができ、具体的な例として、配列番号３の塩基配列によってコーディングされる。
【００１８】
具体的には、同一活性を有するタンパク質であるとしても、個体によって、アミノ酸配列に若干の違いがありえるので、ＦｕｈＣ、ＦｈｕＤ及びＦｈｕＢは、それぞれ配列番号５，６及び７の配列を有することができるが、それに限定されるものではない。すなわち、本明細書において、ＦｕｈＣ、ＦｈｕＤ及びＦｈｕＢは、前記アミノ酸配列の１以上の位置において、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、添加または逆位などを含むアミノ酸配列を有する変異体でもあり、前記配列番号５，６及び７と、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する配列を有することができる。また、前記アミノ酸配列を暗号化する塩基配列は、コドンの縮退性（degeneracy）によって、前記タンパク質を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、コーディング領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内で、コーディング領域に多様な変形がなされる。前述の塩基配列は、当業者に周知の方法で多様に具現される塩基配列の一一例として提示されるのみであり、それに限定されるものではない。
【００１９】
本開示で使用された用語「相同性」は、タンパク質をコーディングする遺伝子のアミノ酸配列または塩基配列において、特定比較領域において、両配列が最大限一致するように整列（align）させた後、配列間の塩基残基またはアミノ酸残基の同一程度を意味する。相同性が十分に高い場合、当該遺伝子の発現産物は、同一であるか、あるいは類似した活性を有することができる。前記配列同一性のパーセントは、公知の配列比較プログラムを使用して決定され、一例として、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）、ＣＬＣ Main Workbench（ＣＬＣ ｂｉｏ）、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ）などを挙げることができる。
【００２０】
本開示で使用された用語「微生物」は、Ｌ−アミノ酸のような有用な目的物質の生産能を有する原核微生物または真核微生物を意味する。例えば、増加した細胞内ＡＴＰ濃度を有する微生物は、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacteria）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、レプトスピラ（Leptospira）属、サルモネラ（Salmonellar）属、ブレビバクテリア（Brevibacteria）属、ヒフォモナス（Hyphomonas）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、ノカルディア（Norcardia）属、あるいはかび（fungi）または酵母（yeast）に属する微生物でもある。具体的には、前記微生物は、エシェリキア属微生物であり、さらに具体的には、前記微生物は、大腸菌である。
【００２１】
本開示において、「非変形菌株」は、突然変異方法または組換え方法のような分子生物学技法によって変形されていない微生物、具体的には、鉄吸収システム、ＦｈｕＣＤＢ複合体を構成するＦｈｕＣ、ＦｈｕＤ及びＦｈｕＢのうち選択される１以上が不活性化され、細胞内ＡＴＰ消耗の減少によって、細胞内ＡＴＰレベルが上昇する前の微生物を意味する。すなわち、組換え微生物が由来した起源微生物を意味する。
【００２２】
本開示の一具体例において、前記微生物は、ＦｈｕＣ、ＦｈｕＤ及びＦｈｕＢのうち１以上の活性が不活性化されたものでもあり、ＦｈｕＣ、ＦｈｕＤ及びＦｈｕＢが組み合わされて不活性化されたものを含み、具体的には、ＦｈｕＣ、ＦｈｕＤ及びＦｈｕＢがいずれも不活性化されたものを含んでもよい。
【００２３】
本開示で使用された用語「不活性化」は、当該タンパク質をコーディングする遺伝子の一部または全体の欠失、置換または挿入による変異、前記遺伝子の発現減少をもたらす発現調節配列の変形、前記タンパク質の活性弱化または活性除去をもたらす染色体上の前記遺伝子の塩基配列の変形、またはそれらの組み合わせによって変形され、当該タンパク質が活性を喪失するか、あるいは弱化されたことを意味する。
【００２４】
具体的には、タンパク質をコーディングする遺伝子の一部または全体の欠失は、バクテリア染色体挿入用ベクターを介して、染色体内の内在的目的タンパク質をコーディングする遺伝子を、その一部配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子で交替されることによって行われる。また、化学物質や紫外線のような突然変異誘発源を利用した突然変異誘発によって、当該遺伝子が欠失された突然変異体が得られたものでもあるが、それらに限定されるものではない。
【００２５】
本開示で使用された用語「発現調節配列」は、遺伝子の発現を調節する塩基配列であり、個体内において、特定遺伝子の発現を増加させたり減少させたりすることができるセグメントを意味し、プローモーター、転写調節因子結合部位、リボソーム結合部位、並びに転写及び解読の終結を調節する配列などを含むが、それらに限定されるものではない。
【００２６】
具体的には、遺伝子の発現減少をもたらす発現調節配列の変形は、発現調節配列の活性をさらに弱化させるように、核酸配列の欠失、挿入、非保全的置換または保全的置換、あるいはそれらの組み合わせによって、発現調節配列上の変異を誘導するか、さらに弱い活性を有する発現調節配列で交替することによって行われるが、それに制限されるものではない。
【００２７】
本開示の一具体例において、前記微生物は、非変形菌株に比べて向上した目的物質生産能が向上したエシェリキア属微生物でもある。本開示のエシェリキア属微生物は、ＦｈｕＣＤＢ複合体を形成するタンパク質のうち１以上の不活性化によって、それを介した鉄分流入経路を不活性化そさせ、該経路を介した鉄分流入によるＡＴＰ消耗を減少させ、非変形菌株に比べて上昇した細胞内ＡＴＰレベルを有し、それによって、目的物質の生産能が増加したものでもある。
【００２８】
本開示で使用された用語「生産能が向上した」微生物は、変異前の非変形菌株または母細胞に比べ、目的物質の生産性が増加した微生物を意味する。
【００２９】
本開示で使用された用語「目的物質」は、微生物細胞内ＡＴＰレベルを上昇させ、生産量が増加した物質であるならば、制限なしに含まれ、具体的には、Ｌ−アミノ酸であり、さらに具体的には、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンでもある。
【００３０】
本開示の一具体例において、前記微生物は、Ｌ−トリプトファン生産能を有する大腸菌から、ＦｈｕＣ、ＦｈｕＤ及びＦｈｕＢのうち選択される１以上が不活性化された、細胞内ＡＴＰレベルが非変形菌株に比べて上昇したＬ−トリプトファン生産能を有する大腸菌でもある。前記Ｌ−トリプトファン生産能を有する大腸菌は、Ｌ−トリプトファンオペロン遺伝子の発現を増加させるか、最終産物であるＬ−トリプトファンによるフィードバック阻害を解除させるか、あるいはＬ−トリプトファンオペロン遺伝子の転写レベルの抑制及び減衰（attenuation）を解除させることによって得られたものでもあるが、それに限定されるものではない。
【００３１】
本開示の一具体例において、前記微生物は、Ｌ−トレオニン生産能を有する大腸菌から、ＦｈｕＣ、ＦｈｕＤ及びＦｈｕＢのうち選択される１以上が不活性化された、細胞内ＡＴＰレベルが非変形菌株に比べて上昇したＬ−トレオニン生産能を有する大腸菌でもある。前記Ｌ−トレオニン生産能を有する大腸菌は、Ｌ−トレオニンオペロン遺伝子の発現を増加させるか、最終産物であるＬ−トレオニンによるフィードバック阻害を解除させるか、あるいはＬ−トレオニンオペロン遺伝子の転写レベルの抑制及び減衰を解除させることによって得られたものでもあるが、それに限定されるものではない。
【００３２】
本開示の一様態において、細胞内ＡＴＰレベルが向上したエシェリキア属微生物を培養する段階、及び得られた微生物の培養液からＬ−アミノ酸を分離する段階を含む、Ｌ−アミノ酸を生産する方法を提供する。
【００３３】
本開示で使用された用語、前記「細胞内ＡＴＰレベルが向上したエシェリキア属微生物」は、前述の通りである。
【００３４】
本開示の一具体例によるＬ−アミノ酸を生産する方法において、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物の培養は、当業界に公知された適する培地及び培養条件によってなされる。かような培養過程は、当業者が、選択される微生物によって、容易に調整して使用することができる。培養方法の例として、回分式、連続式及び流加式の培養が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００３５】
培養に使用される培地は、特定の微生物の要求条件を適切に満足させなければならない。多様な微生物培養培地は、例えば、文献(“Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981）に記載されている。それら培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。該炭素源は、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、果糖、麦芽糖、澱粉及び纎維素のような炭水化物；大豆油、ひまわりオイル、ひまし油（castor oil）及びココナッツオイル（coconut oil）のような脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸（stearic acid）及びリノール酸（linoleic acid）のような脂肪酸；グリセロール及びエタノールのようなアルコール、及び酢酸のような有機酸；を含むことができ、それら炭素源は、単独にまたは組み合わされて使用されるが、それらに限定されるものではない。窒素源としては、ペプトン（peptone）、酵母抽出液（yeast extract）、肉汁（gravy）、麦芽抽出液（malt extract）、とうもろこし浸出液（ＣＳＬ：corn steep liquor）及び豆粉（bean flour）のような有機窒素源、及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源を含み、それら窒素源は、単独にまたは組み合わされて使用されるが、それらに限定されるものではない。前記培地には、リン酸源として、追加してリン酸二水素カリウム（potassium dihydrogen phosphate）、リン酸水素二カリウム（dipotassium hydrogen phosphate）、及び相応するナトリウム含有塩（sodium-containing salts）を含んでもよいが、それらに限定されるものではない。また、該培地は、硫酸ンマグネシウム（magnesium sulfate）または硫酸鉄（iron sulfate）のような金属を含み、アミノ酸、ビタミン、及び適する前駆体などが添加されてもよい。
【００３６】
また、培養液の好気性条件を維持するために、培養液内に、酸素、または酸素を含んだガス（例えば、空気）が培養液に注入されてもよい。培養物の温度は、一般的に、２０〜４５℃でもあり、具体的には、２５〜４０℃である。培養期間は、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンのようなＬ−アミノ酸の生産が、所望レベルに逹するまで続けられ、具体的には、培養時間は１０〜１００時間でもある。
【００３７】
本開示の一具体例によるＬ−アミノ酸を生産する方法は、得られた微生物の培養液から、追加してＬ−アミノ酸を分離する段階を含む。Ｌ−アミノ酸の分離は、本開示の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式の培養方法などによって、当業界に公知された適する方法を利用して、培養液から目的とするＬ−アミノ酸を精製または回収することによってなされるが、それらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
以下、本開示について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本開示について例示的に説明するためのものであり、本開示の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１：ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ及びｆｈｕＢ遺伝子によってコーディングされるタンパク質が不活性化された野生型大腸菌Ｗ３１１０の作製
本実施例においては、野生型大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ(登録商標) ３９９３６ＴＭ）のｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子を相同組換えによってそれぞれ欠失させた。
【００４０】
欠失対象遺伝子であるｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ及びｆｈｕＢ遺伝子は、それぞれ配列番号１、２及び３の塩基配列を有し、それらは、配列番号４のオペロン形態で存在する。
【００４１】
ｆｈｕＣ、ｆｈｕＤ及びｆｈｕＢの欠失のために、Datsenko ＫＡらが開発したラムダレッド組換え酵素（lambda Red recombinase）を利用した、１−段階 不活性化（one step inactivation）方法を使用した（Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645）。遺伝子内部への挿入を確認するためのマーカーとして、ｐＵＣ１９（New England Biolabs（米国））に、ｒｍｆプローモーターをライゲーションさせ、ｐＡＣＹＣ１８４（New England Biolabs）から得られた突然変異ｌｏｘＰ−ＣｍＲ−ｌｏｘＰカセットをライゲーションさせて得られたｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＣのクロラムフェニコール（chloramphenicol）遺伝子を使用した（大韓民国出願公開第２００９−００７５５４９号）。
【００４２】
まず、ｆｈｕＣ遺伝子及びｆｈｕＢ遺伝子の一部分と、ｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＣ遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子の一部との塩基配列を有する配列番号８及び９，１０及び１１，１２及び１３、並びに８及び１３のプライマー組み合わせを利用して、ｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＣをテンプレートにし、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間伸張させることからなるサイクルを３０回反復する一次重合酵素連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」ともする）によって、約１．２ｋｂのＰＣＲ産物△ｆｈｕＣ１ｓｔ，△ｆｈｕＤ１ｓｔ，△ｆｈｕＢ１ｓｔ及び△ｆｈｕＣＤＢ１ｓｔを得た。
【００４３】
その後、ＰＣＲを介して得られた１．２ｋｂのＰＣＲ産物△ｆｈｕＣ１ｓｔ，△ｆｈｕＤ１ｓｔ，△ｆｈｕＢ１ｓｔ及び△ｆｈｕＣＤＢ１ｓｔを、０．８％アガロースゲルでの電気泳動後に溶離させ、二次ＰＣＲのテンプレートとして使用した。二次ＰＣＲは、一次ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の５’及び３’領域の２０ｂｐの塩基配列を含む配列番号１４及び１５、１６及び１７、１８及び１９、１４及び１９のプライマー組み合わせを利用して、溶離された一次ＰＣＲ産物をテンプレートにし、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間伸張させることからなるサイクルを３０回反復することによって行い、約１．３ｋｂのＰＣＲ産物△ｆｈｕＣ，△ｆｈｕＤ，△ｆｈｕＢ，△ｆｈｕＣＤＢを得た。得られたＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲルでの電気泳動後に溶離させて組換えに使用した。
【００４４】
Datsenko ＫＡらが開発した１−段階 不活性化方法（Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645）によって、ｐＫＤ４６ベクターに形質転換された大腸菌Ｗ３１１０をコムピテント（competent）な状態に製造した後、一次ＰＣＲ及び二次ＰＣＲを介して得られた１．３ｋｂの断片を流入させて形質転換させた。クロラムフェニコールを含むＬＢ培地で培養し、クロラムフェニコール耐性を有する変質転換体を選別した。選別された菌株から得られたゲノムをテンプレートにし、配列番号２０及び２１のプライマーを利用したＰＣＲを介して増幅されたサイズがそれぞれ約４．４ｋｂ、４．３ｋｂ、３．３ｋｂ、１．６ｋｂであるということを確認し、ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子が単独で、あるいはいずれも欠失されたということを確認した。
【００４５】
前述のところ得られたクロラムフェニコール耐性を有する一次組換え菌株から、ｐＫＤ４６を除去した後、ｐＪＷ１６８ベクター（Gene, (2000) 247, 255-264）を導入し、クロラムフェニコールマーカー遺伝子を菌体から除去した（Gene, (2000) 247, 255-264））。最終的に得られた菌体から、配列番号２０及び２１のプライマーを利用したＰＣＲを介して得られた約３．４ｋｂ、３．３ｋｂ、２．２ｋｂ、０．６ｋｂのＰＣＲ産物によって、ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子が単独で、あるいはいずれも欠失されたということを確認し、大腸菌Ｗ３１１０＿ΔｆｈｕＣ，Ｗ３１１０＿ΔｆｈｕＤ，Ｗ３１１０＿ΔｆｈｕＢ及びＷ３１１０＿ΔｆｈｕＣＤＢと命名した。
【００４６】
実施例２：作製された野生型大腸菌由来ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子欠失大腸菌の細胞内ＡＴＰレベル測定
本実施例においては、実施例１で作製された菌株を利用して、実際細胞内ＡＴＰレベルを測定した。
【００４７】
そのために、Kiyotaka Ｙ．Haraらが開発したルシフェラーゼ（luciferase）を利用した「細胞ＡＴＰ合成能の定量的測定方法」（An Efficient Method for Quantitative determination of Cellular ATP Synthetic Activity）を利用した（J Biom Scre, (2006) Vol. 11, No.3, pp. 310-17 ）。要約すれば、グルコースが含まれたＬＢ液体培地で、実施例１で使用された非変形菌株である大腸菌Ｗ３１１０と、遺伝子欠失によって得られた大腸菌Ｗ３１１０＿ΔｆｈｕＣＤＢとをそれぞれ一晩培養した。培養後、遠心分離で、上澄み液を除去し、１００ｍＭ Tris−Ｃｌ（ｐＨ７．５）を利用して得られた菌体を洗浄し、ＰＢ緩衝液（permeable buffer：４０％［ｖ／ｖ］グルコース、０．８％［ｖ／ｖ］トリトンＸ−１００）で３０分間処理し、細胞内のＡＴＰを、細胞外部に染み出させた。その後、さらに遠心分離して上澄み液を分離し、ルシフェラーゼの基質として利用されるルシフェリン（luciferin）を添加し、１０分間反応させた。ルミノメーターを利用して、ルシフェラーゼによる発色程度を測定し、ＡＴＰを定量した。図１に、その結果が表示されている。図１の結果は、３回の反復実験結果の平均値を示している。
【００４８】
図１に表示されているように、実施例１で作製した野生型大腸菌由来ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子が、単独で、あるいはいずれも欠失された大腸菌Ｗ３１１０＿ΔｆｈｕＣ，Ｗ３１１０＿ΔｆｈｕＤ，Ｗ３１１０＿ΔｆｈｕＢ及びＷ３１１０＿ΔｆｈｕＣＤＢにおいて、細胞内ＡＴＰレベルが、非変形菌株である大腸菌Ｗ３１１０に比べて上昇しているということを確認した。
【００４９】
実施例３：ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子によってコーディングされるタンパク質が不活性化された野生株由来のＬ−トリプトファン生産菌株の作製、及び細胞内ＡＴＰレベル測定
本実施例においては、野生株由来のＬ−トリプトファン生産菌株である大腸菌Ｗ３１１０ｔｒｐΔ２／ｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ菌株（大韓民国公開特許１０−２０１３−００８２１２１号）のｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子を、実施例１に記載されているように、相同組換えによって、単独で、あるいはいずれも欠失され、Ｗ３１１０ｔｒｐΔ２＿ΔｆｈｕＣ／ｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ，Ｗ３１１０ｔｒｐΔ２＿ΔｆｈｕＤ／ｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ，Ｗ３１１０ｔｒｐΔ２＿ΔｆｈｕＢ／ｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ及びＷ３１１０ｔｒｐΔ２＿ΔｆｈｕＣＤＢ／ｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ菌株を作製した。かように作製された菌株に対して、実施例２と同一方法で、細胞内ＡＴＰレベルを測定し、その結果を図２に示した。
【００５０】
図２に表示されているように、野生株由来のＬ−トリプトファン生産菌株から作製されたｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子は、単独で、またはいずれも欠失された菌株は、細胞内ＡＴＰレベルが、非変形菌株及び対照群菌株より上昇しているということを確認した。
【００５１】
実施例４：ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子によってコーディングされるタンパク質が不活性化された野生株由来のＬ−トリプトファン生産菌株の力価確認
実施例３で記述されているように、野生株由来のＬ−トリプトファン生産菌株であるＷ３１１０ｔｒｐΔ２／ｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ遺伝子とｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子とを、単独で、あるいはいずれも欠失させ、細胞内のＡＴＰを増加させた菌株を対象に、グルコースを炭素源として使用して、力価評価を行った。
【００５２】
前記菌株を、ＬＢ固体培地に、１白金耳ずつ接種し、３７℃培養器で一晩培養し、表１の組成を有する、グルコースが含有された２５ｍＬの力価培地に、１白金耳ずつ接種した。その後、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果が表２に表示されている。全ての結果は、３回反復実験結果の平均値を示している。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
【表２】
2019106993.tif 000004
【００５５】
表２に表示されているように、実施例３で作製された野生株由来のＬ−トリプトファン生産菌株であるＷ３１１０ｔｒｐΔ２／ｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡから、ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子を単独で、あるいはいずれも欠失させて細胞内のＡＴＰを増加させた菌株は、非変形菌株であるＷ３１１０ｔｒｐΔ２／ｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡに比べ、Ｌ−トリプトファンの生産量が非変形菌株対比で、最大約６３％まで増加するということを確認することができた。その結果は、図２で確認した細胞内ＡＴＰレベルを考慮するとき、細胞内ＡＴＰレベル上昇を介して、菌株のＬ−トリプトファン生産能力が増大したということを反映するものと見られる。
【００５６】
実施例５：ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子によってコーディングされるタンパク質が不活性化された、Ｌ−トレオニン生産菌株及びＬ−トリプトファン生産菌株の作製
本実施例においては、Ｌ−トリプトファン生産菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐ（大韓民国登録特許第０７９２０９５号）と、Ｌ−トレオニン生産菌株であるＫＣＣＭ１０５４１Ｐ（大韓民国登録特許第０５７６３４２号）とのｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子を、実施例１に記載されているように相同組換えによってそれぞれ欠失させた。
【００５７】
Ｌ−トリプトファン生産能を有する非変形菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐは、Ｌ−フェニルアラニン生産能を有する大腸菌変異株（ＫＦＣＣ１００６６）に由来した菌株であり、染色体上のトリプトファン要求性が解除され、ｐｈｅＡ，ｔｒｐＲ，ｍｔｒ及びｔｎａＡＢ遺伝子が弱化され、ａｒｏ遺伝子Ｇ及びｔｒｐＥ遺伝子が変異されたことを特徴とするＬ−トリプトファン生産能を有する組換え大腸菌である。
【００５８】
また、Ｌ−トレオニン生産能を有する非変形菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１Ｐは、大腸菌ＫＦＣＣ１０７１８（大韓民国出願公開第１９９２−０００８３６５号）に由来した菌株であり、Ｌ−メチオニン類似体に対する耐性を有し、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシンリーキー型要求性、Ｌ−リジン類似体に対する耐性、及びα−アミノ酪酸耐性を有し、Ｌ−トレオニン生産能を有する大腸菌である。
【００５９】
欠失対象遺伝子であるｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子を、大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐ及び大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１Ｐから、それぞれ実施例１と同一方法で欠失させ、それによって、Ｌ−トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１０５４１＿ΔｆｈｕＣＤＢとＬ−トリプトファン生産菌株ＫＣＣＭ１０８１２Ｐ＿ΔｆｈｕＣＤＢとを作製した。
【００６０】
実施例６：ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子によってコーディングされるタンパク質が不活性化された、Ｌ−トレオニン生産菌株及びＬ−トリプトファン生産菌株のＡＴＰレベル測定
本実施例においては、実施例５で作製された菌株を利用して、実際細胞内ＡＴＰレベルを測定した。
【００６１】
実施例２と同一方法により、細胞内ＡＴＰレベルを測定した。その結果が図３及び図４に表示されている。図３及び図４の結果は、３回反復実験結果の平均値を示している。対照群として、実施例３において、非変形菌株に利用された大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐ及び大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１Ｐより、細胞内ＡＴＰレベルが高いと知られている、ｙｓａ遺伝子及びｙｄａＳ遺伝子が欠失されたＬ−トレオニン生産菌株（大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１Ｐ＿△ｙｓａ△ｙｄａＳ）と、Ｌ−トリプトファン生産菌株（大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐ＿△ｙｓａ△ｙｄａＳ）とを利用した（大韓民国登録特許第１３２７０９３号）。
【００６２】
図３及び図４に表示されているように、Ｌ−トレオニン生産菌株及びＬ−トリプトファン生産菌株から、実施例３によって作製されたｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子が欠失された菌株は、細胞内ＡＴＰレベルが、非変形菌株及び対照群菌株より上昇している。
【００６３】
実施例７：ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子によってコーディングされるタンパク質の機能が不活性化されたＬ−トレオニン生産菌株の力価確認
実施例５で記述されているように、Ｌ−トレオニン生産微生物である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１Ｐ（大韓民国登録特許第０５７６３４２号）から、ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子を欠失させ、細胞内のＡＴＰを増加させた菌株を対象に、グルコースを炭素源として使用して力価評価を行った。ｙｓａ遺伝子及びｙｄａＳ遺伝子が欠失されたＬ−トレオニン生産菌株（大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１Ｐ＿△ｙｓａ△ｙｄａＳ）を対照群として含めて力価評価の結果を比較した。
【００６４】
前記菌株を３３℃培養器で、ＬＢ固体培地で一晩培養し、表１の組成を有する、グルコースが含有された２５ｍＬの力価培地に、１白金耳ずつ接種した後、それを、３３℃、２００ｒｐｍの培養器で５０時間培養した。その結果が表４及び図５に表示されている。全ての結果は、３回反復実験結果の平均値を示している。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
【表４】
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【００６７】
表４に表示されているように、本開示によって作製された組換えＬ−トレオニン生産大腸菌菌株は、非変形菌株に類似した生理活性を示しながら、Ｌ−トレオニンの生産量が非変形菌株対比で、約９％まで増加しているということを確認することができた。その結果は、図２で確認した細胞内ＡＴＰレベルを考慮するとき、細胞内ＡＴＰレベル上昇を介して、菌株のＬ−トレオニン生産能力が増大しているということを反映するものと見られる。
【００６８】
実施例８：ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子によってコーディングされるタンパク質の機能が不活性化されたＬ−トリプトファン生産菌株の力価確認
実施例５で記述されているように、Ｌ−トリプトファン生産菌であるＫＣＣＭ１０８１２Ｐ（大韓民国登録特許第０７９２０９５号）から、ｆｈｕＣ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＢ遺伝子を欠失させ、細胞内のＡＴＰを増加させた菌株を対象に、グルコースを炭素源として使用して力価評価を遂行した。ｙｓａ遺伝子及びｙｄａＳ遺伝子が欠失されたＬ−トリプトファン生産菌株（大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐ＿△ｙｓａ△ｙｄａＳ）を対照群として含め、実施例４と同一方法で力価評価を行った。
【００６９】
力価評価結果は、表５及び図６に表示され、全ての結果は、３回反復実験結果の平均値を示している。
【００７０】
【表５】
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【００７１】
表５に表示されているように、本開示によって作製された組換えＬ−トリプトファン生産大腸菌菌株は、非変形菌株に類似した生理活性を示しながら、Ｌ−トリプトファンの生産量が、非変形菌株対比で、約３０％まで増加するということを確認することができた。その結果は、図３で確認した細胞内ＡＴＰレベルを考慮するとき、上昇した細胞内ＡＴＰレベルを介して、菌株のＬ−トリプトファン生産能力が増大したということを反映するものと見られる。
【００７２】
本開示で組み換えられた菌株ＣＡ０４−２８０１（ＫＣＣＭ１０８１２Ｐ＿△ｆｈｕＣＤＢ）は、２０１３年１１月１５日付けで、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に国際寄託され、ＫＣＣＭ１１４７４Ｐで寄託番号を受けた。
【００７３】
前述の説明から、本開示が属する技術分野の当業者であるならば、本開示が、その技術的思想や必須特徴を変更せずにも、他の具体的な形態で実施されるということを理解することができるであろう。それと係わって、本明細書に記載された実施例は、例示的なものであり、本開示を限定するものではないということを理解しなければならない。本開示の範囲は、前述の詳細な説明よりは、特許請求の範囲の意味、範囲、及びその等価概念から導き出される全ての変更、または変形された形態が、本開示の範囲に含まれるものであると解釈されなければならない。
【００７４】
配列リストフリーテキスト
本明細書に記載された配列番号１ないし配列番号２１の配列は、添付された配列リストに表示される。
【受託番号】
【００７５】
受託番号：ＫＣＣＭ１１４７４Ｐ
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月25日(2019.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄吸収システムを構成する配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質のうち選択される１以上の活性が不活性化され、非変形菌株に比べて上昇した細胞内ＡＴＰ濃度を有するエシェリキア属微生物。
【請求項２】
前記エシェリキア属微生物は、配列番号５，６及び７のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性がいずれも不活性化されたものであることを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属微生物。
【請求項３】
前記微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属微生物。
【請求項４】
前記エシェリキア属微生物は、非変形菌株に比べて向上したＬ−アミノ酸生産能を有することを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属微生物。
【請求項５】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンであることを特徴とする、請求項４に記載のエシェリキア属微生物。
【請求項６】
請求項１ないし５のうちいずれか１項に記載のエシェリキア属微生物を培地で培養する段階、及び得られた培養培地または微生物からＬ−アミノ酸を分離する段階を含む、Ｌ−アミノ酸を生産する方法。
【請求項７】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本開示の一様態において、細胞内ＡＴＰレベルが向上したエシェリキア属微生物を培地で培養する段階、及び得られた培養培地または微生物からＬ−アミノ酸を分離する段階を含む、Ｌ−アミノ酸を生産する方法を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本開示の一具体例によるＬ−アミノ酸を生産する方法は、得られた培養培地または微生物から、追加してＬ−アミノ酸を分離する段階を含む。Ｌ−アミノ酸の分離は、本開示の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式の培養方法などによって、当業界に公知された適する方法を利用して、培養液から目的とするＬ−アミノ酸を精製または回収することによってなされるが、それらに限定されるものではない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
前記菌株を３３℃培養器で、ＬＢ固体培地で一晩培養し、表３の組成を有する、グルコースが含有された２５ｍＬの力価培地に、１白金耳ずつ接種した後、それを、３３℃、２００ｒｐｍの培養器で５０時間培養した。その結果が表４及び図５に表示されている。全ての結果は、３回反復実験結果の平均値を示している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
表４に表示されているように、本開示によって作製された組換えＬ−トレオニン生産大腸菌菌株は、非変形菌株に類似した生理活性を示しながら、Ｌ−トレオニンの生産量が非変形菌株対比で、約９％まで増加しているということを確認することができた。その結果は、図３で確認した細胞内ＡＴＰレベルを考慮するとき、細胞内ＡＴＰレベル上昇を介して、菌株のＬ−トレオニン生産能力が増大しているということを反映するものと見られる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
表５に表示されているように、本開示によって作製された組換えＬ−トリプトファン生産大腸菌菌株は、非変形菌株に類似した生理活性を示しながら、Ｌ−トリプトファンの生産量が、非変形菌株対比で、約３０％まで増加するということを確認することができた。その結果は、図４で確認した細胞内ＡＴＰレベルを考慮するとき、上昇した細胞内ＡＴＰレベルを介して、菌株のＬ−トリプトファン生産能力が増大したということを反映するものと見られる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2019106993.tif 000016
【外国語明細書】
2019106993000001.pdf