(57)【要約】      （修正有）【課題】新たな経皮デリバリーシステムの提供。【解決手段】治療薬の経皮デリバリーためのマイクロニードルベースのアレイを製作するための方法であって、カルボキシメチルセルロース(CMC)とデキストリン(DEX)とを混合して、多糖類ベースの組み合わせを提供すること；および該治療薬を該多糖類ベースの組み合わせに加えること；を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬の経皮デリバリーためのマイクロニードルベースのアレイを製作するための方法であって、
カルボキシメチルセルロース(CMC)とデキストリン(DEX)とを混合して、多糖類ベースの組み合わせを提供すること；および
該治療薬を該多糖類ベースの組み合わせに加えること；
を含む方法。
【請求項２】
多糖類ベースの組み合わせが、30〜70％のCMCおよび30〜70％のDEXを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多糖類ベースの組み合わせが、50％のCMCおよび50％のDEXを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
治療薬が、薬物である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
治療薬が、インスリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
カルボキシメチルセルロース(CMC)とデキストリン(DEX)との多糖類ベースの組み合わせからできている、治療薬の経皮デリバリー用マイクロニードルアレイ。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか1つに記載の方法によって製造されるマイクロニードルアレイ。
【請求項８】
多糖類ベースの組み合わせが、30〜70％のCMCおよび30〜70％のDEXを含む、請求項６に記載のマイクロニードルアレイ。
【請求項９】
多糖類ベースの組み合わせが、50％のCMCおよび50％のDEXを含む、請求項８に記載のマイクロニードルアレイ。
【請求項１０】
治療薬が、インスリンである、請求項６に記載のマイクロニードルアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類ベースの溶解可能なマイクロニードルベースのアレイの製作方法、およびそれから製造されたマイクロニードルアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
新たに開発された薬物のためのデリバリーシステムの開発は、挑戦的な仕事である。薬物は、経口、非経口、眼科的、経皮、経鼻、経肺、および口腔経路などのさまざまな一般的経路を介して投与される(Langer、2001)。これらの経路のうち、経皮ドラッグデリバリーシステム(TDDS)は、医療スタッフの助けを借りずに用いることができる前途有望なシステムである(PrausnitzおよびLanger、2008；Wokovichら、2006)。TDDSは、肝臓初回通過代謝および消化管における経口投与剤形の副作用の排除などのいくつかの利点も有する(Asbill and Michniak、2000；Hadgraftら、1996)。しかしながら、システムは依然として効率が低いなどのいくつかの欠点を有する。効率は、皮膚構造および角質層(SC)のバリア特性などのさまざまな理由により低減されうる(BronaughおよびMaibach、2005)。SCバリアの存在は、油溶性分子および低分子量化合物のみが輸送され得ることを意味する。
【０００３】
厄介なSCバリアを克服するため、ドラッグデリバリーのために皮膚浸透を増強するいくつかの方法が開発されている。そのような方法の1つは、マイクロニードルアレイの使用であり、これは損傷を引き起こすことなく皮膚バリアを通って治療薬をデリバリーする上でより良好な性能を示す(Kaushikら、2001；McAllisterら、2003；Miksztaら、2002)。マイクロニードルアレイ(MN)を皮膚表面に適用し、侵害受容器を刺激することなく表皮を穿孔する(Martinら、2012)。これらのMNは、皮膚を通して微小な穴を形成し、薬物またはワクチンを真皮の微小循環に拡散させる(Cheungら、2014；Kimら、2012；Liuら、2012；Sullivanら、2010；Tuan-Mahmoodら、2013)。MNアレイは、ポリマー、金属、シリコーンゴム、および多糖類などのさまざまな材料で作られている(Badranら、2009；Dingら、2009；Hafeliら、2009；Liら、2009；Linら、2001；Martantoら、2004)。その中で、ポリマーMNアレイは、シリコンまたは金属アレイよりも量産するのが安価であり、適用中に安全であるため、ますます魅力的である。ポリマーを溶解させることを使用する場合、薬物および生体分子をMNの内部に組み込むことができる(ChuおよびPrausnitz、2011；Hirobeら、2015；Leeら、2008；Leeら、2011；Liuら、2012；Sullivanら、2010)。薬物を放出した後、ポリマーは皮膚に溶解し、MNが体内に残留するリスクを回避する(Keら、2012；Sullivanら、2008)。MN適用に使用されるポリマーは、生体適合性、強い機械的特性、および迅速な溶解速度などの特徴を有するべきである。薬物依存性放出時間を考慮すると、異なる溶解速度を有するポリマーが、制御された量の薬物をデリバリーするために必要とされるであろう。
【０００４】
固体MNは、2つのタイプの構造(「ワンピース(one-piece)」および「多層(layer-by-layer)」)として、生分解性ポリマーを使用してキャスティングされ、形成される。「ワンピース」法では、薬物およびポリマーを含む溶液が、同じ鋳型上に同時に注入されてキャスティングされ；「多層」法では、モデル構造が、複数のコーティングステップまたはモデルの各薄片との組み合わせによってキャスティングされる。有機固体のMNは、合成材料および天然材料の分子量範囲数百から数千に拡大し、デキストリン(DEX)、カルボキシメチルセルロース(CMC)、アミロペクチン(AMP)、ポリラクチド-コ-グリコリド、ガラクトース、マルトース、およびポリビニルピロリドンが包含される(Leeら、2008；Raphaelら、2010)。それらの異なる分子適合性にしたがって、さまざまなサイズの多数のモデル化合物を加えることができる；たとえば、β-ガラクトシダーゼ酵素、スルホローダミン、サリチル酸ナトリウム、カルセイン、およびウシ血清アルブミンを、MNに組み込むことに成功している。過去10年間で、さまざまな薬物、生物活性タンパク質、およびワクチンを用いたMNデリバリーの前臨床評価が進歩している(PettisおよびHarvey、2012)。動物およびヒトの研究により、さまざまな薬物およびワクチンの適用が実証されている。しかしながら、MN臨床試験は比較的少数しか発表されていない(Pettis and Harvey、2012)。MNに封入された薬物または生体分子の安定性、皮膚へのMNの確実な挿入、皮膚刺激および皮膚感染の評価、薬物動態学および薬力学の評価、および疼痛および他の知覚の評価などの、さらに詳しい研究が必要である(Kimら、2012；Pettis and Harvey、2012)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
新たな経皮デリバリーシステムが、依然として望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明では、予期せぬことに、CMCとデキストリンDEXの組み合わせを用いて生体適合性マイクロニードルアレイ(MN)を製作することが見出される。したがって、本発明は、侵襲性および経皮性デリバリーシステムとして使用することができる、多糖類ベースの溶解可能なマイクロニードルベースのアレイの製作方法を提供する。本発明方法から得られるマイクロニードルアレイは、安全で生体適合性があり、インスリンなどの薬物の経皮投与に使用されうる。
【０００７】
1つの態様では、本発明は、治療薬の経皮デリバリーためのマイクロニードルベースのアレイを製作するための方法であって、
カルボキシメチルセルロース(CMC)とデキストリン(DEX)とを混合して、多糖類ベースの組み合わせを提供すること；および
該治療薬を該多糖類ベースの組み合わせに加えること；
を含む方法を提供する。
【０００８】
本発明の1つの実施態様では、多糖類ベースの組み合わせは、30〜70％のCMCおよび30〜70％のDEXを含む。
【０００９】
本発明の1つの例では、多糖類ベースの組み合わせは、50％のCMCおよび50％のDEXを含む。
【００１０】
本明細書で使用する用語「治療薬」は、薬物などの、哺乳動物に治療有効量で投与すると哺乳動物に治療上の利益をもたらす化合物または物質を示す。
【００１１】
本発明の1つの実施態様では、治療薬は、薬物である。
【００１２】
本発明の1つの実施態様では、治療薬は、インスリンである。
【００１３】
別の観点において、本発明は、カルボキシメチルセルロース(CMC)とデキストリン(DEX)との多糖類ベースの組み合わせからできている、治療薬の経皮デリバリー用マイクロニードルアレイを提供する。マイクロニードルアレイは、本発明の方法によって製造される。
【００１４】
本発明の上記の概要および以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことにより、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】モードの途中におけるキャスティング領域と、高速カッティングマシンと一体化したコンピュータ支援設計(CAD)システムによって製造された多糖類ベースのマイクロニードルアレイを含む、マイクロニードルアレイを提供する本発明の実施態様を示す画像を提供し、ここで、NAはニードル領域を意味し、BAはブランク領域を意味し、およびRAはリッジ領域を意味する；CTは接続トレンチを意味する。
【図２】本発明によるマイクロニードルアレイの製作のためのスキームを提供する。
【図３】それぞれ、(A)熱重量分析(TGA)のX線回折(XRD)；および(B)元の粉末形態の分析を含む、異なる多糖類の分析に関する図を提供する。
【図４】カルボキシメチルセルロース(CMC)およびデキストリン(DEX)、トレハロースおよびコントロールの個々の多糖の細胞毒性試験の結果を示す図でを提供する；ここで、NIH 3T3細胞は、多糖類の毒性を試験するために、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイに使用された。
【図５】(A)脱イオン水、(B)リン酸緩衝液、pH7.4、および(C)リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)中のカルボキシメチルセルロース(CMC)およびデキストリン(DEX)の粘度測定値を示す図を提供する；ここで、Cは100％のCMC(C)を含む混合物を示し、1C1Dは50％のCMCおよび50％のDEXを含む混合物を示し、1C2Dは34％のCMCおよび66％のDEXを含む混合物を示し、2C1Dは66％のCMCおよび34％のDEXを含む混合物を示し、および3C2Dは60％のCMCおよび40％のDEXを含む混合物を示す。
【図６】(A)走査型電子顕微鏡(SEM)画像および(B)光学顕微鏡(OM)観察などの、本発明によるマイクロニードルアレイの画像を提供する。
【図７】溶媒として脱イオン水またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用する、(A)溶媒としての脱イオン水；(B)リン酸緩衝液、pH 7.4、溶媒として；(C)リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4、およびX線回折(XRD)；および(D)カルボキシメチルセルロース(CMC)およびデキストリン(DEX)からなる製作された多糖類マイクロニードルの分析を提供する、熱重量分析(TGA)の結果を示す図を提供する；ここで、Cは100％のCMC(C)を含む混合物を示し、1C1Dは50％のCMCおよび50％のDEXを含む混合物を示し、1C2Dは34％のCMCおよび66％のDEXを含む混合物を示し、2C1Dは66％のCMCおよび34％のDEXを含む混合物を示し、および3C2Dは60％のCMCおよび40％のDEXを含む混合物を示す。
【図８】本発明によるマイクロニードルアレイの細胞毒性試験を示す；ここで、NIH3T3細胞を、多糖類(カルボキシメチルセルロース(CMC)；CMCおよびデキストリンの混合物(CMC+デキストリン)；およびコントロール)の毒性を試験するために3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイに付した。
【図９】インビボ皮膚浸透試験のための光学顕微鏡下の組織切片の観察を示す；試験薬物としてウシ血清アルブミン(BSA)を添加した本発明に記載のマイクロニードルアレイでヌードマウスを処理した：(A)および(B)は、ヘマトキシリンおよびエオシン(H＆E)染色の2つの代表的な画像を提供し、矢印は、マイクロニードルの貫通部を示す；(C)は、皮膚に貫通した後のBSAの放出を追跡する免疫組織化学およびH＆E(IHC+H)染色後のマウスの組織切片の代表的な画像を提供する；(D)は、BSAの放出を示すIHC+H染色組織の拡大図を提供する(スケールバーは、(A)と(C)では50μm、(B)と(D)では25μmである)。
【図１０】多糖類マイクロニードルから放出され、皮膚に拡散したメチレンブルー(MB)色素の時間追跡の代表的な凍結切片を示す。マウスを、(A)2時間、(B)4時間、および(C)と(D)8時間の間、MBを含むマイクロニードルで処置した。
【図１１】(A)4時間、(B)8時間および(C)24時間のマウスへの取り付けの前(上の画像)および後(下の画像)のマイクロニードルアレイの代表的な画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の記載
MNアレイのための鋳型の設計
図1に示すように、高速カッティングマシンとコンピュータ支援設計(CAD)システム(AutoCAD 2012)を使用して、アルミニウム(Al)プレート上に鋳型を製作した。アルミ鋳型は、予備的な結果に基づいて設計変更された。1つのアルミニウム鋳型は、キャスティングプロセスにおいて2つのマイクロニードルアレイを製作するための2つのアレイユニットを含む。アルミ鋳型には4つの機能領域があった：(1)ニードル領域(NA)；および(2)ブランク領域(BA)；(3)リッジ領域(RA)；および(4)接続トレンチ(CT)。鋳型の中央のNAは、10×10の円錐形のニードルアレイの2つのグループを有する。NAは、靭性を確保し、金型から開放されたときの応力破壊を回避するためにモデルに厚さを提供するBAに囲まれた。RAは、各シングルアレイユニットを分離するために使用され、CTは、粘性のある溶液の流れを遅くし、迅速な注入中に気泡が発生するのを避けるのを補助した。
【００１７】
MN製作のための複合材料を分析するために、図2に示すような2つの試験ループを用いて手順を設計し、本発明によるマイクロニードルアレイの製作スキームを提供した。最初の試験ループは、含水率、およびX線回折(XRD)および熱重量分析(TGA)からの結果に基づいた。さらに、第1のチェックポイントは、複合混合物を100℃までの温度によって切断することができないかどうかを試験することであった。第2のチェックポイントは、混合物が可溶性であるかどうかを試験した。もし、混合溶液が可溶性であったなら、次の試験は、生物毒性試験である。毒性がない場合は、5％の混合溶液からの良好なフィルム形成のためのチェックポイントを用いて一連の流動被覆を試験した。すべてのチェックポイントが試験されたとき、MNの製作が進行した。試験フィルムを用いた全ての作業およびMNの製作は、単一の「オールインワン」鋳型で行われた。
【００１８】
多糖類材料
それらの生体適合性および水溶性に基づいて、我々は、溶解可能なMNを製作するのに適した分子を同定するために、最初にそれらの物理的特性を分析するために4種の異なる多糖類を選択した。セルロース誘導体であるCMCは、さまざまな食品(Chilloら、2007)および医療用途で広く使用されている水溶性天然多糖類である。DEXは、デンプンの加水分解によって生成されるさまざまなサイズの水溶性グルコースポリマーを含む。DEXは、食品添加物として食品産業で、および多くの医薬品において使用されている。高分岐アミロペクチン(AMP)は、デンプンの2つの主要成分の1つである水溶性多糖類である。AMPは、食品増粘などのさまざまな用途において使用される。トレハロース(TRE)は、α,α-1,1-グルコシド結合によって連結された2つのグルコース単位を含む天然の二糖類である(Higashiyama、2002)。TREは、天然に広く分布しており、産業用途にとって魅力的な物質である。この糖類は、食品業界で甘味料として使用される(Higashiyama、2002)。
【００１９】
CMCナトリウム塩(99.5％純度)、DEX(99％純度のジャガイモデンプン由来)、TRE脱水物(Saccharomyces cerevisiae、細胞培養に適し、純度99％)およびAMP(ジャガイモデンプン由来)をSigma-Aldrichから購入した。
【００２０】
MN製作のための多糖類の物理的特性
すべての多糖類の含水率を、赤外線水分計MA150、Sartoriusを用いて測定した。その粉末形態の約0.1gの各糖を加熱し、水分のパーセンテージについて分析した。キャスティングプロセスにおける多糖類物質の加熱温度範囲を得るために、Setaram Labsys-TGDSC、DSC131装置を使用してTGAを実施した。その粉末形態の各糖0.008gのサンプルを、室温から500℃まで加熱速度5℃/分にてTGA分析のために加熱した。粉末形態の材料を、Rigaku(著作権)TTRAXIII粉末X線回折装置を用いるXRD分析にも用いて、材料の結晶化および分子配列に関する情報を得た。
【００２１】
Haake Viscotester 550 Rotational Viscometer(Thermo Scientific)を用いて、水溶液中の多糖類の粘度を測定した。47.5gの溶媒(それぞれ脱イオン水、リン酸緩衝液、およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS))に溶解した2.5gの多糖類を含む5％溶液を、試験のために粘度計に注いだ。
【００２２】
マイクロニードル(MN)キャスティング
MNキャスティングのために、65℃で真空蒸着を行った。多糖類溶液(5％w/v)を、それらをリン酸緩衝液に溶解し、完全分散および溶解のために60分間超音波処理することによって調製した。気泡を除去するために、溶液を室温にて10分間3500rpmで遠心分離した。次に、溶液をアルミニウム鋳型の縁に沿ってゆっくりと注入した。溶液を入れた鋳型を室温で15〜20分間真空中に保持して気泡を持ち上げ、目に見える気泡が観察されなくなるまで繰り返した。鋳型を室温から65℃に加熱し、定常温度65℃で24時間まで加熱した。昇温速度は1℃/分であった。
【００２３】
完成した多糖類フィルムまたはMN製品を、手動剥離によってアルミニウム鋳型から垂直に取り外した。貧弱に形成された製品は完全には剥がれないであろう。選択基準を、鋳型からの完全な分離および亀裂のないMNアレイとして設定した。
【００２４】
製作されたMNの評価
キャスティング後、多糖類フィルムまたは製作されたマイクロニードルの物理的性質を、TGAおよびXRD分析(セクション2.3参照)および硬度試験によって特徴決定した。
【００２５】
鋳型からの分離後、GARDCO(著作権)Wolff-Wilborn硬度鉛筆試験機(Paul N. Gardner)を使用して、製造業者のプロトコルに従って、最終製品の硬度を試験した。この引っかき硬度試験は、表面上の引っかき効果に対する多糖フィルムの耐性を決定した。
【００２６】
我々は、日立(著作権)H-7100顕微鏡上の走査型電子顕微鏡(SEM)および光学顕微鏡(OM)を使用して、MNの構造を決定した。
【００２７】
細胞毒性
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイを用いて、正常なNIH 3T3(マウス胚細胞)細胞株でインビトロ細毒性を実施した。NIH 3T3細胞を、10％ウシ胎児血清(FBS)を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で増殖させた。毒性研究のために、細胞を、10％FBSを含有するDMEM中の24ウェルプレートに5,000細胞/ウェルの播種密度で播種し、試験化合物の添加前に、5％CO2で37℃にて24時間インキュベートした。ポリマーをPBSに溶解し、0.22μMフィルターで濾過した。24時間後、0.05％(w/w)濃度の試験化合物を含む培地10μlを添加し、5％CO2で37℃にて48時間インキュベートした。実験を3回実施し、試験化合物を含まない細胞をコントロールとして供した。48時間後、PBS中のMTT溶液(5mg/ml)200μlを各ウェルに加え、37℃で4時間インキュベートした。MTTを含む培地を除去した後、形成されたホルマザン結晶を150μLのジメチルスルホキシドに可溶化し、540nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。細胞阻害％＝100-Abs(薬物)/Abs(コントロール)×100(ここで、Absは540nmでの吸光度を意味する)を用いて細胞阻害のパーセンテージを決定した。
【００２８】
インビボ皮膚透過性測定
研究で使用されたヌードマウス、BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/Cr1Nar1は、台湾の国立実験動物センターから入手した。MNを、包帯バンドルを用いてマウスに取り付けた。処置後、皮膚を外科的に剥がし、組織切片用に準備した。
【００２９】
MN皮膚貫通後のタンパク質の放出を追跡するために、1％BSA(ウシ血清アルブミン、Sigma-Aldrich)粉末を、キャスティング用多糖類(50％CMC+50％DEX)に混合した。皮膚組織片を4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン(H＆E)で染色した。BSA(Millipore(登録商標)07248)に対する抗体を用いて、免疫組織化学(IHC)を行った。
【００３０】
MNからの色素放出および皮膚への拡散の時間追跡のために、0.25％メチレンブルー(MB)粉末を、キャスティング用多糖類(CMC単独、または50％CMC+50％DEX)と混合した。皮膚組織片を凍結し、凍結切片として調製した。
【００３１】
この研究における動物の使用は、台北医科大学のIACUCによって承認された。
【実施例１】
【００３２】
MN製作のための材料調査と選択
本研究では、経皮ドラッグラリーデリバリーのための生分解性MNを製造する方法を提示する。適切な材料を選択するために、多糖類であるCMC、DEX、TRE、およびAMPをその粉末形態で分析して、それらの含水率、結晶性および熱安定性を調べた。多糖類をさまざまな比率で混合して、水性緩衝液中のそれらの溶解度を試験した。続いて、個々のまたは組み合わせた可溶性多糖類を鋳型表面上に注ぎ、それらのフィルム形成をチェックした。個々の多糖類の細胞毒性も試験した。
【００３３】
含水率試験の結果を表1に示す。55℃で24時間乾燥させても、試験したすべての多糖類に水分子が存在した。材料の水分容量および水分子との親和性は、材料が完全に乾燥するか、または水分がキャスティングプロセス中に失われるのを回避し、材料が、組み込まれた薬剤またはタンパク質と適合性であることを確実にした。
【００３４】
表1
さまざまな多糖類の含水率
【表１】
2019163218.tif 000002
データは、3回反復測定値からの平均として提供される。カルボキシメチルセルロース、CMC；デキストリン、DEX；トレハロース、TRE；アミロペクチン、AMP
【００３５】
粉末形態の個々の糖をXRDおよびTGAで分析して、結晶性および熱安定性を調べた。結晶化特性は、材料の分子配列およびそれらの保水能力に関する情報を提供した。この情報は、異なる多糖類を組み合わせる際に有用であり得る。TGAを使用して熱特性を分析することにより、キャスティングプロセスで使用される乾燥温度で材料が安定することが保証された。
【００３６】
試験したすべての材料は、結晶化のために有意なシグナルピークを示した(図3A)。TREは最も明白なシグナルを生成した。DEXは、デンプンの加水分解によって生成される炭水化物のグループであり、したがって、AMPのシグナルと類似のシグナルを示した(図3A)。CMCのより低い信号およびより滑らかな曲線は、より多くの非晶質領域がCMCに存在することを示した。
【００３７】
温度による質量損失プロファイルを図3Bおよび表2に示す。最初の質量損失(90〜130℃)は水分損失の臨界温度を示し、2番目の損失(240℃以上)は分子分解を反映している。CMCおよびTREは、水損失について、AMPおよびDEXよりもより顕著に減少する曲線を示した(図3B)。この結果は、AMPおよびDEXがそれらの粉末形態で、より良好な水分容量を有することを示した。これは、含水率試験によって確認された(表1)。TGAデータは、多糖類が、55〜75℃の温度を有する一般的な低温MN製造プロセスでのキャスティングにとって熱安定性であることを示した。キャスティング温度を下げると、乾燥時間は、75℃では15時間、65℃では24時間、55℃では28時間となった。その後のMNキャスティングの温度は、多糖類マトリックスおよびBSAが安定していたので、65℃に設定された。
【００３８】
表2
熱分解温度を示す各種多糖類の熱重量分析(TGA)
【表２】
2019163218.tif 000003
カルボキシメチルセルロース、CMC；デキストリン、DEX；トレハロース、TRE；アミロペクチン、AMP
T10：10％質量損失についての熱分解温度
T50：50％質量損失についての熱分解温度
Td：分子分解温度
R340：340℃における残留重量パーセント
【００３９】
糖の溶解度および粘度は、キャスティング製品の品質に直接影響する。多糖類を異なる比率で混合して、水性緩衝液中のそれらの溶解度を試験した。アミロペクチン(AMP)は、種々の多糖類の組合せの中でも、水溶性緩衝液中での溶解度が低く、それを溶解するのに連続的な熱が必要であることから、MNを製造するのに適していなかった。
【００４０】
糖溶液の粘度は、高濃度で増加する。材料の粘度は、糖溶液を鋳型に注いだ後の充填効果に影響を及ぼし、最終製品に影響を及ぼす。高粘性の溶液は、鋳型を満たして気泡を生成することができない。低粘度の溶液は、最終製品に十分な厚さを与えず、物理的特性の低下をもたらす。したがって、鋳型表面を満たすためには適切な粘度を見つけることが必要であった。注入するのに適した粘度を確認するために、CMCを試験管中でさまざまな濃度(5〜50％w/v)にて使用し、管を回転させたときの液体の滑らかな流れを目視で観察した(表3)。5％溶液のみが試験管を完全に被覆することができたが、10％および20％溶液は部分的な被覆しか示さなかった。30％および50％溶液は、その高い粘度のためにゆっくりと移動し、チューブを完全に覆うことができなかった。我々は、さらなる研究のためのベースラインとして5％溶液を選択した。
【００４１】
表3
試験管をカバーするためにさまざまな濃度(5〜50％)のカルボキシメチルセルロース(CMC)による流動被覆試験の概要
【表３】
2019163218.tif 000004
N/A：流動不可能
AC：完全に被覆、C：部分的に被覆、LC：管を被覆することはできない、ゆっくりと流れる。
【００４２】
続いて、それぞれTRE、DEX、またはCMCの5％溶液を用いて、鋳型フィルム(65℃で24時間乾燥)を調べるために、アルミニウム鋳型の裏側のブランク表面を使用した。TREは、シート構造に固定することができない薄い、不規則な、半透明の膜を生成した。DEXは、断片に割れる比較的厚いブロックを作った。したがって、TREおよびDEX単独では、MNアレイにおけるキャスティングに適さなかった。それらはCMCとの混合物として使用するものとみなされた。
【００４３】
CMCと組み合わせたTREは、鋳型表面から分離することが困難であり(データは示さず)、表面の傷跡および繰り返しの洗浄期間をもたらした。CMCと組み合わせたTREの濃度が低下すると、十分に厚いポリマーフィルムを形成することができず、鋳型に固着して分離が困難であり、数枚の破片が生成された(データは示さず)。XRD分析(図3A)は、2つの多糖類間の結晶化度の大きな差を示した。TREは、より多くの結晶化およびより少ない非晶質領域を示したが、CMCは、より少ない結晶化およびより多くの非晶質領域を示した(図3A)。TREは、溶液中に小さな分子量の分子として存在し、乾燥プロセス中に結晶に巨大分子の亀裂を示し、全体の構造を損なう。したがって、TREは、MNを製造するためのCMCとの組み合わせには適していなかった。
【００４４】
DEXは、結晶学的シグナル(図4A)および分子サイズに関してCMCと類似していた；したがって、キャスティング処理中にCMCとの互換性が向上する可能性がある。CMC単独またはDEXとの組み合わせが、さらなる研究のために考慮された。
【実施例２】
【００４５】
キャスティング前評価(粘度試験)
DEXと組み合わせたCMCの粘度試験を行った(図6)。3つの異なる水性緩衝液(脱イオン水、リン酸緩衝液, pH7.4およびPBS, pH7.4)を使用して、CMCおよびDEXをさまざまな比率で溶解させた(100% CMC、50% CMC＋50% DEX、34% CMC＋66% DEX、66% CMC＋34% DEX、および60% CMC＋40% DEX)。材料を混合することにより、流体の性質が大きく変化した。CMC比が高くなると、粘度が上昇した(図5)。緩衝液中に塩が存在するため、溶媒は粘度をわずかに増加させた。緩衝液中に塩が存在するので、溶媒は、粘度をわずかに増加させた。溶媒を置換しても粘度を低下させることはできなかった。しかしながら、溶媒PBSは、純粋なCMCの粘度を有意に増加させた。最後に、MNキャスティングのPBを選択した。
【実施例３】
【００４６】
多糖類ベースのMNアレイの製作
アルミ鋳型は、モデルキャスティングのためのいくつかの利点を提供する。それは、従来のMNキャスティング方法と互換性がある(Leeら、2008；Migalskaら、2011；Parkら、2016)。Al ASTM 6061(FDAにより食品容器としての使用が許可されている)は、重い構造体のための耐食性の高い材料であり、本研究では再使用可能な鋳型を準備するために使用された。MNの製作のために、多糖類混合物をAl鋳型上に注ぎ、65℃で24時間乾燥させた。最終製品が、多糖類と共に生体分子および薬物で製造されるので、キャスティングには低温を使用した。標的分子の熱安定性は、乾燥プロセス中に考慮された(図3Bおよび表2)。図5は、約480μmの長さ、370μmの基板、および600μmの針中心間隔の多糖類ベースのMNのSEMおよびOM観察を示す。
【００４７】
この研究では、CMCのみとCMC/DEX混合物を使用してMNを作製した。CMCは、生物活性化合物と混合可能であり、低温で処理するのが比較的容易であり、安価である天然の溶解性ポリマーである。これは、MN製作(Kommareddyら、2012；Leeら、2017；Leeら、2008；Parkら、2016)などの医療用途(Agarwalら、2015；Chenら、2015；Pasquiら、2014)で広く使用されている。
【実施例４】
【００４８】
製作されたMNの特性
鋳型の分離後の最終製品の硬さを保証するために鉛筆硬度試験を行った。表4に鉛筆硬度試験の詳細を示す。DEXと組み合わせたCMCは、CMC単独よりも優れた硬度を示した。多糖類の組み合わせは、脱イオン水と比較して、リン酸緩衝液中で硬度の増加を示した。
【００４９】
TGAの結果は、水性緩衝液中のCMCとDEXの異なる組み合わせの熱的特性が200℃まで安定であることを示した(図5A-5C、表5)。キャスティングプロセス後の最初の質量損失の曲線は、穏やかで連続的なCMCおよびDEX曲線を示した(フィルムについては図7Aを参照、粉末形態と比較して図3B参照)。しかしながら、PBまたはPBSを溶媒として用いた場合、キャスティングフィルムのTGA曲線は有意差を示さず、材料とリン酸緩衝液との間に直接的化学反応が形成されないことを示した(図7A〜図7Cにおける曲線CMC、1C1D、1C2D、2C1D)。フィルムをキャスティングするための質量損失は水の損失によるものであった。
【００５０】
表4
水性緩衝液中の多糖類のさまざまな組み合わせの鉛筆硬度試験
【表４】
2019163218.tif 000005
カルボキシメチルセルロース、CMC；デキストリン、DEX；リン酸緩衝生理食塩水、PBS；リン酸緩衝液、PB
【００５１】
表5
さまざまな多糖類を用いて製作されたマイクロニードルアレイのTGA解析、熱分解温度を示す
【表５】
2019163218.tif 000006
【００５２】
多糖類フィルムのXRD結果は、キャスティング処理前(図3A)およびキャスティング処理後(図7D)で、大きな差異を示した。結晶化シグナルは、18℃〜21℃、22℃〜24℃、40℃〜42℃で現れた(図7D)。信号面積と間隔を比較すると、信号は主に、DEXまたは溶媒ではなくCMCによって引き起こされることが示された。XRDは、溶媒生成物について余分な結晶化シグナルを示さなかった(3C2Dの曲線をPBS 3C2Dと比較し、1C2Dの曲線を図7DのPBS 1C2Dと比較する)。DEXとの混合はシグナルピークの高さにのみ影響を与えた。この結果は、キャスティング工程がCMCの再結晶化を遅らせるという仮説を裏付けている。再結晶化は、加熱中に水が徐々に失われ、整然として順序正しい分子配列がもたらされることに起因する可能性がある(Jeongら、2016)。結晶化は水分を保持する材料の重要な指標である。整然と配列された分子アレイは、結晶構造への外部水の侵入に対して効果的に抵抗し、内部から外部への蒸発散を阻止する。
【００５３】
作製されたMNの生体適合性を確認するために細胞毒性試験を行った(図8)。NIH-3T3細胞株のMTTアッセイは、MNが製作プロセス中にMNに蓄積された毒性および毒性物質を示さないことを確認した。細胞生存率は、コントロールと比較して、CMC単独およびCMC/DEX混合物の両方において95％を超えた。我々は、CMC単独およびCMC/DEX混合物(50％CMC+50％DEX)を用いて、その後のインビボ研究のためにMNを製作した。
【実施例５】
【００５４】
インビボ皮膚浸透試験および薬物放出時間試験
インビボ皮膚浸透試験のために、BSAと組み合わせたCMC/DEX混合物をMN製作に使用した。MNをマウスに24時間付着させた。H＆Eで染色されたマウス皮膚切片の光学顕微鏡観察は、その表面におけるマイクロニードルの貫通を明らかに示した(図9A、9B)IHC+H染色は、皮膚に貫通した後のBSAの放出(ダークブラウンとして強調された)の追跡を示した(図9C、9D)。H＆EおよびIHC+H染色を組み合わせて、さらなる確認を行い、ドラッグデリバリー法の完全性を評価した。製造されたMNアレイをヌードマウスの皮膚に使用することができ、その結果、BSAの浸透および放出が成功したことが示された。製作したMNアレイを、ヌードマウスの皮膚に使用することができ、その結果、BSAの浸透および放出が成功したことが示された。
【００５５】
薬物溶解および拡散の時間追跡のために、メチレンブルーと組み合わせたCMC単独またはCMC/DEX混合物をMN製作のために使用した。一連のチェックポイントを通してヌードマウスにMNを挿入した後、薬物を表すメチレンブルーを、表面上の放出および皮膚への拡散に対して追跡した。マウス皮膚の凍結切片は、処置後最初の2時間には有意な色素シグナルを示さなかった(図10A)。MN処理後、メチレンブルーの拡散および皮膚への浸透が4時間観察された(図10B、10C)。CMC/DEX混合物は、純粋なCMCのメチレンブルーの放出(図10C)と比較して、メチレンブルーのより良好な放出を示した(図10D)。
【実施例６】
【００５６】
MN溶解の評価
MNの溶解を評価するために、ヌードマウスの皮膚に挿入する前と挿入した後のCMC針の外観を確認した(図11)。4時間(図11A)および8時間(図11B)の処置後、針の外観において、有意な視覚的変化は観察されなかった。24時間のMN治療後、針の外観は、明らかに変化した(図11C)。体液により溶解し、吸収されるので、針はより緩く柔らかになった。この結果は、24時間までの処置後にMNが部分的に溶解することも示した。したがって、MNは、ドラッグデリバリーにおける長期間の放出に適している可能性がある。
【００５７】
参考文献：
[1] T. Agarwal, T., Narayana, S.N., Pal, K., Pramanik, K., Giri, S., Banerjee, I., 2015. Calcium alginate-carboxymethyl cellulose beads for colon-targeted drug delivery. Int J Biol Macromol 75, 409-417.
[2] Asbill, C.S., Michniak, B.B., 2000. Percutaneous penetration enhancers：local versus transdermal activity. Pharm Sci Technolo Today 3, 36-41.
[3] Badran, M.M., Kuntsche, J., Fahr, A., 2009. Skin penetration enhancement by a microneedle device (Dermaroller) in vitro：dependency on needle size and applied formulation. Eur J Pharm Sci 36, 511-523.
[4] Bronaugh, R.L., Maibach, H.I., 2005. Percutaneous absorption ：drugs, cosmetics, mechanisms, methodology, 4th ed. Taylor & Francis, Boca Raton.
[5] Chen, Y.C., Ho, H.O., Liu, D.Z., Siow, W.S., Sheu, M.T., 2015. Swelling/floating capability and drug release characterizations of gastroretentive drug delivery system based on a combination of hydroxyethyl cellulose and sodium carboxymethyl cellulose. PLoS One 10, e0116914.
[6] Cheung, K., Han, T., Das, D.B., 2014. Effect of force of microneedle insertion on the permeability of insulin in skin. J Diabetes Sci Technol 8, 444-452.
[7] Chillo, S., Laverse, J., Falcone, P.M., Del Nobile, M.A., 2007. Effect of carboxymethylcellulose and pregelatinized corn starch on the quality of amaranthus spaghetti. J Food Eng 83, 492-500.
[8] Chu, L.Y., Prausnitz, M.R., 2011. Separable arrowhead microneedles. J Control Release 149, 242-249.
[9] Ding, Z., Verbaan, F.J., Bivas-Benita, M., Bungener, L., Huckriede, A., van den Berg, D.J., Kersten, G., Bouwstra, J.A., 2009. Microneedle arrays for the transcutaneous immunization of diphtheria and influenza in BALB/c mice. J Control Release 136, 71-78.
[10] Hadgraft, J., Peck, J., Williams, D.G., Pugh, W.J., Allan, G., 1996. Mechanisms of action of skin penetration enhancers/retarders：Azone and analogues. International Journal of Pharmaceutics 141, 17-25.
[11] Hafeli, U.O., Mokhtari, A., Liepmann, D., Stoeber, B., 2009. In vivo evaluation of a microneedle-based miniature syringe for intradermal drug delivery. Biomed Microdevices 11, 943-950.
[12] Higashiyama, T., 2002. Novel functions and applications of trehalose. Pure Appl Chem 74, 1263-1269.
[13] Hirobe, S., Azukizawa, H., Hanafusa, T., Matsuo, K., Quan, Y.S., Kamiyama, F., Katayama, I., Okada, N., Nakagawa, S., 2015. Clinical study and stability assessment of a novel transcutaneous influenza vaccination using a dissolving microneedle patch. Biomaterials 57, 50-58.
[14] Jeong, H., Shepard, K.B., Purdum, G.E., Guo, Y.L., Loo, Y.L., Arnold, C.B., Priestley, R.D., 2016. Additive Growth and Crystallization of Polymer Films. Macromolecules 49, 2860-2867.
[15] Kaushik, S., Hord, A.H., Denson, D.D., McAllister, D.V., Smitra, S., Allen, M.G., Prausnitz, M.R., 2001. Lack of pain associated with microfabricated microneedles. Anesth Analg 92, 502-504.
[16] Ke, C.J., Lin, Y.J., Hu, Y.C., Chiang, W.L., Chen, K.J., Yang, W.C., Liu, H.L., Fu, C.C., Sung, H.W., 2012. Multidrug release based on microneedle arrays filled with pH-responsive PLGA hollow microspheres. Biomaterials 33, 5156-5165.
[17] Kim, Y.C., Park, J.H., Prausnitz, M.R., 2012. Microneedles for drug and vaccine delivery. Adv Drug Deliv Rev 64, 1547-1568.
[18] Kommareddy, S., Baudner, B.C., Oh, S., Kwon, S.Y., Singh, M., O'Hagan, D.T., 2012. Dissolvable microneedle patches for the delivery of cell-culture-derived influenza vaccine antigens. J Pharm Sci 101, 1021-1027.
[19] Langer, R., 2001. Drug delivery. Drugs on target. Science 293, 58-59.
[20] Lee, I.C., Lin, W.M., Shu, J.C., Tsai, S.W., Chen, C.H., Tsai, M.T., 2017. Formulation of two-layer dissolving polymeric microneedle patches for insulin transdermal delivery in diabetic mice. Journal of Biomedical Materials Research Part A 105, 84-93.
[21] Lee, J.W., Park, J.H., Prausnitz, M.R., 2008. Dissolving microneedles for transdermal drug delivery. Biomaterials 29, 2113-2124.
[22] Lee, K., Lee, C.Y., Jung, H., 2011. Dissolving microneedles for transdermal drug administration prepared by stepwise controlled drawing of maltose. Biomaterials 32, 3134-3140.
[23] Li, G., Badkar, A., Nema, S., Kolli, C.S., Banga, A.K., 2009. In vitro transdermal delivery of therapeutic antibodies using maltose microneedles. Int J Pharm 368, 109-115.
[24] Lin, W., Cormier, M., Samiee, A., Griffin, A., Johnson, B., Teng, C.L., Hardee, G.E., Daddona, P.E., 2001. Transdermal delivery of antisense oligonucleotides with microprojection patch (Macroflux) technology. Pharm Res 18, 1789-1793.
[25] Liu, S., Jin, M.N., Quan, Y.S., Kamiyama, F., Katsumi, H., Sakane, T., Yamamoto, A., 2012. The development and characteristics of novel microneedle arrays fabricated from hyaluronic acid, and their application in the transdermal delivery of insulin. J Control Release 161, 933-941.
[26] Martanto, W., Davis, S.P., Holiday, N.R., Wang, J., Gill, H.S., Prausnitz, M.R., 2004. Transdermal delivery of insulin using microneedles in vivo. Pharm Res 21, 947-952.
[27] Martin, C.J., Allender, C.J., Brain, K.R., Morrissey, A., Birchall, J.C., 2012. Low temperature fabrication of biodegradable sugar glass microneedles for transdermal drug delivery applications. J Control Release 158, 93-101.
[28] McAllister, D.V., Wang, P.M., Davis, S.P., Park, J.H., Canatella, P.J., Allen, M.G., Prausnitz, M.R., 2003. Microfabricated needles for transdermal delivery of macromolecules and nanoparticles：fabrication methods and transport studies. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 13755-13760.
[29] Migalska, K., Morrow, D.I., Garland, M.J., Thakur, R., Woolfson, A.D., Donnelly, R.F., 2011. Laser-engineered dissolving microneedle arrays for transdermal macromolecular drug delivery. Pharm Res 28, 1919-1930.
[30] Mikszta, J.A., Alarcon, J.B., Brittingham, J.M., Sutter, D.E., Pettis, R.J., Harvey, N.G., 2002. Improved genetic immunization via micromechanical disruption of skin-barrier function and targeted epidermal delivery. Nat Med 8, 415-419.
[31] Park, Y.H., Ha, S.K., Choi, I., Kim, K.S., Park, J., Choi, N., Kim, B., Sung, J.H., 2016. Fabrication of degradable carboxymethyl cellulose (CMC) microneedle with laser writing and replica molding process for enhancement of transdermal drug delivery. Biotechnology and Bioprocess Engineering 21, 110-118.
[32] Pasqui, D., Torricelli, P., De Cagna, M., Fini, M., Barbucci, R., 2014. Carboxymethyl cellulose-hydroxyapatite hybrid hydrogel as a composite material for bone tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A 102, 1568-1579.
[33] Pettis, R.J., Harvey, A.J., 2012. Microneedle delivery：clinical studies and emerging medical applications. Ther Deliv 3, 357-371.
[34] Prausnitz, M.R., Langer, R., 2008. Transdermal drug delivery. Nat Biotechnol 26, 1261-1268.
[35] Raphael, A.P., Prow, T.W., Crichton, M.L., Chen, X., Fernando, G.J., Kendall, M.A., 2010. Targeted, needle-free vaccinations in skin using multilayered, densely-packed dissolving microprojection arrays. Small 6, 1785-1793.
[36] Sullivan, S.P., Koutsonanos, D.G., Del Pilar Martin, M., Lee, J.W., Zarnitsyn, V., Choi, S.O., Murthy, N., Compans, R.W., Skountzou, I., Prausnitz, M.R., 2010. Dissolving polymer microneedle patches for influenza vaccination. Nat Med 16, 915-920.
[37] Sullivan, S.P., Murthy, N., Prausnitz, M.R., 2008. Minimally invasive protein delivery with rapidly dissolving polymer microneedles. Adv Mater 20, 933-938.
[38] Tuan-Mahmood, T.M., McCrudden, M.T., Torrisi, B.M., McAlister, E., Garland, M.J., Singh, T.R., Donnelly, R.F., 2013. Microneedles for intradermal and transdermal drug delivery. Eur J Pharm Sci 50, 623-637.
[39] Wokovich, A.M., Prodduturi, S., Doub, W.H., Hussain, A.S., Buhse, L.F., 2006. Transdermal drug delivery system (TDDS) adhesion as a critical safety, efficacy and quality attribute. Eur J Pharm Biopharm 64, 1-8.
【図１Ａ−１Ｂ】
2019163218.tif 000007
【図２】
2019163218.tif 000008
【図３】
2019163218.tif 000009
【図４】
2019163218.tif 000010
【図５】
2019163218.tif 000011
【図６】
2019163218.tif 000012
【図７】
2019163218.tif 000013
【図８】
2019163218.tif 000014
【図９】
2019163218.tif 000015
【図１０】
2019163218.tif 000016
【図１１】
2019163218.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月4日(2019.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシメチルセルロース(CMC)とデキストリン(DEX)との多糖類ベースの組み合わせからできている、治療薬の経皮デリバリー用マイクロニードルアレイ。
【請求項２】
多糖類ベースの組み合わせが、30〜70％のCMCおよび30〜70％のDEXを含む、請求項１に記載のマイクロニードルアレイ。
【請求項３】
多糖類ベースの組み合わせが、50％のCMCおよび50％のDEXを含む、請求項２に記載のマイクロニードルアレイ。
【請求項４】
治療薬が、インスリンである、請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロニードルアレイ。
【外国語明細書】
2019163218.tif 000018
2019163218.tif 000019
2019163218.tif 000020
2019163218.tif 000021
2019163218.tif 000022
2019163218.tif 000023
2019163218.tif 000024
2019163218.tif 000025
2019163218.tif 000026
2019163218.tif 000027
2019163218.tif 000028
2019163218.tif 000029
2019163218.tif 000030
2019163218.tif 000031
2019163218.tif 000032
2019163218.tif 000033
2019163218.tif 000034
2019163218.tif 000035
2019163218.tif 000036
2019163218.tif 000037
2019163218.tif 000038
2019163218.tif 000039
2019163218.tif 000040
2019163218.tif 000041
2019163218.tif 000042