(57)【要約】【課題】細胞組織の切片をスライドガラスへ貼り付けることなく、神経細胞を観察する装置を提供する。【解決手段】神経細胞を含む細胞組織の観察装置１は、光源２０と、偏光方向を変えることができ、光源２０から照射された光を偏光させる第１の偏光子２２と、脳組織の切片１６を載置可能な鏡面を有し、第１の偏光子２２を通過した光が鏡面上に載置された切片１６に照射されるように設けられた切片刃６と、切片１６を通過して切片刃により反射された反射光が入射され、反射光を所定の角度に変更する第２の偏光子２８と、第２の偏光子２８を通過した光を受光するＣＣＤ３０と、を備える。【選択図】図１
2019204007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞を含む細胞組織の観察装置であって、
光源と、
偏光方向を変えることができ、前記光源から照射された光を偏光させる第１の偏光子と、
前記細胞組織の組織切片を載置可能な鏡面を有し、前記第１の偏光子を通過した光が前記鏡面上に載置された前記組織切片に照射されるように設けられた鏡面部材と、
前記組織切片を通過して鏡面部材により反射された反射光が入射され、前記反射光を偏光する第２の偏光子と、
前記第２の偏光子を通過した光を受光する受光装置と、を備える、ことを特徴とする観察装置。
【請求項２】
前記鏡面部材は、表面に鏡面加工が施された切片刃であり、当該切片刃に前記細胞組織から切り出された前記組織切片が載置される、請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
さらに、第１のビームスプリッタを有し、
前記第１の偏光子を通過した光は前記第１のビームスプリッタを通って前記鏡面部材に照射され、
前記鏡面部材により反射された前記反射光は前記第１のビームスプリッタを通って前記第２の偏光子に入射される、
請求項１又は２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記第１のビームスプリッタにおいて生じる偏光状態の変化である偏光誤差を修正するための光学系をさらに備える、請求項３に記載の観察装置。
【請求項５】
神経細胞を含む細胞組織の観察方法であって、
前記細胞組織の組織切片を鏡面上に配置する切片配置ステップと、
光源から光を照射する照射ステップと、
前記照射された光を第１の偏光子により所定の角度だけ偏光させる第１の偏光ステップと、
前記第１の偏光子を通過した光を、前記組織切片を透過させる第１の透過ステップと、
前記組織切片を透過した光を前記鏡面に入射させる鏡面入射ステップと、
前記鏡面で反射した光を、前記組織切片を再度透過させる第２の透過ステップと、
前記組織切片を再度透過した光を第２の偏光子により偏光する第２の偏光ステップと、
前記第２の偏光子により偏光された透過光を受光する受光ステップと、を備える、ことを特徴とする観察方法。
【請求項６】
前記鏡面は鏡面加工が施された切片刃の表面であり、
前記切片配置ステップでは、前記切片刃により前記細胞組織から前記組織切片を切り出し、載置する、請求項５に記載の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞を含む細胞組織の観察装置及び観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳の神経線維走行を計測する手法として、核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）装置を用いた拡散テンソル画像法（ＤＴＩ）などがある。しかし、ＤＴＩにおける空間解像度は１００μｍ程度で運用されており、ミリエン化神経線維等の神経線維の平均直径に比べて非常に低いため、ＤＴＩでは、細かい神経線維束を捉えることができない。また、ＤＴＩは、脳内の水拡散情報に基づき神経構造を推定するため、神経線維の種類（ミエリン化線維と非ミエリン化線維）を区別できない。さらに、ＭＲＩ装置は高額であるため、汎用性が低い。
【０００３】
これに対して、近年、非特許文献１に記載されているように偏光を脳の切片に透過させて透過光を観察する透過型の偏光観察法（Transmission Polarized Light Imaging、以下、ｔＰＬＩという）が提案されている。図１３は、ｔＰＬＩに用いられる観察装置の構成を示す概略図である。図１３に示すように、ｔＰＬＩに用いられる観察装置２０１の光学系は、光源２２０と、第１の偏光子２２２と、１／４波長板２２６と、第２の偏光子２２８と、ＣＣＤ２３０とを備える。神経線維走行を探知するためには、脳を複数の薄い切片にスライスし、それぞれの切片２１６を順次スライドガラス２０６に貼り付けて観察装置に設置し、光源２２０から光を照射する。光源２２０から照射された光は、第１の偏光子２２２により偏光されて直線偏光となり、脳組織の切片２１６に入射される。そして、切片２１６の透過光は１／４波長板２２６により方位角が回転され、第２の偏光子２２８に入射され、第２の偏光子２２８により偏光された透過光はＣＣＤ２３０により撮像される。ｔＰＬＩでは、第１の偏光子２２２を所定の角度間隔で回転させながら、各角度における透過光をＣＣＤにより撮像する。そして、撮像された各角度における透過光を分析することにより、ミエリン化された神経線維束の走行を顕微鏡レベルの空間解像度で画像化することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hubertus Axer、外2名、"Visualization of Nerve Fiber Orientation in Gross Histological Sections of the Human Brain、Microscopy Research and Technique、［online］、平成12年11月6日、第51巻、p. 481―492 ［平成30年3月28日検索］、インターネット〈URL：https://doi.org/10.1002/1097-0029(20001201)51:5<481::AID-JEMT11>3.0.CO;2-N〉
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ここで、図１３に示す観察装置により神経線維束の走行を探知する場合には、脳のサンプルを光が透過可能な厚さ６０μｍ程度の薄い切片に切断した後、折り曲げたり破いたりしないようにスライドガラスへ貼り付ける必要があった。このため、偏光を脳の切片に透過させて透過光を観察する偏光観察法では、脳の多数の切片をスライドガラスへ貼り付けなければならず、非常に手間と時間がかかるという問題があった。
【０００６】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、細胞組織の切片をスライドガラスへ貼り付けることなく、神経細胞を観察する方法及び装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の観察装置は、神経細胞を含む細胞組織の観察装置であって、光源と、偏光方向を変えることができ、光源から照射された光を偏光させる第１の偏光子と、細胞組織の組織切片を載置可能な鏡面を有し、第１の偏光子を通過した光が鏡面上に載置された組織切片に照射されるように設けられた鏡面部材と、組織切片を通過して鏡面部材により反射された反射光が入射され、反射光を偏光する第２の偏光子と、第２の偏光子を通過した光を受光する受光装置と、を備える、ことを特徴とする。
【０００８】
上記構成の本発明によれば、組織切片を透過し、鏡面部材により反射され、再度組織切片を透過した光に基づき神経細胞を観察する。このため、細胞組織の組織切片をスライドガラスへ貼り付けることなく観察を行うことができる。
【０００９】
本発明において、好ましくは、鏡面部材は、表面に鏡面加工が施された切片刃であり、切片刃に細胞組織から切り出された組織切片が載置される。
【００１０】
上記構成の本発明によれば、切片刃により細胞組織を切り出し、そのままの状態で観察を行うことができる。このため、手間をかけずに細胞組織の組織切片の観察を行うことができる。
【００１１】
本発明において、さらに、第１のビームスプリッタを有し、第１の偏光子を通過した光は第１のビームスプリッタを通って鏡面部材に照射され、鏡面部材により反射された反射光は第１のビームスプリッタを通って第２の偏光子に入射される。
【００１２】
上記構成の本発明によれば、鏡面部材への入射光と反射光の方向が同一方向であっても、光源から出射された光を受光装置で受光することができる。
【００１３】
本発明において、好ましくは、第１のビームスプリッタにおいて生じる偏光状態の変化である偏光誤差を修正するための光学系をさらに備える。
【００１４】
ビームスプリッタでは偏光入射光に位相のシフトが生じてしまうため、神経線維走行の画像化が困難になる。上記構成の本発明によれば、このようなビームスプリッタで生じる偏光誤差を修正することができ、画像化を確実に実現できる。
【００１５】
本発明の観察方法は、神経細胞を含む細胞組織の観察方法であって、細胞組織の組織切片を鏡面上に配置する切片配置ステップと、光源から光を照射する照射ステップと、照射された光を第１の偏光子により所定の角度だけ偏光させる第１の偏光ステップと、第１の偏光子を通過した光を、組織切片を透過させる第１の透過ステップと、組織切片を透過した光を鏡面に入射させる鏡面入射ステップと、鏡面で反射した光を、組織切片を再度透過させる第２の透過ステップと、組織切片を再度透過した光を第２の偏光子により偏光させる第２の偏光ステップと、第２の偏光子により偏光された透過光を受光する受光ステップと、を備える、ことを特徴とする。
【００１６】
上記構成の本発明によれば、組織切片を透過し、鏡面部材により反射され、再度組織切片を透過した光に基づき神経細胞を観察する。このため、細胞組織の組織切片をスライドガラスへ貼り付けることなく観察を行うことができる。
【００１７】
本発明において、好ましくは、鏡面は鏡面加工が施された切片刃の表面であり、切片配置ステップでは、切片刃により細胞組織から組織切片を切り出し、載置する。
【００１８】
上記構成の本発明によれば、切片刃により細胞組織を切り出し、そのままの状態で観察を行うことができる。このため、手間をかけずに細胞組織の組織切片の観察を行うことができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、細胞組織の切片をスライドガラスへ貼り付けることなく、神経細胞を観察する方法及び装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の第１実施形態の観察装置の構成を示す概略図である。
【図２】図１に示す観察装置のスライサーの構成を示す図である。
【図３】第１実施形態の観察装置において脳の切片を設置していない状態での第１の偏光子Ｐ１の角度ρに対するＣＣＤで撮像された光の平均強度を示すグラフである。
【図４】第１のビームスプリッタにおいて光が反射した際の位相のずれを検討するための光学系である。
【図５】第１のビームスプリッタにおいて光が透過した際の位相のずれを検討するための光学系である。
【図６】図４に示す光学系におけるＰ１の角度に対するＣＣＤで撮像された光の平均強度を示すグラフである。
【図７】図５に示す光学系におけるＰ１の角度に対するＣＣＤで撮像された光の平均強度を示すグラフである。
【図８】本発明の第２実施形態の観察装置の構成を示す図である。
【図９】第２実施形態の観察装置における脳の切片を設置していない状態における第１の偏光子Ｐ１の角度ρに対するＣＣＤで撮像された光の平均強度を示すグラフである。
【図１０】ＣＣＤにより撮像された画像を示し、（ａ）は第１の偏光子の角度ρ＝０°、（ｂ）は第１の偏光子の角度ρ＝９０°における画像である。
【図１１】第１の偏光子の角度ρに対する図１０において四角で囲んだ領域の光の強度を示すグラフである。
【図１２】マウスの脳の切片について算出されたパラメータを示し、（ａ）はI0を示し、（ｂ）は｜sinδ｜を示し、（ｃ）はαを示し、（ｄ）はφを示す。
【図１３】ｔＰＬＩに用いられる観察装置の構成を示す概略図である。
【図１４】ミエリン化された神経線維走行の角度α及びφを示す図である。
【図１５】図１３の観察装置における脳の切片を設置していない状態におけるＰ１の角度に対するＣＣＤで撮像された光の平均強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
まず、非特許文献１に記載された従来のｔＰＬＩによる観察装置について詳細に説明する。
上述の通り、図１３に示すように、従来のｔＰＬＩによる観察装置２０１は、光源２２０と、第１の偏光子２２２と、１／４波長板２２６と、第２の偏光子２２８と、ＣＣＤ２３０とを備える。神経線維束の走行を探知するためには、脳を複数の薄い切片２１６にスライスし、それぞれの切片２１６を順次スライドガラス２０６に貼り付けて光学系の第１の偏光子２２２と１／４波長板２２６との間に配置し、光源２２０から光を照射する。光源２２０から照射された光は、第１の偏光子２２２により偏光されて直線偏光となり、脳の切片２１６に入射される。そして、切片２１６を透過した光は１／４波長板２２６により方位角が回転され、第２の偏光子２２８に入射され、第２の偏光子２２８により偏光された透過光はＣＣＤ２３０により撮像される。ｔＰＬＩによる観察装置２０１を用いた観察方法では、第１の偏光子を１０°間隔で０°から１８０°まで回転させながら、各角度における透過光をＣＣＤ２３０により撮像する。
【００２２】
このようにして、ＣＣＤ２３０が受光した光の強度ＩtPLIは、下記のように表せる。
2019204007.tif 000003
【００２３】
ここで、式中の各符号は以下の通りである。
2019204007.tif 000004
I0：入射光の強度
φ：ミエリン化された神経線維走行の面内の方位角（図１４）
ρ：第１の偏光子による偏光角
δ：切片を透過する際の位相遅延
【００２４】
なお、δは下記式で表される。
2019204007.tif 000005
【００２５】
上式中の各符号は以下の通りである。
ｄ：脳の切片の厚さ
Δｎ：脳切片の複屈折率
λ：入射光の波長
α：ミエリン化された神経線維走行の面外の傾角（図１４）
【００２６】
上述の通り、ρを１０°間隔で０°から１８０°まで測定し、ＩtPLIの最大値または最小値を特定することにより、神経線維走行の角度を特定することができる。
【００２７】
図１５は、図１３の観察装置における脳の切片を設置していない状態におけるＰ１の角度に対する光の強度を示すグラフである。また、発明者らは、観察装置の光学系を評価するために以下の式で示されるVisibility  ｖというパラメータを導入した。
2019204007.tif 000006
【００２８】
Imax及びIminは、それぞれ、第１の偏光子のρを１０°間隔で０°から１８０°まで回転した際の、光の強度Ｉの最大値及び最小値である。なお、Visibility  ｖは、位相シフトδ1=arcsin(v)と関連している。理想的な状況では、光の強度が第１の偏光子の角度によらず一定であり、Visibility  ｖは０となる。図１５に示すように、従来のｔＰＬＩでは、光の強度は第１の偏光子の角度によらずほぼ一定であり、visibility が０．０４５であった。このように従来のｔＰＬＩによれば、ミエリン化された神経線維束の走行方向を正確に検出することができる。
【００２９】
ここで、従来の観察装置により観察を行う場合には、脳の切片２１６を、折り曲げたり破いたりしないようにスライドガラス２０６へ貼り付ける必要があり、非常に手間がかかるという問題があった。これに対して、発明者らは反射型の偏光観察法（Reflection Polarized Light Imaging、以下、ｒＰＬＩという）を開発した。ｒＰＬＩによれば、脳組織の切片をスライドガラスに貼り付けることなく、神経線維束の走行の角度を特定することができる。以下、本発明のｒＰＬＩによる観察装置の第１実施形態を、図面を参照しながら、詳細に説明する。
【００３０】
本発明の第１実施形態による観察装置について説明する。以下の説明では、細胞組織としてマウスの脳を用い、マウスの脳の神経線維走行を観察する場合を例として説明するが、サンプルはこれに限らず、神経細胞を含むものであればよい。図１は、本発明の第１実施形態の観察装置の構成を示す概略図である。同図に示すように、第１実施形態の観察装置１は、光学系２と、スライサー４と、により構成される。図２は、図１に示す観察装置のスライサーの構成を示す図である。同図に示すように、スライサー４は切片刃６と、切片刃６を支持する支持部材８と、を備える。切片刃６の上面（切片が載置される側の面）には、鏡面加工が施されており、光を反射可能になっている。支持部材８は、微小振動しながら横方向に移動可能である。観察の対象となる脳組織１０は、シャーレ等の容器１２内に配置され、全体を寒天１４により固めることにより固定されている。スライサー４は、切片刃６に微小振動を加えながら、切片刃６を横方向に移動することにより脳組織１０を光が透過可能な厚さ６０μｍ程度の薄い切片に切り取ることができる。脳組織１０を切り取ると、切り取られた切片１６は、図１に示すように、切片刃６上に載置される。光学系２により観察を行う際には、後述するように、切片１６が第１のビームスプリッタ２４、１／４波長板２６、第２の偏光子２８、及び、ＣＣＤ３０と同軸上に位置するように、切片刃６の振動及び移動が停止される。
【００３１】
光学系２は、光源２０と、第１の偏光子２２と、第１のビームスプリッタ２４と、１／４波長板２６と、第２の偏光子２８と、受光装置としてのＣＣＤ３０と、を備える。受光装置としては、ＣＣＤ３０以外にもＣＭＯＳセンサー等を用いることができる。スライサー４の切片刃６と、第１のビームスプリッタ２４と、１／４波長板２６と、第２の偏光子２８と、ＣＣＤ３０とは同軸上に配置されており、第１の偏光子２２と、光源２０とは第１のビームスプリッタ２４の側方に同軸上に配置されている。第１の偏光子２２は、回転可能に支持されており、所定の偏光角度に回転することができる。
【００３２】
観察を行う際には、まず、スライサー４の切片刃６により脳組織を切断して切片を形成する。形成された切片は切片刃６上に配置される（切片配置ステップ）。なお、切片が載置された切片刃６は、切片１６が第１のビームスプリッタ２４、１／４波長板２６、第２の偏光子２８、及び、ＣＣＤ３０と同軸となるように位置するように位置が調整される。
【００３３】
次に、光源２０から光を照射する（照射ステップ）。光源２０から照射された照射光は第１の偏光子２２に入射し、所定の角度だけ偏光される（第１の偏光ステップ）。第１の偏光子２２を通過して出射された直線偏光は第１のビームスプリッタ２４に入射する。第１のビームスプリッタ２４で反射された反射光は、切片刃６に向けて差し向けられる。
【００３４】
切片刃６に差し向けられた光は切片１６に入射され、切片１６を透過する（第１の透過ステップ）。切片１６を透過した光は切片刃６の表面（鏡面）に入射する（鏡面入射ステップ）。
【００３５】
切片刃６に入射した光は切片刃６の表面で反射され、反射された光は、再度切片１６を逆向きに透過する（第２の透過ステップ）。切片１６を再透過した光は第１のビームスプリッタ２４を透過する。そして、第１のビームスプリッタ２４の透過光は１／４波長板２６に入射する。１／４波長板２６に入射した光は円偏光に変換され、第２の偏光子２８に入射され偏光される（第２の偏光ステップ）。そして、第２の偏光子２８により偏光された光はＣＣＤ３０に入射される。このようにして、第１の偏光子２２の角度を変更しながら、各角度における第２の偏光子２８により偏光された光をＣＣＤ３０により受光する（受光ステップ）。
【００３６】
ここで、受光した光の強度は、下記のように表せる。
2019204007.tif 000007
【００３７】
したがって、ρを１０°間隔で０°から１８０°まで測定し、ＩrPLIの最大値あるいは最小値を特定することにより、ｔＰＬＩと同様に神経線維走行の角度を特定することができる。さらに、上記の工程を各切片に対して行うことにより、３次元的な神経線維走行を推定することができる。なお、ρの角度間隔は１０°には限られず、適宜設定できる。
【００３８】
図３は、第１実施形態の観察装置において脳の切片を設置していない状態での第１の偏光子Ｐ１の角度ρに対するＣＣＤで撮像された光の平均強度を示すグラフである。上述の通り、理想的な状況では、光の強度が第１の偏光子の角度によらず一定であり、Visibility ｖが小さくなる。図３に示すように、第１実施形態の観察装置の光学系では、光の強度は第１の偏光子に角度に応じて変化している。この変化幅が、脳切片による変化よりも大きいために、第１実施形態の観察装置では脳切片中の神経線維走行を計測が困難になる。また、第１実施形態の観察装置では、visibilityが０．１２４と大きくなってしまった。
【００３９】
この原因としては、上述した通り、第１のビームスプリッタにおいてｐ偏光とｓ偏光の光の間で位相にずれが生じるためである。このような、ビームスプリッタの透過や反射による偏光状態の変化を以下、偏光誤差という。図４は、第１のビームスプリッタにおいて光が反射した際の位相のずれを検討するための光学系であり、図５は、第１のビームスプリッタにおいて光が透過した際の位相のずれを検討するための光学系である。また、図６及び図７は、それぞれ、図４及び図５に示す光学系におけるＰ１の角度に対するＣＣＤで撮像された光の平均強度を示すグラフである。
【００４０】
図４に示す光学系３０１では、光源２０から出射された光は、第１の偏光子２２に入射され、第１の偏光子２２により偏光された光は、ビームスプリッタ２４に入射される。ビームスプリッタ２４で反射された光は、１／４波長板２６及び第２の偏光子２８を透過する。第２の偏光子２８を透過した光は、ＣＣＤ３０で捕捉される。このような光学系３０１では、図６に示すように、第１の偏光子２２の角度ρによって光の強度が大きく変化し、Visibility ｖが０．６４６と非常に高い値となってしまった。
【００４１】
また、図５に示す光学系４０１では、光源２０から出射された光は、第１の偏光子２２に入射され、第１の偏光子２２により偏光された光は、ビームスプリッタ２４に入射される。ビームスプリッタ２４を透過した光は、１／４波長２６板及び第２の偏光子２８を透過する。第２の偏光子２８を透過した光は、ＣＣＤ３９で捕捉される。このような光学系４０１では、図７に示すように、第１の偏光子の角度によって光の強度が大きく変化し、Visibility  ｖが０．１４６と非常に高い値となってしまった。
【００４２】
このように、ビームスプリッタは光を透過、又は反射する際に偏光の位相のずれが生じる。そこで、発明者らは、ビームスプリッタによる位相のずれを補償する光学系を組み込むこととした。
【００４３】
図８は、本発明の第２実施形態の観察装置の構成を示す図である。図８に示すように、第２実施形態の観察装置１０１では、第１実施形態の観察装置の光学系に加えて、第１のビームスプリッタ２４による位相のずれを補償するための補償光学系を含む。補償光学系としては、第１の偏光子２２と第１のビームスプリッタ２４との間に第２のビームスプリッタ１３２及び１／２波長板１３４を含む。さらに、補償光学系として、第１のビームスプリッタ２４と１／４波長板２６との間に第３のビームスプリッタ１３８を含む。さらに、本実施形態の観察装置１０１の光学系１０２は、第１のビームスプリッタ２４と切片刃６との間に第１のレンズ１３６を含み、第２の偏光子２８とＣＣＤ３０との間に第２のレンズ１４０を含む。
【００４４】
観察を行う際には、まず、スライサー４の切片刃６により脳組織を切断して切片を形成する。形成された切片は切片刃６上に配置される（切片配置ステップ）。なお、切片が載置された切片刃６は、切片１６が第１のレンズ１３６、第１のビームスプリッタ２４、第３のビームスプリッタ１３８、１／４波長板２６、第２の偏光子２８、第２のレンズ１４０、及び、ＣＣＤ３０と同軸となるように位置するように位置が調整される。
【００４５】
次に、光源２０から光を照射する（照射ステップ）。光源２０から照射された照射光は第１の偏光子２２に入射し、所定の角度だけ偏光される（第１の偏光ステップ）。第１の偏光子２２を通過して出射された直線偏光は第２のビームスプリッタ１３２に入射する。第２のビームスプリッタ１３２からの反射光は１／２波長板１３４に入射する。そして、１／２波長板１３４の透過光は第１のビームスプリッタ２４に入射する。第１のビームスプリッタ２４で反射された反射光は第１のレンズ１３６に向けて差し向けられ、第１のレンズ１３６を透過する。第１のレンズ１３６を透過した光は、切片１６に入射され、切片１６を透過する（第１の透過ステップ）。切片１６を透過した光は切片刃６の表面（鏡面）に入射する（鏡面入射ステップ）。
【００４６】
切片刃６に入射した光は切片刃６の表面で反射され、反射された光は、再度切片１６を逆向きに透過する（第２の透過ステップ）。切片１６を再透過した光は、再度第１のレンズ１３６を逆向きに通過し、第１のビームスプリッタ２４に入射する。そして、第１のビームスプリッタ２４を透過した透過光は、第３のビームスプリッタ１３８に入射する。なお、第３のビームスプリッタ１３８は光軸周りに９０°回転させてある。これによってビームスプリッタ２４を透過した際に生じた位相差を補正した。第３のビームスプリッタ１３８を透過した透過光は、１／４波長板２６に入射する。１／４波長板２６に入射した光は円偏光に変換され、第２の偏光子２８に入射され偏光される（第２の偏光ステップ）。第２により偏光された光は、第２のレンズ１４０を透過し、ＣＣＤ３０に入射される。このようにして、第１の偏光子２２の角度を変更しながら、各角度における第２の偏光子２２により偏光された光をＣＣＤ３０により受光する（受光ステップ）。
【００４７】
ここで、受光した光の強度は、下記のように表せる。
2019204007.tif 000008
ここで、δ2は第１のビームスプリッタ24あるいは第３のビームスプリッタ138を透過した場合の位相シフトを表す。また、
2019204007.tif 000009
であり、第３のビームスプリッタ１３８を示すJones matrixである。
【００４８】
図９は、第２実施形態の観察装置における脳の切片を設置していない状態における第１の偏光子Ｐ１の角度ρに対するＣＣＤで撮像された光の平均強度を示すグラフである。図９に示すように、第２実施形態の観察装置において、光の強度は第１の偏光子の角度によらずほぼ一定であり、visibility ｖが０．０５２であった。これにより、図９に示す光学系によれば、ビームスプリッタにおける位相のずれを補償することができることがわかった。
【００４９】
このようにして得られた第１の偏光子２２の角度ρに対する各ピクセルの強度に関するデータに基づき、以下のようにして画像化することができる。以下の説明では、マウスの脳の切片について観察した場合を例として説明する。
【００５０】
図１０は、ＣＣＤにより撮像された画像を示し、（ａ）は第１の偏光子の角度ρ＝０°、（ｂ）は第１の偏光子の角度ρ＝９０°における画像である。また、図１１は、第１の偏光子の角度ρに対する図１０において四角で囲んだ領域の光の強度を示すグラフである。図１０において、矢印は光の強度Ｉが最低値となったデータを示す。
【００５１】
図示を行うためには、下記のパラメータI0、｜sinδ｜、α、φを算出する。
‐Transmission（透過度） I0は下記の式で算出される。
2019204007.tif 000010
ここで、Iiは、第１の偏光子の角度ρiにおける各ピクセルの光の強度であり、Ｎは、ρiのサンプル数である。
【００５２】
‐ミエリン化による位相シフト（位相変位）｜sinδ｜
2019204007.tif 000011
ここで、上式における各パラメータは以下の通りである。
2019204007.tif 000012
【００５３】
‐平面側のミエリンの傾角α
2019204007.tif 000013
ここで、上式におけるdrelは、
2019204007.tif 000014
で算出される、脳切片の相対厚さである。
【００５４】
‐平面内のミエリンの方位角φ
tPLIおよびrPLIwocの場合
2019204007.tif 000015
rPLIwcの場合
2019204007.tif 000016
ここで、上式におけるρminは、光の最小強度における第１の偏光子の回転角度である。
【００５５】
図１２は、マウスの脳の切片について上記の式により算出されたパラメータを示し、（ａ）は透過度I0を示し、（ｂ）は位相変位｜sinδ｜を示し、（ｃ）は傾度αを示し、（ｄ）は方位角φを示す。同図に示すように、本実施形態によれば、ミエリン化された神経線維束の走行を顕微鏡レベルの空間解像度で画像化することができる。
【００５６】
上記の各実施形態によれば、切片１６を透過し、切片刃６により反射され、再度切片１６を透過した光に基づき神経線維束の走行を観察することができる。このため、脳組織の切片をスライドガラスへ貼り付けることなく観察を行うことができる。
【００５７】
また、上記の各実施形態によれば、切片刃６により脳組織を切り出し、そのままの状態で観察を行うことができる。このため、手間をかけずに脳組織の切片１６の観察を行うことができる。
【００５８】
また、上記の各実施形態によれば、第１のビームスプリッタ２４を有するため、切片刃６の入射光と反射光の方向が同一方向であっても、光源２０から出射された光をＣＣＤ３０で受光することができる。
【００５９】
また、第２実施形態によれば、第１のビームスプリッタ２４による偏光誤差を修正するための光学系をさらに備えるため、ビームスプリッタで生じる位相のシフト等の偏光誤差を修正することができ、画像化を確実に実現できる。
【００６０】
なお、本発明の観察装置及び観察方法は、マウスの脳に限らず、脊椎動物の脳神経等の神経細胞を含む生体組織であれば、適用できる。
【符号の説明】
【００６１】
１  観察装置
２  光学系
４  スライサー
６  切片刃
８  支持部材
１０  脳組織
１２  容器
１４  寒天
１６  切片
２０  光源
２２  第１の偏光子
２４  第１のビームスプリッタ
２６  １／４波長板
２８  第２の偏光子
１０１  観察装置
１０２  光学系
１３２  第２のビームスプリッタ
１３４  １／２波長板
１３６  第１のレンズ
１３８  第２のビームスプリッタ
１４０  第２のレンズ
【図１】
2019204007.tif 000017
【図２】
2019204007.tif 000018
【図３】
2019204007.tif 000019
【図４】
2019204007.tif 000020
【図５】
2019204007.tif 000021
【図６】
2019204007.tif 000022
【図７】
2019204007.tif 000023
【図８】
2019204007.tif 000024
【図９】
2019204007.tif 000025
【図１０】
2019204007.tif 000026
【図１１】
2019204007.tif 000027
【図１２】
2019204007.tif 000028
【図１３】
2019204007.tif 000029
【図１４】
2019204007.tif 000030
【図１５】
2019204007.tif 000031