(57)【要約】【課題】新規な生体リズム調整剤、及び生体リズム調整用医薬組成物を提供する。【解決手段】プロスタグランジンＦ２α受容体を活性化させる物質を有効成分として含有する生体リズム調整剤、該生体リズム調整剤と薬学的に許容される担体とを含有する、生体リズム調整用医薬組成物、及び点眼剤である前記生体リズム調整用医薬組成物。【選択図】図６
2019182814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロスタグランジンＦ２α受容体を活性化させる物質を有効成分として含有する、生体リズム調整剤。
【請求項２】
前記プロスタグランジンＦ２α受容体を活性化させる物質が、プロスタグランジンＦ２α又はその誘導体である、請求項１に記載の生体リズム調整剤。
【請求項３】
前記プロスタグランジンＦ２α誘導体がラタノプロストである、請求項２に記載の生体リズム調整剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の生体リズム調整剤と薬学的に許容される担体とを含有する、生体リズム調整用医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物が点眼剤である、請求項４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体リズム調整剤及び生体リズム調整用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
身体の様々な機能は２４時間の概日周期に従い、活動性が変化する。この生体リズムは、脳内の体内時計機能を持つ神経である視交叉上核（ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ；ＳＣＮ）により制御されている。体内時計の位相を操作することで生体リズムを変化・調整することは可能であるが、ヒトに応用できる手法は限られている。よく知られているのは目からの光刺激であるが、光照射装置が必要である。
【０００３】
プロスタグランジンＦ２α誘導体であるラタノプロストは、点眼剤として緑内障や高眼圧症の治療に用いられることが知られている（特許文献１）が、生体リズムへの作用については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５２９６５０４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような背景のもと、体内時計機構を操作し、生体リズムの位相を調整し、時差ボケや概日リズム障害等の治療に有効な医薬品の開発が求められている。本発明は、新たな生体リズム調整剤、及び生体リズム調整用医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
［１］プロスタグランジンＦ２α受容体を活性化させる物質を有効成分として含有する、生体リズム調整剤。
［２］前記プロスタグランジンＦ２α受容体を活性化させる物質が、プロスタグランジンＦ２α又はその誘導体である、［１］に記載の生体リズム調整剤。
［３］前記プロスタグランジンＦ２α誘導体がラタノプロストである、［２］に記載の生体リズム調整剤。
［４］前記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の生体リズム調整剤と薬学的に許容される担体とを含有する、生体リズム調整用医薬組成物。
［５］前記医薬組成物が点眼剤である、［４］に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、生体リズムを調整し、時差ボケや生体リズム障害等の治療に有用な生体リズム調整剤、及び生体リズム調整用医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例１において、Ｐｅｒ２  Ｌｕｃノックインマウス眼球のＰｅｒ２転写リズムに及ぼすラタノプロストの影響を示した図である。
【図２】実験例２において、明暗周期サイクルの位相操作時におけるマウスの行動リズムに及ぼすＦＰ受容体の影響を示した図である。
【図３】実験例３において、恒暗条件下で飼育したマウスの行動リズムに及ぼすＦＰ受容体の影響を示した図である。
【図４】実験例４において、眼球における時計遺伝子Ｐｅｒ２及びＣｒｙ１の発現量の概日リズムを示した図である。
【図５】実験例５において、恒暗条件下で飼育したマウス行動リズムに及ぼすラタノプロスト点眼時刻の影響を示した図である。
【図６】実験例６において、恒暗条件下で飼育したＦＰＫＯマウスの行動リズムに及ぼすラタノプロスト点眼の影響を示した図である。
【図７】実験例７において、恒暗条件下で飼育したマウスＳＣＮの時計遺伝子Ｐｅｒ１及びＰｅｒ２の発現リズムに及ぼすラタノプロスト点眼の影響を示した図である。
【図８】実験例８において、恒暗条件下で飼育したマウス肝臓の時計遺伝子Ｐｅｒ２遺伝子発現に及ぼすラタノプロスト点眼の影響を示した図である。
【図９】実験例９において、恒暗条件下で飼育したマウスＳＣＮの時計遺伝子Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２及びｃ−Ｆｏｓの発現に及ぼす光刺激単独およびラタノプロスト点眼後の光刺激の影響を示した図である。
【図１０】実験例１０において、ＣＬ５７ＢＬ／６ｊマウス眼球におけるＦＰ受容体及びＯｐｎ４（メラノプシン）の発現量を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［生体リズム調整剤］
１実施形態において、本発明は、プロスタグランジンＦ２α受容体を活性化させる物質を有効成分として含有する、生体リズム調整剤を提供する。
【００１０】
プロスタグランジンＦ２α受容体（以下、ＦＰ受容体という）は、プロスタグランジンＦ２αが結合することにより活性化される分子である。実施例において後述するように、本発明者らは、ＦＰ受容体が、明暗周期サイクルの位相操作時における行動リズムに影響を及ぼすことを明らかにした。
【００１１】
明暗周期に対応した行動リズムは、哺乳動物では目からの光刺激が脳の視交叉上核（ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ；ＳＣＮ）へ到達し、光により時計遺伝子がリセットされることで明暗サイクルに同調した行動リズムが形成される。この明暗周期を変化させると、明暗サイクルに同調して行動リズムが変化する。本発明に係る、ＦＰ受容体は、この明暗周期変動に対する行動リズム変化に関与し、ＦＰ受容体が活性化されると、明暗周期変動に対応して行動リズムが変化する。一方、ＦＰ受容体が不活化されると、明暗周期が変動しても行動リズムの変化が著しく減弱する。
【００１２】
本発明に係る、ＦＰ受容体を活性化させる物質としては、プロスタグランジンＦ２α又はその誘導体等が挙げられる。プロスタグランジンＦ２α誘導体としては、ＦＰ受容体を活性化させることができるプロスタグランジンＦ２αの誘導体であれば、特に制限はないが、例えば、ラタノプロスト（Ｌａｔａｎｏｐｒｏｓｔ）、ビマトプロスト（Ｂｉｍａｔｏｐｒｏｓｔ）、トラボプロスト（Ｔｒａｖｏｐｒｏｓｔ）、カルボプロスト（Ｃａｒｂｏｐｒｏｓｔ）、タフルプロスト（Ｔａｆｌｕｐｒｏｓｔ）等が挙げられる。
【００１３】
本発明に係る、ＦＰ受容体を活性化させる物質は、生体リズムの調整作用を有する。本発明において、生体リズムの調整作用とは、生体リズムの位相を調整する作用を意味する。生体リズムの調整作用としては、生体リズムを調整する作用であれば、特に制限はないが、例えば、暗闇での光刺激を減弱する作用や、暗闇での光刺激と同様の作用等が挙げられる。暗闇での光刺激を減弱する作用を有する生体リズム調整剤は、例えば、夜間に光に暴露される環境に置かれることによる、睡眠障害等の生体リズムの乱れを改善させることができる。また、暗闇で光刺激と同様の作用を有する生体リズム調整剤は、例えば、時差ボケの改善等に用いることができる。
【００１４】
生体リズムの変化は、マウスの行動解析装置であるＣｌｏｃｋ  ｌａｂを用いた行動解析、臓器中の時計遺伝子の発現量や発現時間の変動を調べること等により、調べることができる。時計遺伝子は、概日リズム（体内時計）をつかさどる遺伝子群であり、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｃｒｙ１、Ｂｍａｌ１等が挙げられる。
【００１５】
［生体リズム調整作用の評価］
生体リズム調整作用は、本願発明に係るプロスタグランジンＦ２α受容体を活性化させる物質を投与後、当該物質が生体リズムの調整作用を有するか否かにより評価することができる。生体リズム調整作用の評価は、生体リズム調整作用を評価できれば、特に制限はないが、例えば、以下の方法により行うことができる。
１．暗闇での光刺激減弱作用の評価
暗闇での光刺激減弱作用は、恒暗条件下、ＦＰ受容体を活性化させる物質を投与後、光を１５分間照射した後、１時間経過後の時計遺伝子の発現量を測定することにより、評価することができる。恒暗条件下で光を照射すると、時計遺伝子の発現が変動するが、この変動作用を抑制すれば、暗闇での光刺激減弱作用を有すると判定することができる。又、この変動作用が変化しない、或いは増強させれば、暗闇での光刺激減弱作用を有しないと判定することできる。
【００１６】
２．暗闇での光刺激と同様の作用の有無の評価
暗闇での光刺激と同様の作用を有するか否かは、恒暗条件下、ＦＰ受容体を活性化する物質を投与後、マウスの行動を行動解析装置Ｃｌｏｃｋ  ｌａｂを用いて解析することにより、評価することができる。恒暗条件下でマウスを飼育すると、マウスの行動周期が変動する。この恒暗条件下でのマウスの行動周期は、光刺激により変化するが、ＦＰ受容体を活性化する物質が、光刺激による行動周期と同様に変化させる効果があれば、当該物質は、光刺激と同様の作用を有すると評価することができる。
【００１７】
［医薬組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した生体リズム調整剤と薬学的に許容される担体とを含有する、生体リズム調整用医薬組成物を提供する。
【００１８】
上記の医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤、眼科用製剤等の形態で非経口的に投与することができるが、眼科用製剤、特に点眼剤の形態が好ましい。各製剤は、当業者に公知の製剤方法により製造することができる。
【００１９】
点眼剤は、水性点眼剤、非水性点眼剤、懸濁性点眼剤、乳濁性点眼剤、眼軟膏等のいずれでもよい。このような製剤は、投与形態に適した組成物として、必要に応じて薬学的に許容される担体、特に点眼薬に許容される担体、例えば等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等を配合し、当業者に公知の製剤方法により製造できる。
本発明の点眼薬は、上述した生体リズム調整剤、及び点眼薬に許容される担体を含有するものである。
【００２０】
点眼剤を調製する場合、例えば、所望な上記成分を滅菌精製水、生理食塩水等の水性溶剤、又は綿実油、大豆油、ゴマ油、落花生油等の植物油等の非水性溶剤に溶解又は懸濁させ、所定の浸透圧に調整し、濾過滅菌等の滅菌処理を施すことにより行うことができる。なお、眼軟膏剤を調製する場合は、前記各種の成分の他に、軟膏基剤を含むことができる。前記軟膏基剤としては、特に限定されないが、ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレン等の油性基剤； 油相と水相とを界面活性剤等により乳化させた乳剤性基剤； ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール等からなる水溶性基剤等が好ましく挙げられる。
【００２１】
本発明の医薬組成物を生体リズム調整のために用いる場合、その投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状、投与形態及び投与回数等によって異なるが、通常は成人に対して、ＦＰ受容体を活性化させる物質として、１日０．０２５〜１００００μｇ、好ましくは０．０２５〜２０００μｇ、より好ましくは０．１〜２０００μｇ、さらに好ましくは０．1〜２００μｇ、０．1〜１００μｇの範囲が挙げられる。
【００２２】
また、投与回数は、特に限定されないが、１回又は数回に分けて投与するのが好ましく、液体点眼剤の場合は、１回に１〜数滴点眼すればよい。投与時刻は、生体リズム調整の効果が得られる時刻であれば、特に限定されないが、活動期中に投与するのが好ましい。また、光刺激を減弱する効果を奏するには、光刺激の直前又は、直後、或いは光刺激前後１時間以内に投与するのが好ましい。なお、活動期とは、概日リズムの１サイクルを活動状態と休息状態に２分してみるとき、活動が続くあるいは活動が比較的連続して起こる時間帯のことであり、ヒトでは持続した覚醒期に相当する。マウスなどの夜行性動物では、暗期の生命活動が活発な期間、あるいは実験条件では暗期の時間帯に相当する。
【００２３】
本発明の生体リズム調整用医薬組成物は、生体リズムの調整作用を有する。本発明において、生体リズムの調整作用とは、生体リズムの位相を調整する作用を意味する。生体リズムの調整作用としては、生体リズムを調整する作用であれば、特に制限はないが、例えば、暗闇での光刺激を減弱する作用や、暗闇での光刺激と同様の作用等が挙げられる。暗闇での光刺激を減弱する作用を有する生体リズム調整用医薬組成物は、例えば、夜間の光に暴露される環境に置かれることによる、睡眠障害等の生体リズムの乱れを改善させることができる。また、暗闇で光刺激と同様の作用を有する生体リズム調整用医薬組成物は、例えば、時差ボケの改善等に用いることができる。
【００２４】
本発明の医薬組成物が、生体リズム調整作用を有することは、例えば、上記の［生体リズム調整作用の評価］により調べることができる。
【実施例】
【００２５】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００２６】
［実験例１］
（Ｐｅｒ２  Ｌｕｃノックインマウス眼球のＰｅｒ２転写リズムに及ぼすラタノプロストの影響）
明暗周期（明期 ７：００−１９：００）条件下で飼育した７週齢のＣ５７ＢＬ／６ｊ雄性マウスの、時計遺伝子Ｐｅｒ２遺伝子の下流にルシフェラーゼをノックインしたマウス（以下、Ｐｅｒ２  Ｌｕｃノックインマウスという）を作製し、このＰｅｒ２  Ｌｕｃノックインマウスから眼球を摘出し、眼球の形態のまま、培養シャーレで培養した後、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ法を用い、ルミサイクル（ＬｕｍｉＣｙｃｌｅ−３２／９６）を用いて、経時的にルシフェラーゼ活性を測定した。
【００２７】
ラタノプロスト（キサラタン点眼剤；ファイザー製薬社製）は、培養開始後、Ｐｅｒ２遺伝子の発現量が最大（ピーク)となる時間又は、最小（トラフ）になる時間に眼球に添加した。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、ラタノプロストは、Ｐｅｒ２遺伝子の発現量が最大となる時間に眼球に添加した場合は、Ｐｅｒ２遺伝子の発現リズムを後退させた。また、Ｐｅｒ２遺伝子の発現量が最小となる時間にラタノプロストを眼球に添加した場合は、Ｐｅｒ２遺伝子の発現リズムを前進させた。この結果から、ＦＰ受容体を活性化させる物質は、時計遺伝子の一つであるＰｅｒ２遺伝子の転写活性リズムを変動させることが明らかとなった。
【００２８】
［実験例２］
（明暗周期サイクルの位相操作時におけるマウスの行動リズムに及ぼすＦＰ受容体の影響）
明暗周期（明期 ７：００−１９：００）条件下で飼育した７週齢のＣ５７ＢＬ／６ｊ雄性マウス（以下、野生型マウスという）と、ＦＰ受容体を欠損させたＰｅｒ２  Ｌｕｃノックインマウス（以下、ＦＰＫＯマウスという）を行動解析装置（Ｃｌｏｃｋ  ｌａｂ）に７日間飼育した後に、照明を８時間早く当てて明期を８時間前進させ、マウスの行動の変化をアクトグラムにより調べ、明暗周期サイクルの変化に対する行動のシフトに及ぼすＦＰ受容体欠損の影響を検証した。その結果を図２に示す。図２（Ａ）の左図は野生型マウス、右図はＦＰＫＯマウスのアクトグラムを示す。図２（Ｂ）は、野生型マウス及びＦＰＫＯマウスの経日的な行動の位相変化を示す（N=4,mean±SE, **;P<0.01,*;P<0.05:two-way ANOVA）。
【００２９】
図２（Ｂ）に示したように、野生型マウスは新たな明暗周期に同調するまでに約５日間を要したが、ＦＰＫＯマウスは約１０日間を要した。明暗周期に対応した行動リズムは、哺乳動物では目からの光刺激が脳の視交叉上核（ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ；ＳＣＮ）へ到達し、光により時計遺伝子がリセットされることで明暗サイクルに同調した行動リズムが形成される。上記の結果より、ＦＰ受容体が欠損している動物では、明暗周期変動に対する行動リズム変化が野生型マウスと比較し遅いことから、光−目−ＳＣＮの連関に何らかの機能的変化が生じていると考えられる。
【００３０】
［実験例３］
（恒暗条件下飼育マウスの行動リズムに及ぼすＦＰ受容体の影響）
【００３１】
マウスを行動解析装置（Ｃｌｏｃｋ  ｌａｂ）に７日間飼育した後に、照明を８時間早く当てて明期を８時間前進させ、その後は常に照明を消した恒暗条件下で、野生型マウス及びＦＰＫＯマウスを飼育し、マウスの行動の変化をアクトグラムにより調べた。この手法は、生体が本来有する体内の自律的な行動リズムを解析する手法として古くより用いられている。結果を図３に示す。図３（Ａ）の左図は野生型マウス、右図はＦＰＫＯマウスのアクトグラムを示す。図３（Ｂ）の左図は野生型マウス及びＦＰＫＯマウスの経日的な行動の位相変化を示す（N=4,mean±SE, *;P<0.05:two-way ANOVA）。図３（Ｂ）の右図は野生型マウス及びＦＰＫＯマウスの行動の概日リズム周期の長さを示す（N=3-4,mean±SE, **;P<0.01,*;P<0.05:two-way ANOVA）。
【００３２】
図３（Ｂ）に示したように、野生型マウスの自律的行動リズムの周期は平均２３．５８時間であったが、ＦＰＫＯマウスでは平均２４．０４時間であった。自律的な行動リズムは、哺乳動物では脳のＳＣＮに発現する時計遺伝子の転写翻訳の２４時間サイクルにより制御されている。上記の結果より、ＦＰ受容体が欠損している動物では、恒暗条件下の行動リズム周期が野生型マウスと比較し長いことからＳＣＮに存在する時計遺伝子の発現リズムに何らかの機能的変化が生じていると考えられる。
【００３３】
［実験例４］
（恒暗条件下飼育マウス眼球における時計遺伝子発現リズムに及ぼすＦＰ受容体の影響）
マウスを明暗周期（明期 ７：００−１９：００）条件下で７日間飼育した後に、照明を８時間早く当てて明期を８時間前進させ、その後は常に照明を消した恒暗条件下で、野生型マウス及びＦＰＫＯマウスを飼育し、野生型マウスまたはＦＰＫＯマウス眼球の時計遺伝子であるＰｅｒ２及びＣｒｙ１遺伝子の発現を、Ｐｅｒ２遺伝子については、配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用い、Ｃｒｙ１遺伝子については、配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、リアルタイムＰＣＲ法により測定した。コントロールとして、同じく時計遺伝子であるＢｍａｌ１の発現量を、配列番号５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて測定した。それぞれの遺伝子発現量は、β−アクチン遺伝子発現量を対照として算出した。なお、β−アクチン遺伝子発現量は、配列番号７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８で表される塩基配列からなるリバースプライマーを用いて測定した。その結果を図４に示す。図４において、黒丸は野生型マウス、白丸はＦＰＫＯマウスでの結果を示す（N=3,mean±SE, *;P<0.05:two-way ANOVA）。
【００３４】
図４に示したように、時計遺伝子Ｐｅｒ２及びＣｒｙ１の発現リズムがＦＰ受容体の欠損により変化した。Ｂｍａｌ１遺伝子の発現量は、野生型マウスでもＦＰＫＯマウスでも変化はなかった。Ｐｅｒ２及びＣｒｙ１は、時計機構の重要な因子であり、その発現量の変化は多彩なリズムの変化をもたらす。この結果より、目の体内時計機構本体にＦＰ受容体が影響を及ぼす可能性が高いことが明らかとなった。
【００３５】
［実験例５］
（恒暗条件下飼育マウス行動リズムに及ぼすラタノプロスト点眼時刻の影響）
野生型マウスを行動解析装置（Ｃｌｏｃｋ  ｌａｂ）に７日間飼育した後に、常に照明を消した恒暗条件下で飼育した野生型マウスにおける、自律的行動リズムの位相と周期に及ぼすラタノプロスト点眼時刻の影響を検証した。
【００３６】
具体的には、行動解析装置（Ｃｌｏｃｋ  ｌａｂ）に７日間飼育した後に、常に照明を消した恒暗条件下で飼育した野生型マウスに、ＣＴ６、ＣＴ１４、ＣＴ２２の時刻にそれぞれラタノプロストを点眼し、その後の行動リズムの位相の変化と、各時刻に点眼後の行動リズムの周期を測定した。なお、ＣＴ（Ｃｉｒｃａｒｄｉａｎ  Ｔｉｍｅ）とは、恒暗環境下での主観的な時間であり、夜行性動物であるマウスの場合、概日行動リズムの開始点をＣＴ１２と定めたものである。ＣＴの１時間は、概日リズムの周期を２４等分したものであり、ＣＴ６は主観的明期になってから約６時間後に相当する。ＣＴ１４は、主観的暗期になってから約２時間後の主観的暗期の初期に相当する。ＣＴ２２は、主観的暗期になってから１０時間後に相当する。
【００３７】
その結果を図５に示す。図５（Ａ）は恒暗条件下、飼育した野生型マウスのマウス行動リズムの位相に及ぼすラタノプロスト点眼時刻の影響を示す。図５（Ｂ）は恒暗条件下、飼育した野生型マウスのマウス行動リズムの周期に及ぼすラタノプロスト点眼時刻の影響を示す（N=3-4,mean±SE, **;P<0.01:owo-way ANOVA）。
【００３８】
図５（Ａ）から明らかなように、ＣＴ１４、及びＣＴ２２にラタノプロストを点眼したマウスにおいて行動リズムの位相が後退し、その影響はＣＴ１４にラタノプロストを点眼したマウスにおいて最も強いことが明らかになった。それに対し、ＣＴ６にラタノプロストを点眼したマウスにおいては行動リズムの位相に変化がなかった。この結果、ラタノプロストは、マウスの活動期中に投与することにより行動リズムの位相を後退させる可能性が高いことが明らかとなった。また、図５（Ｂ）から明らかなように、行動リズムの周期にはラタノプロストは影響を及ぼさなかった。
【００３９】
［実験例６］
（恒暗条件下飼育ＦＰＫＯマウス行動リズムに及ぼすラタノプロスト点眼の影響）
ラタノプロストの、行動リズムの位相への作用がＦＰ受容体を介して生じているか否かを検証した。具体的には、実験例５と同じ条件で飼育した野生型マウス及びＦＰＫＯマウスにラタノプロストの影響が最も強い時刻であるＣＴ１４に点眼し、自律的行動リズムに及ぼす影響をアクトグラムにより確認した。
【００４０】
その結果を図６に示す。図６（Ａ）の上図は野生型マウス、下図はＦＰＫＯマウスのアクトグラムをそれぞれ示す。矢印は、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）又はラタノプロスト点眼時刻を示す。図６（Ｂ）は野生型マウス及びＦＰＫＯマウスの行動の概日周期の変化を数値で示す（N=3-4,mean±SE, **;P<0.01:two-way ANOVA）。
【００４１】
図６（Ａ）及び（Ｂ）に示したように、野生型マウスの行動リズムはラタノプロストの点眼により位相が１．５時間程後退したが、ＦＰＫＯマウスにおいてはその効果は認められなかった。自律的な行動リズムは、哺乳動物では脳のＳＣＮに発現する時計遺伝子の転写翻訳の２４時間サイクルにより制御されている。この結果より、野性型マウスではラタノプロスト点眼により行動周期が短縮したことから、目−ＳＣＮ−行動の連関のなんらかのシグナルにＦＰ受容体が影響を及ぼしている可能性がある。また、ラタノプロストの点眼により位相が後退したことから、ラタノプロストの点眼は、哺乳動物において光刺激と同様の効果があることが明らかとなった。
【００４２】
［実験例７］
（恒暗条件下飼育マウスＳＣＮの時計遺伝子発現に及ぼすラタノプロスト点眼の影響）
上記実験例６の結果、恒暗条件下の行動リズムにおいて、ラタノプロスト点眼により行動リズムの周期が変容したことから、脳のＳＣＮの時計遺伝子Ｐｅｒ１及びＰｅｒ２遺伝子発現量に及ぼすラタノプロストの影響を検討した。具体的には、マウスを明暗周期（明期 ７：００−１９：００）条件下で７日間飼育した後に、照明を８時間早く当てて明期を８時間前進させ、その後は常に照明を消した恒暗条件で飼育した野生型マウス及びＦＰＫＯマウスにラタノプロスト点眼し、点眼後のＳＣＮにおけるＰｅｒ１及びＰｅｒ２遺伝子の発現量を、Ｐｅｒ１遺伝子については、配列番号９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用い、Ｐｅｒ２遺伝子については、配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、リアルタイムＰＣＲ法により測定した。その結果を図７に示す。図７（Ａ）は、野生型マウス、図７（Ｂ）はＦＰＫＯマウスの、ラタノプロスト点眼後のＳＣＮのＰｅｒ１及びＰｅｒ２遺伝子の発現量を示す（N=3-4,mean±SE, **P<0.01 *;P<0.05:two-way ANOVA）。
【００４３】
図７に示したように、野生型にラタノプロストを点眼した結果、ＳＣＮのＰｅｒ１及びＰｅｒ２の発現量が変化した。それに対して、ＦＰＫＯマウスではラタノプロストの点眼による影響は認められなかった。Ｐｅｒ１及びＰｅｒ２は、時計機構の重要な因子であり、その発現量の変化は多彩なリズムの変化をもたらす。この結果より、ラタノプロスト点眼は時計中枢の時計遺伝子の発現量に影響を及ぼす可能性が高いことが明らかとなった。
【００４４】
［実験例８］
（恒暗条件下飼育マウス肝臓の時計遺伝子発現リズムに及ぼすラタノプロスト点眼の影響）
【００４５】
末梢臓器である肝臓における、ラタノプロスト点眼による肝臓のＰｅｒ２遺伝子の発現量に及ぼす影響をｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを用いて測定した。具体的には、マウスを明暗周期（明期 ７：００−１９：００）条件下で７日間飼育した後に、照明を８時間早く当てて明期を８時間前進させ、その後は常に照明を消した恒暗条件で飼育した野生型マウス及びＦＰＫＯマウスにラタノプロストを点眼し、６０分経過後に、肝臓におけるＰｅｒ２遺伝子の発現量を、リアルタイムＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ法を用いて測定した。その結果を図８に示す。
【００４６】
図８に示すように、野生型マウスにラタノプロスト点眼した結果、肝臓のＰｅｒ２遺伝子の発現量が増加した。それに対して、ＦＰＫＯマウスではラタノプロスト点眼により肝臓のＰｅｒ２遺伝子の発現量に変化は認められなかった。この結果、ラタノプロストの点眼は脳の時計遺伝子のみならず、末梢の臓器である肝臓おいて発現する時計遺伝子に対しても影響を及ぼす可能性が高いことが明らかとなった。
【００４７】
［実験例９］
（恒暗条件下飼育マウスＳＣＮの時計遺伝子発現に及ぼす光刺激および光刺激とラタノプロスト点眼併用の影響）
恒暗条件下で飼育したマウスに光を照射する条件またはラタノプロスト点眼後に光照射を併用する条件を試した際のＳＣＮの時計遺伝子Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２及びｃ−Ｆｏｓ遺伝子の発現量に及ぼすＦＰ受容体の影響を検討した。具体的には、マウスを明暗周期（明期 ７：００−１９：００）条件下で７日間飼育した後に、照明を８時間早く当てて明期を８時間前進させ、その後は常に照明を消した恒暗条件で７日間飼育した野生型マウス及びＦＰＫＯマウスに、ラタノプロストを点眼し、その後光を１５分間照射し、１時間経過後のＳＣＮにおける時計遺伝子Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２及びｃ−Ｆｏｓ遺伝子の発現量を、Ｐｅｒ１については、配列番号１１で表される塩基配列からなるプローブ、Ｐｅｒ２については、配列番号１２で表される塩基配列からなるプローブ、ｃ−Ｆｏｓについては、配列番号１３で表される塩基配列からなるプローブをそれぞれ用いて、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いて測定した。コントロールとして、ラタノプロストを点眼せずに、光を１５分間照射し、１時間経過後の時計遺伝子の発現量を測定した。その結果を図９に示す。図９（Ａ）は、コントロールである、ラタノプロスト非点眼群における、時計遺伝子Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２及びｃ−Ｆｏｓ遺伝子の発現量を示す。図９（Ｂ）は、ラタノプロスト点眼群における、時計遺伝子Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２及びｃ−Ｆｏｓ遺伝子の発現量を示す。
【００４８】
図９（Ａ）に示したように、野生型マウスに１５分間光で刺激すると、１時間経過後のＳＣＮにおけるＰｅｒ１、Ｐｅｒ２及びｃ−Ｆｏｓ遺伝子の発現量は有意に増加した。それに対して、ＦＰＫＯマウスでは、これら遺伝子の発現量の変化は軽微であった。また、図９（Ｂ）に示したように、ラタノプロスト点眼後に１５分間光で刺激をすると、野生型マウスのＳＣＮの各種遺伝子発現量には有意な変化が認められなかった。また、ＦＰＫＯマウスについても同様な結果が認められた。
【００４９】
光の刺激によりＳＣＮの時計遺伝子の発現が変化し体内時計がリセットされる。上記の結果より野生型マウスでは光刺激でＳＣＮの時計遺伝子の発現量が変化していたことから、野生型マウスでは光による同調機構が働いており、この同調機構はラタノプロストの投与により抑制されることが示唆された。それに対し、ＦＰＫＯマウスでは光による同調機構は著しく減弱しており、ラタノプロストも時計遺伝子の発現調節に作用しないことが示唆された。この結果より、光−目−ＳＣＮの連関のシグナルにＦＰ受容体が関連している可能性があり、ラタノプロストは、光刺激によるＦＰ受容体を介するＳＣＮへの作用を抑制する効果があること明らかとなった。
【００５０】
［実験例１０］
（マウス眼球におけるＦＰ受容体及びＯｐｎ４（ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ）発現量の解析）
現在、目を介した光刺激による体内時計の中枢であるＳＣＮに発現する時計遺伝子の再同調に最も重要な細胞として、網膜に発現するＯｐｎ４（メラノプシン；ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ）発現陽性細胞［光感受性網膜神経節細胞（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＲＧＣ：ｉｐＲＧＣ）］が認められている。
【００５１】
光は、ｉｐＲＧＣに発現する、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である光受容体Ｏｐｎ４に作用し、細胞内へのカルシウムイオンの流入を促進させ、ＳＣＮにその刺激を投射する役割を果たす。その一方で、ＦＰ受容体も同様にＧＰＣＲであり、活性化物質の作用によりカルシウムイオンの細胞内流入を促進させる分子である。上記の実験例の結果より、ＦＰ受容体を活性化させる物質である、ラタノプロストの点眼は光と同じか、若しくは光と拮抗するようにＳＣＮの時計遺伝子の発現に影響を及ぼすことが判明した。このことから、ラタノプロストの点眼はｉｐＲＧＣに発現するＦＰ受容体に作用している可能性がある。
【００５２】
しかしながら、ｉｐＲＧＣにＦＰ受容体が発現しているか否か不明である。そこで、マウスから眼球を摘出し、ＦＰ受容体およびＯｐｎ４の発現量を測定した。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６ｊ雄性マウスの眼球の切片をホルマリン固定後、クライオスタットにより組織切片（１４μｍ）を作製し、その後、一次抗体として、ＦＰ受容体に対する抗体(ＢＯＳＴＥＲ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社製)及びＯｐｎ４に対する抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用い、二次抗体として、ウサギＣｙ３ＩｇＧ（Ｚｅｎｏｎ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８) を用い、ｉｐＲＧＣを免疫染色した。
【００５３】
その結果を図１０に示す。図１０において、ＧＣＬは、ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌ ｌａｙｅｒ、ＩＰＬは、ｉｎ ｓｏｍｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｉｎｎｅｒ ｐｌｅｘｉｆｏｒｍ ｌａｙｅｒ、ＩＮＬは、ｉｎｎｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｌａｙｅｒ、 ＯＮＬは、ｏｕｔｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｌａｙｅｒをそれぞれ示す。図１０の上図は、眼球のＧＣＬ、ＩＰＬ、ＩＮＬ及びＯＮＬのＦＰ受容体とＯｐｎ４（メラノプシン）の染色像を示す。図１０の下図は、上図の丸で囲った部分のＦＰ受容体（左）、Ｏｐｎ４（中央）の染色像と、ＦＰ受容体とＯｐｎ４の染色像を重ねた図（右）を示す。
【００５４】
図１０から、ＧＣＬに存在するＯｐｎ４発現細胞にＦＰ受容体が発現していることが明らかとなった。この結果から、ラタノプロストの点眼により、ラタノプロストはＧＣＬに発現するｉｐＲＧＣのＦＰ受容体に作用し、ＳＣＮに発現する時計遺伝子に影響を及ぼしている可能性があることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によれば、プロスタグランジンＦ２α受容体を活性化させる物質を有効成分として含有する、生体リズム調整剤、及び該生体リズム調整剤と薬学的に許容される担体とを含有する、生体リズム調整用医薬組成物を提供することができる。
【図１】
2019182814.tif 000003
【図２】
2019182814.tif 000004
【図３】
2019182814.tif 000005
【図４】
2019182814.tif 000006
【図５】
2019182814.tif 000007
【図６】
2019182814.tif 000008
【図７】
2019182814.tif 000009
【図８】
2019182814.tif 000010
【図９】
2019182814.tif 000011
【図１０】
2019182814.tif 000012
【配列表】
2019182814000001.app