(57)【要約】【課題】本発明は、脊髄小脳変性症３１型の原因であるリピートＲＮＡに直接作用してその毒性を軽減する低分子化合物を有効成分とする脊髄小脳変性症３１型抑制剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る脊髄小脳変性症３１型抑制剤は、下記式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする。2019182767.tif 000011［式中、ＸおよびＹは独立して＝Ｎ−基などを示し、Ｚはｍ個の括弧内の構造を互いに結合するｍ価のリンカー基を示し、ｍは２以上、４以下の整数を示し、αは置換基を示し、ｌは０以上、４以下の整数を示す］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする脊髄小脳変性症３１型抑制剤。
【化１】
2019182767.tif 000010
［式中、
ＸおよびＹは、独立して＝Ｎ−基または＝ＣＨ−基を示し、ＸおよびＹの少なくとも一方は＝Ｎ−基であり；
Ｚはｍ個の括弧内の構造を互いに結合するｍ価のリンカー基を示し；
ｍは、２以上、４以下の整数を示し；
αは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、モノ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、ニトロ基およびシアノ基から必須的になる群より選択される１以上の置換基を示し；
ｌは、０以上、４以下の整数を示し；
２以上の括弧内の構造は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【請求項２】
上記リンカー基が、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基、エーテル基、チオエーテル基、カルボニル基、チオニル基、エステル基、アミド基、ウレア基、チオウレア基およびウレタン基から必須的になる群より選択される２以上の基が結合された基である請求項１に記載の脊髄小脳変性症３１型抑制剤。
【請求項３】
ＸおよびＹが＝Ｎ−基である請求項１または２に記載の脊髄小脳変性症３１型抑制剤。
【請求項４】
αがＣ1-6アルキル基であり且つｌが１である請求項１〜３のいずれかに記載の脊髄小脳変性症３１型抑制剤。
【請求項５】
置換基αがＸに隣接する炭素に結合している請求項１〜４のいずれかに記載の脊髄小脳変性症３１型抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脊髄小脳変性症３１型の原因となる（ＵＧＧＡＡ）ｎの作用を直接阻害し、症状を根本的に改善する脊髄小脳変性症３１型抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脊髄小脳変性症（ＳＣＡ）は、小脳、脳幹、脊髄などの神経組織に異常が生じ、体を動かすことはできるものの意思通りに動かすことができなくなる運動失調症状を伴う疾患の総称である。
【０００３】
ＳＣＡのうち脊髄小脳変性症３１型（ＳＣＡ３１）は、難治性の遺伝性神経変性疾患であり、１６番染色体中のＢＥＡＮ（Ｂｒａｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＮＥＤＤ４）とＴＫ２（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ２）が共有するイントロンに、（ＴＧＧＡＡ）n、（ＴＡＧＡＡ）n、（ＴＡＡＡＡ）nおよび（ＴＡＡＡＡＴＡＧＡＡ）n等のペンタヌクレオチドの繰り返し配列が挿入されることよって引き起こされる。これらのペンタヌクレオチド繰り返し配列のうち（ＴＧＧＡＡ）nは病原性であり、脊髄小脳変性症３１型に特異的である。
【０００４】
詳しくは、（ＴＧＧＡＡ）ｎから転写される毒性の（ＵＧＧＡＡ）ｎが核内でＲＮＡ結合タンパク質と結合してＲＮＡ凝集体を形成し、神経細胞の脱落を引き起こす。また、（ＵＧＧＡＡ）ｎが核内から細胞質へ送達されると、複数の当該ペンタヌクレオチドにより形成されるループ構造が起点となったり、また（ＵＧＧＡＡ）ｎ中に含まれるＡＵＧ配列が開始コドンであることから、翻訳が促進される。その結果、Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕの繰り返し構造を有する不溶性の異常タンパク質凝集体が細胞質内に蓄積する。
【０００５】
上記の様なリピートＲＮＡの毒性を抑制するための方法として、リピートＲＮＡを標的としたアンチセンス核酸（ＡＳＯ）により標的リピートＲＮＡと二重鎖を形成させてリピートＲＮＡの機能を阻害する方法が知られている（非特許文献１）。また、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）を用い、リピートＲＮＡの異常なフォールディングを解消して毒性を抑制する方法も知られている（非特許文献２）。しかしこの様な生体高分子を用いる方法は、従来の核酸や抗体を用いるバイオ医薬品のように、高薬価や腎毒性の問題や、ドラッグデリバリーが難しいという問題がある。
【０００６】
一方、脊髄小脳変性症の治療薬として低分子のものも開発されている（特許文献１〜８）。しかし遺伝性の神経変性疾患である脊髄小脳変性症３１型は、たとえその症状を軽減したとしても、リピートＲＮＡの発現や働きを抑制しない限り根本的な治療にはなり得ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６３−２９０８７６号公報
【特許文献２】国際公開第９６／００３９８９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／０６３９８９号パンフレット
【特許文献４】特開２００３−０６３９８８号公報
【特許文献５】特表２００８−５１２３４４号公報
【特許文献６】特開２０１３−１０７７６号公報
【特許文献７】特開２０１５−１６０８１９号公報
【特許文献８】特開２０１７−１４１９８号公報
【特許文献９】特開２００３−２５９８９９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｈｕｒｍａｎ  Ｍ．Ｗｈｅｅｌｅｒ１ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５，ｐｐ．３３６−３３９（２００９）
【非特許文献２】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ら，Ｎｅｕｒｏｎ，９４（１），ｐｐ．１０８−１２４（２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、脊髄小脳変性症の治療薬は種々検討されているものの、脊髄小脳変性症の中でも脊髄小脳変性症３１型の原因であるリピートＲＮＡに作用する低分子化合物は未だ報告されておらず、脊髄小脳変性症３１型の根本的な治療手段は存在していないのが実情である。
そこで本発明は、脊髄小脳変性症３１型の原因であるリピートＲＮＡに直接作用してその毒性を軽減する低分子化合物を有効成分とする脊髄小脳変性症３１型抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、本発明者らがミスマッチ塩基を認識してミスマッチ塩基対を検出するためのものとして開発した化合物が、脊髄小脳変性症３１型の原因となる（ＵＧＧＡＡ）nに結合してその働きを阻害し、脊髄小脳変性症３１型を軽減できることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
【００１１】
［１］  下記式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする脊髄小脳変性症３１型抑制剤。
【化１】
2019182767.tif 000002
［式中、
ＸおよびＹは、独立して＝Ｎ−基または＝ＣＨ−基を示し、ＸおよびＹの少なくとも一方は＝Ｎ−基であり；
Ｚはｍ個の括弧内の構造を互いに結合するｍ価のリンカー基を示し；
ｍは、２以上、４以下の整数を示し；
αは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、モノ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、ニトロ基およびシアノ基から必須的になる群より選択される１以上の置換基を示し；
ｌは、０以上、４以下の整数を示し；
２以上の括弧内の構造は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【００１２】
［２］  上記リンカー基が、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基、エーテル基、チオエーテル基、カルボニル基、チオニル基、エステル基、アミド基、ウレア基、チオウレア基およびウレタン基から必須的になる群より選択される２以上の基が結合された基である上記［１］に記載の脊髄小脳変性症３１型抑制剤。
【００１３】
［３］  ＸおよびＹが＝Ｎ−基である上記［１］または［２］に記載の脊髄小脳変性症３１型抑制剤。
【００１４】
［４］  αがＣ1-6アルキル基であり且つｌが１である上記［１］〜［３］のいずれかに記載の脊髄小脳変性症３１型抑制剤。
【００１５】
［５］  置換基αがＸに隣接する炭素に結合している上記［１］〜［４］のいずれかに記載の脊髄小脳変性症３１型抑制剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る脊髄小脳変性症３１型抑制剤は、有効成分として低分子化合物を含む。よって、核酸やタンパク質などの生体高分子を有効成分とする薬剤に比して、ヌクレアーゼやプロテアーゼなどによる分解の問題が少ない。また、本発明者らによる実験的知見により、有効成分である低分子化合物は、脊髄小脳変性症３１型の原因であるＲＮＡリピート（ＵＧＧＡＡ）nに結合してその作用を顕著に低減することが明らかにされている。即ち、本発明薬剤の有効成分である低分子化合物は、脊髄小脳変性症３１型の原因を直接取り除くことができるため、本発明薬剤は脊髄小脳変性症３１型の予防手段または治療手段として実際に活用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明化合物を含むか或いは含まない（ＵＧＧＡＡ）9ＲＮＡ試料、（ＵＡＧＡＡ）9ＲＮＡ試料、および（ＵＡＡＡＡ）9ＲＮＡ試料の差吸光度と温度との関係を示す融解温度曲線グラフである。
【図２】図２は、本発明化合物を含まないか或いは５〜４０μＭの濃度で含むＵＧＧＡＡ／ＵＧＧＡＡモチーフを含むＲＮＡ試料のマススペクトルである。
【図３】図３は、本発明化合物を含むか或いは含まない培地中で培養し、（ＵＧＧＡＡ）76を含むＲＮＡ凝集体を蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図４】図４は、本発明化合物を含むか或いは含まない培地中で培養した細胞内における、（ＵＧＧＡＡ）76を含むＲＮＡ凝集体の数および面積を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明化合物を含むか或いは含まない飼料で飼育したショウジョウバエの眼の顕微鏡写真である。
【図６】図６は、本発明化合物を含むか或いは含まない飼料で飼育したショウジョウバエの眼の面積を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係る脊髄小脳変性症３１型抑制剤は、式（Ｉ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉ）」と略記する場合がある）を有効成分として含む。
【００１９】
化合物（Ｉ）中、ＸとＹは両方とも＝Ｎ−であることが好ましい。この場合、ＲＮＡリピート（ＵＧＧＡＡ）nにより形成されるヘアピン構造において、化合物（Ｉ）は、以下の通りグアノシン中のグアニンに水素結合を介して比較的強く結合すると考えられる。
【００２０】
【化２】
2019182767.tif 000003
【００２１】
Ｚはｍ個の括弧内の構造を互いに結合するｍ価のリンカー基を示す。「括弧内の構造」とは、以下の構造を示す。なお、２以上の括弧内の構造は互いに同一であっても異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
【００２２】
【化３】
2019182767.tif 000004
【００２３】
「リンカ一基」は、ｍ個の上記括弧内の構造を結合する基であり、上記括弧内の構造の位置的自由度を増すことによって化合物（Ｉ）の（ＵＧＧＡＡ）nへの結合性能を高めたり、また、化合物（Ｉ）の製造を容易にする作用を有する。 
【００２４】
「リンカ一基」としては、前述した作用を有するものであれば特に限定されないが、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基（−ＮＨ−または＞Ｎ−）、エーテル基（−Ｏ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、チオニル基（−Ｃ（＝Ｓ）−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−）、ウレア基（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、チオウレア基（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−）およびウレタン基（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）から必須的になる群より選択される２以上の基が結合された基を挙げることができる。上記アミノ基のうち−ＮＨ−は、１もしくは２以上の置換基βにより置換されていてもよいＣ1-6アルキル基、または、１もしくは２以上の置換基βにより置換されていてもよいＣ1-6アシル基により置換されていてもよい。置換基βとしては、Ｃ1-6アルコキシ基、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基（−ＮＨ2）、モノ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、ニトロ基およびシアノ基から必須的になる群より選択される１以上の置換基を挙げることができる。
【００２５】
リンカー基Ｚのうち上記括弧内の構造中のアミノ基（−ＮＨ−）と結合する部分は、化合物（Ｉ）の合成のし易さからカルボニル基であることが好ましい。更に、上記括弧内の構造中のアミノ基と上記部分とで、ウレタン基やウレア基を形成してもよい。
【００２６】
ｍが２である場合のリンカー基Ｚとしては、例えば、下記のリンカー基を挙げることができる。なお、下記リンカー基において、Ａ1とＡ2は同一基であることが好ましく、Ｒ1とＲ2も同一基であることが好ましい。
【００２７】
【化４】
2019182767.tif 000005
【００２８】
［式中、Ａ1とＡ2は独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−または単結合を示し、Ｒ1とＲ2は独立してＣ1-6アルキレン基を示し、Ｒ3は−Ｈ、１もしくは２以上の置換基βにより置換されていてもよいＣ1-6アルキル基、または１もしくは２以上の置換基βにより置換されていてもよいＣ1-6アシル基を示す。］
【００２９】
ｍが４である場合のリンカー基Ｚとしては、例えば、下記のリンカー基を挙げることができる。
【００３０】
【化５】
2019182767.tif 000006
【００３１】
［式中、Ａ3〜Ａ6は独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−または単結合を示し、Ｒ4〜Ｒ7は独立してＣ1-6アルキレン基を示し、Ｒ8はＣ1-10アルキレン基を示す。］
【００３２】
ｍは、化合物（Ｉ）における括弧内の構造の数を示し、２または４が好ましく、２がより好ましい。
【００３３】
ｌは、上記括弧内の構造中のキノリン環またはナフチリジン環上の置換基の数を表し、０以上、４以下の整数を示す。当該数としては３以下が好ましく、２以下がより好ましく、１がより更に好ましい。
【００３４】
ｌが２以上である場合、２以上の置換基αは互いに同一であってもよいし異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。また、置換基αの位置としては、Ｘに隣接する炭素原子が好ましい。置換基αとしては、Ｃ1-6アルキル基が好ましく、Ｃ1-4アルキル基がより好ましく、Ｃ1-2アルキル基がより更に好ましく、メチルが特に好ましい。
【００３５】
本発明に係る化合物（Ｉ）は、比較的シンプルな構造を有しており、当業者であれば容易に合成可能である。例えば、リンカー基Ｚのうち上記括弧内の構造中のアミノ基と結合する部分がカルボニル基である化合物（Ｉ）は、特開２００３−２５９８９９号公報、Ｋａｚｕｈｉｋｏ  Ｎａｋａｔａｎｉら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８．６．１−８．６．２１（２００８）、Ｊｉｎｘｉｎｇ  Ｌｉら，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮ  ＡＳＩＡＮ  ＪＯＵＲＮＡＬ，Ｖｏｌｕｍｅ  １１，Ｉｓｓｕｅ  １３，Ｐａｇｅｓ  １９７１−１９８１（２０１６）に記載の方法を参照して合成することができる。例えば、以下の方法により合成することができる。
【００３６】
【化６】
2019182767.tif 000007
【００３７】
上記反応式中、Ｚ’はＺから末端カルボニル基を除いた構造に相当する。また、括弧内の構造は互いに同一であっても異なっていてもよい。括弧内の構造が異なる場合には、各構造に相当する原料化合物を調製し、各構造を１つずつ反応させていけばよい。また、原料であるアミノキノリン化合物またはアミノナフチリジン化合物は、市販品を使用するか、或いは当業者であれば市販品から容易に合成することができる。
【００３８】
上記括弧内の構造中のアミノ基とＺの末端部分とでウレタン基やウレア基が形成されている化合物（Ｉ）は、例えば、以下の方法により合成することができる。以下の化学反応式では、ウレタン基を有する化合物（Ｉ）の合成方法を代表的に示す。
【００３９】
【化７】
2019182767.tif 000008
【００４０】
上記反応式中、Ｚ”はＺから末端エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）を除いた構造に相当する。また、括弧内の構造は互いに同一であっても異なっていてもよい。括弧内の構造が異なる場合には、各構造に相当する原料化合物を調製し、各構造を１つずつ反応させていけばよい。また、上記出発原料化合物は、Ｚ”を含むジオール化合物とＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートとを反応させることにより合成することができる。
【００４１】
本発明に係る脊髄小脳変性症３１型抑制剤の剤形は特に問わない。例えば、ドラッグデリバリーシステムの発展により、経口投与により化合物（Ｉ）が血液脳関門を通過して脳に到達し、脊髄小脳変性症３１型の原因となる（ＵＧＧＡＡ）ｎに結合し、脳神経細胞の脱落を抑制できる可能性がある。経口製剤としては、特に制限されないが、例えば、錠剤、散剤、カプセル剤、糖衣錠、顆粒剤などを挙げることができる。本発明に係る脊髄小脳変性症３１型抑制剤には、剤形に合わせ、薬学上許容される添加剤を用いてもよい。かかる添加剤としては、例えば、賦形剤、基剤、防腐剤、助剤、安定化剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、着色剤、甘味料などを挙げることができる。
【００４２】
或いは、本発明に係る脊髄小脳変性症３１型抑制剤は、注射剤として点滴投与してもよいし、脳内へ直接注射投与してもよい。その場合、溶媒としては、ｐＨを調整した生理食塩水やグルコース水溶液など、血漿の等張液を用いることができる。或いは、化合物（Ｉ）を塩類などと共に乾燥した場合には、最終的に溶液が血漿と等張または略等張になるならば、純水、蒸留水、滅菌水なども使用できる。その濃度も通常の注射剤のものとすればよく、例えば０．００１ｍｇ／ｍＬ以上、１０ｍｇ／ｍＬ程度とすることができる。
【００４３】
本発明に係る脊髄小脳変性症３１型抑制剤の有効成分である化合物（Ｉ）は、脊髄小脳変性症３１型の原因となる（ＵＧＧＡＡ）ｎに結合し、脳神経細胞の核内におけるＲＮＡ凝集体の形成や、細胞質内における異常タンパク質の凝集体の形成を阻害することができる。よって、症状の進行を妨げ、脊髄小脳変性症３１型を治療することができると考えられる。また、脊髄小脳変性症３１型は遺伝性神経疾患であることから、脊髄小脳変性症３１型を発症するおそれのあるヒトに対して予防的に用い得る可能性もある。即ち、本発明に係る脊髄小脳変性症３１型抑制剤には、治療剤としてのみならず、予防剤としての使用も考えられる。
【００４４】
本発明に係る脊髄小脳変性症３１型抑制剤の投与頻度や投与量は、患者の重篤度、年齢、性別、状態などに応じて適宜調整すればよい。例えば、経口剤の１回当たりの投与量は１００ｎｇ／ｋｇ体重以上、５００μｇ／ｋｇ体重以下とすることができ、注射剤の１回当たりの投与量は１ｎｇ／ｋｇ体重以上、１００μｇ／ｋｇ体重以下とすることができる。また、一日当たりの投与回数としては、１回以上、５回以下が好ましく、１回以上、３回以下がより好ましい。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００４６】
実施例１：  ＵＧＧＡＡ配列に対する選択的結合性の評価
（１）被検化合物の合成
Ｋａｚｕｈｉｋｏ  Ｎａｋａｔａｎｉら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８．６．１−８．６．２１（２００８）に記載の方法に準じて、下記化合物を合成した。以下、当該化合物を「ＮＣＤ」（Ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ  ｃａｒｂａｍａｔｅ  ｄｉｍｅｒ）と略記する。
【００４７】
【化８】
2019182767.tif 000009
【００４８】
（２）  熱変性温度測定
ＮＣＤを１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、２０μＭの濃度で溶解した。更に、４μＭの濃度で（ＵＧＧＡＡ）9を加え、Ｔm解析システム（「ＴＭＳＰＣ−８」島津製作所社製）を備えた分光光度計（「ＵＶ−２７００」島津製作所社製）を使って、２℃から１００℃まで１℃／ｍｉｎの速度で昇温した場合の２６０ｎｍの吸光度を測定した。また、比較のために、ＮＣＤを添加しない場合と、（ＵＧＧＡＡ）9の代わりに（ＵＡＧＡＡ）9と（ＵＡＡＡＡ）9を使った場合でも、同様に測定を行った。差吸光度（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）と温度との関係を示すグラフを図１に示す。
図１に示す結果の通り、（ＵＡＧＡＡ）9と（ＵＡＡＡＡ）9の融解温度（図１（２），（３））は、ＮＣＤの有無でほぼ変化しないのに対して、（ＵＧＧＡＡ）9の融解温度（図１（１））は、ＮＣＤの存在により高温側へシフトした。かかる結果は、ＮＣＤが（ＵＧＧＡＡ）9に選択的に結合し、安定な複合体を形成していることを示していると考えられる。
【００４９】
実施例２：  ＵＧＧＡＡ配列に対する結合性の評価
１００ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する５０％メタノール水に、ＵＧＧＡＡ／ＵＧＧＡＡモチーフを含むヘアピンＲＮＡとＮＣＤを、それぞれ１０μＭおよび０〜４０μＭの濃度で加えて試料を調製した。得られた試料を、４Ｇ質量分析計（「ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＰ  ＡｃｃｕＴＯＦ  ＬＣ−ｐｌｕｓ」ＪＥＯＬ社製）を使って、負モードで分析した。噴霧温度は−１０℃に固定し、試料流速は２０ｍＬ／ｍｉｎとした。測定結果を図２に示す。
図２に示す通り、上記ヘアピンＲＮＡのみを含む試料のマススペクトル（図２（１））には、５価および６価のＲＮＡマイナスイオンピークが認められた。更にＮＣＤを加えた試料のマススペクトル（図２（２）〜（５））では、ＲＮＡの分子イオンピークに加えて、ＲＮＡに２分子のＮＣＤが結合したピークが認められた。かかる結果より、ＮＣＤはＵＧＧＡＡ／ＵＧＧＡＡモチーフに２：１の化学量論比で結合することが明らかとなった。
【００５０】
実施例３：  ＮＣＤによるＲＮＡ凝集体の形成阻害
ＨｅＬａ細胞（理化学研究所由来）を、１０％ウシ胎児血清（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ社製）中、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で培養した。
カバースリップを備えた２４ウェルプレートに、合計で１×１０5の上記培養細胞を播種した。２４時間培養した後、ＮＣＤを含有する細胞培養培地を細胞に添加した。比較のため、同量の細胞培養培地のみも添加した。次いで、（ＵＧＧＡＡ）76を発現するプラスミド（５００ｎｇ）を、トランスフェクション試薬（「ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ」Ｐｒｏｍｅｇａ社製，２μＬ）を使って細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを使って４℃で３０分間固定した。固定した細胞をＰＢＳで洗浄し、−２０℃で予備冷却した２％アセトンを含むＰＢＳを使って４℃で５分間透過処理した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、７０％エタノール中、−２０℃で一晩保存した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ホルムアミドの３０％２×ＳＳＣ溶液を使って室温で１０分間再水和した後、細胞をハイブリダイゼーション緩衝液（３０％ホルムアミド，２×ＳＳＣ，６６ｍｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ，０．０２％ＢＳＡ，１０％硫酸デキストラン，２ｍＭバナジル−リボヌクレオシド）中、３７℃で３０分間インキュベートし、更に、赤色色素であるＡｌｅｘａ６４７で標識した１ｎＭ  ＤＮＡ／ＬＮＡプローブ（ＴＴＣＣＡ）5を含むハイブリダイゼーション緩衝液中、３７℃で２時間ハイブリダイズさせた。カバースリップを、５０％ホルムアミドを含む２×ＳＳＣで３回、１×ＳＳＣで２回、０．１×ＳＳＣで２回、５５℃で２０分間洗浄した。細胞に青色色素であるＤＡＰＩを含む褪色防止用封入剤（「ＳｌｏｗＦａｄｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ」Ｔｈｅｒｍｏ社製）を加え、顕微鏡スライド上に載せた。細胞の蛍光画像を蛍光顕微鏡（「ＢＺ−９０００」ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij/）を用いて画像を解析した。蛍光顕微鏡写真を図３に、ＲＮＡ凝集体の個数を図４（１）に、ＲＮＡ凝集体の合計面積を図４（２）に示す。
図３と図４に示す結果の通り、対照例ではＵＧＧＡＡの繰り返し配列を有するＲＮＡによりＲＮＡ凝集体が生じたが、培地中にＮＣＤを添加した場合には、かかる凝集体が顕著に抑制されることが実証された。
【００５１】
実施例４：  Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ＵＧＧＡＡの繰り返し配列を有するＲＮＡにより、ショウジョウバエの複眼の脱落が生じることが知られている。そこで、ショウジョウバエにおいてＧＡＬ４／ＵＡＳシステムを使い、ＵＡＳ配列の下流の（ＴＧＧＡＡ）n遺伝子を複眼で強制的に発現させ、実験を行った。詳しくは、本実験では、複眼でのみ遺伝子を発現させるＧＭＲプロモーターを用いて複眼で特異的にＧＡＬ４を発現させ、生成したＧＡＬ４タンパク質がＵＡＳと結合することを利用してリピートＲＮＡ遺伝子を複眼でのみ発現させた。
具体的には、乾燥酵母を含む、ショウジョウバエを用いる変異原性試験用培地（「Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｂｌｕｅ」）を超純水またはＮＣＤ水溶液と混合し、ＮＣＤを含まない又は１００μＭのＮＣＤを含む飼料を作製した。当該飼料を用い、複眼特異的に働くＧＭＲプロモーターの下流にＧＡＬ４遺伝子を持つ親バエ（ＧＭＲ−ＧＡＬ４  ｄｒｉｖｅｒ）と、ＵＡＳの下流に病原性（ＵＧＧＡＡ）n配列遺伝子を有する親バエ（ＵＡＳ−（ＵＧＧＡＡ）exp）またはＵＡＳの下流に非病原性リピート配列遺伝子を有する親バエ（ＵＡＳ−（ＵＡＧＡＡ）（ＵＡＡＡＡＵＡＧＡＡ）exp）とを交配させ、同飼料を用いて２３℃で両遺伝子を有する子バエを生成させた。子バエの出生後、１〜２日齢の子バエの眼の形態を、立体顕微鏡（「ＳＺＸ１０」オリンパス社製）を用いて観察した。また、得られた顕微鏡画像を画像解析ソフト（「ＩｍａｇｅＪ」（http://imagej.nih.gov/ij/））で解析し、眼の面積を算出した。また、眼面積の結果に関して、ウェルチのｔ検定により有意差検定を行った。顕微鏡写真を図５に、複眼の総面積を図６に示す。
図５と図６に示す結果の通り、非病原性の（ＵＡＧＡＡ）（ＵＡＡＡＡＵＡＧＡＡ）nＲＮＡを発現させた対照群では、ＮＣＤの摂取の有無にかかわらず、眼に異常は見られなかった。一方、病原性の（ＵＧＧＡＡ）nＲＮＡを強発現させた場合では、複眼の明らかな脱落が認められ、眼面積が減少した。しかしＮＣＤの摂取により複眼の脱落は明らかに抑制され、眼面積も有意に増加した。
かかる結果より、ＮＣＤは（ＵＧＧＡＡ）nＲＮＡによる悪影響を顕著に抑制できることが証明された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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