(57)【要約】      （修正有）【課題】小胞体におけるタンパク質保持によって引き起こされる疾患を治療する方法。【解決手段】ポリマーナノ粒子中にカプセル化された筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）ポンプ阻害剤を得ることと、有効量の前記阻害剤を被験体に投与することと、を含み、該ポリマーナノ粒子が小胞体（ＥＲ）を標的とするように表面修飾され、有効量の該阻害剤がＥＲにおけるタンパク質保持を低減し、カプセル化により該阻害剤の副作用がカプセル化を用いない該阻害剤の投与と比較して減少する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞体におけるタンパク質保持によって引き起こされる疾患を治療する方法であって、
ポリマーナノ粒子中にカプセル化された筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）ポンプ阻害剤を得ることと、
有効量の前記阻害剤を、それを必要とする被験体に投与することと、
を含み、前記ポリマーナノ粒子が小胞体（ＥＲ）を標的とするように表面修飾され、有効量の前記阻害剤がＥＲにおけるタンパク質保持を低減し、カプセル化により該阻害剤の副作用がカプセル化を用いない該阻害剤の投与と比較して減少する、方法。
【請求項２】
前記阻害剤がクルクミン、タプシガルギン、シクロピアゾン酸、２，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、ギンゲロール、ＣＧＰ３７１５７、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、パキシリン及びサイコサポニン−ｄ、又はそれらの組合せからなる群から選択される食餌性ポリフェノール化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記食餌性ポリフェノール化合物がクルクミンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記副作用がＥＲストレス又はアポトーシスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマーがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（ラクチド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリアルキルシアノアクリレート、アルギネート、ゼラチン、レシチン−キトサン、アルブミン又はキトサンである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記食餌性ポリフェノール化合物がクルクミンであり、前記ポリマーがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記表面修飾が前記ポリマーにコンジュゲートしたＥＲ標的化ペプチドを含み、該ＥＲ標的化ペプチドがＫＤＥＬ（配列番号１）、ＫＫＸＸ（配列番号２）、又はアルギニンベースのＲＸＲ型ＥＲ保持／回収シグナルである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（ラクチド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリアルキルシアノアクリレート、アルギネート、ゼラチン、レシチン−キトサン、アルブミン又はキトサンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記食餌性ポリフェノール化合物がクルクミンであり、前記ポリマーがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患が慢性肉芽腫症、嚢胞性線維症、遺伝性気腫、遺伝性ヘモクロマトーシス、眼皮膚白皮症、プロテインＣ欠乏症、Ｉ型遺伝性血管性浮腫、ファブリー病、テイ−サックス病、先天性スクラーゼ−イソマルターゼ欠損症、クリグラー−ナジャール症候群２型、糖尿病、ラロン症候群、原発性甲状腺機能低下症、先天性ＱＴ延長症候群、チロキシン結合グロブリン欠損症、β−サラセミア／Ｈｂ  Ｅ症、家族性高コレステロール血症、家族性カイロミクロン血症、無βリポタンパク血症、先天性甲状腺機能低下症、骨形成不全症、大理石骨病、遺伝性低フィブリノゲン血症、腎性尿崩症、下垂体性尿崩症、シャルコー−マリー−トゥース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、アルツハイマー病、フォンヴィレブランド病ＩＩＡ型、タンジアー病、又はＡＬＫ１ミスセンス突然変異を伴う遺伝性出血性毛細管拡張症（ＨＨＴ）２型である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマーがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（ラクチド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリアルキルシアノアクリレート、アルギネート、ゼラチン、レシチン−キトサン、アルブミン又はキトサンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患が慢性肉芽腫症であり、前記食餌性ポリフェノール化合物がクルクミンであり、前記ポリマーがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）であり、前記表面修飾が前記ポリマーにコンジュゲートしたＥＲ標的化ペプチドＫＤＥＬ（配列番号１）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
有効量の前記阻害剤が、前記被験体において白血球による活性酸素種生成を高める、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
有効量の前記阻害剤が、白血球によって媒介される腹腔内細菌排除を高める、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ポリマーナノ粒子中にカプセル化されたＳＥＲＣＡポンプ阻害剤と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物であって、該ポリマーナノ粒子が小胞体を標的とするように表面修飾される、医薬組成物。
【請求項１６】
前記ポリマーナノ粒子がポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（ラクチド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリアルキルシアノアクリレート、アルギネート、ゼラチン、レシチン−キトサン、アルブミン又はキトサンの１つ以上から形成され、前記ＳＥＲＣＡポンプ阻害剤がクルクミン、タプシガルギン、シクロピアゾン酸、２，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、ギンゲロール、ＣＧＰ３７１５７、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、パキシリン及びサイコサポニン−ｄ、又はそれらの組合せからなる群から選択される食餌性ポリフェノール化合物である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記食餌性ポリフェノール化合物がクルクミンであり、前記ポリマーがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記表面修飾が前記ポリマーにコンジュゲートしたＥＲ標的化ペプチドを含み、該ＥＲ標的化ペプチドがＫＤＥＬ（配列番号１）、ＫＫＸＸ（配列番号２）、又はアルギニンベースのＲＸＲ型ＥＲ保持／回収シグナルである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｈ３３８Ｙ突然変異体ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質をコードする異種核酸をゲノム中に含むトランスジェニックマウスであって、突然変異体ｇｐ９１ｐｈｏｘが該トランスジェニックマウスの細胞内で発現され、野生型ｇｐ９１ｐｈｏｘが該トランスジェニックマウスの細胞内で発現されない、トランスジェニックマウス。
【請求項２０】
前記トランスジェニックマウスの細胞が白血球である、請求項１９に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２１】
腹腔内細菌排除が前記トランスジェニックマウスにおいて野生型マウスと比較して低減する、請求項２０に記載のトランスジェニックマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１８年４月４日付で出願された米国仮特許出願第６２／６５２，５０２号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）は、白血球中のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ２（ＮＯＸ２）の欠陥によって引き起こされる原発性免疫不全症である。例えば、非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３を参照されたい。ＮＯＸ２は、膜結合サブユニットｇｐ９１ｐｈｏｘ及びｐ２２ｐｈｏｘ、並びに細胞質成分ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、並びに低分子量ＧＴＰアーゼＲａｃ１／２で構成される。非特許文献３を参照されたい。ＮＯＸ２成分タンパク質の１つをコードする遺伝子に突然変異を有するＣＧＤ患者は、活性化白血球によるＮＯＸ２媒介性の活性酸素種（ＲＯＳ）産生を欠くことから、様々な感染及び或る特定の自己免疫疾患の影響を受けやすい。非特許文献４、非特許文献５及び非特許文献６を参照されたい。
【０００３】
ＣＧＤ患者は、ｇｐ９１ｐｈｏｘをコードするＣｙｂｂ遺伝子に点突然変異を有すると特定されている。非特許文献７を参照されたい。突然変異Ｃｙｂｂ遺伝子ＣｙｂｂＣ１０２４Ｔは、Ｈ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘと指定される単一アミノ酸変化を有する突然変異体ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質を生じる。Ｈ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘは、小胞体（ＥＲ）中に保持され、続いてＥＲ中のタンパク質品質管理機構により分解される未成熟型で存在する。非特許文献７を参照されたい。
【０００４】
筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）阻害剤、すなわちタプシガルギンは、ＣＧＤ白血球中のＨ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘのＥＲ保持を回避し、白血球の機能を回復させることが以前に示されている。非特許文献８を参照されたい。同様にＳＥＲＣＡ阻害剤であるクルクミンは、嚢胞性線維症において異常なＥＲタンパク質保持を部分的に是正することが示されている。非特許文献９を参照されたい。しかしながら、クルクミンはＥＲストレス及びアポトーシスを含む細胞毒性副作用を有する。非特許文献１０、非特許文献１１及び非特許文献１２を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Holland 2013, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 27:89-99
【非特許文献２】O'Neill et al. 2015, Redox Biol. 6:135-156
【非特許文献３】Roos 2016, Br. Med. Bull. 118:50-63
【非特許文献４】Huang et al. 2016, Inflamm. Bowel Dis. 22:2794-280.
【非特許文献５】Huang et al. 2015, Antioxid. Redox Signal. 23:973-984
【非特許文献６】Nguyen et al. 2017, Front. Cell Infect. Microbiol. 7:373
【非特許文献７】Lin et al. 2002, Biochim. Biophys. Acta 1586:275-286
【非特許文献８】Huang et al. 2009, Free Radical Biol. Med. 47:932-940
【非特許文献９】Egan et al. 2004, Science 304:600-602
【非特許文献１０】Gupta et al. 2013, Mol. Nutr. Food Res. 57:1510-1528
【非特許文献１１】Liu et al. 2016, Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2016:7831282
【非特許文献１２】Reuter et al. 2008, Biochemical Pharmacology 76:1340-1351
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
より大きな有効性及びより少ない副作用を有する、ＥＲ保持の疾患を治療するための医薬組成物及び方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上で論考した必要性を満たすために、小胞体におけるタンパク質保持によって引き起こされる疾患を治療する方法を開示する。該方法は、ポリマーナノ粒子中にカプセル化された筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）ポンプ阻害剤を得ることと、疾患を患う被験体に有効量の阻害剤を投与することとによって行われる。
【０００８】
ポリマーナノ粒子は小胞体（ＥＲ）を標的とするように表面修飾される。さらに、有効量の阻害剤は、ＥＲにおけるタンパク質保持を低減し、カプセル化により該阻害剤の副作用、例えば細胞毒性がカプセル化を用いない該阻害剤の投与と比較して減少する。
【０００９】
上記の方法を行うために使用することができる医薬組成物も開示される。該医薬組成物は、ポリマーナノ粒子中にカプセル化されたＳＥＲＣＡポンプ阻害剤と薬学的に許容可能な担体とを含有する。上述のように、ポリマーナノ粒子は小胞体を標的とするように表面修飾される。
【００１０】
さらに、Ｈ３３８Ｙ突然変異体ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質をコードする異種核酸をゲノム中に有するトランスジェニックマウスが提供される。突然変異体ｇｐ９１ｐｈｏｘは該トランスジェニックマウスの細胞内で発現され、野生型ｇｐ９１ｐｈｏｘは該トランスジェニックマウスの細胞内で発現されない。トランスジェニックマウスをヒト慢性肉芽腫症のモデルとすることができる。
【００１１】
１つ以上の本発明の実施形態の詳細を下記明細書に記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、明細書、図面及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【００１２】
下記の説明は、添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】非処理マウス（−）、遊離クルクミンで処理したマウス又は指定のクルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子で処理したマウスから単離された好中球のウエスタンブロット分析によって決定された、Ｃｙｂｂ−／−バックグラウンドのＣｙｂｂＣ１０２４Ｔトランスジェニックマウス（「ＴＧマウス」）におけるｇｐ９１ｐｈｏｘのグリコシル化形態とグリコシル化不十分な形態との比率を示す棒グラフである（ｎ＝４；＊：ｐ＜０．０５）。
【図１Ｂ】遊離クルクミン又はＥＲ標的化クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子で処理したＴＧマウスから単離された好中球における活性酸素種（ＲＯＳ）生成を示す棒グラフである（ｎ＝４；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図１Ｃ】非処理ＴＧマウス（−）及び指定のように処理したＴＧマウスにおけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）としての細菌量を示す棒グラフである（ｎ＝４；＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図２】非標的化クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子と比較した、ＥＲへのＥＲ標的化クルクミンＰＬＧＡナノ粒子の経時的な共局在化を定量化する棒グラフである（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【図３】時間に対する細胞内カルシウム放出速度のプロットから曲線下面積（ＡＵＣ）として算出される、指定のように処理した分化ＨＬ６０細胞におけるカルシウム流を示す棒グラフである（ｎ＝４；＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【図４】時間に対する細胞外カルシウム取込み速度のプロットから曲線下面積（ＡＵＣ）として算出される、指定のように処理した分化ＨＬ６０細胞におけるカルシウム流を示す棒グラフである（ｎ＝３；＊：ｐ＜０．０５）。
【図５Ａ】指定のように処理した分化ＨＬ６０細胞における蛍光色素を用いて決定されたミトコンドリア膜電位の棒グラフである（ｎ＝４；＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図５Ｂ】指定のように処理した分化ＨＬ６０細胞集団のフローサイトメトリーによって決定されたアネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージの棒グラフである（ｎ＝４；＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図５Ｃ】指定のように処理した分化ＨＬ６０細胞から抽出されたタンパク質のウエスタンブロット分析によって測定されたＢｉｐ（左パネル）、リン酸化ＥＲＫ（中央パネル）及び切断型カスパーゼ−３（右パネル）の相対強度の棒グラフを示す図である（ｎ＝４；＊：ｐ＜０．０５）。
【図６Ａ】非処理の（−）及び指定のように処理したヒト末梢血造血細胞（ＨＳＣ）のフローサイトメトリーによって決定される、非処理に対するパーセンテージとしてのＣＤ７１ｌｏｗＣＤ２３５ａｈｉｇｈ細胞の数を示す棒グラフである（ｎ＝３；＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図６Ｂ】指定のように処理したＨＳＣのフローサイトメトリーによって決定されるアネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージの棒グラフである（ｎ＝３；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
上述のように、小胞体におけるタンパク質保持によって引き起こされる疾患を、ＳＥＲＣＡポンプ阻害剤を用いて治療する方法が開示される。阻害剤は、食餌性ポリフェノール化合物である。化合物はクルクミン、タプシガルギン、シクロピアゾン酸、２，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、ギンゲロール、ＣＧＰ３７１５７、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、パキシリン及びサイコサポニン−ｄとすることができるが、これらに限定されない。これらの化合物の１つ以上の組合せを使用することもできる。特定の方法では、食餌性ポリフェノール化合物はクルクミンである。
【００１５】
ＳＥＲＣＡポンプ阻害剤は、ポリマーナノ粒子中にカプセル化される。ナノ粒子を形成するために使用することができる例示的なポリマーとしては、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（ラクチド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリアルキルシアノアクリレート、アルギネート、ゼラチン、レシチン−キトサン、アルブミン及びキトサンが挙げられる。これらのポリマーの混合物を使用することもできる。特定の一方法では、ポリマーはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）から形成される。
【００１６】
上述のポリマーナノ粒子は、ＥＲを標的とするように表面修飾される。表面修飾は、ポリマーにコンジュゲートしたＥＲ標的化ペプチドとすることができる。１つ以上のＥＲ標的化ペプチド、例えばＫＤＥＬ（配列番号１）、ＫＫＸＸ（配列番号２）、又はアルギニンベースのＲＸＲ型ＥＲ保持／回収シグナルペプチドをポリマーにコンジュゲートすることができる。例示的な方法ではＫＤＥＬがＥＲ標的化ペプチドとして使用される。
【００１７】
ポリマーナノ粒子中にカプセル化されたＳＥＲＣＡポンプ阻害剤を、ＥＲ保持による疾患を患う被験体に疾患の治療に有効な量で投与する。有効量の阻害剤がＥＲにおけるタンパク質保持を低減し、カプセル化により阻害剤の副作用がカプセル化を用いない阻害剤の投与と比較して減少する。低減される副作用は細胞毒性、例えばＥＲストレス及びアポトーシスであり得る。
【００１８】
有効量のＳＥＲＣＡポンプ阻害剤が、被験体において白血球による活性酸素種生成を高め、白血球によって媒介される腹腔内細菌排除を高めることができる。
【００１９】
本明細書に記載の方法は、上記のように小胞体におけるタンパク質保持によって引き起こされる疾患の治療に用いられる。このような疾患として、慢性肉芽腫症、嚢胞性線維症、遺伝性気腫、遺伝性ヘモクロマトーシス、眼皮膚白皮症、プロテインＣ欠乏症、Ｉ型遺伝性血管性浮腫、ファブリー病、テイ−サックス病、先天性スクラーゼ−イソマルターゼ欠損症、クリグラー−ナジャール症候群２型、糖尿病、ラロン症候群、原発性甲状腺機能低下症、先天性ＱＴ延長症候群、チロキシン結合グロブリン欠損症、β−サラセミア／Ｈｂ  Ｅ症、家族性高コレステロール血症、家族性カイロミクロン血症、無βリポタンパク血症、先天性甲状腺機能低下症、骨形成不全症、大理石骨病、遺伝性低フィブリノゲン血症、腎性尿崩症、下垂体性尿崩症、シャルコー−マリー−トゥース病、ペリツェウス−メルツバッハー病、アルツハイマー病、フォンヴィレブランド病ＩＩＡ型、タンジアー病、及びＡＬＫ１ミスセンス突然変異を伴う遺伝性出血性毛細管拡張症（ＨＨＴ）２型が挙げられるが、これらに限定されない。特定の方法では、疾患は慢性肉芽腫症である。
【００２０】
更に別の特定の方法において、疾患は慢性肉芽腫症であり、食餌性ポリフェノール化合物はクルクミンであり、ポリマーはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）であり、表面修飾はポリマーにコンジュゲートしたＥＲ標的化ペプチドＫＤＥＬを含む。
【００２１】
上記の方法を行うために医薬組成物が提供される。医薬組成物は、上述の成分を薬学的に許容可能な担体と共に含む。より具体的には、組成物はポリマーナノ粒子中にカプセル化されたＳＥＲＣＡポンプ阻害剤を含み、該ポリマーナノ粒子が小胞体を標的とするように表面修飾される。
【００２２】
さらに、ポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（ラクチド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリアルキルシアノアクリレート、アルギネート、ゼラチン、レシチン−キトサン、アルブミン又はキトサンの１つ以上から形成さる。ＳＥＲＣＡポンプ阻害剤は、クルクミン、タプシガルギン、シクロピアゾン酸、２，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、ギンゲロール、ＣＧＰ３７１５７、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、パキシリン及びサイコサポニン−ｄ、又はそれらの組合せからなる群から選択される食餌性ポリフェノール化合物である。表面修飾はポリマーにコンジュゲートしたＥＲ標的化ペプチドを含み、ＥＲ標的化ペプチドはＫＤＥＬ、ＫＫＸＸ、又はアルギニンベースのＲＸＲ型ＥＲ保持／回収シグナルである。
【００２３】
例示的な医薬組成物は、ＫＤＥＬで表面修飾されたポリ（乳酸−コ−グリコール酸）ナノ粒子中にカプセル化されたクルクミンを薬学的に許容可能な担体と共に含有する。
【００２４】
上述のように、トランスジェニックマウスが本発明の範囲に含まれる。Ｈ３３８Ｙ突然変異体ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質をコードする異種核酸をゲノム中に含むトランスジェニックマウスは、その細胞内で突然変異体ｇｐ９１ｐｈｏｘを発現する。一例では、Ｈ３３８Ｙ突然変異体ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質を発現する細胞は白血球である。トランスジェニックマウスは腹腔内細菌排除を欠く。特に、腹腔内細菌排除がトランスジェニックマウスにおいて野生型マウスと比較して低減する。
【００２５】
以下の特定の例は単なる例示と解釈され、それ以外の開示を何ら限定するものではない。更に詳述しなくても、当業者であれば本明細書における説明に基づき、最大限に本開示を使用することができると思われる。本明細書に引用した全ての刊行物の全体は引用することにより本明細書の一部をなす。
【実施例】
【００２６】
実施例１：ＣＧＤトランスジェニックマウスの作製
Ｈ３３８Ｙ突然変異体ｇｐ９１ｐｈｏｘによって引き起こされる慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）のトランスジェニックマウスモデルを、以下のようにＣｙｂｂノックアウトバックグラウンドで確立した。マウスＣｙｂｂ遺伝子を含有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）（クローン番号ＲＰ２３−２１０Ｐ９）を、Children's Hospital Oakland Research Institute（Oakland、CA USA）のＢＡＣＰＡＣ資源センターから入手した。Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ＢＡＣ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Gene Bridges, GmbH）を用いて、突然変異体ＣｙｂｂＣ１０２４Ｔを含有するようにＢＡＣを修飾した。得られたＣｙｂｂＣ１０２４Ｔ  ＢＡＣ導入遺伝子を、標準的な技法を用いてＣｙｂｂ標的化突然変異体Ｂ６．１２９Ｓ−Ｃｙｂｂｔｍ１Ｄｉｎ／Ｊマウス（Jackson Labs  カタログ番号００２３６５）から単離された卵子に前核注入によって導入した。ＢＡＣ導入遺伝子を有するファウンダー（Founders）及び子孫を、尾部ＤＮＡのＰＣＲ及び直接ＤＮＡシークエンシングによって同定した。完全長突然変異体ＣｙｂｂＣ１０２４Ｔの発現をウエスタンブロット分析によって確認した。トランスジェニックマウスをＣｙｂｂノックアウトマウスと更に戻し交配し、ＣｙｂｂノックアウトバックグラウンドのＣｙｂｂＣ１０２４Ｔトランスジェニックマウスを作り出した。
【００２７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを野生型（ＷＴ）マウスとして使用し、国立成功大学（ＮＣＫＵ）（台南、台湾）の動物センターから購入した。全てのマウスをＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドに対して慣例的に戻し交配し、ゲノムワイド遺伝子型決定を行って遺伝的背景を確認した。マウスはＮＣＫＵの実験動物センターの動物施設に収容した。全ての手順がＮＣＫＵの動物実験委員会によって承認された。
【００２８】
実施例２：ＣＧＤトランスジェニックマウスの分析
ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスに由来する好中球におけるＨ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ｇｐ９１ｐｈｏｘ抗体を用いたウエスタンブロッティングによって検査した。好中球を単離するために、マウスに３ｍｌの３％チオグリコレートを腹腔内注射して腹腔内好中球を誘導した。４時間後にマウスを屠殺し、２ｍＭエチレングリコール四酢酸を含む５ｍｌのハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で腹腔を２回洗浄して、誘導された腹腔内好中球を採取した。その後、腹腔内好中球を使用前にＰＢＳで洗浄した。
【００２９】
結果から、ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスから単離された好中球がグリコシル化不十分な形態のＨ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘを産生することが示された。グリコシル化形態のＨ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質のレベルは、ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスにおいて野生型マウスと比較して顕著に低かった。予想されるように、Ｃｙｂｂ−／−マウスにおけるｇｐ９１ｐｈｏｘ発現は検出されなかった。これらの結果から、ＣｙｂｂＣ１０２４Ｔ突然変異を有し、ヒトＣＧＤ患者に見られるものを模倣するトラフィッキング異常Ｈ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質発現を示すＣＧＤのマウスモデルが首尾よく確立されたことが示される。
【００３０】
実施例３：クルクミン担持ナノ粒子の作製
クルクミン担持ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子を、二重乳化（double emulsification）の改変アプローチを用いて作製した（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルション；Zhong et al. 2010, J. Nanobiotechnology 8:6を参照されたい）。簡潔に述べると、クルクミンを５００μＬのアルコール（Ｗ１）に溶解させ、一方でＰＬＧＡ（ＰＬＡ：ＰＧＡ＝５０：５０、ＭＷ＝６００００）をジクロロメタン（Ｏ）に分散させた。Ｗ１をＯに添加し、プローブ型超音波振動子を用いて混合して、第１のエマルションを形成した。第１のエマルション、すなわちＷ１／Ｏを１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液（Ｗ２）に添加し、撹拌して、ＰＬＧＡナノ粒子を含有する第２のエマルション（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）を形成した。次いで、第２のエマルションを真空下で脱気して有機溶媒を除去し、残存する全ての遊離クルクミン及びＰＶＡを遠心分離によって除去した。ＰＬＧＡナノ粒子を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００（商標）（NanoDrop Technologies，LLC，USA）を用いて４３５ｎｍでの光学密度を測定することによって平均担持容量（loading capacity）について分析した。
【００３１】
実施例４：ＥＲ標的化クルクミン担持ナノ粒子の作製
前段落に記載のように作製したクルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子を、以下のようにＥＲ標的化ペプチドにコンジュゲートした。クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子をエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド溶液中で１時間インキュベートした後、溶液から取り出した。クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子を１０倍モル過剰のＥＲ標的化ペプチドＫＤＥＬと共にＨ２Ｏに懸濁し、１８時間インキュベートし、その後過剰なペプチドを遠心分離によって除去した。標識されたナノ粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に再分散させた。
【００３２】
実施例５：クルクミン担持ナノ粒子によるＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスの処理
ＥＲ標的化ＫＤＥＬペプチドを含む又は含まないクルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子を、ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスにおけるＨ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質の発現及び成熟に対するそれらの影響について試験した。簡潔に述べると、マウスを処理しないか、又は別個に２０ｍｇ／ｋｇのクルクミンに相当する量の遊離クルクミン、クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子若しくはクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子を用いて２４時間にわたって処理した。上記のようにマウスの好中球を誘導し、単離し、Ｈ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質の発現について分析した。
【００３３】
統計分析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad Software）を用いて行った。各群の平均値を平均±ＳＥＭとして示し、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続く事後最小有意差検定又は二元配置ＡＮＯＶＡに続くボンフェローニの事後検定を用いて比較する。全ての実験で０．０５未満のｐ値を統計的に有意であるとみなした。
【００３４】
結果から、全ての処理及び非処理ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスがグリコシル化不十分な形態のＨ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘを発現することが示された。遊離クルクミンで処理したマウスは、非処理マウスと比較して発現されるグリコシル化Ｈ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘの量にいかなる変化も示さなかった。一方、クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子で処理したマウスは、非処理マウスと比較してグリコシル化Ｈ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘの発現の１．３倍の増加を示した。さらに、クルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子で処理したマウスは、非処理マウスと比較して１．７倍多いグリコシル化Ｈ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘを発現した。同じサンプル中のグリコシル化Ｈ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘとグリコシル化不十分なＨ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘとの比率を分析した場合も同様の結果が得られた。図１Ａを参照されたい。
【００３５】
これらのデータから、ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスにおけるＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子によるＥＲへのクルクミンの送達が、好中球中の突然変異体Ｈ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質の成熟を促進することが示される。
【００３６】
実施例６：ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスにおける活性酸素種産生
上述のように、細菌排除に不可欠な好中球におけるＮＯＸ２活性による活性酸素種（ＲＯＳ）の産生は、ＣＧＤ患者ではＥＲにおけるｇｐ９１ｐｈｏｘの滞留の結果として損なわれる。ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスにおけるＮＯＸ２機能を、遊離クルクミンで処理した又はクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子で処理したこれらのマウスの好中球におけるＲＯＳ産生を測定することによって検査した。
【００３７】
ＲＯＳ産生アッセイ
ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスの腹腔内好中球を上記のように誘導し、単離した。好中球を１×ＨＢＳＳ及び５％ＦＢＳで３回洗浄した後、１０μＭ  ２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテートと共に３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を１００ｎｇ／ｍｌホルボールミリステート１３−アセテート（Sigma）と共に３７℃で１５分間インキュベートして、ＲＯＳ産生を誘導した。ＰＭＡ処理細胞における蛍光を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（BD Biosciences）を用いたフローサイトメトリーによって検出し、データをＦｌｏｗｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２ソフトウェアで分析した。結果を図１Ｂに示す。
【００３８】
クルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子で処理したＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスから単離された好中球によるＲＯＳ産生は、遊離クルクミンで処理した動物から単離された好中球によるものよりも有意に高かった。これらのデータから、ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスにおけるＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子によるＥＲへのクルクミンの送達が好中球におけるＮＯＸ２機能を回復させ、好中球中の突然変異体Ｈ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質の成熟を促進するＥＲに送達されたクルクミンの能力と相関することが示される。
【００３９】
実施例７：腹腔内細菌排除試験
ＮＯＸ２機能は、細菌感染を除去するためにも必要である。細菌排除を非処理ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウス、クルクミンで処理したトランスジェニックマウス及びＰＬＧＡにカプセル化されたクルクミンで処理したトランスジェニックマウスへの細菌、すなわち黄色ブドウ球菌（S. aureus）の腹腔内注射によって検査した。
【００４０】
細菌調製
黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ番号２５９２３）を、１０％ヒツジ血液を含むトリプシン大豆寒天プレート上、３７℃で一晩培養した。単一コロニーをプレートから取り出し、ルリア−ベルターニ培地（ＬＢ）中、３７℃で１６時間継代培養した。細菌培養物を５ｍＬのＬＢで５０倍希釈し、３７℃で６時間インキュベートした。黄色ブドウ球菌培養物中のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を、１０μｌ滴の培養物をＴＳＡプレート上に広げ、プレートを一晩インキュベートし、コロニー数を計数することによって決定した。
【００４１】
黄色ブドウ球菌によるマウスの処理
ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスを処理しないままにするか、又は上記のように２０ｍｇ／ｋｇの遊離クルクミン、クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子若しくはクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子を用いて２４時間処理した。マウスに１００μｌのＰＢＳ中の１×１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌を腹腔内注射した。４時間後にマウスを屠殺し、腹腔細胞を５ｍｌのＰＢＳでの洗浄によって採取した。洗浄液中の黄色ブドウ球菌のＣＦＵを、５０μｌ滴の洗浄液をＴＳＡプレート上にプレーティングし、一晩のインキュベーション後に増殖している黄色ブドウ球菌のコロニーを計数することによって決定した。
【００４２】
図１Ｃに示す結果から、クルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子で処理したマウスにおける細菌量が非処理マウスよりも有意に低く、更には遊離クルクミン又は非標的化クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子で処理したマウスよりも低いことが示された。
【００４３】
上記の手順に従い、遊離クルクミン、クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子又はクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子で処理したマウスから単離された腹腔滲出液中のチオグリコレートにより誘導された好中球のパーセンテージに有意差が見られないことが決定された。
【００４４】
まとめると、これらの知見から、ＣｙｂｂＣ１０２４ＴトランスジェニックＣｙｂｂ−／−マウスにおけるＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子によるＥＲへのクルクミンの送達が好中球の抗細菌機能を回復させることが示される。
【００４５】
実施例８：ＰＬＧＡナノ粒子のＥＲ標的化の定量化
ＥＲ標的化ペプチド修飾（decoration）を有する又は有しないクルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子で処理した細胞における細胞内分布を、好中球の多くの特徴を有する分化ＨＬ−６０細胞において免疫染色及び共局在化によって測定した。
【００４６】
ＨＬ−６０細胞の分化
ＨＬ−６０細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０中、３７℃で培養した。密度３×１０５細胞／ｍｌの細胞を１．３％ジメチルスルホキシド（Sigma-Aldrich）で処理して、分化を誘導した。４日間のインキュベーション後に分化細胞を採取し、死細胞をフィコール−ハイパークによる遠心分離によって除去した。
【００４７】
ナノ粒子の細胞内局在性の決定
分化ＨＬ−６０細胞を８ウェルスライド上に播種した後、ＥＲに局在化する細胞透過性蛍光色素であるＥＲ−Ｔｒａｃｋｅｒで標識した。次いで、標識細胞を１０μＭクルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子又は１０μＭクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子で処理した。タイムラプス蛍光画像を、それぞれクルクミン及びＥＲ−Ｔｒａｃｋｅｒ色素の蛍光を刺激する波長である４８８ｎｍ及び３７４ｎｍの励起波長を用いて共焦点顕微鏡検査によって撮影した。クルクミンナノ粒子とのＥＲ−ｔｒａｃｋｅｒ色素の共局在化の程度をタイムラプス画像からピアソンの相関法によって算出した。結果を図２に示す。
【００４８】
データから、ＥＲ標的化ナノ粒子が非標的化ナノ粒子と比較して細胞への添加から４分間でＥＲに有意に局在化することが示された。図２を参照されたい。この局在化の有意差は、ナノ粒子の添加後２０分にわたって増加した。結果から、ＥＲ標的化ナノ粒子が実際に生細胞においてＥＲにより選択的に局在化することが確認された。
【００４９】
実施例９：クルクミンにより誘導される細胞内カルシウム放出の決定
クルクミン等のＳＥＲＣＡ阻害剤は、ＥＲからの細胞内カルシウム放出の増加を引き起こす。カルシウム放出を誘導するクルクミンの能力を、ＰＬＧＡナノ粒子にカプセル化されたクルクミンと比較した。
【００５０】
分化ＨＬ−６０細胞を８ウェルスライド上のカルシウム無含有培地中に播種し、細胞内カルシウム感受性指示色素Ｆｌｕｏ−４ＡＭを加えた。細胞をタプシガルギン（陽性対照）で処理するか、又は０．５μＭ、１μＭ若しくは１０μＭのクルクミン、クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子若しくはクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子で処理した。経時的な蛍光強度を処理細胞において共焦点顕微鏡検査によって測定し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析した。カルシウム添加前のベースライン蛍光強度で除算した経時的な蛍光強度の変化（ΔＦ／Ｆ０）を時間に対してプロットした。
【００５１】
１０μＭ遊離クルクミンによる細胞の処理は、０．５μＭ及び１μＭの遊離クルクミンによる処理と比較して顕著に高いレベルのカルシウム放出を速い速度で誘導した。より具体的には、１０μＭ遊離クルクミンによる処理の４０秒後、５０秒後及び６０秒後の細胞におけるカルシウムレベルは、０．５μＭ又は１μＭの遊離クルクミンで処理した細胞における同じ時点でのレベルよりも顕著に高かった。蛍光対時間曲線から導かれる細胞内カルシウムの増加速度も、１０μＭ遊離クルクミンで処理した細胞において、より低濃度の遊離クルクミンで処理した細胞と比較して最も高かった。
【００５２】
カルシウム放出を、クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子及びクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子で処理した細胞においても測定した。データから、０．５μＭ及び１μＭのこれらのいずれかのナノ粒子による分化ＨＬ−６０細胞の処理が、１０μＭ遊離クルクミン処理によって誘導されるものと同様の細胞内カルシウムレベル及び増加速度の上昇を誘導することが示された。曲線下面積（ＡＵＣ）として表示される全カルシウム流を図３に示す。
【００５３】
結果から、０．５μＭのクルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子及びＥＲ標的化クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子が、タプシガルギン処理と同じレベルまで細胞内カルシウムレベルを上昇させることが可能であることが示される。１０μＭへのクルクミンナノ粒子濃度の増加は、処理細胞における細胞内カルシウムレベルのピークレベル又は増加速度を更に増加させなかった。
【００５４】
実施例１０：クルクミンにより誘導される細胞外カルシウム流入の決定
ＥＲカルシウム貯蔵の枯渇によって誘発される細胞外カルシウム流入を、遊離クルクミンで処理するか又はクルクミン担持ナノ粒子で処理した細胞において以下のように測定した。
【００５５】
分化ＨＬ−６０細胞を遊離クルクミン（１０μＭ）、クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子（０．５μＭ）及びクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子（０．５μＭ）を用いて３７℃で一晩前処理した。細胞をカルシウム無含有ＨＢＳＳで洗浄し、ポリリジンでコーティングされた８ウェルスライド（ibidi，Planegg，Germany）上に１×１０６細胞／ｍｌの密度で播種し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を２μＭのカルシウム感受性蛍光色素Ｆｌｕｏ−４  ＡＭ及び１μＭのＥＲ−ｔｒａｃｋｅｒを用いて３７℃で３０分間標識した。標識細胞を１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２で処理した。
【００５６】
蛍光画像をＣａＣｌ２の添加後５分間にわたって１０秒に１回、共焦点顕微鏡検査によって撮影した。これらの画像における蛍光強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析した。カルシウム添加前のベースライン蛍光強度で除算した経時的な蛍光強度の変化（ΔＦ／Ｆ０）を時間に対してプロットし、カルシウムレベルの増加速度（ΔＦ／Ｆ／秒）をそのプロットから導いた。全カルシウム流をΔＦ／Ｆ／秒対時間曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）として算出した。結果を図４に示す。
【００５７】
１．２５ｍＭ細胞外カルシウムの添加は、非処理細胞において顕著なカルシウム流入を誘導しなかった。陽性対照として使用したＳＥＲＣＡ阻害剤であるタプシガルギンは、添加後１０秒でカルシウム流入を誘導した。
【００５８】
１０μＭの遊離クルクミンは、タプシガルギンによって誘導されるものと同様の早期の細胞外カルシウム流入を誘導した。対照的に、０．５μＭクルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子及び０．５μＭクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子によって誘導された細胞外カルシウム流入は、これらのナノ粒子による処理の６０秒後になってから検出された。
【００５９】
蛍光強度の増加速度の測定から、遊離クルクミンによる細胞の処理がクルクミン担持ナノ粒子と比較してより顕著なカルシウム流入を早い時点で誘導することが明らかになった。特に、１０μＭの遊離クルクミンによる処理の２０秒後のカルシウム流入速度は、０．５μＭクルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子又は０．５μＭクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子で処理した細胞における処理の２０秒後のカルシウム流入速度よりも顕著に高かった。
【００６０】
ＰＬＧＡナノ粒子にカプセル化されたクルクミンによって誘導される細胞外カルシウム流入の遅れにより、遊離クルクミンによって誘導される細胞外カルシウム流入と比較して全カルシウム流入が低減した。図４を参照されたい。遊離クルクミンがＰＬＧＡナノ粒子に担持されたクルクミンと比較して同様のレベルのＥＲカルシウム枯渇を誘導したことを考えると、この結果は予期せぬものであった。上で指摘したように、ＥＲカルシウムの枯渇は細胞外カルシウム流入を誘発する。
【００６１】
実施例１１：ＥＲストレス及び細胞生存に対するクルクミンの影響
上述のように、クルクミンはＥＲストレス及びアポトーシスを誘導することから、細胞毒性であることが示されている。遊離クルクミンの細胞毒性を、処理細胞においてミトコンドリア膜電位（細胞毒性の一尺度）、アポトーシスマーカー及びＥＲストレス関連タンパク質発現を測定することによってカプセル化クルクミンと比較した。
【００６２】
ミトコンドリア膜電位の測定
分化ＨＬ−６０細胞を０．５μＭ又は１０μＭの遊離クルクミン、クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子又はクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子を用いて２４時間処理した。処理細胞を、２５０ｎＭのミトコンドリア膜電位指示色素であるテトラメチルローダミン（ＴＭＲＭ）を用いて３７℃で３０秒間標識した。ＴＭＲＭ標識細胞をフローサイトメトリーによって分析し、Ｆｌｏｗｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２ソフトウェアパッケージを用いてそれらのミトコンドリア膜電位を定量化した。
【００６３】
結果から、１０μＭ遊離クルクミンで処理した細胞が対照非処理細胞と比較してミトコンドリア膜電位の有意な低減を示すことが明らかになった。図５Ａを参照されたい。対照的に、１０μＭクルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子又は１０μＭクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子で処理した細胞におけるミトコンドリア膜電位は、対照非処理細胞とは異ならず、遊離クルクミン処理細胞と比較した場合に有意に高かった。図５Ａを参照されたい。
【００６４】
アポトーシス細胞の検出
遊離又はカプセル化クルクミンで上記のように処理した細胞を、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、フィコエリトリン−アネキシンＶ及び７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を用いて室温で１５分間染色した。アネキシンＶはアポトーシスを起こしている細胞の表面に結合し、７−ＡＡＤはアポトーシス細胞にのみ侵入し、染色する。染色された細胞をフローサイトメトリー分析に供し、Ｆｌｏｗｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２分析パッケージを用いて結果を分析した。
【００６５】
結果から、細胞表面に結合するアネキシンＶによって測定される、１０μＭ遊離クルクミンによる処理後のアポトーシス細胞数の有意な増加が示された。図５Ｂを参照されたい。同じ濃度のクルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子又はクルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子で処理した細胞は、有意に低いアポトーシス細胞数を示した。図５Ｂを参照されたい。
【００６６】
ＥＲストレス応答
ＥＲストレス応答の活性化がクルクミン誘導性アポトーシスに関与するかを決定するために、ＥＲストレスマーカーであるＢｉｐ及びリン酸化ＥＲＫのレベル、並びにアポトーシスのマーカーである切断型カスパーゼ−３のレベルを、１０μＭのクルクミン又はカプセル化クルクミンで処理した細胞のウエスタンブロット分析によって定量化した。
【００６７】
簡潔に述べると、処理細胞を１００μｌの溶解バッファー（１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  トリス塩基、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０倍プロテアーゼ阻害剤カクテル、ｐＨ７．４）に溶解させた。溶解させたサンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、Ｂｉｐ、ホスホ−ＥＲＫ、総ＥＲＫ、切断型カスパーゼ−３及びβ−アクチンに結合する抗体を用いたウエスタンブロット分析のために膜に転写した。市販の増強化学発光試薬を用いてこれらの抗体の結合を可視化した。化学発光シグナルを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて画像から定量化した。
【００６８】
データから、遊離クルクミン及びクルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子による細胞の処理が、非処理対照細胞と比較してＢｉｐ発現及びＥＲＫリン酸化を増大することが示された。予期せぬことに、クルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子で処理した細胞におけるＢｉｐ発現及びＥＲＫリン酸化は、遊離クルクミン処理細胞よりも有意に低かった。図５Ｃの左パネル及び中央パネルを参照されたい。
【００６９】
カスパーゼ−３切断の測定から、ＰＬＧＡナノ粒子にカプセル化されたクルクミンが、遊離クルクミンによる処理と比較して有意に少ないカスパーゼ−３切断を誘導することが明らかになった。図５Ｃの右パネルを参照されたい。
【００７０】
要するに、上述の実施例に記載される知見から、ＳＥＲＣＡを阻害することができる濃度、すなわち１０μＭの遊離クルクミンが急速なカルシウム流入を誘導し、ミトコンドリア損傷、ＥＲストレス、及びアポトーシスの誘導を引き起こすことが示される。ＰＬＧＡナノ粒子にカプセル化された、同等のＳＥＲＣＡ阻害活性を有するクルクミンは、カルシウム流入の遅延を誘導し、細胞をミトコンドリア損傷、ＥＲストレス及びアポトーシスから保護する。
【００７１】
さらに、クルクミン担持ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子は、ＳＥＲＣＡを阻害することによって、ＥＲ中に滞留するＨ３３８Ｙ−ｇｐ９１ｐｈｏｘを首尾よく放出することにより、細胞生存能力を過度に損なうことなくＮＯＸ２機能を回復させる。
【００７２】
実施例１２：赤芽球分化に対するクルクミンの影響
赤芽球分化を、遊離クルクミンで処理するか又はクルクミン担持ナノ粒子で処理したヒト末梢血造血細胞（ＨＳＣ）において以下のように測定した。
【００７３】
ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを、１５％熱不活性化ウシ胎仔血清、２Ｕ／ｍｌの組換えヒトエリトロポエチン、２０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子及び１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−３（ＩＬ−３）を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地中で培養した。４日目に、ＩＬ−３を含まない新鮮培地に培地を交換し、ＨＳＣを更に５日間培養した。
【００７４】
赤芽球の成熟を、フローサイトメトリーを用いてＣＤ７１及びＣＤ２３５ａの表面発現を検出することによって分析した。結果を図６Ａに示す。データから、遊離クルクミン及びＥＲ標的化クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子が処理ＨＳＣ中のより成熟したＣＤ７１ｌｏｗ，ＣＤ２３５ｈｉｇｈ細胞のパーセンテージを有意に高めることが示された。
【００７５】
アネキシンＶ陽性細胞の測定から、ＥＲ標的化ＰＬＧＡナノ粒子にカプセル化されたクルクミンが、処理ＨＳＣにおいて遊離クルクミンによる処理と比較して有意に少ないアポトーシスを誘導することが明らかになった。図６Ｂを参照されたい。
【００７６】
要するに、ＥＲ標的化クルクミン担持ＰＬＧＡナノ粒子によるＨＳＣの処理は、赤芽球成熟を促進すると同時に、クルクミン誘導性アポトーシスを防ぐ。
【００７７】
その他の実施形態
本明細書に開示される特徴の全てを任意の組合せで組み合わせてよい。本明細書に開示されるそれぞれの特徴は、同じ目的、同等の目的又は類似の目的にかなう代替的な特徴によって置き換えることができる。表現上特に記載が無い限り、開示されるそれぞれの特徴は、一連の包括的な同等の特徴又は類似の特徴の一例に過ぎない。
【００７８】
上記詳細な説明から、当業者は、本発明の必須の特性を容易に突きとめることができ、そしてその趣旨及び範囲から逸脱しなければ、それを様々な使用及び状況に適合させるために、本発明の様々な変化及び変更を行うことが可能である。このように、他の実施形態も添付の特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
2019182834.tif 000002
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2019182834.tif 000009
【図５Ｃ】
2019182834.tif 000010
【図６Ａ】
2019182834.tif 000011
【図６Ｂ】
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【外国語明細書】
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