(57)【要約】      （修正有）【課題】収差の補正量を評価する。【解決手段】顕微鏡は、試料の像を撮像する撮像部４と、試料の像の収差を補正する収差補正部８と、試料に縞パターンを照射する照射部３と、縞パターンが照射された試料を撮像部が撮像した撮像画像と、縞パターンの空間周波数とに基づいて、縞パターンのコントラスト値を算出する算出部４１と、算出部が算出したコントラスト値に基づいて、収差補正部による収差の補正量を解析する解析部４２と、を備える。【選択図】図１
2019204002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の像を撮像する撮像部と、
前記試料の像の収差を補正する収差補正部と、
前記試料に縞パターンを照射する照射部と、
前記縞パターンが照射された前記試料を前記撮像部が撮像した撮像画像と、前記縞パターンの空間周波数とに基づいて、前記縞パターンのコントラスト値を算出する算出部と、
前記算出部が算出した前記コントラスト値に基づいて、前記収差補正部による前記収差の補正量を解析する解析部と、を備える顕微鏡。
【請求項２】
前記算出部は、前記撮像画像をフーリエ変換して得られる周波数スペクトルと、前記縞パターンの空間周波数とに基づいて、前記コントラスト値を算出する、
請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記算出部は、前記周波数スペクトルにおいて前記縞パターンの空間周波数に対応する領域における周波数成分の強度に基づいて、前記コントラスト値を算出する、
請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記算出部は、前記周波数スペクトルにおいて前記縞パターンの空間周波数に対応して周波数成分の強度が極大になる位置に基づいて、前記領域の位置を設定する、
請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記算出部は、前記周波数スペクトルにおいて前記縞パターンの空間周波数に対応する周波数成分の強度の極大値に基づいて、前記領域のサイズを設定する、
請求項３または請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記算出部は、前記周波数スペクトルにおいて前記縞パターンの空間周波数に対応して周波数成分の強度が極大になる位置と、前記周波数スペクトルにおいて直流成分に対応して周波数成分の強度が極大になる位置とに基づいて、前記領域のサイズを設定する、
請求項３または請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記算出部は、予め設定された前記縞パターンの空間周波数に基づいて、前記領域の位置を設定する、
請求項３から請求項６のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項８】
前記算出部は、前記撮像画像をフーリエ変換して得られる変換画像を前記周波数スペクトルとして用い、前記変換画像の画素の輝度値を前記周波数スペクトルにおける周波数成分の強度として用いる、
請求項２から請求項７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項９】
前記解析部は、前記周波数スペクトルにおける直流成分と、前記周波数スペクトルにおける前記縞パターンの空間周波数の成分との比を評価値に用いて、前記収差の補正量の目標値を算出する、
請求項２から請求項８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
前記撮像部は、前記収差の補正量が異なる複数の条件で撮像を実行し、
前記算出部は、前記複数の条件のそれぞれについて前記コントラスト値を算出し、
前記解析部は、前記コントラスト値に基づく評価値が極値となる前記収差の補正量を算出する、
請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１１】
前記照射部は、前記縞パターンとして、第１方向において輝度が周期的に変化する第１縞パターンと、前記第１方向に交差する第２方向において輝度が周期的に変化する第２縞パターンとを前記試料に照射し、
前記算出部は、前記第１方向に対応する前記第１縞パターンの空間周波数に基づいて前記コントラスト値として第１コントラスト値を算出し、前記第２方向に対応する前記第２縞パターンの空間周波数に基づいて前記コントラスト値として第２コントラスト値を算出し、
前記解析部は、前記算出部が算出した前記第１コントラスト値および前記第２コントラスト値に基づいて、前記収差の補正量を解析する、
請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１２】
前記照射部は、前記縞パターンとして、位相が互いに異なる第３縞パターンと第４縞パターンとを前記試料に照射し、
前記算出部は、前記第３縞パターンと前記第４縞パターンと一方または双方について前記コントラスト値を算出する、
請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
前記第４縞パターンの位相は、前記第３縞パターンの位相と１８０°ずれている、
請求項１２に記載の顕微鏡。
【請求項１４】
前記照射部は、前記縞パターンとして、空間周波数が互いに異なる第５縞パターンと第６縞パターンとを前記試料に照射し、
前記算出部は、前記第５縞パターンおよび前記第６縞パターンのそれぞれについて前記コントラスト値を算出する、
請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１５】
前記収差補正部は、前記試料から放射される光の光路に沿って移動可能な光学部材を備え、
前記収差の補正量は、前記光学部材の移動量に基づいて、表される、
請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１６】
前記収差補正部は、前記試料から放射される光の波面を調整する波面調整部を備え、
前記収差の補正量は、前記波面調整部による波面の調整量に基づいて、表される、
請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１７】
縞パターンが照射された試料の像を撮像した撮像画像と、前記縞パターンの空間周波数とに基づいて、前記縞パターンのコントラスト値を算出する算出部と、
前記算出部が算出した前記コントラスト値に基づいて、前記試料の像の収差の補正量を解析する解析部と、を備える画像処理装置。
【請求項１８】
試料の像を撮像することと、
前記試料の像の収差を補正することと、
前記試料に縞パターンを照射することと、
前記縞パターンが照射された前記試料を撮像した撮像画像と、前記縞パターンの空間周波数とに基づいて、前記縞パターンのコントラスト値を算出することと、
前記コントラスト値に基づいて前記収差の補正量を解析することと、
前記解析に基づいて前記収差の補正量を設定することと、を含む観察方法。
【請求項１９】
コンピュータに、
縞パターンが照射された試料の像を撮像した撮像画像と、前記縞パターンの空間周波数とに基づいて、前記縞パターンのコントラスト値を算出することと、
前記コントラスト値に基づいて、前記試料の像の収差の補正量を解析することと、を実行させる解析プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、画像解析装置、観察方法、解析プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡は、試料の像を形成し、試料の観察等に利用される。試料の像は、顕微鏡の光学系等で発生する収差の影響を受ける。そこで、顕微鏡の収差を補正する技術が提案されている（例えば、下記の特許文献１参照）。顕微鏡は、例えば収差の補正量を適切に設定可能なように、収差の補正量を評価可能であることが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−２４３８３８号公報
【発明の概要】
【０００４】
本発明の第１の態様に従えば、試料の像を撮像する撮像部と、試料の像の収差を補正する収差補正部と、試料に縞パターンを照射する照射部と、縞パターンが照射された試料を撮像部が撮像した撮像画像と、縞パターンの空間周波数とに基づいて、縞パターンのコントラスト値を算出する算出部と、算出部が算出したコントラスト値に基づいて、収差補正部による収差の補正量を解析する解析部と、を備える顕微鏡が提供される。
【０００５】
本発明の第２の態様に従えば、縞パターンが照射された試料の像を撮像した撮像画像と、縞パターンの空間周波数とに基づいて、縞パターンのコントラスト値を算出する算出部と、算出部が算出したコントラスト値に基づいて、試料の像の収差の補正量を解析する解析部と、を備える画像解析装置が提供される。
【０００６】
本発明の第３の態様に従えば、試料の像を撮像することと、試料の像の収差を補正することと、試料に縞パターンを照射することと、縞パターンが照射された試料を撮像した撮像画像と、縞パターンの空間周波数とに基づいて、縞パターンのコントラスト値を算出することと、コントラスト値に基づいて収差の補正量を解析することと、解析に基づいて収差の補正量を設定することと、を含む観察方法が提供される。
【０００７】
本発明の第４の態様に従えば、コンピュータに、縞パターンが照射された試料の像を撮像した撮像画像と、縞パターンの空間周波数とに基づいて、縞パターンのコントラスト値を算出することと、コントラスト値に基づいて、試料の像の収差の補正量を解析することと、を実行させる解析プログラムが提供される
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】第１実施形態に係る顕微鏡を示す図である。
【図２】第１実施形態に係る縞パターン及び画像処理部による処理を示す図である。
【図３】第１実施形態に係る算出部の処理を示す図である。
【図４】第１実施形態に係る解析部の処理を示す図である。
【図５】第１実施形態に係る観察方法を示すフローチャートである。
【図６】第２実施形態に係る顕微鏡を示す図である。
【図７】第２実施形態に係る縞パターン及び画像処理部による処理を示す図である。
【図８】第２実施形態に係る縞パターン及び画像処理部による処理を示す図である。
【図９】第２実施形態に係る縞パターン及び画像処理部による処理を示す図である。
【図１０】第２実施形態に係る縞パターン及び画像処理部による処理を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［第１実施形態］
次に、図面を参照しながら実施形態について説明する。図１は、第１実施形態に係る顕微鏡１を示す図である。顕微鏡１は、ステージ２と、照射部３と、撮像部４（検出部）と、制御装置５と、表示装置６（表示部）と、記憶装置７（記憶部）とを備える。顕微鏡１は、例えば蛍光顕微鏡であり、予め蛍光染色された細胞などを含む試料Ｘの観察などに利用される。
【００１０】
なお、顕微鏡１は、蛍光顕微鏡以外の光学顕微鏡でもよい。顕微鏡１は、光と試料とのインコヒーレントな相互作用を用いる顕微鏡（例、ラマン顕微鏡）でもよい。また、顕微鏡１は、蛍光を用いた観察と蛍光を用いない観察との双方に利用可能な顕微鏡でもよい。以下の説明において、顕微鏡１が落射照明を利用する落射照明顕微鏡であるものとする。実施形態に係る顕微鏡１は、試料Ｘに対する照明光の入射側の反対側において、試料Ｘから放射される光（例、蛍光、ラマン散乱光）を検出する顕微鏡（例、透過型顕微鏡）でもよい。
【００１１】
一般的に、顕微鏡によって取得される試料の像は、光学系（例、対物レンズ、照明光学系など）の収差（例、ザイデル収差）の影響を受ける。上記収差は、例えば、球面収差、コマ収差、非点収差、像面湾曲、及び歪曲収差の少なくとも１つを含む。実施形態に係る顕微鏡１は、試料Ｘの像の収差を補正する収差補正部８を備える。また、顕微鏡１は、収差の補正量を解析する画像処理部９を備える。画像処理部９は、例えば、解析結果として収差の補正量の最適値あるいは推奨値を出力する。ユーザは、収差の補正量の解析結果を用いて収差が適切に補正された状態で、試料Ｘの像を観察することが可能である。以下、顕微鏡１の各部について説明する。
【００１２】
ステージ２は、試料Ｘを保持する。ステージ２は、例えば、ＸＹステージまたはＸＹＺステージを含む。ステージ２は、試料Ｘを保持した状態で、対物レンズ２８（後述する）に対して可動である。ステージ２は、対物レンズ２８に対して移動しなくてもよい（固定されていてもよい）。
【００１３】
照射部３（照明部、照明装置）は、ステージ２に載置される試料Ｘに照明光を照射する。照射部３は、試料Ｘにおける照明光の光強度の空間分布を可変である。試料Ｘの観察時に、照射部３は、光強度の空間分布がほぼ均一な照明光を試料Ｘに照射する。また、収差の補正量の解析時に、照射部３は、光強度の空間分布が所定のパターン（所定の分布）に設定された照明光を試料Ｘに照射する。上記の所定のパターンは、例えば、明部と暗部とが周期的に（繰り返し）並ぶ縞パターン（後に図２に示す）に設定される。本実施形態における顕微鏡１は、照射部３が縞パターンを試料Ｘ上に形成させる照明光を照射し、試料Ｘから放射されて後述の対物レンズを通過（透過）した光（例、蛍光）が撮像部４によって受光されて、検出結果（撮像画像、撮像結果、受光結果、受光信号）が得られる。
【００１４】
照射部３は、光源ＬＳと、照明光学系１１とを備える。光源ＬＳは、例えばレーザダイオード（ＬＤ）あるいは発光ダイオード（ＬＥＤ）などの固体光源を含む。以下の説明において、適宜、光源ＬＳから発せられた光を照明光という。顕微鏡１により蛍光観察を行う場合、照明光の波長は、試料Ｘに含まれる蛍光物質の励起波長を含む波長帯に設定される。
【００１５】
なお、照射部３は、光源ＬＳの少なくとも一部を備えなくてもよい。例えば、顕微鏡１は、光源ＬＳを備えない状態で提供されてもよい。光源ＬＳは、顕微鏡１が使用される際に、顕微鏡１に取り付けられてもよい。光源ＬＳは、照射部３に対して交換可能（取り付け可能、取り外し可能）でもよい。
【００１６】
照明光学系１１は、光源ＬＳからの照明光を試料Ｘに照射する。照明光学系１１は、例えば、球面レンズ、非球面レンズなどの回転対称な形状の光学部材（例、レンズ部材）を含む。以下の説明において、適宜、照明光学系１１に含まれる光学部材の回転対称軸を、照明光学系１１の光軸１１ａという。なお、照明光学系１１は、自由曲面レンズを含んでいてもよい。
【００１７】
照明光学系１１は、光源ＬＳから試料Ｘに向かう順に、レンズ１２、導光部材１３、及びレンズ１４、及び分岐部１５を備える。導光部材１３は、例えば光ファイバーである。レンズ１２は、光源ＬＳからの照明光を、導光部材１３の光入射側の端面に集光する。導光部材１３は、レンズ１２からの照明光をレンズ１４へ導く。レンズ１４は、例えばコリメータであり、導光部材１３から出射した照明光を平行光に変換する。
【００１８】
分岐部１５は、縞パターンの生成に利用される。分岐部１５は、例えば回折格子を含み、照明光を複数の回折光に分岐させる。照明光学系１１は、照明光を分岐部１５によって複数の回折光に分岐させ、複数の回折光の干渉により形成される縞パターン（干渉縞）で試料Ｘを照明する。照明光学系１１は、例えば、複数の回折光のうち２つの光束の干渉（２光束干渉）によって縞パターンを形成する。図１には、複数の光束のうち、０次回折光（実線で示す）、＋１次回折光（破線で示す）、及び−１次回折光（２点鎖線で示す）を示した。以下の説明において、回折光のうち＋１次回折光と−１次回折光の一方または双方を指す場合に、単に１次回折光と表記する。
【００１９】
分岐部１５は、照明光学系１１の光軸１１ａに交差する面内に、例えば１次元の周期構造を有する。この周期構造は、濃度（透過率）が周期的に変化する構造であってもよいし、段差（位相差）が周期的に変化する構造であってもよい。分岐部１５が位相型である場合、±１次回折光の回折効率が高く、縞パターンの形成に±１次回折光を用いる場合に光量のロスを低減することができる。なお、分岐部１５は、例えば、回折格子の代わりに空間光変調器（ＳＬＭ）を用いるものでもよい（後に図６で説明する）。
【００２０】
分岐部１５は、試料Ｘにおいて観察対象の面と光学的に共役な位置（例、視野共役位置）に配置される。分岐部１５は、縞パターンのコントラスト値が許容される範囲内で、視野共役位置からずれた位置（視野共役位置の近傍）に配置されてもよい。分岐部１５は、照明光の光路に対して挿入および退避が可能である。収差の補正量の解析時に、分岐部１５は、照明光の光路に挿入（配置）されて照明光を複数の光束に分岐させる。また、試料Ｘの観察時に、分岐部１５は、照明光の光路から退避した位置に配置される。分岐部１５は、照明光の光路に対して、アクチュエータなどの駆動部によって挿入あるいは退避されてもよいし、ユーザの手作業で挿入あるいは退避されてもよい。
【００２１】
照明光学系１１は、分岐部１５から試料Ｘに向かう順に、レンズ２１、マスク２２、レンズ２３、照野絞り２４、レンズ２５、フィルタ２６、ダイクロイックミラー２７、及び対物レンズ２８を含む。
【００２２】
分岐部１５で分岐した照明光は、レンズ２１に入射する。レンズ２１は、例えば、光源ＬＳと同じ側の焦点面が分岐部１５と一致するように、配置される。レンズ２１は、例えば、試料Ｘと同じ側の焦点面が瞳共役面Ｐ１と一致するように配置される。瞳共役面Ｐ１は、対物レンズ２８の瞳面Ｐ０と光学的に共役な面である。
【００２３】
マスク２２は、縞パターンの形成に使われる回折光を通し、縞パターンの形成に使われない回折光を遮る。本実施形態において、縞パターンの形成に使われる回折光は、１次回折光（＋１次回折光、−１次回折光）であり、縞パターンの形成に使われない回折光は０次回折光および２次以上の回折光である。マスク２２は、１次回折光を通し、０次回折光および２次以上の回折光を遮断する。マスク２２は、１次回折光の光路が他の回折光の光路から分離する位置、例えば瞳共役面Ｐ１に配置される。このように、マスク２２において、０次回折光が入射する部分は照明光を遮る遮光部（非透過部）であり、１次回折光が入射する部分は回折した照明光が通る開口部（透過部）である。
【００２４】
マスク２２は、照明光の光路に対して挿入および退避が可能である。収差の補正量の解析時に、マスク２２は、照明光の光路に挿入（配置）されて、縞パターンの形成に使われない回折光を遮る。また、試料Ｘの観察時にマスク２２は照明光の光路から退避する。なお、マスク２２は、照明光の光路に対して、アクチュエータなどの駆動部によって挿入されてもよいし、アクチュエータなどの駆動部によって退避されてもよい。また、マスク２２は、照明光の光路に対して、ユーザの手作業で挿入されてもよいし、ユーザの手作業で退避されてもよい。また、マスク２２は、試料Ｘの観察時に遮光部の位置又は透過する光量が変化するシャッタなどでもよく、照明光の光路から退避しなくてもよい。また、顕微鏡１は、マスク２２を備えなくてもよい。
【００２５】
マスク２２を通った照明光は、レンズ２３に入射する。レンズ２３は、光源ＬＳと反対側の焦点面２３ａが分岐部１５と光学的に共役になるように配置される。照野絞り２４は、焦点面２３ａまたはその近傍に配置される。照野絞り２４は、照明光学系１１の光軸１１ａに垂直な面内において、照明光学系１１から試料Ｘに照明光が照射される範囲（照野、照明領域）を規定する。なお、顕微鏡１は、照野絞り２４を備えなくてもよい。照野絞り２４を通った照明光は、レンズ２５に入射する。レンズ２５は、その試料Ｘと同じ側の焦点面が瞳面Ｐ０の位置になるように、配置される。
【００２６】
レンズ２５を通った照明光は、フィルタ２６に入射する。フィルタ２６は、例えば励起フィルタであり、試料Ｘに含まれる蛍光物質の励起波長を含む波長帯の光が選択的に通る光学特性を有する。フィルタ２６は、例えば、照明光のうち励起波長以外の波長の少なくとも一部、迷光、外光などを遮断する。フィルタ２６を通った光は、ダイクロイックミラー２７に入射する。ダイクロイックミラー２７は、試料Ｘに含まれる蛍光物質の励起波長を含む波長帯の光が反射し、試料Ｘからの光のうち所定の波長帯の光（例、蛍光）が通る光学特性を有する。フィルタ２６からの光は、ダイクロイックミラー２７で反射し、対物レンズ２８に入射する。
【００２７】
対物レンズ２８の焦点面２８ａは、観察対象の面（例、物体面）に相当する。焦点面２８ａは、対物レンズ２８に対して光源ＬＳと反対側の焦点面である。焦点面２８ａは、分岐部１５と光学的に共役な位置に配置される。照射部３は、対物レンズ２８を介して試料Ｘに縞パターンを照射する。焦点面２８ａには、分岐部１５の周期構造に対応した縞パターン（後に図２に示す）が形成される。試料Ｘを観察する際に、試料Ｘの一部は、焦点面２８ａに配置される。試料Ｘに形成される縞パターンは、照明光学系１１の光軸１１ａに垂直な方向に光強度の周期的な分布を有する。
【００２８】
撮像部４は、対物レンズ２８を介して試料Ｘの像を撮像する。撮像部４は、結像光学系３１および撮像素子３２を備える。結像光学系３１は、試料Ｘから撮像素子３２へ向かう順に、対物レンズ２８、ダイクロイックミラー２７、フィルタ３３、及びレンズ３４を備える。対物レンズ２８およびダイクロイックミラー２７は、照明光学系１１と結像光学系３１とで共用である。照明光の照射によって試料Ｘから放射される光（以下、観察光という）は、対物レンズ２８に入射して平行光に変換され、ダイクロイックミラー２７を通ってフィルタ３３に入射する。
【００２９】
フィルタ３３は、例えば蛍光フィルタである。フィルタ３３は、試料Ｘからの観察光のうち所定の波長帯の光（例、蛍光）が選択的に通る特性を有する。この場合、フィルタ３３は、例えば、試料Ｘで反射した照明光、外光、迷光などを遮断する。フィルタ３３を通った光は、レンズ３４に入射する。レンズ３４は、その試料Ｘと同じ側の焦点面が対物レンズ２８の瞳面Ｐ０と一致するように、配置される。結像光学系３１は、対物レンズ２８の焦点面２８ａ（物体面）と光学的に共役な面（像面）を形成する。
【００３０】
撮像素子３２は、例えばＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサなどの二次元イメージセンサを含む。撮像素子３２は、例えば、二次元的に配列された複数の画素を有し、各画素にフォトダイオードなどの光電変換素子が配置された構造である。以下、撮像素子３２において光電変換素子が配置される面を、適宜、受光面という。撮像素子３２は、受光面が対物レンズ２８の焦点面２８ａと光学的に共役になるように、配置される。撮像素子３２は、例えば、光電変換素子への観察光の照射によって生じた電荷を、読出回路によって読み出す。撮像素子３２は、読み出された電荷をデジタルデータ（例、８ビットの階調値）に変換し、画素の位置と階調値とを関連付けたデジタル形式の画像データを出力する。撮像素子３２は、撮像結果として撮像画像のデータを制御装置５に出力する。
【００３１】
収差補正部８は、試料の像の収差を補正する。収差補正部８は、撮像素子３２の受光面に形成される試料Ｘの像の収差を補正する。収差補正部８は、例えば、対物レンズ２８に設けられる。収差補正部８は、対物レンズ２８における光路（例、光軸）に沿って移動可能な光学部材（例、レンズ部材）を備える。収差補正部８は、対物レンズ２８に含まれる光学部材を対物レンズ２８における光路（例、光軸１１ａ）に沿って移動させることで、収差を補正する。
【００３２】
収差補正部８による収差の補正量は、上記光学部材の移動量に基づいて、表されてもよい。収差補正部８は、例えば、補正環などのようにユーザが操作可能な操作部材を含む。収差補正部８による収差の補正量は、上記操作部材の移動量で表されてもよい。上記補正部材が補正環である場合、補正環の移動量（回転角）を示す目盛等のマークが形成され、ユーザは、目盛などから得られる回転角を収差の補正量（収差の補正レベル）として用いることができる。なお、収差補正部８は、上記光学部材をアクチュエータなどの駆動部によって移動させる構成でもよい。また、収差補正部８は、上記光学部材の移動量をエンコーダなどで取得する構成でもよい。
【００３３】
なお、収差補正部８は、試料から放射される光の波面を調整する波面調整部を備えてもよい。波面調整部は、対物レンズ２８の瞳面Ｐ０若しくはその近傍、又は瞳面Ｐ０と光学的に共役な位置若しくはその近傍に配置される。収差補正部８が波面調整部を備える場合、収差の補正量は、波面調整部による波面の調整量に基づいて、例えばツェルニケ(Zernike)多項式の係数などを用いて表されてもよい。波面調整部は、例えば、空間光変調器（ＳＬＭ）またはデフォーマブルミラーを含む。
【００３４】
空間光変調器は、例えば強誘電性液晶を用いた液晶素子を含み、光が入射する領域（例、画素）ごとの屈折率を制御可能である。収差補正部８は、波面調整部として空間光変調器を備える場合、空間光変調器における領域ごとの屈折率を調整することで、波面を調整する。また、デフォーマブルミラーは、例えば、ＭＥＭＳミラーアレイのように反射要素（マイクロミラー）のアレイを含み、光が入射する領域（例、反射要素）ごとに、デフォーマブルミラーの表面の傾き（例、反射角、反射要素の向き）を制御可能である。収差補正部８は、波面調整部としてデフォーマブルミラーを備える場合、デフォーマブルミラーの領域ごとの表面の傾きを制御することによって、波面を調整する。
【００３５】
収差の補正量を評価する手法として、例えば、試料Ｘの像における所望の構造のコントラスト値を評価する手法が考えられる。この場合、評価値が試料Ｘの構造の影響を受け、試料Ｘの構造が位置によって異なることによって収差の補正量を高精度に評価することが難しい。本実施形態においては、顕微鏡１は、試料Ｘを縞パターンで照明し、縞パターンのコントラスト値に基づいて収差の補正量を解析する。この場合、試料Ｘの構造がコントラスト値に及ぼす影響が低減され、収差の補正量を精度よく解析、評価することが可能である。
【００３６】
画像処理部９は、算出部４１と、解析部４２とを備える。図１において、画像処理部９（画像処理装置）は制御装置５に設けられるが、制御装置５と異なる装置に設けられてもよい。算出部４１は、縞パターンが照射された試料Ｘを撮像部４が撮像した撮像画像（撮像結果、検出結果）と、縞パターンの空間周波数とに基づいて、縞パターンのコントラスト値を算出する。例えば、画像処理部９は、該撮像画像と縞パターンの空間周波数とを用いて演算を行い、縞パターンのコントラスト値を算出する。解析部４２は、算出部４１が算出したコントラスト値に基づいて、収差補正部８による収差の補正量を解析して算出する。以下、画像処理部９の各部について説明する。
【００３７】
図２は、本実施形態に係る算出部の処理を示す図である。図２において、符号Ｉｍは、縞パターンＬＰが照射された試料Ｘを撮像部４が撮像した撮像画像である。撮像画像Ｉｍにおいて、符号Ｄｘは、水平走査方向であり、符号Ｄｙは垂直走査方向である。縞パターンＬＰは、第１部分（例、明部ＬＰａ）と、第１部分よりも輝度が低い第２部分（例、暗部ＬＰｂ）とが所定方向に繰り返し並ぶパターンである。以下の説明において、適宜、縞パターンＬＰで輝度が同じ位置を結ぶ線と平行な方向をライン方向と称し、ライン方向に垂直な方向を周期方向と称する。
【００３８】
算出部４１は、縞パターンＬＰの空間周波数に基づいて、縞パターンＬＰのコントラスト値を算出する。算出部４１は、撮像画像Ｉｍをフーリエ変換して得られる周波数スペクトルと、縞パターンＬＰの空間周波数とに基づいて、コントラスト値を算出する。周波数スペクトル（空間周波数スペクトル）は、周波数に対する周波数成分の強度の分布を表す。上記周波数スペクトルは、振幅スペクトルである。振幅スペクトルにおいて、各周波数成分の強度は、各周波数成分の振幅で表される。振幅スペクトルは、撮像画像Ｉｍに対して２次元の高速フーリエ変換を施して得られるパワースペクトルを用いて、各周波数成分のパワーの平方根を算出することで得られる。なお、周波数スペクトルとして上記パワースペクトルを用いてもよく、この場合に、各周波数成分の強度は、パワー（周波数成分の振幅の二乗）で表される。算出部は、周波数スペクトルにおいて縞パターンの空間周波数に対応する領域における周波数成分の強度に基づいて、コントラスト値を算出する。
【００３９】
算出部４１は、縞パターンＬＰの空間周波数に基づいて、周波数スペクトルにおいて縞パターンＬＰに対応する領域を選択する。縞パターンＬＰに対応する周波数成分の強度は、撮像画像Ｉｍにおける縞パターンＬＰの輝度値に対応する。算出部４１は、縞パターンＬＰに対応する領域として選択した領域における周波数成分の強度に基づいて、縞パターンＬＰのコントラスト値を算出する。
【００４０】
図２において、符号Ｔｉは、撮像画像Ｉｍをフーリエ変換して得られる変換画像である。符号Ｄｉは、水平走査方向Ｄｘにおける空間周波数を表す第1軸方向である。符号Ｄｊは、垂直走査方向Ｄｙにおける空間周波数を表す第２軸方向である。図２の変換画像Ｔｉはグレースケールの画像であり、空間周波数に対する周波数成分の強度は、空間周波数に対応する位置の画素の輝度値（例、階調値、画素値）で表される。変換画像Ｔｉにおいて、相対的に明るい（白い）領域は相対的に周波数成分の強度が高い領域であり、相対的に暗い（黒い）領域は相対的に周波数成分の強度が低い領域である。変換画像Ｔｉは、周波数スペクトルを表す情報として利用可能である。以下の説明では、適宜、算出部４１が周波数スペクトルとして変換画像Ｔｉを用い、周波数成分の強度として変換画像Ｔｉの各画素の輝度値を用いるものとする。
【００４１】
変換画像Ｔｉにおける符号ＴＸは、周波数空間の原点Ｔ０、及び原点Ｔ０の周囲を含む領域である。原点Ｔ０は、第1軸方向Ｄｉの座標が０、かつ第２軸方向Ｄｊの座標が０の点であり、直流成分に対応する。また、変換画像Ｔｉにおける符号ＴＬは、縞パターンＬＰに対応する領域を示す。領域ＴＬは、領域ＴＬａおよび領域ＴＬｂを含む。領域ＴＬｂは、原点Ｔ０に関して領域ＴＬａと対称的な位置に配置される。
【００４２】
変換画像Ｔｉにおける符号Ｑ１および符号Ｑ２は、縞パターンＬＰの空間周波数に対応する位置である。位置Ｑ２は、原点Ｔ０に関して位置Ｑ１と点対称な位置である。ここで、撮像画像Ｉｍの水平走査方向Ｄｘにおける縞パターンＬＰの空間周波数をｆｘで表す。また、撮像画像Ｉｍの垂直走査方向Ｄｙにおける縞パターンＬＰの空間周波数をｆｙで表す。位置Ｑ１は、第１軸方向Ｄｉおよび第２軸方向Ｄｊを軸とする周波数空間において座標（ｆｘ，ｆｙ）で表される。位置Ｑ２は、周波数空間において座標（−ｆｘ，−ｆｙ）で表される。
【００４３】
領域ＴＬａは、位置Ｑ１、及び位置Ｑ１の周囲を含む領域である。領域ＴＬａは、変換画像Ｔｉにおいて位置Ｑ１が配置される１つの画素、または、変換画像Ｔｉにおいて位置Ｑ１が配置される画素とその周囲の画素とを含む複数の画素である。領域ＴＬｂは、位置Ｑ２、及び位置Ｑ２の周囲を含む領域である。領域ＴＬｂは、変換画像Ｔｉにおいて位置Ｑ２が配置される１つの画素、または、変換画像Ｔｉにおいて位置Ｑ２が配置される画素とその周囲の画素とを含む複数の画素である。
【００４４】
図３は、第１実施形態に係る算出部の処理を示す図である。符号ＬＱは、変換画像Ｔｉにおいて縞パターンＬＰに対応する領域ＴＬａと領域ＴＬｂとを結ぶ線である。符号ＰＳは、線ＬＱ上の周波数スペクトル（周波数に対する周波数成分の強度の分布）である。周波数スペクトルＰＳにおいて、横軸は線ＬＱ上の位置を表し、縦軸は周波数成分の強度（例、周波数成分の振幅）を表す。周波数スペクトルＰＳの周波数成分の強度は、線ＬＱ上における画素の輝度値の分布に相当する。周波数スペクトルＰＳは、原点に対して対称的な分布であり、図３には原点に対して片側の部分を示した。
【００４５】
算出部４１は、縞パターンＬＰの空間周波数に対応する周波数スペクトルＰＳにおける位置（例、位置Ｑ１、位置Ｑ２）に基づいて、縞パターンＬＰに対応する領域ＴＬａおよび領域ＴＬｂを設定する。算出部４１は、領域ＴＬａおよび領域ＴＬｂの一方または双方について、周波数成分の強度の積分値をコントラスト値として算出する。例えば、図２に示したように周波数スペクトルＰＳが変換画像Ｔｉで表される場合、算出部４１は、変換画像Ｔｉにおいて領域ＴＬに含まれる画素の輝度値の総和をコントラスト値として算出する。
【００４６】
算出部４１は、縞パターンＬＰの空間周波数として、設定値を用いる。縞パターンＬＰの空間周波数の設定値は、照射部３の構成で定まる値である。例えば、分岐部１５が回折格子である場合、上記設定値は、分岐部１５の周期構造の周期、照明光学系１１の倍率、縞パターンＬＰを生成する回折光の次数などで定まる。縞パターンＬＰの空間周波数は、照射部３の構成に基づいて予め求めておくことができる。縞パターンＬＰの空間周波数の設定値は、記憶装置７に予め記憶されている。算出部４１は、記憶装置７から縞パターンＬＰの空間周波数の設定値を読み出して、コントラスト値の算出に用いる領域ＴＬを設定する。
【００４７】
算出部４１は、縞パターンＬＰの空間周波数として、撮像画像Ｉｍから測定される測定値を用いてもよい。例えば、算出部４１は、周波数スペクトルＰＳ（変換画像Ｔｉ）において領域ＴＸを除外した領域を探索し、周波数成分の強度（例、輝度値）が所定値以上（例、極大値）である位置の座標を導出し、この座標を縞パターンＬＰの空間周波数の測定値として用いてもよい。また、算出部４１は、周波数スペクトルＰＳ（変換画像Ｔｉ）において、縞パターンＬＰの空間周波数の設定値に対応する位置とその周囲を探索し、周波数成分の強度（例、輝度値）が所定値以上（例、極大値）である位置の座標を導出し、この座標を縞パターンＬＰの空間周波数の測定値として用いてもよい。
【００４８】
領域ＴＬのサイズ（例、領域ＴＬａの半径、領域ＴＬｂの半径）は、例えば、予め設定される。例えば、領域ＴＬａは、変換画像Ｔｉにおいて、縞パターンＬＰの空間周波数に相当する位置Ｑ１が配置される１つの画素でもよいし、この画素を中心とする複数の画素（例、３行３列の画素の行列）でもよい。
【００４９】
なお、領域ＴＬのサイズ（例、領域ＴＬａの半径、領域ＴＬｂの半径）は、撮像画像Ｉｍを用いて設定されてもよい。算出部４１は、周波数スペクトルＰＳにおいて縞パターンＬＰの空間周波数に対応する位置Ｑ１（例、周波数成分の強度の極大位置）と、周波数スペクトルＰＳにおいて直流成分に対応する位置（例、周波数成分の強度の極大位置、原点Ｔ０）とに基づいて、領域ＴＬａのサイズを設定してもよい。例えば、算出部４１は、領域ＴＬａの半径Ｒ１を、位置Ｑ１と原点Ｔ０との距離ＤＬに対して所定の比率（例、１０％、２０％）となる値に設定することで、領域ＴＬａのサイズを設定してもよい。
【００５０】
また、算出部４１は、周波数スペクトルＰＳにおいて縞パターンＬＰの空間周波数（位置Ｑ１）に対応する周波数成分の強度に基づいて、領域ＴＬａのサイズを設定してもよい。図３において、符号ＰＷ１は、縞パターンＬＰの空間周波数（例、測定値、設定値）に対応する周波数成分の強度（例、極大値）である。また、符号ＰＷ２は、極大値ＰＷ１に対して所定の比率となる周波数成分の強度の値（以下、参照値という）である。所定の比率は、予め設定される任意の値（例、１０％、５０％、９０％）である。算出部４１は、算出部４１は、周波数成分の強度が参照値ＰＷ２以上となる領域（範囲）を領域ＴＬａに設定することで、領域ＴＬａのサイズ（例、半径Ｒ１）を設定してもよい。
【００５１】
解析部４２は、算出部４１が算出したコントラスト値に基づいて、収差補正部８による収差の補正量の評価値を算出することによって、収差の補正量を解析する。解析部４２は、収差が低減されるレベル（程度）を示す評価値を演算によって算出し、評価値を用いて収差の補正量を解析する。まず、解析部４２は、算出部４１が算出したコントラスト値を用いて、評価値を算出する。以下、評価値について説明する。撮像画像Ｉｍの周波数スペクトル（以下、撮像画像スペクトルという）は、下記の式（１）で表される。
【００５２】
【数１】
2019204002.tif 000003
【００５３】
式（１）において、ｋは空間周波数であり、Ｉ（ｋ）は撮像画像スペクトルである。ＯＴＦ（ｋ）は光学伝達関数であり、Ｏ（ｋ）は試料Ｘの構造に基づく物体スペクトルである。ｃおよびｃ＊は、縞コントラストであり、互いに複素共役な関係にある。ｋ０は縞パターンの空間周波数である。なお、図２、図３などに示した領域ＴＸは、式（１）の右辺３項のうちＯ（ｋ）の値が相対的に大きい領域（Ｏ（ｋ）が支配的な領域）である。また、領域ＴＬａは、式（１）の右辺３項のうちＯ（ｋ−ｋ０）の値が相対的に大きい領域（Ｏ（ｋ−ｋ０）が支配的な領域）である。撮像画像スペクトルにおいて、空間周波数がｋ０の成分の周波数成分の強度は、式（１）においてｋ＝ｋ０とおくことによって、下記の式（２）で表される。
【００５４】
【数２】
2019204002.tif 000004
【００５５】
解析部４２は、評価値として、コントラスト値を規格化した値を算出する。ここで、撮像画像スペクトルにおける周波数成分の強度の基準値をＩ（０）として、評価値（|Ｉ（ｋ０）／Ｉ（０）|）を下記の式（３）で定義する。|Ｉ（ｋ０）／Ｉ（０）|は、周波数スペクトルにおける直流成分であるＩ（０）と、周波数スペクトルにおける縞パターンの空間周波数の成分であるＩ（ｋ０）との比である。|Ｉ（ｋ０）／Ｉ（０）|は、直流成分の振幅と、周波数がｋ０の周波数成分の振幅との比の絶対値である。
【００５６】
【数３】
2019204002.tif 000005
【００５７】
Ｏ（０）は、物体スペクトルの直流成分であり、物体スペクトルの他の周波数成分であるＯ（ｋ０）、Ｏ（２ｋ０）と比較して、絶対値が十分に大きく、下記の式（４）の関係が成り立つ。
【００５８】
【数４】
2019204002.tif 000006
【００５９】
式（４）と、ＯＴＦ（０）＝１とを用いると、式（３）の評価値（｜Ｉ（ｋ０）／Ｉ（０）｜）は、下記の式（５）のように近似できる。このように近似した評価値は、物体スペクトルの項を含まないので、収差の補正量を変更した際に物体スペクトルの影響を受けない。そして、収差が小さいほど｜ＯＴＦ（ｋ０）｜が大きいことから、上記の評価値が極大になる条件で収差が最小となる。
【００６０】
【数５】
2019204002.tif 000007
【００６１】
図４は、本実施形態に係る解析部の処理を示す図である。撮像部４（図１参照）は、収差の補正量が異なる複数の条件（例、補正する収差により異なる条件など）で撮像を実行し、複数の撮像画像を取得する。また、算出部４１は、上記複数の条件のそれぞれについてコントラスト値を算出する。算出部４１は、複数の撮像画像のそれぞれについてコントラスト値を算出することで、収差の補正量が異なる複数の条件でコントラスト値を算出する。解析部４２は、算出部４１が算出したコントラスト値のそれぞれについて上記の評価値を算出することで、収差の補正量が異なる複数の条件のそれぞれについて、評価値を算出する。
【００６２】
解析部４２は、収差の補正量が異なる複数の条件での評価値と収差の補正量との関係に基づいて、評価値が極値（例、局所的な最大値、最小値など）又はその近傍値となる収差の補正量を導出する。本実施形態では、解析部４２は、収差の補正量に対する評価値において、評価値が極大となる収差の補正量（図４に符号ＣＡで示す）を、目標値（例、最適値、推奨値）として算出する。例えば、解析部４２は、収差の補正量と評価値とを１組にしたデータをデータ点として、複数のデータ点に対してフィッティングカーブを求め、このフィッティングカーブから補正量の目標値を算出する。なお、解析部４２は、複数のデータ点のうち評価値が最大であるデータ点の収差の補正量を上記の目標値としてもよい。
【００６３】
解析部４２は、算出した収差の補正量の目標値を、例えば画像処理部９の外部に出力する。ユーザは、例えば、収差補正部８による収差の補正量を、解析部４２が算出した収差の補正量の目標値に設定することで、収差が適切に補正された状態で観察を行うことができる。なお、顕微鏡１は、収差補正部８による収差の補正量を、解析部４２が算出した収差の補正量へ自動で設定してもよい。例えば、制御部４３は、外部などからの入力指示によって又は自動的に収差補正部８を制御して、収差補正部８による収差の補正量を目標値に設定してもよい。
【００６４】
制御部４３は、顕微鏡１の各部を制御する。制御部４３は、照射部３を制御して、試料Ｘに照明光を照射させる。制御部４３は、撮像部４を制御して、試料Ｘを撮像させる。制御部４３は、収差補正部８を制御して、収差の補正量を設定（例、調整）させる。制御部４３は、画像処理部９を制御して、収差の補正量を解析させる。
【００６５】
次に、上述の顕微鏡１の構成に基づき、実施形態に係る観察方法について説明する。顕微鏡１の構成については、適宜、図１等を参照する。実施形態に係る観察方法は、試料Ｘの観察に先立ち収差の補正量を解析し、その解析結果に基づいて収差の補正量を設定した状態で、試料Ｘを撮像部４によって撮像して試料Ｘの像を取得する。図５は、実施形態に係る観察方法（画像解析方法）を示すフローチャートである。
【００６６】
本実施形態において、顕微鏡１は、収差の補正量が異なる複数の条件で縞パターンＬＰが照射された試料Ｘを撮像して、収差の補正量を解析する。上記の複数の条件は、予め設定されている。複数の条件を表す情報（例、第１補正量、第２補正量、・・・・）は、記憶装置７に予め記憶されている。
【００６７】
ステップＳ１において、照射部３は、対物レンズ２８を介して試料Ｘに縞パターンＬＰを照射する。ステップＳ２において、収差補正部８は、収差の補正量を設定する。収差補正部８は、収差の補正量を予め設定された値（例、上記第１補正量、初期設定値）に設定する。収差補正部８は、例えば、補正環がユーザによって手動で操作されることで、収差の補正量を設定する。例えば、画像処理部９は、記憶装置７から第１補正量を示す情報を取得し、第１補正量を示す画像を表示装置に表示させる。ユーザは、収差補正部８による収差の補正量が、表示装置に表示された画像に示される第１補正量になるように収差補正部８（例、補正環）を操作する。なお、収差補正部８は、制御部４３によって制御されることで、収差の補正量を自動で設定してもよい。ステップＳ３において、撮像部４は、縞パターンＬＰが照射された試料Ｘを、対物レンズ２８を介して撮像する。
【００６８】
ステップＳ４において、画像処理部９（例、解析部４２）は、収差の補正量を変更するか否かを判定する。画像処理部９は、予定された複数の条件（例、第１補正量、第２補正量、・・・・）の一部についてステップＳ３の撮像が完了していない場合、収差の補正量を変更すると判定する。収差の補正量を変更すると画像処理部９が判定した場合（ステップＳ４；Ｙｅｓ）、顕微鏡１は、ステップＳ２からステップＳ４の処理を繰り返す。ステップＳ２において、収差補正部８は、収差の補正量を次の値（例、第２補正量）に設定する。ステップＳ３において、撮像部４は、収差の補正量が次の値（例、第２補正量）に設定された状態で、縞パターンＬＰが照射された試料Ｘを、対物レンズ２８を介して撮像する。
【００６９】
ステップＳ４において、画像処理部９は、予定された複数の条件（例、第１補正量、第２補正量、・・・・）の全てについてステップＳ３の撮像が完了している場合、収差の補正量を変更しないと判定する。収差の補正量を変更しないと画像処理部９が判定した場合（ステップＳ４；Ｎｏ）、照射部３は、ステップＳ１で開始した縞パターンＬＰの照射を停止する。ステップＳ５において、算出部４１は、撮像画像Ｉｍと、縞パターンの空間周波数とに基づいて、縞パターンＬＰのコントラスト値を算出する。算出部４１は、上記複数の条件のそれぞれについて、縞パターンＬＰのコントラスト値を算出する。
【００７０】
ステップＳ６において、解析部４２は、ステップＳ５で算出されたコントラスト値に基づいて評価値を算出する。解析部４２は、上記複数の条件のそれぞれについて、コントラスト値を算出する。ステップＳ７において、解析部４２は、収差の補正量と評価値との関係を導出する（図４参照）。例えば、解析部４２は、収差の補正量と評価値との関係を示す関数（例、評価関数）を導出する。上記関数は、数式で表されてもよいし、テーブル形式で表されてもよい。解析部４２は、収差の補正量に対する評価値の関係を近似する数式の係数を導出することで、上記関数を導出する。ステップＳ８において、解析部４２は、評価値が極値になる収差の補正量を導出する。解析部４２は、例えば、上記関数において接線の傾きが０になる点に対応する収差の補正量を、収差の補正量の目標値として算出する。
【００７１】
なお、画像処理部９は、今回の条件で撮像された撮像画像と今回よりも前の条件で撮像された撮像画像との一方または双方に基づいて、今回以降の条件を決定してもよい。例えば、画像処理部９は、過去の３条件（例、２回前の条件、前回の条件、今回の条件）に対応する撮像画像から得られるコントラスト値またはコントラスト値から算出される値（例、評価値）を用いた黄金分割法などによって、次回の条件の候補を算出してもよい。この場合、画像処理部９は、次回の条件の候補が所定の条件を満たす場合に、ステップＳ４において、収差の補正量を変更すると判定し次回の条件の候補を次回の条件として決定（例、採用）してもよい。また、上記の所定の条件は、例えば、次回の条件の候補（例、次回の補正量の候補）と今回の条件（例、今回の補正量）との差が閾値以上である条件でもよい。
【００７２】
以上のようにして導出された収差の補正量に基づいて、試料の観察が実行される。ステップＳ９において、収差補正部８は、収差の補正量をステップＳ８で導出された値に設定する。ステップＳ９の処理は、ステップＳ２の処理と同様に、補正量がユーザの操作によって手動で設定されてもよいし、補正量が制御部４３の制御によって自動で設定されてもよい。ステップＳ１０において、撮像部４は、観察対象の試料を撮像する。撮像部４は、収差の補正量がステップＳ８で導出された値に設定された状態において、試料Ｘを撮像する。
【００７３】
ステップＳ１０において撮像部４が撮像した撮像画像は、試料Ｘの観察に利用される。ステップＳ１０において、照射部３は、試料Ｘを均一な照度の照明光で照明してもよい。また、顕微鏡１が、例えば構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）のように構造化照明光を利用する顕微鏡である場合、ステップＳ１０において、照射部３は、試料Ｘを縞パターンＬＰで照明してもよい。また、ステップＳ１０における観察対象の試料は、ステップＳ１からステップＳ３における試料と同じでもよいし、異なってもよい。例えば、ステップＳ１からステップＳ３における試料は、収差の補正量の解析に用いられる解析用の試料でもよい。
【００７４】
一般的に、顕微鏡の光学系には収差が存在する。光学系に収差が存在すると、光学伝達関数（ＯＴＦ）の振幅が低下する。像の空間周波数スペクトルは物体に依存するが、物体が変動しない場合には、像のスペクトル振幅が最大になるように収差を補正することが可能である。一般には、像を取得するたびに物体が変動するため、像のスペクトルを用いた収差補正は困難である。物体の変動は、物体自身の時間的変動や、顕微鏡のステージドリフト等を含む。
【００７５】
本実施形態においては、物体にパターン状の照明（例、縞状の照明、構造化照明）を与える。パターン（例、縞）のコントラストが所定のレベル以上である場合、像のスペクトルの、縞の周波数成分における振幅と直流成分の振幅の比は物体に依らず、縞コントラストとＯＴＦだけで決まる。本実施形態においては、上記の比を測定することで物体の変動の影響を低減して収差の補正量を解析（例、評価）することができ、物体の変動に対してロバストに収差を補正することが可能である。
【００７６】
［第２実施形態］
第２実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図６は、第２実施形態に係る顕微鏡を示す図である。本実施形態に係る顕微鏡１は、照射部３によって照射する縞パターンＬＰ（後に図７から図１０に示す）の特徴量が可変である。縞パターンＬＰの特徴量は、例えば、縞の方向（周期方向、ライン方向）、位相、及び空間周波数（周期）を含む。照射部３は、上記縞パターンＬＰの特徴量の少なくとも１つを可変である。
【００７７】
本実施形態に係る分岐部１５は、偏光分離素子５１および空間光変調器５２を備える。偏光分離素子５１は、例えば偏光ビームスプリッタプリズムである。偏光分離素子５１は、光源ＬＳの光出射方向に対して例えば４５°傾いた偏光分離膜５３を有する。この偏光分離膜５３は、偏光分離膜５３に対するＰ偏光が透過し、偏光分離膜５３に対するＳ偏光が反射する特性を有する。ここでは、光源ＬＳは、照明光として偏光分離膜５３に対するＰ偏光を射出し、この照明光は、偏光分離膜５３を透過して、空間光変調器５２に入射する。以下の説明において、偏光分離膜５３に対するＰ偏光を単にＰ偏光と称し、偏光分離膜５３に対するＳ偏光を単にＳ偏光と称する。
【００７８】
空間光変調器５２（ＳＬＭ）は、例えば、強誘電性液晶（ＦＬＣ）を含む。空間光変調器５２は、複数の画素を有し、画素ごとに強誘電性液晶における液晶分子の方位角を制御可能である。空間光変調器５２は、液晶分子の方位角を制御することによって、その各画素に入射した光の偏光状態を制御可能である。空間光変調器５２は、偏光分離膜５３を透過したＰ偏光の偏光状態を、画素ごとに維持すること、及び画素ごとにＳ偏光に変換することができる。
【００７９】
空間光変調器５２から出射したＰ偏光は、偏光分離膜５３を透過し、試料Ｘへ向かう光路から外れる。また、空間光変調器５２から出射したＳ偏光は、偏光分離膜５３で反射し、レンズ２１へ向かう。照射部３は、このＳ偏光の干渉によって縞パターンＬＰを形成する。照射部３は、空間光変調器５２において偏光状態を変換する画素を制御することによって、縞パターンＬＰの特徴量を変化させる。
【００８０】
図７は、第２実施形態に係る縞パターン及び画像処理部による処理を示す図である。照射部３は、縞パターンＬＰとして、第１縞パターンＬＰ１と第２縞パターンＬＰ２とを試料Ｘに照射する。第１縞パターンＬＰ１は、第１方向Ｄ１において輝度が周期的に変化する。第２縞パターンＬＰ２は、第１方向Ｄ１と交差する第２方向において輝度が周期的に変化する。
【００８１】
照射部３は、第１縞パターンＬＰ１と第２縞パターンＬＰ２とを異なるタイミングで試料Ｘに照射する。照射部３は、第１期間（第１タイミング）において第１縞パターンＬＰ１を試料Ｘに照射し、第１期間と重複しない第２期間（第２タイミング）において第２縞パターンＬＰ２を試料Ｘに照射する。撮像部４は、第１縞パターンＬＰ１が照射された試料Ｘを撮像して、第１撮像画像Ｉｍ１を取得する。撮像部４は、上記第１期間において試料Ｘを撮像して第１撮像画像Ｉｍ１を取得する。また、撮像部４は、第２縞パターンＬＰ２が照射された試料Ｘを撮像して第２撮像画像Ｉｍ２を取得する。撮像部４は、上記第２期間において試料Ｘを撮像して第２撮像画像Ｉｍ２を取得する。
【００８２】
算出部４１は、第１方向Ｄ１に対応する第１縞パターンＬＰ１の空間周波数に基づいてコントラスト値として第１コントラスト値を算出する。例えば、算出部４１は、第１撮像画像Ｉｍ１をフーリエ変換して第１周波数スペクトル（例、第１変換画像Ｔｉ１）を生成する。算出部４１は、第１周波数スペクトル（例、第１変換画像Ｔｉ１）において、第１縞パターンＬＰ１に対応する領域ＴＬ１の周波数成分の強度（例、画素の輝度値）に基づいて、第１コントラスト値を算出する。領域ＴＬ１は、領域ＴＬ１ａおよび領域ＴＬ１ｂを含む。算出部４１は、領域ＴＬ１ａにおける周波数成分の強度と領域ＴＬ１ｂにおける周波数成分の強度との一方または双方を用いて、第１コントラスト値を算出する。
【００８３】
また、算出部４１は、第２方向Ｄ２に対応する第２縞パターンＬＰ２の空間周波数に基づいてコントラスト値として第２コントラスト値を算出する。例えば、算出部４１は、第２撮像画像Ｉｍ２をフーリエ変換して第２周波数スペクトル（例、第２変換画像Ｔｉ２）を生成する。算出部４１は、第２周波数スペクトル（例、第２変換画像Ｔｉ２）において、第２縞パターンＬＰ２に対応する領域ＴＬ２の周波数成分の強度（例、画素の輝度値）に基づいて、第２コントラスト値を算出する。領域ＴＬ２は、領域ＴＬ２ａおよび領域ＴＬ２ｂを含む。算出部４１は、領域ＴＬ２ａにおける周波数成分の強度と領域ＴＬ２ｂにおける周波数成分の強度との一方または双方を用いて、第２コントラスト値を算出する。
【００８４】
照射部３、撮像部４、及び算出部４１は、それぞれ、収差の補正量が異なる複数の条件で上述の処理を実行する。解析部４２は、上記の第１コントラスト値と第２コントラスト値とに基づいて、評価値を算出する。例えば、解析部４２は、第１コントラスト値と第２コントラスト値との平均値をコントラスト値に用いて、評価値を算出する。解析部４２は、収差の補正量が異なる複数の条件で評価値を算出する。図７の下部に示す通り、解析部４２は、評価値が極値になる収差の補正量を、収差の補正量の目標値として導出する。
【００８５】
なお、図７では、第１縞パターンＬＰ１が試料Ｘに照射される第１期間と、第２縞パターンＬＰ２が試料Ｘに照射される第２期間とが重複しないが、第２期間の少なくとも一部が第１期間と重複してもよい。例えば、照射部３は、第１縞パターンＬＰ１の照射と並行して、第２縞パターンＬＰ２を同時に照射してもよい。また、照射部３は、第１縞パターンＬＰ１と第２縞パターンＬＰ２とを合成した縞パターンＬＰを照射してもよい。
【００８６】
図８は、第２実施形態に係る縞パターン及び画像処理部による処理を示す図である。図８において、照射部３は、第１縞パターンＬＰ１と第２縞パターンＬＰ２とを合成して得られる縞パターンＬＰを試料Ｘに照射する。第１縞パターンＬＰ１は、第１方向Ｄ１において輝度が周期的に変化する。第２縞パターンＬＰ２は、第２方向Ｄ２において輝度が周期的に変化する。第１縞パターンＬＰ１と第２縞パターンＬＰ２とを合成した縞パターンＬＰは、第１方向Ｄ１および第２方向Ｄ２のそれぞれにおいて、輝度が周期的に変化する。
【００８７】
撮像部４は、縞パターンＬＰが照射された試料Ｘを撮像して、撮像画像Ｉｍを取得する。算出部４１は、第１方向Ｄ１に対応する第１縞パターンＬＰ１の空間周波数に基づいてコントラスト値として第１コントラスト値を算出する。例えば、算出部４１は、撮像画像Ｉｍをフーリエ変換して周波数スペクトル（例、変換画像Ｔｉ）を生成する。算出部４１は、周波数スペクトル（例、変換画像Ｔｉ）において、第１縞パターンＬＰ１に対応する領域ＴＬ１の周波数成分の強度（例、画素の輝度値）に基づいて、第１コントラスト値を算出する。領域ＴＬ１は、領域ＴＬ１ａおよび領域ＴＬ１ｂを含む。算出部４１は、領域ＴＬ１ａにおける周波数成分の強度と領域ＴＬ１ｂにおける周波数成分の強度との一方または双方を用いて、第１コントラスト値を算出する。
【００８８】
また、算出部４１は、第２方向Ｄ２に対応する第２縞パターンＬＰ２の空間周波数に基づいてコントラスト値として第２コントラスト値を算出する。算出部４１は、周波数スペクトル（例、変換画像Ｔｉ）において、第２縞パターンＬＰ２に対応する領域ＴＬ２の周波数成分の強度（例、画素の輝度値）に基づいて、第２コントラスト値を算出する。領域ＴＬ２は、領域ＴＬ２ａおよび領域ＴＬ２ｂを含む。算出部４１は、領域ＴＬ２ａにおける周波数成分の強度と領域ＴＬ２ｂにおける周波数成分の強度との一方または双方を用いて、第２コントラスト値を算出する。そして、解析部４２は、第１コントラスト値と第２コントラスト値とに基づいて、評価値を算出する。この処理は、図７で説明した処理と同様である。
【００８９】
上述のように、縞パターンＬＰが複数の周期方向（第１方向Ｄ１、第２方向Ｄ２）を有する場合、解析部４２は、軸非対称な収差が加味された補正量を解析することができる。縞パターンＬＰの周期方向の数は、図７および図８において２つ（第１方向Ｄ１、第２方向Ｄ２）であるが、３つでもよいし４以上でもよい。
【００９０】
なお、図７のように、第１縞パターンＬＰ１が試料Ｘに照射される第１期間と、第２縞パターンＬＰ２が試料Ｘに照射される第２期間とが重複しない場合に、照射部３は、撮像部４による露光期間（例、受光期間、１フレームの期間）において上記第１期間と上記第２期間とを切り替えてもおい。この場合、撮像部４は、第１縞パターンＬＰ１と第２縞パターンＬＰ２とを合成した縞パターンＬＰが試料Ｘに照射された状態と同様の撮像画像Ｉｍを取得可能である。
【００９１】
次に、図９、図１０を参照して第２実施形態に係る縞パターン及び画像処理部による処理の変形例について説明する。図９、図１０は、第２実施形態に係る縞パターン及び画像処理部による処理を示す図である。照射部３は、縞パターンＬＰとして、第３縞パターンＬＰ３と第４縞パターンＬＰ４とを試料Ｘに照射する。第３縞パターンＬＰ３と第４縞パターンＬＰ４とは、位相が互いに異なる。第３縞パターンＬＰ３の位相と第４縞パターンＬＰ４の位相とは、試料Ｘ上の各点における照明光（第３縞パターンＬＰ３、第４縞パターンＬＰ４）の輝度の時間平均値が、試料Ｘ上で空間的に均一になるように設定される。
【００９２】
位相が異なるＮ種類の縞パターンを用いる場合、Ｎ種類の縞パターンの位相は、例えば（３６０°／Ｎ×ｍ）に設定される。Ｎは２以上の任意の自然数であり、ｍは０以上Ｎ未満の自然数（０、１、２・・・（Ｎ−１））である。ｍ＝０は、基準の位相に対応する。ここでは、Ｎ＝２であり、ｍ＝１に相当する第４縞パターンＬＰ４の位相は、ｍ＝０に相当する第３縞パターンＬＰ３の位相と１８０°ずれている。なお、Ｎは、２以上の自然数から任意に選択される。例えば、縞パターンＬＰとして３種類の縞パターンを用いる場合、Ｎ＝３であり、３種類の縞パターンの位相を基準の位相（ｍ＝０）と、基準の位相から１２０°ずれた位相（ｍ＝１）と、基準の位相から２４０°ずれた位相（ｍ＝２）とに設定すればよい。
【００９３】
照射部３は、第３期間に、第３縞パターンＬＰ３を試料Ｘに照射する。そして、撮像部４は、第３期間において第３縞パターンＬＰが照射されている試料Ｘを撮像し、第３撮像画像Ｉｍ３を取得する。また、照射部３は、第３期間の少なくとも一部と重複しない第４期間に、第４縞パターンＬＰ４を試料Ｘに照射する。第４縞パターンＬＰ４は、第３縞パターンＬＰ３の明部ＬＰａと暗部ＬＰｂとを入れ替えた縞パターンに相当する。そして、撮像部４は、第４期間において、第４縞パターンＬＰ４が照射されている試料Ｘを撮像し、第４撮像画像Ｉｍ４を取得する。
【００９４】
算出部４１は、第３縞パターンＬＰ３と第４縞パターンＬＰ４との一方または双方についてコントラスト値を算出する。算出部４１は、第３縞パターンＬＰ３の空間周波数に基づいてコントラスト値として第３コントラスト値を算出する。例えば、算出部４１は、第３撮像画像Ｉｍ３をフーリエ変換して、第３周波数スペクトル（例、第３変換画像Ｔｉ３）を生成する。算出部４１は、第３周波数スペクトル（例、第３変換画像Ｔｉ３）において、第３縞パターンＬＰ３に対応する領域ＴＬ３の周波数成分の強度（例、画素の輝度値）に基づいて、第３コントラスト値を算出する。領域ＴＬ３は、領域ＴＬ３ａおよび領域ＴＬ３ｂを含む。算出部４１は、領域ＴＬ３ａにおける周波数成分の強度と領域ＴＬ３ｂにおける周波数成分の強度との一方または双方を用いて、第３コントラスト値を算出する。
【００９５】
また、算出部４１は、第４縞パターンＬＰ４の空間周波数に基づいてコントラスト値として第４コントラスト値を算出する。例えば、算出部４１は、第４撮像画像Ｉｍ４をフーリエ変換して第４周波数スペクトル（例、第４変換画像Ｔｉ４）を生成する。図９において、第４縞パターンＬＰ４の空間周波数は、第３縞パターンＬＰ３の空間周波数と同じである。算出部４１は、第４周波数スペクトル（例、第４変換画像Ｔｉ４）において、第４縞パターンＬＰ４に対応する領域ＴＬ４の周波数成分の強度（例、画素の輝度値）に基づいて、第４コントラスト値を算出する。領域ＴＬ４は、領域ＴＬ４ａおよび領域ＴＬ４ｂを含む。算出部４１は、領域ＴＬ４ａにおける周波数成分の強度と領域ＴＬ４ｂにおける周波数成分の強度との一方または双方を用いて、第４コントラスト値を算出する。解析部４２は、第３コントラスト値と第４コントラスト値とに基づいて、評価値を算出する。この処理は、図７で説明した処理と同様である。
【００９６】
このように２種類以上の位相を有する縞パターンＬＰを用いる場合、顕微鏡１は、試料Ｘ上の各位置における輝度の時間平均値の空間的なばらつきを低減することができ、試料Ｘにおける蛍光物質の退色のレベルの空間的なばらつきを低減することができる。
【００９７】
なお、撮像部４は、第３縞パターンＬＰ３が試料Ｘに照射されている状態または第４縞パターンＬＰ４が試料Ｘに照射されている状態において、試料Ｘを撮像しなくてもよい。例えば、撮像部４は、第３縞パターンＬＰ３が照射されている試料Ｘを撮像し、第４縞パターンＬＰ４が照射されている試料Ｘを撮像しなくてもよい。この場合、算出部４１は、第３撮像画像Ｉｍ３に基づいて第３縞パターンＬＰ３のコントラスト値を算出する。また、解析部４２は、算出部４１が算出した第３縞パターンＬＰ３のコントラスト値に基づいて、収差の補正量の目標値を算出する。このように、第３縞パターンＬＰ３または第４縞パターンＬＰ４に関する撮像およびその後の処理を行わない場合であっても、試料Ｘにおける輝度の時間平均値の空間分布を均一化することができる。
【００９８】
図１０において、照射部３は、縞パターンＬＰとして、第５縞パターンＬＰ５と第６縞パターンＬＰ６とを試料Ｘに照射する。第５縞パターンＬＰ５と第６縞パターンＬＰ６とは、空間周波数が互いに異なる。図１０において、第５縞パターンＬＰ５の空間周波数は、第６縞パターンＬＰ６の空間周波数よりも高い（縞の周期が短い、縞の周期が第６縞パターンと異なる周期）。
【００９９】
照射部３は、第５期間に、第５縞パターンＬＰ５を試料Ｘに照射する。そして、撮像部４は、第５期間において第５縞パターンＬＰ５が照射されている試料Ｘを撮像し、第５撮像画像Ｉｍ５を取得する。また、照射部３は、第５期間の少なくとも一部と重複しない第６期間に、第６縞パターンＬＰ６を試料Ｘに照射する。そして、撮像部４は、第６期間において、第６縞パターンＬＰ６が照射されている試料Ｘを撮像し、第６撮像画像Ｉｍ６を取得する。
【０１００】
算出部４１は、第５縞パターンＬＰ５と第６縞パターンＬＰ６とのそれぞれについてコントラスト値を算出する。算出部４１は、第５縞パターンＬＰ５の空間周波数に基づいてコントラスト値として第５コントラスト値を算出する。例えば、算出部４１は、第５撮像画像Ｉｍ５をフーリエ変換して、第５周波数スペクトル（例、第５変換画像Ｔｉ５）を生成する。算出部４１は、第５周波数スペクトル（例、第５変換画像Ｔｉ５）において、第５縞パターンＬＰ５に対応する領域ＴＬ５の周波数成分の強度（例、画素の輝度値）に基づいて、第５コントラスト値を算出する。領域ＴＬ５は、領域ＴＬ５ａおよび領域ＴＬ５ｂを含む。算出部４１は、領域ＴＬ５ａにおける周波数成分の強度と領域ＴＬ５ｂにおける周波数成分の強度との一方または双方を用いて、第５コントラスト値を算出する。
【０１０１】
また、算出部４１は、第６縞パターンＬＰ６の空間周波数に基づいてコントラスト値として第６コントラスト値を算出する。例えば、算出部４１は、第６撮像画像Ｉｍ６をフーリエ変換して第６周波数スペクトル（例、第６変換画像Ｔｉ６）を生成する。算出部４１は、第６周波数スペクトル（例、第６変換画像Ｔｉ６）において、第６縞パターンＬＰ６に対応する領域ＴＬ６の周波数成分の強度（例、画素の輝度値）に基づいて、第６コントラスト値を算出する。領域ＴＬ６は、領域ＴＬ６ａおよび領域ＴＬ６ｂを含む。算出部４１は、領域ＴＬ６ａにおける周波数成分の強度と領域ＴＬ６ｂにおける周波数成分の強度との一方または双方を用いて、第６コントラスト値を算出する。解析部４２は、第５コントラスト値と第６コントラスト値とに基づいて、評価値を算出する。この処理は、図７で説明した処理と同様である。
【０１０２】
なお、照射部３は、縞パターンＬＰとして、複数の種類の特徴量（縞の方向、位相、空間周波数）のうち２以上の種類の特徴量が異なる複数の縞パターンを試料Ｘに照射してもよい。例えば、照射部３は、縞パターンＬＰとして、縞の方向および空間周波数が互いに異なる複数の種類の縞パターンを試料Ｘに照射してもよい。
【０１０３】
また、照射部３は、第１実施形態で説明した分岐部１５（回折格子）を、照明光学系１１の光軸１１ａを回転中心として回転させることによって、縞パターンＬＰの周期方向を変更してもよい。また、照射部３は、第１実施形態で説明した分岐部１５（回折格子）を、照明光学系１１の光軸１１ａと交差する方向に移動させることによって、縞パターンＬＰの位相を変更してもよい。また、照射部３は、分岐部１５として、周期構造の周期が互いに異なる第１回折格子と第２回折格子とを含み、照明光学系１１の光路に第１回折格子が配置される状態と第２回折格子が配置される状態とが切り替えられることによって、縞パターンＬＰの空間周波数を変更してもよい。
【０１０４】
上述の実施形態において、制御装置５は、例えばコンピュータシステムを含む。制御装置５は、記憶装置７に記憶されているプログラムを読み出し、このプログラムに従って各種の処理を実行する。上記プログラムは、例えば、解析プログラム（画像解析プログラム）を含む。上記解析プログラムは、コンピュータに、対物レンズ２８を介して縞パターンＬＰが照射された試料Ｘを対物レンズを介して撮像した撮像画像Ｉｍと、縞パターンＬＰの空間周波数とに基づいて、縞パターンＬＰのコントラスト値を算出することと、コントラスト値に基づいて、試料Ｘの像の収差の補正量を解析することと、を実行させる。この解析プログラムは、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体に記録されて提供されてもよい。
【０１０５】
なお、本発明の技術範囲は、上述の実施形態などで説明した態様に限定されるものではない。上述の実施形態などで説明した要件の１つ以上は、省略されることがある。また、上述の実施形態などで説明した要件は、適宜組み合わせることができる。また、法令で許容される限りにおいて、上述の実施形態などで引用した全ての文献の開示を援用して本文の記載の一部とする。
【符号の説明】
【０１０６】
１・・・顕微鏡、３・・・照射部、４・・・撮像部、８・・・収差補正部、９・・・画像処理部（画像処理装置）、Ｘ・・・試料、４１・・・算出部、４２・・・解析部、ＬＰ・・・縞パターン、ＰＳ・・・周波数スペクトル
【図１】
2019204002.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019204002.tif 000015
【図９】
2019204002.tif 000016
【図１０】
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