(57)【要約】【課題】標的タンパク質の可溶化を増加させること。【解決手段】本発明は、プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含有する、標的タンパク質の可溶化用組成物、形質転換体、キット、及びそれを用いた標的タンパク質の生産方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む、標的タンパク質の可溶化用組成物。
【請求項２】
前記シャペロンは、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００及びＨｓｐ１０４からなる群から選択される一つ以上である、請求項１に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
【請求項３】
前記シャペロンは、ＤｎａＪ、Ｄｎａｋ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＨｔｐＧ、ＣｌｐＡ、ＣｌｐＸ、ＣｌｐＰ及びＧｒｐＥからなる群から選択される一つ以上である、請求項１に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
【請求項４】
前記ＲＮＡ結合ドメインは、ＫＨ（K Homology）ドメイン、バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質、バクテリオファージＰＰ７コートタンパク質、ＳＡＭ（sterile alpha motif）又はＲＲＭ（RNA recognition motif）である、請求項１に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
【請求項５】
前記融合タンパク質は、シャペロンがＲＮＡ結合ドメインのＮ末端又はＣ末端に結合されたものである、請求項１に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
【請求項６】
前記融合タンパク質は、シャペロン及びＲＮＡ結合ドメインがリンカーを介して結合されたものである、請求項１に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
【請求項７】
前記組成物は、プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その３’末端にヘアピン（hairpin）構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターをさらに含む、請求項１に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
【請求項８】
前記発現カセット又は発現ベクターは、リボソーム結合部位（Ribosome binding site, RBS）をさらに含むものである、請求項１又は７に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
【請求項９】
前記発現カセット又は発現ベクターは、標的タンパク質をコードする遺伝子とヘアピン構造の遺伝子間にスペーサー（spacer）遺伝子をさらに含むものである、請求項７に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
【請求項１０】
前記ヘアピン構造の遺伝子は、一つ以上のヘアピン構造の遺伝子を有するものである、請求項７に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
【請求項１１】
前記ヘアピン構造は、ヘアピン構造とヘアピン構造間にスペーサー遺伝子を含む、請求項１０に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
【請求項１２】
前記ヘアピン構造の遺伝子は、シャペロンに連結されたＲＮＡ結合ドメインが結合する、ＲＮＡ部位を転写する配列を含む、請求項７に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
【請求項１３】
プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む、形質転換体。
【請求項１４】
前記形質転換体は、植物、バクテリア、菌類、酵母又は動物細胞から選択されるものである、請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】
前記形質転換体は、プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その３’末端にヘアピン構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターをさらに含む、請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１６】
プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット。
【請求項１７】
請求項１もしくは７に記載の組成物、又は請求項１３もしくは１５に記載の形質転換体を含む、標的タンパク質生産用キット。
【請求項１８】
（ｉ）（ａ）プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクター、及び
（ｂ）プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その３’末端にヘアピン（hairpin）構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む形質転換体を準備するステップと、
（ｉｉ）前記形質転換体を培養するステップとを含む、標的タンパク質の生産方法。
【請求項１９】
前記方法は、（ｉｉｉ）形質転換体又はその培養物から標的タンパク質を回収するステップをさらに含む、請求項１８に記載の標的タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、前記発現カセットを含む発現ベクター、前記発現カセット又は発現ベクターを含有する標的タンパク質の可溶化用組成物、形質転換体、キット、及びそれを用いた標的タンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質を異種の細胞から生産する場合、組換えタンパク質が不溶性の凝集体を形成するという問題があるので、組換えタンパク質の可溶化を増加させる方法が求められている（非特許文献１）。しかし、様々な組換えタンパク質に適用できる、組換えタンパク質の可溶化方法はいまだ開発されていない。
【０００３】
こうした背景の下、本発明者らは、標的タンパク質の可溶化を増加させる方法を開発すべく鋭意努力した結果、シャペロンが集積したｍＲＮＡスキャフォールド（chaperone-recruiting mRNA scaffold, CRAS）システム及びシャペロン−基質共局在化発現（chaperone-substrate co-localized expression, CLEX）システムが様々な標的タンパク質の可溶化を増加させることを確認し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Current opinion in biotechnology, 2001, 12, 202-207
【非特許文献２】Current protocols in molecular biology, 2007, Chapter 1, Unit117
【非特許文献３】PloS one, 2013, 8, e66084
【非特許文献４】Protein expression and purification, 2015, 116, 59-65
【非特許文献５】Acs Catal, 2015, 5, 5016-5025
【非特許文献６】Journal of molecular biology, 2004, 336, 607-624
【非特許文献７】Science 1989, 244, 48-52
【非特許文献８】Nature methods, 2012, 9, 671-675
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む、標的タンパク質の可溶化用組成物を提供することを目的とする。
【０００６】
また、本発明は、プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む、形質転換体を提供することを目的とする。
【０００７】
さらに、本発明は、前記組成物又は形質転換体を含む、標的タンパク質生産用キットを提供することを目的とする。
【０００８】
さらに、本発明は、プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本発明は、プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その３’末端のヘアピン（hairpin）構造の遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、（ｉ）（ａ）プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクター、及び（ｂ）プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その３’末端にヘアピン（hairpin）構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを微生物に導入するステップと、（ｉｉ）前記微生物を培養するステップとを含む、標的タンパク質の生産方法を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、（ａ）シャペロンをコードするシストロン、及び（ｂ）標的タンパク質をコードするシストロンを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、（ａ）シャペロンをコードするシストロン、及び（ｂ）標的タンパク質をコードするシストロンを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む、標的タンパク質の可溶化用組成物を提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本発明は、（ａ）シャペロンをコードするシストロン、及び（ｂ）標的タンパク質をコードするシストロンを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む、形質転換体を提供することを目的とする。
【００１４】
さらに、本発明は、（ａ）シャペロンをコードするシストロン、及び（ｂ）標的タンパク質をコードするシストロンを含む発現カセット、前記発現カセットを含む発現ベクター、前記発現カセット又は発現ベクターを含む、標的タンパク質の可溶化用組成物、又は前記発現カセットもしくは発現ベクターを含む形質転換体を含む、標的タンパク質生産用キットを提供することを目的とする。
【００１５】
さらに、本発明は、（ｉ）（ａ）シャペロンをコードするシストロン、及び（ｂ）標的タンパク質をコードするシストロンを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む形質転換体を準備するステップと、（ｉｉ）前記形質転換体を培養するステップとを含む、標的タンパク質の生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記目的を達成するための本発明の一態様は、プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む、標的タンパク質の可溶化用組成物を提供する。
【００１７】
前記発現カセット又は発現ベクターにより発現する融合タンパク質は、ＲＮＡ結合ドメイン部分を介して標的タンパク質の配列を含むｍＲＮＡに結合し、その結果融合タンパク質のシャペロン部分が翻訳された標的タンパク質の近くに存在することになるので、標的タンパク質が正しくフォールディングされる。すなわち、前記融合タンパク質は、標的タンパク質の種類に関係なく汎用的に標的タンパク質の可溶化を増加させる。この場合、標的タンパク質の配列を含むｍＲＮＡは、融合タンパク質との結合のために、３’ＵＴＲにヘアピン構造（融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインが結合するＲＮＡ部位を含む）を有する。
【００１８】
本発明における「シャペロン（chaperone）」とは、他のタンパク質の構造的なフォールディング（folding）とアンフォールディング（unfolding）、又は組立（assembly）と分解（disassembly）に関与するタンパク質を意味する。具体的には、本発明におけるシャペロンは、標的タンパク質のフォールディングを誘導又は援助する機能を有し、標的タンパク質の可溶化を増加させる。本発明におけるシャペロンは、ＲＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質の形態で標的タンパク質の配列を含むｍＲＮＡに結合し、結局のところ、翻訳された標的タンパク質の近くで標的タンパク質のフォールディングを援助する。
【００１９】
本発明におけるシャペロンは、標的タンパク質のフォールディングに関与するものであれば微生物由来及び具体的な配列に制限はないが、具体的には原核生物（バクテリアなど）、真核生物又は古細菌（archaea）由来のタンパク質であってもよく、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどからその配列を得てもよい。前記シャペロンは、具体的にはＤｎａＪ、Ｄｎａｋ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＨｔｐＧ、ＣｌｐＡ、ＣｌｐＸ又はＣｌｐＰであってもよく、より具体的にはＤｎａＪ又はＤｎａｋであってもよい。前記ＤｎａＪ又はＤｎａｋは、配列番号７４又は７５の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有してもよいが、これらに限定されるものではない。また、前記シャペロンは、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００又はＨｓｐ１０４であってもよい。
【００２０】
本発明におけるシャペロンは、同種又は異種の２つ以上のシャペロン単位が結合された形態であってもよい。具体的には、前記シャペロンは、ＤｎａＪ及びＤｎａｋが結合された形態（ＤｎａＪＫ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００２１】
本発明における「ＲＮＡ結合ドメイン（RNA binding domain, RBD）」とは、ＲＮＡに結合するドメインを意味する。具体的には、本発明におけるＲＮＡ結合ドメインは、シャペロンと結合体又は融合タンパク質を形成することにより、前記シャペロンを含む結合体又は融合タンパク質が標的タンパク質の配列を含むｍＲＮＡに結合するようにすることができる。すなわち、前記ＲＮＡ結合ドメインは融合タンパク質のシャペロンがリボソームにより翻訳される標的タンパク質の近くに位置するようにするので、標的タンパク質は近くに存在するシャペロンにより正しくフォールディングされる。
【００２２】
本発明におけるＲＮＡ結合ドメインは、標的タンパク質を含むｍＲＮＡに結合するものであれば微生物由来及び具体的な配列に制限はないが、具体的にはＫＨ（K Homology）ドメイン、バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質（coat protein）、バクテリオファージＰＰ７コートタンパク質、ｓｔｅｒｉｌｅ ａｌｐｈａ ｍｏｔｉｆ（ＳＡＭ）又はＲＲＭ（RNA recognition motif）であってもよい。前記ＲＮＡ結合ドメインは、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得てもよい。また、前記ＫＨドメインは、配列番号７６の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有してもよいが、これに限定されるものではない。
【００２３】
本発明における融合タンパク質は、一つ以上の前記シャペロンと前記ＲＮＡ結合ドメインとを含む。また、前記融合タンパク質は、シャペロンがＲＮＡ結合ドメインのＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端とＣ末端に直接連結されてもよく、リンカーを介して連結されてもよい。さらに、前記融合タンパク質は、ＲＮＡ結合ドメインがシャペロンのＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端とＣ末端に直接連結されてもよく、リンカーを介して連結されてもよい。
【００２４】
前記リンカーは、融合タンパク質のシャペロンとＲＮＡ結合ドメインに活性を持たせるものであれば特にこれらに限定されるものではないが、具体的にはグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、リシン、アルギニン酸などのアミノ酸を用いて連結することができ、より具体的にはバリン、ロイシン、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、プロリンなどを複数用いて連結することができ、さらに具体的には遺伝子操作の容易性を考慮して、グリシン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸などのアミノ酸を１個〜１０個ずつ連結して用いることができる。例えば、本発明においては、Ｇ４Ｓ ｌｉｎｋｅｒを介してシャペロンのＣ末端とＲＮＡ結合ドメインのＮ末端を連結することにより融合タンパク質を作製した。
【００２５】
前記融合タンパク質には、それに含まれる各タンパク質又はドメインの野生型のアミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が異なる配列を有するポリペプチドが含まれてもよい。分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びポリペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知である。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。また、アミノ酸配列の変異又は修飾によりタンパク質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性が増加したタンパク質や、タンパク質活性が増加したタンパク質が含まれてもよい。
【００２６】
前記融合タンパク質又は前記融合タンパク質を構成するポリペプチドは、当該分野で公知の化学的ペプチド合成方法で作製することもでき、前記融合タンパク質をコードする遺伝子をＰＣＲ（polymerase chain reaction）による増幅や公知の方法で合成し、その後発現ベクターにクローニングして発現させることにより作製することもできる。
【００２７】
本発明の一実施例における前記融合タンパク質は、シャペロンであるＤｎａＪ及びＤｎａｋ（ＤｎａＪＫ）とＲＮＡ結合ドメインであるＫＨドメインとが結合された形態（ＤｎａＪＫ−ＫＨ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の前記タンパク質は、各配列番号で表される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列だけでなく、前記配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。このような相同性を有する配列であって、実質的に前記各タンパク質と同一又は相当する効能を示すタンパク質を示すアミノ酸配列であれば、制限なく含まれる。また、このような相同性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列も本発明に含まれることは言うまでもない。
【００２９】
さらに、本発明の前記タンパク質をコードする遺伝子は、各配列番号で表される塩基配列だけでなく、前記配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示す塩基配列であって、実質的に前記各タンパク質と同一又は相当する効能を示すタンパク質をコードする塩基配列であれば、制限なく含まれる。さらに、このような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加された塩基配列も本発明に含まれることは言うまでもない。
【００３０】
本発明における「相同性」とは、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列の類似の程度を意味するが、相同性が十分に高いと、当該遺伝子の発現産物は同一又は類似の活性を有する。
【００３１】
本発明における「プロモーター」とは、好適な宿主細胞において作動可能に連結された他の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味し、本発明における「作動可能に連結（operably linked）」とは、一般的機能が行えるように、核酸発現調節配列と目的とするタンパク質又はＲＮＡをコードする核酸配列が機能的に連結（functional linkage）されていることを意味する。例えば、プロモーターとタンパク質又はＲＮＡをコードする核酸配列とが作動可能に連結されてコード配列の発現に影響を及ぼす。このようなプロモーターとタンパク質又はＲＮＡをコードする核酸配列とを作動可能に連結させる方法には当該技術分野で周知の遺伝子組換え技術を用いることができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野において一般に知られた酵素などを用いる。
【００３２】
本発明における「発現ベクター」とは、好適な宿主において標的タンパク質を発現するように好適な調節配列に作動可能に連結された、前記発現カセットを含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【００３３】
本発明に用いられる発現ベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界で公知の任意のベクターが用いられてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどが用いられ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系、ｐＣＰ系などが用いられてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＣＰ２２、ｐＡＭＴ７、ｐＥＴ１６ｂベクターなどが用いられてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明において使用可能なベクターは、特に限定されるわけではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。また、細胞内染色体挿入用ベクターにより、染色体内に標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【００３５】
本発明の組成物は、プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その３’末端にヘアピン（hairpin）構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターをさらに含んでもよい。前記プロモーター及び発現ベクターは前述した通りである。
【００３６】
前記発現カセット又は発現ベクターにより転写されたｍＲＮＡは、標的タンパク質のＲＮＡ及びその３’ＵＴＲにヘアピン（hairpin）構造を有し、前記ヘアピンと前記融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメイン部位を結合させてもよい。前記結合により、標的タンパク質の配列を含むｍＲＮＡの３’ＵＴＲに融合タンパク質のシャペロン部分が集積したスキャフォールドが形成される。本発明においては、前記スキャフォールドをシャペロンが集積したｍＲＮＡスキャフォールド（chaperone-recruiting mRNA scaffold, CRAS）という。
【００３７】
本発明における前記「ヘアピン（hairpin）」とは、一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡの内部塩基同士の水素結合により形成された二本鎖部分（stem）と、それをつなぐループ（loop）部分とから構成される構造を意味する。前記ヘアピンはステム・ループ（Stem-loop）と混用される。前記ヘアピンの配列は、当業界で公知の任意の配列を用いることができる。
【００３８】
また、前記ヘアピン構造は、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメイン、すなわちシャペロンに連結されたＲＮＡ結合ドメインが結合するＲＮＡ配列（部位）を有してもよい。よって、前記発現カセット又は発現ベクターに含まれるヘアピン構造の遺伝子は、前記ＲＮＡ結合ドメインが結合するＲＮＡ配列を転写する配列を含んでもよい。
【００３９】
本発明における前記発現カセット又は発現ベクターは、標的タンパク質をコードする遺伝子とヘアピン構造の遺伝子間にスペーサー（spacer）遺伝子をさらに含んでもよい。前記スペーサー遺伝子とは、遺伝子間のノンコーディング（non-coding）遺伝子を意味し、当業界で公知の任意の配列を用いることができる。
【００４０】
本発明におけるヘアピン構造の遺伝子は、一つ以上のヘアピン構造の遺伝子を有してもよい。この場合、標的タンパク質の配列を含むｍＲＮＡに本発明の融合タンパク質を結合させるヘアピンが一つ以上存在するので、前記ｍＲＮＡにシャペロンをより多く集積させてもよい。
【００４１】
前記一つ以上のヘアピン構造の遺伝子は、ヘアピン構造とヘアピン構造間にスペーサー遺伝子を含んでもよいが、これに限定されるものではない。
【００４２】
本発明における発現カセット又は発現ベクターは、リボソーム結合部位をさらに含んでもよい。前記「リボソーム結合部位（Ribosome binding site, RBS）」とは、タンパク質が生合成を開始する際に、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡが宿主細胞内でリボソームに結合できるようにするリボソームの結合部位を意味する。前記リボソーム結合部位は、当業界で公知の任意の配列を用いることができる。
【００４３】
本発明の他の態様は、プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む、形質転換体を提供する。具体的には、前記形質転換体は、プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その３’末端にヘアピン構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターをさらに含んでもよい。
【００４４】
前記プロモーター、シャペロン、ＲＮＡ結合ドメイン、融合タンパク質、ヘアピン構造の遺伝子、発現カセット、発現ベクターは前述した通りである。
【００４５】
前記形質転換体は、ＣＲＡＳシステムにより可溶性が増加した標的タンパク質を生産することができる。
【００４６】
本発明における「形質転換」とは、本発明の発現カセット又は前記発現カセットを含む発現ベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記発現カセット又は発現ベクターのポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それら全てを含むものであってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。前記形質転換する方法は、核酸を細胞に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
前記形質転換体は、本発明の発現カセット又は発現ベクターのポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現するものであれば限定されるものではないが、具体的には植物、バクテリア、菌類、酵母又は動物細胞であってもよく、より具体的にはエシェリキア（Escherichia）属微生物であってもよい。
【００４８】
本発明のさらに他の態様は、前記標的タンパク質の可溶化用組成物又は前記形質転換体を含む、標的タンパク質生産用キットを提供する。
【００４９】
本発明のさらに他の態様は、プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを提供する。
【００５０】
前記プロモーター、シャペロン、ＲＮＡ結合ドメイン、融合タンパク質、発現カセット、発現ベクターは前述した通りである。
【００５１】
本発明のさらに他の態様は、プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その３’末端にヘアピン（hairpin）構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを提供する。
【００５２】
前記プロモーター、ヘアピン構造の遺伝子、発現カセット、発現ベクターは前述した通りである。
【００５３】
本発明のさらに他の態様は、前記組成物又は形質転換体を含む、標的タンパク質生産用キットを提供する。
【００５４】
本発明のさらに他の態様は、（ｉ）（ａ）プロモーターと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクター、及び（ｂ）プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その３’末端にヘアピン（hairpin）構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む形質転換体を準備するステップと、（ｉｉ）前記形質転換体を培養するステップとを含む、標的タンパク質の生産方法を提供する。
【００５５】
前記プロモーター、シャペロン、ＲＮＡ結合ドメイン、融合タンパク質、ヘアピン構造の遺伝子、発現カセット、発現ベクター、形質転換体は前述した通りである。
【００５６】
前記（ｉ）形質転換体を準備するステップは、（ｂ）プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その３’末端にヘアピン構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを既に有する宿主細胞に、（ａ）プロモーターと、融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターをさらに導入するステップであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
また、前記（ｉ）形質転換体を準備するステップは、（ａ）プロモーターと、融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを既に有する宿主細胞に、（ｂ）プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その３’末端にヘアピン構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターをさらに導入するステップであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
さらに、前記（ｉ）形質転換体を準備するステップは、（ａ）プロモーターと、融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクター、及び（ｂ）プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その３’末端にヘアピン構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを、順次、同時又は逆順に宿主細胞に導入するステップであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
前記生産方法において、前記形質転換体を培養するステップは、特に限定されるものではないが、公知のバッチ培養方法、連続培養方法、流加培養方法などにより行われる。ここで、培養条件は、特にこれらに限定されるものではないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的にはｐＨ６〜８、最も具体的にはｐＨ６．８）に調節することができ、酸素又は酸素含有ガス混合物を培養物に導入して好気性条件を維持することができる。培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃に維持し、約１０〜１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。前記培養により生産された標的タンパク質は、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留してもよい。
【００６０】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）、有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及びウレア）、無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それらに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、培地は、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長促進物質を含んでもよい。
【００６１】
前記生産方法は、形質転換体又はその培養物から標的タンパク質を回収するステップをさらに含んでもよい。前記培養ステップで生産された標的タンパク質を回収する方法は、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて形質転換体又はその培養物から標的タンパク質を回収することができる。例えば、細胞破砕、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて形質転換体又はその培養物から標的タンパク質を回収することができる。
【００６２】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）シャペロンをコードするシストロン、及び（ｂ）標的タンパク質をコードするシストロンを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを提供する。
【００６３】
前記シャペロン、発現カセット、発現ベクターは前述した通りである。
【００６４】
前記発現カセット又は発現ベクターによりシャペロンと標的タンパク質が共に翻訳されるので、シャペロンが標的タンパク質の正しいフォールディングを増加させることができる。本発明においては、前記システムをＣＬＥＸ（chaperone-substrate co-localized expression）システムという。
【００６５】
前記（ａ）及び（ｂ）は５’から３’の方向に順次又は逆順に連結されてもよく、（ａ）又は（ｂ）の終止コドンは（ｂ）又は（ａ）の開始コドンとオーバーラップされてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）シャペロンをコードするシストロン、及び（ｂ）標的タンパク質をコードするシストロンを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む、標的タンパク質の可溶化用組成物を提供する。
【００６７】
前記シャペロン、発現カセット、発現ベクターは前述した通りである。
【００６８】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）シャペロンをコードするシストロン、及び（ｂ）標的タンパク質をコードするシストロンを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む、形質転換体を提供する。
【００６９】
前記シャペロン、発現カセット、発現ベクター、形質転換体は前述した通りである。
【００７０】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）シャペロンをコードするシストロン、及び（ｂ）標的タンパク質をコードするシストロンを含む発現カセット、前記発現カセットを含む発現ベクター、前記発現カセット又は発現ベクターを含む、標的タンパク質の可溶化用組成物、又は前記発現カセットもしくは発現ベクターを含む形質転換体を含む、標的タンパク質生産用キットを提供する。
【００７１】
前記シャペロン、発現カセット、発現ベクター、形質転換体は前述した通りである。
【００７２】
本発明のさらに他の態様は、（ｉ）（ａ）シャペロンをコードするシストロン、及び（ｂ）標的タンパク質をコードするシストロンを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む形質転換体を準備するステップと、（ｉｉ）前記形質転換体を培養するステップとを含む、標的タンパク質の生産方法を提供する。
【００７３】
前記シャペロン、発現カセット、発現ベクター、形質転換体、培養、生産方法は前述した通りである。
【００７４】
前記生産方法は、形質転換体又はその培養物から標的タンパク質を回収するステップをさらに含んでもよい。
【発明の効果】
【００７５】
３’ＵＴＲヘアピン配列が導入された標的タンパク質のｍＲＮＡと、シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質とを用いた本発明のＣＲＡＳシステムは、様々な標的タンパク質の可溶化を向上させることができる。また、２つのシストロンを有する本発明のＣＬＥＸシステムは、様々な標的タンパク質の可溶化を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】シャペロンが集積したｍＲＮＡスキャフォールド（chaperone-recruiting mRNA scaffold, CRAS）システムによる組換えタンパク質の可溶化を示す図である。ａはＣＲＡＳシステムを示す図である。ｃに記載されたＫＨ同族（cognate）ステム・ループ配列が挿入された標的組換えタンパク質と共に、シャペロン分子（ＤｎａＪ、ＤｎａＫ又はＤｎａＪとＤｎａＫの結合体(ＤｎａＪ−ＤｎａＫ)）とＮｏｖａ−１のＲＮＡ結合ドメインＫＨの融合タンパク質が発現する。ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内にＫＨ結合構造を導入することにより、シャペロン結合体が初期タンパク質に結合してタンパク質が凝集することを防止するか、又は正しいフォールディングのために他のシャペロン分子にタンパク質を移動させる。ｂは８つの選択された凝集しやすい組換えタンパク質（ＳｃＦｖ，ＨＩＶ−１ ｐｒｏｔｅａｓｅ，ＢＲ２−ＳｃＦｖ，ＵＧＤ，Ａｄｈ１ｐ，ＵｂｉＣ，Ｌｅｐｔｉｎ，ＢＭＰ２）がＤｎａＪ−ＫＨ単独で、又はＤｎａＪ−ＫＨ及び３’ＵＴＲヘアピンループと共に発現する際の可溶化結果を示す図である。ｄはＤｎａＪ−ＫＨを用いたＣＲＡＳシステムにおいて、可溶化されていない４つの組換えタンパク質に対して、キメラＤｎａＪ−ＫＨを用いたＣＲＡＳシステムを適用した場合に、１つ（＋）又は３つ（＋＋＋）の３’ＵＴＲ配列により可溶化された結果を示す図である。ｅはＣＲＡＳシステムのｉｎ ｖｉｖｏタンパク質可溶化活性を観察するための分割ＧＦＰ実験を示す図である。ｆはＣＲＡＳシステムを用いたｓｆＧＦＰ Ｎ末端のｉｎ ｖｉｖｏ可溶化結果を示す図である。１はｐＥＴ１６ｂ及びｐＡＭＴ７（陰性対照群）、２はｐＥＴ１６ｂ−ｓｆＧＦＰ及びｐＡＭＴ７−ＤｎａＪＫ−ＫＨ（陽性対照群）、３はＫＨ結合ヘアピン及びＤｎａＪ−ＫＨ不在条件のｓｆＧＦＰ Ｎ末端とＣ末端のプラスミド、４は結合ヘアピン存在及びＤｎａＪ−ＫＨ不在条件のｓｆＧＦＰ Ｎ末端とＣ末端のプラスミド、５はＫＨ結合ヘアピン不在及びＤｎａＪ−ＫＨ存在条件のｓｆＧＦＰ Ｎ末端とＣ末端のプラスミド、６はＫＨ結合ヘアピン及びＤｎａＪ−ＫＨ存在条件（ＣＲＡＳシステム）のｓｆＧＦＰ Ｎ末端とＣ末端のプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の蛍光強度測定である。可溶性ＳｃＦｖの定量は、ＩｍａｇｅＪ ｖ１．４８ ｓｏｆｔｗａｒｅ（NHI, USA）を用いて、クマシーブルー染色により得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥイメージにおいて行われた。ｂ、ｄ及びｆのエラーバーは、３回の独立した実験で得られた±標準偏差を示す。
【図２】大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において１つのループ（ａ）又は３つのループ（ｂ）を有するＣＲＡＳシステムを適用した場合のＳｃＦｖの各時間の可溶化を示す図である。レーンＭはマーカー（ELPIS, Daejeon, South Korea）であり、レーンＷは細胞溶解物全体であり、レーンＳは可溶性画分であり、レーンＩは不溶性画分である。
【図３】ＣＲＡＳシステムにおける、終止コドンと３’ＵＴＲ結合ループ間のスペーサーの長さに応じた可溶化の結果を示す図である。発現誘導４時間後のＳｃＦｖ単独発現の場合（ａ）と比較して、ＣＲＡＳシステムを適用した場合（ｂ）にＳｃＦｖの可溶化が増加した。レーン１は終止コドンと３’ＵＴＲ結合ループ間にスペーサーがない場合であり、レーン２は終止コドンと３’ＵＴＲ結合ループ間に５ｎｔスペーサーがある場合であり、レーン３は終止コドンと３’ＵＴＲ結合ループ間に３０ｎｔスペーサーがある場合であり、レーンＭはマーカーであり、レーンＷは細胞溶解物全体であり、レーンＳは可溶性画分であり、レーンＩは不溶性画分である。
【図４】ｄｎａＫノックアウト菌株における、ＣＲＡＳシステムによるＳｃＦｖの可溶化の増加を示す図である。レーンＣ−はｐＥＴ１６ｂ及びｐＡＭＴ７を有する大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)の細胞溶解物全体(陰性対照群)であり、レーン１はＫＨ結合ヘアピン及びＤｎａＪ−ＫＨ不在条件であり、レーン２はＫＨ結合ヘアピン存在及びＤｎａＪ−ＫＨ不在条件であり、レーン３はＫＨ結合ヘアピン不在及びＤｎａＪ−ＫＨ存在条件であり、レーン４はＫＨ結合ヘアピン及びＤｎａＪ−ＫＨ存在条件(RNA Scaffold)であり、レーンＭはマーカーであり、レーンＷは細胞溶解物全体であり、レーンＳは可溶性画分であり、レーンＩは不溶性画分である。
【図５】ＣＬＥＸシステムによる組換えタンパク質の可溶化を示す図である。ａはＣＬＥＸシステムを示す図である。単一ｍＲＮＡ転写物に近接するＤｎａＪと標的タンパク質の翻訳のために翻訳共役された２つのシストロン発現システムが用いられる。ｂは第２シストロンの開始コドン（ＡＴＧ）の前に第１シストロンの終止コドン（ＴＡＡ）をオーバーラップさせるか、一列に並べるか（tandem）、又はｎｎｔの距離を有するように設計した配列を示す図である。第１シストロンの３’配列内の１２個のヌクレオチドは、第２シストロンのためにリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の役割を果たす。ｃはＣＬＥＸシステムにおいてシャペロンＤｎａＪが第１シストロン又は第２シストロンとして用いられた場合の凝集しやすい５つの組換えタンパク質の可溶化を示す図である。ｄは正しくフォールディングされたレプチンのレベルを確認するために、ｐＥＴ１６ｂ（陰性対照群）、ｐＥＴ１６ｂ−Ｌｅｐｔｉｎ（レプチンの過剰発現）及びｐＥＴ１６ｂ−ＤｎａＪ／Ｌｅｐｔｉｎ（ＣＬＥＸシステムにおけるＤｎａＪ及びレプチンの過剰発現，ＣＬＥＸシステム）のプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）から得られたサンプルのＯＤ４５０を測定した結果である。ｅは翻訳共役された２つのシストロン発現構造における、ＤｎａＪ−標的タンパク質の順序に応じたＢＭＰ２の可溶化結果を示す図である。ｆは翻訳共役された２つのシストロン発現構造における、シストロン間の距離に応じたＢＭＰ２の可溶化結果を示す図である。タンパク質間の斜線（／）表示は、ｍＲＮＡ内の各タンパク質をコードする遺伝子の順序を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に基づいて、ＩｍａｇｅＪ ｖ１．４８ ｓｏｆｔｗａｒｅ（NJI, USA）を用いて相対的発現レベルを定量した。ｃ、ｄ、ｅ及びｆのエラーバーは、３回の独立した実験で得られた±標準偏差を意味する。
【図６】ｄｎａＪノックアウト菌株（ａ）又はｄｎａＫノックアウト菌株（ｂ）における、ＣＬＥＸシステムによるＢＭＰ２の可溶化の増加を示す図である。レーンＣ−はｐＥＴ１６ｂ及びｐＡＭＴ７を有する大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)の細胞溶解物全体(陰性対照群)であり、レーンｏｎｌｙ ＢＭＰ２はＤｎａＪ不在条件でのＢＭＰ２発現であり、レーンＢＭＰ２＋ＤｎａＪはＤｎａＪ存在条件でのＢＭＰ２発現であり、レーンＤｎａＪ／ＢＭＰ２はＣＬＥＸシステムにおいて第１シストロンにＤｎａＪが位置し、第２シストロンにＢＭＰ２が位置する場合であり、レーンＭはマーカーであり、レーンＷは細胞溶解物全体であり、レーンＳは可溶性画分であり、レーンＩは不溶性画分である。
【図７】ＣＬＥＸシステムにおける、組換えタンパク質のサイズに応じた可溶化結果を示す図である。ａは脂肪分解酵素ＴｌｉＡ内のＤｎａＪ／ＤｎａＫ結合配列の分布を赤色の長方形で表した図である。結合部位はＬｉｍｂｏシャペロン結合部位推定器を用いて予測した。ｂはＣＬＥＸシステムを用いたＴｌｉＡ１フラグメントの可溶化を示す図である。ＴｌｉＡ１＋ＤｎａＪはＴｌｉＡとＤｎａＪの単なる同時発現を示し、ＤｎａＪ／ＴｌｉＡ１はＤｎａＪが第１シストロンとして用いられた場合のＣＬＥＸシステムを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に基づいて、ＩｍａｇｅＪ ｖ１．４８ ｓｏｆｔｗａｒｅ（NJI, USA）を用いて相対的発現レベルを定量した。ｂのエラーバーは、３回の独立した実験で得られた±標準偏差を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
以下、実施例を挙げて本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。これらの実施例はあくまで本発明を例示するためのものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７８】
実験例１．微生物、酵素及び化学薬品
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）及びＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen, Madison, WI, USA）菌株を用いた。ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ菌株を全てのクローニングに用い、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を遺伝子発現のために用いた。公知のＰ１形質導入（非特許文献２）によりｄｎａＪとｄｎａＫ遺伝子を有しない菌株を作製した。単一ノックアウト（ΔｄｎａＪ及びΔｄｎａＫ）を有するＢＷ２５１１３菌株をＫｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得て、ＢＬ２１（ＤＥ３）のための供与菌株として用いた。標的遺伝子の周辺にあるプライマー対を用いて欠失菌株をスクリーニングするために、Ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲを用いた（表１）。その後、ｐＣＰ２２プラスミド由来ＦＬＰ組換え酵素により宿主ゲノム内の統合領域からカナマイシン抵抗性カセットを除去した。本発明に用いられたオリゴヌクレオチド（Genotech，大田，韓国）と遺伝子（Bioneer，大田，韓国）を表１に示す。化学薬品はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（St. Louis, MO, USA）から購入した。
【００７９】
【表１】
2019076084.tif 000003
2019076084.tif 000004
2019076084.tif 000005
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【００８０】
実験例２．ＣＲＡＳシステムのためのシャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質又は標的組換えタンパク質をコードする発現ベクターの作製
シャペロンが集積したｍＲＮＡスキャフォールド（chaperone-recruiting mRNA scaffold, CRAS）システムのためにシャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質又は標的組換えタンパク質をコードする発現ベクターを作製した。
【００８１】
まず、２つの強力なＴ７プロモーターを有するｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクター（Novagen, Madison, WI, USA）に基づいて中コピー数ベクター（medium-copy number vector）を作製するために、低コピー数の複製起点（origin of replication）であるｐ１５Ａを中コピー数の複製起点であるｐＢＲ３２２に置換することによりｐＡＭＴ７ベクターを作製した。
【００８２】
シャペロン遺伝子ｄｎａＪ（配列番号７４）及びｄｎａＫ（配列番号７５）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムＤＮＡに基づいてＰＣＲにより増幅した。ｄｎａＪとｄｎａＪ−ＫＨの高発現のために、リボソーム結合部位（ribosome binding site, RBS）計算機を用いて合成リボソーム結合部位を設計し、ＤｎａＪＮｃｏＦプライマーの５’末端に付加した。
【００８３】
シャペロンとＲＮＡ結合ドメインの融合タンパク質の作製のために、大腸菌内の発現に最適化された配列を有するＮｏｖａ−１ ＫＨ３ ＲＮＡ結合ドメイン（ＫＨ）の遺伝子（配列番号７６）を合成し、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＰＣＲによりｄｎａＪ又はｄｎａＪＫの下流に結合させた。
【００８４】
標的組換えタンパク質をコードする遺伝子を様々な起源に基づいてＰＣＲにより増幅した。ｓｃｆｖ及びｂｒ２−ｓｃｆｖはｐＢＲ２ＳｃＦｖに基づいて増幅し（非特許文献３）、ｕｇｄ及びｕｂｉＣは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムＤＮＡに基づいて増幅し、ａｄｈ１ｐはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅのゲノムＤＮＡに基づいて増幅した。ＨＩＶ１−Ｐｒ遺伝子をｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＰＣＲにより作製した（非特許文献４）。ｔｌｉＡはｐＴｌｉＡに基づいて増幅した（非特許文献５）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）相補性分析法のために、スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質（ｓｆＧＦＰ）（bioneer，大田，韓国）を鋳型とし、ｓｆＧＦＰのＮ末端とＣ末端を増幅した。ｓｆＧＦＰの高発現のために、ＲＢＳ計算機を用いて合成ＲＢＳ及びｓｆＧＦＰのＮ末端を設計し、ｓｆＧＦＰＸｂａＦプライマーの５’末端に付加した。用いられたプライマーを前記表１に示す。
【００８５】
精製のために、６×Ｈｉｓ−ｔａｇをＨＩＶ１−Ｐｒの場合は正方向プライマーのＮ末端に、標的組換えタンパク質の場合は逆方向プライマーのＣ末端に付加した。ＨＩＶ１−Ｐｒの高発現のために、ＲＢＳ計算機を用いて合成ＲＢＳを設計し、ＨＩＶＰｒＸｂａＦプライマーの５’末端に付加した。表１に示す制限酵素を用いてＰＣＲ産物とそれに対応する発現ベクターを切断し、その後シャペロンの場合はｐＡＭＴ７に、組換えタンパク質の場合はｐＥＴ１６ｂに連結した。
【００８６】
実験例３．ＣＲＡＳシステムのためのＲＮＡスキャフォールド（scaffold）の作製
シャペロンが集積したｍＲＮＡスキャフォールド（chaperone-recruiting mRNA scaffold, CRAS）システムのためにＲＮＡスキャフォールドを作製した。具体的には、ＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ及びｍＦｏｌｄを用いて、ＲＮＡスキャフォールドシステムに用いられるＫＨドメインのための結合ループの配列を設計した（非特許文献６，非特許文献７）。配列制約（constraint）は次の通りである。
５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＣＴＡＧＡＴＣＡＣＣ（配列番号７７）ＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’
【００８７】
ここで、Ｎは８ｂｐのステム構造のための任意のヌクレオチドを示し、下線を付した配列はＫＨ ＲＮＡ結合ドメインのための結合配列を含むループ構造を示す。
【００８８】
複数の結合ループを有するＲＮＡスキャフォールドシステムの場合は、各ステム・ループ構造間に５ｎｔスペーサーを追加する同様のアプローチ（similar approach）を用いてステム・ループ構造を設計した。３’ＵＴＲ内にステム・ループ構造の配列を有する逆方向プライマーを用いたＰＣＲにより標的タンパク質遺伝子に対するステム・ループ構造を作製した。
【００８９】
実験例４．ＣＬＥＸシステムの作製
ＤｎａＪが第１シストロン又は第２シストロンに配置される２つの異なる配列により、ＤｎａＪシャペロンと組換えタンパク質（ＳｃＦｖ、ＵｂｉＣ、Ｌｅｐｔｉｎ、ＨＩＶ１−Ｐｒ、ＢＭＰ２及びＴｌｉＡ）のＣＬＥＸシステムを作製した。第２シストロン内の遺伝子の翻訳開始を向上させるために、ＥＥＶＥのアミノ酸配列（ＥＥＶＥ，配列番号７８）をコードし、シャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno, SD）配列（下線部分）を含む１２ｎｔからなる領域（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡ−３’，配列番号７９）を第１シストロン内の遺伝子のＣ末端に導入した。さらに、翻訳共役（translational coupling）を保障し、ＤｎａＪと組換えタンパク質間の相互作用を促進するために、１ｎｔ（５’−ＴＡＡＴＧ−３’）により第１シストロンの終止コドンを第２シストロンの開始コドンにオーバーラップさせた。ＣＬＥＸシステムを作製するために、ＤｎａＪシャペロンと組換えタンパク質をｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＰＣＲにより組み立てた。プライマー配列を表２に示す。ＰＣＲ産物とｐＥＴ１６ｂを表２に示す制限酵素により切断し、発現ベクターに連結した。
【００９０】
【表２】
2019076084.tif 000008
2019076084.tif 000009
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【００９１】
実験例５．タンパク質可溶化（Solubilization）の測定方法
大腸菌ＢＬ２（ＤＥ３）をシャペロンのプラスミドと標的組換えタンパク質のプラスミドに同時に形質転換した。その後、最終濃度がそれぞれ５０μｇ／ｍｌと２５μｇ／ｍｌのアンピシリンとクロラムフェニコールを補充した３ｍｌのＬＢ（Lysogenic Broth）培地（１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌイースト抽出物及び１０ｇ／ｌ塩化ナトリウム）に前記大腸菌を接種し、回転振とう器（２００ｒｐｍ）にて３７℃で一晩培養した。その後、最終濃度がそれぞれ５０μｇ／ｍｌと２５μｇ／ｍｌのアンピシリンとクロラムフェニコールを補充した１００ｍｌ ＬＢ培地に１ｍｌの培養物を接種し、２００ｒｐｍ、３７℃で培養した。ＯＤ６００が０．５〜０．６に達したら、０．５ｍＭイソプロピルβ−ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside, IPTG）を添加してシャペロンと標的タンパク質の発現を誘導し、その後さらに４時間培養（３７℃，２００ｒｐｍ）した。その後、ＯＤ６００値が２になったら、細胞培養液３ｍｌ（約，１．６×１０９ｃｅｌｌｓを含む）を遠心分離し、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファ（ｐＨ７．６）５００μｌに再懸濁し、超音波処理により溶解した。可溶性及び不溶性画分を遠心分離（２１，６００×ｇ，１５分，４℃）により分離した。不溶性ペレットを１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で２回洗浄し、１０ｍＭ ＴＥバッファ（ｐＨ７．６）に再懸濁し、その後不溶性画分として用いた。標的組換えタンパク質の可溶性をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）を用いて測定した。クマシーブルー（Coomassie Blue）で染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル内の細胞溶解物全体及び標的組換えタンパク質の可溶性画分のバンド強度をＩｍａｇｅＪソフトウェアにより比較し、可溶性標的組換えタンパク質の相対的百分率を計算した。
【００９２】
実験例６．タンパク質の精製方法
最終濃度２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地にて、ｐＡＭＴ７−ＤｎａＪ−ＫＨを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を培養した。前記大腸菌を回転振とう器（２００ｒｐｍ）にて３７℃で一晩培養した。その後、最終濃度２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した１００ｍｌ ＬＢ培地に１ｍｌ培養物を接種し、２００ｒｐｍ、３７℃で培養した。ＯＤ６００が０．６に達したら、ＤｎａＪ−ＫＨタンパク質の発現を誘導するために０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養した（３７℃，２００ｒｐｍ）。その後、２０ｍｌの細胞を遠心分離により収穫し、１×Ｎａｔｉｖｅ ＩＭＡＣ溶解バッファ（Biorad, Hercules, CA, USA）に再懸濁し、超音波処理により溶解した。透明になった細胞溶解物を再び遠心分離した（２１，６００×ｇ，１５分，４℃）。自動化されたＰｒｏｆｉｎｉａＴＭタンパク質精製システム（Biorad, Hercules, CA, USA）のＮａｔｉｖｅ ＩＭＡＣ法を用いて、可溶性画分からＤｎａＪ−ＫＨを精製した。その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４と５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０％のグリセロールを含有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．８）を用いて、精製したＤｎａＪ−ＫＨを透析した。
【００９３】
実験例７．ＧＦＰ相補性分析法
公知のＧＦＰ相補性分析法（非特許文献８）を一部変形して、ＣＲＡＳシステムにおける組換えタンパク質の正確なフォールディングを評価した。最終濃度がそれぞれ５０μｇ／ｍｌと２５μｇ／ｍｌのアンピシリンとクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地に、ｐＡＭＴ７−ＤｎａＪＫ−ＫＨ及びｐＥＴ１６ｂ−ｓｆＧＦＰ／ｐＥＴ１６ｂ−ＣｓｆＧＦＰ−ＮｓｆＧＦＰ／ｐＥＴ１６ｂ−ＣｓｆＧＦＰ−ＮｓｆＧＦＰ３Ｌを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を接種し、回転振とう器（２００ｒｐｍ）にて３７℃で一晩培養した。その後、最終濃度がそれぞれ５０μｇ／ｍｌと２５μｇ／ｍｌのアンピシリンとクロラムフェニコールを補充した１００ｍｌ ＬＢ培地に１ｍｌの培養物を接種し、２００ｒｐｍ、３７℃で培養した。ＯＤ６００が０．６に達したら、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加してＤｎａＪＫ−ＫＨと標的タンパク質の発現を誘導し、その後さらに４時間培養（３７℃，２００ｒｐｍ）した。その後、１ｍｌの細胞を遠心分離により収穫し、５００μｌ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、ＯＤ６００が１に達するまで希釈した。その後、９６ウェルのｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ（SPL Life Sciences，抱川，韓国）にローディングした。Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ ＰＲＯ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland）を用いて、各ウェルの蛍光強度を測定した（λｅｘｃ＝４８８ｎｍ／λｅｍ＝５３０ｎｍ）。
【００９４】
実験例８．電気泳動移動度シフト解析（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）
ＨｉＳｃｒｉｂｅＴＭ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（New England Biolab, Beverly, MA）を用いて、ループがないか、１つ又は３つのループを有するａｎｔｉ ｐ２１ｒａｓ−ＳｃＦｖｄｍｌのｍＲＮＡを作製した。０．１ｎＭ ｍＲＮＡを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）と２００μＭの精製されたＤｎａＪ−ＫＨを混合した。その後、混合物を２５℃で３０分間培養し、２％アガロースゲルを含有するＴｒｉｓ−ｂｏｒｉｃ ａｃｉｄ−ＥＤＴＡバッファを用いて、電気泳動により分析を行った。電気泳動は５０Ｖで２０分間行った。その後、Ｇｅｌ−Ｄｏｃ ｇｅｌ ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて、ゲルを視覚化した。
【００９５】
実験例９．レプチン活性測定法
最終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＬＢ培地において、ｐＥＴ１６ｂ−ＤｎａＪＬｅｐ又はｐＥＴ１６ｂ−Ｌｅｐを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を回転振とう器（２００ｒｐｍ）にて３７℃で一晩培養した。その後、最終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した１００ｍｌ ＬＢ培地に１ｍｌ培養物を接種し、２００ｒｐｍ、３７℃で培養した。ＯＤ６００が０．６に達したら、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、その後さらに４時間培養することにより（３７℃，２００ｒｐｍ）、ＤｎａＪとレプチンの発現を誘導した。その後、２０ｍｌの細胞を遠心分離により収穫し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、超音波処理により溶解した。透明になった細胞溶解物を再び遠心分離した（２１，６００×ｇ，１５分，４℃）。精製されたレプチンの活性をＥＬＩＳＡにより分析した。透明になった細胞溶解物（８ｍｇ／ｍｌ）の４０μｇの可溶性画分を９６ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）に炭酸塩−重炭酸塩バッファと共に３７℃で１時間ローディングした。その後、プレートを１×ＰＢＳ−Ｔ（０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳ）で３回洗浄し、各ウェルをボビンセラムアルブミン（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で１時間ブロックした。その後、抗レプチン抗体（Abcam, Cambridge, UK）を各ウェルに添加し、常温で１時間培養した。プレートを洗浄し、その後ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA）と共に常温で１時間培養した。その後、プレートを１×ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ペルオキシダーゼ反応を開始するために、１００μｌのＴＭＢ（3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine）ペルオキシダーゼ基質（BD, Franklin Lakes, NJ, USA）を添加した。反応を停止させるために、５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加した。ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ（Infinite M200 PRO; Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland）を用いて、各ウェルの４５０ｎｍ吸光度を測定した。
【実施例１】
【００９６】
様々な不溶性タンパク質にＣＲＡＳシステムを適用した結果
バクテリアの分子シャペロンシステムの必須要素であるＤｎａＪは、翻訳された、又は誤ってフォールディングされたタンパク質と相互作用し、正しくフォールディングされたタンパク質を生産するために、ＤｎａＫやＧｒｏＥＳＬなどのフォルダーゼ（foldase）シャペロンとタンパク質の相互作用を促進する。翻訳直後の速いフォールディングのために、ＤｎａＪを標的タンパク質の翻訳終結部位に配置することにより、ＤｎａＪと標的タンパク質間の空間近接性を増加させた。固定（anchoring）のために、ヒトＮｏｖａ−１タンパク質に由来する配列特異的ＲＮＡ結合ドメイン（ＫＨ）とＤｎａＪを結合させた（図１のａ）。ＤｎａＪ−ＫＨ（ＤｎａＪとＫＨの結合体）と３’ＵＴＲヘアピンループの相互作用をゲル遅延度アッセイ（gel retardation assay）により確認した。抗Ｒａｓ ＳｃＦｖ（single chain variable fragment）、ＳｃＦｖと抗菌ペプチドＢＲ２の結合体（BR2-ScFv）、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ（UDP-glucose 6-dehydrogenase, UGD）、ＵｂｉＣ（pyruvate chorismate lyase）、ＢＭＰ２（bone morphogenetic protein 2）、レプチン、Ａｄｈ１ｐ（alcohol dehydrogenase 1p）、大腸菌のＨＩＶ−１プロテアーゼ（ＨＩＶ１−Ｐｒ）などの不溶性組換えタンパク質の溶解度を増加させるために、前記タンパク質をＣＲＡＳ（chaperone recruiting mRNA scaffold）システムに適用した。
【００９７】
その結果、タンパク質とＤｎａＪ−ＫＨが空間制約なしに（結合ループなしに）共に発現する場合や、タンパク質が単独で発現する場合より、ＣＲＡＳシステムを適用した場合にＳｃＦｖ、ＢＲ２−ＳｃＦｖ及びＵＧＤの溶解度が非常に大きく増加した（図１のｂ）。
【実施例２】
【００９８】
ＣＲＡＳシステムにおける３’ＵＴＲヘアピンループの数及び終止コドンと第１ループ間の距離による可溶化結果
しかし、ＣＲＡＳシステムは、Ａｄｈ１ｐ、ＨＩＶ１−Ｐｒ、ＵｂｉＣ、Ｌｅｐｔｉｎ及びＢＭＰ２の溶解度を増加させることができなかった（図１のｂ）。これを解決するために、３’ＵＴＲヘアピンループの数を増加した。まず、複数の３’ＵＴＲヘアピンループを所望の構造にするために、コンピュータシミュレーションにより設計及び検証した（図１のｃ）。
【００９９】
しかし、３つの３’ＵＴＲヘアピンループまではタンパク質の溶解度の増加に有意な影響がなかった。ただし、この場合、ＳｃＦｖの可溶性画分の比率は１８時間の発現時間を通じて一定であったのに対して、１つの３’ＵＴＲヘアピンループを有するタンパク質の溶解度は徐々に減少した（図２）。これは、タンパク質の収率を高めるために非常に重要である。
【０１００】
また、終止コドンと第１ループ構造間の３０ｎｔ以下の空間は、ＳｃＦｖの溶解度の増加に何ら影響を与えなかった（図３）。この結果は、終止コドンとＤｎａＪ間の距離に対してシステムが柔軟性を有することを意味するものである。
【実施例３】
【０１０１】
ΔｄｎａＪ菌株とΔｄｎａＫ菌株におけるＣＲＡＳシステム適用結果の確認
ＤｎａＫシャペロンシステムは大腸菌に自然に存在し、本発明のシステムはＤｎａＪシャペロンを翻訳部位に固定するものであるので、大腸菌のゲノムからｄｎａＪ又はｄｎａＫを欠損させ、その後ＣＲＡＳシステムを用いてＳｃＦｖの溶解度が増加するか否かを測定した。ｍＲＮＡを標的とするＤｎａＪのみがＳｃＦｖと効率的に相互作用することができ、ΔｄｎａＫ菌株においてはフォルダーゼシャペロンの欠乏によりＣＲＡＳシステムの機能が減少するため、ΔｄｎａＪ菌株における溶解度増加効率は同一であろうと予想した。しかし、ΔｄｎａＪ菌株は予想と一致したものの、ΔｄｎａＫ菌株はＳｃＦｖの溶解度が若干増加した（図４）。これは、ＤｎａＪが単独で組換えタンパク質の溶解度を増加させるシャペロンとして機能することができるように、ＣＲＡＳシステムがＤｎａＪのフォルダーゼ活性を増加させることを示唆するものである。
【実施例４】
【０１０２】
ＤｎａＪ、ＤｎａＫ及びＫＨの結合体（ＤｎａＪ−ＤｎａＫ−ＫＨ）におけるＣＲＡＳシステム適用の結果
シャペロンタンパク質の空間範囲を制限する方法と各シャペロンの回転数（turnover number）を増加する方法により、ＣＲＡＳシステムの効率を向上させようとした。このために、ＤｎａＪ、ＤｎａＫ及びＫＨの結合体であるキメラシャペロンＤｎａＪ−ＤｎａＫ−ＫＨ（ＤｎａＪＫ−ＫＨ）を作製し、ＣＲＡＳシステムに適用した。
【０１０３】
その結果、不溶性タンパク質の溶解度が非常に大きく増加し、発現したタンパク質の９０％は可溶性の形態であることが確認された（図１のｄ）。また、ＤｎａＪＫ−ＫＨ及びＫＨヘアピンループの数を増加させるほど、ＤｎａＪ−ＫＨの場合より標的タンパク質の溶解度がタンパク質発現後に速く増加することが確認された（図１のｄ）。これは、翻訳過程と共に近接するシャペロンの数がフォールディング反応の制限要因であることを示唆するものである。
【実施例５】
【０１０４】
ＣＲＡＳシステムにおけるＧＦＰ相補性分析の結果
Ｉｎ ｖｉｖｏで標的タンパク質の機能的フォールディングを観察するために、スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質（ｓｆＧＦＰ）をＮ末端（Ｎ−ｓｆＧＦＰ）とＣ末端（Ｃ−ｓｆＧＦＰ）に分けて、ＧＦＰ相補性分析法を設計した（図１のｅ）。Ｎ−ｓｆＧＦＰは溶解度が低いので、ＣＲＡＳシステムの機能を証明する標的タンパク質として選択した。蛍光のレベルは可溶化された機能性Ｎ−ｓｆＧＦＰのレベルを示す。ＤｎａＪＫ−ＫＨ及びそれと相互作用するＮ−ｓｆＧＦＰを発現させると共にＣ−ｓｆＧＦＰを発現させると、２つのフラグメントを共に発現する細胞の蛍光強度を２倍に増加させるのに対して、ＤｎａＪ−ＫＨと相互作用するＮ−ｓｆＧＦＰの３’ＵＴＲに３つのループを導入すると、蛍光強度が約８倍に増加した。これは、ｓｆＧＦＰの全長タンパク質により放出される蛍光強度の９０％に相当する数値である。これは、ＣＲＡＳシステムが溶解度だけでなく、機能的活性タンパク質の発現も増加させることができるのを意味するものである（図１のｆ）。
【実施例６】
【０１０５】
実施例６−１．ＣＬＥＸシステム適用の結果
翻訳機序に近接するシャペロンの数を制限せず、シャペロンと基質に対する空間制約の重要性を証明するために、不溶性が非常に強いタンパク質を可溶化することができる、翻訳共役された２つのシストロン発現システム（translationally coupled two-cistron expression system）であるＣＬＥＸ（chaperone-substrate co-localized expression）システムを作製した（図５のａ）。第１シストロンと第２シストロンの終止コドンと開始コドンのオーバーラップ（５’−ＴＡＡＴＧ−３’）により、リボソーム複合体が転写物から外れることなく、第２シストロンを翻訳できるようにした。また、ＣＬＥＸシステムにおいて、ＤｎａＪは第１シストロン又は第２シストロンの標的タンパク質をコードする遺伝子に連結されており、第１シストロンは第２シストロンのためにリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む、５’−ＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡ−３’配列（配列番号７９）を有するように設計した（下線を付した配列：ＲＢＳ又はShine-Dalgarno sequence）。２つのシストロン間の統合配列に関して、オーバーラップされた２つのシストロン、タンデム形態の２つのシストロン、及びｎｂｐの距離を有する２つのシストロンを設計した（図５のｂ）。
【０１０６】
その結果、オーバーラップされた終止−開始コドンを有するＣＬＥＸシステムは、ＣＲＡＳシステムにより可溶化されていないＢＭＰ２を含み、不溶性が非常に強いタンパク質の可溶化に非常に効果的であった。平均して６０％から９０％以上の組換えタンパク質が可溶性の形態で得られた（図５のｃ）。特に、レプチンにおいては、実験例９の方法により構造特異的抗体を用いて正しくフォールディングされた状態であることが確認された（図５のｄ）。
【０１０７】
また、ＤｎａＪの役割は発現レベル及び反応時間の差をもたらす２つのシストロンの順序によって異なることが確認された（図５のｃ）。シャペロンが第１シストロンから発現した場合に、より多くの可溶性画分が確認された。これは、第２シストロンの翻訳に先駆けて、利用可能なシャペロンを準備できるからである。また、ＤｎａＪ−ＢＭＰ２配列においては、その逆順より長い長期間のタンパク質発現（誘導後１８時間まで）を示した（図５のｅ）。これは、シャペロンとタンパク質間の好ましい時期の相互作用のほうが、シャペロン反応に関する構成成分の量より重要であることを示唆するものである。
【０１０８】
また、１０ｎｔまで遺伝子間配列を増加させることにより、タンパク質の溶解度を増加させることが確認された（図５のｆ）。２つの遺伝子間に付加されたヌクレオチドは、２つのタンパク質間の理論空燃比（stoichiometric ratio）だけでなく、ＤｎａＪと標的組換えタンパク質の近接性を変化させ、転写物の二次構造及び第２シストロンの翻訳開始のための親和度を変化させることができる。
【０１０９】
実施例６−２．ΔｄｎａＫ菌株におけるＣＬＥＸシステム適用の結果
ＣＬＥＸシステムの組換えタンパク質の可溶化において、ＤｎａＫの役割を確認するためにΔｄｎａＫ菌株を用いた（図６）。
【０１１０】
その結果、ＣＬＥＸシステムにおいて、ＤｎａＪはＤｎａＫがなくてもＢＭＰ２タンパク質を十分に可溶化できることが確認された。これは、ＤｎａＪがＤｎａＫに非依存的なフォルダーゼ活性を有するか、又は大腸菌内のタンパク質フォールディングにおいて他のシャペロンシステムが関与することを示唆するものである。よって、単独シャペロンＤｎａＪを用いるＣＬＥＸシステムは効率が非常に高いことが分かった。
【実施例７】
【０１１１】
ＴｌｉＡ １におけるＣＬＥＸシステム適用の結果
様々な組換えタンパク質の可溶化に成功したものの、ＴｌｉＡ（５２ｋＤａ脂肪分解酵素）などの高分子タンパク質の溶解度増加においては僅かな増加しか得られなかった。これは、高分子タンパク質は誤ってフォールディングされやすい複数のドメインを有する傾向があり、本発明のシステムが非可逆的な誤ったフォールディングの前にシャペロンと複数の基質との相互作用を促進させるのに十分でないからであると判断される。これを確認するために、ｔｌｉＡ遺伝子を２つのフラグメント（ｔｌｉＡ１，ｔｌｉＡ２）に切断し、その後本発明のシステムに適用した。
【０１１２】
その結果、ＴｌｉＡ１は非常に不溶性であるのに対して、ＴｌｉＡ２は可溶性であった（図３のａ及びｂ）。ＴｉｌＡ１を第２シストロンから発現させたＣＬＥＸシステムにおいては約６０％のＴｌｉＡ１が可溶化されたのに対して、単にＴｌｉＡ１とＤｎａＪを共に発現させた場合は２５％のＴｌｉＡ１が可溶化された（図３のｂ）。この結果は、タンパク質の長さやドメイン配列などのＴｌｉＡの内在的特性が不溶性の主要原因であり、内部の誤ってフォールディングされやすい領域をシャペロンに十分に露出させることのできる本発明のシステムにより、高分子タンパク質の溶解度を増加させ得ることを示唆するものである。
【０１１３】
ＣＲＡＳシステムはシャペロンをｍＲＮＡの３’ＵＴＲに配置するのに対して、ＣＬＥＸシステムは標的タンパク質と共に新しいシャペロン分子を生産し続け、それらの速い相互作用を促進する。可溶化活性を考慮すると、ＣＬＥＸシステムはＣＲＡＳシステムよりも優れている。しかし、ＣＬＥＸシステムは各組換えタンパク質においてｄｎａＪを２つのシストロンシステムにクローニングしなければならないので、複数のタンパク質を同時に可溶化するには限界がある。逆に、３つのループ及びＤｎａＪＫ−ＫＨを有するＣＲＡＳシステムは、各ｍＲＮＡに簡単に３’ＵＴＲ ＫＨ結合ヘアピン配列を導入することにより、細胞内で発現した複数のタンパク質の溶解度を向上させることができる。よって、ＣＲＡＳシステムは代謝経路に関与する機能性酵素の可溶性画分を増加させるのに用いられ、ＣＬＥＸシステムは治療用ペプチド、酵素又はペプチドのように１種類の組換えタンパク質を生産するのに適している。
【０１１４】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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