(57)【要約】【課題】繊維芽細胞増殖促進作用およびコラーゲン産生促進作用が高い組成物の製造方法を提供すること。【解決手段】アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の存在下で、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解することを特徴とするプロテアーゼ分解組成物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の存在下で、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解することを特徴とするプロテアーゼ分解組成物の製造方法。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物が鶏冠であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩として、２位の水酸基の水素原子がグリコシル基で置換されたものを用いる、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を前記組成物に添加する工程を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の前記組成物における添加量が、その添加後の組成物全量に対して０．５〜４０質量％である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を、前記組成物にプロテアーゼを接触させる前に添加する、請求項４または５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物が鶏冠であり、
前記鶏冠を１辺０．５ｃｍ角以上に小片化する工程と、小片化した前記鶏冠に、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の溶液を添加し、混合して混合物を得る工程と、前記混合物にプロテアーゼを添加して、小片化した前記鶏冠をプロテアーゼで分解する工程を有する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法により製造した組成物。
【請求項９】
アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の含有量が０．５〜４０質量％である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の組成物を含有する繊維芽細胞増殖促進剤。
【請求項１１】
請求項８または９に記載の組成物を含有するコラーゲン産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ分解組成物の製造方法、組成物、繊維芽細胞増殖促進剤およびコラーゲン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、保湿効果や保水効果を高める働きがあることが知られており、従来からさまざまな化粧品や医薬品に配合されている。例えば、乾燥肌や荒れ肌に直接適用することにより保湿性を高めて肌のコンディションを調えたり、乾燥期に皮膚表面から水分が失われたりすることを防ぐために予防的に皮膚表面に適用することが通常行われている。また、ヒアルロン酸は、保湿効果から派生する機能や保湿効果以外の有用な特性の発現も期待され、その新たな利用法に関する研究も幾つか見受けられる。
【０００３】
例えば、特許文献１には、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物を創傷治療剤に用いることが提案されている。この創傷治療剤は、生体成分であるヒアルロン酸や蛋白質、反応が緩和な酵素を用いているために安全性が高く、例えば経口投与や創傷部位への直接投与により創傷を迅速に治療することができるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１４５８００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物が創傷治療剤として提案されている。
一方、創傷治癒過程で重要な働きを担う生体細胞として繊維芽細胞が知られている。繊維芽細胞は、結合組織を構成する細胞の１種であり、皮膚に損傷が加わると損傷部に遊走して増殖し、コラーゲン等の細胞外マトリックスを産生するなど、創傷治癒過程において重要な働きを果たす。したがって、こうした繊維芽細胞の増殖を促進できるものであれば、高い創傷治療効果が期待できる。
しかしながら、本発明者らが、上記のヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物のプロテアーゼ分解生成物を繊維芽細胞の培地に添加して、その細胞増殖の様子を調べたところ、繊維芽細胞の増殖は殆ど促進されないことが判明した（後掲の実施例参照）。
【０００６】
そこで本発明者らは、このような従来技術の課題を解決するために、繊維芽細胞増殖促進作用と繊維芽細胞のコラーゲン産生促進作用が高い組成物を提供することを課題として検討を進めた。また、そのような組成物を安価に製造することができる製造方法を提供することを課題として検討を進めた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、本発明者らは、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解する際、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を組成物中に存在させておくことにより、これらのものを存在させずに調製したプロテアーゼ分解生成物に比べて、繊維芽細胞増殖促進作用とコラーゲン産生促進作用が顕著に高い分解組成物が得られることを見出した。そして、こうしたプロテアーゼ分解組成物の作用を利用することにより、安全性の高い繊維芽細胞増殖剤およびコラーゲン産生促進剤を安価で提供できることを見出すに至った。本発明は、これらの知見に基づいて提案されたものであり、具体的に以下の構成を有する。
【０００８】
［１］  アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の存在下で、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解することを特徴とするプロテアーゼ分解組成物の製造方法。
［２］  前記ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物が鶏冠であることを特徴とする、［１］に記載の製造方法。
［３］  前記アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩として、２位の水酸基の水素原子がグリコシル基で置換されたものを用いる、［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］  前記アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を前記組成物に添加する工程を有する、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の製造方法。
［５］  前記アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の前記組成物における添加量が、その添加後の組成物全量に対して０．５〜４０質量％である、［４］に記載の製造方法。
［６］  前記アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を、組成物にプロテアーゼを接触させる前に添加する、［４］または［５］に記載の製造方法。
［７］  前記ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物が鶏冠であり、
前記鶏冠を１辺０．５ｃｍ角以上に小片化する工程と、小片化した前記鶏冠に、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の溶液を添加し、混合して混合物を得る工程と、前記混合物にプロテアーゼを添加して、小片化した前記鶏冠をプロテアーゼで分解する工程を有する、［６］に記載の製造方法。
［８］  ［１］〜［７］のいずれか１項に記載の製造方法により製造した組成物。
［９］  アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の含有量が０．５〜４０質量％である、［８］に記載の組成物。
［１０］  ［８］または［９］に記載の組成物を含有する繊維芽細胞増殖促進剤。
［１１］  ［８］または［９］に記載の組成物を含有するコラーゲン産生促進剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のプロテアーゼ分解組成物の製造方法によれば、繊維芽細胞増殖促進作用と繊維芽細胞のコラーゲン産生促進作用が高いプロテアーゼ分解組成物を低コストで製造することができる。本発明の組成物は、繊維芽細胞増殖促進作用およびコラーゲン産生促進作用が高いため、繊維芽細胞増殖剤およびコラーゲン産生促進剤として効果的に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】組成物１、比較組成物１、２またはＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを添加した培地中でヒト繊維芽細胞を１日間培養した後の相対生細胞数を示すグラフである。
【図２】組成物１、比較組成物１、２またはＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを添加した培地中でヒト繊維芽細胞を３日間培養した後の相対生細胞数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下において、本発明について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は「〜」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【００１２】
＜プロテアーゼ分解組成物の製造方法＞
本発明のプロテアーゼ分解組成物の製造方法は、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の存在下で、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解することを特徴とする。
本発明の製造方法では、反応系に存在させたアスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩が、プロテアーゼによる組成物の分解反応に有利な効果をもたらすと考えられ、得られたプロテアーゼ分解組成物は、繊維芽細胞増殖促進作用が高く、また、繊維芽細胞のコラーゲン産生を効果的に促進し得る。
以下において、本発明の製造方法で用いる組成物、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩とその添加条件、およびプロテアーゼについて説明する。なお、以下の説明では、繊維芽細胞のコラーゲン産生を促進する作用を、単に「コラーゲン産生促進作用」という。
【００１３】
［組成物］
まず、本発明において、プロテアーゼ分解組成物の原料として用いる組成物について説明する。
上記組成物に含まれるヒアルロン酸は、化粧品や医薬品の成分として通常用いられているヒアルロン酸であれば特に制限なく使用することができる。ヒアルロン酸は、元来ウシの眼の硝子体から単離されたものであるが、これに限らず、動物の関節液やニワトリの鶏冠などから単離されたものであっても使用することができる。また、自然界から単離されたものでなく、合成や微生物発酵法により得られたものでもよい。
【００１４】
ヒアルロン酸は、アミノ酸とウロン酸からなる複雑な多糖類であるが、その構造の詳細は特に限定されない。例えば、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなるニ糖を繰り返し単位とする多糖を挙げることができる。組成物に含まれるヒアルロン酸の分子量は特に限定されないが、例えば鶏冠に含まれるヒアルロン酸は、分子量が６００万〜１０００万であり、鶏冠から抽出したヒアルロン酸は、抽出過程で分解されるため、平均分子量が数十万〜数百万である。本発明で使用するヒアルロン酸は、本発明で得られるプロテアーゼ分解組成物の繊維芽細胞増殖促進作用およびコラーゲン産生促進作用を過度に失わないものである限り、誘導化や熱変性を受けたものであっても構わない。いわゆるヒアルロン酸誘導体として知られている化合物は、本発明で有効に使用することができる。
【００１５】
上記組成物に含まれる蛋白質はその種類を問わないが、鶏冠に含まれる蛋白質が極めて好ましい。鶏冠の種類は特に制限されないが、ニワトリの鶏冠を用いるのが好ましい。ニワトリの鶏冠はヒアルロン酸を含有するため、本発明の組成物の製造に用いる組成物（ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物）を提供するに際して、鶏冠にヒアルロン酸を別途添加しなくてもよいというメリットがある。このため、鶏冠を用いれば本発明のプロテアーゼ分解組成物の製造工程が簡略化でき、製造コストも下げることができる。
【００１６】
本発明で用いる組成物は、蛋白質とヒアルロン酸のみを含んでいてもよいし、その他の成分や溶媒、分散媒を含んでいてもよい。溶媒および分散媒としては、蛋白質やヒアルロン酸を溶解できるものであればよく、水や水性緩衝液を好適に用いることができる。また、組成物は、蛋白質とヒアルロン酸を含む天然物そのものであってもよい。組成物となる天然物としては、動物の関節液や鶏冠を挙げることができ、ヒアルロン酸を豊富に含むことからニワトリの鶏冠であることが好ましい。
【００１７】
［アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩］
本発明では、上記のヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解してプロテアーゼ分解物を生成するが、この分解反応の際、組成物中にアスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を存在させる点に特徴がある。これにより、得られたプロテアーゼ分解組成物は、これらのものを組成物中に存在させずに調製したプロテアーゼ分解生成物に比べて、高い繊維芽細胞増殖促進作用と高いコラーゲン産生促進作用を示す。
本発明で用いるアスコルビン酸は、下記式で表されるＬ−アスコルビン酸であってもよいし、Ｌ−アスコルビン酸の異性体であってもよい。Ｌ−アスコルビン酸の異性体として、Ｄ−アスコルビン酸、Ｌ−アラボアスコルビン酸、Ｄ−アラボアスコルビン酸（エリソルビン酸、イソアスコルビン酸とも称する）を挙げることができる。
【００１８】
【化１】
2019182768.tif 000002
式において、１〜６はＬ−アスコルビン酸の位置番号を示す。
【００１９】
アスコルビン酸エステルは、アスコルビン酸の水酸基が酸と脱水縮合（エステル化）して形成されたエステル結合を有するアスコルビン酸誘導体である。アスコルビン酸エステルは、Ｌ−アスコルビン酸エステルであってもよいし、上記のＬ−アスコルビン酸の異性体をエステル化した異性体のエステルであってもよい。また、アスコルビン酸は２位、３位、５位および６位に水酸基を有しており、アスコルビン酸エステルで酸とエステル結合を形成している水酸基は、これらの中のいずれの水酸基であってもよく、２つ以上の水酸基が酸とエステル結合を形成していてもよい。アスコルビン酸エステルの種類として、カルボン酸エステル、リン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、ホウ酸エステル、スルホン酸エステルを挙げることができ、カルボン酸エステル、リン酸エステルであることが好ましい。
アスコルビン酸のカルボン酸エステルにおいて、そのアシル基の炭素数は１〜２０であることが好ましく、１０〜１８であることがより好ましく、１４〜１６であることがさらに好ましい。また、カルボン酸エステルは、アスコルビン酸の６位の水酸基がカルボン酸とエステル結合を形成したもの、すなわち、６−Ｏ−アシルアスコルビン酸であることが好ましく、６−Ｏ−パルミトイルアスコルビン酸（アスコルビン酸６−パルミテート）であることが特に好ましい。
アスコルビン酸のリン酸エステルにおいて、そのリン酸基はモノホスホリルオキシ基であってもよいし、ピロホスホリル基、トリホスホリル基、ポリホスホリル基等の複数のリン酸が連結した構造を有するリン酸基であってもよい。また、リン酸エステルは、アスコルビン酸の２位の水酸基がリン酸基に変換したものであることが好ましく、アスコルビン酸の２位の水酸基がモノホスホリルオキシ基に変換したもの、すなわちアスコルビン酸２−リン酸であることがより好ましい。
また、本発明で用いるアスコルビン酸およびアスコルビン酸エステルは、その水酸基の水素原子が置換基で置換されたものであってもよい。置換基として、エチル基等のアルキル基、フェニル基等のアリール基、グリコシル基、リン酸基、硫酸基、アルケニル基を挙げることができる。グリコシル基の具体例としては、α−Ｄ−モノグルコピラノシル基、β−Ｄ−モノグルコピラノシル基などのグルコピラノシル基、β−Ｄ−モノガラクトピラノシル基などのガラクトピラノシル基等を挙げることができる。これらの置換基で水素原子が置換される水酸基は２位、３位、５位および６位のいずれの水酸基（ただし、アスコルビン酸エステルではエステル結合を形成している水酸基を除く）であってもよく、２つ以上の水酸基の水素原子が置換基で置換されていてもよい。例えば、アルキル基で水素原子が置換される水酸基は３位の水酸基であることが好ましく、グリコシル基で水素原子が置換される水酸基は２位の水酸基であることが好ましい。アスコルビン酸の水酸基が置換基で置換されたものの好ましい具体例として、３−Ｏ−エチルアスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド（2-O-α-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸）を挙げることができる。
【００２０】
本発明で用いるアスコルビン酸エステルは、下記一般式（１）で表されるＬ−アスコルビン酸のカルボン酸エステルであることも好ましい。
【００２１】
【化２】
2019182768.tif 000003
【００２２】
一般式（１）において、Ｒ１はアルキル基（ＣｎＨ２n＋１）を表し、Ｒ２は水酸基または置換基を表す。
Ｒ１におけるアルキル基（ＣｎＨ２n＋１）のｎは８以上であることが好ましく、１０以上であることがより好ましく、１２以上であることがさらに好ましい。アルキル基の好ましい例として、ノニル基（Ｃ９Ｈ１９）、ウンデシル基（Ｃ１１Ｈ２３）、トリデシル基（Ｃ１３Ｈ２７）、ペンタデシル基（Ｃ１５Ｈ３１）を挙げることができる。すなわち、アシル基（ＣＯＲ１）は、炭素数が１０のデカノイル基、炭素数が１２のドデカノイル基、炭素数が１４のテトラデカノイル基、炭素数が１６のヘキサデカノイル（パルミトイル）基であることが好ましい。
Ｒ２における置換基として、グリコシル基、リン酸基、硫酸基、アルキル基、アルケニル基、フェニル基等を挙げることができる。グリコシル基の具体例については、上記のアスコルビン酸等の水酸基に置換しうるグリコシル基の具体例を参照することができ、リン酸基の具体例については、上記のリン酸エステルにおけるリン酸基の具体例を参照することができる。
【００２３】
本発明で用いるアスコルビン酸およびアスコルビン酸エステルの塩は、無機イオンとの塩であっても、有機イオンとの塩であってもよいが、毒性の低いものであることが好ましい。アスコルビン酸およびアスコルビン酸エステルと塩を形成する無機イオンとして、アルカリ金属（例えばナトリウム、カリウムなど）、アンモニウム、アルカリ土類金属（例えばカルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウムなど）、アルミニウム等の各陽イオンを挙げることができる。また、アスコルビン酸およびアスコルビン酸エステルと塩を形成する有機イオンとして、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ジシクロヘキシルアミン等の有機塩基から生じる陽イオンを挙げることができる。アスコルビン酸およびアスコルビン酸エステルは、これらの中でも、特にナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウムの各陽イオンと塩を形成していることが好ましい。
ここで、アスコルビン酸およびアスコルビン酸エステルは、これらの陽イオンの１種のみと塩を形成していてもよいし、２種以上と塩を形成していてもよい。また、アスコルビン酸およびアスコルビン酸エステルにおいて、陰イオン部分になる位置は特に限定されず、例えば３位の水酸基のプロトンが解離して陰イオンになっていてもよいし、酸性置換基が導入されている場合には、その酸性置換基のプロトンが解離して陰イオンになっていてもよい。
【００２４】
これらのアスコルビン酸およびアスコルビン酸エステルのうち、食品添加物として使用されていることから、アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド、Ｌ−アスコルビン酸６−パルミテートおよびこれらの塩が好ましく、中でも、組成物を着色し難いことから、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシドおよびその塩が特に好ましい。また、安定性が高い点では、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド、アスコルビン酸２−リン酸、３−Ｏ−エチルアスコルビン酸などの、いわゆる安定型アスコルビン酸誘導体およびこれらの塩が好ましい。
【００２５】
［アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の添加条件］
本発明では、上記のようなアスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の存在下で、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解する。
具体的には、例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を組成物に添加して混合し、その添加したものの存在下で組成物をプロテアーゼで分解する。ここで、組成物が液状である場合には、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩は、その組成物に直接添加して混合してもよいし、組成物を溶媒で希釈した溶液に添加して混合してもよい。また、組成物が固体である場合には、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩は、組成物または組成物を細分化した細分化物に直接添加して混合してもよいし、組成物を溶媒に溶解して溶液とするか、組成物または組成物を細分化した細分化物を分散媒に懸濁させ、その溶液または懸濁液に添加して混合してもよい。組成物に添加するアスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩は、固体であっても溶液であってもよい。溶液に用いる溶媒としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の種類によっても異なるが、水、エタノール等を用いることができる。組成物に添加するのは、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩のうちの１種類であってもよいし、２種類以上の組み合わせであってもよい。
【００２６】
アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を組成物に添加する時機は、プロテアーゼによる分解反応終了前であり、好ましくは分解反応開始前から反応終了１分前までの間、より好ましくは分解反応開始前から反応終了５分前までの間、さらに好ましくは分解反応開始前から反応終了１０分前までの間である。ここで、分解反応開始前とは、具体的には組成物にプロテアーゼを接触させる前のことをいい、反応終了とはプロテアーゼによる分解工程の終了を意味する。上記の時機で添加することにより、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩が、プロテアーゼによる組成物の分解反応に有利な効果をもたらすと考えられる。その結果、得られたプロテアーゼ分解組成物は、これらのものを存在させずに調製したプロテアーゼ分解生成物に単にアスコルビン酸やその誘導体を添加した組成物に比べて、高い繊維芽細胞増殖促進作用と高いコラーゲン産生促進作用を有する。
【００２７】
アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の組成物への添加量は、添加した後の組成物、組成物の溶液または組成物の懸濁液の全量に対して０．５〜４０質量％とすることが好ましく、０．７〜２０質量％とすることがより好ましく、１〜１０質量％とすることがさらに好ましく、１〜５質量％とすることが特に好ましい。なお、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の２種類以上を組成物に添加する場合には、その添加量の合計が上記の「アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の組成物への添加量」であることとする。ここで、添加量を比較的多くする場合には、組成物にｐＨ調整剤を添加するか、アスコルビン酸の塩やアスコルビン酸エステルの塩を用いて、組成物のｐＨを６〜８の範囲に調整することが好ましい。また、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩は、添加すべき量を少量ずつに分けて、徐々に組成物に添加してもよいし、添加すべき量を一度に添加してもよい。
【００２８】
［プロテアーゼ］
本発明で、上記の組成物の分解に用いるプロテアーゼの種類は特に制限されない。通常の蛋白質分解に用いられるプロテアーゼであればいずれも使用することができる。すなわち、エンドペプチダーゼであっても、エキソぺプチダーゼであっても使用することが可能であり、また活性部位はセリン、システイン、金属、アスパラギン酸等のいずれであってもよい。また、複数のプロテアーゼを混合して使用してもよい。好ましいプロテアーゼとして、例えばプロナーゼを使用することができる。
【００２９】
［プロテアーゼ分解組成物の製造例］
次に、本発明のプロテアーゼ分解組成物の製造方法を、組成物に鶏冠を用いる場合を例にして具体的に説明する。
本発明のプロテアーゼ分解組成物の製造方法は、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の存在下で、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解する工程を含み、さらに必要に応じて、この他の工程を有していてもよい。例えば、組成物が鶏冠である場合には、酵素処理工程の前に、鶏冠を小片化する小片化工程を有していてもよい。また、酵素処理工程の後に、分解組成物を濾過する濾過工程、濾過した分解組成物を乾燥した後、粉砕する製粉工程、濾過した分解組成物を精製する精製工程を有していてよい。以下において、本発明のプロテアーゼ分解組成物の製造例を詳細に説明する。
【００３０】
まず、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物を準備する。組成物としてニワトリの鶏冠を利用する場合には、性別、年令を問わず使用し得る。ただし、採取後なるべく時間を置かずにプロテアーゼ分解に供することが好ましい。また、時間を置いてプロテアーゼ分解するときには、冷凍保存した後に解凍して使用することが好ましい。
【００３１】
鶏冠を、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の存在下でプロテアーゼ分解するときには、まず鶏冠を小片化する小片化工程を行ってから、該鶏冠の小片に、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を添加し、その小片をプロテアーゼ含有溶液に接触させることが好ましい。鶏冠は、好ましくは０．５ｃｍ角以上、より好ましくは０．７ｃｍ角以上、さらに好ましくは０．９ｃｍ角以上の小片にする。過度に細片化してしまったり、ミンチ状にしてしまうと、水分が過度に流れ出てしまったりするため好ましくない。
【００３２】
次に、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を組成物に添加して混合し、その添加したものの存在下で、組成物をプロテアーゼで分解する酵素処理工程を行う。アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の説明と好ましい範囲、具体例については、上記の［アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩］の欄の記載を参照することができ、その添加条件については、［アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の添加条件］の欄の記載を参照することができる。また、プロテアーゼの説明については、上記の［プロテアーゼ］の欄の記載を参照することができる。アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の組成物への添加および組成物との混合は、組成物やプロテアーゼの種類によっても異なるが、例えば組成物が鶏冠等の固形物や粉末である場合には、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を溶解した溶液を、酵素処理を行う前の組成物に添加して混合することにより行うことが好ましい。また、酵素処理は、組成物やプロテアーゼの種類によっても異なるが、例えば組成物が鶏冠等の固形物や粉末である場合には、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の溶液と組成物を混合した混合物に、プロテアーゼを溶解した水溶液等の溶液（酵素液）を添加し、その後、一定時間放置することで行うことが好ましい。ここで、酵素液のｐＨは５．０〜１０．０であることが好ましく、処理温度は４０〜６０℃であることが好ましく、処理時間は０．５〜３．０時間であることが好ましい。また、酵素処理は、酵素液を添加した組成物を振とうしながら行うことが好ましい。
【００３３】
以上のようにして得られたプロテアーゼ分解組成物は、ろ過などの方法により鶏冠等の固形分を除去して、液状のプロテアーゼ分解組成物として用いることができる。また、凍結乾燥等により乾燥してさらに粉砕する製粉工程を行うことにより、粉末状のプロテアーゼ分解組成物として用いることもできる。
本発明のプロテアーゼ分解組成物の製造方法は、このように極めて簡単な工程であり、繊維芽細胞増殖促進作用とコラーゲン産生促進作用が高いプロテアーゼ分解組成物を低いコストで提供することができる。
また、濾過したプロテアーゼ分解組成物や粉末状のプロテアーゼ分解組成物を精製することにより、繊維芽細胞増殖促進作用とコラーゲン産生促進作用がより高い分解組成物を得ることができる。分解組成物の精製方法には、分液やカラムクロマトグラフィ等の一般的な精製方法を用いることができる。
【００３４】
＜組成物＞
次に、本発明の組成物について説明する。
本発明の組成物は、本発明のプロテアーゼ分解組成物の製造方法により製造したものである。
本発明のプロテアーゼ分解組成物の製造方法の説明については、上記の＜プロテアーゼ分解組成物の製造方法＞の欄の記載を参照することができる。
以下において、本発明の組成物が含む成分およびその含有量について説明する。なお、以下の説明では、本発明のプロテアーゼ分解組成物の製造方法で原料に用いる組成物（ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物）を、本発明の組成物と区別して「原料組成物」ということがある。
【００３５】
本発明の組成物は、本発明のプロテアーゼ分解組成物の製造方法により製造したものであるため、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の存在下で、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解することで生成したプロテアーゼ分解組成物を含有する。ここで、プロテアーゼ分解組成物は、少なくとも、プロテアーゼにより分解された蛋白質の分解物と、ヒアルロン酸を含有し、分解反応の際に存在させたアスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩、未分解の蛋白質（プロテアーゼ添加前の組成物に元々含まれていた蛋白質）や原料組成物由来の他の成分を含有していてもよい。
プロテアーゼ分解組成物に含まれる蛋白質の分解物としては、未分解の蛋白質よりも低分子量の蛋白質、ペプチド、遊離アミノ酸を挙げることができ、これらが混在していてもよい。
また、プロテアーゼ分解組成物は、遊離アミノ酸を含有することが好ましい。分解組成物が含有する遊離アミノ酸は、蛋白質の分解物としての遊離アミノ酸であってもよいし、プロテアーゼ添加前の組成物に遊離アミノ酸として元々含まれていたものであってもよい。遊離アミノ酸の種類は、組成物の成分によっても異なるが、例えば組成物が鶏冠であるプロテアーゼ分解組成物では、比較的含有率が多いアミノ酸としてイソロイシン、β−アミノイソ酪酸、アラニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチン、チロシン等を挙げることができ、この他にも、多種類のアミノ酸を含む。
【００３６】
本発明の組成物における総蛋白質量は、組成物の全量に対する質量比で０．５〜１０質量％であることが好ましく、１〜７質量％であることがより好ましく、２〜５質量％であることがさらに好ましい。また、本発明の組成物における総遊離アミノ酸量は、組成物の全量に対する質量比で０．５〜１２質量％であることが好ましく、１〜８質量％であることがより好ましく、２〜６質量％であることがさらに好ましい。本発明の組成物における総蛋白質量および遊離アミノ酸量が上記の範囲であることにより、組成物が効果的に作用すると考えられ、繊維芽細胞増殖促進作用およびコラーゲン産生促進作用を顕著に得ることができる。
本明細書中において「総蛋白質量」とは、Lowry法により求めた総蛋白質含量のことをいい、「総遊離アミノ酸量」とは、Ninhydrin法により求めた遊離アミノ酸の総量のことをいう。
【００３７】
上記のプロテアーゼ分解組成物に含まれるヒアルロン酸は、プロテアーゼ添加前の原料組成物に元々含まれていたヒアルロン酸がそのまま残存したもの（以下、「未分解のヒアルロン酸」という）であってもよいし、ヒアルロン酸の分解物（以下、「低分子ヒアルロン酸」という）であってもよいし、未分解のヒアルロン酸と低分子ヒアルロン酸とが混在したものであってもよいが、低分子ヒアルロン酸を含有することが好ましい。低分子ヒアルロン酸は生命体の深部に浸透し易く、生命体に対する作用を効果的に得ることができる。プロテアーゼ分解組成物が低分子ヒアルロン酸を含有する場合、その低分子ヒアルロン酸は、原料組成物中でヒアルロン酸を加水分解させて得た低分子ヒアルロン酸であってもよいし、上記の原料組成物とは別の系でヒアルロン酸を加水分解し、得られた低分子ヒアルロン酸を分解組成物に添加したものであってもよいが、原料組成物中でヒアルロン酸を加水分解させて得た低分子ヒアルロン酸であることが好ましい。原料組成物中での低分子ヒアルロン酸の生成は、塩酸やヒアルロニダーゼ等の、ヒアルロン酸を加水分解する物質を原料組成物に添加することにより行うことができる。また、原料組成物が天然物である場合には、天然物に元々含まれる物質による自己消化を利用して低分子ヒアルロン酸を生成してもよい。ただし、ヒアルロン酸の生体に対する作用を有効に得る点から、ヒアルロン酸は構成単位を保持していること、すなわち、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンまで分解が進行していないことが好ましい。具体的には、本発明の組成物におけるＮ−アセチルグルコサミンの含有量は、組成物の全量に対して０．０１質量％以下であることが好ましく、０質量％であることが最も好ましい。
本明細書中において「Ｎ−アセチルグルコサミン量」とはMorgan-Elson法により求めたＮ−アセチルグルコサミン含量のことをいう。
【００３８】
プロテアーゼ分解組成物が含有する低分子ヒアルロン酸は、分子量が３８０〜５０００であることが好ましい。分子量３８０〜５０００は、ヒアルロン酸の繰り返し単位数で約１〜１４に相当する。本発明の組成物における、分子量３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有量は、組成物の全量に対して５質量％以上であることが好ましく、７質量％以上であることがより好ましく、１０質量％以上であることがさらに好ましい。また、低分子ヒアルロン酸のうちでは、分子量１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸が主成分であることが好ましく、分子量１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の割合が分子量３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸全量の６０質量％以上であることが好ましく、７０質量％以上であることがより好ましく、７５質量％以上であることがさらに好ましい。これにより、本発明の組成物が効果的に作用すると考えられ、繊維芽細胞増殖促進作用およびコラーゲン産生促進作用を顕著に発揮することができる。
低分子ヒアルロン酸の分子量と質量比率は、ポリエチレングリコールを分子量マーカーに用いる高速液体クロマトグラフィにより分析することができる。
【００３９】
プロテアーゼ分解組成物は、通常、分解反応の際に存在させたアスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を含む。本発明の組成物におけるアスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の含有量は、組成物の全量に対して０．５〜４０質量％であることが好ましく、１〜１０質量％であることがより好ましく、３〜５質量％であることがさらに好ましい。
本明細書中においてアスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の含有量は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）法により求めた含有量のことをいう。
【００４０】
プロテアーゼ分解組成物の性状は、用いる原料組成物の成分や組成比、プロテアーゼの種類によっても異なるが、通常は液状、さらには粘質性を帯びた液状である。プロテアーゼ分解組成物は、そのまま本発明の組成物としてもよいし、適宜精製して他の成分と組み合わせる等して本発明の組成物としてもよい。プロテアーゼ分解組成物を精製することにより、より繊維芽細胞増殖促進作用およびコラーゲン産生促進作用が高い組成物とすることができる。液状の組成物は、塗布や点眼のための外用剤、飲料タイプの内服剤等として用いることができる。また、プロテアーゼ分解組成物を凍結乾燥等により乾燥した後、粉砕した場合は、粉末状の組成物を提供することが可能である。粉末状の組成物は、そのまま、もしくは他の成分を含有させて内服剤に用いてもよいし、錠剤やカプセル剤に加工してもよいし、所望の溶媒または分散媒を添加して液状とし、塗布や点眼のための外用剤や飲料タイプの内服剤等として用いてもよい。
このように、本発明の組成物は、繊維芽細胞増殖促進作用およびコラーゲン産生促進作用を発揮しうる態様であれば、いかなる態様で提供されてもよい。例えば、これらの効能を明記した医薬品、医薬部外品、機能性食品（補助食品、健康食品、飴、チューインガム等も含む）、機能性飲料（ゼリー状飲料、固形分を含む流動性飲料も含む）、機能性化粧品、サプリメントとすることが可能であり、これらの使用態様は本発明の「組成物」の範囲内に含まれるものと解釈される。
【００４１】
本発明の組成物には、上記プロテアーゼ分解組成物以外にも、さまざまな成分を含有させることができる。例えば、組成物に賦形剤を含有させた場合には、分解組成物と賦形剤の配合率を制御して総蛋白質量や総遊離アミノ酸量、低分子ヒアルロン酸量等の成分量を調整することができる。また、保存し易い組成物の態様として、凍結乾燥させた分解組成物を粉砕して得た粉末を賦形剤で希釈した混合粉末を挙げることができる。賦形剤としては、特に限定されないが、デキストリンが好適である。賦形剤による希釈倍率は、質量比で２〜１０倍であることが好ましく、２〜７倍であることがより好ましく、３〜５倍であることがさらに好ましい。
【００４２】
本発明の組成物は、繊維芽細胞増殖促進作用およびコラーゲン産生促進作用を有する。このため、本発明の組成物は、経口で摂取され、その成分が腸管から吸収された場合には、到達した真皮や創傷部位において、そこに存在する繊維芽細胞の増殖やコラーゲン産生を効果的に促進する。その結果、皮膚のハリや弾力などのコンディションが改善されるとともに、創傷部位の治癒が促進される。ここで、本発明の組成物は、生体成分であるヒアルロン酸や蛋白質、反応が緩和な酵素を用いているため安全性が高く、経口で摂取する内服剤として使用し易いという利点がある。
【００４３】
本発明の組成物の使用量は、対象とする障害によっても異なるが、例えば以下の使用量で用いることが好ましい。
例えば本発明の組成物を内服薬として経口投与する場合、その投与量は８０〜２０００ｍｇ／成人標準体重／日であることが好ましく、１日に２〜３回に分けて投与することが適当である。プロテアーゼ分解物としての投与量は、１〜１５００ｍｇ／成人標準体重／日であることが好ましい。
【００４４】
［組成物の用途］
上記のように、本発明の組成物は、繊維芽細胞増殖促進作用およびコラーゲン産生促進作用を有する。このため、本発明の組成物は、ヒト等の動物に投与して、その繊維芽細胞の増殖を促進する繊維芽細胞増殖促進剤、および、繊維芽細胞のコラーゲン産生を促進するコラーゲン産生促進剤として効果的に用いることができる。また、これらの作用を組み合わせた医薬品として用いてもよい。内服剤としての組成物には、必要に応じて、上記の分解組成物や賦形剤以外にも、さまざまな成分を含有させることができる。例えば、ビタミン、野菜粉末、ミネラル、酵母エキス、着色剤、増粘剤などを必要に応じて含有させることができる。これらの成分の種類は特に制限されず、含有量は目的とする機能を十分に発揮させることができる範囲内で適宜調節することができる。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、割合、操作等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
【００４６】
本実施例で製造した組成物の成分分析は下記の方法により行った。
（１）水分含有量の測定
水分含有量は、組成物の１ｇを１０５℃で３時問加熱乾燥し、精密天秤で恒量を求め定量した。
【００４７】
（２）全窒素の定食
全窒素はＡＯＡＣ法に基づくセミミクロケルダール法によって定量した。
【００４８】
（３）遊離アミノ酸の定量およびアミノ酸組成の分析
総遊離アミノ酸量はNinhydrin法によって定量した。定量には標準アミノ酸としてロイシンの検量線を作成し使用した。また、遊離アミノ酸の組成は、生体分析用カラムを装着したアミノ酸自動分析機（日立社製、L-8500型）を用いて分析した。この分析には、組成物の５０ｍｇを蒸留水に溶解し、ロータリーエバポレーダー（６０℃）で減圧乾固させた後、０．０２Ｎ塩酸５ｍＬで溶出し、ろ紙でろ過したのち、滅菌フィルターでろ過したろ液５０μＬを分析試料として使用した。
【００４９】
（４）タンパク質の定量
総タンバク質量はLawry法によって決定した。標準検量線の作成には牛血清アルブミンを使用した。
【００５０】
（５）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの定量
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含有量はMorgan-Elson法で定量した。
【００５１】
（６）グルコサミノグリカンの定量
２−ニトロフェニルヒドラジンカップリング法による比色定量法で分析した。標準検量の作成には鶏冠由来ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬社製、ＨＡＲＣ）およびstreptococcus zooepidemicus由来のヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬社製、ＨＡＳＺ）を用いた。
【００５２】
（７）低分子ヒアルロン酸の分子量測定
示差屈折計（Shimazu社製、RID-10A型）を装着した高速液体クロマトグラフィー（Shimazu社製）によってヒアルロン酸の分子量を推定した。カラムとしてTSKgel G-2,500PWXL（7.8mmID×30cm）を用い、水を移動相として流速１ｍｌ／ｍｉｎで分析を行った。分子量マーカーには分子量４００、１０００、２０００、６０００の４種のポリエチレングリコール（Aldrich社製）を用いた。また、各低分子ヒアルロン酸の構成重量比は、医薬組成物とデキストリンのみのサンプルを高速液体クラマトグラフィにより分析し、組成物で現れたピークのピーク面積からデキストリンのピーク面積を差し引くことにより求めた。
【００５３】
［製造例］
採取したてのニワトリの鶏冠１ｋｇを約０．５〜２．０ｃｍ角に切断して小片化し、１００℃で蒸きょうを行うことにより加熱殺菌した。この小片状の鶏冠にＬ−アスコルビン酸２−グルコシド溶液を添加し、十分に混ぜ合わせた。このとき、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシドの添加量は、後述する凍結乾燥粉末量の３．５６質量％となる量とした。その後、プロテアーゼを中心とした食物由来の酵素類を、鶏冠とＬ−アスコルビン酸２−グルコシド溶液の混合物に添加して４５℃で１．５時間反応させた後、攪拌して均質化した。その後、濾過して粗大な固形成分を除去し、液状のプロテアーゼ分解組成物を得た。このプロテアーゼ分解組成物は、ｐＨ６．５、Ｂｒｉｘ値６．２０、固形分濃度５．９１質量％であった。このプロテアーゼ分解組成物を凍結乾燥して粉砕し、プロテアーゼ分解組成物の凍結乾燥粉末を得た。このプロテアーゼ分解組成物の凍結乾燥粉末に等量（質量比）のデキストリンを添加することにより、デキストリン添加凍結乾燥粉末（組成物１）を製造した。
【００５４】
［組成物の成分分析］
製造した組成物１について、上記の方法により成分分析を行った。測定された一般成分の含有率を表１に示し、遊離アミノ酸の組成を表２に示し、低分子ヒアルロン酸の分子量の分析結果を表３に示す。なお、表１〜３中の「％」は「質量％」を表す。
【００５５】
【表１】
2019182768.tif 000004
【００５６】
【表２】
2019182768.tif 000005
【００５７】
【表３】
2019182768.tif 000006
【００５８】
表２に示すように、組成物１に含まれる遊離アミノ酸の中では、イソロイシン、β−アミノイソ酪酸の含有量が多く、ついで、アラニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチン、チロシン等が多く含まれていた。
また、表３に示すように、組成物１に含まれる低分子ヒアルロン酸は、推定分子量５０００、１５２０、１１４０、７６０および３８０の５種類からなることがわかった。また、ヒアルロン酸の繰り返し単位１つの分子量を約４００とすると、各低分子ヒアルロン酸の繰り返し単位数は、分子量の大きい順に、１３〜１４、４、３、２および１であり、質量比率は、３３％、４７％、１０％、６％および４％であった。よって、低分子ヒアルロン酸の主要成分は、分子量１５２０程度の４分子成分と分子量５０００程度の１３〜１４分子成分の２成分であることがわかった。なお、組成物１における、分子量３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有率は、組成物１の全量に対して１３．４質量％であった。
【００５９】
＜組成物の評価＞
本実施例では、上記の製造例で製造した組成物１を被試験物質として、繊維芽細胞増殖試験とコラーゲン産生促進試験を行い、その作用を評価した。
試験に用いた細胞、試薬および培地を以下に示す。
［細胞、試薬、培地］
（１）試験用細胞
試験用細胞には、クラボウ社から購入した成人由来正常ヒト線維芽細胞を使用した。
（２）試薬
ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク社製）
DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地：ナカライテスク社製）
FBS（ウシ胎児血清：Cell Culture Bioscience社製）
生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク社製）
ヒトコラーゲンタイプ１ ELISA kit（エーセル社製）
（３）培地
増殖培地には、１０％FBSと１％ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液を添加したDMEMを使用し、試験培地には、１％FBSと１％ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液を添加したDMEMを使用した。
【００６０】
［比較サンプル］
本実施例では、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシドを用いないこと以外は組成物１と同様にして調製した比較組成物１、比較組成物１にＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを１．７８％の濃度で添加した比較組成物２、およびＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを比較サンプルとした。
【００６１】
［試験方法］
（１）細胞前培養
成人由来正常ヒト線維芽細胞を、細胞培養用フラスコ（コーニング社製：T-75）内の増殖培地に播種して起眠させ、５％ＣＯ２存在下、３７℃の湿潤環境で培養した。このとき、培地の交換は一日置きに行い、80％コンフルエントに到達した時点で細胞を回収し、下記の各試験に使用した。
【００６２】
（２）繊維芽細胞増殖試験
培養した繊維芽細胞を、５×１０３cells/0.1mL/ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１日間培養した。続いて、組成物１、比較組成物１、２、またはＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを添加した各試験培地、および、これらのものを添加していない試験培地（コントロール培地）で各ウェル内の増殖培地をそれぞれ置換した。このとき、組成物１、比較組成物１、２の各ウェル内での終濃度は、１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬまたは０．０１ｍｇ／ｍＬとした。その後、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１日間培養を行い、培養後の各ウェル内の生細胞数を測定するとともに、これとは別に、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３日間培養を行い、培養後の各ウェル内の生細胞数を測定した。ここで、生細胞数の測定は、生細胞数測定試薬SFによるwst-8法にて行った。また、平均値と標準誤差を求めるため同様の試験を５回行った。
各試験培地を添加してから１日間培養した後の相対生細胞数の測定結果を図１に示し、各試験培地を添加してから３日間培養した後の相対生細胞数の測定結果を図２に示す。図１、２において、「相対生細胞数」はコントロール培地の生細胞数を１００％として計算した各試験培地の生細胞数の相対値であり、平均値±標準誤差で示した。また、Student’st-testを用いて両側検定を行い、危険率ｐが０．０５未満であることをもって有意差有りと判定した。図１、２中、「＊」はｐ＜０．０５、「＊＊」はｐ＜０．０１、「＊＊＊」はｐ＜０．００１であることをそれぞれ示す。
図１、２に示されているように、アスコルビン酸２−グルコシド非存在下で得たプロテアーゼ分解生成物を含有する比較組成物１の試験培地は、１日間培養後では、コントロール培地に対する生細胞数の有意差は認められず、３日間培養後においては、むしろコントロール培地よりも生細胞数が減少した。比較組成物１にアスコルビン酸２−グルコシドを加えた比較組成物２の試験培地は、１日間培養後では、コントロール培地に対して若干の生細胞数の増加が認められるものの、３日間培養後においては、コントロール培地よりも生細胞数が減少した。
一方、アスコルビン酸２−グルコシド存在下で得たプロテアーゼ分解組成物を含有する組成物１の試験培地は、１日間培養後および３日間培養後のいずれにおいても、コントロール培地に対して顕著な生細胞数の増加が認められた。このことから、組成物１は、非常に高い繊維芽細胞増殖促進作用を示すことを確認することができた。
【００６３】
（３）コラーゲン産生促進試験
培養した繊維芽細胞を、５×１０３cells/0.1ｍL/ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１日間培養した。続いて、組成物１またはＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを添加した各試験培地、および、これらのものを添加していない試験培地（コントロール培地）で各ウェル内の増殖培地をそれぞれ置換した。このとき、組成物１およびＬ−アスコルビン酸２−グルコシドの各ウェル内での終濃度は１ｍｇ／ｍＬとした。その後、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３日間培養した後、各ウェル内の試験培地の上清を回収し、ヒトコラーゲンタイプ１ ELISA kitを用いて上清中のI型コラーゲンの濃度を測定した。また、同様の試験を５回行い、それらのコラーゲン濃度の平均値を求めた。その結果を表４に示す。
【００６４】
【表４】
2019182768.tif 000007
【００６５】
表４に示しているように、アスコルビン酸２−グルコシド存在下で得たプロテアーゼ分解組成物を含有する組成物１の試験培地は、コントロール培地に比べてコラーゲン濃度が各段に高く、アスコルビン酸２−グルコシドの試験培地のコラーゲン濃度も上回るものであった。このことから、組成物１は、高いコラーゲン産生促進作用を有することも確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、繊維芽細胞増殖促進作用とコラーゲン産生促進作用が高い組成物を低コストで製造することができる。このため、本発明によれば、創傷治癒を効果的に促進し、皮膚のコンディションの改善効果が期待される薬剤を安価で提供することが可能になる。このため、本発明は産業上の利用可能性が高い。
【図１】
2019182768.tif 000008
【図２】
2019182768.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月7日(2018.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の存在下で、鶏冠をプロテアーゼで分解することを特徴とするプロテアーゼ分解組成物の製造方法。
【請求項２】
前記アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩として、２位の水酸基の水素原子がグリコシル基で置換されたものを用いる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を前記組成物に添加する工程を有する、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の前記組成物における添加量が、その添加後の組成物全量に対して０．５〜４０質量％である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を、前記組成物にプロテアーゼを接触させる前に添加する、請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記鶏冠を１辺０．５ｃｍ角以上に小片化する工程と、小片化した前記鶏冠に、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の溶液を添加し、混合して混合物を得る工程と、前記混合物にプロテアーゼを添加して、小片化した前記鶏冠をプロテアーゼで分解する工程を有する、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の存在下で、鶏冠をプロテアーゼで分解することを特徴とする繊維芽細胞増殖促進剤の製造方法。
【請求項８】
アスコルビン酸、アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の存在下で、鶏冠をプロテアーゼで分解することを特徴とするコラーゲン産生促進剤の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月10日(2018.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２位の水酸基の水素原子がグリコシル基またはリン酸基で置換されたアスコルビン酸、２位の水酸基の水素原子がグリコシル基またはリン酸基で置換され、且つ、６位の水酸基の水素原子がアシル基,リン酸基またはグリコシル基で置換されたアスコルビン酸エステル、またはこれらの塩の存在下で、鶏冠をプロテアーゼで分解することを特徴とするプロテアーゼ分解組成物の製造方法。
【請求項２】
前記アスコルビン酸、前記アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩として、２位の水酸基の水素原子がグリコシル基で置換されたものを用いる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記アスコルビン酸、前記アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を前記組成物に添加する工程を有する、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記アスコルビン酸、前記アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の前記組成物における添加量が、その添加後の組成物全量に対して０．５〜４０質量％である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記アスコルビン酸、前記アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を、前記組成物にプロテアーゼを接触させる前に添加する、請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記鶏冠を１辺０．５ｃｍ角以上に小片化する工程と、小片化した前記鶏冠に、前記アスコルビン酸、前記アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の溶液を添加し、混合して混合物を得る工程と、前記混合物にプロテアーゼを添加して、小片化した前記鶏冠をプロテアーゼで分解する工程を有する、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
２位の水酸基の水素原子がグリコシル基またはリン酸基で置換されたアスコルビン酸、２位の水酸基の水素原子がグリコシル基またはリン酸基で置換され、且つ、６位の水酸基の水素原子がアシル基,リン酸基またはグリコシル基で置換されたアスコルビン酸エステル、またはこれらの塩の存在下で、鶏冠をプロテアーゼで分解することを特徴とする繊維芽細胞増殖促進剤の製造方法。
【請求項８】
２位の水酸基の水素原子がグリコシル基またはリン酸基で置換されたアスコルビン酸、２位の水酸基の水素原子がグリコシル基またはリン酸基で置換され、且つ、６位の水酸基の水素原子がアシル基,リン酸基またはグリコシル基で置換されたアスコルビン酸エステル、またはこれらの塩の存在下で、鶏冠をプロテアーゼで分解することを特徴とするコラーゲン産生促進剤の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月23日(2018.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２位の水酸基の水素原子がグリコシル基またはリン酸基で置換されたアスコルビン酸、２位の水酸基の水素原子がグリコシル基またはリン酸基で置換され、且つ、６位の水酸基の水素原子がアシル基,リン酸基またはグリコシル基で置換されたアスコルビン酸エステル、またはこれらの塩の存在下で、鶏冠をプロテアーゼで分解することを特徴とするプロテアーゼ分解組成物の製造方法。
【請求項２】
前記アスコルビン酸、前記アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩として、２位の水酸基の水素原子がグリコシル基で置換されたものを用いる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記アスコルビン酸、前記アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を前記鶏冠に添加する工程を有する、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記アスコルビン酸、前記アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の添加量が、その添加後の組成物全量に対して０．５〜４０質量％である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記アスコルビン酸、前記アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩を、前記鶏冠にプロテアーゼを接触させる前に添加する、請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記鶏冠を１辺０．５ｃｍ角以上に小片化する工程と、小片化した前記鶏冠に、前記アスコルビン酸、前記アスコルビン酸エステルまたはこれらの塩の溶液を添加し、混合して混合物を得る工程と、前記混合物にプロテアーゼを添加して、小片化した前記鶏冠をプロテアーゼで分解する工程を有する、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
２位の水酸基の水素原子がグリコシル基またはリン酸基で置換されたアスコルビン酸、２位の水酸基の水素原子がグリコシル基またはリン酸基で置換され、且つ、６位の水酸基の水素原子がアシル基,リン酸基またはグリコシル基で置換されたアスコルビン酸エステル、またはこれらの塩の存在下で、鶏冠をプロテアーゼで分解することを特徴とする繊維芽細胞増殖促進剤の製造方法。
【請求項８】
２位の水酸基の水素原子がグリコシル基またはリン酸基で置換されたアスコルビン酸、２位の水酸基の水素原子がグリコシル基またはリン酸基で置換され、且つ、６位の水酸基の水素原子がアシル基,リン酸基またはグリコシル基で置換されたアスコルビン酸エステル、またはこれらの塩の存在下で、鶏冠をプロテアーゼで分解することを特徴とするコラーゲン産生促進剤の製造方法。