(57)【要約】【課題】  糖尿病性腎症の予防あるいは治療が可能な薬剤を提供すること。【解決手段】  RARγアゴニストを有効成分として含む、糖尿病性腎症の予防薬及び/又は治療薬。腎性貧血の予防薬及び/又は治療薬、メサンギウム細胞におけるIV型コラーゲンの発現を抑制する薬剤、メサンギウム細胞におけるBMP4の発現を抑制する薬剤、腎尿細管間質における線維化を抑制する薬剤も提供される。【選択図】  図2C
2019182836.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
RARγアゴニストを有効成分として含む、糖尿病性腎症の予防薬及び/又は治療薬。
【請求項２】
RARγアゴニストが、Palovarotene、3-Fluoro-4-(2-hydroxy-2-(5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8,-tetrahydronaphthalen-2-yl)acetamido)benzoic acid、4-[7-(1-Adamantyl)-6-hydroxynaphthalen-2-yl]benzoic acid、それらのエステル及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項１記載の予防薬及び/又は治療薬。
【請求項３】
糖尿病性腎症が２型糖尿病由来である請求項１記載の予防薬及び/又は治療薬。
【請求項４】
RARγアゴニストを有効成分として含む、腎性貧血の予防薬及び/又は治療薬。
【請求項５】
RARγアゴニストを有効成分として含む、メサンギウム細胞におけるIV型コラーゲンの発現を抑制する薬剤。
【請求項６】
RARγアゴニストが、Palovarotene、4-[7-(1-Adamantyl)-6-hydroxynaphthalen-2-yl]benzoic acid、それらのエステル及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項５記載の薬剤。
【請求項７】
RARγアゴニストを有効成分として含む、メサンギウム細胞におけるBMP4の発現を抑制する薬剤。
【請求項８】
RARγアゴニストが、Palovarotene、3-Fluoro-4-(2-hydroxy-2-(5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8,-tetrahydronaphthalen-2-yl)acetamido)benzoic acid、それらのエステル及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項７記載の薬剤。
【請求項９】
RARγアゴニストを有効成分として含む、腎尿細管間質における線維化を抑制する薬剤。
【請求項１０】
RARγアゴニストが、Palovarotene、又はPalovaroteneのエステル及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項９記載の薬剤。
【請求項１１】
尿細管間質細胞におけるpSmad2/3の発現を抑制する請求項９記載の薬剤。
【請求項１２】
腎尿細管間質における線維化が糖尿病性腎症由来である請求項９記載の薬剤。
【請求項１３】
投与形態が経口投与又は非経口投与である、請求項１〜１２のいずれかに記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性腎症の予防薬及び／又は治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
でんぷんなどの糖質（炭水化物）は、我々の生命を維持する栄養素として最も大切なものの一つで、糖質は消化されてブドウ糖（グルコース）となり、血液中から全身の細胞に取り込まれて、主なエネルギー源として利用される。血液中のブドウ糖を血糖といい、食事などで炭水化物を摂取すると血糖値は高くなり、一方、運動などによりブドウ糖がエネルギーとして消費されると血糖値は低くなる。健康な人の場合、血糖値はインスリンやインスリンと逆の働きをもつホルモンのバランスにより、一定の範囲内にコントロールされているため、食事や運動をしても血糖値が極端に変動することはない。
【０００３】
糖尿病とは、インスリンの作用が十分でないため、ブドウ糖が有効に使用されないことにより、血糖値が高くなっている状態のことで、放置すると様々な影響が出てくる。糖尿病は、その原因によって、1型糖尿病、2型糖尿病、特定の原因によるその他の糖尿病、妊娠糖尿病の4つのタイプに分けられる。この中で、特に2型糖尿病が患者数の観点から最も重要である。
【０００４】
2型糖尿病は、インスリンの分泌が少ない、あるいは働きが悪いなどの原因で起こる。主に中高年以降にみられるが、近年は若年層の発症も増加している。日本の場合は、糖尿病患者の約90%が2型糖尿病とされている。2型糖尿病は、遺伝的な体質に過食（特に高脂肪食）、運動不足、肥満、ストレスなどの生活習慣や加齢といった要因が加わり、発症するとされている。また、肥満がなくても、内臓脂肪が増えるメタボリックシンドロームと呼ばれる状態になると発症しやすくなる。
【０００５】
2型糖尿病は、気づかないうちに発症し、ゆっくりと進行するので、症状が無い状態のまま、糖尿病が進行していることがある。そして、症状が無いため血糖コントロールを行わないと、以下に示す合併症を引き起こす。
【０００６】
合併症は、細血管症と大血管症に大きく分けることができる。細血管症は、細い血管にみられる糖尿病に特徴的な合併症で、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害の3つのタイプ（糖尿病の3大合併症と呼ばれる）がある。大血管症は、大きな血管の病気である動脈硬化により起こる合併症で、脳卒中、心筋梗塞、抹消動脈性疾患（足の壊疽など）に分けることができる。
【０００７】
厚生労働省の平成28年「国民健康・栄養調査」（http://www.seikatsusyukanbyo.com/statistics/2017/009436.php）(非特許文献1)によると、「糖尿病が強く疑われる者」の割合は、12.1%で、約1000万人と推計された。また、「糖尿病の可能性を否定できない者」の割合も12.1%であり、約1000万人と推計された。すなわち、糖尿病有病者と糖尿病予備軍は、いずれも約1000万人であると推計された。
【０００８】
国際糖尿病連合（IDF）の発表（糖尿病アトラス  第7番：http://www.diabetesatlas.org/）(非特許文献2)によると、世界の糖尿病人口は爆発的に増加し続けており、2015年時点で、糖尿病有病者数は4億1500万人にのぼり、前年より2830万人増加した。そして、有効な対策を施さないと、2040年までに6億4200万人に増加すると予測している。2015年の20- 79歳の成人の糖尿病有病率は8.8%で、11人に1人が糖尿病有病者であると推定されている。糖尿病関連の医療費は約6730億ドルで、世界の主な国で全医療費の5-20%を占める。糖尿病の医療費は2040年までに8020億ドルに増加すると予測されている。
【０００９】
上述したように、糖尿病患者の爆発的な増加とその医療費の爆発的な増加は、世界的に大きな問題となっているため、様々な糖尿病治療薬が開発されている。その中で、糖尿病の主な治療としては、血糖コントロールと降圧療法がある。血糖コントロールは、低カロリー食、運動療法が基本であるが、糖尿病薬（DPP-4阻害薬、GLP-1受容体作動薬、SGLT2阻害薬、SU剤、αグルコシダーゼ阻害薬、ビグアナイド、速攻型インスリン分泌促進薬、インスリン抵抗性改善薬、配合薬など）の服用やインスリンの注射も行われうる。降圧療法としては、アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害薬、アンジオテンシンII受容体拮抗薬（ARB）の投与、場合によっては、カルシウム拮抗薬、利尿薬などの他の種類の降圧薬の投与）などがある。
【００１０】
一方、上述の糖尿病の3大合併症の中で、糖尿病性腎症は、症状が進むと血液中に老廃物がたまり、腎不全や尿毒症などの生命にかかわる重篤な症状を引き起こす。そして、腎不全になってしまうと人工透析が必要となる。近年、新規に透析療法に導入されるケースの原疾患のうち40％以上が糖尿病性腎症であり（http://www.jsdt.or.jp/overview_confirm.html）(非特許文献3)、2008年以降ほぼ横ばいで推移している（図説 わが国の慢性透析療法の現況 2014年12月31日現在、日本透析医学会発行2015年12月1日）。
【００１１】
日本の場合、2016年の時点で、透析患者が約32万人おり、年間5000人のペースで増加を続けている。患者数の増加のスピードは、高齢化のスピードとほぼ一致しており、2025年まで伸び続けると予想されている。透析患者1人に対して年間約500万円を国庫が負担しており、単純計算で合計1兆6000億円負担している。さらに、透析患者は合併症を起こすことが多いので、その分も含めれば、約2兆円の医療費（日本の医療費の5%）を透析患者に使っていることになり、透析患者数の抑制が医療経済の緊急課題の一つとなっている。それに対して、growth hormone(GH)/insulin-like growth factor(IGF1)系阻害薬（Curr Diabetes Rev (2011) 7(1) 50 (非特許文献4) ）、Jak/Stat系阻害薬（Diabetologia (2016) 59,1624 (非特許文献5); Diabetes (2009) 58, 469 (非特許文献6); Nephrol Dial Transplant (2015) 30, iv54 (非特許文献7)）、CCL2=MCP1/CCR2拮抗薬（Biochem Biophys Res Commun (2007) 360,772 (非特許文献8); Diabetes Care (2009) 32(3) 465 (非特許文献9)）、Nrf2-Keap1系活性化薬（N Engl J Med (2013) 369 (26) 2492 (非特許文献10); Nephrol Dial Transplant (2013) 28, 2841 (非特許文献11); N Engl J Med (2011) 365 (4) 327 (非特許文献12); Am J Physiol Renal Physiol (2013) 304, F808 (非特許文献13)）、Notch1系抑制薬（Nephrol Dial Transplant (2015) 30, iv54 (非特許文献7)）、ETAR拮抗薬（Nephrol Dial Transplant (2015) 30, iv54 (非特許文献7)）などによる糖尿病性腎症の治療の報告がなされているが、その作用は満足できるものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】厚生労働省  <糖尿病有病者と糖尿病予備群は、いずれも約1,000万人と推計> 2017 (http://www.seikatsusyukanbyo.com/statistics/2017/009436.php)
【非特許文献２】国際糖尿病連合(International Diabetes Federation)  <糖尿病アトラス  第7番>   2015  (http://www.diabetesatlas.org/)
【非特許文献３】日本透析医学会  <図説 わが国の慢性透析療法の現況 2014年12月31日現在、日本透析医学会発行2015年12月1日>   2015  (http://www.jsdt.or.jp/overview_confirm.html)
【非特許文献４】Kumar PA, Brosius FC, Menon R.   The Glomerular Podocyte as a Target of Growth Hormone Action: Implications for the Pathogenesis of Diabetic Nephropathy.   Current Diabetes Reviews 2011; 7(1):50-55.
【非特許文献５】Brosius FC, Tuttle KR, Kretzler M.   JAK inhibition in the treatment of diabetic kidney disease.  Diabetologia 2016; 59(8):1624-1627.
【非特許文献６】Berthier CC, Zhang H, Schin ML, et al.          Enhanced Expression of Janus Kinase-Signal Transducer and Activator of Transcription Pathway Members in Human Diabetic Nephropathy.  Diabetes 2009; 58(2):469-477.
【非特許文献７】Zoja C, Zanchi C, Benigni A.   Key pathways in renal disease progression of experimental diabetes.   Nephrology, dialysis, transplantation 2015; 30(iv):54-59.
【非特許文献８】Kanamori H, Matsubara T, Mima A, et al.  Inhibition of MCP-1/CCR2 pathway ameliorates the development of diabetic nephropathy.  Biochemical and Biophysical Research Communications 2007; 360(4):772-777.
【非特許文献９】Zineh I, Beitelshees AL, Silverstein JH, et al.   Serum Monocyte Chemoattractant Protein-1 Concentrations Associate With Diabetes Status but Not Arterial Stiffness in Children With Type 1 Diabetes.  Diabetes Care 2009; 32(3):465-467.
【非特許文献１０】de Zeeuw D, Akizawa T, Audhya P, et al.   Bardoxolone Methyl in Type 2 Diabetes and Stage 4 Chronic Kidney Disease.  The New England Journal of Medicine 2013; 369(26):2492-2503.
【非特許文献１１】Heerspink HJL, Chertow GM, Akizawa T, et al.   Baseline characteristics in the Bardoxolone methyl EvAluation in patients with Chronic kidney disease and type 2 diabetes mellitus: the Occurrence of renal eveNts (BEACON) trial.   Nephrology, dialysis, transplantation 2013; 28(11):2841-2850.
【非特許文献１２】Pergola PE, Raskin P, Toto RD, et al.  Bardoxolone Methyl and Kidney Function in CKD with Type 2 Diabetes.   The New England Journal of Medicine 2011; 365(4):327-336.
【非特許文献１３】Zoja C, Corna D, Nava V, et al.  Analogs of bardoxolone methyl worsen diabetic nephropathy in rats with additional adverse effects.  American journal of physiology. Renal physiology 2013; 369(26):F808-819.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、糖尿病性腎症の予防あるいは治療が可能な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
そこで、発明者らは、発明者らが見出した糖尿病性腎症の発症機序に基づき、糖尿病性腎症の治療薬の開発を行い、治療薬候補物質を見出し、発明を完成させた。
【００１５】
糖尿病性腎症とは、慢性的な高血糖状態により引き起こされる細小血管障害の一つである。病理学的には腎糸球体血管基底膜の肥厚、メサンギウム領域の拡大を呈し、臨床的には蛋白尿（微量アルブミン尿）、高血圧、浮腫などの症候を呈して最終的には糸球体の硬化病変から腎不全に陥ることが多い。また、糖尿病では糸球体以外の組織にも、細動脈硬化症、尿細管間質の変性・線維化などの異常が認められ、糸球体の病変をより悪化させている。すなわち、一定期間の糖尿病罹患の後、蛋白尿、高血圧、腎機能障害が徐々に進行していく病態を腎症と定義できる。本発明者らは、TGF-βスーパーファミリー系のI型レセプターであるALK(activing receptor-like kinase)の下流分子である核内転写因子Smad1が、IV型コラーゲンα1、α2鎖遺伝子を直接転写活性化させる因子であること、そしてこれらが糖尿病性腎症における糸球体のメサンギウム基質拡大の最も重大な成因分子であることを証明した1,2。Smad1はSTZ（ストレプトゾトシン）誘発糖尿病ラットにおいてメサンギウム基質拡大を誘導する最も重要な因子である3。さらに、糖尿病の動物モデルにおいてSmad1シグナル経路が、その病変形成と強い関連があるということを種々の研究で示した4-10。
【００１６】
さらに、本発明者らは、BMP4 (bone morphogenetic protein 4)/ALK3経路を介したSmad1シグナル経路の活性化が、糖尿病性腎症の病理学的特徴であるメサンギウム領域の拡大に重要な役割を示すことを見出した11。以下にその作用機序の詳細を示す。高血糖の状態が続くと、血中にAGE (advanced glycation end products)が増加する。そして、この血中のAGEがメサンギウム細胞上のAGE受容体に結合すると、メサンギウム細胞のBMP4の産生が増加する。そして、メサンギウム細胞上のALK3受容体に、BMP4が結合すると、Smad1のリン酸化が起こり、2分子のリン酸化Smad1と1分子のSmad4が3量体を形成し、細胞質から核内へ移行し、標的遺伝子の一つであるIV型コラーゲンの転写を開始する。そして、このIV型コラーゲンの産生の増加が、メサンギウム基質の拡大につながる（図1）。
【００１７】
上記の作用機序に基づけば、このBMP4/ALK3/Smad1/ IV型コラーゲン経路を抑制するような化合物は、糖尿病性腎症の予防・治療薬となり得ると考えられる。BMP4/ALK3はTGF-βスーパーファミリー系の一員である11。近年RAR（Retinoic acid receptor）アゴニストがTGF-βシグナル伝達抑制することが報告されている12。以上のことから、様々なRARアゴニストに関して評価することを計画した。
【００１８】
RARは三つのサブタイプα、β、およびγを有する。RARのアゴニスト活性を有する化合物がサブタイプに対する特異性又は選択性を有することは、副作用リスクの低減につながることが期待される（特許文献1）。その中で、RARαアゴニストなどレチノイド又は4−［（5，6，7，8−テトラヒドロ−5，5，8，8−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルバモイル］安息香酸は糖尿病性網膜症又は加齢黄斑変性の予防及び／又は治療するための医薬として開示されている（特許文献2、特許文献3と特許文献4を参照）。一方、Palovaroteneを代表とするRARγアゴニストが、肺気腫、癌、及び皮膚疾患に有用であること（特許文献5）や、神経性疼痛に有用であること（特許文献6）が示明されている。さらに、Palovaroteneが筋肉修復に有用であることが特許文献7に記載されている。しかしながら、これまでにPalovaroteneに関して糖尿病性腎症に対する効果について検討した報告はなく、示唆する文献もない。
【００１９】
一方、糖尿病が誘発した尿細管間質病変はTGF-βがSmad2/3をリン酸化して、αSMAを誘導し線維化を誘発する13, 14。尿細管間質病変は糖尿病性腎症が進展した病態の一つである。先行研究は、「高血糖とそれに引き続く糸球体過剰濾過や糖尿病に高頻度に合併する高血圧などの血行動態異常が、最終的にネフロン数の減少、腎間質の線維化などの組織学的変化を加速させ、腎不全が進行する15」ことを示した。
【００２０】
尿細管間質病変は糸球体病変と同じ、糖尿病性腎症の重要な病態の一つである。しかしながら、これまで糖尿病性腎症予防・治療薬の探索において、糸球体と尿細管間質の病変を同時に評価することにより、さらに有効な予防・治療薬を探索する試みはほとんどない。そこで、培養メサンギウム細胞を用いたin vitro評価系を構築し、RARγアゴニストを中心として、BMP4/ALK3/Smad1/IVコラーゲン経路、又はSmad2/3のリン酸化を抑制する低分子化合物の探索を実施した結果、RARγアゴニストがこれらの経路又はリン酸化を抑制できることを見出し、本発明を完成させた。BMP4/ALK3/Smad1/ IVコラーゲン経路やSmad2/3リン酸化を抑制できる化合物は、糖尿病と関連する合併症、特に糖尿病性腎症の予防及び/又は治療に有用である。
また、近年、尿細管間質線維化の病巣を構築する線維芽細胞（少なくともその一部）がエリスロポエチン（EPO）産生細胞に由来しており、線維芽細胞へと形質転換する際にEPO産生能を喪失することから、間質線維化の進行と腎性貧血の進展に共通するメカニズムが想定されている14。この仮説によれば、間質線維化の予防および/または治療薬は、腎性貧血の有効な予防および/または治療薬となり得ると考えられる。
【００２１】
本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）RARγアゴニストを有効成分として含む、糖尿病性腎症の予防薬及び/又は治療薬。
（２）RARγアゴニストが、Palovarotene、3-Fluoro-4-(2-hydroxy-2-(5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8,-tetrahydronaphthalen-2-yl)acetamido)benzoic acid、4-[7-(1-Adamantyl)-6-hydroxynaphthalen-2-yl]benzoic acid、それらのエステル及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である（１）記載の予防薬及び/又は治療薬。
（３）糖尿病性腎症が２型糖尿病由来である（１）記載の予防薬及び/又は治療薬。
（４）RARγアゴニストを有効成分として含む、腎性貧血の予防薬及び/又は治療薬。
（５）RARγアゴニストを有効成分として含む、メサンギウム細胞におけるIV型コラーゲンの発現を抑制する薬剤。
（６）RARγアゴニストが、Palovarotene、4-[7-(1-Adamantyl)-6-hydroxynaphthalen-2-yl]benzoic acid、それらのエステル及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である（５）記載の薬剤。
（７）RARγアゴニストを有効成分として含む、メサンギウム細胞におけるBMP4の発現を抑制する薬剤。
（８）RARγアゴニストが、Palovarotene、3-Fluoro-4-(2-hydroxy-2-(5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8,-tetrahydronaphthalen-2-yl)acetamido)benzoic acid、それらのエステル及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である（７）記載の薬剤。
（９）RARγアゴニストを有効成分として含む、腎尿細管間質における線維化を抑制する薬剤。
（１０）RARγアゴニストが、Palovarotene、又はPalovaroteneのエステル及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である（９）記載の薬剤。
（１１）尿細管間質細胞におけるpSmad2/3の発現を抑制する（９）記載の薬剤。
（１２）腎尿細管間質における線維化が糖尿病性腎症由来である（９）記載の薬剤。
（１３）投与形態が経口投与又は非経口投与である、（１）〜（１２）のいずれかに記載の薬剤。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の糖尿病性腎症の予防薬及び/又は治療薬の有効成分であるRARγアゴニスト、特にPalovarotene、それらのエステル又はそれらの塩は、腎尿細管間質における線維化を抑制することができ、糖尿病性腎症の発症の予防あるいは治療に有用であり、人工透析への移行を阻止できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】糖尿病性腎症の発症の分子機構を示す模式図である。
【図２Ａ】AGE刺激マウスメサンギウム細胞のTGF-β産生に対するPalovaroteneの効果。各グループ（１）無刺激条件、（２）AGE 300μg/mL、（３）AGE 300μg/mL + Palovarotene 0.5μM および（４）AGE 300μg/mL + Palovarotene 1μMを添加し、処理24時間後にAGPC法によるRNA抽出を行った。
【図２Ｂ】AGE刺激マウスメサンギウム細胞のBMP4産生に対するPalovaroteneの効果。各グループ（１）無刺激条件、（２）AGE 300μg/mL、（３）AGE 300μg/mL + Palovarotene 0.5μM および（４）AGE 300μg/mL + Palovarotene 1μMを添加し、処理24時間後にAGPC法によるRNA抽出を行った。
【図２Ｃ】AGE刺激マウスメサンギウム細胞のIV型コラーゲン（Col4α1）産生に対するPalovaroteneの効果。各グループ（１）無刺激条件、（２）AGE 300μg/mL、（３）AGE 300μg/mL + Palovarotene 0.5μM および（４）AGE 300μg/mL + Palovarotene 1μMを添加し、処理24時間後にAGPC法によるRNA抽出を行った。
【図３】ストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスに対するPalovaroteneの効果。（１）Ctrl.はコントロールのマウスの組織解剖結果、（２）Palo. Ctrl.はコントロールのマウスにPalovaroteneを投与した組織解剖結果、（３）DMはストレプトゾトシンを投与して糖尿病を惹起させたマウスの組織解剖結果および（４）DM+Paloは糖尿病を誘発されたマウスにPalovaroteneを投与した組織解剖結果。
【図４】腎臓尿細管間質線維化モデルとしての一側尿管結紮（UUO）マウスに対するPalovaroteneの効果。Control：尿管結紮していないマウスの腎臓のシリウスレッド染色による組織学的評価結果。UUO：尿管結紮後7日間飼育し、尿細管間質の線維化を惹起させたマウスの腎臓のシリウスレッド染色による組織学的評価結果。UUO+Palo：尿管結紮1日後からPalovarotene 1 mg/kgを6日間腹腔内投与したマウスの腎臓のシリウスレッド染色による組織学的評価結果。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、RARγアゴニストを有効成分として含む、糖尿病性腎症の予防薬及び/又は治療薬を提供する。
【００２５】
RARγアゴニストは、BMP4/ALK3/Smad1/ IV型コラーゲン経路を抑制する作用を有するものであるとよい。
【００２６】
本明細書において、「BMP4/ALK3/Smad1/ IV型コラーゲン経路」とは、BMP4が、ALK3/BMPRII（BMPのII型受容体）に結合し、Smad1をリン酸化して、IV型コラーゲンの産生を誘導する経路をいう16。その具体例を以下に示す：メサンギウム細胞をAGE (advanced glycation end product)存在下で培養すると、BMP4 (bone morphogenetic protein 4)の産生が増加する。さらに、メサンギウム細胞上のALK3/ BMPRII受容体に、BMP4が結合すると、Smad1のリン酸化が起こり、2分子のリン酸化Smad1と1分子のSmad4が3量体を形成し、細胞質から核内へ移行し、標的遺伝子の1つであるIV型コラーゲンの転写を開始する。このIV型コラーゲンの産生は、メサンギウム基質拡大の最も重要な要因であることが知られていることから、このBMP4/ALK3/Smad1/ IV型コラーゲン経路を抑制するような化合物は、糖尿病性腎症の予防・治療薬となり得ると考えられる。よって、本発明は、RARγアゴニストを有効成分として含む、メサンギウム細胞におけるIV型コラーゲンの発現を抑制する薬剤を提供する。また、本発明は、RARγアゴニストを有効成分として含む、メサンギウム細胞におけるBMP4の発現を抑制する薬剤も提供する。
【００２７】
また、本発明は、RARγアゴニストを有効成分として含む、糖尿病性腎症、特に糖尿病が誘発した尿細管間質病変（特に、線維化）の予防および/または治療薬を提供する。
【００２８】
RARγアゴニストは、TGF-β/smad2/3 /ECM経路に係るシグナルを抑制する作用を有するとよい。
【００２９】
本明細書において、「TGF-β/smad2/3 /ECM経路」とは、高血糖やAGEsによって，TGF-βが糸球体構成細胞および尿細管構成細胞から分泌され、TGF-β受容体に結合してSmad2/3のリン酸化を促進して、細胞外マトリックス（ECM）蛋白の過剰な蓄積を誘発し、尿細管間質線維化を引きおこす経路をいう。Smad2/3はTGF-β刺激によりリン酸化され、核移行転写活性因子として機能すると考えられている17。よって、本発明は、RARγアゴニストを有効成分として含む、腎尿細管間質における線維化を抑制する薬剤を提供する。この薬剤は、尿細管間質細胞におけるpSmad2/3の発現を抑制するものであるとよい。腎尿細管間質における線維化は、糖尿病性腎症由来であるとよい。
近年、尿細管間質線維化の病巣を構築する線維芽細胞（少なくともその一部）がエリスロポエチン（EPO）産生細胞に由来しており、線維芽細胞へと形質転換する際にEPO産生能を喪失することから、間質線維化の進行と腎性貧血の進展に共通するメカニズムが想定されている14。この仮説によれば、間質線維化の予防および/または治療薬は、腎性貧血の有効な予防および/または治療薬となり得ると考えられる。よって、本発明は、RARγアゴニストを有効成分として含む、腎性貧血の予防薬及び/又は治療薬も提供する。
【００３０】
糖尿病性腎症は、２型糖尿病に由来する腎症であるとよい。しかし、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。本発明は各類型糖尿病性腎症の予防及び/又は治療の適用が可能である。
【００３１】
本発明に係るRARγアゴニストとしては、以下の式（I）で表わされる4-[(E)-2-[5,5,8,8-Tetramethyl-3-(pyrazol-1-ylmethyl)-6,7-dihydronaphthalen-2-yl]ethenyl]benzoic acid（Palovarotene）や、以下の式（II）で表わされる6-[3-(1-Adamantyl)-4-hydroxyphenyl]-2-naphthalene carboxylic acid（O-Desmethyl Adapalene）や、以下の式（III）で表わされる3-Fluoro-4-(2-hydroxy-2-(5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8,-tetrahydronaphthalen-2-yl)acetamido)benzoic acid（BMS189961）や、以下の式（IV）で表わされる4-[7-(1-Adamantyl)-6-hydroxynaphthalen-2-yl]benzoic acid（CD1530）や、これら化合物（Palovarotene、O-Desmethyl Adapalene、BMS189961、CD1530）のエステルや、これら化合物（Palovarotene、O-Desmethyl Adapalene、BMS189961、CD1530）の塩等を例示することができる。
【００３２】
【化１】
2019182836.tif 000003
Palovarotene
【００３３】
【化２】
2019182836.tif 000004
O-Desmethyl Adapalene
【００３４】
【化３】
2019182836.tif 000005
BMS189961
【００３５】
【化４】
2019182836.tif 000006
CD1530
【００３６】
また、本発明の他の態様としては、RARγアゴニストを対象に投与することを特徴とする糖尿病性腎症の予防及び/又は治療方法や、糖尿病性腎症の予防薬及び/又は治療薬として使用するためのRARγアゴニストや、RARγアゴニストの糖尿病性腎症の予防薬及び/又は治療薬の調製における使用を挙げることができる。
本発明のさらに別の態様としては、RARγアゴニストを対象に投与することを特徴とする腎性貧血の予防及び/又は治療方法や、腎性貧血の予防薬及び/又は治療薬として使用するためのRARγアゴニストや、RARγアゴニストの腎性貧血の予防薬及び/又は治療薬の調製における使用を挙げることができる。
【００３７】
本発明の糖尿病性腎症及び／又は腎性貧血の予防薬及び/又は治療薬の有効成分の一つとして利用可能である、Palovaroteneは特許文献5に、O-Desmethyl Adapaleneは次の文献（Sun SY. et al., Cancer Research (2002)）18及び特許文献8に、BMS189961は特許文献8に、CD1530は次の文献（Shimono K. et al., Nat Med. 17(4): 454-460 (2011)）19に記載された公知の化合物であり、かかる化合物、そのエステル又はその塩は、常法に準じて製造することができるほか、市販品を購入することができる。後述の実施例で使ったPalovaroteneについてはToronto社から、O-Desmethyl AdapaleneについてはToronto社から、BMS189961についてはAxon Medchem社から、CD1530についてはApexBio社から購入した。
【００３８】
本発明の糖尿病性腎症及び／又は腎性貧血の予防薬及び/又は治療薬の有効成分である、RARγアゴニストのエステルにおけるエステルとは、生体内における生理条件下で酵素等による反応によりRARγアゴニストに変換されるエステルであれば特に制限はなく、そのようなエステルとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ヘキサノール若しくはドデカノール等の一級アルコールとのエステル；イソプロパノール、ｓ−ブタノール若しくは１−エチルプロパノール等の二級アルコールとのエステル；t−ブタノール若しくは１−メチル−１−エチルプロパノール等の三級アルコールとのエステル；又は２−アミノエタノール等のアミノアルコールとのエステル等が挙げられる。
【００３９】
上記のエステルは、公知の方法によってRARγアゴニスト又はその合成中間体から製造することができる。
【００４０】
本発明の糖尿病性腎症及び／又は腎性貧血の予防薬及び/又は治療薬の有効成分である、RARγアゴニストの塩における塩としては、医薬として許容される塩であれば特に制限はなく、こうした塩には、（１）酸付加塩として、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩若しくはリン酸塩等の無機酸塩；又は酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、安息香酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、グルタミン酸塩若しくはアスパラギン酸塩等の有機酸塩、或いは（２）塩基性塩として、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩若しくはマグネシウム塩等の金属塩；アンモニウム塩等の無機塩；又はトリエチルアミン塩若しくはグアニジン塩等の有機アミン塩等が挙げられる。
【００４１】
本発明の糖尿病性腎症及び／又は腎性貧血の予防薬及び/又は治療薬は、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合して製造される、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、経皮吸収剤、坐剤、軟膏剤、ローション、吸入剤又は注射剤等の形態で、経口、又は非経口（静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、経気道投与、皮内投与又は皮下投与）で投与することができる。例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は常法により製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有してもよい。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、庶糖、ステアリン酸マグネシウムなどがあげられる。
【００４２】
非経口投与のための組成物としては、たとえば、注射剤、坐剤などがあげられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤型であるとよい。かかる注射剤は常法、すなわちRARγアゴニストを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえば、アルコール（たとえば、エタノール）、ポリアルコール（たとえば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤（たとえば、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil））などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は通常適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、Smad1の発現を抑制する作用を有する物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製することができる。
【００４３】
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、有効成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されるとよい。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などがあげられる。
【００４４】
これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、矯味矯臭剤又は希釈剤等の添加剤を使用して、周知の方法で製造される。
【００４５】
賦形剤は、例えば、有機系賦形剤又は無機系賦形剤が挙げられる。有機系賦形剤は、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール若しくはソルビトール等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン若しくはデキストリン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；又はプルラン等が挙げられる。無機系賦形剤は、例えば、軽質無水珪酸；又は硫酸カルシウム等の硫酸塩等が挙げられる。
【００４６】
滑沢剤は、例えば、ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム若しくはステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス若しくはゲイロウ等のワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；Ｄ，Ｌ−ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム；無水珪酸若しくは珪酸水和物等の珪酸類；又は上記の賦形剤におけるデンプン誘導体等が挙げられる。
【００４７】
結合剤は、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール又は上記の賦形剤で示された化合物等が挙げられる。
【００４８】
崩壊剤は、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム若しくは内部架橋カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；架橋ポリビニルピロリドン；又はカルボキシメチルスターチ若しくはカルボキシメチルスターチナトリウム等の化学修飾されたデンプン若しくはセルロース誘導体等が挙げられる。
【００４９】
乳化剤は、例えば、ベントナイト若しくはビーガム等のコロイド性粘土；ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤；又はポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル若しくはショ糖脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤等が挙げられる。
【００５０】
安定剤は、例えば、メチルパラベン若しくはプロピルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール若しくはフェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール若しくはクレゾール等のフェノール類；チメロサール；無水酢酸；又はソルビン酸が挙げられる。
【００５１】
矯味矯臭剤は、例えば、サッカリンナトリウム若しくはアスパルテーム等の甘味料；クエン酸、リンゴ酸若しくは酒石酸等の酸味料；又はメントール、レモンエキス若しくはオレンジエキス等の香料等が挙げられる。
【００５２】
希釈剤は、通常希釈剤として使用される化合物であり、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ショ糖、硫酸カルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、デンプン、ポリビニルピロリドン又はこれらの混合物等が挙げられる。
【００５３】
本発明の糖尿病性腎症及び／又は腎性貧血の予防または治療薬の投与量は、剤型、投与すべき患者の症状の軽重、年齢、体重、医師の判断等に応じて適宜変えることができるが、経口剤の場合、一般には、成人に対し1日あたり、有効成分の量に換算して、0.01〜5000mg、好ましくは0.1〜2500mg、より好ましくは0.5〜1000mgを1 回又は数回に分けて投与することができる。
【００５４】
本発明の糖尿病性腎症及び／又は腎性貧血の予防薬及び/又は治療薬としては、RARγアゴニストを有効成分とするものであれば特に制限されない。Palovaroteneを代表とするRARγアゴニストはTGF-β、BMP4、Col4α1の発現を抑制するため、メサンギウム基質拡大を抑制することが期待される。
【００５５】
上記の作用機序に基づけば、BMP4/ALK3/Smad1/IV型コラーゲン経路、又はTGF-β/smad2/3 /ECM経路を抑制出来る化合物、たんぱく質等阻害剤は、Palovaroteneと類似効果を出ることを予想できる。例えば、Zhangらは、Nogginは糖尿病マウスのBMP4の表現を抑制できることを証明した20。Macielらは、GREM1はBMP4活性を抑制できることを示した21。Yuらは、Dorsomorphin はBMP4誘導したSmad1リン酸化を抑制できることを示した、さらにDorsomorphin はBMP4シグナル伝達経路相関ターゲットALK3またはSmad1抑制できることを証明した22。Yuらは、最適化された分子LDN-193189 はBMP4を介した Smad1とALK3の転写活性を抑制することを示唆した23。Xuらは、CalmodulinとSmad1のN-terminal domainを作用してSmad1の活性を抑制することを証明した24。他の研究も、Smad6はSmad1関連のRunx1活性を抑制するのでBMP4シグナル伝達経路を抑制することを示した25。一方、先行研究はChondroitin-4-sulfate (C4S) は IV型コラーゲンの分解を抑制できること示唆した26。他の阻害物質、例えば、NeelyらはDMH-1がNogginを置き換えてALK3を抑制できること27、ΔSmad73TEVGRはSmad1のリン酸化を抑制できること28を示唆した。BMP4/ALK3/Smad1/ IV型コラーゲン経路に関係する重要な標的分子であるBMP4、ALK3、Smad1およびIV型コラーゲンの阻害剤等について表１にまとめた。
【００５６】
表1. BMP4/ALK3/Smad1/ IV型コラーゲン経路相関シグナルの阻害剤一覧
2019182836.tif 000007
【００５７】
一方、BourgeoisらはMAN1の過剰発現はSmad2およびSmad3の脱リン酸化を誘導することを示した29。TGF-β/smad2/3 /ECM経路の阻害剤等について表2にまとめた。
【００５８】
表2. TGF-β/smad2/3 /ECM経路の阻害剤一覧
2019182836.tif 000008
【００５９】
上記阻害剤、分子、シグナルだけではなくて、BMP4/ALK3/Smad1/IV型コラーゲン経路、又はTGF-β/smad2/3 /ECM経路を阻害できる物質は、本発明と同じ効果を予想できる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。なお、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００６１】
〔実施例１〕
＜マウスメサンギウム細胞に対するPalovaroteneの作用の検討＞
（方法）
４週齢の野生型C57BL/6JマウスからDavies Mらの方法(Kidney Int. 1994;45(2):320-7)36に準じて糸球体を単離、初期培養を行い、マウスメサンギウム細胞株を確立した。細胞刺激に用いるためのAGEはDoi Tらの方法(Proc, Nalt. Acad. Sci. U.S.A. 1992; 89:2873-2877)37に準じて作製した。
マウスメサンギウム培養細胞をコンフルエンスまで増殖させ、Opti-MEM(Invitrogen)にて血清飢餓を行い、(1)無刺激条件、(2)AGE 300μg/mL、(3)AGE 300μg/mL + Palovarotene 0.5μM および(4)１μMを添加し、２４時間後にAGPC法によるRNA抽出を行った。そのRNAを用いてRT-quantitative PCRを行い、サイクル比較法（ΔΔCt法）にてmRNA発現レベルを評価した。評価対象遺伝子は、TGF-β1、BMP4、及びCol4α1とした。
結果を図2に示す。
【００６２】
（結果）
RARアゴニストがTGF-βシグナル伝達を抑制するという知見に基づき、まず、PalovaroteneがAGE刺激によるTGF-βの発現を抑制するか否かを検討したところ、図2A に示すように、AGE刺激により発現促進されたTGF-βの発現が強く抑制された。
次いで、AGE刺激によりメサンギウム細胞のBMP4の発現が増加するとの知見に基づき、PalovaroteneのBMP4発現に対する作用を検討したところ、図2Bに示すように、Palovaroteneは、AGE刺激により増加したBMP4発現を用量依存的に抑制し、1 μMの濃度でほぼ完全に抑制することが明らかになった。
さらに、メサンギウム領域の拡大の原因因子であるCol4α1（IV型コラーゲン）の発現に対するPalovaroteneの作用を検討したところ、AGE刺激により増加したCol4α1（IV型コラーゲン）の産生を、0.5 μMの濃度においても、完全に抑制することが判明した（図2C）。
以上の結果より、Palovaroteneは、BMP4の発現の抑制を介して、BMP4/ALK3を介したIV型コラーゲンの発現を抑制できる可能性が示唆された。
そこで、この可能性を検討するために、糖尿病モデルマウスを用いたPalovaroteneの評価を実施した。
【００６３】
〔実施例２〕
＜STZ誘発糖尿病マウスに対するPalovaroteneの作用の検討＞
（方法）
12〜15週齢のICRマウス（日本クレア社より購入）に１回あたり50mg/kgのストレプトゾトシン(Wako)を5日連続腹腔内投与(I.P.)を行い、糖尿病を惹起させた。ストレプトゾトシン投与４週間後から、高脂肪食HFD60（オリエンタル酵母工業）に切り替えるとともに、Palovaroteneを60μg/kgで週２回の腹腔内投与を開始し、その12週間後に解剖、組織学的評価を実施した。結果を図3に示す。
【００６４】
（結果）
図3に示すように、ストレプトゾトシンを投与した糖尿病マウス（DM）では、コントロールマウス（Ctrl）に比べ、糸球体メサンギウム領域の拡大（PAS染色）、Smad1の活性化（pSmad1）、Smad2/3の活性化（pSmad2/3）、およびIV型コラーゲン（Col4）の発現増加が観察された。さらに、糸球体ポドサイトの細胞間接合分子ネフリンの発現領域の低下（Nephrin）およびポドサイト細胞核に発現するWT1の減少（WT1）が観察された。以上の結果は、ストレプトゾトシンを投与した糖尿病マウスは、ヒトの糖尿病性腎症の病理組織学的変化をよく反映した優れたモデルマウスであることを示す。
そして、この糖尿病マウスにPalovaroteneを投与した（DM+Palo）場合には、糖尿病マウス（DM）に比べ、糸球体メサンギウム領域の拡大の抑制（PAS染色）、Smad1の活性化の抑制（pSmad1）、およびIV型コラーゲン発現の低下（Col4）が観察された。さらに、ネフリンの発現領域の低下抑制（Nephrin）およびポドサイト細胞核に発現するWT1の減少抑制（WT1）が観察された。
また、糖尿病マウスにPalovaroteneを投与した（DM+Palo）場合には、糖尿病マウス（DM）に比べ、Smad2/3のリン酸化が強く抑制されることが判明した。Smad2/3の活性化は糖尿病により誘発される尿細管間質病変を進展させる重要な因子である。Smad2/3のリン酸化を抑制する結果に基づいて、Palovaroteneは尿細管間質線維化を抑制することが示めされた。これを根拠に、Palovaroteneの糖尿病性腎症に対する予防又は治療能力は、糸球体ではSmad1のリン酸化を抑制し糸球体硬化病変を抑え、間質ではSmad2/3のリン酸化を抑制し間質線維化を抑えることを示す。
【００６５】
〔実施例３〕
＜腎臓尿細管間質線維化モデルとしての一側尿管結紮（UUO）マウスに対するPalovaroteneの効果＞
（方法）
一側尿管結紮（UUO：unilateral ureter obstruction）モデルは尿管結紮状態で７日間飼育し腎臓間質線維化を惹起さるモデルである。すなわち、片側背部切開により腎臓を腹膜外に露出させ、縫合糸にて1mm間隔で2〜３ヶ所の尿管結紮を行なうと、尿管結紮により腎血流および糸球体ろ過率が低下する。また尿細管間質にマクロファージが浸潤し、尿細管上皮細胞のアポトーシスが起こり、間質に線維芽細胞及び細胞外基質タンパクの増加が進行することにより、間質の線維化は惹起される。このモデルは、短期間で線維化を惹起し、毒物を使用しないため尿毒症を合併しない再現性の高い間質線維化モデルである。
10〜12週齢のICRマウス（日本クレアより購入）を用いて、UUOモデルを作成した。Control群は、尿管結紮を行わなかったマウスである。UUO群は、尿管結紮状態で７日間飼育し腎臓間質線維化を惹起させたマウスである。Palovarotene群は、UUO処置１日後からPalovarotene 1mg/kgを6日間連続で腹腔内投与したマウスである。各群のマウスについて、UUO処置７日後に解剖し、シリウスレッド染色にて腎臓の組織学的評価を実施した。各群の典型的な組織染色の結果（各群2切片）を図４に示す。
【００６６】
（結果）
図４に示すように、Control群のマウスの腎臓では、尿細管間質の線維化は全く観察されなかった。尿管結紮後7日間経過したUUOマウスの腎臓では、尿細管間質がシリウスレッドにより非常に強く染色されたことから、尿細管間質の顕著な線維化が明らかになった。そして、UUOマウスに6日間Palovaroteneを投与した（UUO+Palo）ところ、尿細管間質のシリウスレッドによる染色される程度が、UUOマウスの腎臓組織に比べ、明らかに軽度であったことから、Palovaroteneは、尿細管間質の線維化を顕著に抑制することが判明した。
尿細管間質線維化の病巣を構築する線維芽細胞がEPO産生細胞に由来しており、線維芽細胞へと形質転換する際にEPO産生能を喪失するという仮説14によれば、Palovaroteneは尿細管間質線維化の予防および/または治療薬としてのみならず、腎性貧血の有効な予防および/または治療薬となり得ると考えられる。
【００６７】
〔実施例４〕
＜マウスメサンギウム細胞に対する4種類のRARγアゴニストの作用の比較＞
（方法）
実施例１の方法に従って、4種類のRARγアゴニスト（Palovarotene、O-Desmethyl Adapalene、BMS189961、CD1530）のTGF-β1、BMP4、およびCol4α1発現抑制作用の比較を行った。
【００６８】
（結果）
「AGE 300 μg/ml +Palovarotene 0.5μM」の値を100％とした時の相対値で示した。
まず、RARγアゴニストのTGF-β1発現抑制作用を検討したところ、表3に示すように、Palovaroteneは用量依存的な抑制作用を示した。CD1530も用量依存的な抑制作用を示したが、その作用はPalovaroteneに比べて弱かった。O-Desmethyl Adapalene及びBMS189961は、Palovaroteneに比べて、抑制活性が弱かった。
次いで、BMP4発現の抑制作用について、検討したところ、表3に示すようにPalovaroteneは用量依存的な抑制作用を示した。しかし、他の3種類の化合物は抑制作用を示さなかった。
さらに、Col4α1（IV型コラーゲン）発現の抑制作用について検討したところ、表3に示すように、Palovaroteneは用量依存的な抑制作用を示した。CD1530も用量依存的な抑制作用を示したが、その作用はPalovaroteneに比べて弱かった。一方、O-Desmethyl Adapaleneは用量依存的なCol4α1（IV型コラーゲン）の発現促進作用を示した。また、CD1530の抑制作用はPalovaroteneより弱かった。
【００６９】
表3. 4種類のRARγアゴニストのTGF-β1、BMP4、とCol4α1産生抑制作用の比較
2019182836.tif 000009
【００７０】
以上の結果（実施例1、2、3、4）より、RARγアゴニストの中では、Palovaroteneは糖尿病性腎症進展の関連因子TGF-β、BMP4、およびCol4α1（IV型コラーゲン）に対して最も強く、しかも用量依存的な抑制効果を示したことから、Palovaroteneは糖尿病性腎症の予防薬又は治療薬として有望であると考えられる。
[引用文献]
1．Doi T, Vlassara H, Kirstein M, Yamada Y, et al.  Receptor-specific increase in extracellular matrix production in mouse mesangial cells by advanced glycosylation endproducts is mediated via platelet derived growth factor.  Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:2873-2877.
2．Abe H, Matsubara T, Iehara N, et al.  Type IV collagen is transcriptionally regulated by Smad1 under advanced glycation end product (AGE) stimulation.  J Biol Chem 2004; 279:14201-14206.
3．Matsubara T, Abe H, Arai H, et al.  Expression of Smad1 is directly associated with glomerulosclerosis in diabetic nephropathy.  Lab Invest 2006; 86:357-68.
4．Mima A, Matsubara T, Arai H, et al.  Angiotensin II-dependent Src and Smad1 signaling pathway is crucial for the development of diabetic nephropathy.  Lab Invest 2006; 86:927-939.
5．Ohashi S, Abe H, Takahashi T, et al.  Advanced glycation end products increase collagen-specific chaperone protein in mouse diabetic nephropathy.  J Biol Chem 2004; 279:19816-23.
6．Takahashi T, Abe H, Arai H, et al.  Activation of STAT3/Smad1 is a key signaling pathway for progression to glomerulosclerosis in experimental glomerulonephritis.  J Biol Chem 2005; 280:7100-7106.
7．Tominaga T, Abe H, Ueda O, et al.  Activation of BMP4 signaling leads to glomerulosclerosis that mimics diabetic nephropathy.  J Biol Chem 2011; 286:20109-20116.
8．Kishi S, Abe H, Akiyama H, et al.  Sox9 protein induces a chondrogenic phenotype of mesangial cells and contributes to advanced diabetic nephropathy.  J Biol Chem 2011; 286:32162-32169.
9．Abe H, Tominaga T, Matsubara T, et al.  Scleraxis modulates bone morphogenetic protein 4 (BMP4)-Smad1-smooth muscle α-actin (SMA) signal transduction in diabetic nephropathy.  J Biol Chem 2012; 287:20430-42.
10．Matsubara T, Araki M, Abe H, et al.  Bone morphogenetic protein 4 and Smad1 mediate extracellular matrix production in the development of diabetic nephropathy.  Diabetes 2015, 64(8):2978-90.
11．Tominaga T, Abe H, Ueda O, et al.  Activation of BMP4 signaling leads to glomerulosclerosis that mimics diabetic nephropathy.  J Biol Chem 2011; 286:20109-20116.
12．Pendaries V, Verrcchia F, Michel S, et al.  Retinoic acid receptors interfere with the TGF-β/Smad signaling pathway in a ligand-specific manner.  Oncogene 2003; 22:8212-8220.
13．Khalil H, Kanisicak O, Prasad V, et al.  Fibroblas-specific TGF-β-Smad2/3 signaling underlies cardiac fibrosis.  The journal of Clinical Investigation 2017; 127(10):3770-3783.
14．岡田浩一  腎臓疾患と線維化  日本内科学会雑誌2015、104巻8号、1658-1664。
15．渡邊乃梨子、草場哲郎  糖尿病性腎症  京都府立医科大学雑誌2017、126巻10号、685-695。
16．阿部秀斉、土井俊夫  糖尿病性腎症の発症・進展の分子病態  日本内科学会雑誌2008、97巻4号、122-128。
17．澁谷浩司  TGF-β細胞内シグナル伝達の分子機構  化学と生物  35巻7号、477-482。
18．Sun SY et al.  The synthetic retinoid CD437 selectively induces apoptosis in human lung cancer cells while sparing normal human lung epithelial cells. Cancer Research 2002; 62(8): 2430-2436.
19．Shimono K, Tung W, Macolino C, et al.  Potent inhibition of heterotopic ossification by nuclear retinoic acid receptor-[gamma] agonists.  Nature medicine 2011; 17:454-460.
20．Zhang Y, Liu J, Tian XY, et al.  Inhibition of bone morphogenic protein 4 restores endothelial function in db/db diabetic.  Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 2014; 34:152-159.
21．Maciel TT, Melo RS, Schor N, et al.  Gremlin promotes vascular smooth muscle cell proliferation and migration.  J Mol Cell Cardiol 2008; 44:370-9.
22．Yu PB, Hong CC, Sachidanandan C, et al.  Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.  Nature Chemical Biology 2008; 4(1): 33-41.
23．Yu PB, Deng DY, Lai CS, et al.   BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification.   Nature Medicine 2008; 14:1363-1369.
24．Xu RH, Lechleider RJ, Shih HM, et al.  Functional Analysis of Human Smad1: Role of the Amino-Terminal Domain.   Biochemical and Biophysical Research Communications 1999; 258(2): 366-373.
25．Pimanda JE, Donaldson IJ, Bruijn MFTR, et al.   The SCL transcriptional network and BMP signaling pathway interact to regulate RUNX1 activity.  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007; 104(3): 840-845.
26．Novinec M, Lenarcic B, Turk B.  Cysteine cathepsin activity regulation by glycosaminoglycans.  Biomed Research Intnational 2014; doi: 10.1155/2014/309718.
27．Neely MD, Litt MJ, Tidball AM, et al.   DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction.   ACS Chemical Neuroscience 2012; 3(6):482-491.
28．Wawersik S, Evola C, Whitman M, et al.  Conditional BMP inhibition in Xenopus reveals stage-specific roles for BMPs in neural and neural crest induction.  Developmental Biology 2005; 277(2):425-442.
29．Bourgeois B, Gilquin B, Tellier-Lebegue C, et al. Inhibition of TGF-βsignaling at the nuclear envelope: Characterization of interactions between MAN1, Smad2 and Smad3, and PPM1A. Science Signaling 2013; 6(280): ra49.
30．Li W, Wei W, Zhu S, et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell 2009; 4(1):16-19.
31．Rena G, Bain J, Elliott M, et al. D4476, a cell permeant inhibitor of CK1, suppresses the site‐specific phosphorylation and nuclear exclusion of FOXO1a. EMBO report 2004; 5(1): 60-65
32．Sawyer JS, Andersonhttps://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jm0205705 - jm0205705AF10 BD, Beight DB, et al. Synthesis and activity of new Aryl- and heteroaryl-substituted pyrazole inhibitors of the transforming growth factor-β type I receptor kinase domain. Journal of Medicinal Chemistry 2003; 46(19):3953-3956.
33．Ogawa K, Saito A, Matsui H, et al. Activin-Nodal signaling is involved in propagation of mouse embryonic stem cell. Journal of Cell Science 2007; 120: 55-65.
34．Grygielko ET, Martin WM, Tweed C, et al. Inhibition of gene markers of fibrosis with a novel inhibitor of transforming growth factor-βtype I receptor kinase in puromycin induced nephritis. The journal of pharmacology and Experimental Therapeutics 2005; 313(3): 943-951.
35．Kapoun AM, Gaspar NJ, Wang Y, et al. Transforming growth factor-βreceptor type 1 (TGFRI) kinase activity but not p38 activation is required for TGF RI-induced myofibroblast differentiation and profibrotic gene expression. Molecular Pharmacology 2006; 70(2): 518-531.
36．Davies M.  The mesangial cell: A tissue culture view.  Kidney International 1994; 45(2):320-327.
37．Doi T, Vlassara H, Kirstein M, et al.  Receptor-specific increase in extracellular matrix production in mouse mesangial cells by advanced glycosylation end products is mediated via platelet-derived growth factor. Proc.  Nalt Acad Sci. USA. 1992; 89:2873-2877.
[特許文献１]国際公開第２０１４／０７３２０９号パンフレット
[特許文献２]再表２００７／０３７１８８号公報
[特許文献３]アメリカ公開第20160120843号公報
[特許文献４]国際公開第２０１４／１８８７１６号パンフレット
[特許文献５]国際公開第２００２／０２８８１０号パンフレット
[特許文献６]国際公開第２００８／０５７９３０号パンフレット
[特許文献７]アメリカ公開第20140363402号公報
[特許文献８]特開第２０１３−５３６８５５号公報
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、糖尿病性腎症の予防・治療に利用できる。さらに、本発明の糖尿病性腎症の予防薬あるいは治療薬の有効成分である、RARγアゴニスト（例：Palovarotene）は、糸球体メサンギウムの拡大の抑制、Smad1活性化の抑制、およびIV型コラーゲンの抑制にも有用である。
【図１】
2019182836.tif 000010
【図２Ａ】
2019182836.tif 000011
【図２Ｂ】
2019182836.tif 000012
【図２Ｃ】
2019182836.tif 000013
【図３】
2019182836.tif 000014
【図４】
2019182836.tif 000015