(57)【要約】      （修正有）【課題】特定のタイプの成体多能性心臓幹細胞の特定、単離、増殖および特性決定の方法の提供。【解決手段】特定のタイプの成体多能性心臓幹細胞は特定のパターンのマーカーを天然に発現することを特徴とし、これは、該細胞の単離および増殖を補助するために用いることができる。特に、該細胞はSOX17およびGATA4を発現するが、Oct4、Nanog、c-kitおよびテロメラーゼ逆転写酵素を発現しない。これらの細胞は、以下の細胞タイプのうちの1種以上へと分化することができる：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された通りの細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のタイプの成体心臓幹細胞の特定、単離、増殖および特性決定に関する。これらの成体幹細胞は、特定のパターンのマーカーを天然に発現することを特徴とし、これは、該細胞の単離および増殖を補助するために用いることができる。本発明の細胞は、損傷を受けた心臓組織の修復をもたらし、活性化し、かつ/または誘導することに関して、かつてない能力を示す。これらの成体幹細胞は、限定するものではないが、組織の再生のための、特に心筋などの損傷を受けた心臓組織の再生のためのものをはじめとする、治療剤として用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
多数の様々な心臓幹細胞株が先行技術で記載されてきており、国際公開第99/49015号、同第2005/012510号、同第2006/052925号、同第02/09650号、同第02/13760号、同第03/103611号、同第2007/100530号、同第2009/073616号、同第2011/057249号、同第2011/057251号、同第2012/048010号、同第2006/093276号および同第2009/136283号に記載されたものが挙げられる。
【０００３】
これらの幹細胞株はすべて、異なる手段により単離されているが、それらのすべてが、同じ特性のうちの多くを共有し、実際に、同じかまたは実質的に同一の幹細胞集団であり得る。特に、成体心臓幹細胞の公知の集団のすべてが、一部の特性、マーカーおよび形態学的形質を共有する。公知の細胞は、同じ起源（心臓組織）、表面に接着させて培養した場合の形態を有し、CD90またはCD44のような成体幹細胞の表面マーカーを発現し、増殖プロセスの最中のある時点で、主に幹細胞培養が開始されるときに、ほとんどがc-kitも発現する。これらの細胞ではテロメラーゼが活性であることも示されている。また、これらのすべての細胞は、平滑筋、内皮細胞または心筋細胞のような心臓系統に分化する能力を有する。
【０００４】
多数の様々な心臓幹細胞株が先行技術で公知であるにもかかわらず、治療用途で用いることができる心臓幹細胞株の特定および特性決定に対する必要性が残っている。治療の文脈では、レシピエントと遺伝学的に同一でない幹細胞株は、多くの場合に、いかなる治療的利益も見ることができないうちに、幹細胞の免疫原性拒絶（immunogenic rejection）から来る問題を引き起こす。成体由来の多能性細胞によく見られる別の問題は、成体動物に注入される際に奇形腫を形成する傾向であり、したがって、治療薬としてのそれらの使用は限定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第99/49015号
【特許文献２】国際公開第2005/012510号
【特許文献３】国際公開第2006/052925号
【特許文献４】国際公開第02/09650号
【特許文献５】国際公開第02/13760号
【特許文献６】国際公開第03/103611号
【特許文献７】国際公開第2007/100530号
【特許文献８】国際公開第2009/073616号
【特許文献９】国際公開第2011/057249号
【特許文献１０】国際公開第2011/057251号
【特許文献１１】国際公開第2012/048010号
【特許文献１２】国際公開第2006/093276号
【特許文献１３】国際公開第2009/136283号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、治療的使用に対する潜在能力を有するが、患者へ注入される際に奇形腫を形成する傾向を有しない、成体心臓幹細胞の集団を特定するという継続中の要求が残っている。さらに、免疫拒絶のリスクを引き起こさないそのような細胞に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、マーカープロフィールおよび形態にて公知の細胞集団とは異なり、かつその低い免疫原性、および同種異系、同系（syngenic）または免疫不全宿主に投与される場合の奇形腫の形成不能性によって治療用途のために好適である、成体心臓幹細胞の新規集団を提供する。本発明の心臓幹細胞はまた、同種異系細胞に対するレシピエントの免疫応答を調節すること、および血管新生を引き起こすこともできる。本発明の細胞は、心臓組織から、好ましくは心筋組織から単離することができ、細胞バンクを作製するために一般的に用いられる表面に接着させてin vitroで増殖させることができる。他の以前に記載された細胞とは異なり、本発明の細胞は、テロメラーゼ逆転写酵素陰性であり、したがって、腫瘍形成を防止する限定された増殖能力を有する。
【０００８】
本発明の成体心臓幹細胞の心臓保護、免疫調節能力および心臓再生能のため、それらは、虚血性心疾患、自己免疫疾患、創傷治癒プロセスまたは再生治療などの様々な疾患の治療のための好適な治療用ツールとなる。特に、本発明の成体心臓幹細胞により媒介される以下の現象のため、それらは、細胞死または炎症プロセスが関与する疾患の治療のための有用な治療用ツールとなる：
・それらの細胞生成物により媒介される心臓保護シグナルが、発作後の細胞損失を限定するであろう。
・成体心臓幹細胞の免疫調節能力が、T細胞およびマクロファージにより媒介される炎症プロセスを調節するであろう。発作後の最初の段階での免疫応答は、細胞デブリを除去し、かつ瘢痕形成を開始するために必須であるが、長期の炎症プロセスは瘢痕の解消および組織再生を可能にしないであろう。
【０００９】
・最後に、ラットモデルでのin vivo実験により、新規組織の形成を誘導し、瘢痕サイズを減少させ、かつ新規筋線維の存在を増加させることに対する成体心臓幹細胞の能力が示される。これは、内在性幹細胞を活性化する成体心臓幹細胞の能力により媒介されるであろう。
【００１０】
つまり、本発明の成体心臓幹細胞により媒介されるこれらすべての活性のため、これらは、細胞死または炎症プロセスが関与する疾患の治療のための有用な治療剤となる。また、これらの細胞は、新規組織形成が必要とされる病変中での組織再生を促進するために用いることができるであろう。この意味では、ヒト虚血性心疾患を、これらの細胞を用いて治療することができるであろう。成体心臓幹細胞は、疾患の急性期の間の細胞損失を制限するであろうし、炎症応答を調節して、より速い再生を可能にするであろうし、かつ最終的に内在性の組織常在細胞を活性化して、新規組織形成を促進するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の心臓幹細胞の生成のためのプロトコールの模式的表示である。
【図２】(A)本発明の心臓幹細胞（CSC）は、骨髄由来または脂肪組織由来のMSCと比較した場合に、SOX17およびGATA4について高いmRNA発現（qPCRにより測定した場合）を有する。(B)タンパク質発現アレイ試験で観察できる通り、CSCはSOX17およびGATA4タンパク質を発現する。
【図３】(A) CSCでのフローサイトメトリー分析により、c-kitの発現は観察されないかまたは非常に低い発現が観察される。c-kit（黒線）の代表的発現を示す。灰色で埋めた領域は、アイソタイプ対照を示す。(B)フローサイトメトリー分析は、CSCが、その細胞膜上でCD45、CD11b、CD34、CXCR4およびCD133の発現について陰性であることを明らかにする。CD45、CD11b、CD34、CXCR4およびCD133の発現（黒色ヒストグラム）を、アイソタイプ対照（灰色で埋めたヒストグラム）に対して示す。
【図４】(A) CSCはテロメラーゼを発現しない。テロメラーゼの触媒サブユニットの発現がないことが、CSCに対するqPCR分析により観察された。(B)MSCまたはHDFと比較したCSCでのテロメア反復増幅プロトコール（Telomeric Repeat Amplification Protocol；TRAP）テロメラーゼ活性。CSCではテロメラーゼ活性が観察されなかった。(C) in vitroでの大幅な増幅（30倍超の集団倍増）後のヒトCSCの細胞化学的分析を、老化関連β-ガラクトシダーゼ活性（SA-βGal）の検出について行なった。in vitro増殖後に、一部のCSCはX-galと共にインキュベートした場合に青色になり、このことは、これらの細胞は老化していることを示す。
【図５】(A) CSCはタンパク質アレイにより分析して、Oct3/4またはNanogを発現しない。(B) CSCはウエスタンブロットにより分析して、Oct3/4またはNanogを発現しない。
【図６】(A) ELISA試験は、CSCが、ワーキングセルバンクおよび最終生成物（FP）で、いかに多量のCCL2を発現するかを示してきた。MSCを参照細胞株として用いた。(B)タンパク質発現アレイ試験で観察できる通り、CSCはIL-8、IL-6、CXCL6、sICAM1およびIL-1αタンパク質を発現する。
【図７】CSCはMHCクラスIを発現するが、共刺激分子CD40、CD80およびCD86を発現しない。
【図８】(A)単離後およびin vitro増殖後に、CSC細胞サイズを分析した。(B)単離後に、CSCは丸みを帯びた形態を有する。(C) in vitro増殖中に、CSCは間質様形態を獲得する。(D)第2継代（P2）および第7継代（P7）にて、CSCはクローン原性を有する。(E)および(F)単一細胞を超低接着プレートに播種する場合、CSCは、カーディオスフェアを形成し、かつ懸濁液中で増殖することができる。
【図９】(A)細胞遊走アッセイトランスウェルプレート。(B) CSCは、単球に対して強い動員能を有する。(C) CSCは、活性化型Tリンパ球に対して免疫調節能を示した。
【図１０】(A) CSCにより分泌される増殖因子は生存を促す。(B) CSCにより分泌される因子の生存促進能力（pro-survival ability）はまた、血清枯渇後のH9c2細胞でもアッセイされた。
【図１１】(A)心臓系統へのCSCの分化能力を、免疫蛍光により分析する。CSC細胞は、特異的な分化培地中での培養後に、平滑筋、内皮細胞および心筋細胞に対応するマーカーの発現を示した。(B)さらに、CSCはまた、適切な培地中での培養後に、脂肪細胞および骨細胞にも分化できた。脂肪細胞分化はオイルレッドO染色（細胞質油滴を示すため）により分析し、骨細胞分化はアリザリンレッド染色（カルシウム沈着を示すため）により確認した。
【図１２】図中に示される比較ゲノムハイブリダイゼーション解析は、ヒト女性ゲノムに対応し、重複または欠失などの染色体変化は観察されない。
【図１３】同種異系CSCは、冠動脈内投与後に強い体液性応答を誘導しないことを示す図である。(A)同種異系ブタCSCを、免疫正常梗塞ブタに冠動脈内注入し、細胞投与前、投与15日後または30日後に血液サンプルを採取した。30日目に、同じ細胞の新規用量を静脈内注入し、2回目の注入後の3日目、7日目、15日目および30日目に血液サンプルを採取した。(B)特異的免疫反応性免疫グロブリン（IgGおよびIgM）の存在を、様々な血液サンプルで分析した。最初の30日間の間に、注入された細胞に対する特異的免疫反応性IgGを見出すことはできなかった。対照的に、本発明者らは、2回目の注入後の7日目、15日目および30日目に同種異系CSC特異的IgMおよびIgGの存在を観察した。これらの結果は、同種異系CSCは投与後に強い体液性応答を誘発しないが、免疫学的記憶を生成する免疫系により認識およびおそらくは排除されて、2回目の投与後により強くかつ速い応答を誘導することを示す。
【図１４】CSCは投与後の少なくとも24時間心臓に留まることを示す図である。GFP標識細胞を用いる追跡実験は、CSCが、注入後の少なくとも24時間梗塞領域中に留まることを実証した。ヒトCSCを、GFPを用いて標識し（＞）、梗塞させてから7日後の免疫不全ラットの心筋へと注入した。24時間後に、動物を屠殺し、GFP陽性細胞の存在を組織学により分析した。蛍光標識されたミクロスフェアを、投与部位を特定できるように細胞と共に注入した（黒色矢頭）。細胞核は、DAPIを用いて染色した（*）。
【図１５】(A)冠動脈前下行枝の結紮により免疫不全ラットを梗塞させ、異なるドナー由来のCSCを心筋内移植し（5×105）、PBSを注入された動物と比較した。前壁（AW）肥厚は、CSCを移植された動物で有意に高かった。(B)マッソンのトリクローム染色を用いた組織学的分析もまた、対照動物と比較した場合に、細胞を用いて処置したラットでの瘢痕サイズの著明な減少および罹患領域中の心筋細胞の増加を示した。
【図１６】投与溶液（プラセボ）または50×106個のヒトCSCの用量を、健康なブタに冠動脈内注入した。基底状態および細胞投与24時間後での心臓酵素を調べ、毒性は観察されなかった。
【図１７】特異的プローブ（Life Technologies社からのTaqManプローブ）を用いる定量的PCR（qPCR）分析は、参照細胞株として用いたMSCと比較した場合に、GATA4、SOX17、WT1、HEY2、KDR、HHEXおよびHAND2がCSCで過剰発現することを示した。遺伝子GUSBを、内在性対照遺伝子として用いた。値は、相対定量のLog2である。
【図１８】フローサイトメトリー分析は、CSCがその細胞膜上に高レベルのCD166、CD90、CD44、CD105、CD31およびCD49c（黒色ヒストグラム）を発現することを明らかにする。アイソタイプ対照を、灰色で埋めたヒストグラムに示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
成体心臓幹細胞および成体心臓幹細胞集団
本発明は、成体心臓幹細胞を、特に、成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の形態で提供し、ここで、該成体心臓幹細胞（CSC）または成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、マーカーSOX17およびGATA4を発現し、かつ該成体心臓幹細胞または成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、マーカーOct4、Nanogおよびc-kitを発現しない。
【００１３】
「成体」とは、幹細胞が胚性でないことを意味する。一実施形態では、「成体」とは、後胚性（post-embryonic）または「生後」（post-natal）を意味する。本発明の幹細胞に関して、「成体幹細胞」との用語は、幹細胞が、胎芽期よりも後の生長の段階で、動物の組織または器官から単離されることを意味する。一態様では、本発明の幹細胞は、生後期に単離することができる。細胞は、ラット、マウス、ブタまたはヒトなどの哺乳動物から単離することができる。成体幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、胚性幹細胞は、その起源により定義され、胚盤胞の内細胞塊である。本発明に係る成体幹細胞は、いずれかの非胎児組織から単離することができ、新生児、幼若、若年および成体被験体を含むであろう。一般的には、本発明の幹細胞は、非新生児哺乳動物から、例えば、非新生児ヒト、ラット、マウスまたはブタから単離されるであろう。好ましくは、本発明の幹細胞はヒトから単離され、したがって、ヒト成体心臓幹細胞またはヒト成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団である。
【００１４】
本発明の成体心臓幹細胞および本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、単離されていることができる。
【００１５】
「単離された」との用語は、該用語が言及する細胞または細胞集団がその天然環境内にはないことを示す。細胞または細胞集団は、周囲の組織から実質的に分離されている。一部の実施形態では、サンプルが少なくとも約75％の、一部の実施形態では少なくとも約85％の、一部の実施形態では少なくとも約90％の、一部の実施形態では少なくとも約95％の成体幹細胞を含有する場合、細胞または細胞集団は周囲の組織から実質的に分離されている。換言すると、サンプルが約25％未満の、一部の実施形態では約15％未満の、一部の実施形態では約5％未満の、成体幹細胞以外の物質を含有する場合、サンプルは周囲の組織から実質的に分離されている。そのようなパーセント値は重量パーセントまたは細胞数によるパーセントを指す。該用語は、起源である生物から取り出されて培養物中に存在している細胞を包含する。該用語はまた、起源である生物から取り出され、その後に生物中に再挿入されている細胞も包含する。再挿入された細胞を含有する生物は、細胞が取り出された生物と同じ生物であることができ、または異なる生物、すなわち、同じ生物種の異なる個体であることができる。
【００１６】
新規成体心臓幹細胞および成体心臓幹細胞の新規集団のマーカープロフィールは、追加のマーカーの存在および/もしくは非存在により、または存在するマーカーおよび非存在のマーカーの組み合わせの特異的プロフィールにより、さらに定義することができる。それぞれの場合に、マーカーの特異的な組み合わせは、細胞の集団内の特定のプロフィールとしておよび/または集団内の個々の細胞上のマーカーの特定のプロフィールとして存在することができる。
【００１７】
つまり、一実施形態では、本発明は、単離された多能性成体心臓幹細胞を提供し、該細胞は、以下のマーカー：(a) SOX17およびGATA4を発現し、かつ該細胞は以下のマーカー：(b) Oct4、Nanog、c-kitおよびテロメラーゼ逆転写酵素を発現せず、該細胞は、以下の細胞タイプのうちの1種以上へと分化することができる：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞。本発明はまた、成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団も提供し、該細胞の集団は、以下のマーカー：(a) SOX17およびGATA4を発現し；かつ/または該集団は以下のマーカー：(b) Oct4、Nanog、c-kitおよびテロメラーゼ逆転写酵素を発現せず、該細胞は、以下の細胞タイプのうちの1種以上へと分化することができる：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞。
【００１８】
1つの具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、検出可能なレベルでSOX17およびGATA4のうちの1種以上を発現する。さらなる実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、検出可能なレベルでSOX17およびGATA4の両方を発現する。
【００１９】
1つの具体的な実施形態では、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約95％が、検出可能なレベルでSOX17およびGATA4を発現する。より具体的には、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％が、検出可能なレベルでSOX17およびGATA4を発現する。
【００２０】
本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の細胞はまた、マーカーKDR、HEY2、WT1、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-β、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL8のうちの1種以上、すなわち、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種またはすべてを発現することもできる。
【００２１】
1つの具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または該成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の細胞はまた、IL-1βおよび任意によりCD49cおよび/またはHHEXを発現することもできる。この意味で、1つの具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞または実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の細胞のうちの少なくとも約95％が、検出可能なレベルでIL-1β、CD49cおよびHHEXを発現する。より具体的には、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％が、検出可能なレベルでIL-1β、CD49cおよびHHEXを発現する。
【００２２】
1つの具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、検出可能なレベルでSOX17、GATA4、IL-1β、CD49cおよびHHEXを発現し、ならびに任意により検出可能なレベルでマーカーKDR、HEY2、WT1、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-β、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL8のうちの1種以上、すなわち、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種またはすべてを発現する。1つの具体的な実施形態では、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％または95％が、検出可能なレベルでSOX17、GATA4、IL-1β、CD49cおよびHHEXをを発現し、ならびに任意により検出可能なレベルでマーカーKDR、HEY2、WT1、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-β、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL8のうちの1種以上、すなわち、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、またはすべてを発現する。より具体的には、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％が、検出可能なレベルでSOX17、GATA4、IL-1β、CD49cおよびHHEXをを発現し、ならびに任意により検出可能なレベルでマーカーKDR、HEY2、WT1、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-β、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL8のうちの1種以上、すなわち、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、またはすべてを発現する。
【００２３】
一実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、検出可能なレベルでCD31を発現する。1つの具体的な実施形態では、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約60％（好ましくは少なくとも62％）が、検出可能なレベルでCD31を発現する。つまり、一実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞は、以下のマーカー：(a) CD31、CD49cおよび/もしくはHHEXのうちの1種、2種またはすべてを発現し；かつ/または該細胞は以下のマーカー：(b) CD133、Nkx2.5および/もしくはCXCR4タンパク質のうちの1種、2種またはすべてを発現しない。別の実施形態では、本発明の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団は、以下のマーカー：CD31、CD49cおよび/もしくはHHEXのうちの1種、2種またはすべてを発現し；かつ/または該細胞の集団は以下のマーカー：CD133、Nkx2.5および/もしくはCXCR4タンパク質のうちの2種またはすべてを発現しない。
【００２４】
つまり、一実施形態では、本発明は、単離された多能性成体心臓幹細胞を提供し、該細胞は、以下のマーカー：SOX17、GATA4、IL-1β、CD31、CD49cおよびHHEXを発現し；かつ該細胞は以下のマーカー：Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4タンパク質、Nkx2.5およびCD133を発現せず、該細胞は、以下の細胞タイプのうちの1種以上へと分化することができる：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞。本発明はまた、成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団も提供し、該細胞の集団は、以下のマーカー：(a) SOX17、GATA4、IL-1β、CD31、CD49cおよびHHEXを発現し、かつ該細胞は以下のマーカー：(b) Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4タンパク質、Nkx2.5およびCD133を発現せず、該細胞は、以下の細胞タイプのうちの1種以上へと分化することができる：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞。
【００２５】
好ましくは、本発明の成体心臓幹細胞は、心筋組織から単離される。
【００２６】
1つの具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、検出可能なレベルでc-kit、Oct4および/またはNanogのうちの1種以上を発現しない。さらなる実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、検出可能なレベルでc-kit、Oct4およびNanogのうちのいずれも発現しない。
【００２７】
1つの具体的な実施形態では、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約95％が、検出可能なレベルでc-kitタンパク質を発現しない。より具体的には、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％が、検出可能なレベルでc-kitタンパク質を発現しない。
【００２８】
さらなる具体的な実施形態では、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約95％が、検出可能なレベルでc-kitタンパク質、Oct4および/またはNanogのうちの1種以上を発現しない。より具体的には、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の細胞のうちの少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％が、検出可能なレベルでc-kitタンパク質、Oct4および/またはNanogのうちの1種以上を発現しない。
【００２９】
さらなる具体的な実施形態では、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約95％が、検出可能なレベルでc-kitタンパク質、Oct4およびNanogのうちのいずれも発現しない。より具体的には、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の細胞のうちの少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％が、検出可能なレベルでc-kitタンパク質、Oct4およびNanogのうちのいずれも発現しない。
【００３０】
別の具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、検出可能なレベルでNkx2.5、CXCR4タンパク質および/またはCD133のうちの1種以上を発現しないこともできる。さらなる実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、検出可能なレベルでNkx2.5、CXCR4タンパク質およびCD133のうちのいずれも発現しない。
【００３１】
さらなる具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の細胞のうちの少なくとも約95％が、検出可能なレベルでNkx2.5、CXCR4タンパク質および/またはCD133のうちの1種以上を発現しない。より具体的には、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％が、検出可能なレベルでNkx2.5、CXCR4タンパク質および/またはCD133のうちの1種以上を発現しない。本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の細胞はまた、CD45、CD34、CD11b、テロメラーゼ逆転写酵素、CD40、CD80、および/またはCD86のうちの1種以上、すなわち、1種、2種、3種、4種、5種、6種、またはすべてを発現しないこともできる。
【００３２】
1つの具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の細胞は、マーカーSOX17およびGATA4の組み合わせを発現し、マーカーOct4、Nanogおよびc-kitの組み合わせを発現しない。1つの具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団中の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約95％、例えば少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％が、マーカーSOX17およびGATA4の組み合わせを発現し、マーカーOct4、Nanogおよびc-kitの組み合わせを発現しない。
【００３３】
1つの具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の細胞は、マーカーSOX17、GATA4、IL-1β、CD49cおよびHHEXの組み合わせを発現し、マーカーOct4、Nanog、c-kit、Nkx2.5、CXCR4タンパク質、テロメラーゼ逆転写酵素およびCD133の組み合わせを発現しない。1つの具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の細胞のうちの少なくとも約95％、例えば少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％が、マーカーSOX17、GATA4、IL-1β、CD49cおよびHHEXの組み合わせを発現し、マーカーOct4、Nanog、c-kit、Nkx2.5、CXCR4タンパク質、テロメラーゼ逆転写酵素およびCD133の組み合わせを発現しない。
【００３４】
1つの具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、検出可能なレベルで、マーカーSOX17、GATA4、IL-1β、CD49cおよびHHEXの組み合わせならびに任意によりマーカーKDR、HEY2、WT1、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-β、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL8のうちの1種以上、すなわち、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種またはすべてを発現し、かつ、検出可能なレベルで、マーカーOct4、Nanog、c-kit、Nkx2.5、CXCR4タンパク質、テロメラーゼ逆転写酵素およびCD133の組み合わせならびに任意によりCD45、CD34、CD11b、テロメラーゼ逆転写酵素、CD40、CD80、および/またはCD86を発現しない。さらなる具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団のうちの少なくとも約95％、例えば少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％が、検出可能なレベルで、マーカーSOX17、GATA4、IL-1β、CD49cおよびHHEXの組み合わせならびに任意によりマーカーKDR、HEY2、WT1、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-β、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL8のうちの1種以上、すなわち、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、またはすべてを発現し、かつ、検出可能なレベルで、マーカーOct4、Nanog、c-kit、Nkx2.5、CXCR4タンパク質、テロメラーゼ逆転写酵素およびCD133の組み合わせならびに任意によりCD45、CD34、CD11b、テロメラーゼ逆転写酵素、CD40、CD80、および/またはCD86を発現しない。
【００３５】
特定の具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、マーカーSOX17、GATA4、WT1、HEY2およびKDRのすべてを発現する。さらなる具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、マーカーSOX17、GATA4、CD44、CD90、CD105、CD166、WT1、HEY2およびKDRのすべてを発現する。好ましくは、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、以下のマーカー：CD31、IL-1β、CD44、CD90、CD105、CD166、WT1、HEY2、KDR、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-b、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL-8を発現し；かつ以下のマーカー：CD45、CXCR4タンパク質、Nkx2.5、CD34、CD11b、CD40、CD80および/またはCD86を発現しない。
【００３６】
さらなる具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、マーカーOct4、Nanog、c-kit、CD40、CD80およびCD86のうちのいずれも発現しない。またさらなる実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、マーカーOct4、nanog、c-kit、CD45、およびテロメラーゼ逆転写酵素のうちのいずれも発現しない。
【００３７】
本発明の特定の実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、以下のマーカー発現プロフィールを有する：SOX17、GATA4、CD44、CD90、CD105、CD166、WT1およびKDR陽性、ならびにOct4、Nanog、c-kit、CD45、およびテロメラーゼ逆転写酵素陰性。
【００３８】
本発明はまた、少なくとも約0.5％（他の態様では、少なくとも1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％または70％）の本発明の成体CSC、および、限定するものではないが、脂肪組織由来または骨髄由来のMSC、心外膜細胞、内皮細胞、周皮細胞および線維芽細胞などの本発明の成体CSC以外の細胞を含む「細胞の混合集団」も提供する。好ましくは、細胞の混合集団は、MSCを含む。より好ましくは、細胞の混合集団の細胞のうちの少なくとも約80％（他の態様では、少なくとも85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または99.5％）がMSCである。
【００３９】
本発明の細胞の実質的に純粋な集団に関連して、「実質的に純粋な」とは、幹細胞の集団を意味し、該細胞集団は、本質的に本発明の成体心臓幹細胞のみを含み、すなわち、該細胞集団は、実質的に純粋である。本発明の多数の態様では、細胞集団は、少なくとも約80％（他の態様では、少なくとも85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％または100％）の本発明の成体心臓幹細胞を含む。
【００４０】
本明細書中で用いる場合、「マーカー」との用語は、その存在、濃度、活性またはリン酸化状態を検出することができ、かつ、ある細胞の表現型を特定するために用いることができるいずれかの生物学的分子を包含する。
【００４１】
「発現された（発現される）」との用語は、細胞内のマーカーの存在を説明するために使用される。発現されたと見なされるためには、マーカーは検出可能なレベルで存在する必要がある。「検出可能なレベル」とは、PCR、ブロッティング、免疫蛍光、ELISAまたはFACS分析などの標準的な実験室方法の1種を使用して、マーカーを検出することができることを意味する。「発現された」とは、限定するものではないが、タンパク質、タンパク質のリン酸化状態またはタンパク質をコードするmRNAの検出可能な存在を指すことができる。30回のPCRサイクル後に、好ましくは37回のPCRサイクル後に発現が合理的に検出できる場合に、本発明の細胞または本発明の集団の細胞により、遺伝子が発現されていると見なされ、このサイクル数は、1個の細胞当たり少なくとも約100コピーの細胞中の発現レベルに相当する。「発現する」および「発現」との用語は、対応する意味を有する。閾値未満の発現レベルでは、マーカーは発現されていないと見なされる。本発明の成体幹細胞でのマーカーの発現レベルと、例えば間葉系幹細胞などの別の細胞での同じマーカーの発現レベルとの比較は、同じ生物種から単離された2種類の細胞タイプを比較することにより行うことができる。好ましくは、この生物種は哺乳動物であり、より好ましくはこの生物種はヒトである。そのような比較は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）実験を用いて都合よく行うことができる。
【００４２】
本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の集団は、特定のマーカーに関する際立った発現レベルを有することを特徴とする。本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞集団が、検出可能なレベルで多数の特異的マーカーを発現することが、本明細書中で示される。
【００４３】
集団中の本発明の細胞のうちの少なくとも約80％がマーカーの検出可能な発現を示す場合に、本発明の成体心臓幹細胞集団がマーカーを発現すると見なされる。他の態様では、集団中の本発明の細胞のうちの少なくとも約85％、少なくとも約90％または少なくとも約95％または少なくとも約97％または少なくとも約98％またはそれ以上が、マーカーの検出可能な発現を示す。特定の態様では、集団中の本発明の細胞のうちの少なくとも少なくとも約99％または100％が、マーカーの検出可能な発現を示す。発現は、RT-PCR実験、免疫ブロッティング、免疫蛍光、ELISAなどのいずれかの好適な手段の使用を通じて、または蛍光活性化セルソーティング（FACS）を通じて検出することができる。このリストが単に例として提供され、限定することを意図しないことが理解されるべきである。
【００４４】
代替的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、マーカーの発現レベルが、対照細胞での、例えば間葉系幹細胞でのレベルよりも本発明の細胞で大きい場合に、マーカーを発現していると見なされる。この文脈では、「より大きい」とは、本発明の細胞集団でのマーカー発現のレベルが、対照細胞でのレベルよりも少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍高いことを意味する。
【００４５】
1つの具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団でのSOX17およびGATA4のmRNA転写産物のレベルは、骨髄からまたは脂肪組織から得られる間葉系幹細胞での同じmRNA転写産物の対応するレベルよりも少なくとも約10倍大きく、例えば、約10倍大きく、約15倍大きく、もしくは約20倍またはそれ以上大きい。
【００４６】
1つの具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団でのWT1、HEY2および/またはKDRのmRNA転写産物のレベルは、脂肪組織から得られる間葉系幹細胞での同じmRNA転写産物の対応するレベルよりも少なくとも約10倍大きく、例えば、約10倍大きく、約15倍大きく、もしくは約20倍またはそれ以上大きい。
【００４７】
さらなる具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の心臓幹細胞の実質的に純粋な成体集団でのIL-1α、コロニー刺激因子3（CSF3）および/またはPDGF-βのmRNA転写産物のレベルは、脂肪組織から得られる間葉系幹細胞での同じmRNA転写産物の対応するレベルよりも少なくとも約5倍大きく、例えば、約5倍大きく、約10倍大きく、もしくは約15倍またはそれ以上大きい。
【００４８】
本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞集団の実質的に純粋な集団はまた、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞集団の実質的に純粋な集団が、検出可能なレベルで特定のマーカーまたはマーカーの組み合わせを発現しないことを特徴とすることもできる。これらのうちの多数が、分化した細胞または部分的に分化した細胞を示すものである。本明細書中で定義される通り、これらのマーカーは、陰性マーカーであると言われる。
【００４９】
一部の実施形態では、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団は、その中に存在する成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約80％がマーカーの検出可能な発現を示さない場合、マーカーを発現しないと見なされる。他の実施形態では、その中に存在する成体心臓細胞のうちの少なくとも約85％、少なくとも約90％または少なくとも約95％または少なくとも約97％または少なくとも約98％または少なくとも約99％または100％が、マーカーのいかなる検出可能な発現も示さない。また、検出可能な発現の欠失は、RT-PCR実験、免疫ブロッティング、免疫蛍光、ELISAの使用を通じて、またはFACSを用いて証明することができる。
【００５０】
本明細書中に記載されるマーカーは、発現が、1個の細胞当たり約100コピー未満の細胞中の発現レベルに相当する、PCRの30サイクルのレベルで合理的に検出できず、かつ/または免疫蛍光、免疫ブロッティング、ELISAもしくはFACSにより容易に検出できない場合に、本発明の成体心臓幹細胞により発現されないと見なされる。
【００５１】
本発明の特異的マーカー
本発明で言及されるマーカーは、そのマーカーに対する特異的参照配列、およびそれらのマーカーのいずれかの公知のオルソログを含む。マーカーとしては、SOX17、GATA4、KDR、WT1、CCL2、IL-1α、IL-8、IL6、G-CSF、CXCL1、sICAM-1、CSF3、PDGF-β、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、HAND2、MHCクラスI、CD45、CD34、CD11b、テロメラーゼ逆転写酵素、CD40、CD80、CD86、CD31、IL-1β、CD49c、HHEX、CXCR4タンパク質、Nkx2.5およびCD133が挙げられる。
【００５２】
Nanogとの用語には、Nanogおよびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、2410002E02Rik、ENK、ecat4ホメオボックス転写因子Nanog、およびホメオボックス転写因子Nanog-Δ48が挙げられる。
【００５３】
Oct-4との用語には、Oct-4およびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、Pou5f1、POUドメインクラス5転写因子1、Oct-3、Oct-3/4、Oct3、Otf-3、Otf-4、Otf3-rs7、およびOtf3gが挙げられる。
【００５４】
c-kitとの用語には、c-kitおよびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、CD117、Fdc、Gsfsco1、Gsfsco5、Gsfsow3、SCO1、SCO5、SOW3、Ssm、Tr-kit、およびKITが挙げられる。
【００５５】
TERTとの用語には、TERTおよびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、テロメラーゼ逆転写酵素、EST2、TCS1、TP2、TRT、hEST2、およびテロメラーゼ触媒サブユニットが挙げられる。
【００５６】
SOX17との用語には、Sox17およびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、NG_028171.1 GI:325053743が挙げられる。
【００５７】
CD90との用語には、CD90およびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、Thy1、胸腺細胞抗原1、シータ、T25、Thy-1、Thy-1.2、Thy1.1、およびThy1.2が挙げられる。
【００５８】
CD166との用語には、CD166およびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、Alcam、活性化型白血球細胞接着分子、AI853494、BEN、DM-GRASP、MGC27910、MuSC、およびSC1が挙げられる。
【００５９】
cd11bとの用語には、cd11bおよびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、Itgam、インテグリンαM、CD11b/CD18、CR3、CR3A、F730045J24Rik、Ly-40、MAC1、Mac-1、Mac-1a、CD11B（p170）；Mac-1α；細胞表面糖タンパク質MAC-1αサブユニット；補体成分受容体3α、補体成分受容体3α-a、補体受容体3型、白血球接着受容体MO1、およびマクロファージ抗原αが挙げられる。
【００６０】
CD29との用語には、CD29およびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、ITGB1、インテグリン、β1フィブロネクチン受容体、βポリペプチド、MDF2、MSK12、FNRB、GPIIA、MDF2、MSK12、VLAB、OTTHUMP00000046253、OTTHUMP00000063731、OTTHUMP00000063732；OTTHUMP00000063733、フィブロネクチン受容体βサブユニット、インテグリンVLA-4βサブユニット、およびインテグリンβ1が挙げられる。
【００６１】
CD105との用語には、CD105およびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、ENG、エンドグリン、RP11-228B15.2、END、FLJ41744、HHT1、ORW、およびORW1が挙げられる。
【００６２】
Gata-4との用語には、Gata-4およびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、GATA-4 zincフィンガー転写因子が挙げられる。
【００６３】
CD31との用語には、CD31およびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、PECAM1、血小板/内皮細胞接着分子、CD31/EndoCAM、PECAM-1、およびCD31/EndoCAM接着分子が挙げられる。
【００６４】
IL-1βとの用語には、IL-1bおよびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、IL-1β、IL1-BETA、IL1F2、およびカタボリン（catabolin）が挙げられる。
【００６５】
CD49cとの用語には、CD49cおよびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、ITGA3、GAP-B3、VCA-2、VLA3a、モノクローナル抗体J143により特定される抗原、およびMSK18が挙げられる。
【００６６】
HHEXとの用語には、HHEXおよびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、HEX、HOX11L-PEN、およびPRHXが挙げられる。
【００６７】
CXCR4タンパク質との用語には、CXCR4タンパク質およびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、フシン（fusin）またはCD184、D2S201E、FB22、HM89、HSY3RR、LAP3、LCR1、LESTR、NPY3R、NPYR、NPYRL、NPYY3R、およびWHIMが挙げられる。
【００６８】
Nkx2.5との用語には、Nkx2.5およびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、CHNG5、心臓特異的ホメオボックス、CSX、CSX1、HLHS2、NKX2-5、NKX2E、NKX4-1、およびVSD3が挙げられる。
【００６９】
CD133との用語には、CD133およびそのいずれかのオルソログが含まれ、限定するものではないが、プロミニン1（prominin 1）、PROM1、MCDR2、STGD4、CORD12、RP41、AC133、MSTP061、PROMLI、hプロミニン（hProminin）、造血幹細胞抗原、およびプロミニン様1（prominin-like 1）が挙げられる。
【００７０】
細胞形態および他の特性
本発明の成体心臓幹細胞の集団は、独特の形態を有する細胞から構成される。典型的には、当技術分野で公知のカーディオスフェア（cardiosphere）由来細胞は、少なくとも直径20μmである。しかしながら、本発明の成体心臓幹細胞は、典型的にはより小さく、約20μm未満の直径を有する。具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団中または本発明の細胞の混合集団中の本発明の成体心臓幹細胞の平均直径は、≦18μm、≦17μm、≦16μm、≦15μm、≦14μmまたはさらに小さい。具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団中または本発明の細胞の混合集団中の本発明の成体心臓幹細胞の平均直径は、約10μm以上〜約15μm以下の範囲内である。さらなる実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団中または本発明の細胞の混合集団中の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも90％、例えば少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上の直径が、約10μm以上〜約15μm以下の範囲内である。
【００７１】
本発明の成体心臓幹細胞の形態は、それらの比較的小さなサイズのためそれらが冠状血管その他の血管への投与により好適になるので、該細胞の集団を治療用途で特に有用となる。例えば、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団は、冠動脈、冠静脈への投与、および/または心筋への直接的な投与に特によく適している。本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団は、注入による投与またはカテーテルを介した投与によく適している。
【００７２】
本発明の成体心臓幹細胞はクローン原性を有し、すなわち、細胞はクローンを形成することができる。「クローン原性」との用語は、本発明の細胞のクローン性増殖能に関する。この用語は、播種後の単一細胞が、増殖でき、かつ元の培養物を反復できることを伝えることが意図される。
【００７３】
一部の実施形態では、本発明の実質的に純粋な成体幹細胞集団は、成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約10％が、単一細胞としての播種後に、増殖し、かつ細胞培養物を確立する場合に、クローン原性を有すると見なされる。一部の実施形態では、成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団または本発明の細胞の混合集団の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約15％、一部の実施形態では少なくとも約20％、一部の実施形態では少なくとも約25％、一部の実施形態では少なくとも30％またはそれ以上が、クローン原性を有する。
【００７４】
本発明の実質的に純粋な成体幹細胞集団中または細胞の混合集団中の本発明の成体心臓幹細胞はまた、自己複製も可能である。つまり、本発明の成体心臓幹細胞は、母細胞と同じマーカー発現および発生能の特徴的パターンを有する娘細胞を生じさせる。この特性は、マーカー発現のパターンを失なうことなく複数回の継代を経ることができる、本発明の細胞の培養物の能力を通じて測定することができる。しかしながら、本発明の成体心臓幹細胞は、無制限に継代することはできない。本発明の成体幹細胞は、特性のいかなる変化も伴わずに、最大20回まで複製することができる。一実施形態では、本発明の成体幹細胞は、特性のいかなる変化も伴わずに、最大50回まで複製することができる。
【００７５】
本発明の実質的に純粋な成体幹細胞集団中または本発明の細胞の混合集団中の本発明の成体心臓幹細胞はまた、高度なゲノム安定性も示す。「高度なゲノム安定性」とは、本発明の実質的に純粋な成体幹細胞集団が、比較ゲノムハイブリダイゼーション解析を用いて染色体変化のいかなる兆候もなしに、最大5回まで継代することができ、増殖させることができ、かつ/または被験体に投与することができることを意味する。具体的な実施形態では、本発明の実質的に純粋な成体幹細胞集団中の細胞のうちの≦約25％、例えば≦約20％、≦約15％、≦約10％、またはそれ以下が、いずれかの染色体変化を示す。「染色体変化」との用語は、染色体構造を正常な予測される染色体構造とは異なるようにする、染色体構造のいずれかの再編成を含む。例として、この用語は、染色体転座、染色体切断、および染色体増加または染色体欠損を包含する。
【００７６】
本発明の成体心臓幹細胞は、懸濁液中で培養した場合に、カーディオスフェアを形成することが可能である。「カーディオスフェア」との用語は当技術分野で周知であり、心臓幹細胞のクローンから構成される偽胚様体（pseudo-embryoid body）を含む。本出願では同義として用いられる「胚様体」または「偽胚様体」とは、本出願で与えられる培養条件下で種々の細胞タイプに分化し始める、細胞の凝集体である。
【００７７】
特定の実施形態では、本発明の実質的に純粋な成体幹細胞集団中または細胞の混合集団中の本発明の成体心臓幹細胞は、本発明の実質的に純粋な成体幹細胞集団中または細胞の混合集団中の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約20％が偽胚様体を形成することが可能である場合に、偽胚様体を形成することが可能であると見なされる。一部の実施形態では、本発明の実質的に純粋な成体幹細胞集団中または細胞の混合集団中の本発明の成体心臓幹細胞のうちの少なくとも約25％、少なくとも約30％または少なくとも約35％またはそれ以上が、偽胚様体を形成することが可能である。
【００７８】
慣習的には、そのような偽胚様体は、懸滴法（hanging drop method）により作製される。しかしながら、本発明の細胞は、負の電荷でコーティングされていない細菌培養ディッシュの中で、増殖培地中で培養される場合に、容易に胚様体を形成する。この定義が限定を意図するものではなく、胚様体の作製のための当技術分野で公知のいずれかの方法を用い得ることは、当業者には明らかであろう。超低接着ディッシュ中で低密度にて播種される場合に偽胚様体を形成する本発明の細胞の能力は、自己複製するそれらの能力の特徴であり、この能力は、本発明の成体心臓幹細胞でない同じ組織由来の培養物中に存在する他の細胞からのその単離および分離のために活用できる。本発明の成体心臓幹細胞はまた、細胞遊走アッセイでの単球遊走および/または単球動員を誘導することもできる。好ましい細胞遊走アッセイは、実施例3Dに記載されている。「単球遊走または動員を誘導できる」とは、本発明の成体幹細胞を生育するために前もって用いた培養培地が、本明細書中に記載される通りの細胞遊走アッセイで下部チャンバー中に置かれた場合に、間葉系幹細胞（MSC）を生育するために前もって用いた培養培地により誘導される速度よりも少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍またはそれ以上の速度で、下部チャンバーへと5ミクロン膜孔を通って遊走するように、上部チャンバー中に置かれた単球を誘導することを意味する。
【００７９】
本発明の成体心臓幹細胞はまた、単球増殖も誘導できる。「単球増殖を誘導する」とは、単球との本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の共培養が、単球単独またはMSCとの共培養中の単球の増殖の基底速度よりも、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍またはそれ以上で単球を増殖させることを意味する。単球増殖は、本明細書中に記載されるかまたは当技術分野で公知のいずれかの方法により測定することができる。
【００８０】
単球動員、遊走および/または増殖を誘導する能力は、本発明の成体心臓幹細胞の治療用途のために重要であり得る。理論に拘泥することを望まないが、被験体への投与後に、本発明の成体心臓幹細胞が、単球動員および増殖を誘導すると本発明者らは考える。次に、単球は、被験体の免疫応答の調節での機能を果たす。単球の存在はまた、被験体での血管新生も誘導し得る。
【００８１】
本発明の成体心臓幹細胞はまた、Tリンパ球応答を調節することもできる。Tリンパ球応答の調節は、当技術分野で公知であるかまたは本明細書中に記載されるいずれかのアッセイにより測定できる。好ましいアッセイは、実施例3Eに提供される。「Tリンパ球応答を調節する」とは、本発明の成体心臓幹細胞が、活性化型T細胞増殖を調節することができること、および特に、制御性T細胞集団を活性化および増殖させ、かつ/またはCD4+およびCD8+ T細胞の増殖をダウンレギュレーションすることができることを意味する。特定の実施形態では、制御性T細胞との本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を含む懸濁物の共培養は、単独で培養される制御性T細胞と比較して、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％またはそれ以上、増殖性の制御性T細胞の割合を増加させる。別の特定の実施形態では、PHA活性化型T細胞との本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を含む懸濁物の共培養は、単独で培養されるPHA活性化型T細胞と比較して、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれ以上、CD4+およびCD8+ T細胞の増殖を減少させる。別の実施形態では、マイトマイシンC処理した本発明の成体心臓幹細胞と共培養する場合に、IL2+CD3/CD28 Dynabeadsを用いて活性化したヒト初代Tリンパ球の倍増数は、本発明の成体心臓幹細胞を含まない陰性対照と比較して、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれ以上、減少する。
【００８２】
これらのTリンパ球制御特性は、本発明の成体心臓幹細胞の、つまり本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団または本発明の細胞の混合集団の低い免疫原性に寄与する可能性があり、このため次に、それらが治療での使用に好適となり、かつ同種異系細胞としての投与に好適となる。本発明の成体心臓幹細胞は、弱い免疫原性プロフィールを示す。本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団中または本発明の細胞の混合集団中の本発明の成体心臓幹細胞は、マーカーCD40、CD80、および/またはCD86を発現しない。本発明の成体心臓幹細胞の低い免疫原性および弱い免疫原性プロフィールのため、細胞が、レシピエントの免疫系による急性拒絶を回避することが可能となり、つまり、レシピエントからの排除を防止し、かつ/または遅延させる。つまり、本発明の成体心臓幹細胞は、治療的利益が生じるために十分な時間、レシピエント体内に留まる。レシピエントの免疫応答を調節する能力はまた、損傷組織での瘢痕形成を防止し、かつ心筋再生を促す本発明の成体心臓幹細胞の能力に寄与するという理由でも、治療用途に有用である。
【００８３】
本発明の成体心臓幹細胞は、in vitroもしくはin vivoでの免疫応答を誘発しないか、または被験体への同種異系細胞集団の注入に際して誘発されることが予測されるであろうものよりも実質的に弱い免疫応答を誘発する。本発明の特定の態様では、成体心臓幹細胞および/または実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団は、成体心臓幹細胞および/または実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団の細胞のうちの少なくとも約70％が免疫応答を誘発しない場合に、免疫応答を誘発しないと見なされる。一部の実施形態では、実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団の細胞のうちの少なくとも約80％、少なくとも約90％、もしくは少なくとも約95％、少なくとも約99％、もしくはそれ以上が、免疫応答を誘発しないか、または弱い免疫応答しか誘発しない。好ましくは、本発明の細胞は、抗体媒介免疫応答を誘発しないか、in vivo体液性免疫応答を誘発しないか、または同種異系細胞の注入に際して誘発されることが予測されるであろうものよりも弱い応答を誘発する。
【００８４】
「弱い免疫応答」とは、本発明の成体心臓幹細胞および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団により誘発される免疫応答が、対照同種異系細胞または細胞の集団により誘発される対応する免疫応答のレベルの約40％未満、≦約30％、≦約25％、≦約20％または≦約10％またはそれ以下であることを意味する。
【００８５】
免疫応答がないこと、または弱い免疫応答の存在は、いずれかの慣用の手段を用いて、および実施例中で本明細書中に記載される通りに、好ましくは実施例4Aに記載される通りに評価することができる。一実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、注入された本発明の細胞に対する同種抗体のレベルが、非適合個体由来のMSCまたは最終分化細胞などの注入された対照細胞に対する同種抗体のレベルの10％未満である場合に、免疫応答を誘発しないか、または弱い免疫応答のみしか誘発しないと見なされるであろう。具体的には、注入された本発明の細胞に対する同種抗体のレベルは、非適合個体由来のMSCまたは最終分化細胞などの注入された対照細胞に対する同種抗体のレベルの、≦約9％、≦約8％、≦約7％、≦約6％、≦約5％、≦約4％、≦約3％、≦約2％、≦約1％、≦約0.5％またはそれ以下である。
【００８６】
特に好ましい実施形態では、注入された細胞または本発明の細胞の集団に対する同種抗体のレベルは、フローサイトメトリーなどの慣用の手段により検出可能でない。
【００８７】
一実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞および/または実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団は、非適合個体由来のT細胞との実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団のインキュベーション後に誘導される、IL2、IFNλ、TNFβ、IL4、IL5、IL10、IL3、TNFαおよび/またはTGFβのうちの1種以上の発現のレベルが、非適合個体から単離された最終分化細胞またはMSCとの同等なT細胞集団のインキュベーション後のIL2、IFNλ、TNFβ、IL4、IL5、IL10、IL3、TNFαおよび/またはTGFβのうちの1種以上の発現のレベルの約50％未満である場合に、免疫応答を誘導しないかまたは弱い免疫応答のみしか誘発しないと見なされる。一部の実施形態では、非適合個体由来のT細胞との実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団のインキュベーション後に誘導される、IL2、IFNλ、TNFβ、IL4、IL5、IL10、IL3、TNFαおよび/またはTGFβのうちの1種以上の発現のレベルは、非適合個体から単離された最終分化細胞またはMSCとの同等なT細胞集団のインキュベーション後のIL2、IFNλ、TNFβ、IL4、IL5、IL10、IL3、TNFαおよび/またはTGFβのうちの1種以上の発現のレベルの約40％、約30％、約25％、約20％または約10％未満またはそれ以下である。具体的な実施形態では、非適合個体由来のT細胞との実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団のインキュベーション後に誘導されるIL2およびIFNλの両方のレベルが、非適合個体由来の同等なT細胞との最終分化細胞のインキュベーション後に誘導されるIL2およびIFNλの両方の発現のレベルの約50％未満（例えば、≦約40％、≦約30％、≦約25％、≦約20％または≦約10％またはそれ以下）である。
【００８８】
別の実施形態では、上記のアッセイにより生成される結果として生じる免疫応答は、アッセイでT細胞の増殖速度を検出することにより測定することができる。一実施形態では、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団は、実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団とのインキュベーション後の、非適合個体由来のT細胞の増殖速度が、非適合個体から単離された最終分化細胞またはPBMCとのインキュベーション後のTの同等な集団の倍加速度の約50％未満である場合に、免疫応答を誘発しないと見なされるであろう。一部の実施形態では、非適合個体由来のT細胞との単離された成体幹細胞のインキュベーション後に誘導される増殖速度は、非適合個体から単離された最終分化細胞との同等なT細胞のインキュベーション後のT細胞倍加速度の約40％、約30％、約25％、約20％または約10％未満またはそれ以下である。
【００８９】
上記のアッセイは例示のみのために提供され、排他的であることを意図しない。当業者は、用い得るであろう種々の代替的なアッセイに気づくであろう。好ましいアッセイは、実施例にて本明細書中に記載されている。
【００９０】
本発明の成体心臓幹細胞はまた、抗アポトーシス因子を分泌することもできる。抗アポトーシス因子の分泌は、本明細書中に記載される通りに、特に、実施例3Fに記載される通りに測定することができる。特定の実施形態では、抗アポトーシス因子の分泌は、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の増殖に用いられた培養培地またはMCSの増殖に用いられた培養培地のいずれかに曝露される、発作を受けた（insulted）心筋細胞の細胞生存率を比較することにより測定することができる。特定の実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団に曝露された細胞の細胞生存率は、対照よりも少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍またはそれ以上である。
【００９１】
本発明の成体心臓幹細胞はまた、例えば、内在性心筋細胞の再生を引き起こすこと、新規な筋肉形成を促進すること、ならびに/または瘢痕形成および心臓組織のリモデリングを防止することにより、心臓再生（cardio-regeneration）を促進することも可能である。心臓再生の促進を測定するための好ましいアッセイは、実施例4Cに提供される。
【００９２】
本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団中または本発明の細胞の混合集団中に存在する成体心臓幹細胞はまた、多能性である。「多能性」（multipotent）とは、複数の系統であるが、限られた数だけの系統由来の細胞タイプを生成することが可能であることを意味する。
【００９３】
特に、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団中または本発明の細胞の混合集団中の細胞は、以下の細胞タイプのうちの1種以上に分化することができる：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞、心筋細胞および/または平滑筋細胞。
【００９４】
本発明の成体心臓幹細胞の集団を生成する方法
心臓組織から心臓幹細胞の調製のための多数の方法が、当技術分野で公知である。本発明は、本発明に係る成体心臓幹細胞および/または成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法を提供する。成体心臓幹細胞の所望の集団に固有である多数のマーカーが明らかになっているので、本発明者らは、以下のステップ：
(a)成体心臓幹細胞の集団を含む懸濁物を提供するステップ；および
(b)少なくともSOX17およびGATA4を発現する細胞を選択するステップ
を含む、該集団を調製する方法を開発した。
【００９５】
選択は、いずれかの慣用の手段により少なくともSOX17およびGATA4の発現を検出すること、そしてこれらのマーカーを発現しない細胞を破棄することにより、行なうことができる。特定の実施形態では、細胞ペレットがステップ(a)の後に得られ、SOX17およびGATA4の高レベルのmRNAを発現している細胞を、さらなる処理のために選択する。
【００９６】
本発明の方法は、ステップ(b)で選択される細胞を増殖させるステップであるステップ(c)をさらに含むことができる。本実施形態では、本発明は、以下のステップ：
(a)成体心臓幹細胞の集団を含む懸濁物を提供するステップ；
(b)少なくともSOX17およびGATA4を発現する細胞を選択するステップ；および
(c)ステップ(b)で選択される細胞を増殖させるステップ
を含む、本発明に係る心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法を提供する。
【００９７】
この増殖ステップは、多数の細胞を含む成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を提供する。したがって、増殖ステップは、本明細書中に記載される治療用途などの下流の用途のために利用可能な本発明の細胞の集団のサイズを増大させるのに有用である。
【００９８】
本発明の方法は、増殖ステップ(c)から生じる幹細胞の実質的に純粋な集団が、少なくともSOX17およびGATA4を今もなお発現することを確認するステップであるステップ(d)をさらに含むことができる。つまり、本発明の方法は、ステップ(c)からの増殖された細胞での少なくともSOX17およびGATA4の発現を確認するステップを含むことができる。本実施形態では、本発明は、以下のステップ：
(a)成体心臓幹細胞の集団を含む懸濁物を提供するステップ；
(b)少なくともSOX17およびGATA4を発現する細胞を選択するステップ；
(c)ステップ(b)で選択される細胞を増殖させるステップ；および
(d)増殖ステップ(c)から生じる幹細胞の実質的に純粋な集団が、少なくともSOX17およびGATA4を今もなお発現することを確認するステップ。好ましくは、増殖ステップ(c)から生じる幹細胞の実質的に純粋な集団が少なくともSOX17、GATA4およびIL-1βを発現し、かつ以下のマーカー：Oct4、Nanog、C-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4タンパク質およびNkx2.5を発現しないことを確認するステップ；ならびに任意により、細胞が以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および平滑筋細胞のうちの1種以上に分化できることを確認するステップ
を含む、本発明に係る心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法を提供する。
【００９９】
本発明の方法は、成体心臓幹細胞の集団を含むいずれかの既知の懸濁物から出発することができる。しかしながら、具体的な実施形態では、方法はまた、成体心臓幹細胞の集団を含む最初の細胞懸濁物の調製も含む。一実施形態では、この細胞懸濁物は、心臓生検などの心臓組織（例えば、心臓手術の途中に、心臓カテーテル術（cardiac catheterism）の途中に生検カテーテルを用いて、または屠殺された動物の心臓から取得される）から調製される。つまり、本実施形態では、本発明の方法は、細胞を選択するステップの前に、心臓組織から成体心臓幹細胞の集団を単離するステップ、および細胞の該集団を増殖させるステップを含む。本実施形態では、本発明の方法は、以下のステップ：
(a)心筋組織から細胞を含む懸濁物を調製するステップ；
(b)成体心臓幹細胞の集団を単離するステップ；
(c)成体心臓幹細胞の該集団を増殖させるステップ；および
(d)少なくともSOX17およびGATA4を発現する細胞を選択するステップ
を含む。
【０１００】
好ましくは、ステップ(d)は、少なくともSOX17、GATA4、IL-1β、および任意によりCD31を発現し、かつ以下のマーカー：Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4およびNkx2.5を発現せず；かつ以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および平滑筋細胞のうちの1種以上に分化できる細胞を選択することを含む。
【０１０１】
心臓組織から成体心臓幹細胞の集団を単離するステップは、当技術分野で公知のいずれかの手段により行なうことができる。具体的な実施形態では、心臓組織由来の細胞をろ過して心筋細胞を取り出し、CD45陽性細胞について免疫枯渇（immunodepleted）させる。枯渇させた細胞を次に、任意によりCD117（c-kit）陽性細胞について免疫選択することができる。しかしながら、本発明に係る成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団はc-kit陰性であり、したがって、本発明者らはこのステップが任意的であり、かつ存在する場合に真の免疫選択をもたらさない場合もあると考える。このステップが単に追加のサイズろ過（size filtration）ステップを表わし、いずれかの免疫選択的抗体を含有するかまたは抗体をまったく含まないビーズを用いるろ過により置き換えられることがあり得る。あるいは、CD117についての免疫選択を用いて最初に単離される細胞は、c-kitを発現する成体心臓幹細胞の最初の集団を生じ得る。しかしながら、本発明の実質的に純粋な成体心臓幹細胞集団はc-kit陰性であることが明らかであり、このことは、最初に存在し得るいずれかのc-kit発現が、後続の選択ステップまたは選択および増殖ステップ中に失われることを意味する。細胞のマーカープロフィールは、方法のステップ同士の間で、特に成体心臓幹細胞の集団を含む最初の懸濁物と選択ステップから生じる細胞との間で変化する場合がある。
【０１０２】
成体心臓幹細胞の前記集団を増殖させるステップは、細胞生育を促す好適な条件下で（例えば、3％O2雰囲気にて）、増殖培地中で成体心臓幹細胞の単離された集団を生育させることを含むことができる。増殖させた成体心臓幹細胞の集団は、次に、凍結保存して、ワーキングセルバンク（WCB）を作製することができる。例えば、成体心臓幹細胞の集団は、WCBを作製するために、21回の複製後に第4継代で凍結保存することができる。次に、細胞の発現プロフィールを分析することができる。
【０１０３】
さらなる具体的な実施形態では、本発明に係る成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法は、以下のステップ：
(a)心筋組織から細胞を含む懸濁物を調製するステップ；
(b)成体心臓幹細胞の集団を単離するステップ；
(c)成体心臓幹細胞の該集団を増殖させるステップ；
(d)複数の細胞株を含むワーキングセルバンク（WCB）またはそれぞれが1種類の細胞株を有する複数のワーキングセルバンクを調製するステップ；
(e)該ワーキングセルバンク（1種類または複数）から、少なくともSOX17およびGATA4を発現する細胞株を選択するステップ；好ましくは、該ワーキングセルバンク（1種類または複数）から、少なくともSOX17、GATA4、IL-1β、および任意によりCD31を発現し、かつ以下のマーカー：Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4タンパク質およびNkx2.5を発現しない細胞株を選択するステップ；ならびに任意により、該細胞が以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および平滑筋細胞のうちの1種以上に分化できることを確認するステップ；
(f)選択された細胞株を増殖させるステップ；および
(g)成体心臓幹細胞の最終的な実質的に純粋な集団での少なくともSOX17およびGATA4の発現を確認するステップ、好ましくは、少なくともSOX17、GATA4、IL-1β、および任意によりCD31の成体心臓幹細胞の最終的な実質的に純粋な集団での発現、ならびに以下のマーカー：Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4タンパク質およびNkx2.5の発現の非存在を確認するステップ
を含む。
【０１０４】
本発明のこの方法の具体的な実施形態では、ステップ(b)とステップ(c)との間にさらなる選択ステップがあり、該ステップは、さらなる処理のために、少なくともSOX17およびGATA4を発現する細胞を選択することを含む。より具体的には、追加の選択ステップは、17回の複製を含み得る少なくとも3回の継代にわたって細胞を増殖させた後に行なわれる。第3継代にて、細胞ペレットを取得し、SOX17およびGATA4について高レベルのmRNAを発現する細胞を選択し、ワーキングセルバンクを形成させるためにさらに増殖させる。細胞表現型は、フローサイトメトリーおよびqPCRによりWCB段階で確認され、細胞は、最終生成物をもたらすために増殖させる。
【０１０５】
本発明の方法のいずれかでは、選択ステップおよび/または確認ステップはまた、任意により、1種以上のさらなるマーカーについての選択または検出を含むことができる。これらのマーカーとしては、WT1、HEY2、KDR、PDGF、CCL2、IL1αおよび/またはCSF3が挙げられる。1つの具体的な実施形態では、選択ステップは、マーカーSOX17、GATA4、WT1、およびHEY2のすべてを発現する細胞について選択することを含む。さらなる具体的な実施形態では、選択ステップは、マーカーSOX17、GATA4、WT1、HEY2、KDR、PDGF-β、CCL2、IL1αおよびCSF3のすべてを発現する細胞について選択することを含む。具体的な実施形態では、確認ステップは、細胞がマーカーSOX17、GATA4、WT1、およびHEY2のすべてを発現することを確認することを含む。
【０１０６】
「ワーキングセルバンク」との用語は、慣用の意味で本明細書中で用いられ、当業者には十分に理解されるであろう。「ワーキングセルバンク」は、マスターセルバンク由来または単離された細胞の初代集団由来の細胞の培養物であり、本発明の医薬組成物（「最終生成物」とも称される）を製造するために用いることができる生成細胞培養物の調製での使用を目的とする。
【０１０７】
他の方法により本発明の細胞を作製することが可能であり得るが、本発明者らは、少なくともSOX17およびGATA4を発現する細胞について選択するステップが、特許請求の範囲に記載される幹細胞集団の有利な特性のすべてを保持する成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の作製の効率を増大させることを見出している。
【０１０８】
WCBから選択された細胞および/または細胞株を、次に、解凍し、かつ増殖させることができる。一部の実施形態では、選択された細胞株は、第5継代（25回の複製が蓄積される）まで増殖させ、そして、細胞品質が分析された最終生成物（FP）を作製することができる。品質管理（QC）は、最終生成物の特性（identity）、純度および安全性を確認するために、製造プロセス中に行なうことができる。
【０１０９】
成体心臓幹細胞の最終的な実質的に純粋な集団中での少なくともSOX17およびGATA4の発現を確認するための最終検証ステップが、品質管理の目的のために有用であり、最終生成物が本発明に係る成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団であることを確実にするものである。
【０１１０】
本発明はまた、本明細書中に記載される方法により取得されるかまたは取得可能である成体心臓幹細胞および成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団にも及ぶ。
【０１１１】
成体心臓幹細胞の集団は、当技術分野で公知のいずれかの好適な培地中で単離することができる。用語「培養培地」または「培地」は当技術分野で理解されており、一般に、生細胞の培養に使用されるいずれかの材料または調製物を指す。用語「培地」は、細胞培養に関して使用する場合、細胞を取り囲む環境の成分を含む。培地は固体であることができ、液体であることができ、気体であることができ、または相および材料の混合物であることができる。培地として、液体増殖培地および細胞増殖を維持しない液体培地が挙げられる。培地として、寒天マトリクス、アガロースマトリクス、ゼラチンマトリクスおよびコラーゲンマトリクス等のゼラチン状培地も挙げられる。例示的な気体培地として、ペトリ皿または他の固体支持体もしくは半固体支持体上で生育している細胞が曝される気相が挙げられる。用語「培地」は、たとえ該培地が細胞と未だ接触していないとしても、細胞培養での使用を目的とする材料も指す。換言すると、細菌培養用に調製された、栄養素に富んだ液体が培地である。同様に、水または他の液体と混合した場合に細胞培養に適するようになる粉末混合物を「粉末化培地」と称することができる。「規定培地」は、化学的に定義された（通常は精製された）成分で作られている培地を指す。「規定培地」は、酵母エキスおよびビーフブロス等の特徴が明らかでない生物学的エキスを含有しない。「富栄養培地」として、特定種のほとんどまたはすべての生存可能な形態の生育を支持するように設計されている培地が挙げられる。富栄養培地は複雑な生物学的エキスを含むことが多い。「高密度培養の増殖に適した培地」は、他の条件（温度および酸素移動速度など）がそのような増殖を可能とする場合に細胞培養物がOD600 3以上に到達するのが可能ないずれかの培地である。用語「基礎培地」は、任意の特別な栄養素添加剤を必要としない、多くの種類の微生物の増殖を促進する培地を指す。ほとんどの基礎培地は一般的に、4種の基礎化学群、すなわちアミノ酸、炭水化物、無機塩およびビタミンから構成される。基礎培地は一般的に、より複雑な培地の基礎となり、これには血清、緩衝剤、増殖因子、脂質等の添加剤が添加される。一態様では、増殖培地は、本発明の細胞の自己複製能力を維持しつつ該細胞の生長および増殖の支持に必須の増殖因子を含む複雑な培地であることができる。基礎培地の例としては、限定するものではないが、イーグル基礎培地、最小必須培地、ダルベッコ改変イーグル培地、199培地、栄養混合物（Nutrient Mixtures）ハムF-10およびハムF-12、マッコイ5A、ダルベッコMEM/F-12、RPMI 1640、ならびにイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）が挙げられる。
【０１１２】
好ましい実施形態では、単離培地は、EGF、bFGF、IGFIIおよびITSを含む。単離培地は、DMEM/F-12培地、FBS、L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシンおよび/またはhEPOをさらに含むことができる。具体的な好ましい実施形態では、単離培地は、指定された濃度で以下の成分のうちの1種以上を含む：
・約80〜95％、例えば、85〜90％、または86％、87％、88％もしくは89％の濃度でのDMEM/F-12培地；
・約5〜15％、例えば、7〜13％、8％〜12％または9％、10％、11％もしくは12％の濃度でのFBS；
・約0.5〜2％、例えば、0.75％〜1.5％、0.8％〜1.2％、または0.9％、1％、もしくは1.1％の濃度での、あるいはそれぞれ100U/mlおよび100μg/mlの濃度でのペニシリン-ストレプトマイシン；
・約5〜15ng/ml、7〜13ng/ml、8％〜12ng/mlまたは9ng/ml、10ng/ml、11ng/mlもしくは12ng/mlの濃度でのbFGF；
・約10〜30mg/mlの濃度でのEGF
・約20〜40ng/mlの濃度でのIGF II
・約0.01〜1×、例えば、0.25〜0.75×または0.5×の濃度でのITS；および/または
・約0.0001〜0.05U/ml、例えば、0.001〜0.01U/ml、0.0025〜0.0075U/mlまたは0.004〜0.006U/ml、もしくは0.005U/mlの濃度でのhEPO。
【０１１３】
具体的な実施形態では、単離培地は、DMEM/F-12培地、FBS、L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン、EGF、bFGF、IGFII、ITSおよびhEPOのすべてを含む。
【０１１４】
成体心臓幹細胞の集団は、当技術分野で公知のいずれかの好適な培地中で増殖させることができる。好ましい実施形態では、増殖培地は、EGF、bFGF、IGFIIおよびITSを含む。増殖培地は、DMEM/F-12培地、Neurobasal培地、FBS-ESCq、L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン、B27、N2、および/またはβ-メルカプトエタノールをさらに含むことができる。
【０１１５】
具体的な好ましい実施形態では、単離培地は、指定された濃度で以下の成分のうちの1種以上を含む：
・約40〜50％、例えば、42〜45％、または42％、43％、44％もしくは45％の濃度でのDMEM/F-12培地；
・約40〜50％、例えば、42〜45％、または42％、43％、44％もしくは45％の濃度でのNeurobasal培地；
・約5〜15％、例えば、7〜13％、8％〜12％または9％、10％、11％もしくは12％の濃度でのFBS-ESCq；
・約0.5mM〜5mM、例えば、1mM〜3mM、1.5mM〜2.5mMまたは2mMの濃度でのL-グルタミン；
・約0.5〜2％、例えば、0.75％〜1.5％、0.8％〜1.2％、または0.9％、1％、もしくは1.1％、あるいはそれぞれ100U/mlおよび100μg/mlの濃度でのペニシリン-ストレプトマイシン；
・40〜60μM、例えば、45〜55μM、47〜52μMまたは50μMの濃度でのβ-メルカプトエタノール；
・0.01〜1×、例えば、0.25〜0.75×または0.5×の濃度でのB27；
・0.01〜1×、例えば、0.25〜0.75×または0.5×の濃度でのN2；
・約5〜15ng/ml、7〜13ng/ml、8％〜12ng/mlまたは9ng/ml、10ng/ml、11ng/mlもしくは12ng/mlの濃度でのbFGF；
・約10〜30mg/mlの濃度でのEGF
・約20〜40ng/mlの濃度でのIGF II；および/または
・約0.01〜1×、例えば、0.25〜0.75×または0.5×の濃度でのITS。
【０１１６】
具体的な実施形態では、増殖培地は、DMEM/F-12培地、Neurobasal培地 FBS ESCq、L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン、B27、N2、β-メルカプトエタノール、EGF、bFGF、IGFIIおよびITSのすべてを含む。
【０１１７】
心臓幹細胞の単離および増殖のための上記で定義した培地の使用は、本発明の成体心臓幹細胞の特性を保持する少数の細胞をもたらし得る。しかしながら、Lauden et al.（Circulation Research (2012) DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.112.276501）に明らかにされている通り、本明細書中に記載される選択ステップを用いないと、心臓幹細胞は、本発明の細胞とは異なり、Oct4およびNanog陽性であり得る。つまり、本明細書中に記載される選択ステップは、本発明に係る成体心臓幹細胞の大きな集団を作製するために有用である。
【０１１８】
本発明の方法は、細胞生育を促すいずれかの好適な条件下で行なうことができる。例示的な培養条件としては、約30〜40℃、好ましくは約35〜38℃、36〜37.5℃または約37℃の温度が挙げられる。酸素濃度は、約1〜5％、例えば、約2〜4％または2.5〜3.5％、または約3％であり得る。
【０１１９】
治療方法、治療的使用および製薬上許容される組成物
本明細書中に記載される方法のうちのいずれかにより取得されるかまたは取得可能な細胞をはじめとする、本発明の成体心臓幹細胞は、治療における使用ならびに虚血性傷害および心血管疾患を治療する方法、特に、in vivoでの組織修復/再生の誘導をはじめとする細胞療法のために好適である。本発明の成体心臓幹細胞は、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の形態で、または本発明の細胞の混合集団の形態での治療方法および治療的使用で一般的に用いられるであろう。
【０１２０】
したがって、本発明は、本発明の成体心臓幹細胞または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団もしくは本発明の細胞の混合集団をレシピエント被験体に投与するステップを含む方法を提供し、治療における使用のための本発明の成体心臓幹細胞または成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団もしくは本発明の細胞の混合集団も提供する。
【０１２１】
特に、本発明の成体心臓幹細胞または成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団もしくは本発明の細胞の混合集団は、心筋梗塞、慢性虚血性心筋症、心筋症および慢性心不全などの虚血性傷害および心血管疾患を治療するために有用である。本発明の細胞の免疫調節能によって、これらは自己免疫疾患、炎症プロセス、慢性潰瘍および創傷治癒全般の治療のために用いることができる。また、これらは同種異系移植臓器拒絶を防止するために用いることができる。本発明の細胞は血管新生能を有するので、これらは、重篤な肢虚血などの虚血性疾患（ischemic affectation）に対して用いることができる。
【０１２２】
したがって、本発明は、本発明の成体心臓幹細胞、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団、本発明の混合集団または本発明の医薬組成物をレシピエント被験体に投与するステップを含む、自己免疫疾患、炎症プロセス、慢性潰瘍を治療し、かつ創傷治癒を促進するための方法を提供する。本発明はまた、本発明の成体心臓幹細胞、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団または本発明の細胞の混合集団をレシピエント被験体に投与するステップを含む、同種異系臓器移植拒絶を防止するための方法も提供する。
【０１２３】
一般的に、本発明の成体心臓幹細胞または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団もしくは本発明の細胞の混合集団は、注入または移植（implantation）によって被験体の身体へと導入される。一般的に、本発明の成体心臓幹細胞または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団もしくは本発明の細胞の混合集団は、作用することが意図される組織へと直接的に注入されるであろう。具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団、本発明の細胞の混合集団または本発明の医薬組成物は、静脈内に、動脈内に、冠動脈内にまたは心筋内に投与される。
【０１２４】
本発明の成体心臓幹細胞は、1×106〜50×106細胞の用量で、好ましくは25×106〜45×106細胞の用量で、より好ましくは35×106〜40×106細胞の用量で、最も好ましくは38×106細胞の用量で投与することができる。
【０１２５】
一実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団もしくは本発明の細胞の混合集団は、心筋の再生をはじめとする心臓組織の再生に用いることができる。本実施形態では、本発明の細胞は、心臓内経由で（trans-endocardically）；動脈内で心筋へと細胞を注入する針カテーテルを用いて；損傷組織領域に栄養供給する（irrigating）動脈へのバルーンカテーテルを用いて、または逆行性に；損傷領域を排液する（draining）冠静脈へと細胞を注入することにより、損傷心臓組織へと直接的に注入または移植することができる。心筋の治療のための代替的な実施形態は、NOGAシステムまたはいずれかの類似の注入システムなどのシステムを用いた電気的マッピングを用いるかまたは用いない、心臓内経由の（transendocardically）経カテーテル注入である。一実施形態では、本発明は、心臓組織の再生での使用のための、任意により生体適合性インプラントに接着された、本発明の成体心臓幹細胞、本発明の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団、または本発明の細胞の混合集団を提供する。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団または本発明の細胞の混合集団は、生体適合性インプラントに接着させて損傷組織へと移植することができる。本実施形態内では、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団または本発明の細胞の混合集団は、被験体への移植に先立って、in vitroで生体適合性インプラントに接着させることができる。当業者には明らかであろう通り、多数の接着剤（adherent）のうちのいずれか1種を、移植に先立ってインプラントに細胞を接着させるために用いることができる。単に例として、そのような接着剤としては、フィブリン、インテグリンファミリーの1種以上のメンバー、カドヘリンファミリーの1種以上のメンバー、セレクチンファミリーの1種以上のメンバー、1種以上の細胞接着分子（CAM）、免疫グロブリンファミリーの1種以上および1種以上の人工接着剤が挙げられる。このリストは、単に例示として提供され、限定することを意図しない。1種以上の接着剤のいずれかの組み合わせを用いることができることは、当業者には明らかであろう。
【０１２７】
別の実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団または本発明の細胞の混合集団は、被験体へのマトリクスの移植に先立って、マトリクス中に包埋することができる。一般的に、マトリクスは、被験体の損傷組織へと移植されるであろう。マトリクスの例としては、コラーゲン系マトリクス、フィブリン系マトリクス、ラミニン系マトリクス、フィブロネクチン系マトリクスおよび人工マトリクスが挙げられる。このリストは、単に例示として提供され、限定することを意図しない。
【０１２８】
さらなる実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団または本発明の細胞の混合集団は、マトリクス形成性成分と共に被験体へと移植または注入することができる。これは、注入または移植後に、細胞がマトリクスを形成することを可能にし、細胞が被験体体内で適切な位置に留まることを確実にする。マトリクス形成性成分の例としては、フィブリン糊液体アルキル（fibrin glue liquid alkyl）、シアノアクリレートモノマー、可塑剤、デキストランなどの多糖、エチレンオキシド含有オリゴマー、ポロキサマーおよびプルロニックなどのブロックコポリマー、TweenおよびTriton‘8’などの非イオン性界面活性剤、および人工マトリクス形成性成分が挙げられる。このリストは、単に例示として提供され、限定することを意図しない。1種以上のマトリクス形成性成分のいずれかの組み合わせを用いることができることは、当業者には明らかであろう。
【０１２９】
さらなる実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団または本発明の細胞の混合集団は、ミクロスフェア内に含まれることができる。本実施形態では、細胞は、ミクロスフェアの中心にカプセル封入することができる。本実施形態の範囲内ではまた、細胞は、ミクロスフェアのマトリクス材料に包埋することもできる。マトリクス材料としては、限定するものではないが、アルギネート、ポリエチレングリコール（PLGA）、およびポリウレタンをはじめとするいずれかの好適な生体分解性ポリマーが挙げられる。このリストは、単に例示として提供され、限定することを意図しない。
【０１３０】
治療および治療方法における使用のために、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団または細胞の混合集団は、治療有効量で被験体に送達されるであろう。in vivoまたはex vivoで送達される細胞の数は、被験体の体重、組織損傷の重症度、および被験体体内で生存している細胞数をはじめとする多数のパラメータに基づく。典型的な細胞数は、およそ1×106〜1×108細胞、より詳細には体重1kg当たり105〜107細胞であり得る。一般的に、単回治療レジメンで被験体に送達される細胞の総数は、約1×106〜50×106細胞であろう。
【０１３１】
上述した通り、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、治療用途での使用のためにそれらを特によく適したものにする数種類の特徴を保持する。特に、低い免疫原性、レシピエントでのT細胞応答を調節する能力、血管新生を誘導する能力および心臓再生を促進し、かつ内在性の心筋細胞の再生を誘導する能力はすべて、治療的有効性に寄与し得る。したがって、本発明は、心血管疾患を治療する方法および/または心血管疾患の治療のための本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の治療的使用を提供し、ここで、成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団は、以下のメカニズムのうちの1種以上により心臓組織修復を誘導する：
(a)単球の動員；
(b)免疫調節；
(c)血管新生の活性化；
(d)心臓再生を促進する、および/または
(e)内在性心筋細胞の再生の誘導。
【０１３２】
つまり、一実施形態では、本発明は、本発明の成体心臓幹細胞、本発明の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団、本発明の混合集団または本発明の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、心血管疾患または虚血性傷害に罹患した被験体を治療する方法を提供する。本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の低い免疫原性および/または本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の免疫調節能力は、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団が、投与後のレシピエント被験体の免疫系による急性拒絶および/または排除を回避することを可能にする。つまり、少なくとも24時間、例えば36時間、48時間、72時間、4日間、5日間、6日間、1週間、2週間、1ヵ月またはそれ以上の期間にわたって、投与された細胞のうちの検出可能な量が、被験体体内に依然として存在する。具体的な実施形態では、24時間後に、投与された細胞のうちの少なくとも約50％以上、例えば、少なくとも約60％、70％、80％、90％、95％、99％またはそれ以上が、被験体体内に依然として存在する。
【０１３３】
投与された細胞のこの保持のため、細胞が、心血管疾患または虚血性疾患の治療でその機能を実行することが可能となる。例えば、細胞は、最大で約24時間以上、例えば最大で36時間、48時間、72時間、4日間、5日間、6日間、1週間、2週間、1ヵ月またはそれ以上の期間にわたって、その免疫調節作用を発揮し、単球動員および/もしくは活性化を誘導し、血管新生を誘導し、かつ/または内在性の心筋細胞の再生を誘導することができる。
【０１３４】
投与された本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団由来の細胞は治療的作用を発揮するのに十分な時間にわたって被験体体内に留まることができるが、細胞は、被験体体内に永続的に維持されるのではない。治療的作用を発揮するのに十分な時間は少なくとも24時間であり、最大で1ヵ月以上であり得る。例えば、細胞は、最大で36、48、72時間、4日間、5日間、6日間、1週間、2週間または1ヵ月、保持される場合がある。
【０１３５】
本発明の成体心臓幹細胞および成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団のさらなる有益な特性は、実施例4Eに記載される通りに、それらが投与後に免疫不全被験体での腫瘍を誘導しないことである。
【０１３６】
本発明の成体心臓幹細胞および成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団はまた、心臓毒性のいかなる兆候もなしに、冠動脈内投与により、少なくとも50×106細胞の用量で投与することもできる。本発明の文脈では、心臓毒性は、許容される正常限界を上回るある種の心臓酵素の上昇レベルの存在または非存在を検出することにより測定される。特に、心臓トロポニンI（cTnI）、クレアチンキナーゼ-MB（CK_MB）および/またはミオグロビン（Mb）のレベルが、心臓毒性を示す。実施例4Dで本明細書中に記載される通り、これらの酵素のレベルは、被験体への本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団の投与後に上昇しない。本発明はまた、以下の成分：(a)本発明の成体心臓幹細胞、(b) 本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団、または(c)本発明の細胞の混合集団、および製薬上許容される担体を含む医薬組成物も提供する。好ましくは、本発明の医薬組成物は、1×106〜50×106個の細胞、好ましくは25×106〜45×106個の細胞、より好ましくは35×106〜40×106個の細胞、最も好ましくは38×106個の細胞を含む。
【０１３７】
製薬上許容される担体は、細胞の生存能力を支える細胞培養培地を含むことができる。培地は、レシピエントでの免疫応答を誘発することを回避するために、一般的に血清不含であろう。担体は、一般的に、緩衝されており、かつ/またはパイロジェン不含であろう。
【０１３８】
製薬上許容される担体および希釈剤としては、生理食塩液、バッファー水溶液、溶媒および/または分散媒が挙げられる。そのような担体および希釈剤の使用は、当技術分野で周知である。溶液は好ましくは無菌であり、かつ容易な注射可能性（syringability）が存在する程度まで流動性である。多数の実施形態では、溶液は、製造および保管の条件下で安定であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールの使用を通じて、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護される。このリストは、単に例示として提供され、限定することを意図しない。本発明の成体幹細胞組成物である溶液は、ろ過により滅菌されている、製薬上許容される担体または希釈剤および、必要であれば、上記で列挙された他の成分中に、本明細書中に記載される通りの成体幹細胞を組み込むことにより調製することができる。
【０１３９】
製薬上許容される担体として機能し得る材料および溶液の一部の例としては、以下のものが挙げられる：(1)ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；(2)トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン；(3)セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；(4)粉末化トラガカント；(5)麦芽；(6)ゼラチン；(7)タルク；(8)カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；(9)ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；(10)プロピレングリコールなどのグリコール；(11)グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；(12)オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；(13)寒天；(14)水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；(15)アルギン酸；(16)パイロジェン不含水；(17)等張食塩液；(18)リンゲル液；(19)エチルアルコール；(20) pH緩衝化溶液；(21)ポリエステル、ポリカーボネートおよび/またはポリ無水物；ならびに(22)医薬製剤に用いられる他の無毒な適合性物質。このリストは、単に例示として提供され、限定することを意図しない。
【０１４０】
具体的な実施形態では、本発明の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団または本発明の医薬組成物は、凍結媒中で凍結させることができる。約−20℃未満の温度（例えば、約−40℃、または約−80℃未満の温度）で細胞の生存能力を維持するいずれかの媒体が、凍結媒として好適である。例えば、凍結媒は、2.5％〜10％DMSOを含むことができる。より具体的には、凍結媒は、5〜7.5％DMSOを含むことができる。
【０１４１】
凍結媒は、ウシ胎児血清もしくはヒト血清または細胞を解凍した後に細胞の完全性を維持できるいずれかの他のタンパク質もしくはタンパク質の混合物をさらに含む、本明細書中に記載される培養培地または増殖培地に基づくことができる。本発明の細胞はまた、デキストランに基づくタンパク質不含培地中でも凍結することができる。
【０１４２】
解凍後、本発明の細胞を、投与または投与溶液中での再懸濁前に、DMSOまたは他の凍結媒成分を除去するために洗浄することができる。投与溶液は、毒性なく患者に注入することができるいずれかの生理学的溶液であろう。投与溶液は、ヒト血清アルブミンなどの3〜15％のタンパク質を含むことができる。
【０１４３】
本発明の医薬組成物はまた、本明細書中に記載される治療方法または治療的使用のいずれかでも用いることができる。
本発明は以下の実施形態を包含する：
１．単離された多能性成体心臓幹細胞であって、以下のマーカー：
(a) SOX17およびGATA4
を発現し、以下のマーカー：
(b) Oct4、Nanog、c-kitおよびテロメラーゼ逆転写酵素
を発現せず、以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞のうちの1種以上に分化することができる、上記細胞。
２．IL-1βを発現する、実施形態1に記載の細胞。
３．単離された多能性成体心臓幹細胞であって、以下のマーカー：
(a) SOX17、GATA4、IL-1β、CD31、CD49cおよびHHEX
を発現し、以下のマーカー：
(b) Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4タンパク質、Nkx2.5およびCD133
を発現せず、以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞のうちの1種以上に分化することができる、上記細胞。
４．以下のマーカー：
(a) CD31、CD49cおよび/もしくはHHEX
のうちの1種、2種またはすべてを発現し；かつ/または、
以下のマーカー：
(b) CD133、Nkx2.5および/もしくはCXCR4タンパク質
のうちの1種、2種またはすべてを発現しない、
実施形態1または2に記載の細胞。
５．心筋組織から単離される、実施形態1〜4のいずれかに記載の細胞。
６．以下のマーカー：
KDR、HEY2、WT1、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-β、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL-8
のうちの1種以上を発現する、実施形態1〜5のいずれかに記載の細胞。
７．以下のマーカー：
CD45、CD34、CD11b、CD40、CD80、および/またはCD86
のうちの1種以上を発現しない、実施形態1〜6のいずれかに記載の細胞。
８．前記細胞が以下のマーカー：
(a) CD31、IL-1β、CD44、CD90、CD105、CD166、WT1、HEY2、KDR、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-b、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL-8
を発現し；かつ、成体心臓多能性幹細胞の前記集団が以下のマーカー：
(b) CD45、CXCR4タンパク質、Nkx2.5、CD34、CD11b、CD40、CD80および/またはCD86を発現しない、実施形態1〜7のいずれかに記載の細胞。
９．約10μm以上〜約15μm以下の直径を有する、実施形態1〜8のいずれかに記載の細胞。
１０．実施形態1〜9のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団。
１１．成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団であって、該細胞の集団が、以下のマーカー：
(a) SOX17およびGATA4
を発現し、かつ/または
該集団が以下のマーカー：
(b) Oct4、Nanog、c-kitおよびテロメラーゼ逆転写酵素
を発現せず、
該細胞が、以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞のうちの1種以上に分化することができる、上記成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団。
１２．前記細胞の集団がIL-1βを発現する、実施形態10または実施形態11に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団。
１３．成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団であって、該細胞の集団が、以下のマーカー：
(a) SOX17、GATA4、IL-1β、CD31、CD49cおよびHHEX
を発現し、該細胞が以下のマーカー：
(b) Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4タンパク質、Nkx2.5およびCD133
を発現せず、該細胞が以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞のうちの1種以上に分化することができる、上記成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団。
１４．前記細胞の集団が以下のマーカー：
(a) CD31、CD49cおよび/もしくはHHEX
のうちの1種、2種またはすべてを発現し；
該細胞の集団が以下のマーカー：
(b) CD133、Nkx2.5および/もしくはCXCR4タンパク質、
のうちの2種またはすべてを発現しない、
実施形態10〜12のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団。
１５．前記細胞の集団が、以下のさらなるマーカー：
(a) KDR、HEY2、WT1、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-β、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL8
のうちの1種以上を発現する、実施形態10〜14のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団。
１６．前記細胞の集団が、以下のさらなるマーカー：
(a)CD45、CD34、CD11b、CD40、CD80、および/またはCD86
のうちの1種以上を発現しない、実施形態10〜15のいずれかに記載の多能性成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
１７．前記集団がWT1、HEY2およびKDRを発現する、実施形態10〜16のいずれかに記載の多能性成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
１８．前記細胞の集団がCD40、CD80およびCD86を発現しない、実施形態10〜17のいずれかに記載の多能性成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
１９．前記細胞の集団が、CD44、CD90、CD105、CD166、WT1、HEY2およびKDRを発現し、かつ、該細胞の集団がCD45を発現しない、実施形態10〜18のいずれかに記載の多能性成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
２０．前記細胞の集団が以下のマーカー：
CD31、IL-1β、CD44、CD90、CD105、CD166、WT1、HEY2、KDR、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-b、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL-8
を発現し；かつ、該細胞の集団が以下のマーカー：
CD45、CXCR4タンパク質、Nkx2.5、CD34、CD11b、CD40、CD80および/またはCD86
を発現しない、実施形態10〜19のいずれかに記載の多能性成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
２１．前記集団の成体心臓幹細胞が、約10μm以上〜約15μm以下の平均直径を有する、実施形態10〜20のいずれかに記載の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
２２．前記成体心臓幹細胞が：
(a) 懸濁液中で培養される場合にスフェアを形成することができ；
(b) 単球動員を誘導することができ；
(c) Tリンパ球応答を調節することができ；
(d) 抗アポトーシス因子を分泌することができ；かつ/または
(e) クローンを形成することができる、
実施形態1〜9のいずれかに記載の細胞、または実施形態10〜21のいずれかに記載の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
２３．以下のステップ：
(a)成体心臓幹細胞の集団を含む懸濁物を提供するステップ；および
(b)少なくともSOX17およびGATA4を発現する細胞を選択するステップ
を含む、成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法。
２４．以下のステップ：
(c)ステップ(b)で選択された細胞を増殖させるステップ
をさらに含む、実施形態23に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法。
２５．以下のステップ：
(d)ステップ(c)からの増殖させた細胞での少なくともSOX17およびGATA4の発現を確認するステップ
をさらに含む、実施形態24に記載の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法。
２６．以下のステップ：
(a)心筋組織から細胞を含む懸濁物を調製するステップ；
(b)成体心臓多能性幹細胞の集団を単離するステップ；
(c)成体心臓幹細胞の該集団を増殖させるステップ；および
(d)少なくともSOX17、GATA4、およびIL-1βを発現し、かつ以下のマーカー：Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4およびNkx2.5を発現せず；かつ以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および平滑筋細胞のうちの1種以上に分化することができる細胞を選択するステップ
を含む、心筋組織から成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法。
２７．以下のステップ：
(a)心筋組織から細胞を含む懸濁物を調製するステップ；
(b)成体心臓多能性幹細胞の集団を単離するステップ；
(c)成体心臓幹細胞の該集団を増殖させるステップ；および
(d)複数の細胞株を含むワーキングセルバンク（WCB）を調製するステップ；
(e)少なくともSOX17、GATA4、CD31およびIL-1βを発現し、かつ以下のマーカー：Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4およびNkx2.5を発現せず；かつ以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および平滑筋細胞のうちの1種以上に分化することができる細胞株を該ワーキングセルバンクから選択するステップ；
(f)選択された細胞株を増殖させるステップ；ならびに
(g)成体心臓多能性幹細胞の最終的な実質的に純粋な集団において、少なくともSOX17、GATA4、CD31およびIL-1βの発現を確認するステップ；以下のマーカー：Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4およびNkx2.5の発現の欠失を確認するステップ；および以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および平滑筋細胞のうちの1種以上に分化する能力を確認するステップ
を含む、心筋組織から成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法。
２８．選択ステップが、WT1、およびHEY2を発現する細胞を選択することを含む、実施形態23〜27のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法。
２９．実施形態23〜28のいずれかに記載の方法により取得されるかまたは取得可能な成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
３０．実施形態1〜9および22のいずれかに規定される細胞以外の細胞を含む、実施形態1〜9および22のいずれかに規定される細胞を含む細胞の混合集団。
３１．脂肪組織由来または骨髄由来の間葉系幹細胞、心外膜細胞、内皮細胞、周皮細胞および線維芽細胞を含む、細胞の混合集団。
３２．(a)実施形態1〜9および22のいずれかに記載の細胞、
(b)実施形態9〜22および29のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；または
(c)実施形態30もしくは実施形態31に記載の細胞の混合集団；
および製薬上許容される担体
を含む、医薬組成物。
３３．1×106〜50×106個の細胞、好ましくは25×106〜45×106個の細胞、より好ましくは35×106〜40×106個の細胞、最も好ましくは38×106個の細胞を含む、実施形態32に記載の医薬組成物。
３４．治療における使用のための、実施形態1〜9および22のいずれかに記載の細胞；実施形態9〜22および29のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；実施形態30もしくは実施形態31に記載の細胞の混合集団；または実施形態32もしくは実施形態33に記載の医薬組成物。
３５．以下の疾患：
(a)心血管疾患、好ましくは、急性心筋梗塞、慢性虚血性心筋症、心筋症および/もしくは慢性心不全；または
(b)虚血性傷害、好ましくは重篤な肢虚血
の治療における使用のための、実施形態1〜9および22のいずれかに記載の細胞；実施形態9〜22および29のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；実施形態30もしくは実施形態31に記載の細胞の混合集団；または実施形態32もしくは実施形態33に記載の医薬組成物。
３６．実施形態1〜9および22のいずれかに記載の細胞；実施形態9〜22および29のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；実施形態30もしくは実施形態31に記載の細胞の混合集団または実施形態32もしくは実施形態33に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、心血管疾患または虚血性傷害に罹患した被験体を治療する方法。
３７．成体心臓多能性幹細胞が同種異系である、実施形態1〜9および22のいずれかに記載の細胞；実施形態8〜17、19および27のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；実施形態30もしくは実施形態31に記載の細胞の混合集団または実施形態30もしくは実施形態31に記載の医薬組成物、または実施形態36に記載の方法。
３８．前記細胞が、
(a)静脈内、動脈内、冠動脈内または心筋内に；かつ/または
(b) 1×106〜50×106細胞の用量、好ましくは25×106〜45×106細胞の用量、より好ましくは35×106〜40×106細胞の用量、最も好ましくは38×106細胞の用量で
投与される、実施形態1〜9および22のいずれかに記載の細胞；実施形態8〜17、19および27のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；実施形態30もしくは実施形態31に記載の細胞の混合集団または実施形態30もしくは実施形態31に記載の医薬組成物、または実施形態36に記載の方法。
３９．前記成体心臓幹細胞が、以下のメカニズム：
(a)単球の動員；
(b)免疫調節；
(c)血管新生の活性化；
(d)心臓再生を促進すること、および/または
(e)内在性心筋細胞の再生を誘導すること
のうちの1種以上により心臓組織修復を誘導する、実施形態1〜9および22のいずれかに記載の細胞；実施形態8〜17、19および27のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；実施形態30もしくは実施形態31に記載の細胞の混合集団または実施形態30に記載の医薬組成物、または実施形態36に記載の方法。
４０．以下の用途：
(a)自己免疫疾患、炎症プロセス、慢性潰瘍を治療すること、および創傷治癒を促進すること；または
(b)同種異系臓器移植拒絶を予防すること
における使用のための、実施形態1〜9および22のいずれかに記載の細胞；実施形態8〜17、19および27のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；実施形態27もしくは実施形態28に記載の細胞の混合集団、または実施形態30に記載の医薬組成物。
４１．心臓組織の再生における使用のための、任意により生体適合性インプラントに接着された、実施形態1〜9および22のいずれかに記載の細胞；実施形態9〜22および29のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；実施形態30または実施形態31に記載の細胞の混合集団。
４２．急性心筋梗塞の治療における使用のための、実施形態1〜9および22のいずれかに記載の細胞；実施形態9〜22および29のいずれかに記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；実施形態30もしくは実施形態31に記載の細胞の混合集団または実施形態32もしくは実施形態33に記載の医薬組成物であって、
該細胞、実質的に純粋な集団、混合集団または医薬組成物が、冠動脈内経路により投与され；かつ
該成体心臓多能性幹細胞の投与量が、1×106〜50×106細胞、好ましくは25×106〜45×106細胞の用量、より好ましくは35×106〜40×106細胞の用量、最も好ましくは38×106細胞の用量である、
上記細胞、実質的に純粋な集団、混合集団または医薬組成物。
【０１４４】
一般的定義
数値に関する「約」との用語は、当該数値の+/-10％を意味する。数値に関する「約」との用語はまた、当該数値の+/-5％も含む。
【０１４５】
「含む」および「含むこと」との用語は、包括的な開かれた意味で用いられ、追加の要素が含まれ得ることを意味する。該用語はまた、包含する、も含み、「からなる」および「基本的にからなる」との用語と相互に交換可能に用いることができる。
【０１４６】
「実質的に純粋な」との用語は、「完全に純粋な」を含み、当該用語と相互に交換可能に用いることができる。
【実施例】
【０１４７】
実施例1：細胞単離および増殖
本発明の細胞を、右心耳から、および屠殺した動物（マウス、ラット、ブタ等）の心臓から取得した心臓生検から単離した。生検を小さな欠片（＜1mm3）に細かく刻み、それぞれ30分間の3サイクル、2型コラゲナーゼ（Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ, USA）を用いて処理することにより、細胞懸濁物を取得した。遠心分離および40μmセルストレイナーを用いるろ過により、心筋細胞を取り出した。心臓幹細胞/前駆細胞をCD45陽性細胞の免疫枯渇およびマイクロビーズ（Miltenyi Biotech, Bergish Gladbach, Germany）を用い、かつ製造業者の推奨に従うCSCの選択後に取得した。用いたマイクロビーズはCD117（c-kit）マイクロビーズであったが、CSCの単離はc-kitの存在に頼らないので、他のマイクロビーズも用いることができる。
【０１４８】
単離後、単離培地（以下の成分を添加されたDMEM/F12培地：10％胚性幹細胞用ウシ胎児血清（FBS ESCq）、L-グルタミン（2mM）、ペニシリン-ストレプトマイシン（100U/mLおよび100μg/mL）、bFGF（10ng/mL）およびITS（Invitrogen, Madrid, Spain and Saint-Aubin, France）、IGF-II（30ng/mL）およびEGF（20ng/mL）（Peprotech, Neuilly-sur-Seine, France）、およびhEPO（Sigma-Aldrich, Madrid, Spain））（表1を参照されたい）中でマトリゲル（BD Biosciences, Madrid, Spain）コーティングプレートに、細胞を播種した。
【表１】
2019076112.tif 000002
【０１４９】
細胞を37℃で3％O2雰囲気にて生育し、それにより適正な機能を促し、かつ生理学的/病理学的条件を模倣した。細胞播種の1週間後、単離培地を増殖培地に置換し、これは、以下の成分を添加されたDMEM/F12とNeurobasal培地との組み合わせ（1：1）である：10％FBS ESCq、L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン、B27（1×）、N2（1×）、β-メルカプトエタノール（50μM）、ITSおよび増殖因子（bFGF、IGF-II、EGF）（表2を参照されたい）。
【表２】
2019076112.tif 000003
【０１５０】
細胞を、3％O2雰囲気にて増殖培地中で生育し、次に、ワーキングセルバンク（WCB）を作製するために21回の複製後に第4継代で凍結保存した。続いて、細胞の発現プロフィールを分析した。正しい発現プロフィールを有する細胞を解凍し、第5継代（25回の複製が蓄積された）まで増殖させ、そうして細胞品質を分析する最終生成物（FP）を作製した。最終生成物の特性（identity）、純度および安全性を確実にするために、作製プロセス中に品質管理（QC）を行なう。
【０１５１】
実施例2：CSC中のmRNAおよびタンパク質発現の特性決定
A. CSCはSOX17およびGATA4 mRNAを発現する
実施例1の方法により取得された心臓幹細胞（CSC）でのSOX17およびGATA4のmRNA発現を、骨髄由来または脂肪組織由来の間葉系幹細胞（mesochymal stem cell）（MSC）と比較した。CSC由来のmRNAおよびMSC由来のmRNAを単離し、qPCRおよび発現アレイ実験のためにcDNAを作製した。
【０１５２】
発現アレイ実験のために、1×106個のCSCまたは脂肪組織由来MSCから、Qiagenカラム（RNeasyカラム）を用いてRNAを単離し、Bioanalyzerアッセイ（Agilent Technologies社）によりRNA品質を分析した。RIN＞7を有するRNA調製物のみを増幅し、Low Input Labeling Kit（Agilent Technologies社）を用いて標識した。試験は、WCBレベルでは8種類の異なるドナーのCSCを用い、FPレベルでは6種類を用いて行なった。参照サンプルとして、WCBでは4種類の異なるドナーのMSCを用い、FPでは4種類を用いた。マイクロアレイ発現SurePrint G3v2, 60Kプラットフォームが用いられ、解析はGeneSpring v12.1ソフトウェアを用いて行なった。統計学的有意性（補正p値）は、一元配置分散分析（ANOVA）を用いて算出し、多重検定（Benjamini-Hochderg）により補正した。補正済みp値＜0.05を、統計学的に有意であると見なした。図2Aに示される通り、SOX17およびGATA4のmRNA発現は、脂肪組織由来のMSCよりもCSCで20倍超高かった。
【０１５３】
マイクロアレイ発現分析の確認を、qPCRを用いて求めた。CSCおよびヒトMSCを回収し、総RNAを、TRI-Reagent（Sigma-Aldrich社）を製造業者の使用説明書に従って用いて単離した。RNA濃度を、光度測定により測定した。cDNAを、SuperScript(登録商標)III First Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen社）を製造業者の使用説明書に従って用いて、2μg RNAから合成した。合成されたcDNAを1：10希釈し、50〜200ngのcDNAを、ヒト特異的TaqManプローブ（Applied Biosystems社、表3を参照されたい）を用いる定量的リアルタイムPCR（qPCR）に供した。qPCR反応は、TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を用いて3回反復で行なった。PCR反応は、StepOnePlus（Applied Biosystems社）マシンで行ない、StepOneソフトウェアv2.2.2およびData Assist v3.0ソフトウェアを、結果を解析するために用いた。mRNAの発現はβグルコロニダーゼ（beta Glucoronidase）の発現に対して標準化した。RQ算出（2-ΔΔCT）のために、ヒト骨髄MSCを参照細胞株として用いた。
【表３】
2019076112.tif 000004
【０１５４】
ヒトMSCに対してCSCでのSOX17およびGATA4についてのより高レベルのmRNA発現が、図2Bに示される通りにこの方法を用いて確認された。
【０１５５】
B. CSCはSOX17およびGATA4タンパク質を発現する
タンパク質発現アレイ試験を、GATA4およびSOX17 mRNAが翻訳されるか否かを決定するために行なった。10×106個の細胞のペレットを、直線増殖相にある培養物から調製し、PBSを用いて2回洗浄し、−80℃で乾燥保存した（stored dry）。ハイブリダイゼーションを行なう前に、ペレットを解凍し、CSC溶解物を製造業者の使用説明書に従って調製した。各細胞溶解物のタンパク質濃度を定量した。
【０１５６】
アレイ試験は、プロテオームプロファイラーヒトアレイキット、すなわち、Proteome ProfilerヒトサイトカインアレイキットPanel A（ARY005）およびヒト多能性（pluripotent）幹細胞アレイキット（ARY010）を用いて行なった。溶解物（200μgのタンパク質抽出物）をアレイ中に存在するタンパク質（ヒトサイトカインおよび幹細胞調節タンパク質）に対する抗体と混合し、続いてタンパク質-抗体複合体をメンブレンと共にインキュベートした。抗体アレイメンブレンとのハイブリダイゼーションは、製造業者の使用説明書に従って行なった。CSCがSOX17およびGATA4タンパク質を発現することが見出された（図2B）。
【０１５７】
C. CSCはCD166、CD90、CD44およびCD105を発現するが、c-kit、CD45、CD34およびCD11bを発現しない
c-kit、CD45、CD34、CD11b、CD166、CD90、CD44およびCD105の発現を、フローサイトメトリーにより測定した。細胞をトリプシン-EDTAを用いてはがし、DMEM中に再懸濁した。トリパンブルー色素排除技術により、細胞生存率は85％超であると見出された。細胞を遠心分離し、0.2〜1.0×106細胞/mLの濃度でPBS中に再懸濁した。染色前に、細胞を、氷上で20分間、PBS中の1％（v/v）ヒト血清を用いてブロッキングした。約0.5〜3.0×105個の細胞を、飽和濃度の表面マーカー特異的抗体およびアイソタイプ適合対照を用いて染色した。細胞を、4℃にて1時間、暗所でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、PBSを用いて2回洗浄した。一次抗体が精製形態であった場合、細胞を、4℃にて暗所で20分間、蛍光色素コンジュゲート化生物種特異的抗Ig抗体と共にさらにインキュベートした。所定のマーカーについて陽性に染色されている細胞数を、2％未満の測定された陽性イベントがアイソタイプ適合対照による非特異的結合を表わすように確立されたゲートの範囲内に存在する細胞のパーセンテージにより決定した。最低でも2,500イベントを、各分析に対してカウントした。細胞表面マーカーの発現を、製造業者により推奨される希釈率で市販の抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した。細胞を、Epics XLフローサイトメーター（Beckman Coulter社）を用いて取得し、FCS Express 3ソフトウェアを用いて分析した。
【表４】
2019076112.tif 000005
【０１５８】
図3Aに示される通り、CSCではc-kitの発現は観察されないか、または非常に低い発現が観察された。2種類の異なる抗体（1種類はMiltenyi社から入手し、もう1種類はBD社から入手した）を用いて同様の結果が得られた。
【０１５９】
図3Bに示される通り、CSCはまた、系統マーカーであるCD45、CD11bおよびCD34について陰性であることも見出された。図18に示される通り、CSCはCD166、CD90、CD44およびCD105を発現する。
【０１６０】
D. CSCはテロメラーゼを発現しない
実施例2Aに記載される方法に従って、テロメラーゼの触媒サブユニットを発現するか否かを決定するために、qPCRによりCSCを分析した。腫瘍細胞株KG1およびMCF7を陽性対照として用い、骨髄由来MSC（BM-MSC）ならびにヒト2倍体線維芽細胞（HDF）を陰性対照として用いた。mRNAを実施例2Aに記載される通りに単離し、特異的TaqManプローブを用いるqPCRにより、テロメラーゼの触媒サブユニットの発現を試験した。テロメラーゼの触媒サブユニットの発現は、CSCでは検出されなかった（図4Aを参照されたい）。
【０１６１】
また、CSCでのテロメラーゼ活性を、テロメア反復増幅プロトコール（TRAP）によりMSCまたはHDFと比較し、このプロトコールは、蛍光検出およびテロメラーゼ活性のリアルタイム定量に基づく非常に感度の高いアッセイである。テロメラーゼ活性は温度感受性であり、85℃で不活性化される。85℃でのサンプルのインキュベーションを伴うかまたは伴わずに検出されるテロメラーゼ活性を比較した。1×106個のCSCのペレットを調製し、TRAPEZE RT Telomerase Detection kit（CHEMICON社）を用いるテロメラーゼ活性検出のために用いた。異なるドナー由来およびin vitro増殖の異なるステップ（WCBおよびFP）でのCSCを試験した。細胞株K562およびMCF7を陽性対照サンプルとして用いた。製造業者により提供された使用説明書に従って、テロメラーゼ活性を分析した。PCR反応は、StepOnePlus（Applied Biosystems社）で行なった。テロメア配列の様々な量を含む標準曲線を作成し、テロメラーゼ活性定量を、Quantification-Standard Curveソフトウェアを用いて分析した。
【０１６２】
3種類の細胞タイプのいずれでも、顕著な活性は検出されなかった。また、in vitro細胞増殖の間のCSCでのテロメア長の減少が検出され、このことは、これらの細胞がテロメアを伸長させないことを示す。各細胞分裂でのテロメア長のこの減少は、大幅なin vitro細胞培養後の増殖の停止を最終的にはもたらすであろう。
【０１６３】
E. in vitroでの大規模増殖後のCSCの老化
in vitroでの大規模な（30倍超の集団倍増）増殖後に老化するか否かを決定するために、CSCを細胞化学的に分析した。老化は、老化関連β-ガラクトシダーゼ活性（SA-βGal）に基づいて検出した。CSCをin vitroで増殖させ、固定して、発色性基質である5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド（5-bromo-4-chloro-3-indoyl β-D-galactopyranoside）（X-gal）と共にpH6でインキュベートし、該基質は、β-ガラクトシダーゼにより切断された場合に、不溶性の青色化合物を生じる。図4Cに示される通り、in vitro増殖後には、X-galと共にインキュベートした場合に、一部のCSCが青色になり、このことは、これらの細胞が老化したことを示す。
【０１６４】
F. CSCはOct3/4またはNanogを発現しない
幹細胞発達に関与する様々な遺伝子の発現を、上記の通りのタンパク質発現アレイを用いて分析した。図5Aに示された通り、Oct3/4またはNanogの発現は観察されなかった。
【０１６５】
Oct3/4発現はまた、ラットCSCおよびヒトCSCで、3種類の異なる抗体を用いてウエスタンブロットによっても分析した。1〜5×106細胞の細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを添加したRIPA溶解バッファー（20mM Tris pH7.5、150mM NaCl、2mM EDTA、1％デオキシコール酸Na、1％Triton X-100、0.25％ドデシル硫酸ナトリウム）中で溶解させた。全細胞抽出物（WCE）のタンパク質濃度をNanodropを用いて測定し、等量のWCE（50μg）をTris-グリシンゲルにロードし、0.45μmポリフッ化ビニリデンメンブレン（PVDF）にトランスファーした。メンブレンを、Tweenを含むTris緩衝生理食塩液（10mM Tris-HCl、pH 8、150mM NaCl、および0.05％Tween 20）の中で洗浄し、Tweenを含むTris緩衝生理食塩液中の5％脱脂乳または1％BSAを用いて室温で1時間ブロッキングし、次に、製造業者により推奨される濃度で様々な一次抗体を用いて4℃にて一晩プロービング（検出）した。免疫ブロットをHRP-コンジュゲート化二次抗体を用いて処理し、続いてECL-plusを用いて発光反応を行なった。等量のロードを、抗β-アクチン抗体を用いてメンブレンを再プロービング（検出）することにより確実にした。
【表５】
2019076112.tif 000006
【０１６６】
NTERA細胞株を陽性対照として用いた。CSC由来の50μgの細胞タンパク質抽出物をSDS-PAGEゲル上で泳動し、タンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、特異的抗体を用いてOct3/4の存在を調べた（表5を参照されたい）。アクチンを、ロード対照として用いた。図5Bに示される通り、Oct3/4発現の欠失が、ウエスタンブロット分析により確認された。
【０１６７】
G. WT1、HEY2、KDR、HHEXおよびHAND2 mRNA発現は、MSCよりもCSCでより高い
実施例2Aに記載される方法に従う発現アレイを用いて、CSCでのWT1、HEY2、KDRおよびHHEXの発現を、脂肪組織由来MSCと比較した。表6に示される通り、CSCが、脂肪組織から取得されたMSCよりもCSCでWT1、HEY2、KDRおよびHHEXについて少なくとも20倍多いmRNA転写産物を発現することが見出された。
【表６】
2019076112.tif 000007
【０１６８】
これらの結果は、特異的TaqManプローブを用いてqPCRにより確認した（実施例2Aを参照されたい）。図17はqPCR分析結果をまとめ、この結果は、参照細胞株として用いられたMSCと比較した場合に、CSCではGATA4、SOX17、WT1、HEY2、KDR、HHEXおよびHAND2が過剰発現されることを示す。図17の値は相対定量のLog2である。
【０１６９】
H. CSCは分泌型因子IL-1α、CSF、PDGFおよびIL-1βを過剰発現する
分泌型因子であるIL-1α、コロニー刺激因子3（CSF3）、PDGFおよびIL-1βの比較発現（変化倍率）を、mRNA発現アレイにより、CSCと脂肪組織由来MSCとで評価した。表7に示される通り、分泌型因子IL-1α、CSF、PDGFおよびIL-1βのmRNA発現は、脂肪組織由来MSCよりも少なくとも10倍高かった。
【表７】
2019076112.tif 000008
【０１７０】
I. CSCは多量のCCL2を分泌する
WCBおよびFBでのCCL2分泌のレベルをELISAにより測定した。CSCを、10％血清を添加したDMEM/F12：Neurobasal培地（1：1）培地中に5000細胞/cm2で播種した。次の日に、培養培地を、増殖因子であるインスリン様増殖因子2（IGF-II）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および上皮増殖因子（EGF）を添加し、胎児血清を含まない培地に置換した。細胞培養物からの上清を3日後に回収し、1500×gにて3分間の遠心分離によりデブリを除去し、すぐにアッセイした。ヒトCCL2/MCP-1 Quantikine ELISA kit（R&D systems社）を、製造業者の使用説明書に従って用いた。
【０１７１】
図6Aに示される通り、CSCは、WCBおよびFPの両方で多量のCCL2を発現する。対照的に、MSCは比較的少量のCCL2を産生した。
【０１７２】
J. CSCはIL-8、IL-6、CXCL1、sICAM1、IL-1α、IL-1β、G-CSFタンパク質を過剰発現する  CSCでのIL-8、IL-6、CXCL1、sICAM1、IL-1α、IL-1βおよびG-CSFタンパク質の発現のレベルを評価するために、タンパク質アレイ試験を行なった。骨髄由来間葉系幹細胞（MSC-BM）を対照細胞株として用いた。R&D社のヒト多能性（pluripotent）幹細胞抗体アレイを用いた。CSC溶解物（200μgのタンパク質抽出物）を、幹細胞調節に関連するタンパク質に対する抗体と混合し、次に、タンパク質-抗体複合体をタンパク質定量のためにメンブレンと共にインキュベートした。
【０１７３】
図6Bに示される通り、CSCが、MSCよりもCSCで高レベルにG-CSF、IL-8、IL-6、CXCL1、sICAM-1、IL-1βおよびIL-1αタンパク質を発現することが見出された。
【０１７４】
K. CSCはNkx2.5を発現しない
参照細胞株として用いた骨髄MSCと比較して、CSCでのNkx2.5発現のレベルを測定するために、定量的PCR（qPCR）を用いた。mRNAをこれらの細胞から単離し、Nkx2.5の発現を特異的TaqManプローブを用いてqPCRにより評価した。Nkx2.5の発現は、CSCでは検出されなかった。
【０１７５】
L. CSCはCD31およびCD49cタンパク質を発現するが、CD133またはCXCR4タンパク質を発現しない
CD31、CD49c、CD133およびCXCR4タンパク質の発現を、実施例2Cに記載される方法に従って、フローサイトメトリーにより評価した。
【０１７６】
実施例2Cと同様に、細胞カウントに対する蛍光強度のヒストグラムを各抗体染色について取得し、細胞を、デブリを排除するために、前方散乱パラメータに対する側方散乱パラメータを用いてゲートした。陽性細胞に対応するヒストグラムが、発現レベル（蛍光強度）に関してアイソタイプ対照および/または陰性細胞から得られたものと明らかに区別できる場合に、ゲート分析を適用した。比較的低い蛍光強度に関して、陽性細胞の数は、マーカー特異的抗体と非特異的アイソタイプ適合対照抗体との両方に対する細胞の結合性から生じる部分的に重複するヒストグラムの面積減算によっても確認された。面積減算アプローチを発現レベルを定量するために用いる場合、30％超の発現を有するときに、細胞が陽性と見なされた。
【０１７７】
図3Bのフローサイトメトリー結果は、CSCが表面上にケモカイン受容体CXCR4を発現しないことを示す。CSCはまた、cKit（CD117）マーカーについても陰性である（既述の通り、図3Aを参照されたい）。対応するマーカー抗体により生成されるシグナルがアイソタイプ対照により生成されるシグナルと同じ強度であるので、これらのマーカーの発現は陰性である。同様に、CSCの表面膜では、フローサイトメトリーによりCD133発現は検出されなかった。図3Bに示される通り、特異的抗CD133抗体とのCSCのインキュベーション後に観察されるシグナルは、対照抗体（灰色領域）を用いて観察されるものと同様であった。
【０１７８】
CD31は、CSCの集団の中で均一に発現される。抗CD31抗体へのCSCの結合により生成されるヒストグラムは、独特なピークおよび不均一な分布を描き、このことは、アイソタイプ対照ヒストグラム（中実灰色）と比べて増大した蛍光強度を示すことが、図18で観察できる。つまり、CSCは、CD31細胞表面マーカーについて陽性である。図18に示される通り、CD31の発現は、面積減算アプローチが用いられた場合には30％よりも高かった。CD49cもまた、CSCのうちの100％で均一に発現することが示された。
【０１７９】
実施例3：in vitroでのCSC表現型形質の分析
A. CSCは低い免疫原性プロフィールを有する
CSCでの共刺激分子CD40、CD80およびCD86の発現ならびにMHCクラスI（またはHLAクラスI）の発現を、実施例2Cに記載されるフローサイトメトリーアッセイ方法を用いて測定した。CSCはMHCクラスIを発現することが見出されたが、共刺激分子CD40、CD80およびCD86を発現しないかまたは非常に低いレベル（＜2％）で発現する。
【０１８０】
B. CSCの形態およびサイズは独特である
CSCのサイズを、単離後およびin vitro増殖後に分析した。凍結細胞の解凍後に、最終生成物での細胞サイズも測定した。図8Aに示される通り、単離されたCSC細胞はMSCおよび線維芽細胞よりも小さく、この小さなサイズは、培養後に維持される。CSCの平均サイズは、図7に示される通り、直径15μm以下であり、10μmよりも大きかった。
図8Bに示される通り、CSC細胞は単離後に丸みを帯びた形態を有する。図8Cに示される通り、細胞はin vitro増殖の間に間質様形態を獲得する。
【０１８１】
C. クローン原性およびCSCがカーディオスフェアを形成する能力
CSCのクローン原性を、超低接着96ウェルプレートのウェルに単一細胞を播種することにより、第2継代（P2）および第7継代（P7）で評価した。カーディオスフェアの存在を、播種後の14日目および21日目に顕微鏡下での目視検査により分析した。図8D〜Fに示される通り、CSCは第2継代（P2）および第7継代（P7）でクローン原性を有することが見出され、カーディオスフェアを形成し、かつ超低接着プレート中に播種した場合に、懸濁液中で生育できる。
【０１８２】
D. CSCは単球動員を誘導できる
CSCが多孔性膜を介する単球の遊走を誘導できるか否かを決定するために、細胞遊走アッセイを行なった。5ミクロン孔径インサートを有する24ウェル遊走チャンバー（Costar, USA）を用いた。MonoMac-1細胞を、アッセイ時に指数増殖期になるように、好適な濃度で培養した。細胞を計数し、2回洗浄し、遊走チャンバーのインサートに配置した（100μL中、2.5×105個の細胞）。CSC、MSC（骨髄由来）またはHDFの細胞上清に対応する馴化培地を、ウェルの下部に入れた。細胞を、5％CO2にて37℃で240分間インキュベートした。すべての点を2回反復で行なった。次に、インサートを取り出し、チャンバーの下部に遊走した細胞を、フローサイトメトリーによりカウントした。図9Bに示される通り、CSCは、MSCまたはHDFと比較した場合に、より強い単球動員を誘導する。
【０１８３】
E. CSCは活性化型Tリンパ球に対する免疫調節能を示す
T細胞免疫調節に対するCSCの作用を、CFSEを用いてT細胞を標識した後に分析した。HLA不適合CFSE標識PBMC（1×105）を、5日間、マイトマイシンC処理CSC（1×104）の非存在下または存在下で、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Life Technologies社）＋IL-2（10ng/ml）またはフィトヘマグルチニン（PHA）を用いて刺激した。共培養の終了時に、T細胞の増殖を、CD3、CD4またはCD8陽性細胞でのCFSEトラッキングを用いて、フローサイトメトリーにより測定した。図9Cに示される通り、CSCは、活性化型Tリンパ球（CD3陽性）に対する免疫調節能を示す。
【０１８４】
F. CSCにより分泌される増殖因子は細胞生存を促進する
H9C2筋原細胞に対する、CSCにより分泌される因子の心臓保護能を、CSC馴化培地を用いることによりin vitroで試験した。H9C2細胞の細胞死を、1mM過酸化水素（hydroxide peroxide）（H2O2）を用いて誘導し、これは、アポトーシス誘導性酸素フリーラジカルの産生を引き起こす。H9C2細胞を20×103細胞/mLで播種し、24時間後に、1mMのH2O2を添加し、細胞をさらに30分間インキュベートした。次に、増殖培地をCSC、MSC-BMまたはHDFからの馴化培養培地に置換し、細胞をまた16時間培養した。最後に、アラマーブルーを添加し（1：10希釈）、2時間後に、EnVisionマルチラベルプレートリーダーにて570nmでの吸光度を定量することにより、細胞生存率を分析した。図10Aに示される通り、過酸化水素を用いて処理されたH9C2細胞へのCSC馴化培地の添加は、細胞死を防止し、かつ細胞代謝を増加させることが見出された。
【０１８５】
CSCにより分泌される因子の生存促進能力（pro-survival ability）はまた、血清枯渇後のH9c2細胞でもアッセイした。血清枯渇アポトーシスを、無血清培地中で24時間、細胞を培養することにより誘導した。血清枯渇によるアポトーシスプログラムの開始時に、H9c2細胞は、プロ型とカスパーゼ3との切断により、カスパーゼ3を活性化させる。ウシ胎児血清を含まないCSC、MSC-BMまたはHDFの馴化培地を添加し、24時間後に、実施例2Fに記載される方法に従ってウエスタンブロットによりカスパーゼ3の活性化を分析した。図10Bに示される通り、プロ-カスパーゼ3の活性化は、無血清/CSC馴化培地中で共培養される飢餓H9c2細胞中では減少することが見出された。
【０１８６】
G. CSCは様々な系統に分化することができる
心臓系統へのCSCの分化能力を、免疫蛍光顕微鏡法により分析した。ヒトCSCを、0.1％ゼラチンコーティング6ウェルプレートに5000細胞/cm2で播種し、10％FBS ESCq＋増殖因子を添加したDMEM/F12およびNeurobasal（1：1）培地中で24時間インキュベートした。細胞を100nMオキシトシン（Sigma-Aldrich社）を用いて3日間処理し、次にトリプシン処理して、p24超低接着ウェル（Costar社）（2000細胞/ウェル）に播種した。7日後、カーディオスフェアを回収し、分化培地：α-MEM、FBS 2％、デキサメタゾン（1μM）（Sigma-Aldrich社）、β-グリセロホスフェート（10nM）（Sigma-Aldrich社）、アスコルビン酸（50μ/mL）（Sigma-Aldrich社）中で、ラミニン（Sigma-Aldrich社）で予めコートしたスライドガラス（10μg/mL）を含む24ウェルプレートに広げた。最初の4日間、培地にはTGF-β1（5ng/ml）（Peprotech社）、BMP-2（10ng/ml）（R&D systems, Madrid, Spain）およびBMP-4（10ng/ml）（R&D systems社）を添加し、続いて、この添加剤をDKK-1（0.15μg/ml）（Peprotech社）に置換した。分化プロトコールの終了時（第30日）に、免疫蛍光顕微鏡法により細胞を分析した。図11A〜Cに示される通り、CSCは、特異的分化培地中での培養後に、平滑筋、内皮細胞および心筋細胞に対応するマーカーの発現を示した。
【０１８７】
CSCはまた、適切な培地中での培養後に脂肪細胞および骨細胞にも分化できた。脂肪細胞分化はオイルレッドO染色により分析し、骨細胞分化はアリザリンレッド染色により確認した。
【０１８８】
H. CSCのゲノム安定性
単離されたヒトCSCのゲノム安定性を決定し、かつin vitro増殖後にCSCで重複または欠失などのいずれかの染色体変化が起こったか否かを評価するために、比較ゲノムハイブリダイゼーション解析を行なった。オリゴアレイ-CGH解析を、ヒトゲノムCGH 44kマイクロアレイ（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いて行なった。細胞由来の合計1μgのゲノムDNAおよび参照用健康ゲノムDNA（Promega, Madison, WI, USA）を、Cy5-dCTPおよびCy3-dUTPを用いてランダムプライミングにより示差的に標識した。ハイブリダイゼーションは、製造業者のプロトコールに従って行なった。コピー数変化領域は、AGW社により供給されるADM-2（6として設定）統計を用いて検出し、このとき5個の連続的プローブの最小数を用い、これはつまり、少なくとも200kbのいずれかの異常領域の検出を可能にする。図12は、ヒト女性ゲノムについての比較ゲノムハイブリダイゼーション解析を示す。染色体変化は観察されず、このことは、CSCのゲノムの安定性を実証した。
【０１８９】
実施例4：in vivoでのCSCの分析
A. CSCは冠動脈内投与後に強い体液性応答を誘導しない
冠動脈内注入後のCSCの免疫原性を、図13Aに示されるタイムスケールに従ってブタで評価した。100×106個の同種異系ブタCSC細胞を免疫正常梗塞大型白色ブタに冠動脈内注入により投与し、注入された細胞に対する同種抗体であるIgGおよびIgMの存在を、細胞投与前、細胞投与15日後および30日後に分析した。投与の30日後に、50×106個の同じCSCを静脈内注入し、血清中の特異的同種抗体の存在を、2回目の注入後の3日目、7日目、15日目および30日目に試験した。血液サンプルから取得された血清を、注入細胞と共にインキュベートした。血清中の注入細胞に対する同種反応性抗体の存在を、抗IgGまたは抗IgM標識抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した。
【０１９０】
特異的免疫反応性免疫グロブリン（IgGおよびIgM）の存在を、種々の血液サンプル中で分析した。最初の30日間に注入細胞に対する特異的免疫反応性IgGを見出すことはできなかった。対照的に、図13Bに示される通り、本発明者らは、2回目の注入後の7日目、15日目および30日目にCSC特異的IgMおよびIgGの存在を観察した。これらの結果は、CSCは投与後に強い体液性応答を誘発しないが、免疫学的記憶を生成する免疫系により認識およびおそらくは排除されて、2回目の投与後により強くかつ速い応答を誘導することを示す。
【０１９１】
B. in vivo投与後のCSCの保持
心臓CSC中のCSCの投与後の保持を、追跡実験により測定した。ヒトCSCをGFPで標識し、梗塞させてから7日後の免疫不全ラットの心筋に注入した。注入の24時間後に動物を屠殺し、GFP陽性細胞の存在を組織学的分析により分析した。投与部位を特定できるように、蛍光標識ミクロスフェアを細胞と共に注入した。図14に示される通り、これらの追跡実験は、CSCが少なくとも注入後24時間は梗塞部位に留まることを実証した。
【０１９２】
C. CSCは心臓再生を促進する
梗塞ラット心臓に対するCSCの作用を、心エコーおよび組織学的分析により評価した。200〜250gの免疫不全ヌードラット（HIH-Foxn1 rnu、Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, Massachusetts）を、冠動脈前下行枝の永続的結紮により梗塞させた。罹患組織の血色が悪くなったら、ハミルトンシリンジを用いて、梗塞境界領域の2箇所に心筋内移植を行なった（PBSまたは異なるドナー由来の5×105個のCSC）。細胞投与の15日後、1ヵ月後および2ヵ月後に、動物を鎮静させ、心臓機能を心エコーにより分析した。移植の2ヵ月後、動物を屠殺して、心臓を取り出し、リン酸緩衝生理食塩液を用いて洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで24時間固定し、さらなる処理まで70％エタノール中で保存した。封入前に、心房を除去し、心臓を同様のサイズの3つの部分に切断した：心尖領域（A区画）、中間領域（B区画）（結紮を行なった箇所）、および弁に近い領域（C区画）。それぞれすべての領域をパラフィン内封入し、選択された心臓（下記に示される）由来の75mm間隔で5mmの3枚の切片を、マッソンのトリクローム染色技術を用いて染色した。組織学的分析を行なって、左心室の総直径に対する瘢痕サイズを算出した。総壁厚に対する筋線維のパーセンテージを、代表的な梗塞領域で算出した。CellA Olympusソフトウェアを、組織形態学的測定値を取得するために用いた。心エコーまたは組織学的分析により得られたデータの有意性を解析するために、スチューデントのt検定を用いた。
【０１９３】
図15Aに示される通り、対照動物と比較した場合に、CSCを注入された動物では有意に高い心臓機能が観察された。細胞処置群では、収縮面積変化（FAC）に関して心臓パフォーマンスの改善は移植の1ヵ月後に観察され、2ヵ月で維持されていた。より具体的には、移植の2ヵ月後に、FACは、生理食塩液で33.76±1.69％であり、CSC処置群で42.53±8.29％であった。前壁肥厚（AWT）はCSCを移植された動物で有意に高く（生理食塩液で18.93±4.18％、CSC処置群で27.37±5.14％）、このことは、CSCが、新規筋肉形成の促進およびリモデリングの予防で生理食塩液よりも効果的であることを示す。
【０１９４】
マッソンのトリクローム染色を用いた組織学的分析も、対照動物と比較した場合に細胞を用いて処置されたラットで、瘢痕サイズの著明な減少および罹患領域での心筋細胞の増加を示した。これらの実験は、単離および増殖プロセスの再現性を確認するために、ならびに異なるバッチ間での生物学的同等性を確かめるために、4種類の異なるドナーから取得されたCSCを用いて行なった。
【０１９５】
D. CSCは冠動脈内注入後に心臓毒性を引き起こさない
CSCを投与することの安全性を調べるために、健康なブタへのヒトCSCの注入後に、心臓酵素の存在をモニタリングした。投与溶液（プラセボ）または50×106個のヒトCSCの用量を、ブタへと冠動脈内注入により投与した。細胞は2mL/分の速度で注入し、細胞投与前および細胞投与24時間後に心臓トロポニンI（cTnl）、ミオグロビンおよびクレアチンキナーゼ-MBを定量し、毒性は観察されなかった。cTnlについての結果を図16に示す。
【０１９６】
E. CSCは腫瘍形成を引き起こさない
CSCの腫瘍形成能力を調べるために、免疫不全マウス（SCIDマウス）で2種類の異なる実験を行なった。CSCを免疫不全マウスに静脈内（3×106細胞）または皮下（10×106細胞）注入し、腫瘍形成を、それぞれ8ヵ月間または4ヵ月間、分析した。すべての動物を、日常的に1日1回（月曜日〜金曜日）の全般的な臨床観察に供し、ならびに、試験物品投与に対する肉眼で見える悪性反応の出現に関して試験物品投与の直後に臨床観察に供した。実験期間の終了時に、各動物について全身解剖を行ない、腹腔、胸腔、頭蓋腔を、それらに伴う臓器と共にその場で（in situ）調べた。また、実験期間の終了時に、一部の臓器の組織学的評価を、各動物について行なった。これらの試験（臨床観察、体重および臓器重量、解剖所見および組織学的評価）は、アッセイした期間にわたって、SCIDマウスでは試験した用量でのCSCの腫瘍形成性がないことを実証する。
【０１９７】
F. ヒトでの治療用生成物としての本発明の成体心臓幹細胞の使用に関する根拠
本発明の成体心臓幹細胞の心臓保護能、免疫調節能および心臓再生能力のため、それらは、虚血性心疾患、自己免疫疾患、創傷治癒プロセスまたは再生治療などの様々な疾患の治療のための好適な治療用ツールとなる。特に、本発明のCSCにより介される以下の現象のため、それらは細胞死または炎症プロセスが関与する疾患の治療のための有用な治療的ツールとなる：
・これらの細胞生成物により媒介される心臓保護シグナル（図10を参照されたい）は、発作後の細胞損失を制限するであろう。
・CSCの免疫調節能は、T細胞およびマクロファージにより媒介される炎症プロセスを調節するであろう。発作後の最初の段階での免疫応答は、細胞デブリを除去し、かつ瘢痕形成を開始するために必須であるが、長期の炎症プロセスは瘢痕の解消および組織再生を可能にしないであろう。
・最後に、ラットモデルでのin vivo実験により、新規組織の形成を誘導し、瘢痕サイズを減少させ、かつ新規筋線維の存在を増加させることに対するCSCの能力が示された。これは、内在性幹細胞を活性化するCSCの能力により媒介されるであろう。
【０１９８】
つまり、CSCにより媒介されるこれらの活性は、それらを、細胞死または炎症プロセスが関与する疾患の治療のための有用な治療剤にする。また、これらの細胞は、新規組織形成が必要とされる病変中での組織再生を促進するために用いることができるであろう。この意味では、ヒト虚血性心疾患を、これらの細胞を用いて治療することができるであろう。CSCは、疾患の急性期の間の細胞損失を制限するであろうし、免疫応答を調節して、より速い再生を可能にするであろうし、かつ最終的に内在性の組織常在細胞を活性化して、新規組織形成を促進するであろう。
【０１９９】
また、これらの細胞は、疾患発達の異なる時期に投与することができる。細胞を、細胞損失を予防するために疾患の急性期に投与することができ、免疫応答を調節しかつ内因性の再生を活性化するために亜急性期または慢性期に投与することができる。CSCの低い免疫原性プロフィール、ならびにそれらの免疫調節能は、in vivoでのそれらの生存を長引かせ、したがってそれらの治療能力を増大させるであろう。
【０２００】
本発明の成体心臓幹細胞は、冠動脈内、心筋内、静脈内、皮内などのような様々な経路を用いて投与することができる。MSCと比較して減少したCSCのサイズのため、これらの細胞は冠動脈内投与に特に好適となる。30×106個を超える細胞を、cTnI上昇を観察することなく冠動脈内送達することができる。
【０２０１】
実施例5：急性心筋梗塞および左心室機能不全を有する患者での同種異系ヒトCSCの冠動脈内注入のための臨床プロトコールの例
【表８】
2019076112.tif 000009
【図１】
2019076112.tif 000010
【図２】
2019076112.tif 000011
【図３】
2019076112.tif 000012
【図４】
2019076112.tif 000013
【図５】
2019076112.tif 000014
【図６】
2019076112.tif 000015
【図７】
2019076112.tif 000016
【図８】
2019076112.tif 000017
【図９】
2019076112.tif 000018
【図１０】
2019076112.tif 000019
【図１１】
2019076112.tif 000020
【図１２】
2019076112.tif 000021
【図１３】
2019076112.tif 000022
【図１４】
2019076112.tif 000023
【図１５】
2019076112.tif 000024
【図１６】
2019076112.tif 000025
【図１７】
2019076112.tif 000026
【図１８】
2019076112.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月1日(2019.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された多能性成体心臓幹細胞であって、以下のマーカー：
(a) SOX17およびGATA4
を発現し、以下のマーカー：
(b) Oct4、Nanog、c-kitおよびテロメラーゼ逆転写酵素
を発現せず、以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞のうちの1種以上に分化することができる、上記細胞。
【請求項２】
IL-1βを発現する、請求項1に記載の細胞。
【請求項３】
単離された多能性成体心臓幹細胞であって、以下のマーカー：
(a) SOX17、GATA4、IL-1β、CD31、CD49cおよびHHEX
を発現し、以下のマーカー：
(b) Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4タンパク質、Nkx2.5およびCD133
を発現せず、以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞のうちの1種以上に分化することができる、上記細胞。
【請求項４】
以下のマーカー：
(a) CD31、CD49cおよび/もしくはHHEX
のうちの1種、2種またはすべてを発現し；かつ/または、
以下のマーカー：
(b) CD133、Nkx2.5および/もしくはCXCR4タンパク質
のうちの1種、2種またはすべてを発現しない、
請求項1または2に記載の細胞。
【請求項５】
心筋組織から単離される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項６】
以下のマーカー：
KDR、HEY2、WT1、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-β、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL-8
のうちの1種以上を発現する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項７】
以下のマーカー：
CD45、CD34、CD11b、CD40、CD80、および/またはCD86
のうちの1種以上を発現しない、請求項1〜6のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項８】
前記細胞が以下のマーカー：
(a) CD31、IL-1β、CD44、CD90、CD105、CD166、WT1、HEY2、KDR、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-b、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL-8
を発現し；かつ、成体心臓多能性幹細胞の前記集団が以下のマーカー：
(b) CD45、CXCR4タンパク質、Nkx2.5、CD34、CD11b、CD40、CD80および/またはCD86を発現しない、請求項1〜7のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項９】
約10μm以上〜約15μm以下の直径を有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項１１】
成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団であって、該細胞の集団が、以下のマーカー：
(a) SOX17およびGATA4
を発現し、かつ/または
該集団が以下のマーカー：
(b) Oct4、Nanog、c-kitおよびテロメラーゼ逆転写酵素
を発現せず、
該細胞が、以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞のうちの1種以上に分化することができる、上記成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項１２】
前記細胞の集団がIL-1βを発現する、請求項10または請求項11に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項１３】
成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団であって、該細胞の集団が、以下のマーカー：
(a) SOX17、GATA4、IL-1β、CD31、CD49cおよびHHEX
を発現し、該細胞が以下のマーカー：
(b) Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4タンパク質、Nkx2.5およびCD133
を発現せず、該細胞が以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および/または平滑筋細胞のうちの1種以上に分化することができる、上記成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項１４】
前記細胞の集団が以下のマーカー：
(a) CD31、CD49cおよび/もしくはHHEX
のうちの1種、2種またはすべてを発現し；
該細胞の集団が以下のマーカー：
(b) CD133、Nkx2.5および/もしくはCXCR4タンパク質、
のうちの2種またはすべてを発現しない、
請求項10〜12のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項１５】
前記細胞の集団が、以下のさらなるマーカー：
(a) KDR、HEY2、WT1、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-β、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL8
のうちの1種以上を発現する、請求項10〜14のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項１６】
前記細胞の集団が、以下のさらなるマーカー：
(a)CD45、CD34、CD11b、CD40、CD80、および/またはCD86
のうちの1種以上を発現しない、請求項10〜15のいずれか1項に記載の多能性成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項１７】
前記集団がWT1、HEY2およびKDRを発現する、請求項10〜16のいずれか1項に記載の多能性成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項１８】
前記細胞の集団がCD40、CD80およびCD86を発現しない、請求項10〜17のいずれか1項に記載の多能性成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項１９】
前記細胞の集団が、CD44、CD90、CD105、CD166、WT1、HEY2およびKDRを発現し、かつ、該細胞の集団がCD45を発現しない、請求項10〜18のいずれか1項に記載の多能性成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項２０】
前記細胞の集団が以下のマーカー：
CD31、IL-1β、CD44、CD90、CD105、CD166、WT1、HEY2、KDR、CCL2、IL-1α、CSF3、PDGF-b、CD29、HAND2、MHCクラスIおよび/またはIL-8
を発現し；かつ、該細胞の集団が以下のマーカー：
CD45、CXCR4タンパク質、Nkx2.5、CD34、CD11b、CD40、CD80および/またはCD86
を発現しない、請求項10〜19のいずれか1項に記載の多能性成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項２１】
前記集団の成体心臓幹細胞が、約10μm以上〜約15μm以下の平均直径を有する、請求項10〜20のいずれか1項に記載の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項２２】
前記成体心臓幹細胞が：
(a) 懸濁液中で培養される場合にスフェアを形成することができ；
(b) 単球動員を誘導することができ；
(c) Tリンパ球応答を調節することができ；
(d) 抗アポトーシス因子を分泌することができ；かつ/または
(e) クローンを形成することができる、
請求項1〜9のいずれか1項に記載の細胞、または請求項10〜21のいずれか1項に記載の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項２３】
以下のステップ：
(a)成体心臓幹細胞の集団を含む懸濁物を提供するステップ；および
(b)少なくともSOX17およびGATA4を発現する細胞を選択するステップ
を含む、成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法。
【請求項２４】
以下のステップ：
(c)ステップ(b)で選択された細胞を増殖させるステップ
をさらに含む、請求項23に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法。
【請求項２５】
以下のステップ：
(d)ステップ(c)からの増殖させた細胞での少なくともSOX17およびGATA4の発現を確認するステップ
をさらに含む、請求項24に記載の成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法。
【請求項２６】
以下のステップ：
(a)心筋組織から細胞を含む懸濁物を調製するステップ；
(b)成体心臓多能性幹細胞の集団を単離するステップ；
(c)成体心臓幹細胞の該集団を増殖させるステップ；および
(d)少なくともSOX17、GATA4、およびIL-1βを発現し、かつ以下のマーカー：Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4およびNkx2.5を発現せず；かつ以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および平滑筋細胞のうちの1種以上に分化することができる細胞を選択するステップ
を含む、心筋組織から成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法。
【請求項２７】
以下のステップ：
(a)心筋組織から細胞を含む懸濁物を調製するステップ；
(b)成体心臓多能性幹細胞の集団を単離するステップ；
(c)成体心臓幹細胞の該集団を増殖させるステップ；および
(d)複数の細胞株を含むワーキングセルバンク（WCB）を調製するステップ；
(e)少なくともSOX17、GATA4、CD31およびIL-1βを発現し、かつ以下のマーカー：Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4およびNkx2.5を発現せず；かつ以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および平滑筋細胞のうちの1種以上に分化することができる細胞株を該ワーキングセルバンクから選択するステップ；
(f)選択された細胞株を増殖させるステップ；ならびに
(g)成体心臓多能性幹細胞の最終的な実質的に純粋な集団において、少なくともSOX17、GATA4、CD31およびIL-1βの発現を確認するステップ；以下のマーカー：Oct4、Nanog、c-kit、テロメラーゼ逆転写酵素、CXCR4およびNkx2.5の発現の欠失を確認するステップ；および以下の細胞タイプ：脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞および平滑筋細胞のうちの1種以上に分化する能力を確認するステップ
を含む、心筋組織から成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法。
【請求項２８】
選択ステップが、WT1、およびHEY2を発現する細胞を選択することを含む、請求項23〜27のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団を調製する方法。
【請求項２９】
請求項23〜28のいずれか1項に記載の方法により取得されるかまたは取得可能な成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項３０】
請求項1〜9および22のいずれか1項に規定される細胞以外の細胞を含む、請求項1〜9および22のいずれか1項に規定される細胞を含む細胞の混合集団。
【請求項３１】
脂肪組織由来または骨髄由来の間葉系幹細胞、心外膜細胞、内皮細胞、周皮細胞および線維芽細胞を含む、細胞の混合集団。
【請求項３２】
(a)請求項1〜9および22のいずれか1項に記載の細胞、
(b)請求項9〜22および29のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；または
(c)請求項30もしくは請求項31に記載の細胞の混合集団；
および製薬上許容される担体
を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
1×106〜50×106個の細胞、好ましくは25×106〜45×106個の細胞、より好ましくは35×106〜40×106個の細胞、最も好ましくは38×106個の細胞を含む、請求項32に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
治療における使用のための、請求項1〜9および22のいずれか1項に記載の細胞；請求項9〜22および29のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；請求項30もしくは請求項31に記載の細胞の混合集団；または請求項32もしくは請求項33に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
以下の疾患：
(a)心血管疾患、好ましくは、急性心筋梗塞、慢性虚血性心筋症、心筋症および/もしくは慢性心不全；または
(b)虚血性傷害、好ましくは重篤な肢虚血
の治療における使用のための、請求項1〜9および22のいずれか1項に記載の細胞；請求項9〜22および29のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；請求項30もしくは請求項31に記載の細胞の混合集団；または請求項32もしくは請求項33に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
請求項1〜9および22のいずれか1項に記載の細胞；請求項9〜22および29のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；請求項30もしくは請求項31に記載の細胞の混合集団または請求項32もしくは請求項33に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、心血管疾患または虚血性傷害に罹患した被験体を治療する方法。
【請求項３７】
成体心臓多能性幹細胞が同種異系である、請求項1〜9および22のいずれか1項に記載の細胞；請求項8〜17、19および27のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；請求項30もしくは請求項31に記載の細胞の混合集団または請求項30もしくは請求項31に記載の医薬組成物、または請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が、
(a)静脈内、動脈内、冠動脈内または心筋内に；かつ/または
(b) 1×106〜50×106細胞の用量、好ましくは25×106〜45×106細胞の用量、より好ましくは35×106〜40×106細胞の用量、最も好ましくは38×106細胞の用量で
投与される、請求項1〜9および22のいずれか1項に記載の細胞；請求項8〜17、19および27のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；請求項30もしくは請求項31に記載の細胞の混合集団または請求項30もしくは請求項31に記載の医薬組成物、または請求項36に記載の方法。
【請求項３９】
前記成体心臓幹細胞が、以下のメカニズム：
(a)単球の動員；
(b)免疫調節；
(c)血管新生の活性化；
(d)心臓再生を促進すること、および/または
(e)内在性心筋細胞の再生を誘導すること
のうちの1種以上により心臓組織修復を誘導する、請求項1〜9および22のいずれか1項に記載の細胞；請求項8〜17、19および27のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；請求項30もしくは請求項31に記載の細胞の混合集団または請求項30に記載の医薬組成物、または請求項36に記載の方法。
【請求項４０】
以下の用途：
(a)自己免疫疾患、炎症プロセス、慢性潰瘍を治療すること、および創傷治癒を促進すること；または
(b)同種異系臓器移植拒絶を予防すること
における使用のための、請求項1〜9および22のいずれか1項に記載の細胞；請求項8〜17、19および27のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；請求項27もしくは請求項28に記載の細胞の混合集団、または請求項30に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
心臓組織の再生における使用のための、任意により生体適合性インプラントに接着された、請求項1〜9および22のいずれか1項に記載の細胞；請求項9〜22および29のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；請求項30または請求項31に記載の細胞の混合集団。
【請求項４２】
急性心筋梗塞の治療における使用のための、請求項1〜9および22のいずれか1項に記載の細胞；請求項9〜22および29のいずれか1項に記載の成体心臓多能性幹細胞の実質的に純粋な集団；請求項30もしくは請求項31に記載の細胞の混合集団または請求項32もしくは請求項33に記載の医薬組成物であって、
該細胞、実質的に純粋な集団、混合集団または医薬組成物が、冠動脈内経路により投与され；かつ
該成体心臓多能性幹細胞の投与量が、1×106〜50×106細胞、好ましくは25×106〜45×106細胞の用量、より好ましくは35×106〜40×106細胞の用量、最も好ましくは38×106細胞の用量である、
上記細胞、実質的に純粋な集団、混合集団または医薬組成物。