(57)【要約】【課題】臨床応用が容易な血管新生関連疾患の治療又は予防剤を提供する。【解決手段】被検物質の存在下及び非存在下で、サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖とを接触させる工程と、前記被検物質の存在下及び非存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量を定量する工程と、前記被検物質の存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量が、前記被検物質の非存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量と比較して変化した場合に、前記被検物質を血管新生関連疾患の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質の存在下及び非存在下で、サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖とを接触させる工程と、
前記被検物質の存在下及び非存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量を定量する工程と、
前記被検物質の存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量が、前記被検物質の非存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量と比較して変化した場合に、前記被検物質を血管新生関連疾患の治療又は予防剤であると判定する工程と、
を含む、血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記血管新生関連疾患が、癌、心筋梗塞、慢性炎症、網膜血管新生症、糖尿病性網膜症又は閉塞性動脈硬化症である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
サリューシン−β及びＡＴＰ合成酵素β鎖を含む、血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニングキット。
【請求項４】
サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、血管新生関連疾患の治療又は予防剤。
【請求項５】
サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合を阻害する前記物質が、
サリューシン−βに対する特異的結合物質、
ＡＴＰ合成酵素β鎖に対する特異的結合物質、
可溶化したＡＴＰ合成酵素β鎖であって、前記ＡＴＰ合成酵素β鎖が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、可溶化したＡＴＰ合成酵素β鎖、あるいは、
可溶化した、ＡＴＰ合成酵素β鎖の誘導体であって、前記ＡＴＰ合成酵素β鎖の誘導体が、（ｉ）配列番号２からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつサリューシン−βに対する結合活性を有するペプチド、（ｉｉ）前記ＡＴＰ合成酵素β鎖にポリエチレングリコールが結合したもの、又は（ｉｉｉ）配列番号２からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつサリューシン−βに対する結合活性を有するペプチドにポリエチレングリコールが結合したものである、可溶化した、ＡＴＰ合成酵素β鎖の誘導体、
である、請求項４に記載の血管新生関連疾患の治療又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法に関する。より具体的には、血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法、スクリーニングキット及び血管新生関連疾患の治療又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンギオスタチンは、３８ｋＤａの分子量を有するプラスミノ−ゲンの断片であり、血管新生、転移癌の増殖の強力な阻害薬であることが知られている（例えば、非特許文献１を参照。）。なお、プラスミノ−ゲンはプラスミンの前駆体タンパク質であり、プラスミンは、フィブリンやフィブリノーゲンを分解して血栓を分解するプロテアーゼの一種である。
【０００３】
ところで、サリューシン−βは、バイオインフォマティクス解析により発明者らが同定した、２０アミノ酸からなる生理活性ペプチドである（例えば、非特許文献２を参照。）。サリューシン−βは、血圧降下作用、除脈作用、副交感神経刺激活性、動脈硬化促進作用、抗利尿ホルモン分泌刺激作用等の多くの生理活性を示すことが明らかにされているが、その受容体は不明であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】O'Reilly M.S., et al., Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma, Cell, 79(2), 315-328, 1994.
【非特許文献２】Shichiri M., et al., Salusins: newly identified bioactive peptides with hemodynamic and mitogenic activities, Nature Med., 9(9), 1166-1172, 2003.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アンギオスタチンは、血管新生関連疾患の治療又は予防剤への応用が検討されてきたが、分子量が大きく臨床応用が困難である。そこで本発明は、臨床応用が容易な血管新生関連疾患の治療又は予防剤を提供することを目的とする。本発明はまた、血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法、及び血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニングキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の通りである。
（１）サリューシン−β若しくはその誘導体、ＡＴＰ合成酵素β鎖若しくはその誘導体、サリューシン−βに対する特異的結合物質、又はＡＴＰ合成酵素β鎖に対する特異的結合物質、を有効成分として含有する血管新生関連疾患の治療又は予防剤。
（２）前記血管新生関連疾患が、癌、心筋梗塞、慢性炎症、網膜血管新生症、糖尿病性網膜症又は閉塞性動脈硬化症である、（１）に記載の治療又は予防剤。
（３）被検物質の存在下及び非存在下で、サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖とを接触させる工程と、前記被検物質の存在下及び非存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量を定量する工程と、前記被検物質の存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量が、前記被検物質の非存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量と比較して変化した場合に、前記被検物質を血管新生関連疾患の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法。
（４）前記血管新生関連疾患が、癌、心筋梗塞、慢性炎症、網膜血管新生症、糖尿病性網膜症又は閉塞性動脈硬化症である、（３）に記載のスクリーニング方法。
（５）サリューシン−β及びＡＴＰ合成酵素β鎖を含む、血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニングキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、臨床応用が容易な血管新生関連疾患の治療又は予防剤を提供することができる。また、血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法、及び血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニングキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例１におけるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図２】実験例２の結果を示す共焦点蛍光顕微鏡写真である。
【図３】実験例３の結果を示すグラフである。
【図４】実験例４の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［血管新生関連疾患の治療又は予防剤］
１実施形態において、本発明は、サリューシン−β若しくはその誘導体、ＡＴＰ合成酵素β鎖若しくはその誘導体、サリューシン−βに対する特異的結合物質、又はＡＴＰ合成酵素β鎖に対する特異的結合物質、を有効成分として含有する血管新生関連疾患の治療又は予防剤を提供する。血管新生関連疾患の治療又は予防剤は、血管新生を抑制するものであってもよく、血管新生を促進するものであってもよい。
【００１０】
（サリューシン−β若しくはその誘導体）
後述する実施例において示すように、発明者らはサリューシン−βがインビボで血管新生抑制活性を示すことを明らかにした。したがって、サリューシン−β若しくはその誘導体は、血管新生関連疾患の治療又は予防剤として使用することができる。
【００１１】
本明細書において、血管新生関連疾患としては、例えば、癌、心筋梗塞、慢性炎症、網膜血管新生症、糖尿病性網膜症、閉塞性動脈硬化症等が挙げられる。また、慢性炎症としては、ぜんそく、アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患に関連する炎症、関節リウマチなどの自己免疫性疾患に関連する炎症等が挙げられる。
【００１２】
サリューシン−βのアミノ酸配列を配列番号１に示す。サリューシン−βはわずか２０アミノ酸からなるペプチドであるため、簡単に合成することができ、臨床応用が容易である。
【００１３】
サリューシン−βは、例えば固相合成等により人工的に合成してもよいし、例えばサリューシン−βをコードする遺伝子を含む発現ベクターを、無細胞タンパク合成系、又は大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞等の適切な宿主中で発現させて精製することにより製造してもよい。
【００１４】
サリューシン−βの誘導体としては、例えば、サリューシン−βのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生抑制活性を有するペプチド；サリューシン−β又は上記のペプチドに、例えばポリエチレングリコール等の化合物が結合したもの等が挙げられる。ポリエチレングリコールを結合することにより、例えば血中安定性を高めること等が可能になる。ここで、１若しくは数個とは、例えば１〜１０個、例えば１〜５個、例えば１〜３個を意味する。
【００１５】
（ＡＴＰ合成酵素β鎖若しくはその誘導体）
後述する実施例において示すように、発明者らはサリューシン−βの受容体がＡＴＰ合成酵素β鎖であることを明らかにした。したがって、遊離状態の（可溶化した）ＡＴＰ合成酵素β鎖若しくはその誘導体は、サリューシン−βに結合してサリューシン−β受容体への結合を阻害することによってサリューシン−βの働きを抑制することにより、サリューシン−βの生理活性を調節することができる。したがって、ＡＴＰ合成酵素β鎖若しくはその誘導体は、血管新生関連疾患の治療又は予防剤として使用することができる。ＡＴＰ合成酵素β鎖のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００１６】
ＡＴＰ合成酵素β鎖は、例えば、ＡＴＰ合成酵素β鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターを、無細胞タンパク合成系、又は、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞等の適切な宿主中で発現させて精製すること等により製造することができる。
【００１７】
ＡＴＰ合成酵素β鎖の誘導体としては、例えば、ＡＴＰ合成酵素β鎖のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつサリューシン−βに対する結合活性を有するペプチド；ＡＴＰ合成酵素β鎖又は上記のペプチドに、例えばポリエチレングリコール等の化合物が結合したもの等が挙げられる。ポリエチレングリコールを結合することにより、例えば血中安定性を高めること等が可能になる。ここで、１若しくは数個とは、例えば１〜３０個、例えば１〜２０個、例えば１〜１０個、例えば１〜５個、例えば１〜３個を意味する。
【００１８】
（サリューシン−βに対する特異的結合物質）
上述したように、発明者らはサリューシン−βがインビボで血管新生抑制活性を示すことを明らかにした。したがって、サリューシン−βに対する特異的結合物質は、サリューシン−βに結合してサリューシン−βの働きを抑制することにより、サリューシン−βの生理活性を調節することができる。したがって、サリューシン−βに対する特異的結合物質は、血管新生関連疾患の治療又は予防剤として使用することができる。特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー、受容体等が挙げられる。
【００１９】
抗体は、例えば、マウス等の動物にサリューシン−βを抗原として免疫することにより作製することができる。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することができる。また、抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。ヒトに投与した場合の拒絶反応等を抑制する観点から、抗体及び抗体断片は、ヒト化されているかヒト由来であることが好ましい。
【００２０】
アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。サリューシン−βに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、サリューシン−βに対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００２１】
（ＡＴＰ合成酵素β鎖に対する特異的結合物質）
上述したように、発明者らはサリューシン−βの受容体がＡＴＰ合成酵素β鎖であることを明らかにした。したがって、ＡＴＰ合成酵素β鎖に対する特異的結合物質は、ＡＴＰ合成酵素β鎖に結合してサリューシン−βのＡＴＰ合成酵素β鎖への結合を抑制することにより、サリューシン−βの生理活性を調節することができる。したがって、ＡＴＰ合成酵素β鎖に対する特異的結合物質は、血管新生関連疾患の治療又は予防剤として使用することができる。特異的結合物質については、上述したものと同様である。
【００２２】
［血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被検物質の存在下及び非存在下で、サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖とを接触させる工程と、前記被検物質の存在下及び非存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量を定量する工程と、前記被検物質の存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量が、前記被検物質の非存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量と比較して変化した場合に、前記被検物質を血管新生関連疾患の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２３】
本実施形態のスクリーニング方法により、サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合を制御することに基づく血管新生関連疾患の治療又は予防剤をスクリーニングすることができる。血管新生関連疾患については上述したものと同様である。
【００２４】
（サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖とを接触させる工程）
本工程において、被検物質の存在下及び非存在下でサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖とを接触させる。被検物質としては、例えば化合物ライブラリー等を用いることができる。本工程は、例えば、後述する実験例で示すように、ＡＴＰ合成酵素β鎖を発現する細胞の培地に、被検物質の存在下又は非存在下で、蛍光標識したサリューシン−βを反応させること等により実施することができる。あるいは、被検物質の存在下又は非存在下で、サリューシン−β又はＡＴＰ合成酵素β鎖を固定した固相に、蛍光標識したＡＴＰ合成酵素β鎖又は蛍光標識したサリューシン−βをそれぞれ接触させてもよい。固相としては、例えば、ビーズ等の粒子；スライドガラス、イムノプレート等の板状構造体等が挙げられる。
【００２５】
（サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量を定量する工程）
本工程において、サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量を定量する。本工程は、例えば、上述した細胞表面に結合した、サリューシン−βの蛍光量を測定すること等により実施することができる。あるいは、上述した固相に結合したＡＴＰ合成酵素β鎖又はサリューシン−βの蛍光量を測定すること等により実施することができる。
【００２６】
（被検物質が血管新生関連疾患の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程において、被検物質が血管新生関連疾患の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量が、被検物質の非存在下におけるサリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量と比較して変化した場合に、被検物質を血管新生関連疾患の治療又は予防剤であると判定する。
【００２７】
変化する場合としては、上記の結合量が増加する場合及び減少する場合があり得る。サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合を変化させる被検物質は、血管新生関連疾患の治療又は予防剤となり得る。例えば、サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量を増加させる被検物質は、血管新生を抑制することにより血管新生関連疾患の治療又は予防剤となり得る。また、サリューシン−βとＡＴＰ合成酵素β鎖との結合量を減少させる被検物質は、例えばサリューシン−βの過剰な活性を抑制することにより血管新生を適正な範囲にすることにより、血管新生関連疾患の治療又は予防剤となり得る。
【００２８】
本実施形態のスクリーニング方法は、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用する測定装置等を用いて実施することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用する測定装置としては、例えば、ビアコア（登録商標、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）等が挙げられる。
【００２９】
［血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニングキット］
１実施形態において、本発明は、サリューシン−β及びＡＴＰ合成酵素β鎖を含む、血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニングキットを提供する。サリューシン−β又はＡＴＰ合成酵素β鎖は、蛍光色素等で標識されていてもよい。本実施形態のスクリーニングキットは、上述した血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法を実施するのに好適に用いることができる。
【００３０】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、サリューシン−β若しくはその誘導体、ＡＴＰ合成酵素β鎖若しくはその誘導体、サリューシン−βに対する特異的結合物質、又はＡＴＰ合成酵素β鎖に対する特異的結合物質を、哺乳動物に投与する工程を備える、血管新生関連疾患の治療又は予防方法を提供する。
【００３１】
１実施形態において、本発明は、血管新生関連疾患の治療又は予防のための、サリューシン−β若しくはその誘導体、ＡＴＰ合成酵素β鎖若しくはその誘導体、サリューシン−βに対する特異的結合物質、又はＡＴＰ合成酵素β鎖に対する特異的結合物質を提供する。
【００３２】
１実施形態において、本発明は、血管新生関連疾患の治療又は予防剤の製造のための、サリューシン−β若しくはその誘導体、ＡＴＰ合成酵素β鎖若しくはその誘導体、サリューシン−βに対する特異的結合物質、又はＡＴＰ合成酵素β鎖に対する特異的結合物質の使用を提供する。
【実施例】
【００３３】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３４】
＜実験例１＞
［サリューシン−βの受容体の同定］
膜タンパク質ライブラリー（membrane protein library、ＭＰＬ）をスクリーニングすることにより、サリューシン−βの受容体を同定した。
【００３５】
（膜タンパク質ライブラリーの調製）
まず、ラット、マウス及びブタの様々な臓器由来の組織から膜タンパク質を抽出した。臓器としては、心臓、大脳、小脳、肺、肝動脈、腎臓、骨格筋、視床下部／下垂体、大動脈を使用した。
【００３６】
膜タンパク質の抽出は次のようにして行った。臓器２ｇを１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）−ＤＮａｓｅＩ（７０Ｕ／μＬ）−１ｍＭ  ＤＴＴの溶液１０ｍＬに入れてホモジナイズし、２，５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。上清を回収し、４０％飽和スクロース液１２ｍＬに重層し、９５，０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心した。続いて、２層に分かれた液体の界面に存在する膜タンパク質を回収し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００３７】
続いて、抽出した膜タンパク質を、卵黄レシチン及びコレステロールから作製したリポソームと混合し、膜融合させることにより、膜タンパク質が埋め込まれたリポソームを作製した。
【００３８】
リポソームの作製は次のようにして行った。精製卵黄レシチン（旭化成社）１ｇ及びコレステロール（和光純薬工業社）０．２ｇを１０ｍＬのクロロホルムに溶解し、室温で真空乾燥した。続いて、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）１０ｍＬを添加して再構成した。続いて、混合液を激しく撹拌してリポソーム懸濁液を得、使用するまで４℃で保存した。
【００３９】
続いて、抽出した膜タンパク質５０ｍｇに１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）５ｍＬを添加し、超音波処理装置（型式「ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ  ２０１Ｍ」、クボタ社）を用いて超音波処理を行い、リポソーム懸濁液と混合し、凍結融解を３回繰り返した。続いて、再び超音波処理を行い、膜タンパク質が埋め込まれたリポソームを得た。
【００４０】
続いて、膜タンパク質が埋め込まれたリポソームに、ポアサイズ２００ｎｍのポリカーボネート膜（型式「Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ」、ワットマン社）を通過させ、直径２００ｎｍ以下のものを回収し、膜タンパク質ライブラリーとしてスクリーニングに用いた。
【００４１】
（膜タンパク質ライブラリーのスクリーニング）
予備検討の結果を踏まえ、ＮＨＳ−セファロース上にサリューシン−βのＮ末端を固定したものを使用して、サリューシン−βに結合する膜タンパク質の単離を試みた。
【００４２】
具体的には、ＮＨＳ−セファロース上に固定したサリューシン−βに上述した膜タンパク質ライブラリーを反応させ、サリューシン−βに結合する膜タンパク質をアフィニティー精製した。図１は、精製物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後、銀染色した結果を示す写真である。図１の右側のレーンは分子量マーカーである。
【００４３】
図１の矢印で示すバンドを切り出して、トリプシン消化−液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−質量分析（ＭＳ）／ＭＳによりタンパク質解析を行った。その結果、当該タンパク質はラットのＡＴＰ合成酵素β鎖であることが明らかとなった。
【００４４】
従来、ＡＴＰ合成酵素β鎖は、ＡＴＰ合成酵素のＦ１ドメインに属し、ミトコンドリアの内膜に閉じ込められていると考えられてきた。しかしながら、近年、ＡＴＰ合成酵素β鎖は、それぞれ一見関連性のないリガンドである、アンギオスタチン、エンテロスタチン、β−カソモルフィン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉの細胞表面受容体であることが見出されている。なお、アンギオスタチン、エンテロスタチン、β−カソモルフィン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、それぞれＡＴＰ又はＡＤＰの生成を通じて、血管新生、食餌の摂取、高血圧、リポタンパク質の代謝を制御することが報告されている。
【００４５】
＜実験例２＞
［サリューシン−βの細胞表面に対する結合能の検討］
ＦＩＴＣ標識したサリューシン−βを、いくつかの上皮細胞及び癌由来細胞とインキュベートし、共焦点蛍光顕微鏡で観察した。図２（ａ）〜（ｎ）は、実験結果を示す共焦点蛍光顕微鏡写真である。
【００４６】
その結果、図２（ａ）に示すように、子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａ細胞の表面に特に強い蛍光が観察された。
【００４７】
また、図２（ｂ）に示すように、ＦＩＴＣ標識したサリューシン−βのＨｅＬａ細胞に対する結合は、ＨｅＬａ細胞を予めＡＴＰ合成酵素β鎖に対する抗体とプレインキュベーションすることによって顕著に抑制された。
【００４８】
また、図２（ｃ）〜（ｅ）に示すように、ＦＩＴＣ標識したサリューシン−βのＨｅＬａ細胞に対する結合は、ＨｅＬａ細胞を予め過剰量のβ−カソモルフィン５（図２（ｃ））、β−カソモルフィン７（図２（ｄ））、エンテロスタチン（図２（ｅ））とプレインキュベーションすることによって顕著に抑制された。β−カソモルフィン５、β−カソモルフィン７及びエンテロスタチンは、ＡＴＰ合成酵素β鎖のリガンドとして同定されたものであり、サリューシン−βの結合を競合的に阻害したと考えられる。
【００４９】
図２（ｆ）は、陰性対照として、ＦＩＴＣ標識した無関係のペプチドをＨｅＬａ細胞とインキュベーションした結果である。
【００５０】
図２（ｇ）及び（ｈ）は、ＡＴＰ合成酵素α鎖（図２（ｇ））及びＡＴＰ合成酵素β鎖（図２（ｈ））に対する抗体でＨｅＬａ細胞を染色した結果である。その結果、ＡＴＰ合成酵素α鎖及びＡＴＰ合成酵素β鎖がＨｅＬａ細胞の表面に発現していることが確認された。同様の結果がヒト上皮細胞においても確認された（図示せず。）。
【００５１】
サリューシン−βは、ヒト臍静脈内皮細胞（ｈＵＶＥＣｓ）（図２（ｉ））、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ｈＭＶＥＣｓ）等の内皮由来細胞にも結合することが確認された。
【００５２】
しかしながら、例えばラット大動脈内皮細胞（ｒＡＥＣｓ）、ラット肺動脈内皮細胞（ｒＰＥＣｓ）等のより大きなサイズの動脈由来の細胞では、サリューシン−βの結合はほとんど認められなかった（図示せず。）。
【００５３】
ヒト単球性白血病細胞株ＴＨＰ−１は、１５０ｎＭのＴＰＡを添加してマクロファージへと分化誘導すると、ＦＩＴＣ標識したサリューシン−βと結合することが確認された（図２（ｊ））。この結合は、抗ＡＴＰ合成酵素α鎖抗体とプレインキュベーションすることによりわずかに阻害され（図２（ｋ））、抗ＡＴＰ合成酵素β鎖抗体（図２（ｌ））、過剰量のβ−カソモルフィン７（図２（ｍ））及び過剰量のエンテロスタチン（図２（ｎ））とプレインキュベーションすることにより完全に阻害された。
【００５４】
以上の結果は、これらの細胞においては、ＡＴＰ合成酵素β鎖がサリューシン−βの主な受容体であることを示す。
【００５５】
＜実験例３＞
［ＡＴＰ合成酵素の活性に対するサリューシン−βの影響の検討］
内皮細胞表面のＡＴＰ合成酵素はＡＴＰを合成することが知られている。そして、このＡＴＰ合成能は、低いｐＨ環境下において、アンギオスタチンによって阻害されることが知られている。
【００５６】
発明者らは、細胞表面のＡＴＰ合成酵素の活性を、細胞の培地中で合成されるＡＴＰを定量することにより測定した。ＡＴＰの定量には市販のキット（商品名「ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）ルミネッセンスアッセイ」、プロメガ社）を用いた。
【００５７】
９６ウェルプレートにサブコンフルエントに培養されたＨｅＬａ細胞又はヒト皮膚微小血管内皮細胞（ｈＭＶＥＣｓ）を血清不含培地で洗浄し、終濃度１０−１２〜１０−７Ｍのサリューシン−β、ピセアタンノール（シグマ社）、抗ＡＴＰ合成酵素抗体を含む培地又は培地のみの存在下で３０分間静置した。静置は、ｐＨ７．２に調整する場合には５％ＣＯ２環境下で行い、ｐＨ６．７に調整する場合には１７％ＣＯ２環境下で行った。続いて、細胞をＡＤＰで２０秒間処理し、上清を直ちに回収して、合成されたＡＴＰを定量した。
【００５８】
図３（ａ）〜（ｃ）は、実験結果を示すグラフである。グラフ中、縦軸は合成されたＡＴＰ量（相対値）を示す。図３（ａ）はｐＨ７．２におけるＨｅＬａ細胞の結果であり、図３（ｂ）はｐＨ７．２におけるｈＭＶＥＣｓの結果である。その結果、サリューシン−βは生理的なｐＨにおいて、細胞表面のＡＴＰ合成酵素の活性を濃度依存的に阻害することが明らかとなった。また、図３（ａ）に示すように、ＨｅＬａ細胞を１０−６Ｍのβ−カソモルフィンとプレインキュベーションすることにより、サリューシン−βのＡＴＰ合成酵素阻害活性が拮抗された。
【００５９】
また、図３（ａ）に示すように、ＡＴＰ合成酵素の阻害剤であるピセアタンノールはＡＴＰ合成を顕著に抑制した。また、図３（ａ）に示すように、抗ＡＴＰ合成酵素β鎖ＩｇＧ抗体はＡＴＰ合成酵素の活性を増加させたが、抗ＡＴＰ合成酵素α鎖ＩｇＧ抗体はＡＴＰ合成酵素の活性に影響を与えなかった。
【００６０】
図３（ｃ）は、ｐＨ６．７においてｈＭＶＥＣｓを用いて同様の実験を行った結果である。ｐＨ６．７では、サリューシン−βのＡＴＰ合成酵素阻害活性がｐＨ７．２よりも顕著であった。なお、ｐＨ６．７は、アンギオスタチンがＡＴＰ合成の阻害作用を示すｐＨである。
【００６１】
サリューシン−βは、ＡＴＰ合成酵素β鎖を細胞表面に発現していない、ラット大動脈内皮細胞（ｒＡＥＣｓ）、ラット肺動脈内皮細胞（ｒＰＥＣｓ）のＡＴＰ合成には影響を与えなかった。
【００６２】
＜実験例４＞
［血管新生に対するサリューシン−βの影響の検討］
マウス肉腫細胞株であるＳａｒｃｏｍａ１８０細胞をミリポアチャンバーに入れ、Ｃｒｌｊ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスの背部皮下に移植すると、ほとんど血管の無い皮下領域に強力な血管新生を誘導する。この現象を利用したマウス背部皮下法（ｄｏｒｓａｌ  ａｉｒ  ｓａｃ  ａｓｓａｙ）により、血管新生に対するサリューシン−βの影響を検討した。
【００６３】
ミリポアチャンバーの両側をポアサイズ０．４５μｍのフィルターで覆い、０．１５ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した５×１０６個のＳａｒｃｏｍａ１８０細胞で満たし、癌細胞含有チャンバーを作製した。続いて、９〜１０週齢のメスのＣｒｌｊ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスの背部皮下に約８ｍＬの空気を注入して作製した背部気嚢に癌細胞含有チャンバーを移植した。
【００６４】
癌細胞含有チャンバーの移植後のマウスに、０、２、２０又は２００ｎｇ／ｋｇ／日のサリューシン−βを５日間静脈注射した。対照として、癌細胞を含まないチャンバーを移植したマウス（図中、「ベヒクル」と示す。）、及び癌細胞含有チャンバーを移植し、サリューシン−βの代わりに蒸留水を注射したマウスを使用した。
【００６５】
処置終了後、マウスをと殺してチャンバーを取出し、チャンバーと接触していた皮膚の新生血管を顕微鏡で観察した。新生血管の特徴である、３ｍｍ以上の長さの蛇行性微小血管を全て新生血管として数えた。
【００６６】
図４は実験結果を示すグラフである。グラフ中、縦軸は新生血管の数を示す。その結果、サリューシン−βは、濃度依存的に血管新生を阻害することが明らかとなった。また、サリューシン−βによる毒性は認められなかった。この結果は、サリューシン−βがインビボで血管新生抑制活性を有することを示す。
【００６７】
以上の結果から、サリューシン−βの細胞表面受容体はＡＴＰ合成酵素β鎖であり、この分子を標的とすることにより、内皮細胞や種々の腫瘍細胞のＡＴＰ合成能を抑制して血管新生抑制作用を惹起することが考えられた。わずか２０アミノ酸からなるサリューシン−βは、分子量３８ｋＤａのアンギオスタチンに比較して遙かに低分子量であるにもかからわらず、アンギオスタチンと同様の生理活性を示すことから、臨床応用が容易であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明によれば、臨床応用が容易な血管新生関連疾患の治療又は予防剤を提供することができる。また、血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法、及び血管新生関連疾患の治療又は予防剤のスクリーニングキットを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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