(57)【要約】      （修正有）【課題】操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドおよびその組成物の提供。【解決手段】特定の配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む組換えαガラクトシダーゼＡおよび／または生物学的に活性な組換えαガラクトシダーゼＡフラグメント。操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドは、酸性（ｐＨ＜４．５）および塩基性（ｐＨ＞７）の両方の条件下で、改良された安定性を提供するように最適化されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１４年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／０９５３１３号および２０１５年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２１６４５２号（これらの両方は、全ての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドは、酸性（ｐＨ＜４．５）および塩基性（ｐＨ＞７）の両方の条件下で、改良された安定性を提供するように最適化されている。本発明はまた、治療目的のための、操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。
【０００３】
配列表、表、またはコンピュータプログラムに関する言及
配列表の写しを、ファイル名「ＣＸ７−１４７ＷＯ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１５年１１月３０日、およびサイズ２，５４５，８５１バイトのＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂから明細書と同時に提出している。ＥＦＳ−Ｗｅｂから提出した配列表は、本明細書の一部を構成し、その全体が本明細書中で参照によって組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ヒトαガラクトシダーゼ（「ＧＬＡ」；ＥＣ３．２．１．２２）は、糖脂質および糖タンパク質からの末端αガラクトシル部分の加水分解に関与するリソソーム糖タンパク質である。それは、一連のヒト組織内に存在する多くの基質に作用する。ファブリー病（びまん性体部被角血管腫、アンダーソン−ファブリー病、遺伝性異所性リピドーシス（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｄｙｓｔｏｐｉｃ  ｌｉｐｉｄｏｓｉｓ）、α−ガラクトシダーゼＡ欠損症、ＧＬＡ欠損症およびセラミドトリヘキソシダーゼ欠損症とも称される）は、α−ガラクトシダーゼＡの欠損または活性欠如に起因するスフィンゴ糖脂質異化のＸ連鎖先天異常である。ファブリー病に罹患している患者は、血管、組織および器官の血漿および細胞リソソーム中に、グロボトリオシルセラミド（Ｇｂ３）および関連スフィンゴ糖脂質を蓄積する（例えば、Ｎａｎｃｅら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６３：４５３−４５７［２００６］を参照のこと）。患者が老化するにつれて、これらの脂質の蓄積により、血管は徐々に狭くなり、組織、特に皮膚、腎臓、心臓、脳および神経系における血流および栄養が減少する。したがって、ファブリー病は、腎不全、心疾患、脳血管疾患、小線維末梢神経障害および皮膚病変ならびに他の障害として症状発現する全身性障害である（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．，１２２：６５−７７［２００９］を参照のこと）。罹患患者は、手足の痛み、皮膚上の小さな暗赤色の斑点のクラスター、発汗能力の低下、角膜混濁、胃腸の問題、耳鳴りおよび難聴などの症状を示す。生命に関わる恐れのある合併症には、進行性腎損傷、心臓発作および脳卒中が含まれる。この疾患は、男性では推定で４０，０００〜６０，０００人に１人が罹患しているが、女性でも起こる。実際、ファブリー病を有するヘテロ接合女性は、医療処置を必要とする重大な生命に関わる状態（神経系異常、慢性疼痛、疲労、高血圧、心臓病、腎不全および脳卒中を含む）を経験する（例えば、Ｗａｎｔら、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．，１３：４５７−４８４［２０１１］を参照のこと）。ファブリー病の徴候は、乳児期以降の任意の時点で始まる可能性があり、徴候は通常、４〜８歳に現れ始めるが、一部の患者は、より軽度の遅発性疾患を示す。一般に、処置は支持的であり、ファブリー病の治療法はないので、安全で有効な処置が依然として必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｎｃｅら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，［２００６］６３：４５３〜４５７
【非特許文献２】Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．，［２００９］１２２：６５〜７７
【非特許文献３】Ｗａｎｔら、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．，［２０１１］１３：４５７〜４８４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドは、酸性（ｐＨ＜４．５）および塩基性（ｐＨ＞７）の両方の条件下で、改良された安定性を提供するように最適化されている。本発明はまた、治療目的のための、操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。
本発明は、配列番号５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む組換えαガラクトシダーゼＡおよび／または生物学的に活性な組換えαガラクトシダーゼＡフラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、αガラクトシダーゼＡは、表２．１、２．２、２．４、および／または２．５に提供した少なくとも１つの位置であって、配列番号５を参照してナンバリングされている位置において少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、αガラクトシダーゼＡは、表２．３に提供した少なくとも１つの位置であって、配列番号１０を参照してナンバリングされている位置において少なくとも１つの変異を含む。いくつかのさらなる実施形態では、組換えαガラクトシダーゼＡは、ヒトαガラクトシダーゼＡに由来する。いくつかのさらなる実施形態では、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号１５、１３、１０、または１８のポリペプチド配列を含む。またいくつかのさらなる実施形態では、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号５のαガラクトシダーゼＡよりも熱安定性である。いくつかのさらなる実施形態では、組換えαガラクトシダーゼＡは、ｐＨ７．４において、配列番号５のαガラクトシダーゼＡよりも安定であり、さらなる実施形態では、組換えαガラクトシダーゼＡは、ｐＨ４．３において、配列番号５のαガラクトシダーゼＡよりも安定である。いくつかの実施形態では、組換えαガラクトシダーゼＡは、ｐＨ７．４およびｐＨ４．３において、配列番号５のαガラクトシダーゼＡよりも安定である。またいくつかのさらなる実施形態では、組換えαガラクトシダーゼＡは、脱免疫化αガラクトシダーゼＡである。いくつかの実施形態では、組換えαガラクトシダーゼＡは、表７．１に提供した脱免疫化αガラクトシダーゼＡである。またいくつかのさらなる実施形態では、組換えαガラクトシダーゼＡは、精製されている。いくつかの実施形態では、組換えαガラクトシダーゼＡは、参照配列と比較して、ｉ）触媒活性の増強；ｉｉ）ｐＨ７．４に対する耐性の増加；ｉｉｉ）ｐＨ４．３に対する耐性の増加；またはｉｖ）免疫原性の減少；またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、もしくはｉｖ）のいずれかの組み合わせから選択される少なくとも１つの改良された特性を示す。いくつかの実施形態では、参照配列は配列番号５であり、いくつかの代替的な実施形態では、参照配列は配列番号１０である。
【０００７】
本発明はまた、本明細書中（例えば、表２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、および／または表７．１）に提供した少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡをコードする組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
【０００８】
本発明はまた、本明細書中（例えば、表２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、および／または表７．１）に提供した少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、調節配列に作動可能に連結されている。いくつかのさらなる実施形態では、調節配列は、プロモーターである。いくつかのさらなる実施形態では、プロモーターは、異種プロモーターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、本明細書中に提供したシグナル配列をさらに含む。
【０００９】
本発明はまた、本明細書中に提供した少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書中（例えば、表２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、および／または表７．１）に提供した少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核生物である。
【００１０】
本発明はまた、αガラクトシダーゼＡバリアントを生成する方法であって、組換えポリヌクレオチドによってコードされるαガラクトシダーゼＡが産生される条件下で、本明細書中に提供した宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、αガラクトシダーゼＡを回収する工程をさらに含む。いくつかのさらなる実施形態では、該方法は、αガラクトシダーゼＡを精製する工程をさらに含む。
【００１１】
本発明はまた、本明細書中（例えば、表２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、および／または表７．１）に提供した少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、医薬組成物を提供する。いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、ファブリー病を処置するための医薬組成物であって、本明細書中に提供した酵素組成物を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容され得るキャリアおよび／または賦形剤をさらに含む。いくつかのさらなる実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの非経口注射または注入に適切である。
【００１２】
本発明はまた、被験体におけるファブリー病の症状を処置および／または予防するための方法であって、ファブリー病を有する被験体を提供する工程、および本明細書中（例えば、表２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、および／または表７．１）に提供した少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡを含む少なくとも１つの医薬組成物組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）を提供する工程、および医薬組成物を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ファブリー病の症状は、被験体において改善される。いくつかのさらなる実施形態では、本発明の医薬組成物が投与された被験体は、ファブリー病の症状を示す被験体が必要とする食事よりも、その脂肪含有量の制限が少ない食事を摂ることができる。いくつかの実施形態では、被験体は乳児または小児であり、いくつかの代替的な実施形態では、被験体は成人または若年成人である。
【００１３】
本発明はまた、本明細書中に提供した組成物の使用を提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、組換えαガラクトシダーゼＡおよび／または生物学的に活性な組換えαガラクトシダーゼＡフラグメント。
（項目２）
表２．１、２．２、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、および／または７．１に提供した少なくとも１つの位置であって、配列番号５を参照してナンバリングされている位置において少なくとも１つの変異を含む、項目１に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目３）
表２．３に提供した少なくとも１つの位置であって、配列番号１０を参照してナンバリングされている位置において少なくとも１つの変異を含む、項目２に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目４）
ヒトαガラクトシダーゼＡに由来する、項目１〜３のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目５）
配列番号１５、１３、１０、１８、４０、４２、４４、または４６のポリペプチド配列を含む、組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目６）
配列番号５のαガラクトシダーゼＡよりも熱安定性である、項目１〜５のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目７）
ｐＨ７．４において、配列番号５のαガラクトシダーゼＡよりも安定である、項目１〜６のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目８）
ｐＨ４．３において、配列番号５のαガラクトシダーゼＡよりも安定である、項目７に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目９）
配列番号５のαガラクトシダーゼＡよりも血清への曝露に対して安定である、項目７に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目１０）
脱免疫化αガラクトシダーゼＡである、項目１〜９のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目１１）
表７．１に提供した脱免疫化αガラクトシダーゼＡである、項目１〜１０のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目１２）
精製されている、項目１〜１１のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目１３）
参照配列と比較して、ｉ）増強した触媒活性；ｉｉ）ｐＨ７．４に対する増加した耐性；ｉｉｉ）ｐＨ４．３に対する増加した耐性；ｉｖ）血清に対する増加した耐性；またはｖ）減少した免疫原性；またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、もしくはｖ）のいずれかの組み合わせから選択される少なくとも１つの改良された特性を示す、項目１〜１２のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目１４）
前記参照配列が配列番号５または配列番号１０である、項目１３に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
（項目１５）
項目１〜１４のいずれかに記載の少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡを含む、組成物。
（項目１６）
項目１〜１５のいずれかに記載の少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡをコードする、組換えポリヌクレオチド配列。
（項目１７）
コドン最適化されている、項目１６に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
（項目１８）
項目１６および／または１７に記載の組換えポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
（項目１９）
前記組換えポリヌクレオチド配列が調節配列に作動可能に連結されている、項目１８に記載の発現ベクター。
（項目２０）
前記調節配列がプロモーターである、項目１９に記載の発現ベクター。
（項目２１）
前記プロモーターが異種プロモーターである、項目２０に記載の発現ベクター。
（項目２２）
項目１８〜２１のいずれかに記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目２３）
真核生物である、項目２２に記載の宿主細胞。
（項目２４）
αガラクトシダーゼＡバリアントを生成する方法であって、組換えポリヌクレオチドによってコードされる前記αガラクトシダーゼＡが産生される条件下で、項目２２または２３に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
（項目２５）
前記αガラクトシダーゼＡを回収する工程をさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記αガラクトシダーゼＡを精製する工程をさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
ファブリー病を処置するための医薬組成物であって、項目１５に記載の酵素組成物を含む、医薬組成物。
（項目２８）
薬学的に許容され得るキャリアおよび／または賦形剤をさらに含む、項目２７に記載の医薬組成物。
（項目２９）
ヒトへの非経口注射または注入に適切である、項目２７および／または２８に記載の医薬組成物。
（項目３０）
被験体におけるファブリー病の症状を処置および／または予防するための方法であって、ファブリー病を有する被験体を提供する工程、および項目２７〜３９のいずれかに記載の医薬組成物を前記被験体に提供する工程を含む、方法。
（項目３１）
ファブリー病の前記症状を改善する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記被験体が、ファブリー病の症状を示す被験体が必要とする食事よりも、その脂肪含有量の制限が少ない食事を摂ることができる、項目３０および／または３１に記載の方法。
（項目３３）
前記被験体が乳児または小児である、項目３０〜３２のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
前記被験体が成人または若年成人である、項目３０〜３２のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
項目１５および２７〜２９のいずれかに記載の組成物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、２〜５日間の培養後のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける異なるＧＬＡ構築物の相対活性を示すグラフを提供する。
【００１５】
【図２】図２は、種々のｐＨにおけるインキュベーション後のＧＬＡバリアントの絶対（パネルＡ）および相対（パネルＢ）活性を示すグラフを提供する。
【００１６】
【図３】図３は、種々の温度におけるインキュベーション後のＧＬＡバリアントの絶対（パネルＡ）および相対（パネルＢ）活性を示すグラフを提供する。
【００１７】
【図４−１】図４は、漸増量の血清を含有する緩衝液によるチャレンジ後のＧＬＡバリアントの絶対（パネルＡおよびＢ）および相対（パネルＣおよびＤ）活性を示すグラフを提供する。
【図４−２】図４は、漸増量の血清を含有する緩衝液によるチャレンジ後のＧＬＡバリアントの絶対（パネルＡおよびＢ）および相対（パネルＣおよびＤ）活性を示すグラフを提供する。
【００１８】
【図５】図５は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されたＧＬＡバリアントの相対活性を示すグラフを提供する。
【００１９】
【図６】図６は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現され、活性について正規化し、種々のｐＨでインキュベートしたＧＬＡバリアントの絶対（パネルＡ）および相対（パネルＢ）活性を示すグラフを提供する。
【００２０】
【図７】図７は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現され、活性について正規化し、種々の温度でインキュベートしたＧＬＡバリアントの絶対（パネルＡ）および相対（パネルＢ）活性を示すグラフを提供する。
【００２１】
【図８】図８は、酸性（パネルＡ）または塩基性（パネルＢ）溶液中におけるインキュベーション後に残存するＧＬＡバリアント活性を示すグラフを提供する。
【００２２】
【図９】図９は、ＧＬＡバリアントの投与後のラット血清中における回復したＧＬＡ活性を示すグラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の説明
本発明は、操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドは、酸性（ｐＨ＜４．５）および塩基性（ｐＨ＞７）の両方の条件下で、改良された安定性を提供するように最適化されている。本発明はまた、治療目的のための、操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドは、種々のレベルで改良された安定性を提供するように最適化されている。本発明はまた、治療目的のための、操作されたヒトα−ガラクトシダーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。
【００２５】
適格な個体については、ファブリー病の処置のための酵素補充療法（例えば、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）アガルシダーゼベータ；Ｇｅｎｚｙｍｅ）が利用可能であり、検討される。現在使用されている酵素補充療法は、野生型ヒトＧＬＡの組換え発現形態である。静脈内投与したＧＬＡは循環し、エンドサイトーシスされて、標的器官のエンドソーム／リソソームに移動し、そこで、Ｇｂ３の蓄積を減少させることが公知である。神経因性疼痛および一過性虚血発作が低い割合で起こり続けるので、これらの薬物は、患者の症状を完全に取り除くものではない。加えて、ほとんどの標的器官によるＧＬＡの取り込みは、肝臓と比較して乏しく、血液およびリソソームのｐＨでは、この酵素は不安定である。したがって、利用可能な処置には依然として問題がある。加えて、患者は、免疫応答（投与した薬物を標的とするＩｇＧおよびＩｇＥ抗体）を起こし、重度のアレルギー（アナフィラキシー）反応、重度の注入反応に苦しみ、さらには死に至り得る。本発明は、現在利用可能な処置と比較して、ファブリー病の処置に適切なより安定な酵素であって、副作用がより少なく、転帰が改善された酵素を提供することを意図する。実際、本発明は、血流中への注射時に酵素が遭遇する血液（ｐＨ７．４）中において、増加した安定性を有する組換えＧＬＡ酵素を提供することを意図する。加えて、該酵素は、リソソーム（すなわち、治療中に酵素が活性である場所）のｐＨ（ｐＨ４．３）において、増加した安定性を有する。したがって、所望の安定特性を有する新規ＧＬＡバリアントを提供するために、多様な酵素バリアントライブラリーのハイスループットスクリーニングを用いた、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて組換え発現されたヒトＧＬＡの指向進化を使用した。加えて、減少した予測免疫原性を有する新規ＧＬＡバリアントを同定するために、バリアント酵素をスクリーニングし、それらのアミノ酸配列を決定した。増加したｐＨ安定性および減少した免疫原性を有するＧＬＡバリアントを提供することによって、本発明は、患者の処置耐性を増加させ、患者転帰の改善のために投与および製剤化の柔軟性を提供することによって、患者における使用に適切な組成物および方法を提供する。
【００２６】
略語および定義：
特に定義がない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。一般に、本明細書中で使用する命名法ならびに下記の細胞培養、分子遺伝学、微生物学、生化学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験手順は、当該分野で周知であり一般に用いられるものである。かかる技術は周知であり、当業者に周知の多数のテキストおよび参考文献に記載されている。標準的な技術またはその改変は、化学合成および化学分析に使用される。本明細書（上記および下記の両方）中で言及する全ての特許、特許出願、論文および刊行物は、本明細書中で参照によって明確に組み込まれる。
【００２７】
本明細書中に記載のものと類似または同等の任意の適切な方法および材料が本発明の実施に使用されるが、いくつかの方法および材料が本明細書中に記載される。本発明は、記載する特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないが、それは、当業者によって使用される状況に応じてこれらが変動し得るためであることを理解すべきである。したがって、以下に直接定義する用語は、全体として本出願を参照することによってより詳細に説明される。本明細書（上記および下記の両方）中で言及する全ての特許、特許出願、論文および刊行物は、本明細書中で参照によって明確に組み込まれる。
【００２８】
また、特に文脈上明確な指示がない限り、本明細書中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。
【００２９】
数値範囲は、範囲を規定する数を含む。したがって、本明細書中に開示のあらゆる数値範囲は、より狭い数値範囲が全て本明細書中に明確に記述されているかのように、かかるより広い数値範囲内に含まれるあらゆるより狭い数値範囲を包含することを意図する。本明細書中に開示のあらゆる最大（または最小）数値限定は、より小さい（またはより大きい）数値限定が本明細書中に明確に記述されているかのように、あらゆるかかるより小さい（またはより大きい）数値限定を含むことも意図する。
【００３０】
用語「約」は、特定の値に対する許容誤差を意味する。いくつかの場合では、「約」は、所定の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％、または２．０％内を意味する。いくつかの場合では、「約」は、所定の値の１、２、３または４標準偏差内を意味する。
【００３１】
さらに、本明細書中に提供した見出しは、全体として本出願を参照することによってなされ得る本発明の種々の態様または実施形態の限定ではない。したがって、以下に直接定義する用語は、全体として本出願を参照することによってより詳細に説明される。それにもかかわらず、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００３２】
特に指示がない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’方向で左から右に記述され；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向で左から右に記述される。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同義語は、その包括的な意味で使用される（すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同義語と同等）。
【００３４】
「ＥＣ」番号は、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法をいう。ＩＵＢＭＢの生化学的分類は、酵素が触媒する化学反応に基づく酵素の数値分類体系である。
【００３５】
「ＡＴＣＣ」は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎをいい、そのバイオレポジトリーコレクションには、遺伝子および株が含まれる。
【００３６】
「ＮＣＢＩ」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎおよびその中で提供されている配列データベースをいう。
【００３７】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」を、長さや翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）と無関係にアミド結合によって共有結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために本明細書中で互換的に使用する。  
【００３８】
「アミノ酸」は、本明細書中では、それらの一般的に公知の３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号のいずれかによって参照される。同様に、ヌクレオチドは、一般的に認められている１文字コードによって参照され得る。
【００３９】
用語「操作された」、「組換えの」、「天然に存在しない」、および「バリアント」は、細胞、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドに関して使用する場合、材料、すなわち、本来は天然に存在しないと考えられる様式で改変された材料の天然または未変性の形態に対応する材料、または天然または未変性の形態に同一であるが、合成材料および／または組換え技術を使用した操作によって産生または誘導された材料をいう。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、天然に見出される形態をいう。例えば、野生型のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然供給源から単離することができ、且つ人為的に意図的に改変されていない生物中に存在する配列である。
【００４１】
「脱免疫化された」は、本明細書中で使用する場合、野生型または参照タンパク質ほど免疫原性でないと予測されるバリアントを作るためのタンパク質配列の操作をいう。いくつかの実施形態では、バリアントタンパク質が投与される患者において、バリアントタンパク質が免疫応答を刺激しないと予測される点で、予測脱免疫化は完全なものである。この応答は、限定されないが、抗薬物抗体の存在もしくは存在量、中和抗体の存在もしくは存在量、アナフィラキシー応答の存在、主要組織適合複合体−ＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）タンパク質上のペプチド提示、またはタンパク質の投与時のサイトカイン放出の蔓延もしくは強度を含む種々の方法によって測定され得る。いくつかの実施形態では、バリアントタンパク質は、野生型または参照タンパク質よりも低免疫原性である。いくつかの実施形態では、脱免疫化は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）受容体によって認識されるタンパク質の部分配列（例えば、エピトープ）に対する改変を伴う。いくつかの実施形態では、かかる部分配列がＨＬＡ受容体によってもはや認識されない脱免疫化バリアントタンパク質を生成するために、これらのエピトープは、それらのアミノ酸配列を変化させることによって除去される。いくつかの他の実施形態では、これらのエピトープは、ＨＬＡ受容体に対する結合親和性を保持するが、提示されない。いくつかの実施形態では、脱免疫化タンパク質は、ヒト免疫応答の生化学的および細胞生物学的予測因子（樹状細胞Ｔ細胞活性化アッセイまたは（ＨＬＡ）ペプチド結合アッセイを含む）において、より低レベルの応答を示す。いくつかの実施形態では、エピトープがＴ細胞受容体によってもはや認識されない脱免疫化バリアントタンパク質を生成するために、これらのエピトープは、それらのアミノ酸配列を変化させることによって除去される。また他の実施形態では、脱免疫化タンパク質は、その対応するＴ細胞のアネルギーを誘導し、Ｔ制御性細胞を活性化し、または認識Ｂ細胞のクローン除去をもたらす。
【００４２】
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の一部をいう。
【００４３】
用語「パーセント（％）配列同一率」を、ポリヌクレオチド間およびポリペプチド間の比較をいうために本明細書中で使用し、比較ウィンドウにわたる２つの最適にアラインメントした配列の比較によって決定し、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列部分またはポリペプチド配列部分は、２配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較した場合に付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一率を得ることによって百分率を計算することができる。あるいは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に生じるか、核酸塩基またはアミノ酸残基をギャップを用いてアラインメントした位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一率を得ることによって百分率を計算することができる。当業者は、２つの配列をアラインメントするために利用可能な確立されたアルゴリズムが多数存在すると認識する。比較のための配列の最適アラインメントを、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３［１９７０］）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｅａｒｓｏｎ
ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９８８］）の類似性検索法、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実行（例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または当技術分野において公知の通りの目視検査によって行うことができる。配列同一率および配列類似率の決定に適切なアルゴリズムの例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０［１９９０］およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３８９−３４０２［１９７７］を参照のこと）による記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターウェブサイトから公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードとアラインメントした場合にいくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか満たすクエリー配列中の長さＷのショートワードの同定による高スコア配列対（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）の第１の同定を含む。Ｔを、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）という（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出を参照のこと）。これらの最初の隣接ワードヒットは、これらのワードヒットを含むより長いＨＳＰを見出すための検索開始のためのシードとして働く。次いで、ワードヒットを、累積アラインメントスコアを増加させることができるかぎり、各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアを、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（一致する残基対のための報酬スコア；常に０超）およびＮ（ミスマッチ残基のためのペナルティスコア；常に０未満）を使用して計算する。アミノ酸配列について、スコア行列を使用して、累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたはそれを超える負スコアの残基アラインメントの蓄積によって累積スコアが０またはそれ未満に進行した場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワードレングス（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワードレングス（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５［１９８９］を参照のこと）を使用する。例示的な配列アラインメントおよび配列同一率の決定には、提供されたデフォルトパラメーターを使用したＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉ��ｏｎ  ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴプログラムまたはＧＡＰプログラムを使用することができる。
【００４４】
「参照配列」は、配列比較の基本として使用される定義された配列をいう。参照配列は、より大きな配列のサブセット（例えば、全長の遺伝子配列またはポリペプチド配列のセグメント）であり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長またはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、少なくとも１００残基長、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それぞれ、（１）２配列間で類似する配列（すなわち、完全配列の一部）を含むことができ、（２）２配列間で異なる配列をさらに含むことができるので、２つ（またはそれを超える）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較を、典型的には、配列が類似する局所領域を同定および比較するための「比較ウィンドウ」にわたる２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の比較によって行う。いくつかの実施形態では、「参照配列」は一次アミノ酸配列に基づくことができ、ここで、参照配列は一次配列中に１つまたはそれを超える変化を有し得る配列である。「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の連続するヌクレオチドの位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントをいい、ここで、ある配列を少なくとも２０個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウ中の配列の一部が２配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加や欠失を含まない）と比較した場合に２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウは、２０個の連続残基よりも長いことが可能であり、任意選択的に、３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウィンドウが含まれる。
【００４５】
「〜に相当する」、「〜に関する」、または「〜に関連する」は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の付番の文脈で使用する場合、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合に指定した参照配列の残基の付番をいう。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基の位置を、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の番号の位置によるよりもむしろ参照配列に関して命名する。例えば、所与のアミノ酸配列（操作されたＧＬＡのアミノ酸配列など）を、２配列間の残基マッチを最適にするためのギャップの導入によって参照配列とアラインメントすることができる。これらの場合、ギャップが存在するにもかかわらず、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列中の残基を、アラインメントした参照配列に関して付番する。
【００４６】
「アミノ酸の相違」または「残基の相違」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基と比較したポリペプチド配列の位置のアミノ酸残基の相違をいう。アミノ酸の相違の位置を、一般に、本明細書中で「Ｘｎ」といい、ここで、ｎは残基の相違に基づいた参照配列中の対応する位置をいう。例えば、「配列番号２と比較した場合のＸ９３位の残基の相違」は、配列番号２の９３位に対応するポリペプチドの位置でのアミノ酸残基の相違をいう。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが９３位にセリンを有する場合、「配列番号２と比較した場合のＸ９３位の残基の相違」は、配列番号２の９３位に対応するポリペプチドの位置でのセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換をいう。本明細書中のほとんどの例では、ある位置での特異的なアミノ酸残基の相違を「ＸｎＹ」として示し、ここで、「Ｘｎ」は上記の対応する位置を指定し、「Ｙ」は操作されたポリペプチド中に見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中の残基と異なる残基）の一文字識別子である。いくつかの場合（例えば、表２．１、２．２、２．３、２．４、２．５および６．１中）、本開示はまた、従来の表示法「ＡｎＢ」で示す特異的なアミノ酸の相違を提供し、ここで、Ａは参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は参照配列中の残基の位置の番号であり、Ｂは操作されたポリペプチド配列中の残基置換の一文字識別子である。いくつかの例では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比較した１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の相違を含むことができ、この相違は、参照配列と比較した場合に残基の相違が存在する特定の位置のリストによって示される。１つを超えるアミノ酸が、ポリペプチドの特定の残基の位置で使用され得るいくつかの実施形態では、使用され得る種々のアミノ酸残基は、「／」によって区切られる（例えば、Ｘ３０７Ｈ／Ｘ３０７ＰまたはＸ３０７Ｈ／Ｐ）。いくつかの実施形態では、酵素バリアントは、１つを超える置換を含む。これらの置換は、読みやすさのために、スラッシュによって区切られる（例えば、Ｃ１４３Ａ／Ｋ２０６Ａ）。本出願は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換のいずれか／または両方を含む１つまたはそれを超えるアミノ酸の相違を含む操作されたポリペプチド配列を含む。
【００４７】
「保存的アミノ酸置換」は、ある残基の類似の側鎖を有する異なる残基との置換をいい、したがって、典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸の同一または類似と定義されたアミノ酸クラス内のアミノ酸との置換を含む。制限されない例として、それぞれ、脂肪族側鎖を有するあるアミノ酸を、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）と置換することができ；ヒドロキシル側鎖を有するあるアミノ酸を、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）と置換し；芳香族側鎖を有するあるアミノ酸を、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）と置換し；塩基性側鎖を有するあるアミノ酸を、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）と置換し；酸性側鎖を有するあるアミノ酸を、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）と置換し；かつ／またはある疎水性または親水性のアミノ酸を、別の疎水性または親水性のアミノ酸と置換する。
【００４８】
「非保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸の有意に性質が異なる側鎖を有するアミノ酸との置換をいう。非保存的置換は、定義した群内よりもむしろ群間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換領域中のペプチド骨格の構造（例えば、グリシンのプロリンへの置換）、（ｂ）電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さに影響を及ぼす。制限されない例として、例示的な非保存的置換は、塩基性アミノ酸または脂肪族アミノ酸に置換された酸性アミノ酸；小アミノ酸に置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸に置換された親水性アミノ酸であり得る。
【００４９】
「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つまたはそれを超えるアミノ酸の除去によるポリペプチドの改変をいう。欠失は、操作された酵素の酵素活性を保持し、そして／またはその改良された性質を保持しながら、参照酵素を構成する１またはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、または２０またはそれを超えるアミノ酸、全アミノ酸数の１０％まで、または全アミノ酸数の２０％までを除去することができる。欠失は、ポリペプチドの内部および／または末端部が対象であり得る。種々の実施形態では、欠失は、連続的なセグメントを含むことができるか、不連続であり得る。
【００５０】
「挿入」は、参照ポリペプチドに対する１つまたはそれを超えるアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変をいう。ポリペプチドの内部またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に挿入することができる。本明細書中で使用される挿入には、当該分野で公知の融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続セグメントであり得るか、天然に存在するポリペプチド中で１つまたはそれを超えるアミノ酸によって分離され得る。
【００５１】
本明細書中で互換的に使用する「機能的フラグメント」または「生物学的に活性なフラグメント」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失および／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、それが比較される配列（例えば、本発明の操作された全長ＧＬＡ）中の対応する位置と同一であるポリペプチドであって、全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持するポリペプチドをいう。
【００５２】
「単離されたポリペプチド」は、ポリペプチドに天然に付随している他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドをいう。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されているポリペプチドを含む。組み換えＧＬＡポリペプチドは、細胞内に存在することができるか、細胞培地中に存在することができるか、種々の形態（溶解物または単離された調製物など）で調製することができる。そのようなものとして、いくつかの実施形態では、組み換えＧＬＡポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
【００５３】
「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が主に存在する種である（すなわち、モルベースまたは重量ベースで、組成物中の任意の他の個別の高分子種よりも豊富に存在する）組成物をいい、一般に、モルまたは重量％で存在する高分子種の少なくとも約５０％を対象種が占める場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なＧＬＡ組成物は、モルまたは重量％で組成物に存在する全高分子種の約６０％またはそれを超えて、約７０％またはそれを超えて、約８０％またはそれを超えて、約９０％またはそれを超えて、約９５％またはそれを超えて、および約９８％またはそれを超えて含まれる。いくつかの実施形態では、対象種を、本質的に均一（すなわち、従来の検出方法によって組成物中の夾雑種を検出できない）まで精製し、ここで、組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。溶媒種、小分子（５００ダルトン未満）、および元素イオン種は、高分子種と見なさない。いくつかの実施形態では、単離された組み換えＧＬＡポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００５４】
「改良された酵素特性」は、参照ＧＬＡポリペプチドおよび／または野生型ＧＬＡポリペプチドもしくは別の操作されたＧＬＡポリペプチドと比較して、任意の酵素特性の改良を示す操作されたＧＬＡポリペプチドをいう。改良された特性には、増加したタンパク質発現、増加した熱活性（ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｖｉｔｙ）、増加した熱安定性、増加したｐＨ活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性または親和性、増加した比活性、基質または最終生成物阻害に対する増加した抵抗性、増加した化学安定性、改良された化学選択性、改良された溶媒安定性、酸性または塩基性ｐＨに対する増加した耐性、タンパク質分解活性に対する増加した耐性（すなわち、タンパク質分解に対する減少した感受性）、減少した凝集、増加した溶解度、減少した免疫原性、改良された翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）、および変化した温度プロファイルなどの特性が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
「酵素活性の増加」または「触媒活性の向上」は、操作されたＧＬＡポリペプチドの性質の改良をいい、この酵素活性の増加を、参照ＧＬＡ酵素と比較した場合の比活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質重量）の増加または基質の生成物への変換率（例えば、特定の量のＧＬＡを使用した特定の時間における出発量の基質の生成物への変換率）の増加によって示すことができる。例示的な酵素活性の決定方法を、実施例に示す。酵素活性に関する任意の性質（その変化によって酵素活性が増加し得るＫｍ、Ｖｍａｘ、またはｋｃａｔの古典的な酵素の性質が含まれる）が影響を受け得る。酵素活性の改良は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、ＧＬＡポリペプチドが由来する天然に存在するＧＬＡまたは別の操作されたＧＬＡよりも酵素活性が２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、またはそれを超えるまでであり得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、少なくとも０．１／秒、少なくとも０．５／秒、少なくとも１．０／秒、少なくとも５．０／秒、少なくとも１０．０／秒の、およびいくつかの好ましい実施形態では１０．０／秒を超えるｋｃａｔを有する。いくつかの実施形態では、Ｋｍは、約１μＭ〜約５ｍＭの範囲内；約５μＭ〜約２ｍＭの範囲内；約１０μＭ〜約２ｍＭの範囲内；または約１０μＭ〜約１ｍＭの範囲内である。いくつかの特定の実施形態では、操作されたＧＬＡ酵素は、特定の条件への曝露後に、参照ＧＬＡ酵素（例えば、野生型ＧＬＡまたは任意の他の参照ＧＬＡ）のものよりも１．５〜１０倍、１．５〜２５倍、１．５〜５０倍、１．５〜１００倍の範囲内またはそれを超える改良された酵素活性を示す。ＧＬＡ活性は、当該分野で公知の任意の適切な方法（例えば、反応物質または生成物の分光光度特性の変化のモニタリングなどの標準的なアッセイ）によって測定され得る。いくつかの実施形態では、生成される生成物の量は、ＵＶ吸光度または直接的な蛍光検出またはその後のｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）誘導体化と組み合わせた高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分離によって測定され得る。本明細書中にさらに詳述するように、酵素活性を、定義された酵素の調製、設定された条件下での定義されたアッセイ、および１つまたはそれを超える定義された基質を使用して比較する。一般に、溶解物を比較する場合、宿主細胞による酵素の生成量および溶解物中の酵素の存在量の変動を最小にするために同一の発現系および同一の宿主細胞も使用して細胞数およびタンパク質のアッセイ量を決定する。  
【００５７】
用語「酸性ｐＨに対する改良された耐性」は、本発明の組換えＧＬＡが、参照ＧＬＡまたは別の酵素と比較して増加した安定性を有する（酸性ｐＨへの曝露後に、約ｐＨ４．８において、より高い活性が特定の期間（１時間、最大２４時間）保持される）ことを意味する。
【００５８】
「生理学的ｐＨ」は、本明細書中で使用する場合、被験体（例えば、ヒト）の血液中に一般に見出されるｐＨ範囲を意味する。
【００５９】
（例えば、塩基性ｐＨ条件に対する改良された安定性、または塩基性ｐＨに対する増加した耐性に関して使用する）用語「塩基性ｐＨ」は、約７〜１１のｐＨ範囲を意味する。
【００６０】
（例えば、酸性ｐＨ条件に対する改良された安定性、または酸性ｐＨに対する増加した耐性に関して使用する）用語「酸性ｐＨ」は、約１．５〜４．５のｐＨ範囲を意味する。
【００６１】
「変換」は、基質の対応する生成物への酵素変化（または生物学的転換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ））をいう。「変換率」は、特定の条件下での時間内の生成物に変換した基質の百分率をいう。したがって、ＧＬＡポリペプチドの「酵素活性」または「活性」を、特定の期間における基質の生成物への「変換率」として示すことができる。
【００６２】
「ハイブリッド形成ストリンジェンシー」は、核酸のハイブリッド形成における洗浄条件などのハイブリッド形成条件をいう。一般に、ハイブリッド形成反応を、低い方のストリンジェンシーの条件下で実施後、多様であるが高い方のストリンジェンシーで洗浄する。用語「中程度のストリンジェントなハイブリッド形成」は、標的−ＤＮＡが標的ＤＮＡに対して約６０％同一、好ましくは約７５％同一、約８５％同一、標的−ポリヌクレオチドに対して約９０％を超える同一性で相補核酸に結合可能な条件をいう。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、４２℃での５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでのハイブリッド形成後、４２℃での０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでの洗浄に等価な条件である。「高ストリンジェンシーハイブリッド形成」は、一般に、定義されたポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で決定した熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満低い温度の条件をいう。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．０１８Ｍ  ＮａＣｌにて安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみがハイブリッド形成することが可能な条件をいう（すなわち、ハイブリッドが６５℃の０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中で安定ではない場合、本明細書中で意図するように、高ストリンジェンシー条件下で安定でないであろう）。高ストリンジェンシー条件を、例えば、４２℃の５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ後、６５℃で０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳでの洗浄に等価な条件でのハイブリッド形成によって提供することができる。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃の０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含む５×ＳＳＣでのハイブリッド形成および６５℃の０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣの洗浄に等価な条件でのハイブリッド形成である。他の高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件および中程度にストリンジェントな条件は、上記で引用した文献に記載されている。
【００６３】
「コドン最適化」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、コードされたタンパク質が目的の生物中でより効率的に発現されるように特定の生物中で優先的に使用されるコドンへの変化をいう。ほとんどのアミノ酸がいくつかのコドンによって示されるという点で遺伝暗号が縮重している（「同義語」または「同義」コドンと呼ばれる）にもかかわらず、特定の生物によるコドン使用頻度が非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または起源となる祖先の遺伝子、低コピー数タンパク質に対する高発現タンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関して高い可能性がある。いくつかの実施形態では、ＧＬＡ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化することができる。
【００６４】
「調節配列」は、本明細書中で、本出願のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要であるか有利な全ての成分を含むことをいう。各調節配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して未変性または外来であり得る。かかる調節配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。最小限でも、調節配列は、プロモーター、転写停止シグナル、および翻訳停止シグナルを含む。調節配列に、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域内の調節配列のライゲーションを容易にする特異的な制限部位を導入するためのリンカーを提供することができる。
【００６５】
「作動可能に連結された」は、本明細書中で、調節配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または制御するように目的のポリヌクレオチドに関連する位置に調節配列が適切に（すなわち、機能的関係において）配置された構成と定義する。
【００６６】
「プロモーター配列」は、目的のポリヌクレオチド（コード配列など）の発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列をいう。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、最適な宿主細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であってよく（変異プロモーター、短縮プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが含まれる）、宿主細胞と同種または異種のいずれかの細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【００６７】
「適切な反応条件」は、本出願のＧＬＡポリペプチドが基質を所望の生成物化合物に変換することができる酵素的変換反応溶液中の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒の範囲など）をいう。例示的な「適切な反応条件」を、本出願中に示し、実施例で例示する。「化合物負荷」、または「酵素負荷」などにおける「負荷」は、反応開始時の反応混合物中の成分の濃度または量をいう。酵素的変換反応プロセスの文脈における「基質」は、ＧＬＡポリペプチドが作用する化合物または分子をいう。酵素的変換プロセスの文脈中の「生成物」は、ＧＬＡポリペプチドの基質に対する作用に起因する化合物または分子をいう。
【００６８】
本明細書中で使用する場合、用語「培養する」は、（例えば、液体、ゲルまたは固体培地を使用した）任意の適切な条件下で、微生物細胞の集団を成長させることをいう。
【００６９】
組換えポリペプチドは、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して生成され得る。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、プラスミドなどのベクターにクローニングされ、大腸菌、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの所望の宿主において発現され得る。組換えポリペプチドのバリアントは、当該分野で公知の種々の方法によって生成され得る。実際、当業者に周知の多種多様な異なる変異誘発技術がある。加えて、変異誘発キットはまた、多くの商業的分子生物学供給業者から入手可能である。規定のアミノ酸における特異的置換（部位特異的）、遺伝子の局所領域における特異的もしくはランダム変異（領域特異的）、または遺伝子全体にわたるランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行うための方法が利用可能である。酵素バリアントを生成するための多数の適切な方法が当業者に公知であり、ＰＣＲを使用した一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、および化学飽和変異誘発、または当該分野で公知の任意の他の適切な方法が含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡおよびタンパク質工学に使用される方法の非限定的な例は、以下の特許：米国特許第６，１１７，６７９号；同第６，４２０，１７５号；同第６，３７６，２４６号；同第６，５８６，１８２号；同第７，７４７，３９１号；同第７，７４７，３９３号；同第７，７８３，４２８号；および同第８，３８３，３４６号に提供されている。バリアントが生成された後、それらは、任意の所望の特性（例えば、高いもしくは増加した活性、または低いもしくは減少した活性、増加した熱活性、増加した熱安定性、および／または酸性ｐＨ安定性など）についてスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態では、「組換えＧＬＡポリペプチド」（本明細書中では「操作されたＧＬＡポリペプチド」、「バリアントＧＬＡ酵素」および「ＧＬＡバリアント」とも称される）が使用される。
【００７０】
本明細書中で使用する場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列中のコードされるポリペプチドの適切な宿主における発現を行うことができる適切な調節配列に作動可能に連結されている発現ベクターである。いくつかの実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するためのＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されているプロモーター配列を有し、いくつかの実施形態では、転写終結配列も含む。
【００７１】
本明細書中で使用する場合、用語「発現」は、ポリペプチドの産生に関与する任意の工程（転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾が含まれるが、これらに限定されない）を含む。いくつかの実施形態では、この用語はまた、細胞からのポリペプチドの分泌を包含する。
【００７２】
本明細書中で使用する場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生をいう。この用語は、ポリペプチドの産生に関与する任意の工程（転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾が含まれるが、これらに限定されない）を包含することを意図する。いくつかの実施形態では、この用語はまた、細胞からのポリペプチドの分泌を包含する。
【００７３】
本明細書中で使用する場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、終結配列など）は、２つの配列が天然では結合されていない場合、それが作動可能に連結されている別の配列に対して「異種」である。
【００７４】
本明細書中で使用する場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書中に提供したＤＮＡ（例えば、ＧＬＡバリアントをコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターのための適切な宿主をいう。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターで形質転換またはトランスフェクトされた原核細胞または真核細胞である。
【００７５】
用語「類似体」は、参照ポリペプチドと７０％超１００％未満の配列同一性（例えば、７５％超、７８％超、８０％超、８３％超、８５％超、８８％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超の配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、類似体は、１つまたはそれを超える天然に存在しないアミノ酸残基（ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンが含まれるが、これに限定されない）および天然に存在するアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、類似体はまた、１つまたはそれを超えるＤ−アミノ酸残基と、２つまたはそれを超えるアミノ酸残基間の非ペプチド結合とを含む。
【００７６】
用語「治療薬」は、病状の徴候または症状を示す被験体に投与される化合物であって、有益なまたは望ましい医学的効果を有する化合物をいう。
【００７７】
用語「医薬組成物」は、哺乳動物被験体（例えば、ヒト）における医薬用途に適切な組成物であって、薬学的に有効な量の本発明によって包含される操作されたＧＬＡポリペプチドと、許容され得るキャリアとを含む組成物をいう。
【００７８】
用語「有効量」は、所望の結果をもたらすために十分な量を意味する。当業者は、日常的な実験を使用することによって、有効量を決定し得る。
【００７９】
用語「単離された」および「精製された」は、それが天然に結合している少なくとも１つの他の成分から取り出された分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど）または他の成分をいうために使用される。用語「精製された」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろそれは、相対的な定義として意図される。
【００８０】
用語「被験体」は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、コンパニオンアニマル、および実験動物（例えば、齧歯類およびウサギ類）などの哺乳動物を包含する。この用語は、雌および雄を包含することを意図する。
【００８１】
本明細書中で使用する場合、用語「患者」は、疾患について評価されているか、疾患について処置されているか、または疾患を経験している任意の被験体を意味する。
【００８２】
用語「乳児」は、生後１カ月〜約１歳の期間の小児をいう。本明細書中で使用する場合、用語「新生児」は、出生〜生後２８日の期間の小児をいう。用語「未熟児」は、妊娠満２０週後だが正常な妊娠期間完了前に生まれた乳児であって、一般に、体重が出生時に約５００〜約２４９９グラムの乳児をいう。「極低出生体重児」は、体重が出生時に１５００ｇ未満の乳児である。
【００８３】
本明細書中で使用する場合、用語「小児」は、処置または研究手順の同意に関する法定年齢に達していない者をいう。いくつかの実施形態では、この用語は、出生時〜青年期の者をいう。
【００８４】
本明細書中で使用する場合、用語「成人」は、関連権限に関する法定年齢（例えば、米国では１８歳）に達した者をいう。いくつかの実施形態では、この用語は、完全に成長して成熟した任意の生物をいう。いくつかの実施形態では、用語「若年成人」は、１８歳未満だが性的成熟に達した者をいう。
【００８５】
本明細書中で使用する場合、「組成物」および「製剤」は、少なくとも１つの本発明の操作されたＧＬＡを含む製品であって、任意の適切な使用を目的とする製品（例えば、医薬組成物、食事／栄養サプリメント、飼料など）を包含する。
【００８６】
組成物の「投与」および組成物を「投与する」という用語は、本発明の組成物を被験体（例えば、ファブリー病の影響に苦しんでいる者）に提供することを意味する。
【００８７】
用語「キャリア」は、医薬組成物に関して使用する場合、標準的な医薬キャリア、緩衝液、および賦形剤（例えば安定剤、保存剤、およびアジュバント）のいずれかを意味する。
【００８８】
用語「薬学的に許容され得る」は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさず、およびそれが含まれる成分のいずれかと有害な様式で相互作用せずに、被験体に投与され得る材料であって、所望の生物学的活性を有する材料を意味する。
【００８９】
本明細書中で使用する場合、用語「賦形剤」は、活性医薬成分（ＡＰＩ；例えば、本発明の操作されたＧＬＡポリペプチド）以外の任意の薬学的に許容され得る添加剤、キャリア、希釈剤、アジュバント、または他の成分をいう。賦形剤は、典型的には、製剤化および／または投与目的で含められる。
【００９０】
用語「治療有効量」は、疾患／状態の症状に関して使用する場合、疾患／状態の１つもしくはそれを超える症状を改善、軽減もしくは排除し、または症状の発症を予防もしくは遅延する化合物（例えば、操作されたＧＬＡポリペプチド）の量および／または濃度をいう。
【００９１】
用語「治療有効量」は、疾患／状態に関して使用する場合、疾患／状態を改善、軽減または排除する組成物（例えば、操作されたＧＬＡポリペプチド）の量および／または濃度をいう。いくつかの実施形態では、この用語は、研究者、医師、獣医、または他の臨床医が求める組織、系または動物被験体による生物学的（例えば医学的）応答を誘発する組成物の量に関して使用される。
【００９２】
用語「処置すること」、「処置する」および「処置」は、予防的（例えば、保護的）および緩和的処置を包含することを意図する。
【００９３】
操作されたＧＬＡの発現および活性：
酵母コドン最適化成熟ヒトＧＬＡの分泌を促すために、酵母ＭＦαシグナルペプチド（ＭＦ−ＳＰ）または８３アミノ酸のより長いリーダー配列（ＭＦリーダー）を使用して、分泌ＧＬＡ発現のための２つの戦略を利用した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＩＮＶＳｃ１においてｐＹＴ−７２ベクターからクローンを発現させた。両アプローチは、蛍光原基質４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−ガラクトピラノシド（４−ＭｕＧａｌ）に対して測定可能な活性を有する上清を提供した。しかしながら、酵母ＭＦαシグナルペプチドを有する構築物は、３倍高い活性を提供し、指向進化の開始配列として使用した。
【００９４】
変異の多様性を同定するために、１３位保存「ホモログ」コンビナトリアルライブラリーおよび１９２位部位飽和変異誘発ライブラリーを構築した。非チャレンジ条件（インキュベーションなし、ｐＨ４．８）で、または低ｐＨ（３．９〜４．２）もしくは高ｐＨ（７．１〜８．２）環境における１時間のインキュベーション後に、等容量の上清をスクリーニングした。ＧＬＡ発現またはＧＬＡ比活性の増加による増加した活性を有するＧＬＡバリアントを、親ＧＬＡに対するそれらの改良の倍数に基づいて同定した。チャレンジ条件下で観察された改良の倍数を、非チャレンジ条件下で観察された改良の倍数で割ることによって、増加した安定性を有するＧＬＡバリアントを同定した。このアプローチは、極端なｐＨにおける比活性の変化を伴わない発現の増加に基づいてバリアントを選択することに対するバイアスを減少させる。複合活性スコア（全３条件の改良の倍数の結果（ｐｒｏｄｕｃｔ））および安定性（安定性スコアの結果）を使用して、後のＧＬＡライブラリーに含めるための改良されたバリアントの変異をランク付けした。
【００９５】
操作されたＧＬＡ：
いくつかの実施形態では、改善された特性を示す操作されたＧＬＡは、配列番号５との少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％のアミノ酸配列同一性、および１つまたはそれより多くのアミノ酸位置に配列番号５と比較した場合のアミノ酸残基の差異（例えば、配列番号５と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０またはそれより多くのアミノ酸位置において、または配列番号５と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列）を有する。いくつかの実施形態では、１つまたはそれより多くのアミノ酸位置における配列番号５と比較した場合の残基の差異は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くの保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、表２．１、２．２、２．４、２．５または表７．１に列挙されるポリペプチドである。
【００９６】
いくつかの実施形態では、改善された特性を示す操作されたＧＬＡは、配列番号１０との少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％のアミノ酸配列同一性、および１つまたはそれより多くのアミノ酸位置に配列番号１０と比較した場合のアミノ酸残基の差異（例えば、配列番号１０と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０またはそれより多くのアミノ酸位置において、または配列番号１０と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列）を有する。いくつかの実施形態では、１つまたはそれより多くのアミノ酸位置における配列番号１０と比較した場合の残基の差異は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くの保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、表２．３に列挙されるポリペプチドである。
【００９７】
いくつかの実施形態では、改善された特性を示す操作されたＧＬＡは、配列番号５との少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、改善された特性を示す操作されたＧＬＡは、配列番号１０との少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、配列番号１５、１３、１０および１８から選択される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、本発明に包含される操作されたＧＬＡポリペプチドの機能的フラグメントを含む。機能的フラグメントは、それが由来する操作されたＧＬＡポリペプチド（すなわち、親の操作されたＧＬＡ）の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の活性を有する。機能的フラグメントは、操作されたＧＬＡの親配列の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％およびさらには９９％を含む。いくつかの実施形態では、機能的フラグメントは、５未満、１０未満、１５未満、１０未満、２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、４５未満および５０未満のアミノ酸だけ短縮されている。
【０１００】
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞；
本発明は、本明細書中に記載の操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を調節する１つまたはそれを超える異種制御配列に作動可能に連結してポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製する。操作されたＧＬＡポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するＧＬＡポリペプチドを発現させることができる。
【０１０１】
当業者に明らかなように、種々のアミノ酸に対するタンパク質配列の利用可能性および対応するコドンの知識により、対象ポリペプチドをコードすることができる全てのポリヌクレオチドが説明される。同一のアミノ酸が代替コドンまたは同義コドンによってコードされる遺伝暗号の縮重により、非常に多数の核酸を作製することが可能であり、その核酸の全てが操作されたＧＬＡポリペプチドをコードする。したがって、特定のアミノ酸配列の知識を有することにより、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変えない方法で１つまたはそれを超えるコドンの配列を改変するだけでいくつもの異なる核酸を作製することができる。これに関して、本発明は、可能なコドンの選択に基づいた組み合わせの選択による本明細書中に記載のポリペプチドをコードする作製可能なポリヌクレオチドのそれぞれおよびあらゆる可能なバリエーションを具体的に意図し、全てのかかるバリエーションは、本明細書中に記載の任意のポリペプチド（表２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、および６．１に提供したバリアントが含まれる）について具体的に開示されるとみなされるものとする。
【０１０２】
種々の実施形態では、タンパク質が生成される宿主細胞に適合するようにコドンを選択することが好ましい。例えば、細菌で使用される好ましいコドンは、細菌における発現のために使用される。その結果、操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を超えるコドン位置において好ましいコドンを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、上記のように、ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示の特性を有するＧＬＡ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、配列番号５、および／もしくは１０から選択される参照配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列、または表２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、もしくは６．１に開示の任意のバリアントのアミノ酸配列、ならびに配列番号５、および／もしくは１０の参照ポリペプチドと比較した場合に１つもしくはそれを超える残基の相違、または表２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、もしくは６．１に開示の任意のバリアントのアミノ酸配列（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを超えるアミノ酸残基の位置）を含む。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号５および／または１０から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示の特性を有するＧＬＡ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、配列番号５のポリペプチドと最適にアラインメントした場合に、配列番号５の参照配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性と、表２．１、２．２、２．４、２．５、または６．１に提供したものから選択される残基の位置において、配列番号５と比較した場合に１つまたはそれを超える残基の相違とを有するアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示の特性を有するＧＬＡ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、配列番号１０のポリペプチドと最適にアラインメントした場合に、配列番号１０の参照配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性と、表２．３に提供したものから選択される残基の位置において、配列番号１０と比較した場合に１つまたはそれを超える残基の相違とを有するアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０、１３、１５、１８、２１、および２４をコードするポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８、９、１１、１２、１４、１６、１７、１９、２０、２２、および／または２３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド残基同一性を有する。いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８、９、１１、１２、１４、１６、１７、１９、２０、２２、および２３から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェントな条件下で、配列番号８、９、１１、１２、１４、１６、１７、１９、２０、２２、および２３から選択される参照ポリヌクレオチド配列もしくはその相補物、または本明細書中に提供したバリアントＧＬＡポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、表２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、および／または６．１に示されている任意の位置から選択される残基の位置において、配列番号５および／または１０と比較した場合に１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含むＧＬＡポリペプチドをコードする。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本明細書中に提供した操作されたＧＬＡポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現させる種々の方法で操作する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を制御するための１つまたはそれを超える調節配列が存在する発現ベクターとして提供する。発現ベクターに応じて単離されたポリヌクレオチドをベクターへの挿入前に操作することが望ましいか必要かもしれない。組換えＤＮＡ法を利用したポリヌクレオチドおよび核酸配列の改変技術は、当該分野で周知である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、調節配列には、とりわけ、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれる。当該分野で公知のように、適切なプロモーターは、使用される宿主細胞に基づいて選択され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターには、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、ＷＯ９６／００７８７号を参照のこと）の遺伝子から得たプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、その変異プロモーター、短縮プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが含まれる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら、Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８［１９９２］を参照のこと）。哺乳動物細胞における使用のための例示的なプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアン空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）由来のもの、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）、ベータアクチン、伸長因子１Ａもしくはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ由来のもの、またはＧａｌｌｕｓ
ｇａｌｌｕｓのβ−アクチン由来のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、調節配列はまた、適切な転写終結配列（転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列）である。終結配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞で機能する任意のターミネーターを、本発明で使用する。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのα−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら，前出を参照のこと）。哺乳動物細胞のための例示的なターミネーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サル空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）由来のもの、またはＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ成長ホルモン由来のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、調節配列は、適切なリーダー配列（宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞で機能する任意のリーダー配列を使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得る。酵母宿主細胞に適切なリーダーには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
調節配列はまた、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写時に転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）であり得る。最適な宿主細胞で機能する任意のポリアデニル化配列を、本発明で使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼの遺伝子に由来するものが含まれるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列もまた、当該分野で公知である（例えば、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．，１５：５９８３−５９９０［１９９５］を参照のこと）。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向づけるシグナルペプチドコード領域である。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと共に翻訳読み枠中に天然に連結したシグナルペプチドコード領域を固有に含むことができる。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード領域を含むことができる。発現されたポリペプチドを最適な宿主細胞の分泌経路に方向づける任意のシグナルペプチドコード領域を、本明細書中に提供した操作されたＧＬＡポリペプチドの発現に使用する。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ
ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得たシグナルペプチドコード領域が含まれるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子に由来するものが含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物宿主細胞のための有用なシグナルペプチドには、免疫グロブリンガンマ（ＩｇＧ）の遺伝子由来のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。得られたポリペプチドは、「プロ酵素」または「プロポリペプチド」（または、いくつかの場合、「酵素原」）と呼ばれる。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断によって活性な成熟ポリペプチドに変換され得る。
【０１１４】
別の態様では、本発明はまた、操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および導入される宿主のタイプに応じて１つまたはそれを超える発現制御領域（プロモーターおよびターミネーターなど）、複製起点などを含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、上記の種々の核酸および調節配列を共に接合して組換え発現ベクターを産生し、この組換え発現ベクターは、１つまたはそれを超える都合の良い制限部位を含み、この制限部位は、かかる部位でのバリアントＧＬＡポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換が可能である。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列を、ポリヌクレオチド配列または該ポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物の、発現に適切なベクター内への挿入によって発現する。発現ベクターの作製では、コード配列が発現に適切な調節配列と作動可能に連結されるようにコード配列をベクター中に配置する。
【０１１５】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に都合よく供することができ、且つバリアントＧＬＡポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとベクターを導入する宿主細胞との適合性に依存するであろう。ベクターは、線状プラスミドまたは閉じた環状プラスミドであり得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、その複製が染色体複製から独立している自己複製ベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクター）（例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）である。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含むことができる。いくつかの代替的な実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入された場合にゲノムに組み込まれ、既に組み込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。さらに、単一のベクターまたはプラスミドまたは宿主細胞のゲノムに導入されるべきＤＮＡの全てを共に含む２つまたはそれを超えるベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンを使用することができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、形質転換した細胞を容易に選択することができる１つまたはそれを超える選択マーカーを含むことが好ましい。「選択マーカー」は、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、および栄養素要求体に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。酵母宿主細胞に適切なマーカーには、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が含まれるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞で用いる選択マーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにその等価物が含まれるが、これらに限定されない。別の態様では、本発明は、少なくとも１つの本出願の操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、このポリヌクレオチドが宿主細胞中で操作されたＧＬＡ酵素の発現のための１つまたはそれを超える調節配列に作動可能に連結されている、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされたポリペプチドの発現で用いる宿主細胞は、当該分野で周知であり、真菌細胞、例えば酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞［例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８］）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞）、植物細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびＢＨＫ）およびヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ヒト線維芽細胞、ＴＨＰ−１、ＪｕｒｋａｔおよびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞株）である。
【０１１８】
したがって、別の態様では、本発明は、操作されたＧＬＡポリペプチドを生成するための方法であって、ポリペプチドの発現に適切な条件下で、操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、本明細書中に記載のＧＬＡポリペプチドを単離および／または精製する工程をさらに含む。
【０１１９】
上記宿主細胞の適切な培養培地および成長条件は当該分野で周知である。ＧＬＡポリペプチド発現のためのポリヌクレオチドを、当該分野で公知の種々の方法によって細胞に導入することができる。技術には、とりわけ、エレクトロポレーション、遺伝子銃粒子衝突、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が含まれる。
【０１２０】
本明細書中に開示の特性を有する操作されたＧＬＡは、天然に存在するまたは操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当該分野で公知のおよび本明細書中に記載の変異誘発法および／または指向進化法に供することによって得ることができる。例示的な指向進化技術は、変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号を参照のこと）。使用され得る他の指向進化手順には、とりわけ、スタッガードエクステンションプロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、インビトロ組換え（例えば、Ｚｈａｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：２５８−２６１［１９９８］を参照のこと）、変異誘発ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，３：Ｓ１３６−Ｓ１４０［１９９４］を参照のこと）、およびカセット変異誘発（例えば、Ｂｌａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：３５２５−３５２９［１９９６］を参照のこと）が含まれる。
【０１２１】
例えば、変異誘発法および指向進化法を、発現、スクリーニング、およびアッセイが可能なバリアントライブラリーを生成するために、ポリヌクレオチドに容易に適用することができる。変異誘発法および指向進化法は当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，７１６，６３１号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２８８，３７５号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、および同第７，９５７，９１２号、同第８，３８３，３４６号、同第８，５０４，４９８号、同第８，８４９，５７５号、同第８，８７６，０６６号、同第８，７６８，８７１号ならびに全ての関連する非米国対応物；Ｌｉｎｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４（２）：１５７−７８［１９９７］；Ｄａｌｅら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５７：３６９−７４［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：４２３−４６２［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１１９３−１２０１［１９８５］；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３７：１−７［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ，３８：８７９−８８７［１９８４］；Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，３４：３１５−３２３［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３：２８４−２９０［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：２５９−２６４［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８−２９１［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉ，ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：４３６−４３８［１９９７］；Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：４５０４−４５０９［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３１５−３１９［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１［１９９４］；米国特許出願公開第２００８／０２２０９９０号、米国特許出願公開第２００９／０３１２１９６号、米国特許出願公開第２０１４／０００５０５７号、米国特許出願公開第２０１４／０２１４３９１号、米国特許出願公開第２０１４／０２２１２１６号；米国特許出願公開第２０１５／００５０６５８号、米国特許出願公開第２０１５／０１３３３０７号、米国特許出願公開第２０１５／０１３４３１５号ならびに全ての関連する非米国対応物；ＷＯ９５／２２６２５号、ＷＯ９７／００７８号、ＷＯ９７／３５９６６号、ＷＯ９８／２７２３０号、ＷＯ００／４２６５１号、ＷＯ０１／７５７６７号、およびＷＯ２００９／１５２３３６号（その全てが本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、変異誘発処理後に得られた酵素バリアントは、酵素バリアントを規定の温度（または他のアッセイ条件）に供し、熱処理または他のアッセイ条件後に残存する酵素活性の量を測定することによってスクリーニングされる。次いで、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡは、宿主細胞から単離され、配列決定されてヌクレオチド配列変化（存在する場合）が同定され、異なるまたは同じ宿主細胞において酵素を発現させるために使用される。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、当該分野で公知の任意の適切な方法（例えば、ＨＰＬＣ分析などの標準的な生化学技術）を使用して実施され得る。
【０１２３】
配列が既知の操作されたポリペプチドについては、酵素をコードするポリヌクレオチドを、公知の合成方法にしたがった標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、約１００塩基までのフラグメントを、個別に合成し、次いで、接合して（例えば、酵素的もしくは化学的なライゲーション（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）法、またはポリメラーゼ媒介法による）、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、本明細書中に開示のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを、自動化合成法で典型的に実施される古典的なホスホルアミダイト法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−６９［１９８１］；およびＭａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：８０１−０５［１９８４］を参照のこと）を使用した化学合成によって調製することができる。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを（例えば、自動ＤＮＡ合成機で）合成し、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適切なベクター中にクローニングする。
【０１２４】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）表２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、および／または６．１に提供した任意のバリアントのアミノ酸配列ならびに配列番号１０、１３、１５、１８、２１、および／または２４から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程、ならびに（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされるＧＬＡポリペプチドを発現させる工程を含み得る。方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、任意選択的に１つまたは数個の（例えば、３、４、５まで、または１０までの）アミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
【０１２５】
発現された操作されたＧＬＡポリペプチドは、当該分野で公知の任意の適切なアッセイ（本明細書中に記載のアッセイおよび条件が含まれるが、これらに限定されない）を使用して、任意の所望の改良された性質（例えば、活性、選択性、安定性、酸耐性、プロテアーゼ感受性など）について評価され得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞において発現された操作されたＧＬＡポリペプチドのいずれかは、周知のタンパク質精製技術（とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、ろ過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィが含まれる）のいずれか１つまたはそれを超えるものを使用して、細胞および／または培養培地から回収される。
【０１２７】
ＧＬＡポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィ技術には、とりわけ、逆相クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィが含まれる。特定の酵素を精製するための条件は、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの要因に部分的に依存し、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、親和性技術は、改良されたバリアントＧＬＡ酵素を単離するために使用され得る。アフィニティークロマトグラフィ精製を利用するいくつかの実施形態では、バリアントＧＬＡポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が使用される。アフィニティークロマトグラフィ精製を利用するいくつかの実施形態では、ＧＬＡに共有結合されているグリカンに結合するタンパク質が使用される。アフィニティークロマトグラフィ精製を利用するまた他の実施形態では、ＧＬＡ活性部位に結合する任意の小分子が使用される。抗体の生成のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどが含まれるが、これらに限定されない）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、ＧＬＡバリアント）またはそのフラグメントの注射によって免疫化される。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドまたはフラグメントは、側鎖官能基または側鎖官能基に結合されているリンカーによって、ＢＳＡなどの適切なキャリアに結合される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、操作されたＧＬＡポリペプチドの産生を促す条件下で、本明細書中に記載の操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）、またはＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（例えば、ＣＨＯ））を培養する工程、ならびに細胞および／または培養培地から操作されたＧＬＡポリペプチドを回収する工程を含む方法によって、宿主細胞において産生される。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、操作されたＧＬＡポリペプチドを生成する方法であって、配列番号５および／または１０のアミノ酸配列と最適にアラインメントした場合に、配列番号５および／もしくは１０の参照配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性、表２．１、２．２、２．４、２．５、および／もしくは６．１に提供したものから選択される配列番号５および／もしくは１０と比較した場合に１つもしくはそれを超えるアミノ酸残基の相違、ならびに／またはそれらの組み合わせを有する操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え真核細胞を、操作されたＧＬＡポリペプチドの産生を可能にするための適切な培養条件下で培養する工程、ならびに任意選択的に、培養物および／または培養細菌細胞から操作されたＧＬＡポリペプチドを回収する工程を含む方法を包含する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞または細胞培養培地から操作されたＧＬＡポリペプチドが回収されたら、それらは、当該分野で公知の任意の適切な方法によってさらに精製される。いくつかのさらなる実施形態では、異なる適用および使用（例えば、医薬組成物）に適切な操作されたＧＬＡポリペプチドを含む組成物および製剤を提供するために、精製されたＧＬＡポリペプチドは、他の成分および化合物と組み合わされる。いくつかのさらなる実施形態では、精製されたＧＬＡポリペプチドまたは製剤化されたＧＬＡポリペプチドは、凍結乾燥される。
【０１３１】
組成物：
本発明は、種々の組成物およびフォーマット（下記のものが含まれるが、これらに限定されない）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、医薬組成物および他の組成物（例えば、食事／栄養サプリメント）に使用するのに適切な操作されたＧＬＡポリペプチドを提供する。
【０１３２】
投与様式に応じて、治療有効量の本発明の操作されたＧＬＡを含むこれらの組成物は、固体、半固体または液体の形態である。いくつかの実施形態では、組成物は、希釈剤、緩衝液、賦形剤、塩、乳化剤、保存剤、安定剤、充填剤、および他の成分などの他の薬学的に許容され得る成分を含む。製剤化および投与のための技術の詳細は当該分野で周知であり、文献に記載されている。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、医薬組成物における使用のために製剤化される。操作されたＧＬＡポリペプチドの送達に使用するための任意の適切なフォーマット（丸剤、錠剤、ゲルタブ（ｇｅｌ  ｔａｂ）、カプセル、ロゼンジ、糖衣錠、粉末、ソフトゲル、ゾルゲル、ゲル、エマルジョン、インプラント、パッチ、スプレー、軟膏、リニメント、クリーム、ペースト、ゼリー、ペイント、エアロゾル、チューインガム、粘滑剤、スティック、溶液、懸濁液（油性懸濁液、水中油型エマルジョンなどが含まれるが、これらに限定されない）、スラリー、シロップ、制御放出製剤、坐剤などが含まれるが、これらに限定されない）が、本発明において使用される。いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、注射または注入に適切なフォーマット（すなわち、注射可能な製剤）で提供される。いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、シリカ系（例えば、オキシシラン）ゾルゲルを含むゾルゲルなどの生体適合性マトリックスで提供される。いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、カプセル化される。いくつかの代替的な実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、ナノ構造物（例えば、ナノチューブ（ｎａｎｏｔｕｂｅ）、ナノチューブ（ｎａｎｏｔｕｂｕｌｅ）、ナノカプセル、またはマイクロカプセル、マイクロスフェア、リポソームなど）中にカプセル化される。実際、本発明は、任意の特定の送達製剤および／または送達手段に限定されることを意図しない。操作されたＧＬＡポリペプチドは、当該分野で公知の任意の適切な手段（非経口、経口、局所、経皮、鼻腔内、眼内、髄腔内、インプラントによるなどを含むが、これらに限定されない）によって投与されることを意図する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、グリコシル化、化学架橋試薬、ペグ化（すなわち、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］または活性化ＰＥＧなどによる改変）または他の化合物（例えば、Ｉｋｅｄａ，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ２９：２８３−２８７［２００５］；米国特許第７，５３１，３４１号、同第７，５３４，５９５号、同第７，５６０，２６３号、および同第７，５３，６５３号；米国特許出願公開第２０１３／００３９８９８号、米国特許出願公開第２０１２／０１７７７２２号などを参照のこと）によって化学的に改変される。実際、本発明は、任意の特定の送達方法および／または機構に限定されることを意図しない。
【０１３５】
いくつかのさらなる実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、マトリックス安定化酵素結晶を含む製剤で提供される。いくつかの実施形態では、製剤は、操作された架橋結晶ＧＬＡ酵素と、酵素結晶に付着する反応性部分を有するポリマーとを含む。本発明はまた、ポリマーの操作されたＧＬＡポリペプチドを提供する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本発明の操作されたＧＬＡポリペプチドを含む組成物は、１つまたはそれを超える一般的に使用されるキャリア化合物（糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールおよび／またはソルビトール）、デンプン（例えば、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモまたは他の植物デンプン）、セルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ゴム（例えば、アラビア、トラガカント、グアーなど）および／またはタンパク質（例えば、ゼラチン、コラーゲンなど）が含まれるが、これらに限定されない）を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本発明は、血液、脳脊髄液などの流体中の糖脂質の濃度を減少させるのに使用するために適切な操作されたＧＬＡポリペプチドを提供する。操作されたＧＬＡポリペプチドの投与量は、状態または疾患、被験体の全身状態、および当業者に公知の他の要因に依存する。いくつかの実施形態では、組成物は、単回投与または複数回投与のためのものである。いくつかの実施形態では、ファブリー病を有するヒトに投与される組成物中の操作されたＧＬＡポリペプチドの濃度は、疾患（例えば、ファブリー病）を有効に処置および／または改善するのに十分であると考えられる。いくつかの実施形態では、操作されたＧＬＡポリペプチドは、他の医薬組成物および／または食事用組成物と組み合わせて投与される。
【実施例】
【０１３８】
実験
以下の実施例（達成された実験および結果が含まれる）を、例示のみを目的として提供し、この実施例は、本発明を制限すると解釈されない。
【０１３９】
以下に開示の実験では、以下の略語を適用する：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；℃（摂氏）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；大腸菌Ｗ３１１０（一般的に使用される研究用大腸菌株，ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴから利用可能）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ）；ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）；ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）；ＧＩＤＨ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）；ＦＩＯＰＣ（ポジティブコントロールに対する改良の倍数）；ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）；ＬＢ（Ｌｕｒｉａブロス）；ＭｅＯＨ（メタノール）；Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）；ＰｒｏＳｐｅｃ（ＰｒｏＳｐｅｃ  Ｔａｎｙ  Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ，Ｅａｓｔ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；Ｒａｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒａｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｙｏｎｋｅｒｓ，ＮＹ）；Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．（Ｐａｌｌ，Ｃｏｒｐ．，Ｐｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ
ＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）；Ｋｕｈｎｅｒ（Ａｄｏｌｆ  Ｋｕｈｎｅｒ，ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ａｘｙｇｅｎ（Ａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ｐａｒｔ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ｐａｒｔ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）；Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）；Ｅｎｚｏ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）；Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｎｏｗ  ｐａｒｔ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；ＬＩ−ＣＯＲ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）；Ａｍｉｃｕｓ（Ａｍｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ）；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）；Ｏｐｔｉｍａｌ（Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）；およびＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。
【０１４０】
以下のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列が本発明において使用される。（以下に示されているように）いくつかの場合では、ポリヌクレオチド配列の後に、コードされるポリペプチドが続く。
【化１】
2019076110.tif 000002
【化２】
2019076110.tif 000003
【化３】
2019076110.tif 000004
【化４】
2019076110.tif 000005
【化５】
2019076110.tif 000006
【化６】
2019076110.tif 000007
【化７】
2019076110.tif 000008
【化８】
2019076110.tif 000009
【化９】
2019076110.tif 000010
【化１０】
2019076110.tif 000011
【化１１】
2019076110.tif 000012
【化１２】
2019076110.tif 000013
【化１３】
2019076110.tif 000014
【化１４】
2019076110.tif 000015
【化１５】
2019076110.tif 000016
【化１６】
2019076110.tif 000017
【化１７】
2019076110.tif 000018
【化１８】
2019076110.tif 000019
【化１９】
2019076110.tif 000020
【化２０】
2019076110.tif 000021
【０１４１】
実施例１
ＧＬＡ遺伝子の取得および発現ベクターの構築
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける最適化された遺伝子発現のために、ＷＴヒトＧＬＡをコードする合成遺伝子（配列番号３）を設計し、アセンブルし、大腸菌発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉ（配列番号６）にサブクローニングした。
【０１４２】
成熟形態の酵母最適化ＧＬＡに融合された１９アミノ酸のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＦαシグナルペプチドをコードするキメラＧＬＡ発現構築物を、以下のように、分泌発現のために設計した酵母発現ベクターで生成した。Ｓ２８８ＣゲノムＤＮＡ由来のオリゴヌクレオチドＭＭＯ４３５（配列番号２７）およびＭＭＯ４３９（配列番号２８）を使用してＰＣＲによって、ＭＦαシグナルペプチドをコードするフラグメント（配列番号２５）を増幅し、プライマーＭＭＯ５１４（配列番号２９）およびＭＭＯ４８１（配列番号３０）を使用して、合成ＧＬＡをコードするフラグメント（配列番号３）を増幅した。これらのオリゴヌクレオチドの５’末端のさらなる配列は、線状化されたプラスミドｐＹＴ−７２Ｂｇｌ（配列番号７）で共形質転換する場合の酵母組換えクローニングのための相同性を提供する。得られたベクターにおいて、融合タンパク質ＳＰ−ＧＬＡ（配列番号３６）の発現は、ＡＤＨ２プロモーターによって駆動される。ＧＬＡ（配列番号３７）にＮ末端融合された８３アミノ酸のＭＦαリーダーペプチド（配列番号３８）の融合物をコードする融合構築物を、同じ技術を使用してクローニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＩＮＶＳｃ１において、組換えクローニングおよび遺伝子発現を実施した。当業者に一般に公知の指向進化技術を使用して、このプラスミド構築物から遺伝子バリアントのライブラリーを生成した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ２０１０／１４４１０３を参照のこと）。
【０１４３】
一過性トランスフェクションにおける分泌発現のための成熟ヒトＧＬＡコード配列をコードする合成遺伝子に融合された合成シグナルペプチドをコードするキメラＧＬＡ発現構築物を、以下のように生成した。オリゴヌクレオチドＰＬＥＶ１１３Ｆｗ（配列番号３２）およびＳＰＧＬＡＲｖ（配列番号３３）を使用し、ＰＣＲを使用して、合成シグナルペプチドをコードするフラグメント（配列番号３１）を増幅した。成熟形態のＧＬＡの天然ヒトコード配列をコードする第２のフラグメント（配列番号４）を、オリゴヌクレオチドＳＰＧＬＡＦｗ（配列番号３４）およびＧＬＡＲｖ（配列番号３５）を使用して増幅した。オーバーラップエクステンションＰＣＲによるスプライシングを使用して、これらのフラグメントを組換え、得られたキメラフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩで線状化した哺乳動物発現ベクターｐＬＥＶ１１３にライゲーションした。当業者に一般に公知の指向進化技術を使用して、このプラスミド構築物から特定の遺伝子バリアントを生成した。
【０１４４】
実施例２
ハイスループット増殖アッセイ
ＧＬＡおよびＧＬＡバリアントのハイスループット（ＨＴＰ）増殖
酢酸リチウム法を使用して、ＧＬＡおよびＧＬＡバリアントを発現するベクターで形質転換した酵母（ＩＮＶＳｃ１）細胞を、ＳＤ−Ｕｒａ寒天プレート上で選択した。３０℃で７２時間インキュベートした後、６％グルコースを補充した２００μｌ／ウェルのＳＤ−Ｕｒａブロス（２ｇ／Ｌ  ＳＤ−Ｕｒａ、６．８ｇ／Ｌアミノ酸不含酵母ニトロゲンベース［Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ］）、３．０６ｇ／Ｌリン酸二水素ナトリウム、０．８０４ｇ／Ｌリン酸水素二ナトリウム、ｐＨ６．０を充填したＡｘｙｇｅｎ（登録商標）１．１ｍｌ  ９６ウェルディープウェルプレートのウェルに、コロニーを入れた。Ｋｕｈｎｅｒシェーカー（２５０ｒｐｍ、３０℃および相対湿度８５％）中で、細胞を２０〜２４時間成長させた。２％グルコースを補充した３８０μＬのＳＤ−ｕｒａブロスを充填したＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェルディーププレートに、一晩培養したサンプル（２０μＬ）を移した。Ｋｕｈｎｅｒシェーカー（２５０ｒｐｍ、３０℃および相対湿度８５％）中で、プレートを６６〜８４時間インキュベートした。次いで、細胞をペレット化し（４０００ｒｐｍ×２０分間）、上清を単離し、分析前に４℃で保存した。
【０１４５】
上清のＨＴＰ分析
４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵＧａｌ）の加水分解を測定することによって、ＧＬＡバリアント活性を決定した。このアッセイのために、上記のように生成した５〜５０μＬの酵母培養上清を、９６ウェルブラック不透明底プレート中で、０〜４５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９：１８３−１８６［１９２１］）、ｐＨ４．８および５０μＬの５０ｍＭクエン酸塩中２ｍＭ  ＭＵＧａｌ、２００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ４．６と混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で３０〜１８０分間インキュベートしてから、１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムでクエンチした。蛍光をモニタリングするＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダー（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）を使用して、加水分解を分析した。
【０１４６】
酸で前処理した上清のＨＴＰ分析
リソソーム中でバリアントが遭遇し得る極端なｐＨをシミュレートするために、酸性緩衝液でＧＬＡバリアントをチャレンジした。最初に、５０μＬの酵母培養上清および５０ｕＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ３．３〜４．３）を９６ウェル丸底プレートのウェルに添加した。ＰｌａｔｅＬｏｃ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｅａｌｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）でプレートを密封し、３７℃で１〜３時間インキュベートした。アッセイのために、１０〜５０μＬの酸性ｐＨチャレンジサンプルを、０〜４０μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８、２５μＬの１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．３および２５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８中４ｍＭ  ＭＵＧａｌと混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で３０〜１８０分間インキュベートしてから、１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムでクエンチした。蛍光をモニタリングするＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダー（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）を使用して、加水分解を分析した。
【０１４７】
塩基で前処理した上清のＨＴＰ分析
患者への投与後に血液中でバリアントが遭遇するｐＨをシミュレートするために、塩基性（中性）緩衝液でＧＬＡバリアントをチャレンジした。最初に、５０μＬの酵母培養上清および５０ｕＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．２）または２００ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．１〜９．７）を９６ウェル丸底プレートのウェルに添加した。プレートを密封し、３７℃で１〜１８時間インキュベートした。アッセイのために、１０〜５０μＬの塩基性ｐＨチャレンジサンプルを、０〜４０μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８、２５μＬの１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．３および２５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８中４ｍＭ  ＭＵＧａｌと混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で３０〜１８０分間インキュベートしてから、１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムでクエンチした。蛍光をモニタリングするＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダー（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）を使用して、加水分解を分析した。
【０１４８】
ウシ血清で前処理した上清のＨＴＰ分析
患者への注入後にバリアントが遭遇する条件をシミュレートするために、ウシ血清でＧＬＡバリアントをチャレンジした。最初に、２０μＬの酵母培養上清および８０μＬのウシ血清を９６ウェル丸底プレートのウェルに添加した。プレートを密封し、３７℃で１時間インキュベートした。アッセイのために、５０μＬの血清チャレンジサンプルを、２５μＬの１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．３および２５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８中４ｍＭ  ＭＵＧａｌと混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で１８０分間インキュベートしてから、１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムでクエンチした。蛍光をモニタリングするＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダー（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）を使用して、加水分解を分析した。
【表２−１】
2019076110.tif 000022
【表２−２】
2019076110.tif 000023
【表２−３】
2019076110.tif 000024
【表２−４】
2019076110.tif 000025
【表２−５】
2019076110.tif 000026
【表２−６】
2019076110.tif 000027
【表２−７】
2019076110.tif 000028
【表２−８】
2019076110.tif 000029
【表２−９】
2019076110.tif 000030
【表２−１０】
2019076110.tif 000031
【表２−１１】
2019076110.tif 000032
【表２−１２】
2019076110.tif 000033
【表２−１３】
2019076110.tif 000034
【表２−１４】
2019076110.tif 000035
【表２−１５】
2019076110.tif 000036
【表２−１６】
2019076110.tif 000037
【表２−１７】
2019076110.tif 000038
【表２−１８】
2019076110.tif 000039
【表２−１９】
2019076110.tif 000040
【表２−２０】
2019076110.tif 000041
【表２−２１】
2019076110.tif 000042
【表２−２２】
2019076110.tif 000043
【表２−２３】
2019076110.tif 000044
【表２−２４】
2019076110.tif 000045
【表２−２５】
2019076110.tif 000046
【表２−２６】
2019076110.tif 000047
【表２−２７】
2019076110.tif 000048
【表２−２８】
2019076110.tif 000049
【表２−２９】
2019076110.tif 000050
【表２−３０】
2019076110.tif 000051
【表２−３１】
2019076110.tif 000052
【表２−３２】
2019076110.tif 000053
【表２−３３】
2019076110.tif 000054
【０１４９】
実施例３
ＧＬＡバリアントのインビトロ特徴付け
酵母におけるＧＬＡの産生
ＧＬＡ含有上清を産生するために、実施例２に記載されているように、ＧＬＡのレプリカＨＴＰ培養物を成長させた。さらなる分析の前に、レプリカ培養物由来の上清（ｎ＝１２〜３６）を合わせた。
【０１５０】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＬＡの産生
哺乳動物細胞におけるＧＬＡバリアントの分泌発現を、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって実施した。Ｎ末端合成哺乳動物シグナルペプチドに融合されたＧＬＡバリアント（配列番号３、４、９、１２、１７、２０、２３、および４１）で細胞をトランスフェクトし、実施例１に記載されているように、哺乳動物発現ベクターｐＬＥＶ１１３にサブクローニングした。プラスミドＤＮＡでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、当業者に公知の技術を使用して４日間懸濁物中で成長させた。上清を回収し、４℃で保存した。
【０１５１】
実施例４
ＧＬＡバリアントの精製
哺乳動物細胞上清からのＧＬＡバリアントの精製
基本的には当該分野で公知のように（Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ，．３７，４９９−５０６［２００４］を参照のこと）、哺乳動物培養上清からＧＬＡバリアントを精製した。０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、およびＭｎＣｌ２ｐＨ６．０（ＣｏｎＡ結合緩衝液）でコンカナバリンＡ樹脂（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を平衡化した。結合緩衝液で上清を１：１希釈し、カラムにロードした。１５容量のコンカナバリンＡ結合緩衝液でカラムを洗浄し、０．９Ｍメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドおよび０．９Ｍメチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを含むコンカナバリンＡ結合緩衝液を添加することによって、サンプルを溶出した。溶出したタンパク質を濃縮し、１０ｋＤａ分子量カットオフのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ−２０ろ過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＴｈｉｏＧａｌ結合緩衝液（２５ｍＭクエン酸−リン酸（ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．８）に３回緩衝液交換した。緩衝液交換したサンプルを、ＴｈｉｏＧａｌ結合緩衝液で平衡化した固定化Ｄ−ガラクトース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）にロードした。６容量のＴｈｉｏＧａｌ結合緩衝液で樹脂を洗浄し、２５ｍＭクエン酸リン酸、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｄ−ガラクトース、ｐＨ５．５で溶出した。１０ｋＤａ分子量カットオフのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ−２０ろ過ユニットを使用して、溶出したサンプルを濃縮した。ブラッドフォード定量に基づき、精製により、培養上清１ｍｌ当たり２．４〜１０μｇの精製タンパク質が得られた。
【０１５２】
ＧＬＡバリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、酵母培養上清および哺乳動物細胞培養上清および精製ＧＬＡのサンプルを分析した。酵母上清では、ＧＬＡレベルは低過ぎて、この方法によって検出されなかった。哺乳動物細胞培養上清および精製ＧＬＡサンプルの両方において、約４９ｋＤａの予測ＧＬＡ分子量に対応するバンドが見出された。
【０１５３】
ＧＬＡバリアントのイムノブロット分析
イムノブロットによって、酵母上清および哺乳動物細胞培養上清のサンプルを分析した。簡潔に言えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、サンプルを分離した。ｉＢｌｏｔドライブロットシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。オデッセイブロッキング緩衝液（ＴＢＳ）（ＬＩ−ＣＯＲ）で膜を室温で１時間ブロッキングし、０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むオデッセイブロッキング緩衝液で１：２５０希釈したウサギα−ＧＬＡ  ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｃｈｅｒ）によって４℃で１４時間プローブした。トリス緩衝食塩水＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で膜を４×５分間洗浄し、０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および０．０１％ＳＤＳを含むオデッセイブロッキング緩衝液で１：５０００希釈したＩＲＤｙｅ８００ＣＷロバα−ウサギＩｇＧ（ＬＩ−ＣＯＲ）によって室温で１時間プローブした。トリス緩衝食塩水＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で膜を４×５分間洗浄し、オデッセイイメージャー（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して分析した。哺乳動物細胞培養物および酵母上清の両方において、約４９ｋＤａの予測ＧＬＡ分子量に対応するバンドが見出された。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現サンプルでは、変異Ｅ３６７Ｎを含む変異体が、わずかに高い分子量に泳動した。この変異は、標準的なＮＸＴ  Ｎ結合グリコシル化部位（Ｘは、Ｐ以外の任意のアミノ酸である）を導入し、さらなるＮ結合グリカンの導入の可能性によってより高い分子量を説明することができる。
【０１５４】
実施例５
ＧＬＡバリアントのインビトロ特徴付け
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるＧＬＡの分泌発現のためのシグナルペプチドの最適化
Ｍｆリーダー−ＧＬＡ（配列番号７）、ＳＰ−ＧＬＡ（配列番号３６）またはベクターコントロールで形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、実施例２に記載されているようにＨＴＰで成長させた。実施例２に記載されているように、上清の回収および分析（ｎ＝６）の前に、培養物を４８〜１２０時間成長させた。図１は、２〜５日間の培養後のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける異なるＧＬＡ構築物の相対活性を示すグラフを提供する。この図に示されているように、３日間の成長後に、ＳＰ−ＧＬＡ（配列番号３６）は、飽和した高レベルの活性酵素を産生した。
【０１５５】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現されたＧＬＡバリアントのｐＨ安定性
酵素の全体的な安定性を評価するために、異なる緩衝液でＧＬＡバリアントをチャレンジした。最初に、５０μＬのＧＬＡバリアント酵母培養物由来上清および５０ｕＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ２．８６〜９．２７）または２００ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６９）を９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３７９８，Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した。プレートを密封し、３７℃で１時間インキュベートした。アッセイのために、５０μＬのチャレンジ上清を、２５μＬの１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．３および２５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８中４ｍＭ  ＭＵＧａｌと混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で６０〜１８０分間インキュベートしてから、１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムでクエンチした。蛍光をモニタリングするＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダー（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）を使用して、加水分解を分析した。図２は、種々のｐＨにおけるインキュベーション後のＧＬＡバリアントの絶対（パネルＡ）および相対（パネルＢ）活性を示すグラフを提供する。
【０１５６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現されたＧＬＡバリアントの熱安定性
酵素の全体的な安定性を評価するために、１μＭ  １−デオキシガラクトノジリマイシン（Ｍｉｇａｌａｓｔａｔ；Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の存在下および非存在下、種々の温度でＧＬＡバリアントをチャレンジした。最初に、５０μＬのＧＬＡバリアント酵母培養物由来上清および５０ｕＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ７．６５）＋／−２ｍＭ  １−デオキシガラクトノジリマイシンを９６ウェルＰＣＲプレート（Ｂｉｏｒａｄ，ＨＳＰ−９６０１）のウェルに添加した。プレートを密封し、サーモサイクラーの勾配プログラムを使用して３０〜５４℃で１時間インキュベートした。アッセイのために、５０μＬのチャレンジ上清を、２５μＬの１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．３および２５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８中４ｍＭ  ＭＵＧａｌと混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で９０分間インキュベートしてから、１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムでクエンチした。蛍光をモニタリングするＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダー（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）を使用して、加水分解を分析した。図３は、種々の温度におけるインキュベーション後のＧＬＡバリアントの絶対（パネルＡ）および相対（パネルＢ）活性を示すグラフを提供する。
【０１５７】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現されたＧＬＡバリアントの血清安定性
血液の存在下におけるバリアントの相対的な安定性を評価するために、サンプルを血清に曝露した。最初に、２０μＬのＧＬＡバリアント酵母培養物由来上清および０〜８０μＬの水または０〜８０μＬのウシ血清を９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３７９８，Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した。プレートを密封し、３７℃で１時間インキュベートした。アッセイのために、５０μＬのチャレンジ上清を、２５μＬの１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．３および２５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８中４ｍＭ  ＭＵＧａｌと混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で９０分間インキュベートしてから、１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムでクエンチした。蛍光をモニタリングするＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダー（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）を使用して、加水分解を分析した。図４は、種々の割合の血清によるチャレンジ後のＧＬＡバリアントの絶対（パネルＡおよびＢ）および相対（パネルＣおよびＤ）活性を示すグラフを提供する。
【０１５８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されたＧＬＡバリアントの相対活性
ＨＥＫＴ２９３Ｔ細胞において発現されたＧＬＡバリアント由来の上清を、非ＧＬＡ発現酵母培養物由来の上清で２倍連続希釈した。希釈物（５０μＬ）を、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６ウェルブラック不透明底プレート中で、２５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８中４ｍＭ  ＭＵＧａｌおよび２５μＬの１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．３と混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で６０分間インキュベートしてから、１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムでクエンチした。蛍光をモニタリングするＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダー（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）を使用して、加水分解を分析した。図５は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されたＧＬＡバリアントの相対活性を示すグラフを提供する。バリアントＧＬＡ酵素でトランスフェクトした細胞由来の上清は、ＷＴ酵素と比較して顕著に高い加水分解酵素活性を示し、容量当たりの活性は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現において見られたものよりもかなり高かった。
【０１５９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されたＧＬＡバリアントのｐＨ安定性
全体的な安定性を評価するために、異なる緩衝液でＧＬＡバリアントをチャレンジした。非ＧＬＡ発現培養物由来の上清による希釈によって、哺乳動物細胞培養物由来の上清を同等の活性に正規化した。正規化上清（５０μＬ）および５０μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ４．０６〜８．１４）を９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３７９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した。プレートを密封し、３７℃で３時間インキュベートした。アッセイのために、５０μＬのチャレンジ上清を、２５μＬの１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．３および２５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８中４ｍＭ  ＭＵＧａｌと混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で３時間インキュベートしてから、１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムでクエンチした。蛍光をモニタリングするＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダー（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）を使用して、加水分解を分析した。図６は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現され、活性について正規化し、種々のｐＨでインキュベートしたＧＬＡバリアントの絶対（パネルＡ）および相対（パネルＢ）活性を示すグラフを提供する。
【０１６０】
全ての酵素は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現されたＷＴ  ＧＬＡと比較した場合、ｐＨチャレンジに対してより安定であることが見出された（図２との比較）。この相違はおそらく、発現宿主間の差示的なグリコシル化によるものである。しかしながら、本発明は、いかなる特定の機構にも理論にも限定されるものではない。変異体酵素は、ＨＥＫ２９３Ｔにおいて発現されたＷＴ酵素と比較してより広いｐＨ安定性プロファイルを有していた。
【０１６１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されたＧＬＡバリアントの熱安定性
全体的な安定性を評価するために、１μＭ  １−デオキシガラクトノジリマイシン（Ｍｉｇａｌａｓｔａｔ）の存在下および非存在下、種々の温度でＧＬＡバリアントをチャレンジした。非ＧＬＡ発現培養物由来の上清による希釈によって、哺乳動物細胞培養物由来の上清をほぼ同等の活性に正規化した。希釈上清を９６ウェルＰＣＲプレート（Ｂｉｏｒａｄ，ＨＳＰ−９６０１）のウェルに添加した。プレートを密封し、サーモサイクラーの勾配プログラムを使用して３０〜５４℃で１時間インキュベートした。アッセイのために、２０μＬのチャレンジ上清を、３０μＬの１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．３および５０μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８中４ｍＭ  ＭＵＧａｌと混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で９０分間インキュベートしてから、１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムでクエンチした。蛍光をモニタリングするＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダー（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）を使用して、加水分解を分析した。図７は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現され、活性について正規化し、種々の温度でインキュベートしたＧＬＡバリアントの絶対（パネルＡ）および相対（パネルＢ）活性を示すグラフを提供する。この図に示されているように、全ての酵素は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現されたＷＴ  ＧＬＡと比較した場合、温度チャレンジ後においてより安定であったが（図２との比較）、これはおそらく、発現宿主間の差示的なグリコシル化によるものである。ＧＬＡバリアント（配列番号１０および１３）では、酵素のＴｍは、それぞれ２℃および４℃増加した。Ｍｉｇａｌａｓｔａｔの添加は、Ｔｍを５．５℃増加させたが、アッセイにおける０．２μＭの最終濃度では、Ｍｉｇａｌａｓｔａｔ処理サンプルの活性は、約６０％減少した。
【０１６２】
代替基質に対するＷＴ  ＧＬＡおよびＧＬＡバリアントの活性
改良されたＭＵＧａｌ加水分解活性が、より天然の基質に対応していたことを確認するために、基質としてＮ−ドデカノイル−ＮＢＤ−セラミドトリヘキソシド（ＮＢＤ−ＧＢ３）を使用して、哺乳動物細胞発現ＧＬＡバリアントをアッセイした。ＨＥＫ２９３Ｔ培養上清（１０μＬ）、１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ４．８（８０μＬ）、および１０％エタノール中ＮＢＤ−ＧＢ３（０．１ｍｇ／ｍｌ）（１０μＬ）を微小遠心管に添加した。サンプルを逆さにして混合し、３７℃で１時間インキュベートした。５０μＬのメタノールの添加によって反応物をクエンチし、１００μＬのクロロホルムで希釈し、ボルテックスし、分析のために有機層を単離した。有機相（１０μＬ）をシリカプレート上にスポットし、３６５ｎｍ  ＵＶランプを使用して出発物質および生成物を検出する薄層クロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール：水、１００：４２：６）によって分析した。配列番号１３の場合にのみ、有意な変換が観察されたが、これは、バリアントが、ＷＴ−ＧＬＡと比較して改良された活性を示すことを確認している。
【０１６３】
ＧＬＡバリアントの比活性
実施例４に記載されているように精製したＧＬＡバリアントを、それらの比活性について評価した。０〜０．２５ｎｇの精製酵素を、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８（最終ｐＨ４．８）中４ｍＭ  ＭＵＧａｌに添加した。サンプルを３７℃で６０分間インキュベートし、１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムの添加によってクエンチした。蛍光をモニタリングするＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダー（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）を使用して、加水分解を分析し、標準曲線の使用によって、４−メチルウンベリフェロンの絶対量と相関させた。
【０１６４】
時間をわたっての精製ＧＬＡバリアントのｐＨ安定性
精製ＧＬＡバリアントが、酵母における発現後に観察された所望のｐＨ安定性を示すことを確認するために、酸性または塩基性緩衝液中で、ＷＴ  ＧＬＡ（配列番号５）および配列番号４２をインキュベートし、残存活性について分析した。ＧＬＡバリアント（２００ｎｇ）をＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．１またはｐＨ７．５に添加し、３７℃で０〜２４時間インキュベートした。２５ｕＬの１Ｍクエン酸ｐＨ４．３および２５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．８中４ｍＭ  ＭＵＧａｌの混合物にサンプル（５０μＬ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムでサンプルをクエンチし、１Ｍ炭酸ナトリウムで１：４希釈し、蛍光分光法（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）によって分析した。酸性および塩基性チャレンジ条件下の両方において、配列番号４２はかなり安定であったが、これは、酵母において開発された安定性の上昇が、哺乳動物細胞において発現されたタンパク質に転換したことを裏付けている（結果のグラフについては、図８を参照のこと）。
【０１６５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現された精製ＧＬＡバリアントの熱安定性
全体的な安定性を評価するために、ＷＴ  ＧＬＡ（配列番号５）および配列番号４２の熱安定性を決定した。実施例４に記載されているように精製した酵素を、１×Ｓｙｐｒｏ
Ｏｒａｎｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む１×ＰＢＳで２０μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルＰＣＲプレート（Ｂｉｏｒａｄ，ＨＳＰ−９６０１）に添加した。ＲＴ−ＰＣＲ装置によって、プレートを０．５℃／分で３０℃〜７５℃に加熱し、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ蛍光をモニタリングした。これらの条件下では、ＷＴ  ＧＬＡは３７℃で融解した一方、配列番号４２は５５℃で融解した。
【０１６６】
実施例６
ＧＬＡバリアントのインビボ特徴付け
精製ＧＬＡバリアントの血清薬物動態
実施例４に記載されているように生成した精製ＧＬＡバリアントを、生存ラットの血清中における安定性について評価した。１ｍｇ／ｍｌのＷＴ  ＧＬＡ（配列番号５）または配列番号４２を、３匹のナイーブ頸静脈カニューレ挿入Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（７〜８週齢）にそれぞれ静脈内投与した。投与前ならびに投与５分後、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、および２４０分後に、各ラットから２００μＬの血液をＥＤＴＡチューブに採取し、４℃および６０００ｒｐｍで遠心分離して、１サンプル当たり８０μＬ超の血清を生成した。サンプルを凍結し、分析前にドライアイス上で保存した。分析のために、血清（１０μＬ）を４０μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ４．４中５ｍＭ  ＭＵＧａｌに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。５０μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムでサンプルをクエンチし、１Ｍ炭酸ナトリウムで１：１００希釈し、蛍光分光法（励起３５５ｎｍ、発光４４８ｎｍ）によって分析した。投与４時間後に、配列番号４２は最大活性の１５．３％を保持していた一方、ＷＴ  ＧＬＡは０．６６％しか保持していなかった（図９を参照のこと）。
【０１６７】
実施例７
ＧＬＡの脱免疫化
本実施例では、ＧＬＡから予測Ｔ細胞エピトープを除去する多様性を同定するために行った実験を説明する。
【０１６８】
脱免疫化多様性の同定：
Ｔ細胞エピトープを除去する変異多様性を同定するために、コンピュータによる方法を使用して、代表的なＨＬＡ受容体に効率的に結合すると予測されたＧＬＡ部分配列を同定した。加えて、特に、（例えば、実施例２に記載されているアッセイにおいて）ＧＬＡ活性に影響を及ぼさない変異について、アミノ酸変異の実験的探索を行った。次いで、コンピュータによる方法を使用して、予測免疫原性について、活性バリアントのアミノ酸配列を分析した。
【０１６９】
ＷＴ  ＧＬＡにおける推定Ｔ細胞エピトープのコンピュータによる同定：
当該分野で公知の免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ；免疫エピトープデータベースおよび分析リソースウェブサイト）ツールおよび独自の統計分析ツール（例えば、ｉｅｄｂ．ｏｒｇおよびＶｉｔａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ８５４−６２［２０１０］．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｎｏｖ  １１］を参照のこと）を使用して、ＷＴ  ＧＬＡ（配列番号５）における推定Ｔ細胞エピトープを同定した。ＷＴ  ＧＬＡを、考えられる全ての１５マーの分析フレームに分解した（各フレームは、最後の１４アミノ酸が重複する）。ＩＥＤＢウェブサイトで推奨されている方法を使用して、合計でヒト集団の約９５％をカバーする８つの一般的なクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子（ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１、およびＤＲＢ１＊１５０１）（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０：３３６３−３３７３［１９９８］を参照のこと）への予測結合について、９マーのコア領域をスコア化することによって、１５マーの分析フレームを免疫原性について評価した。当該分野で公知の統計分析ツールを使用して、酵素内に含まれる潜在的なＴ細胞エピトープクラスタ（すなわち、ＧＬＡ内に含まれる部分領域であって、免疫原性である可能性が非常に高い部分領域）を同定した。同定したＴ細胞エピトープクラスタを、公知のエピトープのＩＥＤＢデータベースに対してスクリーニングした。これらのスクリーニングによって、ＷＴ酵素における５つの推定Ｔ細胞エピトープを同定した。これらのエピトープは、以下でＴＣＥ−Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶと称する。
【０１７０】
脱免疫化ライブラリーの設計：
最初に、実施例２で同定した活性ＧＬＡ変異体の配列を、Ｔ細胞エピトープの存在について評価する。ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子への結合を潜在的に減少させると同定された変異を組換えライブラリーに組み込む。５つのＴ細胞エピトープ内の全ての単一アミノ酸の飽和変異誘発を使用して、さらなるライブラリーを調製する。これらのライブラリーからのヒットを、さらなる一連の飽和変異誘発、ＨＴＰスクリーニングおよび組換えに供して、考えられる全てのＴ細胞エピトープを除去する。
【０１７１】
脱免疫化ライブラリーの構築およびスクリーニング：
上記のように設計したコンビナトリアルおよび飽和変異誘発ライブラリーを、当該分野で公知の方法によって構築し、実施例２に記載されている非チャレンジアッセイにおいて、活性について試験した。活性バリアントを同定し、配列決定した。ＷＴ  ＧＬＡと比べたそれらの活性および変異は、以下の表に提供されている。
【０１７２】
脱免疫化多様性の同定：
上記のように、８つの一般的なクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子への結合を評価することによって、予測免疫原性のレベルについて、活性バリアントを分析した。総免疫原性スコアおよび免疫原性ヒットカウントは、表７．１に示されている。総免疫原性スコア（ＴＩＳ）は、バリアントの全体的な予測免疫原性を反映する（すなわち、より高いスコアは、より高レベルの予測免疫原性を示す）。免疫原性「ヒットカウント」（ＩＨＣ）は、免疫原性である可能性が非常に高い１５マーの分析フレームの数を示す（すなわち、より高いスコアは、より高い免疫原性の可能性を示す）。参照配列のものよりも低い総免疫原性スコアおよび／または免疫原性ヒットカウントをもたらす変異を、潜在的な「脱免疫化変異」であるとみなした。最も脱免疫化する変異の収集物を組換えて、活性であり、かつＷＴ  ＧＬＡよりも有意に低免疫原性であると予測されたいくつかのバリアントを生成した。総免疫原性スコア（ＴＩＳ）および免疫原性ヒットカウント（ＩＨＣ）は、以下の表に提供されている。
【表７−１】
2019076110.tif 000055
【表７−２】
2019076110.tif 000056
【表７−３】
2019076110.tif 000057
【表７−４】
2019076110.tif 000058
【表７−５】
2019076110.tif 000059
【表７−６】
2019076110.tif 000060
【表７−７】
2019076110.tif 000061
【表７−８】
2019076110.tif 000062
【表７−９】
2019076110.tif 000063
【表７−１０】
2019076110.tif 000064
【表７−１１】
2019076110.tif 000065
【表７−１２】
2019076110.tif 000066
【表７−１３】
2019076110.tif 000067
【表７−１４】
2019076110.tif 000068
【表７−１５】
2019076110.tif 000069
【表７−１６】
2019076110.tif 000070
【表７−１７】
2019076110.tif 000071
【表７−１８】
2019076110.tif 000072
【表７−１９】
2019076110.tif 000073
【表７−２０】
2019076110.tif 000074
【表７−２１】
2019076110.tif 000075
【表７−２２】
2019076110.tif 000076
【表７−２３】
2019076110.tif 000077
【表７−２４】
2019076110.tif 000078
【表７−２５】
2019076110.tif 000079
【０１７３】
特定の実施形態を参照して本発明を説明したが、種々の変更を行うことができ、特定の状況、材料、物質組成、プロセス、プロセスステップまたはステップに適合させるために等価物に置き換え、それにより、特許請求の範囲から逸脱せずに本発明の利益を達成することができる。
【０１７４】
米国における全ての目的のために、本出願で引用した各々のおよびあらゆる刊行物および特許文献は、各々のかかる刊行物または文献が本明細書中で参照によって組み込まれると具体的且つ個別に示されているかのように、本明細書中で参照によって組み込まれる。刊行物および特許文献の引用は、かかる文献が関連先行技術であることを示すものではなく、その内容または日付に関する承認を構成するものでもない。
【図１】
2019076110.tif 000080
【図２】
2019076110.tif 000081
【図３】
2019076110.tif 000082
【図４−１】
2019076110.tif 000083
【図４−２】
2019076110.tif 000084
【図５】
2019076110.tif 000085
【図６】
2019076110.tif 000086
【図７】
2019076110.tif 000087
【図８】
2019076110.tif 000088
【図９】
2019076110.tif 000089
【配列表】
2019076110000001.app
【外国語明細書】
2019076110000001.pdf