(57)【要約】【課題】  本発明は、ウシ等の家畜の体内のTh1型反応とTh2型反応のバランスをTh1側にシフトさせることができる、安全なワクチン製剤を提供することを目的とする。さらに本発明は、ネオスポラ原虫感染に対して効果的な免疫応答、特に細胞性免疫を誘導し得る、安全なワクチン製剤を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、ネオスポラ原虫由来のシクロフィリン又はその免疫原性を保持した変異体若しくは誘導体が封入された、抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合し得るオリゴ糖を表面に有するリポソームを含む、ネオスポラ原虫感染症に対するワクチン製剤に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネオスポラ原虫由来のシクロフィリン又はその免疫原性を保持した変異体若しくは誘導体が封入された、抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合し得るオリゴ糖を表面に有するリポソームを含む、ネオスポラ原虫感染症に対するワクチン製剤。
【請求項２】
変異体が、シクロフィリンを構成するアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、ネオスポラ原虫に対する免疫応答を誘導し得るタンパク質である、請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項３】
誘導体が、シクロフィリン若しくはその変異体のアミノ酸残基の1若しくは数個が化学修飾されたタンパク質、シクロフィリン若しくはその変異体と他のポリペプチドとの融合タンパク質、及びシクロフィリン若しくはその変異体が血中滞留性を高める高分子で修飾されたタンパク質よりなる群から選択され、かつネオスポラ原虫に対する免疫応答を誘導し得るタンパク質である、請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項４】
シクロフィリンが、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
【請求項５】
前記抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子がマンノース・レセプターである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
【請求項６】
前記オリゴ糖が2〜11の糖残基からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
【請求項７】
前記オリゴ糖が3〜5の糖残基からなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
【請求項８】
前記オリゴ糖が2以上のマンノース糖残基を含むものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
【請求項９】
さらに製薬上許容し得る担体を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
【請求項１０】
皮下、皮内、経口又は経鼻投与されるものである、請求項９に記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネオスポラ原虫感染症に対するワクチン製剤に関する。より詳しくは、抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合し得るオリゴ糖を表面に有するリポソームにネオスポラ原のタンパク質であるシクロフィリンを封入してなるワクチン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネオスポラ原虫（Neospora caninum）はイヌ科動物を終宿主とし、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ等を中間宿主とする細胞内寄生性原虫であり、宿主の上皮細胞、脳脊髄液中の単核細胞及び神経細胞の細胞内に寄生する。ネオスポラ原虫は、終宿主の糞便中に排出されるオーシストによる水平感染や中間宿主における垂直感染により伝播する。
【０００３】
ネオスポラ原虫は、イヌに対しては多発性筋炎、上行性麻痺を引き起こし、またウシに対しては流産、死産あるいは子牛の神経症状を主徴とする異常産を高い頻度で引き起こす。特に、母体が免疫抑制状態になっている妊娠中期にネオスポラ原虫に感染すると、胎児に垂直感染して、先天的にネオスポラ原虫に感染している個体が生まれてくる。また、ネオスポラ原虫に感染した母牛は搾乳に供することができない場合が多い。このように、畜産業界において、特にウシのネオスポラ感染は大きな経済的損失を与える深刻な問題である。
【０００４】
ネオスポラ原虫感染に対する治療として、サルファ剤、エリスロマイシン、ドキシサイクリン、クリンダマイシン等の投与が行われる。しかしながら、食用家畜に対する抗生物質の投与は望ましくないことから、ネオスポラ原虫の感染を予防する方法の確立が重要な課題となっている。
【０００５】
ネオスポラ原虫の感染予防法として、不活化したネオスポラ原虫とアジュバントとを含む不活化ワクチン（非特許文献１）や生ワクチンが検討された。また、ネオスポラ原虫そのものを使用する不活化ワクチン又は生ワクチンに加えて、ネオスポラ原虫の抗原タンパク質を含むワクチン等も開発されている。例えば、MIC1、MIC3、GRA2、GRA6、SAG1、SRS2等の組換えタンパク質を含むワクチンが提案されており、ネオスポラ原虫の感染抑制が確認されている（非特許文献２及び３）。しかしながら、これら組換えワクチンは、その生産に微生物やウイルスをベクターとして使用していることから、ベクターの病原性が問題となり得る。
【０００６】
ネオスポラ原虫は細胞内寄生性の原虫であるため、ネオスポラ原虫感染症における液性免疫の誘導は、細胞外に存在する原虫の体内伝播阻止や原虫から放出される病原性因子の機能阻害には有効であるものの、細胞内の原虫への直接的な効果は期待できない。一方、細胞性免疫は原虫感染細胞を破壊することができるため、より直接的に細胞内原虫の駆除に寄与するものと考えられる。
【０００７】
細胞性免疫を誘導し得る非生物的なワクチンキャリアとして、抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合する2〜11個の糖残基から成るオリゴ糖、特にマンノースオリゴ糖を表面に有するリポソームに抗原を封入したワクチンが報告されている（特許文献１）。マンノースオリゴ糖を表面に有するリポソームは、マンノース受容体を介して抗原提示細胞に貪食され、MHCクラスI又はII分子を介して抗原を提示することにより、細胞性免疫を誘導することができる。
【０００８】
本発明者らは、上記のマンノトリースを表面に有するリポソームにネオスポラ原虫由来のタンパク質であるDense granule protein 7（GRA7）又はApical membrane antigen 1（AMA1）を封入した、ネオスポラ原虫に対するワクチン製剤を提唱している（特許文献２）。
【０００９】
細胞性免疫はTh1細胞が産生するIFN-γ、IL-2等のTh1サイトカインによりマクロファージや細胞傷害性T細胞が活性化されて誘導されるのに対し、液性免疫はTh2細胞が産生するIL-4、IL-10等のTh2サイトカインによりB細胞の形質細胞への分化や抗体産生が促進されて誘導される。生体内でTh1細胞による免疫応答（Th1型反応）とTh2細胞による免疫応答（Th2型反応）は相互に制御し合って平衡関係を維持しており、細胞性免疫の誘導が望まれる場合、平衡状態をTh1側にシフトさせることが重要であると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平７−１２６１８５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／３２４０８号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Dubey et al., Clinical Microbiology Reviews, 2007, 20:323-367
【非特許文献２】Ramamoorthy et al., Int. J. Parasitol., 2007, 37:1531-1538
【非特許文献３】Nishikawa et al., Vaccine, 2001, 19:1710-1716
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ウシ等の家畜の体内のTh1型反応とTh2型反応のバランスをTh1側にシフトさせることができる、安全なワクチン製剤を提供することを目的とする。さらに本発明は、ネオスポラ原虫感染に対して効果的な免疫応答、特に細胞性免疫を誘導し得る、安全なワクチン製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合するオリゴ糖を表面に有するリポソームにネオスポラ原虫由来のシクロフィリン（Neospora caninum cyclophilin、NcCypと略すことがある）を封入して生体に投与することで、Th1サイトカインがTh2サイトカインよりも優位に産生され、ネオスポラ原虫に対する細胞性免疫が優位に誘導されることを見いだし、以下の各発明を完成した。
【００１４】
（１）ネオスポラ原虫由来のシクロフィリン又はその免疫原性を保持した変異体若しくは誘導体が封入された、抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合し得るオリゴ糖を表面に有するリポソームを含む、ネオスポラ原虫感染症に対するワクチン製剤。
（２）変異体が、シクロフィリンを構成するアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、ネオスポラ原虫に対する免疫応答を誘導し得るタンパク質である、（１）に記載のワクチン製剤。
（３）誘導体が、シクロフィリン若しくはその変異体のアミノ酸残基の1若しくは数個が化学修飾されたタンパク質、シクロフィリン若しくはその変異体と他のポリペプチドとの融合タンパク質、及びシクロフィリン若しくはその変異体が血中滞留性を高める高分子で修飾されたタンパク質よりなる群から選択され、かつネオスポラ原虫に対する免疫応答を誘導し得るタンパク質である、（１）に記載のワクチン製剤。
（４）シクロフィリンが、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、（１）〜（３）のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
（５）前記抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子がマンノース・レセプターである、（１）〜（４）のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
（６）前記オリゴ糖が2〜11の糖残基からなる、（１）〜（５）のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
（７）前記オリゴ糖が3〜5の糖残基からなる、（１）〜（６）のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
（８）前記オリゴ糖が2以上のマンノース糖残基を含むものである、（１）〜（７）のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
（９）さらに製薬上許容し得る担体を含む、（１）〜（８）のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
（１０）皮下、皮内、経口又は経鼻投与されるものである、（９）に記載のワクチン製剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明で提供されるワクチン製剤は、Th1型反応とTh2型反応のバランスをTh1側にシフトさせ、ネオスポラ原虫感染に対して免疫応答、特に細胞性免疫を誘導することができることから、ネオスポラ感染症に対して高い予防効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】リポ多糖（LPS）、シクロフィリン（NcCyp）又はシクロフィリンを封入したリポソーム（NcCyp-OML）を導入したRAW264.7細胞株（NF-kB/SEAP）が産生するアルカリフォスファターゼ量を示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表される。図中、*は未処理群（mock）に対して有意差（*: p < 0.05、**: p < 0.01、***: p < 0.001）があることを示す。
【図２】LPS、NcCyp又はNcCyp-OMLを導入したマウス腹腔由来マクロファージが産生するIL-12 p40量を示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表される。図中、異なるアルファベットは群間に有意差があることを示す。
【図３】NcCyp又はNcCyp-OMLを免疫したマウスにネオスポラ原虫を接種したときの、血清中NcCyp特異的IgG1抗体（左図）及びIgG2a抗体（右図）濃度を示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表される。図中、*は同一群内で免疫前（0日）との有意差（p < 0.05）があることを示し、また異なるアルファベットは採材日が同一のサンプル間で有意差があることを示す。
【図４】NcCyp又はNcCyp-OMLで免疫したマウスから採取した脾臓細胞にコンカナバリンA、ネオスポラ原虫ライセート（NLA）又はNcCypを加えて培養したときの、脾臓細胞の増殖（パネルA）及び培養上清中のIFN-γ産生量（パネルB）を示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表される。図中、#は同一接種群内で陰性対照（Medium）との有意差（p < 0.05）があることを示し、また異なるアルファベットは同一の抗原刺激間で有意差があることを示す。
【図５】NcCyp又はNcCyp-OMLで免疫したマウス（パネルA）、NcGRA7、M3-NcGRA7又はM3-GSTで免疫したマウス（パネルB）、NcAMA1、M3-NcAMA1又はM3-GSTで免疫したマウス（パネルC）から採取した脾臓細胞をそれぞれに対応する抗原刺激下で培養したときの、培養上清中のIFN-γ産生量とIL-4産生量の比を示すグラフである。
【図６】NcCyp又はNcCyp-OMLで免疫したマウスにネオスポラ原虫を接種したときのマウスの生存曲線（パネルA）、臨床スコア（パネルB）、脳組織中の原虫量（パネルC）を示すグラフである。パネルBの結果は平均値±標準誤差で表される。図中、*はPBS投与群に対して有意差（p < 0.05）があることを示す。
【図７】NcCyp又はNcCyp-OMLで免疫したマウスにネオスポラ原虫を接種したときのC57BL/6マウス（パネルA）及びTLR2 KOマウス（パネルB）の生存曲線を示すグラフである。図中、*はPBS投与群に対して有意差（p < 0.05）があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ネオスポラ原虫由来のシクロフィリン又はその免疫原性を保持した変異体若しくは誘導体が封入された、抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合し得るオリゴ糖を表面に有するリポソーム製剤を含む、ネオスポラ原虫感染症に対するワクチン製剤に関する。
【００１８】
ネオスポラ原虫由来のシクロフィリン（Neospora caninum cyclopilin, NcCyp）
NcCypは、peptidyl-prolyl cis-trans isomerase （PPIase）活性及び免疫抑制剤であるシクロスポリン（cyclosporine）への結合能を有するタンパク質であり、感染した宿主のIFN-γ産生を促す主要な成分であることが知られている（Tuo et al., Infect Immun., 2005, 73(8): 5093-5100.）。
【００１９】
NcCypのアミノ酸配列や、これをコードする遺伝子のORF配列はすでに公知であり、それぞれ公共のデータベースであるGenBankにACCESSION No. XP_003880037.1
（アミノ酸配列）、ACCESSION No. XM_003879988（塩基配列）として登録されている。シグナル配列を含まないNcCypのアミノ酸配列を配列番号１に、これをコードするDNAの塩基配列を配列番号２、シグナル配列を含むNcCypのアミノ酸配列を配列番号３に、これをコードするDNAの塩基配列を配列番号４にそれぞれ示す。
【００２０】
本発明において、NcCypの他に、NcCypの免疫原性を保持した、すなわちネオスポラ原虫に対して免疫応答を誘導することができるNcCypの変異体又は誘導体も、リポソームに封入されるタンパク質として利用することができる。
【００２１】
変異体の例としては、NcCypのアミノ酸配列において１又は数個の、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜５個、最も好ましくは２〜３個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、かつNcCypの免疫原性を保持したタンパク質を挙げることができる。
【００２２】
置換はいわゆる保存的置換が好ましく、そのような例としては、グリシン（Gly）とプロリン（Pro）、グリシンとアラニン（Ala）又はバリン（Val）、ロイシン（Leu）とイソロイシン（Ile）、グルタミン酸（Glu）とグルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）とアスパラギン（Asn）、システイン（Cys）とスレオニン（Thr）、スレオニンとセリン（Ser）又はアラニン、リジン（Lys）とアルギニン（Arg）等のアミノ酸の間での置換を挙げることができる。
【００２３】
また、NcCypのアミノ酸配列と、例えばBLASTの初期条件パラメーターを用いて同一性を計算したときに、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％、98％若しくは99％以上の同一性を有しているアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつネオスポラ原虫に対して免疫応答を誘導することができるものもNcCypの変異体に含まれ、リポソームに封入されるタンパク質として利用することができる。
【００２４】
また、NcCyp若しくはその変異体のアミノ酸残基の1若しくは数個を化学修飾したタンパク質、NcCyp若しくはその変異体と他のポリペプチドとの融合タンパク質、又はNcCyp若しくはその変異体をポリエチレングリコール（PEG）等の血中滞留性を高める高分子で修飾したタンパク質であって、かつネオスポラ原虫に対して免疫応答を誘導することができるものも、NcCypの誘導体として、リポソームに封入されるタンパク質として利用することができる。
【００２５】
NcCypsの調製
NcCypは、ネオスポラ原虫から公知の手段によって単離、精製したものを使用してもよいが、大腸菌その他の微生物、昆虫細胞又は動物細胞を宿主細胞とした組換えタンパク質の生産方法によって調製される組換えNcCypを使用することが好ましい。組換え遺伝子の構築、宿主細胞への発現ベクターの導入、宿主細胞での目的タンパク質の発現その他の遺伝子工学的手法は、種々の遺伝子組換え操作を詳細に解説した実験操作マニュアル書の指示に基づいて行うことができる。
【００２６】
NcCyp、その変異体又は誘導体（以下、纏めてNcCypsと表す）をコードするDNAは、NcCypsの組換え生産のため、適当な発現ベクターに組み込むことができる。NcCypsをコードするDNAを有する組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。また、かかる組換えベクターは、NcCypsをコードする塩基配列に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列の例は、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチド等のペプチドや他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリA付加配列、スプライシング配列、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等である。
【００２７】
遺伝子組換えに際しては、適当な合成DNAアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンをNcCypsをコードするDNAに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生又は消失させたりすることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、当業者はNcCypsをコードするDNAを任意かつ容易に加工することができる。
【００２８】
またNcCypsをコードするDNAを保持する発現ベクターとしては、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択することができ、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であるが、微生物、特にエシェリヒア属等の細菌を用いた宿主発現系に利用可能なベクターを用いることが好ましい。
【００２９】
NcCypsは、NcCyp遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。あるいは、NcCypsをコードする塩基配列の上流に別の適当な発現プロモーターを連結して使用することもできる。その様な発現プロモーターは、宿主に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主がエシェリヒア属細菌、好ましくは大腸菌である場合にはT7プロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、λPLプロモーター等を、宿主がバチルス属細菌、好ましくはB. subtillisである場合にはP43プロモーター，vegIプロモーター，xylose―inducible プロモーター，tetracycline inducible プロモーター等を挙げることができる。また、宿主が酵母である場合にはPHO5プロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター等を、宿主が動物細胞である場合にはSV40由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。
【００３０】
宿主細胞の例としては、エシェリヒア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、エルウィニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属及びロドバクター（Rhodobacter）属等の細菌、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ザイモモナス（Zymomonas）属及びサッカロミセス（Saccharomyces）属等の真菌を挙げることができる。またカイコ等の昆虫細胞、HEK293細胞、MEF細胞、Vero細胞、Hela細胞、CHO細胞、WI38細胞、BHK細胞、COS-7細胞、MDCK細胞、C127細胞、HKG細胞及びヒト腎細胞株等の動物細胞も利用可能である。
【００３１】
発現ベクターを宿主細胞に導入する形質転換の方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法等を挙げることができる。
【００３２】
NcCypsは、発現ベクターを導入した形質転換細胞を培養し、細胞内でタンパク質を発現させ、細胞又は培地から目的とするタンパク質を回収し、精製することによって得ることができる。形質転換細胞の培養は、炭素資化性や栄養要求性等の宿主細胞の性質、導入した組換え遺伝子に含まれる選択マーカー、プロモーター等に応じて常法に従って行えばよい。
【００３３】
NcCypsの精製は、タンパク質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー等の通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりHPLCシステム等を使用して適当な順序で精製を行えばよい。
【００３４】
また、NcCypsを他の機能性タンパク質又はペプチドとの融合タンパク質として発現させた場合には、その機能性タンパク質又はペプチドに特徴的な精製法を採用することが好ましい。かかる機能性タンパク質又はペプチドとそれに対応した精製法としては、6〜10個程度の連続するヒスチジン残基からなるヒスチジンタグとニッケル固定化アフィニティークロマトグラフィー、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）とグルタチオン固定化アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。精製された融合タンパク質を適当なプロテアーゼ（トロンビン、トリプシン等）を用いて切断することで、NcCypsを回収することができる。
【００３５】
さらに、組換えDNA分子を利用した無細胞系の合成方法も、遺伝子工学的な生産方法の１つである。
【００３６】
NcCypsは、例えばFmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やtBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の有機化学的合成方法により、市販の適当なペプチド合成機を用いて生産することもできるが、遺伝子組換え技術によって、前記の核酸、特に発現ベクターに組み込まれたDNAを原核生物又は真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた好適な発現系に導入することによって生産することが好ましい。
【００３７】
リポソーム及びその調製
本発明において使用されるリポソームは、抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合し得るオリゴ糖を表面に有するリポソームである。かかるリポソームは、特開平7-126185、US5759572、WO2010/32408、US2011/0250265及びUS8821882に、その構成及び製造方法とともに記載されている。これらの文献は、その全体が参照により本願明細書に組み入れられる。
【００３８】
「抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子」とは、マクロファージ、樹状細胞等の抗原提示細胞の表面に存在するFcレセプター、補体レセプター、スカベンジャーレセプター、マンノース・レセプター、リポ多糖（LPS）レセプター、CD11b/CD18（CR3）、Toll様レセプター等の、糖鎖を介する細菌等の貪食、外来異物中の糖タンパク質の取り込み及び細胞表面への抗原提示に直接的又は間接的に関与している糖鎖結合性のレクチン様の性質を有する分子全般を意味する。その好適な例は、マンノース・レセプターである。
【００３９】
リポソーム表面のオリゴ糖は、上述の抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子と結合可能なものであれば特に限定されない。構成糖残基としては、D-マンノース（D-Man）、L-フコース（L-Fuc）、D-アセチルグルコサミン（D-GlcNAc）、D-グルコース（D-Glc）、D-ガラクトース（D-Gal）、D-アセチルガラクトサミン（D-GalNAc）、D-ラムノース（D-Rha）等を挙げることができるが、D-Manを含むオリゴ糖、例えばD-Manのみからなるオリゴ糖又はD-ManとD-GlcNAcとからなるオリゴ糖が好ましく、特にD-Manのみからなるオリゴ糖が好ましい。D-Manのみからなるオリゴ糖としては、マンノビオース（Man2）、マンノトリオース（Man3）、マンノテトラオース（Man4）、マンノペンタオース（Man5）、マンノヘキサオース（Man6）、マンノヘプタオース（Man7）を挙げることができる。
【００４０】
オリゴ糖を構成する各糖残基の結合様式は特に限定されず、α1→2結合、α1→3結合、α1→4結合、α1→6結合、β1→4結合等を挙げることができ、また直鎖状に結合していても分岐状に結合していてもよい。
【００４１】
オリゴ糖を構成する糖残基の数は２〜１１個が好ましく、特に３〜１１個、なかでも３〜５個程度が好ましい。
【００４２】
本発明におけるリポソームを構成する脂質は、リポソームを構成することが知られている通常の脂質であればよく、例えば、飽和又は不飽和のアシル基を有する脂肪酸類、リン脂質類、ステロール類等を挙げることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチン等の天然物由来のリン脂質を含んでいてもよい。これらは単独で、又は二種以上を組み合せて使用することができる。
【００４３】
脂肪酸及びリン脂質等における脂肪酸残基は任意に選択することができる。好ましい脂肪酸又は脂肪酸残基としては、炭素数４〜３０の飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸、より好ましくはラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等の炭素数１２〜２４の飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等の炭素数１４〜２２、不飽和結合１〜６の不飽和脂肪酸を挙げることができる。これらは単独で、又は混合して利用することができ、また二以上の脂肪酸残基を有する脂質においてはそれらの基は同一又は異なっていてもよい。
【００４４】
リン脂質の好適な例としては、ホスファチジルエタノールアミン（PA）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）等のホスファチジルエタノールアミン類；ホスファチジルセリン（PS）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（DPPS）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）等のホスファチジルセリン類；ホスファチジルコリン（PC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）等のホスファチジルコリン類；ホスファチジン酸（PA）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）等のホスファチジン酸類等が挙げられる。
【００４５】
ステロール類としては、コレステロール（Chol）、3β-[N-（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（DC-Chol）、N-(トリメチルアンモニオエチル）カルバモイルコレステロール（TC-Chol）等を挙げることができる。 
【００４６】
リポソーム表面へのオリゴ糖の導入は、上記オリゴ糖と脂質を結合して調製した人工糖脂質をリポソームの構成脂質として用いることで行うことができる。人工糖脂質は、オリゴ糖が有するアルデヒド基を、アミノ基を有するリン脂質と反応させてシッフ塩基を形成し、次にこのシッフ塩基を、常法に従い還元、好ましくは化学還元、例えばNaBH3CNにより還元することにより、オリゴ糖と脂質とを結合して調製することができる（例えば水落次男、糖質工学、224-232頁、1992）。リポソーム表面におけるオリゴ糖は、抗原提示細胞表面に存在する糖鎖認識分子又はその一部を添加したときにリポソームの凝集反応が生じることで確認することができる。リポソーム表面に導入されるオリゴ糖の量は、リポソーム構成脂質1mgに対して0.5μg〜500μgであればよい。
【００４７】
リポソームに封入されるNcCyps量は特に限定されず、投与経路に応じて適宜調節可能であるが、一般的にリポソームに用いる脂質1mgに対して0.1μg〜500μgであることが望ましい。
【００４８】
リポソームへのNcCypsの封入は、脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒にNcCypsを溶解することで行うことができる。例えば、前述のリポソームの脂質膜を構成する脂質及び人工糖脂質をクロロホルム等の有機溶媒で溶解後、有機溶媒を留去した乾燥物に、NcCypsを含む水性溶媒を添加した後、超音波処理又はボルテックス等による乳化を行うことでNcCypsが封入されたリポソームを調製することができる。この他にも、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等によっても調製することができる。また、NcCypsに加えて、ネオスポラ原虫の感染予防又は治療等に有用な薬物、核酸、ペプチド、タンパク質又はこれらの複合体等を併せて封入することができる。
【００４９】
本発明におけるリポソームは、脂質二重層で構成される脂質膜を有する閉鎖小胞である限り、脂質膜の数は特に限定されず、多重膜リポソーム（multi lamella vesicle）であっても、また一枚膜リポソーム（uni lamella vesicle）であってもよい。また、リポソームの平均粒径に特に限定はなく、例えば所望の孔サイズのフィルターによる濾過を繰り返す等により平均粒径を調整することができる。
【００５０】
ワクチン製剤
本発明のワクチン製剤は、上記のリポソームを生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の適当な水性溶媒に分散させた分散液の形態で使用することができる。分散液には、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤、アルブミン又はカゼイン等のタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳等のタンパク質含有物質等の、製薬上許容される担体や添加剤を適宜添加されていてもよい。本発明のワクチン製剤は、上記の分散液を凍結乾燥等した乾燥製剤の形態で利用することもできる。
【００５１】
本発明のワクチン製剤は、所望によりアジュバント等を含有し得る。アジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、サポニン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、N-アセチルムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン（thr-MDP）、N-アセチルノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（CGP11637、nor-MDP）、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1’-2’-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン（CGP19835A、MTP-PE）等を挙げることができるが、これらには限定されない。
【００５２】
本発明のワクチン製剤の投与方法は特に制限はないが、皮下注射、静脈内注射又は筋内注射による投与が好ましい。
【００５３】
投与量は、通常、１投与当たり抗原を0.01μgから100,000μgまでの範囲で、対象動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ、イヌ等の哺乳動物の種類、その体調、年齢等、また投与経路を考慮して、適宜調節される。
【００５４】
本発明のワクチン製剤は、単独投与スケジュールで、又は好ましくは複合投与スケジュールで与えられ得る。複合投与スケジュールでは、接種の開始時期に１〜１０の個別の投与を行い、続いて免疫応答を維持する及び又は強化するのに必要とされる時間間隔で、例えば２回目の投与として１〜４ヵ月後に、別の投与を行い得る。必要であれば、数ヶ月後に引続き投与を行い得る。投与のレジメもまた、少なくとも部分的には、個体の必要性により決定され、獣医師の判断に依存する。
【００５５】
本発明のワクチン製剤は、ネオスポラ原虫感染の予防を目的に使用してもよいが、ネオスポラ原虫に感染した対象に投与してネオスポラ原虫を排除する治療的ワクチンとしても使用することができる。
【００５６】
したがって、本発明はまた、その必要がある動物に有効量の上記ワクチン製剤を投与することを含む、ネオスポラ原虫感染症を治療及び／又は予防する方法を提供する。さらに本発明は、その必要がある動物に有効量の上記ワクチン製剤を投与することを含む、ネオスポラ原虫に対して特異的な免疫応答を当該動物において惹起させる方法をも提供する。
【００５７】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
実施例１  リポソームの調製
（１）ネオスポラ原虫（Neospora caninum）のゲノムDNAを鋳型とし、シクロフィリン遺伝子（GenBank ACCESSION No. XM_003879988）が増幅されるように設計したプライマーDNAを用いてPCRを行った。増副産物を発現ベクターpGEX-4T1のBamH I と EcoR Iサイトに組み込み、glutathione S-transferase（GST）と配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるNcCypとの融合タンパク質を発現するベクターを構築した。このベクターで大腸菌DH5αを形質転換し、菌体内で融合タンパク質を発現させた。菌体から融合タンパク質を回収し、Glutathione Sepharose 4B（Amersham Pharmacia Biotech）及びDetoxi-GelTM Endotoxin Removing Gel（Pierce）を用いて精製及びエンドトキシン除去を行い、さらにGSTを切断除去して、組換えタンパク質としてNcCyp／リン酸緩衝液を得た。
【００５９】
（２）Manα1→6(Manα1→3)Manという構造を有するマンノトリオース（Man3）2.5〜5mgを600μlの蒸留水に溶解して、オリゴ糖溶液を調製した。クロロホルム／メタノール（1：1体積比）混合液にジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）を5mg/mlの濃度で溶解してDPPE溶液を調製した。また、メタノールにNaBH3CNを10mg/mlの濃度に溶解して、NaBH3CN溶液を調製した。前記オリゴ糖溶液600μlに前記DPPE溶液9.4ml及び前記NaBH3CN溶液1mlを加えて攪拌混合し、60℃にて16時間反応させた。反応混合液をシリカゲルカラム及びC18逆相カラムを通して、マンノトリオースジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（M3-DPPE）を調製した。
【００６０】
（３）10mL容フラスコ中のクロロホルム2mLに、Chol、DPPC及び（２）のM3-DPPEを10：10：1（モル比）で混合溶解した後、クロロホルムを留去して脂質フィルムを作製した。この脂質フィルムに（１）で調製したNcCyp／リン酸緩衝液を1.4 ml（NcCyp含量2.0 mg）加え、40℃の水槽でVortexしてリポソームを調製した。さらに0.2〜1 MPaで加圧しながら1μmのフィルターを5回通過させた後、PBS (-) で3回遠心洗浄して、NcCypが封入されたリポソーム（NcCyp-OML、平均粒径1.0μm）を得た。
【００６１】
実施例２  NcCyp-OMLの免疫誘導能の評価（in vitro）
（１）RAW264.7細胞
NF-κBの活性化によって分泌型アルカリホスファターゼ（NF-kB/SEAP）を産生するマウスマクロファージ様RAW264.7細胞株を10%牛胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地中に2 ×106 cells/mlの濃度に懸濁し、0.1 ml/wellずつ96 well plateに分注した。次いで各ウェルにリポ多糖（LPS）（終濃度50μg/ml、100μg/ml）、NcCyp（終濃度10 nM、100nM）、NcCyp-OML（終濃度10nM、100nM）を加え、37℃、5% CO2下で24時間インキュベートした。インキュベート後の培養上清中の分泌型アルカリホスファターゼ量を、Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Assay Kit（ノバス バイオロジカルス）を用いて測定した。一元配置のANOVAとチューキー・クレーマーの多重比較検定により、測定値の統計解析を行った。
【００６２】
結果を図１に示す。アルカリフォスファターゼ量は未処理群（mock）と比較してNcCyp-OML群で有意に多く、NcCyp-OML添加によるNF-κBの活性化が確認された。
【００６３】
（２）マウス腹腔由来マクロファージ
C57BL/6マウス（オス、8週齢）から常法に従って得たマウス腹腔由来マクロファージを10%牛胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地中に3×106 cells/mlの濃度に懸濁し、0.1 ml/wellずつ96 well plateに分注した。次いで各ウェルにリポ多糖（LPS）（終濃度10 ng/ml）、NcCyp（終濃度10 nM、100nM）、NcCyp-OML（終濃度10 nM、100nM）を加え、37℃、5% CO2下で20時間インキュベートした。インキュベート後の培養上清におけるIL-12 p40濃度を、IL-12 p40 Mouse ELISA Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。一元配置のANOVAとチューキー・クレーマーの多重比較検定により、統計解析を行った。
【００６４】
結果を図２に示す。NcCyp-OMLの添加により、マクロファージからのIL-12p40の産生が誘導された。
【００６５】
以上から、NcCyp-OMLがNcCypよりも強くNFκBを活性化し、マクロファージからの炎症性サイトカインの産生を誘導することが確認された。
【００６６】
実施例３  NcCyp-OMLのNcCyp特異抗体産生誘導能の評価（in vivo）
BALB/cマウス（メス、８週齢）に、NcCyp、NcCyp-OML又はPBSを2週間隔で3回皮下免疫し（1回あたり25 pmolタンパク質）、さらに最終免疫から2週目にネオスポラ原虫（1×106）を腹腔内接種した。それぞれの免疫日の2日前に血清を採取し、NcCyp特異的IgG1及びIgG2a抗体をELISA法により検出した。ELISA法はNcCyp精製組換えタンパク質を抗原とし、一次抗体を100倍希釈マウス血清、２次抗体を4,000倍希釈HRP標識抗マウスIgGおよびIgG2a抗体、ABTSを基質として実施した。1回の実験で1試験区6匹のマウスを使用し、2回の実験で同様の結果を得た。二元配置のANOVAとチューキー・クレーマーの多重比較検定により、測定値の統計解析を行った。
【００６７】
代表的な1回の実験結果を図３に示す。NcCyp-OMLの免疫によりNcCyp特異的IgG1抗体の産生が確認された。また、ネオスポラ原虫感染後である初回免疫後49日目には、PBS投与群と比較して、NcCyp-OML免疫群及びNcCyp免疫群においてNcCyp特異的IgG2a抗体の産生が確認され、NcCyp-OML免疫の方がより多くの抗体産生が誘導された。
【００６８】
以上から、NcCyp-OMLの免疫により、NcCypに対する特異抗体であるTh2型のIgG1抗体とTh1型のIgG2a抗体の両方の産生が誘導されること、NcCypをOMLに封入することにより特異抗体の誘導効率が向上することが示された。
【００６９】
実施例４  NcCyp-OMLのNcCyp特異的サイトカイン産生誘導能の評価（マウス由来脾臓細胞）
（１）脾臓細胞の増殖及びIFN-γ産生
BALB/cマウス（メス、8週齢）に対し、NcCyp、NcCyp-OML、PBSを2週間隔で3回皮下免疫した（1回あたり25 pmolタンパク質）。最終免疫から2週目に脾臓を摘出し、ホモジネートすることで脾臓細胞懸濁液を調製した（5×106 cells/ml RPMI1640培地）。脾臓細胞懸濁液にコンカナバリンA（ConA）（終濃度0.5μg/ml、5μg/ml）、ネオスポラ原虫ライセート（NLA）（終濃度10μg/ml、50μg/ml）、NcCyp（終濃度10μg/ml、50μg/ml）を加えて、又は陰性対照（Medium）として何も加えずに、37℃、5% CO2下で48時間培養した。脾臓細胞の増殖をCell Counting Kit-8 reagent （CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan）を用いて、培養上清中のIFN-γ濃度をIFN-γ Mouse ELISA Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。1試験区4匹のマウスを使用した。二元配置のANOVAとチューキー・クレーマーの多重比較検定により、測定値の統計解析を行った。
【００７０】
結果を図４に示す。NcCyp-OML免疫群由来脾臓細胞はNcCyp刺激下で増殖が亢進し（図４Ａ）、またIFN-γ産生量が増加した（図４Ｂ）。
【００７１】
（２）他のネオスポラ原虫由来抗原封入リポソームとの比較
実施例１と同様の方法で、NcCypに代えてGST融合組換えタンパク質であるネオスポラDense granule protein 7（NcGRA7）を封入したリポソーム（M3-NcGRA7）、GST融合組換えタンパク質であるネオスポラApical membrane antigen 1（NcAMA1）を封入したリポソーム（M3-NcAMA1）を、又はGSTを封入したリポソーム（M3-GST）を調製した。BALB/cマウス（メス、6週齢）に対し、NcGRA7、M3-NcGRA7、NcAMA1、M3-NcAMA1、PBSを2週間隔で3回皮下免疫した（1回あたり25 pmolタンパク質）。最終免疫から2週目に脾臓を摘出し、ホモジネートすることで脾臓細胞懸濁液を調製した（5×106 cells/ml RPMI1640培地）。脾臓細胞懸濁液にコンカナバリンA（ConA）（終濃度２μg/ml）、ネオスポラ原虫ライセート（NLA）（終濃度50μg/ml）、NcGRA7（終濃度10μg/ml）、NcAMA1（終濃度10μg/ml）を加えて、又は陰性対照（Medium）として何も加えずに、37℃、5% CO2下で48時間培養した後、培養上清中のIFN-γ濃度を（１）と同様に測定した。培養上清中のIL-4濃度はIL-4 Mouse ELISA Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。
【００７２】
免疫した抗原間の比較のため、上記のIFN-γ濃度及びIL-4濃度の測定値、並びに（１）で測定したIFN-γ濃度及びIL-4濃度の測定値を、CoA刺激下での対応する測定値で除算して内部補正を行い、Th1反応指向性を表すIFN-γ/IL-4の値を算出した。
【００７３】
結果を図５に示す。M3-NcGRA7（図５Ｂ）又はM3-NcAMA1（図５Ｃ）を免疫した場合と比較して、NcCyp-OMLを免疫したマウスの脾臓細胞は、NcCyp及びNLAの抗原刺激に対して高いIFN-γ/IL-4値を示した（図５Ａ）。
【００７４】
以上から、NcCyp-OMLは、既存のOMLワクチンと比較して、Th1型反応とTh2型反応のバランスをTh1側にシフトさせる能力が高いことが示された。
【００７５】
実施例５  感染マウスモデルにおけるNcCyp-OMLの有効性の評価
BALB/cマウス（メス、８週齢）に対し、NcCyp、NcCyp-OML又はPBSを2週間隔で3回皮下免疫し（1回あたり25 pmolタンパク質）、さらに最終免疫から２週目にネオスポラ原虫（1×106）を腹腔内接種した。ネオスポラ原虫感染後-2から32日まで、マウスの臨床スコアを評価した。臨床スコアは身体的症状、行動、神経症状、脱水・食欲減退、その他の5項目に関しての合計値を用いた（Reichel and Ellis, Int J Parasitol 2009, 39:1173-1187）。また、感染後32日目に生存マウスの脳組織を採材し、脳組織DNAの50ngあたりに含まれる原虫量を定量した（Abe et al., Parasit Vectors. 2015, 6;8:5）。1回の実験で1試験区6匹のマウスを使用し、合計2回の実験結果を示した（1試験区12匹のマウス）。感染後32日目のマウス生存率をLog-rank（Mantel-Cox）testにより、臨床スコアを二元配置のANOVAとBonferroniの多重比較検定により、感染後32日目の生存マウス脳組織中の原虫量を一元配置のANOVAとチューキー・クレーマーの多重比較検定により統計解析した。
【００７６】
感染後32日間のマウスの生存曲線を図６Ａに示す。NcCyp免疫群とNcCyp-OML免疫群では、PBS投与群に対して有意に高い生存率が確認された。
【００７７】
また、マウスの臨床スコアを図６Ｂに示す。NcCyp免疫群とNcCyp-OML免疫群では、PBS投与群に対して臨床スコアが有意に低く、NcCyp又はNcCyp-OML免疫による臨床症状の抑制効果が確認された。
【００７８】
さらに、感染後32日目の生存マウス脳組織中の原虫量を図６Ｃに示す。NcCyp-OML免疫群では、PBS投与群に対して原虫量が有意に少なかった。
【００７９】
以上から、NcCyp-OMLは、ネオスポラ原虫感染症に対して有効であることが示された。
【００８０】
実施例６  TLR2 KOマウスにおけるNcCyp-OMLの有効性の評価
C57BL/6マウス及びToll-like receptor 2遺伝子を欠損したTLR2 KOマウス（オス、８週齢）に対し、NcCyp、NcCyp-OML又はPBSを2週間隔で3回皮下免疫し（1回あたり25 pmolタンパク質）、さらに最終免疫から２週目にネオスポラ原虫（1×106）を腹腔内接種した。1回の実験で1試験区8匹のマウスを使用した。感染後70日目のマウス生存率をLog-rank（Mantel-Cox）testにより統計解析した。
【００８１】
感染後70日間のC57BL/6マウスの生存曲線を図７Ａに、TLR2 KOマウスの生存曲線を図７Ｂに示す。C57BL/6マウスの場合、NcCyp-OML免疫群でPBS投与群に対して有意に高い生存率が確認された。一方、TLR2 KOマウスの場合、NcCyp-OML免疫群とPBS投与群との間に有意差は認められなかった。
【００８２】
以上から、NcCyp-OMLによる防御免疫の誘導には、TLR2が必要であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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