(57)【要約】      （修正有）【課題】肌細胞増殖作用、ヒアルロン酸及びＩ型コラーゲン産生を促進作用、保湿作用等を有し、肌荒れ、シワ、肌の弾力等の改善作用、メラニン生成抑制作用、色素沈着改善作用等に優れたアラビノガラクタンプロテイン（ＡＧＰ）の簡便な入手方法の提供。【解決手段】発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出した樹液である、アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液、及び前記水溶液を乾燥して得られる粉体。前記樹液を採取する採取工程と、前記ブドウ樹液と尿糖試験紙とを接触させる接触工程と、前記尿糖試験紙の呈色に基いてブドウ樹液を回収するか回収しないかを判断する選別工程と、前記工程においてブドウ樹液を回収すると判断した場合にブドウ樹液を回収する回収工程とを含む、アラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出した樹液である、アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液。
【請求項２】
請求項１に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液を乾燥してなるアラビノガラクタンプロテイン含有粉体。
【請求項３】
請求項１に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液または請求項２に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有粉体を含む化粧品組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液または請求項２に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有粉体を含む機能性食品。
【請求項５】
発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出したブドウ樹液を採取する採取工程と、
前記ブドウ樹液と尿糖試験紙とを接触させる接触工程と、
前記尿糖試験紙の呈色に基いてブドウ樹液を回収するか回収しないかを判断する選別工程と、
回収すると判断した場合にブドウ樹液を回収する回収工程と
を含む、アラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法。
【請求項６】
請求項５に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法の各工程と、
回収したブドウ樹液から、前記アラビノガラクタンプロテインよりも低分子量の成分の少なくとも一部を除去する低分子量成分除去工程と
を含む、アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法の各工程と、
低分子量成分を除去して得られたアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液を乾燥し、粉体化する粉体化工程と
を含む、アラビノガラクタンプロテイン含有粉体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液、アラビノガラクタンプロテイン含有粉体、化粧品組成物、機能性食品、アラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法、アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法、およびアラビノガラクタンプロテイン含有粉体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブドウの木は、春先、地温が上昇すると根が盛んに水を吸い上げ、水分および養分を枝の隅々にまで行き渡らせてみずみずしく再生する。このとき、ブドウの木の剪定された枝の切り口から樹液が流れ出る。この現象は、１週間から３週間続き、ブドウの木は樹液中の水分および養分で甦り、発芽することとなる。
【０００３】
ブドウの木の剪定された枝の切り口から溢出するブドウ樹液には、ブドウ糖、ショ糖および果糖等の糖類、リンゴ酸、酒石酸およびクエン酸等の有機酸、スレオニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸等のアミノ酸、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム等のミネラル、ならびにイノシトール（ビタミンＢ群）等のビタミンなどが含まれることが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
ところで、肌の最上部に位置する角質層には、天然保湿因子（ＮＭＦ：Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）と呼ばれる各種糖、アミノ酸およびミネラル等からなる親水性の吸湿成分が存在し、皮膚の水分を保持している。ブドウ樹液は、この皮膚の保湿機能を支えるＮＭＦと同様の成分を数多く含み、さらに、肌と同じ弱酸性であるため、肌に対する浸透性が優れている。
【０００５】
そのため、ブドウ樹液を化粧水として、または他の基礎化粧品の素材として用いることにより、皮膚が本来持っている保湿機能を補強し、皮膚への負担が少ない、自然な使用感を与える化粧料を得ることができる（特許文献１）。
【０００６】
さらに、ブドウ樹液は、コラーゲンを生産する主な細胞のひとつである線維芽細胞賦活作用を有すること（特許文献２）、および皮膚のバリア機能維持に最も重要なセラミド合成系酵素を亢進することによってセラミド合成を高めること（特許文献３）も知られている。
【０００７】
また、枝の太さ、樹液が溢出する切口の位置および形状が木ごとに異なるブドウの木からブドウ樹液を効率的に採取し、かつ、採取したブドウ樹液の品質劣化を抑制することができるブドウ樹液の採取装置および採取方法が提案されている（特許文献４）。
【０００８】
また、ブドウ樹液中には、上記成分以外にも数多くの化合物が含まれ、これらに起因すると考えられる濁り、沈殿および着色が問題になっていたが、これらの問題は、加熱処理または清澄処理により解決することができることが知られている（特許文献５）。
【０００９】
一方、近年、肌の細胞の増殖や、ヒアルロン酸、Ｉ型コラーゲンの産生を促し、なおかつそれ自体高い保水能力を持ち、肌荒れ、シワ、肌の弾力、メラニン生成抑制作用や色素沈着改善作用も確認され、若々しい肌を保つ作用効果があるとして、プロテオグリカンが着目されている。
【００１０】
プロテオグリカンはコアプロテインにコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等のグリコサミノグリカンとよばれる糖鎖が結合した、糖タンパク質の一種である。
従来、プロテオグリカンは、サケの鼻軟骨（氷頭）から抽出して得られ、化粧品や健康食品の原料に使われてきたが、抽出工程が複雑であり、得られる量も限られることから、ＰＧを安価に供給することができなかった。
【００１１】
動物由来のプロテオグリカンの他に植物由来のプロテオグリカンも知られており、コアプロテインにアラビノース、ガラクトース等のアラビノガラクタンとよばれる糖鎖が結合した構造を有することから、アラビノガラクタンプロテインと呼ばれている。アラビノガラクタンプロテインは、サケの鼻軟骨（氷頭）由来のプロテオグリカンと同様の機能性を持つとされている。なお、アラビノガラクタンプロテインはプロテオグリカンの下位概念であり、プロテオグリカンはグリコプロテインの下位概念である。
【００１２】
アラビノガラクタンプロテインは、単子葉、双子葉植物を問わず、高等植物各組織に普遍的に存在し、細胞膜や細胞壁に局在していることが知られている（非特許文献２）。また、アラビノガラクタンプロテインは、植物の種類によって、分子量、糖鎖（アラビノガラクタン）の糖組および構造などが異なることが知られている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平１０−０４５５６４号公報
【特許文献２】国際公開第２００７／０４６３５３号
【特許文献３】国際公開第２００８／０５３９６０号
【特許文献４】特開平１０−２９５２０７号公報
【特許文献５】特開平１１−１３９９５０号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】今村一幸，ブドウの木液の秘密，現代農業，２００４年３月１日，第８３巻，第３号，５８−６１頁
【非特許文献２】円谷陽一，植物のアラビノガラクタン−プロテインの構造と関連酵素，ＣＡＣＳ  Ｆｏｒｕｍ，埼玉大学研究機構  科学分析支援センター，２０１４年１２月，第５号，２−１０頁
【非特許文献３】小崎誠，アラビノガラクタンの構造とその生理機能−機能性アラビノガラクタンと農産物由来アラビノガラクタンの構造比較−，応用糖質科学，応用糖質科学会，２０１１年７月２０日，第１巻，第３号，２３８〜２４３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ブドウ樹液中にもアラビノガラクタンプロテインが存在することは予想されたが、植物体のアラビノガラクタンプロテイン含有量は一般的に少ないことから（円谷，２０１４）、ブドウ樹液中のＡＧＰも同様に少ないことが予想され、ＡＧＰを高濃度で含むブドウ樹液を得ることは不可能だと思われていた。
【００１６】
本発明は、上記事情に鑑みて、アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液を簡易に得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねたところ、春先の発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出した樹液（導管液）は、高濃度のアラビノガラクタンプロテインを含むこと、さらに、尿糖試験紙を用いると、意外にも、高濃度のアラビノガラクタンプロテインを含むブドウ樹液を選択的に得られることを知得し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下に掲げるものである。
【００１８】
［１］  発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出した樹液である、アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液。
［２］  上記［１］に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液を乾燥してなるアラビノガラクタンプロテイン含有粉体。
［３］  上記［１］に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液または上記［２］に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有粉体を含む化粧品組成物。
［４］  上記［１］に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液または上記［２］に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有粉体を含む機能性食品。
［５］  発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出したブドウ樹液を採取する採取工程と、
前記ブドウ樹液と尿糖試験紙とを接触させる接触工程と、
前記尿糖試験紙の呈色に基いてブドウ樹液を回収するか回収しないかを判断する選別工程と、
回収すると判断した場合にブドウ樹液を回収する回収工程と
を含む、アラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法。
［６］  上記［５］に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法の各工程と、
回収したブドウ樹液から、前記アラビノガラクタンプロテインよりも低分子量の成分の少なくとも一部を除去する低分子量成分除去工程と
を含む、アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法。
［７］  上記［６］に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法の各工程と、
低分子量成分を除去して得られたアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液を粉体化処理する粉体化工程と
を含む、アラビノガラクタンプロテイン含有粉体の製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液を簡易に得ることが可能となる。
【００２０】
ブドウ樹液は、春先の発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝から自発的に流出するものであり、回収して利用しなければ、何ら役立つことなく流出して散逸するだけである。本発明は、このようなブドウ樹液中にアラビノガラクタンプロテインが高濃度で含まれることを知見し、化粧品または機能性食品の用途があることを見出したものである。
【００２１】
本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液は、春先の発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出した樹液（導管液）である。春先の発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝からは、ブドウ樹液（導管液）が自発的に流出するため、流出したブドウ樹液を回収することにより、容易に得ることができる。そのため、ブドウの果実その他の植物体から抽出するよりも、はるかに簡易に、かつ、低コストで、ブドウ由来のアラビノガラクタンプロテインを高濃度で含む水溶液を得ることができる。この水溶液中に含まれるブドウ樹液由来のアラビノガラクタンプロテインは、本明細書の実施例で示されるように、従来知られていなかった新規なアラビノガラクタンプロテインであり、ブドウ果実由来の既知のＡＧＰとは、少なくとも、糖鎖の糖組成が相違している。
【００２２】
本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有粉体は、上述した本発明アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液を乾燥して得られる粉体である。本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有粉体は、防腐剤無添加でも保存が効き、取扱いも容易である。
【００２３】
本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法は、高濃度のアラビノガラクタンプロテインを含むブドウ樹液を簡易な方法で得ることができ、経済的かつ効率的である。
【００２４】
本発明は、これらの効果のうち少なくとも一つの効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ブドウ樹液由来アラビノガラクタンプロテインの糖鎖構造モデル（予想）を表す図である。
【図２】図２は、実施例および比較例における保湿性の評価を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明について詳細に説明する。
以下、アラビノガラクタンプロテインを「ＡＧＰ」、アラビノガラクタンを「ＡＧ」と略基する場合がある。
なお、本明細書において「〜」を用いて表される範囲は、その範囲に「〜」の前後に記載された両端を含む範囲を意味する。
【００２７】
［アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液］
本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液は、発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出した樹液（導管液）である。
【００２８】
本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液を得る方法は、特に限定されないが、後述するアラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法が好ましい。
【００２９】
本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液は、上記アラビノガラクタンプロテインよりも低分子量の成分の少なくとも一部を除去する低分子量成分除去処理を施してもよい。ここで、低分子量成分は、ブドウ樹液中に含まれるアラビノガラクタンプロテインよりも低分子量の成分であれば特に限定されないが、例えば、遊離アミノ酸、有機酸類、糖類およびミネラル類が挙げられる。
【００３０】
また、低分子量成分の少なくとも一部を除去する方法としては、透析処理、限外ろ過処理、精密ろ過処理、またはゲルろ過などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
［アラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法］
春先の発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出する樹液（導管液）の回収方法は、特に限定されないが、以下に説明するアラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法が好ましい。
【００３２】
ブドウ樹液が、春先、剪定された枝の切口から溢出し、採取できる期間は、ブドウの木が冬の休眠期を終え、根が盛んに水を吸い上げ始める樹液流動から萌芽前までの２〜３週間程である。
【００３３】
しかし、その時期の気温、降雨状況、畑の地形、土壌、および栽培品種（巨峰、甲州、甲斐路またはデラウエア等）により、それぞれのブドウの木で樹液溢出開始のタイミングおよび溢出状況（連続的か断続的か、溢出量の多少等）が異なっており、それに合わせてブドウ樹液の品質が大きく異なる。
【００３４】
例えば、採取期間中、ブドウ樹液が連続的に溢出することもあるが、春先の寒の戻りで気温が下がり溢出が止まったり、次に暖かくなって再び溢出が始まったりすることもあり、必ずしも一定量が一定期間に溢出してくるものではない。
【００３５】
またブドウ樹液の元は、ブドウの木が土壌中から吸収した水分、ミネラル分および根などに蓄えられた栄養成分であるため、降雨量および根が生育する土壌によっても、溢出してくるブドウ樹液の量や質に違いが生じる。
【００３６】
日本一のブドウ産地である山梨で採取した経験では、川沿いの水はけの良い砂礫状地と山手の水持ちのよい粘土質状地で比較した場合、一般的に、砂礫状地の方が樹液溢出開始時期は早いが、溢出期間は短く、量も少ない。
【００３７】
本発明の回収方法によれば、尿糖試験紙を用いることにより、ＡＧＰ濃度が高いブドウ樹液を選択的に回収することができ、しかも、簡易であるから、経済的かつ効率的である。
【００３８】
尿糖試験紙はブドウ樹液中のグルコース濃度を測定するものであり、ＡＧＰ濃度を測定するものではないが、尿糖試験紙の呈色を指標として、ブドウ樹液中のＡＧＰ濃度を測定できる。いまのところ、ブドウ樹液中のＡＧＰ濃度を測定する方法は、ブドウ樹液採取の現場で実施できるほど簡易なものは、知られていない。
【００３９】
本発明者は、グルコース濃度の基準を、５０ｍｇ／ｄＬまたは１００ｍｇ／ｄＬとすれば、ＡＧＰ濃度が高く、有用性の高いブドウ樹液のみを回収することができるものと考えた。５０ｍｇ／ｄＬを基準として採用すれば、１００ｍｇ／ｄＬを基準として採用するよりも、より多くのブドウ樹液を回収することができ、１００ｍｇ／ｄＬを基準として採用すれば、５０ｍｇ／ｄＬを基準として採用するよりも、より高濃度のＡＧＰを含む、より高品質のブドウ樹液を回収することができる。
【００４０】
本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法（以下、単に「本発明の回収方法」という場合がある。）は、（１）発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出したブドウ樹液を採取する採取工程と、（２）前記ブドウ樹液と尿糖試験紙とを接触させる接触工程と、（３）前記尿糖試験紙の呈色に基いてブドウ樹液を回収するか回収しないかを判断する選別工程と、（４）回収すると判断した場合にブドウ樹液を回収する回収工程とを含む。以下では、本発明の回収方法の各工程について説明する。
【００４１】
（１）採取工程
採取工程は、発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出したブドウ樹液を採取する工程である。
【００４２】
ブドウ樹液の採取の時期は、春先の、ブドウの木の剪定された枝の切口からブドウ樹液の溢出が開始してから、１週間、２週間または３週間の期間内である。ただし、この期間内であっても、ブドウ樹液の溢出が中断したり、停止したり、ブドウ樹液に着色が認められたりすれば、ブドウ樹液を採取することはできない。
【００４３】
ブドウ樹液の採取の方法は、発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出したブドウ樹液を採取することができるものであれば特に限定されないが、例えば、小さな容器等を樹液が流れるよう剪定された箇所に取り付けて流れ出てくる樹液を容器に集めることによって行うことができる。容器には防腐剤等を投入しておいてもよい。
【００４４】
ブドウ樹液の採取の際には、作業効率が高く、また、品質劣化を防ぐことができることから、一度に種々の位置から樹液を採取できる採取装置および採取方法、例えば、特開平１０−２９５２０７号公報に記載された樹液の採取装置および樹液の採取方法を用いることが好ましい。
【００４５】
ブドウ樹液を採取するブドウはブドウ（Ｖｉｔｉｓ）属に属する植物であればよく、特にその種、品種等は限定されない。例えば、ブドウとしては、ヨーロッパブドウ（Ｖ．  ｖｉｎｉｆｅｒａ，ヴィニエラ種）、アメリカブドウ（Ｖ．  ｌａｂｒｕｓｃａ、ラブルスカ種）、マスカダイン（Ｖ．  ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ，ロトゥンディフォリア種）、アムールブドウ（Ｖ．  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ，アムレンシス種）、これらの雑種などが挙げられる。また、ブドウの品種としては、巨峰、甲州、甲斐路、マスカット・ベリーＡ、デラウェア、キャンベル・アーリー、ピオーネ、ネオ・マスカット、ナイアガラ、コンコード、スチューベン、カベルネ・ソーヴィニヨン、ピノ・ノワール、メルロー、セミヨン、リースリング、シャルドネ等の品種を挙げることができる。
【００４６】
（２）接触工程
接触工程は、ブドウ樹液と尿糖試験紙とを接触させる工程である。
【００４７】
尿糖試験紙はグルコースオキシダーゼ法による呈色反応を利用したものである。呈色反応が定量的であるため、呈色とブドウ糖濃度との関係を示すカラーチャートと組み合わせることにより、グルコースの定量に利用することができる。
【００４８】
（３）選別工程
選別工程は、尿糖試験紙の呈色に基いてブドウ樹液を回収するか回収しないかを判断する工程である。
【００４９】
選別工程においては、まず、尿糖試験紙の呈色が予め定めた基準以上であるか否かを判断する。
【００５０】
次に、尿糖試験紙の呈色が予め定めた基準以上であれば、ブドウ樹液を回収すると判断し、基準未満であれば、ブドウ樹液を回収しないと判断する。
【００５１】
基準としては、例えば、グルコース濃度で５０ｍｇ／ｄＬとすることが好ましい。
【００５２】
尿糖試験紙は、特に限定されないが、新ウリエースＧａ（テルモ株式会社製）、新ウリエースＢＴ（テルモ株式会社製）またはウリエースＫｃ（テルモ株式会社製）が好ましい。グルコース濃度の基準値を５０ｍｇ／ｄＬに設定した場合と１００ｍｇ／ｄＬに設定した場合の両方に対応することができる。
【００５３】
（４）回収工程
回収工程は、選別工程において回収すると判断した場合にブドウ樹液を回収する工程である。
【００５４】
回収したブドウ樹液は、汚染、変質等による品質の劣化を防止するため、半日回収分、１日回収分等に小分けして保存することが好ましく、凍結保存することが好ましい。凍結保存する際の温度は、ブドウ樹液の凍結状態を維持できる温度であれば特に限定されないが、細菌の増殖を抑制できることから、−１８℃以下が好ましく、−２０℃以下がより好ましく、化学反応の進行を抑制できることから、−６０℃以下がさらに好ましく、−８０℃以下がいっそう好ましい。
【００５５】
回収したブドウ樹液は、混合して用いることが好ましい。混合することによりブドウ樹液の品質が均一化し、バラツキが少なくなることから、品質保証および品質管理の上でも有利である。
【００５６】
また、回収したブドウ樹液は、必要に応じて防腐剤等と混合して液状物質として、または乾燥して粉体として、用いることもできる。
【００５７】
また、回収したブドウ樹液には、必要に応じて加熱処理、清澄処理を施してもよい。これにより、より確実に、樹液の白濁や褐変を防止することができる。加熱処理は、ブドウ樹液を、例えば、６０〜１００℃、好ましくは８０〜９０℃で、例えば、１０分以上加熱することによって行うことができる。この範囲内であると、白濁および褐変を防止できるとともに、ブドウ樹液中に含まれる糖やアミノ酸の変質も防止することができる。加熱処理は任意のタイミングで行うことができ、回収したブドウ樹液に対して行ってもよいし、ブドウ樹液を含む化粧品組成物とした後に行ってもよい。また、清澄処理は、公知の清澄剤、例えば、活性炭、ベントナイト、シリカゲル、シリカゾル、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ；Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）等を用いて行うことができる。いずれの清澄剤もブドウ樹液を含む化粧水の濁りおよび変色の進行を抑制するが、特にベントナイトは、化粧水の濁り及び変色の両方ともを良好に抑制し、好ましい。
【００５８】
本発明のブドウ樹液の採取方法の別の有利な点は、ブドウ糖濃度が基準値以上であるブドウ樹液を回収することによって、液量を確保しながら、ＡＧＰを高濃度で含有することによる優れた保湿性を有するブドウ樹液を得ることができる点にある。
【００５９】
［アラビノガラクタン水溶液の製造方法］
本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法は、特に限定されないが、上述した本発明のアラビノガラクタン含有ブドウ樹液の回収方法の各工程と、回収したブドウ樹液から、上記アラビノガラクタンプロテインよりも低分子量の成分の少なくとも一部を除去する低分子量成分除去工程とを含むアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法が好ましい。
【００６０】
ここで、低分子量成分は、ブドウ樹液中に含まれるアラビノガラクタンプロテインよりも低分子量の成分であれば特に限定されないが、例えば、遊離アミノ酸、有機酸類、糖類およびミネラル類が挙げられる。
【００６１】
また、低分子量成分の少なくとも一部を除去する方法としては、透析処理、限外ろ過処理、精密ろ過処理、またはゲルろ過などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
透析処理工程における透析処理する場合、その方法は、特に限定されず、従来公知の透析処理方法を用いることができる。
【００６３】
透析処理の際に使用する半透膜は、分子量１０００以下の低分子量成分を透過するものであることが好ましい。
【００６４】
透析処理の際に使用する透析液は、特に限定されないが、透析膜を透過する成分の除去効率の点から、水が好ましく、イオン交換水、蒸留水、逆浸透水（ＲＯ水）などを用いることができる。
【００６５】
透析処理の際の温度は、特に限定されないが、ブドウ樹液（ＡＧＰ含有水溶液）および透析液が凍結しない限りにおいて、０℃〜２５℃が好ましく、０℃〜１５℃がより好ましく、１℃〜５℃がさらに好ましい。透析により、アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の純度をより高くすることができ、後述する化粧品組成物や機能性食品の原料としてより適したものとなる。また、不純物が低減されることから、ＡＧＰ含有水溶液の変色や腐敗もしにくくなる。
【００６６】
［アラビノガラクタンプロテイン含有粉体］
本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有粉体は、上記アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液を乾燥し、粉体化してなるものである。
【００６７】
アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液を乾燥し、粉体化することにより、防腐剤無添加でも保存が効き、取扱いも容易な濃縮パウダーとすることができる。
【００６８】
本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有粉体の製造方法は、特に限定されず、風乾、凍結乾燥、噴霧乾燥など従来公知の乾燥方法を用いることができるが、後述するアラビノガラクタンプロテイン含有粉体の製造方法が好ましい。
【００６９】
［アラビノガラクタンプロテイン含有粉体の製造方法］
本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有粉体の製造方法は、特に限定されないが、上述したアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法の各工程と、製造したアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液を乾燥し、粉体化する粉体化工程とを含むアラビノガラクタンプロテイン含有粉体の製造方法が好ましい。
【００７０】
製造したＡＧＰ含有水溶液を乾燥し、粉体化することにより、防腐剤無添加でも保存が効き、取扱いも容易な凍結乾燥粉体とすることができる。
【００７１】
粉体化工程における乾燥および粉体化の方法は、特に限定されず、従来公知の乾燥および粉体化の方法を用いることができ、例えば、風乾、凍結乾燥、噴霧乾燥などが挙げられる。
【００７２】
凍結乾燥により乾燥および粉体化をする場合、凍結乾燥処理の第一段階である凍結処理は、ＡＧＰ含有水溶液を凍結することができればよく、従来公知の種々の方法を用いることができる。
【００７３】
凍結乾燥処理の第二段階である乾燥処理は、凍結したＡＧＰ含有水溶液から水（氷）を昇華により除去することができればよく、従来公知の種々の方法を用いることができる。
【００７４】
凍結乾燥処理を一連の処理として行える凍結乾燥装置を用いて凍結乾燥処理を行ってもよい。
【００７５】
［化粧品組成物］
本発明の化粧品組成物は、上記アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液または上記アラビノガラクタンプロテイン含有粉体を含む。
【００７６】
ＡＧＰに期待される作用効果として、肌の細胞の増殖や、ヒアルロン酸、Ｉ型コラーゲンの産生を促し、なおかつそれ自体高い保水能力を持ち、肌荒れ、シワ、肌の弾力、メラニン生成抑制作用や色素沈着改善作用も確認され、若々しい肌を保つ作用効果があるが、化粧品または機能性食品として、これらの作用効果を期待することができる。
【００７７】
本発明の化粧品組成物には、本発明のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液またはアラビノガラクタンプロテイン含有粉体の他、化粧品組成物一般に用いられる成分を添加することができる。ここで、化粧品組成物一般に用いられる成分は、特に限定されるものではないが、多価アルコール、低級アルコール、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、香料、色素、水等を適宜配合することができる。これらを本発明の効果を損なわない範囲で使用することができる。
【００７８】
上記多価アルコールとしては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ソルビトールなどが挙げられる。上記低級アルコールとしては、例えば、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ベンジルアルコールなどが挙げられる。上記紫外線吸収剤としては、例えば、ｔ−ブチルメトキシジベンゾイルメタン（４−ｔｅｒｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン）、パラメトキシケイ皮酸エチルヘキシル（４−メトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル）、オキシベンゾン−３（２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン）などが挙げられる。上記紫外線散乱剤としては、例えば、酸化チタン、酸化亜鉛などが挙げられる。上記防腐剤としては、例えば、パラベン（パラオキシ安息香酸エステル）、安息香酸、安息香酸Ｎａ（安息香酸ナトリウム）、デヒドロ酢酸Ｎａ（デヒドロ酢酸ナトリウム）、ヒノキチオールなどが挙げられる。上記酸化防止剤としては、例えば、ＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）、没食子酸プロピル、トコフェロールなどが挙げられる。
【００７９】
本発明の化粧品組成物を製造する際の化粧品組成物中のブドウ樹液の含有量は、化粧品組成物の用途によって適宜変更できるが、通常未調製樹液換算で５質量％以上が好ましい。
【００８０】
また、化粧品組成物の剤型も任意であり、さらに可溶系、乳化系、粉末系、分散系などいずれでもよく、用途も化粧水、乳液、クリーム、洗顔料、石けん、シャンプー、浴用化粧品などの化粧料全般に広く用いることができる。
【００８１】
［機能性食品］
本発明の機能性食品は、上記アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液または上記アラビノガラクタンプロテイン含有粉体を含む。
【００８２】
ＡＧＰに期待される作用効果として、肌の細胞の増殖や、ヒアルロン酸、Ｉ型コラーゲンの産生を促し、なおかつそれ自体高い保水能力を持ち、肌荒れ、シワ、肌の弾力、メラニン生成抑制作用や色素沈着改善作用も確認され、若々しい肌を保つ作用効果があるが、化粧品または機能性食品として、これらの作用効果を期待することができる。
【００８３】
機能性食品としては、ＡＧＰ自体が水溶性であり、また加工時の加熱に対しても比較的安定なこともあるため、加工方法にはあまり制限がなく、食品としての態様も、ドリンク飲料やゲル食品、固形食品など、使用目的に沿った様々な形態で利用できる。
【００８４】
［アラビノガラクタンプロテイン］
アラビノガラクタンプロテイン（以下「ＡＧＰ」という場合がある）は、植物において、細胞間の接着および認識、ならびに情報伝達を介して植物細胞の分化・成長に関わっている重要な生理機能成分であると考えられている。ＡＧＰはコアプロテイン部分とそれに結合する糖鎖部分から構成される糖タンパク質である。糖鎖部分は、ＡＧＰの質量の９０％以上を占め、主にアラビノース（以下「Ａｒａ」という場合がある）およびガラクトース（以下「Ｇａｌ」という場合がある）から構成されるアラビノガラクタン（以下「ＡＧ」という場合がある）鎖である。
【００８５】
ＡＧは、（１→３）−β−Ｄ−ガラクタン鎖を主鎖に持ち、これに、（１→６）−β−Ｄ−ガラクタンまたはＡｒａから構成される側鎖が結合したものである。高度に分岐していることが特徴として挙げられる。さらに、側鎖には、微量成分として、ラムノース（以下「Ｒｈａ」という場合がある）、フコース（以下「Ｆｕｃ」という場合がある）、キシロース（以下「Ｘｙｌ」という場合がある）およびグルコース（以下「Ｇｌｃ」という場合がある）等のその他の糖が結合することがある。また、植物によって、側鎖の糖組成（Ｒｈａ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎ、Ｇｌｃ、ＧａｌＡまたはＧｌｃＡなど）だけではなく、コンホメーションおよび結合様式も異なっている。
【００８６】
このようなＡＧの構造の複雑性に加え、精製および構造解析が非常に困難であること、それに植物中の含有量が低いこともあり、個々のＡＧについて全体構造が完全に明らかにされた例は多くない。
【００８７】
本発明者は、ブドウ樹液中の保湿成分を特定すべく、春先のブドウの木の剪定された枝の切口から溢出したブドウ樹液のうち、グルコース濃度が５００ｍｇ／ｄＬ以上のものについて、高分子量成分も含めて全糖分析を行った。その結果、ブドウ樹液には、アラビノースおよびガラクトースが高い濃度で含まれることがわかった。
【００８８】
また、本発明者は、アラビノースおよびガラクトースは高分子多糖に由来するものと予測し、さらにブドウ樹液中の成分を分析したところ、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が７万以上の高分子量成分を取得した。
【００８９】
この高分子量成分を、ＡＧＰ特異的に結合して沈殿を生じるヤリブ試薬と反応させたところ、赤褐色の沈澱が生じたことから、この高分子量成分はＡＧＰであることがわかった。
【００９０】
さらに、このＡＧＰの糖鎖を解析したところ、（１→３）−β−Ｄ−アラビノガラクタンを主鎖とするアラビノガラクタン鎖であることがわかった。しかも、このＡＧＰの糖鎖は、既知のブドウ果実由来のＡＧＰの糖鎖とは、糖構造が異なるものであると推測された。
【００９１】
これまで、ブドウ樹液中にＡＧＰが含まれることは知られておらず、ブドウ樹液からＡＧＰが得られたこともなかった。
【００９２】
〈ＡＧＰの分子量〉
本発明のブドウ樹液由来のＡＧＰは、ゲルろ過クロマトグラフィー（以下「ＧＰＣ」という場合がある）により測定した平均分子量が７万以上である。
ここで、ＧＰＣの条件は以下に記載するとおりである。
カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＨＲ  １０／３０  １０ｍｍ×３０ｃｍ（ＧＥヘルスケア社製）
溶媒：５０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ５．３
カラム温度：室温
検出器：示差屈折率検出器ＲＩＤ−１０Ａ（島津製作所社製）
【００９３】
〈コアプロテインと糖鎖部分の構造〉
本発明のブドウ樹液由来のＡＧＰは、コアプロテイン部分および糖鎖部分を有し、糖鎖部分（ＡＧ）は、（１→３）−β−Ｄ−ガラクタンを主鎖とする。
【００９４】
ＡＧは、主鎖の（１→３）−β−Ｄ−ガラクタンのＯ−６位に、（１→６）−β−Ｄ−ガラクタン側鎖が結合し、さらに、側鎖のＯ−３位にＡｒａ（１→が結合していると考えられる。
【００９５】
また、上記主鎖は、コアプロテイン部分のヒドロキシプロリン残基に結合している。
【００９６】
〈ヤリブ試薬との反応性〉
本発明のブドウ樹液由来のＡＧＰは、ＡＧＰに特異的に結合するヤリブ試薬と反応して複合体を形成し、赤褐色の沈澱を生じる。
【００９７】
ＡＧＰの研究では、特異的に結合し、その生理機能を阻害するヤリブ試薬が利用されてきた。ヤリブ試薬がＡＧＰのどこに結合するのかは、長年の間、不明であったが、近年、ダイコン由来のＡＧＰとアカシア由来のＡＧＰでは、糖鎖主鎖の（１→３）−β−Ｄ−ガラクタンに特異的に結合することがわかった。
【実施例】
【００９８】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００９９】
［実施例１］
〈ブドウ樹液中に含まれる保湿成分の特定〉
《ブドウ樹液の全糖分析》
１．試料
ブドウの木の剪定された枝の切口からブドウ樹液が溢出開始した直後に採取したブドウ樹液を用いた。このブドウ樹液のグルコース濃度は、新ウリエースＧａ（テルモ社製）を用いて測定したところ、色調が＋＋評価（グルコース濃度５００ｍｇ／ｄＬ以上２０００ｍｇ／ｄＬ未満）であった。
【０１００】
２．方法
ブドウ樹液４００ｍＬを凍結乾燥し、凍結乾燥品１ｍｇを耐圧・耐熱のねじ口試験管に移し、１ｍＬの２Ｍ  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、１２１℃で１時間加温した。次に、ＴＦＡを除去するため、４０℃以下で加温しながら、乾燥空気により溶媒を除去した。乾燥後、２５０μＬの１Ｍ  塩酸−メタノール（ＨＣｌ−ＭｅＯＨ  ５％（ｗ／ｖ）、ジーエルサイエンス社製）を加え、８０℃で１５時間加温した。これに１００μＬのｔ−ブチルアルコールを加え、乾燥空気により溶媒を除去した。０．０５ｍＬのピリジン、０．１ｍＬのヘキサメチルジシラザン、０．０５ｍＬのトリメチルクロロシランを加え、撹拌した後、８０℃で２０分以上加温し、トリメチルシリル化（ＴＭＳ化）処理をした。室温で乾燥空気によりＴＭＳ化剤を除去した。１ｍＬのヘキサンに溶かし、軽く撹拌し、３０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心後、パスツールピペットを用いて上清を取り出し、新しいねじ口試験管へ移した。室温で乾燥空気により溶媒を除去した。シリンジを用いて、約１０μＬのヘキサンに溶かし、溶液のうち１μＬを用いてガスクロマトグラフィ分析を行った（ＤＢＩ  ３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２μｍ、カラム条件：１４０℃（２℃／分）→２００℃（３０℃／分）→２７５℃（１０分）、ｓｐｌｉｔ  ｒａｔｉｏ＝５０：１、ガスクロマトグラフ  ＧＣ−ｌ７Ａ（島津製作所社製））。さらに、ブドウ樹液の糖定量方法として、次の２つの方法も用いた。中性糖の定量にはアンスロン硫酸法を用いた。すなわち、試料５００μＬ（２０μｇ以下の中性糖を含む）に、濃硫酸でアンスロン粉末を溶解した０．２％アンスロン溶液  １ｍＬを静かに注ぎ、直ちに混和、次に沸騰水溶液中に５分間保った後、氷上で急冷した。この試料の６２０ｎｍの吸光度を測定した。酸性糖の定量にはメタヒドロキシビフェニル法を用いた。すなわち、試料２００μＬ（２０μｇ以下の酸性糖を含む）に、ホウ酸溶液（４．７７ｇ  ＮａＢ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ  ｐｅｒ  １ｉｔｅｒ  ｏｆ  ｃｏｎｃ．Ｈ２ＳＯ４）１．２ｍＬを静かに注ぎ、直ちに混和、次に沸騰水溶液中で、５分間保った後、氷上で急冷した。そこに、０．１５％メタヒドロキシビフェニル溶液を２０μＬ加え、直ちに混和し、室温で５分間静置した後、この試料の５２０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０１】
３．結果
上記のような方法でブドウ樹液の糖成分についてＴＭＳ化を行い、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）による解析によって糖組成を調査した。その結果、グルコース濃度が最も多く存在したが、その他アラビノースおよびガラクトースが多いことが判明した。また、溢出開始直後と溢出一週間後と比べてグルコース濃度が１／５０程度に低下しており、アラビノースおよびガラクトースについても、ともに、１／２０程度に濃度が低下していた（下表）。ブドウ樹液中のグルコースについては、一般成分分析から遊離糖として存在することがわかっているが、アラビノースおよびガラクトースについては高分子多糖由来であることが予想された。
【０１０２】
【表１】
2019182790.tif 000002
【０１０３】
《ブドウ樹液高分子成分の分子量測定》
１．試料
ブドウの木の剪定された枝の切口からブドウ樹液が溢出開始した直後に採取したブドウ樹液を用いた。このブドウ樹液のグルコース濃度は、新ウリエースＧａ（テルモ社製）を用いて測定したところ、色調が＋＋評価（グルコース濃度５００ｍｇ／ｄＬ以上２０００ｍｇ／ｄＬ未満）であった。
【０１０４】
２．方法
ブドウ樹液２００ｍＬを、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ６  ＭＷＣＯ：１，０００）を用いて、２日間、４℃で、蒸留水に対して透析処理をした。この処理により、分子量１０００以下の低分子を除去した。次に、試料をギ酸アンモニウムに溶解させ、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ：Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により分子量を測定した（カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＨＲ  １０／３０  １０ｍｍ×３０ｃｍ（ＧＥライフサイエンス社製）；溶媒：５０ｍＭ  ギ酸アンモニウム，ｐＨ５．３；室温；検出器：示差屈折率検出器ＲＩＤ−１０Ａ（島津製作所社製））。
【０１０５】
３．結果
ＧＰＣ分析の結果、高分子画分に平均分子量７万超のピークを確認した。
【０１０６】
《ブドウ樹液由来ＡＧＰの抽出》
以上の結果から、アラビノースおよびガラクトースが含まれる分子量７万超の高分子多糖類は、アラビノガラクタンプロテイン（ＡＧＰ）であることを予想した。
【０１０７】
１．試料
ブドウの木の剪定された枝の切口からブドウ樹液が溢出開始した直後に採取したブドウ樹液を用いた。このブドウ樹液のグルコース濃度は、新ウリエースＧａ（テルモ社製）を用いて測定したところ、色調が＋＋評価（グルコース濃度５００ｍｇ／ｄＬ以上２０００ｍｇ／ｄＬ未満）であった。
【０１０８】
２．方法
ブドウ樹液を凍結乾燥した後、８０％エタノールを２０ｍＬ加えて懸濁し、８０〜９０℃で１０分間加温した。溶液が室温程度に冷えた後、５０００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を取り除き沈殿物を凍結乾燥した。１ｇの沈殿物あたり１００ｍＬの５０ｍＭ  ＣＤＴＡ（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）を加え、室温で６時間撹拌し、５０００×ｇ、４℃で１０分間遠心後、上清を蒸留水に透析した。得られた溶液からＡＧＰを分画するため、ＡＧＰに特異的に結合するヤリブ試薬（Ｂｉｏｓｕｐｐｌｉｅｓ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ）を用いて、ヤリブ沈殿を行った。ＡＧＰとヤリブ試薬は１：２の質量比で混合し、蒸留水には溶解するが、１％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液ではＡＧＰ−ヤリブ試薬複合体として沈殿する性質を利用した。試料にヤリブ試薬を１：２の質量比となるように加え、溶液の最終濃度が１％（ｗ／ｖ）になるように２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ水溶液を加えた。４℃で一晩静置し、遠心処理（５０００×ｇ、４℃、２０分）後、沈殿物（ＡＧＰ−ヤリブ試薬複合体）を１％  ＮａＣｌ水溶液で懸濁し、再び遠心処理を行った。不溶性残査を取り除くため、沈殿物（ＡＧＰ−ヤリブ試薬複合体）を蒸留水に溶解し、遠心処理を行い、沈殿（不溶性残査）を取り除いた上清に、最終濃度が１％（ｗ／ｖ）になるように１０％（ｗ／ｖ）  ＮａＣｌ水溶液を加えた。再び遠心処理を行い、上清を取り除き、回収した沈殿物（ＡＧＰ−ヤリブ試薬複合体）を蒸留水に溶解した。この時、上清に不溶性残査が生じなくなるまでこの操作を繰り返した。最終の沈殿物（ＡＧＰ−ヤリブ試薬複合体）を蒸留水で溶解し、亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）を最終濃度が１０％（ｗ／ｖ）になるように加え、赤褐色がなくなるまで室温で放置した。色が無くなったらすぐにＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）で脱塩（蒸留水で溶出）し、凍結乾燥後、ヤリブ沈殿画分（ＡＧＰ）とした。
【０１０９】
３．結果
上記のような方法で、ブドウ樹液を凍結乾燥し、ＣＤＴＡ可溶画分にＡＧＰに特異的に結合するヤリブ試薬を加えたところ、複合体である赤褐色の沈殿を生じたため、ブドウ樹液中に確かにＡＧＰが存在することが判明した。
【０１１０】
《ブドウ樹液高分子画分の糖の構造解析》
１．試料
ブドウの木の剪定された枝の切口からブドウ樹液が溢出開始した直後に採取したブドウ樹液を用いた。このブドウ樹液のグルコース濃度は、新ウリエースＧａ（テルモ社製）を用いて測定したところ、色調が＋＋評価（グルコース濃度５００ｍｇ／ｄＬ以上２０００ｍｇ／ｄＬ未満）であった。ブドウ樹液２００ｍＬを、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ６  ＭＷＣＯ：１，０００）を用いて、２日間、４℃で、蒸留水に対して透析処理をした。この処理により、分子量１０００以下の低分子を除去した。さらに、上記ブドウ樹液からのＡＧＰ抽出方法と同じ方法でヤリブ沈殿画分から調製したＡＧＰの凍結乾燥品のうち、２ｍｇを用いて、部分メチル化アルジトールアセテート法により糖鎖の構造解析を行った。
【０１１１】
２．方法
（１）メチル化
ねじ口試験管に試料を入れ、５００μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を加え、室温にて一晩撹拌した。ドラフト内で１００〜２００μＬのＫ＋ＤＭＳＯ−  （カリウムメチルスルフィニルカルバアニオン）を加え、室温にて２時間撹拌した。サンプルを氷上で凍らせながら、ドラフ卜内で１５０μのヨウ化メチル（ＭｅＩ）を加えた。氷上から取り出して室温に戻し、１時間撹拌した（メチル化反応）。次に、５００μＬの蒸留水を加え、メチル化反応を止めた。アルゴン（Ａｒ）を用いてバブリングさせ、ＭｅＩを除去した。次に１日かけて、４℃で蒸留水に対して透析をした。
【０１１２】
（２）部分メチル化アルジトールのアセチル化
透析し凍結乾燥した試料をねじ口試験管に移し、２００μＬの２Ｍ  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、１時間、１２１℃にて加温した。室温にて、乾燥空気により溶媒を除去した。２５０μＬの２−プロパノールを加え、室温にて乾燥空気により溶媒を除去した。次に、２００μＬの重水素化ほう素ナトリウム（ＮａＢＤ４）（ＮａＢＤ４  １０ｍｇ／１Ｍ  ＮＨ４ＯＨ  １ｍＬ）を加え、室温にて１時間反応させた（還元反応）。５０μＬの酢酸を加え、過剰の重水素化ホウ素化合物を分解した。２００μＬの酢酸：メタノール（＝１：９）を加え、乾燥空気により溶媒を除去し、その後この操作を３回行った。２００μＬのメタノールを加え、乾燥空気により溶媒を除去し、その後この操作を３回行った。１００μＬの無水酢酸を加え、３時間、１２１℃にて加温した（アセチル化反応）。アセチル化した試料に、少量の炭酸ナトリウム（無水）を加え中和した。５００μＬのクロロホルムを加え、撹拌し、１５０００ｒｐｍ、５分間の遠心をした。有機層を残すために上清を取り除き、乾燥空気により溶媒を除去した。２００μＬのアセトンを加え、ねじ口試験管中の試料を溶解させ回収した。新たなねじ口試験管へ移し、乾燥空気により溶媒を除去し、約１０μＬのアセトンに溶かし、そのうち１μＬを用いて、ガスクロマトグラフィ一分析（ＳＰＴＭ  ２３３０  ３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２μｍ；カラム条件：１７０℃（２分）→１７０℃（４℃／分）→２３５℃（１０分）；ガスクロマトグラフＧＣ−１７Ａ（島津製作所社製））、およびガスクロマトグラフィ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を行った（ＤＢＩ  ３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２μｍ；カラム条件：５０℃（２分）→１７０℃（３０℃／分）→２３５℃（２０分）、ガスクロマトグラフ  ＨＰ  ＨＥＷＬＥＴＴ  ＰＡＣＫＡＲＤ  ５８９０；質量分析系  ＪＥＯＬ  ＪＭＳ−ＤＸ  ３０３  ＨＦ）。
【０１１３】
３．結果
上記の方法で高分子画分に含まれる高分子多糖の糖の構造解析を行ったところ、ＡＧＰに特徴的な糖鎖の結合様式である３，６−ガラクタンが多く、ブドウ樹液の高分子多糖は、ほとんどがＡＧＰであると示唆された。また、ＡＧＰの糖鎖構造モデルを作成したところ、３，６−ガラクタンの糖鎖はＡＧＰに特徴的な構造を取っていることが予想されたが、１，２−アラビナン鎖が長いことが特徴的であり、ブドウ樹液由来のＡＧＰは、ブドウ果実由来のＡＧＰとは、別異の物質であることが示唆された。糖鎖結合様式の解析結果として表２に示す糖組成と、図１に示す糖鎖構造モデル（予想）を得た。
【０１１４】
【表２】
2019182790.tif 000003
【０１１５】
〈アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液および粉末の製造〉
１．試料
ブドウの木の剪定された枝の切口からブドウ樹液が溢出開始した直後に採取したブドウ樹液を用いた。このブドウ樹液のグルコース濃度は、新ウリエースＧａ（テルモ社製）を用いて測定したところ、色調が＋＋評価（グルコース濃度５００ｍｇ／ｄＬ以上２０００ｍｇ／ｄＬ未満）であった。
【０１１６】
２．方法
ブドウ樹液２００ｍＬを、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ６  ＭＷＣＯ：１，０００）を用いて、２日間、４℃で、蒸留水に対して透析処理をした。この処理により、分子量１０００以下の低分子を除去した。次に、低分子量成分を除去したアラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液を、凍結乾燥した。
【０１１７】
３．結果
凍結乾燥品１０８ｍｇを得た。ブドウ樹液の場合は他に高分子量成分をほとんど含まないことからこの大部分がＡＧＰであると考えられた。非特許文献２（円谷，２０１４）においてダイコン成根の場合、１ｋｇの生組織から得られるＡＧＰは約５０ｍｇであると記載されており、それと比較すると本ブドウ樹液では、１ｋｇから１０倍以上の約５００ｍｇが得られることになり、方法も簡単できわめて効率的なＡＧＰの回収方法である。
【０１１８】
〈総括〉
以上の結果から、本発明者は、ブドウ樹液（導管液）の高分子画分はＡＧＰが主成分であり、ブドウ樹液から本発明の回収方法により得られたＡＧＰ含有水溶液は、従来知られていた植物から抽出したＡＧＰを含有する水溶液と比較して、高濃度にＡＧＰを含有していると考えている。また、回収できるブドウ樹液の総質量が多いことから、ブドウ樹液から得られるＡＧＰの総質量も、従来では考えられないほどの量になると考えている。
【０１１９】
［実施例２］
〈ブドウ樹液糖質の測定〉
ブドウ樹液を採取する現場の農園で、誰でも簡単かつ短時間にまた低費用でブドウ樹液中のグルコース糖濃度を測定する方法として、一般的に市販されている尿糖検査用試験紙「新ウリエースＧａ」（テルモ社製）を用いることにして、春先溢出する様々なブドウ樹液のグルコース濃度を測定した。
【０１２０】
・糖試験紙について
ブドウ樹液に試験紙を浸してから３０秒後の色で判定した。試験紙のグルコース濃度と色調表を表３に示す。
【０１２１】
【表３】
2019182790.tif 000004
【０１２２】
・試験実施
山梨県のブドウ農園で広く栽培されているブドウ品種（甲州、巨峰、デラウェア、甲斐路およびベリーＡ）の木から春先に溢出する様々なブドウ樹液を１５検体採取し、採取現場（農園）にて糖試験紙で糖濃度を分析、色調を記録した。その後、試験機関において同検体の糖濃度を一般分析法（ＨＰＬＣ法）により測定した。
【０１２３】
・試験結果
１５件体のブドウ樹液は、尿糖試験紙での測定により色調表で、−〜±〜＋〜＋＋の範囲にあった。また、同検体の糖濃度を一般分析した結果、０．２〜１２ｇ／Ｌ（２０〜１２００ｍｇ／ｄＬ）の範囲内であった。これは、尿糖試験紙で測定できる有効濃度範囲内（０〜２０００ｍｇ／ｄＬ）であり、十分にブドウ樹液の糖（グルコース）検査に供することができることがわかった。
【０１２４】
［実施例３］
〈高濃度ＡＧＰ含有ブドウ樹液の採取〉
《ブドウ樹液の採取》
山梨県内のブドウ園（日本国）にて、２０１４年（平成２６年）３月２２日から４月７日までの期間内に、３本のブドウの木（「Ｎｏ．１」、「Ｎｏ．２」および「Ｎｏ．３」と付番した。）から、それぞれの木について、１日あたり２００ｍＬずつ、ブドウ樹液の溢出が認められてから２週間にわたり、ブドウ樹液を採取した。以下、採取したブドウ樹液を「採取サンプル」という場合がある。採取時に、糖試験紙（新ウリエース（Ｒ）Ｇａ，テルモ社製）を用いて、「糖試験紙によるブドウ糖濃度の測定方法」に記載した方法によって、採取サンプルのブドウ糖濃度を測定し、記録した。各採取サンプルは採取後、他の採取サンプルと混合することなく、直ちに−１８℃で冷凍保存した。表４に、各採取サンプルについて、採取日、採取サンプル番号、採取量およびブドウ糖濃度を示す。
【０１２５】
《尿糖試験紙によるブドウ糖濃度の測定方法》
尿糖試験紙（新ウリエースＧａ、テルモ社製）を各採取サンプル（ブドウ樹液）に約１秒間浸し、それから３０秒後の尿糖検査薬の色を添付の色調表と比較して各採取サンプル中のグルコース濃度を測定し、記号で示した。
【０１２６】
色調表の色とグルコース濃度との関係は概ね以下のとおりである。
色調・・・「黄」、記号・・・「−」、糖濃度・・・検出限界以下
色調・・・「黄緑」、記号・・・「±」、糖濃度・・・約５０ｍｇ／ｄＬ
色調・・・「緑」、記号・・・「＋」、糖濃度・・・約１００ｍｇ／ｄＬ
色調・・・「やや濃緑」、記号・・・「＋＋」、糖濃度・・・約５００ｍｇ／ｄＬ
色調・・・「濃緑」、記号・・・「＋＋＋」、糖濃度・・・約２０００ｍｇ／ｄＬ
【０１２７】
【表４】
2019182790.tif 000005
【０１２８】
〈試験サンプルの調製〉
ブドウの木（Ｎｏ．１）から採取した採取サンプルのうち、糖試験紙によるブドウ糖濃度測定結果が「±」以上（ブドウ糖濃度約５０ｍｇ／ｄＬ以上）であったもの、すなわち、採取サンプル番号Ｘ１からＸ７までの採取サンプルを選別し、これらを等量ずつ混合して、試験サンプルを調製した。この試験サンプルを、以下「試験サンプルＡ−１」という場合がある。
【０１２９】
〈試験サンプルのブドウ糖濃度測定〉
ブドウ糖標準液Ｉ（２００ｍｇ／ｄＬ）、ブドウ糖標準液ＩＩ（５００ｍｇ／ｄＬ）および蒸留水を用いて、ブドウ糖標準液（濃度５０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ）を調製した。これらを試料として用いて、吸光度を縦軸に、ブドウ糖濃度を横軸にとり、検量線を作成した。試験サンプル０．０２ｍＬと発色試薬３．０ｍＬとを混合し、３７℃で５分間加温することにより、測定用サンプルを調製した。分光光度計を用いて、測定用サンプルの波長５０５ｎｍにおける吸光度を測定した（光路長１０ｍｍ、角型セル、測定温度２０℃）。測定用サンプルの吸光度と検量線から、試験サンプルのブドウ糖濃度を求めた。求めた試験サンプルのブドウ糖濃度を、表５の「ブドウ糖濃度」の欄に示した。
【０１３０】
〈試験サンプルの保湿性の評価〉
保湿効果を評価するため、パネラー２０人に生体皮膚角層水負荷試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｗａｔｅｒ  ｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ，Ｔａｇａｍｉ，  Ｈ．、外７名、「Ｗａｔｅｒ  ｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、１９８２年、第７８巻、第５号、ｐ．４２５−４２８）を実施した。評価方法は、２０名のパネラーの上腕部において、各試験サンプルを一定量塗布し、表皮角層水分量測定装置  ＳＫＩＣＯＮ−２００ＥＸ（ＩＢＳ社製）を用いて、塗布前の角質水分量、ならびに塗布１０分後、塗布１時間後および塗布４時間後の角質水分量を測定し、塗布前に比べて角質水分量が上昇した人数により評価を行った。評価結果を、表５の「保湿性［人］」の欄に示した。
【０１３１】
〈試験サンプルの保存安定性の評価〉
各試験サンプルを、３０℃の恒温槽内に放置し、１日後、３日後および１週間後に肉眼による目視で色調および濁りを観察し、以下の評価基準に従って評価した。評価結果を、表５の「保存安定性」の欄に示した。
【０１３２】
（評価基準）
色調および濁りに変化なし・・・「○」
やや黄変および／またはやや白濁・・・「△」
黄変および／または白濁・・・「×」
化粧品原料として用いるためには「△」評価以上でなければならず、殊に、化粧水原料等の透明性を要求される用途に用いるためには「○」評価であることが好ましい。
【０１３３】
［実施例４、５］
ブドウの木（Ｎｏ．２）から採取したブドウ樹液（採取サンプル）のうち、糖試験紙によるブドウ糖濃度測定結果が「±」以上（ブドウ糖濃度約５０ｍｇ／ｄＬ以上）であったもの、すなわち、採取サンプル番号Ｙ１からＹ８までの採取サンプルを選別し、これらを等量ずつ混合して、試験サンプルを調製した。この試験サンプルを、以下「試験サンプルＡ−２」という場合がある。ブドウの木（Ｎｏ．３）から採取したブドウ樹液（採取サンプル）のうち、糖試験紙によるブドウ糖濃度測定結果が「±」以上（ブドウ糖濃度約５０ｍｇ／ｄＬ以上）であったもの、すなわち、採取サンプル番号Ｚ１からＺ６までの採取サンプルを選別し、これらを等量ずつ混合して、試験サンプルを調製した。この試験サンプルを、以下「試験サンプルＡ−３」という場合がある。試験サンプルＡ−２およびＡ−３について、実施例３と同様にして、ブドウ糖濃度測定、ならびに保湿性および保存安定性の評価を行った。ブドウ糖濃度測定結果を表５の「ブドウ糖濃度［ｍｇ／ｄＬ］」の欄に、保湿性および保存安定性の評価結果を表５の「保湿性［人］」の欄に、保存安定性の評価結果を表５の「保存安定性」の欄に、それぞれ示した。
【０１３４】
［比較例１〜３］
ブドウの木（Ｎｏ．１）から採取したブドウ樹液（採取サンプル）のうち、糖試験紙によるブドウ糖濃度測定結果が「−」（測定限界以下）であったもの、すなわち、採取サンプル番号Ｘ８からＸ１４までの採取サンプルを選択し、これらを等量ずつ混合して、試験サンプルを調製した（比較例１）。この試験サンプルを、以下「試験サンプルＢ−１」という場合がある。ブドウの木（Ｎｏ．２）から採取したブドウ樹液（採取サンプル）のうち、糖試験紙によるブドウ糖濃度測定結果が「−」（測定限界以下）であったもの、すなわち、採取サンプル番号Ｙ９からＹ１４までの採取サンプルを選択し、これらを等量ずつ混合して、試験サンプルを調製した（比較例２）。この試験サンプルを、以下「試験サンプルＢ−２」という場合がある。ブドウの木（Ｎｏ．３）から採取したブドウ樹液（採取サンプル）のうち、糖試験紙によるブドウ糖濃度測定結果が「−」（測定限界以下）であったもの、すなわち、採取サンプル番号Ｚ７からＺ１４までの採取サンプルを選択し、これらを等量ずつ混合して、試験サンプルを調製した（比較例３）。この試験サンプルを、以下「試験サンプルＢ−３」という場合がある。試験サンプルＢ−１、Ｂ−２およびＢ−３について、実施例３と同様にして、ブドウ糖濃度測定、ならびに保湿性および保存安定性の評価を行った。ブドウ糖濃度測定結果を表５の「ブドウ糖濃度［ｍｇ／ｄＬ］」の欄に、保湿性および保存安定性の評価結果を表５の「保湿性［人］」の欄に、保存安定性の評価結果を表５の「保存安定性」の欄に、それぞれ示した。
【０１３５】
［比較例４］
比較例４は従来のブドウ樹液の採取方法、すなわち、ブドウ樹液をその溢出開始から２〜３週間の期間にわたって採取したブドウ樹液を用いる例である。ブドウの木（Ｎｏ．１ないしＮｏ．３）とは異なる、別のブドウの木（Ｎｏ．４）から、ブドウ樹液の溢出開始から２週間の間に採取したブドウ樹液をすべて混合し、混合したブドウ樹液を孔径０．４５μｍのセルロースアセテートタイプメンブレンフィルター（ＤＩＳＭＩＣ  ２５ＣＳ０４５ＡＮ、アドヴァンテック社製）で無菌ろ過することにより、特許第３１６９０６７号明細書中の実施例に記載の試験サンプルを調製した。この試験サンプルを、以下「試験サンプルＣ−１」という場合がある。試験サンプルＣ−１について、実施例３と同様にして、ブドウ糖濃度測定、ならびに保湿性および保存安定性の評価を行った。ブドウ糖濃度測定結果を表５の「ブドウ糖濃度［ｍｇ／ｄＬ］」の欄に、保湿性および保存安定性の評価結果を表５の「保湿性［人］」の欄に、保存安定性の評価結果を表５の「保存安定性」の欄に、それぞれ示した。
【０１３６】
［比較例５〜７］
濃度２００ｍｇ／ｄＬのブドウ糖水溶液（比較例５、以下「試験サンプルＤ−１」という場合がある。）、濃度２００ｍｇ／ｄＬのブドウ糖水溶液（比較例６、以下「試験サンプルＤ−２」という場合がある。）および精製水（比較例７、以下「試験サンプルＤ−３」という場合がある。）を準備した。各試験サンプルについて、実施例３と同様にして、ブドウ糖濃度測定および保湿性の評価を行った。ブドウ糖濃度測定結果を表５の「ブドウ糖濃度［ｍｇ／ｄＬ］」の欄に、保湿性の評価結果を表５の「保湿性［人］」の欄に、それぞれ示した。
【０１３７】
【表５】
2019182790.tif 000006
【０１３８】
〔保湿性〕
実施例３〜５に示されるように、糖試験紙によるブドウ糖濃度測定結果が「±」以上、すなわちブドウ糖濃度が約５０ｍｇ／ｄＬ以上のブドウ樹液（採取サンプル）を回収することによって、優れた保湿性を有するブドウ樹液（試験サンプルＡ−１、試験サンプルＡ−２、試験サンプルＡ−３）を得ることができた（表４、表５、図２）。
【０１３９】
実施例３〜５と比較例１〜４との対比から、ブドウ樹液のブドウ糖濃度が高いほど、ブドウ樹液の保湿性および保存安定性が高いことが示された（表５、図２）。
【０１４０】
また、実施例３〜５と比較例５、６との対比から、ブドウ樹液の保湿性はブドウ糖のみによるものではなく、ブドウ糖を含むＡＧＰの濃度に依存すること、すなわち、ブドウ樹液中のＡＧＰの濃度が高いほど、保湿性が高いことが示唆された。
【０１４１】
したがって、ブドウ樹液のブドウ糖濃度はブドウ樹液中のＡＧＰの濃度を示すよい指標であること、換言すれば、ブドウ糖樹のブドウ糖濃度はブドウ樹液中のＡＧＰの濃度に連繋することが示唆された。
【０１４２】
〔保存安定性〕
また、ＡＧＰの濃度が高くなれば、それだけ褐変反応（アミノカルボニル反応）を起こし得る物質の濃度も高くなるため、保存安定性の低下が予想されたが、実施例３〜５と比較例１〜４との対比によれば、その予想に反して、ブドウ糖濃度が高くＡＧＰの濃度も高い実施例３〜５の方が、ブドウ糖濃度が低くＡＧＰの濃度も低い比較例１〜４に比べて、高い保存安定性を示した。
【０１４３】
〔ブドウ樹液の回収量〕
糖試験紙によるブドウ糖濃度測定結果が「±」以上、すなわちブドウ糖濃度が約５０ｍｇ／ｄＬ以上のブドウ樹液を回収することによって、優れた保湿性および保存安定性を有するブドウ樹液を十分量得ることができた（表４、表５、図２）。
【図１】
2019182790.tif 000007
【図２】
2019182790.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月17日(2018.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出したブドウ樹液を採取する採取工程と、
前記ブドウ樹液とグルコースオキシダーゼ法による呈色反応を利用した尿糖試験紙とを接触させる接触工程と、
前記尿糖試験紙の呈色に基づいて、グルコース濃度が５０ｍｇ／ｄＬ以上のブドウ樹液を回収し、グルコース濃度が５０ｍｇ／ｄＬ未満のブドウ樹液を回収しないと判断する選別工程と、
グルコース濃度が５０ｍｇ／ｄＬ以上のブドウ樹液を回収する回収工程と
を含む、アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法の各工程、および、回収したブドウ樹液を乾燥する工程を含む、アラビノガラクタンプロテイン含有粉体の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法の各工程を含む、または、請求項２に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有粉体の製造方法の各工程を含む、化粧品組成物の製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法の各工程を含む、または、請求項２に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有粉体の製造方法の各工程を含む、機能性食品の製造方法。
【請求項５】
発芽期前に露地栽培のブドウの剪定された枝より溢出したブドウ樹液を採取する採取工程と、
前記ブドウ樹液とグルコースオキシダーゼ法による呈色反応を利用した尿糖試験紙とを接触させる接触工程と、
前記尿糖試験紙の呈色に基いて、グルコース濃度が５０ｍｇ／ｄＬ以上のブドウ樹液を回収し、グルコース濃度が５０ｍｇ／ｄＬ未満のブドウ樹液を回収しないと判断する選別工程と、
グルコース濃度が５０ｍｇ／ｄＬ以上のブドウ樹液を回収する回収工程と
を含む、アラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法。
【請求項６】
請求項５に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有ブドウ樹液の回収方法の各工程と、
回収したブドウ樹液から、前記アラビノガラクタンプロテインよりも低分子量の成分の少なくとも一部を除去する低分子量成分除去工程と
を含む、アラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載のアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液の製造方法の各工程と、
低分子量成分を除去して得られたアラビノガラクタンプロテイン含有水溶液を乾燥し、粉体化する粉体化工程と
を含む、アラビノガラクタンプロテイン含有粉体の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
【表５】
2019182790.tif 000009