(57)【要約】      （修正有）【課題】操作が容易で、海産物の細胞の破損を極力少なくすることで長期間鮮度を保ち維持することの出来る方法およびシートの提供。【解決手段】死滅させた氷核活性細菌液をタンパク質吸着能のあるシートに浸漬、乾燥させることで、植氷シートを製造し、該シートを利用することで海産物の凍結保存による損傷を防ぎ、鮮度保持する、海産物の凍結方法および植氷シート製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
死滅させた氷核活性細菌液をタンパク質吸着能のあるシートに浸漬、乾燥させることで、植氷シートを製造し、該シートを利用することで海産物の凍結保存による損傷を防ぎ、鮮度保持することを特徴とする、海産物の凍結方法および植氷シート製造方法
【請求項２】
死滅させた氷核活性細菌液が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅおよびＥｒｗｉｉａ  ａｎａｎａｓのいずれかであり、該バクテリアを２５℃以下で培養し、生理食塩水に懸濁した状態で、超音波ホモジナイザーあるいはフレンチプレスなどにより細胞を破砕した液であることを特徴とする、請求項１に記載の海産物の凍結方法および植氷シート製造方法
【請求項３】
タンパク質吸着能のあるシートの素材が、タンパク質結合性が高い活性炭担持シート、セルロースシートあるいは官能基で表面修飾したセルロースシート、ガラス繊維もしくは樹脂であることを特徴とする、請求項１および２に記載の海産物の凍結方法および植氷シート製造方法
【請求項４】
凍結シートの上に海産物を静置、もしくは包むことで凍結を促すことを特徴とする、精求項１〜３のそれぞれに記載の海産物の凍結方法および植氷シート製造方法
【請求項５】
凍結は氷核活性細菌の氷結温度（−２〜−７℃）以下で行ない、解凍を０℃以上室温で行なうことを特徴とする、請求項１〜４のそれぞれに記載の海産物の凍結方法および植氷シート製造方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、氷核活性細菌をシートに固定化する方法、および該シートを用いて海産物を凍結させ、鮮度保持する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  氷核活性細菌は、氷点下３０℃でも凍結しない静置した純水を、氷点下２〜氷点下７℃で凍結させる働きを持つ細菌のことであり、その生成するタンパク質が、凍結を誘導する氷核として働くことが知られている。つまり氷核活性細菌が死菌であっても活性が維持されるが、該タンパク質が細胞膜と共存していることが活性発現に重要であることが明らかになっている。氷核活性細菌にはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅやＥｒｗｉｎｉａ  ａｎａｎａｓなどがあり、植物の氷害細菌として知られていた。近年、これら細菌の活性が明らかになったことで、逆に応用する凍結技術が様々に提案されている。【０００３】  動物の生殖細胞の保存には、一般に液体窒素中での凍結保存が用いられている。保存にはグリセリンなどの耐凍剤とともに卵黄、糖類、緩衝剤などを組成とする希釈液に細胞を浮遊させ、一定の速度で予備凍結温度まで冷却した後、氷点下１９７℃の液体窒素中で保存する。例えば、精子保存の場合には、卵黄は１５〜２０％で用い、成分中のリポタンパク質中、リポビテリン、リポビテレニン、およびレシチンが凍害予防に有効であるとされる。このうち糖類は、浸透圧の調製、凍害予防、および細胞のエネルギー源として機能している。５単糖＞６単糖＞２糖類＞３糖類の順で凍害保護効果が高い。緩衝液としては、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＨＡＭ）などの両性緩衝液が優れており、凍結融解の過程での細胞膜の保存に重要であり、融解後の細胞の代謝にも有効であるとされる。この他、胚などの保存には、グリセリンのほか、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの細胞膜透過型の耐凍剤も用いられており、血清あるいは血清アルブミンを入れた等張の培養液とともに胚の凍結媒液として用いられる。胚の凍結保存には、精子の場合のように、卵黄は通常は用いられない。現在、温度制御緩速冷却法あるいは細胞をガラス化する保存法が胚の保存に用いられている。【０００４】  温度制御緩速冷却法とは、過冷却温度域の媒液の凍結点よりも少し低い温度、通常−７℃、で媒液に氷晶形成を誘起する操作（植氷と呼ばれる）で行なうものである。操作は、予め液体窒素で冷却しておいたピンセットなどで媒液部に容器の外側から触れるという単純な操作によって行なわれる。しかしながら、この方法は熟練された手技が要求される上に、数をこなせない欠点があった。
ガラス化とは、凍結温度に達しても結晶化が起こらず、冷却とともに粘度が増し、明確な凝固点を示さず無定形状態に固化する現象を言う。一種の過冷却状態とも言える。この状態を細胞で引き起こすガラス化液がこれまでに多く提案され用いられている。例えば３０％グリセロール、２０％ショ糖、１５％エチレングリコール、１５％ＤＭＳＯなどがある。これらは細胞からの脱水を浸透圧によって引き起こし、細胞内液の粘度を上げ、細胞が凍結とともにガラス化する働きがある。このために細胞の凍結による損傷を防ぎ、解凍後の生存率を高めるために利用される。しかしながら、該溶液は胚などの凍結に応用されているばかりであり、万能ではない。
海産物は食品であり、凍結剤の仕様は適正では無く、液体窒素を用いることは大量生産上困難であり、経済的にも不向きであった。細胞内部の氷結晶形成を妨げることが鮮度保持には重要であり、このために細胞からの脱水と、引き続く凍結がより高い温度で実現出来ることが嘱望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明の目的は、タンパク質結合能を持つシート化素材に対し、植氷機能を持つ氷核活性細菌の死菌液を結合させ、それを乾燥させて製造したシートの製造方法を確立することであり、さらにそのシートによって海産物を、氷点下２〜氷点下７℃の範囲内で氷晶形成することにより鮮度を保持するための鮮度保持技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明者は、上記目的の達成に鋭意研究を重ねた結果、超音波処理などで氷核活性細菌を破壊死滅させたものを、シート状の素材、活性炭シートなどに浸漬することで、固定化させ乾燥させたものを、海産物を載せる、あるいは包むことで、凍結から海産物の細胞中に水結晶の形成を防ぎ、鮮度を保持することが可能となり、上記の問題を解決できるとの知見を得た。
本発明は、この知見に基づいて、
１．死滅させた氷核活性細菌液をタンパク質吸着能のあるシートに浸漬、乾燥させることで、植氷シートを製造し、該シートを利用することで海産物の凍結保存による損傷を防ぎ、鮮度保持することを特徴とする、海産物の凍結方法および植氷シート製造方法、
２．死滅させた氷核活性細菌液が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅおよびＥｒｗｉｉａ  ａｎａｎａｓのいずれかであり、該バクテリアを２５℃以下で培養し、生理食塩水に懸濁した状態で、超音波ホモジナイザーあるいはフレンチプレスなどにより細胞を破砕した液であることを特徴とする、１に記載の海産物の凍結方法および植氷シート製造方法、
３．タンパク質吸着能のあるシートの素材が、タンパク質結合性が高い活性炭担持シート、セルロースシートあるいは官能基で表面修飾したセルロースシート、ガラス繊維もしくは樹脂であることを特徴とする、１および２に記載の海産物の凍結方法および植氷シート製造方法、
４．凍結シートの上に海産物を静置、もしくは包むことで凍結を促すことを特徴とする、１〜３のそれぞれに記載の海産物の凍結方法および植氷シート製造方法、
５．凍結は氷核活性細菌の氷結温度（−２〜−７℃）以下で行ない、解凍を０℃以上室温で行なうことを特徴とする、１〜４のそれぞれに記載の海産物の凍結方法および植氷シート製造方法、
を提供する。
【発明を実施するための形態】
【実施例及び比較例】
【実施例１】
【０００７】［氷核活性細菌の培養と破壊］
氷核活性細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅはＫｉｎｇＢ培地（ポリペプトン２０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１．５ｇ、グリセロール１０ｇを水で１Ｌに調製）に接種し、２５℃で一夜培養した。２５℃を越えた温度帯では氷核タンパク質の活性が損なわれるからである。培養細菌はほぼ１．５ｘ１０８ｐｆｕ／ｍＬであった。これを遠心し、沈殿のバクテリアを当量の生理食塩水で懸濁した。
バクテリアは超音波ホモジナイザーで冷却しながらパルスモード（２０ｋＨｚ、１０秒照射、１０秒休止）で２０分に渡って処理し、破砕を行った。破砕が完了したことをＫｉｎｇＢ寒天培地により生菌が出現するかどうかで判断を行った。上述の２０分処理では生菌が認められず、破砕が完全であったことが判った。
【実施例２】
【０００８】［氷核活性細菌の固定化］
破砕した氷核活性細菌懸濁液は、シート状に加工された活性炭（市販品）に固定化した。バットにシートを置き、懸濁液を１／１０に生理食塩水で希釈したものを、噴霧器を用いてシート全体が濡れる程度まで吹きかけた。シートは取り上げて吊るし、一夜風乾した。風乾したシートはポリ袋に入れて保存し、これを植氷シートとした。
【実施例３】
【０００９】［魚の凍結比較］
水槽で飼育していたクロソイを即殺し、三枚に卸してそれぞれの身を凍結サンプルとして用いた。一つは氷核活性細菌が固定されていない対照の活性炭シートの上に、もう一つの身は植氷シートの上にそれぞれ置き、包み込んで輪ゴムで留め、これらを−２０℃の冷凍庫に入れ、凍結した。凍結は一夜に渡って行ない、翌日解凍した。
解凍は室温で行ない、完全に解凍した後、シートを剥がし、シート重量を測定して、魚の重量に対するドリップ量で比較を行なった。凍結による細胞の損傷は、解凍時にドリップとして観察されるからである。結果は表１に示した。
【表１】
2019115329.tif 000002
結果から明らかなように、植氷シートを用いた場合には魚重量に対するドリップ量が、無処理の場合と比べ、１６．７％となり、細胞破砕が大きく減少したことが示された。
【実施例４】
【００１０】［イカの凍結比較］
イカは水揚げに入港した漁船から直接購入し、即殺してそのまま実施例３と同様にして凍結を行なった。解凍後、イカのドリップも実施例３と同様に測定し、結果を表２に示した。また、解凍後のイカの観察を行なったが、植氷シートを用いた場合には、用いない場合と比べ、透明度が高く、目が窪んでいなかった。鮮度が落ちるとイカの目は窪むことは良く知られている。
【表２】
2019115329.tif 000003
イカのドリップは魚と比べ少ないが、植氷シートを用いた場合には、用いない場合の７％になり、細胞破砕が少ないことが判明した。
【実施例５】
【００１１】［ウニの凍結比較］
ウニは凍結保存が困難なものであり、一旦凍結させるとウニ卵が破壊され形状が保たれずにのり状になってしまう。これについて植氷シートを適用した。ウニは獲りたてのものの入手が困難であったので、保存料を使用していない市販品を購入して用いた。植氷シートの上にウニ卵を並べ、そのまま容器に入れて冷凍した。解凍も実施例３および４と同様室温で行なった。
その結果、植氷シートを用いた方は、用いないものと比べ卵がしっかりと保持され、のり状への変化は全く見られなかった。ウニ卵においても植氷シートは有効に作用することが判明した。
【発明の効果】
【００１２】  本発明の氷核活性細菌破砕液のシートへの固定化によって、海産物の凍結が細胞を破砕することなく達成できることが示された。一度氷の結晶が形成されずに凍結されれば、冷凍温度は０℃を越えて解凍しなければ何℃で保存していても良く、長期に渡って鮮度を保ったまま保存されることが期待され、保存、流通のみならず、消費電力等エネルギー的にも大きなメリットがある。