(57)【要約】【課題】偽陽性の発生確率を考慮して塩基配列が変異陽性であるか変異陰性であるかを判定するプログラム等を提供すること。【解決手段】プログラムは、正常配列と該正常配列の一部が変異した変異配列とを含む参照核酸塩基配列を取得し、検体から読み取った複数の検体核酸塩基配列を取得し、前記検体核酸塩基配列のうち、前記参照核酸塩基配列に対応する読取配列数と、前記変異配列に対応する変異配列数とを判定し、核酸塩基配列を読み取る際のエラー率を取得し、前記変異配列数と、前記読取配列数と、前記エラー率と、所定の偽陽性率とに基づいて、前記検体核酸塩基配列が変異陽性であるか否かを判定する処理をコンピュータに実行させる。【選択図】図１６
2019191952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常配列と該正常配列の一部が変異した変異配列とを含む参照核酸塩基配列を取得し、
検体から読み取った複数の検体核酸塩基配列を取得し、
前記検体核酸塩基配列のうち、前記参照核酸塩基配列に対応する読取配列数と、前記変異配列に対応する変異配列数とを判定し、
核酸塩基配列を読み取る際のエラー率を取得し、
前記変異配列数と、前記読取配列数と、前記エラー率と、所定の偽陽性率とに基づいて、前記検体核酸塩基配列が変異陽性であるか否かを判定する
処理をコンピュータに実行させるプログラム。
【請求項２】
前記変異配列数と、前記読取配列数と、所定の偽陰性率と、所定の検出限界値とに基づいて、前記検体核酸塩基配列が変異陽性であるか否かを判定する
請求項１に記載のプログラム。
【請求項３】
前記読取配列数と、前記エラー率と、所定の偽陽性率とに基づいて、前記検体核酸塩基配列が変異陽性であるか否かを判定する第１閾値を算出し、
前記読取配列数と、所定の偽陰性率と、所定の検出限界値とに基づいて、前記検体核酸塩基配列が変異陽性であるか否かを判定する第２閾値を算出し、
前記第２閾値が前記第１閾値以上であり、かつ、前記変異配列数が前記第２閾値以上である場合に、変異陽性であると判定する
請求項２に記載のプログラム。
【請求項４】
前記第１閾値は（１）式に基づいて判定し、
前記第２閾値は（２）式に基づいて判定する
請求項３に記載のプログラム。
【数１】
2019191952.tif 000006
【請求項５】
検体核酸塩基配列は、次世代シーケンサにより読み取られる
請求項１から請求項４のいずれか一つに記載のプログラム。
【請求項６】
前記検体核酸塩基配列が変異陽性であると判定した場合、該検体核酸塩基配列に基づいて薬剤名を出力する
請求項１から請求項５のいずれか一つに記載のプログラム。
【請求項７】
複数の参照核酸塩基配列のそれぞれについて、前記読取配列数を取得し、
第１の参照核酸塩基配列に対応する前記読取配列数が所定の値以下である場合に、他の参照核酸塩基配列に対応する前記読取配列数に基づいて、前記検体核酸塩基配列が変異陽性であるか否かを判定する
請求項１から請求項６のいずれか一つに記載のプログラム。
【請求項８】
正常配列と変異配列とを含む参照核酸塩基配列を取得し、
検体から読み取った複数の検体核酸塩基配列を取得し、
前記検体核酸塩基配列のうち、前記参照核酸塩基配列に対応する読取配列数と、前記変異配列に対応する変異配列数とを判定し、
核酸塩基配列を読み取る際のエラー率を取得し、
前記変異配列数と、前記読取配列数と、前記エラー率と、所定の偽陽性率とに基づいて、前記検体核酸塩基配列が変異陽性であるか否かを判定する
処理をコンピュータに実行させる情報処理方法。
【請求項９】
正常配列と変異配列とを含む参照核酸塩基配列を取得する参照核酸塩基配列取得部と、
検体から読み取った複数の検体核酸塩基配列を取得する検体核酸塩基配列取得部と、
前記検体核酸塩基配列取得部が取得した検体核酸塩基配列のうち、前記参照核酸塩基配列取得部が取得した参照核酸塩基配列に対応する読取配列数と、前記参照核酸塩基配列取得部が取得した変異配列に対応する変異配列数とを判定する判定取得部と、
核酸塩基配列を読み取る際のエラー率を取得するエラー率取得部と、
前記判定取得部が判定した変異配列数および読取配列数と、前記エラー率取得部が取得したエラー率と、所定の偽陽性率とに基づいて、前記検体核酸塩基配列取得部が取得した検体核酸塩基配列が変異陽性であるか否かを判定する変異陽性判定部と
を備える情報処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プログラム、情報処理方法および情報処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎がん患者から腎がん組織を採取し、腎がんに関連する遺伝子の発現レベルまたは発現量を測定して腎がんの悪性度を判別する方法が開示されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１６−８６６７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
大量の遺伝子の塩基配列を高速で読み取る、次世代シーケンサが使用されている。次世代シーケンサにおいては、複数の塩基配列を平行して読み取ることにより高速化を実現している。次世代シーケンサを用いて読み取った塩基配列の変異に基づいて、適切な抗がん剤が選択される。しかしながら、塩基配列を読み取るために遺伝子を増幅する工程の間に、複製エラーが生じる場合がある。また、塩基配列を次世代シーケンサで読み取る課程でも、読み取りエラーが生じる場合がある。
【０００５】
複製エラー、および、次世代シーケンサ内部での読み取りエラーにより、 がん細胞を含まない検体にがん細胞が含まれると誤って判定される、偽陽性の判定が行なわれる場合がある。特許文献１に記載の方法では、偽陽性の発生確率を考慮した判定を行なえない。
【０００６】
一つの側面では、複製エラー、および、次世代シーケンサ内部での読み取りエラーによる偽陽性の発生確率を考慮して塩基配列が変異陽性であるか変異陰性であるかを判定するプログラム等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
プログラムは、正常配列と当該正常配列の一部が変異した変異配列とを含む参照核酸塩基配列を取得し、検体から読み取った複数の検体核酸塩基配列を取得し、前記検体核酸塩基配列のうち、前記参照核酸塩基配列に対応する読取配列数と、前記変異配列に対応する変異配列数とを判定し、核酸塩基配列を読み取る際のエラー率を取得し、前記変異配列数と、前記読取配列数と、前記エラー率と、所定の偽陽性率とに基づいて、前記検体核酸塩基配列が変異陽性であるか否かを判定する処理をコンピュータに実行させる。
【発明の効果】
【０００８】
一つの側面では、偽陽性の発生確率を考慮して塩基配列が変異陽性であるか変異陰性であるかを判定するプログラム等を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】遺伝子検査を用いた治療手順の概要を説明する説明図である。
【図２】遺伝子検査方法の概要を説明する説明図である。
【図３】遺伝子検査方法の概要を説明する説明図である。
【図４】リードの例を説明する説明図である。
【図５】塩基配列の増幅過程を説明する説明図である。
【図６】塩基配列の増幅過程を説明する説明図である。
【図７】一つの標的配列に関連する変異陽性配列数Ｍの確率密度分布を説明する説明図である。
【図８】図７のＡ部拡大図である。
【図９】遺伝子検査システムの構成を説明する説明図である。
【図１０】参照配列ＤＢのレコードレイアウトを説明する説明図である。
【図１１】読取データファイルの例を説明する説明図である。
【図１２】読取結果ＤＢのレコードレイアウトを説明する説明図である。
【図１３】判定結果ＤＢのレコードレイアウトを説明する説明図である。
【図１４】未知変異ＤＢのレコードレイアウトを説明する説明図である。
【図１５】判定結果を表示する画面の例である。
【図１６】判定結果を表示する画面の例である。
【図１７】プログラムの処理の流れを説明するフローチャートである。
【図１８】判定のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。
【図１９】閾値判定のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。
【図２０】統計判定のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。
【図２１】第１閾値ＭＰ算出のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。
【図２２】第２閾値ＭＮ算出のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。
【図２３】パラメータＤＢのレコードレイアウトを説明する説明図である。
【図２４】実施の形態２の閾値判定のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。
【図２５】パラメータ調整のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。
【図２６】実施の形態３のプログラムの処理の流れを説明するフローチャートである。
【図２７】実施の形態３のプログラムの処理の流れを説明するフローチャートである。
【図２８】実施の形態３のプログラムの処理の流れを説明するフローチャートである。
【図２９】情報処理装置の機能ブロック図である。
【図３０】実施の形態５の遺伝子検査システムの構成を説明する説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［実施の形態１］
図１は、遺伝子検査を用いた治療手順の概要を説明する説明図である。以下では、肺がんの治療を例に挙げて説明する。まず、がん患者、または、がんの疑いのある患者から検体が採取される。検体の採取は、たとえば気管支内視鏡を用いた擦過細胞診、洗浄細胞診、経気管支肺生検、または、超音波気管鏡ガイド下針生検等の手技により行なわれる。これらの経内視鏡的な検体採取法は比較的低侵襲であるが、採取できる検体の量は少ない。
【００１１】
検体は、経皮針生検、開胸針生検、または、胸腔鏡下肺生検等の、比較的高侵襲の検体採取法により採取される場合もある。肺切除等の手術が行なわれた場合には、切除された組織の一部が遺伝子検査の検体に使用される。
【００１２】
検体から、核酸、すなわちＤＮＡ（Deoxyribonucleic Acid）およびＲＮＡ（Ribonucleic Acid）を抽出して、増幅させる前処理を行なう。前処理の詳細については後述する。次世代シーケンサ解析により核酸塩基配列、すなわちＤＮＡの塩基配列およびＲＮＡの塩基配列を読み取る。読み取られた核酸塩基配列は、たとえばＦＡＳＴＱフォーマット形式のファイルに保存される。以後の説明においては、核酸塩基配列を塩基配列と記載する場合がある。
【００１３】
保存された核酸塩基配列を所定の参照配列と比較して、どのような遺伝子変異が生じているかを判定する。遺伝子変異の状態に応じて、抗がん剤を選択する等の治療方針を決定し、治療を行なう。
【００１４】
図２および図３は、遺伝子検査方法の概要を説明する説明図である。検体Ｎｏ．１は、一人の患者から、または一つの患部から採取した検体である。検体には、正常細胞とがん細胞とが含まれている。肺がん患者から気管支鏡を用いた洗浄細胞診等により採取した検体の場合、全細胞中に占めるがん細胞の割合は数パーセント程度である。
【００１５】
遺伝子検査を行なう検体より、ＤＮＡおよびＲＮＡを抽出する。逆転写酵素を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡ（complementary Deoxyribonucleic Acid）に変換する。検体をＤＮＡ解析用と、ＲＮＡ解析用とに分割する。
【００１６】
ＤＮＡ解析用のサンプルの処理について説明する。図３に示すように、検体のＤＮＡに含まれる標的配列を切断する。標的配列は、がん関連遺伝子の塩基配列である。図２に戻って説明を続ける。ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等により標的配列を増幅する。たとえば、３４サイクルのＰＣＲを行なうことにより、標的配列の量を約１７０億倍に増幅できる。ＳＰＲＩ（Solid Phase Reversible Immobilization）技術等により、増幅した標的配列を精製する。
【００１７】
図３に示すように、増幅した標的配列の両端に検体識別用の識別アダプタを付加する。識別アダプタは、検体ごとに定めた塩基配列である。図２に戻って説明を続ける。識別アダプタの付加は、たとえば６サイクルのＰＣＲにより実施する。識別アダプタを付加した標的配列を精製する。
【００１８】
ＲＮＡ解析用のサンプルの処理について説明する。たとえば３４サイクルのＰＣＲを行い、標的配列のｃＤＮＡを増幅する。増幅した標的配列を精製する。増幅した標的配列の両端に検体識別用の識別アダプタを付加する。識別アダプタの付加は、たとえば６サイクルのＰＣＲにより実施する。識別アダプタを付加した標的配列を精製する。
【００１９】
一つの検体から分割して増幅と精製を実施したＤＮＡ解析用の検体とＲＮＡ解析用の検体とを混合する。図３に示すように、識別アダプタを付与した標的配列の両端に、指定配列を付加する。指定配列は、次世代シーケンサによる増幅および塩基配列の読み取りを行なうために必要な塩基配列である。図２に戻って説明を続ける。指定配列の付加は、たとえば６サイクルのＰＣＲにより実施する。指定配列をよび識別アダプタを付加した標的配列を精製する。
【００２０】
たとえば９６個の検体のそれぞれについて以上の処理を行った後に混合し、次世代シーケンサ解析を行なう。次世代シーケンサは、多数の核酸塩基配列を平行して読み取り、識別アダプタごとにファイルを分けて記録する。
【００２１】
図４は、リードの例を説明する説明図である。リードは、１本の標的配列から読み取った塩基配列を意味する。塩基配列は、Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）およびＣ（シトニン）の４文字により表現される。
【００２２】
参照配列は、標的配列に対応する正常配列、および、正常配列の一部が変異した変異配列である。なお、図４においては、１つの塩基が他の塩基に置き換えられた変異配列を例示するが、変異配列はこれに限定しない。変異配列には、正常配列の塩基の一部が脱落した配列、正常配列の途中に塩基が追加された配列、正常配列の一部に繰り返しが生じた配列等、正常配列とは異なる塩基数を有する塩基配列を含む。一つの標的配列にかかる変異配列には、第１変異配列から順次番号が付与される。
【００２３】
それぞれのリードは、参照配列と比較して、分類される。正常配列と一致する配列は、変異陰性に分類される。いずれかの変異配列と一致する配列は、変異陽性に分類される。参照配列とは異なる標的配列に対応する塩基配列は、無関係の配列に分類される。標的配列のそれぞれに対応する参照配列との比較と分類を行なうことにより、それぞれの標的配列の変異陰性配列数、第Ｉ変異配列と一致する第Ｉ変異陽性配列数ＭＩ、および、読取配列数ｎを判定できる。以下の説明においては、第Ｉ変異陽性配列数ＭＩを変異陽性配列数Ｍと記載する場合がある。
【００２４】
図５および図６は、塩基配列の増幅過程を説明する説明図である。図５の左側は、変異のない塩基配列が正常に増幅された場合を示す。図５の左側は、変異のある塩基配列が正常に増幅された場合を示す。いずれの場合も、元の塩基配列と同じ塩基配列が増幅する。
【００２５】
図６の左側は、変異のない塩基配列が正常に増幅された場合を示す。元の塩基配列と同じ塩基配列が増幅する。図６の右側は、増幅過程の途中で、複製エラーによる変異が生じた場合を示す。増幅した塩基配列の一部が、元の塩基配列と異なる配列になっている。
【００２６】
複製エラー、および、次世代シーケンサ内部での読み取りエラーの発生確率は、標的配列の塩基配列、標的配列の長さ、前処理における増幅条件、および、次世代シーケンサの機種等により異なる。予備実験により、それぞれの標的配列について、元の塩基配列と、増幅過程を経て、次世代シーケンサにより読み取られる塩基配列とが異なる確率であるエラー率ｐを調査できる。 エラー率ｐは、複製エラーと、次世代シーケンサ内部での読み取りエラーとを合算した総エラーの発生確率である。
【００２７】
図７は、一つの標的配列に関連する変異陽性配列数Ｍの確率密度分布を説明する説明図である。図８は、図７のＡ部拡大図である。横軸は、変異陽性であると判定された変異陽性配列数Ｍであり、単位は本である。縦軸は、確率密度であり、単位は無次元である。なお、図７および図８に示すグラフは説明のための例示であり、グラフの形状は以下に説明する各パラメータにより変化する。
【００２８】
実線は、がん細胞が含まれない検体から取得したｎ本のリードに、Ｍ本の変異陽性リードが含まれる確率密度ｆ（ｎ，Ｍ，ｐ）を示す。すなわち、確率密度ｆは、Ｎ本のリード中に偽陽性の変異陽性リードがＭ本生じる確率密度である。
【００２９】
破線は、検出限界値ｑでがん細胞が含まれる検体から取得したｎ本のリードに、Ｍ本の変異陽性リードが含まれる確率密度ｇ（ｎ、Ｍ、ｑ／２）を示す。すなわち、確率密度ｇは、Ｎ本のリード中に真陽性の変異陽性リードがＭ本生じる確率密度である。
【００３０】
ここで、検出限界値ｑは検体に含まれる細胞中のがん細胞の割合の検出限界値を意味する。検出限界値ｑが大きい場合には、がん細胞の含有率の大きい検体を使用する必要がある。細胞診により採取された検体はがん細胞の含有率が比較的少ないため、検出限界値ｑは小さいことが望ましい。
【００３１】
以下の説明では、確率密度ｆ（ｎ，Ｍ，ｐ）および確率密度ｇ（ｎ、Ｍ、ｑ／２）を、変数を省略してそれぞれ確率密度ｆおよび確率密度ｇと記載する場合がある。確率密度ｆおよび確率密度ｇは、変異陽性配列数Ｍが０からｎの範囲で積分した場合に、１になる関数である。
【００３２】
確率密度ｆは、（１）式により算出される。
【００３３】
【数１】
2019191952.tif 000003
【００３４】
図３を使用して説明を続ける。変異陽性配列数Ｍが、第１閾値ＭＰ以下である場合に、検体は標的配列にかかる変異を含まないと判定される。この場合、変異陽性配列数ＭがＭＰよりも大きい場合に、判定が偽陽性になる可能性がある。図８に左下がりのハッチングで示す部分の面積が、偽陽性率Ｆｐに対応する。
【００３５】
第１閾値ＭＰは、偽陽性率Ｆｐ＝（１−特異度）が所定の値以下である最大の変異陽性配列数Ｍになるように設定される。第１閾値ＭＰを調整することにより、遺伝子検査の特異度を調整できる。
【００３６】
確率密度ｇは、（２）式により算出される。
【００３７】
【数２】
2019191952.tif 000004
【００３８】
変異陽性配列数Ｍが、第２閾値ＭＮより大きい場合に、検体は標的配列にかかる変異を含むと判定される。この場合、変異陽性配列数ＭがＭＮ以下である場合に、判定が偽陰性になる可能性がある。図８に右下がりのハッチングで示す部分の面積が、偽陰性率Ｆｎに対応する。
【００３９】
第２閾値ＭＮは、偽陰性率Ｆｎ＝（１−感度）が所定の値以下である最小の変異陽性配列数Ｍになるように設定される。第２閾値ＭＮを調整することにより、遺伝子検査の感度を調整できる。
【００４０】
読取配列数ｎが小さい場合、エラー率ｐが大きい場合、および、検出限界値ｑが小さい場合には、ＭＰがＭＮより大きくなる場合がある。このような場合には、検体が標的配列にかかる変異を含むか否かを判定できない。
【００４１】
たとえば、検出限界値ｑを大きく設定することにより、ＭＰがＭＮ以下になる場合がある。これは、検体中に含まれるがん細胞の比率が低い場合には、標的配列の変異が検出されずに、変異陰性であると判定することに対応する。
【００４２】
図９は、遺伝子検査システム１０の構成を説明する説明図である。遺伝子検査システム１０は、ネットワークを介して接続された次世代シーケンサ１３、ファイルサーバ１６および情報処理装置２０を備える。
【００４３】
次世代シーケンサ１３は、図２を使用して説明した前処理が行なわれた検体の塩基配列を読み取り、所定のフォーマットで記録した読取データファイル４６をファイルサーバ１６に保存する。次世代シーケンサ１３の構成の詳細およびファイルサーバ１６の構成の詳細については、説明を省略する。なお、次世代シーケンサ１３とファイルサーバ１６とは、一体になっていても良い。
【００４４】
情報処理装置２０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２１、主記憶装置２２、補助記憶装置２３、通信部２４、入力部２５、表示部２６およびバスを備える。ＣＰＵ２１は、本実施の形態のプログラムを実行する演算制御装置である。ＣＰＵ２１には、一または複数のＣＰＵまたはマルチコアＣＰＵ等が使用される。ＣＰＵ２１は、バスを介して情報処理装置２０を構成するハードウェア各部と接続されている。
【００４５】
主記憶装置２２は、ＳＲＡＭ（Static Random Access Memory）、ＤＲＡＭ（Dynamic Random Access Memory）、フラッシュメモリ等の記憶装置である。主記憶装置２２には、ＣＰＵ２１が行なう処理の途中で必要な情報およびＣＰＵ２１で実行中のプログラムが一時的に保存される。
【００４６】
補助記憶装置２３は、ＳＲＡＭ、フラッシュメモリまたはハードディスク等の記憶装置である。補助記憶装置２３には、参照配列ＤＢ４１、読取結果ＤＢ４２、ＣＰＵ２１に実行させるプログラム、およびプログラムの実行に必要な各種データが保存される。
【００４７】
通信部２４は、情報処理装置２０とネットワークとの間のデータ通信を行なうインターフェイスである。入力部２５は、キーボードおよびマウス等である。表示部２６は、液晶表示パネルまたは有機ＥＬ（electro-luminescence）表示パネル等である。
【００４８】
本実施の携帯の情報処理装置２０は、汎用のパソコンまたはタブレット等の情報処理装置である。情報処理装置２０は、次世代シーケンサ１３またはファイルサーバ１６と一体になっていても良い。情報処理装置２０と、次世代シーケンサ１３と、ファイルサーバ１６とが一体になっていても良い。情報処理装置２０は一つまたは複数の大型計算機上で動作する仮想マシンであっても良い。
【００４９】
参照配列ＤＢ４１および読取結果ＤＢ４２は、ファイルサーバ１６、または、ネットワークを介して情報処理装置２０に接続されたデータサーバ等の記憶装置に記憶されていても良い。各ＤＢは、別々の記憶装置に記憶されていても良い。
【００５０】
図１０は、参照配列ＤＢ４１のレコードレイアウトを説明する説明図である。参照配列ＤＢ４１は、領域名と、参照配列と、エラー率ｐとを関連づけて記録するＤＢである。参照配列ＤＢ４１は、領域名フィールド、参照配列フィールドおよびエラー率ｐフィールドを有する。参照配列フィールドは、正常配列フィールドおよび変異配列フィールドを有する。変異配列フィールドは、第１変異配列フィールドから順次番号付けされた変異配列サブフィールドを有する。
【００５１】
領域名フィールドには、標的配列の領域名が記録されている。正常配列フィールドには、正常な塩基配列が記録されている。変異配列フィールドには、既知の変異配列が記録されている。なお、既知の変異配列の数は標的配列により異なる。変異配列が少ない標的領域に関するレコードにおいては、後ろの変異配列フィールドは空欄である。エラー率ｐフィールドには、予備実験等により算出したエラー率ｐが記録されている。
【００５２】
図１１は、読取データファイル４６の例を説明する説明図である。図１１には、ＦＡＳＴＱフォーマット形式のファイルの例を示す。ＦＡＳＴＱファイル形式においては、リードＩＤ行、塩基配列行、＋記号およびクオリティ行の４行に、１本のリードのデータが記録される。
【００５３】
リードＩＤ行には、次世代シーケンサによりリードに固有に付与されたリードＩＤが記録されている。塩基配列行には、次世代シーケンサにより読み取られた塩基配列が記録されている。クオリティ行には、塩基配列行に記録されたそれぞれの塩基のクオリティ値、すなわち信頼性の指標が記録されている。
【００５４】
前述の通り、次世代シーケンサ１３は図３を使用して説明した識別アダプタごとに別々の読取データファイル４６を作成する。したがって、１つの読取データファイル４６には、一つの検体のリードが記録されている。次世代シーケンサ１３は、一回の解析の結果を一つのフォルダに記録する。なお、読取データファイル４６の形式はＦＡＳＴＱフォーマット形式に限定しない。
【００５５】
図１２は、読取結果ＤＢ４２のレコードレイアウトを説明する説明図である。判定結果ＤＢ４３は、検体に固有に付与された検体ＩＤと、領域名と、次世代シーケンサにより読み取った読取結果とを関連づけて記録するＤＢである。
【００５６】
読取結果ＤＢ４２は、検体ＩＤフィールド、領域名フィールド、読取配列数ｎフィールドおよび変異陽性配列数Ｍフィールドを有する。変異陽性配列数Ｍフィールドは、第１変異陽性配列数Ｍ１フィールド、第２変異陽性配列数Ｍ２フィールド等の第Ｉ変異陽性配列数ＭＩフィールドを有する。
【００５７】
検体ＩＤフィールドには、検体に固有に付与された検体ＩＤ（Identifier）が記録されている。領域名フィールドには、標的配列の領域名が記録されている。読取配列数ｎフィールドには、標的配列の読取配列数ｎが記録されている。
【００５８】
第１変異陽性配列数Ｍ１フィールドには、参照配列ＤＢ４１の第１変異配列フィールドに対応する変異陽性リードの数が記録されている。第２変異陽性配列数Ｍ２フィールドには、参照配列ＤＢ４１の第２変異配列フィールドに対応する変異陽性リードの数が記録されている。第Ｉ変異陽性配列数ＭＩフィールドには、参照配列ＤＢ４１の第Ｉ変異配列フィールドに対応する変異陽性リードの数が記録されている。読取結果ＤＢ４２は、一つの検体の一つの領域について、一つのレコードを有する。
【００５９】
図１３は、判定結果ＤＢ４３のレコードレイアウトを説明する説明図である。判定結果ＤＢ４３は、検体に固有に付与された検体ＩＤと、領域名と、判定結果とを関連づけて記録するＤＢである。
【００６０】
判定結果ＤＢ４３は、検体ＩＤフィールド、領域名フィールド、変異配列フィールド、判定結果フィールドおよび判定条件フィールドを有する。判定条件フィールドは、特異度フィールド、感度フィールドおよび検出限界値ｑフィールドを有する。
【００６１】
検体ＩＤフィールドには、検体に固有に付与された検体ＩＤが記録されている。領域名フィールドには、標的配列の領域名が記録されている。変異配列フィールドには、変異配列名が記録されている。変異配列フィールドの「−」は、どの変異配列であるかを特定しないことを意味する。
【００６２】
判定結果フィールドには、判定結果が記録されている。「ZeroReads」はリードが検出されなかったことを、「Positive」は変異陽性を、「Negative」は変異陰性を示す。特異度フィールドには、判定に用いた特異度が記録されている。感度フィールドには、判定に用いた感度が記録されている。検出限界値ｑフィールドには、判定に用いた検出限界値ｑが記録されている。
【００６３】
図１４は、未知変異Ｄ４４Ｂのレコードレイアウトを説明する説明図である。未知変異ＤＢ４４は、検体ＩＤフィールド、領域名フィールド、リードフィールドおよび備考フィールドを有する。検体ＩＤフィールドには、検体に固有に付与された検体ＩＤが記録されている。領域名フィールドには、標的配列の領域名が記録されている。リードフィールドには、未知変異と判定されたリードの塩基配列が記録されている。なお、リードフィールドに塩基配列の代わりにリードＩＤを記録しても良い。備考フィールドには、備考が記録される。
【００６４】
未知変異について、説明する。たとえば、ＥＧＦＲ  ｅｘ１９領域、および、ＡＬＫ領域は、数多くの変異型を有する。変異型の中には、まだ学会等に報告されていない、いわゆる未知変異が含まれる。
【００６５】
参照配列ＤＢ４１の末尾の変異配列サブフィールドに、塩基配列の一部分をいわゆるワイルドカードにした変異配列を記憶しておくことにより、既知の変異配列のいずれとも一致しない未知変異を有するリードを検出できる。このようなリードの塩基配列が、リードフィールドに記録される。未知変異ＤＢ４４に記録したデータを研究することにより、治療方法の研究等に役立てられる。
【００６６】
図１５および図１６は、判定結果を表示する画面の例である。図１５に示す画面は、検体選択欄５１、解析ボタン５２および解析結果欄５３を有する。解析ボタン５２は、単一解析ボタン５２１および複数解析ボタン５２２を含む。解析結果欄５３は、第１解析結果欄５３１、第２解析結果欄５３２、第３解析結果欄５３３、および第４解析結果欄５３４を含む。
【００６７】
ユーザにより、単一解析ボタン５２１が選択された場合、ＣＰＵ２１はユーザにより指定された１つの検体に対応する読取データファイル４６を取得して、解析を行なう。ユーザにより、複数解析ボタン５２２が選択された場合、ＣＰＵ２１はユーザにより指定された１つのフォルダに保存された複数の読取データファイル４６を取得して、解析を行なう。図１５は、複数解析ボタン５２２が選択されて、解析が行なわれた後の画面を示す。
【００６８】
第１解析結果欄５３１には、標的配列のうち体細胞変異ＤＮＡに関する解析結果が表示される。第２解析結果欄５３２には、標的配列のうち生殖細胞系列ＤＮＡに関する解析結果が表示される。第３解析結果欄５３３には、標的配列のうち体細胞変異ＲＮＡに関する解析結果が表示される。第４解析結果欄５３４には、標的配列のうち生殖細胞系列ＲＮＡに関する解析結果が表示される。
【００６９】
第１解析結果欄５３１について、さらに詳細に説明する。第１解析結果欄５３１の１行は、一つの標的配列に関する解析結果を示す。たとえば、第１解析結果欄５３１の１行目は、がん遺伝子の一つであるＥＧＦＲ（Epidermal Growth Factor Receptor：上皮増殖因子受容体）遺伝子のエクソン（exon）１８領域が変異陰性であると判定されたことを示す。
【００７０】
ユーザは、検体選択欄５１を使用して、所望の検体の解析結果を閲覧できる。図１５においては、Ｎｏ．２４の検体が選択されている。図１６は、図１５とは異なるＮｏ．２の検体の解析結果を表示する状態を示す。
【００７１】
図１６においては、第１解析結果欄５３１に、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｃ（３７Ｇ＞Ｔ）が変異陽性であり、検体に５１．６％のがん細胞が含まれていると推定する旨が表示されている。第５解析結果欄５３５がポップアップ表示されており、関連するリード数の詳細が表示されている。第５解析結果欄５３５の下部に、解析に使用した検出限界値ｑ、特異度および感度が表示されている。
【００７２】
図１５の第３解析結果欄５３３および図１６の第１解析結果欄５３１に例示するように、いずれかの標的配列が変異陰性である場合、解析結果欄５３の表題が枠で囲まれる。ユーザは、変異陽性の標的配列が含まれることに、容易に気付ける。なお、肺がんにおいては標的配列の変異の有無によって、薬剤の治療効果が大きく異なることが知られている。したがって、ユーザは図１５および図１６に示す解析結果を参照することにより、患者に投与する薬剤を適切に選択できる。
【００７３】
ＣＰＵ２１は、変異陽性である標的配列に基づいて、推奨する薬剤名を表示しても良い。たとえば検体のＥＧＦＲ  ｅｘ１９が欠失しているか、または、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異が検出された場合には、ＣＰＵ２１は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ等の薬剤名を表示する。薬剤名は、商品名を用いて表示しても良い。
【００７４】
図１７は、プログラムの処理の流れを説明するフローチャートである。ＣＰＵ２１は、リード数のカウントに使用する各変数をゼロに初期化する（ステップＳ５０１）。ＣＰＵ２１は、参照配列ＤＢ４１より１つの参照配列レコードを取得する（ステップＳ５０２）。ＣＰＵ２１は、読取データファイル４６から１本のリードの塩基配列を取得する（ステップＳ５０３）。
【００７５】
ＣＰＵ２１は、判定のサブルーチンを起動する（ステップＳ５０４）。判定のサブルーチンは、ステップＳ５０３で取得したリードの塩基配列と、ステップＳ５０２で取得した参照配列とを対比して、リードが参照配列に対応するか否かを判定するサブルーチンである。判定のサブルーチンの処理の流れは後述する。
【００７６】
ＣＰＵ２１は、１つの読取データファイル４６に記録された全リードの処理を終了したか否かを判定する（ステップＳ５０５）。終了していないと判定した場合（ステップＳ５０５でＮＯ）、ＣＰＵ２１はステップＳ５０３に戻る。
【００７７】
終了したと判定した場合（ステップＳ５０５でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は読取結果ＤＢ４２に新規レコードを追加し、各フィールドにデータを記録する（ステップＳ５０６）。ＣＰＵ２１は閾値判定のサブルーチンを起動する（ステップＳ５０７）。閾値判定のサブルーチンは、所定の特異度、感度および検出限界値ｑに基づいて、標的配列が変異陽性であるか変異陰性であるかを判定する閾値を判定するサブルーチンである。閾値判定のサブルーチンの処理の流れは後述する。
【００７８】
ＣＰＵ２１は、参照配列ＤＢ４１に記録されたすべてのレコードの処理を終了したか否かを判定する（ステップＳ５０８）。終了していないと判定した場合（ステップＳ５０８でＮＯ）、ＣＰＵ２１はステップＳ５０１に戻る。終了したと判定した場合（ステップＳ５０８でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は処理を終了する。
【００７９】
図１８は、判定のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。判定のサブルーチンは、リードの塩基配列と参照配列とを対比して、リードが参照配列に対応するか否かを判定するサブルーチンである。
【００８０】
ＣＰＵ２１は、リードが参照配列レコードの正常配列フィールドに記録された正常配列と一致するか否かを判定する（ステップＳ５１１）。リードが正常配列と一致しないと判定した場合（ステップＳ５１１でＮＯ）、ＣＰＵ２１はカウンタＩを１に設定する（ステップＳ５２１）。ＣＰＵ２１は、リードが参照配列レコードの第Ｉ変異配列フィールドに記録された第Ｉ変異配列と一致するか否かを判定する（ステップＳ５２２）。
【００８１】
第Ｉ変異配列と一致しないと判定した場合（ステップＳ５２２でＮＯ）、ＣＰＵ２１は、処理中の参照配列レコードに記録されたすべての変異配列の処理を終了したか否かを判定する（ステップＳ５２３）。終了していないと判定した場合（ステップＳ５２３でＮＯ）、ＣＰＵ２１はカウンタＩに１を加算する（ステップＳ５２４）。ＣＰＵ２１はステップＳ５２２に戻る。終了したと判定した場合（ステップＳ５２３でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は処理を終了する。
【００８２】
第Ｉ変異配列と一致すると判定した場合（ステップＳ５２２でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は第Ｉ変異配列数ＭＩをカウントする変数に１を加算する（ステップＳ５２６）。
【００８３】
ＣＰＵ２１は、処理中のリードが未知変異であるか否かを判定する（ステップＳ５２７）。前述のとおり、第Ｉ変異配列がワイルドカードを含む場合に、ＣＰＵ２１は処理中のリードは未知変異であると判定する。
【００８４】
未知変異であると判定した場合（ステップＳ５２７でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は未知変異ＤＢ４４にレコードを作成し、リードを記録する（ステップＳ５２８）。未知変異ではないと判定した場合（ステップＳ５２７でＮＯ）、正常配列と一致すると判定した場合（ステップＳ５１１でＹＥＳ）、または、ステップＳ５２８の終了後、ＣＰＵ２１は読取配列数ｎをカウントする変数に１を加算する（ステップＳ５１２）。ＣＰＵ２１は、処理を終了する。
【００８５】
図１９は、閾値判定のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。閾値判定のサブルーチンは、所定の特異度、感度および検出限界値に基づいて、標的配列が変異陽性であるか変異陰性であるかを判定する閾値を判定するサブルーチンである。
【００８６】
ＣＰＵ２１は、特異度、感度、および検出限界値ｑにかかる初期条件を取得する（ステップＳ５３１）。なお、特異度、感度、および検出限界値ｑにかかる初期条件は補助記憶装置２３に記憶されている。ＣＰＵ２１は、ユーザによる初期条件の入力を受け付けても良い。
【００８７】
ＣＰＵ２１は、読取配列数ｎがゼロであるか否かを判定する（ステップＳ５３２）。ゼロであると判定した場合（ステップＳ５３２でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は、判定結果は「ZeroReads」である、すなわち処理中の参照配列に対応するリードは読取データファイル４６に含まれないと判定する（ステップＳ５３３）。
【００８８】
ＣＰＵ２１は、判定結果ＤＢ４３に新規レコードを追加する。ＣＰＵ２１は、各フィールドに結果を記録する（ステップＳ５３４）。具体的には、ＣＰＵ２１は、検体ＩＤフィールドおよび領域名フィールドに処理中の検体ＩＤおよび領域名を記録する。ＣＰＵ２１は、判定結果フィールドにどの変異配列であるかを特定しないことを意味する「−」を記録する。ＣＰＵ２１は、判定結果フィールドに「ZeroReads」を記録する。ＣＰＵ２１は、判定条件フィールドに、特異度、感度および検出限界値ｑをそれぞれ記録する。ＣＰＵ２１は、処理を終了する。
【００８９】
読取配列数ｎがゼロではないと判定した場合（ステップＳ５３２でＮＯ）、ＣＰＵ２１は第１閾値ＭＰ算出のサブルーチンを起動する（ステップＳ５４１）。第１閾値ＭＰ算出のサブルーチンは、図７および図８を使用して説明した、特異度に関連する第１閾値ＭＰを算出するサブルーチンである。第１閾値ＭＰ算出のサブルーチンの処理の流れは後述する。
【００９０】
ＣＰＵ２１は第２閾値ＭＮ算出のサブルーチンを起動する（ステップＳ５４２）。第２閾値ＭＮ算出のサブルーチンは、図７および図８を使用して説明した、感度に関連する第２閾値ＭＮを算出するサブルーチンである。第２閾値ＭＮ算出のサブルーチンの処理の流れは後述する。
【００９１】
ＣＰＵ２１は、第１閾値ＭＰが第２閾値ＭＮ以下であるか否かを判定する（ステップＳ５４３）。第１閾値ＭＰが第２閾値ＭＮ以下であると判定した場合（ステップＳ５４３でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は統計判定のサブルーチンを起動する（ステップＳ５４４）。統計判定のサブルーチンは読取結果ＤＢ４２に記録された変異陽性配列数Ｍと、第２閾値ＭＮとを比較して、変異陽性であるか否かを統計的に判定するサブルーチンである。統計判定のサブルーチンの処理の流れは後述する。その後、ＣＰＵ２１は処理を終了する。
【００９２】
第１閾値ＭＰが第２閾値ＭＮを越えると判定した場合（ステップＳ５４３でＮＯ）、ＣＰＵ２１は検出限界値ｑの増加が許されているか否かを判定する（ステップＳ５４５）。検出限界値ｑの最大値は、補助記憶装置２３に記録されている。ＣＰＵ２１は、ユーザによる検出限界値ｑの最大値の入力を受け付けても良い。
【００９３】
増加が許されていると判定した場合（ステップＳ５４５でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は検出限界値ｑを増加させる（ステップＳ５４６）。１回あたりの増加量は、補助記憶装置２３に記録されている。ＣＰＵ２１は、ユーザによる検出限界値ｑの増加量の入力、または、増加後の検出限界値ｑの値の入力を受け付けても良い。ＣＰＵ２１は、ステップＳ５４２に戻る。
【００９４】
増加が許されていないと判定した場合（ステップＳ５４５でＮＯ）、ＣＰＵ２１は、判定結果は「not determined」である、すなわち処理中の参照配列が変異陽性であるか、変異陰性であるかは判定できないと判定する（ステップＳ５４７）。
【００９５】
ＣＰＵ２１は、判定結果ＤＢ４３に新規レコードを追加する。ＣＰＵ２１は、各フィールドに結果を記録する（ステップＳ５４８）。具体的には、ＣＰＵ２１は、検体ＩＤフィールドおよび領域名フィールドに処理中の検体ＩＤおよび領域名を記録する。ＣＰＵ２１は、判定結果フィールドにどの変異配列であるかを特定しないことを意味する「−」を記録する。ＣＰＵ２１は、判定結果フィールドに「not determined」を記録する。ＣＰＵ２１は、判定条件フィールドに、特異度、感度および検出限界値ｑをそれぞれ記録する。ＣＰＵ２１は、処理を終了する。
【００９６】
図２０は、統計判定のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。統計判定のサブルーチンは読取結果ＤＢ４２に記録された変異陽性配列数Ｍと、第２閾値ＭＮとを比較して、変異陽性であるか否かを統計的に判定するサブルーチンである。
【００９７】
ＣＰＵ２１は、カウンタＩを初期値１に設定する（ステップＳ５５１）。ＣＰＵ２１は、判定結果ＤＢ４３に新規レコードを追加する（ステップＳ５５２）。ＣＰＵ２１は、検体ＩＤフィールドおよび領域名フィールドに処理中の検体ＩＤおよび領域名を記録する。ＣＰＵ２１は、判定条件フィールドに、特異度、感度および検出限界値ｑをそれぞれ記録する。
【００９８】
ＣＰＵ２１は、検体ＩＤおよび領域名をキーとして、読取結果ＤＢ４２からレコードを抽出する。ＣＰＵ２１は、第Ｉ変異陽性配列数ＭＩフィールドから、第Ｉ変異陽性配列数ＭＩを取得する（ステップＳ５５３）。
【００９９】
ＣＰＵ２１は、第Ｉ変異陽性配列数ＭＩが第２閾値ＭＮ以下であるか否かを判定する（ステップＳ５５４）。第Ｉ変異陽性配列数ＭＩが第２閾値ＭＮ以下であると判定した場合（ステップＳ５５４でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は、判定結果は「Negative」、すなわち変異陰性であると判定する（ステップＳ５５５）。第Ｉ変異陽性配列ＭＩが第２閾値ＭＮ以下でないと判定した場合（ステップＳ５５４でＮＯ）、ＣＰＵ２１は、判定結果は「Positive」、すなわち変異陽性であると判定する（ステップＳ５５６）。
【０１００】
ステップＳ５５５またはステップＳ５５６の終了後、ＣＰＵ２１は、ステップＳ５５１で作成したレコードの判定結果フィールドに、ステップＳ５５５またはステップＳ５５６で判定した判定結果を記録する（ステップＳ５５７）。
【０１０１】
ＣＰＵ２１は、すべての変異配列リードの処理を終了したか否かを判定する（ステップＳ５５８）。終了していないと判定した場合（ステップＳ５５８でＮＯ）、ＣＰＵ２１はカウンタＩに１を加算する（ステップＳ５５９）。ＣＰＵ２１はステップＳ５５２に戻る。終了したと判定した場合（ステップＳ５５８でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は処理を終了する。
【０１０２】
図２１は、第１閾値ＭＰ算出のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。第１閾値ＭＰ算出のサブルーチンは、図７および図８を使用して説明した、特異度に関連する第１閾値ＭＰを算出するサブルーチンである。
【０１０３】
ＣＰＵ２１は、変数Ｆを初期値０に設定する（ステップＳ５６１）。ＣＰＵ２１は、変数Ｍを初期値１に設定する（ステップＳ５６２）。ＣＰＵ２１は、前述の（１）式に基づいて、ｆ（ｎ、Ｍ、ｐ）を算出する（ステップＳ５６３）。ｎは、読取結果ＤＢ４２の読取配列数ｎフィールドから取得した読取配列数ｎである。ｐは、参照配列ＤＢ４１のエラー率ｐフィールドから取得したエラー率ｐである。
【０１０４】
ＣＰＵ２１は、変数ＦにステップＳ５６３で算出したｆ（ｎ、Ｍ、ｐ）を加算する（ステップＳ５６４）。ＣＰＵ２１は、変数Ｆが特異度以上であるか否かを判定する（ステップＳ５６５）。変数Ｆが特異度未満であると判定した場合（ステップＳ５６５でＮＯ）、ＣＰＵ２１は変数Ｍに１を加算する（ステップＳ５６６）。ＣＰＵ２１は、ステップＳ５６３に戻る。
【０１０５】
変数Ｆが特異度以上であると判定した場合（ステップＳ５６５でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は、第１閾値ＭＰが変数Ｍに等しいと判定する（ステップＳ５６７）。ＣＰＵ２１は処理を終了する。
【０１０６】
図２２は、第２閾値ＭＮ算出のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。第２閾値ＭＮ算出のサブルーチンは、図７および図８を使用して説明した、感度に関連する第２閾値ＭＮを算出するサブルーチンである。
【０１０７】
ＣＰＵ２１は、変数Ｇを初期値０に設定する（ステップＳ５７１）。ＣＰＵ２１は、変数Ｍを初期値１に設定する（ステップＳ５７２）。ＣＰＵ２１は、前述の（２）式に基づいて、ｇ（ｎ、Ｍ、ｑ／２）を算出する（ステップＳ５７３）。ｎは、読取結果ＤＢ４２の読取配列数ｎフィールドから取得した読取配列数ｎである。検出限界値ｑは、検体中に含まれるがん細胞数と、検体中に含まれる全細胞数との比率である。
【０１０８】
ＣＰＵ２１は、変数ＧにステップＳ５７３で算出したｇ（ｎ、Ｍ、ｑ／２）を加算する（ステップＳ５７４）。ＣＰＵ２１は、変数Ｇが（１−感度）を越えるか否かを判定する（ステップＳ５７５）。変数Ｇが（１−感度）を越えないと判定した場合（ステップＳ５７５でＮＯ）、ＣＰＵ２１は変数Ｍに１を加算する（ステップＳ５７７）。ＣＰＵ２１は、ステップＳ５７３に戻る。
【０１０９】
変数Ｆが（１−感度）を越えると判定した場合（ステップＳ５７５でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は、第２閾値ＭＮが（変数Ｍ−１）に等しいと判定する（ステップＳ５７８）。ＣＰＵ２１は処理を終了する。
【０１１０】
本実施の形態によると、塩基配列を増幅する際のエラーに起因する偽陽性および偽陰性の発生確率を考慮して、塩基配列が変異陽性であるか、変異陰性であるかを判定できる。判定を行なう際の、感度、特異度および検出限界値ｑが明確であるため、判定結果を受領した臨床医は、判定結果の信頼性を考慮して、投与する抗がん剤を選択できる。
【０１１１】
本実施の形態によると、検出限界値ｑを適宜調整することにより、読取配列数ｎが比較的少ない場合であっても、変異陽性であるか、変異陰性であるかを判定できる。検体の質および量が不十分であり、かつ、再採取が困難である場合であっても、限界を明示した上で、可能な判定を出力することにより、臨床医の判断に寄与する情報を提供できる。
【０１１２】
本実施の形態によると、内視鏡を用いた細胞診等により採取された、微量、かつ、検出限界値ｑの低い検体であっても、感度および特異度を明確にして変異陽性であるか変異陰性であるかを判定できる。
【０１１３】
本実施の形態によると、複数の検体の塩基配列を１台の次世代シーケンサを用いて同時に読み取ることができる。たとえば、次世代シーケンサを用いた解析サービスを提供する臨床検査会社においては、次世代シーケンサの処理能力を有効に活用して、検体を受け取ってから、遺伝子変異の有無を医療機関に報告するまでの期間を短縮できる。また、それぞれの検体の処理コストを低減できる。
【０１１４】
本実施の形態によると、検体ごとに、および、標的配列ごとに所定の感度、特異度および検出限界値ｑで変異陽性であるか変異陰性であるかを判定できる。したがって、同時に読み取りを行なう複数の検体の一部に、質の低い検体が含まれている場合であっても、他の検体の判定に影響を及ぼさない。ここで、質の低い検体とは、壊死組織が多く含まれている検体、または、採取した後に適切に処理されなかった検体等、十分な質および量のＤＮＡおよびＲＮＡを抽出できない検体を意味する。
【０１１５】
本実施の形態によると、図２を使用して説明したように、塩基配列を増幅する処理の後に精製処理を行なう。精製処理で質の低い検体に起因するプライマダイマーを除去することにより、次世代シーケンサによる塩基配列の読み取りを安定して行なえる。
【０１１６】
本実施の形態によると、ＥＧＦＲ  ｅｘ１９およびＡＬＫのように、多くの変異型を有する標的配列について、データベースに記録されていない未知の変異配列を検出できる。検出した未知の変異配列を、未知変異ＤＢ４４に記録することにより、新たな治療法の開発等を目指す医学研究に寄与できる。
【０１１７】
本実施の形態によると、抗がん剤の選定に影響を及ぼす重要な変異配列が新たに発見された場合、当該変異配列を参照配列ＤＢ４１に追加した後に、読取データファイル４６を再度解析することにより、当該変異配列に関する判定を行なえる。
【０１１８】
検査対象は、肺がんに限定しない。遺伝子検査システム１０は、消化器、泌尿器、生殖器等のさまざまな部位から採取した検体の遺伝子変異の検査に使用できる。この場合、それぞれの臓器に発現するがん遺伝子を参照配列ＤＢ４１に記録する。また、前処理において対応するがん遺伝子を切断および増幅させる。
【０１１９】
なお、本実施の形態においては、（１）式および（２）式中の変異陽性配列数Ｍを変数に使用して、第１閾値ＭＰおよび第２閾値ＭＮを算出したが、読取配列数ｎを変数に使用して、所定の感度および特異度に対応する閾値を算出しても良い。このようにする場合には、次世代シーケンサが実際に読んだ読取配列数ｎと、算出した閾値とを対比して、変異陽性であるか、変異陰性であるかを判定する。
【０１２０】
［実施の形態２］
本実施の形態は、検出限界値ｑ、感度および特異度を動的に変化させて判定を行なう遺伝子検査システム１０に関する。実施の形態１と共通する部分については、説明を省略する。
【０１２１】
図２３は、パラメータＤＢのレコードレイアウトを説明する説明図である。パラメータＤＢは、検出限界値ｑ、感度および特異度の特異度の組合せを記録するＤＢである。パラメータＤＢは検出限界値ｑフィールド、感度フィールドおよび特異度フィールドを有する。検出限界値ｑフィールドには検出限界値ｑが、感度フィールドには感度が、特異度フィールドには特異度がそれぞれ記録されている。パラメータＤＢの一つのレコードには、検出限界値ｑと、感度と、特異度との組合せが記録されている。
【０１２２】
図２４は、実施の形態２の閾値判定のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。図２４に示すサブルーチンは、図１９を使用して説明したサブルーチンの代わりに使用される。ステップＳ５４３までは、図１９を使用して説明したサブルーチンと同一の処理であるため、説明を省略する。
【０１２３】
第１閾値ＭＰが第２閾値ＭＮを越えると判定した場合（ステップＳ５４３でＮＯ）、ＣＰＵ２１はパラメータ調整のサブルーチンを起動する（ステップＳ５８１）。パラメータ調整のサブルーチンは、検出限界値ｑ、感度および特異度の３つのパラメータを調整するサブルーチンである。パラメータ調整のサブルーチンの処理の流れは後述する。
【０１２４】
ＣＰＵ２１は、パラメータ調整のサブルーチンにより、いずれか一つまたは複数のパラメータが変更されたか否かを判定する（ステップＳ５８２）。どのパラメータも変更されていないと判定した場合（ステップＳ５８２でＮＯ）、ＣＰＵ２１は、判定結果は「not determined」である、すなわち処理中の参照配列が変異陽性であるか、変異陰性であるかは判定できないと判定する（ステップＳ５８３）。
【０１２５】
ＣＰＵ２１は、判定結果ＤＢ４３に新規レコードを追加する。ＣＰＵ２１は、各フィールドに結果を記録する（ステップＳ５８４）。具体的には、ＣＰＵ２１は、検体ＩＤフィールドおよび領域名フィールドに処理中の検体ＩＤおよび領域名を記録する。ＣＰＵ２１は、判定結果フィールドにどの変異配列であるかを特定しないことを意味する「−」を記録する。ＣＰＵ２１は、判定結果フィールドに「not determined」を記録する。ＣＰＵ２１は、判定条件フィールドに、特異度、感度および検出限界値ｑをそれぞれ記録する。ＣＰＵ２１は、処理を終了する。
【０１２６】
パラメータが変更されたと判定した場合（ステップＳ５８２でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は特異度が変更されたか否かを判定する（ステップＳ５８５）。特異度が変更されたと判定した場合（ステップＳ５８５でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１はステップＳ５４１に戻る。特異度が変更されていないと判定した場合（ステップＳ５８５でＮＯ）、ＣＰＵ２１はステップＳ５４２に戻る。
【０１２７】
図２５は、パラメータ調整のサブルーチンの処理の流れを説明するフローチャートである。ＣＰＵ２１は、検出限界値ｑ、感度および特異度の３つのパラメータを補助記憶装置２３に一時的に記憶する（ステップＳ６０１）。
【０１２８】
ＣＰＵ２１は、ステップＳ６０１で記憶した感度および検出限界値ｑをキーとして、パラメータＤＢから対応するレコードすべてを抽出する（ステップＳ６０２）。ＣＰＵ２１は、抽出したレコードから特異度を減少させるレコードを選択できるか否かを判定する（ステップＳ６０３）。
【０１２９】
選択できると判定した場合（ステップＳ６０３でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は、特異度の減少量が最も少ないレコードを選択し、当該レコードの特異度フィールドに記録された特異度を新たな特異度に設定する（ステップＳ６０４）。その後、ＣＰＵ２１は処理を終了する。
【０１３０】
選択できないと判定した場合（ステップＳ６０３でＮＯ）、ＣＰＵ２１は、ステップＳ６０１で記憶した特異度および検出限界値ｑをキーとして、パラメータＤＢから対応するレコードすべてを抽出する（ステップＳ６０５）。ＣＰＵ２１は、抽出したレコードから感度を減少させるレコードを選択できるか否かを判定する（ステップＳ６０６）。
【０１３１】
選択できると判定した場合（ステップＳ６０６でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は、感度の減少量が最も少ないレコードを選択し、当該レコードの感度フィールドに記録された感度を新たな感度に設定する（ステップＳ６０７）。その後、ＣＰＵ２１は処理を終了する。
【０１３２】
選択できないと判定した場合（ステップＳ６０６でＮＯ）、ＣＰＵ２１は、ステップＳ６０１で記憶した特異度および感度をキーとして、パラメータＤＢから対応するレコードすべてを抽出する（ステップＳ６０８）。ＣＰＵ２１は、抽出したレコードから検出限界値ｑを増加させるレコードを選択できるか否かを判定する（ステップＳ６０９）。
【０１３３】
選択できると判定した場合（ステップＳ６０９でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は、検出限界値ｑの増加量が最も少ないレコードを選択し、当該レコードの検出限界値ｑフィールドに記録された感度を新たな検出限界値ｑに設定する（ステップＳ６１０）。その後、ＣＰＵ２１は処理を終了する。選択できないと判定した場合（ステップＳ６０９でＮＯ）、ＣＰＵ２１は処理を終了する。
【０１３４】
本実施の形態によると、検出限界値ｑに加えて、感度および特異度も動的に変化させて判定を行なう遺伝子検査システム１０を提供できる。
【０１３５】
検出限界値ｑ、感度および特異度の３つのパラメータのうちの１つを固定して、残りの２つを変化させても良い。検出限界値ｑ、感度および特異度の３つのパラメータのうちの２つを固定して、残りの１つを変化させても良い。
【０１３６】
［実施の形態３］
本実施の形態は、検出できない標的配列がある場合に、推定結果を出力する遺伝子検査システム１０に関する。実施の形態１と共通する部分については、説明を省略する。
【０１３７】
図２６から図２８は、実施の形態３のプログラムの処理の流れを説明するフローチャートである。図２６から図２８のプログラムは、実施の形態１または実施の形態２のプログラムにより、各標的配列に関する判定結果が判定結果ＤＢ４３に記録された後に実行されるプログラムである。
【０１３８】
ＣＰＵ２１は、検体ＩＤをキーとして判定結果ＤＢ４３から１検体分のレコードを抽出する（ステップＳ６２１）。ＣＰＵ２１は、表１に示す第１グループの遺伝子にかかる領域名をキーとして、ステップＳ６２１で抽出したレコードからさらにレコードを抽出する（ステップＳ６２２）。
【０１３９】
【表１】
2019191952.tif 000005
【０１４０】
ＣＰＵ２１は、ステップＳ６２２で抽出されたレコードに、リードが検出されたレコードがあるか否かを判定する（ステップＳ６２３）。具体的には、判定結果フィールドに「ZeroReads」以外の判定結果が記録されたレコードがあるか否かを判定する。
【０１４１】
検出されたレコードがあると判定した場合（ステップＳ６２３でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１はステップＳ６２２で抽出されたレコードにリードが欠落したレコードがあるか否かを判定する。具体的には、判定結果フィールドに「ZeroReads」が記録されたレコードがあるか否かを判定する（ステップＳ６２４）。欠落したレコードがあると判定した場合（ステップＳ６２４でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は、当該レコードの判定結果フィールドを「Negative」に変更する（ステップＳ６２５）。
【０１４２】
判定結果フィールドを変更する場合、ＣＰＵ２１は同じレコードの判定条件フィールドの各サブフィールドを「−」に変更することにより、他のレコードの判定結果に基づく推測であることを示しても良い。ＣＰＵ２１は、判定結果ＤＢ４３に設けた備考フィールドに、他のレコードの判定結果に基づく推測であることを記録しても良い。
【０１４３】
検出されたレコードがないと判定した場合（ステップＳ６２３でＮＯ）、欠落したレコードがないと判定した場合（ステップＳ６２４でＮＯ）、または、ステップＳ６２５の終了後、ＣＰＵ２１はステップＳ６２１で抽出したレコードから、ＥＧＦＲ  ｅｘ２０のＴ７９０Ｍ変異にかかるレコードを抽出する。ＣＰＵ２１は、抽出したレコードの判定結果フィールドに「Positive」が記録されているか否かを判定する（ステップＳ６２６）。
【０１４４】
「Positive」が記録されていると判定した場合（ステップＳ６２６でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１はステップＳ６２１で抽出したレコードから、ＥＧＦＲ  ｅｘ１９にかかるレコードを抽出する。ＣＰＵ２１は、抽出したレコードの判定結果フィールドに「ZeroReads」が記録されているか否かを判定する（ステップＳ６２７）。
【０１４５】
「ZeroReads」が記録されていると判定した場合（ステップＳ６２７でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１はＥＧＦＲ  ｅｘ１９にかかるレコードの判定結果フィールドを「Positive」に変更する（ステップＳ６２８）。
【０１４６】
「ZeroReads」が記録されていないと判定した場合（ステップＳ６２７でＮＯ）またはステップＳ６２８の終了後、ＣＰＵ２１はステップＳ６２１で抽出したレコードから、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異にかかるレコードを抽出する。ＣＰＵ２１は、抽出したレコードの判定結果フィールドに「ZeroReads」が記録されているか否かを判定する（ステップＳ６２９）。
【０１４７】
「ZeroReads」が記録されていると判定した場合（ステップＳ６２９でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１はＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異にかかるレコードの判定結果フィールドを「Positive」に変更する（ステップＳ６３０）。
【０１４８】
ＥＧＦＲ  ｅｘ２０のＴ７９０Ｍ変異にかかるレコードの判定結果フィールドに「Positive」が記録されていないと判定した場合（ステップＳ６２６でＮＯ）、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異にかかるレコードの判定結果フィールドに「ZeroReads」が記録されていないと判定した場合（ステップＳ６２９でＮＯ）、または、ステップＳ６３０の終了後、ＣＰＵ２１はＥＧＦＲ  ｅｘ１９にかかる領域名をキーとして参照配列ＤＢ４１からレコードを抽出し、正常配列フィールドからＥＧＦＲ  ｅｘ１９の正常配列を取得する（ステップＳ６４１）。
【０１４９】
ＣＰＵ２１は、ＥＧＦＲ  ｅｘ１９にかかる領域名をキーとして未知変異ＤＢ４４から１つのレコードを抽出する（ステップＳ６４２）。ＣＰＵ２１は、抽出したレコードのリードフィールドに記録されたリードと、ステップＳ６４１で取得した正常配列とを比較して、リードに塩基の欠失があるか否かを判定する（ステップＳ６４３）。欠失があると判定した場合（ステップＳ６４３でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は欠失塩基の数は３の倍数であるか否かを判定する（ステップＳ６４４）。
【０１５０】
３の倍数であると判定した場合（ステップＳ６４４でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１はステップＳ６４２で抽出したレコードの備考フィールドに、当該レコードに新規のＥＧＦＲ  ｅｘ１９欠失リードが記録されている旨を記録する（ステップＳ６４５）。
【０１５１】
欠失がないと判定した場合（ステップＳ６４３でＮＯ）、３の倍数でないと判定した場合（ステップＳ６４４でＮＯ）、またはステップＳ６４５の終了後、ＣＰＵ２１は、未知変異ＤＢ４４に記録されたＥＧＦＲ  ｅｘ１９にかかるレコードの処理を終了したか否かを判定する（ステップＳ６４６）。終了していないと判定した場合（ステップＳ６４６でＮＯ）、ＣＰＵ２１はステップＳ６４２に戻る。
【０１５２】
終了したと判定した場合（ステップＳ６４６でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１はＡＬＫ遺伝子にかかる領域名をキーとして参照配列ＤＢ４１からレコードを抽出し、正常配列フィールドからＡＬＬ遺伝子の正常配列を取得する（ステップＳ６５１）。なお、ステップＳ６５１においてＣＰＵ２１は、ＡＬＫ遺伝子に含まれる各領域の正常配列をすべて取得する。
【０１５３】
ＣＰＵ２１は、ＡＬＫ遺伝子にかかる領域名をキーとして未知変異ＤＢ４４から１つのレコードを抽出する（ステップＳ６５２）。ＣＰＵ２１は、抽出したレコードのリードフィールドに記録されたリードと、ステップＳ６４１で取得した正常配列とを比較して、リードがＡＬＫ遺伝子と他の遺伝子Ｘとの融合遺伝子であるか否かを判定する（ステップＳ６５３）。
【０１５４】
融合遺伝子であると判定した場合（ステップＳ６５３でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は、ＡＬＫ遺伝子と遺伝子Ｘとの融合部位が、ＡＬＫ  ｅｘ２０のアクセプタ部位であるか否かを判定する（ステップＳ６５４）。ＡＬＫ  ｅｘ２０のアクセプタ部位であると判定した場合（ステップＳ６５４でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は遺伝子Ｘの塩基読み枠とＡＬＫ遺伝子の塩基読み枠とが一致しているか否かを判定する（ステップＳ６５５）。
【０１５５】
一致していると判定した場合（ステップＳ６５５でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１はステップＳ６５２で抽出したレコードの備考フィールドに、当該レコードに新規のＡＬＫ融合遺伝子リードが記録されている旨を記録する（ステップＳ６５６）。
【０１５６】
融合遺伝子でないと判定した場合（ステップＳ６５３でＮＯ）、ＡＬＫ  ｅｘ２０のアクセプタ部位でないと判定した場合（ステップＳ６５４でＮＯ）、一致していないと判定した場合（ステップＳ６５５でＮＯ）、または、ステップＳ６５６の終了後、ＣＰＵ２１は未知変異ＤＢ４４に記録されたＡＬＫ遺伝子にかかるレコードの処理を終了したか否かを判定する（ステップＳ６５７）。終了していないと判定した場合（ステップＳ６５７でＮＯ）、ＣＰＵ２１はステップＳ６５２に戻る。終了していると判定した場合（ステップＳ６５７でＹＥＳ）、ＣＰＵ２１は処理を終了する。
【０１５７】
本実施のプログラムは、実施の形態１または実施の形態２のプログラムにより、各標的配列に関する判定結果が判定結果ＤＢ４３に記録された後に自動的に実行されても、ユーザによる指示を受け付けた後に実行されても良い。本実施の形態のプログラムは、臨床検査機関から解析結果を受領した臨床医または研究者等が、検体にかかるデータを閲覧する際に実行されても良い。
【０１５８】
本実施の形態のプログラムは、たとえばステップＳ６２１からステップＳ６３０までの欠落リードの補間と、ステップＳ６４１以降の新規の変異を推定する部分とに分けて、ユーザにより選択された部分が実行されても良い。
【０１５９】
本実施の形態によると、検出できない標的配列がある場合に、推定結果を出力する遺伝子検査システム１０を実現できる。本実施の形態によると、新規のＥＧＦＲ  ｅｘ１９欠失および新規のＡＬＫ融合遺伝子を検出する遺伝子検査システム１０を提供できる。これらの新規遺伝子にかかる情報は、抗がん剤の研究に有益な情報である。
【０１６０】
［実施の形態４］
図２９は、情報処理装置２０の機能ブロック図である。情報処理装置２０は、参照核酸塩基配列取得部８１と、検体核酸塩基配列取得部８２と、判定取得部８３と、エラー率取得部８４と、変異陽性判定部８５とを備える。
【０１６１】
参照核酸塩基配列取得部８１は、正常配列と変異配列とを含む参照核酸塩基配列を取得する。検体核酸塩基配列取得部８２は、検体から読み取った複数の検体核酸塩基配列を取得する。判定取得部８３は、検体核酸塩基配列取得部８２が取得した検体核酸塩基配列のうち、参照核酸塩基配列取得部８１が取得した参照核酸塩基配列に対応する読取配列数と、参照核酸塩基配列取得部８１が取得した変異配列に対応する変異配列数とを判定する。
【０１６２】
エラー率取得部８４は、核酸塩基配列を読み取る際のエラー率ｐを取得する。変異陽性判定部８５は、判定取得部８３が判定した変異配列数および読取配列数と、エラー率取得部８４が取得したエラー率ｐと、所定の偽陽性率とに基づいて、検体核酸塩基配列取得部８２が取得した検体核酸塩基配列が変異陽性であるか否かを判定する。
【０１６３】
［実施の形態５］
本実施の形態は、汎用のコンピュータとプログラム９７とを組み合わせて動作させることにより、本実施の形態の遺伝子検査システム１０を実現する形態に関する。図３０は、実施の形態５の遺伝子検査システム１０の構成を説明する説明図である。実施の形態１と共通する部分については、説明を省略する。
【０１６４】
本実施の形態の遺伝子検査システム１０は、ネットワークを介して接続された次世代シーケンサ１３、ファイルサーバ１６およびコンピュータ９０を備える。コンピュータ９０は、ＣＰＵ２１、主記憶装置２２、補助記憶装置２３、通信部２４、入力部２５、表示部２６、読取部２７およびバスを備える。
【０１６５】
プログラム９７は、可搬型記録媒体９６に記録されている。ＣＰＵ２１は、読取部２７を介してプログラム９７を読み込み、補助記憶装置２３に保存する。ＣＰＵ２１は、コンピュータ９０に実装されたフラッシュメモリ等の半導体メモリ９８に記憶されたプログラム９７を読出しても良い。ＣＰＵ２１は、通信部２４および図示しないネットワークを介して接続される図示しない他のサーバコンピュータからプログラム９７をダウンロードして補助記憶装置２３に保存しても良い。
【０１６６】
プログラム９７は、コンピュータ９０の制御プログラムとしてインストールされ、主記憶装置２２にロードして実行される。これにより、コンピュータ９０は上述した情報処理装置２０として機能する。
【０１６７】
各実施例で記載されている技術的特徴（構成要件）はお互いに組合せ可能であり、組み合わせすることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
今回開示された実施の形態はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は、上記した意味では無く、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【符号の説明】
【０１６８】
１０  遺伝子検査システム
１３  次世代シーケンサ
１６  ファイルサーバ
２０  情報処理装置
２１  ＣＰＵ
２２  主記憶装置
２３  補助記憶装置
２４  通信部
２５  入力部
２６  表示部
２７  読取部
４１  参照配列ＤＢ
４２  読取結果ＤＢ
４３  判定結果ＤＢ
４４  未知変異ＤＢ
４６  読取データファイル
５１  検体選択欄
５２  解析ボタン
５２１  単一解析ボタン
５２２  複数解析ボタン
５３  解析結果欄
５３１  第１解析結果欄
５３２  第２解析結果欄
５３３  第３解析結果欄
５３４  第４解析結果欄
５３５  第５解析結果欄
８１  参照核酸塩基配列取得部
８２  検体核酸塩基配列取得部
８３  判定取得部
８４  エラー率取得部
８５  変異陽性判定部
９０  コンピュータ
９６  可搬型記録媒体
９７  プログラム
９８  半導体メモリ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2019191952.tif 000023
【図１８】
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【図１９】
2019191952.tif 000025
【図２０】
2019191952.tif 000026
【図２１】
2019191952.tif 000027
【図２２】
2019191952.tif 000028
【図２３】
2019191952.tif 000029
【図２４】
2019191952.tif 000030
【図２５】
2019191952.tif 000031
【図２６】
2019191952.tif 000032
【図２７】
2019191952.tif 000033
【図２８】
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【図２９】
2019191952.tif 000035
【図３０】
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