(57)【要約】【課題】構成型１，４−ジオキサン分解菌Ｎ２３株の効率的な培養方法を提供する。【解決手段】ｐＨ３．０以上５．５以下である培地を用いて、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託された構成型１，４−ジオキサン分解菌であるＮ２３株を培養する培養方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ３．０以上５．５以下である培地を用いて、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託された構成型１，４−ジオキサン分解菌であるＮ２３株を培養することを特徴とする培養方法。
【請求項２】
前記培地が、１，４−ジオキサン、グリオキシル酸、グリコール酸、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１−ブタノール、テトラヒドロフラン、グルコース、酢酸、グリセリンのいずれか１種以上を含有することを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記培地が、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールのいずれか１種以上を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記培地が液体培地であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の培養方法。
【請求項５】
液体培地を供給しながら、該液体培地の供給量と同量の培養液を取り出す連続培養であることを特徴とする請求項４に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構成型１，４−ジオキサン分解菌Ｎ２３株の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，４−ジオキサンは、下記式（１）で表される環状エーテルである。１，４−ジオキサンは、水や有機溶媒との相溶性に優れており、主に有機合成の反応溶剤として使用されている。
【０００３】
【化１】
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【０００４】
２０１０年度の日本国における１，４−ジオキサンの製造・輸入量は、約４５００ｔ／年であり、約３００ｔ／年が環境中へ放出されたと推測される。１，４−ジオキサンは、水溶性であるため、水環境中へ放出されると広域に拡散してしまう。また、揮発性、固体への吸着性、光分解性、加水分解性、生分解性がいずれも低いため、水中からの除去が困難である。１，４−ジオキサンは急性毒性及び慢性毒性を有する上、発がん性も指摘されていることから、１，４−ジオキサンによる水環境の汚染は、人や動植物に悪影響を及ぼすことが懸念されている。そのため、日本国では、水道水質基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）、環境基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）及び排水基準（０．５ｍｇ／Ｌ以下）により、１，４−ジオキサンの規制がなされている。
【０００５】
また、非特許文献１には、１，４−ジオキサンを含む産業廃水には、１，４−ジオキサンの他に１，３−ジオキソラン及び２−メチル−１，３−ジオキソランといった環状エーテルが含まれていることが報告されている。特に１，３−ジオキソランは、急性毒性等の毒性が確認されており、１，３−ジオキソランを含む汚染水等は適切に処理しなければならない。
【０００６】
従来の活性汚泥法や活性炭吸着法等の処理方法では、水中から１，４−ジオキサン等の環状エーテルを十分に除去することができない。例えば、１，４−ジオキサンは、過酸化水素を添加してのオゾン処理（Ｏ３／Ｈ２Ｏ２）、紫外線照射下でのオゾン処理（Ｏ３／ＵＶ）、放射線や超音波照射下でのオゾン処理等、複数の物理化学的な酸化方法を併用する促進酸化法においてのみ、処理の有効性が確認されている。しかし、促進酸化法はイニシャルコスト及びランニングコストが高いことから普及に至っていない。また、非特許文献２には、１，４−ジオキサン以外の有機物が存在すると、促進酸化法による１，４−ジオキサンの処理効率が低下することが報告されている。
【０００７】
低コストかつ安定的に１，４−ジオキサン等の環状エーテルを含む水を処理する方法が求められており、特許文献１、非特許文献３では、１，４−ジオキサン分解菌による１，４−ジオキサン処理が提案されている。１，４−ジオキサン分解菌は、１，４−ジオキサンを単一炭素源として分解する菌（資化菌）と、テトラヒドロフラン等の特定の基質の存在下にて１，４−ジオキサンを分解できる菌（共代謝菌）の２種類に大別される。そのため、地下水や廃水等に含まれる１，４−ジオキサンを１，４−ジオキサン分解菌で処理する場合、特定の基質を添加する必要がない資化菌を活用する方が効率的である。
【０００８】
資化菌は、さらに１，４−ジオキサン分解酵素の誘導の有無によって、誘導型と構成型に分けられる。非特許文献４に記載されているように、誘導型１，４−ジオキサン分解菌は、１，４−ジオキサンなどの誘導物質が存在することで分解酵素の生産・分泌がされるため、１，４−ジオキサン処理に用いる前に予め馴養する必要がある。一方、構成型１，４−ジオキサン分解菌は、常時、分解酵素を生産しているため、馴養することなく、直ちに１，４−ジオキサン処理に用いることができる。
【０００９】
ここで、１，４−ジオキサン分解菌は増殖が極めて遅く、他の微生物が混入していると他の微生物が優先的に増殖してしまう。そのため、１，４−ジオキサン分解菌を培養するには、他の微生物が混入しないように、事前に培養装置や培地を十分に滅菌する必要がある。滅菌処理には、オートクレーブを用いる蒸気滅菌、オーブン等で加熱する乾熱滅菌、ガンマ線を用いる放射線滅菌、エチレンオキサイドガスを用いる化学滅菌等の方法がある。しかし、滅菌のための設備が大規模になりすぎる、エネルギーコストがかかりすぎる、使用する薬品量が膨大となりコスト・安全性の点で問題がある等、いずれの滅菌方法も、大規模スケールで行うことは困難である。
【００１０】
本発明者らは、特許文献２において、ジエチレングリコールを含む培地を用いて１，４−ジオキサン分解菌を増やす１，４−ジオキサン分解菌の培養方法を提案した。１，４−ジオキサン分解菌は、他の微生物と比較してジエチレングリコールを炭素源として利用する能力に優れているため、ジエチレングリコールを含有する培地を用いることにより、滅菌処理を行うことなく、他の微生物が生息している条件下でも優先的に増殖することができる。
【００１１】
さらに、本発明者らは、特許文献３において、構成型１，４−ジオキサン分解菌であるＮ２３株を報告している。Ｎ２３株は、これまでに報告されている構成型１，４−ジオキサン分解菌の中で、最も高い１，４−ジオキサン最大比分解速度を示し、１，４−ジオキサンを始めとする環状エーテルの生分解に非常に有望である。
Ｎ２３株は、１，４−ジオキサン分解能を有さない微生物と比較して、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールを炭素源として利用する能力に優れている。また、上記したＮ２３株が炭素源として利用しやすい有機物の中で、エチレングリコールは、ｐＨ５．０以下の酸性環境下においてほとんど生分解されないことが報告されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００８−３０６９３９号公報
【特許文献２】特許第５８７７９１８号公報
【特許文献３】特許第６１１７４５０号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】CD. Adams, PA. Scanlan and ND. Secrist: Oxidation and biodegradability enhancement of 1,4-dioxane using hydrogen peroxide and ozone, Environ. Sci. Technol., 28(11), pp.1812-1818, 1994.
【非特許文献２】K. KOSAKA, H. YAMADA, S. MATSUI, and K. SHISHIDA: The effects of the co-existing compounds on the decomposition of micropollutants using the ozone/hydrogen peroxide process, Water Sci. Technol., 42, pp.353-361, 2000.
【非特許文献３】清和成、池道彦：１，４−ジオキサン分解菌を用いた汚染地下水の生物処理・浄化の可能性，用水と廃水，Vol.53, No.7,pp.555-560, 2011.
【非特許文献４】K. Sei, K. Miyagaki, T. Kakinoki, K. Fukugasako, D. Inoue and M. Ike: Isolation and characterization of bacterial strains that have high ability to degrade 1,4-dioxane as a sole carbon and energy source, Biodegradation, 24, 5, pp.665-674, 2012.
【非特許文献５】今枝孝夫、徳弘健郎、平井正名：ＬＬＣの微生物分解システム，豊田中央研究所，Vol.34，No.3，pp.23-30，1999.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
構成型１，４−ジオキサン分解菌Ｎ２３株の効率的な培養方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
１．ｐＨ３．０以上５．５以下である培地を用いて、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託された構成型１，４−ジオキサン分解菌であるＮ２３株を培養することを特徴とする培養方法。
２．前記培地が、１，４−ジオキサン、グリオキシル酸、グリコール酸、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１−ブタノール、テトラヒドロフラン、グルコース、酢酸、グリセリンのいずれか１種以上を含有することを特徴とする１．に記載の培養方法。
３．前記培地が、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールのいずれか１種以上を含有することを特徴とする１．または２．に記載の培養方法。
４．前記培地が液体培地であることを特徴とする１．〜３．のいずれかに記載の培養方法。
５．液体培地を供給しながら、該液体培地の供給量と同量の培養液を取り出す連続培養であることを特徴とする４．に記載の培養方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の培養方法は、他の微生物による汚染（コンタミネーション）が起こりにくいため、Ｎ２３株を効率的に培養することができる。本発明の培養方法は、他の微生物が活動・増殖しにくい条件下で行われるため、培養装置に他の微生物が存在していても、Ｎ２３株を効率的に培養することができる。Ｎ２３株が代謝しやすい有機化合物、または、Ｎ２３株が他の微生物と比較して炭素源として利用する能力に優れている有機化合物を、培地中の炭素源とすることにより、他の微生物のコンタミネーションをさらに抑制することができる。
本発明の培養方法により、事前に完全な滅菌処理を行うことなく、Ｎ２３株を培養することができるため、大規模スケールでＮ２３株を培養することが可能であり、生分解処理に必要とされる大量のＮ２３株を供給することができる。また、滅菌処理にかかるコストを軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｎ２３株のＳＥＭ画像。
【図２】Ｎ２３株の初期１，４−ジオキサン濃度に対する比分解速度を示す図。
【図３】実験１における初期ｐＨと環状エーテル分解速度との関係を示す図。
【図４】実験２における異なる炭素源での初期ｐＨと菌体濃度増加量との関係を示す図。
【図５】実験３における異なる炭素源での培養終了時の菌体濃度を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明を詳細に説明する。
「Ｎ２３株」
本発明で使用する構成型１，４−ジオキサン分解菌Ｎ２３株（以下、Ｎ２３株という。）は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８））に、２０１５年４月１０日付で国際寄託されている。Ｎ２３株のＳＥＭ画像を図１に示す。Ｎ２３株は、グラム染色性が陽性、カタラーゼ反応が陽性である。
【００１９】
Ｎ２３株は、構成型１，４−ジオキサン分解菌であり、常時、分解酵素を生産している。一般に、構成型１，４−ジオキサン分解菌は、誘導型１，４−ジオキサン分解菌と比較して低い１，４−ジオキサン最大比分解速度を示すことが知られている。Ｎ２３株の初期１，４−ジオキサン濃度に対する比分解速度を図２に示す。
【００２０】
Ｎ２３株は、これまでに報告されている構成型１，４−ジオキサン分解菌の中で最も高い１，４−ジオキサン最大比分解速度を有し、その値は誘導型１，４−ジオキサン分解菌と同等以上である。また、Ｎ２３株は、１，４−ジオキサンを０．０１７ｍｇ／Ｌ以下の極低濃度まで分解することができ、約５２００ｍｇ／Ｌという高濃度の１，４−ジオキサンを処理することができる。
Ｎ２３株は、１，４−ジオキサン等を用いて馴養する必要がない。また、Ｎ２３株は、高い１，４−ジオキサン最大比分解速度を有し、１，４−ジオキサンを極低濃度まで分解することができ、高濃度の１，４−ジオキサンを処理することができる。そのため、Ｎ２３株は、１，４−ジオキサンの処理に好適に利用することができる。
【００２１】
Ｎ２３株は、１，４−ジオキサンだけでなく、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフラン等の環状エーテルを効率よく分解することができる。また、複数の環状エーテルを同時に処理することもできる。さらに、Ｎ２３株は、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールの分解性にも優れている。そのため、Ｎ２３株は、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールの生分解処理に好適に利用することができる。
【００２２】
Ｎ２３株は、ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下であっても、ほとんど活動性が低下しない。すなわち、Ｎ２３株は、ｐＨ７．０付近で最も高い１，４−ジオキサン分解活性を示すが、ｐＨ７．０における分解活性に対して、ｐＨ５．０で９割以上、ｐＨ３．８で８割以上の分解活性を維持できる。また、Ｎ２３株は、酸性環境下において、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールのいずれか１種以上を炭素源として利用して増殖することができる。それに対し、多くの微生物（以下、雑菌という）は、ｐＨ６．０〜８．０程度の中性環境下が至適ｐＨであり、ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下で活動できる種類は少ない。
【００２３】
「培養方法」
本発明の培養方法は、ｐＨ３．０以上５．５以下である培地を用いて、Ｎ２３株を培養することを特徴とする。
ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下では、雑菌の活動・増殖が抑制されるため、Ｎ２３株を効率的に培養することができる。より確実に雑菌のコンタミネーションを防ぐために、培養時のｐＨは低いほうが好ましく、ｐＨ４．９以下がより好ましく、ｐＨ４．５以下がさらに好ましい。
【００２４】
Ｎ２３株を培養する培地としては、液体培地、または固体培地が挙げられる。培地としては、Ｎ２３株を培養できるものであれば特に限定されず、ＭＧＹ培地やＣＧＹ培地等の公知の培地を使用することができる。Ｎ２３株を大量に培養するためには液体培地を使用することが好ましい。液体培地を供給しながら、液体培地の供給量と同量のＮ２３株を含む培養液を取り出す連続培養を行うことがさらに好ましい。
【００２５】
本発明の培養方法は、雑菌の活動・増殖が抑制されるため、培養前に完全な滅菌処理を施さずとも、Ｎ２３株を培養することができる。本発明の培養方法は、雑菌のコンタミネーションが起こりにくいため、確実に滅菌処理を施すことが困難である大容量の培養装置を用いて、Ｎ２３株を大量に培養することができる。具体的には、本発明の培養方法において、Ｎ２３株を液体培地で培養する場合は、培養槽の容量を１０Ｌ以上１０００Ｌ以下とすることができる。また、本発明の培養方法は、滅菌装置の小型化や滅菌のための薬品使用量が抑制でき、さらにはこれらの装置、薬品が不要な場合もあるため、非常に低コストである。
【００２６】
Ｎ２３株を培養する際には、必要な無機物質や有機物質を添加することができる。微生物の活動量は、必要な栄養素等の因子のうち、最も少ない因子によって制限されるため、不足する栄養素を添加することで、増殖を促進することができる。添加する無機物質としては特に制限されず、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ３、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌなどが挙げられる。また、添加する有機物質としては特に制限されないが、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンなどが好ましい。
【００２７】
Ｎ２３株は、１，４−ジオキサン、グリオキシル酸、グリコール酸、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１−ブタノール、テトラヒドロフラン、グルコース、酢酸を、炭素源として利用する能力に優れている（特許文献３参照）。また、グリセリンを炭素源として利用する能力にも優れている。そのため、雑菌の活動が抑制されるｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下で、上記した有機化合物のいずれか１種以上を含有する培地を用いることにより、早い増殖速度でＮ２３株を培養することができる。培地中の上記有機化合物の総濃度は特に限定されないが、１．０×１０−８ｗｔ％以上１０．０ｗｔ％以下が好ましい。総濃度の下限値は、０．１ｗｔ％以上であることがより好ましく、０．５ｗｔ％以上であることがより好ましく、１．０ｗｔ％以上であることが最も好ましい。総濃度の上限値は９．０ｗｔ％以下であることがより好ましく、８．０ｗｔ％以下であることがさらに好ましく、７．０ｗｔ％以下であることが最も好ましい。また、上記有機化合物の総計が、培地中の全有機化合物量に対して、６０．０ｗｔ％以上であることが好ましく、８０．０ｗｔ％以上であることがより好ましく、９５．０ｗｔ％以上であることがさらに好ましく、９９．９ｗｔ％以上であることが最も好ましい。
【００２８】
さらに、Ｎ２３株は、雑菌と比較して、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールを炭素源として利用する能力に優れている。そのため、培地が、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールを主たる炭素源として含むことがさらに好ましい。ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下で、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールを主たる炭素源として含有する培地を用いることにより、雑菌のコンタミネーションをさらに防止することができる。１，４−ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールの総量は、培地中の全有機化合物量に対して、６０．０ｗｔ％以上であることが好ましく、８０．０ｗｔ％以上であることがより好ましく、９５．０ｗｔ％以上であることがさらに好ましく、９９．９ｗｔ％以上であることが最も好ましい。
【実施例】
【００２９】
「Ｎ２３株」
Ｎ２３株は、ＭＧＹ培地（Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ：１０ｇ／Ｌ、グルコース：４ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ：４ｇ／Ｌ、ｐＨ７．３）を用いて２週間培養した。この培養液を、１００００×ｇ、４℃、３分間遠心分離して集菌し、無機塩培地（組成：
１ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３、５０ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．３）を用いて二回洗浄した菌体を用いた。
【００３０】
「実験１」
Ｎ２３株の１，４−ジオキサンによる培養
１００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに、液体培地（組成：５００ｍｇ／Ｌ  １，４−ジオキサン、１ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２００ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３、５０ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２）を１９ｍＬ添加し、Ｎ２３株の菌体濃縮液を１ｍＬ加え（菌体終濃度：２００ｍｇ−ｃｅｌｌ／Ｌ）、２８℃にて回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）を行った（ｎ＝３）。液体培地のｐＨは塩酸溶液及び水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ３．８、５．０、５．９、７．０、８．２に調整した。
【００３１】
培養開始２．５時間後、１０時間後及び１２時間後にサンプリングを行い、溶液中の１，４−ジオキサン濃度をヘッドスペースガスクロマトグラフ質量分析計（島津製作所：ＧＣ／ＭＳ−ＱＰ２０１０  ＰＬＵＳ、ＴＵＲＢＯＭＡＴＲＩＸ  ＨＳ４０）を用いて測定した。各時間ごとの１，４−ジオキサン濃度の減少速度に直線性があることを確認し、１，４−ジオキサン分解速度を算出した。また、培養前後における溶液中のｐＨを測定した。図３に初期ｐＨと分解速度の関係を、表１に培養前後のｐＨを示す。
【００３２】
【表１】
2019000074.tif 000004
【００３３】
Ｎ２３株が、ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下において、１，４−ジオキサンを炭素源として培養できることが確かめられた。また、培養後にｐＨが低下していることが確認できた。これは、１，４−ジオキサンの分解により、中間代謝物であるグリオキシル酸が生じたためであると考えられる。
【００３４】
「実験２」
Ｎ２３株の他の炭素源による培養１
３００ｍｌ容量のフラスコに、ｐＨ３．６〜７．９に調整した栄養塩培地（組成：０．５ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ  ５ｇ／Ｌ  酵母エキス）を加えた後、炭素源を４ｇ／Ｌになるように添加し、液量を１００ｍＬとした。その後、Ｎ２３株を７０ｍｇ−ｃｅｌｌ／Ｌになるように添加し、２８℃、１２０ｒｐｍにて、回転振盪培養を行った（ｎ＝１）。炭素源としては、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールを用いた。図４に、７日間の培養により増加した菌体濃度を示す。
【００３５】
Ｎ２３株が、ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下において、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオールを炭素源として培養できることが確かめられた。
【００３６】
「実験３」
Ｎ２３株の他の炭素源による培養２
３００ｍｌ容量のフラスコに、炭素源を４ｇ／Ｌ含む栄養塩培地（組成：０．５ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、ｐＨ７．０）を１００ｍＬ添加した後、Ｎ２３株を１００ｍｇ−ｃｅｌｌ／Ｌになるように添加し、２８℃、１２０ｒｐｍにて、回転振盪培養を行った（ｎ＝２）。炭素源としては、グルコース、グリセリン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコール、１，４−ブタンジオール、ジエチレングリコールを用いた。
【００３７】
７日間培養後、ガラス繊維ろ紙（ＧＦ／Ｂ、Ｗｈａｔｍａｎ、直径４７ｍｍ）を用いて、培養液中の固形分を回収し、１０５℃にて乾燥させて菌体濃度を測定した。図５に７日間の培養により増加した菌体濃度を示す。
【００３８】
Ｎ２３株が、グルコース、グリセリン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコール、１，４−ブタンジオール、ジエチレングリコールを炭素源として増殖できることが確かめられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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