(57)【要約】      （修正有）【課題】ハイ・スループットおよびサンプル調製時間の短縮という利点を有する単一分子シークエンシングに適した装置、および上記の装置を使用することによる核酸分子のシークエンシングをする方法の提供。【解決手段】単一分子シークエンシングに適した装置。前記装置は、少なくとも１つのナノウェル１１０、複数の核酸固定化部位１２０ａ，１２０ｂ、および複数種類の核酸断片１３０ａ，１３０ｂを含む。前記ナノウェルには観察ゾーン１１２がある。前記核酸固定化部位は、前記観察ゾーン内または前記観察ゾーンに近接して配置される。前記核酸断片は、前記核酸固定化部分にそれぞれ固定化される。少なくとも１つのポリメラーゼ１４０ａ〜１４０ｃが前記観察ゾーン内に配置される。上記の装置を用いて核酸分子のシークエンシングをする方法が提供される。【選択図】図１Ｃ
2019000108.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一分子シークエンシングに適した装置であって、
観察ゾーンを有する、少なくとも１つのナノウェル；
前記観察ゾーンの中または前記観察ゾーンに近接して配置した、複数の核酸固定化部位；
それぞれ前記複数の核酸固定化部位に固定した、複数種類の核酸断片；および、
前記観察ゾーンの中に配置した、少なくとも１つのポリメラーゼ；
を含む、装置。
【請求項２】
前記観察ゾーンの直径が 10 nm から 500 nm の範囲にあり、且つ前記観察ゾーンの高さが 200 nm 未満である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記複数種類の核酸断片が線状である、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記複数種類の核酸断片が長さとして50 ヌクレオチドから 200 ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記少なくとも１つのポリメラーゼが１つのポリメラーゼである、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記複数種類の核酸断片が長さとして200 ヌクレオチド超を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記少なくとも１つのポリメラーゼが複数のポリメラーゼを含み、前記装置が、前記観察ゾーンに複数のポリメラーゼ固定化部位を更に含み、且つ前記複数のポリメラーゼが前記複数のポリメラーゼ固定化部位に固定化されている、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
核酸分子のシークエンシングをする方法であって、
（a）観察ゾーンを有する、少なくとも１つのナノウェルを提供すること；
（b）複数の核酸固定化部位を介して、前記観察ゾーンに複数種類の核酸断片を固定化すること；
（c）１つのプライマーおよび複数種類の標識ヌクレオチド類似体を少なくとも１つの前記ナノウェルに添加し、前記観察ゾーン内で、前記プライマーおよび前記複数種類の核酸断片のうちのの１種類によって、プライマー−核酸断片複合体を生成させること；
（d）ポリメラーゼを使用すること、および前記プライマー−核酸断片複合体中に前記複数の標識ヌクレオチド類似体を取り込ませることを介して、前記プライマー−核酸断片複合体の新生鎖合成反応を開始させることにより、新生鎖を生成させること；並びに、
（e）取り込まれた複数の標識ヌクレオチド類似体の配列を検出することにより、前記複数種類の核酸断片の配列を決定すること；
を含む、方法。
【請求項９】
更に以下の工程：
（f）前記新生鎖を解離させること；および、
（g）工程（c）から工程（f）を繰り返すこと；
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記観察ゾーンの直径が 10 nm から 500 nm であり、且つ前記観察ゾーンの高さが 200 nm 未満である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数種類の核酸断片が長さとして50 ヌクレオチドから 200 ヌクレオチドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
工程（c）が前記ポリメラーゼを添加することを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数種類の核酸断片が長さとして200 ヌクレオチド超を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
複数のポリメラーゼを複数のポリメラーゼ固定化部位を介して前記観察ゾーンに固定化し、その中で、工程（d）で使用するポリメラーゼが前記複数のポリメラーゼのうちの１つであることを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数のポリメラーゼを固定化する工程が工程（c）の前に行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
以下の工程：
（f）前記新生鎖を解離させること；および、
（g）工程（c）から工程（f）を繰り返すことであって、繰り返しの工程（d）で使用するポリメラーゼが前記複数のポリメラーゼのうちの１つであること；
を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数種類の核酸断片の調製方法が
抽出したゲノム DNA を提供すること；
前記抽出したゲノム DNA を複数の DNA 断片に断片化すること；
固相に固定化した dsDNA アダプターに、前記 DNA 断片の一方の末端を結合させること；
標識した DNA 断片を生成させるために、前記 DNA 断片の他方の末端に標識したアダプターを結合させること；および、
前記標識した DNA 断片を解離させることにより、複数の一本鎖 DNA 断片を溶出すること；
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記標識したアダプターを結合させる前、および前記複数の一本鎖 DNA 断片を溶出する前に、洗浄プロセスをそれぞれ行うことを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数種類の核酸断片の調製方法が、
抽出したゲノム DNA を提供すること；
前記抽出したゲノム DNA を複数の DNA 断片に断片化すること；
プローブを前記 DNA 断片のうちの１つとハイブリダイズさせること；
DNA ポリメラーゼおよび標識ヌクレオチド類似体を使用することで、標識した新生鎖−DNA 断片複合体を生成させるために、前記ハイブリダイズしたプローブを伸長させること；
前記標識した新生鎖−DNA 断片複合体を精製すること；
前記標識した新生鎖−DNA 断片複合体を解離させることによって、複数の一本鎖 DNA 断片を溶出すること；および、
標識した一本鎖 DNA 断片を生成させるために、アンカーを、前記一本鎖 DNA 断片の一方の末端に結合させること；
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識した新生鎖−DNA 断片複合体を精製する工程の中で洗浄プロセスを行うことを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列決定（シークエンシング（sequencing））のための装置および方法、より詳細には、単一分子シークエンシングのための装置および核酸分子のシークエンシングをする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成による配列決定（シークエンシング・バイ・シンセシス（sequencing-by-synthesis））の従来方法では、１つの観察空間内の反応領域内またはその近接に、１つのポリメラーゼまたは１つの鋳型（テンプレート（template））を固定化する。現在の単一分子シークエンシング方法の１つは、以下の工程を含む。シークエンシングをする対象の核酸テンプレート（DNA または RNA など）を閉ループ（環状の鋳型）にする。次いで、前記核酸テンプレートを、鎖置換活性（strand displacement activity）および高い反応性（processivity）といった特性を有し、検出可能なゾーン（zone）の内部に固定化したポリメラーゼによって捕捉させる。その後、前記テンプレートの配列を、シークエンシング・バイ・シンセシス（sequencing-by-synthesis：SBS）・プロセスによって数回読み取る。この方法では、シークエンシングの最終的な結果は、有用な多重リード（redundant reads）の統計的な一致度（statistical consensus）によって決定される。しかしながら、該方法は、鎖置換活性（strand displacement activity）および高い反応性（processivity）を有するポリメラーゼを必要とし、一旦そのポリメラーゼが失活したり、またはポリメラーゼから核酸テンプレートが離れてしまうと、シークエンシングは終結する。また、この方法は、各検出可能なゾーンに、１つのテンプレートを保持し、１つのテンプレートのみを許容するようにするために、非常に正確な充填プロセス（ローディング・プロセス（loading process））を必要とする。そして、テンプレートが存在しないか、あるいはテンプレートが複数存在する検出可能ゾーンは、不具合箇所とみなされる。それゆえ、この厳しい要件によって実施機会（operation window）が狭まることになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の装置および方法は、ハイ・スループットおよびサンプル調製時間の短縮という利点を有する単一分子シークエンシングに適した装置、および上記の装置を使用することによる核酸分子のシークエンシングをする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ある実施形態では、本発明は、単一分子シークエンシングに適した装置を提供する。前記装置は、少なくとも１つのナノウェル（nanowell）、複数の核酸固定化部位、複数種類の核酸断片、および少なくとも１つのポリメラーゼを含む。前記ナノウェルには観察ゾーンがある。前記核酸固定化部位は、前記観察ゾーン内または前記観察ゾーンに近接して配置される。前記核酸断片は、前記核酸固定化部位にそれぞれ固定化される。前記ポリメラーゼは、前記観察ゾーンに配置される。
【０００５】
本発明のある実施形態では、前記観察ゾーンの直径が 10 nm から500 nm の範囲にあり、且つ観察ゾーンの高さが 200 nm 未満である。
【０００６】
本発明のある実施形態では、前記複数種類の核酸断片が線状である。
【０００７】
本発明のある実施形態では、前記複数種類の核酸断片が長さとして 50 ヌクレオチドから 200 ヌクレオチドを含む。
【０００８】
本発明のある実施形態では、前記少なくとも１つのポリメラーゼが１つのポリメラーゼである。
【０００９】
本発明のある実施形態では、前記核酸断片が長さとして 200 ヌクレオチド超を含む。
【００１０】
本発明のある実施形態では、前記少なくとも１つのポリメラーゼが複数のポリメラーゼを含み、前記装置が複数のポリメラーゼ固定化部位を更に含む。前記ポリメラーゼ固定化部位が前記観察ゾーン内に配置されており、前記ポリメラーゼは前記ポリメラーゼ固定化部位に固定化される。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、核酸分子のシークエンシングをする方法を提供し、以下の工程を含む。（a）観察ゾーンを有する、少なくとも１つのナノウェルを提供する。（b）複数の核酸固定化部位を介して、前記観察ゾーンに複数種類の核酸断片を固定化する。（c）１つのプライマーおよび複数の標識ヌクレオチド類似体を前記ナノウェルに添加し、前記観察ゾーン内で、前記プライマーおよび前記核酸断片の１つによって、プライマー−核酸断片複合体を生成させる。（d）ポリメラーゼを使用すること、および前記プライマー−核酸断片複合体中に前記標識ヌクレオチド類似体を取り込ませることを介して、前記プライマー−核酸断片複合体の新生鎖合成反応を開始させることにより、新生鎖を生成させる。（e）取り込まれた標識ヌクレオチド類似体の配列を検出することにより、前記核酸断片の配列を決定する。
【００１２】
本発明のある実施形態では、前記方法は、以下の工程を更に含む。（f）前記新生鎖を解離させる。（g）工程（c）から工程（f）を繰り返す。
【００１３】
本発明のある実施形態では、工程（c）は前記ポリメラーゼを添加することを更に含む。
【００１４】
本発明のある実施形態では、前記方法は、以下の工程を更に含む。複数のポリメラーゼを複数のポリメラーゼ固定化部位を介して前記観察ゾーンに固定化し、その中で、工程（d）で使用するポリメラーゼが前記複数のポリメラーゼのうちの１つである。
【００１５】
本発明のある実施形態において、前記複数のポリメラーゼを固定化する工程が工程（c）の前に行われる。
【００１６】
本発明のある実施形態では、前記方法は、以下の工程を更に含む。（f）前記新生鎖を解離させる。（g）工程（c）から工程（f）を繰り返すことであって、繰り返しの工程（d）で使用するポリメラーゼが前記複数のポリメラーゼのうちの１つである。
【００１７】
本発明のある実施形態では、前記複数種類の核酸断片を調製する方法が、以下の工程を含む。抽出したゲノム DNA を提供する。前記抽出したゲノム DNA を複数の DNA 断片に断片化する。固相に固定化した dsDNA アダプターに、前記 DNA 断片の一方の末端を結合させる。標識した DNA 断片を生成させるために、前記 DNA 断片の他方の末端に標識したアダプターを結合させる。前記標識した DNA 断片を解離させることにより、複数の一本鎖 DNA 断片を溶出する。
【００１８】
本発明のある実施形態では、前記標識したアダプターを結合させる前、および前記複数の一本鎖 DNA 断片を溶出する前に、洗浄プロセスをそれぞれ行うことを更に含む。
【００１９】
本発明のある実施形態では、前記複数種類の核酸断片を調製する方法が、以下の工程を含む。抽出したゲノム DNA を提供する。前記抽出したゲノム DNA を複数の DNA 断片に断片化する。プローブを前記 DNA 断片のうちの１つとハイブリダイズさせる。DNA ポリメラーゼおよび標識ヌクレオチド類似体を使用することで、標識した新生鎖−DNA 断片複合体を生成させるために、前記ハイブリダイズしたプローブを伸長させる。前記標識した新生鎖−DNA 断片複合体を精製する。前記標識した新生鎖−DNA 断片複合体を解離させることによって、複数の一本鎖 DNA 断片を溶出する。標識した一本鎖 DNA 断片を生成させるために、アダプターを、前記一本鎖 DNA 断片の一方の末端に結合させる。
【００２０】
本発明のある実施形態では、前記複数種類の核酸断片を調製する工程が、前記標識した新生鎖−DNA 断片複合体を精製する工程の中で洗浄プロセスを行うことを更に含む。
【発明の効果】
【００２１】
上記に基づいて、本発明は、単一分子シークエンシングのための装置、および核酸分子のシークエンシングをする方法を提供する。この装置は、少なくとも１つのナノウェル、複数の核酸固定化部位、および複数種類の核酸断片を含む。この方法では、複数種類の核酸断片を同時に添加するが、各時点では１つのプライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体のみが生成され、各時点において１つの核酸断片（単一分子として示す）のみがシークエンシングされる。ある実施形態では、ある種類の核酸断片のシークエンシングをした後に、同じ種類または別の種類の核酸断片を連続的にシークエンシングをする。そして、２つのシークエンシング・プロセス間で、シークエンシングがなされる核酸断片を添加するための時間が節約される。したがって、本発明の装置および方法は、ハイ・スループットおよびサンプル調製時間の短縮という利点を有する
【図面の簡単な説明】
【００２２】
以上を理解し易くするために、いくつかの実施形態を図面を添付して、以下に詳細に説明する。
【００２３】
添付の図面は、本発明の更なる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれ、その一部を構成する。この図面は、本発明の例示的な実施形態を説明し、その説明と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図１】図１Ａから図１Ｄは、本発明の一実施形態による、核酸分子のシークエンシングをする方法の概略図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態による、核酸分子のシークエンシングをする方法のフローチャートを示す。
【図３】図３は、本発明の一実施形態による、単一分子シークエンシングに適した装置の概略図である。
【図４】図４Ａから図４Ｇは、本発明の一実施形態による、複数種類の核酸断片を調製する方法の概略図である。
【図５】図５Ａから図５Ｇは、本発明の一実施形態による、複数種類の核酸断片を調製する別の方法の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下に記載される詳細な説明は、本発明の態様に従って提供される現在の例示的な装置の説明を意図しており、本発明を準備または利用することができる唯一の形態を表すことを意図するものではない。むしろ、同じまたは同等の機能および構成要素は、本発明の精神および範囲内に包含されることを意図した異なる実施形態によっても達成され得ると、理解されるべきである。
【００２５】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。記載した方法、装置および材料と類似または等価なあらゆる方法、装置および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、例示的な方法、装置および材料をここに記載する。
【００２６】
図１Ａから図１Ｄは、本発明の一実施形態による、核酸分子のシークエンシングをする方法の概略図である。図２は、本発明の一実施形態による、核酸分子のシークエンシングをする方法のフローチャートを示す。図１Ａ及び図２を同時に参照すると、工程 S100 において、少なくとも１つのナノウェル 110 が提供され、前記ナノウェル 110 には、観察ゾーン 112 がある。ある実施形態では、前記ナノウェル 110 を含む装置 100 が提供され、前記装置 100 は単一分子シークエンシングに適している。詳細には、装置 100 は、前記ナノウェル 110、複数の核酸固定化部位 120a、120b、複数種類の核酸断片 130a、130b、および少なくとも1つのポリメラーゼ 140a、140b、140c を含む。ある実施形態では、前記装置 100 は、長さとして 200 ヌクレオチド超を有する核酸断片のシークエンシングをするのに適している。なお、前記核酸固定化部位、前記核酸断片および前記ポリメラーゼの数は、説明する目的のための例示であり、本発明はこれに限定されるものではない。言い換えれば、前記核酸固定化部位および前記核酸断片の数は、それぞれ３つまたはそれより多くてもよく、前記ポリメラーゼの数は１つ又は複数であってもよい。いくつかの実施形態では、前記ポリメラーゼ 140a、140b、140c は既に前記装置 100 内にあるが、ある別の実施形態では、前記ポリメラーゼを後で添加することもできることに留意されたい。
【００２７】
ナノウェル 110 には、観察ゾーン 112 がある。ある実施形態では、前記観察ゾーン 112 は、前記ナノウェル 110 の底部またはその近くに生成される。前記ナノウェル 110 の底部は透明であってもよく、これにより、前記ナノウェル 110 中でのシークエンシング・プロセスを、前記観察ゾーン 112 を介して観察または検出することができる。したがって、前記観察ゾーン 112 は、検出可能ゾーン、シークエンシング・サイト（sequencing site）、または単一分子シークエンシング・ウェル（sequencing well）と呼ぶことができる。ある実施形態では、前記観察ゾーン 112 の直径は、例えば、10 nm から 500 nm の範囲である。ある実施形態では、前記観察ゾーン 112 の高さは、例えば、200 nm 未満である。ある実施形態では、前記観察ゾーン 112 の高さは、例えば、100 nm 未満である。いくつかの実施形態では、前記観察ゾーン 112 の上部境界は、湾曲した形状であってもよい。
【００２８】
次に、工程 S110 において、複数種類の核酸断片 130a、130b を複数の核酸固定化部位 120a、120b を介して観察ゾーン 112 に固定化する。前記核酸固定化部位 120a、120b は、前記観察ゾーン 112 内またはその近接に配置される。ある実施形態では、前記核酸固定化部位 120a は前記観察ゾーン 112 内に配置され、前記核酸固定化部位 120b は前記観察ゾーン 112 の近接に配置される。前記核酸断片 130a、130b は、シークエンシングをするテンプレートであり、前記核酸固定化部位 120a、120b にそれぞれ固定される。前記核酸断片 130a および 130b は、異なる種類の核酸断片であり、このことは、前記核酸断片 130a と核酸断片 130b とが異なる配列を有することを意味する。ある実施形態では、前記複数種類の核酸断片 130a、130b は線状である。ある実施形態では、核酸断片は、ヘアピン構造のような線状の一本鎖または部分的に二本鎖であってもよい。ある実施形態では、前記核酸断片 130a、130b は、例えば、長さとして 200 ヌクレオチド超を含む。ある別の実施形態では、前記核酸断片は 5 ' または3' 末端、好ましくは 3 ' 末端に固定化アンカーを有し、前記核酸断片を前記固定化アンカーを介して前記核酸固定部位に固定化する。前記固定化アンカーはまた、末端ではなく前記核酸断片の他の位置に配置することもできる。
【００２９】
核酸固定化部位 120a、120b は、共有結合または親和性結合によって核酸断片 130a、130b を固定するための官能基であってもよい。共有結合のための例示的な官能基は、例えば、チオール、第１アミン、第２アミン、ジオール、アルデヒド、カルボキシル基、メタクリレート、メタクリレートシラン、アミノシラン、メルカプトシラン、アルデヒドシラン、ジオールシラン、アジドシラン、システイン、シスチン誘導体、アミノ官能性ホスホン酸およびその誘導体、エポキシ、マレイミド、シランマレイミド、シラン PEG マレイミド、またはシラン PEG アジドのことがある。親和性結合のための例示的な官能基は、ビオチン、ヒスチジン、ストレプトアビジン、タンパク質、タンパク質阻害剤、タンパク質基質、抗体、抗原、またはアプタマーのことがある。
【００３０】
ある実施形態では、前記ポリメラーゼ 140a、140b、140c を前記観察ゾーン 112 内に配置する。いくつかの実施形態では、前記核酸断片 130a、130b は長さが長く、前記観察ゾーン 112 内に完全には配置されない。そしてそれ故、もし、前記ポリメラーゼ 140d が前記観察ゾーン 112 に固定化されていない場合、前記ポリメラーゼ−核酸複合体は、前記観察ゾーン 112 の外側に配置され得る。したがって、前記装置 100 は、前記ポリメラーゼ 140a、140b、140c を固定化するために、前記観察ゾーン 112 に複数のポリメラーゼ固定化部位 150a、150b、150c を更に含む。このようにして、前記複数のポリメラーゼ 140a、140b、140c が、前記ポリメラーゼ固定化部位 150a、150b、150c にそれぞれ固定化されることによって、前記観察ゾーン 112 に局在することになり、前記ポリメラーゼ−核酸複合体も前記観察ゾーン 112 に局在することになる。なお、前記ポリメラーゼ固定化部位の数は説明をする目的のために例示されており、本発明はこれに限定されないことに留意されたい。
【００３１】
次に、図１Ｂおよび図２を同時に参照すると、工程 S120 において、１つのプライマー 160a および複数の標識ヌクレオチド類似体 170 が、少なくとも１つのナノウェル 110 の中に添加され、前記プライマー 160a および複数種類の核酸断片 130a、130b のうちの１つによって、前記観察ゾーン 112 の中で、プライマー核酸断片複合体 180a が生成される。ある実施形態では、ただ１つの前記プライマー 160a のみが前記ナノウェル 110 に添加される。ある実施形態では、前記プライマー 160a は、前記核酸断片 130a に対して相補的な配列を有することがある。そうして、前記プライマー 160a は前記核酸断片 130a とアニール（anneal）し、前記観察ゾーン 112 内で、前記プライマー−核酸断片複合体 180a が生成される。
【００３２】
ある実施形態では、前記核酸断片 130a、130b は、例えば、長さとして 200 ヌクレオチド超を含む。ある実施形態では、前記プライマー 160a は前記核酸断片 130a の真ん中部分にアニールし、その結果、前記核酸断片 130a の真ん中部分がシークエンシング・プロセスの開始点になる。しかしながら、本発明はこれに限定されるものではない。ある別の実施形態では、前記シークエンシング・プロセスは、設計されたプライマー（プローブ）を介して、または前記核酸断片についてのランダム・プライミング（random priming）を介して（図示せず）、新生鎖を生成するために、5’ 末端またはどこからでも開始することができる。ある実施形態では、ただ１つのプライマーを添加することのみによって、前記核酸断片 130a、130b のうちのただ１つだけが１回のシークエンシング反応開始のきっかけとなる。ある実施形態では、前記標識ヌクレオチド類似体 170 には、例えば、標識した dATP、dCTP、dGTP および dTTP が含まれる。前記標識ヌクレオチド類似体 170 は、蛍光標識ヌクレオチド類似体であってもよい。
【００３３】
その後、図１Ｃ及び図２を同時に参照すると、工程 S130 において、前記プライマー−核酸断片複合体 180a の新生鎖合成反応は、ポリメラーゼ 140a、140b、140c を使用すること、および前記複数の標識ヌクレオチド類似体 170 を前記プライマー−核酸 180a に取り込ませることによって開始する。ある実施形態では、前記ポリメラーゼ 140a、140b、140c のうちの１つ（例えば、前記ポリメラーゼ 140a）を用いて新生鎖 190a を合成する。ある実施形態では、前記単一分子シークエンス・バイ・シンセシス・プロセスは、前記核酸断片 130a、130b のうちの１つ、前記ポリメラーゼ 140a、140b、140c のうちの１つ、および１つのプライマー 160a を含む前記プライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体が生成された後に、開始する。すなわち、前記シークエンシング・プロセスの開始点は前記プライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体の中にあり、前記シークエンシング・プロセスは前記プライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体の中で開始し、新生鎖 190a が合成される。工程 S110、S120 および S130 は順番に記載されるが、前記核酸断片および前記ポリメラーゼが前記ナノウェル中に既に添加されているため、前記プライマーおよび前記ヌクレオチド類似体がひとたび添加されると、これらの工程が同時に生じることに留意されたい。
【００３４】
次に、工程 S140 において、前記標識ヌクレオチド類似体 170 が取り込まれた配列を検出することによって、前記核酸断片 130a の配列を決定する。ある実施形態では、ただ１つの標識ヌクレオチド類似体 170 だけが、前記観察ゾーン 112 にある前記プライマー−核酸複合体 180a に各時点において取り込まれるので、前記核酸断片130aの配列を高精度に決定することができる。ある実施形態では、前記標識ヌクレオチド類似体 170 は、それぞれ異なる蛍光で標識された dATP、dCTP、dGTP および dTTP を含む。ある実施形態では、前記核酸断片 130a の配列を、前記標識された dATP、dCTP、dGTP および dTTP が取り込まれた配列の異なる蛍光シグナルを検出することによって決定することができる。
【００３５】
その後、工程 S150 において、前記新生鎖 190a は解離する。ある実施形態では、前記新生鎖 190a を合成することによるシークエンシング・プロセスは、ポリメラーゼ 140a が失活するために、または前記核酸断片 130a が解離してしまうために終結する可能性がある。しかしながら、前記新生鎖 190a が解離した後、前記シークエンシング・プロセスを、近くの前記ポリメラーゼ 140a、140b、140c を再捕捉させることによって、再開させることができる。具体的には、もし、ポリメラーゼ 140a の失活により前記シークエンシング・プロセスが終結した場合、そのポリメラーゼ 140a を任意選択的に除去し、その近接にある別のポリメラーゼ 140b、140c を再捕捉させることによって、前記シークエンシング・プロセスを再開させることができる。もし、前記核酸断片 130a が解離してしまうことによって前記シークエンシング・プロセスが終結した場合、同じポリメラーゼ 140a またはその近接にある別のポリメラーゼ 140b、140c を再捕捉させることによって、前記シークエンシング・プロセスを再開させることができる。
【００３６】
その後、図１Ｄ及び図２を同時に参照すると、工程 S160 において、工程 S120 から工程 S150 が繰り返される。ある実施形態では、繰り返しの工程 S120 において、新しいプライマー 160b を添加し、ポリメラーゼ 140a、140b、140c のうちの１つが再捕獲されて 新生鎖190b を合成する。ある実施形態では、前記ポリメラーゼ 140b は、説明をする目的でのみ使用される。言い換えれば、上述したように、ある別の実施形態では、繰り返しの工程 S130 において、前記ポリメラーゼ 140a または別のポリメラーゼ 140c が再捕捉されて前記新生鎖 190a を合成することができる。したがって、前記新生鎖を解離し、新しいプライマーを加え、ポリメラーゼのうちの１つを再捕捉させることによって、前記シークエンシング・プロセスを数回繰り返すことができる。ある実施形態では、一致する配列（コンセンサス配列（consensus sequence））の精度が必要な程度に達するまで、工程 S120 から工程 S150 を繰り返して、前記核酸断片 130a、130b に対しての配列カバレッジ（sequence coverage）を増加させる。なお、前記ポリメラーゼ 140a、140b、140c は最初から前記ナノウェル中に存在しているので、前記プライマーを添加することによって前記単一分子シークエンシング・バイ・シンセシスが開始されることに留意されたい。ある実施形態では、前記核酸断片 130b が前記観察ゾーン 112 に近接して固定化されているが、前記核酸断片 130b、前記プライマー 160b および前記ポリメラーゼ 140b の前記プライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体は、観察ゾーン 112 の中で生成され局在することに留意されたい。言い換えれば、「近接する（"proximate”）」とは、前記核酸断片 130b が前記観察ゾーン 112 の近くにあり、且つ、前記核酸断片 130b と前記観察ゾーン 112 とが、ある距離、離れていて、その距離が、前記核酸断片 130b が前記プライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体を前記観察ゾーン 112 内に生成するのに適したものである、ことを意味する。一本鎖 DNA 分子の場合、塩基当たりの平均長さは約 0.6~0.7 nm である（一本鎖 DNA の持続長および塩基あたりの長さは、場の理論を用いた蛍光相関分光測定（Physica A：Statistical Mechanics and its Applications 第 392 巻、第 5 号、2013年3月1日、ページ1072-1079）から得られる）。核酸断片 130b のあるものは観察ゾーン内に完全には固定化されていないが、それら断片の一部は、観察ゾーンの中へ拡散して観察ゾーン内で固定化されたポリメラーゼとプライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体を形成するのに十分長く、それにより前記シーケンシング・プロセスが進行できる。ある実施形態では、前記観察ゾーンの境界から前記固定点までの前記観察ゾーン 112 内で、効率的に前記プライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体が生成されるためには、前記観察ゾーン 112 の境界から核酸断片 130b の前記核酸固定化部位 120b までの距離は、L x 0.6 x 50 ％ nm 以内でなければならない。ここで、例えば、L は塩基数での前記断片の長さである。
【００３７】
ある実施形態では、前記核酸断片 130a、130b は、同一の観察ゾーン 112 内、またはその近接に固定化されているため、洗浄および別の核酸断片を再ローディングすること無く、前記核酸断片 130a、130b を、同じ観察ゾーン 112 内で交互にかつ完全にシークエンシングすることができる。言い換えれば、ある１つの種類の核酸断片 130a のシークエンシングをした後、同じ種類の核酸断片 130a、および別の種類の 130b は既に前記ナノウェル中に存在するので、前記核酸断片 130a または 130b を連続的にシークエンシングすることができ、２つのシークエンシング・プロセス間で、シークエンシングがなされる核酸断片を添加するための時間が節約される。ある実施形態では、ある１つの核酸断片 130a のシークエンシングをした後、同じ核酸断片 130a、および別の 130bは既に前記ナノウェル中に存在するので、核酸断片 130a または 130b を連続的にシークエンシングすることができ、２つのシークエンシング・プロセス間で、シークエンシングがなされる核酸断片を添加するための時間が節約される。なお、前記核酸断片 130a、130b は同じ観察ゾーン 112 に、または近接して同時に固定化されるが、各時点において１つのプライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体のみが生成され、各時点において１つの核酸断片（単一分子として示す）130a のみがシークエンシングされる。
【００３８】
なお、前記核酸断片 130a、130b としては、例えば、図１Ａから図１Ｄにおいて、長さとして 200 ヌクレオチド超を有するものを含むが、本発明はこれに限定されるものではないことに留意されたい。ある実施形態では、図３に示すように、前記核酸断片 130c、130d、130e としては、例えば、長さとして 50ヌクレオチドから 200ヌクレオチドを含む。ある実施形態では、前記核酸断片 130c、130d、130e は、無細胞 DNA またはマイクロ RNA のような短い断片である。ある実施形態では、前記核酸断片 130c、130d、130e は、それぞれ、前記核酸固定化部位 120c、120d、120e に固定されている。前記核酸断片 130c、130d、130e の長さはより短いので、前記核酸断片 130c、130d、130e は実質的に完全に前記観察ゾーン 112 内またはその近接に配置される。したがって、前記ポリメラーゼ 140d を前記観察ゾーン 112 内に固定する必要はない。更に、ある実施形態では、１つのプライマー 160c および１つのポリメラーゼ 140d を前記ナノウェル 110 に添加すると、前記プライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体の生成、および前記単一分子シークエンシング・バイ・シンセシス・プロセスが始まる。ある実施形態では、前記新生鎖 190c を合成することによるシークエンシング・プロセスは、ポリメラーゼ 140d の失活、または前記核酸断片 130e から解離するために終結する可能性がある。しかし、前記新生鎖 190c を解離した後、別の新たに添加されたポリメラーゼ（図示せず）が再捕捉されることによって、前記シークエンシング・プロセスを再開させることができる。具体的には、もし、前記シークエンシング・プロセスがポリメラーゼ 140d の失活により終結したのなら、このポリメラーゼ 140d を任意選択的に除去し、新たに添加したポリメラーゼ（図示せず）を再捕捉させることで、前記シークエンシング・プロセスを再開させることができる。もし、前記シークエンシング・プロセスが前記核酸断片 130e から解離することにより終結したのなら、同じポリメラーゼ 140d を再捕捉させることで、前記シークエンシング・プロセスを再開させることができる。なお、３つの核酸断片 130c、130d、130e が図３に概略的に示されているが、本発明はこれに限定されるものではないことに留意されたい。ある別の実施形態では、前記核酸断片は、１回のローディングで数十、あるいは数百の断片であってもよく、各断片を繰り返しシークエンシングすることができる。したがって、前記装置 100a のシーケンシング容量を何倍にも増加させることができる。
【００３９】
図３は、本発明の一実施形態による単一分子シークエンシングに適した装置の概略図である。前記装置 100a の構成要素は、前記装置100の構成要素と同様であり、前記装置 100 と100a との主な違いは、前記装置 100 がより長い核酸断片（例えば、長さとして 200 ヌクレオチド超をもつもの等）をシークエンシングするのに適しており、前記装置 100a は、より短い核酸断片（例えば、長さとして 200 ヌクレオチド未満をもつもの等）をシークエンシングするのに適している、ということにある。その違いを以下に記載する。図３を参照すると、前記装置 100a は、少なくとも１つのナノウェル 110、複数の核酸固定化部位 120c、120d、120e（例示の目的で、３つの核酸固定化部位 120c、120d、120e が図３に概略的に示されている）、複数種類の核酸断片 130c、130d、130e（例示の目的で、３種類の核酸断片 130c、130d、130e が図３に概略的に示されている）、およびただ１つのポリメラーゼ 140d を含む。ここで、前記核酸断片 130c、130d、130e は、例えば、長さとして 50 ヌクレオチドから 200 ヌクレオチドを含む。前記核酸断片 130c、130d および 130e は、異なる種類の核酸断片であり、このことは、前記核酸断片 130c、前記核酸断片 130d、および前記核酸断片 130e が異なる配列を有することを意味する。ある実施形態では、前記ポリメラーゼ 140d を前記観察ゾーン 112 の中に配置する。ある実施形態では、前記核酸断片 130c、130d、130e の長さはより短く、全体が前記観察ゾーン 112 内または前記観察ゾーン112に近接して配置され、それによって、前記プライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体は前記観察ゾーン 112 内に局在することがある。ある実施形態では、前記プライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体は、１つのプライマー、１つのポリメラーゼおよび１つの核酸断片を含む複合体である。したがって、前記ポリメラーゼ 140d を、前記観察ゾーン 112 内に追加的に固定する必要はない。
【００４０】
簡潔に述べると、単一分子シークエンシングのための装置において、前記複数の核酸固定化部位を前記ナノウェルの観察ゾーン内またはその近接に配置し、前記複数種類の核酸断片を前記核酸固定化部位に固定化する。前記ナノウェルには複数種類の核酸断片を同時に添加するが、各時点において１つのプライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体のみが生成され、各時点において１種類の核酸断片（単一分子として示す）のみがシークエンスされる。更に、１種類の核酸断片をシークエンシングした後、同じ種類または別の種類の核酸断片が前記ナノウェル中に既に存在するので、その同じ種類または別の種類の核酸断片を連続的にシークエンシングする。そして、２つのシークエンシング・プロセス間で、シークエンシングがなされる核酸断片を添加するための時間が節約される。したがって、本発明の装置および方法は、ハイ・スループットおよびサンプル調製時間の短縮という利点を有する。
【００４１】
図４Ａから図４Ｇは、本発明の一実施形態における複数種類の核酸断片を調製する方法の概略図である。図５Ａから図５Ｇは、本発明の別の実施形態における複数種類の核酸断片を調製する別の方法の概略図である。
【００４２】
図４Ａから図４Ｇを参照すると、複数種類の核酸断片を調製する方法は以下の工程を含む。まず、抽出したゲノム DNA 210 を提供する。その後、前記抽出されたゲノム DNA 210 を複数の DNA 断片212 に断片化する。その後、前記 DNA 断片 212 の一方の末端 212a を、固相230 の表面上に固定した dsDNA アダプター 220 に結合させる。その後、未結合の DNA 断片212 を洗い流すために、洗浄工程を実施する。それから、標識したアダプター 240 を、前記固相 230 の表面上に付着した前記 DNA 断片 212 の他方の末端 212b に結合させて、標識した DNA 断片 214 とする。ある実施形態では、前記標識したアダプター 240 は、例えば、一本鎖部分を有する部分的な二本鎖DNAであり、前記一本鎖部分の末端において、標識 F で標識されている。ある実施形態では、前記標識 F は、例えばビオチンである。その後、洗浄工程を行って未結合の標識アダプター 240 を洗い流す。その後、前記標識化した DNA 断片 214 を解離させることによって、複数の一本鎖 DNA 断片214a を溶出させる。ここで、前記一本鎖 DNA 断片214a を、シーケンシングのための核酸断片として直接的に使用することができる。
【００４３】
図５Ａから図５Ｇを参照すると、複数種類の核酸断片を調製する別の方法は以下の工程を含む。まず、抽出したゲノム DNA 310 を提供する。次に、前記抽出したゲノム DNA 310 を複数の DNA 断片 312 に断片化する。その後、プローブ 320 を前記 DNA 断片 312 のうちの１つとハイブリダイズさせる。その後、DNA ポリメラーゼ 330 および標識ヌクレオチド類似体 340 を使用することによって、ハイブリダイズしたプローブ 322 を伸長させて、標識した新生鎖−DNA 断片複合体とする。ある実施形態において、それぞれの標識ヌクレオチド類似体 340 は標識を含み、例えば、その標識はビオチンである。次いで、前記標識した新生鎖−DNA 断片複合体 313 を精製する。未標識の DNA 断片 312 を洗い流すために、洗浄工程を行う。ある実施形態では、前記標識した新生鎖-DNA 断片複合体 313 を、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ 350 および磁石 360 によって精製する。その後、前記標識した新生鎖−DNA 断片複合体 313 を解離させることによって、複数の一本鎖 DNA 断片 313a を溶出する。その後、アンカー 370 を一本鎖 DNA 断片 313a の一方の末端 313a1（又は他方の末端 313a2）に結合させて、標識した一本鎖 DNA 断片314 とする。ここで、前記標識した一本鎖 DNA 断片 314 を、シークエンシングのための核酸断片として直接使用することができる。
【００４４】
ある実施形態において、各シークエンシング・プロセスによって、前記核酸断片の部分配列を得ることができる。前記部分配列は、同じ開始点または異なる開始点から開始し、異なる終結点で終結することがある。前記シークエンシング・プロセスを、１つのナノウェル内で、いくつかの部分配列を得るために数回繰り返すことがある。次いで、そのいくつかの部分配列を一緒に並べることにより、前記核酸断片のより長いコンセンサス配列を得ることができる。
【００４５】
要約すると、本発明は、単一分子シークエンシングのための装置、および核酸分子のシークエンシングをする方法を提供し、前記装置は、少なくとも１つのナノウェル、複数の核酸固定化部位、および複数種類の核酸断片を含む。ある実施形態では、前記シークエンシング・プロセスの開始は、１つのプライマーまたは１つのポリメラーゼの添加によって制御することができ、したがって、生成されるプライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体が１つだけであることが保証される。したがって、各時点において、ただ１つの標識ヌクレオチド類似体のみが前記プライマー−ポリメラーゼ−核酸複合体に取り込まれ、前記標識ヌクレオチド類似体が、前記ナノウェルの前記観察ゾーンを通じてでのシークエンシング結果として検出され得る。したがって、妨害を受けることなく、正確に前記シークエンシング結果を得ることができる。更に、前記核酸断片を連続的にシークエンシングすることができ、それらは前記ナノウェルに最初から添加されているので、シークエンシングがなされる核酸断片を添加するための時間が節約される。また、１回のローディングで、１つのナノウェル中に、前記核酸断片および/又は前記ポリメラーゼのローディングされる分子数が増加する（１より大きい）ので、ローディングに失敗することを防ぐことができる。したがって、本発明の装置および方法は、ハイ・スループットおよびサンプル調製時間の短縮という利点を有する。
【００４６】
当業者には、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、開示された実施形態に様々な変更および変形を加えることができることが明らかであろう。上記を考慮して、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内に入るという条件で、変更および変形をカバーすることが意図されている。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の装置およびそれを用いた核酸分子のシークエンシングをする方法は、単一分子シークエンシング装置およびそれを用いたシークエンシング方法に適用することができる。
【符号の説明】
【００４８】
100、100a：装置
110：ナノウェル
112：観察ゾーン
120a、120b、120c、120d、120e：核酸固定化部位
130a、130b、130c、130d、130e：核酸断片
140a、140b、140c、140d：ポリメラーゼ
150a、150b、150c：ポリメラーゼ固定化部位
160a、160b、160c：プライマー
170：標識ヌクレオチド類似体
180a：プライマー−核酸断片複合体
190a、190b、190c：新生鎖
210、310：抽出したゲノム DNA
212、312：DNA 断片
212a、212b、313a1、313a2：末端
214：標識した DNA 断片
214a、313a：一本鎖 DNA 断片
220：dsDNA アダプター
230：固相
240：標識したアダプター
313：標識した新生鎖−DNA 断片複合体
314：標識した一本鎖 DNA 断片
320：プローブ
322：ハイブリダイズしたプローブ
330：DNA ポリメラーゼ
340：標識ヌクレオチド類似体
350：ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ
360：磁石
370：アンカー
F：標識
S100、S110、S120、S130、S140、S150、S160：工程
【図１Ａ】
2019000108.tif 000003
【図１Ｂ】
2019000108.tif 000004
【図１Ｃ】
2019000108.tif 000005
【図１Ｄ】
2019000108.tif 000006
【図２】
2019000108.tif 000007
【図３】
2019000108.tif 000008
【図４】
2019000108.tif 000009
【図５】
2019000108.tif 000010
【外国語明細書】
2019000108000001.pdf