(57)【要約】      （修正有）【課題】1つまたは複数の免疫モジュレーターを発現させる免疫細胞または治療補助細胞（ＴＳＣ）の遺伝子操作、およびそれらの細胞の治療薬としての使用を提供する。【解決手段】遺伝子発現モジュレーションシステムの制御下にあるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）および１つまたは複数の免疫モジュレーターを活性化リガンドの存在下で条件的に発現する、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞。動物における治療目的での使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数の免疫モジュレ
ーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現させるためのベクター
であって、
該ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転
写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）該リガンド依存性転写因子に
よって活性化されるプロモーターに機能的に連結された、免疫モジュレーターの機能を有
する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含み、
1つまたは複数の免疫モジュレーターが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8
、IL-9、IL-10R DNまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-2
7、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α1、IFN α2、IL-15-R-α、CCL3（MIP-1a）、CCL5（R
ANTES）、CCL7（MCP3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MI
P-3b）、CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、
4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、
dnFADD、BCG、TGF-α、PD-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN
、ICOS-LおよびS100から選択される、ベクター。
【請求項２】
アデノウイルスベクターである、請求項1記載のベクター。
【請求項３】
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項2
記載のベクター。
【請求項４】
免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌク
レオチド、およびIL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、遺
伝子スイッチの調節性プロモーターの制御下にある、請求項1記載のベクター。
【請求項５】
遺伝子スイッチがエクジソン受容体（EcR）に基づく遺伝子スイッチである、請求項1記
載のベクター。
【請求項６】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列と第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを含み、該
第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク
質複合体を形成する、請求項1記載のベクター。
【請求項７】
免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌク
レオチドが、ヒト免疫モジュレーターをコードする、請求項1記載のベクター。
【請求項８】
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒトIL-12をコード
する、請求項3記載のベクター。
【請求項９】
1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を発現
する免疫細胞または治療補助細胞（TSC）の集団を生成する方法であって、1つまたは複数
の免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する組
換えベクターによって免疫細胞を改変する段階を含み、該ベクターが遺伝子スイッチをコ
ードするポリヌクレオチドを含み、
該ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転
写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）該リガンド依存性転写因子に
よって活性化されるプロモーターに機能的に連結された、免疫モジュレーターの機能を有
する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含み、
1つまたは複数の免疫モジュレーターが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8
、IL-9、IL-10R DNまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-2
7、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α1、IFN-α2、IL-15-R-α、CCL3（MIP-1a）、CCL5（R
ANTES）、CCL7（MCP3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MI
P-3b）、CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、
4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、
dnFADD、TGF-α、PD-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICO
S-LおよびS100から選択される、方法。
【請求項１０】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
ベクターが、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに
含む、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチの制
御下にある、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列と第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを含み、該
第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク
質複合体を形成する、請求項9記載の方法。
【請求項１５】
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒト
免疫モジュレーターをコードする、請求項9記載の方法。
【請求項１６】
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒトIL-12をコード
する、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
細胞がヒト樹状細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項１８】
樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件
的に発現する組換えベクターによって改変された、1つまたは複数の免疫モジュレーター
の機能を有する1つまたは複数のタンパク質を発現する免疫細胞またはTSCの集団であって
、該ベクターが遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、
該ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転
写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）該リガンド依存性転写因子に
よって活性化されるプロモーターに連結された、免疫モジュレーターの機能を有する1つ
または複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含み、
免疫モジュレーターが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R D
Nまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-
α、IFN-α1、INF-α2、IL-15Rα、IFN-γ、CCL3（MIP-1a）、CCL5（RANTES）、CCL7（MC
P3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MIP-3b）、CXCL9（MI
G）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、4-1BBL、CD40、CD7
0、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、P
D-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS-LおよびS100から
選択される、集団。
【請求項２０】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項19記載の集団。
【請求項２１】
ベクターが、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに
含む、請求項19記載の集団。
【請求項２２】
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチの制
御下にある、請求項19記載の集団。
【請求項２３】
遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項19記載の集団。
【請求項２４】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列と第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを含み、該
第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク
質複合体を形成する、請求項19記載の集団。
【請求項２５】
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒト
免疫モジュレーターをコードする、請求項19記載の集団。
【請求項２６】
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒトIL-12をコード
する、請求項21記載の集団。
【請求項２７】
細胞がヒト樹状細胞である、請求項19記載の集団。
【請求項２８】
樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項27記載の集団。
【請求項２９】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、インビトロで遺
伝子操作された免疫細胞またはTSCであって、
該遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連
結された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）
該リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、免疫モジュ
レーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含み、
免疫モジュレーターが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R D
Nまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-
α、IFN-γ、IFN-α1、INF-α2、IL-15Rα、CCL3（MIP-1a）、CCL5（RANTES）、CCL7（MC
P3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MIP-3b）、CXCL9（MI
G）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、4-1BBL、CD40、CD7
0、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、P
D-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS-LおよびS100から
選択される、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSC。
【請求項３０】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項29記載のインビトロで遺伝子操作さ
れた免疫細胞。
【請求項３１】
ベクターが、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに
含む、請求項29記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項３２】
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチの制
御下にある、請求項29記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項３３】
遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項29記載のインビトロで遺
伝子操作された免疫細胞。
【請求項３４】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列と第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを含み、該
第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク
質複合体を形成する、請求項29記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項３５】
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒト
免疫モジュレーターをコードする、請求項29記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細
胞。
【請求項３６】
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒトIL-12をコード
する、請求項31記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項３７】
ヒト樹状細胞である、請求項29記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項３８】
樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項37記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細
胞。
【請求項３９】
請求項19記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの集団を含む薬学的
組成物。
【請求項４０】
請求項29記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCを含む薬学的組成物
。
【請求項４１】
腫瘍内、腹腔内または皮下投与に適している、請求項39または40記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
細胞の集団が少なくとも104個の細胞を含む、請求項39記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
細胞の集団が少なくとも107個の細胞を含む、請求項39記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
（a）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現す
るようにインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの集団を、腫瘍の微小環境に
対して腫瘍内投与する段階；および
（b）1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含み
、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質の発現を
誘導して該腫瘍を治療する、哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、
免疫モジュレーターが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R D
Nまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-
α、IFN-γ、IFN-α1、INF-α2、IL-15Rα、CCL3（MIP-1a）、CCL5（RANTES）、CCL7（MC
P3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MIP-3b）、CXCL9（MI
G）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、4-1BBL、CD40、CD7
0、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、P
D-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS-LおよびS100から
選択される、方法。
【請求項４５】
腫瘍が良性腫瘍である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍が悪性腫瘍である、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
腫瘍が黒色腫である、請求項44記載の方法。
【請求項４８】
腫瘍が悪性黒色腫皮膚癌である、請求項44記載の方法。
【請求項４９】
インビトロで遺伝子操作された免疫細胞が、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオ
チドを含むベクターを含み、該ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結
された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）該
リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、免疫モジュレ
ーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項44記載
の方法。
【請求項５０】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項44記載の方法。
【請求項５１】
ベクターが、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに
含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチの制
御下にある、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列と第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを含み、該
第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク
質複合体を形成する、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒト
免疫モジュレーターをコードする、請求項44記載の方法。
【請求項５６】
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒトIL-12をコード
する、請求項51記載の方法。
【請求項５７】
免疫細胞がヒト樹状細胞である、請求項44記載の方法。
【請求項５８】
樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項44記載の方法。
【請求項６０】
リガンドがRG-115819、RG-115932およびRG-115830から選択される、請求項44記載の方
法。
【請求項６１】
リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項44記載の方法。
【請求項６２】
リガンドを、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞の前または後の1時間未満のうち
に投与する、請求項44記載の方法。
【請求項６３】
リガンドを、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞の後の24時間未満のうちに投与す
る、請求項44記載の方法。
【請求項６４】
リガンドを、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞の後の48時間未満のうちに投与す
る、請求項44記載の方法。
【請求項６５】
患者における、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞に基づく治療レジメンの有効性
を判定するための方法であって、
（a）それを必要とする該患者から、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞の投与の
前に入手した第1の生体試料におけるインターフェロン-γ（IFN-γ）の発現のレベルまた
は活性のレベルまたはその両方を測定し、それによって対照レベルを求める段階；
（b）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質および任意でIL-1
2の機能を有するタンパク質を条件的に発現するように遺伝子操作された、インビトロで
遺伝子操作された免疫細胞を、それを必要とする患者に対して投与する段階；
（c）活性化リガンドの有効量を、それを必要とする該患者に対して投与する段階；
（d）それを必要とする該患者から、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞および活
性化リガンドの投与後に入手した第2の生体試料におけるIFN-γの発現のレベルまたは活
性のレベルまたはその両方を測定し、それによって試験レベルを求める段階；ならびに
（e）IFN-γの試験レベルを対照レベルと比較し、IFN-γの発現、活性またはその両方
の試験レベルが対照レベルに比して高いことにより、その治療レジメンがそれを必要とす
る該患者において有効であることが指し示される段階を含み、
免疫モジュレーターが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R D
Nまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-
α、IFN-γ、IFN-α1、INF-α2、IL-15Rα、CCL3（MIP-1a）、CCL5（RANTES）、CCL7（MC
P3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MIP-3b）、CXCL9（MI
G）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、4-1BBL、CD40、CD7
0、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、P
D-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS-LおよびS100から
選択される、方法。
【請求項６６】
それを必要とする患者がヒト患者である、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
患者が癌患者である、請求項65記載の方法。
【請求項６８】
癌患者が黒色腫患者である、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
IFN-γのレベルをELISAによって測定する、請求項65記載の方法。
【請求項７０】
免疫細胞が、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質および任
意でIL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するように、かつ遺伝子スイッチを
コードするポリヌクレオチドを含むベクターを含むようにインビトロで遺伝子操作されて
おり、
該ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転
写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）該リガンド依存性転写因子に
よって活性化されるプロモーターに連結された、免疫モジュレーターの機能を有する1つ
または複数のタンパク質および任意でIL-12をコードするポリヌクレオチドとを含む、請
求項65記載の方法。
【請求項７１】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項70記載の方法。
【請求項７３】
リガンドがEcRのリガンド結合ドメインと結合する、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項72記載の方法。
【請求項７５】
リガンドがRG-115819、RG-115932およびRG-115830から選択される、請求項74記載の方
法。
【請求項７６】
リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項72記載の方法。
【請求項７７】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列と第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを含み、該
第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク
質複合体を形成する、請求項72記載の方法。
【請求項７８】
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒトIL-12をコード
する、請求項70記載の方法。
【請求項７９】
免疫細胞がヒト樹状細胞である、請求項65記載の方法。
【請求項８０】
樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
活性化リガンドを腫瘍内、経口的、腹腔内または皮下に投与する、請求項65記載の方法
。
【請求項８２】
活性化リガンドを、インビトロで遺伝子操作された樹状細胞の前または後の1時間未満
のうちに投与する、請求項65記載の方法。
【請求項８３】
活性化リガンドを、インビトロで遺伝子操作された樹状細胞の後の24時間未満のうちに
投与する、請求項65記載の方法。
【請求項８４】
活性化リガンドを、インビトロで遺伝子操作された樹状細胞の後の48時間未満のうちに
投与する、請求項65記載の方法。
【請求項８５】
（a）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質および任意でIL-1
2の機能を有するタンパク質の発現を制御する遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオ
チドを含むベクターを含むように遺伝子操作された免疫細胞と、（b）遺伝子スイッチを
活性化するリガンドとを含むキット。
【請求項８６】
リガンドがRG-115819、RG-115830またはRG-115932である、請求項85記載のキット。
【請求項８７】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、1つのプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列を含み、該第1の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコードされるタンパク質とが相互作
用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項1
記載のベクター。
【請求項８８】
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列がEMCV配列内リボソーム進入部位（IRES）
によって連結されている、請求項87記載のベクター。
【請求項８９】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、1つのプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列を含み、該第1の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコードされるタンパク質とが相互作
用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項29
記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項９０】
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列がEMCV配列内リボソーム進入部位（IRES）
によって連結されている、請求項89記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項９１】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、1つのプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列を含み、該第1の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコードされるタンパク質とが相互作
用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項53
記載の方法。
【請求項９２】
第1の転写因子配列および第2の転写因子がEMCV配列内リボソーム進入部位（IRES）によ
って連結されている、請求項91記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項９３】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、1つのプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列を含み、該第1の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコードされるタンパク質とが相互作
用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項72
記載の方法。
【請求項９４】
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列がEMCV配列内リボソーム進入部位（IRES）
によって連結されている。請求項93記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項９５】
インビトロで遺伝子操作された免疫細胞または治療補助細胞の2つまたはそれ以上の集
団を含む組成物を含む組成物であって、組成物中のインビトロで遺伝子操作された細胞の
各集団が、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、該ポリ
ヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子を
コードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）該リガンド依存性転写因子によって活
性化されるプロモーターに連結された、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質を
コードするポリヌクレオチドとを含み、組成物中のインビトロで遺伝子操作された細胞の
各集団が、組成物中のインビトロで遺伝子操作された細胞の他の集団において発現される
1つまたは複数の免疫モジュレーターとは異なる1つまたは複数の免疫モジュレーターを発
現する、組成物。
【請求項９６】
哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、
（a）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現す
るようにインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの2つまたはそれ以上の集団を
、腫瘍の微小環境に対して腫瘍内投与する段階であって、
免疫細胞またはTSCの各集団が1つまたは複数の免疫モジュレーターの異なるセットを発
現する、段階；および
（b）1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を該哺乳動物に投与する段階を含
み、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質の発現を誘導して該腫瘍を
治療する、方法。
【請求項９７】
哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、
（a）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質およびIL-12の機
能を有するタンパク質を条件的に発現するようにインビトロで遺伝子操作された免疫細胞
またはTSCの2つまたはそれ以上の集団を、腫瘍の微小環境に対して腫瘍内投与する段階で
あって、
免疫細胞またはTSCの各集団が免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタン
パク質の異なるセットを発現し、
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質またはIL-12のうち少なくとも1つが、リ
ガンドによって活性化される条件的プロモーターの制御下にある段階；ならびに
（b）1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を該哺乳動物に投与する段階を含
み、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質および／またはIL-12の機
能を有するタンパク質の発現を誘導して該腫瘍を治療する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2008年10月8日に提出された米国仮出願第61／103,810号の優先権による恩典
を主張し、それはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
EFS-WEBを介して電子的に提出した配列表への言及
本出願とともに提出された、電子的に提出した配列表（名称：sequence listing.ST25.
txt；サイズ：213,102バイト；作成日：2009年10月8日）は、その全体が参照により本明
細書に組み入れられる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、癌などの疾患および障害の治療のための遺伝子治療の分野に関する。1つの
態様において、本発明は、1つまたは複数の免疫モジュレーターを発現させる免疫細胞ま
たは治療補助細胞（TSC）の遺伝子操作、およびそれらの細胞の治療薬としての使用を提
供する。
【背景技術】
【０００４】
背景
インターロイキン-12（IL-12）は、防御免疫応答および腫瘍形成の抑制を非限定的に含
む、いくつかの生物学的過程への寄与に関係するI型サイトカインファミリーのメンバー
である（Abdi et al., 2006；Adorini, 1999；Adorini, 2001；Adorini et al., 2002；A
dorini et al., 1996；Akhtar et al., 2004；Akiyama et al., 2000；Al-Mohanna et al
., 2002；Aliberti et al., 1996；Allavena et al., 1994；Alli and Khar, 2004；Alzo
na et al., 1996；Amemiya et al., 2006；Araujo et al., 2001；Arulanandam et al., 
1999；Athie et al., 2000；Athie-Morales et al., 2004；Bertagnolli et al., 1992；
Bhardwaj et al., 1996；Biedermann et al., 2006；Brunda and Gately, 1994；Buchana
n et al., 1995；Romani et al., 1997；Rothe et al., 1996；Satoskar et al., 2000；
Schopf et al., 1999；Thomas et al., 2000；Tsung et al., 1997；Wolf et al., 1994
；Yuminamochi et al., 2007）。IL-12がヒト疾患（例えば、癌）を抑えるための有望な
標的である可能性を示唆する証拠は増えている。
【０００５】
IL-12が1型抗腫瘍NK細胞、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞に対するその強力な補助活性に
基づき、癌治療薬として依然として有望であるという事実（Trinchieri, 2003）にもかか
わらず、患者において報告されている組換えヒトIL-12（rhIL-12）の毒性（Atkins et al
., 1997）は、臨床適用のためのGMP等級のrhIL-12の供給源が限られていることと併せて
、IL-12に基づく治療アプローチの成功を妨げてきた。このため、遺伝子治療アプローチ
がより安全で、筋道の立った治療選択肢であると考えることは妥当であるように思われる
。実際に、組換えウイルス（Sangro et al., 2004；Triozzi et al., 2005）もしくは組
換えプラスミドに基づくIL-12 cDNA（Heinzerling et al., 2005）の、またはIL-12遺伝
子が改変された自己線維芽細胞（Kang et al., 2001）の腫瘍内または腫瘍周囲送達を採
り入れた第1相臨床試験では、安全性および十分な忍容性が明らかにされている。
【０００６】
しかし、これらの遺伝子療法を受けている黒色腫またはさまざまな癌の患者における客
観的な臨床的奏効は稀で、一定せず、一過性であり、かつ多くは治療部位に限局していた
（Heinzerling et al., 2005；Kang et al., 2001；Sangro et al., 2004；Triozzi et a
l., 2005）。疾患の消散が部分的または完全であった症例では、腫瘍浸潤性リンパ球の頻
度の増大（Heinzerling et al., 2005；Sangro et al., 2004）および腫瘍特異的循環CD8
+ T細胞のレベルの上昇（Heinzerling et al., 2005）が認められており、これはこれら
の患者における抗原特異的T細胞のクロスプライミングの向上と合致する。
【０００７】
特異的T細胞のクロスプライミングは、IL-12の自然の、しかし調節下にある供給源とし
て働く樹状細胞（DC）によって最もうまく達成されるため（Berard et al., 2000）、DC
に基づくIL-12遺伝子治療の前臨床試験での有効性が相対的に優れていたという最近の報
告は大変興味深い（Satoh et al., 2002；Tatsumi et al., 2003；Yamanaka et al., 200
2）。例えば、マウスモデルにおける、IL-12p70を産生するように（組換えアデノウイル
ス感染により）遺伝子操作されたDCの腫瘍内（i.t.）注射は、広域反応性の腫瘍特異的CD
8+ T細胞レパートリーのクロスプライミングの劇的な向上をもたらし、それに呼応して腫
瘍拒絶が生じたことが示されている（Tatsumi et al., 2003）。CMVに基づくプロモータ
ーの下でmIL-12をコードする組換えアデノウイルス（rAd.cIL12、（Tatsumi et al., 200
3））が以前に用いられたことを考慮すれば、遺伝子操作されたDCによるIL-12の産生は恒
常的であり、それ故に、初期の腫瘍病変内および後期の腫瘍流入領域リンパ節内でのこの
サイトカインの免疫学的影響を治療成績に関して分けて分析することはできなかった。こ
のため、導入遺伝子の発現レベルおよび導入遺伝子の活性化のタイミングの両方を調節す
ることを目的として、IL-12の条件的発現のために遺伝子操作されたDCには需要が存在す
る。本発明は、そのような細胞の使用に関する有望な治療成績を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、1つまたは複数のプロモーターの制御下にある、1つまたは複数の免疫モジュ
レーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードする組換えベクターを提供
する。1つの態様において、1つまたは複数のプロモーターは条件的である。別の態様にお
いて、1つまたは複数のプロモーターは構成的である。別の態様において、ベクターは、
ジアシルヒドラジン（例えば、RG-115819、RG-115830またはRG-115932）などの可溶性低
分子リガンドの供給によって条件的に活性化させることのできるプロモーターで駆動され
る1つまたは複数のタンパク質をコードするアデノウイルスベクターである。このベクタ
ーは、免疫細胞およびTSCからの1つまたは複数のタンパク質の発現の制御を可能にする。
【０００９】
1つの態様において、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む
、1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件
的に発現させるためのベクターであって、遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオ
チドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードす
る少なくとも1つの転写因子配列、および（2）前記リガンド依存性転写因子によって活性
化されるプロモーターに連結された、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数
のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、を含むベクターを提供する。1つの態様に
おいて、免疫モジュレーターは、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL
-10R DNまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF
、IFN-α、IFN-γ、CCL3（MIP-1a）、CCL5（RANTES）、CCL7（MCP3）、XCL1（リンホタク
チン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MIP-3b）、CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）、
CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-デ
フェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、PD-L1RNAi、PD-L1アンチ
センスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS-LおよびS100から選択される。
【００１０】
別の態様において、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、
1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質およびIL
-12の機能を有するタンパク質を発現させるためのベクターであって、前記ポリヌクレオ
チドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードす
る少なくとも1つの転写因子配列、（2）1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有
する前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および（3）IL-12の機能を有するタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチド、を含み；ここで（2）および（3）の少なくとも
1つのポリヌクレオチドがリガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに
連結されている、ベクターを提供する。
【００１１】
本発明はさらに、1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数の
タンパク質を条件的に発現する組換えベクターによって細胞を改変すること（例えば、ト
ランスフェクトすること、エレクトロポレーションを行うこと、その他）により、1つま
たは複数の免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を発現する細
胞、例えば免疫細胞またはTSCの集団を生成する方法であって、そのベクターが遺伝子ス
イッチをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、（1）プロモー
ターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写
因子配列、および（2）前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーター
に連結された、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコード
するポリヌクレオチド、を含む方法を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、組換え遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを
含むベクターによって細胞を改変することにより、1つまたは複数の免疫モジュレーター
の機能を有するタンパク質およびIL-12の機能を有するタンパク質を発現する細胞、例え
ば免疫細胞またはTSCの集団を生成する方法であって、前記ポリヌクレオチドが、（1）プ
ロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つ
の転写因子配列、（2）1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有する前記タンパク
質をコードするポリヌクレオチド、および（3）IL-12の機能を有するタンパク質をコード
するポリヌクレオチド、を含み；ここで（2）および（3）の少なくとも1つのポリヌクレ
オチドが前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結されてい
る、方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数の
タンパク質を条件的に発現する組換えベクターによって改変された（例えば、トランスフ
ェクトされた、エレクトロポレーションを受けた、その他）、1つまたは複数の免疫モジ
ュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を発現する細胞、例えば免疫細胞
またはTSCの集団であって、そのベクターが遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチ
ドを含み、前記ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガン
ド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および（2）前記リガンド
依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、免疫モジュレーターの
機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、集団を
提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、組換え遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを
含むベクターによって改変された、1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有する
タンパク質およびIL-12の機能を有するタンパク質を発現する細胞、例えば免疫細胞また
はTSCの集団であって、前記ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結され
た、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、（2）1つまた
は複数の免疫モジュレーターの機能を有する前記タンパク質をコードするポリヌクレオチ
ド、および（3）IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、を含み
；ここで（2）および（3）の少なくとも1つのポリヌクレオチドが前記リガンド依存性転
写因子によって活性化されるプロモーターに連結されている、集団を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、本発明の細胞、例えば免疫細胞またはTSCの2つまたはそ
れ以上の集団を含む組成物であって、組成物中のそれぞれの細胞の集団が、組成物中の他
の細胞集団において発現される1つまたは複数の免疫モジュレーターとは異なる1つまたは
複数の免疫モジュレーターを発現する、組成物を提供する。1つの態様において、組成物
は2つの細胞集団を含む。別の態様において、組成物は2つを上回る細胞集団を含む。別の
態様において、組成物は3つの細胞集団を含む。別の態様において、組成物は4つの細胞集
団を含む。
【００１６】
別の態様において、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベ
クターを含む、インビトロで遺伝子操作された細胞、例えば免疫細胞またはTSCであって
、前記ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性
転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および（2）前記リガンド依存性転
写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、免疫モジュレーターの機能を有
するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、を含む細胞を提供する。別の態様におい
て、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、イ
ンビトロで遺伝子操作された細胞、例えば免疫細胞またはTSCであって、前記ポリヌクレ
オチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコード
する少なくとも1つの転写因子配列、（2）免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質
をコードするポリヌクレオチド、および（3）IL-12の機能を有するタンパク質をコードす
るポリヌクレオチド、を含み；ここで（2）および（3）の少なくとも1つのポリヌクレオ
チドが前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結されている
、細胞を提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、本発明のインビトロで遺伝子操作された細胞、例えば免
疫細胞またはTSCの2つまたはそれ以上の集団を含む組成物であって、組成物中のインビト
ロで遺伝子操作された細胞の集団のそれぞれが遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオ
チドを含むベクターを含み、前記ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連
結された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および
（2）前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、免
疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、を含み、組
成物中のインビトロで遺伝子操作された細胞のそれぞれの集団が、組成物中のインビトロ
で遺伝子操作された細胞の他の集団において発現される1つまたは複数の免疫モジュレー
ターとは異なる1つまたは複数の免疫モジュレーターを発現する、組成物を提供する。1つ
の態様において、本発明は、インビトロで遺伝子操作された細胞、例えば免疫細胞または
TSCの2つまたはそれ以上の集団を含む組成物であって、前記細胞集団のそれぞれが遺伝子
スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、前記ポリヌクレオチドが
、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少な
くとも1つの転写因子配列、（2）免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコード
するポリヌクレオチド、および（3）IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌ
クレオチド、を含み；ここで（2）および（3）の少なくとも1つのポリヌクレオチドが前
記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結されている、組成物
を提供する。1つの態様において、組成物はインビトロで遺伝子操作された細胞の2つの集
団を含む。別の態様において、組成物はインビトロで遺伝子操作された細胞の2つを上回
る集団を含む。別の態様において、組成物はインビトロで遺伝子操作された細胞の3つの
集団を含む。別の態様において、組成物はインビトロで遺伝子操作された細胞の4つの集
団を含む。
【００１８】
本発明はまた、本明細書に記載したような、細胞、例えば免疫細胞またはTSCの集団を
含む薬学的組成物も提供する。
【００１９】
1つの態様において、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を
コードするポリヌクレオチドは遺伝子スイッチのプロモーターの制御下にあり、IL-12の
機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは構成的プロモーターの制御下に
ある。別の態様において、1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは
複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびIL-12の機能を有するタンパク質
をコードするポリヌクレオチドは両方とも、遺伝子スイッチの1つのマルチシストロン性
プロモーターの制御下にある。別の態様において、1つまたは複数の免疫モジュレーター
の機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは遺伝子スイ
ッチのプロモーターの制御下にあり、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドは、遺伝子スイッチプロモーターとは異なる条件的プロモーターの制御下に
ある。さらなる態様において、1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有する1つま
たは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する遺伝子調節システム、およ
びIL-12の機能を有するポリヌクレオチドに関する遺伝子調節システムはオルソゴナル（o
rthogonal）である。さらなる態様において、各タンパク質をコードする各ポリヌクレオ
チドに関する遺伝子調節システムはオルソゴナルである。
【００２０】
1つの態様において、本発明はまた、黒色腫腫瘍、神経膠腫腫瘍、腎癌および前立腺癌
、さらには表1に列記された癌など、ただしこれらには限定されない癌の治療も提供する
。IL-12遺伝子治療は、動物モデル試験において組換えcDNAベクターとして適用した場合
に抗腫瘍効果を示している（Faure et al., 1998；Sangro et al., 2005）が、遺伝子を
改変したDCの状況で適用した場合にはさらに効果的であった（Satoh et al., 2002；Svan
e et al., 1999；Tatsumi et al., 2003；Yamanaka et al., 2002）。しかし、現在まで
に、プラスミドまたはウイルスベクターを採り入れたIL-12遺伝子治療のヒト第I相試験は
、癌の環境では持続性のある客観的な臨床的奏効を達成することができていない（Heinze
rling et al., 2005；Kang et al., 2001；Sangro et al., 2004；Triozzi et al., 2005
）。本明細書に記載された遺伝子治療は、有望な治療手段を提供する。
【００２１】
1つの態様において、本発明は、哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって
、以下の段階：
（a）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現す
るようにインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの集団を、腫瘍の微小環境に
腫瘍内投与する段階；および
（b）前記哺乳動物に対して、活性化リガンドの治療的有効量を投与する段階；を含み
、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質の発現を誘導して該腫瘍を
治療する方法を提供する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、
以下の段階：
（a）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現す
るようにインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの2つまたはそれ以上の集団を
、腫瘍の微小環境に腫瘍内投与する段階であって、免疫細胞またはTSCの各集団が1つまた
は複数の免疫モジュレーターの異なるセットを発現する段階；および
（b）前記哺乳動物に対して、1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を投与す
る段階；を含み、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有する複数のタンパク質の発現を誘導して前
記腫瘍を治療する方法を提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、以下
の段階：：
（a）腫瘍の微小環境に対して、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタ
ンパク質およびIL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するようにインビトロで
遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの集団を腫瘍内投与する段階であって、免疫モジュ
レーターの機能を有するタンパク質またはIL-12のうち少なくとも1つが、リガンドによっ
て活性化される条件的プロモーターの制御下にあるような段階；ならびに
（b）前記哺乳動物に対して、活性化リガンドの治療的有効量を投与する段階；を含み
、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質および／またはIL-12の機
能を有するタンパク質の発現を誘導して、前記腫瘍を治療する方法を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、
以下の段階：
（a）腫瘍の微小環境に対して、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタ
ンパク質およびIL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するようにインビトロで
遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの2つまたはそれ以上の集団を腫瘍内投与する段階で
あって、免疫細胞またはTSCのそれぞれの集団が免疫モジュレーターの機能を有する1つま
たは複数のタンパク質の異なるセットを発現し、免疫モジュレーターの機能を有するタン
パク質またはIL-12のうち少なくとも1つが、リガンドによって活性化される条件的プロモ
ーターの制御下にあるような段階；ならびに
（b）前記哺乳動物に対して、1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を投与す
る段階；を含み、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質および／またはIL-12の機
能を有するタンパク質の発現を誘導して、前記腫瘍を治療する方法を提供する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を治療するための方法
であって、以下の段階：
（a）前記哺乳動物に対して、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタン
パク質を条件的に発現するように改変された改変細胞の集団を投与する段階；および
（b）前記哺乳動物に対して、活性化リガンドの治療的有効量を投与する段階；を含み
、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質の発現を誘導して、前記疾
患または障害を治療する方法を提供する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を治療するための方法
であって、以下の段階：
（a）前記哺乳動物に対して、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタン
パク質を条件的に発現するように改変された改変細胞の2つまたはそれ以上の集団を投与
する段階であって、改変細胞のそれぞれの集団が1つまたは複数の免疫モジュレーターの
異なるセットを発現する、段階；および
（b）前記哺乳動物に対して、1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を投与す
る段階；を含み、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質の発現を誘導して、前記疾
患または障害を治療する方法を提供する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を治療するための方法
であって、以下の段階：
（a）前記哺乳動物に対して、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタン
パク質およびIL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するように改変された改変
細胞の集団を投与する段階であって、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質また
はIL-12のうち少なくとも1つが、リガンドによって活性化される条件的プロモーターの制
御下にある段階；ならびに
（b）前記哺乳動物に対して、活性化リガンドの治療的有効量を投与する段階；を含み
、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質および／またはIL-12の機
能を有するタンパク質の発現を誘導して、前記疾患または障害を治療する方法を提供する
。
【００２８】
別の態様において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を治療するための方法
であって、以下の段階：
（a）前記哺乳動物に対して、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタン
パク質およびIL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するように改変された改変
細胞の2つまたはそれ以上の集団を投与する段階であって、改変細胞のそれぞれの集団が
免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質の異なるセットを発現し
、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質またはIL-12のうち少なくとも1つが、リ
ガンドによって活性化される条件的プロモーターの制御下にあるような段階；ならびに
（b）前記哺乳動物に対して、1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を投与す
る段階；を含み、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質および／またはIL-12の機
能を有するタンパク質の発現を誘導して、前記疾患または障害を治療する方法を提供する
。
【００２９】
本発明はまた、遺伝子操作された細胞に基づく、例えば免疫細胞またはTSCに基づく治
療法の有効性を判定するための方法であって、患者におけるIFN-γ発現または活性のレベ
ルを治療法の開始前に測定し、それにより対照レベルを求めて、その後に、免疫モジュレ
ーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質および任意でIL-12の機能を有するタン
パク質を発現するように遺伝子操作された細胞の投与を行い、活性化リガンドの有効量を
投与し、続いて発現のIFN-γのレベルを測定して試験レベルを求めた上で、対照レベルを
試験レベルと比較してその治療レジメンが有効であるか否かを判定することによる方法も
提供する。
【００３０】
1つの態様において、本発明は、患者における、インビトロで遺伝子操作された細胞に
基づく、例えば免疫細胞またはTSCに基づく治療レジメンの有効性を判定するための方法
であって、
（a）それを必要とする前記患者から、インビトロで遺伝子操作された細胞の投与の前
に入手した第1の生体試料におけるインターフェロン-γ（IFN-γ）の発現のレベルまたは
活性のレベルまたはその両方を測定し、それによって対照レベルを求める段階；
（b）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質および任意でIL-1
2の機能を有するタンパク質を条件的に発現するように遺伝子操作された、インビトロで
遺伝子操作された細胞を、それを必要とする患者に対して投与する段階；ならびに
（c）活性化リガンドの有効量を、それを必要とする前記患者に対して投与する段階；
（d）それを必要とする前記患者から、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞および
活性化リガンドの投与後に入手した第2の生体試料におけるIFN-γの発現のレベルまたは
活性のレベルまたはその両方を測定し、それによって試験レベルを求める段階；ならびに
（e）IFN-γの対照レベルを試験レベルと比較し、IFN-γの発現、活性またはその両方
の試験レベルが対照レベルに比して高いことにより、その治療レジメンがそれを必要とす
る前記患者において有効であることが指し示される段階、を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】hIL-12をコードするバイシストロン性転写物のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。
【図２】hIL-21およびhIL-15をコードするバイシストロン性転写物のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。
【図３】mIL-12をコードするバイシストロン性転写物のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。
【図４】mIL-21およびmIL-15をコードするバイシストロン性転写物のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。
【図５】hIL-21のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。
【図６】mIL-21のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。
【図７】hIL-12およびhIL-21をコードするトリシストロン性転写物のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。
【図８】mIL-12およびmIL-21をコードするトリシストロン性転写物のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。
【図９】E1領域およびE3領域が欠失し、かつE1領域がRheoSwitch（登録商標）Therapeutic System（RTS）-IL-12成分に置き換えられているベクターrAd.RheoIL12の構造を示している。「IL12」と表示した枠は、IRESによって隔てられたIL-12p40コード配列およびIL-12p35コード配列を提示している。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
配列の詳細な説明
免疫モジュレーター
サイトカイン
感染に対する炎症性反応のために重要なサイトカインであるインターロイキン1（IL-1
）のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号M28983（ヒト
IL-1α）；M15330（ヒトIL-1β）；AF201830（ヒトIL-1δ）；AF201831（ヒトIL-1ε）；
AF201832（ヒト1L-1ζ）；AF201833（ヒトIL-1η）；NM_010554（マウスIL-1α）；NM_00
8361（マウスIL-1β）；NM_019451（マウスL-1δ）；NM_019450（マウスIL-1f6）；NM_02
7163（マウスIL-1f8）；NM_153511（マウスIL-1f9）；NM_204524（ニワトリIL-1β）；NM
_017019（ラットIL-1α）；およびNM_031512（ラットIL-1β）として入手可能であり、こ
れらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００３３】
インターロイキン1（IL-1）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッショ
ン番号AAA59134（ヒトIL-1α）；AAA59135（ヒトIL-1β）；AAF25210（ヒトIL-1δ）；AA
F25211（ヒトIL-1ε）；AAF25212（ヒト1L-1ζ）；AAF25213（ヒトIL-1η）；NP_034684
（マウスIL-1α）；NP_032387（マウスIL-1β）；NP_062324（マウスL-1δ）；NP_062323
（マウスIL-1f6）；NP_081439（マウスIL-1f8）；NP_705731（マウスIL-1f9）；NP_98985
5（ニワトリIL-1β）；NP_058715（ラットIL-1α）；およびNP_113700（ラットIL-1β）
として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。Laurent 
et al., Psychiatr. Genet. 7: 103 (1997)は、ヒトインターロイキン-1β遺伝子におけ
る多型性突然変異を同定している。
【００３４】
IL-4、IL-7、IL-9、IL-15およびIL-21を含むサイトカインのファミリーに属する、イン
ターロイキン2（IL-2）のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号U25676（ヒト）；NM_008366（マウス）；NM_204153（ニワトリ）；およびNM_053
836（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れら
れる。
【００３５】
インターロイキン2（IL-2）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッショ
ン番号AAA70092（ヒト）；NP_032392（マウス）；NP_989484（ニワトリ）；およびNP_446
288（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れら
れる。
【００３６】
Liu et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 133: 77 (2006)は突然変異性ヒトIL-2を作
製しており、Lorberboum et al., J. Biol. Chem. 265: 16311 (1990)はキメラIL-2の作
製を記載している。
【００３７】
ナイーブヘルパーT細胞のTh2細胞への分化を誘導するサイトカインであるインターロイ
キン4（IL-4）のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号M
23442（ヒト）；NM_021283（マウス）；NM_001007079（ニワトリ）；およびNM_201270（
ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００３８】
インターロイキン4（IL-4）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッショ
ン番号AAA59150（ヒト）；NP_067258（マウス）；NP_001007080（ニワトリ）；およびNP_
958427（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れ
られる。
【００３９】
Kawashima et al., J. Med. Genet. 35: 502 (1998)は、アトピー性皮膚炎と関連づけ
られているIL-4遺伝子における多型を記載している。
【００４０】
インターロイキン7（IL-7）は、B細胞およびT細胞の発生のために重要なサイトカイン
である。IL-7のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号J0
4156（ヒト）；NM_008371（マウス）；NM_001037833（ニワトリ）；およびNM_013110（ラ
ット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００４１】
インターロイキン7（IL-7）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッショ
ン番号AAA59156（ヒト）；NP_032397（マウス）；NP_001032922（ニワトリ）；およびNP_
037242（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れ
られる。
【００４２】
Feng et al., Genetics 175:545 (2007)は、機能的欠陥をもたらす、IL-7における点突
然変異を同定している。
【００４３】
インターロイキン9（IL-9）は、T細胞によって産生されるサイトカインであり、造血細
胞の調節因子である。IL-9のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッ
ション番号NM_000590（ヒト）；NM_008373（マウス）；NM_001037825（ニワトリ）；およ
びNM_001105747（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に
組み入れられる。
【００４４】
インターロイキン9（IL-9）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッショ
ン番号NP_000581（ヒト）；NP_032399（マウス）；NP_001032914（ニワトリ）；およびNP
_001099217（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み
入れられる。
【００４５】
IL-12は、活性化されたT細胞およびNK細胞に対する増殖因子として作用し、NK／リンホ
カインにより活性化されたキラー細胞の溶解活性を高め、かつ休止末梢血単核細胞（PBMC
）によるIFN-γの産生を刺激することのできるサイトカインである。IL-12のポリヌクレ
オチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_000882（ヒトIL12A）；NM
_002187（ヒトIL12B）；NM_008351（マウスIL12a）；NM_008352（マウスIL12b）；NM_213
588（ニワトリIL12A）；NM_213571（ニワトリIL12B）；NM_053390（ラットIL12a）；およ
びNM_022611（ラットIL12b）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書
に組み入れられる。
【００４６】
インターロイキン12（IL-12）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号NP_000873（ヒトIL12A）；NP_002178（ヒトIL12B）；NP_032377（マウスIL12a）
；NP_032378（マウスIL12b）；NP_998753（ニワトリIL12A）；NP_998736（ニワトリIL12B
）；NP_445842（ラットIL12a）；およびNP_072133（ラットIL12b）として入手可能であり
、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００４７】
インターロイキン15（IL-15）は、T細胞およびナチュラルキラー細胞の活性化および増
殖を調節するサイトカインである。IL-15のポリヌクレオチド配列は、公開データベース
から、アクセッション番号U14407（ヒト）；NM_008357（マウス）；EU334509（ニワトリ
）；およびAF015719（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細
書に組み入れられる。
【００４８】
インターロイキン15（IL-15）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号AAA21551（ヒト）；NP_032383（マウス）；ABY55312（ニワトリ）；およびAAB94
536（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れら
れる。
【００４９】
インターロイキン18（IL-18）、マクロファージによって産生され、インターロイキン1
2とともに、微生物産物の感染後に細胞媒介性免疫を誘導するサイトカイン。IL-18のポリ
ヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号U90434（ヒト）；NM_0
08360（マウス）；EU747333（ニワトリ）；およびAY258448（ラット）として入手可能で
あり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００５０】
インターロイキン18（IL-18）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号AAB50010（ヒト）；NP_032386（マウス）；ACE79188（ニワトリ）；およびAAP14
669（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れら
れる。
【００５１】
細胞増殖を誘導することによって、ナチュラルキラー細胞および細胞傷害性T細胞を含
む免疫系の細胞に対して強力な調節作用を及ぼすサイトカインであるインターロイキン21
（IL-21）のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号AF254
069（ヒト）；NM_021782（マウス）；NM_001024835（ニワトリ）；およびNM_001108943（
ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００５２】
インターロイキン21（IL-21）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号AAG29348（ヒト）；NP_068554（マウス）；NP_001020006（ニワトリ）；およびN
P_001102413（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組
み入れられる。
【００５３】
インターロイキン27（IL-27）は、Bリンパ球およびTリンパ球の活性の調節において重
要な役割を果たすサイトカインである。IL-27のポリヌクレオチド配列は、公開データベ
ースから、アクセッション番号AY099296（ヒト）；NM_145636（マウス）；およびXM_3449
62（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられ
る。
【００５４】
インターロイキン27（IL-27）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号AAM34498（ヒト）；NP_663611（マウス）；およびXP_344963（ラット）として入
手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００５５】
特異的な細胞表面受容体（IFNAR）と結合し、マクロファージおよびナチュラルキラー
（NK）細胞の両方を刺激して抗ウイルス応答を誘発させる一群のインターフェロンタンパ
ク質のメンバーであるインターフェロンβ1（IFNB1）のポリヌクレオチド配列は、公開デ
ータベースから、アクセッション番号NM_002176（ヒト）；NM_010510（マウス）；NM_001
024836（ニワトリ）；およびNM_019127（ラット）として入手可能であり、これらの配列
は参照により本明細書に組み入れられる。
【００５６】
インターフェロンβ1（IFNB1）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号NP_002167（ヒト）；NP_034640（マウス）；NP_001020007（ニワトリ）；および
NP_062000（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み
入れられる。
【００５７】
インターフェロンγ（IFN-γ）は、唯一のII型インターフェロンであり、かつ抗ウイル
ス活性、免疫調節および抗腫瘍活性を有する可溶性サイトカインである。IFN-γのポリヌ
クレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_000619（ヒト）；NM_
008337（マウス）；およびNM_138880（ラット）として入手可能であり、これらの配列は
参照により本明細書に組み入れられる。
【００５８】
インターフェロンγ（IFN-γ）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号NP_000610（ヒト）；NP_032363（マウス）；およびNP_620235（ラット）として
入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００５９】
主として単球／マクロファージによって分泌され、脂質代謝、凝固、インスリン抵抗性
および内皮機能に対して作用を及ぼす多機能性の炎症誘発性サイトカインである腫瘍壊死
因子（TNF-α）のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号
X02910（ヒト）；NM_013693（マウス）；およびBC107671（ラット）として入手可能であ
り、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６０】
TNF-αのアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号CAA26669（ヒト
）；NP_038721（マウス）；およびAAI07672（ラット）として入手可能であり、これらの
配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６１】
ケモカイン
ケモカイン（Cモチーフ）リガンド1（XCL1、リンホタクチンとしても知られる）は、CD
4+ T細胞およびCD8+ T細胞にとっては走化性であるが単球にとってはそうではなく、末梢
血リンパ球における細胞内カルシウムの上昇を誘導する。XCL1のポリヌクレオチド配列は
、公開データベースから、アクセッション番号NM_002995（ヒト）；NM_008510（マウス）
；およびNM_134361（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細
書に組み入れられる。
【００６２】
XCL1のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_002986（ヒト
）；NP_032536（マウス）；およびNP_599188（ラット）として入手可能であり、これらの
配列は参照により本明細書に組み入れられる。米国特許第6,022,534号は、リンホタクチ
ン、ならびに細胞傷害性T細胞および／もしくはNK細胞を誘引するため、ならびに／また
は増殖もしくは常在細胞を誘導するためのそれらの使用を開示している。抗リンホタクチ
ン抗体およびXCL1融合タンパク質の単離および使用のための方法も開示されている。
【００６３】
急性炎症性状態において多形核白血球の動員および活性化に関与するいわゆるモノカイ
ン（主として単球およびマクロファージによって産生されるサイトカインの一種）である
、マクロファージ炎症性タンパク質-1（MIP-1）としても知られるCCケモカインリガンド3
（CCL3）のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_002
983（ヒト）；NM_011337（マウス）；およびNM_013025（ラット）として入手可能であり
、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６４】
CCL3のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_002974（ヒト
）；NP_035467（マウス）；およびNP_037157（ラット）として入手可能であり、これらの
配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
炎症および喘息に関与する炎症誘発性サイトカインであるCCL5（RANTES）のポリヌクレ
オチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号AF043341（ヒト）；NM_01365
3（マウス）；およびNM_031116（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照に
より本明細書に組み入れられる。
【００６６】
CCL5のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号AAC03541（ヒト）
；NP_038681（マウス）；およびNP_112378（ラット）として入手可能であり、これらの配
列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６７】
炎症および癌浸潤の際にマクロファージ動員に関与するケモカインであるCCケモカイン
リガンド7（CCL7）のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション
番号NM_006273（ヒト）；NM_013654（マウス）；およびNM_001007612（ラット）として入
手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６８】
CCL7のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_006264（ヒト
）；NP_038682（マウス）；およびNP_001007613（ラット）として入手可能であり、これ
らの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６９】
ケモカイン（CXCモチーフ）リガンド9（CXCL9、MIGとしても知られる）は、γインター
フェロンによって誘導されうるT細胞化学誘引物質である。CXCL9のポリヌクレオチド配列
は、公開データベースから、アクセッション番号NM_002416（ヒト）；NM_0108599（マウ
ス）；およびNM_145672（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本
明細書に組み入れられる。
【００７０】
CXCL9のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_002407（ヒト
）；NP_032625（マウス）；およびNP_663705（ラット）として入手可能であり、これらの
配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００７１】
ケモカイン（C-X-Cモチーフ）リガンド10（CXCL10）は、免疫系における細胞に対する
化学誘引、T細胞の内皮細胞との接着、抗腫瘍活性および血管新生における役割を有する
低分子サイトカインである。CXCL10のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、
アクセッション番号X02530（ヒト）；NM_021274（マウス）；およびBC058444（ラット）
として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００７２】
ケモカイン（C-X-Cモチーフ）リガンド10（CXCL10）のアミノ酸配列は、公開データベ
ースから、アクセッション番号CAA26370（ヒト）；NP_067249（マウス）；およびAAH5844
4（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられ
る。
【００７３】
ストロマ細胞-由来因子1（SDF-1）としても知られるケモカイン（C-X-Cモチーフ）リガ
ンド12（CXCL12）は、インタークリンファミリーに属する低分子サイトカインであり、こ
のファミリーのメンバーは白血球を活性化し、多くの場合、LPS、TNFまたはIL1などの炎
症誘発性刺激によって誘導される。CXCL12のポリヌクレオチド配列は、公開データベース
から、アクセッション番号NM_000609（ヒト）；NM_001012477（マウス）；NM_204510（ニ
ワトリ）；およびNM_001033883（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照に
より本明細書に組み入れられる。
【００７４】
CXCL12のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_000600（ヒ
ト）；NP_001012495（マウス）；NP_989841（ニワトリ）；およびNP_001029055（ラット
）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００７５】
Hansson et al., Microbes and Infection 8:841 (2006)は、ケモカイン（C-Cモチーフ
）受容体7（CCR7）とケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド19（CCL19、MIP-3βとしても知
られる）との間の相互作用が、一次免疫応答の生成のために決定的に重要であると考察し
ている。CCR7のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM
_001838（ヒト）；およびNM_007719（マウス）として入手可能であり、これらの配列は参
照により本明細書に組み入れられる。
【００７６】
CCR7のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_001829（ヒト
）；およびNP_031745（マウス）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明
細書に組み入れられる。
【００７７】
CCL19のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_0062
74（ヒト）；およびNM_011888（マウス）として入手可能であり、これらの配列は参照に
より本明細書に組み入れられる。
【００７８】
CCL19のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_006265（ヒト
）；およびNP_036018（マウス）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明
細書に組み入れられる。
【００７９】
CCケモカインリガンド21（CCL21）は、CCR7の十分に確立されたリガンドであり、CD4+ 
T細胞が定常状態「セットポイント」に到達するためには必要であるがCD8+ T細胞につい
てはそうではなく、CCL21の発現の擾乱は自己免疫に対する感受性を変化させる可能性が
あり、そのポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号AB0024
09（ヒト）；NM_011335（マウスCCL21a）；NM_011124（マウスCCL21b）；およびNM_02305
2（マウスCCL21c）；として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み
入れられる。
【００８０】
CCL21のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号BAA21817（ヒト
）；NP_035465（マウスCCL21a）；NP_035254（マウスCCL21b）；およびNP_075539（マウ
スCCL21c）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる
。
【００８１】
インターロイキン-8（IL-8）は、好中球活性化ペプチド-1またはSCYB8とも呼ばれるケ
モカインであり、炎症性刺激に応答していくつかの種類の細胞によって分泌される組織由
来ペプチドである。米国特許第6,133,426号および第6,177,980号は、ヒト化抗IL-8抗体の
アミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列を開示している。ヒトIL-8のポリヌクレオチド
配列は、公開データベースからアクセッション番号NM_000584として入手可能であり、そ
の配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８２】
ヒトIL-8のアミノ酸配列は、公開データベースからアクセッション番号NP_000575とし
て入手可能であり、その配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８３】
増殖因子
顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）は、白血球増殖因子として機能し
、幹細胞を刺激して顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）ならびに単球を生成させる
サイトカインである。GM-CSFのポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセ
ッション番号M11734（ヒト）；NM_009969（マウス）；EU520303（ニワトリ）；NM_001037
660（ラットCsf2ra）；およびNM_133555（ラットCsf2rb）として入手可能であり、これら
の配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８４】
顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）のアミノ酸配列は、公開データベ
ースから、アクセッション番号AAA52122（ヒト）；NP_034099（マウス）；ACB11534（ニ
ワトリ）；NP_001032749（ラットCsf2ra）；およびNP_598239（Csf2rb）として入手可能
であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８５】
造血幹細胞または始原細胞またはその両方の表面で増殖因子受容体として機能する可能
性がある、FMS関連チロシンキナーゼリガンド（FLT3／FLK2リガンド、Flt3L）のポリヌク
レオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号U04806（ヒト）；およびNM
_013520（マウス）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入
れられる。
【００８６】
FLT3／FLK2リガンド（Flt3L）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号AAA17999（ヒト）；およびNP_038548（マウス）として入手可能であり、これら
の配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８７】
形質転換した表現型を培養細胞に可逆的に付与することのできる、ある種のヒト癌にお
いてアップレギュレートしているトランスフォーミング増殖因子α（TGF-α）のポリヌク
レオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_001099691（ヒト）；NM
_031199（マウス）；NM_001001614（ニワトリ）；およびNM_012671（ラット）として入手
可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８８】
TGF-αのアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_001093161（
ヒト）；NP_112476（マウス）；NP_001001614（ニワトリ）；およびNP_036803（ラット）
として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８９】
アジュバント
β-デフェンシンは、多くのグラム陰性菌およびグラム陽性菌、真菌ならびにウイルス
に対する先天性免疫応答との関連性が示されている抗菌性ペプチドである。β-デフェン
シンのポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号X92744（ヒ
トhBD-1）；AJ000152（ヒトhBD-2）；AF217245（ヒトβデフェンシン-3）；AJ314835（ヒ
トβデフェンシン-4）；AB089180（ヒトhBD-5）；AY122466（ヒトデフェンシンβ106、DE
FB106）；AF540979（ヒトβデフェンシン107、DEFB107）；AF529416（ヒトβデフェンシ
ン、DEFB108）；DQ012014（ヒトβデフェンシン110、DEFB110）；DQ012015（ヒトβデフ
ェンシン111、DEFB111）；DQ012016（ヒトβデフェンシン112、DEFB112）；DQ012017（ヒ
トβデフェンシン113、DEFB113）；DQ012018（ヒトβデフェンシン114、DEFB114）；DQ01
2019（ヒトβデフェンシン115、DEFB115）；DQ012020（ヒトβデフェンシン116、DEFB116
）；DQ012021（ヒトβデフェンシン117、DEFB117）；NM_007843（マウスデフェンシンβ1
）；NM_010030（マウスデフェンシンβ2、Defb2）；NM_013756（マウスデフェンシンβ3
、Defb3）；NM_019728（マウスデフェンシンβ4、Defb4）；NM_030734（マウスデフェン
シンβ5、Defb5）；NM_054074（マウスデフェンシンβ6、Defb6）；NM_139220（マウスデ
フェンシンβ7）；NM_153108（マウスデフェンシンβ8、Defb8）；NM_139219（マウスデ
フェンシンβ9、Defb9）；およびNM_139225（マウスデフェンシンβ10、Defb10）として
入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００９０】
β-デフェンシンのアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号CAA63
405（ヒトhBD-1）；CAB65126（ヒトhBD-2）；AAF73853（ヒトβデフェンシン-3）；CAC85
520（ヒトβデフェンシン-4）；BAC10630（ヒトhBD-5）；AAM93908（ヒトデフェンシンβ
106、DEFB106）；AAN33115（ヒトβデフェンシン107、DEFB107）；AAQ09525（ヒトβデフ
ェンシン、DEFB108）；AAY59750（ヒトβデフェンシン110、DEFB110）；AAY59751（ヒト
βデフェンシン111、DEFB111）；AAY59752（ヒトβデフェンシン112、DEFB112）；AAY597
53（ヒトβデフェンシン113、DEFB113）；AAY59754（ヒトβデフェンシン114、DEFB114）
；AAY59755（ヒトβデフェンシン115、DEFB115）；AAY59756（ヒトβデフェンシン116、D
EFB116）；AAY59757（ヒトβデフェンシン117、DEFB117）；NP_031869（マウスdefeninβ
1）；NP_034160（マウスデフェンシンβ2、Defb2）；NP_038784（マウスデフェンシンβ3
、Defb3）；NP_062702（マウスデフェンシンβ4、Defb4）；NP_109659（マウスデフェン
シンβ5、Defb5）；NP_473415（マウスデフェンシンβ6、Defb6）；NP_631966（マウスデ
フェンシンβ7、Defb7）；NP_694748（マウスデフェンシンβ8、Defb8）；NP_631965（マ
ウスデフェンシンβ9、Defb9）；およびNP_631971（マウスデフェンシンβ10、Defb10）
として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。そのほか
のヒトおよびラットのデフェンシンのペプチド配列については、米国特許第5,242,902号
も参照されたい。
【００９１】
高速移動群ボックス-1（HMGB1）タンパク質は、サイトカインとして機能して、壊死性
細胞死および癌、病原体による浸潤、外傷ならびに敗血症に対する局所的および全身的な
応答を媒介する非ヒストン染色体タンパク質である。HMGB1タンパク質のポリヌクレオチ
ド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_002128（ヒト）；NM_010439（
マウス）；NM_204902（ニワトリ）；およびNM_012963（ラット）として入手可能であり、
これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００９２】
高速移動群ボックス-1（HMGB1）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッ
ション番号NP_002119（ヒト）；NP_034569（マウス）；NP_990233（ニワトリ）；およびN
P_037095（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入
れられる。
【００９３】
食細胞性S100タンパク質は、炎症性反応を媒介し、炎症性細胞を組織損傷の部位に動員
するほか、先天性免疫に重要な損傷関連分子パターン（DAMP）分子のメンバーでもある。
Foell et al., J. Leukocyte Biol. 81:1 (2006)を参照のこと。S100タンパク質のポリヌ
クレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号BC014392（ヒトS100 A1
）；BC002829（ヒトS100 A2）；BC012893（ヒトS100 A3）；BC016300（ヒトS100 A4）；Z
18954（ヒトS100D）；BC001431（ヒトS100 A6）；BC 034687（ヒトS100 A7）；BC005928
（ヒトS100 A8）；BC047681（ヒトS100 A9）；BC015973（ヒトS100 A10）；D38583（ヒト
クラギザリン（clagizzarin））；NM_011309（マウスS100a1）；NM_009115（マウスS100b
）；NM_013650（マウスS100a8）；NM_009114（マウスS100a9）；NM_011310（マウスS100a
3）；NM_011311（マウスS100a4）；およびNM_011312（マウスS100a5）として入手可能で
あり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００９４】
S100タンパク質のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号AAH143
92（ヒトS100 A1）；AAH02829（ヒトS100 A2）；AAH12893（ヒトS100 A3）；AAH16300（
ヒトS100 A4）；CAA79479（ヒトS100D）；AAH01431（ヒトS100 A6）；AAH34687（ヒトS10
0 A7）；AAH05928（ヒトS100 A8）；AAH47681（ヒトS100 A9）；AAH15973（ヒトS100 A10
）；BAA07597（ヒトクラギザリン）；NP_035439（マウスS100a1）；NP_033141（マウスS1
00b）；NP_038678（マウスS100a8）；NP_033140（マウスS100a9）；NP_035440（マウスS1
00a3）；NP_035441（マウスS100a4）；およびNP_035442（マウスS100a5）として入手可能
であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００９５】
マンノース糖の重合体である植物性多糖の1つであるマンナンは、免疫応答の生成のた
めに有用である。米国特許第5,807,559号は、腫瘍に付随する糖質構造に対する、または
感染性因子および／もしくは感染した宿主細胞上に発現される糖質構造に対するT細胞免
疫を生じさせるために有用な可能性のある、マンナンの免疫原性コンジュゲートを開示し
ている。米国特許第5,773,425号は、症状を緩和するため、および／またはウイルス性疾
患を治癒させるため、ならびに免疫応答を強化するためのマンナンの使用を開示している
。
【００９６】
弱毒生マイコバクテリア種であるカルメット-ゲラン桿菌（BCG）は、重症および致死性
の結核を予防するためのワクチンとして用いられる。米国特許第7,393,541号は、哺乳動
物対象におけるマイコバクテリアに対するインビボでのT細胞媒介性免疫応答を生じさせ
るためのアジュバントワクチンの作製を開示している。Hubbard and Collins, Infect. I
mmun. 59(2): 570。米国特許第5,292,513号は、殺菌活性および抗ウイルス活性の強化を
要する患者における加熱死BCGによる、インビボでのマクロファージのプライミングのた
めの方法を開示している。BCGの全ゲノム配列は、公開データベースから、アクセッショ
ン番号NC_008769（ウシ型結核菌BCG株（M. bovis BCG str.）Pasteur 1173P2、全ゲノム
）として入手可能である。
【００９７】
細菌リポ多糖（LPS）は、グラム陰性菌が感染した際に強い免疫応答を誘導するエンド
トキシンである。米国特許第4,148,877号は、細菌培養物からのLPSの分画、および細菌感
染に対する抵抗性を誘導するための薬物としてのその画分の使用を開示している。米国特
許第5,292,513号は、殺菌活性および抗ウイルス活性の強化を要する患者におけるLPSによ
るインビボでのマクロファージのプライミングを開示している。
【００９８】
（正の）共刺激分子
OX40リガンド（OX40L）は、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーのメンバー4
（Tnfsf4）に属し、樹状細胞上で発現され、Th2細胞の分化を促進する。OX40リガンドの
ポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号X79929（ヒト）；
U12763（マウス）；およびAF037067（ラット）として入手可能であり、これらの配列は参
照により本明細書に組み入れられる。
【００９９】
OX40リガンド（OX40L）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番
号CAA56284（ヒト）；AAA21871（マウス）；およびAAC67236（ラット）として入手可能で
あり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１００】
4-1BBリガンド（4-1BBL）は、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーのメンバ
ー9（Tnfsf9）に属し、これは2型膜貫通糖タンパク質であり、活性化Tリンパ球上で発現
される。4-1BBLのポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号
NM_003811（ヒト）；NM_009404（マウス）；およびAY332409（ラット）として入手可能で
あり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０１】
4-1BBリガンド（4-1BBL）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション
番号NP_003802（ヒト）；NP_033430（マウス）；およびAAQ01228（ラット）として入手可
能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
CD40タンパク質は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー5に属し、T細胞
依存性免疫グロブリンクラススイッチ、記憶B細胞の発生および胚中心形成を含む、広範
囲にわたる種々の免疫応答および炎症性反応を媒介するのに必須である。CD40タンパク質
のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号X60592（ヒト）
；NM_170701（マウス）；NM_204665（ニワトリ）；およびNM_134360（ラット）として入
手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０３】
CD40タンパク質のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号CAA430
45（ヒト）；NP_733802（マウス）；NP_989996（ニワトリ）；およびNP_599187（ラット
）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０４】
グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連タンパク質（GITR）は、
T細胞刺激を介して有効な腫瘍免疫を誘起することができる。抗GITRモノクローナル抗体
（mAb）の投与は、強力な腫瘍特異的免疫を惹起することができ、定着した腫瘍を、顕性
の自己免疫疾患を誘発することなく根絶させた。Ko et al., J. Exp. Med. 7: 885 (2005
)。米国特許第6,503,184 B1号は、抗GITR抗体を開示している。
【０１０５】
GITRリガンド（GITRL）のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッ
ション番号AY358868（ヒト）；およびAY359852（マウス）として入手可能であり、これら
の配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０６】
GITRリガンド（GITRL）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番
号AAQ89227（ヒト）；およびAAQ55265（マウス）として入手可能であり、これらの配列は
参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０７】
ヘルペスウイルス侵入メディエーター（HVEM）結合リガンド（HSVgD）は、p30またはLI
GHTとも称され、T細胞の共刺激に関与するTNFファミリーのメンバーである。LIGHTは、ヘ
ルペスウイルス侵入メディエーター（HVEM）およびリンホトキシン-β受容体（LT-βR）
という2つの受容体を有する。HSVgDはHVEMのリガンドであり、T細胞に対するコスティミ
ュレーターとして作用することによってT細胞を活性化し、T細胞の増殖およびサイトカイ
ン分泌をもたらす。LIGHTのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列については米国特
許第7,118,742号を参照されたい。米国特許第5,654,174号は、カルボニル末端残基の欠失
を伴う変異性gDタンパク質を記載している。
【０１０８】
CD70は、CD27と結合するサイトカインである。これはT細胞活性化において役割を果た
し、共刺激されたT細胞の増殖を誘導し、細胞溶解性T細胞の生成を増強する。CD70のポリ
ヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_001252（ヒト）；N
M_011617（マウス）；およびNM_001106878（ラット）として入手可能であり、これらの配
列は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０９】
CD70のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_001243（ヒト
）；NP_035747（マウス）；およびNP_001100348（ラット）として入手可能であり、これ
らの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１０】
ICOS-Lは、T細胞特異的な細胞表面受容体ICOSのリガンドであり、T細胞増殖およびサイ
トカイン分泌のための共刺激シグナルとして作用する。ICOS-Lはまた、B細胞の増殖およ
び形質細胞への分化も誘導する。ICOS-Lは、炎症性状態に対する局所的組織応答を媒介す
る上でも、さらには記憶T細胞の機能を共刺激することによって二次免疫応答を媒介する
上でも役割を果たしうると考えられる。ICOS-Lのポリヌクレオチド配列は、公開データベ
ースから、アクセッション番号NM_015259（ヒト）；およびNM_015790（マウス）として入
手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１１】
ICOS-Lのアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_056074（ヒ
ト）；およびNP_056605（マウス）として入手可能であり、これらの配列は参照により本
明細書に組み入れられる。
【０１１２】
PD-L1（CD274としても知られる）タンパク質は、活性化された単球、T細胞およびB細胞
で発現される。PD-L1は、IFN-γで処理した単球において、さらには他のアクチベーター
とともにIFN-γで処理した樹状細胞およびケラチノサイトにおいてアップレギュレートさ
れる。PD-L1タンパク質のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号NM_014143（ヒト）；およびNM_021893（マウス）として入手可能であり、これら
の配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１３】
PD-L1タンパク質のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_05
4862（ヒト）；およびNP_068693（マウス）として入手可能であり、これらの配列は参照
により本明細書に組み入れられる。
【０１１４】
（負の）共刺激分子
cytotoxic T lymphocyte-associated 4（CTLA4）は、免疫グロブリンスーパーファミリ
ーのメンバーであり、活性化T細胞において発現される共刺激分子である。米国特許第7,0
34,121号および第6,984,720号は、CTLA4に対する抗体の調製および使用の方法を開示して
いる。米国特許第6,984,720号はまた、抗CTLA4抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列も開
示している。
【０１１５】
PD-1分子は、PD-1リガンド（PD-L1）と結合する、免疫グロブリン遺伝子スーパーファ
ミリーのメンバーである。T細胞上のPD-1受容体にPD-L1が結合すると、共刺激シグナルが
細胞に伝達され、そのために細胞が細胞周期を進行させることが妨げられて、T細胞増殖
が増加する。PD-L1とT細胞上の受容体との相互作用の抗PD-L1抗体による阻害は、免疫応
答のダウンレギュレーションをもたらし、これは免疫細胞エネルギーと命名されている。
米国特許第7,029,674号は、抗PD-L1抗体の調製方法および配列を開示している。
【０１１６】
PD-L2は、主としてPD-1（またはヒトホモログPDCD1）のリガンドとして知られている。
しかし、PD-12は、PDCD1非依存的な様式でのTリンパ球増殖およびIFN-γ産生のために必
須な共刺激シグナルに関与することが報告されている。PDCD1との相互作用は、細胞周期
進行およびサイトカイン産生を阻止することにより、T細胞増殖を阻害する。Yamazaki et
al., J. of Immunol. 169: 5538 (2002)およびAnsari et al., J. Exp. Med. 198: 63 (
2003)は、抗PD-L2モノクローナル抗体の調製を記載している。
【０１１７】
対抗性免疫抑制物質（Counter Immune Suppressant）（寛容阻害因子（Tolerance Inhibi
tor））
トランスフォーミング増殖因子-β（TGF-β）は、I型およびII型という2種類の膜貫通
性セリン／トレオニンキナーゼ受容体のうち1つと相互作用することによって細胞増殖お
よび分化を調節する多機能性タンパク質である。Chen et al., Science 28: 1335 (1993)
を参照されたい。TGF受容体II型 (TGFR2)はI型受容体をリン酸化して活性化し、後者は自
己リン酸化して、続いてSMAD転写レギュレーターと結合してそれを活性化する。Lynch MA
et al., Cancer Res. 58: 4227 (1998)は、ヒト卵巣癌と関連のあるトランスフォーミン
グ増殖因子β受容体II型遺伝子（TGFBR2）における突然変異を記載している。Brand et a
l., J. Biol. Chem. 268:11500-11503 (1993)は、セリン／トレオニンキナーゼ細胞質ド
メインと予想されるものの欠失（TGFβR2 cDNA H2-3FFのヌクレオチド1172〜2036、公開
データベースからアクセッション番号M85079として入手可能、アミノ酸配列はアクセッシ
ョン番号AAA61164として入手可能）が、3種のTGF-β（1、2および3）に依存的な遺伝子発
現をすべて損なわせることを記載している。TGF-βはほとんどのヒト腫瘍において発現さ
れ、腫瘍抗原特異的な細胞性免疫を阻害する。Foster et al., J. Immunother. 31:500 (
2008)は、細胞傷害性Tリンパ球におけるドミナントネガティブTGFβR2の発現が、TGF-β
の阻害作用に対する抵抗性につながることを記載している。
【０１１８】
TGFβは、形質転換の誘導においてTGFαと相乗的に作用する。これはまた、負のオート
クリン増殖因子としても作用する。TGFβ活性化およびシグナル伝達の調節不全は、アポ
トーシスをもたらす可能性がある。Ziyadeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 8015 
(2000)は、抗TGFβ抗体の投与が、顕性腎症を発症するII型糖尿病のモデルであるdb／db
マウスにおける腎機能不全および糸球体硬化を予防しうることを記載している。TGFβモ
ノクローナル抗体の作製および使用の方法は、米国特許第6,419,928号に記載されている
。Barcellos-Hoff et al., Am J. Pathol. 147:5 (1995)も、TGFβ抗体の作製のための方
法を記載している。TGFβ融合タンパク質構築物のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列
は、米国特許第6,756,215号に記載されている。
【０１１９】
IL-10は、活性化されたTh2細胞、B細胞、ケラチノサイト、単球およびマクロファージ
によって産生されるサイトカインである。IL-10は、活性化マクロファージによって、お
よびヘルパーT細胞によって産生される、IFN-γ、IL-2、IL-3、TNFおよびGM-CSFを含むい
くつかのサイトカインの合成を阻害する。IL-10は、活性化されたヒトB細胞の成長および
分化を促進し、Th1応答を阻害して移植拒絶反応およびT細胞媒介性自己免疫疾患を予防す
る上で有用である。O'Farrell et al., EMBO J. 17:1006 (1998)；Kanbayashi et al., C
ell Immunol. 171:153 (1996)；Fukushima et al., Br. J. Ophthalmol. 90:1535 (2006)
；およびvan Lent et al., Ann. Rheum. Dis. 66:334 (2007)は、抗IL10抗体の調製を記
載している。米国特許第7,326,567号は、IL-10抗体のポリヌクレオチド配列を開示してい
る。米国特許第5,837,232号は、抗IL-10抗体を用いてB細胞媒介性自己免疫障害を治療す
るための方法を開示している。
【０１２０】
サイトカインシグナル伝達抑制因子（SOCS）ファミリータンパク質は、サイトカインシ
グナル伝達を調節する古典的なネガティブフィードバック系の一部を構成する。Alexande
r et al. Cell 98: 597 (1999)は、サイトカインシグナル伝達抑制因子1（SOCS1）がイン
ターフェロン-γシグナル伝達の決定的な阻害因子であり、そのサイトカインの新生児に
対する致死的な可能性のある作用を防止することを記載している。Hilton et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:114 (1999)は、SOCS1が、JAK／STAT3経路を通じてシグナルを
伝達するサイトカインの負の調節に関与していると考察している。Ohya et al. J. Biol.
Chem. 272: 27178 (1997)は、SOCSタンパク質がインターロイキン6（IL-6）および白血
病阻害因子（LIF）によるシグナル伝達の主要な調節因子であると思われると記載してい
る。米国特許第6,534,277号は、抗体が細胞またはその子孫によって発現されるようにSOC
S1抗体をコードする核酸配列を細胞に導入し、続いて治療効果のために組換え細胞をイン
ビボで投与する、抗SOCS1抗体の調製および使用のための方法を開示している。米国特許
第6,323,317号および第7,049,418号も、抗SOCS1抗体を開示している。
【０１２１】
TGF-αは、EGF受容体と結合し、TGF-βと相乗的に作用して、軟寒天中での足場非依存
的な細胞増殖を促進することのできる分裂促進性ポリペプチドである。Ellis et al., N.
Engl. J. Med. 317:158 (1987)は、TGF-αが黒色腫のある種の傍腫瘍性症状発現におい
て役割を果たすことを記載している。米国特許第4,742,003号およびXian et al., The J.
of Histochem. & Cytochem. 47:949 (1999)は、抗TGF-α抗体の調製の方法を記載してい
る。
【０１２２】
腫瘍壊死因子受容体（TNFR1）およびFasはいずれも、プログラム細胞死（アポトーシス
）および受容体オリゴマー化のためのFasおよびTNF誘導性シグナル伝達のために必須であ
る、細胞質Fas結合デスドメインタンパク質（FADD）を含む。Fas受容体の細胞質領域また
はドメインと結合する能力を有し、FAS媒介性アポトーシスを阻害する、FADDと命名され
た哺乳動物タンパク質が同定されている。FADDのポリヌクレオチド配列は、公開データベ
ースからアクセッション番号U24231として、アミノ酸配列はアクセッション番号AAA86517
として入手可能であり、これらは参照により本明細書に組み入れられる。機能的に完全な
ネイティブ性FADDのドミナントネガティブ阻害因子であるFADD断片またはそれをコードす
る核酸は、米国特許第6,562,797 B1号に記載されている。
【０１２３】
配列表の説明
SEQ ID NO：1は、mIL-12およびm-IL21をコードする構築物のポリヌクレオチド配列であ
る。
【０１２４】
SEQ ID NO：2は、hIL-12およびhIL-21をコードする構築物のポリヌクレオチド配列であ
る。
【０１２５】
SEQ ID NO：3は、mIL-21およびmIL-15をコードする構築物のポリヌクレオチド配列であ
る。
【０１２６】
SEQ ID NO：4は、mIL-12をコードする構築物のポリヌクレオチド配列である。
【０１２７】
SEQ ID NO：5は、hIL-21およびhIL-15をコードする構築物のポリヌクレオチド配列であ
る。
【０１２８】
SEQ ID NO：6は、hIL-21をコードする構築物のポリヌクレオチド配列である。
【０１２９】
SEQ ID NO：7は、mIL-21をコードする構築物のポリヌクレオチド配列である。
【０１３０】
SEQ ID NO：8は、hIL-21をコードする構築物のポリヌクレオチド配列である。
【０１３１】
SEQ ID NO：9は、mIL-21をコードするポリヌクレオチド配列である。
【０１３２】
SEQ ID NO：10は、mIL-21のアミノ酸配列である。
【０１３３】
SEQ ID NO：11は、mIL-15をコードするポリヌクレオチド配列である。
【０１３４】
SEQ ID NO：12は、mIL-15のアミノ酸配列である。
【０１３５】
SEQ ID NO：13は、mIL-12のmp40をコードするポリヌクレオチド配列である。
【０１３６】
SEQ ID NO：14は、mIL-12のmp40のアミノ酸配列である。
【０１３７】
SEQ ID NO：15は、mIL-12のmp35をコードするポリヌクレオチド配列である。
【０１３８】
SEQ ID NO：16は、mIL-12のmp35のアミノ酸配列である。
【０１３９】
SEQ ID NO：17は、hIL-21をコードするポリヌクレオチド配列である。
【０１４０】
SEQ ID NO：18は、hIL-21のアミノ酸配列である。
【０１４１】
SEQ ID NO：19は、hIL-15をコードするポリヌクレオチド配列である。
【０１４２】
SEQ ID NO：20は、hIL-15のアミノ酸配列である。
【０１４３】
SEQ ID NO：21は、hIL-12のp40をコードするポリヌクレオチド配列である。
【０１４４】
SEQ ID NO：22は、hIL-12のp40のアミノ酸配列である。
【０１４５】
SEQ ID NO：23は、hIL-12のp35をコードするポリヌクレオチド配列である。
【０１４６】
SEQ ID NO：24は、hIL-12のp35のアミノ酸配列である。
【０１４７】
SEQ ID NO：25は、ショウジョウバエ（Drosophila）で認められるエクジソン応答エレ
メントの核酸配列である。
【０１４８】
SEQ ID NO：26は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）で認められる
エクジソン応答エレメントの核酸配列である。
【０１４９】
SEQ ID NO：27は、キイロショウジョウバエで認められるエクジソン応答エレメントの
核酸配列である。
【０１５０】
SEQ ID NO：28は、ホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）酵素（I-SceI）の制限部位で
ある。
【０１５１】
SEQ ID NO：29は、ヒトIL-12コード配列を含むアデノウイルスベクター：Ad-RTS-hIL-1
2（SP1-RheoIL-12）のDNA配列である。
【０１５２】
発明の詳細な説明
定義
別に定義する場合を除き、本明細書において用いられるすべての技術用語、表記および
他の科学用語または専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解
されている意味を有するものとする。場合によっては、明確さおよび／または参照の便宜
を図るために、意味が一般的に理解されている用語を本明細書において定義しているが、
このような定義を本明細書に含めたことは、当技術分野において一般に理解されているも
のとの実質的な違いを意味するとは必ずしもみなされるべきではない。分子生物学の用語
および／または方法および／またはプロトコールの一般的に理解されている定義は、Rieg
er et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-
Verlag: New York, 1991；Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994
；Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)およびAus
ubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1994)に見いだすことができる
。適宜、市販のキットおよび／または試薬の使用を伴う手順は、別に記載のある場合を除
き、一般に、製造元の手引きおよび／またはプロトコールおよび／またはパラメーターに
従って実施する。
【０１５３】
本発明において「単離された」という用語は、その元の環境（それが天然に存在する環
境）から取り出された生物材料（細胞、核酸またはタンパク質）のことを指す。例えば、
植物または動物において天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、そ
れが天然に存在する隣接核酸から分離された同じポリヌクレオチドは「単離された」とみ
なされる。
【０１５４】
生物材料に対して適用される「精製された」という用語は、その材料が、他の化合物の
存在を排除して、絶対的純粋さを呈する形で存在することを要求するものではない。そう
ではなくて、この用語は相対的な定義である。
【０１５５】
「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「ポリヌ
クレオチド」は互換的に用いられ、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかにある
、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「RNA分子」
）もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオ
キシチミジン、またはデオキシシチジン；「DNA分子」）のリン酸エステル重合形態、ま
たはその任意のホスホエステル類似体、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルな
どのことを指す。DNA-DNA、DNA-RNAおよびRNA-RNAの二本鎖ヘリックスが可能である。核
酸分子、特にDNA分子またはRNA分子という用語は、分子の一次構造および二次構造のみの
ことを指し、それを何らかの特定の三次形態に限定することはない。したがって、この用
語は、いくつか例を挙げると、直鎖状または環状DNA分子（例えば、制限断片）、プラス
ミド、超らせんDNAおよび染色体において認められる二本鎖DNAを含む。特定の二本鎖DNA
分子の構造について考察する際に、本明細書では配列を、DNAの非転写鎖（すなわち、mRN
Aと相同の配列を有する鎖）に沿って5'から3'への向きの配列のみを表示するという通常
の慣習に従って記載することがある。「組換えDNA分子」とは、分子生物学的操作を受け
たDNA分子のことである。DNAには、cDNA、ゲノムDNA、プラスミドDNA、合成DNAおよび半
合成DNAが非限定的に含まれる。
【０１５６】
ポリヌクレオチド配列に対して適用される「断片」という用語は、参照核酸に比して長
さが短く、その共通の部分にわたって、参照核酸と同一なヌクレオチド配列を含むヌクレ
オチド配列のことを指す。本発明によるそのような核酸断片は、必要に応じて、それを構
成要素とする、より大きいポリヌクレオチドの中に含まれていてもよい。そのような断片
は、本発明による核酸の少なくとも6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25
、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、1
05、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000個
またはそれ以上の連続したヌクレオチドの範囲にわたる長さのオリゴヌクレオチドを含む
か、またはそれらからなる。
【０１５７】
本明細書で用いる場合、「単離された核酸断片」とは、合成性、非天然性または改変さ
れたヌクレオチド塩基を任意で含む、一本鎖または二本鎖であるRNAまたはDNAの重合体の
ことを指す。DNAの重合体の形態にある単離された核酸断片は、cDNA、ゲノムDNAまたは合
成DNAの1つまたは複数のセグメントで構成されてもよい。
【０１５８】
「遺伝子」とは、転写のみによって（例えば、生物活性のあるRNA種）、または転写お
よび翻訳によって（例えば、ポリペプチド）産生される機能性分子を含む、機能性分子を
コードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのことを指す。「遺伝子」という用語は
、cDNAおよびゲノムDNA核酸を範囲に含む。「遺伝子」はまた、コード配列の前の調節配
列（5'非コード配列）および後の調節配列（3'非コード配列）を含む、特定のRNA、タン
パク質またはポリペプチドを発現する核酸断片のことも指す。「ネイティブ性遺伝子」と
は、それ自身の調節配列を有する、天然に見いだされる遺伝子のことを指す。「キメラ遺
伝子」とは、天然では一緒には見られない調節配列および／またはコード配列を含む、ネ
イティブ性遺伝子ではない任意の遺伝子のことを指す。したがって、キメラ遺伝子は、異
なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが天然に見いださ
れるものとは異なる様式で並んでいる調節配列およびコード配列を含みうる。キメラ遺伝
子は、異なる源に由来するコード配列および／または異なる源に由来する調節配列を含み
うる。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノム中でその天然の位置にあるネイティブ性遺伝
子のことを指す。「外来性」遺伝子または「異種」遺伝子とは、宿主生物中に通常は見ら
れず、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子のことを指す。外来性遺伝子には
、非ネイティブ性生物に挿入されたネイティブ性遺伝子、またはキメラ遺伝子が含まれう
る。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子のことであ
る。例えば、インターロイキン-12（IL-12）遺伝子はIL-12タンパク質をコードする。IL-
12は、ジスルフィド結合によって連結されて完全に機能性のIL-12p70を生じる、35kDサブ
ユニット（p35）および40kDサブユニット（p40）のヘテロ二量体である。IL-12遺伝子はp
35サブユニットおよびp40サブユニットの両方をコードする。
【０１５９】
「異種DNA」とは、細胞内に、または細胞の染色体部位内に天然には位置しないDNAのこ
とを指す。異種DNAは細胞にとって外来性である遺伝子を含みうる。
【０１６０】
「ゲノム」という用語は、染色体、ならびにミトコンドリア、葉緑体およびウイルスの
DNAまたはRNAを含む。
【０１６１】
核酸分子は、その核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液イオン強度に関して適切な
条件下で、cDNA、ゲノムDNAまたはRNAなどの別の核酸分子とアニーリングしうる場合に、
そのもう一方の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよ
び洗浄の条件は周知であり、Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1
989)、特にその中の第11章および表11.1に例示されている。温度およびイオン強度の条件
が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定づける。
【０１６２】
ストリンジェンシー条件は、遠い関係にある生物由来の相同配列のように中程度の類似
性のある断片から、近い関係にある生物由来のそっくり同じ機能性酵素を産生する遺伝子
のように極めて類似性の高い断片に至るまでをスクリーニングしうるように調節すること
が可能である。相同核酸の予備的スクリーニングのためには、Tm 55°に対応する低スト
リンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば、5×SSC、0.1％ SDS、0.25％乳、
およびホルムアミドなし；または30％ホルムアミド、5×SSC、0.5％ SDSを用いることが
できる。中等度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いTm、例え
ば、40％ホルムアミド、5×または6×SSCに対応する。高ストリンジェンシーハイブリダ
イゼーション条件は、最も高いTm、例えば、50％ホルムアミド、5×または6×SSCに対応
する。
【０１６３】
ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補配列を含むことを必要とするが、ハイブ
リダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間のミスマッチが可能である。「
相補的」という用語は、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述す
るために用いられる。例えば、DNAに関して、アデノシンはチミンに対して相補的であり
、シトシンはグアニンに対して相補的である。したがって、本発明はまた、本明細書にお
いて開示または使用される完全な配列に対して、さらにはそれらの実質的に類似した核酸
配列に対して相補的な単離された核酸断片も含む。
【０１６４】
本発明の1つの態様においては、ポリヌクレオチドを、Tm 55℃でのハイブリダイゼーシ
ョン段階を含み、上述の条件を用いるハイブリダイゼーション条件を用いることによって
検出する。他の態様において、Tmは60℃、63℃または65℃である。
【０１６５】
ハイブリダイゼーション後の洗浄もストリンジェンシー条件を決定づける。条件の1つ
のセットでは、6×SSC、0.5％ SDS中、室温、15分間で開始し、続いて2×SSC、0.5％ SDS
中、45℃、30分間で繰り返し、続いて0.2×SSC、0.5％ SDS中、50℃、30分間を2回繰り返
す、一連の洗浄を用いる。ストリンジェントな条件の1つの好ましいセットでは、より高
い温度を用い、0.2×SSC、0.5％ SDS中での最後の2回の30分間の洗浄の温度を60℃に高め
る以外は、洗浄は上記のものと同じとする。より高度にストリンジェントな条件の別の好
ましいセットでは、0.1×SSC、0.1％ SDS中、65℃で最後の2回の洗浄を用いる。
【０１６６】
核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当技術分野において
周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の度合いに依存する。2つのヌクレオチド配
列間の類似性および相同性の度合いが大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリ
ッドのためのTmの値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高い
Tmに対応）は、RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNAの順に低くなる。長さが100ヌクレオチド
を上回るハイブリッドについては、Tmを計算するための式が導き出されている（Sambrook
et al., 前記、9.50-0.51を参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイ
ブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長
さがその特異性を決定づける（Sambrook et al., 前記、11.7-11.8を参照）。
【０１６７】
本発明の1つの態様においては、ポリヌクレオチドを、500mM未満の塩中および少なくと
も37℃でのハイブリダイゼーション段階、ならびに2×SSPE中、少なくとも63℃の温度で
の洗浄段階を含むハイブリダイゼーション条件を用いることによって検出する。別の態様
において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション段階に関して200mM
未満の塩および少なくとも37℃を含む。さらなる態様において、ハイブリダイゼーション
条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方の段階に関して2×SSPEおよび63℃を
含む。
【０１６８】
別の態様において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約10ヌクレオチドで
ある。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最短の長さは少なくとも約15ヌクレオチ
ド；例えば、少なくとも約20ヌクレオチド；例えば、少なくとも30ヌクレオチドである。
さらに、当業者であれば、温度および洗浄液の塩濃度を、プローブの長さなどの要因に応
じて適宜調節しうることを理解するであろう。
【０１６９】
「プローブ」という用語は、相補的な一本鎖標的核酸と塩基対合して二本鎖分子を形成
することのできる一本鎖核酸分子のことを指す。
【０１７０】
本明細書で用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ゲノムDNA分子、cDNA
分子、プラスミドDNAまたはmRNA分子とハイブリダイズ可能な短鎖核酸のことを指す。オ
リゴヌクレオチドは、例えば、32P-ヌクレオチド、またはビオチンなどの標識を共有結合
ささせたヌクレオチドで標識することができる。標識オリゴヌクレオチドは、核酸の存在
を検出するためのプローブとして用いることができる。オリゴヌクレオチド（その一方ま
たは両方が標識されていてもよい）は、核酸の全長もしくは断片をクローニングするため
、DNAシークエンシングのため、または核酸の存在を検出するためのPCRプライマーとして
用いることができる。また、オリゴヌクレオチドを、DNA分子と三重らせんを形成させる
ために用いることもできる。一般に、オリゴヌクレオチドは合成により、好ましくは核酸
合成装置にて調製する。このため、オリゴヌクレオチドを、チオエステル結合などの天然
に存在しないホスホエステル類似体結合によって調製することができる。
【０１７１】
「プライマー」とは、標的核酸配列とハイブリダイズして、適した条件下でDNA合成の
ための開始点としての役を果たしうる二本鎖核酸領域を作り出すオリゴヌクレオチドのこ
とを指す。そのようなプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応において、またはDNAシーク
エンシングのために用いることができる。
【０１７２】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、PCRと略記され、特定の核酸配列を酵素的に増幅するた
めのインビトロ法のことを指す。PCRは一連の温度サイクルの繰り返しを伴い、各サイク
ルは次の3つの段階を含む：標的分子の鎖を分離させるためのテンプレート核酸の変性、
一本鎖PCRオリゴヌクレオチドプライマーとテンプレート核酸とのアニーリング、および
アニールしたプライマーのDNAポリメラーゼによる伸長。PCRは、標的分子の存在を検出す
るための手段、および定量的または半定量的な条件下で、核酸の出発プール内のその標的
分子の相対量を決定するための手段を提供する。
【０１７３】
「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」は、RT-PCRと略記され、1つまたは複数のRNA分子から
1つまたは複数の標的cDNA分子を酵素的に生成し、続いて上記の1つまたは複数の標的cDNA
分子内の1つまたは複数の特定の核酸配列を酵素的に増幅するためのインビトロ法のこと
を指す。RT-PCRはまた、標的分子の存在を検出するための手段、および定量的または半定
量的な条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対量を決定するための手段も提
供する。
【０１７４】
DNA「コード配列」とは、ポリペプチドをコードし、適した調節配列の制御下に置かれ
るとインビトロまたはインビボで細胞内でポリペプチドに転写および翻訳されうる二本鎖
DNA配列のことを指す。「適した調節配列」とは、コード配列の上流（5'非コード配列）
、内部、または下流（3'非コード配列）に位置し、随伴するコード配列の転写、RNAプロ
セシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列のことを指す。調
節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、
RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム-ループ構造が含まれうる。コ
ード配列の境界は、5'（アミノ）末端にある開始コドンおよび3'（カルボキシ）末端にあ
る翻訳停止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物配列、mRNA由来のcDNA
、ゲノムDNA配列、さらには合成DNA配列が非限定的に含まれうる。コード配列が真核生物
細胞における発現を意図したものである場合には、ポリアデニル化シグナルおよび転写終
結配列は通常、コード配列に対して3'側に位置することになる。
【０１７５】
「オープンリーディングフレーム」は、ORFと略記され、ATGまたはAUGなどの翻訳翻訳
開始シグナルまたは開始コドン、および終止コドンを含み、かつポリペプチド配列に翻訳
される可能性のある、DNA、cDNAまたはRNAのいずれかである、ある長さの核酸配列のこと
を指す。
【０１７６】
「頭-頭（head-to-head）」という用語は、本明細書において、2つのポリヌクレオチド
配列の互いに対する向きを記述するために用いられる。2つのポリヌクレオチドは、一方
のポリヌクレオチドのコード鎖の5'末端がもう一方のポリヌクレオチドのコード鎖の5'末
端に隣接していれば頭-頭の向きに位置しており、それにより、各ポリヌクレオチドの転
写の方向は他方のポリヌクレオチドの5'末端から離れる方に進行する。「頭-頭」という
用語は、(5')-(5')と略記してもよく、また、記号(←→)または(3'←5'5'→3')によって
表示してもよい。
【０１７７】
「尾-尾」という用語は、本明細書において、2つのポリヌクレオチド配列の互いに対す
る向きを記述するために用いられる。2つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチ
ドのコード鎖の3'末端がもう一方のポリヌクレオチドのコード鎖の3'末端に隣接していれ
ば尾-尾の向きに位置しており、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向は他方の
ポリヌクレオチドに向かうように進行する。「尾-尾」という用語は、(3')-(3')と略記し
てもよく、また、記号(→←)または(5'→3'3'←5')によって表示してもよい。
【０１７８】
「頭-尾」という用語は、本明細書において、2つのポリヌクレオチド配列の互いに対す
る向きを記述するために用いられる。2つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチ
ドのコード鎖の5'末端がもう一方のポリヌクレオチドのコード鎖の3'末端に隣接していれ
ば頭-尾の向きに位置しており、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向は他方の
ポリヌクレオチドと同じ方向に進行する。「頭-尾」という用語は、(5')-(3')と略記して
もよく、また、記号(→→)または(5'→3'5'→3')によって表示してもよい。
【０１７９】
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して3'側に位置するヌクレオチド配
列のことを指す。特に、下流ヌクレオチド配列は一般に、転写開始点の後に続く配列に関
係している。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。
【０１８０】
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して5'側に位置するヌクレオチド配
列のことを指す。特に、上流ヌクレオチド配列は一般に、コード配列または転写開始点の
5'側に位置する配列に関係している。例えば、ほとんどのプロモーターは転写の開始部位
の上流に位置する。
【０１８１】
「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は互換的に用いられ、二本
鎖DNA内の特定のヌクレオチド配列の内部に結合してそれを切断する酵素のことを指す。
【０１８２】
「相同組換え」とは、別のDNA分子への外来DNA配列の挿入、例えば、染色体へのベクタ
ーの挿入のことを指す。好ましくは、ベクターは、特異的な染色体部位を相同組換えのた
めの標的とする。特異的な相同組換えのために、ベクターは、ベクターの染色体との相補
的結合およびその中への組み入れが可能になるように、染色体の配列に対する十分に長い
相同性領域を含むと考えられる。相同性領域がより長く、配列類似性の度合いがより大き
いほど、相同組換えの効率を高めることができる。
【０１８３】
当技術分野において公知のいくつかの方法を用いて、本発明によるポリヌクレオチドを
増やすことができる。ひとたび適した宿主系および増殖条件が確立されれば、組換え発現
ベクターを増やして、大量に調製することができる。本明細書において記載される通り、
用いうる発現ベクターには、少数であるが例を挙げると、以下のベクターまたはその誘導
体が非限定的に含まれる：ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスなどのヒトまたは動
物のウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファー
ジベクター（例えば、λ）、ならびにプラスミドおよびコスミドDNAベクター。
【０１８４】
「ベクター」とは、宿主細胞への核酸のクローニングおよび／または導入のための任意
の媒体のことを指す。ベクターは、別のDNAセグメントを結びつけて、結びつけたセグメ
ントの複製を生じさせることのできるレプリコンであってもよい。「レプリコン」とは、
インビボでDNA複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製す
ることのできる、任意の遺伝因子（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、
ウイルス）のことを指す。「ベクター」という用語は、インビトロ、エクスビボまたはイ
ンビボで核酸を細胞に導入するためのウイルス性および非ウイルス性媒体の両方を含む。
当技術分野において公知の数多くのベクターを、核酸を操作して、応答エレメントおよび
プロモーターを遺伝子に組み入れるなどのために用いることができる。考えられるベクタ
ーには、例えば、λ誘導体などのバクテリオファージ、またはpBR322もしくはpUCプラス
ミド誘導体などのプラスミド、またはBluescriptベクターなどを含む、プラスミドまたは
改変ウイルスが含まれる。本発明において有用なベクターの別の例は、WO 2007／038276
号に記載された、UltraVector（商標） Production System（Intrexon Corp., Blacksbur
g, VA）である。例えば、応答エレメントおよびプロモーターに対応するDNA断片の、適し
たベクター中への挿入は、適切なDNA断片を、相補的付着末端を有する選択したベクター
中にライゲートすることによって達成することができる。または、DNA分子の末端を酵素
的に修飾してもよく、またはヌクレオチド配列（リンカー）をDNA末端にライゲートする
ことによって任意の部位を作製してもよい。そのようなベクターは、マーカーが細胞ゲノ
ム中に組み入れられた細胞の選択をもたらす選択マーカー遺伝子を含むように遺伝子操作
することができる。そのようなマーカーは、マーカーを組み入れ、それによってコードさ
れるタンパク質を発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。
【０１８５】
ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞、さらには生きている動物対
象において多岐にわたる遺伝子送達用途に用いられている。用いうるウイルスベクターに
は、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター
、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベク
ター、エプスタイン-バーウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ジェミニウイル
スベクターおよびカリモウイルスベクターが非限定的に含まれる。非ウイルス性ベクター
には、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、DNA-タンパク質複合体
および生体高分子が含まれる。核酸に加えて、ベクターが、1つもしくは複数の調節領域
、ならびに／または核酸移入の結果（どの組織への導入か、発現の持続時間など）を選択
、測定およびモニターする上で有用な選択マーカーを含んでもよい。
【０１８６】
「プラスミド」という用語は、細胞の中心的代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖DN
A分子の形態にある、多くの場合は遺伝子を保有している染色体外因子のことを指す。そ
のような因子は、いくつかのヌクレオチド配列が、選択した遺伝子産物のためのプロモー
ター断片およびDNA配列を適切な3'非翻訳配列とともに細胞に導入することのできる独特
な構築物として連結されるか組み換えられている、任意の源に由来する、一本鎖または二
本鎖のDNAまたはRNAの、直鎖状、環状または超らせん状の、自律複製配列、ゲノム組込み
配列、ファージ配列またはヌクレオチド配列であってよい。
【０１８７】
「クローニングベクター」とは、プラスミド、ファージまたはコスミドのように、別の
核酸セグメントを結びつけて、結びつけたセグメントの複製を生じさせることのできる、
連続して複製するある単位長の核酸、好ましくはDNAであって、かつ複製起点を含む、「
レプリコン」のことを指す。クローニングベクターは、1つの細胞種において複製が可能
であって、別のものにおいて発現が可能であってもよい（「シャトルベクター」）。クロ
ーニングベクターは、ベクターを含む細胞の選択のために用いうる1つもしくは複数の配
列、および／または関心対象の配列を挿入するための1つもしくは複数のマルチクローニ
ングサイトを含んでもよい。
【０１８８】
「発現ベクター」という用語は、宿主への形質転換導入の後に、挿入された核酸配列の
発現を可能とするように設計されたベクター、プラスミドまたは媒体のことを指す。クロ
ーニングされた遺伝子、すなわち挿入された核酸配列は、通常、プロモーター、最小プロ
モーター、エンハンサーなどの制御エレメントの制御下に置かれる。所望の宿主細胞にお
いて核酸の発現を駆動することのできる事実上あらゆるプロモーターを発現ベクター中に
用いることができ、これにはウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモータ
ー、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモ
ーター、病原性または疾患関連プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモー
ター、光調節性プロモーター；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPD
H、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、アルカリ性ホスファターゼプロモーター（サッ
カロミセス属（Saccharomyces）における発現のために有用）；AOX1プロモーター（ピキ
ア属（Pichia）における発現のために有用）；β-ラクタマーゼ、lac、ara、tet、trp、l
PL、lPR、T7、tacおよびtrcプロモーター（大腸菌（Escherichia coli）における発現の
ために有用）；光調節性、種子特異的、花粉特異的、子房特異的、カリフラワーモザイク
ウイルス35S、最小CMV 35S、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（CsVMV）、クロロフィルa
／b結合タンパク質、リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ、苗条特異的、根特異的
、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロ桿状ウイルス、植物スーパープロモーター
、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸レダクターゼ、マンノピンシンターゼ、
ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパク質およびアントシアニンプロモーター
（植物細胞における発現のために有用）；SV40初期（SV40e）プロモーター領域、ラウス
肉腫ウイルス（RSV）の3'末端反復配列（LTR）に含まれるプロモーター、アデノウイルス
（Ad）のE1Aのプロモーターまたは主要後期プロモーター（MLP）遺伝子、サイトメガロウ
イルス（CMV）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ（TK）
プロモーター、バキュロウイルスIE1プロモーター、伸長因子1α（EF1）プロモーター、
ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター、ユビキチン（Ubc）プロモーター、ア
ルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン-Lプロモーターの調節配列および転写制
御領域、ユビキタスプロモーター（HPRT、ビメンチン、α-アクチン、チューブリンなど
）、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAPなど）のプロ
モーター、（MDR、CFTRまたは第VIII因子型などの）治療用遺伝子のプロモーター、病原
性または疾患関連プロモーター、ならびに、組織特異性を呈し、かつトランスジェニック
動物で利用されているプロモーター、例えば、膵臓腺房細胞において活性のあるエラスタ
ーゼI遺伝子制御領域；膵臓β細胞において活性のあるインスリン遺伝子制御領域、リン
パ細胞において活性のある免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ系および
肥満細胞において活性のあるマウス乳癌ウイルス制御領域；肝臓において活性のあるアル
ブミン遺伝子、Apo AIおよびApo AII制御領域、肝臓において活性のあるα-フェトタンパ
ク質遺伝子制御領域、肝臓において活性のあるα1-アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨
髄系細胞において活性のあるβ-グロビン遺伝子制御領域、脳内の乏突起神経膠細胞にお
いて活性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋において活性のあるミ
オシン軽鎖-2遺伝子制御領域、および視床下部において活性のあるゴナドトロピン放出ホ
ルモン遺伝子制御領域、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸
結合腸タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞α-アクチンのプロモーターなどを非限定
的に含む、当技術分野において公知の動物および哺乳動物プロモーターが非限定的に含ま
れる。加えて、これらの発現配列を、エンハンサーまたは調節配列などの付加によって修
飾してもよい。
【０１８９】
ベクターは、当技術分野において公知の方法、例えば、トランスフェクション、エレク
トロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン
法、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、ま
たはDNAベクター輸送体などによって、所望の宿主細胞に導入することができる（例えば
、Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963 (1992)；Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621 
(1988)；およびHartmut et al., カナダ特許出願第2,012,311号を参照）。
【０１９０】
また、本発明によるポリヌクレオチドを、リポフェクションによってインビボで導入す
ることもできる。過去10年の間に、インビトロでの核酸のカプセル封入およびトランスフ
ェクションのためのリポソームの使用が増えている。リポソーム媒介トランスフェクショ
ンに伴う困難および危険を抑えるように設計された合成カチオン脂質を用いて、マーカー
をコードする遺伝子のインビボでのトランスフェクションのためのリポソームを調製する
ことができる（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413 (1987)；Mackey
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027 (1988)；およびUlmer et al., Science 
259:1745 (1993)）。カチオン脂質の使用は、負に荷電した核酸のカプセル封入を助長し
、また、負に荷電した細胞膜との融合も助長しうる（Felgner et al., Science 337:387 
(1989)）。核酸の移入のために特に有用な脂質化合物および組成物は、WO95／18863号、W
O96／17823号、および米国特許第5,459,127号に記載されている。インビボで外因性遺伝
子を特定の臓器に導入するためのリポフェクションの使用には、いくつかの実用的な利点
がある。特定の細胞へのリポソームの分子ターゲティングは、恩恵のある1つの領域であ
る。トランスフェクションを特定の細胞種に向かわせることが、膵臓、肝臓、腎臓および
脳のような細胞不均質性のある組織において特に好ましいと考えられることは明らかであ
る。脂質をターゲティングの目的で他の分子に化学的にカップリングさせてもよい（Mack
ey et al. 1988, 前記）。標的指向性ペプチド、例えばホルモンもしくは神経伝達物質な
ど、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド性分子を、リポソームに化学的にカ
ップリングさせることが可能と考えられる。
【０１９１】
カチオン性オリゴペプチド（例えば、WO 95／21931号）、DNA結合タンパク質由来のペ
プチド（例えば、WO 96／25508号）、またはカチオン性重合体（例えば、WO 95／21931号
）などの他の分子も、インビボでの核酸のトランスフェクションを助長するために有用で
ある。
【０１９２】
ベクターを裸のDNAプラスミドとしてインビボで導入することも可能である（米国特許
第5,693,622号、第5,589,466号および第5,580,859号を参照）。受容体を介したDNA送達ア
プローチを用いることもできる（Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147 (1992)；およ
びWu et al., J. Biol. Chem. 262:4429 (1987)）。
【０１９３】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外因性または異種性のRNAまたはD
NAの取り込みのことを指す。外因性または異種性のRNAまたはDNAが細胞の内側に導入され
た場合、細胞はそのようなRNAまたはDNAによって「トランスフェクト」されている。トラ
ンスフェクトされたRNAまたはDNAが表現型の変化をもたらす場合、細胞は外因性または異
種性のRNAまたはDNAによって「形質転換」されている。形質転換用のRNAまたはDNAは染色
体DNAに組み込まれて（共有結合されて）、細胞のゲノムを構成することができる。
【０１９４】
「形質転換」とは、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、宿主生物のゲノム中への核酸断片
の移入のことを指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック
」または「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
【０１９５】
加えて、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、その増幅または発現
が求められる細胞宿主における複製のための1つまたは複数の起点、マーカーまたは選択
マーカーを含んでもよい。
【０１９６】
「選択マーカー」という用語は、マーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質に対する耐
性、除草剤に対する耐性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択するこ
とのできる識別用因子、通常は抗生物質耐性遺伝子または化学物質耐性遺伝子のことを指
し、この効果を利用して、関心対象の核酸の遺伝を追跡し、かつ／または関心対象の核酸
を遺伝によって受け継いだ細胞もしくは生物を同定する。当技術分野において公知であり
、用いられる選択マーカー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタ
マイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミドなど
に対する耐性を与える遺伝子；および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち
、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが含まれる
。
【０１９７】
「レポーター遺伝子」という用語は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定すること
ができる識別用因子をコードする核酸のことを指し、この効果を利用して、関心対象の核
酸の遺伝を追跡し、関心対象の核酸を遺伝によって受け継いだ細胞もしくは生物を同定し
、かつ／または遺伝子発現の誘導もしくは転写を測定する。当技術分野において公知であ
り、用いられるレポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ（Luc）、緑色蛍光タンパク
質（GFP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β-ガラクトシ
ダーゼ（LacZ）、β-グルクロニダーゼ（Gus）などが含まれる。選択マーカー遺伝子をレ
ポーター遺伝子とみなすこともできる。
【０１９８】
「プロモーター」および「プロモーター配列」は互換的に用いられ、コード配列または
機能性RNAの発現を制御することのできるDNA配列のことを指す。一般に、コード配列はプ
ロモーター配列の3'側に位置する。プロモーターは、その全体がネイティブ性遺伝子に由
来してもよく、または天然に見いだされる異なるプロモーターに由来する異なるエレメン
トで構成されてもよく、またはさらには合成DNAセグメントを含んでもよい。当業者であ
れば、異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞種において、または発生の異なる
段階において、または異なる環境条件もしくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を導
くことを理解するであろう。遺伝子をほとんどの細胞種においてほとんどの時点で発現さ
せるプロモーターは、一般的には「構成的プロモーター」と呼ばれる。遺伝子を特定の細
胞種において発現させるプロモーターは、一般的には「細胞特異的プロモーター」または
「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。遺伝子を発生または細胞分化の特定の段階で発
現させるプロモーターは、一般的には「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異
的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する作用物質、生体分子、化学物質、
リガンド、光などによる細胞の曝露または処理の後に誘導され、遺伝子を発現させるプロ
モーターは、一般的には「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」と呼ばれ
る。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に明確には規定されないため
、異なる長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有しうることも認識されている。
【０１９９】
本発明のベクターの任意のものにおいて、ベクターは任意で、本明細書に開示されたプ
ロモーターを含む。1つの態様において、プロモーターは、本明細書において表1に列記さ
れたプロモーターである。
【０２００】
本発明のベクターの任意のものにおいて、ベクターは任意で、組織特異的プロモーター
を含む。1つの態様において、組織特異的プロモーターは、本明細書に開示された組織特
異的プロモーターである。別の態様において、組織特異的プロモーターは、本明細書にお
いて表2に列記された組織特異的プロモーターである。
【０２０１】
プロモーター配列は、典型的には、その3'末端では転写開始部位を境界とし、上流（5'
方向）に、バックグラウンドを超える検出可能なレベルでの転写を開始させるのに必要な
最少数の塩基またはエレメントを含むように伸びる。プロモーター配列の内部には、転写
開始部位（例えば、ヌクレアーゼS1を用いたマッピングによって規定することが好都合で
ある）のほか、RNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配
列）も存在する。
【０２０２】
「治療用スイッチプロモーター」（「TSP」）とは、遺伝子スイッチ構成要素の発現を
制御するプロモーターのことを指す。遺伝子スイッチおよびそれらのさまざまな成分は、
本明細書における他の箇所に詳細に記載されている。ある態様において、TSPは構成的で
あり、すなわち、継続的に活性がある。構成的TSPは、構成的-遍在性（すなわち、いかな
る組織または細胞においても、別の因子もレギュレーターも必要とせずに、全般的に機能
する）、または構成的-組織もしくは細胞特異的（すなわち、特定の組織型または細胞種
において、別の因子もレギュレーターも必要とせずに、全般的に機能する）のいずれであ
ってもよい。ある態様において、本発明のTSPは、疾患、障害または病状に付随する条件
下で活性化される。2つまたはそれ以上のTSPがかかわる本発明のある態様において、プロ
モーターは構成的プロモーターおよび活性化しうるプロモーターの組み合わせであってよ
い。本明細書で用いる場合、「疾患、障害または病状に付随する条件下で活性化されるプ
ロモーター」には、疾患特異的プロモーター、特定の生理的、発生的、分化的または病的
条件に応答するプロモーター、特異的な生体分子に応答するプロモーター、および疾患、
障害または病状に付随する特定の組織型または細胞種、例えば、腫瘍組織または悪性細胞
に特異的なプロモーターが非限定的に含まれる。TSPは、天然に存在するプロモーターの
配列、天然に存在するプロモーターに由来する改変配列、または合成配列（例えば、プロ
モーターの応答性を変更するための、最小プロモーター配列中への応答エレメントの挿入
）を含みうる。
【０２０３】
コード配列は、RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、続いてそれがトランス-
RNAスプライシングされ（コード配列がイントロンを含む場合）、コード配列によってコ
ードされるタンパク質に翻訳される場合、細胞内で転写制御配列および翻訳制御配列の「
制御下」にある。
【０２０４】
「転写制御配列および翻訳制御配列」とは、宿主細胞におけるコード配列の発現をもた
らす、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのDNA調節配列のことを指す。
真核細胞において、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
【０２０５】
「応答エレメント」という用語は、転写因子のDNA結合ドメインとの相互作用を通じて
媒介される、プロモーターに対する応答性を付与する1つまたは複数のシス作用性DNAエレ
メントのことを指す。このDNAエレメントは、その配列がパリンドローム性（完全または
不完全）であるか、またはさまざまな数のヌクレオチドによって隔てられた配列モチーフ
もしくはハーフサイト（half site）で構成されるかのいずれかであってよい。ハーフサ
イトは類似または同一であってよく、直列反復配列もしくは逆方向反復配列のいずれかと
して、または単一のハーフサイトもしくは縦列に隣接するハーフサイトの多量体として配
列されうる。応答エレメントは、この応答エレメントが組み入れられる細胞または生物の
性質に応じて、異なる生物から単離された最小プロモーターを含んでもよい。転写因子の
DNA結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下で、応答エレメントのDNA配列と結
合して、この応答エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始させるかまたは抑制す
る。天然エクジソン受容体の応答エレメントのDNA配列の例には、
2019000118.tif 000002
（Cherbas et. al., Genes Dev. 5:120 (1991)を参照）；
2019000118.tif 000003
、式中、N(n)は1つまたは複数のスペーサーヌクレオチドでありうる（SEQ ID NO：26）（
D'Avino et al., Mol. Cell. Endocrinol. 113:1 (1995)を参照）；および
2019000118.tif 000004
（Antoniewski et al., Mol. Cell Biol. 14:4465 (1994)を参照）が含まれる。
【０２０６】
「機能的に連結された」という用語は、一方の機能がもう一方によって影響されるよう
な、1つの核酸断片上の核酸配列の連係のことを指す。例えば、プロモーターは、コード
配列の発現に影響を及ぼしうる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にあ
る）場合、プロモーターはそのコード配列と機能的に連結している。コード配列は、セン
スまたはアンチセンスの向きに、調節配列と機能的に連結させることができる。
【０２０７】
「発現」という用語は、本明細書で用いる場合、核酸またはポリヌクレオチドに由来す
るセンスRNA（mRNA）またはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄積のことを指す。発現
が、mRNAのタンパク質またはポリペプチドへの翻訳のことを指すこともある。
【０２０８】
「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」という用語は、特定の
制限部位に、または相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することの
できるDNAのセグメントのことを指す。DNAのセグメントは、関心対象のポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のための
正しいリーディングフレームでのカセットの挿入を確実とするように設計される。「形質
転換カセット」とは、関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ポ
リヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を助長するエレメントを有する特定
のベクターのことを指す。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび
形質転換カセットは、宿主細胞における関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドの発現強化を可能とするエレメントも含みうる。これらのエレメントには、プロモ
ーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリ
アデニル化配列が非限定的に含まれうる。
【０２０９】
本発明において、「遺伝子スイッチ」という用語は、プロモーターと連係している応答
エレメントと、応答エレメントおよびプロモーターが組み入れられた遺伝子の発現を1つ
または複数のリガンドの存在下でモジュレートするリガンド依存性転写因子に基づく系と
の組み合わせのことを指す。「遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド」という用
語は、プロモーターと連係している応答エレメントと、応答エレメントおよびプロモータ
ーが組み入れられた遺伝子の発現を1つまたは複数のリガンドの存在下でモジュレートす
るリガンド依存性転写因子に基づく系をコードするポリヌクレオチドとの組み合わせのこ
とを指す。
【０２１０】
本発明の治療用スイッチプロモーターは、特定の疾患、障害または病状を治療するため
、改善するため、または予防するために有用な任意のプロモーターであってよい。その例
には、特定の疾患、障害または病状の際にのみ発現増大を呈する遺伝子のプロモーター、
および特定の細胞条件（例えば、増殖、アポトーシス、pHの変化、酸化状態、酸素レベル
）下で発現増大を呈する遺伝子のプロモーターが非限定的に含まれる。遺伝子スイッチが
複数の転写因子配列を含むいくつかの態様においては、疾患特異的または病状特異的プロ
モーターと、治療用産物が発現される組織を限定する組織型特異的または細胞種特異的プ
ロモーターとを組み合わせることにより、治療方法の特異性を高めることができる。した
がって、組織特異的または細胞種特異的プロモーターは、治療用スイッチプロモーターの
定義の範囲に含まれる。
【０２１１】
疾患特異的プロモーターの例として、癌を治療するために有用なプロモーターには、癌
遺伝子のプロモーターが含まれる。癌遺伝子のクラスの例には、増殖因子、増殖因子受容
体、プロテインキナーゼ、プログラム細胞死レギュレーターおよび転写因子が非限定的に
含まれる。癌遺伝子の具体的な例には、sis、erb B、erb B-2、ras、abl、mycおよびbcl-
2およびTERTが非限定的に含まれる。他の癌関連遺伝子の例には、新生物細胞において過
剰発現される腫瘍関連抗原遺伝子および他の遺伝子（例えば、MAGE-1、癌胎児性抗原、チ
ロシナーゼ、前立腺特異的抗原、前立腺特異的膜抗原、p53、MUC-1、MUC-2、MUC-4、HER-
2／neu、T／Tn、MART-1、gp100、GM2、Tn、sTnおよびトンプソン・フリーデンライヒ（Th
ompson-Friedenreich）抗原（TF））が含まれる。
【０２１２】
当技術分野において公知であり、本発明における治療用スイッチプロモーターとして有
用なプロモーター配列および他の調節エレメント（例えば、エンハンサー）の例は、表1
および2に列記された参考文献中に、各プロモーターと関連のある疾患／障害（表1）また
は組織特異性（表2）とともに開示されている。これらの参考文献中に開示されているプ
ロモーター配列は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０２１３】
（表１）
2019000118.tif 000005
2019000118.tif 000006
2019000118.tif 000007
【０２１４】
（表２）
2019000118.tif 000008
2019000118.tif 000009
【０２１５】
特定の疾患または障害の際に発現レベルの変化を呈し、それ故に本発明において有用な
プロモーターをもたらす可能性のある他の遺伝子には、表3に（関連のある疾患／障害と
ともに）列記された遺伝子が非限定的に含まれる。
【０２１６】
（表３）
2019000118.tif 000010
2019000118.tif 000011
2019000118.tif 000012
2019000118.tif 000013
2019000118.tif 000014
2019000118.tif 000015
2019000118.tif 000016
2019000118.tif 000017
2019000118.tif 000018
2019000118.tif 000019
【０２１７】
疾患、障害または病状の際に発現パターンがモジュレートされる遺伝子がひとたび同定
されれば、その遺伝子のプロモーターは本発明の遺伝子スイッチに用いうる可能性がある
。プロモーター領域を含む、多くの遺伝子の配列が当技術分野において公知であり、公開
データベース、例えば、GenBankで入手可能である。このため、ひとたび適切な遺伝子が
同定されれば、そのプロモーター配列を容易に同定して入手することができる。本発明の
別の局面は、そのプロモーターを単離して遺伝子スイッチ中に配置することのできる、適
した遺伝子を同定することを対象とする。したがって、プロモーターを単離して、その後
の状況または環境において用いることができる限り、遺伝子の実体は、本発明の具体的な
態様において特に重要ではないと考えられる。本発明はこのため、まだ同定されていない
遺伝子に由来するプロモーターの使用も含む。ひとたび適した遺伝子が同定されれば、プ
ロモーター機能のために必要な遺伝子配列を決定することは、当技術分野の定型的な技能
または実験に属する事柄である。実際に、関心対象の遺伝子のプロモーター領域の決定の
助けになる、いくつかの商業的プロトコールが存在する。例を挙げると、Dingらは最近、
ヒトSprouty4遺伝子の5'隣接配列を漸進的に欠失させることにより、新規Sprouty4遺伝子
のプロモーター配列を解明した（Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287: L52 
(2004)、これは参照により組み入れられる）。手短に述べると、ひとたび転写開始部位が
決定されたところで、一般的なPCRプライマーを用いてPCR断片を生成させて、5'隣接セグ
メントのセグメントを一方向様式でクローニングした。生成されたセグメントをルシフェ
ラーゼレポーターベクター中にクローニングして、ルシフェラーゼ活性を測定することで
、ヒトSprouty4遺伝子のプロモーター領域が決定された。
【０２１８】
遺伝子プロモーターの取得および検証のためのプロトコールの別の例は、以下の段階を
含む：（1）組織型が同様／同一である罹患性および非罹患性の細胞／組織試料を取得す
る段階；（2）試料から全RNAまたはmRNAを単離する段階；（3）罹患性および非罹患性RNA
の示差的マイクロアレイ分析を行う段階；（4）疾患特異的転写物の候補を同定する段階
；（5）疾患特異的転写物と関連のあるゲノム配列を同定する段階；（6）疾患特異的転写
物の転写開始部位と予想される部位の上流および下流にあるDNA配列を取得または合成す
る段階；（7）段階6による種々の長さのDNAを用いてプロモーターレポーターベクターを
設計および作製する段階；ならびに（8）罹患性および非罹患性の細胞／組織、さらには
無関係な細胞／組織において、プロモーターレポーターベクターを試験する段階。
【０２１９】
遺伝子スイッチ中に挿入されるプロモーターの源は天然性でも合成性でもよく、プロモ
ーターの源が本明細書に記載される本発明の範囲を限定すべきではない。換言すれば、プ
ロモーターを細胞から直接クローニングしてもよく、またはプロモーターが異なる源から
以前にクローニングされていてもよく、またはプロモーターを合成してもよい。
【０２２０】
遺伝子スイッチシステム
遺伝子スイッチは、特定のリガンドの添加または除去によって遺伝子発現を調節する任
意の遺伝子スイッチシステムでありうる。1つの態様において、遺伝子スイッチは、遺伝
子発現のレベルが、その中に存在するリガンドのレベルに依存するものである。本発明の
遺伝子スイッチ中に用いうるリガンド依存性転写因子複合体の例には、それぞれのリガン
ド（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソ
ン、ならびにその類似体および模倣物）によって活性化される核内受容体スーパーファミ
リーのメンバー、およびテトラサイクリンによって活性化されるrTTAが非限定的に含まれ
る。本発明の1つの局面において、遺伝子スイッチはEcRに基づく遺伝子スイッチである。
そのようなシステムの例には、米国特許第6,258,603号、第7,045,315号、米国特許出願公
開第2006／0014711号、第2007／0161086号、およびWO 01／70816号に記載されたシステム
が非限定的に含まれる。キメラエクジソン受容体システムの例は、米国特許第7,091,038
号、米国特許出願公開第2002／0110861号、第2004／0033600号、第2004／0096942号、第2
005／0266457号、および第2006／0100416号、ならびにWO 01／70816号、第02／066612号
、第02／066613号、第02／066614号、第02／066615号、第02／29075号、および第2005／1
08617号に記載されており、これらはそれぞれその全体が参照により組み入れられる。非
ステロイド性エクジソンアゴニスト調節システムの一例は、RheoSwitch（登録商標）Mamm
alian Inducible Expression System（New England Biolabs, Ipswich, MA）である。本
発明の別の局面において、遺伝子スイッチは、FK506結合タンパク質（FKBP）と、ラパマ
イシンまたはその非免疫抑制性類似体を通じて調節されるFKBPラパマイシン関連タンパク
質（FRAP）とのヘテロ二量体化に基づく。そのようなシステムの例には、ARGENT（登録商
標）Transcriptional Technology（ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, MA）、ならびに
米国特許第6,015,709号、第6,117,680号、第6,479,653号、第6,187,757号および第6,649,
595号に記載されたシステムが非限定的に含まれる。
【０２２１】
1つの態様において、遺伝子スイッチは、治療用スイッチプロモーターの制御下にある
リガンド依存性転写因子複合体をコードする単一の転写因子配列を含む。転写因子配列は
、天然に存在するかまたは人工的なリガンド依存性転写因子複合体であるリガンド依存性
転写因子複合体をコードしてよい。人工的転写因子とは、例えば、配列の突然変異によっ
て、または複数の異なる転写因子からのドメインを組み合わせることによって転写因子の
天然配列が改変されたもののことである。1つの態様において、転写因子はグループH核内
受容体リガンド結合ドメインを含む。1つの態様において、グループH核内受容体リガンド
結合ドメインは、エクジソン受容体、ユビキタス受容体（UR）、オーファン受容体1（OR-
1）、ステロイドホルモン核内受容体1（NER-1）、レチノイドX受容体相互作用タンパク質
-15（RIP-15）、肝臓X受容体β（LXRβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（RLD
-1）、肝臓X受容体（LXR）、肝臓X受容体α（LXRα）、ファルネソイドX受容体（FXR）、
受容体相互作用タンパク質14（RIP-14）またはファルネソール受容体（HRR-1）からのも
のである。別の態様において、グループH核内受容体LBDはエクジソン受容体からのもので
ある。
【０２２２】
A．エクジソンに基づく遺伝子スイッチ
EcRおよび他のグループH核内受容体は核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり
、これはそのすべてのメンバーが、任意でヘテロ二量体化パートナー（HP）と融合してコ
アクチベーションタンパク質（CAP）を形成するアミノ末端トランス活性化ドメイン（AD
、「TA」または「TD」とも互換的に呼ばれる）、DNA結合ドメイン（DBD）、およびヒンジ
領域を介してDBDと融合してリガンド依存性転写因子（LTF）を形成するLBDの存在によっ
て一般に特徴づけられる。本明細書で用いる場合、「DNA結合ドメイン」という用語は、D
NA結合ドメインが特定の応答エレメントと会合するように機能する限り、最長でDNA結合
タンパク質の全長までの、DNA結合タンパク質の最小のポリペプチド配列を含む。核内受
容体スーパーファミリーのメンバーは、以下の4つまたは5つのドメインの存在によっても
特徴づけられる：A／B、C、D、E、およびいくつかのメンバーではF（米国特許第4,981,78
4号およびEvans, Science 240:889 (1988)を参照）。「A／B」ドメインはトランス活性化
ドメインに対応し、「C」はDNA結合ドメインに対応し、「D」はヒンジ領域に対応し、「E
」はリガンド結合ドメインに対応する。このファミリーのいくつかのメンバーは、「F」
に対応するLBDのカルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインを有することもある。
【０２２３】
以下のポリペプチド配列は、エクジソン受容体（エクジステロイド受容体）（20-ヒド
ロキシ-エクジソン受容体）（20E受容体）（EcRH）（核内受容体サブファミリー1グルー
プHメンバー1）のポリペプチド配列として報告されており、Genbankではアクセッション
番号P34021を有する。
【０２２４】
キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）由来のエクジソン受容体（878aa）（SEQ
ID NO：5）
2019000118.tif 000020
【０２２５】
DBDは、応答エレメントに対する特異性を付与する2つのアミノ酸モチーフ、P-ボックス
およびD-ボックスが間にある2つのシステインジンクフィンガーの存在によって特徴づけ
られる。これらのドメインは、ネイティブ性、修飾性、または異種受容体タンパク質の異
なるドメインのキメラ体のいずれであってもよい。EcRは、核内受容体ファミリーのサブ
セットと同様に、ヘテロ二量体化特性を担う、あまり詳細には解明されていない領域も有
する。核内受容体のドメインはモジュール的な性質であるため、LBD、DBDおよびADを入れ
替えてもよい。
【０２２６】
別の態様において、転写因子は、AD、その発現をモジュレートしようとする治療用タン
パク質または治療用ポリヌクレオチドと連係している応答エレメントを認識するDBD；お
よびグループH核内受容体LBDを含む。ある態様において、グループH核内受容体LBDは置換
突然変異を含む。
【０２２７】
別の態様において、遺伝子スイッチは、第1の治療用スイッチプロモーター（TSP-1）の
制御下にある第1の転写因子配列、例えばCAP、および第2の治療用スイッチプロモーター
（TSP-2）の制御下にある第2の転写因子配列、例えばLTFを含み、前記第1の転写因子配列
によってコードされるタンパク質と前記第2の転写因子配列によってコードされるタンパ
ク質とが相互作用してタンパク質複合体（LDTFC）を形成するが、すなわちこれは「二重
スイッチ」または「ツーハイブリッド」に基づく遺伝子スイッチである。第1および第2の
TSPは同じでも異なってもよい。この態様においては、遺伝子スイッチ中に治療用分子の
発現のために必要な2つの異なるTSPが存在するため、治療方法の特異性が高まる（図2参
照）。図2はまた、適切なTSPを単に挿入することのみにより、任意の疾患、障害または病
状を治療するために治療用遺伝子スイッチを改変しうることも示している。
【０２２８】
さらなる態様において、第1および第2の転写因子配列、例えばCAPまたはLTFは、単一の
治療用スイッチプロモーター（例えば、図1中のTSP-1）の制御下にある。このプロモータ
ーの活性化は、単一のオープンリーディングフレームの下でCAPおよびLTFの両方を生成さ
せると考えられる。これは、IRES（配列内リボソーム進入部位）などの転写リンカーの使
用によって達成することができる。この態様においては、リガンド依存性転写因子複合体
の両方の部分がTSP-1の活性化に応じて合成される。TSP-1は構成的プロモーターであって
もよく、または疾患、障害もしくは病状と関連のある条件下のみにおいて活性化されても
よい。
【０２２９】
さらなる態様において、一方の転写因子配列、例えばLTFは、疾患、障害または病状と
関連のある条件下のみにおいて活性化される治療用スイッチプロモーターの制御下にあり
（例えば、図4中のTSP-2またはTSP-3）、もう一方の転写因子配列、例えばCAPは、構成的
治療用スイッチプロモーター（例えば、図4中のTSP-1）の制御下にある。この態様におい
て、リガンド依存性転写因子複合体の1つの部分は構成的に存在し、一方、第2の部分は疾
患、障害または病状と関連のある条件下でのみ合成されると考えられる。
【０２３０】
別の態様において、一方の転写因子配列、例えばCAPは、第1のTSP（例えば、図3中のTS
P-1）の制御下にあり、2つまたはそれ以上の異なる第2の転写因子配列は、例えばLTF-1お
よびLTF-2は異なるTSP（例えば、図3中のTSP-2およびTSP-3）の制御下にある。この態様
において、LTFのそれぞれは、異なる因子調節性プロモーター配列を認識する異なるDBDを
有してよい（例えば、DBD-Aは因子調節性プロモーター-1（FRP-1）と連係している応答エ
レメントと結合し、DBD-Bは因子調節性プロモーター-2（FRP-2）と連係している応答エレ
メントと結合する。因子調節性プロモーターのそれぞれが異なる治療用遺伝子と機能的に
連結されていてもよい。この様式では、複数の治療を同時に提供することができる。
【０２３１】
1つの態様において、第1の転写因子配列は、AD、その発現をモジュレートしようとする
治療用産物配列と連係している応答エレメントを認識するDBD；およびグループH核内受容
体LBDを含むポリペプチドをコードし、第2の転写因子配列は、脊椎動物レチノイドX受容
体（RXR）、無脊椎動物RXR、ウルトラスピラクル（ultraspiracle）タンパク質（USP）、
または脊椎動物RXR、無脊椎動物RXRおよびUSPから選択される少なくとも2つの異なる核内
受容体リガンド結合ドメインポリペプチド断片を含むキメラ核内受容体から選択される核
内受容体LBDを含む転写因子をコードする（WO 01／70816 A2号およびUS 2004／0096942 A
1号を参照）。「パートナー」核内受容体リガンド結合ドメインは、短縮突然変異、欠失
突然変異、置換突然変異または別の修飾をさらに含んでもよい。
【０２３２】
別の態様において、遺伝子スイッチは、核内受容体LBDおよびその発現をモジュレート
しようとする治療用産物配列と連係している応答エレメントを認識するDBDを含む第1のポ
リペプチドをコードする第1の転写因子配列、ならびにADおよび核内受容体LBDを含む第2
のポリペプチドをコードする第2の転写因子配列を含み、ここで核内受容体LBDの1つはグ
ループH核内受容体LBDである。1つの好ましい態様において、第1のポリペプチドはADを実
質的に含まず、第2のポリペプチドはDBDを実質的に含まない。本発明において、「実質的
に含まない」とは、当該タンパク質が活性化または結合活性を提供するのに十分な当該ド
メインの配列を含まないことを意味する。
【０２３３】
本発明の別の局面において、第1の転写因子配列はヘテロ二量体化パートナーおよびAD
を含むタンパク質（「CAP」）をコードし、第2の転写因子配列はDBDおよびLBDを含むタン
パク質（「LTF」）をコードする。
【０２３４】
一方の核内受容体LBDだけがグループH LBDである場合、もう一方の核内受容体LBDは、
グループH LBDと二量体を形成する任意の他の核内受容体からのものであってよい。例え
ば、グループH核内受容体LBDがEcR LBDである場合、もう一方の核内受容体LBD「パートナ
ー」は、EcR、脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR、ウルトラスピラクルタンパク質（USP）、ま
たは脊椎動物RXR、無脊椎動物RXRおよびUSPから選択される少なくとも2つの異なる核内受
容体LBDポリペプチド断片を含むキメラ核内受容体からのものであってよい（WO 01／7081
6 A2号、国際特許出願第PCT／US02／05235号および米国特許第2004／0096942 A1号を参照
）。「パートナー」核内受容体リガンド結合ドメインは、短縮突然変異、欠失突然変異、
置換突然変異、または別の修飾をさらに含んでもよい。
【０２３５】
1つの態様において、脊椎動物RXR LBDは、ヒト（ヒト、Homo sapiens）、マウス（ハツ
カネズミ、Mus musculus）、ラット（ドブネズミ、Rattus norvegicus）、ニワトリ（チ
ャボ、Gallus gallus）、ブタ（ブタ、Sus scrofa domestica）、カエル（アフリカツメ
ガエル、Xenopus laevis）、ゼブラフィッシュ（ゼブラダニオ、Danio rerio）、ホヤ（
ミサキマメイタボヤ、Polyandrocarpa misakiensis）、またはクラゲ（ミツデリッポウク
ラゲ、Tripedalia cysophora）のRXRからのものである。
【０２３６】
1つの態様において、無脊椎動物RXRリガンド結合ドメインは、トノサマバッタ（トノサ
マバッタ、Locusta migratoria）ウルトラスピラクルポリペプチド（「LmUSP」）、マダ
ニ（アムブリオンマ-アメリカヌム、Amblyomma americanum）RXRホモログ1（「AmaRXR1」
）、マダニ（アムブリオンマ-アメリカヌム）RXRホモログ2（「AmaRXR2」）、シオマネキ
（セルカ-プギレーター、Celuca pugilator）RXRホモログ（「CpRXR」）、カブトムシ（
チャイロコメノゴミムシダマシ、Tenebrio molitor）RXRホモログ（「TmRXR」）、ミツバ
チ（ヨーロッパミツバチ、Apis mellifera）RXRホモログ（「AmRXR」）、アブラムシ（モ
モアカアブラムシ、Myzus persicae）RXRホモログ（「MpRXR」）、または非双翅目（non-
Dipteran）/非鱗翅目（non-Lepidopteran）RXRホモログからのものである。
【０２３７】
1つの態様において、キメラRXR LBDは、脊椎動物種RXRポリペプチド断片、無脊椎動物
種RXRポリペプチド断片、および非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種RXRホモログポリペプチ
ド断片から選択される、少なくとも2つのポリペプチド断片を含む。本発明に用いるため
のキメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも2つの異なる種のRXRポリペプチド断片
を含んでよく、または種が同一である場合、2つまたはそれ以上の複数のポリペプチド断
片はその種のRXRポリペプチド断片の2つまたはそれ以上の異なるアイソフォームからのも
のであってよい。
【０２３８】
1つの態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動物種R
XRポリペプチド断片および1つの無脊椎動物種RXRポリペプチド断片を含む。
【０２３９】
別の態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動物種RX
Rポリペプチド断片および1つの非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種RXRホモログポリペプチ
ド断片を含む。
【０２４０】
リガンドは、核内受容体のLBDと組み合わされると、続いてそれが治療用産物配列と連
係しているFRPの応答エレメントと結合することで、治療用産物配列の発現の外部からの
時間的調節をもたらす。結合の機序、または本発明のさまざまな構成要素が互いに結合す
る順序、すなわち、例えばリガンドからLBDに、DBDから応答エレメントに、ADからプロモ
ーターに、といったことは特に重要ではない。
【０２４１】
1つの具体的な例において、グループH核内受容体のLBDおよびその核内受容体LBDパート
ナーに対するリガンドの結合は、治療用産物配列の発現を可能にする。この機序は、グル
ープH核内受容体（GHNR）またはそのパートナーに対するリガンド結合、およびその結果
生じる活性ホモ二量体複合体（例えば、GHNR＋GHNRまたはパートナー＋パートナー）の形
成の可能性を否定するものではない。好ましくは、受容体ドメインの1つまたは複数を変
更して、ハイブリッド遺伝子スイッチを作製する。典型的には、ハイブリッド遺伝子およ
びその結果生じるハイブリッドタンパク質が、選択した宿主細胞または生物において、ト
ランス活性化活性、リガンドの相補的結合および特定の応答エレメントの認識に関して最
適化されるように、DBD、LBDおよびADという3つのドメインのうち1つまたは複数を、他の
ドメインの源とは異なる源から選択することができる。加えて、応答エレメント自体を、
酵母由来のGAL-4タンパク質（Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)を参照）もしく
は大腸菌由来のLexAタンパク質（Brent et al., Cell 43:729 (1985)を参照）などの他の
DNA結合タンパク質ドメインに対する応答エレメント、またはそのような特異的相互作用
のために設計、修飾および選択されたタンパク質との標的指向性相互作用に対して特異的
な合成応答エレメント（例えば、Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1
997)を参照）で修飾または置換して、ハイブリッド受容体に適応させることもできる。ツ
ーハイブリッドシステムの別の利点は、それらが、所望の最終結果に即した遺伝子発現を
駆動するために用いられるプロモーターの選択を可能にすることである。そのような二重
制御は、発現のタイミングならびに発現が起こる細胞の両方を制御しうるため、遺伝子治
療の領域において、特に細胞傷害性タンパク質が産生される場合に、特に重要であると考
えられる。適したプロモーターに連結された遺伝子を対象の細胞に導入する場合、外因性
遺伝子の発現は本発明のシステムの存在によって制御される。プロモーターは、構成的で
あっても誘導的に調節されてもよく、または組織特異的（すなわち、特定の型の細胞のみ
で発現される）であってもその生物のある特定の発生段階に対して特異的であってもよい
。
【０２４２】
第1のハイブリッドタンパク質のDNA結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下
で応答エレメントのDNA配列と結合して、この応答エレメントの調節下で、下流遺伝子の
転写を開始させるかまたは抑制する。
【０２４３】
機能性LDTFC、例えばEcR複合体は、イムノフィリンなどの別のタンパク質を含んでもよ
い。転写因子（DHR38またはβFTZ-1など）として知られるタンパク質の核内受容体ファミ
リーの別のメンバーは、EcR、USPおよび／またはRXRのリガンド依存性または非依存性パ
ートナーであってもよい。さらに、一般にコアクチベーター（アダプターまたはメディエ
ーターとも呼ばれる）として知られるタンパク質などの他の補因子が必要とされることも
ある。これらのタンパク質はDNAと配列特異的には結合せず、基本的な転写にも関与しな
い。それらは、クロマチン構造に影響を及ぼすことにより、またはアクチベーター-開始
複合体相互作用を媒介することにより、アクチベーターのDNA結合の刺激を含む、さまざ
まな機序を通じて転写活性化に対する効果を発揮しうる。そのようなコアクチベーターの
例には、RIP140、TIF1、RAP46／Bag-1、ARA70、SRC-1／NCoA-1、TIF2／GRIP／NCoA-2、AC
TR／AIB1／RAC3／pCIP、さらには乱交雑性コアクチベーターC応答エレメントB結合タンパ
ク質CBP／p300が含まれる（総説については、Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:
222 (1997)を参照）。また、コリプレッサー（リプレッサー、サイレンサーまたはサイレ
ンシングメディエーターとしても知られる）として一般に知られているタンパク質補因子
が、リガンドの非存在下における転写活性化を効果的に阻害するために必要とされること
もある。これらのコリプレッサーは、リガンドが結合していないEcRと相互作用して、応
答エレメントでの活性をサイレンシングさせることができる。現時点での証拠は、リガン
ドの結合が受容体のコンフォメーションを変化させ、その結果、コリプレッサーの放出お
よび上記のコアクチベーターの動員が起こり、それにより、それらのサイレンシング活性
が消失することを示唆している。コリプレッサーの例には、N-CoRおよびSMRTが含まれる
（総説については、Horwitz et al., Mol Endocrinol. 10:1167 (1996)を参照）。これら
の補因子は細胞もしくは生物内にある内因性のものであってもよく、または調節性もしく
は非調節性のいずれかの様式で発現される導入遺伝子として外因的に添加してもよい。
【０２４４】
B．ラパマイシンに基づく遺伝子スイッチ
本発明はさらに、FK506結合タンパク質をリガンド依存性転写因子複合体として、およ
びラパマイシンをリガンドとして利用する遺伝子スイッチシステムを提供する。1つの態
様において、遺伝子スイッチをコードする構築物は、
（a）ラパマイシンまたはその類似体と結合し、少なくとも1つのFK506結合タンパク質
（FKBP）ドメインおよびそれに対して異種性である少なくとも1つのタンパク質ドメイン
異種を含み、FKBPドメインが以下から選択されるペプチド配列を含む、第1のキメラタン
パク質をコードする第1のポリヌクレオチド：
（1）天然に存在するFKBP
（2）最大で10個のアミノ酸残基が欠失している、挿入されている、または置換アミノ
酸によって置き換えられている、天然に存在するFKBPの変異体、および
（3）（1）または（2）のFKBPをコードするDNA配列と選択的にハイブリダイズするDNA
配列によってコードされるFKBP；
（b）（a）ラパマイシンまたはラパマイシン類似体および（b）第1のキメラタンパク質
の両方と複合体を形成し、少なくとも1つのFKBP：ラパマイシン結合（FRB）ドメインおよ
びそれに対して異種性である少なくとも1つのタンパク質ドメインを含み、FRBドメインが
以下から選択するペプチド配列を含む、第2のキメラタンパク質をコードする第2のポリヌ
クレオチド：
（4）天然に存在するFRBドメイン、
（5）最大で10個のアミノ酸残基が欠失している、挿入されている、または置換アミノ
酸によって置き換えられている、天然に存在するFRBドメインの変異体、および
（6）（4）または（5）のFRBをコードするDNA配列と選択的にハイブリダイズするDNA配
列によってコードされるFRBドメイン、
を含む。
【０２４５】
この遺伝子スイッチシステムにおいて、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレ
オチドのそれぞれは、本明細書中の他の箇所で記載された1つまたは複数の治療用スイッ
チプロモーターの制御下にある。さらに、ある態様において、第1および第2のキメラタン
パク質中のFKBPおよび／またはFRBドメインに対して異種性である少なくとも1つのタンパ
ク質ドメインは、1つまたは複数の「作用」または「エフェクター」ドメインであってよ
い。エフェクタードメインは、DNA結合ドメイン、転写活性化ドメイン、細胞局在化ドメ
インおよびシグナル伝達ドメイン（すなわち、クラスター化または多量体化されると細胞
成長、増殖、分化、アポトーシス、遺伝子転写などを誘発することのできるドメイン）を
含む、多岐にわたるタンパク質ドメインから選択されうる。
【０２４６】
ある態様において、1つの融合タンパク質は少なくとも1つのDNA結合ドメイン（例えば
、GAL4またはZFHD1 DNA結合ドメイン）を含み、別の融合タンパク質は少なくとも1つの転
写活性化ドメイン（例えば、VP16またはp65転写活性化ドメイン）を含む。リガンドを介
した融合タンパク質の会合は転写因子複合体の形成に相当し、融合タンパク質の一方の上
のDNA結合ドメインによって認識される（すなわち、それと結合することのできる）DNA配
列に連結された標的遺伝子の転写の開始を導く。遺伝子発現システムならびにリガンドに
関する情報は、米国特許第6,187,757 B1号、第6,649,595 B1号、第6,509,152 B1号、第6,
479,653 B1号および第6,117,680 B1号に開示されている。
【０２４７】
他の態様において、本発明は、リガンドの非存在下において自己凝集する2つの融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子スイッチシステムであって、（a）
第1の融合タンパク質が、選択したリガンドと結合する条件的凝集ドメインおよび転写活
性化ドメインを含み、かつ（b）第2の融合タンパク質が、選択したリガンドと結合する条
件的凝集ドメインおよびDNA結合ドメインを含み、かつ（c）リガンドの非存在下において
、細胞が、前記DNA結合ドメインが結合する調節性DNAと機能的に連結された遺伝子を発現
する、遺伝子スイッチシステムを提供する。遺伝子スイッチシステムを含む改変細胞を、
遺伝子のリプレッションのために十分な量のリガンドの存在下で増やす。リガンドの除去
は、細胞死を引き起こす、コードされたタンパク質の発現を誘導する。この2つの融合タ
ンパク質をコードする核酸は、少なくとも1つの条件的プロモーターの制御下にある。条
件的凝集ドメインを利用する遺伝子発現システムは、米国特許出願公開第2002／0048792
号に開示されている。
【０２４８】
C．原核生物リプレッサー／オペレーターに基づく遺伝子スイッチシステム
1つの態様において、本発明は、（a）原核生物テトラサイクリン（「tet」）リプレッ
サーおよび真核生物転写アクチベータータンパク質ドメインを含むトランスアクチベータ
ー融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド；ならびに（b）治療用タンパク質
または治療用ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、を含む遺伝子スイッチ
システムであって、前記第2のポリヌクレオチドが最小プロモーターおよび少なくとも1つ
のtetオペレーター配列と機能的に連結されている、遺伝子スイッチシステムを提供する
。トランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドは、本明
細書中の他の箇所で記載された治療用スイッチプロモーターを含みうる。この致死性タン
パク質の発現はテトラサイクリンの非存在下でアップレギュレートされる（例えば、Goss
en et al.（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. 89：5547-5551；Gossen et al.（1993）TIBS
18：471-475；Furth et al.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. 91：9302-9306；およびSh
ockett et al.（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. 92：6522-6526を参照）。TetO発現シス
テムは、米国特許第5,464,758 B1号に開示されている。
【０２４９】
別の態様において、遺伝子スイッチシステムは、細菌である大腸菌（Escherichia coli
）由来のラクトース（「Lac」）リプレッサー-オペレーターシステムを含む。本発明の遺
伝子スイッチシステムはまた、（a）原核生物lac Iリプレッサーおよび真核生物転写アク
チベータータンパク質ドメインを含むトランスアクチベーター融合タンパク質をコードす
る第1のポリヌクレオチド；ならびに（b）治療用タンパク質または治療用ポリペプチドを
コードする第2のポリヌクレオチドを含んでもよく、ここで前記第2のポリヌクレオチドは
治療用スイッチプロモーターに機能的に連結されている。このLacシステムにおいて、lac
オペロンは、ラクトースまたはイソプロピル-b-D-チオガラクトシドなどの合成類似体の
非存在下では不活性化される。
【０２５０】
そのほかの遺伝子スイッチシステムには、以下に記載されたものが含まれる：US 7,091
,038号；WO2004078924号；EP1266015号；US20010044151号；US20020110861号；US2002011
9521号；US20040033600号；US20040197861号；US20040235097号；US20060020146号；US20
040049437号；US20040096942号；US20050228016号；US20050266457号；US20060100416号
；WO2001／70816号；WO2002／29075号；WO2002／066612号；WO2002／066613号；WO2002／
066614号；WO2002／066615号；WO2005／108617号；US 6,258,603号；US20050209283号；U
S20050228016号；US20060020146号；EP0965644号；US 7,304,162号；US 7,304,161号；MX
234742号；KR10-0563143号；AU765306号；AU2002-248500号；およびAU2002-306550号。
【０２５１】
D．遺伝子スイッチシステムの組み合わせ
本発明は、1つまたは複数のリガンドの有効量によって活性化される複数の異なるリガ
ンド依存性転写因子複合体を含む2つまたはそれ以上の遺伝子スイッチシステムを含み、
その2つまたはそれ以上の遺伝子スイッチシステムが、1つまたは複数のリガンドと結合す
ると1つまたは複数の治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドの発現を選択的
に誘導する第1の遺伝子スイッチおよび第2の遺伝子スイッチを含む、核酸組成物、改変さ
れた細胞およびバイオリアクターを提供する。任意の数の遺伝子スイッチシステムおよび
／またはその任意の組み合わせが本発明の範囲内にある。
【０２５２】
1つの態様において、本発明は、以下のものを含む核酸組成物を提供する：
a．以下のものを含む第1の遺伝子スイッチシステム：
i．以下のものを含む第1のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む第1の遺伝子発現カセット：
1．治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオ
チドと機能的に連携している因子調節性プロモーターを活性化するトランス活性化ドメイ
ン；および
2．ヘテロ二量体パートナードメイン；
ii．以下のものを含む第2のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを含む第2の遺伝子発現カセット：
1．治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオ
チドと機能的に連携している因子調節性プロモーターを認識するDNA結合ドメイン；およ
び
2. リガンド結合ドメイン；ならびに
iii．以下のものを含む、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコード
するポリヌクレオチドを含む第3の遺伝子発現カセット：
1．第2のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化され
る因子調節性プロモータ；および
2．治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオ
チド、ならびに
b．以下のものを含む、第2の遺伝子発現システム：
i．以下のものを含む、第1のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを含む第1の遺伝子発現カセット：
1．治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオ
チドと機能的に連携している因子調節性プロモーターを活性化するトランス活性化ドメイ
ン；および
2．ヘテロ二量体パートナードメイン、
ii．以下のものを含む、第2のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを含む第2の遺伝子発現カセット：
1．治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオ
チドと機能的に連携している因子調節性プロモーターを認識するDNA結合ドメイン；およ
び
2．リガンド結合ドメイン；ならびに
iii．以下のものを含む、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコー
ドするポリヌクレオチドを含む第3の遺伝子発現カセット：
1．第2のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化され
る因子調節性プロモーター；および、
2．治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオ
チド。
【０２５３】
この複数の誘導性遺伝子発現システムは、複数の異なる疾患、障害もしくは病状と関連
のある条件下における所与の治療用ポリヌクレオチドもしくは治療用ポリペプチドの発現
、または、同じ疾患 障害もしくは病状と関連のある同じ条件下または複数の異なる疾患
、障害もしくは病状と関連のある複数の異なる条件下のいずれかにおいて複数の治療用ポ
リペプチドもしくは治療用ポリヌクレオチドの発現をもたらす。
【０２５４】
ある態様において、2つまたはそれ以上の遺伝子スイッチシステムの組み合わせは、（1
）二重スイッチ性のエクジソン受容体に基づく遺伝子発現システム、および（2）単一ス
イッチ性のエクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチであってよい。他の態様において、
組み合わせは、（1）単一スイッチ性または二重スイッチ性のエクジソン受容体に基づく
遺伝子スイッチ、および（2）ラパマイシンに基づく遺伝子スイッチであってよい。また
は、遺伝子スイッチシステムの組み合わせは、2つの同一な、上記に開示されたラパマイ
シンに基づく遺伝子スイッチシステムであってもよい。遺伝子スイッチシステムのあらゆ
る可能な組み合わせが、本発明の範囲内にある。
【０２５５】
リガンド
本明細書で用いる場合、LDTFCに基づく遺伝子スイッチ、例えば、EcD複合体に基づく遺
伝子スイッチに対して適用される「リガンド」という用語は、遺伝子スイッチを活性化し
てその中にコードされるポリペプチドの発現を刺激する能力を有する低分子および可溶性
分子を記述している。本発明のリガンド依存性転写因子複合体のリガンドは、リガンド結
合ドメイン、ヘテロ二量体パートナードメイン、DNA結合ドメインおよびトランス活性化
ドメインのうち1つまたは複数を含むタンパク質複合体と結合する。リガンド依存性転写
因子複合体を活性化するためのリガンドの選択は、利用する遺伝子スイッチの型に応じて
決まる。
【０２５６】
リガンドの例には、エクジソン、20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA、ムリステ
ロンAなどのエクジステロイド、9-シス-レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、米国
特許第6,013,836号；第5,117,057号；第5,530,028号；および第5,378,726号ならびに米国
特許出願公開第2005／0209283号および第2006／0020146号に開示されたものなどのN,N'-
ジアシルヒドラジン；米国特許出願公開第2004／0171651号に記載されているオキサジア
ゾリン；欧州特許出願第461,809号に開示されたものなどのジベンゾイルアルキルシアノ
ヒドラジン；米国特許第5,225,443号に開示されたものなどのN-アルキル-N,N'-ジアロイ
ルヒドラジン；欧州特許出願第234,994号に開示されたものなどのN-アシル-N-アルキルカ
ルボニルヒドラジン；米国特許第4,985,461号に記載されたものなどのN-アロイル-N-アル
キル-N'-アロイルヒドラジン；米国特許出願公開第2004／0049037号に記載されたものな
どのアミドケトン；および3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ-N-イソブチル-ベンズアミ
ド、8-O-アセチルハルパギド、オキシステロール、22(R)ヒドロキシコレステロール、24(
S)ヒドロキシコレステロール、25-エポキシコレステロール、T0901317、5-α-6-α-エポ
キシコレステロール-3-スルフェート（ECHS）、7-ケトコレステロール-3-スルフェート、
ファメソール、胆汁酸、1,1-ビホスホン酸エステル、幼若ホルモンIIIなどを含む、他の
類似の材料が非限定的に含まれる。本発明において有用なジアシルヒドラジンリガンドの
例には、RG-115819（3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N'-(2
-メチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド）、RG-115932（(R)-3,5-ジメチル-安息香
酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N'-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド）、お
よびRG-115830（3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N'-(2-エチル-3-メト
キシ-ベンゾイル)-ヒドラジド）が含まれる。米国特許出願第12／155,111号およびPCT／U
S2008／006757号を参照されたく、これは両方ともその全体が参照により本明細書に組み
入れられる。
【０２５７】
例えば、エクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチのリガンドは、任意の適したリガン
ドから選択することができる。天然に存在するエクジソンまたはエクジソン類似体（例え
ば、20-ヒドロキシエクジソン、ムリステロンA、ポナステロンA、ポナステロンB、ポナス
テロンC、26-ヨードポナステロンA、イコノステロンまたは26-メシルイコノステロン）お
よび非ステロイド性誘導物資の両方を、本発明の遺伝子スイッチのリガンドとして用いる
ことができる。米国特許第6,379,945 B1号は、ステロイドおよびある種の非ステロイド性
誘導物資の両方に応答する遺伝子スイッチとして作用しうる、ニセアメリカタバコガ（He
liothis virescens）から単離された昆虫ステロイド受容体（「HEcR」）を記載している
。非ステロイド性誘導物資は、ステロイドおよび非ステロイド性誘導物資の両方に対して
応答するこのシステムおよび多くの他のシステムにおいて、例えば以下のもの：製造コス
トがより低いこと、代謝的安定性、昆虫にも植物にも哺乳動物にも存在しないこと、およ
び環境的受容性を含むいくつかの理由から、ステロイドを上回る明確な利点を有する。米
国特許第6,379,945 B1号は、1,2-ジベンゾイル-1-tert-ブチル-ヒドラジンおよびテブフ
ェノジド（N-(4-エチルベンゾイル)-N'-(3,5-ジメチルベンゾイル)-N'-tert-ブチル-ヒド
ラジン）という2種のジベンゾイルヒドラジンの、エクジソンに基づく遺伝子スイッチの
リガンドとしての有用性を記載している。同じく本発明にリガンドとして含まれるものに
、米国特許第5,117,057 B1号に開示されたものなどの他のジベンゾイルヒドラジンがある
。キイロショウジョウバエ由来のエクジソン受容体に対する化学リガンドとしてのテブフ
ェノジドの使用は、米国特許第6,147,282号にも開示されている。エクジソンリガンドの
そのほかの非限定的な例には、3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ-N-イソブチル-ベンズ
アミド、8-O-アセチルハルパギド、1,2-ジアシルヒドラジン、N'-置換-N,N'-二置換ヒド
ラジン、ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、N-置換-N-アルキル-N,N-ジアロイルヒ
ドラジン、N-置換-N-アシル-N-アルキル、カルボニルヒドラジンまたはN-アロイル-N'-ア
ルキル-N'-アロイルヒドラジンがある（米国特許第6,723,531号を参照）。
【０２５８】
1つの態様において、エクジソンに基づく遺伝子スイッチシステムのリガンドは、ジア
シルヒドラジンリガンドまたはキラルジアシルヒドラジンリガンドである。遺伝子スイッ
チシステムに用いられるリガンドは、式I
2019000118.tif 000021
の化合物、
式中、Aはアルコキシ、アリールアルキルオキシもしくはアリールオキシであり；
Bは置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；か
つ
R1およびR2は独立に、置換されてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアル
キル、ハロアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルケニル、
置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいヘテロシクロ置換されてもよいアリール
、もしくは置換されてもよいヘテロアリールである；
または、それらの薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態もしくは非晶質形態であっ
てよい。
【０２５９】
別の態様において、リガンドは、式II
2019000118.tif 000022
の鏡像異性的に濃縮された化合物、
式中、Aはアルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル
、置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；
Bは置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；か
つ
R1およびR2は独立に、置換されてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアル
キル、ハロアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルケニル、
置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいヘテロシクロ、置換されてもよいアリー
ル、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；
ただし、R1はR2と等しくはなく；
ここで、R1およびR2を有する不斉炭素原子での絶対配置は大部分がSである；
または、それらの薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態もしくは非晶質形態であっ
てよい。
【０２６０】
ある態様において、リガンドは、式III
2019000118.tif 000023
の鏡像異性的に濃縮された化合物、
式中、Aはアルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル
、置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；
Bは置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；か
つ
R1およびR2は独立に、置換されてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアル
キル、ハロアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルケニル、
置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいヘテロシクロ、置換されてもよいアリー
ル、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；
ただしR1はR2と等しくはなく；
ここでR1およびR2を有する不斉炭素原子での絶対配置は大部分がRである；
または、それらの薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態もしくは非晶質形態であっ
てよい。
【０２６１】
1つの態様において、リガンドは、鏡像異性体過剰率が少なくとも95％である(R)-3,5-
ジメチル-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N'-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒ
ドラジド、またはその薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態もしくは非晶質形態であ
ってよい。
【０２６２】
式Iのジアシルヒドラジンリガンドおよび式IIまたはIIIのキラルジアシルヒドラジンリ
ガンドは、エクジソンに基づく遺伝子スイッチシステムに用いた場合、本発明の治療用ポ
リペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドの外部からの時間的調節をもたらす。2008年5
月29日に提出された米国特許出願第12／155,111号を参照されたく、これは参照により本
明細書に全面的に組み入れられる。
【０２６３】
本発明に用いられるリガンドは、塩を形成してもよい。「塩」という用語は、本明細書
で用いる場合、無機性および／または有機性の酸および塩基によって形成される酸性およ
び／または塩基性塩を表す。加えて、式I、IIまたはIIIの化合物が塩基性モイエティおよ
び酸性モイエティの両方を含む場合には、両性イオン（「分子内塩」）が形成されること
があり、これは本明細書で用いる「塩」という用語に含まれる。薬学的に許容される（す
なわち、無毒性で生理的に許容される）塩が用いられるが、他の塩も、例えば、調製中に
用いられる可能性のある単離または精製の段階において有用である。式I、IIまたはIIIの
化合物の塩は、例えば、塩が内部に沈殿するもののような媒質中、または水性媒質中で、
化合物を、ある量の、例えば等量の酸または塩基と反応させ、その後に凍結乾燥を行うこ
とによって形成させることができる。
【０２６４】
塩基性モイエティを含むリガンドは、種々の有機酸および無機酸との塩を形成すること
ができる。例示的な酸付加塩には、酢酸塩（酢酸またはトリハロ酢酸、例えばトリフルオ
ロ酢酸と形成されるものなど）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アス
パラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ク
エン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、
ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸
塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン塩酸、塩酸塩（塩酸と形成
される）、臭化水素酸塩（臭化水素と形成される）、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタ
ンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩（マレイン酸と形成される）、メタンスルホン酸
塩（メタンスルホン酸と形成される）、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸
塩、シュウ酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピ
クリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩（硫酸
と形成されるものなど）、スルホン酸塩（本明細書中で言及したものなど）、酒石酸塩、
チオシアン酸塩、トシレートなどのトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩などが含まれ
る。
【０２６５】
酸性モイエティを含むリガンドは、種々の有機塩基および無機塩基と塩を形成すること
ができる。例示的な塩基性塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウム
塩、リチウム塩およびカリウム塩など、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩および
マグネシウム塩など、有機塩基（例えば、有機アミン）との塩、例えば、ベンザチン、ジ
シクロヘキシルアミン、ヒドラバミン（N,N-ビス(デヒドロアビエチル)エチレンジアミン
と形成される）、N-メチル-D-グルカミン、N-メチル-D-グルカミド、t-ブチルアミン、お
よびアルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩が含まれる。
【０２６６】
FK506結合ドメインを利用する誘導性遺伝子発現システムのリガンドの非限定的な例に
は、FK506、シクロスポリンAまたはラパマイシンがある。FK506、ラパマイシンおよびそ
れらの類似体は、米国特許第6,649,595 B2号および第6,187,757号に開示されている。米
国特許第7,276,498号および第7,273,874号も参照されたい。
【０２６７】
本明細書に記載されたリガンドは、単独で、または薬学的に許容される担体を含む薬学
的組成物の一部として投与することができる。1つの態様において、薬学的組成物は、液
剤、懸濁剤、錠剤、カプセル剤、軟膏、エリキシル剤および注射用組成物の形態にある。
【０２６８】
遺伝子スイッチに関して、「エクジソン受容体に基づく」という用語は、天然に存在す
るかまたは合成性のエクジソン受容体リガンド結合ドメインの少なくとも機能性部分を含
み、エクジソン受容体リガンド結合ドメインと結合するリガンドに応答して遺伝子発現を
調節する遺伝子スイッチのことを指す。エクジソン応答システムの例は、米国特許第7,09
1,038号および第6,258,603号に記載されている。1つの態様において、システムはRheoSwi
tch（登録商標）Therapeutic System（RTS）であり、これは図1に示されているように、
構成的プロモーターの下で発現される、突然変異を誘発させたエクジソン受容体（EcR）
のDEFドメインをGal4 DNA結合ドメインと融合させたもの、およびキメラRXRのEFドメイン
をVP 16転写活性化ドメインと融合させたものという2つの融合タンパク質を含む。
【０２６９】
「モジュレートする（modulate）」および「モジュレートする（modulates）」という
用語は、核酸または遺伝子の発現を誘導する、減少させる、または阻害して、その結果、
タンパク質またはポリペプチドの産生のそれぞれ誘導、減少または阻害がもたらされるこ
とを指す。
【０２７０】
本発明によるポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞において遺伝子の発現を駆
動するのに適した少なくとも1つのプロモーターをさらに含んでもよい。
【０２７１】
本発明の態様において用いうるエンハンサーには、SV40エンハンサー、サイトメガロウ
イルス（CMV）エンハンサー、伸長因子1（EF1）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイ
ルス遺伝子エンハンサーなどが非限定的に含まれる。
【０２７２】
終結制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列も、好ましい宿主
に対してネイティブ性であるさまざまな遺伝子に由来しうる。任意で、終結部位が必要で
ないこともあるが、含まれれば最も好ましい。本発明の1つの態様において、終結制御領
域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、SV40後期ポリアデニル化シグナル、SV40
ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化シグナル、ウイルス
ターミネーター配列などで構成されるか、またはそれらに由来してよい。
【０２７３】
「3'非コード配列」または「3'非翻訳領域（UTR）」という用語は、コード配列の下流
（3'）に位置するDNA配列のことを指し、ポリアデニル化［ポリ(A)］認識配列、およびmR
NAプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことのできる調節シグナルをコードする
他の配列を含んでよい。ポリアデニル化シグナルは通常、mRNA前駆体の3'末端へのポリア
デニル酸鎖の付加に影響を及ぼすことによって特徴づけられる。
【０２７４】
「調節領域」とは、第2の核酸配列の発現を調節する核酸配列のことを指す。調節領域
は、特定の核酸の発現を天然において担う配列（相同領域）を含んでもよく、または異な
るタンパク質もしくはさらには合成タンパク質の発現を担う異なる起源の配列（異種領域
）を含んでもよい。特に、これらの配列は、遺伝子の転写を特異的または非特異的な様式
で、および誘導性または非誘導性の様式で刺激または抑圧する、原核生物、真核生物もし
くはウイルス遺伝子の配列または導き出された配列でありうる。調節領域は、複製起点、
RNAスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、およびポリペプチド
を標的細胞の分泌経路に導くシグナル配列を含む。
【０２７５】
「異種性の源」からの調節領域とは、発現される核酸に天然では付随していない調節領
域のことを指す。異種性調節領域に含まれるものには、異なる種からの調節領域、異なる
遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列、および天然には存在せずに当業者によっ
て設計された調節配列が含まれる。
【０２７６】
「RNA転写物」とは、RNAポリメラーゼにより触媒されるDNA配列の転写の結果として生
じる産物のことを指す。RNA転写物がDNA配列の完全な相補的コピーである場合には、それ
は一次転写物と呼ばれるが、またはこれが一次転写物の転写後プロセシングに由来するRN
A配列であってもよく、それは成熟RNAと呼ばれる。「メッセンジャーRNA（mRNA）」とは
、イントロンを伴わず、細胞によってタンパク質に翻訳されうるRNAのことを指す。「cDN
A」とは、mRNAに対して相補的であり、それに由来する二本鎖DNAのことを指す。「センス
」RNAとは、mRNAを含み、そのため細胞によってタンパク質に翻訳されうるRNA転写物のこ
とを指す。「アンチセンスRNA」とは、標的一次転写物またはmRNAの全体または一部に対
して相補的であって、標的遺伝子の発現を阻止するRNA転写物のことを指す。アンチセン
スRNAの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の一部、すなわち、5'非コード配列、3'非
コード配列、またはコード配列におけるものでありうる。「機能性RNA」とは、アンチセ
ンスRNA、リボザイムRNA、または翻訳されないものの細胞過程に影響を及ぼす他のRNAの
ことを指す。
【０２７７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、互換的に用いられ、共有結
合したアミノ酸残基で構成される高分子化合物のことを指す。
【０２７８】
「単離されたポリペプチド」、「単離されたペプチド」または「単離されたタンパク質
」とは、その天然状態において通常はそれに付随する化合物（例えば、他のタンパク質ま
たはポリペプチド、核酸、糖質、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたはタンパク
質のことを指す。「単離された」は、他の化合物との人工的もしくは合成的な混合物も、
生物活性に干渉せず、かつ例えば、不完全な精製、安定剤の添加または薬学的に許容され
る製剤への調合が原因となって存在する可能性のある不純物の存在も排除しないものとす
る。
【０２７９】
「置換突然変異体ポリペプチド」または「置換突然変異体」とは、野生型または天然の
ポリペプチドに比して、少なくとも1つの野生型または天然のアミノ酸の異なるアミノ酸
による置換を含む、突然変異体ポリペプチドを意味することが理解されるであろう。置換
突然変異体ポリペプチドは、1つの野生型または天然のアミノ酸置換のみを含んでもよく
、これは「点突然変異体」または「単一点突然変異体」ポリペプチドと呼ばれることもあ
る。または、置換突然変異体ポリペプチドは、野生型または天然のポリペプチドに比して
、2つまたはそれ以上の野生型または天然のアミノ酸の2つまたはそれ以上のアミノ酸によ
る置換を含んでもよい。本発明によれば、置換突然変異を含むグループH核内受容体リガ
ンド結合ドメインポリペプチドは、野生型または天然のグループH核内受容体リガンド結
合ドメインポリペプチドに比して、少なくとも1つの野生型または天然のアミノ酸の異な
るアミノ酸による置換を含む。
【０２８０】
置換突然変異体ポリペプチドが2つまたはそれ以上の野生型または天然のアミノ酸の置
換を含む場合、この置換は、置換のために欠失した野生型もしくは天然のアミノ酸と同じ
数、すなわち、2つの非野生型もしくは非天然のアミノ酸による2つの野生型もしくは天然
のアミノ酸の置き換えを含んでもよく、または置換のために欠失した野生型アミノ酸と同
じでない数、すなわち、1つの非野生型アミノ酸による2つの野生型アミノ酸の置き換え（
置換＋欠失突然変異）、もしくは3つの非野生型アミノ酸による2つの野生型アミノ酸の置
き換え（置換＋挿入突然変異）を含んでもよい。
【０２８１】
置換突然変異体は、参照ポリペプチド配列内部の置き換えられたアミノ酸残基および数
、ならびに新たな置換されたアミノ酸残基を示すための略記命名法を用いて記述すること
ができる。例えば、ポリペプチドの20番目（20th）のアミノ酸残基が置換されている置換
突然変異体は「x20z」と略記することができ、ここで「x」は置き換えられるアミノ酸で
あり、「20」はポリペプチド内部のアミノ酸残基の位置または数であり、「z」は新たな
置換されたアミノ酸である。したがって、互換的に「E20A」または「Glu20Ala」と略記さ
れる置換突然変異体は、その変異体が、ポリペプチドの20位にグルタミン酸（当技術分野
において一般的には「E」または「Glu」と略記される）の代わりにアラニン残基（当技術
分野において一般的には「A」または「Ala」と略記される）を含むことを指し示している
。
【０２８２】
置換突然変異体は、インビトロ部位指定突然変異誘発法（Hutchinson et al., J. Biol
. Chem. 253:6551 (1978)；Zoller et al., DNA 3:479 (1984)；Oliphant et al., Gene 
44:177 (1986)；Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:710 (1986)）、TA
B（登録商標）リンカー（Pharmacia）の使用、制限エンドヌクレアアーゼ消化／断片欠失
および置換、PCR媒介性／オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発などを非限定的に含む
、当技術分野において公知の任意の突然変異誘発技術によって作製しうる。PCRに基づく
手法が、部位指定突然変異誘発のためには好ましい（Higuchi, 1989, "Using PCR to Eng
ineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification
, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70を参照）。
【０２８３】
ポリペプチドに対して適用される「断片」という用語は、そのアミノ酸配列が参照ポリ
ペプチドの配列よりも短く、かつこれらの参照ポリペプチドの全部分にわたって同一のア
ミノ酸配列を含むポリペプチドのことを指す。そのような断片は、必要に応じて、それら
がその一部である、より大きなポリペプチドの中に含まれてもよい。本発明によるポリペ
プチドのそのような断片は、長さは少なくとも2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240もしくは300また
はそれ以上のアミノ酸であってよい。
【０２８４】
ポリペプチドまたはタンパク質の「変異体」とは、ポリペプチドまたはタンパク質に由
来し、かつそのポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも1つの生物学的特性を保って
いる任意の類似体、断片、誘導体または突然変異体のことを指す。ポリペプチドまたはタ
ンパク質の複数の異なる変異体が天然に存在することもある。これらの変異体は、タンパ
ク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の違いによって特徴づけられるアレル変
種であってもよく、または差異のあるスプライシング、もしくは翻訳後修飾がかかわって
もよい。当業者であれば、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを
有する変異体を作製することができる。これらの変異体には、いくつか例を挙げると、（
a）1つまたは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的なアミノ酸で置換されている変
異体、（b）1つまたは複数のアミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質に付加されている
変異体、（c）1つまたは複数のアミノ酸が置換基を含む変異体、および（d）ポリペプチ
ドまたはタンパク質が血清アルブミンなどの別のポリペプチドと融合されている変異体が
含まれうる。これらの変異体を入手するための手法は、遺伝的（抑制、欠失、突然変異な
ど）、化学的および酵素的な手法を含め、当業者に公知である。1つの態様において、変
異体ポリペプチドは少なくとも約14個のアミノ酸を含む。
【０２８５】
「相同性」という用語は、2つのポリヌクレオチドモイエティまたは2つのポリペプチド
モイエティの間の一致度（percent of identity）のことを指す。1つのモイエティからの
配列と別のものからの配列との間の対応性は、当技術分野において公知の技術によって決
定することができる。例えば、相同性は、配列情報のアラインメントを行って、容易に入
手しうるコンピュータプログラムを用いることによる、2つのポリペプチド分子間の配列
情報の直接比較によって決定することができる。または、相同性を、相同領域の間で安定
な二重鎖を形成する条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、その
後の一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化および消化された断片のサイズ決定によって決
定することもできる。
【０２８６】
本明細書で用いる場合、「相同な」という用語は、そのすべての文法的形態および綴り
変形物において、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）か
らのタンパク質および異なる種からの相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）を含
む、「共通の進化的起源」を有するタンパク質の間の関係のことを指す（Reeck et al., 
Cell 50:667 (1987)）。そのようなタンパク質（およびそれらをコードする遺伝子）は、
それらの高度の配列類似性に反映されるような配列相同性を有する。しかし、一般的用法
および本出願において、「相同な」という用語は、「高度に」などの副詞で修飾された場
合には、配列類似性を意味し、共通の進化的起源を意味しないこともある。
【０２８７】
すなわち、「配列類似性」という用語は、そのすべての文法的形態において、タンパク
質の核酸配列またはアミノ酸配列の間の同一性または対応性の度合いのことを指し、それ
らは共通の進化的起源を有してもよく、または有しなくてもよい（Reeck et al., Cell 5
0:667 (1987)を参照）。1つの態様において、2つのDNA配列は、ヌクレオチドの少なくと
も約50％（例えば、少なくとも約75％、90％、または95％）が、DNA配列の規定の長さに
わたって一致する場合に、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相
同な配列は、配列を、配列データバンクで入手しうる標準的なソフトウェアを用いて、ま
たは例えば、その特定の系に対して定められたストリンジェントな条件などにおけるサザ
ンハイブリダイゼーション実験において比較することによって、同定することができる。
適切なハイブリダイゼーション条件を定めることは、当業者の技能の範囲内にある（例え
ば、Sambrook et al., 1989, 前記を参照）。
【０２８８】
本明細書で用いる場合、「実質的に類似」とは、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の
変化が、結果として、1つまたは複数のアミノ酸の置換をもたらすが、そのDNA配列によっ
てコードされるタンパク質の機能的特性には影響を及ぼさないような核酸断片のことを指
す。「実質的に類似」はまた、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、アンチセン
ス技術または共抑制技術によって遺伝子発現の改変を媒介する核酸断片の能力に影響を及
ぼさないような核酸断片のことも指す。「実質的に類似」はまた、結果として生じる転写
物の機能的特性に実質的に影響を及ぼさない、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の欠失
または挿入といった本発明の核酸断片の修飾のことも指す。したがって、本発明は具体的
な例示的配列を上回るものを範囲に含むことが分かる。提案されている修飾はそれぞれ、
当業者の定型的な技能の範囲内に十分に含まれ、コードされる産物の生物活性の保持の判
定についても同様である。
【０２８９】
さらに、当業者は、本発明の範囲に含まれる実質的に類似した配列が、本明細書におい
て例示した配列とストリンジェントな条件（0.1×SSC、0.1％ SDS、65℃、その上で2×SS
C、0.1％ SDSで洗浄し、続いて0.1×SSC、0.1％ SDSで洗浄）下でハイブリダイズする能
力によっても規定されることを認識しているであろう。本発明の実質的に類似した核酸断
片は、そのDNA配列が本明細書に報告された核酸断片のDNA配列と少なくとも約70％、80％
、90％または95％同一である核酸断片である。
【０２９０】
2つのアミノ酸配列は、約40％を上回るアミノ酸が同一であるか、または60％を上回る
アミノ酸が類似している（機能的に同一である）場合に、「実施的に相同」または「実質
的に類似」である。好ましくは、類似した配列または相同な配列は、例えば、GCG（Genet
ics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisc
onsin）パイルアッププログラムを用いるアラインメントによって同定される。
【０２９１】
「対応する」という用語は、本明細書において、類似性または相同性を測定する対象に
なる分子と正確な位置が同一であるかまたは異なるかにかかわらず、類似した配列または
相同な配列を指して用いられる。核酸配列またはアミノ酸配列のアラインメントはスペー
スを含んでもよい。したがって、「対応する」という用語は、配列類似性のことを指し、
アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けのことは指していない。
【０２９２】
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手作
業による評価によるか、またはBLAST（Basic Local Alignment Search Tool；Altschul e
t al., J. Mol. Biol. 215:403 (1993)）；ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で入手可能）などの
アルゴリズムを用いるコンピュータでの自動化された配列比較および同定によるかのいず
れかにより、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチド
のアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、ポリペプチド配列また
は核酸配列が公知のタンパク質または遺伝子に対して相同であると推定的に同定するため
には、10個もしくはそれ以上の連続したアミノ酸または30個もしくはそれ以上のヌクレオ
チドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、20〜30個の連続したヌ
クレオチドを含む遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを、配列依存的な遺伝子同
定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたは
バクテリオファージプラークのインサイチューハイブリダイゼーション）の方法に用いる
こともできる。加えて、12〜15塩基の短いオリゴヌクレオチドをPCRにおける増幅プライ
マーとして、そのプライマーを含む特定の核酸断片を入手する目的で用いることもできる
。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列を含む核酸断片を特異
的に同定および／または単離するのに十分な配列を含む。
【０２９３】
「一致度」という用語は、当技術分野において公知であるように、配列を比較すること
によって決定される、2つもしくはそれ以上のポリペプチド配列間または2つもしくはそれ
以上のポリヌクレオチド配列間の関係のことを指す。当技術分野において、「同一性」は
また、ポリペプチドまたポリヌクレオチド配列間の配列関連性の度合いのことも指し、こ
れは場合によってはそのような配列鎖の間の合致によって決定される。「同一性」および
「類似性」は、Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford Universi
ty Press, New York (1988)；Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith,
D. W., ed.) Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data
, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (19
94)；Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press
(1987)；およびSequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) St
ockton Press, New York (1991)に記載されたものを非限定的に含む、公知の方法によっ
て容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、被験配列の間
で最良の合致が得られるように設計されている。同一性および類似性を決定する方法は、
公開コンピュータプログラムで体系的に整備されている。配列アラインメントおよび一致
度の計算は、LASERGENE bioinformatics computing suiteのMegalignプログラム（DNASTA
R Inc., Madison, WI）などの配列分析ソフトウェアを用いて行うこともできる。配列の
多重アラインメントは、Clustalアラインメント法（Higgins et al., CABIOS. 5:151 (19
89)）をデフォルトパラメーター（GAP PENALTY＝10、GAP LENGTH PENALTY＝10）で用いて
行うことができる。Clustal法を用いる対アラインメントのデフォルトパラメーターを選
択してもよい：KTUPLE 1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5およびDIAGONALS SAVED＝5。
【０２９４】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のた
めに有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムのことを指す
。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでもよく、または独自に開発したものでもよ
い。典型的な配列分析ソフトウェアには、GCGプログラムスイート（Wisconsin Package V
ersion 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI）、BLASTP、BLASTN、BLASTX
（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)）、およびDNASTAR（DNASTAR, Inc. 
1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA）が非限定的に含まれる。本出願の文脈におい
て、配列分析ソフトウェアを分析に用いる場合には、別に指定しない限り、分析の結果は
参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが明らかであろう。本明細書で用い
る場合、「デフォルト値」とは、最初に初期化した時にソフトウェアに最初にロードされ
た値またはパラメーターの任意のセットを意味するものとする。
【０２９５】
DNAの配列に関して「化学的に合成された」とは、構成要素のヌクレオチドがインビト
ロで組み立てられたことを指す。DNAの手作業での化学合成を十分に確立された手順を用
いて行ってもよく、またはいくつかの市販の装置の1つを用いて自動化学合成を行うこと
もできる。このようにして、遺伝子を、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチ
ド配列の最適化に基づき、最適な遺伝子発現となるように調整することができる。当業者
は、コドン使用が宿主によって優先されるコドン側に偏る場合に遺伝子発現が成功する確
率を評価可能である。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である場合には、宿
主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【０２９６】
本明細書で用いる場合、2つまたはそれ以上の個別に動作可能な遺伝子調節システムは
、a）選択された濃度でのその各々のリガンドによる所与のシステムのそれぞれのモジュ
レーションが、結果として、そのシステムの遺伝子の発現の大きさの測定可能な変化をも
たらし、かつb）その変化が、実際のモジュレーションが同時であるかまたは逐次的であ
るかに関係なく、細胞、組織または生物において同時に動作可能な他のすべてのシステム
の発現の変化と統計学的に有意に異なる場合、「オルソゴナル」であるという。好ましく
は、それぞれの個別に動作可能な遺伝子調節システムのモジュレーションは、細胞、組織
または生物における他のすべての動作可能なシステムよりも少なくとも2倍大きい、例え
ば、少なくとも5倍、10倍、100倍、または500倍大きい遺伝子発現の変化を生じさせる。
理想的には、選択された濃度でのその各々のリガンドによる所与のシステムのそれぞれの
モジュレーションは、結果として、そのシステムの遺伝子の発現の大きさの測定可能な変
化をもたらし、その細胞、組織または生物において動作可能な他のすべてのシステムの発
現の測定可能な変化はもたらさない。そのような場合、これらの多重誘導性遺伝子調節シ
ステムは「完全にオルソゴナル」であるという。有用なオルソゴナルリガンドおよびオル
ソゴナルな受容体に基づく遺伝子発現システムは、US 2002／0110861 A1号に記載されて
いる。
【０２９７】
「外因性遺伝子」という用語は、その対象にとって外来性である遺伝子、すなわち、形
質転換過程を通じて対象に導入される遺伝子、内因性突然変異遺伝子の非突然変異型のも
の、または内因性非突然変異遺伝子の突然変異型のものを意味する。形質転換の方法は本
発明にとって特に重要ではなく、当業者に公知の、対象に適した任意の方法であってよい
。外因性遺伝子は、DNA、または逆転写酵素などによってDNA中間体を経由して機能しうる
RNAの形態で対象に導入される、天然遺伝子または合成遺伝子のいずれでもありうる。そ
のような遺伝子は、標的細胞に導入すること、対象に直接導入すること、または対象への
形質転換細胞の移入によって間接的に導入することができる。
【０２９８】
「治療用産物」という用語は、そのような産物が発現される宿主細胞に対して有益な機
能を付与する治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドのことを指す。治療用ポ
リペプチドには、長さ3アミノ酸ほどの短いペプチド、単鎖または複数鎖タンパク質、お
よび融合タンパク質が非限定的に含まれうる。治療用ポリヌクレオチドには、アンチセン
スオリゴヌクレオチド、短鎖干渉性RNA、リボザイムおよびRNA外部ガイド配列が非限定的
に含まれうる。治療用産物には、天然配列、合成配列、または天然および合成配列の組み
合わせが含まれうる。
【０２９９】
「リガンド依存性転写因子複合体」または「LDTFC」という用語は、1つまたは複数のタ
ンパク質サブユニットを含む転写因子のことを指し、この複合体は、本明細書で定義する
ような「因子調節型プロモーター」によって駆動される遺伝子発現を調節することができ
る。モデルとなるLDTFCは「エクジソン受容体複合体」であり、これは一般に、エクジソ
ン受容体（「EcR」）およびウルトラスピラクル（「USP」）タンパク質という核内受容体
ファミリーの少なくとも2つのメンバーを有するヘテロ二量体性タンパク質複合体のこと
を指す（Yao et al., Nature 366:476 (1993)；Yao et al., Cell 71:63 (1992)を参照）
。EcR複合体などの機能性LDTFCがイムノフィリンなどの別のタンパク質を含んでもよい。
転写因子として知られる核内受容体ファミリーのタンパク質の別のメンバー（DHR38、βF
TZ-1または他の昆虫ホモログなど）が、EcRおよび／またはUSPのリガンド依存性または非
依存性パートナーであってもよい。EcR複合体などのLDTFCが、EcRタンパク質と、ウルト
ラスピラクルタンパク質の脊椎動物ホモログ、レチノイン酸X受容体（「RXR」）タンパク
質、またはUSPおよびRXRのキメラ体とのヘテロ二量体であってもよい。「LDTFC」および
「EcR複合体」という用語は、EcRタンパク質またはUSPのホモ二量体複合体、さらには同
じ機能を果たす単一のポリペプチドまたは三量体、四量体および他の多量体も範囲に含む
。
【０３００】
EcR複合体などのLDTFCは、EcRを含むが複合体の他のタンパク質も除外されない複合体
のタンパク質の1つと結合した活性エクジステロイドまたは非ステロイドリガンドによっ
て活性化されうる。EcR複合体などのLDTFCは、すべてのメンバーがアミノ末端トランス活
性化ドメイン（本明細書において互換的に用いられる「AD」、「TD」または「TA」）、DN
A結合ドメイン（「DBD」）およびリガンド結合ドメイン（「LBD」）を含む1つまたは複数
のポリペプチドサブユニットの存在によって特徴づけられる、核内受容体スーパーファミ
リーのメンバーであるタンパク質を含む。ADは「ヘテロ二量体化パートナー」または「HP
」との融合体として存在してもよい。本発明のADおよびHPを含む融合タンパク質を、本明
細書では「共活性化タンパク質」または「CAP」と称する。DBDおよびLBDを融合タンパク
質として発現させることもでき、本明細書ではこれを「リガンド誘導性転写因子（「LTF
」）と称する。これらの融合パートナーは、リンカー、例えばヒンジ領域によって隔てら
れていてよい。LTFファミリーの一部のメンバーが、LBDのカルボキシ末端側に別のトラン
ス活性化ドメインを有してもよい。DBDは、エクジソン応答エレメントに対する特異性を
付与する2つのアミノ酸モチーフ、P-ボックスおよびD-ボックスが間にある2つのシステイ
ンジンクフィンガーの存在によって特徴づけられる。これらのドメインは、ネイティブ性
、修飾性、または異種受容体タンパク質の異なるドメインのキメラ体のいずれであっても
よい。
【０３０１】
外因性遺伝子、応答エレメント、および例えばEcR複合体などのLDTFCを構成するDNA配
列は、古細菌、原核細胞、例えば大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）もしくは他の腸
内細菌など、または真核細胞、例えば植物細胞もしくは動物細胞などに組み入れることが
できる。しかし、遺伝子によって発現されるタンパク質の多くは細菌内では不正確に処理
されるため、真核細胞が好ましい。細胞は単細胞または多細胞生物の形態であってよい。
また、外因性遺伝子、応答エレメントおよび受容体複合体のヌクレオチド配列を、RNA分
子として、好ましくはタバコモザイクウイルスなどの機能性ウイルスRNAの形態で組み入
れることもできる。真核細胞の中でも脊椎動物細胞が好ましいが、これはそれらがEcRに
対する本発明のリガンドへの応答を付与する分子を天然では持たないためである。その結
果として、それらは本発明のリガンドに対して「実質的に非感受性」である。したがって
、本発明において有用なリガンドは、形質転換細胞または生物体全体に対して、無視しう
る程度の生理学的または他の影響しか及ぼさないと考えられる。このため、細胞はリガン
ド自体の存在によって実質的な影響を受けずに、成長して所望の産物を発現することがで
きる。
【０３０２】
「エクジソン受容体複合体」という用語は一般に、エクジソン受容体（「EcR」）およ
びウルトラスピラクル（「USP」）タンパク質という核内受容体ファミリーの少なくとも2
つのメンバーを有するヘテロ二量体性タンパク質複合体のことを指す（Yao et al., Natu
re 366:476 (1993)；Yao et al., Cell 71:63 (1992)を参照）。機能性EcR複合体がイム
ノフィリンなどの別のタンパク質を含んでもよい。転写因子として知られる核内受容体フ
ァミリーのタンパク質の別のメンバー（DHR38、βFTZ-1または他の昆虫ホモログなど）が
、EcRおよび／またはUSPのリガンド依存性または非依存性パートナーであってもよい。Ec
R複合体が、EcRタンパク質と、ウルトラスピラクルタンパク質の脊椎動物ホモログ、レチ
ノイン酸X受容体（「RXR」）タンパク質、またはUSPおよびRXRのキメラ体とのヘテロ二量
体であってもよい。EcR複合体という用語は、EcRタンパク質またはUSPのホモ二量体複合
体も範囲に含む。
【０３０３】
EcR複合体は、EcRを含むが複合体の他のタンパク質も除外されない複合体のタンパク質
の1つと結合した活性エクジステロイドまたは非ステロイドリガンドによって活性化され
うる。本明細書で用いる場合、「リガンド」という用語は、EcRに基づく遺伝子スイッチ
に適用される場合、遺伝子スイッチを活性化してその中にコードされるポリペプチドの発
現を刺激する能力を有する可溶性の低分子を記述する。リガンドの例には、エクジソン、
20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA、ムリステロンAなどのエクジステロイド、9-
シス-レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、米国特許第6,013,836号；第5,117,057
号；第5,530,028号；および第5,378,726号ならびに米国特許出願公開第2005／0209283号
および第2006／0020146号に開示されているものなどのN,N'-ジアシルヒドラジン；米国特
許出願公開第2004／0171651号に記載されているオキサジアゾリン；欧州特許出願第461,8
09号に開示されているものなどのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第5,
225,443号に開示されているものなどのN-アルキル-N,N'-ジアロイルヒドラジン；欧州特
許出願第234,994号に開示されているものなどのN-アシル-N-アルキルカルボニルヒドラジ
ン；米国特許第4,985,461号に記載されているものなどのN-アロイル-N-アルキル-N'-アロ
イルヒドラジン；米国特許出願公開第2004／0049037号に記載されているものなどのアミ
ドケトン；および3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ-N-イソブチル-ベンズアミド、8-O-
アセチルハルパギド、オキシステロール、22(R)ヒドロキシコレステロール、24(S)ヒドロ
キシコレステロール、25-エポキシコレステロール、T0901317、5-アルファ-6-アルファ-
エポキシコレステロール-3-スルフェート（ECHS）、7-ケトコレステロール-3-スルフェー
ト、ファメソール、胆汁酸、1,1-ビホスホン酸エステル、幼若ホルモンIIIなどを含む他
の類似の材料が非限定的に含まれる。本発明において有用なジアシルヒドラジンリガンド
の例には、RG-115819（3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N'-
(2-メチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド）、RG-115932（(R)-3,5-ジメチル-安息
香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N'-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド）、
およびRG-115830（3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N'-(2-エチル-3-メ
トキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド）が含まれる。本発明の実施において有用なそのほかの
ジアシルヒドラジンについては、2008年5月29日に提出された米国特許出願第12／155,111
号、および2008年5月29日に提出されたPCT／US2008／006757号を参照されたい。
【０３０４】
EcR複合体は、ヒンジ領域によって隔てられた、すべてのメンバーがアミノ末端トラン
ス活性化ドメイン（「TA」）、DNA結合ドメイン（「DBD」）およびリガンド結合ドメイン
（「LBD」）の存在によって特徴づけられる核内受容体スーパーファミリーのメンバーで
あるタンパク質を含む。ファミリーの一部のメンバーが、LBDのカルボキシ末端側に別の
トランス活性化ドメインを有してもよい。DBDは、エクジソン応答エレメントに対する特
異性を付与する2つのアミノ酸モチーフ、P-ボックスおよびD-ボックスが間にある2つのシ
ステインジンクフィンガーの存在によって特徴づけられる。これらのドメインは、ネイテ
ィブ性、修飾性、または異種受容体タンパク質の異なるドメインのキメラ体のいずれであ
ってもよい。
【０３０５】
外因性遺伝子、応答エレメント、およびEcR複合体を構成するDNA配列は、古細菌、原核
細胞、例えば大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）もしくは他の腸内細菌など、または
真核細胞、例えば植物細胞もしくは動物細胞などに組み入れることができる。しかし、遺
伝子によって発現されるタンパク質の多くは細菌内では不正確に処理されるため、真核細
胞が好ましい。細胞は単細胞または多細胞生物の形態であってよい。また、外因性遺伝子
、応答エレメントおよび受容体複合体のヌクレオチド配列を、RNA分子として、好ましく
はタバコモザイクウイルスなどの機能性ウイルスRNAの形態で組み入れることもできる。
真核細胞の中でも脊椎動物細胞が好ましいが、これはそれらがEcRに対する本発明のリガ
ンドへの応答を付与する分子を天然では持たないためである。その結果として、それらは
本発明のリガンドに対して「実質的に非感受性」である。したがって、本発明において有
用なリガンドは、形質転換細胞または生物体全体に対して、無視しうる程度の生理学的ま
たは他の影響しか及ぼさないと考えられる。このため、細胞はリガンド自体の存在によっ
て実質的な影響を受けずに、成長して所望の産物を発現することができる。
【０３０６】
EcRリガンドは、外因性遺伝子（例えば、IL-12）と連結した応答エレメントと引き続い
て結合するEcR複合体とともに用いると、外因性遺伝子の発現を外部から時間的に調節す
る手段を提供する。さまざまな構成要素が互いに結合する順序、すなわちリガンドが受容
体複合体に、受容体複合体が応答エレメントに、といったことは特に重要ではない。典型
的には、外因性遺伝子の発現のモジュレーションは、EcR複合体の特異的な制御DNAエレメ
ントまたは調節性DNAエレメントとの結合に応答したものである。EcRタンパク質は、核内
受容体ファミリーの他のメンバーと同様に、少なくとも3つのドメイン、すなわちトラン
ス活性化ドメイン、DNA結合ドメインおよびリガンド結合ドメインを有する。この受容体
は、核内受容体ファミリーのあるサブセットと同様に、ヘテロ二量体化特性を担う詳細に
は解明されていない領域も有する。EcRタンパク質のリガンド結合ドメインに対するリガ
ンドの結合は、USPまたはRXRタンパク質とヘテロ二量体化した後、ヘテロ二量体タンパク
質のDNA結合ドメインが応答エレメントに活性型で結合するのを可能にし、そのようにし
て外因性遺伝子の発現または抑制をもたらす。この機序は、リガンドがEcRまたはUSPのい
ずれかと結合し、その結果として活性ホモ二量体複合体（例えば、EcR＋EcRまたはUSP＋U
SP）が形成されるという可能性を否定するものではない。1つの態様において、受容体ド
メインの1つまたは複数を変更して、キメラ遺伝子スイッチを作製することもできる。典
型的には、キメラ受容体が、選択した宿主細胞または生物においてトランス活性化特性、
リガンドの相補的結合および特異的な応答エレメントの認識に関して最適化されるように
、3つのドメインの1つまたは複数を他のドメインの源とは異なる源から選択することがで
きる。加えて、応答エレメント自体を、酵母由来のGAL-4タンパク質（Sadowski et al., 
Nature 335:563 (1988)を参照）または大腸菌由来のLexAタンパク質（Brent et al., Cel
l 43:729 (1985)を参照）などの他のDNA結合タンパク質ドメインに対する応答エレメント
で修飾または置換して、キメラEcR複合体に順応させることもできる。キメラシステムの
別の利点は、それが、所望の最終結果に応じて、外因性遺伝子を駆動するために用いるプ
ロモーターの選択を可能にすることである。そのような二重制御は、遺伝子療法の領域に
おいて、特に細胞傷害性タンパク質が産生される場合には、発現のタイミングならびに発
現が起こる細胞の両方を制御しうるため、特に重要である可能性がある。適切なプロモー
ターに機能的に連結された外因性遺伝子を対象の細胞に導入する場合、外因性遺伝子の発
現は本発明のリガンドの存在によって制御される。プロモーターは構成的もしくは誘導的
に調節されてもよく、または組織特異的（すなわち、特定の型の細胞のみにおいて発現さ
れる）もしくは生物のある特定の発生段階に対して特異的であってもよい。
【０３０７】
ある態様において、方法の項に記載された治療用スイッチプロモーターは構成的である
。ある態様において、治療用スイッチプロモーターは疾患、障害または病状と関連のある
条件下において活性化され、例えば、プロモーターは、疾患に応答して、特定の生理的、
発生的、分化的もしくは病的条件に応答して、および／または1つもしくは複数の特異的
な生体分子に応答して活性化される；かつ／または、プロモーターは、特定の組織型また
は細胞種において活性化される。ある態様において、疾患、障害または病状は、治療用ポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドに対する反応性がある。例えば、ある非限定的な態様
において、治療用ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、疾患、障害または病状を治療
する、予防する、改善する、症状を軽減する、進行を予防する、または治癒させるために
有用であるが、これらの事項のいずれか1つまたはすべてを達成する必要はない。ある態
様においては、第1および第2のポリヌクレオチドを、疾患、障害または病状と関連のある
条件下におけるリガンド依存性転写因子複合体の発現が可能になるように導入する。1つ
の態様において、治療方法は、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドが発現
し、前記疾患、障害または病状を治療する、改善する、または予防するのに十分なレベル
で対象の全体にわたって散布されるように行われる。本明細書で用いる場合、「散布され
る」とは、対象における効果または活性を十分に有するように、ポリペプチドが改変細胞
から発現されて放出されることを意味する。散布は全身性、局所性またはその中間の任意
のものでよい。例えば、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドが、血流また
はリンパ系を経由して全身性に散布されてもよいであろう。または、治療用ポリペプチド
または治療用ポリヌクレオチドを、治療しようとする組織もしくは臓器中に局所的に散布
させてもよいであろう。
【０３０８】
転写因子およびレポータータンパク質などの種々のポリペプチドをコードする数多くの
ゲノム核酸配列およびcDNA核酸配列が、当技術分野において周知である。当業者は、事実
上すべての公知の遺伝子に関する核酸配列情報にアクセスして、その核酸分子を公的な寄
託機関、その配列を公開した施設から直接入手すること、または定型的な方法を用いてそ
の分子を調製することのいずれかを行うことができる。例えば、下記の配列アクセッショ
ン番号の記載を参照されたい。
【０３０９】
遺伝子スイッチは、特定のリガンドの添加または除去によって遺伝子発現を調節する任
意の遺伝子スイッチシステムであってよい。1つの態様において、遺伝子スイッチは、遺
伝子発現のレベルが、その中に存在するリガンドのレベルに依存するものである。本発明
の遺伝子スイッチ中に用いうるリガンド依存性転写因子の例には、その各々のリガンド（
例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン、
ならびにその類似体および模倣物）によって活性化される核内受容体スーパーファミリー
のメンバー、およびテトラサイクリンによって活性化されるrTTAが非限定的に含まれる。
本発明の1つの局面において、遺伝子スイッチはEcRに基づく遺伝子スイッチである。その
ようなシステムの例には、米国特許第6,258,603号、第7,045,315号、米国特許出願公開第
2006／0014711号、第2007／0161086号、およびWO 01／70816号に記載されたシステムが非
限定的に含まれる。キメラエクジソン受容体システムの例は、米国特許第7,091,038号、
米国特許出願公開第2002／0110861号、第2004／0033600号、第2004／0096942号、第2005
／0266457号、および第2006／0100416号、ならびにWO 01／70816号、第02／066612号、第
02／066613号、第02／066614号、第02／066615号、第02／29075号、および第2005／10861
7号に記載されている。非ステロイド性エクジソンアゴニスト調節システムの一例は、Rhe
oSwitch（登録商標）Mammalian Inducible Expression System（New England Biolabs, I
pswich, MA）である。
【０３１０】
1つの態様において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター
の制御下にある、リガンド依存性転写因子をコードする単一の転写因子配列を含む。転写
因子配列は、天然に存在するかまたは人工的なリガンド依存性転写因子複合体をコードし
てよい。人工的転写因子とは、例えば、配列の突然変異によって、または複数の異なる転
写因子からのドメインを組み合わせることによって転写因子の天然配列が改変されたもの
のことである。1つの態様において、転写因子はグループH核内受容体リガンド結合ドメイ
ン（LBD）を含む。1つの態様において、グループH核内受容体LBDは、EcR、ユビキタス受
容体、オーファン受容体1、NER-1、ステロイドホルモン核内受容体1、レチノイドX受容体
相互作用タンパク質-15、肝臓X受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓
X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用タンパク質14または
ファルネソール受容体からのものである。別の態様において、グループH核内受容体LBDは
エクジソン受容体からのものである。
【０３１１】
EcRおよび他のグループH核内受容体は核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり
、これはそのすべてのメンバーが、アミノ末端トランス活性化ドメイン（TD）、DNA結合
ドメイン（DBD）、およびヒンジ領域によってDBDから隔てられたLBDの存在によって一般
に特徴づけられる。本明細書で用いる場合、「DNA結合ドメイン」という用語は、DNA結合
ドメインが特定の応答エレメントと会合するように機能する限り、最長でDNA結合タンパ
ク質の全長までの、DNA結合タンパク質の最小のポリペプチド配列を含む。核内受容体ス
ーパーファミリーのメンバーは、以下の4つまたは5つのドメインの存在によっても特徴づ
けられる：A／B、C、D、E、およびいくつかのメンバーではF（米国特許第4,981,784号お
よびEvans, Science 240:889 (1988)を参照）。「A／B」ドメインはトランス活性化ドメ
インに対応し、「C」はDNA結合ドメインに対応し、「D」はヒンジ領域に対応し、「E」は
リガンド結合ドメインに対応する。このファミリーのいくつかのメンバーは、「F」に対
応するLBDのカルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインを有することもある。
【０３１２】
DBDは、応答エレメントに対する特異性を付与する2つのアミノ酸モチーフ、P-ボックス
およびD-ボックスが間にある2つのシステインジンクフィンガーの存在によって特徴づけ
られる。これらのドメインは、ネイティブ性、修飾性、または異種受容体タンパク質の異
なるドメインのキメラ体のいずれであってもよい。EcRは、核内受容体ファミリーのサブ
セットと同様に、ヘテロ二量体化特性を担う詳細には解明されていない領域も有する。核
内受容体のドメインはモジュール的な性質があるため、LBD、DBDおよびTDを入れ替えても
よい。
【０３１３】
別の態様において、転写因子は、TD、発現をモジュレートしようとする治療用タンパク
質または治療用ポリヌクレオチドと連係している応答エレメントを認識するDBD；および
グループH核内受容体LBDを含む。ある態様において、グループH核内受容体LBDは置換突然
変異を含む。
【０３１４】
別の態様において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、第1のプロモー
ターの制御下にある第1の転写因子配列、および第2のプロモーターの制御下にある第2の
転写因子配列を含み、該第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転
写因子配列によってコードされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子
として機能するタンパク質複合体、すなわち「二重スイッチ」または「ツーハイブリッド
」に基づく遺伝子スイッチを形成する。第1および第2のプロモーターは同じでも異なって
もよい。
【０３１５】
ある態様において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、1つのプロモー
ターの制御下にある第1の転写因子配列および第2の転写因子配列を含み、該第1の転写因
子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコードされるタ
ンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体、
すなわち「単一遺伝子スイッチ」を形成する。第1の転写因子配列および第2の転写因子配
列は、配列内リボソーム進入部位（IRES）によって連結されていてもよい。IRESはEMCV I
RESであってもよい。
【０３１６】
1つの態様において、第1の転写因子配列は、TD、その発現をモジュレートしようとする
治療用産物配列と連係している応答エレメントを認識するDBD；およびグループH核内受容
体LBDを含むポリペプチドをコードし、第2の転写因子配列は、脊椎動物RXR LBD、無脊椎
動物RXR LBD、ウルトラスピラクルタンパク質LBD、および2つのポリペプチド断片を含む
キメラLBDから選択される核内受容体LBDを含む転写因子をコードし、ここで第1のポリペ
プチド断片は脊椎動物RXR LBD、無脊椎動物RXR LBDまたはウルトラスピラクルタンパク質
LBDからのものであり、第2のポリペプチド断片は異なる脊椎動物RXR LBD、無脊椎動物RXR
LBDまたはウルトラスピラクルタンパク質LBDからのものである。
【０３１７】
別の態様において、遺伝子スイッチは、核内受容体LBDおよびその発現をモジュレート
しようとする外因性遺伝子と連係している応答エレメントを認識するDBDを含む第1のポリ
ペプチドをコードする第1の転写因子配列、ならびにTDおよび核内受容体LBDを含む第2の
ポリペプチドをコードする第2の転写因子配列を含み、ここで核内受容体LBDの1つはグル
ープH核内受容体LBDである。1つの好ましい態様において、第1のポリペプチドはTDを実質
的に含まず、第2のポリペプチドはDBDを実質的に含まない。本発明において、「実質的に
含まない」とは、当該タンパク質が活性化または結合活性を提供するのに十分な当該ドメ
インの配列を含まないことを意味する。
【０３１８】
本発明の別の局面において、第1の転写因子配列はヘテロ二量体パートナーおよびTDを
含むタンパク質をコードし、第2の転写因子配列はDBDおよびLBDを含むタンパク質をコー
ドする。
【０３１９】
一方の核内受容体LBDだけがグループH LBDである場合、もう一方の核内受容体LBDは、
グループH LBDと二量体を形成する任意の他の核内受容体からのものであってよい。例え
ば、グループH核内受容体LBDがEcR LBDである場合、もう一方の核内受容体LBD「パートナ
ー」は、EcR、脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR、ウルトラスピラクルタンパク質（USP）、ま
たは脊椎動物RXR、無脊椎動物RXRおよびUSPから選択される少なくとも2つの異なる核内受
容体LBDポリペプチド断片を含むキメラ核内受容体からのものであってよい（WO 01／7081
6 A2号、国際特許出願第PCT／US02／05235号および米国特許第2004／0096942 A1号を参照
）。「パートナー」核内受容体リガンド結合ドメインは、短縮突然変異、欠失突然変異、
置換突然変異、または別の修飾をさらに含んでもよい。
【０３２０】
1つの態様において、脊椎動物RXR LBDは、ヒト（ヒト、Homo sapiens）、マウス（ハツ
カネズミ、Mus musculus）、ラット（ドブネズミ、Rattus norvegicus）、ニワトリ（チ
ャボ、Gallus gallus）、ブタ（ブタ、Sus scrofa domestica）、カエル（アフリカツメ
ガエル、Xenopus laevis）、ゼブラフィッシュ（ゼブラダニオ、Danio rerio）、ホヤ（
ミサキマメイタボヤ、Polyandrocarpa misakiensis）、またはクラゲ（ミツデリッポウク
ラゲ、Tripedalia cysophora）RXRからのものである。
【０３２１】
1つの態様において、無脊椎動物RXRリガンド結合ドメインは、トノサマバッタ（トノサ
マバッタLocusta migratoria）ウルトラスピラクルポリペプチド（「LmUSP」）、マダニ
（アムブリオンマ-アメリカヌムAmblyomma americanum）RXRホモログ1（「AmaRXR1」）、
マダニ（アムブリオンマ-アメリカヌム）RXRホモログ2（「AmaRXR2」）、シオマネキ（セ
ルカ-プギレーターCeluca pugilator）RXRホモログ（「CpRXR」）、甲虫（チャイロコメ
ノゴミムシダマシTenebrio molitor）RXRホモログ（「TmRXR」）、ミツバチ（ヨーロッパ
ミツバチApis mellifera）RXRホモログ（「AmRXR」）、アブラムシ（モモアカアブラムシ
Myzus persicae）RXRホモログ（「MpRXR」）、または非双翅目（non-Dipteran）／非鱗翅
目（non-Lepidopteran）RXRホモログからのものである。
【０３２２】
1つの態様において、キメラRXR LBDは、脊椎動物種RXRポリペプチド断片、無脊椎動物
種RXRポリペプチド断片、および非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種RXRホモログポリペプチ
ド断片から選択される、少なくとも2つのポリペプチド断片を含む。本発明に用いるため
のキメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも2つの異なる種のRXRポリペプチド断片
を含んでよく、または種が同一である場合、2つまたはそれ以上の複数のポリペプチド断
片はその種のRXRポリペプチド断片の2つまたはそれ以上の異なるアイソフォームからのも
のであってよい。
【０３２３】
1つの態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動物種R
XRポリペプチド断片および1つの無脊椎動物種RXRポリペプチド断片を含む。
【０３２４】
別の態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動物種RX
Rポリペプチド断片および1つの非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種RXRホモログポリペプチ
ド断片を含む。
【０３２５】
リガンドは、核内受容体のLBDと組み合わされると、続いて外来遺伝子と連結している
応答エレメントと結合し、外来遺伝子発現の外部からの時間的調節をもたらす。結合の機
序、または本発明のさまざまな構成要素が互いに結合する順序、すなわち、例えばリガン
ドがLBDに、DBDが応答エレメントに、TDがプロモーターに、といったことは特に重要では
ない。
【０３２６】
1つの具体的な例において、グループH核内受容体のLBDおよびその核内受容体LBDパート
ナーに対するリガンドの結合は、治療用産物配列の発現を可能にする。この機序は、グル
ープH核内受容体（GHNR）またはそのパートナーに対するリガンド結合、およびその結果
生じる活性ホモ二量体複合体（例えば、GHNR＋GHNRまたはパートナー＋パートナー）の形
成の可能性を否定するものではない。好ましくは、受容体ドメインの1つまたは複数を変
更して、ハイブリッド遺伝子スイッチを作製する。典型的には、ハイブリッド遺伝子およ
びその結果生じるハイブリッドタンパク質が、選択した宿主細胞または生物において、ト
ランス活性化活性、リガンドの相補的結合および特定の応答エレメントの認識に関して最
適化されるように、DBD、LBDおよびTDという3つのドメインのうち1つまたは複数を、他の
ドメインの源とは異なる源から選択することができる。加えて、応答エレメント自体を、
酵母由来のGAL-4タンパク質（Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)を参照）もしく
は大腸菌由来のLexAタンパク質（Brent et al., Cell 43:729 (1985)を参照）などの他の
DNA結合タンパク質ドメインに対する応答エレメント、またはそのような特異的相互作用
のために設計、修飾および選択されたタンパク質との標的指向性相互作用に対して特異的
な合成応答エレメント（例えば、Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1
997)を参照）で修飾または置換して、ハイブリッド受容体に適応させることもできる。
【０３２７】
機能性EcR複合体がイムノフィリンなどの別のタンパク質を含んでもよい。転写因子と
して知られる核内受容体ファミリーのタンパク質の別のメンバー（DHR38またはβFTZ-1な
ど）が、EcR、USP、および／またはRXRのリガンド依存性または非依存性パートナーであ
ってもよい。さらに、一般にコアクチベーター（アダプターまたはメディエーターとも呼
ばれる）として知られるタンパク質などの他の補因子も必要とされることもある。これら
のタンパク質はDNAと配列特異的には結合せず、基本的な転写にも関与しない。それらは
、クロマチン構造に影響を及ぼすことにより、またはアクチベーター-開始複合体相互作
用を媒介することにより、アクチベーターのDNA結合の刺激を含む、さまざまな機序を通
じて転写活性化に対する効果を発揮しうる。そのようなコアクチベーターの例には、RIP1
40、TIF1、RAP46／Bag-1、ARA70、SRC-1／NCoA-1、TIF2／GRIP／NCoA-2、ACTR／AIB1／RA
C3／pCIP、さらには乱交雑性コアクチベーターC応答エレメントB結合タンパク質CBP／p30
0が含まれる（総説については、Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:222 (1997)を
参照）。また、コリプレッサー（リプレッサー、サイレンサーまたはサイレンシングメデ
ィエーターとしても知られる）として一般に知られているタンパク質補因子が、リガンド
の非存在下における転写活性化を効果的に阻害するために必要とされることもある。これ
らのコリプレッサーは、リガンドが結合していないEcRと相互作用して、応答エレメント
での活性をサイレンシングさせることができる。現時点での証拠は、リガンドの結合が受
容体のコンフォメーションを変化させ、その結果、コリプレッサーの放出および上記のコ
アクチベーターの動員が起こり、それにより、それらのサイレンシング活性が消失するこ
とを示唆している。コリプレッサーの例には、N-CoRおよびSMRTが含まれる（総説につい
ては、Horwitz et al., Mol Endocrinol. 10:1167 (1996)を参照）。これらの補因子は細
胞もしくは生物内にある内因性のものであってもよく、または調節性もしくは非調節性の
いずれかの様式で発現される導入遺伝子として外因的に添加してもよい。
【０３２８】
外因性遺伝子は、遺伝子スイッチによってコードされるリガンド依存性転写因子のDBD
によって認識される少なくとも1つの応答エレメントを含むプロモーターに機能的に連結
されている。1つの態様において、プロモーターは、応答エレメントの1、2、3、4、5、6
、7、8、9、10、またはそれ以上のコピーを含む。所望の応答エレメントを含むプロモー
ターは、天然に存在するプロモーターであってもよく、または当技術分野において周知の
手法、例えば、最小プロモーターに機能的に連結された1つまたは複数の応答エレメント
を用いて作り出された人工プロモーターであってもよい。
【０３２９】
ポリヌクレオチドを細胞に導入するために、ベクターを用いることができる。ベクター
は、例えば、プラスミドベクターまたは一本鎖もしくは二本鎖のRNAもしくはDNAウイルス
ベクターであってよい。そのようなベクターは、DNAおよびRNAを細胞に導入するための周
知の手法によって細胞に導入することができる。ウイルスベクターは複製能を有してもよ
く、または複製能を欠損していてもよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般に、補完性の
ある宿主細胞のみで起こると考えられる。本明細書で用いる場合、「宿主細胞」または「
宿主」という用語は、1つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドを有している本発明の
細胞を意味して用いられる。
【０３３０】
したがって、最低限でも、ベクターは本発明のポリヌクレオチドを含まなければならな
い。ベクターの他の構成要素には、選択マーカー、クロマチン修飾ドメイン、ベクター上
に同じく存在しうる他のポリペプチド（例えば、致死性ポリペプチド）の発現を駆動する
別のプロモーター、ゲノム組込み部位、組換え部位、および分子挿入中心点（molecular 
insertion pivot）が非限定的に含まれうる。ベクターは、ベクターを所望の治療方法の
具体的な目標に合わせて調整しうるように、ポリヌクレオチドの内部または内部以外のい
ずれかに、任意の数のこれらの追加的なエレメントを含んでよい。
【０３３１】
本発明の1つの態様において、細胞に導入されるベクターは、発現された場合に、本発
明の遺伝子スイッチ構築物が宿主細胞のゲノムに組み込まれたことを指し示す「選択マー
カー遺伝子」をさらに含む。このように、選択用遺伝子はゲノム組込みに関する陽性マー
カーとなりうる。本発明の方法にとって特に重要ではないが、選択マーカー遺伝子の存在
は、ベクター構築物が細胞のゲノム中に組み込まれた生細胞の集団を実施者が選択するこ
とを可能にする。したがって、本発明のある態様は、ベクターが首尾良く組み込まれた細
胞を選択することを含む。本明細書で用いる場合、「選択する」という用語またはその変
形物は、細胞とともに用いる場合、特定の遺伝的構成または表現型を有する細胞を選ぶた
めの標準的な周知の方法を意味するものとする。典型的な方法には、細胞をG418、ネオマ
イシンおよびアンピシリンなどの抗生物質の存在下で培養することが非限定的に含まれる
。選択マーカー遺伝子の他の例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンまた
はミコフェノール酸に対する耐性を付与する遺伝子が非限定的に含まれる。他の選択方法
には、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
またはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼを選択用物質として用いることを可能
にする選択マーカー遺伝子が非限定的に含まれる。1つまたは複数の抗生物質耐性遺伝子
を含むベクター構築物を含む細胞は、したがって、培養下で抗生物質に耐えることができ
ると考えられる。同様に、1つまたは複数の抗生物質耐性遺伝子を含むベクター構築物を
含まない細胞は、培養下で抗生物質に耐えることができないと考えられる。
【０３３２】
本明細書で用いる場合、「クロマチン修飾ドメイン」（CMD）は、クロマチン構造の維
持および／または改変に関連する種々のタンパク質と相互作用するヌクレオチド配列のこ
とを指し、これにはDNAインスレーターなどがあるが、それらには限定されない。Ciavatt
a et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 103:9958 (2006)を参照。CMDの例には、ニ
ワトリβ-グロブリンインスレーターおよびニワトリ高感受性部位4（cHS4）が非限定的に
含まれる。1つまたは複数の遺伝子プログラム（すなわち、プロモーター、コード配列、
および3'調節領域）の間に複数の異なるCMD配列を用いることにより、例えば、これらの
差異のあるCMD DNA配列を、さまざまな微生物またはインビトロのリコンビニアリング技
術と組み合わせて、既存の複遺伝子および単一遺伝子シャトルベクターの間で遺伝子プロ
グラムを「交換」するための「ミニ相同性アーム」として用いることが容易になる。クロ
マチン修飾ドメインの他の例は、当技術分野において公知であるか、または容易に同定す
ることができる。
【０３３３】
本発明とともに用いるための特定のベクターは、タンパク質またはポリヌクレオチドを
コードする発現ベクターである。一般に、そのようなベクターは、発現させようとするポ
リヌクレオチドと機能的に連結された、宿主における発現のために有効なシス作用性制御
領域を含む。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給されるか、補完的ベクター
によって供給されるか、または宿主への導入後にベクター自体によって供給される。
【０３３４】
非常にさまざまな発現ベクターを、タンパク質またはポリヌクレオチドを発現させるた
めに用いることができる。そのようなベクターには、染色体ベクター、エピソームベクタ
ーおよびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来
、酵母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来、アデノ随伴ウイルス、レンチウイル
ス、バキュロウイルス、SV40などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイル
ス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス由来のベク
ター、ならびにそれらの組み合わせに由来するベクター、例えばコスミドおよびファージ
ミドといったプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝子エレメントに由来するものな
どが含まれる。これらすべてを、本発明のこの局面に従った発現のために用いることがで
きる。一般に、宿主においてポリヌクレオチドまたはタンパク質を維持する、増やす、ま
たは発現させるのに適した任意のベクターを、これに関連した発現のために用いることが
できる。
【０３３５】
発現ベクター中のポリヌクレオチド配列は、例えば、mRNAの転写を導くプロモーターを
含む、適切な発現制御配列と機能的に連結されている。そのほかのプロモーターの代表例
には、構成的プロモーターおよび組織特異的または誘導性プロモーターが非限定的に含ま
れる。構成的真核生物プロモーターの例には、マウスメタロチオネインI遺伝子のプロモ
ーター（Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273 (1982)）；ヘルペスウイルスのTKプ
ロモーター（McKnight, Cell 31:355 (1982)）；SV40初期プロモーター（Benoist et al.
, Nature 290:304 (1981)）；およびワクシニアウイルスプロモーターが非限定的に含ま
れる。タンパク質またはポリヌクレオチドの発現を作動させるために用いうると考えられ
るプロモーターのそのほかの例には、アルブミンプロモーター（肝細胞）、プロインスリ
ンプロモーター（膵臓β細胞）などといった、組織特異的プロモーターおよび特定のタン
パク質に対する他の内因性プロモーターが非限定的に含まれる。一般に、発現構築物は、
転写、開始および終結のための部位、ならびに転写される領域に翻訳のためのリボソーム
結合部位を含むと考えられる。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻
訳されるポリペプチドの始端に翻訳を開始させるAUGを、その末端に適切に配置された終
止コドン（UAA、UGAまたはUAG）を含みうる。
【０３３６】
加えて、構築物は発現を調節するとともに発生させる制御領域を含みうる。一般に、そ
のような領域は、いくつか例を挙げるとリプレッサー結合部位およびエンハンサーなどの
ように、転写を制御することによって動作すると考えられる。
【０３３７】
真核生物ベクターの例には、Stratageneから販売されているpW-LNEO、pSV2CAT、pOG44
、pXT1およびpSG；Amersham Pharmacia Biotechから販売されているpSVK3、pBPV、pMSGお
よびpSVL；ならびにClontechから販売されているpCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、p
DsRed2-Mito、およびpCMV-EGFPが非限定的に含まれる。他にも多くのベクターが周知であ
り、市販されている。
【０３３８】
遺伝子プログラムのエレメントの迅速な挿入および除去のための分子挿入中心点を含む
、特に有用なベクターは、米国特許出願公開第2004／0185556号、米国特許出願第11／233
,246号、ならびに国際公開公報WO 2005／040336号およびWO 2005／116231号に記載されて
いる。そのようなベクターの一例は、WO 2007／038276号に記載されたUltra Vector（商
標）Production System（Intrexon Corp., Blacksburg, VA）である。本明細書で用いる
場合、「遺伝子プログラム」は、プロモーター（P）、発現配列（E）および3'調節配列（
3）を含む遺伝子エレメントの組み合わせのことであり、このため「PE3」は1つの遺伝子
プログラムである。遺伝子プログラム内部のエレメントは、遺伝子プログラムのエレメン
トのそれぞれを挟み込んだ分子中心点の間で容易に交換することができる。分子中心点と
は、本明細書で用いる場合、直鎖状に並んだ少なくとも2つの非可変性の稀なまたは一般
的でない制限部位を含むポリヌクレオチドと定義される。1つの態様において、分子中心
点は、直鎖状に並んだ少なくとも3つの非可変性の稀なまたは一般的でない制限部位を含
む。典型的には、任意の1つの分子中心点は、同じ遺伝子プログラム内の任意の他の分子
中心点の稀なまたは一般的でない制限部位を含まないと考えられる。所与の制限酵素が作
用する6ヌクレオチドを上回るコグネイト配列は「稀な」制限部位と呼ばれる。しかし、
統計学的に予測されるよりも低い頻度で出現する6bpの制限部位があり、これらの部位お
よびそれらを切断するエンドヌクレアーゼは「一般的でない」制限部位と呼ばれる。稀な
または一般的でない制限酵素の例には、AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、S
naB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MI
V、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、Sgf I、Srf I、Nru I、Acl I、Cla I、Csp45 I、Age I
、Bst1107 I、BstB I、Hpa I、Aat II、EcoR V、Nhe I、Spe I、Avi II、Avr II、Mfe I
、Afe I、Fsp I、Kpn I、Sca I、BspE I、Nde I、Bfr I、Xho I、Pml I、ApaL I、Kas I
、Xma I、BsrB I、Nsi I、Sac II、Sac I、Blp I、PspoM I、Pci I、Stu I、Sph I、BamH
I、Bsu36 I、Xba I、BbvC I、Bgl II、Nco I、Hind III、EcoR I、BsrG IおよびSse8781
Iが非限定的に含まれる。
【０３３９】
ベクターが、ホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）酵素と呼ばれる第2のクラスの制限
酵素の制限部位を含んでもよい。HE酵素は大きな非対称性制限部位（12〜40塩基対）を有
し、その制限部位は天然では低頻度である。例えば、I-SceIとして知られるHEは18bpの制
限部位
2019000118.tif 000024
を有し、これはランダムな配列の7×1010塩基対毎に1回しか出現しないと予想される。こ
の出現率は、哺乳動物ゲノムの20倍のサイズのゲノム中でわずか1部位に等しい。HE部位
のこの希少性は、HE部位がクローニングベクタープラスミド中の適切な位置に含まれる場
合に、遺伝子操作者が、遺伝子プログラムの完全性を損なうことなしに遺伝子プログラム
を切り出せる見込みを大きく高める。
【０３４０】
宿主細胞における発現のための適切なベクターおよびプロモーターの選択は公知の手順
であり、ベクターの構築および宿主への導入、ならびに宿主におけるその発現のために必
要な手法は、当技術分野において定型的な技能である。
【０３４１】
細胞へのポリヌクレオチドの導入は、ベクターの一時的トランスフェクション、安定的
なトランスフェクションであってもよく、または遺伝子座特異的な挿入であってもよい。
宿主細胞へのベクターの一時的および安定的なトランスフェクションは、リン酸カルシウ
ムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン脂質
媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法に
よって生じさせることができる。そのような方法は、Davis et al., Basic Methods in M
olecular Biology (1986)；Keown et al., 1990, Methods Enzymol. 185: 527-37；Sambr
ook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, N.Y.などの、多くの標準的な実験マニュアルに記載され
ている。これらの安定的な形質転換方法は、細胞のゲノム中へのベクターのランダムな挿
入をもたらす。さらに、ベクターのコピー数および配向も、一般的に言ってランダムであ
る。
【０３４２】
本発明の1つの態様においては、ベクターをゲノム中の生物学的中立部位（bio-neutral
site）に挿入する。生物学的中立部位とは、ポリヌクレオチドの挿入が、細胞の正常な
機能に、仮にあるにしても極めてわずかしか干渉しない、ゲノム中の部位である。生物学
的中立部位を、利用可能なバイオインフォマティクスを用いて分析してもよい。多くの生
物学的中立部位が当技術分野において公知であり、これには例えば、ROSA等価遺伝子座（
ROSA-equivalent locus）がある。他の生物学的中立部位を、当技術分野において周知の
定型的な手法を用いて同定することもできる。ゲノム挿入部位の特性決定は、当技術分野
において公知の方法を用いて行われる。ベクターを細胞に導入する際にポリヌクレオチド
の場所、コピー数および／または配向を制御するために、遺伝子座特異的な挿入の方法を
用いてもよい。遺伝子座特異的な挿入の方法は当技術分野において周知であり、これには
相同組換えおよびリコンビナーゼ媒介ゲノム挿入が非限定的に含まれる。当然ながら、遺
伝子座特異的な挿入方法を本発明の方法に用いる場合には、ベクターは、この遺伝子座特
異的な挿入、例えば限定されるわけではないが相同組換えなどを助けるエレメントを含ん
でもよい。例えば、ベクターが、1、2、3、4個またはそれ以上のゲノム組込み部位（GIS
）を含んでもよい。本明細書で用いる場合、「ゲノム組込み部位」は、そのヌクレオチド
配列が、ゲノム中へのベクターの挿入を可能にする細胞内のゲノムの部分と同一またはほ
ぼ同一である、ベクター配列の部分と定義される。特に、ベクターは、少なくともそのポ
リヌクレオチドを挟み込む2つのゲノム挿入部位を含みうる。当然ながら、GISが追加的な
エレメントを、またはさらにはベクター上に存在するすべてのエレメントを挟み込んでも
よい。
【０３４３】
別の態様において、遺伝子座特異的な挿入を、リコンビナーゼ部位特異的な遺伝子挿入
によって行うこともできる。手短に述べると、限定されるわけではないがPhiC31インテグ
ラーゼなどの細菌リコンビナーゼ酵素は、ヒトゲノム内部の「偽」組換え部位に対して作
用しうる。これらの偽組換え部位はリコンビナーゼを用いる遺伝子座特異的な挿入の標的
となりうる。リコンビナーゼ部位特異的な遺伝子挿入は、Thyagarajan et al., Mol. Cel
l Biol. 21:3926 (2001)に記載されている。リコンビナーゼ部位特異的な遺伝子挿入に用
いうるリコンビナーゼおよびその各々の部位の他の例には、R4およびTP901-1などのセリ
ンリコンビナーゼならびにWO 2006／083253号に記載されたリコンビナーゼが非限定的に
含まれる。
【０３４４】
さらなる態様において、ベクターが、化学療法耐性遺伝子、例えば、多剤耐性遺伝子md
r1、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはO6-アルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェ
ラーゼを含んでもよい。化学療法耐性遺伝子は、構成的（例えば、CMV）または誘導性（
例えば、RheoSwitch（登録商標））プロモーターの制御下にあってよい。この態様におい
て、対象内部の改変細胞を維持しながら対象の疾患を治療することが望まれる場合には、
医師は罹患細胞を破壊するために化学療法薬を適用することができ、その際、改変細胞は
適した化学療法耐性遺伝子の発現のために薬剤から防御されると考えられることから、疾
患または障害の治療、改善または予防のために使用を継続することができる。化学療法耐
性遺伝子を誘導性プロモーターの下に配置することにより、化学療法耐性遺伝子の不必要
な発現を避けることができ、それでも、継続治療が必要とされる場合には依然として利用
可能であると考えられる。改変細胞自体が罹患した場合でも、それらは依然として、以下
に記載する致死性ポリペプチドの発現を誘導することによって破壊することができると考
えられる。
【０３４５】
本発明の方法は、遺伝子スイッチおよび外因性遺伝子をコードするポリヌクレオチドを
対象の細胞に導入することによって行われる。当技術分野において公知である、ポリヌク
レオチドを細胞に導入するための、上記のもののような任意の公知の方法を用いることが
できる。
【０３４６】
ポリヌクレオチドを細胞にエクスビボで導入する場合には、生検、擦過および外科的組
織摘出を非限定的に含む、当技術分野において公知の任意の手法によって、対象から細胞
を入手することができる。単離した細胞は、ポリヌクレオチドを細胞に導入するのに十分
な時間、例えば、2、4、6、8、10、12、18、24、36、48時間またはそれ以上にわたって培
養することができる。初代細胞を短期間培養するための方法は当技術分野において周知で
ある。例えば、細胞をプレート（例えば、マイクロウェルプレート）中で、付着させるか
浮遊させて培養することができる。
【０３４７】
エクスビボでの治療法のためには、細胞を対象から単離して、ポリヌクレオチドを細胞
に導入するのに適した条件下で培養する。ポリヌクレオチドが細胞にひとたび導入されれ
ば、細胞をリガンド依存性転写因子が発現されるのに十分な期間、例えば、0.5、1、2、3
、4、5、6、7、8、9、10、12、18、もしくは24時間またはそれ以上にわたってインキュベ
ートする。ポリヌクレオチドを細胞に導入した後のある時点（意味のあるレベルのリガン
ド依存性転写因子が発現される前または後のいずれか）で、細胞を対象に再導入する。再
導入は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、静脈内注入または組織もしくは
腔への直接注射によって行うことができる。1つの態様においては、細胞を対象に再導入
する前に、細胞におけるポリヌクレオチドの存在を判定する。別の態様においては、ポリ
ヌクレオチドを含む細胞を選択し（例えば、ポリヌクレオチド中の選択マーカーの存在に
基づいて）、ポリヌクレオチドを含む細胞のみを対象に再導入する。細胞を対象に再導入
した後に、リガンドを対象に投与して、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチ
ドの発現を誘導する。1つの代替的な態様においては、治療用ポリペプチドまたは治療用
ポリヌクレオチドが細胞の再導入前に発現されるように、細胞を対象に再導入するよりも
前にリガンドを細胞に添加してもよい。リガンドは、全身性（例えば、経口、静脈内）ま
たは局所性（例えば、腹腔内、髄腔内、脳室内、細胞を再導入する組織もしくは臓器中へ
の直接注射）のいずれかで、任意の適した方法によって投与してよい。リガンド投与の最
適なタイミングは、定型的な範囲にとどまる手法を用いて、細胞および疾患または障害の
それぞれの種類に対して決定することができる。
【０３４８】
本発明のインビボでの治療法は、対象の細胞へのポリヌクレオチドの直接的なインビボ
導入を伴う。ポリヌクレオチドは対象に全身性または局所性（例えば、疾患または障害の
部位）に導入することができる。ポリヌクレオチドが対象にひとたび導入されれば、リガ
ンドを投与して、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドの発現を誘導するこ
とができる。リガンドは、全身性（例えば、経口、静脈内）または局所性（例えば、腹腔
内、髄腔内、脳室内、疾患もしくは障害が起こっている組織もしくは臓器中への直接注射
）のいずれかで、任意の適した方法によって投与してよい。リガンド投与の最適なタイミ
ングは、定型的な範囲にとどまる手法を用いて、細胞および疾患または障害のそれぞれの
種類に対して決定することができる。
【０３４９】
インビボでの使用のためには、本明細書に記載したリガンドを、例えば、溶液、懸濁液
、錠剤、カプセル、軟膏、エリキシル剤および注射用組成物といった、薬学的に許容され
る担体中に取り入れることができる。薬学的組成物は、リガンドを重量比で0.01％から99
％の範囲で含むことができる。組成物は単回投与剤形または多回投与剤形のいずれであっ
てもよい。任意の特定の薬学的組成物におけるリガンドの量は、有効用量、すなわち、所
望の遺伝子発現または抑制を誘発させるために必要な用量に依存すると考えられる。
【０３５０】
薬学的製剤の適した投与経路には、経口、直腸、局所（皮膚、口腔内および舌下を含む
）、膣、避腸的（皮下、筋肉内、静脈内、腫瘍内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）、
および経鼻胃管によるものが含まれる。当業者であれば、好ましい投与経路は治療される
病状に依存すると考えられ、レシピエントの状態などの要因によって変化しうることを理
解するであろう。
【０３５１】
本明細書で用いる場合、「rAD.RheoIL12」という用語は、活性化リガンドの存在下でIL
-12タンパク質を産生させることのできる、RheoSwitch（登録商標）Therapeutic System
（RTS）の遺伝子スイッチの制御下にあるIL-12遺伝子を保有するアデノウイルスポリヌク
レオチドベクターのことを指す。本明細書で用いる場合、「rAd.cIL12」という用語は、
構成的プロモーターの制御下にあるIL-12遺伝子を含むアデノウイルスポリヌクレオチド
制御ベクターのことを指す。
【０３５２】
本明細書で用いる場合、「IL-12p70」という用語は、p40およびp35と一般的に呼ばれる
2つのサブユニットを天然に有するIL-12タンパク質のことを指す。IL-12p70という用語は
、IL-12（p40およびp35）の2つのサブユニットを含む融合タンパク質を範囲に含み、ここ
で融合タンパク質はサブユニットの間にリンカーアミノ酸を含んでもよい。
【０３５３】
本明細書で用いる場合、「免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質」という用語
は、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10Rまたはそのサブユニット
DN、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、CCL3（MIP-
1a）、CCL5（RANTES）、CCL7（MCP3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CC
R7、CCL19（MIP-3b）、CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Cki
ne）、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN
-β、TNF-α、dnFADD、BCG、TGF-α、PD-L1、TGFbRII DN、ICOS-LおよびS100から選択さ
れる免疫モジュレーターの任意の生物活性の少なくとも20％（例えば、少なくとも30％、
40％、50％、60％、70％、80％または90％）を有するタンパク質のことを指す。同様に、
「IL-12の機能を有するタンパク質」という用語は、ヒトIL-12の任意の生物活性の少なく
とも20％（例えば、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％）を有す
るタンパク質のことを指す。そのような免疫モジュレーターの生物活性は周知である。以
下の表を参照されたい。
【０３５４】
（表４）免疫モジュレーターおよびそれらの機能
2019000118.tif 000025
2019000118.tif 000026
2019000118.tif 000027
2019000118.tif 000028
2019000118.tif 000029
2019000118.tif 000030
【０３５５】
IL-12の生物活性も当技術分野において周知であり、これには、ナイーブT細胞のTh1細
胞への分化、T細胞の成長および機能の刺激、T細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞か
らのインターフェロン-γ（IFN-γ）および腫瘍壊死因子-α（TNF-α）の産生、IL-4を介
したIFN-γ抑制の低下、NK細胞およびCD8+細胞傷害性Tリンパ球の細胞傷害活性の強化、I
L-12R-β1およびIL-12R-β2の発現の刺激、MHC IおよびII分子のアップレギュレーション
、ならびに抗血管新生活性が非限定的に含まれる。「IL-12の機能を有するタンパク質」
という用語は、野生型配列がアミノ酸の付加、欠失または置換のうち1つまたは複数によ
って改変されている、野生型IL-12配列の突然変異体、ならびにIL-12の生物活性の1つま
たは複数を模倣する非IL-12タンパク質を範囲に含む。
【０３５６】
本明細書で用いる場合、「活性化すること」または「活性化する」という用語は、関心
対象の遺伝子（例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10Rまた
はそのサブユニットDN、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、
IFN-γ、CCL3（MIP-1a）、CCL5（RANTES）、CCL7（MCP3）、XCL1（リンホタクチン）、CX
CL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MIP-3b）、CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SD
F-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン
、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、PD-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオ
リゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS-LおよびS100から選択される）の発現をもたらす、
遺伝子スイッチの細胞活性の何らかの測定可能な増加のことを指す。
【０３５７】
本明細書で用いる場合、疾患を「治療すること」または疾患の「治療」という用語は、
あるプロトコールを遂行することを指し、それは疾患の徴候または症状を改善するための
取り組みにおいて、1つまたは複数の薬物またはインビトロで遺伝子操作された細胞を、
哺乳動物（ヒトまたは非ヒト）に投与することを含みうる。したがって、「治療すること
」または「治療」は、必ずしも徴候または症状の完全な改善が必要であると解釈されるべ
きではなく、治癒を必要とはせず、特に、対象に対してわずかな効果しかないプロトコー
ルも含む。
【０３５８】
本明細書で用いる場合、「免疫細胞」には、樹状細胞、マクロファージ、好中球、マス
ト細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞およびリンパ球（例えば、B細胞およ
びT細胞）が含まれる。
【０３５９】
本明細書で用いる場合、「樹状細胞」および「DC」という用語は、互換的に用いられる
。
【０３６０】
本明細書で用いる場合、「治療補助細胞」（TSC）という用語は、免疫モジュレーター
の機能を有する1つまたは複数のタンパク質、および任意でIL-12の機能を有するタンパク
質を、腫瘍の微小環境に送達するために、本発明のベクターによって改変すること（例え
ば、トランスフェクトさせること、エレクトロポレーションを行うこと、など）ができる
細胞である。そのようなTSCには、幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞およびケラチノサイト
が非限定的に含まれる。
【０３６１】
本明細書で用いる場合、「インビトロで遺伝子操作された免疫細胞」または「インビト
ロで遺伝子操作された免疫細胞の集団」または「遺伝子操作された免疫細胞の集団」また
は「免疫モジュレーターを発現する免疫細胞」または「IL-12を発現する免疫細胞」とい
う用語は、場合により活性化リガンドによって活性化することができる遺伝子スイッチの
制御下にある、免疫モジュレーターおよび／またはIL-12を条件的に発現する免疫細胞、
例えば樹状細胞のことを指す。
【０３６２】
本明細書で用いる場合、「インビトロで遺伝子操作されたTSC」または「インビトロで
遺伝子操作されたTSCの集団」または「遺伝子操作されたTSCの集団」または「免疫モジュ
レーターを発現するTSC」または「IL-12を発現するTSC」という用語は、場合により活性
化リガンドによって活性化することができる遺伝子スイッチの制御下にある、免疫モジュ
レーターおよび／またはIL-12を条件的に発現する治療補助細胞、例えば幹細胞、繊維芽
細胞、内皮細胞およびケラチノサイトのことを指す。
【０３６３】
本明細書で用いる場合、「改変細胞」という用語は、トランスフェクション、エレクト
ロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン法
、リン酸カルシウム沈殿およびリポフェクション（リソソーム融合）を非限定的に含む過
程によって改変された細胞のことを指す。
【０３６４】
本明細書で用いる場合、「MOI」または「感染多重度」という用語は、特定の実験にお
いて単一細胞を感染させるアデノウイルス粒子（例えば、組換えアデノウイルスまたは対
照アデノウイルス）の平均数のことを指す。
【０３６５】
本明細書で用いる場合、「腫瘍」という用語は、前癌性または癌性細胞および／または
組織のいずれかを問わず、インビボまたはインビトロのいずれかにあるすべての良性また
は悪性の細胞成長および増殖のことを指す。
【０３６６】
本発明に従って治療することができる癌の例には、乳癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌
、膵癌、結腸癌、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣癌、脳悪性腫瘍、原発性脳癌腫、頭頸部癌、
神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭部または頸部の癌腫、乳癌腫
、卵巣癌腫、肺癌腫、小細胞肺癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌腫、精巣癌腫、膀胱癌腫
、膵癌腫、胃癌腫、結腸癌腫、前立腺癌腫、尿生殖器癌腫、甲状腺癌腫、食道癌腫、骨髄
腫、多発性骨髄腫、副腎癌腫、腎細胞癌腫、子宮内膜癌腫、副腎皮質癌腫、悪性膵インス
リノーマ、悪性カルチノイド癌腫、絨毛癌、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血症、子宮頸
部過形成、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性
骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、ヘアリーセル白血病、神経芽
細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、ホジキン病
、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン血症、およ
び網膜芽細胞腫などが含まれる。
【０３６７】
本発明は、免疫モジュレーターおよび任意でIL-12の機能を有するタンパク質を条件的
に発現させるための細胞、例えば免疫細胞およびTSCの遺伝子操作、ならびに癌または腫
瘍またはその両方の治療のための治療的使用および／または適用を提供する。免疫モジュ
レーターおよび任意でIL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する、インビトロ
で遺伝子操作された免疫細胞およびTSCは、そのタンパク質の構成的産生よりも優れてい
る安全な改良物である。加えて、免疫モジュレーターおよび任意でIL-12の発現のタイミ
ングおよびレベルを制御することが可能であることは、治療の有効性の制御の改善をもた
らす。このため、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞およびTSCは、ヒトまたは非ヒ
ト生物における癌または腫瘍の治療のための治療薬として、薬学的組成物へと製剤化する
ことができる。または、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞、TSCまたはそのサブセ
ットの集団を、免疫モジュレーターおよび任意でIL-12タンパク質の産生をヒトまたは非
ヒト生物の体内の特定の領域（正常組織、癌または腫瘍）に条件的に送達するための媒体
として用いることもできる。免疫細胞は自己性または非自己性の樹状細胞であってよい。
樹状細胞は骨髄から、または末梢血循環から単離することができる。ヒト患者では、樹状
細胞の集団を、白血球画分を単離して取り出し、他の血液成分は患者に再注入する白血球
フェレーシス手順を介して単離してもよい。
【０３６８】
別の態様において、樹状細胞は、ヒト造血幹細胞に対して、免疫モジュレーターの機能
を有するタンパク質および任意でIL-12の機能を有するタンパク質を発現する本発明のベ
クターをトランスフェクトさせ、トランスフェクトされた幹細胞を分化させて樹状細胞を
得ることによって調製することもできる。米国特許第6,734,014号を参照。
【０３６９】
1つの態様においては、VP16-RXRおよびGal4-EcRのコード配列がEMCV配列内リボソーム
進入部位（IRES）配列によって隔てられ、アデノウイルスシャトルベクター中にヒトユビ
キチンCプロモーターの制御下にあるように挿入された、遺伝子スイッチを含む核酸アデ
ノウイルスベクターを提供する。IRES配列によって隔てられ、合成誘導性プロモーターの
制御下に配置された、IL12のp40およびp35サブユニットのコード配列を、ユビキチンCプ
ロモーターの上流に挿入する。
【０３７０】
別の態様において、本発明は、大腸菌BJ5183細胞内でアデノウイルス骨格（AdEasy1）
と組み換えた2つの融合タンパク質の転写単位（VP16-RXRおよびGal4-EcR）および誘導性I
L-12サブユニットを有するシャトルベクターを提供する。組換えクローンを検証した後に
、rAd.RheoIL12ゲノムを有するプラスミドをXL10-Gold細胞において増殖させた上で精製
し、消化してプラスミド骨格から分離させ、HEK 293細胞へのトランスフェクションによ
ってパッケージングする。
【０３７１】
1つの特定の態様においては、その結果得られた一次ウイルス株をHEK 293細胞の再感染
によって増幅し、CsCl密度勾配遠心法によって精製する。
【０３７２】
1つの態様において、免疫モジュレーターおよび／またはIL-12遺伝子は、野生型遺伝子
配列である。別の態様において、免疫モジュレーターおよび／またはIL-12遺伝子は、改
変された遺伝子配列、例えば、キメラ配列または好ましいコドンを用いるように改変され
た配列である。
【０３７３】
1つの態様において、免疫モジュレーターおよび／またはIL-12遺伝子は、ヒト野生型配
列である。別の態様において、配列は野生型ヒト配列に対して少なくとも85％同一であり
、例えば、野生型ヒト配列に対して少なくとも90％、95％または99％同一である。さらな
る態様において、遺伝子配列はヒトポリペプチドをコードする。別の態様において、遺伝
子は、野生型ヒトポリペプチドに対して少なくとも85％同一な、例えば、野生型ヒトポリ
ペプチドに対して少なくとも90％、95％または99％同一なポリペプチドをコードする。
【０３７４】
1つの態様において、IL-12遺伝子は野生型マウスIL-12配列である。別の態様において
、配列は野生型マウスIL-12に対して少なくとも85％同一であり、例えば、野生型マウスI
L-12に対して少なくとも90％、95％または99％同一である。さらなる態様において、IL-1
2遺伝子配列はマウスIL-12ポリペプチドをコードする。別の態様において、遺伝子は、野
生型マウスIL-12に対して少なくとも85％同一な、例えば、野生型マウスIL-12に対して少
なくとも90％、95％または99％同一なポリペプチドをコードする。
【０３７５】
DCはヒト、マウスまたは他の哺乳動物由来の骨髄から単離してもよい。樹状細胞をヒト
、マウスまたは他の哺乳動物の血液から単離してもよい。ヒト患者では、樹状細胞の集団
を、白血球画分を単離して取り出し、他の血液成分は患者に再注入する、当技術分野で公
知であるような白血球フェレーシス手順を介して単離してもよい。1つの態様において、D
Cは以前に記載された通り（Tatsumi et al., 2003）、マウス骨髄由来である。手短に述
べると、野生型マウスまたはEGFP Tgマウスの骨髄（BM）を、1000単位／mlの組換えマウ
ス顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子および組換えmIL-4（Peprotech, Rocky Hill
, NJ）を加えた馴化培地（CM）中で、加湿した5％ CO2インキュベーター内において37℃
で7日間培養する。続いて、CD11c+ DCを、例えば、特異的MACSTMビーズを製造元（Milten
yi Biotec, Auburn, CA）の指示に従って用いて単離する。このようにして生成されるCD1
1c+ DCは、形態、ならびにCD11b、CD40、CD80とクラスIおよびII MHC抗原の共発現に基づ
くと、95％を上回る純度である。
【０３７６】
本発明の1つの態様は、ヒトまたは非ヒト生物における遺伝子療法としての癌または腫
瘍またはその両方の治療のための治療的適用に適している、免疫モジュレーターおよび任
意でIL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する、遺伝子操作された免疫細胞お
よびTSCを提供する。1つの態様において、本発明は、遺伝子スイッチを含む、遺伝子操作
された免疫細胞およびTSCを提供する。
【０３７７】
別の態様において、本発明は、エクジソン受容体の少なくとも一部分を含む、遺伝子操
作された免疫細胞およびTSCを提供する。別の態様において、本発明は、エクジソン受容
体に基づく遺伝子スイッチを含む、遺伝子操作された免疫細胞およびTSCを提供する。別
の態様において、本発明は、RheoSwitchを含む、遺伝子操作された免疫細胞およびTSCを
提供する。別の態様において、本発明は、遺伝子スイッチを含む遺伝子操作された免疫細
胞およびTSC、ならびに遺伝子スイッチをモジュレートするリガンドを含むキットを提供
する。別の態様において、キットはジアシルヒドラジンリガンドをさらに含む。別の態様
において、キットはRG-115830またはRG-115932をさらに含む。
【０３７８】
1つの態様において、本発明は、遺伝子操作された免疫細胞およびTSCの集団を提供する
。1つの態様においては、第7日の培養DCを、ある範囲にわたる感染多重度（MOI）で、構
成的もしくは誘導性プロモーターによって作動される免疫モジュレーターおよび／もしく
はIL-12をコードする組換えアデノウイルスで処理するか、またはモックの対照アデノウ
イルスベクター（rAdψ5）に感染させる。48時間後に、感染させたDCを採取し、表現型に
関して、ならびに免疫モジュレーターおよび／またはIL-12の産生に関して、特異的ELISA
キット（BD-PharMingen, San Diego, CA）を用いて、62.5pg／mlという比較的低い検出レ
ベルで分析する。
【０３７９】
別の態様において、本発明は、免疫モジュレーターおよび／またはIL-12の機能を有す
るタンパク質を条件的に発現することができる遺伝子スイッチを有するベクター、例えば
、DNAベクターを含み、さらに活性化リガンドを含む、インビトロで遺伝子操作された免
疫細胞およびTSCの集団を提供する。
【０３８０】
さらなる態様において、本発明は、遺伝子操作されたDCを患者に投与し、続いてRG-115
819、RG-115830またはRG-115932などの活性化リガンドを前記患者に投与することにより
、癌、例えば、黒色腫または神経膠腫を治療する方法を提供する。患者は癌を有するヒト
であっても動物であってもよい。これらの治療法ならびに製品、遺伝子操作された細胞、
キットおよびリガンドは、ヒトの治療法および獣医学的な動物の治療法における用途を有
する。したがって、これらの製品および方法はヒトおよび獣医学的動物のために用いられ
ることを想定している。
【０３８１】
1つの局面において、本発明は、免疫モジュレーターおよび／またはIL-12の機能を有す
るタンパク質を発現する、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの集団を含
む、ヒトまたは非ヒトへの投与に適した薬学的組成物であって、製剤が腫瘍内投与による
投与に適している組成物を提供する。本発明はさらに、RG-115819、RG-115830またはRG-1
15932などの活性化リガンドを含む薬学的組成物であって、腹腔内、経口または皮下投与
による投与に適している組成物も提供する。
【０３８２】
本明細書に記載された特定の態様において、本発明は、腫瘍を治療するための方法であ
って：
a．インビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの集団を哺乳動物に腫瘍内投与す
る段階；および
b．前記哺乳動物に対して、活性化リガンドの治療的有効量を投与する段階、
を、この順序で含む方法を提供する。
【０３８３】
1つの態様においては、活性化リガンドを、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞ま
たはTSCと実質的に同時に、例えば、細胞の投与の前または後の1時間以内のうちに投与す
る。別の態様においては、活性化リガンドを、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞ま
たはTSCの投与時または投与後の約24時間未満のうちに投与する。さらに別の態様におい
ては、活性化リガンドを、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの投与時ま
たは投与後の約48時間未満のうちに投与する。別の態様において、リガンドはRG-115932
である。別の態様においては、リガンドを約1〜50mg／kg／日の用量で投与する。別の態
様においては、リガンドを約30mg／kg／日の用量で投与する。別の態様においては、リガ
ンドを7〜28日の期間にわたって毎日投与する。別の態様においては、リガンドを14日の
期間にわたって毎日投与する。別の態様においては、約1×106〜1×108個の細胞を投与す
る。別の態様においては、約1×107個の細胞を投与する。
【０３８４】
1つの態様においては、IL-2およびIL-12を条件的に発現するように樹状細胞を遺伝子操
作する。IL-2は、エフェクター細胞ならびに調節性T細胞、NK細胞およびNK-T細胞に対し
て強力な免疫調節作用を発揮する。細胞においてIL-2およびIL-12を発現させることは、
互いの受容体の相互アップレギュレーションをもたらし、別々のシグナル伝達経路を理由
とする補完的な生物学的作用によって異なるものを誘導することが予想される。また、IL
-2とIL-12の組み合わせは、免疫刺激の持続時間を延長させるとともに細胞の有効用量を
減少させることも予想され、これは動物による忍容性を高めると考えられる。Dietrich 2
002, Wigginton 2002, 2001, 1996およびKoyama, 1997, McDermott and Atkins 2008；Be
rntsen et al 2008；Tarhini et al 2008；Heemskerk et al 2008；Horton et al 2008を
参照。IL-2のポリヌクレオチド配列は、アクセッション番号U25676（ヒト）；NM_008366
（マウス）；NM_204153（ニワトリ）；およびNM_053836（ラット）で入手可能である。IL
-12のポリヌクレオチド配列は、アクセッション番号NM_000882（ヒトIL12A）；NM_002187
（ヒトIL12B）；NM_008351（マウスIL12a）；NM_008352（マウスIL12b）；NM_213588（ニ
ワトリIL12A）；NM_213571（ニワトリIL12B）；NM_053390（ラットIL12a）；およびNM_02
2611（ラットIL12b）で入手可能である。SEQ ID NO：13、15、21および23は、ヒトおよび
マウスのIL-12ならびにそれらのサブユニットをコードする。
【０３８５】
別の態様においては、IL-18およびIL-12を条件的に発現するように樹状細胞を遺伝子操
作する。IL-18はIFN-γ産生を誘導し、Tヘルパー細胞の発生およびNK活性化を促進する。
加えて、IL-18はGM-CSF産生を増大させ、IL-10産生を減少させることができる。IL-18お
よびIL-12を発現させることで、いずれかのサイトカインのみを投与した場合に観察され
る限界が克服されると予想される。樹状細胞におけるIL-12およびIL-18の発現は、樹状細
胞にいずれかのサイトカインのみを形質導入した場合よりも力強い腫瘍抗原特異的Th1応
答を刺激すると考えられる。
【０３８６】
IL-12およびIL-18の両方を分泌するように遺伝子操作されたDCの腫瘍内注射は、最も高
いレベルのINF-γ産生および完全な腫瘍拒絶反応を媒介した（Tatsumi 2003）。Vujanovi
c, 2006を参照。Coughlin, 1998, Subleski, 206, Tatsumi, 2003、およびSabel, 2007；
Shiratori et al 2007；Lian et al 2007；Iinuma et al 2006も参照されたい。IL-12の
ポリヌクレオチド配列については上記を参照のこと。IL-18のポリヌクレオチド配列は、
アクセッション番号U90434（ヒト）；NM_008360（マウス）；EU747333（ニワトリ）；お
よびAY258448（ラット）で入手可能である。
【０３８７】
別の態様においては、IL-15およびIL-12を条件的に発現するように樹状細胞を遺伝子操
作する。IL-15は一部の生物活性をIL-2と共有しており、そのため、これは癌に対する治
療法に有用な可能性がある。IL-15はNK細胞および活性化T細胞の増殖を刺激し、エフェク
ターT細胞の増量を補助する。IL-15提示はIL-12との相乗作用により、NK細胞によるIFN-
γ産生を強化することが報告されている。Koka, 2004；Basak 2008；Lasek et al 2004。
黒色腫モデルにおいてIL-15およびIL-12の腫瘍内送達は有意な腫瘍退縮を誘導した（Lase
k 1999）。IL-12のポリヌクレオチド配列については上記を参照のこと。SEQ ID NO：11お
よび19はヒトおよびマウスのIL-15をコードする。図2および4は、ヒトおよびマウスのIL-
12およびIL-15に対して用いうるであろう発現システムのプラスミド地図である。
【０３８８】
別の態様においては、IL-21およびIL-12を条件的に発現するように樹状細胞を遺伝子操
作する。IL-21およびその受容体は、IL-2およびIL-15との配列相同性を有している。IL-2
1はNK細胞の増量および成熟を促進する。NK細胞をIL-21で処理するとIL-12受容体の顕著
なアップレギュレーションがもたらされるため、IL-21の生物学的作用はIL-12と相乗的に
作用する可能性がある。加えて、IL-21はIL-12シグナル伝達を強化し、協調的に作用して
IFN-γ産生を増加させることができる。IL-12のポリヌクレオチド配列については上記を
参照のこと。IL-21のポリヌクレオチド配列は、アクセッション番号AF254069（ヒト）；N
M_021782（マウス）；NM_001024835（ニワトリ）；およびNM_001108943（ラット）で入手
可能である。SEQ ID NO：6、7、8、9および17は、ヒトおよびマウスのIL-21をコードする
。SEQ ID NO：1および2は、マウスおよびヒトのIL-12およびIL-21をコードするポリヌク
レオチド構築物である。図7および8は、それぞれヒトおよびマウスのIL-12およびIL-21を
発現させるために用いうるであろう発現システムのプラスミド地図である。
【０３８９】
別の態様においては、TNF-αおよびIL-12を条件的に発現するように樹状細胞を遺伝子
操作する。TNF-αは免疫細胞の強力なアクチベーターであり、抗腫瘍特性を媒介する。加
えて、TNF-αはIL-12と相乗的に作用して、T細胞上のIFN-γおよびIL-12受容体の発現を
強化することができる。ある動物試験において、IL-12およびTNF-αの両方の適用は、DN8
+ T細胞による腫瘍浸潤、有意なIFN-γ産生およびその後の腫瘍退縮をもたらした。Sabel
, 2003, 2004, 2007, Taniguchi, 1998, Lasek, 2000；およびXia et al 2008を参照。IL
-12のポリヌクレオチド配列については上記を参照のこと。TNF-αをコードするポリヌク
レオチド配列は、アクセッション番号X02910（ヒト）；NM_013693（マウス）；およびBC1
07671（ラット）で入手可能である。
【０３９０】
別の態様においては、IL-7およびIL-12を条件的に発現するように樹状細胞を遺伝子操
作する。IL-7はIL-2ファミリーのメンバーであり、T細胞およびB細胞のリンパ球新生（ly
mpophoiesis）のために重要である。IL-7はナイーブT細胞および記憶CD8+ T細胞の生存お
よび増殖のホメオスタシスを調節する。IL-7は腫瘍に対するCTL生成を強化することが証
明されている。加えて、IL-12はCD8+ T細胞に対して作用して、IL-7により媒介される増
殖を強化する。さらに、IL-7およびIL-12はCD8+ T細胞の細胞傷害性を相乗的に強化する
ことが報告されている。Mehrotra, 1995；Sharma et al 2003；Tirapu et al 2002。この
ため、IL-7およびIL-12の共発現はより最適な抗腫瘍応答をもたらすことが予想される。I
L-12をコードするポリヌクレオチド配列については上記を参照のこと。IL-7をコードする
ポリヌクレオチド配列は、アクセッション番号J04156（ヒト）；NM_008371（マウス）；N
M_001037833（ニワトリ）；およびNM_013110（ラット）で入手可能である。
【０３９１】
別の態様においては、GM-CSFおよびIL-12を条件的に発現するように樹状細胞を遺伝子
操作する。GM-CSFは造血始原細胞の分化および増殖を調節し、樹状細胞などの特化した抗
原提示細胞（APC）の成熟において特に重要な役割を果たす。GM-CSFはまた、樹状細胞が
抗原のプロセシングを行って提示する能力も強化する。GM-CSFはIL-12とは異なるように
機能し、動物試験ではいずれも有意な抗腫瘍応答を誘発している。IL-12（T細胞活性化）
とGM-CSF（樹状細胞活性化）の組み合わせは、より強力な抗腫瘍免疫をもたらすと予想さ
れる。動物試験において、GM-CSFはIL-12投与との併用で、複数の癌モデルにおける腫瘍
成長を有意に抑制している。Wang, 2001；Chang, 2007；Jean, 2004；Nair, 2006；Hill 
2002；Small et al 2007。ヒトでの試験において、GM-CSF＋IL-12は黒色腫患者の治療に
用いられて成果を上げているが、この両方のサイトカインの複合作用は流血中B細胞の減
少を招いた。Rasmussen, 2003；Hansson, 2007；Abdalla, 2007。単一細胞におけるGM-CS
FおよびIL-12の共発現により、流血中B細胞の減少のような望ましくない全身作用は回避
されると考えられる。IL-12をコードするポリヌクレオチド配列については上記を参照の
こと。GM-CSFのポリヌクレオチド配列は、アクセッション番号M11734（ヒト）；NM_00996
9（マウス）；EU520303（ニワトリ）；NM_001037660（ラットCsf2ra）；およびNM_133555
（ラットCsf2rb）で入手可能である。
【０３９２】
別の態様においては、ケモカイン（例えば、CCL3（MIP-1a）、CCL5（RANTES）、CCL7（
MCP3）、XCL1（リンホタクチン）、CCL19（MIP-3b）、CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）、
CXCL12（SDF-1）またはCCL21（6Ckine））およびIL-12を条件的に発現するように樹状細
胞を遺伝子操作する。ケモカインは、種々の炎症性および非炎症性の病状において白血球
および他の細胞種の輸送および活性化を調節している化学誘引性サイトカインである。炎
症性サイトカインは炎症および組織傷害において白血球の動員を制御する。恒常性ケモカ
インは、白血球（例えば、樹状細胞）を二次リンパ器官およびその内部に、さらには造血
の際に骨髄内および胸腺内に誘導するといったハウスキーピング機能を遂行する。動物試
験において、IL-12およびCXCL10を発現する2つの別個のアデノウイルスの腫瘍内同時注射
は、CT26マウス結腸直腸腺癌細胞株に由来する腫瘍結節の100％退縮を招いた。Narvaiza 
et al., 2000. Emtage et al., 1999は、IL2とXCL1（リンホタクチン）、またはIL-12とX
CL1のいずれかを発現する2種類の二重組換えアデノウイルスベクターを記載している。マ
ウスにおける乳腺癌腫瘍へのベクターの腫瘍内注射は強力な抗腫瘍応答を誘発し、防御免
疫を生じさせた。他の動物試験において、IL-12およびCCL27を発現するアデノウイルスベ
クターの同時形質導入は、腫瘍退縮および長期的な特異的免疫をもたらした。Gao et al.
, 2007。このため、本発明によるケモカインおよびIL-12の共発現は相乗的な抗腫瘍活性
をもたらすことが予想される。
【０３９３】
別の態様においては、抗血管新生サイトカイン（例えば、IP-10およびMig）およびIL-1
2を条件的に発現するように樹状細胞を遺伝子操作する。IP-10およびMigは、T細胞および
NK細胞の化学誘引物質であり、それらが血管新生を阻害する能力はNK細胞に依存する。動
物試験により、一方がIP10を発現し、もう一方がIL-12を発現する2種類のアデノウイルス
による併用療法は顕著な抗腫瘍相乗効果をもたらすことが示されている。Narvaiza et al
., 2000。他の試験では、IP10またはMIGおよび／またはIL-12を発現するアデノウイルス
ベクターが乳腺癌および線維肉腫のマウスモデルに腫瘍内投与されている。IP-10またはM
IGとIL-12との併用投与は、IP10、MIG、IL-12のみ、または対照を投与した動物と比較し
て担癌動物の大幅な腫瘍退縮および生存期間をもたらし、IP-10、IL12の併用が最も有効
であったことが見いだされた。Palmer, 2001。Mazzolini, 2003；およびHuang 2004も参
照。このため、抗血管新生サイトカインおよびIL-12の共発現は相乗的な抗腫瘍活性をも
たらすことが予想される。
【０３９４】
IL-12を介した遺伝子治療が有効なことを実証するためには、腫瘍内注射後のさまざま
な時点で免疫細胞またはTSCによる免疫モジュレーターおよび／またはIL-12の産生を作動
させることを可能にする条件的cDNA発現システムを用いる。C57BL／6マウスにおける高侵
襲性B16黒色腫モデルでの結果に基づき、以下の結論が下されている：1）活性化リガンド
RG-115830の存在下ではDC.RheoIL12から高レベルのIL-12が分泌されるが、リガンドの非
存在下ではそうではない；2）腫瘍内のDC.RheoIL12に基づく治療法は、処置を行う動物に
DC注射から24時間以内にRG-115830を投与する限り、腫瘍内のDC.cIL12に基づく治療法と
同等に有効である（リガンド供給からそれ以後の時点では、RG-115830療法は奏効しない
）；3）DCにおけるIL-12発現は、腫瘍の微小環境におけるこれらの細胞の生存を延長させ
るように思われ、腫瘍所属リンパ節に移動する腫瘍内注射したDCの数の多さと関連してい
る；および、4）治療法の成績と相関する最も強い免疫は、治療法によってクロスプライ
ミングを受けた腫瘍特異的CD8+ T細胞のレベルであり、腫瘍の微小環境に維持される注入
したDCの数ではない。全体として、これらのデータは、DC.IL12に基づく治療法が、1型CD
8+ T細胞エフェクターのアフェレント事象（クロスプライミング）に対するその正の影響
に基づいて奏効しており、注入したDCによって媒介される抗腫瘍T細胞の腫瘍の微小環境
への動員といった、後に起こるエフェレント事象に対する影響によるものではない可能性
が高いことを示唆している。
【０３９５】
腫瘍内注射の前に、細胞（免疫細胞またはTSC）を、細胞の活性を刺激する因子によっ
て処理してもよい。例えば、細胞を、OX40L、4-1BBL、CD40、CD40L、GITRL、CD70、LIGHT
もしくはICOS-Lを含む正の共刺激分子、または抗CTLA4、抗PD-L1もしくは抗PD-L2抗体な
どの負の共刺激分子などの共刺激分子で処理してもよい。例えば、細胞（例えば、免疫細
胞またはTSC）を、1つまたは複数の共刺激分子を発現する細胞、例えば、CD40リガンド分
子を発現するJ588リンパ腫細胞とともにインキュベートしてもよい。別の態様において、
細胞（免疫細胞またはTSC）を、抗TGF-β抗体（微小環境内のTGFシグナル伝達を阻害する
ため）、抗IL10抗体、TGFbRII DN（遺伝子改変細胞内のTGFシグナル伝達を阻害するため
）、IL-10R DN、dnFADD（細胞内の細胞死経路を阻害するため）、抗SOCS1抗体、siRNAも
しくはデコイ（細胞内の抑制性サイトカインシグナル伝達を阻害するため）、または抗TG
Fa抗体といった、対抗性免疫抑制分子（counter immune suppressant molecule）（寛容
阻害因子（tolerance inhibitor））で処理してもよい。
【０３９６】
図1〜8に示されたポリヌクレオチド配列を有する組換えアデノウイルスを作製する。例
えば、hIL-21は、左ITRの上流の部位での制限消化によって直鎖状にしたhIL-21発現ベク
ターと、HEK293細胞などの許容性細胞株内にある適切な（例えばE3を欠失した）アデノウ
イルス骨格とのコトランスフェクションによって産生される。マウス治療モデルに用いる
ためのマウス樹状細胞またはTSCの形質導入には、マウスの免疫調節性遺伝子を有するア
デノウイルスベクターを用いる。ヒトへの治療的適用のためには、免疫調節性遺伝子のヒ
トホモログをコードするポリヌクレオチドを適切なベクター中に挿入する。ヒトへの治療
的適用のためのアデノウイルスベクターはGMP条件下で作製する。ステージIII／IV黒色腫
患者に対する治療の概要（臨床試験）の例は以下の通りである：この場合における治療は
、アデノウイルスを形質導入した樹状細胞の腫瘍内注射、およびアクチベーター薬（リガ
ンド）の14回の毎日の経口投与を伴う。臨床試験の30日〜1週間前に対象のスクリーニン
グを行う。いかなる手順を開始する前にも、各対象にインフォームドコンセントへの署名
を求める。治験担当者はすべての対象に対して、治験の性質、目的、継続期間、起こりう
る危険、および治験中に行われる手順、ならびに彼らの診療録がFDAによって審査される
可能性があることを伝える。対象（合計16〜20人）を4つのコホートに無作為にグループ
分けする。すべてのコホートに対して、リガンドの初回経口投与からおよそ3時間後に、
最大で5×107個の形質導入樹状細胞の腫瘍内注射を行う。4つのコホートは、投与される
リガンドの1日経口投与量に違いがある：例えば、コホート1＝0.01mg／kg；コホート2＝0
.3mg／kg；コホート3＝1mg／kg；コホート4＝3mg／kg。治療の過程では、アクチベーター
薬およびその主要な代謝産物の単回投与後および定常状態の薬物動態の評価のために、指
定された時間間隔で採血する。同じく、ウイルスベクター、RTS構成要素および腫瘍に対
する体液性および細胞性免疫応答の評価のために、指定された時点で採血する。血清生化
学検査、尿分析および血液学的検査（安全性プロフィール）のために特定の時点で尿を収
集し、血液を採取する。導入遺伝子の発現および治療法の結果としての腫瘍に対する免疫
応答について評価するために、腫瘍および／または所属リンパ節の生検標本を指定された
時点で採取する。有害事象の場合に備えて患者の早期中止に関する基準を策定し、有害事
象は記録する。有害事象および治療成績に関する患者の経過観察を1、2、3および4カ月の
時点で行う。
【０３９７】
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、（a）免疫モジュレーター、例
えば本明細書で開示された免疫モジュレーターを構成的または条件的に発現するように遺
伝子操作された樹状細胞を投与し、かつ（b）免疫モジュレーター、例えば本明細書で開
示された免疫モジュレーターを構成的または条件的に発現するベクターを対象に腫瘍内注
射する。1つの好ましい態様においては、樹状細胞を、Ad-免疫モジュレーターベクター、
特にAd-RTS-免疫モジュレーターベクターを発現するように遺伝子操作する。別の好まし
い態様において、対象に腫瘍内注射するベクターは、Ad-免疫モジュレーターベクター、
特にAd-RTS-免疫モジュレーターベクターである。
【０３９８】
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、（a）IL-12を構成的または条件
的に発現するように遺伝子操作された樹状細胞を投与し、かつ（b）IL-12を構成的または
条件的に発現するベクターを対象に腫瘍内注射する。1つの好ましい態様においては、樹
状細胞を、Ad-IL-12ベクター、特にAd-RTS-IL-12ベクターを発現するように遺伝子操作す
る。別の好ましい態様において、対象に腫瘍内注射するベクターは、Ad-IL-12ベクター、
特にAd-RTS-IL-12ベクターである。
【０３９９】
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、（a）IL-12を構成的または条件
的に発現するように遺伝子操作された樹状細胞を投与し、かつ（b）その対象に1つまたは
複数の抗癌化学療法薬を投与する。1つの好ましい態様において、遺伝子操作された樹状
細胞は、Ad-IL-12ベクター、特にAd-RTS-IL-12ベクターを発現するように遺伝子操作され
ている。1つまたは複数の抗癌化学療法薬は、遺伝子操作された樹状細胞を投与する前、
遺伝子操作された樹状細胞を投与した後、または遺伝子操作された樹状細胞の投与と同時
に投与することができる。1つの好ましい態様において、抗癌化学療法薬は、パクリタキ
セル、パクリタキセルの誘導体もしくは類似体、テモゾロミド、テモゾロミドの誘導体も
しくは類似体、スニチニブ、スニチニブの誘導体もしくは類似体、ゲムシタビン、または
ゲムシタビンの誘導体もしくは類似体である。
【０４００】
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、（a）IL-12を構成的または条件
的に発現するように遺伝子操作された樹状細胞を投与して、（b）IL-12を構成的または条
件的に発現するベクターを対象に腫瘍内注射し、かつ（c）対象に1つまたは複数の抗癌化
学療法薬を投与する。1つの好ましい態様においては、樹状細胞を、Ad-IL-12ベクター、
特にAd-RTS-IL-12ベクターを発現するように遺伝子操作する。別の好ましい態様において
、対象に腫瘍内注射するベクターはAd-IL-12ベクター、特にAd-RTS-IL-12ベクターである
。1つまたは複数の抗癌化学療法薬は、遺伝子操作された樹状細胞およびIL-12を発現する
ベクターを投与する前、遺伝子操作された樹状細胞およびIL-12を発現するベクターを投
与した後、または遺伝子操作された樹状細胞およびIL-12を発現するベクターの投与と同
時に投与することができる。1つの好ましい態様において、抗癌化学療法薬は、パクリタ
キセル、パクリタキセルの誘導体もしくは類似体、テモゾロミド、テモゾロミドの誘導体
もしくは類似体、スニチニブ、スニチニブの誘導体もしくは類似体、ゲムシタビン、また
はゲムシタビンの誘導体もしくは類似体である。
【０４０１】
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、（a）免疫モジュレーター、例
えば本明細書で開示された免疫モジュレーターを構成的または条件的に発現するように遺
伝子操作された樹状細胞を投与し、かつ（b）免疫モジュレーター、例えば本明細書で開
示された免疫モジュレーターを構成的または条件的に発現するベクターを対象に腫瘍内注
射する。1つの好ましい態様においては、樹状細胞を、Ad-免疫モジュレーターベクター、
特にAd-RTS-免疫モジュレーターベクターを発現するように遺伝子操作する。別の好まし
い態様において、対象に腫瘍内注射するベクターは、Ad-IL-免疫モジュレーターベクター
、特にAd-RTS-免疫モジュレーターベクターである。
【０４０２】
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、（a）免疫モジュレーター、例
えば本明細書で開示された免疫モジュレーターを構成的または条件的に発現するように遺
伝子操作された樹状細胞を投与し、かつ（b）対象に1つまたは複数の抗癌化学療法薬を投
与する。1つの好ましい態様において、遺伝子操作された樹状細胞は、Ad-免疫モジュレー
ターベクター、特にAd-RTS-免疫モジュレーターベクターを発現するように遺伝子操作さ
れている。1つまたは複数の抗癌化学療法薬は、遺伝子操作された樹状細胞を投与する前
、遺伝子操作された樹状細胞を投与した後、または遺伝子操作された樹状細胞の投与と同
時に投与することができる。1つの好ましい態様において、抗癌化学療法薬は、パクリタ
キセル、パクリタキセルの誘導体もしくは類似体、テモゾロミド、テモゾロミドの誘導体
もしくは類似体、スニチニブ、スニチニブの誘導体もしくは類似体、ゲムシタビン、また
はゲムシタビンの誘導体もしくは類似体である。
【０４０３】
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、（a）免疫モジュレーター、例
えば本明細書で開示された免疫モジュレーターを構成的または条件的に発現するように遺
伝子操作された樹状細胞を投与して、（b）免疫モジュレーター、例えば本明細書で開示
された免疫モジュレーターを構成的または条件的に発現するベクターを対象に腫瘍内注射
し、かつ（c）対象に1つまたは複数の抗癌化学療法薬を投与する。1つの好ましい態様に
おいては、樹状細胞を、Ad-免疫モジュレーターベクター、特にAd-RTS-免疫モジュレータ
ーベクターを発現するように遺伝子操作する。別の好ましい態様において、対象に腫瘍内
注射するベクターは、Ad-免疫モジュレーターベクター、特にAd-RTS-免疫モジュレーター
ベクターである。1つまたは複数の抗癌化学療法薬は、遺伝子操作された樹状細胞および
免疫モジュレーターを発現するベクターを投与する前、遺伝子操作された樹状細胞および
免疫モジュレーターを発現するベクターを投与した後、または遺伝子操作された樹状細胞
および免疫モジュレーターを発現するベクターの投与と同時に投与することができる。1
つの好ましい態様において、抗癌化学療法薬は、パクリタキセル、パクリタキセルの誘導
体もしくは類似体、テモゾロミド、テモゾロミドの誘導体もしくは類似体、スニチニブ、
スニチニブの誘導体もしくは類似体、ゲムシタビン、またはゲムシタビンの誘導体もしく
は類似体である。
【０４０４】
本発明の方法の任意のものにおいて、疾患または障害は、本出願において開示された疾
患または障害であってよい。1つの態様において、疾患または障害は、本明細書中の表1に
列記された疾患または障害である。別の態様において、疾患または障害は、本明細書中の
表3に列記された疾患または障害である。
【０４０５】
本発明の方法の任意のものにおいて、癌または腫瘍は、本出願において開示された疾患
または障害であってよい。1つの態様において、癌または腫瘍は、本明細書中の表1に列記
された癌または腫瘍である。別の態様において、癌または腫瘍は、本明細書中の表3に列
記された癌または腫瘍である。
【０４０６】
細胞の集団に対する免疫モジュレーターおよび／またはIL-12の発現の効果は、患者か
らの生体試料におけるTh1／Tc1型サイトカイン、IFN-γの発現または活性のレベルを測定
することにより、測定することが可能である。
【０４０７】
本発明の目的のため、本発明は、以下の段階を含む、インビトロで遺伝子操作された免
疫細胞またはTSCに基づく治療レジメンの、癌患者における有効性を判定するための方法
を提供する：
a．インビトロで遺伝子操作された細胞、例えば免疫細胞またはTSCの投与の前にヒト患
者から入手した第1の生体試料におけるインターフェロン-γ（IFN-γ）の発現のレベルま
たは活性のレベルまたはその両方を測定し、それによって対照レベルを求める段階；
b．前記患者に対して、インビトロで遺伝子操作された細胞を腫瘍内投与する段階；
c．前記患者に対して、活性化リガンドの有効量を投与する段階；
d．前記活性化リガンドの投与後の時点で前記患者から入手した第2の生体試料における
IFN-γの発現のレベルまたは活性のレベルまたはその両方を測定し、それによって試験レ
ベルに関するデータを求める段階；および
e．IFN-γの対照レベルを試験レベルと比較する段階であって、対照レベルに比しての
試験レベルにおけるIFN-γの発現、活性またはその両方のレベルの増加を示すデータによ
り、その治療的治療レジメンが前記患者において有効であることが指し示される段階、を
含む方法を提供する。本発明はまた、任意で、
f．生検試料を採取して、腫瘍内浸潤リンパ球（TIL）を算定する段階、および／または
g．治療に反応した腫瘍退縮を観察する段階。
【０４０８】
「対象」という用語は、完全な昆虫、植物または動物のことを意味する。また、対象が
真菌または酵母である場合にも、リガンドは同等に働くものと予期される。本発明ととも
に用いるための動物には、脊椎動物、例えばヒト、齧歯類、サルなどの哺乳動物、および
他の動物が非限定的に含まれるが、ヒトおよびマウスがより好ましい。他の動物には、イ
ヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの獣医学的動物が含まれる。
【０４０９】
理論に拘束されることは望まないが、本発明は、一次試験エンドポイントとして客観的
な臨床反応に注目し、二次試験エンドポイントとしてクロスプライミングを受けた抗腫瘍
CD8+ T細胞（IFN-γを産生する）に注目した上で、インビトロで遺伝子操作されて腫瘍内
注入された免疫細胞およびTSCに基づく遺伝子療法の臨床状況における使用を裏づけるも
のと考えられる。インビボでの免疫モジュレーターおよび／またはIL-12の発現のオンお
よびオフの切り替えが可能であることは、タンパク質発現のタイミングおよびレベルの両
方をリガンドの投与によって制御しうるという点、ならびに、さらに免疫モジュレーター
および／またはIL-12の発現のタイミングはこの方法の治療的有効性にとって決定的に重
要であると予想されるという点で、この治療に安全性および治療的制御の要素を加えるも
のである。
【０４１０】
本発明はさらに、関心対象の遺伝子が条件的に発現されるインビトロで遺伝子操作され
た細胞の、ヒトの疾患の有効かつ効率的な治療のための革新的アプローチとしての治療的
適用の裏づけともなる。
【０４１１】
本明細書において引用された任意の参照文献の任意の教示または示唆と本明細書との間
に矛盾がある場合は、本発明においては後者が優先するものとする。
【０４１２】
本明細書において引用された特許、特許出願および刊行物はすべて、それらの全体が参
照により全面的に組み入れられる。
【０４１３】
前述した態様および例示は本発明の範囲を限定することを全く意図していないこと、な
らびに、本明細書中に提示された特許請求の範囲は、すべての態様および例示を、本明細
書中に明示的に提示されているか否かにかかわらず範囲に含むことを意図していることが
理解されるべきである。
【０４１４】
2008年10月8日に提出された、「遺伝子操作された樹状細胞および癌の治療のための使
用」と題する米国特許出願第12／247,738号は、その全体が参照により本明細書に組み入
れられる。2008年9月29日に提出された、「生物治療用分子の発現のための治療用遺伝子-
スイッチ構築物およびバイオリアクター、ならびにそれらの使用」と題する米国特許出願
第12／241,018号も、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０４１５】
実施例1
Renca腎細胞癌腫瘍モデルにおいて腫瘍特異的な免疫応答および抗腫瘍活性を誘導する
ことのできる樹状細胞の用量および最も有効なサイトカインを判定するための試験に取り
組む。
【０４１６】
この試験には、2種類の腫瘍細胞株：RencaおよびRenca-HAを用いる。後者の細胞株は、
インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）によるRenca細胞のトランスフェクションによ
って作製される。Renca-HAモデルの利点は、CD8特異的およびCD4特異的なHA由来エピトー
プがいずれも公知であって使用されているため、抗原特異的T細胞を追跡しうることにあ
る。
【０４１７】
具体的目標‐樹状細胞の腫瘍内投与後のHA特異的免疫応答の誘導について判定する。
【０４１８】
Renca-HA腫瘍をBALB／cマウスにおいて皮下に定着させる。腫瘍が触知可能になった時
点で、樹状細胞を腫瘍内に注射する。樹状細胞の投与を7日間隔で2回繰り返し、合計3回
の投与を行う。
【０４１９】
以下のマウス群を用いる（各群はマウス3匹を含む）：
1．非処置マウス；
2．対照プラスミドを形質導入した5×105個の樹状細胞を投与したマウス；
3．対照プラスミドを形質導入した106個の樹状細胞を投与したマウス；
4．対照プラスミドを形質導入した5×106個の樹状細胞を投与したマウス；
5．群2〜4と同じ、ただしIL-12を形質導入した樹状細胞を用いる；
6．群2〜4と同じ、ただしIL-15を形質導入した樹状細胞を用いる；および
7．群2〜4と同じ、ただしIL-21を形質導入した樹状細胞を用いる。
【０４２０】
異なるサイトカインの組み合わせの効果を検討するために、マウスに以下のものを同時
に投与する：
8．IL-12を形質導入した5×105個の樹状細胞、およびIL-15を形質導入した5×105個の
樹状細胞、
9．IL-12を形質導入した5×105個の樹状細胞、およびIL-21を形質導入した5×105個の
樹状細胞、ならびに
10．IL-15を形質導入した5×105個の樹状細胞、およびIL-21を形質導入した5×105個の
樹状細胞。
【０４２１】
最終投与から4日後に担癌マウスのリンパ節を収集し、細胞を、MHCクラスI適合ペプチ
ド（CD8+ T細胞応答を検出するため）またはMHCクラスII適合ペプチド（CD4+ T細胞応答
を検出するため）のいずれかで刺激する。
【０４２２】
以下のアッセイを用いる：
1．ELISPOT IFN-γおよびIL-2；
2．T細胞増殖；
3．リンパ節細胞によるTNFα、IL-10、IL-4およびGM-CSFの放出の検出。
【０４２３】
加えて、リンパ節細胞のNK活性を、YAC細胞を標的として評価する。
【０４２４】
並行して、T細胞の非特異的応答を評価するために細胞を抗CD3／CD28抗体で刺激する。
【０４２５】
抗原特異的な免疫応答を誘導することのできる樹状細胞の最も有効な用量を判定する。
【０４２６】
具体的目標2‐サイトカイン遺伝子を形質導入した樹状細胞の抗腫瘍活性を評価する。
【０４２７】
サイトカインを形質導入した樹状細胞のうち、免疫応答の統計学的に有意な誘導が実証
されたもののみを以降の実験に用いる。
【０４２８】
Renca-HA担癌マウスの処置を、具体的目標1に記載した通りに行う。以前の実験で特異
的活性を示した、サイトカインを形質導入したDCの1回分の用量を用いる。対照として、
対照アデノウイルスを形質導入した樹状細胞を用いる。統計学的有意性が達成されるよう
に、各群にはマウス10匹を含める。
【０４２９】
腫瘍成長を評価する。Renca-HA腫瘍は、抗腫瘍効果の免疫学的モニタリングおよび初期
試験のために有用な免疫原性エピトープを含む。しかし、治療の抗腫瘍活性を検証するた
めには、トランスフェクトされていない腫瘍細胞を用いる必要がある。このため、上記の
実験を、Renca腫瘍モデルを用いて再度行う。
【０４３０】
実施例2
ステージIIIおよびIVの黒色腫を有する患者における、RTSの制御下でhIL-12および1つ
または複数の他の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された、アデノウイル
スを形質導入した自己樹状細胞の腫瘍内注射の安全性、忍容性、導入遺伝子の機能、およ
び免疫学的効果を、以下のような手順を通じて評価する。
【０４３１】
ステージIIIおよびIVの黒色腫を有する試験対象が参加する試験を対象の4つのコホート
（群）で行い、各対象に対して、ヒトインターロイキン-12（hIL-12）および1つまたは複
数の他の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された、アデノウイルスを形質
導入した自己（それらを取り出した同じ対象に再挿入する）樹状細胞（DC）の5×107個の
用量での単回腫瘍内注射（黒色腫内）を、アクチベーター薬（活性化リガンド）の毎日の
経口投与と組み合わせて行う。この試験は、ヒトIL-12および1つまたは複数の他の免疫モ
ジュレーターの誘導性発現のためのアデノウイルスベクターによりエクスビボで（細胞を
対象から取り出した後に）形質導入した樹状細胞の注射を用いる。注射したDCからの、IL
-12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの産生は、アクチベーター薬（RG-115
932）の経口投与によるRTSの活性化を通じて「オンに切り替わる」（誘導される）。安全
性および忍容性は、身体診察（ECOGパフォーマンスステータスを含む）、バイタルサイン
測定、血清生化学検査、尿分析、血液学的検査、有害事象「副作用」、ならびにアデノウ
イルス、RTSの構成要素、およびアクチベーター薬に対する抗体および細胞性免疫応答を
通じて評価する。経過を評価するために、アクチベーター薬およびその主要な代謝産物の
単回投与後および定常状態の薬物動態／ADME、標的腫瘍、所属リンパ節および末梢循環の
生検試料におけるhIL-12レベルおよび細胞性免疫応答（T細胞）の分析、ならびに血清サ
イトカインプロファイルの測定を行う。
【０４３２】
例えば、ステージIIIおよびIVの黒色腫を有する対象16人を4つのコホートに分け、コホ
ート1および2には3人を含め、コホート3および4には5人を含める。すべての対象に、RTS
の制御下でヒトIL-12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターをコードするアデノ
ウイルスベクターを形質導入した5×107個の自己DCの単回腫瘍内注射を行う。例えば、対
象に、RTSの制御下にあるヒトIL-12、およびIL-15またはIL-21などの免疫モジュレーター
をコードするアデノウイルスを形質導入した自己DCの腫瘍内注射による投与を行う。
【０４３３】
対象には、初回投与を第1日のDC注射のおよそ3時間前に開始し、さらに連続13日間にわ
たって継続する、アクチベーター薬の1日1回経口投与（コホート1：0.01mg／kg、コホー
ト2：0.1mg／kg；コホート3：1.0mg／kgまたはコホート4：3mg／kg）を行う。アデノウイ
ルスを形質導入した自己樹状細胞の追加注射を、アクチベーター薬の14回の毎日の単回（
1回）経口投与と組み合わせて、再治療の基準を満たす適格対象に投与してもよい。コホ
ート1の各群のすべての対象について、安全性、忍容性、および樹状細胞の機能を、イン
ビトロで遺伝子操作された樹状細胞の注射後から最長1カ月後まで評価し、その後に対象
をアクチベーター薬の次に最も高い用量を投与するように組み入れる。安全性評価は、す
べての対象において、遺伝子操作された樹状細胞の初回注射から3カ月間にわたって継続
し、毒性が観察されるか、または対象が樹状細胞の追加注射を受ける場合には、対象の安
全性をモニターするために経過観察期間を合計6カ月間まで延長する可能性を想定してお
く。
【０４３４】
そのような試験は、黒色腫を有する対象における、経口アクチベーター薬と組み合わせ
た、アデノウイルスを形質導入した自己樹状細胞の単回または多回腫瘍内注射の安全性お
よび忍容性を示す。この試験は、経口アクチベーター薬の定常状態での薬物動態／ADMEを
与える。この試験は、アクチベーター薬の経口投与によるRTSの活性化に応答した、標的
腫瘍および／または所属リンパ節におけるアデノウイルスを形質導入した自己樹状細胞の
hIL-12の発現および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの発現を測定することによ
り、対象におけるRTSの機能性を示す。さらに、この試験は、アクチベーター薬の経口投
与後の、標的腫瘍、所属リンパ節および末梢循環における細胞性免疫応答に関する、アデ
ノウイルスを形質導入した自己樹状細胞の免疫学的効果も示す。
【０４３５】
黒色腫を例示的な癌として選択する。固形腫瘍の中でも特に黒色腫は免疫療法アプロー
チに反応することが示されており、かつ黒色腫は腫瘍内注射および生検のためのアクセス
が容易である。試験に含まれる対象は、切除不能なステージIIIまたはIVの黒色腫を有し
、それは少なくとも0.5cmの直径、任意の厚みの腫瘍、任意の数の波及リンパ節、移行段
階にある転移、または遠隔転移を有する。
【０４３６】
RheoSwitch Therapeutic System、hIL-12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーター
を保有するアデノウイルスの調製
組換えDNAを、エクスビボでのアデノウイルスベクター形質導入により、樹状細胞（DC
）に移入する。組換えDNAを用いて、腫瘍内に注射した未熟樹状細胞からヒトIL-12(p70)
および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターを発現させ、腫瘍の微小環境におけるDC
の生存を付与するとともにその成熟を刺激し、その結果、その後にそれらの所属リンパ節
への移動をもたらす。これはTヘルパー細胞のTh1型への分化の偏りを招くとともに、腫瘍
抗原とのクロスプライミングによる腫瘍特異的細胞傷害性T細胞の活性化も招く。
【０４３７】
組換えアデノウイルスベクターとして用いる組換えDNAは、RheoSwitch（登録商標）The
rapeutic System（RTS）の制御下でのヒトIL-12および1つまたは複数の他の免疫モジュレ
ーターの発現を可能にする。RTSはヒトユビキチンCプロモーターから発現されるバイシス
トロン性メッセージを含み、2つの融合タンパク質：Gal4-EcRおよびVP16-RXRをコードす
る。Gal4-EcRは、酵母Gal4のDNA結合ドメイン（アミノ酸1〜147）と昆虫トウヒシントメ
ハマキ（Choristoneura fumiferana）由来のエクジソン受容体のDFFドメインとの間の融
合物である。別の態様において、RTSはヒトユビキチンCプロモーターから発現されるバイ
シストロン性メッセージからなり、2つの融合タンパク質：Gal4-EcRおよびVP16-RXRをコ
ードする。Gal4-EcRは、酵母Gal4のDNA結合ドメイン（アミノ酸1〜147）と昆虫トウヒシ
ントメハマキ由来のエクジソン受容体のDFFドメインとの間の融合物である。VP16-RXRは
、HSV-VP16の転写活性化ドメインと、ヒトおよびバッタ配列由来のキメラRXRのEFドメイ
ンとの間の融合物である。これらのGal4-EcRおよびVP16-RXR配列は、EMCV由来の配列内リ
ボソーム進入部位（IRES）によって隔てられている。これらの2つの融合タンパク質は、G
al4-EcRが低分子薬（RG-115932）と結合すると二量体化し、6つのGal4結合部位および合
成最小プロモーターを含むGal4応答性プロモーターからのhIL-12および1つまたは複数の
他の免疫モジュレーターの転写を活性化する。上記のRTS転写単位はhIL-12および1つまた
は複数の他の免疫モジュレーターの転写単位の下流に位置する。このRTS-hIL12カセット
全体を、アデノウイルス5ゲノム中に、E1領域が欠失している部位で組み入れる。アデノ
ウイルス骨格はE3遺伝子も欠いている。アデノウイルスベクターAd-RTS-hIL-12の地図は
、US 2009／0123441 A1号の図8に示されている。
【０４３８】
この試験で用いられる組換えアデノウイルスベクターは、ウイルスベクター配列に加え
て、以下の例示的な調節エレメントを含む：ヒトユビキチンCプロモーター、EMCV由来の
配列内リボソーム進入部位、Gal4結合部位の6つのコピーを含む誘導性プロモーター、SP-
1結合部位の3つのコピー、および合成最小プロモーター配列、SV40ポリアデニル化部位、
ならびにヒトα-グロビン遺伝子由来の転写終結配列。他の調節エレメントを代替物とし
て用いることも可能と考えられることが理解されるべきである。
【０４３９】
例示的な組換えアデノウイルスベクターAd-RTS-hIL-12-免疫モジュレーターは、以下の
様式で作製される。EMCV-IRES（配列内リボソーム進入部位）によって隔てられた受容体
融合タンパク質、VP16-RXRおよびGal4-EcRのコード配列を、ヒトユビキチンCプロモータ
ー（構成的プロモーター）の制御下にあるようにアデノウイルスシャトルベクターに挿入
する。引き続いて、IRESによって隔てられたhIL-12のp40およびp35サブユニット、ならび
に1つまたは複数の他の免疫モジュレーターのコード配列を、Gal4結合部位の6つのコピー
を含む合成誘導性プロモーターの制御下にあるように配置し、ユビキチンCプロモーター
および受容体配列の上流に挿入する。このシャトルベクターは、左端から地図単位16（mu
16）までにアデノウイルス血清型5配列を含み、それからはE1配列が欠失し、RTS、IL-12
および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの配列によって置き換えられている（RTS
-hIL-12）。RTS-hIL-12-免疫モジュレーターを有するシャトルベクターを、HT-1080細胞
における一時的トランスフェクションにより、アクチベーター薬依存的なIL-12および他
の免疫モジュレーターの発現に関して検討する。続いて、このシャトルベクターを、HEK 
293細胞内へのコトランスフェクションにより、アデノウイルス骨格と組み換えて、組換
えアデノウイルスAd-RTS-hIL-12-免疫モジュレーターを得る。アデノウイルス骨格は、ゲ
ノムの左端およびE3遺伝子にmu 0〜9.2の配列欠失を含む。このシャトルベクターおよび
アデノウイルス骨格は、mu9.2からmu16までに、それらの間の組換えおよび組換えアデノ
ウイルスベクターの作製を可能にする部分的に重複する配列を含む。この組換えアデノウ
イルスベクターはE1およびE3領域が欠損しているため、このウイルスは正常な哺乳動物細
胞における複製能に欠損がある。しかし、このウイルスは、アデノウイルス-5 E1領域を
有し、それ故にE1機能をトランス性に与えるHEK 293細胞内では複製することができる。
【０４４０】
例示的な組換えアデノウイルスベクターは以下の様式で作製される：ヒトIL12および1
つまたは複数の他の免疫モジュレーターの誘導性発現のためのDNAエレメントを有する直
鎖状にしたシャトルベクター、ならびにアデノウイルス骨格を、HEK293細胞にコトランス
フェクトする。シャトルベクター上およびウイルス骨格上の部分的に重複する配列間の組
換えは組換えアデノウイルスの作製をもたらし、それはHEK293細胞内でウイルス粒子へと
パッケージングされる。このHEK293細胞を、ウシ胎仔血清を含むDMEM中で増殖させる。
【０４４１】
提案した試験に用いるためのウイルスをCsCl密度勾配遠心法によって精製した。組換え
アデノウイルスを2回のプラーク精製に供し、その結果得られた種株を用いて、詳細に特
徴づけられたマスター細胞バンクからのHEK293細胞内での増幅により、マスターウイルス
バンク（MVB）を作製する。このMVBを、複製可能アデノウイルス（RCA）、無菌性、マイ
コプラズマ、外来ウイルス、レトロウイルス、ヒトウイルスHIV1／2、HTLV1／2、HAV、HB
V、HCV、EBV、B19、CMV、HHV-6、7および8、ウシおよびブタウイルス、ベクターの完全シ
ークエンシング、ならびにヒト細胞株におけるAD誘導性のIL-12および1つまたは複数の他
の免疫モジュレーターの発現による機能試験を含む、広範囲にわたるcGMP／GLP出荷試験
に供する。
【０４４２】
MVB由来のウイルスはcGMP施設で精製ウイルスの生産のために用いることができ、これ
を再び、同一性、RCA、無菌性、マイコプラズマ、外来ウイルス、ウイルス粒子と感染単
位との比、宿主細胞DNA、エンドトキシンおよびタンパク質の混入、ならびにヒト細胞株
におけるAD誘導性のIL-12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの発現による機
能試験を含む出荷試験に供することができる。
【０４４３】
hIL-12導入遺伝子および1つまたは複数の他の免疫モジュレーター、ならびにRheoSwitch
（登録商標）Therapeutic System（RTS）を含むアデノウイルスによる自己樹状細胞の形
質導入
ヒト対象由来の樹状細胞にエクスビボで形質導入を行い、腫瘍内に注射する。このDCを
、ウイルス形質導入の前に、生存度、純度（典型的には80％を上回る細胞がDC表現型を示
す）、無菌性、マイコプラズマおよびエンドトキシンに関して特徴づける。ウイルス形質
導入の後に、細胞を繰り返し洗浄して、吸収されなかったウイルスをすべて除去する。最
後の洗浄による上清を、残留ウイルスの含有量に関してPCRによって検査する。これらのD
Cはエクスビボでアデノウイルスベクター（非組込み型ベクター）によって形質導入され
ており、腫瘍内注射およびその後の所属リンパ節への移動後のDCの寿命は短いため、ウイ
ルスDNAが任意の非標的細胞内に取り込まれるとは考えられない。DCのアデノウイルス形
質導入に用いられるプロトコールは80〜90％の形質導入を生じさせると予想され、極めて
効率が高いと考えられる。
【０４４４】
白血球フェレーシスによるPBMCの収集：対象に、UPCI外来のアフェレーシス部門で標準
的な90〜120分の白血球フェレーシスを行う。白血球フェレーシス手順は、一方の腕の静
脈から血液を取り出し；血液を遠心分離機（血球分離機）に通して、ここでその成分を分
離し、1つまたは複数の成分を除去し；かつ、残りの成分を対象の同じ腕または他方の腕
の静脈に戻すことを含む。血液を血球分離装置によって処理する場合、1回に対象の全血
液量の15％を超えて抜き取ることはしない。血球分離機内で、血液は血漿、血小板、白血
球および赤血球に分離される。白血球（WBC）を除去し、他の成分をすべて対象の循環中
に戻す。この手順のために2つの末梢IVラインを用いるように最善を尽くす。それが不可
能であれば、中心ラインが必要になることもある。対象は医師により、白血球フェレーシ
スを行うための清拭を受けなければならず、手順の前にはバイタルサイン（血圧を含む）
について定型的なスクリーニングを受ける。
【０４４５】
処理：収集後に、ロイカパック（leukapack）を手渡しでCPLに搬送し、直ちにELUTRA（
商標）での遠心エルトリエーションによって処理する。これは臨床使用の妥当性が確認さ
れた閉鎖系である。単球画分を回収し、細胞の回収および生存度を確認した後に、それら
をAastromカートリッジに移して、IL-4およびGM-CSFの存在下で6日間培養する。すべての
処理および洗浄手順を無菌条件下で行う。
【０４４６】
初期プレーティング：1つのロイカパックから回収した単球を、トリパンブルー色素の
存在下で算定して、生細胞の数を求める。フローサイトメトリーにより単球の純度を評価
する。単球を、SOP-CPL-0166に従い、1,000IU／mLのIL-4および1,000IU／mLのGM-CSFを含
む無血清かつ抗生物質非含有のCellGenix培地中に5〜10×106個／mLで再懸濁させ、Aarst
romカートリッジに入れる。カセット接種のためには、50mlという最小ローディング量お
よび最小限の細胞数が必要である。
【０４４７】
培養：Aastromカートリッジを、未熟DC生成のための完全に閉鎖されたcGMP適合自動培
養装置であるReplicell Systemのインキュベーターに入れる。
【０４４８】
未熟DCの収集：第6日目に、Aastromカートリッジをインキュベーターから取り出し、未
熟DCを収集する。細胞を1,500rpmでの遠心によって回収し、CellGenix培地で洗浄し、ト
リパンブルー色素の存在下で算定し、形態学的および表現型上の特徴を調べる。
【０４４９】
生存度：これはトリパンブルーの存在下で血球算定器による細胞算定を行うことによっ
て判定する。一般に、収集した細胞の95％超が生存しており、すなわちトリパンブルー色
素を排除する。生存度が70％未満であれば、その未熟DCは廃棄する。
【０４５０】
表現型分類：培養下で生成された細胞を、血球算定器上での顕微鏡観察によって算定し
、予備的な分類百分率（DC対リンパ球）をトリパンブルー色素を用いて得る。分類百分率
の確認は、フローサイトメトリーにより、DC対リンパ球でゲーティングして、未熟DCの同
定のための基準として高度の前方散乱および側方散乱特性を用いて行う。未熟DCは通常、
樹状細胞の形態を有する細胞を80％を上回る割合で含み、DC表現型を有する。
【０４５１】
IL-12p70力価アッセイ：成熟DC（mDC）は、自発的に、または先天性免疫シグナル（例
えば、LPS）の追加を伴ってもしくは伴わずにCD40Lで活性化すると、IL-12p70を産生する
能力を有することが立証されている。標準化されたIL-12p70産生アッセイが最近確立され
ており、これは種々の条件下で生成されたDCワクチンの少量の試料または大規模ロットに
適用可能である。現行の力価アッセイは2つの異なる段階からなり、第1の段階は応答性DC
を、刺激物質としてのヒトCD40リガンド遺伝子を安定にトランスフェクトしたJ588リンパ
腫細胞と同時インキュベートすることを伴う。第2の段階は、これらの共培養物からの上
清を、J558／CD40L+/-LPSで刺激したDCにより分泌されるIL-12p70のレベルに関してLumin
exシステムで検査することを伴う。この力価アッセイはアッセイ間CVが18.5％（n＝30）
で、広いダイナミックレンジを有し、このことは、大きく異なるレベルでのIL-12p70産生
によって特徴づけられるさまざまなDC製品の評価を容易にする。13人の健常ドナーの単球
から生成されたDC製品を用いて確かめたアッセイの正常範囲は8〜999pg／mLであり、平均
は270pg／mLであった。
【０４５２】
樹状細胞の生成および出荷基準
インビトロで生成された樹状細胞の各ロットを、微生物混入物（好気性細菌および嫌気
性細菌、真菌ならびにマイコプラズマ）ならびにエンドトキシンの存在に関して検査し、
表現型上および機能上の特徴づけを行う。対象に注射する樹状細胞はすべて新鮮なものと
し、凍結保存は行わない。
【０４５３】
DCの品質保証試験：上記の通りに生成されたDCを、無菌性、生存度、純度、力価および
安定性について評価する。細胞製剤の出荷のための基準は確立されており、これに厳密に
従う。
【０４５４】
生存度：培養下で生成された細胞を、血球算定器上での顕微鏡観察によって算定し、分
類百分率（DC対リンパ球）をトリパンブルー色素を用いて得る。この算定により、被験培
養物における生細胞のパーセンテージが得られる。出荷基準に合格するためには、トリパ
ンブルー排除による細胞生存度が70％を上回り、単球由来DCマーカーとしてHLA-DRおよび
CD86を発現する細胞が最低70％であることが必要とされる。試験的分析のために、DC成熟
状態を評価するためのCD83およびCCR7、ならびにリンパ球混入を評価するためのCD3およ
びCD19といった追加のマーカーを含めてもよい。
【０４５５】
純度：FITCおよびPEを結合させたmAbで染色した細胞の二色フローサイトメトリー分析
を用いて、形態学的に同定されたDCが、DCに関して定められた表面抗原を発現し、単球な
らびにT細胞およびB細胞系列の抗原を欠いていることを確認する。ワクチン調製のために
は、生成されたDCがHLA-DRおよびCD86を発現しなければならず、CD3、CD19またはCD14を
発現してはならない。mDCとみなされるためには、細胞がCD83+およびCCR7+を発現しなけ
ればならない。
【０４５６】
力価：DCの力価の指標を明確に定めるためには、本発明者らは上記の通りに、それらが
IL-12p70を産生する能力を調べる。
【０４５７】
無菌性：DCを、University of Pittsburgh Medical Center Microbiology Laboratory
にて、BD Bactecシステム（Becton Dickinson Co., Sparks, MD）を用いて細菌（好気性
および嫌気性）ならびに真菌培養によって検査する。微生物培養の最終結果は14日で得ら
れる。ワクチン用のDCの出荷の前には、グラム染色を実施し、微生物の存在が陰性でなけ
ればならない。
【０４５８】
IMCPLはGen-Probe Mycoplasma Tissue Culture Rapid Detection System（Gen-Probe, 
Inc. San Diego, CA）を用いてマイコプラズマを検査しており、これは核酸ハイブリダイ
ゼーション技術に基づいている。エンドトキシン試験は、Limulus Amoebocyte Lysate Py
rogen Plus Assay（Bio Whittaker, Inc., Walkerville, MD）を用いて行う。エンドトキ
シン試験は、細胞培養物について収集時点および最終製品の発売前に行う。許容されるエ
ンドトキシンレベルは体重1kg当たり5EU未満である。形質導入を行わなかった樹状細胞お
よび形質導入を行った樹状細胞を以降の分析のために凍結保存する。
【０４５９】
形質導入細胞はすべて導入遺伝子を発現すると予想される。80％を上回るDCが形質導入
されると予想される。導入遺伝子においてネイティブ性コード配列が維持されるため、製
品は生物学的に活性であると考えられる。腫瘍内に注射されたウイルス形質導入DCは未熟
DC表現型のものであり、それらは成熟するまでIL-12および1つまたは複数の他の免疫モジ
ュレーターを発現せず、それ故にこの段階では、IL-12および1つまたは複数の他の免疫モ
ジュレーターの発現はほとんどが導入遺伝子からのものである。IL-12および1つまたは複
数の他の免疫モジュレーターの導入遺伝子の発現は、低分子アクチベーター薬RG-115932
によって用量依存的な様式で誘導されるため、形質導入DCにおける導入遺伝子発現のレベ
ルを所望のレベルへと制御することができる。ヒト対象への投与のために調製された形質
導入DCのごく一部を、IL12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの発現のアク
チベーター薬依存的な誘導に関して、インビトロで検査することもできる。IL-12および1
つまたは複数の他の免疫モジュレーターの発現を、4ng／mlの感度のELISAによってアッセ
イすることもできる。
【０４６０】
提案した試験に用いられるベクターを形質導入した細胞からの、IL-12および1つまたは
複数の他の免疫モジュレーターのインビトロでの誘導は、ELISAによる評価で、24時間で
細胞106個当たり約500ngのIL-12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターを生じさ
せると予想される。黒色腫のマウスモデルを用いた前臨床試験において、106個またはそ
れ以上の形質導入DCの腫瘍内注射は有効性を示している。しかし、必要とされる腫瘍内注
射はこの量よりも低いレベルで有効性を示しうると予想され、このため、より少ない量ま
たはより多い量が必要かどうかを調べるために、5×107個の形質導入DCの注射を出発点と
して用いてもよい。
【０４６１】
例えば、インビトロで、IL12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの遺伝子
を有する組換えアデノウイルスを形質導入したヒトおよびマウスの細胞株ならびに初代樹
状細胞は、アクチベーター薬に用量依存的に反応したIL12発現の誘導を示す。
【０４６２】
6.3．アクチベーター薬の製剤化
本明細書において用いられるアクチベーター薬は、以下の製剤のいずれか1つの形で製
剤化される：
（1）100％ラブラソール（Labrasol）；
（2）（a）メントール、（b）チモール、（c）ユーカリプトール、（d）アスパルテー
ム、（e）サッカリンナトリウム、（f）クエン酸、（g）ペパーミント香料、（h）クリー
ム香料、（i）ラブラソールを含む、リステリン（Listerine）風味のラブラソール（Lati
tude Pharmaceuticals Inc., USA）；
（3）ミグリオール（Miglyol）812およびホスホリポン（phospholipon）90G（Latitude
Pharmaceuticals Inc., USA）；または
（4）ミグリオール812、ホスホリポン90GおよびビタミンEトコフェリルポリエチレング
リコールスクシネート（Latitude Pharmaceuticals Inc., USA）。
【０４６３】
送達
種々の濃度および特定のプロトコールを想定することができるが、患者を治療するため
の一例は、患者に、RTSの制御下でhIL-12（ヒトインターロイキン12）および1つまたは複
数の他の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作され、滅菌食塩水中に5×107個
の濃度で懸濁させた形質導入自己樹状細胞（AdDC）の腫瘍内注射を、経口アクチベーター
薬（RG-115932）と組み合わせて行うことを含むと考えられる。
【０４６４】
初期治療
第1日の入院患者受診：第1日に、ベースラインの身体診察（バイタルサイン、体重およ
びECOG状態を含む）を行う。ベースラインの血清生化学検査、尿分析および血液学的検査
（安全性プロフィール）のために、尿を収集し、血液を採取する。インビトロで遺伝子操
作された樹状細胞の腫瘍内注射のおよそ3時間前に、各対象にアクチベーター薬（コホー
ト1‐0.01mg／kg、0.3mg／kg、1.0mg／kgおよび3mg／kg）を食事の直後に投与する。アク
チベーター薬およびその主要な代謝産物の単回投与後の薬物動態の評価のために、第1日
に、指定された時間間隔（投与前、AD投与から0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16および2
4時間後）で採血する。各対象に、RTSの制御下でhIL-12および1つまたは複数の他の免疫
モジュレーターを発現するように遺伝子操作された、アデノウイルスを形質導入した自己
樹状細胞の単回腫瘍内注射を5×107個の濃度で行う。対象を局所注射部位反応および／ま
たは過敏反応について注意深くモニターする。第2日から第14日までの入院患者受診：第2
日から第14日まで、各対象にアクチベーター薬を食事の直後に投与する。バイタルサイン
および有害事象を第2日から第14日まで毎日収集する。第4日±24時間の時点で、hIL-12お
よび細胞性免疫応答の測定のために、腫瘍および／または所属リンパ節の生検試料を対象
の約50％から採取する。第8日に体重を測定する。第8日±24時間の時点で、第4日目に生
検を実施しなかった対象から、腫瘍および／または所属リンパ節の生検試料を採取し、hI
L-12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターならびに細胞性免疫応答を測定する
。第4日±24時間および第8日±24時間の時点で、アデノウイルスおよび／またはRTS構成
要素に対する抗体および細胞性免疫応答のアッセイのために血液を採取する。他のサイト
カインの発現がhIL-12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの導入遺伝子の投
与によって影響されるかどうかを調べるために、血清サイトカインプロファイルも得る。
第8日に、ベースラインの血清生化学検査、尿分析および血液学的検査（安全性プロフィ
ール）のために、尿を収集し、血液を採取する。第8日に、アクチベーター薬およびその
主要な代謝産物の定常状態での薬物動態／ADMEの評価のために、指定された時間間隔（投
与前、AD投与から0.5、1、2、4、6、8、12、16および24時間後）で採血する。
【０４６５】
第14日の入院患者受診：第14日に、各対象にアクチベーター薬を食事の直後に投与する
。各対象に身体診察（バイタルサイン、身長、体重およびECOG状態を含む）を行う。血清
生化学検査、尿分析および血液学的検査（安全性プロフィール）のために、尿を収集し、
血液を採取する。第14日±24時間の時点で、アデノウイルスおよび／またはRTS構成要素
に対する抗体および細胞性免疫応答のアッセイのために血液を採取する。他のサイトカイ
ンの発現が影響されるかどうかを調べるために、血清サイトカインプロファイルも得る。
【０４６６】
指定された入院患者受診および外来患者受診時に対象から血液を採取し、アデノウイル
スおよびRTSの構成要素に対する抗体および細胞性免疫応答について測定する。ベースラ
インの血清サイトカインプロファイルのために採血する。AdVeGFP感染性阻止型アッセイ
を用いて、アデノウイルスベクターに対する抗体応答を検出する（Gambotto, Robins et 
al. 2004）。RTS構成要素に対する抗体応答は、患者からの血清および発現ベクターから
産生されたRTSタンパク質を用いるウエスタンブロットおよび／またはELISAによって評価
する。加えて、多重サイトカイン試験を、血清中で、Luminexにより、IL-12、IFN-γ、IP
-10、ならびにIL-2、TNF-α、IL-4、IL-5およびIL-10などの他のTh1／Th2サイトカインに
関して行う。これらの抗体およびサイトカインのアッセイには約10mlの血液が必要である
。
【０４６７】
アデノウイルスおよび／またはRTSの構成要素に対して生じうる抗体および細胞性免疫
応答：指定された入院患者受診および外来患者受診時に対象から血液を採取し、アデノウ
イルスおよびRTSの構成要素および腫瘍抗原に対する抗体および細胞性免疫応答について
評価する。AdVeGFP感染性阻止型アッセイを用いて、アデノウイルスベクターに対する抗
体応答を検出する（Nwanegbo, et al. 2004）。RTS構成要素に対する抗体応答は、対象か
らの血清および発現ベクターから産生されたRTSタンパク質を用いるウエスタンブロット
および／またはELISAによって評価する。加えて、多重サイトカイン試験を、血清中で、L
uminexにより、IL-12、IFN-γ、IP-10、ならびにIL-2、TNFa、IL-4、IL-5およびIL-10な
どの他のTh1／Th2サイトカインに関して行う。これらの抗体およびサイトカインのアッセ
イには約10mlの血液が必要である。
【０４６８】
細胞性免疫応答アッセイには約50〜60mlの血液を用い、それからCD4およびCD8 T細胞サ
ブセットを分離する。分離したT細胞は、AdVおよびRTSに由来する抗原が仮にあるとして
、それらによって活性化されたT細胞によるINF-γ産生に関するELISPOTアッセイにおいて
、エンプティAdVベクター、AdV-RTSまたはAdV-RTS-hIL12-免疫モジュレーターベクターを
形質導入した自己DCと混合する。腫瘍に対する早期免疫応答を評価するために、腫瘍細胞
それ自体および／または共有される黒色腫抗原を発現するDCを用いて同様のアッセイを行
うことも考えられる。必要に応じて追加のアッセイを実施してもよい。
【０４６９】
妊娠試験：妊娠可能な女性には、スクリーニング受診時および再治療期の初回入院患者
受診の前に尿妊娠試験を行う。試験は、初期治療期間およびすべての再治療期間の両方に
おいて、アクチベーター薬の投与の少なくとも72、48、24または12時間前に行う。尿妊娠
試験が陽性であれば、血清妊娠試験による確認を行う。妊娠が確認されれば、対象を治験
に参加させることも、再治療期を継続することも認められない。妊娠試験は必要がある限
り何度も繰り返し実施してよい。
【０４７０】
併用薬物の問診：スクリーニング時、および再治療期の初回入院患者受診の前に、治験
および経過観察期に起こる有害事象との関係について判定するために、各対象に併用薬物
のリストを提供するように依頼する。
【０４７１】
再治療基準：対象が過去のAdDC接種に対して制約となる有害反応を伴わずに忍容性を示
し、かつ再治療時に疾患の進行も症状の悪化も示していなければ、彼らに再治療を検討す
る。治験責任医師および治療に当たる医師の見解で、AdDCのさらなる腫瘍内注射と連続14
日にわたるアクチベーター薬（コホート1からの最大認容用量）との組み合わせに臨床上
の利益の可能性があるという場合は、以下の基準を満たすことを前提として、対象に再治
療を提案する：
1．制約となる毒性が全くなく、
2．対象の疾患が安定しているか、または臨床的もしくは主観的に改善の徴候を示して
おり、かつ
3．RheoSwitch（登録商標）Therapeutic Systemのアデノウイルス構成要素に対する抗
体の所見も細胞性免疫応答の所見もない。
【０４７２】
導入遺伝子の機能および免疫学的効果の評価：スクリーニング中（第-12日から第-7日
まで）、治験の第4日、第8日および第14日、ならびに経過観察の1カ月時点に（表3〜5を
参照）、hIL-12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの導入遺伝子発現ならび
に細胞性免疫応答のインビボ評価のために、腫瘍および関連する所属リンパ節のパンチ生
検試料または切除生検試料を採取する。再治療期間の第-12日〜-第7日および第14日に、h
IL-12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの導入遺伝子発現ならびに細胞性免
疫応答のインビボ評価のために、腫瘍および関連する所属リンパ節の細径針生検試料を採
取する。生検試料を標準的な光学顕微鏡検査および免疫組織化学検査によって評価し、T
細胞の腫瘍および所属リンパ節への細胞浸潤について評価する。生検切片の解釈は、試験
対象の背景を知らない病理医が行うものとする。腫瘍および所属リンパ節における内因性
のIL-12発現とDCにより誘導されたIL-12発現を識別するためには、適切に設計されたプラ
イマーを用いるRNAに対するRT-PCRを行う。血清サイトカインプロファイルのために、ス
クリーニング時、治験の第4日、第8日および第14日、経過観察の1カ月時点、ならびに再
治療期間の第-12日〜第-7日、第8日および第14日に採血する（表3〜5を参照）。他のサイ
トカインの発現がhIL-12導入遺伝子を用いた治療によって影響されるかどうかを調べるた
めに、血清サイトカインプロファイルを得る。多重サイトカイン試験を、血清中で、Lumi
nexにより、IL-12、IFN-γ、IP-10、ならびにIL-2、TNFa、IL-4、IL-5およびIL-10などの
他のTh1／Th2サイトカインに関して行う。これらの抗体およびサイトカインのアッセイに
は約10mlの血液が必要である。
【０４７３】
アクチベーター薬の単回投与後および定常状態での薬物動態：アクチベーター薬および
その主要な代謝産物の単回投与後の薬物動態の評価のために試験の第1日に、さらにアク
チベーター薬およびその主要な代謝産物の定常状態での薬物動態／ADMEの測定のために治
験の第8日に、指定された時間間隔（投与前、朝の投与から0.5、1、1.5、2、4、6、8、12
、16および24時間後）で採血する。血漿をHPLCによって評価して、アクチベーター薬およ
びその主要な代謝産物の以下の定常状態薬物動態エンドポイントを得る：Cmax（観察され
た最高血漿中濃度）、Tmax（観察された最高血漿中濃度までの時間）、Ctrough（0時間お
よび24時間での濃度の平均として算出される、観察された最低血漿中濃度）、C24h（24時
間時の血漿中濃度）、AUC24h（0〜24時間の血漿中濃度-時間曲線下面積）、Ke（見かけの
排出速度）およびT112（見かけの半減期）。
【０４７４】
前述した態様および例示は本発明の範囲を限定することを全く意図していないこと、な
らびに、本明細書中に提示された特許請求の範囲は、すべての態様および例示を、本明細
書中に明示的に提示されているか否かにかかわらず範囲に含むことを意図していることが
理解されるべきである。
【０４７５】
文献
2019000118.tif 000031
2019000118.tif 000032
2019000118.tif 000033
2019000118.tif 000034
2019000118.tif 000035
2019000118.tif 000036
2019000118.tif 000037
【図１】
2019000118.tif 000038
【図２】
2019000118.tif 000039
【図３】
2019000118.tif 000040
【図４】
2019000118.tif 000041
【図５】
2019000118.tif 000042
【図６】
2019000118.tif 000043
【図７】
2019000118.tif 000044
【図８】
2019000118.tif 000045
【図９】
2019000118.tif 000046
【配列表】
2019000118000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月14日(2018.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記述された発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７４】
前述した態様および例示は本発明の範囲を限定することを全く意図していないこと、な
らびに、本明細書中に提示された特許請求の範囲は、すべての態様および例示を、本明細
書中に明示的に提示されているか否かにかかわらず範囲に含むことを意図していることが
理解されるべきである。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数の免疫モジュレ
ーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現させるためのベクター
であって、
該ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転
写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）該リガンド依存性転写因子に
よって活性化されるプロモーターに機能的に連結された、免疫モジュレーターの機能を有
する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含み、
1つまたは複数の免疫モジュレーターが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8
、IL-9、IL-10R DNまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-2
7、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α1、IFN α2、IL-15-R-α、CCL3（MIP-1a）、CCL5（R
ANTES）、CCL7（MCP3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MI
P-3b）、CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、
4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、
dnFADD、BCG、TGF-α、PD-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN
、ICOS-LおよびS100から選択される、ベクター。
［２］
アデノウイルスベクターである、請求項1記載のベクター。
［３］
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項2
記載のベクター。
［４］
免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌク
レオチド、およびIL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、遺
伝子スイッチの調節性プロモーターの制御下にある、請求項1記載のベクター。
［５］
遺伝子スイッチがエクジソン受容体（EcR）に基づく遺伝子スイッチである、請求項1記
載のベクター。
［６］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列と第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを含み、該
第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク
質複合体を形成する、請求項1記載のベクター。
［７］
免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌク
レオチドが、ヒト免疫モジュレーターをコードする、請求項1記載のベクター。
［８］
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒトIL-12をコード
する、請求項3記載のベクター。
［９］
1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を発現
する免疫細胞または治療補助細胞（TSC）の集団を生成する方法であって、1つまたは複数
の免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する組
換えベクターによって免疫細胞を改変する段階を含み、該ベクターが遺伝子スイッチをコ
ードするポリヌクレオチドを含み、
該ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転
写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）該リガンド依存性転写因子に
よって活性化されるプロモーターに機能的に連結された、免疫モジュレーターの機能を有
する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含み、
1つまたは複数の免疫モジュレーターが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8
、IL-9、IL-10R DNまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-2
7、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α1、IFN-α2、IL-15-R-α、CCL3（MIP-1a）、CCL5（R
ANTES）、CCL7（MCP3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MI
P-3b）、CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、
4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、
dnFADD、TGF-α、PD-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICO
S-LおよびS100から選択される、方法。
［１０］
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項9記載の方法。
［１１］
ベクターが、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに
含む、請求項9記載の方法。
［１２］
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチの制
御下にある、請求項11記載の方法。
［１３］
遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項9記載の方法。
［１４］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列と第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを含み、該
第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク
質複合体を形成する、請求項9記載の方法。
［１５］
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒト
免疫モジュレーターをコードする、請求項9記載の方法。
［１６］
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒトIL-12をコード
する、請求項11記載の方法。
［１７］
細胞がヒト樹状細胞である、請求項9記載の方法。
［１８］
樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項17記載の方法。
［１９］
1つまたは複数の免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件
的に発現する組換えベクターによって改変された、1つまたは複数の免疫モジュレーター
の機能を有する1つまたは複数のタンパク質を発現する免疫細胞またはTSCの集団であって
、該ベクターが遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、
該ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転
写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）該リガンド依存性転写因子に
よって活性化されるプロモーターに連結された、免疫モジュレーターの機能を有する1つ
または複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含み、
免疫モジュレーターが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R D
Nまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-
α、IFN-α1、INF-α2、IL-15Rα、IFN-γ、CCL3（MIP-1a）、CCL5（RANTES）、CCL7（MC
P3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MIP-3b）、CXCL9（MI
G）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、4-1BBL、CD40、CD7
0、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、P
D-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS-LおよびS100から
選択される、集団。
［２０］
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項19記載の集団。
［２１］
ベクターが、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに
含む、請求項19記載の集団。
［２２］
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチの制
御下にある、請求項19記載の集団。
［２３］
遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項19記載の集団。
［２４］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列と第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを含み、該
第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク
質複合体を形成する、請求項19記載の集団。
［２５］
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒト
免疫モジュレーターをコードする、請求項19記載の集団。
［２６］
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒトIL-12をコード
する、請求項21記載の集団。
［２７］
細胞がヒト樹状細胞である、請求項19記載の集団。
［２８］
樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項27記載の集団。
［２９］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、インビトロで遺
伝子操作された免疫細胞またはTSCであって、
該遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連
結された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）
該リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、免疫モジュ
レーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含み、
免疫モジュレーターが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R D
Nまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-
α、IFN-γ、IFN-α1、INF-α2、IL-15Rα、CCL3（MIP-1a）、CCL5（RANTES）、CCL7（MC
P3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MIP-3b）、CXCL9（MI
G）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、4-1BBL、CD40、CD7
0、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、P
D-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS-LおよびS100から
選択される、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSC。
［３０］
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項29記載のインビトロで遺伝子操作さ
れた免疫細胞。
［３１］
ベクターが、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに
含む、請求項29記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
［３２］
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチの制
御下にある、請求項29記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
［３３］
遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項29記載のインビトロで遺
伝子操作された免疫細胞。
［３４］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列と第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを含み、該
第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク
質複合体を形成する、請求項29記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
［３５］
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒト
免疫モジュレーターをコードする、請求項29記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細
胞。
［３６］
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒトIL-12をコード
する、請求項31記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
［３７］
ヒト樹状細胞である、請求項29記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
［３８］
樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項37記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細
胞。
［３９］
請求項19記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの集団を含む薬学的
組成物。
［４０］
請求項29記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCを含む薬学的組成物
。
［４１］
腫瘍内、腹腔内または皮下投与に適している、請求項39または40記載の薬学的組成物。
［４２］
細胞の集団が少なくとも104個の細胞を含む、請求項39記載の薬学的組成物。
［４３］
細胞の集団が少なくとも107個の細胞を含む、請求項39記載の薬学的組成物。
［４４］
（a）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現す
るようにインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの集団を、腫瘍の微小環境に
対して腫瘍内投与する段階；および
（b）1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含み
、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質の発現を
誘導して該腫瘍を治療する、哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、
免疫モジュレーターが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R D
Nまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-
α、IFN-γ、IFN-α1、INF-α2、IL-15Rα、CCL3（MIP-1a）、CCL5（RANTES）、CCL7（MC
P3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MIP-3b）、CXCL9（MI
G）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、4-1BBL、CD40、CD7
0、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、P
D-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS-LおよびS100から
選択される、方法。
［４５］
腫瘍が良性腫瘍である、請求項44記載の方法。
［４６］
腫瘍が悪性腫瘍である、請求項44記載の方法。
［４７］
腫瘍が黒色腫である、請求項44記載の方法。
［４８］
腫瘍が悪性黒色腫皮膚癌である、請求項44記載の方法。
［４９］
インビトロで遺伝子操作された免疫細胞が、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオ
チドを含むベクターを含み、該ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結
された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）該
リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、免疫モジュレ
ーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項44記載
の方法。
［５０］
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項44記載の方法。
［５１］
ベクターが、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに
含む、請求項50記載の方法。
［５２］
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチの制
御下にある、請求項51記載の方法。
［５３］
遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項52記載の方法。
［５４］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列と第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを含み、該
第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク
質複合体を形成する、請求項53記載の方法。
［５５］
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒト
免疫モジュレーターをコードする、請求項44記載の方法。
［５６］
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒトIL-12をコード
する、請求項51記載の方法。
［５７］
免疫細胞がヒト樹状細胞である、請求項44記載の方法。
［５８］
樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項57記載の方法。
［５９］
リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項44記載の方法。
［６０］
リガンドがRG-115819、RG-115932およびRG-115830から選択される、請求項44記載の方
法。
［６１］
リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項44記載の方法。
［６２］
リガンドを、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞の前または後の1時間未満のうち
に投与する、請求項44記載の方法。
［６３］
リガンドを、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞の後の24時間未満のうちに投与す
る、請求項44記載の方法。
［６４］
リガンドを、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞の後の48時間未満のうちに投与す
る、請求項44記載の方法。
［６５］
患者における、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞に基づく治療レジメンの有効性
を判定するための方法であって、
（a）それを必要とする該患者から、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞の投与の
前に入手した第1の生体試料におけるインターフェロン-γ（IFN-γ）の発現のレベルまた
は活性のレベルまたはその両方を測定し、それによって対照レベルを求める段階；
（b）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質および任意でIL-1
2の機能を有するタンパク質を条件的に発現するように遺伝子操作された、インビトロで
遺伝子操作された免疫細胞を、それを必要とする患者に対して投与する段階；
（c）活性化リガンドの有効量を、それを必要とする該患者に対して投与する段階；
（d）それを必要とする該患者から、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞および活
性化リガンドの投与後に入手した第2の生体試料におけるIFN-γの発現のレベルまたは活
性のレベルまたはその両方を測定し、それによって試験レベルを求める段階；ならびに
（e）IFN-γの試験レベルを対照レベルと比較し、IFN-γの発現、活性またはその両方
の試験レベルが対照レベルに比して高いことにより、その治療レジメンがそれを必要とす
る該患者において有効であることが指し示される段階を含み、
免疫モジュレーターが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R D
Nまたはそのサブユニット、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-
α、IFN-γ、IFN-α1、INF-α2、IL-15Rα、CCL3（MIP-1a）、CCL5（RANTES）、CCL7（MC
P3）、XCL1（リンホタクチン）、CXCL1（MGSA-α）、CCR7、CCL19（MIP-3b）、CXCL9（MI
G）、CXCL10（IP-10）、CXCL12（SDF-1）、CCL21（6Ckine）、OX40L、4-1BBL、CD40、CD7
0、GITRL、LIGHT、b-デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、P
D-L1 RNAi、PD-L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS-LおよびS100から
選択される、方法。
［６６］
それを必要とする患者がヒト患者である、請求項65記載の方法。
［６７］
患者が癌患者である、請求項65記載の方法。
［６８］
癌患者が黒色腫患者である、請求項67記載の方法。
［６９］
IFN-γのレベルをELISAによって測定する、請求項65記載の方法。
［７０］
免疫細胞が、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質および任
意でIL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するように、かつ遺伝子スイッチを
コードするポリヌクレオチドを含むベクターを含むようにインビトロで遺伝子操作されて
おり、
該ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転
写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）該リガンド依存性転写因子に
よって活性化されるプロモーターに連結された、免疫モジュレーターの機能を有する1つ
または複数のタンパク質および任意でIL-12をコードするポリヌクレオチドとを含む、請
求項65記載の方法。
［７１］
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項70記載の方法。
［７２］
遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項70記載の方法。
［７３］
リガンドがEcRのリガンド結合ドメインと結合する、請求項72記載の方法。
［７４］
リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項72記載の方法。
［７５］
リガンドがRG-115819、RG-115932およびRG-115830から選択される、請求項74記載の方
法。
［７６］
リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項72記載の方法。
［７７］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列と第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを含み、該
第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク
質複合体を形成する、請求項72記載の方法。
［７８］
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ヒトIL-12をコード
する、請求項70記載の方法。
［７９］
免疫細胞がヒト樹状細胞である、請求項65記載の方法。
［８０］
樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項79記載の方法。
［８１］
活性化リガンドを腫瘍内、経口的、腹腔内または皮下に投与する、請求項65記載の方法
。
［８２］
活性化リガンドを、インビトロで遺伝子操作された樹状細胞の前または後の1時間未満
のうちに投与する、請求項65記載の方法。
［８３］
活性化リガンドを、インビトロで遺伝子操作された樹状細胞の後の24時間未満のうちに
投与する、請求項65記載の方法。
［８４］
活性化リガンドを、インビトロで遺伝子操作された樹状細胞の後の48時間未満のうちに
投与する、請求項65記載の方法。
［８５］
（a）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質および任意でIL-1
2の機能を有するタンパク質の発現を制御する遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオ
チドを含むベクターを含むように遺伝子操作された免疫細胞と、（b）遺伝子スイッチを
活性化するリガンドとを含むキット。
［８６］
リガンドがRG-115819、RG-115830またはRG-115932である、請求項85記載のキット。
［８７］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、1つのプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列を含み、該第1の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコードされるタンパク質とが相互作
用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項1
記載のベクター。
［８８］
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列がEMCV配列内リボソーム進入部位（IRES）
によって連結されている、請求項87記載のベクター。
［８９］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、1つのプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列を含み、該第1の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコードされるタンパク質とが相互作
用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項29
記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
［９０］
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列がEMCV配列内リボソーム進入部位（IRES）
によって連結されている、請求項89記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
［９１］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、1つのプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列を含み、該第1の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコードされるタンパク質とが相互作
用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項53
記載の方法。
［９２］
第1の転写因子配列および第2の転写因子がEMCV配列内リボソーム進入部位（IRES）によ
って連結されている、請求項91記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
［９３］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、1つのプロモーターの制御下にある
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列を含み、該第1の転写因子配列によってコー
ドされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコードされるタンパク質とが相互作
用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項72
記載の方法。
［９４］
第1の転写因子配列および第2の転写因子配列がEMCV配列内リボソーム進入部位（IRES）
によって連結されている。請求項93記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞。
［９５］
インビトロで遺伝子操作された免疫細胞または治療補助細胞の2つまたはそれ以上の集
団を含む組成物を含む組成物であって、組成物中のインビトロで遺伝子操作された細胞の
各集団が、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、該ポリ
ヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子を
コードする少なくとも1つの転写因子配列と、（2）該リガンド依存性転写因子によって活
性化されるプロモーターに連結された、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質を
コードするポリヌクレオチドとを含み、組成物中のインビトロで遺伝子操作された細胞の
各集団が、組成物中のインビトロで遺伝子操作された細胞の他の集団において発現される
1つまたは複数の免疫モジュレーターとは異なる1つまたは複数の免疫モジュレーターを発
現する、組成物。
［９６］
哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、
（a）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現す
るようにインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの2つまたはそれ以上の集団を
、腫瘍の微小環境に対して腫瘍内投与する段階であって、
免疫細胞またはTSCの各集団が1つまたは複数の免疫モジュレーターの異なるセットを発
現する、段階；および
（b）1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を該哺乳動物に投与する段階を含
み、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質の発現を誘導して該腫瘍を
治療する、方法。
［９７］
哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、
（a）免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質およびIL-12の機
能を有するタンパク質を条件的に発現するようにインビトロで遺伝子操作された免疫細胞
またはTSCの2つまたはそれ以上の集団を、腫瘍の微小環境に対して腫瘍内投与する段階で
あって、
免疫細胞またはTSCの各集団が免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタン
パク質の異なるセットを発現し、
免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質またはIL-12のうち少なくとも1つが、リ
ガンドによって活性化される条件的プロモーターの制御下にある段階；ならびに
（b）1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を該哺乳動物に投与する段階を含
み、
それにより、免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質および／またはIL-12の機
能を有するタンパク質の発現を誘導して該腫瘍を治療する、方法。
【外国語明細書】
2019000118000001.pdf