(57)【要約】【課題】特定の糖鎖構造を未分化マーカーとして有する細胞を結合することが可能な吸着剤を用いた細胞の分離方法において、吸着剤に結合した未分化マーカーを有する細胞を、吸着剤から剥離回収する方法を提供すること。【解決手段】特定の構造を有する糖鎖に結合性を有するタンパク質を水に不溶性の担体に固定化して得られる吸着剤と、特定の糖鎖構造を未分化マーカーとして有する細胞を含む細胞混合物とを接触させたのち、吸着剤に結合した未分化マーカーを有する細胞を、糖類を含む水溶液で処理し、未分化マーカーを有する細胞を吸着剤から剥離回収する方法により、前記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸着剤に結合した細胞を、剥離液で処理することにより吸着剤から剥離させることを特徴とする、細胞の剥離回収方法であって、
前記吸着剤が、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」に結合性を有するタンパク質が水に不溶性の担体に固定化された構成を有する、方法。
【請求項２】
剥離液がフコースおよび浸透圧調節剤を含む水溶液であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞の剥離回収方法。
【請求項３】
浸透圧調節剤が糖類および／または糖アルコール類であることを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞の剥離回収方法。
【請求項４】
「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」に結合性を有するタンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の細胞の剥離回収方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」に結合性を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に結合性を有するタンパク質。
【請求項５】
水に不溶性の担体に親水性高分子が共有結合で固定されていることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の細胞の剥離回収方法。
【請求項６】
以下の（Ａ）から（Ｃ）の工程を含む工程から製造された吸着剤を用いることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の細胞の剥離回収方法：
（Ａ）水に不溶性の担体に親水性高分子を共有結合で固定する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた親水性高分子を共有結合で固定した担体に、請求項４の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化するための官能基を導入する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた官能基を導入した担体に、請求項４の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化する工程。
【請求項７】
以下の（Ｘ）から（Ｚ）に記載の工程を含むことを特徴とする、細胞の分離方法：
（Ｘ）請求項１に記載の吸着剤と、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を含む細胞混合物とを接触させる工程、
（Ｙ）前記（Ｘ）に記載の工程後、吸着剤に結合した「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞と、吸着剤に結合しない細胞とを分離する工程、
（Ｚ）前記（Ｙ）に記載の工程後、請求項１から６のいずれかに記載の細胞の剥離回収方法により、吸着剤に結合した「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を剥離回収する工程。
【請求項８】
カラムに充填した吸着剤を用いることを特徴とする、請求項７に記載の細胞の分離方法。
【請求項９】
「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞が未分化細胞である、請求項７または８に記載の細胞の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の構造を有する糖鎖に結合性を有するタンパク質を、水に不溶性の担体に固定化した吸着剤を用いる細胞の分離方法において、特定の糖鎖構造を未分化マーカーとして有する細胞を吸着剤に結合させ、剥離回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療分野に関する研究が著しく進展しており、再生医療支援事業の市場規模は２０３０年に世界で５１兆円、国内でも５５００億円に達すると予測されている。ヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞から分化誘導される細胞は、造血幹細胞などの血球系細胞、心筋細胞などの筋肉系細胞、神経幹細胞などの神経系細胞、網膜色素上皮細胞などの上皮系細胞など多岐に渡り、多能性幹細胞より誘導した医療用細胞を利用した再生医療の実現に対する期待が急速に高まりつつある。特に山中らにより樹立された人工多能性幹細胞であるｉＰＳ細胞は、受精胚を使用するＥＳ細胞に比べて倫理的障壁が低く、自家組織から樹立できるという極めて大きなメリットがあり、ドナーに負担を与えることなく比較的容易に樹立可能であることが知られている。
【０００３】
しかしながら、ｉＰＳ細胞より作製された再生医療用細胞については、安全性評価、品質管理および安定大量供給システムが十分に整備されていないのが現状であり、特に、ｉＰＳ細胞の安全性評価は今後の大きな課題となっている。さらに、ｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞は、多様な体細胞に分化出来る能力を有している反面、分化誘導させた細胞集団の中に未分化状態の幹細胞（以下、未分化細胞）が残存する性質があることがわかっており、実用化にあたっては、目的とする分化誘導させた細胞を純化精製すると同時に、腫瘍形成の可能性が高い未分化細胞を除去する方法の開発が必要不可欠である。
【０００４】
未分化細胞を除去する方法としては、例えば、以下の方法が知られている。非特許文献１に開示されている方法では、ｉＰＳ細胞から心筋細胞を誘導する際に、通常は培養液に必要不可欠とされるグルコースおよびグルタミンを除去し、心筋細胞にとってエネルギー源となる乳酸を添加することにより、未分化細胞のみを選択的に除去し、心筋細胞のみを選別できるということが報告されている。また、特許文献１に開示されている方法では、ｉＰＳ細胞表面に存在する未分化マーカーに結合するレクチンであるＢＣ２ＬＣＮレクチンのＣ末端へ緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ）由来外毒素の触媒ドメイン（ＰＥ２３）を結合した融合タンパクを調製し、体細胞の分化誘導中に添加することで、未分化細胞の除去が可能であることが報告されている。
【０００５】
しかしながら、これら非特許文献１および特許文献１に開示されている方法では、ｉＰＳ細胞の増殖に必要な栄養素を枯渇させる、または毒素の作用により不要な未分化細胞を死滅させ除去することから、除去対象となる未分化細胞を生細胞として回収することはできなかった。そのため、残存する未分化細胞自体の性状解析が出来ず、細胞数、分化能、表面マーカー、細胞エネルギー代謝などといった情報を得ることができなかった。残存ｉＰＳ細胞の分化能やリスク評価には、分化できずに細胞群に残存する未分化細胞の遺伝子や表面構造、分化能などを解析することが必要であり、これら残存未分化細胞のみを選択的に生細胞のまま回収する方法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−１２６１４６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，４（５），８１１−８２０，２０１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、特定の糖鎖構造を未分化マーカーとして有する未分化細胞を吸着分離することが可能な吸着剤を用いた細胞分離方法において、吸着剤に結合した特定の糖鎖構造を未分化マーカーとして有する未分化細胞を、剥離回収する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の構造を有する糖鎖に結合性を有するタンパク質を水に不溶性の担体に固定化して得られる吸着剤を作製し、作製した当該吸着剤を特定の糖鎖構造を未分化マーカーとして有する細胞を含む細胞混合物と接触させたのち、当該吸着剤に結合した細胞と結合しなかった細胞を分離することで、未分化マーカーが存在する細胞を高効率に除去できることを見出した。さらに、前記細胞の分離方法において、吸着剤に結合した未分化マーカーが存在する細胞を、フコースおよび浸透圧調節剤を含む剥離液で処理することにより吸着剤から剥離させ、生細胞として回収することが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の（１）から（９）に記載した発明を提供するものである。
（１）吸着剤に結合した細胞を、剥離液で処理することにより吸着剤から剥離させることを特徴とする、細胞の剥離回収方法であって、
前記吸着剤が、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」に結合性を有するタンパク質が水に不溶性の担体に固定化された構成を有する、方法。
（２）剥離液がフコースおよび浸透圧調節剤を含む水溶液であることを特徴とする、（１）に記載の細胞の剥離回収方法。
（３）浸透圧調節剤が糖類および／または糖アルコール類であることを特徴とする、（１）または（２）に記載の細胞の剥離回収方法。
（４）「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」に結合性を有するタンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする、（１）から（３）のいずれかに記載の細胞の剥離回収方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」に結合性を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に結合性を有するタンパク質。
（５）水に不溶性の担体に親水性高分子が共有結合で固定されていることを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載の細胞の剥離回収方法。
（６）以下の（Ａ）から（Ｃ）の工程を含む工程から製造された吸着剤を用いることを特徴とする、（１）から（５）のいずれかに記載の細胞の剥離回収方法：
（Ａ）水に不溶性の担体に親水性高分子を共有結合で固定する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた親水性高分子を共有結合で固定した担体に、（４）に記載の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化するための官能基を導入する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた官能基を導入した担体に、（４）に記載の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化する工程。
（７）以下の（Ｘ）から（Ｚ）に記載の工程を含むことを特徴とする、細胞の分離方法：
（Ｘ）（１）に記載の吸着剤と、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を含む細胞混合物とを接触させる工程、
（Ｙ）前記（Ｘ）に記載の工程後、吸着剤に結合した「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞と、吸着剤に結合しない細胞とを分離する工程、
（Ｚ）前記（Ｙ）に記載の工程後、（１）から（６）のいずれかに記載の細胞の剥離回収方法により、吸着剤に結合した「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を剥離回収する工程。
（８）カラムに充填した吸着剤を用いることを特徴とする、（７）に記載の細胞の分離方法。
（９）「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞が未分化細胞である、（７）または（８）に記載の細胞の分離方法。
【００１１】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に結合性を有するタンパク質（以下、糖鎖結合性タンパク質とする）を水に不溶性の担体に固定化した吸着剤を用いる細胞分離方法において、吸着剤に結合したＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する細胞を、糖類を含む水溶液で処理することにより、吸着剤から剥離回収すること特徴とする。
【００１３】
糖鎖結合性タンパク質はグラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）が産生するＢＣ２Ｌ−Ｃタンパク質のＮ末端ドメイン（ＹＰ＿００２２３２８１８）に由来するレクチン（以下、ＢＣ２ＬＣＮレクチンとする）であり、より詳しくは、このレクチンを形質転換大腸菌で発現させたものである。糖鎖結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ１型糖鎖、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ３型糖鎖、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つルイスＹ型糖鎖など、フコースを含む複数種の糖鎖に高い結合性を有する。糖鎖結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃの構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加してもよく、例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加してもよい。
【００１４】
また、糖鎖結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なタンパク質タグや、前記吸着剤を作製する際に有用な担体固定化用タグを有していてもよい。前記タンパク質タグとしては、ポリヒスチジン、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合性ドメイン（ＣＢＤ）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグを、また、前記担体固定化用タグとしては、例えば配列番号２で示されるシステインを含むオリゴペプチドや、リジンを含むオリゴペプチドからなる担体固定化用タグを例示することができる。これらタンパク質タグや担体固定化用タグのアミノ酸配列およびその長さは、糖鎖結合性タンパク質がＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃの構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、特に制限はない。さらに糖鎖結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを有していてもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる。
【００１５】
本発明の細胞の剥離回収方法に用いる吸着剤は、糖鎖結合性タンパク質が水に不溶性の担体に固定化されていることから、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖構造を有する細胞を吸着剤に結合させたのち、糖鎖結合性タンパク質と細胞の結合を弱めることが可能な物質を含む剥離液で処理することにより、吸着剤から剥離回収することができる。前述のように、糖鎖結合性タンパク質はフコースを含む糖鎖であるＨタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）、ルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）に結合性を有することから、フコースを含む剥離液で処理することにより糖鎖結合性タンパク質と細胞の結合が弱まり、吸着剤に結合した前記糖鎖を有する細胞を剥離回収することができる。剥離液中のフコース濃度は、細胞が死滅しない濃度範囲であれば特に制限はないが、吸着剤に結合した細胞の剥離回収作用を示す点で、０．１ｍｏｌ／Ｌ（以下、Ｍと記載する）以上であることが好ましく、０．２Ｍ以上であることがより好ましい。
【００１６】
また、本発明の細胞の剥離回収方法に用いる剥離液は、フコース以外の成分を含むことができる。例えば、フコース以外の成分として浸透圧調節剤を添加することにより、フコースのみを含む場合よりも高い細胞の剥離回収作用を示すことができる。すなわち、浸透圧調節剤を一定濃度以上添加することで細胞内の浸透圧を調整し、且つＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる糖鎖構造とレクチン間の結合を解離させることで、吸着剤に結合した細胞の活性を損なうことなく、生細胞のまま回収することが可能である。前記浸透圧調節剤の種類は、細胞毒性を及ぼさないものであれば特に制限はなく、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロースなどの単糖類、マルトース、シュークロース、ラクトース、トレハロースなどの二糖類、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マンニトールなどの糖アルコール類を例示することができる。これらの中では、浸透圧の調整しやすさの点でエリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マンニトールなどの糖アルコール類を用いることが好ましく、マンニトールを用いることがより好ましい。これらの糖類および糖アルコール類は単独で使用することもできるが、２種類以上を混合して使用することもできる。
【００１７】
剥離液中の浸透圧調節剤の濃度は、細胞浸透圧維持の点で０．１Ｍ以上１．５Ｍ以下であることが好ましく、０．２Ｍ以上１．２Ｍ以下であることがより好ましく、０．３Ｍ以上１．０Ｍ以下であることがことさらに好ましい。剥離液中のフコースと浸透圧調節剤の組成は、例えば、０．２Ｍフコースと０．３Ｍ浸透圧調節剤からなる組成、０．２Ｍフコースと０．５Ｍ浸透圧調節剤からなる組成、０．２Ｍフコースと０．７Ｍ浸透圧調節剤からなる組成、０．４Ｍフコースと０．３Ｍ浸透圧調節剤からなる組成、０．４Ｍフコースと０．５Ｍ浸透圧調節剤からなる組成を例示することができる。一般的に、水溶液中の細胞の直径は溶液の浸透圧が高まるほど収縮することが知られており、本発明の細胞の剥離回収方法においては、フコースと浸透圧調節剤の合計濃度が０．５Ｍ以上の高張の水溶液を用いることで、細胞の膨潤による細胞死を防げるだけでなく、細胞の収縮により細胞が吸着剤と吸着剤の隙間を通過しやすくなることで、細胞剥離回収をより効率的に行えるといった効果が期待できる。さらに、剥離液に０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）や２ｍＭから１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加したものを用いることで、ＢＳＡによる細胞剥離時における細胞へのダメージの軽減と吸着剤への細胞の非特異的吸着を抑制する効果や、ＥＤＴＡの細胞分散作用によるスムーズな細胞の剥離回収効果を期待することができる。
【００１８】
一方、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなるＨタイプ１型糖鎖やＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなるＨタイプ３型糖鎖は、ヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの未分化細胞に特異的に存在する未分化マーカーとして知られている糖鎖である（例えば、Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１１，  ２８６（２３）：２０３４５−５３．）。従って、前記吸着剤を用いてＨタイプ１型糖鎖やＨタイプ３型糖鎖を有する未分化細胞を吸着剤に結合させたのち、前述の糖類を含む水溶液で処理することにより、これらの細胞を吸着剤から剥離させ、生細胞として回収することができる。また、前記吸着剤を用いることにより、ヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの未分化細胞以外に、前記未分化マーカーとして知られている糖鎖を有する細胞、例えば、２１０２Ｅｐ細胞やＮＴ２／Ｄ１細胞などのヒト胎児性がん細胞を選択的に吸着剤に結合させたのち、前述の剥離液で処理することにより、これらのがん細胞を生細胞として剥離回収することができる。
【００１９】
本発明の細胞の剥離回収方法に用いる吸着剤を構成する水に不溶性の担体に特に制限はなく、シリカゲルや、金薄膜を蒸着したガラスなどの無機系担体、アガロース、セルロース、キチン、キトサンなどの多糖類を原料とした水に不溶性の多糖系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋多糖系担体、デキストラン、プルラン、デンプン、アルギン酸塩、カラギーナンなどの水溶性多糖類を架橋剤で架橋した架橋多糖系担体、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリスチレンなどの合成高分子系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋合成高分子系担体を例示することができる。これらの担体の中では、水酸基を有し、後述する親水性高分子による修飾が容易に行える点で、アガロース、セルロース、デキストラン、プルランなどの電荷をもたない多糖系担体およびそれらの架橋多糖系担体や、ポリ（メタ）アクリレートやポリウレタンなどの親水性合成高分子系担体および架橋親水性合成高分子系担体が好ましい。
【００２０】
また、前述の水に不溶性の担体は、親水性高分子が共有結合で固定されていることにより、細胞の非特異的吸着を抑制することができる。担体の表面を修飾する親水性高分子としては、アガロース、セルロース、デキストラン、プルラン、デンプンなどの中性多糖類や、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）やポリビニルアルコールなどの水酸基を有する合成高分子を例示することができる。これら親水性高分子の中では、親水性が高く、担体表面への共有結合による固定が容易に行える点で、デキストラン、プルランおよびデンプンなどの中性多糖類が好ましく、デキストランおよびプルランがより好ましい。デキストランおよびプルランの分子量に特に制限はないが、担体表面の親水性修飾が十分に行える点で、数平均分子量が１０，０００から１，０００，０００のものが好ましい。
【００２１】
さらに、前述の水に不溶性の担体の形状に特に制限はなく、粒子状、スポンジ状、平膜状、平板状、中空状、繊維状のいずれであってもよいが、吸着剤への細胞吸着を効率的に行える点で粒子状の担体であることが好ましい。本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の粒子状担体の、水に膨潤させた状態での粒径は、担体から作製される吸着剤をカラムに充填した場合に分離対象となる細胞が吸着剤表面と十分接触し、且つ細胞が吸着剤同士の隙間を淀みなく通過できる点で、好ましくは５０μｍ以上１０００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以上５００μｍ以下であり、さらに好ましくは１５０μｍ以上４００μｍ以下である。また、水に不溶性の担体の細孔の有無に特に制限はなく、多孔性または無孔性のいずれであってもよい。さらに、本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体は、本発明の吸着剤に使用するタンパク質を担体に固定化するための活性官能基導入が容易に行える点で、水酸基を有する粒子状担体であることが好ましい。さらに、本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体は市販品を使用してもよく、例えば、ポリ（メタ）アクリレートを原料としたトヨパール（東ソー製）や、アガロースを原料としたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）、セルロースを原料としたセルフィア（旭化成製）を使用することができる。
【００２２】
本発明の細胞の剥離回収方法に用いる吸着剤は、以下の（Ａ）から（Ｃ）の工程を含む工程から製造することができる。
（Ａ）水に不溶性の担体に親水性高分子を共有結合で固定する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた親水性高分子を共有結合で固定した担体に、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化するための官能基を導入する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた官能基を導入した担体に、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化する工程。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」に結合性を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に結合性を有するタンパク質。
【００２３】
以下に工程（Ａ）から工程（Ｃ）の詳細を説明する。
【００２４】
工程（Ａ）は、本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体表面の水酸基とエポキシ基含有化合物を塩基性条件下で反応させることにより担体にエポキシ基を導入する工程（Ａ−Ｉ）と、エポキシ基と親水性高分子の水酸基を塩基性条件下で反応させる工程（Ａ−ＩＩ）の２つからなる工程である。
【００２５】
工程（Ａ−Ｉ）で使用することができるエポキシ基含有化合物は、担体にエポキシ基を導入することができれば特に制限はなく、エピクロロヒドリンやエピブロモヒドリンなどのハロヒドリン類、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラエチレングリコールジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテルなどのジグリシジルエーテル類、グリセロールトリグリシジルエーテル、エリスリトールトリグリシジルエーテル、ジグリセロールトリグリシジルエーテルなどのトリグリシジルエーテル類、エリスリトールテトラグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテルなどのテトラグリシジルエーテル類を例示することができる。これらの中では、短時間でエポキシ基が導入できる点で、エピクロロヒドリンなどのハロヒドリン類が好ましい。これらのエポキシ基含有化合物は単独で使用することもできるが、数種の混合物を使用することもできる。エポキシ基含有化合物の使用量は、使用量が少ない場合にはエポキシ基の導入量が低下し、工程（Ａ−ＩＩ）における親水性高分子との反応が十分に起こらない可能性が高くなることから、本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体の重量に対して０．１から１０倍量を使用することが好ましい。
【００２６】
工程（Ａ−Ｉ）で使用することができる溶媒に特に制限はなく、水、有機溶媒、及びこれらの混合物を利用することができる。有機溶媒としてはアセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトンなどのケトン類、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリジノンなどのアミド系溶媒、ジメチルスルホキシドなどの含硫黄溶媒などを例示することができる。これらの溶媒の中ではエポキシ基含有化合物の溶解性が高く、エポキシ基の導入が容易な点で、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの水溶性非プロトン性極性有機溶媒と水との混合溶媒が好ましい。溶媒の使用量に特に制限はないが、本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体の分散性を高める点で、担体の含水重量に対して０．５から５倍量の溶媒を使用することが好ましい。また、前述の有機溶媒と水の混合比率にも特に制限はないが、反応液全体に対する前述の有機溶媒の比率が２０から８０重量％であることが好ましい。工程（Ａ−Ｉ）の反応温度は１０から７０℃が好ましく、より好ましくは２０から５０℃である。反応液の撹拌方法は本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体の破壊を抑制する点で、撹拌翼を使用する方法あるいは反応容器全体を攪拌することが好ましい。また、撹拌速度については担体が懸濁液中で良好に分散できれば特に制限はない。
【００２７】
工程（Ａ−Ｉ）の反応は、反応容器に担体、溶媒およびエポキシ基含有化合物を添加し、撹拌条件下、前述の温度で３０から６０分加熱したのち、反応を促進させる目的で反応液に塩基を添加することが好ましい。具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類やトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基類を例示することができる。これらの中では無機塩基類が好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。塩基の添加量に特に制限はないが、反応溶液中の塩基濃度が０．０１Ｍから１．０Ｍであることが好ましい。塩基を添加後、反応温度を２０から５０℃に維持したまま、さらに２から２４時間撹拌を継続することが好ましい。反応後、グラスフィルターなどを使用して水で洗浄することにより、目的のエポキシ基を導入した担体を得ることができる。
【００２８】
工程（Ａ−ＩＩ）で使用することができる親水性高分子は、前述の通りである。
【００２９】
工程（Ａ−ＩＩ）で使用することができる溶媒に特に制限はなく、水、有機溶媒、及びこれらの混合物を利用することができる。これらの溶媒の中では親水性高分子の溶解性が高い点で水が好ましい。溶媒の使用量に特に制限はないが、本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体の分散性を高める点で、担体の含水重量に対して０．５から５倍量の溶媒を使用することが好ましい。また、親水性高分子の溶液を工程（Ａ−ＩＩ）の溶媒として使用してもよい。親水性高分子の使用量は、使用量が少ない場合には担体表面に導入したエポキシ基との反応が十分に起こらない可能性が高くなることから、本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体の重量に対して０．１から２０倍量を使用することが好ましい。また、親水性高分子の溶液を溶媒として使用する場合の親水性高分子の濃度に特に制限はなく、親水性高分子の溶媒への溶解度および溶解時の粘度を考慮して適宜設定すればよい。工程（Ａ−ＩＩ）の反応温度は１０から７０℃が好ましく、より好ましくは２０から５０℃である。反応液の撹拌方法は担体の破壊を抑制する点で、撹拌翼を使用する方法あるいは反応容器全体を攪拌することが好ましい。また、撹拌速度については担体が懸濁液中で良好に分散できれば特に制限はない。
【００３０】
工程（Ａ−ＩＩ）の反応は、反応容器にエポキシ基を導入した担体、溶媒および親水性高分子、あるいは親水性高分子溶液を添加し、攪拌条件下、前述の温度で３０から６０分加熱したのち、反応を促進させる目的で反応液に塩基を添加することが好ましい。具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類やトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基類を例示することができる。これらの中では無機塩基類が好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。塩基の添加量に特に制限はないが、反応溶液中の塩基濃度が０．０１Ｍから１．０Ｍであることが好ましい。塩基を添加後、反応温度を２０から５０℃に維持したまま、さらに２から２４時間撹拌を継続することが好ましい。反応後、グラスフィルターなどを使用して水で洗浄することにより、目的の親水性高分子を共有結合で固定した担体を得ることができる。
【００３１】
工程（Ｂ）は、親水性高分子を共有結合で固定した担体に糖鎖結合性タンパク質を固定化するための官能基を導入する工程である。
【００３２】
親水性高分子を共有結合で固定した水に不溶性の担体に、糖鎖結合性タンパク質を固定化するため官能基は、一般的なタンパク質固定化用の官能基であれば特に制限されず、エポキシ基、ホルミル基、カルボキシル基および活性エステル基、アミノ基、マレイミド基、ハロアセチル基などを例示することができる。また、担体に前記官能基を導入する方法は、一般的な官能基導入方法であれば特に制限はされず、例えば、アフィニティクロマトグラフィー（東京化学同人刊）や、特開２０１５−１９９８６８号公報等に記載の方法により、前記官能基を導入することができる。
【００３３】
工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で得られた官能基を導入した担体に、糖鎖結合性タンパク質を固定化する工程である。工程（Ｂ）で得られた官能基を導入した担体に糖鎖結合性タンパク質を固定化する方法は、一般的なタンパク質の固定化方法であれば特に制限はされず、例えば、工程（Ｂ）で担体に導入したエポキシ基、ホルミル基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性エステル基と糖鎖結合性タンパク質のアミノ基を反応させる方法、担体に導入したアミノ基と糖鎖結合性タンパク質のカルボキシル基を反応させる方法、担体に導入したエポキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、ハロアルキル基と糖鎖結合性タンパク質のメルカプト基を反応させる方法を例示することができる。これらの固定化方法の中では、短時間に高収率で担体へのタンパク質固定化が行える点で、工程（Ｂ）で担体に導入したホルミル基、活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させる方法、および、担体に導入したマレイミド基、ハロアセチル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法が好ましく、固定化反応をｐＨが中性付近で行うことが可能でありタンパク質の変性を抑制できることが可能である点で、担体に導入したマレイミド基、ハロアセチル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法がより好ましく、官能基の安定性が高い点で、担体に導入したマレイミド基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法が、ことさらに好ましい。
【００３４】
工程（Ｃ）で用いる糖鎖結合性タンパク質は、緩衝液に溶解して、工程（Ｂ）で担体に導入した官能基と反応させることが好ましい。糖鎖結合性タンパク質を溶解する緩衝液に特に制限はなく、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液や、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬製）などの市販の緩衝液を例示することができる。また、固定化反応の効率を高めることを目的として、緩衝液に塩化ナトリウムなどの無機塩類やポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）などの界面活性剤を添加してもよい。糖鎖結合性タンパク質を担体に固定化する際の反応温度およびｐＨは、活性官能基の反応性や本発明のタンパク質の安定性を考慮した上で反応温度については０℃以上５０℃以下、ｐＨについてはｐＨ４以上ｐＨ１０以下の範囲の中から適宜設定すればよく、糖鎖結合性タンパク質の失活を抑制する点で、反応温度については１５℃以上４０℃以下、ｐＨについてはｐＨ５以上ｐＨ９以下の範囲が好ましい。
【００３５】
水に不溶性の担体への糖鎖結合性タンパク質の固定化量は、分離対象となる細胞と糖鎖結合性タンパク質の結合性を考慮したうえで適宜設定すればよく、１ｍＬの担体あたり０．０１ｍｇ以上３０ｍｇ以下が好ましく、０．０５ｍｇ以上１０ｍｇ以下がより好ましい。また、水に不溶性の担体への糖鎖結合性タンパク質の固定化量は、固定化反応時の糖鎖結合性タンパク質の使用量や担体への活性官能基導入量を調節することにより調整することができる。糖鎖結合性タンパク質の担体への固定化量は、固定化反応液および反応後の洗浄液を回収して未反応の糖鎖結合性タンパク質の量を求めたのち、固定化反応に使用した糖鎖結合性タンパク質量から未反応の糖鎖結合性タンパク質の量を差し引くことで算出することができる。
【００３６】
本発明の細胞の分離方法は、以下の（Ｘ）から（Ｚ）に記載の工程を含むことを特徴とする。
（Ｘ）前記（１）に記載の吸着剤と、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を含む細胞混合物とを接触させる工程、
（Ｙ）前記（Ｘ）に記載の工程後、吸着剤に結合した「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞と、吸着剤に結合しない細胞とを分離する工程、
（Ｚ）前記（Ｙ）に記載の工程後、前記（１）から（６）のいずれかに記載の細胞の剥離回収方法により、吸着剤に結合した「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を剥離回収する工程。
【００３７】
以下に工程（Ｘ）から工程（Ｚ）の詳細を説明する。
【００３８】
工程（Ｘ）は、糖鎖結合性タンパク質を水に不溶性の担体に固定化した吸着剤と、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞と前記糖鎖を有さない細胞を含む細胞混合物とを接触させる工程である。
【００３９】
本発明の細胞の分離方法に用いる吸着剤と細胞の接触方法は特に制限はなく、細胞混合物中に吸着剤を添加し、一定時間振盪する方法を例示することができるが、吸着剤に結合した細胞の再遊離や、吸着剤との過剰な接触による細胞へのダメージを避けることができる点で、吸着剤をカラムに充填して細胞と接触させることが好ましい。
【００４０】
本発明の細胞の分離方法に用いる吸着剤は、吸着剤の糖鎖結合性タンパク質の固定化量が吸着剤１ｍＬあたり０．０５ｍｇ以上１０ｍｇ以下であれば、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を少なくとも１００万個以上結合することが可能である。従って、本発明の細胞の分離方法に用いる吸着剤の使用量およびカラムへの充填量は、前述の吸着剤への細胞の結合数と、吸着剤と接触させる細胞混合物中の「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞数を考慮して、適宜設定すればよい。また、本発明の細胞の剥離回収方法に用いる吸着剤を充填するカラムの内径や長さなどの形状に特に制限はなく、前述の細胞数に応じて適宜設定すればよいが、吸着剤を効率的に充填できる点や、カラム内での細胞の滞留を抑制できる点で、円筒状のカラムであることが好ましい。さらに、本発明の細胞の剥離回収方法に用いる吸着剤を充填するカラムの材質は、カラムへの細胞の非特異的吸着が起こらなければ特に制限はなく、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネートなどの合成高分子製カラムや、ガラス製カラムを利用することができる。本発明の細胞の分離方法に使用するカラムは市販品を使用してもよく、例えば、テルモシリンジ（テルモ製）と注射針を組合せて使用してもよい。
【００４１】
本発明の細胞の分離方法において、前述の細胞混合物には、細胞死と細胞凝集を防ぐために有効な成分が添加されていると好ましい。本発明の細胞の剥離回収方法で使用する吸着剤を充填したカラムに通液する細胞混合物は、市販のＭＡＣＳバッファ（１×ＰＢＳに０．５％のＢＳＡと２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したもの）で調製することができる。この場合、ＢＳＡによる細胞分離時における細胞へのダメージの軽減と吸着剤への非特異的吸着を抑制する効果、およびＥＤＴＡによる細胞の凝集防止効果を期待できる。
【００４２】
工程（Ｙ）は、工程（Ｘ）で吸着剤に結合した「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞と、吸着剤に結合しなかった前記糖鎖を有さない細胞とを分離する工程である。
【００４３】
本発明の細胞の分離方法では、糖鎖結合性タンパク質、すなわち、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」に結合性を有するタンパク質と、前記糖鎖を有する細胞を溶液中で接触させる代わりに、糖鎖結合性タンパク質を粒子状担体に固定化した吸着剤を用いることにより、前記糖鎖を有する細胞が吸着剤に結合するが、前記糖鎖を有さない細胞は吸着剤に結合しないため、溶液中で分離を行う場合に比べて、効率的に細胞分離を行うことができる。
【００４４】
工程（Ｚ）は、工程（Ｙ）で「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有さない細胞を分離したのち、工程（Ｘ）で吸着剤に結合した前記糖鎖を有する細胞を、剥離回収する工程である。
【００４５】
工程（Ｚ）において、吸着剤に結合した「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を剥離回収する方法は、前述の通りである。
【００４６】
本発明の細胞の分離方法では、吸着剤を充填したカラムを用いることで、カラム上部より組成の異なる水溶液（以下、キャリア液とする）を順次通液するだけで、煩雑な操作を行うことなく、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞と前記糖鎖を有さない細胞を分離して分取することが可能である。例えば、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を含む細胞混合物をカラムに添加後、第１のキャリア液としてＭＡＣＳバッファをカラムに通液することで、吸着剤に前記糖鎖を有する細胞のみを結合させ、吸着剤に結合しなかった前記糖鎖を有さない細胞のみをカラム下部より回収することができる。その後、第２のキャリア液としてフコースおよび浸透圧調節剤を含む剥離液をカラムに通液することにより、吸着剤に結合した前記糖鎖を有する細胞を吸着剤より剥離させ、カラム下部より回収することが可能となる。
【００４７】
前述の通り、本発明の細胞の剥離回収方法および分離方法に用いる吸着剤は、糖鎖結合性タンパク質の固定化量が吸着剤１ｍＬあたり０．０５ｍｇ以上１０ｍｇ以下であれば、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を少なくとも１００万個以上結合することが可能であることから、吸着剤に結合した前記糖鎖を有する細胞を効率良く剥離して、回収することが可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から誘導した心筋細胞を用いた再生医療においては、一人あたり１０億個の臨床グレードの心筋細胞が必要であり、０．１％の未分化細胞が混入していると仮定した場合では１００万個、１％の未分化細胞が混入していると仮定した場合では１０００万個の未分化幹細胞を完全に吸着分離する技術が必要となる。これらのような大量の細胞中に混在する未分化細胞を吸着分離する場合でも、本発明の吸着剤を少量（それぞれ１ｍＬまたは１０ｍＬ）用いることにより、短時間で効率良く未分化細胞を吸着剤に結合させ、且つ吸着剤に結合した未分化細胞を、本発明の剥離液で処理することにより、生細胞として回収することができる。また、例えば患者一人あたり１００億〜１０００億個の膨大な医療用細胞が必要とされる赤血球や血小板を未分化幹細胞から誘導する場合、１％の未分化幹細胞が混入していると仮定した場合であっても、本発明の吸着剤を１００ｍＬから１０００ｍＬ用いることにより赤血球や血小板などの血球系細胞に残存する未分化細胞を短時間で効率良く吸着剤に結合させ、且つ吸着剤に結合した未分化細胞を、本発明の剥離液で処理することにより、生細胞として回収することができる。
【００４８】
本発明の細胞の剥離回収方法は、既存の細胞分離技術であるフローサイトメトリーや磁気ビーズ法、背景技術に記載した技術と比べても、上記大量細胞からの未分化細胞の除去と未分化細胞の回収を５から３０分程度の極めて短時間行うことができ、目的の分化誘導させた細胞および除去対象となる未分化細胞それぞれを大量に処理、精製する場合にも極めて有効な方法である。また、本発明の細胞の剥離回収方法は、吸着剤に結合した未分化細胞を死滅させることなく生細胞として回収できることから、剥離回収した未分化細胞の性状解析においても極めて有用なツールとなりうる。すなわち、生細胞として回収した未分化細胞のＦＡＣＳによる表面マーカー解析などは当然のことながら、回収した未分化細胞を培地中で再増殖させることで、高感度な未分化細胞混入率の定量の実施や、分化誘導前の未分化細胞との増殖能・分化能の比較を行うことができる。また、回収した未分化細胞を生体移植試験に供することで造腫瘍性リスクの評価も実施可能である。そのため、本細胞分離および細胞剥離回収方法は、本来除去対象である未分化細胞を研究材料として回収し活用する場合において、極めて優れた手法である。
【発明の効果】
【００４９】
本発明の細胞の剥離回収方法では、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」に結合性を有するタンパク質を水に不溶性の担体に固定化した吸着剤を用いることにより、前記糖鎖を未分化マーカーとして有する未分化細胞を含む細胞混合物から、未分化細胞だけを選択的に吸着剤に結合させたのち、フコースおよび浸透圧調節剤を含む剥離液で処理することにより、吸着剤に結合した未分化細胞を効率良く剥離回収することができる。また、本発明の細胞の剥離回収方法では、吸着剤を充填したカラムに未分化細胞を含む細胞混合物を通液することにより、体細胞などの未分化マーカーが存在しない細胞と、未分化マーカーが存在する細胞のそれぞれを、高効率に分離回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】実施例４における、吸着剤Ｃ１に２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞の混合物を通液した場合の、流出細胞の顕微鏡画像（「明視野」または「明視野＋オレンジ蛍光」）である。
【図２】比較例１における、吸着剤Ａ０に２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞の混合物を通液した場合の、流出細胞の顕微鏡画像（「明視野」または「明視野＋オレンジ蛍光」）である。
【図３】実施例４における、吸着剤Ｃ１に２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞の混合物を通液した場合の各細胞の流出率を示したクロマトグラムである。
【図４】比較例１における、吸着剤Ａ０に２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞の混合物を通液した場合の各細胞の流出率を示したクロマトグラムである。
【図５】実施例５および比較例２における、それぞれ吸着剤Ｂ１と吸着剤Ｂ０に２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の細胞流出率と細胞剥離率を示したグラフである。
【図６】実施例５および比較例２における、それぞれ吸着剤Ｂ１と吸着剤Ｂ０に２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、アプライ細胞、流出細胞、剥離細胞をＦＡＣＳで解析したドットプロットを示したものである。
【図７】実施例５および比較例２における、それぞれ吸着剤Ｂ１と吸着剤Ｂ０に２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、アプライ細胞、流出細胞、剥離細胞のＴＲＡ−１−６０陽性率を示したグラフである。
【図８】実施例５および比較例２における、それぞれ吸着剤Ｂ１と吸着剤Ｂ０に２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、アプライ細胞、流出細胞、剥離細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率を示したグラフである。
【図９】実施例６と比較例３における、吸着剤Ｂ１に２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、細胞流出率と細胞剥離率を示したグラフである。
【図１０】実施例７と比較例４における、それぞれ吸着剤Ｃ１と吸着剤Ｂ０に２０１Ｂ７細胞を通液した場合の、細胞流出率と細胞剥離率を示したグラフである。
【図１１】実施例７と比較例４における、それぞれ吸着剤Ｃ１と吸着剤Ｂ０に２０１Ｂ７細胞を通液した場合の、アプライ細胞、流出細胞、剥離細胞をＦＡＣＳで解析したドットプロットを示したものである。
【図１２】実施例７と比較例４における、それぞれ吸着剤Ｃ１と吸着剤Ｂ０に２０１Ｂ７細胞を通液した場合の、アプライ細胞、流出細胞、剥離細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率を示したグラフである。
【図１３】実施例８における、吸着剤Ｃ１、Ｃ３に２０１Ｂ７細胞を通液した場合の、細胞流出率と細胞剥離率を示したグラフである。
【図１４】実施例８における、吸着剤Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３に２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、細胞流出率と細胞剥離率を示したグラフである。
【図１５】比較例５における、吸着剤Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３にＫ５６２細胞を通液した場合の、細胞流出率と細胞剥離率を示したグラフである。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例、比較例、調製例および参考例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５２】
実施例１  システインタグを有するレクチンの作製
実施例１では、大腸菌を用いて、システインを含むオリゴペプチドからなる担体固定化用タグ（以下、システインタグ）を付加したレクチンを作製した。
【００５３】
（１）プラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓの作製
以下（ａ）から（ｅ）記載の方法により、配列番号３に示したレクチンのアミノ酸配列をコードした配列番号４のポリヌクレオチドを作製した。
【００５４】
（ａ）以下の試薬組成および反応条件にて、１段階目のＰＣＲ反応を行った。
（試薬組成、総反応液量：５０μＬ）
・０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ製）
・各３０ｎＭ  配列番号５から２８に示したプライマー
・酵素に付属する緩衝液
（反応条件）
・サーマルサイクラーを用い、９８℃・１０秒間、５５℃・５秒間、７２℃・６０秒間のＰＣＲ反応を５サイクル実施した。
【００５５】
（ｂ）次に、（ａ）の反応液を用いて、以下の試薬組成および反応条件にて、２段階目のＰＣＲ反応を行った。
（試薬組成、総反応液量：５０μＬ）
・０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（タカラバイオ製）
・各５００ｎＭ  配列番号２９と３０に示したプライマー
・１μＬ  １段階目のＰＣＲ反応液
・酵素に付属する緩衝液
（反応条件）
・サーマルサイクラーを用い、９８℃・１０秒間、５５℃・５秒間、７２℃・６０秒間のＰＣＲ反応を３０サイクル実施した。
【００５６】
（ｃ）２段階目のＰＣＲ反応後の（ｂ）の反応液をアガロースゲル電気泳動で泳動後、目的物に相当する０．５ｋｂｐのバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
【００５７】
（ｄ）前記（ｃ）で得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重消化し、消化後のＤＮＡをプラスミドｐＥＴ−２８（＋）の制限酵素ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩサイトに、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ製）を用いてライゲーションしてプラスミドを調製後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを得た。
【００５８】
（ｅ）前記（ｄ）で得られた組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを培養し、集菌したのち、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いてプラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（５．６ｋｂｐ）を得た。当該方法で得られたプラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに挿入されているレクチンをコードする塩基配列を分析した結果、塩基配列は設計どおりであることを確認した。
【００５９】
（２）大腸菌を用いたレクチンの作製
前記（１）で得られた組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓより、以下（ｆ）から（ｊ）記載の方法で、システインタグを付加したレクチンを作製した。
（ｆ）組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ／Ｋｍ液体培地に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．６になるように植菌後、３７℃で培養した。
（ｇ）前培養液を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ／Ｋｍ液体培地１Ｌに接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を２０℃に切り替え、一晩培養した。
（ｈ）培養終了後、培養液を氷冷したのち、遠心分離により集菌した。集めた菌を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加したＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク製）を用いて処理し、可溶性画分を１５０ｍＬ得た。
（ｉ）前記（ｈ）で得られた可溶性画分の溶液を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した担体（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ、メルク製、担体容積１５ｍＬ）を充填したカラムに通液し、可溶性画分に含まれるシステインタグを付加したレクチンを吸着させた。担体に吸着したシステインタグを付加したレクチンを１５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出させることにより、目的のシステインタグを付加したレクチンを含む溶出液を５０ｍＬ得た。
（ｊ）前記（ｉ）で得られたシステインタグを付加したフコース結合性レクチンを含む溶出液を、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬製）に対して透析することにより、目的のシステインタグを付加したレクチンのＤ−ＰＢＳ（−）溶液を７５ｍＬ得た。
【００６０】
得られたＤ−ＰＢＳ（−）溶液中のシステインタグを付加したレクチン濃度を紫外線吸収法により測定し、２８０ｎｍにおける吸光度が１．０の場合のシステインタグを付加したレクチン濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとして濃度を算出した結果、濃度は１．２ｍｇ／ｍＬであった。
【００６１】
（３）システインタグを付加したレクチンの糖鎖への親和性評価
前記（２）で得られたシステインタグを付加したレクチンの糖鎖に対する結合性評価は、表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトとしてシステインタグを付加したレクチン、固相としてＨタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）およびルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）を用い、各糖鎖に対する結合性を測定した。センサーチップはデキストランがコートされたＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を使用し、デキストランにストレプトアビジン（和光純薬）をアミンカップリング法により固定した後、ビオチン標識された各糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により糖鎖をセンサーチップ上に固定して作製した。
【００６２】
糖鎖親和性の測定はカイネティクス解析により行った。緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ＋を用い、結合反応は流速３０μＬ／分、結合時間は６分間、解離時間は３分間とした。センサーチップの再生は２５ｍＭの水酸化ナトリウムを用い、流速３０μＬ／分、再生時間１５秒で行った。アナライトタンパク質の濃度は１〜１００ｎＭで行った。解析は解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１．１）を用いて行い、１：１  Ｂｉｎｄｉｎｇのフィッティングにより解離定数を算出した。システインタグを付加したレクチンの各糖鎖に対する結合性評価（解離定数）の結果を表１に示した。
【００６３】
【表１】
2019000063.tif 000002
【００６４】
調製例１  親水性高分子が固定されたトヨパールＨＷ−４０ＥＣの作製−１
トヨパールＨＷ−４０ＥＣ（東ソー製）はステンレス製標準ふるいにより１５０−２５０μｍの粒度範囲に湿式分級したのち、グラスフィルターでろ過したものを使用した。２５０ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に１０．０ｇのトヨパールＨＷ−４０ＥＣ、１０．８ｍＬ（５４ｍｍｏｌ）の５Ｍ  ＮａＯＨ水溶液（関東化学製）、５．０ｍＬの水を添加したのち、５．０ｇ（５４ｍｍｏｌ）のエピクロロヒドリン（東京化成製）と５．０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、関東化学製）の混合溶液を添加し、３０℃の振盪機内で３時間振盪することによりトヨパールＨＷ−４０ＥＣのエポキシ化を行なった。反応終了後、溶液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄した。エポキシ化したトヨパールＨＷ−４０ＥＣ全量を２５０ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加し、１５．０ｇの４０重量％デキストラン水溶液（分子量４０，０００、東京化成製）を添加したのち、３０℃の振盪機内で３０分間振盪した。次に、反応容器に１．０５ｍＬ（１．５８ｇ、１９ｍｍｏｌ）の４８％ＮａＯＨ水溶液を添加し、３０℃の振盪機内でさらに１８時間振盪することにより、エポキシ化トヨパールにＨＷ−４０ＥＣにデキストランを固定した。反応終了後、溶液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄することにより、目的のデキストラン修飾トヨパールＨＷ−４０ＥＣ（ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣ）を調製した。以下、調製例１で作製したＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを吸着剤として評価する場合は、吸着剤Ｂ０とする。
【００６５】
実施例２  親水性高分子が固定された吸着剤Ｂ１の作製
実施例２では、担体として調製例１で作製したＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを用い、実施例１で作製した担体固定化用システインタグを付加したレクチンを固定化するための官能基（マレイミド基）の導入およびレクチン固定化を行うことにより、細胞の吸着剤Ｂ１を製造した。
【００６６】
１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に５．０ｇのＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣと、予め調製した１０．０ｍＬのテトラエチレングリコールジグリシジルエーテル水溶液（ナガセケムテックス製デナコールＥＸ−８２１から調製、濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を添加したのち、３０℃の振盪機内で３０分間振盪したのち、反応容器に１０４μＬ（１５６ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）の４８％ＮａＯＨ水溶液を添加し、３０℃の振盪機内で８時間振盪することによりＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣのエポキシ化を行なった。反応終了後、反応液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄した。次に、エポキシ化ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣ全量を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加し、１０．０ｍＬの０．５Ｍ  エチレンジアミン水溶液（東京化成製エチレンジアミンから調製）を添加したのち、５０℃の振盪機内で３時間振盪することによりエポキシ化ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣのアミノ化を行なった。反応終了後、反応液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄した。次に、アミノ化ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣ全量を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加し、１０．０ｍＬの３−マレイミドプロピオン酸  Ｎ−スクシンイミジル／ＤＭＳＯ溶液（和光純薬製３−マレイミドプロピオン酸  Ｎ−スクシンイミジルから調製、濃度１０ｍｇ／ｍＬ）を添加したのち、３５℃の振盪機内で４時間振盪することによりアミノ化ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣのマレイミド化を行なった。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で２０ｍＬのＤＭＳＯで３回、３０ｍＬの水で５回洗浄することにより、目的のマレイミド化ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを調製した。
【００６７】
次に、マレイミド化ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣへのレクチン固定化を行なった。レクチン固定化には、実施例１で作製したレクチンのＤ−ＰＢＳ（−）溶液を濃縮したものを使用した。また、マレイミド化ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣは水で懸濁したものをグラスフィルターでろ過したものを使用した。
【００６８】
９２０μＬのレクチン溶液（濃度９．７５ｍｇ／ｍＬ）に、５．０２ｍＬのＤ−ＰＢＳ（−）と６０μＬの０．１Ｍトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、和光純薬製）水溶液を添加して、担体固定化用レクチン溶液を調製した。
【００６９】
１００  ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に４．５ｇのマレイミド化ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣ（６．０ｍＬ相当）を添加したのち、６．０ｍＬの固定化用緩衝液（０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を添加した。次に、６．０ｍＬの担体固定化用レクチン溶液（レクチン仕込み濃度：１．５ｍｇ／ｍＬ−担体）を添加し、３５℃で１５時間振盪することによりマレイミド化ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣへのレクチン固定化を行い、吸着剤Ｂ１を作製した。レクチン固定化終了後、吸着剤Ｂ１をＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄し、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いて洗浄液中のレクチン量を測定し、固定化反応前のレクチン仕込み量から回収レクチン量を差し引くことにより、１ｍＬ当りの吸着剤Ｂ１のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．２５ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。
【００７０】
調製例２  親水性高分子が固定されたトヨパールＨＷ−４０ＥＣの作製−２
調製例１において、４０重量％デキストラン水溶液（分子量４０，０００、東京化成製）の代わりに、３０重量％デキストラン水溶液（分子量４５０，０００〜６５０，０００、シグマアルドリッチ製）を用いた以外は調製例１と同様の方法でデキストランを固定することにより、目的のデキストラン修飾トヨパールＨＷ−４０ＥＣ（ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣ）を調製した。以下、調製例２で作製したＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを吸着剤として評価する場合は、吸着剤Ｃ０とする。
【００７１】
実施例３  親水性高分子が固定された吸着剤Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３の作製
調製例２で作製したＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを用い、実施例２と同様の方法で担体へのマレイミド基の導入およびレクチン固定化を行うことにより、吸着剤Ｃ１を作製した。実施例２に記載の方法により１ｍＬ当りの吸着剤Ｃ１のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．４１ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。
【００７２】
また、実施例２で用いた固定化用緩衝液および担体固定化用レクチン溶液の量を、０．７５倍に減量して３５℃で１５時間振盪反応させ、吸着剤Ｃ２を作製した。実施例２に記載の方法により１ｍＬ当りの吸着剤Ｃ２のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．３１ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。さらに、実施例２で用いた固定化用緩衝液および担体固定化用レクチン溶液の量を、１．５倍に増量して３５℃で１５時間振盪反応させ、吸着剤Ｃ３を作製した。実施例２に記載の方法により１ｍＬ当りの吸着剤Ｃ３のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．６８ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。
【００７３】
実施例４  吸着剤Ｃ１への２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞の吸着・剥離実験
「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有さないヒト慢性骨髄性白血病細胞であるＫ５６２細胞（ＪＣＲＢ００１９）を浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）にてＧＩＴ培地（日本製薬製）で５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養を行った。
【００７４】
また、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有するヒトｉＰＳ細胞である２０１Ｂ７株（特許実施許諾契約およびＭＴＡ契約を締結後、京都大学ＣｉＲＡより分譲、以下、２０１Ｂ７細胞とする）を接着細胞培養用シャーレ（コーニング製）にて、以下の手順によりフィーダーフリー培養を行った。
【００７５】
まずｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ製）をＤ−ＰＢＳ（−）に３μｇ／ｍＬで希釈した溶液を調製し、シャーレに導入して４℃で一晩以上放置することで、シャーレ培養面へのｉＭａｔｒｉｘ−５１１のコーティングを行った。コーティングを行ったシャーレのｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液を廃棄した後、ｉＰＳ細胞培養用培地であるＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地（味の素製）を導入しリンス後、凍結バイアルより解凍した２０１Ｂ７細胞をロックインヒビター  Ｙ２７３６２（和光純薬製）を１０μＭ添加した同培地に懸濁して播種した。一晩培養後、Ｙ２７３６２を含むＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地を廃棄し、Ｙ２７３６２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地へと培地交換を行った。その後、シャーレは毎日ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地にて培地交換を行い、適当な細胞密度になったところで、細胞回収と継代を行った。細胞回収については以下のようにして行った。まず、シャーレにＤ−ＰＢＳ（−）を導入し細胞をリンスした後、Ｄ−ＰＢＳ（−）を廃棄する操作を２回繰り返して細胞を洗浄後、ＣＴＳ  ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）とＶｅｒｓｅｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を１：１で混合した溶液を導入して５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１分間放置した。細胞が丸く剥がれつつあるのを確認した後、剥離液を廃棄、１０μＭ  Ｙ２７３６２を含むＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地を導入し、セルスクレ―バーで細胞を剥離し、５０ｍＬチューブ中に回収した。回収した細胞の細胞数は血球計算盤でカウントし、Ｙ２７３６２を含むＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地にて、１０４〜１０５個／ｍＬの濃度で播種し、適当な細胞密度になるまで培養を継続した。
【００７６】
次に、２０１Ｂ７細胞を以下の手順でＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で蛍光染色した。まず、シャーレ中の培地を廃棄後、Ｄ−ＰＢＳ（−）を導入して細胞をリンス後、Ｄ−ＰＢＳ（−）を吸引廃棄した。次にＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅを無血清ＲＰＭＩ培地に終濃度２０μＭで溶解した液を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。蛍光試薬液を廃棄後、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。培地を廃棄後、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養した。
【００７７】
次にそれぞれの細胞の回収と調製を以下の方法で行った。Ｋ５６２細胞についてはシャーレから直接５０ｍＬチューブへと回収を行った。また、２０１Ｂ７細胞については、まず、シャーレにＤ−ＰＢＳ（−）を導入し細胞をリンスした後、Ｄ−ＰＢＳ（−）を廃棄する操作を２回繰り返して細胞を洗浄後、ＣＴＳ  ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）とＶｅｒｓｅｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を１：１で混合した溶液を導入して５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃で１分間放置した。細胞が丸く剥がれつつあるのを確認した後、剥離液を廃棄、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地を導入し、セルスクレ―バーで細胞を剥離し、５０ｍＬチューブ中に回収した。それぞれの細胞を遠心分離して沈降後、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ（ＰＢＳに０．５％ＢＳＡと２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したもの）にて懸濁し、再度遠心分離して上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞洗浄操作を２回繰り返した後、最終的に、数ｍＬのＭＡＣＳバッファに懸濁したＫ５６２細胞と２０１Ｂ７細胞をそれぞれセルストレーナーで濾過することで凝集塊を除去し、９．０ｘ１０７個／ｍＬのＫ５６２細胞と７．０ｘ１０６個／ｍＬの２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液を得た。
【００７８】
次に、５０ｍＬ容ファルコンピペット（コーニング製、Ｆａｌｃｏｎ）と１ｍＬピペットチップの間に目開き１００μｍメッシュのナイロンネットフィルター（ミリポア製）を装着したカラムを作製した。実施例３で作製した吸着剤Ｃ１（５ｍＬ）を前述のＭＡＣＳバッファ（１０ｍＬ）で懸濁したのち、懸濁液を５０ｍＬチューブ中に添加し、静置して吸着剤Ｃ１を沈降させた。吸着剤Ｃ１が沈降した懸濁液の上清を廃棄したのち、新たにＭＡＣＳバッファ（１０ｍＬ）を添加して吸着剤Ｃ１を懸濁し、静置して吸着剤Ｃ１を沈降させた。その後、上清の廃棄、ＭＡＣＳバッファ添加による吸着剤Ｃ１の懸濁、吸着剤Ｃ１の沈降からなる一連の操作を４回繰り返すことにより、吸着剤Ｃ１をＭＡＣＳバッファで置換した。上清を廃棄したあとの吸着剤Ｃ１（５ｍＬ）が入った５０ｍＬチューブ中にＭＡＣＳバッファ（５ｍＬ）を添加して懸濁することにより、吸着剤Ｃ１の５０％懸濁液（１０ｍＬ）を調製し、作製したカラムに添加することにより、吸着剤をカラムに充填した。
【００７９】
次に、前述の９．０ｘ１０７個／ｍＬのＫ５６２細胞を７ｍＬと７．０ｘ１０６個／ｍＬの２０１Ｂ７細胞を２．５ｍＬ混合した細胞混合液（合計量９．５ｍＬ）を調製し、このうち４．５ｍＬを分取してＭＡＣＳバッファ０．５ｍＬを加えて５ｍＬとした後、この５ｍＬの細胞混合液、すなわち３．０ｘ１０８個のＫ５６２細胞と８．３ｘ１０６個の２０１Ｂ７細胞を、カラム中に充填した吸着剤上部にアプライした。次に、表２に示す条件で順次キャリア液の導入を行った。すなわち、５ｍＬずつ７回（細胞懸濁液と合計で４０ｍＬ）のＭＡＣＳバッファ導入の後、０．５Ｍマンニトールと０．２Ｍフコースと１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む剥離液を５ｍＬずつ２回（合計で１０ｍＬ）、および再びＭＡＣＳバッファを５ｍＬずつ２回（合計で１０ｍＬ）導入した。
【００８０】
カラム下部のピペットチップ先端より流出した細胞液は、それぞれ５ｍＬずつのフラクションとして、１２フラクション（合計で６０ｍＬ）をそれぞれファルコンチューブ（コーニング製）に回収した。回収した流出細胞液フラクションのうち、フラクション１と２はＭＡＣＳバッファで１０倍に希釈した。ＭＡＣＳバッファで１０倍に希釈したフラクション１と２、フラクション３から１２はそれぞれ原液を血球計算盤に導入し、蛍光顕微鏡の明視野＋オレンジ蛍光、およびオレンジ蛍光で細胞カウントを行った。明視野＋オレンジ蛍光でカウントされた細胞数をＫ５６２細胞数と２０１Ｂ７細胞数の合計、オレンジ蛍光でカウントされた細胞を２０１Ｂ７細胞数とし、Ｋ５６２細胞数は両者の差分として、各フラクション中のＫ５６２細胞数と２０１Ｂ７細胞数の定量を行った。
【００８１】
蛍光顕微鏡で観察した明視野＋オレンジ蛍光、およびオレンジ蛍光の各視野の写真を図１に示す。また、横軸を流出液量、縦軸を細胞流出率とした場合の細胞分離クロマトグラムを図３に示す。各細胞の細胞流出率は「カウントにより算出した細胞数／カラムにアプライした細胞数」として算出した。また、１−８フラクション流出分（４０ｍＬ）のそれぞれの細胞流出率（％）合計値と９フラクション以降の流出分（４５−６０ｍＬｍＬ）のそれぞれの細胞流出率（％）合計値、全フラクションのそれぞれの細胞流出率（％）合計値を表３に示す。
【００８２】
図１と図３と表３の結果から、吸着剤Ｃ１にＫ５６２細胞と２０１Ｂ７細胞の細胞混合物を通液した場合、ＭＡＣＳバッファを導入して得られた細胞流出液である１から８フラクションまでの画分では、Ｋ５６２細胞の流出率が６３．４％と多く、２０１Ｂ７細胞の流出は０．６％と僅かであった。また、０．５Ｍ  マンニトールと０．２Ｍ  フコースおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む剥離液を導入した後のフラクションである９フラクション以降ではＫ５６２細胞の流出率が６．５％、２０１Ｂ７細胞の流出が１０３．７％と顕著な２０１Ｂ７細胞の流出が認められ、剥離液処理による吸着剤からの２０１Ｂ７細胞剥離効果が確認された。これらの結果から、トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤である吸着剤Ｃ１にＫ５６２細胞と２０１Ｂ７細胞の混合細胞液を導入し、ＭＡＣＳバッファおよび０．５Ｍマンニトールと０．２Ｍフコースおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む剥離液を順次導入しフラクションとして得ることで、Ｋ５６２細胞と２０１Ｂ７細胞をそれぞれ分離し選択的に得ることが出来た。
【００８３】
比較例１  吸着剤Ａ０への２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞の吸着・剥離実験
ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化していない担体であるトヨパールＨＷ−４０ＥＣ（以下、吸着剤Ａ０）を用い、その他の方法については実施例４と同様の方法で細胞の吸着実験を行った。
【００８４】
蛍光顕微鏡で観察した明視野＋オレンジ蛍光、およびオレンジ蛍光の各視野の写真を図２に示す。また、横軸を流出液量、縦軸を細胞流出率とした場合の細胞分離クロマトグラムを図４に示す。各細胞の細胞流出率は「カウントにより算出した細胞数／カラムにアプライした細胞数」として算出した。また、１−８フラクション流出分（４０ｍＬ）のそれぞれの細胞流出率（％）合計値と９フラクション以降の流出分（４５−６０ｍＬｍＬ）のそれぞれの細胞流出率（％）合計値、全フラクションのそれぞれの細胞流出率（％）合計値を表３に示す。
【００８５】
図２と図４と表３の結果から、吸着剤Ａ０にＫ５６２細胞と２０１Ｂ７細胞の細胞混合物を通液した場合、ＭＡＣＳバッファを導入して得られた細胞流出液である１から８フラクションまでの画分では、Ｋ５６２細胞の流出率が７５．０％、２０１Ｂ７細胞の流出は８９．３％であり、また、０．５Ｍ  マンニトールと０．２Ｍ  フコースおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む剥離液を導入した後のフラクションである９フラクション以降ではＫ５６２細胞の流出率が３．９％、２０１Ｂ７細胞の流出が６．０％であり、いずれのフラクションにおいても細胞選択性は認められなかった。
【００８６】
これらの結果から、市販トヨパールＨＷ−４０ＥＣである吸着剤Ａ０にＫ５６２細胞と２０１Ｂ７細胞の混合細胞液を導入し、ＭＡＣＳバッファおよび０．５Ｍ  マンニトールと０．２Ｍ  フコースおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む剥離液を順次導入しフラクションとして得た場合、それぞれの細胞を選択的に分離することが出来ないことが確認された。
【００８７】
【表２】
2019000063.tif 000003
【００８８】
【表３】
2019000063.tif 000004
【００８９】
実施例５  吸着剤Ｂ１への２１０２Ｅｐ細胞の吸着・剥離実験とＦＡＣＳ解析
「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有するＥｍｂｒｙｏｎａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃｌ．４／Ｄ３細胞（コスモバイオ製、以下２１０２Ｅｐ細胞と記載）を接着細胞培養用フラスコ（コーニング製）にて、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）と抗生物質溶液（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、和光純薬製）を添加したＤ−ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬製）で５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養を行った。
【００９０】
カラム通液試験実施日より１日前、２日前、３日前、４日前にそれぞれ継代した２１０２Ｅｐ細胞を準備しておき、カラム通液試験当日、それぞれの細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで剥離回収することで、培養期間がそれぞれ１日目、２日目、３日目、４日目となる２１０２Ｅｐ細胞を用意した。
【００９１】
次に、それぞれの培養日数で準備した２１０２Ｅｐ細胞の回収と調製を以下の方法で行った。まず培養フラスコにＤ−ＰＢＳ（−）を導入した後、細胞をリンスしてＤ−ＰＢＳ（−）液を廃棄した。次に、適当量のＡｃｃｕｔａｓｅ製を導入し、数分間放置することで２１０２Ｅｐ細胞を剥離させ、５０ｍＬチューブへと回収した。それぞれの細胞を１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離して沈降後、細胞ペレットを前述のＭＡＣＳバッファに懸濁し、再び遠心後上清を廃棄することで細胞洗浄を行った。ＭＡＣＳバッファに懸濁した２１０２Ｅｐ細胞をセルストレーナーで濾過することで、凝集塊の無い均一な２１０２Ｅｐ細胞懸濁液を得た。それぞれの細胞懸濁液は血球計算盤で細胞数をカウントした後、ＭＡＣＳバッファで希釈することで、各細胞懸濁液濃度を３．０ｘ１０７個／ｍＬに調整した。
【００９２】
次に、２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製  セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。実施例２で作製した吸着剤Ｂ１（５００μＬ）をＭＡＣＳバッファ（１．０ｍＬ）で懸濁したのち、懸濁液を５ｍＬチューブ中に添加し、静置して吸着剤Ｂ１を沈降させた。吸着剤Ｂ１が沈降した懸濁液の上清を廃棄したのち、新たにＭＡＣＳバッファ（１．０ｍＬ）を添加して吸着剤Ｂ１を懸濁し、静置して吸着剤Ｂ１を沈降させた。その後、上清の廃棄、ＭＡＣＳバッファ添加による吸着剤Ｂ１の懸濁、吸着剤Ｂ１の沈降からなる一連の操作を４回繰り返すことにより、吸着剤Ｂ１をＭＡＣＳバッファで置換した。上清を廃棄したあとの吸着剤Ｂ１（５００μＬ）が入った５ｍＬチューブ中にＭＡＣＳバッファ（５００μＬ）を添加して懸濁することにより、吸着剤Ｂ１の５０％懸濁液（１．０ｍＬ）を調製し、作製したカラムに添加することにより、吸着剤をカラムに充填した。
【００９３】
次にそれぞれのカラムを垂直に立てた状態で、上記の方法で調製した３．０ｘ１０７個／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞懸濁液をそれぞれ１００μＬ、すなわち６．０ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤の条件で２１０２Ｅｐ細胞をカラム上部にアプライした。
【００９４】
次に、カラム上部よりＭＡＣＳバッファを１ｍＬ導入し、針部から流出した約１ｍＬの細胞液を別容器に回収した（以下、この回収液を流出細胞液と記載する）。次に、さらにカラム上部より０．５Ｍマンニトールと０．２Ｍ  フコース、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む剥離液を１ｍＬ導入し、針部から流出した約１ｍＬの細胞液を別容器に回収した。その後、吸着剤が０．５Ｍマンニトールと０．２Ｍ  フコース、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む剥離液に浸漬した状態で３０分室温放置し、さらにカラム上部よりＭＡＣＳバッファを２ｍＬ導入することで、針部から流出した約２ｍＬの細胞液を別容器に回収した。これらの０．５Ｍマンニトールと０．２Ｍ  フコース、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む剥離液の導入による１ｍＬの流出液、ＭＡＣＳバッファの導入による２ｍＬの流出液は混合して３ｍＬとした（以下、この回収液を剥離細胞液と記載する）。回収した流出細胞液と剥離細胞液は血球計算盤で細胞数をカウントし、「細胞流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」「細胞剥離率（％）＝カラムあたりの剥離細胞数／導入細胞数」として、アプライした細胞数に対する比率である流出率と剥離率をそれぞれ算出した。細胞流出率と細胞剥離率を表４、グラフを図５に示す。
【００９５】
吸着剤Ｂ１を充填したカラムでは２１０２Ｅｐ細胞の流出率は７％（培養日数１日の細胞）、１２％（培養日数２日の細胞）、１０％（培養日数３日の細胞）、１７％（培養日数４日の細胞）と低く、吸着剤に２１０２Ｅｐ細胞が強く吸着されるために流出率が低いことが明らかとなった。一方、２１０２Ｅｐ細胞の剥離率は６０％（培養日数１日の細胞）、６０％（培養日数２日の細胞）、２９％（培養日数３日の細胞）、４５％（培養日数４日の細胞）と、吸着剤に結合した多くの２１０２Ｅｐ細胞が剥離することが明らかとなった。
【００９６】
次に、以下の方法でフローサイトメトリー（日本ＢＤ製  ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩｕ、以下ＦＡＣＳと記載）により、各アプライ細胞液、流出細胞液、剥離細胞液のＴＲＡ−１−６０陽性率、およびＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率を測定した。まず各細胞液を遠心分離して細胞を沈降後、上清を廃棄して細胞ペレットをＭＡＣＳバッファにて懸濁することで細胞の洗浄を行った。再び遠心分離して細胞を沈降した後、上清を廃棄して、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ１ｍＬに再懸濁した。Ａｎｔｉ−ＴＲＡ−１−６０  ＰＥ（ノバスバイオロジカル製）を５μＬおよびｒＢＣ２ＬＣＮ−ＦＩＴＣ（和光純薬製）を５μＬ添加し、室温で１時間反応した。蛍光試薬反応後、遠心分離して細胞を沈降した後、上清を廃棄して、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ１ｍＬに懸濁した。再び遠心分離して細胞を沈降した後、上清を廃棄して、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ１ｍＬに再懸濁することで、ＦＡＣＳ測定用細胞サンプルとした。
【００９７】
各アプライ細胞液、流出細胞液、剥離細胞液をＦＡＣＳで解析したドットプロットを図６に示す。横軸をＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸をＰＥの蛍光強度として解析を行った。図６中のＱ１とＱ２をＴＲＡ−１−６０陽性の細胞集団、Ｑ２とＱ３をＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性の細胞集団とし、ＴＲＡ−１−６０陽性率（％）＝（Ｑ１＋Ｑ２）／（Ｑ１＋Ｑ２＋Ｑ３＋Ｑ４）、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率（％）＝（Ｑ２＋Ｑ３）／（Ｑ１＋Ｑ２＋Ｑ３＋Ｑ４）として、それぞれ陽性率の算出を行った。
【００９８】
ＴＲＡ−１−６０陽性率およびＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率解析結果を表５、ＴＲＡ−１−６０陽性率のグラフを図７、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率のグラフを図８、に示す。ＴＲＡ−１−６０陽性率は培養日数によるアプライ時の陽性率、流出細胞の陽性率、剥離細胞の陽性率による違いは見られず、全ての細胞集団で９９％以上の高い値を示し、２１０２Ｅｐ細胞がＡｎｔｉ−ＴＲＡ−１−６０抗体と強い結合性を元々有するためであることが明らかとなった。また、カラムにアプライした２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率はそれぞれ７５％（培養日数１日の細胞）、６０％（培養日数２日の細胞）、６８％（培養日数３日の細胞）、５９％（培養日数４日の細胞）、流出細胞液のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率はそれぞれ５７％（培養日数１日の細胞）、４５％（培養日数２日の細胞）、４７％（培養日数３日の細胞）、３９％（培養日数４日の細胞）、剥離細胞液のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率はそれぞれ７６％（培養日数１日の細胞）、７１％（培養日数２日の細胞）、８１％（培養日数３日の細胞）、７４％（培養日数４日の細胞）であり、流出細胞液ではＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率が他の細胞集団と比べ１〜２割低下すること、および剥離細胞液ではアプライ細胞液に比べＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率が最大で約１５ポイント高いことが明らかとなった。これらの結果から、レクチンを固定化した吸着剤Ｂ１に２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合、吸着剤に結合した２１０２Ｅｐ細胞を剥離液で処理することで生細胞として剥離回収し、ＦＡＣＳにて表面マーカーの発現解析をすることができ、カラムからの流出細胞はＢＣ２ＬＣＮレクチン反応性の低い細胞集団、吸着剤に結合した細胞（すなわち剥離細胞）はＢＣ２ＬＣＮレクチン反応性の高い細胞集団であることが明らかとなった。
【００９９】
比較例２  吸着剤Ｂ０への２１０２Ｅｐ細胞の吸着・剥離実験とＦＡＣＳ解析
調製例１で作製した吸着剤Ｂ０を用い、その他の方法については実施例５と同様の方法で細胞の吸着実験を行った。２１０２Ｅｐ細胞の培養日数は３日間とした。細胞流出率と細胞剥離率を表４、グラフを図５に示す。トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化していない吸着剤である吸着剤Ｂ０を用いた場合、細胞流出率は５９％、細胞剥離率は１％であり、２１０２Ｅｐ細胞が吸着剤に結合せず流出するため、剥離処理による細胞剥離率が低いことが明らかとなった。また、アプライ細胞液、流出細胞液、剥離細胞液をＦＡＣＳで解析したドットプロットを図６、ＴＲＡ−１−６０陽性率およびＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率解析結果を表５、ＴＲＡ−１−６０陽性率のグラフを図７、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率のグラフを図８に示す。ＦＡＣＳ解析の結果、ＴＲＡ−１−６０陽性率はアプライ細胞液で９９％、流出細胞液で９９％、剥離細胞液で１００％であり、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率はアプライ細胞液で６８％、流出細胞液で６７％、剥離細胞液で６７％であったことから、それぞれの細胞集団における陽性率に違いは見られず、アプライした細胞が吸着剤に結合せずにそのまま流出していることが明らかとなった。
【０１００】
【表４】
2019000063.tif 000005
【０１０１】
【表５】
2019000063.tif 000006
【０１０２】
実施例６  吸着剤Ｂ１への２１０２Ｅｐ細胞の吸着と剥離液による剥離実験
２１０２Ｅｐ細胞を接着細胞培養用フラスコ（コーニング製）にて、実施例５と同様の手順により、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養を行った。
【０１０３】
次に、以下の手順により２１０２Ｅｐ細胞をＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で蛍光染色した。まずフラスコ中の培地を廃棄後、Ｄ−ＰＢＳ（−）を導入して細胞をリンス後、Ｄ−ＰＢＳ（−）を廃棄した。次にＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅを無血清ＲＰＭＩ培地に終濃度１０μＭで溶解した液を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。蛍光試薬液を廃棄後、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）と抗生物質溶液（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、和光純薬製）を添加したＤ−ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬製）を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養した。
【０１０４】
次に、２１０２Ｅｐ細胞を回収、洗浄、シングルセル化し、２．０ｘ１０７個／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液を得た。
【０１０５】
次に、２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製  セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。実施例２で作製した吸着剤Ｂ１（５００μＬ）を用い、実施例５に記載の方法により吸着剤Ｂ１の５０％懸濁液を調製（１．０ｍＬ）したのち、作製したカラムに添加することにより、吸着剤をカラムに充填した。
【０１０６】
次にそれぞれのカラムを垂直に立てた状態で、上記の方法で調製した２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液をカラム上部より１００μＬずつ、すなわち、４．０ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤の条件でアプライした。
【０１０７】
次に、カラム上部よりＭＡＣＳバッファを１ｍＬ導入し、針部からの流出液を別容器に回収した（以下、この回収液を流出細胞液と記載する）。次に、カラム上部より吸着剤に結合した２１０２Ｅｐ細胞を剥離するため、表６に記載の条件の剥離液を１ｍＬ導入し、針部からの流出液を別容器に回収した。次にカラム上部よりＭＡＣＳバッファを２ｍＬ導入し、細胞剥離液導入により得られた流出液１ｍＬとＭＡＣＳバッファ導入により得られた流出液２ｍＬを混合し合計３ｍＬとして別容器に回収した（以下、この回収液を剥離細胞液と記載する）。また、カラムに剥離液を導入してからの操作は、カラムＮＯ．１−５とＮＯ．１１−１４は３７℃、ＮＯ．６−１０は室温で処理を行った。
【０１０８】
次に、回収した流出細胞液と剥離細胞液中の細胞数の定量を以下に示す９６穴蛍光プレートリーダーによる蛍光測定法にて行った。
【０１０９】
まず回収した各細胞液をフルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）に１００μＬずつ分注し、プレートリーダーで励起波長５４１ｎｍでの蛍光スキャンを行うことで、検出波長５８０ｎｍでの蛍光強度をそれぞれ測定した。また同様に、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色した２．０ｘ１０７個／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞の希釈系列を作製し、フルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレートに１００μＬずつ分注してプレートリーダーで励起波長５４１ｎｍ、検出波長５８０ｎｍでの蛍光スキャンを行うことで、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色した２１０２Ｅｐ細胞の細胞濃度と蛍光強度の検量線を作製した。このようにして得られた各フラクションの蛍光強度と検量線から、各カラムにおける流出率と剥離率を、「流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」「剥離率（％）＝カラムあたりの剥離細胞数／導入細胞数」として算出した。
【０１１０】
２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率と細胞剥離率の数値を表６、グラフを図９に示す。細胞流出率はいずれのカラムも７％から１３％であり、トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤である吸着剤Ｂ１を用いることで、導入した２１０２Ｅｐ細胞のうち、約９割が吸着剤に結合していることが明らかとなった。また、細胞剥離率については、フコースとマンニトールを含む剥離液を３７℃で作用させた場合の細胞剥離率は４６％（カラムＮＯ．１：０．３Ｍマンニトール＋０．２Ｍフコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、４１％（カラムＮＯ．２：０．５Ｍマンニトール＋０．２Ｍフコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、４７％（カラムＮＯ．３：０．７Ｍマンニトール＋０．２Ｍフコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、４１％（カラムＮＯ．４：０．３Ｍマンニトール＋０．４Ｍフコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、４６％（カラムＮＯ．５：０．５Ｍマンニトール＋０．４Ｍフコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、室温で作用させた場合の細胞剥離率は４７％（カラムＮＯ．６：０．３Ｍマンニトール＋０．２Ｍフコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、６０％（カラムＮＯ．７：０．５Ｍマンニトール＋０．２Ｍフコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、５７％（カラムＮＯ．８：０．７Ｍマンニトール＋０．２Ｍフコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、５４％（カラムＮＯ．９：０．３Ｍマンニトール＋０．４Ｍフコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、６２％（カラムＮＯ．１０：０．５Ｍマンニトール＋０．４Ｍフコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）と、フコースとマンニトールを含む剥離液で細胞剥離処理を行うことにより、アプライした２１０２Ｅｐ細胞のうち、約４割から６割を効率良く剥離回収できることが確認された。また、これらのフコースとマンニトールを含む剥離液で細胞剥離処理を行う場合は、室温での処理により３７℃で処理する場合よりも高い細胞剥離率が得られることが明らかとなった。
【０１１１】
比較例３  吸着剤Ｂ１への２１０２Ｅｐ細胞の吸着とフコースを含まない剥離液による剥離実験
細胞剥離液として、またはフコースを含まない剥離液（浸透圧調節剤であるマンニトールとＥＤＴＡを含む水溶液）を用いた以外は、実施例６と同様の方法で、細胞の吸着・剥離実験を行った。剥離液を導入する以降の操作は、すべて３７℃で行った。２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率と細胞剥離率の数値を表６、グラフを図９に示す。細胞流出率はいずれのカラムも約１０％であり、トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤である吸着剤Ｂ１を用いることで、導入した２１０２Ｅｐ細胞のうち、約９割が吸着剤に結合していることが明らかとなった。また、細胞剥離率については、マンニトールとＥＤＴＡのみを含む剥離液を作用させた場合の剥離率は、０．３Ｍマンニトール＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡの場合は１４％（カラムＮＯ．１１）、０．５Ｍマンニトール＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡの場合は２２％（カラムＮＯ．１２）０．７Ｍマンニトール＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡの場合は２０％（カラムＮＯ．１３）であった。これらの結果から、フコースを含まない細胞剥離液を用いた場合は、十分な細胞の剥離回収効果が得られないことが明らかとなった。
【０１１２】
【表６】
2019000063.tif 000007
【０１１３】
実施例７  吸着剤Ｃ１への２０１Ｂ７細胞の吸着・剥離実験とＦＡＣＳ解析
２０１Ｂ７細胞を接着細胞培養用シャーレ（コーニング製）にて、実施例４と同様の手順によりフィーダーフリー培養を行った。
【０１１４】
次に、実施例４と同様の方法により、細胞回収・洗浄を行い、最終的に２．０ｘ１０７個／ｍＬの２０１Ｂ７細胞のＭＡＣＳバッファ細胞懸濁液を得た。
【０１１５】
次に、２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製  セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。実施例３で作製した吸着剤Ｃ１（５００μＬ）を用い、実施例５に記載の方法により吸着剤Ｃ１の５０％懸濁液（１．０ｍＬ）を調製したのち、作製したカラムに添加することにより、吸着剤をカラムに充填した。
【０１１６】
次にカラムを垂直に立てた状態で、上記の方法で調製した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液をカラム上部より１００μＬ、すなわち、４．０ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤の条件でアプライした。
【０１１７】
次に、カラム上部よりＭＡＣＳバッファを１ｍＬ導入し、針部からの流出液を別容器に回収した（以下、この回収液を流出細胞液と記載する）。次に、カラム上部より吸着剤に結合した２０１Ｂ７細胞を剥離するため、細胞剥離液（０．５Ｍマンニトール＋０．２Ｍフコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を１ｍＬ導入し、針部からの流出液を別容器に回収した。次にカラム上部よりＭＡＣＳバッファを１ｍＬ導入し、回収した流出液１ｍＬを細胞剥離液の導入により得られた流出液１ｍＬと混合し、合計２ｍＬとした（以下、この回収液を剥離細胞液と記載する）。
【０１１８】
流出細胞液の細胞数については血球計算盤またはコールターカウンターＺ２シリーズ（ベックマンコールター製）、また、剥離細胞液中の細胞数については血球計算盤で計測し、「流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」、「剥離率（％）＝カラムあたりの剥離細胞数／導入細胞数」としてそれぞれの値を算出した。
【０１１９】
細胞流出率と細胞剥離率の数値を表７、グラフを図１０に示す。細胞流出率は、１．２％（血球計算盤）、０．４％（コールターカウンター）であり、ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤である吸着剤Ｃ１を用いることで、導入した２０１Ｂ７細胞のほとんどが吸着していることが明らかとなった。また細胞剥離率は５０．０％（血球計算盤）であり、吸着剤に結合した２０１Ｂ７細胞が良好に回収されることが明らかとなった。
【０１２０】
次に、以下の方法でフローサイトメトリー（日本ＢＤ製  ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩｕ、以下ＦＡＣＳと記載）により、アプライ細胞液、流出細胞液、剥離細胞液のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率を測定した。まず各細胞液を遠心分離して細胞を沈降後、上清を廃棄して細胞ペレットをＭＡＣＳバッファにて懸濁することで細胞の洗浄を行った。再び遠心分離して細胞を沈降した後、上清を廃棄して、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ１ｍＬに再懸濁した。ｒＢＣ２ＬＣＮ−ＦＩＴＣ（和光純薬製）を５μＬ添加し、室温で１時間反応した。蛍光試薬反応後、遠心分離して細胞を沈降した後、上清を廃棄して、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ１ｍＬに懸濁した。再び遠心分離して細胞を沈降した後、上清を廃棄して、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ１ｍＬに再懸濁することで、ＦＡＣＳ測定用細胞サンプルとした。
【０１２１】
各アプライ細胞液、流出細胞液、剥離細胞液をＦＡＣＳで解析したドットプロットを図１１、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率の値を表８、グラフを図１２に示す。図１１中の横軸をＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸をＰＥの蛍光強度として解析を行った。Ｑ３をＢＣ２ＬＣＮレクチン陰性の２０１Ｂ７細胞集団とし、Ｑ４をＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性の２０１Ｂ７細胞集団とし、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率（％）＝Ｑ４／（Ｑ３＋Ｑ４）として、陽性率の算出を行った。カラムにアプライした２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は９４．５％、流出細胞液では２．４％、剥離細胞液では８３．０％であった。この結果から、ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤である吸着剤Ｃ１を用いた場合、流出細胞液中に含まれる２０１Ｂ７細胞はアプライした２０１Ｂ７細胞のうち、極度にＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率が低い細胞集団であることが確認できた。
【０１２２】
これらの結果からトヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤である吸着剤Ｃ１を用いることで、２０１Ｂ７細胞を効率良く吸着剤に結合させ、剥離液で処理することでそれらを剥離し、特にＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率が高い細胞を選択的に回収・精製できることが明らかとなった。
【０１２３】
比較例４  吸着剤Ｂ０への２０１Ｂ７細胞の吸着・剥離実験とＦＡＣＳ解析
ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化していない吸着剤Ｂ０を使用した以外は、実施例７と同様の方法で２０１Ｂ７細胞の吸着・剥離実験とＦＡＣＳ解析を行った。細胞流出率と細胞剥離率の数値を表７、グラフを図１０に示す。細胞流出率は、それぞれ７８．０％（血球計算盤）、８１．０％（コールターカウンター）であり、ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化していない吸着剤である吸着剤Ｂ０を用いた場合、導入した２０１Ｂ７細胞のうち約８割が流出、つまり２０１Ｂ７細胞がほとんど吸着されないことが明らかとなった。また細胞剥離率は４．０％（血球計算盤）であり、２０１Ｂ７細胞がほとんど吸着剤に結合されないために、細胞剥離率も低いことが確認された。
【０１２４】
アプライ細胞液、流出細胞液、剥離細胞液をＦＡＣＳで解析したドットプロットを図１１、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率の値を表８、グラフを図１２に示す。カラムにアプライした２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は９４．５％、流出細胞液では９２．９％、剥離細胞液では８６．４％であった。この結果から、ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化していない吸着剤である吸着剤Ｂ０を用いた場合、ほとんどの２０１Ｂ７細胞が吸着剤に結合せずに素通りするため、アプライ細胞液、流出細胞液、剥離細胞液中の２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率がほぼ同じ値であることが確認できた。
【０１２５】
これらの結果からＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮを固定化していない吸着剤Ｂ０を用いた場合は、２０１Ｂ７細胞を吸着できず、回収および精製ができないことが明らかとなった。
【０１２６】
【表７】
2019000063.tif 000008
【０１２７】
【表８】
2019000063.tif 000009
【０１２８】
実施例８  吸着剤Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３への２０１Ｂ７細胞と２１０２Ｅｐ細胞の吸着・剥離実験
実施例４に記載の方法に従って２０１Ｂ７細胞を培養し、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅでの染色、回収、洗浄を行い、最終的に３．０ｘ１０７個／ｍＬの２０１Ｂ７細胞のＭＡＣＳバッファ細胞懸濁液を得た。また、同様に実施例６に記載の方法に従って２１０２Ｅｐ細胞を培養し、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅでの染色、回収、洗浄を行い、最終的に４．３ｘ１０６個／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞のＭＡＣＳバッファ細胞懸濁液を得た。
【０１２９】
次に、２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製  セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。実施例３で作製したＢＣ２ＬＣＮレクチン固定化量が０．３１ｍｇ／ｍＬ−吸着剤である吸着剤Ｃ２（５００μＬ）、ＢＣ２ＬＣＮレクチン固定化量が０．４１ｍｇ／ｍＬ−吸着剤である吸着剤Ｃ１（５００μＬ）、ＢＣ２ＬＣＮレクチン固定化量が０．６８ｍｇ／ｍＬ−吸着剤である吸着剤Ｃ３（５００μＬ）を用い、実施例５に記載の方法により吸着剤Ｃ２、Ｃ１、Ｃ３の５０％懸濁液（各１．０ｍＬ）を調製したのち、作製したカラムに添加することにより、各吸着剤を充填したカラムを作製した。
【０１３０】
次にそれぞれのカラムを垂直に立てた状態で、上記の方法で調製した２０１Ｂ７細胞または２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液をカラム上部より１００μＬずつ、すなわち、２０１Ｂ７細胞は６．０ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤の条件、２１０２Ｅｐ細胞は８．６ｘ１０５個／ｍＬ−吸着剤の条件でアプライした。２０１Ｂ７細胞については、吸着剤Ｃ１、吸着剤Ｃ３を充填したカラム、２１０２Ｅｐ細胞については、吸着剤Ｃ２、吸着剤Ｃ１、吸着剤Ｃ３Ｃ４を充填したカラムを用いて細胞通液試験を実施した。
【０１３１】
次に、カラム上部よりＭＡＣＳバッファを１ｍＬ導入し、針部からの流出液を別容器に回収した（以下、この回収液を流出細胞液と記載する）。次に、吸着剤に結合した細胞を剥離するため、細胞剥離液として、０．５Ｍマンニトール＋０．２Ｍフコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡの組成の剥離液をそれぞれ１ｍＬカラム上部より導入し、針部からの流出液を別容器に回収した（以下、この回収液を剥離細胞液と記載する）。
【０１３２】
次に、実施例６の方法に従い、回収した流出細胞液と剥離細胞液中の細胞数の定量を９６穴蛍光プレートリーダーによる蛍光測定法にて行った。細胞流出率と細胞剥離率の数値を表９、２０１Ｂ７細胞の細胞流出率と細胞剥離率のグラフを図１３、２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率と細胞剥離率のグラフを図１４に示す。ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３を充填したカラムに、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞である２０１Ｂ７細胞、または２１０２Ｅｐ細胞を通液した結果、吸着剤のＢＣ２ＬＣＮレクチン固定化量の増大に伴い、細胞流出率が低下し、細胞剥離率は増大することが確認できた。
【０１３３】
このことから、ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤である吸着剤Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３を用いることで、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞である２０１Ｂ７細胞および２１０２Ｅｐ細胞を、吸着剤のＢＣ２ＬＣＮレクチン固定化量依存的に結合させ、剥離回収することが可能であることが明らかとなった。
【０１３４】
比較例５  吸着剤Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３へのＫ５６２細胞の吸着・剥離実験
実施例４の方法に従い培養したＫ５６２細胞を５０ｍＬチューブに回収後、１５００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を廃棄した。次に、細胞ペレットをＤ−ＰＢＳ（−）に懸濁し、再び、１５００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を廃棄することで細胞を洗浄した。Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を無血清ＲＰＭＩ培地に終濃度２０μＭで溶解した液に細胞ペレットを懸濁し、培養シャーレに移し替え、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。次にこの細胞を５０ｍＬチューブに回収し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を廃棄した。その後、ＧＩＴ培地に懸濁し、培養シャーレに移し替え、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃でさらに１時間培養した。再び、細胞を５０ｍＬチューブに回収し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心後、上清を廃棄した。細胞ペレットをＧＩＴ培地に再懸濁し、培養シャーレに移し替え、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養を行った。次に、実施例４の方法に従い細胞の回収、洗浄を行い、最終的に１．５ｘ１０７個／ｍＬ−吸着剤のＫ５６２細胞のＭＡＣＳバッファ細胞懸濁液を得た。
【０１３５】
次に、細胞としてＫ５６２細胞を用いた以外は実施例８と同様の方法で、細胞の吸着・剥離実験を行った。吸着剤はＢＣ２ＬＣＮレクチン固定化量が異なる吸着剤Ｃ２、吸着剤Ｃ１、吸着剤Ｃ３について、それぞれ細胞通液試験を実施した。上記の方法で調製したＫ５６２細胞の細胞懸濁液をカラム上部より１００μＬずつ、すなわち、３．０ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤の条件でアプライした。
【０１３６】
次に、回収した流出細胞液と剥離細胞液中の細胞数の定量を、以下に示す９６穴蛍光プレートリーダーによる蛍光測定法にて行った。
【０１３７】
まず回収した各細胞液をフルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）に１００μＬずつ分注し、プレートリーダーで励起波長４９２ｎｍでの蛍光スキャンを行うことで、検出波長５３０ｎｍでの蛍光強度をそれぞれ測定した。また同様に、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色した１．５ｘ１０７個／ｍＬのＫ５６２細胞の希釈系列を作製し、フルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレートに１００μＬずつ分注してプレートリーダーで励起波長４９２ｎｍ、検出波長５３０ｎｍでの蛍光スキャンを行うことで、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色したＫ５６２細胞の細胞濃度と蛍光強度の検量線を作製した。このようにして得られた各細胞流出液と細胞剥離液の蛍光強度と検量線から、各カラムにおける流出率と剥離率を、「流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」「剥離率（％）＝カラムあたりの剥離細胞数／導入細胞数」として算出した。細胞流出率と細胞剥離率の数値を表９、Ｋ５６２細胞の細胞流出率と細胞剥離率のグラフを図１５に示す。
【０１３８】
ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３に、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有さない細胞である、Ｋ５６２細胞を通液した結果、吸着剤へのＢＣ２ＬＣＮレクチン固定化量に関わらず、Ｋ５６２細胞の流出率と剥離率はほぼ一定であることが確認できた。
【０１３９】
このことから、ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３を用いた場合、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有さない細胞であるＫ５６２細胞は吸着剤にほとんど結合しないことが明らかとなった。
【０１４０】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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