(57)【要約】【課題】ブタＣＤ４を種特異的に認識するモノクローナル抗体を提供すること。【解決手段】ブタＣＤ４Ｂを認識し、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血を認識しない、モノクローナル抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタＣＤ４Ｂを認識し、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血を認識しない、モノクローナル抗体。
【請求項２】
ブタＣＤ４Ａを認識する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ブタＣＤ４Ａを認識しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ブタＣＤ４Ｂを発現する細胞を免疫原として免疫動物を免疫し、前記免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、請求項１から３の何れか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
重鎖のアミノ酸配列として配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１から４の何れか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
重鎖のアミノ酸配列として配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号８に記載のアミノ酸配列及び／又は配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１から４の何れか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６６又は受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６７を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
【請求項８】
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６６又は受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６７を有するハイブリドーマ。
【請求項９】
請求項１から７の何れか一項に記載のモノクローナル抗体と、ブタＣＤ４を含む試料又はブタＣＤ４を発現する細胞とを接触させる工程を含む、ブタＣＤ４を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタＣＤ４を認識するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近交系ブタは、ヒトと進化系統的に遠いマウス等の齧歯類に代わる「ＭＨＣを含む移植関連遺伝子が固定された唯一の中型実験動物」である。またブタは、インフルエンザなどヒト感染症の媒体となることが知られており、その血液学的・免疫学的性状がヒトとどのような共通性を持つのかについて明らかにすることが動物を介したヒトへのウイルス伝搬機構の解明や健全な家畜育成と食糧供給にとって重要である。ブタは、高い繁殖効率や臓器サイズ、ヒトとの生理学的類似性からヒトへの異種移植ドナーとしても最適であるとみなされ、これまで中型動物としてはもっとも免疫系の研究結果が集積している。
【０００３】
ブタＣＤ４については、複数の亜型の存在が報告されている。本発明者らも、マイクロミニピッグにおいて、現在市販されているＣＤ４抗体で認識されないブタのＣＤ４亜型の存在を報告した（非特許文献１及び非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Identification and characterization of two CD4 alleles in Microminipigs.  Tatsuya Matsubara, Naohito Nishii, Satoshi Takashima, Masaki Takasu, Noriaki Imaeda, Kayo Aiki-Oshimo, Kazuaki Yamazoe, Michinori Kakisaka, Shin-nosuke Takeshima, Yoko Aida, Yoshie Kametani, Jerzy K Kulski, Asako Ando, Hitoshi Kitagawa  BMC Veterinary Research 2016 Oct 7;12(1):222.
【非特許文献２】Identification of a CD4 variant in Microminipigs not detectable with available anti-CD4 monoclonal antibodies. Tatsuya Matsubara, Naohito Nishii, Satoshi Takashima, Masaki Takasu, Noriaki Imaeda, Kayo Aiki-Oshimo, Kazuaki Yamazoe, Yoshie Kametani, Asako Ando, Hitoshi Kitagawa 2015 Veterinary immunology and Immunopathology 168(3-4):176-183 (IF 1.535)doi:10.1016/j.vetimm.2015.09.008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
日本で開発されたマイクロミニピッグは小型で、実験動物としての有用性も指摘されているが、これらのブタのコロニーでは、発明者らが報告した通り、ＣＤ４Ｂ分子を発現する個体が大きな割合を占めている。従って、これらブタの免疫系の解析のため、ＣＤ４Ｂを認識するモノクローナル抗体の作製が強く望まれている。また、同様のＣＤ４亜型はＮＩＨ（米国立衛生研究所Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）ミニブタでも報告されており、全世界のブタで、ＣＤ４Ｂの亜型の存在が推定されている。また、ブタは移植免疫のみならず再生医療の研究にも汎用されつつあり、種特異的な免疫担当細胞の識別は急務となっている。しかし、市販のブタCD4抗体は、ＣＤ４Ａのみに特異的な抗体であり、今まで他のブタＣＤ４を認識する抗体は作成されていなかった。
【０００６】
本発明は、ブタＣＤ４を種特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、ブタＣＤ４Ｂを亜型特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ブタＣＤ４を認識し、ヒト、マウス及びコモンマーモセットの末梢血を認識しないモノクローナル抗体を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  ブタＣＤ４Ｂを認識し、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血を認識しない、モノクローナル抗体。
（２）  ブタＣＤ４Ａを認識する、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）  ブタＣＤ４Ａを認識しない、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（４）  ブタＣＤ４Ｂを発現する細胞を免疫原として免疫動物を免疫し、前記免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、（１）から（３）の何れか一に記載のモノクローナル抗体。
（５）  重鎖のアミノ酸配列として配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、（１）から（４）の何れか一に記載のモノクローナル抗体。
（６）  重鎖のアミノ酸配列として配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号８に記載のアミノ酸配列及び／又は配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、（１）から（４）の何れか一に記載のモノクローナル抗体。
（７）  受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６６又は受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６７を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
（８）  受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６６又は受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６７を有するハイブリドーマ。
（９）  （１）から（７）の何れか一に記載のモノクローナル抗体と、ブタＣＤ４を含む試料又はブタＣＤ４を発現する細胞とを接触させる工程を含む、ブタＣＤ４を検出する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のモノクローナル抗体は、日本国内で開発されたミニピッグのみならず、ＮＩＨの保有するブタ系統を含め、大部分のブタが持つＣＤ４遺伝子の産物を種特異的に認識することができる。ＣＤ４は免疫系に関わる最重要分子のひとつであり、本発明のモノクローナル抗体は、ブタ免疫系に関連した、再生医療、移植免疫及び感染免疫等の免疫研究において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、免疫スケジュールと、免疫マウスの血漿中交差性抗体価を示す。
【図２】図２は、免疫を行ったマウス血漿のＣＤ４ＡおよびＣＤ４Ｂトランスフェクタントとの交差性を測定した結果を示す。
【図３】図３は、ブタＣＤ４ＡＢを認識するクローンx１Ｅ１０についてＦＣＭにより特異性を解析した結果を示す。
【図４】図４は、ブタＣＤ４Ｂを特異的に認識するクローンｂ１Ｄ７についてＦＣＭにより特異性を解析した結果を示す。
【図５】図５は、ブタＣＤ４Ｂを特異的に認識するクローンｂ１Ｄ７について種特異性を解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明以前に、ブタＣＤ４Ｂの発現確認に関しては、非特許文献１及び非特許文献２にあるように、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ法を用いるしか手段がなく、それらの手法を用いて発明者らもマイクロミニピッグコロニーにおけるＣＤ４亜型の優位な存在を確認した。しかし、ｍＲＮＡの発現とタンパク質の発現、特に細胞表面上への発現は必ずしも一致せず、タンパク質の挙動を明らかにすることはできなかった。また、これらの分子のシグナル伝達の上での機能的な差違についても明らかにすることができなかった。
【００１２】
ＣＤ４Ａ抗原とＣＤ４Ｂ抗原に共通して反応する抗体、およびＣＤ４Ｂ抗原に特異的に反応する抗体は、ブタ同種または異種の細胞、臓器移植実験、並びに各種ワクチン接種後の抗体産生能の解析やペプチド等の外来抗原に対する免疫応答実験におけるリンパ球サブセットの動態の解析等に必須の抗体として、医用実験動物学や獣医・畜産学等の幅広い領域において有用である。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、ブタＣＤ４Ｂを認識し、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血を認識しないことを特徴とする。
本発明のモノクローナル抗体の第一の例としては、ブタＣＤ４Ａ及びブタＣＤ４Ｂを認識し、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血を認識しないモノクローナル抗体を挙げることができる。
本発明のモノクローナル抗体の第二の例としては、ブタＣＤ４Ａを認識せず、ブタＣＤ４Ｂを認識し、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血を認識しないモノクローナル抗体を挙げることができる。
【００１４】
本明細書において、「認識しない」とは、実質的に認識しないこと、即ち、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血と実質的に交差反応しないことを意味し、必ずしも全く反応しないことのみを意味するわけではない。実質的に交差反応しないとは、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血に対する本発明のモノクローナル抗体の結合親和性が、同一条件下におけるブタ末梢血単核球に対する結合親和性よりも、少なくとも１／１０、より好ましくは１／１００、さらに好ましくは１／１０００であることを意味する。
【００１５】
本発明の抗体は特に限定されず、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体の一例としては、ブタＣＤ４Ｂを発現する細胞を免疫原として免疫動物を免疫し、前記免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体を挙げることができる。
モノクローナル抗体の作製は、当業者に既知の方法により行うことができる。
所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、通常の免疫方法にしたがって免疫動物を免疫する。免疫動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、サル、などの哺乳動物を用いることができる。免疫動物への抗原の投与は常法に従って行う。例えば完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントと抗原との懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化することができる。
【００１７】
本発明においては、好ましくは、  ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＣＤ４Ｂホモタイプのブタ末梢血単核球を２回免疫し、さらにＣＤ４Ｂ遺伝子導入Ａ２０細胞を免疫することができる。このようにして免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス血漿中には、ＣＤ４Ｂ遺伝子導入ＨＥＫ２９３細胞の他、ＣＤ４Ａ遺伝子導入ＨＥＫ２９３細胞にも結合し得る抗体を産生されていることが示された（図１参照）。
【００１８】
次いで、上記の免疫動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用することができる。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞は特に制限されないが、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマとして得ることができる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。即ち、免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とを公知の方法により融合することにより、ハイブリドーマを作製することができる。
【００２０】
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用することができる。細胞融合により得られたハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングすることができる。
【００２１】
次いで、得られたハイブリドーマをスクリーニングすることによって、ブタＣＤ４Ｂを認識し、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血を認識しない、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得することができる。
【００２２】
ハイブリドーマのスクリーニングは、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、ブタＣＤ４Ｂを発現している細胞を用いたＦＡＣＳ等の当該技術分野において公知の方法を用いて、ブタＣＤ４Ｂを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択することができる。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野において公知の方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。
【００２３】
本発明の抗体の一例としては、後記する実施例で取得された受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６６を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を挙げることができる。本モノクローナル抗体は、重鎖のアミノ酸配列として配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む抗体である。受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６６を有するハイブリドーマも本発明の範囲内である。
【００２４】
本発明の抗体の別の例としては、後記する実施例で取得された受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６７を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を挙げることができる。本モノクローナル抗体は、重鎖のアミノ酸配列として配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号８に記載のアミノ酸配列及び／又は配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む抗体である。受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６７を有するハイブリドーマも本発明の範囲内である。
【００２５】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用な方法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）により容易に単離、配列決定できる。
【００２６】
抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成することができる。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００２７】
上記のように、抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
【００２８】
また、本発明のモノクローナル抗体は、ブタＣＤ４Ｂを認識する特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
【００２９】
上記の通り発現又は産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる。
【００３０】
本発明によれば、本発明のモノクローナル抗体と、ブタＣＤ４を含む試料又はブタＣＤ４を発現する細胞とを接触させることによって、ブタＣＤ４を検出することができる。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体と、ブタＣＤ４を発現する細胞とを接触させ、フローサイトメトリーアッセイによりブタＣＤ４を検出することができる。
【００３１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
＜材料＞
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、日本クレアから８週齢のメスを購入した。
ブタ血液は国内の大学などから入手した。スクリーニングにおいて二次抗体として用いたＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＡＰＣ抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社  のものを使用した。細胞融合には、ＰＥＧ溶液とＰ３Ｘ６３−Ｕ１ミエローマ細胞株を用いた。ハイブリドーマ培養のための選択培地はＳＩＧＭＡ社のＨＡＴサプリメントとＧｉｂｃｏ（登録商標）のＨＴサプリメントを使用した。モノクローナル抗体のアイソタイプはＲｏｃｈｅ社のＩｓｏＳｔｒｉｐＴＭマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを使用し決定した。
【００３３】
＜方法＞
（１）トランスフェクション
ＣＤ４ＡおよびＣＤ４Ｂ遺伝子は、発明者らのグループが解析したマイクロミニピッグのＣＤ４遺伝子のｍＲＮＡ配列  （非特許文献１）（ＣＤ４Ａ：ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＬＣ０６４０５９．１；ＣＤ４Ｂ：ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＬＣ０６４０６０．１）よりプライマーを設計し、マイクロミニピッグのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成後、コンストラクトを作製した。ベクターとしては、modified S/MAR (scaffold/matrix attachment region) episomal vectorを用いた(Modified S/MAR episomal vectors for stably expressing fluorescent-protein tagged transgenes with small cell-to-cell fluctuations. Akiko Mizutani, Eri Kikkawa, Akira Matsuno, Atsuko Shigenari, Hiroko Okinaga, Mineko Murakami, Hideyuki Ishida, Masafumi Tanaka, Hidetoshi Inoko Analytical Biochemistry. 2013; 443(1):113-6. PMID: 23969013 doi: 10.1016/j.ab.2013.08.009)。コンストラクトの遺伝子配列は、配列番号１１〜１５に示す。
【００３４】
配列番号１１：ｏｒｉ２  ｐＥＰＩ  Ｋｍ  ＣＡＧ（Ｋ４９９）Ａｇｅ  ＳＬＡ１−ＢａｍＨＩ  ＩＲＥＳ／ＥＭ７  ９１７／９２１／９１９／９２０  ｍＶｅｎｕｓ−Ｋｍ  ｆｕｓｉｏｎ  ｎｏＢａｍ (ベクター)
配列番号１２：ＣＤ４Ａ(cDNA)
配列番号１３：ＣＤ４Ｂ(cDNA)
配列番号１４：Ｌｉｇ  １３−１１７（ＣＤ４Ａを組み込んだ発現ベクター）
配列番号１５：Ｌｉｇ  １３−１１８（ＣＤ４Ｂを組み込んだ発現ベクター）
【００３５】
ＨＥＫ２９３細胞はＤ−ＭＥＭ−１０％ＦＣＳ培地で培養し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｅｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、１１００Ｖ  １０ｍｓ  ３ｐａｌｓｅｓの条件で遺伝子導入を行い、５％ＣＯ２濃度の３７℃インキュベーター内で４２時間〜４８時間培養した後、Ｇ４１８を培地に添加し、遺伝子導入された細胞のみを抽出した。Ａ２０細胞はＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＣＳ培地で培養し、１５００Ｖ  １０ｍｓ  ３ｐａｌｓｅｓの条件でＣＤ４ＡあるいはＣＤ４Ｂのいずれかの遺伝子導入を行い、５％ＣＯ２濃度の３７℃インキュベーター内で１８時間〜２４時間培養した。培養した遺伝子導入Ａ２０細胞を回収し、ｍＶｅｎｕｓの遺伝子発現量についてフローサイトメトリーにより確認した。
【００３６】
（２）免疫・マウス抗体価確認
ブタ末梢血よりＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰを用いて単核球を採取した。ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒで赤血球を溶解し、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ（ＭＭＣ）処理を３７℃で４０分間行った後、３ｘ１０６個の細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスへ２週間の間隔を開け、腹腔内投与した。さらに２週間後、上記の方法でＣＤ４Ｂ遺伝子を導入したＡ２０細胞をＭＭＣ処理した後、腹腔内投与を行った。この追加免疫を２回行った後、ＭＭＣ処理を行ったブタ末梢血単核球を２週間の間隔を開けて２回投与した。マウスの抗体価はＨＥＫ２９３細胞とＨＥＫ２９３細胞を親株としたＣＤ４Ａ／Ｂ導入細胞にマウスの血漿を添加し、二次抗体としてａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＡＰＣを用いて染色し、マウス血漿中のポリクローナル抗体の産生を確認した。
【００３７】
（３）細胞融合
ハイブリドーマ作製法は申請者らが行う常法を用いた(Production of a Locus and Allele-Specific Monoclonal Antibody for the Characterisation of SLA-1*0401 mRNA and Protein Expression Levels in MHC-Defined Microminipigs. Yoshie Kametani*, Shino Ohshima, Asuka Miyamoto, Atsuko Shigenari, Masaki Takasu, Noriaki Imaeda, Tatsuya Matsubara, Masafumi Tanaka, Takashi Shiina, Hiroshi Kamiguchi, Ryuji Suzuki, Hitoshi Kitagawa, Jerzy K. Kulski, Noriaki Hirayama, Hidetoshi Inoko, Asako Ando PLOS ONE 2016 11(10):e0164995. doi: 10.1371/journal.pone.0164995.)。
【００３８】
免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスをイソフルランを用いて麻酔し、心臓採血を行った後、頸椎脱臼により安楽死させ、脾臓を摘出した。ＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＣＳ培地中で脾臓をスライドグラスですりつぶし、メッシュ（７７μｍ）を通した後、３００xｇで５分間、４℃で遠心した。上清を除去し、沈殿をＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、懸濁後すぐに３００xｇで５分間、４℃で遠心分離を行なった。遠心後、上清を除去し、ＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＣＳ培地１０ｍｌに細胞を懸濁し、細胞数を測定した。Ｐ３Ｘ６３−Ｕ１細胞と脾臓細胞が１：１０の割合になるようにＰ３Ｘ６３−Ｕ１細胞を用意し、脾臓細胞と混合し、３００ｘｇで５分間、４℃で遠心分離を行った。上清を除去し、３７℃に温めておいたＰＥＧ溶液１ｍｌを１分間かけて添加し、３７℃の恒温水槽で１分間静置した。その後２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＣＳ培地を１分間かけて添加し、続いて１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＣＳ培地を１分間かけて添加した。９０ｘｇで５分間、４℃で遠心を行い、上清除去後５×１０６／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＣＳ培地とＨＡＴサプリメントが５０：１になるように調製した培地に細胞を懸濁し、Ｃｏｒｎｉｎｇの９６ｗｅｌｌプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、５％ＣＯ２  濃度の３７℃インキュベーター内で培養を行った。１０日後にハイブリドーマのコロニー数を計測し、培地交換を行った。
【００３９】
（４）スクリーニング
ＨＥＫ２９３細胞と該細胞を親株としたＣＤ４ＡあるいはＣＤ４Ｂ導入細胞を用いてスクリーニングを行った。
スクリーニング前日にＨＥＫ２９３細胞とＨＥＫ２９３  ＣＤ４Ａ／Ｂ導入細胞の混合細胞を１×１０４／ｗｅｌｌずつ、Ｔｈｕｒｍｏの９６ｗｅｌｌプレートに分注し、５％ＣＯ２濃度の３７℃インキュベーター内で培養を行った。スクリーニング当日にハイブリドーマ培養上清を１６０μＬ取り出した。
【００４０】
ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３  ＣＤ４Ａ／Ｂ導入細胞の培地を除き、取り出したハイブリドーマ培養上清を細胞が剥がれないように７０μＬ／ｗｅｌｌでゆっくり添加し、１５分間、室温でインキュベートした。１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、チップの先端がプレートの底に付かないように上清１２０μＬを除去した。１５０μＬ／ｗｅｌｌの１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳを添加した後、１８０μＬの上清を除去した。１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳで５００倍希釈したＢｉｏＲｅｇｅｎｄ社のａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＡＰＣを５０μＬ／ｗｅｌｌずつ、ゆっくり添加し、１５分間室温でインキュベートした。１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、３００×ｇで５分間、４℃で遠心を行い、チップの先端がプレートの底に付かないように上清１２０μＬを除去した。１５０μＬ／ｗｅｌｌの１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳを添加した後、３００×ｇで５分間、４℃で遠心を行い、チップの先端がプレートの底に付かないように上清１５０μＬを除去し、１０００倍希釈をしたヘキスト３３３４２を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。
【００４１】
Ｔｈｕｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＡｒａｙ  Ｓｃａｎ  ＶＴＩを用いてハイブリドーマ上清とＨＥＫ２９３細胞とＣＤ４Ａ／Ｂ導入細胞との反応性を解析した。Ａｒａｙ  Ｓｃａｎによる解析後、フローサイトメトリ―を用いて、同様の解析を行った。ＨＥＫ２９３細胞とＨＥＫ２９３  ＣＤ４Ａ、ＣＤ４Ｂ導入細胞をそれぞれＦｉｓｈｅｒチューブに入れ、ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／チューブずつ添加し、１５分間４℃でインキュベートした。インキュベート後、１×ＰＢＳ１ｍｌを添加し、１０００ｇで５分間（ＫＵＢＯＴＡ２４２０）遠心分離を行い、５０μＬの上清を残し、他の上清を除去した。１００倍希釈したＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社のａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＡＰＣを１０μＬ／チューブずつ添加し、１５分間４℃でインキュベートした。インキュベート後、１×ＰＢＳ１ｍｌを添加し、１０００ｇで５分間、遠心分離を行い、上清を除去した後、１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳを２００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、メッシュを通してＦＡＬＣＯＮ（登録商標）のラウンドボトムチューブに移し、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＶＥＲＳＥ）で解析を行った。蛍光強度３ｘ１０１をカットオフ値とし、ＣＤ４トランスフェクタントの染色により、それ以上の蛍光を示す陽性細胞が２０％以上存在し、親株ではカットオフ値以下が９０％以上となるという条件を持つ抗体を産生するクローンを陽性クローンとした。
【００４２】
（５）種特異性およびアロタイプ特異性の解析
ヒトリンパ球、マイクロミニブタリンパ球、マウスリンパ球はそれぞれ末梢血からフィコール（ヒト）、あるいはＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰＴＭ（マイクロミニブタ・マウス）を用いた比重分離により単核球画分を採取した。１次抗体としてスクリーニングにより得られたクローンの培養上清を用いて染色を以下の様に行い、上記と同様の方法でフローサイトメトリーにより解析を行った。陽性コントロールとしては、ブタＣＤ４抗体（ＳｏｕｔｈｅｎＢｉｏｔｅｃｈ社  ７４−１２−４）を用いた。  
【００４３】
（６）抗体の一次構造解析
ハイブリドーマより抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、特定のバンドが増幅される事を確認した後、次世代シークエンサーにて遺伝子配列を解析した。ｃＤＮＡ代表配列に識別されたリードＩＤをソートし、長いもののみを抜粋してＧｅｎｅｔｙｘ（登録商標）等のソフトで全長配列を確定した。
【００４４】
＜結果＞
（１）ブタＣＤ４Ａ／Ｂ両者を特異的に認識する抗体作成の為の免疫
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＣＤ４Ｂホモタイプのブタ末梢血単核球を２回免疫し、さらにＣＤ４Ｂ遺伝子導入Ａ２０細胞を免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス血漿中には、ＣＤ４Ｂ遺伝子導入ＨＥＫ２９３細胞の他、ＣＤ４Ａ遺伝子導入ＨＥＫ２９３細胞にも結合し得る抗体を産生されていることが示された（図１Ａ、Ｂ）。
【００４５】
したがって、ＣＤ４Ｂ遺伝子導入Ａ２０細胞を免疫後、ＣＤ４ＡとＣＤ４Ｂの各遺伝子を導入した２種類のＨＥＫ２９３細胞に対して血漿中交差性抗体価の上昇を示すマウスを選択し、マウス脾細胞とＰ３Ｘミエローマ細胞との細胞融合を行った。作製されたハイブリドーマの培養上清は、同様の２種類のＣＤ４遺伝子導入細胞を用いて、スクリーニングを行った。ＣＤ４ＡＢを認識するクローンはＣＤ４ＡＢ両者を染色するもの、ＣＤ４Ｂのみを認識するクローンはＣＤ４Ｂのみを認識するものとしてピックアップした。
【００４６】
（２）免疫後のマウス血漿中交差性抗体価の測定とスクリーニング
図２は、１２匹の免疫マウスそれぞれにＰＢＭＣ  ２回免疫後、ＣＤ４A遺伝子導入Ａ２０細胞を用いて免疫を行ったマウス血漿のＣＤ４ＡおよびＣＤ４Ｂトランスフェクタントとの交差性を示している。図２では、多くのマウスでＣＤ４Aを免疫してもＣＤ４Bとも交差する抗体を産生していることが示されている。
【００４７】
特に４回免疫を行った２８週のＲ  ｃｕｔマウスの血漿は、ＣＤ４Ａ遺伝子導入ＨＥＫ２９３細胞とＣＤ４Ｂ遺伝子導入ＨＥＫ２９３細胞の両細胞で強く染色され、ＣＤ４Ａ，ＣＤ４Ｂの共通エピトープを認識すると考えられるＣＤ４抗体価の上昇が認められた。そのため、このマウス脾細胞の細胞融合（図２：  Ｆｕｓｉｏｎ  ｘ）を行った。さらに、これらの細胞融合から作製されたハイブリドーマ上清のスクリーニングを行った。
同様の免疫方法およびチェック方法を用いて、ＣＤ４ＡＢ両者を認識する抗体の力価が上昇したマウスを得た。これらを用いて脾細胞融合を行った。その後、Ａｒｒａｙ  ｓｃａｎにて陽性細胞を選択した。
【００４８】
モノクローナル抗体ｘ１Ｅ１０を産生するハイブリドーマ細胞は、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６６として、２０１８年３月７日に、独立行政法人  製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
モノクローナル抗体ｂ１Ｄ７を産生するハイブリドーマ細胞は、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６６７して、２０１８年３月７日に、独立行政法人  製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
【００４９】
（３）モノクローナル抗体
＜１＞ＣＤ４ＡＢを認識するクローンｘ１Ｅ１０
（１）ＦＣＭによる特異性の解析
ＨＥＫ２９３-ＣＤ４ＡおよびＨＥＫ２９３−ＣＤ４Ｂ両トランスフェクタントを用いて、特異性の解析を行った。その結果、ｘ１Ｅ１０はＣＤ４ＡおよびＣＤ４Ｂの両トランスフェクタントを認識した。その結果、ｘ１Ｅ１０はＣＤ４Ａ及びＣＤ４Ｂ両者に特異的であり、ＣＤ４ＡとＣＤ４Ｂを共通して認識することが明らかとなった（図３Ａ）。また、本クローンの抗体は、ヒト、マウス、コモンマーモセット（ＣＭ）の末梢血を認識せず、ブタ末梢血単核球のみと反応した（図３Ｂ）。従って、本モノクローナル抗体は、ブタのみに特異的であることが明らかとなった。
【００５０】
（２）次世代シークエンサーによるモノクローナル抗体遺伝子の構造解析
本抗体のハイブリドーマｍＲＮＡより次世代シークエンサーによって遺伝子配列解析を行った。ＣＤ４ＡＢを認識するクローンｘ１Ｅ１０の重鎖の塩基配列とアミノ酸配列と、ｘ１Ｅ１０の軽鎖の塩基配列とアミノ酸配列とを以下に記載する。
【００５１】
重鎖：
塩基配列（配列番号１）
CGCTCTCACTGGAGGCTGATCTCTGAAGATAAGGAGGTGTAGCCTAAAAGATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTGGCTGTTCACAGCCTTTCCTGGTATCCTGTCTGATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCATCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAGATGGAGTGGATGGGCTACATACTCTACAGTGGAACCACTAACTACAACCCCTCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCACGAAGGACCTACTATGATTACGATTACTATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGG
【００５２】
アミノ酸配列（配列番号２）
MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSIISDYAWNWIRQFPGNKMEWMGYILYSGTTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARRTYYDYDYYGMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVK
【００５３】
軽鎖：
塩基配列（配列番号３）
TCCTCAGGCTGTCTCCTCAGGTTGCCTCCTCAAAATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAATTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGACCATTGTCCATAGTCTTGGTAACACCTATTTAGAATGGTACCTACAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCATTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACACTCAAGATCACCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAA
【００５４】
アミノ酸配列（配列番号４）
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVLMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSLGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFIGSGSGTDFTLKITRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQL
【００５５】
＜２＞ブタＣＤ４Ｂを特異的に認識するクローンｂ１Ｄ７
（１）ＦＣＭによる特異性の解析
ＨＥＫ２９３-ＣＤ４ＡおよびＨＥＫ２９３−ＣＤ４Ｂ両トランスフェクタントを用いて、特異性の解析を行ったところ、本クローンは図４に示す通り、ＣＤ４Ａトランスフェクタントは認識せず、ＣＤ４Ｂトランスフェクタントのみを高い結合能を持って認識した。以上の結果、ｂ１Ｄ７はＣＤ４Ｂのみに特異的であり、ＣＤ４Ａを認識しないことが明らかとなった。
【００５６】
次に、ブタ、ヒト、マウスの末梢血単核球を用いて、ｂ１Ｄ７の種特異性について解析した。その結果、図５に示すように、ｂ１Ｄ７は、ヒト、マウス、コモンマーモセット（ＭＣ）の末梢血を認識せず、ＣＤ４Ｂホモのブタ末梢血単核球のみと反応した。従って、本モノクローナル抗体は、種特異的であることが明らかとなった。
【００５７】
（２）モノクローナル抗体遺伝子構造解析
本抗体のハイブリドーマｍＲＮＡより次世代シークエンサーによって遺伝子配列解析を行った。ブタＣＤ４Ｂを特異的に認識するクローンｂ１Ｄ７の重鎖の塩基配列とアミノ酸配列と、ｂ１Ｄ７の軽鎖の塩基配列とアミノ酸配列とを以下に記載する。本抗体には２種類の軽鎖が存在することが明らかになった。これらの軽鎖はクローニングによっても常に２つ発現しており、２つのＢ細胞が１ミエローマと融合したクローンである可能性が高いと考えられた。
【００５８】
重鎖：
塩基配列（配列番号５）
CACTGGAGGCTGATCTCTGAAGATAAGGAGGTGTAGCCTAAAAGATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTGGCTGTTCACAGCCTTTCCTGGTATCCTGTCTGATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAGCTTCAGTGGTAGCACTAGCTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGACAGGGCTATGGAGATTACGACCCCTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCT[G|T]GTCAA[G|A]GG
【００５９】
アミノ酸配列（配列番号６）
MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISFSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARQGYGDYDPFPYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK
【００６０】
軽鎖：
塩基配列（配列番号７）
IGKV6-20_IGKJ2_CGQGYSYPYTFの予測DNA配列
TAGAGGCCAGCCCAGCTGTCCATGATTTATAACCTAGGCCTTTGCAGTGAGATCTGAAATGCATCAGACCAGCATGGGCATCAAGATGGAATCACAGACTCTGGTCTTCATATCCATACTGCTCTGGTTATATGGAGCTGATGGGAACATTGTAATGACCCAATCTCCCAAATCCATGTCCATGTCAGTAGGAGAGAGGGTCACCTTGACCTGCAAGGCCAGTGAGAATGTGGTTACTTATGTTTCCTGGTATCAACAGAAACCAGAGCAGTCTCCTAAACTGCTGATATACGGGGCATCCAACCGGTACACTGGGGTCCCCGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGCAACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTTGCAGATTATCACTGTGGACAGGGTTACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAA 
【００６１】
アミノ酸配列（配列番号８）
MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQL
【００６２】
軽鎖：
塩基配列（配列番号９）
AAGAACTGACTAGACTCTATCTTGCTATTTGCATATTACATTTTCAGTAACCACAAATATCTCACAGTTGGTTTATAGCAAAGTACTTATGAGAATAGTAGTAATTAGCTAGGGACCAAAGTTCAAAGACAAAATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATACTGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAACAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTTAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAA
【００６３】
アミノ酸配列（配列番号１０）
MDFQVQIFSFLLISASVILSRGQIVLTQSPTIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQL
【００６４】
以上の結果、本スクリーニング法及び本モノクローナル抗体は、ブタ特異的CD4モノクローナル抗体作製法及びモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとしてフローサイトメトリーに最適であることが分かる。
【図１】
2019172586.tif 000002
【図２】
2019172586.tif 000003
【図３】
2019172586.tif 000004
【図４】
2019172586.tif 000005
【図５】
2019172586.tif 000006
【配列表】
2019172586000001.app