(57)【要約】【課題】ＴＴＲの線維化を阻害する活性を測定する方法を提供する。【解決手段】デオキシコール酸Ｎａの存在下で変異ＴＴＲと評価試料を反応させる工程を含む、ＴＴＲの線維化を阻害する活性を測定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシコール酸Ｎａの存在下で変異ＴＴＲと評価試料を反応させる工程を含む、ＴＴＲの線維化を阻害する活性を測定する方法。
【請求項２】
中性条件で線維化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
デオキシコール酸Ｎａの濃度が０.１％から１％である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
評価試料がＴＴＲに対する抗体である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
変異ＴＴＲがＶ３０Ｍ ＴＴＲである、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスサイレチン（TTR:transthyretin）のアミロイド線維の形成や組織への沈着を効果的に抑制する抗体ならびに、当該抗体を用いた治療法を提供する。本抗体療法は、正常型TTRには作用せず、異常型TTRのアミロイド形成のみを抑えるという新たな治療戦略に基づくものであり、安全性に優れた新規治療法になりうると期待される。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドーシスは、線維構造を形成したタンパク質が全身の臓器に沈着することによって機能障害を引き起こす一連の疾患群であり、アルツハイマー型認知症やプリオン病などの様々な疾患が含まれる（非特許文献１）。
【０００３】
家族性アミロイドポリニューロパチー（Familial Amyloidotic Polyneuropathy : FAP）は、TTR、アポリポタンパク質A1、ゲルソリンなどの遺伝子の点変異や欠失が原因となって起こる常染色体優性の遺伝性全身性アミロイドーシスである（非特許文献２）。この中で、TTRの遺伝的な変異によって起こるFAPが最も多い。変異型のTTRがアミロイド線維を形成し、通常、中年期以降に末梢神経や心臓、腎臓、消化管、眼、脳、髄膜といった、ほぼ全身の組織に沈着して機能不全を起こすことが知られている。患者の予後は非常に悪く、発症から10年程度で死に至る難病である。
【０００４】
現在までに100を超えるTTR遺伝子の点変異や欠失が報告されている。中でも、TTRの30番目のバリンがメチオニンに変異したVal30Met変異（以下V30Mのように表記）が最も多く、患者はポルトガル、スウェーデン、日本に多い。ポルトガルに6,000人以上のFAP患者が確認されていること、未だFAPが調べられていないと考えられる地域も少なくなく、今後もFAP 患者群の世界的な発見が続くことが予想されていることから、全世界には1万人をゆうに上回る患者がいると考えられている。最近の研究から、FAPの臨床像（発症年齢や沈着臓器特異性など）はTTR遺伝子の変異の種類に大きく影響されることがわかってきている（非特許文献３）。例えばFAPの発症年齢に関しては、L55P変異は10代に発症する劇症型の臨床像をきたすが、V122I変異は60歳以降に発症する。一方でV30M変異では、若年で発症する病型と高齢で発症する病型の両方が存在することが知られている。沈着する臓器の特異性に関しては、D18G変異は脳や髄膜に沈着して中枢神経障害を引き起こす一方で、V30M変異は全身の組織に沈着し、末梢神経障害や心筋障害を引き起こす（非特許文献３、４）。
【０００５】
TTRは、127個のアミノ酸からなる分子量14 kDaのタンパク質であり、内部に存在する8つのβ−ストランドが2つの逆平行β−シートを形成した構造を有する（非特許文献５）TTRの主な産生場所は肝臓であるが、脳室脈絡叢、網膜の網膜色素上皮細胞、脾臓などにおいても産生されている。TTRは通常、血中で分子量55 kDaの四量体を形成して安定な構造をとり、主に血中および髄液中で、ビタミンA-レチノール結合タンパク質複合体、および甲状腺ホルモンT4の輸送担体として機能している。その血中濃度は200-400μg/mLと高いものの、半減期は2日と短い（非特許文献２〜６）。TTR四量体の中心部には2つの相同なT4結合部位が存在し、T4が結合することにより四量体構造は安定化されることが知られている（非特許文献３）。その他の機能として、インスリン分泌促進作用、脳神経保護作用、脂質代謝に関わる作用など様々な報告がなされている（非特許文献２）。一方で、TTR遺伝子をノックアウトしたマウスでは、血中のレチノールや甲状腺ホルモン濃度は低下するものの、生存率や繁殖能といった表現型に大きな変化は見られなかったことから（非特許文献７）、TTRが実際の生命活動の維持において直接必須なものであるかどうかは不明なままである。
【０００６】
TTRのアミロイド形成には、四量体から単量体への解離と、単量体の構造変化が非常に重要なステップである（非特許文献３）。中でも、四量体から単量体への解離が反応の律速段階であることが明らかにされている。一方、TTRがアミロイドを形成して組織に沈着し、全身の臓器に障害を及ぼす過程で、組織に対して毒性を発揮する分子形態は完全には明らかにされていない。単量体、二量体などの低分子量オリゴマーが細胞毒性を有し、一方で100 kDa以上のTTRアミロイドは細胞毒性を有していないという報告もあり（非特許文献５）、毒性と分子形態との関連性の解明が待たれる。
【０００７】
TTRの遺伝子異常に起因するFAPの治療戦略は主に以下の４種類に分類される。
（１）変異型TTRの産生レベルを抑制する
（２）変異型TTRを含むTTR四量体構造を安定化させる
（３）四量体から解離したTTRのアミロイド化を阻止する
（４）組織に沈着したTTRアミロイドを除去する
【０００８】
血中TTRのほとんどが肝臓で産生されることから（非特許文献２）、この中で現在最も一般的な治療法は（１）に分類される肝移植である。肝移植を行うことで病態進行の遅延が見られるものの、免疫抑制剤を終生使用しなければならず、ドナーや患者への負担も大きい。更に、眼や心臓を含むいくつかの臓器での沈着は継続するため、これら臓器の症状が増悪する例が少なくないなど（非特許文献８）、問題点も多く、有効な治療法の開発が切望されている。
【０００９】
肝移植以外の治療法として、（１）の戦略では、siRNAやアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた治療法が臨床開発段階にあるが、いずれも変異型のみならず野生型TTRの産生も抑制してしまうため、長期にわたり使用した場合の安全性の評価は慎重になされるべきであろう。（２）の戦略では、TTR四量体のT4結合部位に結合することで四量体構造を安定化させる薬剤が開発されている。同戦略で開発された新薬VyndaquelRが2011年にEUで、2013年には日本国内で承認された。30ヵ月に及ぶ臨床試験の結果、VyndaqelRはFAP患者の末梢神経障害を遅らせる効果を示しているものの、症状の進行を完全に抑えるには至っていない（非特許文献９）その他（３）や（４）の戦略においても、複数種類の薬剤が臨床開発段階にあるものの、いずれの治療法も根治療法にはなりえていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開WO2010030203号公報
【特許文献２】特許公開2010-195710号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Glenner, G.G.: Amyloid deposits and amyloidosis: the beta-fibrilloses (second of two parts).: N Engl J Med, 302:1333-1343, 1980
【非特許文献２】Ando, Y. & Jono, H.: Pathogenesis and therapy for transthyretin related amyloidosis.: Rinsho Byori, 56:114-120, 2008
【非特許文献３】関島良樹: TTRアミロイド沈着の分子機構とその制御.: 医学のあゆみ, 229:349-356, 2009
【非特許文献４】本崎裕子, 山田正二: 家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)の分子疫学.: 医学のあゆみ, 229:357-362, 2009
【非特許文献５】Hou, X., Aguilar, M.I. & Small, D.H.: Transthyretin and familial amyloidotic polyneuropathy. Recent progress in understanding the molecular mechanism of neurodegeneration.: FEBS J, 274:1637-1650, 2007
【非特許文献６】Araki, S. & Ando, Y.: Transthyretin-related familial amyloidotic polyneuropathy -Progress in Kumamoto, Japan （1967-2012)-.: Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci, 86:694-706, 2010
【非特許文献７】Episkopou, V., Maeda, S., Nishiguchi, S., Shimada, K., Gaitanaris, G.A., Gottesman, M.E. & Robertson, E.J.: Disruption of the transthyretin gene results in mice with depressed levels of plasma retinol and thyroid hormone.: Proc Natl Acad Sci U S A, 90:2375-2379, 1993
【非特許文献８】安東由喜雄: 家族性アミロイドポリニューロパチー（FAP)の肝移植とその他の治療.: 医学のあゆみ, 229:363-368, 2009
【非特許文献９】Said, G., Grippon, S. & Kirkpatrick, P.: Tafamidis.: Nat Rev Drug Discov, 11:185-186, 2012
【非特許文献１０】Goldsteins, G., Persson, H., Andersson, K., Olofsson, A., Dacklin, I., Edvinsson, A., Saraiva, M.J. & Lundgren, E.: Exposure of cryptic epitopes on transthyretin only in amyloid and in amyloidogenic mutants.: Proc Natl Acad Sci U S A, 96:3108-3113, 1999
【非特許文献１１】Terazaki, H., Ando, Y., Fernandes, R., Yamamura, K., Maeda, S. & Saraiva, M.J.: Immunization in familial amyloidotic polyneuropathy: counteracting deposition by immunization with a Y78F TTR mutant.: Lab Invest, 86:23-31, 2006
【非特許文献１２】Bergstroem, J., Engstroem, U., Yamashita, T., Ando, Y. & Westermark, P.: Surface exposed epitopes and structural heterogeneity of in vivo formed transthyretin amyloid fibrils.: Biochem Biophys Res Commun, 348:532-539, 2006
【非特許文献１３】Matsubara, K., Mizuguchi, M. & Kawano, K.: Expression of a synthetic gene encoding human transthyretin in Escherichia coli.: Protein Expr Purif, 30:55-61, 2003.
【非特許文献１４】Ueda, M., Ando, Y., Hakamata, Y., Nakamura, M., Yamashita, T., Obayashi, K., Himeno, S., Inoue, S., Sato, Y., Kaneko, T., Takamune, N., Misumi, S., Shoji, S., Uchino, M. & Kobayashi, E.: A transgenic rat with the human ATTR V30M: a novel tool for analyses of ATTR metabolisms.: Biochem Biophys Res Commun, 352:299-304, 2007.
【非特許文献１５】Matsubara, K., Mizuguchi, M., Igarashi, K., Shinohara, Y., Takeuchi, M., Matsuura, A., Saitoh, T., Mori, Y., Shinoda, H. & Kawano, K.: Dimeric transthyretin variant assembles into spherical neurotoxins.: Biochemistry, 44:3280-3288, 2005.
【非特許文献１６】Senju, S., Haruta, M., Matsumura, K., Matsunaga, Y., Fukushima, S., Ikeda, T., Takamatsu, K., Irie, A. & Nishimura, Y.: Generation of dendritic cells and macrophages from human induced pluripotent stem cells aiming at cell therapy.: Gene Ther, 18:874-883, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
近年、免疫療法によるFAPの治療に注目が集まっている。TTRアミロイドが形成される過程で、TTRの構造変化に伴って新たなエピトープ（クリプティックエピトープ、Cryptic Epitope）が分子表面に露出することが明らかになってきた（非特許文献１０）。
【００１３】
そこでTerazakiらは、Cryptic Epitopeの露出する変異として知られていたTTR Y78F変異体で、FAPのモデル動物であるヒトTTR V30M トランスジェニックマウス（hTTR Tgマウス）を免疫し、マウス組織へのTTRアミロイド沈着に対する影響を評価した（非特許文献１１）その結果、TTR Y78F変異体で免疫したマウス群で、有意に抗TTR抗体の抗体価の上昇が確認され、それに伴って食道、胃および腸におけるTTR沈着量の減少が見られた。また、既にTTR沈着が見られる生後18ヵ月齢のhTTR Tgマウスを用いた同様の試験においても、Y78F免疫群で有意にTTRアミロイド沈着量の減少が見られた。以上の結果から、Cryptic Epitopeが露出するTTR変異体でマウスを免疫することにより、TTRに対する抗体がマウス体内で産生され、その結果TTRアミロイドの沈着が抑制された可能性が示唆された。
【００１４】
一方でBergstroemらは、Cryptic Epitopeの１つであるTTR 115-124部位のペプチドでウサギを免疫し、抗TTR115-124 ポリクローナル抗体を調製した（非特許文献１２）。このポリクローナル抗体をhTTR V30Mトランスジェニックラットに投与し、ラット組織へのTTR沈着に及ぼす影響を評価したところ、ラット腸管におけるTTRの沈着量は、ポリクローナル抗体を投与した群で有意に減少していた（非特許文献１３）
【００１５】
これらの結果から、TTRのCryptic Epitopeを特異的に認識する抗体が、TTRアミロイド（あるいはTTRアミロイドを構成する、構造変化を起こしたTTR）に特異的に結合し、TTRアミロイドの、形成阻害または除去の促進をしている可能性が考えられる。つまり、TTRのCryptic Epitopeを特異的に認識する抗体は、FAPの新規治療薬になりうる可能性が示唆される。
【００１６】
こうしたコンセプトに基づく抗TTR抗体の研究は、BIOCODEX社により報告されている。同社はアミロイド形成性のTTRに特異的なマウスモノクローナル抗体AD7F6を、TTRノックアウトマウスを用いて作製し、FAP病態モデルであるTgマウス（ATTR V30M）を用いてTTRの組織沈着を抑制することを示した（特許文献１）。BIOCODEX社の特許はマウス抗体のアミノ酸配列をクレームしており、ヒトへの投与は困難である。また、本抗体に関しては、四量体構造をとったV30M変異体に対する反応性の有無については明言されていない。V30M変異を有するFAP患者においては、血中に存在するV30M変異体は四量体構造をとっているが、単量体に解離後その一部が構造変化を起こしてアミロイドを形成すると考えられている。よって、四量体構造をとったV30M変異体には反応せず、アミロイド化した（或いはアミロイドを形成する途中段階の）V30M変異体にのみ反応する抗体であることが、より効果的で安全な抗体療法を実現する上では必要な要件と考えられる。また、本抗体の反応性については、臨床サンプルとしてはV30Mキャリアの血清を用いているのみであるため、患者の体内に存在する組織沈着性のアミロイドとの反応性は不明である。
【００１７】
同様なコンセプトに基づく抗TTR抗体の研究は、ポルトガルのPorto大学のグループからも報告されている（非特許文献１０）。構造変化を起こしたTTRに特異的なマウスモノクローナル抗体mAb 39-44及びmAb 56-61を作製したこと、これらが生体由来のV30M変異体のアミロイドと反応することが報告されている。しかし、これらはアミロイド形成に対して阻害作用を示さなかったことが明記されており、FAPの診断に利用できる可能性について言及されているのみである。
【００１８】
上述のように、TTRのCryptic Epitopeをマウス（又はラット）へ免疫して得られたポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が、TTRの沈着を抑制することは報告されているが、構造変化を起こしたTTRへ特異的に結合する活性、TTRの線維化を阻害する活性を有する抗体や、人体への投与に適したヒト化抗体やヒト抗体は報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、TTRアミロイドーシスでは、一部の四量体TTRが単量体へ解離後、単量体TTRが構造変化を起こし、アミロイドを形成する、その一方で、正常に機能する四量体TTRも存在すると考えた。そこで、本発明者らは、構造変化を起こしたTTRへ特異的に結合し、TTRの線維化を阻害する活性を有する抗体について検討を行った。また、最終的にTTRアミロイドーシスに対する抗体医療を目標として、上記の活性を有するヒト抗体について鋭意検討を重ね、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
（１）トランスサイレチン（以下、ＴＴＲと称する）の線維化を阻害する活性を持つヒト抗体；
（２）構造変化を起こしたＴＴＲを特異的に認識する、（１）に記載のヒト抗体；
（３）ＴＴＲアミロイドと特異的に結合する、（１）又は（２）に記載のヒト抗体；
（４）２種類以上の変異ＴＴＲに由来するＴＴＲアミロイドと結合する、（１）から（３）のいずれか一項に記載のヒト抗体；
（５）変異ＴＴＲが、Ｄ１８Ｇ、Ｖ３０Ｍ、Ｅ５４Ｋ、Ｌ５５Ｐ、Ｙ１１４Ｃ、Ｙ１１６ＳおよびＶ１２２Ｉからなる群から選択される変異を有するＴＴＲである、（４）に記載のヒト抗体；
（６）ＴＴＲアミロイドの除去を促進する、（１）から（５）のいずれか一項に記載のヒト抗体；
（７）ＴＴＲアミロイドに対するマクロファージ貪食能を促進する、（１）から（６）のいずれか一項に記載のヒト抗体；
（８）エピトープがＴＴＲの７９位から８９位を含む配列である、（１）から（７）のいずれか一項に記載のヒト抗体；
（９）エピトープがＴＴＲの７９位から８９位である、（８）に記載のヒト抗体；
（１０）ＴＴＲアミロイドーシスに対する治療効果及び／又は予防効果を有する、（１）から（９）のいずれか一項に記載のヒト抗体；
（１１）ＴＴＲアミロイドーシスが家族性アミロイドポリニューロパチー（以下、ＦＡＰと称する）である、（１０）に記載のヒト抗体；
（１２）ＴＴＲアミロイドーシスが老人性全身性アミロイドーシス（以下、ＳＳＡと称する）である、（１０）に記載のヒト抗体；
（１３）ファージディスプレイ法により得られた抗体である、（１）から（１２）のいずれか一項に記載の抗体；
（１４）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域と、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域とを含む、（１）から（１３）のいずれか一項に記載のヒト抗体
（ａ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｃ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド；
（１５）以下の（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域と、（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域とを含む、（１）から（１３）のいずれか一項に記載のヒト抗体
（ｅ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番７〜９に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｇ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド；
（１６）以下の（ｉ）または（ｊ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｋ）または（ｌ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む、（１）から（１３）のいずれか一項に記載のヒト抗体
（ｉ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｊ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｋ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｌ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド；
（１７）以下の（ｍ）または（ｎ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｏ）または（ｐ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む、（１）から（１３）のいずれか一項に記載のヒト抗体
（ｍ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｎ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｏ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｐ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド；
（１８）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片
（ａ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド；
（１９）以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片
（ｃ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド；
（２０）以下の（ｉ）又は（ｊ）のポリペプチドからなる、Ｈ鎖可変領域断片
（ｉ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｊ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド；
（２１）以下の（ｋ）又は（ｌ）のポリペプチドからなる、Ｌ鎖可変領域断片
（ｋ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｌ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド；
（２２）以下の（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片
（ｅ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド；
（２３）以下の（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片
（ｇ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド；
（２４）以下の（ｍ）又は（ｎ）のポリペプチドからなる、Ｈ鎖可変領域断片
（ｍ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｎ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド；
（２５）以下の（ｏ）又は（ｐ）のポリペプチドからなる、Ｌ鎖可変領域断片
（ｏ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｐ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド；
（２６）（１８）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または（２０）に記載のＨ鎖可変領域断片と、（１９）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または（２１）に記載のＬ鎖可変領域断片とを連結してなる、ＴＴＲに対する抗体の１本鎖可変領域断片；
（２７）（１８）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または（２０）に記載のＨ鎖可変領域断片、及び／又は、（１９）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または（２１）に記載のＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、（１）から（１３）に記載のヒト抗体又はその断片；
（２８）（２２）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または（２４）に記載のＨ鎖可変領域断片と、（２３）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または（２５）に記載のＬ鎖可変領域断片とを連結してなる、ＴＴＲに対する抗体の１本鎖可変領域断片；
（２９）（２２）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または（２４）に記載のＨ鎖可変領域断片、及び／又は、（２３）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または（２５）に記載のＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、（１）から（１３）のいずれか一項に記載のヒト抗体又はその断片；
（３０）（１）から（２９）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片をコードする遺伝子；
（３１）（３０）に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター；
（３２）（３０）に記載の遺伝子、又は（３１）に記載の発現ベクターが導入された形質転換体；
（３３）（１）から（２９）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドを検出する器具；
（３４）（１）から（２９）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドを検出する試薬；
（３５）（１）から（２９）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドを除去するする担体；
（３６）（１）から（２９）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドーシス診断薬；
（３７）ＴＴＲアミロイドーシスがＦＡＰである、（３６）に記載の診断薬；
（３８）ＴＴＲアミロイドーシスがＳＳＡである、（３６）に記載の診断薬；
（３９）（１）から（２９）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲの線維化阻害剤；
（４０）（１）から（２９）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドーシスを予防及び／又は治療するための医薬組成物；
（４１）ＴＴＲアミロイドーシスがＦＡＰである、（４０）に記載の医薬組成物；
（４２）ＴＴＲアミロイドーシスがＳＳＡである、（４０）に記載の医薬組成物；
（４３）デオキシコール酸Ｎａの存在下で変異ＴＴＲと評価試料を反応させる工程を含む、ＴＴＲの線維化を阻害する活性を測定する方法；
（４４）中性条件で線維化させる、（４３）に記載の方法；
（４５）デオキシコール酸Ｎａの濃度が０.１％から１％である、（４３）又は（４４）に記載の方法；
（４６）評価試料がＴＴＲに対する抗体である、（４３）から（４５）のいずれか一項に記載の方法；
（４７）変異ＴＴＲがＶ３０Ｍ ＴＴＲである、（４３）から（４６）のいずれか一項に記載の方法；
に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明者らは，構造変化を起こしたTTRを特異的に認識するモノクローナル抗体を創出し，FAPの治療を可能にする抗体医薬開発への道を開くことに成功した．本発明の抗体は、TTRのアミロイド線維の形成や組織への沈着を効果的に抑制し、更に血中で機能する正常なTTRとは反応しないことから、安全性に優れた抗体医薬となることが期待される。また、作用メカニズムとして、（１）TTRのアミロイドの形成と組織沈着を抑制する、更には、（２）組織に沈着しているTTRアミロイドにも作用してクリアランスを促す、すなわち、一旦蓄積したアミロイドを減少させる、という２つの効果を期待することができる。そのような効果は、従来の技術や先行開発品では成しえないものであり、TTRアミロイドーシスに対する新規治療戦略としての本抗体療法に期待が持たれる。
【００２１】
本発明の抗体は、上述のとおり、FAPに対して肝移植以外の新たな治療法を提供することが期待出来るだけでなく、老人性全身性アミロイドーシス（SSA）治療薬としての可能性も有する。TTRアミロイドーシスには、TTR遺伝子の変異が原因となって起こるFAPの他にも、野生型TTRが主に心臓にアミロイド沈着を起こすことにより発症するSSAが知られている。心臓におけるアルツハイマー病とも位置付けられている。アミロイド沈着は肺や血管壁、腎髄質などにも認められる。患者は、無症状であるか、心症状（緩徐進行性の心不全）を呈することが多く、手根管症候群を呈することもある。60歳代から発症が認められ、80歳以上ではおおよそ4人に1人が発症しているとも言われている。米国のみで40万人を超える患者推計値も報告されている。本疾患にも有効な治療法は確立されていない。本発明の抗体は野生型TTRの線維化を阻害する活性を有するため、SSAへの適用も期待される。
【００２２】
本抗体製剤にはFAPのみならずTTRに起因する各種臓器に対するアミロイド形成性の疾患への適用が期待され、現在治療方法がない多くのこれらの疾患患者への治療貢献ができるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】（a）キメラ371抗体H鎖発現ベクターpKMA010-371-mCg1、（b）キメラ371抗体L鎖発現ベクターpKMA009-371-mCλ、（c）キメラ313抗体H鎖発現ベクターpKMA010-313-mCg1、および（d）キメラ313抗体L鎖発現ベクターpKMA009-313-mCλのマップを示す。
【図２】エピトープ解析の結果を示す。（a）はTTRの76-85部位、（b）はTTRの84-93部位に関する解析結果をそれぞれ示す。
【図３】表面プラズモン共鳴法を用いた反応特異性解析の結果を示す。（a）は371M抗体、（b）は313M抗体、（c）はDako社製ポリクローナル抗体、（d）は陰性コントロール抗体での結果をそれぞれ示す。
【図４】患者血清への反応性解析の結果を示す。（a）は371抗体、（b）は313抗体の結果をそれぞれ示す。
【図５ａ】患者組織への反応性解析の結果を示す(パラフィン切片)。
【図５ｂ】患者組織への反応性解析の結果を示す(凍結切片)。
【図６】TTR線維への反応性解析の結果を示す。（a）は銀染色の結果を、（b）は371M抗体、（c）は313M抗体でのウエスタンブロッティングの結果をそれぞれ示す。
【図７】TTR線維化阻害試験の予備検討の結果を示す。
【図８】TTR線維化阻害試験の予備検討の結果を示す。
【図９】TTR線維化阻害試験の結果を示す。（a）は371抗体および313抗体、（b）は371M抗体および313M抗体の結果をそれぞれ示す。
【図１０】マクロファージ貪食能試験の結果を示す。（a）は未処理の精製V30M、（b）はTTR線維での結果をそれぞれ示す。
【図１１】V30M Tgラットを用いた薬効評価試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明の具体的態様について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
１．本発明のリコンビナントヒト抗体およびその断片
本発明では、構造変化したTTRと特異的に結合し、TTRの線維化を阻害するヒト抗体を取得するために、TTRのS112Iが構造変化して2量体で存在することに着目し、S112Iを抗体作製の抗原として選択し、ファージディスプレイ法でヒト抗体を作成した。ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術としては、「Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay et al」、「Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al」、「ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A. K. BORREBAECK」が例示される。本発明では、S112Iを酸処理によって線維化したものをパンニング用のプレートへ固相化した後、ファージライブラリーと反応させる。酸処理はS112Iが線維化する温度、時間、pHを適宜選択して構わない。線維化の有無はThioflavinT assayによって、確認しても構わない。例えば、S112IをpH3.0-pH4.4の条件下で37℃で16時間処理する方法が例示される。そして、プレートを洗浄して非結合ファージを除去した後、標的分子に結合したファージを回収し、大腸菌へ感染させる。大腸菌を培養後、ファージを回収し、再度プレートへ反応させる。そうした一連のパンニングサイクルを3−5回程度行った後に、S112Iとの反応性が優れるファージをELISA試験で選抜する。
【００２５】
そして、選抜したファージを産生する大腸菌からファージ由来のプラスミドDNAを回収し、VH領域（又はVL領域）の塩基配列を解析する。H鎖またはL鎖の定常領域をコードする塩基配列を含む発現ベクターに対して、VH領域又はVL領域の塩基配列を挿入し、H鎖又はL鎖の発現ベクターを作製する。当該発現ベクターを適当な宿主（動物細胞）へ導入し、宿主を用いてヒト抗体を発現させる。
【００２６】
本発明では、CDRのアミノ酸配列が異なるヒト抗体を２種類取得し、それらの抗体についてフレームワーク部分のアミノ酸配列を変異させた改良型のヒト抗体を作製した（371M、313M）。
【００２７】
ヒト抗体についてエピトープを解析する方法を例示する。ヒトTTRの76-93位のアミノ酸配列のうち、１アミノ酸をアラニンへ改変させた（91位はアラニンのため、セリンへ改変）ヒトTTR改変体を作製する。定法のsite-directed mutagenesis法により改変体の遺伝子を作製し、発現ベクターに挿入後、適当な宿主（好ましくは大腸菌）を用いて発現させ精製する。定法のウェスタンブロッティング法を用いて、当該改変体をSDS-PAGEで電気泳動させた後、解析対象の抗体と反応させ、当該改変体と抗体の反応性を検出する。抗体との結合性が低下した改変体が存在する場合、改変した部分を抗体のエピトープ部分と考えても構わない。本発明の抗体は78-89位にエピトープ部分があり、そうした部分は野生型TTR四量体では隠れる部分に存在すると推定される。また、当該エピトープは新規エピトープであった。
【００２８】
上記のヒト抗体は、構造変化を起こしたTTRに対する特異的反応性、線維化したTTRとの反応性、TTR患者由来の組織に対する免疫染色、変異TTRの線維化に対する阻害活性、TTRアミロイドに対するマクロファージ貪食作用の促進活性、FAPモデル動物を用いた薬効評価を行ってもかまわない。
【００２９】
構造変化を起こしたTTRに対する特異的な反応性を解析する方法として、表面プラズモン共鳴法を用いた方法が例示される。野生型TTR四量体、変異TTR（V30Mなど）四量体、又は変異TTRアミロイドを作製する。野生型TTR四量体や変異TTR四量体を作製する方法としては、Matsubaraらの方法（非特許文献13）が例示される。変異TTRアミロイドを作製する方法としては、上記の酸処理が例示される。次に、これらの調製物をセンサーチップへ結合させる。そして、解析対象の抗体を流して、センサーチップと反応させることで、TTRと抗体の結合性がレスポンスユニット（RU）として表される。この場合に、変異TTRアミロイドに対するRUが、野生型TTR四量体や変異TTR四量体に対するRUよりも優位に高い抗体は、構造変化を起こしたTTRを特異的に認識していると考えられる。そうした四量体TTRと比較して、四量体以上の分子構造を有するTTR（例えば、TTRアミロイド）を特異的に認識する抗体を、構造変化を起こしたTTRを特異的に認識する抗体としても構わない。
【００３０】
TTRの線維化を阻害する活性を解析する方法を例示する。TTR及び評価抗体を含有する溶液に対して界面活性剤を終濃度0.01-1％となるように混合し、TTRが線維を形成する温度と時間静置する。そして、ThioflavinT assay(励起波長 440 nm, 蛍光波長 480 nm)で蛍光強度を測定し、TTR線維化の程度を評価する。界面活性剤の種類は塩化ベンザルコニウム、デオキシコール酸ナトリウム、Zwittergent3-16、NP-40が例示される。特にデオキシコール酸が好ましい。終濃度0.01-1％が例示されるが、0.1％が特に好ましい。時間と温度は37℃で3〜4日間が例示されるが、時間や温度の組み合わせに応じて適宜変更しても構わない。本解析方法は中性付近のpHで解析を行えるため、評価抗体の変性を抑えることのできる優れた評価系である。
【００３１】
TTRアミロイドに対するマクロファージ貪食作用を解析する方法を例示する。健常人由来の皮膚組織から、定法に従ってヒトiPS細胞を作製し、更に定法に従ってiPS細胞をマクロファージに分化させる。TTR線維と分化させたマクロファージ5×104個を混合し、評価抗体を添加して、一定期間（例えば、3日間）培養する。培養後のTTR残量をELISA法で定量し、マクロファージによる貪食能を評価する。
【００３２】
本発明のヒト抗体とTTRアミロイドとの反応性を解析する方法を例示する。野生型TTRや変異TTRをTTRが線維化する時間、酸性条件で処理し、TTRアミロイドを作製する。線維化の時間は、pHやTTRの種類によって適宜選択することが可能である。酸処理後のサンプルをNative PAGEで泳動し、銀染色を行った後に、60kDaより高い位置にブロードなバンドが確認された場合には、TTRが線維化していることの指標としても構わない。そして、定法のウェスタンブロット法を用いて、TTRアミロイドをSDS-PAGEに泳動し、解析対象の抗体を反応させ、検出する。酸処理していないTTR（線維化していないTTR）と比較して、TTRアミロイドに対する反応性が高い抗体を、TTRアミロイドに対する結合作用を有する抗体としても構わない。
【００３３】
FAPモデル動物を用いた薬効評価の方法を例示する。V30M Tgラット（非特許文献14、TTRのアミノ酸配列において30位をバリンからメチオニンに変異させたヒトTTRの遺伝子を導入したトランスジェニックラット）を用いて、一定量の評価抗体を（例えば、10mg/kg）、一定期間に亘り（例えば、6ヶ月間）、一定頻度で投与する（例えば、週１回）。投与後に剖検して大腸を採取し、ホルマリン固定を行う。固定した大腸組織をパラフィンブロックに包埋し、組織切片を作製する。組織切片をPolyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin(Dako)、HRP標識Goat anti-Rabbit IgG(Dako)を用いて免疫染色し、大腸の筋層におけるTTR沈着の程度を数値化して群間での比較を行う。
【００３４】
本発明のヒト抗体はTTRの線維化を阻害する活性、構造変化したTTRに対する特異な結合活性、マクロファージによるTTRアミロイドの貪食作用を促進する効果、TTRアミロイドに対する結合作用、FAPモデル動物に対する効果を有する。また、本発明の抗体についてエピトープを解析した結果、TTR78-89に存在していた。そのため、本発明には下記のヒト抗体が含まれる。
（１）TTRの線維化を阻害する活性を持つヒト抗体。
（２）構造変化を起こしたTTRを特異的に認識し、かつ四量体の機能性TTRを認識しないヒト抗体。
（３）TTRアミロイドと特異的に結合するヒト抗体。
（４）TTRアミロイドの除去を促進するヒト抗体。
（５）TTRアミロイドに対するマクロファージ貪食能を促進するヒト抗体。
（６）TTRアミロイドーシスに対する治療効果及び／又は予防効果を有するヒト抗体。
（７）TTR78-89をエピトープとするヒト抗体。
上記の（１）から（７）の抗体は、（１）から（７）に記載される通り、一つの特徴を有してもよく、他の（１）から（７）に記載される特徴をあわせ持っていてもかまわない。
【００３５】
本発明のヒト抗体（371M）ではVH領域又はVL領域上のCDR1-3のアミノ酸配列や塩基配列は下表となる。
【００３６】
【表１】
2019191174.tif 000002
【００３７】
そのため、本発明にはアミノ酸配列において下記の特徴を有するヒト抗体が含まれる。
（８）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域と、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域とを含む、ヒト抗体。
（ａ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｃ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
また、当該ヒト抗体は、（１）から（７）に記載される特徴を併せ持っていても構わない。
【００３８】
また、本発明のヒト抗体（313M）ではVH領域又はVL領域上のCDR1-3のアミノ酸配列や塩基配列は下表となる。
【００３９】
【表２】
2019191174.tif 000003
【００４０】
そのため、本発明にはアミノ酸配列において下記の特徴を有するヒト抗体が含まれる。
（９）以下の（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域と、（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域とを含む、ヒト抗体。
（ｅ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番７〜９に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｇ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
また、当該ヒト抗体は、（１）から（７）に記載される特徴を併せ持っていても構わない。
【００４１】
ヒト抗体（371M）のVH領域又はVL領域におけるアミノ酸配列や塩基配列は下表となる。
【００４２】
【表３】
2019191174.tif 000004
【００４３】
そのため、本発明にはアミノ酸配列において下記の特徴を有するヒト抗体が含まれる。
（１０）以下の（ｉ）または（ｊ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｋ）または（ｌ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む、ヒト抗体。
（ｉ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｊ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｋ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｌ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
また、当該ヒト抗体は、（１）から（７）に記載される特徴を併せ持っていても構わない。
【００４４】
ヒト抗体（313M）のVH領域又はVL領域におけるアミノ酸配列や塩基配列は下表となる。
【００４５】
【表４】
2019191174.tif 000005
【００４６】
そのため、本発明にはアミノ酸配列において下記の特徴を有するヒト抗体が含まれる。
（１１）以下の（ｍ）または（ｎ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｏ）または（ｐ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む、ヒト抗体。
（ｍ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｎ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｏ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｐ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
また、当該ヒト抗体は、（１）から（７）に記載される特徴を併せ持っていても構わない。
【００４７】
本発明には下記のH鎖のCDRを含むH鎖可変領域断片が含まれる。
（１２）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片。
（ａ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（１３）以下の（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片。
（ｅ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
【００４８】
本発明には下記のL鎖のCDRを含むL鎖可変領域断片が含まれる。
（１４）以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片。
（ｃ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（１５）以下の（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片。
（ｇ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
【００４９】
本発明には下記のH鎖可変領域断片が含まれる。
（１６）以下の（ｉ）又は（ｊ）のポリペプチドからなる、Ｈ鎖可変領域断片。
（ｉ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｊ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（１７）以下の（ｍ）又は（ｎ）のポリペプチドからなる、Ｈ鎖可変領域断片。
（ｍ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｎ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
【００５０】
本発明には下記のL鎖可変領域断片が含まれる。
（１８）以下の（ｋ）又は（ｌ）のポリペプチドからなる、Ｌ鎖可変領域断片。
（ｋ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｌ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
（１９）以下の（ｏ）又は（ｐ）のポリペプチドからなる、Ｌ鎖可変領域断片。
（ｏ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｐ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
【００５１】
本発明には下記の１本鎖可変領域断片が含まれる。
（２０）（１２）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または（１６）に記載のＨ鎖可変領域断片と、（１４）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または（１８）に記載のＬ鎖可変領域断片とを連結してなる、TTRに対する抗体の１本鎖可変領域断片。
（２１）（１３）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または（１７）に記載のＨ鎖可変領域断片と、（１５）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または（１９）に記載のＬ鎖可変領域断片とを連結してなる、TTRに対する抗体の１本鎖可変領域断片。
【００５２】
１本鎖可変領域断片において、H鎖可変領域断片とL鎖可変領域断片とを連結する場合、通常、適当なペプチドリンカーなどによって連結される。このペプチドリンカーとしては、例えば、10〜25アミノ酸残基からなる任意の1本鎖ペプチドが用いられる。
【００５３】
本発明には、下記のH鎖可変領域断片及び／又はL鎖可変領域断片にヒト由来の定常領域を連結した抗体またはその断片が含まれる。
（２２）（１２）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または（１６）に記載のＨ鎖可変領域断片、及び／又は、（１４）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または（１８）に記載のＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、ヒト抗体又はその断片。
（２３）（１３）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または（１７）に記載のＨ鎖可変領域断片、及び／又は、（１５）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または（１９）に記載のＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、ヒト抗体又はその断片。
【００５４】
上記のヒト由来の定常領域を連結した抗体又はその断片は、Ｆab、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2や、少なくとも一部のFc部を有したscAb、またはscFvFc、さらには完全抗体であってもよい。なお、scAbとはscFvにL鎖またはH鎖の定常領域の一部のドメイン（Cドメイン）が結合したもの、scFvFcとはscFvにH鎖の定常領域の一部（Fc領域）が結合したものである。
【００５５】
また、上記抗体は、抗体と構造的に関連したタンパク質も包含し、免疫グロブリンの意味である。さらに、本発明の抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG又はIgMの何れのクラスでもよい。言い換えると、単量体であってもよいし、2量体、3量体、4量体、5量体といった多量体であってもよい。
【００５６】
ここで、上記「1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。したがって、例えば、上記（b）のポリペプチドは、上記（a）のポリペプチドの変異ペプチドであり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然（例えばヒト）に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００５７】
なお、上記「変異」は、後述のように本発明の抗体またはその断片を、医薬組成物として利用する場合（ヒトに投与する場合）には、ヒト由来の構造またはヒトが免疫反応を起こさない範囲で行い、検出器具や診断薬などとして利用する場合（ヒトに投与しない場合）には、特に制限されない。また、本発明の抗体またはその断片を、ヒトに投与する場合、抗原を認識するCDRの高次構造を維持する範囲で、変異を行うことが好ましい。
【００５８】
本発明の抗体およびその断片は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、HisやMyc、Flag等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００５９】
さらに、本発明の抗体およびその断片には、安定性や抗体価を向上させるために、修飾剤が結合されていてもよい。すなわち、本発明の抗体およびその断片は、修飾抗体であってもよい。この修飾剤としては、例えば、糖鎖や高分子などが挙げられる。糖鎖修飾を行った場合には、その糖鎖が何らかの生理活性を有する可能性があるが、ポリエチレングリコール（PEG）などの単純な高分子修飾を行った場合にはそれ自体生理活性を示さない。さらに、PEG化によって肝臓での吸収を抑制したり、血中での安定性を向上したりする可能性がある。つまり、修飾剤としては、PEGなどの単純高分子が好ましい。
【００６０】
なお、本発明の抗体およびその断片の修飾剤による修飾は、前述の変異ペプチドの作製と同様に、治療薬として利用する場合には、ヒトが免疫反応を起こさない範囲で行い、検出器具や診断キットなどとして利用する場合には、特に制限されない。また、本発明の抗体またはその断片を、ヒトに投与する場合、抗原を認識するCDRの高次構造を維持する範囲で、修飾することが好ましい。
【００６１】
２．本発明の遺伝子
本発明には、上記１の抗体またはその断片をコードする遺伝子が含まれる。例えば、下記の塩基配列をオープンリーディングフレーム（ORF）領域として有する遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子などが含まれる。
（１）配列番号1〜3、及び／又は、配列番号4〜6を含む塩基配列
（２）配列番号7〜9、及び／又は、配列番号10〜12を含む塩基配列
（３）配列番号13、及び／又は、配列番号14を含む塩基配列
（４）配列番号15、及び／又は、配列番号16を含む塩基配列
【００６２】
上記の遺伝子は、本発明の抗体またはその断片をコードしているので、適当な宿主（例えば細菌、酵母）に導入して、本発明の抗体またはその断片を発現させることができる。
【００６３】
さらに、上記の遺伝子は、抗体またはその断片をコードする塩基配列以外に、非翻訳領域（UTR）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。例えば、配列番号13又は14に記載の配列をベクター配列につないで本発明の遺伝子を構成し、これを適当な宿主で増幅させることにより、本発明の遺伝子を所望に増幅させることができる。また、本発明の遺伝子の一部配列をプローブに用いてもよい。
【００６４】
本発明の遺伝子は、TTRアミロイドが関与する疾患において、遺伝子治療剤として利用しても構わない。この遺伝子治療剤は投与後に本発明の抗体またはその断片を体内で発現するように設計することによって、該治療剤を摂取後に体内で本発明の抗体またはその断片を形成させ、上記阻害剤と同様の効果を持たせても構わない。
【００６５】
３．本発明の組換え発現ベクター
本発明には、前記２の遺伝子、すなわち、上記１の抗体またはその断片をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターが含まれる。例えば、配列番号13又は14に示される塩基配列を有するcDＮAが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
【００６６】
ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
【００６７】
本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係る抗体またはその断片とマーカータンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質GFP（Green Fluorescent Protein）をマーカーとして用い、本発明に係る抗体またはその断片をGFP融合タンパク質として発現させてもよい。
【００６８】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、ヒト又はマウス由来の細胞をはじめとして、線虫（Caenorhabditis elegans）、アフリカツメガエル（Xenopas laevis）の卵母細胞、各種哺乳動物（ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等などの動物細胞、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）や分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００６９】
組換え発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DＥAＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００７０】
本発明の形質転換体は、前記２の遺伝子、すなわち、上記１の抗体またはその断片をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作手技）により、対象細胞（ホスト細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体を含む意味である。対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。特に、マウスやラット等の齧歯目動物は、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、なかでもマウスは近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っており、実験動物・病態モデル動物として好ましい。
【００７１】
なお、上記１の抗体またはその断片は、本発明の組換え発現ベクターを用いて作製した、本発明の形質転換体によっても生産することが可能である。
【００７２】
４．本発明のヒト抗体およびその断片の利用方法
本発明のヒト抗体は、構造変化を起こしたTTR（例えば、TTRアミロイド）を特異的に認識し、TTRの線維化を阻害し、FAPに対する予防効果を発揮する。そのため、本発明は、TTRの構造変化を検出する器具、TTRアミロイドーシス（特にFAP）診断薬、TTRの線維化を阻害する薬剤、TTRアミロイドーシス（特にFAP）に対する予防及び／又は治療するための医薬組成物を含む。
【００７３】
本発明には、（1）の抗体またはその断片を含む、TTRの構造変化を検出する器具（TTRアミロイド検出器具）が含まれる。本発明の検出器具としては、例えば、構造変化したTTRへ特異的に結合する抗体またはその断片を基盤（担体）上に固定化した抗体チップや抗体カラム等が挙げられる。本発明の検出器具は、例えば、血液や尿などの試料中に含まれる構造変化したTTR（例えばTTRアミロイド）を検出する用途に用いても構わない。さらに、構造変化したTTR(TTRアミロイド)が関与する疾患の判定や治療効果を評価するための診断用途、治療用途で利用しても構わない。
【００７４】
また、本発明には、（１）の抗体またはその断片を含む、TTRアミロイドを除去する用途で使用される担体（TTRアミロイド除去担体）が含まれる。当該除去担体は、クロマトグラフィーにおいて通常使用される担体に対して、一般的な方法で抗体等を結合させることによって作成しても構わない。上記の除去用担体は、TTRアミロイドが原因となるアミロイドーシス患者から血液を採取し、その血液を除去用担体が充填されたカラムを通して、血中のTTRアミロイドを除去するといった用途が例示される。
【００７５】
さらに、本発明には、上記１の抗体またはその断片を含む、TTRアミロイドを検出するための試薬（TTRアミロイド検出用試薬）が含まれる。すなわち、これらの抗体またはその断片によるラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどの標識イムノアッセイを適用するときには、被検試料中のTTRを迅速且つ正確に定性又は定量分析することができる。この標識イムノアッセイでは、上記抗体またはその断片は、例えば、放射性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標識して用いられる。また、これらの抗体およびその断片は、TTRアミロイドに特異的に反応し、免疫反応を呈するので、その免疫反応について標識物質を指標に測定すれば、被検試料中のごく微量のTTRアミロイドを精度良く検出することができる。標識イムノアッセイは、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被検試料を分析できるうえに、分析に要する時間と労力が少なくてすみ、しかも、分析が高精度であるという特徴がある。
【００７６】
本発明には、上記１の抗体またはその断片を含む、TTRアミロイドーシス診断薬が含まれる。本発明の診断薬による疾患を診断する方法は、被検試料（血液や体液、組織など）中のTTRアミロイド量を測定し、その測定結果に応じて疾患の診断を行うものである。なお、疾患は、TTRアミロイドが原因となる疾患が含まれる。そうした疾患としては、老人性全身性アミロイドーシス（SSA）、家族性アミロイドポリニューロパチー（FAP）が例示される。
【００７７】
本発明の抗体はTTRの線維化を抑制する効果が確認された。そのため、本発明には、上記１の抗体またはその断片を含む、TTRの線維化を阻害する薬剤（線維化阻害剤）が含まれる。線維化阻害剤には、1種類以上の賦形剤、1種類以上の結合剤、1種類以上の崩壊剤、1種類以上の滑沢剤、1種類以上の緩衝剤などのように、医薬品として許容される添加物が含まれていてもよい。
【００７８】
本発明のヒト抗体は、TTRアミロイドーシスのモデル動物へ投与した場合に、効果が確認された。そのため、本発明は上記１の抗体またはその断片を含む、TTRアミロイドーシスに対する予防及び／又は治療を行うための医薬組成物が含まれる。当該医薬組成物は、1種類以上の賦形剤、1種類以上の結合剤、1種類以上の崩壊剤、1種類以上の滑沢剤、1種類以上の緩衝剤などのように、医薬品として許容される添加物が含まれていてもよい。
【００７９】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。市販のキットあるいは試薬を用いた部分については、特に断りの無い限り添付のプロトコールにしたがって実験を行った。
【実施例１】
【００８０】
組換えS112I TTR精製品の調製
Matsubaraらの方法（非特許文献13、非特許文献15）を参考に、組換えTTR精製品の調製を行った。S112I TTR(ヒトTTRの112番目のセリンをイソロイシン変えた変異体)発現ベクターpQE30-hTTR(S112I)-Hisを大腸菌株M15に形質転換し、20mLのLB / Ampicillin (50μg/mL) / Kanamycin (25μg/mL) で、37℃で培養した。O.D.600nm=0.5になった時点でIPTGを終濃度10mMになるように添加し、一晩培養した。培養液から菌体を遠心で回収し、BufferA(50mM PB + 0.3M NaCl + 10mM Imidazole + 20mM 2-Mercaptoethanol)に懸濁した。懸濁液を15分間ソニケーションし、更に遠心を行い、上清を回収した。上清をNi-NTA Agarose (QIAGEN)を用いてHis-tag精製を行い、組換えTTRの含まれた溶出画分を20mM NaHCO3に対して透析した。透析後の組換えTTRを、10mM PB (pH7.5)下でSuperdex75 (GE Healthcare)を用いてゲルろ過精製し、2量体TTR画分を組換えTTR S112I精製品とした。
【実施例２】
【００８１】
ヒトTTR遺伝子のクローニング
ヒトTTR発現ベクターを構築するにあたり、ヒトTTR遺伝子のクローニングを行った。Human liver Marathon-Ready cDNA (Clontech)を鋳型に、成熟型TTRの5´末端又は3´末端に設定したプライマー（TTR-F2：配列番号17、およびTTR-R：配列番号18）、およびEx-Taq (Takara)を用いてPCRを行った。PCR産物をpCR2.1-TOPOにTAクローニングした後、シークエンス解析によってヒトTTR遺伝子の塩基配列を確認した。配列が正しいことを確認した後、TTR遺伝子が挿入されたpCR2.1-TOPOをBamHIおよびHindIII処理して、TTR遺伝子をコードする配列が含まれた領域を切り出した。切り出し配列をBamHIおよびHindIII処理したpQE-30 (QIAGEN)に導入し、野生型ヒトTTR発現ベクターを構築した。
【実施例３】
【００８２】
ヒトTTR変異体発現ベクターの構築
実施例２で構築したヒトTTR発現ベクターを鋳型に、site-directed mutagenesis法を用いてアミノ酸の点変異導入を行った。アミノ酸の点変異導入は、D18G、V30M、E54K、L55P、Y114C、V122I、K76A、S77A、Y78A、W79A、K80A、A81S、L82A、G83A、I84A、S85A、P86A、F87A、H88A、E89A、H90A、A91A、E92A、およびV93Aの24種類についてそれぞれ実施した。上記24種類のTTR変異体をコードする配列をpQE-30にそれぞれ導入した。
【実施例４】
【００８３】
組換えTTR精製品の調製
実施例２および３で構築した野生型TTR、又はD18G、V30M、E54K、L55P、Y114C、Y116S、V122I TTR変異体を発現する発現ベクターを大腸菌株M15に形質転換し、実施例１に示す方法で、組換えTTR精製品の調製を行った。上記TTR変異体については、4量体TTR画分を組換えTTR精製品とした。
【実施例５】
【００８４】
抗ヒトTTR抗体の単離
ヒトB細胞（例えばリンパ節や脾臓）由来のmRNAからヒトVHおよびVL cDＮAを使用して調製されたscFvファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、構造変化を起こしたヒトTTRに対する抗体を単離した。用いた抗体ライブラリーは1011種以上の多様な抗体分子を含む極めて優れたものである。
【００８５】
実施例１で調製したS112I TTR変異体精製品を、3mg/mLになるように10mM PB (pH7.5)で希釈し、等量の200mM 酢酸バッファー + 100 mM NaCl (pH4.4)と混合して1.5mg/mLの濃度になるように調製し、37℃恒温槽で16時間反応させることでS112I TTR線維を調製した。反応後のTTRについては、ThioflavinT assayによって蛍光強度を測定し、線維化が進行していることを確認した。ThioflavinT assayは、ThioflavinTが20μM、TTRが30〜60μg/mLになるように、50mM Glycine-NaOH Buffer(pH9.5)で希釈し、分光蛍光光度計FP-6500(JASCO) によって蛍光強度を測定することにより行った（励起波長 440 nm、蛍光波長 480 nm)。
【００８６】
標準の手順を使用してMaxisorp plate (Nunc)にS112I TTR線維を固相化し、標準の手順を使用して、S112I TTR線維へ特異的に結合するscFvファージを取得した（Antibody Phage Display Methods and protocols Edited by Philippa M. O’Brien and Robert Aitken）。取得したscFv-phageのclone名を「371」及び「313」と命名した。取得したscFvファージの結合活性は以下の方法で評価した。
【実施例６】
【００８７】
組換えTTR線維の調製
実施例４で調製したD18G、V30M、E54K、L55P、Y114C、Y116S、V122Iの7種類の変異TTR精製品、および野生型TTR精製品を、3 mg/mLになるように10mM PB (pH7.5)で希釈し、等量の200 mM 酢酸バッファー + 100 mM NaCl (pH3.0)と混合して1.5mg/mLの濃度になるように調製し、37℃恒温槽で一晩反応させることでTTR線維を調製した。反応後のTTRについては、ThioflavinT assayによって線維が形成されていることを確認した。
【実施例７】
【００８８】
抗TTR抗体の結合活性試験
取得したscFvファージの抗原結合活性をELISA法で評価した。実施例５で作製したS112I TTR線維、および実施例６で作製したV30M TTR線維をPBS (SIGMA)で10μg/mLに希釈し、Maxisorp Plate (Nunc)に各ウェル当り50μL入れ、1時間室温でインキュベートすることによってTTRを固相化した。固相化したプレートに1%BSA-PBSを各ウェル当り300μL入れ、1時間室温でインキュベートすることによってプレートのブロッキングを行った。取得したscFvファージの培養上清をプレートの各ウェルに100μLずつ加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTでウェルを洗浄し、1%BSA-PBSで5000倍希釈した検出抗体anti-M13/HRP (GE Healthcare)をプレートの各ウェルに100μLずつ加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMB (SIGMA)をプレートの各ウェルに100μLずつ加えることによって発色させた。30分後に1N 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で発色値(O.D.450nm/650nm)を測定した。
【００８９】
その結果、scFv371およびscFv313はS112I TTR線維およびV30M TTR線維に対して優れた結合活性を有していた。
【実施例８】
【００９０】
scFv371およびscFv313のシークエンス解析
取得したscFv371およびscFv313のVH領域又はVL領域の塩基配列を確認した。両者のファージ中に含まれるDNA塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit (Applied Biosystems)を用いて決定した。
【００９１】
scFv371およびscFv313のVH領域又はVL領域について、数個のアミノ酸を改変した配列を設計・構築し、それぞれ371M抗体および313M抗体とした。371Mおよび313M中のVH領域又はVL領域におけるCDR1〜3はKabatのナンバリング法により決定した。当該CDR1〜3のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号1〜12に示す。また、VH領域又はVL領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号13〜16に示す。
【実施例９】
【００９２】
キメラ371抗体、キメラ313抗体の発現
取得したscFv371およびscFv313のV領域の配列をマウスIgG1λ発現ベクターに導入し、マウス定常領域を持つこれらの抗体（以下キメラ371抗体およびキメラ313抗体）の発現を行った。実施例５で取得したscFv371およびscFv313ファージ中に含まれているプラスミドを鋳型として、以下の表に示す組み合わせでscFv371およびscFv313のVHおよびVLを含む領域をPCR法によって増幅した。プライマーの組合せと配列番号を表５に示した。
【００９３】
【表５】
2019191174.tif 000006
【００９４】
増幅した配列をVH領域はマウスCγ1定常領域を発現するベクターpKMA010-mCg1 (XhoI, NruI処理済)に、VL領域はマウスCλ定常領域を発現するベクターpKMA009-mCλ (XhoI, BamHI処理済)にそれぞれIn-fusion enzyme (Clontech)を用いて導入した（図１）。pKMA010-371/313-mCg1ベクターはCAGプロモーターの下流に、scFv371又はscFv313のVH領域、及びマウスCγ1定常領域が挿入されており、薬剤耐性遺伝子としてDHFR遺伝子を有している。pKMA009-371/313-mCλベクターは、CAGプロモーターの下流に、scFv371又はscFv313のVL領域、及びマウスCλ定常領域が挿入されたベクターである。pKMA010-371-mCg1ベクター、及びpKMA009-371-mCλベクターを総じてキメラ371抗体発現ベクターと呼ぶ。また、pKMA010-313-mCg1ベクター、及びpKMA009-313-mCλベクターを総じてキメラ313抗体発現ベクターと呼ぶ。
【００９５】
scFv371およびscFv313のVH領域又はVL領域を鋳型として、site-directed mutagenesis法を用いて変異を導入し、実施例８で設計した371M抗体、313M抗体のVH領域およびVL領域を作出した。そして上記と同様に、マウス定常領域を持つこれらの抗体（以下キメラ371M抗体およびキメラ313M抗体）の発現ベクターを構築した。pKMA010-371M/313M-mCg1ベクターは、CAGプロモーターの下流に、371M又は313MのVH領域、及びマウスCγ1定常領域が挿入されたベクターである。また、pKMA009-371M/313M-mCλベクターは、CAGプロモーターの下流に、371M又は313MのVL領域、及びマウスCλ定常領域が挿入されたベクターである。pKMA010-371M-mCg1およびpKMA009-371M-mCλを総じてキメラ371M抗体発現ベクターと呼び、pKMA010-313M-mCg1およびpKMA009-313M-mCλを総じてキメラ313M抗体発現ベクターと呼ぶ。
【００９６】
次に、ヒト定常領域を持つ371M抗体および313M抗体（以下それぞれヒト371M抗体およびヒト313M抗体）を発現するベクターを以下の方法で構築した。先に構築したキメラ371M抗体およびキメラ313M抗体発現ベクターを鋳型として、以下の表に示す組み合わせで371Mおよび313MのVHおよびVLを含む領域をPCR法によって増幅した。プライマーの組合せと配列番号を表６に示した。
【００９７】
【表６】
2019191174.tif 000007
【００９８】
増幅した配列をVH領域はヒトCγ1定常領域を発現するベクターpKMA010-hCg1 (XhoI, BamHI処理済)に、VL領域はヒトCλ定常領域を発現するベクターpKMA009-hCL (XhoI, BamHI処理済)にそれぞれIn-fusion enzyme (Clontech)を用いて導入した。pKMA010-371/313-hCg1ベクターはCAGプロモーターの下流に371M抗体あるいは313M抗体のH鎖の配列が挿入されており、薬剤耐性遺伝子としてDHFR遺伝子を有している。pKMA009-371/313-hCLベクターは、CAGプロモーターの下流に371M抗体あるいは313M抗体のL鎖の配列が挿入されたベクターである。pKMA010-371-hCg1及びpKMA009-371-hCLを総じてヒト371M抗体発現ベクターと呼び、pKMA010-313-hCg1及びpKMA009-313-hCLを総じてヒト313M抗体発現ベクターと呼ぶ。各種ベクターと挿入配列の関係を下表に示す。
【００９９】
【表７】
2019191174.tif 000008
【０１００】
キメラ371、313、371M、313M抗体、およびヒト371M、313M抗体の、H鎖およびL鎖を発現するベクターをFreestyle293F細胞(Invitrogen)にNeofection(アステック)を用いて遺伝子導入し、37℃ 8%CO2環境下において125rpmで振とう培養し各種抗体を分泌発現させた。培養5日目に上清を回収し、HiTrap rProteinA FF (GE Healthcare)を用いたクロマトグラフィー精製を行った。両抗体が含まれた溶出画分をPBS(SIGMA)に対して透析し、それぞれキメラ371抗体、キメラ313抗体、キメラ371M抗体、キメラ313M抗体、ヒト371M抗体、ヒト313M抗体精製品とした。
【実施例１０】
【０１０１】
371M抗体のエピトープ解析
371M抗体のエピトープを更に詳しく解析するために、実施例３で構築したTTRアラニン置換変異体を用いて、371M抗体の反応性解析を行った。実施例３で構築したTTR変異体発現ベクターを大腸菌株M15に形質転換し、20mLのLB / Ampicillin (50μg/mL) / Kanamycin (25μg/mL) で、37℃で培養した。O.D.600nm=0.5になった時点でIPTGを終濃度1mMになるように添加し、一晩培養した。培養液を遠心し、沈殿画分をBugbuster (Merck)によって可溶化した。可溶化した菌体液を8-16%SDS-PAGEゲルに泳動し、ゲルからImmobilon-P (Millipore)へ転写した。転写した膜に2% Skimmilk-PBSTを加え、室温で1時間振とうすることで膜のブロッキングを行った。キメラ371M抗体を2% Skimmilk-PBSTで1μg/mLの濃度に希釈し、10mLを膜へ添加して室温で1時間振とうした。PBSTで洗浄し、検出抗体HRP標識anti-mouse IgG(H+L) (AMERICAN QUALEX INTERNATIONAL)を2%Skimmilk-PBSTで5000倍希釈した後に膜へ添加し、室温で1時間振とうした。PBSTで洗浄した後、Ez West Blue (ATTO)で発色させた。
【０１０２】
その結果、図２に示すように、371M抗体は、ヒトTTRの78-89部位をエピトープとして持つことが明らかになった。
【実施例１１】
【０１０３】
371M抗体および313M抗体の反応特異性解析
371M抗体および313M抗体のTTR 4量体に対する反応性を解析するため、表面プラズモン共鳴法を用いた反応特異性解析を行った。Biacore2000 (GE Healthcare)を用い、Sensorchip CM5 (GE Healthcare)にWT TTR4量体、V30M TTR4量体、V30M TTR線維（実施例４，６で調製、いずれも組換え体）を1000RU程度固相化した。リガンドの固相化は10mM 酢酸バッファー (pH6.0)で行った。HBS-EP Bufferで10μg/mLに希釈したPolyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin (Dako)、キメラ371M抗体、キメラ313M抗体、陰性コントロール抗体を20μL/minで2分間泳動した。泳動後に解離を60分間行い、10 mM Gly-NaOH (pH9.0)で30秒間再生を行った。
【０１０４】
その結果、図３に示すように、371M抗体および313M抗体はWT TTRおよびV30M 4量体TTRには反応せず、V30M 線維を特異的に認識することが明らかとなった（（a）および（b））。Dako社製ポリクローナル抗体ではWT TTRおよびV30M TTRと強く反応し、V30M TTR線維への反応性は弱く（c）、陰性コントロール抗体ではいずれのTTRに対しても反応を示さなかった（d）。
【実施例１２】
【０１０５】
371抗体および313抗体の患者血清への反応性解析
371抗体および313抗体がFAP患者由来の血清に対して反応性を示すかどうかについて解析を行った。投与した抗体が患者血清中のヒトTTRを認識しないことが、FAP治療用の抗体として望ましい特性である。健常人の血清、及びV30M TTR変異を有するFAP患者由来の血清を2μg/mLで、実施例６と同様に酸処理を行った血清由来の野生型TTRの線維、及びFAP患者の腎臓から抽出したTTRアミロイドを約4μg/mLで、Maxisorp plate (Nunc)に各ウェル当り100μL添加し、抗原の固相化を行った。固相化したプレートに1%BSA-PBSを各ウェル当り300μL入れ、1時間室温でインキュベートすることによってプレートのブロッキングを行った。キメラ371抗体およびキメラ313抗体を1%BSA-PBSで段階希釈し、プレートの各ウェルに100μLずつ加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTでウェルを洗浄し、検出抗体anti-mouse IgG(H+L)/HRP (Zymed)をプレートの各ウェルに100 μLずつ加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMB (SIGMA)をプレートの各ウェルに100μLずつ加えることによって発色させた。30分後、1N 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で発色値(O.D.450nm)を測定した。
【０１０６】
その結果、図４に示すように、371抗体（a）および313抗体（b）は、FAP患者由来のTTRアミロイドと血清由来の野生型TTRを酸処理によりアミロイド化させたものには明らかな濃度依存的反応性を示したのに対し、健常者及びFAP患者由来の血清には明確な反応性を示さなかった。
【実施例１３】
【０１０７】
371M抗体、および313M抗体の患者組織への反応性解析
V30M TTR保有FAP患者の心臓を採取し、ホルマリン固定を行った。固定した心臓組織をパラフィンブロックに包埋し、組織切片を作製した。組織切片を4μmの厚さにスライスしてスライドグラスに接着させた後、脱パラフィン処理を行った。PBSで洗浄した後、0.1% 過よう素酸二水和物に10分間浸透し、更にPBSで洗浄した。0.5% BSA-PBSで50倍希釈したRabbit serum (Dako)に室温で1時間浸漬し、ブロッキング処理を行った。PBSで洗浄した後、一次抗体としてキメラ371抗体/キメラ313抗体/キメラ371M抗体/キメラ313M抗体/陰性コントロール抗体をそれぞれ0.5%BSA-PBSで10μg/mLに希釈し、4℃で一晩浸漬した。二次抗体としてHRP標識Rabbit anti-mouse IgG (Dako)を0.5%BSA-PBSで100倍希釈し、室温で1時間浸漬した。PBSで洗浄し、DABを用いて発色させた。ヘマトキシリン染色もあわせて行った。陽性コントロールでは、一次抗体にPolyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin (Dako)を、二次抗体にHRP標識Goat anti-Rabbit IgG (Dako)を用いて同様な処理を行った。また、ホルマリン固定によりTTRが変性し、立体構造が変化してしまう可能性を考慮し、V30M TTR保有FAP患者の心臓の凍結組織切片についても、同様に免疫染色を行った。さらに、アミロイド線維の存在を確認するために、Congo red染色も行った。Congo redはアミロイド線維に定着して短波長シフトを起こすことが知られている。
【０１０８】
これらの解析の結果、図５に示すように、371抗体/313抗体/371M抗体/313M抗体はいずれもパラフィン切片（図５a）と凍結切片（図５b）のいずれにおいても、FAP患者由来の心臓に沈着したTTRを特異的に認識することが確認された。
【実施例１４】
【０１０９】
371M抗体および313M抗体のTTR線維への反応性解析
実施例６で調製した７種類のTTR線維、および野生型TTR精製品を、1.5μgずつ8-16%SDS-PAGEで泳動し、Immobilon-P (Millipore)に転写した。転写した膜に2%Skimmilk-PBSTを加え、室温で1時間振とうすることで膜のブロッキングを行った。キメラ371M抗体またはキメラ313M抗体を2%Skimmilk-PBSTで1μg/mLの濃度に希釈し、10mLを膜へ添加して室温で1時間振とうした。PBSTで洗浄し、検出抗体anti-mouse IgG(H+L)を2% Skimmilk-PBSTで5000倍希釈し、室温で1時間振とうした。PBSTで洗浄した後、Ez West Blue (ATTO)で発色させた。
【０１１０】
その結果、図６に示すように、371M抗体および313M抗体は、各種TTR線維を認識し、一方で野生型TTR精製品を認識しないことが明らかになった。
【実施例１５】
【０１１１】
V30M TTR線維化阻害活性測定系の構築
組換えV30M TTRを375μg/mLになるようにPBS(-)で希釈し、4種類の界面活性剤を終濃度が0.1%、0.01%、0.001%になるように混合した。使用する界面活性剤として、（１）塩化ベンザルコニウム(山善)、（２）デオキシコール酸ナトリウム(ナカライ)、（３）Zwittergent3-16 (Carbiochem)、（４）NP-40 (Wako)を用いた。37℃で4日間静置し、ThioflavinT assay(励起波長 440 nm, 蛍光波長 480 nm)によって蛍光強度を測定し、TTR線維化の程度を評価した。
【０１１２】
ThioflavinT assayの結果を図７に示す。いずれの界面活性剤でも、0.1%の濃度で用いた際にTTRの線維化が進行していた。中でも、デオキシコール酸ナトリウムを用いた時が、TTRの線維化が一番早く進行することを見出した。続いて、デオキシコール酸ナトリウムの最適な濃度について検討した。組換えV30M TTRを375μg/mLになるようにPBS(-)で希釈し、デオキシコール酸ナトリウムの濃度が1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%になるように混合した。37℃で静置し、4日後、7日後にThioflavinT assayを行ってTTR線維化の程度を評価した。
【０１１３】
その結果を図８に示す。デオキシコール酸ナトリウム濃度が1%の条件で、最も顕著な線維化が見られたが、0hr（添加直後）でも線維化が認められたため、急速に線維化が進行し過ぎていると考えられた。それに対し、0.1%では一晩以上の静置後に線維化が認められ、0.5%、0.2%、0.01%と比べると、最も処理時間に依存した顕著な線維化の進行が見られた。これらのことから、デオキシコール酸ナトリウム濃度は0.1%が最適であることが明らかになった。これまで、中性pH環境下でV30M TTRの線維化が進行する条件に関する報告はなされておらず、pH3.0といった酸性環境下にTTRを置くことで、TTRの線維化を進行させていた。一方で、抗体を酸性環境下に曝してしまうと抗体が変性し、その活性を失ってしまうことから、抗TTR抗体のTTR線維化阻害能を評価することは困難であった。今回デオキシコール酸を系に導入することで中性環境下でも V30M TTRの線維化が進行することを新たに見出し、抗TTR抗体の線維化阻害能を評価できる系の構築に成功した。
【実施例１６】
【０１１４】
371M抗体、および313M抗体のV30M TTR線維化阻害試験
V30M TTR精製品、および371抗体、313抗体、371M抗体、313M抗体、または陰性コントロール抗体のモル比が 10μM：0.01〜2μMになるように両者を混合し（TTR: 550μg/mL、抗体: 1.5〜300μg/mL）、PBS+0.1%デオキシコール酸ナトリウム環境下で37℃ 3日間静置した。静置後のサンプルを用いてThioflavinT assay(励起波長 440 nm, 蛍光波長 480 nm)を行い、蛍光強度を測定した。
【０１１５】
その結果、図９に示すように、371、313、371Mおよび313M抗体は抗体濃度依存的にV30M TTRの線維化を阻害する活性を有していることが明らかになった。
【実施例１７】
【０１１６】
マクロファージ貪食能試験
マクロファージがTTR線維を貪食する際、371M抗体や313M抗体がその能力を促進するかどうかについて、マクロファージ貪食能試験を行った。本試験は、TTR患者組織内に沈着しているTTRをマクロファージが除去する過程を模倣しており、両抗体の添加によってマクロファージの貪食活性が促進されれば、両抗体はヒト組織内でTTR沈着の除去を促進する活性を有していると期待される。
【０１１７】
健常人由来の皮膚組織から、非特許文献１６に記載の方法に従ってヒトiPS細胞を作製し、更にマクロファージ（iPS-MP）に分化させた。1〜2×106個のiPS-MPを10cm dishにて、50ng/mL hGM-SCF及び25pg/mL M-CSF存在下で24 時間前培養した。iPS-MPをPBS 洗浄後、20μg/mLマイトマイシンCを含む培地にて37℃で10分間インキュベートし、細胞増殖能を停止させ、96wellプレートに5×104個/100μL/wellになるように加えた。未処理あるいは24 時間の酸処理を行なったV30M TTRを3.2μg/mLになるように培地で希釈後、50μLずつ添加した。さらに、PBS/ヒト371M抗体/ヒト313M抗体/陰性コントロール抗体をそれぞれ40μg/mLになるように希釈し、50μLずつ添加した。37℃、5% CO2下で2日間培養した後、培養上清を回収した。
【０１１８】
培養後のTTR残量を以下に記すELISA法で定量し、マクロファージによる貪食能を評価した。培養上清を5μLずつ96wellプレートに加え、さらにコーティング溶液（25mMの炭酸ナトリウムバッファー）を100μL加えた後、4℃で一晩静置した。PBSTで洗浄後、ブロッキング溶液（コーティング溶液に0.5%ゼラチンを溶かしたもの) を250μL加え、室温で1時間インキュベートした。PBST で洗浄後、Polyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin (Dako)を0.05%ゼラチン-PBSTで1000倍希釈し、100μLずつ添加して室温で1時間インキュベートした。PBSTで洗浄後、HRP標識Goat anti-Rabbit IgG(Dako)を0.05%ゼラチン-PBSTで5000倍希釈し、100μLずつ添加して室温で1時間インキュベートした。PBSTで洗浄後、100μLのSureBlue (KPL)で5分間発色し、100μLの1M塩酸で発色を停止させた。xMARK マイクロプレートリーダー(Bio-Rad Laboratories)にて450nmの波長を測定した。
【０１１９】
結果を図１０に示す。未処理の精製V30Mに対しては、いずれの検体でもTTR残量に統計学的有意差は見られなかったのに対し（a）、TTR線維に対しては、PBS (none)と比較して371M抗体および313M抗体では統計学的に有意なTTR残量の減少が認められ（b）、371M抗体および313M抗体はヒトiPS細胞分化マクロファージのTTR線維貪食作用を促進する活性を有していることが明らかになった。
【実施例１８】
【０１２０】
V30M Tgラットを用いた薬効評価試験
3ヶ月齢のV30M Tgラット（非特許文献14、TTRのアミノ酸配列において30位をバリンからメチオニンに変異させたヒトTTRの遺伝子を導入したトランスジェニックラット）を用いて、キメラ371抗体、キメラ313抗体 各10mg/kg あるいはPBSを各群7または8匹ずつ、3〜9ヶ月齢の6ヶ月間に亘り、週1回ずつ26回投与した。投与後に剖検して大腸を採取し、ホルマリン固定を行った。固定した大腸組織をパラフィンブロックに包埋し、組織切片を作製した。組織切片を一次抗体にPolyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin (Dako)を、二次抗体にHRP標識Goat anti-Rabbit IgG (Dako)を用いて免疫染色し、大腸の筋層におけるTTR沈着の程度を数値化して群間での比較した。
【０１２１】
その結果、図１１に示すように、PBS投与群と比較して371抗体投与群及び313抗体投与群ではTTR沈着が有意に抑制されていた。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明の組換えヒト抗トランスサイレチン抗体は、活性（TTR線維化阻害活性、マクロファージ貪食能促進活性等）および／または特異性（構造変化を起こしたTTR、TTR線維を特異的に認識する）に優れているため、TTRの構造変化や線維化が関与する様々な疾患に対して有効な薬剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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