(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚における損傷が、全層欠損創に対しても治癒促進効果を発揮することができる、皮膚損傷治癒促進剤の提供。【解決手段】デクチン−２の発現を抑制すると、炎症応答が低下した結果、皮膚損傷治癒の進行レベルは促進し、損傷した皮膚の修復・再生が速まったことから、デクチン−２阻害剤、例えば、哺乳類生体内のデクチン−２をコードするｍＲＮＡに対して特異的にＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡ、又はその発現ベクターを含むものを、皮膚損傷治癒の促進剤とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デクチン−２阻害剤を含むことを特徴とする皮膚における損傷治癒の促進剤。
【請求項２】
皮膚における損傷が、全層欠損創であることを特徴とする請求項１に記載の促進剤。
【請求項３】
デクチン−２阻害剤が、哺乳類生体内のデクチン−２をコードするｍＲＮＡに対して特異的にＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡ、又はその発現ベクターである請求項１又は２に記載の促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デクチン（Dectin）−２阻害剤を含む、皮膚損傷治癒の促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、外界から生体を保護している人体最大の臓器である。皮膚は、表皮、真皮、及び皮下組織と、皮膚付属器（例えば、毛器管、汗腺、脂腺）とから構成されている。表皮のみが損傷を受けても、皮膚は完全に再生し、損傷の痕跡は、通常残らないが、表皮を超える損傷を受けた場合、線維芽細胞の増殖や、結合組織の過形成により、損傷部位における充填が生じるとともに、表皮細胞の増殖による上皮化が起こり、治癒後に瘢痕を残すことがある。特に、治癒の進行が遅延するほど、肥厚性瘢痕、ケロイドといった病的な瘢痕形成が生じやすく、また、関節部における拘縮や露出部における醜形の原因となり、ＱＯＬ（Quality of life）を損なうため、皮膚損傷治癒を促進できる薬剤が望まれている。
【０００３】
例えば、オオムギは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）産生促進作用を有し、皮膚損傷治療剤として利用できることが報告されている（特許文献１）。また、植物に含まれるトリテルペン酸は、幹細胞に対する未分化状態維持効果及び増殖促進効果を有し、皮膚損傷治癒剤として有用であることが報告されている（特許文献２）。また、ユーグレナ由来のパラミロンが、高い皮膚損傷治癒促進効果を有することが報告されている（特許文献３）。また、損傷した皮膚にＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンを適用すると、皮膚損傷治癒が顕著に促進されることが報告されている（特許文献４）。
【０００４】
一方、デクチン−２は、マクロファージや樹状細胞に発現するＣ型レクチン受容体の１つである。デクチン−２は、真菌感染の防御に関与していることが報告されている（非特許文献１）。また、カンジダ（Candida）属菌等の真菌の細胞壁に存在するαマンナンが、デクチン−２受容体に結合すると、Ｔｈ１７応答及び好中球性炎症反応を誘導することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、デクチン−２阻害剤が、皮膚損傷治癒を促進する効果を有することについては、これまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１７−２２６６１３号公報
【特許文献２】特開２０１６−１６９１７２号公報
【特許文献３】特開２０１４−２３１４７９号公報
【特許文献４】特開２０１２−２５６９２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Robinson M,J. et al. J. Exp. Med. 2009;206(9):2037-2051.
【非特許文献２】Saijo S. et al. Immunity. 2010;32(5):681-691.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、全層欠損創に対しても治癒促進効果を発揮することができる、皮膚損傷治癒の促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進める過程において、まず、α−マンナン／デクチン−２受容体の経路を活性化させると、炎症応答が上昇した結果、皮膚損傷治癒の進行レベルは低下し、損傷した皮膚の修復・再生は遅れることを見出した。さらに、デクチン−２の発現を抑制すると、炎症応答が低下した結果、皮膚損傷治癒の進行レベルは促進し、損傷した皮膚の修復・再生は速まることを確認した。本発明は、これらの知見に基づき、完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕デクチン−２阻害剤を含むことを特徴とする皮膚における損傷治癒の促進剤。
〔２〕皮膚における損傷が、全層欠損創であることを特徴とする上記〔１〕に記載の促進剤。
〔３〕デクチン−２阻害剤が、哺乳類生体内のデクチン−２をコードするｍＲＮＡに対して特異的にＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡ、又はその発現ベクターである上記〔１〕又は〔２〕に記載の促進剤。
【００１０】
また本発明の実施の他の形態として、デクチン−２阻害剤を、皮膚損傷の早期治療を必要とする哺乳類に投与する工程を含む、皮膚損傷治癒を促進する方法；や、皮膚損傷治癒の促進剤として使用するためのデクチン−２阻害剤；や、皮膚損傷治癒の促進における使用のためのデクチン−２阻害剤；や、皮膚損傷治癒の促進剤を製造するための、デクチン−２阻害剤の使用；を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１１】
デクチン−２阻害剤は、損傷した皮膚における炎症応答を低下させ、皮膚損傷治癒の進行レベルを促進し、損傷した皮膚の修復・再生を速める作用を有する。このため、本発明は、皮膚損傷の早期治療に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａは、皮膚損傷モデルＷＴマウスについて、皮膚損傷直後（０日目）、並びに皮膚損傷を与えてから０．２５日目（６時間目）、０．５日目（１２時間目）、１日目、３日目、及び５日目に、損傷部位におけるデクチン−２遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の「デクチン−２遺伝子発現レベル」は、皮膚損傷開始直後（０日）のｍＲＮＡの発現レベルを１としたときの相対値として示す。図１Ｂは、対照群及びマンナン処理群の皮膚損傷モデルＷＴマウスにおいて、皮膚損傷を与えてから５日目に、皮膚損傷の閉鎖レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の「皮膚損傷の閉鎖率（％）」は、０日目の損傷部位の面積に対して減少した割合を示す。図中の「＊」及び「＊＊」は、それぞれ統計学的に有意差（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）があることを示す。なお、図１〜９のグラフにおける縦軸の値は、平均値±標準誤差（ＳＤ）として示し、統計処理は、Welch’s t-testを使用して行った。
【図２】対照群及びマンナン処理群の皮膚損傷モデルＷＴマウスにおいて、皮膚損傷を与えてから５日目に、損傷部位におけるヒドロキシプロリン含量（図２Ａ）、及び２種類の遺伝子（ＣＯＬ１Ａ１遺伝子［図２Ｂ］、及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子［図２Ｃ］）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。図２Ｂ及びＣにおけるｍＲＮＡの発現レベルは、対照群におけるｍＲＮＡの発現レベルを１としたときの相対値として示す。図中の「＊＊」は、統計学的に有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【図３】対照群及びマンナン処理群の皮膚損傷モデルＷＴマウスにおいて、皮膚損傷を与えてから１日目、２日目、及び５日目に、損傷部位における白血球（図３Ａ）、好中球（図３Ｂ）、マクロファージ（図３Ｃ）、及びリンパ球（図３Ｄ）の細胞数を測定した結果を示す図である。図中の「＊」及び「＊＊」は、それぞれ統計学的に有意差（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）があることを示す。
【図４】対照群及びマンナン処理群の皮膚損傷モデルＷＴマウスにおいて、皮膚損傷を与えてから３日目に、損傷部位におけるインターロイキン（interleukin；ＩＬ）−１７Ａ発現量（図４Ａ）、及び３種類の遺伝子（腫瘍壊死因子［Tumor Necrosis Factor；ＴＮＦ］−α遺伝子［図４Ｂ］、ＩＬ−１β遺伝子［図４Ｃ］、及びＣＸＣＬ２遺伝子［図４Ｄ］）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。図４Ｂ〜ＤにおけるｍＲＮＡの発現レベルは、対照群におけるｍＲＮＡの発現レベルを１としたときの相対値として示す。図中の「＊」は、統計学的に有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
【図５】皮膚損傷モデルＷＴマウス（ＷＴ）及び皮膚損傷モデルＫＯマウス（ＫＯ）について、皮膚損傷直後（０日目）、並びに皮膚損傷を与えてから３日目、及び５日目に、皮膚損傷の閉鎖レベルを解析した結果を示す図である。図５Ｂにおける縦軸の「皮膚損傷の閉鎖率（％）」は、０日目の損傷部位の面積に対して減少した割合を示す。図中の「＊＊」は、統計学的に有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【図６】皮膚損傷モデルＷＴマウス（ＷＴ）及び皮膚損傷モデルＫＯマウス（ＫＯ）について、皮膚損傷を与えてから５日目に、損傷部位におけるヒドロキシプロリン含量を解析した結果を示す図である。
【図７】皮膚損傷モデルＷＴマウス（ＷＴ）及び皮膚損傷モデルＫＯマウス（ＫＯ）について、皮膚損傷を与えてから５日目に、損傷部位における再上皮形成化の割合（図７Ａ）、及び肉芽領域（図７Ｂ）を解析した結果を示す図である。図中の「＊」は、統計学的に有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
【図８】皮膚損傷モデルＷＴマウス（ＷＴ）及び皮膚損傷モデルＫＯマウス（ＫＯ）について、皮膚損傷を与えてから０．５日目（１２時間目）、１日目、及び３日目に、損傷部位における白血球（図８Ａ）、好中球（図８Ｂ）、マクロファージ（図８Ｃ）、及びリンパ球（図８Ｄ）の細胞数を測定した結果を示す図である。図中の「＊」及び「＊＊」は、それぞれ統計学的に有意差（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）があることを示す。
【図９】皮膚損傷モデルＷＴマウス（ＷＴ）及び皮膚損傷モデルＫＯマウス（ＫＯ）について、皮膚損傷を与えてから０．５日目（１２時間目）に、損傷部位における３種類の遺伝子（ＴＮＦ−α遺伝子［図９Ａ］、ＣＣＬ３遺伝子［図９Ｂ］、及びＣＣＬ４遺伝子［図９Ｃ］）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。各種因子のｍＲＮＡの発現レベルは、ＷＴにおけるｍＲＮＡの発現レベルを１としたときの相対値として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の皮膚における損傷治癒の促進剤は、「皮膚における損傷治癒を促進するため」という用途が限定されたデクチン−２阻害剤を含有する剤（以下、「本件促進剤」ということがある）である。本件促進剤は、皮膚損傷治癒促進の有効成分であるデクチン−２阻害剤を、単独で飲食品又は医薬品（製剤）として使用してもよいし、さらに添加剤を混合し、組成物の形態（飲食品組成物又は医薬組成物）として使用してもよい。かかる飲食品としては、例えば、健康食品（機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、栄養強化食品、栄養調整食品、サプリメント等）、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等）を挙げることができる。
【００１４】
本明細書において、「皮膚における損傷治癒を促進する」とは、本件促進剤を投与した場合、本件促進剤を未投与の場合と比べ、皮膚における損傷治癒の進行レベルが促進することを意味する。
【００１５】
本明細書において、「デクチン−２阻害剤」とは、哺乳類生体内のデクチン−２（「C-type lectin domain family 6 member A」ともいう）の発現；又はその受容体としての機能；を、特異的に阻害（抑制）する物質（例えば、ポリペプチド、抗体等のタンパク質；ポリヌクレオチド；糖類；脂質；有機化合物；無機化合物）を意味する。デクチン−２阻害剤により阻害されるデクチン−２の割合としては、少なくとも５０％が好ましく、少なくとも５５％がより好ましく、少なくとも６０％がさらに好ましく、少なくとも６５％がさらにより好ましく、少なくとも７０％が好ましく、少なくとも７５％が特に好ましく、少なくとも８０％がまた特に好ましく、少なくとも８５％が特により好ましく、少なくとも９０％が特にさらに好ましく、少なくとも９５％が特にさらにより好ましく、少なくとも９８％が最も好ましい。
【００１６】
上記デクチン−２阻害剤としては、例えば、哺乳類生体内のデクチン−２受容体に結合し、デクチン−２受容体と、デクチン−２受容体のリガンドであるα−マンナンとの結合を阻害できるデクチン−２のアンタゴニスト（例えば、抗デクチン−２抗体）；哺乳類生体内のデクチン−２をコードするｍＲＮＡに対して特異的にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有するＲＮＡ（以下、「デクチン−２を標的とするＲＮＡ」ということがある）又はその発現ベクター；を挙げることができ、後述する本実施例において、哺乳類生体内のデクチン−２の発現を抑制した場合、皮膚における損傷治癒の促進効果が実証されているため、デクチン−２を標的とするＲＮＡ又はその発現ベクターが好ましい。
【００１７】
本明細書において、「デクチン−２を標的とするＲＮＡ」とは、哺乳類生体内のデクチン−２をコードするｍＲＮＡの一部又は全部とアニーリングすることができ、かつ、哺乳類生体内のデクチン−２をコードするｍＲＮＡの発現を抑制、及び／又は哺乳類生体内のデクチン−２受容体をコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することができる１本鎖又は２本鎖構造のＲＮＡを意味する。デクチン−２を標的とするＲＮＡは、通常、哺乳類生体内のデクチン−２をコードするｍＲＮＡの一部又は全部と少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９６％、さらに好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％）同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡである。
【００１８】
「デクチン−２を標的とするＲＮＡ」の形態としては、例えば、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、ｄｓＲＮＡ（double-strand RNA）、ｍｉＲＮＡ（microRNA）を挙げることができる。
【００１９】
本明細書において、「デクチン−２を標的とするＲＮＡの発現ベクター」とは、投与対象の哺乳類において、デクチン−２を標的とするＲＮＡが発現し得るものを意味する。デクチン−２を標的とするＲＮＡの発現ベクターは、通常、プロモーターと、かかるプロモーターの下流に作動可能に連結された、デクチン−２を標的とするＲＮＡをコードする遺伝子とを含むポリヌクレオチドであり、環状のものであっても線状のものであってもよい。
【００２０】
本明細書において、「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ及び基本転写因子）が結合し、その下流に位置する遺伝子がコードするｍＲＮＡの転写を開始させる領域を意味する。プロモーターには、通常転写開始点（ＴＳＳ）が含まれる。
【００２１】
上記「デクチン−２を標的とするＲＮＡの発現ベクター」としては、「デクチン−２を標的とするＲＮＡ」の発現効率を高めるために、エンハンサー領域やターミネーター領域をさらに含むものや、発現ベクターのクローニングのために、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子（選択マーカー遺伝子）をさらに含むものであってもよい。
【００２２】
上記抗デクチン−２抗体としては、具体的には、例えば、抗ヒトデクチン−２抗体の市販品（cat# mabg-hdect2、Anti-hDectin-2-IgG、容量：１００μｇ；INVIVOGEN社製）を挙げることができる。また、上記デクチン−２を標的とするＲＮＡとしては、具体的には、例えば、ヒトデクチン−２を標的とするｓｉＲＮＡの市販品（Dectin-2 siRNA (h)、cat# sc-63278；SANTA CRUZ社製）や、マウスデクチン−２を標的とするｓｉＲＮＡの市販品（（Dectin-2 siRNA (m)、cat# sc-63279；SANTA CRUZ社製）を挙げることができる。また、上記デクチン−２を標的とするＲＮＡの発現ベクターとしては、具体的には、例えば、ヒトデクチン−２を標的とするｓｈＲＮＡの発現プラスミドベクターの市販品（Dectin-2 shRNA Plasmid (h)、cat# sc-63278-SH；SANTA CRUZ社製）や、マウスデクチン−２を標的とするｓｈＲＮＡを発現するプラスミドベクターの市販品（Dectin-2 shRNA Plasmid (m)、cat# sc-63279-SH；SANTA CRUZ社製）や、マウスデクチン−２を標的とするｓｈＲＮＡを発現するレトロウィルスベクターの市販品（TRCN0000066783［＃RMM3981-201784120］、TRCN0000066784［＃RMM3981-201784121］、TRCN0000066785［＃RMM3981-201784122］、TRCN0000066786［＃RMM3981-201784123］、及びTRCN0000066787［＃RMM3981-201784124］；すべてOpen Biosystems社製）（文献「Barrett N,A. et al. J. Immunol. 2009;182(2):1119-1128.」参照）を挙げることができる。
【００２３】
上記哺乳類としては、ヒトや、非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス）を挙げることができる。
【００２４】
本発明において、「皮膚における損傷（皮膚損傷）」とは、物理的又は科学的な外的要因（例えば、挫創、挫滅創、挫傷、切創、熱傷、化学損傷、電撃症、放射線）、生物学的外的要因（例えば、感染症）、内的要因（例えば、動脈閉塞性症、糖尿病、強皮症、ベーチェット病）等の何らかの原因により少なくとも表皮が損傷した状態を意味する。すなわち、本発明において、「皮膚損傷」には、表皮損傷に加えて、真皮が損傷した状態（真皮表層に至る損傷［partial-thickness dermal wounds］）や、表皮及び真皮損傷に加えて、皮下組織が損傷した状態や、皮下組織を超えて皮筋層（皮下組織と筋層との境界）まで達する皮膚損傷、すなわち、全層欠損創（full-thickness dermal wounds）が含まれる。表皮のみの損傷の場合、表皮細胞（ケラチノサイト）の増殖だけで治癒に至るが、全層欠損創の場合、治癒過程で真皮層における収縮（筋線維芽細胞による）や血管新生（血管内皮細胞による）等も必要となり、治癒期間が延長するだけでなく、感染のリスクが上昇すると考えられている。本件促進剤は、このような全層欠損創に対しても優れた治癒促進効果を発揮する。
【００２５】
本件促進剤の添加剤としては、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、滑走剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の配合成分を例示することができる。かかる配合成分としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。
【００２６】
本件促進剤の投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液などの剤型で投与する経口投与や、溶液、乳剤、懸濁液などの剤型を注射、又はスプレー剤の型で鼻孔内投与する非経口投与を挙げることができる。
【００２７】
本件促進剤の投与対象の哺乳類は、通常ヒトであるが、非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス）であってもよい。
【００２８】
本件促進剤におけるデクチン−２阻害剤の投与量は、年齢、体重、性別、症状、デクチン−２阻害剤に対する感受性等に応じて適宜決定され、例えば、０．１μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の投与量の範囲である。
【００２９】
本件促進剤としては、デクチン−２阻害剤以外の、皮膚における損傷治癒を促進する成分を含むものであってもよいが、デクチン−２阻害剤単独でも優れた皮膚における損傷治癒の促進効果を発揮するため、デクチン−２阻害剤以外の、皮膚における損傷治癒を促進する成分（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、植物由来の抽出物）を含まないものが好ましい。
【００３０】
デクチン−２阻害剤は、損傷した皮膚における炎症応答を低下させ、皮膚損傷治癒の進行レベルを促進し、損傷した皮膚の修復・再生を速める作用を有する。このため、本件促進剤は、損傷した皮膚における炎症応答の低下剤や、皮膚損傷治癒の進行レベルの促進剤又は改善剤や、損傷した皮膚の修復及び／又は再生の促進剤に有利に適用することができる。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
１．材料と方法
［実験マウス］
デクチン−２遺伝子ノックアウトマウス（デクチン−２ＫＯマウス）は、文献「Saijo et al., Immunity 2010;32:681-91」記載の方法に従って、デクチン−２（Ｃｌｅｃ４ｎ）遺伝子の相同組み換えにより作製した後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに７世代に渡ってバッククロスした。また、デクチン−２ＫＯマウスと同腹の野生型（ＷＴ）マウスを、コントロールとして使用した。デクチン−２ＫＯマウスを用いた実験以外の実験においては、CLEA Japan社から購入したＣ５７ＢＬ／６マウス（７〜１０週齢のオス）を用いた。全ての実験マウスは、食料及び水は自由に与えられ、東北大学大学院医学系研究科で特定の病原菌のいない条件下で飼育された。本研究で記載される全ての実験プロトコルは、東北大学の動物実験倫理委員会によって承認された。
【００３３】
［皮膚損傷モデルマウスの作製］
４０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウム（ソムノペンチル、共立製薬社製）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型マウス）又はデクチン−２ＫＯマウスの腹腔内に注入し、麻酔処理した後、維持麻酔としてイソフルラン（共立製薬社製、東京）で持続吸入投与し、背中の毛を剃って皮膚を完全に露出させ、その後７０％エタノールでリンスした。直径３ｍｍの生検パンチ（Biopsy punch、カイインダストリーズ社製）を用い、滅菌条件下で、皮筋層まで達する全層損傷を形成させ、皮膚損傷モデルマウス（それぞれ皮膚損傷モデル野生型マウス［「皮膚損傷モデルＷＴマウス」ということがある］及び皮膚損傷モデルデクチン−２ＫＯマウス［「皮膚損傷モデルＫＯマウス」ということがある］）を作製した。なお、皮膚損傷部位は、閉鎖包帯としてポリウレタン膜（Tegaderm Transparent Dressing、3M Health Care社製）及び絆創膏（Hilate、Iwatsuki社製）で覆った。
【００３４】
［皮膚損傷部位の回収］
皮膚損傷モデルマウスを犠牲にした後、８ｍｍ直径の生検パンチで切除することにより、皮膚損傷部位を回収した。
【００３５】
［皮膚損傷の閉鎖率の測定］
皮膚損傷部位を形成させた直後の皮膚損傷モデルマウスについて、閉鎖包帯を行う前に、デジタルカメラ（ＣＸ４；リコー社製）を用いて、皮膚損傷部位のデジタル画像（０日目）を取得した。皮膚損傷後の各経過時間における皮膚損傷部位のデジタル画像は、ポリウレタン膜を優しく除去した後、撮影した。デジタル画像中の皮膚損傷部位の縁をトレースし、Axio  Vision imaging software Release 4.6（Carl Zeiss社製）を用いて、ピクセル領域を計算し、皮膚損傷部位の面積を定量化した。皮膚損傷の閉鎖率は、式「皮膚損傷の閉鎖率＝（１−［皮膚損傷後、各経過時間における皮膚損傷部位の面積／皮膚損傷直後（０日目）における皮膚損傷部位の面積］）×１００」を基に算出した。
【００３６】
［ＨＥ染色法］
回収した皮膚損傷部位を、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ溶液で固定し、パラフィンに包埋した。切片を皮膚損傷部位の中央部分から取り、定法に従ってヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色し、ＨＥ染色後の切片を基に、損傷部位における再上皮形成化の割合や肉芽領域を解析した。損傷部位における再上皮形成化の割合は、損傷部位の縁から、正常な上皮の端までの距離を測定し、算出した。
【００３７】
［免疫組織染色法］
上記皮膚損傷部位の切片を、メタノール／過酸化水素を用いて内在性ペルオキシダーゼをブロッキング処理し、１０％ノーマルラビット血清で２０分間インキュベートすることにより、非特異的な免疫染色をブロックした。その後、１次抗体反応処理及び２次抗体反応処理を、それぞれ、抗デクチン−２抗体（２０μｇ／ｍＬ；Bio-Rad社製）、及びペルオキシダーゼが結合した２次抗体（４μｇ／ｍＬ；Histofine Simple Stain MAX-PO、ニチレイバイオサイエンス社製）を用いて行った。
【００３８】
［α−マンナン処理］
マンナン処理群においては、サッカロマイセスセレビシエ由来のマンナン（α‐マンナン）（Sigma-Aldrich 社製）を、終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように、ＰＢＳ溶液で調整し、１８０μｇ相当のα―マンナンを、皮膚損傷モデルＷＴマウスにおける皮膚損傷部位に塗布した。一方、対照群においては、α‐マンナンの溶媒であるＰＢＳ溶液を、皮膚損傷モデルＷＴマウスにおける皮膚損傷部位に塗布した。
【００３９】
［白血球分画の調製］
回収した皮膚損傷部位を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ ＦＣＳ（BioWest社製）、１ｍｇ/ｍＬ コラゲナーゼ、及び１ｍｇ／ｍＬ ヒアルロニダーゼ（Sigma-Aldrich社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培養液（Nipro社製）を添加した、ステンレス製メッシュに移し、２時間、３７℃で激しく振盪した。振盪後、７０μｍセルストレーナー（BD Falcon、Bedford社製）に通し、組織断片及び死滅細胞を除去した。１％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培養液で３回洗浄し、フローサイトメトリー解析用の白血球分画を調製した。
【００４０】
［フローサイトメトリーを用いた白血球分画の解析］
調製した白血球分画に含まれる細胞を、８種類の蛍光物質で標識した抗体、すなわち、Pacific blue−抗ＣＤ４５抗体（clone 30-F11、BioLegend社製）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）−抗ＣＤ１１ｂ抗体（clone M1/70、BioLegend社製）、ＡＰＣ／Ｃｙ（シアニン）７−抗Ｌｙ６Ｇ抗体（clone 1A8、BioLegend社製）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）−抗Ｆ４／８０抗体（clone BM8、BioLegend社製)、ＰＥ（フィコエリトリン）−抗ＣＤ３ε抗体（clone 145-2C11、BioLegend社製）、ＰＥ−抗ＮＫ１．１抗体（clone PK136、BioLegend社製)、ＰＥ−抗Ｔ細胞受容体γδ（ＴＣＲγδ）抗体（clone GL3、BioLegend社製)、及びＰＥ−抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０抗体（clone RA3-6B2、BioLegend社製)を用いて抗原・抗体反応処理を行った。抗原・抗体反応処理後、フローサイトメーター（BD FACSCanto II フローサイトメーター［BD BioScience社製］）を用いて、好中球（ＣＤ４５陽性、ＣＤ１１ｂ陽性で、かつＬｙ６Ｇ陽性の細胞）、マクロファージ（ＣＤ４５陽性、ＣＤ１１ｂ陽性で、かつＦ４／８０陽性の細胞）、及びリンパ球（ＣＤ３、ＮＫ１．１、ＴＣＲγδ、及びＢ２２０のいずれかが陽性で、かつＣＤ４５陽性の細胞）の細胞数を測定し、それぞれの比率を算出した後、全細胞数（白血球数）を基に、白血球分画に含まれる３種類の細胞（好中球、マクロファージ、及びリンパ球）の全細胞数を算出した。なお、抗原・抗体反応処理のネガティブコントロールとして、アイソタイプが同じコントロールＩｇＧを使用した。
【００４１】
［定量ＰＣＲ］
回収した皮膚損傷部位から、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用い、添付のマニュアルに従って、全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡを基に、PrimeScript 一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（TaKaRa社製）を用い、添付のマニュアルに従って、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型とし、８種類の因子（デクチン−２、コラーゲンα−１（I）鎖、コラーゲンα−１（III）鎖、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン３、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン４、及びＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン２）をコードする遺伝子（それぞれ、デクチン−２遺伝子、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−１β遺伝子、ＣＣＬ３遺伝子、ＣＣＬ４遺伝子、及びＣＸＣＬ２遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析するために、以下の表１に示すプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマーのセット、並びにFast Start essential ＤＮＡグリーンマスターミックス（Roche Applied Science社製）と、リアルタイムＰＣＲシステム（LightCycler nanosystem［Roche Applied Science社製］)とを用いて定量ＰＣＲ解析を行った。なお、内部標準遺伝子として、β−アクチンをコードするＡＣＴＢ遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルも同様に検出した。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
［ＩＬ−１７Ａ発現量の測定］
回収した皮膚損傷部位を、ＰＢＳ溶液中でホモジナイズし、上清を回収後、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）キット（Biolegend社製）を用いて、皮膚損傷部位におけるＩＬ−１７Ａ濃度を測定した。なお、かかるキットの検出限界は、１５ｐｇ／ｍＬである。
【００４４】
［ヒドロキシプロリン含量の測定］
回収した皮膚損傷部位を、ＰＢＳ溶液中でホモジナイズし、６Ｎ塩酸溶液中で１２０℃、２１時間加水分解処理した。加水分解処理後、水酸化ナトリウムで中和し、０．０５ｍｏｌ／Ｌ クロラミンＴ（ナカライテスク社製）、３．１５ｍｏｌ／Ｌ 過塩素酸（ナカライテスク社製）、及び２０％ ジメチルアミノベンズアルデヒド（ナカライテスク社製）を、それぞれ１ｍＬずつ添加した後、分光光度計（Smart SpecTM3000、Bio-Rad社製）を用いて５５７ｎｍの吸光度を測定し、ヒロドロキシプロリン含量を比色測定した。
【００４５】
２．結果
［皮膚損傷モデル野生型マウスを用いた解析］
皮膚損傷と、デクチン−２との関連性を調べるために、皮膚損傷モデル野生型マウスについて、皮膚損傷を与えてから各経過時間におけるデクチン−２の発現レベルを解析した。
その結果、皮膚損傷を与えてから時間の経過とともに、デクチン−２遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルは上昇し、１２時間目にピークに達した（図１Ａ参照）。また、免疫組織染色法を用いた解析により、デクチン−２タンパク質は、皮膚損傷を与えてから１日目（２４時間）に、皮膚損傷部位の浸潤白血球において増加することを確認した。
これらの結果は、皮膚損傷を与えると、その部位においてデクチン−２の発現量が増加することを示している。
【００４６】
次に、α−マンナン／デクチン−２受容体の経路と、皮膚損傷治癒との関連性を調べるために、皮膚損傷モデル野生型マウスを、デクチン−２受容体のリガンドであるα−マンナンで処理し、皮膚損傷治癒の進行レベル、皮膚損傷レベル、及び炎症応答を解析した。
その結果、α−マンナンで処理した皮膚損傷モデルＷＴマウスは、α−マンナン未処理の皮膚損傷モデルＷＴマウスと比べ、皮膚損傷の閉鎖率が低下することや（図１Ｂ参照）、皮膚損傷部位において、ヒドロキシプロリン（コラーゲン特異的アミノ酸）含量が低下すること（図２Ａ参照）、I型コラーゲンタンパク質をコードする遺伝子（ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルが低下すること（図２Ｂ及びＣ参照）、皮膚損傷を与えてから少なくとも３〜５日目に白血球、好中球、及びリンパ球の細胞数が増加すること（図３参照）、並びに、炎症性サイトカインをコードする遺伝子（ＩＬ−１７Ａ遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子、及びＩＬ−１β遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルが増加すること（図４Ａ〜Ｃ参照）、及び炎症性ケモカインをコードする遺伝子（ＣＸＣＬ２遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルが増加すること（図４Ｄ参照）が示された。
これらの結果は、α−マンナン／デクチン−２受容体の経路を活性化させると、炎症応答が上昇した結果、皮膚損傷治癒の進行レベルは低下し、損傷した皮膚の修復・再生は遅れたことを示している。
【００４７】
［皮膚損傷モデルデクチン−２ＫＯマウス］
デクチン−２の発現を抑制した場合、皮膚損傷治癒の進行レベルは促進するかどうかを調べるために、皮膚損傷モデルデクチン−２ＫＯマウスを用い、皮膚損傷治癒の進行レベル、皮膚損傷レベル、及び炎症応答を解析した。
その結果、皮膚損傷モデルデクチン−２ＫＯマウスは、皮膚損傷モデル野生型マウスと比べ、皮膚損傷の閉鎖率が上昇することや（図５参照）、皮膚損傷部位において、ヒドロキシプロリン（コラーゲン特異的アミノ酸）含量が上昇すること（図６参照）、再上皮形成化の割合が上昇すること（図７参照）、白血球、好中球、マクロファージ、及びリンパ球の細胞数が減少（特に皮膚損傷を与えてから少なくとも０．５〜３日目にマクロファージや、少なくとも１〜３日目にリンパ球が顕著に減少）すること（図８参照）、並びに、炎症性サイトカインをコードする遺伝子（ＴＮＦ−α遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルが低下すること（図９Ａ参照）、及び炎症性ケモカインをコードする遺伝子（ＣＣＬ３遺伝子及びＣＣＬ４遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルが低下すること（図９Ｂ及びＣ参照）が示された。
これらの結果は、デクチン−２の発現を抑制すると、炎症応答が低下した結果、皮膚損傷治癒の進行レベルは促進し、損傷した皮膚の修復・再生は速まったことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、皮膚損傷の早期治療に資するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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