(57)【要約】【課題】マイクロ流体アッセイのための方法、組成物およびシステムの提供。【解決手段】本明細書では、いくつかある側面の中でも、サンプル中の粒子を分析するための方法および装置が提供される。いくつかの側面では、粒子は、被分析物、細胞、核酸、またはタンパク質であり得、タグと接触し、アリコートに分割し、ランク付けデバイスによって検出し、単離することができる。本明細書で提供される方法および装置は、マイクロ流体チップを含んでもよい。いくつかの側面では、本方法および装置は、疾患の診断、予後、または治療のために癌細胞および他の希少細胞等のサンプル中の希少粒子を定量化するように使用されてもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体サンプル中の第１の細胞型を検出するための装置であって、前記流体サンプルは、前記第１の細胞型と第２の細胞型とを含み、前記装置は、
入力チャネルと、第１の出力チャネルと、第２の出力チャネルと、前記第１の出力チャネルと流体連通しているチャンバと、指向性流チャネルとを備えるマイクロ流体チップと、
弁であって、前記弁は、前記マイクロ流体チップから分離可能であり、前記弁は、前記指向性流チャネル中の第１の流体の流動を調節し、前記指向性流チャネル中の前記第１の流体の流動は、前記入力チャネルから前記第１の出力チャネル、前記第２の出力チャネル、または、それらの組み合わせへ第２の流体の流動を指向する、弁と、
前記入力チャネル中の前記第２の流体の一部分から発せられる信号を検出するように構成された検出器と、
プロセッサと
を備え、
前記プロセッサは、
前記第１の細胞型を第１のタグに取り付けられた第１の構造に接触させることであって、前記第１の細胞型は、第１のマーカーを含み、前記第１の構造は、前記第１のマーカーに対する親和性を有する、ことと、
前記一部分中の前記第１の細胞型の存在または不存在を検出することであって、前記一部分中の前記第１の細胞型の存在または不存在を検出することは、放射線源を使用して前記第１のタグによって発せられる第１の信号を検出することを含み、前記第１の信号は、前記第１のマーカーの存在を示す、ことと、
前記信号に基づいて値を前記一部分に割り当てることと、
前記弁を操作することによって前記割り当てられた値に基づいて前記一部分の流動を指向することであって、前記一部分の流動を指向することは、前記第１のタグの存在に基づいて前記第１の細胞型を分割することを含む、ことと、
前記放射線源を使用して前記第１の信号の強度を低減させることと、
前記第１の細胞型を、前記第１のマーカーとは異なる第２のマーカーに対する親和性を有する第２の構造に接触させることであって、前記第２の構造は、第２のタグに結合されている、ことと、
前記第２のタグによって発せられる第２の信号を検出することであって、前記第２の信号は、前記第１の信号に重複する、ことと
を行うように構成されている、装置。
【請求項２】
前記第１の細胞型は、希少細胞である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記一部分は、アリコートであり、前記アリコートは、３次元空間を通して無作為に分布された複数の細胞を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記第１の出力チャネルと流体連通しているフィルタをさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
一式の管類をさらに備え、前記マイクロ流体チップは、前記一式の管類に流体的に接続された少なくとも１つのチャネルを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記フィルタは、開口のアレイを備える、請求項４に記載の装置。
【請求項７】
前記チャンバは、管類を介して前記第１の出力チャネルと流体連通している、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記フィルタは、希少細胞が前記フィルタを通過することができないように構成されている、請求項４または６のうちのいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記チャンバは、バイアル、微小遠心管、または、ウェルプレート内のウェルである、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記第１の細胞型から発せられる信号を低減させるように構成された放射線源をさらに備える、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記弁は、前記アリコートに割り当てられた前記値に依存して、前記第１の出力チャネルまたは前記第２の出力チャネルへ前記アリコートの流動を指向する、請求項３に記載の装置。
【請求項１２】
マイクロ流体チップ内の流体サンプルのアリコートを単離するための方法であって、前記マイクロ流体チップは、第１の出力チャネルと流体連通しているチャンバを備え、前記アリコートは、３次元空間を通して無作為に分布された複数の細胞の中の第１の細胞型を含み、前記複数の細胞は、前記第１の細胞型と第２の細胞型とを含み、前記方法は、
前記第１の細胞型を第１のタグに結合された第１の構造に接触させるステップであって、前記第１の細胞型は、第１のマーカーを含み、前記第１の構造は、前記第１のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、
前記アリコート中の前記第１の細胞型の存在または非存在を検出するステップであって、前記アリコート中の前記第１の細胞型の存在または非存在を検出するステップは、放射線源を使用して前記第１のタグによって発せられる第１の信号を検出することを含み、前記第１の信号は、前記第１のマーカーの存在を示す、ステップと、
前記第１の細胞型の存在または非存在に基づいて、値を前記アリコートに割り当てるステップと、
電子作動型弁を開放することによって、前記割り当てられた値に基づいて前記アリコートの流動を指向するステップであって、前記アリコートの流動を指向するステップは、前記第１のタグの存在に基づいて前記第１の細胞型を分割することを含み、前記電子作動型弁は、前記マイクロ流体チップの外部にあるデバイス上に位置する、ステップと、
前記第１の信号の強度を低減させるステップと、
前記第１の細胞型を、前記第１のマーカーとは異なる第２のマーカーに対する親和性を有する第２の構造に接触させるステップであって、前記第２の構造は、第２のタグに結合されている、ステップと、
前記第２のタグによって発せられる第２の信号を検出するステップであって、前記第２の信号は、前記第１の信号に重複する、ステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
（ａ）前記サンプルを前記マイクロ流体チップに導入することと、
（ｂ）入力チャネルを通して前記サンプルの一部分を流動させることであって、前記一部分は、複数の前記第１の細胞型、複数の前記第２の細胞型、または、それらの組み合わせを含む、ことと、
（ｃ）検出器を使用して、前記一部分内の前記第１の細胞型の存在または非存在を検出することと、
（ｄ）前記第１の細胞型が前記一部分内に存在する場合、前記一部分を前記チャンバの中へ指向することと、
（ｅ）前記チャンバが、前記サンプル内に存在する前記第１の細胞型の総数の８０％超を含み、かつ、前記サンプル内に存在する前記第２の細胞型の総数の５％未満を含むように、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を十分な回数繰り返すことと
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロ流体チップは、サンプル入力チャネルと、少なくとも２つの出力チャネルと、少なくとも１つの指向性流チャネルとを備え、前記電子作動型弁は、前記指向性流チャネル内の流体の流動を制御する、請求項１２〜１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも２つの出力チャネルのうちの少なくとも１つと流体連通しているフィルタを使用して前記第１の細胞型を捕捉することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記フィルタは、開口のアレイを備える、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の細胞型は、希少細胞であり、前記フィルタは、前記希少細胞が前記フィルタを通過することができないように構成されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の細胞型または前記第２の細胞型のうちの少なくとも１つは、癌細胞である、請求項１２〜１７のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記希少細胞は、癌細胞である、請求項１７または１８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の細胞型または前記第２の細胞型のうちの少なくとも１つは、循環腫瘍細胞である、請求項１２〜１９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の細胞型または前記第２の細胞型のうちの少なくとも１つは、細菌細胞、免疫細胞、胎児細胞、治療後に残留する疾患を示す細胞、または、幹細胞である、請求項１２〜２０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の細胞型または前記第２の細胞型のうちの少なくとも１つは、前記サンプル中の全細胞集団の１％未満を含む希少細胞である、請求項１２〜２１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルは、全血、分画血液、血清、血漿、汗、涙、耳内流動物、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣内流動物、糞便、経頸管洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心膜外液、ならびに呼吸器、腸管、尿生殖路の分泌物から成る群から選択される、請求項１２〜２２のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記弁は、電子作動型弁であり、前記電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネル中の前記流体の前記流動を制御するソレノイド弁である、請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の装置。
【請求項２５】
少なくとも１つの指向性流チャネルは、少なくとも２つのポートを備え、前記弁は、電子作動型弁であり、前記弁は、前記ポートのうちの１つを通る前記流体の流動を制御する、請求項１〜１１または２４のうちのいずれか１項に記載の装置。
【請求項２６】
前記弁は、電子作動型弁であり、前記弁は、少なくとも１つの指向性流チャネル中の流体の流動を直接制御する、請求項１〜１１または２４〜２５のうちのいずれか１項に記載の装置。
【請求項２７】
前記弁は、電子作動型弁であり、前記弁は、少なくとも１つの指向性流チャネルに流れ込むチャネル中の流体の流動を直接制御する、請求項１〜１１または２４〜２６のうちのいずれか１項に記載の装置。
【請求項２８】
前記弁は、電子作動型弁であり、前記弁は、出力チャネル中の流体の流動を直接制御する、請求項１〜１１または２４〜２７のうちのいずれか１項に記載の装置。
【請求項２９】
前記検出器は、出力チャネルではない少なくとも１つのチャネルの上に位置している、請求項１〜１１または２４〜２８のうちのいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（相互参照）
本願は、２０１３年７月５日に出願された米国仮出願番号第６１／８４３，２５２号および２０１３年１０月２３日に出願された米国仮出願番号第６１／８９４，７８８号の利益を主張しており、これら出願は、すべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（連邦政府によって後援された研究に関する陳述）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＣＡ１４７８３１の下で政府支援とともになされた。政府は本発明において特定の権利を有している。
【０００３】
（背景）
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、原発腫瘍から血流に流され、癌転移の重要な側面である。ＣＴＣは、乳、肺、前立腺、および膵臓癌等の多くの異なる種類の癌で検出されてきた。ＣＴＣの数は、転移患者における臨床転機と直接相関し、臨床診療を管理するために役立ち得る、貴重な予後情報を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
本明細書では、粒子を単離して分析し、検定（アッセイ）を行うための方法、装置、システム、およびデバイスが説明される。
【０００５】
種々の側面では、流体内の被分析物上に存在する複数のマーカーを識別するために方法が提供され、本方法は、（ａ）放射線源を使用して、第１のタグから信号を検出するステップであって、第１のタグは、被分析物上の第１のマーカーに結合する第１の構造に取り付けられる、ステップと、（ｂ）第１のタグの存在に基づいて被分析物を分割するステップと、（ｃ）第１のタグの信号の強度を低減させるステップと、（ｄ）被分析物を、第２のマーカーに結合する第２の構造と接触させるステップであって、第２の構造は、第２のタグに取り付けられる、ステップと、（ｅ）第２のタグを検出するステップとを含む。
【０００６】
種々の側面では、被分析物上に存在する複数のマーカーを検出するために方法が提供され、本方法は、被分析物を第１のタグと接触させるステップであって、被分析物は、第１のマーカーを含み、第１のタグは、第１のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、第１のタグによって発せられる第１の信号を検出するステップであって、第１の信号の存在は、第１のマーカーの存在を示す、ステップと、第１の信号の存在に基づいて、被分析物を含む流体を分割するステップと、第１の信号の強度を低減させるステップと、被分析物を第２のタグと接触させるステップであって、被分析物は、第２のマーカーを備え、第２のタグは、第２のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、第２のタグによって発せられる第２の信号を検出するステップであって、第２の信号の存在は、第２のマーカーの存在を示す、ステップとを含む。
【０００７】
種々の側面では、第１の細胞型および第２の細胞型を含むサンプルから細胞を単離するために方法が提供され、本方法は、（ａ）一式の管類を介してサンプルをマイクロ流体チップに導入するステップであって、マイクロ流体チップは、（ｉ）一式の管類に流体的に接続される少なくとも１つのチャネルと、（ｉｉ）少なくとも１つのチャネル内の細胞の信号を検出するように構成される検出器と、（ｉｉｉ）少なくとも１つのチャネルに流体的に接続される少なくとも１つのチャンバとを備える、ステップと、（ｂ）検出器を通り過ぎてサンプルの一部分を流動させるステップと、（ｃ）サンプルの一部分内の第１の細胞型の存在または非存在を検出するために、検出器を使用するステップと、（ｄ）第１の細胞型がサンプルの一部分内で検出される場合、サンプルのアリコートをチャンバの中へ指向するステップであって、アリコートは、第１の細胞型を含む、ステップと、（ｅ）ステップ（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を繰り返し、それによって、チャンバが、サンプル内の第１の細胞型の総数の８０％超、およびサンプル内の第２の細胞型の総数の５％未満を含むように、チャンバ中の複数のアリコートを単離するステップとを含む。
【０００８】
種々の側面では、サンプルから細胞を単離するために方法が提供され、本方法は、（ａ）サンプルをマイクロ流体チップに導入するステップであって、サンプルは、第１の細胞型と、第２の細胞型とを含み、マイクロ流体チップは、チャネルと、チャネル内で発せられる信号を検出するように構成される検出器と、チャネルと流体連通しているチャンバとを備える、ステップと、（ｂ）チャネルを通してサンプルの一部分を流動させるステップであって、一部分は、複数の第１の細胞型、複数の第２の細胞型、またはそれらの組み合わせを含む、ステップと、（ｃ）検出器を使用して、一部分内の第１の細胞型の存在または非存在を検出するステップと、（ｄ）第１の細胞型が一部分内に存在する場合、一部分をチャンバの中へ指向するステップと、（ｅ）チャンバが、サンプル内に存在する第１の細胞型の総数の８０％超、およびサンプル内に存在する第２の細胞型の総数の５％未満を含むように、十分な回数で（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を繰り返すステップとを含む。
【０００９】
種々の側面では、流体に由来するサンプルから特定のバイオマーカープロファイルを発現する細胞を分割するために装置が提供され、本装置は、少なくとも１つのチャネル、およびチャンバを有する、マイクロ流体チップに接続される一式の管類を備え、本装置は、チャンバ中の細胞を単離することが可能であり、単離後、チャンバは、特定のバイオマーカープロファイルを発現するサンプル中の細胞の全集団の８０％超を含み、単離後、チャンバは、異なるバイオマーカープロファイルを発現するサンプル中の細胞の全集団の５％未満を含む。
【００１０】
種々の側面では、被分析物上に存在する複数のマーカーを識別するために方法が提供され、本方法は、（ａ）複数の微小空洞またはマイクロパッチを備える基板を経由して被分析物を流動させることによって、複数の被分析物を分割するステップであって、微小空洞またはマイクロパッチの大部分は、多くても１つの被分析物を含有することが可能であり、微小空洞またはマイクロパッチは、マイクロ流体デバイスの中に位置する、ステップと、（ｂ）微小空洞またはマイクロパッチの中で、各被分析物を、第１のマーカーに結合することが可能である第１の構造と接触させるステップであって、第１の構造は、第１のタグに接続される、ステップと、（ｃ）第１のタグから信号を検出するステップと、（ｄ）第１のタグの信号のレベルを低減させるステップと、（ｅ）被分析物を、第２のマーカーに結合する第２の構造と接触させるステップであって、第２の構造は、第２のタグに接続される、ステップと、（ｆ）第２のタグを検出するステップとを含む。
【００１１】
種々の側面では、被分析物上に存在する複数のマーカーを検出するために方法が提供され、本方法は、微小空洞またはマイクロパッチを備える基板を経由して流体を流動させることによって、微小空洞中またはマイクロパッチ中の被分析物を単離するステップであって、流体は、被分析物を含む、ステップと、被分析物を第１のタグと接触させるステップであって、被分析物は、第１のマーカーを含み、第１のタグは、第１のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、第１のタグによって発せられる第１の信号を検出するステップであって、第１の信号の存在は、第１のマーカーの存在を示す、ステップと、第１の信号の強度を低減させるステップと、被分析物を第２のタグと接触させるステップであって、被分析物は、第２のマーカーを含み、第２のタグは、第２のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、第２のタグによって発せられる第２の信号を検出するステップであって、第２の信号の存在は、第２のマーカーの存在を示す、ステップとを含む。
【００１２】
種々の側面では、流体サンプル中の粒子を検出するためにシステムが提供され、本システムは、入力チャネル、第１の出力チャネル、第２の出力チャネル、および指向性流チャネルを備える、マイクロ流体チップと、弁であって、弁は、マイクロ流体チップから分離可能であり、弁は、指向性流チャネル中の第１の流体の流動を調節し、指向性流チャネル中の第１の流体の流動は、入力チャネルから第１の出力チャネル、第２の出力チャネル、またはそれらの組み合わせへ第２の流体の流動を指向する、弁と、入力チャネル中の第２の流体の一部分から発せられる信号を検出するように構成される、検出器と、信号に基づいて値を一部分に割り当て、弁を操作するように構成される、プロセッサとを備える。いくつかの側面では、弁は、電子作動型弁である。
【００１３】
種々の側面では、流体サンプル中の粒子を検出するためにシステムが提供され、本システムは、（ａ）少なくとも１つのサンプル入力チャネル、少なくとも１つの指向性流チャネル、および少なくとも２つの出力チャネルを備える、マイクロ流体チップであって、少なくとも１つの指向性流チャネルは、サンプル入力チャネルに交差する、マイクロ流体チップと、（ｂ）マイクロ流体チップの一部ではないデバイス上に位置する、電子作動型弁であって、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネルまたは少なくとも２つの出力チャネルのうちの少なくとも１つに交差する入力チャネルを制御することによって、流体の流動を制御する、電子作動型弁と、（ｃ）流体サンプルのアリコート中の１つまたはそれを上回る被分析物を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と、（ｄ）アリコート中の被分析物の存在、非存在、識別、組成、または数量に基づいて、値をアリコートに割り当てることが可能なプロセッサであって、プロセッサは、検出器および電子作動型弁と通信している、プロセッサとを備える。
【００１４】
種々の側面では、マイクロ流体チップ内の流体サンプルのアリコートを単離するために方法が提供され、アリコートは、希少粒子を含み、本方法は、（ａ）アリコート中の希少粒子の存在または非存在を検出するステップと、（ｂ）希少粒子の存在または非存在に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、（ｃ）電子作動型弁を開放することによって、割り当てられた値に基づいてアリコートの流動を指向するステップであって、電子作動型弁は、マイクロ流体チップの外部にあるデバイス上に位置する、ステップとを含む。いくつかの側面では、マイクロ流体チップは、サンプル入力チャネルと、少なくとも２つの出力チャネルと、少なくとも１つの指向性流チャネルとを備え、電子作動型弁は、指向性流チャネル内の流体の流動を制御する。
【００１５】
種々の側面では、流体サンプル中の希少粒子を検出するためにデバイスが提供され、本デバイスは、入力チャネルと、第１の出力チャネルと、第２の出力チャネルと、流体サンプルの一部分中の粒子の存在または非存在を検出するように構成される、検出器と、粒子の存在または非存在に基づいて、入力チャネルから第１の出力チャネル、第２の出力チャネル、またはそれらの組み合わせへ一部分の流動を指向するための機構と、第１の出力チャネルと流体連通しているフィルタとを備える。
【００１６】
種々の側面では、流体サンプル中の希少粒子を検出するためにデバイスが提供され、本デバイスは、（ａ）少なくとも１つのサンプル入力チャネルと、（ｂ）少なくとも２つの出力チャネルであって、２つの出力チャネルのうちの少なくとも１つは、開口のアレイと流体連通している、出力チャネルと、（ｃ）流体サンプルのアリコート中の１つまたはそれを上回る希少粒子を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と、（ｄ）第１の出力チャネルを通して、１つまたはそれを上回る希少粒子を含有するアリコートの流動を指向することによって、１つまたはそれを上回る希少粒子を選別するための機構とを備える。
【００１７】
種々の側面では、検定を行うために統合システムが提供され、本システムは、粒子を含む流体サンプルであって、粒子は、マーカーを含む、流体サンプルと、入力チャネルと、第１の出力チャネルと、第２の出力チャネルと、流体サンプルの一部分中の粒子の存在または非存在を検出するように構成される、第１の検出器であって、一部分は、入力チャネル内に配置される、第１の検出器と、粒子の存在または非存在に基づいて、入力チャネルから第１の出力チャネルへ一部分の流動を指向するための機構と、第１の出力チャネルと流体連通し、粒子を捕捉するように構成される、微小空洞と、微小空洞中のマーカーの存在または非存在を検出するように構成される、第２の検出器とを備える。
本願明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
流体内の被分析物上に存在する複数のマーカーを識別するための方法であって、
ａ．放射線源を使用して、第１のタグから信号を検出するステップであって、前記第１のタグは、前記被分析物上の第１のマーカーに結合する第１の構造に取り付けられる、ステップと、
ｂ．前記第１のタグの存在に基づいて前記被分析物を分割するステップと、
ｃ．前記第１のタグの前記信号の強度を低減させるステップと、
ｄ．前記被分析物を、第２のマーカーに結合する第２の構造と接触させるステップであって、前記第２の構造は、第２のタグに取り付けられる、ステップと、
ｅ．前記第２のタグを検出するステップと、
を含む、方法。
（項目２）
ステップ（ｂ）の前記分割は、前記第１のタグおよび第３のタグの存在に基づく、項目１に記載の方法。
（項目３）
ステップ（ｂ）の前記分割は、マイクロ流体デバイスを用いて行われる、項目１〜２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４）
ステップ（ｂ）の前記分割およびステップ（ｂ）またはステップ（ｅ）のうちの少なくとも１つにおける前記検出は、同一のマイクロ流体デバイス内で起こる、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
被分析物上に存在する複数のマーカーを検出するための方法であって、
前記被分析物を第１のタグと接触させるステップであって、前記被分析物は、第１のマーカーを含み、前記第１のタグは、前記第１のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、
前記第１のタグによって発せられる第１の信号を検出するステップであって、前記第１の信号の存在は、前記第１のマーカーの存在を示す、ステップと、
前記第１の信号の存在に基づいて、前記被分析物を含む流体を分割するステップと、
前記第１の信号の強度を低減させるステップと、
前記被分析物を第２のタグと接触させるステップであって、前記被分析物は、第２のマーカーを含み、前記第２のタグは、前記第２のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、
前記第２のタグによって発せられる第２の信号を検出するステップであって、前記第２の信号の存在は、前記第２のマーカーの存在を示す、ステップと、
を含む、方法。
（項目６）
前記第１のタグの前記信号は、５０％超低減させられる、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記流体を分割するステップは、前記第１の信号および第３の信号の存在に基づく、項目５〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記第１の信号を検出するステップ、前記第２の信号を検出するステップ、前記流体を分割するステップ、またはそれらの組み合わせは、マイクロ流体デバイスを使用して行われる、項目５〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記被分析物は、細胞である、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞は、癌細胞である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記癌細胞は、希少細胞である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記被分析物は、循環腫瘍細胞である、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞は、細菌細胞、免疫細胞、胎児細胞、治療後に残留する疾患を示す細胞、または幹細胞である、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞は、前記流体中の全細胞集団の１％未満を占める、希少細胞である、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前記流体は、全血、分画血液、血清、血漿、汗、涙、耳内流動物、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣内流動物、糞便、経頸管洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心膜外液、ならびに呼吸器、腸管、および尿生殖路の分泌物から成る群から選択される、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記流体は、全血である、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記流体は、分画全血である、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記第１のタグは、フルオロフォアである、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記第１のタグは、抗体である、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記第１のタグは、核酸を含むプローブである、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記信号の前記強度を低減させるステップは、放射線を前記被分析物に印加することによって達成される、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
白色光が、前記信号の前記強度を低減させるために使用される、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
レーザが、前記信号の前記強度を低減させるために使用される、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
発光ダイオードが、前記信号の前記強度を低減させるために使用される、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記信号の前記強度を低減させるステップは、化学物質を前記第１のタグに適用することによって達成される、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記化学物質は、還元剤である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記還元剤は、ジチオスレイトールである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記第１のタグおよび前記第２のタグから前記信号を撮像するステップをさらに含む、項目１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記被分析物は、流体中に存在し、前記流体は、より大きい体積の流体のアリコートである、項目１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記分割は、半自動的または自動的に行われる、項目１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記分割は、アンサンブル決定アリコートランク付けによって行われる、項目１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記被分析物は、複数のマーカーを含む、項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記複数のマーカーのそれぞれは、バイオマーカーである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記被分析物は、発現プロファイルを含み、前記発現プロファイルは、前記複数のマーカーによって定義される、項目３２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記被分析物を緩衝剤と接触させるステップをさらに含む、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記緩衝剤は、固定剤を含有する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記緩衝剤は、透過化剤を含有する、項目３５〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記緩衝剤は、洗浄緩衝剤である、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
フローサイトメータが、前記被分析物を分割するために使用されない、項目１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記被分析物は、解離細胞である、項目１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記第１のタグによって発せられる前記第１の信号を検出するステップは、複数の被分析物上で同時に行われる、項目５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
第１の細胞型および第２の細胞型を含むサンプルから細胞を単離する方法であって、
ａ．一式の管類を介して前記サンプルをマイクロ流体チップに導入するステップであって、前記マイクロ流体チップは、（ｉ）前記一式の管類に流体によって接続される少なくとも１つのチャネルと、（ｉｉ）前記少なくとも１つのチャネル内の細胞の信号を検出するように構成される検出器と、（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのチャネルに流体によって接続される少なくとも１つのチャンバとを備える、ステップと、
ｂ．前記検出器を通り過ぎて前記サンプルの一部分を流動させるステップと、
ｃ．前記サンプルの前記一部分内の前記第１の細胞型の存在または非存在を検出するために、前記検出器を使用するステップと、
ｄ．前記第１の細胞型が前記サンプルの前記一部分内で検出される場合、前記サンプルのアリコートを前記チャンバの中へ指向するステップであって、前記アリコートは、前記第１の細胞型を含む、ステップと、
ｅ．ステップ（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を繰り返し、それによって、前記チャンバが、前記サンプル内の第１の細胞型の総数の８０％超、および前記サンプル内の第２の細胞型の総数の５％未満を含むように、前記チャンバ中の複数のアリコートを単離するステップと、
を含む、方法。
（項目４３）
サンプルから細胞を単離する方法であって、
ａ．前記サンプルをマイクロ流体チップに導入するステップであって、前記サンプルは、第１の細胞型と、第２の細胞型とを含み、前記マイクロ流体チップは、
チャネルと、
前記チャネル内で発せられる信号を検出するように構成される検出器と、
前記チャネルと流体連通しているチャンバと、
を備える、ステップと、
ｂ．前記チャネルを通して前記サンプルの一部分を流動させるステップであって、前記一部分は、複数の前記第１の細胞型、複数の前記第２の細胞型、またはそれらの組み合わせを含む、ステップと、
ｃ．前記検出器を使用して、前記一部分内の前記第１の細胞型の存在または非存在を検出するステップと、
ｄ．前記第１の細胞型が前記一部分内に存在する場合、前記一部分を前記チャンバの中へ指向するステップと、
ｅ．前記チャンバが、前記サンプル内に存在する前記第１の細胞型の総数の８０％超、および前記サンプル内に存在する前記第２の細胞型の総数の５％未満を含むように、十分な回数で（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を繰り返すステップと、
を含む、方法。
（項目４４）
前記第１の細胞型および前記第２の細胞型のうちの少なくとも１つは、癌細胞である、項目４２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記癌細胞は、希少細胞である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記第１の細胞型および前記第２の細胞型のうちの少なくとも１つは、循環腫瘍細胞である、項目４２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記第１の細胞型および前記第２の細胞型のうちの少なくとも１つは、細菌細胞、免疫細胞、胎児細胞、治療後に残留する疾患を示す細胞、または幹細胞である、項目４２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
前記第１の細胞型および前記第２の細胞型のうちの少なくとも１つは、前記サンプル中の全細胞集団の１％未満を占める、希少細胞である、項目４２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
前記サンプルは、全血、分画血液、血清、血漿、汗、涙、耳内流動物、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣内流動物、糞便、経頸管洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心膜外液、ならびに呼吸器、腸管、および尿生殖路の分泌物から成る群から選択される、項目４２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
前記サンプルは、全血である、項目４２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記サンプルは、分画全血である、項目４２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
前記チャンバは、前記マイクロ流体チップの外部にある、項目４２〜５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記チャンバは、バイアル、微小遠心管、またはウェルプレート内のウェルである、項目４２〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記チャンバは、管類を介して前記チャンバと流体連通している、項目４２〜５３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記チャンバは、毛細管を介して前記チャネルと流体連通している、項目４２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
流体に由来するサンプルから特定のバイオマーカープロファイルを発現する細胞を分割するための装置であって、
ａ．前記装置は、少なくとも１つのチャネル、およびチャンバを有する、マイクロ流体チップに接続される一式の管類を備え、
ｂ．前記装置は、前記チャンバ中の前記細胞を単離することが可能であり、単離後、前記チャンバは、前記特定のバイオマーカープロファイルを発現する前記サンプル中の細胞の全集団の８０％超を含み、単離後、前記チャンバは、異なるバイオマーカープロファイルを発現する前記サンプル中の細胞の全集団の５％未満を含む、装置。
（項目５７）
特定のバイオマーカープロファイルを発現する前記細胞の前記単離は、２０分未満で起こる、項目５６に記載の装置。
（項目５８）
前記特定のバイオマーカープロファイルは、前記流体のサンプル中の前記細胞の５％未満上に存在する、項目５６〜５７のいずれか１項に記載の装置。
（項目５９）
前記流体は、血液である、項目５６〜５８のいずれか１項に記載の装置。
（項目６０）
前記流体は、分画全血である、項目５６〜５８のいずれか１項に記載の装置。
（項目６１）
前記流体は、全血の有核細胞分画である、項目５６〜５８のいずれか１項に記載の装置。
（項目６２）
被分析物上に存在する複数のマーカーを識別するための方法であって、
ａ．複数の微小空洞またはマイクロパッチを備える基板上で複数の被分析物を流動させることによって、前記複数の被分析物を分割するステップであって、微小空洞またはマイクロパッチの大部分は、多くても１つの被分析物を含有することが可能であり、前記微小空洞またはマイクロパッチは、マイクロ流体デバイスの中に位置する、ステップと、
ｂ．前記微小空洞またはマイクロパッチの中で、各被分析物を、第１のマーカーに結合することが可能である第１の構造と接触させるステップであって、前記第１の構造は、第１のタグに接続される、ステップと、
ｃ．前記第１のタグから信号を検出するステップと、
ｄ．前記第１のタグの前記信号のレベルを低減させるステップと、
ｅ．前記被分析物を、第２のマーカーに結合する第２の構造と接触させるステップであって、前記第２の構造は、第２のタグに接続される、ステップと、
ｆ．前記第２のタグを検出するステップと、
を含む、方法。
（項目６３）
ステップｂの前記接触は、前記微小空洞またはマイクロパッチと流体連通しているチャネルを通して、前記第１の構造を備える流体を流動させることによって達成される、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
ステップｂの前記接触させるステップに続いて、前記方法はさらに、前記被分析物を洗浄緩衝剤と接触させるステップを含む、項目６２〜６３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６５）
被分析物上に存在する複数のマーカーを検出するための方法であって、
微小空洞またはマイクロパッチを備える基板上で流体を流動させることによって、前記微小空洞中または前記マイクロパッチ中の被分析物を単離するステップであって、前記流体は、前記被分析物を含む、ステップと、
前記被分析物を第１のタグと接触させるステップであって、前記被分析物は、第１のマーカーを含み、前記第１のタグは、前記第１のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、
前記第１のタグによって発せられる第１の信号を検出するステップであって、前記第１の信号の存在は、前記第１のマーカーの存在を示す、ステップと、
前記第１の信号の強度を低減させるステップと、
前記被分析物を第２のタグと接触させるステップであって、前記被分析物は、第２のマーカーを含み、前記第２のタグは、前記第２のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、
前記第２のタグによって発せられる第２の信号を検出するステップであって、前記第２の信号の存在は、前記第２のマーカーの存在を示す、ステップと、
を含む、方法。
（項目６６）
前記方法は、複数の微小空洞またはマイクロパッチ内で単離される複数の被分析物に対して行われる、項目６３に記載の方法。
（項目６７）
前記第１のタグの前記信号は、５０％超低減させられる、項目６２〜６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目６８）
少なくとも１つの被分析物は、細胞である、項目６２〜６７のいずれか１項に記載の方法。
（項目６９）
被分析物は、流体流動によって生成される力、重力、または接着力によって、前記微小空洞内の固定位置で保持される、項目６２〜６８のいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
被分析物は、分子相互作用を通して微小空洞またはマイクロパッチに接続される、項目６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
被分析物は、非共有結合によって微小空洞に接続される、項目６２〜７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
前記非共有結合は、ファン・デル・ワールス相互作用、静電結合、疎水結合、または非特異的吸着である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
流体サンプル中の粒子を検出するためのシステムであって、
入力チャネル、第１の出力チャネル、第２の出力チャネル、および指向性流チャネルを備える、マイクロ流体チップと、
弁であって、前記弁は、前記マイクロ流体チップから分離可能であり、
前記弁は、前記指向性流チャネル中の第１の流体の流動を調節し、
前記指向性流チャネル中の前記第１の流体の流動は、前記入力チャネルから前記第１の出力チャネル、前記第２の出力チャネル、またはそれらの組み合わせへ第２の流体の流動を指向する、弁と、
前記入力チャネル中の前記第２の流体の一部分から発せられる信号を検出するように構成される、検出器と、
前記信号に基づいて値を前記一部分に割り当て、前記弁を操作するように構成される、プロセッサと、
を備える、システム。
（項目７４）
前記弁は、電子作動型弁である、項目７３に記載のシステム。
（項目７５）
流体サンプル中の粒子を検出するためのシステムであって、
ａ．少なくとも１つのサンプル入力チャネル、少なくとも１つの指向性流チャネル、および少なくとも２つの出力チャネルを備える、マイクロ流体チップであって、前記少なくとも１つの指向性流チャネルは、前記サンプル入力チャネルに交差する、マイクロ流体チップと、
ｂ．前記マイクロ流体チップの一部ではないデバイス上に位置する、電子作動型弁であって、前記電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネルまたは前記少なくとも２つの出力チャネルのうちの少なくとも１つに交差する入力チャネルを制御することによって、流体の流動を制御する、電子作動型弁と、
ｃ．前記流体サンプルのアリコート中の１つまたはそれを上回る被分析物を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と、
ｄ．前記アリコート中の被分析物の存在、非存在、識別、組成、または量に基づいて、値を前記アリコートに割り当てることが可能なプロセッサであって、前記プロセッサは、前記検出器および前記電子作動型弁と通信している、プロセッサと、
を備える、システム。
（項目７６）
前記電子作動型弁は、ソレノイド弁である、項目７４〜７５のいずれか１項に記載のシステム。
（項目７７）
前記電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネル中の前記流体の前記流動を制御する、項目７５〜７６のいずれか１項に記載のシステム。
（項目７８）
前記電子作動型弁は、常時閉であり、前記電子作動型弁は、前記プロセッサから信号を受信した後に開放する、項目７４〜７７のいずれか１項に記載のシステム。
（項目７９）
前記電子作動型弁は、常時開であり、前記電子作動型弁は、前記プロセッサから信号を受信した後に閉鎖する、項目７４〜７７のいずれか１項に記載のシステム。
（項目８０）
少なくとも１つの指向性流チャネルは、少なくとも２つのポートを備え、前記電子作動型弁は、前記ポートのうちの１つを通る前記流体の流動を制御する、項目７４〜７９のいずれか１項に記載のシステム。
（項目８１）
前記電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネル中の流体の流動を直接制御する、項目７４〜８０のいずれか１項に記載のシステム。
（項目８２）
前記電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネルに流れ込むチャネル中の流体の流動を直接制御する、項目７４〜８１のいずれか１項に記載のシステム。
（項目８３）
前記電子作動型弁は、１つだけの指向性流チャネル中の流体の流動を直接制御する、項目７４〜８２のいずれか１項に記載のシステム。
（項目８４）
前記電子作動型弁は、出力チャネル中の流体の流動を直接制御する、項目７４〜８２のいずれか１項に記載のシステム。
（項目８５）
前記電子作動型弁は、出力チャネルに流れ込むチャネル中の流体の流動を直接制御する、項目７４〜８２のいずれか１項に記載のシステム。
（項目８６）
前記電子作動型弁は、圧電弁である、項目７４〜８５のいずれか１項に記載のシステム。
（項目８７）
指向性流チャネルは、合流点で出力チャネルに交差する、項目７３〜８６のいずれか１項に記載のシステム。
（項目８８）
前記検出器は、出力チャネルではない、少なくとも１つのチャネルの上に位置する、項目７３〜８７のいずれか１項に記載のシステム。
（項目８９）
前記デバイスは、確認レーザを備える、項目７３〜８８のいずれか１項に記載のシステム。
（項目９０）
前記確認レーザは、入力チャネルではない、少なくとも１つのチャネル上に位置する、項目８９に記載のシステム。
（項目９１）
前記システムは、第２の検出器を備える、項目７３〜８０のいずれか１項に記載のシステム。
（項目９２）
少なくとも１つのチャネルは、フィルタと流体連通している、項目７３〜８１のいずれか１項に記載のシステム。
（項目９３）
マイクロ流体チップ内の流体サンプルのアリコートを単離するための方法であって、前記アリコートは、希少粒子を含み、
ａ．前記アリコート中の前記希少粒子の存在または非存在を検出するステップと、
ｂ．前記希少粒子の存在または非存在に基づいて、値を前記アリコートに割り当てるステップと、
ｃ．電子作動型弁を開放することによって、前記割り当てられた値に基づいて前記アリコートの流動を指向するステップであって、前記電子作動型弁は、前記マイクロ流体チップの外部にあるデバイス上に位置する、ステップと、
を含む、方法。
（項目９４）
前記マイクロ流体チップは、サンプル入力チャネルと、少なくとも２つの出力チャネルと、少なくとも１つの指向性流チャネルとを備え、前記電子作動型弁は、前記指向性流チャネル内の流体の流動を制御する、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
流体サンプル中の希少粒子を検出するためのデバイスであって、
入力チャネルと、
第１の出力チャネルと、
第２の出力チャネルと、
前記流体サンプルの一部分中の粒子の存在または非存在を検出するように構成される、検出器と、
前記粒子の存在または非存在に基づいて、前記入力チャネルから前記第１の出力チャネル、前記第２の出力チャネル、またはそれらの組み合わせへ前記一部分の流動を指向するための機構と、
前記第１の出力チャネルと流体連通しているフィルタと、
を備える、デバイス。
（項目９６）
前記フィルタは、開口のアレイを備える、項目９５に記載のデバイス。
（項目９７）
前記アレイ内の各開口の最小寸法は、前記粒子の最小寸法より小さい、項目９６に記載のデバイス。
（項目９８）
流体サンプル中の希少粒子を検出するためのデバイスであって、
ａ．少なくとも１つのサンプル入力チャネルと、
ｂ．少なくとも２つの出力チャネルであって、前記２つの出力チャネルのうちの少なくとも１つは、開口のアレイと流体連通している、出力チャネルと、
ｃ．前記流体サンプルのアリコート中の１つまたはそれを上回る希少粒子を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と、
ｄ．第１の出力チャネルを通して、前記１つまたはそれを上回る希少粒子を含有するアリコートの流動を指向することによって、前記１つまたはそれを上回る希少粒子を選別するための機構と、
を備える、デバイス。
（項目９９）
第１の出力チャネルと、第２の出力チャネルとを備える、項目９８に記載のデバイス。
（項目１００）
前記機構は、前記アリコートが希少粒子を含有しない場合、前記アリコートの前記流動を前記第２の出力チャネルの中へ指向する、項目９９に記載のデバイス。
（項目１０１）
前記開口のアレイは、入力チャネルと出力チャネルとの間に配置される、項目９６〜１００のいずれか１項に記載のデバイス。
（項目１０２）
前記開口のアレイは、入力チャネルおよび出力チャネルと同一の平面内にある、項目９６〜１００のいずれか１項に記載のデバイス。
（項目１０３）
前記開口のアレイは、前記第１の出力チャネル内に配置される、項目９６〜１００のいずれか１項に記載のデバイス。
（項目１０４）
前記開口のアレイは、前記第１の出力チャネルと流体連通しているチャンバの中に配置される、項目９６〜１００のいずれか１項に記載のデバイス。
（項目１０５）
前記開口のアレイは、前記希少粒子が前記開口を通過することができないが、少なくとも１つの他の粒子が前記開口を通過することが可能であるように構成される、項目９８〜１０４のいずれか１項に記載のデバイス。
（項目１０６）
前記開口のアレイは、前記希少粒子が前記開口を通過することが可能であるが、少なくとも１つの他の粒子が前記開口を通過することができないように構成される、項目９８〜１０４のいずれか１項に記載のデバイス。
（項目１０７）
前記開口のアレイは、１０００個超の開口を備える、項目９６〜１０６いずれか１項に記載のデバイス。
（項目１０８）
前記選別のための機構は、電極、磁気要素、音響要素、または電子作動型要素を備える、項目９５〜１０７いずれか１項に記載のデバイス。
（項目１０９）
前記検出器は、カメラ、電子倍増管、電荷結合素子（ＣＣＤ）画像センサ、光電子倍増管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、単光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）、シリコン光電子倍増管（ＳｉＰＭ）、および相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）画像センサから成る群から選択される、項目９５〜１０８いずれか１項に記載のデバイス。
（項目１１０）
検定を行うための統合システムであって、
粒子を含む流体サンプルであって、前記粒子は、マーカーを含む、流体サンプルと、
入力チャネルと、
第１の出力チャネルと、
第２の出力チャネルと、
前記流体サンプルの一部分中の前記粒子の存在または非存在を検出するように構成される、第１の検出器であって、前記一部分は、前記入力チャネル内に配置される、第１の検出器と、
前記粒子の存在または非存在に基づいて、前記入力チャネルから前記第１の出力チャネルへ前記一部分の流動を指向するための機構と、
前記第１の出力チャネルと流体連通し、前記粒子を閉じ込めるように構成される、微小空洞と、
前記微小空洞中の前記マーカーの存在または非存在を検出するように構成される、第２の検出器と、
を備える、システム。
【００１８】
参照による組み込み
本明細書で記述される全ての出版物、特許、および特許出願は、各個別出版物、特許、または特許出願が、参照することにより組み込まれるように具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００１９】
本開示の新規の特徴は、添付の請求項で詳細に記載される。本開示の特徴および利点のより深い理解は、本開示の原理が利用される、例証的実施形態を記載する以下の発明を実施するための形態および添付図面を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本開示の側面による、流体マイクロ流体チップを使用した免疫染色および光退色の概観である。
【図２】図２は、本開示の側面による、ｅＤＡＲ装置を使用した免疫染色および光退色の概観である。
【図３】図３は、本開示の側面による、単一被分析物アレイを使用した免疫染色および光退色の概観である。
【図４】図４は、本開示の側面による、ｅＤＡＲの概観である。
【図５】図５は、本開示の側面による、ｅＤＡＲマイクロ流体チップの微細加工のためのプロセスフローの実施例を図示する。
【図６】図６は、８つの例示的な流体力学的選別方式を図示する。
【図７】図７は、本開示の側面による、アンサンブルｅＤＡＲのマイクロ流体チップおよび流体力学的切替方式を示す。
【図８】図８は、本開示の側面による、高速カメラによって記録された現在の流体方式の切替時間の実施例を描写する。
【図９】図９は、本開示の側面による、ｅＤＡＲの特性評価および分析性能を示す。
【図１０】図１０は、本開示の側面による、捕捉されたＣＴＣのマルチスリットおよびマルチカラー蛍光画像を示す。
【図１１】図１１は、本開示の側面による、「二重捕捉」ｅＤＡＲの一般構造を描写する。
【図１２】図１２は、血流の３つの状態の明視野像を示す。
【図１３】図１３は、本開示の側面による、逐次免疫染色および光退色試験の一般方式および手順を提供する。
【図１４】図１４は、本開示の側面による、ｅＤＡＲマイクロ流体チップ上に閉じ込められた６つの癌細胞の逐次免疫染色および光退色結果を示す。
【図１５】図１５は、本開示の側面による、光源の異なる出力に暴露される抗ＥｐＣＡＭ−ＰＥで標識されたＭＣＦ−７細胞の光退色曲線の実施例を描写する。
【図１６】図１６は、本開示の側面による、Ｈｅｒ２＋／ＭＵＣ１−特性を伴うｅＤＡＲで捕捉された４つの癌細胞の蛍光画像を示す。
【図１７】図１７は、本開示の側面による、単一被分析物アレイの略図である。
【図１８】図１８は、本開示の側面による、閉じ込め密度および寸法を伴うデバイスの概略図である。
【図１９】図１９は、本開示の側面による、並列流抵抗トラップを描写する。
【図２０】図２０は、本開示で説明されるデバイスのうちのいくつかを構築するために使用される手順の概略図である。
【図２１】図２１は、本開示の側面による、並列流抵抗トラップを生産するために使用することができる微細加工方法の実施例である。
【図２２】図２２は、本開示の側面による、直列流抵抗トラップおよび並列流抵抗トラップが生物学的由来サンプルを収集し、離散化し、読み出すことができる、ステップを描写する。
【図２３】図２３は、本開示の側面による、明視野および蛍光顕微鏡検査法に基づくマイクロウェルおよび側方チャンバのアレイの検出および読出方式を示す。
【図２４】図２４は、本開示の側面による、分析および放出のために生物学的粒子／細胞のアレイを閉じ込めるための順序を図示する。
【図２５】図２５は、本開示の側面による、本明細書で報告される方法によって分析することができる、１５個の対照サンプルおよび１０個の膵臓癌サンプルの分布を示す。
【図２６】図２６は、本開示の側面による、膵臓癌サンプルからの低い上皮細胞接着マーカー（ＥｐＣＡＭ）発現を伴うＣＴＣ集合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（開示の詳細な説明）
本開示は、多くの場合、マイクロ流体装置の使用とともに、流体サンプル（例えば、血液）中の粒子（例えば、細胞）を検出、分離、および分析するための方法、システム、およびデバイスを提供する。粒子は、希少粒子（例えば、希少細胞）であり得る。本明細書で提供されるマイクロ流体装置の多くは、アンサンブル決定アリコートランク付け（ｅＤＡＲ）を流体サンプルに行うために使用することができ、これは、流体サンプルがアリコートに分割された後に流体サンプルの分析を可能にする。
【００２２】
いくつかの側面では、（ｉ）流体サンプルのアリコート中の希少粒子（例えば、希少細胞）の存在または非存在を検出し、（ｉｉ）例えば、非ゼロまたはヌル等の項をアリコートに割り当てることによって、希少粒子の存在または非存在に従ってアリコートをランク付けし、（ｉｉｉ）流体力学的切替方式等の方式を使用して、割り当てられたランク付けに基づいてアリコートの流動または集合を指向するために、ｅＤＡＲ装置を使用することができる。アリコートは、分析される流体サンプルの全体積の一部分であり得る。いくつかの側面では、アリコートは、３次元空間を占有し、アリコート内の粒子は、無作為に分配することができる。
【００２３】
いくつかの側面では、本開示は、非常に高い効率、感度、および／または回収率でｅＤＡＲを流体サンプルに行うための装置および方法を提供する。例えば、本明細書で提供されるｅＤＡＲ装置は、流体サンプル（例えば、血液、全血、尿等）から特定の希少細胞型の９５％超を回収することができる。ｅＤＡＲ装置は、１０％未満、５％未満、またはさらに０％の偽陽性率で機能することができる。偽陽性率は、１０個超のサンプル、または１５個超のサンプル等のいくつかのサンプルを上回り得る。ｅＤＡＲ装置の速度はまた、非常に速くあり得る。例えば、サンプル全体を、２５分未満、２０分未満等で処理することができる。
【００２４】
多くの場合、本明細書で提供されるｅＤＡＲ装置は、（ａ）チャネル、（ｂ）チャンバ、（ｃ）フィルタ、（ｄ）検出器、および／または（ｅ）弁を含有する、マイクロ流体チップを備える。マイクロ流体チップは、（ａ）緩衝剤を保持するための容器、（ｂ）オフチップ弁（例えば、ソレノイド弁）、（ｃ）光源および検出器、（ｄ）管類、（ｅ）サンプルポート、（ｆ）デジタルプロセッサ、および／または他の特徴も含む、より大型のシステムの一部であり得る。フィルタおよびマイクロスリットまたは微小開口（例えば、マイクロスリットのアレイ）は、サンプルをさらに精製するために使用することができる。本明細書で、「マイクロスリット」および「微小開口」という用語は、同義的に使用され、マイクロスリットまたは微小開口はまた、支柱間間隔が濾過を実行するために使用される、支柱のアレイを含むこともできる。支柱間間隔は、一様または可変であり得る。いくつかの側面では、サンプルがｅＤＡＲ装置に導入され、これは、次いで、流体力学的切替方式によって細胞の能動的選別を行う。流体力学的切替方式は、本明細書でさらに説明されるような特定の幾何学形状を伴うチャネルを含むことができる。
【００２５】
いくつかの側面では、本開示は、１つより多くの種類の被分析物（例えば、希少細胞）またはサンプル内の被分析物（例えば、希少細胞）の集団中の被分析物（例えば、希少細胞）の１つより多くの亜集団を捕捉するための方法および装置を提供する。サンプルは、複数の被分析物（例えば、希少細胞）が検出されるように、複数の検出試薬で標識することができる。例えば、サンプルは、混合サンプルであり得、希少細胞の混合集団を含有することができる。希少細胞の混合集団は、いくつかある細胞型の中でも、上皮細胞および間葉細胞を含むことができる。複数の検出試薬内で、１つの検出試薬が、上皮細胞上の上皮マーカーに結合することができる一方で、異なる試薬は、間葉細胞上の間葉マーカーに結合することができる。
【００２６】
混合サンプルは、入力チャネルにおいてマイクロ流体チップ装置に導入することができる。混合サンプルの流動の流体力学的切替を制御するために、本装置上の側方チャネルを使用することができる。流体の流動は、複数の被分析物がマイクロ流体チップの２つの異なる領域に分離されるように、２つのソレノイドによって制御することができる。いくつかの側面では、被分析物はさらに、フィルタまたはマイクロスリットのアレイに流体を通過させることによって等、マイクロ流体チップ上で精製される。被分析物は、フィルタにおいて、またはマイクロスリットのアレイ上で収集することができる。
【００２７】
本開示はさらに、ｅＤＡＲと併用することができる、または他のマイクロ流体デバイスとともに使用することができる、染色および洗浄システムのための方法を提供する。染色および洗浄システムの方法は、インラインであり得る。インライン染色および洗浄方法は、個々の被分析物（例えば、細胞）を単離してバイオマーカーを検出する自動プロセスを提供する。本方法は、被分析物上の異なるマーカーを検出するために必要とされる、検出試薬（例えば、抗体）の量を低減させることもできる。本方法はさらに、本システムの死容積を最小限化することができる。加えて、本装置は、本装置への気泡の導入を回避する機構を含むことができる。
【００２８】
ｅＤＡＲは、特性評価および分析の下流方法と併用することができる。本方法は、希少細胞の細胞および分子分析を含むことができる。いくつかの側面では、希少細胞上のあるバイオマーカーの発現を判定するために、免疫染色を使用することができる。免疫染色のための半自動方法およびシステムが本明細書で説明される。
【００２９】
本開示はさらに、流体サンプルとともに単一被分析物アレイを使用するためのシステム、方法、および装置を提供する。単一被分析物アレイは、流体サンプル中の多くても１つの被分析物が特定のウェルを占有するように構成される、複数のウェルまたはマイクロウェルを備えることができる。いくつかの側面では、マイクロウェルは、微小空洞であり得る。単一被分析物アレイはまた、流体サンプル中の多くても１つの被分析物が特定のパッチを占有するように構成される、複数のパッチまたはマイクロパッチを備えることもできる。被分析物を含む流体サンプルをアレイに導入することができ、被分析物（例えば、細胞）は、デバイスのマイクロウェルまたはマイクロパッチの少なくとも８０％がわずか１つの被分析物を含有するように分割することができる。いくつかの側面では、単一被分析物アレイは、マイクロ流体システムとともに使用することができる。いくつかの側面では、マイクロ流体システムは、ｅＤＡＲデバイスであり得る。
【００３０】
単一被分析物アレイは、いくつかの側面では、細胞が液相で輸送される際の単一細胞の格納または物理的閉じ込めのステップと、この相の流路を辿って、物理的に画定された位置まで通過するステップと、次の流動ベースの力または表面接着力により、画定された位置に存在するステップとを含む、方法を伴う。別の場合において、細胞は、流体流路が入口から出口に対して直列であるため連続的に閉じ込められる。別の場合において、複数の流体流路および同等の複数の単一細胞が、入口と出口との間で細胞によって同時に体験することができる多数の流路により、並行して閉じ込められ／隔離される。
【００３１】
本開示で説明される方法、システム、装置、およびデバイスは、被分析物（例えば、希少細胞）の分離、濃縮、および／または単離のために、生物学および病理学における多種多様の用途で使用することができる。例えば、いくつかの用途は、疾患の診断および予後のための流体（例えば、体液）からの希少細胞（例えば、癌細胞、癌幹細胞、マラリアに感染した赤血球、幹細胞、胎児細胞、免疫細胞、感染細胞）の捕捉、水質管理のための単細胞寄生生物（例えば、ジアルジア、クリプトスポリジウム）の単離、疾患予後（例えば、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、癌）を監視するための感染細胞（例えば、リンパ球、白血球）の単離、（例えば、疾患、遺伝学的異常の）スクリーニグのための母体血中の胎児細胞、治療用途で使用するための幹細胞、プリオン関連（例えば、狂牛病）疾患スクリーニングのためのプリオンに感染した細胞、およびその他を含むことができるが、それらに限定されない。
【００３２】
特定の側面では、希少粒子は、希少細胞である。希少細胞は、有核または非有核であり得る。希少細胞は、悪性表現型を発現する細胞、母体末梢血中の胎児細胞等の胎児細胞、腫瘍から血液または他の体液に流された腫瘍細胞等の腫瘍細胞、ＨＩＶに感染した細胞等のウイルスに感染した細胞、着目遺伝子が移入された細胞、および自己反応障害に罹患した対象の末梢血中に存在するＴ細胞またはＢ細胞の異常サブタイプを含むが、それらに限定されない。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「アンサンブル決定」とは、粒子の集合または群内の特性の存在または非存在の検出に基づいて行われる決定を指す。群は、少なくとも３つの粒子、被分析物、および／または細胞を含むことができる。いくつかの側面では、アンサンブル決定は、複数の粒子を含有する流体サンプルのアリコート中の単一の特異的な粒子の存在または非存在に基づいて行われるであろう。重要なことには、単一の粒子の存在または非存在に基づいて行われるアンサンブル決定は、アリコート全体に（すなわち、アリコート中に存在する粒子の全てに）適用されるであろう。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「アリコート」とは、分析される流体サンプルの全体積の一部分を指す。アリコートは、少なくとも１つの粒子、被分析物、または細胞を含有することができる。アリコートは、粒子、被分析物、または細胞の群を含有することができる。アリコートは、３次元空間を占有し、粒子は、その内側で組織化を伴わずに無作為に分布する。アリコートは、有限深度を有し、粒子は、識別できる層を伴わずに深度に沿って分布することができる。本願の文脈で、アリコートは、細分化を伴わずに、その全体で分析される。
【００３５】
本明細書で使用されるように、「流体を分割すること」という語句は、流体サンプルの全体積から流体の一部分またはアリコートを分離すること、または別様に再指向することを指す。
【００３６】
ある側面では、アリコートは、より大きい流体サンプルの分数、例えば、流体サンプルの約１／２、または流体サンプルの約１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、あるいはそれ未満から成ることができる。ある側面では、アリコートは、例えば、流体サンプルの約１０％、または流体サンプルの約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％、あるいはそれ未満から成ることができる。したがって、本明細書で提供されるｅＤＡＲ方法によって検査または処理される流体は、例えば、少なくとも約２つのアリコート、または少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１００万、２００万、３００万、４００万、５００万、６００万、７００万、８００万、９００万、１０００万、あるいはそれより多くのアリコートに分割することができる。当業者であれば、流体サンプルが分割されるであろうアリコートの数が、流体中で期待される希少粒子の数および流体サンプルの全体積に依存するであろうと理解するであろう。
【００３７】
ある側面では、アリコートは、より大きい流体サンプルの分数、例えば、流体サンプルの１／２、または流体サンプルの１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、あるいはそれ未満を含むことができる。ある側面では、アリコートは、例えば、流体サンプルの１０％、または流体サンプルの９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％、あるいはそれ未満を含むことができる。したがって、本明細書で提供されるｅＤＡＲ方法によって検査または処理される流体は、例えば、少なくとも約２つのアリコート、または少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１００万、２００万、３００万、４００万、５００万、６００万、７００万、８００万、９００万、１０００万、あるいはそれより多くのアリコートに分割することができる。当業者であれば、流体サンプルが分割されるであろうアリコートの数が、流体中で期待される希少粒子の数および流体サンプルの全体積に依存するであろうと理解するであろう。
【００３８】
ある側面では、アリコートは、例えば、約０．１ｎＬ〜約１０ｍＬ、または約１ｎＬ〜約１ｍＬ、または約１ｎＬ〜約１００μＬ、または約１ｎＬ〜約１０μＬ、または約１ｎＬ〜約１μＬ、または約１ｎＬ〜約１００ｎＬ、または約０．１ｎＬ〜約１０ｎＬの体積を有することができる。
【００３９】
ある側面では、アリコートは、例えば、０．１ｎＬ〜１０ｍＬ、または１ｎＬ〜１ｍＬ、または１ｎＬ〜１００μＬ、または１ｎＬ〜１０μＬ、または１ｎＬ〜１μＬ、または１ｎＬ〜１００ｎＬ、または０．１ｎＬ〜１０ｎＬの体積を有することができる。
【００４０】
本明細書で使用されるように、「ランク付け」という用語は、カテゴリ化によってアリコートの定量的性質、定性的性質、または重要性を査定することを指す。一側面では、アリコートをヌル（例えば、希少粒子がアリコート中で検出されない）または非ゼロ（例えば、少なくとも１つの希少粒子がアリコート中で検出される）のいずれかとしてランク付けすることができる。一側面では、ランク付けは、二元であり得る。他の側面では、例えば、アリコート中の希少粒子の濃度、アリコート中の希少粒子の識別、アリコート中の複数の異なる希少粒子の識別、および同等物と相関する、付加的なカテゴリに従って、アリコートをランク付けすることができる。このようにして、濃度の範囲、例えば、約１〜１０、約１１〜２０、約１〜５０、約５１〜１００、約１〜１００、約１０１〜２０１等に基づいて、任意の数のカテゴリを割り当てることができる。いくつかの側面では、カテゴリの数は、濃度の範囲、例えば、１〜１０、１１〜２０、１〜５０、５１〜１００、１〜１００、１０１〜２０１等に基づいて割り当てることができる。これらのランク付けには、いくつかの所定の定量的または定性的カテゴリのうちの１つに対応する恣意的な数（例えば、０、１、２、３、４、５等）、またはアリコート中の希少粒子の数または概数の実際の値に対応する数を割り当てることができる。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「マイクロ流体チップ」という用語は、チップ、流体チップ、マイクロチップ、または流体マイクロチップという用語と同義的に使用される。
【００４２】
本明細書で使用されるように、「コンピュータ」とは、少なくともデジタルプロセッサを指す。デジタルプロセッサは、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＧＰＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、またはリアルタイム（ＲＴ）プロセッサであり得るが、それらに限定されない。
【００４３】
検定を行うためのデバイス、装置、および方法
本開示で説明される方法は、流体サンプルからの被分析物の単離および検出に使用することができる。いくつかの側面では、本方法は、第１のタグまたはタグの第１のセットを使用した被分析物上の分子の検出、タグによって発せられる信号の低減、および第２のタグまたはタグの第２のセットを使用した被分析物上の別の分子のセットの検出を含むことができる。いくつかの側面では、本方法は、サンプルから分離される被分析物を使用して行うことができる。いくつかの側面では、本方法は、マイクロ流体デバイスと組み合わせることができる。マイクロ流体デバイスは、サンプルから被分析物を単離するために使用することができる。いくつかの側面では、免疫染色および退色と称される本方法は、サンプルから被分析物を単離するために使用されるマイクロ流体デバイスに行うことができる。
【００４４】
免疫染色および光退色方法の例示的な場合を図示する概念図が、図１に示されている。免疫染色および光退色の方法は、検出方式１５５とともにマイクロ流体デバイス１００に行うことができる。マイクロ流体デバイス１００は、光源１８０および放射線源１７５の上方または下の顕微鏡のステージ１６０上に配置することができる。被分析物をマイクロ流体デバイス１００に導入することができ、流体サンプルから被分析物を単離するようにｅＤＡＲを行うことができる１１０。単離された被分析物は、被分析物が免疫染色および光退色方法の持続時間にわたってとどまることができる、ステージングチャンバ１１５に指向することができる。被分析物は、１つまたはそれを上回るタグ１２０と接触させることができる。放射線源１７５は、被分析物１２５上の１つまたはそれを上回るタグを照射することができ、１つまたはそれを上回るタグによって発せられる信号を検出することができる１３０。放射線源１７５は、レーザ、または発光ダイオード（ＬＥＤ）、あるいはランプ１９０から生じることができる。タグによって発せられる信号は、光源１８０を使用して低減させることができる１３５。信号の低減１３５中に、タグによって発せられる信号の持続時間を検出する１３０ために、デジタルプロセッサ（例えば、コンピュータ）およびソフトウェア１６５ならびに電荷結合素子（ＣＣＤ）１７０を使用することができる。いくつかの側面では、照明源へのタグ付けされた被分析物の暴露時間は、タグによって発せられる信号が排除されるまで持続することができる。ステップ１２０、１２５、１３０、および１３５は、免疫染色および光退色の１つのサイクルを含む。免疫染色および光退色のサイクル１４０は、複数のサイクルが完了するまで繰り返すことができる。最終回の光退色１３５は、最終サイクル中に行われる場合もあり、行われない場合もある。被分析物の検出１３０後、最終サイクルは、続けてタグによって発せられる信号を分析することができる１５０。
【００４５】
免疫染色および光退色方法２９０と組み合わせて使用することができる、ｅＤＡＲ装置２００の例示的な場合を図示する概念図が、図２に示されている。流体サンプルリザーバ２２５およびチャネル２３０は、流体サンプル入口２４５に接続することができる。緩衝剤リザーバ２１５は、ライン２３５を通して加圧ガス源２０５に接続することができる。緩衝剤入口２５０は、流体サンプル入口２４５に接続することができる。濾過領域２７０は、緩衝剤入口２５０、流体サンプル入口２４５、出口２７５、および廃棄物チャンバ２８０に接続することができる。流体サンプルがｅＤＡＲ装置２００に進入することができ、被分析物または複数の被分析物を濾過ステージ２７０上に閉じ込めることができる。濾過ステージは、各チャンバが単一の被分析物を含有することができる、複数のチャンバを含有することができる。免疫染色および光退色方法２９０は、濾過ステージ２７０を含有することができる、マイクロ流体チップ２６０の一区分で行うことができる。
【００４６】
本開示は、単一被分析物アレイを使用して行うことができる、逐次免疫染色および光退色のための方法を提供する。単一被分析物アレイは、単一被分析物（例えば、細胞）の隔離、閉じ込め、操作、および検出を可能にする。多くの場合、細胞は、流体流動から生成される力、重力、表面接着力、化学力、または光学力によって閉じ込められる。いくつかの側面では、単一被分析物アレイウェルは、閉じ込められた細胞に（例えば、共有、イオン等）結合することができる要素を伴って機能化される。閉じ込められた細胞は、化学剤と接触させることができる。化学剤は、外部分子を検出するか、または細胞膜を透過して細胞内分子を標識するために使用される、標識であり得る。標識細胞を撮像し、さらに分析することができる。
【００４７】
免疫染色方法と組み合わせた単一被分析物アレイの例示的な場合を図示する概念図が、図３に示されている。流体単一被分析物アレイ３１５は、マイクロ流体チップまたは構造の一部であり得、マイクロ流体ステージ３１０上に配置することができる。免疫染色の方法は、検出方式３５０とともに流体単一被分析物アレイ３１５で行うことができる。マイクロ流体チップステージ３１０は、光源３７０および放射線源３７５の上方または下方の顕微鏡のステージ３５５上に配置することができる。流体サンプル中の被分析物は、流体単一被分析物アレイ３００に導入することができる。単離された被分析物は、閉じ込められた単一被分析物が免疫染色方法の持続時間にわたってとどまることができる、流体単一被分析物アレイ３２０の領域に指向することができる。被分析物は、透過化および／または固定を含むことができるが、それに限定されない、種々の方法を使用して調製することができる３２５。被分析物は、１つまたはそれを上回るタグ３３０と接触させることができる。放射線源３７５は、被分析物上の１つまたはそれを上回るタグを照射することができ３３５、１つまたはそれを上回るタグによって発せられる信号を検出することができる３４０。放射線源３７５は、レーザ３８０から生じることができる。被分析物は、さらなる処理および分析３４５を受けることができる。タグによって発せられる信号を検出するために、デジタルプロセッサ（例えば、コンピュータ）およびソフトウェア３６０、ならびに電荷結合素子（ＣＣＤ）３６５を使用することができる。
【００４８】
逐次免疫染色および光退色について、光源３７０を使用して、タグによって発せられる信号を低減させることができる。信号の低減中に、タグによって発せられる信号の強度を検出するために、コンピュータおよびソフトウェア３６０、ならびに電荷結合素子（ＣＣＤ）３６５を使用することができる。照明源へのタグ付けされた被分析物の暴露時間は、タグによって発せられる信号が排除されるまで持続することができる。ステップ３３０、３３５、３４０、および３４５は、免疫染色および光退色の１つのサイクルを含む。サイクルは、複数のサイクルが完了するまで繰り返すことができる。
【００４９】
ｅＤＡＲ装置は、被分析物（例えば、希少細胞）の識別および単離に使用することができる。ｅＤＡＲは、アリコート中のサンプルを処理することができ、かつ流体力学的切替方式によって制御される能動的選別ステップによって、チャネルまたはチャンバ中で希少細胞を収集することができる。チャネルおよびチャンバを伴う、本明細書ではマイクロ流体チップと称される「一体型マイクロ流体チップ」は、希少細胞を選別するために使用することができる。マイクロ流体チップは、部分的に、機能的領域、すなわち、微細加工フィルタから成ることができる。高い回収率（例えば、９０％超またはそれに等しい）および低い偽陽性率（例えば、ゼロに近い）で被分析物（例えば、１ミリメートル超またはそれに等しい全血）の混合集団を含有する流体を急速に（例えば、１ｍＬにつき１２．５分未満またはそれに等しい）分析するために、ｅＤＡＲを使用することができる。
【００５０】
マイクロ流体チップの一般構造およびｅＤＡＲの例示的構成が、図８で描写されている。左下のチャネルは、選別されたアリコートを収集するために使用することができ、かつそれらを後続の精製（例えば、精製チャンバ）領域（例えば、２０，０００個のマイクロスリット）に移送するために使用することができる。鎖線付きのボックスで印付けられた領域が、図８Ｂ−Ｄでさらに描写されている。陽性アリコートがランク付けられなかったときの例示的流動条件が、図８Ｂに示されている。血流は、収集チャネルに切り替えることができ、選別されたアリコートは、図８Ｃの第２のウィンドウによって確認することができる。図８Ｄは、アリコートを選別した後に血流を切り替えて戻すことができることを示す。
【００５１】
本装置は、いくつかの流速を有することができる。流速とは、流体がｅＤＡＲ装置および本装置に取り付けられた任意の構成要素を通って流動する、流速を指すことができる。いくつかの側面では、例示的な流速は、約５μＬ／分、１０μＬ／分、２０μＬ／分、２５μＬ／分、３０μＬ／分、３５μＬ／分、４０μＬ／分、４１μＬ／分、４２μＬ／分、４３μＬ／分、４４μＬ／分、４５μＬ／分、４６μＬ／分、４７μＬ／分、４８μＬ／分、４９μＬ／分、５０μＬ／分、５１μＬ／分、５２μＬ／分、５３μＬ／分、５４μＬ／分、５５μＬ／分、５６μＬ／分、５７μＬ／分、５８μＬ／分、５９μＬ／分、６０μＬ／分、６１μＬ／分、６２μＬ／分、６３μＬ／分、６４μＬ／分、６５μＬ／分、６６μＬ／分、６７μＬ／分、６８μＬ／分、６９μＬ／分、７０μＬ／分、７１μＬ／分、７２μＬ／分、７３μＬ／分、７４μＬ／分、７５μＬ／分、７６μＬ／分、７７μＬ／分、７８μＬ／分、７９μＬ／分、８０μＬ／分、８１μＬ／分、８２μＬ／分、８３μＬ／分、８４μＬ／分、８５μＬ／分、８６μＬ／分、８７μＬ／分、８８μＬ／分、８９μＬ／分、９０μＬ／分、９１μＬ／分、９２μＬ／分、９３μＬ／分、９４μＬ／分、９５μＬ／分、９６μＬ／分、９７μＬ／分、９８μＬ／分、９９μＬ／分、１００μＬ／分、１０５μＬ／分、１１０μＬ／分、１１５μＬ／分、１２０μＬ／分、１２５μＬ／分、１３０μＬ／分、１４０μＬ／分、１５０μＬ／分、１６０μＬ／分、１７０μＬ／分、１８０μＬ／分、１９０μＬ／分、２００μＬ／分、２２５μＬ／分、２５０μＬ／分、２７５μＬ／分、３００μＬ／分、３５０μＬ／分、４００μＬ／分、４５０μＬ／分、５００μＬ／分、６００μＬ／分、７００μＬ／分、８００μＬ／分、９００μＬ／分、または１０００μＬ／分未満であり得る。
【００５２】
いくつかの側面では、流速は、約５μＬ／分〜３０μＬ／分、１５μＬ／分〜５０μＬ／分、２５μＬ／分〜７５μＬ／分、４０μＬ／分〜８０μＬ／分、５０μＬ／分〜９０μＬ／分、６０μＬ／分〜１００μＬ／分、８０μＬ／分〜１６０μＬ／分、９０μＬ／分〜１８０μＬ／分、１００μＬ／分〜２００μＬ／分、１５０μＬ／分〜３００μＬ／分、２００μＬ／分〜４００μＬ／分、３００μＬ／分〜５００μＬ／分、４００μＬ／分〜６００μＬ／分、５００μＬ／分〜７００μＬ／分、６００μＬ／分〜８００μＬ／分、７００μＬ／分〜９００μＬ／分、または８００μＬ／分〜１０００μＬ／分の範囲内であり得る。
【００５３】
いくつかの側面では、例示的な流速は、５μＬ／分、１０μＬ／分、２０μＬ／分、２５μＬ／分、３０μＬ／分、３５μＬ／分、４０μＬ／分、４１μＬ／分、４２μＬ／分、４３μＬ／分、４４μＬ／分、４５μＬ／分、４６μＬ／分、４７μＬ／分、４８μＬ／分、４９μＬ／分、５０μＬ／分、５１μＬ／分、５２μＬ／分、５３μＬ／分、５４μＬ／分、５５μＬ／分、５６μＬ／分、５７μＬ／分、５８μＬ／分、５９μＬ／分、６０μＬ／分、６１μＬ／分、６２μＬ／分、６３μＬ／分、６４μＬ／分、６５μＬ／分、６６μＬ／分、６７μＬ／分、６８μＬ／分、６９μＬ／分、７０μＬ／分、７１μＬ／分、７２μＬ／分、７３μＬ／分、７４μＬ／分、７５μＬ／分、７６μＬ／分、７７μＬ／分、７８μＬ／分、７９μＬ／分、８０μＬ／分、８１μＬ／分、８２μＬ／分、８３μＬ／分、８４μＬ／分、８５μＬ／分、８６μＬ／分、８７μＬ／分、８８μＬ／分、８９μＬ／分、９０μＬ／分、９１μＬ／分、９２μＬ／分、９３μＬ／分、９４μＬ／分、９５μＬ／分、９６μＬ／分、９７μＬ／分、９８μＬ／分、９９μＬ／分、１００μＬ／分、１０５μＬ／分、１１０μＬ／分、１１５μＬ／分、１２０μＬ／分、１２５μＬ／分、１３０μＬ／分、１４０μＬ／分、１５０μＬ／分、１６０μＬ／分、１７０μＬ／分、１８０μＬ／分、１９０μＬ／分、２００μＬ／分、２２５μＬ／分、２５０μＬ／分、２７５μＬ／分、３００μＬ／分、３５０μＬ／分、４００μＬ／分、４５０μＬ／分、５００μＬ／分、６００μＬ／分、７００μＬ／分、８００μＬ／分、９００μＬ／分、または１０００μＬ／分未満であり得る。
【００５４】
いくつかの側面では、流速は、５μＬ／分〜３０μＬ／分、１５μＬ／分〜５０μＬ／分、２５μＬ／分〜７５μＬ／分、４０μＬ／分〜８０μＬ／分、５０μＬ／分〜９０μＬ／分、６０μＬ／分〜１００μＬ／分、８００μＬ／分〜１６０μＬ／分、９０μＬ／分〜１８０μＬ／分、１００μＬ／分〜２００μＬ／分、１５０μＬ／分〜３００μＬ／分、２００μＬ／分〜４００μＬ／分、３００μＬ／分〜５００μＬ／分、４００μＬ／分〜６００μＬ／分、５００μＬ／分〜７００μＬ／分、６００μＬ／分〜８００μＬ／分、７００μＬ／分〜９００μＬ／分、または８００μＬ／分〜１０００μＬ／分の範囲内であり得る。
【００５５】
本装置は、いくつかの選別効率を有することができる。選別効率は、着目被分析物の回収を指すことができる。いくつかの側面では、例示的な選別効率は、約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％超であり得る。いくつかの側面では、選別効率は、約５％〜３０％、１５％〜５０％、２５％〜７５％、４０％〜８０％、５０％〜９０％、または６０％〜１００％の範囲内であり得る。
【００５６】
いくつかの側面では、例示的な選別効率は、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％超であり得る。いくつかの側面では、選別効率は、５％〜３０％、１５％〜５０％、２５％〜７５％、４０％〜８０％、５０％〜９０％、または６０％〜１００％の範囲内であり得る。
【００５７】
ｅＤＡＲ装置は、いくつかの回収率を有することができる。回収率は、着目被分析物の回収を指すことができる。いくつかの側面では、回収率は、約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％超であり得る。いくつかの側面では、回収率は、約５％〜３０％、１５％〜５０％、２５％〜７５％、４０％〜８０％、５０％〜９０％、または６０％〜１００％の範囲内であり得る。
【００５８】
いくつかの側面では、回収率は、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％超であり得る。
【００５９】
いくつかの側面では、回収率は、５％〜３０％、１５％〜５０％、２５％〜７５％、４０％〜８０％、５０％〜９０％、または６０％〜１００％の範囲内であり得る。
【００６０】
いくつかの側面では、ｅＤＡＲ装置または方法が、第２の細胞型から第１の細胞型を分離するために使用される。いくつかの側面では、単離されたサンプルは、第１の細胞型の総数の５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％超を含む。いくつかの側面では、単離されたサンプルは、第２の細胞型の総数の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満を含む。
【００６１】
ｅＤＡＲ装置は、励起および検出モードのための放射線源（例えば、レーザ）を装備した顕微鏡と、光源（例えば、光退色）と、タイマと、管類と、廃棄物収集デバイスと、タグ付けされた被分析物（例えば、細胞）を撮像するためのカメラと、マイクロ流体チップの中および外への流体の流動を制御するポンプと、能動的選別ステップを制御するデジタルプロセッサと、画像を処理するためのデジタルプロセッサ（例えば、コンピュータシステム）とを含むことができる。デジタルプロセッサは、コンピュータであり得る。
【００６２】
いくつかの側面では、ｅＤＡＲプラットフォームは、１つより多くの被分析物（例えば、希少細胞）の捕捉のための装置を含むことができる。「二重捕捉」ｅＤＡＲは、混合サンプルから複数の希少細胞を分離することができる。混合サンプル（例えば、流体サンプル）は、検出試薬で標識し、主要チャネルにおいて「二重捕捉」装置の最上部に進入させることができる。混合サンプルの流動の流体力学的切替を制御するために、２つの側方チャネルを使用することができる。いくつかの側面では、２つのマイクロ流体チップソレノイドを使用して、流動を制御することができる。希少細胞の２つの亜集団を分離し、同一マイクロ流体チップの上の２つの異なる濾過領域上に閉じ込めることができる。
【００６３】
種々の側面では、流体に由来するサンプルから特定のバイオマーカープロファイルを発現する細胞を分割するために装置が提供され、本装置は、少なくとも１つのチャネル、およびチャンバを有する、マイクロ流体チップに接続される一式の管類を備え、本装置は、チャンバ中の細胞を単離することが可能であり、単離後、チャンバは、特定のバイオマーカープロファイルを発現するサンプル中の細胞の全集団の８０％超を含み、単離後、チャンバは、異なるバイオマーカープロファイルを発現するサンプル中の細胞の全集団の５％未満を含む。
【００６４】
いくつかの側面では、特定のバイオマーカープロファイルを発現する細胞の単離は、２０分未満で起こる。いくつかの側面では、特定のバイオマーカープロファイルは、流体のサンプル中の細胞の５％未満の上に存在する。ある側面では、流体は、血液である。さらなる側面では、流体は、分画全血である。なおもさらなる側面では、流体は、全血の有核細胞分画である。
【００６５】
種々の側面では、流体サンプル中の粒子を検出するためにシステムが提供され、本システムは、入力チャネル、第１の出力チャネル、第２の出力チャネル、および指向性流チャネルを備える、マイクロ流体チップと、弁であって、弁は、マイクロ流体チップから分離可能であり、弁は、指向性流チャネル中の第１の流体の流動を調節し、指向性流チャネル中の第１の流体の流動は、入力チャネルから第１の出力チャネル、第２の出力チャネル、またはそれらの組み合わせへ第２の流体の流動を指向する、弁と、入力チャネル中の第２の流体の一部分から発せられる信号を検出するように構成される、検出器と、信号に基づいて値を一部分に割り当て、弁を操作するように構成されるプロセッサとを備える。いくつかの側面では、弁は、電子作動型弁である。
【００６６】
種々の側面では、流体サンプル中の粒子を検出するためにシステムが提供され、本システムは、（ａ）少なくとも１つのサンプル入力チャネル、少なくとも１つの指向性流チャネル、および少なくとも２つの出力チャネルを備える、マイクロ流体チップであって、少なくとも１つの指向性流チャネルは、サンプル入力チャネルに交差する、マイクロ流体チップと、（ｂ）マイクロ流体チップの一部ではないデバイス上に位置する、電子作動型弁であって、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネルまたは少なくとも２つの出力チャネルのうちの少なくとも１つに交差する入力チャネルを制御することによって、流体の流動を制御する、電子作動型弁と、（ｃ）流体サンプルのアリコート中の１つまたはそれを上回る被分析物を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と、（ｄ）アリコート中の被分析物の存在、非存在、識別、組成、または数量に基づいて、値をアリコートに割り当てることが可能なプロセッサであって、プロセッサは、検出器および電子作動型弁と通信している、プロセッサとを備える。
【００６７】
いくつかの側面では、電子作動型弁は、ソレノイド弁である。ある側面では、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネル中の流体の流動を制御する。さらなる側面では、電子作動型弁は、常時閉であり、電子作動型弁は、プロセッサから信号を受信した後に開放する。なおもさらなる側面では、電子作動型弁は、常時開であり、電子作動型弁は、プロセッサから信号を受信した後に閉鎖する。
【００６８】
いくつかの側面では、少なくとも１つの指向性流チャネルは、少なくとも２つのポートを備え、電子作動型弁は、ポートのうちの１つを通る流体の流動を制御する。ある側面では、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネル中の流体の流動を直接制御する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネルに流れ込むチャネル中の流体の流動を直接制御する。ある側面では、電子作動型弁は、１つだけの指向性流チャネル中の流体の流動を直接制御する。さらなる側面では、電子作動型弁は、出力チャネル中の流体の流動を直接制御する。なおもさらなる側面では、電子作動型弁は、出力チャネルに流れ込むチャネル中の流体の流動を直接制御する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、圧電弁である。
【００６９】
いくつかの側面では、指向性流チャネルは、合流点で出力チャネルに交差する。ある側面では、検出器は、出力チャネルではない、少なくとも１つのチャネルの上に位置する。いくつかの側面では、本デバイスは、確認レーザを備える。ある側面では、確認レーザは、入力チャネルではない、少なくとも１つのチャネルの上に位置する。さらなる側面では、本システムは、第２の検出器を備える。なおもさらなる側面では、少なくとも１つのチャネルは、フィルタと流体連通している。
【００７０】
種々の側面では、流体サンプル中の希少粒子を検出するためにデバイスが提供され、本デバイスは、入力チャネルと、第１の出力チャネルと、第２の出力チャネルと、流体サンプルの一部分中の粒子の存在または非存在を検出するように構成される、検出器と、粒子の存在または非存在に基づいて、入力チャネルから第１の出力チャネル、第２の出力チャネル、またはそれらの組み合わせへ一部分の流動を指向するための機構と、第１の出力チャネルと流体連通しているフィルタとを備える。いくつかの側面では、フィルタは、開口のアレイを備える。ある側面では、アレイ内の各開口の最小寸法は、粒子の最小寸法より小さい。
【００７１】
種々の側面では、流体サンプル中の希少粒子を検出するためにデバイスが提供され、本デバイスは、（ａ）少なくとも１つのサンプル入力チャネルと、（ｂ）少なくとも２つの出力チャネルであって、２つの出力チャネルのうちの少なくとも１つは、開口のアレイと流体連通している、出力チャネルと、（ｃ）流体サンプルのアリコート中の１つまたはそれを上回る希少粒子を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と、（ｄ）第１の出力チャネルを通して、１つまたはそれを上回る希少粒子を含有するアリコートの流動を指向することによって、１つまたはそれを上回る希少粒子を選別するための機構とを備える。
【００７２】
いくつかの側面では、本デバイスは、第１の出力チャネルと、第２の出力チャネルとを備える。ある側面では、機構は、アリコートが希少粒子を含有しない場合、アリコートの流動を第２の出力チャネルの中へ指向する。ある側面では、選別のための機構は、電極、磁気要素、音響要素、または電子作動型要素を備える。
【００７３】
いくつかの側面では、開口のアレイは、入力チャネルと出力チャネルとの間に配置される。ある側面では、開口のアレイは、入力チャネルおよび出力チャネルと同一の平面内にある。さらなる側面では、開口のアレイは、第１の出力チャネル内に配置される。なおもさらなる側面では、開口のアレイは、第１の出力チャネルと流体連通しているチャンバの中に配置される。いくつかの側面では、開口のアレイは、希少粒子が開口を通過することができないが、少なくとも１つの他の粒子が開口を通過することが可能であるように構成される。ある側面では、開口のアレイは、希少粒子が開口を通過することが可能であるが、少なくとも１つの他の粒子が開口を通過することができないように構成される。さらなる側面では、開口のアレイは、１０００個超の開口を備える。
【００７４】
ある側面では、検出器は、カメラ、電子倍増管、電荷結合素子（ＣＣＤ）画像センサ、光電子倍増管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、単光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）、シリコン光電子倍増管（ＳｉＰＭ）、および相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）画像センサから成る群から選択される。
【００７５】
種々の側面では、検定を行うために統合システムが提供され、本システムは、粒子を含む流体サンプルであって、粒子は、マーカーを含む、流体サンプルと、入力チャネルと、第１の出力チャネルと、第２の出力チャネルと、流体サンプルの一部分中の粒子の存在または非存在を検出するように構成される、第１の検出器であって、一部分は、入力チャネル内に配置される、第１の検出器と、粒子の存在または非存在に基づいて、入力チャネルから第１の出力チャネルへ一部分の流動を指向するための機構と、第１の出力チャネルと流体連通し、粒子を閉じ込めるように構成される、微小空洞と、微小空洞中のマーカーの存在または非存在を検出するように構成される、第２の検出器とを備える。
【００７６】
マイクロ流体チップ設計および加工
マイクロ流体チップは、効率的かつ能動的選別方式および後続の精製（例えば、精製チャンバ）方式を提供するように加工することができる。マイクロ流体チップは、シリコンマスタ上の２つの層から成ることができ、かつポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）への１段階複製成形で加工することができる。マイクロ流体チップは、ガラス基板への結合で仕上げることができる。
【００７７】
いくつかの側面では、２つのフォトリソグラフィプロセスを使用して、シリコンマスタを加工することができる（図５）。特徴は、標準ソフトウェア（例えば、Ａｕｔｏｄｅｓｋ社（Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）製ＡｕｔｏＣＡＤ）を使用して設計することができ、かつクロムマスク上に書き込むことができる。これらの場合において、第１の層を形成するために、ポジ型レジストリソグラフィおよび深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を使用することができる（図５）。第１の層は、マイクロフィルタ特徴であり得る。いくつかの側面では、ＤＲＩＥプロセスを含むことができるプロセスによって、ポジ型フォトレジスト（例えば、ＡＺ  １５１２）が達成される。ＤＲＩＥプロセスは、種々の特徴に好適な深度（例えば、４．５μｍ〜５μｍ）を達成することができる。
【００７８】
いくつかの側面では、ネガ型フォトレジスト（例えば、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ，  Ｎｅｗｔｏｎ，  ＭＡ製ＳＵ−８−３０５０）を使用して、ｅＤＡＲマイクロ流体チップ特徴の第２の層を加工することができ、特徴の高さを制御することができる（例えば、５０μｍ）。マスタは、例えば、トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル−１−トリクロロシラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ））を使用して、シラン化することができる。シラン化マスタおよびシリコンウエハは、未硬化ＰＤＭＳでコーティングし、（例えば、７０℃で２時間）焼き付けることができる。いくつかの側面では、所望の微小特徴を伴うＰＤＭＳ片をシリコンマスタから剥離し、次いで、ｅＤＡＲマイクロ流体チップの加工を完了するように、プラズマ酸化の標準プロセスを使用してカバーガラス片と結合することができる。
【００７９】
マイクロ流体チップは、染色領域、光退色領域、撮像領域、および付加的な領域を含む、特殊領域を含有することができる。いくつかの側面では、領域は、少なくとも１つの目的で使用される同一の領域であり得る。他の場合において、領域は、１つの目的で使用される異なる領域であり得る。他の場合において、領域は、少なくとも１つの目的で使用される異なる領域であり得る。各領域は、１つより多くの目的で使用することができる。いくつかの側面では、ｅＤＡＲマイクロ流体チップは、標準リソグラフィ方法によって加工される統合濾過領域を含む。いくつかの側面では、マイクロ流体チップは、２つの統合機能領域、すなわち、ｅＤＡＲ選別領域およびスリット構造ベースの濾過ユニットを有することができる。
【００８０】
マイクロ流体チップ内のチャネル
本明細書で提供される本開示は、流体サンプル中の被分析物（例えば、希少粒子）を検出するための装置を説明し、本装置は、（ａ）少なくとも第１の入力チャネルと、（ｂ）少なくとも２つの出口チャネルと、（ｃ）生物学的流体のアリコート中の１つまたはそれを上回る希少粒子を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と、（ｄ）アリコートの流動を指向するための機構と、（ｅ）アリコート中の希少粒子の存在、非存在、識別、組成、または数量に基づいて、値をアリコートに割り当てることが可能なランク付けデバイスとを備え、デジタルプロセッサ（例えば、コンピュータ）は、検出器およびアリコートの流動を指向するための機構と通信している。
【００８１】
いくつかの側面では、本明細書で提供される装置は、被分析物（例えば、希少細胞）への不慮の損傷を最小限化する設計特徴とともに、壁によって取り囲まれ、および／または基板上に微細加工された流動チャネルを備えることができる。希少細胞の不慮の損傷を低減させることにより、誤った患者診断または予後を引き起こす偽陰性率を低減させることができる。流動チャネルはさらに、最小限の応力または損傷を伴って生体細胞を除外するように流体力学的に設計された開口を伴うチャネルを備えることができる。流動チャネルは、米国特許出願第２００７／００３７１７２号および第２００８／０２４８４９９号で説明される通りである。前述の特許出願では１次元（「１Ｄ」）開口を伴うチャネルと称される、そのようなチャネルは、細胞除外プロセス中に細胞によって被られる流体力学的圧力を低減させ、したがって、細胞溶解の可能性を低減させる。１Ｄ開口を伴うチャネルは、流動をさらに再指向し、分割し、抑制し、または分散させ、その結果として、除外の瞬間に細胞によって被られる衝撃の力を低減させるように、米国特許第２００８／０３１８３２４号で説明されるような「流出濾過」構成に従って、方略的にアレイで配列することができる。流動チャネルを取り囲む壁は、ｅＤＡＲ装置が医療デバイス製造を統制する規制に準拠し得るように、医療デバイスグレードポリマーである生体適合性基板材料から、第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０２４２６号で説明される手順に従って紫外線硬化プロセスを使用して加工することができる。
【００８２】
選別合流点に流体を導入するために使用することができる、選別領域内の主要チャネルは、特定の高さ（例えば、５０μｍ）および特定の幅（例えば、１５０μｍ）を有することができる。大抵の場合、他のチャネル（例えば、４つ）は、特定の高さ（例えば、５０μｍ）および特定の幅（例えば、２００μｍ）を有することができる。濾過ユニット内のスリット構造ベースのフィルタは、特定の高さ（例えば、５μｍ）および特定の幅（例えば、５μｍ）を有することができる。マイクロ流体チップは、最大５０，０００個のスリットを含有することができ、かつそれらをスリット構造に含むことができる。
【００８３】
いくつかの側面では、ｅＤＡＲ装置はさらに、該ランク付けに基づいて、該アリコートを導くためのチャネルを備えることができる。チャネルは、抗凝固化合物、被分析物（例えば、希少生体粒子）に優先的に結合する化合物、希少生体粒子の凝集を防止する化合物、またはそれらの組み合わせで処理することができる。
【００８４】
いくつかの側面では、本明細書で提供されるｅＤＡＲ装置は、１つまたはそれを上回る入力流チャネル（例えば、アリコートを検出容積に運ぶチャネル）、および１つまたはそれを上回る出力チャネル（例えば、検出容積からアリコートを運び去るチャネル）を含む、複数の流動チャネルを備えることができる。いくつかの側面では、本明細書で提供されるようなｅＤＡＲ装置は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれを上回る入力チャネル、および少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれを上回る出力チャネルの組み合わせを備えることができる。いくつかの側面では、本明細書で提供されるようなｅＤＡＲ装置は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれを上回る入力チャネル、および少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれを上回る出力チャネルの組み合わせを備えることができる。いくつかの側面では、装置は、付加的な流体を注入して局所速度を変化させるように、主要チャネルに接続する複数の流動チャネルを備えることができる。
【００８５】
いくつかの側面では、流体は、マイクロ流体チップの一部であるチャネルから、チャネルと流体連通しているがマイクロ流体チップの外部にあるチャンバへ送達される。いくつかの側面では、チャンバは、バイアルである。他の側面では、チャンバは、単一のウェルまたはウェルプレート内のウェルである。さらなる側面では、チャンバは、微小遠心管である。さらなる側面では、チャンバは、微小遠心管であり、微小遠心管は、エッペンドルフ型管である。任意の好適な構造をバイアルに使用することができ、当業者であれば、本開示とともに使用するための好適なチャンバを容易に識別することができる。
【００８６】
いくつかの側面では、流体は、流体を輸送するための管または他の好適な構造を介して、チャネルからチャネルと流体連通しているチャンバへ送達される。管は、生体適合性ポリマーから構築された材料を含むことができる。他の側面では、チャンバは、例えば、キャピラリ電気泳動を行うために使用されるような溶融石英毛細管等の毛細管を介して、チャネルと流体連通することができる。チャネルをチャンバと流体連通させるために好適な他の種類の管類が、当業者に容易に明白となるであろう。
【００８７】
本明細書で使用されるように、「と流体連通している」という用語（およびその変形例）は、構成要素間の流体経路の存在を指す。流体連通していることは、任意の中間構造または構成要素の存在を示唆することも除外することもない。２つの構成要素は、たとえ場合によってはそれらの間の経路が遮断され、および／または流体がそれらの間で流動していなくても、流体連通することができる。したがって、流体連通がある、ある側面では、断続的な流体流が考慮される。
【００８８】
いくつかの側面では、本明細書で提供される装置は、ポリマー材料（ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリウレタンメタクリレート（ＰＵＭＡ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレン、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、パリレン、ポリ塩化ビニル、フルオロエチルプロピレン、レキサン、ポリスチレン、環状オレフィン共重合体、ポリウレタン、炭酸ポリエステル、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリアクリレート、ポリカプロラクトン、ポリケトン、ポリフタルアミド、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリスルホン、エポキシポリマー、熱可塑性物質、フッ素重合体、およびポリフッ化ビニリデン、ポリアミド、ポリイミド）、無機材料（ガラス、石英、シリコン、ＧａＡｓ、窒化ケイ素）、溶融石英、セラミック、ガラス（有機）、金属および／または他の材料、ならびにそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない材料から加工される、壁によって取り囲まれた流動チャネルまたはチャンバを備えることができる。
【００８９】
いくつかの側面では、壁材料は、多孔質膜、羊毛の織物または不織繊維（布またはメッシュ等）、金属（例えば、ステンレス鋼またはモネル）、ガラス、紙、または合成物質（例えば、ナイロン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、パリレン、および種々のポリエステル）、焼結ステンレス鋼および他の金属、ならびにアルミナ、シリカ、または炭素等の多孔質無機材料で加工することができる。
【００９０】
いくつかの側面では、本明細書で提供される装置は、化学または生体分子で前処理された流動チャネルまたはチャンバを備えることができる。例えば、チャネルまたはチャンバは、流体サンプル中の被分析物（例えば、希少粒子または細胞）の関連を防止または低減させる抗凝固化合物、被分析物（例えば、希少粒子または細胞）に優先的に結合する化合物、または流体サンプル中の被分析物（例えば、希少粒子または細胞）の凝集または集合を防止または低減させる化合物で処理することができる。
【００９１】
いくつかの側面では、チャネルまたはチャンバ表面は、抗凝固化合物、循環腫瘍細胞に優先的に結合する化合物、または細胞の付着を防止する化合物で処理することができる。
【００９２】
いくつかの側面では、チャネルまたはチャンバ表面は、湿潤を増進するように、または選択細胞、粒子、あるいは分子の吸着を支援するように、化学的に修飾することができる。表面修飾化学物質は、トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）、（トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン、クロロジメチルオクチルシラン、オクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）、またはγ−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン等のシラン、アクリル酸、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エポキシポリ（ジメチルアクリルアミド）（ＥＰＤＭＡ）、またはＰＥＧ−モノメトキシルアクリレート等のポリマー、プルロニック界面活性剤、ポリ（エチレングリコール）系（ＰＥＧ）界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＣ）、臭化セチルトリエチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、またはＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（ＰＢ）等の界面活性剤、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、またはヒドロキシプロピルメチルルロース（ＨＰＭＣ）等のセルロース誘導体、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、またはトリエタノールアミン等のアミン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）を含有するものまたはＴｅｆｌｏｎ等のフッ素含有化合物を含むことができるが、それらに限定されない。
【００９３】
濾過
本明細書で提供されるｅＤＡＲ装置はさらに、フィルタ要素を備えることができる。いくつかの側面では、フィルタ要素は、微小支柱、微小障壁、微小衝突体、微小篩、生体粒子より小さい開口を伴うチャネル、生体粒子が開口に進入することを防止することができるが、開口（「１Ｄチャネル」）を通って生体粒子の周囲で流体を流動し続けさせることができるような開口を伴うチャネル、マイクロビーズ、多孔質膜、壁からの突出部、接着コーティング、羊毛の織物または不織繊維（布またはメッシュ等）、金属（例えば、ステンレス鋼またはモネル）、ガラス、紙、または合成物質（例えば、ナイロン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、パリレン、およびポリエステル）、焼結ステンレス鋼または他の金属、あるいはアルミナ、シリカ等の多孔質無機材料の形態であり得る。
【００９４】
いくつかの側面では、フィルタ要素内の開口のアレイは、希少粒子または細胞等の着目粒子がフィルタ要素の開口を通過することができない一方で、少なくとも１つの他の粒子がフィルタ要素の開口を開口することが可能であるように構成される。他の側面では、フィルタ要素内の開口のアレイは、希少粒子または細胞等の着目粒子がフィルタ要素の開口を開口することが可能である一方で、少なくとも１つの他の粒子がフィルタ要素の開口を通過することができないように構成される。
【００９５】
いくつかの側面では、ｅＤＡＲマイクロ流体チップは、マイクロスリットを伴って加工することができる（図１０ａ）。マイクロスリットは、いかなる付加的な非特異的粒子（例えば、赤血球、ＲＢＣ）も保持することなく、希少細胞を捕捉するために使用することができる。マイクロスリットのサイズは、変動し得る。いくつかの側面では、マイクロスリットの高さは、高さ約０．１μｍ、０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、あるいは１００μｍ未満、またはそれに等しくあり得る。いくつかの側面では、マイクロスリットの高さは、高さ約０．１μｍ〜５μｍ、１μｍ〜１０μｍ、５μｍ〜１５μｍ、１０μｍ〜３０μｍ、１５μｍ〜４０μｍ、２０μｍ〜５０μｍ、３０μｍ〜７５μｍ、および５０μｍ〜１００μｍの範囲内であり得る。いくつかの側面では、マイクロスリットの幅は、高さ約０．１μｍ、０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、あるいは１００μｍ未満、またはそれに等しくあり得る。いくつかの側面では、マイクロスリットの幅は、高さ約０．１μｍ〜５μｍ、１μｍ〜１０μｍ、５μｍ〜１５μｍ、１０μｍ〜３０μｍ、１５μｍ〜４０μｍ、２０μｍ〜５０μｍ、３０μｍ〜７５μｍ、および５０μｍ〜１００μｍの範囲内であり得る。例えば、マイクロスリットは、５μｍの高さおよび５μｍの幅を有することができる（図１０ｂ）。
【００９６】
いくつかの側面では、マイクロスリットの高さは、高さ０．１μｍ、０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、あるいは１００μｍ未満、またはそれに等しくあり得る。いくつかの側面では、マイクロスリットの高さは、高さ０．１μｍ〜５μｍ、１μｍ〜１０μｍ、５μｍ〜１５μｍ、１０μｍ〜３０μｍ、１５μｍ〜４０μｍ、２０μｍ〜５０μｍ、３０μｍ〜７５μｍ、および５０μｍ〜１００μｍの範囲内であり得る。いくつかの側面では、マイクロスリットの幅は、高さ０．１μｍ、０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、あるいは１００μｍ未満、またはそれに等しくあり得る。いくつかの側面では、マイクロスリットの幅は、高さ０．１μｍ〜５μｍ、１μｍ〜１０μｍ、５μｍ〜１５μｍ、１０μｍ〜３０μｍ、１５μｍ〜４０μｍ、２０μｍ〜５０μｍ、３０μｍ〜７５μｍ、および５０μｍ〜１００μｍの範囲内であり得る。
【００９７】
いくつかの側面では、マイクロ流体チップは、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、５０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、または５０，０００個の開口またはマイクロスリットを伴って製作することができる。他の側面では、マイクロ流体チップは、１００個超、２００個超、３００個超、４００個超、５００個超、６００個超、７００個超、８００個超、９００個超、１０００個超、５０００個超、２０，０００個超、３０，０００個超、４０，０００個超、または５０，０００個超の開口またはマイクロスリットを伴って製作することができる。いくつかの側面では、圧力は、より多くのマイクロスリットを伴うマイクロ流体チップにとって、より低くあり得る。例えば、２０，０００個のスリットを伴うｅＤＡＲマイクロ流体チップは、流体力学的切替プロセスの平衡を保つために、２つの側方緩衝剤チャネルに４ｐｓｉ未満の圧力を必要とした。いくつかの側面では、マイクロフィルタにわたるより低い圧力が、単離された希少細胞への応力およびその変形を最小限化することができる。
【００９８】
マイクロスリットは、濾過源として使用することができる。いくつかの側面では、マイクロスリットは、選別を可能にし、撮像中に収差を引き起こさない任意の材料（例えば、ＰＤＭＳ）から加工し、撮像システムとともに使用するためのカバースリップ片と結合することができる（図１０ｃおよび１０Ｄ）。いくつかの側面では、マイクロスリットは、マイクロフィルタであり得る。
【００９９】
いくつかの側面では、濾過目的でのマイクロスリットの使用は、撮像精度および閉じ込められた細胞の計数を向上させることができる。いくつかの側面では、マイクロスリットは、閉じ込められた希少細胞上の２回目の標識の速度および効率を増加させることができる。例えば、抗ＥｐＣＡＭ−ＰＥで標識された２つの癌細胞をマイクロスリット上に閉じ込めることができる（図１０ｅ）。細胞は、固定し、透過化し、抗サイトケラチン−Ａｌｅｘａ４８８、抗ＣＤ４５−Ａｌｅｘａ７００、抗Ｈｅｒ２−Ａｌｅｘａ６４７、およびＨｏｅｃｈｓｔで標識することができる。
【０１００】
流体力学的選別
ｅＤＡＲプラットフォームの特徴および性能に寄与する、２つの主要な要因は、（１）効率的かつ能動的選別方式、および（２）後続の効率的な精製（例えば、精製チャンバ）方式である。マイクロ流体チップおよび流体力学的切替機構の分析性能は、特定の回収効率（例えば、９５％）、特定の偽陽性率（例えば、０）、および特定のスループット（例えば、１時間につき４．８ｍＬの全血）のために最適化することができる。
【０１０１】
いくつかの側面では、流動を指向するための機構は、希少粒子の識別、組成、または数量に応じて、希少粒子を含有するアリコートの流動を複数の出口チャネルのうちの１つの中へ指向する。アリコートの流動を指向するための機構は、アリコートが希少粒子を含有する場合は第１の出口チャネル、またはアリコートが希少粒子を含有しない場合は第２の出口チャネルのいずれかの中へ入り得る。
【０１０２】
いくつかの側面では、アリコートの流動を指向するための機構は、電極、磁気要素、音響要素、電子作動型要素、電場、圧電弁、または磁場を備えることができる。他の場合において、アリコートの流動を指向するための機構は、１つまたはそれを上回る電子作動型弁またはピストンを備えることができ、弁またはピストンは、第１の合流点で第１の入力チャネルおよび２つの出口チャネルに交差する、少なくとも第１の指向性流チャネルの中の液体流を制御することができる。
【０１０３】
いくつかの側面では、本明細書で提供される装置は、粒子、アリコート、または流体サンプルの軌道または流動を追跡および／または操作するための１つまたはそれを上回る電極を備えることができる。いくつかの側面では、本明細書で提供される装置は、粒子またはアリコートの集合または群の軌道または流動を追跡および／または操作するための１つまたはそれを上回る電極を備えることができる。この場合、電極は、そのような誘電泳動またはエレクトロウェッティング現象に基づいて、アリコートの分離を増進することができる。
【０１０４】
他の場合において、本明細書で提供される装置はさらに、磁気粒子に結合された、または磁気粒子によって結合された希少粒子（例えば、細胞）の分離のための磁気要素を備えることができる。他の場合において、本明細書で提供される装置はさらに、少なくとも１つの磁気粒子に結合された、または少なくとも１つの磁気粒子によって結合された希少粒子（例えば、細胞）の集合または群の分離のための磁気要素を備えることができる。いくつかの側面では、磁気要素は、細胞、あるいは粒子または細胞に付着したマイクロ磁気またはナノ磁気粒子の磁化率に基づいて、アリコート、粒子、または細胞の分離を増進することができる。いくつかの側面では、磁気要素は、細胞、あるいは少なくとも１つの粒子または細胞に付着したマイクロ磁気またはナノ磁気粒子の磁化率に基づいて、粒子または細胞の集合または群の分離を増進することができる。
【０１０５】
ｅＤＡＲ装置は、リアルタイムで流体力学的切替の効率を監視するように、収集側に位置する第２線共焦点検出窓を有することができる。いくつかの側面では、ｅＤＡＲ装置は、共焦点撮像と対合することができる。
【０１０６】
いくつかの側面では、流体力学的切替は、ソレノイドおよび２つの側方緩衝剤ライン内の圧力降下によって制御することができる。ソレノイドは、希少細胞収集チャネルの中に位置することができる。いくつかの側面では、このソレノイドは、左側の閉鎖位置にあり、「陰性」アリコートは、右側の廃棄物チャネルに流入する（図４Ａ）。ソレノイドが開放されるとき、緩衝剤を含有する２つの側方チャネル間の圧力降下は、廃棄物チャネルから収集側に血流を切り替える。この切替は、希少粒子（例えば、細胞）を収集するように、１０ミリ秒未満（例えば、２〜３ミリ秒）で起こることができる。
【０１０７】
いくつかの側面では、種々の流体力学的選別方式を使用することができる。本開示は、８つの異なる流体力学的選別方式を提供する（図６）。流体サンプル（例えば、血液）は、黒色の流動として示される、主要チャネルから注入することができる。緩衝剤（マイクロ流体チップ内の薄い灰色）は、２つの側方チャネルに流入することができ、希少細胞は、左下のチャネルに収集することができ、廃棄物は、右下のチャネルに指向することができる。長方形のブロックは、ソレノイドを表す（「ソレノイド」参照）。ソレノイドは、それぞれ、濃い灰色または薄い灰色のブロックによって示されるように、常時開（Ｎ．Ｏ．）または常時閉（Ｎ．Ｃ．）に設定することができる（図６）。
【０１０８】
マイクロ流体チップのチャネルは、合流点で交差してもよい。いくつかの側面では、１つのチャネルが、合流点で異なるチャネルと交差する。いくつかの側面では、１つのチャネルが、合流点で１つより多くの異なるチャネルと交差する。いくつかの側面では、１つのチャネルが、合流点で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個の異なるチャネルと交差する。いくつかの側面では、１つより多くのチャネルが、合流点で異なるチャネルと交差する。いくつかの側面では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個の異なるチャネルが、合流点で１つの異なるチャネルと交差する。
【０１０９】
マイクロ流体チップのチャネルは、合流点で交差しなくてもよい。いくつかの側面では、１つのチャネルが、合流点ではないマイクロ流体チップ上の場所で異なるチャネルと交差する。いくつかの側面では、１つのチャネルが、合流点ではないマイクロ流体チップ上の場所で、１つより多くの異なるチャネルと交差する。いくつかの側面では、１つのチャネルが、合流点ではないマイクロ流体チップ上の場所で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個の異なるチャネルと交差する。いくつかの側面では、１つより多くのチャネルが、合流点ではないマイクロ流体チップ上の場所で異なるチャネルと交差する。いくつかの側面では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個の異なるチャネルが、合流点ではないマイクロ流体チップ上の場所で１つの異なるチャネルと交差する。
【０１１０】
ソレノイドおよび流動の調節
ｅＤＡＲ装置は、流体の流動および流体力学的選別方式を制御するようにソレノイドを含む。いくつかの側面では、ソレノイドは、ピストンであり得る。例えば、ソレノイドピストンは、電子作動型ソレノイド弁の副次構成要素である。いくつかの側面では、電子作動型ソレノイド弁は、圧電弁であり得る。いくつかの側面では、ソレノイドピストンは、成形によって装置に組み込むことができる。いくつかの側面では、ソレノイドは、弁であり得る。例えば、組み込みソレノイドピストンは、管類を介して流体連通しているソレノイド弁によって置換されてもよい。
【０１１１】
いくつかの側面では、ｅＤＡＲ装置は、１つのソレノイドを含有することができる。他の場合において、ｅＤＡＲ装置は、１つより多くのソレノイドを含有することができる。例えば、ｅＤＡＲ装置は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０個超のソレノイドを含有することができる。いくつかの側面では、少なくとも１つのソレノイドが、開放し得る。例えば、開放ソレノイドは、流動がマイクロ流体デバイスの１つの部分からマイクロ流体デバイスの異なる部分へ通過することを可能にするために使用することができる。いくつかの側面では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０個超のソレノイドが、開放し得る。いくつかの側面では、１つの部分が、サンプル進入点であり得る。いくつかの側面では、１つの部分が、廃棄物チャネルであり得る。いくつかの側面では、１つの部分が、選別チャンバであり得る。いくつかの側面では、少なくとも１つのソレノイドが、常時開（Ｎ．Ｏ．）であり得る。いくつかの側面では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０個超のソレノイドが、常時開であり得る。
【０１１２】
いくつかの側面では、ソレノイドを閉鎖することができる。例えば、閉鎖ソレノイドは、流動がマイクロ流体デバイスの１つの部分からマイクロ流体デバイスの異なる部分へ通過することを防止するために使用することができる。いくつかの側面では、少なくとも１つのソレノイドを閉鎖することができる。いくつかの側面では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０個超のソレノイドを閉鎖することができる。いくつかの側面では、１つの部分が、サンプル進入点であり得る。いくつかの側面では、１つの部分が、廃棄物チャネルであり得る。いくつかの側面では、１つの部分が、選別チャンバであり得る。いくつかの側面では、少なくとも１つのソレノイドが、常時閉（Ｎ．Ｃ．）であり得る。いくつかの側面では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０個超のソレノイドが、常時閉であり得る。
【０１１３】
いくつかの側面では、ソレノイドを開放から閉鎖に切り替えることができる。例えば、開放ソレノイドを閉鎖することは、流動がマイクロ流体デバイスの１つの部分からマイクロ流体デバイスの異なる部分へ通過することを防止するために使用することができる。いくつかの側面では、少なくとも１つのソレノイドを開放から閉鎖に切り替えることができる。いくつかの側面では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０個超のソレノイドを開放から閉鎖に切り替えることができる。いくつかの側面では、１つの部分が、サンプル進入点であり得る。いくつかの側面では、１つの部分が、廃棄物チャネルであり得る。いくつかの側面では、１つの部分が、選別チャンバであり得る。
【０１１４】
いくつかの側面では、ソレノイドを閉鎖から開放に切り替えることができる。例えば、閉鎖ソレノイドを開放することは、流動がマイクロ流体デバイスの１つの部分からマイクロ流体デバイスの異なる部分へ通過することを可能にするために使用することができる。いくつかの側面では、少なくとも１つのソレノイドを閉鎖から開放に切り替えることができる。いくつかの側面では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０個超のソレノイドを閉鎖から開放に切り替えることができる。いくつかの側面では、１つの部分が、サンプル進入点であり得る。いくつかの側面では、１つの部分が、廃棄物チャネルであり得る。いくつかの側面では、１つの部分が、選別チャンバであり得る。
【０１１５】
いくつかの側面では、ｅＤＡＲに使用することができる、流体マイクロ流体チップの構造および流体力学的選別の対応する方式が、図６に示されている。ソレノイドの位置は、単一のチャネル上に出口または入口があるときに印付けることができる。例えば、図６Ｆでは、第２のソレノイドの位置は、廃棄物収集チャネルの中心出口の上にあることを意味する、「中心廃棄物」であり得る。図６Ｇに示されるものを除く全方式では、「陽性」事象を検出することができるときに、選別をトリガするように、ソレノイドに印加されるＤＣ電圧を変化させることができ、ある期間後に通常状態に戻すことができる。いくつかの側面では、選別を制御するために、４つの個々のステップを使用することができる（例えば、図６Ｇに示される方式）。両方のソレノイドを閉鎖することができ、流体が廃棄物チャネルへ流動することができる。スイッチオーバーステップを行うように収集側のソレノイドを開放することができる、選別をトリガすることができる。他のソレノイドは、細胞が収集された後にスイッチバックステップを行うように開放することができる。通常状態に戻るように流体流を完全に切り替えて戻した後に、両方のソレノイドを同時に閉鎖することができる。本明細書で説明される８つの異なる流体力学的選別方式の流体構成および性能の概要が、表１（以下）で描写されている。いくつかの側面では、２つのソレノイドを使用することができる（例えば、図６Ｃ、６Ｅ、および６Ｇに示される方式）。
【表１】
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【０１１６】
いくつかの側面では、オフチップソレノイドを使用することができる。オフチップソレノイドは、方法の大半で閉鎖することができる。オフチップソレノイドを開放するために、電圧（例えば、５ＶＤＣ電圧）を印加することができる。オフチップソレノイドは、急速に（例えば、３ミリ秒未満またはそれに等しい）開放することができる。オフチップソレノイドが使用される場合、マイクロ流体チップの製作を修正することができ、ソレノイドをマイクロチャネルと接続することができる。いくつかの側面では、オンチップソレノイドを使用することができる。オンチップソレノイドは、方法の大半で閉鎖することができる。オンチップソレノイドを開放するために、電圧（例えば、５ＶＤＣ電圧）を印加することができる。オンチップソレノイドは、急速に（例えば、３ミリ秒未満またはそれに等しい）開放することができる。オンチップソレノイドが使用される場合、マイクロ流体チップの製作を修正することができ、ソレノイドをマイクロチャネルと接続することができる。
【０１１７】
例えば、この方式では、オフチップソレノイドが使用される。シリンジポンプを使用して、標識流体サンプルをマイクロ流体チップの上部チャネルに注入することができる（図７ａ）。能動的選別ステップを制御するために、緩衝剤が通って流動する、２つの側方チャネルを使用することができる。２つのポートが、右側チャネル上に位置し、両方が、加圧緩衝剤源に接続される。オフチップソレノイドは、流体力学的切替を制御するように、選別合流点付近のポートに接続することができる。オフチップソレノイドを使用する切替プロセスは、安定し得、１０５のオン・オフサイクルを通して安定性を維持することができる。
【０１１８】
いくつかの側面では、流体サンプルがソレノイドに接触することを防止するように、インラインソレノイドを緩衝剤ライン上に配置することができる。これは、サンプルの腐敗および二次汚染の可能性を排除することができる。ｅＤＡＲ装置および方法の使用中に、希少細胞収集チャネルの中に一定流量の緩衝剤があり得る。オンチップソレノイドは、後続の精製（例えば、精製チャンバ）ステップの効率を向上させることができ、かつ細胞の凝集体の形成を防止することができる。
【０１１９】
いくつかの側面では、ｅＤＡＲ装置内の流体の流動は、検出容積の上流または下流のいずれかにある、ソレノイド、弁、気泡、電場、磁場、光場、空気圧源、固体粒子、膜、不混和液滴、重力差、またはチャネルの表面張力を変化させるコーティングのうちの１つを用いて調節することができる。流動は、細胞が検出容積を通って横断するにつれて、停止させ、減速し、または加速することができる。
【０１２０】
いくつかの側面では、流動チャネルを通る流体サンプルの連続流を検出中に維持することができる。いくつかの側面では、個々のアリコートは、物理的に分離されなくてもよいが、むしろ光学検出ステップおよび／または選別ステップによって定義することができる。
【０１２１】
例えば、流動は、廃棄物を収集するために使用することができるチャネルの中へ指向することができる（図７ｂ）。選別合流点の後に、２つのチャネルがあり得る。左のチャネルは、陽性アリコートを収集し、それらをさらなる精製（例えば、精製チャンバ）のための濾過および収集領域に送達することができ、右のチャネルは、廃棄物（例えば、陰性アリコート）を収集する。この場合、アリコートが「陰性」としてランク付けされ、閉鎖されたままであるときに、いかなる電圧もソレノイドに印加されない（図７ｂ）。第１および第３緩衝剤源の間の初期圧力降下後に、流動パターンの変化が起こり得る（図７ａ）。第１の検出窓によって、陽性事象を検出することができる。この場合、緩衝剤リザーバ（例えば、２番）から緩衝剤流を開放するように、ＤＣ電圧（例えば、５Ｖ）をソレノイドに印加することができる。右側の緩衝剤チャネルの減少した流動抵抗が、より速い流速を生成することができる。流体流は、陽性アリコートを収集するように右側から左側に押動することができる（図７ｃ）。アリコートは、収集し、第２の検出窓によって確認することができる。いくつかの側面では、ソレノイドは、流体流を廃棄物収集チャネルに戻して切り替えるように閉鎖することができる（図７ｄ）。スイッチオーバーおよびバックに必要とされる時間は、２０ミリ秒未満であり得、例示的な場合において、時間は、２〜３ミリ秒またはその間である（表１および図８、フレームレート＝毎秒１，９１８フレーム）。いくつかの側面では、使用される条件は、１０５超のオン・オフサイクルに繰り返すことができる。
【０１２２】
いくつかの側面では、流動は、例えば、機械的原理（例えば、外部シリンジポンプ、空気圧膜ポンプ、振動膜ポンプ、真空デバイス、遠心力、および毛管作用）、電気または磁気的原理（例えば、電気浸透流、動電ポンプ、圧電／超音波ポンプ、強磁性流体プラグ、電気流体力学的ポンプ、および電磁流体力学的ポンプ）、熱力学的原理（例えば、気泡生成／位相変化誘導型体積膨張）、表面湿潤原理（例えば、エレクトロウェッティング、化学、熱、および放射性誘導型表面張力勾配）に基づいて動作するものを含むが、それらに限定されない、流体力学的流体圧力を誘導する方法およびデバイスによって送達することができる。
【０１２３】
さらに他の場合において、流体は、重力送給によって提供される流体駆動力、（毛管作用のような）表面張力、静電力（動電流）、遠心力流（コンパクトディスク上に配置され、回転させられる基板）、磁力（振動するイオンが流動を引き起こす）、電磁流体力学的力、および真空または圧力差によって送達するか、または導くことができる。
【０１２４】
いくつかの側面では、流体力学的流体圧力または流体駆動力を誘導するための方法およびデバイスに関して列挙されるもの等の流体流制御デバイスを、本主題の入力ポートまたは出力ポートに連結することができる。いくつかの側面では、複数のポートが、入口および出口のいずれか一方または両方で提供され、１つまたはそれを上回るポートが、流体流制御デバイスに連結される。
【０１２５】
経過時間
被分析物（例えば、希少細胞または循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））は、第１の検出窓から第２の検出窓へ流動することができる。第１の窓での決定ＡＰＤピークの記録と確認信号の検出との間で経過し得る時間は、被分析物を選別するための経過時間であり得る。いくつかの側面では、経過時間は、変動し得る。いくつかの側面では、線形流速が、経過時間に影響を及ぼし得る。いくつかの側面では、マイクロチャネルの層流が、経過時間に影響を及ぼし得る。いくつかの側面では、体積流速を４０μＬ／分に設定することができる（図９ｂ）。いくつかの側面では、体積流速は、約１μＬ／分、２μＬ／分、３μＬ／分、４μＬ／分、５μＬ／分、６μＬ／分、７μＬ／分、８μＬ／分、９μＬ／分、１０μＬ／分、１１μＬ／分、１２μＬ／分、１３μＬ／分、１４μＬ／分、１５μＬ／分、１６μＬ／分、１７μＬ／分、１８μＬ／分、１９μＬ／分、２０μＬ／分、２１μＬ／分、２２μＬ／分、２３μＬ／分、２４μＬ／分、２５μＬ／分、３０μＬ／分、３５μＬ／分、４０μＬ／分、４５μＬ／分、５０μＬ／分、５５μＬ／分、６０μＬ／分、６５μＬ／分、７０μＬ／分、７５μＬ／分、８０μＬ／分、８５μＬ／分、９０μＬ／分、９５μＬ／分、１００μＬ／分、または２００μＬ／分であり得る。
【０１２６】
いくつかの側面では、流速は、約１μＬ／分〜５μＬ／分、３μＬ／分〜１０μＬ／分、５μＬ／分〜１５μＬ／分、１０μＬ／分〜２０μＬ／分、１５μＬ／分〜３０μＬ／分、２０μＬ／分〜４０μＬ／分、３０μＬ／分〜５０μＬ／分、４０μＬ／分〜６０μＬ／分、５０μＬ／分〜７０μＬ／分、６０μＬ／分〜８０μＬ／分、７０μＬ／分〜９０μＬ／分、８０μＬ／分〜１００μＬ／分、９０μＬ／分〜１００μＬ／分、または９０μＬ／分〜２００μＬ／分の範囲内であり得る。他の場合において、体積流速は、８０μＬ／分に設定することができる（図９ｂ）。
【０１２７】
いくつかの側面では、体積流速は、１μＬ／分、２μＬ／分、３μＬ／分、４μＬ／分、５μＬ／分、６μＬ／分、７μＬ／分、８μＬ／分、９μＬ／分、１０μＬ／分、１１μＬ／分、１２μＬ／分、１３μＬ／分、１４μＬ／分、１５μＬ／分、１６μＬ／分、１７μＬ／分、１８μＬ／分、１９μＬ／分、２０μＬ／分、２１μＬ／分、２２μＬ／分、２３μＬ／分、２４μＬ／分、２５μＬ／分、３０μＬ／分、３５μＬ／分、４０μＬ／分、４５μＬ／分、５０μＬ／分、５５μＬ／分、６０μＬ／分、６５μＬ／分、７０μＬ／分、７５μＬ／分、８０μＬ／分、８５μＬ／分、９０μＬ／分、９５μＬ／分、１００μＬ／分、または２００μＬ／分であり得る。
【０１２８】
いくつかの側面では、流速は、１μＬ／分〜５μＬ／分、３μＬ／分〜１０μＬ／分、５μＬ／分〜１５μＬ／分、１０μＬ／分〜２０μＬ／分、１５μＬ／分〜３０μＬ／分、２０μＬ／分〜４０μＬ／分、３０μＬ／分〜５０μＬ／分、４０μＬ／分〜６０μＬ／分、５０μＬ／分〜７０μＬ／分、６０μＬ／分〜８０μＬ／分、７０μＬ／分〜９０μＬ／分、８０μＬ／分〜１００μＬ／分、９０μＬ／分〜１００μＬ／分、または９０μＬ／分〜２００μＬ／分の範囲内であり得る。より少ない経過時間を達成するために、より速い流速を使用することができる（図９ｃ）。
【０１２９】
検出
本開示は、検出システムを装備することができるマイクロ流体チップを使用する、ｅＤＡＲ用の装置を提供する。いくつかの側面では、検出システムは、線共焦点検出方式を含むことができる。線共焦点検出方式では、２つのレーザ源（例えば、４８８および６３３ｎｍ）は、一連のダイクロイックミラー、円柱レンズ、およびビームスプリッタを使用して、（例えば、２つの）検出窓を形成する。第１の検出窓は、同時に重複する２つのレーザビームを有することができ、かつ標識希少細胞（例えば、ＣＴＣ）から蛍光信号を検出するために使用することができる。第２の検出窓は、選別されたアリコート中で、希少細胞の識別または希少細胞の欠如を確認するために使用することができる。第２の検出窓はさらに、選別効率を監視するために使用することができる。
【０１３０】
いくつかの側面では、２つの希少粒子を同時に検出することができる。各希少粒子を一意の検出試薬と接触させることができ、各検出試薬を２つの検出デバイスのうちの１つによって検出することができる。さらに、検出試薬は、蛍光部分を含み、異なる蛍光部分の励起波長に対応する異なる波長で放射線を生成する、２つの調査デバイス（例えば、２つのレーザ）を使用することができる。それぞれの蛍光放射線は、２つの異なる検出デバイスによって検出することができる。いくつかの側面では、検出試薬は、異なる波長における蛍光によって区別可能であり得る。
【０１３１】
いくつかの側面では、２つまたはそれを上回る希少粒子を連続して検出することができる。例えば、本方法は、ｅＤＡＲ装置の第１の場所で第１の希少粒子を検出するステップと、ｅＤＡＲ装置の第２の場所で第２の希少細胞を検出するステップとを含むことができる。この場合、第１および第２の粒子が存在するアリコートを、第１の検出ステップの後、第２の検出ステップの後、または両方の検出ステップの後に、新しい場所へ導くことができる。
【０１３２】
ある側面では、検出事象は、規則的な周波数で起こり得る。周波数は、検出容積のサイズおよび流体サンプルの流速に関し得る。特定の装置の検出容積は、０．１μＬ〜１００μＬであり、かつその限界を含む範囲内（例えば、１０μＬ）であり得、流体サンプルは、１μＬ／秒〜１０００μＬ／秒であり、かつその限界を含む範囲内の速度（例えば、１００μＬ／秒）で、装置を通って流動することができ、０．００１秒〜１秒であり、かつその限界を含む範囲内（例えば、０．１秒）で１回、または１Ｈｚ〜１００Ｈｚであり、かつその限界を含む範囲内の速度（例えば、１０Ｈｚ）で、異なるアリコートを検出することができる。
【０１３３】
いくつかの側面では、装置の幾何学形状および処理される流体の体積が、速度に影響を及ぼし得る。例えば、アリコートは、０．１ｋＨｚ〜１００ＭＨｚであり、かつその限界を含む範囲内の速度で、検出容積を通って横断することができる。いくつかの側面では、アリコートは、１０Ｈｚ〜１０ＭＨｚまたは約１０ＭＨｚであり、かつその限界を含む範囲内の速度で、検出容積を通って横断する。いくつかの側面では、アリコートは、０．１ｋＨｚ〜１００ＭＨｚまたは約１００ＭＨｚであり、かつその限界を含む範囲内、あるいは１ｋＨｚまたは約１ｋＨｚ〜１０ＭＨｚまたは約１０ＭＨｚであり、かつその限界を含む範囲内の周波数で、あるいは約１ｋＨｚ〜５ＭＨｚまたは約５ＭＨｚであり、かつその限界を含む範囲内の周波数で、あるいは１ｋＨｚまたは約１ｋＨｚ〜１ＭＨｚまたは約１ＭＨｚであり、かつその限界を含む範囲内の周波数で、検出容積を通って横断してもよい。いくつかの側面では、アリコートが検出容積を通って横断する周波数は、少なくとも約０．１ｋＨｚ、または少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、あるいは９００ｋＨｚ、または少なくとも約１ＭＨｚ、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、あるいは１００ＭＨｚであり得る。いくつかの側面では、アリコートが検出容積を通って横断する周波数は、少なくとも０．１ｋＨｚ、または少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、あるいは９００ｋＨｚ、または少なくとも１ＭＨｚ、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、あるいは１００ＭＨｚであり得る。
【０１３４】
いくつかの側面では、流体サンプルのアリコート中の被分析物（例えば、細胞）の集合からの特性の検出は、同時または経時的に累積的であり得る。例えば、特性の検出は、被分析物の集合を含有する、大きいアリコートから同時であり得る。同時モード中に、粒子は、可変速度の流動によって搬送することができる。他の場合において、粒子は、検出容積を通って横断するにつれて定常流によって搬送することができる。
【０１３５】
種々の側面では、ｅＤＡＲ装置および方法は、信号が複数の被分析物（例えば、複数の細胞）から同時に検出されることを可能にする。いくつかの側面では、アリコート内に存在する複数の被分析物から同時に検出される信号に基づいて、アリコートがランク付けされる。
【０１３６】
他の場合において、細胞の集合からの特性の検出のための本明細書で提供される方法は、複数の細胞が流動を用いて検出容積を通って横断するが、およそ１つの単一細胞である小さい検出容積から、経時的に（「累積的」）発生し得る。ｅＤＡＲの累積モードは、単一の生体粒子から発生する連続信号またはフレームの時間経過オーバーレイとは明確に異なり、単一の生体粒子の時間経過オーバーレイは、生体粒子の集合を構成しない。同時および累積の両方で、細胞の集合からの特性が検出された後のみ、決定が下される。
【０１３７】
いくつかの側面では、検出器は、カメラ、電子倍増管、電荷結合素子（ＣＣＤ）画像センサ、光電子倍増管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、単光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）、シリコン光電子倍増管（ＳｉＰＭ）、および相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）画像センサから成る群から選択される。いくつかの側面では、本明細書で提供されるｅＤＡＲ装置は、選択細胞の運動を追跡するように、またはアリコート中に存在する選択粒子あるいは細胞を計数するように、光、電気、音響、または磁気検出器を備えることができる。
【０１３８】
いくつかの側面では、本明細書で提供される装置または方法は、明視野、落射、共焦点、透過、ＤＩＣ（微分干渉コントラスト）、暗視野、ホフマン、または位相差を含むが、それらに限定されない、種々の構成において、蛍光（単または多色）顕微鏡検査法を組み込むことができる。
【０１３９】
いくつかの側面では、本明細書で提供される装置は、複数の検出デバイス、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれを上回る検出デバイスを備えることができる。複数の検出デバイスが、本開示の方法を行うために有用であり得、例えば、１つより多くの希少粒子または細胞が、流体サンプル中に存在し、１つより多くの細胞マーカーが、異なる細胞型を区別するために使用されており、または複数の検出試薬が同時に検出されている。いくつかの側面では、検出デバイスは、確認レーザを含むことができる。例えば、確認レーザは、選別されたアリコートを調査するために使用することができる。いくつかの側面では、確認レーザによって検出される、選別されたアリコートは、陽性アリコートであり得、選別後に保持することができる。いくつかの側面では、確認レーザによって検出される、選別されたアリコートは、陰性アリコートであり得、選別後に廃棄することができる。例えば、確認レーザは、ｅＤＡＲ選別方式の精度を制御するために第２の検出方法として使用することができる。
【０１４０】
放射線源およびデバイス
本開示は、検出デバイスまたは撮像デバイスと、ランク付けデバイス（例えば、コンピュータ）とを含むことができる、ｅＤＡＲ用の装置を提供する。いくつかの側面では、レーザ（または１つより多くのレーザ）が、調査デバイスとしての機能を果たすことができる。フォトダイオード、光電子倍増管、またはカメラを伴う倒立顕微鏡を、検出デバイスとして使用することができる。マスクをチャネルと検出デバイスとの間の経路に配置することができる。
【０１４１】
いくつかの側面では、調査デバイス（例えば、４８８ｎｍ固体ダイオード励起レーザおよび６３３ｎｍＨｅＮｅレーザ）を倒立顕微鏡の中へ指向することができる。顕微鏡対物レンズに進入することに先立って、１０対１の縦横比を伴う平行楕円ビームを形成するように、円柱光学部または回折光学部を使用して、２つのレーザビームを成形することができる。半波長板および偏光ビームスプリッタの組み合わせを使用して、各ビームの強度を調整することができる一方で、鏡が、空間的に共局在化した励起領域を作成するように独立して光を操縦する。生体粒子からの蛍光は、帯域通過フィルタを通過する前に、２つのダイクロイックミラーによって３つの波長帯に分割し、３つの単光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）上に再集束することができる。１つのＳＰＡＤは、５６０ｎｍ〜６１０ｎｍの波長範囲内の蛍光を収集することができ、第２のＳＰＡＤは、６４５ｎｍ〜７００ｎｍの範囲内の蛍光を収集することができ、第３のＳＰＡＤは、５００ｎｍ〜５４０ｎｍの範囲内で収集することができる。ＳＰＡＤ出力は、カウンタ／タイマボードを伴うデジタルプロセッサ（例えば、コンピュータ）に指向され、いくつかのアルゴリズムで分析される。
【０１４２】
いくつかの側面では、デジタルプロセッサは、アリコートをランク付けするように、検出デバイスからアルゴリズムを通して信号を受容する。デジタルプロセッサは、ランク付けの値（例えば、流体サンプル中の希少粒子の存在、非存在、数量、識別、または組成）に基づいて、アリコートを適切なチャネルの中へ指向することができる。ｅＤＡＲは、１、２、３、４、５、または６個の検出デバイス、および１、２、３、４、５、または６個の調査デバイス、あるいは多数の検出デバイスおよび調査デバイスから成ることができる。
【０１４３】
二重捕捉ｅＤＡＲ
本開示はさらに、ｅＤＡＲの「二重捕捉」バージョン用の装置を提供する。二重捕捉装置は、混合流体の同一のサンプルから、希少細胞の２つの異なる亜集団を分離することができる。これは、単一のマイクロ流体チップ上で同時に行うことができる。２つの亜集団はさらに、マイクロ流体チップ上の２つの異なる領域上で別々に閉じ込めることができる。
【０１４４】
マイクロ流体ｅＤＡＲデバイスの二重捕捉バージョンの一般構造が、図１１で描写されている。サンプルは、一意の蛍光タグに共役される少なくとも２つの一意の抗体で標識することができる。例えば、サンプル（例えば、血液）は、サンプル内の被分析物上のマーカー（例えば、上皮、抗ＥｐＣＡＭ−ＰＥ）に結合する一意のフルオロフォアと共役される第１のタグ、およびサンプル内の被分析物上のマーカー（例えば、間葉、抗ＥＧＦＲ、または抗ビメンチン）に結合する一意のフルオロフォアと共役される第２のタグで標識することができ、各フルオロフォアは、異なる発光波長を有することができる（例えば、ＦＩＴＣ）。標識血液サンプルは、マイクロ流体チップに注入することができる。ＥｐＣＡＭを発現する希少細胞は、（以前に説明された）線共焦点方式を使用して検出することができ、ピークを黄色チャネル内で検出することができる。収集チャネル（例えば、収集チャネル＃１）の中へその特定のアリコートを収集するように、選別事象をトリガすることができる。いくつかの側面では、アリコートは、間葉マーカーに対して陽性としてランク付けすることができ、次いで、希少細胞は、異なる収集チャネル（例えば、収集チャネル＃２）の中へ選別することができる。希少細胞の２つの亜集団は、別々に二重捕捉ｅＤＡＲマイクロ流体チップ上に閉じ込めて濃縮することができる。
【０１４５】
二重捕捉ｅＤＡＲ装置は、流体切替方式（図１１）を使用することができる。標識サンプルは、最上部の主要チャネルに導入することができる。緩衝剤は、２つのソレノイドを使用して、血流の流体力学的切替を制御するように、２つの側方チャネルに流入することができる。いくつかの側面では、二重捕捉ｅＤＡＲの濾過領域は、（以前に説明された）マイクロスリットを使用して構築することができる。ＣＴＣの２つの亜集団を分離し、同一のマイクロ流体チップ上の２つの異なる濾過領域上で閉じ込めることができる。
【０１４６】
二重捕捉ｅＤＡＲ装置は、ソレノイドを含むことができる。いくつかの側面では、アリコートが陰性としてランク付けされるときに、ソレノイドの両方を閉鎖することができる（図１２）。サンプルは、圧力が両方のチャネル内で平衡を保たれた場合に、廃棄物として収集するように底部中心チャネルへ流動することができる。他の場合において、アリコートが２つのマーカーのうちの１つだけ（例えば、上皮）に対して陽性としてランク付けされるとき、次いで、サンプルが左側の収集チャネルに流入するために、ソレノイド＃２を開放することができる（図１２Ｂ）。アリコートが収集された後、ソレノイド＃２を再度閉鎖することができ、サンプル流が中心チャネルに戻される。いくつかの側面では、アリコートを１つだけのマーカー（例えば、上皮）に対して陽性としてランク付けすることができ、サンプル流が右チャネルへ流動することを可能にするように、ソレノイド＃１を開放することができる（図１２Ｃ）。いくつかの側面では、二重捕捉ｅＤＡＲ装置における２種類の選別事象の応答時間は、迅速である（例えば、３ミリ秒未満またはそれに等しい）。
【０１４７】
マイクロ流体チップ内の免疫染色および退色
本開示は、マイクロ流体デバイスを使用する、逐次免疫染色および退色方法のための方式を提供する。本方法は、第ＰＣＴ  ＷＯ  ２０１０／１２０８１８号で引用されるｅＤＡＲ装置、本明細書で提供される装置、または当技術分野で公知である他の装置を使用することができる。いくつかの側面では、本方式は、ｅＤＡＲと併用することができる。いくつかの側面では、本方式は、死容積を最小限化し、使用される抗体の量を減少させ、気泡を導入することを回避し、希少細胞を単離し、染色し、および退色させるプロセスを自動化するように、インライン染色および洗浄システムと併用することができる。
【０１４８】
被分析物（例えば、希少細胞）を捕捉するために、ｅＤＡＲを使用することができる。希少細胞は、マイクロ流体チップ上の小さい領域（例えば、チャンバ）に濃縮することができる。小さい領域は、標識細胞を急速に撮像し、使用される試薬（例えば、抗体、緩衝剤等）の量を最小限化するために使用することができる。マイクロ流体チップは、開放したアクセス可能構造を伴って設計することができる。開放構造は、単一細胞のさらなる操作（例えば、着目細胞を取り出す、またはある試薬を細胞に送達する）を可能にすることができる。
【０１４９】
いくつかの側面では、レーザ検出ビーム、体積流速、および選別速度の組み合わせによって、仮想アリコートを取得することができる。これらの要因に基づいて、事実上、標識サンプルをアリコートに分割することができる（例えば、アリコートにつき２ｎＬで１ｍＬのサンプルにつき５００，０００）。いくつかの側面では、線共焦点検出方法は、各細胞からの蛍光発光を検出することができる。仮想アリコートは、標識方式に従ってランク付けすることができる。標識された場合、アリコートは「陽性」であり、標識されていない場合、アリコートは「陰性」である。いくつかの側面では、陰性アリコートを破棄することができる（図４Ａ）。
【０１５０】
いくつかの側面では、アリコートランク付けに続いて、自動フィードバック機構が、流動の流体力学的切替をトリガすることができる。切替は、「陽性」アリコートを収集し、さらなる精製（例えば、精製チャンバ）および分析のためのマイクロ流体チップの領域に移送することができる。いくつかの側面では、選別されたアリコートは、希少細胞（例えば、循環腫瘍細胞）を閉じ込めることができ、血液細胞を破棄することができる、マイクロ流体チップの領域に移送することができる（図４Ａ）。いくつかの側面では、閉じ込められた細胞は、撮像し、バイオマーカーを認識する１つまたはいくつかのタグ（例えば、標識抗体）で標識することができる。
【０１５１】
被分析物（例えば、希少細胞）の標識および撮像は、マイクロ流体チップ（例えば、ｅＤＡＲ装置）上で起こることができる。いくつかの側面では、灌流標識および洗浄ステップを行うように、マイクロ流体チップ上の２つのポートを開放位置に配置することができる（図１３Ａ）。残りの３つのポートは、閉鎖されたままとなることができる。蠕動ポンプは、洗浄緩衝剤（例えば、Ｉｓｏｔｏｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｎｏ，ＣＡ）））および標識試薬をマイクロ流体チップに送達することができる。６方向弁を使用して、加圧緩衝剤源を、ポンプおよびマイクロ流体チップに連結することができる。いくつかの側面では、漏出および／または汚染を防止するように、弁上の他の３つのポートを閉鎖することができる。
【０１５２】
本方法は、単離された被分析物（例えば、希少細胞）上のマーカーの染色を提供する（図１３Ｂ）。本方法は、抗体（例えば、１０ナノグラム未満またはそれに等しい）およびインキュベーションステップ（例えば、３０分未満またはそれに等しい）を使用して行うことができる。免疫染色および光退色の方法を行うために、６方向弁は、流体力学的切替の安定した制御のために、加圧緩衝剤に向かって旋回させて開放することができる。弁は、特定の量の試薬をマイクロ流体チップに注入するように、蠕動ポンプに向かって旋回させることができる。蠕動ポンプは、標識試薬および洗浄試薬を送達するために使用することができる（図１３）。クロスバーは、対応するポートを閉鎖できることを示す。いくつかの側面では、弁は、気泡がマイクロ流体チップシステムに進入することを防止することができる。
【０１５３】
いくつかの側面では、本方法は、細胞内マーカー染色を行うために使用することができる。本方法では、捕捉された細胞を固定し、免疫染色に先立って、マイクロ流体チップ上で洗剤（例えば、トリトン、サーフィノール４６５界面活性剤等）等の透過化剤を使用して透過化することができる。本方法はさらに、複数回の個々の細胞の免疫染色、染色細胞の洗浄、細胞内のマーカーの撮像、および個々の細胞に結合されるマーカーの光退色を説明する。ステップは、複数回にわたって連続的に繰り返すことができる。
【０１５４】
いくつかの側面では、単離された細胞を固定することができる。固定は、灌流（例えば、手動または自動）または拡散（例えば、手動または自動）方法を使用して行うことができる。いくつかの側面では、固定は、マイクロ流体チップ上で、またはサンプルがマイクロ流体チップから除去された後にマイクロ流体チップ外で行うことができる。いくつかの側面では、サンプルまたは単離された粒子は、固定されなくてもよい。この場合、サンプルは、生体粒子（例えば、哺乳類細胞、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞等）を含んでもよい。サンプルは、固定によって損傷され得る構造を含んでもよい。
【０１５５】
いくつかの側面では、単離された粒子を透過化することができる。透過化は、灌流（例えば、手動または自動）または拡散（例えば、手動または自動）を使用して行うことができる。いくつかの側面では、透過化は、マイクロ流体チップ上で、またはサンプルがマイクロ流体チップから除去された後にマイクロ流体チップ外で行うことができる。いくつかの側面では、サンプルまたは単離された粒子は、透過化されなくてもよい。この場合、サンプルは、マーカー（例えば、細胞外、細胞関連等）を含んでもよい。サンプルは、透過化によって損傷され得る構造を含んでもよい。
【０１５６】
タグと接触させられている被分析物を光退色させることができる。光退色のプロセスは、被分析物と接触させられるタグから発せられる信号を低減させることができる。いくつかの側面では、光退色に使用することができるデバイスは、レーザ、発光ダイオード、発電アーク灯、白熱灯、蛍光灯、紫外線ランプ、またはハロゲンランプを含むことができる。いくつかの側面では、発電アーク灯は、以下の種類のアーク灯、すなわち、ネオン、アルゴン、キセノン、クリプトン、ナトリウム、金属ハロゲン化物、水銀、または炭素から選択することができるが、それらに限定されない。
【０１５７】
いくつかの側面では、被分析物をタグと接触させることができ、タグを化学的に退色させることができる。いくつかの側面では、タグは、検出器によって可読である信号を生成することができる。例えば、信号は、フルオロフォアによって発することができる。いくつかの側面では、信号は、酸化試薬、ハロゲンイオン、還元剤、または任意の他の適切な蛍光消光剤を含むが、それらに限定されない化学物質を使用して、化学的に消光または退色させることができる。いくつかの側面では、還元剤は、ジチオスレイトールである。他の場合において、抗体等のバイオマーカーを認識することができるタグは、適切な試薬を使用して、高い効率で結合部位から化学的に解離することができる。いくつかの側面では、脱染試薬は、２％ＳＤＳ、２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、およびｐＨ６．８の６０ｍＭトリスを伴うトリス系緩衝剤であり得る。
【０１５８】
本方法は、各撮像ステップ後に光退色を含むことができる。使用されるパラメータは、高度に効率的かつ急速なスループット光退色プロセスを実現することができる（図１４および表２）。光退色光源の異なる出力への標識細胞の暴露後に、バイオマーカー（例えば、抗ＥｐＣＡＭ−ＰＥ）を対象とするタグで標識された細胞（例えば、ＭＣＦ−７）の光退色曲線を生成することができる（図１５Ａ）。同一の抗体への複数の共役（例えば、Ａｌｅｘａ  ６４７、Ａｌｅｘａ４８８、ＦＩＴＣ、ＰＥ）を使用して、付加的な曲線を生成することができる（図１５Ｂ）。
【０１５９】
標識および光退色のステップは、バイオマーカーのいくつかの群を研究するように複数回繰り返すことができる。例えば、群を生成するように、２つの着目バイオマーカーを陽性対照マーカー（例えば、核染色）および陰性対照マーカー（例えば、ＣＤ４５）と組み合わせることができる。各回で一群を研究することができ、２回目の免疫染色が起こる前に光退色が続く。いくつかの側面では、逐次免疫染色および光退色の方法は、被分析物上の異なるタンパク質マーカーの発現を判定するために使用することができる。例えば、マイクロ流体チップ上に閉じ込められた被分析物（例えば、希少細胞、癌細胞等）は、ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン、およびＨｏｅｓｃｈｔ陽性であるが、ＣＤ４５陰性である（以下の表２）。
【表２】
2019191190.tif 000004
【０１６０】
いくつかの側面では、バイオマーカーを対象とする１つだけの第１のタグを１回目の免疫染色で使用することができる。この場合、第１のタグは、光退色させることができる。異なるバイオマーカーを対象とする異なる第２のタグは、次回の免疫染色で使用することができる。異なる第２のタグは、光退色させることができる。
【０１６１】
いくつかの側面では、バイオマーカーを対象とする１つだけの第１のタグを１回目の免疫染色で使用することができる。この場合、第１のタグは、光退させることができる。異なるバイオマーカーを対象とする同一の第２のタグは、次回の免疫染色で使用することができる。第２の同一のタグは、光退色させることができる。
【０１６２】
いくつかの側面では、バイオマーカーを対象とする１つだけの第１のタグを１回目の免疫染色で使用することができる。この場合、第１のタグは、光退色させることができる。異なるバイオマーカーを対象とする異なる第２のタグは、次回の免疫染色で使用することができる。第２の異なるタグは、光退色させることができる。
【０１６３】
いくつかの側面では、バイオマーカーを対象とする１つだけの第１のタグを１回目の免疫染色で使用することができる。この場合、第１のタグは、光退色させることができる。同一のバイオマーカーを対象とする異なる第２のタグは、次回の免疫染色で使用することができる。第２の異なるタグは、光退色させることができる。
【０１６４】
いくつかの側面では、複数のタグは、１回目の免疫染色で使用することができる、それぞれが一意のバイオマーカーを対象とする第１のセットを含む。この場合、複数のタグの第１のセットは、光退色させられる。一意のバイオマーカーの異なるセットを対象とする、複数のタグの異なる第２のセットは、次回の免疫染色で使用することができる。異なるタグの第２のセットは、光退色させることができる。いくつかの側面では、第１のセットで使用されるタグのうちのいくつかはまた、第２のセットで使用することもできる。いくつかの側面では、第１のセットの中のタグによって標的にされるバイオマーカーのうちのいくつかはまた、第２のセットの中のタグによって標的にすることもできる。いくつかの側面では、バイオマーカーの第２のセットは、バイオマーカーの第１のセットと同一であり得る。いくつかの側面では、タグの第２のセットは、タグの第１のセットと同一であり得る。いくつかの側面では、タグの第２のセットは、タグの第１のセットと重複するタグを含有することができる。いくつかの側面では、バイオマーカーの第２のセットは、バイオマーカーの第１のセットに重複するバイオマーカーを含有することができる。
【０１６５】
別の場合において、６つの（例えば、複数の）個々の細胞（例えば、癌細胞）をマイクロ流体チップ上に閉じ込めることができる（図１４）。８つのバイオマーカーは、２つの対照バイオマーカー（例えば、１つの陽性対照および１つの陰性対照）を含むことができ、４つのバイオマーカー（例えば、ＥｐＣＡＭ／サイトケラチン、ＭＵＣ１／Ｈｅｒ２、ＣＤ４４／ＣＤ２４、およびＣＤ１６６／ＥＧＦＲ）を１回につき観察することができる。いくつかの側面では、陽性対照バイオマーカー（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色）は、光退色させられなくてもよい。陰性対照バイオマーカー（例えば、ＣＤ４５）は、光退色させることができ、新しいタグを各回の免疫染色で含むことができる。１回あたりの４つのバイオマーカーは、両方の対照および２つの付加的なマーカーを含むことができる。各回は、免疫染色、撮像、および光退色を含むことができる（表２）。
【０１６６】
インライン免疫染色および光退色システムは、被分析物（例えば、希少細胞）の標識および蛍光撮像のために、免疫染色および光退色の方法と併用することができる。インラインシステムは、複数回が使用されるときに、免疫染色および光退色方法の速度および効率を増加させることができる。本システムは、異なるフルオロフォアに共役される抗体の群で希少細胞（例えば、ＣＴＣ）を標識することを含むことができ、その後に光退色が続く。光退色後、希少細胞は、付加的なバイオマーカーに対する異なる蛍光抗体で再標識することができる。
【０１６７】
いくつかの側面では、緩衝剤を使用して、ｅＤＡＲマイクロ流体チップ装置を使用して単離される希少細胞を洗浄することができる。緩衝剤は、本用途に好適な任意の緩衝剤であり得る。単離された細胞は、マイクロ流体チップ上にとどまることができ、インライン弁をオフにすることによって、主要、側方、および廃棄物チャネルを閉鎖することができる。
【０１６８】
本方法は、デバイスを使用して、タグによって発せられる信号またはいくつかのタグによって発せられる信号の検出を提供する。いくつかの側面では、本デバイスは、顕微鏡であり得る。顕微鏡（例えば、共焦点、倒立等）は、蛍光用の光源および検出器を装備することができる。他の場合において、本デバイスは、タグによって発せられる信号の検出のために、当業者に公知であるいくつかのデバイスのうちの１つであり得る。
【０１６９】
いくつかの側面では、検出は、光退色と併せて、光退色が完了した後に、または光退色が開始する前に起こることができる。検出は、タグからの検出可能な信号の放出の終点を判定するために使用することができる。いくつかの側面では、検出は、免疫染色と併せて起こることができる。検出はまた、洗浄ステップの後に、洗浄ステップの前に、洗浄ステップの間に、または洗浄ステップがない場合に起こることもできる。いくつかの側面では、検出はまた、透過化ステップの後に、透過化ステップの前に、透過化ステップの間に、または透過化ステップがない場合に起こることもできる。いくつかの側面では、検出はまた、固定ステップの後に、固定ステップの前に、固定ステップの間に、または固定ステップがない場合に起こることもできる。
【０１７０】
本方法は、タグによって発せられる信号の撮像を含む。撮像に使用されるデバイスは、上記で説明されている、第ＰＣＴ  ＷＯ２０１２０／１２０８１８号に含まれる、または当業者に公知である。例えば、光退色ステップの前および後に蛍光画像を収集することができる。画像は、全ての発光チャネルからのデータを含むことができる。いくつかの側面では、発光チャネルは、黄色（５５５ｎｍ〜６０５ｎｍ）、青色（４３５ｎｍ〜４８５ｎｍ）、緑色（５１０ｎｍ〜５４０ｎｍ）、および赤色（６６５ｎｍ〜６９５ｎｍ）を含むことができる。いくつかの側面では、単離された被分析物は、明視野またはノマルスキー顕微鏡検査法を使用して撮像することができる。
【０１７１】
いくつかの側面では、複数のバイオマーカーの発現について画像を分析することができる。ｅＤＡＲによって捕捉され、バイオマーカー（例えば、Ｈｅｒ２およびＭＵＣ１）および陽性対照バイオマーカー（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ）を検出するようにタグと接触させられる、個々の細胞（例えば、４つ）は、蛍光を使用して撮像することができる（図１６）。複数の画像を単一の多色画像にマージするために、デジタルプロセッサ（例えば、コンピュータ）およびソフトウェアを使用することができる（図１６Ｄ）。
【０１７２】
本方法はさらに、被分析物（例えば、粒子）の収集を提供する。収集される粒子（例えば、希少細胞）は、免疫染色および光退色を受けていてもよい。いくつかの側面では、閉じ込められた希少細胞は、付加的な回の免疫染色およびマイクロ流体チップからの光退色を受けることができる。いくつかの側面では、希少細胞は、さらなる処理のために収集することができる。収集は、リザーバ（例えば、管、プレート、アレイ等）の中への希少細胞の配置を伴うことができる。希少細胞は、収集後に固定することができる。いくつかの側面では、希少細胞は、生体細胞であり得、細胞培養で維持することができる。
【０１７３】
いくつかの側面では、本明細書で提供される方法はさらに、被分析物の単離に続いて、検定プロトコルと併用することができる。本明細書で提供される方法と併用することができる検定の非限定的実施例は、ＲＮＡ抽出（増幅を伴う、または伴わない）、ｃＤＮＡ合成（逆転写）、遺伝子マイクロアレイ、ＤＮＡ抽出、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（単一、ネスト化、定量的リアルタイム、またはリンカ・アダプタ）、またはＤＮＡメチル化分析等の核酸ベースの方法、蛍光原位置ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、レーザキャプチャマイクロダイセクション、フローサイトメトリ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、細胞培養、または比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）研究等のサイトメトリ方法、電気泳動、サザンブロット分析、または酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）等の化学検定方法、マイクロＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ含有量を判定する検定、ＤＮＡ／ＲＮＡ含有量を判定する検定、脂質含有量を判定する検定、炭水化物含有量を判定する検定、代謝産物含有量を判定する検定、タンパク質含有量を判定する検定、および機能的細胞検定（例えば、アポトーシス検定、細胞移動検定、細胞増幅検定、細胞分化検定等）、ならびに同等物を含む。
【０１７４】
標識の種類
免疫染色および光退色の方法は、閉じ込められた被分析物（例えば、粒子）上に位置するバイオマーカーを識別するためのタグまたは標識の使用を含むことができる。いくつかの側面では、タグは、本明細書で説明されるｅＤＡＲ装置、または当業者に公知であるタグの検出のために構成される他の装置を使用して、検出することができる。いくつかの側面では、タグは、本明細書で説明される装置の構成要素を使用して、または当業者に公知である光退色デバイスを使用して、光退色させることができる。いくつかの側面では、タグは、粒子に損傷を引き起こし得る装置を使用して、光退色させることができる。他の場合においては、タグを光退色させることができない。
【０１７５】
いくつかの側面では、タグは、免疫染色のための標識として使用することができる。タグは、分光、光化学、生化学、免疫化学、化学、または他の物理的手段によって検出可能であり得る。例えば、有用なタグは、限定ではないが、放射性核種、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ、ローダミン、テキサスレッド、テトラロージミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコエリトリン（ＰＥ）等）、腫瘍関連プロテアーゼによって活性化される自己消光蛍光化合物、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン、および同等物を含むことができる。いくつかの側面では、タグは、画像内で色として検出可能なスペクトルで発光することができる。色は、赤、青、黄、緑、紫、橙、および同等物を含むことができる。
【０１７６】
いくつかの側面では、タグは、単離された細胞を選択的に標識または強調するように灌流させることができる。そのような試薬の実施例は、限定ではないが、蛍光、免疫蛍光、色素共役分子（抗体、ｆａｂ断片、アプタマー、ポリマー、リガンド、作動物質、拮抗物質、またはそれらの組み合わせ等）、磁気、電気活性、生物活性、または光活性化合物を含む。実施例は、上皮癌細胞内の細胞骨格の一体的構成要素である、サイトケラチンと反応する染色を使用することである。他の色素例は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役マウス抗ヒト上皮抗体（ＨＥＡ）およびフィコエリトリン（ＰＥ）共役抗ＣＤ４５を含む。色素共役抗体の他の実施例は、汎サイトケラチン抗体Ａ４５Ｂ／Ｂ３、ＡＥ１／ＡＥ３、またはＣＡＭ５．２（サイトケラチン８（ＣＫ８）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、またはサイトケラチン１９（ＣＫ１９）を認識する汎サイトケラチン抗体、および乳癌抗原ＮＹ−ＢＲ−１に対するもの（Ｂ７２６Ｐ、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、アンキリン反復ドメイン３０Ａとしても知られている））、Ｂ３０５ＤアイソフォームＡまたはＣ（Ｂ３０５Ｄ−ＡまたはＢ３０５Ｄ−Ｃ、抗原Ｂ３０５Ｄとしても知られている）、Ｈｅｒｍｅｓ抗原（抗原ＣＤ４４、ＰＧＰ１としても知られている）、Ｅ−カドヘリン（ウボモルリン、カドヘリン−１、ＣＤＨ１としても知られている）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５または癌胎児性抗原関連細胞接着分子５としても知られている）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（β−ＨＣＧ、ＣＧＢ、慢性ゴナドトロピン、βポリペプチドとしても知られている）、カテプシン−Ｄ（ＣＴＳＤとしても知られている）、神経ペプチドＹ受容体Ｙ３（ＮＰＹ３Ｒとしても知られている、リポ多糖関連タンパク質３、ＬＡＰ３、融合、ケモカイン（ＣＸＣモチーフ、受容体４）、ＣＸＣＲ４）、癌遺伝子ＥＲＢＢ１（ｃ−ｅｒｂＢ−１、上皮細胞成長因子受容体、ＥＧＦＲとしても知られている）、Ｈｅｒ−２  Ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ−２またはＥＲＢＢ２としても知られている）、ＧＡＢＡ受容体Ａ、パイ（π）ポリペプチド（ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡ−Ａ受容体、パイ（π）ポリペプチド（ＧＡＢＡ  Ａ（π）、γ−アミノ酪酸型Ａ受容体パイ（π）サブユニット）、またはＧＡＢＲＰとしても知られている）、ｐｐＧａｌＮａｃ−Ｔ（６）（β−１−４−Ｎ−アセチル−ガラククトサミニル−トランスフェラーゼ６、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ６、ＧａｌＮＡｃＴ６、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラククトサミニルトランスフェラーゼ６、またはＧＡＬＮＴ６としても知られている）、ＣＫ７（サイトケラチン７、サルコレクチン、ＳＣＬ、ケラチン７、またはＫＲＴ７としても知られている）、ＣＫ８（サイトケラチン８、ケラチン８、またはＫＲＴ８としても知られている）、ＣＫ１８（サイトケラチン１８、ケラチン１８、またはＫＲＴ１８としても知られている）、ＣＫ１９（サイトケラチン１９、ケラチン１９、またはＫＲＴ１９としても知られている）、ＣＫ２０（サイトケラチン２０、ケラチン２０、またはＫＲＴ２０としても知られている）、Ｍａｇｅ（メラノーマ抗原族Ａサブタイプまたは��ＡＧＥ−Ａサブタイプとしても知られている）、Ｍａｇｅ３（メラノーマ抗原族Ａ３またはＭＡＧＡ３としても知られている）、肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ、腎細胞乳頭状癌２、ＲＣＣＰ２、癌原遺伝子ｍｅｔ、またはＭＥＴとしても知られている）、ムチン−１（ＭＵＣ１、癌抗原１５．３、（ＣＡ１５．３）、癌抗原２７．２９（ＣＡ２７．２９）、ＣＤ２２７抗原、エピシアリン、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、多型上皮ムチン（ＰＥＭ）、ピーナッツ反応性尿中ムチン（ＰＵＭ）、腫瘍関連糖タンパク質１２（ＴＡＧ１２）としても知られている）、肉眼的嚢胞性疾患流体タンパク質（ＧＣＤＦＰ−１５、プロラクチン誘導タンパク質、ＰＩＰとしても知られている）、ウロキナーゼ受容体（ｕＰＲ、ＣＤ８７抗原、プラスミノゲン活性化因子受容体ウロキナーゼ型、ＰＬＡＵＲとしても知られている）、ＰＴＨｒＰ（副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ＰＴＨＬＨとしても知られている）、ＢＳ１０６（Ｂ５１１Ｓ、小乳房上皮ムチン、またはＳＢＥＭとしても知られている）、プロスタテイン様リポフィリンＢ（ＬＰＢ、ＬＰＨＢ、抗原ＢＵ１０１、分泌グロビン族１−Ｄ要素２、ＳＣＧＢ１−Ｄ２としても知られている）、マンマグロビン２（ＭＧＢ２、マンマグロビンＢ、ＭＧＢＢ、ラクリグロビン（ＬＧＢ）リポフィリンＣ（ＬＰＣ、ＬＰＨＣ）、分泌グロビン族２Ａ要素１、またはＳＣＧＢ２Ａ１としても知られている）、マンマグロビン（ＭＧＢ、マンマグロビン１、ＭＧＢ１、マンマグロビンＡ、ＭＧＢＡ、分泌グロビン族２Ａ要素２、またはＳＣＧＢ２Ａ２としても知られている）、乳房セリンプロテアーゼ阻害剤（マスピン、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤クレードＢ（オボアルブミン）要素５、またはＳＥＲＰＩＮＢ５としても知られている）、前立腺上皮特異的Ｅｔｓ転写因子（ＰＤＥＦ、無菌アルファモチーフ指向性ドメイン含有ｅｔｓ転写因子、またはＳＰＤＥＦとしても知られている）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（結腸直腸癌抗原ＣＯ１７−１Ａ、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０ｋＤａ（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮特異的抗原（ＥＳＡ）、胃腸腫瘍関連抗原７３３−２（ＧＡ７３３−２）、ＫＳ１／４抗原、染色体膜成分４表面マーカー１（Ｍ４Ｓ１）、ＭＫ−１抗原、ＭＩＣ１８抗原、ＴＲＯＰ−１抗原、またはＴＡＣＳＴＤ１としても知られている）、テロメラーゼ逆転写酵素（テロメラーゼ触媒サブユニットまたはＴＥＲＴとしても知られている）、トレフォイル因子１（乳癌エストロゲン誘発性配列、ＢＣＥＩ、胃腸トレフォイルタンパク質、ＧＴＦ、ｐＳ２タンパク質、またはＴＦＦ１としても知られている）、葉酸塩、またはトレフォイル因子３（胃腸トレフォイル因子、ＩＴＦ、ｐ１．Ｂ、またはＴＦＦ３としても知られている）、あるいは同等物を含むが、それらに限定されない。
【０１７７】
マーカー／バイオマーカー
本方法は、被分析物（例えば、閉じ込められた粒子）によって発現する、その上に位置する、またはその付近に位置することができる、複数のバイオマーカーを提供する。本開示によって検出することができる複数のバイオマーカーは、閉じ込められた粒子に行うことができる、数回の免疫染色および光退色を受ける。各回の免疫染色は、０個のタグ、１個のタグ、２個のタグ、３個のタグ、４個のタグ、５個のタグ、６個のタグ、７個のタグ、８個のタグ、９個のタグ、または１０個のタグを含むことができる。各回の免疫染色のためのタグの範囲は、１〜１０個のタグ（例えば、４つ）を含むことができる。
【０１７８】
いくつかの側面では、バイオマーカー等のマーカーの存在は、タグによって発せられる信号によって示され、タグは、マーカーに対する親和性を有する。本明細書で使用されるように、「〜に対する親和性を有する」という語句は、タグによるマーカーに対する直接分子結合親和性、ならびに１つまたはそれを上回る他の構造を伴う分子錯体を介して相互作用するタグおよびマーカーの能力等の間接親和性の両方を広義に包含する。例えば、いくつかの側面では、タグは、マーカーに対する直接親和性を伴う一次抗体であってもよい一方で、他の側面では、タグは、マーカーに対する間接親和性を伴う二次抗体であってもよい。
【０１７９】
いくつかの側面では、細胞は、所与の細胞が一意および／または識別可能なマーカーまたはバイオマーカープロファイルを呈するように、特定のマーカーまたはバイオマーカープロファイルに従って単離される。ある側面では、マーカーまたはバイオマーカープロファイルは、細胞または細胞型を定義して識別するために使用することができる、１つまたはそれを上回る、２つまたはそれを上回る、３つまたはそれを上回る、４つまたはそれを上回る、５つまたはそれを上回る、６つまたはそれを上回る、７つまたはそれを上回る、８つまたはそれを上回る、９つまたはそれを上回る、あるいは１０個またはそれを上回るマーカーまたはバイオマーカーの特定の組み合わせである。いくつかの側面では、マーカーまたはバイオマーカープロファイルは、特定の一式の性質を有する細胞の特定の集団の一部として、細胞を識別するために使用することができる。
【０１８０】
いくつかの側面では、バイオマーカーは、細胞外である。他の場合において、バイオマーカーは、細胞内、細胞質、細胞質内、細胞表面、核外、核内、リソソーム、ミトコンドリア、小胞体、および同等物であり得る。他の場合において、バイオマーカーは、粒子に付着することができるが、粒子に移行しない。
【０１８１】
いくつかの側面では、バイオマーカーは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、変性タンパク質であり得る。これらの場合において、構造は、天然または変性であり得る。
【０１８２】
いくつかの側面では、バイオマーカーは、核酸、オリゴ核酸、リボ核酸、転移リボ核酸、メッセンジャーリボ核酸、マイクロリボ核酸、またはデオキシリボ核酸であり得る。これらの場合において、酸は、一本または二本鎖であり得る。
【０１８３】
他の場合において、希少粒子は、細胞、タンパク質、タンパク質錯体、核酸、核タンパク質錯体、炭水化物、代謝産物、異化代謝産物、および同等物であり得る。いくつかの側面では、希少粒子は、細胞である。いくつかの側面では、細胞は、癌細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、癌幹細胞、癌表面抗原を表示する癌細胞、例えば、ＣＤ４４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１４０ｂ、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される１つであり得る。
【０１８４】
いくつかの側面では、細胞は、胎児細胞である。いくつかの側面では、胎児細胞は、母体流体中にあり得る。母体流体は、全血、分画血液、血清、血漿、汗、涙、耳内流動物、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣内流動物、糞便、経頸管洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心膜外液、ならびに呼吸器、腸管、および尿生殖路の分泌物を含むことができる。
【０１８５】
いくつかの側面では、被分析物は、他の細胞または細胞外基質に接続されていない、または組織に埋め込まれていない解離細胞である。
【０１８６】
いくつかの側面では、癌幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１４０ｂ、またはＣＤ１６６を含むことができるが、それらに限定されないバイオマーカーに選択的に結合する、他の試薬を灌流させることによって、通常の癌細胞と区別することができる。
【０１８７】
例えば、タグは、ＥＧＦＲおよびＣＤ１６６の発現を検出して腫瘍細胞の間葉特性を実証するように設計することができる。ビメンチンおよびカドヘリン等の他の関連マーカーをこの群で使用することができる。
【０１８８】
他の場合において、粒子の生存能力を示すバイオマーカーを使用することができる。これらの場合において、アポトーシス、壊死、有糸分裂、有糸分裂の段階、減数分裂、および同等物を示す、バイオマーカーを使用することができる。
【０１８９】
いくつかの側面では、各一式のマーカーは、陽性対照バイオマーカーとして核染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、陰性対照バイオマーカーとしてＦＩＴＣと共役したＣＤ４５、およびＰＥまたはＡｌｅｘａ６４７と共役した２つのタンパク質バイオマーカーを含むことができる。いくつかの側面では、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色は、光退色させられなくてもよい。この場合、Ｈｏｅｃｈｓｔは、陽性対照である。この場合、Ｈｏｅｃｈｓｔは、標準光源で光退色させられなくてもよい。この場合、染色を退色させるために、紫外線暴露が使用されてもよい。
【０１９０】
光退色
本方法は、免疫染色後に光退色を提供する。光退色は、被分析物からタグの検出可能部分によって発せられる信号の強度を除去するか、または低減させるための光の使用を伴うことができる。タグは、タグまたは標識が発する信号を消光することによって除去することができる。いくつかの側面では、光退色は、１回の免疫染色後に、または逐次的な回数の免疫染色後に起こることができる。
【０１９１】
いくつかの側面では、光源としてＬＥＤまたはキセノンアーク灯（Ｓｕｔｔｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｎｏｖａｔｏ，  ＣＡ））を使用して、光退色を行うことができる。キセノンアーク灯を使用して、各光退色ステップは、１〜５９秒、１〜３０分、または１５分にわたって起こることができる。
【０１９２】
いくつかの側面では、ＬＥＤキセノンアーク灯の最大出力は、光源の出力密度（例えば、Ｗ／ｍ２）に応じて、１ｍＷ〜２０ｍＷの範囲内で、または１０ｍＷで、または１００ｍＷあるいは１Ｗで、安全性のためにロックすることができる。保護眼鏡を装着すること、または黒い箱で光退色領域を覆うこと等の保護方法の使用を考慮することができる。
【０１９３】
いくつかの側面では、フルオロフォア（例えば、ＰＥ、ＦＩＴＣ、およびＡｌｅｘａ４８８）の蛍光発光を退色させることができる。（例えば、１０％未満まで）信号を退色させることは、短い時間量で（例えば、５分未満で）起こることができる。より長い波長（例えば、６１０ｎｍ〜６６０ｎｍ）を伴うレーザの使用は、より短い波長のものより長い光退色の持続時間を有し得る（図１７Ｂ）。いくつかの側面では、種々の波長での複数のレーザの使用が関与するとき、退色時間は、容認可能なスループットで高い退色効率を達成するように、レーザのうちの１つに対する最小限の要件（例えば、１５分）より長くあり得る。
【０１９４】
例えば、抗ＥｐＣＡＭ−ＰＥで標識され、２番のカバースリップ上に配置されたＭＣＦ−７細胞を使用する、異なる暴露を使用した光退色の曲線が、図１５Ａに示されている。細胞を退色させるために、異なる出力設定（例えば、３つ）を使用することができる。いくつかの側面では、高い出力（例えば、２ｍＷ超）で、暴露時間は、高い（例えば、９５％）退色効率を達成するように短縮させられてもよい（例えば、１０分未満）。
【０１９５】
サンプル
本明細書で提供される本開示では、サンプルは、流体サンプルを含むことができる。流体サンプルは、種々の発生源を起源とすることができる。いくつかの側面では、発生源は、ヒト、哺乳類、動物、微生物、細菌、真菌、酵母、ウイルス、齧歯類、昆虫、両生類、および魚類であってもよい。
【０１９６】
本開示で提供される流体サンプルは、着目希少粒子を含有する場合もあり、含有しない場合もある液体であり得る。いくつかの側面では、サンプルは、例えば、湖、川、海、池、小川、泉、沼地、貯水池、または同等物からの環境流体サンプルであってもよい。さらに他の場合において、サンプルは、例えば、脱塩工場、水処理工場、貯水池、泉、小川、氷河水流、給水塔、または飲料水源と見なされ得る他の水源からの水サンプルであってもよい。
【０１９７】
いくつかの側面では、本開示は、希少粒子である被分析物を含む、被分析物である。希少粒子は、低レベルで流体サンプル中に存在する細胞または巨大分子であり得る。ある側面では、希少粒子は、細胞、タンパク質、タンパク質錯体、核酸、核タンパク質錯体、炭水化物、代謝産物、異化代謝産物、および同等物であり得る。ある側面では、粒子は、流体中の全粒子集団の約１０％未満の濃度で、または流体中の全粒子集団の約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％未満で、あるいはそれより少なく、流体サンプル中に存在する場合に希少と見なすことができる。さらに他の場合において、希少粒子は、流体中の全粒子集団の約１０３分の１未満で、または流体中の全粒子集団の約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２分の１未満で、あるいはそれより少なく、流体サンプル中に存在し得る。ある側面では、粒子は、流体中の全粒子集団の１０％未満の濃度で、または流体中の全粒子集団の９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％未満で、あるいはそれより少なく、流体サンプル中に存在する場合に希少と見なすことができる。さらに他の場合において、希少粒子は、流体中の全粒子集団の１０３分の１未満で、または流体中の全粒子集団の１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２分の１未満で、あるいはそれより少なく、流体サンプル中に存在し得る。
【０１９８】
いくつかの側面では、流体サンプルは、ある割合の水および／または他の要素を含有することができる。例えば、流体サンプルは、いくつかある物質の中でも血漿を含有する、血液であり得る。概して、血漿は、大部分が水であり、タンパク質、イオン、ビタミン、酵素、ホルモン、および体内の他の化学物質を含有することができる。
【０１９９】
いくつかの側面では、流体サンプルは、体液であり得る。体液は、多くの場合、液体中の生物学的粒子の複合懸濁液である。例えば、体液は、血液であり得る。いくつかの側面では、血液は、血漿および／または細胞（例えば、赤血球、白血球、循環希少細胞）、ならびに血小板を含むことができる。いくつかの側面では、血液の液量の５５％は、細胞であり得る。いくつかの側面では、血液サンプルは、血液の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が細胞であるように、濃縮することができる。いくつかの側面では、血液サンプルは、１つまたはそれを上回る細胞型が奪われた血液を含有する。いくつかの側面では、血液サンプルは、１つまたはそれを上回る細胞型が豊富にされた血液を含有する。いくつかの側面では、血液サンプルは、血液の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が細胞であるように、希釈することができる。いくつかの側面では、血液サンプルは、細胞の異質、均質、または近均質混合を含有する。
【０２００】
体液は、全血、分画血液、血清、血漿、汗、涙、耳内流動物、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣内流動物、糞便、経頸管洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心膜外液、ならびに呼吸器、腸管、および尿生殖路の分泌物を含むことができるが、それらに限定されない。いくつかの側面では、体液は、細胞および生体粒子の混合物を含有する種々の臓器（例えば、肺）と接触することができる。
【０２０１】
いくつかの側面では、体液は、希少粒子を含有することができる。いくつかの側面では、希少粒子は、希少細胞である。希少細胞は、有核または非有核であり得る。希少細胞は、悪性表現型を発現する細胞、母体末梢血中の胎児細胞等の胎児細胞、腫瘍から血液または他の体液に流された腫瘍細胞等の腫瘍細胞、ＨＩＶに感染した細胞等のウイルスに感染した細胞、着目遺伝子が移入された細胞、および自己反応障害に罹患した対象の末梢血中に存在するＴ細胞またはＢ細胞の異常サブタイプを含むが、それらに限定されない。
【０２０２】
いくつかの側面では、体液は、血液であり得、希少細胞を含有することができる。希少細胞は、赤血球、白血球細胞、白血球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞、幹細胞、赤血球系細胞、癌細胞、腫瘍細胞、または内胚葉、中胚葉、外胚葉、あるいは神経堤組織を起源とする任意の細胞から単離された細胞であり得る。希少細胞は、一次発生源または二次発生源（例えば、細胞株）に由来し得る。
【０２０３】
特定の体液（例えば、血液）中に存在する細胞および生体粒子の種類および量は、生物の健康についての情報を明らかにすることができる。例えば、癌に罹患している対象は、体液中に癌細胞を有し得る。感染に罹患している対象からのサンプルは、感染を示す増加した数の免疫細胞（例えば、リンパ球、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞等）を含有し得るか、または微生物細胞あるいは核酸等の病原性物質を含有し得る。妊婦からのサンプルは、胎児の遺伝子型または核型を示す胎児細胞を含有し得る。
【０２０４】
いくつかの細胞または生体粒子は、通常数量と比較して希少数量で体液中に存在し得る。そのような希少細胞は、循環腫瘍細胞、癌幹細胞等を含むことができる。これらの細胞は、身体の領域中で発生する事象（例えば、癌）の結果として、体液中に出現することができる。細胞は、体液を含有する臓器または体液の付近の臓器を起源とすることができる。例えば、希少乳癌細胞は、乳腺の付近に位置する血液またはリンパ液中に存在し得る。いくつかの側面では、細胞は、より遠隔の臓器を起源とする。例えば、精巣腫瘍を起源とする細胞は、腕から採取された血液サンプル中に存在し得る。
【０２０５】
分析
本開示はさらに、分析を行うことができる方法を提供する。いくつかの側面では、分析は、アリコートを調査するための発生源を含むことができる。アリコートが化学発光または生物発酵を本質的に呈することができる被分析物（例えば、希少粒子）を含有する、他の場合において、本装置は、アリコートを調査するための発生源を必要としなくてもよい。
【０２０６】
いくつかの側面では、ランク付けデバイスを、コンピュータ、プロセッサ、コントローラ、集積回路を伴うチップ、回路基板、電子要素、ソフトウェア、アルゴリズム、またはそれらの組み合わせから選択することができる。いくつかの側面では、プロセッサは、デジタルプロセッサ（例えば、ＦＧＰＡ、ＡＳＩＣ、またはＲＴ）であり得る。いくつかの側面では、コンピュータは、検出デバイスから信号を受け取り、アルゴリズムを通してアリコートをランク付けする。ランク付けデバイスは、ランク付けの値（例えば、流体サンプル中の希少粒子の存在、非存在、数量、識別、または組成）に基づいて、アリコートを適切なチャネルの中へ指向することができる。
【０２０７】
いくつかの側面では、第１の検出器に由来する情報を分析することができる。第１の検出器からの情報を分析することができ、結果は、被分析物が陽性であることを示すことができる。いくつかの側面では、検出器からの情報を分析することができ、結果は、被分析物が陰性であることを示すことができる。いくつかの側面では、ランク付けデバイスは、被分析物を選別するように、陽性または陰性被分析物を読み取る信号を流体力学的切替要素（例えば、ソレノイド弁）に送信する。いくつかの側面では、陽性被分析物は、マイクロ流体チップの一意のチャネルへ移動させることができる。いくつかの側面では、陽性被分析物は、マイクロ流体チップの一意のチャネルへ移動させることができる。いくつかの側面では、陽性被分析物は、マイクロ流体チップの廃棄物チャンバへ移動させることができる。いくつかの側面では、陰性被分析物は、マイクロ流体チップの一意のチャネルへ移動させることができる。いくつかの側面では、陰性被分析物は、マイクロ流体チップの一意のチャネルへ移動させることができる。いくつかの側面では、陰性被分析物は、マイクロ流体チップの廃棄物チャンバへ移動させることができる。いくつかの側面では、陽性被分析物は、陰性被分析物から分割される。
【０２０８】
いくつかの側面では、第２の検出器から中継される情報を使用して、分析を行うことができる。第２の検出器は、第１の検出器を使用して取得される情報を確認するために使用することができる。いくつかの側面では、第２の検出器は、マイクロ流体チップ上に位置することができる。いくつかの側面では、第２の検出器は、マイクロ流体チップ上に位置しなくてもよい。いくつかの側面では、第２の検出器は、第１の検出器によって検出される信号に基づいて選別することができる細胞から信号を取得する。いくつかの側面では、第２の検出器は、選別された細胞から検出信号を受信し、信号についての情報をコンピュータに送信することができる。コンピュータは、適切な細胞が選別されたかどうかを判定するために使用することができる。
【０２０９】
いくつかの側面では、免疫染色の方法中に取得される情報の分析を行うことができる。被分析物の免疫染色の方法は、マイクロ流体チップのチャンバ中で起こる。チャンバでは、検出器が１回目の染色から１つまたは複数の信号を検出することができる。いくつかの側面では、１つまたは複数の信号を光退色させることができる。検出器は、発せられる信号の持続時間および強度を監視することができる。いくつかの側面では、被分析物は、２回目の染色を受けることができる。検出器は、２回目の染色に続いて、被分析物によって発せられる信号を検出することができる。いくつかの側面では、１つまたは複数の信号を光退色させることができる。検出器は、発せられる信号の持続時間および強度を監視することができる。いくつかの側面では、免疫染色および光退色のサイクルは、複数のサイクルで繰り返すことができる。例えば、免疫染色被分析物の１つまたはそれを上回る信号を１回目の免疫染色と比較して、光退色が起こったことを確実にするために、コンピュータを使用することができる。
【０２１０】
単一被分析物アレイデバイスおよび方法
本開示は、液相から単一被分析物を捕捉するための方法および装置を提供する。いくつかの側面では、被分析物は、粒子であり得る。他の場合において、被分析物は、細胞であり得る。被分析物は、チャンバの中に閉じ込めることができる。他の場合において、被分析物は、ウェルの中に閉じ込めることができる。他の場合において、被分析物は、パッチ上に閉じ込めることができる。いくつかの側面では、チャンバまたはウェルは、線形形式で配列することができる。他の場合において、チャンバまたはウェルは、アレイ形式で配列することができる。
【０２１１】
本デバイスは、種々の形式で設計することができる。例えば、２次元（２Ｄ）デバイスを作成することができる。いくつかの側面では、２Ｄデバイスは、軸方向線形流を有することができる（図１７Ｂ）。軸方向線形流は、直列流設計であり得る。いくつかの側面では、３次元（３Ｄ）デバイスを作成することができる。例えば、３Ｄデバイスは、グリッドに配列されたチャンバを有することができる（図１７Ｃ）。必要であれば、２Ｄまたは３Ｄ方略のいずれかに使用することができる、いくつかの代替的な設計がある。
【０２１２】
２Ｄデバイスは、種々の潜在的な寸法を伴うチャネルおよびチャンバを有することができる。寸法は、直列流抵抗トラップ設計に影響を及ぼし得る。潜在的な閉じ込め密度および寸法を伴うデバイスの概略図が、図１８および差し込み図内のデバイスの拡大領域に示されている。いくつかの側面では、潜在的な寸法は、主要チャネルの幅、収縮部の幅、主要チャネル収縮入口から主要チャネル収縮出口までの長さ、収縮部を横断する長さ、ならびに主要チャネル、収縮部、および収縮チャンバの高さを含むことができる。
【０２１３】
いくつかの側面では、直列流抵抗トラップは、マイクロ流体デバイスと対合することができる。本デバイスは、サンプルを導入することができる入口（左側）、ならびに過剰な液相を除去することができる出口（右側）から成ることができる。デバイスの中心は、組み込むことができる流動抵抗トラップの高い密度を有することができる。図１８Ｂは、図１８Ｃの拡大領域を示す。いくつかの側面では、流動抵抗トラップは、デバイスの機能的部分を構成することができる。
【０２１４】
３Ｄデバイスは、種々の潜在的な寸法および形状を伴うチャンバを有することができる。寸法および形状は、並列流抵抗トラップ設計に影響を及ぼし得る。いくつかの側面では、３Ｄデバイスのチャンバは、ウェルであり得る。デバイスは、溶液から単一粒子／細胞（例えば、ビーズ、細胞等）を閉じ込めることができ、本デバイスを形成するように、複数のウェルを並列に配列することができる。３Ｄデバイス上のウェルの断面側面図は、潜在的な形状変形例を図示することができる（図１９）。いくつかの側面では、ウェル設計は、らせん、楕円形、放物線、双曲線、多角形、無限角形、千角形、十角形、九角形、１０の１００乗角形、百角形、七角形、十一角形、六角形、百万角形、一万角形、八角形、五角形、四角形、三角形、台形、円柱、超平面、平面、プラトンの立体、十二面体、六面体、二十面体、八面体、四面体、環状体、二次曲面、半球体、円柱、球体、双曲面、放物面、多胞体、正百二十胞体、正六百胞体、正十六胞体、正二十四胞体、正五胞体、正八胞体、球錐、または半球体を含むことができる。いくつかの側面では、ウェルの寸法は、ｈ１＝ウェルの深度、ｈ２＝収縮部の深度、ｒ１＝ウェルの半径、およびｒ２＝収縮部の半径によって画定することができる。
【０２１５】
いくつかの側面では、デバイスの物理的材料は、ガラス、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ、マイラー、Ｄｙｍａｘ、ポリウレタン）を含むが、それらに限定されない、光学的透明材料から成ることができる。他の場合において、デバイスの物理的材料は、複数の層から構築することができる。いくつかの側面では、複数の層は、前述の材料の種々の層を備えることができる。
【０２１６】
本開示で説明されるデバイスは、本明細書で説明される方法を使用して構築することができる。例えば、図２０は、デバイスのうちのいくつかを構築するために使用することができる方法の概略的描写である。いくつかの側面では、本方法は、層毎にデバイス層を構築するステップを含むことができる。第１の層については、固体基板（例えば、シリコンウエハ）をフォトレジストでスピンコーティングすることができる。コーティングされた基板は、紫外線透明および不透明領域で描写される所望の設計で刻み込まれたフォトリソグラフィックマスクとしっかり接触して配置することができる。マスクおよび基板は、紫外線に暴露させることができる。紫外線は、フォトレジスト内の光化学物質を架橋するために使用することができる。加工されたデバイスの第１の層は、フォトレジストの非架橋部分を溶解させる、結果として生じた架橋パターンを現像することによって完成することができる。いくつかの側面では、第２の層は、金型を使用して構築することができる。金型は、フォトレジストの別の層をコーティングし、暴露し、現像することによって製作することができる。いくつかの側面では、金型は、硬化性（例えば、ＰＤＭＳ）またはエンボス加工可能材料にチャネル、チャンバ、およびウェル構造を形成するために使用することができる。例えば、金型は、皿の中に配置することができる。いくつかの側面では、ＰＤＭＳは、金型に注ぎ入れて硬化させることができる。ＰＤＭＳは、金型から解放することができ、入口および出口を開けることができる。いくつかの側面では、チャネルおよびチャンバまたはウェルを取り囲むように、パターン形成されたＰＤＭＳを平坦ガラスまたはＰＤＭＳ片に密閉することができる。
【０２１７】
本開示で説明されるデバイスは、本明細書で説明される方法を使用して構築することができる。例えば、並列流抵抗トラップを生産するために、微細加工方法を使用することができる（図２１）。本デバイスは、ポリマー材料、フォトレジスト、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリメチルウレタン（ＰＵＭＡ）等を含むことができるが、それらに限定されない、フォトレジスト（例えば、ＳＵ−８）以外の材料で加工することができる。いくつかの側面では、微細加工方法は、（１）シリコン（Ｓｉ）ウエハ上に犠牲層をスピンコーティングするステップ、（２）最上部にフォトレジスト（ＳＵ−８）を堆積させるステップ、（３）フォトマスクをマイクロアレイパターンと整合させ、ウエハを紫外線に暴露させるステップ、（４）非架橋フォトレジストを処理して除去し、必要であれば、フォトレジストの第２の層をスピンコーティングして処理するステップ、および最終的に、（５）ＳｉウエハからＳＵ−８層を解放し、多孔質ポリカーボネートフィルタ（経路１のみ）および／または管類を挿入するための単一の出口を伴うＰＤＭＳマウント（経路１−２）上に組み立てるステップを含むことができる。
【０２１８】
いくつかの側面では、単一細胞を流体力によって閉じ込めることができる。流体力は、細胞を保持することができる。いくつかの側面では、流体力は、デバイスの表面上の分子との相互作用によって増進することができる。いくつかの側面では、分子は、特異的結合（例えば、アプタマー、抗体、１級アミン、スクシンイミジルエステル）または非特異的結合（例えば、高分子電解質）を呈することができる。他の場合において、流体力は、光学力によって増進することができる。光学力は、引力（例えば、単一ビーム勾配光学トラップ、渦トラップ）、反発力（例えば、散乱）、界面張力（例えば、マランゴニ力）、静電力（反発力、引力）、または磁力（例えば、固有の磁気的に影響を受けやすい内部種との印加された磁場の相互作用によって及ぼされる）を含むことができるが、それらに限定されない。
【０２１９】
本開示は、サンプルの隔離または閉じ込め、操作、および検出を行うことができる、デバイス、方法、およびシステムを提供する。いくつかの側面では、サンプルは、マイクロ流体デバイスの中に閉じ込められている（例えば、流体流から生成される力、重力、光学力、または分子相互作用、あるいは共有結合の形成によって固定位置で保持される）被分析物から成ることができる。
【０２２０】
いくつかの側面では、被分析物は、マイクロ流体デバイス内のウェルまたはコンパートメント等の微小空洞で閉じ込められ、固定化され、保持され、または別様にそれに取り付けられる。さらなる側面では、被分析物は、微小空洞内にある。いくつかの側面では、被分析物は、マイクロ流体デバイス内の基板でコーティングされたパッチ等のマイクロパッチで閉じ込められ、固定化され、保持され、または別様にそれに取り付けられる。さらなる側面では、被分析物は、流体流から生成される力および／または重力を通して、微小空洞またはマイクロパッチで閉じ込められ、固定化され、保持され、または別様にそれに取り付けられる。いくつかの側面では、被分析物は、接着力、分子相互作用、および／または共有結合を通して、微小空洞またはマイクロパッチで閉じ込められ、固定化され、保持され、または別様にそれに取り付けられる。いくつかの側面では、被分析物は、限定ではないが、ファン・デル・ワールス相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、および／または非特異的吸着を含む、非共有結合を通して、微小空洞またはマイクロパッチで閉じ込められ、固定化され、保持され、または別様にそれに取り付けられる。
【０２２１】
いくつかの側面では、被分析物は、単一細胞である。被分析物は、タグと接触させることができる。いくつかの側面では、タグは、被分析物上の標的を認識することができる。タグは、標的に結合することができる。いくつかの側面では、標的は、被分析物の分子成分であり得る。いくつかの側面では、分子成分は、被分析物の外部にあり得る。他の場合において、分子成分は、被分析物の内部にあり得る。タグは、種々の検出方法を使用して検出することができる。
【０２２２】
本開示は、単一被分析物の格納または物理的閉じ込めのための方法を提供する。いくつかの側面では、被分析物は、細胞であり得る。細胞は、液体が流路を辿ることができ、かつ物理的に画定された位置へ移行することができる、液相で輸送することができる。いくつかの側面では、細胞は、画定された位置にとどまることができる。細胞を画定された位置に閉じ込めるように、流動ベースの力を細胞に加えることができる。別の場合において、流体流路が入口から出口に対して直列であるため、細胞を連続的に閉じ込めることができる。さらに別の場合において、複数の流体流路およびそれらの同等の複数の単一細胞を、並行して閉じ込める／隔離することができる。いくつかの側面では、並行して閉じ込めることは、入口と出口との間で細胞によって同時に被られ得る多数の流路によるものであり得る。
【０２２３】
好ましい場合において、本方法は、流体経路を辿ってチャンバに進入する流体サンプル中の各被分析物（例えば、細胞）を提供することができる。被分析物は、チャンバに進入し、流体経路を遮断して、流体経路を通る流動を停止させることができる。この場合、別の被分析物は、チャンバに進入しなくてもよい。流体サンプル中の残りの細胞は、チャンバのうちのいくつかまたは全てが被分析物を含有するまで、残りの空のチャンバに進入することができる。
【０２２４】
いくつかの側面では、直列流抵抗トラップが生物学的由来サンプルを収集し、離散化し、読み出すように機能する方法が、本明細書で開示される。例えば、図２２Ａは、どのようにしてサンプルが画定された場所を連続的に充填することができるかを示す。本プロセスは、サンプルの臨界寸法（直径）が（１）主要チャネルの高さおよび幅より小さい、および（２）収縮部の高さまたは幅より大きいときに起こることができる。いくつかの側面では、流動に対する抵抗差が、サンプルを画定された領域の中へ指向することができ、そうするとすぐに、収縮部を閉塞することができ、流動を停止させることができる。後続のサンプルは、全てのトラップが充填されるまで、次の閉じ込め場所まで主要チャネルを通る流路を辿ることができる。例えば、図２２Ｂは、どのようにしてサンプル入口を通して不混和液相を導入することができるかを示す。不混和液相は、閉じ込められたサンプルを連続的に離散化することができる。いくつかの側面では、不混和液体は、サンプル領域に流入しなくてもよい。不混和液体の流体流の不足は、閉塞制約に起因し得る。いくつかの側面では、流体流の不足は、チャネル材料および閉じ込め領域の寸法との不混和相の接触角度差によって生成される界面障壁に起因し得る。いくつかの側面では、各サンプルに関する時間的情報を各場所で物理的に符号化することができる。離散化サンプルの様々な化学的性質を検出することができる（図２２Ｃ）。
【０２２５】
いくつかの側面では、並列流抵抗トラップが生物学的由来サンプルを収集し、離散化し、読み出すように機能する方法が、本明細書で開示される。例えば、図２２Ａおよび２２Ｄは、どのようにしてサンプルが並列流抵抗トラップを充填することができるかを示す。いくつかの側面では、サンプル粒子は、デバイスの最上部からウェルの中へ流動を辿ることができる。複数のサンプルを並列流抵抗トラップの中に同時に閉じ込めることができる。いくつかの側面では、サンプル収集の速度は、直列流抵抗トラップよりもむしろ並列流抵抗トラップを使用すると、より速くあり得る。例えば、図２２Ｄは、どのようにして閉じ込めウェルの平面の上方または下方で不混和相を置換できるかを示す。いくつかの側面では、閉じ込めウェルの平面の上方または下方の不混和相は、離散化サンプルを生成することができる。いくつかの側面では、各サンプルに関する時間的情報を各場所で物理的に符号化することができる。離散化サンプルの様々な化学的性質を検出することができる（図２２Ｃ）。
【０２２６】
いくつかの側面では、閉じ込められた被分析物を単一被分析物アレイから解放し、分析することができる。例えば、図２４は、分析および放出のために生物学的被分析物のアレイを閉じ込めるための可能な順序を図示する。いくつかの側面では、順序は、（１）トラップを通して流体流を移動させるように、管類から流体を適用すること、（２）いったん被分析物が閉じ込められると、局所的領域中の流動を停止させること、および（３）緩衝剤を使用して過剰な流体および粒子を洗い流すことを含むことができる。
【０２２７】
いくつかの側面では、単一被分析物アレイの中に閉じ込められた被分析物は、さらなる分析を受けることができる。いくつかの側面では、単一被分析物アレイは、逐次免疫染色および光退色の方法とともに使用することができる。
【０２２８】
いくつかの側面では、単一被分析物被分析物アレイは、核酸の分析のための当業者に公知である方法とともに使用することができる。いくつかの側面では、核酸の分析は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むことができる。単一被分析物アレイを使用してＰＣＲを行う場合（図１７）、全てのチャンンバを流体中の単一の被分析物で充填することができる。各チャンバを（例えば、油を使用して）密閉することができ、並行して各単一の被分析物にＰＣＲを行うことができる。
【０２２９】
単一被分析物アレイの個々のウェルまたはチャンバに含有される被分析物は、種々の技法を使用して検出することができる。例えば、ウェルまたはチャンバ中の被分析物は、顕微鏡検査法を使用して撮像することができる。いくつかの側面では、顕微鏡検査法は、明視野顕微鏡検査法を含むことができる。いくつかの側面では、顕微鏡検査法は、蛍光顕微鏡検査法を含むことができる。顕微鏡検査法のいずれの場合でも、サンプルをステージ上に配置することができる。いくつかの側面では、ステージは、手動で操作することができる。他の場合において、ステージは、コンピュータプログラムによって制御することができる、自動平行移動ステージであり得る。顕微鏡検査法のいずれの場合でも、ＣＣＤカメラによって画像を取得することができる。
【０２３０】
用途
本開示は、種々の用途で使用される方法を提供する。いくつかの側面では、本方法は、流体サンプル、例えば、血液サンプル等の生物学的流体中の希少粒子の存在と関連付けられる条件の診断または予後を対象に提供することができる。
【０２３１】
本明細書で説明される方法および装置は、（ａ）タグを、該タグおよび被分析物を含む錯体に変換するために好適な条件下で、対象からの生物学的流体をタグと接触させるステップと、（ｂ）生物学的流体のアリコート中で、ステップ（ａ）で形成された錯体の存在または非存在を検出するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）で形成された錯体の存在または非存在に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、（ｄ）単離されたアリコートの分析に基づいて、診断または予後を対象に提供するステップとを含むことができる。いくつかの側面では、ステップ（ｂ）は、放射線源でアリコートを調査し、被分析物に結合されたタグによって発せられる信号を検出するステップを含むことができる。
【０２３２】
種々の側面では、流体内の被分析物上に存在する複数のマーカーを識別するために方法が提供され、本方法は、（ａ）放射線源を使用して、第１のタグから信号を検出するステップであって、第１のタグは、被分析物上の第１のマーカーに結合する第１の構造に取り付けられる、ステップと、（ｂ）第１のタグの存在に基づいて被分析物を分割するステップと、（ｃ）第１のタグの信号の強度を低減させるステップと、（ｄ）被分析物を、第２のマーカーに結合する第２の構造と接触させるステップであって、第２の構造は、第２のタグに取り付けられる、ステップと、（ｅ）第２のタグを検出するステップとを含む。
【０２３３】
いくつかの側面では、ステップ（ｂ）の分割は、第１のタグおよび第３のタグの存在に基づく。さらなる側面では、ステップ（ｂ）の分割は、マイクロ流体デバイスを用いて行われる。なおもさらなる側面では、ステップ（ｂ）の分割およびステップ（ｂ）またはステップ（ｅ）のうちの少なくとも１つにおける検出は、同一のマイクロ流体デバイス内で起こる。
【０２３４】
種々の側面では、被分析物上に存在する複数のマーカーを検出するために方法が提供され、本方法は、被分析物を第１のタグと接触させるステップであって、被分析物は、第１のマーカーを含み、第１のタグは、第１のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、第１のタグによって発せられる第１の信号を検出するステップであって、第１の信号の存在は、第１のマーカーの存在を示す、ステップと、第１の信号の存在に基づいて、被分析物を含む流体を分割するステップと、第１の信号の強度を低減させるステップと、被分析物を第２のタグと接触させるステップであって、被分析物は、第２のマーカーを含み、第２のタグは、第２のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、第２のタグによって発せられる第２の信号を検出するステップであって、第２の信号の存在は、第２のマーカーの存在を示す、ステップとを含む。
【０２３５】
いくつかの側面では、第１のタグの信号は、５０％超低減させられる。ある側面では、信号の強度を低減させるステップは、放射線を被分析物に印加することによって達成される。さらなる側面では、白色光が、信号の強度を低減させるために使用される。なおもさらなる側面では、レーザが、信号の強度を低減させるために使用される。他の側面では、発光ダイオードが、信号の強度を低減させるために使用される。いくつかの側面では、信号の強度を低減させるステップは、化学物質を第１のタグに適用することによって達成される。ある側面では、化学物質は、還元剤である。さらなる側面では、還元剤は、ジチオスレイトールである。
【０２３６】
いくつかの側面では、流体を分割するステップは、第１の信号および第３の信号の存在に基づく。さらなる側面では、第１の信号を検出するステップ、第２の信号を検出するステップ、流体を分割するステップ、またはそれらの組み合わせは、マイクロ流体デバイスを使用して行われる。
【０２３７】
いくつかの側面では、被分析物は、細胞である。ある側面では、細胞は、癌細胞である。さらなる側面では、癌細胞は、希少細胞である。いくつかの側面では、被分析物は、循環腫瘍細胞である。ある側面では、細胞は、細菌細胞、免疫細胞、胎児細胞、治療後に残留する疾患を示す細胞、または幹細胞である。さらなる側面では、細胞は、流体中の全細胞集団の１％未満を含む、希少細胞である。ある側面では、被分析物は、解離細胞である。
【０２３８】
いくつかの側面では、流体は、全血、分画血液、血清、血漿、汗、涙、耳内流動物、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣内流動物、糞便、経頸管洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心膜外液、ならびに呼吸器、腸管、および尿生殖路の分泌物から成る群から選択される。ある側面では、流体は、全血である。他の側面では、流体は、分画全血である。
【０２３９】
いくつかの側面では、第１のタグは、フルオロフォアである。さらなる側面では、第１のタグは、抗体である。他の側面では、第１のタグは、核酸から成るプローブである。ある側面では、本方法はさらに、第１のタグおよび第２のタグから信号を撮像するステップを含む。いくつかの側面では、被分析物は、流体中に存在し、流体は、より大きい体積の流体のアリコートである。さらなる側面では、第１のタグによって発せられる第１の信号を検出するステップは、複数の被分析物上で同時に行われる、
【０２４０】
ある側面では、分割は、半自動的または自動的に行われる。ある側面では、分割は、アンサンブル決定アリコートランク付けによって行われる。いくつかの側面では、フローサイトメータが、被分析物を分割するために使用されない。
【０２４１】
さらなる側面では、被分析物は、複数のマーカーを含む。いくつかの側面では、複数のマーカーのそれぞれは、バイオマーカーである。ある側面では、被分析物は、発現プロファイルを含み、発現プロファイルは、複数のマーカーによって定義される。
【０２４２】
さらなる側面では、本方法はさらに、被分析物を緩衝剤と接触させるステップを含む。なおもさらなるいくつかの側面では、緩衝剤は、固定剤を含有する。ある側面では、緩衝剤は、透過化剤を含有する。他の側面では、緩衝剤は、洗浄緩衝剤である。
【０２４３】
種々の側面では、第１の細胞型および第２の細胞型を含むサンプルから細胞を単離するために方法が提供され、本方法は、（ａ）一式の管類を介してサンプルをマイクロ流体チップに導入するステップであって、マイクロ流体チップは、（ｉ）一式の管類に流体的に接続される少なくとも１つのチャネルと、（ｉｉ）少なくとも１つのチャネル内の細胞の信号を検出するように構成される検出器と、（ｉｉｉ）少なくとも１つのチャネルに流体的に接続される少なくとも１つのチャンバとを備える、ステップと、（ｂ）検出器を通り過ぎてサンプルの一部分を流動させるステップと、（ｃ）サンプルの一部分内の第１の細胞型の存在または非存在を検出するために、検出器を使用するステップと、（ｄ）第１の細胞型がサンプルの一部分内で検出される場合、サンプルのアリコートをチャンバの中へ指向するステップであって、アリコートは、第１の細胞型を含む、ステップと、（ｅ）ステップ（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を繰り返し、それによって、チャンバが、サンプル内の第１の細胞型の総数の８０％超、およびサンプル内の第２の細胞型の総数の５％未満を含むように、チャンバ中の複数のアリコートを単離するステップとを含む。
【０２４４】
種々の側面では、サンプルから細胞を単離するために方法が提供され、本方法は、（ａ）サンプルをマイクロ流体チップに導入するステップであって、サンプルは、第１の細胞型と、第２の細胞型とを含み、マイクロ流体チップは、チャネルと、チャネル内で発せられる信号を検出するように構成される検出器と、チャネルと流体連通しているチャンバとを備える、ステップと、（ｂ）チャネルを通してサンプルの一部分を流動させるステップであって、一部分は、複数の第１の細胞型、複数の第２の細胞型、またはそれらの組み合わせを含む、ステップと、（ｃ）検出器を使用して、一部分内の第１の細胞型の存在または非存在を検出するステップと、（ｄ）第１の細胞型が一部分内に存在する場合、一部分をチャンバの中へ指向するステップと、（ｅ）チャンバが、サンプル内に存在する第１の細胞型の総数の８０％超、およびサンプル内に存在する第２の細胞型の総数の５％未満を含むように、十分な回数で（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を繰り返すステップとを含む。
【０２４５】
いくつかの側面では、第１の細胞型および第２の細胞型のうちの少なくとも１つは、癌細胞である。ある側面では、癌細胞は、希少細胞である。さらなる側面では、第１の細胞型および第２の細胞型のうちの少なくとも１つは、循環腫瘍細胞である。なおもさらなる側面では、第１の細胞型および第２の細胞型のうちの少なくとも１つは、細菌細胞、免疫細胞、胎児細胞、治療後に残留する疾患を示す細胞、または幹細胞である。いくつかの側面では、第１の細胞型および第２の細胞型のうちの少なくとも１つは、サンプル中の全細胞集団の１％未満を含む、希少細胞である。
【０２４６】
いくつかの側面では、サンプルは、全血、分画血液、血清、血漿、汗、涙、耳内流動物、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣内流動物、糞便、経頸管洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心膜外液、ならびに呼吸器、腸管、および尿生殖路の分泌物から成る群から選択される。ある側面では、サンプルは、全血である。他の側面では、サンプルは、分画全血である。
【０２４７】
いくつかの側面では、チャンバは、マイクロ流体チップの外部にある。ある側面では、チャンバは、バイアル、微小遠心管、またはウェルプレート内のウェルである。さらなる側面では、チャンバは、管類を介してチャンバと流体連通している。なおもさらなる側面では、チャンバは、毛細管を介してチャネルと流体連通している。
【０２４８】
種々の側面では、被分析物上に存在する複数のマーカーを識別するために方法が提供され、本方法は、（ａ）複数の微小空洞またはマイクロパッチを備える基板を経由して被分析物を流動させることによって、複数の被分析物を分割するステップであって、微小空洞またはマイクロパッチの大部分は、多くても１つの被分析物を含有することが可能であり、微小空洞またはマイクロパッチは、マイクロ流体デバイスの中に位置する、ステップと、（ｂ）微小空洞またはマイクロパッチの中で、各被分析物を、第１のマーカーに結合することが可能である第１の構造と接触させるステップであって、第１の構造は、第１のタグに接続される、ステップと、（ｃ）第１のタグから信号を検出するステップと、（ｄ）第１のタグの信号のレベルを低減させるステップと、（ｅ）被分析物を、第２のマーカーに結合する第２の構造と接触させるステップであって、第２の構造は、第２のタグに接続される、ステップと、（ｆ）第２のタグを検出するステップとを含む。
【０２４９】
いくつかの側面では、ステップ（ｂ）の接触は、微小空洞またはマイクロパッチと流体連通しているチャネルを通して、第１の構造を備える流体を流動させることによって達成される。ある側面では、ステップ（ｂ）の接触させるステップに続いて、本方法はさらに、被分析物を洗浄緩衝剤と接触させるステップを含む。
【０２５０】
種々の側面では、被分析物上に存在する複数のマーカーを検出するために方法が提供され、本方法は、微小空洞またはマイクロパッチを備える基板を経由して流体を流動させることによって、微小空洞中またはマイクロパッチ中の被分析物を単離するステップであって、流体は、被分析物を含む、ステップと、被分析物を第１のタグと接触させるステップであって、被分析物は、第１のマーカーを含み、第１のタグは、第１のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、第１のタグによって発せられる第１の信号を検出するステップであって、第１の信号の存在は、第１のマーカーの存在を示す、ステップと、第１の信号の強度を低減させるステップと、被分析物を第２のタグと接触させるステップであって、被分析物は、第２のマーカーを含み、第２のタグは、第２のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、第２のタグによって発せられる第２の信号を検出するステップであって、第２の信号の存在は、第２のマーカーの存在を示す、ステップとを含む。
【０２５１】
いくつかの側面では、本方法は、複数の微小空洞またはマイクロパッチ内で単離される複数の被分析物で行われる。ある側面では、第１のタグの信号は、５０％超低減させられる。さらなる側面では、少なくとも１つの被分析物は、細胞である。
【０２５２】
いくつかの側面では、被分析物は、流体流動によって生成される力、重力、または接着力によって、微小空洞内の固定位置で保持される。ある側面では、被分析物は、分子相互作用を通して微小空洞またはマイクロパッチに接続される。さらなる側面では、被分析物は、非共有結合を通して微小空洞に接続される。なおもさらなる側面では、非共有結合は、ファン・デル・ワールス相互作用、静電結合、疎水結合、または非特異的吸着である。
【０２５３】
種々の側面では、マイクロ流体チップ内の流体サンプルのアリコートを単離するために方法が提供され、アリコートは、希少粒子を含み、本方法は、（ａ）アリコート中の希少粒子の存在または非存在を検出するステップと、（ｂ）希少粒子の存在または非存在に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、（ｃ）電子作動型弁を開放することによって、割り当てられた値に基づいてアリコートの流動を指向するステップであって、電子作動型弁は、マイクロ流体チップの外部にあるデバイス上に位置する、ステップとを含む。いくつかの側面では、マイクロ流体チップは、サンプル入力チャネルと、少なくとも２つの出力チャネルと、少なくとも１つの指向性流チャネルとを備え、電子作動型弁は、指向性流チャネル内の流体の流動を制御する。
【０２５４】
疾患の診断
いくつかの側面では、本方法を使用して単離される被分析物（例えば、細胞）はさらに、標的治療を開発するように（例えば、遺伝子型または表現型に従って）亜集団分析を受けることができる。例えば、単離された細胞（例えば、腫瘍細胞）は、薬剤標的の発現の存在または程度を判定するように、特定のバイオマーカー（例えば、薬剤標的）に結合するタグ（例えば、蛍光抗体）とともに培養することができる。いったん薬剤標的の発現が確認されると、特定の薬剤標的の発現を標的にするように特異的に開発される薬剤を治療のために選択することができる。一実施例では、単離された腫瘍細胞は、ＣＴＣを流す乳房腫瘍がＨｅｒ２陽性であるかどうかを判定するように、Ｈｅｒ２受容体に特異的に結合する蛍光抗体とともに培養することができる。単離された腫瘍細胞が高いＨｅｒ２発現を呈する場合、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）が、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現の機能を標的にして遮断するように設計されているため、この薬剤を治療として使用することができる。ＢＣＲ−ＡＢＬまたはＰＤＧＦＲ（薬剤Ｇｌｅｅｖｅｃによって標的にされる）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎによって標的にされる）、ＥＦＧＲ（Ｉｒｅｓｓａ、Ｔａｒｃｅｖａによって標的にされる）、ＲＡＲアルファ（ＡＴＲＡによって標的にされる）、エストロゲン受容体（タモキシフェンによって標的にされる）、アロマターゼ（レトロゾールによって標的にされる）、アンドロゲン受容体（フルタミド、ビカルタミドによって標的にされる）、ＣＤ２０（リツキシマブによって標的にされる）、ＶＥＧＦ受容体（Ａｖａｓｔｉｎによって標的にされる）を含む、他の既知の薬剤標的もまた、適切な化学療法計画を処方する前に単離された腫瘍細胞から同様に選抜することができる。
【０２５５】
いくつかの側面では、被分析物は、希少粒子（例えば、癌細胞または循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））であり得る。他の場合において、希少粒子は、寄生細胞または生物、例えば、ジアルジアまたはクリプトスポリジウムの種、原虫の種に感染した赤血球、ＨＩＶに感染したリンパ球または白血球、母体血中の胎児細胞、幹細胞、プリオンに感染した細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、および同等物であり得る。
【０２５６】
いくつかの側面では、本方法は、対象からの血液サンプル中の循環腫瘍細胞を検出するステップを含むことができる。本方法は、ｅＤＡＲを含むことができる。ある側面では、対象は、癌と診断された患者であり得る。いくつかの側面では、癌は、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶであり得る。いくつかの側面では、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を、癌と以前に診断された患者からの血液サンプル中で検出することができる。これらの場合において、患者はさらに、転移癌と診断され得る。
【０２５７】
いくつかの側面では、本方法は、固形腫瘍と以前に診断された対象で転移癌を診断するために使用することができ、本方法は、（ａ）対象からの血液サンプルのアリコート中のＣＴＣの存在または非存在を検出するステップと、（ｂ）ＣＴＣの存在または非存在に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、（ｃ）割り当てられた値に基づいてアリコートの流動または収集を指向するステップとを含む。
【０２５８】
いくつかの側面では、血液サンプル中のＣＴＣの非存在は、転移癌を有していない対象と相関することができる。血液サンプル中の少なくとも１つのＣＴＣの存在は、転移癌を有する対象と相関することができる。いくつかの側面では、血液中の少なくともいくつかのＣＴＣの存在は、転移癌を有する対象と相関することができる。本方法はさらに、（ｄ）ＣＴＣが血液サンプル中で検出されない場合には転移癌を有していないものとして対象を診断し、または少なくとも１つのＣＴＣが血液サンプル中で検出される場合には転移癌を有するものとして対象を診断するステップを含むことができる。
【０２５９】
本開示はまた、癌と診断された対象を監視するための方法も提供する。本方法は、本明細書で提供されるｅＤＡＲ方法を使用して、対象からの血液サンプルのアリコート中のＣＴＣの存在または非存在を検出するステップを含むことができる。いくつかの側面では、規則的な間隔で、例えば、１年に少なくとも１回、１年に少なくとも２回、１年に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれを上回って、あるいは少なくとも１年に約３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれを上回って、転移癌への癌の進行について患者を監視することができる。いくつかの側面では、１ヶ月に１回、あるいは１ヶ月に少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれを上回って、対象を監視することができる。いくつかの側面では、１ヶ月に約１回、あるいは１ヶ月に少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれを上回って、対象を監視することができる。血液サンプル中のＣＴＣの非存在は、転移癌を有していない対象と相関することができる。血液サンプル中の少なくとも１つのＣＴＣの存在は、転移癌を有する対象と相関することができる。血液中の少なくともいくつかのＣＴＣの存在は、転移癌を有する対象と相関することができる。
【０２６０】
ＣＴＣが血液サンプル中で検出される場合において、本方法はさらに、１つまたは複数のＣＴＣ細胞の１つまたはそれを上回る特性を識別するように、ＣＴＣを含有するものとして識別される１つまたはそれを上回るアリコートにさらなる分析を受けさせるステップを含むことができる。例えば、ＣＴＣを含有するアリコートまたはアリコートのプールを、１つまたはそれを上回る癌特異的表面抗原に対して特異的な１つまたはそれを上回る検出試薬と接触させることができる。解析することができる、癌特異的表面抗原の非限定的実施例は、限定ではないが、ＢＣＲ−ＡＢＬまたはＰＤＧＦＲ（薬剤Ｇｌｅｅｖｅｃによって標的にされる）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎによって標的にされる）、ＥＦＧＲ（Ｉｒｅｓｓａ、Ｔａｒｃｅｖａによって標的にされる）、ＲＡＲアルファ（ＡＴＲＡによって標的にされる）、エストロゲン受容体（タモキシフェンによって標的にされる）、アロマターゼ（レトロゾールによって標的にされる）、アンドロゲン受容体（フルタミド、ビカルタミドによって標的にされる）、ＣＤ２０（リツキシマブによって標的にされる）、ＶＥＧＦ受容体（Ａｖａｓｔｉｎによって標的にされる）、および同等物を含む。いくつかの側面では、表面抗原は、本明細書で説明される逐次免疫染色および光退色方法を使用して解析することができる。
【０２６１】
本明細書で提供される方法およびデバイスは、癌以外の疾患を診断するために使用することができる。いくつかの側面では、マラリアを診断することができ、本方法は、原虫に感染した赤血球を検出するステップを含む。別の場合において、ＨＩＶ感染を診断するための方法が提供され、本方法は、本明細書で提供されるｅＤＡＲ方法および／または装置を使用して、ＨＩＶウイルスに感染したリンパ球または白血球を検出するステップを含む。さらに別の場合において、プリオンと関連付けられる疾患を診断するための方法が提供され、本方法は、ヒトまたは他の動物からの生物学的流体中でプリオンを検出するステップを含む。
【０２６２】
いくつかの側面では、被分析物は、希少細胞であり、希少細胞は、細菌細胞である。いくつかの側面では、細菌細胞は、全血サンプル中に存在する。他の側面では、全血中の希少細菌細胞の存在を検出するために、デバイス、方法、システム、または装置が使用される。いくつかの側面では、細菌感染または敗血症を特性評価または管理することに関係付けられる診断、予後、または他の治療パラメータを提供するために、全血サンプル中の希少細菌細胞の存在を検出するように、デバイス、方法、システム、または装置が使用される。
【０２６３】
疾患の予後
本開示は、流体中の被分析物の存在と関連付けられる疾患または症状の予後のための方法を提供する。いくつかの側面では、被分析物は、生物学的粒子であり得る。いくつかの側面では、流体は、生物学的流体であり得る。いくつかの側面では、本方法は、（ａ）対象からのサンプルのアリコート中の被分析物の存在または非存在を検出するステップと、（ｂ）被分析物の存在または非存在に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、（ｃ）割り当てられた値に基づいてアリコートの流動または収集を指向するステップと、（ｄ）被分析物がサンプル中で検出されない場合に良好な予後、または被分析物がサンプル中で検出される場合に不良な予後のいずれかを提供するステップとを含む。
【０２６４】
いくつかの側面では、アリコート中の被分析物の数量または識別に基づいて、アリコートに値を割り当てることができる。いくつかの側面では、サンプル中の被分析物の数量に基づいて、良好または不良な予後を提供することができる。例えば、サンプル中の被分析物の数量が所定の参照値より少ない場合に、良好な予後を提供することができ、サンプル中の被分析物の数量が参照値に等しいか、またはそれより大きい場合に、不良な予後を提供することができる。いくつかの側面では、所定の参照値を、特定の治療に応答する可能性、またはある期間、例えば、少なくとも６ヶ月、あるいは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０年、またはそれを上回る期間にわたる全または無病生存率の可能性と関連付けることができる。
【０２６５】
いくつかの側面では、希少粒子と関連付けられる任意の疾患の予後を提供するために、本明細書で提供される方法を使用することができる。いくつかの側面では、マラリアの予後を提供するための方法が提供され、本方法は、本明細書で提供されるｅＤＡＲ方法および／または装置を使用して、個人からの血液サンプル中の原虫に感染した赤血球の数を判定するステップを含むことができる。いくつかの側面では、血液サンプル中で検出される感染赤血球の総数が所定の参照値より少ない場合に良好な予後、あるいはサンプル中で検出される感染赤血球の総数が参照値に等しいか、またはそれより大きい場合に不良な予後のいずれかを提供することができる。いくつかの側面では、ＨＩＶ感染の予後を提供するための方法が提供され、本方法は、本明細書で提供されるｅＤＡＲ方法および／または装置を使用して、個人からの血液サンプル中のＨＩＶウイルスに感染したリンパ球または白血球の数を判定するステップと、血液サンプル中で検出される感染細胞の総数が所定の参照値より少ない場合に良好な予後、あるいはサンプル中で検出される感染細胞の総数が所定の参照値に等しいか、またはそれより大きい場合に不良な予後のいずれかを提供するステップとを含むことができる。いくつかの側面では、プリオンと関連付けられる疾患の予後を提供するための方法が提供され、本方法は、本明細書で提供されるｅＤＡＲ方法および／または装置を使用して、対象からの生物学的流体サンプル中のプリオンの数を判定するステップと、サンプル中で検出されるプリオンの総数が所定の参照値より少ない場合に良好な予後、あるいはサンプル中で検出されるプリオンの総数が所定の参照値に等しいか、またはそれより大きい場合に不良な予後のいずれかを提供するステップとを含むことができる。
【０２６６】
いくつかの側面では、本開示は、固形腫瘍と診断された対象の予後を提供するための方法を提供する。いくつかの側面では、本方法は、（ａ）対象からの血液サンプルのアリコート中のＣＴＣの存在または非存在を検出するステップと、（ｂ）ＣＴＣの存在または非存在に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、（ｃ）割り当てられた値に基づいてアリコートの流動または収集を指向するステップと、（ｄ）ＣＴＣが検出されない場合に良好な予後、またはＣＴＣが検出される場合に不良な予後のいずれかを提供するステップとを含む。
【０２６７】
いくつかの側面では、転移癌と診断された対象の予後を提供するために方法が提供される。いくつかの側面では、本方法は、（ａ）対象からの血液サンプルのアリコート中のＣＴＣの存在または非存在を検出するステップと、（ｂ）アリコート中で検出されるＣＴＣの数に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、（ｃ）割り当てられた値に基づいてアリコートの流動または収集を指向するステップと、（ｄ）血液サンプル中で検出されるＣＴＣの総数が所定の参照値より少ない場合に良好な予後、あるいはサンプル中で検出されるＣＴＣの総数が参照値に等しいか、またはそれより大きい場合に不良な予後のいずれかを提供するステップとを含む。
【０２６８】
いくつかの側面では、所定の参照値を、特定の治療に応答する可能性、またはある期間、例えば、少なくとも６ヶ月、あるいは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０年、またはそれを上回る期間にわたる全または無病生存率の可能性と関連付けることができる。
【０２６９】
治療への疾患の応答
本開示は、疾患の進行または治療への応答を監視するための方法を提供する。いくつかの側面では、本方法は、流体サンプル中の被分析物を検出するステップを含むことができる。いくつかの側面では、本方法は、（ａ）第１の時間に対象から採取された第１の生物学的サンプルの複数のアリコート中の被分析物の存在または非存在を検出するステップと、（ｂ）希少粒子の存在、非存在、数量、または識別に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、（ｃ）第１のサンプルからの全てのアリコートの合計値を判定するステップと、（ｄ）第２の時間に対象から採取された第２の生物学的サンプルの複数のアリコート中の被分析物の存在または非存在を検出するステップと、（ｅ）被分析物の存在、非存在、数量、または識別に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、（ｆ）第２のサンプルからの全てのアリコートの合計値を判定するステップと、（ｇ）第１のサンプルに割り当てられた合計値を第２のサンプルに割り当てられた合計値と比較するステップとを含み、第１のサンプルと比較して、第２のサンプルに割り当てられた増加値は、疾患の進行および／または治療への不良な応答と相関し、および／または第１のサンプルと比較して、第２のサンプルに割り当てられた減少値は、疾患の退行および／または治療への良好な応答と相関する。いくつかの側面では、アリコートはさらに、収集、さらなる濃縮、またはさらなる分析のために割り当てられた値に基づいて、特定のチャネルまたはチャンバ（チャネル付き）の中へ指向することができる。
【０２７０】
いくつかの側面では、疾患の診断または治療計画の開始後に規則的に、疾患の進行または治療への応答を監視する方法を採用することができる。例えば、１年に少なくとも１回、１年に少なくとも２回、１年に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれを上回って、あるいは１年に少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれを上回って、サンプルを対象から収集することができる。いくつかの側面では、１ヶ月に１回、あるいは１ヶ月に少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれを上回って、対象を監視することができる。いくつかの側面では、１ヶ月に約１回、あるいは１ヶ月に少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれを上回って、対象を監視することができる。
【０２７１】
疾患の進行または治療への不良な応答が見出される、いくつかの側面では、本方法はさらに、治療を割り当てるステップ、投薬計画を増加させるステップ、治療計画を変更するステップ、および同等物を含むことができる。いくつかの側面では、希少粒子と関連付けられる疾患または症状は、癌、マラリア、ＨＩＶ／Ａｉｄｓ、プリオン関連疾患、または同等物であり得る。
【０２７２】
範囲は、本明細書では「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表されるとき、別の実施形態は、一方の特定の値から、および／または他方の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表されるとき、「約」という先行詞の使用によって、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。さらに、範囲のそれぞれの終点が、他方の終点に関連して、および他方の終点から独立して、両方で重要であることが理解されるであろう。本明細書で使用されるような「約」という用語は、特定の使用法の文脈内で規定数値からプラスまたはマイナス１５％である範囲を指す。例えば、約１０は、８．５から１１．５までの範囲を含むであろう。
【０２７３】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され、説明されているが、そのような実施形態は一例のみとして提供されることが当業者に明白となるであろう。ここで、本発明から逸脱することなく、多数の変形例、変更、および置換が当業者に想起されるであろう。本明細書で説明される本発明の実施形態の種々の代替案が、本発明を実践する際に採用され得ることを理解されたい。以下の請求項は、本発明の範囲を定義し、これらの請求項およびそれらの均等物の範囲内の方法および構造がそれによって対象とされることが意図される。
【０２７４】
本明細書で示される詳細は、一例として、および本発明の好ましい実施形態の例証的議論の目的のためにすぎず、本発明の種々の実施形態の原理および概念的側面の最も有用で容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示される。この点に関して、本発明、図面とともに解釈される説明、および／または本発明のいくつかの形態がどのようにして実践で具現化され得るかを当業者に明白にする実施例の基本的理解のために、本発明の構造的詳細を必要以上に詳細に示す試行は行われない。以下の定義および説明は、以下の実施例で明瞭かつ明確に修正されない限り、または意味の適用が任意の構造を無意味あるいは本質的に無意味にするときに、任意の将来の構造を統括するように意図および意向されている。用語の構造がそれを無意味または本質的に無意味にする場合において、定義は、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ第３版、またはＯｘｆｏｒｄ
Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．  Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ２００４）等の当業者に公知である辞書から取られるべきである。
【０２７５】
本明細書で使用されるように、かつ別様に指示されない限り、「１つの（「ａ」および「ａｎ」）」という用語は、「１つ」、「少なくとも１つ」、あるいは「１つまたはそれを上回る」を意味すると解釈される。文脈によって別様に要求されない限り、本明細書で使用される単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
【０２７６】
文脈が明確に別様に要求しない限り、説明および請求項の全体を通して、「備える」ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉、および同等物は、排他的または包括的な意味とは対照的に包含的な意味で解釈されるものである。すなわち、「を含むが、限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」という意味である。
【０２７７】
別様に特定されない限り、現在説明されている方法およびプロセスは、任意の順序で行うことができる。例えば、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を説明する方法は、最初にステップ（ａ）、それに続いてステップ（ｂ）、次いで、ステップ（ｃ）で行うことができる。または、本方法は、例えば、最初にステップ（ｂ）、それに続いてステップ（ｃ）、次いで、ステップ（ａ）等の異なる順序で行うことができる。さらに、これらのステップは、詳細に別様に規定されない限り、同時に、または別々に行うことができる。
【０２７８】
単数または複数を使用する言葉はまた、それぞれ、複数および単数も含む。加えて、「本明細書で」、「上記で」、および「以下で」という用語、ならびに類似する趣旨の言葉は、本願で使用されるときに、本願の任意の特定の部分ではなく、本願を全体として指すものとする。
【実施例】
【０２７９】
以下の実施例は、本発明のいくつかの側面をさらに説明するように含まれ、本発明の範囲を限定するために使用されるべきではない。
（実施例１）
循環腫瘍細胞の大容量閉じ込めのためのマイクロ流体構成要素に基づくアンサンブル決定アリコートランク付け
【０２８０】
本実施例は、本開示の側面による、細胞を含む粒子を単離するための新規のｅＤＡＲプラットフォームを説明し、その正当性を立証する。
【０２８１】
ｅＤＡＲプラットフォームの特徴および性能を判定した２つの要因は、効率的かつ能動的選別方式、および後続の効率的な精製（例えば、精製チャンバ）方式である。本ｅＤＡＲプラットフォームは、これら２つの構成要素を最適化する。一実施例では、ｅＤＡＲプラットフォームは、標準リソグラフィ方法によって加工される統合濾過領域を含むことができる。マイクロ流体チップは、シリコンマスタ上の２つの層から成ることができ、かつポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）への１段階複製成形で加工することができる。マイクロ流体チップは、ガラス基板への結合で仕上げることができる。システム全体は、能動的選別方式を含むことができる。マイクロ流体チップおよび流体力学的切替機構の分析性能は、特定の回収効率（例えば、９５％）、特定の偽陽性率（例えば、０）、および特定のスループット（例えば、１時間につき４．８ｍＬの全血）のために最適化することができる。
【０２８２】
マイクロ流体チップ
本実施例で使用されるマイクロ流体チップは、同一の設計で統合される２つの機能的領域、すなわち、ｅＤＡＲ選別領域およびスリット構造に基づく濾過ユニットを有していた。選別合流点に血液を導入した、選別ユニット内の主要チャネルは、５０μｍの高さおよび１５０μｍの幅を有し、全ての他の４つのチャネルは、高さ５０μｍおよび幅２００μｍであった。スリットフィルタは、高さ５μｍおよび幅５μｍであった。試験されたスリットの最大数は、２０，０００であった。
【０２８３】
シリコンマスタは、２つのフォトリソグラフィプロセスを使用して加工された（図５、２０、および２１）。特徴は、ＡｕｔｏＣＡＤ（Ａｕｔｏｄｅｓｋ（Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，  ＣＡ））を使用して設計され、クロムマスク（ＴＲＩＣＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＳＦ，  ＣＡ））上に書き込まれた。ポジ型レジストリソグラフィおよび深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）が、マイクロフィルタ特徴である第１の層を形成するために選択された。ワシントン大学（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）の微細製造施設（Ｍｉｃｒｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ；ＭＭＦ）によって提供されたＡＺ  １５１２が、ポジ型フォトレジストとして使用された。ＤＲＩＥプロセスは、４．５μｍ〜５μｍの範囲内の深度を達成するように最適化された。ｅＤＡＲ特徴の第２の層は、ネガ型フォトレジストとしてＳＵ−８−３０５０（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ（Ｎｅｗｔｏｎ，  ＭＡ））を使用して加工され、特徴の高さは、５０μｍであるように制御された。トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル−１−トリクロロシラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ））を使用して、マスタがシラン化された後、未硬化ＰＤＭＳがシリコンウエハ上に注がれ、７０℃で２時間焼き付けられた。所望の微小特徴を伴うＰＤＭＳ片が、シリコンマスタから剥離され、次いで、プラズマ酸化の標準プロセスを使用してカバーガラス片と結合された。
【０２８４】
生物学的および臨床サンプル
３つの乳癌細胞株、すなわち、ＳＫＢｒ−３、ＭＣＦ−７、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ））が、ｅＤＡＲシステムを特性評価して最適化するために使用された。ＳＫＢｒ−３細胞は、マッコイ５培地で培養され、ＭＣＦ−７は、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で培養され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））で培養された。全ての細胞培地はまた、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））、および５０μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））も含有していた。培養は、加湿環境内で５％ＣＯ２を伴って３７℃で行われた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ細胞株は、タフツ大学（Ｔｕｆｆｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＧａｉｌ  Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ教授によって提供され、１０％ＦＢＳおよび１μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ））を伴うＤＭＥＭ培地で培養された。健康なドナーからの対照血液が、Ｐｌａｓｍａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂ（Ｅｖｅｒｅｔｔ，  ＷＡ）から購入され、皮膚細胞からの任意の起こり得る汚染を防止するように、採血の第１の管が廃棄された。全血サンプルが、Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒの施設内倫理委員会によって承認されたプロトコルに基づいて、転移膵臓癌がある患者から採取された。患者サンプルが、抗凝固剤としてＥＤＴＡを含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ管（ＢＤ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ））を使用して、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃａｒｅ  Ａｌｌｉａｎｃｅ（ＳＣＣＡ）で収集され、４℃で貯蔵され、４時間以内に分析された。
【０２８５】
サンプル調製およびｅＤＡＲ分析
別様に特定されない限り、Ｉｓｏｔｏｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｎｏ，  ＣＡ））が全ての実験用の緩衝剤として使用された。典型的なｅＤＡＲ実験については、１ｍＬの全血サンプルが、暗室にて室温で３０分間、フィコエリトリン（ＰＥ）（ロット番号５１５７７６、Ａｂｎｏｖａ（Ｗａｌｎｕｔ，  ＣＡ））と共役した抗ＥｐＣＡＭで標識された。全ての標識パラメータが最適化されている。標識サンプルは、１４ｍＬまで希釈され、次いで、遊離抗体を除去するように遠心分離された。最終体積は、初期体積と同一であるように調整された。調製されたサンプルは、次に、シリンジポンプを使用してマイクロ流体チップに注入された。ファイバ連結アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）（Ｅｘｃｅｌｉｔａｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ））からのトレースが、ＰＣＩデータ取得カード（ＰＣＩ  ６６０２、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ））によって収集された。ｅＤＡＲの選別プロセスは、施設で書かれたＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ））スクリプトおよび施設内で構築されたフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）デバイスを使用して、自動的に制御された。選別されたアリコートを収集した流体力学的切替は、Ｌｅｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，  ＣＴ）から購入されたソレノイド（ＩＮＫＡ１２２６２１２Ｈ）によって制御された。
【０２８６】
全ての陽性アリコートが濾過領域上に収集された後、濾過領域を１分未満で迅速に洗浄するためにｉｓｏｔｏｎが使用された。任意の細胞質マーカーが二次標識に使用された場合、細胞を固定するように、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）が濾過領域の中へ装填された。Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標）４６５（Ａｉｒ  ｐｒｏｄｕｃｔ（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，  ＰＡ））が、固定された細胞を透過化するために使用された。抗ＥｐＣＡＭ−ＰＥおよび抗サイトケラチン−ＡＰＣ（ロット番号ＭＡＢ５１３１、Ａｂｎｏｖａ（Ｗａｌｎｕｔ，  ＣＡ））、ならびに抗ＣＤ４５−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ロット番号Ｂ１１６３１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ））が、典型的には、二次標識のための抗体として使用された。Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ））もまた、標識標的が実際に有核細胞であったことを検証するために核染色として使用された。
【０２８７】
ｅＤＡＲの方法は、以下の通りであり、血液サンプルがマイクロ流体チップに注入され、アリコートに分割された。次いで、標識方式によって判定された「陽性」または「陰性」としてアリコートをランク付けするように、線共焦点検出方式が適用された。例えば、多くの用途では、血液が抗ＥｐＣＡＭ−ＰＥで標識されたため、その抗体に共役した特定の色素からの蛍光信号を有していたアリコートが、陽性事象としてランク付けされた。陽性アリコートが迅速に収集されることを可能にした、血流の方向の切替を生成するように、自動フィードバック方式が適用された。ＣＴＣの非常に低い濃度により、アリコートの９９．９９９％超が、所望の蛍光信号の非存在のため廃棄された。陽性蛍光信号を生じた、これらのアリコートは、さらに精製され、次いで、数えられるように、マイクロ流体チップ上の別の領域に移送された。二次免疫染色ステップ、より複雑な染色／退色プロセス、または単一被分析物レベルでの操作および培養等の一連の下流分析を、閉じ込められた細胞に行うことができる。
【０２８８】
再設計された流体力学的選別方式
以前に、ｅＤＡＲは、電気浸透流またはゾル・ゲル変換等の他の報告された切替機構と比較して、高速（約２ミリ秒の応答時間）かつ堅調であった、能動的選別ステップを制御する機械弁を有していた。有望であるが、この機械弁方式のいくつかの設計要因は、ｅＤＡＲの潜在的用途を潜在的に制約した。マイクロ流体チップ上で機械弁を形成するために、３つの個々の構造層、すなわち、ソレノイド、そのＰＤＭＳスレッド、および１５０μｍＰＤＭＳフィルム上のマイクロチャネルが必要とされた。これは、マイクロ流体チップの製作を複雑で時間がかかるものにするであろう。別の欠点は、ＣＴＣの損失または損傷のリスクを潜在的に増加させた、捕捉された血液アリコートと機械弁との間の直接接触であった。本実施例では、ソレノイドは、常時閉であるが、５ＶＤＣ電圧が印加されるときに２〜３ミリ秒で開放することができる、オフチップモデルと置換された。このインラインソレノイドがマイクロ流体チップの一部ではなかったため、マイクロ流体デバイスの製作は、有意に簡略化された。ソレノイドは、流体力学的選別方式を試験するように、任意のマイクロチャネルと容易に接続することができる。８つの異なる方式が、流体切替を駆動するように設計および試験された（図６）。この種類のソレノイドの構造、およびＰＤＭＳの弾性的性質により、流体性能が変動し（表１）、各方式が最良性能のために特性評価された。
【０２８９】
特性評価および最適化後に、プラットフォームの構造および流体力学的選別の対応する方式が、ｅＤＡＲのために選択された（図７）。標識血液サンプルが、シリンジポンプを使用して、マイクロ流体チップの上部チャネルに注入された（図７ａ）。能動的選別ステップを制御するために、緩衝剤が通って流動した、２つの側方チャネルが使用された。右側チャネル上に配置された２つのポートがあり、それらの両方が加圧緩衝剤源に接続された。常時閉ソレノイドは、流体力学的切替を制御するように、選別合流点付近のポートに接続された。選別合流点の後に、２つのチャネルがあった。左側の１つは、陽性アリコートを収集し、それらをさらなる精製（例えば、精製チャンバ）のために濾過および収集領域に送達するために使用され、右側の１つは、全ての陰性アリコートが通って流動した、廃棄物収集チャネルであった。
【０２９０】
これらのアリコートが「陰性」としてランク付けられたとき（図７ｂ）、ソレノイドに印加された電圧がなかったため、それが閉鎖された。初期圧力降下が１番および３番の緩衝剤源の間で設定されたため、血液は廃棄物を収集したチャネルのみに流入することができ、これは、図７ｂの明視野像にも示されている。陽性事象が第１の検出窓によって検出されたとき、２番の緩衝剤リザーバから緩衝剤流を開放するように、５ＶＤＣ電圧が即時にソレノイドに印加された。これは、右側の緩衝剤チャネルの流動抵抗を減少させ、そこでより速い流速を生成した。血流は、陽性アリコートを収集するように右側から左側に押動された（図７ｃ）。このアリコートが収集され、第２の検出窓によって確認された後、ソレノイドは、血流を廃棄物収集チャネルに戻して切り替えるように閉鎖された（図７ｄ）。スイッチオーバーおよびバックに必要とされる時間は、それぞれについて２〜３ミリ秒であると判定された（図８）。本プロセスは、１０５超のオン・オフサイクルが試験された後でさえもｅＤＡＲのために十分に安定していた。インラインソレノイドが緩衝剤ライン上に配置されたため、血液はソレノイドと接触することができず、これは、血液凝固および二次汚染の可能性を排除した。また、本方式では、ｅＤＡＲプロセス中にＣＴＣ収集チャネルの中に一定流量の緩衝剤があった。これは、後続の精製（例えば、精製チャンバ）ステップの効率を向上させ、細胞の凝集体の形成を防止した。
【０２９１】
本実施例のいくつかの側面では、陽性アリコートを濾過領域上に収集することができ、濾過領域を１分未満で洗浄するために、Ｉｓｏｔｏｎを使用することができる。細胞質マーカーは、二次標識に使用することができ、細胞を固定するように、濾過領域の中への４％パラホルムアルデヒドの装填を伴うことができる。固定された細胞を透過化するために、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標）４６５（Ａｉｒ  ｐｒｏｄｕｃｔ（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，  ＰＡ））を使用することができる。抗ＥｐＣＡＭ−ＰＥおよび抗サイトケラチン−ＡＰＣ（Ａｂｎｏｖａ（Ｗａｌｎｕｔ，  ＣＡ））、ならびに抗ＣＤ４５−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ））を、二次標識に使用することができる。有核細胞を検証するために、核染色としてＨｏｅｃｈｓｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ））を使用することができる。
【０２９２】
精製（例えば、精製チャンバ）機構の設計
本実施例のさらに別の側面は、ＰＤＭＳで作製することができ、付加的な層を必要としない場合がある、オンチップ濾過ベースのマイクロスリット構造の新しい方式を含むことができる（図１０ａ）。図１０ａは、いかなる赤血球（ＲＢＣ）も保持することなくＣＴＣを捕捉するために使用された、これらのマイクロスリットの実施例の基本構造を示す。スリットのサイズは、いかなる小さいＣＴＣの損失も回避するために、高さ５μｍおよび幅５μｍ（図１０ｂ）であるように最適化された。濾過に基づくＣＴＣ方法の大部分で使用されるものより小さい、このサイズのフィルタを使用して、多くの白血球が捕捉されなかった。マイクロフィルタがＰＤＭＳで作製され、カバースリップ片と結合されたため、完全に透明ではなく、散乱および収差を生成し得る、ポリカーボネートフィルタと比較して、画質が有意に向上させられた（図１０ｃおよび１０Ｄ）。また、細胞をスリットのアレイに沿って捕捉することのみできたため、それらを容易に参照して追跡することができ、多くの他の方法では、細胞は、表面上に無作為に分配される。スリットに沿ったこの閉じ込めは、撮像手技をより高速にし、計数の結果をより正確にした。スリットはまた、閉じ込められたＣＴＣに二次標識を行うことをより高速かつ効率的にした。図１０ｅは、抗ＥｐＣＡＭ−ＰＥで標識された２つの癌細胞がマイクロスリット上に閉じ込められたことを示す。抗サイトケラチン−Ａｌｅｘａ４８８、抗Ｈｅｒ２−Ａｌｅｘａ６４７、およびＨｏｅｃｈｓｔを使用して、細胞が固定、透過化、および標識された。蛍光画像は、これら２つの細胞上のこれらのマーカーの発現を明確に示し、明視野像もまた、それらの形態を確認した。２つの細胞はまた、陰性対照マーカーとして抗ＣＤ４５−Ａｌｅｘａ７００で標識され、カラーチャネルからのいかなる信号も、このタグに対応しなかった。
【０２９３】
ｅＤＡＲの特性評価および分析性能
能動的選別ステップの効率が、リアルタイムで監視された。図９は、膵臓癌患者サンプルからのＡＰＤデータのごく一部分を示す。「決定ＡＰＤトレース」は、アリコートをランク付けし、選別を制御した第１の検出窓に由来した。９７８および１２９８ミリ秒における２つのピークは、アリコート選別をトリガした、抗ＥｐＣＡＭ−ＰＥで標識された２つのＣＴＣを表した。「確認ＡＰＤトレース」の２つのピークは、２つの癌細胞が収集チャネル上に位置する第２の検出窓を通って流動したことを示し、２つの陽性アリコートが実際に選別されたことを確認する。第２の検出器からの背景変化（図９ａ）がまた、血液のごく一部分のみがｅＤＡＲによって収集され、ＣＴＣの高い濃縮比（典型的な臨床サンプルについて最大１００万倍）に寄与したことも確認したことを指摘する価値がある。
【０２９４】
標識ＣＴＣが第１の検出窓から第２の検出窓へ流動する必要があったため、決定ＡＰＤピークとその確認信号との間の時間差が観察された。この時間差は、マイクロチャネル中の層流の性質により、ＣＴＣが異なる線流速を有することができるため変動し得る、選別されたＣＴＣの経過時間として定義された。図９ｂは、４０および８０μＬ／分の流速での経過時間の分布ヒストグラムを示す。概して、血液のより高い体積流速は、選別されたＣＴＣの短縮した経過時間をもたらした（図９ｃ）。流速が９０μＬ／分であったとき、平均経過時間は、選別方式の切替時間（２〜３ミリ秒）に非常に近い、４ミリ秒まで低減させられ、これがｅＤＡＲのための設計の本特定実施形態のためのスループットの限界であることを示唆する。他の実施形態では、本ｅＤＡＲ設計は、２ミリ秒未満の経過時間をもたらしてもよい。
【０２９５】
選別されたＣＴＣの経過時間が流体力学的切替時間より短かった場合、細胞は、本プラットフォーム上で確実に選別されなかった場合がある。したがって、選別効率は、選別をトリガした事象の総数と対比した、収集された事象の数として定義された。図９ｄは、３０μＬ／分〜１００μＬ／分の流速での選別効率の値を示す。流速が３０μＬ／分であったとき、その流速での平均経過時間が約１０ミリ秒であっため（図９ｃ）、選別効率はほぼ１００％であった。この経過時間は、能動的選別ステップがＣＴＣを収集するために十分に長かった。選別効率は、８０μＬ／分の流速で９０％まで減少し、次いで、流速が９０μＬ／分であったときに４９％まで降下した。図９ｄはまた、選別効率と比較して類似動向を有していた、異なる流速でのｅＤＡＲの回収効率も示す。しかしながら、回収効率は、マイクロ流体チップ上で多色蛍光撮像を使用して数えられる、回収された細胞の数と対比した、混入細胞の数として定義された。この性能は、抗体標識効率、線共焦点検出効率、および選別効率を含む、多くの要因の組み合わせである。これは、同一の流速での回収および選別効率の間の差を説明する。結果として、この現世代のｅＤＡＲについて、スループットの上限は、８８％回収率で８０μＬ／分であった（１ｍＬの血液に１２．５分）。このスループットは、全血の分析のためのほとんどのＣＴＣ技術より高いが、より広い血液入口チャネルを設計すること、または第１の検出ビームをさらに上方に移動させることによって、さらに向上させることができる。
【０２９６】
３〜９７５個のＭＣＦ−７細胞が、５０μＬ／分の流速での回収効率を分析するように、１ｍＬの健康な血液に混入された。低性能で細胞数の精度を確保するために、毛管計数方法が、濃度が１００個の細胞／ｍＬより低かったときに培養細胞を正確に混入するように使用された。平均回収率は、第１世代のｅＤＡＲ（９３％）より少し高い、０．９９８のＲ２値で９５％であった（図９ｅ）。ＣＴＣの濃度が、通常は非常に低いため、計数結果は、ポアソン分布の影響を受けた。この場合、容認可能なスループットおよび回収率でより大量の全血サンプルを分析する能力が非常に重要であった。同数のＭＣＦ−７細胞が、１、５、および１０ｍＬの健康な血液に混入され、次いで、これらの３つのサンプルが、５０μＬ／分の流速で分析された。それらの回収率に有意な変化はなく（図９ｆ）、本方法が高い効率およびスループットで大量の全血を流すことが可能であることを示す。
【０２９７】
ＥｐＣＡＭが腫瘍細胞を選択するためにＣＴＣ検査の大部分で使用されたが、ますます多くの研究は、低いＥｐＣＡＭ発現を伴うＣＴＣがより多くの間葉特性を有し、より活動的であることを報告している。最新のｅＤＡＲプラットフォームは、ＥｐＣＡＭ以外のバイオマーカーを使用して腫瘍細胞を捕捉するように希少細胞を選択する任意の標識方式を使用するために、十分に便宜的である。３つの方式が、異なる培養乳癌細胞株を選択するように設計された（図９ｇ）。ＥｐＣＡＭがＭＣＦ−７細胞を選択するために使用され、Ｈｅｒ−２がＳＫＢｒ−３細胞を選択するために使用され、ＥＧＦＲがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を選択するために使用された。これら３つ全ての方式は、８８％より高い回収率で標的細胞を単離して閉じ込めた。ｅＤＡＲの別の一意の重要な特徴は、マーカーが位置する場所の独立性である。例えば、表面捕捉方法または免疫磁性方法等の他の技術では、細胞表面上の抗原のみを捕捉することができる。本方法は、ＧＦＰ等の細胞内マーカーを伴う細胞を選択することができる（図９ｄ）。ヒト全血に混入されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ細胞の回収率は、９１％であった（図９ｇ）。蛍光タンパク質が、転移の進行および機構を研究するために動物モデルで広く使用されるため、ｅＤＡＲは、いかなる免疫染色ステップも伴わずに、これらのモデルでＣＴＣを選択するための理想的なツールである。
【０２９８】
膵臓癌がある患者からのサンプルの高スループット分析
本方法の偽陽性率を評価するために、１５人の健康なドナーからの血液サンプルが使用され、それらのうちのいずれでもＣＴＣが見出されなかった。２６個の血液サンプルが、膵臓癌がある患者から収集された。第１世代のｅＤＡＲを使用して、それらのうちの１６個が分析され、より新しいｅＤＡＲプラットフォームを使用して、他の１０個のサンプルが分析された。図２５は、３つのデータセット、すなわち、現在の方法によって分析された対照血液、第１世代のｅＤＡＲによって分析された膵臓癌サンプル、および現在の方法によって分析された膵臓癌サンプルの分布を示す。これらの臨床サンプルの未加工データが、表３（以下）内にある。
【表３−１】
2019191190.tif 000005
【表３−２】
2019191190.tif 000006
【０２９９】
本方法を用いて、ＣＴＣが、２〜８７２個の細胞／ｍＬに及ぶサンプルの８０％（１０のうち８）で検出された。以前の研究によって報告されたＣＴＣ集合もまた、患者血液サンプル中で検出された。実験で観察された集合の多くが低いＥｐＣＡＭ発現を有していたことを指摘することが興味深い。図２６は、サイトケラチンの高い発現を有していたが、ＥｐＣＡＭの低い発現を有していた、ＣＴＣ集合を示す。
【０３００】
（実施例２）
逐次免疫染色および光退色による、捕捉された希少細胞中の複数のバイオマーカーの撮像
本実施例では、逐次免疫染色および光退色プロセスのための好ましい方式が開示される。好ましい実施例では、死容積を最小限化し、使用される抗体の量を減少させ、気泡を導入することを回避し、プロセスを自動化するために、インライン染色および洗浄システムがｅＤＡＲと併用される。
【０３０１】
本実施例は、閉じ込められたＣＴＣ上のタンパク質マーカーの発現分析を行うための最適化された単純な半自動方法を説明する。インライン免疫染色および光退色システムは、選択されたＣＴＣ上で標識および蛍光撮像を可能にすることができる。本方法は、異なるフルオロフォアに共役される抗体の群でＣＴＣを標識するステップを含むことができ、その後に、光退色およびバイオマーカーの別の群に対する異なる蛍光抗体を用いた再標識が続く。本プロセスは、タンパク質バイオマーカーのいくつかの群を研究するように、複数回繰り返すことができる。例示的な場合において、群を生成するように、２つの着目タンパク質マーカーを陽性対照マーカー（例えば、核染色）および陰性対照マーカー（例えば、ＣＤ４５）と組み合わせることができる。各回で一群を研究することができ、その後に、着目タンパク質マーカーの発現を見るように、２回目の前に光退色（例えば、４回の免疫染色および光退色）が続く。
【０３０２】
マイクロ流体構成要素および線共焦点光学部
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マイクロ流体チップは、以前に説明された方法を使用して加工された。簡潔には、本特徴は、ＡｕｔｏＣＡＤ（ＡｕｔｏＤｅｓｋ（Ｓａｎ
Ｒａｆａｅｌ，  ＣＡ））を使用して設計され、次いで、Ｆｉｎｅｌｉｎｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，  ＣＯ）によって透明マスク上に書き込まれた。微小特徴が、陰性フォトレジストとしてＳＵ−８−３０５０（Ｍｉｃｒｏ−Ｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．（Ｎｅｗｔｏｎ，  ＭＡ））を使用してシリコンウエハ上で加工され、特徴の高さは、５０μｍであるように制御された。いったん特徴が開発されると、未硬化ＰＤＭＳがシリコンマスタ上に注がれ、７５℃で２時間培養され、剥離され、次いで、プラズマ酸化方法を使用してガラスカバースリップに結合された。
【０３０３】
線共焦点検出方式は、一連のダイクロイックミラー、円柱レンズ、およびビームスプリッタを使用して、２つの検出窓を形成するために、４８８および６３３ｎｍの２つのレーザ源を使用した。同時に重複した２つのレーザビームを有する、第１の検出窓は、標識ＣＴＣから蛍光信号を検出するために使用され、次いで、選別を自動的に制御した。第２の検出窓は、選別されたアリコートを確認し、選別効率を監視するために使用された。
【０３０４】
生物学的物質およびｅＤＡＲプロセス
別様に特定されない限り、Ｉｓｏｔｏｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｎｏ，  ＣＡ））が全ての実験用の緩衝剤として使用された。乳癌細胞株、すなわち、ＭＣＦ−７、ＳＫＢｒ−３、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））が、本システムを特性評価するために使用された。細胞培養が、ベンダによって推奨される条件下で行われ、週に１回収穫された。ＭＣＦ−７は、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で培養され、ＳＫＢｒ−３細胞は、マッコイ５培地で培養され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））で培養された。全ての細胞培地はまた、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））、および５０μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンも含有していた。健康なドナーから採取されたヒト全血が、Ｐｌａｓｍａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂ（Ｅｖｅｒｅｔｔ，  ＷＡ）から購入され、到着時に４℃で貯蔵された。各２０ｍＬ採血は、抗凝固剤としてＥＤＴＡでコーティングされた４本の５ｍＬ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管で入荷した。皮膚細胞からの潜在的な汚染を回避するように、各採血の第１の管が廃棄された。
【０３０５】
抗体が、任意の標識手技の前に起こり得る凝集体を除去するように、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離された。各血液サンプルが、暗室でフィコエリトリン（ＰＥ）（Ａｂｎｏｖａ（Ｔａｉｐｅｉ  Ｃｉｔｙ，  Ｔａｉｗａｎ））と共役した抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）で標識され、室温で３０分間培養された。標識血液サンプルは、遊離抗体を除去するように洗浄および遠心分離（１０分にわたって２，３００ｒｐｍ）された。サンプルは、シリンジポンプを使用して、即時にマイクロ流体チップに注入された。典型的には、流速は、ｅＤＡＲの操作のために５０μＬ／分に設定されたが、以前の最適化方法に基づいて、より高くあり得る。ＡＰＤ信号トレースが、ＰＣＩデータ取得カード（ＰＣＩ  ６６０２、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ））を使用して収集され、施設内で開発されたＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ（Ｎａｔｉｃｋ，  ＭＡ））スクリプトによって分析された。施設で構築された電子装置は、検出されたＡＰＤ信号に基づいて自動フィードバック制御を与え、マイクロ流体チップに接続されたソレノイド（Ｓ−１０−３８−Ｈ−４０、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｖａｎ  Ｎｕｙｓ，  ＣＡ））に電圧を印加するようにプログラムされた。ｅＤＡＲについてのさらなる詳細は、以前に説明されている。
【０３０６】
逐次免疫染色および光退色プロセス
ｅＤＡＲによって単離された細胞を洗浄した後、インライン弁をオフにすることによって、主要、側方、および廃棄物チャネルが閉鎖された。細胞固定緩衝剤（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ））の４００μＬアリコートが、１５μＬ／分の流速で蠕動ポンプポンプ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，  ＰＡ））によってマイクロ流体チップに導入された。緩衝剤で同一の流速にて５分間洗浄した後、２５０μＬの２．５％ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４６５界面活性剤（Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，  ＰＡ））を１５分間流動させることによって、細胞が透過化された。本ステップ後、細胞の４回の免疫染色および光退色が行われた。各回の染色について、４つの異なる蛍光色素に共役した４つのバイオマーカーを伴う２２０μＬの染色溶液が調製された。各回で使用される抗体および核染色についての詳細が、表２に要約される。凝集体を除去する遠心分離ステップ（５分にわたって１４，０００ｒｐｍ）後、２００μＬの上清が染色緩衝剤として収集された。上清は、２０μＬ／分の流速でマイクロ流体チップに注入された。抗体溶液が濾過領域全体を充填したとき、流動が停止された。培養は、全ての閉じ込められた細胞が抗体に効率的に接触したことを確実にするように、暗室で２０分間行われた。本ステップ後、細胞は、任意の遊離抗体を除去し、蛍光背景を最小限化するように、１０分間洗浄された。光源としてキセノンアーク灯（Ｓｕｔｔｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｎｏｖａｔｏ，  ＣＡ））を使用して、光退色が行われた。各退色ステップは、１５分かかった。２０倍対物レンズが、落射蛍光撮像および光退色に使用された。蛍光画像が、４つの異なる発光チャネル、すなわち、黄色（ＰＥの場合、５５５ｎｍ〜６０５ｎｍ）、青色（Ｈｏｅｃｈｓｔの場合、４３５ｎｍ〜４８５ｎｍ）、緑色（ＦＩＴＣまたはＡｌｅｘａ  ４８８の場合、５１０ｎｍ〜５４０ｎｍ）、および赤色（Ａｌｅｘａ  ６４７またはＡＰＣの場合、６６５ｎｍ〜６９５ｎｍ）から、光退色ステップの前および後に収集された。
【０３０７】
光退色プロセスのための安全性考慮
光退色試験を実行するときの安全性を確保するために、最高出力が１０ｍＷにロックされた。サンプルが光源に暴露されるときに、保護眼鏡を装着すること、または黒い箱で光退色領域を覆うこと等のある保護方法が考慮されるべきである。
【０３０８】
ｅＤＡＲによって単離されたＣＴＣ
全血サンプルが、フルオロフォアに共役した抗体で事前標識され、次いで、マイクロ流体チップに導入された。多くの用途で、ＥｐＣＡＭが、陽性選択のためのバイオマーカーとして使用された。しかしながら、本方法は、異なる、またはより複雑な選択論理を使用することにおいて便宜的であり得る。
【０３０９】
ｅＤＡＲでは、レーザ検出ビーム、体積流速、および選別速度の組み合わせによって、仮想アリコートが最初に定義された。これらの要因に基づいて、標識血液サンプルは、事実上、アリコートにつき２ｎＬで、１ｍＬにつき最大５０万アリコートに分割された。線共焦点検出方法は、単一被分析物選択性で蛍光発光を検出した。結果として、これらの仮想アリコートは、「陽性」または「陰性」として一次標識に基づいてランク付けされた。ＣＴＣの非常に低い濃度により、アリコートの９９．９９９％超が廃棄され（図１０Ａ）、１００万倍超の濃縮比をもたらした。
【０３１０】
アリコートランク付けの結果に基づいて、「陽性」アリコートを収集し、さらなる精製（例えば、精製チャンバ）および分析のための領域に移送することができるように、自動フィードバック機構が、血流の流体力学的切替をトリガするように適用された。２つの設計要素、すなわち、ソレノイド、および２つの側方緩衝剤ライン内の圧力降下が、この流体力学的切替を制御した。「陰性」アリコートのみが右側の廃棄物チャネルに流入するように、ソレノイドが、左側の閉鎖位置でＣＴＣ収集チャネルの中に配置された（図４Ａ）。また、ソレノイドが開放したときに、廃棄物チャネルから収集側に血流を切り替えた、緩衝剤が流動した２つの側方チャネルの間の圧力降下もあった。本単純方式は、最小量の血液細胞とともにＣＴＣを収集するために、２〜３ミリ秒で十分に高速であった。第２の線共焦点検出窓もまた、リアルタイムで流体力学的切替の効率を監視するように収集側に配置された。図４Ｂは、肺癌患者から採取されたサンプルからのデータのごく一部を示す。この図では、緑色の信号は、アリコート選別を制御した、第１の検出領域からのＡＰＤトレースを示し、赤色の信号は、アリコートが実際に選別されたことを確認する、第２の検出領域からのＡＰＤカウントであった。
【０３１１】
これらの選別されたアリコートは、ＣＴＣを閉じ込め、血液細胞の大部分を廃棄することができる領域に移送された（図４Ａ）。捕捉された細胞をさらに精製するための多くの可能な方法があるが、小さい一片のポリカーボネートフィルタ（５×５μｍ細孔径）がマイクロ流体チップ上に組み込まれた。閉じ込められた細胞は、撮像され、さらに、それらの識別を判定するようにマイクロ流体チップ上のより多くのバイオマーカーで標識された。例えば、図２６ａおよび図２６ｂは、ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン、および核染色に対して陽性であったが、ＣＤ４５に対して陰性であった、マイクロ流体チップ上に閉じ込められた癌細胞を示す。本細胞はまた、形態学的情報を提供した、明視野顕微鏡検査法によって観察された。
【０３１２】
逐次免疫染色および光退色
死容積を最小限化し、使用される抗体の量を減少させ、気泡を導入することを回避し、プロセスを自動化するために、インライン染色および洗浄システムが開発され、ｅＤＡＲと併用された。図１３Ａに示されるように、灌流標識および洗浄ステップを行うように、マイクロ流体チップ上の２つのポートが開かれたままにされた一方で、他の３つ全てのポートは完全に閉鎖された。蠕動ポンプが、洗浄緩衝剤および標識試薬をマイクロ流体チップに送達し、６方向弁を介して加圧緩衝剤源と連結された。この弁の上の他の３つのポートは、任意の起こり得る漏出または汚染を防止するように完全に遮断された。ｅＤＡＲ実験を実行するとき、６方向弁は、流体力学的切替の安定した制御を提供するように、加圧緩衝剤側に旋回させられた。これは、いかなる気泡も導入することなく、正確な量の試薬をマイクロ流体チップに注入するように、蠕動ポンプ側に旋回させられた。本方式を使用して、数ナノグラムの抗体が、５分未満で閉じ込められた細胞に導入され、典型的な培養ステップは、２０分未満かかった（図１３Ｂ）。
【０３１３】
細胞内マーカー試験を行う必要性があった場合、捕捉された細胞が、試験に先立ってマイクロ流体チップ上で固定および透過化された。次いで、複数回の染色、洗浄、撮像、および退色実験が、連続的に行われた。各回で、４色の蛍光、すなわち、黄色（ＰＥ）、赤色（Ａｌｅｘａ  ６４７またはＡＰＣ）、緑色（ＦＩＴＣ）、および青色（核染色）が監視された。
【０３１４】
研究のこの部分について、４回の逐次免疫染色および光退色プロセスに基づく、捕捉されたＣＴＣ上のタンパク質マーカーの発現の検定が設計された。落射蛍光顕微鏡検査法を使用して、４つの個々のチャネルを通した各回で４つの異なるマーカーが監視された。マーカーの各セットは、陽性対照マーカーとして核染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、陰性対照マーカーとしてＦＩＴＣと共役したＣＤ４５、およびＰＥまたはＡｌｅｘａ  ６４７と共役した２つのタンパク質マーカーを有していた。本システムは、２つの理由で、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を退色させないように設計された。すなわち、染色は、陽性対照マーカーとして使用され、染色を退色させるために、有意な細胞損傷を引き起こし得る紫外線暴露を必要とするであろう。ＣＤ４５は、ＣＴＣの分離において最大の妨害と見なされる、多くの種類の白血球（ＷＢＣ）上で広く発現される。したがって、それらは、頻繁に陰性対照マーカーとして使用される。
【０３１５】
多くのタンパク質マーカーをＣＴＣ上で試験することができるが、概念実証として、８つの抗原が選択され、４つの群に分割された（表２）。第１のセットは、ＣＴＣを識別するための最も広く使用されているマーカーである、ＥｐＣＡＭおよびサイトケラチンを有していた。免疫染色試験セットは、上皮バイオマーカーを伴うＣＴＣをさらに確認して計数するように、ｅＤＡＲによるＣＴＣの捕捉の直後に適用された。表２は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色に対して陽性であるが、ＣＤ４５に対して陰性である、マイクロ流体チップ上に閉じ込められた６つの腫瘍細胞があったことを示す。それらのうちの２つは、細胞が上皮特性を有していたことを示唆した、ＥｐＣＡＭおよびサイトケラチンの強い発現を有していた。
【０３１６】
第２のセットは、臨床および生物学的研究のために重要である、他の上皮マーカーを調査するように設計された。Ｈｅｒ２およびＭＵＣ１は、これら２つのバイオマーカーが癌の病因および薬剤に対する抵抗において重要な役割を果たすため、２つのタンパク質マーカーとして選択された。それらはまた、抗腫瘍薬剤および免疫療法の潜在的標的でもある。図１４の２回目の標識は、マイクロ流体チップ上に閉じ込められた細胞の一部がＭＵＣ１発現を有していたが、それら全ては、Ｈｅｒ２発現が非常に低かったことを示す。
【０３１７】
癌幹細胞は、腫瘍の進行において重要な役割を果たすことが示されており、ＣＴＣの集団で観察されている。マーカーの第３のセットは、２つの癌幹細胞抗原、すなわち、ＣＤ４４およびＣＤ２４を有していた。それらは、乳癌に対する、およびおそらく他の種類の癌にも対する幹細胞マーカーとして広範囲に研究されている。表２のデータは、４つの細胞がＣＤ４４＋／ＣＤ２４−の強い発現を有し、他の２つがＣＤ４４−／ＣＤ２４＋であることを示す。ＣＤ１３３およびＣＤ１０５等の他の幹細胞マーカーもまた、原発癌の種類に基づいて、この群で使用することができる。
【０３１８】
表２のマーカーの最後のセットは、ＥＧＦＲおよびＣＤ１６６の発現を見て、腫瘍細胞の間葉特性を実証するように設計された。ＥＧＦＲは、ＥＭＴプロセスと関連付けられることが示されており、ＣＤ１６６は、骨髄中の間葉幹細胞を定義するために使用された。ビメンチンおよびカドヘリン等の他の関連マーカーも、この群で使用することができる。
【０３１９】
光退色の特性評価
光退色ステップの効率を判定することができる、２つの重要な要因、すなわち、細胞が潜在的な加熱によって損傷されないことを確実にしながら、効率およびスループットを向上させるように特性評価および最適化された暴露強度および時間があった。異なる暴露強度下の光退色曲線が、最初に研究された（図１５Ａ）。ＭＣＦ−７細胞が、抗ＥｐＣＡＭ−ＰＥで標識され、２番のカバースリップ上に配置された。標識単細胞は、３つの異なる強度設定で退色させられた。退色曲線は、暴露強度が２ｍＷより高かったときに９５％超の退色効率を得るように、暴露時間を１０分を下回って制御できることを示す。
【０３２０】
これに基づいて、４つのフルオロフォア、すなわち、ＰＥ、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  ４８８、およびＡｌｅｘａ  ６４７の退色曲線のうちのいずれかを、本方式で直接適用することができる。図１５Ｂは、ＰＥ、ＦＩＴＣ、およびＡｌｅｘａ  ４８８の蛍光発光を５分未満で１０％未満まで退色させることができ、部分的に、６１０ｎｍ〜６６０ｎｍ（赤色励起）の光源の出力が黄色および緑色励起の範囲内の出力より低かったため、Ａｌｅｘａ  ６４７に対する光退色時間が、より長くかかったことを示す。結果として、退色時間は、容認可能なスループットで高い退色効率を得るように、１５分に設定された。これは、光源の出力を上昇させることによって向上させることができるが、これは、加熱および細胞損傷のリスクを潜在的に増加させ得る。
【０３２１】
（実施例３）
逐次免疫染色および撮像のための単一被分析物閉じ込め
本実施例は、逐次免疫染色および撮像の方法と併用される、単一被分析物閉じ込め装置を説明する。
【０３２２】
関連寸法は、効果的な直列流抵抗トラップ設計、ならびに恣意的な閉じ込め密度および寸法を有するデバイスの概略図（図１７）を伴い、差し込み図は、拡大領域が図１８で描写されていることを示す。図１８Ａの概略図は、主要チャネルの幅、収縮部の幅、主要チャネル収縮入口から主要チャネル収縮出口までの長さ、収縮部を横断する長さ、ならびに主要チャネル、収縮部、および収縮チャンバの高さ等のデバイスの相対寸法を示す。図１８Ｃは、直列流抵抗トラップを利用する、例示的なマイクロ流体デバイス設計を示す。設計は、サンプルが導入される入口（左側）と、過剰な液相が除去される出口（右側）とを備える。デバイス設計の中心は、組み込まれる流動抵抗トラップの高い密度を描写する。図１８Ｂは、図１８Ｃの拡大領域を示し、デバイスの機能的部分を構成する流動抵抗トラップを示す。
【０３２３】
図１９は、並列流抵抗トラップを描写する。図１９の上部パネルは、ウェルおよび収縮部の形状変形例を示す、デバイスからのウェルの３次元断面側面図を描写する。ウェル設計は、円柱、円錐、正方形、六角形、半球体等の形状の異なる、または類似する組み合わせにあり得る。ウェルの寸法は、ｈ１＝ウェルの深度、ｈ２＝収縮部の深度、ｒ１＝ウェルの半径、およびｒ２＝収縮部の半径によって画定することができる。本側面によると、本デバイスは、溶液からビーズ、細胞等の単一粒子／細胞を閉じ込めることが可能である。本デバイスを形成するように、複数のウェルを並列に配列することができる。
【０３２４】
図２０は、本開示で説明されるデバイスのうちのいくつかを構築するために使用される手順の概略的描写である。本プロセスでは、固体基板（例えば、シリコンウエハ）が、フォトレジストでスピンコーティングされる。コーティングされた基板は、紫外線透明および不透明領域で描写される所望の設計で刻み込まれたフォトリソグラフィックマスクとしっかり接触して配置される。マスクおよび基板は、フォトレジスト内で光化学架橋反応を開始する、紫外線に暴露させられる。加工されたデバイスの第１の層は、フォトレジストの非架橋部分を溶解させる、結果として生じた架橋パターンを現像することによって完成させられる。加工の第２の層は、フォトレジストの第２の層をコーティングし、暴露し、現像することによって進展する。結果は、硬化性材料（例えば、ＰＤＭＳ）またはエンボス加工可能材料にチャネル、チャンバ、およびウェル構造を形成するために使用される金型である。例えば、金型は、皿の中に配置される。第２に、ＰＤＭＳが、金型に注ぎ入れられ、硬化させられる。第３に、ＰＤＭＳは、金型から解放（剥離）され、この時点で、入口および出口が開けられる（描写せず）。最終的に、パターン形成されたＰＤＭＳが、チャネルおよびチャンバ／ウェルを取り囲むように平坦ガラスまたはＰＤＭＳ片に密閉される。
【０３２５】
図２１は、並列流抵抗トラップを生産するために使用される微細加工方法の実施例を示す。本デバイスは、上記で説明されるように、フォトレジスト（例えば、ＳＵ−８）以外の材料で加工される。利用可能な材料は、ポリマー材料、フォトレジスト、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリメチルウレタン（ＰＵＭＡ）等を含むことができるが、それらに限定されない。（１）犠牲層をシリコン（Ｓｉ）ウエハ上にスピンコーティングすることができる。（２）フォトレジスト（ＳＵ−８）を最上部に堆積させることができる。（３）マイクロアレイパターンを伴うフォトマスクが整合させられ、ウエハが紫外線に暴露させられる。（４）非架橋フォトレジストが処理され、シリコンウエハ上に所望のパターンを残して除去される。２層設計が一側面で使用される。その場合において、フォトレジストの第２の層がスピンコーティングおよび処理される。（５）ＳＵ−８層がＳｉウエハから解放され、多孔質ポリカーボネートフィルタ（経路１のみ）および／または管類を挿入するための単一の出口を伴うＰＤＭＳマウント（経路１−２）上に組み立てられる。
【０３２６】
図２２は、直列流抵抗トラップおよび並列流抵抗トラップが生物学的由来サンプルを収集し、離散化し、読み出すように機能する、一式のステップを描写する。部分Ａは、どのようにしてサンプルが画定された場所を連続的に充填するかを示す。本プロセスは、サンプルの臨界寸法（直径）が、主要チャネルの高さおよび幅より小さいとともに、収縮部の高さまたは幅より大きいときに起こる。流動に対する抵抗差が、サンプルを画定された領域の中へ操縦し、そうするとすぐに、収縮部が閉塞され、流動が停止させられる。後続のサンプルは、全てのトラップが充填されるまで、次の閉じ込め場所まで主要チャネルを通る流路を辿る。部分Ｂは、どのようにして不混和液相がサンプル入口を通して導入され、閉じ込められたサンプルを連続的に離散化するかを示す。不混和液体は、閉塞制約による、ならびにチャネル材料および閉じ込め領域の寸法との不混和相の接触角度差によって生成される界面障壁による、流体流の不足のため、サンプル領域に流入しないであろう。部分Ｃは、どのようにして離散化サンプルの様々な化学的性質が検出されるかを実証する。充填の直列性質の結果として、各サンプルに関する時間的情報も各場所で物理的に符号化される。部分Ｄは、並列流抵抗トラップを充填するサンプルの第１のステップを図示する。サンプル粒子は、デバイスの最上部から画定された閉じ込めウェルの中へ流動を辿る。設計の並列性質により、複数のサンプルが、本明細書で提示されるある他の閉じ込め方式より速いサンプル収集のために同時に閉じ込められる。部分Ｅは、どのようにして不混和相が閉じ込めウェルの平面の上方または下方で置換され、それによって、離散化サンプルを生成するかを示す。部分Ｆは、どのようにして様々な化学的性質のサンプルが同時に検出されるかを表示する。
【０３２７】
図２３は、明視野顕微鏡検査法および蛍光顕微鏡検査法に基づくマイクロウェルおよび側方チャンバのアレイの検出および読出方式を示す。サンプルは、コンピュータプログラムによって制御される自動平行移動ステージ上に配置される。画像が高速ＣＣＤカメラによって取得される。
【０３２８】
図２４は、分析および放出のために生物学的粒子／細胞のアレイを閉じ込めるための順序を図示する。（１）流動が、トラップを通した流体流を促進するように管類から適用される。流体中の独立粒子／細胞が、開放ウェルの中への流動パターンを辿る。（２）いったん閉じ込められると、流動がその局所的領域中で停止する。（３）溶液が、過剰な流体および粒子／細胞を洗い流すために使用される。本デバイスは、蛍光撮像、退色、および分析の反復サイクル等の以降の分析が粒子／細胞に行われることを可能にする。分析の完了時に、（４）管類中の流動が粒子を放出するように逆転させられる。
【０３２９】
（実施例４）
二重捕捉ｅＤＡＲ
本実施例は、本開示の側面による、ｅＤＡＲの「二重捕捉」バージョンを説明する。二重捕捉ｅＤＡＲは、同一のマイクロ流体デバイス上の同一のヒト血液サンプルからＣＴＣの２つの異なる亜集団を同時に分離することができる。これら２つの亜集団は、それぞれ、高い回収率および純度で、マイクロ流体チップ上の２つの異なる領域上に別々に閉じ込めることができる。
【０３３０】
図１１は、マイクロ流体デバイスの一般構造を示す。血液サンプルが、異なる蛍光タグと共役した２種類の抗体で事前標識された。例えば、血液サンプルは、ＰＥと共役した抗ＥｐＣＡＭ等の上皮マーカー、ならびにＦＩＴＣ等のＰＥと比較して異なる発光波長を有する別のフルオロフォアと共役した抗ＥＧＦＲまたは抗ビメンチン等の間葉マーカーで標識された。標識血液サンプルは、マイクロ流体チップに注入され、ＥｐＣＡＭ発現を伴うＣＴＣは、黄色チャネルにピークを伴って、線共焦点方式を使用して検出することができ、次いで、収集チャネル＃１の中へその特定のアリコートを収集するように、能動的選別事象がトリガされた。同様に、アリコートは、間葉マーカーに対して陽性としてランク付けされた場合、収集チャネル＃２に選別された。次いで、２つの亜集団は、別々にマイクロ流体チップ上に閉じ込められて濃縮された。濾過領域は、第２世代のｅＤＡＲで使用される同一設計のマイクロスリット上に構築された。
【０３３１】
流体切替方式は、以下のように要約される。アリコートが適用される任意のマーカーに対して陰性としてランク付けされたとき、次いで、図１１のソレノイドの両方が閉鎖された。２つの側方チャネルへの圧力が平衡を保たれた場合、血液は、廃棄物を収集するために使用された底部中心チャネルへ流動した。アリコートが上皮マーカーのみに対して陽性としてランク付けされたとき、ソレノイド＃２が即時に開放したため、血流が左側の収集チャネルへ押動された（図１２Ｂ）。アリコートが収集された後、ソレノイド＃２が再度閉鎖したため、血流が中心に戻った。アリコートが上皮マーカーのみに対して陽性としてランク付けされたとき、ソレノイド＃１が即時に開放したため、血流が右側へ押動された（図１２Ｃ）。２種類のｅＤＡＲ選別事象の応答時間は、約２〜３ミリ秒であった。
【０３３２】
図１１は、「二重捕捉」ｅＤＡＲの一般構造を示す。標識血液が、最上部の主要チャネルに導入された。緩衝剤が、２つのソレノイドを使用して、血流の流体力学的切替を制御するように、２つの側方チャネルの中で流動していた。ＣＴＣの２つの亜集団が、分離され、同一のマイクロ流体チップ上の同一の異なる濾過領域上に閉じ込められた。
【０３３３】
図１２は、血流の３つの状態の明視野像を描写する。Ａ）アリコートがいずれか一方のマーカーに対して陰性としてランク付けされたため、血流は廃棄物収集チャネルに流入した。Ｂ）血液は、収集チャネル＃１に切り替えられ、ＣＴＣの第１の亜集団は、そこに移送された。Ｃ）血液は、収集チャネル＃２に切り替えられ、ＣＴＣの第２の亜集団は、そこに移送された。
【０３３４】
付加的な側面
本明細書では、（１）具体的には、被分析物上の少なくとも各マーカーにタグを使用し、各タグによって発せられる信号を除去することに先立って、各タグによって発せられる信号を検出し、信号を検出して低減させるプロセスを繰り返すことによって、流体内の被分析物上に存在する複数のマーカーを識別し、（２）具体的には、一式の管類および少なくとも１つのチャンバに流体的に接続された少なくとも１つのチャネルを備える、マイクロ流体チップにサンプルを導入することによって、細胞の第１および第２のサブタイプの混合物を含むサンプルから細胞を単離し、（３）具体的には、少なくとも１つのチャネルを有するマイクロ流体チップに接続された一式の管類を備える装置を使用して、流体サンプルから特定のバイオマーカープロファイルを発現する細胞を分割し、（４）具体的には、各微小空洞またはマイクロパッチにわずか１つの被分析物を含有するよう、複数の微小空洞またはマイクロパッチを備える基板を使用して、複数の被分析物を分割することによって、被分析物上に存在する複数のマーカーを識別し、（５）具体的には、少なくとも１つのサンプル入力チャネル、少なくとも１つの指向性流チャネル、および少なくとも２つの出力チャネルを伴うマイクロ流体チップ、およびマイクロ流体チップの一部ではないデバイス上に位置する電子作動型弁を使用することによって、流体サンプル中の粒子を検出し、（６）具体的には、希少粒子の存在または非存在に基づいて値をアリコートに割り当て、マイクロ流体チップの外部にあるデバイス上に位置する電子作動型弁を開放することにより、割り当てられた値に基づいてアリコートの流動を指向することによって、マイクロ流体チップ内の流体サンプルのアリコートを単離し、（７）少なくとも２つの出力チャネルを伴う、具体的には、微小開口のアレイと流体的に接続される２つの出力チャネルのうちの少なくとも１つを伴うデバイスを使用して、および１つまたはそれを上回る希少粒子を選別するためにデバイスを使用して、流体サンプル中の希少粒子を検出するために、粒子、具体的には、粒子が被分析物であり、被分析物が細胞である、流体サンプルのアリコート中の粒子を分析するための方法および装置が説明される。
【０３３５】
いくつかの側面では、本開示は、流体内の被分析物上に存在する複数のマーカーを識別するための方法を提供し、本方法は、（ａ）放射線源を使用して、第１のタグから信号を検出するステップであって、第１のタグは、被分析物上の第１のマーカーに結合する第１の構造に取り付けられる、ステップと、（ｂ）第１のタグの存在に基づいて被分析物を分割するステップと、第１のタグの信号のレベルを低減させるステップと、（ｃ）被分析物を、第２のマーカーに結合する第２の構造と接触させるステップであって、第２の構造は、第２のタグに取り付けられる、ステップと、（ｄ）第２のタグを検出するステップとを含む。これらの側面のいくつかの実施形態では、第１のタグの信号は、５０％超低減させられる。いくつかの側面では、ステップ（ａ）の分割は、第１のタグおよび第３のタグの存在に基づく。いくつかの側面では、ステップ（ａ）の分割は、マイクロ流体デバイスを用いて行われる。いくつかの側面では、ステップ（ａ）の分割およびステップ（ｂ）における検出は、同一のマイクロ流体デバイス内で起こる。いくつかの側面では、被分析物は、細胞である。いくつかの側面では、細胞は、癌細胞である。いくつかの側面では、癌細胞は、希少細胞である。いくつかの側面では、被分析物は、循環腫瘍細胞である。いくつかの側面では、細胞は、細菌細胞、免疫細胞、胎児細胞、治療後に残留する疾患を示す細胞、または幹細胞である。いくつかの側面では、流体は、全血、分画血液、血清、血漿、汗、涙、耳内流動物、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣内流動物、糞便、経頸管洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心膜外液、ならびに呼吸器、腸管、および尿生殖路の分泌物から成る群から選択される。いくつかの側面では、流体は、全血である。いくつかの側面では、流体は、分画全血である。いくつかの側面では、第１のタグは、抗体である。いくつかの側面では、第１のタグは、フルオロフォアである。いくつかの側面では、第１のタグは、核酸から成るプローブである。いくつかの側面では、ステップ（ｃ）における信号の低減は、放射線を被分析物に印加することによって達成される。いくつかの側面では、放射線は、白色光である。いくつかの側面では、ステップ（ｃ）における信号の低減は、化学物質を第１のタグに適用することによって達成される。いくつかの側面では、化学物質は、還元剤である。いくつかの側面では、還元剤は、ジチオスレイトールである。いくつかの側面では、放射線は、レーザを使用して印加される。いくつかの側面では、放射線は、発光ダイオード（ＬＥＤ）を使用して印加される。
【０３３６】
いくつかの側面では、本方法はさらに、第１のタグおよび第２のタグから信号を撮像するステップを含んでもよい。いくつかの側面では、被分析物は、流体中に存在し、流体は、より大きい体積の流体のアリコートである。いくつかの側面では、分割は、半自動的または自動的に行われる。いくつかの側面では、分割は、アンサンブル決定アリコートランク付けによって行われる。いくつかの側面では、各マーカーは、バイオマーカーである。いくつかの側面では、複数のバイオマーカーは、発現プロファイルによって特性評価される。
【０３３７】
いくつかの側面では、本方法はさらに、被分析物を緩衝剤と接触させるステップを含む。いくつかの側面では、緩衝剤は、固定剤を含有する。いくつかの側面では、緩衝剤は、透過化剤を含有する。いくつかの側面では、緩衝剤は、洗浄緩衝剤である。いくつかの側面では、フローサイトメータが、被分析物を分割するために使用されない。いくつかの側面では、ステップａにおける検出時に、被分析物は、組織内の付加的な細胞に接続される細胞ではない。
【０３３８】
本明細書では、細胞サンプルから細胞を単離するための方法および組成が説明され、いくつかの側面では、細胞サンプルから細胞を単離する方法は、第１の細胞サブタイプと、第２の細胞サブタイプとを含んでもよく、さらに、（ａ）一式の管類を介してサンプルをマイクロ流体チップに導入するステップであって、マイクロ流体チップは、（ｉ）一式の管類に流体的に接続される少なくとも１つのチャネルと、（ｉｉ）少なくとも１つのチャネル内の細胞の信号を検出するように構成される検出器と、（ｉｉｉ）少なくとも１つのチャネルに流体的に接続される少なくとも１つのチャンバとを備える、ステップと、（ｂ）検出器を通り過ぎてサンプルの一部分を流動させるステップと、（ｃ）細胞サンプルの一部分内の第１の細胞サブタイプの存在または非存在を検出するために、検出器を使用するステップと、（ｄ）第１の細胞サブタイプが細胞サンプルの一部分内で検出される場合、細胞サンプルのアリコートをチャンバの中へ指向するステップであって、アリコートは、第１の細胞サブタイプを含む、ステップと、（ｅ）ステップ（ｂ）−（ｄ）を繰り返し、それによって、チャンバが、サンプル内の第１の細胞サブタイプの総数の８０％超、およびサンプル内の第２の細胞サブタイプの総数の５％未満を含むように、チャンバ中の複数のアリコートを単離するステップとを含んでもよい。
【０３３９】
いくつかの側面では、流体に由来するサンプルから特定のバイオマーカープロファイルを発現する細胞を分割するための装置が本明細書で提供され、本装置は、少なくとも１つのチャネル、およびチャンバを有する、マイクロ流体チップに接続される一式の管類を備え、本装置は、チャンバ中の細胞を単離することが可能であり、単離後、チャンバは、特定のバイオマーカープロファイルを発現するサンプル中の細胞の全集団の８０％超を含み、単離後、チャンバは、異なるバイオマーカープロファイルを発現するサンプル中の細胞の全集団の５％未満を含む。いくつかの側面では、特定のバイオマーカープロファイルを発現する細胞の単離は、２０分未満で起こる。いくつかの側面では、特定のバイオマーカープロファイルは、流体のサンプル中の細胞の５％未満の上に存在する。いくつかの側面では、流体は、血液である。いくつかの側面では、流体は、分画全血である。いくつかの側面では、流体は、全血の有核細胞分画である。
【０３４０】
いくつかの側面では、被分析物上に存在する複数のマーカーを識別するための方法が本明細書で提供され、本方法は、（ａ）複数の微小空洞またはマイクロパッチを備える基板を経由して被分析物を流動させることによって、複数の被分析物を分割するステップであって、微小空洞またはマイクロパッチの大部分は、多くても１つの被分析物を含有することが可能であり、微小空洞またはマイクロパッチは、マイクロ流体デバイスの中に位置する、ステップと、（ｂ）微小空洞またはマイクロパッチの中で、各被分析物を、第１のマーカーに結合することが可能である第１の構造と接触させるステップであって、第１の構造は、第１のタグに接続される、ステップと、（ｃ）第１のタグから信号を検出するステップと、第１のタグの信号のレベルを低減させるステップと、（ｄ）被分析物を、第２のマーカーに結合する第２の構造と接触させるステップであって、第２の構造は、第２のタグに接続される、ステップと、（ｅ）第２のタグを検出するステップとを含む。いくつかの側面では、第１のタグの信号は、５０％超低減させられる。いくつかの側面では、ステップｂの接触は、微小空洞またはマイクロパッチと流体連通しているチャネルを通して、第１の構造を備える流体を流動させることによって達成される。いくつかの側面では、ステップｂの接触させるステップに続いて、本方法はさらに、被分析物を洗浄緩衝剤と接触させるステップを含む。いくつかの側面では、被分析物は、細胞である。いくつかの側面では、被分析物は、流体流動によって生成される力、重力、または接着力によって、微小空洞内の固定位置で保持される。いくつかの側面では、各被分析物は、分子相互作用を通して微小空洞またはマイクロパッチに接続される。いくつかの側面では、各被分析物は、非共有結合を通して微小空洞に接続される。いくつかの側面では、非共有結合は、ファン・デル・ワールス相互作用、静電結合、疎水結合、または非特異的吸着である。
【０３４１】
いくつかの側面では、流体サンプル中の粒子を検出するためのデバイスが本明細書で提供され、本デバイスは、少なくとも１つのサンプル入力チャネル、少なくとも１つの指向性流チャネル、および少なくとも２つの出力チャネルを備える、マイクロ流体チップであって、少なくとも１つの指向性流チャネルは、サンプル入力チャネルに交差する、マイクロ流体チップと、マイクロ流体チップの一部ではないデバイス上に位置する、電子作動型弁であって、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネルまたは少なくとも２つの出力チャネルのうちの少なくとも１つに交差する入力チャネルを制御することによって、液体の流動を制御する、電子作動型弁と、流体サンプルのアリコート中の１つまたはそれを上回る被分析物を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と、アリコート中の被分析物の存在、非存在、識別、組成、または数量に基づいて、値をアリコートに割り当てることが可能なデジタルプロセッサであって、デジタルプロセッサは、検出器および電子作動型弁と通信している、プロセッサとを備える。いくつかの側面では、電子作動型弁は、ソレノイド弁である。いくつかの側面では、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネル中の液体の流動を制御する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、常時閉であり、電子作動型弁は、コンピュータから信号を受信した後に開放する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、常時開であり、電子作動型弁は、コンピュータから信号を受信した後に閉鎖する。いくつかの側面では、少なくとも１つの指向性流チャネルは、少なくとも２つのポートを備え、電子作動型弁は、ポートのうちの１つを通る流体の流動を制御する。いくつかの側面では、本デバイスは、第２の検出器を備える。いくつかの側面では、出力チャネルのうちの少なくとも１つは、フィルタに流体的に接続される。いくつかの側面では、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネル中の液体の流動を直接制御する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネルに流れ込むチャネル中の液体の流動を直接制御する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、１つだけの指向性流チャネル中の液体の流動を直接制御する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、少なくとも２つの出力チャネルのうちの１つの中の液体の流動を直接制御する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、少なくとも２つの出力チャネルのうちの１つに流れ込むチャネル中の液体の流動を直接制御する。いくつかの側面では、少なくとも１つの指向性流チャネルは、１つまたはそれを上回る合流点で少なくとも２つの出力チャネルに交差する。いくつかの側面では、本デバイスは、検出器を備える。いくつかの側面では、本デバイスは、確認レーザを備える。いくつかの側面では、検出器は、出力チャネルではない、少なくとも１つのチャネルの上に位置する。いくつかの側面では、確認レーザは、入力チャネルではない、少なくとも１つのチャネルの上に位置する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、圧電弁である。
【０３４２】
いくつかの側面では、マイクロ流体チップ内の流体サンプルのアリコートを単離するための方法が本明細書で提供され、アリコートは、希少粒子を含み、本方法は、アリコート中の希少粒子の存在または非存在を検出するステップと、希少粒子の存在または非存在に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、電子作動型弁を開放することによって、割り当てられた値に基づいてアリコートの流動を指向するステップであって、電子作動型弁は、マイクロ流体チップの外部にあるデバイス上に位置する、ステップとを含む。いくつかの側面では、マイクロ流体チップは、サンプル入力チャネルと、少なくとも２つの出力チャネルと、少なくとも１つの指向性流チャネルとを備え、電子作動型弁は、指向性流チャネル内の流体の流動を制御する。
【０３４３】
いくつかの側面では、流体サンプル中の希少粒子を検出するためのデバイスが本明細書で提供され、本デバイスは、少なくとも第１のサンプル入力チャネルと、少なくとも２つの出力チャネルであって、２つの出力チャネルのうちの少なくとも１つは、微小開口のアレイと流体的に接続される、出力チャネルと、流体サンプルのアリコート中の１つまたはそれを上回る希少粒子を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と、第１の出力チャネルを通して、１つまたはそれを上回る希少粒子を含有するアリコートの流動を指向することによって、１つまたはそれを上回る希少粒子を選別するための機構とを備える。いくつかの側面では、機構は、アリコートが希少粒子を含有しない場合、アリコートの流動を第２の出力チャネルの中へ指向する。いくつかの側面では、開口のアレイは、第１のサンプル入力チャネルと少なくとも２つの出力チャネルとの間に配置される。いくつかの側面では、開口のアレイは、第１のサンプル入力チャネルおよび出力チャネルと同一の平面内にある。いくつかの側面では、開口のアレイは、希少粒子が開口を通過することができないが、少なくとも１つの他の粒子が開口を通過することが可能であるように構成される。いくつかの側面では、開口のアレイは、１０００個超の開口を備える。いくつかの側面では、希少粒子を選別するための機構は、電極、磁気要素、音響要素、または電子作動型要素を備える。いくつかの側面では、検出器は、カメラ、電子倍増管、電荷結合素子（ＣＣＤ）画像センサ、光電子倍増管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、単光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）、シリコン光電子倍増管（ＳｉＰＭ）、および相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）画像センサから成る群から選択される。
【０３４４】
種々の側面では、流体内の被分析物上に存在する複数のマーカーを識別するために方法が提供され、本方法は、（ａ）放射線源を使用して、第１のタグから信号を検出するステップであって、第１のタグは、被分析物上の第１のマーカーに結合する第１の構造に取り付けられる、ステップと、（ｂ）第１のタグの存在に基づいて被分析物を分割するステップと、（ｃ）第１のタグの信号のレベルを低減させるステップと、（ｄ）被分析物を、第２のマーカーに結合する第２の構造と接触させるステップであって、第２の構造は、第２のタグに取り付けられる、ステップと、（ｅ）第２のタグを検出するステップとを含む。
【０３４５】
いくつかの側面では、第１のタグの信号は、５０％超低減させられる。他の側面では、ステップ（ａ）の分割は、第１のタグおよび第３のタグの存在に基づく。さらなる側面では、ステップ（ａ）の分割は、マイクロ流体デバイスを用いて行われる。なおもさらなる側面では、ステップ（ａ）の分割およびステップ（ｂ）における検出は、同一のマイクロ流体デバイス内で起こる。いくつかの側面では、被分析物は、細胞である。他の側面では、細胞は、癌細胞である。さらなる側面では、癌細胞は、希少細胞である。なおもさらなる側面では、被分析物は、循環腫瘍細胞である。いくつかの側面では、細胞は、細菌細胞、免疫細胞、胎児細胞、治療後に残留する疾患を示す細胞、または幹細胞である。他の側面では、流体は、全血、分画血液、血清、血漿、汗、涙、耳内流動物、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣内流動物、糞便、経頸管洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心膜外液、ならびに呼吸器、腸管、および尿生殖路の分泌物から成る群から選択される。いくつかの側面では、流体は、全血である。さらなる側面では、流体は、分画全血である。なおもさらなる側面では、第１のタグは、抗体である。いくつかの側面では、第１のタグは、フルオロフォアである。いくつかの側面では、第１のタグは、核酸から成るプローブである。他の側面では、ステップ（ｃ）における信号の低減は、放射線を被分析物に印加することによって達成される。さらなる側面では、放射線は、白色光である。なおもさらなる側面では、ステップ（ｃ）における信号の低減は、化学物質を第１のタグに適用することによって達成される。いくつかの側面では、化学物質は、還元剤である。さらなる側面では、還元剤は、ジチオスレイトールである。いくつかの側面では、放射線は、レーザを使用して印加される。他の側面では、放射線は、発光ダイオード（ＬＥＤ）を使用して印加される。さらなる側面では、本方法はさらに、第１のタグおよび第２のタグから信号を撮像するステップを含む。なおもさらなる側面では、被分析物は、流体中に存在し、流体は、より大きい体積の流体のアリコートである。いくつかの側面では、分割は、半自動的または自動的に行われる。他の側面では、分割は、アンサンブル決定アリコートランク付けによって行われる。いくつかの側面では、各マーカーは、バイオマーカーである。さらなる側面では、複数のバイオマーカーは、発現プロファイルによって特性評価される。なおもさらなる側面では、本方法はさらに、被分析物を緩衝剤と接触させるステップを含む。いくつかの側面では、緩衝剤は、固定剤を含有する。他の側面では、緩衝剤は、透過化剤を含有する。さらなる側面では、緩衝剤は、洗浄緩衝剤である。なおもさらなる側面では、フローサイトメータが、被分析物を分割するために使用されない。いくつかの側面では、ステップａにおける検出時に、被分析物は、組織内の付加的な細胞に接続される細胞ではない。
【０３４６】
種々の側面では、第１の細胞サブタイプおよび第２の細胞サブタイプを含む細胞サンプルから細胞を単離するために、（ａ）一式の管類を介してサンプルをマイクロ流体チップに導入するステップであって、マイクロ流体チップは、（ｉ）一式の管類に流体的に接続される少なくとも１つのチャネルと、（ｉｉ）少なくとも１つのチャネル内の細胞の信号を検出するように構成される検出器と、（ｉｉｉ）少なくとも１つのチャネルに流体的に接続される少なくとも１つのチャンバとを備える、ステップと、（ｂ）検出器を通り過ぎて細胞サンプルの一部分を流動させるステップと、（ｃ）細胞サンプルの一部分内の第１の細胞サブタイプの存在または非存在を検出するために、検出器を使用するステップと、（ｄ）第１の細胞サブタイプが細胞サンプルの一部分内で検出される場合、細胞サンプルのアリコートをチャンバの中へ指向するステップであって、アリコートは、第１の細胞サブタイプを含む、ステップと、（ｅ）ステップ（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を繰り返し、それによって、チャンバが、サンプル内の第１の細胞サブタイプの総数の８０％超、およびサンプル内の第２の細胞サブタイプの総数の５％未満を含むように、チャンバ中の複数のアリコートを単離するステップとを含む、方法が提供される。
【０３４７】
種々の側面では、流体に由来するサンプルから特定のバイオマーカープロファイルを発現する細胞を分割するために装置が提供され、（ａ）本装置は、少なくとも１つのチャネル、およびチャンバを有する、マイクロ流体チップに接続される一式の管類を備え、（ｂ）本装置は、チャンバ中の細胞を単離することが可能であり、単離後、チャンバは、特定のバイオマーカープロファイルを発現するサンプル中の細胞の全集団の８０％超を含み、単離後、チャンバは、異なるバイオマーカープロファイルを発現するサンプル中の細胞の全集団の５％未満を含む。いくつかの側面では、特定のバイオマーカープロファイルを発現する細胞の単離は、２０分未満で起こる。他の側面では、特定のバイオマーカープロファイルは、流体のサンプル中の細胞の５％未満の上に存在する。さらなる側面では、流体は、血液である。なおもさらなる側面では、流体は、分画全血である。いくつかの側面では、流体は、全血の有核細胞分画である。
【０３４８】
種々の側面では、被分析物上に存在する複数のマーカーを識別するために方法が提供され、本方法は、（ａ）複数の微小空洞またはマイクロパッチを備える基板を経由して被分析物を流動させることによって、複数の被分析物を分割するステップであって、微小空洞またはマイクロパッチの大部分は、多くても１つの被分析物を含有することが可能であり、微小空洞またはマイクロパッチは、マイクロ流体デバイスの中に位置する、ステップと、（ｂ）微小空洞またはマイクロパッチの中で、各被分析物を、第１のマーカーに結合することが可能である第１の構造と接触させるステップであって、第１の構造は、第１のタグに接続される、ステップと、（ｃ）第１のタグから信号を検出するステップと、（ｄ）第１のタグの信号のレベルを低減させるステップと、（ｅ）被分析物を、第２のマーカーに結合する第２の構造と接触させるステップであって、第２の構造は、第２のタグに接続される、ステップと、（ｆ）第２のタグを検出するステップとを含む。
【０３４９】
いくつかの側面では、第１のタグの信号は、５０％超低減させられる。他の側面では、ステップｂの接触は、微小空洞またはマイクロパッチと流体連通しているチャネルを通して、第１の構造を備える流体を流動させることによって達成される。さらなる側面では、ステップ（ｂ）の接触させるステップに続いて、本方法はさらに、被分析物を洗浄緩衝剤と接触させるステップを含む。なおもさらなる側面では、被分析物は、細胞である。いくつかの側面では、被分析物は、流体流動によって生成される力、重力、または接着力によって、微小空洞内の固定位置で保持される。他の側面では、各被分析物は、分子相互作用を通して微小空洞またはマイクロパッチに接続される。
さらなる側面では、各被分析物は、非共有結合を通して微小空洞に接続される。なおもさらなる側面では、非共有結合は、ファン・デル・ワールス相互作用、静電結合、疎水結合、または非特異的吸着である。
【０３５０】
種々の側面では、流体サンプル中の粒子を検出するためにデバイスが提供され、本デバイスは、（ａ）少なくとも１つのサンプル入力チャネル、少なくとも１つの指向性流チャネル、および少なくとも２つの出力チャネルを備える、マイクロ流体チップであって、少なくとも１つの指向性流チャネルは、サンプル入力チャネルに交差する、マイクロ流体チップと、（ｂ）マイクロ流体チップの一部ではないデバイス上に位置する、電子作動型弁であって、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネルまたは少なくとも２つの出力チャネルのうちの少なくとも１つに交差する入力チャネルを制御することによって、液体の流動を制御する、電子作動型弁と、（ｃ）流体サンプルのアリコート中の１つまたはそれを上回る被分析物を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と、（ｄ）アリコート中の被分析物の存在、非存在、識別、組成、または数量に基づいて、値をアリコートに割り当てることが可能なデジタルプロセッサであって、デジタルプロセッサは、検出器および電子作動型弁と通信している、プロセッサとを備える。いくつかの側面では、電子作動型弁は、ソレノイド弁である。他の側面では、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネル中の液体の流動を制御する。
【０３５１】
さらなる側面では、電子作動型弁は、常時閉であり、電子作動型弁は、コンピュータから信号を受信した後に開放する。なおもさらなる側面では、電子作動型弁は、常時開であり、電子作動型弁は、コンピュータから信号を受信した後に閉鎖する。いくつかの側面では、少なくとも１つの指向性流チャネルは、少なくとも２つのポートを備え、電子作動型弁は、ポートのうちの１つを通る流体の流動を制御する。他の側面では、本デバイスは、第２の検出器を備える。さらなる側面では、出力チャネルのうちの少なくとも１つは、フィルタに流体的に接続される。
【０３５２】
種々の側面では、マイクロ流体チップ内の流体サンプルのアリコートを単離するために方法が提供され、アリコートは、希少粒子を含み、本方法は、（ａ）アリコート中の希少粒子の存在または非存在を検出するステップと、（ｂ）希少粒子の存在または非存在に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、（ｃ）電子作動型弁を開放することによって、割り当てられた値に基づいてアリコートの流動を指向するステップであって、電子作動型弁は、マイクロ流体チップの外部にあるデバイス上に位置する、ステップとを含む。
【０３５３】
いくつかの側面では、マイクロ流体チップは、サンプル入力チャネルと、少なくとも２つの出力チャネルと、少なくとも１つの指向性流チャネルとを備え、電子作動型弁は、指向性流チャネル内の流体の流動を制御する。
【０３５４】
種々の側面では、流体サンプル中の希少粒子を検出するためにデバイスが提供され、本デバイスは、（ａ）少なくとも第１のサンプル入力チャネルと、（ｂ）少なくとも２つの出力チャネルであって、２つの出力チャネルのうちの少なくとも１つは、微小開口のアレイと流体的に接続される、出力チャネルと、（ｃ）流体サンプルのアリコート中の１つまたはそれを上回る希少粒子を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と、（ｄ）第１の出力チャネルを通して、１つまたはそれを上回る希少粒子を含有するアリコートの流動を指向することによって、１つまたはそれを上回る希少粒子を選別するための機構とを備える。
【０３５５】
いくつかの側面では、機構は、アリコートが希少粒子を含有しない場合、アリコートの流動を第２の出力チャネルの中へ指向する。いくつかの側面では、開口のアレイは、第１のサンプル入力チャネルと少なくとも２つの出力チャネルとの間に配置される。いくつかの側面では、開口のアレイは、第１のサンプル入力チャネルおよび出力チャネルと同一の平面内にある。いくつかの側面では、開口のアレイは、希少粒子が開口を通過することができないが、少なくとも１つの他の粒子が開口を通過することが可能であるように構成される。いくつかの側面では、開口のアレイは、１０００個超の開口を備える。いくつかの側面では、希少粒子を選別するための機構は、電極、磁気要素、音響要素、または電子作動型要素を備える。いくつかの側面では、検出器は、カメラ、電子倍増管、電荷結合素子（ＣＣＤ）画像センサ、光電子倍増管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、単光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）、シリコン光電子倍増管（ＳｉＰＭ）、および相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）画像センサから成る群から選択される。いくつかの側面では、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネル中の流体の流動を直接制御する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、少なくとも１つの指向性流チャネルに流れ込むチャネル中の流体の流動を直接制御する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、１つだけの指向性流チャネル中の流体の流動を直接制御する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、少なくとも２つの出力チャネルのうちの１つの中の液体の流動を直接制御する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、少なくとも２つの出力チャネルのうちの１つに流れ込むチャネル中の液体の流動を直接制御する。いくつかの側面では、少なくとも１つの指向性流チャネルは、１つまたはそれを上回る合流点で少なくとも２つの出力チャネルに交差する。いくつかの側面では、本デバイスは、検出器を備える。いくつかの側面では、本デバイスは、確認レーザを備える。いくつかの側面では、検出器は、出力チャネルではない、少なくとも１つのチャネルの上に位置する。いくつかの側面では、確認レーザは、入力チャネルではない、少なくとも１つのチャネルの上に位置する。いくつかの側面では、電子作動型弁は、圧電弁である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2019191190.tif 000030
【図２５】
2019191190.tif 000031
【図２６】
2019191190.tif 000032
【外国語明細書】
2019191190000001.pdf