(57)【要約】【課題】  非特異吸着が抑制され、沈降しにくい粒子を提供すること。【解決手段】  ポリマーを含むコア構造と、シリカを含むシェル構造と、を含み構成される粒子であって、前記シェル構造は、前記シリカのシリル基に、ベタイン構造を有する官能基を含む分子が結合している粒子。【選択図】  図１
2019191120.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーを含むコア構造と、
シリカを含むシェル構造と、を含み構成される粒子であって、
前記シェル構造は、
前記シリカのシリル基に、下記式（１）で示される分子が結合した構造と、
前記シリカのシリル基に、下記式（２）で示される分子が結合した構造と、
を有する粒子、
【化１】
2019191120.tif 000010
上記式（１）において、
＊１は、前記シリル基のＳｉに結合する結合位置を表す。
Ｒ１は、（ＣＨ２）ａ−Ｓ、あるいは（ＣＨ２）ｂ−ＮＨを表しａ、ｂは、各々独立に１から５の整数を表す）、
Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３を表し、
Ｒ３は、ベタイン構造を有する官能基を表し、
【化２】
2019191120.tif 000011
上記式（２）において、
＊２は、前記シリル基のＳｉに結合する結合位置を表し、
Ｌ１は、（ＣＨ２）ｘ（ｘは０から５のいずれかの整数）であり、
Ｌ２は、ＮＨ−ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ（ｎは１から３０のいずれかの整数）のうち少なくともいずれか１つを含む２価の基、または直接結合であり、
Ｌ３は（ＣＨ２）ｙ（ｙは０から５のいずれかの整数）であり、
Ｒ４は、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、グリシジル基のいずれかを表す。
【請求項２】
前記式（２）において、前記Ｌ２が直接結合であり、前記Ｌ３におけるｙが０である請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記式（２）において、前記Ｌ２が（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎであり、前記ｎが１から２０のいずれかの整数である請求項１に記載の粒子。
【請求項４】
前記ベタイン構造を有する官能基が、４級アンモニウム、スルホニウム、及びホスホニウムのいずれかと、及びスルホン酸、カルボン酸、及びホスホン酸のいずれかと、を有する請求項１乃至３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項５】
前記ベタイン構造を有する官能基の分子量が２０００以下である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項６】
前記ベタイン構造を有する官能基の分子量が１０００以下である請求項１乃至５のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項７】
前記式（１）で表される分子が、下記式（１−ｉ）で表される請求項１に記載の粒子。
【化３】
2019191120.tif 000012
【請求項８】
前記式（２）で表される分子が、下記式（２−ｉ）で表される請求項１または２に記載の粒子、
【化４】
2019191120.tif 000013
上記式（２−ｉ）において、Ｒ４はＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、及びグリシジル基のいずれかを表す。
【請求項９】
前記ポリマーがポリスチレンである、
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の粒子と、前記粒子を分散させる分散媒とを有する分散液。
【請求項１１】
前記分散液に含まれる前記粒子の平均直径が、１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下である請求項１０に記載の分散液。
【請求項１２】
前記分散液に含まれる前記粒子の平均直径が、１５０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下である請求項１０または１１に記載の分散液。
【請求項１３】
前記分散液に含まれる前記粒子の粒度分布の変動係数が５％以下である請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の分散液。
【請求項１４】
前記分散液に含まれる前記粒子の粒度分布の変動係数が３％以下である請求項１０乃至１３のいずれか１項に記載の分散液。
【請求項１５】
請求項１及至９のいずれか１項に記載の粒子と、前記Ｒ４に結合したリガンドと、を有するアフィニティー粒子。
【請求項１６】
前記リガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることを特徴とする請求項１５に記載のアフィニティー粒子。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のアフィニティー粒子と、前記アフィニティー粒子を分散させる分散媒と、を有することを特徴とする体外診断用の検査試薬。
【請求項１８】
前記リガンドが抗体または抗原であり、ラテックス凝集法による検体中の抗原または抗体の検出に用いられる請求項１７に記載の検査試薬。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の検査試薬と、前記検査試薬を内包する筐体とを有することを特徴とする体外診断用の検査キット。
【請求項２０】
検体中の標的物質の検出方法であって、
請求項１７または１８に記載の検査試薬に、検体を混合する工程を有することを特徴とする検出方法。
【請求項２１】
ラテックス凝集法による検体中の標的物質の検出方法であって、
請求項１７または１８に記載の検査試薬に、検体を混合して混合液を得る工程と、
前記混合液に、光を照射する工程と、
前記混合液に照射された光の、透過光または散乱光の少なくともいずれかを検出する工程と、
を有することを特徴とする検出方法。
【請求項２２】
ビニル基を有するモノマーと、ラジカル重合開始剤とを混合することで、ポリマーを含むコア粒子を含む溶液を得る工程（工程１）と、
前記溶液に、ビニル基と、及びチオール基またはアミノ基と、を有するシランを添加して加水分解することで、前記コア粒子の表面にシリカを含むシェル構造を形成し、コア−シェル構造を有する粒子を得る工程（工程２）と、
前記粒子における前記チオール基またはアミノ基に、ビニル基とベタイン構造を有する分子を結合させる工程（工程３）と、
を有する粒子の製造方法。
【請求項２３】
前記ビニル基を有するモノマーがスチレンである請求項２２に記載の粒子の製造方法。
【請求項２４】
ビニル基を有するシランが、トリメチトキシビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、テトラメチルオルソシリケート、テトラエチルオルソシリケート、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシランで構成する群から選択される少なくとも１種である請求項２２または２３に記載の粒子の製造方法。
【請求項２５】
粒子にリガンドを結合する工程をさらに有する請求項２２乃至２４のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
【請求項２６】
前記リガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることを特徴とする請求項２５に記載の粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子、及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
医学、臨床検査の分野において、血液や採取された臓器の一部などから微量な生体成分を高感度で検出することは、病気の原因を追究するために必要である。生体成分の検出手法の中でも、免疫分析は広く利用されている。免疫分析の一つに、抗原抗体反応を利用したラテックス凝集法がある。ラテックス凝集法とは、生体試料等の液体中の抗原を検出する場合、抗原に特異的に結合する抗体などを担持させたラテックスと、液体とを混合して、ラテックスの凝集の程度を測定することにより、抗原の検出や定量を行う方法である。
【０００３】
ラテックス凝集法では、抗原がラテックスに結合した抗体に捕捉され、捕捉された抗体を介して複数のラテックスが架橋し、その結果凝集が起きる。つまり、生体試料等の液体中の抗原の量は、ラテックスの凝集の程度を評価することで定量できる。凝集の程度は、液体試料を透過、あるいは散乱する光の量の変化を評価することで定量できる。
【０００４】
ラテックス凝集法は、簡便かつ迅速に、抗原の定量評価ができる一方、生体試料などの液体中の抗原の量が少ないと、検出できないという課題があった。
【０００５】
検出感度を向上させるためには、ラテックスが目的の抗原のみを補捉し、他のタンパク質などの特異的吸着を抑制させる事や、目的の抗原の吸着量を大きくする事が挙げられる。
【０００６】
ラテックスへのタンパク質の非特異吸着を抑制する方法として、ラテックス粒子の表面を親水化することが効果的であると考えられている。一般的にタンパク質は疎水的な性質が強いものが多いので、ラテックスの表面を強い電荷を帯びずに親水化することにより、非特異吸着は抑制できると考えられている。このような考え方に沿って、ラテックス、例えばポリスチレン粒子などの表面に親水層をコートする試みがなされている（特許文献１、２）。
【０００７】
特許文献１では、ポリスチレン粒子の表面にシリカのみで構成される層を付与したコアーシェル構造体が提案されている。しかしながら、シリカ表面の化学状態が不明である事と、シリカ層の厚みが明確ではなく、実施例などにみられる４０ｎｍの厚みでは、粒子の比重が大きくなり、液体中で容易に沈降してしまうため、ラテックス凝集法では測定することができない。
【０００８】
特許文献２では、コア粒子の表面に親水構造を有するベタインポリマーをシェルとして付与した構造体が提案されている。ベタインは、正電荷と負電荷を同一分子内の隣り合わない位置に持ち、正電荷をもつ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず、分子全体としては電荷を持たない化合物の事を示す。つまり、ベタインは構造的に電荷がゼロであり、非常に高い親水性を示す構造なので、ベタインでコートした担体は非特異吸着が著しく抑制できることが知られている。しかしながら、特許文献２では分子量５０００以上のベタインポリマーでコア粒子を被覆しているため、抗体を粒子に吸着させ、更に粒子表面で目的の抗原を前記抗体で捕捉することが難しい。その結果、ラテックス凝集法で必要な、抗原抗体反応による粒子の凝集を起こすことが困難である。
【０００９】
従って、先行技術では、粒子表面の親水性を保ち非特異吸着を抑制でき、かつ、抗原を補足して、粒子が凝集した状態でも沈降しにくいような分散安定性を有するような材料を作製することが難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許３２６５６５３号公報
【特許文献２】特開２０１６−１８０７１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、この様な背景技術に鑑みてなされたものであり、ポリマーを含むコア構造の表面にシリカを含むシェルが被覆し、シェルの表面にベタイン構造の分子が結合したラテックス凝集法用の検体検査粒子を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る粒子はポリマーを含むコア構造と、シリカを含むシェル構造とを含み構成される粒子であって、前記シェル構造は、前記シリカのシリル基に、下記式（１）で示される分子が結合した構造と、前記シリカのシリル基に、下記式（２）で示される分子が結合した構造と、を有する粒子。
【００１３】
【化１】
2019191120.tif 000003
【００１４】
上記式（１）において、
＊１は、前記シリル基のＳｉに結合する結合位置を表す。
Ｒ１は、（ＣＨ２）ａ−Ｓ、あるいは（ＣＨ２）ｂ−ＮＨを表しａ、ｂは１から５の整数を表す）、
Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３を表す。
Ｒ３は、ベタイン構造を有する官能基を表す。
【００１５】
【化２】
2019191120.tif 000004
【００１６】
上記式（２）において、
＊２は、前記シリル基のＳｉに結合する結合位置を表す。
Ｌ１は、（ＣＨ２）ｘ（ｘは０から５のいずれかの整数）であり、
Ｌ２は、ＮＨ−ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ（ｎは１から３０のいずれかの整数）のうち少なくともいずれか１つを含む２価の基、または直接結合であり、
Ｌ３は（ＣＨ２）ｙ（ｙは０から５のいずれかの整数）であり、
Ｒ４は、ＳＨ、ＮＨ２、及びＣＯＯＨのいずれかを表す。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る粒子によれば、非特異吸着の抑制能に優れ、かつ、沈降しにくい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施形態に係る粒子を説明する図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について、添付図面を参照して詳細に説明する。ただし、発明の範囲を限定するものではない。
【００２０】
（粒子）
本発明の実施形態に係る粒子は、中心にコア構造があり、その周囲にシェル構造形成している構造体である。図１は本発明の実施形態に係る粒子の概略図である。図中のコア構造１は球状（粒子状）であり、構造体の中に一つだけ存在するものである。
【００２１】
（コア構造）
コア構造１はポリマーを含む。ポリマーは、スチレン類、（メタ）アクリレート類の群から選択される少なくとも一種であることが好ましく、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレートがより好ましい。好ましくはポリスチレンを含む場合で、ポリスチレンを主成分として含むことが特に好ましい。
【００２２】
コア構造１はポリスチレンモノマーを主成分として乳化重合することで得ることができる。コア構造１の強度を向上させるために、コア構造を形成する時に、ジビニルベンゼン、３−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランなどを加えて架橋しても良い。また、コア構造１のサイズを厳密に制御するために添加剤などを加えても良い。添加剤はドデシル硫酸ナトリウムやパラスチレンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００２３】
（シェル構造）
図１におけるシェル構造２はコア構造１の外周を均一に被覆した層状の構造体である。シェル構造２はコア構造１に密着していて、シェル構造２の厚さは３ｎｍ以上１５ｎｍ以下のとすることができる。好適には５ｎｍ以上１０ｎｍ以下の厚さのシェル構造２が用いられる。シェル構造の厚さは薄すぎると、シリカ層としての物性が十分に機能しないおそれがある。一方シェル構造の厚さが厚すぎると、粒子の比重が重くなり、水中で安定な分散状態を得ることが難しくなり、沈降速度が速くなる。本発明の実施形態に係る粒子材料の沈降速度が、４．０×１０−３μｍ／秒以下（水中、温度２５度）であることが好ましい。
【００２４】
シェル構造２は３官能のシランを加水分解することで形成した構造体である。加水分解したシランによって形成するシリカの一部にシラノール基が存在することで、粒子材料の表面に親水性を付与することができる。
【００２５】
更に、３官能のシランを用いる事で、シェル構造のシリカのシリル基に下記式（１）で示される分子を結合する事が可能となる。
【００２６】
【化３】
2019191120.tif 000005
【００２７】
上記式（１）において、
＊１は、前記シリル基のＳｉ（シリコン）に結合する結合位置を表す。
Ｒ１は、（ＣＨ２）ａ−Ｓ、あるいは（ＣＨ２）ｂ−ＮＨを表す（ａ、ｂは、各々独立に、１から５の整数を表す）。
Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３を表す。
Ｒ３は、ベタイン構造を有する官能基を表す。
【００２８】
上記式（１）で示される分子は、シェル構造２の表面に結合している。上記式（１）のＲ１は、シリコンと共有結合している炭素、アルキル鎖などが好ましい。上記式（２）のＲ２とＲ３は、チオール基とアクリル基、あるいはメタクリル基間でマイケル付加反応を起こして形成することができる。つまり、シェル構造２の原料にチオール基を有する３官能アルコキシシランを用い、アクリレート、メタクリレート分子と反応させることで形成する。上記式（１）のＲ４はベタイン構造を有する官能基を示す。本実施形態において、ベタイン構造を有する官能基は正電荷と負電荷を同一分子内の隣り合わない位置に持ち、正電荷をもつ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず、分子全体としては電荷を持たない官能基である。具体的には正電荷を有する官能基は４級アンモニウム、スルホニウム、及びホスホニウムのいずれか等を用いる事ができ、負電荷を有する官能基は、スルホン酸、カルボン酸、及びホスホン酸等を用いる事が出来る。Ｒ４は、正電荷を有する官能基と負電荷を有する官能基が１：１の割合で存在している。なお、ベタイン構造が、カルボキシベタイン、またはスルホベタインであることが好ましい。
【００２９】
上記式（１）で示される分子において、分子中のベタイン構造を有する官能基の分子量は２０００以下が好ましく、１０００以下がさらに好ましい。分子量が２０００より大きくなると、粒子の表面が強く水和し、ヒドロゲルの様な性質を示すと考えられる。その結果、後述する抗体等のリガンドを粒子の表面に結合する事が困難になる。また、水和した分子層が屈折率干渉層として働き、粒子の光散乱強度が低下する可能性がある。結果として、ラテックス凝集法で検出できる感度が下がってしまう。
【００３０】
本実施形態において、上記式（１）で表される分子が、下記式（１−ｉ）で表されることが好ましい。
【００３１】
【化４】
2019191120.tif 000006
【００３２】
図１におけるシェル構造２は３官能のシランを加水分解することで形成した構造体である。３官能のシランを用いる事で、シェル構造の表面のシリカのシリル基に式（２）で示される分子を作製する事が可能となる。
【００３３】
【化５】
2019191120.tif 000007
【００３４】
上記式（２）において、
＊２は、前記シリル基のＳｉに結合する結合位置を表す。
Ｌ１は、（ＣＨ２）ｘであり（ｘは０から５のいずれかの整数）、
Ｌ２は、ＮＨ−ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ（ｎは１から３０のいずれかの整数）のうち少なくともいずれか１つを含む２価の基、または直接結合であり、
Ｌ３は（ＣＨ２）ｙ（ｙは０から５のいずれかの整数）である。
Ｒ４は、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、グリシジル基のいずれかを表す。
【００３５】
上記式（２）において、Ｌ２が直接結合であり、Ｌ３におけるｙが０であることが好ましい。また、上記式（２）において、Ｌ２が（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎであり、ｎが１から２０のいずれかの整数であることが好ましく、ｎが５から１０のいずれかの整数であることさらに好ましい。（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）は粒子に親水性を付与することができる。また、上記ｎが５から１０以下だと、式（２）で表す基が適切な長さとなり、リガンドを結合させやすい。
【００３６】
Ｒ４は、抗体などのリガンドを結合する際に用いられる反応性官能基である。シェル構造２を構成する原料の３官能のシランは、例えば、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランなどを用いることができる。シェル構造２の表面に存在するチオール基、アミノ基乃至カルボキシル基は粒子材料に抗体を結合するための足場として利用する。ビニル基、グリシジル基、メタクリル基などからは付加反応、挿入反応などを用いてチオール基、アミノ基乃至カルボキシル基を付加する事ができる。シェル構造２の表面に存在するチオール基、アミノ基乃至カルボキシル基の量は多すぎると抗体が多く結合しすぎて、粒子材料の親水性が損なわれるおそれがある。具体的には本実施形態に係る粒子の表面に存在するチオール基やアミノ基の単位面積あたりの密度が０．０１個／ｎｍ２以下である事が好ましい。
【００３７】
本実施形態において、上記式（２）で表される分子が、下記式（２−ｉ）で表されることが好ましい。
【００３８】
【化６】
2019191120.tif 000008
【００３９】
上記式（２−ｉ）において、Ｒ４はＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、及びグリシジル基のいずれかを表す。
【００４０】
本実施形態に係る粒子を用いると、非特異吸着が少なく、水溶媒への分散性が高く、かつ、沈降も少ないコロイド液を得ることができる。したがって、本実施形態に係る粒子材料を水溶媒に分散したコロイド液はラテックス凝集法用の抗体検査試薬として利用する事ができる。水溶媒には、緩衝液を用いる事も可能である。また、本実施形態にかかる粒子を分散した液の安定性を増すために、水溶媒中に、界面活性剤、防腐剤や増感剤なども添加してもよい。
【００４１】
（分散液）
本実施形態に係る分散液は粒子と、粒子を分散させる分散媒とを有する。また適宜、酸化防止剤、等が含まれていても良い。本実施形態において、分散液に含まれる粒子の平均直径が、１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましく、１５０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下であるがさらに好ましい。本実施形態において、分散液に含まれる粒子の粒度分布の変動係数が５％以下であることが好ましく、３％以下であることがさらに好ましい。
【００４２】
（リガンド・アフィニティー粒子）
本実施形態では、本実施形態に係る粒子と、上記式（２）のＲ４に結合したリガンドとを有するアフィニティー粒子を提供できる。Ｒ４は、ＳＨ（チオール記）、ＮＨ２（アミノ基）、ＣＯＯＨ（カルボキシル基）、グリシジル基のいずれかである。
【００４３】
本実施形態において、リガンドとは、特定の標的物質が有する受容体に特異的に結合する化合物のことである。リガンドが標的物質と結合する部位は決まっており、選択的または特異的に高い親和性を有する。例えば、抗原と抗体、酵素タンパク質とその基質、ホルモンや神経伝達物質などのシグナル物質とその受容体、核酸などが例示されるが、本実施形態におけるリガンドはこれらに限定されない。核酸としてはデオキシリボ核酸等が挙げられる。本実施形態におけるアフィニティー粒子とは、標的物質に対して選択的または特異的に高い親和性（アフィニティー）を有する。本実施形態におけるリガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることが好ましい。
【００４４】
本実施形態において、本実施形態に係る粒子が有する反応性官能基とリガンドとを化学結合する化学反応の方法は、本発明の目的を達成可能な範囲において、従来公知の方法を適用することができる。また、リガンドをアミド結合させる場合は、１−［３−（ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド］等の触媒を適宜用いることができる。
【００４５】
本実施形態におけるアフィニティー粒子が、リガンドとして抗体（抗原）、標的物質として抗原（抗体）を用いる場合、臨床検査、生化学研究等の領域において広く活用されている免疫ラテックス凝集測定法に好ましく適用できる。
【００４６】
（体外診断用の検査試薬）
本実施形態における体外診断用の検査試薬、すなわち体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるための検査試薬は、本実施形態に係るアフィニティー粒子と、アフィニティー粒子を分散させる分散媒を有する。本実施形態における試薬中に含有される本実施形態に係るアフィニティー粒子の量は、０．００１質量％から２０質量％が好ましく、０．０１質量％から１０質量％がより好ましい。本実施形態に係る試薬は、本発明の目的を達成可能な範囲において、本実施形態に係るアフィニティー粒子の他に、溶剤やブロッキング剤などの第三物質を含んでも良い。溶剤やブロッキング剤などの第三物質は２種類以上を組み合わせて含んでも良い。本実施形態において用いる溶剤の例としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、アンモニア緩衝液などの各種緩衝液が例示されるが、本実施形態における試薬に含まれる溶剤はこれらに限定されない。
【００４７】
ラテックス凝集法による検体中の抗原または抗体の検出に用いる場合は、リガンドは、抗体または抗原を用いることができる。
【００４８】
（検査キット）
本実施形態における体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるための検査キットは、上記試薬と、上記試薬を内包する筐体とを有する。本実施形態に係るキットとしては、ラテックス凝集測定用増感剤を含有させても良い。ラテックス凝集測定用増感剤として、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアルギン酸等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。また、本実施形態に係るキットは、陽性コントロール、陰性コントロール、血清希釈液等を備えていても良い。陽性コントロール、陰性コントロールの媒体として、測定しうる標的物質が含まれていない血清、生理食塩水の他、溶剤を用いても良い。本実施形態に係るキットは、通常の体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるためのキットと同様にして、本実施形態に係る標的物質の検出方法に使用できる。また、従来公知の方法によって標的物質の濃度も測定することができ、特に、ラテックス凝集法による検体中の標的物質の検出に用いることが好適である。
【００４９】
（検出方法）
本実施形態における体外診断による検体中の標的物質の検出方法は、本実施形態に係るアフィニティー粒子と、標的物質を含む可能性のある検体とを混合する工程を有する。また、本実施形態に係るアフィニティー粒子と検体との混合は、ｐＨ３．０からｐＨ１１．０の範囲で行われることが好ましい。また、混合温度は２０℃から５０℃の範囲であり、混合時間は１分から２０分の範囲である。また、本検出方法は、溶剤を使用することが好ましい。また、本実施形態に係る検出方法における本実施形態に係るアフィニティー粒子の濃度は、反応系中、好ましくは０．００１質量％から５質量％、より好ましくは０．０１質量％から１質量％である。本実施形態に係る検出方法は、本実施形態に係るアフィニティー粒子と検体との混合の結果として生じる凝集反応を光学的に検出すること、すなわちラテックス凝集法により検体中の標的物質を検出することが好ましい。具体的には、検査試薬に、検体を混合して混合液を得る工程と、混合液に、光を照射する工程と、混合液に照射された光の、透過光または散乱光の少なくともいずれかを検出する工程を有する。混合液において生じる上記凝集反応を光学的に検出することで、検体中の標的物質が検出され、更に標的物質の濃度も測定することができる。前記凝集反応を光学的に検出する方法としては、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出可能な光学機器を用いて、これらの値の変化量を測定すれば良い。
【００５０】
（粒子の製造方法）
次に、本実施形態に係る粒子材料の製造方法について以下に記す。ただし、発明の範囲を限定するものではない。
【００５１】
本実施形態に係る粒子の製造方法は以下の各工程を有する。
【００５２】
ビニル基を有するモノマーと、ラジカル重合開始剤とを混合することで、ポリマーを含むコア粒子を含む溶液を得る工程（工程１）。
（１）で得た溶液に、ビニル基と、及びチオール基またはアミノ基と、を有するシランを添加して加水分解することで、前記コア粒子の表面にシリカを含むシェル構造を形成し、コア−シェル構造を有する粒子を得る工程（工程２）。
（２）で得た粒子における前記チオール基またはアミノ基に、ビニル基とベタイン構造を有する分子を結合させる工程（工程３）。
【００５３】
なお、上記ビニル基を有するモノマーがスチレンであることが好ましい。また、上記ビニル基を有するシランが、トリメチトキシビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、テトラメチルオルソシリケート、テトラエチルオルソシリケート、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシランで構成する群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００５４】
なお、粒子にリガンドを結合する工程をさらに有していてもよく、リガンドは、抗体、抗原、及び核酸等を用いることができる。
【００５５】
以下、本実施形態に係る粒子の製造方法の一例を詳細に説明する。
【００５６】
本実施形態に係る粒子の製造方法は以下の工程を有する。
【００５７】
少なくともスチレンを含有する化合物、開始剤を含む乳化分散液からポリスチレンを含む粒子分散液を製造する工程。
チオール基あるいはアミノ基を有するシリコンアルコキシドを用いて担体の表面にシリカ層を設ける工程。
前記表面上に存在するチオール基あるいはアミノ基にベタイン構造を有するアクリレート乃至メタクリレートをマイケル付加反応により結合をさせる工程。
【００５８】
図１中におけるコア構造１はスチレンモノマーを水溶媒中で乳化重合することで得ることができる。乳化重合は、スチレンモノマーおよび添加剤を水溶媒に加え、充分に撹拌した後、窒素雰囲気化で重合開始剤を加えて加熱することで粒子を得る工程である。乳化重合の開始剤には過硫酸カリウムや２、２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ニ塩酸塩などを用いる事ができる。粒子サイズの調整や、粒度分布をより揃えるために添加剤を加えても良い。具体的にはパラスチレンスルホン酸ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどを用いる事ができる。界面活性剤を用いずに、添加量によって粒子サイズが制御でき、さらに水溶媒中で高い分散性を示すコア構造１を作製できるパラスチレンスルホン酸ナトリウムが好適に用いる事ができる。また架橋剤としてジビニルベンゼン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシランなどを加えることでコア構造１の強度を上げることができる。乳化重合で得たコア構造１を遠心分離し、沈殿物を溶媒に再分散することで精製することができる。
【００５９】
図１中におけるシェル構造２を形成する工程は、３官能あるいは４官能のシランを加水分解することで形成できる。具体的には、シェル構造２はトリメチトキシビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、テトラメチルオルソシリケート、テトラエチルオルソシリケート、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシランなどを原料に加水分解を行うことで得ることができる。これらのシランで構成する群から選択される少なくとも１種をもちいればよく、複数のシランを混合して用いてもよい。しかし、後のベタイン構造を粒子表面に結合させる工程において、チオール基、アミノ基が、シェル構造２の表面に存在させる必要がある。そのため、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシランなど、チオール基、アミノ基を含むシランを少なくとも１種類含む原料を用いる事が好ましい。コア構造１を高いｐＨの水溶媒に分散した液に前記シランを導入し加水分解を行う。液中のｐＨは１１以上であることが好ましい。酸性条件下で行うと、形成したシェル２のゼータ電位が低くなり、凝集する可能性がある。高いｐＨの液中で導入したシランの加水分解の速度を上げてコア構造１の表面に析出するようにすると、均一なシェル構造２を得ることができる。この時、反応温度を条件に応じて６０度〜８０度の間で制御するとよい。また、加水分解の速度が速すぎる場合は、アルコールなどの溶媒を添加しても良い。反応後、得られた粒子材料を遠心分離し、沈殿物を溶媒に再分散することで精製することができる。
【００６０】
前記表面上に存在するチオール基あるいはアミノ基にベタイン構造を有するアクリレート乃至メタクリレートをマイケル付加反応により結合をさせる工程とで得られる。
【００６１】
図１におけるシェル構造２の表面にベタイン構造を結合させる工程は、マイケル付加反応を用いて行うことが好ましい。マイケル付加反応は、不飽和エステル・ケトン・ニトリルなどの電子不足アルケンに、炭素もしくはヘテロ原子求核剤を１，４‐付加させる反応である。具体的には、シェル構造２の表面に存在するチオール基に、ベタイン構造を有するアクリレート、乃至メタクリレートを液中で反応させることで、ベタイン構造を、シェル構造２の表面に結合させることができる。反応は有機溶媒や水溶媒などを用いる事が出来る。溶媒の極性が高い方が、マイケル付加反応が早く進むので、水やメタノール、エタノールなどを用いる事が好ましい。更に、作製したコア−シェル構造の粒子を安定に分散させる事を考慮すると、水溶媒である事が好ましい。水溶媒中のマイケル付加反応は無触媒でも進行するが、アミンなどの触媒を用いる方が好ましい。触媒には、トリエチルアミン、ヘキシルアミン、ジメチルエチレンジアミンなどを用いる事が好ましい。マイケル付加反応は１２時間くらい常温で溶液を撹拌すると完了する。反応後、得られた粒子材料を遠心分離し、沈殿物を溶媒に再分散することで精製することができる。
【００６２】
本実施形態に係る粒子に各種の抗体を結合させることで、ラテックス凝集法用の検体検査粒子として利用することができる。シェル構造２に存在する官能基を利用して目的の抗体を結合させるための最適な手法を選択すればよい。たとえばチオール基にはマレイミドを反応させて抗体を結合させることができる。
【００６３】
（表面処理方法）
本実施形態に係る粒子は、担体の表面の処理に用いることが出来る。本実施形態における表面処理方法は、以下の工程を有する。
【００６４】
チオール基あるいはアミノ基を有するシリコンアルコキシドを用いて担体の表面にシリカ層を設ける工程。
【００６５】
担体の表面上に存在するチオール基あるいはアミノ基にベタイン構造を有するアクリレートまたはメタクリレートをマイケル付加反応により結合をさせる工程。なお、ベタイン構造を有する分子はシリカ層に結合する。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【００６７】
（１）コア構造１−１の作製
乳化重合法にてコア構造１−１を作製した。丸底四ツ口のセパラブルフラスコに純水９００ｇ、スチレンモノマー５６ｇ（キシダ化学製）、パラスチレンスルホン酸ナトリウム０．１６５ｇ（東京化成製）を加え、メカニカルスターラーを用いて窒素バブリングをしながら３０分間撹拌した。オイルバスにて試料を撹拌した状態のまま７０度まで加熱した後、触媒の過硫酸カリウム３．６ｇ（シグマ−アルドリッチ社製）を加え窒素雰囲気にて８時間スチレンの重合反応を行った。試料を冷却した後、遠心分離にて沈殿物を回収し、純水を用いて生成物の洗浄を行った。得られた試料は純水に分散しコア構造１−１のスラリーを得た。コア構造１−１は電子顕微鏡で粒子径と粒度分布を測定した結果、直径２１０ｎｍ、粒度分布の変動係数が３％であった。
【００６８】
（２）コア構造１−２の作製
乳化重合法にてコア構造１−２を作製した。丸底四ツ口のセパラブルフラスコにｐＨ７．４のリン酸緩衝液１５０ｇ（キシダ化学製）、スチレンモノマー７．５ｇ（キシダ化学製）、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン２．５ｇ（信越化学製）、ポリビニルピロリドンＫ−３００．５ｇ（東京化成製、分子量４００００）を加えた。得られた溶液を、メカニカルスターラーを用いて窒素バブリングをしながら３０分間撹拌した。オイルバスにて試料を撹拌した状態のまま７０度まで加熱した後、触媒の過硫酸カリウム０．４ｇ（シグマ−アルドリッチ社製）を加え窒素雰囲気にて７時間スチレンの重合反応を行った。試料を冷却した後、遠心分離にて沈殿物を回収し、純水を用いて生成物の洗浄を行った。得られた試料は純水に分散しコア構造１−２のスラリーを得た。コア構造１−２は電子顕微鏡で粒子径と粒度分布を測定した結果、直径２１９ｎｍ、粒度分布の変動係数が２．４％であった。
【００６９】
（３）シェル構造２の形成
遠心分離によって回収したスラリー状のコア構造１−１、あるいは１−２を純水で０．５ｗｔ％に希釈した。希釈した液に２８ｗｔ％アンモニア水を溶液の５ｗｔ％（キシダ化学製）加えてｐＨ１１．７の分散液を調整した。常温にて３０分間撹拌後、メルカプトプロピルトリメトキシシランを溶液中の固形分に対して１０ｗｔ％（東京化成製）投入した。１０時間撹拌した後、反応液を遠心分離（１８０００ｒｐｍ、３０分間）、純水に再分散してコア−シェル構造体を得た。コア−シェル構造体は水分計（エーアンドディー社製：ＭＸ−５０）にて秤量した。
【００７０】
（４）シェル構造２の表面へのベタイン構造を有する分子の結合
生成したコア−シェル構造体の分散液を純水で１．０ｗｔ％に希釈した。希釈した分散液にベタイン構造を有するメタクリレートを溶液に対して１．０ｗｔ％添加し、ジメチルエチレンジアミンを触媒量（東京化成製）加えて室温にて１４時間撹拌した。撹拌後の反応液を遠心分離（１８０００ｒｐｍ、３０分間）した後、純水に再分散して生成物を得た。生成物は水分計（エーアンドディー社製：ＭＸ−５０）にて秤量した後、純水にて希釈して０．１ｗｔ％に調整した。
【００７１】
（５）シェル構造２の評価
得た粒子材料の分散液を揮発・乾固させて固形分を走査型電子顕微鏡（日立ハイテクノロジー社製：Ｓ−５５００）で観察した。生成した粒子材料を、少なくとも１５０個以上観察して平均、標準偏差、変動係数を求めた。同様に求めていたコア構造１の直径を、得た粒子材料の直径から差し引き、シェル構造２の厚さの合計値を求めた。
【００７２】
（６）生成物の沈降性の評価
得た粒子材料の０．１ｗｔ％の分散液を、１週間常温にて放置し、観察した。放置前後で凝集や沈降がないことを目視にて観察した。
【００７３】
（７）生成物の非特異吸着抑制能の評価（乳び試験）
生成物の非特異吸着抑制能は乳びを用いて評価した。乳びは、血清中の成分において、ラテックス粒子に対して非特異吸着を強く起こし、粒子の凝集を引き起こす要因になる物質である。乳びは干渉チェックＡ（シスメックス製）のキットに含まれる試薬を用いた。乳びの分散液０．８μＬと、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液（エチレンジアミン四酢酸、ＴＷＥＥＮ２０、牛血清アルブミン、塩化ナトリウム含有）１２０μＬを混合した液に、生成した０．１ｗｔ％の粒子材料の分散液を６０μＬ添加した。その後、すぐに紫外可視吸収スペクトル（ＧＥＮＥＱＵＡＮＴ  １３００）を測定した。測定後の試料を３７度の湯浴に５分間浸した後、再び紫外可視吸収スペクトルを測定した。５分間のエージング前後での波長５７２ｎｍの吸光度の変化を測定し、分散液中の粒子の凝集を評価した。この吸光度変化が０．１未満の試料は非特異吸着能が抑制できているものと評価した。０．１未満という変化は、実際のラテックス凝集法による測定に対して、バックグラウンドの変動の最大許容値であり、０．０１以下である事が好ましい。
【００７４】
（８）散乱強度の定量
乳びによる非特異吸着抑制能の評価と同様の方法で、散乱強度を測定した。散乱強度は吸光度の大きさに置き換えて評価した。つまり、吸光度が１．０以上の試料であれば、充分な散乱強度を有し、ラテックス凝集法の実機測定でも検出ができるものとみなした。
【００７５】
（９）チオール基の定量
ＡｍｐｌｉｔｅＴＭ  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｔｏｔａｌ  Ｔｈｉｏｌ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，  Ｉｎｃ．社製）を用いて、生成した粒子材料のチオール基表面密度の定量を行った。ＢｉｏＴｅｋ社製プレートリーダーと９６ｗｅｌｌ黒マイクロプレート（測定量１００ｍＬ）を用いて、蛍光（励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）測定した。サンプルの分散液中の粒子の濃度は１ｍｇ／ｍＬで固定し測定を行った。検量線は、ＧＳＨバッファー（０．０１４ｍＭ〜１０ｍＭ）を標準液として作成した。
【００７６】
（実施例１）
コア構造１−１を用いて作製したコア―シェル構造体の分散液に、３−［［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチルアンモニオ］プロピオナート（東京化成製）を添加して生成物を得た。
【００７７】
（実施例２）
コア構造１−１を用いて作製したコア―シェル構造体の分散液に、３−［［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチルアンモニオ］プロピオナート（東京化成製）と、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−スルホナトプロピル）−２−（メタクリロイルオキシ）エタン−１−アミニウム（シグマーアルドリッチ製）を重量比１：１の割合で添加して生成物を得た。
【００７８】
（実施例３）
コア構造１−１を用いて作製したコア―シェル構造体の分散液に、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−スルホナトプロピル）−２−（メタクリロイルオキシ）エタン−１−アミニウム（シグマ−アルドリッチ製））を添加して生成物を得た。
【００７９】
（実施例４）
コア構造１−２を用いて作製したコア―シェル構造体の分散液に、３−［［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチルアンモニオ］プロピオナート（東京化成製）を添加して生成物を得た。
【００８０】
（比較例１）
直径１８８ｎｍの市販のラテックス粒子（イムテックス、ＪＳＲ社製）を０．１ｗｔ％に純水で希釈して用いた。
【００８１】
（比較例２）
コア構造１−１のスラリー（４２．５ｗｔ％）の濃度を調整して０．１ｗｔ％の分散液とした。
【００８２】
（比較例３）
コア構造１−１を用いて作製したコアーシェル構造体の分散液を０．１ｗｔ％に調整した。
【００８３】
（比較例４）
シリカ粒子（ＱＵＡＲＴＺ  ＤＯＴ（登録商標）：古河電工アドバンスドエンジニアリング製）をそのまま用いた。
【００８４】
（比較例５）
コア構造１−１の粒子のスラリーを希釈し、アンモニア水を加えてｐＨを１１に調整して０．５ｗｔ％の分散液を作製した。作製した分散液を３０分間撹拌した後、ビニルトリメトキシシラン（東京化成製）を液中の固形分に対して１０ｗｔ％添加し、１０時間撹拌した。撹拌後、懸濁液を遠心分離、純水に再分散してｐＨ約７の分散液を得た。得た分散液にＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−スルホナトプロピル）−２−（メタクリロイルオキシ）エタン−１−アミニウム（シグマ−アルドリッチ製）を、重量比で分散液中の固形分の１０倍量を添加した。続いて、窒素雰囲気、７０℃の条件下で重合開始剤（Ｖ−５０：和光純薬製）を触媒量用いて粒子の表面にベタインポリマーを付与した。得られた構造体の分散液を洗浄した後、０．１ｗｔ％に調整した。
【００８５】
（性能評価）
実施例および比較例の粒子材料の構造と物性を表１に示す。
【００８６】
【表１】
2019191120.tif 000009
【００８７】
表１中におけるコア構造の直径およびシェル構造の厚さは電子顕微鏡による観察より求めた値である。
【００８８】
表１中における表面に存在する官能基は、記載した官能基の他に、実施例１、２、３、４および比較例３、４、５にはシラノールが存在する。
【００８９】
表１中における表面に存在する官能基において、スルホベタインの記載はスルホン酸を有するベタイン構造を意味している。
【００９０】
表１中における表面に存在する官能基において、カルボキシベタインの記載はカルボン酸を有するベタイン構造を意味している。
【００９１】
作製した材料を電子顕微鏡で観察したところ、均一な粒子表面を形成していた。また、変動係数は、比較例４以外は約５％以下であり、粒度分布が極めて揃った状態の粒子である事を確認した。比較例４の粒子の変動係数は１３．７％であった。更に比較例４は一晩静置しただけでも凝集し沈降してきた。よって、比較例４の粒子材料はラテックス凝集法用の抗体検査粒子には不適である。
【００９２】
シェル構造を被覆した粒子において、シェル構造２の厚さは、７〜１０ｎｍであった。このシェル構造の有無は、沈降性評価の結果、粒子の沈降性に影響を及ぼさないことを確認した。沈降性はチオール基のみが表面に存在する比較例３およびコア構造がシリカで構成されている比較例４で不安定であり、沈降を確認した。この結果は、シェル構造２が存在することで、増加した生成物の比重は粒子の分散状態に影響を与えない程度である事と、沈降の原因はチオール基が酸化し、ジスルフィド結合を作る事が影響していると考えられる。つまり、チオール基の一部を親水性のベタイン構造に置換した実施例１、２、３、４および比較例５の分散液は沈降せずに安定であり、ベタイン構造が粒子の分散性に効果的である事を示している。
【００９３】
非特異吸着抑制能を比較した結果を表１に示す。粒子表面にベタイン構造が存在する実施例１、２、３、４および比較例５では、乳び試験前後の吸光度の変化がそれぞれ、０．００３、０．０３１、０．００２、０．００９および０．０００となり、ほとんど変動がないことを確認した。一方、比較例では、吸光度変化が０．４以上と大きく、このままの状態の粒子ではラテックス凝集法で用いる事が出来ないことを確認した。
【００９４】
散乱強度評価の結果、実施例は、１．２以上であったのに対して、比較例５の散乱強度は０．８と低い事が判明した。同じ濃度、同じ粒子サイズの実施例などと比較して小さくなってしまうのは、粒子表面に形成したベタインポリマー層が光散乱を抑制する干渉層として働いたためであると考えられる。
【００９５】
（実施例の粒子への抗体結合と抗原抗体反応）
実施例１、２、３の粒子のチオール基に、抗ＣＲＰ抗体を結合した。
【００９６】
チオール反応性の抗体を得るために、抗ＣＲＰ抗体溶液にＥＭＣＳ  （Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を加えて、抗体にマレイミド基を導入した。
【００９７】
ポリマー微粒子分散液を、１５０００ｒｐｍ（２０４００ｇ）、１５分間、遠心して微粒子を沈殿させた。上清を除去した後、微粒子のペレットを、緩衝液で再分散させ、これにあらかじめマレイミド化した抗ＣＲＰ抗体を加えた。室温、１８０分間撹拌した後、遠心分離によって、粒子を回収した。粒子を、緩衝液で十分に洗浄して、抗ＣＲＰ抗体が結合した微粒子を得た。抗体が結合していることは、抗体を加えた緩衝液中の抗体濃度の減少量をＢＣＡアッセイで測定することで確認した。粒子１個あたり、抗体が約２００個結合していることが分かった。
【００９８】
抗体を結合した粒子でラテックス凝集反応を行った。ヒト血清由来ＣＲＰ（シグマアルドリッチ、）とポリマー微粒子分散液とを混合して、混合前後での波長５７２ｎｍにおける吸光度を測定した。微粒子上の抗ＣＲＰ抗体が抗原であるＣＲＰを捕捉できれば、ＣＲＰを介した微粒子同士の凝集反応が起こる。この時、透過率の減少が生じる結果、吸光度の上昇が観測される。抗体を結合した微粒子を含む溶液にＣＲＰを添加したとき（ＣＲＰ添加あり）、ならびにＣＲＰを添加しなかったとき（ＣＲＰ添加なし）について、反応温度３７℃、反応時間５分間の吸光度変化率は１．４〜８．４％となった。この結果より、本発明の実施例に係る粒子を用いると、抗原抗体反応をラテックス凝集法で検出出来る事が示された。
【００９９】
以上のことから、本実施例に粒子材料は、非特異吸着能を有する表面特性かつ、沈降がすくない物性を兼ね揃えた材料であることが明らかとなった。その結果、ラテックス凝集法用の抗体検査薬として優れた性能を示すことがわかった。
【符号の説明】
【０１００】
１  コア構造
２  シェル構造
【図１】
2019191120.tif 000014