(57)【要約】【課題】非アルコール性脂肪性肝炎は、比較的炎症が軽度な場合には、運動及び食事療法並びに必要に応じて薬物療法が適用されるが、患者の日々の生活の負担が重いため、肝組織の線維化を抑制することによる非アルコール性脂肪性肝炎治療剤を開発することを目的とした。【解決手段】非アルコール性脂肪性肝炎モデルと単純性脂肪肝モデルでの遺伝子発現を比較し、非アルコール性脂肪性肝炎モデルで発現が向上しているＩＬ１７に注目した。抗ＩＬ１７抗体が非アルコール性脂肪性肝炎における肝組織の線維化を抑制することを確認し、抗ＩＬ１７抗体を含む非アルコール性脂肪性肝炎治療剤を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＩＬ１７抗体を含む、非アルコール性脂肪性肝炎治療剤。
【請求項２】
抗ＩＬ１７抗体を含む、非アルコール性脂肪性肝炎における肝線維化抑制剤。
【請求項３】
脂肪組織由来間質細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎におけるIL17A分泌抑制剤。
【請求項４】
脂肪組織由来間質細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎における肝線維化抑制剤。
【請求項５】
脂肪組織由来間質細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎での肝内炎症細胞のIL17A分泌の減少を介してIL17A関連肝炎の抑制による肝線維化抑制剤。
【請求項６】
脂肪組織由来間質細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎に起因する慢性肝炎予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＩＬ１７抗体を含む非アルコール性脂肪性肝炎治療剤及び非アルコール性脂肪性肝炎における肝線維化抑制剤に関する。
【０００２】
（慢性肝疾患）
慢性肝疾患では、肝内炎症と肝細胞障害が持続し、それに伴い肝線維化が進展し、終末状態では肝硬変に至る（参照：非特許文献１）。肝硬変では、門脈圧亢進症による食道静脈瘤破裂など様々な重篤な合併症を発症し、さらに肝不全へ進行する。また、肝硬変は肝細胞癌発生の高危険状態である。これらのため、肝硬変では、生活の質の著しい低下、予後の悪化が大きな問題である。慢性肝疾患には、B型、C型ウイルス肝炎、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎等がある。
【０００３】
（非アルコール性脂肪性肝疾患）
非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD：non alcoholic fatty liver disease）は、アルコールの飲酒歴がないにも関わらず、アルコール性肝炎類似の大滴性の脂肪沈着を呈する疾患である。該疾患には、肝炎を伴わない単純性脂肪肝（SS：simple steatosis）と、炎症や肝細胞障害を伴い肝硬変へ進展する非アルコール性脂肪性肝炎（NASH：non alcoholic steatohepatitis）が含まれる。肥満・脂質異常症・糖尿病などの生活習慣病がNASHの病態に関与していることが示唆されている。
近年、生活習慣病増加に伴い慢性肝疾患に占めるNASHの割合が増加している。現在のところNASHの発症、病態進展の機序が明らかにされておらず、NASH発症予防、NASHから肝硬変への進展の抑制や、肝発癌を抑制する確立した予防・治療法はない。
【０００４】
（先行技術）
以下の先行技術が知られている。
特許文献１は、「肝細胞を含み、生体の肝臓切離面に移植して肝組織を再生するための製剤」を開示している。
特許文献２は、「肝細胞増殖因子を有効成分とする移植肝機能改善・再生促進剤」を開示している。
特許文献３は、「肝不全の治療におけるおよび/またはアポトーシスに対する肝細胞の保護のためのおよび/または肝細胞の再生のための薬剤として用いるための、配列番号1204のmRNAによってコードされるMKK4の活性の阻害剤である化合物」を開示している。
特許文献４は、「ベタインを有効成分に含む肝の再生を促進する薬学的組成物」を開示している。
しかしながら、上記いずれの文献も、抗ＩＬ１７抗体を含む非アルコール性脂肪性肝炎治療剤を開示又は示唆をしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2016-209303号公報
【特許文献２】特開平10-194986号公報
【特許文献３】特表2014-511690号公報
【特許文献４】特表2013-503156号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Amico,G.D. et al. Natural history and prognostic indicators ofsurvival incirrhosis: A systematic review of 118 studies.44, 217-231 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非アルコール性脂肪性肝炎は、比較的炎症が軽度な場合には、運動及び食事療法並びに必要に応じて薬物療法が適用されるが、患者の日々の生活の負担が重い。
そこで、本発明者らは、肝組織の線維化（肝線維化）を抑制することによる非アルコール性脂肪性肝炎治療剤を開発することを目的とした。
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、非アルコール性脂肪性肝炎モデルと単純性脂肪肝モデルでの遺伝子発現を比較し、非アルコール性脂肪性肝炎モデルで発現が向上しているＩＬ１７に注目した。
そして、本発明者らは、抗ＩＬ１７抗体が非アルコール性脂肪性肝炎における肝組織の線維化を抑制することを確認し、抗ＩＬ１７抗体を含む非アルコール性脂肪性肝炎治療剤を完成した。
【０００９】
本発明は以下を含む。
１．抗ＩＬ１７抗体を含む、非アルコール性脂肪性肝炎治療剤。
２．抗ＩＬ１７抗体を含む、非アルコール性脂肪性肝炎における肝線維化抑制剤。
３．脂肪組織由来間質細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎におけるIL17A分泌抑制剤。
４．脂肪組織由来間質細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎における肝線維化抑制剤。
５．脂肪組織由来間質細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎での肝内炎症細胞のIL17A分泌の減少を介してIL17A関連肝炎の抑制による肝線維化抑制剤。
６．脂肪組織由来間質細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎に起因する慢性肝炎予防剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の非アルコール性脂肪性肝炎治療剤は、肝組織の線維化を抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】非アルコール性脂肪性肝炎マウスと脂肪肝マウスの肝病態の比較結果。Ａ：肉眼所見、Azan染色、F4/80染色、Gr-1染色。倍率:×100倍、Scale bar:200μm。Ｂ：発現クラスタリング解析結果。Ｃ：非アルコール性脂肪性肝炎に特異的に発現した又は特異的に発現が上昇した遺伝子。
【図２】非アルコール性脂肪性肝炎マウスの肝炎細胞のサイトカイン分泌アッセイ及び抗IL17A抗体処理の結果。Ａ：サイトカイン分泌アッセイの実験概要。Ｂ：FACSによるIL17分泌の解析結果。Ｃ：抗IL17A抗体処理の実験概要。Ｄ：肝臓組織のqRT- PCRによる遺伝子発現の解析結果。Ｅ：線維化面積の比較結果。Ｆ：AZAN染色。
【図３】非アルコール性脂肪性肝炎マウスのADSC処理１の結果。Ａ：実験概要。Ｂ：FACSによるIL17分泌の解析結果。
【図４】非アルコール性脂肪性肝炎マウスのADSC処理２の結果。Ａ：実験概要。Ｂ：肝臓組織のqRT- PCRによる遺伝子発現の解析結果。Ｃ：AZAN染色。Ｄ：線維化面積の比較結果。Ｅ：HIC（肝内炎症細胞）のqRT- PCRによる遺伝子発現の解析結果。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（本発明の対象）
本発明は、以下の治療剤を対象とする。
抗ＩＬ１７抗体を含む、非アルコール性脂肪性肝炎治療剤。
抗ＩＬ１７抗体を含む、非アルコール性脂肪性肝炎における肝線維化抑制剤。
脂肪組織由来間質細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎におけるIL17A分泌抑制剤。
脂肪組織由来間質細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎における肝線維化抑制剤。
脂肪組織由来間質細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎に起因する慢性肝炎予防剤。
脂肪組織由来間質細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎での肝内炎症細胞のIL17A分泌の減少を介してIL17A関連肝炎の抑制による肝線維化抑制剤。
【００１３】
（非アルコール性脂肪性肝炎治療剤）
本発明の非アルコール性脂肪性肝炎治療剤は、肝組織を修復でき、及び／又は肝組織の線維化（肝線維化）を抑制できる。
本発明での肝組織とは、毛細胆管、門脈、肝静脈、及び／又は肝動脈を有する複数の肝細胞の集合体を意味する。
本発明での肝組織の修復とは、肝組織がなんらかの理由（例えば、肝炎、肝毒性物質等）により肝組織が有する機能、構造が欠失、欠損、喪失、消失した場合（例、肝組織障害、ネクローシス等）において、本来の機能・構造に戻す（再生）、又は本来の機能・構造を１００とした場合において、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上又は９０％以上回復（再生）することを意味するだけでなく、新しい肝組織が創生することも意味する。
本発明での肝組織の線維化の抑制とは、肝組織がなんらかの理由（例えば、肝炎、慢性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、高脂肪アテローム性物質等）により肝組織が有する構造が線維化（肝線維化）する場合において、本来の構造を維持する、又は本来の非線維化構造を１００とした場合において、９０％以上、８０％以上、７０％以上、６０％以上、５０％以上、４０％以上、３０％以上、２０％以上、１０％以上又は１％以上維持することを意味するだけでなく、本来の非線維化構造に戻す（再生）、又は本来の非線維化構造を１００とした場合において、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上又は９０％以上回復（再生）すること、及び新しい肝組織が創生することも意味する。
【００１４】
（非アルコール性脂肪性肝炎治療剤）
本発明の非アルコール性脂肪性肝炎治療剤は、有効成分として、抗ＩＬ１７抗体及び／又は脂肪組織由来間質細胞群を含む。
なお、脂肪組織由来間質細胞群は、好ましくは、自家性又は同系である。自家性脂肪組織由来間質細胞群とは、投与対象から得られた脂肪組織由来間質細胞群を意味する。また、同系脂肪組織由来間質細胞群とは、投与対象と同じ種から得られた脂肪組織由来間質細胞群を意味する。例えば、投与対象がヒトであるなら、同系脂肪組織由来間質細胞群は投与対象以外のヒトから得られる。
【００１５】
（非アルコール性脂肪性肝炎）
本発明の非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）は、アルコールに起因しない肝臓に脂肪が蓄積することで起こる肝炎を対象とするが、単純性脂肪肝とは異なることを意味する。より詳しくは、非アルコール性脂肪性肝疾患が肝炎を伴わない単純性脂肪肝ではなく、炎症や肝細胞障害を伴い肝硬変へ進展する非アルコール性脂肪性肝炎である。
さらに、本発明の肝組織修復剤は、非アルコール性脂肪性肝炎予防にも利用できる。
特に、本発明の各治療剤は、好ましくは、非アルコール性脂肪性肝炎の初期段階（肝線維化がみられないか、ごくわずかみられる段階）に投与することが好ましい。
【００１６】
（治療対象）
本発明の各治療剤の治療対象は、哺乳動物を包括的に含む。哺乳動物の例として、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル等であるが、特に限定されない。
【００１７】
（生理活性物質）
本発明の各治療剤には、生理活性物質が含まれていても良い。生理活性物質は、例えば、タンパク質、ポリペプチド、多糖（例えばヘパリン）、オリゴ糖、単糖、二糖、有機化合物、有機金属化合物、又は無機化合物等が挙げられるが特に限定されない。より詳しくは、生物学的に活性な分子、例えば、ホルモン、増殖因子、増殖因子産生ウイルス、増殖因子阻害薬、増殖因子受容体、抗炎症薬、代謝拮抗薬、インテグリン遮断薬、又はセンス遺伝子若しくはアンチセンス遺伝子等が挙げられる。
さらにより詳しくは、増殖因子の例としては、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ヒト成長ホルモン、血小板誘発増殖因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン、サイトカイン、又はそれらの組み合わせ等が挙げられる。
【００１８】
（免疫抑制剤）
本発明の各治療剤には、免疫抑制剤が含まれていても良い。例えば、自家性ではない脂肪組織由来間質細胞群を含む非アルコール性脂肪性肝炎治療剤の場合には、免疫拒絶反応を抑えるために、好ましくは免疫抑制剤を含める。
【００１９】
（担体）
本発明の各治療剤には、担体が含まれていても良い。担体の例としては、生理食塩水、溶媒、分散培地、細胞培養液、水溶性緩衝、抗酸化剤等が挙げられるが特に限定されない。
【００２０】
（投与形態）
本発明の各治療剤の投与経路は特に限定されない。例えば、静脈内注射、動脈内注射、門脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、又は腹腔内注射等を利用することができる。
また、本発明の各治療剤の投与量は、例えば、１回の１治療部位当たり約1×102〜1×1015個、約1×102〜1×106個、約1×106〜1×1010個又は約1×1010〜1×1015個、好ましくは約1×105〜1×1012個、より好ましくは約1×107〜1×109個の脂肪組織由来間質細胞群又は約1 μg〜10 g、約1 μg〜1000 mg、約1000 mg〜3000 mg、約3000 mg〜10 g好ましくは約200 μg〜5000 mg、より好ましくは約100 mg〜2500 mgの抗ＩＬ１７抗体を該治療部位に投与できるが、特に限定されない。
【００２１】
（抗ＩＬ１７抗体）
本発明の抗ＩＬ１７抗体は、抗ＩＬ１７Ａ抗体、抗ＩＬ１７Ｂ抗体、抗ＩＬ１７Ｃ抗体、抗ＩＬ１７Ｄ抗体、抗ＩＬ１７Ｅ抗体、抗ＩＬ１７Ｆ抗体を含み、市販の抗体（例：BD Biosciences社製品、abcam社製品、Santa CruzBiotechnology社製品等）を利用することができ、例えばBD Biosciences社のPurified NA/LE Rat Anti-MouseIL-17A等が挙げられるが、天然由来の抗体、自体公知の方法等により作製しても良い。
抗ＩＬ１７抗体は、好ましくは、ＩＬ１７に対するモノクローナル抗体である。好ましくは、前記抗ＩＬ１７抗体は、ヒトＩＬ１７に対するモノクローナル抗体である。あるいは、好ましくは、前記抗ＩＬ１７抗体は、マウスＩＬ１７に対するモノクローナル抗体である。好ましくは、前記抗ＩＬ１７抗体は組換え型抗体である。前記抗体は更に、ＩＬ１７に対するキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体であってもよい。
【００２２】
（抗ＩＬ１７抗体の調製方法）
本発明で使用される抗ＩＬ１７抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＩＬ１７抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。
抗ＩＬ１７モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＩＬ１７を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＩＬ１７Ａは、アクセッション番号NM_002190に開示されたＩＬ１７遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
【００２３】
（脂肪組織由来間質細胞群）
本発明の脂肪組織由来間質細胞群とは、分取した脂肪組織を酵素処理（好ましくは、コラゲナーゼ処理）して得られた細胞群を意味する。
脂肪組織由来間質細胞群は、少なくとも内皮細胞、血球系細胞を含み、好ましくは、内皮細胞、血球系細胞、線維芽細胞、血管周囲細胞、平滑筋細胞を含む。
本発明の肝組織修復剤では、取得した脂肪組織由来間質細胞群を自体公知の培養方法により培養しない非培養脂肪組織由来間質細胞群が好ましい。
【００２４】
（脂肪組織由来間質細胞群の調製方法）
本発明の脂肪組織由来間質細胞群の調製方法を以下に記載するが、特に限定されない。
脂肪組織（皮下脂肪、内臓脂肪、筋肉内脂肪、筋肉間脂肪）を動物から切除、吸引などの手段で採取する。免疫拒絶を回避するため、治療対象と同一の個体から脂肪組織を採取することが好ましい。
採取した脂肪組織は、必要に応じて、付着した血液成分の除去及び細片化を経た後、酵素処理に供される。酵素処理は、脂肪組織をコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ等の酵素によって消化する。
なお、脂肪組織を適当な緩衝液や培養液中で洗浄することによって血液成分等を除去することができる。
加えて、必要に応じて、初代間質細胞群を、自体公知の培養液（例、抗真菌および抗生物質を含む10%FBS添加DMEM/F12(1:1)培養液）で培養し、非選択的に継代培養増殖を行うことで、培養脂肪組織由来間質細胞群を得ることができる。
【００２５】
（脂肪組織由来間質細胞群の調製方法の例）
脂肪組織由来間質細胞群の調製方法の具体例を以下に示すが、特に限定されない。
ヒトから採取した脂肪を、緩衝液を含有する培養皿に置き、洗浄し、さらに別の緩衝液を含有する培養皿に移す。該脂肪を微細な小片に刻み、2mg/mLコラゲナーゼＩを用いて数時間、約30〜39℃で消化する。消化済みの脂肪の懸濁液をＤＭＥＭ−１０（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン/アンピリシン）中で洗浄する。そして、消化されなかった脂肪組織を除去し、細胞ペレットを５ｍＬのＤＭＥＭ−１０中に懸濁させる。さらに、脂肪細胞懸濁液を、フィルターメッシュに通し、大きな粒子および凝集塊を除去して、脂肪組織由来間質細胞群を得る。
【００２６】
下記の実施例より、以下の効果を確認している。
（１）抗ＩＬ１７抗体による、非アルコール性脂肪性肝炎（特に初期段階の非アルコール性脂肪性肝炎）における肝組織の繊維化（肝線維化）の抑制。
（２）脂肪組織由来間質細胞群による、非アルコール性脂肪性肝炎（特に初期段階の非アルコール性脂肪性肝炎）におけるIL17A分泌の抑制。
（３）脂肪組織由来間質細胞群による、非アルコール性脂肪性肝炎（特に初期段階の非アルコール性脂肪性肝炎）に起因する慢性肝炎の予防。
（４）脂肪組織由来間質細胞群による、非アルコール性脂肪性肝炎初期の肝内炎症細胞からのIL17A分泌の減少を介してIL17A関連肝炎の抑制による肝線維化の発症及び進展の抑制並びに肝線維化の改善。
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
＜材料と方法＞
（マウスモデル）
非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）モデルは、C57Bl/6Jマウスに高脂肪アテローム性飼料（AT-HF）を給餌し、NASHを発症させた（AT-HF給餌NASHマウスモデル）。
単純性脂肪肝（SS）モデルは、C57Bl/6JマウスにHFD-60を給餌し、単純性脂肪肝を発症させた（HFD-60給餌SSマウスモデル）。
野生型マウスは、C57Bl/6Jマウスに通常飼料を給餌した（対照）。
【００２９】
（ADSCの培養）
マウスの皮下脂肪組織をリベラーゼで消化し、脂肪細胞を除去し、間質細胞を培養し、20％ウシ胎仔血清を添加したDMEM/F12で増殖させた。脂肪組織由来間質/幹細胞（ADSC）として4回継代した間質細胞を使用した。
【００３０】
（肝内炎症細胞（HIC）単離）
マウスの肝臓組織の一部をホモジナイズし、I型コラゲナーゼと共にインキュベートし、肝実質細胞および炎症細胞をパーコール勾配法により単離した。
【実施例２】
【００３１】
（非アルコール性脂肪性肝炎マウスと脂肪肝マウスの肝病態の比較）
AT-HF又はHFD-60を給餌し4、8週目における組織所見と肝内炎症細胞の遺伝子発現を評価した。
肝細胞においてはAT-HF給餌NASHマウスモデル、HFD-60給餌SSマウスモデルの4、8週目いずれも同程度の脂肪沈着が認められた（図１Ａ）。しかし、AT-HF給餌NASHマウスモデルでは、肝内にGr-1やF4/80陽性の炎症細胞の集簇がみられ、8週目では線維化をきたした（図１Ａ）。これらの組織所見から、AT-HF給餌NASHマウスモデルは非アルコール性脂肪性肝炎類似病態を示す一方、HFD-60給餌SSマウスモデルは単純性脂肪肝に類似した病態を示すことを確認した。
【００３２】
AT-HF給餌NASHマウスモデルとHFD-60給餌SSマウスモデルの肝内炎症細胞の遺伝子発現を比較した。フィルターを通過した9356個の遺伝子発現を全て用いた階層クラスタリング解析では、AT+HF給餌NASHマウスモデルとHFD-60給餌SSマウスモデルの2群を完全に判別するクラスターを形成した（図１Ｂ）。
HICの遺伝子発現解析により、SS-HICと比較してNASH-HICにおける868個の上方制御された遺伝子を同定した。
さらに、HFD-60給餌SSマウスモデルのHICと比較してAT-HF給餌NASHマウスモデルのHICで発現が上昇していた868遺伝子について生物学的プロセスを解析したところ、上方制御された遺伝子の生物学的プロセスは、IL6、IL10、IL17A、IL17F、RORγによって特徴付けられるCD4＋T細胞免疫応答に関連するものであった（図１Ｃ）。
【実施例３】
【００３３】
（非アルコール性脂肪性肝炎マウスの肝内炎細胞のサイトカイン分泌アッセイ）
AT-HF給餌NASHマウスモデル及び対照の野生型マウスの給餌開始から4週後にHICを単離した。単離したHICをCD3e/CD28（T cellactivation/expansion kit、Miltenyi Biotec社）で刺激した。実験の概要を図２Ａに示す。
各HICのタンパク質発現を、蛍光物質PE（Phycoerythrin）で標識した抗IL17A抗体（IL17PE）を使用してFACS解析（フローサイトメトリー）により評価した。
NASHマウスモデルにおけるIL17分泌細胞の頻度は、野生型より高かった（37％対15％）（図２Ｂ）。
当該結果より、IL17が非アルコール性脂肪性肝炎（特に初期段階の非アルコール性脂肪性肝炎）に関与していると考えられる。
【００３４】
（非アルコール性脂肪性肝炎マウスの抗IL17A抗体処理）
抗IL17A抗体（Ab）（Purified NA/LERat Anti-Mouse IL-17A、BD Biosciences社）、抗CD4抗体又は抗IgG抗体を8週間週1回腹腔内注射し、4、8週目に肝臓組織を得た。実験の概要を図２Ｃに示す。
4週目の肝臓組織についてqRT-PCRによる遺伝子発現解析を行った。
8週目の肝臓組織についてAZAN染色により肝線維化を評価した（図２Ｆ）。
抗IL17A抗体の投与によりNASHマウスの肝臓組織のIVa型コラーゲンの遺伝子発現（図２Ｄ）を下方制御し（p <0.05）、及び線維化面積（p <0.01）（図２Ｅ）を有意に低下させたが、抗CD4抗体はこれらを有意に低下しなかった。
当該結果より、抗IL17A抗体が非アルコール性脂肪性肝炎（特に初期段階の非アルコール性脂肪性肝炎）における肝線維化を抑制できることを確認した。
【００３５】
（非アルコール性脂肪性肝炎マウスのADSC処理１）
AT-HF給餌NASHマウスモデルの給餌開始後4週目にADSC（1×105個）又は対照としてPBSを脾臓被膜下に注射し、72時間後にHICを単離した。単離したHICをCD3e/CD28で刺激した。実験の概要を図３Ａに示す。
各HICのタンパク質発現を、抗IL17A抗体を使用してFACS解析（フローサイトメトリー）により評価した。
HICのIL17A分泌細胞集団は、対照と比較してADSC処理によって減少した（25％対37％）（図３Ｂ）。
当該結果より、ADSCが非アルコール性脂肪性肝炎（特に初期段階の非アルコール性脂肪性肝炎）におけるIL17A分泌を抑制できることを確認した。
【００３６】
（非アルコール性脂肪性肝炎マウスのADSC処理２）
給餌開始後4週目及び8週目にADSC（1×105個）を脾臓被膜下に注射し、12週目に肝臓組織を採取し、HICを単離した。実験の概要を図４Ａに示す。
採取した肝臓組織について、qRT-PCRによる遺伝子発現解析、AZAN染色による線維症の評価（図４Ｃ）及びFACSを行った。
NASHマウスモデルへのADSC処理は、肝臓組織のIa型およびIVa型コラーゲンの遺伝子発現（p <0.05）（図４Ｂ）及び肝臓線維症面積（p <0.01）（図４Ｄ）を減少させた。
NASHマウスモデルへのADSC処理は、NASH-HICのIL17F及びIL17A遺伝子発現を減少させた（図４Ｅ）。
当該結果より、ADSCが非アルコール性脂肪性肝炎（特に初期段階の非アルコール性脂肪性肝炎）における肝線維化を抑制できることを確認した。
【００３７】
＜総論＞
以上の結果より、IL17AはNASHの初期段階において線維化を進行する重要なサイトカインであった。また、ADSCは肝線維化の発症及び進展を抑制でき、肝線維化を改善できるが、 その背景には、NASH初期のHICからのIL17A分泌の減少を介する機序があるが、この機序に限定されない機序もある。
抗IL17A抗体投与は、NASHにおいて線維化発症を抑制できる。
ADSC投与は、NASHに起因する慢性肝炎において予防的に有効であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明では、肝組織の線維化（肝線維化）を抑制できる非アルコール性脂肪性肝炎治療剤を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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