(57)【要約】【課題】脱アミド化小麦タンパク質に対する感受性又は抵抗性の判定に有用な指標を提供することを課題とする。【解決手段】被検者から採取された核酸検体のHLA-DQ遺伝子型を検出するステップであって、HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09及びHLA-DQB1*02:01からなる群より選択される、いずれかの遺伝子型が検出されることが感受性の指標となり、HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02及びHLA-DQB1*04:02からなる群より選択される、いずれかの遺伝子型が検出されることが抵抗性の指標となるステップを含む、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性又は抵抗性の検査法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から採取された核酸検体のHLA-DQ遺伝子型を検出するステップであって、HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09及びHLA-DQB1*02:01からなる群より選択される、いずれかの遺伝子型が検出されることが感受性の指標となり、
HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02及び HLA-DQB1*04:02からなる群より選択される、いずれかの遺伝子型が検出されることが抵抗性の指標となるステップを含む、
脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性又は抵抗性の検査法。
【請求項２】
前記ステップが、被験者から採取された核酸検体中のHLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、 HLA-DQB1*06:02又はHLA-DQB1*04:02の有無を決定することを含む、請求項１に記載の検査法。
【請求項３】
前記ステップが、HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09及びHLA-DQB1*02:01からなる群より選択される、いずれかの遺伝子型の有無を決定することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
以下の(a)又は(b)の基準に従い感受性又は抵抗性を判定することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検査法：
(a) HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09又はHLA-DQB1*02:01の少なくとも一つが検出されれば感受性が高い；
(b) HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02又は HLA-DQB1*04:02が検出されれば抵抗性が高い。
【請求項５】
HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09及びHLA-DQB1*02:01からなる群より選択されるいずれかの感受性遺伝子型、又はHLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02及び HLA-DQB1*04:02からなる群より選択されるいずれかの抵抗性遺伝子型、を検出するための核酸を含む、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性又は抵抗性検査用試薬。
【請求項６】
HLA-DQB1*03:03を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*03:02を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*05:01を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*06:09を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*02:01を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*06:01を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*03:01を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*06:02を検出するための核酸試薬、及び HLA-DQB1*04:02を検出するための核酸試薬からなる群より選択される一以上の核酸試薬を含む、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性又は抵抗性検査用キット。
【請求項７】
HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09及びHLA-DQB1*02:01からなる群より選択される、いずれかのHLA遺伝子型からなる、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性マーカー。
【請求項８】
HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02及びHLA-DQB1*04:02からなる群より選択される、いずれかのHLA遺伝子型からなる、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する抵抗性マーカー。
【請求項９】
前記各遺伝子型に代えて、連鎖不平衡にある遺伝子型が用いられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検査法、請求項５に記載の検査用試薬、或いは請求項６に記載の検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性又は抵抗性の検査に有用な指標（マーカー）及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーの有病率は、本邦の乳児で約5〜10％、幼児で約5％、学童期以降が1.5〜3％と報告されている（非特許文献１）。全世界的にみても、先進国を中心に食物アレルギーは近年増加傾向にあり、今まで症状が全くなかった成人においてもある日突然発症することからその対応は緊喫の課題である。小麦は食物アレルギーの原因として鶏卵、牛乳に次ぎ第3位であり（非特許文献２）、小麦の消費量の増加にともない増加傾向にある。小麦アレルギーの中でも、小麦依存性運動誘発アナフィラキシー（WDEIA）は小麦含有食品摂取後に運動をすることによりアナフィラキシーショックを呈し、生命の危険にさらされることもある重篤な疾患である。WDEIA患者においては小麦アレルゲンのコンポーネントの一つであるω-5グリアジンに対する特異IgE抗体値の上昇が多くの患者で認められる。
【０００３】
これまでの研究により、IgEエピトープが示唆されている（非特許文献４）が、どのようなメカニズムで発症するのかについての詳細は明らかとなっていない。
【０００４】
アレルギー疾患は複数の遺伝子と環境要因が関与して発症する多因子疾患である。近年、全染色体に存在する数十万〜数百万の遺伝子多型を決定することにより、疾患と関連する遺伝子を同定する手法である全ゲノム関連解析（GWAS）が行われ、喘息、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患等、多くの多因子疾患の新規疾患感受性遺伝子同定に貢献している。GWASは、hypothesis freeな実験手法であり、糖尿病や癌などの多因子疾患の疾患感受性遺伝子を同定するために近年盛んに行われるようになった。ヒトゲノム全体をカバーする数十万以上のSNPを使用して、患者（ケース）とその疾患に罹患していない個人（コントロール）との間で、多型の頻度に差があるかどうかを統計的に検定する。喘息、アトピー性皮膚炎については多くのGWASの報告があるが、食物アレルギーについては2015年にHongらが食物アレルギーのGWASを行い、HLA-DRとDQ領域のSNPとピーナツアレルギーとの関連を報告した（非特許論文５）と2017年の同じくピーナツアレルギーの論文（非特許文献６）のみである。
【０００５】
小麦に対する不耐症には、セリアック病、小麦アレルギー、非セリアックグルテン感受性など様々あるが、その発症メカニズムについては、はっきりと解明されていない。特に欧米ではセリアック病や非セリアックグルテン感受性の罹患率が日本に比較すると高く、社会問題となっている。小麦に含まれるグルテンに対する食事療法、グルテンフリーダイエットも欧米では一般に浸透しており、日本においても近年注目されている。これらの不耐症に関しては胃腸症状から疲労、頭痛など症状が多彩であることから一見、小麦に対する不耐症であるとは気づきにくい。
【０００６】
近年、加水分解小麦含有石鹸を使用していた方が、小麦摂取により重度の小麦アレルギーを発症した症例が本邦において報告され（非特許文献３）、大きな社会問題となった。本症例は当該石鹸の使用で引き起こされた経皮感作による、上記のWDEIAとは臨床症状的にも全く異なるタイプの小麦アレルギーであり、世界的にも注目されている。原因となる小麦由来タンパク質は商品名「グルパール19S」であり、前記タンパク質に対する患者から採取した血清中IgE抗体を使用したウエスタンブロットにおいてもWDEIAとは異なる反応性を示している。前記小麦由来商品「グルパール19S」は、小麦のタンパク質を酵素や塩酸などによって加水分解及び脱アミド化したものであり、高い保湿性があり且つ水溶性にも優れることから、多くの製品（化粧品、シャンプー、食品など）に利用されていた。本研究において、当該小麦由来商品が抗原性を獲得したのは高温下で塩酸処理による脱アミド化が原因と考察している（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】食物アレルギー診療ガイドライン2012
【非特許文献２】平成20年厚生労働省科学研究「アレルギー性疾患の発症・進展・重症化の予防に関する研究」
【非特許文献３】Fukutomi Y. et al. Jpn J Allergol  2009; 58:1325
【非特許文献４】Yokooji T. et al. Allergol Int 2013; 62:435-45
【非特許文献５】Hong X. et al. Nat Commun, 2015 Feb 24;6:6304
【非特許文献６】Martino DJ et al. Clin Exp Allergy. 2017 Feb;47(2):217-223.
【非特許文献７】Masashi N. et al. Contact Dermatitis 2016;74:346-352
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のアレルギー発症事例は、食物アレルギーにおける経皮感作の重要性を改めて認識させるものである。以下、本患者群が発症したアレルギーをimmediate-type wheat allergy caused by a specific HWP (HWP-IWA)と呼ぶ。尚、一般に販売され、使用されていた商品の数に対して発症率（脱アミド化小麦含有石鹸使用者の約0.05％）が高くないこと、また、同じように当該小麦由来商品を使用していても軽度のアレルギー症状に留まった者やアレルギー症状を訴えない者が存在したことも、この事例の特徴である。(Yagami A. et al., Outbreak of immediate-type hydrolyzed wheat protein allergy due to a facial soap in Japan., Journal of Allergy and Clinical Immunology. in press)
【０００９】
この事例に関し発明者らは、発症率は高くなく、使用者の一部が発症したことから、発症を規定する遺伝的素因の存在を伺わせることを考察した。今回の各個人の遺伝的感受性又は抵抗性を判定できれば、予防的措置を講じて発症を未然に防ぐことや（例えば、感受性の高い個人に対して事前に注意を喚起する）、食事制限（グルテンフリー食）の必要性を客観的な指標に基づき判断すること（例えば、感受性の高い個人に対しては積極的に食事制限を推奨する一方で、抵抗性の高い個人に対して食事制限の必要性が低いことを提示する）等が可能となり、予防医療、医療経済、更には生活の質の向上などの点において多大な恩恵がもたらされる。
そこで本発明は、アレルギー発症事例の中でも、脱アミド化小麦タンパク質に対する感受性又は抵抗性の判定に有用な指標を見出し、その利用・応用を図ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、経皮感作による重篤な小麦アレルギーの病態解明及び予防法の確立を目指し、脱アミド化小麦タンパク質を有するグルパール19Sによる食物アレルギー確定例（詳細は後述の実施例の欄を参照）の患者のゲノムDNAを使用して全ゲノム関連解析を行うとともに、詳細な遺伝子タイピングを実施した。
【００１１】
詳細な検討の結果、HLAクラスII領域に存在する、感受性又は抵抗性を示す遺伝子（HLA遺伝子型）を特定することに成功した。特定された遺伝子型の中には、著しく高い感受性を示すものがあった。尚、本疾患は経皮、経粘膜感作により発症に至ったと考えられるため、候補遺伝子解析として、現在までにアトピー性皮膚炎との関連が報告された17領域22箇所、及び皮膚のバリア機能低下と関連するフィラグリン機能喪失変異についても遺伝子型決定を行い、関連解析を行ったが、疾患との関連は認められず、本疾患と皮膚の脆弱性との関連は確認できなかった。
以下の発明は、主として上記の成果及び考察に基づく。
［１］被検者から採取された核酸検体のHLA-DQ遺伝子型を検出するステップであって、HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09及びHLA-DQB1*02:01からなる群より選択される、いずれかの遺伝子型が検出されることが感受性の指標となり、
HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02及びHLA-DQB1*04:02からなる群より選択される、いずれかの遺伝子型が検出されることが抵抗性の指標となるステップを含む、
脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性又は抵抗性の検査法。
［２］前記ステップが、被験者から採取された核酸検体中のHLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02又はHLA-DQB1*04:02の有無を決定することを含む、［１］に記載の検査法。
［３］前記ステップが、HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09及びHLA-DQB1*02:01からなる群より選択される、いずれかの遺伝子型の有無を決定することをさらに含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］以下の(a)又は(b)の基準に従い感受性又は抵抗性を判定することを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の検査法：
(a) HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09又はHLA-DQB1*02:01の少なくとも一つが検出されれば感受性が高い；
(b) HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02又はHLA-DQB1*04:02が検出されれば抵抗性が高い；
［５］HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09及びHLA-DQB1*02:01からなる群より選択されるいずれかの感受性遺伝子型、又はHLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02及びHLA-DQB1*04:02からなる群より選択されるいずれかの抵抗性遺伝子型、を検出するための核酸を含む、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性又は抵抗性検査用試薬。
［６］HLA-DQB1*03:03を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*03:02を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*05:01を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*06:09を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*02:01を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*06:01を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*03:01を検出するための核酸試薬、HLA-DQB1*06:02を検出するための核酸試薬、及びHLA-DQB1*04:02を検出するための核酸試薬からなる群より選択される一以上の核酸試薬を含む、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性又は抵抗性検査用キット。
［７］HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09及びHLA-DQB1*02:01からなる群より選択される、いずれかのHLA遺伝子型からなる、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性マーカー。
［８］HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02及びHLA-DQB1*04:02からなる群より選択される、いずれかのHLA遺伝子型からなる、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する抵抗性マーカー。
［９］前記各遺伝子型に代えて、連鎖不平衡にある遺伝子型が用いられる、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の検査法、［５］に記載の検査用試薬、或いは［６］に記載の検査用キット。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】全ゲノム関連解析(GWAS)とPrincipal component Analysis(PCA)の解析結果。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性又は抵抗性の検査法
本発明の第１の局面は脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性又は抵抗性の検査法に関する。小麦のタンパク質を脱アミド化することによって得られる「脱アミド化小麦」は、その特性（主に高い保湿性）を利用して、化粧品（基礎化粧品、メーキャップ化粧品、ヘアケア製品、ボディーケア製品を含む）、トイレタリー製品、食品等の添加物として広く用いられている。脱アミド化小麦が適用される製品の具体例として、石鹸、洗顔料、ボディー用洗浄料、シャンプー、コンディショナー、トリートメント、ヘアパック、化粧水、美容液、乳液、化粧下地、フェイスクリーム、マッサージ料、ハンドクリーム、マスカラ、アイライナー、整髪料、ヘアトニック、香水、歯磨き粉、洗口液、入浴剤を挙げることができる。尚、脱アミド化小麦の一般的な製造方法は酸分解法（典型的には塩酸を使用する）と酵素分解法（プロテアーゼ）に大別される。
【００１４】
本発明における「脱アミド化小麦タンパク質」は、脱アミド化小麦タンパク質が含まれている限り特に限定されない。例えば、小麦タンパク中のグルタミンがグルタミン酸になったものを含む小麦タンパク質が「脱アミド化小麦タンパク質」に該当する。例えば、小麦タンパク質を酸分解法で処理すると（典型的には、高温下で塩酸処理する）、グルタミンがグルタミン酸になる。このような処理が行われることが、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーの原因の一つである。
【００１５】
本発明において、「感受性」及び「抵抗性」は、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーを発症する可能性を表す用語である。例えば、感受性が高ければアレルギーを発症し易く、抵抗性が高ければアレルギーを発症し難いことになる。但し、アレルギーの発症には、「感受性」及び「抵抗性」以外の要因も影響すると考えられる。従って、通常、実際にアレルギーを発症するか否かについては医師等の専門知識を有する者によって診断される。
【００１６】
本発明の検査法では、被検者から採取された核酸検体のHLA-DQ遺伝子型を検出するステップを行い、検出結果に基づき、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する被検者の感受性又は抵抗性を判定する。
【００１７】
本発明における判定では、本発明者らの検討によって、表１に記載する感受性と関連が認められた遺伝子型（「感受性遺伝子型」と呼ぶ）及び抵抗性と関連が認められた遺伝子型（「抵抗性遺伝子型」と呼ぶ）を指標として用いる。感受性遺伝子型が検出されることが感受性の指標となり、抵抗性遺伝子型が検出されることが抵抗性の指標となる。本発明での判定は、その判定指標ないし基準から明らかな通り、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。
【表１】
2019000017.tif 000002
【００１８】
各遺伝子型に関する配列情報などは公共のデータベース（例えばIMGT/HLAデータベース）に登録されている。なお、HLA-DQB1*03:03等には複数の登録番号（Accession Number）があり、例えば、HLA-DQB1*03:03に含まれるHLA-DQB1*03:03:02:01の登録番号はIPD-IMGT/HLA Acc NoではHLA00629である。つまり、本願明細書における遺伝子型は、例えば、HLA-DQB1*03:03に含まれるHLA-DQB1*03:03:02:01というにように、HLA-DQB1*03:03に属するもの（異なる塩基配列）や、表記の異なったもの（同じアミノ酸配列）も含む。
【００１９】
上記の(1)〜(9)の遺伝子型に代えて、これらと連鎖不平衡にある遺伝子型を検出対象にしてもよい。特定の遺伝子型と連鎖不平衡（r2値＞0.8)の遺伝子型は類似した挙動を示し、同様に感受性又は抵抗性のマーカーとして有用と考えられるからである。連鎖不平衡状態にある遺伝子型は、例えば、ARLEQUIN(Molecular Ecology Resources. 10: 564-567.）などの解析用ソフトウエアによって同定することができる。また、特定の遺伝子型と連鎖不平衡の遺伝子型は、特に限定しないが、既存のデータベース（例えば、http://hla.or.jp/med/frequency_search/en/haplo/）を参照することができる。上記の(1)〜(6)、(8)の遺伝子型に対して連鎖不平衡を示す遺伝子型は、HLA-DQA1遺伝子型（アレル）、HLA-DRB1遺伝子型遺伝子型（アレル）又はHLA-DPB1遺伝子型（アレル）等に見出される。具体的には、例えば、表２に記載する遺伝子型が挙げられる。
【表２】
2019000017.tif 000003
【００２０】
特に限定するものではないが、本発明の検査法において、上記一群の遺伝子型（５個の感受性遺伝子型、４個の抵抗性遺伝子型及びそれらと連鎖不平衡にある遺伝子型）における特定の１個又は複数個（例えば感受性遺伝子型の中の２個、３個、４個又は５個（全部）、或いは抵抗性遺伝子型の中の３個又は４個（全部）、或いはその代わりに連鎖不平衡にある遺伝子型の中の２個、３個、４個または５個以上）を標的として検出操作を行うことにしてもよい。また、感受性遺伝子型または抵抗性遺伝子型のいずれか一方を標的として検出操作を行うことにしてもよい。好ましくは、検査精度を高めるため、上記一群の遺伝子型全てが検出可能な検出操作を行う。
【００２１】
本発明の検査法の実施にあたっては、まず、被検者から採取された核酸検体を用意する。本発明では、感受性又は抵抗性の判定を必要とする者（被検者）に由来する核酸検体を使用する。核酸検体は、HLA-DQ遺伝子が存在するMHCクラスII領域を含むものであれば任意の長さのゲノムDNA（そのゲノムDNAが断片化物したものも含む）またはそれらのDNAが含まれる試料を核酸検体として用いることができ、例えば、被検者の血液、唾液、リンパ液、尿、汗、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等の核酸を含む生体試料から公知の抽出方法、精製方法を用いて核酸検体を調製することができる。
【００２２】
本発明の適用範囲は日本人に限られない。即ち、日本人以外のモンゴロイドやその他の人種（コーカソイド等）に対して本発明を適用することを排除する意図はない。
【００２３】
遺伝子型の検出法（解析法）は特に限定されるものではなく、例えば、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、PCR-SSO法、PCR-rSSO法、PCR-SSP法、PCR-SBT法、TaqMan（登録商標、Roche Molecular Systems社）-PCR法、Invader（登録商標、Third Wave Technologies社）法、FRETを利用した方法（Heller, Academic Press Inc, pp. 245-256(1985)、など）、ASP-PCR法、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法(Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7,378(1997))、RCA法、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法など、公知の方法を採用できる。さらに、検出対象の遺伝子型に特徴的な多型部位を直接シークエンスすることにしてもよい。また、市販のキット（例えば、WAKFlow（登録商標）HLAタイピング試薬（湧永製薬））を用いることもできる。尚、これらの方法を任意に組み合わせて遺伝子型を検出してもよい。
【００２４】
以上の方法では、各方法に応じたプローブやプライマー等の核酸（本発明において「遺伝子型検出用核酸」ともいう）が使用される。プローブとして利用される遺伝子型検出用核酸の例としては、検出対象の遺伝子型に特徴的な多型位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に特異的にハイブリダイズする核酸を挙げることができる。ここでの「部分染色体領域」の長さは、例えば16〜500塩基長、好ましくは18〜200塩基長である。また、当該核酸は好ましくは部分染色体領域に相補的な配列を有するが、特異的なハイブリダイゼーションに支障のない限り、多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、1〜10個、好ましくは1〜5個、更に好ましくは1〜3個である。ここでの「特異的なハイブリダイゼーション」とは、プローブによる検出の際に通常採用されるハイブリダイゼーション条件（好ましくはストリンジェントな条件）の下、標的の核酸（部分染色体領域）に対してハイブリダイズする一方で、他の核酸との間にクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。尚、当業者であれば例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)を参考にしてハイブリダイゼーション条件を容易に設定可能である。
【００２５】
プライマーとして利用される遺伝子型検出用核酸の例としては、検出対象の遺伝子型に特徴的な多型位置を含む一定領域（染色体の一部の領域）に相補的な配列を有し、当該多型部分を含むDNAフラグメントを特異的に増幅できるように設計された核酸を挙げることができる。プライマーとして利用される遺伝子型検出用核酸の他の例として、検出対象の遺伝子型に特徴的な多型部位が、検出対象の遺伝子型のものである場合にのみ当該多型部位を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された遺伝子型検出用核酸セットを挙げることができる。より具体的には、検出対象の遺伝子型に特徴的な多型部位を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された遺伝子型検出用核酸セットであって、多型部位が検出対象の遺伝子型のものであるアンチセンス鎖の当該多型部位を含む一定領域（染色体の一部の領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域（多型部位の近傍領域）に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる遺伝子型検出用核酸セットを例示することができる。ここで、増幅されるDNAフラグメントの長さはその検出に適した範囲で適宜設定され、例えば15〜1000塩基長、好ましくは20〜500塩基長、更に好ましくは30〜200塩基長である。尚、プローブの場合と同様、プライマーとして利用される遺伝子型検出用核酸についても、増幅対象（鋳型）に特異的にハイブリダイズし、目的のDNAフラグメントを増幅することができる限り、鋳型となる配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、1〜10個、好ましくは1〜3個、更に好ましくは1〜2個である。
【００２６】
遺伝子型検出用核酸（プローブ、プライマー）には、検出法に応じて適宜DNA、RNA、ペプチド核酸（PNA: Peptide nucleic acid)等が用いられる。遺伝子型検出用核酸の塩基長は、その機能が発揮される長さであればよい。プローブとして用いられる場合、塩基長の例としては15〜150塩基長、好ましくは16〜100塩基長である。また、プライマーとして用いられる場合、塩基長の例としては10〜70塩基長、好ましくは15〜60塩基長、更に好ましくは20〜50塩基長である。
【００２７】
遺伝子型検出用核酸（プローブ、プライマー）はホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。尚、遺伝子型検出用核酸の設計、合成等に関しては成書（例えばMolecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New YorkやCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al. 1987））を参考にすることができる。
【００２８】
本発明における遺伝子型検出用核酸を予め標識物質で標識しておくことができる。このような標識化遺伝子型検出用核酸を用いることにより例えば、増幅産物の標識量を指標として遺伝子型を検出することができる。また、多型を構成する各遺伝子型の遺伝子における部分DNA領域をそれぞれ特異的に増幅するように設計された複数種類のプライマーを互いに異なる標識物質で標識しておけば、増幅産物から検出される標識物質及び標識量によって核酸検体の遺伝子型を判別できる。このような標識化プライマーを用いた検出方法の具体例としては、多型を構成する各遺伝子型のセンス鎖にそれぞれ特異的にハイブリダイズする２種類の核酸プライマー（アリル特異的センスプライマー）を別々の蛍光物質で標識し、これら標識化プライマーとアンチセンス鎖に特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとを用いて多型部位を含む部分DNA領域を増幅し、得られた増幅産物における各蛍光物質の標識量を測定して多型を検出する方法を挙げることができる。尚、ここでのアンチセンスプライマーを例えばビオチンで標識しておけば、ビオチンとアビジンとの特異的な結合を利用して増幅産物の分離を行うことができる。
【００２９】
遺伝子型検出用核酸の標識に用いられる標識物質としては7-AAD、Alexa Fluor（登録商標）色素（例えば、Alexa Fluor488、PE-Alexa Fluor700、APC-Alexa Fluor750等）、Cy（登録商標）色素(例えば、Cy2、PE-Cy5、APC-Cy7等) DsRED、EGFP、EYFP、FITC、PerCPTM、R-Phycoerythrin、Propidium Iodide、AMCA、DAPI、ECFP、MethylCoumarin、Allophycocyanin、、Rhodamine-123、Tetramethylrhodamine、Texas Red（登録商標）、PE、Oregon Green、FAMTM、VIC（登録商標）、ABY（登録商標）、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテート、量子ドットなどの蛍光色素、32P、131I、125Iなどの放射性同位元素、ビオチンを例示でき、標識方法としてはアルカリフォスファターゼ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた5'末端標識法、T4 DNAポリメラーゼやKlenow断片を用いた3'末端標識法、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法（Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 9，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）などを例示できる。
【００３０】
また、遺伝子型検出用核酸を不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる。固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、ビーズ状などに加工しておけば、これら固定化核酸を用いて各遺伝子型の検出をより簡便に行うことができる。
【００３１】
上記の通り、本発明では感受性遺伝子型又は抵抗性遺伝子型の検出を指標として、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する被検者の感受性又は抵抗性を判定する。具体的な判定基準として以下の(a)、(b)を採用することができる。
(a) HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09又はHLA-DQB1*02:01の少なくとも一つが検出されれば感受性が高いとする。
(b) HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02又はHLA-DQB1*04:02が検出されれば抵抗性が高いとする。
【００３２】
なお、典型的には、感受性アレルが一つ以上検出される場合には感受性が高くなるとする。同様に、典型的には、抵抗性アレルが一つ以上検出される場合には抵抗性が高くなるとする。感受性アレルと抵抗性アレルのヘテロ接合体の場合にはリスクは一般集団と変わらないと評価する。
【００３３】
本発明の検出法がもたらす情報（検出結果）は、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーの発症リスクの判定に有用である。即ち、検出結果を利用すれば、被検者が脱アミド化小麦タンパク質アレルギーの発症リスクが高いか、或いは発症リスクが低いかを判定することができ、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーの発症予防、早期発見に役立つ。また、生活の質の向上にも役立つ。具体的には、発症リスクが高いと判定された被検者に対しては、判定結果を参考にして医師等の専門知識を有する者によって診断し、例えば、事前に注意を喚起したり、積極的に食事制限（脱アミド化小麦含有食品・製品の摂取・使用の制限等）を推奨したりすること等により、発症を未然に防ぐことや症状の軽減を図ることが可能となる。また、発症後においては重症化の阻止、より適切な治療方針の決定等も可能となる。他方、発症リスクが低いと判定された被検者に対しては、例えば、食事制限の必要性が低いことを提示することが可能になり、生活の質の向上を図ることができる。
【００３４】
２．検査用試薬及びキット
本発明の他の局面は、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性又は抵抗性の検査に用いられる試薬及びキットを提供する。本発明の試薬（以下、「核酸試薬」とも呼ぶ）は、上記の遺伝子型検出用核酸を含有する。核酸試薬は、特定の感受性遺伝子型、即ち、HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*06:09又はHLA-DQB1*02:01を検出するための遺伝子型検出用核酸、或いは、特定の抵抗性遺伝子型、即ち、HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02又はHLA-DQB1*04:02を検出するための遺伝子型検出用核酸、或いは上記感受性遺伝子型又は抵抗性遺伝子型と連鎖不平衡にある遺伝子型を検出する遺伝子型検出用核酸、少なくともいずれか一種の遺伝子型検出用核酸、及び／又は、より好ましくは二種以上の遺伝子型検出用核酸を含有する。本発明の核酸試薬は、検出法（PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、PCR-SSO法、PCR-rSSO法、PCR-SSP法、PCR-SBT法等）に応じて適宜設計される。なお、遺伝子型検出用核酸の詳細については既述の通りである。
【００３５】
本発明のキットは、一つ以上の核酸試薬を必須の構成要素として含む。例えば、二種類以上の核酸試薬を含む構成とすれば、複数の遺伝子型を検出可能なキットとなる。また、各々が特定の感受性遺伝子型に対応する、５種の核酸試薬を組み合わせ、５種全ての感受性遺伝子型を検出可能なキットにしてもよい。同様に、各々が特定の抵抗性遺伝子型に対応する、４種の核酸試薬を組合せ、４種全ての抵抗性遺伝子型を検出可能なキットにしてもよい。更には、各々が特定の感受性遺伝子型に対応する、５種の核酸試薬と、各々が特定の抵抗性遺伝子型に対応する、４種の核酸試薬を含み、５種の感受性遺伝子型及び４種の抵抗性遺伝子型を網羅するキットにしてもよい。
【００３６】
本発明のキットには、本発明の核酸試薬の他、核酸試薬を使用する際（即ち遺伝子型の検出の際）に必要な試薬（DNAポリメラーゼ、制限酵素、緩衝液、発色試薬など）や容器、器具等を本発明のキットに含めてもよい。尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
【００３７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００３８】
＜被検者＞
脱アミド化小麦タンパク質を有する脱アミド化小麦（グルパール19S）含有石鹸を使用した後に小麦アレルギーを発症したHWP-IWA患者のゲノムDNAを使用した。すべての患者は以下に示す、「化粧品中のタンパク加水分解物の安全性に関する特別委員会」の診断基準（http://www.fa.kyorin.co.jp/jsa/jsa_0528_09.pdf）を満たしている。
［HWP-IWA患者選定基準］
［確定例］
以下の１〜３を全て満たす症例を確定例とした。
１．加水分解小麦（グルパール19S）を含有する石鹸等を使用したことある。
２．以下のうち少なくとも一つの臨床症状があった。
２−１）加水分解小麦（グルパール19S）を含有する石鹸等を使用して数分後から30分以内に、痒み、眼瞼浮腫、鼻汁、膨疹などが出現した。
２−２）小麦製品摂取後4時間以内に痒み、膨疹、眼瞼浮腫、鼻汁、呼吸困難、悪心、嘔吐、腹痛、下痢、血圧低下などの全身症状がでた。
３．以下の検査で少なくとも一つ陽性を示す。
３−１）グルパール19S 0.1％溶液、あるいは、それより薄い溶液でプリックテストが陽性を示す。
３−２）ドットブロット、ELISA、ウエスタンブロットなどの免疫学的方法により、血液中にグルパール19Sに対する特異的IgE抗体が存在することを証明できる。
３−３）グルパール19Sを抗原とした好塩基球活性化試験が陽性である。
［否定できる基準］
４．グルパール19S 0.1％溶液でプリックテスト陰性
【００３９】
小麦アレルギーのない健常コントロールとして、一般集団2700人のゲノムDNAを使用した。患者の静脈から7mlの血液を採取し、QIAamp（登録商標） DNA Blood Midi/Maxi Kit（キアゲン社）を用いてゲノムDNAを抽出した。その抽出したゲノムDNAを核酸検体とした。
【００４０】
＜SNPとHWP-IWAとの関連性＞
上記調製した核酸検体を用いて、全ゲノム関連解析(GWAS)を行った。なおGWASにおける解析対象数についてHWP-IWA患者は468名を対象とした。全ゲノム関連解析のアレイはillumina HumanOmniExpress Exome BeadChipを用い、532,838 SNPsについて検討を行った。さらに、Principal component Analysis (PCA)を行った。解析結果を図１に示す。
【００４１】
GWASとPCAの結果から、HLA-DQB1遺伝子座近傍に位置するSNPにHWP-IWAとの最も強い関連が推測されたことから、HLA-DQB1アレルの遺伝子型解析を行った。
【００４２】
＜HLA-DQB1アレルの遺伝子型解析＞
HLA-DQアレルの遺伝子型解析では、対照としてHLA研究所の一般集団のアレル頻度を使用した（公開データ、HLA Laboratory提供のAllele Frequency）（http://hla.or.jp/med/frequency_search/en/allele/）。なお、解析対象数について、HWP-IWA患者は466名を対象とした。HLA遺伝子のタイピングはWAKFlow（登録商標）HLAタイピング試薬（湧永製薬）を用い、取扱説明書に基づきPCR-rSSO法により行った。HWP-IWA患者のアレル頻度は以下のような計算方法で求めた（代表例として、DQB1*0302のアレル頻度を調べる場合の計算式を示す）。
（DQB1*0302のアレル数）／（DQB1*0302のアレル数＋HLA-DQB1アレルにおけるDQB1*0302以外のアレル数）
【００４３】
同様の計算方法で各HLA-DQB1アレル頻度を計算し求めた。各HLA-DQB1アレルとHWP-IWAとの関連は、ロジスティック回帰検定により評価した。なお、ロジスティック回帰検定により得られた回帰係数を指数変換しオッズ比とした。
【００４４】
HLA-DQB1アレルの遺伝子型解析の結果を表３及び表４に示す。なお、Benjamini & Hochberg(BH)法によるFalse Discovery Rate（FDR）法による多重検定の補正により得られるq値が0.05以下であることを満たすと、HWP-IWAと有意に関連することを示す。
【００４５】
本実施例において、上記BH法によるFDR法による多重検定の補正により得られるq値が0.05以下かつ上記オッズ比が1.0未満の場合は、上記小麦アレルギーに対して抵抗性があると判断する。他方、q値が0.05以下かつオッズ比が1.0より大きいの場合は、上記小麦アレルギーに対して感受性があると判断する。また、q値に関らずオッズ比が5.0以上の場合も、上記小麦アレルギーに対して感受性があると判断する。
【００４６】
【表３】
2019000017.tif 000004
CasealleleFreq：HWP-IWA患者のアレル頻度
ContalleleFreq：一般集団のアレル頻度(コントロールのアレル頻度)
OR：オッズ比
LCI: 95％信頼区間の下限値
UCI: 95％信頼区間の上限値
P値：ロジスティック回帰分析より得られるＰ値
q値：BH法によるFDR法による多重検定の補正により得られる値
【００４７】
【表４】
2019000017.tif 000005
【００４８】
HLA-DQB1*06:01アレルの頻度は、一般集団と比較してHWP-IWA患者において有意に低かった（表３、q値6.02×10-9、オッズ比0.484）。さらに、HLA-DQB1*06:01の患者における遺伝子型の割合は、ホモ接合体のHWP-IWA患者は存在せず、HLA-DQB1*06:01の遺伝子型頻度がHardy Weinberg平衡からも逸脱していた（表４、Hardy-Weinberg平衡の検定におけるP値  0.0095）。以上のことからDQB1*06:01は、ホモ接合体において抵抗性が特に高まることがわかる。
【００４９】
HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02、HLA-DQB1*04:02アレルの頻度は、一般集団と比較してHWP-IWA患者において有意に低かった。よって、HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02 及びHLA-DQB1*04:02は、脱アミド化小麦タンパク質に対する抵抗性が高いと評価した。
【００５０】
DQB1*02:01は上記BH法によるFDR法による多重検定におけるFDR補正後の有意性の閾値を満たしていないが、これはアレル頻度が低いことが影響しており、オッズ比も5を超えるため、感受性アレルと判定している。よって、DQB1*03:03、DQB1*03:02、DQB1*05:01、DQB1*06:09及びDQB1*02:01は、脱アミド化小麦タンパク質に対する感受性が高いと評価した。また、一般集団とHWP-IWA患者とを比較して、感受性・抵抗性アレルを複数有する場合において、抵抗性アレルを多く有する場合はHWP-IWPの発症リスクが低下する傾向にあり、感受性アレルを多く有する場合はHWP-IWPの発症リスクが増加する傾向にあり、感受性アレルと抵抗性アレルのヘテロ接合体の場合にはリスクは一般集団と変わらないと評価される。
【００５１】
＜評価したアレルの保有者について＞
HWP-IWA患者において、感受性が高いと評価したアレル（DQB1*03:03、DQB1*03:02、DQB1*05:01、DQB1*06:09及びDQB1*02:01）の保有者がいた。一方、HWP-IWA患者において、抵抗性が高いと評価したアレル（HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*06:02、HLA-DQB1*04:02）を有していない者がいた。HWP-IWA患者において、一部抵抗性アレルと感受性アレルとを有する者を確認した。アレルギー疾患は多因子疾患であり、本研究の「感受性」及び「抵抗性」以外の遺伝子の変化、および環境的要因も影響しているためと考えられる。
【００５２】
以上の通り、抵抗性・感受性が高いと評価したアレルを指標（抵抗性マーカー・感受性マーカー）とすることによって、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーの発症リスクの判定が可能であった。即ち、検出結果を利用すれば、被検者が脱アミド化小麦タンパク質アレルギーの発症リスクが高いか、或いは発症リスクが低いかを判定することができる。判定結果は、医師等の専門知識を有するものによる診断及びそれに基づく助言などに有用である。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーに対する感受性又は抵抗性を客観的な指標に基づき検査することができる。本発明は、脱アミド化小麦タンパク質アレルギーの発症リスクが高い個人及び／又は発症リスクが低い個人を特定することを可能にし、予防医療、医療経済、生活の質等の点において恩恵をもたらす。
【００５４】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
2019000017.tif 000006