(57)【要約】      （修正有）【課題】ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）骨格を有し、生体蛍光イメージングに求められる十分な親水性と耐光性の両立を実現する蛍光性色素、及びこの蛍光性色素を有する蛍光標識生体物質の提供。【解決手段】式（１）で表される蛍光性化合物、及びこの蛍光性色素を有する蛍光標識生体物質。2019172826.tif 000033Ａ１〜Ａ３及びＲ１１〜Ｒ１４は水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基又はこれら以外の特定の基を示す。Ｘ１及びＸ２はハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ヘテロアリール基又はこれら以外の特定の基を示す。Ａ１〜Ａ３、Ｒ１１〜Ｒ１４、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一つは、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、ホスホノ基もしくはその塩、ポリアルキレンオキシ基、オニオ基、及びポリアミノ酸残基の少なくとも１種を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される蛍光性化合物。
【化１】
2019172826.tif 000030
式中、Ａ１〜Ａ３及びＲ１１〜Ｒ１４は水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基又は下記式（２−１）〜式（２−６）及び下記式（３−１）〜式（３−１２）のいずれかで表される基を示す。
ただし、Ａ１〜Ａ３のうち少なくとも２つはアリール基又はヘテロアリール基である。また、Ｒ１３がアルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基である場合、これらの基がさらに置換基としてアリール基及びヘテロアリール基を有することはない。また、Ｒ１４がアルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基である場合、これらの基がさらに置換基としてアリール基及びヘテロアリール基を有することはない。
Ｘ１及びＸ２はハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ヘテロアリール基又は下記式（２−１）〜式（２−６）のいずれかで表される基を示す。
Ａ１〜Ａ３、Ｒ１１〜Ｒ１４、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一つは、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、ホスホノ基もしくはその塩、ポリアルキレンオキシ基、オニオ基、及びポリアミノ酸残基の少なくとも１種を有する。
【化２】
2019172826.tif 000031
式中、Ｒ１１１〜Ｒ１１４は水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基を示す。
＊は結合部を示す。
【請求項２】
前記Ａ１〜Ａ３がアリール基又はヘテロアリール基である請求項１に記載の蛍光性化合物。
【請求項３】
前記Ａ１〜Ａ３におけるアリール基又はヘテロアリール基のうち、少なくとも１つが下記式（４）で表される基である請求項１又は２に記載の蛍光性化合物。
【化３】
2019172826.tif 000032
式中、Ａｒ１１は芳香族炭化水素基又は芳香族複素環基を示し、Ｒ１１５は水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基又は前記式（２−１）〜式（２−６）及び前記式（３−１）〜式（３−１２）のいずれかで表される基を示す。
ただし、ｎ個のＲ１１５の少なくとも一つはカルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、ホスホノ基もしくはその塩、ポリアルキレンオキシ基、オニオ基、及びポリアミノ酸残基の少なくとも１種を有する。
ｎは１以上の整数である。
＊は結合部を示す。
【請求項４】
前記Ａ１〜Ａ３、Ｒ１１〜Ｒ１４、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一つが、生体物質との結合性部位を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光性化合物。
【請求項５】
請求項４に記載の蛍光性化合物と生体物質とが結合してなる蛍光標識生体物質。
【請求項６】
前記生体物質がタンパク質、アミノ酸、核酸、糖鎖及びリン脂質のいずれかである請求項５に記載の蛍光標識生体物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光性化合物及びこれを用いた蛍光標識生体物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中の生体分子、細胞、組織等の動態ないし機能を解析するバイオイメージング技術が、種々の疾患の診断等に活用されている。近年、生体の特定の部位を蛍光色素により可視化して観察する生体蛍光イメージングが、生体観察の新しい技術として期待されている。
この生体蛍光イメージングでは、一般的には有機蛍光色素が用いられる。しかし、有機蛍光色素は耐光性が低く励起光照射により劣化し、目的の生体観察を十分に行えない場合がある。
【０００３】
ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）化合物は、量子収率が高く、シャープな発光特性を示す蛍光色素として知られている。しかし、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）化合物はそのままでは親水性に劣り、耐光性も低く、生体観察ツールとしての汎用性が低い
他方、親水性を高めたＢＯＤＩＰＹ（登録商標）化合物が報告されている。例えば特許文献１には、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）骨格の２位及び６位にスルホ基を導入し、ｍｅｓｏ位には芳香族環と標識用の相互作用性部位とを導入した構造の化合物が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００８年，Ｖｏ．７３，Ｎｏ．５，ｐ．１９６３〜１９７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１に記載のＢＯＤＩＰＹ（登録商標）化合物は、スルホ基等の導入により親水性が一定程度高められる。しかし、生体蛍光イメージングへの適用を想定して本発明者らが検討したところ、非特許文献１に記載のＢＯＤＩＰＹ（登録商標）化合物は、耐光性において十分な特性を有するものでないことがわかってきた。
そこで本発明は、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）骨格を有し、生体蛍光イメージングに求められる高い親水性と耐光性の両立を実現する蛍光色素を提供することを課題とする。また本発明は、この蛍光色素と生体物質とを結合してなる蛍光標識生体物質を提供することを課題とする
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の上記課題は、下記の手段によって解決された。
〔１〕
下記式（１）で表される蛍光性化合物。
【化１】
2019172826.tif 000002
式中、Ａ１〜Ａ３及びＲ１１〜Ｒ１４は水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基又は下記式（２−１）〜式（２−６）及び下記式（３−１）〜式（３−１２）のいずれかで表される基を示す。
ただし、Ａ１〜Ａ３のうち少なくとも２つはアリール基又はヘテロアリール基である。また、Ｒ１３がアルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基である場合、これらの基がさらに置換基としてアリール基及びヘテロアリール基を有することはない。また、Ｒ１４がアルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基である場合、これらの基がさらに置換基としてアリール基及びヘテロアリール基を有することはない。
Ｘ１及びＸ２はハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ヘテロアリール基又は下記式（２−１）〜式（２−６）のいずれかで表される基を示す。
Ａ１〜Ａ３、Ｒ１１〜Ｒ１４、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一つは、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、ホスホノ基もしくはその塩、ポリアルキレンオキシ基、オニオ基、及びポリアミノ酸残基の少なくとも１種を有する。
【化２】
2019172826.tif 000003
式中、Ｒ１１１〜Ｒ１１４は水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基を示す。
＊は結合部を示す。
〔２〕
上記Ａ１〜Ａ３がアリール基又はヘテロアリール基である〔１〕に記載の蛍光性化合物。
〔３〕
上記Ａ１〜Ａ３におけるアリール基又はヘテロアリール基のうち、少なくとも１つが下記式（４）で表される基である〔１〕又は〔２〕に記載の蛍光性化合物。
【化３】
2019172826.tif 000004
式中、Ａｒ１１は芳香族炭化水素基又は芳香族複素環基を示し、Ｒ１１５は水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基又は上記式（２−１）〜式（２−６）及び上記式（３−１）〜式（３−１２）のいずれかで表される基を示す。
ただし、ｎ個のＲ１１５の少なくとも一つはカルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、ホスホノ基もしくはその塩、ポリアルキレンオキシ基、オニオ基、及びポリアミノ酸残基の少なくとも１種を有する。
ｎは１以上の整数である。
＊は結合部を示す。
〔４〕
上記Ａ１〜Ａ３、Ｒ１１〜Ｒ１４、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一つが、生体物質との結合性部位を有する〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の蛍光性化合物。
〔５〕
〔４〕に記載の蛍光性化合物と生体物質とが結合してなる蛍光標識生体物質。
〔６〕
上記生体物質がタンパク質、アミノ酸、核酸、糖鎖及びリン脂質のいずれかである〔５〕に記載の蛍光標識生体物質。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の蛍光性化合物は、生体蛍光イメージングに求められる十分な親水性と耐光性の両立を実現する化合物である。また、本発明の蛍光標識生体物質は親水性と耐光性の両特性に優れ、生体蛍光イメージングに好適に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明において、特定の符号又は式で表示された置換基もしくは連結基等（以下、置換基等という）が複数あるとき、又は、複数の置換基等を同時に規定するときには、特段の断りがない限り、それぞれの置換基等は互いに同一でも異なっていてもよい。このことは、置換基等の数の規定についても同様である。また、複数の置換基等が近接するとき（特に、隣接するとき）には、特段の断りがない限り、それらが互いに連結して環を形成していてもよい。また、特段の断りがない限り、環、例えば脂環、芳香族環、ヘテロ環は、さらに縮環して縮合環を形成していてもよい。
本明細書において、特段の断りがない限り、二重結合については、分子内にＥ型及びＺ型が存在する場合、そのいずれであっても、またこれらの混合物であってもよい。
【０００９】
本発明において、置換又は無置換を明記していない化合物又は規定する基において、本発明の効果を損なわない範囲で、任意の置換基を有していてもよい意味である。
このような任意の置換基のうち、本発明において好ましい置換基は、後述の置換基群Ｔから選択される置換基である。
【００１０】
また、本発明において「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【００１１】
＜＜蛍光性化合物＞＞
本発明の蛍光性化合物は、下記式（１）で表される化合物である。
本発明の蛍光性化合物は、ＢＯＤＩＰＹ骨格を有し、また従来にない特徴的な構造部を有する。かかる構造により、本発明の蛍光性化合物は親水性に優れ、また水溶性溶媒中においても優れた耐光性を示す。この耐光性向上の理由は不明ではあるが、光で分解しやすいピロメテン骨格の２、４、６位（式（１）で説明すると、Ａ１〜Ａ３が結合するピロメテン骨格の炭素原子）の少なくとも２つの部位にアリール基又はヘテロアリール基を有することが、光照射による分解の抑制に寄与しているものと推定される。
本発明の蛍光性化合物の上記特性は、生体蛍光イメージングへの適用において有利である。
【００１２】
【化４】
2019172826.tif 000005
【００１３】
式中、Ａ１〜Ａ３及びＲ１１〜Ｒ１４は水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基又は下記式（２−１）〜式（２−６）及び下記式（３−１）〜式（３−１２）のいずれかで表される基を示す。
ここで、Ａ１〜Ａ３のうち少なくとも２つはアリール基又はヘテロアリール基である。
また、Ｒ１３がアルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基である場合、これらの基がさらに置換基としてアリール基及びヘテロアリール基を有することはない。また、Ｒ１４がアルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基である場合にも、これらの基がさらに置換基としてアリール基及びヘテロアリール基を有することはない。
Ｘ１及びＸ２はハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ヘテロアリール基又は下記式（２−１）〜式（２−６）のいずれかで表される基を示す。
Ａ１〜Ａ３、Ｒ１１〜Ｒ１４、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一つは、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基（−ＳＯ３Ｈ）もしくはその塩、ホスホノ基〔−ＰＯ（ＯＨ）２〕もしくはその塩、ポリアルキレンオキシ基、オニオ基、及びポリアミノ酸残基の少なくとも１種を有する。上記「塩」は、式（１）で表される化合物の分子内で塩を形成する形態を含む意味である。
【００１４】
【化５】
2019172826.tif 000006
【００１５】
式中、Ｒ１１１〜Ｒ１１４は水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基を示す。
＊は結合部を示す。
【００１６】
Ａ１〜Ａ３及びＲ１１〜Ｒ１４におけるハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、塩素原子又は臭素原子が好ましい。
Ａ１〜Ａ３及びＲ１１〜Ｒ１４におけるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基及びヘテロアリール基の例として、例えば、後述の置換基群Ｔにおけるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基及びヘテロアリール基が挙げられる。
【００１７】
Ａ１〜Ａ３及びＲ１１〜Ｒ１４は、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基、アルキルチオ基、又はアミノ基が好ましく、水素原子、アルキル基、アリール基、又はヘテロアリール基がより好ましい。
【００１８】
ここで、本発明では、Ａ１〜Ａ３のうち少なくとも２つはアリール基又はヘテロアリール基であり、少なくともＡ１及びＡ２がアリール基又はヘテロアリール基であることが好ましい。Ａ１〜Ａ３の３つすべてがアリール基又はヘテロアリール基であることがさらに好ましい。
【００１９】
Ａ１〜Ａ３及びＲ１１〜Ｒ１４として採り得るアルキル基は、炭素数１〜１０のアルキル基が好ましく、炭素数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素数１〜３のアルキル基がさらに好ましく、特に好ましくはメチルである。
Ａ１〜Ａ３及びＲ１１〜Ｒ１４として採り得るアルケニル基及びアルキニル基は、炭素数２〜１０のアルケニル基が好ましく、炭素数２〜６のアルケニル基がより好ましく、炭素数２〜４のアルケニル基がさらに好ましい。
Ａ１〜Ａ３及びＲ１１〜Ｒ１４として採り得るアリール基は、フェニル基が好ましい。このフェニル基は置換基を有することの好ましい。Ａ１〜Ａ３及びＲ１１〜Ｒ１４として採り得るヘテロアリール基のヘテロ環は、ピリジン環、ピロール環、イミダゾール環、ピラゾール環、トリアゾール環、フラン環、チオフェン環、オキサゾール環、又はチアゾール環が好ましい。
【００２０】
Ｘ１及びＸ２として採り得るハロゲン原子は、Ａ１として採り得るハロゲン原子と同義であり、好ましい形態も同じである。Ｘ１及びＸ２として採り得るアルキル基、アルケニル基、アリール基、及びヘテロアリール基としては、例えば、後述の置換基群Ｔにおけるアルキル基、アルケニル基、アリール基、及びヘテロアリール基が挙げられる。Ｘ１及びＸ２として採り得るアルキル基、アルケニル基、アリール基、及びヘテロアリール基の好ましい形態は、上述したＡ１として採り得るアルキル基、アルケニル基、アリール基、及びヘテロアリール基の好ましい形態と同じである。
【００２１】
式（２−１）〜式（２−６）及び下記式（３−１）〜式（３−１２）におけるＲ１１１〜Ｒ１１４として採り得るアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、及びヘテロアリール基として、例えば、後述の置換基群Ｔにおけるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基アリール基、及びヘテロアリール基を挙げることができる。Ｒ１１１〜Ｒ１１４として採り得るアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、及びヘテロアリール基の好ましい形態は、上述したＡ１として採り得るアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、及びヘテロアリール基の好ましい形態と同じである。
【００２２】
Ｘ１及びＸ２は、ハロゲン原子、式（２−１）で表される基、又は式（２−２）で表される基が好ましい。
【００２３】
ここで、本発明では、Ａ１〜Ａ３、Ｒ１１〜Ｒ１４、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一つは、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、ホスホノ基もしくはその塩、ポリアルキレンオキシ基、オニオ基、及びポリアミノ酸残基の少なくとも１種を有する。
ここで、「ポリアミノ酸」とは、２以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物を意味し、ペプチド及びタンパク質を含む概念である。「ポリアミノ酸」を構成するアミノ酸の数は、２〜３０が好ましく、４〜２０がより好ましく、６〜１０がさらに好ましい。「ポリアミノ酸残基」は、ポリアミノ酸から得られる基である。「ポリアミノ酸残基」は、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸が有する−ＮＨ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＯＨ、又は−ＳＨの水素原子１つを結合手（−）に置き替えた基（例えば−ＣＯ２Ｈの水素原子を結合手に置き換えると−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−＊＊となる。＊＊はポリアミノ酸が式（１）の化合物中に組み込まれるための結合部となる。）が好ましい。
上記ポリアルキレンオキシ基のアルキレンの炭素数は１〜３の整数が好ましい。ポリアルキレンオキシ基のアルキレンオキシ単位の数は、２〜１０が好ましく、３〜８がより好ましい。
上記オニオ基は、アンモニオ基（ピリジニウム塩、ピペリジニウム塩、ピペラジニウム塩、ピロリジニウム塩などの環状アンモニオを含む。）、スルホニオ基、ホスホニオ基が挙げられ、アンモニオ基が好ましい。
【００２４】
本発明では、Ａ１〜Ａ３におけるアリール基又はヘテロアリール基のうち、少なくとも１つが下記式（４）で表される基が好ましい。
【００２５】
【化６】
2019172826.tif 000007
【００２６】
式中、Ａｒ１１は芳香族炭化水素基又は芳香族複素環基を示す。Ａｒ１１として採り得る芳香族炭化水素基又は芳香族複素環基は、ｎ＋１価の基である。
Ｒ１１５は水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基又は式（２−１）〜式（２−６）及び式（３−１）〜式（３−１２）のいずれかで表される基を示す。ただし、ｎ個のＲ１１５の少なくとも一つはカルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、ホスホノ基もしくはその塩、ポリアルキレンオキシ基、オニオ基、及びポリアミノ酸残基の少なくとも１種を有する。
ｎは１以上の整数である。
＊は結合部を示す。
【００２７】
Ａｒ１１として採り得る芳香族炭化水素基の芳香族炭化水素環としては、ベンゼン環又はナフタレン環が好ましく、ベンゼン環がより好ましい。Ａｒ１１として採り得る芳香族複素環基の芳香族複素環としては、ピリジン環、ピロール環、イミダゾール環、ピラゾール環、トリアゾール環、フラン環、チオフェン環、オキサゾール環、又はチアゾール環が好ましい。
Ｒ１１５の好ましい形態は、Ｒ１１の好ましい形態と同じである。
【００２８】
ｎは１〜５の整数が好ましく、１又は２がより好ましい。
【００２９】
以下に、本発明の式（１）で表される蛍光性化合物の具体例を以下に示すが、本発明はこれらの化合物に限定されない。
【００３０】
【化７】
2019172826.tif 000008
【００３１】
【化８】
2019172826.tif 000009
【００３２】
【化９】
2019172826.tif 000010
【００３３】
本発明の式（１）で表される蛍光性化合物は、公知の方法で合成できる。例えば、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００８，７３（５），１９６３〜１９７０やＪ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２０１４，２，１５７６〜１５８３が挙げられる。
【００３４】
本発明の式（１）で表される蛍光性化合物は親水性に優れ、タンパク質、アミノ酸、核酸、糖鎖及びリン脂質などの生体物質に結合させることにより、生体蛍光イメージング用試薬として使用することができる。
さらに、本発明の式（１）で表される蛍光性化合物は、水を含む水溶性溶媒（水溶性溶媒は酸素を比較的多く含む溶媒である）中においても、耐光性に優れる。そのため、従来の蛍光性化合物を用いた場合に比べ、長期間、高解像度で生体観察等することが可能とまる。
すなわち、本発明の式（１）で表される蛍光性化合物は、生体物質との間で相互作用（物理吸着、化学結合等）する基を有した化合物も包含され、このような形態は、本発明の蛍光性化合物として特に好ましい。
具体的には、式（１）におけるＡ１〜Ａ３、Ｒ１１〜Ｒ１４、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一つが、生体物質との結合性部位を有することが好ましい。
以下にこれらの化合物の具体例を示すが、本発明はこれらの化合物に限定されない。
【００３５】
【化１０】
2019172826.tif 000011
【００３６】
生体物質に作用（付着を含む）もしくは結合するための基を有した化合物は、公知の方法で合成できる。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著）を参照することができる。
【００３７】
＜＜蛍光標識生体物質＞＞
本発明の式（１）で表される蛍光標識生体物質は、本発明の式（１）で表される蛍光性化合物と生体物質とが結合した物質である。
上記生体物質としては、タンパク質、アミノ酸、核酸、糖鎖及びリン脂質が好ましく挙げられる。
タンパク質としては抗体が好ましく挙げられる。
本発明の式（１）で表される蛍光性化合物と生体物質が相互作用して結合した具体的な形態としては、例えば、下記に記載する形態が挙げられる。
ｉ）蛍光性化合物中のペプチドと生体物質中のペプチドとの非共有結合（例えば、水素結合、キレート形成を含むイオン結合）、又は共有結合、
ii）蛍光性化合物中の長鎖アルキル基と生体物質中の脂質二重膜、リン脂質などとのファンデルワールス力、
iii）蛍光性化合物中のＮＨＳエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）と生体物質中のアミノ基との反応によるアミド結合、
iv）蛍光性化合物中のマレイミド基と生体物質中のスルファニル基（−ＳＨ）との反応によるチオエーテル結合、
ｖ）蛍光性化合物中のアジド基と生体物質中のアセチレン基とのＣｌｉｃｋ反応又は蛍光性化合物中のアセチレン基と生体物質中のアジド基とのＣｌｉｃｋ反応によるトリアゾール環の形成、
が挙げられる。
【００３８】
【化１１】
2019172826.tif 000012
【００３９】
＜蛍光標識生体物質の用途＞
本発明の式（１）で表される蛍光性化合物から得られる蛍光標識生体物質は、光照射により蛍光性化合物を励起し、蛍光を安定的に検出することができる。このため、生体蛍光イメージング試薬として好適である。
【００４０】
−  置換基群Ｔ  −
本発明において、好ましい置換基としては、下記置換基群Ｔから選ばれる置換基が挙げられる。
また、本明細書において、単に置換基としてしか記載されていない場合は、この置換基群Ｔを参照するものであり、各々の基、例えば、アルキル基、が記載されているのみの場合は、この置換基群Ｔの対応する基が好ましく適用される。
さらに、本明細書において、アルキル基を環状（シクロ）アルキル基と区別して記載している場合、アルキル基は、直鎖アルキル基及び分岐アルキル基を包含する意味で用いる。一方、アルキル基を環状アルキル基と区別して記載していない場合、及び、特段の断りがない場合、アルキル基は、直鎖アルキル基、分岐アルキル基及びシクロアルキル基を包含する意味で用いる。このことは、環状構造を採りうる基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等）を含む基（アルコキシ基、アルキルチオ基、アルケニルオキシ基等）、環状構造を採りうる基を含む化合物についても同様である。基が環状骨格を形成しうる場合、環状骨格を形成する基の原子数の下限は、この構造を採りうる基について下記に具体的に記載した原子数の下限にかかわらず、３以上であり、５以上が好ましい。
下記置換基群Ｔの説明においては、例えば、アルキル基とシクロアルキル基のように、直鎖又は分岐構造の基と環状構造の基とを明確にするため、これらを分けて記載していることもある。
【００４１】
置換基群Ｔに含まれる基としては、下記の基を含む。
アルキル基（好ましくは炭素数１〜３０、より好ましくは炭素数１〜２０、さらに好ましくは炭素数１〜１２、さらに好ましくは炭素数１〜８、さらに好ましくは炭素数１〜６、特に好ましくは炭素数１〜３）、アルケニル基（好ましくは炭素数２〜３０、より好ましくは炭素数２〜２０、さらに好ましくは炭素数２〜１２、さらに好ましくは炭素数２〜６、さらに好ましくは炭素数２〜４）、アルキニル基（好ましくは炭素数２〜３０、より好ましくは炭素数２〜２０、さらに好ましくは炭素数２〜１２、さらに好ましくは炭素数２〜６、さらに好ましくは炭素数２〜４）、シクロアルキル基（好ましくは炭素数３〜２０）、シクロアルケニル基（好ましくは炭素数５〜２０）、アリール基（単環の基であってもよく、縮環の基（好ましくは２〜６環の縮環の基）であってもよい。縮環の基である場合、５〜７員環等からなる。アリール基は好ましくは炭素数６〜４０、より好ましくは炭素数６〜３０、さらに好ましくは炭素数６〜２６、特に好ましくは炭素数６〜１０）、ヘテロ環基（環構成原子として少なくとも１つの窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子又はセレン原子を有し、単環の基であってもよく、縮環の基（好ましくは２〜６環の縮環の基）であってもよい。単環の基である場合、その環員数は５〜７員が好ましく、５員又は６員がより好ましい。ヘテロ環基の炭素数は好ましくは２〜４０、より好ましくは２〜２０である。ヘテロ環基は芳香族ヘテロ環基（ヘテロアリール基）及び脂肪族ヘテロ環基（脂肪族複素環基）が包含される。）、アルコキシ基（好ましくは炭素数１〜２０、より好ましくは炭素数１〜１２）、アルケニルオキシ基（好ましくは炭素数２〜２０、より好ましくは炭素数２〜１２）、アルキニルオキシ基（好ましくは炭素数２〜２０、より好ましくは炭素数２〜１２）、シクロアルキルオキシ基（好ましくは炭素数３〜２０）、アリールオキシ基（好ましくは炭素数６〜４０、より好ましくは炭素数６〜２６、さらに好ましくは炭素数６〜１４）、ヘテロ環オキシ基（好ましくは炭素数２〜２０）、
【００４２】
アルコキシカルボニル基（好ましくは炭素数２〜２０）、シクロアルコキシカルボニル基（好ましくは炭素数４〜２０）、アリールオキシカルボニル基（好ましくは炭素数６〜２０）、アミノ基（好ましくは炭素数０〜２０で、無置換アミノ基（−ＮＨ２）、（モノ−又はジ−）アルキルアミノ基、（モノ−又はジ−）アルケニルアミノ基、（モノ−又はジ−）アルキニルアミノ基、（モノ−又はジ−）シクロアルキルアミノ基、（モノ−又はジ−）シクロアルケニルアミノ基、（モノ−又はジ−）アリールアミノ基、（モノ−又はジ−）ヘテロ環アミノ基を含む。無置換アミノ基を置換する上記各基は置換基群Ｔの対応する基と同義である。）、スルファモイル基（好ましくは炭素数０〜２０で、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールのスルファモイル基が好ましい。）、アシル基（好ましくは炭素数１〜２０、より好ましくは炭素数２〜１５）、アシルオキシ基（好ましくは炭素数１〜２０）、カルバモイル基（好ましくは炭素数１〜２０で、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールのカルバモイル基が好ましい。）、
【００４３】
アシルアミノ基（好ましくは炭素数１〜２０）、スルホンアミド基（好ましくは炭素数０〜２０で、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールのスルホンアミド基が好ましい。）、アルキルチオ基（好ましくは炭素数１〜２０、より好ましくは炭素数１〜１２）、シクロアルキルチオ基（好ましくは炭素数３〜２０）、アリールチオ基（好ましくは炭素数６〜４０、より好ましくは炭素数６〜２６、さらに好ましくは炭素数６〜１４）、ヘテロ環チオ基（好ましくは炭素数２〜２０）、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールスルホニル基（好ましくは炭素数１〜２０）、
【００４４】
シリル基（好ましくは炭素数１〜３０、より好ましくは炭素数１〜２０で、アルキル、アリール、アルコキシもしくはアリールオキシが置換したシリル基が好ましい。）、シリルオキシ基（好ましくは炭素数１〜２０で、アルキル、アリール、アルコキシもしくはアリールオキシが置換したシリルオキシ基が好ましい。）、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子）、カルボキシ基（−ＣＯ２Ｈ）、ホスホノ基〔−ＰＯ（ＯＨ）２〕、ホスホリル基〔−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２〕、スルホ基（−ＳＯ３Ｈ）、ホウ酸基〔−Ｂ（ＯＨ）２〕、オニオ基（環状アンモニオを含むアンモニオ基、スルホニオ基、ホスホニオ基を含み、好ましくは炭素数０〜３０、より好ましくは１〜２０）、スルファニル基（−ＳＨ）、又は、アミノ酸残基、ポリアミノ酸残基が挙げられる。
【００４５】
置換基群Ｔから選ばれる置換基は、より好ましくは、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、シクロアルコキシ基、アリールオキシ基、アルコキシカルボニル基、シクロアルコキシカルボニル基、アミノ基、アシルアミノ基、シアノ基又はハロゲン原子であり、特に好ましくは、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アミノ基、アシルアミノ基又はシアノ基である。
【００４６】
置換基群Ｔから選ばれる置換基は、特段の断りがない限り、上記の基を複数組み合わせてなる基をも含む。例えば、化合物又は置換基等がアルキル基、アルケニル基等を含むとき、これらは置換されていても置換されていなくてもよい。また、アリール基、ヘテロ環基等を含むとき、それらは単環でも縮環でもよく、置換されていても置換されていなくてもよい。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００４８】
実施例及び比較例で用いた下記化合物（１）〜（９）、化合物（１５）、化合物（４９）、化合物（５０）、比較化合物（１）及び（２）を、以下に示す。
【００４９】
【化１２】
2019172826.tif 000013
【００５０】
ここで、比較化合物（１）はＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ４９６／５１２（インビトロジェン社製、商品名）であり、比較化合物（２）は、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２０１４，２，１５７６〜１５８３に記載のＢＯＤＩＰＹである。
【００５１】
以下に、各実施例で用いる化合物（１）〜（９）、化合物（１５）、化合物（４９）、化合物（５０）の合成方法を詳しく説明するが、出発物質、色素中間体及び合成ルートはこれらに限定されるものではない。
【００５２】
特に記載のない場合、カラムクロマトグラフィーによる精製は、自動精製装置ＩＳＯＬＥＲＡ（Ｂｉｏｔａｇｅ社）又は中圧液体クロマトグラフＹＦＬＣ  Ｗ−ｐｒｅｐ  ２ＸＹ〔山善（株）〕を使用した。
同じく、特に記載のない場合、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおける担体は、ＳＮＡＰ  ＫＰ−Ｓｉｌ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｂｉｏｔａｇｅ社）、ハイフラッシュカラムＷ００１、Ｗ００２、Ｗ００３、Ｗ００４又はＷ００５〔山善（株）〕を使用した。ＮＨシリカは、ＳＮＡＰ  ＫＰ−ＮＨ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｂｉｏｔａｇｅ社）を使用した。溶離液における混合比は、容量比である。例えば、「クロロホルム：メタノール＝９０：１０→５０：５０」は、「クロロホルム：メタノール＝９０：１０」の溶離液を「クロロホルム：メタノール＝５０：５０」の溶離液へ変化させたことを意味する。
分取薄層シリカゲルクロマトグラフィーは、ＰＬＣガラスプレートシリカゲルＦ６０（メルク社）を使用した。ＮＨシリカは、ＰＬＣ０５  Ｐｌａｔｅｓ  ＮＨ〔富士シリシア化学（株）〕を使用した。
【００５３】
代表的には以下の条件である。
【００５４】
カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製ＢＥＨＣ  １８  １．７μｍ，  ２．１ｘ３０  ｍｍ
溶媒：Ａ液：０．１％ギ酸−水
Ｂ液：０．１％ギ酸−アセトニトリル
グラジエントサイクル：０．００ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝９５／５）、２．００ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝５／９５）、３．００ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝５／９５）、３．０１ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝１００／０）、３．８０ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝１００／０）
流速：０．５  ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：２５４ｎｍ
【００５５】
なお、本発明において、室温とは２５℃を意味する。
また、保持時間（ＲＴ）は、ＳＱＤ（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて測定し、分（ｍｉｎ）で示した。
具体的には、以下の通りである。
ＲＴ（ｍｉｎ）：保持時間（分）
【００５６】
逆相分取ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ  ２９９８  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ（ＰＤＡ）Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ社）、Ｗａｔｅｒｓ  ６００  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ社）、Ｗａｔｅｒｓ  ２７６７  Ｓａｍｐｌｅ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ社）一式及びＹＭＣ−Ａｃｔｕｓ  ＰｒｏＣ１８，３０Ｘ５０ｍｍカラム〔（株）ワイエムシィ〕を用いた。
【００５７】
ＭＳスペクトルは、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＳＱＤ  ＬＣ／ＭＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ社、イオン化法：ＥＳＩ（ＥｌｅｃｔｒｏＳｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、エレクトロスプレーイオン化）法又はＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ〔（株）島津製作所、イオン化法：ＥＳＩ及びＡＰＣＩ（Ａｔｏｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ＣｈｅｍｉｃａｌＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ、大気圧化学イオン化〕を同時に行うイオン化法を用いて測定した。
特に記載のない場合、表中のＭＳは、ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ）を意味する。
【００５８】
マイクロウェーブ反応装置は、Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  Ｓｉｘｔｙ（Ｂｉｏｔａｇｅ社）を使用した。
フロー式水素化反応装置は、Ｈ−Ｃｕｂｅ（ＴｈａｌｅｓＮａｎｏ社）を使用した。
【００５９】
ＮＭＲスペクトルは、内部基準としてテトラメチルシランを用い、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ３００（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて測定し、全δ値をｐｐｍで示した。
特に記載のない場合、表中のＮＭＲスペクトルの溶媒は、ＣＤ３ＯＤである。ＣＤ３ＯＤ以外の溶媒を使用した場合は、カッコ内に溶媒名を記載した。
【００６０】
〔化合物の合成〕
以下に示す各化合物の合成に用いた略語は下記の化合物である。
【００６１】
ＮＢＳ：Ｎ−ブロモスクシンイミド
ＣＰＭＥ：シクロプロピルメチルエーテル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
Ｅｔ：エチル
ｉＰｒ：イソプロピル
ｒｔ：室温（２５℃）
【００６２】
［合成例１］
以下のようにして、化合物（１）を合成した。
【００６３】
１）化合物（１−Ａ）の合成
【００６４】
【化１３】
2019172826.tif 000014
【００６５】
１Ｌ三ツ口フラスコに、窒素雰囲気下、２，４−ジメチルピロール５．４４ｍｌ及び塩化メチレン２６０ｍＬを導入し、室温で撹拌した。次いで２，３，５，６−テトラフルオロベンズアルデヒド３．０４ｍｌ、塩化メチレン２５ｍｌ、トリフルオロ酢酸８４ｍｇを加えた後、室温で２０分間撹拌した。クロラニル（Ｃｈｌｏｒａｎｉｌ）１２．９ｇを加え、室温で２０分間撹拌した後、水冷しジイソプロピルエチルアミン（ｉＰｒ２ＮＥｔ）３２ｍＬ、塩化メチレン１５ｍｌを滴下し、続いて、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）３６．４ｍＬ、塩化メチレン１５ｍｌを滴下し、氷冷下で２０分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム３５０ｍＬを滴下し、氷冷下にて３０分撹拌した後、セライトろ過を施した。塩化メチレン層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、シリカゲルカラムクロマグラフィー（展開溶媒：塩化メチレン）で精製した後、塩化メチレンを減圧留去した。メタノールで分散洗浄することにより、化合物（１−Ａ）を３．１５ｇ得た。
【００６６】
２）化合物（１−Ｂ）の合成
【００６７】
【化１４】
2019172826.tif 000015
【００６８】
３００ｍＬ三ツ口フラスコに、化合物（１−Ａ）を２ｍｇ、及び塩化メチレン５０ｍＬを導入し、氷冷下０℃にて撹拌した。Ｎ−ブロモスクシンイミド２．１６ｇを導入し、１５分間撹拌した。反応液をナス型フラスコへ移し、メタノール３５ｍｌを加え、減圧濃縮により塩化メチレンを留去し、メタノール分散液を得た。室温に戻し、８０分間撹拌し吸引ろ過及びメタノール洗浄を施し、その後乾燥させることにより、化合物（１−Ｂ）を２．３５ｇ得た。
【００６９】
３）化合物（１−Ｃ）の合成
【００７０】
【化１５】
2019172826.tif 000016
【００７１】
化合物（１−Ｂ）０．７５ｇのＣＰＭＥ６８ｍＬ溶液に、水０．６８ｍＬ、ＣｓＦ  １．６５ｇ、４−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＡｒＢ（ＯＨ）２）  １．２ｇ及びＳＰｈｏｓ  Ｐｄ  Ｇ３〔ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社：（２−Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｏ−２’，６’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｉｐｈｅｎｙｌ）［２−（２‘−ａｍｉｎｏ−１，１’−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）］ｐａｌｌａｄｉｕｍ（ＩＩ）  ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ〕を０．８５ｇ加え、窒素気流下で２時間還流した。反応混合物に水１００ｍＬを加えた後、酢酸エチル（１００ｍＬ）で３回抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後ろ過し、減圧化で溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝９５：５）で精製し、赤色固体の化合物（１−Ｃ）０．８０ｇを得た。
【００７２】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：７４９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：２．５９
【００７３】
４）化合物（１）の合成
【００７４】
【化１６】
2019172826.tif 000017
【００７５】
化合物（１−Ｃ）０．３０ｇの塩化メチレン２ｍＬ溶液に、氷冷下ＴＦＡ２ｍＬを加え、２時間撹拌した。反応混合物に飽和重層水５０ｍＬと酢酸エチル５０ｍＬを加え、生成した固体を減圧濾過にて分取し、酢酸エチルにて洗浄後に減圧化乾燥し、赤色固体の化合物（１）を０．１６ｇ得た。
【００７６】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：６３５（Ｍ−Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．６２
【００７７】
［合成例２］
以下のようにして、化合物（２）を合成した。
【００７８】
【化１７】
2019172826.tif 000018
【００７９】
化合物（１）の合成法において、４−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄを３−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ〔東京化成工業（株）〕に変更した以外は化合物（１）の合成法と同様にして化合物（２）を６１ｍｇ得た。
【００８０】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：６３５（Ｍ−Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．７１
【００８１】
［合成例３］及び［合成例５］
以下のようにして、化合物（３）及び（５）を合成した。
【００８２】
【化１８】
2019172826.tif 000019
【００８３】
化合物（１）１０ｍｇのＤＭＦ０．５ｍＬ溶液に、タウリン６ｍｇ、ＨＡＴＵ１３ｍｇ及びＤＩＰＥＡ１４μＬを加え、室温にて３時間撹拌した。反応混合物に水０．５ｍＬを加えた後、酢酸エチル１ｍＬで１０回洗浄し、水層を減圧化で溶媒留去した。得られた残渣を分取薄層シリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：クロロホルム＝２０：８０）で精製し、赤色固体の化合物（３）３ｍｇと化合物（５）１ｍｇを得た。
【００８４】
化合物（３）
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：８４９（Ｍ−Ｈ）、ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０４
化合物（４）
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：８４７（Ｍ−Ｈ）、ＲＴ（ｍｉｎ）：０．９４
【００８５】
［合成例４］
以下のようにして、化合物（４）を合成した。
【００８６】
【化１９】
2019172826.tif 000020
【００８７】
化合物（３）の合成法において、化合物（１）を化合物（２）に変更した以外は化合物（３）の合成法と同様にして化合物（４）３ｍｇを得た。
【００８８】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：８４９（Ｍ−Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１３
【００８９】
［合成例６］
以下のようにして、化合物（６）を合成した。
【００９０】
【化２０】
2019172826.tif 000021
【００９１】
１）化合物（６―Ａ）の合成
化合物（１）１０ｍｇのＤＭＦ０．５ｍＬ溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン５μＬ、ＨＡＴＵ１３ｍｇ及びＤＩＰＥＡ１４μＬを加え、室温にて１時間撹拌した。反応混合物に水０．５ｍＬを加えた後、酢酸エチル１ｍＬで３回抽出し、減圧化で溶媒留去した。得られた残渣を逆相分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル：水＝１０：９０→９０：１０）で精製し、赤色固体の化合物（６―Ａ）を２ｍｇ得た。
【００９２】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：７７７（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０７
【００９３】
２）化合物（６）の合成
化合物（６−Ａ）２ｍｇの酢酸エチル溶液０．５ｍＬに１，３−プロパンスルトン１μＬを加え、マイクロウェーブ反応装置にて１００℃下６０分加熱撹拌した。析出した固体をろ過し、酢酸エチルで洗浄後に減圧下で乾燥し、化合物（６）を１ｍｇ得た。
【００９４】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１０２２（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．９５
【００９５】
［合成例７］
以下のようにして、化合物（７）を合成した。
【００９６】
【化２１】
2019172826.tif 000022
【００９７】
１）化合物（７−Ａ）の合成
４−（４，４，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１，３，２−ｄｉｏｘａｂｏｒｏｌａｎ−２−ｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ  ２２０ｍｇ〔東京化成工業（株）〕のＤＭＦ溶液１ｍＬに、水素化ナトリウム４４ｍｇ〔６０％，ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ：和光純薬工業（株）〕及び１３−ｂｒｏｍｏ−２，５，８，１１−ｔｅｔｒａｏｘａｔｒｉｄｅｃａｎｅ２７１ｍｇ〔東京化成工業（株）〕を氷冷下添加し、室温に昇温後１００分間撹拌した。反応液を直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０）で精製し、無色オイル状の化合物（７−Ａ）２８８ｍｇを得た。
【００９８】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４１１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５５
【００９９】
２）化合物（７）の合成
化合物（１―Ｂ）５５ｍｇのＣＰＭＥ１０ｍＬ溶液に、水０．０６ｍＬ、ＣｓＦ１２１ｍｇ、２−（４−（（２，５，８，１１−ｔｅｔｒａｏｘａｔｒｉｄｅｃａｎ−１３−ｙｌ）ｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１，３，２−ｄｉｏｘａｂｏｒｏｌａｎｅ１６３ｍｇ及びＳＰｈｏｓ  Ｐｄ  Ｇ３（６２ｍｇ）を加え、マイクロウェーブ反応装置にて１２０℃下３０分及び１４０℃下９０分加熱撹拌した。反応混合物に水（１００ｍＬ）を加えた後、酢酸エチル１００ｍＬで３回抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後ろ過し、減圧化で溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール：酢酸エチル＝０：１００→１０：９０）で精製した。粗生成物を回収し減圧下で溶媒留去後、逆相分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル：水＝１０：９０→９０：１０）で再度精製し、赤色固体の化合物（７）を１ｍｇ得た。
【０１００】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：９５９（Ｍ−Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．９６
【０１０１】
［合成例８］
化合物（１）の合成において、２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅをＢｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅに変更した以外は化合物（１）の合成法と同様にして化合物（８）を１ｍｇ得た。
【０１０２】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５６３（Ｍ−Ｈ）
【０１０３】
［合成例９］
以下のようにして、化合物（９）を合成した。
【０１０４】
【化２２】
2019172826.tif 000023
【０１０５】
化合物（１）の合成において、４−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄを３−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄに変更した以外は化合物（１）の合成法と同様にして化合物（９）を１ｍｇ得た。
【０１０６】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５６３（Ｍ−Ｈ）
【０１０７】
［合成例１０］
以下のようにして、化合物（１５）を合成した。
【０１０８】
１）化合物（１５−Ａ）の合成
【０１０９】
【化２３】
2019172826.tif 000024
【０１１０】
５００ｍＬ三ツ口フラスコに、窒素雰囲気下、２，４−ジメチルピロール２．７２ｍｌ及び塩化メチレン１００ｍＬを導入し、室温で撹拌した。次いでオルト酢酸トリエチル酢酸トリエチル２．３９ｍｌ、トリフルオロ酢酸８１．０１ｍｌを加えた後、室温で１時間撹拌した。室温にて一晩放置し、水冷しジイソプロピルエチルアミン（ｉＰｒ２ＮＥｔ）１３．７ｍＬ、塩化メチレン１０ｍｌを滴下し、続いて、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）１３．２ｍＬ、塩化メチレン１０ｍｌを滴下し、氷冷下で１時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム１００ｍＬを滴下し、氷冷下にて３０分撹拌した後、一晩放置した。塩化メチレン層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、シリカゲルカラムクロマグラフィー（展開溶媒：塩化メチレン）で精製した後、塩化メチレンを減圧濃縮した。メタノールを加えた後に塩化メチレンを減圧留去し、室温にて３０分撹拌させ、得られた沈殿物をろ過、乾燥を施すことで化合物（１５−Ａ）を１．５ｇ得た。
【０１１１】
２）化合物（１５）の合成
【０１１２】
【化２４】
2019172826.tif 000025
【０１１３】
化合物（２）の合成において、化合物（１−Ａ）を化合物（１５−Ａ）に変更したこと以外は化合物（２）の合成法と同様にして、化合物（１５）を合成した。
【０１１４】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５０３（Ｍ＋Ｈ），５０１（Ｍ−Ｈ）
［合成例１１］
以下のようにして、化合物（４９）を合成した。
【０１１５】
【化２５】
2019172826.tif 000026
【０１１６】
化合物（４）の合成において、化合物（２）を化合物（９）に変更したこと以外は化合物（４）の合成法と同様にして、化合物（４９）を合成した。
【０１１７】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：７７９（Ｍ＋Ｈ），７７７（Ｍ−Ｈ）
【０１１８】
［合成例１２］
以下のようにして、化合物（５０）を合成した。
【０１１９】
【化２６】
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【０１２０】
化合物（４）の合成において、化合物（２）を化合物（１５）に変更したこと以外は化合物（４）の合成法と同様にして、化合物（５０）を合成した。
【０１２１】
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：７１７（Ｍ＋Ｈ），７１５（Ｍ−Ｈ）
【０１２２】
＜蛍光性化合物の水溶性及び耐光性評価＞
上記で合成した蛍光性化合物について、下記特性を評価した。
【０１２３】
（水溶性の評価）
１．５ｍＬのエッペンチューブ中に、蛍光性化合物を含むＤＭＳＯ溶液（２０ｍＭ  ｉｎ  ＤＭＳＯ、評価サンプル溶液）５μＬと、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳバッファー）４９５μＬとを入れて混合し、マルチシェーカーＭＳ  ３０００型により、２０００ｒｐｍで３０分間撹拌した。混合液を遮光下で６０分間静置した後、遠心沈降（１２０００ｒｐｍ、５分間）させた。０．２０μｍのフィルタでろ過したろ液について、ＵＨＰＬＣ  Ｎｅｘｅｒａ〔（株）島津製作所、Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＸＲ−ＯＤＳＩＩ〕を用いて蛍光性化合物濃度（蛍光性化合物がすべて溶解した場合、蛍光性化合物濃度は２００μＭとなる。）を測定し、以下の評価基準に基づき評価した。
【０１２４】
〔水溶性の評価基準〕
Ａ：  １００μＭ以上
Ｂ：  １μＭ以上１００μＭ未満
Ｃ：  ０．１μＭ以上１μＭ未満
Ｄ：  水溶性が低く濃度測定不可
【０１２５】
得られた結果をまとめて、下記表１に示した。
【０１２６】
【表１】
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【０１２７】
（耐光性の評価）
ＤＭＳＯを１体積％含むＰＢＳ溶液に上記で合成した蛍光性化合物を、吸収波長ピークの吸光度が０．９５〜１．０５となるように溶解した。この溶液を、メリーゴーランド光照射機〔ウシオ電機（株）のキセノンランプＵＸＬ−５００Ｄ−Ｏ、ＨＡ−５０フィルタ、Ｙ４４フィルタ、露光強度２２ｍＷ／ｃｍ２（５００ｎｍ換算）〕を用いて露光した状態で、吸収スペクトルを分光器（ＨＰ社、Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３）により吸収を経時的に測定した。
【０１２８】
〔耐光性の評価基準〕
露光前の吸収波長ピークの吸光度を１００％として、吸収波長ピークの吸光度が２０％低下（吸収波長ピークの吸光度が８０％に到達）するまでの露光時間を求め、得られた結果を耐光性として、下記表２に示した。
【０１２９】
【表２】
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【０１３０】
上記表１及び２の結果から、本発明の式（１）で表される蛍光性化合物は、水溶性に優れ、また耐光性にも優れることがわかる。