(57)【要約】【課題】本発明は、非ＲＩで末梢血単核球のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）活性を測定する方法を提供することを課題とする。【解決手段】（１）末梢血単核球溶解液にウラシル標品を添加し測定試料１を調製する工程；（２）測定試料１を一定時間反応させ測定試料２を調製する工程；（３）測定試料１及び測定試料２をそれぞれ、下記式（Ｉ）：2019000109.tif 000013（式中、Ａは、Ｃ１−４アルキル基で置換されていてもよいＣ６−１０アリール基である）で表される化合物と、酸化剤及び塩基の存在下で反応させて蛍光性化合物を得る工程；（４）測定試料１に由来する蛍光性化合物の蛍光強度と測定試料２に由来する蛍光性化合物の蛍光強度とを測定し比較することによってウラシル量の消失を算出する工程；及び（５）消失したウラシル量に基づきＤＰＤ活性を算出する工程、を含む末梢血単核球中のＤＰＤ活性を測定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）末梢血単核球溶解液にウラシル標品を添加し測定試料１を調製する工程；
（２）測定試料１を一定時間反応させ測定試料２を調製する工程；
（３）測定試料１及び測定試料２をそれぞれ、下記式（Ｉ）：
【化１】
2019000109.tif 000012
（式中、Ａは、Ｃ１−４アルキル基で置換されていてもよいＣ６−１０アリール基である）
で表される化合物と、酸化剤及び塩基の存在下で反応させて蛍光性化合物を得る工程；
（４）測定試料１に由来する蛍光性化合物の蛍光強度と測定試料２に由来する蛍光性化合物の蛍光強度とを測定し比較することによってウラシル量の消失を算出する工程；及び
（５）消失したウラシル量に基づきジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ活性を算出する工程、を含む
末梢血単核球中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ活性を測定する方法。
【請求項２】
塩基の使用量が、式（Ｉ）で表される化合物に対して１００〜１０００当量である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ａが、フェニル基又は３−メチルフェニル基である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）酸化剤が、フェリシアン化カリウムである、及び／又は（ｉｉ）塩基が、水酸化カリウムである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
酸化剤の使用量が、式（Ｉ）で表される化合物に対して０．００１〜３当量である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（２）における反応時間が５〜６０分である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
末梢血単核球が、ヒト患者由来の血液より単離精製されたものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を用いて、ヒト患者由来の血液試料中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ活性を測定することを含む、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ欠損症の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者の末梢血単核球中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ活性を非放射化学的（所謂非ＲＩ）に測定する方法、及び該反応を用いたジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ欠損症の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に代表されるフッ化ピリミジン系抗がん剤（ＦＰｓ）は、様々ながんに対して世界中で利用されているが、骨髄抑制など致死的な副作用を示すことから、ＦＰｓの投与量及び血中５−ＦＵ濃度には注意を払う必要がある。５−ＦＵの約８５％は、肝臓においてジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）によって代謝されるが、ＤＰＤ活性を欠損した患者（ＤＰＤ欠損症患者）にＦＰｓを投与すると、５−ＦＵの血中濃度が異常に上昇して副作用が出現し、最悪の場合は死に至る。そのため、全てのＦＰｓの投与対象者に対して事前にＤＰＤ活性を測定すべきであり、その様に主張する医師も多く存在する。
【０００３】
肝臓のＤＰＤ活性が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＤＰＤ活性と相関することから、ＰＢＭＣのＤＰＤ活性測定はＤＰＤ欠損症の診断法として世界中で定着している（非特許文献１）。この方法は、ＰＢＭＣ溶解液中に含まれるＤＰＤのピリミジン分解活性を直接測定する方法で部分／完全欠損を問わず信頼性が高い。しかし、この手法は放射性標識した基質を必要とするため、現在は放射性物質を使用しない代替法へ移行しつつある。
代替となる、ＤＰＤ欠損症の診断方法として、尿中ジヒドロウラシル／ウラシル比を測定する方法が知られている。この方法はＤＰＤの代謝前後の物質を定量することで間接的にＤＰＤ活性を測定する方法であり、簡便且つ非侵襲的に評価できる反面、多検体の同時検査ができない点や尿検査では部分欠損を判別できない、等の問題点がある。また、ＤＰＤをコードするＤＹＰＤ遺伝子の変異からＤＰＤ活性を予測する遺伝子検査も知られている。この方法は簡便且つ確実に遺伝子変異を読み取ることができる反面、ＤＹＰＤ遺伝子の変異型とＤＰＤ活性との相関が完全に解明されておらず一部の完全欠損しか発見できず、また、後天性異常に対応できない、等の問題点がある。これらの非放射化学的な代替法は、いずれもＤＰＤ部分欠損を検出できないという問題点を有する。
【０００４】
また、これら従来の検査法は、いずれも高額である。この様に、ＤＰＤ欠損症を気軽に精査できる手法が存在しないため、ＦＰｓ投与の際は副作用に注意しながら少量ずつ増量するという対策が取られる。そのため、副作用が出現してＦＰｓ投与を中断したにも関わらず、回復せずに死の転帰をたどる例が、世界中で報告されている。
加えて、ＤＰＤ欠損症の発症率は人種・性別に偏りがあり、白人では約１０％がＤＰＤ活性を欠損している一方、日本人のＤＰＤ活性欠損者は０．１〜０．０１％しか存在しないと報告されている。日本でのＦＰｓの副作用発生率は他国と比較して少なく、高額な検査費用も相まって、現在ＤＰＤ欠損症をＦＰｓ投与前に事前検査できる機関は、国内に存在しない。すなわち、日本のがん臨床現場では、ＦＰｓが実際に使用されているにも関わらずＤＰＤ活性を測定できないという、極めて危険な状態が数年に渡って継続している。事実、毎年１報以上は、ＤＰＤ欠損患者へのＦＰｓ投与による副作用例が報告されている。この様な背景から、簡便・正確・安価かつ多検体を同時に検査できるＤＰＤ欠損症の診断法の開発が必要不可欠であり、実際に医療現場でも長年望まれ続けている。
【０００５】
本発明者は、ウラシルに対して特異的に蛍光を発する新規誘導体化反応を開発し、尿中のウラシルを検出してＤＰＤ欠損患者のスクリーニングを行う方法について報告している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本国特許第５５８６０３４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】L. K. Mattison, H. Ezzeldin, M. Carpenter, A. Modak, M. R. Johnson and R. B. Diasio, Clin. Cancer Res., 2004, 10, 2652-2658
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
簡便・正確・安価かつ多検体を同時に検査できるＤＰＤ欠損症の診断を可能とする方法、具体的には非ＲＩでＤＰＤ活性を測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＤＰＤがウラシルをジヒドロウラシルに分解する酵素であることから、ＰＢＭＣに放射性基質ではなくウラシルを添加しその減少量を測定することでＤＰＤ活性を測定し得るとの発想に至った。さらに、そのウラシルの減少量の測定を、本発明者が開発したウラシルに対して特異的に蛍光を発する誘導体化反応を用いて実施できることを確認して本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、以下を提供する。
［１］（１）末梢血単核球溶解液にウラシル標品を添加し測定試料１を調製する工程；
（２）測定試料１を一定時間反応させ測定試料２を調製する工程；
（３）測定試料１及び測定試料２をそれぞれ、下記式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
2019000109.tif 000002
【００１２】
（式中、Ａは、Ｃ１−４アルキル基で置換されていてもよいＣ６−１０アリール基である）
で表される化合物と、酸化剤及び塩基の存在下で反応させて蛍光性化合物を得る工程；
（４）測定試料１に由来する蛍光性化合物の蛍光強度と測定試料２に由来する蛍光性化合物の蛍光強度とを測定し比較することによってウラシル量の消失を算出する工程；及び
（５）消失したウラシル量に基づきジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ活性を算出する工程、を含む
末梢血単核球中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ活性を測定する方法。
［２］塩基の使用量が、式（Ｉ）で表される化合物に対して１００〜１０００当量である、上記［１］記載の方法。
［３］Ａが、フェニル基又は３−メチルフェニル基である、上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］（ｉ）酸化剤が、フェリシアン化カリウムである、及び／又は（ｉｉ）塩基が、水酸化カリウムである、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］酸化剤の使用量が、式（Ｉ）で表される化合物に対して０．００１〜３当量である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］工程（２）における反応時間が５〜６０分である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］末梢血単核球が、ヒト患者由来の血液より単離精製されたものである、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法を用いて、ヒト患者由来の血液試料中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ活性を測定することを含む、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ欠損症の検査方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、簡便な方法で短時間に高精度かつ経済的にＤＰＤ活性を測定することが可能となる。さらに本発明の方法を用いることにより、部分／完全欠損を問わずＤＰＤ欠損症の診断の診断を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒト血液を用いて、本発明の方法により非ＲＩでＤＰＤ活性を測定した結果を示すグラフである。健常人ボランティアより採取した末梢血単核球を−８０℃で凍結保存し３回に分けて測定した結果を示す。
【図２】ヒト血液を用いて、本発明の方法により非ＲＩでＤＰＤ活性を測定した結果を示すグラフである。病院より提供された血液から末梢血単核球を単離しそのまま測定した結果を示す。
【図３】ヒト血液を用いて、本発明の方法により非ＲＩでＤＰＤ活性を測定した結果を示すグラフである。健常人ボランティアより提供された血液から末梢血単核球を単離しそのまま測定した結果を示す。
【図４】ヒト血液を用いて、本発明の方法により非ＲＩでＤＰＤ活性を測定した結果を示すグラフである。健常人ボランティアより提供された血液から末梢血単核球を単離しそのまま測定した結果を示す。
【図５】定量に用いた検量線のデータ示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
【００１６】
本発明は、以下の５つの工程を少なくとも含み、具体的には実施例に準じた方法で実施することができる。
工程１：末梢血単核球（ＰＢＭＣ）溶解液にウラシル標品を添加し測定試料１を調製する工程
ＦＰｓ投与後に増加する血中の５−ＦＵは肝臓のＤＰＤによって代謝される。肝臓のＤＰＤ活性がＰＢＭＣのＤＰＤ活性と相関することから、本発明では測定対象としてＰＢＭＣを用いることを特徴とする。
まず、全血（好ましくはヒト由来の末梢血）からＰＢＭＣを単離する。末梢血からの単核球の単離は、従来公知の単離方法を使用して実施することができる。具体的には、ヘパリンやクエン酸などの抗凝固剤で処理した末梢血を、単核球分離用に適切に比重が調整された分離剤、例えばフィコールやリンホプレップ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７（シグマアルドリッチ社製）に積層するか、または該分離剤と混合し、遠心分離操作を行い、単核球を単核球以外の血球成分から分離することにより実施することができる。
ＰＢＭＣを溶解する為の方法としては、細胞破砕用の超音波発生機を使用することができる。また、細胞溶解剤を用いることもできる。溶解剤としては、従来公知のものが利用できるが、例えば、主に界面活性剤を用いることが多く、例として高級脂肪族アルコール、アルキルアリールポリエーテルアルコール、スルホネート、サルフェートのポリオキシエチレンエーテル、無水ソルビットの脂肪酸エステルのポリオキシエチレン誘導体が挙げられる。その使用量は、ＰＢＭＣからＤＰＤを放出させるのに充分な量である。
本工程で用いるウラシル標品は、既知濃度のウラシルを含んでいれば特に限定されず、商業的に入手可能である。測定試料１を調製する為に添加されるウラシル標品の量は、試料中に含まれ得るＤＰＤの量によっても異なり、適宜設定することができるが、通常過剰量のウラシルを含む標品が用いられる。
次の工程２において、ＤＰＤの酵素反応は、補酵素であるＮＡＤＰＨの存在下で行われる。ウラシル標品の添加前に、ＰＢＭＣ溶解液にＮＡＤＰＨを添加し、プレインキュベーションすることが好ましい。
【００１７】
工程２：測定試料１を一定時間反応させ測定試料２を調製する工程
本工程は、測定試料１を一定時間反応させている間に、ＰＢＭＣのＤＰＤ活性によりウラシルが分解される工程である。反応時間は、ＤＰＤ活性によるウラシルの分解が検出できる範囲であれば特に限定されず、工程３で用いる式（Ｉ）で表される化合物の種類によっても適宜選択されるが、通常１分〜２時間、好ましくは５〜６０分程度反応させる。反応時間は、より好ましくは５〜３０分である。反応時間が短すぎるとウラシルの分解が十分でなく、長い反応時間は測定の迅速性及び精度という観点から望ましくない。反応温度は、通常４〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃である。測定試料１を一定時間反応させることにより測定試料２が得られる。
工程２において、酵素反応を停止させるために、所定の反応時間の経過後、測定試料２と塩基（工程３に記載）を混合することができる。初期ウラシル量を測定するための測定試料１は、測定試料１を調製した直後（反応時間０分）に塩基（工程３に記載）と混合することにより酵素反応を停止させる。
【００１８】
工程３：測定試料１及び測定試料２をそれぞれ、下記式（Ｉ）：
【００１９】
【化２】
2019000109.tif 000003
【００２０】
（式中、Ａは、Ｃ１−４アルキル基で置換されていてもよいＣ６−１０アリール基である）
で表される化合物（以下、化合物（Ｉ）とも称する）と、酸化剤及び塩基の存在下で反応させて蛍光性化合物を得る工程
本工程は、測定試料１中のウラシル、及び測定試料２中のウラシルをそれぞれ化合物（Ｉ）と反応させて蛍光性化合物を得る工程である。ＰＢＭＣのＤＰＤ活性の強さに応じて得られる蛍光性化合物の量が決まる。すなわち、ＤＰＤ活性が高い場合には測定試料１中のウラシルの分解が進み測定試料２中のウラシルの量が減るので、測定試料２中の蛍光性化合物の量も減少する。
【００２１】
「Ｃ１−４アルキル基」とは、直鎖状もしくは分岐鎖状の炭素数１〜４のアルキル基であり、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。
「Ｃ６−１０アリール基」とは、具体的には、フェニル、ナフチル等が挙げられ、なかでも好ましくはフェニルである。
Ａにおける「Ｃ１−４アルキル基で置換されていてもよいＣ６−１０アリール基」は、好ましくはフェニル基又は３−メチルフェニル基である。
【００２２】
化合物（Ｉ）は、市販品を入手可能であるか、自体公知の方法により製造することができる。
【００２３】
本工程により得られる蛍光性化合物は下記式（ＩＩ）：
【００２４】
【化３】
2019000109.tif 000004
【００２５】
（式中、Ａは、式（Ｉ）におけるＡと同義である）
で表される。
【００２６】
よりウラシル選択的な蛍光性化合物が得られるという点で、ＡはＣ１−４アルキル基（好ましくはメチル基）で置換されたＣ６−１０アリール基（好ましくはフェニル基）である。Ａが無置換のＣ６−１０アリール基（好ましくはフェニル基）である場合は試薬としての化合物（Ｉ）が安価で入手可能であるため、経済的に好ましく、多検体を用いた測定に適している。
【００２７】
上記のウラシルと化合物（Ｉ）との反応は、酸化剤及び塩基（特に、強塩基）の存在下で好適に進行する。
酸化剤としては、自体公知の酸化剤を適宜用いることができるが、このような酸化剤としては、例えば、フェリシアン化カリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、ヨウ素酸ナトリウム、過マンガン酸カリウム、硝酸カリウム、硝酸セリウムアンモニウム、二クロム酸カリウム等が挙げられる。なかでも好ましくは、フェリシアン化カリウムである。酸化剤の使用量は、化合物（Ｉ）に対して、例えば０．００１〜３当量であり、好ましくは０.５〜２.５当量である。
塩基としては、自体公知の塩基を適宜用いることができるが、このような塩基としては、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素リチウム等が挙げられる。なかでも好ましくは、水酸化カリウムである。塩基の使用量は、化合物（Ｉ）に対して、例えば０．１〜２０００当量であり、好ましくは１００〜１０００当量である。
【００２８】
加熱により反応が好適に進行するため、本発明の反応は、５０〜１２０℃の反応温度で行うことが好ましく、８０〜１２０℃で行うことがより好ましい。反応のウラシル選択性及び感度の観点からは９０〜１００℃で行うことが特に好ましい。
【００２９】
極めて短時間の反応及び長時間の反応では得られる化合物（ＩＩ）の蛍光強度が減少するため、本発明の反応は、１〜１５分の反応時間で行うことが好ましく、反応のウラシル選択性及び感度の観点からは２〜５分で行うことが更に好ましい。
【００３０】
本工程は、溶媒を用いて行うこともできる。該溶媒としては、自体公知の溶媒を用いることができ反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、水、Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール類（例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等）等が挙げられる。なかでも好ましくは、水である。また、下記の試料に含まれる水が、溶媒として働いてもよい。
【００３１】
本工程により得られる化合物（ＩＩ）を含む反応液は、反応直後では強アルカリ性である。蛍光強度の増強を目的として酸（例、酢酸）による中和や、塩（例、塩化ナトリウム）による塩析、あるいは有機溶媒（例、酢酸エチル）による抽出等の処理をさらに行うことが好ましい。
中和（ｐＨ６〜７）工程→塩析工程→抽出工程を実施することが特に好ましい。
【００３２】
工程４：測定試料１に由来する蛍光性化合物の蛍光強度と測定試料２に由来する蛍光性化合物の蛍光強度とを測定し比較することによってウラシル量の消失を算出する工程
工程３により得られる化合物（ＩＩ）は蛍光性を有するので、励起波長領域の励起光を化合物（ＩＩ）に照射し、蛍光波長領域の蛍光強度を測定することにより、ウラシルを検出することが可能となる。
該励起波長領域は、励起光を照射することにより化合物（ＩＩ）が蛍光を呈するものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜適切な波長領域を選択して測定することができる。例えば２５０〜４００ｎｍの波長領域の励起光を照射することが好ましく、３１０〜３５０ｎｍの波長領域の励起光を照射することがより好ましく、３１０〜３３０ｎｍの波長の励起光を照射することが特に好ましい。
該蛍光波長領域は、蛍光波長領域であれば特に限定されず、当業者であれば適宜適切な波長領域を選択して測定することができる。例えば３５０〜５００ｎｍの波長領域における蛍光強度を測定することが好ましく、３６０〜４４０ｎｍの波長領域の蛍光強度を測定することがより好ましく、３６５〜４１０ｎｍの波長の蛍光強度を測定することが特に好ましい。
該蛍光強度は、自体公知の検出方法により測定することができるが、例えば蛍光分光光度計を用いて測定することができる。
測定試料１に由来する蛍光性化合物の蛍光強度より求められるウラシル量（初期ウラシル量）は、測定試料１に添加するウラシル標品に含まれるウラシル量に相当する。初期ウラシル量から測定試料２に由来する蛍光性化合物の蛍光強度より求められるウラシル量（残存ウラシル量）を差し引いたものがＰＢＭＣ中のＤＰＤにより分解されたウラシルの量（分解ウラシル量）を示す。各試料中のウラシル量は、あらかじめ蛍光性化合物の蛍光強度とウラシル量との相関関係に基づいた検量線を作成しておき、該検量線に基づいて算出することができる。
【００３３】
工程５：消失したウラシル量に基づきジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ活性を算出する工程
工程４で得られた分解ウラシル量を用いて、１分当たりのウラシル減少量を算出し、さらに使用したＰＢＭＣの量をタンパク質量で補正することで、ＰＢＭＣ中のＤＰＤ活性値(pmol/min/mg protein)を算出する。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。
【００３５】
参考例：ウラシルと３−メチルベンズアミドオキシムとの反応（検量線の作成）
【００３６】
【化４】
2019000109.tif 000005
【００３７】
ウラシル水溶液（０μＭ（参考例）、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ又は２５０μＭ、各々０．２５ｍｌ）、３−メチルベンズアミドオキシム水溶液（４ｍＭ、０．２５ｍｌ）、フェリシアン化カリウム水溶液（８ｍＭ、０．２５ｍｌ）及び水酸化カリウム水溶液（４Ｍ、０．２５ｍｌ）を混合し、９０℃で２分間加熱した。得られた化合物を、下記の条件で蛍光光度分析に供した。蛍光光度分析の測定結果を、表１に示す。
蛍光光度分析:
機種：日本分光  ＦＰ−６３００  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ
Ｅｘ／Ｅｍ＝３３０ｎｍ／４１０ｎｍ
スリット幅：５ｎｍ、５ｎｍ
感度：ｍｅｄｉｕｍ
レスポンス：ｍｅｄｉｕｍ
【００３８】
【表１】
2019000109.tif 000006
【００３９】
実施例１：ＰＢＭＣ溶液のＤＰＤ活性測定（反復測定）
（材料と方法）
健常人からヘパリン入り真空採血管で採取した全血５ｍＬを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７（シグマアルドリッチ社製）３ｍＬ上に、界面を乱さず２層になるように静かに注ぎ、１，５００ｇ、３０分間、室温で遠心分離した。形成されたＰＢＭＣ相の上部約５ｍｍから下部約５ｍｍの分画（約２．０ｍＬ）をパスツールピペットで分取し、１５ｍＬコニカルチューブに移した。コニカルチューブにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１０ｍＬ加え、１，５００ｇ、３０分間、室温で遠心分離した。上清を取り除き、ＰＢＳを５ｍＬ加えてペレットを懸濁させ、１，５００ｇ、３０分間、室温で遠心分離した。この操作をもう一度繰り返した後、上清を取り除き、ＰＢＳを１ｍＬ加えてペレットを懸濁させ、ＴＰＸ（登録商標）製の１．５ｍＬマイクロチューブに移した。１，５００ｇ、３０分間、４℃で遠心分離した後、上清を取り除いた。得られたＰＢＭＣのペレットは、実験に供するまで−８０℃にて保存し、日にちを変えて３回に分けてＤＰＤ活性を測定した。
冷凍したＰＢＭＣを氷浴に漬け、３００μＬの氷冷した酵素反応用緩衝液（８７５μＬの４０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に、１００μＬの２５ｍＭ塩化マグネシウムと２５μＬの２００ｍＭジチオスレイトールを加えたもの）を加えた。カップホーン型超音波細胞破砕装置のカップに０℃の水を循環させながら、１００％出力で１０秒間ＯＮ、３０秒間ＯＦＦのサイクルで４サイクル超音波処理を行った。１４，０００ｇ、１０分間、４℃で遠心分離し、上清を１．５ｍＬチューブに回収した。このＰＢＭＣ溶解液のタンパク質濃度をブラッドフォード法により測定した。
タンパク質量が２００μｇとなる容量のＰＢＭＣ溶解液を、氷冷した０．５ｍＬチューブに写し、さらに氷冷した酵素反応用緩衝液を加えて全量を４００μＬとした。これに１〜４ｍＭ  ＮＡＤＰＨ水溶液を５０μＬ加え、３７℃で５分間プレインキュベーションした後、１００〜４００μＭウラシル水溶液５０μＬを添加し、素早くピペッティングして３７℃でインキュベーションした。反応開始から０、１５、３０分が経過した時点で酵素反応液５０μＬを採取し、４Ｍ水酸化カリウム水溶液２５０μＬをあらかじめ入れておいた１．５ｍＬチューブに加え、酵素反応を停止した。
各タイムポイントにおける反応液（３００μＬ）に水２００μＬ、４ｍＭ  ３−メチルベンズアミドオキシム水溶液２５０μＬ、８ｍＭフェリシアン化カリウム水溶液２５０μＬを順に添加して全量を１ｍＬとした後、１００℃にて５分間加熱し蛍光反応を行った。反応液を冷却後、分光蛍光光度計により蛍光強度を測定した。また、参考例に準じて濃度既知のウラシル標準液に、２０μｇのタンパク質量に相当する上記ＰＢＭＣ溶解液を添加し、同様の蛍光反応を行って検量線を作成した。
横軸に時間（分）、縦軸に蛍光強度を取ってグラフを描いたものを図１に示す。得られる直線の傾き及び上述の検量線から１分当たりのウラシル減少量を計算し、さらに使用したＰＢＭＣの量をタンパク質量で補正することで、ＤＰＤ活性値（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。
（結果）
結果を表２に示す。ＤＰＤ活性は３回の平均値として１９８．５±３４．６ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
実施例２：ＰＢＭＣ溶液のＤＰＤ活性測定（単回測定）
（材料と方法）
咽頭がん患者からヘパリン入り真空採血管で採取した全血６ｍＬを使用して、以下実施例１と同様に実験を行った。
（結果）
ＰＢＭＣ溶液を調製後、ただちに測定した。測定試料１を調製した直後（０ｍｉｎ）、測定試料１を１５分反応させて得られる測定試料２（１５ｍｉｎ）、さらに１５分（計３０分）反応させて得られる測定試料２（３０ｍｉｎ）の蛍光強度を測定した。蛍光強度の減少に基づいてウラシル分解量を算出し、さらにＰＢＭＣ溶液中のＤＰＤ活性を求めた。結果を表３及び図２に示す。ＤＰＤ活性は２５９．３４ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【００４２】
【表３】
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【００４３】
実施例３：ＰＢＭＣ溶液のＤＰＤ活性測定（単回測定）
（材料と方法）健常人からヘパリン入り真空採血管で採取した全血５ｍＬを使用して、以下実施例１と同様に酵素反応を行った。反応開始から０、１５、６０、９０、１２０分が経過した時点で酵素反応液５０μＬを採取し、４Ｍ水酸化カリウム水溶液２５０μＬをあらかじめ入れておいた１．５ｍＬチューブに加え、酵素反応を停止した。
各タイムポイントにおける反応液（３００μＬ）に水２００μＬ、４ｍＭ  ベンズアミドオキシム水溶液２５０μＬ、８ｍＭフェリシアン化カリウム水溶液２５０μＬを順に添加して全量を１ｍＬとした後、１００℃にて５分間加熱し蛍光反応を行った。反応液を冷却後、分光蛍光光度計により蛍光強度を測定した。また、参考例に準じて濃度既知のウラシル標準液に、２０μｇのタンパク質量に相当する上記ＰＢＭＣ溶解液を添加し、同様の蛍光反応を行って検量線を作成し、蛍光強度の減少に基づいてウラシル分解量を算出し、さらにＰＢＭＣ溶液中のＤＰＤ活性を求めた。
（結果）
結果を表４及び図３に示す。ＤＰＤ活性は８５．９ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
実施例４：ＰＢＭＣ溶液のＤＰＤ活性測定（反復測定）
（材料と方法）健常人からヘパリン入り真空採血管で採取した全血５ｍＬを使用して、以下実施例１と同様に酵素反応を行った。反応開始から０、１５、３０、６０、１２０分が経過した時点で酵素反応液５０μＬを採取し、４Ｍ水酸化カリウム水溶液２５０μＬをあらかじめ入れておいた１．５ｍＬチューブに加え、酵素反応を停止した。
各タイムポイントにおける反応液（３００μＬ）に水２００μＬ、４ｍＭ  ベンズアミドオキシム水溶液２５０μＬ、８ｍＭフェリシアン化カリウム水溶液２５０μＬを順に添加して全量を１ｍＬとした後、１００℃にて５分間加熱し蛍光反応を行った。反応液を冷却後、分光蛍光光度計により蛍光強度を測定した。また、参考例に準じて濃度既知のウラシル標準液に、２０μｇのタンパク質量に相当する上記ＰＢＭＣ溶解液を添加し、同様の蛍光反応を行って検量線を作成し、蛍光強度の減少に基づいてウラシル分解量を算出し、さらにＰＢＭＣ溶液中のＤＰＤ活性を求めた。
（結果）
結果を表５及び図４に示す。定量に用いた検量線のデータを表６及び図５に示す。ＤＰＤ活性は３回の平均値として２１０．９±４３．８ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。図４の結果から、酵素反応の反応時間は５〜３０分が好ましく、６０分まではおよそ測定可能であることがわかった。
【００４６】
【表５】
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【００４７】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によれば、非ＲＩという簡便且つ安全な方法で短時間に高精度かつ経済的にＤＰＤ活性を測定することが可能となる。従って、本発明の方法によれば、ＤＰＤ欠損症を簡便に検査することが可能となり、癌化学療法において有益である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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