(57)【要約】      （修正有）【課題】日常的に安全に摂取または適用でき、ＤＮＡ損傷抑制作用を有する機能性素材、ならびにこれを利用した医薬組成物、飲食品組成物及び化粧品組成物の提供。【解決手段】ロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物をＤＮＡ損傷抑制用組成物の有効成分とする。シクロラノスタン化合物が、９，１９−シクロラノスタン−３−オール、及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールからなる群から選択され、ロフェノール化合物が、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールからなる群から選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を有効成分として含有する、ＤＮＡ損傷抑制用組成物。
【請求項２】
シクロラノスタン化合物が、９，１９−シクロラノスタン−３−オール、及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールからなる群から選択される、請求項１に記載のＤＮＡ損傷抑制用組成物。
【請求項３】
ロフェノール化合物が、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールからなる群から選択される、請求項１又は２に記載のＤＮＡ損傷抑制用組成物。
【請求項４】
前記化合物を総量で０．００００１質量％以上含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ損傷抑制用組成物。
【請求項５】
損傷ＤＮＡの修復酵素の活性を向上させるための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡ損傷抑制用組成物。
【請求項６】
表皮のターンオーバーを正常化するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ損傷抑制用組成物。
【請求項７】
神経細胞の変性又は神経細胞の減少を抑制するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ損傷抑制用組成物。
【請求項８】
飲食品組成物又は化粧品組成物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ損傷抑制用組成物。
【請求項９】
医薬組成物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ損傷抑制用組成物。
【請求項１０】
腫瘍形成を抑制するための、請求項９に記載のＤＮＡ損傷抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ損傷抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命情報を担うＤＮＡは、放射線、紫外線、化学物質などの外的要因や細胞の代謝過程で生じる活性酸素種などの内的要因により、絶えず損傷を受けている。
【０００３】
ＤＮＡ損傷としては、酸化、メチル化、脱アミノ化、加水分解、重複、ヌクレオチド挿入や欠失、チミン二量体の形成といった塩基の変化や、一本鎖または二本鎖の切断、同一鎖や対向する塩基間での架橋など、様々な損傷が挙げられる（非特許文献１）。
例えば、太陽光線に含まれる紫外線への暴露は、活性酸素種（ＲＯＳ）やラジカルの生成を介して、あるいは直接的に、シクロブタン型ピリミジン二量体［ｃｙｃｌｏｂｕｔａｎｅ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｄｉｍｅｒｓ（ＣＰＤ）］や６−４光産物［（６−４）ｐｈｏｔｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（（６−４）ＰＰ）］を形成することが知られている（非特許文献２）。
【０００４】
生体は、これらのＤＮＡ損傷を、ミスマッチ修復、塩基除去修復、ヌクレオチド除去修復等の様々な機構により修復し、突然変異や染色体異常の発生を抑制し、発がんやそれ以外の遺伝子異常に起因する疾病を未然に防いでいることがわかってきた（非特許文献３）。特に、ヌクレオチド除去修復機構は、環境由来の要因による様々な塩基損傷に対応する重要な経路としてゲノムに関わる幅広い疾患の発生を防御していると考えられている（非特許文献４）。
【０００５】
ＤＮＡ損傷の修復異常に起因する疾病として、色素性乾皮症（ＸＰ）やウェルナー症候群のような早老症、ブルーム症候群、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、毛細血管拡張性運動失調症（ＡＴ）、コケイン症候群、ポリグルタミン病、眼球運動失調と低アルブミン血症を伴う早期型失調症（ＡＯＡ１／ＥＡＯＨ）、ナイミーヘン症候群、ハンチントン病、ファンコーニ貧血、アテローム性動脈硬化症やアルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症などが知られている（非特許文献５〜８）。例えば、ＸＰ患者は、常染色体上のＸＰ遺伝子を欠損しているためにヌクレオチド除去修復がうまく作用せず、紫外線によって生じたＤＮＡ損傷を除去できないことから、皮膚がんを発症するリスクが健常人に比べ非常に高いことがわかっている。
【０００６】
また、ＤＮＡ損傷修復機能は老化に伴って低下していくこと、変性疾患においてはより早く修復機能の低下が起こっていること、神経細胞は修復機能の低下によるＤＮＡ損傷の蓄積の影響を受けやすく、ＤＮＡ損傷の蓄積が神経変性疾患の原因となっていることが報告されている（非特許文献９）
【０００７】
これまでに、ＤＮＡ損傷を低減させる素材として、センシンレン抽出物（特許文献１）、バラ科ビワ属の抽出物（特許文献２）、キナ抽出物（特許文献３）、マンノースを主体とした単糖類が１〜１０分子結合したオリゴ糖（特許文献４）、クコの実の乳酸菌発酵物（特許文献５）等が報告されている。
【０００８】
ところで、植物ステロールのうち、シクロラノスタン骨格を有する化合物やロフェノール骨格を有する化合物には、動脈硬化モデル動物において、血中過酸化脂質量を低減させる作用があること、胸部大動脈のプラーク形成数を抑制する作用があることが見出され、抗酸化剤としての用途が提案されている（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１３−２０９２９９号公報
【特許文献２】特開２０１４−１１８４０５号公報
【特許文献３】国際公開第２０１３／０３１００３号パンフレット
【特許文献４】特開２０１５−１８９７３２号公報
【特許文献５】特開２０１６−０６７２４８号公報
【特許文献６】国際公開第２０１０／０５８７９５号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  ７６８：５３−６７，２０１６
【非特許文献２】薬学雑誌  １２６（９）：６７７−６９３，２００６
【非特許文献３】生物工学会誌  ９５（２）：７７−８０，２０１７
【非特許文献４】ＡＣＴＡ  ＮＡＴＵＲＡＥ  ６（１）：２３−３４，２０１４
【非特許文献５】保健医療科学  ６２（２）：１８９−１９５，２０１３
【非特許文献６】薬学雑誌  １２９（１２）：１５０１−１５０６，２００９
【非特許文献７】日本生物学的精神医学会誌  ２４（４）：１９１−１９９，２０１３
【非特許文献８】臨床血液  ５４（１０）：７９−８６，２０１３
【非特許文献９】日本生物学的精神医学会誌  ２４巻４号、ｐ．１９９−１９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、新規なＤＮＡ損傷抑制用組成物を提供することを課題とする。
特に、本発明は、日常的に安全に摂取または適用でき、ＤＮＡ損傷抑制作用を有する機能性素材、ならびにこれを利用した医薬組成物、飲食品組成物及び化粧品組成物を提供することを課題とする。
本発明は、特に、安全性が高く、ＤＮＡ損傷の修復能を亢進し、ＤＮＡ損傷の形成を抑制する、ＤＮＡ損傷抑制用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物にＤＮＡ損傷抑制作用があることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、前記課題を解決する本発明は、ロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を有効成分とする、ＤＮＡ損傷抑制用組成物である。
【００１４】
本発明の好ましい形態では、シクロラノスタン化合物は、９，１９−シクロラノスタン−３−オール、及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールからなる群から選択される。
【００１５】
本発明の好ましい形態では、ロフェノール化合物は、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールからなる群から選択される。
【００１６】
本発明の好ましい形態では、前記ＤＮＡ損傷抑制用組成物は、前記化合物を総量で０．００００１質量％以上含む。
【００１７】
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、好ましくは損傷ＤＮＡの修復酵素の活性を向上させるために用いられる。
【００１８】
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、好ましくは表皮のターンオーバーを正常化するために用いられる。
【００１９】
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、好ましくは神経細胞の変性又は神経細胞の減少を抑制するために用いられる。
【００２０】
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、好ましくは腫瘍形成を抑制するために用いられる。
【００２１】
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、好ましくは飲食品組成物又は化粧品組成物である。
また、本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、好ましくは医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】化合物１又は化合物２に暴露した３次元皮膚モデルに紫外線を照射した後、Ｔｈｙｍｉｎｅ  Ｄｉｍｅｒ抗体にて抗体染色した顕微鏡写真である。
【図２】化合物１又は化合物２に暴露した肝がん由来細胞を、オートファジーマーカーで処理した後の顕微鏡写真である。オートファゴソーム形成を示す蛍光部分は矢印で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
次に、本発明の好ましい形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００２４】
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、ロフェノール化合物（化合物１）及びシクロラノスタン化合物（化合物２）からなる群から選択される１又は複数の化合物を有効成分として含有する。ロフェノール化合物（化合物１）は、以下の一般式（１）で表される。
【００２５】
【化１】
2019172645.tif 000002
【００２６】
一般式（１）中、Ｒ１は、炭素数５〜１６の直鎖若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は２重結合を１つ若しくは２つ含むアルケニル基である。また、前記アルキル基又はアルケニル基は、１又は２の水素原子がヒドロキシル基及び／又はカルボニル基に置換された置換アルキル基又は置換アルケニル基であってもよい。
また、Ｒ２、Ｒ３は各々独立に水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基である。ここで、前記炭素原子数１〜３のアルキル基としては、メチル基、エチル基等が好ましく、メチル基が特に好ましい。また、前記アルキル基は、少なくとも１の水素原子がヒドロキシル基及び／又はカルボニル基に置換された置換アルキル基であってもよい。
【００２７】
【化２】
2019172645.tif 000003
【００２８】
また、Ｒ４は環を構成する炭素原子とともにＣ＝Ｏを形成するか、又は−ＯＨ、−ＯＣＯＣＨ３の何れかである。
【００２９】
前記一般式（１）中、Ｒ１は、下記式で表される基の何れかであることが好ましい。
【００３０】
【化３】
2019172645.tif 000004
【００３１】
また、前記一般式（１）中、Ｒ２及びＲ３の一方が水素原子であり、他方がメチル基であることが好ましく、Ｒ４が水素基であることが好ましい。
【００３２】
化合物１として、好ましくは、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールが挙げられる。各化合物は、それぞれ、以下の式で表される構造を有する。
【００３３】
【化４】
2019172645.tif 000005
【００３４】
【化５】
2019172645.tif 000006
【００３５】
【化６】
2019172645.tif 000007
【００３６】
化合物１は、公知の製造方法に準じて化学的に製造することができる。
例えば、Ｖｉｔａｌｉ  Ｍａｔｙａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬＯＳ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２，  Ｉｓｓｕｅ １０, ｅ２８０, ２００４に記載されたサプリメントデータに準じて、合成することが可能である。
【００３７】
また、化合物１が植物に含まれていることは知られており、公知のロフェノールの製造方法に準じて、化合物１を製造することができる（生物化学実験法２４、脂肪脂質代謝実験法、山田晃弘著、学会出版センター、第１７４ページ、１９８９年）。
例えば、化合物１が含まれていること植物より、熱水抽出法、有機溶媒抽出法、超臨界抽出法又は亜臨界抽出法などの方法を用いて抽出することが可能である（例えば、特許第３９０５９１３号公報参照）。化合物１は、例えばユリ科、マメ科、イネ科、ナス科及びバショウ科の植物から抽出することができる。
前記のようにして製造した化合物１は、例えば、マススペクトル（ＭＳ）法、及び核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）法等によって、その分子量や構造等を決定又は確認することができる。
【００３８】
また、化合物１は、医薬組成物に許容される塩であってもよい。医薬組成物に許容される塩として、金属塩（無機塩）と有機塩との両方が含まれ、それらのリストは「レミントン・ファーマシューティカル・サイエンシーズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１７版、１９８５年、第１４１８貢」に掲載されているものが例示される。
具体的には塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、及び臭化水素酸塩などの無機酸塩や、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩、サリチル酸塩、及びステアリン酸塩などの有機酸塩が非限定的に含まれる。
また、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の金属の塩、リジン等のアミノ酸との塩とすることもできる。また、前記化合物若しくはその医薬組成物に許容される塩の水和物等の溶媒和物も使用できる。
【００３９】
シクロラノスタン化合物（化合物２）は、以下の一般式（２）で表される。
【００４０】
【化７】
2019172645.tif 000008
【００４１】
一般式（２）中、Ｒ５は、炭素数６〜８の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基、２重結合を１つ又は２つ含むアルケニル基である。また、前記アルキル基又はアルケニル基は、１又は２の水素原子がヒドロキシル基及び／又はカルボニル基に置換された置換アルキル基又は置換アルケニル基であってもよい。
また、Ｒ６，Ｒ７は各々独立に水素原子又はメチル基である。また、Ｒ８は環を構成する炭素原子とともにＣ＝Ｏを形成するか、又は下記式の何れかである。
【００４２】
【化８】
2019172645.tif 000009
【００４３】
前記一般式（２）中、Ｒ５は、下記式で表される基の何れかであることが好ましい。
【００４４】
【化９】
2019172645.tif 000010
【００４５】
また、前記一般式（２）中、Ｒ６及びＲ７の一方が水素原子であり、他方がメチル基であることが好ましく、Ｒ８が水酸基であることが好ましい。
【００４６】
化合物２としては、好ましくは、９，１９−シクロラノスタン−３−オール及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールが挙げられる。各化合物は、それぞれ、以下の式で表される構造を有する。
【００４７】
【化１０】
2019172645.tif 000011
【００４８】
【化１１】
2019172645.tif 000012
【００４９】
化合物２は、公知の製造方法に準じて化学的に製造することができる。例えば、２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール（慣用名：２４−メチレンシクロアルタノール）は、特開昭５７−０１８６１７号公報や国際公開第２０１２／０２３５９９号（γ−オリザノールから合成する方法）に開示される方法にて製造することが可能である。また、化合物２は、特開２００３−２７７２６９号公報に開示される方法にて、シクロアルテノールフェルレートの加水分解物を出発物質として製造することが可能である。
【００５０】
【化１２】
2019172645.tif 000013
【００５１】
また、化合物２も、ユリ科、マメ科、イネ科、ナス科及びバショウ科などの植物に含まれていることが知られている（［フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），米国、１９７７年、第１６巻、第１４０〜１４１ページ］、［ハンドブック・オブ・フィトケミカル・コンスティチュエンツ・オブ・ＧＲＡＳ・ハーブ・アンド・アザー・エコノミック・プランツ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  ＧＲＡＳ  ｈｅｒｂｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｐｌａｎｔｓ），１９９２年、米国、シーアールシープレス］、又は［ハーゲルス・ハントブーフ・デア・ファルマツォイティシェン・プラクシス（Ｈａｇｅｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｎ  Ｐｒａｘｉｓ）、第２〜６巻、１９６９〜１９７９年、ドイツ、シュプリンガー・フェアラークベルリン］参照）。よって、化合物２は、これらの植物より、有機溶媒抽出法又は熱水抽出法などの公知の方法を用いて抽出することが可能である（例えば、特許第３９２４３１０号公報参照）。化合物２は、ユリ科アロエ属の植物から抽出することが好ましい。
前記のようにして製造した化合物は、例えば、マススペクトル（ＭＳ）法、及び核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）法等によって、その分子量や構造等を決定又は確認することができる。
【００５２】
また、化合物２は、医薬組成物に許容される塩であってもよい。このような塩は化合物１について例示したとおりである。
【００５３】
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、化合物１及び化合物２から選ばれる１又は複数の化合物を有効成分として含有する。また、化合物１及び化合物２のそれぞれについて、１又は複数を有効成分とすることができる。有効成分は、化合物１又は化合物２のいずれか単独であっても化合物１及び化合物２の混合物であってもよいが、化合物１及び化合物２の混合物がより好ましい。すなわち、好ましい態様において、化合物１から選ばれる１又は複数と、化合物２から選ばれる１又は複数の混合物を有効成分として含有する。
化合物１又は化合物２を単独で用いる場合としては、化合物１（主に、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、若しくは４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）、又は化合物２（主に、９，１９−シクロラノスタン−３−オール若しくは２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール）の何れかであることが好ましい。
中でもＤＮＡ損傷抑制用組成物の有効成分として使用する場合において考慮される溶解性等の物性の点で、化合物１としては４−メチルコレスト−７−エン−３−オールが特に好ましく、化合物２としては９，１９−シクロラノスタン−３−オールが特に好ましい。
また、化合物１と化合物２を対比した場合では、化合物１（主に、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール又は４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）であることがより好ましい。
また、化合物１又は化合物２各々においても、１種の化合物を用いてもよいし、複数の化合物を混合して用いてもよい。
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、好ましくは、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール、９，１９−シクロラノスタン−３−オール、２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールからなる群から選択される１又は複数の化合物を有効成分として含有する。
【００５４】
化合物１及び化合物２の両者を組み合わせる場合（化合物１と化合物２との混合物）において、化合物１及び化合物２の質量比の範囲は、例えば以下が挙げられる。
化合物１：化合物２は、好ましくは５：１〜１：５、さらに好ましくは３：１〜１：３、特に好ましくは２：１〜１：２である。
【００５５】
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物における前記化合物の含有量は、症状等に応じて適宜選択することができるが、総量で、好ましくは少なくとも０．００００１質量％以上、より好ましくは少なくとも０．０００１質量％以上、さらに好ましくは少なくとも０．０００５質量％以上、特に好ましくは少なくとも０．００１質量％以上である。また本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物における当該量の上限は特に制限されないが、総量で、９０質量％以下、好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下が例示される。
【００５６】
また、本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、化合物１及び化合物２からなる群から選択される１又は複数の化合物を０．００００１質量％以上含む組成物を、有効成分として含有する形態とすることもできる。
このような組成物としては、例えば、前述した化合物１を含む植物から得られた抽出物、化合物２を含む植物から得られた抽出物、及び化合物１及び化合物２の両者を含む植物から得られた抽出物、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【００５７】
ここで、化合物１、化合物２を含む植物としては、例えば、ユリ科、マメ科、イネ科、ナス科及びバショウ科などの植物を挙げることができる。
【００５８】
天然の植物に含まれる例として、アロエ・ベラ中には、化合物１（主に、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）、及び化合物２（主に、９，１９−シクロラノスタン−３−オール及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール）が含まれていることが知られている。
【００５９】
そのため、アロエ・ベラを原料として、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、若しくは４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール（化合物１）の何れか、又は９，１９−シクロラノスタン−３−オール、若しくは２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール（化合物２）の何れかをそれぞれ精製して、化合物１：化合物２が５：１〜１：５、好ましくは３：１〜１：３、特に好ましくは２：１〜１：２で含む混合物を得ることが可能である。このようにして得られた組成物は、本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物の有効成分として好適である。
【００６０】
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、ロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を投与することにより、未摂取の場合と比べ投与対象のＤＮＡの損傷を抑制する作用を有する。
本明細書において、「ＤＮＡの損傷を抑制する」は、ＤＮＡの損傷を未然に抑制することのみならず、ＤＮＡ損傷に対する修復作用を向上させることで結果としてＤＮＡ損傷を抑制することを含む。
【００６１】
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、好ましくは損傷ＤＮＡの修復酵素の活性を向上させるために用いられる。このような修復酵素としては、ヌクレオチド除去修復に関わるＸＰＡ、ＸＰＣが挙げられる。
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、ＤＮＡ損傷により引き起こされる状態や疾患を予防又は改善するために用いられる。
ＤＮＡ損傷により引き起こされる状態や疾患として、表皮のターンオーバーの異常が挙げられる。正常な皮膚においては、基底細胞層で分裂した表皮細胞が分化、成熟しながら角層となり、順次剥がれ落ちる。紫外線照射などによってＤＮＡが損傷を受けると、このターンオーバーが遅延したり早まったりする。ターンオーバーの異常は、皮膚バリア機能の低下、過角化、ニキビ、色素沈着、肌荒れを引き起こす（特開２０１４−１２２１８３号公報）。
従って、本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、表皮のターンオーバーの正常化のために用いることができる。
表皮のターンオーバーの正常化は、皮膚バリア機能の向上、過角化の予防又は改善、ニキビの予防又は改善、色素沈着の予防又は改善、肌荒れの予防又は改善を含む。
【００６２】
また、ＤＮＡ損傷により引き起こされる症状や疾患としては、神経細胞の変性や神経細胞の減少が挙げられる。神経細胞は修復機能の低下によるＤＮＡ損傷の蓄積の影響を受けやすく、ＤＮＡ損傷の蓄積が神経変性疾患の原因となっている（笹邊ら、日本生物学的精神医学会誌  ２４巻４号、ｐ．１９９−１９１）。
従って、本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、神経細胞の変性又は神経細胞の減少を抑制するために用いることができる。神経細胞の変性又は神経細胞の減少としては、老化に伴うものが挙げられる。
また、本発明のＤＮＡ損傷抑制組成物は、神経細胞の変性を伴う疾患の予防又は改善のために用いることができる。このような疾患としては、色素性乾皮症（ＸＰ）やウェルナー症候群のような早老症、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、毛細血管拡張性運動失調症（ＡＴ）、コケイン症候群、ポリグルタミン病、眼球運動失調と低アルブミン血症を伴う早期型失調症（ＡＯＡ１／ＥＡＯＨ）、ナイミーヘン症候群、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症が挙げられる。
【００６３】
また、ＤＮＡ損傷は、細胞の癌化を引き起こし、ひいては腫瘍形成につながる。
従って、本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、腫瘍形成を抑制するために用いることができる。
【００６４】
また、後述する試験で示すように、本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物の有効成分である化合物１又は化合物２は、ＤＮＡ損傷抑制作用に加え、オートファジー活性化作用を有することが見出された。
オートファジーは老化と密接に関わることが知られている（「オートファジーと老化」、医学のあゆみ、医歯薬出版株式会社、２０１５年、２５３巻、９号、ｐ．７２３−７２７、及び「オートファジーと老化」、日本臨牀、日本臨牀社、２０１６年、７４巻、９号、ｐ．１４６１−１４６３等））。すなわち、オートファジーの活性化は抗老化に寄与する。
そのため、本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は老化に伴う神経細胞の変性や神経細胞の減少の予防又は改善に好ましく用いることができる。
【００６５】
また、オートファジーの異常は、パーキンソン病、ＳＥＮＤＡ病、Ｖｉｃｉ症候群などの神経変性疾患、およびがんの発症に密接に関連することも明らかとなっている（蔭山ら、オートファジーと疾患：ライフサイエンス領域融合レビュー、２０１８年３月８日検索URL：http://leading.lifesciencedb.jp/3-e006）。
従って、本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、オートファジー活性化作用という点から見ても神経変性疾患の予防又は改善、腫瘍形成の抑制に有効である。
【００６６】
また、本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、酸化ストレスに起因しないＤＮＡ損傷の形成に対しても有効である。
【００６７】
本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、医薬組成物とすることができる。
本発明の医薬組成物は、経口的、又は非経口的にヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
【００６８】
また、本発明の医薬組成物は、化合物１及び化合物２からなる群から選択される１又は複数の化合物を総量で、より好ましくは少なくとも０．０００１質量％以上、さらに好ましくは少なくとも０．０００５質量％以上、特に好ましくは少なくとも０．００１質量％以上含む組成物を有効成分として含む形態とすることが好ましい。
【００６９】
本発明の医薬組成物の形態は特に限定されず、用法に応じて適宜選択できる。具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤等を例示できる。
【００７０】
本発明の医薬組成物の投与時期は特に限定されず、対象となる疾患に応じて、適宜選択することが可能である。また、投与量は製剤形態、用法、患者の年齢、性別、その他の条件、症状の程度等に応じて決定されることが好ましい。
本発明の医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常、有効成分の量に換算して、好ましくは０．０００１〜１００ｍｇ／日、より好ましくは、０．００１〜５０ｍｇ／日、特に好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／日の範囲を目安とする。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、医薬組成物に汎用される添加剤を含有してもよい。添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等が挙げられる。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、前記化合物を有効成分として医薬組成物用担体に配合することで製造することができる。本発明の医薬組成物は、例えば、前記化合物を、前述した添加剤とともに製剤化することで製造することができる。
また、本発明の医薬組成物は、前記化合物を含む公知の植物等を原料として、熱水や各種溶媒を用いた抽出、超臨界抽出、亜臨界抽出することにより得た抽出物を、前述した添加剤とともに製剤化することで製造することもできる。
特に、化合物１及び化合物２を前記特定の質量比の範囲で含む本発明の医薬組成物は、各化合物を前記質量比の範囲で混合することで製造することができる。また、このような医薬組成物は、化合物１及び化合物２が含まれている公知の植物等を原料として、熱水や各種溶媒を用いた抽出、超臨界抽出、亜臨界抽出等の方法にて製造することも可能である。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、例えば、ユリ科、マメ科、イネ科、ナス科及びバショウ科などの植物から得ることができる。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、前記化合物が有効成分として機能し、ＤＮＡの損傷により引き起こされる症状の予防又は改善作用を有する。
【００７５】
また、本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、飲食品組成物とすることができる。本発明において、「飲食品組成物」には、人間が摂取する飲食品の他、人間以外の動物が摂取する飼料も含まれる。
【００７６】
本発明の飲食品組成物は、化合物１及び化合物２からなる群から選択される化合物を、有効成分として含有する。該化合物は、１種、すなわち化合物１又は化合物２の何れか単独であっても、化合物１及び化合物２の混合物であってもよい。
化合物１又は化合物２を単独で用いる場合としては、化合物１（主に、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、若しくは４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）、又は化合物２（主に、９，１９−シクロラノスタン−３−オール若しくは２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール）の何れかであることが好ましい。
中でも飲食品組成物の有効成分として使用する場合において考慮される溶解性等の物性の点で、化合物１としては４−メチルコレスト−７−エン−３−オールが特に好ましく、化合物２としては９，１９−シクロラノスタン−３−オールが特に好ましい。
また、化合物１と化合物２を対比した場合では、化合物１（主に、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール又は４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）であることがより好ましい。
また、化合物１又は化合物２各々においても、１種の化合物を用いてもよいし、複数の化合物を混合して用いてもよい。
本発明の飲食品組成物は、好ましくは、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール、９，１９−シクロラノスタン−３−オール、２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールからなる群から選択される１又は複数の化合物を有効成分として含有する。
【００７７】
化合物１及び化合物２の両者を組み合わせる場合（化合物１と化合物２との混合物）において、化合物１及び化合物２の質量比の範囲は、例えば以下が挙げられる。
化合物１：化合物２は、好ましくは５：１〜１：５、さらに好ましくは３：１〜１：３、特に好ましくは２：１〜１：２である。
【００７８】
本発明の飲食品組成物における前記化合物の含有量は、症状等に応じて適宜選択することができるが、総量で、好ましくは少なくとも０．００００１質量％以上、より好ましくは少なくとも０．０００１質量％以上、さらに好ましくは少なくとも０．０００５質量％以上、特に好ましくは少なくとも０．００１質量％以上である。また本発明の飲食品組成物における当該量の上限は特に制限されないが、総量で、９０質量％以下、好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下が例示される。
【００７９】
また、本発明の飲食品組成物は、化合物１及び化合物２からなる群から選択される化合物を０．００００１質量％以上含む組成物を、有効成分として含有する。該化合物は、１種でも、複数種でもよい。
このような組成物としては、例えば、前述した化合物１を含む植物から得られた抽出物、化合物２を含む植物から得られた抽出物、及び化合物１及び化合物２の両者を含む植物から得られた抽出物、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【００８０】
例えば、天然の植物に含まれる例として、アロエ・ベラ中には、化合物１（主に、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）、及び化合物２（主に、９，１９−シクロラノスタン−３−オール及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール）が含まれていることが知られている。
【００８１】
そのため、アロエ・ベラを原料として、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、若しくは４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール（化合物１）の何れか、又は９，１９−シクロラノスタン−３−オール、若しくは２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール（化合物２）の何れかをそれぞれ精製して、化合物１：化合物２が５：１〜１：５、好ましくは３：１〜１：３、特に好ましくは２：１〜１：２で含む混合物を得ることが可能である。このようにして得られた組成物は、本発明の飲食品組成物の有効成分として好適である。
【００８２】
また、本発明の飲食品組成物は、ロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を総量で、より好ましくは少なくとも０．０００１質量％以上、さらに好ましくは少なくとも０．０００５質量％以上、特に好ましくは少なくとも０．００１質量％以上含む組成物を有効成分として含む形態とすることが好ましい。
【００８３】
本発明の飲食品組成物は、ＤＮＡの損傷により引き起こされる症状や疾患の予防及び／又は改善に有効である。
本発明飲食品組成物における予防又は改善対象、前述した医薬組成物の形態の予防又は改善対象と同様である。
【００８４】
また、飲食品組成物における前記化合物の量は、その形態に応じて、前記化合物を、総量で、好ましくは０．０００１〜１００ｍｇ／日、より好ましくは０．００１〜５０ｍｇ／日、特に好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／日の範囲で摂取するのに適した量とすることもできる。従って、本発明の飲食品組成物は、前記化合物を、総量で、好ましくは０．０００１〜１００ｍｇ／日、より好ましくは０．００１〜５０ｍｇ／日、特に好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／日摂取するように用いられることが好ましい。
【００８５】
前記飲食品は、好ましくは保健機能食品である。「保健機能食品」とは、疾患の予防効果、又は疾患の発生リスクの低減効果が、直接的又は間接的に表示された食品、及び事業者の責任で科学的根拠を基に商品パッケージに機能性を表示するものとして、消費者庁に届け出られた食品を意味する。例えば、現在、日本において、特定保健用食品、機能性表示食品、健康補助食品等の態様で販売される食品が挙げられる。
【００８６】
前記飲食品の形態としては特に制限されないが、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）が、前記化合物を効率よく摂取する観点から特に好ましい。
【００８７】
また、機能性飲食品の形態としては、顆粒状、タブレット状又は液状のサプリメントであることも、摂取者が有効成分の摂取量を把握しやすいという点で好ましい。
【００８８】
また、このような機能性飲食品には、「ＤＮＡの損傷により引き起こされる症状の予防又は改善のため」、「損傷ＤＮＡの修復酵素の活性を向上させるため」、「表皮のターンオーバーを正常化するため」、「神経細胞の変性又は神経細胞の減少を抑制するため」、「腫瘍形成を抑制するため」の用途の表示が付された形態とすることも好ましい。すなわち、本発明の飲食品は、例えば「ＤＮＡの損傷により引き起こされる症状の予防又は改善のため」の用途が付された、化合物１及び化合物２からなる群から選択される１又は複数の化合物を有効成分として含有する、ＤＮＡの損傷により引き起こされる症状の予防又は改善のための飲食品として販売することが好ましい。
【００８９】
前記「表示」は、需要者に対して前記用途を知らしめる機能を有するすべての表示を含む。すなわち、前記用途を想起・類推させうるような表示であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、すべて前記「表示」に該当する。
また、前記「表示が付された」とは、前記表示と飲食品（製品）を関連付けて認識させようとする表示行為が存在していることをいう。
表示行為は、需要者が前記用途を直接的に認識できるものであることが好ましい。具体的には、本発明の飲食品に係る商品又は商品の包装への前記用途の記載行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類（電磁的方法により提供されるものを含む）への前記用途の記載行為が例示できる。
【００９０】
一方、表示される内容（表示内容）としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましい。
例えば、健康食品、機能性飲食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、医薬組成物用部外品等の表示を例示することができる。特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品制度、これに類似する制度にて認可される表示を例示できる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を例示することができ、詳細にいえば、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）、及びこれに類する表示が、典型的な例として列挙することが可能である。
【００９１】
前記用途を表す文言は、ＤＮＡ損傷により起こる症状を予防、改善する作用又は効果を表現する文言であれば、本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。
また、本発明の飲食品は、前記用途の表示に加え、前記有効成分の表示、さらには、前記用途と前記有効成分の関連性を示す表示を含むことも好ましい。
【００９２】
前記飲食品は、化合物１及び化合物２から選ばれる化合物を、有効成分として配合することで製造することができる。本発明の飲食品は、例えば、前記化合物を、飲食品原料に混合して、加工することで製造することができる。
また、前記飲食品は、前記化合物を含む公知の植物等を原料として、熱水や各種溶媒を用いた抽出、超臨界抽出、亜臨界抽出することにより得た抽出物を、飲食品原料とともに加工することで製造することもできる。
【００９３】
また、前記飲食品の形態を、顆粒状、タブレット状又は液状のサプリメントとする場合には、有効成分である前記化合物を、例えば、ラクチュロース、マルチトール、及びラクチトール等の糖類、及びそれ以外の糖類、例えばデキストリン、デンプン等；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中性脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等とともに、製剤化することも好ましい。
【００９４】
また、本発明のＤＮＡ損傷抑制用組成物は、化粧品組成物とすることができる。
【００９５】
本発明の化粧品組成物に含まれる有効成分の種類及び比率の好ましい形態は、本発明の飲食品組成物と同じである。
【００９６】
本発明の化粧品組成物における前記化合物の含有量は、症状等に応じて適宜選択することができるが、総量で、好ましくは少なくとも０．００００１質量％以上、より好ましくは少なくとも０．０００１質量％以上、さらに好ましくは少なくとも０．０００５質量％以上、特に好ましくは少なくとも０．００１質量％以上である。また本発明の化粧品組成物における当該量の上限は特に制限されないが、総量で、９０質量％以下、好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下が例示される。
【００９７】
本発明の化粧品組成物は、ＤＮＡの損傷により引き起こされる症状や疾患の予防又は改善に有効である。
本発明の化粧品組成物は、特に、表皮のターンオーバーの正常化のために用いることが好ましい。
【００９８】
「化粧品組成物」には、薬事法における化粧品および医薬部外品が含まれ、皮膚に使用する化粧品、浴用剤、芳香品等が挙げられる。
【００９９】
化粧品組成物には、通常用いられる成分を適宜配合することができる。また、化粧品組成物の形態も特に制限されない。
本発明の化粧品組成物としては、例えば、せっけん、合成化粧せっけん、液状ボディ洗浄料（ボディーソープ）、洗顔料等の洗浄料、クレンジングクリーム、洗浄用化粧水、化粧水、乳液、美容液、ローション、液状パック、ペースト状パック等のパック、粉白粉、水白粉、練白粉等の白粉、打粉、ファンデーション、口紅、頬紅等の化粧品、アイライナー、アイシャドウ等の目のまわりの化粧料、日焼け止め化粧料、サンタン化粧料、除毛化粧料等の化粧料、或いはシェービングローション、アフターシェービングローション等のひげそり用化粧料等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
本発明の化粧品組成物は、上記化合物を有効量含んでなるものであり、使用により、ＤＮＡ損傷抑制作用を発揮できるものである。
【０１０１】
また、化粧品組成物には前記化合物の他、化粧品に通常用いられる成分を本発明の目的、作用、効果を損なわない範囲で適宜選択して添加して使用することができる。このような成分としては例えば界面活性剤、油分、保湿剤、柔軟剤、感触向上剤、油性剤、乳化剤、酸化防止剤、防腐剤、防黴剤、エモリエント剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、安定化剤、紫外線吸収剤、アルコール類、シリコン化合物、増粘剤、粘度調整剤、可溶化剤、パール化剤、香料、清涼剤、殺菌剤、抗菌剤、天然抽出物、着色剤、褪色防止剤、精製水その他の溶剤、噴射剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１０２】
［試験１］ＤＮＡ損傷抑制作用の評価
本試験では、へアレスマウスを用いて、化合物１、化合物２、もしくはこれらを含む組成物のＤＮＡ損傷に対する修復作用について検討した。
【０１０３】
（１）飼料の調製
化合物１及び化合物２をＡＩＮ−９３Ｇ飼料に添加し、化合物１及び化合物２を総量で０．００００２％（０．２ｐｐｍ）含む試験飼料を作製した。また、対照飼料として、通常のＡＩＮ−９３Ｇを用いた。なお、試験飼料における化合物１及び化合物２の質量比は、アロエ粉末に含まれる各化合物の質量比に依存するため５：１〜１：５の範囲内である。以下の方法により、ＤＮＡ損傷の生成、ならびにＤＮＡ損傷修復酵素の発現に対する作用について検討した。
【０１０４】
（２）試験方法
Ｈｏｓ：ＨＲ−１マウス（７週齢、メス）は、星野試験動物飼育所（日本エスエルシー）より購入した。１５匹のマウスを１週間の予備飼育の後、５匹ずつ以下の３つの設定群に群分けした。
【０１０５】
【表１】
2019172645.tif 000014
【０１０６】
群分け後、ＵＶＢ非照射群及び対照群には、そのままＡＩＮ−９３Ｇ飼料を与え、試験飼料群には、化合物１及び化合物２を含有する試験飼料を与えて、１４日間飼育した。１４日目に対照群及び試験飼料群に、ＵＶＢ１８０ｍＪ／ｃｍ２を単回照射した。ＵＶＢ非照射群にはＵＶＢ照射は行わなかった。
ＵＶＢ非照射群については１４日間の飼育終了後に、対照群及び試験飼料群については、ＵＶＢ照射前と照射２４時間後に、背部皮膚組織を採取し、ＤＮＡ光産物量を測定するとともに、光修復酵素の発現量変化を測定した。
ＤＮＡ光産物量については、ＤＮＡ損傷の指標となる、シクロブタン型二量体（ＣＰＤ）および６−４光産物（６−４ＰＰ）の量を、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ  Ｃｅｌｌａｒ  ＵＶ-Ｉｎｄｕｃｅｄ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  （ＣＰＤ）およびＯｘｉＳｅｌｅｃｔ  Ｃｅｌｌａｒ  ＵＶ-Ｉｎｄｕｃｅｄ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  （６−４ＰＰ）を用いて測定した（ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１３，  Ｖｏｌ．８  Ｉｓｓｕｅ１０  ｅ７７３０８参照）。
また、光修復酵素の発現量についてはヌクレオチド修復に関わる修復酵素であるＸＰＡおよびＸＰＣの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。ＲＴ−ＰＣＲのオリゴヌクレオチドは、タカラバイオ社のＸＰＡ  ＭＡ１２８４８４、ＸＰＣ  ＭＡ０９６１１９を利用した。
【０１０７】
（３）試験結果
結果を表２および表３に示す。表３に示すＸＰＡおよびＸＰＣの発現量は、ＵＶＢ非対照群に対する相対値として示す。
【０１０８】
【表２】
2019172645.tif 000015
【０１０９】
表２の結果からも明らかなように、ＣＰＤ及び６−４ＰＰの産生は、紫外線の照射により顕著に増加することが確認された（対照群）。この対照群に対し、試験飼料群では、ＣＰＤ及び６−４ＰＰの産生が有意に抑制されていることが確認された。
【０１１０】
【表３】
2019172645.tif 000016
【０１１１】
表３の結果から明らかなように、ヌクレオチド修復に関わる修復酵素であるＸＰＡおよびＸＰＣの発現量は、紫外線の照射により有意に低値を示すことが確認された（対照群）。これに対し、試験飼料群では、これらの修復酵素の発現が有意に回復することが明らかになった。
【０１１２】
［試験２］
本試験では、３次元皮膚モデルＥＦＴ−４００（ＭａｔＴｅｋ社製）を用いて、シクロラノスタン化合物、またはロフェノール化合物を添加培養することにより、紫外線照射によって誘導されるＤＮＡ損傷の形成を抑制させる作用について検討を行った。
【０１１３】
（１）試験方法
（１−１）試験用培地の調製
化合物１又は化合物２をＤＭＳＯに溶解し、それをＥＦＴ−４００−ＡＳＹ培地（ＭａｔＴｅｋ社製：クラボウ株式会社より入手）に添加することにより、化合物１又は化合物２を１μＭ、ＤＭＳＯを０．２％含む試験用培地を調製した。
また、陰性対照として、ＤＭＳＯを０．２％含む試験用培地を調製した。
【０１１４】
（１−２）皮膚モデルの培養
３次元皮膚モデルは、ＥＦＴ−４００専用培地（ＭａｔＴｅｋ社製）で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。前述した試験用培地、又は対照培地を用いて、３次元皮膚モデルを４日間培養した。５日目に培地を回収後、３次元皮膚モデルをＰＢＳ(−)で洗浄した後、ＰＢＳ(−)２．５ｍＬに３次元皮膚モデルを浸し、ＵＶＢ１２０ｍＪ／ｃｍ２を照射した。３次元皮膚モデルを、再び試験用培地又は対照培地に移して６時間培養した。併せて、ＵＶＢを照射せずにＤＭＳＯを０．２％含む試験用培地で６時間培養した。
３次元皮膚モデルをホルマリン固定、パラフィン包埋し、５μｍの厚さに薄切した。切片は、ＥＤＴＡバッファー存在下で熱処理し、1次抗体としてＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｔｈｙｍｉｎｅ  Ｄｉｍｅｒ  ＣＰＤ抗体  Ｈ３(ａｂｃａｍ)  ５μｇ／ｍＬを、２次抗体として１００倍希釈したＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ-ＦＩＴＣ(ＤＡＣＯ)を用いて、Ｔｈｙｍｉｎｅ  Ｄｉｍｅｒの染色を行った。
【０１１５】
（２）試験結果
図１に紫外線照射した３次元皮膚モデルの組織切片をＴｈｙｍｉｎｅ  Ｄｉｍｅｒ抗体にて抗体染色した顕微鏡写真を示す。
ＵＶＢ非照射群においては、ＤＮＡ損傷の指標であるＴｈｙｍｉｎｅ  Ｄｉｍｅｒ（ＣＰＤ）の形成は確認されなかった。
紫外線を照射した対照群においては、ＤＮＡ損傷の指標であるＴｈｙｍｉｎｅ  Ｄｉｍｅｒ（ＣＰＤ）の形成が確認されたことから、紫外線の照射により細胞のＤＮＡ損傷が誘発されていることが示された。一方、化合物１又は化合物２の存在下で培養することにより、紫外線照射条件においてもＴｈｙｍｉｎｅ  Ｄｉｍｅｒの形成が減少しており、被験物質が紫外線照射によるＤＮＡ損傷を抑制することが示された。
化合物１又は化合物２を１μＭ含む飼料には、ＤＮＡの損傷を抑制する作用があることが認められた。
【０１１６】
［試験３］肝がん由来細胞を用いたオートファジー観察
本試験では、肝がん由来細胞ＨｅｐＧ２を化合物１又は化合物２に暴露し、オートファジー活性化の有無を観察した。
【０１１７】
（１）試験方法
（１−１）試験用培地の調製
化合物１（４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールのモル比１：１：１の混合物）、及び化合物２（９，１９−シクロラノスタン−３−オール及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールのモル比１：１の混合物）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。ＤＭＳＯに溶解した各化合物を、ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：ＤＳファーマバイオメディカル社製）に添加し、化合物１又は化合物２を１００μＭ、ＤＭＳＯを０．２％、ＦＢＳを１０％含有する試験用培地を調製した。
併せて、陰性対照として、ＤＭＳＯ０．２％、ＦＢＳ１０％を含有するＤＭＥＭを調製した。また、陽性対照として、ラパマイシン５００ｎＭ、ＦＢＳ１０％含有するＤＭＥＭを調製した。
【０１１８】
（１−２）肝がん由来細胞ＨｅｐＧ２の培養
肝がん由来細胞ＨｅｐＧ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）４×１０３個をＬａｂ−ＴｅｋＴＭ  ８ウェルチェンバースライド（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に播種し、ＦＢＳを１０％含有するＤＭＥＭで、３７℃、５％  ＣＯ２濃度の培養条件にて２４時間培養した。その後、細胞を（１−１）で調製した試験用培地に移し、同条件で２４時間培養した。
なお、陰性対照では、同条件で２４時間の培養時間、陽性対照では、同条件で１６時間の培養時間とした。
【０１１９】
（１−３）観察用試料の調製
各試験用培地での培養後、培地を回収し、ＣＹＴＯ−ＩＤ（登録商標）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（エンゾライフサイエンス社製）に付属の０．５％  ＦＢＳを含有するＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を洗浄した。その後、細胞を、オートファジー検出用の蛍光プローブであるＣＹＴＯ−ＩＤ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（エンゾライフサイエンス社製）及び核染色試薬であるＨｏｅｃｈｓｔ（登録商標）３３３４２（ヘキスト社製）を含有する緩衝液に浸し、３７℃、５％  ＣＯ２濃度の条件下で３０分間静置した。
【０１２０】
静置後の細胞を４％ホルムアルデヒド液で固定した。固定された細胞は、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ベクターラボラトリーズ社製）に封入して観察用試料とした。
【０１２１】
（１−４）オートファゴソーム形成の観察
（１−３）で得られた観察用試料における緑色の蛍光を、倒立蛍光顕微鏡を用いて観察することで、オートファジー活性を示すオートファゴソーム形成の有無を評価した。
図２に観察結果（顕微鏡写真）を示す。
【０１２２】
（２）結果及び考察
図２に示されるように、陽性対照、化合物１又は化合物２を含む試験用培地で培養した細胞において、オートファゴソームの形成を示す緑色の蛍光が確認された（図２の矢印部分）。
この結果から、化合物１及び化合物２によって、細胞のオートファジーが誘導されたことが分かった。
一方、陰性対照では、緑色の蛍光は確認されなかった。
【０１２３】
［試験４］肝がん由来細胞を用いたオートファジー活性の定量的評価
試験３で観察された化合物１又は化合物２のオートファジーの活性作用を定量的に検出した。
【０１２４】
（１）試験方法
（１−１）肝がん由来細胞ＨｅｐＧ２の培養
肝がん由来細胞ＨｅｐＧ２  ２．５×１０４個を９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで、３７℃、５％  ＣＯ２濃度の条件下で２４時間培養した。その後、細胞を試験１の（１）（１−１）で調製した試験用培地を用いて同条件で２４時間培養した。また、陰性対照、陽性対照についても試験１と同様に培養をした。続いて、クロロキンを、最終濃度が１０μＭとなるように各培地に添加し、３７℃、５％  ＣＯ２濃度の条件下で６時間培養し、リソソーム活性を阻害した。
【０１２５】
（１−２）測定用試料の調製
培養した細胞を、ＣＹＴＯ−ＩＤ（登録商標）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔに付属の０．５％  ＦＢＳを含有するＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて洗浄した。
その後、オートファジー検出用の蛍光プローブであるＣＹＴＯ−ＩＤ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ及び核染色試薬であるＨｏｅｃｈｓｔ（登録商標）３３３４２を含有する緩衝液に浸し、３７℃、５％  ＣＯ２濃度の条件下で３０分間静置した。静置後、上記Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて２回の洗浄を行い測定用試料とした。なお、核染色試薬による染色は、細胞数の標準化を行うために行った。
【０１２６】
（１−３）オートファジーの活性の測定
各ウェルにキット付属のＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（エンゾライフサイエンス社製）を１００μＬ添加し、蛍光マイクロプレートリーダーＳＨ−９０００（コロナ電気社製）を用いて、蛍光強度を測定した。オートファジー検出用の蛍光プローブ由来の蛍光は、励起フィルター４８０ｎｍ及び蛍光フィルター５３０ｎｍの条件で測定した。また、各染色試薬由来の蛍光は、励起フィルター３４０ｎｍ、蛍光フィルター４８０ｎｍの条件で測定した。
【０１２７】
（２）試験結果
蛍光マイクロプレートリーダーにて測定した、化合物１又は化合物２に暴露された細胞の蛍光強度の測定結果を表４に示す。なお、各群３ウェルとし表中のｐ値は、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定による有意確率を示す。
【０１２８】
【表４】
2019172645.tif 000017
【０１２９】
（３）考察
表４に示されるとおり、化合物１又は化合物２に暴露した細胞で、陰性対照に対して有意に高い蛍光強度が測定された。これより、化合物１又は２にはオートファジー活性化作用を有することが確認された。
また、別途、化合物１又は化合物２を１．０μＭ含む培地を用いた試験を同様に行った。その結果、化合物１又は化合物２によるオートファジー活性化作用は濃度依存的であることも確認された。
【０１３０】
試験１〜４の結果から、化合物１又は化合物２は、ＤＮＡ損傷抑制作用、及びオートファジー活性化作用を有することが明らかとなった。これより、化合物１又は化合物２は、特に、神経細胞変性や神経細胞減少を伴う状態や疾患予防又は改善のため、並びに腫瘍形成の抑制のために有効であることが判った。
【０１３１】
［製造例１］
次の組成からなるＤＮＡ損傷抑制効果を有する医薬組成物を、以下の方法により製造した。
ロフェノール化合物と、及びシクロラノスタン化合物とを、ロフェノール化合物：シクロラノスタン化合物＝１：１の質量比で含有した混合物に、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ：第一工業製薬株式会社製）を添加し分散させて調製した前記混合物を０．００１質量％含有する組成物を２質量％、中鎖脂肪酸（ＭＣＴ：理研ビタミン株式会社製）２質量％、グリセリン脂肪酸エステル（理研ビタミン株式会社製）を４質量％、サポニン（丸善製薬株式会社製）を０．５質量％、エタノール（日本アルコール産業株式会社製）を０．２質量％、マルチトール（株式会社林原製）を１．３質量％、グリセリン（日油株式会社製）を７８質量％、さらに水を添加して全量が１００質量％、となるように混合して、ロフェノール化合物（化合物１）及びシクロラノスタン化合物（化合物２）の混合物が最終濃度で０．００００２質量％含有するシロップ状の製剤を製造した。
製造例１の医薬組成物は、ＤＮＡ損傷抑制効果を有する。
【０１３２】
［製造例２］
次の組成からなるＤＮＡ損傷抑制効果を有する飲食品組成物を、以下の方法により製造した。
ロフェノール化合物と、及びシクロラノスタン化合物とを、ロフェノール化合物：シクロラノスタン化合物＝６．１：３．９の質量比で含有した混合物を４質量％含有し、その他に中鎖脂肪酸（ＭＣＴ：理研ビタミン株式会社製）２質量％、グリセリン脂肪酸エステル（理研ビタミン株式会社製）４質量％、サポニン（丸善製薬株式会社製）０．５質量％、エタノール（日本アルコール産業株式会社製）０．２質量％、マルチトール（株式会社林原製）１．３質量％、グリセリン（日油株式会社製）７８質量％、水１０質量％を混合して、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物の混合物を含有する食品添加剤を製造した。
【０１３３】
製造した食品添加剤を飲料に加えて均一に混合することにより、ロフェノール化合物（化合物１）及びシクロラノスタン化合物（化合物２）の混合物が最終濃度で０．００００２質量％含有する飲食品組成物を製造した。
製造例２の飲食品組成物は、ＤＮＡ損傷抑制効果を有する。
【０１３４】
［製造例３］
＜クリーム＞
以下に示す処方でＤＮＡ損傷抑制効果を発揮するクリームを製造した。
（処方）
（１）ステアリン酸  ５．０質量％
（２）ステアリルアルコール  ４．０質量％
（３）イソプロピルミリステート  １８．０質量％
（４）グリセリンモノステアリン酸エステル  ３．０質量％
（５）プロピレングリコール  １０．０質量％
（６）シクロラノスタン化合物およびロフェノール化合物混合物  ０．０００２質量％
（７）苛性カリ  ０．２質量％
（８）亜硫酸水素ナトリウム  ０．０１質量％
（９）防腐剤  適量
（１０）香料  適量
（１１）イオン交換水 残余
【０１３５】
（製法）
イオン交換水に（５）〜（７）を加えて溶解し、加熱して７０℃に保って水相部を調製した。さらに前記水相部とは別に、残りの成分をすべて混合し、加熱融解して７０℃に保って油相部を調製した。次に、水相部に油相部を徐々に加え、全部加え終わってからしばらくその温度に保った後、ホモミキサーで均一に乳化し、よく混合しながら３０℃まで冷却してクリームを調製した。
【０１３６】
［製造例４］
＜乳液＞
以下に示す処方で、ＤＮＡ損傷抑制効果を発揮する乳液を製造した。
（処方）
（１）ステアリン酸  ２．５質量％
（２）セチルアルコール  １．５質量％
（３）ワセリン  ５．０質量％
（４）流動パラフィン  １０．０質量％
（５）ポリオキシエチレン（１０モル）モノオレイン酸エステル  ２．０質量％
（６）ポリエチレングリコール１５００  ３．０ 質量％
（７）トリエタノールアミン  １．０質量％
（８）カルボキシビニルポリマー  ０．０５質量％
（９）シクロラノスタン化合物およびロフェノール化合物混合物  ０．００００２質量％
（１０）亜硫酸水素ナトリウム  ０．０１質量％
（１１）エチルパラベン  ０．３質量％
（１２）香料  適量
（１３）イオン交換水  残余
【０１３７】
（製法）
イオン交換水の一部に（８）を溶解して１液とした。さらに前記１液とは別に、残りのイオン交換水に（６）と（７）を加え、加熱溶解して７０℃に保ち２液とした。また、前記１液および２液とは別に、残りの成分をすべて混合し、７０℃で溶解して３液とした。次いで、２液に３液を加えた後、さらに、これに１液を加えてホモミキサーで均一乳化し、乳化後よくかき混合しながら３０℃まで冷却して乳液を調製した。
【０１３８】
［製造例５］
以下に示す処方で、ＤＮＡ損傷抑制効果を発揮するサンスクリーン剤を製造した。
＜サンスクリーン剤＞
（処方）
（１）環状シリコン  ２１．９ 質量％
（２）酸化亜鉛  １０．０質量％
（３）酸化チタン  １０．０質量％
（４）ジメチコン  ５．５質量％                                                                                            
（５）メトキシケイヒ酸オクチル  ５．５質量％
（６）グリセリン  ３．０質量％  
（７）クオタニウム-１８ベントナイト  １．０質量％
（８）ジグリセリン  １．０質量％
（９）フェノキシエタノール  ０．１質量％
（１０）シクロラノスタン化合物およびロフェノール化合物混合物  ０ ．００００２質量％
（１１）香料  適量
（１２）メチルパラベン  ０．１質量％
（１３）エタノール  １．０質量％
（１４）１,３−ブチレングリコール  ３．０質量％
（１５）イオン交換水  残余
【０１３９】
（製法）
（１）〜（１１）を室温で撹拌しながら分散し、Ａ相とした。水と１,３−ブチレングリコールを室温で撹拌溶解し、Ｂ相とした。メチルパラベンとエタノールを室温で撹拌溶解し、Ｃ相とした。Ａ相をディスパーでかき混ぜながら、Ｂ相とＣ相を加えて乳化した（１０００ｒｐｍ、３分間）。その後パドルでかき混ぜながら３５℃まで冷却した。
【０１４０】
製造例３〜５の化粧品組成物は、ＤＮＡ損傷抑制効果を有する。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明は、ＤＮＡ損傷の抑制や、ＤＮＡ損傷に起因する症状や疾患の予防又は改善に利用できる。
【図１】
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【図２】
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