(57)【要約】【課題】細胞外小胞を簡便に精製し、分類する方法、及びキットを提供することを課題とする。【解決手段】細胞外小胞表面分子が結合するリガンドで被覆したナノ粒子と細胞外小胞を混合した試料溶液を密度勾配遠心によって、細胞外小胞とナノ粒子複合体を沈殿させることができる。細胞外小胞を簡便に検出・分類・精製する方法、及びキットを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象の細胞外小胞の表面に存在する分子に特異的に結合するリガンドで被覆したナノ粒子と、
前記ナノ粒子と細胞外小胞を混合した試料溶液を作製し、
前記試料溶液よりも密度の高い媒質層を少なくとも１つ用意し、
前記媒質層の上に前記試料溶液を積層し、
低速で遠心を行うことによって細胞外小胞を検出、分画、及び／又は精製する方法。
【請求項２】
前記遠心がステップ密度勾配遠心法、又は連続密度勾配遠心法であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞外小胞がエクソソームであることを特徴とする請求項１、又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ナノ粒子が、
第６周期元素を含む粒子であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
検出対象の細胞外小胞の表面に存在する分子に特異的に結合するリガンドで被覆したナノ粒子と、
密度勾配溶液を含むことを特徴とする細胞外小胞検出・分類・精製キット。
【請求項６】
ナノ粒子、リガンド、ナノ粒子にリガンドを結合させるための試薬、及び密度勾配溶液を含むことを特徴とする細胞外小胞検出・分類・精製キット。
【請求項７】
さらに、検出対象の細胞外小胞の表面に存在する分子に特異的に結合する分子、前記リガンドに結合する分子、及び前記リガンドに結合する分子で前記細胞外小胞の表面に存在する分子に特異的に結合する分子を標識するための試薬を含む請求項６に記載の細胞外小胞検出・分類・精製キット。
【請求項８】
前記細胞外小胞がエクソソームであることを特徴とする請求項５〜７いずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
細胞外小胞を簡便に分離、検出する方法に関する。特に、エクソソームをサブクラスに分類し、検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外小胞とは、細胞から放出されるナノメーターサイズの小胞であるが、細胞内の由来からエクソソーム、微小小胞体（Microvesicles）、アポトーシス小体に分類される。中でもエクソソームは診断や治療に利用できる可能性があることから、近年盛んに研究されている。
【０００３】
エクソソームとは、細胞に由来する細胞外に存在する直径１００ｎｍ前後の小胞であり、血液、唾液、尿などのあらゆる体液中に多量に存在する。エクソソームは、その表面に細胞膜由来の脂質、タンパク質を含み、内部にはｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの核酸やタンパク質が含まれており、放出した細胞由来の情報が含まれている。そのため、エクソソームに包含されている情報はバイオマーカーとして、診断マーカーに利用できる。
【０００４】
また、これら核酸やタンパク質からなる生体情報分子はエクソソームを取り込んだ細胞で機能することが知られており、エクソソームを介して、核酸やタンパク質の交換による細胞間コミュニケーションが生じることが明らかとなっている。そのため、診断だけではなく、予防や治療の分野にもエクソソームが利用できると考えられている（非特許文献１）。
【０００５】
このようにエクソソームの生物学的意義については明らかになってきているものの、エクソソームの定義自体は研究者間でコンセンサスが得られておらず、多様性の高いエクソソームをどのように分類し、定義するかは今後のエクソソーム研究にも大きく関わる問題となっている。
【０００６】
ヘテロな集団として存在しているエクソソームを診断や治療に用いるためには、エクソソームをサブクラスに分類することが重要である。エクソソームをサブクラスに分類することができれば、特定の細胞からのバイオマーカーを濃縮することができると考えられるから、より精度の高い診断を行うことができる。また、治療に用いるためにも、コミュニケーションツールとして治療に寄与するエクソソームを濃縮する必要がある。そこで、エクソソームを表出している抗原や、密度などによってサブクラスに分ける試みが行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】He, C et al., 2018, Theranostics, vol. 8(1),p.237-255.
【非特許文献２】立本絵里ら、2012, 関西分析研究会平成24年度第二回例会
【非特許文献３】Cha, H. et al., 2014, ACS Nano, vol.8, No.8, p.8554-8563
【非特許文献４】Cederquist, K.B. et al., 2017, Colloids andSurface B: Biointerfaces, vol.149, p.351-357.
【非特許文献５】Yoshida, M et al. 2017, Biotechnol. Bioeng.doi: 10.1002/bit.26489
【非特許文献６】Jiang, Y et al., 2017, Angew. Chem. Int.Ed. vol. 56, 11916-11920
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、エクソソームをはじめとする細胞外小胞を簡便に精製し、分類することを課題とする。細胞外小胞を精製する方法には、試薬を用いたキットによる方法や密度による遠心によって精製する方法がある。しかしながら、キットは分離の原理や試薬の詳細が記載されていないものも多い。そのため、所望の細胞外小胞をすべて回収することができているのかが不明である。また、密度勾配遠心など超遠心を用いる方法は、時間と手間がかかることから、より簡便な方法が望まれている。
【０００９】
本発明は細胞外小胞を表面の構成要素によってサブクラスに分類し、検出する方法に関する。特にエクソソーム表面の抗原や膜の構成成分を利用して、特定の構成成分を有するエクソソームを沈殿させ、検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、細胞外小胞を検出、分画、及び／又は精製する方法、及びこれに用いるキットに関する。
（１）検出対象の細胞外小胞の表面に存在する分子に特異的に結合するリガンドで被覆したナノ粒子と、前記ナノ粒子と細胞外小胞を混合した試料溶液を作製し、前記試料溶液よりも密度の高い媒質層を少なくとも１つ用意し、前記媒質層の上に前記試料溶液を積層し、低速で遠心を行うことによって細胞外小胞を検出、分画、及び／又は精製する方法。
（２）前記遠心がステップ密度勾配遠心法、又は連続密度勾配遠心法であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）前記細胞外小胞がエクソソームであることを特徴とする（１）、又は（２）に記載の方法。
（４）前記ナノ粒子が、第６周期元素を含む粒子であることを特徴とする（１）〜（３）いずれか１つ記載の方法。
（５）検出対象の細胞外小胞の表面に存在する分子に特異的に結合するリガンドで被覆したナノ粒子と、密度勾配溶液を含むことを特徴とする細胞外小胞検出・分類・精製キット。
（６）ナノ粒子、リガンド、ナノ粒子にリガンドを結合させるための試薬、及び密度勾配溶液を含むことを特徴とする細胞外小胞検出・分類・精製キット。
（７）さらに、検出対象の細胞外小胞の表面に存在する分子に特異的に結合する分子、前記リガンドに結合する分子、及び前記リガンドに結合する分子で前記細胞外小胞の表面に存在する分子に特異的に結合する分子を標識するための試薬を含む（６）に記載の細胞外小胞検出・分類・精製キット。
（８）前記細胞外小胞がエクソソームであることを特徴とする（５）〜（７）いずれか１項記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】細胞外小胞を密度勾配遠心で沈降させる種々の実施態様を模式的に示す図。
【図２】ＭＦＧＥ８修飾金ナノ粒子コロイド溶液の吸光スペクトル。
【図３】ＭＦＧＥ８修飾金-プラチナ合金ナノ粒子コロイド溶液の吸光スペクトル。
【図４】抗ＣＤ８１モノクローナル抗体修飾金ナノ粒子コロイド溶液の吸光スペクトル。
【図５】ＭｉａＰａｃａ−２ヒト膵がん細胞株の培養液から密度勾配遠心法により調製されたエクソソーム試料の各分画の発現タンパク質のウェスタンブロットによる解析（上）、及び各分画の粒子数を示す図（下）。
【図６】図６（Ａ）はＭＦＧＥ８を修飾した金ナノ粒子にＰＢＳ、分画２、８のエクソソーム、ＢＳＡ修飾金ナノ粒子と分画３のエクソソームを混合した写真を示す。図６（Ｂ）は密度勾配遠心後のチューブの写真、及びエクソソーム、修飾金ナノ粒子の存在様式を模式的に示す図。
【図７】沈殿物がエクソソームとナノ粒子であることを確認した結果を示す図。図７（Ａ）は、密度勾配遠心後の写真、及び採取した分画を示す。図７（Ｂ）は、ＣＤ９のウェスタンブロッティングによる解析結果を示す。
【図８】図８（Ａ）はエクソソーム分画１（左）と分画３（右）に、ビオチン化アネキシンＶを添加し、膜表面のホスファチジルセリンを金粒子で標識しＡＦＭで観察した像、図７（Ｂ）は、金粒子が結合したエクソソームの割合を示す。
【図９】レコンビナントＭＦＧＥ８添加により、エクソソームとＭＦＧＥ８修飾金ナノ粒子との結合が阻害されていることを示すＡＦＭ像。
【図１０】ＭＦＧＥ８修飾合金ナノ粒子を用いて密度勾配遠心を行い、各分画に含まれているエクソソーム-合金複合体が沈降していることを示す写真。
【図１１】密度勾配遠心による沈殿の量は、エクソソーム粒子数に依存していることを示す写真。
【図１２】エクソソーム分画にＭＦＧＥ８を添加すると、ＭＦＧＥ８修飾合金ナノ粒子の沈殿が生じないことを示す図。
【図１３】図１３（Ａ）は、抗ＣＤ８１抗体修飾金ナノ粒子を用いたエクソソームの検出を示す図。図１３（Ｂ）は、密度の異なる２つの層によるエクソソームの検出を示す図。
【図１４】ＥｐＣＡＭ陽性エクソソームの検出結果を示す図。図１４（Ａ）は、抗ＥｐＣＡＭ抗体で被覆したナノ粒子を用いると、ＥｐＣＡＭ陽性細胞株由来のエクソソームのみ沈殿が見られることを示す図。図１４（Ｂ）は、沈殿量がＥｐＣＡＭ発現量を反映していることを示す図。
【図１５】デュラマイシンで被覆したナノ粒子を用いたエクソソームの検出結果を示す図。図１５（Ａ）はデュラマイシンで被覆した金ナノ粒子によって、エクソソームが沈殿することを示す図。図１５（Ｂ）は、デュラマイシンで被覆した金ナノ粒子とエクソソームの結合を示すＡＦＭ像。
【図１６】媒質層の密度の検討を行った結果を示す図。
【図１７】未分画エクソソームを用いた検出結果を示す図。
【図１８】血漿サンプルを用いた実験結果を示す図。図１８（Ａ）は、膵がん患者、健常者の２０Ｋ分画、１６０Ｋ分画、１６０Ｋ遠心上清のウェスタンブロッティングの結果を示す図。図１８（Ｂ）はエクソソームを含まない血漿中で、添加したエクソソームが沈殿することを示す図。図１８（Ｃ）は、膵がん患者、健常者でエクソソーム量が異なることを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明はナノ粒子を細胞外小胞が吸着可能な分子で修飾し、細胞外小胞を介して複数のナノ粒子に凝集を起こさせることによって沈降させ、特定の細胞外小胞を精製する方法に関する。以下の実施例で示すように、本発明の方法によれば、低速遠心で特定の表面マーカーを有する細胞外小胞を沈降させることができるので、非常に簡便に細胞外小胞の分画を行うことができる。以下、細胞外小胞としてエクソソームを中心に説明するが、微小小胞体、マイクロ粒子、アポトーシス小体として分類されているエクソソーム以外の細胞外小胞も同様にして、検出、サブクラスに分類、精製することができる。
【００１３】
本実施例に示すように、ナノ粒子は、エクソソームをはじめとする細胞外小胞を沈降させる錘となる役割を担うと共に、細胞外小胞の沈降状態を視覚的に示すインジケーターとしての役割がある。錘としての役割においては、密度の大きな材料を用いるのが好ましく、金（１９．３２ｇ／ｃｍ３）やプラチナ（２１．４５ｇ／ｃｍ３）などに代表される貴金属を含む第６周期元素を重量％で５０％以上１００％以下含むものが良い。タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、プラチナ（Ｐｔ）、金（Ａｕ）は取り分け密度が大きく１５ｇ／ｃｍ３を超えるため、好ましい材料である。微粒子の材料は単体で構成されていてもよいが、合金や固溶体、酸化物などの化合物等、複数の元素から構成されていてもよい。
【００１４】
エクソソームの存在を視覚的に示すインジケーターとしては、金やプラチナなどの貴金属が有するプラズモン共鳴による光吸収を利用することができる。金ナノ粒子は赤色を示し、金‐プラチナのコアシェル構造のナノ粒子は黒色を示すことから、肉眼でも明らかにナノ粒子の沈降を確認することができる。
【００１５】
また、プラズモン共鳴を有する貴金属ナノ粒子を複数凝集させることで、新たなプラズモンモードが出現し、光吸収スペクトル、すなわち色が変化することが知られている(非特許文献２、３）。このようなナノ粒子凝集体からなる微粒子を使用することも可能である。また、視覚的なインジケーターだけではなく、鉄などの磁性金属との合金ナノ粒子を作製し、磁性で検出、定量することも可能である。
【００１６】
ナノ粒子は単一粒子で構成されていてもよいが、複数の粒子から構成されるクラスターであってもよい。大きさは最長軸で５００ｎｍ以下５ｎｍ以上、好ましくは２００ｎｍ以下２０ｎｍ以上、最も好ましくは１００ｎｍ以下３０ｎｍ以上がよい。材料の密度にもよるが、大きすぎると微粒子自体が沈降してしまい、反対に、小さすぎると遠心での沈降に長時間あるいは非常に高い回転数を要してしまう。
【００１７】
以下の実施例で示すように、本発明は細胞外小胞の表面に存在する分子と結合可能な分子でナノ粒子を修飾し、ナノ粒子と細胞外小胞の表面分子とを結合させ、ナノ粒子と細胞外小胞が結合により凝集することを利用して密度勾配遠心により低速遠心で沈降させている。密度勾配は、連続密度勾配を使用しても良いし、ステップ密度勾配を使用してもよい。
【００１８】
図１に本発明の原理を模式的に示す。ナノ粒子は細胞外小胞の表面の特定の分子に特異的に結合する分子で修飾されている。細胞外小胞のうち特定の分子を表出しているものは、ナノ粒子と結合する。図１は、細胞外小胞とナノ粒子を混合した溶液を密度勾配層の上に積層し、遠心した後の様子を模式的に示したものである。特定の分子を表出している細胞外小胞は、ナノ粒子と結合し沈降するが、特定の分子を表出していない細胞外小胞は、上層にとどまっている。本発明者らは、適切な密度勾配と遠心条件を設定することによって、ナノ粒子と結合した細胞外小胞と、結合しない細胞外小胞とを区別し、ナノ粒子と結合した細胞外小胞のみを沈降させることができる条件を見出した。
【００１９】
密度勾配は、ステップ密度勾配でも連続密度勾配でもよく、ステップ密度勾配は、密度の異なる溶媒を幾層か積層したうえにナノ粒子と細胞外小胞が含まれる試料とを混合し積層してもよいし（図１左）、高密度溶媒のうえに、ナノ粒子と細胞外小胞が含まれる試料を適切な密度の溶媒と混合し、直接積層してもよい（図１中央）。図１左では密度の異なる２つの溶媒の上に、ナノ粒子と試料の混合液を積層した場合を模式的に示しているが、密度勾配層は２層に限らず、必要に応じて何層設けてもよい。
【００２０】
溶媒の密度は、細胞外小胞と結合したナノ粒子のみが沈降し、結合しなかったナノ粒子、及び細胞外小胞は沈降させない条件として、高密度層の密度が非常に重要である。高密度層は、用いる粒子の種類や大きさによっても異なるが、密度が１５ｇ／ｃｍ３を超える貴金属を材料とし、最長軸を１００ｎｍ以下３０ｎｍ以上とするナノ粒子を用いる場合には、１．０５３ｇ／ｍｌ（ｉｏｄｉｘａｎｏｌの場合は１０％）以上で、１．３２ｇ／ｍＬ（ｉｏｄｉｘａｎｏｌの場合は６０％）以下の密度である。なお、上記密度はｉｏｄｉｘａｎｏｌを純水と混合した場合であり、生理食塩水などの緩衝液と混合した場合には、上記値よりも若干大きい密度となる。また、密度を同程度に設定することができるｉｏｄｉｘａｎｏｌ以外の溶質を用いてもよい。
【００２１】
以下の実施例では、ｉｏｄｉｘａｎｏｌにより密度勾配を作製しているが、塩化セシウム、臭化ナトリウムなどの塩類、ショ糖、ソルビトール、グリセロールなどの糖類、Ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ、Ｎｙｃｏｄｅｎｚなどのトリヨードベンゼン系、フィコールなどの高分子系、パーコールなどのコロイドシリカ系の化合物など、一般的に密度勾配遠心に使用する化合物を用いることができる。
【００２２】
遠心速度、遠心時間は用いる密度によっても異なるが、簡便に検査するという目的に照らせば、３０分以下、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下の遠心時間で沈降することが好ましい。短時間でナノ粒子と結合した細胞外小胞を沈降させるための遠心速度としては、１ｇから２０００ｇ、好ましくは２００ｇから１５００ｇ、より好ましくは５００ｇから１５００ｇの範囲で設定することができる。
【００２３】
微粒子の製造方法は、化学的手法、物理的手法を問わないが、後の実施例で用いる液中レーザーアブレーション法で作製された微粒子は、コロイド溶液に界面活性剤や反応副産物を含まないため、粒子表面が化学的に露出している状態（chemically-bare）になっており、特にリガンド分子を物理吸着（Passive adsorption）する際に、効率が高いことが報告されている（非特許文献４）ことから、特に好ましい製造方法である。
【００２４】
ナノ粒子表面は、細胞外小胞上に存在する分子に特異的に結合するリガンドで修飾しておく。上述のようにナノ粒子表面のリガンドに介してナノ粒子が細胞外小胞に結合して沈降することから、リガンドに結合する細胞外小胞を分画、精製することができる。特定のリガンドに結合する細胞外小胞を選択的に沈降させることができるので、リガンドとの結合によって細胞外小胞をサブクラスに分類することが可能となる。
【００２５】
また、ナノ粒子表面は細胞外小胞上に存在する分子に特異的に結合するリガンドだけではなく、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧ、各種高分子ポリマーなど、特定の分子に対して結合が認められる分子を用いて被覆してもよい。例えば、ストレプトアビジンで被覆したナノ粒子を用いれば、細胞外小胞に表出している分子に特異的に結合する抗体などの分子をビオチン化することにより、ナノ粒子表面に結合させることができる。例えばペプチドアプタマーを共有結合した高分子ポリマーで被覆すると、そのアプタマーの標的分子に親和性をもつナノ粒子ができる。
【００２６】
細胞外小胞に表出している分子としては、以下の分子が例示できる。例えば、細胞外小胞の一つであるエクソソーム表面には、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ６３、ＣＤ８１、Ｒａｂ５ｂ、ＭＨＣ、α２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｌｉｎ、ＬＡＭＰ１／２、ＩＣＡＭ−１、Ｆｌｏｔｉｌｉｎ  １、ＰＳＭＡ、Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ−１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＰＲＯＭ２、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＬＲＲＣ２６、インテグリン、セラミド、コレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ＥｐＣＡＭ、糖鎖など様々なマーカー分子が存在していることが知られている。また、今後エクソソーム研究が進むことによって、新たな表面マーカーが見つかる可能性があるが、新規に見出されたエクソソーム表面マーカーや上記以外の表面マーカーを利用できることは言うまでもない。ここではエクソソームの表面マーカーについて例示しているが、微小小胞体、マイクロ粒子、アポトーシス小体のような他の細胞外小胞体についても、表面に存在するたんぱく質、脂質、糖鎖などのマーカー分子に特異的に結合する分子を使用することができる。
【００２７】
標的となる表面マーカー分子に特異的に結合する機能を持つ分子（リガンド）としては、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸などがある。例えば、エクソソームの場合、いわゆる一般的なエクソソームマーカーして知られる、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１に対する抗体をはじめ、表出しているタンパク質に対する抗体を挙げることができる。タンパク質としては、例えば、ホスファチジルセリンへ特異的に結合するアネキシンＶ、ラクトアドへリン（又はＭｉｌｋ  ｆａｔ  ｇｌｏｂｕｌｅ−ＥＧＦ  ｆａｃｔｏｒ８  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＦＧＥ８）など、また糖鎖に結合するレクチン類がある。ペプチドとしては、例えば、表面に存在するタンパク質であるＥｐＣＡＭに結合するペプチドアプタマー（非特許文献５）などがある。また、核酸としては、ＣＤ６３に結合する一本鎖ＤＮＡアプタマーなどがある（非特許文献６）。
【００２８】
微粒子とリガンド分子との結合は先に述べた物理吸着以外にも、化学結合による方法も利用可能である。例えば、リガンド分子がチオール（−ＳＨ）またはジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）を有している場合、金などの金属表面への化学結合が可能になる。また、細胞外小胞上の標的分子に特異的に結合する機能を持つ分子を直接ナノ粒子表面に結合させるのではなく、リンカーを介してナノ粒子表面に結合させる方法も可能である。
【００２９】
リガンドが結合していないナノ粒子表面は、標的としていない細胞外小胞表面分子の非特異的な結合を避けるためにブロッキングを行うことが望ましい。ブロッキング分子としては、ＢＳＡのようなタンパク質、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）のような界面活性剤やｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＰＶＰ）のような高分子、あるいはこれらの混合物などがある。ブロッキングは、ナノ粒子をリガンドで被覆した直後に行ってもよいし、使用直前に行ってもよい。また、ナノ粒子を保存する溶液として、上記ブロッキング分子を含む緩衝液を用いることによって、ブロッキングを行ってもよい。
【００３０】
以下に実施例を示しながら説明する。
１．リガンドで被覆されたナノ粒子の製造
［実施例１］ＭＦＧＥ８（Ｍｉｌｋ  ｆａｔ  ｇｌｏｂｕｌｅ−ＥＧＦ  ｆａｃｔｏｒ  ８  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｌａｃｔａｄｈｅｒｉｎ）修飾金ナノ粒子の作製
平均粒子径約４０ｎｍ、プラズモンピーク波長においてＯＤ１のレーザー製金ナノ粒子コロイド溶液ｉ−ｃｏｌｌｏｉｄ  Ａｕ  ４０ｎｍ（ＩＭＲＡ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．製、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．ｉｃＡｕ４０−１−１００、Ｚｅｔａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ＜−６０ｍＶ、Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ＜１０μＳ／ｃｍ）１４．１ｍＬを１５ｍＬ遠心チューブに入れ、ｐＨ８．２の０．１Ｍホウ酸バッファー液０．６ｍＬを加え、攪拌する。
【００３１】
別の１５ｍＬ遠心チューブに、０．１ｍＬの脱イオン水と０．５ｍｇ／ｍＬのＢｏｖｉｎｅ  Ｌａｃｔａｄｈｅｒｉｎ（ＭＦＧＥ８）溶液（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）０．１ｍＬを入れ、上記作製したｐＨ８．２ホウ酸バッファー−金ナノコロイド混合液４．８ｍＬを注ぎ入れる。ボルテックスミキサーで攪拌し、室温のシェイカー上で回転数１００ｒｐｍにて３０分間インキュベーションさせる。なお、ＭＦＧＥ８はエクソソーム表面のホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するタンパク質である。
【００３２】
上記反応液を室温で３０分間４０００ｇの遠心分離にかけ、金ナノ粒子を沈降させる。上清を除去し、ｐＨ８．２の４ｍＭホウ酸バッファー液０．３ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで攪拌し、金ナノ粒子を再分散させる。
【００３３】
作製したＭＦＧＥ８修飾金ナノ粒子コロイド溶液を紫外可視分光光度計（ＵＶ−２７００、島津製作所製）で測定した吸光スペクトルをプラズモン吸収ピーク波長で規格化し、非修飾金ナノ粒子コロイド溶液の吸光スペクトルと比較したものを図２に示す。ＭＦＧＥ８修飾金ナノ粒子コロイド溶液のプラズモン吸収ピーク波長は５２８ｎｍでＯＤは１６．４であった。作製したＭＦＧＥ８修飾金ナノ粒子コロイド溶液は４℃で保存して用いた。
【００３４】
［実施例２］ＭＦＧＥ８修飾金−プラチナ合金ナノ粒子の作製
平均粒子径約４０ｎｍ、波長４００ｎｍにおいてＯＤ１のレーザー製金プラチナ合金ナノ粒子コロイド溶液ｉ−ｃｏｌｌｏｉｄ  ＡｕＰｔ  ４０ｎｍ（ＩＭＲＡ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．製、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．ｉｃＡｕＰｔ４０−１−１００、Ｚｅｔａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ＜−５０ｍＶ、Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ＜１０μＳ／ｃｍ）１４．１ｍＬを１５ｍＬ遠心チューブに入れ、ｐＨ８．２の０．１Ｍホウ酸バッファー液０．６ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで攪拌する。
【００３５】
１．７ｍＬ遠心チューブに、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＦＧＥ８溶液０．１ｍＬを入れ、上記作製したｐＨ８．２ホウ酸バッファーと金−プラチナ合金ナノ粒子コロイド溶液の混合液０．９ｍＬを注ぎ入れる。ボルテックスミキサーで攪拌し、室温のシェイカー上で回転数２００ｒｐｍにて２時間インキュベーションさせた後、４℃で一晩静置する。
【００３６】
上記チューブに入った反応液を室温で３０分間４０００ｇの遠心分離にかけ、金−プラチナ合金ナノ粒子を沈降させる。チューブ底のペレットを残し上清を除去する。ｐＨ８．２の４ｍＭホウ酸バッファー液０．５ｍＬをチューブに加え、ボルテックスミキサーで攪拌し、金−プラチナ合金ナノ粒子を再分散させる。
【００３７】
上記作製したＭＦＧＥ８修飾金−プラチナ合金ナノ粒子４０ｎｍを実施例１と同様にして測定した吸光スペクトルを図３に示す。波長４００ｎｍでＯＤは１．９６であった。
【００３８】
また、動的光散乱法（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．製、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ−９０）による粒子径測定を行った。測定されたＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｉａｍｅｔｅｒは７４．６１ｎｍで、ＭＦＧＥ８修飾前のＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｉａｍｅｔｅｒ  ５５．４４ｎｍに対して約１９ｎｍのサイズ増加が確認された。
【００３９】
上記、ＭＦＧＥ８修飾金−プラチナ合金ナノ粒子４０ｎｍコロイド溶液１．０ｍＬを室温で３０分間４０００ｇの遠心分離にかけ、上清０．９ｍＬを除去し、ＭＦＧＥ８修飾金−プラチナ合金ナノ粒子の濃度を１０倍濃縮し、使用時まで４℃で保存した。
【００４０】
［実施例３］抗ＣＤ８１モノクローナル抗体修飾金ナノ粒子の作製
実施例１で使用した金ナノ粒子コロイド溶液１４．１ｍＬを１５ｍＬ遠心チューブに入れ、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸バッファー液０．６ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで攪拌し、静置する。
【００４１】
抗ＣＤ８１モノクローナル抗体溶液（ＥＸＢＩＯ  Ｐｒａｈａ、ａ．ｓ．製、マウスモノクローナルＣＤ８１、Ｍ３８（ＩｇＧ１））２００μＬとｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸バッファー液５０μＬを入れ、混合する。
【００４２】
１．５ｍＬ遠心チューブに、上記抗ＣＤ８１モノクローナル抗体−リン酸バッファー溶液２０μＬを入れ、次に、上記作製したｐＨ７．０リン酸バッファー−金ナノコロイド混合液９８０μＬを注ぎ入れる。ボルテックスミキサーで攪拌し、室温で回転シェイカーを用い２時間インキュベーションする。
【００４３】
次に、新たな１．５ｍＬ遠心チューブに、混合液１．０ｍＬのうち半量である０．５ｍＬを取り出し、１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含む４ｍＭ  ｐＨ７．０リン酸バッファー液０．５ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで攪拌し、４℃で一晩インキュベーションさせる。インキュベーション後、再度ボルテックスミキサーで攪拌し、室温で１５分間２５００ｇの遠心分離にかけ、金ナノ粒子を沈降させる。チューブ底のペレットを残し上清約０．９５ｍＬを除去する。
【００４４】
作製した抗ＣＤ８１モノクローナル抗体修飾金ナノ粒子コロイド溶液を実施例１と同様にして吸光スペクトルを測定し、最終的なプラズモン吸収ピーク波長におけるＯＤが２０前後となるようにＢＳＡ濃度５ｍｇ／ｍＬを含む４ｍＭ  ｐＨ７．０リン酸バッファー液で希釈しながら調整する。
【００４５】
紫外可視分光光度計で測定した吸光スペクトルをプラズモン吸収ピーク波長で規格化し、非修飾金ナノ粒子コロイド溶液の吸光スペクトルと比較したものを図４に示す。抗ＣＤ８１モノクローナル抗体修飾金ナノ粒子コロイド溶液のプラズモン吸収ピーク波長は５３０ｎｍでＯＤは２１．０であった。作製した抗ＣＤ８１モノクローナル抗体修飾金ナノ粒子コロイド溶液は４℃で保存した。
【００４６】
２．ナノ粒子によるエクソソームの検出
［実施例４］ＭＦＧＥ８修飾金ナノ粒子を用いたエクソソームの検出
実施例１で作製したＭＦＧＥ８を修飾した４０ｎｍの金ナノ粒子（以下、Ｍ４０という。）を用いて、ＭＦＧＥ８とエクソソーム表面のホスファチジルセリンの結合を利用してエクソソームの検出を行った。
【００４７】
ＭｉａＰａｃａ−２ヒト膵がん細胞株の培養液からエクソソーム試料を調製した。超遠心法によって得られた粗エクソソームを密度勾配遠心法によって、チューブ上部の分画（密度の軽い分画）を分画１として、等量ずつ１０個の分画に分離した。ウェスタンブロッティング法により、各分画に発現しているタンパク質を、ナノ粒子解析装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社製、ＮａｎｏＳｉｇｈｔＬＭ１０）により各分画の粒子数（個／ｍＬ）を解析した。図５上は、細胞溶解液（Ｃ．Ｌ．）、マイクロベシクル粗精製物（Ｍ．Ｖ．１０Ｋ）、及び各分画を抗ＣＤ６３抗体、又は抗ＣＤ８１抗体によりウェスタンブロッティングで解析した結果を示す。図５下に示すように、粒子数は分画１、及び３に多いが、エクソソームマーカータンパク質として多用されているＣＤ６３及びＣＤ８１は分画３、４で特に発現が高い（図５上）。したがって、分画３、４にＣＤ６３やＣＤ８１が表出しているエクソソームが濃縮されていると考えられる。
【００４８】
上記エクソソームの分画１、２、３、７、８とＭ４０を０．０１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中で混合し、室温に３０分静置した。比較として、エクソソームの代わりに溶媒のＰＢＳのみと混合したもの、あるいはＢＳＡで修飾した金ナノ粒子（以下、Ｂ４０という。）をＣＤ６３やＣＤ８１が表出しているエクソソーム粒子が濃縮されている分画３と混合した試料も同様に調製した。各溶液は、エクソソーム分画に含まれる粒子の数を４．４×１０１０個／ｍＬとし、これに対して約３．６倍の数の金ナノ粒子を添加した。室温に３０分静置した溶液は金ナノ粒子に由来する赤色を帯びているが、分画の違いあるいはエクソソームの有無によって顕著な色の違いはみられなかった（図６（Ａ））。
【００４９】
各分画のエクソソーム、あるいはＰＢＳとＭ４０の混合液を、又は分画３（Ｆｒ．３）とＢ４０の混合液をｉｏｄｉｘａｎｏｌ密度勾配溶液の上に重層し低速遠心を行った。具体的には、１４％、１２％、１０％  ｉｏｄｉｘａｎｏｌを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４溶液を調製し、ガラスチューブ（マルエム社製、ミクロチューブＮｏ．１）の底から２００μＬ（１４％、密度１．０７９ｇ／ｍＬ）、１００μＬ（１２％、密度１．０６９ｇ／ｍＬ）、１００μＬ（１０％、密度１．０５８ｇ／ｍＬ）の順に積層して３段階の密度勾配溶液を調製した。その上にエクソソーム又はＰＢＳとＭ４０、あるいはエクソソームとＢ４０の混合液（４０μＬ）を重層し、４℃にセットした遠心機で１，５００ｇ、５分遠心した（コクサン社製遠心機Ｈ−３Ｒ、ローター：ＲＦ−１１０）。
【００５０】
遠心後のチューブの写真、及び金ナノ粒子とエクソソームの状態の模式図を図６（Ｂ）に示す。Ｍ４０は、エクソソームを含まない試料（ＰＢＳ）及びエクソソームの分画７、８との混合液では沈殿がみられなかったが、分画１、２、３との混合液では赤色の沈殿がみられた。一方、Ｂ４０と分画３との混合液では沈殿はみられなかった。金ナノ粒子に修飾されたＭＦＧＥ８がホスファチジルセリンの露出の多いエクソソームサブクラスと相互作用し、沈殿物を生じさせていると考えられる。
【００５１】
得られた沈殿物が、エクソソームとナノ粒子の複合体であることを確認するために、遠心後のチューブを３つの領域に分割し、エクソソームの存在をウェスタンブロッティングで調べた。
【００５２】
上記と同様にＭｉａＰａｃａ-２より調製したエクソソーム分画、あるいはＰＢＳと、ＭＦＧＥ８をコートしたナノ粒子Ｍ４０、又はエクソソーム分画とＢＳＡでコートしたＢ４０の混合液をｉｏｄｉｘａｎｏｌ密度勾配溶液の上に重層し低速遠心を行った。具体的には、１４％、１０％ｉｏｄｉｘａｎｏｌを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４溶液を調製し、０．２ｍＬ遠心チューブの底から１４％ｉｏｄｉｘａｎｏｌ溶液を６０μＬ、１０％溶液を６０μＬ、順に積層して２段階の密度勾配溶液を調製した。その上にエクソソームとＭ４０、あるいはエクソソームとＢ４０の混合液（１２μＬ）を重層し、２０℃にセットした遠心機で８００ｇ、６分遠心した（クボタ社製遠心機５５００、ローター：ＳＴ−７２２Ｍ）。遠心後のチューブのトップ（２０μＬ：ｔｏｐ）、ボトム（２０μＬ：ｒｅｓｉｄｕｅ（ｂｏｔｔｏｍ））、及びボトムの少し上の部分（２０μＬ：ｍｉｄｄｌｅ）を回収した（図７（Ａ））。
【００５３】
エクソソームマーカーであるＣＤ９の存在をウェスタンブロッティングにより解析を行った（図７（Ｂ））。エクソソームとＭＦＧＥ８をコートしたナノ粒子と混合した試料（Ｍ４０  ＥＶ）では、ＣＤ９は主にボトム領域から回収された。一方、エクソソームとコントロールであるＢＳＡをコートしたナノ粒子を混合した試料（Ｂ４０  ＥＶ）では、ＣＤ９由来のシグナルは、ほとんどトップに検出されていた。したがって、沈殿として得られた分画からは予想通りにエクソソームとナノ粒子の混合物であることが確認された。
【００５４】
エクソソーム表面に露出しているホスファチジルセリンの量が、分画３より分画１のほうが多いことを以下の方法で調べた。細胞膜表面のホスファチジルセリンを検出するために最もよく用いられているアネキシンＶを用いてエクソソーム膜表面のホスファチジルセリンを金粒子でラベルし、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観察した。
【００５５】
具体的には、エクソソームの分画１と分画３をアミノ化処理したマイカ基板に滴下し、１時間静置することでエクソソームを基板表面に吸着させた。基板をＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＨＢＳ）で洗浄後、５％ＢＳＡを含むＨＢＳ溶液を滴下し、室温で５分静置してブロッキングを行い、カルシウムを含むＨＢＳ（Ｃａ−ＨＢＳ）で１回洗浄した。Ｃａ−ＨＢＳ中でビオチン化アネキシンＶを添加して室温に２時間静置して結合させ、Ｃａ−ＨＢＳで洗浄後、二次抗体として２０ｎｍの金粒子とコンジュゲートした抗ビオチン抗体を添加し、４℃で一晩静置した。Ｃａ-ＨＢＳで洗浄後、グルタルアルデヒドと四酸化オスミニウムで固定した。Ｃａ-ＨＢＳで３回、水で５回洗浄し、室温に静置して乾燥させ、大気中、室温下でＡＦＭ（オックスフォード・インストゥルメンツ社製、アサイラムＭＦＰ−３Ｄ）観察を行った。
【００５６】
分画１と分画３のＡＦＭイメージを図８（Ａ）に示す。矢印はアネキシンＶを介して結合した金粒子を示している。エクソソームと金粒子が結合したエクソソームの数を計測した。金粒子が結合したエクソソームの割合は、分画１は２９％、分画３は１５％であった（図８（Ｂ））。このことから、ホスファチジルセリンが露出しているエクソソームは分画１のほうが分画３より多いと考えられる。
【００５７】
また、Ｍ４０がＭｉａＰａｃａ−２エクソソームに結合することをＡＦＭ観察によって確認した。アネキシンＶ及び抗ビオチン抗体を用いる代わりに、Ｍ４０を含む１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を滴下し室温に２時間静置した。ＰＢＳで３回、水で５回洗浄し、上記と同様の方法でＡＦＭ観察を行った。図９に示すように、基板上のエクソソームに多数の金ナノ粒子Ｍ４０が結合している様子が観察された（図９左）。レコンビナントのＭＦＧＥ８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２７６７−ＭＦ）を添加すると結合している金ナノ粒子Ｍ４０が大きく減少したことから（図９右）、エクソソームへのＭ４０の結合はＭＦＧＥ８に依存したものであると考えられる。
【００５８】
［実施例５］ＭＦＧＥ８修飾合金ナノ粒子を用いたエクソソームの検出
実施例２で合成したＭＦＧＥ８を修飾したプラチナと金からなる４０ｎｍの合金ナノ粒子（以下、ＭＡＰ４０という。）を用いて、エクソソーム表面のホスファチジルセリンの結合を利用してエクソソームの検出を行なった。
【００５９】
ＭｉａＰａｃａ−２の培養液から上記と同様に分離したエクソソームの分画１、３、４、６とＭＡＰ４０を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液中で混合し、室温に３０分静置した。比較として、エクソソームの代わりに溶媒のＰＢＳのみと混合したもの、あるいはＢＳＡで修飾した合金ナノ粒子（以下、ＢＡＰ４０という。）を分画１と混合した試料も同様に調製した。各溶液は、エクソソーム分画に含まれる粒子数を４×１０１０個／ｍＬとし、一定量の合金ナノ粒子（４００ｎｍにおける吸光度が２．４になる濃度）を添加して、合金の粒子数とエクソソーム分画に含まれる粒子数の比が同じになるように調製した。
【００６０】
静置後のエクソソームとＭＡＰ４０の混合液２０μＬを、１４％  ｉｏｄｉｘａｎｏｌ、１００μＬ、１０％  ｉｏｄｉｘａｎｏｌ、４０μＬの密度勾配溶液の上に重層し低速遠心を行った。遠心は２０℃にセットした遠心機で６００ｇ、５分で行った（クボタ社製遠心機５５００、ローター：ＳＴ−７２２Ｍ）。
【００６１】
遠心後のチューブの写真を図１０に示す。ＭＡＰ４０は、エクソソームを含まない試料（ＰＢＳ）及びエクソソームの分離分画４、６との混合液では、上方に合金ナノ粒子に由来する黒色のバンドがみられ沈殿はみられなかった。しかし、分画１、３との混合液では黒色のバンドは薄くなり、黒色の沈殿がみられた。一方、ＢＡＰ４０と分画１との混合液では沈殿は見られなかった。以上のように、ＭＡＰ４０においてもＭ４０と同様にエクソソームを含む試料では沈殿が見られるという結果が得られた。
【００６２】
沈殿の量は、試料中に含まれるエクソソーム粒子の数に依存して変化した（図１１）。分画１に含まれるエクソソームの粒子数を２、４、あるいは６×１０１０個／ｍＬに変えて、上記と同様の条件で遠心を行った。図１１においてかっこ内の数字は、エクソソームの粒子数（×１０１０個／ｍＬ）を示しているが、分画１に含まれるエクソソームの粒子数を２、４、あるいは６×１０１０個／ｍＬに変化させて比較すると、エクソソーム粒子数が多くなるにつれて沈殿量も多くなった。
【００６３】
次に、沈殿が、エクソソーム表面の分子とナノ粒子の特異的な結合によるものであることを試料にＭＦＧＥ８を添加することによって確認した。ＭＦＧＥ８（０．５６μＭ）と分画１を混合し室温に４０分静置した後、上記と同様にＭＡＰ４０と混合及び遠心の操作を行った。ＭＡＰ４０と混合する前に、分画１とＭＦＧＥ８を混合すると沈殿はみられなくなった（図１２）。
【００６４】
［実施例６］抗ＣＤ８１抗体修飾金ナノ粒子を用いたエクソソームの検出
実施例３で製造した金ナノ粒子（以下、８１Ａ４０という。）を用いてエクソソームの検出を行った。
【００６５】
実施例４と同様にしてエクソソームを調製し、分離したエクソソームの分画１、３、４、６と８１Ａ４０を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液中で混合し、室温に２時間静置した。比較として、エクソソームの代わりに溶媒であるＰＢＳのみと混合したもの、あるいはアイソタイプコントロール抗体で修飾した金ナノ粒子（以下、ｃｔＡ４０という。）を分画３と混合した試料も同様に調製した。各溶液は、エクソソーム分画に含まれる粒子の数を３．３×１０１０個／ｍＬとし、これに対して約４．９倍の数の金ナノ粒子を添加した。
【００６６】
静置後のエクソソームと金ナノ粒子の混合液を、ｉｏｄｉｘａｎｏｌ密度勾配溶液の上に重層し低速遠心を行った。具体的には、１４％、１０％  ｉｏｄｉｘａｎｏｌを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４溶液を調製し、０．２ｍＬのプラスチックチューブ（グライナー社製、ＰＣＲチューブ）の底から１００μＬ（１４％）、４０μＬ（１０％）の順に重層して２段階の密度勾配層を調製した。その上にエクソソームと金ナノ粒子の混合液（２０μＬ）を重層し、２０℃にセットした遠心機で１０００ｇ、５分遠心した（クボタ社製遠心機５５００、ローター：ＳＴ−７２２Ｍ）。
【００６７】
遠心後のチューブの写真を図１３（Ａ）に示す。抗ＣＤ８１抗体で被覆された金ナノ粒子８１Ａ４０は、エクソソームを含まない試料（ＰＢＳ）及びエクソソームの分離分画１、６との混合液では、上方に金ナノ粒子に由来する赤色のバンドがみられ沈殿はみられなかった。しかし分画３、４との混合液では上方の赤色のバンドが薄くなり、赤色の沈殿がみられた。一方、ｃｔＡ４０と分画３との混合液では沈殿はみられなかった。図５で示したように、分画３、４ではＣＤ８１の発現が高いことから、８１Ａ４０はＣＤ８１の発現が高いエクソソームサブクラスと相互作用し沈殿を生じていると考えられる。
【００６８】
次に、単一の密度層の上にサンプルを含む層を積層した場合でも、エクソソームの検出が可能であることを示す。実施例４と同様にしてＭｉａＰａｃａ−２からエクソソームを調製し、分離したエクソソームの分画３、あるいはＰＢＳと８１Ａ４０を混合した。混合した溶液と２０％ｉｏｄｉｘａｎｏｌ各２０μＬを混合し（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ最終濃度は１０％）、室温で静置した後、１６０μＬの３０％ｉｏｄｉｘａｎｏｌ上に積層した。
【００６９】
遠心は２０℃にセットした遠心機で１０００ｇ、５分で行った（クボタ社製遠心機５５００、ローター：ＳＴ−７２２Ｍ）。図１３（Ｂ）左に示すように、分画３と８１Ａ４０を混合した試料では、エクソソームの沈殿が検出された。さらに、１０００ｇ、２分の遠心を行うことにより、分画３と混合した試料では、はっきりと沈殿を確認することができた。単一の層の上にエクソソームと修飾ナノ粒子を混合した試料溶液を積層した場合でもエクソソームを沈殿させ、検出することが可能であった。
【００７０】
［実施例７］抗ＥｐＣＡＭ抗体修飾金ナノ粒子を用いたエクソソームの検出
ナノ粒子にコートする分子を変えることにより、所望のエクソソームを分画できることを示す。一例として、循環腫瘍マーカーとして頻繁に使われているＥｐＣＡＭ陽性エクソソームの検出に利用できることを示す。
【００７１】
ＥｐＣＡＭ陽性がん細胞からＥｐＣＡＭ陽性エクソソームが放出されることは、すでに確認している。そこで、ＥｐＣＡＭに対する抗体分子をナノ粒子にコートし、ＥｐＣＡＭ陽性がん細胞株、ＥｐＣＡＭ陰性がん細胞株から分離したエクソソームを用いて解析した。ＥｐＣＡＭ分子は多くの上皮性がん腫瘍で発現が認められるが、ここで用いた大腸がん由来細胞株ＨＣＴ１５では発現が認められ、他方、肉腫由来細胞株ＨＴ−１０８０では発現が認められない。
【００７２】
実施例３と同様にして、抗ＥｐＣＡＭ抗体（マウスモノクローナル抗体、ＶＵ−１Ｄ９、ＧｅｎｅＴｅｘ社製）で金ナノ粒子を被覆した。ＨＣＴ１５（ＥｐＣＡＭ陽性）、又はＨＴ−１０８０（ＥｐＣＡＭ陰性）からエクソソームを調製し、抗ＥｐＣＡＭ抗体で被覆したナノ粒子（Ｖ４０）、又はコントロールとしてＢＳＡで被覆したナノ粒子（Ｂ４０）と混合し密度勾配遠心を行った。具体的には、１４％、１２％、１０％のｉｏｄｉｘａｎｏｌ溶液を底から６０μＬ（１４％）、３０μＬ（１２％）、３０μＬ（１０％）積層し、金ナノ粒子と混合した試料を１２μＬ積層し、８００ｇ、５分遠心を行った（クボタ社製遠心機５５００、ローター：ＳＴ−７２２Ｍ）。ＥｐＣＡＭを発現する大腸がん由来細胞株、ＨＣＴ−１５から調整したエクソソームをＥｐＣＡＭに対する抗体をコートした金ナノ粒子Ｖ４０と混合したときのみ、沈殿が観察される（図１４（Ａ））。
【００７３】
次に、生じる沈殿量が、ＥｐＣＡＭ発現量を反映していることを示す。大腸がん由来細胞株のＨＣＴ−１５とＨＴ−２９は、いずれもＥｐＣＡＭを発現する細胞株である。実施例４と同様にして各細胞株の培養液からエクソソーム試料を調製し、密度勾配遠心法によって、チューブ上部の分画から、等量ずつ分画を分離した。
【００７４】
次に抗ＥｐＣＡＭ抗体で被覆したナノ粒子と、調製した各分画同じ液量のエクソソームとを混合し、上記と同様にして密度勾配遠心を行い、生じる沈殿を比較した。ＨＣＴ−１５の分画３の方がＨＴ−２９の分画３より沈殿量が多くなっている（図１４（Ｂ）左）。ウェスタンブロッティングにより、夫々の分画３のＣＤ６３、及びＥｐＣＡＭ発現量を比較すると、ＨＣＴ−１５の方が、ＥｐＣＡＭが多く検出されていた（図１４（右））。したがって、沈殿量がエクソソームのＥｐＣＡＭ発現量を反映している。
【００７５】
［実施例８］デュラマイシンを用いたエクソソームの検出
デュラマイシンは放線菌由来のペプチド抗生物質であるが、エクソソームに含まれる脂質のホスファチジルエタノールアミンに結合する。デュラマイシンで被覆したナノ粒子を用いたエクソソームの検出結果を示す（図１５）。ストレプトアビジンで修飾した金ナノ粒子を作製し、ビオチン標識したデュラマイシンを結合させた。
【００７６】
デュラマイシンで被覆した金ナノ粒子と、細胞株ＨＴ−２９、ＨＴ−１０８０から分離したエクソソームを混合し、複合体を形成し、沈殿を生じるか解析を行った（図１５（Ａ））。ストレプトアビジン−ビオチンを介してデュラマイシンを被覆した金ナノ粒子、デュラマイシンの代わりに溶媒であるＤＭＳＯと混合した金ナノ粒子を、ＨＴ−２９の分画２から調製したエクソソーム、コントロールとしてＰＢＳのみと混合した。その後、１４％、１２％、１０％のｉｏｄｉｘａｎｏｌ溶液をチューブ下層から６０μＬ（１４％）、３０μＬ（１２％）、３０μＬ（１０％）の順に積層して３段階の密度勾配溶液を作製し、上記で調製したエクソソーム、あるいはＰＢＳとナノ粒子の混合物１２μＬを積層し、クボタ社製遠心機５５００により８００ｇ、４分遠心を行った（（図１５（Ａ）上図）。デュラマイシンで被覆したナノ粒子とエクソソームを混合した場合のみ、沈殿が生じるのが観察された。
【００７７】
また、ＨＴ−１０８０より調製したエクソソーム、又はＰＢＳと、デュラマイシンで被覆したナノ粒子を混合し、上記と同様にして密度勾配遠心を行い、沈殿が生じるか解析を行ったところ、エクソソームと混合した試料のみ沈殿が確認された（図１５（Ａ）下左図）。また、５、７．５、１０×１０１０個／ｍＬとエクソソーム量を変えて解析を行ったところ、エクソソーム量に対応して沈殿量が増加することが確認された（図１５（Ａ）下右図）。
【００７８】
さらに、デュラマイシンで被覆した金ナノ粒子がエクソソームに結合していることをＡＦＭによって示した（図１５（Ｂ））。デュラマイシンを被覆したナノ粒子、あるいはデュラマイシンが結合していないナノ粒子（ＤＭＳＯ）と、ＨＴ−１０８０から調製したエクソソームとを混合し、実施例４と同様にして顕微鏡観察用の試料を作製した。デュラマイシンで被覆されたナノ粒子を用いた場合には、エクソソームと金ナノ粒子との結合が観察される。他方、デュラマイシンが結合していない金ナノ粒子（ＤＭＳＯ）と混合しても結合は観察されなかった。
【００７９】
上記実施例で示したＭＦＧＥ８、デュラマイシン、抗ＣＤ８１抗体や抗ＥｐＣＡＭ抗体のように、コートするプローブの分子種を変えることにより、エクソソームを回収することができる。すなわち、エクソソームのサブクラスを分画して回収することができる。
【００８０】
［実施例９］密度の検討
媒質層の密度を変えて、ナノ粒子が結合した細胞外小胞を分画できる密度を検討した。ＢＳＡで修飾した金ナノ粒子を用いて、金ナノ粒子が沈殿しない媒質層の密度の検討を行った。図１６（Ａ）の表に示すように試験番号１から７では、８％、１０％、１２％、１４％のｉｏｄｉｘａｎｏｌを１００〜４００μＬずつ積層したうえに、ＰＢＳに混合した金ナノ粒子試料液４０μＬを重層し、コクサン遠心機により４℃で１０００ｇ、１０分遠心を行った。
【００８１】
金ナノ粒子の存在するところを図１６（Ａ）では矢印で、また、表では下線で示している。いずれの試験でも、金ナノ粒子は遠心後ｉｏｄｉｘａｎｏｌが１２％以上の媒質には存在しない。また、試験１、５に見られるように、ｉｏｄｉｘａｎｏｌが１０％であっても、それよりも２％濃度の低い媒質を積層した場合には、１０％  ｉｏｄｉｘａｎｏｌ層には入っていかない。また、試験３のように単一層ではナノ粒子は下方に拡散してしまう。ここではデータを示さないが、１２％、１４％  ｉｏｄｉｘａｎｏｌであっても、単一層を用いた場合にはナノ粒子の拡散が見られた。
【００８２】
さらに、密度勾配について検討を行った。ｉｏｄｉｘａｎｏｌ溶液をチューブ下層から上記と同様に１００μＬ（１４％）、４０μＬ（１０％）の順に積層して２段階の密度勾配溶液を作製したものと、１４０μＬの１４％のｉｏｄｉｘａｎｏｌ単独の溶液にｃｔＡ４０のみを２０μＬ積層し、上記と同様に１０００ｇ、５分遠心した（クボタ社製遠心機５５００、ローター：ＳＴ−７２２Ｍ）（図１６（Ｂ））。１４％のｉｏｄｉｘａｎｏｌ単独の溶液では金ナノ粒子が広がっているのに対し、ステップ勾配遠心にすると金ナノ粒子は沈殿しない。
【００８３】
これらの結果から、単一の層ではナノ粒子が拡散してしまい分離することが困難となるが、２以上の層を設けることによって、エクソソームと結合し重くなったナノ粒子とエクソソーム複合体は分離することができる。すなわち、エクソソームを沈殿させるためには、サンプル層を含め、密度の異なる少なくとも２つの層が必要であると結論付けた。
【００８４】
以上の結果から、１０％  ｉｏｄｉｘａｎｏｌ、すなわち密度１．０５３ｇ／ｍＬ以下になるように、表面分子に結合するリガンドで修飾したナノ粒子と細胞外小胞を含む溶液を調製し、より高い密度層の上に積層すれば、細胞外小胞と結合したナノ粒子は沈殿し、結合しなかったナノ粒子は沈殿しないことから、細胞外小胞を表面分子によって分画することができる。
【００８５】
［実施例１０］粗エクソソームを用いた検討
エクソソームの精製を行わない未精製の状態で、エクソソームを検出することができれば、臨床検査などにおいて、非常に有用である。そこで、粗精製のエクソソームを用いて同様に検出を行うことができるか検討した。
【００８６】
超遠心法によって濃縮したＭｉａＰａｃａ−２の粗エクソソームとＭＡＰ４０、あるいはＢＡＰ４０と混合した試料２０μＬを１４％  ｉｏｄｉｘａｎｏｌ、１００μＬ、１０％  ｉｏｄｉｘａｎｏｌ、４０μＬの密度勾配層の上に積層し、コクサン遠心機で４℃において８００ｇ、５分遠心した（図１７）。ＭＡＰ４０と粗エクソソームを混合した試料では沈殿がみられるのに対し、ＢＡＰ４０と混合した試料では沈殿は見られなかった。精製した試料でなくても、この方法を用いることにより特定のサブクラスのエクソソームを分離できることから、検査、研究において非常に有用な方法である。
【００８７】
［実施例１１］血漿を用いた解析
卵巣がん患者の血漿中にはホスファチジルセリン陽性ベシクルが存在するとの報告があるが、膵がん患者については情報がない。倫理委員会の承認を得て、がん研有明病院で採取された膵がん患者の血漿を材料として用い、解析を行った。基礎的な情報を得るために、膵がん患者血漿、健常人血漿から、２０Ｋ、１６０Ｋの遠心操作で、エクソソーム粒子を沈殿させ、ＣＤ９をマーカーとしてエクソソーム粒子が存在することをウェスタンブロッティングで確認した（図１８（Ａ））。
【００８８】
エクソソームマーカーとして用いているＣＤ９のシグナルは、１６０Ｋ沈殿物、及び２０Ｋ分画から検出される。しかし、主に小さな粒子が含まれる１６０Ｋ分画に強いシグナルが観察され、エクソソームが濃縮されていることが示された。ナノ粒子解析装置によって、患者３名、健常者１名の粒径分布を解析したところ、１６０Ｋ分画が含む粒子の最頻値粒径は、いずれも１００ｎｍ前後でいわゆるエクソソームの粒径範囲であった。
【００８９】
上記遠心条件で得られた上清（Ｓｕｐ）分画には、ＣＤ９シグナルが殆ど検出されなかった。したがって、エクソソームが含まれない夾雑物からのみなる体液として取り扱える。そこで、健常者の血漿から、エクソソームを除去した上清（ＥＶ−ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ）に、分離したＨＴ−２９由来エクソソームを添加し、沈殿実験をおこなった。コントロールとして０．４％ＢＳＡを含むＰＢＳ（図中ＰＢＳ）を用いた（図１８（Ｂ））。ＢＳＡ含有ＰＢＳと比べて少ないものの、ＥＶ−ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａでもエクソソームの沈殿がみられた。
【００９０】
次に、健常者と膵がん患者から回収した１６０Ｋのエクソソームを用いて０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で沈殿実験を行った。膵がん患者由来エクソソームと計算上、同じ粒子数、又は同じタンパク質量の健常者エクソソームをコントロールに用いた（図１８（Ｃ））。
【００９１】
膵がん患者と健常者の間で、沈殿量の差が見られた。この観察は、膵がん患者のエクソソームにはホスファチジルセリン陽性エクソソームの割合が増えているという、既報の卵巣がんでの結果と合致する。この結果は、回収されるエクソソーム量から、疾患を検査することができることを示唆している。
【００９２】
以上、実施例で示したように、エクソソームの表面に存在する分子に結合するリガンドを被覆したナノ粒子を用いることによって、低速遠心でエクソソームを沈殿させることができる。表面に存在する分子を利用してサブクラスに分類することができることから、サブクラスに分類したうえでエクソソーム解析を行うことができるようになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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