(57)【要約】【課題】低濃度核酸標準試料に含まれる核酸の分子数が高精度に制御された細胞保持基材を得ることができる細胞保持基材の生成方法の提供。【解決手段】少なくとも１つの細胞保持領域を有する基材に対して、液滴吐出手段により細胞懸濁液を液滴として吐出する液滴吐出工程と、前記液滴の前記細胞保持領域への飛翔中に、前記液滴に含まれる細胞数を複数のセンサによって２以上の方向から計数する細胞数計数工程と、少なくとも１つの前記細胞保持領域に所定数の細胞が配置されるように前記液滴を着弾させる液滴着弾工程と、を含む細胞保持基材の生成方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの細胞保持領域を有する基材に対して、液滴吐出手段により細胞懸濁液を液滴として吐出する液滴吐出工程と、
前記液滴の前記細胞保持領域への飛翔中に、前記液滴に含まれる細胞数を複数のセンサによって２以上の方向から計数する細胞数計数工程と、
少なくとも１つの前記細胞保持領域に所定数の細胞が配置されるように前記液滴を着弾させる液滴着弾工程と、を含むことを特徴とする細胞保持基材の生成方法。
【請求項２】
前記細胞懸濁液に含まれる細胞の細胞周期を測定し、
測定した前記細胞周期に基づき前記細胞懸濁液に含まれる細胞数から特定の塩基配列を有する核酸の数を推定し、
推定した前記特定の塩基配列を有する核酸の数に基づき前記各細胞保持領域内へ配置された前記特定の塩基配列を有する核酸の数を算出する請求項１に記載の細胞保持基材の生成方法。
【請求項３】
前記センサが、前記液滴が細胞保持領域の直上の位置にあるタイミングで、飛翔中の前記液滴中の細胞数を計数する請求項１から２のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法。
【請求項４】
前記センサが、前記液滴吐出手段の吐出面から、前記液滴の吐出方向と反対方向の領域に設置される請求項１から３いずれかに記載の細胞保持基材の生成方法。
【請求項５】
前記細胞保持領域内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数を前記センサにより計数された値を用いて出力する出力工程をさらに含む請求項１から４のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法。
【請求項６】
前記液滴着弾工程において、複数の水準を得るように前記液滴を前記細胞保持領域内に着弾させる請求項１から５のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法。
【請求項７】
前記細胞が、光を受光したときに発光可能な細胞であり、
前記センサが、前記液滴内の前記細胞からの蛍光を受光する光学センサであり、
前記細胞数が、前記光学センサにより計数された値に基づいて算出される請求項１から６のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法。
【請求項８】
前記液滴吐出手段が、オンデマンド式である請求項１から７のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法。
【請求項９】
前記特定の塩基配列を有する核酸を有する複数の細胞及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する細胞懸濁液生成工程をさらに含む請求項１から８のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法。
【請求項１０】
前記細胞の細胞周期、前記液滴に含まれる細胞数を計数する精度、及び前記細胞保持領域内の目的範囲内に前記液滴が着弾する割合（精度）の少なくともいずれかに基づき、前記細胞保持領域に含まれる前記核酸の数の平均値を算出する核酸数算出工程をさらに含む請求項２から９のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法により生成された細胞保持基材を用いて核酸を検出する核酸検出装置の評価を行うことを特徴とする装置評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞保持基材の生成方法、及び装置評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分析技術の高感度化により、測定対象を分子数単位で測定することが可能となっており、食品、環境検査、及び医療へ、微量核酸を検出する遺伝子検出技術の産業利用が求められている。
【０００３】
例えば、分子生物学研究分野で多く使用されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)は、その技術特性から、理論上１分子の核酸からでも増幅が可能とされている。
これらの微量の遺伝子検出においては、定量解析を行う場合に、標準試料を用いる必要があり、例えば、特定の塩基配列を有するＤＮＡ断片を限界希釈し、得られた希釈液のリアルタイムＰＣＲの結果から、目的とする分子数を含む希釈液を選別する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、特定のコピー数のＤＮＡ断片を細胞に遺伝子組み換え技術により導入し、培養した細胞を単離することにより、目的のコピー数のＤＮＡ断片を含有する標準試料の製造方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
また、複数の細胞を含む溶液をインクジェット法により液滴として吐出する技術の開発も行われている。細胞を代表とする粒子を含む液滴を吐出する際に、吐出する液滴中にどの程度の数の粒子が含まれているのかを検知することは重要である。
【０００５】
このような機能を備えた方法として、例えば、圧電素子によって液室の振動板を加圧してノズルから細胞を含有する液滴を吐出し、吐出した液滴にレーザー光を照射し、ＣＣＤカメラ又はフォトダイオードで撮影あるいは光量を測定することで吐出した液滴中の細胞数を計測する吐出方法が提案されている（例えば、特許文献３参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、低濃度核酸標準試料に含まれる核酸の分子数が高精度に制御された細胞保持基材を得ることができる細胞保持基材の生成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
課題を解決するための手段としての、本発明の細胞保持基材の生成方法は、少なくとも１つの細胞保持領域を有する基材に対して、液滴吐出手段により細胞懸濁液を液滴として吐出する液滴吐出工程と、
液滴の細胞保持領域への飛翔中に、液滴に含まれる細胞数を複数のセンサによって２以上の方向から計数する細胞数計数工程と、
少なくとも１つの細胞保持領域に所定数の細胞が配置されるように液滴を着弾させる液滴着弾工程と、を含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、低濃度核酸標準試料に含まれる核酸の分子数が高精度に制御された細胞保持基材を得ることができる細胞保持基材の生成方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の各工程の一例を示すフローチャートである。
【図２】図２は、ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、図３Ｂにおけるピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。
【図４Ａ】図４Ａは、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。
【図５Ａ】図５Ａは、液滴の状態の一例を示す模式図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、液滴の状態の一例を示す模式図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、液滴の状態の一例を示す模式図である。
【図６】図６は、細胞保持基材の細胞保持領域内に順次液滴を着弾させるための装置の一例を示す概略図である。
【図７】図７は、液滴形成装置の一例を示す模式図である。
【図８】図８は、図７の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。
【図９】図９は、図７の制御手段の機能ブロックを例示する図である。
【図１０】図１０は、液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、図７の液滴形成装置の変形例を示す模式図である。
【図１２】図１２は、図７の液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、飛翔する液滴に２個の蛍光粒子が含まれる場合を例示する図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、飛翔する液滴に２個の蛍光粒子が含まれる場合を例示する図である。
【図１４】図１４は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。
【図１５】図１５は、図７の液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。
【図１６】図１６は、液滴形成装置の他の一例を示す模式図である。
【図１７】図１７は、マイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法の一例を示す模式図である。
【図１８】図１８は、吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法の一例を示す模式図である。
【図１９】図１９は、確率Ｐ（＞２）と平均細胞数の関係を表すグラフである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、ノロウイルスのオープンリーディングフレーム１部分のプライマーとプローブの位置を表す図である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ノロウイルスのオープンリーディングフレーム２部分のプライマーとプローブの位置を表す図である。
【図２１】図２１は、酵母のＧ０／Ｇ１期における同調を示すフローサイトメトリーの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（細胞保持基材の生成方法）
本発明の細胞保持基材の生成方法は、少なくとも１つの細胞保持領域を有する基材に対して、液滴吐出手段により細胞懸濁液を液滴として吐出する液滴吐出工程と、液滴の細胞保持領域への飛翔中に、液滴に含まれる細胞数を複数のセンサによって２以上の方向から計数する細胞数計数工程と、少なくとも１つの細胞保持領域に所定数の細胞が配置されるように液滴を着弾させる液滴着弾工程と、を含み、細胞懸濁液生成工程、及び核酸抽出工程を含むことが好ましく、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程における推定する核酸の数の確からしさを算出する工程、出力工程、記録工程を含むことがより好ましく、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００１１】
本発明者らは、低濃度核酸標準試料に含まれる核酸の分子数が高精度に制御された細胞保持基材を得ることができる細胞保持基材の生成方法について検討したところ、以下の知見を得た。
例えば、従来の核酸溶液試料の製造方法であると、低濃度核酸標準試料を限界希釈法により調製しているため、確率的に核酸を含まない場合や、所望の核酸の分子数を試料に含有させることが難しいという問題がある。
また、例えば、従来の標準試料の製造方法では、特定コピー数のＤＮＡ断片を導入した細胞を手技により単離しているため、単離の際に生じる不確定な要因によって所望の核酸の分子数を含有する試料を調製することが難しいという問題がある。
さらに、例えば、従来の吐出方法では、吐出した液滴中に含まれる細胞数を計数手段により計数しているが、液滴中の細胞を１方向からしか計数していないため、液滴中の細胞を精度良く計数することが難しいという問題がある。
本発明者らは、細胞懸濁液を液滴として吐出し、当該液滴に含まれる細胞数を複数のセンサによって２以上の方向から計数することにより、低濃度核酸標準試料に含まれる核酸の分子数が高精度に制御された細胞保持基材を得ることができることを見出した。
【００１２】
以下に、本発明の細胞保持基材（細胞数既知プレート、又は核酸抽出済プレート）の生成方法の一例を示すフローチャートを図１に示すと共に、各工程（ステップ）について以下に説明する。
図１に示すように、本発明の細胞保持基材の生成方法は、Ｂ：液滴吐出工程、Ｃ：細胞数計数工程、及びＤ：液滴着弾工程を含み、更に必要に応じて、Ａ：細胞懸濁液生成工程、Ｅ：Ａ〜Ｄ工程における推定する核酸の数の確からしさを算出する工程、Ｆ：核酸数算出工程、Ｇ：出力工程、Ｈ：記録工程、Ｉ：核酸抽出工程、Ｊ：酵素失活工程を含む。また、必要に応じて、Ａ：細胞懸濁液生成工程において、Ａ２：細胞懸濁液に含まれる核酸の数を推定してもよく、Ｃ：細胞数計数工程において、Ｃ１：吐出前に細胞を観察する処理、及びＣ３：着弾後の細胞をカウントする処理を含んでもよい。
【００１３】
＜細胞懸濁液生成工程＞
前記細胞懸濁液生成工程は、特定の塩基配列を有する核酸を有する複数の細胞、及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する工程である。
溶剤とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。
細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が溶剤中に分散して存在する状態を意味する。
生成とは、作り出すことを意味する。
【００１４】
−細胞懸濁液−
前記細胞懸濁液は、特定の塩基配列を有する核酸を有する複数の細胞、及び溶剤を含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
【００１５】
−−細胞−−
前記細胞は、特定の塩基配列を有する核酸を有し、かつ複数である。
細胞とは、生物体を形成する構造的及び機能的単位を意味する。
【００１６】
細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１７】
真核細胞としては、特に制限はなく、目的応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌、藻類、原生動物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞、真菌が好ましい。
【００１８】
接着性細胞としては、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものでもよく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。
【００１９】
分化した細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。
【００２０】
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。
【００２１】
真菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞周期を調節することができ、１倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。
細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞（娘細胞）が再び細胞分裂を行う細胞（母細胞）となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
【００２２】
酵母菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞周期をＧ１期に制御するフェロモン（性ホルモン）の感受性が増加したＢａｒ−１欠損酵母が好ましい。酵母菌がＢａｒ−１欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、細胞容器（例えば、ウェルプレート、マイクロプレート、マイクロタイタープレートなど）内に収容された細胞の特定の塩基配列を有する核酸の数の増加等を防ぐことができる。
【００２３】
原核細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２４】
細胞としては、死細胞が好ましい。死細胞であると、分取後に細胞分裂が起こることを防ぐことができる。
また、細胞としては、光を受光したときに発光可能な細胞であることが好ましい。光を受光したときに発光可能な細胞であると、細胞の数を高精度に制御して細胞保持基材に着弾させることができる。
受光とは、光を受けることを意味する。
光学センサとは、人間の目で見ることができる可視光線と、それより波長の長い近赤外線や短波長赤外線、熱赤外線領域までの光のいずれかの光をレンズで集め、対象物である細胞の形状などを画像データとして取得する受動型センサを意味する。
【００２５】
−−光を受光した時に発光可能な細胞−−
光を受光したときに発光可能な細胞としては、光を受光したときに発光可能であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、蛍光色素によって染色された細胞、蛍光タンパク質を発現した細胞、蛍光標識抗体により標識された細胞などが挙げられる。
細胞における蛍光色素による染色部位、蛍光タンパク質の発現部位、又は蛍光標識抗体による標識部位としては、特に制限はなく、細胞全体、細胞核、細胞膜などが挙げられる。
【００２６】
−−−蛍光色素−−−
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類が好ましく、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３がより好ましい。
【００２７】
蛍光色素としては、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、商品名：ＥｏｓｉｎＹ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：エバンスブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：トリパンブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン６Ｇ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミンＢ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン１２３（和光純薬工業株式会社製）などが挙げられる。
【００２８】
−−−蛍光タンパク質−−−
蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２９】
−−−蛍光標識体−−−
蛍光標識抗体としては、蛍光標識されていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３０】
［光を受光したときに発光可能な細胞懸濁液の作製方法］
５０ｇ／Ｌ  のＹＰＤ培地（例えば、商品名：ＹＰＤ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等で培養した遺伝子組換え酵母を９０ｍＬ分取した三角フラスコに、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製、以下、「ＤＰＢＳ」とも称することがある）を用いて５００μｇ／ｍＬとなるように調製したαファクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、α１−Ｍａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｃｅｔａｔｅ  ｓａｌｔ）を９００μＬ添加し、バイオシェイカー（例えば、装置名：ＢＲ−２３ＦＨ、タイテック株式会社製）を用いて、振盪速度：２５０ｒｐｍ、温度：２８℃にて２時間インキュベートし、酵母をＧ０／Ｇ１期に同調して酵母懸濁液を得る。
同調確認済み酵母懸濁液を遠心管（例えば、ビオラモ、商品名：ＶＩＯ−５０Ｒ、アズワン株式会社製）に４５ｍＬ移し、遠心分離機（例えば、装置名：ＣＦ１６ＲＮ、株式会社日立製作所製）を用いて、回転速度：３,０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得る。酵母ペレットにホルマリン（例えば、和光純薬工業株式会社製、０６２−０１６６１）を４ｍＬ添加し、５分間静置後、遠心して上澄み液を除去し、エタノールを１０ｍＬ添加して懸濁させることにより固定化済みの酵母懸濁液を得る。
固定化済み酵母懸濁液を１．５ｍＬ遮光チューブ（例えば、ワトソン株式会社製、１３１−９１５ＢＲ）に５００μＬ移し、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去し、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（例えば、ＴＯＣＲＩＳ社製、２００−４４９−４）となるように調製したＤＰＢＳ（１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を４００μＬ添加し、ピペッティングでよく懸濁した後、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去することにより酵母ペレットを得る。ペレットに１ｍｇ／ｍＬに調製したエバンスブルー水溶液（例えば、和光純薬工業株式会社製、０５４−０４０６１）を１ｍＬ添加し、ボルテックスを用いて５分間撹拌後、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去し、ＤＰＢＳ（１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ボルテックスで撹拌することにより染色済み酵母懸濁液を得ることができる。
【００３１】
細胞の体積平均粒径としては、遊離状態において、１００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下が特に好ましい。体積平均粒径が、１００μｍ以下であれば、インクジェット法に好適に用いることができる。
【００３２】
細胞の体積平均粒径としては、例えば、下記の測定方法で測定することができる。
作製した染色済み酵母分散液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに乗せ、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いることにより体積平均粒径を測定することができる。なお、細胞数も同様の測定方法により求めることができる。
【００３３】
細胞懸濁液における細胞の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下がより好ましい。細胞数が、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができる。細胞数としては、体積平均粒径の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。
【００３４】
特定の塩基配列を有する核酸を有する細胞の細胞数は、複数であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
−−−特定の塩基配列を有する核酸−−−
特定の塩基配列を有する核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、感染症検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない核酸、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、特定の塩基配列を有する核酸としては、プラスミドも好適に使用することができる。
特定とは、特に定められていることを意味する。
核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖、及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味する。
【００３６】
特定の塩基配列を有する核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられる。これらの中でも、ノロウイルスなどの感染症固定領域に由来するＲＮＡに対応するＤＮＡ、自然界に存在しないＤＮＡなどが好適に用いることができる。
【００３７】
特定の塩基配列を有する核酸を有する複数の細胞は、使用する細胞由来の特定の塩基配列を有する核酸であってもよく、遺伝子導入により導入された特定の塩基配列を有する核酸であってもよい。特定の塩基配列を有する核酸として、遺伝子導入により導入された特定の塩基配列を有する核酸、及びプラスミドを使用する場合は、１細胞に１コピーの特定の塩基配列を有する核酸が導入されていることを確認することが好ましい。１コピーの特定の塩基配列を有する核酸が導入されていることの確認方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シーケンサー、ＰＣＲ法、サザンブロット法などを用いて確認することができる。
【００３８】
遺伝子導入の方法としては、特定の塩基配列を有する核酸配列が狙いの場所に狙いの分子数導入できれば特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｆｌｉｐ−ｉｎ、Ｊｕｍｐ−ｉｎなどが挙げられる。特に、酵母菌の場合は、効率の高さ、及び制御のしやすさの点から、相同組換えが好ましい。
【００３９】
［遺伝子組換え酵母の作製方法］
出芽酵母を１コピーの特定の塩基配列のキャリア細胞として組換え体の作製に使用することができる。具体的には、特定の塩基配列をノロウイルスの特異的な配列とし、選択マーカーとタンデムに並ぶように作出し、キャリア細胞の例えば、ＢＡＲ１領域を対象に相同組換えによって１コピーの特定の塩基配列を酵母染色体に導入し、組換え酵母を作製することができる。
出芽酵母としては、例えば、ｗ３０３−１ａ（商品名：ＡＴＣＣ４００１４０８、ＡＴＣＣ社製）などが挙げられる。
ノロウイルスの特異的な配列としては、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、例えば、配列番号１参照）から入手することができる。
選択マーカーとしては、例えば、ウラシル合成酵素（例えば、ＵＲＡ３等）、ヒスチジン合成酵素（例えば、ＨＩＳ３等）、トリプトファン合成酵素（例えば、ＴＲＰ１等）、リジン合成酵素（例えば、ＬＹＳ２等）、メチオニン合成酵素（例えば、ＭＥＴ１７等）、アデニン合成酵素（例えば、ＡＤＥ２等）などが挙げられる。
【００４０】
−−溶剤−−
溶剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液、及びこれらの混合液体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、水、緩衝液が好ましく、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）がより好ましい。
【００４１】
−−添加剤−−
添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、核酸、樹脂などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４２】
−−−界面活性剤−−−
界面活性剤は、細胞同士の凝集を防止し、連続吐出安定性を向上することができる。
【００４３】
界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性及び失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００４４】
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。
【００４５】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ  ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズなど）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリソルベート類が好ましい。
【００４６】
界面活性剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞懸濁液全量に対して、０．００１質量％以上３０質量％以下が好ましい。含有量が、０．００１質量％以上であると、界面活性剤の添加による効果を得ることができ、３０質量％以下であると、細胞の凝集を抑制することができるため、細胞懸濁液中の核酸の分子数を厳密に制御することができる。
【００４７】
−−−核酸−−−
核酸としては、特定の塩基配列を有する核酸の検出に影響しないものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣｏｌＥ１  ＤＮＡなどが挙げられる。前記核酸であると、特定の塩基配列を有する核酸が、細胞保持基材の壁面などに付着することを防ぐことができる。
【００４８】
−−−樹脂−−−
樹脂としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンイミドなどが挙げられる。
【００４９】
−−その他の材料−−
その他の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤などが挙げられる。
【００５０】
［細胞を分散する方法］
細胞を分散する方法としては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズミル等のメディア方式、超音波ホモジナイザー等の超音波方式、フレンチプレス等の圧力差を利用する方式などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから超音波方式がより好ましい。メディア方式では、解砕能力が強く、細胞膜や細胞壁を破壊する可能性やメディアがコンタミとして混入することがある。
【００５１】
［細胞のスクリーニング方法］
細胞のスクリーニング方法としては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式分級、セルソーター、フィルタによるスクリーニングなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから、セルソーター、フィルタによるスクリーニングが好ましい。
【００５２】
細胞は、細胞懸濁液に含まれる細胞の細胞周期を測定し、測定した細胞周期に基づき細胞懸濁液に含まれる細胞数から特定の塩基配列を有する核酸の数を推定し、推定した特定の塩基配列を有する核酸の数に基づき各細胞保持領域内へ配置された特定の塩基配列を有する核酸の数を算出することが好ましい。
細胞周期を測定するとは、細胞分裂による細胞の核相を数値化することを意味する。
核酸の数を推定するとは、細胞数及び測定した細胞周期から、核酸のコピー数をおしはかることを意味する。
【００５３】
計数対象が細胞数ではなく特定の塩基配列が何個入っているかであってもよい。通常は、係数対象の細胞は、細胞１個につき１つの特定の塩基配列が入っているものを選択するため、あるいは遺伝子組み換えにより導入するため、特定の塩基配列の数は細胞数と等しいと考えてよい。ただし、細胞は特定の周期で細胞分裂を起こすために細胞内で核酸の複製が行われる。細胞周期は細胞の種類によって異なるが、細胞懸濁液から所定量の溶液を抜き取り複数細胞の周期を測定することによって、細胞１個中に含まれる特定の塩基配列を有する核酸数に対する期待値及びその確からしさを算出することが可能である。これは、例えば、核染色した細胞をフローサイトメーターによって観測することによって可能である。
確からしさとは、いくつかの事象の生じる可能性がある時、特定の１つの事象が起こる可能性の程度を事前に予測して、その事象の起こる確率を意味する。
算出とは、計算して求める数値を出すことを意味する。
【００５４】
図２は、ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。図２に示すように、ヒストグラム上でＤＮＡの複製有無により２つのピークが現れるため、ＤＮＡ複製済みの細胞がどの程度の割合で存在するかを算出することが可能である。この算出結果から１細胞中に含まれる平均的なＤＮＡ数を算出することが可能であり、前述の細胞数の計数結果に乗じることにより、核酸の数を推定することが可能である。
また、細胞懸濁液を作成する前に細胞周期を制御する処理を行うことが好ましく、前述のような複製が起きる前、又は後の状態に揃えることによって、特定の塩基配列を有する核酸の数を細胞数からより精度良く算出することが可能になる。
【００５５】
推定する核酸の数は、確からしさ（確率）を算出することが好ましい。確からしさ（確率）を算出することにより、これらの数値に基づき確からしさを分散または標準偏差として表現して出力することが可能である。複数因子の影響を合算する場合には、一般的に用いられる標準偏差の二乗和平方根を用いることが可能である。例えば、因子として吐出した細胞数の正答率、細胞内のＤＮＡ数、吐出された細胞が細胞保持領域内に着弾する着弾率などを用いることができる。この中で影響の大きい項目を選択して算出することもできる。
【００５６】
＜液滴吐出工程＞
液滴吐出工程は、少なくとも１つの細胞保持領域を有する基材に対して、液滴吐出手段により細胞懸濁液を液滴として吐出する工程である。
液滴とは、表面張力によりまとまった液体のかたまりを意味する。
吐出とは、細胞懸濁液を液滴として飛翔させることを意味する。
基材とは、細胞を保持することが可能な細胞保持領域を有する材料を意味する。
細胞保持領域とは、細胞を保持可能である特定の領域を意味する。
【００５７】
液滴吐出手段としては、細胞懸濁液を液滴として吐出する手段（以下、「吐出ヘッド」とも称することがある）を好適に用いることができる。
【００５８】
細胞懸濁液を液滴として吐出する方式としては、例えば、オンデマンド方式、コンティニュアス方式などが挙げられる。これらの中でもコンティニュアス方式の場合、安定的な吐出状態に至るまでの空吐出、液滴量の調整、細胞保持領域間を移動する際にも連続的に液滴形成を行い続ける等の理由から、用いる細胞懸濁液のデッドボリュームが多くなる傾向にある。本発明では細胞数を調整する観点からデッドボリュームによる影響を低減させることが好ましく、そのため上記２つの方式では、オンデマンド方式の方がより好適である。
【００５９】
オンデマンド方式としては、例えば、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式などが挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。
【００６０】
静電方式は、細胞懸濁液を保持して液滴を形成する吐出部に対向して電極を設置する必要がある。本発明の細胞保持基材生成方法では、液滴を受けるための細胞保持基材が対向して配置されており、細胞保持基材構成の自由度を上げるため電極の配置は無いほうが好ましい。
サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である細胞への影響や、ヒーター部への焦げ付き（コゲーション）が懸念される。熱による影響は、含有物や細胞保持基材の用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から好ましい。
【００６１】
圧力印加方式としては、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式などが挙げられる。細胞懸濁液の液滴吐出に使用可能な液滴生成デバイスの構成例を図３Ａ〜図３Ｃに示す。
図３Ａは、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の吐出ヘッドは、電動機１３ａ、電磁弁１１２、液室１１ａ、細胞懸濁液３００ａ、及びノズル１１１ａを有する。
電磁バルブ方式の吐出ヘッドとしては、例えば、ＴｅｃｈＥｌａｎ社のディスペンサなどを好適に用いることができる。
また、図３Ｂは、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｂ、液室１１ｂ、細胞懸濁液３００ｂ、及びノズル１１１ｂを有する。
ピエゾ方式の吐出ヘッドとしては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンターなどを好適に用いることができる。
これらの吐出ヘッドのいずれも用いることが可能であるが、電磁バルブによる圧力印加方式では高速に繰り返し液滴を形成することができないため、細胞保持基材の生成のスループットを上げるためにはピエゾ方式を用いることが好ましい。また、一般的な圧電素子１３ｂを用いたピエゾ方式の吐出ヘッドでは、沈降によって細胞濃度のムラが発生することや、ノズル詰まりが生じることが問題として生じることがある。
このため、より好ましい構成として図３Ｃに示した構成などが挙げられる。図３Ｃは、図３Ｂにおける圧電素子を用いたピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。図３Ｃの吐出ヘッドは、圧電素子１３ｃ、液室１１ｃ、細胞懸濁液３００ｃ、及びノズル１１１ｃを有する。
図３Ｃの吐出ヘッドでは、図示していない制御装置からの圧電素子１３ｃに対して電圧印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレンを紙面上下方向に変形させることができる。これにより、液室１１ｃ内の細胞懸濁液３００ｃを撹拌しつつ、液滴を形成するため、ノズル詰まりを抑制し、かつ高速に繰り返し液滴を形成することができる。
【００６２】
オンデマンド方式以外の方式としては、例えば、連続的に液滴を形成させるコンティニュアス方式などが挙げられる。コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。さらに、飛翔中の液滴の吐出方向を、電圧を印加することによって制御することにより、細胞保持領域に着弾させるか、回収部に回収するかを選ぶことも可能である。このような方式は、セルソーター、又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製の装置名：セルソーターＳＨ８００を用いることができる。
【００６３】
図４Ａは、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。また、図４Ｂは、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。図４Ａは、液滴を形成するための駆動電圧を示す。電圧（ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ）の強弱により、液滴を形成することができる。図４Ｂは、液滴の吐出を行わずに細胞懸濁液を撹拌するための電圧を示している。
【００６４】
液滴を吐出しない期間中に、液滴を吐出するほどには強くない複数のパルスを入力することによって、液質内の細胞懸濁液を撹拌することが可能であり、細胞沈降による濃度分布の発生を抑制することができる。
【００６５】
本発明において使用することができる吐出ヘッドの液滴形成動作に関して、以下に説明する。
吐出ヘッドは、圧電素子に形成された上下電極に、パルス状の電圧を印加することにより液滴を吐出することができる。図５Ａ〜図５Ｃは、液滴吐出工程における液滴の形成状態を示す模式図である。図５Ａは、まず、圧電素子１３ｃに電圧を印加することにより、メンブレン１２ｃが急激に変形することによって、液室１１ｃ内に保持された細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの間に高い圧力が発生し、この圧力によってノズル部から液滴が外に押し出される。次に、図５Ｂに示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル部からの液押し出しが続き液滴が成長する。最後に、図５Ｃに示すように、メンブレン１２ｃが元の状態に戻る際に細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの界面近傍の液圧力が低下し、液滴３１０’が形成される。
【００６６】
基材としては、バイオ分野において一般的に用いられる部材であれば特に制限はなく、例えば、穴、凹部、及び凸部の少なくともいずれかの区画が形成されたプレート、区画が形成されていないプレート、チューブなどの基材などが挙げられる。より具体的には、区画が形成されたプレートとしては、例えば、２４穴、９６穴、３８４穴プレート等が挙げられ、区画が形成されていないプレートとしては、例えば、スライドガラスなどが挙げられ、チューブとしては、８連ＰＣＲチューブ、単独で使用するＰＣＲチューブなどが挙げられる。
細胞保持領域としては、細胞を保持可能である特定の領域があれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞保持基材に設けられた区画、細胞保持基材に設けられた区画以外の領域などが挙げられる。より具体的には、例えば、２４穴、９６穴、３８４穴プレートなどにおけるウェルなどが挙げられる。
基材における細胞保持領域の数は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単数であってもよく、複数であってもよい。ここで、細胞保持領域の数とは、区画が形成されているプレートにおいては、区画の数そのものを意味し、区画が形成されていないプレートにおいては、細胞を保持可能である特定の領域の数を意味し、チューブにおいては、そのチューブの個数を意味する。
細胞保持領域数が複数である基材としては、細胞保持領域の数が２４個、９６個、３８４個など業界において一般的な個数及び寸法で穴が形成されたものを用いることが好ましい。
なお、本発明において、基材をプレートと称することもある。本発明において、基材をプレートと称するときには、凹凸を有しているもの、及び凹凸を有していない基材の少なくともいずれかの基材を意味する。
【００６７】
基材の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後の処理のために、細胞や核酸の壁面への付着が抑制されているものを用いることが好ましい。
【００６８】
基材としては、個々に認識することが可能な認識手段が設けられたものを利用することが好ましい。認識手段としては、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（以下、「ＲＦＩＤ」とも称することがある）などを用いることが可能である。細胞保持基材を大量生産する場合には、無線でも使用可能なＲＦＩＤが好ましい。
【００６９】
基材としては、１穴マイクロチューブ、８連チューブ、９６穴、３８４穴のウェルプレートなどを用いることが好ましいが、細胞保持領域が複数である場合には、これらの基材における細胞保持領域には同じ個数の細胞を分注することも可能であるし、異なる水準の個数を入れることも可能である。また、細胞が含まれない細胞保持領域が存在していてもよい。特に核酸の量を定量的に評価するリアルタイムＰＣＲ装置やデジタルＰＣＲ装置の評価に用いる細胞保持基材を作製する際には、複数水準の数の核酸を分注することが好ましい。例えば、細胞（または核酸）が、おおよそ１個、２個、４個、８個、１６個、３２個、６４個の７水準で分注した細胞保持基材を作製することが考えられる。このような細胞保持基材を用いることによって、リアルタイムＰＣＲ装置やデジタルＰＣＲ装置の定量性、線形性、評価下限値などを調べることが可能である。
【００７０】
＜細胞数計数工程＞
細胞数計数工程は、液滴の細胞保持領域への飛翔中に、液滴に含まれる細胞数を複数のセンサによって２以上の方向から計数する工程である。
センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的、又は化学的性質、或いはそれらにより示される空間情報・時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。
計数とは、数を数えることを意味する。
【００７１】
細胞数計数工程としては、液滴の細胞保持領域への飛翔中に、液滴に含まれる細胞数を複数のセンサによって２以上の方向から計数すれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を含んでもよい。
【００７２】
液滴の細胞保持領域への飛翔中に、液滴に含まれる細胞数を計数する方法としては、例えば、液滴が基材の細胞保持領域に確実に入ることが予測される所望の細胞保持領域の直上の位置にあるタイミングにて液滴中の細胞を計数することが好ましい。なお、細胞保持領域が開口部を有する場合には、所望の細胞保持領域の開口部の直上にあるタイミングを意味する。
【００７３】
液滴中の細胞数を計数する方法としては、例えば、光学的に検出する方法、電気的・磁気的に検出する方法などが挙げられる。
【００７４】
−光学的に検出する方法−
図７、図１１、及び図１２を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に述べる。
図７は、液滴形成装置の一例を示す模式図である。図１１、及び図１２は、液滴形成装置の他の一例を示す模式図である。図７に示すように、液滴形成装置１は、吐出ヘッド（液滴吐出手段）１０と、駆動手段２０と、光源３０と、受光素子６０と、制御手段７０とを有する。
【００７５】
図７では、細胞懸濁液として細胞を特定の色素によって蛍光染色した後に所定の溶液に分散した液を用いており、吐出ヘッドから形成した液滴に光源から発せられる特定の波長を有する光を照射し細胞から発せられる蛍光を受光素子によって検出することによって計数を行う。このとき、蛍光色素によって細胞を染色する方法に加え、細胞中に元々含まれる分子が発する自家蛍光を利用してもよいし、細胞に蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ））を生産するための遺伝子を予め導入しておき細胞が蛍光を発するようにしておいてもよい。
光を照射とは、光をあてることを意味する。
【００７６】
吐出ヘッド１０は、液室１１と、メンブレン１２と、駆動素子１３とを有しており、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を液滴として吐出することができる。
【００７７】
液室１１は、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を保持する液体保持部であり、下面側には貫通孔であるノズル１１１が形成されている。液室１１は、例えば、金属やシリコン、セラミック等から形成することができる。蛍光染色細胞３５０としては、蛍光色素によって染色された無機微粒子や有機ポリマー粒子などが挙げられる。
【００７８】
メンブレン１２は、液室１１の上端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２の平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
【００７９】
駆動素子１３は、メンブレン１２の上面側に設けられている。駆動素子１３の形状は、メンブレン１２の形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２の平面形状が円形である場合には、円形の駆動素子１３を設けることが好ましい。
【００８０】
駆動素子１３に駆動手段２０から駆動信号を供給することにより、メンブレン１２を振動させることができる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を、ノズル１１１から吐出させることができる。
【００８１】
駆動素子１３として圧電素子を用いる場合には、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造とすることができる。この場合、駆動手段２０から圧電素子の上下電極間に電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わり、メンブレン１２を紙面上下方向に振動させることができる。圧電材料としては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、或いはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたもの等、様々な圧電材料を用いることができる。
【００８２】
光源３０は、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。なお、飛翔中とは、液滴３１０が液滴吐出手段１０から吐出されてから、着弾対象物に着弾するまでの状態を意味する。飛翔中の液滴３１０は、光Ｌが照射される位置では略球状となっている。又、光Ｌのビーム形状は略円形状である。
【００８３】
ここで、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１０倍〜１００倍程度であることが好ましい。これは、液滴３１０の位置ばらつきが存在する場合においても、光源３０からの光Ｌを確実に液滴３１０に照射するためである。
【００８４】
ただし、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１００倍を大きく超えることは好ましくない。これは、液滴３１０に照射される光のエネルギー密度が下がるため、光Ｌを励起光として発する蛍光Ｌｆの光量が低下し、受光素子６０で検出し難くなるからである。
【００８５】
光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましく、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザー等が好適に用いられる。光Ｌがパルス光である場合のパルス幅は１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。単位パルス当たりのエネルギーとしては、集光の有無等、光学系に大きく依存するが、概ね０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。
【００８６】
受光素子６０は、飛翔中の液滴３１０に蛍光染色細胞３５０が含有されていた場合に、蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として吸収して発する蛍光Ｌｆを受光する。蛍光Ｌｆは、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられるため、受光素子６０は蛍光Ｌｆを受光可能な任意の位置に配置することができる。この際、コントラストを向上するため、光源３０から出射される光Ｌが直接入射しない位置に受光素子６０を配置することが好ましい。
【００８７】
受光素子６０は、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆを受光できる素子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴に特定の波長を有する光を照射して液滴内の細胞からの蛍光を受光する光学センサが好ましい。受光素子６０としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の１次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光素子６０として、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等の２次元素子を用いてもよい。
【００８８】
なお、光源３０が発する光Ｌと比較して蛍光染色細胞３５０の発する蛍光Ｌｆが弱いため、受光素子６０の前段（受光面側）に光Ｌの波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、受光素子６０において、非常にコントラストの高い蛍光染色細胞３５０の画像を得ることができる。フィルタとしては、例えば、光Ｌの波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタ等を用いることができる。
【００８９】
また、前述のように、光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましいが、光源３０から発せられる光Ｌを連続発振の光としてもよい。この場合には、連続発振の光が飛翔中の液滴３１０に照射されるタイミングで受光素子６０が光を取り込み可能となるように制御し、受光素子６０に蛍光Ｌｆを受光させることが好ましい。
【００９０】
制御手段７０は、駆動手段２０及び光源３０を制御する機能を有している。また、制御手段７０は、受光素子６０が受光した光量に基づく情報を入手し、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する機能を有している。以下、図８〜図１０を参照し、制御手段７０の動作を含む液滴形成装置１の動作について説明する。
【００９１】
図８は、図７の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。図９は、図７の制御手段の機能ブロックを例示する図である。図１０は、液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【００９２】
図８に示すように、制御手段７０は、ＣＰＵ７１と、ＲＯＭ７２と、ＲＡＭ７３と、Ｉ／Ｆ７４と、バスライン７５とを有している。ＣＰＵ７１、ＲＯＭ７２、ＲＡＭ７３、及びＩ／Ｆ７４は、バスライン７５を介して相互に接続されている。
【００９３】
ＣＰＵ７１は、制御手段７０の各機能を制御する。記憶手段であるＲＯＭ７２は、ＣＰＵ７１が制御手段７０の各機能を制御するために実行するプログラムや、各種情報を記憶している。記憶手段であるＲＡＭ７３は、ＣＰＵ７１のワークエリア等として使用される。また、ＲＡＭ７３は、所定の情報を一時的に記憶することができる。Ｉ／Ｆ７４は、液滴形成装置１を他の機器等と接続するためのインターフェイスである。液滴形成装置１は、Ｉ／Ｆ７４を介して、外部ネットワーク等と接続されてもよい。
【００９４】
図９に示すように、制御手段７０は、機能ブロックとして、吐出制御手段７０１と、光源制御手段７０２と、細胞数計数手段（細胞数検知手段）７０３とを有している。
【００９５】
図９及び図１０を参照しながら、液滴形成装置１の粒子数計数について説明する。まず、ステップＳ１１において、制御手段７０の吐出制御手段７０１は、駆動手段２０に吐出の指令を出す。吐出制御手段７０１から吐出の指令を受けた駆動手段２０は、駆動素子１３に駆動信号を供給してメンブレン１２を振動させる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０が、ノズル１１１から吐出される。
【００９６】
次に、ステップＳ１２において、制御手段７０の光源制御手段７０２は、液滴３１０の吐出に同期して（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号に同期して）光源３０に点灯の指令を出す。これにより、光源３０が点灯し、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。
【００９７】
なお、ここで、同期するとは、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出と同時に（駆動手段２０が液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するのと同時に）発光することではなく、液滴３１０が飛翔して所定位置に達したときに液滴３１０に光Ｌが照射されるタイミングで、光源３０が発光することを意味する。つまり、光源制御手段７０２は、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号）に対して、所定時間だけ遅延して発光するように光源３０を制御する。
【００９８】
例えば、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給した際に吐出する液滴３１０の速度ｖを予め測定しておく。そして、測定した速度ｖに基づいて液滴３１０が吐出されてから所定位置まで到達する時間ｔを算出し、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するタイミングに対して、光源３０が光を照射するタイミングをｔだけ遅延させる。これにより、良好な発光制御が可能となり、光源３０からの光を確実に液滴３１０に照射することができる。
【００９９】
次に、ステップＳ１３において、制御手段７０の細胞数計数手段７０３は、受光素子６０からの情報に基づいて、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する。ここで、受光素子６０からの情報とは、蛍光染色細胞３５０の輝度値（光量）や面積値である。
【０１００】
細胞数計数手段７０３は、例えば、受光素子６０が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。この場合には、受光素子６０として１次元素子を用いても２次元素子を用いても構わない。
【０１０１】
受光素子６０として２次元素子を用いる場合は、細胞数計数手段７０３は、受光素子６０から得られた２次元画像に基づいて、蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。
【０１０２】
なお、蛍光染色細胞３５０は、細胞や染色細胞であってもよい。染色細胞とは、蛍光色素によって染色された細胞、又は、蛍光タンパク質を発現可能な細胞を意味する。
【０１０３】
染色細胞において、蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類、アゾ類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３がより好ましい。
蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１０４】
このように、液滴形成装置１では、蛍光染色細胞３５０を縣濁した細胞懸濁液３００を保持する液滴吐出手段１０に、駆動手段２０から駆動信号を供給して、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を吐出させ、飛翔中の液滴３１０に光源３０から光Ｌを照射する。そして、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として蛍光Ｌｆを発し、蛍光Ｌｆを受光素子６０が受光する。更に、受光素子６０からの情報に基づいて、細胞数計数手段７０３が、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を計数（カウント）する。
【０１０５】
つまり、液滴形成装置１では、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を実際にその場で観察するため、蛍光染色細胞３５０の個数の計数精度を従来よりも向上することが可能となる。又、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０に光Ｌを照射して蛍光Ｌｆを発光させて蛍光Ｌｆを受光素子６０で受光するため、高いコントラストで蛍光染色細胞３５０の画像を得ることが可能となり、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を低減できる。
【０１０６】
図１１は、図７の液滴形成装置の変形例を示す模式図である。図１１に示すように、液滴形成装置１Ａは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置した点が、液滴形成装置１（図７参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【０１０７】
このように、液滴形成装置１Ａでは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置したことにより、受光素子６０のレイアウトの自由度を向上することができる。
【０１０８】
例えば、ノズル１１１と着弾対象物を近づけた際に、図７のレイアウトでは着弾対象物（図７では省略しているが、例えば、図６の細胞保持基材７００に相当）と液滴形成装置１の光学系（特に受光素子６０）との干渉が発生するおそれがあるが、図１１のレイアウトにすることで、干渉の発生を回避することができる。
【０１０９】
すなわち、図１１のように受光素子６０を、液滴吐出手段の吐出面から、液滴の吐出方向と反対方向の領域に設置することにより、液滴３１０が着弾する着弾対象物とノズル１１１との距離（ギャップ）を縮めることが可能となり、着弾位置のばらつきを抑制することができる。その結果、分注の精度を向上することが可能となる。
【０１１０】
図１２は、図７の液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。図１２に示すように、液滴形成装置１Ｂは、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ１を受光する受光素子６０に加え、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ２を受光する受光素子６１を設けた点が、液滴形成装置１（図７参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【０１１１】
ここで、蛍光Ｌｆ１及びＬｆ２は、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられる蛍光の一部を示している。受光素子６０及び６１は、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる任意の位置に配置することができる。なお、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる位置に３つ以上の受光素子を配置してもよい。又、各受光素子は同一仕様としてもよいし、異なる仕様としてもよい。
【０１１２】
受光素子が１つであると、飛翔する液滴３１０に複数個の蛍光染色細胞３５０が含まれる場合に、蛍光染色細胞３５０同士が重なることに起因して、細胞数計数手段７０３が液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を誤計数する（カウントエラーが発生する）おそれがある。
【０１１３】
図１３は、飛翔する液滴に２個の蛍光染色細胞が含まれる場合を例示する図である。例えば、図１３Ａに示すように、蛍光染色細胞３５０１と３５０２とに重なりが発生する場合や、図１３Ｂに示すように、蛍光染色細胞３５０１と３５０２とに重なりが発生しない場合があり得る。受光素子を２つ以上設けることで、蛍光染色細胞が重なる影響を低減することが可能である。
【０１１４】
前述のように、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光粒子の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光粒子の個数を計数することができる。
【０１１５】
受光素子を２つ以上設置する場合，それぞれの受光素子から得られる輝度値或いは面積値のうち、最大値を示すデータを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能である。これに関して、図１４を参照して、より詳しく説明する。
【０１１６】
図１４は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。図１４に示すように、液滴内の粒子同士の重なりがない場合には、Ｌｅ＝Ｌｉとなる。例えば、細胞１個の輝度値をＬｕとすると、細胞数／滴=１個の場合はＬｅ＝Ｌｕであり、粒子数／滴＝ｎ個の場合はＬｅ＝ｎＬｕである（ｎ：自然数）。
【０１１７】
しかし、実際には、ｎが２以上の場合には粒子同士の重なりが発生し得るため、実測される輝度値はＬｕ≦Ｌｅ≦ｎＬｕ（図１４の網掛部分）となる。そこで、細胞数／滴＝ｎ個の場合、例えば閾値を（ｎＬｕ−Ｌｕ／２）≦閾値＜（ｎＬｕ＋Ｌｕ／２）と設定することができる。そして、複数の受光素子を設置する場合、それぞれの受光素子から得られたデータのうち最大値を示すものを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能となる。なお、輝度値に代えて面積値を用いてもよい。
【０１１８】
また、受光素子を複数設置する場合、得られる複数の形状データを基に、細胞数を推定するアルゴリズムにより粒子数を決定づけてもよい。
このように、液滴形成装置１Ｂでは、蛍光染色細胞３５０が異なる方向に発した蛍光を受光する複数の受光素子を有しているため、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を更に低減できる。
【０１１９】
図１５は、図７の液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。図１５に示すように、液滴形成装置１Ｃは、液滴吐出手段１０が液滴吐出手段１０Ｃに置換された点が、液滴形成装置１（図７参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【０１２０】
液滴吐出手段１０Ｃは、液室１１Ｃと、メンブレン１２Ｃと、駆動素子１３Ｃとを有している。液室１１Ｃは、液室１１Ｃ内を大気に開放する大気開放部１１５を上部に有しており、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能に構成されている。
【０１２１】
メンブレン１２Ｃは、液室１１Ｃの下端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２Ｃの略中心には貫通孔であるノズル１２１が形成されており、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００はメンブレン１２Ｃの振動によりノズル１２１から液滴３１０として吐出される。メンブレン１２Ｃの振動の慣性により液滴３１０を形成するため、高表面張力（高粘度）の細胞懸濁液３００でも吐出が可能である。メンブレン１２Ｃの平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
【０１２２】
メンブレン１２Ｃの材質としては特に限定はないが、柔らか過ぎるとメンブレン１２Ｃが簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。メンブレン１２Ｃの材質としては、例えば、金属材料やセラミック材料、ある程度硬さのある高分子材料等を用いることができる。
【０１２３】
特に、蛍光染色細胞３５０として細胞を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料であることが好ましい。細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があると言われており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミック（金属酸化物）を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
【０１２４】
このような材料の他の例としては、ステンレス鋼やニッケル、アルミニウム等や、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニア等を挙げることができる。これ以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー（例えば日油株式会社製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ）によってコーティングすることが可能である。
【０１２５】
ノズル１２１は、メンブレン１２Ｃの略中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル１２１の径としては特に限定はないが、蛍光染色細胞３５０がノズル１２１に詰まることを避けるため、蛍光染色細胞３５０の大きさの２倍以上とすることが好ましい。蛍光染色細胞３５０が例えば動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは一般的に５μｍ〜５０μｍ程度であるため、ノズル１２１の径を、使用する細胞に合わせて１０μｍ以上が好ましく、１００μｍ以上がより好ましい。
【０１２６】
一方で、液滴が大きくなり過ぎると微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、ノズル１２１の径は２００μｍ以下であることが好ましい。つまり、液滴吐出手段１０Ｃにおいては、ノズル１２１の径は、典型的には１０μｍ〜２００μｍの範囲となる。
【０１２７】
駆動素子１３Ｃは、メンブレン１２Ｃの下面側に形成されている。駆動素子１３Ｃの形状は、メンブレン１２Ｃの形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２Ｃの平面形状が円形である場合には、ノズル１２１の周囲に平面形状が円環状（リング状）の駆動素子１３Ｃを形成することが好ましい。駆動素子１３Ｃの駆動方式は、駆動素子１３と同様とすることができる。
【０１２８】
駆動手段２０は、メンブレン１２Ｃを振動させて液滴３１０を形成する吐出波形と、液滴３１０を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させる撹拌波形とを駆動素子１３Ｃに選択的に（例えば、交互に）付与することができる。
【０１２９】
例えば、吐出波形及び撹拌波形を何れも矩形波とし、吐出波形の駆動電圧よりも撹拌波形の駆動電圧を低くすることで、撹拌波形の印加により液滴３１０が形成されないようにすることができる。つまり、駆動電圧の高低により、メンブレン１２Ｃの振動状態（振動の程度）を制御することができる。
【０１３０】
液滴吐出手段１０Ｃでは、駆動素子１３Ｃがメンブレン１２Ｃの下面側に形成されているため、駆動素子１３Ｃによりメンブレン１２が振動すると、液室１１Ｃの下部方向から上部方向への流れを生じさせることが可能である。
【０１３１】
この時、蛍光染色細胞３５０の動きは下から上への運動となり、液室１１Ｃ内で対流が発生して蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００の撹拌が起きる。液室１１Ｃの下部方向から上部方向への流れにより、沈降、凝集した蛍光染色細胞３５０が液室１１Ｃの内部に均一に分散する。
【０１３２】
つまり、駆動手段２０は、吐出波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００をノズル１２１から液滴３１０として吐出させることができる。又、駆動手段２０は、撹拌波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００を撹拌することができる。なお、撹拌時には、ノズル１２１から液滴３１０は吐出されない。
【０１３３】
このように、液滴３１０を形成していない間に細胞懸濁液３００を撹拌することにより、蛍光染色細胞３５０がメンブレン１２Ｃ上に沈降、凝集することを防ぐと共に、蛍光染色細胞３５０を細胞懸濁液３００中にムラなく分散させることができる。これにより、ノズル１２１の詰まり、及び吐出する液滴３１０中の蛍光染色細胞３５０の個数のばらつきを抑えることが可能となる。その結果、蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００を、長時間連続して安定的に液滴３１０として吐出することができる。
【０１３４】
また、液滴形成装置１Ｃにおいて、液室１１Ｃ内の細胞懸濁液３００中に気泡が混入する場合がある。この場合でも、液滴形成装置１Ｃでは、液室１１Ｃの上部に大気開放部１１５が設けられているため、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を、大気開放部１１５を通じて外気に排出できる。これによって、気泡排出のために大量の液を捨てることなく、連続して安定的に液滴３１０を形成することが可能となる。
【０１３５】
すなわち、ノズル１２１の近傍に気泡が混入した場合や、メンブレン１２Ｃ上に多数の気泡が混入した場合には吐出状態に影響を及ぼすため、長い時間安定的に液滴の形成を行うためには、混入した気泡を排出する必要がある。通常、メンブレン１２Ｃ上に混入した気泡は、自然に若しくはメンブレン１２Ｃの振動によって上方に移動するが、液室１１Ｃには大気開放部１１５が設けられているため、混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能となる。そのため、液室１１Ｃに気泡が混入しても不吐出が発生することを防止可能となり、連続して安定的に液滴３１０を形成することができる。
【０１３６】
なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させ、積極的に気泡を液室１１Ｃの上方に移動させてもよい。
【０１３７】
−電気的又は磁気的な検出方法−
電気的又は磁気的な検出方法としては、図１６に示すように、液室１１’から細胞懸濁液を液滴３１０’として細胞保持基材７００’に吐出する吐出ヘッドの直下に、細胞数計数のためのコイル２００がセンサとして設置されている。細胞は特定のタンパク質によって修飾され細胞に接着することが可能な磁気ビーズによって覆うことにより、磁気ビーズが付着した細胞がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の細胞の有無を検出することが可能である。一般的に、細胞はその表面に細胞特有のタンパク質を有しており、このタンパク質に接着することが可能な抗体を磁気ビーズに修飾することによって、細胞に磁気ビーズを付着させることが可能である。このような磁気ビーズとしては既製品を用いることが可能であり、例えば、株式会社ベリタス製のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）が利用可能である。
【０１３８】
センサの位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液滴吐出手段と細胞保持基材との間、もしくは細胞保持基材と液滴吐出手段との間以外の領域で、特に、液滴吐出手段の吐出面から液滴の吐出方向と反対方向の領域などが挙げられる。
液滴吐出手段の吐出面から液滴の吐出方向と反対方向の領域とは、液滴吐出を吐出する面の液滴吐出手段側の空間を意味している。
【０１３９】
＜＜吐出前に細胞を観測する処理＞＞
吐出前に細胞を観測する処理としては、図１７に示すマイクロ流路２５０中を通過してきた細胞３５０’をカウントする方法や、図１８に示す吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法などが挙げられる。図１７はセルソーター装置において用いられている方法であり、例えば、ソニー株式会社製のセルソーターＳＨ８００を用いることができる。図１７では、マイクロ流路２５０中に光源２６０からレーザー光を照射して散乱光や蛍光を、集光レンズ２６５を用いて検出器２５５により検出することによって細胞の有無や、細胞の種類を識別しながら液滴を形成することが可能である。本方法を用いることによって、マイクロ流路２５０中に通過した細胞の数から所定の細胞保持領域中に着弾した細胞の数を推測することが可能である。また、図１８に示す吐出ヘッド１０’としては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンターを用いることが可能である。図１８では、吐出前において、ノズル部近傍をレンズ２６５’を介して、画像取得部２５５’において画像取得した結果からノズル部近傍の細胞３５０”が吐出されたと推定することや、吐出前後の画像から差分により吐出されたと考えられる細胞の数を推定することによって、所定の細胞保持領域中に着弾した細胞の数を推測することができる。図１７に示すマイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法では、液滴が連続的に生成されるのに対して、図１８は、オンデマンドで液滴形成が可能であるため、より好ましい。
【０１４０】
＜＜着弾後の細胞をカウントする処理＞＞
着弾後の細胞をカウントする処理としては、細胞保持基材における細胞保持領域を蛍光顕微鏡などにより観測することにより、蛍光染色した細胞を検出する方法を取ることが可能である。この方法は、例えば、Ｓａｎｇｊｕｎ  ｅｔ  ａｌ．,  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ６（３），  ｅ１７４５５などに記載されている。
【０１４１】
液滴の吐出前及び着弾後に、細胞を観測する方法では、以下に述べる問題があるが、生成する細胞保持基材の種類によっては吐出中の液滴内の細胞を観測することがもっとも好ましい。吐出前に細胞を観測する手法においては、流路中を通過した細胞数や吐出前（および吐出後）の画像観測から、着弾したと思われる細胞数を計数するため、実際にその細胞が吐出されたのかどうかの確認は行われておらず、思いがけないエラーが発生することがある。例えば、ノズル部が汚れていることにより液滴が正しく吐出せず、ノズルプレートに付着し、それに伴い液滴中の細胞も着弾しない、といったケースが発生する。他にも、ノズル部の狭い領域に細胞が残留することや、細胞が吐出動作によって想定以上に移動し観測範囲外に出てしまうといった問題の発生も起こりうる。また、着弾後の細胞保持基材上の細胞を検出する手法においても問題がある。まず、基材として顕微鏡観察が可能であるものを準備する必要がある。観測可能な細胞保持基材として、一般的に底面が透明かつ平坦な基材、特に底面がガラス製となっている基材が用いられるが、特殊な細胞保持基材となってしまうため、一般的な細胞保持領域（例えば、ウェル）を使用することができなくなる問題がある。また、細胞数が数十個など多いときには、細胞の重なりが発生するため正確な計数ができなくなる問題もある。そのため、液滴の吐出後、かつ液滴の細胞保持領域への着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサ及び粒子数（細胞数）計数手段によって計数することに加えて、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を行うことが好ましい。
【０１４２】
また、受光素子としては１又は少数の受光部を有する受光素子、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管を用いることが可能であるし、その他に２次元アレイ状に受光素子が設けられたＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｐｕｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤなど二次元センサを用いることも可能である。
１又は少数の受光部を有する受光素子を用いる際には、蛍光強度から細胞が何個入っているかを予め用意された検量線を用いて決定することも考えられるが、主として飛翔液滴中の細胞有無を二値的に検出することが行われる。細胞懸濁液の細胞濃度が十分に低く、液滴中に細胞が１個または０個しかほぼ入らない状態で吐出を行う際には、前記の二値的な検出で十分精度よく計数を行うことが可能である。細胞懸濁液中で細胞はランダムに配置していることを前提とすれば、飛翔液滴中の細胞数はポアソン分布に従うと考えられ、液滴中に細胞数が２個以上入る確率Ｐ（＞２）は下記式（１）で表される。図１９は、確率Ｐ（＞２）と平均細胞数の関係を表すグラフである。ここで、λは液滴中の平均細胞数であり、細胞懸濁液中の細胞濃度に吐出液滴の体積を乗じたものになる。
Ｐ（＞２）＝１−（１＋λ）×ｅ−λ  ・・・  式（１）
【０１４３】
二値的な検出で細胞数計数を行う場合には、確率Ｐ（＞２）が十分小さい値であることが精度を確保する上では好ましく、確率Ｐ（＞２）が１％以下となるλ＜０．１５であることが好ましい。光源としては、細胞の蛍光を励起できるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、水銀ランプやハロゲンランプなどの一般的なランプに特定の波長を照射するようにフィルタをかけたものや、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）、レーザーなどを用いることが可能である。ただし、特に１ｎＬ以下の微小な液滴を形成するときには、狭い領域に高い光強度を照射する必要があるため、レーザーを用いるのが好ましい。レーザー光源としては、固体レーザーやガスレーザー、半導体レーザーなど一般的に知られている多種のレーザーを用いることが可能である。また、励起光源としては、液滴が通過する領域を連続的に照射したものであってもよいし、液滴の吐出に同期して液滴吐出動作に対して所定時間遅延を付けたタイミングでパルス的に照射するものであってもよい。
【０１４４】
＜液滴着弾工程＞
液滴着弾工程は、少なくとも１つの細胞保持領域に所定数の細胞が配置されるように液滴を着弾させる工程である。
所定数とは、任意に設定した数を意味する。ここでは、各細胞保持領域に配置する細胞数を任意に設定することを意味する。
所定数としては、例えば、細胞保持基材の全ての細胞保持領域に配置する細胞数を同じ数としてもよく、各細胞保持領域において同じ細胞数のグループ（水準とも称することがある）を複数設けるようにしてもよい。
配置とは、所定の位置に所定のものが配されることを意味する。
着弾とは、液滴を細胞保持領域に到達させることを意味する。
【０１４５】
液滴を着弾させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、一の細胞保持領域に設定された所定数に達するまで液滴を配置した後に、他の細胞保持領域に設定された所定数に達するまで液滴を着弾させるようにすることを繰り返す方法、各細胞保持領域に設定された所定数に達するまで順次液滴を配置する方法などが挙げられる。
順次とは、次々に順序どおりにすることを意味する。
【０１４６】
図６では、本発明の細胞保持基材の生成方法において、細胞保持領域（凹部）が形成された細胞保持基材を移動可能なステージ上に固定し、ステージの駆動と吐出ヘッドとからの液滴形成を組み合わせることにより、細胞保持領域（凹部）に順次液滴を着弾させる。ここで、ステージの移動として細胞保持基材を移動させる方法を示したが、当然のことながら吐出ヘッドを移動させてもよい。
【０１４７】
図６は、細胞保持基材の細胞保持領域内に順次液滴を着弾させるための装置の一例を示す概略図である。
図６に示すように、液滴を着弾させるための装置（分注装置）２は、液滴形成手段１と、ステージ８００と、制御装置９００とを有している。
【０１４８】
細胞保持基材７００は、移動可能に構成されたステージ８００上に配置されている。細胞保持基材７００には液滴形成手段１の吐出ヘッドから吐出された液滴３１０が着弾する複数の細胞保持領域７１０（凹部）が形成されている。制御装置９００は、ステージ８００を移動させ、液滴形成手段１の吐出ヘッドとそれぞれの細胞保持領域７１０との相対的な位置関係を制御する。これにより、液滴形成手段１の吐出ヘッドからそれぞれの細胞保持領域７１０中に順次、蛍光染色細胞３５０を含む液滴３１０を吐出することができる。
【０１４９】
制御装置９００は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御装置９００の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。ただし、制御装置９００の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。又、制御装置９００は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
【０１５０】
吐出する液滴としては、細胞保持領域内に細胞懸濁液を着弾させる際に、複数の水準を得るように液滴を細胞保持領域内に着弾させることが好ましい。
複数の水準とは、標準となる複数の基準を意味する。
複数の水準としては、例えば、細胞保持領域ごとに特定の塩基配列を有する核酸を有する複数の細胞を異なる数で配置することで、細胞保持部材が所定の濃度勾配を有することを意味する。濃度勾配を有することにより、検量線用試薬として好適に使用することができる。複数の水準は、前記センサによって計数される値を用いて制御することができる。
【０１５１】
＜細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程における推定する核酸の数の確からしさを算出する工程＞
細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程における推定する核酸の数の確からしさを算出する工程は、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程それぞれの工程における確からしさを算出する工程である。
当該推定する核酸の数の確からしさの算出は、細胞懸濁液生成工程における確からしさと同様に算出することができる。
なお、確からしさの算出タイミングは、図１のように細胞数計数工程の次工程で、纏めて算出してもよいし、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程の各工程の最後に算出し、細胞数計数工程の次工程で各不確かさを合成して算出してもよい。言い換えれば、上記各工程での確からしさは、合成算出までに適宜算出しておけばよい。
【０１５２】
＜核酸数算出工程＞
核酸数算出工程は、細胞の細胞周期、液滴に含まれる細胞数を計数する精度、及び細胞保持領域内の目的範囲内に液滴が着弾する割合（精度）の少なくともいずれかに基づき、細胞保持領域に含まれる核酸の数の平均値を算出する工程である。
液滴に含まれる細胞数を計数する精度は、センサにより検知された細胞数と、顕微鏡により観察された着弾後の細胞数とを比較することにより求めることができる。
核酸数算出工程を行うことにより、生成した細胞保持基材の各細胞保持領域に含まれる特定の塩基配列を有する核酸の数を精度良く認識することができる。
【０１５３】
＜出力工程＞
出力工程は、細胞保持領域内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数を、センサにより測定された検出結果に基づいて粒子数計数手段にて計数された値を出力する工程である。
計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、粒子数計数手段にて算出した当該細胞保持領域に含まれる合計の細胞数を意味する。
粒子数計数手段は、センサにより測定された細胞数を計数して合計値を算出する手段である。
出力とは、原動機、通信機、計算機などの装置が入力を受けて計数された値を外部の計数結果記憶手段としてのサーバに電子情報として送信することや、計数された値を印刷物として印刷することを意味する。
【０１５４】
出力工程は、細胞保持基材の生成時に、細胞保持基材における各細胞保持領域の細胞数又は核酸数を観察又は推測し、観測値又は推測値、外部の記憶部に出力する。
出力は、細胞数計数工程と同時に行ってもよく、細胞数計数工程の後に行ってもよい。
【０１５５】
＜記録工程＞
記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。
記録工程は、記録部において好適に実施することができる。
記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。
記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む意味である。
【０１５６】
＜核酸抽出工程＞
核酸抽出工程は、前記細胞保持領域内の細胞から核酸を抽出する工程である。
抽出とは、細胞膜や細胞壁などを破壊し、核酸をぬき出すことを意味する。
【０１５７】
細胞から核酸を抽出する方法としては、９０℃〜１００℃で熱処置する方法が知られている。９０℃以下で熱処理すると核酸が抽出されない可能性があり、１００℃以上で熱処理すると核酸が分解される可能性がある。このとき界面活性剤を添加し熱処理することが好ましい。
【０１５８】
界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性・失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【０１５９】
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。
【０１６０】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｏｔｉｔｏｎ  Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ  ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズなど）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリソルベート類が好ましい。
【０１６１】
界面活性剤の含有量としては、細胞保持領域中の細胞懸濁液全量に対して、０．０１質量％以上５．００質量％以下が好ましい。含有量が、０．０１質量％以上であると、ＤＮＡ抽出に対して効果を発揮でき、５．００質量％以下であると、ＰＣＲの際に増幅の阻害を防止することができるため、両方の効果を得られる数値範囲として上記０．０１質量％以上５．００質量％以下が好適である。
細胞壁を保有している細胞に関しては、上記の方法で十分に核酸抽出されないことがある。その場合、例えば、浸透圧ショック法、凍結融解法、酵素消化法、核酸抽出用キットの使用、超音波処理法、フレンチプレス法、ホモジナイザーなどの方式などが挙げられる。これらの中でも、抽出核酸のロスが少ないことから、酵素消化法が好ましい。
【０１６２】
＜その他の工程＞
その他の工程としては、例えば、酵素失活工程などが挙げられる。
【０１６３】
＜＜酵素失活工程＞＞
酵素失活工程は、酵素を失活させる工程である。
酵素としては、例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、核酸抽出工程において核酸を抽出するために使用した酵素などが挙げられる。
酵素を失活させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の方法を好適に用いることができる。
【０１６４】
本発明の細胞保持基材の生成方法により生成される細胞保持基材は、バイオ関連産業、ライフサイエンス産業、及び医療産業等において幅広く使用され、例えば、装置校正や感染症の検量線作成などの用途等に好適に用いることができる。
【０１６５】
細胞保持基材としては、感染症に対して実施する場合は公定法や通知法などに定められている方法に適用することができる、
公定法としては、ノロウイルスに関する公定法（食安監発第０５１４００４号）などが挙げられる。図２０Ａは、ノロウイルスのオープンリーディングフレーム１部分のプライマーとプローブの位置を表す図である。図２０Ｂは、ノロウイルスのオープンリーディングフレーム２部分のプライマーとプローブの位置を表す図である。
【０１６６】
ノロウイルスに関する公定法としては、例えば、図２０Ａ及び図２０Ｂに示された領域の核酸配列を、遺伝子導入技術を利用して細胞内に導入する。このノロウイルスに特異的な核酸配列を有した細胞を細胞保持領域に既知数（１０〜１０７）分注する。ここで、低コピー数領域（１０〜１０３）においては、希釈法では精度が低く、検量線の値がばらつき、検出コピー数の正確性が低下する懸念があるため、分注精度の高いインクジェットやセルソーターなどを用いて分注することにより精度を高められるため好ましい。次に、空の細胞保持領域に食安監発第０５１４００４号に示されている方法で抽出された検体を分注し、プライマー、酵素、ＴａｑＭａｎプローブ、水を添加し、リアルタイムＰＣＲで反応を行うことによりノロウイルスの有無を確認することができる。ＲＴ−ＰＣＲの場合は、前記ＴａｑＭａｎプローブ以外の材料を添加し、サーマルサイクラーで反応させ、得られたサンプルを電気泳動することでノロウイルスの有無を確認できる。
【０１６７】
（装置評価方法）
本発明の装置評価方法は、本発明の細胞保持基材の生成方法により生成された細胞保持基材を用いて核酸を検出する核酸検出装置の評価を行う方法である。
本発明の装置評価方法は、少なくとも１つの細胞保持領域に配置された特定の塩基配列を有する核酸の数が既知数である細胞保持基材を用いることにより、使用した装置の定量性及び検出精度を精度良く評価することができる。さらに、本発明装置評価方法に基づいて、使用した装置の管理を行うことができる。
【実施例】
【０１６８】
以下、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。
【０１６９】
（遺伝子組換え酵母）
出芽酵母ｗ３０３−１ａ（商品名：ＡＴＣＣ４００１４０８、ＡＴＣＣ社製）を１コピーの特定の塩基配列のキャリア細胞として組換え体の作製に使用した。特定の塩基配列はノロウイルスの特異的な配列（ＮＣＢＩ、食安監発第０５１４００４号（図２０Ａ、及び図２０Ｂ）から入手、配列番号１参照）とし、選択マーカーとしたＵＲＡ３とタンデムに並ぶように作出し、キャリア細胞のＢＡＲ１領域を対象に相同組換えによって１コピーの特定の塩基配列を酵母染色体に導入し、遺伝子組換え酵母を作製した。
【０１７０】
（培養、及び細胞周期制御）
５０ｇ／Ｌ  のＹＰＤ培地（商品名：ＹＰＤ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）で培養した遺伝子組換え酵母を９０ｍＬ分取した三角フラスコに、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製、以下、「ＤＰＢＳ」とも称することがある）を用いて５００μｇ／ｍＬとなるように調製したαファクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、α１−Ｍａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｃｅｔａｔｅ  ｓａｌｔ）を９００μＬ添加し、バイオシェイカー（装置名：ＢＲ−２３ＦＨ、タイテック株式会社製）を用いて、振盪速度：２５０ｒｐｍ、温度：２８℃にて２時間インキュベートし、酵母をＧ０／Ｇ１期に同調して酵母懸濁液を得た。同調細胞の細胞周期の確認は、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｉｎ（装置名：Ｓ７０２０、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて染色し、フローサイトメーター（装置名：ＳＨ８００、ソニー株式会社製）を用いたフローサイトメトリーにて、励起波長４８８ｎｍで、Ｇ０／Ｇ１期に同調していることを確認した。Ｇ１期の割合は９７．１％、Ｇ２期の割合は２．９％であった。結果を図２１に示す。
【０１７１】
（固定化）
同調確認済み酵母懸濁液を遠心管（ビオラモ、商品名：ＶＩＯ−５０Ｒ、アズワン株式会社製）に４５ｍＬ移し、遠心分離機（装置名：ＣＦ１６ＲＮ、株式会社日立製作所製）を用いて、回転速度：３,０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。得られた酵母ペレットにホルマリン（和光純薬工業株式会社製、０６２−０１６６１）を４ｍＬ添加し、５分間静置後、遠心して上澄み液を除去し、エタノールを１０ｍＬ添加して懸濁させることにより固定化済みの酵母懸濁液を得た。
【０１７２】
（染色）
固定化済み酵母懸濁液を１．５ｍＬ遮光チューブ（ワトソン株式会社製、１３１−９１５ＢＲ）に５００μＬ移し、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去し、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＯＣＲＩＳ社製、２００−４４９−４）となるように調製したＤＰＢＳ（１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を４００μＬ添加し、ピペッティングでよく懸濁した後、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去することにより酵母ペレットを得た。得られたペレットに１ｍｇ／ｍＬに調製したエバンスブルー水溶液（和光純薬工業株式会社製、０５４−０４０６１）を１ｍＬ添加し、ボルテックスを用いて５分間撹拌後、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去し、ＤＰＢＳ（１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ボルテックスで撹拌することにより染色済み酵母懸濁液を得た。
【０１７３】
（分散）
染色済みの酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー（装置名：ＬＵＨ１５０、ヤマト科学株式会社）を用いて、出力：３０％，１０秒間分散処理し、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去し、ＤＰＢＳを１，０００μＬ添加して洗浄した。遠心分離、上澄み液の除去を計２回実施し、最後にＤＰＢＳで懸濁させて酵母懸濁インクを得た。
【０１７４】
（分注、及び細胞計測）
以下のようにして、液滴中の酵母数を計数（カウント）して、細胞数が既知の細胞保持基材を作製した。具体的には、図１２に示す液滴形成装置を用いて、９６プレート（商品名：ＭｉｃｒｏＡｍｐ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）の各細胞保持領域（ウェル）に、液滴吐出手段として圧電印加方式の吐出ヘッド（社内製）を用いて１０Ｈｚにて酵母懸濁インクを順次吐出し、吐出された液滴中の酵母の受光手段としては高感度カメラ（東京インスツルメンツ株式会社製、ｓＣＭＯＳ  ｐｃｏ．ｅｄｇｅ）を用いて撮影し、光源としてはＹＡＧレーザー（スペクトラ・フィジックス社製、Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＯＮＥ−５３２−２００−ＫＥ）を用いて、撮影した画像の粒子計数手段として画像処理ソフトウェアであるＩｍａｇｅ  Ｊを用いて画像処理して細胞数を計数し、細胞数既知の細胞保持基材を作製した。
【０１７５】
（核酸抽出）
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）  Ｂｕｆｆｅｒを用いてＣｏｌＥ１  ＤＮＡ（和光純薬工業株式会社製、３１２−００４３４）を５ｎｇ／μＬとなるようにＣｏｌＥ１／ＴＥを調製し、ＣｏｌＥ１／ＴＥを用いてＺｙｍｏｌｙａｓｅ（Ｒ）  １００Ｔ（ナカライテスク株式会社製、０７６６５−５５）を１ｍｇ／ｍＬとなるようにＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を調製した。作製した細胞数既知の細胞保持基材の各細胞保持領域（ウェル）にＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を４μＬ添加し、３７℃にて３０分間インキュベートすることにより、細胞壁溶解後（核酸抽出）、９５℃で２分間熱処理して細胞保持基材を生成した。
【０１７６】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  少なくとも１つの細胞保持領域を有する基材に対して、液滴吐出手段により細胞懸濁液を液滴として吐出する液滴吐出工程と、
前記液滴の前記細胞保持領域への飛翔中に、前記液滴に含まれる細胞数を複数のセンサによって２以上の方向から計数する細胞数計数工程と、
少なくとも１つの前記細胞保持領域に所定数の細胞が配置されるように前記液滴を着弾させる液滴着弾工程と、を含むことを特徴とする細胞保持基材の生成方法である。
＜２＞  前記所定数が１０以下である前記＜１＞に記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜３＞  前記細胞懸濁液に含まれる細胞の細胞周期を測定し、
測定した前記細胞周期に基づき前記細胞懸濁液に含まれる細胞数から特定の塩基配列を有する核酸の数を推定し、
推定した前記特定の塩基配列を有する核酸の数に基づき前記各細胞保持領域内へ配置された前記特定の塩基配列を有する核酸の数を算出する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜４＞  前記推定する核酸の数の確からしさを算出する前記＜３＞に記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜５＞  前記センサが、前記液滴が細胞保持領域の直上の位置にあるタイミングで、飛翔中の前記液滴中の細胞数を計数する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜６＞  前記センサが、前記液滴吐出手段の吐出面から、前記液滴の吐出方向と反対方向の領域に設置される前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜７＞  前記細胞保持領域内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数を前記センサにより計数された値を用いて出力する出力工程をさらに含む前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜８＞  前記液滴着弾工程において、複数の水準を得るように前記液滴を前記細胞保持領域内に着弾させる前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜９＞  前記細胞が、光を受光したときに発光可能な細胞であり、
前記センサが、前記液滴内の前記細胞からの蛍光を受光する光学センサであり、
前記細胞数が、前記光学センサにより計数された値に基づいて算出される前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜１０＞  前記細胞が、酵母である前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜１１＞  前記細胞の体積平均粒径が、遊離状態において、１００μｍ以下である前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜１２＞  前記細胞懸濁液が、界面活性剤をさらに含む前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜１３＞  前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である前記＜１２＞に記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜１４＞  前記界面活性剤の含有量が、細胞懸濁液全量に対して、０．００１質量％以上３０質量％以下である前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜１５＞  前記液滴吐出工程における吐出が、オンデマンド方式である前記＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜１６＞  前記オンデマンド方式が、圧力印加方式である前記＜１５＞に記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜１７＞  前記圧力印加方式が、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式である前記＜１６＞に記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜１８＞  前記細胞数計数工程が、吐出前に細胞を観測する処理をさらに含む前記＜１＞から＜１７＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜１９＞  前記細胞数計数工程が、着弾後の細胞をカウントする処理をさらに含む前記＜１＞から＜１８＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜２０＞  前記特定の塩基配列を有する核酸を有する複数の細胞及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する細胞懸濁液生成工程をさらに含む前記＜１＞から＜１９＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜２１＞  前記細胞の細胞周期、前記液滴に含まれる細胞数を計数する精度、及び前記細胞保持領域内の目的範囲内に前記液滴が着弾する割合（精度）の少なくともいずれかに基づき、前記細胞保持領域に含まれる前記核酸の数の平均値を算出する核酸数算出工程をさらに含む前記＜３＞から＜２０＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜２２＞  記録工程をさらに含む前記＜１＞から＜２１＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜２３＞  前記細胞保持領域内の細胞から核酸を抽出する核酸抽出工程を更に含み、前記核酸抽出工程後に、酵素失活工程をさらに含む前記＜１＞から＜２２＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法である。
＜２４＞  前記＜１＞から＜２３＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法により生成された細胞保持基材を用いて核酸を検出する核酸検出装置の評価を行うことを特徴とする装置評価方法である。
【０１７７】
前記＜１＞から＜２３＞のいずれかに記載の細胞保持基材の生成方法、及び前記＜２４＞に記載の装置評価方法によると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１７８】
【特許文献１】特開２０１４−３３６５８号公報
【特許文献２】特開２０１５−１９５７３５号公報
【特許文献３】特開２００８−６９３号公報
【符号の説明】
【０１７９】
３００      細胞懸濁液
３１０、３１０’      液滴
３５０、３５０’、３５０’’      細胞
７００、７００’      細胞保持基材
Ｌ      光
Ｌｆ      蛍光
【図１】
2019000104.tif 000002
【図２】
2019000104.tif 000003
【図３Ａ】
2019000104.tif 000004
【図３Ｂ】
2019000104.tif 000005
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2019000104.tif 000009
【図５Ｂ】
2019000104.tif 000010
【図５Ｃ】
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【図６】
2019000104.tif 000012
【図７】
2019000104.tif 000013
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
2019000104.tif 000021
【図１５】
2019000104.tif 000022
【図１６】
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【図１７】
2019000104.tif 000024
【図１８】
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【図１９】
2019000104.tif 000026
【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【配列表】
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