(57)【要約】      （修正有）【課題】受精卵の発生率を高めるとともに、変性細胞発生を低減でき、胚盤胞発生率を高めることのできる、より実用性の高い受精卵生産方法の提供。【解決手段】プロテオグリカンが添加されている、受精卵培養液であり、前記受精卵培養液が１ｍｌあたり１００μｇ以上のプロテオグリカンが添加されていていることが好ましく、前記プロテオグリカンのカリウム塩が１ｍｌあたり１００μｇ以上のプロテオグリカンのカリウム塩であることが好ましい、方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカンが添加されていることを特徴とする、受精卵培養液。
【請求項２】
１ｍｌあたり１００μｇ以上のプロテオグリカンが添加されていることを特徴とする、受精卵培養液。
【請求項３】
プロテオグリカンのカリウム塩が添加されていることを特徴とする、受精卵培養液。
【請求項４】
１ｍｌあたり１００μｇ以上のプロテオグリカンのカリウム塩が添加されていることを特徴とする、受精卵培養液。
【請求項５】
家畜または哺乳動物の受精卵培養用であることを特徴とする、請求項１、２、３、４のいずれかに記載の受精卵培養液。
【請求項６】
牛の受精卵培養用であることを特徴とする、請求項１、２、３、４のいずれかに記載の受精卵培養液。
【請求項７】
請求項１、２、３、４のいずれかに記載の受精卵培養液を用いて行なうことを特徴とする、受精卵生産方法。
【請求項８】
請求項１、２、３、４のいずれかに記載の受精卵培養液を用いて家畜または哺乳動物の一卵性分離受精卵を得ることを特徴とする、受精卵生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は受精卵培養液、および受精卵生産方法に係り、特に、優秀な雄（オス）牛生産のための一卵性双子を人為的に生産する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
牛の一卵性双子を人為的に生産する技術は、優秀な雄牛生産のスピードアップに繋がり、育種改良の効率化を図る上で有用な技術である。
図７は、一卵性双子生産による双子検定の方法を示す説明図である。図示するように双子検定では、遺伝的に同一である一卵性双子の一方を種雄候補牛、他方を肥育・肉質調査用の牛とし、後者の調査結果に基づいて前者を種雄牛とするか否かを決定する。従来は平均６年を要した種雄牛生産が、この方法を採ることによって３年半に短縮され、優良種雄牛生産を早期化することが期待できる。
【０００３】
牛などの哺乳動物の胚などを人為的に生産する技術については従来、特許出願等による技術的提案も多数なされている。たとえば後掲特許文献１には、受胎率が高い哺乳動物胚を効率的に取得する方法として、受精から第一卵割が完了するまでの時間、第一卵割後かつ第二卵割前の段階での形態、第三卵割後かつ第四卵割前の段階での形態、および、初期胚盤胞期、胚盤胞期または拡張胚盤胞期での酸素消費量、のうちの二つ以上を指標として胚を選別する、哺乳動物胚選別方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−２９６８６号公報「体外培養による胚の製造方法、並びに胚を選別するための方法、装置、及びシステム」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述の通り、体外受精を利用した雄牛の一卵性双子生産技術は確立されてきたが、なお課題は存在する。それは、受精卵発生率が低いこと、および、得られる受精卵の品質には改善の余地があることである。
図８は、従来の受精卵生産方法を示す説明図である。図示するように従来は、未受精卵採取、体外受精、細胞分離の各段階を経て、移植可能な胚である胚盤胞を得る。しかし、胚盤胞形成に至らず死滅してしまう場合もある。これを変性細胞というが、従来の受精卵生産方法では変性細胞発生率が高く、満足のいくものではなかった。受精卵の発生率を高めるとともに、変性細胞発生を低減でき、胚盤胞発生率を高めることのできる、より実用性の高い手法が求められている。
【０００６】
そこで本発明が解決しようとする課題は、かかる従来技術の問題点をなくし、受精卵の発生率を高めるとともに、変性細胞発生を低減でき、胚盤胞発生率を高めることのできる、より実用性の高い受精卵生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者は上記課題について検討した結果、受精卵培養液に、高等多細胞動物由来の糖タンパク質の一種であって細胞増殖促進作用を有するプロテオグリカンを用いることによって、特にカリウム塩のプロテオグリカンを用いることによって解決できることを見出し、これに基づいて本発明を完成するに至った。すなわち、上記課題を解決するための手段として本願で特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は、以下の通りである。
【０００８】
〔１〕  プロテオグリカンが添加されていることを特徴とする、受精卵培養液。
〔２〕  １ｍｌあたり１００μｇ以上のプロテオグリカンが添加されていることを特徴とする、受精卵培養液。
〔３〕  プロテオグリカンのカリウム塩が添加されていることを特徴とする、受精卵培養液。
〔４〕  １ｍｌあたり１００μｇ以上のプロテオグリカンのカリウム塩が添加されていることを特徴とする、受精卵培養液。
〔５〕  家畜または哺乳動物の受精卵培養用であることを特徴とする、〔１〕、〔２〕、〔３〕、〔４〕のいずれかに記載の受精卵培養液。
【０００９】
〔６〕  牛の受精卵培養用であることを特徴とする、〔１〕、〔２〕、〔３〕、〔４〕のいずれかに記載の受精卵培養液。
〔７〕  〔１〕、〔２〕、〔３〕、〔４〕のいずれかに記載の受精卵培養液を用いて行なうことを特徴とする、受精卵生産方法。
〔８〕  〔１〕、〔２〕、〔３〕、〔４〕のいずれかに記載の受精卵培養液を用いて家畜または哺乳動物の一卵性分離受精卵を得ることを特徴とする、受精卵生産方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の受精卵培養液および受精卵生産方法は上述のように構成されるため、これらによれば、哺乳動物の受精卵の発生率を高めるとともに、変性細胞発生を低減でき、胚盤胞発生率を高めることができる。特に本発明によれば、優秀な雄牛生産のための一卵性双子生産技術において、受精卵の発生率を高めるとともに、変性細胞発生を低減でき、胚盤胞発生率を高めることができる。
【００１１】
本発明受精卵培養液は、従来の培地にプロテオグリカンを添加したものだが、それによって一卵性分離受精卵の生存胚率を高めることができ、また、高品位（高ランク）の胚を増加させることができる。特にカリウム塩のプロテオグリカンを用いる本発明受精卵培養液では、培養中における白濁や沈澱が発生せず、細胞膜にダメージを与えない培養を行うことができる。このように本発明によれば、従来よりも実用性の高い受精卵生産を行うことができる。
【００１２】
なお、本発明が想定する主要な適用対象は雄牛生産であるが、受精卵培養液にプロテオグリカンを用いるという考え方は、家畜を初めとする他の哺乳動物に対しても適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明受精卵培養液の構成を示す概念図である。（以下は、実施例に係る図面）
【図２】本研究において検討する方法を示す説明図である。
【図３】プロテオグリカン添加濃度による受精卵発生率をランクごとに示したグラフである。
【図４】プロテオグリカン添加による結晶析出を示す写真図である。
【図５】濃度５００μｇ／ｍｌを含む各プロテオグリカン添加濃度での受精卵発生率をランクごとに示したグラフである。
【図６】各種プロテオグリカン添加による受精卵発生率をランクごとに示したグラフである。（以下は、背景技術に係る図面）
【図７】一卵性双子生産による双子検定の方法を示す説明図である。
【図８】従来の受精卵生産方法を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図面により本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明受精卵培養液の構成を示す概念図である。図示するように本受精卵培養液５は、従来の培養液（以下、「基礎培養液」ともいう。）２に対してプロテオグリカン３が添加されていることを、基本構成とする（図中、（ａ））。プロテオグリカンは、培養液１ｍｌあたり１００μｇ以上が添加されている構成とすることができる。また、より好ましくは、基礎培養液２に対してプロテオグリカンのカリウム塩４が添加されている受精卵培養液６とすることができる（図中、（ｂ））。この場合も、プロテオグリカンのカリウム塩４は、培養液１ｍｌあたり１００μｇ以上添加されている構成とすることができる。
【００１５】
なお、後述する実施例に示す結果を考慮し、プロテオグリカン３、そのカリウム塩４、いずれのタイプでも、添加量を培養液１ｍｌあたり１００μｇ以上１０００μｇ未満とすることができる。添加量はさらに、培養液１ｍｌあたり５００μｇ程度、たとえば３００μｇ以上７００μｇ以下、あるいは４００μｇ以上６００μｇ以下、等としてもよい。本発明におけるより良好な結果を得られる添加量範囲の例として特定するためである。
【００１６】
実施例に後述するように本発明受精卵培養液５、６、特にプロテオグリカンのカリウム塩４を用いる受精卵培養液６は、牛の受精卵培養用として好適に用いることができる。また、上述の通り培養液にプロテオグリカンを用いるという本発明の考え方は、その他の家畜・哺乳動物に対しても適用可能である。
【００１７】
また、以上述べた受精卵培養液５、６のいずれかを用いて行なう受精卵生産方法、受精卵培養液５、６のいずれかを用いて家畜または哺乳動物の一卵性分離受精卵を得る受精卵生産方法もまた、本発明の範囲内である。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明がかかる実施例に限定されるものではない。なお、本発明を完成するに至った研究経過の概要をもって実施例の説明とする。
研究テーマ  雄牛一卵性双子生産のための、新規な受精卵培養液の検討
目的
プロテオグリカンの細胞増殖促進作用（ＥＧＦ様領域による）によって、受精卵発生率改善の効果が期待される。そこで、受精卵培地にプロテオグリカンを添加することによる、一卵性分離受精卵の発生成績の向上如何を検討する。
なお、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、上皮細胞増殖（成長）因子）は、細胞の成長と増殖の調整に重要な役割を担う因子である。プロテオグリカンのコアタンパク質にはＥＧＦのような作用を有する領域があり、これがＥＧＦ様領域である。
【００１９】
図２は、本研究において検討する方法を示す説明図である。図示するように、前掲図８における細胞分離段階後の受精卵培養液として、プロテオグリカンを添加した培養液を用いることが、本方法の特徴である。なお本研究では、試験する培養液による、割球単位の胚盤胞発生率、およびペアでの胚盤胞発生率を調査した。
【００２０】
［２］試験方法
［２］―１  基礎培養液
表１に、プロテオグリカン添加試験の対象である受精卵培養液（基礎培養液）とした、１０％ＲＤ−修正ＫＳＯＭ／ａａ培地の組成を示す。なお本培養液が、プロテオグリカン添加培養液の比較対象となる。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
［２］―２  プロテオグリカン
プロテオグリカンは、市販のサケ由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を用いた。また、カリウム塩プロテオグリカンの調製は下記の通りに行なった。
【００２３】
原料のプロテオグリカンは、市販のサケ由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を用いた。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８  ｒｅｓｉｎ（バイオラッド社））をガラス製カラムに充填し（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ）、１Ｍ塩酸６０ｍＬで樹脂を流下した。樹脂を脱イオン水で中性になるまで洗浄し、その後、１Ｍ水酸化カリウム水溶液１５０ｍＬを流下して樹脂をカリウムイオン型に活性化した。その後、樹脂を脱イオン水で中性になるまで洗浄し、原料のプロテオグリカン０．３ｇを脱イオン水に溶解した溶液を室温でカラム上方から添加・流下した。ついで樹脂に脱イオン水を１７０ｍＬ流下し、得られた溶出液をエバポレーター（東京理科器械（株））にて濃縮した後、凍結乾燥し、０．２９ｇの白色綿状固体であるカリウムイオン型プロテオグリカンを得た。
【００２４】
［２］―３  プロテオグリカン添加受精卵培養液
［２］―１の基礎培養液に［２］―２のプロテオグリカンを添加して、試験する受精卵培養液を調製した。なお、プロテオグリカン添加量（濃度）等については、後述の「［３］試験経過と結果」の中で述べる。
【００２５】
［２］―４  試験の手順
試験の手順は以下の通りである。
１）経腟採卵による卵子の採取
経腟採卵は、当所繋養の黒毛和種雌牛から、指先用探触子（日立メディコ  ＥＵＰ−Ｆ５３１）、採卵アダプター（日立メディコ  ＥＺＵ−ＰＡ６）、超音波画像診断装置（日立メディコ  ＥＣＨＯＰＡＬII）、動物用採卵針（ミサワ医科工業）および卵胞吸引器（富士平工業  ＦＶ−４）を用いて行った。回収液は、ＮａＨＣＯ３の２０ｍＭをＨｅｐｅｓで置き換えたＨｅｐｅｓ−緩衝ＴＣＭ１９９培地へ、子牛血清（ＣＳ）を２％濃度、ヘパリンＮａを１０単位／ｍｌとなるように添加し採取した。
【００２６】
２）体外成熟
成熟培地には、１０％ＣＳ、０．０１ＡＵ／ｍｌ  ＦＳＨ、および０．５μｇ／ｍｌ  エストラジオール１７βを添加したＨｅｐｅｓ緩衝Ｍ１９９培地を用いた。採取した卵子は、流動パラフィン（ナカライテスク  ２６１３７−８５）で覆った１００μｌの成熟培地に移し、３８．５℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下で２２〜２４時間成熟培養を行った。
【００２７】
３）体外受精
精子は、黒毛和種１頭の凍結精液を３８℃温水中で融解して使用した。媒精液Ｇセット（機能性ペプチド研究所  ＩＶＦ１１０Ｓ）を使用して精子を洗浄、および１，０００万／ｍｌとなるように精子懸濁液を調製した。この精子懸濁液を１００μｌずつ分注して流動パラフィンで覆い、成熟培養後の卵子を移して６時間媒精を行った。媒精終了後は、発生培地（１０％ＲＤ−修正ＫＳＯＭ／ａａ培地）へ移して培養を継続した。
【００２８】
４）割球分離
媒精開始から２８〜３０時間後に得られた２細胞期胚を、０．５％プロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ６９１１）により透明帯を除去し、ピペッティングすることにより割球の分離を行った。［２］―３に述べた通りに、各種、各濃度のプロテオグリカンを添加した１０％ＲＤ−ＫＳＯＭ／ａａ培地を１０μｌずつ分注して流動パラフィンで覆い、１組ずつ割球を移し、３８．５℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％空気の条件下で８日間培養した。
【００２９】
５）受精卵品質の判定
体外受精後７〜８日目に受精卵の形態を観察し、変性細胞の割合により受精卵のランク付けをした。すなわち；
Ａ：変性細胞の割合が０〜１０％のもの
Ｂ：１０〜３０％のもの
Ｃ：３０〜５０％のもの
Ｄ：５０％以上のもの
変性卵：生存部分が残っていないもの
とし、供試卵数のうちＡおよびＢランクの数の割合を発生率として算出した。なお、Ａの中でも変性細胞の割合が高いものはＡ’、Ｂの中でも変性細胞の割合が高いものはＢ’とし、Ａ〜Ａ’を高ランクの胚とした。
【００３０】
６）受精卵細胞数の計測
体外受精後７〜８日目の受精卵を、２５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂ２２６１）を添加したエタノールにより染色・固定をした後、グリセリンで洗浄を行い、スライドガラスへマウントした。蛍光顕微鏡により染色された細胞核の数を計測することにより、受精卵の細胞数を計測した。
【００３１】
［３］試験経過と結果
［３］―１  プロテオグリカン添加による高ランク品質胚の増加
図３は、プロテオグリカン添加濃度による受精卵発生率をランクごとに示したグラフである。ここでは、プロテオグリカン添加濃度０、１００、１，０００  μｇ／ｍｌでの受精卵発生率（生存胚率）、およびランクごとの受精卵発生率を調べた。なお、「生存胚率」とは変性卵にはなっていない卵の割合である。、図示するように生存胚率としては、プロテオグリカン添加の有無による顕著な差は見られなかった。しかし、プロテオグリカン添加によって、高ランク（Ａ〜Ａ’）胚が増加する傾向が見られた。すなわち、プロテオグリカンを一卵性受精卵培養液に添加することにより、受精卵の品質が向上する可能性が示された。
【００３２】
図４は、プロテオグリカン添加による結晶析出を示す写真図である。図中、左は培養液の白濁の状態、中は培養液中の結晶、右はダメージを受けた細胞膜を示す。図示するように、プロテオグリカン添加濃度が１，０００μｇ／ｍｌでは、白濁と沈殿（結晶）析出の生じる場合があった。濃度１，０００μｇ／ｍｌでは濃過ぎる可能性が示唆された。
【００３３】
［３］―２  結晶析出による発生率低下
そこで、受精卵発生率を高めるとともに結晶析出の生じない至適濃度を得るために、プロテオグリカン添加濃度５００μｇ／ｍｌで試験した。
表２に、プロテオグリカン添加濃度５００μｇ／ｍｌでの受精卵発生率を示す。ここに示すように、濃度５００μｇ／ｍｌでも１，０００μｇ／ｍｌの場合と同様に、結晶析出の見られる場合があった。そして、結晶析出が見られた場合には、胚盤胞発生率もペアでの発生率もともに低下した。つまり、結晶析出によって受精卵発生率の低下が認められた。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
図５は、濃度５００μｇ／ｍｌを含む各プロテオグリカン添加濃度での受精卵発生率をランクごとに示したグラフである。なお、結晶析出が見られた場合のデータは除外している。図示するように、結晶が析出しない限りでは、プロテオグリカン添加により高ランク胚（Ａ〜Ａ’）が増加する傾向が再確認された。また、添加濃度５００μｇ／ｍｌの場合に、高ランク胚（Ａ〜Ａ’）の割合が高かった。このように、プロテオグリカン添加による発生率向上効果が認められたが、細胞のダメージに繋がる結晶析出を防止する必要性が課題として残った。
【００３６】
［３］―３  カリウム塩のプロテオグリカンの利用
そこで、プロテオグリカンに替えてカリウム塩のプロテオグリカン（カリウムイオン型プロテオグリカン、カリウム型ＰＧ）を用いて検討した。これは［２］―２に述べた通り、プロテオグリカン（ＰＧ）のカルシウムＣａをカリウムＫに置換したものである。
【００３７】
カリウム型ＰＧを培養液に用いた場合の受精卵発生率の比較を表３に、細胞数の比較を表４に示す。また、図６は、各種プロテオグリカン添加による受精卵発生率をランクごとに示したグラフである。図６中、「５００」は通常のＰＧを５００μｇ／ｍｌ濃度で添加、「カリウム型５００」はカリウム型ＰＧを５００μｇ／ｍｌ濃度で添加したことを、それぞれ示す。これらに示すように、カリウム型ＰＧを培養液に用いることにより、白濁や結晶析出（沈殿）が発生せず、細胞増殖効果が示された。しかも、同濃度（５００μｇ／ｍｌ）のＰＧと比較してカリウム型ＰＧでは、より高い生存胚率と高ランク胚率を得られることが示された。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
【表４】
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【００４０】
［４］まとめ
１）プロテオグリカンを添加した受精卵培養液区分は無添加区分と比較し、生存胚率が高まることがわかった。
２）プロテオグリカンを添加した受精卵培養液区分は無添加区分と比較し、高ランク（Ａ〜Ａ'）胚が増加する傾向が見られた。
３）カリウム塩のプロテオグリカンを用いることで白濁や結晶析出（沈澱）の発生が見られず、細胞膜にダメージを与えないことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の受精卵培養液および受精卵生産方法によれば、哺乳動物の受精卵の発生率を高め、胚盤胞発生率を高めることができる。特に、優秀な雄牛生産のための一卵性双子生産技術において、かかる効果を得ることができる。したがって、牛等の繁殖技術分野、およびこれに関連する全分野において、産業上利用性が高い発明である。
【符号の説明】
【００４２】
２…従来の培養液（基礎培養液）
３…プロテオグリカン
４…プロテオグリカンのカリウム塩
５、６…受精卵培養液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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