(57)【要約】【課題】本発明は、比較的多くのペプチドの担持が可能であり、製造も容易であり、また、耐久性が高いことから標的化合物を精製などするに当たり再利用が可能な芯鞘型複合繊維と、当該芯鞘型複合繊維の製造方法、当該芯鞘型複合繊維を用いた標的化合物の精製方法、標的化合物の検出方法、および、当該複合繊維が親和性を示す膜タンパク質を有する細胞の培養方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る芯鞘型複合繊維は、芯部と鞘部の二層構造を有し、前記芯部が水不溶性ポリマーを含み、前記鞘部が親水性ポリマーとぺプチドを含み、前記ペプチドが標的化合物に対する親和性を有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
芯部と鞘部の二層構造を有し、
前記芯部が水不溶性ポリマーを含み、
前記鞘部が親水性ポリマーとぺプチドを含み、
前記ペプチドが標的化合物に対する親和性を有することを特徴とする芯鞘型複合繊維。
【請求項２】
前記鞘部において前記ペプチドが前記親水性ポリマーに共有結合している請求項１に記載の芯鞘型複合繊維。
【請求項３】
同軸スピナレットを備えるエレクトロスピニング装置に、水不溶性ポリマーを含む芯材溶液と、親水性ポリマーおよびぺプチドを含む鞘材溶液を供給し、エレクトロスピニング法で紡糸する工程を含むことを特徴とする芯鞘型複合繊維の製造方法。
【請求項４】
前記標的化合物の精製方法であって、
請求項１または２に記載の芯鞘型複合繊維と前記標的化合物を含む溶液とを接触させる工程、
前記標的化合物が結合した前記複合繊維を前記溶液から分離する工程、および、
分離した前記複合繊維から前記標的化合物を脱離させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の芯鞘型複合繊維を含む液体培地中で細胞を培養する工程を含み、
前記複合繊維の前記ペプチドが、前記細胞の膜タンパク質に親和性を有することを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載の芯鞘型複合繊維と被検試料とを接触させる工程を含むことを特徴とする前記標的化合物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐久性が高いことから標的化合物を精製などするに当たり再利用が可能な芯鞘型複合繊維と、当該芯鞘型複合繊維の製造方法、当該芯鞘型複合繊維を用いた標的化合物の精製方法、標的化合物の検出方法、および、当該複合繊維が親和性を示す膜タンパク質を有する細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、繊維とペプチドを組み合わせて、繊維の風合いなどを改善する技術が開発されている。例えば特許文献１には、発色性が高く、同色性が良好な、ソフトでしなやかな風合を有するポリエステル繊維とウールなどのタンパク繊維との混用品が開示されている。また、特許文献２には、透湿防水性や風合いの改良のため、溶融状態にあるポリエステル糸条をタンパク質溶液に導入してタンパク質を付着させる改質ポリエステル繊維の製造法が開示されている。
【０００３】
また、特許文献３には、グルタルアルデヒドやポリグリセロールポリグリシジルエーテルなどにより酵素を架橋した衣料用化学繊維が開示されている。特許文献４にも、カフェインなどの機能性物質が加水分解コラーゲンなどの加水分解タンパク質と架橋剤を併用して固着されている機能性繊維が開示されている。
【０００４】
最近、芯部と鞘部の二層構造を有する複合繊維が開発されている。かかる複合繊維は、芯部と鞘部をそれぞれ異なる性質のポリマーで構成したり、それぞれに異なる添加剤を配合することができ、様々な機能や構造特性のデザインが可能であるため有用である。例えば特許文献５には、絹様の光沢、風合い、保湿性を有し、鞘部に絹粉末を含む生体適合性芯鞘型複合繊維が開示されている。
【０００５】
ところで、タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物からキャプチャリングして一度に高い純度で精製するために利用されるプロテインＡアフィニティー分離マトリックスが挙げられる（非特許文献１，２）。特許文献６にも、ポリマーナノファイバーにプロテインＡなどを固定化したクロマトグラフィー担体が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２９９０４６号公報
【特許文献２】特開平５−１２５６７０号公報
【特許文献３】特開平８−２６９８７３号公報
【特許文献４】特開２０００−２１２８７４号公報
【特許文献５】特開２００３−３４２８３５号公報
【特許文献６】特開２０１６−５３４３７３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｏｂｅｒ  Ｓ．ら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，２００７，８４８巻，４０−４７頁
【非特許文献２】Ｓｈｕｋｌａ  Ａ．Ａ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，２８巻，２５３−２６１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献６の記載のように、プロテインＡなどでナノファイバーを官能化した例はある。しかし特許文献６の技術では、ナノファイバーの表面に官能基を導入した上でプロテインＡなどを結合させているため、製造に手間がかかり、また、十分量のプロテインＡなどを結合できない場合があり得る。
上記状況下、本発明は、比較的多くのペプチドの担持が可能であり、製造も容易であり、また、耐久性が高いことから標的化合物を精製などするに当たり再利用が可能な芯鞘型複合繊維と、当該芯鞘型複合繊維の製造方法、当該芯鞘型複合繊維を用いた標的化合物の精製方法、標的化合物の検出方法、および、当該複合繊維が親和性を示す膜タンパク質を有する細胞の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、水不溶性ポリマーの芯部と親水性ポリマーの鞘部の二層構造を有する芯鞘型複合繊維の鞘部に、標的化合物に対する親和性を有するペプチドを比較的多く配合しても、ペプチドと標的化合物との相互作用が生じる状態にあり且つ耐久性に優れ繰り返しの使用が可能であることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
【００１０】
［１］  芯部と鞘部の二層構造を有し、
前記芯部が水不溶性ポリマーを含み、
前記鞘部が親水性ポリマーとぺプチドを含み、
前記ペプチドが標的化合物に対する親和性を有することを特徴とする芯鞘型複合繊維。
【００１１】
［２］  前記鞘部において前記ペプチドが前記親水性ポリマーに共有結合している上記［１］に記載の芯鞘型複合繊維。
【００１２】
［３］  同軸スピナレットを備えるエレクトロスピニング装置に、水不溶性ポリマーを含む芯材溶液と、親水性ポリマーおよびぺプチドを含む鞘材溶液を供給し、エレクトロスピニング法で紡糸する工程を含むことを特徴とする芯鞘型複合繊維の製造方法。
【００１３】
［４］  前記標的化合物の精製方法であって、
上記［１］または［２］に記載の芯鞘型複合繊維と前記標的化合物を含む溶液とを接触させる工程、
前記標的化合物が結合した前記複合繊維を前記溶液から分離する工程、および、
分離した前記複合繊維から前記標的化合物を脱離させる工程を含むことを特徴とする方法。
【００１４】
［５］  上記［１］または［２］に記載の芯鞘型複合繊維を含む液体培地中で細胞を培養する工程を含み、
前記複合繊維の前記ペプチドが、前記細胞の膜タンパク質に親和性を有することを特徴とする細胞の培養方法。
【００１５】
［６］  上記［１］または［２］に記載の芯鞘型複合繊維と被検試料とを接触させる工程を含むことを特徴とする前記標的化合物の検出方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の複合繊維は、芯部と鞘部の二層構造を有し、鞘部の親水性ポリマー中に標的化合物に対する親和性を有するペプチドの少なくとも一部が埋設されていると考えられるが、本発明者らによる実験的知見によれば、ペプチドの親和性は十分に維持されていた。また、ペプチドは鞘部に強固に結合しており、耐久性に優れているため、標的化合物の精製などに繰り返し使用することも可能である。よって本発明に係る複合繊維は、抗体の精製などに非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ポリビニルアルコールで構成された芯部と、プロテインＡが結合したポリビニルアルコールで構成された鞘部を有する芯鞘型複合繊維の位相差顕微鏡写真である。
【図２】図２は、ポリビニルアルコールで構成された芯部と、プロテインＡが結合したポリビニルアルコールで構成された鞘部を有する芯鞘型複合繊維の位相差顕微鏡写真と、蛍光標識抗体を作用させた後の蛍光顕微鏡写真である。
【図３】図３は、蛍光標識抗体を作用させた後と、更に結合した蛍光標識抗体を脱離させた後における、ポリビニルアルコールで構成された芯部と、プロテインＡが結合したポリビニルアルコールで構成された鞘部を有する芯鞘型複合繊維の位相差顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真である。
【図４】図４は、アセチルセルロースで構成された芯部と、プロテインＡが結合したポリビニルアルコールで構成された鞘部を有する芯鞘型複合繊維の位相差顕微鏡写真である。
【図５】図５は、アセチルセルロースで構成された芯部と、プロテインＡが結合したポリビニルアルコールで構成された鞘部を有する芯鞘型複合繊維の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図６】図６は、アセチルセルロースで構成された芯部と、プロテインＡが結合したポリビニルアルコールで構成された鞘部を有する芯鞘型複合繊維の位相差顕微鏡写真と、蛍光標識抗体を作用させた後の蛍光顕微鏡写真である。
【図７】図７は、蛍光標識抗体を作用させた後と、更に結合した蛍光標識抗体を脱離させた後における、アセチルセルロースで構成された芯部と、プロテインＡが結合したポリビニルアルコールで構成された鞘部を有する芯鞘型複合繊維の位相差顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真である。
【図８】図８は、芯鞘型複合繊維に蛍光標識抗体を作用させた後と、更に結合した蛍光標識抗体を脱離させた後における、抗体結合量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の芯鞘型複合繊維は、芯部と鞘部の二層構造を有する。その直径は適宜調整すればよいが、例えば、１００ｎｍ以上、１０μｍ以下とすることができる。直径が１００ｎｍ以上であれば、実際の使用に際して十分な強度を有するといえる。また、直径が１０μｍ以下であれば、比表面積が大きく、鞘部に含まれるペプチドと標的化合物との接触効率が十分に高いといえる。上記直径としては、３００ｎｍ以上が好ましく、５００ｎｍ以上がより好ましく、また、５μｍ以下が好ましく、２μｍ以下がより好ましい。
【００１９】
本発明の複合繊維において、芯部の直径としては５０ｎｍ以上、５μｍ以下が好ましく、２００ｎｍ以上、２μｍ以下がより好ましい。また、鞘部の厚さとしては５０ｎｍ以上、３μｍ以下が好ましく、１００ｎｍ以上、３μｍ以下がより好ましい。更に、本発明に係る複合繊維の長さは、複合繊維の利用形態などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、１ｍｍ以上、５０ｍｍ以下とすることができる。
【００２０】
本発明に係る芯鞘型複合繊維の芯部は水不溶性ポリマーを含む。本開示において「水不溶性」とは、１ｇのポリマーを２５±５℃で５分ごとに激しく振り混ぜて３０分以内に溶解させるのに要する水の量が１０００ｍＬ以上、好ましくは１００００ｍＬ以上であることをいう。
【００２１】
水不溶性ポリマーは、特に制限されないが、例えば、セルロース、アガロース、デキストランなどの水不溶性多糖類；アセチルセルロース、メチルセルロースなどの水不溶性多糖類誘導体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリル酸、架橋ポリアクリルアミド、ポリエチレンやポリプロピレンなどのオレフィン系ポリマー、ポリエステル系ポリマーなどの水不溶性合成高分子を挙げることができる。本発明はペプチドを含む芯鞘型複合繊維に関するものであるので、生体適合性の観点から、水不溶性ポリマーとしては水不溶性多糖類または水不溶性多糖類誘導体が好ましい。なお、架橋ポリマーは、架橋しないまま紡糸し、紡糸後に架橋して不溶化してもよい。
【００２２】
セルロースは高分子であることから、両末端水酸基を無視すれば、セルロースを構成するグルコースの１分子あたり３個の水酸基を有する。アセチルセルロースやメチルセルロースなどでは、総水酸基数に対するアセチル基やメチル基などの数の割合をアセチル化度やメチル化度という。例えばアセチルセルロースのアセチル化度としては、２０％以上、８０％以下が好ましい。アセチル化度およびメチル化度が２０％以上、８０％以下であれば、水に対して不溶性を示すと共に、溶媒への溶解性が十分に良好であり、溶液を芯鞘型複合繊維の簡便な製造に利用することが可能になる。アセチルセルロースのアセチル化度およびメチル化度としては、３０％以上、５０％以下がより好ましい。
【００２３】
セルロースおよび水不溶性セルロース誘導体の数平均分子量としては、５０００以上、３０００００以下が好ましい。数平均分子量が５０００以上であれば、芯鞘型複合繊維の強度を十分に確保することができ、３０００００以下であれば、芯鞘型複合繊維を製造する際の溶液を十分容易に調製することができる。上記数平均分子量としては、２００００以上、１０００００以下がより好ましい。
【００２４】
本発明に係る芯鞘型複合繊維の芯部は、１種のみの水不溶性系ポリマーを含むものであってもよいし、２種以上の水不溶性ポリマーを含むものであってもよい。また、芯部における水不溶性ポリマーの割合は制限されないが、例えば、芯部全体に対して９０質量％以上が好ましく、９５質量％以上または９８質量％以上がより好ましく、９９質量％以上がより更に好ましく、不可避的不純物や不可避的残留物以外、実質的に水不溶性ポリマーのみからなることが好ましい。
【００２５】
本発明に係る芯鞘型複合繊維の鞘部は、親水性ポリマーとぺプチドを含む。親水性ポリマーは、水酸基やアミノ基などの親水性基を多く有し、水への親和性が高いものをいう。但し、当該親水性ポリマーは、鞘部が水と接触する場合に水へ溶解してペプチドが脱落することを抑制するために水不溶性であることが好ましい。親水性ポリマーとしては、例えば、ポリビニルアルコール；アシル化度が２０％以上、８０％以下のアシル化セルロース；アルキル化度が２０％以上、８０％以下のアルキルセルロース；ポリビニルピロリドン；ポリ（メタ）アクリル酸などを挙げることができる。例えばポリビニルアルコール等は多くの水酸基を有し親水性であるが、水酸基による分子間水素結合により結晶化し、いったん鞘部を形成した後は水に対して不溶性を示すようになる場合がある。親水性ポリマーは、１種のみ用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２６】
親水性ポリマーの分子量は適宜調整すればよいが、例えば５０００以上、５０００００以下とすることができる。当該分子量が５０００以上であれば、複合繊維の強度を十分に確保することができ、５０００００以下であれば、複合繊維を製造する際の溶液を十分容易に調製することができる。上記分子量としては、３００００以上、２０００００以下が好ましい。
【００２７】
本発明に係る複合繊維の鞘部に配合するペプチドは、精製や検出などすべき標的化合物に対する親和性を有する。ペプチドとは２以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物をいい、いわゆるポリペプチドも含まれる。例えば、抗体結合性タンパク質、抗体様タンパク質、酵素、受容体、細胞外マトリックスタンパク質などが挙げられる。抗体結合性タンパク質とは、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域、ＶＬ領域のいずれか一つ以上に結合するポリペプチドであれば特に限定はされない。このようなポリペプチドとして、例えばプロテインＡの免疫グロブリン結合性ドメインであるＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣドメイン、プロテインＧの免疫グロブリン結合性ドメインであるＢ１、Ｂ２ドメインおよびＣ１−Ｃ３ドメイン、プロテインＬの免疫グロブリン結合性ドメインであるＢ１−Ｂ５ドメインおよびＣ１−Ｃ４ドメイン、並びにそれらの変異体や連結体が挙げられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８３，８０：６９７−７０１；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２８：１３３８８−１３３９１；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７：１２８２０−１２８２５；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，１２：６９１１−９２０）。上記「変異体」とは、野生型のポリペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠失が導入されたペプチドであって、抗体に対する結合性が改善または維持されたものをいう。また、上記「連結体」とは、免疫グロブリン結合活性を有するペプチドあるいはその変異体を直列に連結して得られるペプチドである。同じペプチドを連結してもよく、異なるペプチドを連結してもよい。連結されるペプチドの数としては、例えば２個以上、１０個以下とすることができる。
【００２８】
抗体様タンパク質としては、免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。免疫グロブリンＧとしては、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ｃ、ヤギＩｇＧ１、ＩｇＧ２、モルモットＩｇＧ、ウシＩｇＧ２、ウサギＩｇＧが挙げられる。免疫グロブリンＧ誘導体としては、例えば、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧや、ヒト免疫グロブリンＧのＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ）部分を他生物種抗体のＣＤＲ部分に置き換えて融合させたヒト型化免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、ヒト免疫グロブリンＧのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工免疫グロブリンＧなどが挙げられる。
【００２９】
酵素としては、特にバイオセンサーに利用される酵素が好ましい。例えば、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。本発明の芯鞘型複合繊維をバイオセンサーに用いる場合は、検出したい測定対象物質（グルコース、アルコール、乳酸、コレステロール、ザルコシン、フルクトシルアミン、ピルビン酸、ヒドロキシ酪酸など）に応じて酵素を選択すればよい。
【００３０】
受容体は、情報伝達物質など、特定のリガンドに選択的に結合されるペプチドをいう。例えば、Ｇタンパク質共役型受容体、チロシンキナーゼ受容体、グアニル酸シクラーゼ受容体、イオンチャネル型受容体、核内受容体などの細胞内受容体が挙げられる。
【００３１】
細胞外マトリックスタンパク質としては、例えば、Ｉ〜ＸＩＸ型コラーゲンなどのコラーゲン；オステオポンチン、ビトロネクチン、ファイブロネクチン、フォンビルブラント因子、ラミニン、テネイシン、フィブリノーゲン、トロンボスポンジンなどの非コラーゲン性糖タンパク質；エラスチン；ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどのプロテオグリカン、およびこれらの部分ペプチドを挙げることができる。本発明の芯鞘型複合繊維を培養基材に用いる場合は、培養したい細胞に応じて細胞外マトリックスタンパク質を選択すればよい。
【００３２】
また、標的化合物が細胞の膜タンパク質である場合には、ペプチドを当該膜タンパク質を抗原とする抗体とすることができる。その場合、標的化合物は当該膜タンパク質を有する細胞ということもできる。
【００３３】
鞘部における親水性ポリマーに対するペプチドの割合としては、０．１質量％以上、５質量％以下が好ましい。当該割合が０．１質量％以上であれば、鞘部の表面にペプチドの少なくとも一部が十分に露出できるといえ、５質量％以下であれば、ペプチドを鞘部へ十分に固定化できるといえる。当該割合としては、０．５質量％以上がより好ましく、また、２質量％以下がより好ましく、１質量％以下がより更に好ましい。
【００３４】
本発明に係る複合繊維の鞘部では、ペプチドの少なくとも一部が親水性ポリマーから露出していることが好ましい。より具体的には、ペプチドが標的化合物に対する親和性を維持している範囲でペプチドは親水性ポリマーから露出しており、また、ペプチドが鞘部から容易に脱落しない範囲でその一部が親水性ポリマー中に存在することが好ましい。但し、鞘部においてペプチドが親水性ポリマー中に埋没していても、親水性ポリマーがゲル状で標的化合物が侵入可能になっており、鞘部内でペプチドと標的化合物が相互作用可能であることも考えられる。
【００３５】
ペプチドの親水性ポリマーからの露出をより確実なものとするためや、ペプチドの脱落をより一層抑制するためには、ペプチドを親水性ポリマーに共有結合させればよい。かかる共有結合のための縮合剤としては、例えば、１，１’−カルボニルジイミダゾール、１，１’−カルボニル（１，２，４−トリアゾール）、１，１’−オキサリルジイミダゾールなどのアゾール系縮合剤；ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドメチオジド、１−エチル−３−ｔｅｒｔ−ブチルカルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホナート、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボジイミド、１，３−ビス（ｐ−トリル）カルボジイミドなどのカルボジイミド系縮合剤；クロロヒドリンやブロモヒドリン；炭酸ビス（ペンタフルオロフェニル）；グルタルアルデヒド；トルエンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、ジフェニルメタンジイソシアネートなどのジイソシアネート系縮合剤；ジビニルサルフェートなどを挙げることができる。
【００３６】
縮合剤の使用量は、ペプチドと親水性ポリマーの量などに依存するが、例えば、ペプチドに対して５質量％以上、１００質量％以下とすることができる。
【００３７】
鞘部における親水性ポリマーとペプチドの割合は制限されないが、例えば、鞘部全体に対して９０質量％以上が好ましく、９５質量％以上または９８質量％以上がより好ましく、９９質量％以上がより更に好ましい。残部は、不可避的不純物や不可避的残留物以外、架橋剤とすることができる。
【００３８】
本発明に係る芯鞘型複合繊維は、芯部と鞘部からなる二層構造を有する繊維の一般的製法に準じて製造することができる。例えば、同軸スピナレットとコレクターを有するエレクトロスピニング装置を使って製造することができる。即ち、本発明に係る芯鞘型複合繊維は、芯材溶液と鞘材溶液をエレクトロスピニング装置に供給し、エレクトロスピニング法により紡糸する工程を含む方法により製造することができる。
【００３９】
同軸スピナレットは、外層ノズルと内層ノズルを有し、芯材溶液と鞘材溶液を紡糸口から同時に吐出できるものである。外層ノズルと内層ノズルの外径と内孔径は、所望の複合繊維と芯部の太さや、鞘部の厚さに応じて適宜調整すればよい。同軸スピナレットとコレクターとの間に印加する電界は、０．５ｋＶ／ｃｍ以上、１０ｋＶ／ｃｍ以下とすることができる。
【００４０】
芯材溶液と鞘材溶液の溶媒は、芯材と鞘材を適度に溶解できるものの中から適宜選択すればよいが、鞘材溶液の溶媒はペプチドを変性させないものから選択する。溶媒としては、例えば、水や緩衝液；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド系溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド系溶媒；メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール系溶媒；およびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
【００４１】
芯材溶液と鞘材溶液の濃度も適宜調整すればよいが、例えば、芯材溶液における水不溶性ポリマーの濃度としては、例えば、５質量％以上、５０質量％以下とすることができ、鞘材溶液における親水性ポリマーの濃度としては５質量％以上、３０質量％以下とすることができ、鞘材溶液におけるペプチドの濃度としては０．０１質量％以上、１質量％以下とすることができ、鞘材溶液における架橋剤の濃度としては０．００１質量％以上、１質量％以下とすることができる。
【００４２】
なお、特にセルロース系ポリマーやペプチドが溶媒に溶解し難いものである場合には、芯材溶液や鞘材溶液の代わりに、セルロース系ポリマーやペプチドが完全に溶解せず少なくともその一部が分散している芯材分散液や鞘材分散液を用いてもよい。例えばセルロース系ポリマーのうちセルロースは、溶媒に溶解し難いことが知られているが、低温のアルカリ水溶液には分散し易いことも知られている。よって、セルロースを低温のアルカリ水溶液に分散させて芯材分散液とし、エレクトロスピニング装置に供給してもよい。アルカリ水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液や水酸化カリウム水溶液を用いることができる。また、アルカリ水溶液の温度は、−１０℃以上、２０℃以下に調整することができる。当該温度としては、−５℃以上が好ましく、０℃以上がより好ましく、また、１５℃以下が好ましく、１０℃以下がより好ましく、５℃以下がより更に好ましい。
【００４３】
複合繊維の太さや鞘部の厚さは、芯材溶液と鞘材溶液の供給速度によって調整することもできる。例えば、鞘材溶液と芯材溶液の供給速度は０．１ｍＬ／ｈ以上、１０ｍＬ／ｈ以下とすることができる。
【００４４】
鞘材溶液に縮合剤を配合する場合には、親水性ポリマーとペプチドを共有結合するための反応時間をとる必要は特にない。具体的には、親水性ポリマーとペプチドと縮合剤を含む鞘材溶液をエレクトロスピニング装置に供給すれば、おそらく紡糸後であっても縮合反応は進行し、ペプチドは親水性ポリマーに共有結合する。
【００４５】
本発明に係る複合繊維は、鞘部に含まれるペプチドと相互作用する標的化合物の精製や検出などに利用することが可能である。具体的には、本発明の複合繊維と標的化合物を含む溶液とを接触させることにより、溶液中の標的化合物を鞘部のペプチドへ選択的に結合させる。接触方法は特に制限されず、標的化合物を含む溶液中に本発明の複合繊維を添加してもよいし、複合繊維をカラムに充填し、標的化合物を含む溶液を通液することにより複合繊維に標的化合物を選択的に吸着させてもよいし、複合繊維を不織布フィルターなどに加工し、標的化合物を含む溶液を通液することにより複合繊維に標的化合物を選択的に吸着させてもよい。
【００４６】
次に、標的化合物が結合した複合繊維を溶液から分離する。この工程により、目的物とその他の物質を分離することができる。分離手段としては、濾過や遠心分離などを適用することができる。また、上記のカラムやフィルターを用いる場合には、標的化合物の吸着と溶液からの分離を同時に行うことができる。
【００４７】
標的化合物が選択的に吸着した複合繊維は、吸着した標的化合物が溶出されない条件で洗浄してもよい。かかる工程により、不純物をより一層効果的に除去することができる。洗浄液は標的化合物が溶出されない限り特に制限されないが、例えば、純水、超純水、蒸留水、脱イオン水、精製水などの水や、ｐＨが６．０以上、８．０以下の水溶液や緩衝液を用いることができる。上記のカラムやフィルターを用いる場合には、洗浄液をカラムやフィルターに通液するのみでよい。
【００４８】
次いで、溶液から分離した複合繊維から標的化合物を脱離させる。標的化合物の脱離には、溶出液を用いればよい。溶出液としては、例えば、ｐＨが２．５以上、４．５以下程度の酸性緩衝液を用いることができる。
【００４９】
上記精製方法の対象となる標的化合物は、上記ペプチドが親和性を示すものであれば特に制限されないが、例えば、上述の抗体様タンパク質が挙げられる。
【００５０】
また、本発明に係る複合繊維の鞘部に含まれるペプチドが親和性を有する標的化合物には、細胞の膜タンパク質が含まれる。膜タンパク質の少なくとも一部は細胞外に露出しているため、本発明の複合繊維は細胞の培養にも利用することができる。具体的には、液体培地に細胞の培養足場として本発明の複合繊維を加え、細胞を培養する。複合繊維として、そのペプチドが細胞の膜タンパク質に親和性を有するものを用いれば、細胞は複合繊維に接着されつつ増殖する。培養後、上記精製方法と同様に、細胞と複合繊維を濾過や遠心分離などで液体培地から分離し、洗浄した後、溶出液で細胞を複合繊維から分離することにより、細胞のみを取り出すことが可能になる。
【００５１】
更に、本発明の複合繊維は、標的化合物と選択的に結合するため、標的化合物の検出にも用いることが可能である。具体的には、例えば、表面プラズモン共鳴装置のプリズムに本発明に係る複合繊維を結合させ、被検試料を接触させる。その上でプリズム側から光を全反射する様に照射すると、表面プラズモン共鳴により反射光強度が低下する入射角度がある。この際の角度は、質量変化、即ち複合繊維に結合する標的化合物の量により鋭敏に変化することから、表面プラズモン共鳴装置では、反射光強度からこの質量変化を測定データ（レゾナンスユニット，１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ2）として表示することができる。その結果、被検試料に標的化合物が含まれているか否かや、含まれている場合にはその量を測定することが可能である。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００５３】
比較例１：  プロテインＡ固定化ＰＶＡ芯鞘型複合繊維の作製
（１）プロテインＡの調製
特開２００６−３２０２２０号公報に記載の方法に準じて、スタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣ６５３８Ｐ株由来プロテインＡからシグナル配列（Ｓドメイン）と細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）の一部を除いた部分を遺伝子組換えにより生産し、クロマトグラフィーで精製してプロテインＡを得た。
【００５４】
（２）  プロテインＡ固定化ＰＶＡ芯鞘型複合繊維の作製
芯材溶液として１５％ポリビニルアルコール（シグマアルドリッチ社製，Ｍｗ：１４６０００〜１８６０００，けん化度：９９％以上）を含むＤＭＳＯ溶液と、５％同ポリビニルアルコール、０．１％プロテインＡおよび０．０５％１，１’−カルボニルジイミダゾールを、それぞれ５ｍＬ／ｈと１．５ｍＬ／ｈの速度でエレクトロスピニング装置（「Ｕｌｔｒａ  ｃｏ−ａｘｉａｌ  ｓｐｉｎｎｅｒｅ」ＭＥＣＣ社製）に供給し、芯鞘型複合繊維を作製した。当該装置が備えるノズルは、芯０．２ｍｍ、鞘０．８ｍｍの同軸の二層構造を有する。作製した複合繊維の位相差顕微鏡写真を図１に示す。
【００５５】
（３）プロテインＡ固定化ＰＶＡ芯鞘型複合繊維の抗体結合能の評価
上記比較例１（２）で作製したプロテインＡ固定化複合繊維を蛍光標識抗体（Ａｌｅｘａ−４８８  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ）の０．５％溶液に常温で１時間浸漬した。次いで、ＰＢＳで洗浄した後、蛍光観察を行った。結果を図２に示す。図２に示す結果の通り、複合繊維表面に完全にプロテインＡがコーティングされていることが分かった。
その後、複合繊維から抗体を分離するために５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で１回、水で３回洗浄した後に再度同じ条件で顕微鏡観察した。結果を図３に示す。
図３に示す結果の通り、酸性緩衝液で洗浄した後には蛍光が認められず、蛍光標識抗体が完全に脱離していることが確認された。しかし繊維が膨潤してしまっており、脱離前に認められた繊維構造を観察することができず、酸性緩衝液による処理で繊維構造が消失してしまっていた。本結果より、上記複合繊維は標的化合物の吸脱着の繰り返し操作に対する耐久性が不十分であることが分かった。
【００５６】
実施例１：  プロテインＡ固定化ＣＡ芯鞘型複合繊維の作製
（１）芯鞘型複合繊維の作製
芯部に２５％アセチルセルロース（シグマアルドリッチ社製，Ｍｎ：３００００，アセチル化度：４０％）を含むＤＭＳＯ溶液、鞘部には１５％ポリビニルアルコール（上記比較例１で用いたものと同製品）、０．１％プロテインＡおよび０．０５％１，１’−カルボニルジイミダゾールを含むＤＭＳＯ溶液を用いて比較例１と同様の方法で芯鞘型複合繊維を作製した。作製した芯鞘型複合繊維の顕微鏡観察結果を図４に示す。また、作製した芯鞘型複合繊維の断面の走査型電子顕微鏡写真を図５に示す。
【００５７】
（２）プロテインＡ固定化ＣＡ芯鞘型複合繊維の抗体結合能の評価
上記実施例１（１）で作製したプロテインＡ固定化芯鞘型複合繊維を比較例１と同様の方法で蛍光観察したところ，繊維表面にプロテインＡがコーティングされていることがわかった（図６）。
【００５８】
（３）プロテインＡ固定化ＣＡ芯鞘型複合繊維の再利用性評価
上記実施例１（１）で作製したプロテインＡ固定化芯鞘型複合繊維を、上記比較例１（３）と同様に蛍光標識抗体溶液に浸漬し、ＰＢＳで洗浄した後、複合繊維への蛍光標識抗体の結合を蛍光観察した。その後、複合繊維を５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で洗浄し、蛍光標識抗体の脱離を観察した。以上の操作を繰り返し、蛍光標識抗体を結合させた後の蛍光写真と位相コントラスト写真と、クエン酸緩衝液で同抗体を脱離させた後の蛍光写真と位相コントラスト写真を得、ファイバー表面に固定化されたプロテインＡの安定性ならびに再利用性を評価した（図７）。また、蛍光観察で撮影した画像の蛍光強度から抗体結合量を定量評価した。その結果を図８に示す。
図７と図８の結果から、本発明に係るプロテインＡ固定化複合繊維は抗体の吸着操作と脱離操作の繰り返しに対して安定であり、再利用性に優れることが確認された。即ち、本発明に係るプロテインＡ固定化複合繊維は血清や培養液から抗体を精製する資材として利用できることが実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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