(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子指向性プロドラッグ療法のためのワクシニアウイルスを作成する方法を明らかにし、疾病の治療におけるその使用を提供する。【解決手段】細胞内でグルタミン酸カルボキシペプチダーゼを発現する能力を有し、プロドラッグの被験体への投与を含んでおり、該プロドラッグはグルタミン酸カルボキシペプチダーゼによって活性型へと変換されうるものであり、かつ該グルタミン酸カルボキシペプチダーゼは特定の配列に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCPG2である、前記ワクシニアウイルスを提供する。【選択図】図６
2019115343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において腫瘍の治療法に使用するためのワクシニアウイルスであって、
このワクシニアウイルスは、細胞内でグルタミン酸カルボキシペプチダーゼを発現する能力を有し、
該方法は、プロドラッグの被験体への投与を含んでおり、該プロドラッグはグルタミン酸カルボキシペプチダーゼによって活性型へと変換されうる、
前記ワクシニアウイルス。
【請求項２】
ワクシニアウイルスが、腫瘍選択性を高めるように遺伝子改変されている、請求項1に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項３】
ワクシニアウイルスが、1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子を有する、請求項1または2に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項４】
1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子にワクシニアチミジンキナーゼ（vTK）を含める、請求項3に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項５】
不活化されたvTK遺伝子がCPG2発現カセットインサートを含有する、請求項4に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項６】
不活化されたvTK遺伝子がルシフェラーゼ発現カセットインサートを含有する、請求項4または5に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項７】
1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子にワクシニア増殖因子（VGF）を含める、請求項3〜6のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項８】
腫瘍が固形腫瘍である、請求項1〜7のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項９】
腫瘍が、頭頸部がん、結腸直腸がん、肺がん、黒色腫、乳がん、頸がん、中枢神経系（CNS）のがん、卵巣がん、腎臓がん、白血病、脳腫瘍、または前立腺がんから選択される、請求項1〜8のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項１０】
腫瘍が、頭頸部がん、結腸直腸がん、肺がん、黒色腫、または乳がんから選択される、請求項9に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項１１】
方法が、静脈内または腫瘍内注入によるワクシニアウイルス投与を含む、請求項1〜10のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項１２】
方法が、被験体への放射線治療の実施を含む、請求項1〜11のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項１３】
方法が、追加の抗がん剤の投与を含む、請求項1〜12のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項１４】
追加の抗がん剤がChk1阻害剤である、請求項13に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項１５】
腫瘍体積がプロドラッグ投与後に減少する、請求項1〜14のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項１６】
グルタミン酸カルボキシペプチダーゼがCPG2であるか、またはその変異体、バリアント、もしくはホモログである、請求項1〜15のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項１７】
CPG2が、配列番号2に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、請求項16に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項１８】
プロドラッグが、グルタミン酸基またはグルタミン酸アナログ基を含有しており、そのグルタミン酸基もしくはグルタミン酸アナログ基は、Nを介してリンカーに結合し、このリンカーが細胞毒性薬に結合している、請求項1〜17のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項１９】
リンカーが、カルボニル、カルバミン酸、尿素から選択される官能基を含有する、請求項18に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項２０】
細胞毒性薬が、ナイトロジェンマスタード、またはナイトロジェンマスタードアナログを含んでなる、請求項18または19に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項２１】
プロドラッグが、N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸、またはその塩である、請求項20に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。
【請求項２２】
細胞内でグルタミン酸カルボキシペプチダーゼを発現することができる、ワクシニアウイルス。
【請求項２３】
グルタミン酸カルボキシペプチダーゼが、CPG2、またはその変異体、バリアント、もしくはホモログである、請求項22に記載のワクシニアウイルス。
【請求項２４】
グルタミン酸カルボキシペプチダーゼが、配列番号2に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、配列番号23に記載のワクシニアウイルス。
【請求項２５】
ワクシニアウイルスが、ワクシニアウイルスビルレンス遺伝子内にCPG2発現カセットインサートを含有する、請求項23または24に記載のワクシニアウイルス。
【請求項２６】
ワクシニアウイルスビルレンス遺伝子がワクシニアチミジンキナーゼ（vTK）である、請求項25に記載のワクシニアウイルス。
【請求項２７】
遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法のための2成分系であって、(a）請求項22〜26のいずれか1つに記載のワクシニアウイルス、および（b）グルタミン酸カルボキシペプチダーゼにより活性型薬物に変換できるプロドラッグ、を含んでなる、前記2成分系。
【請求項２８】
プロドラッグが、グルタミン酸基またはグルタミン酸アナログ基を含有しており、そのグルタミン酸基もしくはグルタミン酸アナログ基は、Nを介してリンカーに結合し、このリンカーが細胞毒性薬に結合している、請求項27に記載の2成分系。
【請求項２９】
リンカーが、カルボニル、カルバミン酸、尿素、および同等物から選択される官能基を含有する、請求項28に記載の2成分系。
【請求項３０】
細胞毒性薬が、ナイトロジェンマスタード、またはナイトロジェンマスタードアナログを含んでなる、請求項28または29に記載の2成分系。
【請求項３１】
プロドラッグが、N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸、またはその塩である、請求項30に記載の2成分系。
【請求項３２】
腫瘍細胞を死滅させる方法であって、その方法が、請求項22〜26のいずれか1つに記載のワクシニアウイルス、およびグルタミン酸カルボキシペプチダーゼにより活性型に変換可能なプロドラッグを用いて、腫瘍細胞を処理することを含む、前記方法。
【請求項３３】
プロドラッグが、グルタミン酸基またはグルタミン酸アナログ基を含有しており、そのグルタミン酸基もしくはグルタミン酸アナログ基は、Nを介してリンカーに結合し、このリンカーが細胞毒性薬に結合している、請求項32に記載の腫瘍細胞を死滅させる方法。
【請求項３４】
リンカーが、カルボニル、カルバミン酸、尿素、および同等物から選択される官能基を含有する、請求項33に記載の腫瘍細胞を死滅させる方法。
【請求項３５】
細胞毒性薬が、ナイトロジェンマスタード、またはナイトロジェンマスタードアナログを含んでなる、請求項33または34に記載の腫瘍細胞を死滅させる方法。
【請求項３６】
プロドラッグが、N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸、またはその塩である、請求項35に記載の腫瘍細胞を死滅させる方法。
【請求項３７】
治療を必要とする患者において腫瘍を治療する方法であって、その方法が、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼを細胞内で発現する能力を有するワクシニアウイルス、およびグルタミン酸カルボキシペプチダーゼにより活性型に変換可能なプロドラッグを、患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項３８】
ワクシニアウイルスが、腫瘍選択性を高めるように遺伝子改変されている、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
ワクシニアウイルスが、1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子を有する、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４０】
1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子にワクシニアチミジンキナーゼ（vTK）を含める、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
不活化されたvTK遺伝子がCPG2発現カセットインサートを含有する、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
不活化されたvTK遺伝子がルシフェラーゼ発現カセットインサートを含有する、請求項40または41に記載の方法。
【請求項４３】
1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子にワクシニア増殖因子（VGF）を含める、請求項39〜42のいずれか1つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子指向性プロドラッグ療法のためのワクシニアウイルス、ならびに、疾病の治療、特に腫瘍の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（GDEPT）およびウイルス指向性酵素プロドラッグ療法（VDEPT）（Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 8302-8306, 1994）は、固形腫瘍への毒性代謝物のデリバリーを増大させることを目指す自殺遺伝子治療アプローチである。これは、現行のがん治療に関する主要な問題の１つ、すなわち、結果的として消化管壁および骨髄などの正常組織に有害な副作用をもたらす、特異性の欠如を克服することを目標とする。「GDEPT」という用語は、ウイルス的および非ウイルス的デリバリーシステムの双方を含めて使用される。第1のステップにおいて、外来のプロドラッグ活性化酵素をコードする遺伝子は、確実に腫瘍限定の発現をするような方法で腫瘍細胞に送達される。その後、適当なプロドラッグを全身投与すると、腫瘍部位でのみ毒性のある代謝産物を生じ、その結果、腫瘍選択的な死滅をもたらす。
【０００３】
本発明者らにより開発されたGDEPT系は、シュードモナス属（Pseudomonas）菌株RS16に由来する酵素カルボキシペプチダーゼG2（CPG2）の発現を利用する（WO 96/03151）。CPG2は、安息香酸ナイトロジェンマスタードプロドラッグおよびフェノールナイトロジェンマスタードプロドラッグなどのプロドラッグを活性化して、L-グルタミン酸および活性のある細胞毒性薬を放出する。
【０００４】
非ウイルス的遺伝子デリバリー法は、in vitroで、プロドラッグ活性化酵素を腫瘍細胞内で発現させるために用いられてきたが（Marais et al., Cancer Res. 56, 4735-4942, 1996; Chen et al., Cancer Res. 55, 581-589, 1995）、さまざまな研究から、ウイルス的遺伝子治療を用いてin vivoで、腫瘍を標的とした、プロドラッグ活性化酵素の発現を達成できることが明らかになった（Schepelmann et al., Cancer Res. 67, 4949-4955, 2007; Hedley et. al., Nat. Rev. Can. 7, 870-879, 2007）。GDEPTではベクターとして、腫瘍選択性を有する、複製しないウイルスベクターおよび条件的複製型腫瘍溶解性ウイルスが使用された；GDEPT臨床試験では、複製しないレトロウイルスおよび条件的複製型アデノウイルスがベクターとして使用されている（Hedley et. al., Nat. Rev. Can. 7, 870-879, 2007）。
【０００５】
ほとんどのウイルスは、ビルレンス遺伝子と称される、ウイルスの複製を促進する1つもしくは複数の遺伝子を有する。野生型アデノウイルスは、細胞分裂を促進するために正常細胞の細胞周期制御因子を攪乱する、いくつかのタンパク質を発現しており、そのようにしてアデノウイルスのライフサイクルをサポートする細胞内環境を作り出す。たとえば、アデノウイルスE1Aは網膜芽細胞腫抑制タンパク質と結合し、E1Bはp53を捕捉して細胞分裂およびウイルス複製を促進する。したがって、E1B遺伝子が変異しているアデノウイルスベクターは、p53が機能していない細胞、たとえば多くのがん細胞に選択的である。条件的複製型腫瘍溶解性アデノウイルスと呼ばれるベクターが、広範に選択されたプロドラッグ活性化酵素をがん細胞にin vivoで送達するために使用されてきた（Jounaidi et al., Cur. Cancer Drug Targets. 7(3): 285-301, 2007）。
【０００６】
CPG2を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスはAdV.hTERT-CPG2と表記されるが、これを用いたヒト結腸がん異種移植片の自殺遺伝子療法がすでに発表されている（Schepelmann et al., Cancer Res. 67, 4949-4955, 2007）。ヒト結腸がん異種移植片を有するヌードマウスは、AdV.hTERT-CPG2を1回全身投与した後、プロドラッグZD2767Pを1週間間隔で6回注射投与することによって治療し、有意な抗腫瘍効果を達成することが示された。AdV.hTERT-CPG2は、ヒトテロメラーゼプロモーターの制御下でE1Aを発現し、それによってテロメラーゼ陽性腫瘍細胞において複製してCPG2を発現することができる。ウイルスの細胞毒性とCPG2生成との直接的な相関関係が、テストしたそれぞれの結腸直腸がん細胞株で示された。他の研究から、プロドラッグの活性化がGDEPT型の系に使用されるワクシニアウイルスベクターの複製を止めることが判明した（Puhlmann et al., Hum. Gene Therapy, 10, 649-57, 1999; McCart et al., Gene Therapy, 7, 1217-23, 2000）が、Schepelmannらは、アデノウイルスベクターAdV.hTERT-CPG2が、プロドラッグの投与を受けなかった動物の腫瘍と比べて、プロドラッグの投与を受けた動物の腫瘍において、いっそう効率よく複製することを見いだした。
【０００７】
この分野の進歩にもかかわらず、アデノウイルスによるがん治療は、臨床試験において限定された治療効果を達成したのみであった。当技術分野においてさらに有効な抗がん治療を提供することは、依然として課題のままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第96/03151号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 8302-8306, 1994
【非特許文献２】Marais et al., Cancer Res. 56, 4735-4942, 1996;
【非特許文献３】Chen et al., Cancer Res. 55, 581-589, 1995
【非特許文献４】Schepelmann et al., Cancer Res. 67, 4949-4955, 2007;
【非特許文献５】Hedley et. al., Nat. Rev. Can. 7, 870-879, 2007
【非特許文献６】Jounaidi et al., Cur. Cancer Drug Targets. 7(3): 285-301, 2007
【非特許文献７】Puhlmann et al., Hum. Gene Therapy, 10, 649-57, 1999;
【非特許文献８】McCart et al., Gene Therapy, 7, 1217-23, 2000
【発明の概要】
【００１０】
概括すると、本発明は、プロドラッグ活性化酵素を発現するように改変されたワクシニアウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターAdV.hTERT-CPG2より強力な抗腫瘍作用を引き起こす能力を有するという、予想外の発見に基づいている。ワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科に属し、天然痘を根絶するために使用された、免疫原性の高いDNAウイルスである。アデノウイルス同様、ポックスウイルスも、細胞分裂を促進するように細胞をトランスフォームするために正常細胞の細胞周期を乱すことができるビルレンス遺伝子を発現する。ワクシニアウイルスおよび他のポックスウイルス、たとえば粘液種ウイルスは、腫瘍細胞に対してある程度、自然の親和性を有しており、それは腫瘍細胞における細胞周期の調節不全に起因するので、この腫瘍細胞に対する選択性は、特定のポックスウイルスビルレンス遺伝子を欠失させることによって高めることができる。たとえば、ワクシニアウイルスの腫瘍選択性は、ビルレンス遺伝子の不活化、たとえば、ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の欠失によって高めることができる（Hedley et. al., Nat. Rev. Can. 7, 870-879, 2007）。本発明者らは、腫瘍を治療するGDEPT系に使用するための、プロドラッグ活性化酵素を発現する改変型ワクシニアウイルスを開発した。
【００１１】
したがって、第1の態様において、本発明は、被験体において腫瘍の治療法に使用するためのワクシニアウイルスを提供するが、
このワクシニアウイルスは、細胞内でグルタミン酸カルボキシペプチダーゼを発現する能力を有し、
その方法は、プロドラッグの被験体への投与を含んでおり、このプロドラッグをグルタミン酸カルボキシペプチダーゼによって活性型へと変換することができる。
【００１２】
ワクシニアウイルスは、腫瘍選択性が高まるように遺伝子改変することができる。遺伝子改変は、1つもしくは複数のワクシニアビルレンス遺伝子の不活化変異、たとえば欠失、挿入もしくは置換変異の形をとることができる。不活化ビルレンス遺伝子には、不活化ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（vTK）を含めることができる。ワクシニアウイルスは、さらに他のビルレンス遺伝子が不活化されていてもよく、たとえば、ワクシニア増殖因子（VGF）の欠失である。
【００１３】
vTKは、CPG2発現カセットの挿入によって不活化することができるが、この発現カセットは、CPG2、またはその変異体、バリアント、もしくはホモログを発現し、しかも挿入変異によってvTKを不活化する。vTKはさらにルシフェラーゼ発現カセットインサートを含んでいてもよい。両者が存在する場合、CPG2発現カセットとルシフェラーゼ発現カセットは隣接していてもよい。好ましくは、CPG2発現カセットおよびルシフェラーゼ発現カセットは互いに隣接し、そのそれぞれの転写プロモーターが隣接しており、反対方向にプライミングする。
【００１４】
あるいはまた、CPG2発現カセットは、ワクシニアウイルスゲノム内の他のどこか、たとえば別のビルレンス遺伝子に挿入されてもよい。
【００１５】
治療すべき腫瘍は固形腫瘍とすることができる。腫瘍は、頭頸部がん、結腸直腸がん、肺がん、黒色腫、乳がん、頸がん、中枢神経系（CNS）のがん、卵巣がん、腎臓がん、白血病、脳腫瘍、または前立腺がんとすることができる。好ましくは、腫瘍は、頭頸部がん、結腸直腸がん、肺がん、黒色腫または乳がんから選択される。
【００１６】
本発明にしたがって治療される腫瘍の体積は好ましくは、プロドラッグ投与後に減少する。好ましくは、被験体はプロドラッグ投与後に生存可能性が高くなる。
【００１７】
ワクシニアウイルスは、静脈内または腫瘍内注入によって被験体に投与することができる。治療方法は、被験体への放射線治療の実施を含めることができる。追加の抗がん剤、たとえばChk1阻害剤を被験体に投与してもよい。
【００１８】
グルタミン酸カルボキシペプチダーゼは、CPG2、またはその変異体、バリアント、もしくはホモログを含めることができる。CPG2は、配列番号2と少なくとも80%同一、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
プロドラッグは、グルタミン酸基またはグルタミン酸アナログ基を含有することができるが、そのグルタミン酸基もしくはグルタミン酸アナログ基は、Nを介してリンカーに結合し、リンカーは細胞毒性薬に結合している。リンカーは、カルボニル、カルバミン酸、尿素、および同等物から選択される官能基を含有することができる。細胞毒性薬は、ナイトロジェンマスタード、またはナイトロジェンマスタードアナログを含めることができる。プロドラッグは、N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸、またはその塩とすることができる。
【００２０】
他の態様において、本発明は、細胞内でグルタミン酸カルボキシペプチダーゼを発現することができるワクシニアウイルスを提供する。ワクシニアウイルスは、CPG2、またはその変異体、バリアント、もしくはホモログを含有することができる。CPG2は、配列番号2と少なくとも80%同一、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を有する。CPG2遺伝子は、ワクシニアウイルスビルレンス遺伝子に挿入されたCPG2発現カセットによって、発現が可能となる。ワクシニアウイルスビルレンス遺伝子はワクシニアチミジンキナーゼ（vTK）とすることができるが、それによってvTKの不活化がもたらされる。ワクシニアウイルスは、さらに他のビルレンス遺伝子が不活化されていてもよく、たとえば、ワクシニア増殖因子（VGF）の欠失である。
【００２１】
もう1つの態様において、本発明は、遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法のための2成分系を提供するが、これは(a）グルタミン酸カルボキシペプチダーゼを発現する能力を有するワクシニアウイルス、および（b）グルタミン酸カルボキシペプチダーゼにより活性型薬物に変換できるプロドラッグ、を含む。
【００２２】
また別の態様において、腫瘍細胞を死滅させる方法は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼを発現する能力を有するワクシニアウイルス、およびグルタミン酸カルボキシペプチダーゼにより活性型に変換可能なプロドラッグを用いて腫瘍細胞を処理することを含む方法である。
【００２３】
もう1つの態様において、本発明は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼを細胞内で発現する能力を有するワクシニアウイルス、およびグルタミン酸カルボキシペプチダーゼにより活性型に変換可能なプロドラッグを患者に投与することによって、治療を必要とする患者において腫瘍を治療する方法を提供する。
【００２４】
本発明の実施形態は、添付の図面を参照して、ここで説明されるが、それは例としてであって制限ではない。しかしながら、本明細書に照らして、本発明のさまざまな他の態様および実施形態が当業者に明白となるであろう。
【００２５】
本明細書で使用される「および/または」は、2つの特定の特徴または構成要素について、他方あり、または他方なしでの、それぞれの個別の開示とみなされるべきものである。たとえば、「Aおよび/またはB」は、それぞれが本明細書で個々に提示されているかのように、(i) A、(ii) B、ならびに(iii) AおよびBのそれぞれの、個別の開示とみなされるべきである。
【００２６】
文脈上ほかに指示のない限り、上記の特徴の説明および定義は、本発明のいかなる特定の態様もしくは実施形態にも限定されず、記載されたすべての態様および実施形態に等しく当てはまる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸からN-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノールへのCPG2に触媒された変換。
【図２】腫瘍細胞におけるプロドラッグ活性化酵素のウイルスによる発現、およびプロドラッグ投与後に遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（GDEPT）によって引き起こされる腫瘍細胞死の図解
【図３】VV-CPG2の作製に関する分子生物学的ステップ。
【図４】AdV-hTertまたはVV-CPG2ベクターの腫瘍内（IT）または静脈内（IV）投与後の頭頸部FaDu異種移植片におけるCPG2発現。
【図５】FaDu頭頸部がん移植片のGDEPTにおけるAdV-hTert。AdV-hTertは腫瘍内（IT）投与。腫瘍体積（mm3）vs時間（A）；生存率vs時間（B）。(A)の最も上のプロットは対照群を表す。
【図６】FaDu頭頸部がん移植片のGDEPTにおけるVV-CPG2。VV-CPG2は腫瘍内（IT）投与。腫瘍体積（mm3）vs時間（A）；生存率vs時間（B）。(A)の最も下のプロットおよび(B)の右上のプロットはGDEPT群を表す。
【図７】FaDu頭頸部がん移植片のGDEPTにおけるAdV-hTert。AdV-hTertは静脈内（IV）投与。腫瘍体積（mm3）vs時間（A）；生存率vs時間（B）。(A)の最も上のプロットおよび(B)の最も下のプロットは対照群を表す。
【図８】FaDu頭頸部がん移植片のGDEPTにおけるVV-CPG2。VV-CPG2は静脈内（IV）投与。腫瘍体積（mm3）vs時間（A）；生存率vs時間（B）。(A)の最も下のプロットおよび(B)の右上のプロットはGDEPT群を表す。
【図９】放射線治療（RT）と併用したFaDu頭頸部がん移植片のGDEPTにおけるVV-CPG2。VV-CPG2は腫瘍内（IT）投与。腫瘍体積（mm3）vs時間（A）；生存率vs時間（B）。(A)の下方のプロット（160日まで延長）および(B)の右上のプロットはRT+GDEPT群を表す。
【図１０】放射線治療（RT）と併用したFaDu頭頸部がん移植片のGDEPTにおけるVV-CPG2。VV-CPG2は静脈内（IV）投与、腫瘍体積vs時間。最も下のプロットはRT+GDEPT群を表す。
【図１１】ZD2767Pプロドラッグで処理されたWM266.4細胞であって、VV-CPG2によって形質導入されなかった前記細胞（右側のy軸）またはMOI 0.1でVV-CPG2によって形質導入された前記細胞（左側のy軸）のMTS生死判別アッセイ。
【図１２】ZD2767Pプロドラッグで処理されたFaDu細胞であって、VV-CPG2によって形質導入されなかった前記細胞（右側のy軸）またはMOI 0.1でVV-CPG2によって形質導入された前記細胞（左側のy軸）のMTS生死判別アッセイ。
【図１３】ZD2767Pプロドラッグで処理されたSW620細胞であって、VV-CPG2によって形質導入されなかった前記細胞（右側のy軸）またはMOI 0.1でVV-CPG2によって形質導入された前記細胞（左側のy軸）のMTS生死判別アッセイ。
【図１４】ZD2767Pプロドラッグで処理されたA549細胞であって、VV-CPG2によって形質導入されなかった前記細胞（右側のy軸）またはMOI 0.1でVV-CPG2によって形質導入された前記細胞（左側のy軸）のMTS生死判別アッセイ。
【図１５】VV-CPG2ベクターの静脈内（IV）投与後の肺A549異種移植片におけるCPG2発現(A)；およびVV-CPG2ベクターの静脈内（IV）投与後の結腸直腸SW620異種移植片におけるCPG2発現(B)。
【図１６】頭頸部FaDu異種移植片(A)；結腸直腸SW620異種移植片(B)；および肺がんA549異種移植片(C)を有するマウスにおけるVV-CPG2ベクターの静脈内（IV）投与後の腫瘍/組織CPG2発現。活性は、（固形腫瘍について）グラムあたりの単位活性、ならびに（血漿について）mlあたりの単位活性で表される。
【図１７】肺がんA549異種移植片のGDEPTにおけるVV-CPG2。VV-CPG2は静脈内（IV）投与。腫瘍体積（mm3）vs時間（A）；生存率vs時間（B）。(A)の最も下のプロットおよび(B)の上方のプロットはGDEPT群を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（GDEPT）
GDEPTは腫瘍のための2段階の治療である。外来のプロドラッグ活性化酵素は標的細胞に送達されて発現するが、その細胞内で酵素はその後、投与された毒性のないプロドラッグを活性化して活性薬物を形成することができる。図2はGDEPT系の図解を示すが、その第1段階では、腫瘍感染性ウイルスを用いて、プロドラッグ活性化酵素を発現する遺伝子を送達する。第2段階ではプロドラッグが投与されるが、それは腫瘍内で発現された酵素によって活性化され、毒性のある薬物を形成することができるものである。プロドラッグ活性化酵素遺伝子は、もっぱら腫瘍細胞においてのみ、または正常組織および血液に比べて腫瘍細胞において比較的高割合で、発現されるべきであり、臨床上有効となるために十分な濃度を達成しなければならない。遺伝子デリバリーの後、プロドラッグの投与は、標的となる細胞内でのタンパク質発現が可能となるように、遅らせる必要がある。発現された酵素の触媒活性は、プロドラッグの活性化のために十分なものである必要がある。プロドラッグ活性化酵素の発現は、in vivoで、標的とする腫瘍の必ずしもすべての細胞で生じるわけではないので、プロドラッグが切断されて、腫瘍細胞だけでなく隣接する非発現腫瘍細胞をも死滅させる活性薬物となるバイスタンダー細胞毒性効果は、有益である。このことは、腫瘍細胞のうち100%未満の発現でも、全腫瘍細胞の死滅をもたらすことができることを意味する。プロドラッグ活性化酵素は通常、細胞内で発現されるが、細胞表面に方向付けられた膜結合型バリアントであってもよい。
【００２９】
酵素系
多数のさまざまなプロドラッグ活性化酵素がGDEPT療法に使用されている。たとえば、シトシンデアミナーゼ、HSVチミジンキナーゼ、およびシトクロムP450がGDEPTに使用されている（Hedley et. al., Nat. Rev. Can. 7, 870-879, 2007）。これらの酵素はいずれも、本発明のワクシニアウイルスとともに使用することができる。
【００３０】
本発明により開発されたGDEPT系は、シュードモナス属(Pseudomonas)菌株RS16由来の酵素であるカルボキシペプチダーゼG2（CPG2）を使用する。ペプチダーゼは、基質に作用してペプチド（アミド）結合を切断する酵素の一分類である；カルボキシペプチダーゼはタンパク質もしくはペプチドのカルボキシ末端においてペプチド結合を切断する。
【００３１】
本発明の一部の実施形態において、プロドラッグ活性化酵素はカルボキシペプチダーゼであって、それはプロドラッグから保護基を取り除くことによって、プロドラッグを活性薬物に変換する。プロドラッグ活性化酵素は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、たとえばCPG1もしくはCPG2とすることができるが、それはプロドラッグからグルタミン酸およびグルタミン酸アナログを優先的に切断する。
【００３２】
好ましい酵素は、シュードモナス属（Pseudomonas）菌株SR16由来のトランケート型カルボキシペプチダーゼCPG2であって（WO88/07378に記載）、配列番号2に記載の配列を有するが、ただし、全長CPG2、膜に固定されたCPG2、CPG2の他の変異体、オルソログ、ホモログ、もしくはバリアントも使用してもよい。本出願に関連して、CPG2ホモログはCPG2と共通の祖先を共有する酵素であって、これは配列番号2のCPG2とほぼ同じ速度でプロドラッグを活性薬物に変換することができる。本出願に関連して、CPG2変異体は、配列番号2のうち少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%からなるアミノ酸配列を有しており、また場合によっては、別のタンパク質に由来する他のアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。バリアントは、配列番号2に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含有することができる。バリアントは、配列番号1に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。配列比較は、場合によって、関連するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、関連配列の全長にわたって行ってもよいが、より好ましくは、約20、25、30、33、40、50、67、133、167、200、233、267、300、333程度かそれ以上、もしくはそれより多くのアミノ酸またはヌクレオチドトリプレットの連続した配列にわたって、行うことができる。配列の変更は、その酵素が天然型酵素とほぼ同じ速度でプロドラッグを活性薬物に変換する能力を保持するような変更である。これに関して、「ほぼ同じ速度」は、1桁の範囲内であれば望ましいが、好ましくは、約50分の1、たとえば約2分の1から、約2、5、もしくは10倍までである。
【００３３】
本発明により使用されるCPG2バリアントは、WO 01/085960に記載のように、細胞膜指向性となるように操作することが可能であって（すなわち膜結合型CPG2）、細胞内で利用可能性が低いプロドラッグを細胞外間隙で活性化することができる。
【００３４】
あるいはまた、他の細菌カルボキシペプチダーゼ酵素、たとえば、シュードモナス（Pseudomonas）属の他種であるPseudomonas aeruginosa、Pseudomonas cepacia、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudomonas syringae、Pseudomonas savastanoiなどに由来するCPG2酵素を使用してもよい。好ましいカルボキシペプチダーゼは、以下の特性のうち1つもしくは2つ以上を有する：配列番号2に配列が示されるポリペプチドと反応する抗体との免疫学的交差反応性；配列番号2にアミノ酸配列が示されるポリペプチドとエピトープを共有すること（たとえば、2つのポリペプチド間の免疫学的交差反応性によって確認される）；配列番号2に配列が示されるポリペプチドに対して生じる抗体によって阻害される生物活性；安息香酸マスタードプロドラッグからL-グルタミン酸を遊離する能力。配列の変更は、カルボキシペプチダーゼの性質、および/または活性レベル、および/または安定性を変化させる可能性がある。
【００３５】
CPG2の好ましい基質はL-グルタミン酸基であって、それは、アミド結合、カルバミン酸結合、または尿素結合によって芳香環に結合している。グルタミン酸アナログも、受容可能な基質である。たとえば、γ-炭素の位置で（たとえば、酸、-COOHの代わりにアミド、-CONH2により）修飾されたL-グルタミン酸も、CPG2の適当な基質となる。
【００３６】
プロドラッグ
さまざまなプロドラッグがDGEPT療法に使用されている。たとえば、5-フルオロシトシンは、シトシンデアミナーゼGDEPT系で使用され、ガンシクロビルはHSVチミジンキナーゼGDEPT系で使用され、またシクロホスファミドはシトクロムP450 GDEPT系で使用されている（Hedley et. al., Nat. Rev. Can. 7, 870-879, 2007）。これらのプロドラッグ/酵素系のうち任意の1つを本発明のワクシニアウイルスとともに使用することができる。
【００３７】
本発明が開発したGDEPT系は、酵素カルボキシペプチダーゼG2（CPG2）を使用して、安息香酸ナイトロジェンマスタードプロドラッグ、アニリンナイトロジェンマスタードプロドラッグ、およびフェノールナイトロジェンマスタードプロドラッグ、たとえばZD2767P (N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸)およびその塩などのプロドラッグを活性化する。CPG2は、ZD2767Pのカルバミン酸結合を切断してL-グルタミン酸、二酸化炭素分子、ならびにDNAアルキル化剤ナイトロジェンマスタードN-4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノールを遊離するが、これは強力な細胞毒性薬である。図1は、CPG2に触媒されて、N-4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノールを生成する、ZD2767Pの変換を示す。
【００３８】
ナイトロジェンマスタードは、第一次世界大戦中に使用された「マスタードガス」である硫黄マスタード(ClCH2CH2)2Sと関係がある。ナイトロジェンマスタードは一般式(ClCH2CH2)2NRを有する。in vivoでそれぞれの2-クロロエチル側鎖は、塩素イオンの遊離により分子内環化を受ける。その結果得られる高反応性エチレンインモニウム誘導体は、たとえばアルキル化剤および/または架橋剤として、DNAおよび他の分子と反応することができる。ナイトロジェンマスタードは、たとえばがんなどの、増殖性疾患の治療に有用である。
【００３９】
ナイトロジェンマスタードアナログは、その塩素基が、他の基、たとえば他のハロゲン（ZD2767Pで例示されるように、たとえばブロモおよびヨード）や他の適当な脱離基（たとえばメシルオキシ、-OSO2Meなどのスルホン酸）で置き換えられたものが知られており、「ナイトロジェンマスタード」と呼ばれる分類に含まれる。ナイトロジェンマスタードは、便宜上R基に応じて分類することができる。たとえば、2つのグループ、フェノール性ナイトロジェンマスタードおよびアニリン性ナイトロジェンマスタードがある。
【００４０】
GDEPT系において、ナイトロジェンマスタードもしくは他の細胞毒性薬物はプロドラッグの形で提供され、プロドラッグは細胞毒性部分に結合した保護基を有している。ほとんどの場合、保護基はプロドラッグからまるごと切断される。しかしながら、酵素が保護基の一部を切断するか、または単に変化させることもあり、その結果として、部分的に切断または変更された、不安定化した保護基を生じ、保護基の残りの部分の自然発生的な除去に至ることもある。
【００４１】
CPG2に適した基質となるさまざまなプロドラッグがすでに報告されている（WO 94/002450, WO 04/020400）。典型的な基質の部分構造は、-芳香環-X-CO-Gluであるが、このXは-NH-、-O-、または-CH2であり、Gluはグルタミン酸もしくはグルタミン酸アナログである。
【００４２】
ZD2767Pのほかに、本発明にしたがってCPG2 GDEPT系に使用することができる他のナイトロジェンマスタードプロドラッグには下記のものがある：
(S)-2-(4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェノキシカルボニルアミノ)-4-(1H-1,2,3,4-テトラゾール-5-イル)酪酸、およびその塩；
N-(4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-3-フルオロフェニルカルバモイル)-L-グルタミン酸、およびその塩；
N-(4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニルカルバモイル)-L-グルタミン酸、およびその塩；ならびに
N-(4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸、およびその塩。
【００４３】
WO 04/020400は「自壊性」CPG2基質を記載するが、これは、活性化プロセスを受けて、その後の多段階で活性薬物を遊離する、不安定な中間体を生じる化合物として定義されるものである。したがって、CPG2は、プロドラッグの保護基の一部を切断するか、もしくは単に変化させることによって、こうした自壊性プロドラッグを活性化し、その結果として、部分的に切断または変更された、不安定化した保護基を生じ、保護基の残りの部分の自然発生的な除去をもたらすことができる。
【００４４】
本明細書に記載のプロドラッグのいずれか、または本明細書で考慮されるプロドラッグ活性化酵素とともに使用することができる他の任意の化合物を、過度の負担なしに本発明にしたがって使用することができることは、当業者には明らかであろう。
【００４５】
ワクシニアウイルス
ワクシニアウイルスは、大型DNAウイルスのポックスウイルス科に属するが、このDNAウイルスは典型的には130-300 kbpの大きさのゲノムを有しており、そのゲノムは、線状二本鎖DNAの一方の鎖長にコードされる。比較的大量の遺伝子材料を収容するために、ポックスウイルスは、縦横の寸法が約200nm×300nmの、大きなカプシドを有している。その大きなDNA収容力によって、ポックスウイルスは複数のトランスジーンおよび/または大型のトランスジーンを送達するよう操作することが可能となる。
【００４６】
ポックスウイルスビリオンはそのライフサイクルのさまざまな段階で異なる形態をとる。細胞外のエンベロープを有するビリオンは、細胞に結合して侵入する感染性粒子である。細胞外のエンベロープを有するビリオン（EEV）は、ウイルスコアをカプシド粒子内に有しており、これは外側の膜に覆われている。外側の膜は細胞への侵入に際して取り除かれ、それがEEV脱核の2つのプロセスのうち最初の部分を特徴付ける。脱核プロセスの後半部分で、ウイルスDNAを含有するウイルスコアが細胞質内に遊離される。
【００４７】
ワクシニア遺伝子は細胞質において発現されるが、このプロセスは、初期遺伝子発現、中期遺伝子発現、および後期遺伝子発現を含むいくつかの段階で起こる。ゲノム複製に必要な遺伝子、たとえば、ウイルスDNA依存性RNAポリメラーゼは初期遺伝子である。宿主の抗ウイルス反応を和らげてウイルス複製を促進する遺伝子も、おもに感染の初期段階に発現される。これに対して、ウイルスの構造成分は主として後期に発現され、後期遺伝子発現の活性化に重要と考えられる比較的少数の遺伝子群が中期に発現される。構造遺伝子はサイトゾル内で集合して細胞内成熟ビリオン（IMV）を形成し、それはゴルジ装置により2つの膜で被覆されて、細胞内のエンベロープを有するビリオン（IEV）を形成する。
【００４８】
IEVは細胞骨格微小管にそって細胞周縁部に移動し、そこで細胞膜と融合して、細胞結合型のエンベロープを有するビリオン（CEV）を形成し、それが細胞溶解時にEEVとして放出されて細胞死をもたらす。本発明のワクシニアウイルスは、おもにEEVの形をとるが、ワクシニアビリオンの細胞内型であっても感染性が知られており、やはり本発明の一部をなすとみなされる。
【００４９】
ワクシニアウイルスゲノムは、ウイルス複製に適した細胞内の条件を促進するために、宿主の抗ウイルス反応を和らげたり、宿主の細胞周期を乱したりする役割を果たす、多数のビルレンス遺伝子を含有する。たとえば、ワクシニアウイルスは、チミジンキナーゼ、インターフェロン結合タンパク質、セリンプロテイナーゼ阻害剤、および上皮増殖因子受容体（EGFR）-結合増殖因子を発現する遺伝子を含有する。感染する腫瘍細胞に対するワクシニアの選択性を高めるための、上記ワクシニアビルレンス遺伝子クラスのそれぞれのメンバー遺伝子の変異が、すでに報告されている（(Kirn et al., Nat. Rev. Can., 9, 64-71, 2009）。I型IFN結合タンパク質の欠失を有するワクシニアウイルスは、インターフェロン反応のない腫瘍において選択的に複製する。宿主の抗ウイルス防御を妨げるセリンプロテイナーゼ阻害剤SPI-1およびSPI-2の欠失は、おもにトランスフォーム細胞で複製するワクシニアをもたらす。ワクシニアチミジンキナーゼの欠失は、ウイルスが細胞のチミジンキナーゼ発現に依存する状態をもたらすが、これはがんの大部分において増殖状態にかかわらず構成的に発現されている（Kirn et al., Nat. Rev. Can., 9, 64-71, 2009）。
【００５０】
ワクシニアウイルスは、肺がん、頸がんおよびCNSがん（A Ascierto et al., BMC Cancer, 11:451, 2011）、ならびに黒色腫、卵巣がん、腎臓がん、乳がん、白血病、非小細胞肺がん、結腸がん、脳腫瘍、前立腺がん（Parato et al., Mol. Ther., 20(4), 749-758, 2012）を含むさまざまな腫瘍型に効率的に感染してこれを死滅させることが示されている。
【００５１】
ウイルスの腫瘍選択性は、標準的な技術によって評価もしくは数値化することができる。たとえば、腫瘍サンプルのウイルスDNAコピー数と、非腫瘍サンプルのウイルスDNAコピー数との比較は、各サンプルについてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することによって可能であり、当業者はそれによって、ウイルスの腫瘍選択性の程度を定量的に評価することができる。当業者には当然のことであるが、ウイルスタンパク質に特異的な酵素結合免疫吸着検査法（ELISA）などの別法を用いて、腫瘍および非腫瘍サンプル中のウイルス量の測定および比較を行うこともできる。
【００５２】
VV-CPG2
本発明者らは、CPG2を発現するよう改変したワクシニアウイルスが、適当なプロドラッグとともにGDEPTプロトコールで使用されると、in vivoで強力な抗腫瘍反応を引き起こすことができることを見いだした。ワクシニアp7.5プロモーター制御下でCPG2を発現するDNAをワクシニアチミジンキナーゼ（TK）遺伝子に挿入すると、不活化されたチミジンキナーゼを有するワクシニアウイルスが生じる。ワクシニア増殖因子（VGF）遺伝子は、上皮増殖因子と相同であるが、これも欠失させた。さらに、ワクシニアpsyn(E/L)プロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現するDNAも挿入して、感染細胞を容易に識別できるようにした。図3はVV-CPG2のTK遺伝子におけるルシフェラーゼおよびCPG2の配置方向を示す。
【００５３】
（実施例）
材料および方法
細胞株、親ウイルス、およびプラスミド
認証されたFaDu、SW620およびWM266.4をAmerican Type Culture Collection (LGC Promochem)から入手した。FaDu細胞はテロメラーゼ陽性ヒトがん細胞株である。ウイルスの産生および特性評価のために使用される細胞株、CV1細胞（American Type Culture Collectionから入手）、143B TK-（STRプロファイリングにより確認）、ならびに親ウイルス、VSC20.VGF- およびシャトルベクター、pSC65に基づくpSC65.lacZ.luc、（Chakrabarti et al., 1997）、はJennerex Inc.により供給された。CPG2配列およびAdV-hTertを含有するプラスミドの構築は、すでに記載されている（Marais et al., 1996）（Schepelmann et al, 2005, 2007）。
【００５４】
VV-CPG2の構築
図2はVV-CPG2プラスミドのクローニングにおける分子生物学的ステップの概略図を示す。
【００５５】
pSC65.lacZ.lucはXhoIおよびBamHIで消化してLacZ配列を除去し、ポリリンカー配列TCGAGACGCGTGATATCATGCATACATGTCACGTGGAATTCACTAGTG（top）およびGATCCACTAGTGAATTCCACGTGACATGTATGCATGATATCACGCGTC(bottom）と再び連結して、pSC65.polylinker.lucを生成し、これをMluIおよびSpeIで消化した。pEF.CPG2は、CPG2 ATG開始コドンのすぐ上流にアダプター-コザック配列ACGCGTGCCGCCACC（top）およびGGTGGCGGCACGCGT（bottom）を含有するように改変し、pEF.adaptor.CPG2が与えられたが、これをMluIおよびXbaIで消化した。線状化されたシャトルプラスミド、pSC65.polylinker.lucを、切り取られたCPG2配列とふたたび連結してpSC65.CPG2.lucが与えられたが、このCPG2およびlucはワクシニアプロモーターp7.5 およびpsyn(E/L)のそれぞれ下流にある。
【００５６】
pSC65.CPG2.lucのVSC20.VGF-との組換え、および組換え体のプラーク精製は、標準プロトコールにしたがって行った（Earl et al., 1998）。手短に述べると、CV1細胞にVSC20.VGF-を感染させた後、Lipofectamine (Invitrogen)を用いてpSC65.CPG2.lucでトランスフェクトした。バイオルミネッセンスは、ワクシニア転写因子およびルシフェラーゼ遺伝子の細胞共局在化を示した。組換え体は、ブロモデオキシウリジンの存在下で143B TK-細胞において3回のプラーク精製により選抜し、導入遺伝子領域配列決定、バイオルミネッセンス、およびCPG2活性アッセイにより確認した（(Stribbling et al., 1997）。組換えウイルスは、CV1細胞において実用ストックになるまで増やして、ショ糖密度勾配遠心法で精製し、プラークタイトレーションにより定量した。tkおよびvgfの欠失、ならびにcpg2およびlucの挿入を有する、操作されたウイルスをVV-CPG2と命名した。インサートの忠実度はダイターミネーターサイクルシークエンシングによって確認した。
【００５７】
腫瘍細胞株のVV-CPG2による感染
次の細胞株について、VV-CPG2による形質導入に対する感受性を調べた；
SW620およびHT29：結腸直腸がん細胞株
A549：肺がん
FaDu：頭頸部がん
WM266.4：黒色腫
MDA-MB-231：乳がん。
【００５８】
テストしたそれぞれの腫瘍細胞株は、VV-CPG2による感染後CPG2を発現することが判明した。たとえば、0.1の感染効率（MOI）でそれぞれVV-CPG2により形質導入されたA549細胞、MDA-MB-231細胞、およびHT29細胞は、形質導入後72時間の時点で、それぞれ、1 ユニット/mg (U/mg)、1.2 U/mg、または1.1 U/mgのCPG2活性を有していた。WM226.4細胞、FaDu細胞、SW620およびA549細胞において、細胞生存率の低下が図11から14で示されている。いずれの場合も細胞生存率はMTSアッセイで測定した。0.1のMOIでVV-CPG2により形質導入された細胞において、ZD2767PのEC50の低下は、114倍（WM226.4細胞）；119倍（SW620細胞）；ならびに103倍（FaDu細胞）である。したがって、いずれの場合も、MOI = 0.1でのVV-CPG2による形質導入は、結果として、ZD2767Pに対する感受性の100倍を超える増加をもたらす。
【００５９】
in vivo実験
あらゆる動物実験は、英国内務省のパーソナルおよびプロジェクトライセンス（Personal and Project UK Home Office License）の制限、ならびにUKCCCR指針（Workman, 1998）に準拠した。CD1 nu/nu胸腺欠損マウスは、5-7週齢でCharles Riverより入手し、実験前1週間の間、環境に慣らしておいた。特定の病原体を含まない環境を維持した。動物は食餌および水を無制限に利用することができ、ケージ当たり5匹だけが収容された。腫瘍異種移植片を定着させるために、対数増殖期にある細胞を右側腹部の皮下区画に注入した。FaDu細胞は動物ごとにPBS中106個の細胞数で注入した。細胞の点滴注入後14もしくは15日の時点で、定着した腫瘍の存在下で、治療介入を開始した。A549細胞は動物ごとに、1:1比率のPBSおよびMatrigel中107個の細胞数で注入した。腫瘍が約100mm3となったら、治療介入を開始した。SW620細胞は動物ごとにPBS中106個の細胞数で注入した。
【００６０】
平均腫瘍直径が15 mmを越えるか、いずれか1つの直径が17 mmに達したとき、または進行性の腫瘍潰瘍化がある場合に、プロジェクトライセンス条件の指示にしたがって、頸椎脱臼により動物を屠殺した。
【００６１】
腫瘍内実験のために、公表された前例（Bazan-Peregrino et al., 2008）をもとに作られた体系的な方法を用いて、AdV-hTertは、0.2ml/20g体重で4x108 プラーク形成単位/kg (PFU/kg)を投与したのに対して、VV-CPG2は、総容量20μlの溶媒中として腫瘍内注入によって4x107 PFU/kgを投与した。静脈内実験のために、AdV-hTertは、尾静脈注射により0.2ml/20g体重で4x109 PFU/kgを投与した。VV-CPG2も、尾静脈注射により0.2ml/20g体重で4x109 PFU/kgを投与した。ZD2767Pは腹腔内注入により、1時間間隔で3回に分けて150-300 mg/kgを投与した。4-8週間にわたって、4から6回のプロドラッグ投与を行ったが、それは毒性モニタリングにより判断された。対照群では、物質の投与は適当な溶媒で置き換えられた。腫瘍のカリパス測定は週2回行われ、体積は、長径×短径×高さ×π/6の式を用いて算出した。組織CPG2活性は既述のように（Stribbling et al., 1997）、間接的なエンドポイントアッセイで定量した。簡単に述べると、サンプルをホモジナイズし、メトトレキサートとともに30分間インキュベートして、反応を終了させた。分解産物DAMPAの濃度を高速液体クロマトグラフィーで測定した。標準曲線を基準として最終産物濃度をCPG2活性に変換したが、その標準曲線は、分析ごとに別の反応速度アッセイを用いて作製された。放射線照射はGammacell 40 Exactor（Best Theratronics, Ottawa, Canada）を用いて実施し、一つのセシウム-137線源から662 kVで片側性局所腫瘍照射を実現するように構成した。オフライン線量測定は、ガフクロミックフィルム（Gafchromic EBT film）（International Specialty Products, Vertec Scientific, UK）を用いて行い、実行中の線量率0.6 Gy/分が与えられた。対照群では、物質投与を適当な溶媒に置き換え、動物を処理容器内に同様の期間、鎮静して収容することによって、偽照射を行った。
【００６２】
結果
図4は、FaDuヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて、AdV-hTERTまたはVV-CPG2を腫瘍内（IT）もしくは静脈内（IV）注入した後の、腫瘍内のCPG2酵素の濃度を示す。FaDuヒト腫瘍異種移植片モデルにおけるCPG2酵素レベルは、腫瘍組織グラムあたりのユニットとして評価されるが（CPG2 U/g）、これは活性エンドポイントアッセイにより下記のように測定した。図4は、FaDuヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて、VV-CPG2のIV注入後に、同じ用量の4 x 109 プラーク形成単位/kgで投与されたAdV-hTERTと比べて、同様レベルのCPG2活性が達成されることを示している。FaDuヒト腫瘍異種移植片モデルでのIT投与については、FaDuヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて4 x 108のAdV-hTERT投与量で達成されるのと同レベルのCPG2活性を達成するのに、4 x 107 pfu/kgのVV-CPG2で十分である。
【００６３】
図5および6は、FaDuヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて、それぞれAdV-hTERTベクターまたはVV-CPG2ベクターのIT投与後に、腫瘍体積および動物生存に及ぼすGDEPTの影響を示す。図5Aは、AdV-hTERTによるGDEPTが腫瘍体積の減少をもたらさないことを示す。AdV-hTERT-GDEPTで治療された動物の腫瘍体積は、対照動物の腫瘍体積とも、AdV-hTERTベクターのみで処理された（その後のプロドラッグ投与なしの）動物の腫瘍体積とも有意差はない。図5Bは、AdV-hTERTによるGDEPT後に動物の生存が延びないことを示す；それどころか、生存時間は短くなる。これに対して、FaDuヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて、図6Aは、VV-CPG2によるGDEPTが結果として、有意で長期間持続する腫瘍体積の減少をもたらすことを示しており、腫瘍体積は生存動物ではゼロに近づく。図6Bは、VV-CPG2によるGDEPT後に動物の生存が延びることを示しており、VV-CPG2-GDEPT動物の約35%が100日を越える期間生存する。
【００６４】
図7および8は、FaDuヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて、それぞれAdV-hTERTベクターおよびVV-CPG2ベクターのIV投与後に、腫瘍体積および動物生存に及ぼすGDEPTの影響を示す。図7Aは、AdV-hTERTによるGDEPTが腫瘍体積の減少をもたらさないことを示す。AdV-hTERT-GDEPTで治療された動物の腫瘍体積は、対照動物の腫瘍体積とも、AdV-hTERTベクターのみで処理された（その後のプロドラッグ投与なしの）動物の腫瘍体積とも有意差はない。図7Bは、AdV-hTERTによるGDEPT後に動物の生存時間がごくわずかだけ延びることを示す。図8Aは、FaDuヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて、VV-CPG2によるGDEPTが結果として、経時的な腫瘍体積の減少をもたらすことを示す。図8Bは、VV-CPG2によるGDEPT後に動物の生存が延びることを示しており、VV-CPG2-GDEPT動物の約50%が100日を越える期間生存する。
【００６５】
図9は、FaDuヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて、VV-CPG2によるGDEPTと放射線治療（RT）の併用有効性を示す。VV-CPG2は腫瘍内に投与した。対照以外の全動物は、20Gyの放射線量を受けた。図9Aは、ベクターのみと併用したRTが時間とともに腫瘍体積の安定をもたらすこと、ならびにVV-CPG2によるGDEPTと併用したRTは、腫瘍体積の減少をもたらし、それはゼロに近づくことを示す。図9Bは、放射線治療と併用してVV-CPG2によるGDEPTを受けた動物の75%より多くが150日間を越えて生存したことを示す。
【００６６】
図10は、VV-CPG2が静脈内投与された場合に、放射線治療（RT）と併用したVV-CPG2によるGDEPTが、不変の腫瘍体積をもたらすことを示す。対照以外のすべての動物は10Gyの放射線量を受けた。
【００６７】
他の抗がん治療との併用も本発明の一部をなすと考えることができる。たとえば、細胞毒性薬に対して腫瘍を増感させることが知られている、Chk1などの細胞チェックポイント阻害剤を、がん治療のために本明細書に記載のGDEPT系と並行して使用してもよい。
【００６８】
図15は、VV-CPG2の静脈内（IV）注入後の、(A) 肺A549腫瘍および(B)結腸直腸SW620腫瘍におけるCPG2酵素の濃度を示す。CPG2酵素レベルは、腫瘍組織グラムあたりのユニットとして評価されるが（CPG2 U/g）、これは活性エンドポイントアッセイにより測定した。図15は、図4に示す頭頸部がんモデルと同様に、同レベルのCPG2活性が肺がんモデルで達成されることを示す。
【００６９】
図16は、VV-CPG2ワクシニアベクターの、頭頸部FaDu腫瘍(A)、結腸直腸SW620腫瘍(B)、および肺がんA549腫瘍(C)に対する優れた腫瘍特異性を示す。
【００７０】
図17Aは、肺がんA549腫瘍を有する動物にVV-CPG2をIV投与した後の、腫瘍体積および動物生存に及ぼすGDEPTの影響を示す。対照動物の腫瘍体積、またはVV-CPG2ベクターのみで処理された（その後のプロドラッグ投与なしの）動物の腫瘍体積はごくわずかに減少した（中央のプロット）。この抗腫瘍効果は、さらにプロドラッグも投与される場合に強くなる（下部のプロット）。ZD2767Pプロドラッグは、腹腔内（IP）注入によるVV-CPG2注入の4時間後に開始して、1時間間隔で3回に分けて150mg/kgを投与した。6回のプロドラッグ投与を7週間にわたって実施した。対照群では、物質の投与は適当な溶媒で置き換えられた。
【００７１】
図17Bは、VV-CPG2によるGDEPT後の動物生存が、50日後に、対照動物の約40%の死亡率と比較して、100%の生存（上のライン）をもたらすことを示す。
配列表
配列番号1 - CPG2* DNA配列：
2019115343.tif 000003
配列番号2 - CPG2* アミノ酸配列：
2019115343.tif 000004
配列番号3 - pSC65.luc.lacZ：
2019115343.tif 000005
2019115343.tif 000006
2019115343.tif 000007
2019115343.tif 000008
【００７２】
参考文献
本明細書に引用された、または本出願に提出された、あらゆる出版物および特許出願は、特許開示陳述書の一部として提出された参考文献を含めて、その全体を参考として含めるものとする。
1. B. E. Huber, E. A. Austin, C. A. Richards, S. T. Davis, and S. S. Good, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1994, 91, 8302-8306.
2. WO 96/03151, C. J. Springer et. al.
3. R. Marais, R. A. Spooner, Y. Light, J. Martin, and C. Springer, Cancer Research, 1996, 56, 4735-4742.
4. L. Chen, L. J. Yu, and D. J. Waxman, Cancer Research, 1997, 57, 4830-4837.
5. S. Schepelmann, L. M. Ogilvie, D. Hedley, F. Friedlos, J. Martin, I. Scanlon, P. Chen, R. Marais, and C. J. Springer, Cancer Research, 2007, 67, 4949-4955.
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8. M. Puhlmann, M. Gnant, C. K. Brown, H. R. Alexander, D. L. Bartlett, Human Gene Therapy, 1999, 10, 649-57.
9. J. A. McCart, M. Puhlmann, J. Lee, Gene Therapy, 2000, 7, 1217-23.
10. WO 01/085960, C. J. Springer et. al.
11. WO 94/002450, C. J. Springer et. al. 
12. WO 04/020400, C. J. Springer et. al.
13. S. Chakrabarti, J. R. Sisler, and B. Moss, BioTechniques, 1997, 23(6), 1094-1097.
14. D. H. Kirn and S. H. Thorne, Nature Reviews Cancer, 2009, 9, 64-71.
15. S. Schepelmann, P. Hallenbeck, L. M. Ogilvie, D. Hedley, F. Friedlos, J. Martin, I. Scanlon, C. Hay, L. K. Hawkins, R. Marais, and C. J. Springer, Cancer Research, 2005, 65, 5003-5008.
16. P. L. Earl et. al., Current Protocols in Molecular Biology, 1998, 16.16.1 - 16.17.19.
17. S. M. Stribling, J. Martin, R. B. Pedley, J. A. Boden, S. K. Sharma, and C. J. Springer, Cancer Chemother. Pharmacol, 1997, 40, 277-284.
18. M. Bazan-Peregrino, R. C. Carlisle, L. Purdie, and L. W. Seymour, Gene Therapy, 2008, 15, 688-694.
19. M. L. Ascierto, A. Worschech, Z. Yu, S. Adams, J. Reinboth, N. G. Chen, Z. Pos, R. Roychoudhuri, G. Di Pasquale, D. Bedognetti, L. Uccellini, F. Rossano, P. A. Ascierto, D. F. Stroncek, N. P. Restifo, E. Wang, A. A. Szalay, and F. M. Marincola BMC Cancer, 2011, 11:451.
20. A. Parato, C. J. Breitbach, F. Le Boeuf, J. Wang, Chris Storbeck, C. Ilkow, Jean-Simon Diallo, T. Falls, J. Burns, V. Garcia, F. Kanji, L. Evgin, K. Hu, F. Paradis, S Knowles, Tae-Ho Hwang, B. C. Vanderhyden, R. Auer, D. H. Kirn and J C Bell, Molecular Therapy, 2012, 20(4), 749-758.
【図１】
2019115343.tif 000009
【図２】
2019115343.tif 000010
【図３】
2019115343.tif 000011
【図４】
2019115343.tif 000012
【図５】
2019115343.tif 000013
【図６】
2019115343.tif 000014
【図７】
2019115343.tif 000015
【図８】
2019115343.tif 000016
【図９】
2019115343.tif 000017
【図１０】
2019115343.tif 000018
【図１１】
2019115343.tif 000019
【図１２】
2019115343.tif 000020
【図１３】
2019115343.tif 000021
【図１４】
2019115343.tif 000022
【図１５】
2019115343.tif 000023
【図１６】
2019115343.tif 000024
【図１７】
2019115343.tif 000025
【配列表】
2019115343000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月28日(2019.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において腫瘍の治療法に使用するためのワクシニアウイルスであって、
このワクシニアウイルスは、細胞内でグルタミン酸カルボキシペプチダーゼを発現する能力を有し、
該方法は、プロドラッグの被験体への投与を含んでおり、該プロドラッグはグルタミン酸カルボキシペプチダーゼによって活性型へと変換されうるものであり、かつ該グルタミン酸カルボキシペプチダーゼは配列番号2に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCPG2である、
前記ワクシニアウイルス。
【請求項２】
ワクシニアウイルスが、腫瘍選択性を高めるように遺伝子改変されており、1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子を有する、請求項１に記載のワクシニアウイルス。
【請求項３】
1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子がワクシニアチミジンキナーゼ（vTK）を含む、請求項２に記載のワクシニアウイルス。
【請求項４】
不活化されたvTK遺伝子がCPG2発現カセットインサート及び／又はルシフェラーゼ発現カセットインサートを含有する、請求項３に記載のワクシニアウイルス。
【請求項５】
1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子がワクシニア増殖因子（VGF）を含む、請求項２〜４のいずれか1つに記載のワクシニアウイルス。
【請求項６】
腫瘍が固形腫瘍である、請求項１〜５のいずれか1つに記載のワクシニアウイルス。
【請求項７】
腫瘍が、頭頸部がん、結腸直腸がん、肺がん、黒色腫、乳がん、頸がん、中枢神経系（CNS）のがん、卵巣がん、腎臓がん、白血病、脳腫瘍、または前立腺がんから選択される、請求項６に記載のワクシニアウイルス。
【請求項８】
方法が、静脈内または腫瘍内注入によるワクシニアウイルス投与を含む、請求項１〜７のいずれか1つに記載のワクシニアウイルス。
【請求項９】
方法が、被験体への放射線治療の実施を含む、請求項１〜８のいずれか1つに記載のワクシニアウイルス。
【請求項１０】
方法が、追加の抗がん剤の投与を含む、請求項１〜９のいずれか1つに記載のワクシニアウイルス。
【請求項１１】
追加の抗がん剤がChk1阻害剤である、請求項１０に記載のワクシニアウイルス。
【請求項１２】
プロドラッグが、グルタミン酸基またはグルタミン酸アナログ基を含有しており、そのグルタミン酸基もしくはグルタミン酸アナログ基は、Nを介してリンカーに結合し、このリンカーが細胞毒性薬に結合している、請求項１〜１１のいずれか1つに記載のワクシニアウイルス。
【請求項１３】
リンカーが、カルボニル、カルバミン酸、および尿素から選択される官能基を含有する、請求項１２に記載のワクシニアウイルス。
【請求項１４】
細胞毒性薬が、ナイトロジェンマスタード、またはナイトロジェンマスタードアナログを含んでなる、請求項１２または１３に記載のワクシニアウイルス。
【請求項１５】
プロドラッグが、N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸、またはその塩である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のワクシニアウイルス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
参考文献
本明細書に引用された、または本出願に提出された、あらゆる出版物および特許出願は、特許開示陳述書の一部として提出された参考文献を含めて、その全体を参考として含めるものとする。
1. B. E. Huber, E. A. Austin, C. A. Richards, S. T. Davis, and S. S. Good, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1994, 91, 8302-8306.
2. WO 96/03151, C. J. Springer et. al.
3. R. Marais, R. A. Spooner, Y. Light, J. Martin, and C. Springer, Cancer Research, 1996, 56, 4735-4742.
4. L. Chen, L. J. Yu, and D. J. Waxman, Cancer Research, 1997, 57, 4830-4837.
5. S. Schepelmann, L. M. Ogilvie, D. Hedley, F. Friedlos, J. Martin, I. Scanlon, P. Chen, R. Marais, and C. J. Springer, Cancer Research, 2007, 67, 4949-4955.
6. D. Hedley, L. Oglivie, and C. Springer, Nature Reviews Cancer, 2007, 7, 870-879.
7. Y. Jounaidi, J. C. Doloff, and D. J. Waxman, Current Cancer Drug Targets, 2007, 7(3), 285-301.
8. M. Puhlmann, M. Gnant, C. K. Brown, H. R. Alexander, D. L. Bartlett, Human Gene Therapy, 1999, 10, 649-57.
9. J. A. McCart, M. Puhlmann, J. Lee, Gene Therapy, 2000, 7, 1217-23.
10. WO 01/085960, C. J. Springer et. al.
11. WO 94/002450, C. J. Springer et. al. 
12. WO 04/020400, C. J. Springer et. al.
13. S. Chakrabarti, J. R. Sisler, and B. Moss, BioTechniques, 1997, 23(6), 1094-1097.
14. D. H. Kirn and S. H. Thorne, Nature Reviews Cancer, 2009, 9, 64-71.
15. S. Schepelmann, P. Hallenbeck, L. M. Ogilvie, D. Hedley, F. Friedlos, J. Martin, I. Scanlon, C. Hay, L. K. Hawkins, R. Marais, and C. J. Springer, Cancer Research, 2005, 65, 5003-5008.
16. P. L. Earl et. al., Current Protocols in Molecular Biology, 1998, 16.16.1 - 16.17.19.
17. S. M. Stribling, J. Martin, R. B. Pedley, J. A. Boden, S. K. Sharma, and C. J. Springer, Cancer Chemother. Pharmacol, 1997, 40, 277-284.
18. M. Bazan-Peregrino, R. C. Carlisle, L. Purdie, and L. W. Seymour, Gene Therapy, 2008, 15, 688-694.
19. M. L. Ascierto, A. Worschech, Z. Yu, S. Adams, J. Reinboth, N. G. Chen, Z. Pos, R. Roychoudhuri, G. Di Pasquale, D. Bedognetti, L. Uccellini, F. Rossano, P. A. Ascierto, D. F. Stroncek, N. P. Restifo, E. Wang, A. A. Szalay, and F. M. Marincola BMC Cancer, 2011, 11:451.
20. A. Parato, C. J. Breitbach, F. Le Boeuf, J. Wang, Chris Storbeck, C. Ilkow, Jean-Simon Diallo, T. Falls, J. Burns, V. Garcia, F. Kanji, L. Evgin, K. Hu, F. Paradis, S Knowles, Tae-Ho Hwang, B. C. Vanderhyden, R. Auer, D. H. Kirn and J C Bell, Molecular Therapy, 2012, 20(4), 749-758.
本発明は以下の実施形態を包含する。   
[１]  被験体において腫瘍の治療法に使用するためのワクシニアウイルスであって、
このワクシニアウイルスは、細胞内でグルタミン酸カルボキシペプチダーゼを発現する能力を有し、
該方法は、プロドラッグの被験体への投与を含んでおり、該プロドラッグはグルタミン酸カルボキシペプチダーゼによって活性型へと変換されうる、
前記ワクシニアウイルス。   
[２]  ワクシニアウイルスが、腫瘍選択性を高めるように遺伝子改変されている、実施形態1に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[３]  ワクシニアウイルスが、1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子を有する、実施形態1または2に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[４]  1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子にワクシニアチミジンキナーゼ（vTK）を含める、実施形態3に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。  
[５]  不活化されたvTK遺伝子がCPG2発現カセットインサートを含有する、実施形態4に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[６]  不活化されたvTK遺伝子がルシフェラーゼ発現カセットインサートを含有する、実施形態4または5に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[７]  1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子にワクシニア増殖因子（VGF）を含める、実施形態3〜6のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[８]  腫瘍が固形腫瘍である、実施形態1〜7のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[９]  腫瘍が、頭頸部がん、結腸直腸がん、肺がん、黒色腫、乳がん、頸がん、中枢神経系（CNS）のがん、卵巣がん、腎臓がん、白血病、脳腫瘍、または前立腺がんから選択される、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[１０]  腫瘍が、頭頸部がん、結腸直腸がん、肺がん、黒色腫、または乳がんから選択される、実施形態9に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[１１]  方法が、静脈内または腫瘍内注入によるワクシニアウイルス投与を含む、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[１２]  方法が、被験体への放射線治療の実施を含む、実施形態1〜11のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[１３]  方法が、追加の抗がん剤の投与を含む、実施形態1〜12のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[１４]  追加の抗がん剤がChk1阻害剤である、実施形態13に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[１５]  腫瘍体積がプロドラッグ投与後に減少する、実施形態1〜14のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[１６]  グルタミン酸カルボキシペプチダーゼがCPG2であるか、またはその変異体、バリアント、もしくはホモログである、実施形態1〜15のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[１７]  CPG2が、配列番号2に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、実施形態16に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[１８]  プロドラッグが、グルタミン酸基またはグルタミン酸アナログ基を含有しており、そのグルタミン酸基もしくはグルタミン酸アナログ基は、Nを介してリンカーに結合し、このリンカーが細胞毒性薬に結合している、実施形態1〜17のいずれか1つに記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[１９]  リンカーが、カルボニル、カルバミン酸、尿素から選択される官能基を含有する、実施形態18に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[２０]  細胞毒性薬が、ナイトロジェンマスタード、またはナイトロジェンマスタードアナログを含んでなる、実施形態18または19に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[２１]  プロドラッグが、N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸、またはその塩である、実施形態20に記載の、治療法に使用するためのワクシニアウイルス。   
[２２]  細胞内でグルタミン酸カルボキシペプチダーゼを発現することができる、ワクシニアウイルス。   
[２３]  グルタミン酸カルボキシペプチダーゼが、CPG2、またはその変異体、バリアント、もしくはホモログである、実施形態22に記載のワクシニアウイルス。   
[２４]  グルタミン酸カルボキシペプチダーゼが、配列番号2に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、配列番号23に記載のワクシニアウイルス。   
[２５]  ワクシニアウイルスが、ワクシニアウイルスビルレンス遺伝子内にCPG2発現カセットインサートを含有する、実施形態23または24に記載のワクシニアウイルス。   
[２６]  ワクシニアウイルスビルレンス遺伝子がワクシニアチミジンキナーゼ（vTK）である、実施形態25に記載のワクシニアウイルス。   
[２７]  遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法のための2成分系であって、(a）実施形態22〜26のいずれか1つに記載のワクシニアウイルス、および（b）グルタミン酸カルボキシペプチダーゼにより活性型薬物に変換できるプロドラッグ、を含んでなる、前記2成分系。   
[２８]  プロドラッグが、グルタミン酸基またはグルタミン酸アナログ基を含有しており、そのグルタミン酸基もしくはグルタミン酸アナログ基は、Nを介してリンカーに結合し、このリンカーが細胞毒性薬に結合している、実施形態27に記載の2成分系。   
[２９]  リンカーが、カルボニル、カルバミン酸、尿素、および同等物から選択される官能基を含有する、実施形態28に記載の2成分系。   
[３０]  細胞毒性薬が、ナイトロジェンマスタード、またはナイトロジェンマスタードアナログを含んでなる、実施形態28または29に記載の2成分系。   
[３１]  プロドラッグが、N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸、またはその塩である、実施形態30に記載の2成分系。   
[３２]  腫瘍細胞を死滅させる方法であって、その方法が、実施形態22〜26のいずれか1つに記載のワクシニアウイルス、およびグルタミン酸カルボキシペプチダーゼにより活性型に変換可能なプロドラッグを用いて、腫瘍細胞を処理することを含む、前記方法。   
[３３]  プロドラッグが、グルタミン酸基またはグルタミン酸アナログ基を含有しており、そのグルタミン酸基もしくはグルタミン酸アナログ基は、Nを介してリンカーに結合し、このリンカーが細胞毒性薬に結合している、実施形態32に記載の腫瘍細胞を死滅させる方法。   
[３４]  リンカーが、カルボニル、カルバミン酸、尿素、および同等物から選択される官能基を含有する、実施形態33に記載の腫瘍細胞を死滅させる方法。   
[３５]  細胞毒性薬が、ナイトロジェンマスタード、またはナイトロジェンマスタードアナログを含んでなる、実施形態33または34に記載の腫瘍細胞を死滅させる方法。   
[３６]  プロドラッグが、N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸、またはその塩である、実施形態35に記載の腫瘍細胞を死滅させる方法。   
[３７]  治療を必要とする患者において腫瘍を治療する方法であって、その方法が、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼを細胞内で発現する能力を有するワクシニアウイルス、およびグルタミン酸カルボキシペプチダーゼにより活性型に変換可能なプロドラッグを、患者に投与することを含む、前記方法。   
[３８]  ワクシニアウイルスが、腫瘍選択性を高めるように遺伝子改変されている、実施形態37に記載の方法。   
[３９]  ワクシニアウイルスが、1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子を有する、実施形態37または38に記載の方法。   
[４０]  1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子にワクシニアチミジンキナーゼ（vTK）を含める、実施形態39に記載の方法。   
[４１]  不活化されたvTK遺伝子がCPG2発現カセットインサートを含有する、実施形態40に記載の方法。   
[４２]  不活化されたvTK遺伝子がルシフェラーゼ発現カセットインサートを含有する、実施形態40または41に記載の方法。   
[４３]  1つもしくは複数の不活化されたビルレンス遺伝子にワクシニア増殖因子（VGF）を含める、実施形態39〜42のいずれか1つに記載の方法。
【外国語明細書】
2019115343000001.pdf