(57)【要約】【課題】対象内での合成抗体の生成方法を提供すること。【解決手段】合成抗体をｉｎ  ｖｉｖｏ発現させるために、抗体およびその機能性断片をコードする最適化された核酸配列を含む組成物、および対象内での合成抗体の生成方法を開示する。本開示は、前記組成物および方法を用いる対象内の疾患の予防および／または治療方法についても提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象内での合成抗体の生成方法であって、
抗体またはその断片をコードする組み換え核酸配列を含む組成物を前記対象に投与することを含み、
前記組み換え核酸配列は前記対象内で発現されて前記合成抗体を生成する方法。
【請求項２】
前記抗体が重鎖ポリペプチドまたはその断片、および軽鎖ポリペプチドまたはその断片を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記重鎖ポリペプチドまたはその断片が第１の核酸配列によってコードされ、かつ、前記軽鎖ポリペプチドまたはその断片が第２の核酸配列によってコードされる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組み換え核酸配列が前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組み換え核酸配列が、前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列を単一転写産物として前記対象内で発現するプロモーターをさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組み換え核酸配列が、プロテアーゼ切断部位をコードする第３の核酸配列をさらに含み、前記第３の核酸配列が前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列間に位置する請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記対象のプロテアーゼが前記プロテアーゼ切断部位を認識し、切断する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組み換え核酸配列が前記対象内で発現されて抗体ポリペプチド配列を生成し、前記抗体ポリペプチド配列が、前記重鎖ポリペプチドまたはその断片、前記プロテアーゼ切断部位、および前記軽鎖ポリペプチドまたはその断片を含み、前記対象によって産生されたプロテアーゼが前記抗体ポリペプチド配列のプロテアーゼ切断部位を認識し、切断することで、開裂重鎖ポリペプチドおよび開裂軽鎖ポリペプチドを生成し、前記合成抗体が該開裂重鎖ポリペプチドおよび該開裂軽鎖ポリペプチドによって生成される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組み換え核酸配列が、第１の転写産物として前記第１の核酸配列を発現する第１のプロモーターと、第２の転写産物として前記第２の核酸配列を発現する第２のプロモーターとを含み、前記第１の転写産物が第１のポリペプチドに翻訳され、前記第２の転写産物が第２のポリペプチドに翻訳され、前記合成抗体が前記第１および第２のポリペプチドによって生成される請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のプロモーターと前記第２のプロモーターが同一である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記重鎖ポリペプチドが可変重領域および定常重領域１を含む請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記重鎖ポリペプチドが、可変重領域、定常重領域１、ヒンジ領域、定常重領域２、および定常重領域３を含む請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記軽鎖ポリペプチドが可変軽領域および定常軽領域を含む請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記組み換え核酸配列がＫｏｚａｋ配列をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記組み換え核酸配列が免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＩｇシグナルペプチドがＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組み換え核酸配列が、配列番号１、２、５、４１、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５３、５５、５７、５９、および６１の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記組み換え核酸配列が、配列番号３、４、６、７、４０、４２、４４、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、および６３の少なくとも１つの核酸配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
対象内での合成抗体の生成方法であって、
重鎖ポリペプチドまたはその断片をコードする第１の組み換え核酸配列および軽鎖ポリペプチドまたはその断片をコードする第２の組み換え核酸配列を含む組成物を前記対象に投与することを含み、
前記第１の組み換え核酸配列が前記対象内で発現されて第１のポリペプチドを生成し、前記第２の組み換え核酸配列が前記対象内で発現されて第２のポリペプチドを生成し、前記合成抗体が前記第１および第２のポリペプチドによって生成される方法。
【請求項２２】
前記第１の組み換え核酸配列が、前記第１のポリペプチドを前記対象内で発現する第１のプロモーターをさらに含み、前記第２の組み換え核酸配列が、前記第２のポリペプチドを前記対象内で発現する第２のプロモーターをさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のプロモーターと第２のプロモーターが同一である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記重鎖ポリペプチドが可変重領域および定常重領域１を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記重鎖ポリペプチドが可変重領域、定常重領域１、ヒンジ領域、定常重領域２、および定常重領域３を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記軽鎖ポリペプチドが可変軽領域および定常軽領域を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の組み換え核酸配列および前記第２の組み換え核酸配列がＫｏｚａｋ配列をさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の組み換え核酸配列および前記第２の組み換え核酸配列が免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドをさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＩｇシグナルペプチドがＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
対象内の疾患の予防または治療方法であって、
請求項１または２１に記載の方法によって対象内での合成抗体を生成することを含む方法。
【請求項３２】
前記合成抗体が外来抗原に特異的である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記外来抗原がウイルス由来である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）、またはデングウイルスである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ウイルスがＨＩＶである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記組み換え核酸配列が、配列番号１、２、５、４６、４７、４８、４９、５１、５３、５５、および５７の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記組み換え核酸配列が、配列番号３、４、６、７、５０、５２、５５、５６、６２、６３、および６４の少なくとも１つの核酸配列を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ウイルスがＣＨＩＫＶである請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記組み換え核酸配列が、配列番号５９および６１の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記組み換え核酸配列が、配列番号５８および６０の少なくとも１つの核酸配列を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ウイルスがデングウイルスである請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記組み換え核酸配列が、配列番号４５の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記組み換え核酸配列が、配列番号４４の少なくとも１つの核酸配列を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記合成抗体が自己抗原に特異的である請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
前記自己抗原がＨｅｒ２である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記組み換え核酸配列が、配列番号４１および４３の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記組み換え核酸配列が、配列番号４０および４２の少なくとも１つの核酸配列を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
請求項１〜４７に記載の方法のいずれか１つによって産生された産物。
【請求項４９】
前記産物が、機能性抗体を発現可能な単一ＤＮＡプラスミドである請求項４８に記載の産物。
【請求項５０】
前記産物が、ｉｎ  ｖｉｖｏ結合して機能性抗体を形成する機能性抗体の構成要素を発現可能な２つの異なるＤＮＡプラスミドからなる請求項４８に記載の産物。
【請求項５１】
病原体による感染からの対象の治療方法であって、
前記病原体に特異的な合成抗体をコードするヌクレオチド配列を投与することを含む方法。
【請求項５２】
前記病原体の抗原を投与して前記対象内で免疫応答を生成することをさらに含む請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１２年１２月１３日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，０９４号、２０１３年９月２３日出願の米国仮特許出願第６１／８８１，３７６号、および２０１３年１０月２８日出願の米国仮特許出願第６１／８９６，６４６号に対する優先権を主張するものである。この全ての出願は、参照することで本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（米国政府利益の記載）
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた契約番号ＨＨＳＮ２７２２００８０００６３Ｃおよび５−Ｐ３０−ＡＩ−０４５００８−１３の下での政府支援に基づいて達成されたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有するものである。
【０００３】
本発明は、合成抗体またはその断片をｉｎ  ｖｉｖｏ生成する組み換え核酸配列を含む組成物、および該組成物を投与することによる対象内の疾患の予防および／または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
免疫グロブリン分子は、システイン残基間のジスルフィド結合（Ｓ−Ｓとして示す）によって共有結合された軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖を２つずつ含む。重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインは、抗体分子の結合部位に寄与する。重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）と、（柔軟な）ヒンジ領域とからなる。軽鎖も、定常ドメイン（ＣＬ）を有する。重鎖および軽鎖の可変領域は、４つのフレームワーク領域（ＦＲｓ；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む。従って、これらは非常に複雑な遺伝系であり、ｉｎ  ｖｉｖｏ組み立てが困難となっている。
【０００５】
標的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、過去２５年間で最も重要な医療用治療の進歩の１つである。この種の免疫療法は今や、多数の自己免疫疾患、癌および感染症の治療に対して日常的に用いられている。悪性腫瘍に対して、現在用いられている免疫グロブリン（Ｉｇ）療法の多くは、腫瘍に向けた細胞毒性化学療法レジメンを併用する。この併用法により全体的な生存率が著しく改善されている。特定の癌に対して用いるｍＡｂ製剤が多数認可されており、例えば、非ホジキンリンパ腫治療のためのＣＤ２０を標的とするキメラｍＡｂであるリツキサン（リツキシマブ）、ならびにＣＴＬＡ−４を阻害し、黒色腫および他の悪性腫瘍の治療に用いられているヒトｍＡｂであるイピリムマブ（エルボイ）が挙げられる。さらに、ベバシズマブ（アバスチン）は、ＶＥＧＦおよび腫瘍新血管形成を標的とし、大腸癌の治療に用いられているもう一つの代表的なヒト化ｍＡｂである。悪性腫瘍の治療に最も注目されているｍＡｂは、恐らくＨｅｒ２／ｎｅｕを標的とするヒト化製剤であるトラスツズマブ（ハーセプチン）であり、患者の一部の乳癌に対して大きな有効性を持つことが実証されている。さらに、多数のｍＡｂが、自己免疫および特定の血液疾患の治療に用いられている。
【０００６】
癌治療に加えて、ジフテリア、Ａ型およびＢ型肝炎、狂犬病、破傷風、水痘、および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）などの多くの感染症に対する防御効力をポリクローナルＩｇｓの受動伝達により調節する。実際、いくつかのポリクローナルＩｇ製剤は、積極的なワクチン接種を介して防御Ｉｇｓを生成するのに十分な時間がない状況下の疾患流行地を旅行している個人において特定の感染性因子に対する一時的な防御をもたらす。さらに、免疫不全の子供において、ＲＳＶ感染を標的とするｍＡｂであるパリビズマブ（シナジス）は、ＲＳＶに対して防御することが臨床的に実証されている。
【０００７】
ｍＡｂ療法の臨床効力は素晴らしいものがある。しかしながら、この治療アプローチの使用および普及を制限する問題が残っている。これらの問題のいくつかには、これらの複雑な生物製剤の製造コストが高いことが挙げられ、より広範な人口、とりわけ、大きな影響をもたらし得る発展途上国における使用を限定してしまう。さらに、有効性を達成し維持するためにｍＡｂｓを反復投与する必要性がしばしばあることもロジスティクスおよび患者のコンプライアンスという点で障害になり得る。また、これらの抗体製剤の長期安定性は短いことが多く最適ではない。したがって、当該技術分野では、安全かつコスト効率のよい方法で対象に送達することができる合成抗体分子が必要とされている。さらに、合成抗体の同定および発現方法についても論じられているが、タンパク質の製造についてはいまだ問題がありかつ高価である。
【０００８】
免疫療法および免疫修飾は、対象の免疫系と連動または対象の免疫系を調節もしくは刺激することで疾患を治療し、病原体を撃退もしくは異常細胞を殺すことができる、治療モードを提供する。ワクチンは、細胞性および体液性免疫応答双方を刺激して、疾患の予防、場合によっては、疾患の治療をすることができる、１つのクラスの薬剤を提供する。例えば、インフルエンザ用ワクチンは、インフルエンザウイルスに対する記憶応答を対象が生成するのを助け、将来の感染を予防するのを助けることができる。しかしながら、急速な発症を引き起こす病原体に対する懸念があり、例えば、チクングンヤ熱、デング熱、またはエボラ熱などの熱帯性ウイルスには迅速な中和抗体反応が有益であり得る。かかる状況下で、確立された有効な記憶応答を対象が有しない場合、宿主体液性反応の遅れは致命的になり得る。さらに、中和抗体を直ちに産生することは、ＨＩＶなどの問題のあるウイルスが完全に感染し宿主に住み着く前に感染を未然に防ぐのに有益であろう。記憶応答もしくはさらに好ましくは中和抗体反応を直ちにもたらし得るワクチンが必要であり、必要に応じて、併用療法における宿主免疫応答を刺激するワクチンと対をなすことができる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、対象内での合成抗体の生成方法に関する。本方法は、抗体またはその断片をコードする組み換え核酸配列を含む組成物を対象に投与することを含む。組み換え核酸配列は、対象内で発現されて合成抗体を生成する。
【００１０】
抗体は、重鎖ポリペプチドまたはその断片および軽鎖ポリペプチドまたはその断片を含むことができる。重鎖ポリペプチドまたはその断片は第１の核酸配列によってコードされ、軽鎖ポリペプチドまたはその断片が第２の核酸配列によってコードされ得る。組み換え核酸配列は、第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むことがきる。組み換え核酸配列は、第１の核酸配列および第２の核酸配列を単一転写産物として対象内で発現するプロモーターをさらに含むことができる。プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得る。
【００１１】
組み換え核酸配列は、プロテアーゼ切断部位をコードする第３の核酸配列をさらに含むことができる。第３の核酸配列は、第１の核酸配列および第２の核酸配列間に位置することができる。対象のプロテアーゼは、プロテアーゼ切断部位を認識し、切断することができる。
【００１２】
組み換え核酸配列は、対象内で発現されて抗体ポリペプチド配列を生成することができる。抗体ポリペプチド配列は、重鎖ポリペプチドまたはその断片、プロテアーゼ切断部位、および軽鎖ポリペプチドまたはその断片を含むことができる。対象によって産生されたプロテアーゼは、抗体ポリペプチド配列のプロテアーゼ切断部位を認識することができ、切断することで、開裂重鎖ポリペプチドおよび開裂軽鎖ポリペプチドを生成する。合成抗体は、開裂重鎖ポリペプチドおよび開裂軽鎖ポリペプチドによって生成され得る。
【００１３】
組み換え核酸配列は、第１の転写産物として第１の核酸配列を発現する第１のプロモーターと、第２の転写産物として第２の核酸配列を発現する第２のプロモーターとを含むことができる。第１の転写産物は第１のポリペプチドに翻訳され、第２の転写産物は第２のポリペプチドに翻訳され得る。合成抗体は、第１および第２のポリペプチドによって生成され得る。第１のプロモーターと第２のプロモーターは同一であり得る。プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得る。
【００１４】
重鎖ポリペプチドは、可変重領域および定常重領域１を含むことができる。重鎖ポリペプチドは、可変重領域、定常重領域１、ヒンジ領域、定常重領域２、および定常重領域３を含むことができる。軽鎖ポリペプチドは、可変軽領域および定常軽領域を含むことができる。
【００１５】
組み換え核酸配列は、Ｋｏｚａｋ配列をさらに含むことができる。組み換え核酸配列は、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドをさらに含むことができる。Ｉｇシグナルペプチドは、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドを含むことができる。
【００１６】
組み換え核酸配列は、配列番号１、２、５、４１、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５３、５５、５７、５９、および６１の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号３、４、６、７、４０、４２、４４、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、および６３の少なくとも１つの核酸配列を含むことができる。
【００１７】
本発明はまた、対象内での合成抗体の生成方法に関する。本方法は、重鎖ポリペプチドまたはその断片をコードする第１の組み換え核酸配列および軽鎖ポリペプチドまたはその断片をコードする第２の組み換え核酸配列を含む組成物を対象に投与することを含むことができる。第１の組み換え核酸配列は、対象内で発現されて第１のポリペプチドを生成し、第２の組み換え核酸配列は、対象内で発現されて第２のポリペプチドを生成することができる。合成抗体は、第１および第２のポリペプチドによって生成され得る。
【００１８】
第１の組み換え核酸配列は、第１のポリペプチドを対象内で発現する第１のプロモーターをさらに含むことができる。第２の組み換え核酸配列は、第２のポリペプチドを対象内で発現する第２のプロモーターをさらに含むことができる。第１のプロモーターと第２のプロモーターは同一であり得る。プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得る。
【００１９】
重鎖ポリペプチドは、可変重領域および定常重領域１を含むことができる。重鎖ポリペプチドは、可変重領域、定常重領域１、ヒンジ領域、定常重領域２、および定常重領域３を含むことができる。軽鎖ポリペプチドは、可変軽領域および定常軽領域を含むことができる。
【００２０】
第１の組み換え核酸配列および第２の組み換え核酸配列は、Ｋｏｚａｋ配列をさらに含むことができる。第１の組み換え核酸配列および第２の組み換え核酸配列は、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドをさらに含むことができる。Ｉｇシグナルペプチドは、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドを含むことができる。
【００２１】
本発明はさらに、対象内の疾患の予防または治療方法に関する。本方法は、上記の方法の１つによって対象内での合成抗体を生成することを含むことができる。合成抗体は、外来抗原に特異的であり得る。外来抗原はウイルス由来であり得る。ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）、またはデングウイルスであり得る。
【００２２】
ウイルスはＨＩＶであり得る。組み換え核酸配列は、配列番号１、２、５、４６、４７、４８、４９、５１、５３、５５、および５７の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号３、４、６、７、５０、５２、５５、５６、６２、６３、および６４の少なくとも１つの核酸配列を含むことができる。
【００２３】
ウイルスはＣＨＩＫＶであり得る。組み換え核酸配列は、配列番号５９および６１の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号５８および６０の少なくとも１つの核酸配列を含むことができる。
【００２４】
ウイルスはデングウイルスであり得る。組み換え核酸配列は、配列番号４５の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号４４の少なくとも１つの核酸配列を含む。
【００２５】
合成抗体は自己抗原に特異的であり得る。自己抗原はＨｅｒ２であり得る。組み換え核酸配列は、配列番号４１および４３の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号４０および４２の少なくとも１つの核酸配列を含む。
【００２６】
本発明の一態様は、本明細書に記載のヌクレオチド産物を含む。ヌクレオチド産物は、場合によっては、１つのヌクレオチド構築物からなり、場合によっては、２つの異なるヌクレオチド構築物からなる。
【００２７】
本発明の一態様は、病原体に特異的な合成抗体をコードするヌクレオチド配列を投与することを含む、病原体による感染からの対象の治療方法に関し、場合によっては、病原体の抗原を投与して対象内で免疫応答を生成することも含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施例１に記載のＩｇＧ重鎖をコードする核酸配列を示す。
【図２】実施例１に記載のＩｇＧ軽鎖をコードする核酸配列を示す。
【図３】時間（時）対ＯＤ４５０ｎｍ（組織培養上清を１：１００に希釈）をプロットしたグラフを示す。
【図４】ウエスタンブロットの画像を示す。
【図５】ｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂの生成および発現確認を示す。（ＡおよびＢ）ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂ抗ｇｐ１２０Ｆａｂ発現構築物の環状プラスミドマップは、ＶＲＣ０１重（Ｈ）および軽（Ｌ）可変鎖Ｉｇ遺伝子を用いて設計した。発現レベルを増すためにＦａｂプラスミドを構築する際にいくつかの修飾を含んだ。図５に示すように、Ｆａｂ  ＶＬ断片遺伝子およびＶＨ断片遺伝子は、ｐＶａｘ１ベクターのＢａｍＨ１およびＸｈｏ１制限部位間で別々にクローニングした。（Ｃ）ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現。グラフは、２９３Ｔ細胞トランスフェクション後のｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂ発現の時間的動態を示した。発現を示す値は、３列ウェルの平均値ＯＤ４５０ｎｍ±標準偏差である。対照として、２９３Ｔ細胞もｐＶａｘ１バックボーンでトランスフェクトした。
【図６】ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂによる抗ＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的Ｆａｂの時間的生成の測定を示す。（Ａ）抗ＨＩＶ１  Ｆａｂの経時的生成。ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂの投与後、ＥＬＩＳＡにより１：１００に最終希釈した血清中で特異的Ｆａｂの産生を１０日間にわたって測定し、ＯＤ４５０ｎｍとして示した。ｐＶａｘ１投与されたマウスの血清を陰性対照として用いた。（Ｂ）組み換えｇｐ１２０（ｒｇｐ１２０）で免疫化した後の抗ｇｐ１２０抗体反応の比較測定。実施例２に記載のように、ｒｇｐ１２０を単回注射してマウスを免疫化した後、１０日目までの抗ｇｐ１２０抗体の産生を測定し、ＯＤ４５０ｎｍ値として示した。この研究において、ＰＢＳを陰性対照注射として用いた。（Ｃ）免疫ブロット分析によって結合しているＨＩＶ１Ｅｎｖ−Ｆａｂの確認。実施例に記載のように、５μｇまたは１０μｇいずれかのｇｐ１２０をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびニトロセルロースブロッティングに供した後、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂ投与されたマウスの血清とともにブロットを培養した。実験用血清が結合ｒｇｐ１２０を認識したことが免疫ブロットにより示され、生成されたＦａｂの特異性が確認された。（Ｄ）ヒトＩｇＧ１Ｆａｂの時間的定量化。ｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂを投与後、マウス血清中のＩｇＧ１を測定した。標準ＥＬＩＳＡキットにより、示された時点でＩｇＧ１を測定し、Ｆａｂ（μｇ／ｍＬ）±標準偏差で表わした。ｐＶａｘ１投与されたマウスの血清を陰性対照として用いた。ｘ軸上に示された時点で血清サンプルを分析した。図６（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｄ）に示すグラフの矢印は、ＤＮＡプラスミドを投与した時点を示す。
【図７】ＨＩＶ１  Ｅｎｖ  ＦａｂのクレードＡ  ＨＩＶ  Ｅｎｖ糖タンパク質へのＦＡＣＳ結合分析を示す。（Ａ）抗ＨＩＶ１Ｅｎｖ−ＦａｂのＨＩＶ−１クレードＡ  Ｅｎｖ糖タンパク質への結合を示すＦＡＣＳスキャニング。コンセンサス（ｐＣｏｎ−Ｅｎｖ−Ａ）または「最適化」（ｐＯｐｔ−Ｅｎｖ−Ａ）ＨＩＶ−１クレードＡエンベロープのいずれかを発現するＤＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２日後、精製された天然ＶＲＣ０１  Ｉｇ、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂ（プラスミド単回投与後４８時間で回収）から生成された血清、またはｐＩｇＧ−Ｅ１Ｍ２投与から生成された対照Ｉｇのいずれかで細胞を染色した。血清およびＶＲＣ０１抗体をＰＢＳ５０μｌ中でそれぞれ１：４または１：１００に希釈し、室温で３０分間培養した。その後、適切な二次フィコエリトリン（ＰＥ）に複合体化させたＩｇｓで細胞を染色し、ＦＡＣＳ分析用に単一および生細胞としてゲートした。陽性細胞の結合率をスキャニングごとに示した。（Ｂ）ＦＡＣＳ結合データのグラフ図。Ｉｇ／血清試験群ごとに染色した細胞数（すなわち、発現レベルを示す）をバックグラウンド染色値で割り、試験した異なるＨＩＶクレードＡ  Ｅｎｖ製剤の関数としてｙ軸上に特異結合率（％）として示した。
【図８】ｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂ投与されたマウスの血清によるＨＩＶ−１の経時中和を示す。中和活性の分析に用いた血清は、グラフに示された時点で回収した。中和分析をＨＩＶ−１偽型ウイルス：Ｂａｌ２６（パネルＡ；クレードＢ、Ｔｉｅｒ１）、Ｑ２３Ｅｎｖ１７（パネルＢ；クレードＡ、Ｔｉｅｒ１）、ＳＦ１６２Ｓ（パネルＣ；クレードＢ、Ｔｉｅｒ１）、およびＺＭ５３Ｍ（パネルＤ；クレードＣ、Ｔｉｅｒ２）のパネルを用いてＴＺＭ−ＢＬ細胞で行った。実施例２に記載した通り、０．０１のＭＯＩで細胞を感染させ、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂ投与から生成されたＦａｂを含む血清（最終希釈１：５０）の存在下で培養した。中和値を％で示す。この計算は実施例２に記載した。なお、グラフごとに示した横線は、実験用血清が５０％のウイルス中和を介在したおおよその時点を示す。
【図９】実施例２〜７に記載のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂの重鎖（ＶＨ−ＣＨ１）をコードする核酸配列を示す。
【図１０】実施例２〜７に記載のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂの軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）をコードする核酸配列を示す。
【図１１】ＨＩＶ  Ｅｎｖをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞の免疫蛍光を示す。ｐＶＡＸ１（左パネル）またはｐＨＩＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂ（右パネル）からの製剤で細胞を染色した。
【図１２】抗原の種類対血清濃度（ｎｇ／ｍＬ）をプロットしたグラフを示す。
【図１３】合成ヒトＩｇＧ１抗体をコードする構築物を模式的に示す。
【図１４】図１３の構築物によってコードされる組み立て抗体（発現時）を模式的に示す。
【図１５】ＶＲＣ０１  ＩｇＧのアミノ酸配列を示す。
【図１６Ａ】（Ａ）ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇをコードする構築物の模式図を示す。
【図１６Ｂ】（Ｂ）（Ａ）の構築物を含むベクターの模式図を示す。
【図１６Ｃ】（Ｃ）染色したゲルの画像を示す。
【図１７Ａ】（Ａ）ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇをコードする構築物の模式図を示す。
【図１７Ｂ】（Ｂ）（Ａ）の構築物を含むベクターの模式図を示す。
【図１７Ｃ】（Ｃ）染色したゲルの画像を示す。
【図１８】フリンによる切断前のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇのアミノ酸配列を示す。
【図１９】フリンによる切断前のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇのアミノ酸配列を示す。
【図２０Ａ】（Ａ）ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの重（ＶＨ−ＣＨ１）鎖をコードする構築物の模式図を示す。
【図２０Ｂ】（Ｂ）ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの重（ＶＬ−ＣＬ）鎖をコードする構築物を模式的に示す。
【図２１】ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの重（ＶＨ−ＣＨ１）または軽（ＶＬ−ＣＬ）鎖をコードする構築物を含む発現ベクターを模式的に示す。
【図２２】時単位の時間（ｈｒ）対ＯＤ４５０ｎｍをプロットしたグラフを示す。
【図２３】免疫ブロットの画像を示す。
【図２４】ＤＮＡ投与のタイミング、事前採血および採血を模式的に示す。
【図２５】日単位の時間対ＯＤ４５０ｎｍをプロットしたグラフを示す。
【図２６】抗原投与後の日数対生存率（％）をプロットしたグラフを示す。
【図２７】マウス群対ＴＮＦ−αのｐｇ／ｍＬをプロットしたグラフを示す。
【図２８】マウス群対ＩＬ−６のｐｇ／ｍＬをプロットしたグラフを示す。
【図２９】ＶＨ−ＣＨ１をコードするプロモーター制御下の構築物を模式的に示す。
【図３０】ＶＨ−ＣLをコードするプロモーター制御下の構築物を模式的に示す。
【図３１】発現ベクター内でクローニングした抗Ｈｅｒ−２  ＦａｂのＶＨ−ＣＨ１またはＶＬ−ＣＬをコードする構築物を模式的に示す。
【図３２】抗Ｈｅｒ−２  ＦａｂのＶＨ−ＣＨ１をコードする核酸配列を示す。
【図３３】図３２の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列（すなわち、抗Ｈｅｒ−２  ＦａｂのＶＨ−ＣＨ１のアミノ酸配列）を示す。
【図３４】抗Ｈｅｒ−２  ＦａｂのＶＬ−ＣＬをコードする核酸配列を示す。
【図３５】図３４の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列（すなわち、抗Ｈｅｒ−２  ＦａｂのＶＬ−ＣＬのアミノ酸配列）を示す。
【図３６】トランスフェクト細胞の種類対ＩｇＧ濃度（μｇ／ｍＬ）をプロットしたグラフを示す。
【図３７】免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖の可変重領域（ＶＨ）、可変重定常領域１（ＣＨ１）、ヒンジ領域、可変重定常領域２（ＣＨ２）、および可変重定常３（ＣＨ３）をコードし、かつ、ＩｇＧ軽鎖の可変軽領域（ＶＬ）および可変軽定常領域（ＣＬ）をコードする構築物を模式的に示す。ＩｇＧの重鎖および軽鎖は、プロテアーゼ切断部位によって分離され、各々は、（リーダー配列によってコードされる）シグナルペプチドによって先行される。
【図３８】抗デングウイルス（ＤＥＮＶ）ヒトＩｇＧをコードする核酸配列を示す。
【図３９】図３９の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列（すなわち、抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧのアミノ酸配列）を示す。このアミノ酸配列では、重鎖および軽鎖を２つの別々のポリペプチドに分離させるプロテアーゼ切断がまだ起こっていない。
【図４０】マウス群対ＯＤ４５０ｎｍをプロットしたグラフを示す。
【図４１】注射後の日数対ヒトＩｇＧ濃度（ｎｇ／ｍＬ）をプロットしたグラフを示す。
【図４２】図１の核酸配列（すなわち、配列番号６）によってコードされるアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、以下の実施例１に記載のＩｇＧ重鎖のアミノ酸配列である。
【図４３】図２の核酸配列に（すなわち、配列番号７）よってコードされるアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、以下の実施例１に記載のＩｇＧ軽鎖のアミノ酸配列である。
【図４４】図９の核酸配列（すなわち、配列番号３）によってコードされるアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、実施例２〜７に記載のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−Ｆａｂの重鎖（ＶＨ−ＣＨ１）のアミノ酸配列である。
【図４５】図１０の核酸配列（すなわち、配列番号４）によってコードされるアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、実施例２〜７に記載のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−Ｆａｂの軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）のアミノ酸配列である。
【図４６】以下の実施例１１に記載のＨＩＶ−１  ＰＧ９一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）をコードする核酸配列を示す。
【図４７】図４６の核酸配列（すなわち、配列番号５０）によってコードされるアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、以下の実施例１１に記載のＨＩＶ−１  ＰＧ９  ｓｃＦａｂのアミノ酸配列である。
【図４８】以下の実施例１３に記載のＨＩＶ−１  ４Ｅ１０一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）をコードする核酸配列を示す。
【図４９】図４８の核酸配列（すなわち、配列番号５２）によってコードされるアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、以下の実施例１３に記載のＨＩＶ−１  ４Ｅ１０  ｓｃＦａｂのアミノ酸配列である。
【図５０】免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖の可変重領域（ＶＨ）、可変重定常領域１（ＣＨ１）、ヒンジ領域、可変重定常領域２（ＣＨ２）、および可変重定常３（ＣＨ３）をコードする構築物を模式的に示す。ＩｇＧ重鎖をコードする核酸配列は、リーダー配列によって先行される。
【図５１】ＩｇＧ軽鎖の可変軽領域（ＶＬ）および可変軽定常領域（ＣＬ）をコードする構築物を模式的に示す。ＩｇＧ軽鎖をコードする核酸配列は、リーダー配列によって先行される。
【図５２】以下の実施例９に記載のＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１  ＩｇＧ１重鎖をコードする核酸配列を示す。
【図５３】図５２の核酸配列（すなわち、配列番号５４）によってコードされるアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、以下の実施例９に記載のＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１  ＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列である。
【図５４】以下の実施例９に記載のＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１  ＩｇＧ軽鎖をコードする核酸配列を示す。
【図５５】図５４の核酸配列（すなわち、配列番号５６）によってコードされるアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、以下の実施例９に記載のＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１  ＩｇＧ軽鎖のアミノ酸配列である。
【図５６】以下の実施例１４に記載のＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの重鎖（ＶＨ−ＣＨ１）をコードする核酸配列を示す。
【図５７】図５６の核酸配列（すなわち、配列番号５８）によってコードされるアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、以下の実施例１４に記載のＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの重鎖（ＶＨ−ＣＨ１）のアミノ酸配列である。
【図５８】以下の実施例１４に記載のＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）をコードする核酸配列を示す。
【図５９】図５８の核酸配列（すなわち、配列番号６０）によってコードされるアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、以下の実施例１４に記載のＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）のアミノ酸配列である。
【図６０】以下の実施例１２に記載のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇをコードする核酸配列を示す。
【図６１】以下の実施例１０に記載のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇをコードする核酸配列を示す。
【図６２】ＶＲＣ０１  ＩｇＧ（配列番号６４）をコードする核酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、抗体、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする組み換え核酸配列を含む組成物に関する。組成物を、それを必要とする対象に投与し、合成抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ発現および形成し易くすることができる。
【００３０】
特に、組み換え核酸配列から発現した重鎖および軽鎖ポリペプチドは、合成抗体に組み立てることができる。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、抗原に結合することができ、本明細書に記載のように組み立てられていない抗体に比べてより免疫原性が強く、かつ、抗原に対して免疫応答を引き起こすかもしくは誘導することが可能な合成抗体をアセンブリがもたらすように、互いに相互作用することができる。
【００３１】
また、これらの合成抗体は、抗原誘導の免疫応答に応じて産生される抗体よりもさらに速やかに対象内で生成される。合成抗体は、広範な抗原に効率的に結合し、中和することができる。合成抗体は、疾患に対して効率的に防御し、および／または、疾患生存率を促進することもできる。
【００３２】
１．定義
特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先となる。本発明の実施または試験において、本明細書中に記載されたものと同様または同等の方法および材料を用いることはできるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の引用文献は、引用によりそれらの全体が組み入れられる。尚、本明細書で開示した材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図していない。
【００３３】
本明細書で使用する「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「を有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「を含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、およびその変形は、付加的な行為あるいは構造の可能性を妨げない、制限しない移行句、用語、または単語であることを意図している。単数形である「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上例外が明記されていない限り、複数形の意味を持つこともある。本開示は、明示的に記載されているかどうかに関わらず、本明細書に示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、および「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
【００３４】
「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、またはその断片もしくは誘導体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含む）、ならびにその一本鎖抗体、および誘導体を意味し得る。抗体は、哺乳動物の血清サンプルから単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはこれらの混合物のうち、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対する十分な結合特異性を示すものであり得る。
【００３５】
本明細書で互換的に使用する、「抗体断片」または「抗体の断片」は、抗原結合部位または可変領域を含む完全抗体の一部分を指す。この部分は、完全抗体のＦｃ領域のある特定の重鎖領域（すなわち、抗体アイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４）を含まない。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１つの軽鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチド、１つの重鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチドおよび重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
「抗原」は、宿主内で免疫応答を引き起こすことが可能なタンパク質を指す。抗原は抗体により認識され結合される。抗原は体内または外部環境から生じる。
【００３７】
本明細書で使用する、「コード配列」または「コード化核酸」は、本明細書に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味し得る。コード配列は、核酸の投与先である個体または哺乳動物の細胞中の発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始および終了シグナルをさらに含むことができる。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含むことができる。
【００３８】
本明細書で使用する、「相補体」または「相補的」は、ある核酸が、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間にワトソン・クリック（例えば、Ａ-Ｔ／ＵおよびＣ-Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を表わすことを意味し得る。
【００３９】
本明細書で使用する、「定電流」は、組織、または該組織を規定する細胞が、同組織に送達される電気パルスの持続期間中に受容するまたは経験する電流を定義する。電気パルスは、本明細書に記載の電気穿孔装置から送達される。この電流は、電気パルスの寿命期間中、該組織に定電流量で留まるが、それは、本明細書で提供される電気穿孔装置が、好ましくは瞬間的フィードバックを有する、フィードバック素子を有するからである。フィードバック素子は、パルスの持続期間中の組織（または細胞）の抵抗を測定し、電気穿孔装置に自身の電気エネルギー出力を変化させる（例えば、電圧を上げる）ようにすることができるので、同組織中の電流は、電気パルスの間ずっと（約マイクロ秒）、およびパルス間において、一定であり続ける。いくつかの実施形態において、フィードバック素子は、制御器を含む。
【００４０】
本明細書で使用する、「電流フィードバック」または「フィードバック」は互換的に使用されており、提供される電気穿孔装置の活発な応答を意味し得るが、これは、電極間の組織の電流を測定することと、電流を一定レベルで維持するために、ＥＰ装置が送達するエネルギー出力を適宜変化させることとを含む。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気処理を開始する前に、ユーザが予め設定する。電気穿孔装置の中の電気回路が、電極間の組織の電流を連続的にモニターし、そのモニターされた電流（または組織中の電流）を予め設定された電流と比較し、連続的にエネルギー出力の調整を行なって、モニターされた電流を予め設定されたレベルで維持することができるように、フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔構成要素、例えば、制御器によって達成され得る。フィードバックループは瞬時のものであり得、それは、フィードバックループがアナログ閉ループフィードバックであるからである。
【００４１】
本明細書で使用する、「分散電流」は、本明細書に記載の電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、これらのパターンは、電気穿孔される任意の組織領域に対する電気穿孔関連の熱ストレスの発生を最小限に抑えるか、または好ましくは消失させる。
【００４２】
本明細書で互換的に使用する、「電気穿孔」、「電気透過処理」、「界面動電増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味し得る。こうした微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、および水などの生体分子が、細胞膜の片側から他方の側に通過することが可能になる。
【００４３】
本明細書で使用する、「内因性抗体」は、体液性免疫応答を誘導するのに有効な量の抗原を投与されている対象内で生成される抗体を指し得る。
【００４４】
本明細書で使用する、「フィードバック機構」は、ソフトウェアまたはハードウェア（もしくはファームウェア）のいずれかによって実行されるプロセスであって、（エネルギーパルスの送達前、送達中、および／または送達後の）所望の組織のインピーダンスを受容し、それを現在値、好ましくは電流と比較し、送達されるエネルギーパルスを調整して、予め設定された値を達成するプロセスを指し得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施され得る。
【００４５】
「断片」は、機能、すなわち、所望の標的に結合でき、かつ、全長抗体と同じ意図した効果を有する抗体のポリペプチド断片を意味し得る。抗体の断片は、シグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンを備えているかまたは備えていないかのいずれの場合にも、Ｎおよび／またはＣ末端から少なくとも１つのアミノ酸が欠けている以外は全長と１００％同一であってもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除き、特定の全長抗体の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含んでいてもよい。断片は、抗体に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一で、かつ、同一率を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをさらに含むポリペプチドの断片を含んでいてもよい。断片はさらに、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのＮ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをさらに含んでいてもよい。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、抗体の断片に結合し得る。
【００４６】
抗体をコードする核酸配列の断片は、シグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンをコードする配列を備えているかまたは備えていないかのいずれの場合にも、５’および／または３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドが欠けている以外は全長と１００％同一であってもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除く特定の全長コード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含んでいてもよい。断片は、抗体に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一で、かつ、同一率を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに必要に応じて含むポリペプチドをコードする断片を含んでいてもよい。断片はさらに、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのＮ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドに対するコード配列をさらに含んでいてもよい。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に結合し得る。
【００４７】
本明細書で使用する、「遺伝子構築物」は、抗体などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子の投与先である個体の細胞中の発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始および終了シグナルを含む。本明細書で使用する「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞中に存在しているときにコード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列に機能的に連結している必要な調節要素を含んでいる遺伝子構築物を指す。
【００４８】
本明細書において２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で使用する「同一」または「同一性」は、当該配列が指定領域に渡って指定の割合の同一残基を有することを意味し得る。この割合を計算するには、２つの配列を最適に整列させ、指定領域に渡って２つの配列を比較し、両配列の同一残基が発生する位置の数を確定して一致位置の数を得て、一致位置の数を指定領域の総位置数で割り、計算結果に１００を掛けることにより、配列同一性のパーセント値が得られる。２つの配列の長さが異なるか、アライメントにより１つ以上の付着末端が生じ、指定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合には、単一配列の残基を計算の分母に含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合には、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を同等とみなすことができる。同一性の計算は、手動で行っても、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ  ２．０等のコンピューター配列アルゴリズムを使用して行ってもよい。
【００４９】
本明細書で使用する、「インピーダンス」は、フィードバック機構を論ずる際に用いられ、かつ、オームの法則に従って電流値に変換することができるため、予め設定された電流と比較することができる。
【００５０】
本明細書で使用する、「免疫応答」は、１つ以上の核酸および／またはペプチドの導入に応答して、宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系が活性化することを意味し得る。この免疫応答は、細胞性もしくは体液性の形態、またはその両方であり得る。
【００５１】
本明細書で使用する、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖を表現することにより、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、表現される一本鎖の相補鎖も包含する。ある核酸の多くの変異体を、所与の核酸として同一目的で使用できる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００５２】
核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部分を含むこともできる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、核酸はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含むことができる。核酸は、化学合成法または組み換え法により取得できる。
【００５３】
本明細書で使用する、「機能的に連結」は、遺伝子と空間的に接続しているプロモーターの制御下で遺伝子が発現することを意味し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置できる。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーターの派生元遺伝子において当該プロモーターが制御する遺伝子とプロモーターの間の距離とほぼ同一であってもよい。当技術分野で知られているように、プロモーター機能を失うことなく、この距離の変化に適応することができる。
【００５４】
本明細書で使用する、「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の結合配列を意味することができ、天然、合成、または、天然および合成の修飾あるいはその組み合わせであってもよい。
【００５５】
本明細書で使用する、「プロモーター」は、核酸の細胞中発現を授与、活性化、または増強することのできる合成分子または天然由来分子を意味し得る。プロモーターは、発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現および／またはその一時的発現を改変する目的で、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターは遠位のエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントを含むこともでき、このエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントは、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置できる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来してよい。プロモーターは、発現が発生する細胞、組織、もしくは臓器に関して、もしくは発現が生じる発生段階に関して、恒常的もしくは差次的に遺伝子成分の発現を調節でき、または、例えば生理的ストレス、病原体、金属イオン、誘発剤等の外部刺激に応答して遺伝子成分の発現を調節できる。プロモーターの代表例として、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ-ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００５６】
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端に結合することができるアミノ酸配列を指す。一般に、シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用するシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質を産生する細胞からタンパク質を分泌し易くすることが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、タンパク質（しばしば成熟タンパク質と呼ばれる）の残余から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端に結合する。
【００５７】
本明細書で使用する、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば核酸の複合混合物において、第１の核酸配列（例えばプローブ）が第２の核酸配列（例えばターゲット）とハイブリダイズする際の条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は配列に依存するため、状況によって異なる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列に対する融点（Ｔm）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔmは、（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔmにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）では最低約３０℃、長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチド超）では最低約６０℃であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件例には、以下の条件が含まれる：５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート。または、５倍ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、０．２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃での洗浄。
【００５８】
本明細書で互換的に使用する、「対象」および「患者」は、任意の脊椎動物を指し、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルもしくはアカゲザル、チンパンジーなどのサル）、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトあるいは非ヒトであってもよい。対象あるいは患者は、他の形態の治療を受けていてもよい。
【００５９】
本明細書で使用する、「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列が第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００６０】
本明細書で使用する、「実質的に同一」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列と第２の配列が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは、核酸に関して、第１の配列が第２の配列の相補体と実質的に相補的である場合を意味し得る。
【００６１】
本明細書で使用する、「合成抗体」は、本明細書に記載の組み換え核酸配列によってコードされ、対象内で生成される抗体を指す。
【００６２】
本明細書で使用する、「治療」または「治療する」は、疾患を予防するか、抑制するか、抑圧するかまたは完全に除去することで対象を疾患から防御することを意味することができる。疾患を予防することは、その疾患の発症前に対象に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑制することは、その疾患の誘導後でその疾患の臨床的出現前に、対象に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑圧することは、その疾患の臨床的出現後に、対象に本発明のワクチンを投与することを含む。
【００６３】
核酸に関して本明細書で使用する、「変異体」は、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片；（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体；（ｉｉｉ）基準核酸もしくはその相補体と実質的に同一の核酸；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、基準核酸、その相補体、もしくはその実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸を意味し得る。
【００６４】
ペプチドまたはポリペプチドに関して使用する、「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持しているものである。また、変異体は、基準タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を類似特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の別のアミノ酸に置換することは、当技術分野では、通常は軽微な変化を伴うものと認識されている。こうした軽微な変化は、当技術分野で理解されているように、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を検討することにより部分的に特定できる。Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性と電荷の考察に基づく。類似の疎水性親水性指標を有するアミノ酸は置換可能であり、その後もタンパク質機能を維持することが当技術分野において公知である。一態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物機能を保持したタンパク質となる置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を検討することにより、そのペプチドの局所的な最大平均親水性を計算でき、抗原性および免疫原性と良く相関すると報告されている有用な尺度となる。米国特許第４，５５４，１０１号（この文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。当技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、例えば免疫原性等の生物活性を保持したペプチドが得られる。親水性値が互いに±２以内のアミノ酸を用いて、置換を実施できる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。こうした知見と一致して、生物機能に適合するアミノ酸置換とは、アミノ酸の相対的類似性、特に当該アミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存するものと理解されており、この相対的類似性は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、その他の特性により明らかになる。
【００６５】
変異体は、完全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一な核酸配列であってもよい。核酸配列は、遺伝子配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。変異体は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一なアミノ酸配列であってもよい。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。
【００６６】
本明細書で使用する、「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製過剰染色体ベクターまたは宿主ゲノムに組み込むベクターのいずれかであってもよい。
【００６７】
本明細書中の数値範囲の記述について、同程度の精度でその間に入る各数が明示的に企図される。例えば、６〜９という範囲の場合、６および９に加えて７および８という数が企図され、６．０〜７．０という範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０という数が明示的に企図される。
【００６８】
２．組成物
本発明は、抗体、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする組み換え核酸配列を含む組成物に関する。組成物は、それを必要とする対象に投与された場合、対象内で合成抗体の生成をもたらし得る。合成抗体は、対象内に存在するターゲット分子（すなわち、抗原）に結合することができる。かかる結合は、抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸によって抗原の認識をブロックし、抗原に免疫応答を引き起こすかまたは誘発することができる。
【００６９】
合成抗体は、組成物を投与された対象内の疾患を治療する、予防する、および／または防御することができる。抗原に結合することで合成抗体は、組成物を投与された対象内の疾患を治療する、予防する、および／または防御することができる。合成抗体は、組成物を投与された対象内の疾患生存率を促進することができる。合成抗体は、組成物を投与された対象内の疾患生存率を少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％もたらすことができる。他の実施形態において、合成抗体は、組成物を投与された対象内の疾患生存率を少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％もたらすことができる。
【００７０】
組成物は、対象に組成物を投与後少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、または６０時間以内にその対象内で合成抗体の生成をもたらし得る。組成物は、対象に組成物を投与後少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日以内にその対象内で合成抗体の生成をもたらし得る。組成物は、対象に組成物を投与後約１時間〜約６日、約１時間〜約５日、約１時間〜約４日、約１時間〜約３日、約１時間〜約２日、約１時間〜約１日、約１時間〜約７２時間、約１時間〜約６０時間、約１時間〜約４８時間、約１時間〜約３６時間、約１時間〜約２４時間、約１時間〜約１２時間、または約１時間〜約６時間以内にその対象内で合成抗体の生成をもたらし得る。
【００７１】
組成物は、それを必要とする対象に投与された場合、抗原を投与された対象内で内因性抗体を生成するよりも迅速に対象内で合成抗体の生成をもたらし、体液性免疫応答を誘発することができる。組成物は、抗原を投与された対象内で内因性抗体を生成する少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日前に合成抗体の生成をもたらし、体液性免疫応答を誘発することができる。
【００７２】
本発明の組成物は、安全であることなど、有効な組成物に必要な特徴を有しているため、組成物は、病気または死を引き起こさず、病気に対して防御し、投与し易く、副作用もほとんどなく、生物学的安定性や投与量当たりの低コスト化をもたらすことができる。
【００７３】
３．組み換え核酸配列
上述したように、組成物は、組み換え核酸配列を含んでいてもよい。組み換え核酸配列は、抗体、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードし得る。以下により詳細に抗体について記載する。
【００７４】
組み換え核酸配列は、異種核酸配列であってもよい。組み換え核酸配列は、少なくとも１つの異種核酸配列または１つ以上の異種核酸配列を含んでいてもよい。
【００７５】
組み換え核酸配列は、最適化核酸配列であってもよい。かかる最適化により抗体の免疫原性を増大あるいは変化させることができる。最適化により転写および／または翻訳も改善することができる。最適化とは、以下の１つ以上を含んでいてもよい：低ＧＣ含量リーダー配列により転写を増大させる；ｍＲＮＡ安定性およびコドン最適化；ｋｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を追加して翻訳を増大させる；シグナルペプチドをコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列を追加；シス作用配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）を可能な限り取り除く。
【００７６】
ａ．組み換え核酸配列構築物
組み換え核酸配列は、１つ以上の組み換え核酸配列構築物を含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素を含んでいてもよい。以下により詳細に記載する。
【００７７】
組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、プロテアーゼまたはペプチダーゼ切断部位をコードする異種核酸配列も含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含んでいてもよく、各リーダー配列は、シグナルペプチドをコードする。組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーター、１つ以上のイントロン、１つ以上の転写終結領域、１つ以上の開始コドン、１つ以上の終結または終止コドン、および／または１つ以上のポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカーまたはタグ配列も含んでいてもよい。タグ配列は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグをコードすることができる。
【００７８】
（１）重鎖ポリペプチド
組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする異種核酸を含んでいてもよい。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域および／または少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含んでいてもよい。少なくとも１つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、定常重鎖領域３（ＣＨ３）、および／またはヒンジ領域を含んでいてもよい。
【００７９】
いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含んでいてもよい。他の実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含んでいてもよい。
【００８０】
重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含んでいてもよい。ＣＤＲセットは、ＶＨ領域の３つの超可変領域を含んでいてもよい。重鎖ポリペプチドのＮ−末端から開始して、これらのＣＤＲは、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と称せられる。重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原への結合または抗原の認識に寄与することができる。
【００８１】
（２）軽鎖ポリペプチド
組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域および／または定常軽鎖（ＣＬ）領域を含んでいてもよい。
【００８２】
軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含んでいてもよい。ＣＤＲセットは、ＶＬ領域の３つの超可変領域を含んでいてもよい。軽鎖ポリペプチドのＮ−末端から開始して、これらのＣＤＲは、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と称せられる。軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原への結合または抗原の認識に寄与することができる。
【００８３】
（３）プロテアーゼ切断部位
組み換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって認識することができる。プロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼであってもよく、フリン、エラスターゼ、ＨｔｒＡ、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプシンおよびペプシンが挙げられるが、これらに限定されない。プロテアーゼは、フリンであってもよい。他の実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または内部ペプチド結合を切断する（すなわち、Ｎ−末端またはＣ−末端ペプチド結合を切断しない）任意のプロテアーゼであってもよい。
【００８４】
プロテアーゼ切断部位は、切断効率を促進するかまたは増大させる１つ以上のアミノ酸配列を含んでいてもよい。１つ以上のアミノ酸配列は、別々のポリペプチドの形成または生成効率を促進するかまたは増大させることができる。１つ以上のアミノ酸配列は、２Ａペプチド配列を含んでいてもよい。
【００８５】
（４）リンカー配列
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカー配列を含んでいてもよい。リンカー配列は、本明細書に記載の１つ以上の構成要素を空間的に分離もしくは連結することができる。他の実施形態において、リンカー配列は、２つ以上のポリペプチドを空間的に分離もしくは連結するアミノ酸配列をコードすることができる。
【００８６】
（５）プロモーター
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含んでいてもよい。１つ以上のプロモーターは、遺伝子発現を推進し、かつ、調節することが可能な任意のプロモーターであってもよい。かかるプロモーターは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ経由の転写に要するシス作用配列要素である。遺伝子発現の指示に用いられるプロモーターは、特定の用途に依って選択される。プロモーターは、組み換え核酸配列構築物の転写開始部から、これがその天然の設定における転写開始部位からの距離であるのとほぼ同じ距離に配置される。しかしながら、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失を伴うことなく、適合されることができる。
【００８７】
プロモーターは、重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列に機能的に連結していてもよい。プロモーターは、真核細胞中での発現に対して有効であることを示すプロモーターであってもよい。コード配列に機能的に連結したプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０  初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーターなどのシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、エプステインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターでよい。プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトポリヘドリン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。
【００８８】
プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターであってもよく、後者は、宿主細胞がいくつか特定の外的刺激にさらされた場合にのみ転写を開始する。多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織または臓器もしくは特定の発生段階に特異的であってもよい。プロモーターは、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターでよく、天然もしくは合成であってもよい。かかるプロモーターの例は、米国特許公開公報ＵＳ２００４０１７５７２７に記載され、その内容は全体として本明細書に組み入れられる。
【００８９】
プロモーターは、エンハンサーと関連していてもよい。エンハンサーは、コード配列の上流に位置してもよい。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、または、ＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、またはＥＢＶなどのウイルスエンハンサーであってもよい。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、およびＷ０９４／０１６７３７に記載されており、それぞれの内容は参照により全体が組み入れられる。
【００９０】
（６）イントロン
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のイントロンを含んでいてもよい。各イントロンは、機能的スプライスドナー部位および機能的スプライスアクセプター部位を含んでいてもよい。イントロンは、スプライシングのエンハンサーを含んでいてもよい。イントロンは、効率のよいスプライシングに必要な１つ以上のシグナルを含んでいてもよい。
【００９１】
（７）転写終結領域
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上の転写終結領域を含んでいてもよい。転写終結領域は、効率よい終結を提供するためにコード配列の下流であってもよい。転写終結領域は、上述のプロモーターと同じ遺伝子から得てもよいし、あるいは、１つ以上の異なる遺伝子から得てもよい。
【００９２】
（８）開始コドン
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上の開始コドンを含んでいてもよい。開始コドンは、コード配列の上流に位置してもよい。開始コドンは、コード配列と共にインフレームであってもよい。開始コドンは、効率のよい翻訳開始に必要な１つ以上のシグナルと関連していてもよく、例えば、リボソーム結合部位と関連していてもよいが、これに限定されない。
【００９３】
（９）終結コドン
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上の終結または終止コドンを含んでいてもよい。終結コドンは、コード配列の下流であってもよい。終結コドンは、コード配列と共にインフレームであってもよい。終結コドンは、効率のよい翻訳終結に必要な１つ以上のシグナルと関連していてもよい。
【００９４】
（１０）ポリアデニル化シグナル
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。ポリアデニル化シグナルは、効率のよい転写産物のポリアデニル化に必要な１つ以上のシグナルを含んでいてもよい。ポリアデニル化シグナルは、コード配列の下流に位置してもよい。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであってもよい。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）からのポリアデニル化シグナルであってもよい。
【００９５】
（１１）リーダー配列
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含んでいてもよい。リーダー配列は、シグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドであってもよく、例えば、ＩｇＧシグナルペプチドおよびＩｇＥシグナルペプチドであるが、これらに限定されない。いくつかの実施例では、リーダー配列は、ＩｇＥリーダー配列であり、配列番号６５のａｔｇｇａｃｔｇｇａ  ｃｔｔｇｇａｔｔｃｔ  ｇｔｔｃｃｔｇｇｔｃ  ｇｃｃｇｃｃｇｃａａ  ｃｔｃｇｃｇｔｇｃａ  ｔａｇｃである。これは、タンパク質の配列番号６６のＭｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒをコードする。
【００９６】
ｂ．組み換え核酸配列構築物の配置構成
上述したように、組み換え核酸配列は、１つ以上の組み換え核酸配列構築物を含んでいてもよく、各々の組み換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素を含んでいてもよい。１つ以上の構成要素は、先に詳しく説明した通りである。１つ以上の構成要素は、組み換え核酸配列構築物に含まれる場合、互いに任意の順序で配置してもよい。いくつかの実施形態において、１つ以上の構成要素は、後述の組み換え核酸配列構築物に配置される。
【００９７】
（１）配置構成１
一つの配置構成において、第１の組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでいてもよく、第２の組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。
【００９８】
第１の組み換え核酸配列構築物は、ベクターに配置してもよい。第２の組み換え核酸配列構築物は、第２もしくは別々のベクターに配置してもよい。組み換え核酸配列構築物をベクターに配置することは、以下により詳細に記載する。
【００９９】
第１の組み換え核酸配列構築物は、プロモーター、イントロン、転写終結領域、開始コドン、終結コドン、および／またはポリアデニル化シグナルも含んでいてもよい。第１の組み換え核酸配列構築物は、リーダー配列をさらに含んでもよく、該リーダー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’）に位置する。従って、リーダー配列よってコードされるシグナルペプチドは、ペプチド結合によって重鎖ポリペプチドに連結する。
【０１００】
第２の組み換え核酸配列構築物は、プロモーター、開始コドン、終結コドン、およびポリアデニル化シグナルも含んでいてもよい。第２の組み換え核酸配列構築物は、リーダー配列をさらに含んでもよく、該リーダー配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’）に位置する。従って、リーダー配列よってコードされるシグナルペプチドは、ペプチド結合によって軽鎖ポリペプチドに連結する。
【０１０１】
従って、配置構成１の一例としては、ＶＨおよびＣＨ１を含む重鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター（従って、第１の組み換え核酸配列構築物）と、ＶＬおよびＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター（従って、第２の組み換え核酸配列構築物）とが挙げられる。配置構成１の第２例としては、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む重鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター（従って、第１の組み換え核酸配列構築物）と、ＶＬおよびＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター（従って、第２の組み換え核酸配列構築物）とが挙げられる。
【０１０２】
（２）配置構成２
第２の配置構成において、前記組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列および軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’）に位置してもよい。あるいは、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’）に位置してもよい。
【０１０３】
組み換え核酸配列構築物は、ベクターに配置してもよく、以下により詳細に記載する。
【０１０４】
組み換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位および／またはリンカー配列をコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物に含まれる場合、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列および軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列間に位置してもよい。従って、プロテアーゼ切断部位により発現時に重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを別々のポリペプチドに分離することができる。他の実施形態において、リンカー配列が組み換え核酸配列構築物に含まれる場合、リンカー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置してもよい。
【０１０５】
組み換え核酸配列構築物は、プロモーター、イントロン、転写終結領域、開始コドン、終結コドン、および／またはポリアデニル化シグナルも含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、１つのプロモーターが、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と関連し、かつ、第２のプロモーターが、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と関連するように２つのプロモーターを含んでいてもよい。さらに別の実施形態において、組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列および軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と関連する１つのプロモーターを含んでいてもよい。
【０１０６】
組み換え核酸配列構築物は、２つのリーダー配列をさらに含んでもよく、このうち、第１のリーダー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’）に位置し、第２のリーダー配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’）に位置する。従って、第１のリーダー配列によってコードされる第１のシグナルペプチドは、ペプチド結合によって重鎖ポリペプチドに連結し、第２のリーダー配列によってコードされる第２のシグナルペプチドは、ペプチド結合によって軽鎖ポリペプチドに連結する。
【０１０７】
従って、配置構成２の一例としては、ＶＨおよびＣＨ１を含む重鎖ポリペプチドと、ＶＬおよびＣＬを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター（従って、組み換え核酸配列構築物）が挙げられ、ここで、リンカー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置する。
【０１０８】
配置構成２の第２例としては、ＶＨおよびＣＨ１を含む重鎖ポリペプチドと、ＶＬおよびＣＬを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター（従って、組み換え核酸配列構築物）が挙げられ、ここで、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置する。
【０１０９】
配置構成２の第３例としては、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む重鎖ポリペプチドと、ＶＬおよびＣＬを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター（従って、組み換え核酸配列構築物）が挙げられ、ここで、リンカー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置する。
【０１１０】
配置構成２の第４例としては、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む重鎖ポリペプチドと、ＶＬおよびＣＬを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター（従って、組み換え核酸配列構築物）が挙げられ、ここで、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置する。
【０１１１】
ｃ．組み換え核酸配列構築物からの発現
上述したように、組み換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素の中で、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列および／または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。従って、組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現し易くすることができる。
【０１１２】
上述の配置構成１を用いた場合、第１の組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドを発現し易くすることができ、第２の組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチドを発現し易くすることができる。上述の配置構成２を用いた場合、組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを発現し易くすることができる。
【０１１３】
発現時、例えば、限定されないが、細胞、生物、または哺乳動物内において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを合成抗体に組み立てることができる。特に、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、抗原に結合することが可能な合成抗体をアセンブリがもたらすように、互いに相互作用することができる。他の実施形態において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、本明細書に記載のように組み立てられていない抗体に比べてより免疫原性が強い合成抗体をアセンブリがもたらすように、互いに相互作用することができる。さらに別の実施形態において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、抗原に対して免疫応答を引き起こすかもしくは誘導することが可能な合成抗体をアセンブリがもたらすように、互いに相互作用することができる。
【０１１４】
ｄ．ベクター
上述の組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のベクターに配置し得る。１つ以上のベクターは、複製起点を含んでいてもよい。１つ以上のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。１つ以上のベクターは、自己複製過剰染色体ベクターまたは宿主ゲノムに組み込むベクターのいずれかであってもよい。
【０１１５】
１つ以上のベクターは、異種発現構築物であってもよく、これは、一般に、特定の遺伝子をターゲット細胞を導入するのに使用されるプラスミドである。発現ベクターがいったん細胞中に入ると、組み換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドは、細胞性−転写および翻訳機械であるリボソーム複合体によって産生される。１つ以上のベクターは、大量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、従って、大量のタンパク質を発現することができる。
【０１１６】
（１）発現ベクター
１つ以上のベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であってもよい。環状プラスミドおよび線状核酸は、適切な対象細胞中で特定のヌクレオチド配列の発現を誘導することができる。組み換え核酸配列構築物を含む１つ以上のベクターは、キメラであってもよい。これは、その構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに対して異種であることを意味する。
【０１１７】
（２）プラスミド
１つ以上のベクターは、プラスミドであってもよい。プラスミドは、組み換え核酸配列構築物を備えた細胞をトランスフェクトするのに有用であり得る。プラスミドは、組み換え核酸配列構築物を対象に導入するのに有用であり得る。プラスミドは、調節配列も含んでもよく、これは、プラスミドを投与された細胞中での遺伝子発現に十分に適していてもよい。
【０１１８】
プラスミドは、プラスミドを染色体外に維持し、かつ、細胞中でプラスミドの複数のコピーを産生するために哺乳類の複製起点も含んでいてもよい。プラスミドは、インビトロジェン（サンディエゴ、カリフォルニア州）からのｐＶＡＸＩ、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であって、これらは、エプステイン・バー・ウイルスの複製起点と、核抗原ＥＢＮＡ−１のコード領域とを含んでいてもよく、統合しないで高いコピーのエピソーム複製を生じる。プラスミドのバックボーンは、ｐＡＶ０２４２であってもよい。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであってもよい。
【０１１９】
プラスミドは、ｐＳＥ４２０（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）であってもよく、それを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中でのタンパク質産生のために用いてもよい。プラスミドは、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）であってもよく、それを酵母のサッカロマイセス・セレビシエ株でのタンパク質産生に用いてもよい。プラスミドは、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）のものであってもよく、それを昆虫細胞中でのタンパク質産生に用いてもよい。プラスミドは、ｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）であってもよく、それを哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でのタンパク質産生に用いてもよい。
【０１２０】
（３）環状および線状ベクター
１つ以上のベクターは、環状プラスミドであってもよく、これは、標的細胞を統合によって細胞性ゲノムに形質転換してもよく、あるいは、染色体外に存在してもよい（例えば、複製起点をもつ自律複製プラスミド）。ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、ｐｒｏｖａｘ、または、組み換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現可能な任意の他の発現ベクターであってもよい。
【０１２１】
また、本明細書で提供されるのは、線状核酸または線状発現カセット（「ＬＥＣ」）であり、これは、電気穿孔を介して対象に効率よく送達され、かつ、組み換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現することができる。ＬＥＣは、任意のリン酸バックボーンを欠いた任意の線状ＤＮＡであってもよい。ＬＥＣは、任意の抗生物質抵抗性遺伝子および／またはリン酸バックボーンをを含んでいなくてもよい。ＬＥＣは、所望の遺伝子発現に関連しない他の核酸配列を含んでいなくてもよい。
【０１２２】
ＬＥＣは、線状にすることが可能な任意のプラスミド由来であってもよい。プラスミドは、組み換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現可能であってもよい。プラスミドは、ｐＮＰ（プエルトリコ／３４）またはｐＭ２（ニューカレドニア／９９）であってもよい。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、ｐｒｏｖａｘ、または、組み換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現可能な任意の他の発現ベクターであってもよい。
【０１２３】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であってもよい。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであってもよい。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれｐＮＰ（プエルトリコ／３４）およびｐＭ２（ニューカレドニア／９９）由来であってもよい。
【０１２４】
（４）ベクターを調製する方法
本明細書で提供されるのは、組み換え核酸配列構築物が配置されている１つ以上のベクターを調製する方法である。最終的なサブクローニングステップの後、ベクターを、当該技術分野で公知の方法を用いて、大規模発酵タンクで細胞培養物に接種するのに用いることができる。
【０１２５】
他の実施形態において、最終的なサブクローニングステップの後、ベクターを１つ以上の電気穿孔（ＥＰ）装置で用いることができる。ＥＰ装置を以下により詳細に記載する。
【０１２６】
１つ以上のベクターは、公知の装置および技術の組み合わせを利用して配合または製造することができるが、好ましくはそれらは、２００７年３月２３日に出願された許諾対象である同時係属中の米国特許仮出願第６０／９３９，７９２号に記載されたプラスミド製造技術を用いて製造される。幾つかの例において、本明細書に記載のＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で配合させることができる。その製造技術は、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されたものに加えて、２００７年７月３日発行の許諾対象特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されたものをはじめとする、当業者に概ね公知の様々な装置およびプロトコルも含み、組み入れている。先に参照された出願および特許である、米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ全体が本明細書に組み入れられる。
【０１２７】
４．抗体
上述したように、組み換え核酸配列は、抗体、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードすることができる。抗体は、抗原に結合できるかあるいは抗原と反応することができ、これは、以下により詳細に記載する。
【０１２８】
抗体は、重鎖および軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含んでいてもよく、それぞれは、ＣＤＲに対する支持体をもたらし、互いにＣＤＲの空間関係を規定する、重鎖および軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットの間に介在する。ＣＤＲセットは、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含んでいてもよい。重鎖または軽鎖のＮ−末端から開始して、これらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と称せられる。従って、抗原結合部位は、各々が重鎖および軽鎖Ｖ領域からなるＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含んでいてもよい。
【０１２９】
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかの断片を生じさせ、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は、各々無傷抗原結合部位を含む共有結合ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、双方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）2断片を含めたいくつかの断片を供することができる。従って、抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2であってもよい。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含んでいてもよい。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含んでいてもよい。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含んでいてもよい。
【０１３０】
抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であってもよい。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであってもよい。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含んでいてもよい。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含んでいてもよい。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含んでいてもよい。
【０１３１】
抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってもよい。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種由来の抗体であってもよい。
【０１３２】
５．抗原
合成抗体は、抗原またはその断片あるいはその変異体に向けられるものである。抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、またはその組み合わせであってもよい。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、その断片、またはその組み合わせであってもよい。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、その変異体、その断片、またはその組み合わせであってもよい。
【０１３３】
抗原は、任意の数の生物、例えば、ウイルス、寄生虫、細菌、真菌、または哺乳動物由来であってもよい。抗原は、自己免疫疾患、アレルギー、または喘息と関連し得る。他の実施形態において、抗原は、癌、ヘルペス、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と関連し得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、抗原は外来である。いくつかの実施形態において、抗原は自己抗原である。
【０１３５】
ａ．外来抗原
いくつかの実施形態において、抗原は外来である。外来抗原は、体内に導入された場合、免疫応答を刺激することが可能な任意の非自己物質（すなわち、対象の外部由来）である。
【０１３６】
（１）ウイルス抗原
外来抗原は、ウイルス抗原、またはその断片、またはその変異体であってもよい。ウイルス抗原は、以下の科：アデノウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、またはトガウイルス科の一つからであってもよい。ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、天然痘ウイルス（大痘瘡および小痘瘡）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトＴ−細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、毛様細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス（出血熱）、狂犬病ウイルス、エボラ出血熱ウイルス、マールブルグ・ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、１型単純ヘルペスウイルス（口腔ヘルペス）、２型単純ヘルペスウイルス（陰部ヘルペス）、帯状疱疹（水痘帯状疱疹、ａ．ｋ．ａ．、水痘）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ヒトＣＭＶ）、エプステイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、ラッサ熱ウイルス、アレナウイルス、または発がん性ウイルス由来であってもよい。
【０１３７】
（ａ）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原
ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ウイルス由来であってもよい。いくつかの実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＡエンベロープタンパク質、サブタイプＢエンベロープタンパク質、サブタイプＣエンベロープタンパク質、サブタイプＤエンベロープタンパク質、サブタイプＢ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖタンパク質、ＧａｇサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤタンパク質、ＭＰｏｌタンパク質、核酸、またはＥｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、またはその任意の組み合わせのアミノ酸配列であってもよい。
【０１３８】
ＨＩＶに特異的な合成抗体は、配列番号３の核酸配列によってコードされる配列番号４８のアミノ酸配列と配列番号４の核酸配列によってコードされる配列番号４９のアミノ酸配列とを含むＦａｂ断片を含んでいてもよい。合成抗体は、配列番号６の核酸配列によってコードされる配列番号４６のアミノ酸配列および配列番号７の核酸配列によってコードされる配列番号４７のアミノ酸配列を含んでいてもよい。Ｆａｂ断片は、配列番号５０の核酸配列によってコードされる配列番号５１のアミノ酸配列を含む。Ｆａｂは、配列番号５２の核酸配列によってコードされる配列番号５３のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０１３９】
ＨＩＶに特異的な合成抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＩｇを含んでいてもよい。Ｉｇは、配列番号６２の核酸配列によってコードされる配列番号１のアミノ酸配列を含んでいてもよい。Ｉｇは、配列番号６３の核酸配列によってコードされる配列番号２のアミノ酸配列を含んでいてもよい。Ｉｇは、配列番号５４の核酸配列によってコードされる配列番号５５のアミノ酸配列および配列番号５６の核酸配列によってコードされる配列番号５７のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０１４０】
（ｂ）チクングンヤ熱ウイルス
ウイルス抗原は、チクングニヤウイルス由来であってもよい。チクングニヤウイルスは、トガウイルス科のアルファウイルス属に属する。チクングニヤウイルスは、ヤブカ属などの感染蚊の刺咬によってヒトに伝染する。
【０１４１】
ＣＨＩＫＶに特異的な合成抗体は、配列番号５８の核酸配列によってコードされる配列番号５９のアミノ酸配列と配列番号６０の核酸配列によってコードされる配列番号６１のアミノ酸配列とを含むＦａｂ断片を含んでいてもよい。
【０１４２】
（ｃ）デングウイルス
ウイルス抗原は、デングウイルス由来であってもよい。デングウイルス抗原は、ウイルス粒子を形成する３つのタンパク質またはポリペプチド（Ｃ、ｐｒＭ、およびＥ）の１つであってもよい。デングウイルス抗原は、ウイルスの複製に関わる７つの他のタンパク質またはポリペプチド（ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５）の１つであってもよい。デングウイルスは、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、およびＤＥＮＶ−４を含む、ウイルスの５つの株または血清型の１つであってもよい。抗原は、複数のデングウイルス抗原の任意の組み合わせであってもよい。
【０１４３】
デングウイルスに特異的な合成抗体は、配列番号４４の核酸配列によってコードされる配列番号４５のアミノ酸配列を含むＩｇを含んでいてもよい。
【０１４４】
（ｄ）肝炎抗原
ウイルス抗原は、肝炎ウイルス抗原（すなわち、肝炎抗原）、またはその断片、またはその変異体を含んでいてもよい。肝炎抗原は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、および／またはＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）の１つ以上由来の抗原または免疫原であってもよい。
【０１４５】
肝炎抗原は、ＨＡＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＡＶカプシドタンパク質、ＨＡＶ非構造タンパク質、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってもよい。
【０１４６】
肝炎抗原は、ＨＣＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＣＶヌクレオカプシドタンパク質（すなわち、コアタンパク質）、ＨＣＶエンベロープタンパク質（例えば、Ｅ１およびＥ２）、ＨＣＶ非構造タンパク質（例えば、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂ）、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってもよい。
【０１４７】
肝炎抗原は、ＨＤＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＤＶデルタ抗原、その断片、またはその変異体であってもよい。
【０１４８】
肝炎抗原は、ＨＥＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＥＶカプシドタンパク質、その断片、またはその変異体であってもよい。
【０１４９】
肝炎抗原は、ＨＢＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面タンパク質、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｘ遺伝子によってコードされるＨＢＶタンパク質、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってもよい。肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子Ａ型コアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｂ型コアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｃ型コアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｄ型コアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｅ型コアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｆ型コアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｇ型コアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｈ型コアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ａ型表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｂ型表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｃ型表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｄ型表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｅ型表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｆ型表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｇ型表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子Ｈ型表面タンパク質、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってもよい。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子Ａ型、ＨＢＶ遺伝子Ｂ型、ＨＢＶ遺伝子Ｃ型、ＨＢＶ遺伝子Ｄ型、ＨＢＶ遺伝子Ｅ型、ＨＢＶ遺伝子Ｆ型、ＨＢＶ遺伝子Ｇ型、またはＨＢＶ遺伝子Ｈ型由来の抗原であってもよい。
【０１５１】
（ｅ）ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原
ウイルス抗原は、ＨＰＶ由来の抗原を含んでいてもよい。ＨＰＶ抗原は、子宮頸癌、直腸癌、および／またはその他の癌を引き起こすＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、４５、５２、および５８由来であってもよい。ＨＰＶ抗原は、性器疣贅を引き起こし、かつ、頭部癌および頸部癌の原因としても知られるＨＰＶ型６および１１由来であってもよい。
【０１５２】
ＨＰＶ抗原は、各ＨＰＶ型からのＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７領域であってもよい。例えば、ＨＰＶ型１６（ＨＰＶ１６）において、ＨＰＶ１６抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、断片、変異体、またはその組み合わせを含んでいてもよい。同様に、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ６  Ｅ６および／またはＥ７、ＨＰＶ１１  Ｅ６および／またはＥ７、ＨＰＶ１８  Ｅ６および／またはＥ７、ＨＰＶ３１  Ｅ６および／またはＥ７、ＨＰＶ３３  Ｅ６および／またはＥ７、ＨＰＶ５２  Ｅ６および／またはＥ７、ＨＰＶ５８  Ｅ６および／またはＥ７、断片、変異体、またはその組み合わせであってもよい。
【０１５３】
（ｆ）ＲＳＶ抗原
ウイルス抗原は、ＲＳＶ抗原を含んでいてもよい。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ融合タンパク質（本明細書では、「ＲＳＶ  Ｆ」、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質」、および「Ｆタンパク質」と称することもある）、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ヒトＲＳＶ融合タンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡおよびＢの間で保存されてもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ長株（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＡＡＸ２３９９４．１）由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ａ２株（ジェンバンクＡＡＢ５９８５８．１）由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の単量体、二量体、三量体、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。
【０１５４】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、前融合形態または後融合形態であってもよい。ＲＳＶ  Ｆの後融合形態は、免疫動物中で高い中和抗体力価を引き起こし、該動物をＲＳＶ抗原投与から防御する。
【０１５５】
ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ付着糖タンパク質（本明細書では、「ＲＳＶ  Ｇ」、「ＲＳＶ  Ｇタンパク質」、および「Ｇタンパク質」と称することもある）、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ヒトＲＳＶ  Ｇタンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡおよびＢ間で異なる。抗原は、ＲＳＶ長株（ジェンバンクＡＡＸ２３９９３）由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶサブタイプＢ単離体Ｈ５６０１、ＲＳＶサブタイプＢ単離体Ｈ１０６８、ＲＳＶサブタイプＢ単離体Ｈ５５９８、ＲＳＶサブタイプＢ単離体Ｈ１１２３由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。
【０１５６】
他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ非構造タンパク質１（「ＮＳ１タンパク質」）、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ長株（ジェンバンクＡＡＸ２３９８７．１）由来のＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ非構造タンパク質２（「ＮＳ２タンパク質」）、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ長株（ジェンバンクＡＡＸ２３９８８．１）由来のＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。さらに、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶヌクレオカプシド（「Ｎ」）タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ長株（ジェンバンクＡＡＸ２３９８９．１）由来のＲＳＶ  Ｎタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶリン（「Ｐ」）タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ長株（ジェンバンクＡＡＸ２３９９０．１）由来のＲＳＶ  Ｐタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ基質（「Ｍ」）タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ長株（ジェンバンクＡＡＸ２３９９１．１）由来のＲＳＶ  Ｍタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。
【０１５７】
さらに別の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ疎水性低分子（「ＳＨ」）タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ長株（ジェンバンクＡＡＸ２３９９２．１）由来のＲＳＶ  ＳＨタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ基質２−１（「Ｍ２−１」）タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ長株（ジェンバンクＡＡＸ２３９９５．１）由来のＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。さらに、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ基質２−２（「Ｍ２−２」）タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ長株（ジェンバンクＡＡＸ２３９９７．１）由来のＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶポリメラーゼＬ（「Ｌ」）タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ長株（ジェンバンクＡＡＸ２３９９６．１）由来のＲＳＶ  Ｌタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。
【０１５８】
別の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＬタンパク質の最適化アミノ酸配列を有し得る。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶタンパク質または組み換え抗原であってもよく、これは、ヒトＲＳＶゲノムによってコードされるタンパク質のいずれか一つである。
【０１５９】
他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ長株由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ長株由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、最適化アミノ酸ＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列、ＲＳＶ長株のヒトＲＳＶゲノム、最適化アミノ酸ＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列、ＲＳＶ長株由来のＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、ＲＳＶ長株由来のＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、ＲＳＶ長株由来のＲＳＶ  Ｎタンパク質、ＲＳＶ長株由来のＲＳＶ  Ｐタンパク質、ＲＳＶ長株由来のＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ長株由来のＲＳＶ  ＳＨタンパク質、ＲＳＶ長株由来のＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、ＲＳＶ長株由来のＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、ＲＳＶ長株由来のＲＳＶ  Ｌタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離体Ｈ５６０１由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離体Ｈ１０６８由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離体Ｈ５５９８由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離体Ｈ１１２３由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその断片、またはその変異体であってもよいが、これらに限定されない。
【０１６０】
（ｇ）インフルエンザ抗原
ウイルス抗原は、インフルエンザウイルス由来の抗原を含んでいてもよい。インフルエンザ抗原は、１つ以上のインフルエンザ血清型に対して哺乳動物中で免疫応答を引き起こすことができるものである。抗原は、全長翻訳産物ＨＡ０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、その変異体、その断片、またはその組み合わせを含んでいてもよい。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、複数株のＡ型インフルエンザ血清型Ｈ１、複数株のＡ型インフルエンザ血清型Ｈ２由来であっても、異なる複数株セットのＡ型インフルエンザ血清型Ｈ１由来のハイブリッド配列であっても、あるいは、複数株のＢ型インフルエンザ由来であってもよい。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、Ｂ型インフルエンザ由来であってもよい。
【０１６１】
インフルエンザ抗原は、免疫応答が誘発される特定のインフルエンザ免疫原に対して効果的な少なくとも１つの抗原エピトープを含んでいてもよい。抗原は、無傷インフルエンザウイルス内に存在する免疫原性部位およびエピトープの全てのレパートリーを供し得る。抗原は、血清型Ｈ１または血清型Ｈ２の複数のＡ型インフルエンザウイルス株など、１つの血清型の複数のＡ型インフルエンザウイルス株からのヘマグルチニン抗原配列由来であってもよい。抗原は、２つの異なるヘマグルチニン抗原配列またはその一部分の組み合わせ由来であるハイブリッドヘマグルチニン抗原配列であってもよい。２つの異なるヘマグルチニン抗原配列の各々は、血清型Ｈ１の複数のＡ型インフルエンザウイルス株など、１つの血清型の複数のＡ型インフルエンザウイルス株の異なるセット由来であってもよい。抗原は、複数のＢ型インフルエンザウイルス株からのヘマグルチニン抗原配列由来であるヘマグルチニン抗原配列であってもよい。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、またはＢＨＡ抗原であってもよい。
【０１６３】
（ｈ）エボラウイルス
ウイルス抗原は、エボラウイルス由来であってもよい。エボラウイルス疾患（ＥＶＤ）またはエボラ出血熱（ＥＨＦ）としては、５つの公知のエボラウイルス、ブンディブギョウイルス（ＢＤＢＶ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、スーダンウイルス（ＳＵＤＶ）、およびタイフォレストウイルス（ＴＡＦＶ、コートジボワールエボラウイルス（象牙海岸エボラウイルス、ＣＩＥＢＯＶ）とも呼ばれる）の任意の４つが挙げられる。
【０１６４】
（２）細菌性抗原
外来抗原は、細菌性抗原またはその断片あるいはその変異体であってもよい。細菌は、以下の門：アシドバクテリウム門、アクチノバクテリア門、アクウィフェクス門、バクテロイデス門、カルディセリクム門、クラミジア門、クロロビウム門、クロロフレクサス門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア門、デフェリバクター門、デイノコックス・テルムス門、ディクチオグロムス門、エルシミクロビウム門、フィブロバクター門、フィルミクテス門、フソバクテリウム門、ゲマティモナス門、レンティスファエラ門、ニトロスピラ門、プランクトミケス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、シネルギステス門、テネリクテス門、サーモデスルフォバクテリア門、テルモトガ門、およびウェルコミクロビウム門の任意の１つ由来であってもよい。
【０１６５】
細菌は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌であってもよい。細菌は、好気性細菌または嫌気性細菌であってもよい。細菌は、独立栄養細菌または従属栄養細菌であってもよい。細菌は、中温菌、好中菌、好極限菌、好酸菌、好アルカリ菌、好熱菌、低温菌、好塩菌、または好濃菌であってもよい。
【０１６６】
細菌は、炭疽菌、抗生物質耐性菌、病原菌、食中毒菌、感染性菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、連鎖球菌属細菌、または破傷風菌であってもよい。細菌は、抗酸菌、破傷風菌、ペスト菌、炭疽菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、またはクロストリジウム−ディフィシレ菌であってもよい。細菌は、結核菌であってもよい。
【０１６７】
（ａ）結核菌抗原
細菌性抗原は、結核菌抗原（すなわち、ＴＢ抗原またはＴＢ免疫原）、またはその断片、またはその変異体であってもよい。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＡｇ８５科、例えば、Ａｇ８５ＡおよびＡｇ８５Ｂ由来であってもよい。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＥｓｘ科、例えば、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＤ、ＥｓｘＥ、ＥｓｘＦ、ＥｓｘＨ、ＥｓｘＯ、ＥｓｘＱ、ＥｓｘＲ、ＥｓｘＳ、ＥｓｘＴ、ＥｓｘＵ、ＥｓｘＶ、およびＥｓｘＷ由来であってもよい。
【０１６８】
（３）寄生虫抗原
外来抗原は、寄生虫抗原またはその断片あるいはその変異体であってもよい。寄生虫は、原虫、寄生蠕虫、または外部寄生虫であってもよい。寄生蠕虫（すなわち、蠕虫）は、扁虫（例えば、吸虫および条虫）、鉤頭虫、または回虫（例えば、蟯虫）であってもよい。外部寄生虫は、シラミ、ノミ、マダニ、およびダニであってもよい。
【０１６９】
寄生虫は、以下の疾患のうちの任意の１つの原因となる任意の寄生虫であってもよい：アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、回虫症（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉａｓｉｓ）、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ症、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮病、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ランブル鞭毛虫症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、メタゴニムス症、ハエ蛆症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫病、および鞭虫症。
【０１７０】
寄生虫は、アカントアメーバ、アニサキス、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、ウマバエ、大腸バランチジウム、トコジラミ、条虫綱（条虫）、ツツガムシ、ラセンウジバエ、赤痢アメーバ、肝蛭、ランブル鞭毛虫、鉤虫、リーシュマニア、鼻腔舌虫、肝吸虫、ロア糸状虫、肺吸虫（肺吸虫）、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、糞線虫、ダニ、条虫、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ、鞭虫、またはバンクロフト糸状虫であってもよい。
【０１７１】
（ａ）マラリア抗原
外来抗原は、マラリア抗原（すなわち、ＰＦ抗原またはＰＦ免疫原）、またはその断片、またはその変異体であってもよい。抗原は、マラリアの原因となる寄生虫由来であってもよい。マラリア病原性の寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫であってもよい。熱帯熱マラリア原虫抗原は、スポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原を含んでいてもよい。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、マラリア抗原は、熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳ；ＬＳＡ１；ＴＲＡＰ；ＣｅｌＴＯＳ；およびＡｍａ１の１つであってもよい。免疫原は、全長タンパク質またはその免疫原性断片であってもよい。
【０１７３】
他の実施形態において、マラリア抗原は、ＳＳＰ２とも呼ばれるＴＲＡＰであってもよい。さらに別の実施形態において、マラリア抗原は、Ａｇ２とも呼ばれ、かつ、高度に保存されたプラスモジウム抗原であるＣｅｌＴＯＳであってもよい。別の実施形態において、マラリア抗原は、高度に保存されたプラスモジウム抗原であるＡｍａ１であってもよい。いくつかの実施形態において、マラリア抗原は、ＣＳ抗原であってもよい。
【０１７４】
他の実施形態において、マラリア抗原は、本明細書に記載のＰＦタンパク質の２つ以上の組み合わせを含む融合タンパク質であってもよい。例えば、融合タンパク質は、互いに隣接して直接結合しているか、スペーサーと結合しているか、あるいは、１つ以上のアミノ酸の間で結合しているＣＳ免疫原、ＣｏｎＬＳＡ１免疫原、ＣｏｎＴＲＡＰ免疫原、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原、およびＣｏｎＡｍａ１免疫原の２つ以上を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、２つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、３つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、４つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、５つのＰＦ免疫原を含む。２つのＰＦ免疫原を持つ融合タンパク質は、ＣＳおよびＬＳＡ１；ＣＳおよびＴＲＡＰ；ＣＳおよびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳおよびＡｍａ１；ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ；ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１およびＡｍａ１；ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；または、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含んでいてもよい。３つのＰＦ免疫原を持つ融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、およびＴＲＡＰ；ＣＳ、ＬＳＡ１、およびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１、およびＡｍａ１；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＡｍａ１；または、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１を含んでいてもよい。４つのＰＦ免疫原を持つ融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＡｍａ１；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１；ＣＳ、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１；または、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１を含んでいてもよい。５つのＰＦ免疫原を持つ融合タンパク質は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１を含んでいてもよい。
【０１７５】
（４）真菌抗原
外来抗原は、真菌抗原またはその断片あるいはその変異体であってもよい。真菌は、アスペルギルス種、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ属酵母（例えば、カンジダ・アルビカンス）、コクシジオイデス、クリプトコックス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ガッティ、皮膚糸状菌、フザリウム属種、ヒストプラスマ‐カプスラーツム、ケカビ亜門、ニューモシスチス・イロベチ、スポロトリックス‐シェンキィ、エクセロヒルム、またはクラドスポリウムであってもよい。
【０１７６】
ｂ．自己抗原
いくつかの実施形態において、抗原は、自己抗原である。自己抗原は、免疫応答を刺激することが可能な対象自身の体の構成要素であってもよい。いくつかの実施形態において、自己抗原は、対象が疾患状態、例えば、自己免疫疾患でなければ、免疫応答を誘発しない。
【０１７７】
自己抗原としては、サイトカイン、ＨＩＶおよびデング熱を含む上に列挙したウイルスに対する抗体、癌の進行または発生に影響を及ぼす抗原、細胞表面受容体、または膜貫通タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
（１）ＷＴ−１
自己抗原は、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子１（ＷＴ１）、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってもよい。ＷＴ１は、プロリン／グルタミンリッチＤＮＡ−結合領域をＮ−末端に、かつ、４つの亜鉛フィンガーモチーフをＣ−末端に含む転写因子である。ＷＴ１は、泌尿生殖器系の正常な発達に関与しており、多くの因子、例えば、腫瘍抑制因子として知られるｐ５３、および細胞毒性薬による治療後に多数の部位でＷＴ１を切断するセリンプロテアーゼＨｔｒＡ２と相互作用する。ＷＴ１の突然変異により、腫瘍または癌形成、例えば、ＷＴ１を発現するウィルムス腫瘍または腫瘍がもたらされる。
【０１７９】
（２）ＥＧＦＲ
自己抗原は、上皮成長増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、またはその断片あるいはその変異体を含んでいてもよい。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１およびＨＥＲ１とも呼ばれる）は、細胞外タンパク質リガンドの上皮細胞増殖因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）メンバーの細胞表面受容体である。ＥＧＦＲは、受容体のＥｒｂＢファミリーメンバーであり、４つの密接に関連した受容体チロシン・キナーゼであるＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、およびＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む。ＥＧＦＲ発現または活性に影響を及ぼす突然変異は癌になり得る。
【０１８０】
抗原は、ＥｒｂＢ−２抗原を含んでいてもよい。Ｅｒｂ−２（ヒト上皮成長増殖因子受容体２）は、Ｎｅｕ、ＨＥＲ２、ＣＤ３４０（分化３４０のクラスター）、またはｐ１８５としても知られ、ＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされる。この遺伝子の増幅または過剰発現が、ある侵攻性の乳癌の発生および進行に役割を果たすことが実証されている。乳癌の女性の約２５〜３０％において、ＥＲＢＢ２遺伝子で遺伝子変化が起きており、腫瘍細胞の表面上でＨＥＲ２の産生量が増している。ＨＥＲ２の過剰発現により急速な細胞分裂が促進されるため、ＨＥＲ２は腫瘍細胞をマークする。
【０１８１】
ＨＥＲ２に特異的な合成抗体は、配列番号４０の核酸配列によってコードされる配列番号４１のアミノ酸配列および配列番号４２の核酸配列によってコードされる配列番号４３のアミノ酸配列を含むＦａｂ断片を含んでいてもよい。
【０１８２】
（３）コカイン
自己抗原は、コカイン受容体抗原であってもよい。コカイン受容体は、ドーパミン輸送体を含む。
【０１８３】
（４）ＰＤ−１
自己抗原は、プログラム死１（ＰＤ−１）を含んでいてもよい。プログラム死１（ＰＤ−１）およびそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、Ｔ細胞活性化、耐性、および免疫病理学間のバランスを調節する抑制シグナルを送達する。ＰＤ−１は、膜貫通領域および細胞内尾部に続く細胞外ＩｇＶ領域を含む２８８アミノ酸細胞表面タンパク質分子である。
【０１８４】
（５）４−１ＢＢ
自己抗原は、４−１ＢＢリガンドを含んでいてもよい。４−１ＢＢリガンドは、ＴＮＦ上科に属する２型の膜貫通糖タンパク質である。４−１ＢＢリガンドは、活性化Ｔリンパ球上で発現されてもよい。４−１ＢＢは、活性化誘発性Ｔ細胞共刺激分子である。４−１ＢＢ経由のシグナル伝達により、生存遺伝子が上方制御され、細胞分裂が高められ、サイトカイン産生が誘発され、Ｔ細胞の活性化誘発性細胞死が防止される。
【０１８５】
（６）ＣＴＬＡ４
自己抗原は、ＣＤ１５２（分化１５２のクラスター）としても知られるＣＴＬＡ−４（細胞毒性Ｔリンパ球抗原４）を含んでいてもよい。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞の表面上に見られるタンパク質受容体であり、抗原への細胞性免疫攻撃をもたらす。抗原は、細胞外Ｖ領域、膜貫通領域、細胞質尾部、またはその組み合わせなどのＣＴＬＡ−４の断片であってもよい。
【０１８６】
（７）ＩＬ−６
自己抗原は、インターロイキン６（ＩＬ−６）を含んでいてもよい。ＩＬ−６は、限定されないが、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、鬱病、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、多発性骨髄腫、癌、ベーチェット病、および関節リウマチを含む多くの疾患において炎症および自己免疫プロセスを刺激する。
【０１８７】
（８）ＭＣＰ−１
自己抗原は、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）を含んでいてもよい。ＭＣＰ−１は、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）または小誘導性サイトカインＡ２とも呼ばれる。ＭＣＰ−１は、ＣＣケモカインファミリーに属するサイトカインである。ＭＣＰ−１は、組織傷害または感染のいずれかによって産生された炎症部位に、単球、記憶Ｔ細胞、および樹枝状細胞を補充する。
【０１８８】
（９）アミロイドベータ
自己抗原は、アミロイドベータ（Ａβ）またはその断片あるいはその変異体を含んでいてもよい。Ａβ抗原は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドを含み、ＸおよびＹ両方を含むヒト配列Ａβタンパク質のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙのアミノ酸配列であり、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩ（アミノ酸位置１〜４７に対応；ヒトクエリ配列）のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙのアミノ酸配列またはその変異体である。Ａβ抗原は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ポリペプチドのＡβポリペプチドを含んでいてもよく、Ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２であってもよく、Ｙは、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、または１５であってもよい。Ａβポリペプチドは、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、または少なくとも４６アミノ酸である断片を含んでいてもよい。
【０１８９】
（１０）ＩＰ−１０
自己抗原は、インターフェロン（ＩＦＮ）ガンマ誘発タンパク質１０（ＩＰ−１０）を含んでいてもよい。ＩＰ−１０は、小誘導性サイトカインＢ１０またはＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）としても知られる。ＣＸＣＬ１０は、ＩＦＮ−γに応答して、単球、内皮細胞、および線維芽細胞などのいくつかの細胞型から分泌される。
【０１９０】
（１１）ＰＳＭＡ
自己抗原は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を含んでいてもよい。ＰＳＭＡは、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミン酸ペプチダーゼＩ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ  Ｉ）、ＮＡＡＧペプチダーゼ、または葉酸加水分解酵素（ＦＯＬＨ）としても知られる。ＰＭＳＡは、前立腺癌細胞によって高発現される内在性膜タンパク質である。
【０１９１】
ｃ．他の抗原
いくつかの実施形態において、抗原は、外来抗原および／または自己抗原以外の抗原である。
【０１９２】
（ａ）ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１
他の抗原は、ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１であってもよい。ＨＩＶ−１  ＶＣＲ０１は、ＨＩＶの中和ＣＤ４結合部位抗体である。ＨＩＶ−１  ＶＣＲ０１は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０ループＤ、ＣＤ４結合ループ、およびＶ５領域内をはじめとするＨＩＶ−１の一部分と接触する。
【０１９３】
（ｂ）ＨＩＶ−１  ＰＧ９
他の抗原は、ＨＩＶ−１  ＰＧ９であってもよい。ＨＩＶ−１  ＰＧ９は、ＨＩＶ（ＨＩＶ−１）エンベロープ（Ｅｎｖ）糖タンパク質（ｇｐ）三量体に優先的に結合し、かつ、ウイルスを広く中和するグリカン依存ヒト抗体の拡大ファミリーの創立メンバーである。
【０１９４】
（ｃ）ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０
他の抗原は、ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０であってもよい。ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０は、中和抗ＨＩＶ抗体である。ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０は、ＨＩＶ−１の膜近接外部領域（ＭＰＥＲ）にマップした線状エピトープに対するものであり、ｇｐ４１細胞外ドメインのＣ末端に位置する。
【０１９５】
（ｄ）ＤＶ−ＳＦ１
他の抗原は、ＤＶ−ＳＦ１であってもよい。ＤＶ−ＳＦ１は、４つのデングウイルス血清型のエンベロープタンパク質に結合する中和抗体である。
【０１９６】
（ｅ）ＤＶ−ＳＦ２
他の抗原は、ＤＶ−ＳＦ２であってもよい。ＤＶ−ＳＦ２は、デングウイルスのエピトープに結合する中和抗体である。ＤＶ−ＳＦ２は、ＤＥＮＶ４血清型に特異的であり得る。
【０１９７】
（ｆ）ＤＶ−ＳＦ３
他の抗原は、ＤＶ−ＳＦ３であってもよい。ＤＶ−ＳＦ３は、デングウイルスエンベロープタンパク質のＥＤＩＩＩ  Ａ鎖に結合する中和抗体である。
【０１９８】
６．組成物の賦形剤および他の成分
組成物は、薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容しうる賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤としての機能的分子であり得る。薬学的に許容しうる賦形剤は、界面活性剤を含みうるトランスフェクション促進剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤であり得る。
【０１９９】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマートであり、ポリ−Ｌ−グルタマートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で組成物中に存在してもよい。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞を含んでいてもよく、ヒアルロン酸を用いて、組成物と一体化させて投与してもよい。組成物は、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、ＷＯ０９３２４６４０参照）などの当該技術分野で公知の他のリポソームをはじめとするリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知トランスフェクション促進剤を含んでいてもよい。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０２００】
組成物は、１９９４年４月１日出願の米国特許出願第０２１，５７９号に記載された遺伝子促進剤をさらに含んでいてもよく、参照により完全に組み入れられる。
【０２０１】
組成物は、ＤＮＡを約１ナノグラム〜約１００ミリグラム；約１マイクログラム〜約１０ミリグラム；好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム；さらに好ましくは約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量で含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、本発明による組成物は、ＤＮＡを約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、ＤＮＡを約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、ＤＮＡを約０．１〜約５００マイクログラム含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、ＤＮＡを約１〜約３５０マイクログラム含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、ＤＮＡを約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラム〜１００ミリグラム；約１マイクログラム〜約１０ミリグラム；約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム；約１ミリグラム〜約２ミリグラム、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム含んでいてもよい。
【０２０２】
組成物は、用いられる投与様式に従って配合してもよい。注射可能な医薬組成物は、滅菌されたパイロジェンフリーおよび微粒子フリーであってもよい。等張性配合剤または溶液が用いられてもよい。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。組成物は、血管収縮剤を含んでいてもよい。等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでいてもよい。組成物は、ゼラチンおよびアルブミンをはじめとする安定化剤をさらに含んでいてもよい。ＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオンなどの安定剤により、配合剤を室温または周囲温度で長時間安定にさせることができる。
【０２０３】
７．合成抗体の生成方法
また、本発明は、合成抗体の生成方法に関する。本方法は、組成物を、以下により詳細に記載の送達方法を用いてそれを必要とする対象に投与することを含んでいてもよい。従って、合成抗体は、組成物を対象に投与した際に、対象内もしくはｉｎ  ｖｉｖｏで生成される。
【０２０４】
本方法は、組成物を１つ以上の細胞中に導入することも含んでいてもよい。従って、合成抗体は、１つ以上の細胞中で生成もしくは産生されてもよい。本方法は、組成物を、１つ以上の組織、例えば、限定されないが、皮膚および筋肉中に導入することをさらに含んでもよい。従って、合成抗体は、１つ以上の組織中で生成もしくは産生されてもよい。
【０２０５】
８．抗体の特定方法またはスクリーニング方法
さらに、本発明は、上述の抗原に反応するかもしくは結合する上述の抗体の特定方法またはスクリーニング方法に関する。抗体を特定またはスクリーニングする本方法を当業者に公知の方法論で抗原に用いて、抗体を特定またはスクリーニングすることができる。かかる手法としては、ライブラリ（例えば、ファージディスプレイ）からの抗体の選択、動物の免疫化、続いて、抗体の単離および／または精製が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｒａｊａｎ，Ｓ．とＳｉｄｈｕ，Ｓ．、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、５０２巻、１章「簡易化された合成抗体ライブラリ（Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）（２０１２）」に記載の方法を参照されたい。その内容は、全体として本明細書に組み入れられる。
【０２０６】
９．組成物の送達方法
また、本発明は、組成物をそれを必要とする対象に送達する方法に関する。送達方法は、組成物を対象に投与することを含んでいてもよい。投与としては、ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔付きおよび無しのＤＮＡ注射、リポソーム介在送達、およびナノ粒子促進送達が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
組成物の送達を受ける哺乳動物は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、水牛、バイソン、ウシ属、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、およびニワトリであってもよい。
【０２０８】
組成物を、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入、口腔投与、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせをはじめとする異なる経路で投与してもよい。獣医学的使用では、通常の獣医学的実践に従い、組成物を適切に許容しうる配合剤として投与してもよい。獣医は、特定の動物に最も適した投与レジメンおよび投与経路を、容易に決定することができる。組成物を、伝統的なシリンジ、針なし注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または他の物理的方法、例えば電気穿孔法（ＥＰ）、「水力学的方法」、または超音波により投与してもよい。
【０２０９】
ａ．電気穿孔
電気穿孔による組成物の投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得、好ましくは、エネルギーパルスは、ユーザーにより入力されたプリセット電流に近い定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含んでいてもよい。電気穿孔構成要素は、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリー成分、電源、および電源スイッチをはじめとする電気穿孔装置の１種以上の様々な要素を含み、それらを組み込んでいてもよい。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易化するｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔装置、例えばＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）  ＥＰシステム（ＶＧＸファーマシューティカルズ社製、ペンシルベニア州ブルーベル）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（ジェネトロニクス社（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）製、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて達成され得る。
【０２１０】
電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の一要素として機能してもよく、他の要素は、電気穿孔構成要素と連通する別々の要素（または構成要素）である。電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つを超える要素として機能してもよく、それが電気穿孔構成要素とは別々の電気穿孔装置の他の要素とも連通していてもよい。１つの電気機械的または機械的装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素は、その要素が１つの装置として、または互いに連通する別々の要素として機能しうるように限定しなくてもよい。電気穿孔構成要素は、所望の組織内で定電流を生成するエネルギーパルスを送達することができてもよく、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的配置内に複数の電極を有する電極アレイを含んでいてもよく、電極アセンブリは、電気穿孔構成要素からエネルギーパルスを受け、電極を介して所望の組織にそれを送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達時にはニュートラルであり、所望の組織中のインピーダンスを測定して、そのインピーダンスを電気穿孔構成要素に連通する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受けてもよく、電気穿孔構成要素により送達されたエネルギーパルスを調整して定電流を維持することができる。
【０２１１】
複数の電極が、分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよい。複数の電極は、プログラムされたシーケンス下の電極制御を介して、分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよく、プログラムされたシーケンスは、ユーザーにより電気穿孔構成要素に入力される。プログラムされたシーケンスは、順に送達された複数のパルスを含んでいてもよく、複数のパルスの各パルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を含む少なくとも２つの活性電極により送達され、複数のパルスの次のパルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を含む少なくとも２つの活性電極の異なる１つにより送達される。
【０２１２】
フィードバック機構は、ハードウエアまたはソフトウエアのいずれかにより実施してもよい。フィードバック機構は、アナログ閉回路により実施してもよい。フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓごとに起こるが、好ましくは実時間フィードバックまたは瞬時（すなわち、応答時間を決定するための入手可能な技術により決定すると実質的に瞬時）である。ニュートラル電極で所望の組織中のインピーダンスを測定してもよく、そのインピーダンスをフィードバック機構に連通し、フィードバック機構がインピーダンスに応答してエネルギーパルスを調整し、プリセット電流と類似の値の定電流を維持する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達時に定電流を連続および瞬時的に維持してもよい。
【０２１３】
本発明の組成物の送達を促進しうる電気穿孔装置および電気穿孔法の例としては、内容が全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されたそれらのものが挙げられる。組成物の送達を促進するのに用いられうる他の電気穿孔装置および電気穿孔法としては、その全てが全体として参照により本明細書に組み入れられた、２００６年１０月１７日出願の米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号に対して３５ＵＳＣ  １１９（ｅ）による利益を主張する、２００７年１０月１７日出願の同時係属中および共有の米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されたものが挙げられる。
【０２１４】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を促進するためのモジュラー電極システムおよびその使用が記載されている。モジュラー電極システムは、複数の針電極；皮下注射針；プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクター；および電源を含んでいてもよい。オペレータが、支持構造上に搭載された複数の針電極を掴み、体内または植物内の選択された組織にそれらをしっかりと挿入することができる。その後、皮下注射針を介して、生体分子を選択された組織へ送達する。プログラム可能な定電流パルス制御器を活性化して、定電流の電気パルスを複数の針電極に印加する。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間での細胞への生体分子導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全体的内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１５】
Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子導入を効果的に促進するために用いられうる電気穿孔装置が記載されている。該電気穿孔装置は、操作がソフトウエアまたはファームウエアに特定される電気運動装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤ装置は、ユーザ制御に基づく一列の電極とパルスパラメータ入力との間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存および取得を可能にする。電気穿孔装置は、針電極、注射針用の中央注入チャネル、および取り外し可能なガイドディスクのアレイを有する交換可能な電極ディスクも含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全体的内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１６】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載された電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または臓器にも深く浸透させるように適合され得る。電極アレイの形態によって、注射針（選択された生体分子を送達する）が、ターゲット臓器にも完全に挿入され、電極によってあらかじめ描かれた領域のターゲット組織に垂直に注射投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載された電極は、好ましくは２０ｍｍ長および２１ゲージである。
【０２１７】
加えて、電気穿孔装置およびその使用を組み込んだいくつかの実施形態で予期される通り、以下の特許：１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号、２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、および２００５年９月６日発行の米国特許第６，９３９，８６２号に記載された電気穿孔装置が存在する。さらに、様々な装置のいずれかを用いたＤＮＡの送達に関係する２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡ注入の方法が注目された２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号に提供された主題を含む特許が、本明細書で企図される。先の特許は、全体として参照により組み入れられる。
【０２１８】
１０．治療方法
また、本明細書で提供されるのは、合成抗体を対象内で生成することで、疾患に対する治療、防御、および／または予防を、それを必要とする対象において行う方法である。本方法は、組成物を対象に投与することを含んでいてもよい。対象への組成物の投与は、上述の送達方法を用いて行うことができる。
【０２１９】
対象内で合成抗体を生成する際、合成抗体は、抗原に結合するかもしくは抗原と反応することができる。かかる結合により、抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸による抗原の認識をブロックし、抗原への免疫応答を引き起こすかまたは誘発することにより、対象内の抗原と関連する疾患を治療、防御、および／または予防することができる。
【０２２０】
組成物の用量は、１μｇ〜１０ｍｇ有効成分／ｋｇ体重／時間であってもよく、２０μｇ〜１０ｍｇ有効成分／ｋｇ体重／時間であってもよい。組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日おきに投与することができる。効果的な治療のための組成物の投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であってもよい。
【０２２１】
治療の一方法において、合成抗体またはその機能的断片を、ウイルスまたは細菌の感染、あるいは癌性細胞に対して治療を必要としている対象に投与することができる。本明細書に記載の合成抗体を投与することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現時に、体の罹患部位に機能的抗体が急速に存在することができ、かつ、標的に中和反応を起こすことができる機能的抗体をもたらすことができる（結合するように設計されており、中和することが好ましい）。急速に存在することは、かなり急速に進む疾患病状および／または既存の記憶免疫を持たない個体において重要である。感染している対象に対して急速な中和が重要となるいくつかの特定のケースは、デング熱、チクングンヤ熱、およびエボラなどの熱帯病においてである。かかる感染においては、ウイルスに感染した瞬間から急速な中和を要する。実施例５、図６Ａおよび図６Ｂは、上記方法で生成された発現構築物を用いた抗体の急速な生成を示す。図６Ａは、プラスミドＤＮＡ構築物の投与後１日内に抗体が発現されることを示し；図６Ｂは、タンパク質／抗原の投与から抗体発現までに約８日要したことを示す。
【０２２２】
この治療方法は、単独でもよいし、標的に対する宿主免疫応答を対象に生成させ得る抗原の通常のワクチン接種と組み合わせてもよい。ワクチンを組み合わせることにより、意図した標的に対して２段階の免疫応答がもたらされる利益がある：１）合成抗体をコードするヌクレオチド配列およびその機能的断片によってもたらされる第１の急速な応答と、２）従来のワクチン（ＤＮＡワクチンまたは合成免疫原を含んでいてもよい）によって引き起こされ、宿主が標的に対して自身の免疫応答を起こすことができるまで遅れ時間がある第２の宿主免疫応答とである。
【０２２３】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示される多くの態様を有する。
【実施例】
【０２２４】
以下に実施例を用いて本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、説明のためだけに記載されるものと理解されるべきである。上記の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の用途及び条件に適合させるために本発明の種々の変更例及び改変例を作ることができる。したがって、本明細書中に示され説明されているものに加え、本発明の種々の改変例が上記の説明から当業者には明らかであろう。そのような改変例も特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０２２５】
実施例１
ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫グロブリン（Ｉｇ）生成の高発現システムを構築した。具体的には、完全に組み立てられたＩｇ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を改善するために、２つの重鎖ポリペプチドおよび２つの軽鎖ポリペプチドを含むＩｇ重鎖および軽鎖配列を修飾した。ｇｐ１２０ＩｇＧ−重鎖分子および軽鎖分子の構築物を作成し、ｐＶＡＸ１ベクター（ライフテクノロジーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）に別々に挿入した。この抗体は、後述の特徴付け研究に用いることが可能な規定の特性を持つ。Ｉｇ発現を最適化する構築物を作成する際にいくつかの修飾を含んだ。最適化には、コドン最適化およびｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）の導入を含んでいた。Ｉｇの重鎖および軽鎖について最適化された構築物の核酸配列は、配列番号６および配列番号７にそれぞれ記載されている（それぞれ図１および図２）。図１および図２において、下線および二重下線は、構築物をｐＶＡＸ１ベクターにクローニングするのに用いたＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限酵素部位を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡＴＡＡ）コドンを示す。配列番号６は、配列番号４６に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＩｇＧ重鎖のアミノ酸配列（図４２）をコードする。配列番号７は、配列番号４７に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＩｇＧ軽鎖のアミノ酸配列（図４３）をコードする。
【０２２６】
天然Ｉｇ構築物（すなわち、非最適化）または配列番号６および７を含む構築物（すなわち、最適化）のいずれかで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、トランスフェクト細胞からＩｇＧ分泌を測定した。ＩｇＧ合成の動態を図３に示す。図３に示すように、非最適化構築物および最適化構築物の両方ともＩｇの重鎖および軽鎖を発現して、ＩｇＧを形成したが、最適化構築物の方がＩｇＧ抗体の蓄積をより早くもたらした。配列番号６および７（すなわち、最適化Ｉｇ配列）を含むプラスミドでトランスフェクトした細胞は、非最適化Ｉｇ配列を含むプラスミドでトランスフェクトした細胞よりも、完全に組み立てられたＩｇ分子のより多い産生を示した。従って、構築物の最適化または修飾によりＩｇ発現は実質的に増した。換言すれば、配列番号６および７を含む構築物は、配列番号６および７の作成に用いた最適化または修飾により、天然構築物と比較して顕著により高いＩｇ発現をもたらした。Ｉｇの重鎖および軽鎖がプラスミドシステムからｉｎ  ｖｉｖｏで効率よく組み立てられることもこれらのデータにより実証された。
【０２２７】
配列番号６および７を含む構築物をさらに調べるため、配列番号６および７に記載の配列を含むプラスミドをマウスに投与した。特に、電気穿孔を用いてプラスミドを投与した。投与後、免疫化マウスで免疫応答（すなわち、ＩｇＧレベル）の誘導をウエスタンブロット法（すなわち、マウスの血清を用いてｇｐ１２０抗原を検出した）により評価した。図４に示すように、配列番号６および７を含むプラスミドを投与されたマウスは、抗体の結合がウエスタンブロット分析で観察されたため、強い抗体産生を示した。この抗体産生を観察するために要した投与はたった１回であった。
【０２２８】
要するに、Ｉｇ重鎖および軽鎖をコードする核酸配列が、ｐＶＡＸ１などの発現ベクターに含まれる場合、トランスフェクト細胞および発現ベクターを投与されたマウスで、組み立てられたＩｇＧ（すなわち、重鎖および軽鎖がまとまって、抗原に結合する抗体を形成する）の発現をもたらすことがこれらのデータにより示された。さらに、Ｉｇ重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を最適化または修飾することでＩｇ産生が著しく増大したこともこれらのデータにより示された。
【０２２９】
実施例２
実施例３〜７の材料および方法
細胞および試薬。２９３Ｔ細胞およびＴＺＭ−Ｂｌ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および抗生物質を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ：インビトロジェン社製、カリフォルニア州）中で維持し、コンフルエンス時に継代させた。組み換えＨＩＶ−１  ｐ２４およびｇｐ１２０  Ｅｎｖ（ｒｇｐ１２０）タンパク質をプロテインサイエンス社（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）から取得し、ペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジンをジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から取得した。記載されている細胞株および他の試薬は、ＡＩＤＳ研究および参照用試薬プログラム（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨから入手した。
【０２３０】
動物、タンパク質、ならびにプラスミドの投与および送達。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢）を、タコニックファームズ（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から購入した。これらの投与には、体積５０μｌ（ｐＶａｘ１またはｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂ）中のプラスミドＤＮＡ２５μｇを筋肉内注射（ＩＭ）した後、ＭＩＤ−ＥＰシステム（ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）；イノビオ・ファーマシューティカルズ、ペンシルベニア州ブルーベル）によってＥＰ介在の送達を増強した。送達用パルスパラメータは、０．５アンペア定電流の３パルスで、１秒おきで５２ミリ秒の長さであった。各動物は、実験用プラスミド製剤または対照プラスミド製剤のいずれかの単回投与を受けた。ＪＲＦＬ株（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ社から購入、ニューヨーク州）由来のＨＩＶ−１組み換えｇｐ１２０（ｒｇｐ１２０）をタンパク質免疫分析に用いた。タンパク質免疫研究では、ｒｇｐ１２０の単回用量２５μｇをＴｉｔｅｒＭａｘアジュバントと混合し、皮下注射した。ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂまたはｒｇｐ１２０を投与されたマウスの血清を特定の分析に応じて異なる時点で回収した。
【０２３１】
ＨＩＶ−１Ｅｎｖ−ＦａｂプラスミドＤＮＡの構築。抗Ｅｎｖ  ＶＲＣ０１ヒトｍＡｂからのＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−Ｆａｂ配列（ＶＨおよびＶＬ）を、いくつかの修飾を持つ合成オリゴヌクレオチドを用いて生成した。重鎖（ＶＨ−ＣＨ１）は、配列番号３に記載の核酸配列によってコードされ、軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、配列番号４に記載の核酸配列によってコードされる（それぞれ図９および図１０）。図９および図１０において、下線および二重下線は、コード化核酸配列をｐＶＡＸ１にクローニングするのに用いたＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限酵素部位を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡまたはＴＡＡ）コドンを示す。配列番号３は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＦａｂのＶＨ−ＣＨ１のアミノ酸配列（図４４）をコードする。配列番号４は、配列番号４９に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＦａｂのＶＬ−ＣＬのアミノ酸配列（図４５）をコードする。
【０２３２】
発現を向上させるために、効率的なＩｇＥリーダー配列（配列番号６６タンパク質をコードする配列番号６５ヌクレオチド）をＥｎｖ抗原遺伝子配列に組み込んだ。得られた修飾および強化されたＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂ  ＤＮＡ免疫原は、コドンおよびＲＮＡ最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカッタウェイ）によってｐＶａｘ１発現ベクターにクローニングした後、これらの構築物を大規模に産生した。ＶＨおよびＶＬ遺伝子（それぞれ配列番号３および４）をＢａｍＨ１およびＸｈｏ１制限部位の間に挿入した。精製プラスミドＤＮＡに水を配合した後、マウスに投与した。陰性対照プラスミドとして、「無関係な」対照Ｉｇを生成するｐＩｇＧ−Ｅ１Ｍ２を用いた。
【０２３３】
ＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂ発現および免疫ブロット分析。製造者によって推奨された方法によって、非リポソームＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（プロメガ、ウィスコンシン州）を用いた発現分析に２９３Ｔ細胞株を利用した。簡単に言えば、細胞を５０〜７０％のコンフルエンス（３５ｍｍ培養皿のウエル２ｍＬあたり１〜３ｘ１０5細胞）で２４時間播種した後、５μｇのｐＶａｘ１対照またはｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂでトランスフェクションした。７０時間までの様々な時点で上清を回収し、標準的なＥＬＩＳＡ法によって特異的Ｆａｂ分子のレベルを評価した。ｐＶａｘ１トランスフェクト細胞からの上清を陰性対照として用いた。さらに、２９３Ｔ細胞をＨＩＶ  ｇｐ１６０  Ｅｎｖタンパク質遺伝子でトランスフェクトした。
【０２３４】
さらに、生成されたＦａｂによる天然ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質の認識確認を免疫ブロット分析でを行った。この研究では、上述のｒｇｐ１２０を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動を行った。ニトロセルロース膜（マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア）上でゲルをブロットし、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％）中で５％ｗ／ｖの脱脂粉乳でブロックした。その後、ニトロセルロースを別々のストリップに切断して、分析した。ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂ投与されたマウスの血清を、投与から４８時間後に回収し、ＰＢＳ中で１：１００に希釈し、個々のニトロセルロースストリップと１時間反応させた。その後、ストリップをトリス緩衝生理食塩水−０．２％ツイーンで４時間洗浄し、マウスＩｇＧ（ジャクソン研究所、メイン州）に対するペルオキシダーゼ結合抗血清と反応させ、ジアミノベンジジン基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）とともに培養し、生成されたＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂのｇｐ１２０への適正な結合を視覚化させた。
【０２３５】
Ｉｇ結合分析-ＥＬＩＳＡ。Ｆａｂまたは抗ｒｇｐ１２０抗体を生成したＤＮＡプラスミドのｒｇｐ１２０への結合をＥＬＩＳＡで評価した。ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂ、ｐＶａｘ１、またはｒｇｐ１２０タンパク質のいずれかを投与された個体動物の血清でＩｇ結合アッセイを行った。ここでも、基本的なＩｇ免疫測定分析において、ＤＮＡプラスミド単回投与から４８時間後に血清サンプルを回収した。簡単に言えば、９６ウェル高結合ポリスチレンプレート（ニューヨーク州コーニング）をクレードＢ  ＨＩＶ  ＭＮ  ｒｇｐ１２０（２μｇ／ｍＬ）で一晩４℃でコーティングし、ＰＢＳで希釈した。翌日、プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０）で洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ中の３％ＢＳＡで１時間ブロックし、免疫化マウスおよびナイーブマウスの血清の１：１００希釈物とともに１時間３７℃で培養した。１：５，０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（リサーチ・ダイアグノスティックス社、ニュージャージー州）を用いて結合ＩｇＧを検出した。色原体基質溶液ＴＭＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加して結合酵素を検出し、Ｂｉｏｔｅｋ製ＥＬ３１２ｅ  Ｂｉｏ−Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｒｅａｄｅｒ上で４５０ｎｍで読んだ。全ての血清サンプルを２度重複して試験した。追加の免疫測定分析を行い、市販のＩｇＧ１定量ＥＬＩＳＡキットを用いてｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂ投与されたマウスの血清中のＦａｂ濃度を定量化した。この分析は、製造者仕様に従って行った。
【０２３６】
フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）では、コンセンサスクレードＡ  Ｅｎｖプラスミド（ｐＣｏｎ−Ｅｎｖ−Ａ）、または、一次ウイルス単離体（Ｑ２３Ｅｎｖ１７）からＥｎｖを発現する最適化クレードＡプラスミド（ｐＯｐｔ−Ｅｎｖ−Ａ）のいずれかで２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。標準的な方法によってトランスフェクションを行った。トランスフェクションを確認後、細胞を氷冷した緩衝液Ａ（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０１％ＮａＮ３）で洗浄し、一次Ｉｇ（精製ＶＲＣ０１、または、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂまたは対照ｐＩｇＧ−Ｅ１Ｍ２プラスミドのいずれかを投与されたマウスの血清のいずれか、プラスミド投与から４８時間後に回収）の１：１００希釈物とともに２０分間４℃で培養した。次いで、これを洗浄し、フィコエリトリン（ＰＥ）に共役した蛍光標識二次Ｉｇの１：１００希釈物の５０μｌとともにさらに２０分間培養した。その後、細胞を洗浄し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ：ベクトン・ディッキンソン社製）で直ちに分析した。培養および洗浄は全て氷冷した緩衝液Ａで４℃で行った。細胞をシングレットおよび生細胞にゲートした。ＧＦＰを評価するため、ＧＦＰ陽性細胞の発現をＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたＦＡＣＳ−ＬＳＲ計器で行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアでデータを分析した。
【０２３７】
シングルサイクルＨＩＶ−１中和アッセイ。Ｆａｂ介在ＨＩＶ−１中和分析をＴＺＭ−ＢＩ（ＨｅＬａ細胞由来）ベースアッセイで測定し、ここで、ルシフェラーゼ遺伝子発現の減少を中和の終点として用い、次いで実験用血清または対照血清の存在下または非存在下でＥｎｖ偽型ウイルスに１ラウンド感染させた。ＴＺＭ−Ｂｌ細胞を操作して、ＣＤ４およびＣＣＲ５を発現させ、蛍ルシフェラーゼのレポーター遺伝子を含有させた。このアッセイでは、ｐＶａｘ１のみまたはｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ  Ｆａｂ投与されたマウスの血清をウエルで１：５０に希釈後、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で、偽型ＨＩＶ−１  Ｂａｌ２６、Ｑ２３Ｅｎｖ１７、ＳＦ１６２Ｓ、またはＺＭ５３Ｍ無細胞ウイルスを添加した。Ｂａｌ２６およびＳＦ１６２Ｓは両方ともクレードＢ  Ｔｉｅｒ１ウイルスであり、Ｔｉｅｒ１ステータスは、ウイルスの中和感度が高かったもしくは平均以上であったことを示す。Ｑ２３Ｅｎｖ１７およびＺＭ５３Ｍは、それぞれ、クレードＡのＴｉｅｒ１ウイルスおよびクレードＣのＴｉｅｒ２ウイルスである。Ｔｉｅｒ２ステータスは、ウイルスの中和感度が平均的もしくは中程度であったことを示す。次いで、このアッセイでは、１０4ＴＺＭ−ＢＬ細胞を各ウエルに添加し、４８時間培養し、溶解させ、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ基質（ルシフェラーゼアッセイシステム、プロメガ、ウィスコンシン州）を１００μｌ添加した後、ルミノメータを用いてルシフェラーゼを定量化した。このアッセイはＲＬＵ（相対発光量）で読み取った。ＲＬＵ減少率は、（１−（実験用サンプルの平均ＲＬＵ−対照）／対照からの平均ＲＬＵ−非添加対照ウエル））ｘ１００として算出した。ＨＩＶ−１中和はＲＬＵの減少率（％）で表わし、これは、感染阻害率を示すものであった。
【０２３８】
実施例３
抗ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−Ｆａｂ発現構築物の生成
ヒトｍＡｂ  ＶＲＣ０１を広く中和する抗ＨＩＶ−１エンベロープのＶＨおよびＶＬ−Ｉｇ（免疫グロブリン）鎖コード配列の両方のｃＤＮＡを、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ経由でＶＲＣ（ワクチンリサーチセンター、ＮＩＨ）から入手し、ｐＶａｘ１ベクターにクローニングした。上記の実施例２に示すように、生物活性のあるＩｇ分子の産生を最大化および最適化するために、いくつかの修飾を発現ベクターに組み込んだ。すなわち、これらの修飾により、コドンおよびＲＮＡの最適化および安定化がもたらされ、リーダー配列の活用が増強され、プラスミドが高濃度で産生され、ＥＰ経由でｉｎ  ｖｉｖｏプラスミド送達が促進された。生成された構築物をヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の前初期プロモーターの制御下に置いた。これは、哺乳類細胞および組織中で適切かつ効率のよい発現に重要である。この研究に用いた構築物の模式的なマップを図５Ａおよび図５Ｂに示す。
【０２３９】
さらに、抗ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ＦａｂをｐＨＩＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂから調製し、これを用いて、ＨＩＶ  Ｅｎｖをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞を染色した。ｐＶＡＸ１を対照として用いた。図１１に示すように、抗ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂが、ＨＩＶ  Ｅｎｖをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞を染色したため、ベクターｐＨＩＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂにより抗ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂを調製できることが免疫蛍光染色により実証された。従って、抗ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂは、ＨＩＶ  Ｅｎｖ糖タンパク質への結合に特異的であった。
【０２４０】
実施例４
トランスフェクト細胞によるＩｇ産生
ｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂの発現を評価するため、構築物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。コンセンサスＨＩＶ−１クレードＢ  ｇｐ１２０タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ免疫測定により、トランスフェクション後早ければ２４時間でトランスフェクト２９３Ｔ細胞由来の上清中に抗ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−Ｆａｂの存在が確認された（図５Ｃ）。トランスフェクション後２４〜７２時間で高ＯＤ４５０ｎｍ値（すなわち、約０．５〜０．８の範囲）が細胞抽出物中で検出され、４８時間でピークおよび平坦域に到達した。ＨＩＶ  Ｅｎｖ糖タンパク質に対する抗ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂの特異性が、これらの結果により確認された。図５Ｃに示したデータの統計解析は以下の通りであった：ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−Ｆａｂ投与されたマウスの血清のＯＤ４５０ｎｍ値は、２２〜７２時間の時点における測定において、ｐＶａｘ１対照と比較して有意（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）であった。
【０２４１】
実施例５
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂのｉｎ  ｖｉｖｏ特性
ＤＮＡプラスミドからのｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｆａｂ産生を実証するため、マウスにｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂを筋肉内経路で投与し、次いでＥＰを介して送達を増強させた。ＤＮＡプラスミドを単回注入で送達し、投与してから１２時間、１日、２日、３日、４日、７日、および１０日後に血清を回収した。その後、図６Ａに示すように、ＥＬＩＳＡ分析により血清（１：１００の希釈）のＩｇ／Ｆａｂレベルを評価した。図６Ａのデータ（ｐＶａｘ１およびＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−Ｆａｂ両方の群からの個体マウスから）は、ＯＤ４５０ｎｍとして示され、Ｉｇ／Ｆａｂレベルに比例していた。ｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂの単回投与後のＦａｂの相対レベルは、１日目に検出可能となり、その後、経時的に増大したことが、これらのデータにより実証された。比較の目的で、実施例２に記載されているようにｒｇｐ１２０の単回投与／免疫化をＢａｌｂ／Ｃマウスに施した後、血清を回収し、特定の抗ｇｐ１２０抗体レベルの程度および寿命を判断するために、ＥＬＩＳＡで経時的な分析（１：１００希釈物）を行った。その結果を図６Ｂに示す。
【０２４２】
このタンパク質送達研究では、バックグラウンド上で抗原特異的なＩｇレベルは、免疫化した後１０日目になってやっと検出可能となった。これは、ＯＤ４５０ｎｍ値が、投与後１日目で少なくとも０．１ＯＤ４５０ｎｍユニットに達し、１０日目で０．２８〜０．３５ＯＤユニット間のレベルで平坦域となったｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂ投与（図６Ａ）により引き起こされたＦａｂレベルと対照的であった。従って、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂの送達により、従来のタンパク質免疫よりも特定のＦａｂのより急速な生成がもたらされた。この発見は、生物活性のあるＩｇの生成によるＤＮＡプラスミドの送達方法の潜在的な臨床的有用性を強調するものであった。
【０２４３】
ＤＮＡ送達技術によって産生された組み換えＦａｂの質と量を確保するためにさらなる分析を行った。すなわち、電気泳動された後ブロットされた組み換えＨＩＶ−１  ｇｐ１２０タンパク質を用いて免疫ブロット分析を行い、投与してから４８時間後にｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂマウスの血清でプローブした（図６Ｃ）。このブロットにより、ｇｐ１２０タンパク質の分子量に適したバンドであることが示され、機能的でありかつｇｐ１２０に結合可能であることが確認された。同様に、ヒトＦａｂ定量をＥＬＩＳＡによって行い、プラスミド投与後の時間（すなわち、日数）の関数として示した（図６Ｄ）。結果は、生成されたＦａｂレベルが２〜３μｇ／ｍｌでピークに達したことを示す。生成されたＶＲＣ０１ベースのＦａｂのＶＨ鎖およびＶＬ鎖のポリペプチドアセンブリが、正確であり、なおかつ、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質を認識し、それに特異的に結合する能力を有することが、これらの結果により実証された。
【０２４４】
図６に示したデータの統計解析は以下の通りである。図６Ａにまとめたデータでは、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−Ｆａｂ投与されたマウスの血清のＯＤ４５０ｎｍ値は、１日目〜１０日目の時点の測定において、ｐＶａｘ１投与されたマウスの血清と比較して統計的（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）に増大した。図６Ｂにまとめたデータでは、ｒｐｇ１２０群からのＯＤ４５０ｎｍ値は、１０日目〜１４日目の時点の測定において、ＰＢＳ対照と比較して有意（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）に増大した。図６Ｄにまとめたデータでは、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−Ｆａｂ投与されたマウスからのＯＤ４５０ｎｍ値は、２日目〜１０日目の時点の測定において有意（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）に増大した。
【０２４５】
実施例６
異なるＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質を発現する細胞へのＦａｂ／Ｉｇｓの結合：ＦＡＣＳベース分析
ｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂ投与されたマウスの血清を用いて、生成されたＦａｂの、２９３Ｔ細胞によって一時的に発現された異なるＨＩＶ−  Ｅｎｖタンパク質への結合について試験した。天然型のＶＲＣ０１−ｍＡｂを陽性対照として用いて、細胞の表面上にＥｎｖタンパク質を適切に発現させ、確実に検出した。先に示した通り、「無関係な／無関連な」Ｉｇ（Ｉｇ−Ｅ１Ｍ２）を陰性対照として用いた。図７Ａおよび図７Ｂに示した通り、基本的に、異なるＩｇｓ／ＦａｂｓでｐＶａｘ１（すなわち、Ｅｎｖインサートを欠いた）トランスフェクト細胞に背景染色しただけであった。しかしながら、精製ＶＲＣ０１  ｍＡｂと、ｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂ投与されたマウスの血清との両方において、コンセンサスクレードＡ  Ｅｎｖプラスミド（ｐＣｏｎ−Ｅｎｖ−Ａ）、または、一次ＨＩＶ−１単離体であるｐＱ２３Ｅｎｖ１７からＥｎｖを発現する最適化クレードＣプラスミド（ｐＯｐｔ−Ｅｎｖ−Ａ）のいずれかを発現するトランスフェクト細胞で著しい正の染色があった。さらに、ｐＩｇ−Ｅ１Ｍ２投与されたマウスの血清では、ＨＩＶ１  Ｅｎｖトランスフェクト細胞のいずれにおいてもバックグラウンドレベルを上回る染色が示されなかった。これらの結果を示すＦＡＣＳ分析を図７Ａに示す。この実験のＦＡＣＳ分析（すなわち、図７Ａ）からのデータを示す代表的なグラフを図７Ｂに示した。
【０２４６】
図７Ｂに示したデータの統計解析は以下の通りである。天然ＶＲＣ０１抗体と、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−Ｆａｂ投与されたマウスの血清間で、ｐＣｏｎ−Ｅｎｖ−Ａによって生成されたエンベロープ糖タンパク質への特異結合における有意差（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）はなかった。しかしながら、ｐＯｐｔ−Ｅｎｖ−Ａによって生成されたエンベロープ糖タンパク質へのＶＲＣ０１抗体の結合は、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−Ｆａｂ投与されたマウスの血清による結合よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。
【０２４７】
実施例７
ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂによって産生されたＩｇのＨＩＶ中和活性
ｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂ投与されたマウスの血清を用いて、ＨＩＶ−Ｅｎｖ  Ｆａｂの、トランスフェクト２９３Ｔ細胞によって一時的に発現されるＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質への結合について試験した。ｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂの投与６日後のマウスの血清を入手した。具体的に、クレードＡ、Ｂ、またはＣ株由来のＨＩＶ−１  Ｅｎｖを発現するプラスミドで細胞をトランスフェクトした。クレードＡ、Ｂ、およびＣ株は、９２ＲＷ０２０、ＳＦ１６２、およびＺＭ１９７であった。図１２に示すように、ｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂ投与されたマウスの血清が、クレードＡ、Ｂ、およびＣ  ＨＩＶ−１株由来のＨＩＶ−１  Ｅｎｖに結合したことで、ＨＩＶ−１の多数のサブタイプ由来のＨＩＶ−１  Ｅｎｖと交差反応した抗体（すなわち、ＨＩＶ−Ｅｎｖ  Ｆａｂ）を血清が含んでいたことが示された。
【０２４８】
この研究で製造されたＨＩＶ−Ｅｎｖ  Ｆａｂの潜在的なＨＩＶ−１中和活性を評価するために、ＴＺＭ−Ｂｌ標的細胞を用いて蛍光ベース中和アッセイを行った。ＴＺＭ−Ｂｌ標的細胞を、実施例２に記載されているように、実験用血清または対照血清の存在下または非存在下で４つの異なる偽型ＨＩＶウイルス単離体に感染させた。
【０２４９】
図８は、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂ投与されたマウスの血清のＨＩＶ偽型ウイルスに対する中和曲線を示す。具体的には、ＨＩＶ−１  Ｔｉｅｒ１ウイルスであるＢａｌ２６およびＳＦ１６２Ｓ（両方ともクレードＢ）ならびにＱ２３Ｅｎｖ（クレードＡ）について試験した。さらに、ＨＩＶ−１クレードＣ  Ｔｉｅｒ２ウイルスであるＺＭ５３Ｍに対しても血清を試験した。ＨＩＶ感染の中和率／阻害率としてデータを示した。グラフの水平斜線は、アッセイにおいて５０％の中和／阻害レベルを示した。この研究では、中和の陽性対照ｍＡｂ（データ不図示）を利用して、この分析法の有用性および信頼性について確認した。簡単に言えば、ｍＡｂを中和する陽性対照は、４つ全てのウイルス偽型の感染を少なくとも５０％阻害することができた。
【０２５０】
プラスミド投与してから経時的にＨＩＶ中和活性が増大し、Ｂａｌ２５、Ｑ２３Ｅｎｖ１７、およびＳＦ１６２Ｓに対する中和率が２日目で５０％に達したことが、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂ投与されたマウスの血清により実証された。これら３つのウイルスに対する平坦域での中和率は、それぞれ、約６２、６０、および７０％であった。ＺＭ５３Ｍに対しては、３日目まで５０％の中和閾値には到達せず、平坦域での中和率も５０％を超えなかった。試験した他の３つと比べたこのロバスト性の低い中和プロファイルは、ＺＭ５３Ｍが中和可能性の低いＴｉｅｒ２ウイルスであったことを反映しているようであった。要するに、この研究で生成されたＦａｂは、広範なＨＩＶ単離体を効果的に中和することができた。図８に示したデータの統計解析は以下の通りである。クラスカル・ワリスノンパラメトリック解析に基づいて、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−Ｆａｂ投与されたマウスの血清によって誘発されたＺＭ５３ＭクレードＣウイルス（図８Ｄ）のＨＩＶ中和レベルのみ、試験した他のウイルス（図８Ａ、図８Ｂ、および図８Ｃ）と著しく異なっていた。この差は、５０％中和の達成に要する時間（日数）のみならず、達した最大の中和レベルでもあった。
【０２５１】
実施例３〜７をまとめると、ｐＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  Ｆａｂ投与されたマウス中のＶＲＣ０１  Ｆａｂの血清濃度は、注入してから１２日後に２〜３μｇ／ｍＬでピークに達した。この範囲は、ＦＤＡによって現在認可されている多くのモノクローナル抗体に匹敵するものであり、我々の抗体アプローチによって、有意かつ生物学的に関連したレベルの抗体が小動物モデル中で産生されたことが示された。特に、尋常性乾癬および関節炎などの自己免疫疾患に対して使用される、ウステキヌマブ（商品名：Ｓｔｅｌａｒａ）およびゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ）の２つの抗体は、それぞれ、０．３１±０．３３μｇ／ｍＬおよび１．８±１．１μｇ／ｍＬの平均値±標準偏差の血清濃度を有する。さらに、ＴＮＦインヒビターであるアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）は、およそ６μｇ／ｍＬの平均血清濃度を有する。これに関し、抗体をコードするＤＮＡを生物に送達することで、有意かつ生物学的に関連したレベルの抗体が生物中に存在するように、ｉｎ  ｖｉｖｏ組み立てがもたらされたことが、実施例４〜８に記載のデータにより実証された。
【０２５２】
従来のタンパク質投与によって産生されたＩｇｓ（図６Ａおよび図６Ｂ）と比べて、ｐＨＩＶ−１Ｅｎｖ  ＦａｂのＥＰ増強単回投与後、Ｆａｂｓをｉｎ  ｖｉｖｏでさらに速やかに産生する能力がこれらのデータにより実証された。さらに、難しいワクチン標的に対しても機能性防御Ｉｇ様分子を生成する能力が示された。今日まで、積極的なワクチン接種後にＨＩＶ−１中和抗体を誘導することは非常に困難であり、一次感染中、伝染してから何年も後になるまで中和抗体は作り出されない。このＤＮＡプラスミドアプローチでは、送達後１〜２日内で中和力価が観察され、ピークの中和Ｆａｂ血清濃度（３．３１±０．１３μｇ／ｍＬ）は、投与後１週間で起こった（図６Ｄ）。このレベルのＩｇは、近年の研究において感染から完全に防御することが実証されている８．３μｇ／ｍＬ濃度と比較的同様であった。生物活性のあるＩｇ断片が急速に誘導されることがこれらのデータにより実証された。
【０２５３】
中和抗体力価およびＨＩＶ−１一次単離体に対する反応がＨＩＶ−１Ｅｎｖ−Ｆａｂ  ＤＮＡ投与によって引き起こされたこともこれらのデータにより示された。クレードＡ、Ｂ、およびＣの例を表わす、異なるウイルスＴｉｅｒ１およびＴｉｅｒ２ウイルス単離体のパネルに対して血清を試験した。これらのウイルスに対する潜在的な中和活性を生成する結果が示された（図８）。
【０２５４】
従って、このＤＮＡプラスミドベースの方法により、特異的かつ生物活性のあるＦａｂまたはＩｇ分子をｉｎ  ｖｉｖｏ生成し、抗体生成において従来の抗原ベースのワクチン接種を用いる必要性を避けて、Ｉｇｓをｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成し精製する必要性を除去した。
【０２５５】
実施例８
ヒトＩｇ抗体をコードするプラスミドの構築
上述したように、Ｆａｂは、ＶＲＣ０１抗体、すなわち、ＨＩＶ−Ｅｎｖ  Ｆａｂから生成され、これは、コード化核酸を対象に投与した際にｉｎ  ｖｉｖｏ生成された。これらの研究をさらに拡張するため、ＶＲＣ０１抗体由来のＩｇＧ１抗体をコードする核酸配列を作成した。図１３の模式図に示すように、ＩｇＧ重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を、フリン切断部位とＰ２Ａペプチド配列をコードする核酸配列とで分離した。Ｐ２Ａペプチド配列は、プロテアーゼによって切断効率が増すため、別々のポリペプチドが切断後にもたらされた。
【０２５６】
ＩｇＧ重鎖は、可変重（ＶＨ）領域、定常重１（ＣＨ１）領域、ヒンジ領域、定常重２（ＣＨ２）領域、および定常重３（ＣＨ３）領域を含んでいた。ＩｇＧ軽鎖は、可変軽（ＶＬ）領域および定常軽（ＣＬ）領域を含んでいた。この構築物をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、発現ベクターｐＶＡＸ１の制御下に置いた。この構築物により、ｇｐ１２０（すなわち、ＶＲＣ０１抗体によって認識された抗原）に反応性があった完全に組み立てられたＩｇＧ抗体（図１４示すように）の産生がもたらされた。本明細書では、この完全に組み立てられたＩｇＧのことを「ＶＲＣ０１  ＩｇＧ」と呼ぶ。ＶＲＣ０１  ＩｇＧ（フリンによる切断前の）のアミノ酸配列は、配列番号５（図１５を参照）に記載されており、これは、配列番号６４（図６２を参照）をコードする核酸配列によってコードされる。
【０２５７】
特に、ＶＲＣ０１  ＩｇＧ（フリンによる切断前；配列番号５および図１５、これは、配列番号６４のヌクレオチド配列によってコードされる）のアミノ酸配列は、以下の構造を有する：免疫グロブリンＥ１（ＩｇＥ１）シグナルペプチド、可変重領域（ＶＨ）、定常重領域１（ＣＨ１）、ヒンジ領域、定常重領域２（ＣＨ２）、定常重領域３（ＣＨ３）、フリン切断部位、ＧＳＧリンカー、Ｐ２Ａペプチド、ＩｇＥ１シグナルペプチド、可変軽領域（ＶＬ）、および定常軽領域（ＣＬ、特にカッパ）である。構造（その全ては、上述の順序かつ図１３に示すように配列番号１５内に含まれる）の各部分の配列を以下に示す。
【０２５８】
ＶＲＣ−１  ＩｇＧのＩｇＥ１シグナルペプチド−ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号８）。
【０２５９】
ＶＲＣ０１  ＩｇＧの可変重領域−ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＱＭＫＫＰＧＥＳＭＲＩＳＣＲＡＳＧＹＥＦＩＤＣＴＬＮＷＩＲＬＡＰＧＫＲＰＥＷＭＧＷＬＫＰＲＧＧＡＶＮＹＡＲＰＬＱＧＲＶＴＭＴＲＤＶＹＳＤＴＡＦＬＥＬＲＳＬＴＶＤＤＴＡＶＹＦＣＴＲＧＫＮＣＤＹＮＷＤＦＥＨＷＧＲＧＴＰＶＩＶＳＳＰＳＴＫＧ（配列番号９）。
【０２６０】
ＶＲＣ０１  ＩｇＧの定常重領域１（ＣＨ１）−ＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＡＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。
【０２６１】
ＶＲＣ０１  ＩｇＧのヒンジ領域−ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１１）。
【０２６２】
ＶＲＣ０１  ＩｇＧの定常重領域２（ＣＨ２）−ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号１２）。
【０２６３】
ＶＲＣ０１  ＩｇＧの定常重領域３（ＣＨ３）−ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１３）。
【０２６４】
ＶＲＣ０１  ＩｇＧのフリン切断部位−ＲＧＲＫＲＲＳ（配列番号１４）。
【０２６５】
ＶＲＣ０１  ＩｇＧのＧＳＧリンカーおよびＰ２Ａペプチド−ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１５）。
【０２６６】
ＶＲＣ０１  ＩｇＧのＩｇＥ１シグナルペプチド−ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号８）。
【０２６７】
ＶＲＣ０１  ＩｇＧの可変軽領域（ＶＬ）−ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＴＡＩＩＳＣＲＴＳＱＹＧＳＬＡＷＹＱＱＲＰＧＱＡＰＲＬＶＩＹＳＧＳＴＲＡＡＧＩＰＤＲＦＳＧＳＲＷＧＰＤＹＮＬＴＩＳＮＬＥＳＧＤＦＧＶＹＹＣＱＱＹＥＦＦＧＱＧＴＫＶＱＶＤＩＫＲ（配列番号１６）。
【０２６８】
ＶＲＣ０１  ＩｇＧの定常軽領域（ＣＬ、カッパ）−ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＲＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１７）。
【０２６９】
実施例９
２つのプラスミドによってコードされたＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１  ＩｇＧ
上記の実施例２〜８に記載したように、Ｆａｂ（各鎖は別々のプラスミドから発現）は、ＶＲＣ０１抗体、すなわち、ＨＩＶ−Ｅｎｖ  Ｆａｂから生成され、ＩｇＧ（単一プラスミドから発現）は、ＶＲＣ０１抗体、すなわち、ＶＲＣ０１  ＩｇＧから生成された。これらの研究をさらに拡張するため、ＩｇＧは、ＶＲＣ０１抗体から生成され、ここで、重鎖（すなわち、可変重領域（ＶＨ）、定常重領域１（ＣＨ１）、ヒンジ領域、定常重領域２（ＣＨ２）、および定常重領域３（ＣＨ３））および軽鎖（すなわち、可変軽領域（ＶＬ）および定常軽領域（ＣＬ））は、別々の構築物によってコードされた（図５０および図５１）。本明細書では、このＩｇＧのことを「ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１  ＩｇＧ」と呼ぶ。
【０２７０】
各構築物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでいったん生成された抗体の分泌を最適化するリーダー配列も含んでいた。各構築物をｐＶＡＸ１ベクターのＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位でクローニングすることで、構築物をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下に置いた（図５０および図５１）。従って、ＶＲＣ０１  ＩｇＧをｉｎ  ｖｉｖｏ形成または生成するため、プラスミドの混合物、すなわち、重鎖をコードする構築物を含むプラスミドと軽鎖をコードする構築物を含むプラスミドとを対象に投与しなければならない。
【０２７１】
また、各構築物をさらに最適化した。最適化には、ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）の添加およびコドン最適化を含んでいた。ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１  ＩｇＧのＩｇＧ１重鎖をコードする核酸配列は、配列番号５４および図５２に記載されている。図５２において、下線および二重下線は、核酸配列をｐＶＡＸ１ベクターにクローニングするのに用いたＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限酵素部位を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡＴＡＡ）コドンを示す。配列番号５４は、配列番号５５および図５３に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１  ＩｇＧのＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列をコードする。
【０２７２】
ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１  ＩｇＧのＩｇＧ軽鎖をコードする核酸配列は、配列番号５６および図５４に記載されている。図５４において、下線および二重下線は、核酸配列をｐＶＡＸ１ベクターにクローニングするのに用いたＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限酵素部位を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡＴＡＡ）コドンを示す。配列番号５６は、配列番号５７および図５５に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１  ＩｇＧのＩｇＧ軽鎖のアミノ酸配列をコードする。
【０２７３】
実施例１０
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇ
ＶＲＣ０１  ＩｇＧに加えて、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖに反応性のあるＩｇＧをコードする別の構築物を作成した。この構築物はＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９であり、これを最適化し、発現ベクター内でクローニングした（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。最適化には、ｋｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ）、リーダー配列の導入およびコドン最適化を含んでいた。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇをコードする核酸配列を含む発現ベクターが作成されたことが、図１６Ｃに示すような制限酵素消化によって確認された。図１６Ｃにおいて、レーン１は未消化の発現ベクターであり、レーン２はＢａｍＨＩおよびＸｈｏ１で消化された発現ベクターであり、レーンＭはマーカーであった。
【０２７４】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇをコードする核酸配列は、配列番号６３および図６１に記載されている。図６１において、下線および二重下線は、核酸配列をｐＶＡＸ１ベクターにクローニングするのに用いたＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限酵素部位を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡＴＡＡ）コドンを示す。配列番号６３は、配列番号２および図１８に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＨＩＶ−１  ＥＮｖ−ＰＧ９  Ｉｇ（フリンによる切断前）のアミノ酸配列をコードする。
【０２７５】
このアミノ酸配列では、シグナルペプチドが、重鎖および軽鎖の各々にペプチド結合で結合されることで、ｉｎ  ｖｉｖｏ生成された抗体の分泌が向上する。また、Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列が、重鎖および軽鎖をコードする核酸配列間に位置するので、翻訳されたポリペプチドを、重鎖または軽鎖を含む別々のポリペプチドにより効率的に切断することができる。
【０２７６】
特に、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇ（フリンによる切断前；配列番号２および図１８）のアミノ酸配列は、以下の構造を有する：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド、可変重領域（ＶＨ）、定常重領域１（ＣＨ１）、ヒンジ領域、定常重領域２（ＣＨ２）、定常重領域３（ＣＨ３）、フリン切断部位、ＧＳＧリンカー、Ｐ２Ａペプチド、ヒトラムダ軽鎖シグナルペプチド、可変軽領域（ＶＬ）、および定常軽領域（ＣＬ、特にラムダ）である。構造（その全ては、上述の順序で配列番号２内に含まれる）の各部分の配列を以下に示す。
【０２７７】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  ＩｇのヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＴＨＡ（配列番号１８）。
【０２７８】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇの可変重領域−ＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＦＬＲＧＶＱＣＱＲＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＳＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＳＲＱＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＶＡＦＩＫＹＤＧＳＥＫＹＨＡＤＳＶＷＧＲＬＳＩＳＲＤＮＳＫＤＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＴＹＦＣＶＲＥＡＧＧＰＤＹＲＮＧＹＮＹＹＤＦＹＤＧＹＹＮＹＨＹＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１９）。
【０２７９】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇの定常重領域１（ＣＨ１）−ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶ（配列番号２０）。
【０２８０】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇのヒンジ領域−ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２１）。
【０２８１】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇの定常重領域２（ＣＨ２）−ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２２）。
【０２８２】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇの定常重領域３（ＣＨ３）−ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２３）。
【０２８３】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇのフリン切断部位−ＲＧＲＫＲＲＳ（配列番号２４）。
【０２８４】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  ＩｇのＧＳＧリンカーおよびＰ２Ａペプチド−ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）。
【０２８５】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇのヒトラムダ軽鎖シグナルペプチド−ＭＡＷＴＰＬＦＬＦＬＬＴＣＣＰＧＧＳＮＳ（配列番号２６）。
【０２８６】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇの可変軽領域（ＶＬ）−ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＮＧＴＳＮＤＶＧＧＹＥＳＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＶＶＩＹＤＶＳＫＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＧＤＹＹＣＫＳＬＴＳＴＲＲＲＶＦＧＴＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号２７）。
【０２８７】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇの定常軽領域（ＣＬ、ラムダ）−ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（配列番号２８）。
【０２８８】
実施例１１
ＨＩＶ−１  ＰＧ９一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）
上述のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇに加えて、一本鎖Ｆａｂ（すなわち、単一転写産物に転写され、単一ポリペプチドに翻訳される核酸配列によってコードされたＶＨ／ＣＨ１およびＶＬ／ＣＬ）をＰＧ９抗体（本明細書では、「ＨＩＶ−１  ＰＧ９  ｓｃＦａｂ」と呼ぶ）に基づいて作成した。ＨＩＶ−１  ＰＧ９  ｓｃＦａｂをコードする核酸配列は、配列番号５０および図４６に記載されている。図４６において、下線および二重下線は、この核酸配列をｐＶＡＸ１ベクターにクローニングするのに用いたＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡＴＡＡ）コドンを示す。配列番号５０に記載の核酸配列は、ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）、コドン最適化、およびリーダー配列を含む最適化核酸配列であった。リーダー配列は、構築物の５’末端、すなわち、一本鎖Ｆａｂの前に位置していたため、リンカー配列によってコードされたシグナルペプチドは、一本鎖Ｆａｂのアミノ末端にペプチド結合で結合された。配列番号５０に記載の核酸配列は、ＶＨ／ＣＨ１をコードする核酸配列と、ＶＬ／ＣＬをコードする核酸配列との間に位置するリンカー配列も含んでいた。従って、配列番号５０によってコードされるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列は、ＶＨ／ＣＨ１およびＶＬ／ＣＬを一緒にするリンカー配列によってコードされた。配列番号５０は、配列番号５１および図４７に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＨＩＶ−１  ＰＧ９  ｓｃＦａｂのアミノ酸配列をコードする。
【０２８９】
実施例１２
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇ
ＶＲＣ０１  ＩｇＧおよびＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇに加えて、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖに反応性のあるＩｇＧをコードする別の構築物を作成した。この構築物はＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０であり、これを最適化し、発現ベクター内でクローニングした（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。最適化には、ｋｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ）、リーダー配列の導入およびコドン最適化を含んでいた。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇをコードする核酸配列を含む発現ベクターが作成されたことが、図１７Ｃに示すような制限酵素消化によって確認された。図１７Ｃにおいて、レーン１は未消化の発現ベクターであり、レーン２はＢａｍＨＩおよびＸｈｏ１で消化された発現ベクターであり、レーンＭはマーカーであった。
【０２９０】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇをコードする核酸配列は、配列番号６２および図６０に記載されている。図６０において、下線および二重下線は、核酸配列をｐＶＡＸ１ベクターにクローニングするのに用いたＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限酵素部位を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡＴＡＡ）コドンを示す。配列番号６２は、配列番号１および図１９に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＨＩＶ−１  ＥＮｖ−４Ｅ１０  Ｉｇ（フリンによる切断前）のアミノ酸配列をコードする。
【０２９１】
このアミノ酸配列では、シグナルペプチドが、重鎖および軽鎖の各々にペプチド結合で結合されることで、ｉｎ  ｖｉｖｏ生成された抗体の分泌が向上する。また、Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列は、重鎖および軽鎖をコードする核酸配列間に位置するので、翻訳されたポリペプチドを、重鎖または軽鎖を含む別々のポリペプチドにより効率的に切断することができる。
【０２９２】
特に、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇ（フリンによる切断前；配列番号１および図１９）のアミノ酸配列は、以下の構造を有する：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド、可変重領域（ＶＨ）、定常重領域１（ＣＨ１）、ヒンジ領域、定常重領域２（ＣＨ２）、定常重領域３（ＣＨ３）、フリン切断部位、ＧＳＧリンカー、Ｐ２Ａペプチド、ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド、可変軽領域（ＶＬ）、および定常軽領域（ＣＬ、特にカッパ）である。構造（その全ては、上述の順序で配列番号１内に含まれる）の各部分の配列を以下に示す。
【０２９３】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  ＩｇのヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＴＨＡ（配列番号２９）。
【０２９４】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇの可変重領域−ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＲＰＧＳＳＶＴＶＳＣＫＡＳＧＧＳＦＳＴＹＡＬＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＭＧＧＶＩＰＬＬＴＩＴＮＹＡＰＲＦＱＧＲＩＴＩＴＡＤＲＳＴＳＴＡＹＬＥＬＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＴＴＧＷＧＷＬＧＫＰＩＧＡＦＡＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３０）。
【０２９５】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇの定常重領域１（ＣＨ１）−ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶ（配列番号３１）。
【０２９６】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇのヒンジ領域−ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３２）。
【０２９７】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇの定常重領域２（ＣＨ２）−ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号３３）。
【０２９８】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇの定常重領域３（ＣＨ３）−ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３４）。
【０２９９】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇのフリン切断部位−ＲＧＲＫＲＲＳ（配列番号３５）。
【０３００】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  ＩｇのＧＳＧリンカーおよびＰ２Ａペプチド−ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３６）。
【０３０１】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇのヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＭＶＬＱＴＱＶＦＩＳＬＬＬＷＩＳＧＡＹＧ（配列番号３７）。
【０３０２】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇの可変軽領域（ＶＬ）−ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＱＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＧＮＮＫＬＡＷＹＱＱＲＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＰＳＧＶＡＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＱＳＬＳＴＦＧＱＧＴＫＶＥ（配列番号３８）。
【０３０３】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−４Ｅ１０  Ｉｇの定常軽領域（ＣＬ、カッパ）−ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥ（配列番号３９）。
【０３０４】
実施例１３
ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０  ＳｃＦａｂ
上述のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ＰＧ９  Ｉｇに加えて、一本鎖Ｆａｂ（すなわち、単一転写産物に転写され、単一ポリペプチドに翻訳される核酸配列によってコードされたＶＨ／ＣＨ１およびＶＬ／ＣＬ）を４Ｅ１０抗体（本明細書では、「ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０  ｓｃＦａｂ」と呼ぶ）に基づいて作成した。ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０  ｓｃＦａｂをコードする核酸配列は、配列番号５２および図４８に記載されている。図４８において、下線および二重下線は、この核酸配列をｐＶＡＸ１ベクターにクローニングするのに用いたＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡＴＡＡ）コドンを示す。配列番号５２に記載の核酸配列は、ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣ  ＡＣＣ）、コドン最適化、およびリーダー配列を含む最適化核酸配列であった。リーダー配列は、構築物の５’末端、すなわち、一本鎖Ｆａｂの前に位置していたため、リンカー配列によってコードされたシグナルペプチドは、一本鎖Ｆａｂのアミノ末端にペプチド結合で結合された。配列番号５２に記載の核酸配列は、ＶＨ／ＣＨ１をコードする核酸配列と、ＶＬ／ＣＬをコードする核酸配列との間に位置するリンカー配列も含んでいた。従って、配列番号５２によってコードされるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列は、ＶＨ／ＣＨ１およびＶＬ／ＣＬを一緒にするリンカー配列によってコードされた。配列番号５２は、配列番号５３および図４９に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０  ｓｃＦａｂのアミノ酸配列をコードした。
【０３０５】
実施例１４
ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂ
上述したように、ＨＩＶ−１Ｅｎｖ  Ｆａｂの重（ＶＨ−ＣＨ１）鎖および軽（ＶＬ−ＣＬ）鎖をコードする核酸配列を細胞またはマウスに送達する際に、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖに反応性のあるＦａｂをｉｎ  ｖｉｖｏで組み立てたかもしくは生成した。コード化核酸配列を細胞または対象に送達する際に、他の抗原に反応性のあるＦａｂｓ  をｉｎ  ｖｉｖｏ生成することができるか判定するため、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）のエンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）に反応性のある抗体の重（ＶＨ−ＣＨ１）鎖および軽（ＶＬ−ＣＬ、ラムダ型）鎖をコードする構築物を作成した。各構築物は、図２０Ａ、図２０Ｂ、および図２１に示すようにリーダー配列およびｋｏｚａｋ配列を含んでいた。ＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬをコードする構築物を発現ベクター内でクローニングしたことで、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（図２１）の制御下に置いた。ＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬをコードする構築物を含む発現ベクターは、それぞれ、ＣＨＩＫＶ−ＨおよびＣＨＩＶ−Ｌとして知られている。ＣＨＩＫＶ−ＨおよびＣＨＩＫＶ−Ｌベクターの混合物は、ｐＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂとして知られており、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏ（すなわち、細胞または対象内に導入時）生成されたＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂである。換言すれば、以下により詳細に記載のＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂをｉｎ  ｖｉｖｏ生成するには両方のベクターが必要であった。
【０３０６】
構築物を発現のために最適化も行った。具体的に、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂのｉｎ  ｖｉｖｏ生成時にＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの分泌効率を増大させるため、各構築物にはリーダー配列が含まれた。各構築物をコドン最適化し、ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）を含んだ。ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの重鎖（ＶＨ−ＣＨ１）をコードする核酸配列は、配列番号５８および図５６に記載されている。図５６において、下線および二重下線は、核酸配列をｐＶＡＸ１ベクターにクローニングするのに用いたＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限酵素部位を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡＴＡＡ）コドンを示す。配列番号５８は、配列番号５９および図５７に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの重鎖（ＶＨ−ＣＨ１）のアミノ酸配列をコードする。
【０３０７】
ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）をコードする核酸配列は、配列番号６０および図５８に記載されている。図５８において、下線および二重下線は、核酸配列をｐＶＡＸ１ベクターにクローニングするのに用いたＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限酵素部位を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡＴＡＡ）コドンを示す。配列番号６０は、配列番号６１および図５９に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）のアミノ酸配列をコードする。
【０３０８】
ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂのｉｎ  ｖｉｖｏ生成の時間的動態を測定するため、ｐＶＡＸ１、ＣＨＩＫＶ−Ｈ、ＣＨＩＫＶ−Ｌ、またはｐＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＥＬＩＳＡを用いて、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの経時的な生成レベルを測定した。図２２に示すように、ｐＶＡＸ１、ＣＨＩＫＶ−Ｈ、またはＣＨＩＫＶ−Ｌでトランスフェクトした細胞は、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ抗原に反応性のある抗体を産生しなかった。これに対し、ｐＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂでトランスフェクトした細胞は、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ抗原に反応性のある抗体（すなわち、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂ、ＣＨＩＫＶ−Ｆａｂとしても知られる）を産生した。従って、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの重（ＶＨ−ＣＨ１）鎖および軽（ＶＬ−ＣＬ）鎖をコードする核酸配列を送達することでＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ抗原に結合するかまたは該抗原に反応性のあるＦａｂが生成されたことが、これらのデータにより示された。
【０３０９】
また、ｐＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖでトランスフェクトした細胞から得た溶解物のウエスタンブロットにＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂを用いた。これは、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ抗原をコードするプラスミドである。図２３に示すように、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ抗原がＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂを介して検出され、これは、このＦａｂが抗原に結合したことを示唆するものである。
【０３１０】
ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂのｉｎ  ｖｉｖｏ生成またはｉｎ  ｖｉｖｏ組み立てをさらに調べるため、ｐＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂ（すなわち、１２．５μｇのＣＨＩＫＶ−Ｈと１２．５μｇのＣＨＩＫＶ−Ｌ）をマウスに投与した。さらに、２５μｇのｐＶＡＸ１、ＣＨＩＫＶ−Ｈ、およびＣＨＩＫＶ−Ｌを、対照としての第２群、第３群、および第４群のマウスにそれぞれ投与した。具体的には、事前採血のサンプルを得た後、それぞれのマウス群に０日目にプラスミドを投与した。１日目、２日目、３日目、５日目、７日目、および１０日目に血液を採取した（図２４）。これらの血液にＥＬＩＳＡ測定を行い、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ抗原に反応性のある抗体のレベルを測定した。図２５に示すように、ｐＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂを投与されたマウスは、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ抗原に反応性のある抗体（すなわち、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂ）を生成した。ｐＶＡＸ１、ＣＨＩＫＶ−Ｈ、またはＣＨＩＫＶ−Ｌを投与されたマウスは、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ抗原に著しい反応性を持つ抗体を生成しなかった。従って、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの重（ＶＨ−ＣＨ１）鎖および軽（ＶＬ−ＣＬ）鎖をコードする核酸配列の送達時に、このＦａｂはｉｎ  ｖｉｖｏ（すなわち、マウス内）生成され、その抗原（すなわち、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ）に反応性のあることがこれらのデータにより実証された。これにより、Ｆａｂがｉｎ  ｖｉｖｏで正しく組み立てられたことが実証された。
【０３１１】
ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−ＦａｂがＣＨＩＫＶ感染に対して防御することができるかどうか判断するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２〜３週齢；約２０〜２５グラム量）にｐＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂ（５０μｇ）またはｐＶＡＸ１を０日目に投与した。ｐＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂを投与してから６時間後、各マウスに全容量２５μｌ中の７ログ１０ＰＦＵを鼻腔内経路により接種した。その後毎日、各マウスの体重を測定し、体重減少３０％以上のマウスは犠牲にした。
【０３１２】
図２６に示すように、ｐＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂを投与されたマウスのうち約７５％が、本研究１４日目の時点でＣＨＩＫＶ感染から生き残ったが、ｐＶＡＸ１を投与されたマウスは全て１４日目までに死んだ。さらに、ｐＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂを投与されたマウスは、ｐＶＡＸ１を投与されたマウスと比較して、低レベルのサイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を伴った（図２７および図２８）。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のレベルを、マウスから得た血清で測定した。これらの生き残ったマウスは、病気や体重減少の兆候を示さず、サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６は低レベルであった。従って、ｐＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂの投与により、ＣＨＩＫＶ感染からマウスを防御し、ＣＨＩＫＶ感染からの生存が促進されたことが、これらのデータにより示された。換言すれば、マウス内におけるＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ−Ｆａｂのｉｎ  ｖｉｖｏ生成により、ＣＨＩＫＶ感染に対して防御し、ＣＨＩＫＶ感染からの生存が促進された。
【０３１３】
実施例１５
抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ
上述したように、ＨＩＶ−１Ｅｎｖ  ＦａｂまたはＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ−Ｆａｂの重（ＶＨ−ＣＨ１）鎖および軽（ＶＬ−ＣＬ）鎖をコードする核酸配列を細胞またはマウスに送達する際に、ＨＩＶ−１  ＥｎｖまたはＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖに反応性のあるＦａｂ（すなわち、ＶＨ／ＣＨ１およびＶＬ／ＣＬ）をｉｎ  ｖｉｖｏ組み立てまたはｉｎ  ｖｉｖｏ生成した。コード化核酸配列を細胞または対象に送達する際に、自己抗原（すなわち、Ｆａｂをコードする核酸配列を投与された対象における内因性の抗原）に反応性のあるＦａｂｓ  をｉｎ  ｖｉｖｏ生成することができるか判断するため、ヒト上皮成長増殖因子受容体２（Ｈｅｒ−２；Ｅｒｂ２としても知られる）に反応性のある抗体の重（ＶＨ−ＣＨ１）鎖および軽（ＶＬ−ＣＬ、カッパ型）鎖をコードする構築物を作成した。各構築物は、リーダー配列およびｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）を含み、これらは、図２８、図３０、および図３１示すように抗Ｈｅｒ−２ＦａｂのＶＨ−ＣＨ１またはＶＬ−ＣＬをコードする核酸配列の前に来た。従って、これらの構築物は、リーダー配列およびｋｏｚａｋ配列の導入により最適化され、コドン使用にさらに最適化された。
【０３１４】
ＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬをコードする構築物をｐＶＡＸ１発現ベクター内、すなわち、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位間でクローニングしたことで、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下に置いた。具体的に、ＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬをコードする構築物を２つの別々のｐＶＡＸ１ベクターにクローニングしたことで、得られた２つのプラスミドは、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂをｉｎ  ｖｉｖｏ生成するのに必要とされた。
【０３１５】
抗Ｈｅｒ−２  ＦａｂのＶＨ−ＣＨ１をコードする核酸配列が、配列番号４０および図３２に記載されている。図３２において、下線および二重下線は、核酸配列をｐＶＡＸ１ベクターにクローニングするのに用いたＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限酵素部位を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡＴＡＡ）コドンを示す。配列番号４０は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列、すなわち、抗Ｈｅｒ−２  ＦａｂのＶＨ−ＣＨ１のアミノ酸配列（図３２および図３３）をコードする。
【０３１６】
抗Ｈｅｒ−２  ＦａｂのＶＬ−ＣＬをコードする核酸配列が、配列番号４２および図３４に記載されている。図３４において、下線および二重下線は、核酸配列をｐＶＡＸ１ベクターにクローニングするのに用いたＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限酵素部位を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡＴＡＡ）コドンを示す。配列番号４２は、配列番号４３に記載のアミノ酸配列、すなわち、抗Ｈｅｒ−２  ＦａｂのＶＬ−ＣＬのアミノ酸配列（図３４および図３５）をコードする。
【０３１７】
抗Ｈｅｒ−２  ＦａｂのＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬをコードするプラスミドの混合物が抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂをｉｎ  ｖｉｖｏ生成したかどうか判断するため、抗Ｈｅｒ−２  ＦａｂまたはｐＶＡＸ１の重（ＶＨ−ＣＨ１）鎖および軽（ＶＬおよびＣＬ）鎖をコードするプラスミドの混合物で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、図３６に示すように全ＩｇＧ濃度を測定した。図３６において、エラーバーは標準偏差を表わす。抗Ｈｅｒ−２  ＦａｂのＶＨ−ＣＨ１またはＶＬ−ＣＬをそれぞれコードする２つのプラスミドを導入した際に、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂがｉｎ  ｖｉｖｏ生成されたことが、これらのデータにより示された。
【０３１８】
実施例１６
抗デングウイルスヒトＩｇＧ
単一プラスミド系を作成して、抗デングウイルス（ＤＥＮＶ）ヒトＩｇＧ抗体をｉｎ  ｖｉｖｏ生成した。具体的には、図３７に模式的に示すように構築物を生成した。すなわち、リーダー配列を、ＩｇＧ重鎖（すなわち、可変重領域（ＶＨ）、定常重領域１（ＣＨ１）、ヒンジ領域、定常重領域２（ＣＨ２）、および定常重領域３（ＣＨ３））をコードする核酸配列の上流に位置づけた。次に、プロテアーゼ切断部位をコードする配列を、ＩｇＧ重鎖をコードする核酸配列の下流に位置づけた。ＩｇＧ軽鎖（すなわち、可変軽領域（ＶＬ）および定常軽領域（ＣＬ））をコードする核酸配列を、プロテアーゼ切断部位（すなわち、フリン切断部位）をコードする配列の後に置いた。この構築物によってコードされるシグナルペプチドは、同種のシグナルペプチドであるため、発現時に抗体の適切な分泌をもたらした。さらに、発現時に、単一転写産物は単一ポリペプチドに翻訳され、これは、プロテアーゼによって、抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧの重鎖および軽鎖に対応するポリペプチドに処理される。これらの重鎖および軽鎖ポリペプチドを、その後、機能性抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧ、すなわち、その同種抗原に結合する抗体に組み立てる。
【０３１９】
この構築物を発現ベクターｐＶＡＸ１（すなわち、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位）にクローニングすることで、プロモーターの制御下に置いた。抗デングウイルスヒトＩｇＧをコードする構築物は、配列番号４４（図３８）に記載の核酸配列を持ち、これは、発現用に最適化されている。図３８において、下線および二重下線は、構築物をｐＶＡＸ１ベクターにクローニングするのに用いたＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限酵素部位を示し、太字は、開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＧＡＴＡＡ）コドンを示す。最適化には、ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣ  ＡＣＣ）の包含とコドン最適化とが含まれていた。配列番号４４は、配列番号４５および図３９に記載のアミノ酸配列、すなわち、重鎖および軽鎖をプロテアーゼによって２つの別々のポリペプチドに分離する前の抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧのアミノ酸配列をコードする。
【０３２０】
抗デングウイルスヒトＩｇＧをコードする核酸配列を含むプラスミドをマウスに投与し、抗デングウイルスヒトＩｇＧがｉｎ  ｖｉｖｏ（すなわち、マウス内）生成されたかどうか判断した。プラスミドの投与後、マウスから血清を得て、ＥＬＩＳＡによって分析し、４つのデングウイルス血清型、すなわち、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、およびＤＥＮＶ−４由来のデング熱Ｅタンパク質に反応性のある抗体を血清が含んでいたかどうか判定した。図４０に示すように、抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧをコードする核酸配列を含むプラスミドを投与されたマウスの血清は、血清型ＤＥＮＶ−１、−２、−３、および−４由来のＤＥＮＶ  Ｅタンパク質に反応性があった。同形抗体を陽性対照として用いた。従って、プラスミドをマウス内に導入した際に、抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧをコードする核酸配列を転写し、ポリペプチドに翻訳され、処理されることで、抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧの重鎖および軽鎖を含むポリペプチドを生成することが、これらのデータにより示された。これらのポリペプチドを抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧに組み立てることで、ＤＥＮＶ  Ｅタンパク質に結合するかまたは該タンパク質に反応性のある機能性抗体がもたらされた。
【０３２１】
単一プラスミドの投与による抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧのｉｎ  ｖｉｖｏ生成をさらに調べるため、抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧをコードする核酸配列を含むプラスミドをマウスに注射投与した。具体的には、５０μｇまたは１００μｇのプラスミドをマウスに投与した。各群はマウス５匹であった。注射してから３日目および６日目に、マウスの血清反応反転を調べた。図４１に示すように、両群のマウスは、抗ＤＥＮＶ  ＩｇＧ抗体に対する血清反応が陽性であった。具体的には、５０μｇのプラスミドを投与されたマウスは、約１１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩｇＧがあり、１００μｇのプラスミドを投与されたマウスは、約１７０ｎｇ／ｍＬのヒトＩｇＧがあった。従って、抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧをコードするプラスミドの投与後、抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧがｉｎ  ｖｉｖｏ生成されることが、これらのデータによりさらに実証された。また、抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧ抗体産生が１週間以内に起こったことで、抗ＤＥＮＶヒトＩｇＧを急速に産生できることが、これらのデータにより実証された。
【０３２２】
前述の詳細な説明および添付の実施例は単に例証であり、添付された特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ定義される本発明の範囲の限定としてみなすべきではないことが理解される。
【０３２３】
開示された実施形態に対する、様々な変更および修正は当業者に明白であろう。そのような変更および修正は、本発明の化学構造、代替物、派生物、中間体、合成物、製剤および／または使用の方法に関するものを限定することなく含み、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月26日(2019.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象内での合成抗体の生成方法であって、
抗体またはその断片をコードする組み換え核酸配列を含む組成物を前記対象に投与する
ことを含み、
前記組み換え核酸配列は前記対象内で発現されて前記合成抗体を生成する方法。
【外国語明細書】
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