(57)【要約】【課題】ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）免疫原、該免疫原をコードする核酸分子、かかるＷＴ１免疫原および／または核酸分子を含むワクチン、並びに、免疫反応を誘導するため及びＷＴ１を発現する腫瘍を有する対象の予防および／または治療のためのワクチンの使用方法を提供すること。【解決手段】変異ＷＴ１抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を開示する。変異ＷＴ１抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含むベクター、組成物、およびワクチンを開示する。ＷＴ１発現腫瘍を有する個体の治療方法およびＷＴ１発現腫瘍の予防方法を開示する。変異ＷＴ１抗原を開示する。【選択図】図１
2019115369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２をコードする核酸配列、配列番号２の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号２に少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、配列番号２に少なくとも９８％同一であるタンパク質の少なくとも９０％の長さを含む断片をコードする核酸配列、配列番号４をコードする核酸配列、配列番号４の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号４に少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号４に少なくとも９８％同一であるタンパク質の少なくとも９０％の長さを含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号１、配列番号１の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号１に少なくとも９８％同一である核酸配列、配列番号１に少なくとも９８％同一である核酸配列の少なくとも９０％の長さを含む断片、配列番号３、配列番号３の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号３に少なくとも９８％同一である核酸配列、および配列番号３に少なくとも９８％同一である核酸配列の少なくとも９０％の長さを含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項３】
前記分子が、プラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれる請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の１つ以上の核酸分子を含む組成物。
【請求項５】
請求項２に記載の１つ以上の核酸分子を含む組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の１つ以上の核酸分子を含むワクチン。
【請求項７】
請求項２に記載の１つ以上の核酸分子を含むワクチン。
【請求項８】
ＷＴ１発現腫瘍を有する個体の治療方法であって、
ＷＴ１発現腫瘍の増殖を遅らせる、ＷＴ１発現腫瘍を縮小させるかもしくは取り除くのに有効な量の請求項６または７に記載のワクチンを投与することを含む方法。
【請求項９】
個体内のＷＴ１発現腫瘍の予防方法であって、
ＷＴ１発現腫瘍の形成または増殖を阻害するのに有効な量の請求項６または７に記載のワクチンを投与することを含む方法。
【請求項１０】
配列番号２、配列番号２の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号２に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、配列番号２に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列の少なくとも９０％の長さを含む断片、配列番号４、配列番号４の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号４に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、および配列番号４に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列の少なくとも９０％の長さを含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項１１】
核酸分子を含むワクチンであって、
（ａ）前記核酸分子が、配列番号１に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有する核酸配列を含む；または、
（ｂ）前記核酸分子が、配列番号３に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有する核酸配列を含むワクチン。
【請求項１２】
（ａ）配列番号２に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド；または、
（ｂ）配列番号４に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド
をさらに含む請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記核酸分子が、発現ベクターを含む請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１４】
薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１５】
アジュバントをさらに含む請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１６】
核酸分子を含むワクチンであって、
（ａ）前記核酸分子が、配列番号２に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードし；または、
（ｂ）前記核酸分子が、配列番号４に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードするワクチン。
【請求項１７】
（ａ）配列番号２に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド；または、
（ｂ）配列番号４に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド
をさらに含む請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記核酸分子が、発現ベクターを含む請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１９】
薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む請求項１６に記載のワクチン。
【請求項２０】
アジュバントをさらに含む請求項１６に記載のワクチン。
【請求項２１】
配列番号１に記載の前記核酸配列を含む核酸分子。
【請求項２２】
配列番号３に記載の前記核酸配列を含む核酸分子。
【請求項２３】
配列番号２に記載の前記アミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２４】
配列番号４に記載の前記アミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２５】
抗原を含むワクチンであって、
前記抗原が、配列番号１または配列番号３によりコードされるワクチン。
【請求項２６】
前記抗原が、配列番号１によりコードされる請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記抗原が、配列番号３によりコードされる請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２８】
前記抗原が、配列番号２または配列番号４に記載の前記アミノ酸配列を含む請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２９】
前記抗原が、配列番号２に記載の前記アミノ酸配列を含む請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３０】
前記抗原が、配列番号４に記載の前記アミノ酸配列を含む請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３１】
ペプチドを含むワクチンであって、
（ａ）前記ペプチドが、配列番号２に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；または、
（ｂ）前記ペプチドが、配列番号４に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むワクチン。
【請求項３２】
前記ペプチドが、配列番号２に記載の前記アミノ酸配列を含む請求項３１に記載のワクチン。
【請求項３３】
前記ペプチドが、配列番号４に記載の前記アミノ酸配列を含む請求項３１に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１２年１２月１３日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，０９４号に対する優先権を主張するものである。この出願の全教示内容は、参照することで本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）免疫原と、該免疫原をコードする核酸分子とに関する。また、本発明は、かかるＷＴ１免疫原および／または核酸分子を含むワクチンに関する。さらに、本発明は、免疫反応を誘導するため、ならびにＷＴ１を発現する腫瘍を有する対象の予防および／または治療のためのワクチンの使用方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は、依然米国および世界中で死の主原因である。癌ワクチン市場は急速に拡大している。リンパ腫ワクチンは、市場の約０．５％を占める。効果的な腫瘍ワクチンは、腫瘍増殖の予防に有用であり得、および／または、進行癌に侵されている患者に対して、標準治療よりも効果的かつ毒性の低い代替手段として有用であり得る。癌に関連する抗原、したがって抗腫瘍ワクチンの標的は、ＷＴ１である。
【０００４】
ウィルムス腫瘍抑制遺伝子１（ＷＴ１）は、腎臓の胚性悪性腫瘍（腎芽腫）の原因として特定されており、約１０，０００人に１人の幼児に影響を及ぼす。当該遺伝子は散発型および遺伝型のどちらでも起こる。ＷＴ１を不活性化することにより、ウィルムス腫瘍およびＤｅｎｙｓ−Ｄｒａｓｈ症候群（ＤＤＳ）の発症につながる。これは、腎症のみならず生殖器に異常をきたす可能性がある。ＷＴ１タンパク質は、腫瘍抑制転写因子でもある主な腫瘍調節遺伝子ｐ５３を含む多くの細胞性因子と相互作用することが分かっている。
【０００５】
ＷＴ１は、多くの腫瘍型に発現され、多くの癌により広範に関与している。例えば、ＷＴ１タンパク質は、７５％の中皮腫（毎年世界中で１４，２００の症例、米国での発生率が最も高い）および９３％の漿液性卵巣癌（２０１０年世界中で１９０，０００の卵巣癌症例）の細胞核に限局している。さらに、ＷＴ１は、膵臓癌、白血病、肺癌、乳癌、結腸癌、膠芽腫、頭部癌、頸部癌のみならず、とりわけ、良性中皮腫、子宮頸癌、および卵巣癌に関与している。ＷＴ１は、癌治療に対するアプローチとして、遺伝子治療または免疫療法の標的である。
【０００６】
ＷＴ１は、Ｃ末端に４つのジンクフィンガーモチーフを含む転写因子と、Ｎ末端のプロリン／グルタミンリッチＤＮＡ結合ドメインとをコードする。ＷＴ１は、泌尿生殖器系の正常な発達に重要な役割を果たす。しかしながら、成人にはより不必要であるため、免疫療法の標的として示唆される。２つのコードエクソンの選択的スプライシングからもたらされる複数の転写産物変異体は、よく特徴付けられている。ＣＴＬ範囲を最大化するために全リーディングフレームを用いることは利点と考えられる。
【０００７】
ＷＴ１抗原が保存されているため、この遺伝子標的に対して強い免疫力を生成させるほとんどの試みは成功していない。ＤＮＡワクチン技術、痘ウイルスワクチン技術、アデノウイルスワクチン技術、ペプチドワクチン技術、およびタンパク質ベースワクチン技術を用いたワクチン研究がこれまでなされている。研究したワクチンには、真の遺伝子構造、すなわち、天然の「正常」遺伝子を用いた。これらの研究では、低レベルまたは非機能性のＴ細胞免疫しか達成されなかった。
【０００８】
より効果的なＷＴ１免疫原の開発にはいくつかの大きな問題がある。ＷＴ１抗原が宿主ＷＴ１に似ているため、強い抑制性Ｔ細胞応答が生成されることで、免疫誘導を阻害してしまう。また、遺伝子自身がＲＮＡレベルで著しく処理されるため、多数の開裂転写産物が、未知の競合する可能性のある値で生成されてしまう。さらに、送達されたＷＴ１発現が低いため、免疫不全をもたらしてしまう。
【０００９】
癌の治療および予防用ワクチンには大きな関心が集まっている。ＷＴ１を標的とする既存のワクチンでは、抗原のｉｎ  ｖｉｖｏ発現が低いことで制限される。従って、ＷＴ１を発現する腫瘍に適用可能な安全かつ効果的なワクチンを開発し、かかる癌の治療提供および生存率の促進が当該技術分野では必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、配列番号２をコードする核酸配列、配列番号２の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号２に少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、配列番号２に少なくとも９８％同一であるタンパク質の少なくとも９０％の長さを含む断片をコードする核酸配列、配列番号４をコードする核酸配列、配列番号４の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号４に少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号４に少なくとも９８％同一であるタンパク質の少なくとも９０％の長さを含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む単離核酸分子に関する。
【００１１】
また、本発明は、配列番号１、配列番号１の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号１に少なくとも９８％同一である核酸配列、配列番号１に少なくとも９８％同一である核酸配列の少なくとも９０％の長さを含む断片、配列番号３、配列番号３の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号３に少なくとも９８％同一である核酸配列、および配列番号３に少なくとも９８％同一である核酸配列の少なくとも９０％の長さを含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む単離核酸分子に関する。
【００１２】
上記の核酸分子をプラスミドまたはウイルスベクターに組み込むことができる。さらに、本発明は、１つ以上の上記核酸分子を含む組成物に関する。また、本発明は、１つ以上の上記核酸分子を含むワクチンに関する。
【００１３】
さらに、本発明は、ＷＴ１発現腫瘍を有する個体の治療方法に関し、該方法は、ＷＴ１発現腫瘍の増殖を遅らせる、ＷＴ１発現腫瘍を縮小させるかもしくは取り除くのに有効な量の上記ワクチンを投与することを含む。
【００１４】
本発明は、個体内のＷＴ１発現腫瘍の予防方法にも関し、該方法は、ＷＴ１発現腫瘍の形成または増殖を阻害するのに有効な量の上記ワクチンを投与することを含む。
【００１５】
さらに、本発明は、配列番号２、配列番号２の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号２に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、配列番号２に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列の少なくとも９０％の長さを含む断片、配列番号４、配列番号４の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号４に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、および配列番号４に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列の少なくとも９０％の長さを含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質に関する。
【００１６】
また、本発明は、核酸分子を含むワクチンに関する。核酸分子は、配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有する核酸配列を含み得る。核酸分子は、配列番号３に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有する核酸配列を含み得る。ワクチンは、ペプチドをさらに含み得る。ペプチドは、配列番号２に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ペプチドは、配列番号４に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００１７】
核酸分子は、発現ベクターを含み得る。ワクチンは、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含み得る。ワクチンは、アジュバントをさらに含み得る。
【００１８】
また、本発明は、核酸分子を含むワクチンに関する。核酸分子は、配列番号２に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードすることができる。核酸分子は、配列番号４に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードすることができる。ワクチンは、ペプチドをさらに含み得る。ペプチドは、配列番号２に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ペプチドは、配列番号４に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００１９】
核酸分子は、発現ベクターを含み得る。ワクチンは、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含み得る。ワクチンは、アジュバントをさらに含み得る。
【００２０】
さらに、本発明は、配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸分子に関する。
【００２１】
また、本発明は、配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸分子に関する。
【００２２】
さらに、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに関する。
【００２３】
また、本発明は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに関する。
【００２４】
さらに、本発明は、抗原を含むワクチンに関し、該抗原は、配列番号１または配列番号３によりコードされる。抗原は、配列番号１によってコードされ得る。抗原は、配列番号３によってコードされ得る。抗原は、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み得る。抗原は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み得る。抗原は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【００２５】
また、本発明は、ペプチドを含むワクチンに関する。ペプチドは、配列番号２に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ペプチドは、配列番号４に記載の前記核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み得る。ペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】免疫化群対１０6個の脾細胞当たりのスポット形成ユニット（ＳＦＵ）をプロットしたグラフを示す。
【図２】免疫化群対１０6個の脾細胞当たりのＳＦＵをプロットしたグラフを示す。
【図３】免疫ブロットを示す。
【図４】ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓの模式図を示す。
【図５】ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１それぞれのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図６】（Ａ）ＣｏｎＷＴ１−Ｌをコードするヌクレオチド配列を示し、（Ｂ）ＣｏｎＷＴ１−Ｌのアミノ酸配列を示す。
【図７】（Ａ）ＣｏｎＷＴ１−Ｓをコードするヌクレオチド配列を示し、（Ｂ）ＣｏｎＷＴ１−Ｓのアミノ酸配列を示す。
【図８】トランスフェクト細胞の染色を示す。
【図９】免疫ブロットを示す。
【図１０】免疫化計画を模式的に示す。
【図１１】免疫化群対１０6個の脾細胞当たりのＳＦＵをプロットしたグラフを示す。
【図１２】免疫化群対１０6個の脾細胞当たりのＳＦＵをプロットしたグラフを示す。
【図１３】トランスフェクト細胞の染色を示す。
【図１４】免疫ブロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、ＷＴ１抗原を含むワクチンに関する。ＷＴ１は多くの腫瘍で発現される。従って、ワクチンにより、ＷＴ１を発現する癌または癌性腫瘍の治療がもたらされる。
【００２８】
ＷＴ１抗原は、異なる種からのＷＴ１の配列由来のコンセンサスＷＴ１抗原であり得るため、コンセンサスＷＴ１抗原は独自のものである。また、コンセンサスＷＴ１抗原は、ジンクフィンガーが全て改変もしくは除去されている点でも独自のものである。改変には、亜鉛構造に配位するシステイン残基およびヒスチジン残基の置換を含み得る。
【００２９】
驚くべきことに、コンセンサスＷＴ１抗原が改変ジンクフィンガーを有するかもしくはジンクフィンガーを有さない場合、ＷＴ１に反応する著しい免疫反応が誘導される。誘導された免疫反応には、体液性免疫反応と細胞性免疫反応の両方が含まれ、細胞性免疫反応は、天然ＷＴ１または発現用に最適化されたＷＴ１を含むワクチンによって誘導された細胞性免疫反応と比較して、約４００倍の増加が誘導される。
１．定義
【００３０】
特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先となる。本発明の実施または試験において、本明細書中に記載されたものと同様または同等の方法および材料を用いることはできるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の引用文献は、引用によりそれらの全体が組み入れられる。尚、本明細書で開示した材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図していない。
【００３１】
本明細書で使用する「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「を有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「を含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、およびその変形は、付加的な行為あるいは構造の可能性を妨げない、制限しない移行句、用語、または単語であることを意図している。単数形である「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上例外が明記されていない限り、複数形の意味を持つこともある。本開示は、明示的に記載されているかどうかに関わらず、本明細書に示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、および「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
【００３２】
本明細書で用いられる「アジュバント」は、本明細書の以下に記載されるＤＮＡプラスミドおよびコード核酸配列によりコードされる１つ以上の抗原の抗原性を高めるために本明細書に記載のＤＮＡプラスミドワクチンに添加される任意の分子を意味し得る。
【００３３】
「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、またはその断片もしくは誘導体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含む）、ならびにその一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二機能性抗体、および誘導体を意味し得る。抗体は、哺乳動物の血清サンプルから単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはこれらの混合物のうち、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対する十分な結合特異性を示すものであり得る。
【００３４】
「抗原」は、配列番号２；本明細書に記載の長さのその断片、変異体、すなわち、本明細書に記載の配列番号２に同一性を有する配列を持つタンパク質、本明細書に記載の長さを有する変異体の断片、配列番号４；本明細書に記載の長さのその断片、変異体、すなわち、本明細書に記載の配列番号４に同一性を有する配列を持つタンパク質、本明細書に記載の長さを有する変異体の断片、およびそれらの組み合わせを含む変異ＷＴ１アミノ酸配列を有するタンパク質を指す。抗原は、他のタンパク質由来のものなどのシグナルペプチドを任意に含んでもよい。
【００３５】
本明細書で使用する、「コード配列」または「コード化核酸」は、本明細書に記載の抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸の投与先である個体または哺乳動物の細胞中の発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始および終了シグナルをさらに含むことができる。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含むことができる。
【００３６】
本明細書で使用する、「相補体」または「相補的」は、ある核酸が、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間にワトソン・クリック（例えば、Ａ-Ｔ／ＵおよびＣ-Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を表わすことを意味し得る。
【００３７】
本明細書で用いられる「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、特定の抗原の複数のサブタイプのアライメント分析に基づいて構築された合成核酸配列またはそれに対応するポリペプチド配列を意味し得る。配列を用いて、特定の抗原の複数のサブタイプ、血清型、または株に対する幅広い免疫を誘導することができる。融合タンパク質などの合成抗原を、コンセンサス配列（またはコンセンサス抗原）に操作することができる。
【００３８】
本明細書で使用する、「定電流」は、組織、または該組織を規定する細胞が、同組織に送達される電気パルスの持続期間中に受容するまたは経験する電流を定義する。電気パルスは、本明細書に記載の電気穿孔装置から送達される。この電流は、電気パルスの寿命期間中、該組織に定電流量で留まるが、それは、本明細書で提供される電気穿孔装置が、好ましくは瞬間的フィードバックを有する、フィードバック素子を有するからである。フィードバック素子は、パルスの持続期間中の組織（または細胞）の抵抗を測定し、電気穿孔装置に自身の電気エネルギー出力を変化させる（例えば、電圧を上げる）ようにすることができるので、同組織中の電流は、電気パルスの間ずっと（約マイクロ秒）、およびパルス間において、一定であり続ける。いくつかの実施形態において、フィードバック素子は、制御器を含む。
【００３９】
本明細書で使用する、「電流フィードバック」または「フィードバック」は互換的に使用されており、提供される電気穿孔装置の活発な応答を意味し得るが、これは、電極間の組織の電流を測定することと、電流を一定レベルで維持するために、ＥＰ装置が送達するエネルギー出力を適宜変化させることとを含む。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気処理を開始する前に、ユーザが予め設定する。電気穿孔装置の中の電気回路が、電極間の組織の電流を連続的にモニターし、そのモニターされた電流（または組織中の電流）を予め設定された電流と比較し、連続的にエネルギー出力の調整を行なって、モニターされた電流を予め設定されたレベルで維持することができるように、フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔構成要素、例えば、制御器によって達成され得る。フィードバックループは瞬時のものであり得、それは、フィードバックループがアナログ閉ループフィードバックであるからである。
【００４０】
本明細書で使用する、「分散電流」は、本明細書に記載の電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、これらのパターンは、電気穿孔される任意の組織領域に対する電気穿孔関連の熱ストレスの発生を最小限に抑えるか、または好ましくは消失させる。
【００４１】
本明細書で互換的に使用する、「電気穿孔」、「電気透過処理」、「界面動電増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味し得る。こうした微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、および水などの生体分子が、細胞膜の片側から他方の側に通過することが可能になる。
【００４２】
本明細書で使用する、「フィードバック機構」は、ソフトウェアまたはハードウェア（もしくはファームウェア）のいずれかによって実行されるプロセスであって、（エネルギーパルスの送達前、送達中、および／または送達後の）所望の組織のインピーダンスを受容し、それを現在値、好ましくは電流と比較し、送達されるエネルギーパルスを調整して、予め設定された値を達成するプロセスを指し得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施され得る。
【００４３】
「断片」は、哺乳類においてで免疫反応を誘発することができるポリペプチド断片を意味し得る。抗原の断片は、シグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンを備えているかまたは備えていないかのいずれの場合にも、Ｎおよび／またはＣ末端から少なくとも１つのアミノ酸が欠けている以外は全長と１００％同一であってもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除き、特定の全長抗原の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含んでいてもよい。断片は、抗原に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一で、かつ、同一率を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをさらに含むポリペプチドの断片を含んでいてもよい。断片はさらに、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのＮ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをさらに含んでいてもよい。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、抗原の断片に結合し得る。
【００４４】
抗原をコードする核酸配列の断片は、シグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンをコードする配列を備えているかまたは備えていないかのいずれの場合にも、５’および／または３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドが欠けている以外は全長と１００％同一であってもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除く特定の全長コード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含んでいてもよい。断片は、抗体に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一である抗原、かつ、同一率を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに必要に応じて含むポリペプチドをコードする断片を含んでいてもよい。断片はさらに、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのＮ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドに対するコード配列をさらに含んでいてもよい。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に結合し得る。
【００４５】
本明細書で使用する、「遺伝子構築物」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子の投与先である個体の細胞中の発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始および終了シグナルを含む。本明細書で使用する「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞中に存在しているときにコード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列に機能的に連結している必要な調節要素を含んでいる遺伝子構築物を指す。
【００４６】
本明細書において２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で使用する「同一」または「同一性」は、当該配列が指定領域に渡って指定の割合の同一残基を有することを意味し得る。この割合を計算するには、２つの配列を最適に整列させ、指定領域に渡って２つの配列を比較し、両配列の同一残基が発生する位置の数を確定して一致位置の数を得て、一致位置の数を指定領域の総位置数で割り、計算結果に１００を掛けることにより、配列同一性のパーセント値が得られる。２つの配列の長さが異なるか、アライメントにより１つ以上の付着末端が生じ、指定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合には、単一配列の残基を計算の分母に含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合には、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を同等とみなすことができる。同一性の計算は、手動で行っても、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ  ２．０等のコンピューター配列アルゴリズムを使用して行ってもよい。
【００４７】
本明細書で使用する、「インピーダンス」は、フィードバック機構を論ずる際に用いられ、かつ、オームの法則に従って電流値に変換することができるため、予め設定された電流と比較することができる。
【００４８】
本明細書で使用する、「免疫応答」は、１つ以上の本明細書に記載のワクチンを介した本明細書に記載の抗原の導入に応答して、宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系が活性化することを意味し得る。この免疫応答は、細胞性もしくは体液性の形態、またはその両方であり得る。
【００４９】
本明細書で使用する、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖を表現することにより、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、表現される一本鎖の相補鎖も包含する。ある核酸の多くの変異体を、所与の核酸として同一目的で使用できる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００５０】
核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部分を含むこともできる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、核酸はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含むことができる。核酸は、化学合成法または組み換え法により取得できる。
【００５１】
本明細書で使用する、「機能的に連結」は、遺伝子と空間的に接続しているプロモーターの制御下で遺伝子が発現することを意味し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置できる。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーターの派生元遺伝子において当該プロモーターが制御する遺伝子とプロモーターの間の距離とほぼ同一であってもよい。当技術分野で知られているように、プロモーター機能を失うことなく、この距離の変化に適応することができる。
【００５２】
本明細書で使用する、「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の結合配列を意味することができ、天然、合成、または、天然および合成の修飾あるいはその組み合わせであってもよい。
【００５３】
本明細書で使用する、「プロモーター」は、核酸の細胞中発現を授与、活性化、または増強することのできる合成分子または天然由来分子を意味し得る。プロモーターは、発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現および／またはその一時的発現を改変する目的で、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターは遠位のエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントを含むこともでき、このエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントは、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置できる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来してよい。プロモーターは、発現が発生する細胞、組織、もしくは臓器に関して、もしくは発現が生じる発生段階に関して、恒常的もしくは差次的に遺伝子成分の発現を調節でき、または、例えば生理的ストレス、病原体、金属イオン、誘発剤等の外部刺激に応答して遺伝子成分の発現を調節できる。プロモーターの代表例として、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ-ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００５４】
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端に結合することができるアミノ酸配列を指す。一般に、シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用するシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質を産生する細胞からタンパク質を分泌し易くすることが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、タンパク質（しばしば成熟タンパク質と呼ばれる）の残余から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端に結合する。
【００５５】
本明細書で用いられる「対象」は、本明細書に記載のワクチンで免疫を得ることを望むかまたは必要とする哺乳類を意味する。哺乳類は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはネズミであり得る。
【００５６】
本明細書で使用する、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば核酸の複合混合物において、第１の核酸配列（例えばプローブ）が第２の核酸配列（例えば標的）とハイブリダイズする際の条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は配列に依存するため、状況によって異なる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列に対する融点（Ｔm）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔmは、（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔmにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）では最低約３０℃、長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチド超）では最低約６０℃であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件例には、以下の条件が含まれる：５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート。または、５倍ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、０．２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃での洗浄。
【００５７】
本明細書で使用する、「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列が第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００５８】
本明細書で使用する、「実質的に同一」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列と第２の配列が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは、核酸に関して、第１の配列が第２の配列の相補体と実質的に相補的である場合を意味し得る。
【００５９】
本明細書で使用する、「治療」または「治療する」は、疾患を予防するか、抑制するか、抑圧するかまたは完全に除去することで動物を疾患から防御することを意味することができる。疾患を予防することは、その疾患の発症前に動物に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑制することは、その疾患の誘導後でその疾患の臨床的出現前に、動物に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑圧することは、その疾患の臨床的出現後に、動物に本発明のワクチンを投与することを含む。
【００６０】
核酸に関して本明細書で使用する、「変異体」は、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片；（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体；（ｉｉｉ）基準核酸もしくはその相補体と実質的に同一の核酸；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、基準核酸、その相補体、もしくはその実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸を意味し得る。
【００６１】
ペプチドまたはポリペプチドに関して使用する、「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持しているものである。また、変異体は、基準タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を類似特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の別のアミノ酸に置換することは、当技術分野では、通常は軽微な変化を伴うものと認識されている。こうした軽微な変化は、当技術分野で理解されているように、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を検討することにより部分的に特定できる。Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性と電荷の考察に基づく。類似の疎水性親水性指標を有するアミノ酸は置換可能であり、その後もタンパク質機能を維持することが当技術分野において公知である。一態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物機能を保持したタンパク質となる置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を検討することにより、そのペプチドの局所的な最大平均親水性を計算でき、抗原性および免疫原性と良く相関すると報告されている有用な尺度となる。米国特許第４，５５４，１０１号（この文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。当技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、例えば免疫原性等の生物活性を保持したペプチドが得られる。親水性値が互いに±２以内のアミノ酸を用いて、置換を実施できる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。こうした知見と一致して、生物機能に適合するアミノ酸置換とは、アミノ酸の相対的類似性、特に当該アミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存するものと理解されており、この相対的類似性は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、その他の特性により明らかになる。
【００６２】
変異体は、完全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一な核酸配列であってもよい。核酸配列は、遺伝子配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。変異体は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一なアミノ酸配列であってもよい。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。
【００６３】
本明細書で使用する、「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製過剰染色体ベクターまたは宿主ゲノムに組み込むベクターのいずれかであってもよい。
【００６４】
本明細書中の数値範囲の記述について、同程度の精度でその間に入る各数が明示的に企図される。例えば、６〜９という範囲の場合、６および９に加えて７および８という数が企図され、６．０〜７．０という範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０という数が明示的に企図される。
【００６５】
２．ワクチン
抗原、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせを含むワクチンが本明細書において提供される。ワクチンは、抗原に対する免疫反応を哺乳類内で生成することができる。ワクチンは、以下により詳細に記載されるように、プラスミドまたは複数のプラスミドを含み得る。ワクチンは、治療的または予防的免疫反応を誘導することができる。
【００６６】
ワクチンを用いて、癌、例えば、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子１（ＷＴ１）を発現する癌または腫瘍に対して防御することができる。ワクチンを用いて、ＷＴ１を発現する腫瘍を予防および／または治療することを、それを必要とする対象において行うことができる。ワクチンは、ＷＴ１かつＷＴ１を発現する腫瘍に対して細胞性反応および／または抗体反応を誘導することができる。
【００６７】
ワクチンは、ワクチンを投与された対象において免疫反応を誘導するかまたは誘発することができる。ワクチンを投与された対象における免疫反応は、少なくとも約４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２２５倍、２５０倍、２７５倍、３００倍、３２５倍、３５０倍、３７５倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、５００倍、５２５倍、５５０倍、５７５倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、３５００倍、または４０００倍誘導することができる。いくつかの実施形態において、ワクチンを投与された対象における免疫反応は、少なくとも約３００倍、３２５倍、３５０倍、３７５倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、または５００倍誘導することができる。
【００６８】
ワクチンは、ワクチンを投与された対象において体液性および／または細胞性の免疫反応を誘導することができる。誘導された体液性免疫反応は、抗原に免疫反応性の抗体を含み得る。誘導された細胞性免疫反応は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を産生し、かつ、抗原に免疫反応性のあるＴ細胞を含み得る。ワクチンを投与された対象における細胞性免疫反応は、少なくとも約４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２２５倍、２５０倍、２７５倍、３００倍、３２５倍、３５０倍、３７５倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、５００倍、５２５倍、５５０倍、５７５倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、３５００倍、または４０００倍誘導することができる。いくつかの実施形態において、ワクチンを投与された対象における細胞性免疫反応は、少なくとも約３００倍、３２５倍、３５０倍、３７５倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、または５００倍誘導することができる。
【００６９】
ワクチンを用いて、抗原、かかる抗原の断片、かかる抗原の変異体、および変異体の断片からなる群から選択される１つ以上の抗原を送達することができる。複数の抗原を送達する場合、ワクチンは、複数の組成物または単一組成物を含み得る。送達には、複数の異なる抗原または同一抗原の異なる部分をコードするのに用いられる単一プラスミドを含み得る。他の実施形態において、送達には、異なる抗原または同一抗原の異なる部分をコードする異なるプラスミドを含み得る。
【００７０】
ワクチンは、核酸ワクチン、ペプチドワクチン、または、核酸およびペプチドワクチンの組み合わせであり得る。核酸ワクチンは、核酸分子を含み得る。核酸ワクチンは、単一プラスミドなどの単一核酸分子の複数のコピー、２つ以上の異なるプラスミドなどの２つ以上の異なる核酸分子の複数のコピーを含み得る。
【００７１】
核酸ワクチンは、単一抗原のコード配列、２つ以上の抗原の異種コード配列をまとめて含むプラスミドなどの核酸分子を含み得る。２つの抗原の異種コード配列を含む核酸ワクチンは、単一プラスミドなどの単一核酸分子上であってもよいし、あるいは、核酸ワクチンは、２つの異なるプラスミドなどの２つの異なる核酸分子を含んでいてもよく、一方の核酸分子は、１つの抗原の異種コード配列を含み、他方の核酸分子は、異なる抗原の異種コード配列を含む。核酸ワクチンは、２つの異なるプラスミドなどの２つの異なる核酸分子を含んでいてもよく、一方の核酸分子は、抗原の第１の部分の異種コード配列を含み、他方の核酸分子は、抗原の第２の部分の異種コード配列を含む。
【００７２】
同様に、３つの抗原の異種コード配列を含む核酸ワクチンは、単一プラスミドなどの単一核酸分子、２つの異なる核酸分子、または３つの異なる核酸分子を含み得る。同様に、４つの抗原の異種コード配列を含む核酸ワクチンは、単一プラスミドなどの単一核酸分子、２つの異なる核酸分子、３つの異なる核酸分子、または４つの異なる核酸分子を含み得る。
【００７３】
核酸ワクチンは、抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含み得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。また、核酸配列は、リンカーやリーダーをコードする付加配列、および／または、ペプチド結合により抗原に連結しているタグ配列を含み得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、核酸ワクチンは、分子アジュバントのコード配列をさらに含んでいてもよく、場合によっては、分子アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳであってもよく、場合によっては、分子アジュバントは、抗細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、抗プログラム死受容体−１（ＰＤ−１）、および抗リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ−３）などのチェックポイントインヒビターである。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳのコード配列は、１つ以上の抗原のコード配列を含む１つ以上の核酸分子上に含まれ得る。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳのコード配列は、別個のプラスミドなどの別個の核酸分子上に含まれ得る。
【００７５】
ペプチドワクチンは、抗原性ペプチド、抗原性タンパク質、その変異体、その断片、またはそれらの組み合わせを含み得る。ＤＮＡおよびペプチドワクチンの組み合わせには、抗原、抗原性ペプチド、または抗原性タンパク質をコードする上記の１つ以上の核酸配列を含み得る。
【００７６】
本発明のワクチンは、安全であることなど、有効なワクチンに必要な特徴を有しているため、ワクチン自体は、病気または死を引き起こさず、病気に対して防御し、中和抗体を誘導する；防御T細胞を誘導し、投与し易く、副作用もほとんどなく、生物学的安定性や投与量当たりの低コスト化をもたらすことができる。
【００７７】
a.抗原
上述のように、ワクチンは、抗原を含み得る。抗原は、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子１（ＷＴ１）、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってもよい。ＷＴ１は、プロリン／グルタミンリッチＤＮＡ−結合領域をＮ−末端に、かつ、４つの亜鉛フィンガーモチーフをＣ−末端に含む転写因子である。ＷＴ１は、泌尿生殖器系の正常な発達に関与しており、多くの因子、例えば、腫瘍抑制因子として知られるｐ５３、および細胞毒性薬による治療後に多数の部位でＷＴ１を切断するセリンプロテアーゼＨｔｒＡ２と相互作用する。
【００７８】
ＷＴ１の突然変異は、腫瘍形成または癌形成、例えば、ウィルムス腫瘍またはＷＴ１を発現する腫瘍をもたらし得る。ウィルムス腫瘍は、限定的ではないが、例えば、肝組織、尿路系組織、リンパ組織、および肺組織などの他の組織に転移する前に片方または両方の腎臓に形成されることが多い。従って、ウィルムス腫瘍は、転移性腫瘍と考えることができる。ウィルムス腫瘍は、通常、低年齢の子ども（例えば、５歳未満）に散発型および遺伝型の両方で起こる。
【００７９】
従って、ワクチンを用いて、ウィルムス腫瘍を患っている対象を治療することができる。ワクチンを用いて、ＷＴ１を発現する癌または腫瘍を有する対象を治療して、対象内におけるかかる腫瘍の発症を防ぐこともできる。ＷＴ１抗原は、天然の「正常」ＷＴ１遺伝子とは異なるため、ＷＴ１抗原発現腫瘍に対して治療または予防を提供することができる。従って、天然ＷＴ１遺伝子とは異なるＷＴ１抗原配列（すなわち、変異ＷＴ１遺伝子または変異ＷＴ１配列）が本明細書において提供される。
【００８０】
天然ＷＴ１遺伝子の転写産物は、様々なｍＲＮＡに加工され、得られたタンパク質は、免疫反応を誘導する価値が全て同じではない。本明細書に記載の変異ＷＴ１遺伝子により、選択的処理を避け、１つの全長転写産物を産生し、エフェクターＴおよびＢ細胞応答がより強く誘導される。第１の変異ＷＴ１配列は、改変ジンクフィンガーを有するＣＯＮ  ＷＴ１、すなわち、ＣｏｎＷＴ１−Ｌと称される。配列番号１は、改変ジンクフィンガーを有するＷＴ１抗原ＣＯＮ  ＷＴ１をコードする核酸配列である。配列番号２は、改変ジンクフィンガーを有するＷＴ１抗原ＣＯＮ  ＷＴ１のアミノ酸配列である。第２の変異ＷＴ１配列は、ジンクフィンガーを有しないＣＯＮ  ＷＴ１、すなわち、ＣｏｎＷＴ１−Ｓと称される。配列番号３は、ジンクフィンガーを有しないＷＴ１抗原ＣＯＮ  ＷＴ１をコードする核酸配列である。配列番号４は、改変ジンクフィンガーを有しないＷＴ１抗原ＣＯＮ  ＷＴ１のアミノ酸配列である。
【００８１】
上述の異種配列を含む単離核酸分子が提供される。上述の異種配列からなる単離核酸分子が提供される。上述の異種配列を含む単離核酸分子は、プラスミドなどのベクター、ウイルスベクター、および以下に記載の他の形態の核酸分子に組み込まれてもよい。ＷＴ１抗原をコードする核酸配列が本明細書において提供される。ＷＴ１抗原をコードするコード配列は、上述の配列を有する。
【００８２】
上述の異種アミノ酸配列を含むタンパク質分子が提供される。上述の異種アミノ酸配列からなるタンパク質分子が提供される。上記の配列を有するタンパク質およびポリペプチドが本明細書において提供される。タンパク質およびポリペプチドは、ＷＴ１抗原およびＷＴ１免疫原と称され得る。ＷＴ１抗原は、ＷＴ１抗原を発現する腫瘍に対して免疫反応を誘発することができる。
【００８３】
本発明の一態様において、コンセンサス抗原は、以下の１つ以上を含む改良された転写および翻訳を提供するのが望ましい：低ＧＣ含量リーダー配列により転写を増大させる；ｍＲＮＡ安定性およびコドン最適化、およびシス作用配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）を可能な限り取り除く。
【００８４】
本発明のいくつかの態様において、以下の１つ以上を含む、多数の株にわたる幅広い免疫反応を生成するコンセンサス抗原を生成するのが望ましい：入手可能な全ての全長配列を組み込む；各位で最もよく発生するアミノ酸を利用する配列をコンピュータ生成する；および、株間での交差反応を増大させる。
【００８５】
ＷＴ１抗原は、２つ以上の種由来のコンセンサス抗原（または免疫原）配列であり得る。ＷＴ１抗原は、コンセンサス配列、および／または、改良発現用の改変を含み得る。改変には、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、翻訳開始を増大させるためのｋｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣ ＡＣＣ）の付加、および／または、ＷＴ１抗原の免疫原性を増大させるための免疫グロブリンリーダー配列の付加を含み得る。ＷＴ１抗原は、限定的ではないが、例えば、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）シグナルペプチドまたは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）シグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ＷＴ１コンセンサス抗原は、血球凝集素（ＨＡ）タグを含み得る。ＷＴ１コンセンサス抗原は、対応するコドン最適化ＷＴ１抗原よりもより強く広範な細胞性および／または体液性免疫反応を誘発するように設計されていてもよい。
【００８６】
ＷＴ１コンセンサス抗原は、１つ以上のジンクフィンガーに１つ以上の変異を含み、それにより対応するコドン最適化ＷＴ１抗原よりもより強く広範な細胞性および／または体液性免疫反応を誘発することができる。１つ以上の変異は、１つ以上のジンクフィンガーで亜鉛イオンに配位する１つ以上のアミノ酸の置換であり得る。亜鉛イオンに配位する１つ以上のアミノ酸は、ＣＣＨＨモチーフであり得る。従って、いくつかの実施形態において、１つ以上の変異は、ＣＣＨＨモチーフの１つ、２つ、３つ、または４つ全てのアミノ酸の置換であり得る。
【００８７】
他の実施形態において、１つ以上の変異は、配列番号２の残基３１２、３１７、３４２、および３４７が、システイン（Ｃ）以外の任意の残基であり、配列番号２の残基３３０、３３４、３６０、および３６４が、ヒスチジン（Ｈ）以外の任意の残基であるものである。特に、１つ以上の変異は、配列番号２の残基３１２、３１７、３３０、３３４、３４２、３４７、３６０、および３６４が、グリシン（Ｇ）であるものである。
【００８８】
他の実施形態において、１つ以上のジンクフィンガーがＷＴ１コンセンサス抗原から除去され得る。１つ、２つ、３つ、または４つ全てのジンクフィンガーがＷＴ１コンセンサス抗原から除去され得る。
【００８９】
ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号２をコードする核酸配列番号１であり得る（図６Ａおよび図６Ｂ）。いくつかの実施形態において、ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号２に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。
【００９０】
さらに他の実施形態において、ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号２に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。ただし、配列番号２の残基３１２、３１７、３４２、および３４７は、システイン（Ｃ）以外の任意の残基であり、配列番号２の残基３３０、３３４、３６０、および３６４は、ヒスチジン（Ｈ）以外の任意の残基である。他の実施形態において、ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号２に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。ただし、  配列番号２の残基３１２、３１７、３３０、３３４、３４２、３４７、３６０、および３６４は、グリシン（Ｇ）である。
【００９１】
ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号２のアミノ酸配列であり得る。いくつかの実施形態において、ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号２に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号２に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列であり得るが、ただし、配列番号２の残基３１２、３１７、３４２、および３４７は、システイン（Ｃ）以外の任意の残基であり、配列番号２の残基３３０、３３４、３６０、および３６４は、ヒスチジン（Ｈ）以外の任意の残基である。いくつかの実施形態において、ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号２に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。ただし、配列番号２の残基３１２、３１７、３３０、３３４、３４２、３４７、３６０、および３６４は、グリシン（Ｇ）である。
【００９２】
ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号４をコードする核酸配列番号３であり得る（図７Ａおよび図７Ｂ）。いくつかの実施形態において、ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号３に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号４に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。
【００９３】
ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号４のアミノ酸配列であり得る。いくつかの実施形態において、ＷＴ１コンセンサス抗原は、配列番号４に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【００９４】
配列番号２および配列番号４の免疫原性断片が得られる。免疫原性断片は、配列番号２および／または配列番号４の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、免疫原性断片は、配列番号２の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。ただし、配列番号２の残基３１２、３１７、３４２、および３４７が免疫原性断片に存在する場合、これらの残基は、システイン（Ｃ）以外の任意の残基であり、配列番号２の残基３３０、３３４、３６０、および３６４が免疫原性断片に存在する場合、これらの残基は、ヒスチジン（Ｈ）以外の任意の残基である。他の実施形態において、免疫原性断片は、配列番号２の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。ただし、配列番号２の残基３１２、３１７、３３０、３３４、３４２、３４７、３６０、および３６４が免疫原性断片に存在する場合、これらの残基は、グリシン（Ｇ）である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、免疫原性断片は、リーダー配列を含まない。
【００９６】
配列番号２および４の免疫原性断片に同一性を有するアミノ酸配列を持つタンパク質の免疫原性断片が得られる。かかる断片は、配列番号２および／または配列番号４に９５％以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＷＴ１タンパク質配列の免疫原性断片に９６％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＷＴ１タンパク質配列の免疫原性断片に９７％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＷＴ１タンパク質配列の免疫原性断片に９８％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＷＴ１タンパク質配列の免疫原性断片に９９％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、免疫原性断片は、リーダー配列を含まない。
【００９７】
いくつかの実施形態は、配列番号１および配列番号３の免疫原性断片に関する。免疫原性断片は、配列番号１および／または配列番号３の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、免疫原性断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。配列番号１および配列番号３の免疫原性断片に同一性を有するヌクレオチド配列を持つ核酸の免疫原性断片が得られる。かかる断片は、配列番号１および／または配列番号３に９５％以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＷＴ１核酸配列の免疫原性断片に９６％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＷＴ１核酸配列の免疫原性断片に９７％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＷＴ１核酸配列の免疫原性断片に９８％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＷＴ１核酸配列の免疫原性断片に９９％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、免疫原性断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００９８】
ｂ．ベクター
ワクチンは、抗原をコードする異種核酸を含む１つ以上のベクターを含み得る。１つ以上のベクターは、哺乳類内において免疫反応を誘発するのに有効な量の抗原を発現することができる。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、複製起点を含む核酸配列を有し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【００９９】
１つ以上のベクターは、発現構築物であり得、これは、一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するのに用いられるプラスミドである。発現ベクターが細胞の中に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞性転写および翻訳機械リボソーム複合体によって産生される。プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として作用する調節配列を含み、かつ、発現ベクター上に運搬された遺伝子の効率的な転写をもたらすように操作されることが多い。本発明のベクターは、多量の安定したメッセンジャーＲＮＡを発現するため、多量の安定したタンパク質を発現する。
【０１００】
ベクターは、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローン化遺伝子の間の距離の調節、転写終結配列およびＰＴＩＳ（ポータブルな翻訳開始配列）の挿入などの発現シグナルを有し得る。
【０１０１】
（１）発現ベクター
ベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であり得る。環状プラスミドおよび線状核酸は、適切な対象細胞内において特定のヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる。ベクターは、抗原コードヌクレオチド配列に機能的に連結しているプロモーターを有してもよく、これは、終止シグナルに機能的に連結し得る。ベクターは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含み得る。対象のヌクレオチド配列を含むベクターは、キメラであってもよく、これは、その成分の少なくとも１つが、その他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下であってもよく、宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に晒された場合にのみ転写を開始する。多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織または臓器もしくは発生の段階に特異的であり得る。
【０１０２】
（２）プラスミド
ベクターは、プラスミドであり得る。プラスミドは、抗原をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞を、抗原の発現が起こる条件下で培養し、維持する。
【０１０３】
プラスミドは、合成抗原、抗原に対して免疫反応を誘発することができるコンセンサス抗原、かかるタンパク質の断片、かかるタンパク質の変異体、変異体の断片、または、コンセンサスタンパク質および／またはコンセンサスタンパク質の断片および／またはコンセンサスタンパク質の変異体および／またはコンセンサスタンパク質の変異体の断片の組み合わせからなる融合タンパク質をコードするコード配列を含む上述の種々の抗原の１つ以上をコードする核酸配列を含み得る。
【０１０４】
単一プラスミドは、単一抗原のコード配列、２つの抗原のコード配列、３つの抗原のコード配列、または４つの抗原のコード配列を含んでいてもよい。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、プラスミドは、ＣＣＲ２０のみをコードするコード配列、あるいは、これらのプラスミドの一部としてコードするコード配列をさらに含み得る。同様に、プラスミドは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２８のコード配列をさらに含み得る。
【０１０６】
プラスミドは、コード配列の上流であってもよい開始コドンと、コード配列の下流であってもよい終止コドンとをさらに含み得る。開始コドンおよび終止コドンは、コード配列とインフレームであり得る。
【０１０７】
プラスミドは、コード配列に機能的に連結しているプロモーターを含み得る。コード配列に機能的に連結しているプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、エプステインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得る。プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターは、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターでよく、天然もしくは合成であってもよい。かかるプロモーターの例は、米国特許公開公報ＵＳ２００４０１７５７２７に記載され、その内容は全体として本明細書に組み入れられる。
【０１０８】
プラスミドは、ポリアデニル化シグナルを含み得、これは、コード配列の下流であり得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであってもよい。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）からのポリアデニル化シグナルであってもよい。
【０１０９】
プラスミドは、コード配列の上流にエンハンサーを含み得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、または、ＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、またはＥＢＶなどのウイルスエンハンサーであってもよい。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、およびＷ０９４／０１６７３７に記載されており、それぞれの内容は参照により全体が組み入れられる。
【０１１０】
プラスミドは、プラスミドを染色体外に維持し、かつ、細胞中でプラスミドの複数のコピーを産生するために哺乳類の複製起点も含んでいてもよい。プラスミドは、インビトロジェン（サンディエゴ、カリフォルニア州）からのｐＶＡＸＩ、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であって、これらは、エプステイン・バー・ウイルスの複製起点と、核抗原ＥＢＮＡ−１のコード領域とを含んでいてもよく、統合しないで高いコピーのエピソーム複製を生じる。プラスミドのバックボーンは、ｐＡＶ０２４２であってもよい。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであってもよい。
【０１１１】
プラスミドは、調節配列も含んでもよく、これは、プラスミドを投与された細胞中での遺伝子発現に十分に適し得る。コード配列は、宿主細胞内においてコード配列をより効率的に転写することができるコドンを含み得る。
【０１１２】
コード配列は、Ｉｇリーダー配列を含み得る。リーダー配列は、コード配列の５’’であり得る。この配列によりコードされるコンセンサス抗原は、コンセンサス抗原タンパク質に続くＮ末端Ｉｇリーダーを含み得る。Ｎ末端Ｉｇリーダーは、ＩｇＥまたはＩｇＧであり得る。
【０１１３】
プラスミドは、ｐＳＥ４２０（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）であってもよく、それを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中でのタンパク質産生のために用いてもよい。プラスミドは、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）であってもよく、それを酵母のサッカロマイセス・セレビシエ株でのタンパク質産生に用いてもよい。プラスミドは、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）のものであってもよく、それを昆虫細胞中でのタンパク質産生に用いてもよい。プラスミドは、ｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）であってもよく、それを哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でのタンパク質産生に用いてもよい。
【０１１４】
（３）環状および線状ベクター
ベクターは、環状プラスミドであってもよく、これは、標的細胞を統合によって細胞性ゲノムに形質転換してもよく、あるいは、染色体外に存在してもよい（例えば、複製起点をもつ自律複製プラスミド）。
【０１１５】
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、ｐｒｏｖａｘ、または、抗原をコードするＤＮＡを発現することができ、かつ、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳できるようにすることが可能な発現可能な任意の他の発現ベクターであってもよい。
【０１１６】
また、本明細書で提供されるのは、線状核酸ワクチンまたは線状発現カセット（「ＬＥＣ」）であり、これは、電気穿孔を介して対象に効率よく送達され、かつ、１つ以上の所望の抗原発現することができる。ＬＥＣは、任意のリン酸バックボーンを欠いた任意の線状ＤＮＡであってもよい。ＤＮＡは、１つ以上の抗原をコードしてもよい。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、および／またはポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。抗原の発現は、プロモーターにより制御されてもよい。ＬＥＣは、任意の抗生物質抵抗性遺伝子および／またはリン酸バックボーンをを含んでいなくてもよい。ＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現に関連しない他の核酸配列を含んでいなくてもよい。
【０１１７】
ＬＥＣは、線状にすることが可能な任意のプラスミド由来であってもよい。プラスミドは、抗原発現可能であってもよい。プラスミドは、ｐＮＰ（プエルトリコ／３４）またはｐＭ２（ニューカレドニア／９９）であってもよい。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、ｐｒｏｖａｘ、または、抗原をコードするＤＮＡを発現することができ、かつ、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳できるようにすることが可能な任意の他の発現ベクターであってもよい。
【０１１８】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であってもよい。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであってもよい。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれｐＮＰ（プエルトリコ／３４）およびｐＭ２（ニューカレドニア／９９）由来であってもよい。
【０１１９】
（４）プロモーター、イントロン、停止コドン、およびポリアデニル化シグナル
ベクターは、プロモーターを有し得る。プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、単離核酸の発現を調節することができる任意のプロモーターであり得る。かかるプロモーターは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ経由の転写に要するシス作用配列要素であり、本明細書に記載の抗原配列を転写する。異種核酸の発現の指示に用いられるプロモーターは、特定の用途に依って選択される。プロモーターは、ベクターの転写開始部位から、これがその天然の設定における転写開始部位からの距離であるのとほぼ同じ距離に配置され得る。しかしながら、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失を伴うことなく対応し得る。
【０１２０】
プロモーターは、抗原をコードする核酸配列と、転写産物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、および翻訳終結に必要なシグナルとに機能的に連結し得る。
【０１２１】
プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞内で効率的な発現を示す他のプロモーターであってもよい。
【０１２２】
ベクターは、機能的スプライスドナー部位および機能的スプライスアクセプター部位を持つエンハンサーおよびイントロンを含み得る。ベクターは、効率よい終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含み得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよいし、あるいは、異なる遺伝子から得てもよい。
【０１２３】
（５）ベクターを調製する方法
本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されているＤＮＡワクチンを含むベクターを調製する方法である。ベクターを、哺乳類発現プラスミドにサブクローニング最終的なステップの後、当該技術分野で公知の方法を用いて、大規模発酵タンクで細胞培養物に接種するのに用いることができる。
【０１２４】
ＥＰ装置で用いられるベクターは、以下に詳細に記載するように、公知の装置および技術の組み合わせを利用して配合または製造することができるが、好ましくはそれらは、２００７年５月２３日に出願された許諾対象である同時係属中の米国特許仮出願第６０／９３９，７９２号に記載された最適化プラスミド製造技術を用いて製造される。幾つかの例において、これらの研究で用いたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で配合させることができる。その製造技術は、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されたものに加えて、２００７年７月３日発行の許諾対象特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されたものをはじめとする、当業者に概ね公知の様々な装置およびプロトコルも含み、組み入れている。先に参照された出願および特許である、米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ全体が本明細書に組み入れられる。
【０１２５】
ｃ．ワクチンの賦形剤および他の成分
ワクチンは、薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容しうる賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤としての機能的分子であり得る。薬学的に許容しうる賦形剤は、界面活性剤を含みうるトランスフェクション促進剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤であり得る。
【０１２６】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマートであり、ポリ−Ｌ−グルタマートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチン中に存在してもよい。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞を含んでいてもよく、ヒアルロン酸を用いて、遺伝的構築物と一体化させて投与してもよい。ＤＮＡプラスミドワクチンは、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、ＷＯ０９３２４６４０参照）などの当該技術分野で公知の他のリポソームをはじめとするリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知トランスフェクション促進剤を含んでいてもよい。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０１２７】
薬学的に許容可能な賦形剤は、１つ以上のアジュバントであり得る。アジュバントは、別のプラスミドから発現される他の遺伝子であることが可能であり、または、ワクチン中に上記プラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される。１つ以上のアジュバントは、ＣＣＬ２０、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘因性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１〜、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、変異体型ＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲＳ、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、欠失され、かつ、ＩｇＥ由来のシグナルペプチドなどの異なるシグナルペプチドを任意に含むシグナル配列をコードするシグナル配列もしくはコード配列、またはＩｇＥ由来のシグナルペプチドなどの異なるシグナルペプチドをコードするコード配列を有するＩＬ-１５、およびその機能的断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、アジュバントは、１つ以上のタンパク質、および／または、ＣＣＬ−２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、またはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸分子であり得る。ＩＬ-１２構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号と対応する米国特許出願第０８／９５６，８６５号、および２０１１年１２月１２日に提出された米国仮特許出願第６１／５６９６００号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ-１５構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号と対応する米国特許出願第１０／５６０，６５０号、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６号と対応する米国特許出願第１２／１６０，７６６号、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０４８８２７号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ-２８構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号と対応する米国特許出願第１２／９３６，１９２号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ、他の構築物、および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号と対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ、他の構築物、および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号と対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８に開示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。ケモカインＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫおよびＭＥＣ構築物、ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号と対応する米国特許出願第１１／７１９，６４６号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＯＸ４０および他の免疫調節因子の例は、米国特許出願第１０／５６０，６５３号に開示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。ＤＲ５および他の免疫調節因子の例は、米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
アジュバントとして有用であり得る他の遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、変異体型ＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、ＩＬ−２２、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびその機能的断片をコードするものが挙げられる。
【０１３０】
ワクチンは、参照により完全に組み込まれる、１９９４年４月１日に提出された米国特許出願第０２１，５７９号に記載されるような遺伝的ワクチン促進剤をさらに含み得る。
【０１３１】
ワクチンは、抗原およびプラスミドを約１ナノグラム〜約１００ミリグラム；約１マイクログラム〜約１０ミリグラム；好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム；さらに好ましくは約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量で含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、ＤＮＡを約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、ＤＮＡを約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、ＤＮＡを約０．１〜約５００マイクログラム含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、ＤＮＡを約１〜約３５０マイクログラム含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、抗原またはそのプラスミドを約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラム〜１００ミリグラム；約１マイクログラム〜約１０ミリグラム；約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム；約１ミリグラム〜約２ミリグラム、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム含んでいてもよい。
【０１３２】
ワクチンは、用いられる投与様式に従って配合してもよい。注射可能なワクチン医薬組成物は、滅菌されたパイロジェンフリーおよび微粒子フリーであってもよい。等張性配合剤または溶液が用いられてもよい。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。ワクチンは、血管収縮剤を含んでいてもよい。等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでいてもよい。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンをはじめとする安定化剤をさらに含んでいてもよい。ＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオンなどの安定剤により、配合剤を室温または周囲温度で長時間安定にさせることができる。
【０１３３】
３．ワクチンの送達方法
免疫反応を誘導することができる標的免疫原に対して特に有効となるエピトープを含む遺伝的構築物および抗原を供給するためのワクチンを送達する方法が本明細書において提供される。治療的免疫反応および予防的免疫反応を誘導するためのワクチンを送達する方法またはワクチン投与の方法が提供され得る。ワクチン投与過程は、哺乳類内で抗原に対する免疫反応を生成し得る。ワクチンは、哺乳類の免疫系の活性を調節し、免疫反応を高めるために、個体にワクチンを送達し得る。ワクチンの送達は、細胞内で発現し、その上で免疫系が認識し、細胞性反応、体液性反応、または細胞性反応と体液性反応を誘導する細胞表面に送達される核酸分子としての抗原のトランスフェクションであり得る。哺乳類に先に考察したようなワクチンを投与することにより、抗原に対する免疫反応を哺乳類内で誘導または誘発するために、ワクチンの送達を用いることができる。
【０１３４】
哺乳類の細胞にワクチンとプラスミドが送達されると、トランスフェクト細胞は、ワクチンから注入されたプラスミドそれぞれに対する抗原を発現し、分泌する。この抗原は免疫系によって異物として認識され、それらに対して抗体が生成される。これらの抗体は免疫系によって維持され、抗原に対して効果的に反応することができる。
【０１３５】
哺乳類内で免疫反応を誘発するために、哺乳類にワクチンを投与することができる。哺乳類は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、水牛、バイソン、ウシ属、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、およびニワトリであってもよい。
【０１３６】
ａ．併用治療
他のタンパク質および／またはＣＣＬ２０、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ-ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘因性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ-１２、欠失され、かつ、ＩｇＥのシグナルペプチドなどの異なるシグナルペプチドを任意に含むシグナル配列を有するＩＬ-１５を含むＩＬ-１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−２８、ＩＬ−ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、変異体型ＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲＳ、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、およびそれらの機能的断片またはそれらの組み合わせをコードする遺伝子と組み合わせてワクチンを投与することができる。いくつかの実施形態において、以下の核酸分子および／またはタンパク質の１つ以上と組み合わせてワクチンを投与する：ＣＣＬ２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、およびＲＡＮＴＥＳ、またはそれらの機能的断片の１つ以上をコードするコード配列を含む核酸分子からなる群から選択される核酸分子、ならびに、ＣＣＬ２０、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−２８タンパク質、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、ＲＡＮＴＥＳタンパク質、またはそれらの機能的断片からなる群から選択されるタンパク質。
【０１３７】
ワクチンを、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入、口腔投与、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせをはじめとする異なる経路で投与してもよい。獣医学的使用では、通常の獣医学的実践に従い、ワクチンを適切に許容しうる配合剤として投与してもよい。獣医は、特定の動物に最も適した投与レジメンおよび投与経路を、容易に決定することができる。ワクチンを、伝統的なシリンジ、針なし注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または他の物理的方法、例えば電気穿孔法（ＥＰ）、「水力学的方法」、または超音波により投与してもよい。
【０１３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法、リポソーム介在法、ナノ粒子促進法、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルスおよび組み換えワクシニアウイルスなどの組み換えベクターを用いる、および用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン投与とも称される）を含むいくつかの周知の技術により哺乳類にワクチンのプラスミドを送達することができる。ＤＮＡ注入により、ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法と共に抗原または免疫原を送達することができる。
【０１３９】
ｂ．電気穿孔法
ワクチンを、薬学技術分野の当業者に周知の標準的な技術に従って調製することができる。かかる組成物を、特定の対象の年齢、性別、体重、および状態、ならびに投与経路などの要因を考慮して、医学分野の当業者に周知の用量および技術によって投与することができる。対象は、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ネズミ、またはマウスなどの哺乳類であり得る。
【０１４０】
ワクチンを、予防的または治療的に投与することができる。予防的投与において、ワクチンは、免疫反応を誘導するのに十分な量で投与される。治療的適用の場合、ワクチンは、治療的作用を誘発するの十分な量で、それを必要とする対象に投与される。これを達成するために十分な量を、「治療的有効用量」として定義する。この用途のための有効量は、例えば、投与されるワクチン療法の特定の組成物、投与様式、疾患の段階および重症度、患者の全身健康状態、および処方する医師の判断に依存するであろう。
【０１４１】
ワクチンは、ワクチンは、ドネリー（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ）ら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７〜６４８（１９９７）；フェルナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら（１９９６年１２月３日に公布された米国特許第５，５８０，８５９号）；フェルナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら（１９９７年１２月３０日に公布された米国特許第５，７０３，０５５号）；およびカーソン（Ｃａｒｓｏｎ）ら（１９９７年１０月２１日に公布された米国特許第５，６７９，６４７号）に記載されているように当該技術分野で周知の方法によって投与され、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ワクチンのＤＮＡは、例えば、粒子またはビーズと複合体を形成して、これをワクチン銃を用いて個体に投与することができる。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容可能な担体の選択が、例えば、発現ベクターの投与経路に依存することを承知している。
【０１４２】
ワクチンを、多様な経路によって送達してもよい。典型的な送達経路には、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、または皮下送達が含まれる。他の経路には、経口投与、鼻腔内、および膣内経路が含まれる。特にＤＮＡワクチンに関して、ワクチンを、個体の組織の間質空間に送達することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，５８０，８５９号および第５，７０３，０５５号、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ワクチンは、筋肉に投与してもよいし、または、皮内または皮下注射を通して、あるいは、イオン導入法（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）による経皮投与を通して投与してもよい。ワクチンの表皮投与も用いることができる。表皮投与は、刺激物質に対する免疫反応を刺激するために、表皮の最も外側の層を機械的または化学的に刺激することを含むことができる（Ｃａｒｓｏｎら、米国特許第５，６７９，６４７号、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１４３】
また、ワクチンを、鼻腔内経路を通して投与するために調製することができる。担体が固体であって鼻腔投与に適した製剤には、粒径、例えば約１０ミクロン〜約５００ミクロンの範囲の粒径を有する目の粗い粉末が含まれ、鼻から吸うように投与される、すなわち、鼻に近づけて保持した粉末容器から鼻腔を通して急速に吸入することによって投与される。製剤は、点鼻スプレー、点鼻薬、またはネブライザーによるエアロゾル投与であってもよい。製剤は、ワクチンの水溶液または油性溶液を含み得る。
【０１４４】
ワクチンは、懸濁剤、シロップ、またはエリキシル剤などの液体調製物であり得る。また、ワクチンは、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば、注射投与）用の製剤、例えば、滅菌懸濁液またはエマルションであり得る。
【０１４５】
ワクチンは、リポソーム、ミクロスフェア、または他のポリマーマトリクスに組み込むことができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，７０３，０５５号；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉ巻〜ＩＩＩ巻（第２版、１９９３）、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。リポソームは、リン脂質または他の脂質からなり、作製および投与が比較的単純な、非毒性の、生理学的に許容される、代謝可能な担体であり得る。
【０１４６】
ワクチンのプラスミドの電気穿孔によるワクチンの投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得、好ましくは、エネルギーパルスは、ユーザーにより入力されたプリセット電流に近い定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含んでいてもよい。電気穿孔構成要素は、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリー成分、電源、および電源スイッチをはじめとする電気穿孔装置の１種以上の様々な要素を含み、それらを組み込んでいてもよい。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易化するｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔装置、例えばＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）  ＥＰシステム（ＶＧＸファーマシューティカルズ社製、ペンシルベニア州ブルーベル）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（ジェネトロニクス社（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）製、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて達成され得る。
【０１４７】
電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の一要素として機能してもよく、他の要素は、電気穿孔構成要素と連通する別々の要素（または構成要素）である。電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つを超える要素として機能してもよく、それが電気穿孔構成要素とは別々の電気穿孔装置の他の要素とも連通していてもよい。１つの電気機械的または機械的装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素は、その要素が１つの装置として、または互いに連通する別々の要素として機能しうるように限定しなくてもよい。電気穿孔構成要素は、所望の組織内で定電流を生成するエネルギーパルスを送達することができてもよく、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的配置内に複数の電極を有する電極アレイを含んでいてもよく、電極アセンブリは、電気穿孔構成要素からエネルギーパルスを受け、電極を介して所望の組織にそれを送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達時にはニュートラルであり、所望の組織中のインピーダンスを測定して、そのインピーダンスを電気穿孔構成要素に連通する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受けてもよく、電気穿孔構成要素により送達されたエネルギーパルスを調整して定電流を維持することができる。
【０１４８】
複数の電極が、分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよい。複数の電極は、プログラムされたシーケンス下の電極制御を介して、分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよく、プログラムされたシーケンスは、ユーザーにより電気穿孔構成要素に入力される。プログラムされたシーケンスは、順に送達された複数のパルスを含んでいてもよく、複数のパルスの各パルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を含む少なくとも２つの活性電極により送達され、複数のパルスの次のパルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を含む少なくとも２つの活性電極の異なる１つにより送達される。
【０１４９】
フィードバック機構は、ハードウエアまたはソフトウエアのいずれかにより実施してもよい。フィードバック機構は、アナログ閉回路により実施してもよい。フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓごとに起こるが、好ましくは実時間フィードバックまたは瞬時（すなわち、応答時間を決定するための入手可能な技術により決定すると実質的に瞬時）である。ニュートラル電極で所望の組織中のインピーダンスを測定してもよく、そのインピーダンスをフィードバック機構に連通し、フィードバック機構がインピーダンスに応答してエネルギーパルスを調整し、プリセット電流と類似の値の定電流を維持する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達時に定電流を連続および瞬時的に維持してもよい。
【０１５０】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進しうる電気穿孔装置および電気穿孔法の例としては、内容が全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されたそれらのものが挙げられる。ＤＮＡワクチンの送達を促進するのに用いられうる他の電気穿孔装置および電気穿孔法としては、その全てが全体として参照により本明細書に組み入れられた、２００６年１０月１７日出願の米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号に対して３５ＵＳＣ  １１９（ｅ）による利益を主張する、２００７年１０月１７日出願の同時係属中および共有の米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されたものが挙げられる。
【０１５１】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を促進するためのモジュラー電極システムおよびその使用が記載されている。モジュラー電極システムは、複数の針電極；皮下注射針；プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクター；および電源を含んでいてもよい。オペレータが、支持構造上に搭載された複数の針電極を掴み、体内または植物内の選択された組織にそれらをしっかりと挿入することができる。その後、皮下注射針を介して、生体分子を選択された組織へ送達する。プログラム可能な定電流パルス制御器を活性化して、定電流の電気パルスを複数の針電極に印加する。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間での細胞への生体分子導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全体的内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５２】
Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子導入を効果的に促進するために用いられうる電気穿孔装置が記載されている。該電気穿孔装置は、操作がソフトウエアまたはファームウエアに特定される電気運動装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤ装置は、ユーザ制御に基づく一列の電極とパルスパラメータ入力との間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存および取得を可能にする。電気穿孔装置は、針電極、注射針用の中央注入チャネル、および取り外し可能なガイドディスクのアレイを有する交換可能な電極ディスクも含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全体的内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５３】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載された電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または臓器にも深く浸透させるように適合され得る。電極アレイの形態によって、注射針（選択された生体分子を送達する）が、標的臓器にも完全に挿入され、電極によってあらかじめ描かれた領域の標的組織に垂直に注射投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載された電極は、好ましくは２０ｍｍ長および２１ゲージである。
【０１５４】
加えて、電気穿孔装置およびその使用を組み込んだいくつかの実施形態で予期される通り、以下の特許：１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号、２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、および２００５年９月６日発行の米国特許第６，９３９，８６２号に記載された電気穿孔装置が存在する。さらに、様々な装置のいずれかを用いたＤＮＡの送達に関係する２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡ注入の方法が注目された２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号に提供された主題を含む特許が、本明細書で企図される。先の特許は、全体として参照により組み入れられる。
【０１５５】
ワクチンは、米国特許第７，６６４，５４５号に記載の方法によりエレクトロポレーションを介して投与することができる。その内容は参照により本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションは、米国特許第６，３０２，８７４；同第５，６７６，６４６号；同第６，２４１，７０１号；同第６，２３３，４８２号；同第６，２１６，０３４号；同第６，２０８，８９３号；同第６，１９２，２７０号；同第６，１８１，９６４号；同第６，１５０，１４８号；同第６，１２０，４９３号；同第６，０９６，０２０号；同第６，０６８，６５０号；および同第５，７０２，３５９号に記載の方法および／または装置によってであってもよく、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションは、最小侵襲装置を介して行ってもよい。
【０１５６】
最小侵襲性電気穿孔装置（「ＭＩＤ」）は、上述のワクチンおよび関連流体を体組織に注入する装置であり得る。装置は、中空針、ＤＮＡカセット、および流体送込み手段を含んでもよく、装置は、針の体組織への挿入中にＤＮＡを体組織に同時に（例えば、自動的に）注入するように、使用時に流体送込み手段を作動するようになっている。これは、針が挿入されている間にＤＮＡおよび関連流体を徐々に注入する能力が体組織中の流体のより一様な分布をもたらすという利点を有する。また、注入されるＤＮＡのより大きい面積に渡る分布により、注入中に体感される痛みが低減され得る。
【０１５７】
ＭＩＤは、針を使用せずにワクチンを組織に注入することができる。ＭＩＤは、ワクチンが組織表面を貫通し、下層の組織および／または筋肉に入るような力で、ワクチンを小さなストリームまたはジェットとして注入することができる。小さなストリームまたはジェットの背後にある力は、マイクロオリフィスを通じた二酸化炭素などの圧縮ガスを瞬時に膨張させることで提供することができる。最小侵襲性電気穿孔装置およびそれらの使用方法の例については、米国公開特許出願第２００８／０２３４６５５号；米国特許第６，５２０，９５０号；米国特許第７，１７１，２６４号；米国特許第６，２０８，８９３号；米国特許第６，００９，３４７号；米国特許第６，１２０，４９３号；米国特許第７，２４５，９６３号；米国特許第７，３２８，０６４号；および米国特許第６，７６３，２６４号に記載されており、それぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
ＭＩＤは、痛みを伴わずに組織を貫通する液体の高速ジェットを生成する注射器を含み得る。かかる針なし注射器は市販されている。本明細書で利用することができる針なし注射器の例としては、米国特許第３，８０５，７８３号；同第４，４４７，２２３号；同第５，５０５，６９７号；および同第４，３４２，３１０号に記載のものが挙げられ、それぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
直接的または間接的な電気輸送に適した形態の所望のワクチンを、針なし注射器を用いて、治療対象組織に導入する（例えば、注入する）ことができる。これは、通常、組織表面に注射器を接触させ、ワクチンを組織に貫通させるのに十分な力で薬剤をジェット送達させて行う。例えば、治療対象組織が粘膜、皮膚、または筋肉の場合、薬剤を角質層を通じて皮層へ、または下層組織および筋肉それぞれへと貫通させるのに十分な力で、粘膜または皮膚表面に向けて薬剤を発射する。
【０１６０】
針なし注射器は、全タイプの組織、特に、皮膚および粘膜にワクチンを送達するのに適している。いくつかの実施形態において、針なし注射器は、ワクチンを含む液体を表面および対象の皮膚または粘膜に進ませるのに用いることができる。本発明の方法を用いて治療することができる様々なタイプの組織の代表的な例としては、膵臓、喉頭、鼻咽頭、下咽頭、中咽頭、唇、喉、肺、心臓、腎臓、筋肉、乳房、結腸、前立腺、胸腺、睾丸、皮膚、粘膜組織、卵巣、血管、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１６１】
ＭＩＤは、組織を電気穿孔する針状電極を有し得る。例えば、長方形または正方形パターンにセットされた複数の電極アレイにおける複数対の電極間にパルスを発生させることで、一対の電極間にパルスを発生させるよりも優れた結果がもたらされる。「薬剤および遺伝子の仲介送達用針電極（Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes）」と題された米国特許第５，７０２，３５９号に開示されているものは、針アレイであり、治療的処置中に複数対の針にパルス発生させ得るものである。参照によりその内容全体が完全に本明細書に組み込まれる該出願において、針は、円形配列で設置されているが、対向する対の針状電極間にパルスを発生させることが可能な接続器および切替装置を有する。一対の針状電極を用いて、組み換え発現ベクターを細胞に送達することができる。かかる装置およびシステムは、米国特許第６，７６３，２６４号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。あるいは、ＤＮＡの注入、および、通常の注射針に似た単一針によるエレクトロポレーションが可能な単一針装置を用いて、現在使用されている装置によって送達する場合よりも低い電圧パルスを印加することで、患者が受ける電気が走ったような感覚を減らすことができる。
【０１６２】
ＭＩＤは、１つ以上の電極アレイを含み得る。アレイは、同一直径または異なる直径の２つ以上の針を含み得る。針は等間隔または不等間隔に配置されていてもよい。針は、０．００５インチ〜０．０３インチ、０．０１インチ〜０．０２５インチ；または０．０１５インチ〜０．０２０インチであり得る。針は、直径０．０１７５インチであり得る。針は、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍ、またはそれ以上の間隔で配置されていてもよい。
【０１６３】
ＭＩＤは、１つのパルス発生器と、ワクチンを送達し、シングルステップでエレクトロポレーションパルスを与える２つ以上の針ワクチン注射器とからなり得る。パルス発生器により、パーソナルコンピュータ操作によるフラッシュカード経由でパルスや注入パラメータをフレキシブルにプログラミングできるだけでなく、エレクトロポレーションおよび患者データを包括的に記録・保存することができる。パルス発生器は、様々な電圧パルスを短時間で送達することができる。例えば、パルス発生器は、長さ１００ミリ秒（ｍｓ）の１５ボルトのパルスを３回送達することができる。かかるＭＩＤの例としては、米国特許第７，３２８，０６４号に記載されているイノビオバイオメディカル社（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製のＥｌｇｅｎ１０００システムであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６４】
ＭＩＤは、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（イノビオファーマシューティカルズ社製、ペンシルベニア州ブルーベル）装置およびシステムであってもよく、これは、生体または植物の選択された組織の細胞へＤＮＡなどの高分子の導入を円滑にするためのモジュール式の電極システムである。モジュール式の電極システムは、複数の針状電極；皮下注射針；プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針状電極への導電性連結を提供する電気接続器；および電源を含み得る。操作者は、支持構造に搭載される複数の針状電極を握り、生体または植物の選択された組織の中へそれをしっかりと挿入することができる。次いで皮下注射針を介して選択された組織の中に高分子を送達する。プログラム可能な定電流パルス制御器が活性化され、複数の針状電極に定電流の電気パルスが印加される。印加された定電流の電気パルスは複数の電極間で細胞への高分子の導入を促進する。細胞の過熱による細胞死は、定電流パルスにより組織内の電力消費を制限することで最小化される。Ｃｅｌｌｅｃｔｒａ装置およびシステムは、米国特許第７，２４５，９６３号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
ＭＩＤは、Ｅｌｇｅｎ１０００システム（イノビオファーマシューティカルズ社製）であり得る。Ｅｌｇｅｎ１０００システムは、中空針と流体送込み手段とを備える装置を含んでもよく、該装置は、針の体組織への挿入中に本明細書に記載のワクチンである流体を体組織に同時に（例えば、自動的に）注入するように、使用時に流体送込み手段を作動するようになっている。これは、針が挿入されている間に流体を徐々に注入する能力が体組織中の流体のより一様な分布をもたらすという利点を有する。また、注入される流体量のより大きい面積に渡る分布により、注入中に体感される痛みが低減されると考えられる。
【０１６６】
流体の自動注入は、注入される流体の実際の投与量の自動的な監視および登録を容易にする。このデータは所望なら、証拠資料用に制御ユニットにより記憶できる。
【０１６７】
注入速度は直線的であっても、非直線的であってもよく、注入は、針が治療対象の皮膚を通って挿入された後でかつそれらがさらに体組織に挿入される間に実行されることが理解されるであろう。
【０１６８】
本発明の装置によって流体を注入するのに適した組織は、腫瘍組織、皮膚、または肝組織を含むが、筋肉組織であってもよい。
【０１６９】
装置は、体組織への針の挿入をガイドする針挿入手段をさらに含む。流体の注入速度は、針の挿入速度により制御される。これは、注入速度に対し挿入速度を所望通りに整合できるように、針の挿入と流体の注入の両方を制御できるという利点を有する。それはまたユーザにとって装置をより操作しやすくする。所望なら、針を体組織に自動的に挿入する手段を設けることもできる。
【０１７０】
ユーザは、流体の注入を開始すべき時点を選ぶことができる。しかしながら理想的には、注入は針の先端が筋肉組織に到達したときに開始され、装置は針が流体の注入が始まる十分な深さまで挿入された時点を感知する手段を含む。これは、針が所望の深さ（これは通常は筋肉組織が始まる深さであろう）に到達したときに流体の注入が自動的に始まるようにできることを意味する。筋肉組織が始まる深さは、例えば、４ｍｍ（この値は針が皮膚層を通り抜けるのに十分であると思われる）の値等の予め設定された針の挿入深さとなるように取ることもできる。
【０１７１】
感知手段は、超音波プローブを含み得る。感知手段は、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知する手段を含み得る。この場合、この手段はそれ自体、体組織内の針の深さを記録しなくてもよいが、むしろ針が種々のタイプの体組織から筋肉に移動しながらインピーダンスまたは抵抗の変化を感知するようになっている。これらの代案のいずれも、比較的正確で操作が簡単な注入開始感知手段を提供する。所望なら針の挿入深さがさらに記録でき、それは流体の注入を制御するために使用でき、それにより針の挿入深さが記録されながら注入すべき流体の量が決定される。
【０１７２】
装置は、針を支持する基体と、中に基体を受容するハウジングとをさらに含み、基体がハウジングに対して第１の後方位置にあるときに針がハウジング内に引っ込められ、基体がハウジング内の第２の前方位置にあるときに針がハウジングか出ているように、基体はハウジングに対して移動可能である。これは、ハウジングが患者の皮膚の上に並べられ、そうして基体に対してハウジングを移動することにより針を患者の皮膚に挿入できるので、ユーザにとって好都合である。
【０１７３】
上に述べたように、針が皮膚に挿入されながら、針の長さに渡り流体が一様に分布するように制御された流体注入速度を達成することが望ましい。流体送込み手段は、制御された速度で流体を注入するようになっているピストン駆動手段を含み得る。ピストン駆動手段は、例えば、サーボモータにより駆動することもできる。しかしながら、ピストン駆動手段は、基体がハウジングに対して軸方向に移動されることにより作動され得る。流体送達の代わりの手段を設けてもよいことが理解されるであろう。従って、例えば、制御された、あるいは制御されない速度で流体を送達するために搾り出しができる閉じられた容器を注射器およびピストンシステムの代わりに設けることもできる。
【０１７４】
上記の装置は、どのようなタイプの注入にも使用できる。しかしながら、エレクトロポレーションの分野において特に有用であると考えられ、従って、それは、針に電圧を印加する手段をさらに含み得る。これは針が注入に使用されるだけでなく、エレクトロポレーション中の電極としても使用されることを可能にする。これは、電界が注入される流体と同じ領域に印加されることを意味するので特に好都合である。エレクトロポレーションには、前に注入された流体に電極を正確に合わせることが非常に難しいという問題が伝統的にあり、従って、注入された物質と電界の間の重なりを保証しようとして、ユーザは大きい領域に渡り必要以上に大量の流体を注入し、また大面積に渡り電界を印加する傾向にあった。本発明を使用すれば、電界と流体の良好な適合を達成しつつ、流体の注入量と電界の印加サイズの両方を減少できる。
【０１７５】
4. 治療方法 および／または予防
また、本明細書で提供されるのは、ワクチンをそれを必要とする対象において投与す方法である。疾患は、癌、例えば、ウィルムス腫瘍、ウィルムス腫瘍から生じる転移性癌、およびＷＴ１を発現する癌または腫瘍であり得る。ワクチンは、上述の送達方法で対象に投与することができる。ワクチンを対象に投与することにより、対象において免疫反応を誘導するかまたは誘発することができる。特に、ワクチンを対象に投与することにより、対象において体液性および／または細胞性の免疫反応を誘導または誘発することができる。
【０１７６】
特に、ワクチンにより、ウィルムス腫瘍、ウィルムス腫瘍から生じる転移性癌、および／またはＷＴ１発現腫瘍または癌の増殖を遅らせ、縮小させ、取り除かれるため、本方法は、ウィルムス腫瘍、ウィルムス腫瘍から生じる転移性癌、および／またはＷＴ１発現腫瘍または癌を有する対象を治療することができる。ウィルムス腫瘍、ウィルムス腫瘍から生じる転移性癌、および／またはＷＴ１発現腫瘍または癌の形成および増殖がワクチンによって阻害されるため、本方法は、対象内におけるウィルムス腫瘍、ウィルムス腫瘍から生じる転移性癌、および／またはＷＴ１発現腫瘍または癌を予防することもできる。上述のように、ワクチンは、体液性および／または細胞性の免疫反応を誘導または誘発する。この誘導された体液性および／または細胞性の免疫反応は、ウィルムス腫瘍、ウィルムス腫瘍から生じる転移性癌、および／またはＷＴ１発現腫瘍または癌を標的にするため、ワクチンを投与された対象内においてウィルムス腫瘍、ウィルムス腫瘍から生じる転移性癌、および／またはＷＴ１発現腫瘍または癌の増殖を遅らせ、縮小させ、取り除くことができる。ワクチンによって誘導された体液性および／または細胞性の免疫反応により、ワクチンを投与された対象内において任意のウィルムス腫瘍、ウィルムス腫瘍から生じる転移性癌、および／またはＷＴ１発現腫瘍または癌の形成や増殖を阻害することもできる。
【０１７７】
ワクチンの用量は、１μｇ〜１０ｍｇ有効成分／ｋｇ体重／時間であってもよく、２０μｇ〜１０ｍｇ有効成分／ｋｇ体重／時間であってもよい。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日おきに投与することができる。効果的な治療のためのワクチンの投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であってもよい。
【０１７８】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示される多くの態様を有する。
【実施例】
【０１７９】
５．実施例
以下に実施例を用いて本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、説明のためだけに記載されるものと理解されるべきである。上記の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の用途及び条件に適合させるために本発明の種々の変更例及び改変例を作ることができる。したがって、本明細書中に示され説明されているものに加え、本発明の種々の改変例が上記の説明から当業者には明らかであろう。そのような改変例も特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０１８０】
実施例において、本明細書に記載されている段階的アプローチを取って、ＷＴ１免疫原を生成した。いくつかの段階的な改変を通じてＷＴ１遺伝子を改変した。まず、ＷＴ１  ＲＮＡ構造を改変し、単一の全長転写産物を産生するようにした。次に、ＲＮＡ構造を５’末端で変化させ、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現を高めるためにコドン使用を改変した。最後に、ＷＴ１活性を修正し、ジンクフィンガー結合部位の一部分を削除するように、遺伝子のジンクフィンガードメインを変異させた。
【０１８１】
実施例１
最適化ＷＴ−１
ＷＴ１免疫原を生成するための段階的アプローチを開発した。まず、単一の全長転写産物のみが産生されるようにＲＮＡ構造の変化を設計することで、格段に制御された表現型を持つ免疫原を作成した。配列は、改変されたコドン使用選択も含み、ＲＮＡ構造を５’末端で変化させて、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現を高めた。従って、ＷＴ１免疫原は、発現用に最適化された。この改良型免疫原用の発現カセットをコードしたプラスミドを生成し、潜在的な免疫性およびＴ細胞ならびにＢ細胞応答を生成する能力について動物で試験した。エレクトロポレーションによるｉｎ  ｖｉｖｏ送達を高めるようにこのプラスミドワクチンを製剤化した。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達には特定の条件を用いた。
【０１８２】
この免疫原（ＷＴ１−ｐＶＡＸ１、ＷＴ１−ｐＶＡＸ２、ＷＴ１−ｐＶＡＸ３、ＷＴ１−ｐＶＡＸ４、およびＷＴ１−ｐＶＡＸ５と呼ばれる）をコードするプラスミドを、当該分野にて研究されている標準的なワクチンを代表するＷＴ１ワクチン（ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ１、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ２、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ３、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ４、およびＷＴ１−ｐＣＤＮＡ５と呼ばれる）と比較した。
【０１８３】
マウス研究を行った。改変型ＷＴ１ワクチン（すなわち、ベクターＷＴ１−ｐＶＡＸ１、ＷＴ１−ｐＶＡＸ２、ＷＴ１−ｐＶＡＸ３、ＷＴ１−ｐＶＡＸ４、およびＷＴ１−ｐＶＡＸ５）を接種されたマウスは、天然ＷＴ１（すなわち、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ１、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ２、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ３、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ４、およびＷＴ１−ｐＣＤＮＡ５）を含む従来型ＷＴ１ワクチンを接種されたマウスよりも大きな抗ＷＴ１  ＴおよびＢ細胞応答が認められた。
【０１８４】
動物（すなわち、ＢａｌＢ／Ｃマウス）を、全く同じ量のＷＴ−１プラスミド（新型ＷＴ１−ｐＶａｘワクチン（すなわち、ベクターＷＴ１−ｐＶＡＸ１、ＷＴ１−ｐＶＡＸ２、ＷＴ１−ｐＶＡＸ３、ＷＴ１−ｐＶＡＸ４、およびＷＴ１−ｐＶＡＸ５）かもしくは原型ＷＴ−１プラスミドワクチン（すなわち、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ１、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ２、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ３、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ４、およびＷＴ１−ｐＣＤＮＡ５）のいずれか）で３回免疫化した。Ｔ細胞アッセイ（すなわち、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）の結果を図１および図２に示す。新たに設計されたＷＴ−１ワクチン（すなわち、ベクターＷＴ１−ｐＶＡＸ１、ＷＴ１−ｐＶＡＸ２、ＷＴ１−ｐＶＡＸ３、ＷＴ１−ｐＶＡＸ４、およびＷＴ１−ｐＶＡＸ５）は、原型ＷＴ−１ワクチン（すなわち、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ１、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ２、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ３、ＷＴ１−ｐＣＤＮＡ４、およびＷＴ１−ｐＣＤＮＡ５）よりもＴ細胞応答の生成においておよそ４倍優れていることが明らかであった。図１および図２に示すように、従来型ワクチンでは低レベルまたは非機能性のＴ細胞免疫しか観察されなかった。これは、予め達成されているデータと一致した。
【０１８５】
この新型ＤＮＡワクチンが抗体反応を誘導する能力についても調べた。ＷＴ１−ｐＣＤＮＡワクチンまたはＷＴ１−ｐＶＡＸワクチンのいずれかで免疫化した動物の血清を回収することでこれらの研究を行った。ＷＴ１−ｐＣＤＮＡワクチンによるセロコンバージョンまたは抗体反応の誘導は観察されなかった（データ不図示）。これに対し、ＷＴ１−ｐＶＡＸ免疫原は、正しい特異性および分子量を有する強力なウエスタンブロット反応性を誘導し、ロバストなＷＴ１セロコンバージョンと強力な抗体反応を示した（図３）。送達変化およびＷＴ１免疫原の改良型デザインを通じてこのワクチン免疫遺伝子が改善されたことが、これらのデータにより一括して強力に支持された。
【０１８６】
免疫原の立体配座の性質が、腫瘍細胞内において天然遺伝子配列と明確に反応した最適化ＷＴ１免疫原を含むこれらのワクチンとして維持されていたこともこれらのデータにより示された。
【０１８７】
免疫原配列は、コード配列を２つの手段：（１）ジンクフィンガー領域を標的にし、ＷＴ１活性を改変する変異を誘導する、（２）重要なジンクフィンガー結合部位から配列を削除する、を通じてその天然構造を破壊するように改変することで標的にした。これらの変化を以下の実施例２および実施例３にまとめる。
【０１８８】
実施例２
コンセンサスＷＴ１
上述のように、最適化ＷＴ１免疫原（すなわち、実施例１に記載のようにＷＴ１遺伝子を最適化した）は、体液性および細胞性免疫反応を誘導した。ＷＴ１免疫原配列をさらに標的にし、改変するため、コンセンサスＷＴ１免疫原を生成した。
【０１８９】
具体的には、複数種からのＷＴ１配列を互いに比較した。以下の表１に示すように、ＷＴ１は高度に保存されている。従って、複数種からのＷＴ１配列を用いて、ＷＴ１コンセンサス配列を生成した。ＷＴ１コンセンサス配列は、ヒトＷＴ１と約９５％の同一性を共有した。得られたコンセンサスＷＴ１免疫原（ＣｏｎＷＴ１とも称される）は、ヒトＷＴ１と９５．９％の同一性を共有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する（図５）。
【０１９０】
【表１】
2019115369.tif 000003
【０１９１】
実施例３
ジンクフィンガー改変および除去
上記実施例２に記載のコンセンサスＷＴ１免疫原をさらに改変し、ＷＴ１免疫原の免疫原性を改善した。特に、ＷＴ１免疫原のカルボキシ末端（Ｃ末端）に位置するジンクフィンガーを破壊するようにコンセンサスＷＴ１免疫原を改変した。これらの改変には、２つのアミノ末端（Ｎ末端）ジンクフィンガーにおける亜鉛イオン（すなわち、ＣＣＨＨモチーフ）に配位している残基を置換して、改変ジンクフィンガーを持つコンセンサスＷＴ１免疫原（本明細書では、改変ジンクフィンガーを有するＣＯＮ  ＷＴ１またはＣｏｎＷＴ１−Ｌとも呼ばれる）を生成することを含んだ（図４および図５）。ＣＣＨＨモチーフのＣおよびＨ残基をグリシン（Ｇ）と置き換えた。免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列をＣｏｎＷＴ１−ＬペプチドのＮ末端上に配置した。ＣｏｎＷＴ１−Ｌは、配列番号１によりコードされ、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する（それぞれ、図６Ａおよび図６Ｂ）。
【０１９２】
図５は、コンセンサスＷＴ１免疫原（ＣｏｎＷＴ１）および改変ジンクフィンガーを持つコンセンサスＷＴ１免疫原（ＣｏｎＷＴ１−Ｌ）のアミノ酸配列のアライメントを示す。図５における陰影は、ＣｏｎＷＴ１とＣｏｎＷＴ１−Ｌとの間で異なる残基を示している。ＩｇＥリーダー配列をＣｏｎＷＴ１−Ｌに付加することに加えて、ＣｏｎＷＴ１−Ｌの残基３１２、３１７、３３０、３３４、３４２、３４７、３６０、および３６４は、ＣｏｎＷＴ１の対応する残基（すなわち、残基２９５、３００、３１３、３１７、３２５、３３０、３４３、および３４７）とは異なっていた。これらの差は、上述の２つのＮ末端ジンクフィンガーにおけるＣＣＨＨモチーフの改変を反映していた。
【０１９３】
さらに、コンセンサスＷＴ１免疫原を改変して、ジンクフィンガーを除去し、ジンクフィンガーを持たないコンセンサスＷＴ１免疫原（本明細書では、ジンクフィンガーを有しないＣＯＮ  ＷＴ１またはＣＯＮＷＴ１−Ｓとも呼ばれる）を生成した（図４）。ＣｏｎＷＴ１−Ｓは、配列番号３によりコードされ、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する（それぞれ、図７Ａおよび図７Ｂ）。
【０１９４】
実施例４
ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓをコードする構築物の発現分析
ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓをコードする核酸配列をｐＶＡＸ１ベクターに別々に配置した（ライフテクノロジーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）。得られたベクターは、それぞれ、ＷＴ１−ｐＶＡＸ−ＬおよびＷＴ１−ｐＶＡＸ−Ｓと名づけられた。ＷＴ１−ｐＶＡＸ−ＬおよびＷＴ１−ｐＶＡＸ−Ｓは、ｐＶＡＸ１と共に、細胞内でトランスフェクトし、これらのベクターからＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓの発現を確認した。ｐＶＡＸ１は陰性対照として使用した。
【０１９５】
トランスフェクション後、細胞を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色し、ＷＴ１に特異的な核および抗体をマーキングした。図８は、この染色結果を示す。図８において、左の欄および中央の欄は、ＤＡＰＩ染色およびＷＴ１染色を示し、右の欄は、ＤＡＰＩ染色とＷＴ１染色の合成を示す。ｐＶＡＸ１でトランスフェクトした細胞内のＷＴ１抗体で染色は検出されなかった。ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓの両方がそれぞれのベクターから発現されたことが、これらのデータにより示された。
【０１９６】
トランスフェクト細胞由来の溶解物の免疫ブロットによりＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓの発現についてさらに確認した。具体的には、免疫ブロットを抗ＷＴ１抗体でプローブした。図９に示すように、期待されたサイズのＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓが検出された（ＷＴ１−ｐＶＡＸ−ＬおよびＷＴ１−ｐＶＡＸ−Ｓとそれぞれ標識されたレーンを参照）。ｐＶＡＸ１でトランスフェクトした細胞から得られた溶解物でシグナルは検出されなかった。従って、ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓがトランスフェクト細胞内で発現されたことがこれらのデータにより示された。
【０１９７】
実施例５
ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓをコードする構築物により誘導された免疫反応
ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓをコードする構築物が免疫反応を誘導したかどうか判定するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２５μｇのＷＴ１−ｐＶＡＸ−ＬまたはＷＴ１−ｐＶＡＸ−Ｓでそれぞれ免疫化した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２５μｇのＷＴ１−ｐＶＡＸ（実施例１に記載のＷＴ１をコードする最適化構築物）または２５μｇのＷＴ１−ｐＣＤＮＡ（ＷＴ１をコードする非最適化構築物）でも免疫化した。未感作マウスを対照として使用した。
【０１９８】
具体的には、免疫化計画には、０週目、２週目、３週目、および５週目にそれぞれのワクチン２５μｇをマウスの各群に投与することを含んだ（図１０）。０週目にワクチン投与する前に各マウスから血液を採取したことで、この０週目の血液を抗体誘導の対照として使用した。マウスを犠牲にした５週目で二回目の血液を採取した。犠牲にしたマウスから脾細胞を単離し、以下に記載のＥＬＩＳｐｏｔアッセイで用いて、Ｔ細胞応答を調べた。
【０１９９】
ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓに対する細胞性免疫反応（すなわち、Ｔ細胞応答）をＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて調べた。ここでは、Ｔ細胞によって産生されたインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を測定した。図１１および図１２に示すように、ＷＴ１−ｐＶＡＸ構築物およびＷＴ１−ｐＣＤＮＡ構築物の免疫化により、未感作マウスで観察されたものと同様のＴ細胞応答が生成された。これに対し、ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ−Ｓをそれぞれ発現するＷＴ１−ｐＶＡＸ−Ｌ構築物およびＷＴ１−ｐＶＡＸ−Ｓ構築物は、最適化構築物および非最適化構築物（すなわち、それぞれ、ＷＴ１−ｐＶＡＸおよびＷＴ１−ｐＣＤＮＡ）と比べて著しく高いＴ細胞応答を生成した。図１１および図１２では、エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を反映した。
【０２００】
特に、ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ−Ｓ抗原は、最適化および非最適化構築物によって誘導されたＴ細胞応答よりも約４００倍高いＴ細胞応答を誘導した。従って、ＷＴ１のジンクフィンガーの改変および除去によりＷＴ１免疫原の免疫原性が著しく増加したことで、ＷＴ１免疫原に対する著しいＴ細胞応答が供給されたことがこれらのデータにより示された。
【０２０１】
５週目の血液からの血清が抗原に特異的な抗体を含んでいたかどうか判定することで、ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓ抗原に対する体液性免疫反応を調べた。具体的には、２９３Ｔ細胞をベクターＷＴ１−ｐＶＡＸ−ＬおよびＷＴ１−ｐＶＡＸ−Ｓでトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＷＴ１−ｐＶＡＸ−ＬまたはＷＴ１−ｐＶＡＸ−Ｓでトランスフェクトした細胞をＤＡＰＩで染色し、核およびＷＴ１−ｐＶＡＸ−ＬまたはＷＴ−ｐＶＡＸ−Ｓで免疫化したマウスの５週目の血液からの血清をマーキングした。図１３に示すように、ＷＴ１−ｐＶＡＸ−ＬまたはＷＴ１−ｐＶＡＸ−Ｓで免疫化したマウスの血清から、トランスフェクト細胞内においてＣｏｎＷＴ１−ＬまたはＣｏｎＷＴ１−Ｓ抗原をそれぞれ検出した。従って、ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓ抗原を発現する構築物の免疫化により、ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓ抗原に免疫反応性のある抗体の産生がもたらされたことがこれらのデータにより示された。
【０２０２】
ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓを発現する構築物による体液性免疫反応の誘導について免疫ブロッティングによりさらに調べた。具体的には、溶解物を上記トランスフェクト細胞から得て、ＷＴ１−ｐＶＡＸ−ＬまたはＷＴ１−ｐＶＡＸ−Ｓで免疫化したマウスの血清でプローブした。図１４は、代表的な免疫ブロットを示し、非トランスフェクト２９３Ｔ細胞から得られた溶解物をバックグラウンド対照として使用した。図１４の免疫ブロットを抗アクチン抗体でプローブし、３本のレーン間に同等量の溶解物がロードされていることが実証された。免疫化したマウスの血清には、ＣｏｎＷＴ１−ＬおよびＣｏｎＷＴ１−Ｓ抗原に免疫反応性のある抗体が含まれていたことがこれらのデータにより示され、上述の細胞染色結果が確認された。
【０２０３】
要するに、ＣｏｎＷＴ１−ＬまたはＣｏｎＷＴ１−Ｓ抗原のいずれかを発現する構築物は、ＩＦＮ−γと、ＣｏｎＷＴ１−ＳおよびＣｏｎＷＴ−Ｌ抗原に免疫反応性のある抗体とを産生した著しいＴ細胞応答を誘導した。
【０２０４】
前述の詳細な説明および添付の実施例は単に例証であり、添付された特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ定義される本発明の範囲の限定としてみなすべきではないことが理解される。
【０２０５】
開示された実施形態に対する、様々な変更および修正は当業者に明白であろう。そのような変更および修正は、本発明の化学構造、代替物、派生物、中間体、合成物、製剤および／または使用の方法に関するものを限定することなく含み、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１】
2019115369.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019115369.tif 000009
【図７】
2019115369.tif 000010
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月27日(2019.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リーダー配列を有しない配列番号２をコードする核酸配列、リーダー配列を有しない配列番号２の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、リーダー配列を有しない配列番号２に少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、リーダー配列を有しない配列番号２に少なくとも９８％同一であるタンパク質の少なくとも９０％の長さを含む断片をコードする核酸配列、リーダー配列を有しない配列番号４をコードする核酸配列、リーダー配列を有しない配列番号４の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、リーダー配列を有しない配列番号４に少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、およびリーダー配列を有しない配列番号４に少なくとも９８％同一であるタンパク質の少なくとも９０％の長さを含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、ウィルムス腫瘍免疫原としての機能を有する単離核酸分子。
【請求項２】
リーダー配列を有しない配列番号１、リーダー配列を有しない配列番号１の長さの少なくとも９０％を含む断片、リーダー配列を有しない配列番号１に少なくとも９８％同一である核酸配列、リーダー配列を有しない配列番号１に少なくとも９８％同一である核酸配列の少なくとも９０％の長さを含む断片、リーダー配列を有しない配列番号３、リーダー配列を有しない配列番号３の長さの少なくとも９０％を含む断片、リーダー配列を有しない配列番号３に少なくとも９８％同一である核酸配列、およびリーダー配列を有しない配列番号３に少なくとも９８％同一である核酸配列の少なくとも９０％の長さを含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、ウィルムス腫瘍免疫原としての機能を有する単離核酸分子。
【請求項３】
前記分子が、プラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれる請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の１つ以上の核酸分子を含む組成物。
【請求項５】
請求項２に記載の１つ以上の核酸分子を含む組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の１つ以上の核酸分子を含むワクチン。
【請求項７】
請求項２に記載の１つ以上の核酸分子を含むワクチン。
【請求項８】
ＷＴ１発現腫瘍を有する個体を治療するための医薬組成物であって、
ＷＴ１発現腫瘍の増殖を遅らせる、ＷＴ１発現腫瘍を縮小させるかもしくは取り除くのに有効な量の請求項６または７に記載のワクチンを含む、医薬組成物。
【請求項９】
個体内のＷＴ１発現腫瘍を予防するための医薬組成物であって、
ＷＴ１発現腫瘍の形成または増殖を阻害するのに有効な量の請求項６または７に記載のワクチンを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
リーダー配列を有しない配列番号２、リーダー配列を有しない配列番号２の長さの少なくとも９０％を含む断片、リーダー配列を有しない配列番号２に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、リーダー配列を有しない配列番号２に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列の少なくとも９０％の長さを含む断片、リーダー配列を有しない配列番号４、リーダー配列を有しない配列番号４の長さの少なくとも９０％を含む断片、リーダー配列を有しない配列番号４に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、およびリーダー配列を有しない配列番号４に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列の少なくとも９０％の長さを含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ウィルムス腫瘍免疫原としての機能を有するタンパク質。
【請求項１１】
ウィルムス腫瘍免疫原としての機能を有する核酸分子を含むワクチンであって、
（ａ）前記核酸分子が、リーダー配列を有しない配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む；または、
（ｂ）前記核酸分子が、リーダー配列を有しない配列番号３に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むワクチン。
【請求項１２】
（ａ）リーダー配列を有しない配列番号２に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド；または、
（ｂ）リーダー配列を有しない配列番号４に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド
をさらに含む請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記核酸分子が、発現ベクターを含む請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１４】
薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１５】
アジュバントをさらに含む請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１６】
ウィルムス腫瘍免疫原としての機能を有する核酸分子を含むワクチンであって、
（ａ）前記核酸分子が、リーダー配列を有しない配列番号２に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードし；または、
（ｂ）前記核酸分子が、リーダー配列を有しない配列番号４に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードするワクチン。
【請求項１７】
（ａ）リーダー配列を有しない配列番号２に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド；または、
（ｂ）リーダー配列を有しない配列番号４に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド
をさらに含む請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記核酸分子が、発現ベクターを含む請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１９】
薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む請求項１６に記載のワクチン。
【請求項２０】
アジュバントをさらに含む請求項１６に記載のワクチン。
【請求項２１】
リーダー配列を有しない配列番号１に記載の核酸配列を含む、ウィルムス腫瘍免疫原としての機能を有する核酸分子。
【請求項２２】
リーダー配列を有しない配列番号３に記載の核酸配列を含む、ウィルムス腫瘍免疫原としての機能を有する核酸分子。
【請求項２３】
リーダー配列を有しない配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、ウィルムス腫瘍免疫原としての機能を有するペプチド。
【請求項２４】
リーダー配列を有しない配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、ウィルムス腫瘍免疫原としての機能を有するペプチド。
【請求項２５】
抗原を含むワクチンであって、前記抗原が、リーダー配列を有しない配列番号１またはリーダー配列を有しない配列番号３によりコードされるワクチン。
【請求項２６】
前記抗原が、リーダー配列を有しない配列番号１によりコードされる請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記抗原が、リーダー配列を有しない配列番号３によりコードされる請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２８】
前記抗原が、リーダー配列を有しない配列番号２またはリーダー配列を有しない配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２９】
前記抗原が、リーダー配列を有しない配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３０】
前記抗原が、リーダー配列を有しない配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３１】
ウィルムス腫瘍免疫原としての機能を有するペプチドを含むワクチンであって、
（ａ）前記ペプチドが、リーダー配列を有しない配列番号２に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；または、
（ｂ）前記ペプチドが、リーダー配列を有しない配列番号４に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むワクチン。
【請求項３２】
前記ペプチドが、リーダー配列を有しない配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む請求項３１に記載のワクチン。
【請求項３３】
前記ペプチドが、リーダー配列を有しない配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む請求項３１に記載のワクチン。