(57)【要約】【課題】新たなヒアルロン酸合成阻害剤、およびヒアルロン酸が関与する疾患または状態の治療または予防剤を提供する。【解決手段】  ある態様のヒアルロン酸合成阻害剤は、コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を含む。また、ある態様のヒアルロン酸が関与する疾患または状態の治療または予防剤は、コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を含むことを特徴とするヒアルロン酸合成阻害剤。
【請求項２】
コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を含むことを特徴とするヒアルロン酸が関与する疾患または状態の治療または予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸合成阻害剤、およびヒアルロン酸が関与する疾患または状態の治療または予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ，ＨＡ）はグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンの二糖の繰り返し構造から成るグリコサミノグリカンで、生体に幅広く存在し強力な保水作用を有すると共にＨＡ特異的結合分子との相互作用を通じて様々な生体内機能を発揮している。特に癌の研究分野において、ＨＡは癌細胞同士の接着阻害と癌細胞の遊走促進を通じて癌浸潤を亢進させることがわかっている（例えば非特許文献１参照）。
【０００３】
これまでにヒアルロン酸合成阻害剤としては４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）がよく知られており（例えば非特許文献２参照）、種々の実験系にて汎用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Bohaumilitzky L, Huber AK, Stork EM, Wengert S, Woelfl F, Boehm H: A Trickster in Disguise: Hyaluronan's Ambivalent Roles in the Matrix.. Front Oncol. 7, 242-1-19, 2017.
【非特許文献２】Kudo D, Suto A, Hakamada K: The Development of a Novel Therapeutic Strategy to Target Hyaluronan in the Extracellular Matrix of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Int J Mol Sci. 18, 600-1-10, 2017.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、４−ＭＵは細胞質内でドナー基質と競合することによってＨＡの合成を抑制するため、細胞質内の糖ヌクレオチド濃度や細胞のエネルギー代謝に影響を及ぼすという欠点がある。ＨＡＳ遺伝子の転写調節機構に関しては未だ十分に解明されたとはいえず、ＨＡＳ遺伝子の転写を特異的に抑制する分子はこれまでに見つかっていなかった。
【０００６】
本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、新たなヒアルロン酸合成阻害剤およびヒアルロン酸が関与する疾患または状態の治療または予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明のある態様のヒアルロン酸合成阻害剤は、コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を含む。
【０００８】
本発明の別の態様は、ヒアルロン酸が関与する疾患または状態の治療または予防剤である。該治療または予防剤はコノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、新たなヒアルロン酸合成阻害剤およびヒアルロン酸が関与する疾患または状態の治療または予防剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１（Ａ）は、ヒト包皮線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢをコノフィリン（ＣＮＰ）単独（左）で図示の濃度で、またはＣＮＰと１０ｎＭ  ＴＧＦβとを組み合わせたもので(右)、２４時間処理した後のＭＴＴによる生存能の評価結果を示す図である。図１（Ｂ）は、同様にＮＢ１ＲＧＢ細胞を４８時間処理した後の生存能の評価結果を示す図である。図１（Ｃ）は、同様にＮＢ１ＲＧＢ細胞を１２０時間処理した後の生存能の評価結果を示す図である。
【図２】図２（Ａ）はＴＧＦβの存在下または非存在下でＣＮＰ処理した後、上方制御された遺伝子(３９遺伝子；倍率変化，＞５．０）および下方制御された遺伝子(５３遺伝子，倍率変化＜０．２)のヒートマップである。図２（Ｂ）は、Ｐａｎｔｈｅｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを用いた遺伝子オントロジー分析の結果を示す円グラフ（分子経路）である。
【図３】図３（Ａ）および図３（Ｂ）は、Ｐａｎｔｈｅｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを用いた遺伝子オントロジー分析の結果を示す円グラフ（細胞成分（図３（Ａ））および分子機能（図３（Ｂ）））である。図３（Ｃ）は、ＣＮＰで処理した細胞と非処理細胞との間の遺伝子発現の差異を示すグラフである。
【図４】図４（Ａ）および図４（Ｂ）は、図示の時間ＣＮＰで処理した細胞のＨＡＳ２（図４（Ａ））およびＨＡＳ２ＡＳ（図４（Ｂ））のｑＲＴ−ＰＣＲで評価した発現量を示す図である。図４（Ｃ）は、粒子排除アッセイの下での、図示のようにＣＮＰおよびＴＧＦβで処理したＮＢ１ＲＧＢ細胞を示す図である。図４（Ｄ）は、ＥＬＩＳＡで測定した細胞および細胞外マトリックス中のＨＡ量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本実施の形態に係るヒアルロン酸阻害剤は、コノフィリン（以下、ＣＮＰとも称する）またはその薬理学的に許容される塩を含む。コノフィリンの薬理学的に許容される塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩等が挙げられる。以下、本明細書では、「コノフィリン」という用語は、その薬理学的に許容される塩を含むものとする。
【００１２】
コノフィリンは、ヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子であるＨＡＳ１およびＨＡＳ２の転写を特異的かつ強力に阻害し、それによって、ヒアルロン酸の合成を阻害する。したがって、コノフィリンはヒアルロン酸合成阻害が求められる実験系での使用に有効である。さらに、コノフィリンはヒアルロン酸が関与する疾患または状態の治療または予防にも有効である。
【００１３】
実施の形態に係るヒアルロン酸阻害剤は、精製したコノフィリンを含んでもよく、コノフィリンを含有する植物やその乾燥物、またはその植物の抽出液や抽出物を含んでもよい。コノフィリンは、例えば、キョウチクトウ科の植物であるエルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉に多量に含まれている（Umezawa, K.ら Anticancer Res. 14:2413-2418(1994)）。したがって、その葉を用いることができるが、コノフィリンが含まれてさえすれば、どの植物のどの部位をも用いることができる。
【００１４】
コノフィリンを含有する植物の乾燥物は、コノフィリンを含有する植物を、そのままでまたは粉砕した後、自然乾燥、凍結乾燥、温風乾燥などの方法によって乾燥することによって得ることができる。さらに乾燥物を粉砕し、粉末状にしてもよい。
【００１５】
コノフィリンを含有する植物の抽出液は、コノフィリンを含有する植物またはその乾燥物に溶媒を加え、コノフィリンを溶媒中に溶出させることによって得ることができる。溶媒としては、例えば、水、アルコール、酢酸エチル、クロロホルム、または２種以上の混合溶媒を用いることができる。これらの中でも安全性の面から水、エタノール、またはこれらの混合物を用いることが好ましい。なお、溶媒中への有効成分の溶出において、撹拌、粉砕、加熱などによって、コノフィリンの溶出量の増加およびコノフィリンの溶出時間の短縮を図ることができる。このようにして得られた抽出液は、葉の残渣を除去せず、薬剤の有効成分としてそのまま用いることができる。また、抽出液中の葉の残渣を濾過法又は遠心分離法により除去した抽出液を用いてもよい。さらに、公知の方法によって、抽出液から溶媒を除去することにより、固形物である抽出物を得ることもできる。
【００１６】
なお、コノフィリンは、特開平７−２３３０７１号公報、国際公開第２００４／０９９２１５号などに記載の方法に準じて製造することができる。上述の抽出液や、抽出物の溶液を液体クロマトグラフィーなどにより分離精製することにより製造することもできる。
【００１７】
実施の形態に係るヒアルロン酸合成阻害剤は、ヒアルロン酸合成の阻害が求められる実験系で有効に使用することができる。また、該ヒアルロン酸合成阻害剤は、ヒアルロン酸が関与する疾患または状態の治療または予防に有効である。したがって、本発明の別の実施形態は、コノフィリンまたはその薬学的に許容される塩を含むヒアルロン酸が関与する疾患または状態の治療または予防剤である。ヒアルロン酸が関与する疾患または状態としては、癌浸潤、悪性中皮腫、炎症性疾患、臓器線維症（肝繊維症、肺繊維症など）、変形性膝関節症、関節リウマチ等が挙げられる。
【００１８】
実施の形態にかかるヒアルロン酸阻害剤および上記疾患または上記状態の治療または予防剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などとして、脊椎動物に経口投与してもよいし、注射剤、坐剤などの製剤として、腹腔内や静脈内への注射により非経口投与することもできる。製剤中のコノフィリンの含有率は、１〜９０重量％の間で変動させることができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの形態をとる場合には、有効成分を５〜８０重量％含有させるのが好ましい。シロップ剤などの液剤の場合には、有効成分を１〜３０重量％含有させるのが好ましい。さらに、非経口投与する注射剤の場合には、有効成分を１〜１０重量％含有させるのが好ましい。 製剤の調製は、賦形剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトールなどの糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシなどのデンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機物、結晶セルロースなど）、結合剤（デンプンのり液、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油）、崩壊剤（デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、ＣＭＣ・Ｎａ、ＣＭＣ・Ｃａ、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど）、矯味矯臭剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、芳香性精油類など）、溶剤（注射用水、滅菌精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油など）、安定剤（窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸などのキレート剤、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、ロンガリットなどの還元物質など）、保存剤（パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェノール、塩化ベンザルコニウムなど）、界面活性剤（水素添加ヒマシ油、ポリソルベート８０、２０など）、緩衝剤（クエン酸、酢酸、リン酸のナトリウム塩、ホウ酸など）、希釈剤などの製剤添加物を用いて、公知の方法で行うことができる。
【００１９】
製剤の投与量や投与回数は、投与対象者の症状、年齢、性別、体重、投与方法などにより適宜変更し得る。例えば、製剤をヒトに経口投与する場合には、１日あたり約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、１回または数回に分けて投与してもよい。また、症状によっては、製剤を予防的に投与することもできる。
【００２０】
製剤の投与対象としては特に限定されず、例えば、ほ乳類であってもよい。脊椎動物の具体例としては、ヒト、マウス、ラット、牛、ブタ、犬、猫、マーモセットなどが挙げられる。
【００２１】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００２２】
（実施例１：コノフィリン（ＣＮＰ）の調製）
実施例で用いたコノフィリンは、Fujiiらの論文（M. Fujii, I. Takei and K. Umezawa: Antidiabetic effect of plant extract containing conophylline by oral administration in streptozotocin-treated and Goto-Kakizaki rats. Biomedicine &. Pharmacotherapy 63: 710-716, 2009）に従って、調製した。具体的には、沖縄県宮古島で栽培したタベルネモンタナ・ディヴァリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉を６０℃の温風乾燥機により１６時間乾燥させて乾燥葉を得た。乾燥葉３００ｇを家庭用ミルで粉砕し、３Ｌの６０容量％のエタノールを加えてコノフィリン及びコノフィリジンを抽出した。遠心分離により上清を回収し、沈殿に再度６０容量％のエタノールを３Ｌ加えて再度抽出操作を行い、上清を回収した。回収した上清を混合し、エバポレーターでエタノールの除去と濃縮を行った後に凍結乾燥し、約５０ｇの乾燥物を得た。この乾燥物中、コノフィリンは２２ｍｇ／ｇの割合で含まれている。
【００２３】
（実施例２：コノフィリンのヒアルロン酸合成阻害効果）
（実験手順）
（細胞培養）
ヒト包皮線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢは、日本文部科学省のナショナルバイオリソースプロジェクトを通じて理研バイオリソースセンターによって提供され、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中で、３７℃で、５％ＣＯ２でインキュベーター内にて増殖させた。すべての実験で３継代までの線維芽細胞を用いた。
【００２４】
（ＭＴＴアッセイ）
増殖期およびコンフルエント期のＮＢ１ＲＧＢ細胞を９６ウェルに蒔き、４８時間培養した。培地を新しいものに置換し、ＣＮＰ（０．０２５，０．１，０．１５，０．１，０．２，０．３μｇ／ｍＬ）を添加し、細胞を２４、４８、１２０時間培養した。次に、ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）染料溶液を各ウェルに添加し、４時間インキュベートし、５７０ｎｍでの吸収を、自動ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社，Ｖａｎｔａａ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて決定した（Seubwai, W., Vaeteewoottacharn, K., Kraiklang, R., Umezawa, K., Okada, S., Wongkham, S. (2016) Inhibition of NF-κB activity enhances sensitivity to anticancer drugs in cholangiocarcinoma cells. Oncol. Res. 23, 21-28）。
【００２５】
（マイクロアレイ分析）
細胞を８０％コンフルエンスで蒔き、１６時間培養し、各濃度（０．０２５，０．１μｇ／ｍＬ）のＣＮＰを添加し、細胞を１時間インキュベートした。次に、ＴＧＦβを添加し、細胞を６時間培養した。ＰＢＳで洗浄後、細胞および細胞外マトリックスを回収し、マイクロアレイ分析に適用した。網羅的な遺伝子発現分析を行い、２７，９５８遺伝子を調べることが可能なＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ４ｘ４４Ｋマイクロアレイチップ（Ｇ４８４５Ａ，ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＴＧＦβ＋および−、ＣＮＰ＋および−の群の間で結果を比較した。遺伝子発現プロファイリングの分析のために、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて製造者の説明書に従って全ＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、単離したＲＮＡの質を確認した。ｃＤＮＡマイクロアレイ分析の実験手順は、製造者の説明書（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に従って実施した。要約すると、ｃＤＮＡ合成およびシアニン３（Ｃｙ３）染料でのｃＲＮＡ標識をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社)を用いて実施した。
【００２６】
Ｃｙ３標識ｃＲＮＡを精製し、断片化し、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎハイブリダイゼーションキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、４３，３７７オリゴヌクレオチドプローブを含むヒトＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ４×４４Ｋマイクロアレイチップ上でハイブリダイズした。６０℃で１７時間インキュベーションした後、マイクロアレイスライドを洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡマイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社)を用いてスキャンした。
【００２７】
スキャンしたデータを、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  １１．０．１．１，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて定量した。次に、シグナル強度を先に記載されているように正規化した（Huber, W., von Heydebreck, A., Sultmann, H., Poustka, A., Vingron, M. (2002) Variance stabilization applied to microarray data calibration and to the quantification of differential expression. Bioinformatics. 18, 96-104）。遺伝子発現の変化を以下の通りにして検出した。正規化値の差異＝｛ＣＮＰ処理細胞（０．０２５μＭおよび０．１μＭ）−非処理細胞の平均化した正規化値）、上方制御された遺伝子を、正規化値＞０．５５（倍率変化＞５．０）からの差異で決定し、下方制御された遺伝子を、正規化値＜−０．５５（倍率変化＜−０．２）からの差異で決定した。生および正規化したマイクロアレイデータをＮＣＢＩのＧＥＯデータベース（受入番号ＧＳＥ１０４８１３；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE106401）に投稿した。
【００２８】
（リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ））
細胞を増殖期で培養し、ＣＮＰを上記の濃度で添加した。０，３，６および１２時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、回収し、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商標）(ＱＩＡＧＥＮ社)で抽出した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて合成した。
【００２９】
（赤血球排除アッセイ）
細胞周囲のＨＡコートの評価を先に記載されているように実施した（Knudson, C. B. (1993) Hyaluronan receptor-directed assembly of chondrocyte pericellular matrix. J. Cell. Biol. 120, 825-834）。細胞を２日間培養し、ＣＮＰおよび／またはＴＧＦβでさらに２日間処理した。次に、培養上清を除去し、グルタルアルデヒド固定ウサギ赤血球を添加した。１５分後、細胞を位相差顕微鏡で観察した。
【００３０】
（ＨＡ量の定量）
細胞を６０％コンフルエンスで蒔き、２４時間培養した。次に、ＰＢＳで２回洗浄後、培地をＦＢＳなしのＤＭＥＭに置換し、１６時間インキュベートした。ＣＮＰおよびＴＧＦβを上記と同様に添加し、細胞を３日間培養した。細胞外マトリックスと共に細胞をＣｙｔｏＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）で回収した。ＨＡ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ(ＣＯＳＭＯ  Ｂｉｏ社)を用いてヒアルロン酸を定量した。
【００３１】
（統計分析）
データは平均±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）として表した。統計分析を、ＡＮＯＶＡを用いて、事後解析（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）によって行った。０．０５の確率値を統計的に有意とみなした。
【００３２】
（結果）
最初に、増殖ＮＢ１ＲＧＢ細胞およびコンフルエントなＮＢ１ＲＧＢ細胞を異なる濃度のＣＮＰで処理し、その細胞毒性を調べた。図１は、ＮＢ１ＲＧＢ細胞の生存能に対するコノフィリン（ＣＮＰ）の効果を示す。細胞をＣＮＰ単独（左）で図示の濃度で、またはＣＮＰと１０ｎＭ  ＴＧＦβとを組み合わせたもので（右）、２４時間（Ａ）、４８時間（Ｂ）、１２０時間（Ｃ）処理し、ＭＴＴによって生存能を評価した。増殖期の下では、０．１μｇ／ｍＬ以上の濃度のＣＮＰは、細胞数を減少させ、これは早ければ処理後２日目から明らかとなった。５日目には、０．１μｇ／ｍＬのＣＮＰで処理した細胞は、非処理の細胞の〜４０％に減少した。より高いＣＮＰ濃度では細胞は生存しなかった（図１）。これに対して０．０２５μｇ／ｍＬＣＮＰで処理は、２０％のみの細胞増殖の阻害を示した。ＣＮＰをコンフルエントなＮＢ１ＲＧＢ細胞に添加した場合、細胞数は０．０２５μｇ／ｍＬ以上の濃度で減少した。したがって、以下の実験では、細胞を０．０２５または０．１μｇ／ｍＬのＣＮＰで処理した。
【００３３】
ＣＮＰ処理によって発現が影響される具体的な分子を検出するために、マイクロアレイ分析を行った。ＮＢ１ＲＧＢ細胞を２日間培養し、ＣＮＰおよび／またはＴＧＦβ  （Ｔβ）でさらに２日間処理した。次に、ＣＮＰ処理細胞および未処理細胞から全ＲＮＡを抽出し、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ４ｘ４４Ｋマイクロアレイチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてｃＤＮＡマイクロアレイ分析にかけた。
【００３４】
図２および図３は遺伝子発現分析の結果を示す図である。図２（Ａ）はＴＧＦβの存在下または非存在下でＣＮＰ処理した後、上方制御された遺伝子(３９個の遺伝子；倍率変化，＞５．０）および下方制御された遺伝子(５３個の遺伝子，倍率変化＜０．２)のヒートマップである。ヒートマップは、サンプルごとに正規化した値およびTreeviewソフトウェアを用いて構築した。対応する遺伝子名は、右に注釈した。図２（Ｂ）、図３（Ａ）、図３（Ｂ）は、Ｐａｎｔｈｅｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを用いた遺伝子オントロジー分析の結果を示す。上方制御および/または下方制御された遺伝子をＰＡＮＴＨＥＲ−Ｇｅｎｅ  Ｌｉｓｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ(www.pantherdb.org/)を用いて分類した。遺伝子のパーセンテージを示す円グラフは、それぞれ分子経路（図２（Ｂ））、細胞成分（図３（Ａ））および分子機能（図３（Ｂ））に分類される。図３（Ｃ）は、ＣＮＰで処理した細胞および非処理細胞との間の遺伝子発現の差異を示すグラフである。スキャニングによって得られた生の蛍光値をＨＡＳ２およびＧＡＰＤＨの遺伝子発現の比較に使用した（*Ｐ＜０．０１および**Ｐ＜０．００１，有意差）。
【００３５】
全２７，９５８個の遺伝子を分析した際、ＴＧＦβの存在または非存在下で、ＣＮＰ処理の６時間後、３９個の遺伝子が＞５倍上方制御され、５３個の遺伝子が＜０．２倍下方制御された（図２Ａ）。Ｐａｎｔｈｅｒ分類分析（ＰＣＡ）は、ＣＮＰで抑制された遺伝子の２２％がヘテロ三量体Ｇ−タンパク質シグナル経路−ＧｑαおよびＧ０α介在経路に関連したタンパク質（例えばＢＤＫＲＢ１、ＲＡＳＧＲＰ１、ＳＳＴＲ１およびＢＤＫＲＢ２）をコードし、１１％が炎症シグナル経路に関連したタンパク質（例えばＩＬ６およびＮＦＡＴＣ４）をコードしていることを示した（図２Ｂ）。さらに、細胞成分によるＰＣＡは、ＣＮＰがＨＡＳ１およびＨＡＳ２を含む膜関連遺伝子の発現を下方制御することを示した（図３Ａ）。
【００３６】
さらに、分子機能によるＰＣＡは、ＣＮＰが、触媒活性（２３％、例えばＤＧＫ１、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＮＯＸ４）、受容体活性（２３％、ＢＤＫＲＢ１、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ２１ＲおよびＳＳＴＲ１）および結合活性（３９％、ＡＤＡＭＴＳ４、ＣＸＣＬ１２およびＮＦＡＴＣ４）をコードする遺伝子の発現を下方制御することを示した（図３Ｂ）。ヒアルロン酸合成酵素をコードするＨＡＳ１とＨＡＳ２の両方の生の蛍光強度が、処理なしのものと比較して、ＣＮＰ処理後に有意に減少した（図３Ｃ）。これらの結果は、ＣＮＰが、ＮＢ１ＲＧＢ細胞内でＨＡＳ遺伝子の発現を下方制御することを示唆する。
【００３７】
マイクロアレイの結果を検証するために、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。図４（Ａ）は、図示の時間ＣＮＰで処理した細胞のＨＡＳ２のｑＲＴ−ＰＣＲで評価した発現量を示す。図４（Ｂ）は、図示の時間ＣＮＰで処理した細胞のＨＡＳ２ＡＳのｑＲＴ−ＰＣＲで評価した発現量を示す。図４（Ｃ）は、粒子排除アッセイの下での、図示のようにＣＮＰおよびＴＧＦβで処理したＮＢ１ＲＧＢ細胞を示す。図４（Ｄ）は、ＥＬＩＳＡで測定した細胞および細胞外マトリックス中のＨＡ量を示す。ＨＡＳ２の発現量は、０．０２５または０．１μｇ／ｍＬのＣＮＰでの処理から３時間後に劇的に減少した（図４Ａ）。ＨＡＳ２発現が、そのアンチセンスＲＮＡ（ＨＡＳ２  ＡＳ）によって制御され、その発現量も調べたところ、その実質的な減少が見られた（図４Ｂ）。
【００３８】
赤血球排除アッセイによって、細胞周囲のＨＡコートがＴＧＦβで処理した細胞と非処理の細胞の両方で観察された（図４Ｃ，上のパネル，矢印)。対照的に、０．０２５または０．１μｇ／ｍＬのいずれかの濃度でＣＮＰ処理をしたところ、ＴＧＦβで処理した細胞と処理していない細胞の両方で細胞周囲のＨＡコートが破壊された（図４Ｃ，中央および下のパネル）。細胞溶解物およびＥＣＭ中のＨＡ量を測定したところ、ＣＮＰ濃度と相関したＨＡ沈着の減少がＴＧＦβで処理した細胞と非処理の細胞の両方で観察された（図４Ｄ）。興味深いことに、ＴＧＦβは培養の３日目にてＨＡ沈着にわずかな影響をもたらした。
【００３９】
以上、本発明を上述の実施の形態や各評価試験を参照して説明したが、本発明は上述の実施の形態や各評価試験に限定されるものではなく、実施の形態の構成を適宜組み合わせたものや置換したものについても本発明に含まれるものである。また、当業者の知識に基づいて実施の形態おける組合せやステップの順番を適宜組み替えることや各種の設計変更等の変形を実施の形態に対して加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態も本発明の範囲に含まれうる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明のヒアルロン酸合成阻害剤は、ヒアルロン酸合成阻害が求められる実験系での薬剤として利用できる。また、本発明のヒアルロン酸が関与する疾患または状態の治療または予防剤は、ヒアルロン酸が関与する疾患または状態、例えば癌浸潤、悪性中皮腫、炎症性疾患、臓器線維症（肝繊維症、肺繊維症など）、変形性膝関節症、関節リウマチ等の治療または予防に利用できる。
【図１】
2019172580.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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