(57)【要約】      （修正有）【課題】分岐鎖脂肪酸を製造する技術を提供する。【解決手段】特定の配列からなる塩基配列にコードされるタンパク質、又は特定の配列からなる塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つオレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質、及び、別の特定の配列からなる塩基配列にコードされるタンパク質、又は別の特定の配列からなる塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つ１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質、を発現させた宿主をインキュベートすることにより、不飽和脂肪酸の二重結合にメチル基が導入されて分岐鎖脂肪酸が合成される工程を備える、分岐鎖脂肪酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質、及び下記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質を発現させた宿主をインキュベートすることにより、前記宿主中の不飽和脂肪酸の下記式（１）で表される基にメチル基が導入されて下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸が合成される工程を備える、下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸の製造方法。
（ｉ−１）配列番号１に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
（ｉ−２）配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つオレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質
（ｉｉ−１）配列番号２に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
（ｉｉ−２）配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つ１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質
【化１】
2019000015.tif 000015
【化２】
2019000015.tif 000016
【請求項２】
前記不飽和脂肪酸がオレイン酸であり、前記分岐鎖脂肪酸が１０−メチルステアリン酸である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
不飽和脂肪酸に、下記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質を反応させることにより、前記不飽和脂肪酸の下記式（１）で表される基にメチレン基が導入されて下記式（３）で表される基を有する脂肪酸が合成される工程と、
下記式（３）で表される基を有する前記脂肪酸に、下記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質を反応させることにより、下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸が合成される工程と、
を備える、下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸の製造方法。
（ｉ−１）配列番号１に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
（ｉ−２）配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つオレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質
（ｉｉ−１）配列番号２に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
（ｉｉ−２）配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つ１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質
【化３】
2019000015.tif 000017
【化４】
2019000015.tif 000018
【化５】
2019000015.tif 000019
【請求項４】
前記不飽和脂肪酸がオレイン酸であり、前記分岐鎖脂肪酸が１０−メチルステアリン酸である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
下記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質、及び下記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質を備える、不飽和脂肪酸から下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸を製造するためのキット。
（ｉ−１）配列番号１に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
（ｉ−２）配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つオレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質
（ｉｉ−１）配列番号２に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
（ｉｉ−２）配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つ１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質
【化６】
2019000015.tif 000020
【請求項６】
下記（ｉｉｉ−１）又は（ｉｉｉ−２）に記載の核酸、及び下記（ｉｖ−１）又は（ｉｖ−２）に記載の核酸を備える、不飽和脂肪酸から下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸を製造するためのキット。
（ｉｉｉ−１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸
（ｉｉｉ−２）配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有し且つオレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｉｖ−１）配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸
（ｉｖ−２）配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有し且つ１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質をコードする核酸
【化７】
2019000015.tif 000021
【請求項７】
前記不飽和脂肪酸がオレイン酸であり、前記分岐鎖脂肪酸が１０−メチルステアリン酸である、請求項５又は６に記載のキット。
【請求項８】
下記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質の発現ベクター、及び下記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質の発現ベクター、が導入された宿主。
（ｉ−１）配列番号１に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
（ｉ−２）配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つオレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質
（ｉｉ−１）配列番号２に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
（ｉｉ−２）配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つ１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質
【請求項９】
下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸の製造用である、請求項８に記載の宿主。
【化８】
2019000015.tif 000022
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐鎖脂肪酸の製造方法に関する。より具体的には、分岐鎖脂肪酸の製造方法、不飽和脂肪酸から分岐鎖脂肪酸を製造するためのキット及び宿主に関する。
【背景技術】
【０００２】
分岐鎖脂肪酸は、不飽和脂肪酸の特性である低い融点と、飽和脂肪酸の特性である酸化に対する高い耐性とをあわせ持つことから、その産業応用が期待されている。また、微生物における分岐鎖脂肪酸の合成機構の解析も進められている。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、マイコバクテリウム・ツベルクローシスのＲｖ０４６９（ｕｍａＡ）遺伝子にコードされる酵素（ＵｍａＡ）が、１０−メチルステアリン酸の合成に関与することが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Meena L. S., et al., Biochemical characterization of an S-adenosyl-l-methionine-dependent methyltransferase (Rv0469) of Mycobacterium tuberculosis., Biol. Chem., 394 (7), 871-877, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、実施例に後述するように、発明者らは、非特許文献１に記載されているＵｍａＡタンパク質を大腸菌で発現させても、１０−メチルステアリン酸を合成することができないことを明らかにした。そこで、本発明は、微生物における分岐鎖脂肪酸の合成機構を解明し、分岐鎖脂肪酸を製造する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
［１］下記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質、及び下記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質を発現させた宿主をインキュベートすることにより、前記宿主中の不飽和脂肪酸の下記式（１）で表される基にメチル基が導入されて下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸が合成される工程を備える、下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸の製造方法。
（ｉ−１）配列番号１に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
（ｉ−２）配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つオレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質
（ｉｉ−１）配列番号２に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
（ｉｉ−２）配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つ１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質
【化１】
2019000015.tif 000002
【化２】
2019000015.tif 000003
［２］前記不飽和脂肪酸がオレイン酸であり、前記分岐鎖脂肪酸が１０−メチルステアリン酸である、［１］に記載の製造方法。
［３］不飽和脂肪酸に、上記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質を反応させることにより、前記不飽和脂肪酸の下記式（１）で表される基にメチレン基が導入されて下記式（３）で表される基を有する脂肪酸が合成される工程と、下記式（３）で表される基を有する前記脂肪酸に、上記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質を反応させることにより、下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸が合成される工程と、を備える、下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸の製造方法。
【化３】
2019000015.tif 000004
【化４】
2019000015.tif 000005
【化５】
2019000015.tif 000006
［４］前記不飽和脂肪酸がオレイン酸であり、前記分岐鎖脂肪酸が１０−メチルステアリン酸である、［３］に記載の製造方法。
［５］上記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質、及び上記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質を備える、不飽和脂肪酸から上記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸を製造するためのキット。
［６］下記（ｉｉｉ−１）又は（ｉｉｉ−２）に記載の核酸、及び下記（ｉｖ−１）又は（ｉｖ−２）に記載の核酸を備える、不飽和脂肪酸から上記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸を製造するためのキット。
（ｉｉｉ−１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸
（ｉｉｉ−２）配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有し且つオレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｉｖ−１）配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸
（ｉｖ−２）配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有し且つ１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質をコードする核酸
［７］前記不飽和脂肪酸がオレイン酸であり、前記分岐鎖脂肪酸が１０−メチルステアリン酸である、［５］又は［６］に記載のキット。
［８］上記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質の発現ベクター、及び上記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質の発現ベクター、が導入された宿主。
［９］上記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸の製造用である、［８］に記載の宿主。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、分岐鎖脂肪酸を製造する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２におけるガスクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図２】実験例３におけるガスクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図３】実験例４におけるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。
【図４】実験例６におけるガスクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図５】実験例６におけるガスクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図６】実験例７の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［分岐鎖脂肪酸の製造方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、下記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質、及び下記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質を発現させた宿主をインキュベートすることにより、前記宿主中の不飽和脂肪酸の下記式（１）で表される基にメチル基が導入されて下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸が合成される工程を備える、下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸の製造方法を提供する。
（ｉ−１）配列番号１に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
（ｉ−２）配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つオレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質
（ｉｉ−１）配列番号２に記載の塩基配列にコードされるタンパク質
（ｉｉ−２）配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つ１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質
【００１０】
【化６】
2019000015.tif 000007
【００１１】
【化７】
2019000015.tif 000008
【００１２】
ここで、１０−メチレンステアリン酸は、オレイン酸の１０位の炭素原子にメチレン基が結合した脂肪酸であり、１０−メチレンオクタデカン酸とも呼ばれる。また、１０−メチルステアリン酸は、オレイン酸の二重結合部分にメチル基が導入された分岐脂肪酸であり、１０−メチルオクタデカン酸、ツベルクロステアリン酸とも呼ばれる。１０−メチルステアリン酸は、結核菌であるマイコバクテリウム・ツベルクローシス等の細菌の膜リン脂質に大量に含まれていることが知られている。下記式（４）にオレイン酸の化学式を示し、下記式（５）に１０−メチレンステアリン酸の化学式を示し、下記式（６）に１０−メチルステアリン酸の化学式を示す。
【００１３】
【化８】
2019000015.tif 000009
【００１４】
【化９】
2019000015.tif 000010
【００１５】
【化１０】
2019000015.tif 000011
【００１６】
配列同一性とは、対象の塩基配列が、基準となる塩基配列（基準塩基配列）に対して一致している割合を示す値である。基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００  （１）
【００１７】
実施例において後述するように、配列番号１に記載の塩基配列にコードされるタンパク質は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭＭ４）  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｔｈｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの一種である（以下、「ＳＡＭＭ４タンパク質」という場合がある。ＳＡＭＭ４タンパク質のＲｅｆＳｅｑアクセッション番号はＷＰ＿０４８４７２１２１である。また、ＳＡＭＭ４タンパク質をコードする遺伝子を「ＳＡＭＭ４遺伝子」又は「ＢｆａＢ遺伝子」という場合がある。）。
【００１８】
また、配列番号２に記載の塩基配列にコードされるタンパク質は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅの一種である（以下、「ＦＡＤＯタンパク質」という場合がある。ＦＡＤＯタンパク質のＲｅｆＳｅｑアクセッション番号はＷＰ＿０４８４７２１２０である。また、ＦＡＤＯタンパク質をコードする遺伝子を「ＦＡＤＯ遺伝子」又は「ＢｆａＡ遺伝子」という場合がある。）。
【００１９】
実施例において後述するように、発明者らは、大腸菌にＳＡＭＭ４タンパク質を発現させ、オレイン酸を与えても、オレイン酸から１０−メチルステアリン酸は合成されないことを明らかにした。更に、発明者らは、大腸菌にＳＡＭＭ４タンパク質及びＦＡＤＯタンパク質を発現させ、オレイン酸を与えると、オレイン酸から１０−メチルステアリン酸が合成されることを明らかにした。
【００２０】
すなわち、ＳＡＭＭ４タンパク質及びＦＡＤＯタンパク質の両者が存在する場合に、不飽和脂肪酸の上記式（１）で表される基にメチル基が導入されて上記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸が合成される。
【００２１】
不飽和脂肪酸から分岐鎖脂肪酸を合成するために、ＳＡＭＭ４タンパク質及びＦＡＤＯタンパク質の双方が必要であることは、発明者らが今回初めて明らかにしたものである。本実施形態の製造方法により、分岐鎖脂肪酸を製造することができる。
【００２２】
実施例において後述するように、ロドコッカス・エリスロポリス、ロドコッカス・ラバー、ノカルディア・ブラシリエンシスのＳＡＭＭ４タンパク質及びＦＡＤＯタンパク質も、本実施形態の製造方法に用いることができる。そして、実施例において後述するように、ロドコッカス・エリスロポリス、ロドコッカス・ラバー、ノカルディア・ブラシリエンシスのＳＡＭＭ４遺伝子の塩基配列は、マイコバクテリウム・クロロフェノリカムのＳＡＭＭ４遺伝子の塩基配列とそれぞれ７６％、７９％、７９％の配列同一性を有していた。
【００２３】
したがって、ＳＡＭＭ４タンパク質をコードする塩基配列は、オレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質をコードしている限り、配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上、例えば７５％以上、例えば８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有していれば、配列番号１の記載の塩基配列に対して変異を有していてもよいといえる。本明細書において、配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有し且つオレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質をＳＡＭＭ４タンパク質の変異体という場合がある。
【００２４】
また、実施例において後述するように、ロドコッカス・エリスロポリス、ロドコッカス・ラバー、ノカルディア・ブラシリエンシスのＦＡＤＯ遺伝子の塩基配列は、マイコバクテリウム・クロロフェノリカムのＦＡＤＯ遺伝子の塩基配列とそれぞれ７５％、７７％、７７％の配列同一性を有していた。
【００２５】
したがって、ＦＡＤＯタンパク質をコードする塩基配列は、１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させる活性を有している限り、配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上、例えば７５％以上、例えば８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有していれば、配列番号２の記載の塩基配列に対して変異を有していてもよいといえる。本明細書において、配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有し且つ１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質をＦＡＤＯタンパク質の変異体という場合がある。
【００２６】
上記式（１）で表される基は、不飽和脂肪酸の二重結合部分を含む２価の基である。また、上記式（２）で表される基は、上記式（１）で表される基にメチル基が導入されて形成された基であり、脂肪酸の分岐鎖を含む。上記式（２）で表される基を有する脂肪酸は分岐鎖脂肪酸である。
【００２７】
本実施形態の製造方法において、不飽和脂肪酸は、上記式（１）で表される基を有するものであれば特に限定されず、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。また、不飽和脂肪酸は二重結合を１個有する脂肪酸であってもよく２個以上有する脂肪酸であってもよいが、二重結合を１個有する脂肪酸であることが好ましい。
【００２８】
本実施形態の製造方法において、不飽和脂肪酸及び分岐鎖脂肪酸は特に限定されず、例えば、不飽和脂肪酸がオレイン酸であり、目的生産物である分岐鎖脂肪酸が１０−メチルステアリン酸であってもよい。
【００２９】
本実施形態の製造方法において、不飽和脂肪酸は、遊離していてもよいし、リン脂質等を形成していてもよいし、脂肪酸の金属塩等を形成していてもよい。
【００３０】
第１実施形態の製造方法は、宿主内でＳＡＭＭ４タンパク質及びＦＡＤＯタンパク質を発現させて分岐鎖脂肪酸を製造する方法である。ここで、宿主は、通常、上記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸を製造しない宿主であってもよい。宿主としては、取り扱いが容易なものであれば特に限定されず、例えば、大腸菌、シアノバクテリア、カビ、ラビリンチュラ類、微細藻類等が挙げられる。
【００３１】
宿主は、製造目的の分岐鎖脂肪酸の材料となる不飽和脂肪酸を合成する生物であってもよいし、製造目的の分岐鎖脂肪酸の材料となる不飽和脂肪酸を合成しない生物であってもよい。
【００３２】
例えば、オレイン酸を材料として１０−メチルステアリン酸を製造する場合、宿主としてはオレイン酸を合成しない大腸菌を用いてもよいし、オレイン酸を合成するシアノバクテリアを用いてもよい。
【００３３】
製造目的の分岐鎖脂肪酸の材料となる不飽和脂肪酸を合成しない生物を宿主とする場合には、宿主に不飽和脂肪酸を与えて分岐鎖脂肪酸を製造するとよい。したがって、第１実施形態の製造方法は、宿主に不飽和脂肪酸を与える工程を更に備えていてもよい。宿主に不飽和脂肪酸を与える方法としては、例えば、宿主の培地に不飽和脂肪酸を添加することが挙げられる。この場合、不飽和脂肪酸は、不飽和脂肪酸の金属塩の形態で培地に添加してもよい。
【００３４】
また、製造目的の分岐鎖脂肪酸の材料となる不飽和脂肪酸を合成する生物を宿主とする場合には、宿主に不飽和脂肪酸を与えなくても分岐鎖脂肪酸を製造することができる。また、製造目的の分岐鎖脂肪酸の材料となる不飽和脂肪酸を合成する生物を宿主とする場合であっても、宿主に不飽和脂肪酸を与えて分岐鎖脂肪酸を製造してもよい。
【００３５】
例えば、大腸菌を宿主として１０−メチルステアリン酸を製造する場合、大腸菌の培地にオレイン酸を添加すればよい。また、シアノバクテリアを宿主として１０−メチルステアリン酸を製造する場合、原料となるオレイン酸を添加しなくても１０−メチルステアリン酸を製造することができる。
【００３６】
宿主をインキュベートする条件は、宿主の種類や製造目的の分岐鎖脂肪酸等に応じて適宜設定することができる。また、第１実施形態の製造方法は、宿主から上記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸を回収する工程を更に備えていてもよい。
【００３７】
第１実施形態の製造方法は、一般的なバイオリアクターを用いて実施することができる。バイオリアクターは、宿主をインキュベートする容器を備えており、容器内で分岐鎖脂肪酸が製造される。ここで、宿主は培地中に浮遊した状態でインキュベートされてもよいし、樹脂、多糖類等から構成された担体に固定化された状態でインキュベートされてもよい。宿主が固定化されていると、宿主の取り扱いが容易になる、製造した分岐鎖脂肪酸の回収が容易になる等好ましい場合がある。バイオリアクターを用いて分岐鎖脂肪酸を製造する場合、分岐鎖脂肪酸の製造はバッチ式で実施してもよいし、連続式で実施してもよい。
【００３８】
（第２実施形態）
第２実施形態に係る分岐鎖脂肪酸の製造方法は、不飽和脂肪酸に、上記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質を反応させることにより、前記不飽和脂肪酸の下記式（１）で表される基にメチレン基が導入されて下記式（３）で表される基を有する脂肪酸が合成される工程と、下記式（３）で表される基を有する前記脂肪酸に、上記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質を反応させることにより、下記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸が合成される工程と、を備える。
【００３９】
【化１１】
2019000015.tif 000012
【００４０】
【化１２】
2019000015.tif 000013
【００４１】
【化１３】
2019000015.tif 000014
【００４２】
第２実施形態の製造方法は、インビトロで分岐鎖脂肪酸を製造する方法である。上述したように、上記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質は、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体であり、上記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質は、ＦＡＤＯタンパク質又はその変異体である。
【００４３】
第２実施形態の製造方法では、まず、不飽和脂肪酸にＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体を反応させて、上記式（３）で表される基を有する脂肪酸を合成する。続いて、上記式（３）で表される基を有する脂肪酸にＦＡＤＯタンパク質又はその変異体を反応させて、製造目的である上記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸を合成する。
【００４４】
第２実施形態の製造方法において、不飽和脂肪酸、分岐鎖脂肪酸、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体、ＦＡＤＯタンパク質又はその変異体は、第１実施形態において上述したものと同様である。
【００４５】
第２実施形態の製造方法において、不飽和脂肪酸及び分岐鎖脂肪酸は特に限定されず、例えば、不飽和脂肪酸がオレイン酸であり、目的生産物である分岐鎖脂肪酸が１０−メチルステアリン酸であってもよい。この場合、上記式（３）で表される基を有する脂肪酸は、１０−メチレンステアリン酸である。
【００４６】
また、第２実施形態の製造方法は、反応系から上記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸を回収する工程を更に備えていてもよい。
【００４７】
第２実施形態の製造方法は、一般的なバイオリアクターを用いて実施することができる。バイオリアクターは、反応槽を備えており、反応槽で分岐鎖脂肪酸が製造される。ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体、及びＦＡＤＯタンパク質又はその変異体は、それぞれ、樹脂、多糖類等から構成された担体に固定化された状態で用いると取り扱いが容易である。
【００４８】
また、不飽和脂肪酸の二重結合部分にメチレン基が導入される工程、及び、メチレン基が導入された前記脂肪酸が分岐鎖脂肪酸に変換される工程は、別々の反応槽で実施されてもよいし、同一の反応槽で実施されてもよい。また、第２実施形態の製造方法も、第１実施形態の製造方法と同様に、バッチ式で実施してもよいし、連続式で実施してもよい。
【００４９】
［不飽和脂肪酸から分岐鎖脂肪酸を製造するためのキット］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、上記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質、及び上記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質を備える、不飽和脂肪酸から上記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸を製造するためのキットを提供する。
【００５０】
上述したように、上記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質は、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体であり、上記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質は、ＦＡＤＯタンパク質又はその変異体である。
【００５１】
本実施形態のキットにおいて、不飽和脂肪酸、分岐鎖脂肪酸、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体、ＦＡＤＯタンパク質又はその変異体は、分岐鎖脂肪酸の製造方法の実施形態において上述したものと同様である。本実施形態のキットは、上述した第２実施形態の製造方法に好適に用いることができる。
【００５２】
本実施形態の製造方法において、不飽和脂肪酸及び分岐鎖脂肪酸は特に限定されず、例えば、不飽和脂肪酸がオレイン酸であり、目的生産物である分岐鎖脂肪酸が１０−メチルステアリン酸であってもよい。
【００５３】
（第２実施形態）
第２実施形態に係るキットは、下記（ｉｉｉ−１）又は（ｉｉｉ−２）に記載の核酸、及び下記（ｉｖ−１）又は（ｉｖ−２）に記載の核酸を備える、不飽和脂肪酸から上記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸を製造するためのものである。
（ｉｉｉ−１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸
（ｉｉｉ−２）配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有し且つオレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｉｖ−１）配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸
（ｉｖ−２）配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有し且つ１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させるタンパク質をコードする核酸
【００５４】
ここで、上記（ｉｉｉ−１）又は（ｉｉｉ−２）に記載の核酸は、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体をコードする核酸であり、上記（ｉｖ−１）又は（ｉｖ−２）に記載の核酸は、ＦＡＤＯタンパク質又はその変異体をコードする核酸である。
【００５５】
本実施形態のキットにおいて、不飽和脂肪酸、分岐鎖脂肪酸、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体、ＦＡＤＯタンパク質又はその変異体は、分岐鎖脂肪酸の製造方法の実施形態において上述したものと同様である。本実施形態のキットは、例えば、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体をコードする核酸、及びＦＡＤＯタンパク質又はその変異体をコードする核酸を、発現可能に宿主に導入することにより、上述した第１実施形態の製造方法に好適に用いることができる。
【００５６】
第２実施形態のキットにおいて、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体をコードする核酸は、ベクターに組み込まれていてもよい。また、ＦＡＤＯタンパク質又はその変異体をコードする核酸は、ベクターに組み込まれていてもよい。
【００５７】
更に、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体をコードする核酸、及びＦＡＤＯタンパク質又はその変異体をコードする核酸は、それぞれ独立したベクターに組み込まれていてもよいし、１個のベクターに組み込まれていてもよい。また、上記のベクターは発現ベクターであってもよい。発現ベクターのプロモーターは、使用する宿主内で機能可能なものを適宜選択して用いることができる。
【００５８】
本実施形態の製造方法において、不飽和脂肪酸及び分岐鎖脂肪酸は特に限定されず、例えば、不飽和脂肪酸がオレイン酸であり、目的生産物である分岐鎖脂肪酸が１０−メチルステアリン酸であってもよい。
【００５９】
［宿主］
１実施形態において、本発明は、上記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質の発現ベクター、及び上記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質の発現ベクター、が導入された宿主を提供する。
【００６０】
ここで、宿主としては、第１実施形態の製造方法において上述したものと同様であり、例えば、大腸菌、シアノバクテリア、カビ、ラビリンチュラ類、微細藻類等が挙げられる。
【００６１】
本実施形態の宿主において、上記（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載のタンパク質は、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体であり、上記（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載のタンパク質は、ＦＡＤＯタンパク質又はその変異体である。また、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体、ＦＡＤＯタンパク質又はその変異体は、分岐鎖脂肪酸の製造方法の実施形態において上述したものと同様である。
【００６２】
ここで、「発現ベクターが導入された宿主」とは、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体、及びＦＡＤＯタンパク質又はその変異体を発現可能に構成された宿主であれば特に限定されない。
【００６３】
例えば、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体の発現ベクター、及びＦＡＤＯタンパク質又はその変異体の発現ベクターが宿主のゲノムに組み込まれた宿主であってもよい。あるいは、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体の発現ベクター、及びＦＡＤＯタンパク質又はその変異体の発現ベクターが、宿主のゲノムには組み込まれておらず、エピソーマルに維持された宿主であってもよい。
【００６４】
また、ＳＡＭＭ４タンパク質又はその変異体をコードする核酸、及びＦＡＤＯタンパク質又はその変異体をコードする核酸は、それぞれ独立したベクターに組み込まれていてもよいし、１個のベクターに組み込まれていてもよい。
【００６５】
本実施形態の宿主は、上述した第１実施形態の製造方法に好適に用いることができる。すなわち、本実施形態の宿主は、上記式（２）で表される基を有する分岐鎖脂肪酸の製造用であるということもできる。
【実施例】
【００６６】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６７】
［実験例１］
（大腸菌におけるＵｍａＡタンパク質の発現）
非特許文献１には、マイコバクテリウム・ツベルクローシスのｕｍａＡ（Ｒｖ０４６９）遺伝子にコードされるＵｍａＡタンパク質が、オレイン酸の二重結合にメチル基を導入する酵素であると記載されている。
【００６８】
そこで、これが事実であるか否かを確認した。まず、ｕｍａＡ遺伝子の発現ベクターを作製し、大腸菌ｒｏｓｅｔｔａ２株に導入した。配列番号３にｕｍａＡ遺伝子の塩基配列を示す。また、大腸菌はオレイン酸を合成しないため、大腸菌の培地に終濃度１ｍＭのオレイン酸ナトリウムを添加した。続いて、１８時間培養後、脂肪酸組成を解析した。
【００６９】
《脂肪酸組成の解析》
まず、培地を遠心して大腸菌を回収した。続いて、大腸菌の沈殿を２ｍＬのメタノールに懸濁し、懸濁液をガラス試験管に移した。続いて、遠心濃縮機（型式「ＣＣ−１０５」、トミー精工）で遠心しながら完全に乾燥させた。続いて、沈殿を０．１Ｍ塩酸メタノール溶液に再懸濁した。
【００７０】
続いて、チューブを強く閉め、１００℃で１時間インキュベートし、脂質中のアシル基をけん化して脂肪酸メチルエステルに変換した。続いて、得られた脂肪酸メチルエステルにｎ−ヘキサンを添加した。続いて、ヘキサン相を回収してヘキサンを蒸発させ、脂肪酸メチルエステルを含む残渣を１００μＬのｎ−ヘキサンに溶解させた。続いて、１μＬのヘキサン溶液をガスクロマトグラフ（型式「ＧＣ−２０１４」、島津製作所）に導入し、脂肪酸組成を解析した。
【００７１】
その結果、１０−メチルステアリン酸のピークは検出されないことが明らかとなった。
この結果は、少なくともＵｍａＡタンパク質の発現のみでは、オレイン酸から１０−メチルステアリン酸を合成することができないことを示す。
【００７２】
［実験例２］
（大腸菌におけるＳＡＭＭ１（ＷＰ＿０４８４７１９４２）、ＳＡＭＭ４（ＷＰ＿０４８４７２１２１）、ＳＡＭＭ７（ＷＰ＿０４８４７１６９１）タンパク質の発現）
実験例１の結果から、既知の酵素ではオレイン酸から１０−メチルステアリン酸を合成することができないことが明らかとなった。そこで、オレイン酸から１０−メチルステアリン酸を合成する酵素の探索を行った。
【００７３】
具体的には、まず、１０−メチルステアリン酸の合成において、オレイン酸に導入されるメチル基の供与体は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であると予測した。そして、ＳＡＭ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｔｈｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅであるとアノテーションされた様々な菌株のタンパク質のアミノ酸配列を公共データベースから抽出し、系統樹を作成した。
【００７４】
続いて、ＳＡＭ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｔｈｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを有する菌株のうち、分岐鎖脂肪酸を産生し、全ゲノムが解読されており、遺伝子を入手可能であり、Ｐ１レベルで実験可能であること等から、マイコバクテリウム・クロロフェノリカムを実験対象として選択し、以降の実験を行った。
【００７５】
マイコバクテリウム・クロロフェノリカムには、ＳＡＭ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｔｈｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅとアノテーションされた遺伝子が７つ存在した。そこで、これらを、それぞれ、ＳＡＭＭ１（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＷＰ＿０４８４７１９４２）、ＳＡＭＭ２（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＷＰ＿０４８４７３８４６）、ＳＡＭＭ３（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＷＰ＿０４８４７１０８０）、ＳＡＭＭ４（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＷＰ＿０４８４７２１２１）、ＳＡＭＭ５（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＷＰ＿０４８４７１６９０）、ＳＡＭＭ６（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＷＰ＿０４８４７３８４５）、ＳＡＭＭ７（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＷＰ＿０４８４７１６９１）と呼ぶことにした。
【００７６】
続いて、ＳＡＭＭ１遺伝子、ＳＡＭＭ４遺伝子、ＳＡＭＭ７遺伝子の発現ベクターをそれぞれ作製し、大腸菌ｒｏｓｅｔｔａ２株にそれぞれ導入した。配列番号４にＳＡＭＭ１遺伝子の塩基配列を示し、配列番号１にＳＡＭＭ４遺伝子の塩基配列を示し、配列番号５にＳＡＭＭ７遺伝子の塩基配列を示す。
【００７７】
また、大腸菌はオレイン酸を合成しないため、大腸菌の培地に終濃度１ｍＭのオレイン酸ナトリウムを添加した。続いて、１８時間培養後、実験例１と同様にして脂肪酸組成を解析した。
【００７８】
図１（ａ）及び（ｂ）は各大腸菌の脂肪酸組成を解析したガスクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。図１（ｂ）は、図１（ａ）の四角で囲んだ部分を拡大した図である。図１（ａ）及び（ｂ）中、「１６：１Δ７」は７−ヘキサデセン酸を表し、「１６：１Δ９」はパルミトレイン酸を表し、「１６：０」はヘキサデカン酸を表し、「１７：１ｃｙｃｌｏΔ９」はシス−９，１０−メチレンヘキサデカン酸を表し、「１８：１Δ９」はオレイン酸を表し、「１８：１Δ１１」はバクセン酸を表し、「１８：０」はステアリン酸を表し、「１９：０Ｍｅ１０」は１０−メチルステアリン酸を表し、「対照」は、ＳＡＭＭ１、ＳＡＭＭ４、ＳＡＭＭ７遺伝子を導入していない大腸菌ｒｏｓｅｔｔａ２株の結果であることを表す。
【００７９】
その結果、ＳＡＭＭ１、ＳＡＭＭ４、ＳＡＭＭ７遺伝子を発現させた大腸菌のいずれにおいても１０−メチルステアリン酸のピークが検出されないことが明らかとなった。この結果は、少なくともＳＡＭＭ１、ＳＡＭＭ４、ＳＡＭＭ７遺伝子の単独発現のみでは、オレイン酸から１０−メチルステアリン酸を合成することができないことを示す。
【００８０】
［実験例３］
（大腸菌におけるＦＡＤＯ及びＳＡＭＭ４タンパク質の発現）
実験例２の結果を受け、発明者らは、オレイン酸から１０−メチルステアリン酸を合成するために、ＳＡＭＭ１〜ＳＡＭＭ７遺伝子以外に必要な遺伝子が存在すると予測した。そして、その遺伝子は、ゲノム上ＳＡＭＭ１〜ＳＡＭＭ７遺伝子の近くに存在すると予測した。そこで、ＳＡＭＭ１〜ＳＡＭＭ７遺伝子の周辺遺伝子を調査した。
【００８１】
その結果、ＳＡＭＭ４遺伝子の上流にフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅとアノテーションされたタンパク質（以下、「ＦＡＤＯ」という。）をコードする遺伝子が存在することを見出した。配列番号２に、ＦＡＤＯ遺伝子の塩基配列を示す。
【００８２】
ＦＡＤＯ遺伝子とＳＡＭＭ４遺伝子の特徴的な関係として、ＦＡＤＯ遺伝子の３’末端とＳＡＭＭ４遺伝子の５’末端が４塩基分オーバーラップしていることが見出された。このことから、発明者らは、ＦＡＤＯ及びＳＡＭＭ４は常に同時に発現していると予測した。配列番号６に、マイコバクテリウム・クロロフェノリカムのＦＡＤＯ遺伝子の３’末端とＳＡＭＭ４遺伝子の５’末端が４塩基分オーバーラップしている領域の塩基配列を示す。
【００８３】
なお、分岐鎖脂肪酸を合成するマイコバクテリウム・クロロフェノリカム以外の菌株のゲノムを調べたところ、ロドコッカス・エリスロポリス、ロドコッカス・ラバー、ノカルディア・ブラシリエンシス等の菌株においても、ＦＡＤＯ遺伝子及びＳＡＭＭ４遺伝子が４塩基分オーバーラップして存在していることが確認された。
【００８４】
そこで、まず、ＦＡＤＯ遺伝子とＳＡＭＭ４遺伝子が４塩基分オーバーラップしたものをそのまま発現ベクターにクローニングし、大腸菌ｒｏｓｅｔｔａ２株に導入した。また、大腸菌はオレイン酸を合成しないため、大腸菌の培地に終濃度１ｍＭのオレイン酸ナトリウムを添加した。続いて、１８時間培養後、実験例１と同様にして脂肪酸組成を解析した。
【００８５】
図２は大腸菌の脂肪酸組成を解析したガスクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。図２中、「１６：１Δ９」はパルミトレイン酸を表し、「１６：１Δ７」は７−ヘキサデセン酸を表し、「１６：０」はヘキサデカン酸を表し、「１７：１ｃｙｃｌｏΔ９」はシス−９，１０−メチレンヘキサデカン酸を表し、「１８：１Δ９」はオレイン酸を表し、「１８：１Δ１１」はバクセン酸を表し、「１８：０」はステアリン酸を表し、「１９：０Ｍｅ１０」は１０−メチルステアリン酸を表し、「１９：１ｃｙｃｌｏΔ９」はシス−９，１０−メチレンオクタデカン酸を表し、「１９：１ｃｙｃｌｏΔ１１」はシス−１１，１２−メチレンオクタデカン酸を表し、「ＦＡＤＯ−ＳＡＭＭ４」はＦＡＤＯ遺伝子とＳＡＭＭ４遺伝子が４塩基分オーバーラップしたものをそのまま大腸菌に導入した結果であることを表し、「対照」は遺伝子を導入していない大腸菌の結果であることを表し、「＋」はイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により発現誘導した結果であることを表し、「−」は発現誘導していない結果であることを表す。
【００８６】
その結果、ＦＡＤＯ遺伝子とＳＡＭＭ４遺伝子が４塩基分オーバーラップしたものをそのまま発現させた大腸菌では１０−メチルステアリン酸のピークが検出されないことが明らかとなった。
【００８７】
［実験例４］
（大腸菌におけるＦＡＤＯ及びＳＡＭＭ４タンパク質の発現の検出）
実験例３の結果を受けて、ＦＡＤＯ遺伝子とＳＡＭＭ４遺伝子が４塩基分オーバーラップしたものをそのまま発現させた大腸菌における、ＦＡＤＯタンパク質及びＳＡＭＭ４タンパク質の発現を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認した。また、比較のために、空のベクターを導入した大腸菌、及びＳＡＭＭ４遺伝子のみの発現ベクターを導入した大腸菌についても同様の検討を行った。
【００８８】
図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図３中、「＋」はＩＰＴＧの添加により発現誘導した結果であることを表し、「−」は発現誘導していない結果であることを表し、「対照」は空のベクターを導入した大腸菌の結果であることを表し、「ＳＡＭＭ４」はＳＡＭＭ４遺伝子のみの発現ベクターを導入した大腸菌の結果であることを表し、「ＦＡＤＯ−ＳＡＭＭ４」はＦＡＤＯ遺伝子とＳＡＭＭ４遺伝子が４塩基分オーバーラップしたものをそのまま発現させた大腸菌の結果であることを表し、「Ｍ」は分子量マーカーを表し、矢印はＦＡＤＯタンパク質及びＳＡＭＭ４タンパク質を示す。
【００８９】
その結果、ＦＡＤＯ遺伝子とＳＡＭＭ４遺伝子が４塩基分オーバーラップしたものをそのまま発現させた大腸菌では、プロモーターの直下に位置するＦＡＤＯタンパク質のみしか発現していないことが明らかとなった。
【００９０】
［実験例５］
（発現ベクターの改変）
実験例４の結果から、ＦＡＤＯ遺伝子とＳＡＭＭ４遺伝子が４塩基分オーバーラップしたものをそのまま大腸菌発現させても、ＦＡＤＯタンパク質のみしか発現しないことが明らかとなった。この結果から、マイコバクテリウム・クロロフェノリカム由来の塩基配列では、大腸菌内でｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｏ  ｓｔａｒｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（シャイン・ダルガノ配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＳＤ配列）が機能しないために、ＦＡＤＯタンパク質のみしか発現しないことが考えられた。
【００９１】
そこで、ＦＡＤＯ遺伝子とＳＡＭＭ４遺伝子が４塩基分オーバーラップした遺伝子の発現ベクターに対し、以下のストラテジー１及びストラテジー２の２種類の方法により改変を加え、大腸菌内でＦＡＤＯ遺伝子及びＳＡＭＭ４遺伝子の双方を発現させることを試みた。
【００９２】
《ストラテジー１》
ＳＡＭＭ４遺伝子の上流の塩基配列を、コドンを変化させないようにＡＧリッチにした塩基配列に改変した。配列番号７に、ストラテジー１により改変後の、ＦＡＤＯ遺伝子の３’末端とＳＡＭＭ４遺伝子の５’末端を含む領域の塩基配列を示す。
【００９３】
《ストラテジー２》
ＳＡＭＭ４遺伝子の上流に、大腸菌内で機能する新たなＳＤ配列を挿入した。配列番号８に、ストラテジー２により改変後の、ＦＡＤＯ遺伝子の３’末端とＳＡＭＭ４遺伝子の５’末端を含む領域の塩基配列を示す。
【００９４】
［実験例６］
（オレイン酸の１０−メチレンステアリン酸への変換）
実験例５で改変した、ストラテジー１（ｓｔ１）及びストラテジー２（ｓｔ２）の発現ベクターをそれぞれ大腸菌ｒｏｓｅｔｔａ２株に導入した。また、比較のために空のベクターを導入した大腸菌も用意した。また、大腸菌はオレイン酸を合成しないため、大腸菌の培地に終濃度１ｍＭのオレイン酸ナトリウムを添加した。また、比較のために、培地にオレイン酸ナトリウムを添加しなかったものも用意した。続いて、１８時間培養後、実験例１と同様にして脂肪酸組成を解析した。
【００９５】
図４及び図５は大腸菌の脂肪酸組成を解析したガスクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。図４は培地にオレイン酸ナトリウムを添加しなかった場合の結果であり、図５は培地にオレイン酸ナトリウムを添加した場合の結果である。
【００９６】
図４及び図５中、「ｓｔ１」は実験例５のストラテジー１により改変した発現ベクターを導入した結果であることを表し、「ｓｔ２」は実験例５のストラテジー２により改変した発現ベクターを導入した結果であることを表し、「対照」は空のベクターを導入した結果であることを表し、「ｓｔａｎｄａｒｄ」は１０−メチルステアリン酸の標品を表し、「１８：１Δ９」はオレイン酸を表し、「１８：０」はステアリン酸を表し、「１９：０Ｍｅ１０」は１０−メチルステアリン酸を表す。
【００９７】
その結果、図４に示すように、培地にオレイン酸ナトリウムを添加しなかった場合には、ｓｔ１及びｓｔ２の発現ベクターのいずれを導入した大腸菌においても、１０−メチルステアリン酸のピークが検出されないことが確認された。
【００９８】
一方、図５に示すように、培地にオレイン酸ナトリウムを添加した場合には、ｓｔ１及びｓｔ２の発現ベクターのいずれを導入した大腸菌においても、１０−メチルステアリン酸のピークが検出された。
【００９９】
更に、ｓｔ２の発現ベクターを導入した大腸菌における１０−メチルステアリン酸のピークをガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）により解析した結果、標品の１０−メチルステアリン酸と同一のマススペクトルを示すことが確認された。また、データベース上にある１０−メチルステアリン酸のマススペクトルとも一致することが確認された。
【０１００】
以上の結果は、大腸菌内でＦＡＤＯ遺伝子及びＳＡＭＭ４遺伝子の双方を発現させることにより、オレイン酸から１０−メチルステアリン酸を合成できることを示す。
【０１０１】
以上の結果から、ＳＡＭＭ４タンパク質の活性により、オレイン酸が１０−メチレンステアリン酸に変換され、続いてＦＡＤＯタンパク質の活性により、１０−メチレンステアリン酸が１０−メチルステアリン酸に変換されると考えられた。
【０１０２】
また、上述したように、ＦＡＤＯ遺伝子とＳＡＭＭ４遺伝子が４塩基分オーバーラップしている、ロドコッカス・エリスロポリス、ロドコッカス・ラバー、ノカルディア・ブラシリエンシスは、マイコバクテリウム・クロロフェノリカムと同様に不飽和脂肪酸の二重結合にメチル基を導入して分岐鎖脂肪酸を製造すると考えられる。
【０１０３】
そして、マイコバクテリウム・クロロフェノリカムのＦＡＤＯ遺伝子と、ロドコッカス・エリスロポリス、ロドコッカス・ラバー、ノカルディア・ブラシリエンシスのＦＡＤＯ遺伝子との配列同一性を算出した結果、それぞれ７５％、７７％、７７％であることが明らかとなった。
【０１０４】
また、マイコバクテリウム・クロロフェノリカムのＳＡＭＭ４遺伝子と、ロドコッカス・エリスロポリス、ロドコッカス・ラバー、ノカルディア・ブラシリエンシスのＦＡＤＯ遺伝子との配列同一性を算出した結果、それぞれ７６％、７９％、７９％であることが明らかとなった。
【０１０５】
したがって、マイコバクテリウム・クロロフェノリカムのＦＡＤＯ遺伝子と概ね７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つ１０−メチレンステアリン酸を１０−メチルステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質は、マイコバクテリウム・クロロフェノリカムのＦＡＤＯ遺伝子と同様に機能するといえる。
【０１０６】
また、マイコバクテリウム・クロロフェノリカムのＳＡＭＭ４遺伝子と概ね７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ且つオレイン酸を１０−メチレンステアリン酸に変化させる活性を有するタンパク質は、マイコバクテリウム・クロロフェノリカムのＳＡＭＭ４遺伝子と同様に機能するといえる。
【０１０７】
［実験例７］
（ｓｔ２の発現ベクターを導入した大腸菌における１０−メチルステアリン酸の割合）
実験例６において、ｓｔ２の発現ベクターを導入した大腸菌における、各脂肪酸の全脂肪酸に対する存在割合を測定した。対照として、空のベクターを導入した大腸菌における各脂肪酸の全脂肪酸に対する存在割合を測定した。
【０１０８】
図６は、脂肪酸の存在割合を測定した結果を示すグラフである。図６中、「１４：０」はテトラデカン酸を表し、「１６：０」はヘキサデカン酸を表し、「１６：１Δ７」は７−ヘキサデセン酸を表し、「１６：１Δ９」はパルミトレイン酸を表し、「１７：１ｃｙｃｌｏΔ９」はシス−９，１０−メチレンヘキサデカン酸を表し、「１８：０」はステアリン酸を表し、「１８：１Δ９」はオレイン酸を表し、「１８：１Δ１１」はバクセン酸を表し、「１９：１ｃｙｃｌｏΔ９」はシス−９，１０−メチレンオクタデカン酸を表し、「１９：１ｃｙｃｌｏΔ１１」はシス−１１，１２−メチレンヘキサデカン酸を表し、「１９：０Ｍｅ１０」は１０−メチルステアリン酸を表す。
【０１０９】
その結果、ｓｔ２の発現ベクターを導入した大腸菌では、全脂肪酸の約１モル％程度の１０−メチルステアリン酸が合成されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明によれば、分岐鎖脂肪酸を製造する技術を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
配列番号１はＳＡＭＭ４遺伝子の塩基配列である。
配列番号２はＦＡＤＯ遺伝子の塩基配列である。
配列番号３はｕｍａＡ遺伝子の塩基配列である。
配列番号４はＳＡＭＭ１遺伝子の塩基配列である。
配列番号５はＳＡＭＭ７遺伝子の塩基配列である。
配列番号６は、マイコバクテリウム・クロロフェノリカムのＦＡＤＯ遺伝子の３’末端とＳＡＭＭ４遺伝子の５’末端が４塩基分オーバーラップしている領域の塩基配列である。
配列番号７は、実験例５のストラテジー１により改変後の、ＦＡＤＯ遺伝子の３’末端とＳＡＭＭ４遺伝子の５’末端を含む領域の塩基配列を示す。
配列番号８は、実験例５のストラテジー２により改変後の、ＦＡＤＯ遺伝子の３’末端とＳＡＭＭ４遺伝子の５’末端を含む領域の塩基配列を示す。
【図１】
2019000015.tif 000023
【図２】
2019000015.tif 000024
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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