(57)【要約】【課題】細胞を培養する方法の提供。【解決手段】哺乳動物細胞を培養する方法であって、０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の処理済みウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する液体培養培地中で、組換えタンパク質を産生させるのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養することを含み、処理済みＢＳＡが、培養するステップの前かつ／または培養するステップ中に液体培養培地中に存在し、かつ／または液体培養培地に添加される方法が本明細書に提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１４年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０６４，４４２号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権および利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１５年９月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＡＸＪ−１９８ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは６，２３０バイトである。
【０００３】
本発明は、細胞培養および組換えタンパク質の製造の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞は、治療的または商業的に重要なタンパク質を産生するためにしばしば使用される。哺乳動物細胞によって産生される治療的に重要なタンパク質の一例は、エクリズマブである。エクリズマブは、ヒト補体成分５（Ｃ５）に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体である。エクリズマブは、発作性夜間血色素尿症および非定型溶血性尿毒症症候群を処置するためにＦＤＡによって承認された。エクリズマブは、哺乳動物細胞培養によって産生させることができる多種多様な組換えタンパク質の単なる一例である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、処理済みウシ血清アルブミン（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）（ＢＳＡ）を含む液体培養培地中で哺乳動物細胞を培養すると、生存細胞密度、生存細胞の百分率、および細胞の産生力（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）が増大するという発見に少なくとも部分的に基づく。したがって、本明細書は、哺乳動物細胞を培養する方法であって、０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の処理済みＢＳＡを含む液体培養培地中で、組換えタンパク質を産生させるのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸（組換えエクリズマブをコードする核酸など）を含有する哺乳動物細胞を培養すること（流加培養または灌流培養）を含み、処理済みＢＳＡが、培養するステップの前かつ／または培養するステップ中に液体培養培地中に存在し、かつ／または液体培養培地に添加される方法を含む。
【０００６】
哺乳動物細胞を培養する方法であって、０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の処理済みウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む液体培養培地中で、組換えエクリズマブを産生させるのに十分な条件下で、組換えエクリズマブをコードする核酸を含むＮＳ０細胞を流加培養することを含み、処理済みＢＳＡが、培養するステップの前かつ／または培養するステップ中に液体培養培地中に存在し、かつ／または液体培養培地に添加される方法が本明細書に提供される。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、処理済みＢＳＡは、ウシ由来の血漿を提供するステップ；血漿を脱塩するステップ；限外濾過を使用して血漿を濾過するステップ；血漿から真性グロブリンを沈殿させるステップ；血漿を濾過して沈殿した真性グロブリンを除去するステップ；血漿に対してイオン交換クロマトグラフィーを実施して血清アルブミンおよび免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップ；硫安沈殿法を使用して溶出液から免疫グロブリンを沈殿させるステップ；溶出液から沈殿した免疫グロブリンを除去するステップ；溶出液を濃縮およびフリーズドライして血清アルブミンを含む凍結乾燥材料を生成するステップ；ならびに任意選択で凍結乾燥材料を溶液に再構成するステップを含み、これらからなり、またはこれらから本質的になる方法によって生成される。
【０００７】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、ウシ由来の血漿を提供するステップ；血漿を脱塩するステップ；限外濾過を使用して血漿を濾過するステップ；血漿から真性グロブリンを沈殿させるステップ；血漿を濾過して沈殿した真性グロブリンを除去するステップ；血漿に対してイオン交換クロマトグラフィーを実施して血清アルブミンおよび免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップ；硫安沈殿法を使用して溶出液から免疫グロブリンを沈殿させるステップ；溶出液から沈殿した免疫グロブリンを除去するステップ；溶出液を濃縮およびフリーズドライして血清アルブミンを含む凍結乾燥材料を生成するステップ；ならびに任意選択で凍結乾燥材料を溶液に再構成するステップを実施して処理済みＢＳＡを生成することをさらに含む。
【０００８】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、処理済みＢＳＡは、血清アルブミンを含む溶液を加熱することも、血清アルブミンを含む溶液に安定剤を添加することも、再構成された凍結乾燥血清アルブミンを含む溶液から不純物を沈殿させることも含まない方法によって生成される。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、処理済みＢＳＡは、処理済みＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ＢＳＡである。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、処理済みＮＺ  ＢＳＡは、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＮＺ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  ＮＺ  ＢＳＡである。
【０００９】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、液体培養培地は、少なくとも０．５ｇ／Ｌの処理済みＢＳＡを含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、培養するステップの前かつ／または培養するステップ中に液体培養培地に処理済みＢＳＡを添加して、培養培地中０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の濃度の処理済みＢＳＡを得ることを含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、処理済みＢＳＡは、培養するステップの前に液体培養培地中に存在する。
【００１０】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、培養するステップで産生された組換えエクリズマブを収集することをさらに含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、収集することは、ＮＳ０細胞を溶解させることを含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、組換えエクリズマブは、培地から収集される。
【００１１】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、収集された組換えエクリズマブを医薬組成物に製剤化することをさらに含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、エクリズマブは、配列番号１を含み、またはそれからなる重鎖、および配列番号２を含み、またはそれからなる軽鎖を含む。
【００１２】
本明細書で使用する場合、名詞の前の単語「１つの（ａ）」または「複数の」は、１つまたは複数のその特定の名詞を示す。例えば、語句「哺乳動物細胞」は、「１つまたは複数の哺乳動物細胞」を示す。
【００１３】
用語「ウシ血清アルブミン」または「ＢＳＡ」は、当技術分野で周知である。ＢＳＡは、市販されている。用語「処理済みＢＳＡ」または「処理済みウシ血清アルブミン」は、本明細書に記載される方法を使用して生成されたウシ血清アルブミンを指す。処理済みＢＳＡは、血清アルブミンを含む溶液を加熱するステップ、血清アルブミンを含む溶液に安定剤を添加するステップ、および凍結乾燥血清アルブミンが使用される場合、再構成された凍結乾燥血清アルブミンを含む溶液から不純物を沈殿させるステップを除外する方法によって生成されるＢＳＡである。一部の例では、処理済みＢＳＡを生成するために使用される方法は、ウシ由来の血漿を提供することからスタートする。処理済みＢＳＡを生成するための非限定的な方法が、本明細書に記載されている。
【００１４】
用語「処理済みＮＺ  ＢＳＡ」または「処理済みＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ＢＳＡ」は、ニュージーランドで繁殖および飼育されたウシ由来の血清アルブミンを含む本明細書に定義した処理済みＢＳＡを指す。処理済みＮＺ  ＢＳＡの非限定的な例は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡである。
【００１５】
用語「非増強型ＢＳＡ（ｎｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＢＳＡ）」は、血清アルブミンを含む溶液を加熱すること、血清アルブミンを含む溶液に安定剤を添加すること、および再構成された凍結乾燥血清アルブミンを含む溶液から不純物を沈殿させることのうちの１つまたは複数を含む方法によって生成されるウシ血清アルブミンを指す。例えば、非増強型ＢＳＡは、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標）である。
【００１６】
用語「組換えタンパク質」は、当技術分野で公知であり、哺乳動物細胞培養系を使用して製造されたタンパク質を指す。これらの細胞は、哺乳動物細胞、に由来し得、ここで一般に、細胞培養物中の哺乳動物細胞は、目的の組換えタンパク質をコードする導入された核酸を含有する。組換えタンパク質をコードする核酸は、このタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結した異種プロモーターもまた含有し得る。
【００１７】
用語「産生バイオリアクター」とは、本明細書で使用する場合、培養物中の哺乳動物細胞の増殖および培養物中の哺乳動物細胞による組換えタンパク質産物の産生に十分な条件下で、哺乳動物細胞培養物をインキュベートするために適切な容器を指す。産生バイオリアクターの例は、当技術分野で公知である。
【００１８】
用語「哺乳動物細胞」とは、例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシ、ハムスターまたはウサギを含む任意の哺乳動物由来のまたはかかる哺乳動物から誘導された、任意の細胞を指す。一部の実施形態では、この哺乳動物細胞は、不死化細胞、分化細胞または未分化細胞であり得る。
【００１９】
用語「実質的に含まない」とは、本明細書で使用する場合、特定の物質（例えば、液体培養培地由来または哺乳動物細胞の溶解物由来の混入タンパク質）を、少なくとも９０％もしくは約９０％含まない、または約９５％、９６％、９７％、９８％含まない、または少なくとも９９％もしくは約９９％含まない、または約１００％含まない組成物（例えば、医薬組成物）を指す。
【００２０】
用語「培養」または「細胞培養」とは、本明細書で使用する場合、物理的条件の制御されたセットの下での、液体培養培地中での哺乳動物細胞の維持または増殖を指す。
【００２１】
用語「液体培地」または「液体培養培地」とは、哺乳動物細胞を培地中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させるのに十分な栄養素を含有する流体を指す。例えば、液体培養培地は、以下のうち１つまたは複数を含み得る：アミノ酸（例えば、２０種のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルベート、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛、セレンおよび他の必要な微量金属、ならびに炭酸水素ナトリウム。液体培養培地は、哺乳動物由来の血清または血清成分を含み得る。液体培養培地は、微量金属、哺乳動物成長ホルモンおよび／または哺乳動物増殖因子を含有し得る。液体培養培地の非限定的な例は、本明細書に記載されており、さらなる例は、当技術分野で公知であり、市販されている。
【００２２】
用語「無血清液体培養培地」は、動物血清を含有しない液体培養培地を指す。
【００２３】
「回転撹拌」は、当技術分野で周知の用語であり、例えば、バイオリアクター中の培養物中の溶存Ｏ２濃度を増大させ、かつ／または培養物中で哺乳動物細胞を懸濁して保つために、概して円形様式、例えば、時計回りまたは反時計回りでバイオリアクター（例えば、産生バイオリアクター）中で培養物を撹拌することを指す。撹拌は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、円形または楕円形の動きで培養物を動かす装置、例えば、インペラを使用して、実施され得る。回転撹拌を実施するために使用され得る例示的なデバイスは、当技術分野で公知であり、市販されている。
【００２４】
用語「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリンタンパク質（例えば、可変ドメイン配列、フレームワーク配列または定常ドメイン配列）の少なくとも１５アミノ酸（例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００アミノ酸、または１００超のアミノ酸）のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを指す。免疫グロブリンは、例えば、軽鎖免疫グロブリンの少なくとも１５アミノ酸、例えば、ＣＤＲＨ３などの重鎖免疫グロブリンの少なくとも１５アミノ酸を含み得る。免疫グロブリンは、単離された抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＭ）であり得る。免疫グロブリンは、ＩｇＧのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）であり得、またはＩｇＧの２つのサブクラスのハイブリッドであるＦｃ領域（ＩｇＧ２とＩｇＧ４のハイブリッドであるＦｃ領域など）を含有し得る。免疫グロブリンは、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片またはｓｃＦｖであり得る。免疫グロブリンはまた、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、またはダイマー、トリマーもしくはマルチマー抗体、またはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣＯＤＶ−Ｉｇ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であり得る。免疫グロブリンはまた、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含有する操作されたタンパク質（例えば、融合タンパク質）であり得る。免疫グロブリンの非限定的な例は、本明細書に記載されており、免疫グロブリンのさらなる例は、当技術分野で公知である。
【００２５】
用語「タンパク質断片」または「ポリペプチド断片」とは、少なくとも４アミノ酸長もしくは約４アミノ酸長、少なくとも５アミノ酸長もしくは約５アミノ酸長、少なくとも６アミノ酸長もしくは約６アミノ酸長、少なくとも７アミノ酸長もしくは約７アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長もしくは約８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長もしくは約９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長もしくは約１０アミノ酸長、少なくとも１１アミノ酸長もしくは約１１アミノ酸長、少なくとも１２アミノ酸長もしくは約１２アミノ酸長、少なくとも１３アミノ酸長もしくは約１３アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長もしくは約１４アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長もしくは約１５アミノ酸長、少なくとも１６アミノ酸長もしくは約１６アミノ酸長、少なくとも１７アミノ酸長もしくは約１７アミノ酸長、少なくとも１８アミノ酸長もしくは約１８アミノ酸長、少なくとも１９アミノ酸長もしくは約１９アミノ酸長、または少なくとも２０アミノ酸長もしくは約２０アミノ酸長であるか、あるいは２０アミノ酸長を超えるポリペプチド配列の一部分を指す。
【００２６】
用語「操作されたタンパク質」とは、生物（例えば、哺乳動物）内に存在する内因性核酸によって天然にコードされないポリペプチドを指す。操作されたタンパク質の例には、操作された酵素の安定性および／または触媒活性における増加を生じる１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を有する改変された酵素、融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二価抗体、三価抗体、４結合ドメイン抗体、ダイアボディ、ならびに少なくとも１つの組換え足場配列を含有する抗原結合タンパク質が含まれる。
【００２７】
用語「精製する」または「精製」とは、特定の文脈では、液体培養培地または細胞培養溶解物中に存在する１つまたは複数の他の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他のタンパク質）から、組換えタンパク質を少なくとも部分的に単離することを意味する。精製の程度は、重量で少なくとも５％もしくは約５％、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％〜９９．９％もしくは約９５％〜９９．９％純粋であるなど、特定され得る。液体培養培地からまたは哺乳動物細胞溶解物からタンパク質を精製するための非限定的な方法は、本明細書に記載されており、その他は、当技術分野で公知である。
【００２８】
用語「分泌型タンパク質」または「分泌型組換えタンパク質」とは、哺乳動物細胞内で翻訳される場合、分泌シグナル配列を元々含んでいた組換えタンパク質を指す。シグナル配列は、通常、哺乳動物細胞において酵素的切断を介して除去され、タンパク質は、細胞外空間（例えば、液体培養培地）中に放出される。
【００２９】
用語「流加細胞培養（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）」または「流加培養（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」は、細胞培養物由来の液体培養培地の実質的なまたは著しい除去を伴わない初期細胞培養物へのフィード培地（例えば、液体または固体培養培地）の漸増的または連続的添加を意味する。一部の場合には、フィード培地は、培養期間の開始時に培養物中に存在する第１の液体培養培地と同じである。他の場合には、フィード培地は、第１の液体培養培地の濃縮形態であり、かつ／または乾燥粉末として添加される。流加培養の一部の例では、２種またはそれ超の異なるフィード培地が初期細胞培養物に添加される。
【００３０】
「比産生率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｅ）」または「ＳＰＲ」は、本明細書では、単位時間当たり（１日当たりなど）哺乳動物細胞１個当たりに産生される組換えタンパク質の質量または酵素活性を指す。組換え抗体のＳＰＲは、通常、質量／細胞／日として測定される。組換え酵素のＳＰＲは、通常、単位／細胞／日または（単位／質量）／細胞／日として測定される。
【００３１】
「容積産生率（ｖｏｌｕｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｅ）」または「ＶＰＲ」とは、本明細書で使用する場合、単位時間（例えば、１日当たり）当たり培養物の容積当たり（例えば、バイオリアクター、容器またはチューブ容積の１Ｌ当たり）の産生された組換えタンパク質の質量または酵素活性を指す。組換え抗体についてのＶＰＲは、通常、質量／Ｌ／日として測定される。組換え酵素についてのＶＰＲは、通常、単位／Ｌ／日または質量／Ｌ／日として測定される。
【００３２】
特定の態様では、例えば、以下の項目が提供される：
（項目１）
哺乳動物細胞を培養する方法であって、
０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の処理済みウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む液体培養培地中で、組換えエクリズマブを産生させるのに十分な条件下で、組換えエクリズマブをコードする核酸を含むＮＳ０細胞を流加培養することを含み、前記処理済みＢＳＡが、前記培養するステップの前かつ／または前記培養するステップ中に前記液体培養培地中に存在し、かつ／または前記液体培養培地に添加される、方法。
（項目２）
前記処理済みＢＳＡが、
ウシ由来の血漿を提供するステップ；
前記血漿を脱塩するステップ；
限外濾過を使用して前記血漿を濾過するステップ；
前記血漿から真性グロブリンを沈殿させるステップ；
前記血漿を濾過して沈殿した前記真性グロブリンを除去するステップ；
前記血漿に対してイオン交換クロマトグラフィーを実施して血清アルブミンおよび免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップ；
硫安沈殿法を使用して前記溶出液から免疫グロブリンを沈殿させるステップ；
前記溶出液から沈殿した前記免疫グロブリンを除去するステップ；
前記溶出液を濃縮およびフリーズドライして血清アルブミンを含む凍結乾燥材料を生成するステップ；ならびに任意選択で
前記凍結乾燥材料を溶液に再構成するステップ
を含む方法によって生成される、項目１に記載の方法。
（項目３）
ウシ由来の血漿を提供するステップ；
前記血漿を脱塩するステップ；
限外濾過を使用して前記血漿を濾過するステップ；
前記血漿から真性グロブリンを沈殿させるステップ；
前記血漿を濾過して沈殿した前記真性グロブリンを除去するステップ；
前記血漿に対してイオン交換クロマトグラフィーを実施して血清アルブミンおよび免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップ；
硫安沈殿法を使用して前記溶出液から免疫グロブリンを沈殿させるステップ；
前記溶出液から沈殿した前記免疫グロブリンを除去するステップ；
前記溶出液を濃縮およびフリーズドライして血清アルブミンを含む凍結乾燥材料を生成するステップ；ならびに
任意選択で前記凍結乾燥材料を溶液に再構成するステップ
を実施して前記処理済みＢＳＡを生成することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記処理済みＢＳＡが、血清アルブミンを含む溶液を加熱することも、血清アルブミンを含む溶液に安定剤を添加することも、再構成された凍結乾燥血清アルブミンを含む溶液から不純物を沈殿させることも含まない方法によって生成される、項目１に記載の方法。（項目５）
前記処理済みＢＳＡが、処理済みＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ＢＳＡである、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記処理済みＮＺ  ＢＳＡが、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＮＺ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  ＮＺ  ＢＳＡである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記液体培養培地が、少なくとも０．５ｇ／Ｌの処理済みＢＳＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記培養するステップの前かつ／または前記培養するステップ中に前記液体培養培地に処理済みＢＳＡを添加して、前記培養培地中０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の濃度の処理済みＢＳＡを得ることを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記処理済みＢＳＡが、前記培養するステップの前に前記液体培養培地中に存在する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記培養するステップで産生された前記組換えエクリズマブを収集することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
収集することが、前記ＮＳ０細胞を溶解させることを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
組換えエクリズマブが、前記培地から収集される、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
収集された前記組換えエクリズマブを医薬組成物に製剤化することをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
エクリズマブが、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
エクリズマブが、配列番号１からなる重鎖および配列番号２からなる軽鎖を含む、項目１４に記載の方法。
特記しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載されている；当技術分野で公知の他の適切な方法および材料もまた使用され得る。材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定として解釈されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび他の参考文献は、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。
【００３３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から、明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、非増強型ＢＳＡを作製するために使用される上流および下流処理ステップを示す２つの流れ図（それぞれ、左および中央の流れ図）、ならびに処理済みＢＳＡを創製するために使用されるステップを示す流れ図（右の流れ図）である。
【００３５】
【図２】図２は、（ｉ）１ｇ／Ｌの非増強型ＢＳＡ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標））を含有する第１の液体培養培地、および２２．１ｇ／Ｌの非増強型ＢＳＡ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標））を含有する液体フィード培養培地（黒の実線）（ｎ＝３８）、または（ｉｉ）１ｇ／Ｌの処理済みＢＳＡ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡ）を含有する第１の液体培養培地、および２２．１ｇ／Ｌの処理済みＢＳＡ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡ）を含有する液体フィード培養培地（黒の破線）（ｎ＝２１）を使用して培養されたエクリズマブをコードする核酸を含有するＮＳ０細胞の異なる１０，０００Ｌ流加培養における時間をわたっての生存細胞密度を示す。
【００３６】
【図３】図３は、（ｉ）１ｇ／Ｌの非増強型ＢＳＡ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標））を含有する第１の液体培養培地、および２２．１ｇ／Ｌの非増強型ＢＳＡ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標））を含有する液体フィード培養培地（黒の実線）（ｎ＝３８）、または（ｉｉ）１ｇ／Ｌの処理済みＢＳＡ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡ）を含有する第１の液体培養培地、および２２．１ｇ／Ｌの処理済みＢＳＡ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡ）を含有する液体フィード培養培地（黒の破線）（ｎ＝２１）を使用して培養されたエクリズマブをコードする核酸を含有するＮＳ０細胞の異なる１０，０００Ｌ流加培養における時間をわたっての百分率細胞生存度を示す。
【００３７】
【図４】図４は、（ｉ）１ｇ／Ｌの非増強型ＢＳＡ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標））を含有する第１の液体培養培地、および２２．１ｇ／Ｌの非増強型ＢＳＡ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標））を含有する液体フィード培養培地（黒の実線）（ｎ＝３８）、または（ｉｉ）１ｇ／Ｌの処理済みＢＳＡ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡ）を含有する第１の液体培養培地、および２２．１ｇ／Ｌの処理済みＢＳＡ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡ）を含有する液体フィード培養培地（黒の破線）（ｎ＝２１）を使用して培養されたエクリズマブをコードする核酸を含有するＮＳ０細胞の異なる１０，０００Ｌ流加培養における時間をわたっての組換えエクリズマブの力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の処理済みＢＳＡを含む液体培養培地中で、組換えタンパク質を産生させるのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸（組換えエクリズマブをコードする核酸など）を含む哺乳動物細胞を培養すること（流加培養または灌流培養など）を含む哺乳動物細胞を培養する方法が本明細書に提供される。これらの方法では、処理済みＢＳＡは、培養するステップの前かつ／または培養するステップ中に液体培養培地（例えば、第１の液体培養培地、フィード培養培地、および第２の液体培養培地、フィード培養培地のいずれか、および／または任意の他の液体培養培地のうちの１つまたは複数）中に存在し得、かつ／または液体培養培地に添加することができる。本明細書に記載される方法は、細胞培養におけるいくつかの利益、例えば、非増強型ＢＳＡを含むか、またはＢＳＡを含まない液体培養培地を使用して培養された同様の細胞と比較して、生存細胞密度の増大、生存細胞の百分率の増大、容積産生率の増大、比産生率の増大、組換えタンパク質力価の増大のうちの１つまたは複数などを達成することができる。哺乳動物細胞を培養する方法の非限定的な態様が、以下に記載されている。以下に記載される態様のいずれも、任意の組合せで、または当技術分野で公知の任意の他の要素とともに使用することができる。
【００３９】
処理済みＢＳＡ
処理済みＢＳＡは、以下に記載される方法によって生成されるウシ血清アルブミンである。例えば、処理済みＢＳＡは、血清アルブミンを含む溶液を加熱すること、血清アルブミンを含む溶液に安定剤を添加すること、および再構成された凍結乾燥血清アルブミンを含む溶液から不純物を沈殿させることを含まない方法によって生成される。処理済みＢＳＡを生成するための方法は、ウシ（複数可）由来の血漿を提供または抽出するステップからスタートすることができる。処理済みＢＳＡは、例えば、ウシ由来の血漿を提供するステップ、血漿を脱塩するステップ、限外濾過を使用して血漿を濾過するステップ、血漿から真性グロブリンを沈殿させるステップ、血漿を濾過して沈殿した真性グロブリンを除去するステップ、血漿に対してイオン交換クロマトグラフィーを実施して血清アルブミンおよび免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップ、硫安沈殿法を使用して溶出液から免疫グロブリンを沈殿させるステップ、溶出液から沈殿した免疫グロブリンを除去するステップ、溶出液を濃縮およびフリーズドライして血清アルブミンを含む凍結乾燥材料を生成するステップ、ならびに任意選択で凍結乾燥材料を溶液に再構成するステップを含む方法によって生成されるＢＳＡであり得る。処理済みＢＳＡの非限定的な例は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡである。
【００４０】
本明細書に提供される哺乳動物細胞を培養する方法のいずれも、例えば、ウシ（例えば、ニュージーランドで繁殖および飼育されたウシ）由来の血漿を提供するステップ、血漿を脱塩するステップ、限外濾過を使用して血漿を濾過するステップ、血漿から真性グロブリンを沈殿させるステップ、血漿を濾過して沈殿した真性グロブリンを除去するステップ、血漿に対してイオン交換クロマトグラフィーを実施して血清アルブミンおよび免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップ、硫安沈殿法を使用して溶出液から免疫グロブリンを沈殿させるステップ、溶出液から沈殿した免疫グロブリンを除去するステップ、溶出液を濃縮およびフリーズドライして血清アルブミンを含む凍結乾燥材料を生成するステップ、ならびに任意選択で凍結乾燥材料を溶液に再構成するステップを実施することによって処理済みＢＳＡを生成することをさらに含み得る。
【００４１】
処理済みＢＳＡを含有する培養培地
本明細書に提供する方法は、０．１ｇ／Ｌまたはそれを超える（例えば、少なくとも０．２ｇ／Ｌ、少なくとも０．３ｇ／Ｌ、少なくとも０．４ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも０．６ｇ／Ｌ、少なくとも０．７ｇ／Ｌ、少なくとも０．８ｇ／Ｌ、少なくとも０．９ｇ／Ｌ、少なくとも１．０ｇ／Ｌ、少なくとも１．１ｇ／Ｌ、少なくとも１．２ｇ／Ｌ、少なくとも１．３ｇ／Ｌ、少なくとも１．４ｇ／Ｌ、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、少なくとも１．６ｇ／Ｌ、少なくとも１．７ｇ／Ｌ、少なくとも１．８ｇ／Ｌ、少なくとも１．９ｇ／Ｌ、少なくとも２．０ｇ／Ｌ、少なくとも２．１ｇ／Ｌ．少なくとも２．２ｇ／Ｌ、少なくとも２．３ｇ／Ｌ、少なくとも２．４ｇ／Ｌ、少なくとも２．５ｇ／Ｌ、少なくとも２．６ｇ／Ｌ、少なくとも２．７ｇ／Ｌ、少なくとも２．８ｇ／Ｌ、少なくとも２．９ｇ／Ｌ、少なくとも３．０ｇ／Ｌ、少なくとも３．５ｇ／Ｌ、少なくとも４．０ｇ／Ｌ、少なくとも４．５ｇ／Ｌ、少なくとも５．０ｇ／Ｌ、少なくとも６．０ｇ／Ｌ、少なくとも７．０ｇ／Ｌ、少なくとも８．０ｇ／Ｌ、少なくとも９．０ｇ／Ｌ、少なくとも１０．０ｇ／Ｌ、少なくとも１１．０ｇ／Ｌ、少なくとも１２．０ｇ／Ｌ、少なくとも１３．０ｇ／Ｌ、少なくとも１４．０ｇ／Ｌ、少なくとも１５．０ｇ／Ｌ、少なくとも１６．０ｇ／Ｌ、少なくとも１７．０ｇ／Ｌ、少なくとも１８．０ｇ／Ｌ、少なくとも１９．０ｇ／Ｌ、少なくとも２０．０ｇ／Ｌ、少なくとも２５．０ｇ／Ｌ、少なくとも２６．０ｇ／Ｌ、少なくとも２７．０ｇ／Ｌ、少なくとも２８．０ｇ／Ｌ、少なくとも２９．０ｇ／Ｌまたは少なくとも３０．０ｇ／Ｌ）処理済みＢＳＡ（ＮＺ処理済みＢＳＡなど）を含む液体培養培地（例えば、第１の培養培地および／またはフィード培養培地）中で組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞を培養することを含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、処理済みＢＳＡを含有する液体培養培地は、約０．１ｇ／Ｌ〜約３０．０ｇ／Ｌの間（例えば、約０．１ｇ／Ｌと約３０．０ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２５．０ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２０．０ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１５．０ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１０．０ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約８．０ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約５．０ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約４．０ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．９ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．８ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．７ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．６ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．５ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．４ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．３ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．２ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．１ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．０ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．９ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．８ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．７ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．６ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．５ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．４ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．３ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．２ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．１ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．０ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．９ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．８ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．７ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．６ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．５ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．４ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．３ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約３０．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２５．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２０．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１５．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１０．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約５．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約４．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約３．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．９ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．８ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．７ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．６ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．５ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．４ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．３ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．２ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．１ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．９ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．８ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．７ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．６ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．５ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．４ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．３ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．２ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．１ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約０．９ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約０．８ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約０．７ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約３．０ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約３０．０ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２５．０ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２０．０ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１５．０ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１０．０ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約５．０ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．９ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．８ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．７ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．６ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．５ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．４ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．３ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．２ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．１ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．０ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．９ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．８ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．７ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．６ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．５ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．４ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．３ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．２ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約３０ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２５ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２０ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約１５ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約１０ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約５．０ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約３．０ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．９ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．８ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．７ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．６ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．５ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．４ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．３ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．２ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．１ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．０ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約１．９ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約１．８ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約１．７ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約３０ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２５ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２０ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約１５ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約１０ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約５ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約３．０ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．９ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．８ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．７ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．６ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．５ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．４ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．３ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．２ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約３０ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約２５ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約２０ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約１５ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約１０ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約５ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約３．０ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約２．９ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約２．８ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約２．７ｇ／Ｌとの間、約５．０ｇ／Ｌと約３０ｇ／Ｌとの間、約５．０ｇ／Ｌと約２５．０ｇ／Ｌとの間、約５．０ｇ／Ｌと約２０．０ｇ／Ｌとの間、約５．０ｇ／Ｌと約１５．０ｇ／Ｌとの間、約５．０ｇ／Ｌと約１０．０ｇ／Ｌとの間、約１０．０ｇ／Ｌと約３０ｇ／Ｌとの間、約１０．０ｇ／Ｌと約２５．０ｇ／Ｌとの間、約１０．０ｇ／Ｌと約２０．０ｇ／Ｌとの間、約１０．０ｇ／Ｌと約１５．０ｇ／Ｌとの間、約１５．０ｇ／Ｌと約３０ｇ／Ｌとの間、約１５．０ｇ／Ｌと約２５．０ｇ／Ｌとの間、約１５．０ｇ／Ｌと約２０．０ｇ／Ｌとの間、約２０．０ｇ／Ｌと約３０．０ｇ／Ｌとの間、約２０．０ｇ／Ｌと約２５．０ｇ／Ｌとの間、または約２１ｇ／Ｌと約２３ｇ／Ｌとの間）の処理済みＢＳＡを含有し得る。
【００４２】
０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の処理済みＢＳＡを含む液体培養培地は、第１の液体培養培地であり得、または哺乳動物細胞の流加培養を含む方法における第１の液体培養フィード培地の両方であり得る。本明細書に記載される方法のいずれかにおける流加培養は、２種の異なる液体培養フィード培地の使用を含み得、２種の異なる液体培養フィード培地の一方または両方は、０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の処理済みＢＳＡを含む。０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の処理済みＢＳＡを含む液体培養培地は、哺乳動物細胞の灌流培養を含む方法における第１の液体培養フィード培地および第２の液体培養フィード培地の一方または両方であり得る。
【００４３】
当技術分野で周知であるように、処理済みＢＳＡを含有する液体培養培地は、液体培養培地中に所望の最終濃度の処理済みＢＳＡを達成するのに十分な量の処理済みＢＳＡ（固体形態での、または溶液としての）を液体培養培地に添加することによって生成することができる。
【００４４】
一部の方法では、培養物中に存在する処理済みＢＳＡの濃度は、培養期間全体にわたって実質的に一定のままであり得る。他の方法では、培養物中に存在する処理済みＢＳＡの濃度は、培養期間中に増大し得る。一部の実施形態では、処理済みＢＳＡは、培養期間のスタート時の液体培養培地（第１の液体培養培地）中に存在し得る。他の実施形態では、処理済みＢＳＡは、培養期間のスタート後に第１の液体培養培地に添加されてもよい（例えば、ボーラス注射によって、または処理済みＢＳＡを含有するフィード培養培地または第２の液体培養培地を添加することによって）。
【００４５】
哺乳動物細胞の培養
０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の処理済みＢＳＡを含む液体培養培地中で組換えタンパク質をコードする核酸（例えば、組換えエクリズマブをコードする核酸）を含有する哺乳動物細胞（例えば、ＮＳ０細胞）を培養することを含む、哺乳動物細胞を培養する方法が本明細書に提供される。本方法の一部の実施形態では、処理済みＢＳＡは、培養前かつ／または培養中に液体培養培地中に存在し、かつ／または液体培養培地に添加される。例えば、処理済みＢＳＡは、培養前に第１の液体培養培地中に存在し得る。一部の実施形態では、処理済みＢＳＡは、培養前に第１の液体培養培地に積極的に添加される。一部の例では、処理済みＢＳＡは、培養中に第１の液体培養培地に添加される（例えば、処理済みＢＳＡのボーラス注射によって、または処理済みＢＳＡを含有するフィード培養培地もしくは第２の液体培養培地を添加することによって）。本明細書に記載される処理済みＢＳＡを含有する非限定的な液体培養培地のいずれも、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて使用することができる。
【００４６】
培養方法の一部の実施形態では、培養は、流加培養である。培養方法の他の実施形態では、培養は、灌流培養である。本明細書に記載される培養方法のいずれにおいても、細胞は、組換えエクリズマブをコードする核酸を含有するＮＳ０細胞であり得る。本明細書に記載される方法において使用することができる哺乳動物細胞を培養する態様の非限定的な例が、以下に記載されている。理解され得るように、以下に記載される態様、または当技術分野で公知のさらなる態様のいずれも、任意の組合せで使用することができる。
【００４７】
流加培養
本明細書に記載される方法における培養するステップは、流加培養を含み得る。当技術分野で公知であるように、流加培養は、細胞培養物由来の第１の液体培養培地の実質的なまたは著しい除去を伴わない初期細胞培養物へのフィード培養培地の漸増的（周期的）または連続的添加を含む。流加培養における細胞培養物は、バイオリアクター（例えば、１０，０００Ｌ産生バイオリアクターなどの産生バイオリアクター）中に置くことができる。一部の場合には、フィード培養培地は、第１の液体培養培地と同じである。フィード培養培地は、液体形態であっても、乾燥粉末であってもよい。他の場合には、フィード培養培地は、第１の液体培養培地の濃縮形態であり、かつ／または乾燥粉末として添加される。一部の実施形態では、第１の液体フィード培養培地および異なる第２の液体フィード培養培地の両方が、第１の液体培養培地に添加される（例えば、連続的に添加される）。一部の例では、培養物への第１の液体フィード培養培地の添加および第２の液体フィード培養培地の添加は、ほぼ同じ時間に開始される。一部の例では、培養期間全体にわたって培養物に添加される第１の液体フィード培養培地および第２の液体フィード培養培地の全容積は、ほぼ同じである。
【００４８】
フィード培養培地が連続的に添加されるとき、フィード培養培地の添加の速度は、培養期間にわたって一定に保持することができ、または増大させる（例えば、着実に増大させる）ことができる。フィード培養培地の連続的添加は、培養期間中の特定の時点（例えば、哺乳動物細胞が、標的生存細胞密度、例えば、約１×１０６細胞／ｍＬ、約１．１×１０６細胞／ｍＬ、約１．２×１０６細胞／ｍＬ、約１．３×１０６細胞／ｍＬ、約１．４×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約１．６×１０６細胞／ｍＬ、約１．７×１０６細胞／ｍＬ、約１．８×１０６細胞／ｍＬ、約１．９×１０６細胞／ｍＬまたは約２．０×１０６細胞／ｍＬ）の生存細胞密度に到達するとき）にスタートすることができる。一部の実施形態では、フィード培養培地の連続的添加は、培養期間の２日目、３日目、４日目、または５日目に開始することができる。
【００４９】
一部の実施形態では、フィード培養培地の漸増的（周期的）添加は、哺乳動物細胞が標的細胞密度（例えば、約１×１０６細胞／ｍＬ、約１．１×１０６細胞／ｍＬ、約１．２×１０６細胞／ｍＬ、約１．３×１０６細胞／ｍＬ、約１．４×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約１．６×１０６細胞／ｍＬ、約１．７×１０６細胞／ｍＬ、約１．８×１０６細胞／ｍＬ、約１．９×１０６または約２．０×１０６細胞／ｍＬ）に到達するときに始めることができる。漸増的フィード培養培地添加は、規則的な間隔で（例えば、毎日、隔日、もしくは３日ごとに）行うことができ、または細胞が特定の標的細胞密度（例えば、培養期間にわたって増大する標的細胞密度）に到達するときに行うことができる。一部の実施形態では、添加されるフィード培養培地の量は、フィード培養培地の第１の漸増的添加とフィード培養培地の後続の添加との間で次第に増大させることができる。培養期間中の任意の２４時間にわたって初期細胞培養物に添加される液体培養フィード培養培地の容積は、培養物を含有するバイオリアクターの初期容積の一部の割合または初期培養物の容積の一部の割合であり得る。
【００５０】
例えば、液体フィード培養培地の添加（連続的または周期的）は、培養期間のスタート後、６時間と７日間との間、約６時間と約６日間との間、約６時間と約５日間との間、約６時間と約４日間との間、約６時間と約３日間との間、約６時間と約２日間との間、約６時間と約１日間との間、約１２時間と約７日間との間、約１２時間と約６日間との間、約１２時間と約５日間との間、約１２時間と約４日間との間、約１２時間と約３日間との間、約１２時間と約２日間との間、約１日間と約７日間との間、約１日間と約６日間との間、約１日間と約５日間との間、約１日間と約４日間との間、約１日間と約３日間との間、約１日間と約２日間との間、約２日間と約７日間との間、約２日間と約６日間との間、約２日間と約５日間との間、約２日間と約４日間との間、約２日間と約３日間との間、約３日間と約７日間との間、約３日間と約６日間との間、約３日間と約５日間との間、約３日間と約４日間との間、約４日間と約７日間との間、約４日間と約６日間との間、約４日間と約５日間との間、約５日間と約７日間との間または約５日間と約６日間との間である時点において、行われ得る。
【００５１】
任意の２４時間にわたって初期細胞培養物に添加される（連続的または周期的に）液体フィード培養培地の容積は、バイオリアクターの容量の０．０１倍から約０．３倍の間であり得る。割合は、バイオリアクターの容量の約０．０１倍と約０．２８倍との間、約０．０１倍と約０．２６倍との間、約０．０１倍と約０．２４倍との間、約０．０１倍と約０．２２倍との間、約０．０１倍と約０．２０倍との間、約０．０１倍と約０．１８倍との間、約０．０１倍と約０．１６倍との間、約０．０１倍と約０．１４倍との間、約０．０１倍と約０．１２倍との間、約０．０１倍と約０．１０倍との間、約０．０１倍と約０．０８倍との間、約０．０１倍と約０．０６倍との間、約０．０１倍と約０．０４倍との間、約０．０２倍と約０．３倍との間、約０．０２倍と約０．２８倍との間、約０．０２倍と約０．２６倍との間、約０．０２倍と約０．２４倍との間、約０．０２倍と約０．２２倍との間、約０．０２倍と約０．２０倍との間、約０．０２倍と約０．１８倍との間、約０．０２倍と約０．１６倍との間、約０．０２倍と約０．１４倍との間、約０．０２倍と約０．１２倍との間、約０．０２倍と約０．１０倍との間、約０．０２倍と約０．０８倍との間、約０．０２倍と約０．０６倍との間、約０．０２倍と約０．０５倍との間、約０．０２倍と約０．０４倍との間、約０．０２倍と約０．０３倍との間、約０．０２５倍と約０．３倍との間、約０．０２５倍と約０．２８倍との間、約０．０２５倍と約０．２６倍との間、約０．０２５倍と約０．２４倍との間、約０．０２５倍と約０．２２倍との間、約０．０２５倍と約０．２０倍との間、約０．０２５倍と約０．１８倍との間、約０．０２５倍と約０．１６倍との間、約０．０２５倍と約０．１４倍との間、約０．０２５倍と約０．１２倍との間、約０．０２５倍と約０．１０倍との間、約０．０２５倍と約０．０８倍との間、約０．０２５倍と約０．０６倍との間、約０．０２５倍と約０．０４倍との間、約０．０５倍と約０．３倍との間、約０．０５倍と約０．２８倍との間、約０．０５倍と約０．２６倍との間、約０．０５倍と約０．２４倍との間、約０．０５倍と約０．２２倍との間、約０．０５倍と約０．２０倍との間、約０．０５倍と約０．１８倍との間、約０．０５倍と約０．１６倍との間、約０．０５倍と約０．１４倍との間、約０．０５倍と約０．１２倍との間、約０．０５倍と約０．１０倍との間、約０．１倍と約０．３倍との間、約０．１倍と約０．２８倍との間、約０．１倍と約０．２６倍との間、約０．１倍と約０．２４倍との間、約０．１倍と約０．２２倍との間、約０．１倍と約０．２０倍との間、約０．１倍と約０．１８倍との間、約０．１倍と約０．１６倍との間、約０．１倍と約０．１４倍との間、約０．１倍との間、約０．１５倍と約０．３倍との間、約０．１５倍と約０．２倍との間、約０．２倍と約０．３倍との間、または約０．２５倍と約０．３倍との間であり得る。
【００５２】
他の実施形態では、培養期間中の任意の２４時間にわたって初期細胞培養物に添加される（連続的または周期的に）液体フィード培養培地の容積は、初期細胞培養物の容積の０．０２倍と約１．０倍との間、約０．０２倍と約０．９倍との間、約０．０２倍と約０．８倍との間、約０．０２倍と約０．７倍との間、約０．０２倍と約０．６倍との間、約０．０２倍と約０．５倍との間、約０．０２倍と約０．４倍との間、約０．０２倍と約０．３倍との間、約０．０２倍と約０．２倍との間、約０．０２倍と約０．１倍との間、約０．０２倍と約０．０８倍との間、約０．０２倍と約０．０６倍との間、約０．０２倍と約０．０５倍との間、約０．０２倍と約０．０４倍との間、約０．０２倍と約０．０３倍との間、約０．０５倍と約１．０倍との間、約０．０５倍と約０．８倍との間、約０．０５倍と約０．７倍との間、約０．０５倍と約０．６倍との間、約０．０５倍と約０．５倍との間、約０．０５倍と約０．４倍との間、約０．０５倍と約０．３倍との間、約０．０５倍と約０．２倍との間、約０．０５倍と約０．１倍との間、約０．１倍と約１．０倍との間、約０．１倍と約０．９倍との間、約０．１倍と約０．８倍との間、約０．１倍と約０．７倍との間、約０．１倍と約０．６倍との間、約０．１倍と約０．５倍との間、約０．１倍と約０．４倍との間、約０．１倍と約０．３倍との間、約０．１倍と約０．２倍との間、約０．２倍と約１．０倍との間、約０．２倍と約０．９倍との間、約０．２倍と約０．８倍との間、約０．２倍と約０．７倍との間、約０．２倍と約０．６倍との間、約０．２倍と約０．５倍との間または約０．２倍と約０．４倍との間であり得る。
【００５３】
培養期間全体にわたって添加される（連続的または周期的に）フィード培養培地の合計量は、初期培養物の容積の約１％と約４０％との間（例えば、約１％と約３５％との間、約１％と約３０％との間、約１％と約２５％との間、約１％と約２０％との間、約１％と約１５％との間、約１％と約１０％との間、約１％と約５％との間、約１％と約４％との間、約２％と約４０％との間、約２％と約３５％との間、約２％と約３０％との間、約２％と約２５％との間、約２％と約２０％との間、約２％と約１５％との間、約２％と約１０％との間、約２％と約５％との間、約３％と約４０％との間、約３％と約３５％との間、約３％と約３０％との間、約３％と約２５％との間、約３％と約２０％との間、約３％と約１５％との間、約３％と約１０％との間、約３％と約５％との間、約４％と約４０％との間、約４％と約３５％との間、約４％と約３０％との間、約４％と約２５％との間、約４％と約２０％との間、約４％と約１５％との間、約４％と約１０％との間、約４％と約８％との間、約５％と約４０％との間、約５％と約３５％との間、約５％と約３０％との間、約５％と約２５％との間、約５％と約２０％との間、約５％と約１５％との間、約５％と約１０％との間、約１０％と約４０％との間、約１０％と約３５％との間、約１０％と約３０％との間、約１０％と約２５％との間、約１０％と約２０％との間、約１０％と約１５％との間、約１５％と約４０％との間、約１５％と約３５％との間、約１５％と約３０％との間、約１５％と約２５％との間、約１５％と約２０％との間、約２０％と約４０％との間、約２０％と約３５％との間、約２０％と約３０％との間、約２０％と約２５％との間、約２５％と約４０％との間、約２５％と約３５％との間、約２５％と約３０％との間、約３０％と約４０％との間、約３０％と約３５％または約３５％と約４０％との間）であり得る。
【００５４】
一部の例では、２種の異なるフィード培養培地が、流加培養中に添加される（連続的または漸増的に）。添加される第１のフィード培養培地および第２のフィード培養培地の量または容積は、実質的に同じであり得、または異なり得る。第１のフィード培養培地は、液体の形態にあり得、第２のフィード培養培地は、固体の形態にあり得る。第１のフィード培養培地および第２のフィード培養培地は、液体フィード培養培地であり得る。
【００５５】
灌流培養
本明細書に記載される方法における培養するステップは、灌流培養であり得る。当技術分野で公知のように、灌流培養は、第１の容積の第１の液体培養培地をバイオリアクター（例えば、産生バイオリアクター）から除去すること、および第２の容積の第２の液体培養培地を産生バイオリアクターに添加することを含み、この第１の容積および第２の容積は、ほぼ等しい。哺乳動物細胞は、ある種の細胞保持デバイスによって、または沈降コーンにおける細胞沈降などの技術を介して、バイオリアクター中に保持される。灌流培養における培養培地の除去および添加は、同時にもしくは逐次的に、またはこれら２つのある種の組合せで、実施され得る。さらに、除去および添加は、バイオリアクターの０．１％から８００％の間、１％と７００％との間、１％と６００％との間、１％と５００％との間、１％と４００％との間、１％と３５０％との間、１％と３００％との間、１％と２５０％との間、１％と１００％との間、１００％と２００％との間、５％と１５０％との間、１０％と５０％との間、１５％と４０％との間、８％と８０％との間または４％と３０％との間の容積を除去および置き換える速度などで、連続的に実施され得る。
【００５６】
除去される第１の容積の第１の液体培養培地および添加される第２の容積の第２の液体培養培地は、一部の例では、各２４時間の期間にわたってほぼ同じに保持され得る。当技術分野で公知のように、第１の容積の第１の液体培養培地が除去される速度（容積／時間の単位）および第２の容積の第２の液体培養培地が添加される速度（容積／時間の単位）は、特定の細胞培養系の状態によって変動し得、それらに依存し得る。第１の容積の第１の液体培養培地が除去される速度（容積／時間の単位）および第２の容積の第２の液体培養培地が添加される速度（容積／時間の単位）は、ほぼ同じであり得る、または異なり得る。
【００５７】
代わりに、除去および添加される容積は、それぞれの２４時間にわたって徐々に増大させることによって変更することができる。例えば、それぞれの２４時間内に除去される第１の液体培養培地の容積および添加される第２の液体培養培地の容積は、培養期間にわたって増大させることができる。容積は、２４時間にわたってバイオリアクターの容量の０．５％〜約２０％の間である容積を増大させることができる。容積は、２４時間にわたってバイオリアクターの容量または第１の液体培養培地の容積の約２５％〜約１５０％である容積に培養期間にわたって増大させることができる。
【００５８】
本明細書に記載される方法の一部の例では、培養期間の最初の４８〜９６時間の後、各２４時間の期間中に、除去される第１の容積の第１の液体培養培地および添加される第２の容積の第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地の容積の約１０％から約９５％、約１０％から約２０％、約２０％から約３０％、約３０％から約４０％、約４０％から約５０％、約５０％から約６０％、約６０％から約７０％、約７０％から約８０％、約８０％から約９０％、約８５％から約９５％、約６０％から約８０％または約７０％である。
【００５９】
当業者は、第１の液体培養培地および第２の液体培養培地が、同じ型の培地であり得ることを理解する。他の場合には、この第１の液体培養培地および第２の液体培養培地は、異なり得る。この第２の液体培養培地は、１つまたは複数の培地成分に関してより濃縮され得る。一部の実施形態では、第１の液体培養培地が処理済みＢＳＡを含有し、第２の液体培養培地が処理済みＢＳＡを含有し、または第１および第２の液体培養培地の両方が処理済みＢＳＡを含有する。
【００６０】
第１の容積の第１の液体培養培地は、任意の自動化システムを使用することによって除去され得る。例えば、交互接線流濾過が使用され得る。あるいは、第１の容積の第１の液体培養培地は、哺乳動物細胞を排除する分子量カットオフを有する滅菌メンブレンを通じて第１の容積の第１の液体培養培地を浸出させることまたはその重力流によって、除去され得る。あるいは、第１の容積の第１の液体培養培地は、少なくとも１分間、少なくとも２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、４０分間、５０分間または１時間の期間にわたって、撹拌を停止させることまたは撹拌速度を顕著に減少させること、および第１の容積の第１の液体培養培地を、産生バイオリアクターの上部から取り出しまたは吸引することによって、除去され得る。
【００６１】
第２の容積の第２の液体培養培地は、ポンプによって、第１の液体培養培地に添加され得る。この第２の液体培養培地は、手動で、例えば、第２の容積の第２の液体培養培地を第１の液体培地上に直接ピペッティングもしくは注入することによって、または自動化様式で、第１の液体培養培地に添加され得る。
【００６２】
哺乳動物細胞
本明細書に記載される方法において培養される哺乳動物細胞は、種々の異なる哺乳動物細胞であり得る。一部の例では、この哺乳動物細胞は、接着細胞であり、細胞培養物は、マイクロキャリアを含む。一部の例では、この哺乳動物細胞は、懸濁物中で増殖する細胞であり得る。本明細書に記載される方法を使用して培養され得る哺乳動物細胞の非限定的な例には、以下が含まれる：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞、他の骨髄腫細胞、例えばＮＳ０細胞、Ｂ細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ  ２９３ＥおよびＨＥＫ  ２９３Ｆ）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）細胞およびメイディン・ダービー・イヌ（コッカースパニエル）腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）細胞。本明細書に記載される方法を使用して培養され得るさらなる哺乳動物細胞は、当技術分野で公知である。本明細書に記載される方法のいずれかの非限定的な例では、培養期間のスタート時に産生バイオリアクター中に存在する哺乳動物細胞の細胞密度（最初の細胞密度）は、約０．１×１０６細胞／ｍＬ〜約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．２×１０６細胞／ｍＬ〜約０．４×１０６細胞／ｍＬまたは約０．２５×１０６細胞／ｍＬ〜約０．５×１０６細胞／ｍＬである。
【００６３】
本明細書に記載される方法において使用される哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれた、組換えタンパク質をコードする組換え核酸を含有することができる。一部の実施形態では、組換えタンパク質は、哺乳動物細胞によって液体培養培地中に分泌される。一部の場合には、培養された哺乳動物細胞は、シード培養物由来である。より具体的には、初期細胞培養物は、シードトレインプロセスの結果、または別のバイオリアクター由来の培養物である。
【００６４】
培養培地
培養するステップで使用することができる液体培養培地は、当技術分野で公知である。液体培養培地は、無血清液体培養培地であり得る。無血清培養培地を含めた培養培地の非限定的な例は、市販されている。
【００６５】
液体培養培地は、典型的には、グルコースなどの炭水化物由来のエネルギー源、アミノ酸（例えば、２０種のアミノ酸＋システインの基本的セット）、ビタミン、遊離脂肪酸、微量元素、および低濃度で要求される他の有機化合物を含有する。液体培養培地には、塩および緩衝液（例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジンおよびヒポキサンチン）、タンパク質および組織加水分解物、ならびに／またはこれらもしくは他の添加剤の任意の組合せが補充することができる。
【００６６】
本明細書に記載される方法において有用であり得る液体培養培地の非限定的な例には、例えば、ＣＤ  ＣＨＯ、Ｏｐｔｉ  ＣＨＯおよびＦｏｒｔｉ  ＣＨＯ（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから入手可能）、Ｈｙｃｅｌｌ  ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ｅｘ−ｃｅｌｌ  ＣＤ  ＣＨＯ  Ｆｕｓｉｏｎ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ならびにＰｏｗｅｒＣＨＯ培地（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．；Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が含まれる。本発明の方法においてこれもまた有用であり得る培地成分には、化学的に規定された（ＣＤ）加水分解物、例えば、ＣＤペプトン、ＣＤポリペプチド（２つまたはそれ超のアミノ酸）およびＣＤ増殖因子が含まれるがこれらに限定されない。液体培養培地および培地成分のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【００６７】
哺乳動物細胞の培養において使用される培養培地は、約６．５と約７．５との間、約６．５と約７．４との間、約６．５と約７．３との間、約６．５と約７．２との間、約６．５と約７．１との間、約６．５と約７．０との間、約６．５と約６．９との間、約６．５と約６．８との間、約６．５と約６．７との間、約６．６と約７．５との間、約６．６と約７．４との間、約６．６と約７．３との間、約６．６と約７．２との間、約６．６と約７．１との間、約６．６と約７．０との間、約６．６と約６．９との間、約６．６と約６．８との間、約６．７と約７．５との間、約６．７と約７．４との間、約６．７と約７．３との間、約６．７と約７．２との間、約６．７と約７．１との間、約６．７と約７．０との間、約６．７と約６．９との間、約６．８と約７．５との間、約６．８と約７．４との間、約６．８と約７．３との間、約６．８と約７．２との間、約６．８と約７．１との間、約６．８と約７．０との間、約６．９と約７．５との間、約６．９と約７．４との間、約６．９と約７．３との間、約６．９と約７．２との間、約６．９と約７．１との間、約７．０と約７．５との間、約７．０と約７．４との間、約７．０と約７．３との間、約７．０と約７．２との間、約７．１と約７．５との間、約７．１と約７．４との間、約７．１と約７．３との間、約７．２と約７．５との間、約７．２と約７．４との間または約７．３と約７．５との間のｐＨを有し得る。
【００６８】
当業者は、培養において使用される液体培養培地が、同じであり得るか、または細胞培養条件に依存して培養期間中に変化し得ることを理解する。
【００６９】
一部の実施形態では、流加培養物中に添加されるフィード培養培地は、固体組成物であり得る。流加培養物に添加され得る固体フィード培養培地の例は、当技術分野で公知である。
【００７０】
撹拌
哺乳動物細胞の培養は、通常、培養物を混合するためのいくつかの形態の撹拌を含む。例えば、培養で使用される撹拌は、インペラを使用する回転撹拌であり得る。撹拌は、約２５ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭ、約２５ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約２００ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約１８０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約１６０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約１４０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約１２０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約１００ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約８０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約６０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約４０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３５ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの間、約５０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約２００ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約１８０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約１６０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約１４０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約１２０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約１００ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約８０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約６０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの間、約７５ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約２００ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約１８０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約１６０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約１４０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約１２０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約１００ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約８０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの間、約１００ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約２００ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約１８０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約１６０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約１４０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約１２０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの間、約１５０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約２００ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約１８０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約１６０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの間、約２００ＲＰＭと４８０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約３００ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約４００ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約４００ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約４００ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約４００ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間または約４００ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間の回転数で行うことができる。撹拌は、連続的または周期的に実施することができる。
【００７１】
温度
本明細書に記載される培養するステップは、３２℃〜約３９℃、約３２℃〜約３７℃、約３２℃と約３７．５℃との間、約３４℃と約３７℃との間、約３５℃と約３７℃との間、約３５．５℃と約３７．５℃との間、約３６℃と約３７℃との間または約３６．５℃の温度で実施することができる。例えば、哺乳動物細胞は、培養期間の開始から最後まで約３７℃の温度でインキュベートすることができる。当業者は、温度が、変化し得るか、または例えば、毎時間または毎日ベースで培養期間中にわずかに変化し得ることを理解する。例えば、温度は、培養期間をスタートして約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１４日、もしくは１５日後に、または培養期間の任意の時点に変化またはシフトさせる（例えば、上昇または低下させる）ことができる。例えば、温度を、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０．０℃、上方にシフトし得る。別の例では、温度を、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０℃、下方にシフトし得る。
【００７２】
ＣＯ２
培養するステップは、約１％〜１５％ＣＯ２、多くて、１４％ＣＯ２、１２％ＣＯ２、１０％ＣＯ２、８％ＣＯ２、６％ＣＯ２、５％ＣＯ２、４％ＣＯ２、３％ＣＯ２、２％ＣＯ２もしくは約１４％ＣＯ２、１２％ＣＯ２、１０％ＣＯ２、８％ＣＯ２、６％ＣＯ２、５％ＣＯ２、４％ＣＯ２、３％ＣＯ２、２％ＣＯ２、または多くて、１％ＣＯ２もしくは約１％ＣＯ２を含有する雰囲気を使用して実施することができる。産生バイオリアクター中にＣＯ２をスパージするための方法は、当技術分野で周知である。
【００７３】
本明細書に記載される方法のいずれかは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８５％、８０％、８５％、９０％もしくは約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％もしくは約９５％の湿度、または約１００％の湿度を含む加湿雰囲気中で、第１の期間中に細胞を培養するステップもまた含み得る。
【００７４】
ｄＯ２
培養するステップは、約３％と約５５％との間、約３％と約５０％との間、約３％と約４５％との間、約３％と約４０％との間、約３％と約３５％との間、約３％と約３０％との間、約３％と約２５％との間、約３％と約２０％との間、約３％と約１５％との間、約５％と約５５％との間、約５％と約５０％との間、約５％と約４５％との間、約５％と約４０％との間、約５％と約３５％との間、約５％と約３０％との間、約５％と約２５％との間、約５％と約２０％との間、約５％と約１５％との間、約５％と約１０％との間、約１０％と約５５％との間、約１０％と約５０％との間、約１０％と約４５％との間、約１０％と約４０％との間、約１０％と約３５％との間、約１０％と約３０％との間、約１０％と約２５％との間、約１０％と約２０％との間、約１５％と約５５％との間、約１５％と約５０％との間、約１５％と約４５％との間、約１５％と約４０％との間、約１５％と約３５％との間、約１５％と約３０％との間、約１５％と約２５％との間、約１５％と約２０％との間、約２０％と約５５％との間、約２０％と約５０％との間、約２０％と約４５％との間、約２０％と約４０％との間、約２０％と約３５％との間、約２０％と約３０％との間、約２０％と約２５％との間、約２５％と約５５％との間、約２５％と約５０％との間、約２５％と約４５％との間、約２５％と約４０％との間、約２５％と約３５％との間、約２５％と約３０％との間、約３０％と約５５％との間、約３０％と約５０％との間、約３０％と約４５％との間、約３０％と約４０％との間、約３０％と約３５％との間、約３５％と約５５％との間、約３５％と約５０％との間、約３５％と約４５％との間、約３５％と約４０％との間、約４０％と約５５％との間、約４０％と約５０％との間、約４０％と約４５％との間、約４５％と約５５％との間、約４５％と約５０％との間または約５０％と約５５％との間の溶存酸素（ｄＯ２）を細胞培養物中で維持することによって実施され得る。
【００７５】
ｐＨ
培養するステップ中、細胞培養物のｐＨを、アルカリ塩基溶液などの塩基溶液を添加することによって特定のｐＨ値で維持することができる。細胞培養物のｐＨを、約６．５と約７．５との間、約６．５と約７．４との間、約６．５と約７．３との間、約６．５と約７．２との間、約６．５と約７．１との間、約６．５と約７．０との間、約６．５と約６．９との間、約６．５と約６．８との間、約６．５と約６．７との間、約６．６と約７．５との間、約６．６と約７．４との間、約６．６と約７．３との間、約６．６と約７．２との間、約６．６と約７．１との間、約６．６と約７．０との間、約６．６と約６．９との間、約６．６と約６．８との間、約６．７と約７．５との間、約６．７と約７．４との間、約６．７と約７．３との間、約６．７と約７．２との間、約６．７と約７．１との間、約６．７と約７．０との間、約６．７と約６．９との間、約６．８と約７．５との間、約６．８と約７．４との間、約６．８と約７．３との間、約６．８と約７．２との間、約６．８と約７．１との間、約６．８と約７．０との間、約６．９と約７．５との間、約６．９と約７．４との間、約６．９と約７．３との間、約６．９と約７．２との間、約６．９と約７．１との間、約７．０と約７．５との間、約７．０と約７．４との間、約７．０と約７．３との間、約７．０と約７．２との間、約７．１と約７．５との間、約７．１と約７．４との間、約７．１と約７．３との間、約７．２と約７．５との間、約７．２と約７．４または約７．３と約７．５との間のｐＨで維持することができる。一部の例では、培養物のｐＨは、±０．０５のデッドゾーン（約６．９５から約７．０５の間のｐＨ）を伴ってｐＨ７．００で維持される。
【００７６】
組換えタンパク質
本明細書に記載される方法のいずれかにおける組換えタンパク質の非限定的な例は、軽鎖および重鎖免疫グロブリンを含む免疫グロブリン、ヒト補体タンパク質Ｃ５に特異的に結合するヒト化抗体を含む抗体、例えばエクリズマブ、または抗体断片、酵素、例えば、α−ガラクトシダーゼ、Ｍｙｏｚｙｍｅ、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ、非抗体タンパク質、例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンアルファもしくはベータ、またはワクチンにおける使用のための免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質断片である。一部の実施形態では、この組換えタンパク質は、少なくとも１つの多機能性組換えタンパク質足場を含有する操作されたタンパク質である。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １３巻：２４５〜２５５頁、２００９年；および米国特許出願公開第２０１２／０１６４０６６号に記載される組換え抗原結合タンパク質を参照のこと。抗体である組換えタンパク質の非限定的な例には、以下が含まれる：パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ、アクトクスマブ（ａｃｔｏｘｕｍａｂ）、アダリムマブ、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ（ａｌｔｕｍｏｍａｂ）、アマツキシマブ、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アポリズマブ、アチヌマブ（ａｔｉｎｕｍａｂ）、トシリズマブ、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｚｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ（ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ（ｄｅｎｓｕｍａｂ）、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ（ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブおよびトラスツズマブ。
【００７７】
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて培養される哺乳動物細胞によって産生される組換えタンパク質は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む組換えエクリズマブであり得る。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて培養される哺乳動物細胞によって産生される組換えタンパク質は、配列番号１の重鎖および配列番号２の軽鎖を含む組換えエクリズマブであり得る。エクリズマブの重鎖および軽鎖をコードする核酸は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，３５５，２４５号における核酸配列、およびＡｎら、ｍＡｂｓ、１巻：６号、５７２〜５７９頁、２００９年におけるＦｃ領域配列を参照のこと）。
【００７８】
本明細書に記載される方法によって生成することができる治療抗体のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【００７９】
組換えタンパク質の収集
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、培養するステップで産生された組換えタンパク質を収集するステップをさらに含む。一部の例では、収集するステップは、哺乳動物細胞を溶解させることを含む。一部の例では、組換えタンパク質は、培養培地（例えば、流加培養するステップを含む方法について第１の液体培養培地およびフィード培養培地の一方もしくは両方、または灌流培養するステップを含む方法について第１の液体培養培地および第２の液体培養培地の一方もしくは両方）から収集される。哺乳動物細胞を溶解させるための方法は、当技術分野で周知である。培養培地から組換えタンパク質を収集するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、親和性クロマトグラフィーおよび／または濾過を含む。
【００８０】
収集された組換えタンパク質の精製
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、収集された組換えタンパク質を精製するステップをさらに含む。当技術分野で公知であるように、収集された組換えタンパク質は、当技術分野で公知の方法を使用して精製することができる。例えば、濾過およびクロマトグラフィー（例えば、親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ樹脂を使用する）、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィー）の１つまたは複数のステップを、収集された組換えタンパク質を精製するために形成することができる。収集された組換えタンパク質（例えば、シフトされた組換えタンパク質産物）を精製するためのさらなる方法は、当技術分野で周知である。
【００８１】
精製された組換えタンパク質は、液体培養培地由来の混入タンパク質、ならびに／または哺乳動物細胞の溶解物由来の混入ＤＮＡ、タンパク質、脂質、および炭水化物を実質的に含まない（少なくとも９０％、または約９０％含まない、あるいは約９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％、もしくは約９９％含まないなど）ことができる。
【００８２】
収集または精製された組換えタンパク質の等電性プロファイル（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ）のシフト
一部の例では、収集または精製された組換えエクリズマブの等電性プロファイルを、参照によって本明細書に組み込まれる、２０１４年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０６４，３９７号に記載される方法を使用してシフトさせる（より酸性の等電性プロファイルにシフトさせる）ことができる。
【００８３】
組換えタンパク質の製剤化
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、収集された組換えタンパク質、精製された組換えタンパク質、またはシフトされた組換えタンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む。収集された組換えタンパク質、精製された組換えタンパク質、またはシフトされた組換えタンパク質を医薬組成物に製剤化することは、精製された組換えタンパク質、収集された組換えタンパク質、またはシフトされた組換えタンパク質ブを薬学的に許容される賦形剤に混合または添加して医薬組成物を創製するステップを含み得る。薬学的に許容される賦形剤（例えば、天然に存在しない薬学的に許容される賦形剤）の例は、当技術分野で周知である。
【実施例】
【００８４】
本発明を、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない、以下の実施例においてさらに記載する。
【００８５】
（実施例１）
非増強型ＢＳＡの調製
非増強型ＢＳＡは、いくつかの商業的供給業者を通じて購入することができる。例えば、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標）は、市販されている非増強型ＢＳＡの一例である。Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標）は、図１の左および中央の流れ図に表した方法を使用して創製される。図１の左の流れ図は、Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標）を創製するために使用される上流ステップを示す。Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標）を創製するために使用される上流ステップは、（順次）：ウシ由来の血漿を加温するステップ、加温後に安定剤を添加し、ｐＨを調整するステップ、混合しながら血漿を加熱するステップ、血漿を冷却および濾過するステップ、濾過後に濾液を収集するステップ、濾液からアルブミンを沈殿させるステップ、濾液を濾過して沈殿したアルブミンを取り出すステップ、沈殿したアルブミンを洗浄するステップ、沈殿したアルブミンを乾燥させるステップ、逆浸透精製水中で沈殿したアルブミンを再構成して血清アルブミンを含有する溶液を得るステップ、溶液を清澄化するステップ、溶液のｐＨを調整するステップ、溶液を濾過するステップ、濾過した溶液を凍結乾燥させ、得られた血清アルブミンを含有する凍結乾燥材料を篩にかけるステップである。Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標）を創製することにおいて各ステップを実施するために使用される方法は、一般に当技術分野で周知である。
【００８６】
（実施例２）
処理済みＢＳＡの調製
処理済みＢＳＡの一例は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡである。ＭＰ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡは、図１の右の流れ図に表した方法を使用して創製される。ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡを創製するために使用されるステップは、（順次）：ウシ由来の血漿を脱塩するステップ、限外濾過を使用して血漿を濾過するステップ、血漿から真性グロブリンを沈殿させるステップ、血漿を濾過して沈殿した真性グロブリンを除去するステップ、血漿に対してイオン交換クロマトグラフィーを実施して血清アルブミンおよび免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップ、硫安沈殿法を使用して溶出液から免疫グロブリンを沈殿させるステップ、溶出液から沈殿した免疫グロブリンを除去するステップ、溶出液を濃縮およびフリーズドライして血清アルブミンを含む凍結乾燥材料を生成するステップ、ならびに任意選択で凍結乾燥材料を溶液に再構成するステップである。ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡを創製することにおいて各ステップを実施するために使用される方法は、一般に当技術分野で周知である。
【００８７】
（実施例３）
流加培養におけるＮＳ０細胞増殖、細胞生存度、および産生力に対する処理済みおよび非増強型ＢＳＡの効果
１０，０００流加産生細胞培養におけるＮＳ０細胞増殖、細胞生存度、および産生力に対する処理済みＢＳＡ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＮＺ  ＢＳＡ）および非増強型ＢＳＡ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標））の効果を決定するために、一連の実験を実施した。各細胞培養物中のＮＳ０細胞は、組換えエクリズマブをコードする核酸を含有する。同じ培養パラメーターを各培養について使用した。一セットの培養物を、処理済みＢＳＡを含有する液体培養培地を使用して培養し、別のセットの培養物を、非増強型ＢＳＡを含有する液体培養培地を使用して培養した。液体培養培地中に存在する分泌された組換えエクリズマブの生存細胞密度、百分率細胞生存度、および力価を、当技術分野で公知の方法を使用して各細胞培養の継続時間にわたって測定した。
【００８８】
図２のデータは、処理済みＢＳＡを含有する液体培養培地を使用して培養した細胞が、非増強型ＢＳＡを含有する液体培養培地を使用して培養した細胞と比較して、培養期間全体にわたって有意に改善された生存細胞密度を実証したことを示す。図３のデータは、培養期間の後の時点において、処理済みＢＳＡを含有する液体培養培地を使用して培養した細胞が、非増強型ＢＳＡを含有する液体培養培地を使用して培養した細胞と比較して、増大した百分率生存細胞密度を有することを示す。データは、処理済みＢＳＡを含有する液体培養培地を使用して培養した細胞が、非増強型ＢＳＡを含有する液体培養培地を使用して培養した細胞と比較して、培養の４〜１２日目にわたってエクリズマブのより高い力価を生じさせることも示す（図４）。
【００８９】
つまり、これらのデータは、処理済みＢＳＡを含有する液体培養培地中で培養したＮＳ０細胞が、非増強型ＢＳＡを含有する液体培養培地中で培養したＮＳ０細胞と比較して、実質的に増大した生存細胞密度、百分率細胞生存度、および産生力を有することを示す。
【００９０】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、上記の記載は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を例示し、限定しないように意図されていることが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変も、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【化１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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