(57)【要約】【課題】  試料中に存在するＨＣＶを特異的に増幅し、かつ遺伝子型による差異が発生しにくい検出方法を提供する。【解決手段】試料中に含まれるＨＣＶ  ＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号１とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号１３とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、前記プライマーセットを用いて検出する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるＨＣＶ  ＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、前記プライマーセット。
【請求項２】
第一のプライマーが少なくとも１７塩基からなり、第二のプライマーが少なくとも１４塩基からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
第一のプライマーが、配列番号２に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号１４に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１４塩基からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
第一のプライマーが配列番号３から１２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選択される１以上であり、第二のプライマーが、配列番号１５から３４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選択される１以上である、請求項１から３いずれかに記載のプライマーセット。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、前記核酸の一部とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な、蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＨＣＶ  ＲＮＡを検出する方法。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載のプライマーセットと、配列番号３５に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブとを含む、ＨＣＶ  ＲＮＡ検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を迅速、高感度かつ特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いたＨＣＶの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は１本鎖ＲＮＡウイルスで、フラビウイルス科に分類されている。現在までに１０以上の遺伝子型、数十のサブタイプに分けられている。電子顕微鏡での観察で、ＨＣＶは直径５０〜６０ｎｍの球状のウイルスで、外被（エンベロープ）とコアの二重構造を有している。人に感染すると比較的徐々に食欲不振、全身倦怠感、悪心・嘔吐、右季肋部痛、上腹部膨満感、濃色尿などがみられるようになり、それに引き続き黄疸が見られる例もある。一般的にＣ型肝炎では劇症化することは少なく、黄疸などの症状も軽い（非特許文献１）。
【０００３】
臨床的に用いられているＨＣＶの検出法として、血清抗体の検出と核酸・抗原の検出の２種類がある。一般的に、初めにＨＣＶ抗体検査が用いられる。陽性と出た場合、血清抗体の検出では過去のＨＣＶ感染の既往などでも陽性となるため、核酸検出検査を追加で行う。また、急性Ｃ型肝炎においてもＨＣＶ抗体の陽性化には感染後通常１〜３ヶ月を要するため、この時期には核酸検出検査をおこなう。このように、急性Ｃ型肝炎に対応するためには迅速に核酸検出検査を行う必要がある。しかし、現行のＣ型肝炎核酸検出検査は装置が大きく一部の大型病院にしか設置できないこと、また検査時間が長く診察前検査に使用できないことが問題であった。このため、感度が高く迅速で簡便な検査が望まれている。
【０００４】
本発明で使用されたＴＲＣ法（特許文献１、特許文献２）では精製から検出まで一体となった装置が市販されており、１時間程度で結果を得ることができるため、十分な迅速性を備えている。また、感度、特異度ともに他の核酸増幅による検出法と遜色はない。
【０００５】
ＨＣＶには複数の遺伝子型が存在するが、どの遺伝子型も同じように定量する必要があり、当該プライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブの設計はさらに困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１４４００号公報
【特許文献２】特開２００１−３７５００号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「感染症の辞典」，朝倉書店，２００４年，ｐ．５５−５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、試料中に存在するＨＣＶに由来する核酸を高感度、迅速に増幅し、かつ遺伝子型による定量値の違いが発生しにくい特異的なオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いたＨＣＶの検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）  試料中に含まれるＨＣＶの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
第一のプライマーが、配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
前記プライマーセット。
（２）  第一のプライマーが少なくとも１７塩基からなり、第二のプライマーが少なくとも１４塩基からなるオリゴヌクレオチドである、（１）に記載のプライマーセット。
（３）  第一のプライマーが、配列番号２に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号１４に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１４塩基からなるオリゴヌクレオチドである、（１）または（２）に記載のプライマーセット。
（４）  第一のプライマーが配列番号３から１２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１５から３４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
（１）〜（３）いずれかに記載のプライマーセット。
（５）  （１）から（４）のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、前記核酸の一部とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な、インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＨＣＶを検出する方法。
（６）  （１）から（４）のいずれかに記載のプライマーセットと、配列番号３５に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブとを含む、ＨＣＶ検出試薬。
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明において特定塩基配列とは、ＨＣＶ  ＲＮＡのうち、第ニのプライマーとの相同領域の５’末端から第一のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列のことをいう。すなわち本発明では前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が増幅されることになる。
【００１３】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性（例、同一性または類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的に本発明におけるストリンジェントな条件の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。また、前述したストリンジェントな条件下で、前記特定塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、第一及び第二のプライマーの塩基配列は、前記特定塩基配列と比較して置換、欠失、付加、修飾があってもよい。第一及び第二のプライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲である。なお、もっとも好ましい態様では、ストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとは、対象塩基配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００１４】
本発明は、試料中に含まれるＨＣＶ  ＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２７８番目から３０８番目までの塩基配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、また試料中に含まれるＨＣＶ  ＲＮＡの特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号１３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５１番目から１７４番目までの塩基配列の相補配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いることを特徴としている。
【００１５】
その中でも第一のプライマーが少なくとも１７塩基からなり、第二のプライマーが少なくとも１４塩基からなることが好ましい。
【００１６】
第一のプライマーの一例として、配列番号１に記載の塩基配列の相補配列である配列番号２に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２８６番目から３０８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２８５番目から３０１番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２８１番目から３０１番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２８４番目から３００番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２８０番目から２９９番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２７８番目から２９９番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２７９番目から２９８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２７８番目から２９８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２７９番目から２９７番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２７８番目から２９７番目までの塩基配列の相補配列）から選択される何れかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００１７】
第二のプライマーの一例として、配列番号１３に記載の塩基配列の相補配列である配列番号１４に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１４塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５１番目から１６４番目までの塩基配列）、配列番号１６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５１番目から１６８番目までの塩基配列）、配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５３番目から１６９番目までの塩基配列）、配列番号１８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５３番目から１７４番目までの塩基配列）、配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５５番目から１７１番目までの塩基配列）、配列番号２０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５５番目から１７２番目までの塩基配列）、配列番号２１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５５番目から１７３番目までの塩基配列）、配列番号２２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５５番目から１７４番目までの塩基配列）、配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５６番目から１７１番目までの塩基配列）、配列番号２４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５６番目から１７２番目までの塩基配列）、配列番号２５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５６番目から１７３番目までの塩基配列）、配列番号２６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５６番目から１７４番目までの塩基配列）、配列番号２７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５７番目から１７１番目までの塩基配列）、配列番号２８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５７番目から１７２番目までの塩基配列）、配列番号２９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５７番目から１７３番目までの塩基配列）、配列番号３０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５７番目から１７４番目までの塩基配列）、配列番号３１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５８番目から１７２番目までの塩基配列）、配列番号３２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５８番目から１７３番目までの塩基配列）、配列番号３３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５８番目から１７４番目までの塩基配列）および配列番号３４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の１５９番目から１７４番目までの塩基配列）から選択される何れかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００１８】
中でもＨＣＶ  ＲＮＡを迅速かつ特異的に検出可能であるという点で、第一のプライマーと第二のプライマーの組み合わせが、配列番号４と３１、４と３２、４と３３、４と３４、５と２８、５と３１、５と３２、６と３１、６と３２、７と３１、７と３２、８と２８、８と３１、８と３２、１０と２８、１０と３１、１０と３３、１２と３１、１２と３２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが更に好ましい。また、第一のプライマーとしては１種のみでもよく、２種以上を混合して用いることもできる。第二のプライマーも同様である。
【００１９】
本発明のプライマーセットは、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＰＡ法等、の核酸増幅法を利用した、ＨＣＶ  ＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。プライマーの５’末端側に付加するプロモーターは、ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号３９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２０】
本発明のプライマーセットを用いて増幅したＨＣＶ  ＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた方法、
などがあげられる。前記（Ｃ）の蛍光色素標識プローブの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブがあげられる。
【００２１】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの一例として、ＨＣＶ  ＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの３’末端側、５’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブがある。前記プローブはＨＣＶ  ＲＮＡの特定塩基配列（または当該特定塩基配列の相補配列）と相補的２本鎖を形成すると、インターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸などの適当な修飾がされているとよい。
【００２２】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドの好ましい例として、配列番号３５に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを上げることができる。更に好ましくは、配列番号３６に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２５０番目から２６６番目までの塩基配列の相補配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、配列番号３７に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２５０番目から２６９番目までの塩基配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、配列番号３８に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２６３番目から２７９番目までの塩基配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２３】
本発明のプライマーセットを用いてＨＣＶ  ＲＮＡを検出するには、例えば以下の（１）から（６）に示す工程により実施すればよい。
（１）配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがＨＣＶ  ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号１３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号３５またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程。
【００２４】
前記（１）の工程で用いるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記（２）の工程で用いるＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、および前記（３）の工程で用いるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用できる。
【００２５】
前述した態様によるＨＣＶ  ＲＮＡ検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、プライマー／プローブの長さが１７から３０塩基の範囲である場合は、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０から５０℃の範囲で設定するとより好ましい。
【００２６】
前述した態様によるＨＣＶ  ＲＮＡ検出方法は、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例２０分以内で終了することが可能である。
【００２７】
前述した態様によるＨＣＶ  ＲＮＡ検出方法は、前述した第一のプライマー、第二のプライマー、およびインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含むＨＣＶ  ＲＮＡ試薬に試料を添加し、経時的に蛍光検出可能な温調ブロックに載置することで、自動的にＨＣＶ  ＲＮＡを増幅し検出することができる。本発明のＨＣＶ  ＲＮＡ検出試薬において、オリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドは、配列番号３６、３７または３８に記載の塩基配列からなるものが好ましい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のプライマーセットはＨＣＶ  ＲＮＡに特異的な配列（特定塩基配列）およびその相補配列の一部にそれぞれハイブリダイズすることより、ＨＣＶ  ＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を特異的に増幅させることができる。
【００２９】
本発明のプライマーセットを用いたＨＣＶ  ＲＮＡ検出法は、試料中に含まれるＨＣＶを迅速、高感度に検出できる。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３１】
実施例１  標準ＲＮＡ調製
後述の実施例で使用する、ＨＣＶ標準ＲＮＡを以下に示す方法でそれぞれ調製した。なお調製した各標準ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基に実施した。
【００３２】
ＨＣＶ  ＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１）の１番目から４５０番目までの塩基配列に基づき人工的にＨＣＶ  ＲＮＡ遺伝子の一部を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、ＨＣＶ標準ＲＮＡ（遺伝子型：１ａ）を調製した。同様にして、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＹ５８７０１６．１に基づき遺伝子型：１ｂ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０４７６３９に基づき遺伝子型：２ａ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＦ２３８４８６に基づき遺伝子型：２ｂ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００９８２４．１に基づき遺伝子型３ａ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＤＱ４１８７８８に基づき遺伝子型：４ａ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００９８２６．１に基づき遺伝子型５ａのＨＣＶ標準ＲＮＡを調製した。
【００３３】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００−３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号３６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２５０番目から２６６番目までの塩基配列）からなるオリゴヌクレオチドの５’末端から６番目のシトシンと７番目のグアニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識し、１３番目のチミンの代替として５−ニトロインドールに挿入した。配列番号３７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２５０番目から２６９番目までの塩基配列）からなるオリゴヌクレオチドの５’末端から６番目のシトシンと７番目のグアニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識し、１３番目のチミンの代替として５−ニトロインドールを挿入した。配列番号３８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００４１０２．１の２６３番目から２７９番目までの塩基配列）からなるオリゴヌクレオチドの５’末端から１０番目のシトシンと１１番目のグアニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識し、８番目のシトシンの代替として５−ニトロインドールを挿入した。
【００３４】
実施例３  ＨＣＶ  ＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの検討
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で評価した。なお表１に記載のＩＮＡＦプローブは実施例２で作製したプローブである。
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡは、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  コール酸ナトリウム）を用いて１００００コピー／１５μＬになるように希釈し、試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。
【００３５】
反応液の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭ  トレハロース
各０．３３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各１  ．３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
０．９ｍＭ  ＧＴＰ
３．３ｍＭ  ＩＴＰ
０．５μＭ  第一のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号３９）を付加したもの）
０．５μＭ  第二のプライマー
３５ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ  牛血清アルブミン
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
（３）上記の蒸発乾燥後にＲＮＡ試料を１５μＬ添加後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液１５μＬを添加し撹拌した。
【００３６】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
９．９％  ジメチルスルホキシド
１７．５ｍＭ  塩化マグネシウム
１１０ｍＭ  トリエチルアンモニウムクロリド
（４）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。
【００３７】
開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１および２に示す。実験は表１，２に記載された回数実施した。表２の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．２以下（陰性判定）であったことを意味する。
【００３８】
ＨＣＶ  ＲＮＡの検出性能（表１）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Ａ０１からＡ５９）のうち、Ａ０１、Ａ０２、Ａ０５、Ａ１８，Ａ１９，Ａ２１―２９、Ａ３１―３９、Ａ４２、Ａ４４、Ａ４７−５３、Ａ５５、Ａ５６、Ａ５８、Ａ５９が１００００コピー／ｔｅｓｔのＨＣＶ  ＲＮＡを１０分以内に検出しており、ＨＣＶ  ＲＮＡを迅速に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
【００３９】
【表１】
2019195272.tif 000002
【００４０】
遺伝子型間での差（表２）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、Ａ３４、Ａ３７、Ａ５０、Ａ５１およびＡ５３が１００００コピー／ｔｅｓｔの遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４ａ、５ａのＨＣＶ  ＲＮＡを測定した時、遺伝子型による検出時間差異が１分以内となった。その内、特にＡ５３では遺伝子型による検出時間差異が０．５分以内となり、遺伝子型に関わらず同等の時間で検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
【００４１】
【表２】
2019195272.tif 000003
【配列表】
2019195272000001.app