(57)【要約】【課題】細胞の培養と培養細胞の回収作業とを単純化する。【解決手段】細胞培養装置から培地を除去し、細胞を濃縮するための装置であって、気体透過性細胞培養装置に接続されたフィルタに接続できる気体送出部と、流体流動制御部へ信号を送ることができる流体検出部とを備える。気体送出部がフィルタを経由して気体を気体透過性培養装置に送出することで、細胞培養装置の内部容積を加圧する働きをする。【選択図】図７
2019195336.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養装置から培地を除去し、細胞を濃縮するための装置であって、
気体透過性細胞培養装置に接続されたフィルタに接続でき、前記フィルタを介して前記気体透過性細胞培養装置内に気体を送出することができ、細胞培養装置の内容積を加圧する働きを有する気体送出部と、
前記気体透過性細胞培養装置に接続している培地除去導管内へ移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出でき、前記培地除去導管を通る流体の流れを停止できる第１流体流動制御部へ信号を送ることができる第１流体検出部とを含み、
前記気体透過性細胞培養装置に接続された細胞除去導管内を移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出でき、前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止可能な第２流体流動制御部へ信号を送ることができる第２流体検出部を含むもの。
【請求項２】
請求項１の装置を使用する方法であって、
細胞および培地を含み培地除去導管を備えた気体透過性細胞培養装置内の液体培地の容量を減らして培地１ミリリットル当たりの細胞濃度を増大させるため、気体透過性細胞培養装置に接続されたフィルタに前記気体送出部を接続し、前記第１流体検出部を前記培地除去導管に接続し、第１流体流動制御部を前記培地除去導管に接続し、前記気体送出部からの気体送出を開始することにより、気体を前記細胞培養装置に移動させ、その気体により細胞培養装置を加圧することで培地を前記細胞培養装置から前記培地除去導管に接続された培地回収容器内へ移し、前記第１流体検出部により前記培地除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、その検出を行った際に前記第１流体検出部から前記第１流体流動制御部に信号を送り、前記第１流体流動制御部が前記信号を受け取った際に前記第１流体流動制御部で前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させ、
培地除去導管および細胞除去導管を備える前記細胞培養装置が、第１流体検出部を前記培地除去導管に接続し、前記第１流体流動制御部を前記培地除去導管に接続し、前記気体送出部からの気体送出を開始することにより、気体を前記細胞培養装置に移動させ、
その気体により細胞培養装置を加圧して前記細胞培養装置から前記培地除去導管に接続された培地回収容器内に培地を移し、前記第１流体検出部で前記培地除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、その検出を行ったら前記第１流体検出部から前記第１流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取ったら前記第１流体流動制御部で前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させ、
前記第２流体検出部を前記細胞除去導管に接続し、前記第２流体流動制御部を前記細胞除去導管に接続し、前記気体送出部からの気体送出を開始することにより、気体を前記細胞培養装置内に移動させて細胞培養装置を加圧し、かつ、前記細胞除去導管によって前記細胞培養装置から前記細胞除去導管に接続された細胞回収容器内へと培地および細胞を移し、前記第２流体検出部により前記細胞除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、検出した際に前記第２流体検出部から前記第２流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取った際に前記第２流体流動制御部で前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させることにより前記気体透過性細胞培養装置から細胞を除去する工程も含む方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、前記第２流体流動制御部で前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させた後、前記細胞培養装置を大気に通気し、前記第１流体流動制御部を開放して前記培地除去導管を通る流体が流れられるようにし、培地を前記培地除去導管に通して前記細胞培養装置内へ移動させ、前記第１流体流動制御部を閉鎖し、前記培地を撹拌して細胞を前記培地内に移動させ、
これ以降は前記細胞培養装置を大気に通気させないようにし、気体を前記気体送出部から前記細胞培養装置内に送出して細胞培養装置を加圧し、前記細胞培養装置から前記細胞除去導管に接続された細胞回収容器内に培地および細胞を移し、前記第２流体検出部により前記細胞除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、その検出を行った際に前記第２流体検出部から前記第２流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取った際に前記第２流体流動制御部で前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させる方法。
【請求項４】
細胞および培地を含む気体透過性細胞培養装置内の培地容量を減らす方法であって、
培地容量を減らして培地１ミリリットル当たりの細胞濃度を増大させるため、培地除去導管を備える細胞培養装置を加圧する働きを有する気体送出部を、第１容量の培地と培養面上にある細胞とを含む気体透過性細胞培養装置に接続されたフィルタに接続し、気体を前記気体送出部から送出することにより前記細胞培養装置内に移動させて細胞培養装置を加圧し、その気体により培地を前記細胞培養装置から前記培地除去導管を経由して培地回収容器内へ移し、前記培地除去導管を通って移動する流体が培地から気体へと変化したときに、前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させ、前記第１容量未満の残量となった培地および細胞を前記細胞培養装置内に残し、
前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させた後、培地が前記培地除去導管の培地除去開口と接触した状態で、前記気体送出部から送出した気体を前記細胞培養装置内に移動させて前記細胞培養装置を加圧し、前記残量の培地および細胞を前記培地除去導管を通じて細胞回収容器内に移し、前記培地除去導管を通って移動する流体が培地から気体へと変化したときに前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させる方法。
【請求項５】
請求項２の方法であって、前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させた後、前記細胞培養装置を洗い流して前記細胞培養装置および／または前記細胞除去導管内に残っている可能性がある細胞を回収する更なる工程を含み、前記細胞培養装置を大気に通気する際に、前記培地除去導管を通る液体の流れを開始する工程をさらに備え、前記液体が前記培地除去導管を通って前記細胞培養装置内に移動し、液体を撹拌して前記細胞培養装置内の細胞を前記液体中に移動させ、
前記気体送出部から前記細胞培養装置内への気体送出を開始することにより気体で細胞培養装置を加圧し、液体および細胞を前記細胞培養装置から細胞回収容器内へと前記細胞除去導管を介して移し、前記細胞除去導管を通って移動する流体が液体から気体へと変化したときに、前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させる方法。
【請求項６】
請求項２または４の方法であって、最初の培地の高さが１．０ｃｍ〜２５ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項２または４の方法であって、最初の培地の高さが１．０ｃｍ〜２０ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項２または４の方法であって、最初の培地の高さが１．０ｃｍ〜１５ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項２または４の方法であって、最初の培地の高さが２．０ｃｍ〜１０ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項２または４の方法であって、培養面が疎水性であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項２または４の方法であって、培養面がシリコーンであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法であって、シリコーンの厚さが０．０２５４ｍｍ（０．００１インチ）と０．６０９６ｍｍ（０．０２４インチ）の間の厚さであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項２または４の方法であって、細胞が非接着性細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２の方法であって、細胞がＴ細胞を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法であって、Ｔ細胞がＣＡＲ  Ｔ細胞を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１の装置であって、気体送出部がダイアフラムポンプであることを特徴とする装置。
【請求項１７】
請求項２の方法であって、第１流体流動制御部により培地除去導管を通る流体の流れを停止したときに残る培地の高さが０．２０ｃｍ〜１．０ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年６月２４日に出願された「気体透過性細胞培養作業のための閉鎖系装置および方法」という名称の米国仮出願第６１／８３８，７３０号（その全体を参照により本出願に組み込む）の利点を請求する。更に、同時係属米国特許出願第１０／９６１，８１４号（以下、「８１４」）、米国特許出願第１１／９５２，８４８号（以下、「８４８」）、米国特許出願第１２／９６３，５９７号（以下、「５９７」）、米国特許出願第１３／４７５，７００号（以下、「７００」）および米国特許出願第１３／４９３７６８号（以下、「７６８」）は、その全体を参照により本出願に組み込む。
【０００２】
本発明の技術分野は、新規な気体透過性細胞培養装置内で効率よく細胞を増殖させ、かつ、ほぼまたは全く汚染のリスクを伴わず、ほぼまたは全く細胞損失を伴わず、かつ、ほぼまたは全く気体透過性表面の歪みを伴わずに、流体を培養系に添加するまたはそれから除去することを可能にする静止細胞培養方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術で記載された従来技術の限界に関する考察
Ｔ細胞療法、養子免疫療法および養子細胞療法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫系の細胞を増殖させ、次いで増殖細胞を患者内に投与して病気と闘うことを含み、様々な病気を治療するために効果のある方法を指す。これらの療法形態が幅広く社会に行き渡るには、細胞集団の増殖と当該細胞の回収作業が、費用対効果が高く、実用的で、細胞損失を引き起こしにくく、汚染リスクが最小か全くないものとする必要がある。
【０００４】
今日、Ｔ細胞療法、養子免疫療法および養子細胞療法用途において製造する細胞を調製して保存するための費用対効果が大きくかつ実用的なシステムであって、細胞を製造した後に、培地から細胞を分離するのに相当な量の手間を必要とせず、また汚染を受けないシステムはない。ＦＤＡ承認にとって実用的なＴ細胞製造作業を作成する重要な要素は、作業の複雑性を最小にしつつ、汚染の機会を最小にし、また排除しさえすることである。本分野の通常の語彙において、一般に汚染に閉鎖的な培養作業は、通常、「閉鎖系」と呼ばれる。ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）、ＯｒｉＧｅｎ  ＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）バッグ、および／またはＶｕｅＬｉｆｅ（登録商標）バッグは、閉鎖系Ｔ細胞製造に適合する装置である。バッグは、典型的には重力に応じてバッグを圧搾することにより、および／または、蠕動ポンプで培地を回収することにより培地および細胞を除去する際に崩壊し得る弾性のある容器を有する。ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）は蠕動ポンプに依拠して培地および細胞を除去する。
【０００５】
最近、Ｇ−Ｒｅｘ（商標）細胞培養装置は、ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）、ＯｒｉＧｅｎ  ＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）バッグおよびＶｕｅＬｉｆｅ（登録商標）バッグと比べて多数の利点に基づき、Ｔ細胞培養用として普及している。これら利点の１つを同時係属‘５７０に記載しており、培地から細胞を分離するのに必要な時間と手間の量を最小にするために、細胞を回収する前に大部分の培地を除去する能力である。しかしながら、上述の方法に依拠して培地および細胞を除去する最新技術の方法がＧ−Ｒｅｘ（商標）培養装置では適切に機能しないことがその後に発見されている。Ｇ−Ｒｅｘ装置は、培地が除去される際にバッグが崩壊するようには崩壊せず、Ｇ−Ｒｅｘ装置から培地を除去するために蠕動ポンプを使用することにより、平面状の気体透過性表面が、その水平な培養に適した位置から移動して、装置内に形成される真空によって装置の内容積に引き込まれる状態となる。より大きくかつより広い表面積の通気口フィルタを使用することによって真空が形成されるのを防ぐ試みは、気体透過性表面が平面位置および／または水平位置にとどまることを可能にする実現可能な構成をもたらしてはいない。その平面および／または水平状態から膜を引っ張ることは、製造作業にとって有害であり、培地容量が減少する際に細胞が失われる、または培養物の汚染に繋がるかもしれない漏れが形成されるおよび／または作業者がバイオハザードに曝される可能性を生む。
【０００６】
よって、閉鎖系様式で細胞回収作業を単純化するために、特にＴ細胞療法の分野に関して、‘８１４、‘８４８、‘５９７、‘７００、および‘７６８に開示されるものなどの、気体透過性細胞培養装置のための新規な閉鎖系流体処理方法を作成する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
細胞および残量の培地を細胞回収容器内へ移す前に、気体が初期容量の培地の一部を廃液容器内へ移すことを可能にする特定の実施例を開示する。
【０００８】
１つのこういった実施例は、細胞培養装置から培地を除去するための装置であって、気体透過性細胞培養装置に接続するフィルタに接続できる気体送出部であって、前記フィルタを用いることにより前記気体透過性細胞培養装置内に気体を送出できる気体送出部と、前記気体透過性細胞培養装置に接続される培地除去導管内へ移動する流体がいつ液体から気体へと変化するのかを検出できる第１流体検出部であって、前記培地除去導管を通る流体の流れを停止できる第１流体流動制御部へ信号を送ることができる第１流体検出部と、を含む装置を開示する。
【０００９】
１つのこのような実施例は、前記気体透過性細胞培養装置に接続する細胞除去導管内を移動する流体がいつ液体から気体へと変化するのかを検出できる第２流体検出部であって、前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止できる第２流体流動制御部へ信号を送ることができる第２流体検出部とを含む装置を開示する。
【００１０】
１つのこのような実施例は、細胞および培地を含有する気体透過性細胞培養装置内の液体培地の容量を減らし、前記気体透過性細胞培養装置に接続するフィルタに前記気体送出成分を接続することにより培地１ミリリットル当たりの細胞濃度を上げる装置であって、細胞培養装置が培地除去導管を含み、第１流体検出部を前記培地除去導管に接続し、第１流体流動制御部を前記培地除去導管に接続し、前記気体送出部からの気体送出を開始し、それにより、気体が前記細胞培養装置へ移動し、気体が培地を前記細胞培養装置から前記培地除去導管に接続した培地回収容器内へ移し、前記第１流体検出部が、前記培地除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、その検出を行うと、前記第１流体検出部が前記第１流体流動制御部に信号を送り、前記第１流体流動制御部が前記信号を受け取ると、前記第１流動制御部が前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させる装置を開示する。
【００１１】
１つのこのような実施例は、細胞を回収するための装置の使用であって、第１流動制御部が培地除去導管を通る流体の流れを停止させた後、細胞回収容器を培地除去導管に接続し、前記培地除去導管が培地と接触する培地除去開口部を有し、第１流動制御部が前記培地除去導管を通る流体の流れを開放し、前記気体送出部から送出した気体が前記細胞培養装置内へ移動し、培地および細胞が前記培地除去導管を通って前記細胞回収容器内へ移動し、前記第１流体検出部が、前記培地除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、前記第１流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取ると、前記第１流動制御部が前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させる用途を開示する。
【００１２】
１つのこのような実施例は、液体培地および細胞を含有する気体透過性細胞培養装置に接続するフィルタに気体送出部を接続することにより気体透過性細胞培養装置における培地１ミリリットル当たりの細胞数を増大させ、前記細胞の少なくとも一部分が前記細胞培養装置内の培養面と接触し、前記細胞培養装置が培地除去導管と細胞除去導管とを包含し、前記第１流体検出部を前記培地除去導管に接続し、第１流体流動制御部を前記培地除去導管に接続し、前記気体送出部からの気体送出を開始し、それにより、気体が前記細胞培養装置へ移動し、気体が前記細胞培養装置から培地除去導管に接続した培地回収容器内へ培地を移し、前記第１流体検出部が、前記培地除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、その検出を行うと、前記第１流体検出部が前記第１流体流動制御部へ信号を送り、前記信号を受け取ると、前記第１流動制御部が前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させ、前記第２流体検出部を前記細胞除去導管に接続し、前記第２流体流動制御部を前記細胞除去導管に接続し、前記気体送出部からの気体送出を開始することにより前記気体透過性細胞培養装置から細胞を除去し、それにより、気体が前記細胞培養装置内に移動し、前記細胞除去導管によって前記細胞培養装置から前記細胞除去導管に接続された細胞回収容器内へと培地および細胞を移し、前記第２流体検出部が、前記細胞除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、検出すると、前記第２流体検出部が前記第２流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取ると、前記第２流動制御部が前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させることを開示する。
【００１３】
１つのこのような実施例は、濃縮された細胞を気体透過性細胞培養装置から回収することであって、第２流動制御部が細胞除去導管を通る流体の流れを停止させた後、前記細胞培養装置を大気に通気し、第１流動制御部を開放して前記培地除去導管を通る流体が流れられるようにし、培地が前記培地除去導管を通って前記細胞培養装置内へ移動し、前記第１流動制御部を閉鎖し、前記培地を撹拌して細胞を前記培地内へ移動し、前記細胞培養装置がもはや大気に通気せず、気体が前記気体送出部から前記細胞培養装置内へ送出し、前記細胞培養装置から前記細胞除去導管に接続した細胞回収容器内に培地および細胞を移し、前記第２流体検出部が、前記細胞除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、その検出を行うと、前記第２流体検出部が前記第２流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取ると、前記第２流動制御部が前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させることを開示する。
【００１４】
１つのこのような実施例は、培地容量を減らして、培地除去導管を包含する前記細胞培養装置に接続されるフィルタに気体送出部を接続することにより培地１ミリリットル当たりの細胞濃度を増大させることによって、第１容量の培地および培養面上にある細胞を含有する気体透過性細胞培養装置内の培地１ミリリットル当たりの細胞数を増大させ、第１流体検出部を前記培地除去導管に接続し、第１流体流動制御部を培地除去導管に接続し、前記気体送出部からの気体送出を開始し、それにより、気体が前記細胞培養装置内へ移動し、気体が前記細胞培養装置から前記培地除去導管に接続した培地回収容器内に培地を移し、前記第１流体検出部が、前記培地除去導管を通って移動する流体がいつ培地から気体へと変化したのかを検出し、その検出を行うと、前記第１流体検出部が前記第１流体流動制御部に信号を送り、前記第１流体流動制御部が前記信号を受け取ると、前記第１流動制御部が、前記細胞培養装置内に残量の培地および細胞を残しつつ前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させ、前記培地の残量が前記培地の第１容量未満であることを開示する。
【００１５】
１つのこのような実施例は、気体透過性細胞培養装置内で細胞を濃縮することであって、第１流動制御部が培地除去導管を通る流体の流れを停止させた後、細胞回収容器を前記培地除去導管に接続し、培地が前記培地除去導管の培地除去開口部と接触した状態で、第１流動制御部を開放して前記培地除去導管を通る流体が流れられるようにし、前記気体送出部から送出された気体が前記細胞培養装置内へ移動し、前記残量の培地および細胞を、前記培地除去導管を通じて前記細胞回収容器内へ移し、前記第１流体検出部が、前記培地除去導管を通って移動する流体がいつ培地から気体へと変化したのかを検出し、前記第１流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取ると、前記第１流動制御部が前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させることを開示する。
【００１６】
１つのこのような実施例は、気体透過性細胞培養装置から細胞を回収することであって、培地および細胞を含有する気体透過性細胞培養装置に接続されるフィルタに気体送出部を接続することによって、細胞を含有する気体透過性細胞培養装置内の第１容量の培地を減らして１ミリリットル当たりの細胞濃度を増大させる第１工程であって、前記細胞培養装置が培地除去導管および細胞除去導管を包含し、第１流体検出部を前記培地除去導管に接続し、第１流体流動制御部を前記培地除去導管に接続し、少なくとも一部の細胞が培養面上にある状態で、前記気体送出部からの気体送出を開始し、それにより、気体が前記細胞培養装置内へ移動し、前記気体が培地を前記細胞培養装置から前記培地除去導管に接続される培地回収容器内へ移し、前記第１流体検出部が、前記培地除去導管を通って移動する流体がいつ培地から気体へと変化したのかを検出し、その検出を行うと、前記第１流体検出部が第１流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取ると、前記第１流動制御部が、前記細胞培養装置内に残量の培地および細胞を残しつつ前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させ、前記培地の残量が前記培地の第１容量未満である工程と、第２流体検出部を前記細胞除去導管に接続し、第２流体流動制御部を前記細胞除去導管に接続し、細胞が前記残量の培地全体にわたって分配された状態で、気体送出部からの気体送出を開始することによって前記気体透過性細胞培養装置から細胞を除去する第２工程であって、それにより、気体が前記細胞培養装置内へ移動し、前記細胞培養装置から前記細胞除去導管に接続された細胞回収容器内へと培地および細胞を移し、前記第２流体検出部が、前記細胞除去導管を通って移動する流体がいつ培地から気体へと変化したのかを検出し、その検出がなされると、前記第２流体検出部が前記第２流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取ると、前記第２流動制御部が前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させる工程を含むことを開示する。
【００１７】
１つのこのような実施例は、前記第２流動制御部が前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させた後、前記細胞培養装置を濯いで前記細胞培養装置および／または前記細胞除去導管内に残っている可能性がある更なる細胞を回収する更なる工程を含む細胞の回収であって、前記細胞培養装置が大気に通気する際に、前記培地除去導管を通る液体の流動を開始し、前記液体が前記培地除去導管を通って前記細胞培養装置内へ移動し、前記液体を撹拌して前記細胞培養装置内の細胞を前記液体中へ移動させ、前記気体送出部から前記細胞培養装置内への気体送出を開始し、前記気体が液体および細胞を前記細胞培養装置から前記細胞回収容器内へと前記細胞除去導管を介して移し、前記第２流体検出部が、前記細胞除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、その検出がなされると、前記第２流体検出部が前記第２流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取ると、前記第２流動制御部が前記細胞除去導を通る流体の流れを停止させることを更に含むことを開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図１Ｂ】廃液容器を装着した気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図１Ｃ】廃液容器を装着した気体透過性細胞培養装置、廃液容器内に培地を移動させる蠕動ポンプおよび水平位置から外れた培養面の断面図を示す。
【図１Ｄ】廃液容器を装着した気体透過性細胞培養装置、廃液容器内に培地を移動させる蠕動ポンプ、水平位置から外れた培養面および廃液容器に進入する細胞の断面図を示す。
【図２Ａ】廃液容器を装着した気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図２Ｂ】廃液容器を装着した気体透過性細胞培養装置、廃液容器内に培地を移動させる蠕動ポンプ、水平位置にとどまる培養面および細胞が存在する培地の残量まで減らした初期培地容量の断面図を示す。
【図２Ｃ】細胞および残留培地を除去できるように細胞回収の向きに置いた後の気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図２Ｄ】細胞回収の向きに向け、細胞および残留培地が細胞回収容器へ移動した後の気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図３】培地除去導管および培地除去導管開口部を備えた気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図４Ａ】培地除去導管および培地除去導管開口部を培地除去の配置にした気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図４Ｂ】培地除去導管および培地除去導管開口部を細胞除去の配置にした気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図５Ａ】培地除去導管および培地除去導管開口部を細胞除去の配置にした気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図５Ｂ】培地除去導管および培地除去導管開口部を細胞除去の配置にした気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図５Ｃ】培地除去導管および培地除去導管開口部を細胞除去の配置にした気体透過性細胞培養装置の断面図を示し、ここで、細胞除去導管開口部は培養面ポケット内にある。
【図６Ａ】培地除去導管および細胞除去導管を備えた気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図６Ｂ】気体が装置内に送り込まれ、培地培地除去導管を介して除去された後の気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図６Ｃ】気体が装置内に送り込まれ、培地が培地除去導管を介して除去されて廃液回収容器内へ移動した後の気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図６Ｄ】気体が装置内に送り込まれ、細胞および残量の培地が細胞除去導管を介して除去されて細胞回収容器内へ移動した後の気体透過性細胞培養装置の断面図を示す。
【図７】培地および細胞の除去を自動化する機器と接続している気体透過性細胞培養装置の概略図を示す。
【図８】培養面支持体に連結した培養面の断面図を示す。
【図９】培養面支持体上に成形した培養面の断面図を示す。
【図１０】培地および細胞除去中に培養面が平面位置にとどまる気体透過性細胞培養装置および作業の断面図を示す。
【図１１】培地および細胞除去中に培養面が平面位置にとどまる気体透過性細胞培養装置および作業の断面図を示す。
【図１２Ａ】培地および細胞除去中に培養面が平面位置にとどまる気体透過性細胞培養装置および作業の断面図を示す。
【図１２Ｂ】培地および細胞除去中に培養面が平面位置にとどまる気体透過性細胞培養装置および作業の断面図を示す。
【図１３Ａ】培地および細胞除去中に培養面が平面位置にとどまる気体透過性細胞培養装置および作業の断面図を示す。
【図１３Ｂ】培地および細胞除去中に培養面が平面位置にとどまる気体透過性細胞培養装置および作業の断面図を示す。
【図１３Ｃ】培地および細胞除去中に培養面が平面位置にとどまる気体透過性細胞培養装置および作業の断面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示を通して、指定しない限り、以下の一般的考察を適用する。本書に開示された装置および方法を用いる場合、細胞は均一に広がった状態で気体透過性表面に存在するのが好ましい。当業者は、細胞培養分野で一般的に使用するものに適合する気体透過性材料の選択をするよう推奨されている。気体透過性材料は液体不透過性であることが望ましい。使用できる気体透過性表面の種類に関する更なる指針は、同時係属‘８１４、‘８４８、‘５９７、‘７００および‘７６８にも見られる。任意の種類の非接着性動物細胞を培養の対象となる細胞とする場合、気体透過性表面は、無孔性、液体不透過性および疎水性とするのが好ましい。この表面をシリコーンから構成し、０．００１〜０．０２４インチの厚さを有するのが最も好ましい。特にＴ細胞の場合、シリコーンを材料とするのが好ましい。更に、細胞を気体透過性材料の方に向かわせ、気体透過性材料の表面全体に拡げるために、気体透過性材料は、培養中は水平位置にあるのが好ましく、均一な表面密度内にあるのがより好ましい。当業者は、気体透過性材料は培地の重みで当該材料が支持体と直接接触しない区域において僅かに下方へ移動できるので、本発明を通して、用語「水平な」が「実質的に」水平であることを含むことを認識されたい。実質的に水平な配向の意図は、気体透過性材料全体にわたって細胞を分配させることである。好ましくは、培養面の実質的に水平な状態は、当該表面が表面区域または培養面の２０％を超えて、より好ましくは１０％、更により好ましくは５％および最も好ましくは２．５％面外へ移動しないようなものである。
【００２０】
培養すべき動物細胞が接着性細胞を含む場合、気体透過性材料は親水性でとするのが好ましく、プラズマ帯電表面などの装着しやすい表面を有する。本開示または同時係属‘８１４、‘８４８、‘５９７、‘７００および‘７６８の明細書のいずれかを通して、当業者は、用語「気体透過性膜」が「気体透過性材料」と同義であり、かつ非限定的であることを認識すべきである。その理由は、当業者は更に、用語「膜」が、同時係属‘８１４、‘８４８、‘５９７、‘７００および‘７６８に記載するものを含む細胞培養方法および細胞培養装置に関して、一般的に使用することが当業者に既知であるいずれかの形態の材料の気体透過性材料として広く定義されるものであることを理解すべきだからである。本開示全体を通じて、用語「培地」は、動物細胞培養に使用する任意の様々な基質および／または栄養素を含有する液体と同義である。培養作業と関連する流体に曝される可能性がある装置の全ての材料は、細胞培養に適合するのが好ましい（例えば、ＵＳＰ  ＶＩ、非細胞毒性、許容可能な浸出可能かつ粒子状の標準規格を満たす）。また、培地除去中に細胞が失われているかどうかを判断する、或いは、その他の理由で内容物を評価することが確実にできるように、細胞培養／細胞回収装置は、光学的に透明な構成材料を使用することによりできるような内容物の視覚的評価を可能にするべきとするのが好ましい。
【００２１】
本発明の１つの実施例の態様は、同時係属‘７００および関連図面である図２２Ｂに見ることができ、これは例証目的で図１Ａとしてここで再現し、この図に関して項目番号が１０００番台から１００番台に変えた。図１Ａには、培養が終了し、細胞がまもなく回収されようとしている時点での作動中の細胞回収装置１００が示している。細胞１１６は培養面１０６上にあり、この培養面１０６は、当該装置の底部を形成し、前述の特徴の気体透過性材料から構成される。初期培地容量１２０Ａは初期培地高さ１２１Ａにあり、この高さは最も高い培地面から最も低い培地面までの距離と同じで、ＯｒｉＧｅｎ  ＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）およびＶｕｅＬｉｆｅ（登録商標）バッグなどの静止細胞培養バッグに特有の１．０ｃｍの高さを超えるのが好ましい。初期培地高さ１２１Ａは、２．０ｃｍを超える方が好ましい。いかなる高さも可能であるが、最適な高さは細胞培養用途の詳細に応じて変わる。例えば、同時係属‘７００への記載のように、培地交換の必要なくＣＡＲ  Ｔ細胞を増殖させる際に、培地交換の必要なく僅かな数の細胞からはるかに多い数の細胞までの培養を進行させようとする場合、１０ｃｍの初期培地高さが好ましい。また、培地高さが増大するにつれ、細胞の回収前により多くの培地を除去することが可能になる。我々は、培地高さが低くなるにつれ、従来とは異なる高さのあるの培地の下に沈んだ細胞が容易に培地内に分配されなくなることを発見した。当業者は、細胞を掻き乱すことなく大容量の培地を除去することが、培地交換を行おうとする（即ち、装置内に再導入するために除去する培地から細胞を分離するという要件、および／または、新たな装置に培養物を分割する要件はない）、または培養を終了させて細胞を回収する（即ち、厄介な遠心分離機器の使用とは違って、培地のバルクからの細胞分離は装置内で行われる）上で非常に役立てられることに気付くはずである。
【００２２】
不運にも、標準の閉鎖系流体処理方法を使用して、同時係属‘８１４、‘８４８、‘５９７、‘７００および’７６８にて開示したもののような装置において培地容量を減らす新規な能力の強みを十分に利用すると、細胞損失に繋がり、かつ、培養装置を損傷するかもしれず、そのために、Ｔ細胞療法、養子免疫療法および／または養子細胞療法用途は高額の医療費がかかるかもしれないことを見つけた。図１Ｂ、図１Ｃおよび図１Ｄをまとめると、Ｇ−Ｒｅｘ（商標）装置および同時係属‘８１４、‘８４８、‘５９７、‘７００および’７６８に開示するもののような他の気体透過性装置から細胞を回収する前に、従来の培地処理ツールや方法を用いて培地容量を減らそうとする際に発見した問題の例を示している。図１Ｂは、廃液容器１３２を培地除去導管１１０に装着した後の、図１Ａに記載した装置を示す。細胞１１６を回収しなければならない初期培地容量１２０Ａの量を減らす際の第１工程として、培地除去導管１１０を介して廃液容器１３２にそれを圧送することによって、初期培地容量１２０Ａの一部を細胞培養／細胞回収装置１００から引き出す。培地を圧送する一般的な方法は、蠕動ポンプ１３４を用いて培養装置から培地を引き出すことである。図１Ｃに示すように、初期培地容量の一部を細胞培養／細胞回収装置１００から除去すると、滅菌通気口フィルタ１２８全体で圧力が降下し、内容物１１４が大気圧よりも低くなり、通常は装置の内容物１１４内がすばやく真空になる。培養面１０６は、ほとんどの場合で、材料を薄くかつ脆くさせる気体を透過する性質を有する気体透過性材料を含むのが好ましいため、真空が形成されると、培養面１０６はあっという間にその望ましい水平平面状態から引っ張られて、図に示すように新しく非平面の配置になる。更に、蠕動ポンプのローラー１３６が回転すると、ローラー間の間隙により装置内に真空が発生してパルスし、それにより拡張した培養面１０６をパルスし、細胞１１６を取り除き、培地全体に取り除いた細胞を分散させる。その後、図１Ｄに示すように、培地を廃液容器１３２内へ引き抜き続けると、細胞１１６も廃液容器１３２内へ引き抜かれる。この一連の事象により、相当数の細胞が廃液容器内に分配される可能性が高い。患者の病気の経過は治療用量における細胞数に相関しているので、これら貴重な細胞の損失のために高額の医療費がかかることもある。また、細胞が失われないとしても、培養面は、培地除去導管に引き込まれて損傷を受ける可能性がある。例えば、培養面に穴が開くと、細胞培養設備内のものをバイオハザードに曝す可能性があることに加えて、培養物を汚染し、患者への使用に適合しなくなる可能性がある。培養面が培地除去導管によって損傷しないとしても、培地除去導管に引き込まれる場合は、培地および細胞をこれ以上除去できない可能性がある。要約すると、その平らで望ましい水平な状態から培養面を引っ張ることは、細胞損失、細胞の除去ができないこと、その膨張に起因する培養面の損傷、培地除去導管との物理的接触に起因する培養面への損傷、培養物の汚染、製造労働者のバイオハザードへの暴露、のいずれか、或いはすべてを引き起こすかもしれない。したがって、これらの危険を回避する細胞回収方法が必要となる。
【００２３】
一般に、細胞培養を行った後に、細胞は気体透過性材料を含む装置の底部に引き寄せられていて装置が依然として培地を保持しているとき、装置の内容物を加圧する方法で細胞培養／細胞回収装置内へある容量の気体を移動させる場合に有利である。好ましくは、第１容量の気体を装置内へ移動させて、第１容量の培地を装置から廃液容器内へ移動させる。当該工程は、細胞が存在する培養面が水平面を向くように置いた装置で行われることが好ましい。この工程が完了すると、培地の残留量が装置内に残り、細胞も装置内に残る。第２容量の気体を装置内へ移動させ、それにより、装置から培地の残留量および細胞を移し、培地の残留量および細胞を細胞回収容器内へ移動させる。このようにして、培地容量の細胞数に対する比が減少する。
【００２４】
図２Ａから図２Ｅは本発明の実施例の実例を提供し、これは、図１Ｂ〜図１Ｄに示す課題を、真空下で装置から培地を引き出すのとは異なり、圧力下で装置から培地或いは培地と細胞を追いやる細胞培養／細胞回収装置に気体を押し込むことによって解決する。この手法は、真空の形成を防止し、培養面の上方への歪みを防止し、迅速に細胞を取り除くことができる平面状態になるならないを繰り返す培養面のパルスを防止することのいずれか或いはすべてにより、細胞損失の可能性、装置への損傷のいずれか或いは両方を最小限に抑える。図２Ａでは、細胞培養／細胞回収装置１０００の細胞培養の向きおよびその装置の静止細胞培養状態での断面図を示している。細胞培養／細胞回収装置１０００は、上端１０１２およびそれより低い位置にある培養面１００６により区切られた内容物１０１４と、通気口１０２８と、培地除去開口部１００８を備えた培地除去導管１０１０とを含む。培地除去導管クランプ１００９は、内容物１０１４内に培地を保持するべく閉鎖位置にある。上端１０１２は、側壁１０５４によって培養面１００６に隣接するのが好ましく、側壁１０５４は培養面１００６に垂直であり、かつ、剛性であるので、接種した細胞は培養面１００６上に均一に広がることができる。初期培地容量１０２０Ａは装置内に存在する。初期培地容量１０２０Ａの高さは、細胞培養／細胞回収装置１０００の境界内にて初期培地高さ１０２１Ａとし、この高さは最も高い培地面から最も低い培地面までの距離に等しい。細胞１０１６も存在しており、培養面１００６上に引き寄せられている。培養面１００６は、平面状とするのが好ましく、培養作業中は水平方向に置かれ、無孔性で気体透過性かつ液体不透過性の材料を含み、非接着性細胞を培養する場合には疎水性とする。培地除去開口部１００８は、培養面１００６から少し離れており、図で分かるように、離れていることで残留培地高さ１０２１Ｂが決まる。細胞培養作業のある時点では、初期培地容量１０２０Ａをより少量の残留培地容量まで減らす培地除去作業を行って、新鮮な培地を追加するか細胞を残留培地容量まで濃縮することが望ましい。
【００２５】
初期培地容量１０２０Ａの一部を除去するために、培養面１００６が底部に、上端１０１２が頂部にあるように細胞培養／細胞回収装置１０００を配置する。別の言い方をすれば、細胞培養／細胞回収装置１０００を、静止細胞培養に好ましい位置に配置する。細胞１０１６は、培養面１００６上に初期細胞密度で存在し、この初期細胞密度は細胞１０１６を初期培地容量１０２０Ａで割った数量である（例えば細胞／ｍｌ）。細胞１０１６はまた、初期表面密度で培養面１００６上に存在し、この初期表面密度は細胞１０１６を細胞がある培養面１００６の表面積で割った数量である（例えば細胞／ｃｍ2）。気体送出部を、通気口１０２８に接続し、図２Ｂで一番よく分かるように、装置の頂部に配置するのが好ましい。どのように細胞培養／細胞回収装置の内容物を通気するとしても、それは、０．２ミクロンの通気口フィルタなどの気体を滅菌濾過できるガンマ線安定材料を経由するのが好ましい。この例では、気体送出部をダイアフラムポンプ１０５０とし、これを気体導管１０５２によって通気口１０２８に接続する。気体送出部が盛んに気体を出している（即ち、この例では、ダイアフラムポンプ１０５０を作動させている）とき、気体は気体導管１０５２内に追いやられ、通気口１０２８を介して細胞培養／細胞回収装置１０００内に入る。通気口１０２８は、細胞培養／細胞回収装置１０００内へ気体が確実に移動することができる材料を含み、滅菌されているのが最も好ましい。通気口１０２８はまた、濾過表面上に堆積して濃縮する可能性を最小限にする位置に配置するのが好ましい。この図では、通気口１０２８の濾過表面は、培養面１００６に平行ではなく、代わりに、培養面１００６に対して垂直に配置する。培地除去導管クランプ１００９が開放位置にある状態で細胞培養／細胞回収装置１０００に気体を送出するとき、培地の除去開口部１００８に追いやられる際に初期培地容量１０２０Ａの一部が細胞培養／細胞回収装置１０００から培地除去導管１０１０を介して廃液容器へ移り、それにより細胞１０１６および残留培地容量１０２０Ｂ（残留培地高さ１０２１Ｂで存在する）が残る。廃液容器は筐体とする必要はなく、培地除去導管１０１０に物理的に装着される必要もない。例えば、廃液容器は、代わりに実験室のシンクのように一般的なものとすることもできるが、バッグなどの密封容器とし、閉鎖系の様式でバイオハザードの可能性を封じ込めるために培地除去導管１０１０に密封して接続する。このような密封容器を図２Ａおよび図２Ｂにて密封した廃液容器１０３２として図示しており、この廃液容器１０３２は培地除去導管１０１０に接続している。
【００２６】
この培地除去の作業中、気体が細胞培養／細胞回収装置１０００に進入して内容物１０１４の圧力が上昇する際に、培養面１００６が望ましい水平位置から動かないようにする方が良い。例示的実施例に記載するように、水平面にて培養面を保持する培養面支持体によりこれを果たすことができ、培養面の損傷を防ぐ。当業者は、培養面支持体の構造に関する更なる指針のために、同時係属‘８１４および‘８４８を参照されたい。
【００２７】
培地除去作業の完了後、通気口１０２８を周囲大気に開放し（例えば、気体導管１０５２を切断または通気し）、培地除去導管１０１０（または装置内に存在可能で、その目的にふさわしく構造化できる他のポート）を介して新鮮な培地を足すことで新鮮な培地を足すことができる。新鮮な培地を装置へ足す必要がなく、培養を終了する場合、図２Ｃに示すように、静止細胞培養に好ましい向きから細胞除去のための向き（培地除去開口部１００８が内容物１０１４内の低い地点に存在する）へ細胞培養／細胞回収装置１０００を置き直すことで、細胞１０１６を除去できる。細胞および培養面の固有の特質に応じて、装置から細胞を除去しようとする前に、装置内の残留培地を攪拌して培養面から細胞を取り除き、残留培地にそれらを懸濁することは有用かもしれない。我々は、培養面がシリコーンなどの疎水性の気体透過性材料であったとしても、もはや培地内に細胞が沈んでいない所まで装置を傾けても、Ｔ細胞などの非接着性細胞が培養面上に堆積したまま残る傾向があることを発見した。よって、残留培地を除去する際に確実に細胞が装置内に残らないようにするには、残留培地を引き抜く前に攪拌してその中に細胞を懸濁させることが好ましい。当業者は、残留培地中に細胞を懸濁させる多くの方法があることを認識するであろう。例えば、単に装置に運動を与えて装置の周囲および培養面上に残留培地を渦流させ、いつ細胞を培養面から取り除いて残留培地内へ移動したかを視覚的に判断してもよい。我々は、円形の培養面を囲む円筒状の壁により十分にこの手法が円滑に行われることを見出した。しかしながら、この工程は、細胞を培養面から取り除いて残留培地に分散させると終了し、細胞の回収は培地および細胞を回収する従来の方法（例えば蠕動ポンプを使用する）により行う。しかしながら、通気口が滅菌フィルタを含むときは通気口全体に圧力降下が発生するので、装置から培地を引き出すことにより細胞を引き抜くと、装置内に真空が形成されるために気体透過性材料が平面位置から移動する。しかし、気体透過性材料が水平位置から新たな位置へ移動するときに気体透過性材料が無傷である状態を壊さず、または細胞培養／細胞回収装置のその他の側面が完全であることに影響を受けなければ、これを行うことができる。しかしながら、気体透過性材料または細胞培養／細胞回収装置のその他の側面を損傷の危険のある状況に置かない好ましい方法は、気体を細胞培養／細胞回収装置内に送出することにより残留培地および細胞を移すことである。
【００２８】
図２Ｄは、これを行う方法を示す。細胞培養／細胞回収装置１０００を細胞除去のための向きに置き、培地除去導管１０１０は、できれば密封した廃液容器１０３２の代わりに使用する細胞回収容器１０４０に接続し、ダイアフラムポンプ１０５０などの気体送出部は通気口１０２８に接続し、これは気体導管１０５２によって通気口１０２８に接続する。気体送出部が盛んにガスを送出しているとき（即ち、この例では、ダイアフラムポンプ１０５０を作動させるとき）、気体を気体導管１０５２内に送出し、通気口１０２８を介して細胞培養／細胞回収装置１０００内へ入る。細胞培養／細胞回収装置１０００内に気体を送出するとき、１つ以上の側壁１０５４から出ている培地除去開口部１００８へ懸濁した細胞１０１６を追いやると、懸濁した細胞１０１６を含有する残留培地容量１０２０Ｂは細胞培養／細胞回収装置１０００から培地除去導管１０１０を介して細胞回収容器１０４０へ移る。細胞回収容器１０４０は、遠心分離および／または冷凍保存などに供するあらゆる下流作業にも適する設計の密封容器とするのが好ましい。培養面１００６の損傷を防止するために、培養面支持体が存在し、気体が細胞培養／細胞回収装置１０００に進入するときに培養面１００６を平面状態で保持するのが望ましい。
【００２９】
当業者は、初期培地容量が存在する高さを装置底部よりも高くすることは、様々な理由により有利であることを認識すべきであり、その理由は、栄養源を増加させること、細胞廃物用シンクを大きくすること、初期培地容量のより大きな部分を細胞損失なしに除去する能力を含むものとする。培地の高さを限定はしないとはいえ、培養面及び／又は培地の最上面が水平位置にあるときに培地の最下部から培地の最上部までを測定したときの培地高さは、１ｃｍ〜２５ｃｍの範囲とするのが好ましく、１ｃｍ〜２０ｃｍの範囲とするのがより好ましい。更により好ましいのは１ｃｍ〜１５ｃｍの範囲、更により好ましくは２ｃｍ〜１１ｃｍの範囲内とする。残留培地高さも特に限定しないが、培養面及び／又は培地の最上面が水平位置にあるときに培地の最下部から培地の最上部までを測定したときの残留培地高さを０．２ｃｍ〜２．０ｃｍの範囲内とするのが好ましい。より好ましくは０．２ｃｍ〜１．０ｃｍの範囲内、更により好ましくは０．２ｃｍ〜０．５ｃｍの範囲内とする。
【００３０】
図３は、本発明の更に別の実施例を示し、細胞培養／細胞回収装置２０００の断面図は、培地除去導管２０１０内に位置する細胞除去開口部２００８を含むものとする。培地除去導管は、内容物２０１４に１つ以上の側壁２０５４を介さずにつながり、この図では上端２０１２を介して移動する。細胞培養／細胞回収装置２０００を培地回収の配置（つまり細胞培養の配置）にする際に、前述のように培地の回収が可能であり、この培地回収の配置にて細胞２０１６は培養面２００６上に存在するものとする。図３に示すように、元の培地容量の一部は、培地除去導管２０１０を介して除去する。残留培地２０２０Ｂは、培地除去開口部２００８の高さに存在する。細胞培養／細胞回収装置２０００を細胞除去の配置へ単に置き直すことにより、細胞２０１６を前述のように回収することができ、この細胞除去の配置にて培地除去開口部２００８は、残留培地容量２０２０Ｂの低い点に存在する。細胞２０１６が残留培地２０２０Ｂに懸濁しているので、培地除去導管２０１０を介して残留培地容量２０２０Ｂを除去することによりそれらを回収可能とする。
【００３１】
本発明の別の実施例は、導管の開口（部）が培養面からの距離の変更を可能にする。図４Ａでは、細胞培養の配置かつ静止細胞培養の状態での細胞培養／細胞回収装置３０００の断面図を示している。細胞培養／細胞回収装置３０００は、上端３０１２に区切られた内容物３０１４と、培養面３００６と、通気口３０２８と、培地除去開口部３００８を備えた培地除去導管３０１０とを含むものとする。上端３０１２は、１つ以上の側壁３０５４により培養面３００６に隣接するのが好ましく、１つ以上の側壁３０５４は、培養作業の間、培養面３００６に垂直とするのがより好ましい。
【００３２】
上述のような様式で培地除去開口部３００８を介して培地を除去することが可能であり、細胞培養／細胞回収装置３０００が平面状の培養面３００６が水平位置に存在する状態に置かれ、細胞が培地中に懸濁せずに（つまり培地中に分散していない）培養面上に存在するときが好ましい。培地除去作業の終了後、通気口３０２８を周囲大気に開放させ（例えば気体導管を切断または通気する）、培地除去導管３０１０（或いは、装置内に存在し、その目的のために適切に構造化することが可能なその他のポート）を介して新鮮な培地を添加することにより新鮮な培地を添加することができる。新鮮な培地を装置に添加する必要がなく、培養を終了する場合、細胞除去を行うことができる。細胞除去開口部３００８と培養面３００６の間の距離を変更するための手段を含むように細胞培養／細胞回収装置を構成することにより、培地除去開口部３００８の位置を培地除去の配置から細胞除去の配置へ変更可能とする。その際、培地除去開口部は、前述のように、細胞を除去せずに培地容量を減らすよう動作可能なだけでなく、培地容量を減らした後に残留培地および細胞を除去することも可能とする。このように、たった１つのポートを使用して、残留培地中で細胞を濃縮し、濃縮した細胞を除去することもできる。図４Ｂは、これを実現する方法の一例を示す。この例では、１つ以上の側壁３０５４は、細胞培養／細胞回収装置の内容物の下端を上端へ接続する構造を提供する。この図では、培養面３００６が下端である。細胞培養／細胞回収装置３０００の１つ以上の側壁３０５４は、培地除去開口部３００８と培養面３００６の間の距離を調整する手段を含むものとする。当業者は、これを達成する多くの方法と認識すべきである。例えば、１つ以上の側壁３０５４は、シリコーンなどの弾性のある材料を含むことができ、１つ以上の側壁３０５４の高さを変えられるように蛇腹状にすることもできる。１つ以上の側壁３０５４の高さを変えて、示すように培地除去の配置から細胞除去の配置へ培地除去開口部３００８を動かすと、培地除去開口部３００８と培養面３００６の間の距離が縮まり、培地除去開口部３００８が細胞除去の配置に来る。この細胞除去の配置において、開口部は培養面３００６に近接し、残留培地および細胞の通過を可能にできる。別の言い方をすれば、細胞培養／細胞回収装置３０００を培地除去の配置にしたとき、培地除去開口部３００８と培養面３００６の間の距離（この図では、静止細胞培養の状態で装置が動作しているときに培地が存在できる下端である）は、細胞除去の配置にあるときの培地除去開口部３００８と培養面３００６の間の距離よりも大きい。逆に、細胞培養／細胞回収装置３０００を細胞回収の配置にしたとき、培地除去開口部３００８と培養面３００６の間の距離は、細胞培養／細胞回収装置３０００を培地除去の配置にしたときの培地除去開口部３００８と培養面３００６の間の距離よりも小さい。
【００３３】
当業者は、培地除去開口部と培養面との間の距離を調整する方法が多種多様であることを認識されたい。例えば、壁の一部が他の部分へ液密に滑り込むピストンのような様式で、装置の壁を折りたたみできるようにする多くの方法（弾性のある（曲げやすい）材料での製造を含む。）がある。そのような場合、培地除去開口部を培地除去の配置から細胞除去の配置に変更すると、細胞培養／細胞回収装置の上端と培養面の間の距離は小さくなる。しかし、当業者は、細胞培養／細胞回収装置の上端と培養面との間の距離の変えることが、培地除去の配置から細胞除去の配置へ培地除去開口部を移動する唯一の方法ではないことを認識されたい。
【００３４】
図５Ａおよび図５Ｂは、細胞培養／細胞回収装置４０００の断面図を示し、この細胞培養／細胞回収装置は、培地除去開口部４００８と培養面４００６の間の距離を調整するように作られている。弾性のある側壁４００１は、培地除去導管４０１０および上端４０１２に対して密封を形成する。培地除去導管４０１０は、密封された接続部を有し、この実例では雌口ルアーコネクター４０１１を含み、この雌口ルアーコネクターが雄口ルアーコネクター４０１３と噛み合い、それにより回収容器を培地除去導管４０１０に容易に取り付けることができる。当業者は、滅菌した管の溶着部を含むこのような接続をする多くの方法があることを認識されたい。培地除去開口部４００８と培養面４００６の間の距離を変えるには、弾性のある側壁４００１の高さを変える。弾性のある側壁４００１の上面に力を加えてその高さを低くすることで（つまり培養面４００６の方向へ蛇腹部分を圧縮する）、それにより培地除去開口部４００８を培養面４００６の方向へ移動させ、培地除去開口部４００８と培養面４００６との間隔を小さくした後の弾性のある側壁４００１の高さを図５Ｂは示している。当業者は、細胞培養／細胞回収装置４０００を汚染の危険がある状態に置くことなく、培地除去開口部４００８と培養面４００６との間隔を様々に変えられるようになることを認識すべきである。好ましくは、細胞回収時、培地の除去開口４００８は培養面４００６に隣接し、細胞培養／細胞回収装置４０００は細胞培養の配置（つまり培養面４００６は水平位置にある）にある。これにより、細胞培養／細胞回収装置をその細胞培養の配置から回転させる必要なく細胞培養／細胞回収装置の培地および細胞含有物を除去する自動化作業を容易にする。
【００３５】
細胞回収の前に、装置を撹拌して培養面から細胞を取り除いて、細胞を培地に懸濁させることは有用かもしれない。我々は、培養面がシリコーンなどの疎水性膜であっても、装置を傾けたときに、Ｔ細胞などの非接着性細胞は培養面上に堆積したまま残る傾向があることを発見した。よって、残留培地を除去する際に細胞が確実に残らないようにするには、装置を攪拌するのが好ましい。例えば、単に残留培地を渦流させ、細胞を培養面から取り除いて残留培地内へ移動したことを視覚的に判断してもよい。細胞を培養面から取り除くと、細胞回収は、培地および細胞を引き抜く従来の方法（例えば、蠕動ポンプを使用する）により行うことができる。装置から培地を引き出すことにより細胞を引き抜くと、装置内に真空が形成されるために気体透過性膜が水平位置から移動する。膜が無傷である状態を壊さない限り、これを行うことができる。しかしながら、膜を損傷の危険のある状況に置かない望ましい方法は、前述の気体移送方法を用いて細胞を回収することである。
【００３６】
図５Ｃは細胞培養／細胞回収装置４０００を示し、これは更に、細胞を回収するのに用いる導管開口部を装置内の最も低い位置に置くために装置を傾ける必要をなくすことで、細胞回収の自動化を更に促進するように作られている。培養面４００６が細胞培養に好ましい水平面内にあるとき、細胞回収ポケット４００７は、培養面４００６の水平面より下にある。培地除去開口部４００８は、細胞回収ポケット４００７内にある。この位置にて、培地除去開口部４００８は、内容物４０１４の最下点に存在し（つまり、装置を静止細胞培養の状態に置く際の培地の最も低い位置）、培地および細胞の回収を促す。この特徴は、任意の細胞培養／細胞回収装置の実施例にあり得る。
【００３７】
一般に、培地除去開口部が培地除去の位置にあるとき、当該開口部により細胞培養／細胞回収装置の全ての内容物を除去できないのが好ましい。気体送出部が不良となるか、または、培地除去開口部を通って移動できる培地の全ての移動後に気体の送出を停止することができずに気体を装置内に送出し続ける場合であっても、培地の少なくとも一部および細胞の大部分が装置内に確実に残るようにする。
【００３８】
培地除去開口部と培養面との間隔を変える、または細胞を回収するために大きく傾けなければならないような細胞培養／細胞回収装置の設計を防ぐ場合、別々に培地除去開口部および細胞除去開口部を作成し、下流作業を簡素化するために前述の作業を細胞損失や培養面および／または気体透過性材料に損傷の恐れなく用いることは容易である。図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃおよび図６Ｄはそういった例をもたらす。静止細胞培養の配置での細胞培養／細胞回収装置５０００の断面図を示しており、この装置は上端５０１２と下端（この図では培養面５００６）とにより区切られた内容物５０１４と、通気口５０２８と、培地除去開口部５００８を備えた培地除去導管５０１０と、細胞除去開口部５００２を備えた細胞除去導管５００４とを含むものとする。上端５０１２は、１つ以上の側壁５０５４により下端へ接するのが好ましく、１つ以上の側壁５０５４は、培養面に垂直とするのがより好ましい。初期培地容量５０２０Ａは装置内にある。初期培地容量５０２０Ａの高さは、最も高い培地面から最も低い培地面までの距離と同じ初期培地高さ５０２１Ａとする。使用中、細胞５０１６は培養面５００６上に存在するものとする。一般に、当業者は、非接着性細胞（即ち、浮遊細胞とも呼ばれる）は、培養面と実際に物理的に接触する低い位置の多くの細胞と互いに積み重なることができるので、非接着性細胞の全てが培養面に接触するとは限らないことに気付くべきである。培養面５００６は、培養作業中は水平に置くのが好ましく、無孔性の液体不透過性材料を含むとするのが好ましく、さらに、非接着性細胞を培養する場合には、疎水性とするのが好ましい。細胞５０１６は初期細胞密度にあるとし、この初期細胞密度は初期培地容量５０２０Ａで割った細胞５０１６の量とする（例えば、細胞／ｍｌ）。また、細胞５０１６は初期表面密度にもあるとし、この初期表面密度は細胞が存在する培養面５００６の表面積で割った細胞５０１６の量とする（例えば、細胞／ｃｍ2）。重ねて、非接着性細胞の場合には、これは、静止状態に引き寄せられ、培養面に更に引き寄せられないようにした細胞の総数を含むものとする。これは、他の細胞の上に載っている細胞（培養面と直接接触していないもの）も含む。培地除去開口部５００８は、培養面５００６から離れており、分かるように、その間隔は残留培地高さ５０２１Ｂを構成する。
【００３９】
細胞培養作業のある時点で、初期培地容量５０２０Ａをより少量の残留培地容量まで減らす培地除去作業を行い、新鮮な培地を追加するか細胞を残留培地容量に濃縮することが望ましくなる。初期培地容量５０２０Ａの一部を除去するために、図６Ｂにて最もよく分かるように、気体送出部を通気口５０２８に接続する。この例では、気体送出部はダイアフラムポンプ５０５０とし、これは気体導管５０５２により通気口５０２８に接続する。ダイアフラムポンプ５０５０が作動すると、ダイアフラムポンプ５０５０は気体を気体導管５０５２内に押しやり、通気口５０２８を介して細胞培養／細胞回収装置５０００内に入れる。気体を細胞培養／細胞回収装置５０００の内容物５０１４内に追いやると、初期培地容量５０２０Ａの一部が培地除去開口部５００８内へ移り、培地除去導管５０１０を介して細胞培養／細胞回収装置５０００から廃液容器内に追いやられ、図６Ｃに示すように残留培地容量５０２０Ｂおよび細胞５０１６が残る。残留培地容量５０２０Ｂの高さは、残留培地高さ５０２１Ｂとし、最も高い残留培地面と最も低い残留培地面との間隔としてこの高さを定義する。細胞５０１６は残留細胞密度にあるとし、この残留細胞密度は残留培地容量５０２０Ｂで割った細胞５０１６の量（例えば、細胞／ｍｌ）とする。細胞５０１６はまた残留表面密度にもあるとし、この残留表面密度は細胞が存在する培養面５００６の表面積で割った細胞５０１６の量（例えば、細胞／ｃｍ2）とする。廃液容器を筐体とする必要はなく、培地除去導管５０１０に物理的に装着する必要もない。例えば、廃液容器を代わりに実験室のシンクのように一般的なものとすることもできるが、バッグまたは遠心分離管などの密封容器とするのが好ましく、閉鎖系の様式でバイオハザードの可能性を封じ込めるか、滅菌性を維持するために培地除去導管５０１０に封止して接続する。このような密封容器を図６Ｃにて密封された廃液容器５０３２として示し、この廃液容器５０３２を培地除去導管５０１０に装着する。初期培地容量５０２０Ａの一部を細胞培養／細胞回収装置５０００から除去しているとき、廃液容器５０３２内の培地の容量は培地除去導管５０１０内の初期培地容量５０２０Ａの分（あれば）だけ少ない初期培地容量５０２０Ａとする。この培地の除去作業中、気体が細胞培養／細胞回収装置５０００内に進入して内容物５０１４の圧力が上昇する際に、培養面５００６は制約なしに上端５０１２とは反対方向へ移動することを防止するのが好ましい。図６Ｃに示すように、培養面５００６と接触し、実質的な平面位置で培養面５００６を保持する培養面支持体５０１８によりこれを行い、培養面の損傷を防ぐ。「実質的」という用語は、以前、水平位置に関して説明したが、これは平面位置にも適用する。当業者は、培養面支持体の設計に関する更なる指針について、同時係属‘８１４および‘８４８を参照されたい。
【００４０】
図６Ｄを参照すると、細胞回収容器５０４０を細胞培養／細胞回収装置５０００の細胞除去導管５００４に装着し、培地除去導管５０１０を閉じる培地除去導管クランプ５００９により流体の流れを阻む更なる工程を、細胞５０１６の回収のために行う。培地除去導管５０１０での流体の流れを阻むことは、止血鉗子の使用と同じくらい単純にすることが可能であり、或いは本開示中に更に記載するように自動化してもよい。前述のように、細胞回収の前に、装置内の残留培地を撹拌して培養面から細胞を取り除き、それらを残留培地に懸濁させることは有用かもしれない。細胞回収は、培地及び細胞を回収する従来の方法（例えば、蠕動ポンプを使用すること）により行うことができるが、好ましい方法は、気体移送法が与える正圧を用いることにより、培養面及び／又は気体透過性材料が上端に向かって動いたり、作業中に形状が歪むのを防止することとする。図６Ｄに示すように、気体送出部は気体導管５０５２を介して通気口５０２８に接続する。この例では、気体送出部をダイアフラムポンプ５０５０とする。ダイアフラムポンプ５０５０が作動すると、気体が気体導管５０５２内へ追いやられ、通気口５０２８を介して細胞培養／細胞回収装置５０００内へ入る。気体が細胞培養／細胞回収装置５０００内へ追いやられると、残留培地５０２０Ｂおよび細胞５０１６は細胞除去開口部５００２内へ移り、細胞除去導管５００４を通って細胞回収容器５０４０内へ追いやられる。その後、細胞回収容器５０４０は、細胞５０１６の後続作業のために、滅菌した管の溶着などの好ましい滅菌方法により、滅菌除去できる。
【００４１】
細胞培養／細胞回収装置の内容物の一部を洗い流すことができ、これは初期細胞除去工程後に装置内に残る可能性のある細胞を回収するのに望ましい。例えば、これは、細胞除去作業の開始時には装置内になかった液体供給源を追加する必要なく行うことができる。洗い流す材料として密封した廃液容器内にある培地を使用して行うことができる。これを行うには、培地除去クランプを開放し、通気口を開放し、単に培地が装置に逆流できるようにするのに必要な高さまで廃液容器を上昇させることなどにより廃液容器を加圧する。これは、折りたためる場合（バッグなど）、廃液容器を圧搾して装置内への流動を開始することが役立てられる。十分な量の培地が装置に戻ったと使用者が判断した場合、培地除去導管クランプを閉じ、細胞除去作業を繰り返すことができる。
【００４２】
空気を用いる培地および／または細胞を移す既述の作業は、例えば、止血鉗子で導管を開閉し、作業の視覚的判断により気体送出部をオン・オフに切り替えるなど単純な方法で行うことが可能で、多くの細胞調製を望む場合には作業の一部の自動化が有益かもしれない。考慮すべき要因の１つは、培地および／または細胞をそれぞれの容器内に追いやった後にも気体送出部が気体を装置に送出し続ける可能性があることである。この場合、気体を容器内に追いやり、容器を加圧することにより、容器などの密封が破壊する可能性がある。更に、気泡の表面張力や気体と細胞の接触により細胞膜が完全である状態を破壊するかもしれないため、気体が細胞の損傷を引き起こす可能性がある。考慮すべき別の要因は、培地および／または細胞をそれぞれの容器に追いやった後に気体送出部をオフにしていない場合に細胞培養／細胞回収装置自体の中に形成するかもしれない圧力である。
【００４３】
図７は、これらの問題を解決するために設計した装置の例示的実施例の概略図を示す。当業者は、この例示的実施例が図３などに示すようなたった１つの培地除去導管、又は調節可能な培地除去導管、又は独立した培地／細胞除去導管を備えて作られた細胞培養／細胞回収装置と適合することを認識すべきである。一般に、自動化装置は、培地除去導管又は細胞除去導管を介して細胞培養／細胞回収装置を出た培地を気体に置き換える作業点を認識することが好ましい。再び図７を参照すると、流体検出部６０４４Ａ及び６０４４Ｂは、培地除去導管または細胞除去導管を介して細胞培養／細胞回収装置を出た培地を気体に置き換える作業点を認識することができ、培地除去導管６０１０および細胞除去導管６００４に近接している。別の言い方をすれば、流体検出部は、液体又は気体が導管内に存在するかどうかを検出できる。第１流動制御部６０４６Ａは、培地除去導管６０１０を開閉するように作動し、第２流動制御部６０４６Ｂは、細胞除去導管６００４を開閉するように作動する。この例では、電子作動式ピンチクランプが流動制御部として機能し、導管は弾性のある管で作製される。細胞培養／細胞回収装置６０００は、その細胞培養の配置における静止細胞培養装置（即ち、培地は強制混合に供されず、培養面は上端よりも下、好ましくは水平位置にある）とするのが好ましい。培地６０２０は、第１培地容量にて、かつ、第１培地高さにて細胞培養／細胞回収装置６０００内に存在するものとし、細胞６０１６は培養面６００６上で重力により下に沈んでいる。培養面６００６を、培養面支持体６０１８により水平面に保持するのが好ましい。培地除去開口部６００８から培養面６００６の間隔は、細胞除去開口部６００２から培養面６００６の間隔をより大きい。細胞除去導管は側壁と接触し、又は培養面と接触し、又は１つ以上の側壁６０５４を培養面と接続する縁部に沿って配置し、又は前述のように培養面内のポケットに配置するのが好ましく、それにより細胞回収を最大にするべく細胞除去開口部を配置する。気体導管６０５２は、通気口６０２８を気体送給部６０５０に接続する。培地除去導管６０１０を廃液容器６０３２に接続し、細胞除去導管６００４を細胞回収容器６０４０に装着する。ソフトウェアアルゴリズムは、高濃縮状態で細胞を回収するのに要する様々なタスクを実行するのに必要な電子信号を送出することができる。培地６０２０の容量を減らすために、流動制御部６０４６Ａは培地除去導管６０１０を通る流体が流れられる状態とし、流動制御部６０４６Ｂは細胞除去導管６００４を通る流体が流れられない状態とし、気体送出部を作動し、気体が通気口６０２８を介して細胞培養／細胞回収装置６０００内に進入し、内容物６０１４を加圧し、培地６０２０を培地除去開口部６００８に追いやり、培地除去導管６０１０を通して廃液容器６０３２に追いやる。培地６０２０の高さが培地除去開口部６００８の僅か下に達すると、気体が培地除去開口部６００８へ入り、培地除去導管６０１０を通り、流体検出部６０４４Ａにより検出される。流体検出部６０４４Ａは、流動制御部６０４６Ａへ信号を送り、廃液容器６０３２への流体の流れを停止させる。気体送出部６０３８は、同時に気体の送出の停止と圧力安全弁６０５６開放の両方か片方を行うのが好ましい。この工程は必要があれば行うが、その強みは細胞培養／細胞回収装置６０００内の圧力を最小限にすることであり、当業者は特定の圧力閾値に達した後に気体送出が不可能な気体送出部の使用や圧力安全弁の使用などを含む、その目的を果たす多くの方法があると認識されたい。培地６０２０が廃液容器６０３２へ移動し終わると、操作者は次に、培養面６００６から細胞６０１６を取り除くために残りの培地を撹拌するかどうかを決められる。操作者が自動制御を無効にして、廃液容器への培地移動を停止することが強力なシステムにより可能である（例えば、細胞が廃液容器内に入って無駄になった場合に必要とできるように）ことを当業者は認識されたい。
【００４４】
細胞６０１６が培地６０２０の残量内で適切な懸濁状態にあるおよび／または細胞回収作業を開始すべきと操作者が判断したら、使用者はボタンを押し、作業を再開する。内容物６０１４を加圧し、流動制御部６０４６Ｂは細胞回収容器６０４０へ流体が流れられるように作動する。操作者の好みであったり、細胞培養装置を静止細胞培養の配置にするときに、回収する細胞が最大になるような位置に細胞除去導管がくるように配置するべく当該装置を設計しているかどうかに応じて、この時に全ての培地および細胞が低い点に集まるような向きに細胞培養／細胞回収装置６０００を置いてもよいし、置かなくてもよい。当業者は、攪拌して細胞を取り除き、装置を回収する細胞が最大になるような位置に向ける工程もまた自動制御できると認識するであろう。静止細胞培養の配置で、培養面６００６の高さより低く細胞除去開口部６００２があるとき、回収する細胞を最大にできる。例えば、前述のように培養面のポケット、培養面周囲の周縁凹部（その底部が培養面よりも低い）または培地を培養面よりも低いところに存在させ、細胞除去開口部が回収位置にくるように作用し得る任意の機構などによって可能になる。自動制御細胞除去作業のある時点で、気体は細胞除去開口部６００２へ入り、細胞除去導管６００４を通過し、流体検出部６０４４Ｂにより検出される。その時点で、流体検出部６０４４Ｂは、流動制御部６０４６Ｂへ信号を送り、細胞回収容器６０４０への流体の流れを停止させる。この時点で、容器６０４０を取り外すことができ、好ましくは、滅菌した管の溶着機を用いる無菌的な方法とする。しかしながら、装置内に残っているかもしれないような細胞をより多く回収する上で、培養膜を更に洗い流すことが役に立つと操作者が判断する場合、その作業は簡単であると考えられる。流動制御部６０４６Ａを、培地除去導管６０１０を通る流体の流れを阻止せず、代わりに開放した状態に置くことができ、廃液容器６０３２を単に持ち上げるか、または圧搾して（廃液容器を袋状のものとするのが好ましい）培地６０２０を廃液容器６０３２から細胞培養／細胞回収装置６０００内へ送る。この工程中に、通気口６０２８を大気へ開放するのが好ましい。適切な量の培地６０２０が細胞培養／細胞回収装置６０００に戻ったら、細胞回収作業を繰り返せる。培地を追加したり除去するこの工程は、操作者がふさわしいと考えるだけの細胞を回収するのに必要なだけ繰り返すことができる。
【００４５】
図７に示した実施例の装置を使用する方法は、気体送出部をフィルタに接続し、そのフィルタを培地および細胞を含有する気体透過性の細胞培養／細胞回収装置に接続されるようなものとし、細胞培養装置は培地除去導管を含み、第１流体検出部を培地除去導管に接続し、第１流体流動制御部を培地除去導管に接続し、気体送出部からの気体送出を開始し、それにより、気体を細胞培養装置内へ移動させるあらゆる作業や機器の使用を開始でき、気体により細胞培養装置から培地除去導管に接続した培地回収容器へと培地が移動する。第１流体検出部は、培地除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したかを検出し、第１流体検出部は第１流体流動制御部へ信号を送り、信号を受け取ると、第１流動制御部は培地除去導管を通る流体の流れを停止させる。第１流動制御部が培地除去導管を通る流体の流れを停止させた後、必要に応じて培地を撹拌して培養面から細胞を取り除いて残留培地内に送る工程を行うことができる。前記細胞除去導管と培地が接触する新たな配置に細胞培養装置を置くこともできる。しかしながら、培養面が水平位置にとどまり、細胞除去導管の細胞除去開口部が培養面と接触するか近接している場合、装置の向きを変更するような工程を行う必要はない。細胞回収容器を細胞除去導管に接続し、第２流動制御部により細胞除去導管を通る流体の流れを開放し、気体送出部からの気体は細胞培養装置内へ移動し、培地および細胞は細胞除去導管を通り細胞回収容器内へ移動し、第２流体検出部は細胞除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体に変化したかを検出し、第２流体流動制御部に信号を送る。信号を受け取ると、第２流動制御部は、細胞除去導管を通る流体の流れを停止させる。
【００４６】
当業者は、図７の例示的実施例に記載される装置が、培地容量を減らし、かつ残留培地容量および細胞を除去するように作用するたった１つの培地導管を有する種類の細胞培養／細胞回収装置と接続すると簡素化できることを認識されたい。図２Ａ〜２Ｄ、図３、図４Ａ〜４Ｂ、図５Ａ〜図５Ｂおよび関連文には、こういった装置を更に詳細例として記載する。したがって、装置は、気体透過性細胞培養装置に接続するフィルタに接続できる気体送出部（この気体送出部は前記フィルタを介して前記気体透過性細胞培養装置に気体を送出することができる）と、気体透過性細胞培養装置に接続する培地除去導管内を移動する種類の流体がいつ液体から気体へと変化するのかを検出できる第１流体検出部（この部は前記培地除去導管を通る流体の流れを停止できる第１流動制御部に信号を送ることができる）とを包含する際に簡略化できる。第１流動制御部が培地除去導管を通る流体の流れを停止させた後、必要であれば、細胞培養装置を培地が培地除去導管と接触している新たな位置に向け、細胞回収容器を培地除去導管に接続し、第１流動制御部は、培地除去導管を通る流体の流れを開放し、前記気体送出部からの気体が前記細胞培養装置内へ移動し、培地および細胞は、培地除去導管を通って細胞回収容器内へ移動し、第１流量検出部は、培地除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へ変化したかを検出し、第１流体流動制御部に信号を送る。信号を受け取ると、第１流動制御部は前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させる。
【００４７】
当業者は、細胞が実際に可能な最大限まで細胞除去導管から出て細胞回収容器内へ移ることが有益であることを認識するであろう。したがって、流動制御機構の下流かつできるだけ容器の近くに流体検出部を配置することにより図７に示すような自動制御を使用する場合、流動制御機構が流動を停止する時の導管内の培地容量は、流体検出部の位置と細胞回収容器との間にあるものに限定される。また、管の内径を最小化することにより、更に導管内の細胞数を減らせる。あるいは、気体が導管内で検出された後、少量のさらなる気体が１つ以上の導管を介して運ばれ、作業完了時に液体が１つ以上の導管内に確実に捕捉されないようにできる。これは、全ての細胞を細胞回収容器へ確実に移動し、および／または導管内に液体がない状態で滅菌管をつなぎ合わせられるようにする上で役立つかもしれない。あるいは、導管を通じて気体を送ることで、作業完了時に導管内に液体を捕らえていないことを確実にできる。
【００４８】
当業者は、流動制御部および流体検出部の使用が便利であると認識すべきであるが、細胞回収作業を手動で行うことができる。手動細胞回収作業において、操作者は細胞除去導管を通るクランプ流動を冷却し、培地除去導管を通る流れを開放し、次いで、気体を培地除去導管内へ移動するまで、注射器を使用して装置へ気体を注入できる。次いで、必要に応じて培地を静止状態から攪拌して、培養面から細胞を取り除くことができる。培地除去導管を閉鎖し、細胞除去導管を開放すると、気体を装置に加え、それにより細胞および残留培地を装置から追い出す。
【００４９】
培養面および／または気体透過性材料の歪みを防止するために、培地の移動に気体を使用することは、的確な手法であるが、前述のような気体の移動とは違って、培地および／または細胞を装置から引き抜くことを望む場合、培養面および／または気体透過性材料の歪みが最小になるように装置を作ることが可能である。こういった手法は、装置の外部圧力より小さい圧力において装置の内容物で行うことができ、それにより装置の壁全体に圧力差が生まれる。このような条件の下で培養面の平面状態からの歪みを防止する１つの手法は、構成部分（例えば、培養面支持部などの）へ気体透過性材料を物理的に装着することである。図８および図９は、このような２つの例を提供する。簡素化のために、細胞培養／細胞回収装置全体は示していない。図８において、培養面６００６は、その下面から出るタブ６０５８を包含する。タブ６０５８は、培養面支持体６０１８上の嵌合機構と噛み合っている。鉛直支持体６０１８Ａは、培養面支持体６０１８の基部から突出して、静止細胞培養の間、培養面６００６を水平位置に保持する。培養面６００６は、気体透過性材料を含むのが好ましい。シリコーンの場合、液体射出成形により膜を製造可能であり、タブ６０５８を膜の形にすることができる。図９は、培養面外側の圧力が細胞培養／細胞回収装置の内容物の圧力を超えるときに、培養面を実質的な平面状態で維持する別の例を示している。この実例では、培養面７００６はシリコーンを含み、格子７０６０上の外側を被覆し（即ち、格子に装着し）、培養面支持体７０１８に装着する。通気開口部７０１８Ｂにより、培養物の受動的な気体交換が可能になる。別の言い方をすれば、周囲気体は、接触せざるを得ない状況になる必要なしに培養面と接触する。このように、培養面７００６外側の圧力が細胞培養／細胞回収装置の内容物の圧力を超えても、培養面支持体７０１８との接触点を介して培養面７００６を所定の位置に保持する。
【００５０】
培地および／または流体を装置から引き出すときに培養面を実質的な平面状態で維持する別の方法は、細胞培養／細胞回収装置の内容物の圧力と培養面外側の圧力とのバランスをとることである。図１０は、それを達成可能な方法の実例を示している。細胞成長／細胞回収装置８０００は、培養面支持体８０１８を含むものとする。培養面支持体８０１８は、１つ以上の通気開口部８０２１を含む。１つ以上の通気開口部により培養面８００６へと培養面８００６からの周囲気体の受動的な移動ができ、通気開口部は液体不透過性、気体透過性、無孔性とするのが好ましく、細胞培養中は実質的な水平面にある。別の言い方をすれば、気体を気体透過性材料と物理的に接触せざるを得ない構造を全く用いずに、受動的な移動により周囲気体は気体透過性培養面と接触する。培地除去導管８０１０を廃液容器８０３２に装着し、蠕動ポンプ８０３０により培地８０２０を細胞成長／細胞回収装置８０００から引き出せるように蠕動ポンプ８０３０と接続する。培地の除去中、１つ以上の通気開口部８０２１が周囲気体とやりとりする能力を最小化し、できれば排除する。この図では、培地容量の減少中、液体除去アダプタ８０２７を一時的に装着し、液体除去アダプタ８０２７は、培養面支持体８０１８と嵌合し、圧力平衡導管８０３３Ａを含み、更にたとえば接合部をルアー形状とすることもできる圧力平衡導管接合部８０２９を包含する。圧力平衡導管８０３３Ａは、圧力平衡導管８０３３Ｂに嵌合することができる。圧力平衡導管８０３３Ｂは、培地除去導管８０１０への装着が可能で、作動時に、液体除去アダプタ８０２７と培養面支持体８０１８の間の空間から蠕動ポンプ８０３０は気体を引き出すことができ、事実上、気体空間８０１９は周囲気体に比べて低い圧力となる。圧力平衡導管８０３３Ｂを培地除去導管８０１０に装着する場合、圧力平衡導管８０３３Ｂは、必要があれば、逆止弁８０３４および／または圧力平衡導管フィルタ８０３５を包含し、これは気体を廃液容器へ移動し、培地８０２０が当該容器内へ移動するのを防止することができ、それと同時に装置とその流体接続部分の滅菌性を維持するのが好ましい。当業者は、圧力平衡導管８０３３Ｂを培地除去導管８０１０に取り付ける必要はないが、代わりに蠕動ポンプと接続している別個の導管とすることができることを認識すべきである。この場合、出来れば培地除去導管および圧力平衡導管に接続する多重流路を持つ蠕動ポンプを使用する。このような構成では、蠕動ポンプ８０３０は、培養面８００６の下側から気体を引き出し、培養面８００６に真空を引き、これが細胞成長／細胞回収装置８０００内に作成される真空と平衡し、それにより培養面８００６を実質的な水平状態に保持する、または少なくとも培養面８００６が受ける歪みを軽減する。当業者は、圧力平衡導管から気体を引き出すいかなる装置も、培地を除去する際に、培養面に損傷を与える可能性のある歪みを防止する目的を満たせることを認識すべきである。
【００５１】
培養面支持体８０１８を液体除去アダプタ８０２７と接続するように設計し、培養面支持体８０１８を、培養面に隣接したその外側の圧力が内容物８０１４の圧力以下になるような速度で気体を気体空間８０１９から除去できるように、細胞培養／細胞回収装置８０００と接続するように設計する。当業者は、当該接続部が、気体空間８０１９の圧力を制御する限り、気密シールとする必要はないことを認識されたい。しかしながら、密封が設けられるのが好ましい。当業者はまた、液体除去アダプタ８０２７が、培地を細胞培養／細胞回収装置から引き出すときに実質的な水平状態で培養面を維持するという目的を満たす必要はないことを認識されたい。例えば、圧力平衡導管８０３３Ｂを１つ以上の通気開口部８０２１と直接接続できる。実際、使用する場合、接続を断つときに、周囲気体が任意の機構または作業を必要とすることなく培養面と受動的に接触して気体を送らざるをえないように、液体除去アダプタは、できれば培養面支持体への容易な接続と切断ができるのが好ましい。当業者は、培養面支持体を取り外せないような方法で細胞培養／細胞回収装置に装着する必要がないことに気付くべきである。
【００５２】
図１１は、実質的な歪みがほとんどない培養面を備えた装置から培地を引き出すことができるべく適合した細胞培養／細胞回収装置の別の実施例を示す。細胞成長／細胞回収装置９０００は、培養面支持体９０１８を含むものとする。培養面支持体９０１８は、１つ以上の通気開口部９０２１を含む。１つ以上の通気開口部９０２１は、培養面９００６へと培養面９００６からの周囲気体の受動的な移動を可能にし、できれば気体透過性、液体不透過性で、細胞培養中は水平面内にあるものとする。通気開口部フィルタ９０３６により、１つ以上の通気開口部９０２１への汚染物質の接近を防ぐ。当業者は、通気開口部フィルタに選択した材料が滅菌バリアとして機能し、この材料により培養に十分な酸素付加ができる速度にて培養面へ受動的に気体を出入りさせられることを認識されたい。好ましくは、０．４５ミクロン未満の孔径を有する多孔性材料とし、より好ましくは０．２２ミクロン未満とする。培地除去導管９０１０を廃液容器９０３２に装着し、蠕動ポンプ９０３０により細胞成長／細胞回収装置９０００から培地９０２０を引き出せるように、蠕動ポンプ９０３０と接続する。圧力平衡導管９０３３は、培地除去導管９０１０を気体空間９０１９に繋げ、必要があれば逆止弁９０３４（培地が気体空間へ入る可能性を防ぐため）および／または圧力平衡導管フィルタ９０３６（汚染物質またはバイオハザード物質が気体空間へ侵入し、その後、通気開口部フィルタを通過する可能性を防ぐため）を含んでもよい。培地除去の間、蠕動ポンプの速度は、気体空間内９０１９の圧力（即ち、培養面９００６と通気開口部フィルタ９０３６の間の空間）が内容物９０１４の圧力以下とするようなものであり、それにより、上端９０１２方向への培養面９００６の動きを最小限に抑えるか防止する。好ましくは、圧力平衡導管を、通気開口部から気体空間へ出ている管に嵌合する弾性のある管とし、滅菌した管の溶着部が嵌合するのに使用する。
【００５３】
図１２Ａおよび図１２Ｂには、細胞培養／細胞回収装置および作業の更に別の実施例を示している。本実施例において、培地を細胞培養／細胞回収装置から引き出すときの周囲環境の圧力よりも細胞培養／細胞回収装置の内容物の圧力は低い。図１２Ａは、静止細胞培養の状態にある細胞培養／細胞回収装置１００００を示している。細胞１００１６は、気体透過性、液体不透過性の培養面１０００６上に重力により沈む。図１２Ｂにおいて、周囲気体制限器１００１８は、細胞培養／細胞回収装置１００００と接触している。周囲気体制限器１００１８は、培養面１０００６との周囲気体の接触を制限するように機能し、液体を細胞培養／細胞回収装置１００００から引き出すときに、培養面１０００６全体の圧力不均衡を機能する。この例では、蠕動ポンプ１００３０は、培地除去導管１００１０から培地１００２０を引き出すように機能する。培地を細胞培養／細胞回収装置から引き出すとき、通気口フィルタ１００２８により気体が装置に入るのを制限する場合、圧力が低下する。細胞培養／細胞回収装置１００００の内容物の圧力が周囲環境に比べて低下しているにもかかわらず、周囲気体制限器１０１００により培養面１０００６が相対圧力不均衡を受けないようにする。周囲気体制限器１０１００は、細胞培養／細胞回収装置１００００に対して気密に接続する必要はないが、上端１００１２に向かって培養面が実質的に動かないように制限したい場合には好ましい。１つ以上の導管を用いて、前述のように細胞回収の前に培地容量を減らす作業を行うことができる。好ましくは、培養面支持体１００１８がある場合には、その中の気体を最小限に抑えるようにこれを設計する。
【００５４】
図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃには、細胞培養／細胞回収装置および方法の更に別の実施例を示している。この手法では、所定容量の気体を細胞培養／細胞回収装置へ注入する。この例示的実施例における注入した気体の吹き出し方は配置とするものの、当業者は、吹き出し部分が蛇腹状などのいかなる構造でも既知の容量の気体を分配できることを認識すべきである。図１３Ａに示すように、細胞培養／細胞回収装置１１０００を静止細胞培養状態で示しており、これは初期培地容量１１０２０Ａおよび細胞１１０１６を含むものとする。ピストン１１１００は、通気口フィルタ１１０２８を介して細胞培養／細胞回収装置１１０００に接続する。図３Ｂに示すように、廃培地を除去する際に、ピストンヘッド１１１５０は、細胞培養／細胞回収装置１１０００へある容量の気体を送るために第１の所定距離を移動する。当該容量の気体は、培地除去導管１１０１０から等量の培地を追いやり、この培地除去導管は廃液容器（明確にするのに図示はしない）に対して開放されている。この工程が完了すると、培地除去導管１１０１０を廃液容器に対して閉じ、残存培地容量１１０２０Ｂは、細胞１１０１６とともに細胞培養／細胞回収装置１１０００に残る。図１３Ｃに示すように、細胞１１０１６および残留培地１１０２０Ｂを除去するとき、細胞培養／細胞回収装置１１０００へ追加容量の気体を分配するためにピストン１１１００は第２の所定距離を移動し、それにより細胞１１０１６および残留培地容量１１０２０Ｂを、開放細胞除去導管１１００４を通して細胞回収容器（明確にするのに図示はしない）に追いやる。
【００５５】
当業者は、発明の趣旨を逸脱しない限り、本開示に対して多くの変更を行うことができることを認識するであろう。故に、本発明範囲を記載したり説明した実施例に限定する意図はない。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物により解釈されるべきである。本明細書で引用した各刊行物、特許、特許出願、および参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月16日(2019.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養装置から培地を除去し、細胞を濃縮するための装置であって、
気体透過性の細胞培養装置に接続されたフィルタに接続でき、フィルタを経由して気体を気体透過性の細胞培養装置内に送出することができ、細胞培養装置の内容物を加圧する働きをする気体送出部と、
気体透過性の細胞培養装置に接続された培地除去導管内を移動する流体が液体から気体へと変化したときを検出でき、培地除去導管を通る流体の流れを停止できる流体流動制御部へ信号を送ることができる流体検出部とを備え、
気体透過性の細胞培養装置が、気体透過性の底部の培養面と、気体透過性の底部から離れて配置される培地除去開口部を含む培地除去導管とを含み、培地除去開口部を気体透過性の底部から距離の異なる位置に移動させることができることを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置を使用する方法であって、
培地１ミリリットルあたりの細胞濃度を増大させるために、気体透過性の細胞培養装置に接続されたフィルタに気体送出部を接続することによって、細胞および培地を含む気体透過性の細胞培養装置内の液体培地の容量を減らすステップと、流体検出部を培地除去導管に接続するステップと、気体送出部からの気体の送出を開始するステップとを備え、
それによって気体が細胞培養装置内に移動し、その気体が細胞培養装置を加圧し、培地を細胞培養装置から培地除去開口を通じて培地除去導管に接続された細胞回収容器に移し、流体検出部が、気体透過性の細胞培養装置の底部から離れた位置にある培地除去導管を通って移動する流体が液体から気体に変化したときを検出し、その検出をするとすぐに流体検出部が流体流動制御部へと信号を送信し、流体流動制御部がその信号を受信するとすぐに培地除去導管を流れる流体の流れを停止させ、
気体透過性の培養装置の底部から培地除去開口部までの距離を小さくすることによって気体透過性の細胞培養装置から細胞を除去するステップと、気体送出部からの気体送出を開始するステップとを備え、
それによって気体が細胞培養装置内に移動し、細胞培養装置を加圧し、その気体が培地を細胞培養装置から培地除去導管に接続された細胞回収容器へと移し、流体検出部が、培地除去導管を通って移動する流体が液体から気体に変化したときを検出し、その検出をすると同時に、流体検出部が流体流動制御部に信号を送り、その信号を受け取るとすぐに、流体流動制御部が培地除去導管を流れる流体の流れを停止させることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、流体流動制御部が細胞除去導管を通る流体の流れを停止させた後、細胞培養装置が大気に通気されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、細胞培養装置が大気に通気された後、流体流動制御部が開かれて培地が培地除去導管を流れるようにし、培地が培地除去導管を通って細胞培養装置へと移動され、流体流動制御部が閉じられ、細胞培養装置内の培地が攪拌されて、細胞をその培地内に移動させることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、気体が気体送出部から細胞培養装置内に送出されて、細胞培養装置を加圧し、培地と細胞とを細胞培養装置から、培地除去導管に接続された細胞回収容器へと移し、流体検出部が、気体透過性の細胞培養装置の底部から離れた位置にある培地除去導管を通って移動する流体が液体から気体に変化したときを検出し、その検出をするとすぐに、流体検出部が流体流動制御部に信号を送り、流体流動制御部がその信号を受け取るとすぐに、流体流動制御部が培地除去導管を通る流体の流れを停止させることを特徴とする方法。
【請求項６】
細胞と培地とを含む気体透過性の細胞培養装置内の培地の体積を減らす方法であって、
細胞培養装置を加圧する働きをする気体送出部をフィルタに接続することによって、培地１ミリリットルあたりの細胞濃度を高めるために培地の体積を減らすステップと、気体送出部から気体を送出して気体の移動を開始するステップとを備え、
フィルタは、気体透過性の底部を有する細胞培養装置に接続され、細胞培養装置は培養面上に第１容量の培地と細胞を含み、細胞培養装置の底部から離れた位置にある培地除去開口部を有する培地除去導管を含み、
それらのステップによって気体を細胞培養装置に移動させ、細胞培養装置を加圧し、その気体が培地除去導管を経由して培地を細胞培養装置から培地回収容器へと移し、細胞培養装置内に残った培地と細胞の体積を残して、１ミリリットルあたりの細胞によって決定される残留体積内の細胞の濃度が、第１容量を培地の残留量で割った割合で増加することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項２または６に記載の方法であって、培地の容量を減らす前の、細胞培養装置の底部から培地除去開口部までの距離が１．０ｃｍ〜２５ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項２または６に記載の方法であって、培地の容量を減らす前の、細胞培養装置の底部から培地除去開口部までの距離が１．０ｃｍ〜２０ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項２または６に記載の方法であって、培地の容量を減らす前の、細胞培養装置の底部から培地除去開口部までの距離が１．０ｃｍ〜１５ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項２または６に記載の方法であって、培地の容量を減らす前の、細胞培養装置の底部から培地除去開口部までの距離が２．０ｃｍ〜１０ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項２または６に記載の方法であって、培養面が疎水性であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項２または６に記載の方法であって、培養面がシリコーンであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、シリコーンの厚さが０．０２５４ｍｍ（０．００１インチ）と０．６０９６ｍｍ（０．０２４インチ）の間の厚さであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項２または６に記載の方法であって、細胞が非接着性細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、細胞がＴ細胞を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、Ｔ細胞がＣＡＲ  Ｔ細胞を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の装置であって、気体送出部がダイアフラムポンプであることを特徴とする装置。
【請求項１８】
請求項２に記載の方法であって、培地除去開口部までの距離を小さくした後の、底部と培地除去開口部との間の距離が０．２０ｃｍ〜１．０ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。