(57)【要約】【課題】本発明は、精製技術による溶液の加工処理の結果として、その溶液から除去されるモックウイルス粒子（ＭＶＰ）の量を定量するための方法を提供すること。【解決手段】この方法は、ＭＶＰを溶液に添加する工程、精製技術によって上記溶液を加工処理する工程、上記溶液から除去されるＭＶＰの量を定量する工程を包含する。本発明はまた、上記方法とともに使用され得るキットに関する。このキットは、ＭＶＰの少なくとも１種のストック溶液および少なくとも１種の定量溶液を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の要旨）
本発明は、精製技術によって溶液を加工処理する結果として、その溶液から除去されるモックウイルス粒子（ＭＶＰ）の量を定量するための方法に関する。この方法は、ＭＶＰを溶液に添加する工程、上記溶液を精製技術によって加工処理する工程、および次いで、上記溶液から除去されるＭＶＰの量を定量する工程を包含する。本発明はまた、上記方法とともに使用され得るキットに関する。このキットは、好ましくは、ＭＶＰの少なくとも１種のストック溶液および少なくとも１種の定量溶液を含む。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
生物薬学的生成物（例えば、モノクローナル抗体、組換えタンパク質、ワクチン、血液派生物および動物生成物）は、感染性ウイルスを伝播するリスクがある（Ｂｕｒｎｏｕｆ，  ２００５；  Ａｒａｎｈａ，  ２０１１）。これは、生物薬学的製造のために使用される供給源物質に存在している内因性ウイルス、または製造の間に、生物薬剤含有溶液を汚染する外因性の「偶発的な」ウイルスのリスクのいずれかに起因する（Ｋｅｒｒ，  ２０１０）。結果として、生物薬学的生成物の製造者は、十分なウイルスクリアランス工程をそれらの製造プロセスの中に組み込むことおよびしっかりとしたウイルスクリアランスデータを提供することによってこれら工程を確証することを、国際監督機関によって要求されている（ＥＭＥＡ，  ２００８；  ＥＭＥＡ，  ２００８；  ＩＣＨ，  １９９７；  ＩＣＨ，  ９９８；  ＦＤＡ，  １９９７）。
【０００３】
ウイルスクリアランスを確証するために、ウイルス「添加研究（ｓｐｉｋｉｎｇ  ｓｔｕｄｙ）」は、生ウイルスが生物薬学的材料に添加され、スケールダウンされた精製プロセス工程が行われることによって、行われる（Ｄａｒｌｉｎｇ，  ２００２）。次いで、この工程のウイルスを減少させる能力は、感染性アッセイ（ＴＣＩＤ５０）もしくは定量的ポリメラーゼ連鎖反応法（Ｑ−ＰＣＲ）によって、溶液中に残っているウイルスを定量することによって分析される。これら結果は通常、生ウイルス粒子を増殖および定量するために必要とされる、専門家およびさらなる安全手段に起因して、第三者の契約研究機関によって行われる。結果として、これら研究は、極めて高価であり、論理主義的にも行うのが困難である。実際に、プロセス工程は、代表的には、ウイルス除去効力について評価される前に、数ヶ月もしくは数年にわたって開発される。この実務は、規制上のリスクを増大させる。なぜなら、監督機関が有効性確認研究を可能にする間に、最終的にウイルスを十分に除去できない可能性があるプロセス工程を開発して、時間および金銭が費やされるからである。従って、精製プロセス開発の間に、ウイルス除去効率を決定するための新しい改善された方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、精製技術によって溶液を加工処理する結果として、上記溶液から除去されるモックウイルス粒子（ＭＶＰ）の量を定量するための方法に関する。上記方法の工程は、以下を包含する；ＭＶＰを溶液に添加する工程、上記溶液を精製技術によって加工処理する工程、および上記溶液から除去されるＭＶＰの量を定量する工程。好ましい実施形態において、上記ＭＶＰが添加される溶液は、目的の生物物質を含む。さらにより好ましい実施形態において、上記目的の生物物質は、抗体、非抗体タンパク質、ワクチン、核酸生成物、血液もしくは血漿派生物である。別のさらにより好ましい実施形態において、上記目的の生物物質は、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、ハイブリドーマ細胞、酵母細胞、または細菌細胞を利用する、細胞培養プロセスまたは発酵プロセスによって生成される。別のさらにより好ましい実施形態において、上記溶液に存在する目的の生物物質は、上記精製技術によるその溶液の加工処理によって精製される。
【０００５】
別の好ましい実施形態において、上記ＭＶＰを含む溶液を加工処理する精製技術は、クロマトグラフィー、濾過、限外濾過、遠心分離、もしくはウイルス不活性化技術である。別の好ましい実施形態において、精製技術によって溶液を加工処理する前に、その溶液に添加されるＭＶＰの量は、加工処理後に残っている溶液中のＭＶＰの量より多い。
【０００６】
好ましい実施形態において、ＭＶＰは、ウイルスキャプシドタンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、またはウイルスキャプシドおよびウイルスエンベロープタンパク質の両方を含む。さらにより好ましい実施形態において、上記ウイルスキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質は、細菌、酵母、植物、昆虫、および／もしくは動物の細胞ならびに／またはヒト細胞によって生成される。別のさらにより好ましい実施形態において、上記ウイルスキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質は、ＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅもしくはＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ供給源に由来する。別のさらにより好ましい実施形態において、上記ウイルスキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質は、異種エピトープを含む。別のさらにより好ましい実施形態において、ＭＶＰは、インビトロ核酸を含む。
【０００７】
好ましい実施形態において、上記溶液から除去されるＭＶＰの量を定量する工程は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ナノ画像化法、蛍光法、酵素法、顕微鏡法、分光光度法、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）法、またはウェスタンブロット法を含む、溶液中のＭＶＰの量を決定するための定量技術の使用を包含する。さらにより好ましい実施形態において、上記定量技術は、キャプシドタンパク質エピトープ、エンベロープタンパク質エピトープ、もしくは上記ＭＶＰの表面に存在する異種エピトープに結合し得る抗体を使用する。別のさらにより好ましい実施形態において、上記定量技術は、上記ＭＶＰに結合されるリンカー分子に結合し得る抗体を使用する。別のさらにより好ましい実施形態において、上記定量技術は、上記ＭＶＰに結合される分子および上記分子に結合し得る抗体もしくは上記分子に結合される核酸セグメントに結合し得るプライマーを使用する。別のさらにより好ましい実施形態において、上記定量技術は、上記ＭＶＰ内に含まれるインビトロ核酸配列に結合し得るプライマーを使用する。
【０００８】
本発明は、ＭＶＰが溶液に添加され、上記溶液が精製技術によって加工処理され、上記溶液から除去されるＭＶＰの量が定量されることによる方法に関する。好ましい実施形態において、ＭＶＰの第２の種は、上記溶液に添加される。上記溶液は、精製技術によって加工処理され、上記溶液から除去される上記ＭＶＰの第２の種の量が定量される。さらにより好ましい実施形態において、上記ＭＶＰの第１のおよび第２の種は、同時にもしくは逐次的に、溶液に添加される。別のさらにより好ましい実施形態において、ＭＶＰの２種以上のさらなる種が、上記溶液に添加される。
【０００９】
本発明はまた、ＭＶＰのストック溶液を含む少なくとも１個の容器、および定量溶液を含む少なくとも１個の容器を含むキットに関する。好ましい実施形態において、上記定量溶液は、ＭＶＰに、またはＭＶＰに結合され得る分子に結合し得る抗体を含む。さらにより好ましい実施形態において、上記キットは、ＭＶＰに、またはＭＶＰに結合され得る分子に結合し得る上記抗体に結合し得る第２の抗体の溶液をさらに含む。別のさらにより好ましい実施形態において、上記ＭＶＰに結合し得る抗体は、酵素に結合体化される。別のさらにより好ましい実施形態において、ＭＶＰまたはＭＶＰに結合し得る分子に結合し得る上記抗体に結合し得る上記第２の抗体は、酵素に結合体化される。別の好ましい実施形態において、上記キットは、固定化抗体またはＭＶＰに結合し得る分子を含むＥＬＩＳＡプレートをさらに含む。別の好ましい実施形態において、上記定量溶液は、インビトロ核酸配列もしくはＭＶＰに結合され得る分子に結合される核酸のセグメントに結合し得るプライマーを含む。別の好ましい実施形態において、上記キットは、ＭＶＰに結合し得る分子の溶液を含む別の容器を含む。別の好ましい実施形態において、上記キットはまた、ＥＬＩＳＡ法もしくはＰＣＲ法を行うためのさらなる試薬を含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
溶液から除去されるＭＶＰの量を定量するための方法であって、ここで該方法は、
ａ）ＭＶＰを溶液に添加する工程；
ｂ）精製技術によって該溶液を加工処理する工程；および
ｃ）該溶液から除去されるＭＶＰの量を定量する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
工程（ａ）において、前記溶液は、目的の生物物質を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記目的の生物物質は、抗体、非抗体タンパク質、ワクチン、核酸生成物、および血液もしくは血漿派生物である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記目的の生物物質は、プロセスによって生成され、ここで該プロセスは、細胞培養プロセスもしくは発酵プロセスのいずれかであり、該プロセスは、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、ハイブリドーマ細胞、酵母細胞、もしくは細菌細胞を利用する、項目２または３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記目的の生物物質は、項目１の工程（ｂ）によって精製される、項目２〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記精製技術は、クロマトグラフィー、濾過、限外濾過、遠心分離、もしくはウイルス不活性化技術である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
工程（ａ）において、前記溶液中のＭＶＰの量は、工程（ｂ）の後の溶液中のＭＶＰの量より多い、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記ＭＶＰは、ウイルスキャプシドタンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、またはウイルスキャプシドタンパク質およびウイルスエンベロープタンパク質の両方を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記ウイルスキャプシドタンパク質もしくはウイルスエンベロープタンパク質は、細菌、酵母、植物、昆虫細胞、動物もしくはヒト細胞で生成される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ウイルスキャプシドタンパク質もしくはウイルスエンベロープタンパク質は、ＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅもしくはＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅの供給源に由来する、項目８または９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記ウイルスキャプシドタンパク質もしくはウイルスエンベロープタンパク質は、異種エピトープをさらに含む、項目８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記ＭＶＰは、インビトロ核酸を含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
溶液から除去されるＭＶＰの量を定量する工程は、ＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ法、ナノ画像化法、蛍光法、酵素法、顕微鏡法、分光光度法、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）法、もしくはウェスタンブロット分析法を含む、溶液中のＭＶＰの量を決定するための定量技術の使用を包含する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記定量技術は、キャプシドタンパク質エピトープ、エンベロープタンパク質エピトープもしくは前記ＭＶＰの表面に存在する異種エピトープに結合し得る抗体を使用する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記定量技術は、前記ＭＶＰに結合したリンカー分子に結合し得る抗体を使用する、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記定量技術は、前記ＭＶＰに結合した分子および該分子に結合し得る抗体もしくは該分子に結合される核酸セグメントに結合し得るプライマーを使用する、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記定量技術は、前記ＭＶＰ内に含まれるインビトロ核酸配列に結合し得るプライマーを使用する、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記方法は、
ａ）ＭＶＰの第２の種を前記溶液に添加する工程；
ｂ）該溶液を精製技術によって加工処理する工程；および
ｃ）該溶液から除去される該ＭＶＰの第２の種の量を定量する工程、
をさらに包含する、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記ＭＶＰの第１の種および前記ＭＶＰの第２の種は、同時にもしくは逐次的に、前記溶液に添加される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
ＭＶＰの２種以上のさらなる種は、前記溶液に添加される、項目１８または１９のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
ａ）ＭＶＰのストック溶液を含む少なくとも１個の容器；
ｂ）定量溶液を含む少なくとも１個の容器、
を含む、キット。
（項目２２）
前記定量溶液は、ＭＶＰに、またはＭＶＰに結合され得る分子に結合し得る抗体を含む、項目２１に記載のキット。
（項目２３）
前記キットは、ＭＶＰに、またはＭＶＰに結合され得る分子に結合し得る前記抗体に結合し得る第２の抗体の溶液をさらに含む、項目２１または２２のいずれかに記載のキット。
（項目２４）
前記抗体は、酵素と結合体化される、項目２１または２２のいずれかに記載のキット。（項目２５）
前記第２の抗体は、酵素と結合体化される、項目２３に記載のキット。
（項目２６）
前記キットは、ＭＶＰに結合し得る固定化された抗体または分子を含むＥＬＩＳＡプレートをさらに含む、項目２１〜２５のいずれか１項に記載のキット。
（項目２７）
前記定量溶液は、インビトロ核酸配列またはＭＶＰに結合され得る分子に結合した核酸のセグメントに結合し得るプライマーを含む、項目２１〜２６のいずれか１項に記載のキット。
（項目２８）
前記キットは、ＭＶＰに結合し得る分子の溶液をさらに含む、項目２１〜２７のいずれか１項に記載のキット。
（項目２９）
ＥＬＩＳＡ法もしくはＰＣＲ法を行うためのさらなる試薬が前記キット中に含まれる、項目２１〜２８のいずれか１項に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
実施形態は、例示によって示されるのであって、添付の図面の図中の限定によって示されるのではない。ここで類似の参照は、類似の要素を示す。
【００１１】
【図１】図１：ＭＭＶ  ＭＶＰ画分の純度。
【００１２】
【図２】図２：ＭＭＶ  ＭＶＰストック溶液の透過型電子顕微鏡画像。
【００１３】
【図３】図３：異種エピトープＭＭＶ  ＭＶＰ画分の純度。
【００１４】
【図４】図４：異種エピトープＭＭＶ  ＭＶＰストック溶液の透過型電子顕微鏡画像。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）  ＭＶＰを、実施例１および実施例２において言及される方法によって精製した。塩化セシウム密度勾配画分の純度を決定するために、各密度画分由来のサンプル（レーン１〜１３）を還元し、４−１２％  ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。タンパク質バンドを、クーマシーブルー染色によって可視化した。ＶＰ２タンパク質標準（ａｌｐｈａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃａｔ＃  ＭＶＭＶＰ２５−Ｒ−１０）を、比較のためにレーン「Ｓ」の中で泳動し（ＶＰ２タンパク質は、６４ＫＤａと推測される）、分子量マーカータンパク質をレーン「Ｍ」の中で泳動した。図１において、天然のＶＰ２タンパク質形成から生じるＭＶＰを分析した。画分１１〜１３をプールして、ＭＶＰストック溶液を形成した。染色結果に基づけば、上記プールしたストック溶液は、純度＞９５％のＭＶＰを含んだ。図３において、組換えＶＰ２タンパク質形成から生じるＭＶＰを分析した。画分１１〜１３をプールして、ＭＶＰストック溶液を形成した。染色結果に基づけば、上記プールしたストック溶液は、純度約９０％のＭＶＰを含んだ。
【００１６】
ＭＭＶ  ＭＶＰストック溶液を、実施例１および実施例２に記載される方法によって生成した。図２において、ＴＥＭ画像は、天然の（非改変）ＶＰ２タンパク質の６０コピーのアセンブリから生じるＭＭＶ  ＭＶＰストック溶液のものを撮影した。図４において、ＴＥＭ画像は、組換えＶＰ２タンパク質の６０コピー（各々は、異種エピトープ（ｓｔｒｅｐ  ＩＩタグアミノ酸配列）を含む）のアセンブリから生じるＭＭＶ  ＭＶＰストック溶液のものを撮影した。画像をネガティブ染色した後に取り込んだ。各ストック溶液の２マイクロリットルを、別個のｆｏｒｍｖａｒ／ｃａｒｂｏｎ被覆電子顕微鏡グリッドの上に置き、風乾させた。１０分後、残りの材料を、上記グリッドから逃がした。次いで、上記グリッドを固定し、２０マイクロリットルの２．０％  リンタングステン酸（ＰＴＡ）、ｐＨ７．０を各グリッドの上に１分間置くことによって染色した。次いで、過剰のＰＴＡを除去し、倍率１６５，０００×でＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｓｐｉｒｉｔ  Ｔｗｉｎ顕微鏡を使用して、上記グリッドを調べ、定量および撮影した。結果は、ストック溶液１ｍｌあたり３．０６×１０１３個のＭＭＶ  ＭＶＰ（図２）およびストック溶液１ｍｌあたり３．５６×１０１３個の異種エピトープＭＭＶ  ＭＶＰ（図４）の濃度を示す。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明において、用語「モックウイルス粒子（ＭＶＰ）」とは、合成的に生成され（例えば、組換え発現されたかもしくは化学合成された）ウイルスキャプシドタンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、またはウイルスキャプシドタンパク質およびエンベロープタンパク質から構成される、非感染性で非複製性のアセンブリされたユニットをいう。ＭＶＰは、天然において見出されるウイルス粒子（生ウイルス粒子、天然では感染する能力が失われた天然に見出されるウイルス粒子、もしくはインビトロで感染する能力を失ったウイルス粒子（例えば、「紫外線照射された」か、「熱で死滅させた」か、または「熱不活性化」されたウイルス粒子）が挙げられるが、これらに限定されない）には言及しない。従って、ＭＶＰの合成的性質は、当該分野で使用されるウイルス粒子の他の形態と比較して、それらが産業的状況において容易に生成および使用される能力を提供する。用語「ウイルスキャプシドタンパク質」とは、そのゲノムの周りに殻を含む任意のウイルスのタンパク質をいう。用語「ウイルスエンベロープタンパク質」とは、キャプシドタンパク質の殻を覆い、ウイルスの外側の層の一部になる任意のウイルスタンパク質をいう。ある種のウイルスキャプシドタンパク質およびエンベロープタンパク質は、具体的なウイルス分類学上の科内のウイルスに一般的にあることが公知である。ＭＶＰは、これらウイルスの科内に由来する特定のウイルスに生理化学的に似たユニットを生じるそれらの科のキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質から生成され得る。しかし、アセンブリされたＭＶＰユニットは、これらウイルスに対する遺伝的類似性を欠く（ＭＶＰは、いかなる核酸をも含む可能性がない）。主要なウイルスキャプシドタンパク質およびエンベロープタンパク質の例（当該分野でいわれるこれらタンパク質の共通名）およびそれらの関連づけられるウイルスの科は、それらタンパク質のうちの１種以上からアセンブリされ得る例示的なＭＶＰとともに、以下の表１に列挙される（Ｆａｕｑｕｅｔ  ｅｔ．  ａｌ，  ２００５）。
【表１−１】
2019195333.tif 000002
【表１−２】
2019195333.tif 000003
【００１８】
本発明において、ＭＶＰユニットは、インビトロでのウイルスキャプシドタンパク質もしくはウイルスエンベロープタンパク質の組換え発現もしくは化学合成の結果としてアセンブリされる。好ましくは、アセンブリしてＭＶＰを形成するウイルスキャプシドタンパク質およびエンベロープタンパク質は、天然に存在するウイルスタンパク質核酸配列の発現生成物である。あるいは、それらは、インビトロで変化、もしくは改変されたウイルスタンパク質核酸配列の発現生成物である。本発明において、変化もしくは改変した核酸配列の発現の結果としての変化もしくは改変したアミノ酸配列から構成されるタンパク質生成物は、「組換え」タンパク質といわれる。天然に存在するウイルスタンパク質核酸配列を変化もしくは改変して、組換えウイルスキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質を発現させるという行為は、当該分野で周知である（例えば、Ｇｉｌｌｏｃｋ，
１９９８を参照のこと）。好ましくは、組換えＭＶＰキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質は、標準的なタンパク質ベースのＢＬＡＳＴ相同性検索によれば、それらの天然のウイルスタンパク質源に９９．９％以上相同である。あるいは、ＭＶＰの組換えキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質は、標準的なＢＬＡＳＴ相同性検索によれば、それらの天然のキャプシドタンパク質および／もしくはエンベロープタンパク質源に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である。
【００１９】
好ましくは、アセンブリしてＭＶＰを形成するウイルスキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、もしくはヒト細胞においてそれらの遺伝子を発現させることによって生成される。ＭＶＰをアセンブリする代わりにこれらタンパク質を生成するという行為は、一般に、当該分野で公知である（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ  ２０１１を参照のこと）。例えば、天然のもしくは改変されたウイルス核酸タンパク質配列は、発現ベクターへと最初にクローニングされる。好ましくは、発現ベクターは、酵母ベースの発現ベクター、細菌ベースの発現ベクター、バキュロウイルスベースの発現ベクター、および／もしくは哺乳動物ベースの発現ベクター、および／もしくは植物ベースの発現ベクターである。次いで、上記発現ベクターは、細胞へとトランスフェクトさせられる。好ましくは、トランスフェクトされ得る細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳動物細胞および／もしくはヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、天然もしくは組換えのウイルスキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質の発現後に、上記タンパク質は、ＭＶＰへと自発的にアセンブリする。あるいは、ＭＶＰのアセンブリは、自発的には起こらない。これらの場合、そのアセンブリされないタンパク質を含有する溶液は、ＭＶＰアセンブリの発生を増大させるように、化学物質および／もしくはタンパク質で処理され得る。あるいは、そのアセンブリされないタンパク質を含有する溶液は、溶液中の他の分子に対して溶液中のキャプシドタンパク質および／もしくはエンベロープタンパク質の量を増大させるために精製される。
【００２０】
好ましくは、アセンブリされてＭＶＰを形成するウイルスキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質を生成するために発現される核酸配列は、ＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅもしくはＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅゲノム源に由来する。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ由来核酸配列源の例としては、マウスの微小ウイルス（マウス微小ウイルス）、イヌパルボウイルス、ネコパルボウイルス、ブタパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、アデノ随伴ウイルス１、Ｊｕｎｏｎｉａ  ｃｏｅｎｉａデンソウイルス、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ウイルス、およびネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）デンソウイルスのゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。これらゲノムから生成およびアセンブリされて、ＭＶＰを形成し得るウイルスキャプシドタンパク質の例としては、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、もしくはＶＰ４タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ由来核酸タンパク質配列源の例としては、以下のゲノムが挙げられるが、これらに限定されない：トリ赤芽球症ウイルス、トリ白血病ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリ肉腫ウイルス、トリ骨髄球腫症ウイルス、Ｅｓｈ肉腫ウイルス、藤浪肉腫ウイルス、キンケイウイルス、誘発性白血病ウイルス、リンパ性白血病ウイルス、骨髄芽球症随伴ウイルス、骨髄球腫症ウイルス、ラウス随伴ウイルス、コウライキジウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ＮＫ−２４、ＳＫＶ、ヒヒ内在性ウイルス、ＢＥＶ、ＣＣＣ、ＣＥＲＶ−ＣＩ、ＣＰＣ４、コーンスネークレトロウイルス、ニワトリ合胞体ウイルス、アヒル伝染性貧血ウイルス、シカ腎臓ウイルス、ＤＰＣ４、ウマ皮膚線維肉腫ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ＦｅＬＶ−ＡＩＤＳ、ネコ肉腫ウイルス、Ｆｒ−ＭＬＶ、Ｆｒ−ＳＦＦＶ、ＦＳ−１、テナガザル白血病ウイルス、ハムスター白血病ウイルス、リンパ増殖性疾患ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、ＭＡＩＤＳ、ＭＤＥＶ、ミンク白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ＭＭＣＡ、マウス肉腫ウイルス、骨髄性白血病ウイルス、ＯＭＣＡ、ＰＫ−１Ｓ、Ｒ−３５、ＲａｄＬＶ、ラット白血病ウイルス、Ｒａ−ＭＣＦ、Ｒａ−ＭＬＶ、Ｒａ−ＳＦＦＶ、ラット肉腫ウイルス、ＲＤＬ１４、細胞内皮症随伴ウイルス、脾臓フォーカス形成ウイルス、サル肉腫ウイルス、サルリンパ腫ウイルス、サル骨髄性白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、サル肉腫随伴ウイルス、サル肉腫ウイルス、ＴＲＶ４、Ｖａｎｄ  Ｃ−Ｉ、バイパーレトロウイルス（Ｖｉｐｅｒ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、ウーリーサルウイルス、ウーリーサル白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ＢｏＬＶ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、サルＴ細胞白血病ウイルス、ＳＴＬＶｐａｎ−ｐ、ウシ合胞体ウイルス、ネコ合胞体形成ウイルス、ヒトフォーミーウイルス、サルフォーミーウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ヤギ白質脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ジェンブラナ（Ｊｅｍｂｒａｎａ）、マエディー／ビスナウイルス、進行性肺炎ウイルス、サル免疫不全ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、Ｍ４３２、Ｍ８３２、ＭＮＶ、マソン・ファイザーサル��イルス、ＰＭＦＶ、Ｐ０−１−Ｌｕ、リスザルレトロウイルス、サルレトロウイルス、ヤーグジークテレトロウイルス、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス、ウォールアイ皮膚過形成ウイルス、およびＧｙｐｓｙゲノム。これらＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅゲノムから生成およびアセンブリされて、ＭＶＰを形成し得るウイルスキャプシドタンパク質およびエンベロープタンパク質の例としては、ｇａｇタンパク質（ＭＡ、ＣＡ、ＮＣ）、ｅｎｖタンパク質（ＳＵ、ＴＭ、ＬＰ）、およびＳａｇタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。さらにより好ましくは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ由来タンパク質源としては、哺乳動物細胞の内在性レトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子に由来するゲノム配列が挙げられる。哺乳動物細胞の内在性レトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マウス白血病ウイルス（Ａｂ、ＡＫＴ８、Ｃａｓ−Ｂｒ−Ｅ、Ｄｕ５Ｈ  ＭＡＩＤＳ、ＦＭＣＦ−９８、Ｆｒ、Ｇｒａｆｆｉ、Ｇｒｏｓｓ、ＬＰ−ＢＭ５、Ｋｉ、Ｍｏ、ＭＰＬＶ、ＮＴ４０、ＰＶＣ−２１１、Ｒａ、ＲａｄＬＶ、ＳＬ３−３、ＴＲＩ−３、ＸＭｕＬＶ）および嚢内Ａ粒子(Ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ  Ａ  ｔｙｐｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）。内在性レトロウイルスもしくはレトロウイルス様粒子を含み得る哺乳動物細胞の例としては、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＮＳ−１細胞、Ｓｐ２０Ａｇ１４細胞、ＭＨ細胞、ＢＨＫ細胞、およびＲＨ細胞が挙げられる。
【００２１】
好ましくは、ウイルスキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質は、アセンブリされて、エピトープをその表面に示すＭＶＰを形成する。本発明において、「エピトープ」は、ＭＶＰの外部表面に示されるアミノ酸の特定の配列である。エピトープは、感染性もしくは非感染性のウイルス粒子除去を定量する分野に一般的な、感染性アッセイ、ＱＰＣＲ、もしくは他の扱いづらくかつ高価な方法の必要性なく、溶液中に存在するＭＶＰの量（従って、溶液からのそれらの除去）を定量するために利用され得る。いくつかの場合には、組換えウイルスキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質は、アセンブリされて、ＭＶＰを形成する。これらの場合に、上記ＭＶＰは、その表面に異種エピトープを示し得る。本発明において、「異種エピトープ」とは、組換えキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質の発現から生じるエピトープをいう。同様に、ＭＶＰは、組換えタンパク質からアセンブリされる場合に、異種エピトープを含み得る。異種エピトープの例としては、ｓｔｒｅｐタグ（例えば、アミノ酸配列  ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１））、ｆｌａｇタグ（例えば、アミノ酸配列  ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２））およびＨｉｓタグ（例えば、アミノ酸配列  ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３））が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、エピトープもしくは異種エピトープの１コピーが、そのＭＶＰのタンパク質ユニットあたりで存在し得る。あるいは、エピトープもしくは異種エピトープの複数コピーが、そのＭＶＰのタンパク質ユニットあたりで存在し得る。異種エピトープは、定量法の感度を増強し得、感染性アッセイ、ＱＰＣＲアッセイもしくは当該分野で現在一般的な他のアッセイに関した達成可能であるものを上回るレベルまで溶液中のＭＶＰの量を決定するために使用され得る。
【００２２】
好ましくは、ＭＶＰは、いかなる核酸をも含まない。あるいは、ＭＶＰは、インビトロ核酸のセグメントを含み得る。本発明において、「インビトロ核酸のセグメント」とは、ＭＶＰ溶液に意図的に導入される核酸の特定の配列をいう。なぜなら上記粒子が、得られるＭＶＰがその配列のコピーを保持するようにアセンブリされているからである。従って、当該分野で公知の全ての他の粒子とは異なり、ＭＶＰは、溶液中でのそれらの量を定量することに関して、ウイルスゲノムの遺伝性の遺伝子材料に拠らない。本発明において、用語「遺伝性の遺伝子材料」とは、複製性もしくは複製欠損のウイルス粒子に存在する全ての天然に被包された核酸をいう。例えば、当該分野において、感染性ウイルス粒子の定量は、感染性（天然に被包されたゲノム核酸発現の結果）もしくはＱＰＣＲ（それらの天然に被包されたゲノム核酸に対するプライマーを利用する）の測定のいずれかを要する（Ｓｈｉ，  ２００４）。同様に、当該分野では、非複製性内在性レトロウイルス様粒子の定量は、天然に被包されたゲノム核酸に対するプライマーを利用するＱＰＣＲ、もしくはウイルス逆転写酵素活性を測定する定量的生成物増強逆転写酵素（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（Ｑ−ＰＥＲＴ）を要する（Ｚｈａｎｇ，  ２００８）。好ましくは、インビトロ核酸のセグメントは、核酸の合成由来配列をいい得る。あるいは、インビトロ核酸のセグメントは、天然に由来する配列であり得る。好ましくは、天然に由来するの場合には、上記配列の長さは、上記配列が由来した生物のゲノムの約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約２５％、約３０％以下、約４０％以下、約５０％、約６０％以下、約７０％以下、約７５％以下、約９０％以下、約９５％以下、もしくは約９９％以下である。インビトロ核酸の量は、当該分野で一般的な方法によって測定される場合、ＭＶＰの複製もしくは感染を可能にするには十分でない。感染性を測定するために当該分野で一般に使用される方法の一例は、ＴＣＩＤ５０である。従って、当該分野に一般的な他のウイルス粒子とは異なり、ＭＶＰは、感染性であるかもしくは感染性になるリスクは全く有しない。いくつかの場合に、インビトロ核酸セグメントは、ウイルス源由来であり得る。他の場合に、インビトロ核酸は、非ウイルス源由来であり得る。インビトロ核酸源の例としては、ウイルス、細菌、酵母、昆虫、動物、および／もしくはヒトが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、インビトロ核酸がウイルス源に由来する場合に、上記ウイルス源は、上記ＭＶＰのキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質が由来したものと同じ供給源であり得る。あるいは、インビトロ核酸がウイルス源に由来する場合に、上記ウイルス源は、上記ＭＶＰのキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質が由来した供給源とは異なり得る。さらにより好ましくは、いずれの場合にも、上記インビトロ核酸セグメントの５’末端および３’末端は、上記配列が由来した天然のウイルスゲノムに存在しない特有の配列を含み得る。
【００２３】
好ましくは、アセンブリ後に、上記ＭＶＰは、当該分野で公知の方法を使用して精製され得る（Ｈｅｒｎａｎｄｏ，  ２０００）。さらに、精製後のそのアセンブリ溶液中のＭＶＰの純度は、溶液中の全てのタンパク質のうちの６５％未満が非ＭＶＰ関連である、溶液中の全てのタンパク質のうちの５５％未満が非ＭＶＰ関連である、溶液中の全てのタンパク質のうちの４５％未満が非ＭＶＰ関連である、溶液中の全てのタンパク質のうちの３５％未満が非ＭＶＰ関連である、溶液中の全てのタンパク質のうちの２５％未満が非ＭＶＰ関連である、溶液中の全てのタンパク質のうちの１５％未満が非ＭＶＰ関連である、溶液中の全てのタンパク質のうちの５％未満が非ＭＶＰ関連であるような純度であり得る。本発明において、用語「非ＭＶＰ関連［タンパク質］」とは、ＭＶＰを形成するようにアセンブリしない全ての非キャプシドタンパク質および／もしくは非エンベロープタンパク質をいう。ＭＶＰを精製するための方法の一例は、スクロース密度勾配である。別の例は、遠心分離である。別の例は、クロマトグラフィーである。ストック溶液中のＭＶＰの純度は、当該分野で一般的な方法（ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、高圧液体クロマトグラフィー、質量分析、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、動的光散乱、ゲル濾過、もしくは超遠心分離が挙げられるが、これらに限定されない）によって決定され得る。いくつかの場合には、アセンブリ後に、ＭＶＰは、得られたＭＶＰがリンカー分子をその表面に結合させるように、そのリンカー分子に導入され得、これ対して反応させられ得る。本発明において、用語「リンカー分子」とは、別の分子に共有結合もしくはイオン結合され得る合成ポリマーもしくは天然ポリマー（例えば、タンパク質）をいう。
【００２４】
先に記載されるように、ＭＶＰは、ウイルスキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質からアセンブリされる。本発明において、ＭＶＰは、それらのウイルスタンパク質源に従ってそのように表示される。例えば、上記マウス微小ウイルスのＶＰ２タンパク質（もしくは上記ＶＰ２タンパク質の組換えバージョン）からアセンブリされるＭＶＰは、「ＭＭＶ  ＭＶＰ」といわれる。別の例は、異種指向性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）のｅｎｖタンパク質および／もしくはｇａｇタンパク質（またはｅｎｖタンパク質および／もしくはｇａｇタンパク質の組換えバージョン）からアセンブリされるＭＶＰを「ＸＭｕＬＶ  ＭＶＰ」という。本発明において、ＭＶＰは、ＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅもしくはＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ核酸源から生成される天然のもしくは組換えのウイルスタンパク質から好ましくは構成される。あるいは、ＭＶＰは、他のウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｙｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｄａｅ、Ｐｉｃｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、および／もしくはＰｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅが挙げられるが、これらに限定されない）の核酸源から生成されるウイルスタンパク質から構成される。好ましくは、ＭＶＰは、１つのウイルス源に由来するタンパク質からアセンブリされる。１つのウイルス源からアセンブリされるＭＶＰの例は、天然もしくは組換えのＭＭＶ  ＶＰ２キャプシドタンパク質からアセンブリされるＭＭＶ  ＭＶＰである。あるいは、ＭＶＰは、複数のウイルス源に由来するタンパク質からアセンブリされ得る。１つより多くのウイルスタンパク質源からアセンブリされるＭＶＰの例は、天然もしくは組換えのＸＭｕＬＶ  ｇａｇタンパク質および天然もしくは組換えのＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質からアセンブリされるＸＭｕＬＶ  ＭＶＰである。
【００２５】
本発明において、用語「ＭＶＰの種」とは、同じタンパク質から構成され、それらのタンパク質の同じコピー数を有する全てのＭＶＰに言及する。例えば、ＭＶＰの種は、上記ＭＭＶ  ＶＰ２タンパク質の６０コピーを含む全てのＭＶＰである。ＭＶＰの種のさらに好ましい定義において、タンパク質の組換え形態は、これが由来した天然のタンパク質と同じと考えられるべきである。例えば、組換えＭＭＶ  ＶＰ２タンパク質の６０コピーを含むＭＶＰは、天然に由来するＭＭＶ  ＶＰ２タンパク質の６０コピーを含むＭＶＰと同じ種である。
【００２６】
好ましくは、ＭＶＰを溶液に添加するという行為は、ＭＶＰの１つの種のみを溶液に添加することをいう。あるいは、ＭＶＰを溶液に添加するという行為は、ＭＶＰの第２の種を溶液に添加することをいう。好ましくは、これらの場合に、ＭＶＰの上記第１の種および第２の種は、同時に溶液に添加される。あるいは、これらの場合に、ＭＶＰの上記第１の種および第２の種は、逐次的に添加される。ＭＶＰの２種を溶液に逐次的に添加する一例は、ＭＭＶ  ＭＶＰを溶液に第１に添加し、次いで、ＸＭｕＬＶ  ＭＶＰをその同じ溶液に第２に添加することである。ＭＶＰの２種を溶液に同時に添加する例は、ＭＭＶ  ＭＶＰおよびＸＭｕＬＶ  ＭＶＰの両方を含む溶液を別の溶液に添加することである。他の場合には、ＭＶＰを溶液に添加するという行為は、ＭＶＰの２以上の種を溶液に添加することをいう。
【００２７】
好ましくは、ＭＶＰを溶液に添加することは、ＭＶＰの特定の種を含む溶液のある体積を、ＭＶＰのその特定の種を含まない別の溶液に添加することをいう。本発明において、ＭＶＰの特定の種が溶液に添加されるまでＭＶＰのその種を含まない上記溶液は、「プロセス溶液」といわれる。例えば、ＭＭＶ  ＭＶＰの溶液は、ＭＭＶ  ＭＶＰを未だ含まないＣＨＯ細胞上清プロセス溶液に添加される。別の例では、ＸＭｕＬＶ  ＭＶＰの溶液は、ＭＭＶ  ＭＶＰを含むが、ＸＭｕＬＶ  ＭＶＰを未だ含まないＣＨＯ細胞上清プロセス溶液に添加される。本発明において、上記プロセス溶液に添加されるＭＶＰを含む溶液は、「ＭＶＰのストック溶液」、もしくは「ＭＶＰストック溶液」といわれ得る。好ましくは、当該分野に一般的な非感染性粒子のストック溶液とは異なり、ＭＶＰのストック溶液は、ＭＶＰの既知の濃度を有する。例えば、本発明のキット実施形態内に含まれるＭＶＰのストック溶液は、ＭＶＰ濃度情報を含む。さらに、ＭＶＰのストック溶液は、当該分野に一般的な他の非感染性粒子より高い濃度のＭＶＰを有する。例えば、ストック溶液中のＭＶＰは、少なくとも１×１０５  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０６  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０７  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０８  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０９  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１０  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１１  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１２  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１３  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１４  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１５  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１６  ＭＶＰ／ｍｌ以上の濃度で存在し得る。さらに、ＭＶＰストック溶液は、当該分野に一般的な他の非感染性粒子より高い純度でＭＶＰを含む。例えば、ＭＶＰのストック溶液中の非ＭＶＰ関連タンパク質は、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの６５％未満、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの５５％未満、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの４５％未満、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの３５％未満、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの２５％未満、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの１５％未満、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの５％未満であり得る。ストック溶液中のＭＶＰの純度は、当該分野に共通の方法（ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、高圧液体クロマトグラフィー、質量分析、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、動的光散乱、ゲル濾過、もしくは超遠心分離が挙げられるが、これらに限定されない）によって決定され得る。ＭＶＰのストック溶液を生成する例は、実施例の節に記載される。好ましくは、ＭＶＰのストック溶液は、ＭＶＰの１種を含む。ＭＶＰの１種を含むＭＶＰストック溶液の一例は、ＭＭＶ  ＭＶＰを含むＭＶＰストック溶液である。あるいは、ＭＶＰのストック溶液は、ＭＶＰの複数の種を含み得る。ＭＶＰの複数の種を含むＭＶＰストック溶液の一例は、ＭＭＶ  ＭＶＰおよびＸＭｕＬＶ  ＭＶＰを含むストック溶液である。
【００２８】
プロセス溶液に添加されるＭＶＰストック溶液の量は、いくつかの要因（プロセス溶液の体積、添加後の上記プロセス溶液中のＭＶＰストック溶液の所望のパーセント（ｖ／ｖ）、および上記ＭＶＰストック溶液中のＭＶＰの濃度が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して変動する。好ましくは、ＭＶＰストック溶液添加の体積は、ほぼミリリットルもしくはマイクロリットル程度であり得る。例えば、上記添加の体積は、約１００マイクロリットル以下、約２００マイクロリットル以下、約５００マイクロリットル以下、約１ミリリットル以下、約２ミリリットル以下、約５ミリリットル以下、約１０ミリリットル以下、約１００ミリリットル以下、もしくは約１０００ミリリットル以下であり得る。あるいは、上記添加の体積は、リットルであり得る。例えば、上記添加の体積は、約１リットル以下、約２リットル以下、約５リットル以下、もしくは約１０リットル以下であり得る。好ましくは、添加後に、プロセス溶液内のＭＶＰストック溶液のパーセントは、約１％（ｖ／ｖ）以下、約２％（ｖ／ｖ）以下、約３％（ｖ／ｖ）以下、約４％（ｖ／ｖ）以下、約５％（ｖ／ｖ）以下、約１０％（ｖ／ｖ）以下、約２５％（ｖ／ｖ）以下、もしくは約５０％（ｖ／ｖ）以下であり得る。
【００２９】
好ましくは、上記プロセス溶液は、目的の生物物質を含む。本発明において、用語「目的の生物物質」とは、治療可能性を示し得る、生物学的プロセスによって生成される任意の分子をいう。本発明における生物学的プロセスの一例は、細胞タンパク質発現である。いくつかの場合には、目的の生物物質は、糖、タンパク質、核酸もしくはこれら物質の複雑な組み合わせから構成され得る。他の場合には、目的の生物物質は、細胞および／もしくは組織のような生きている実体であり得る。好ましくは、目的の生物物質は、抗体、非抗体タンパク質、ワクチン、核酸、または血液もしくは血漿派生物である。目的の生物物質としての抗体の例は、トラスツズマブであり、これは、商品名ハーセプチンＴＭの下で市場に出ている。別の例は、リツキシマブ（商品名リツキサンＴＭの下で市場に出ている）である。別の例は、ベバシズマブ（商品名アバスチンＴＭの下で市場に出ている）である。目的の生物物質としての非抗体タンパク質の例としては、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、幹細胞因子、レプチン、ホルモン、サイトカイン、造血因子、増殖因子、抗肥満因子、栄養因子、抗炎症因子、レセプター、可溶性レセプター、酵素、および／またはこれらタンパク質のうちのいずれかの改変体、誘導体、もしくはアナログが挙げられるが、これらに限定されない。目的の生物物質の他の好ましい例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：インスリン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、モチリン、インターフェロン（例えば、α、β、もしくはγ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１および／もしくはＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＮＦ−ｂｐ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ３）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経栄養成長因子（ＮＧＦ）、骨増殖因子（例えば、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ））、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、巨核球由来増殖因子（ＭＧＤＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、トロンボポエチン、血小板由来増殖因子（ＰＧＤＦ）、コロニー刺激増殖因子（ＣＳＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、もしくはカリクレイン、および／またはこれらタンパク質のうちのいずれかの改変体、誘導体、もしくはアナログ。目的の生物物質としてのワクチンの１つの好ましい例は、Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ  ＨＢである。ワクチンの別の好ましい例は、Ｇａｒｄａｓｉｌである。ワクチンの別の好ましい例は、Ｏｐｔａｆｌｕである。別の好ましい例は、Ｃｅｒｖａｒｉｘである。目的の生物物質としての核酸の１つの好ましい例は、ホミビ���センであり、これは、商品名ＶｉｔｒａｖｅｎｅＴＭの下で市場に出ている。核酸の別の好ましい例は、ｍｉｐｏｍｅｒｓｅｎであり、これは、商品名ＫｙｎａｍｒｏＴＭの下で市場に出ている。別の好ましい例は、Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂであり、これは、商品名ＭａｃｕｇｅｎＴＭの下で市場に出ている。目的の生物物質としての血液もしくは血漿派生物の１つの好ましい例は、アルブミンである。血液もしくは血漿派生物の別の好ましい例は、抗血友病因子である。別の好ましい例は、抗血友病因子／フォン・ウィルブランド因子複合体である。本発明における目的の生物物質の他の好ましい例としては、抗インヒビター凝固複合体（ａｎｔｉ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ）アンチトロンビン（組換え）、ｃ１エステラーゼインヒビター、凝固因子、コリファクト、フィブリン、フィブリノゲン、免疫グロブリン、ｐｒｏｆｉｌｎｉｎｅ  ＳＤ−第ＩＸ因子複合体、ｋｃｅｎｔｒａ（プロトロンビン複合体濃縮物、ヒト）、プロテインＣ濃縮物（ヒト）、トロンビン、骨髄生成物、および胚性流体生成物（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
好ましくは、プロセス溶液中の上記目的の生物物質は、細胞培養プロセスもしくは発酵プロセスによって生成されてきた。本発明において、用語「細胞培養発現プロセス」とは、細胞が制御された条件下で増殖させられて、ある種の遺伝子（代表的には、インビトロで導入される）を発現するプロセスをいう。本発明において、用語「発酵発現プロセス」とは、微生物が増殖させられてある種の遺伝子（代表的には、インビトロで導入される）を発現するように条件づけられているプロセスをいう。好ましくは、細胞培養もしくは発酵発現のための細胞株は、ヒト、動物、植物、昆虫、ハイブリドーマ、酵母、もしくは細菌が起源のものである。ヒト細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞、ＮＣＩ６０細胞、ＤＵ１４５細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＰＣ３細胞、ＡＲＨ−７７細胞、および／もしくはＨＥＫ−２９３細胞が挙げられるが、これらに限定されない。動物細胞株の例としては、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＧＨ３細胞、ＰＣ１２細胞、および／もしくはＭＣ３Ｔ３細胞が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞株の例としては、タバコＢＹ−２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。昆虫細胞株の例としては、ｓｆ９細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、および／もしくはＣ６／３６細胞が挙げられるが、これらに限定されない。酵母細胞株が由来し得る酵母種の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞および／もしくはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細菌細胞株が由来し得る細菌種の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよび／もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、細胞培養もしくは発酵発現のための細胞株は、他の起源のものである。他の細胞株の例としては、ＺＦ４細胞、ＡＢ９細胞、および／もしくはＸｅｎｏｐｕｓ  Ａ６腎臓上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明において、用語「ハイブリドーマ」とは、研究室において抗体生成リンパ球と非抗体生成癌細胞、好ましくは、骨髄腫もしくはリンパ腫との融合から生成される細胞をいう。さらに、本発明のハイブリドーマは、増殖させられ、特異的モノクローナル抗体の連続供給を生じさせることができる。ハイブリドーマ細胞株の例としては、ＲＦＴ５細胞、ＳＰ２／ｏ細胞、および／もしくはＨＢ５４細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
いくつかの場合には、目的の生物物質を発現する細胞培養もしくは発酵プロセスは、他の生物物質もしくは分子を共発現する。本発明において、目的の生物物質ではない、細胞培養もしくは発酵プロセスの間に共発現される全ての生物物質もしくは分子は、「不純物」といわれる。不純物の例としては、宿主細胞タンパク質（上記目的の生物物質以外に発現されるタンパク質）、核酸（目的の生物物質である核酸以外）、上記目的の生物物質の電荷改変体、凝集複合体、β−グルカン、および／もしくはウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、不純物とは、目的の生物物質を含む溶液に添加される全ての生物物質、分子、もしくは化学物質をいう。従って、不純物の一例は、それがプロセス溶液に添加された後のＭＶＰである。いくつかの場合には、プロセス溶液は、全ての不純物の起源とともに、元の細胞培養もしくは発酵発現溶液中に存在し得る。他の場合には、この溶液は、ＭＶＰの添加の前に、「精製技術」として当該分野で一般に公知の種々の技術によって、その本来の状態から既に精製されている可能性がある。本発明において、用語「精製する」とは、溶液に存在する不純物の量を、同じ溶液に存在する非不純物の量に対して減少させるという行為をいう。好ましくは、非不純物とは、上記溶液に存在する目的の生物物質をいう。ＭＶＰの添加の前に上記プロセス溶液を既に精製している可能性のある精製技術の例としては、遠心分離、クロマトグラフィー、濾過、沈殿、濃縮、ダイアフィルトレーション、低温殺菌、もしくはウイルス不活性化が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、上記溶液は、ＭＶＰの添加の前に、凍結、融解、ｐＨ調節、および／もしくは希釈が挙げられるが、これらに限定されない他の技術もしくは厳密さに供されている可能性がある。
【００３３】
本発明の第１の実施形態は、「精製技術によって上記溶液を加工処理すること」を含む。上記方法のこの工程において、用語「溶液」とは、ＭＶＰストック溶液のある量が添加された後のプロセス溶液をいう。好ましくは、この溶液は、目的の生物物質を含む。先に言及されるように、目的の生物物質ではない「不純物」もまた、ＭＶＰを含め、存在し得る。本発明の第１の実施形態の間に、この溶液は、「精製技術によって、加工処理される」。本発明において、用語「精製技術」とは、上記溶液を「精製する」技術、すなわち、溶液に存在する不純物の量を、その同じ溶液に存在する非不純物の量に対して減少させる技術をいう。好ましくは、非不純物とは、目的の生物物質をいう。従って、本発明のさらに好ましい実施形態は、精製技術によって上記プロセス溶液を加工処理するという行為を通じて、その溶液に存在する目的の生物物質を精製することである。
【００３４】
好ましくは、上記プロセス溶液を加工処理するために使用される精製技術は、クロマトグラフィー、濾過、限外濾過、遠心分離、もしくはウイルス不活性化技術である。本発明において、クロマトグラフィー、濾過、限外濾過、もしくは遠心分離は、「分離技術」といわれ得る。分離技術は、溶液の構成要素を２種以上の別個の溶液へと分配する物質移動法である。分離技術は、溶液の種々の構成要素間の物理的特性および化学的特性の差異（サイズ、形状、質量、および／もしくは化学的親和性が挙げられるが、これらに限定されない）に基づいて行われる。分離技術の例としては、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、深層濾過、サイズベースの濾過（ナノ濾過、滅菌濾過、もしくは限外濾過が挙げられる）、および遠心分離が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス不活性化技術とは、ウイルスがその適切な構造もしくは複製を保持する能力を低減することを目的とした任意の方法をいう。ウイルス不活性化技術の例としては、溶媒および洗剤もしくは化学的処理、低ｐＨ、熱、もしくは紫外線照射への曝露が挙げられる。
【００３５】
本発明の第１の実施形態は、「上記溶液を精製技術によって加工処理すること」を含む。本発明において、用語「加工処理すること」とは、精製技術を物理的に行うという行為をいう。分離技術をで処理する（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）異なる物理的行為としては、ポンプ輸送すること、直接圧力をかけること、遠心分離、重力、もしくは振盪すること、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、処理の１つより多くの方法が、上記分離技術の形式に依存して、１つの分離技術に適用され得る。例えば、イオン交換クロマトグラフィー法の形式は、充填済みカラム、フィルタ、もしくは９６ウェルプレートであり得る。従って、このイオン交換クロマトグラフィー法で処理するという行為は、ポンプ輸送すること、圧力をかけること、遠心分離すること、重力、および／もしくは振盪することからなり得る。ウイルス不活性化技術で処理する異なる物理的行為としては、有機溶媒、洗剤もしくは酸性溶液を添加すること、マイクロ波にかけること、ＵＶ光に曝すこと、ホットウォーターバスへの浸漬、低温殺菌、もしくはスチーム処理が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
いくつかの場合には、溶液を分離技術によって加工処理することは、溶液中の不純物の量を減少させるので、上記溶液を「精製する」といわれる。ＭＶＰをプロセス溶液に添加した後に、ＭＶＰは、不純物とみなされる。好ましくは、上記プロセス溶液に存在するＭＶＰの量は、加工処理という行為の前に存在するＭＶＰの量と比較して、このような加工処理を通じて減少させられる。あるいは、上記プロセス溶液に存在するＭＶＰの量は、加工処理によって減少しない。精製技術が溶液中の不純物の量を減少させる能力は、当業者が加工処理するために利用するパラメーターのセット、もしくは「変数入力」に依拠する。変数入力の例としては、加工処理される予定の溶液のｐＨ、導電性、および温度が挙げられるが、これらに限定されない。変数入力の他の例としては、かけられる圧力、曝露時間、もしくは溶液の流速が挙げられるが、これらに限定されない。別の例は、上記溶液中の構成要素の濃度である。他の例は、溶液を加工処理するために使用される緩衝液のｐＨ、導電性、もしくは化学的組成である。別の例は、加工処理という行為の間もしくはその後に、上記プロセス溶液を集めるために使用される基準である。従って、精製技術によって溶液を加工処理するために利用される上記パラメーターのセットは、非不純物（例えば、目的の生物物質）に対して、不純物（例えば、ＭＶＰ）を減少させるその技術の能力の有効性に影響を及ぼす。
【００３７】
いくつかの場合に、加工処理の間もしくはその後に、プロセス溶液を集めるための有効な基準が使用され、これは、より少ない不純物を生じさせる。加工処理という行為がいったん始まれば、プロセス溶液を集める方法論は、当業者に依拠する。本発明において、加工処理という行為が始まって以降に集められたプロセス溶液は、「プロセス収集物」といわれる。精製技術の間にプロセス収集物を集めるために使用される方法論の例としては、吸光検出および体積固定（ｆｉｘｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、当業者は、プロセス収集物が、上記プロセス溶液が加工処理する前に含んでいた不純物のより少量を含むように、加工処理の間もしくはその後に、有効な収集基準を利用する。さらにより好ましくは、収集基準は、プロセス収集物が、加工処理前のプロセス溶液より少ないＭＶＰを含むように利用される。
【００３８】
いくつかの場合には、別個のプロセス収集物が、加工処理の間に集められる。別個のプロセス収集物を加工処理の間にどのように集めるかの一例は、クロマトグラフィー分離技術のロード段階の間のカラム溶離液収集である。別の例は、クロマトグラフィー分離技術の洗浄段階の間にカラム溶離液を集めることである。別の例は、クロマトグラフィー分離技術の溶出段階の間にカラム溶離液を集めることである。別の例は、フィルタの濾液を集めることである。別の例は、低ｐＨ滴定の間に上記溶液を集めることである。別の例は、ＵＶ光もしくは化学的処理への曝露の間に上記溶液を集めることである。あるいは、別個のプロセス収集物は、加工処理後に集められ得る。別個の加工処理された溶液を、加工処理後にどのように集めるかの一例は、クロマトグラフィー分離技術の除去段階（ｓｔｒｉｐ  ｐｈａｓｅ）の間にカラム溶離液を集めることによるものである。別の例は、低いｐＨ滴定、続いて、ｐＨの上昇および濾過の後に、上記溶液を集めることである。別の例は、ＵＶ光もしくは化学的処理への曝露後に、上記溶液を集めることである。
【００３９】
本発明の第１の実施形態は、「上記溶液から除去されるＭＶＰの量を定量すること」を含む。この具体的実施形態において、「定量する」という行為は、当業者が上記溶液を加工処理することによって除去されるＭＶＰの量を数学的に計算する手段をいう。好ましくは、この値は、対数減少値（ＬＲＶ）として表され得る。あるいは、この値は、モル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）として、ＭＶＰの総グラムで、および／もしくはＭＶＰの総分子で、表され得る。好ましくは、当業者は、加工処理前の溶液中のＭＶＰの量に対して、加工処理後の溶液中に残っているＭＶＰの量を関連づける等式によって、上記溶液から除去されるＭＶＰの量を数学的に計算し得る。好ましくは、加工処理前の溶液中に存在するＭＶＰの量は、プロセス溶液に添加されるＭＶＰストック溶液の体積にそのＭＶＰストック溶液のＭＶＰ濃度を乗算することによって分かる。さらにより好ましくは、加工処理前の溶液に存在するＭＶＰの量は、経験的に決定され得る。同様に、好ましくは、プロセス収集物中に残っているＭＶＰの量は、経験的に決定され得る。種々の技術が、溶液に存在するＭＶＰの量を経験的に決定するために利用され得る。本発明において、これら技術は、「定量技術」といわれる。溶液から除去されるＭＶＰの量をどのように定量するかの好ましい例は、実施例の節で示される。
【００４０】
好ましくは、溶液中のＭＶＰの量を経験的に決定するために使用される「定量技術」としては、ＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ法、ナノ画像化法、蛍光法、酵素法、顕微鏡法、分光光度法、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）法、およびウェスタンブロット法が挙げられる。本発明のこの実施形態において、ＭＶＰの量が決定されている「溶液」は、ＭＶＰの添加後のプロセス溶液、プロセス収集物、もしくはいずれかから採取したアリコートをいう。この実施形態において、上記溶液は、「ＭＶＰ含有溶液」といわれ得る。好ましくは、定量技術を行う場合、ＭＶＰにもしくはＭＶＰに結合された分子に結合し得る薬剤を含む溶液が、ＭＶＰ含有溶液に添加される。このような薬剤の一例は、抗体である。あるいは、定量技術を行う場合、インビトロ核酸に、もしくはＭＶＰに最初に結合され得る分子に結合した核酸配列に結合し得るＰＣＲプライマーを含む溶液は、ＭＶＰ含有溶液に添加される。本発明において、薬剤もしくはＰＣＲプライマーを含む上記溶液は、「定量溶液」といわれる。
【００４１】
好ましくは、溶液中のＭＶＰの量を定量するという行為の間に、プロセス溶液中のＭＶＰの段階希釈が行われ、定量技術によって分析される。好ましくは、このような分析からのデータは、上記定量技術の結果として受容したシグナルに対して、溶液中のＭＶＰの量を関連づける。定量技術の一部として受容されるシグナルの例としては、光学密度（Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）（ＯＤ）、吸光度単位（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｕｎｉｔｓ）、１ｍｌあたりのｐＲＮＡコピー、１ｍｌあたりのｐＤＮＡコピー、１ｍｌあたりのＲＮＡコピー、１ｍｌあたりのＤＮＡコピー、もしくは逆転写酵素活性の単位が挙げられるが、これらに限定されない。さらにより好ましくは、最良適合の線は、ＭＶＰの未知の量によって生成される定量技術シグナルを既知の量によって生成されるシグナルに関連づけるために、データとともに使用される。溶液からのＭＶＰ除去を定量する代わりに、溶液中のＭＶＰの量を定量するために段階希釈を作製および使用する例は、実施例の節に示される。
【００４２】
いくつかの場合には、ＭＶＰは、天然もしくは組換えのウイルスキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質から構成され、その表面にエピトープもしくは異種エピトープを呈示する。好ましくは、これらの場合において、これらエピトープもしくは異種エピトープに結合する抗体は、溶液に存在するＭＶＰの量を決定するために、定量技術の間に利用され得る。ＭＶＰ上に呈示されるエピトープに結合する抗体がＭＶＰの量を決定するためにどのように利用され得るかの一例は、天然もしくは組換えのＶＰ２キャプシドタンパク質に対して指向される抗ＶＰ２抗体を、ＥＬＩＳＡ定量技術の間にＭＭＶ  ＭＶＰ含有溶液に添加することによるものである。ＭＶＰ上に呈示される異種エピトープに結合する抗体が、どのようにＭＶＰの量を決定するために利用され得るかの例は、ｈｉｓタグ（上記ＭＶＰの表面上の異種エピトープとして存在する）に対して指向される抗ｈｉｓ抗体を、ＥＬＩＳＡ定量技術の間にＭＶＰ含有溶液に添加することによるものである。好ましくは、ＭＶＰによって含まれるエピトープもしくは異種エピトープに結合し得ることが当該分野で公知の抗体は、定量溶液中で使用される薬剤であり得る。さらにより好ましくは、生物において免疫原としてＭＶＰを使用することによって作製される新規な抗体は、定量溶液中で使用される薬剤であり得る。従って驚くほど感度の高い定量測定およびＭＶＰ除去計算が、当該分野に一般的な非遺伝的物質ベースの技術によって達成され得る。
【００４３】
他の場合には、ＭＶＰは、リンカー分子に結合される。好ましくは、これらの場合には、リンカー分子に結合する抗体は、溶液に存在するＭＶＰの量を決定するために、定量技術の間にＭＶＰ含有溶液に添加され得る。他の場合には、分子を含む溶液は、定量溶液を添加する前に、ＭＶＰ含有溶液に添加され得る。本発明において、用語「分子」とは、ＭＶＰに親和性を有する天然もしくは人工の低分子もしくはタンパク質をいう。
【００４４】
いくつかの場合には、分子は、ＭＶＰ−分子複合体を形成するためにＭＶＰ含有溶液に添加される。好ましくは、これらの場合には、分子は、それらの表面上に結合および呈示された核酸配列を有しない。他の場合には、分子は、それらの表面上に結合および呈示された核酸配列を有し得る。好ましくは、分子を含む溶液がＭＶＰ含有溶液に添加される場合、定量溶液は、定量技術によって溶液に存在するＭＶＰの量を決定するために添加される。溶液に存在するＭＶＰの量が、分子を含む溶液を添加することによってどのように決定されるかの一例は、第１に、ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎを含む溶液をｓｔｒｅｐタグ−ＭＶＰ（ｓｔｒｅｐタグ異種エピトープを含むＭＶＰ）を含む溶液に添加し、次いで、抗ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ抗体を使用して、ＭＶＰの量をＥＬＩＳＡ定量技術で決定することによるものである。別の例は、第１に、核酸結合体化ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ（結合された核酸のセグメントを含むｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ）の溶液をＭＶＰ含有溶液に添加し、次いで、上記核酸のセグメントに対して指向されるプライマーを使用して、ＭＶＰの量をＰＣＲ定量技術で決定することによるものである。
【００４５】
いくつかの場合には、ＭＶＰは、その構造内にインビトロ核酸のセグメントを含む。好ましくは、この場合には、上記ＭＶＰ内に含まれるインビトロ核酸に結合するプライマーを含む定量溶液は、ＭＶＰの量をＰＣＲ定量技術で決定するために利用され得る。いくつかの場合には、当該分野に一般的な定量技術によって生成されるシグナルを増強するための方法が使用され得る。定量技術によって生成されるシグナルを増強するための方法の一例は、金属増強発光（ｍｅｔａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を含む。
【００４６】
好ましくは、除去されるＭＶＰの量を定量することは、ＭＶＰの１種に言及される。好ましくは、この場合には、ＭＶＰの１種を、精製技術によって加工処理されるプロセス溶液に添加した。あるいは、ＭＶＰの２種以上が、精製技術によって加工処理されるプロセス溶液に添加される場合には、除去されるＭＶＰの量を定量することは、ＭＶＰの複数の種に言及し得る。好ましくは、この場合には、その同じ定量技術が、溶液中のＭＶＰの複数の種の量を決定するにあたって使用され得る。溶液中のＭＶＰの複数の種の量を決定するにあたってその同じ定量技術を使用する一例は、別個のＥＬＩＳＡ定量技術において、ＭＭＶ  ＭＶＰに結合する抗ＶＰ２抗体およびＸＭｕＬＶ  ＭＶＰに結合する抗ｅｎｖ抗体を使用することである。あるいは、異なる定量技術が、溶液中のＭＶＰの複数の種の量を決定するにあたって使用され得る。異なる定量技術を使用する一例は、ＥＬＩＳＡベースの技術を使用して、溶液中のＭＭＶ  ＭＶＰの量を決定すること、およびＰＣＲ技術を使用して、同じ溶液中でＸＭｕＬＶ  ＭＶＰを決定することである。
【００４７】
好ましくは、ＭＶＰを溶液に添加する工程、上記溶液を精製技術によって加工処理する工程、および溶液から除去されるＭＶＰの量を定量する工程は、逐次的におよび連続して、行われるべきである。あるいは、さらなる工程は、合理的な実験デザインに従って含められ得る。合理的な実験デザインに従って含められ得るさらなる工程の例としては、プロセス溶液に添加する前にＭＶＰのストック溶液をさらに精製する工程（濾過する工程、クロマトグラフィー、もしくは他の技術によって）、プロセス溶液に添加する前にＭＶＰのストック溶液に対して透析もしくはダイアフィルトレーションを行う工程、ＭＶＰを添加する前もしくは後に、非ＭＶＰ溶液を上記プロセス溶液に添加する工程が挙げられるが、これらに限定されない。非ＭＶＰ溶液の一例は、ウイルスを含まない生ウイルス調製物の細胞培養懸濁物である。他のさらなる工程の例としては、ＭＶＰの添加後であるが精製技術によって加工処理する前に、上記プロセス溶液のアリコートを採取する工程、定量技術を行う前に、プロセス収集物もしくは加工処理された収集物のアリコートを遠心分離もしくは希釈する工程、および／または定量技術のために採取された上記アリコートを、上記定量技術を行う前に凍結および融解する工程が挙げられ得る。
【００４８】
従って、本発明の一実施形態は、溶液から除去されるＭＶＰの量を定量するための方法である。本発明の別の実施形態は、上記方法を実施するために使用されるキットである。好ましくは、上記キットは、ＭＶＰの単一の種のストック溶液を含む１つの容器、および定量溶液を含む１つの容器を含む。あるいは、上記キットは、ＭＶＰの複数の種を含むＭＶＰのストック溶液を含む１つの容器を含む。好ましくは、この場合には、上記キットはまた、ストック溶液ボトルに存在するＭＶＰの各種の量を経験的に決定するために、定量溶液の複数の容器を含む。上記キットがＭＶＰの複数のストック溶液のボトル（ＭＶＰの異なる種を含む）を含む場合に、上記キットはまた、ＭＶＰのそれら種の量を決定するために、複数の定量溶液の容器を含む。
【００４９】
本発明において、「ＭＶＰのストック溶液を含む容器」とは、既知の濃度（ＭＶＰの）にあるＭＶＰのストック溶液を含む、上記キット内に含まれるボトルをいう。さらに、ストック溶液容器中の上記ＭＶＰは、当該分野に一般的な他の非感染性粒子の濃度および純度レベルを超える濃度および純度で存在する。例えば、ストック溶液容器中のＭＶＰの濃度は、少なくとも１×１０５  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０６  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０７  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０８  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０９  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１０  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１１  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１２  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１３  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１４  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１５  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０１６  ＭＶＰ／ｍｌ以上であり得、上記非ＭＶＰ関連タンパク質は、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの６５％未満、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの５５％未満、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの４５％未満、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの３５％未満、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの２５％未満、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの１５％未満、上記溶液中の全てのタンパク質のうちの５％未満、のレベルで存在し得る。好ましくは、ストック溶液ボトル中のＭＶＰは、上記ＭＶＰがアセンブリされた元の細胞培養もしくは発酵ベースの発現溶液中にあり得る。さらにより好ましくは、ストック溶液中の上記ＭＶＰは、溶液中の細胞性の非ＭＶＰ関連タンパク質、核酸、もしくは脂質の濃度が、上記ＭＶＰがアセンブリされた元の発現溶液と比較して低下するように精製される。さらにより好ましくは、ストック溶液ボトル中の上記ＭＶＰは、上記ＭＶＰがアセンブリされた元の発現溶液から高度に精製される。いくつかの場合には、ＭＶＰのストック溶液は、添加された緩衝液成分を含み得る。好ましくは、ＭＶＰの単一のストック溶液ボトルは、ＭＶＰのわずか１つの特定の種を含む。あるいは、単一のストック溶液ボトルは、ＭＶＰの複数の種を含む。
【００５０】
本発明において、「定量溶液を含む容器」とは、ＭＶＰに結合し得る薬剤、インビトロ核酸、ＭＶＰに結合した分子、もしくはその分子に結合した核酸配列を含む定量溶液を含む、上記キット内に含まれるボトルをいう。好ましくは、定量ボトルは、ＭＶＰにもしくはＭＶＰに結合され得る分子に結合し得る抗体を含む定量溶液を含む。抗体を含む定量溶液を含む定量ボトルの一例は、溶液中のＭＭＶ  ＭＶＰの量を決定するために、ＥＬＩＳＡ定量技術の間に利用され得る抗ＶＰ２抗体を含む定量溶液を含む定量溶液ボトルである。この場合には、上記抗体は、上記ＭＶＰに存在するエピトープもしくは異種エピトープ、または上記分子に存在するエピトープに結合し得る。本発明のさらにより好ましい実施形態において、上記キットはまた、二次抗体（これは、ＭＶＰもしくはＭＶＰに結合した分子に結合する一次抗体に結合し得る）の溶液を含む。好ましくは、上記二次抗体の溶液は、ＭＶＰもしくは分子に結合し得る抗体の添加後に、定量技術の実施の間に添加される。
【００５１】
いくつかの場合には、ＭＶＰもしくはＭＶＰに結合した分子に結合し得る抗体は、酵素に結合体化されていない。あるいは、本発明のさらに好ましい実施形態において、ＭＶＰにもしくはＭＶＰに結合した分子に結合し得る、定量溶液中に含まれる抗体は、酵素に結合体化される。抗体に結合体化され得る酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼである。同様に、別のさらに好ましい実施形態において、ＭＶＰもしくはＭＶＰに結合した分子に結合し得る抗体に結合する二次抗体は、酵素に結合体化される。
【００５２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記キットは、ＭＶＰに結合する固定化された抗体もしくは分子を含むＥＬＩＳＡプレートをさらに含む。好ましくは、上記プレートは、９６ウェルを含む。あるいは、上記プレートは、９６未満のウェルを含み得る。好ましくは、上記ＥＬＩＳＡプレートに含まれる上記固定化された抗体もしくは分子は、その同じキットのＭＶＰストック溶液内に含まれるＭＶＰに結合する。
【００５３】
あるいは、別のさらに好ましい実施形態において、上記定量ボトルは、インビトロ核酸配列にもしくはＭＶＰに結合され得る分子に結合した核酸のセグメントに結合し得るプライマーを含む定量溶液を含む。好ましくは、この場合には、定量溶液ボトルは、ＭＶＰ内に含まれるインビトロ核酸のセグメントに特異的なＰＣＲプライマーを含み得る。あるいは、この場合には、定量溶液ボトルは、定量工程の間に、ＭＶＰにまず結合され得る分子に結合される核酸のセグメントに対して特異的なＰＣＲプライマーを含み得る。
【００５４】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記キットは、ＭＶＰに結合し得る分子の溶液をさらに含む。分子の溶液の一例は、ストレプトアビジンを含む溶液である。分子の溶液の別の例は、短い核酸配列を呈示するストレプトアビジンを含む溶液である。好ましくは、この溶液は、定量溶液を添加する前に、定量技術の実行の間に添加される。
【００５５】
本発明のさらに好ましい実施形態において、ＥＬＩＳＡもしくはＰＣＲを行うためのさらなる試薬が、上記キット中に含まれる。ＥＬＩＳＡもしくはＰＣＲを行うためのさらなる試薬の例としては、当該分野に一般的な緩衝液、酵素、もしくは分子が挙げられる。
【００５６】
具体的な例示的実施形態を参照しながら実施形態が記載されてきたが、種々の改変および変更が本願のより広い精神および範囲から逸脱することなくこれら例示的実施形態に対して行われ得ることは、明らかである。従って、本明細書および図面は、制限的な意味ではなく例示的意味で考えられるべきである。
【実施例】
【００５７】
（実施例１：ストック溶液を生成するためのマウス微小ウイルス（ＭＭＶ）モックウイルス粒子（ＭＶＰ）のクローニング、発現および精製）
マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）は、脊椎動物宿主に感染する科Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅに属する１本鎖ＤＮＡ含有ウイルスである。マウス微小ウイルスキャプシドタンパク質遺伝子、ＶＰ２は、ＭＶＰを生成するためにバキュロウイルス発現系を使用して、クローニングおよび発現され得る（Ｈｅｒｎａｎｄｏ，  ２０００）。ＭＭＶ  ＭＶＰをクローニングおよび発現するために、上記キャプシドタンパク質遺伝子ＶＰ２を、公開されたＭＭＶ  ＶＰ２配列テンプレート（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｊ０２２７５．１，  ヌクレオチド２７９４〜４５５７，  配列番号４）から合成した。特定のコドンを、この合成の間に最適化して、翻訳効率を高めた（配列番号５）。得られたアミノ酸配列（配列番号６）は、その公開されたＶＰ２配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＡ６７１１４．１，  配列番号７）に１００％相同であった。上記遺伝子を、クローニングベクターｐＵＣ５７へと挿入し、このベクターから、上記遺伝子をｐＦａｓｔＢａｃ発現ベクターへとサブクローニングした。次いで、このベクターを使用して、ＤＨ１０Ｂａｃ細胞を形質転換した。陽性クローンをスクリーニングした後、バクミドＤＮＡを使用して、Ｓｆ９細胞をトランスフェクトした。ＭＭＶ  ＶＰ２遺伝子を有する組換えバキュロウイルスを、Ｓｆ９細胞培養上清から集めた。次いで、その元の組換えバキュロウイルスストックを増幅させ、感染後４日目で集めた。このストックを、１０％  ＦＢＳを補充したＧｒａｃｅ培地中で培養し、次いで、これを使用して、感染多重度４．０でＳｆ９細胞をトランスフェクトした。次いで、細胞を、感染後３日目で採取し、溶解緩衝液中に再懸濁した。次いで、この懸濁物を３回、凍結および融解した。可溶性溶解物を、遠心分離によって回収し、次いで、その得られたＭＶＰの精製を、公開されたプロトコル（Ｈｅｒｎａｎｄｏ，  ２０００）に従って行った。塩化セシウム密度勾配分画後のＭＶＰの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとクーマシーブルー染色（図１）およびウェスタンブロット分析（示さず）によって決定した。その結果に基づいて、画分をプールして、ＭＭＶ  ＭＶＰストック溶液を形成した。ＭＭＶ  ＭＶＰストック溶液の可視化および濃度決定を、透過型電子顕微鏡とネガティブ染色（図２）によって行った。
【００５８】
（実施例２：ストック溶液を生成するための異種エピトープＭＭＶ  ＭＶＰのクローニング、発現および精製）
ＭＭＶ  ＭＶＰを、その構造の表面上に異種エピトープを呈示するように作製し得るので、従って、ＭＶＰ定量のための標的として使用し得る。異種エピトープを呈示するＭＭＶ  ＭＶＰをクローニングするために、ＭＭＶ  ＶＰ２遺伝子の天然のヌクレオチド配列を、まず合成すると同時に（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｊ０２２７５．１、ヌクレオチド２７９４〜４５５７、配列番号４をテンプレートとして使用）、特定のコドンを最適化して、翻訳効率を高めた（配列番号５）。次いで、この配列にアミノ酸２位で変異誘発を受けさせた（配列番号８）ところ、ｓｔｒｅｐ  ＩＩタグ（配列番号９）を含む１０アミノ酸配列の挿入を含むアミノ酸配列を生じた。次いで、その同じ方法および手順を、実施例１から利用して、異種エピトープ（ｓｔｒｅｐ  ＩＩタグ）含有ＭＶＰストック溶液をクローニング、発現、精製および生成した。塩化セシウム密度勾配分画後のＭＶＰの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとクーマシーブルー染色（図３）およびウェスタンブロット分析（示さず）によって決定した。その結果に基づいて、画分をプールして、異種エピトープＭＭＶ  ＭＶＰストック溶液を形成した。その得られたストック溶液の可視化および濃度決定を、透過型電子顕微鏡とネガティブ染色によって行った（図４）。その得られたＭＶＰがｓｔｒｅｐ  ＩＩタグを呈示したというさらなる確認を、ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎおよび上記タグに対するｍＡｂを利用するＥＬＩＳＡアッセイによって行った（データは示さず）。
【００５９】
（実施例３：ストック溶液を生成するための異種指向性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）ＭＶＰのクローニング、発現および精製）
ＸＭＲＶ  ｅｎｖ遺伝子およびｇａｇ遺伝子を共発現するＡｄ５ベクターでの細胞の感染が、非感染性粒子の生成をもたらすことが、以前示された（Ｍａｋａｒｏｖａ，  ２０１１）。第１に、上記ＸＭｕｌＶ  ｇａｇ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子は、テンプレートとしてのこれらの遺伝子の公開された配列を使用してカスタム合成し得る（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ９０８８１７．１、ヌクレオチド５４６〜２１５６、配列番号１０、およびアクセッション番号Ｋ０２７３０．１、ヌクレオチド２９１〜２２２５、配列番号１１）。次いで、上記核酸配列を、ｐＵＣ５７ベクターへとクローニングし得る。次に、上記ｅｎｖ配列を、ｐＤＰ１シャトルベクターのＣＭＶ駆動発現カセットへとサブクローニングし得、上記ｇａｇ配列を、その同じベクターのＭＣＭＶ駆動発現カセットへとクローニングし得、結果、ｐＤＰ１−ＸＭｕＬＶｅｎｖｇａｇが生じる。次いで、２９３−ＡＤ細胞を共トランスフェクトする前に、上記ｐＤＰ１−ＸＭｕＬＶｅｎｖｇａｇプラスミドを直線状にし、ｐＡｄＥａｓｙ−１プラスミドと混合して、組換えＡｄ５−ＸＭｕＬＶを生成し得る。上記組換えアデノウイルスを、塩化セシウム勾配上での二重遠心分離によって精製し得る。ＭＶＰストック溶液を生成するために、Ｍｖ１Ｌｕ細胞を、ウイルス吸収（ｖｉｒｕｓ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）のためにＡｄ５−ＸＭｕＬＶで感染させ得る。次いで、培養培地を感染の４８時間後に集め、０．４５ｍｍフィルタに通過させ、スクロース勾配による超遠心分離によって濃縮／精製し得る。
【００６０】
（実施例４：ストック溶液を生成するための異種エピトープを含むＸＭｕＬＶ  ＭＶＰのクローニング、発現、および精製）
ＸＭｕＬＶ  ＭＶＰを、その構造の表面上に異種エピトープを含むように、Ｓｕｏｍａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４で考察される方法によって作製し得る。あるいは、上記ＸＭｕＬＶ  ｇａｇ遺伝子および／もしくはｅｎｖ遺伝子（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ９０８８１７．１、ヌクレオチド５４６〜２１５６、配列番号１０、およびアクセッション番号Ｋ０２７３０．１、ヌクレオチド２９１〜２２２５、配列番号１１）のいずれかのヌクレオチド配列を、異種タグ（例えば、ａｓｔｒｅｐ−タグ（アミノ酸配列ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１））、Ｆｌａｇタグ（アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２））もしくはＨｉｓタグ（アミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３））が挙げられるが、これらに限定されない）の配列を含むように合成し得る。クローニング、発現、および精製は、上記の実施例３に記載されるとおりに起こり得る。
【００６１】
（実施例５：核酸を含むＸＭｕＬＶ  ＭＶＰのアセンブリ）
１片の核酸を含むＸＭｕＬＶ  ＭＶＰを生成するために、ＸＭｕＬＶ  ｇａｇタンパク質および／もしくはｅｎｖタンパク質を、第１に、実施例４に記載されるように哺乳動物細胞から発現させ得る。次いで、核酸（これは、ＤＮＡもしくはＲＮＡであり得る）を含めるためのＸＭｕＬＶ  ｇａｇタンパク質および／もしくはｅｎｖタンパク質のインビトロアセンブリを、以下の公開されたプロトコル（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）に従って行い得る。
【００６２】
（実施例６．アニオン交換カラムによる加工処理後のｍＡｂ含有溶液からのＭＭＶ  ＭＶＰ除去の定量）
モノクローナル抗体（ｍＡｂ１）を含むＮＳ０採取細胞培養流体を、貯蔵の−８０℃から融解した。上記材料を、ｐＨ７．５へと１Ｍ  Ｔｒｉｓで滴定し、次いで、０．２２μｍフィルタに通して濾過した。異種ｓｔｒｅｐ  ＩＩタグエピトープを呈示するＶＰ２キャプシドタンパク質の６０コピーを含む、１００マイクロリットルのＭＭＶ  ＭＶＰストック溶液（濃度１×１０９  ＭＶＰ／ｍｌ）を、１０ｍｌの上記ｍＡｂ１プロセス溶液に添加した（１％  ｖ／ｖ添加）。よって、上記プロセス溶液は、９．９×１０６  ＭＶＰ／ｍｌ（（０．１ｍｌ×１×１０９  ＭＶＰ／ｍｌ）／１０．１ｍｌ）の濃度を有した。次に、０．６６ｃｍ×２ｃｍ  Ｑセファロースファストフローカラムを、業者が推奨する仕様（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に詰めて、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒを使用して、流速６０ｃｍ／時で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて平衡化した。平衡化後に、ＭＶＰを含むプロセス溶液の１０．１ｍｌを、６０ｃｍ／時でカラムを通してロードした。プロセス収集物を、タンパク質のフロースルーを示すＵＶ２８０追跡として採取した。上記収集物の２００μｌサンプルを採取した。
【００６３】
次いで、ＥＬＩＳＡ定量技術を行って、精製加工処理からのプロセス収集物の各々において除去されるＭＶＰの量を定量した。マイクロタイターウェルを、第１に、ウサギポリクローナル抗ＭＭＶ  ＶＰ２抗体（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，  Ｃａｔ＃ＭＶＭＶＰ２１−Ｓ）でコーティングした。上記プロセス収集物サンプルの各々の５０μｌを、上記コーティングしたウェルに添加し、１時間インキュベートし、１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。さらに、ＭＶＰ濃度１×１０８  ＭＶＰ／ｍｌ、１×１０６  ＭＶＰ／ｍｌ、および１×１０４  ＭＶＰ／ｍｌを生じる上記ＭＭＶ  ＭＶＰストック溶液の段階希釈物を、元のプロセス材料の中で作製した。各希釈物の５０μｌを、コーティングしたウェルに同様に添加し、インキュベートし、洗浄した。次いで、ウサギポリクローナル抗ＭＭＶ  ＶＰ２抗体を、各ウェルに添加し、１時間インキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ＨＲＰ結合体化抗ウサギ抗体（１：５００）を添加し、１時間インキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した。ＴＭＢ基質溶液を添加し、その反応を、停止溶液を添加することによって停止させた。光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。そのＯＤ４５０の結果を、以下の表２に示す。
【表２】
2019195333.tif 000004
【００６４】
最良適合の線を、既知の濃度の３つの希釈サンプルで確立した（ＯＤ４５０およびＭＶＰ濃度を関連づける）。この線の式は、以下であった：
Ｙ＝０．０５２５ｌｎ（ｘ）＋０．１２３５
【００６５】
上記２つのプロセス収集物からのＯＤ４５０の結果の中に当てはめることによって、それらサンプル中のＭＶＰ濃度を決定した。いずれのプロセス収集物中にも０  ＭＶＰ／ｍｌが残っていたことが、このようにして経験的に分かった。このＥＬＩＳＡアッセイにおける検出限界は未知であるので、その限界は、試験したＭＶＰの最低濃度（１×１０４  ＭＶＰ／ｍｌ）であると想定される。ＭＭＶ  ＭＶＰの対数減少値を、上記プロセス溶液中のＭＶＰの既知量および上記プロセス収集物中に残っているＭＶＰの経験的に決定された量から計算した。従って、この値、≧９．９×１０２は、精製技術によって溶液を加工処理する方法によって、その溶液から除去されるＭＶＰの量である。
【００６６】
（実施例７：パルボウイルスフィルタによる加工処理後のＭａｂ含有溶液からのＸＭｕＬＶ  ＭＶＰ除去の定量）
モノクローナル抗体を含むバイオテクノロジープロセスに由来する溶液は、当該分野でよく知られている方法を使用して、タンパク質アフィニティクロマトグラフィーカラムおよびイオン交換クロマトグラフィーカラムによって精製され得る。上記溶液は、−８０℃で数カ月間凍結され、次いで、融解され、０．２２μｍフィルタに通して濾過され得る。次いで、ＸＭｕＬＶ  ＭＶＰストック溶液の１２．５ｍｌは、上記濾過されたプロセス溶液の２５０ｍｌの中へとピペットで移される（５％  スパイク  ｖ／ｖ）。このＭＶＰが添加されたプロセス溶液のうちの１ｍｌサンプルを、後の定量のためにとっておく。次いで、上記プロセス溶液（ここではＸＭｕＬＶ  ＭＶＰを含む）を、３０ｐｓｉでＶｐｒｏパルボウイルスフィルタに通して加圧し、その濾液を集める。この濾液（プロセス収集物）の１ｍｌサンプルを採取する。
【００６７】
プロセス溶液中でのＸＭｕＬＶ  ＭＶＰの段階希釈物を、プロセス溶液の濃度１×１０９、１×１０７、１×１０５、および１×１０３  ＭＶＰ／ｍｌのＭＶＰの希釈物により調製し得る。次いで、各希釈物の５０μｌを、ＸＭｕＬＶ  ｅｎｖエピトープに対する抗体でコーティングしたマイクロタイターウェルに添加し得る。次いで、上記ウェルを、１時間インキュベートし、１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄する。次に、異なるｅｎｖエピトープに対するＨＲＰ結合体化抗体を、各ウェルに添加し、１時間インキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄し得る。次いで、ＴＭＢ基質溶液を添加し、その反応を、停止溶液の添加によって停止させる。ＯＤを４５０ｎｍで測定して、ＯＤとＭＶＰ濃度との間の関係を示すデータ曲線を作成する。ＯＤ４５０の結果は、以下の表３のデータと酷似し得る。
【００６８】
【表３】
2019195333.tif 000005
【００６９】
上記パルボウイルスフィルタによる加工処理から除去されるＸＭｕＬＶ  ＭＶＰの量は、経験的に定量され得る。プロセス溶液（ＭＶＰ添加後）およびプロセス収集物の１ｍｌサンプルを、上記の段階希釈サンプルについて記載されたその同じＥＬＩＳＡ法に供する。そのＯＤ４５０の結果を、表３のデータに最良に適合する式に当てはめて、濾過前および濾過後の溶液中のＭＶＰの量を推定する。このデータから、ＸＭｕＬＶ  ＭＶＰ  ＬＲＶは、実施例６に記載されるようにおよびウイルス除去を定量するために当該分野で一般的な方法に従って計算され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2019195333.tif 000008
【図４】
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【配列表】
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