(57)【要約】      （修正有）【課題】塩基性線維芽細胞増殖因子を生成する、費用効率の高い方法を提供する。【解決手段】１４６個のアミノ酸を備え、Ｃ末端又はＮ末端に何の修飾もなく、真正で生物活性を有するヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を生成する方法を開示する。該方法は、枯草菌宿主を提供するステップと、５’末端から３’末端までセルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）、インテイン配列、及びｂＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡからなるインサートを含むＤＮＡ構築物を、枯草菌宿主に導入することにより、形質転換された枯草菌宿主を生成するステップと、形質転換された枯草菌宿主に振とうフラスコ培養プロセス又は流加発酵プロセスを行うステップと、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１４６個のアミノ酸を備え、Ｃ末端又はＮ末端に何の修飾もなく、真正で生物活性を有するヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を細胞内に生成する方法であって、
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主を提供するステップと、
５’末端から３’末端までセルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）、インテイン配列、及びｂＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡを有するインサートを含むＤＮＡ構築物を、前記枯草菌宿主に導入することにより、形質転換された枯草菌宿主を生成するステップと、
前記形質転換された枯草菌宿主に振とうフラスコ培養プロセス又は流加発酵プロセスを行うことにより、前記形質転換された枯草菌宿主に、切断され、かつ前記インサート内にｂＦＧＦをコードするＤＮＡの前後のＤＮＡ領域でコードされたタンパク質から独立している可溶型ｂＦＧＦを、前記細胞内に生成するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記インテイン配列は、Ｓｓｐ  ＤｎａＢである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記振とうフラスコ培養プロセスを行うとき、１００ｍｌの培地を有する振とうフラスコを使用するステップを含み、或いは、前記流加発酵プロセスを行うとき、２Ｌの培地を有する発酵槽を使用するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記流加発酵方法による前記ｂＦＧＦの生成量は、前記振とうフラスコ培養プロセスの二倍以上である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
５’末端から３’末端までセルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）、インテイン配列、及びｂＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡを有するインサートを含むＤＮＡ構築物を含むことを特徴とする、枯草菌宿主から操作された生物学的システム。
【請求項６】
前記インテイン配列は、Ｓｓｐ  ＤｎａＢである、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
５’末端から３’末端までセルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）、インテイン配列、及びｂＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡを有するインサートを含み、
前記ｂＦＧＦポリペプチドは、細胞内に１４６個のアミノ酸を備え、Ｃ末端又はＮ末端に何の修飾もなく、真正で生物活性を有するヒト塩基性線維芽細胞増殖因子であることを特徴とする、ＤＮＡ構築物。
【請求項８】
前記インテイン配列は、Ｓｓｐ  ＤｎａＢである、請求項７に記載のＤＮＡ構築物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は、２０１８年５月７日に出願された香港出願番号Ｎｏ．１８１０５８３５．８の優先権を主張し、その内容のすべてがここに組み込まれる。
（配列表）
【０００２】
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子出願された配列表を含み、かつそのすべてが参照によってここに組み込まれる。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年３月１５日付で作成されており、Ｇ０２−００８Ａ  １９０３１５  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられ、ファイルサイズが５ＫＢである。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、枯草菌における真正で生物活性を有する塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の発現に関し、ｂＦＧＦが１４６個のアミノ酸残基を備える。
【背景技術】
【０００４】
塩基性線維芽細胞増殖因子は、機能が汎用的であるが、現在非常に高価なポリペプチドである。従来、ポリペプチドの生成方法が既に提案されているが、このような提案の多くは、天然の特徴を有する、真正で生物活性を有する線維芽細胞増殖因子の生成に関するものではない。換言すれば、このような提案の多くは、天然のポリペプチドと類似しないか又は類似の効果を有しない類似体又はアイソフォームしか生成することができない。いくつかの場合に、ポリペプチド又は類似体の生成に起因する安全上の問題も存在する。例えば、いくつかの提案では、望ましくない副生成物、例えば有毒物質を生成する生物学的システムを使用し、これらは、人々の応用に適合しないヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の分離に依存する。
【０００５】
一方、組換えタンパク質の費用対効果的な（ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）生産は、製品が市場で広く利用可能な前提条件である。塩基性線維芽細胞増殖因子は、血管新生、創傷治癒及び軟骨形成を含む様々な生理的プロセスにおいて、重要な役割を果たすユニバーサルタンパク質として示されるが、予想どおりに一般的に利用されていない。例えば、真正なヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、１４６個のアミノ酸残基を含む１６．５ｋＤａのタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１−ＮＨ２ＰＡＬＰＥＤＧＧＳＧ｜１０ＡＦＰＰＧＨＦＫＤＰ｜２０ＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ｜３０ＦＬＲＩＨＰＤＧＲＶ｜４０ＤＧＶＲＥＫＳＤＰＨ｜５０ＩＫＬＱＬＱＡＥＥＲ｜６０ＧＶＶＳＩＫＧＶＣＡ｜７０ＮＲＹＬＡＭＫＥＤ｜８０ＧＲＬＬＡＳＫＣＶＴ｜９０ＤＥＣＦＦＦＥＲＬＥ｜１００ＳＮＮＹＮＴＹＲＳＲ｜１１０ＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫ｜１２０ＲＴＧＱＹＫＬＧＳＫ｜１３０ＴＧＰＧＱＫＡＩＬＦＬ｜１４０ＰＭＳＡＫＳ−ＣＯＯＨ）である。しかしながら、実質的には、様々な分子サイズのｂＦＧＦの構造類似体のみは、商業的用途に利用可能である。それは、一般的なクローニング方法を利用すると、ｂＦＧＦを生成する費用対効果的な処理プロトコルを確立できないからである。したがって、ｂＦＧＦは、スキンケア又は治療用途に一般的に利用されていない。しかしながら、信じられないが、真正ではないにもかかわらず、ｂＦＧＦ類似体は、本願の出願時点で１ｍｇあたり約１３００〜２０００ドルの非常に高い価格で販売されている。したがって、市場では費用対効果的なｂＦＧＦの供給によってのみ、その不合理的な高価格を低下させることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記問題を解決したり、少なくとも公衆に代替手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、１４６個のアミノ酸を備え、Ｃ末端又はＮ末端に何の修飾もなく、真正で生物活性を有するヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を細胞内に生成する方法であって、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主を提供するステップと、５’末端から３’末端までセルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）、インテイン配列、及びｂＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡからなるインサートを含むＤＮＡ構築物を、枯草菌宿主に導入することにより、形質転換された枯草菌宿主を生成するステップと、形質転換された枯草菌宿主に振とうフラスコ培養プロセス又は流加発酵プロセスを行うことにより、形質転換された枯草菌宿主に、切断され、かつインサート内にｂＦＧＦをコードするＤＮＡの前後のＤＮＡ領域でコードされたタンパク質から独立している可溶型ｂＦＧＦを、細胞内に生成するステップと、を含む方法を提供する。
【０００８】
好ましくは、インテイン配列はＳｓｐ  ＤｎａＢであってよい。
【０００９】
好ましくは、方法は、振とうフラスコ培養プロセスを行うとき、１００ｍｌの培地を有する振とうフラスコを使用するステップを含んでもよく、あるいは、流加発酵プロセスを行うとき、２Ｌの培地を有する発酵槽を使用するステップを含んでもよい。流加発酵プロセスによるｂＦＧＦの生成量は、振とうフラスコ培養プロセスの二倍以上であり得る。
【００１０】
本発明の第２の態様は、１４６個のアミノ酸を備え、Ｃ末端又はＮ末端に何の修飾もなく、真正で生物活性を有するヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を生成する方法であって、枯草菌宿主を提供するステップと、５’末端から３’末端までインテイン配列、及びｂＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡからなるインサートを含むＤＮＡ構築物を、枯草菌宿主に導入することにより、形質転換された枯草菌宿主を生成するステップと、形質転換された枯草菌宿主に振とうフラスコ培養プロセス又は流加発酵プロセスを行うことにより、形質転換された枯草菌宿主に、切断され、かつインサート内にｂＦＧＦをコードするＤＮＡの前後のＤＮＡ領域でコードされたタンパク質から独立している可溶型ｂＦＧＦを、細胞内に生成するステップと、を含む方法を提供する。好ましくは、インサートは、５’末端から３’末端まで、セルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）、インテイン配列、及びｂＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡからなり得る。
【００１１】
本発明の第３の態様は、Ｃ末端又はＮ末端に何の修飾もなく、真正で生物活性を有するポリペプチドを細胞内に生成する方法であって、枯草菌宿主を提供するステップと、５’末端から３’末端までセルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）、インテイン配列、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡからなるインサートを含むＤＮＡ構築物を、前記枯草菌宿主に導入することにより、形質転換された枯草菌宿主を生成するステップと、形質転換された枯草菌宿主に振とうフラスコ培養プロセス又は流加発酵プロセスを行うことにより、形質転換された枯草菌宿主に、切断され、かつインサート内にｂＦＧＦをコードするＤＮＡの前後のＤＮＡ領域でコードされたタンパク質から独立している可溶型ｂＦＧＦを、細胞内に生成するステップと、を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明の第４の態様は、５’末端から３’末端までセルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）、インテイン配列、及びｂＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡからなるインサートからなるＤＮＡ構築物を含む、枯草菌宿主から操作された生物学的システムを提供する。好ましくは、インテイン配列はＳｓｐ  ＤｎａＢであってよい。
【００１３】
本発明の第５の態様は、５’末端から３’末端までインテイン配列、及びｂＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡからなるインサートを含むＤＮＡ構築物を含む、枯草菌宿主から操作された生物学的システムを提供する。前記インサートは、５’末端から３’末端まで、セルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）、前記インテイン配列、及び前記ｂＦＧＦポリペプチドをコードする前記ＤＮＡからなり得る。
【００１４】
本発明の第６の態様は、５’末端から３’末端までセルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）、インテイン配列、及びｂＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡからなるインサートを含むＤＮＡ構築物を提供する。インテイン配列はＳｓｐ  ＤｎａＢであってよい。
【００１５】
本発明の第７の態様は、５’末端から３’末端までインテイン配列、及びｂＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡからなるインサートを含むＤＮＡ構築物を提供する。前記インサートは、５’末端から３’末端まで、セルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）、前記インテイン配列、及び前記ｂＦＧＦポリペプチドをコードする前記ＤＮＡからなり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
以下、図面を参照して本発明のいくつかの実施例について説明する。
【００１７】
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【発明を実施するための形態】
【００１８】
大腸菌を宿主として利用して望ましいタンパク質を発現させることは、異なる文脈で提案されている。しかしながら、このようなグラム陰性細菌は、エンドトキシン生産者であり、かつプラスミドのキュアリングのために高い細胞致死率の影響を受けやすいという欠点を有する。その結果、これらの悪影響は、増殖研究をより複雑かつ困難にする可能性がある。
【００１９】
本発明のプロセスにおいて、発明者らは、特定の条件下で、枯草菌がｂＦＧＦの組換えタンパク質発現の代替宿主であり、かつ細胞内での組換えタンパク質発現の代替宿主であることを確認した。これは、様々な理由から予想外である。まず、他の宿主、例えば大腸菌と比較して、枯草菌の特性は良好ではない。しかしながら、グラム陽性細菌である枯草菌は、エンドトキシンを含まないため、ＧＲＡＳ生物（一般に安全と認められる）として考えられている。また、組換え枯草菌株が安定して増殖するため、生成物の発現の最適化は相対的に複雑ではなくなる。しかしながら、枯草菌は、高いレベルの相同タンパク質、例えば、α−アミラーゼを生成することができ、これまで、枯草菌を使用して該細菌内に異種タンパク質の高レベル発現を実現するという証明はほとんど又は全くない。
【００２０】
６００個を超える推定インテイン遺伝子が提供され、かつそれらの大部分は、遺伝子発現を媒介し、主に大腸菌を宿主として使用する。従来の研究結果によると、インテイン媒介の細胞内発現により、大腸菌において真正な構造を有するタンパク質を成功して効果的に生成することができるが、インテインが他の状況でも使用できるという示唆がない。分泌発現は、使用される分泌シグナルの有効性と輸送に利用可能な経路によって制限される。本発明のプロセスにおいて、発明者らは、以前には実施されていなかっただけでなく、実行可能ではないと考えられていた可能性を試みる努力をしている。本発明は、エンドトキシンを生成しない枯草菌を、異種タンパク質、すなわちｂＦＧＦを発現させる生物宿主とするため、生成されたｂＦＧＦを安全に使用できることを可能にする。
【００２１】
本発明は、インテイン、Ｓｓｐ  ＤｎａＢ及びエンドグルカナーゼのセルロース結合ドメインを使用して、枯草菌細胞質における可溶性かつ精密に加工された成熟タンパク質としてのｂＦＧＦの生成の成功を促進する枯草菌細胞内発現システムの開発を提供する。また、発酵槽内のｂＦＧＦの増幅生成は、組換え培養物が高いレベルの細胞活性及びプラスミド安定性を保持することを示すため、（〜１７０％）ｂＦＧＦの収率を顕著に改善することができる。改善とは、振とうフラスコ（３１ｍｇ／Ｌ）で得られた収率と２Ｌの発酵槽（８４ｍｇ／Ｌ）で得られた収率との間の比較を指す。以下の説明を参照する。該発見は、説明される枯草菌のインテイン媒介発現方法が、トキシンを含まないｂＦＧＦ、そして予想可能なことにはその他の医学的に価値のあるタンパク質の生成に実用的な解決案を提供することを支持する。
【００２２】
「タンパク質イントロン」も呼ばれるインテインは、多くの微生物種に存在し、かつ大腸菌のみにおける組換えタンパク質の発現及び精製に広く用いられることが見出される。本発明は、枯草菌にインテインが存在しない可能性があるにしても、該細菌がインテインと組換えタンパク質との間に形成される融合体の自己触媒的切断を促進できることを証明する。インテインＳｓｐ  ＤｎａＢ（ＤｎａＢ）を発現させる構築物を使用し、該インテインＳｓｐ  ＤｎａＢ（ＤｎａＢ）は、そのＮ末端で、セルロモナスフィミのｃｅｎＡ遺伝子でコードされたエンドグルカナーゼのセルロース結合領域（ＣｅｌｌＢＤ）と融合され、かつ該構築物は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の細胞内発現を媒介できることが証明され、次に、ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ融合体を自動加工することにより、ｂＦＧＦが１４６個のアミノ酸を備える真正な構造を有することを可能にする。言及した融合体は、８４ｍｇ／Ｌの生物活性ｂＦＧＦの高収率をもたらすことが示される。枯草菌の増殖の改善についての今後の研究は、このような細菌をインテインと協働させることにより、価値のあるタンパク質を効果的に発現させるための新しいプラットフォームを形成することができる。
【００２３】
以下の実験、結果及び検討により、本発明をさらに説明する。
【００２４】
＜材料及び方法＞
細菌株及び化学品
大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２９２５（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）及びＪＭ１０１（Ｓｉｖａｋｅｓａｖａなど、１９９９）は、組換えＤＮＡ操作のための中間宿主として使用される。枯草菌株（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７５１は、以前に説明された（Ｋｗｏｎｇなど、２０１３ａ）。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＰＣＲキット、制限酵素及び修飾酵素は、ＮＥＢ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入される。全てのオリゴヌクレオチドは、いずれもインビトロジェン（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入される。特に他の規定がなければ、本研究に使用される化学品は、シグマアルドリッチ会社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入される。ウサギにおいて、抗ｂＦＧＦ抗体を生成する。
【００２５】
インテインＳｓｐ  ＤｎａＢ及びｂＦＧＦを含む融合体を発現させる構築物の操作
構築物ｐＭ２−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦの操作は、以下に要約される多くのステップ及び回数のオーバーラップ伸長ＰＣＲを使用して実現される。まず、オリゴヌクレオチドＰ１及びＰ２（表１）をプライマーとして、プラスミドｐＭ２ＶｅｇＣｅｎＡであるｐＦＣの誘導体（Ｌａｍなど、１９９８）を鋳型として使用して、ｖｅｇＣプロモーター、ｌａｃオペレーター及び枯草菌のＲＢＳを含む断片（生成物１−１）を取得する。該ｐＦＣは、ＰＣＲによって伸長されることにより、全長ｃｅｎＡ遺伝子（Ｗｏｎｇなど、１９８６）の５’末端のコドン１−４５（ｐＭ２ＶｅｇＣｅｎＡで欠失している）を再取得する。次に、オリゴヌクレオチドＰ３及びＰ４（表１）をプライマーとして、プラスミドｐＴＷＩＮ１（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を鋳型として使用して、Ｓｓｐ  ＤｎａＢのインテイン遺伝子及びヌクレオチドを有する配列（生成物１−２）を取得する。該ヌクレオチドは、（ｉ）生成物１−１の３’末端及び（ｉｉ）ｂＦＧＦのコード配列の５’末端で互いに重なる。そして、オリゴヌクレオチドＰ５及びＰ６（表１）をプライマーとして、ｐＷＫ３Ｒ（Ｋｗｏｎｇなど、２０１３ｂ）を鋳型として使用して、Ｓｓｐ  ＤｎａＢの部分配列と融合したｂＦＧＦのコード配列を含む断片（生成物１−３）を生成する。全ての生成物を精製して、第２回のオーバーラップ伸長ＰＣＲを行う。オリゴヌクレオチドＰ３及びＰ６（表１）をプライマーとして、生成物１−２及び生成物１−３を鋳型として使用して、Ｓｓｐ  ＤｎａＢをコードする配列と、ｂＦＧＦをコードする配列との間に正確な融合体（生成物２−１）を取得する。同様に、オリゴヌクレオチドＰ１及びＰ６（表１）をプライマーとして、かつ生成物１−１及び２−１を鋳型として使用して、ｖｅｇＣプロモーター、ｌａｃオペレーター、枯草菌のＲＢＳ、インテインＳｓｐ  ＤｎａＢのコード配列及びｂＦＧＦのコード配列を含む１．０２−ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片（生成物３−１）を取得する。最後に、生成物３−１をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化して、枯草菌／大腸菌のシャトルベクターｐＭ２−Ｖｅｇ（Ｌａｍなど、１９９８）を用いて連結し、該ｐＭ２−Ｖｅｇは、構築物ｐＭ２−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦを生成するために、既に同じ２種類の制限酵素によって消化される。
【００２６】
発現構築物ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦを構築するために、オリゴヌクレオチドＰ１、Ｐ６及びＰ７−Ｐ１０（表１）をプライマーとして、プラスミドｐＦＣ及びｐＭ２−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ（いずれも前述したとおりである）を鋳型として使用して、オーバーラップ伸長ＰＣＲを行う。その際に、Ｃ．ｆｉｍｉのｃｅｎＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ１５８２３．１（Ｗｏｎｇなど、１９８６））によってコードされるエンドグルカナーゼのセルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）をコードするＤＮＡ配列を、ＤｎａＢ−ｂＦＧＦＤＮＡ融合体の上流にクローニングして、ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦを取得する。
【００２７】
＜ｂｈＦＧＦ生成物のタンパク質発現、精製及び分析＞
振とうフラスコ培養
振とうフラスコ内に枯草菌形質転換体を増殖させるＭＭＢＬ培地は、以前に説明された（Ｓｉｖａｋｅｓａｖａなど、１９９９、Ｋｗｏｎｇなど、２０１３ｂ）。構築物ｐＭ２−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ及びｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦを含有する２つの形質転換体の種培養物を調製するために、各形質転換体の新鮮なコロニーを、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した１００ｍｌのＭＭＢＬ培地で増殖させる。そして、培養物を、２５０ｒｐｍかつ３７℃で、Ａ６００読み取り値が８．０に達するまで増殖させ、続いて増殖細胞に終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加する。その後に、２時間間隔で培養物サンプルを収集して、ｂｈＦＧＦ発現を分析する。
【００２８】
細胞溶解物の調製
細胞ペレットをそれぞれ１２０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、次に８３μｌのＥＤＴＡ溶液（０．２５Ｍ、ｐＨ８．０）を添加し、氷上で５分間培養する。そして、細胞を１２０μｌのリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）で３７℃で２０分間処理する。細胞溶解を促進するために、８３μｌの溶液Ｘ（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を添加し、次に試験管を５０回穏やかに反転させる。１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、前述のように、溶解物サンプルを収集し、ｂＦＧＦ発現をウエスタンブロットによって分析する。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所、ＵＳＡ）を用いて、濃度測定により画像を定量化する。
【００２９】
流加発酵
種培養物を調製するために、枯草菌［ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ］細胞を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＭＭＢＬ培地で、２５０ｒｐｍかつ３７℃で、Ａ６００読み取り値が１．０に達するまで増殖させる。そして、１５ｍｌの該種培養物を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した１３５ｍｌの新鮮なＭＭＢＬ培地を含有する５００ｍｌの三角フラスコに移し、さらに該培養物を、２５０ｒｐｍかつ３７℃で、Ａ６００読み取り値が１．０に達するまで増殖させる。１５０ｍｌの種全体を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した１．３５ＬのＭＭＢＬ培地を含有する２Ｌの発酵槽に添加し、１ＭのＮａＯＨを添加して培養物のｐＨを６．８に保持する。グルコースが枯渇してｐＨが上昇し始めるとき、３０分間隔で、２ｍｌの５０％グルコースを培養物に供給する。培養物中のｐＯ２を改善するために、インペラの速度を６００ｒｐｍに設定する。ｐＯ２値が約３０％のレベルに低下するとき、５０／５０の比率で調整された圧縮空気と純酸素の混合物を使用して発酵槽中のｐＯ２を改善する。Ａ６００読み取り値が２０に達するまで連続して供給する。培養物のｐＨが６．８になるとき、終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導する。その後に、２時間間隔で培養物サンプルを収集して、ｂＦＧＦ発現を分析する。
【００３０】
ｂＦＧＦの精製とアミノ酸配列の決定
前述のように、ヘパリンアガロースクロマトグラフィーを用いて、細胞溶解物において存在するｂＦＧＦを精製する。精製ｂＦＧＦを、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで観察する。前述のように、該ゲルから回収されたｂＦＧＦを含有するバンドを液体クロマトグラフィー−質量分析法によって分析する（Ｋｗｏｎｇなど、２０１３ａ）。
【００３１】
ｂＦＧＦの生物活性の測定
前述のように、ＭＴＴ試験を用いて、ｂＦＧＦのＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞の増殖に対する分裂促進作用に基づいて、ｂＦＧＦの生物活性を測定する。ｂＦＧＦとその受容体との間の相互作用は細胞内のシグナル伝達経路を活性化することにより、線維芽細胞増殖因子の受容体基質２α（ＦＲＳ２α）をリン酸化する。ウエスタンブロットを用いてリン酸化されたＦＲＳ２αを検出する。したがって、該試験は、組換えｂＦＧＦの分裂促進作用を分析し定量化することができる。
【００３２】
＜結果＞
発現プラスミドの開発の基本原理
インテグリンが枯草菌においてどのように作用するかについてはあまり知られていないので、大腸菌における異種タンパク質のインテイン媒介発現において得られた発明者らの経験が、枯草菌におけるインテインと標的タンパク質との間に形成された自己切断可能な融合体の操作を明らかにすることができると考えられる。これまでの研究から分かるように、標的タンパク質がインテインのＮ末端又はＣ末端において発現するか否かにかかわらず、該インテインを含むＮ−エクステイン及びＣ−エクステインの両方の存在は、何とかして、インテインと異種タンパク質との間に形成された可溶性融合生成物の発現の成功を促進することができる。得られた中間融合体の回復を促進するために、Ｃ．ｆｉｍｉのｃｅｎＡ遺伝子によってコードされるエンドグルカナーゼ（Ｅｎｇ）の１１ｋＤセルロース結合ドメイン（ＣｅｌｌＢＤ）を利用することになり、該中間融合体は、容易なプロトコルを用いて回復可能になる可能性がある。ＣｅｌｌＢＤは、セルロースと結合しかつＥｎｇのＮ末端部分に位置するので、発現しかつＮ−エキソペプチドとして機能して、中間生成物を回収するために必要なアンカーを提供することが予想される。したがって、候補インテインＤｎａＢによって媒介されるｂＦＧＦ発現を取得しようとするとき、ｐＭ２−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ（６．５ｋｂ）（図１）及びｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ（６．８ｋｂ）（図１）と名付けられた２種類の構築物を本研究のために操作し、ここで、該ｐＭ２−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦはＣｅｌｌＢＤのＤＮＡコード配列を欠き、該ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦは関連ＤＮＡ配列を持つ。
【００３３】
ｂＦＧＦの枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における発現
経時的実験の結果（図２）は、構築物ｐＭ２−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ（図１）が、前駆体／中間生成物（Ｐ／Ｉ）から切断される低レベルのｂＦＧＦのみを発現させることを示す。発現が弱いが、自動切断動作が効果的であるように見えるため、Ｐ／Ｉの跡がほとんど検出できない（データ不掲載）。そして、ＥＧＦは、ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦを効果的に発現させて自動処理して、真正なｂＦＧＦを大腸菌の最終生成物として取得することを促進することが以前に示されたため、ＥＧＦのような「Ｎ−エクステイン」の存在は、Ｐ／Ｉが伸長可能かつ切断可能な構造になることを可能にすることが思い出される。しかしながら、ＥＧＦを使用して同じＰ／Ｉ：ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦを生成する同じ方法は、枯草菌におけるｂＦＧＦの発現の成功をもたらすことがない（データ不掲載）。その後、他の一対のＮ−エキソペプチド−インテイン融合体がより良好な結果を達成する可能性があると考えられる。１１ｋＤａのＣｅｌｌＢＤは、ＥＧＦの代わりに使用できると考えられ、かつＥＧＦの２倍のサイズであり、融合タグ（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄなど、１９９４）として使用されたことがある。ＣｅｌｌＢＤの使用に伴い、タンパク質の発現は、ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦをＰ／Ｉとして生成すると予想される。ＥＧＦ−ＶＭＡのためのＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢの代替は、ｂＦＧＦの陽性発現をもたらすことが励みになる。これに関連して、枯草菌［ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ］形質転換体の培養物サンプルにおいて、ＣｅｌｌＢＤのコード配列を欠く構築物ｐＭ２−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦを含有するｂＦＧＦの対応物よりもかなり高いｂＦＧＦレベルが検出される。
【００３４】
ｂＦＧＦの経時的（Ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ）発現
最初の振とうフラスコ培養の結果は、構築物ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦが誘導下で発現を実現する場合に、ｂＦＧＦの比活性を高いレベルに保持できることを支持する（図２Ｂ）。その後、経時的実験を行って、枯草菌におけるｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦの誘導発現から生じるｂＦＧＦの生成のより完全な画像を取得する。該研究から２つの有用な情報が得られる。まず、ＩＰＴＧ誘導効果が高く、増加するだけでなく３１ｍｇ／ＬまでのｂＦＧＦの有利な発現を提供することができる（図３）。次に、このような発現方法もｂＦＧＦの比活性レベルを向上させる（図３Ｂ）。明らかに、枯草菌［ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ］の安定した細胞増殖とプラスミドキュアリングの欠如（図３Ｂ）の両方は、ｂＦＧＦの比活性を高いレベルに保持することに大いに貢献する。
【００３５】
ｂＦＧＦの発酵生産
偏性好気性細菌である枯草菌の培地中に提供される溶存酸素のレベルの向上は、細胞増殖を促進するため、標的組換え生成物のより高い収率が得られることが予想される。ＭＭＢＬ培地及び流加発酵条件が大腸菌における組換えタンパク質のペプチド媒介発現効果に対して有利である（Ｋｗｏｎｇなど、２０１６ｂ）ことを考慮して、同じ方法を採用して、２Ｌの発酵槽で培養された枯草菌における構築物ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦによって媒介されるｂＦＧＦの増幅発現の効果を調査する。
【００３６】
発酵研究の結果は、枯草菌［ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ］培養物のｂＦＧＦ発現及び細胞密度の両方のレベルを顕著に改善することを示す。ｂＦＧＦの最大収率は、振とうフラスコ培養により到達可能な３１ｍｇ／Ｌ（図３）から、発酵生産により生じる８４ｍｇ／Ｌ（図４）に増加する。また、振とうフラスコ培養（図３）から小規模発酵（図４）までの増幅において、培養物の最終細胞密度は５倍増加する。高い細胞密度を達成するために、酸素供給の改善、細胞培養物の供給方式及び増殖培地の精製ｐＨにより、枯草菌［ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ］培養物を増殖させ、それによりｂＦＧＦ発現をＩＰＴＧ誘導下で実施する場合でも、１ｍｌあたり約１０１０個の細胞を取得できると推測される（図４）。このような高密度は、振とうフラスコ内の誘導発現により得られた高密度の６倍であり、全経時的研究を通して加速した細胞増殖がないが、ｂＦＧＦのかなり印象的な収率８４ｍｇ／Ｌをもたらす。誘導発現に使用される細胞は明らかに安定期に入ったが、ｂＦＧＦが活発に発現しても、それらはそのまま完全に保持される。より魅力的なのは、ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ構築物は、その宿主細胞内に安定して維持される（図４）。該観察結果は、大腸菌形質転換体によって示される組換えタンパク質の発酵発現とは大きく異なり、その間に著しいプラスミド損失が検出される。
【００３７】
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現するｂＦＧＦの一次構造
ウエスタンブロット分析（図４）によると、枯草菌［ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ］細胞の溶解物から回収される組換えｂＦＧＦは、１４６個のアミノ酸を備えるｂＦＧＦ標準と同じ分子サイズを有することが示される。しかしながら、Ｐ／Ｉの自動切断により生成されたｂＦＧＦ生成物が適切な１４６個のアミノ酸残基を備えるか否かは、まだ定かではない。そして、発酵増殖の最後の時点から精製ｂＦＧＦサンプルを回収し、かつ質量分析法により分析する（Ｋｗｏｎｇなど、２０１３ａ）。該分析の結果によると、枯草菌は、インビボ融合生成物ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦのインビボ自動切断を受けることにより、１４６個のアミノ酸を備える真正な構造を有する所望の生成物ｂＦＧＦを生成することが始めて証明される（表２）。
【００３８】
組換えｂＦＧＦの分裂促進性
大腸菌形質転換体から回収される真正なｂＦＧＦによって証明される分裂促進効果（Ｋｗｏｎｇなど、２０１３ｂ、Ｋｗｏｎｇなど、２０１６ｂ）を思い出させ、枯草菌においてインテインＤＮＡ構築物ｐＭ２−ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦによって発現する組換えｂＦＧＦも生物活性であることが示される（図５）。それぞれ組換え大腸菌と枯草菌細胞から得られたｂＦＧＦサンプルの比較は、それらが相当する効能を示すことを示す（図５）。
【００３９】
＜検討＞
最初のインテインが１９８０年代の後半から発見されて以来、６００個を超える推定インテイン遺伝子が既に発見されている。インテイン遺伝子のクローニング及び特徴付けは、インテインの分子機能及び生化学的機能をよりよく理解することを可能にするだけでなく、それらを使用して、予想されたアミノ酸組成を備える構造を有する組換えタンパク質の発現を媒介することを促進することができる。大腸菌は、その増倍時間が短く、遺伝的特徴がよく知られ、処理しやすく、生産コストが比較的安価であるため、異種遺伝子の発現に用いられる最も一般的な宿主となり、かつインテインによって媒介される組換えタンパク質の発現に用いられる最も好ましい生物となる。最近、インテインを使用してタンパク質発現を媒介する大腸菌システムは漸進的に開発されており、該タンパク質発現を媒介すると同時に、標的タンパク質とインテインとの間に形成された融合体の自己触媒的切断のインビボ又はインビトロ方法のいずれかを行う。大腸菌は、上記能力を有するが、宿主としての使用が組換え体タンパク質発現中に封入体の形成、プラスミドのキュアリング及び著しい細胞死をもたらし得るという事実は、増幅生成を困難にする可能性がある。
【００４０】
グラム陽性細菌である枯草菌は、よく特徴付けられ、操作しやすくかつ相対的に安価に増殖するため、遺伝子発現に用いられる第２の選択肢の一般的な宿主となり、かつ広く異なる分泌タンパク質を発現させるように操作される。例えば、１ｇ／Ｌを超える分泌産物が生じるように発現するα−アミラーゼは、高レベルの相同タンパク質発現を達成するために使用されるが、枯草菌において同じレベルの異種タンパク質の生成を達成することは、不可能ではないにしても困難であることが示される。
【００４１】
本発明までは、インテインが枯草菌においてどのように作用するかについてはあまり知られていない。ＣｅｌｌＢＤ、ＤｎａＢ及びｂＦＧＦの間で操作された融合体に対する発明者らの研究結果によると、細胞内の可溶性かつ正確に切断された生成物としてのｂＦＧＦの発現の成功が明らかに証明される（図２）。発明者らの研究結果は、さらに、枯草菌の細胞内区画、すなわち細胞質が、その対応物が大腸菌内に行ったことと同様に、所望の条件を有する環境を提供することにより、可溶性かつ自己触媒処理された生成物としての異種タンパク質の発現を促進するという観点を支持する。ＤｎａＢを単独で使用することによりｂＦＧＦの弱い発現のみをもたらすが、全く予想外なことに、Ｃ．ｆｉｍｉのｃｅｎＡ遺伝子によってコードされるエンドグルカナーゼの１１ｋＤのＣｅｌｌＢＤをＤｎａＢのＮ末端に付加することにより、ｂＦＧＦの発現を高度に増強する（図３）。
【００４２】
大腸菌で発現する融合タンパク質の精製に対するアンカーとしてのＣｅｌｌＢＤの応用は、以前に報告された。したがって、我々の研究が残念なことに不溶性のＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦ  Ｐ／Ｉをもたらすと、ＣｅｌｌＢＤは、融合タンパク質を精製し、そしてインビトロ操作によってその切断を行うことに有利であると想定される。説明された融合方法は、ＣｅｌｌＢＤ−ＤｎａＢ−ｂＦＧＦの細胞質での発現の成功をもたらすだけでなく、１４６アミノ酸を備える真正な構造を有するｂＦＧＦ（表２）を生成物として生成するように自動切断可能かつ可溶性の前駆タンパク質が生じることが励みになる。
【００４３】
参考文献
表１  本研究に使用されるプライマー
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＊クローニング実験に使用される制限部位に下線を付ける。
【００４４】
表２  精製ｂＦＧＦの液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法による分析
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ａｂＦＧＦの部分的なトリプシン消化後、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンによりＮ末端及びＣ末端の配列を同定する。
ｂペプチドの理論質量電荷比。
ｃペプチドの実験質量電荷比。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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