(57)【要約】【課題】  両親媒性分子の二分子膜から構成されるベシクルを用いて、基板上で細胞を長時間培養する方法であって、ベシクル内部に封入した細胞を安定的に保持できる方法の提供。【解決手段】  両親媒性分子の二分子膜から構成されるベシクルを用いて細胞を培養する方法であって、細胞が封入された前記ベシクルを作製する工程と、両親媒性分子から構成される平面二分子膜で表面が覆われた基板上に、固定化手段を介してベシクルを固定する工程と、ベシクル内で細胞を培養する工程とを含む、培養方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性分子の二分子膜から構成されるベシクルを用いて細胞を培養する方法であって、
前記細胞が封入された前記ベシクルを作製する工程と、
両親媒性分子から構成される平面二分子膜で表面が覆われた基板上に、固定化手段を介して前記ベシクルを固定する工程と、
前記ベシクル内で前記細胞を培養する工程と
を含む、培養方法。
【請求項２】
請求項１に記載の培養方法であって、
前記ベシクルの内水相が外水相に対して比重が高くなるように調製される、培養方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の培養方法であって、
前記ベシクルの直径が１〜１００μｍの範囲内にあるものを含む、培養方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養方法であって、
前記ベシクルの前記基板上への固定が、ビオチン結合性タンパク質およびアビジン結合性タンパク質の組み合わせ、または、相補的なオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて行われる、培養方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養方法であって、
前記ベシクルが前記細胞を一細胞単位で含む、培養方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養方法であって、
前記ベシクルの前記基板上への固定が、疎水性オリゴヌクレオチドと当該疎水性オリゴヌクレオチドに相補性を有するリンカーオリゴヌクレオチドとを介して固定されるものではない、培養方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養方法であって、
前記ベシクルの前記基板上への固定化手段が、ビオチン結合性タンパク質およびアビジン結合性タンパク質である、培養方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養方法であって、
前記ベシクルの前記基板上への固定が、前記平面二分子膜上のビオチンと、前記ベシクルを構成する二分子膜上のビオチンと、前記２つのビオチンの両方に結合するアビジンを介して行われる、培養方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の培養方法であって、
前記培養工程が、前記ベシクルの内水相および／または外水相の環境を変化させながら培養することを含む、培養方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の培養方法であって、
前記培養工程が、リアルタイムに前記細胞の増殖を観察しながら培養を行う工程であって、所望の状態となるまで前記細胞を培養する工程である、培養方法。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の培養方法であって、
前記細胞が、ベシクルへの封入前に前培養したものである、培養方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の培養方法であって、
前記細胞を培養する工程が１時間以上培養を行う工程である、培養方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の培養方法に用いるキットであって、
（１）ベシクルおよび／または平面二分子膜を構成するための両親媒性分子と
（２）前記ベシクルを平面二分子膜上に固定するための手段と
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を封入したベシクルを用いた微生物の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々の生活において、微生物は非常に密接に関わっており、我々は微生物の活性による機能や微生物らが産生する代謝物質などを利用し、生活している。自然界には我々が未だに知らない微生物が数多く存在しており、自然界に存在する微生物の99%は未だに培養することができず、未知の有用物質を発見・獲得できずにいる。そのため新規の微生物培養法の開発が求められている。
近年、微生物の分取・培養法として、マイクロサイズ(細胞サイズ)のゲルドロップレットやwater-in-oil(W/O)ドロップレットを用いた手法が報告され注目されている(非特許文献１)。これらの手法の特徴として、一つ一つのドロップレットがリアクタとして反応・培養の場となり、菌体数を調整することで、１菌体／１ドロップレットが可能となり、シングルセル解析・培養が可能である。これらマイクロサイズのゲルドロップレットやW/Oドロップレットと同様に菌体の反応・培養場になりうる材料にリポソームがある。リポソームは細胞膜の基本構造である脂質二重膜で形成されたカプセルである。リポソームのカプセルとしての性質を利用した例として広く知られている手法に、リポソーム内部に薬剤などを封入し、目的の部位へ送達して治療を行うドラッグデリバリーシステム(DDS)がある。しかしながら、DDSに使用されるリポソームのサイズは、およそ10〜100nm程度のサイズであり、内部に封入できる物質の大きさや量に制限があり、また１リポソームを光学顕微鏡で観察することはできない。近年、マイクロサイズ(細胞サイズ；10〜100μm程度)の大きさを有するリポソームの作成技術が進化し、目的の物質を内部に封入し、人工細胞の開発や内部での化学反応による物質生産を行うマイクロリアクタとして利用され、また、光学顕微鏡でのリアルタイムな直接観察が可能となり、生物学・医学・産業の発展に応用されている。
【０００３】
微生物の分取・培養法として、マイクロサイズのゲルドロップレットおよびW/Oドロップレットを用いた手法が従来技術として挙げられる。これら問題点として、ゲルドロップレットでは、材料がゲルのため外部と内部を隔てる膜が存在せず、内部で増殖した微生物がゲルのメッシュを透過、同じく代謝産物が透過し有用物質が内部に保持できない。また、この透過性はメッシュサイズに依存するため制御は難しい。一方、W/Oドロップレットでは、内部に微生物を確実に封入し、膜を介してドロップレット外部と内部の物質移動もほとんど行われないために、内部で増殖した微生物・代謝産物などの有用物質を保持できるメリットはあるが、内部の栄養などが枯渇してしまうと補給することが難しい。また、油や有機溶剤を使用するので、微生物回収時に油や有機溶剤を100%除去するのは難しい。
【０００４】
以上の２つの手法と比較して、リポソーム内での微生物培養では、W/Oドロップレットと同様に、内部に微生物を確実に封入し、内部で増殖した微生物・代謝産物などの有用物質を保持できるメリットを維持しつつ、脂質二分子膜の半透過性の効果を利用し、溶媒分子・小さな分子が膜を通過することで適度な物質・栄養交換を可能である。また微生物回収時においても水溶液系なので、内部の微生物を非侵襲的に回収できることが可能である。このように、リポソーム内での微生物の保持は、ゲルドロップレットおよびW/Oドロップレットを用いた手法と比較して、同程度もしくはそれ以上の長時間培養と高密度培養を可能とする。
【０００５】
一方で、微生物をリポソーム内で培養する際には、一定の至適温度(例えば、37℃)で実験を行う必要性がある。温度コントローラーなどを用いて微生物が封入されたリポソームを含む溶液中の温度を一定に保つことができるが、温度コントローラーの熱により生じる溶液中の熱対流により、リポソームは溶液中でブラウン運動する。ブラウン運動は溶液中のリポソーム同士の衝突、ガラス基板との摩擦、カメラの視野から外れるなどの障害を招く。このブラウン運動を防ぎ、顕微鏡下で長時間の観察を容易に行うには、微生物を培養するリポソームを固定する必要があった。
【０００６】
リポソームを固定化する手段としては、ビオチン−アビジンを用いて基板上にリポソームを固定化する手法が報告されている。例えば、特許文献１は、脂質ナノチューブ部を有する脂質構造体の製造方法を開示しており、当該方法により製造されたナノ粒子含有リポソームの固定方法として、ビオチン−アビジンの相互作用を利用して、基板上に固定化する手法を開示している。より具体的には、Biotin(ビオチン)とBSAが結合したBiotin-BSAおよびCaseinによりスライドガラス基板の表面をコーティングし、リポソームの脂質膜中にBiotin-PEGが付加した脂質Biotin-PEG-DSPEを導入、さらに、リポソームを含む溶液中にStreptavidin溶液を添加することで、Streptavidinを介してナノ粒子含有リポソームをスライドガラス上に固定化する手法を開示している。
また、非特許文献２は、バイオチップ作製へ向けた人工細胞膜アレイの構築を課題として、リポソームを人工細胞膜として用いた三次元マイクロアレイを開示している。そして、非特許文献２は、固体基板上へリポソームを固定する手法として、疎水化オリゴヌクレオチドとリン脂質とからなるサポ―テッドメンブレンを基板上に覆い、疎水化オリゴヌクレオチドで標識したリポソームを調整し、基板上のメンブレンから伸びるオリゴヌクレオチドとリポソームの表面上に伸びるオリゴヌクレオチドとをリンカーオリゴヌクレオチドを介すことでリポソームを基板上に固定化する手法を開示する。
また非特許文献３は、微生物を内包したリポソームを製造する手法を開示しており、当該リポソームを顕微鏡下で観察するためリポソーム内部の溶液にスクロースを添加し、リポソームの外液にグルコースを用いることでリポソームの比重を重くし、基板上にリポソームを沈める手法を開示する。
しかしながら、上記文献にはリポソームに封入された微生物などの細胞を培養する目的でリポソームを長時間固定化する課題については記載がなく、これまでに細胞が封入されたリポソームなどのベシクルを長時間基板上に固定する手法については報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報第２０１２／１１７５８７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Minjeong Jang, et al., “Microdroplet-based Cell Culture Models and Their Application”, BioChip J. (2016) 10(4): 310-317, DOI 10.1007/s13206-016-0407-1
【非特許文献２】佐々木  善浩、秋吉  一成、”バイオチップ作製へ向けた人工細胞アレイの構築”、Annual Reports of the Institute of Biomaterials and Bioengineering (2009) 43, 26〜28
【非特許文献３】Sampreeti Chowdhuri, et al., “Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique”, ChemBioChem (2016) 17, 886−889, DOI: 10.1002/cbic.201500643
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決する課題は、両親媒性分子の二重膜から構成されるベシクルを用いて、基板上で細胞を長時間培養する方法であって、ベシクル内部に封入した細胞を安定的に保持できる方法の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、細胞を封入した両親媒性分子の二重膜から構成されるベシクルが、37℃の溶液温度条件下においても、ブラウン運動することなく、顕微鏡の同一視野内に数多くのベシクルを一度に長時間観察できるように、ベシクルをスライドガラスの基板上に固定化することを検討した。
まず、顕微鏡の同一視野内に数多くのベシクルを一度に観察できるように、ベシクル内の溶液にデキストランを加えてリポソームの比重を重くして、ガラス基板上に沈殿させる方法を試みた。比重を重くしたところ、37℃の溶液温度条件下においても、ブラウン運動することなく、基板上に並んだベシクルの数は向上した。しかし、ベシクルの中だけにデキストランが存在するためにベシクルの内側と外側の間に浸透圧差が生じたことやベシクルがガラス基板に直接接触することなどが要因で、基板上に接着して１〜２時間後にはベシクルの破裂や収縮、揺らぎなどの現象が観察され、長期培養等に耐えうるものではなかった。
【００１１】
次に、ベシクルの内部にLB培地とスクロースの混合溶液を用い、かつ、ベシクルを含む溶液(リポソームの外液)としてLB培地とグルコースの混合溶液を用いることでベシクルの比重を重くした。スクロースとグルコースの濃度を同じにすることで、ベシクルの内側と外側の間に浸透圧差が生じないように改善した。また、スライドガラスの基板上をBSAでコートし、ベシクルがガラスに直接接触しないように改善して、スクロースとグルコースの分子量の違いによる比重を利用してベシクルを沈降させた。しかしながら、基板上に接着したベシクルは、わずか１０分程度で中身が露出してしまい、長時間の観察はできなかった。
そこで、本発明者らは、Z.Nourin et al. Angrew. Chem. 2012, 124, 3168-3172を参照し、Biotin(ビオチン)とBSAが結合したBiotin-BSA、Neutravidin、ベシクルを構成するBiotin-PEGが付加した脂質(Biotin-PEG-lipid)を用いて、ベシクルをガラス基板上に固定させる方法を試みた。ベシクルは、内部にスクロースを混合したLB培地を用いて、外液にグルコースを混合したLB培地を用いることで、先ほどと同様に比重差をつけた。ベシクル内部の比重を重くすることで、固定化までの時間を短縮でき、倒立型顕微鏡における同一視野内に数多くのベシクルを並べることができ、また同時観察を容易にすることができた。その結果、固定化から２時間後においても８０％以上のリポソームが基板上に残存していることを確認できた。しかしながら、この方法でも、２時間後のリポソームの形が歪んでいたり、２４時間後には約２０％程度しかリポソームは残っておらず不十分な結果となった。
そこで、本発明者らは、スライドガラス上を両親媒性分子からなる平面脂質二重膜で覆い、かつ、当該二重膜から伸びるBiotin-PEGと、Neutravidin、Biotin-PEG-lipidとを用いてベシクルを固定化する手法を着想した。この方法について鋭意検討した結果、２４時間後であっても、７０％以上のベシクルを変形などの歪みがない球状の状態で維持できることを見出した。本発明は当該知見に基づき完成されたものである。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む：
本発明は、一態様において
〔１〕両親媒性分子の二重膜から構成されるベシクルを用いて細胞を培養する方法であって、
前記細胞が封入された前記ベシクルを作製する工程と、
両親媒性分子から構成される平面二重膜で表面が覆われた基板上に、固定化手段を介して前記ベシクルを固定する工程と、
前記ベシクル内で前記細胞を培養する工程と
を含む、培養方法に関する。
ここで、本発明の培養方法は、一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載の培養方法であって、
前記ベシクルの内水相が外水相に対して比重が高くなるように調製されることを特徴とする。
また、本発明の培養方法は、一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載の培養方法であって、
前記ベシクルの直径が１〜１００μｍの範囲内にあるものを含むことを特徴とする。
また、本発明の培養方法は、一実施の形態において、
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の培養方法であって、
前記ベシクルの前記基板上への固定が、ビオチン結合性タンパク質およびアビジン結合性タンパク質の組み合わせ、または、相補的なオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて行われることを特徴とする。
また、本発明の培養方法は、一実施の形態において、
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の培養方法であって、
前記ベシクルが前記細胞を一細胞単位で含むことを特徴とする。
また、本発明の培養方法は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の培養方法であって、
前記ベシクルの前記基板上への固定が、疎水性オリゴヌクレオチドと当該疎水性オリゴヌクレオチドに相補性を有するリンカーオリゴヌクレオチドとを介して固定されるものではないことを特徴とする。
また、本発明の培養方法は、一実施の形態において、
〔７〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の培養方法であって、
前記ベシクルの前記基板上への固定化手段が、ビオチン結合性タンパク質およびアビジン結合性タンパク質であることを特徴とする。
また、本発明の培養方法は、一実施の形態において、
〔８〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の培養方法であって、
前記ベシクルの前記基板上への固定が、前記平面二重膜上のビオチンと、前記ベシクルを構成する二重膜上のビオチンと、前記２つのビオチンの両方に結合するアビジンを介して行われることを特徴とする。
また、本発明の培養方法は、一実施の形態において、
〔９〕上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の培養方法であって、
前記培養工程が、前記ベシクルの内水相および／または外水相の環境を変化させながら培養することを含むことを特徴とする。
また、本発明の培養方法は、一実施の形態において、
〔１０〕上記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の培養方法であって、
前記培養工程が、リアルタイムに前記細胞の増殖を観察しながら培養を行う工程であって、所望の状態となるまで前記細胞を培養する工程である、培養方法。
また、本発明の培養方法は、一実施の形態において、
〔１１〕上記〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の培養方法であって、
前記細胞が、ベシクルへの封入前に前培養したものであることを特徴とする。
また、本発明の培養方法は、一実施の形態において、
〔１２〕上記〔８〕〜〔１１〕のいずれかに記載の培養方法であって、
前記細胞を培養する工程が１時間以上培養を行う工程であることを特徴とする。
また、本発明の培養方法は、別の態様において、
〔１３〕上記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の培養方法に用いるキットであって、
(１)ベシクルおよび／または平面二重膜を構成するための両親媒性分子と
(２)前記ベシクルを平面二重膜上に固定するための手段と
を含む、キットに関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、両親媒性分子の二重膜から構成されるベシクルを基板上に固定し、基板上で細胞を長時間培養することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａは、下記実施例１に示されるリポソームのガラス基板への固定化法及びその観察方法の模式図を示す。また、図１Ｂおよび図１Ｃは、下記実施例１に示されるマイクロリポソーム固定化後の安定性解析の結果を示す。より具体的には、図１Ｂはマイクロリポソーム固定化後の観察開始時におけるリポソームの顕微鏡画像、及び、マイクロリポソーム固定化後２４時間経過時のリポソームの顕微鏡画像を示す。図１Ｃは経過時間ごとのリポソームの残存率を示す。
【図２】図２Ａは、大腸菌封入W/Oドロップレットを用いた界面通過法により大腸菌封入リポソームを作製する際の模式図を示す。図２Ｂは、大腸菌封入リポソームの顕微鏡画像(左：蛍光像、右：位相差像)を示す。
【図３】図３Ａは、バルク溶液中での大腸菌をSYTOTM9およびPIで染色した際の蛍光像を示す。図３Ｂは、実施例２で作製したリポソーム内に封入した大腸菌をSYTOTM9およびPIで染色した際の蛍光像を示す。図３Ｃは、バルク溶液及びリポソーム内での大腸菌の生存率を示すグラフである。
【図４】図４は、BiotinとNeutravidinとを介して、大腸菌を封入するリポソームをガラス基板上に固定化し、37度で培養を行った際のリポソームの写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、一態様において、両親媒性分子の二分子膜から構成されるベシクルを用いて細胞を培養する方法に関し、当該方法は、微生物が封入されたベシクルを作製する工程と、両親媒性分子から構成される平面二分子膜で表面が覆われた基板上に、固定化手段を介してベシクルを固定する工程と、ベシクル内で細胞を培養する工程とを含む。
【００１６】
ここで、本明細書において「両親媒性分子の二重膜から構成されるベシクル」とは、両親媒性分子の二重膜から構成され、球殻状に閉じた膜構造を有する球状のカプセルであり、かつ、内部に液層を含むものをいう。このようなベシクルとしては、以下に限定されないが、リポソームやポリマーソームを挙げることができる。
【００１７】
本発明に用いる「ベシクル」の大きさは、その内部において細胞を封入でき、かつ、安定的に細胞を長期培養可能である限りにおいて制限されず、マイクロサイズ(例えば、ベシクルの直径が1〜150μm、より好ましくは5〜100μm、さらに好ましくは5〜50μm)やナノサイズ(例えば、ベシクルの直径が1〜1000nm、より好ましくは10〜1000nm、さらに好ましくは100〜1000nm)とすることができる。より好ましい実施の形態においては、ベシクルはマイクロサイズである。
【００１８】
ベシクルの二重膜を構成する「両親媒性分子」としては、細胞の封入および長期培養が可能なベシクルを構成できる限りにおいて限定されず、リポソームを構成するリン脂質やポリマーソームを構成する人工的に作成された高分子などを用いることができる。このような両親媒性分子としては天然物由来、人工合成物、動物・植物細胞抽出物を使用することができる。具体的には、以下に限定されないが例えば、ホスホコリン(PC)、ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルセリン(PS)、Cardiolipinなどのリン脂質群；セラミド、スフィンゴミエリン、糖脂質GM1、GM3などのスフィンゴ脂質；コレステロールならびにその誘導体および酸化物などのステロール骨格を有する脂質群、DOTAPなどの正電荷を有する脂質；蛍光標識された脂質；PEGなどの高分子を標識された脂質など人工的に作成された脂質：Poly(styrene)-block-(poly(ehtylene glycol), Poly(styrene)-block-poly(acrylic acid)などのポリマーソームを構成する高分子を挙げることができる。
【００１９】
リン脂質の具体例としては、1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)、1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)、1,2-dipalmitoyl -sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)、L-α-phosphatidylcholine (Egg PC)などのホスホコリンまたはそれらの頭部がホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルセリン(PS)、Cardiolipinの頭部と置換されたものを挙げることができる。また、リン脂質は、解析や基板上への固定化のため、蛍光修飾されたリン脂質(例えば、蛍光修飾リン脂質Rhodamine B-1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamine (Rhodamine-DHPE)など)、Biotin-PEGが付加されたリン脂質(ビオチン-ポリエチレングリコール修飾リン脂質1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] (Biotin-PEG-DSPE)などを用いてもよい。その他、リポソームを構成するリン脂質として公知のものも用いることができる。
【００２０】
リン脂質の構成比は、用いる脂質や目的に応じて適宜調整することができる。例えば、マイクロサイズのリポソーム作製の一例として、３種類の脂質POPC：Rhodamine-DHPE：Biotin-PEG2000-DSPEを1mM: 0.001mM: 0.002mMの割合で混合したものを用いることができる。
また、ポリマーソームを構成する高分子としては、例えば、上記のPoly(styrene)-block-(poly(ehtylene glycol), Poly(styrene)-block-poly(acrylic acid)などを好適に用いることができる。その他、ポリマーソームを構成する高分子として公知のもの(例えば、特開２０１１−１８３３０９号公報に開示される高分子)を用いることができる。
【００２１】
また、本発明の方法に適用可能な細胞としては、ベシクル内で生育または増殖可能な細胞であれば特に制限されず、例えば、大腸菌、枯草菌、放線菌、根粒菌などを挙げることができる。ベシクルに封入する細胞として微生物を用いる場合は、環境由来の微生物であってもよく、または遺伝子導入などが施された組換え微生物など、人工的に作製されたものであってもよい。
【００２２】
本発明の培養方法に係る一実施の形態において、ベシクルに封入される細胞は環境由来の微生物とすることができる。本発明の方法は、例えば、土壌等の環境中に含まれる微生物群を対象とすることができる。環境中に含まれる微生物群をベシクルに封入させることで、各ベシクルに含まれる微生物ごとの性質に応じた増殖を観察でき、異なる増殖能を示すベシクルごとに解析や分取することができる。特に、一細胞ごとに微生物をベシクル中に封入することで、異なる生育や増殖能等を示す微生物を含むベシクルごとに単離が可能となる。
【００２３】
本発明の培養方法に係る一実施の形態において、ベシクル中に封入される細胞は、封入前に前培養を行ったものを用いることができる。本明細書において「前培養」とは、細胞濃度をある程度揃えるために、定常期まで細胞を培養することをいう。前培養の条件は、用いる細胞や目的とする培養により異なるが、例えば、大腸菌をベシクル中に封入する際には、毎回約12時間程度培養し、その後、新しい液体培地に移し替え2時間の前培養を行うことが好ましい。前培養を行うことで、毎回ほぼ同じ濃度の細胞懸濁液を得ることが出来好ましい。
【００２４】
本発明の培養方法は、細胞が封入されたベシクルを作製する工程を含む。
ここで、リポソームを作製する方法は公知であり、例えば、下記実施例で用いた遠心機の遠心力を利用した界面通過法、この他に、ガラス基板に脂質フィルムを形成し水和・膨潤させることにより作成する静置水和法、電圧印可によって脂質フィルムからリポソームを形成するエレクトロフォーメーション法、あらかじめ脂質二分子膜を作成し、そこにノズルを近づけジェット水流を吹き付け、シャボン玉をつくる要領で作成するパルスジェット法、マイクロ流路を用いて作製する方法などにより作製することができる。
【００２５】
上記の遠心力を利用した界面透過法を用いたリポソームの作製方法を例示として具体的に説明する。
1.5mlのマイクロチューブ内に水溶液(リポソームの外側の溶液(外水相))を先に加え、後からリン脂質が溶けた油を積層させることで、油と水の界面に脂質単層膜(油水界面)が形成される。次に、別のチューブを用意し、リン脂質が溶けた油をチューブに加え、その油の中に、水溶液(リポソームの内側の溶液(内水相)：大腸菌が封入される溶液)を加える。その後、タッピングし、マイクロサイズのエマルション(油中水滴)を作製する。作製した油中水滴を、先ほど油水界面を作製したマイクロチューブ内に全量投入し、遠心機にセット、遠心する。遠心力によって、脂質単層膜を通過し、マイクロサイズのリポソームが形成される。
また、ポリマーソームを作製する方法も公知であり、例えば、リポソームの作製方法と同様の方法を利用することにより行うことができる。またポリマーソームの作製方法は、例えば、特開２０１１−１８３３０９号公報を参照して実施することができる。
【００２６】
リポソームやポリマーソームなどのベシクルへの細胞の封入方法は、例えば、ベシクルの内水相となる溶液中に細胞を懸濁し、当該溶液を用いて上記リポソームやポリマーソームを作製することにより達成できる。
ベシクル内に封入される細胞の数は、一細胞単位で封入されてもよく、または、二細胞以上の複数の細胞単位で封入されても良い。二細胞以上の複数の細胞単位で封入する場合、細胞は一つの種に由来するものでも良く、二種以上の細胞が封入されても良い。
本発明の一実施の形態においては、二種以上の細胞(例えば、微生物)を含むベシクルを作製しても良い。一つのベシクル内に二種以上の微生物を含むことにより、一つのベシクル内に封入された微生物間の相互作用の影響について検証することが可能となる。
また、本発明の培養方法に係る一実施の形態において、ベシクルは細胞を一単位で含むことができる。ベシクル中に一細胞単位で細胞を封入させる方法は公知である。例えば、遠心力を利用した界面透過法によりベシクルを作製する際には、細胞が内部に封入されたW/Oドロップレットの作製時に、当該W/Oドロップレット内に細胞が一細胞ずつ含まれるようにW/Oドロップレットを調製すればよい。このようなW/Oドロップレットを調製する方法は公知である(例えば、Boedicker J. Q. et al., “Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics” Lab on a Chip, 2008; 8, 1265-1272)。具体的には、以下に限定されないが、ポワソン分布に従い、水相中に存在する細胞数とW/Oドロップレット数の調整をすることで、１細胞が封入されたドロップレットを作製することができる。このようなドロップレット内に含まれる微生物は、単一の細胞由来の微生物である。特に、複数種の微生物を含む試料から特定の微生物種の観察・単離を目的とする場合、ベシクル内には一細胞単位で微生物を含むことが好ましい。よって、複数の微生物種を含む微生物群を試料とした場合、異なる増殖能を示すドロップレットごとに選択的に分取することで、各微生物の解析、スケールアップに寄与することができる。
また、ドロップレット内に二種以上の微生物を封入する際にも、各種ごとに一細胞単位でドロップレット内に微生物を封入させることもできる。
【００２７】
また、上述のように、本発明の培養方法は、一実施の形態において、ベシクル内に細胞を二細胞以上で含むことができる。各ベシクル中に複数の細胞を封入することで所望する細胞数や状態までの生育に必要な培養時間を短縮することができ好ましい。また、共生関係を持つ微生物同士が同一ベシクル内に封入された場合、微生物相互間作用等によって増殖が促進されるという効果も期待される。
【００２８】
ベシクル内の水相は、封入対象の細胞が生育、増殖等できる環境であれば制限されない。ベシクル内の水相を構成する溶媒として、例えば、細胞ごとに適した培養液を用いることができる。具体的には、以下に制限されないが、例えば、LB培地、NB培地、SCD培地、MS培地などを用いることができる。
ベシクル外水相は、ベシクルの構造が維持でき、かつ、ベシクル内の細胞の培養が培養可能である限りにおいて限定されず、基本的にはベシクル内の水相と同じ溶液を用いることが好ましい。また、ベシクル外水相は、ベシクル内の細胞に栄養を与える目的や培養条件に変化を与える目的で、他の成分を含むことができる。
【００２９】
また、本発明の培養方法に係る一実施の形態において、ベシクルの内水相が外水相に対して比重が高くなるように調製される。ベシクルの内水相と外水相に比重差をかけることでベシクルが基板上への固定の時間を短縮し、固定化率を上げることができる。このような効果が得られる限り比重差をつける方法は限定されないが、例えばベシクルの内水相と外水相との比重に差をつけるために比重剤を用いることができる。用いる比重剤としては、ベシクルの形成や安定性に悪影響がなく、水に可溶な物質であることが好ましい。例えば、下記実施例で用いているスクロースやデキストランの他に、塩化カリウム、ポリエチレングリコール(PEG)などを挙げることができる。実際の使用にあたっては、ベシクルに浸透圧を与えてしまうとベシクルは変形や壊れてしまうので、脂質膜内外の塩濃度を均等にしていなければならない。そのため下記実施例のように、内水相にスクロース(二糖)を用い、外水相にグルコース(一糖)を用いる組み合わせや、内水相に塩化カリウム(二価)を用い、外水相に塩化ナトリウム(一価)を用いるというような組み合わせで用いることができる。内水相と外水相との浸透圧差によりベシクルの構造が変形しない限り、比重剤の組み合わせは上記のものに限定されない。
【００３０】
ベシクル内水相の比重を重くするために、内水相に添加する比重剤は、外水相に添加する比重剤の分子量よりも大きくする必要がある。内水相に添加する比重剤の分子量は、特に限定されないが、好ましくは外水相に添加する比重剤の分子量の１．５倍〜３倍程度、さらに好ましくは、１.８倍から２倍程度である。
また、内水相に添加する比重剤のモル濃度と、外水相に添加する比重剤のモル濃度は浸透圧差がないように実質的に同じとする。ここで、「実質的に同じ」とは、同じか又は異なってはいるが、その差はベシクルの形成や安定性に悪影響を与えない程度に小さいことを意味し、好ましくは、内水相に添加する比重剤のモル濃度は、外水相に添加する比重剤のモル濃度の90％〜110％、さらに好ましくは95％〜105％、最も好ましくは100％(モル濃度が同じ)である。
比重剤として内水相にスクロースを用い、外水相にグルコースを用いる場合、比重剤の濃度は50mM〜1Mとすることができ、より好ましくは100mM〜500mM、さらに好ましくは200mM〜400mMである。他の比重剤を用いる場合、当業者は適宜比重剤の添加濃度を調整することができる。
【００３１】
本発明の培養方法は、細胞が封入されたベシクルを作製する工程の後、両親媒性分子から構成される平面二重膜で表面が覆われた基板上に、固定化手段を介してベシクルを固定する工程を含む。
【００３２】
本明細書において、「両親媒性分子から構成される平面二重膜」とは、基板上を覆うための二重膜であって、長時間の培養条件下においてベシクルが直接基板に接触して崩壊するのを防ぐために用いられる。
平面二重膜を構成する両親媒性分子としては、長時間の培養条件下においてベシクルが直接基板に接触することを防ぐことができる限りにおいて限定されず、上記に列挙するようなリポソームやポリマーソームを形成する脂質や高分子を用いることができる。複数の脂質や高分子を組み合わせて用いる場合も、ベシクルの作製にならい適宜構成成分の構成比を調製可能である。
【００３３】
本発明に用いることのできる「基板」は、細胞培養に用いることができれば限定されず、顕微鏡下において培養中の細胞が観察できる程度に透明なものであることが好ましい。例えば、ガラス基板、PDMS樹脂、透明アクリル板などを用いることができる。ガラス基板としては市販のもの(例えば、松浪硝子工業、カバーガラス30×40、厚さNo.3(0.25mm-0.35mm)を用いることができる。また、培養中または顕微鏡観察時に蓋をする役割で使うカバーガラスも市販のもの(松浪硝子工業、カバーガラス18×18、厚さNo.1(0.12mm-0.17mm)を用いることができる。
【００３４】
基板上に平面二重膜を形成する方法を具体的に説明する。下記では、両親媒性分子から構成される平面二重膜の原料としてナノサイズリポソームを用いる方法を例示する。なお、基板上に平面二重膜を形成する方法は下記に限定されない。
まず、ナノサイズリポソーム溶液を調製し、ナノサイズリポソーム溶液をガラス基板上に撒く。ナノサイズリポソーム溶液が乾燥しないように気をつけながら、30分静置する。静置によりリポソームがガラス基板と接触することで壊れ、自発的にガラス基板上に脂質二分子膜が形成される。
【００３５】
なお、ナノサイズリポソームの製造方法は公知であり、例えば、以下のようにして製造することができる。
ガラスバイアルチューブ(ダーラム管)に、クロロホルム/メタノール混合溶液(2/1 v/v)中に脂質成分(平面二重膜となる両親媒性分子)が溶けた脂質溶液を加える。有機溶剤を飛ばし、ガラス壁面に脂質で出来たフィルムを形成する。その後、完全にクロロホルム/メタノールを飛ばすために、真空デシケーター内で１時間程度置いておく。１時間後、溶液(LB培地とグルコースの混合溶液)を適量加えて、超音波洗浄機で１時間ソニケーションを行い、脂質成分を溶液に溶かし込む。脂質成分が溶解した溶液とエクストルーダーを用いて、ナノサイズのリポソームを作製する。
基板上を覆う平面二重膜は基板全体を覆うことが好ましいが、長時間の培養条件下においてベシクルが直接基板に接触して崩壊するのを防ぐことが可能な限りにおいて、基板上を部分的に覆う形態であってもよい。
【００３６】
上述のようにして作成された両親媒性分子から構成される平面二重膜で表面が覆われた基板上に、固定化手段を介してベシクルを固定する。
本明細書において「固定化手段」とは、培養中のベシクルが対流などにより移動しないように、基板上の平面二重膜に固定するための手段をいう。本発明に用いられる固定化手段としては、基板上の平面二重膜と細胞を封入するベシクルとを固定でき、かつ、細胞の培養を阻害しないものである限り限定されない。
このような固定化手段としては、以下に限定されないが、例えば、Biotinタンパク質およびAvidinタンパク質の組み合わせ、コレステリル基を有する疎水化オリゴヌクレオチドおよび当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するリンカーオリゴヌクレオチドの組み合わせなどを挙げることができる。
好ましい一実施の形態においては、固定化手段はBiotinタンパク質およびAvidinタンパク質の組み合わせである。固定化手段としてBiotinタンパク質およびAvidinタンパク質を用いる場合、例えば、以下のようにして固定することができる。まず、ベシクルおよび基板上の平面二重膜を構成する成分中にBiotinが付加された脂質や高分子を用いて細胞が封入されたベシクルの調製、および、基板上への平面二重膜の形成を行う。平面二重膜で覆われた基板上に、細胞が封入されたベシクルを含む溶液を添加するが、このときAvidinを添加しておくことで、ベシクルを構成する二重膜から伸びるBiotinと溶液中のAvidinが結合し、かつ、基板上の平面二重膜から伸びるBiotinと溶液中のAvidinが結合することによりベシクルが基板上(より詳細には基板上の平面二重膜上)に固定される。なお、固定化手段としてBiotinタンパク質およびAvidinタンパク質を用いる場合、ベシクルおよび平面二重膜を構成する両親媒性分子としてBiotinが導入されたリン脂質などを用いることができ、市販の1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] (Biotin-PEG-DSPE)などを用いることができる。また、Avidinタンパク質として、市販のNeutravidin(Thermo Fisher Scientific, 31000)などを用いることができる。
【００３７】
また、コレステリル基を有する疎水化オリゴヌクレオチドおよび当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するリンカーオリゴヌクレオチドの組み合わせを介して、ベシクルを基板上に固定化する手法としては、例えば、オリゴヌクレオチドとリン脂質とからなるサポ―テッドメンブレンで基板上を覆い、コレステリル基を有する疎水化オリゴヌクレオチドを含んだリポソームを調整し、基板上のメンブレンから伸びるオリゴヌクレオチドとリポソームの表面上に伸びるオリゴヌクレオチドとをリンカーオリゴヌクレオチドを介すことでリポソームを基板上に固定化することができる。
【００３８】
リポソームを構成する脂質二重膜中に、Biotinタンパク質やオリゴヌクレオチドが付加された両親媒性分子を導入する際、他のリン脂質に対する割合は用いる固定化手段などにより適宜設定することができ、例えば、0.1mol%〜100mol%の範囲で導入することが好ましく、0.2mol%〜5mol%の範囲で導入することがより好ましい。
また、基板上の平面二重膜中に、ビオチン結合性タンパク質を有する両親媒性分子や疎水化オリゴヌクレオチドなどの固定化手段を導入する際、他のリン脂質に対する割合も適宜設定することができ、例えば、0.1mol%〜100mol%の範囲で導入することが好ましく、0.2mol%〜5mol%の範囲で導入することがより好ましい。
【００３９】
なお、本発明の培養方法に係る一実施の形態において、ベシクルの基板上への固定は、コレステリル基を有する疎水化オリゴヌクレオチドと当該疎水化オリゴヌクレオチドに相補性を有するリンカーオリゴヌクレオチドとを介して固定されるものを含まない。
【００４０】
本発明の培養方法は、ベシクルを基板上に固定した後、ベシクル内で細胞を培養する工程を含む。
基板上に固定したベシクル内で細胞を培養する際の培養条件は、ベシクル内に含まれる細胞が生育や増殖等できる条件であれば特に制限されず、当業者であれば、培養の目的や培養の対象となる微生物に応じて適宜好ましい培養条件を設定することができる。以下に限定されないが、例えば、温度条件は4〜95℃とすることができる。培養時間も特に制限されず、少なくとも１時間以上行うことができ、例えば、好ましくは24時間以上行うことができる。
【００４１】
本発明の培養方法に係る一実施の形態において、培養工程は、ベシクルの内水相および／または外水相の環境を変化させながら培養することを含む。
ここで、内水相および／または外水相の環境の変化とは、例えば、pHの変化、温度変化、成長活性因子などの添加、抗生物質などの成長抑制因子などの添加などを挙げることができる。このような環境の変化を与えることで培養中の細胞の生育への影響を観察することができる。
【００４２】
培養工程において、ベシクル中の細胞は顕微鏡下で観察することが可能である。これにより、リアルタイムに培養中の細胞の挙動を解析、評価することができる。
すなわち、本発明の培養方法に係る一実施の形態において、培養工程は、リアルタイムに細胞の増殖を観察しながら培養を行う工程であって、所望の状態となるまで前記細胞を培養する工程とすることができる。
ここで、「所望の状態」とは、培養している細胞の細胞密度、細胞の形状などを含む。このように、本実施の培養方法は、リポソーム中で培養する細胞をリアルタイムにモニタリングすることで細胞密度などの細胞の状態を観察・制御可能な手法である。
【００４３】
本発明は、一態様として、両親媒性分子の二重膜から構成されるベシクルを用いて細胞を培養する方法に用いるキットを提供する。
本発明のキットは、(１)ベシクルおよび／または平面二重膜を構成するための両親媒性分子と、(２)ベシクルを平面二重膜上に固定するための手段とを含む。
(１)ベシクルおよび／または平面二重膜を構成するための両親媒性分子と、(２)ベシクルを平面二重膜上に固定するための手段は、本発明の培養方法として上記に開示するものを含む。また本発明のキットには、上記の構成以外のものも含まれてよく、比重剤、培養液、培養皿などが含まれていても良い。
【実施例】
【００４４】
以下に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、本明細書中で引用する文献の内容は、本明細書に参照として組み込まれる。
なお、以下の実施例では、両親媒性分子の二重膜から構成されるベシクルとしてリポソームを採用し、当該リポソームに封入する細胞として大腸菌を用いた例を具体的に示す。
【００４５】
（実施例１：リポソームのガラス基板への固定化）
スライドガラス(松浪硝子工業、カバーガラス30×40、厚さNo.3(0.25mm-0.35mm)のガラス基板上に穴(穴の直径は、約7mm)を空けた両面テープ(厚さ1mm)を貼る。その穴に、エクストルーダー(Avanti polar lipids, 610000)を使用して作製した100nmのサイズのナノサイズリポソーム溶液(溶液はLB培地と200mMグルコース溶液の混合溶液)を添加し30分ほど静置した。静置することにより、ナノサイズリポソームがガラス基板に接触し、リポソームが崩壊することで平面脂質二分子膜を基板上に形成する。なお、ナノサイズリポソームの脂質二重膜を構成する脂質の組成は、POPC：Biotin-PEG2000-DSPE=1mM: 0.002mMである。30分の静置後、LB培地と200mMグルコース溶液の混合溶液でガラス基板上のwashを２回行ったのち、Neutravidin溶液(Thermo Fisher Scientific, 31000)(溶媒としてはLB培地と200mMグルコース溶液の混合溶液を使用)を添加し30分ほど静置した。その後同じくLB培地と200mMグルコース溶液の混合溶液でwashを２回行った。最後にマイクロサイズリポソームを添加し、観察を開始した。マイクロサイズリポソームは、卓上遠心機の遠心力を利用して、界面透過法によって作製した。マイクロサイズリポソームの脂質二重膜を構成する脂質の組成は、POPC：Rhodamine-DHPE：Biotin-PEG2000-DSPEを1mM: 0.001mM: 0.002mMを用いた。
その結果、観察開始後24時間経過しても70%以上のマイクロリポソームが壊れることなく観察することができた。これは、ガラス基板に平面脂質二分子膜が敷いてあるので、リポソームとガラス基板の直接的な接触による崩壊が抑えられたためと考えられる。また、ガラス基板上にマイクロリポソームを固定することで、ヒートステージで熱を加えても、対流によるリポソームのブラウン運動による移動を抑えることができ、同じく基板との直接的な接触を防げたためであると考えらえる。
【００４６】
（実施例２：リポソーム内への大腸菌の封入）
リポソームへ封入する大腸菌は、LB培地中でOD600=1.1〜1.5となるまで前培養(約2時間程度培養)したものを用いた。前培養後の大腸菌は、実験時に1/100倍に希釈し使用した。大腸菌を封入するリポソームの作製方法は卓上遠心機の遠心力を利用した界面通過法を用いて行った。
まず、大腸菌が封入されたW/Oドロップレットを作製した。作製方法は、0.6mLマイクロチューブに、脂質(POPC：Rhodamine-DHPE：Biotin-PEG2000-DSPEを1mM: 0.001mM: 0.002mM)が溶けたミネラルオイル(ナカライテスク、23334-85)を入れ、そこに、大腸菌を1/100倍に希釈した溶液(希釈溶液は、LB培地と200mMスクロース溶液の混合溶液)を加え、タッピングによって作製した。W/Oドロップレットの直径は、約1~100μm程度とした。W/Oドロップレットの水相として用いた溶液は、上記で希釈した大腸菌を含むLB培地にスクロース(終濃度200mM)を用いた。油相にはPOPC：Rhodamine-DHPE：Biotin-PEG2000-DSPEを1mM: 0.001mM: 0.002mMの組成比を有するものを用いた。大腸菌が封入されたW/Oドロップレットを作製後、当該W/Oドロップレットを脂質で覆われた油と水溶液(200mMグルコース含有LB培地)の界面を通過させることで、大腸菌が封入された脂質二分子膜を有するマイクロサイズリポソームを作製した(図２Ａ)。本実施例では、脂質膜をRhodamine-DHPE(赤色)と大腸菌をSYTO TM 9(緑色)で染色し蛍光像を取得した。大腸菌の染色は、大腸菌を1/100倍に希釈した溶液を作製する際に、SYTOTM9を溶液に一緒に加え、20分ほど静置して行った。また、本実施例では、同時に位相差像でも大腸菌が封入されているか観察を行った。大腸菌を封入したマイクロサイズリポソームの顕微鏡写真を図２Ｂに示す。図２Ｂに示すように、１つのリポソーム中に２個程度から数えられないくらいの数の大腸菌を封入されていることが観察できた。また、大腸菌が封入されたマイクロサイズリポソームの大きさは約20μｍであった。
【００４７】
（実施例３：リポソーム内での大腸菌の生存率解析）
実施例２に記載の大腸菌封入マイクロサイズリポソームの作製過程において、マイクロサイズリポソーム中に封入された大腸菌の生存率について解析した。解析方法は、生菌と死菌の両方を染色するSYTOTM9と呼ばれる染色剤と、死菌のみを染色するPropidium iodide(PI)と呼ばれる染色剤を用いて行った。具体的には、当該染色剤を用いて大腸菌を染色し、各々の蛍光を励起する波長の光を照射し、大腸菌が発する蛍光の色から生存率を解析した。生きている大腸菌は緑色を示すのに対し、死んだ大腸菌は赤色もしくは黄色(赤と緑の重ね合わせ)を示す。大腸菌の生存率を解析すると、マイクロサイズリポソームに封入する前の培養液中の大腸菌では、100%の割合で生きた大腸菌が観察されたが、マイクロサイズリポソームに封入した場合93%程度になることがわかった。いくらかの大腸菌は死んでしまうが、ほぼ非侵襲的に大腸菌をリポソームに封入できることが示された。
【００４８】
（実施例４：リポソーム内での大腸菌の高密度培養）
マイクロサイズリポソーム内に封入された大腸菌の培養実験を行った。大腸菌が封入されたマイクロサイズリポソームは、実施例２に記載の方法により作製したものを用いた。また、大腸菌が封入されたマイクロサイズリポソームは、実施例１に記載の方法と同様に、穴の空いた両面テープが貼られたスライドガラス上に固定した。すなわち、ガラス基板はその表面に脂質二分子膜を形成させたものを用いた。また、脂質二分子膜上のBiotinと、Neutravidinと、マイクロサイズリポソームを構成する脂質二分子膜上のBiotinとを介してマイクロサイズリポソームをガラス基板上(より詳細には、ガラス基板上の脂質二分子膜上)に固定化した。培養時には、両面テープの上からカバーガラスを覆い、顕微鏡のステージ温度を37度にセットして培養を行った。培養中、カメラを用いて、１リポソームの中にいる大腸菌の増殖程度を、写真を撮影して確認した。
撮影した写真図を図４に示す。図４に示すように、培養スタート時では数えられる程度の大腸菌が封入されていたが、時間が経過するとともに、大腸菌が増殖し、数えるのが困難な状況まで増殖した。以上のように、マイクロサイズリポソーム内での大腸菌の培養ができることを明らかにした。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の培養方法によれば、長時間の培養や環境変化に対する細胞の反応をベシクルに封入したままリアルタイムに解析できるようになる。また、適度な物質透過性を有した膜に覆われたマイクロサイズの閉鎖空間内で高密度培養することも可能である。
これまでDDSなどに使用されてきたナノサイズ(10〜100nm程度)のベシクルでは、細胞の封入および培養が実現不可能であった。しかしながら、本発明の方法によれば、マイクロサイズ(10〜100μm程度)のベシクル内での細胞の培養を実現することが可能となり、将来的に、健康に良いとされる微生物の封入・培養の実現による医薬品・リポソーム製剤への応用展開、及び、未知微生物の封入・培養の実現によるバイオ工学・産業界への応用展開が期待出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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