(57)【要約】      （修正有）【課題】新たなキシラナーゼの提供。【解決手段】下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチド：（Ａ）ある特定のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、（Ｂ）前記ある特定のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列。該ポリペプチドをキシランに作用させる、キシロオリゴ糖の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチド：
（Ａ）配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
エンド型キシラナーゼ活性が４−Ｏ−メチルグルクロニル側鎖を有するキシラン及びアラビノフラノシル側鎖を有するキシランを基質とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号４のアミノ酸配列における下記のアミノ酸残基が保存されている、請求項１又は２に記載のポリペプチド：
６位のアスパラギン、１２位のグルタミン、１６位のグリシン、１８位のグリシン、２０位のセリン、２２位のアラニン、２３位のフェニルアラニン、２４位のグリシン、４５位のフェニルアラニン、５２位のグリシン、５５位のイソロイシン、５７位のアルギニン、５８位のアスパラギン、６０位のイソロイシン、６７位のイソロイシン、６９位のプロリン、７２位のプロリン、７５位のプロリン、８１位のチロシン、８７位のアスパラギン酸、９０位のグルタミン、９７位のアラニン、１０６位のチロシン、１０７位のアラニン、１０８位のアスパラギン酸、１０９位のアラニン、１１０位のトリプトファン、１１２位のアラニン、１１３位のプロリン、１１６位のメチオニン、１１７位のリジン、１１８位のトレオニン、１２６位のグリシン、１２９位のシステイン、１３０位のグリシン、１３３位のグリシン、１３６位のシステイン、１４０位のアスパラギン酸、１４１位のトリプトファン、１４２位のアルギニン、１４３位のグルタミン、１４４位のアラニン、１４５位のチロシン、１４６位のアラニン、１４９位のロイシン、１５０位のバリン、１５１位のグルタミン、１５２位のチロシン、１５６位のチロシン、１６０位のグリシン、１６７位のグリシン、１７０位のアスパラギン、１７１位のグルタミン酸、１７２位のプロリン、１８９位のアラニン、１９２位のフェニルアラニン、１９６位のロイシン、２０３位のアラニン、２１１位のシステイン、２１２位のシステイン、２１３位のアスパラギン酸、２１６位のグリシン、２２７位のロイシン、２３０位のアラニン、２３１位のグリシン、２３５位のチロシン、２４０位のトレオニン、２４２位のヒスチジン、２４４位のチロシン、２４６位のセリン、２５１位のプロリン、２６１位のトレオニン、２６２位のグルタミン酸、２７３位のトレオニン、２７４位のトリプトファン、２７８位のグリシン、２８２位のグルタミン酸、２８３位のグリシン、２８６位のトリプトファン、２８７位のアラニン、２９５位のバリン、３００位のセリン、３０５位のトリプトファン、３２８位のセリン、３３２位のトリプトファン、３３３位のアラニン、３３４位のフェニルアラニン、３３５位のアラニン、３３９位のアルギニン、３４２位のアルギニン、３４３位のプロリン、３４７位のアルギニン、３５６位のアスパラギン、３６４位のアスパラギン、３７５位のアスパラギン、３８７位のグリシン、３９６位のチロシン、３９９位のアスパラギン酸、及び４２８位のトレオニン、並びに、２５位のフェニルアラニン、２６位のグリシン、４２位のアスパラギン、４３位のチロシン、６１位のアラニン、６２位のアラニン、９８位のアルギニン、９９位のアラニン、１２４位のアスパラギン、１２５位のグリシン、１６４位のアスパラギン酸、１６５位のフェニルアラニン、１７８位のチロシン、１７９位のアスパラギン酸、１８０位のセリン、２０４位のグリシン、２０５位のロイシン、２０６位のセリン、２０７位のトレオニン、２０８位のグリシン、２０９位のイソロイシン、２４３位のトリプトファン、２５６位のロイシン、２５７位のアルギニン、２５８位のバリン、２５９位のトリプトファン、２６０位のグルタミン酸、２６３位のチロシン、２６４位のアラニン、２６５位のアスパラギン酸、２６６位のロイシン、２６７位のアスパラギン酸、２６８位のアスパラギン酸、２６９位のアラニン、２９２位のグルタミン、２９３位のグリシン、２９４位のバリン、２９６位のグルタミン酸、３０６位のイソロイシン、３０７位のグリシン、３０８位のアラニン、３１０位のセリン、３１１位のアスパラギン、３１２位のセリン、３１３位のアスパラギン、３１４位のアラニン、及び３１５位のアラニン。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載の発現ベクターが組み込まれた宿主細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１０】
セルラーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ガラクツロン酸リアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−キシロシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、及びフェルラ酸エステラーゼからなる群より選択される一種以上の酵素を更に含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、或いは、請求項９又は１０に記載の組成物を、キシランに作用させることを含む、キシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項１２】
キシランが、４−Ｏ−メチルグルクロニル側鎖、ガラクトシル側鎖、アラビノフラノシル側鎖、及びアセチル側鎖からなる群より選択される一種以上の側鎖を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
更にリグノセルロースを含む、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１４】
飼料である、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
キシラナーゼに関する技術が開示される。
【背景技術】
【０００２】
キシランは広く天然に存在する多糖の１つであり、農産廃棄物や木質などのリグノセルロースの主要構成成分である。その構造は、キシロースを単位とするβ−１，４結合により重合した主鎖を有する高分子多糖である。キシランは、天然には、キシロース残基のＯ−２またはＯ−３あるいはその両方で、４−Ｏ−メチルグルクロニル側鎖、アラビノフラノシル側鎖やアセチル側鎖などの残基やキシロース、アラビノース、ガラクトース、グルコースなどからなるオリゴ糖側鎖が結合されたヘテロキシランとして存在し、その主要な構造に基づいて、グルクロノキシラン、アラビノグルクロノキシラン、アラビノキシランなどに分類される。広葉樹材はグルクロノキシランを、イネ科草本はアラビノグルクロノキシランを主に含む。アラビノキシランは、ムギ、エンバク、コメ、アワ、トウモロコシ、ソルガムのような穀物やタケノコなどの植物に分布している。
【０００３】
キシラナーゼは、キシランを加水分解する酵素群の総称であり、その作用様式によって、エンド型キシラナーゼ、エキソ型キシラナーゼ、β-キシロシダーゼなどに大別される。エンド型キシラナーゼは、立体構造及びアミノ酸配列の疎水性クラスター解析に基づいて、現在少なくとも８つのグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリーに分けられる（非特許文献１）。
【０００４】
近年、リグノセルロース処理における酵素の利用という観点から、エンド型キシラナーゼの有用性が注目されている。エンド型キシラナーゼ活性を示すＧＨ１０およびＧＨ１１キシラナーゼは、アルコール燃料用リグノセルロースの酵素分解、飼料中の糖を遊離させるための酵素処理、セルロース製造時にパルプを溶解させるための酵素処理、木材パルプ漂白における酵素処理などに使用されている（特許文献１）。
【０００５】
ＧＨ１０およびＧＨ１１キシラナーゼは、キシランからのキシロオリゴ糖の製造にも用いられる。キシロオリゴ糖は、キシロースが２〜１０個程度、β−１，４結合した構造を持つ糖の総称であり、ラクトバチルス種およびビフィズス菌種等の腸内有用菌の栄養源となるプレバイオティクな性質を示すため、食品用ならびに家畜の飼料の添加剤としての用途がある（特許文献２）。
【０００６】
最近、ＧＨ３０に分類されるキシラナーゼが新しく定義され（非特許文献２）、新たな酵素資源として注目されている。ＧＨ３０キシラナーゼは、一般的に一次構造中の保存された領域がグルクロノキシランの４−Ｏ−メチルグルクロニル側鎖を認識してキシランを切断するため、グルクロノキシラナーゼと呼ばれる。一方で、４−Ｏ−メチルグルクロニル側鎖を認識せずに、様々なキシランに対してエンド型キシラナーゼ活性を有するＧＨ３０キシラナーゼが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、キシランに対する分解活性は、一般的なＧＨ１０およびＧＨ１１エンド型キシラナーゼに比べて著しく低い。加えてＧＨ３０ファミリーの一次構造からはエンド型キシラナーゼ活性を有する酵素の存在を容易に推測出来ないため、公知のデータベースを用いた場合においても、産業上の有効利用に充分な活性を有するエンド型のＧＨ３０キシラナーゼが得難いという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平０６−２６１７５０
【特許文献２】特許第２６２９００６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Curr Protein Pept Sc 19 (1):48-67.
【非特許文献２】FEBS Lett 584 (21):4435-4441.
【非特許文献３】Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 70 (Pt 11):2950-2958.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
新たなキシラナーゼの提供が１つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
下記に代表される発明が提供される。
項１．
下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチド：
（Ａ）配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列。
項２．
エンド型キシラナーゼ活性が４−Ｏ−メチルグルクロニル側鎖を有するキシラン及びアラビノフラノシル側鎖を有するキシランを基質とする、項１に記載のポリペプチド。
項３．
配列番号４のアミノ酸配列における下記のアミノ酸残基が保存されている、項１又は２に記載のポリペプチド：
６位のアスパラギン、１２位のグルタミン、１６位のグリシン、１８位のグリシン、２０位のセリン、２２位のアラニン、２３位のフェニルアラニン、２４位のグリシン、４５位のフェニルアラニン、５２位のグリシン、５５位のイソロイシン、５７位のアルギニン、５８位のアスパラギン、６０位のイソロイシン、６７位のイソロイシン、６９位のプロリン、７２位のプロリン、７５位のプロリン、８１位のチロシン、８７位のアスパラギン酸、９０位のグルタミン、９７位のアラニン、１０６位のチロシン、１０７位のアラニン、１０８位のアスパラギン酸、１０９位のアラニン、１１０位のトリプトファン、１１２位のアラニン、１１３位のプロリン、１１６位のメチオニン、１１７位のリジン、１１８位のトレオニン、１２６位のグリシン、１２９位のシステイン、１３０位のグリシン、１３３位のグリシン、１３６位のシステイン、１４０位のアスパラギン酸、１４１位のトリプトファン、１４２位のアルギニン、１４３位のグルタミン、１４４位のアラニン、１４５位のチロシン、１４６位のアラニン、１４９位のロイシン、１５０位のバリン、１５１位のグルタミン、１５２位のチロシン、１５６位のチロシン、１６０位のグリシン、１６７位のグリシン、１７０位のアスパラギン、１７１位のグルタミン酸、１７２位のプロリン、１８９位のアラニン、１９２位のフェニルアラニン、１９６位のロイシン、２０３位のアラニン、２１１位のシステイン、２１２位のシステイン、２１３位のアスパラギン酸、２１６位のグリシン、２２７位のロイシン、２３０位のアラニン、２３１位のグリシン、２３５位のチロシン、２４０位のトレオニン、２４２位のヒスチジン、２４４位のチロシン、２４６位のセリン、２５１位のプロリン、２６１位のトレオニン、２６２位のグルタミン酸、２７３位のトレオニン、２７４位のトリプトファン、２７８位のグリシン、２８２位のグルタミン酸、２８３位のグリシン、２８６位のトリプトファン、２８７位のアラニン、２９５位のバリン、３００位のセリン、３０５位のトリプトファン、３２８位のセリン、３３２位のトリプトファン、３３３位のアラニン、３３４位のフェニルアラニン、３３５位のアラニン、３３９位のアルギニン、３４２位のアルギニン、３４３位のプロリン、３４７位のアルギニン、３５６位のアスパラギン、３６４位のアスパラギン、３７５位のアスパラギン、３８７位のグリシン、３９６位のチロシン、３９９位のアスパラギン酸、及び４２８位のトレオニン、並びに、２５位のフェニルアラニン、２６位のグリシン、４２位のアスパラギン、４３位のチロシン、６１位のアラニン、６２位のアラニン、９８位のアルギニン、９９位のアラニン、１２４位のアスパラギン、１２５位のグリシン、１６４位のアスパラギン酸、１６５位のフェニルアラニン、１７８位のチロシン、１７９位のアスパラギン酸、１８０位のセリン、２０４位のグリシン、２０５位のロイシン、２０６位のセリン、２０７位のトレオニン、２０８位のグリシン、２０９位のイソロイシン、２４３位のトリプトファン、２５６位のロイシン、２５７位のアルギニン、２５８位のバリン、２５９位のトリプトファン、２６０位のグルタミン酸、２６３位のチロシン、２６４位のアラニン、２６５位のアスパラギン酸、２６６位のロイシン、２６７位のアスパラギン酸、２６８位のアスパラギン酸、２６９位のアラニン、２９２位のグルタミン、２９３位のグリシン、２９４位のバリン、２９６位のグルタミン酸、３０６位のイソロイシン、３０７位のグリシン、３０８位のアラニン、３１０位のセリン、３１１位のアスパラギン、３１２位のセリン、３１３位のアスパラギン、３１４位のアラニン、及び３１５位のアラニン。
項４．
配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
項５．
項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項６．
項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
項７．
項５に記載のポリヌクレオチドまたは項６に記載の発現ベクターが組み込まれた宿主細胞。
項８．
項７に記載の宿主細胞を培養することを含む、項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
項９．
項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを含む組成物。
項１０．
セルラーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ガラクツロン酸リアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−キシロシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、及びフェルラ酸エステラーゼからなる群より選択される一種以上の酵素を更に含む、項９に記載の組成物。
項１１．
項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、或いは、項９または１０に記載の組成物を、キシランに作用させることを含む、キシロオリゴ糖の製造方法。
項１２．
キシランが、４−Ｏ−メチルグルクロニル側鎖、ガラクトシル側鎖、アラビノフラノシル側鎖、及びアセチル側鎖からなる群より選択される一種以上の側鎖を有する、項１１に記載の方法。
項１３．
更にリグノセルロースを含む、項９または１０に記載の組成物。
項１４．
飼料である、項１３に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
新たなキシラナーゼが提供される。好適な一実施形態において、キシランから効率的にキシロオリゴ糖を製造する手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】精製Ｘｙｎ３０ＣのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
【図２】Ｘｙｎ３０Ｃの４５℃における最適ｐＨ
【図３】Ｘｙｎ３０Ｃの４５℃、３０ｍｉｎにおけるｐＨ安定性
【図４】Ｘｙｎ３０ＣのｐＨ４．０における最適温度
【図５】Ｘｙｎ３０ＣのｐＨ４．０、２４時間における温度安定性
【図６】Ｘｙｎ３０Ｃによる小麦アラビノキシランの分解
【図７】Ｘｙｎ３０ＣとＡｂｆ６２Ａによる小麦アラビノキシランの分解
【図８】Ｘｙｎ３０ＣによるＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランの分解
【図９】Ｘｙｎ３０Ｃのアミノ酸配列と他のキシラナーゼのアミノ酸配列とのマルチプルアライメント：網掛け部分はＸｙｎ３０Ｃに特徴的な部分であり、「＊」は全てのアミノ酸配列に共通しているアミノ酸残基であることを示し、「：」は全てのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基が類似していることを示す。「T.reesei_Xyn4」の配列を配列番号７、「T.reesei_Xyn6」の配列を配列番号８、「P.subrubescens」の配列を配列番号９、「P.oxalicum」の配列を配列番号１０とする。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．ポリペプチド
エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、（Ａ）配列番号４のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、を有することが好ましい。
【００１４】
エンド型キシラナーゼ活性を有することは、ポリペプチドをキシランに作用させて、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、及びキシロヘキサオースを生産することを測定することによって確認できる。これら全てのキシロオリゴ糖を生産する必要はなく、例えば、キシロビオース、キシロトリオース、及び／又はキシロテトラオースを生産することに基づいて、エンド型キシラナーゼ活性を確認してもよい。
【００１５】
ポリペプチドは、４−Ｏ−メチルグルクロニル側鎖を有するキシラン及びアラビノフラノシル側鎖を有するキシランの両方を基質としてエンド型キシラナーゼ活性を示すことが好ましい。４−Ｏ−メチルグルクロニル側鎖を有するキシランとしては、例えば、Ｂｅｅｃｈｗｏｏｄキシラン及びＢｉｒｃｈｗｏｏｄキシランを挙げることができる。アラビノフラノシル側鎖を有するキシランとしては、小麦アラビノキシランを挙げることができる。ポリペプチドは、これらのいずれを基質とした場合も効率的にキシロビオース、キシロトリオース及びキシロテトラオース等のキシロオリゴ糖（特に、キシロビオース及びキシロトリオース）を生産する活性を有することが好ましい。
【００１６】
（Ａ）のアミノ酸配列の配列番号４のアミノ酸配列との同一性は、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であることが好ましい。一層好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００１７】
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、
ClustalW ver2.1 Pairwise Alignment（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja）を使用し、デフォルトのパラメータを用いて算出することができる。また、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、算出することができる。
【００１８】
（Ｂ）のポリペプチドに関し、「数個」とは、例えば、５０個以下、４５個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下、３個以下、又は２個以下である。キシラナーゼ活性の有無は、例えば、ソモギ-ネルソン法等の公知に手法を用いて確認することができる。
【００１９】
１又は数個のアミノ酸残基が置換されている場合、置換の種類は、特に制限されないが、ポリペプチドの高次構造、表現形又は特性に顕著な負の影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、同様の性質を有するファミリーに分類することができる。よって、アミノ酸置換は、置換前のアミノ酸残基と同一の上記カテゴリーに属する他のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。
【００２０】
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドの高次構造、表現形又は特性に顕著な負の影響を与えないという観点から、（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列におけるＧＨ３０キシラナーゼに特徴的なアミノ酸残基及び／又はＸｙｎ３０Ｃに特徴的なアミノ酸残基が保存されていることが好ましい。保存されているとは、あるアミノ酸残基が、（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列において、配列番号４における位置と同等の位置に存在することを意味する。
【００２１】
配列番号４のアミノ酸配列におけるＧＨ３０キシラナーゼに特徴的なアミノ酸残基とは、６位のアスパラギン、１２位のグルタミン、１６位のグリシン、１８位のグリシン、２０位のセリン、２２位のアラニン、２３位のフェニルアラニン、２４位のグリシン、４５位のフェニルアラニン、５２位のグリシン、５５位のイソロイシン、５７位のアルギニン、５８位のアスパラギン、６０位のイソロイシン、６７位のイソロイシン、６９位のプロリン、７２位のプロリン、７５位のプロリン、８１位のチロシン、８７位のアスパラギン酸、９０位のグルタミン、９７位のアラニン、１０６位のチロシン、１０７位のアラニン、１０８位のアスパラギン酸、１０９位のアラニン、１１０位のトリプトファン、１１２位のアラニン、１１３位のプロリン、１１６位のメチオニン、１１７位のリジン、１１８位のトレオニン、１２６位のグリシン、１２９位のシステイン、１３０位のグリシン、１３３位のグリシン、１３６位のシステイン、１４０位のアスパラギン酸、１４１位のトリプトファン、１４２位のアルギニン、１４３位のグルタミン、１４４位のアラニン、１４５位のチロシン、１４６位のアラニン、１４９位のロイシン、１５０位のバリン、１５１位のグルタミン、１５２位のチロシン、１５６位のチロシン、１６０位のグリシン、１６７位のグリシン、１７０位のアスパラギン、１７１位のグルタミン酸、１７２位のプロリン、１８９位のアラニン、１９２位のフェニルアラニン、１９６位のロイシン、２０３位のアラニン、２１１位のシステイン、２１２位のシステイン、２１３位のアスパラギン酸、２１６位のグリシン、２２７位のロイシン、２３０位のアラニン、２３１位のグリシン、２３５位のチロシン、２４０位のトレオニン、２４２位のヒスチジン、２４４位のチロシン、２４６位のセリン、２５１位のプロリン、２６１位のトレオニン、２６２位のグルタミン酸、２７３位のトレオニン、２７４位のトリプトファン、２７８位のグリシン、２８２位のグルタミン酸、２８３位のグリシン、２８６位のトリプトファン、２８７位のアラニン、２９５位のバリン、３００位のセリン、３０５位のトリプトファン、３２８位のセリン、３３２位のトリプトファン、３３３位のアラニン、３３４位のフェニルアラニン、３３５位のアラニン、３３９位のアルギニン、３４２位のアルギニン、３４３位のプロリン、３４７位のアルギニン、３５６位のアスパラギン、３６４位のアスパラギン、３７５位のアスパラギン、３８７位のグリシン、３９６位のチロシン、３９９位のアスパラギン酸、及び４２８位のトレオニンである。
【００２２】
配列番号４のアミノ酸配列におけるＸｙｎ３０Ｃに特徴的なアミノ酸残基とは、２５位のフェニルアラニン、２６位のグリシン、４２位のアスパラギン、４３位のチロシン、６１位のアラニン、６２位のアラニン、９８位のアルギニン、９９位のアラニン、１２４位のアスパラギン、１２５位のグリシン、１６４位のアスパラギン酸、１６５位のフェニルアラニン、１７８位のチロシン、１７９位のアスパラギン酸、１８０位のセリン、２０４位のグリシン、２０５位のロイシン、２０６位のセリン、２０７位のトレオニン、２０８位のグリシン、２０９位のイソロイシン、２４３位のトリプトファン、２５６位のロイシン、２５７位のアルギニン、２５８位のバリン、２５９位のトリプトファン、２６０位のグルタミン酸、２６３位のチロシン、２６４位のアラニン、２６５位のアスパラギン酸、２６６位のロイシン、２６７位のアスパラギン酸、２６８位のアスパラギン酸、２６９位のアラニン、２９２位のグルタミン、２９３位のグリシン、２９４位のバリン、２９６位のグルタミン酸、３０６位のイソロイシン、３０７位のグリシン、３０８位のアラニン、３１０位のセリン、３１１位のアスパラギン、３１２位のセリン、３１３位のアスパラギン、３１４位のアラニン、及び３１５位のアラニンである。
【００２３】
一実施形態において、上記配列番号４のアミノ酸配列におけるＧＨ３０キシラナーゼに特徴的なアミノ酸残基のうち、１個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、８０個以上９０個以上、又は９５個以上が保存されていることが好ましい。一実施形態において、上記配列番号４のアミノ酸配列におけるＸｙｎ３０Ｃに特徴的なアミノ酸残基のうち、１個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、又は４５個以上が保存されていることが好ましい。
【００２４】
配列番号４の１７１位のグルタミン酸及び２６２位のグルタミン酸は活性部位を構成すると考えられる。よって、（Ａ）及び（Ｂ）のポリペプチドは、これらのアミノ酸残基を保存していることが好ましい。
【００２５】
（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列は、そのＣ末端にリンカー配列及びセルロース結合モジュールに相当するアミノ酸配列を有していてもよい。リンカー配列及びセルロース結合モジュールに相当するアミノ酸配列としては、各々配列番号３のアミノ酸配列における第４５６位〜第４８６位のアミノ酸配列及び第４８７位〜第５２４位のアミノ酸配列を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。例えば、リンカー配列及びセルロース結合モジュールに相当するアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列における第４５６位〜第４８６位のアミノ酸配列及び第４８７位〜第５２４位のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００２６】
エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、キシランからキシロオリゴ糖を効率的に生産する特性を有することが好ましい。キシロオリゴ糖とは、２個〜１０個程度のキシロースが結合したオリゴ糖である。一実施形態において、好ましいキシロオリゴ糖は、キシロビオース及びキシロトリオースである。一実施形態において、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、それを一定時間キシランに作用させることにより、キシロースよりも、キシロビオース及びキシロトリオースを多く生産することが好ましい。エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、キシロビオース及びキシロトリオースに対する基質特異性が他のキシロオリゴ糖に対する特異性よりも低いことが好ましい。例えば、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、後述する実施例４と同じ条件で小麦アラビノキシランに２４時間作用させた場合に、精製されるキシロースとキシロビオースの比率（重量比）が、キシロース：キシロビオース＝１：２〜１：８、好ましくは１：３〜１：６である。また、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、後述する実施例４と同じ条件で小麦アラビノキシランに２４時間作用させた場合に、精製されるキシロースとキシロトリオースの比率（重量比）が、キシロース：キシロトリオース＝１：２〜１：５、好ましくは１：２〜１：４である。ここで、キシランは、４−Ｏ−メチルグルクロニル側鎖を有するキシラン及び／又はアラビノフラノシル側鎖を有するキシランであることが好ましい。
【００２７】
一実施形態において、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、至適活性温度が約５５℃であることが好ましい。至適活性温度が約５５℃であるとは、５５℃におけるエンド型キシラナーゼ活性が５０℃及び６０℃におけるエンド型キシラナーゼ活性よりも高いことを意味する。一実施形態において、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、５５℃以下の温度で安定であることが好ましい。５５℃以下の温度で安定であるとは、５５℃以下の温度の緩衝液中に２４時間保持しても失活しないことを意味する。一実施形態において、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、至適ｐＨが３．５〜４．５であることが好ましい。至適ｐＨが３．５〜４．５であるとは、ｐＨ３．５〜４．５でのエンド型キシラナーゼ活性がｐＨ３及び５における同活性よりも高いことを意味する。一実施形態において、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、ｐＨ２〜５．７で安定であることが好ましい。ｐＨ２〜５．７で安定であるとは、ｐＨ２〜５．７の緩衝液中で３０分保持しても失活しないことを意味する。
【００２８】
一実施形態において、ポリペプチドは、小麦アラビノキシランを基質とした場合の比活性が２５Ｕ／ｍｇ以上、３０Ｕ／ｍｇ以上、３５Ｕ／ｍｇ以上、４０Ｕ／ｍｇ以上、又は４５Ｕ／ｍｇ以上であることが好ましい。一実施形態において、ポリペプチドは、Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄキシランを基質とした場合の比活性が１５Ｕ／ｍｇ以上、２０Ｕ／ｍｇ以上、又は２５Ｕ／ｍｇ以上であることが好ましい。一実施形態において、ポリペプチドは、Ｂｅｅｃｈｗｏｏｄキシランを基質とした場合の比活性が２０Ｕ／ｍｇ以上、２５Ｕ／ｍｇ以上、３０Ｕ／ｍｇ以上、又は３５Ｕ／ｍｇ以上であることが好ましい。ここで比活性は、後述する実施例の３（１）に記載する方法・条件で測定されるものであり、１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量である。
【００２９】
上述のポリペプチドは、後述するポリヌクレオチドを利用して、遺伝子工学的な手法で製造することができる。同ポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列の情報に基づいて、一般的なタンパク質の化学合成法（例えば、液相法及び固相法）を用いて製造することも可能である。
【００３０】
２．ポリヌクレオチド
エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は特に制限されない。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１又は２の塩基配列或いはこれらのリンカー及びＣＢＭ１をコードする領域以外の塩基配列と一定以上の同一性を有する塩基配列を有することが好ましい。一定以上の同一性とは、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。配列番号１はイントロンを含む塩基配列であり、配列番号２はイントロンを含まない塩基配列である。
【００３１】
塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（%）を算出することができる。
【００３２】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離された状態で存在するポリヌクレオチドであることが好ましい。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離されたＤＮＡ」は、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まないことを意味する。一実施形態において、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡであることが好ましい。
【００３３】
ポリヌクレオチドは、配列番号１又は２の塩基配列に基づいて、化学的なＤＮＡの合成法（例えば、フォスフォアミダイト法）や遺伝子工学的手法を用いて容易に取得することができる。
【００３４】
３．ベクター
ベクターは、上記ポリヌクレオチドを発現可能な様式で含むことが好ましい。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適宜選択することができる。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。
【００３５】
大腸菌で発現可能なベクターとしては、例えば、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pQE、及びpET等を挙げることができる。酵母で発現可能なベクターとしては、例えば、pBR322、pJDB207、pSH15、pSH19、pYepSec1、pMFa、pYES2、pHIL、pPIC、pAO815、及びpPink等を挙げることが出来る。昆虫で発現可能なベクターとしては、例えば、pAc、pVL、及びpFastbac等を挙げることが出来る。
【００３６】
宿主細胞として真核細胞を使用する場合は、発現ベクターとして、発現しようとするポリヌクレオチドの上流にプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用することができ、更に必要により複製起点、エンハンサー、及び／又は選択マーカーを有していてもよい。
【００３７】
４．形質転換体
形質転換体は、上記ベクターで形質転換されているものが好ましい。形質転換体中において、ベクターは、宿主細胞中において自律的に存在してもゲノム中に相同組換え的または非相同組換え的に組み込まれて存在してもよい。形質転換に使用する宿主細胞は、上記ポリペプチドを産生できる限り特に制限されず、原核細胞及び真核細胞のいずれでもよい。具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌（例えば、HB101、MC1061、JM109、CJ236、MV1184等）、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネ型細菌、ストレプトミセス属細菌等の放線菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌等の原核細胞；サッカロミセス属、ピシア属及びクルイベロマイセス属等の酵母、アスペルギルス属、ペニシリウム属、タラロマイセス属、トリコデルマ属、ハイポクレア属及びアクレモニウム属等の真菌細胞；ドロソフィラS2、スポドプテラSf9、カイコ培養細胞等の昆虫細胞；並びに植物細胞等を挙げることができる。枯草菌、酵母、真菌、放線菌等のタンパク質分泌能を利用して、ポリペプチドを培地中に生産させることもできる。
【００３８】
組換え発現ベクターの宿主細胞内への導入方法は、従来の慣用的に用いられている方法により行うことができる。例えば、コンピテントセル法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法等の種々の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
形質転換体は、ポリペプチドを産生可能であるため、ポリペプチドを製造するために用いることが可能であり、また形質転換体の状態で、キシランを含む試料からキシロース及び／又はキシロオリゴ糖を製造するために使用することもできる。
【００４０】
５．形質転換体を用いたポリペプチドの製造方法
上記形質転換体を培養し、培養物からエンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドを回収することにより、上述のポリペプチドを製造することができる。培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養を行うことができる。また、培養は、形質転換体の内外に生産されたポリペプチドの活性を指標にして、適当量得られるまで実施することができる。
【００４１】
培地としては、宿主細胞の種類に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。例えば、大腸菌の培養にはＬＢ培地などの栄養培地や、Ｍ９培地などの最少培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添加した培地を用いることができる。
【００４２】
培養条件は宿主の種類に応じて適宜設定することができる。通常、１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で５〜１６８時間、好ましくは８〜７２時間培養される。宿主に依存して、振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌及び／又は通気を行ってもよい。遺伝子発現のために誘導型プロモーターを用いる場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。
【００４３】
培養上清からのポリペプチドの精製又は単離は、公知の手法を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール等の溶媒沈殿、透析、限外濾過、酸抽出、及び各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等）等を用いた手法が挙げられる。アフィニティークロマトグラフィーに用いる担体としては、例えば、ポリペプチドに対する抗体を結合させた担体や、ポリペプチドにペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合した担体を利用することもできる。
【００４４】
ポリペプチドが宿主の細胞内に蓄積される場合は、形質転換細胞を破砕し、破砕物の遠心上清から上記と同様にしてポリペプチドを精製又は単離することができる。例えば、培養終了後、遠心により集菌した菌体を菌体破砕用バッファー（２０〜１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕し、破砕処理液を１００００〜１５０００ｒｐｍで１０〜１５分間遠心して上清を得ることができる。遠心後の沈殿は、必要に応じて塩酸グアニジウム又は尿素などで可溶化したのち更に精製することもできる。
【００４５】
６．ポリペプチドを用いたキシロオリゴ糖の製造方法
エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドを、キシランを含む試料（例えば、バイオマス資源）に接触させることにより、キシランを分解し、キシロース及び／又はキシロオリゴ糖を含む糖液を製造することができる。また、キシランを含む試料として、バイオマス資源を使用する場合は、上述のポリペプチドに加えて、他のセルラーゼ等の酵素を併用し、より効率的に糖液を製造することが好ましい。上述のエンド型キシラナーゼは、キシロビオース及びキシロトリオースに対する基質特異性が低く、キシランからキシロースよりもキシロオリゴ糖を効率的に生産するため、キシロオリゴ糖を高濃度で含有する糖液の生産が可能である。
【００４６】
キシランを含む試料の種類は、本発明のポリペプチドによって分解可能である限り特に制限されないが、例えば、バガス、木材、ふすま、麦わら、稲わら、イネ科もしくはマメ科等の牧草、コーンコブ、ササ、パルプ、もみがら、小麦フスマ、大豆粕、大豆オカラ、コーヒー粕、コメ糠等を挙げることができる。
【００４７】
キシランを含む試料からキシロース及び／又はキシロオリゴ糖を含む糖液を製造する方法は、公知の手法に従って行うことができる。利用するバイオマス資源は、乾燥物でも、湿潤物でもよいが、処理効率を高めるために予め１００〜１００００μｍサイズに粉砕されていることが好ましい。粉砕はボールミル、振動ミル、カッターミル、ハンマーミル等の装置を用いて行うことができる。そして、粉砕したバイオマス資源は、水、蒸気もしくはアルカリ溶液などに浸漬して６０〜２００℃の間で高温処理もしくは高温高圧処理を施して、酵素処理効率をさらに高めることもできる。例えば、アルカリ処理は、苛性ソーダやアンモニア等を用いて行うことができる。このような前処理がされたバイオマス試料を水性媒体中に懸濁し、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドと他のセルラーゼを加え、攪拌しながら加温して、バイオマス資源を分解または糖化することができる。
【００４８】
ポリペプチドを水溶液中でキシランを含む試料に接触させる場合は、反応液のｐＨおよび温度等の条件は、ポリペプチドが失活しない範囲であればよい。例えば、上述の至適温度及び至適ｐＨ付近の条件を採用することが効率的に試料を分解し、糖液を得るという観点から好ましい。
【００４９】
キシロース及び／又はキシロオリゴ糖を含有する糖液は、そのまま利用しても良く、水分を除去して乾燥物として使用しても良く、目的に応じて、更に化学反応又は酵素反応によって異性化又は分解することも可能である。糖液又はその分画物は、例えば、発酵法によりメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコールの原料として使用することができる。
【００５０】
７．ポリペプチドを含む組成物
組成物は、上記ポリペプチドを含むことが好ましい。そのような組成物は、キシランから効率的にキシロオリゴ糖を生産するために使用することができる。また、組成物は、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドに加えて、任意の他の物質を含みえる。他の物質は、例えば、他の酵素であってもよい。他の酵素としては、例えば、セルラーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ガラクツロン酸リアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−キシロシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、及びフェルラ酸エステラーゼからなる群より選択される一種以上であり得る。これらの他の酵素の一種以上との組み合わせでエンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドを含むことにより、効率的にバイオマスを糖化することができる。
【００５１】
組成物に含まれる他の物質は上述のキシランを含む試料（例えば、リグノセルロース）であってもよい。エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチド及びキシランを含む試料を含む組成物は、家畜などの飼料として有用である。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００５３】
１．ＧＨ３０タンパク質遺伝子の同定
タラロマイセス・セルロリティカスＣＦ−２６１２株を特開２００８−２７１９２７に記載の方法に従い、セルロースパウダーを炭素源として培養した。培養液を遠心し、上澄み液を得た。上澄み液中には種々のセルラーゼやキシラナーゼを含む糖化酵素が含まれる。上澄み液（酵素液）をトリプシン処理した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行い、分析により得られた全てのＭＳ／ＭＳスペクトルのプロダクトイオン測定データをＭＡＳＣＯＴ  Ｓｅｒｖｅｒ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）を用いてタラロマイセス・セルロリティカスのゲノムデータを対象に検索を行うことにより、酵素液中に存在するタンパク質の網羅的な同定を行った。その結果、機能未知のＧＨ３０ファミリーに相当するタンパク質のペプチド断片が同定された。ゲノム情報より、同ペプチド断片を含むタンパク質をコードする遺伝子（Ｘｙｎ３０Ｃ）は１８４５ｂｐであり（配列番号１）、Ｘｙｎ３０Ｃ遺伝子を含むゲノム配列から、イントロンに相当する部分を除いた本酵素のポリペプチドをコードする遺伝子配列１５７２ｂｐを決定した（配列番号２）。配列番号２に基づいて推定される５２４アミノ酸残基からなるＸｙｎ３０Ｃのポリペプチド配列（配列番号３）を決定した。
【００５４】
Ｘｙｎ３０Ｃの分泌シグナル配列（第１位〜第２２位）は、Ｓｉｇｎａｌ−Ｐ Ｓｅｒｖｅｒを用いて決定した。更に、Ｘｙｎ３０Ｃのポリペプチド配列は、第４５６位〜第４８６位にリンカー配列を有し、第４８７位〜第５２４位にセルロース結合モジュール１（ＣＢＭ１）を有することが判明した。シグナル配列は、タンパク質の分泌生産に必要であり、菌体外へ分泌後に切断される。分泌シグナル配列を除いたタンパク質の理論上の分子量およびｐＩ値は、それぞれ５２６７３Ｄａおよび４．４３と見積もられた。リンカー配列及びＣＢＭ１の配列は、セルロースとの結合において機能し、セルロース近傍のキシランの分解促進に効果を持つが、触媒機能とは直接関係ないと推測され、欠失されても酵素の触媒活性は維持される。Ｘｙｎ３０Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）からシグナルペプチド、リンカー配列及びＣＢＭ１の配列を除いたアミノ酸配列を配列番号４とする。
【００５５】
２．ＧＨ３０タンパク質の発現と精製
Ｘｙｎ３０Ｃ遺伝子のＮ末端配列およびＣ末端配列がコードされる遺伝子配列から、以下の２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー１，プライマー２）を作成した。
プライマー１：ＡＴＴＧＴＴＡＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣ（配列番号５）
プライマー２：ＡＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧＣＧＡＡＴＡＧ（配列番号６）
【００５６】
タラロマイセス・セルロリティカスＣＦ−２６１２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマー１および２を用いて配列番号１を含む約１．９ＫｂのＸｙｎ３０Ｃ遺伝子断片を増幅した。本遺伝子をＨｐａＩおよびＳｂｆＩで切断し、ｐＡＮＣ２０２（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，４０（８）：８２３−８３０）のＥｃｏＲＶ−ＳｂｆＩ間に導入し、グルコアミラーゼプロモーターの支配下にてＸｙｎ３０Ｃ遺伝子を発現させる発現プラスミドｐＡＮＣ２５１を得た。本プラスミドを、プロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて、アクレモニウム（現タラロマイセス）・セルロリティカスのウラシル要求性ＹＰ−４株（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，４０（８）：８２３−８３０）の染色体に、非相同的に組み込んだ。
【００５７】
Ｘｙｎ３０Ｃ遺伝子を組み込んだ形質転換株は、文献（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，４０（８）：８２３−８３０）に記載されるデンプンを炭素源とする液体培地で３０℃、１２０時間しんとう培養することによって組換えＸｙｎ３０Ｃを菌体外に分泌生産した。培養液を遠心した上澄み液を用いて、Ｘｙｎ３０Ｃの精製を行った。先ず、上澄み液は２０ｍＭ  ２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＨｉｐｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケア製）で脱塩された。脱塩溶液は、同緩衝液で平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア製）に供され、非吸着画分として回収された。得られた画分は、最終濃度１．０Ｍになるように硫酸アンモニウムを加えられ、１．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５Ｐｈｅ疎水性相互作用カラム（ＧＥヘルスケア製）に供された。Ｘｙｎ３０Ｃは、硫酸アンモニウムを含まない２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にてグラジエント溶出された。得られた画分は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で置換され、同緩衝液で平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５Ｓ陽イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア製）に供された。Ｘｙｎ３０Ｃは、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）にてグラジエント溶出され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析によって電気泳動的に単一であることが確認された（図１）。分子量既知のタンパク質マーカーとの泳動度の比較によって、Ｘｙｎ３０Ｃの分子量は、約５４．２ｋＤａと見積もられた。
【００５８】
３．Ｘｙｎ３０Ｃの酵素学的諸性質
（１）基質特異性
各種基質に対するＸｙｎ３０Ｃの酵素活性を調べた。５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に上記で得た０．００２ｍｇ／ｍｌの精製Ｘｙｎ３０Ｃ及び１０ｍｇ／ｍｌの各種基質を加え（各々最終濃度）、４５℃で酵素反応を開始した。反応開始後３０分の時点で遊離した還元糖濃度をジニトロサリチル酸法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６０：８７−１１２）によって定量し、酵素１ｍｇあたりの酵素活性（比活性）を算出した。酵素活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量である。測定結果を表１に示す。酵素のタンパク質濃度の測定は、PierceTM BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher製)を用いて行った。タンパク質濃度定量用の標準物質としては、濃度既知のウシ血清アルブミン(Thermo Fisher製)を使用した。
【００５９】
【表１】
2019195303.tif 000002
【００６０】
４−Ｏ−メチルグルクロニル側鎖を有するＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシラン（Megazyme社製 Code:P-XYLNBE）およびＢｉｒｃｈｗｏｏｄキシラン（Sigma-Aldrich社製 Code:X0502）、ならびにアラビノフラノシル側鎖を有する小麦アラビノキシラン（Megazyme社製 Code:P-WAXYRS）の両方に対して酵素活性を示すことから、Ｘｙｎ３０Ｃは、ＧＨ３０キシラナーゼにおいて通常観察されるグルクロノキシラナーゼではなく、エンド型キシラナーゼであることが示された。
【００６１】
（２）至適ｐＨ
Ｘｙｎ３０Ｃの至適ｐＨを調べた。ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液にてｐＨを調整し、上記精製酵素（Ｘｙｎ３０Ｃ）を１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランと共に４５℃で３０分処理後に生成した還元糖濃度を定量し、相対酵素活性を算出した。相対酵素活性とｐＨとの関係を図２に示す。図２から明らかなように、Ｘｙｎ３０Ｃは、ｐＨ３．５〜４．５のときに最大の活性を示すと共に、約ｐＨ２．５〜５．０においても活性を有していた。
【００６２】
（３）ｐＨ安定性
Ｘｙｎ３０ＣのｐＨ安定性を調べた。ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液にてｐＨを調整し、上記精製酵素（Ｘｙｎ３０Ｃ）を４５℃で３０分処理後、これらを希釈し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランと共に４５℃で３０分処理後に生成した還元糖濃度を定量し、残存酵素活性を算出した。残存酵素活性とｐＨとの関係を図３に示す。図３から明らかなように、Ｘｙｎ３０ＣはｐＨ２．３〜５．７の範囲で安定であり、ｐＨ２．０においても高い安定性を有していた。
【００６３】
（４）至適温度
Ｘｙｎ３０Ｃの至適温度（作用最適温度）を調べた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランを上記精製酵素と共に４０〜６０℃で３０分処理後に生成した還元糖濃度を定量し、相対酵素活性を算出した。相対酵素活性と温度との関係を図４に示す。図４から明らかなように、Ｘｙｎ３０Ｃの至適温度は５５℃であったが、約４５〜６０℃の範囲において高い活性を有していた。
【００６４】
（５）温度安定性
Ｘｙｎ３０Ｃの熱安定性を調べた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて上記精製酵素を４０〜６０℃にて２４時間処理した後、同緩衝液中にて１０ｍｇ／ｍｌＢｅｅｃｈキシランと共に４５℃で３０分処理後に生成した還元糖濃度を定量し、残存酵素活性を算出した。残存酵素活性と温度との関係を図５に示す。図５から明らかなように、Ｘｙｎ３０Ｃは、５０℃以下の範囲で安定であったが、５５℃においても高い安定性を有していた。また、Ｘｙｎ３０Ｃの変性温度（Ｔｍ値）は、タンパク質を５秒間ずつ加温しながら測定した結果、Ｔｍ値６４℃と見積もられた。
【００６５】
４．Ｘｙｎ３０Ｃによる小麦アラビノキシランの分解特性  
１０ｍｇ／ｍｌの小麦アラビノキシランに対し、基質１ｇあたり２ｍｇの精製Ｘｙｎ３０Ｃを混合し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて５０℃で０．５、１、３、６、１２、並びに２４時間処理した後、９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止した。反応液中に含まれるキシロース及びキシロオリゴ糖量の経時変化をパルスアンペロメトリ検出器と陰イオン交換法を組合せたＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって定量した。定量に用いる標準物質としては、キシロース、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、並びにキシロヘキサオース（Megazyme社製）を用いた。図６に反応時間ごとに生成したキシロース並びにキシロオリゴ糖の濃度を示した。反応液中でキシロース及びキシロオリゴ糖が経時的に蓄積され、小麦アラビノキシランは反応後２４時間で約１６％糖化された。糖化液中のキシロースならびにキシロオリゴ糖の濃度は、キシロース０．１６ｍｇ／ｍｌ、キシロビオース０．６４ｍｇ／ｍｌ、キシロトリオース０．３３ｍｇ／ｍｌ、キシロテトラオース０．０１１ｍｇ／ｍｌと見積もられた。
【００６６】
５．Ｘｙｎ３０ＣとＡｂｆ６２Ａによる小麦アラビノキシランの分解特性
１０ｍｇ／ｍｌの小麦アラビノキシランに対し、基質１ｇあたり２ｍｇのＸｙｎ３０Ｃと２ｍｇのタラロマイセス・セルロリティカス由来α-アラビノフラノシダーゼ（Ａｂｆ６２Ａ）を混合し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて５０℃で０．５、１、３、６、１２、並びに２４時間処理した後、９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止した。反応液中に含まれるキシロース及びキシロオリゴ糖量の経時変化を、実施例４と同様にＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって定量した。その結果、実施例４と同様に反応液中でキシロース単糖及びキシロオリゴ糖が経時的に蓄積された（図７）。キシロオリゴ糖への糖化はＸｙｎ３０Ｃ単体での酵素処理よりも迅速に進み、六糖以下のキシロオリゴ糖量の増加は、反応開始後３時間でほぼ頭打ちになった。反応後３時間で小麦アラビノキシランは約３１％糖化された。糖化液中のキシロースならびにキシロオリゴ糖の濃度は、キシロース０．０６５ｍｇ／ｍｌ、キシロビオース０．６８ｍｇ／ｍｌ、キシロトリオース０．９１ｍｇ／ｍｌ、キシロテトラオース０．５４ｍｇ／ｍｌ、キシロペンタオース０．１２ｍｇ／ｍｌ、キシロヘキサオース０．０４８ｍｇ／ｍｌだった。反応後２４時間では、小麦アラビノキシランは約３３％糖化された。糖化液中の組成は、キシロース０．２３ｍｇ／ｍｌ、キシロビオース１．４ｍｇ／ｍｌ、キシロトリオース０．９３ｍｇ／ｍｌ、キシロテトラオース０．０３２ｍｇ／ｍｌだった。Ｘｙｎ３０ＣにＡｂｆ６２Ａを添加することで、アラビノキシランから効率的にキシロオリゴ糖を生産できた。
【００６７】
６．Ｘｙｎ３０ＣによるＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランの分解特性
１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランに対し、基質１ｇあたり２ｍｇのＸｙｎ３０Ｃを混合し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて５０℃で３時間処理した後、９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止した。反応液中に含まれるキシロース及びキシロオリゴ糖の量を、実施例４と同様にＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって定量した（図８）。その結果、反応液中のＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランは、約４８％が糖化された。糖化液中のキシロースならびにキシロオリゴ糖の濃度は、キシロース０．５８ｍｇ／ｍｌ、キシロビオース９．８ｍｇ／ｍｌ、キシロトリオース１４ｍｇ／ｍｌ、キシロテトラオース９．０ｍｇ／ｍｌ、キシロペンタオース２．２ｍｇ／ｍｌ、キシロヘキサオース０．５４ｍｇ／ｍｌだった。
【００６８】
７．Ｘｙｎ３０Ｃによる水熱処理稲わらの可溶性画分の分解特性
Ｘｙｎ３０Ｃを用いて、バイオマスからのキシロオリゴ糖生産を試みた。バイオマスとして稲わらを使用した。乾燥後にカッターミルにて３ｍｍ以下に粉砕した稲わら１２ｇを１２０ｍｌの蒸留水と混合し、オートクレーブにて１６０℃、１時間処理した。遠心分離により、液体を２０ｍｌ回収した。稲わら水熱処理液に含まれる糖組成を分析したところ、キシランに相当する多糖が、１ｍｌ中に４．３２ｍｇ含まれていた。基質１ｇあたり２ｍｇのＸｙｎ３０Ｃを混合し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて終濃度３．４６ｍｇ／ｍｌのキシラン相当を含む水熱処理液を５０℃で３時間処理した後、９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止した。また、コントロールとして酵素を混合しない反応液も調製した。反応液中に含まれるキシロース及びキシロオリゴ糖の量を、実施例４と同様にＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって定量した。その結果、Ｘｙｎ３０Ｃ処理は、キシロース単糖をほとんど増加させることなく、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、及びキシロヘキサオースを合わせたキシロオリゴ糖の濃度を０．４７ｍｇ／ｍｌから１．７ｍｇ／ｍｌに増加させ、バイオマス水熱処理液からのキシロオリゴ糖製造に有効であることが分かった（表２）。
【００６９】
【表２】
2019195303.tif 000003
【００７０】
８．既報のエンド型ＧＨ３０キシラナーゼとの比較
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ由来のＧＨ３０キシラナーゼ（Ｐ２４１Ｍ１、ＵＳ２０１４−０２８９９０５  Ａ１、ＷＯ２０１３／０６７９６４）とＸｙｎ３０Ｃは、６２％の同一性を有する。Ｐ２４１Ｍ１は、ＡＺＣＬ−キシランに作用して可溶性のＡＺＣＬを遊離する活性が定性的に検出されたが、酵素活性（Ｕ）やキシランに対する主生成物を始めとする酵素化学的な知見は明らかにされていない。
【００７１】
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ由来のＧＨ３０キシラナーゼ（Ｐ２２４１ＫＺ）は、小麦アラビノキシランから還元糖を遊離することが示されているが、酵素活性（Ｕ）やキシランに作用させた場合に生じる主生成物を始めとする酵素化学的な知見は明らかにされていない（ＵＳ２０１４−０２８９９０５  Ａ１、ＷＯ２０１３／０６７９６４  Ａ１）。Ｐ２２４１ＫＺとＸｙｎ３０Ｃは、４４％の同一性を有する。
【００７２】
Ｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．由来のＧＨ３０キシラナーゼＸＹＬＤ（ＵｎｉＰｏｒｔ  ＩＤ：  Ｄ６ＭＹＳ９）は、エンド型キシラナーゼ活性を示す（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８６  （６）：１８２９−１８３９）。キシラナーゼＸＹＬＤをＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランに作用させた場合に生じる主要分解産物の組成は、キシロース(65%)およびキシロビオース（26.7%）である。これは、Ｘｙｎ３０ＣをＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランに作用させた場合の結果（図８：主要分解産物の殆どがキシロオリゴ糖であり、分解産物中のキシロース含量は約１％）と大きく異なる。キシラナーゼＸＹＬＤとＸｙｎ３０Ｃは、３９％の同一性を有する。
【００７３】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｐｙｒｏｓｏｌｖｅｎｓのＧＨ３０キシラナーゼＣｐＸｙｎ３０Ａ（ＵｎｉＰｏｒｔ  ＩＤ：  Ｆ１ＴＢＹ８）は、Ｓｗｅｅｔｇｕｍ  ｗｏｏｄグルクロノキシラン（１．１Ｕ／ｍｇ）ならびに小麦アラビノキシラン（１．７Ｕ／ｍｇ）の両方に対してエンドキシラナーゼ活性を示し、キシロオリゴ糖を生成することが報告されている（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ７０  （Ｐｔ  １１）：２９５０−２９５８）。Ｘｙｎ３０Ｃは、ＣｐＸｙｎ３０Ａに比べて約３０倍以高い比活性を小麦アラビノキシランに対して示した（表１）。ＣｐＸｙｎ３０ＡとＸｙｎ３０Ｃは、２１％の同一性を有する。
【００７４】
以上のように、Ｘｙｎ３０Ｃは、既報のＧＨ３０キシラナーゼと一次構造が大きく異なり、主としてキシロオリゴ糖を生成する高いエンド型キシラナーゼ活性を有する特徴を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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