(57)【要約】【課題】種々のバイオフィルムの形成を効果的に抑制できると共に形成されたバイオフィルムを除去できるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤を提供する。【解決手段】PLA、PLC及びPLDの少なくとも何れか一つを有することを特徴とするバイオフィルム抑制及び／又は除去剤である。好ましくはPLA、DNA分解酵素（DNase I)及び多糖分解酵素（Dispersin B）を有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤である。黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌及び腐性ブドウ球菌のバイオフィルムの形成を抑制でき、形成されたバイオフィルムを除去できる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
PLA、PLC及びPLDの少なくとも何れか一つを含むことを特徴とするバイオフィルム抑制及び／又は除去剤。
【請求項２】
前記PLAはPLA1であることを特徴とする請求項１に記載のバイオフィルム抑制及び／又は除去剤。
【請求項３】
更に、DNA分解酵素（DNase I）、及び、多糖分解酵素（Dispersin B）を有する請求項１又は２記載のバイオフィルム抑制及び／又は除去剤。
【請求項４】
PLA、DNA分解酵素（DNase I）、及び、多糖分解酵素（Dispersin B）を有する請求項３記載のバイオフィルム抑制及び／又は除去剤。
【請求項５】
PLC、DNA分解酵素（DNase I）、及び、多糖分解酵素（Dispersin B）を有する請求項３記載のバイオフィルム抑制及び／又は除去剤。
【請求項６】
バイオフィルムが、ブドウ球菌属に属するグラム陽性球菌由来である請求項１乃至５の何れか１に記載のバイオフィルム抑制及び／又は除去剤。
【請求項７】
ブドウ球菌属に属するグラム陽性球菌が、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌及び腐性ブドウ球菌から選択されるいずれかである請求項６に記載のバイオフィルム抑制及び／又は除去剤。
【請求項８】
黄色ブドウ球菌が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（MSSA）、又は、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（VRSA）である請求項７に記載のバイオフィルム抑制及び／又は除去剤。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載のバイオフィルム抑制及び／又は除去剤で処理されてなる医療用器具。
【請求項１０】
バイオフィルム抑制及び／又は除去剤で処理されてなる医療用器具が、当該医療用器具の表面をバイオフィルム抑制及び／又は除去剤でコーティングされているか、又は当該医療用器具にバイオフィルム抑制及び／又は除去剤が浸透しているものである請求項９に記載の医療用器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルムの形成を抑制及び／又は形成されたバイオフィルムを除去するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムとは、細菌が菌体外に分泌する多糖類等のマトリクスと菌の集合体から成る構造物である。細菌が付着・増殖すると、マトリクスに覆われた状態、即ちバイオフィルムを形成して薬剤に抵抗性を示し、また生体の防御機構からも逃れやすくなるために治療が困難になる。
【０００３】
近年、中心静脈カテーテルや人工関節等の人工医療材料を用いた治療に伴い、バイオフィルムに関連した感染症（バイオフィルム感染症）が増加している。バイオフィルム感染症としては例えば、カテーテル関連血流感染（CR-BSI）や尿道留置カテーテル関連尿路感染（UA-UTI）が問題となっている。一旦バイオフィルム感染症が起これば、感染症のコントロールは困難となり、医療材料を摘出せざるを得ないのが現況である。
【０００４】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は、医療機関では主に易感染患者において手術部位感染、血流感染、呼吸器感染、尿路感染等の起因菌となり、感染部位によっては難治性となって時に死因となる場合もある。特に、院内感染の原因菌とされるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus：MRSA）の進入経路は、４８％が血液留置カテーテル、１４％が尿路カテーテル留置によるといわれており、難治化すると同時に、重症化することが問題となる。このようにバイオフィルム感染症は外科系診療科をはじめとした全ての診療科において極めて重要な課題となっており、根本的な予防法・治療法の開発は急務である。
【０００５】
これまでのバイオフィルムに関する研究は、実験室レベルで行われているものの、感染部位におけるバイオフィルムがどのような細菌種で構成されているのか、またそれらが採取部位や臨床所見とどのような関連性を持つか等、臨床における重要な基礎的データが得られていないのが現状である（非特許文献１，２）。
【０００６】
バイオフィルムは菌種のみならず菌株レベルで性質が異なり、個々のバイオフィルムの細胞外マトリクス（ECM, extracellular matrix）を構成する成分を正確に評価することは、バイオフィルム形成の分子メカニズムの理解とそれぞれの性質に合わせた柔軟なバイオフィルム感染症対策の立案に重要であると考えられる（非特許文献３，４，５，６，７）。
【０００７】
近年、酵素を包含するバイオフィルム形成抑制剤が開発されており、例えばオリジン又はバシロリシンを有効成分とするバイオフィルム形成抑制剤が提案されている（特許文献１）。このバイオフィルム形成抑制剤はカンジダに由来するバイオフィルムの形成抑制にある程度効果を有するが、種々のバイオフィルムの形成を効果的に抑制するものではない。
【０００８】
また例えばヘキシルレゾルシノールを所定濃度で包含するバイオフィルム形成抑制剤が提案されている（特許文献２）。このバイオフィルム形成抑制剤は緑膿菌に由来するバイオフィルムの形成抑制にある程度効果を有するが、種々のバイオフィルムの形成を効果的に抑制するものではない。またこれらのバイオフィルム形成抑制剤は、バイオフィルムの形成抑制効果のみを奏するものであり、形成されたバイオフィルムを除去するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１８−０３０８１９号公報
【特許文献２】特開２０１７−２１８３９０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】水之江義充, 杉本真也, 岩瀬忠行: 常在細菌による黄色ブドウ球菌排除メカニズム. 呼吸器内科. 26(1):49-52, 2014
【非特許文献２】水之江義充, 杉本真也, 奥田賢一: バイオフィルム感染症制圧に向けての展望. 家畜感染症学会誌.5(4): 113-120. 2016
【非特許文献３】水之江義充, 千葉明生, 岩瀬忠行, 杉本真也: バイオフィルム細胞外マトリクスの分離・解析．化学療法の領域. 31(11): 2158-2165, 2015
【非特許文献４】Sugimoto S, Sato F, Miyakawa R, Chiba A, Onodera S, Hori S, Mizunoe Y: Broad impact of extracellular DNA on biofilm formation by clinically isolated Methicillin-resistant and -sensitive strains of Staphylococcus aureus. Sci Rep. 8(1): 2254, 2018
【非特許文献５】Sugimoto S, Okuda K, Miyakawa R, Sato M, Arita-Morioka K, Chiba A, Yamanaka K, Ogura T, Mizunoe Y, Sato C: Imaging of bacterial multicellular behaviour in biofilms in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Sci Rep. 6: 25889, 2016
【非特許文献６】Chiba A, Sugimoto S, Sato F, Hori S, Mizunoe Y: A refined technique for extraction of extracellular matrices from bacterial biofilms and its applicability.Microb Biotechnol. 8(3): 392-403, 2015.
【非特許文献７】Sugimoto S, Iwamoto T, Takada K, Okuda K, Tajima A, Iwase T, Mizunoe Y: Staphylococcus epidermidis Esp degrades specific proteins associated with Staphylococcus aureus biofilm formation and host-pathogen interaction. J Bacteriol. 195(8): 1645-55, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、種々のバイオフィルムの形成を効果的に抑制可能とするとともに形成されたバイオフィルムを除去できるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明にかかるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤は、PLA（Phospholipase A、ホスホリパーゼA）、PLC（Phospholipase C、ホスホリパーゼC）、及び、PLD（Phospholipase D、ホスホリパーゼD）の少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、種々のバイオフィルムの形成を効果的に抑制でき、更に形成されたバイオフィルムを除去できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ホスホリパーゼによる化学結合の切断部位を説明する図である。
【図２】MRSA、MSSA、及び、表皮ブドウ球菌が形成するバイオフィルムに対する各種の単体酵素（PLA、PLC、PI-PLC、PLD、Lipase）によるバイオフィルム形成抑制効果を示す図である。
【図３】MRSA10株、MSSA7株及び表皮ブドウ球菌4株が形成するバイオフィルムに対する各種の単体酵素（PLA、PLC、PK、DNase、DispB）によるバイオフィルム形成抑制効果を示す図である。
【図４】MRSA10株、MSSA7株及び表皮ブドウ球菌4株が形成するバイオフィルムに対する各種のカクテル酵素（PK/DNase/DispB、PLC/DNase/DispB及びPLA/DNase/DispB）によるバイオフィルム形成抑制効果を示す図である。
【図５】MRSA11が形成するバイオフィルムに対するPLAによるバイオフィルム破壊効果を示す共焦点レーザー顕微鏡（CLSM）を用いたイメージ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
本発明にかかるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤は、PLA（Phospholipase A、ホスホリパーゼA）、PLC（Phospholipase C、ホスホリパーゼC）、及び、PLD（Phospholipase D、ホスホリパーゼD）の少なくとも何れか一つを含む。
【００１７】
ホスホリパーゼは、リン脂質を脂肪酸とその他の親油性物質に加水分解する酵素であり、触媒する反応の種類によりA, B, C, Dの4種に大きく分類される。後述する実施例に示されるように、好ましくは溶血性を示さないPLAである。図１はホスホリパーゼの切断部位を説明する図である。図１に示されるように、PLA1はSN-1アシル基を切断し、PLA2はSN-2アシル基を切断してアラキドン酸を生成し、PLDはリン酸エステル結合を切断し、ホスファチジン酸とアルコールを生成する。本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤において、PLAはPLA1又はPLA2の何れか若しくはこれらの混合物でも良いが、好ましくはPLAはPLA1である。
【００１８】
本発明においてバイオフィルムの抑制とは、バイオフィルムの増殖を制限する他、バイオフィルムの付着予防並びに堆積防止を意味する。本発明に形成されたバイオフィルムの除去とは、付着したバイオフィルムの破壊、並びに、バイオフィルム中の細菌を抑制、死滅、除去を意味する。
【００１９】
本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤が作用するバイオフィルムの由来は特に限定されないが、本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤は、ブドウ球菌属（Staphylococcus）に属するグラム陽性球菌により形成されるものに対して特に抑制活性を有する。本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤は、ブドウ球菌属のうち好ましくは、黄色ブドウ球菌 （S. aureus） 、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）や腐性ブドウ球菌（S. saprophyticus） 由来のバイオフィルム形成を有効に抑制する。本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤は、黄色ブドウ球菌のうち、さらにはMRSA、MSSAやバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（vancomycin-resistant Staphylococcus aureus：VRSA）由来のバイオフィルム形成阻害について有効に作用する。
【００２０】
本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤は、更に、DNA分解酵素（DNase I）、及び、多糖分解酵素（Dispersin B）を有することが可能である。
【００２１】
DNA分解酵素（DNase I）は、DNAを非特異的に分解して5'-リン酸基と3'-ヒドロキシル基末端を持つジヌクレオチド、トリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを産生するエンドヌクレアーゼである。多糖分解酵素（Dispersin B）は、種々の多糖のグルコシド結合を加水分解によって切断して、構成している単糖またはオリゴ糖（単糖が数個結合した糖）あるいはそれらの誘導体を生成する酵素である。
【００２２】
バイオフィルムにおいて細胞間を埋める物質がマトリクスであり、マトリクスの成分には例えばeDNA（extracellular DNA）と呼ばれる細胞外核酸、タンパク質、及び、多糖体が挙げられる。マトリクスの成分としてのタンパク質の中にはバイオフィルム関連タンパク質や宿主細胞接着因子のみならず、多数の細胞質タンパク質が含まれる。マトリクスの成分としての多糖体としては、緑膿菌ではpsl（polysaccharide synthesis locus）やpel（pellicle formation locus）遺伝子産物によって合成されるマンノースやガラクトースあるいはグルコースを主成分とする多糖がバイオフィルム形成の鍵を握っているが、グラム陰性細菌や黄色ブドウ球菌ではPIA（polysaccharide intercellular adhesin）とも呼ばれるPNAG（poly-β(1, 6)-N-acetyl-D-glucosamine）が知られている。
【００２３】
バイオフィルムを形成する菌種によってマトリクスの主成分が異なり、例えばMRSAではeDNAが主成分であり、MSSAではタンパク質が主成分であり、表皮ブドウ球菌ではPIAが主成分である場合が多いが、本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤では、更に、DNA分解酵素（DNase I）及び多糖分解酵素（Dispersin B）を有することにより、更に、種々のバイオフィルムの形成を効果的に抑制可能となる。
【００２４】
そのため本実施形態にかかるバイオフィルム抑制剤は、例えば、下記構成となる。
・PLAを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLCを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLDを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLA及びPLCを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLA及びPLDを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLC及びPLDを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLA、PLC及びPLDを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLA、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLC、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLD、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLA、PLC、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLA、PLD、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLC、PLD、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
・PLA、PLC、PLD、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤
【００２５】
本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤において、特に限定されるものではないが、例えば、PLA 20〜200 μg/mL、PLC 20〜200 μg/mL、PLD 100〜1,000 U/mL、DNase I 10〜100 U/mL、Dispersin B 2〜20 μg/mLである。
【００２６】
PLA、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤において、各酵素の配合割合は特に限定されるものではないが、例えばPLA 20〜200 μg/mL、DNase I 10〜100 U/mL、及び、Dispersin B 2〜20 μg/mLである。
【００２７】
PLC、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤において、各酵素の配合割合は特に限定されるものではないが、例えばPLC 20〜200 μg/mL、DNase I 10〜100 U/mL、及び、Dispersin B 2〜20 μg/mLである。
【００２８】
PLD、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び／又は除去剤において、各酵素の配合割合は特に限定されるものではないが、例えばPLD 100〜1,000 U/mL、DNase I 10〜100 U/mL、及び、Dispersin B 2〜20 μg/mLである。
【００２９】
本実施形態にかかる医療用器具は、上記バイオフィルム抑制及び／又は除去剤で処理されてなる医療用器具、例えば、医療用デバイス、医療用ドレッシングや医療用テープ等である。バイオフィルム抑制及び／又は除去剤で処理されてなる医療用器具とは、当該医療用器具の表面の一部若しくは全体をバイオフィルム抑制及び／又は除去剤でコーティングされているか、又は医療用器具の一部若しくは全体にバイオフィルム抑制及び／又は除去剤が浸透しているものである。
【００３０】
医療用デバイスは例えばインプラント（implant）である。インプラントの例として、特に限定されないが、例えばカテーテル、人工歯（デンタルインプラント）、骨折・リウマチ等の治療で骨を固定するためのボルト、ペースメーカー、人工心臓弁、人工関節、ボイスプロテーゼ、コンタクトレンズ等が挙げられる。前記カテーテルとしては、尿道カテーテル、腹腔カテーテル及び中心静脈カテーテル等が挙げられる。
【００３１】
なお本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び／又は除去剤には、必要に応じて、バイオフィルムを形成しうる菌に有効な消毒薬、例えばグルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、両性界面活性剤、アルコール、次亜塩素酸ナトリウム、ポビドンヨード、グルタラール等を併用して用いることも可能である。なお、ブドウ球菌に対する持続効果の面ではクロルヘキシジンが効果的である。
【実施例】
【００３２】
１．菌株、酵素及び試薬類
下記に示す菌株を使用した。
・黄色ブドウ球菌臨床分離株：慈恵医大病院で患者から分離されたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）10株及びメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（MSSA）7株
・表皮ブドウ球菌臨床分離株： 慈恵医大病院で患者から分離された表皮ブドウ球菌4株
下記に示す酵素を使用した。
・PLA: Phospholipase A1 from Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich, Cat#: L3295)
・PLC: Phospholipase C from Clostridium perfringens (Sigma-Aldrich, Cat#: P4039)
・PI-PLC: Phosphatidylinositol-specific phospholipase C from Bacillus cereus (Sigma-Aldrich, Cat#: P5542)
・PLD: Phospholipase D from Streptomyces chromofuscus (Sigma-Aldrich, Cat#: P0065)
・Lipase from Candida rugosa (Sigma-Aldrich, Cat#: L1754)
・DNase: DNase I recombinant, RNase-free from Bovine pancreas, expressed in Pichia pastoris (Roche, Cat#: 4716728001)
・DispB: Dispersin B (beta-1,6-N-acetylglucosaminidase) from Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Kane Biotech)
・PK: Proteinase K from Tritirachium album (Sigma-Aldrich, Cat#: P6556)
下記に示す試薬類を使用した。
・Brain heart infusion (BHI) medium (Becton Dickinson, Cat#: 211065)： 37 g/Lとなるように脱イオン水に溶かし、121°Cで15分間オートクレーブして滅菌した。
・BHIG培地： 1% glucoseを含むBHI培地。
・Glucose (Nacalai Tesque, Cat#: 16805-35)
・Crystal violet (CV): 50 mgのCVを秤とり、1 mLのエタノールに溶かし、滅菌水で500 mLとなるようにメスアップした。
・Phosphate buffered saline (PBS)
・滅菌水
【００３３】
２．バイオフィルム形成抑制試験
(a)グリセロールストックから滅菌爪楊枝を使って滅菌したBHI培地2 mLにブドウ球菌臨床分離株を接種し、37°Cで一晩振とう培養した（振とう速度：150 rpm）。
【００３４】
(b)一晩培養した培養液を滅菌したBHIG培地に1,000倍希釈した。
【００３５】
(c)希釈した菌液を滅菌した96穴ポリスチレンプレートに1穴あたり200 μLずつ分注し、各種酵素（200 μg/mL PLA, 200 μg/mL PLC, 200 μg/mL PI-PLC, 1,000 U/mL PLD, 200 μg/mL Lipase, 100 μg/mL PK, 100 U/mL DNase I, 20 μg/mL Dispersin B）を単独もしくは様々な組み合わせで添加した。
【００３６】
(d)37°Cで24時間静置培養した。
【００３７】
(e)アスピレーターを使って培養液と浮遊菌を吸い取り、150 μLのPBSでバイオフィルムが形成されたプレートの穴を洗浄した。
【００３８】
(f)アスピレーターを使って洗浄液を吸い取り、0.05% の CV を1穴あたり150 μL添加し、25 °Cで約3分間染色した。
【００３９】
(g)アスピレーターを使って染色液を吸い取り、150 μLのPBSでバイオフィルムが形成されたプレートの穴を洗浄した。
【００４０】
(h)プレートリーダーInfinite F200 Proを使って、プラスチックプレートに形成されたバイオフィルムの吸光度（595 nm）を測定した。
【００４１】
図２は、MRSA、MSSA、及び、表皮ブドウ球菌が形成するバイオフィルムに対する各種の単体酵素（PLA、PLC、PI-PLC、PLD、Lipase）によるバイオフィルム形成抑制効果を示す図である。PLDは、MSSA及び表皮ブドウ球菌が形成するバイオフィルムに対する形成抑制効果は優れているが、溶血性が示された。PLAは、溶血性が示されず、更にMRSA及びMSSAが形成するバイオフィルムに対する形成抑制効果が優れているものの、表皮ブドウ球菌が形成するバイオフィルムに対する形成抑制効果はコントロールとほぼ同じであった。図２の結果は、MRSA、MSSA及び表皮ブドウ球菌が形成するバイオフィルムのマトリクスの主構成物が、それぞれ、相違するため、各種酵素によるバイオフィルム形成抑制効果のバラツキがあることを示す。
【００４２】
図３は、MRSA10株、MSSA7株及び表皮ブドウ球菌4株が形成するバイオフィルムに対する各種の単体酵素（PLA、PLC、PK、DNase、DispB）によるバイオフィルム形成抑制効果を示す図である。図３の結果は、MRSA(図３A)、MSSA(図３B)及び表皮ブドウ球菌(図３C)の株ごとにおいて、各種酵素によるバイオフィルム形成抑制効果のバラツキがあることを示す。
【００４３】
図４は、MRSA10株(図４A)、MSSA7株(図４B)及び表皮ブドウ球菌4株(図４C)が形成するバイオフィルムに対する各種のカクテル酵素によるバイオフィルム形成抑制効果を示す図である。カクテル酵素は、PK/DNase/DispBの混合酵素、PLC/DNase/DispBの混合酵素、及び、PLA/DNase/DispBの混合酵素であった。PK/DNase/DispBは、PK 100 μg/mL、DNase I 100 U/mL、及び、Dispersin B 20 μg/mLであった。PLC/DNase/DispBは、PLC 200 μg/mL、DNase I 100 U/mL、及び、Dispersin B 20 μg/mLであった。PLA/DNase/DispBは、PLA 200 μg/mL、DNase I 100 U/mL、及び、Dispersin B 20 μg/mLであった。PLC/DNase/DispBの混合酵素は、MRSA10株、MSSA7株及び表皮ブドウ球菌4株が形成するバイオフィルムに対する形成抑制効果が優れていた。PLA/DNase/DispBの混合酵素は、PLC/DNase/DispBの混合酵素よりも、更に、MRSA10株、MSSA7株及び表皮ブドウ球菌4株が形成するバイオフィルムに対する形成抑制効果が優れていた。
【００４４】
３．共焦点レーザー顕微鏡（CLSM）を用いたバイオフィルムの観察
(a)MRSA No.11株（MR11株）のグリセロールストックから滅菌した爪楊枝を使って滅菌したBHI培地2 mLに菌を接種し、37°Cで一晩振とう培養した（振とう速度：150 rpm）。
【００４５】
(b)一晩培養した培養液を滅菌したBHIG培地に1,000倍希釈した。
【００４６】
(c)希釈した菌液を滅菌したガラス底培養皿（松浪硝子工業, Cat#: D111300）に2 mLずつ分注し、37°Cで24時間静置培養した。
【００４７】
(d)バイオフィルム培養液に200 μg/mL PLAを添加し、37°Cで2時間インキュベートすることでバイオフィルムを破壊した。
【００４８】
(e)アスピレーターを使って培養液と浮遊菌を吸い取り、2 mLの酢酸バッファー（pH 5.0）で2回洗浄した。
【００４９】
(f)4%パラフォルムアルデヒド/PBSを2 mL添加し、バイオフィルムを室温で10分間固定した。
【００５０】
(g)アスピレーターを使って固定液を吸い取り、2 mLの酢酸バッファー（pH 5.0）で3回洗浄した。
【００５１】
(h)FilmTracerTM FMTM 1-43 Green Biofilm Cell Stain（Themo Fisher Scientific, Cat#: F10317）を用いてバイオフィルムに含まれるリン脂質（細胞膜等）を室温で30分間染色した。
【００５２】
(i)アスピレーターを使って染色液を吸い取り、2 mLの滅菌水で3回洗浄した。
【００５３】
(j)滅菌水を2 mL添加し、NucBlueTM Fixed Cell ReadyProbesTM Reagent（Themo Fisher Scientific, Cat#: R37606）を2滴滴下し、核酸を染色した。
【００５４】
(k)共焦点レーザー顕微鏡LSM-880（カールツァイス）を用いてバイオフィルムを観察した。
【００５５】
図５は、MR11が形成するバイオフィルムに対するPLAによるバイオフィルム破壊効果を示す共焦点レーザー顕微鏡（CLSM）を用いたイメージ図である。PLAによるバイオフィルム破壊効果が、視覚的に確認できる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
バイオフィルムの形成抑制および除去に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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