(57)【要約】【課題】器官培養によって作製される皮膚同等物を、調製し、保管し、発送し、そして使用するためのシステム及び方法を提供する。【解決手段】本発明は、一般的に、器官培養によって作製される皮膚同等物を、調製し、保管し、発送し、そして使用するためのシステム及び方法に関する。特に、本発明は、生育可能な皮膚代用物を凍結保存するためのシステム及び方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、生育可能なヒト皮膚代用物の凍結保存のためのシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織工学（ＴＥ）の新興分野では、今後１０年において、器官の疾患及び機能不全の治療を著しく進歩させる準備が整っている。２００１年において、米国（Ｕ．Ｓ．）及び欧州市場のために承認された細胞に基づく治療法が２３あり、そのうちの９つは、皮膚代用物または皮膚移植片であり、１００を超える製品が開発中であった（Ｄｅ Ｂｒｅｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｒｔ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （１） ２：７７−９６ （２００１））。１０年後に、人工組織は、創傷治療産業内の個別の産業セクターとして現れ、再生医学の最も有望な細胞に基づく治療プラットホームの１つとなっている。創傷治療の世界市場は、２０１２年に１６８億ドルであると推定され、約６％の平均年間成長率で成長してきた（Ｋａｌｏｒａｍａ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、２０１２年４月）。この市場の大半は、成熟し高度に競争的であり、かつ、基礎的及び先進的な創傷治療、創傷閉鎖、及び抗感染剤を目標としている製品を含む従来のセクターから成っている。このことにより、競争者は、市場全体の約１５％を占めているより革新的で活発な創傷治療セクターにおいて高度に差別化された製品を開発することに益々関心を高めている。陰圧創傷治療の売上高は依然として優位であるが、米国の生物学的製剤市場における人工組織及び他の製品の２０１０年の売上高は、４億４８００万ドルまで成長し、２０１５年までには、１８．８％の複合年間成長率によって１０億５８００万ドルまで増加すると予測されている（ＢｉｏＭｅｄＧＰＳ−ＳｍａｒＴＲＡＫ ｍａｒｋｅｔ ａｎａｌｙｓｉｓ，２０１２）。
【０００３】
人工組織及び器官の画期的かつ経済的に重要な用途の多くは、ヒトの保健分野に存在するが、前記産業のすべての潜在的経済力の実現には、ほど遠い。現時点では、全世界で、２つの組織工学の会社だけが、皮膚創傷治癒に主眼を置いた細胞に基づく皮膚代用物製品を商業化することができており、１億ドルを上回る年間売上高を達成している。
【０００４】
医療従事者、保健医療提供者、及び関連する他の購入者（ｓｅｃｏｎｄ ｐａｒｔｙ ｐａｙｅｒｓ）による人工組織の採用に対する主な障害は、人工組織を有効かつ効率的に保存及び保管する手段がないことである。生細胞及び組織製品の特性が、長期保存の開発を妨げている。現在の人工組織は、生育可能性及び機能を維持するために、注意深く管理された状況下でしばしば保管かつ発送されなければならない。典型的には、人工組織製品は、製造に数週間または数ヶ月間かかるが、製造から数時間または数日間以内に使用しなければならない。結果として、ＴＥの会社は、最大の能力で製造設備を継続的に運転し、廃棄しなければならない売れ残った製品の費用を吸収しなければならない。既にコストが掛かる製造プロセスに加えて、これらの在庫による損失は、価格を非現実的な水準に押し上げている。具体例の１つとして、ＡＰＬＩＧＲＡＦは、製造に約４週間を要し、わずか１５日間しか使用できず、使用まで２０〜２３℃に維持する必要がある。他の例として、ＥＰＩＣＥＬは、携帯型培養器に入れられて、マサチューセッツ州ケンブリッジにあるＧｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏｓｕｒｇｅｒｙの製造施設から使用現場まで看護師によって運ばれ、到着後すぐに使用される。このような制約は、便利かつ対費用効果が高い製品の開発にとっては重要な課題である。
【０００５】
保存問題の解決策として凍結保存が探求されてきたが、氷の形成、冷害、及び浸透圧の不均衡を介して組織損傷を誘発することが知られている。ＡＰＬＩＧＲＡＦに加えて、他に唯一承認されている、生きている皮膚同等物であるＯＲＣＥＬは、凍結製品として評価中であるが、使用前に−１００℃未満の低い温度に維持する必要があるという欠点を有している。これは、輸送の間の危険物の使用、ならびに高価かつ危険であり、地方の診療所及び野戦病院では入手が難しい保存用液体窒素の使用を含む、特殊な製品配達条件及び保存条件を要する。
【０００６】
したがって、当該技術分野で必要とされるものは、使用に利用可能な条件下で保存するための生育可能な人工組織及び細胞を凍結保存する改良された方法である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、一般的に、生育可能なヒト皮膚代用物の凍結保存のためのシステム及び方法に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は：１工程で、器官培養された皮膚同等物を、凍結防止剤中で処理すること；前記の器官培養された皮膚同等物を包装して、包装された皮膚同等物を提供すること；及び前記の器官培養された皮膚同等物を凍結させて、包装された凍結保存皮膚同等物を提供すること、を含む器官培養された皮膚同等物を凍結保存して生育可能な組織を維持する方法を提供する。いくつかの実施形態では、温度にしたがって、凍結防止剤は、体積基準で、溶液の約２０％もしくは２１％〜約７０％、更に好ましくは溶液の２０％もしくは２１％〜約４５％、または溶液の３７．５％〜６２．５％、または最も好ましくは溶液の約２５％〜４０％もしくは４２．５％〜５７．５％を含む溶液で提供する。いくつかの実施形態では、凍結防止剤による処理は、約２℃〜８℃で行い、他の実施形態では、前記処理工程は、室温で、例えば約１５℃〜３０℃で行う。いくつかの実施形態では、凍結防止剤はグリセロールである。いくつかの実施形態では、凍結は、実質的に過剰な凍結防止剤の非存在下で、器官培養された皮膚同等物を凍結させることを更に含む。いくつかの実施形態では、凍結は約−８０℃での凍結を更に含む。いくつかの実施形態では、凍結は約−５０℃〜−１００℃の温度に直接曝露することを更に含む。いくつかの実施形態では、包装は、無菌バッグ中に凍結保存された皮膚同等物を封入し、そしてその無菌バッグを第２のバッグ中に封入することを更に含む。いくつかの実施形態では、器官培養された皮膚同等物は、ＮＩＫＳ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＮＩＫＳ細胞は、外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、皮膚同等物は、解凍後に生育可能性を保持している。いくつかの実施形態では、皮膚同等物は、ＭＴＴアッセイによって測定した基準皮膚同等物の少なくとも５０％のＡ５５０を有する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本方法は、前記凍結保存された皮膚同等物を解凍し、前記解凍された皮膚同等物をそれを必要とする患者に適用することを更に含み、ここで前記解凍された皮膚同等物は、前記患者に前記適用を実施する前に、すすがない。いくつかの実施形態では、本発明は：凍結保存された皮膚同等物を温めること；及び拡散による凍結防止剤溶液の除去を可能にする組織適合性溶液を含む拡散媒介物と、凍結保存された皮膚同等物とを接触させること、を含む対象に適用する前に凍結保存された皮膚同等物を解凍する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記温めることは、使用現場で室温に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、拡散媒介物は、吸収媒体、膜、及び透析バッグから成る群より選択される。いくつかの実施形態では、吸収媒体は、Ｔｅｌｆａパッド、発泡体パッド、ガーゼパッド、及び組織適合性媒体を含むセルロースパッドから成る群より選択される。いくつかの実施形態では、組織適合性溶液は緩衝液である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記のようにして製造された、包装された凍結保存皮膚同等物を提供すること；前記パッケージから凍結保存された皮膚同等物を無菌的に移動させること；前記の凍結保存された皮膚同等物を温めること；拡散によって凍結防止剤溶液の除去を可能にする組織適合性溶液（ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む吸収媒体と、凍結保存された皮膚同等物とを接触させること；及び凍結保存された皮膚同等物を対象に適用すること、を含む前記対象を治療する方法を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、凍結防止剤と平衡させた凍結保存皮膚同等物を提供する。その皮膚同等物は、皮膚同等物の外面上に過剰な凍結防止剤を実質的に有していない。いくつかの実施形態では、本発明は、吸収媒体上に配置された前記皮膚同等物を含むシステムを提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の包装された凍結保存皮膚同等物を提供すること；及び皮膚同等物が創傷と接触するような条件下で皮膚同等物を創傷に適用すること、を含む方法を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存された皮膚代用物、吸収媒体、及び組織適合性溶液を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、凍結保存された皮膚代用物は、密封可能な封入体の中に包装される。いくつかの実施形態では、凍結保存された皮膚代用物は、バッグ中に包装された培養容器で提供される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明は：画定された上下の位置の間で移動可能な細胞培養基材を含む培養皿を提供すること、細胞培養基材の上に皮膚同等物を形成すること（ここで、前記細胞培養基材は上の位置にある）、更に加工するために下の位置まで前記細胞培養基材を下げること、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、更なる加工は、皮膚同等物を、凍結防止剤溶液で処理することを含む。いくつかの実施形態では、更なる加工は、培養皿で皮膚同等物を凍結させることを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明は：培養皿において上下の位置の間で移動可能なインサートを含む培養皿を提供すること（前記インサートは多孔質膜から形成される底平面を有する）、前記インサート中の多孔質膜上に線維芽細胞を含む真皮同等物を形成すること（ここで、前記インサートは培養皿において上の位置に配置される）、前記線維芽細胞を培養して真皮同等物を形成すること、ケラチノサイト細胞を真皮同等物に適用すること、前記ケラチノサイトが重層上皮を含む皮膚同等物を形成するような条件下で、培地で前記ケラチノサイトを培養すること、前記培地を除去すること、前記インサートを下の位置まで下げること、前記皮膚同等物を凍結防止剤溶液で処理すること、及び前記培養皿で前記皮膚同等物を凍結させること、を含む凍結保存された皮膚同等物を製造する方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、前記方法によって作製された凍結保存皮膚同等物によってそれを必要としている患者を治療する方法を提供する。前記方法は、前記の凍結保存された皮膚同等物を解凍すること；及び前記の解凍された皮膚同等物を、それを必要としている前記患者に適用すること（ただし、前記解凍された皮膚同等物は前記患者に前記適用を実施する前にすすがない）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＭＴＴアッセイを使用した解凍組織の生育可能性試験のグラフである。前記組織は、速度制御冷凍庫（ＣＲＦ）を使用して、または超低温冷凍庫（−８０℃に設定）における受動冷凍によって、凍結保存され、そして最高３ヵ月間保管し、次いで解凍し、１時間及び１日で分析した。生育可能性は、各時点で、各４４ｃｍ２の組織から得た３つの０．５ｃｍ２のパンチに関するＭＴＴアッセイによって測定した（平均＋／−１標準偏差）。
【図２】シミュレーションした受動組織凍結から得られた温度プロフィールである。温度プローブは、上部にＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートを有する３つの１００ｍｍ ｘ ２０ｍｍ皿の底部に固定した。その皿に蓋をし、次いで、それを、内部Ｗｈｉｒｌ−Ｐａｋパウチと外部Ｍｙｌａｒパウチの内側に包装し、−８０℃に設定された超低温冷凍庫の中に入れた。その包装した組織を、底部、中間、及び上部にある金属ラックの中に置いた。
【図３】ＭＴＴアッセイを使用した解凍組織の生育可能性試験のグラフである。組織は、ＣＲＦを使用して凍結保存し、次いで１〜６ヵ月間、−８０℃または−５０℃に設定した超低温冷凍庫に保管し、次いで解凍して、１時間及び１日で分析した。生育可能性は、各時点で、各４４ｃｍ２の組織から得た３つの０．５ｃｍ２のパンチに関するＭＴＴアッセイによって測定した（平均＋／−１標準偏差）。
【図４】ＭＴＴアッセイを使用した解凍組織の生育可能性試験のグラフである。２つの独立したロットからの組織を、凍結保存し、次いで、１ヵ月を超える間、−８０℃に設定した超低温冷凍庫に保管した。各ロットからの２つの組織をドライアイスの容器に４８時間入れ、各ロットからの２つの対照組織を超低温冷凍庫に入れたままにしておいた。ドライアイスへの曝露終了後に、すべての組織を解凍し、１５分及び１日で分析した。生育可能性は、各時点で、各４４ｃｍ２の組織から得た４つの０．５ｃｍ２のパンチに関するＭＴＴアッセイによって測定した（平均＋／−１標準偏差）。
【図５】ＭＴＴアッセイを使用した解凍組織の生育可能性試験のグラフである。組織を、無菌セルロースパッド中に浸漬された段階的な一連のグリセロール濃度に曝露しながら、段階的に温度降下（室温から２〜８℃へ、そして−２０℃へ）させた後、ＣＲＦを使用して凍結保存した。すべての組織を、室温で、１６．３％のグリセロールに最初に曝露した。次に、すべての組織を２〜８℃に切り替え、２つの組織を３２．５％のグリセロールに移した。最後に、すべての組織を−２０℃に切り替え、１つの組織を６５％のグリセロールに移した。組織を気相ＬＮ２中に６日間保管した。生育可能性は、解凍後１時間及び１日で、各４４ｃｍ２の組織から得た３つの０．５ｃｍ２のパンチに関して、ＭＴＴアッセイによって測定した（平均＋／−１標準偏差）。
【図６】ＭＴＴアッセイを使用した解凍組織の生育可能性試験のグラフである。組織は、−８０℃に設定した超低温冷凍庫で受動冷凍することによって６５％のグリセロール中で凍結保存し、次いで−８０℃で６週間保管した。組織を、解凍し、そして１００ｍｌの規定溶液を含む、上昇ステンレス鋼製リフター（ｒａｉｓｅｄ ｓｔａｉｎｌｅｓｓ ｓｔｅｅｌ ｌｉｆｔｅｒ）上の２つのセルロースフィルターパッドから成る収容チャンバ中に置き、規定温度で１時間保った。組織を１時間後及び１日後に分析した。生育可能性は、各時点で、各４４ｃｍ２の組織から得た３つの０．５ｃｍ２のパンチに関するＭＴＴアッセイによって測定した（平均＋／−１標準偏差）。
【図７】ＭＴＴアッセイを使用した解凍組織の生育可能性試験のグラフである。組織を６５％のグリセロール中で凍結保存し、次いで気相ＬＮ２中に２週間保管した。１つの組織を解凍して直接セルロースパッドの無いグロースチャンバ中に入れ、もう一方の組織を、１００ｍｌの成長培地を含む、上昇ステンレス鋼製リフター上の２つのセルロースフィルターパッドから成る収容チャンバ中に置いた。解凍した組織を３７℃で１時間保持した。組織を１時間後及び１日後に分析した。生育可能性は、各時点で、各４４ｃｍ２の組織から得た三つの０．５ｃｍ２のパンチに関するＭＴＴアッセイによって測定した（平均＋／−１標準偏差）。
【図８】ＭＴＴアッセイを使用した解凍組織の生育可能性試験のグラフである。１つのロットからの組織を、凍結保存し、次いで、−８０℃に設定した超低温冷凍庫に１週間保管した。組織を、１０分間解凍し、そして３７℃または室温のいずれかまで温めた４０ｍｌの緩衝栄養液で浸漬したＴｅｌｆａパッドまたはＷｈａｔｍａｎパッドを含む収容チャンバ内に置いた（解凍条件につきｎ＝２の組織）。その組織を、１５〜２０分間、収容チャンバ内に置き、次いでグロースチャンバ内で１日再培養した。その組織を、解凍１日後に分析した。生育可能性は、各４４ｃｍ２の組織から得た４つの０．５ｃｍ２のパンチに関するＭＴＴアッセイによって測定した（平均＋／−１標準偏差）。生育可能性の規格は、赤い破線によって示してある。
【図９】ＭＴＴアッセイを使用した解凍組織の生育可能性試験のグラフである。実施例２に記載してあるように、３つの独立ロットからの組織を、２〜８℃において５０％のグリセロールで処理し、凍結保存した。凍結保存組織は、最高１２ヵ月、約−８０℃で超低温冷凍庫中に保管した。０、２、３、５及び１２ヵ月の保管後、各ロットからの２つの組織を室温で解凍し、培地飽和Ｔｅｌｆａパッド上に１５分間保持した。次いで、組織を戻し、９０ｍｌの成長培地を含む上昇ステンレス鋼製リフターを有する培養皿で一晩培養した。生育可能性は、各時点で、各４４ｃｍ２の組織から得た４つの０．５ｃｍ２のパンチに関するＭＴＴアッセイによって測定した（平均＋／−１標準偏差）。
【図１０】ＭＴＴアッセイを使用した解凍組織の生育可能性試験のグラフである。１つのロットからの組織を、凍結前にリストした条件で、規定のグリセロール濃度（３２．５％または５０％）で処理し、次いで−８０℃に設定した超低温冷凍庫中に９日間保管した。その組織を１０分間解凍し、４０ｍｌの緩衝栄養液で浸漬したＴｅｌｆａスタックに１５〜２０分間置き、次いでグロースチャンバ中で１日再培養した。その組織を、解凍１日後に分析した。生育可能性は、各４４ｃｍ２の組織から得た４つの０．５ｃｍ２のパンチに関するＭＴＴアッセイによって測定した（平均＋／−１標準偏差）。生育可能性の規格は、赤い破線によって示してある。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本明細書で使用する場合、「皮膚同等物」、「ヒト皮膚同等物」、「ヒト皮膚代用物」、及び「器官培養物」という用語は、層状化して扁平上皮になっている、インビトロにおいて（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）誘導されるケラチノサイトの培養物を指すために、交換可能に使用される。典型的には、皮膚同等物は、器官培養によって製造され、ケラチノサイト層に加えて真皮層を含む。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「無菌の」という用語は、検出可能な細菌汚染または真菌汚染が実質的にまたは完全に存在しない皮膚同等物を指している。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「ＮＩＫＳ細胞」という用語は、細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２１９として沈着された細胞の特徴を有する細胞を指している。ＮＩＫＳは、近二倍体の不死化ケラチノサイトを表している。
【００２１】
本明細書で使用される「生育可能な」という用語は、皮膚同等物について使用されるとき、凍結保存後の皮膚同等物における細胞の生育可能性を指している。好ましい実施形態では、「生育可能な」皮膚は、ＭＴＴアッセイで測定すると、対照の非凍結保存組織の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％のＡ５５０を有するか、または類似の生育可能性アッセイの読出し値の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％のＡ５５０を有する。
【００２２】
詳細な説明
本発明は、一般的に、ヒト皮膚代用物を凍結保存するためのシステム及び方法に関する。特に、本発明は、使用する場所、例えば病院、手術室または熱傷ユニットで、長期間保管できるように、生育可能なヒト皮膚同等物を凍結保存する方法に関するものである。本明細書で開示される方法は、保存プロセスの効率を、そして保存皮膚同等物の利用を新たに増加させ、凍結防止剤における１工程平衡、凍結保存前の無菌包装における皮膚同等物の包装、及びすすぐこと無く患者に対して（例えば、移植手技で）直接適用するための凍結保存組織を使用する能力を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、患者の治療で使用するための直ちに使用できる凍結保存皮膚同等物を提供し、好ましい実施形態では、移植手技用で使用するための直ちに使用できる凍結保存皮膚同等物を提供する。凍結保存皮膚同等物は、使用する場所で長期間保管するように設計される。いくつかの実施形態では、凍結保存同等物を遺伝子操作して、広域スペクトルのヒト宿主防御ペプチドを、例えばβ−デフェンシン−３（ｈＢＤ−３）またはカテリシジン（ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７）、またはプロ血管形成因子を、創傷床に送達する。
【００２３】
これまでは、死体皮膚を、回収し、凍結保存剤として１０％〜２０％のグリセロールで処理することによって凍結保存していた。Ｋａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２５ （２００５） ５８７−６０５を参照されたい。驚くべきことに、ヒト皮膚同等物を凍結保存するためにグリセロール濃度を増加させる必要があることが分かっている。
【００２４】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は凍結保存された皮膚同等物を提供する。いくつかの実施形態では、皮膚同等物を遺伝子操作して、外因性抗菌ポリペプチドまたはプロ血管形成因子を発現及び提供してきた。本発明は、任意の特定の抗菌ポリペプチドの使用に限定されない。好ましい実施形態では、抗菌ポリペプチドは、ヒトβ−デフェンシン−１、ヒトβ−デフェンシン−２、ヒトβ−デフェンシン−３、またはカテリシジン（ｈＣＡＰ−１８／ＬＬ３７）または変異体である。いくつかの好ましい実施形態では、抗菌ポリペプチドまたはプロ血管形成因子をコードする核酸構築体またはベクターをケラチノサイト（例えば、ＮＩＫＳ細胞）に導入し、そのトランスフェクトされたケラチノサイトを使用して器官培養技法によって皮膚同等物を作製する。外因性ポリペプチドならびに追加の野生型及び変異型の抗菌ポリペプチド（ｖａｒｉａｎｔ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を発現する皮膚同等物の製造のための好ましい実施形態は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，６７４，２９１；７，８０７，１４８；７，９１５，０４２；７，９８８，９５９；及び８，０９２，５３１に見出すことができ、前記特許のそれぞれは、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、凍結保存された皮膚同等物は、解凍後に創傷に適用され、適所に留置される。他の実施形態では、凍結保存された皮膚同等物は、創傷に一時的に適用される。いくつかの実施形態では、凍結保存された皮膚同等物は取り除かれて、追加の凍結保存されたヒト皮膚同等物に置き換えられる。
【００２６】
Ａ）器官培養によって製造される皮膚同等物
本発明は、扁平上皮に分化可能である任意の特定の細胞供給源の使用に限定されない。実際に、本発明は、扁平上皮に分化することができる種々の細胞株及び供給源（初代ケラチノサイト及び不死化ケラチノサイトが挙げられる）の使用を意図している。細胞の供給源としては、ヒト及び死体ドナーから生体採取されたケラチノサイト及び真皮繊維芽細胞（Ａｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．− Ａｎｉｍａｌ ３６：９６−１０３；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，９６８，５４６及び５，６９３，３３２，前記文献のそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）、新生児包皮（Ａｓｂｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７（９）：１０９２−９７ （２０００）；Ｍｅａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｒｎｓ ２４：６２１−３０ （１９９８）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，４８５，０９６；６，０３９，７６０；及び５，５３６，６５６，前記文献のそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）、及び不死化ケラチノサイト細胞株、例えばＮＭ１細胞（Ｂａｄｅｎ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２３（３）：２０５−２１３ （１９８７）），ＨａＣａＴ細胞（Ｂｏｕｃａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｃｅｌｌ．Ｂｏｉｌ．１０６：７６１−７７１ （１９８８））；及びＮＩＫＳ細胞（細胞株ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ；参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，９８９，８３７；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２１９１）が挙げられる。言及した細胞株のそれぞれは、所望のタンパク質（１種または複数種）を発現または共発現することができる細胞株を製造するために、培養または遺伝子組換えすることができる。特に好ましい実施形態では、ＮＩＫＳ細胞が使用される。新規のＮＩＫＳヒトケラチノサイト細胞株の発見は、非ウイルスベクターを使用してヒトケラチノサイトを遺伝子操作する機会を提供する。ＮＩＫＳ細胞の特有の利点は、それらが、遺伝的に均一であり、病原体が無いヒトケラチノサイトの定常的な供給源であることである。このため、それらは、現在利用可能な皮膚同等物を超える向上した特性を有するヒト皮膚同等物を提供するために、遺伝子工学及びゲノム遺伝子発現方法を適用するのに有用である。ウィスコンシン大学で同定され、特性が調べられているＮＩＫＳ細胞は、非腫瘍原性であり、安定な核型を示し、そして単層培養及び器官培養のいずれにおいても正常な増殖及び分化を示す。ＮＩＫＳ細胞は、培養において完全に層状化された皮膚同等物を形成する。これらの培養物は、これまでに調べられているすべての基準によって、初代ヒトケラチノサイトから形成された器官培養物から区別することができない。しかしながら、初代細胞とは異なり、ＮＩＫＳ細胞は、単層培養において長期の寿命を示す。これは、細胞を遺伝的に操作し、新規の有用な特性を有する新規な細胞のクローンを単離する機会を提供する（Ａｌｌｅｎ−Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１４（３）： ４４４−４５５ （２０００））。
【００２７】
ＮＩＫＳ細胞は、外見上正常な男児から単離されたヒト新生児包皮ケラチノサイトのＢＣ−１−Ｅｐ株から生じた。初期の継代において、ＢＣ−１−Ｅｐ細胞は、培養された正常ヒトケラチノサイトにおいて非典型的である形態学的特性または増殖特性を示さなかった。培養されたＢＣ−１−Ｅｐ細胞は、層状化、ならびにプログラムされた細胞死の特徴を示した。複製の寿命を測定するために、ＢＣ−１−Ｅｐ細胞を、標準的なケラチノサイト成長培地において、１００ｍｍ培養皿当たり３×１０５個の細胞密度において、老化するまで培養し続け、１週間の間隔で継代した（約１：２５に分裂）。１５継代目まで、集団内のほとんどのケラチノサイトは、大きくて平坦な細胞を示している多くの未成熟コロニーの存在によって判断されるような老化を呈した。しかしながら、１６継代目において、小さい細胞サイズを示しているケラチノサイトが認められた。１７継代目まで、小さいサイズのケラチノサイトのみが培養物中に存在し、大きくて老化したケラチノサイトは認められなかった。この危機的と思われる時期を生き延びた得られた小さいケラチノサイトの集団は、形態的に均一な外観を示し、細胞間接着及び扁平な外観の細胞の生成を含む、典型的なケラチノサイトの特徴を示すケラチノサイトのコロニーを形成した。老化時期を生き延びたケラチノサイトを、１００ｍｍ培養皿当たり３×１０５個の細胞密度で培養し続けた。典型的には、培養物は７日以内に約８×１０６個の細胞密度に達した。この細胞増殖の安定した速度は、少なくとも５９継代目まで維持され、細胞が不死に達したことを証明している。老化している元の集団から出現したケラチノサイトは、現在ではＮＩＫＳと呼ばれている。ＮＩＫＳ細胞株は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＢＶ、ＨＣＶ、Ｂ−１９パルボウイルス、ＨＰＶ−１６、ＳＶ４０、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＨＰＶ−１８、及びＨＰＶ−３１のプロウイルスＤＮＡ配列の存在について、ＰＣＲまたはサザン分析のいずれかを使用してスクリーニングされている。これらのウイルスのいずれも検出されなかった。
【００２８】
３継代目における親株ＢＣ−１−Ｅｐ細胞及び３１継代目ならびに５４継代目におけるＮＩＫＳ細胞について、染色体分析を行った。親株ＢＣ−１−Ｅｐ細胞は、ＸＹを含めて４６本の正常な染色体組を有する。３１継代目において、すべてのＮＩＫＳ細胞は、第８染色体長腕の余分な同腕染色体を有する４７本の染色体を含んでいた。大きな染色体異常または標識染色体は他に検出されなかった。ＮＩＫＳ細胞の核型は少なくとも５４継代目におけるまで一定であることが示された。
【００２９】
ＮＩＫＳ細胞株及びＢＣ−１−Ｅｐケラチノサイトに関するＤＮＡ指紋は、分析された１２個のすべての遺伝子座において同一であり、ＮＩＫＳ細胞が親株ＢＣ−１−Ｅｐ集団から生じたことを証明している。ＮＩＫＳ細胞株が親株ＢＣ−１−ＥｐのＤＮＡ指紋を偶然に有する確率は、４×１０−１６である。ヒトケラチノサイトの３種の供給源であるＥＤ−１−Ｅｐ、ＳＣＣ４及びＳＣＣ１３ｙからのＤＮＡ指紋は、ＢＣ−１−Ｅｐのパターンとは異なっている。このデータは、他のヒトＥＤ−１−Ｅｐ、ＳＣＣ４、及びＳＣＣ１３ｙから単離されたケラチノサイトが、ＢＣ−１−Ｅｐ細胞または互いに対して類縁関係に無いことも示している。ＮＩＫＳのＤＮＡ指紋のデータは、ＮＩＫＳ細胞株を同定する明確な手法を提供する。
【００３０】
ｐ５３機能の喪失は、培養細胞における増殖能力の向上及び不死化頻度の増加と関連している。ＮＩＫＳ細胞におけるｐ５３の配列は、発表されているｐ５３配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ１４６９５）と同一である。ヒトの場合、ｐ５３は、コドン７２のアミノ酸によって区別される２種類の主要な多型として存在している。ＮＩＫＳ細胞におけるｐ５３の対立遺伝子は、両方とも野生型であり、コドン７２にアルギニンをコードする配列ＣＧＣを有する。もう一方の一般的な型のｐ５３は、この位置にプロリンを有する。ＮＩＫＳ細胞におけるｐ５３の全配列は、ＢＣ−１−Ｅｐ前駆細胞と同一である。ＮＩＫＳ細胞ではＲｂも野生型であることが明らかになっている。
【００３１】
足場非依存的な増殖は、インビボでの腫瘍形成能と高度に相関している。この理由から、寒天またはメチルセルロースを含む培地中でのＮＩＫＳ細胞の足場非依存的な増殖特性を調べた。寒天またはメチルセルロースを含む培地中での４週間後も、ＮＩＫＳ細胞は単細胞であり続けた。ＮＩＫＳ細胞の増殖の遅い変異体を検出するために、そのアッセイを合計８週間にわたって継続した。ＮＩＫＳ細胞の増殖の遅い変異体は、全く観察されなかった。
【００３２】
親ＢＣ−１−Ｅｐケラチノサイト及び不死化ＮＩＫＳケラチノサイト細胞株の腫瘍形成能を判定するために、胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に細胞を注入した。ヒト扁平上皮癌細胞株ＳＣＣ４を、これらの動物における腫瘍形成に関する陽性対照として使用した。試料の注射は、動物の一方の側腹部にＳＣＣ４細胞を入れ、反対側の側腹部に親株のＢＣ−１-ＥｐケラチノサイトまたはＮＩＫＳ細胞を入れるように設計した。この注入方式によって、腫瘍形成における動物間の差異を排除し、マウスが腫瘍形成性細胞の激しい増殖を助けることが確認された。親ＢＣ−１−Ｅｐケラチノサイト（６継代目）もＮＩＫＳケラチノサイト（３５継代目）も、胸腺欠損ヌードマウスにおいて腫瘍を形成しなかった。
【００３３】
ＮＩＫＳ細胞を、液内培養及び器官培養の両方における分化能について分析した。器官培養の技法は、実施例に詳細が記載されている。特に好ましい実施形態では、本発明の器官培養された皮膚同等物は、コラーゲンまたは類似の物質ならびに繊維芽細胞から形成された真皮同等物を含む。ケラチノサイト、例えば、ＮＩＫＳ細胞、またはＮＩＫＳ細胞と患者由来細胞の組み合わせが真皮同等物に接種され、器官培養プロセスの後に、扁平分化を特徴とする表皮層を形成する。
【００３４】
液内培養における細胞に関しては、扁平分化のマーカーとして角化膜の形成をモニターした。培養されたヒトケラチノサイトにおいて、角化膜構築の初期段階では、インボルクリン、シスタチン−α、及び他のタンパク質から成る未熟構造の形成が起こり、それは成熟角化膜の最内側３分の１に相当する。接着性ＢＣ−１−Ｅｐ細胞またはＮＩＫＳ細胞株に由来するケラチノサイトの２％未満が角化膜を形成する。この所見は、活発に増殖している、集密に達する以前のケラチノサイトは、５％未満の角化膜を形成することを証明した以前の研究と一致する。分化させるために誘導されたときにＮＩＫＳ細胞株が角化膜を形成し得るか否かを判定するために、細胞を接着培養物から取り出し、メチルセルロースを使用して半固体にした培地中で２４時間にわたって浮遊させた。ケラチノサイトの細胞間接着及び細胞−基層接着の喪失によって、終末分化の多くの態様（ケラチンの示差的発現及び角化膜の形成が挙げられる）は、インビトロで誘発することができる。ＮＩＫＳケラチノサイトは親ケラチノサイトと同程度、通常はより多くの角化膜を形成した。これらの所見は、この細胞型に特異的な分化構造の形成を開始させる能力をＮＩＫＳケラチノサイトが失っていないことを証明している。
【００３５】
ＮＩＫＳケラチノサイトが扁平分化を起こし得ることを確認するために、細胞を器官培養で培養した。プラスチック基層上で増殖させかつ培地中に浸漬させたケラチノサイト培養物は、複製するが、分化は限定的であった。詳しくは、ヒトケラチノサイトは集密化して、３層以上のケラチノサイトから成るシートを生成する限定的な重層化を起こす。光学顕微鏡及び電子顕微鏡によれば、液内培養で形成される多層シートの構造と完全なヒト皮膚の構造との間には、大きな差がある。これに対して、器官培養技法では、ケラチノサイトがインビボに類似した条件下で増殖及び分化を行うことが可能である。詳しくは、細胞は、原繊維のコラーゲン基質内に包埋された真皮繊維芽細胞から成る生理学的基層に接着する。器官培養物は、空気−培地の界面で維持される。このように、上方のシート内の細胞は空気に曝露されるのに対して、増殖中の基底細胞は、コラーゲンゲルを介した拡散によって供給される栄養分の勾配に接した状態に保たれる。これらの条件下で、正しい組織構造が形成される。正常に分化している表皮のいくつかの特徴が認められる。親細胞及びＮＩＫＳ細胞株の両方において、立方基底細胞の単層が、表皮と真皮同等物との接合部に存在する。円形の形態、及び核の細胞質に対する高い比率は、ケラチノサイト集団が活動的に分裂していることを表す。正常なヒトの上皮では、基底細胞が分裂すると、それらは、組織の分化している層中へと上方に移動する娘細胞を生み出す。娘細胞はサイズを増大させ、平坦になり、扁平になる。最終的には、これらの細胞は、脱核し、角化した角質構造を形成する。この正常な分化プロセスは、親細胞及びＮＩＫＳ細胞の両方の上層において認められる。平坦な扁平細胞の出現は、上の上皮層において明らかであり、層状化が器官培養において起こったことを証明している。器官培養物の最上部分では、脱核した扁平細胞が培養物の上部から剥落する。現在のところ、器官培養で増殖させた親ケラチノサイトとＮＩＫＳケラチノサイト細胞株との間に、光学顕微鏡のレベルにおいて、分化における組織学的な差は観察されていない。
【００３６】
親株（５継代目）及びＮＩＫＳ（３８継代目）の器官培養物のより詳細な特徴を観察し、かつ組織学的観察を確認するために、電子顕微鏡を使用して試料を分析した。親細胞及び不死化ＮＩＫＳヒトケラチノサイト細胞株を１５日間の器官培養を行った後に回収し、重層化の程度を示すために基底層に対して直角に切片化した。親細胞及びＮＩＫＳ細胞株の両方は、器官培養において広範な層状化を起こし、正常ヒト表皮に特徴的な構造を形成する。大量のデスモソームが、親細胞及びＮＩＫＳ細胞株の器官培養において形成される。また、親細胞及び細胞株の両方の基底ケラチノサイト層における基底層及び随伴性のヘミデスモソームの形成も認められた。
【００３７】
ヘミデスモソームは、ケラチノサイトの基底層への接着を増強する特殊な構造であり、組織の完全性及び強度の維持に役立つ。これらの構造の存在は、親細胞またはＮＩＫＳ細胞が多孔性支持体に対して直接付着した領域において特に明らかであった。これらの所見は、線維芽細胞を含む多孔性支持体上で培養したヒト包皮ケラチノサイトを使用して以前に得られた超微細構造の所見と一致する。光学顕微鏡レベル及び電子顕微鏡レベルの両方の分析は、器官培養におけるＮＩＫＳ細胞株が層状化し、分化し、そして正常なヒトの上皮に見出されるデスモソーム、基底層、及びヘミデスモソームのような構造を形成し得ることを証明している。
【００３８】
Ｂ）凍結保存
本発明は、凍結保存された生育可能な皮膚同等物を提供する。凍結保存された皮膚同等物は、約−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃以下で、１、２、３、４、５または６ヵ月を超え、最大１２または２４カ月までの長期間、生育可能性を実質的に失うこと無く、好ましく保管できる。
【００３９】
好ましい実施形態では、製品包装より前の凍結保存プロセスのすべての工程は、クラス１０，０００のクリーンルームで、クラス１００の安全キャビネット内で、無菌的に行う。いくつかの実施形態では、前記の凍結保存プロセスは、凍結防止剤溶液中で器官培養された皮膚同等物を処理することを含む。本発明のある実施形態は、任意の特定の凍結防止剤の使用に限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、凍結防止剤はグリセロールである。前記凍結防止剤は、凍結防止剤溶液中の異なる濃度で提供してもよい。いくつかの実施形態では、凍結防止剤は、温度に応じて、体積基準で溶液の約２０％もしくは２１％〜約７０％、更に好ましくは、体積基準で溶液の約２０％もしくは２１％〜約４５％、または体積基準で３７．５％〜６２．５％、または、最も好ましくは、体積基準で溶液の約２５％〜４０％、または、体積基準で溶液の４２．５％〜５７．５％含む溶液で提供する。いくつかの実施形態では、凍結防止剤溶液は、好ましくは、約３２．５％ｖ／ｖまたは約５０％ｖ／ｖの凍結防止剤（例えば、グリセロール）を含む。いくつかの実施形態では、凍結防止剤は、基本培地溶液で提供される。適当な基本培地溶液としては、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、ＭＥＭ及びＲＰＭＩが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、前記基本培地は溶液体積の残りを形成する。いくつかの実施形態では、凍結防止剤溶液は緩衝される。適当な緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、及びＴｒｉｚｍａ緩衝剤が挙げられるが、それらに限定されない。緩衝剤は、ｐＨ７．０〜７．４の緩衝系を提供する量で含有されてよい。いくつかの好ましい実施形態では、凍結防止剤溶液を、約５ｍＭ〜１５ｍＭのＨＥＰＥＳで、最も好ましくは約１０ｍＭのＨＥＰＥＳで、約７．０〜７．４のｐＨまで緩衝する。
【００４０】
いくつかの特に好ましい実施形態では、凍結防止剤溶液による処理は、１工程で実行される。「１工程」とは、当業で一般的であるような平衡手順中に、凍結防止剤溶液が交換されないことを意味している。例えば、その処理工程は、各工程で凍結防止剤の濃度を上昇させると共にいくつかの培地を変える段階的平衡手順（ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）とは対照的に、規定濃度の凍結防止剤を有する凍結防止剤溶液を使用して行う。いくつかの実施形態では、処理工程は、換算温度で行われる。いくつかの好ましい実施形態では、処理工程は約２℃〜８℃で行い、他の実施形態では、前記処理工程は、室温で、例えば約１５℃〜３０℃で行う。いくつかの実施形態では、皮膚同等物を、約１０〜６０分間、好ましくは約２０〜３０分間、凍結防止剤溶液中で培養する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、皮膚同等物は、凍結防止剤で処理された後凍結される。いくつかの実施形態では、過剰な凍結防止剤溶液は、例えば溶液を吸引するかまたは処理した皮膚同等物を新鮮な容器へと移すことによって、凍結前に皮膚同等物から除去される。したがって、いくつかの実施形態では、処理した皮膚同等物を、約−５０℃〜−１００℃、最も好ましくは約−８０℃の温度に曝露することによって、凍結させる。いくつかの好ましい実施形態では、処理した皮膚同等物を、バッグ、または培養皿のような他の容器の中に単に置き、次いで、凍結ユニット、例えば低温の凍結ユニット（例えば−８０℃の冷凍庫）の中に配置する。対照的に、凍結ユニット内の温度を制御することよって、または、温度の低下速度を制御できる容器内に凍結させる組織を配置することによって、凍結速度を制御することは当業において一般的である。いくつかの実施形態では、処理した皮膚同等物を、凍結させるために無菌の培養容器に配置する。用語「培養容器」は、細胞または組織を培養するために通常使用されるタイプの任意の容器を指しており、適当な材料、例えば組織培養プラスチック、ポリスチレン、ポリマー、プラスチック、ガラスなどから作られる円形の、矩形の、及び正方形の皿を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、凍結保存された皮膚同等物は、長期保管のために包装される。いくつかの好ましい実施形態では、皮膚同等物は、上記のようなバッグまたは培養容器の中に配置される。いくつかの実施形態では、バッグまたは培養容器を、封入し、好ましくは無菌バッグ（例えば、プラスチックまたはポリマーのバッグ）中にヒートシールして一次包装を提供する。次いで、一次包装を、第２のバッグ、例えば第２のプラスチック、箔、またはＭｙｌａｒバッグの中に封入する。本発明の凍結保存された組織は、低温で、すなわち約−５０℃〜約−１００℃、好ましくは約−８０℃で保管するのが好適である。皮膚同等物は、好ましくは、実質的に生育可能性を失うことなく、約１、２、３、４、５または６ヵ月、及び最大１２または２４ヵ月まで保管してもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、前記凍結保存された皮膚同等物を温めることを含む、対象に適用する前に凍結保存された皮膚同等物を解凍し、拡散によって前記凍結防止剤溶液の除去を可能にする組織適合性溶液を含む吸収媒体と、前記凍結保存された皮膚同等物とを接触させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、適当なバッグまたは培養容器における凍結保存された皮膚同等物を、ベンチまたはテーブルの上に単に配置し、そして解凍させる。当業において一般的である制御された条件下での解凍は、必要ではない。いくつかの実施形態では、凍結保存された皮膚同等物を、吸収媒体に配置して、前記皮膚同等物から、解凍された凍結防止剤溶液を除去する。本発明は、特定の吸収媒体の使用に限定されない。適当な吸収媒体としては、Ｔｅｌｆａパッド、セルロースパッド（例えばＷｈａｔｍａｎ １００３−０９０濾過パッド及びＰａｌｌ ７００１０濾過パッド）、ガーゼパッド、及び発泡体パッド（例えばＣｏｖｉｄｉｅｎ ５５５４４親水性発泡体パッド）が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、吸収媒体はＴｅｌｆａパッドである。いくつかの実施形態では、吸収媒体は組織適合性溶液を含む。いくつかの実施形態では、組織適合性溶液は緩衝液である。適当な組織適合性溶液としては、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、ＭＥＭ及びＲＰＭＩが挙げられるが、それらに限定されない。適当な緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、及びＴｒｉｚｍａ緩衝剤が挙げられるが、それらに限定されない。緩衝剤は、ｐＨ７．０〜７．４の緩衝系を提供する量で含有されてよい。
【００４４】
更なる実施形態では、本発明は、凍結保存された皮膚代用物を含むキットを、好ましくは上記したようなパッケージで提供する。いくつかの実施形態では、キットは、吸収媒体及び組織適合性溶液を更に含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、器官培養された皮膚同等物を形成し、同じ培養容器で前記皮膚同等物を凍結させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、培養容器は、培養皿で上下の位置の間で移動可能なインサートを含む。インサートは、好ましくは多孔質膜である底面を含む。使用中、培養容器は適当な培地で満たされ、真皮同等物は多孔質膜上で形成される。次いで、真皮同等物に、適当な培地の存在下で、ケラチノサイト（例えば、ＮＩＫＳ細胞）を接種する。適当な時間に、気体界面を、培養容器中の培地のレベルを低下させることによって作り出し、層状化された皮膚同等物が形成されるまで、培養を続けた。次いで、培地を培養容器から取り出し、インサートを下の位置まで降ろす。処理のために凍結防止剤溶液を加え、次いで取り除き、そして培養容器を凍結ユニットに移す。
【００４６】
Ｃ）治療用途
本発明の凍結保存された皮膚同等物は治療的に使用できるものと考えられる。いくつかの実施形態では、凍結保存された皮膚代用物は、創傷閉鎖及び熱傷に対する治療用途で使用される。熱傷に対する治療及び創傷閉鎖のための自己移植及び同種異系移植の利用については、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１７０（１）：７５−８３ （１
９９５）及びＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６９３，３３２；５，６５８，３３１；及び６，０３９，７６０に記載されており、前記文献のそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、皮膚同等物は、ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴまたはＩＮＴＥＧＲＡのような真皮代用物と共に使用してもよい。したがって、本発明は、創傷（創傷としては熱傷によって生じた潰瘍または創傷が挙げられる）閉鎖の方法であって、皮膚同等物と、創傷を受けている患者とを提供すること、並びに創傷が閉鎖されるような状況下において皮膚同等物で患者を治療することを含む方法を提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、皮膚同等物を使用して慢性の皮膚創傷を治療する。慢性の皮膚創傷（例えば静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、圧迫潰瘍）は、深刻な問題である。そのような創傷の治療には、しばしば、１年をはるかに超える治療が必要になる。治療の選択肢としては、現在のところ、包帯法及び壊死組織除去法（壊死している組織を除去するための化学物質または手術の利用）、及び／または感染症の場合には抗生物質が挙げられる。これらの治療の選択肢は、長期間を要し、高いレベルの患者の同意を要する。したがって、慢性創傷を治療する際の医師による治療の成功を増やすことができかつ創傷治癒の速度を速めることができる治療法により、この分野において対処されてこなかったニーズが満たされるであろう。したがって、本発明は、凍結保存された皮膚同等物による皮膚創傷の治療を意図している。いくつかの実施形態において、皮膚同等物は、典型的には、創傷に対して適用される。他の実施形態では、凍結保存された皮膚同等物は、部分層創傷に対する適用のために使用される。他の実施形態では、凍結保存された皮膚同等物を使用して全層創傷を治療する。他の実施形態では、凍結保存された皮膚同等物は、数多くのタイプの内部創傷（消化管の内側を覆う粘膜の内部創傷、潰瘍性大腸炎、及び癌治療によって引き起こされる可能性のある粘膜の炎症が挙げられるが、それらに限定されない）を治療するために使用される。更に他の実施形態では、宿主防御ペプチドまたはプロ血管形成因子を発現する皮膚同等物は、一時的または永久的な創傷被覆物として使用される。
【００４８】
なお更なる実施形態では、細胞を遺伝子操作して追加の治療剤を対象に提供する。本発明は、任意の特定の治療剤の送達に限定されない。実際に、種々の治療剤を対象に送達できることが意図され、前記治療剤としては、酵素、ペプチド、ペプチドホルモン、他のタンパク質、リボソームＲＮＡ、リボザイム、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びアンチセンスＲＮＡが挙げられるが、それらに限定されない。好ましい実施形態では、前記薬剤は、宿主防御ペプチド、例えばヒトβ−デフェンシン１、ヒトβ−デフェンシン２、もしくはヒトβ−デフェンシン３、またはカテリシジンであるか、または他のタンパク質、例えばＶＥＧＦ及びＨＩＦ−１αであり、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，６７４，２９１；７，８０７，１４８；７，９１５，０４２；７，９８８，９５９；及び８，０９２，５３１を参照されたい；前記特許のそれぞれは参照により本明細書に完全に組み込まれる。これらの治療剤は、遺伝的欠損を修正する目的が挙げられるが、これに限定されない種々の目的のために、送達され得る。いくつかの特有な好ましい実施形態では、遺伝的な先天性代謝異常（例えば、アミノ酸尿）の患者を解毒させる目的で治療剤は送達され、皮膚同等物は野生型の組織として機能する。治療剤の送達は欠損を修正すると考えられる。いくつかの実施形態では、細胞は、治療剤（例えばインスリン、凝固第ＩＸ因子、エリスロポエチンなど）をコードするＤＮＡ構築体によってトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞から調製された皮膚同等物は、対象に投与される。次いで、治療剤は、移植片から患者の血流または他の組織に送達される。好ましい実施形態では、治療剤をコードする核酸は、適当なプロモーターに作動可能に連結される。本発明は、任意の特定のプロモーターの使用に限定されない。実際に、種々のプロモーターの使用が意図され、例えば、誘導的、構成的、組織特異的、及びケラチノサイト特異的プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、治療剤をコードする核酸は、ケラチノサイト中に直接的に（すなわち、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿、またはリポソームトランスフェクションによって）導入される。他の好ましい実施形態では、治療剤をコードする核酸は、ベクターとして供給され、ベクターは当該技術分野で公知の方法によってケラチノサイト中に導入される。いくつかの実施形態では、ベクターは、複製するプラスミドのようなエピソーム性ベクターである。他の実施形態では、ベクターはケラチノサイトのゲノム中に組み込まれる。組み込みベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、非複製プラスミドベクター、及びトランスポゾンベクターが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４９】
実験
以下の実施例は、本発明のある好ましい実施形態及び態様を証明しかつ更に説明するために提供されるものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【００５０】
以下の実験の開示においては、以下の略語を適用する：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（規定）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；ｌまたはＬ（リットル）；ｍｌまたはｍＬ（ミリリットル）；μｌまたはμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｃ（摂氏）；Ｕ（ユニット）、ｍＵ（ミリユニット）；ｍｉｎ．（分）；ｓｅｃ．（秒）；％（パーセント）；ｋｂ（キロベース）；ｂｐ（塩基対）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＣＦＵ（コロニー形成単位）；ｋＧｙ（キログレイ）；ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）；ＢＣＡ（ビシンコニン酸）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）。
【００５１】
実施例１
ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織は、正常ヒト皮膚の構造的及び生物学的特性の多くを再生させる、生きている全層の同種異系ヒト皮膚代用物である。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織は、ＮＩＫＳ（登録商標）細胞（病原体が無いヒトケラチノサイト前駆細胞の定常的でかつ特徴の明確な供給源である）に由来する生育可能な完全に重層化した表皮層と、コラーゲンに富むマトリックスに包埋された正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を含む真皮層との両方を含む。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織は、ヒト皮膚移植片と同様にかみ合わせることができ、ステープルで留めることができ、そして縫合することができる優れた引張り強度及び取扱適性を有する。また、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）は、完全なヒト皮膚に匹敵するバリア機能を示し、そして創傷床の前処置及び組織再生のために生物活性分子を送達することができる。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織の物理的及び生物学的特徴により、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔは種々の皮膚創傷の治療にとって理想的である。
【００５２】
ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織のための製造プロセスは、３つの連続した細胞及び組織の培養プロセスを含む。製造プロセスのステージＩでは、ＮＩＫＳケラチノサイトは単層細胞培養で増大させる。ステージＩにおけるＮＩＫＳケラチノサイト培養と同時に、ＮＨＤＦを、単層培養で増大させ、精製されたＩ型コラーゲン及び培地と組み合わせ、そして、ゲル化させて、細胞化された真皮同等物（ＤＥ）を形成させる。あるいは、ＮＨＤＦを、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート内に接種し、増殖かつ分泌させ、そして細胞外マトリックス分子を集合させて単純な真皮同等物を構築することができる。ステージＩＩでは、ＮＩＫＳケラチノサイトをＤＥの表面上に接種し、浸漬状態下で２日間培養してＤＥ表面の完全な上皮形成を促進する。次いで、ステージＩＩＩにおいて、その組織を気液界面まで上げ、そこで、その組織を、制御された低湿度環境に１８日間維持して、組織の成熟を促進する。皮膚同等物は一般的にＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，６７４，２９１；７，８０７，１４８；７，９１５，０４２；７，９８８，９５９；及び８，０９２，５３１に記載されているように調製される；前記特許のそれぞれは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００５３】
実施例２
本実施例では、ヒト皮膚同等物のための改善された凍結保存方法を説明する。製造プロセスは、上記した現在の方法と変わらない。ロットのすべての組織を、新鮮な培地と一緒に供給し、凍結保存前に一晩培養する。凍結保存前に、各ロットのすべての組織からの培地サンプルを、無菌性について試験する。各ロットの残留組織を、以下の通りに凍結保存する。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
凍結保存プロセスの説明
最終製品の包装工程前に、凍結保存プロセスのすべての工程を、クラス１０，０００のクリーンルームにおいて、クラス１００の安全キャビネットで無菌的に行う。
工程１−安全キャビネット内でステンレス鋼製冷間処理表面上で２〜８℃まで２０ｍｌの凍結防止剤溶液を含む１００ｍｍの培養皿を予冷する。冷間処理表面の温度を、水中に沈められた冷凍ゲルパックとの接触によって、数時間２〜８℃に維持する。
工程２−ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織を含むＴｒａｎｓｗｅｌｌｓを、予冷した凍結防止剤溶液を含む各培養皿中に移す。冷間処理表面上の凍結防止剤中で組織を２０〜３０分間培養する。
工程３−処理したＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織を、培養皿の底に組織が存在するように最終製品ラベルを含む新しい無菌の１００ｍｍ培養皿に移し、そして冷間処理表面へと組織を戻す。過剰な凍結防止剤を皮膚同等物から排出させて、処理された皮膚同等物を提供する。前記処理された皮膚同等物は、皮膚同等物の外面上に実質的に過剰な凍結防止剤を有していない。
工程４−透明で無菌のバッグ内に１００ｍｍ培養皿をヒートシールする。一次包装を、二次のＭｙｌａｒバッグに入れ、ヒートシールし、包装された組織を、すべての組織が包装されるまで、低温保存容器に移す。
工程５−包装されたＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織を有する低温保存容器をクリーンルームから取り出し、超低温冷凍庫（−７５℃〜−８０℃）に組織を移す。その組織を前記冷凍庫内の予冷ラック内に置き、その包装された組織の上下に無制限に気流を流して均一で迅速な冷却を確保する。凍結プロセスの間、一晩、組織を静置する。
組織は、ロット発送試験の結果が出るまで−７０〜−９０℃の隔離保管庫に入れる。凍結保存されたＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織の各ロットからの代表的な組織を、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織のロット発送試験のために歴史的に使用されてきた品質管理ＳＯＰのパネルを使用して、試験する。
【００５６】
Ｓｔｒａｔａｔｅｃｈは、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織の特性を決定するために使用されるロット発送アッセイのパネルを確立し、認定してきた。これらのロット発送アッセイのサブセットを使用して、保管条件に対する変更がＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織の重要な生物学的及び構造的特徴（例えばバリア機能、生育可能性、及び組織学的外見）に関して有し得る影響をモニターし評価してきた。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の組織学的外観の一過性の軽微な変化は凍結保存後に一般的に観察されるが、組織学的構造は、数日間、器官培養に再導入された後に、正規化される。このことは、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）の基底層における生細胞が、凍結保存後に、上皮層を増殖させかつ再生させ得ることを示唆している。凍結防止剤濃度、培養時間、培養温度、凍結速度、及び保管条件を系統的に評価することによって、Ｓｔｒａｔａｔｅｃｈは、定常的でかつ規定品質を有するＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織の長期保管を可能にし、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織を規定する規格を満たす凍結保存プロセスを確認することができる。
【００５７】
ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ凍結保存プロセスの開発中に、以下のパラメーターを系統的に評価した。
・凍結防止剤組成物
・予備凍結の凍結防止剤培養温度
・予備凍結の凍結防止剤培養時間
・凍結防止剤培養中に必要とされる工程数
・凍結速度
・最終製品包装
・保管温度
・発送状態
・解凍温度及び解凍時間
・解凍後の凍結防止剤拡散媒介物
・解凍後の培養溶液
・解凍後の培養温度
・解凍後の培養時間
予想されるように、これらの各パラメーターの多くは相互作用して凍結保存組織の特性に影響を及ぼす。例えば、凍結防止剤培養時間及び温度も考慮せずに、凍結防止剤濃度を最適化することはできない。同様に、解凍後の培養温度は、解凍後の培養時間の許容範囲に影響を及ぼす。凍結保存プロセスの開発中に、個々のパラメーターのそれぞれに関する許容可能な値の範囲を確認し使用して、凍結防止剤の配合、予備凍結の培養時間、予備凍結の培養温度、凍結速度、及び保管条件の最終的な組み合わせを規定する。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織の凍結保存及び保管のために開発された凍結保存プロセスの運転パラメーターは、上記してある。
【００５８】
グリセロール（グリセリン）は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織のための最も望ましい凍結防止剤であると確認した。凍結防止剤配合物で使用されるグリセロールは、使用のためにリリースする前に、内毒素に関する追加の試験を受ける合成ＵＳＰグレードの材料である。グリセロールに加えて、凍結防止剤溶液は、周囲大気条件下においてｐＨ７．０〜７．４を維持するために、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。ＤＭＥＭを、凍結保存溶液のための基剤として選択した。なぜならば、既に、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織を調製するために使用される培地の成分であるからである。ＨＥＰＥＳは、ＣＯ２環境外で凍結保存溶液のｐＨを維持する特徴の明確な緩衝剤である。
【００５９】
凍結防止剤溶液で使用するための適当なグリセロール濃度を決定するために一連の研究を行った。試験されるグリセロール濃度は、１６．２５％〜６５％であった。場合によっては、グリセロールの濃度は、グリセロール濃度が増加していく一連の溶液中で培養することによって、２工程または３工程で徐々に増強された。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織を凍結保存するフィージビリティを証明するための初期の研究は、３工程プロセスを使用した。前記プロセスでは、各グリセロール溶液において、１５〜２０分間の培養によって、グリセロール濃度は、１６．２５％まで、次いで３２．５％まで、そして最後に６５％まで順次に増強され、一方、各培養工程で温度を徐々に低下させた（室温で１６．２５％のグリセロール培養、２〜８℃で３２．５％、及び−２０℃で６５％）。最後に、組織を、速度制御冷凍庫において、−１５℃／分で−１４０℃まで冷凍した。凍結保存組織は、超低温冷凍庫（−８０℃）へ移し、そこで、分析のために解凍するまで維持した。この３工程プロセスを使用して、凍結保存された保管中に、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の生育可能性及び組織学的構造を維持することができるだろうが、異なる温度で行われる異なる溶液による多重工程を有する複雑さは、エラーの可能性をもたらし、かつ、商業化のために要求されるだろうプロセスのスケールアップを受け入れない。
【００６０】
３工程法によって凍結保存された組織を分析すると、凍結防止剤の解凍及び希釈後に、組織は、凍結保存されなかった組織に匹敵する生育可能性（ＭＴＴをそのホルマザン生成物へと変換する組織の生細胞の能力によって評価される）、組織学的構造、及びバリア機能を示したことが明らかになった。解凍後９日間の器官培養への再導入後に高いレベルの生育可能性を維持した組織は、解凍直後に検出された代謝活性が単に残留していた酵素活性ではなかったことを証明している。
【００６１】
これらの初期の研究中に、凍結保存組織におけるグリセロール濃度は、解凍後に、グリセロール濃度が減少していく一連の溶液中で組織を培養することによって、または、グリセロールの拡散を減速させるために組織の真下にフィルターパッドを有する培地レザバー中に組織を配置することによって、低下され得るだろうことを見出した。これらの結果に基づいて、次の研究では、グリセロール拡散を減速させるために、パッドを有する培地において解凍組織を培養する１工程法を主に用いた。図７を参照されたい。
【００６２】
３工程法を使用してＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織を凍結保存することのフィージビリティを証明した後、我々は、単純化を前記凍結保存法と比較するベンチマークとして３工程法を使用した。これらの研究は、同じ最終グリセロール濃度（６５％）に達するように要求される工程数を減らすこと、または、初期研究で使用されるグリセロール濃度に比べて低い最終グリセロール濃度を評価することを調べた。これらの研究に基づいて、３２．５％の低さのグリセロール濃度を使用して、凍結保存された保管中に、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の生育可能性及び組織学的構造を再現的に維持できることが確認された。対照的に、凍結防止剤溶液中１６．２５％の最終グリセロール濃度は、凍結組織における生育可能性の維持を支援しなかった。図５を参照されたい。グリセロール濃度の範囲を評価することによって、５０％グリセロールを含む凍結防止剤溶液は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織の凍結保存を再現的に支援し、また、効率的な凍結保存も支援する幾分低いグリセロール濃度（例えば３２．５％）を超える誤差限界を提供することが確認された。
【００６３】
予備凍結の凍結防止剤培養温度、培養時間、及び培養工程数
凍結防止剤溶液におけるグリセロールの濃度に加えて、凍結保存前に、凍結防止剤によるＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織の処理に影響を及ぼす３つの他の因子は：１）予備凍結の凍結防止剤培養時間、２）組織が凍結防止剤で処理される温度、及び３）最終グリセロール濃度に達するのに必要とされる工程の数、である。上記のように、３工程プロセスによる初期のフィージビリティスタディは、各工程で、１５〜２０分間、連続的に低い温度でグリセロール濃度を増加させて、溶液中で組織を順次に培養することを含む。上記のように、異なる温度で行われる異なる溶液による多重工程を有する複雑性を回避して、エラーの可能性を減し、プロセススケールアップを容易にするためには、より単純な凍結保存プロセスが好ましい。この目的に向かって、予備凍結の凍結防止剤平衡相中における凍結防止剤濃度の段階的増加及び温度の段階的低下の必要性が評価された。
【００６４】
異なる凍結防止剤濃度の評価に関連して行われる一連の研究では、わずか１５分間に、また６０分間もの長い間に、２〜８℃において、１工程で、３２．５、５０、または６５％のグリセロールを含む凍結防止剤溶液で処理されるＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織はすべて、生育可能性または表皮構造の最小の損失で凍結保存に耐えることが可能であると確認された。組織性能の低下は６０分までの凍結防止剤処理時間では観察されなかったが、凍結前に凍結防止剤に対して長時間曝露するときのあらゆる潜在的副作用を最小化するために、比較的短いグリセロール処理時間（２０〜３０分）を選択した。
【００６５】
凍結速度
上記のように、初期のフィージビリティスタディは、凍結防止剤と平衡させた後、−１５℃／分の速度で組織を凍結させるために、速度制御冷凍庫を利用した。しかしながら、速度制御冷凍庫の使用は、かなりの追加の経費を必要とし、プロセスのスケールアップのためには受け入れられない。歴史的に、ヒト細胞の凍結保存は、速度制御冷凍庫を用いずに、約−１℃／分のより穏やかな速度で達成されてきた。これは、冷却速度を約−１℃／分まで減速するように設計された絶縁された箱または容器の中で超低温冷凍庫中に細胞のバイアルを配置することによって、通常達成される。
【００６６】
プロセス開発研究は、速度制御冷凍庫を使用せずにＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織を凍結保存できるか否かを確認するように設計した。これらの研究により、凍結防止剤で処理した後に、超低温冷凍庫（約−８０℃）へと直接移動させることによって凍結された組織は、速度制御冷凍庫で凍結された組織と同様に機能することが証明された。図１を参照されたい。
【００６７】
温度モニタリング研究を行って、凍結保存プロセス中の組織の温度を追跡した。内部無菌バッグ及び外部Ｍｙｌａｒバッグで包装後に、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織を、超低温冷凍庫内の予冷ラックに移す。各組織を、凍結プロセス中に無制限の気流を流すために組織の上下に十分な余地を有する、冷凍庫ラック内の分離スロットに配置する。上記のように包装され、そしてこの構成における冷凍庫ラック中に装填された培養皿内に配置された温度モニタリングプローブを使用し、温度を最初の１５分以内に急速に約−５０℃まで低下させ、更に３０分で約−６５℃まで冷却し、そして３時間後に約−８０℃の最終温度にする。冷凍庫ラックの一番上、中間、及び一番下の位置に置かれた組織間の温度プロフィールに有意差は無い。図２を参照されたい。
【００６８】
最終製品の包装
初期の研究では、組織は、凍結防止剤と一緒に培養した後に、凍結防止剤溶液の層と接触させて凍結させた。このように凍結保存された組織は良好な解凍後特性を示したが、凍結防止剤のこの層と接触させて凍結させた組織の迅速解凍は、３５〜３９℃の水浴中での数分間の培養を必要とし、そしてそれは、手術室で実行及び標準化するのは困難であるだろう。続いて、凍結防止剤溶液との接触は、凍結防止剤で組織が処理された後には必要ないことが確認された。これにより、組織を凍結防止剤によって処理した後、空で無菌の１００ｍｍの培養皿へ移し、凍結防止剤溶液の層と接触させて組織を凍結させるのではなく、空の培養皿の底と接触させて組織を凍結させるという最終製品構成の開発が可能になった。
【００６９】
凍結保存組織の無菌性を維持するために、凍結防止剤で処理した組織を含む１００ｍｍ培養皿を、無菌のポリエチレンサンプルバッグ内に無菌的に包装し、ヒートシールする。次いで、内袋を、穿刺耐性で食品用グレードの金属化されたポリエステル／ポリエチレンバッグ内に入れてヒートシールし、光及び水分から包装された組織を保護し、そしてドライアイスを用いた発送中にＣＯ２蒸気に対するバリアを提供する。後述する安定性及び比較性研究は、この構成で包装され凍結保存された組織を利用した。
【００７０】
保存温度
生育可能な皮膚同等物の凍結保存によって、熱傷センターは、迅速な介入処置を必要とする熱傷及び他の徴候にとって治療的なこの細胞に基づく再生医学を即座に利用できるようになる。最も望ましいのは、主要な熱傷センターが、その都度配達を予定する必要も無く、使用のために製品の在庫を維持することができることであろう。初期のフィージビリティスタディでは、凍結保存組織を、気相式窒素冷凍庫（ｖａｐｏｒ−ｐｈａｓｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｆｒｅｅｚｅｒ）内で−１９６℃で保管した。熱傷センターは典型的には液体窒素貯蔵能力を有していないので、超低温冷凍庫（−６０℃〜−９０℃）内で組織を少なくとも６ヵ月間保管できる凍結保存手順が開発されており、そしてそれは、大部分の病院及び外傷センターで血液及び組織のバンクにおいて直ぐに利用できる。これらの実験結果は、−５０℃で保管された組織は数週間中に生育可能性の有意な損失を示す一方、−８０℃で保管された組織は、窒素蒸気中に保管されていた組織に匹敵する生育可能性レベルを維持することを証明した。図３を参照されたい。これらの結果は、凍結保存組織のいくつかの独立ロットで得られ、この所見の再現性を確認した。以下の凍結保存組織の安定性の項で説明してあるように、−８０℃で６ヶ月間保管された組織の分析は、保管中に、表皮構造への生育可能性または変化に関する有意な損失を示さなかった。
【００７１】
発送状態
凍結保存ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織は、ＦｅｄＥｘまたはＵＰＳのような商業的な宅配便業者を介して翌朝に配達するために、ドライアイスを使用して臨床現場に発送される。発送容器（Ｆｒｅｅｚｅｔｈｅｒｍ ＦＴ２９、Ｌａｍｉｎａｒ Ｍｅｄｉｃａ）は、発送時に起こり得る受渡しの遅延を考慮して、最高３５℃の周囲温度で、少なくとも７２時間、＜−７５℃に凍結保存組織を維持するのに十分なドライアイスを保持している認定されているドライアイス付き発送ボックスである。実験データは、４８時間を超える時間、ドライアイス付き発送容器における凍結保存組織の保管は、組織生育可能性または組織学的構造に関してなんらの検出可能な有害作用を有しないことを示している。図４を参照されたい。臨床現場での受領後、利用するまで、凍結保存ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織を、超低温冷凍庫（例えば、−６０℃〜−９０℃）に保管する。
【００７２】
凍結保存組織の術前調製
臨床で使用する前に、凍結保存ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織を解凍し、培地で飽和させたパッド上で短時間培養して、残留している凍結防止剤を除去する。その組織のジオメトリーに起因して解凍相は急速である。組織の解凍後、その組織を含むＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートを、無菌野へ無菌的に移し、培地で飽和させた吸収パッドを含む無菌皿に配置する。後述するように、解凍後培養相のタイミングは、臨床使用中に合理的に予期され得る遅延に合わせるのに十分に柔軟である。
【００７３】
解凍温度及び解凍時間
上記した最終製品の包装の項で説明しているように、凍結防止剤溶液の層を用いずに培養皿において組織を凍結保存すると、パッケージをベンチまたはテーブルの上に単に置くだけで、周囲温度で組織を急速に解凍することができる。２２℃〜４０℃の温度において様々な時間で組織を解凍しても同様な解凍後特性を示すことを実験データは証明しているので、解凍温度及び解凍時間を正確に制御する必要はない。
【００７４】
解凍後の培養溶液
緩衝された解凍後培養溶液は、非緩衝溶液に比べてより良好に機能する。単純な非緩衝塩溶液（乳酸加リンゲル液または通常生理食塩溶液）中で培養された組織は、培地ベースの溶液中培養された組織と同様に、生存しない。ＨＥＰＥＳで緩衝されたＳｔｒａｔａｔｅｃｈ’ｓ ＳＭ０１培地（ＳｔｒａｔａＬｉｆｅシリーズ）または市販のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地が好ましい。図６を参照されたい。
【００７５】
解凍後の培養温度
初期の開発研究では、緩衝培地は、３７℃及び室温の両方で、解凍後培養の後に、組織の生育可能性を支援できることを見出した。しかしながら、温かい解凍後培養温度（３７℃）は、最適以下の培養溶液のためのより低い温度（２０〜２５℃）に比べて、より良好に作用する。図６を参照されたい。１５〜３０分にわたって室温までゆっくり冷える３７℃の培地を含むパッド上での解凍後培養の開始も十分に機能する。解凍後最初の数分間ではより高い温度が最も重要であると考えられる。
【００７６】
後の開発研究では、解凍組織の特性を支援する能力において、室温にのみ予熱された緩衝培地溶液は、３７℃に温められた培地と同等であることが証明された。これは、ＴｅｌｆａパッドまたはＷｈａｔｍａｎパッドのいずれかで保持された組織には当てはまった。図８を参照されたい。
【００７７】
解凍後の培養時間
組織は、２０〜２５℃で１５分〜４時間、４０℃で最大２時間、培地で飽和されたパッド上に置くことができるが、組織の生育可能性に関する有意な効果は認められなかった。
【００７８】
安定性研究
凍結保存組織の安定性
上記研究の多くは、数日間または数週間だけ凍結状態で保管された組織を分析したが、凍結保存された細胞及び組織に対する損傷の大部分は、凍結及び解凍段階で起こり、細胞の生育可能性の損失は、低い温度での長期保管中には比較的殆ど起こらないことが広く認められている。長期保管の結果は、凍結保存ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）皮膚組織が、超低温での少なくとも１２ヵ月の保管後に、高いレベルの生育可能性と組織学的構造を維持していることを示している。上記の凍結保存プロセスを使用して製造及び凍結保存された組織に関する分析は、このプロセスで凍結保存された組織は、超低温で少なくとも１２ヵ月間の保存中に、重要な生物学的、構造的、及び物理的な特性を維持していることを示している。図９を参照されたい。
【００７９】
実施例３
この実施例では、室温で３２．５％または５０％のグリセロールを含む凍結保存溶液を用いる予備凍結処理工程を利用するヒト皮膚同等物のための改善された凍結保存方法を説明する。前記製造プロセスは、既に説明した現在の方法と変わらない。製造プロセス終了後、組織を処理し、以下のように凍結保存する。
【００８０】
【表２】
2019195344.tif 000003
【００８１】
凍結保存プロセスの説明
最終製品の包装工程前に、凍結保存プロセスのすべての工程を、クラス１０，０００のクリーンルームにおいて、クラス１００の安全キャビネット内で無菌的に行う。
工程１−２０ｍｌの凍結防止剤溶液を１００ｍｍ培養皿に分注する。
工程２−ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織を含むＴｒａｎｓｗｅｌｌｓを、凍結防止剤溶液を含む各培養皿の中に移す。凍結防止剤中で組織を１５〜４５分培養する。
工程３−処理したＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織を、培養皿の底に組織が存在するように、最終製品ラベルを含む新しい無菌の１００ｍｍ培養皿に移す。過剰な凍結防止剤を皮膚同等物から排出させて、処理された皮膚同等物を提供する。前記処理された皮膚同等物は、皮膚同等物の外面上に実質的に過剰な凍結防止剤を有していない。
工程４−透明で無菌のバッグ内に１００ｍｍ培養皿をヒートシールする。一次包装を二次Ｍｙｌａｒバッグ内に配置し、ヒートシールする。
工程５−包装されたＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）組織をクリーンルームから取り出し、超低温冷凍庫（−７５℃〜−８０℃）に組織を移す。その組織を前記冷凍庫内の予冷ラック内に置き、その包装された組織の上下に無制限に気流を流して均一で迅速な冷却を確保する。凍結プロセスの間、一晩、組織を静置する。
凍結保存組織を、室温で１０分間解凍し、室温まで温められた４０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝培地で飽和させたＴｅｌｆａパッドを含む収容チャンバへ移し、１５〜２０分間、室温で保持した。その組織を、９０ｍｌのＳＭ０１媒体を含む培養皿へ移し、一晩再培養した。一晩、再培養した後、生育可能性に関して組織を分析した。室温で、１５〜４５分間、３２．５％のグリセロールで前処理された組織は、許容可能な解凍後生育可能性を有していた。室温で、１５分間、５０％のグリセロールで処理された組織も、許容可能な生育可能性を有しているが；室温で、４５分間、５０％のグリセロールで処理された組織の生育可能性は許容できないものであった。図１０を参照されたい。
【００８２】
実施例４
ＭＴＴアッセイを好ましくは以下の通りに実行する。試料を、８ｍｍの生検パンチを使用して皮膚組織から切除する。試料を、３７℃／５％ＣＯ２に予熱された２４ウェルプレート内の０．３ｍｌのＭＴＴ Ａｓｓａｙ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２中１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬）へ移す。試料を３７℃／５％のＣＯ２で８５〜９５分間培養する。試料を吸い取って２ｍｌのイソプロパノールへ移す。その試料を徹底的に混合して紫のホルマザン生成物を完全に抽出する。各抽出物から３つずつ得られる２００μｌを９６ウェルプレートに等分し、ブランクとしてイソプロパノールを使用する。吸光度（５５０ｎｍ）は分光光度計で測定する。
【００８３】
上記の明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、引例によって本明細書に組み込まれる。本発明の範囲及び趣旨からの逸脱がない、説明した本発明の方法及びシステムに関する様々な改良及び変更は、当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解しておく必要がある。実際に、組織培養、分子生物学、生化学、または関連分野の当業者にとって明らかな、本発明を実行するための説明した様式の様々な改良は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
2019195344.tif 000004
【図２】
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【図３】
2019195344.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月24日(2019.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生育可能性を実質的に失うことなく、凍結保存された皮膚同等物を温める方法であって、
器官培養された皮膚同等物である、包装および凍結保存された生育可能な皮膚同等物を提供する工程；
前記凍結保存された皮膚同等物を室温において解凍する工程であって、前記凍結保存された皮膚同等物を包装内で任意に解凍する、工程；
前記解凍した凍結保存された皮膚同等物を、（ｉ）２０〜４０℃において２時間まで、または、（ｉｉ）２０〜２５℃において４時間まで、拡散媒介物と接触させる工程；
を含み、
前記拡散媒介物は組織適合性溶液を含み、
前記組織適合性溶液は、ｐＨ７．０〜７．４になるように緩衝剤によって処理され、約３７℃に予熱されている、方法。
【請求項２】
前記凍結保存された皮膚同等物は密封可能な封入体中に包装されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凍結保存された皮膚同等物は、密封可能な封入体中に包装された培養容器の中に提供されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記拡散媒介物が、吸収媒体、膜および透析バッグからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記拡散媒介物が、発泡体パッド、ガーゼパッドおよびセルロースパッドからなる群より選択される吸収媒体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記組織適合性溶液が、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、ＭＥＭおよびＲＰＭＩからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記緩衝剤がＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳおよびＴｒｉｚｍａからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記組織適合性溶液がＤＭＥＭ／Ｆ−１２であり、前記緩衝剤がＨＥＰＥＳである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
解凍開始から、凍結保存された皮膚同等物と組織適合性溶液を含む拡散媒介物との接触までの経過時間が１５分以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
解凍開始から、凍結保存された皮膚同等物と組織適合性溶液を含む拡散媒介物との接触までの経過時間が１０分以下である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記解凍した凍結保存された皮膚同等物を、前記拡散媒介物と少なくとも１５分間接触させる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記凍結保存された皮膚同等物は、密封可能な封入体中に包装された培養容器の中に提供され、
前記凍結保存された皮膚同等物は、前記培養容器中、任意で前記密封可能な封入体中で解凍され、
前記拡散媒介物が膜であり、
前記解凍した凍結保存された皮膚同等物を、２０〜２５℃において４時間まで、拡散媒介物と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記凍結保存された皮膚同等物は、密封可能な封入体中に包装された培養容器の中に提供され、
前記凍結保存された皮膚同等物は、前記培養容器中、任意で前記密封可能な封入体中で解凍され、
前記拡散媒介物が、発泡体パッド、ガーゼパッドおよびセルロースパッドからなる群より選択される吸収媒体であり、
前記解凍した凍結保存された皮膚同等物を、２０〜２５℃において４時間まで、前記拡散媒介物と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記器官培養された皮膚同等物がＮＩＫＳ細胞を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＩＫＳ細胞が、外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
包装および凍結保存された生育可能な皮膚同等物と、拡散媒介物と、組織適合性溶液と、を含むキット。
【請求項１７】
前記凍結保存された生育可能な皮膚同等物が密封可能な封入体中に包装されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記凍結保存された生育可能な皮膚同等物が、密封可能な封入体中に包装された培養容器の中に提供されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
培養容器をさらに含む、請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項２０】
第２の培養容器をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記凍結保存された生育可能な皮膚同等物がＮＩＫＳ細胞を含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
前記ＮＩＫＳ細胞が、外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
包装および凍結保存された生育可能な皮膚同等物が以下の工程によって製造される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法：
１工程で、器官培養された皮膚同等物を、凍結防止剤溶液中で処理する処理工程であって、前記凍結防止剤溶液は平衡手順中交換せず、前記器官培養された皮膚同等物は繊維芽細胞を含む真皮層上に層状化された扁平上皮を含み、前記凍結防止剤は体積基準で溶液の約２１〜７０％で含まれる溶液で提供し、前記凍結防止剤はグリセロールである、処理工程；
過剰な凍結防止剤溶液から前記処理した器官培養された皮膚同等物を分離し、さらなる凍結防止剤の非存在下において前記処理した器官培養された皮膚同等物を包装して、包装された皮膚同等物を提供する包装工程であって、好ましくは、無菌バッグに前記凍結保存された皮膚同等物を封入し、第２のバッグに前記無菌バッグを封入する封入工程をさらに含む、包装工程；および、
前記包装された器官培養された皮膚同等物を凍結し、解凍後に生育可能性を保持する凍結保存された皮膚同等物を提供する凍結工程。
【請求項２４】
前記凍結防止剤溶液が、体積基準で凍結防止剤溶液の約２１〜４５％の量のグリセロールを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記凍結防止剤溶液が、体積基準で凍結防止剤溶液の約３７．５〜６２．５％の量のグリセロールを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記凍結防止剤溶液が、体積基準で凍結防止剤溶液の約３２．５％の量のグリセロールを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記凍結防止剤溶液が、体積基準で凍結防止剤溶液の約３７．５％の量のグリセロールを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記凍結防止剤溶液が、体積基準で凍結防止剤溶液の約５０％の量のグリセロールを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記凍結工程が約−８０℃における凍結を含む、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記凍結工程が、約−５０℃〜−１００℃の温度への直接曝露を含む、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
包装および凍結保存された生育可能な皮膚同等物が以下の工程によって製造されている、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載のキット：
１工程で、器官培養された皮膚同等物を、凍結防止剤溶液中で処理する処理工程であって、前記凍結防止剤溶液は平衡手順中交換せず、前記器官培養された皮膚同等物は繊維芽細胞を含む真皮層上に層状化された扁平上皮を含み、前記凍結防止剤は体積基準で溶液の約２１〜７０％で含まれている溶液で提供し、前記凍結防止剤はグリセロールである、処理工程；
過剰な凍結防止剤溶液から前記処理した器官培養された皮膚同等物を分離し、さらなる凍結防止剤の非存在下において前記処理した器官培養された皮膚同等物を包装して、包装された皮膚同等物を提供する包装工程であって、好ましくは、無菌バッグに前記凍結保存された皮膚同等物を封入し、第２のバッグに前記無菌バッグを封入する封入工程をさらに含む、包装工程；および、
前記包装された器官培養された皮膚同等物を凍結し、解凍後に生育可能性を保持する凍結保存された皮膚同等物を提供する凍結工程。
【請求項３２】
前記凍結防止剤溶液が、体積基準で凍結防止剤溶液の約２１〜４５％の量のグリセロールを含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記凍結防止剤溶液が、体積基準で凍結防止剤溶液の約３７．５〜６２．５％の量のグリセロールを含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
前記凍結防止剤溶液が、体積基準で凍結防止剤溶液の約３２．５％の量のグリセロールを含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３５】
前記凍結防止剤溶液が、体積基準で凍結防止剤溶液の約３７．５％の量のグリセロールを含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３６】
前記凍結防止剤溶液が、体積基準で凍結防止剤溶液の約５０％の量のグリセロールを含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３７】
前記凍結工程が約−８０℃における凍結を含む、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３８】
前記凍結工程が、約−５０℃〜−１００℃の温度への直接曝露を含む、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載のキット。