(57)【要約】【課題】従来知られているＧＯを利用した阻害剤よりも高い阻害活性を有するＭＢＬ阻害剤を提供すること。カルバペネマーゼ産生菌を検出するための新規方法を提供すること。【解決手段】本発明は、還元型酸化グラフェンを含むメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤、および酸化グラフェンを含むメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤であって、酸化グラフェンの大きさが、０．１ｎｍ以上かつ５００ｎｍ未満である、前記阻害剤を提供する。また本発明は、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法であって、以下の工程：ａ）カルバペネム系β−ラクタム剤の存在下かつ本発明の前記阻害剤の存在下または非存在下で、被験菌の生育を観察すること；およびｂ）被験菌が、前記阻害剤の存在下では生育が抑制され、前記阻害剤の非存在下では生育が阻害されない場合に、被験菌がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であると判定することを含む、前記方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元型酸化グラフェンを含むメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤。
【請求項２】
還元型酸化グラフェンの大きさが、０．１ｎｍ以上かつ５００ｎｍ未満である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
酸化グラフェンを含むメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤であって、
酸化グラフェンの大きさが、０．１ｎｍ以上かつ５００ｎｍ未満である、前記阻害剤。
【請求項４】
メタロ−β−ラクタマーゼが、ＩＭＰ−１型メタロ−β−ラクタマーゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の阻害剤を含む、医薬組成物。
【請求項６】
メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌感染症の治療のための医薬組成物であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の阻害剤を含む、前記医薬組成物。
【請求項７】
カルバペネム系β−ラクタム剤をさらに含む、カルバペネム系β−ラクタム剤と組み合わせてなる、またはカルバペネム系β−ラクタム剤と組み合わせて使用される、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
カルバペネム系β−ラクタム剤の投与の前に、同時に、または後に、患者に投与されることを特徴とする、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法であって、以下の工程：
ａ）カルバペネム系β−ラクタム剤の存在下かつ請求項１〜４のいずれか一項に記載の阻害剤の存在下または非存在下で、被験菌の生育を観察すること；および
ｂ）被験菌が、前記阻害剤の存在下では生育が抑制され、前記阻害剤の非存在下では生育が阻害されない場合に、被験菌がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であると判定すること
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記工程ａ）が、以下の工程：
１）培地表面に被験菌を塗布すること；
２）カルバペネム系β−ラクタム剤を含有するディスクおよび請求項１〜４のいずれか一項に記載の阻害剤を含有するディスクを工程１）で調製した培地上に置くこと；および
３）メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の生育に十分な時間培養すること
を含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタロ-β-ラクタマーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどすべての抗菌薬が効かない薬剤耐性菌が社会問題となっている。特に最近、臨床で切り札的に使用されている抗菌薬であるカルバペネム系β−ラクタム剤（カルバペネム）が効かない、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（ＣＲＥ）が大きな関心事になっている。ＣＲＥの中でも、カルバペネムを加水分解する酵素（カルバペネマーゼ）を産生するカルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌（ＣＰＥ）は、特に注意が必要とされている。ＣＰＥは、他の薬剤耐性遺伝子も持つことから、これらの遺伝子とカルバペネマーゼをコードする遺伝子とが一緒に水平伝播することにより、カルバペネム耐性の多剤耐性菌が蔓延することが危惧されている。
【０００３】
カルバペネマーゼは、β-ラクタマーゼのうちカルバペネムを分解するものの総称である。β-ラクタマーゼは、活性中心がセリン残基であるセリン-β-ラクタマーゼおよび活性中心がＺｎ（ＩＩ）イオンであるメタロ-β-ラクタマーゼ（ＭＢＬ）の２つのタイプに分けられる。保存されたアミノ酸配列に基づいて、セリン-β-ラクタマーゼはクラスＡ、Ｃ、およびＤ、メタロ-β-ラクタマーゼはクラスＢにさらに分類されている。現在までに世界中で拡散しているカルバペネマーゼは５種類あり、そのうち３種類（ＩＭＰ型、ＶＩＭ型、およびＮＤＭ型）は酵素の活性中心にＺｎ（ＩＩ）イオンをもつＭＢＬである。カルバペネマーゼであるＭＢＬの一つであるＩＭＰ−１は、環境中に多数生存するグラム陰性細菌によって産生され、日本の臨床現場で単離されている。
【０００４】
ＭＢＬに対する阻害剤は、製薬企業により開発が進められてきた。例えば、ＩＭＰ−１に対しては、メルク（ＩＣ５０値＞３．７ｎＭ）および明治ファルマ（ＩＣ５０値＞１９０ｎＭ）がジカルボン酸タイプの阻害剤を開発したことが報告されている（非特許文献１および２）。しかしながら、臨床上利用可能なＭＢＬに対する阻害剤は未だ開発されていない。
【０００５】
酸化グラフェン（ＧＯ）は、グラファイトの酸化および剥離によって得られる、グラフェンの酸化物である。ＧＯは、ベーサル面およびエッジ面に様々な酸素官能基を持つため、水への分散や機能性分子による修飾が可能である。近年の研究により、ＧＯをドラッグデリバリーシステムや酵素阻害剤として利用できることが報告されている。例えば、カルバペネマーゼであるＭＢＬの一つであるＶＩＭ−２の活性がＧＯによって阻害されること、またＶＩＭ−２の活性を完全に阻害するために必要な濃度は２０μｇ／ｍＬであることが報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Biol. Chem. 2001, 276(34), 31913-31918
【非特許文献２】Bioorg. Med. Chem. Lett., 2009, 19(17), 5162-5165
【非特許文献３】ACS Appl. Mater. Interfaces 2015, 7, 9898-9903
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のとおり、ＧＯがＶＩＭ−２に対する阻害活性を有することが報告されているものの、ＧＯを利用した実用可能なＭＢＬ阻害剤の開発には至っていない。したがって、本発明は、従来知られているＧＯを利用した阻害剤よりも高い阻害活性を有するＭＢＬ阻害剤を提供することを課題とする。また本発明は、カルバペネマーゼ産生菌を検出するための新規方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、ＧＯのサイズをナノオーダーにまで低下させることにより、ＭＢＬに対する阻害活性が向上することを見出した。さらにＧＯまたはサイズを低下させたＧＯ（ナノＧＯ、ｎＧＯ）を還元することにより、ＭＢＬに対する阻害活性が顕著に向上することを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］還元型酸化グラフェンを含むメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤。
［２］還元型酸化グラフェンの大きさが、０．１ｎｍ以上かつ５００ｎｍ未満である、［１］に記載の阻害剤。
［３］酸化グラフェンを含むメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤であって、
酸化グラフェンの大きさが、０．１ｎｍ以上かつ５００ｎｍ未満である、前記阻害剤。
［４］メタロ−β−ラクタマーゼが、ＩＭＰ−１型メタロ−β−ラクタマーゼである、［１］〜［３］のいずれかに記載の阻害剤。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の阻害剤を含む、医薬組成物。
［６］メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌感染症の治療のための医薬組成物であって、
［１］〜［４］のいずれかに記載の阻害剤を含む、前記医薬組成物。
［７］カルバペネム系β−ラクタム剤をさらに含む、カルバペネム系β−ラクタム剤と組み合わせてなる、またはカルバペネム系β−ラクタム剤と組み合わせて使用される、［５］または［６］に記載の医薬組成物。
［８］カルバペネム系β−ラクタム剤の投与の前に、同時に、または後に、患者に投与されることを特徴とする、［５］または［６］に記載の医薬組成物。
［９］メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法であって、以下の工程：
ａ）カルバペネム系β−ラクタム剤の存在下かつ［１］〜［４］のいずれかに記載の阻害剤の存在下または非存在下で、被験菌の生育を観察すること；および
ｂ）被験菌が、前記阻害剤の存在下では生育が抑制され、前記阻害剤の非存在下では生育が阻害されない場合に、被験菌がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であると判定すること
を含む、前記方法。
［１０］前記工程ａ）が、以下の工程：
１）培地表面に被験菌を塗布すること；
２）カルバペネム系β−ラクタム剤を含有するディスクおよび［１］〜［４］のいずれかに記載の阻害剤を含有するディスクを工程１）で調製した培地上に置くこと；および
３）メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の生育に十分な時間培養すること
を含む、［９］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、高い阻害活性を有するＭＢＬ阻害剤、特にＩＭＰ−１阻害剤が提供される。また本発明により提供されるＭＢＬ阻害剤を利用した、ＭＢＬ産生菌、特にＩＭＰ−１産生菌を検出するための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】GOのTEM画像およびサイズ分布のヒストグラムを示す図である。
【図２】GOのAFM画像（上のパネル）および当該画像に基づくGOのサイズおよび厚みの分析結果（下のパネル）を示す図である。上のパネルにおける縦軸および横軸は、それぞれ0μmの地点からの距離を示す。下のパネルは、上のパネル中の線で示された部分における厚さを示す。横軸は線の一端からの距離（μｍ）を示し、縦軸は線上の各地点の厚さ（ｎｍ）を示す。
【図３】GOのXPS測定結果を示す図である。
【図４】GOのFT-IR測定結果を示す図である。
【図５】RGOのXPS測定結果を示す図である。
【図６】RGOのFT-IR測定結果を示す図である。
【図７】nGOのTEM画像およびサイズ分布のヒストグラムを示す図である。
【図８】nGOのAFM観察結果（上のパネル）および当該画像に基づくnGOのサイズおよび厚みの分析結果（下のパネル）を示す図である。上のパネルにおける縦軸および横軸は、それぞれ0μmの地点からの距離を示す。下のパネルは、上のパネル中の線で示された部分における厚さを示す。横軸は線の一端からの距離（ｎｍ）を示し、縦軸は線上の各地点の厚さ（ｎｍ）を示す。
【図９】nGOのXPS測定結果を示す図である。
【図１０】nGOのFT−IR測定結果を示す図である。
【図１１】RnGOのXPS測定結果を示す図である。
【図１２】RnGOのFT-IR測定結果を示す図である。
【図１３】RGO、nGO、およびRnGOによるIMP-1酵素活性阻害試験について、阻害剤濃度に対する[E]/[E]0をプロットしたグラフを示す図である。
【図１４】GO、RGO、nGO、およびRnGOによるIMP-1酵素活性阻害試験について、Lineweaver-Burkプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．メタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤
本発明は、新規メタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を提供する。
本明細書中、メタロ−β−ラクタマーゼとは、活性中心がＺｎ（ＩＩ）イオンであるβ−ラクタマーゼをいう。メタロ−β−ラクタマーゼには、カルバペネム系β−ラクタム剤を分解する活性を有するものが含まれる。
【００１３】
本明細書中、カルバペネム系β−ラクタム剤とは、ペネム骨格の１位硫黄原子が炭素原子に置換されたβ−ラクタム系抗菌薬の総称であり、具体的な薬剤としては、例えばイミペネム、パニペネム、メロペネム、ドリペネム、ビアペネム、テビペネムピボキシルなどが挙げられる。カルバペネム系β−ラクタム剤を分解する活性を有する酵素を、カルバペネマーゼということもある。
【００１４】
カルバペネム系β−ラクタム剤を分解する活性を有するメタロ−β−ラクタマーゼとしては、ＩＭＰ型、ＶＩＭ型、およびＮＤＭ型が知られている。これらはＢｕｓｈ＆Ｊａｃｏｂｙ分類でクラス３ａ（Ａｍｂｌｅｒ分類でクラスＢ）に分類される酵素である（日本臨床微生物学雑誌、Vol. 24, No. 3, p. 1 - 9 (2014)；Antimicrob. Agents. Chemother., 54(3), p. 969 - 76 (2010)）。したがって、本発明においてメタロ−β−ラクタマーゼという場合、ＩＭＰ型メタロ−β−ラクタマーゼ、ＶＩＭ型メタロ−β−ラクタマーゼ、およびＮＤＭ型メタロ−β−ラクタマーゼも含まれる。ＩＭＰ型メタロ−β−ラクタマーゼとしては、例えばＩＭＰ−１〜ＩＭＰ−２６が知られている。
【００１５】
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤は、好ましくはカルバペネム系β−ラクタム剤を分解する活性を有するメタロ−β−ラクタマーゼに対する阻害剤であり、より好ましくはＩＭＰ型メタロ−β−ラクタマーゼに対する阻害剤である。
【００１６】
メタロ−β−ラクタマーゼに対する阻害活性は、公知の方法によって測定することができる。例えばニトロセフィン法による測定は以下のように行うことができる。0.5 M NaClを含む50 mM Tris-HCl (pH 7.5)をUV測定セルに入れ、メタロ−β−ラクタマーゼ酵素溶液および被験物質を加える。温度を一定に保つため、30℃の保温槽に5分間放置した後、3 mMニトロセフィン溶液を加え、491 nmの吸光度を60秒間測定する。1分間当たりの吸光度の増加値が、被験物質を含まない場合の値と比較して低ければ、被験物質がメタロ−β−ラクタマーゼに対して阻害活性を有すると決定することができる。またこの方法により、２種類以上の被験物質のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害活性の強度を比較することも可能である。
【００１７】
一態様において、本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤は、活性成分として還元型酸化グラフェンを含む。
【００１８】
酸化グラフェンは、グラファイトを部分酸化した後、層剥離することによって得られるナノシート材料であり、官能基としてカルボキシル基、カルボニル基、ヒドロキシル基、エポキシ基等の官能基を有する。還元型酸化グラフェンは、酸化グラフェンを還元して得ることができる。後述の実施例に示されるように、還元型酸化グラフェンは、酸化グラフェンと比較して顕著に低い重量で、メタロ−β−ラクタマーゼに対する阻害活性を示す。本発明における還元型酸化グラフェンは、酸化グラフェンと比較して、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、１０倍以上、５０倍以上、または１００倍以上高い、重量当たりの阻害活性を示す。
ここでメタロ−β−ラクタマーゼに対する阻害活性は、精製したメタロ−β−ラクタマーゼに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ））を上述のニトロセフィン法による測定結果から算出することにより評価される。具体的には、ニトロセフィン法の測定結果から、阻害剤を含まない場合の1分間当たりの吸光度の増加値（[E]0）および阻害剤を含む場合の1分間当たりの吸光度の増加値（[E]）を求め、阻害剤濃度（[I]）に対する[E]/[E]0をプロットする。このプロットより、近似曲線を描き、IC50値を算出する。阻害剤は酵素のみと相互作用すると仮定する。IC50値が低いほど、高い阻害活性を有することを意味する。
【００１９】
還元型酸化グラフェンは、グラフェンと同程度の酸化度にまで還元されたものであってもよいし、部分的に還元されたものであってもよい。還元型酸化グラフェンの還元度は、例えば酸素含有率で表すことができる。酸素含有率は、MICRO CORDER JM 10などの元素分析装置を用いて当該技術分野において公知の方法により測定することができる。本発明における還元型酸化グラフェンの酸素含有率は、例えば４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満であり得る。酸化グラフェンを還元する方法としては、化学的、熱的、または光電気化学的方法が一般に知られており、例えば光還元法、ヒドラジン処理による還元などが挙げられる。本発明においては、いずれの方法を用いて還元型酸化グラフェンを作製してもよい。また還元型酸化グラフェンとして、SIGMA-ALDRICH社などから市販されている製品を用いることもできる。
【００２０】
光還元法を用いる場合、例えば以下の手順により、本発明における還元型酸化グラフェンを製造することができる。酸化グラフェン（GO）をイオン交換水に添加し、超音波処理を行い、GO分散液を調製する。この分散液を撹拌しながら、水銀灯（全光）で光照射する。光照射後の分散液を超音波処理したのち、遠心分離を行い、上澄みを還元型酸化グラフェン（RGO）分散液として回収する。
【００２１】
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤に含まれる還元型酸化グラフェンの大きさは、メタロ−β−ラクタマーゼ阻害活性を有する限り特に限定されない。本発明における還元型酸化グラフェンの大きさは、例えば、１０μｍ未満、９μｍ未満、８μｍ未満、７μｍ未満、６μｍ未満、または５μｍ未満であり得る。また本発明における還元型酸化グラフェンの大きさは、例えば、０．５μｍ以上、１μｍ以上、または１．５μｍ以上であり得る。また本発明における還元型酸化グラフェンの大きさは、例えば、０．５μｍ以上かつ１０μｍ未満、１μｍ以上かつ６μｍ未満、または１．５μｍ以上かつ５μｍ未満であり得る。
本明細書中、酸化グラフェンまたは還元型酸化グラフェンの大きさとは、試料中の酸化グラフェンまたは還元型酸化グラフェンのベーサル面で最も長い径の長さの平均値をいう。酸化グラフェンまたは還元型酸化グラフェンの大きさは、試料を透過型電子顕微鏡で観察し、得られた画像に基づいて測定される。
【００２２】
別の態様において、本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤は、活性成分としてナノ酸化グラフェン（本明細書中、nGO（nano Graphene oxide）ともいう）を含む。ナノ酸化グラフェンとは、通常数μｍ〜数十μｍの大きさである酸化グラフェンの大きさを、ナノオーダーにまで小さくしたものをいう。後述の実施例に示されるように、ナノ酸化グラフェンは、酸化グラフェンと比較して顕著に低い重量で、メタロ−β−ラクタマーゼに対する阻害活性を示す。本発明におけるナノ酸化グラフェンは、酸化グラフェンと比較して、例えば１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、１０倍以上、５０倍以上、または１００倍以上高い、重量当たりの阻害活性を示す。
【００２３】
本発明におけるナノ酸化グラフェンの大きさは、例えば、５００ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、または５０ｎｍ未満であり得る。また本発明におけるナノ酸化グラフェンの大きさは、例えば、０．１ｎｍ以上、０．５ｎｍ以上、１ｎｍ以上、５ｎｍ以上、または１０ｎｍ以上であり得る。また本発明におけるナノ酸化グラフェンの大きさは、例えば０．１ｎｍ以上かつ５００ｎｍ未満、０．５ｎｍ以上かつ２００ｎｍ未満、または１０ｎｍ以上かつ１００ｎｍ未満であり得る。あるいは、本発明におけるナノ酸化グラフェンの大きさは、例えば０．５ｎｍ以上かつ３ｎｍ未満、３ｎｍ以上かつ１０ｎｍ未満、１０ｎｍ以上かつ５０ｎｍ未満、または５０ｎｍ以上かつ１００ｎｍ未満であり得る。
【００２４】
ナノ酸化グラフェンは、例えばmodified Hummers法（J. Am. Chem. Soc. 1958, 80, 1339）やJiayan Luo, Laura J. Cote, Vincent C. Tung, Alvin T. L. Tan, Philip E. Goins, Jinsong Wu, and Jiaxing Huang, J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 17667.に記載されている方法などの、公知の方法により製造することができる。例えば、プレートレットグラファイトナノファイバー（PGNF）を出発原料としてmodified Hummers法により製造する場合の手順を以下に示す。この方法によれば、１２０ｎｍ以下、平均サイズ３２ｎｍのナノ酸化グラフェンが得られる。
濃硫酸5 mLを80℃に加熱し、ペルオキソ二硫酸カリウム0.15 g、五酸化二リン0.15 gを加え、完全に溶解するまで加熱撹拌する。次にPGNF 0.2 gを加え、溶液を80℃に保ち、4.5時間加熱撹拌する。その後、溶液を自然冷却し、イオン交換水100 mLで希釈し、ブフナー漏斗を用いて吸引濾過を行い、イオン交換水100 mLで洗浄する。得られた黒色粉末を真空乾燥することにより、酸化PGNFを得る。濃硫酸25 mLを氷浴撹拌しながら酸化PGNFを加え、その後、過マンガン酸カリウム1.0 gをゆっくりと加える。35℃の湯浴へ移し、8時間加熱撹拌する。溶液を氷浴中で500 mL三角フラスコへ移し、撹拌しながらイオン交換水100 mLをゆっくりと加えて希釈する。その後、30%過酸化水素水5 mLをゆっくりと加える。暗めの黄色へと変化した溶液を3000 rpmで10分間遠心分離し、上澄みを捨て、沈殿物を3.4%塩酸で3回洗浄し、その後桐山漏斗を用いて、アセトンで3回洗浄する。真空乾燥後、得られた黒色粉末100 mgを再度イオン交換水100 mLに加え超音波処理を2時間行う。12000 rpmで20分間遠心分離し、上澄みを精製nGOとして回収する。
【００２５】
後述の実施例に示すとおり、還元型酸化グラフェンの大きさをナノオーダーにまで小さくすることで、さらにメタロ−β−ラクタマーゼに対する重量当たりの阻害効果を向上させることができる。したがって、好ましい実施形態において、本発明における還元型酸化グラフェンの大きさは、例えば５００ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、または５０ｎｍ未満であり得る。また本発明における還元型酸化グラフェンの大きさは、例えば、０．１ｎｍ以上、０．５ｎｍ以上、１ｎｍ以上、５ｎｍ以上、または１０ｎｍ以上であり得る。また本発明における還元型酸化グラフェンの大きさは、例えば０．１ｎｍ以上かつ５００ｎｍ未満、０．５ｎｍ以上かつ２００ｎｍ未満、または１０ｎｍ以上かつ１００ｎｍ未満であり得る。あるいは、本発明における還元型酸化グラフェンの大きさは、例えば０．５ｎｍ以上かつ３ｎｍ未満、３ｎｍ以上かつ１０ｎｍ未満、１０ｎｍ以上かつ５０ｎｍ未満、または５０ｎｍ以上かつ１００ｎｍ未満であり得る。なお、本明細書中、このような大きさをナノオーダーにまで小さくした還元型酸化グラフェンを還元型ナノ酸化グラフェン（Reduced nano Graphene oxide, RnGO）と言うことがある。
【００２６】
還元型ナノ酸化グラフェンは、酸化グラフェンと比較して顕著に低い重量で、メタロ−β−ラクタマーゼに対する阻害活性を示す。本発明における還元型ナノ酸化グラフェンは、酸化グラフェンと比較して、例えば５倍以上、１０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、または５００倍以上高い、重量当たりの阻害活性を示す。
【００２７】
還元型ナノ酸化グラフェンは、ナノ酸化グラフェン（nGO）を上述の方法により還元するか、または還元型酸化グラフェンを上述の方法によりナノオーダーにまで小さくすることにより製造することができる。
【００２８】
本発明はさらに、本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、メタロ−β−ラクタマーゼ阻害活性を有することから、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌感染症の治療に有用である。メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌としては、例えばPseudomonas属の細菌（例えば、P. aeruginosaなど）、Bacteroides属の細菌（例えば、B. fragilisなど）、Serratia属の細菌（例えば、S. marcescensなど）、Klebsiella属の細菌（例えば、K. pneumoniaeなど）、Escherichia属の細菌（例えば、E. coliなど）などが挙げられる。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤の他に薬学的に許容可能な賦形剤、ビヒクルおよび／または担体（以下、賦形剤等と記載する）を含んでもよい。薬学的に許容可能な賦形剤等は特に限定されず、当該技術分野において既知の賦形剤等から当業者が適宜選択することができる。
【００３０】
別の態様において、本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤または本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患を治療する方法が提供される。また別の態様において、対象における疾患の治療に用いるための本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤が提供される。あるいは、対象における疾患の治療に用いる医薬を製造するための本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤の使用もまた、提供される。疾患は、メタロ−β−ラクタマーゼの阻害が治療に有効な疾患であり、例えば上記のようなメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌による感染症が挙げられる。
【００３１】
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤または本発明の医薬組成物が投与される対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００３２】
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤の有効量は、当業者が適宜決定することができる。対象への投与に適した量は、患者群（年齢、性別、体重等）、治療対象となる疾患の性質及び重症度、投与する特定のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤及びその投与経路に応じて当業者、例えばヒトの場合は医師によって、適宜決定することができる。例えば、本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤の有効量は、０．１μｇ／ｋｇ／日〜１００μｇ／ｋｇ／日であり得る。
【００３３】
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤または本発明の医薬組成物は、当該技術分野において既知のいずれの方法で投与してもよい。例えば、経口投与および非経口投与が含まれる。経口投与に適した製剤の例には、錠剤、カプセル剤、丸薬、粉末剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤及びカシェ剤が含まれる。非経口投与する場合は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射及び皮下注射を含む注射剤、ならびに点滴剤、が含まれる。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤以外の少なくとも１つの治療剤と併用してもよい。併用には、本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤または本発明の医薬組成物が、他の治療剤の投与の前に、同時に、または後に、患者に投与されることが含まれる。例えば、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの他の治療剤をさらに含んでもよい。また本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの他の治療剤と組み合わせてなる医薬組成物、すなわち本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤および他の治療剤を取り合せてひとまとまりにした医薬組成物であってもよい。また本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの他の治療剤と組み合わせて使用されてもよい。他の治療剤としては、β−ラクタム剤、好ましくはカルバペネム系β−ラクタム剤が挙げられる。
【００３５】
２．メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法
本発明はさらに、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法であって、以下の工程：
ａ）カルバペネム系β−ラクタム剤の存在下かつ本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤の存在下または非存在下で、被験菌の生育を観察すること；および
ｂ）被験菌が、前記阻害剤の存在下では生育が抑制され、前記阻害剤の非存在下では生育が阻害されない場合に、被験菌がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であると判定すること
を含む、前記方法（本明細書中、本発明の検出方法ともいう）を提供する。
【００３６】
メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌は、カルバペネム系β−ラクタム剤を分解することができるため、カルバペネム系β−ラクタム剤の存在下でも生育できる。一方、カルバペネム系β−ラクタム剤および本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤の両方の存在下では、カルバペネマーゼの活性が阻害され、カルバペネム系β−ラクタム剤が分解されないため、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌は生育できない。この生育の違いを指標として、被験菌がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であるか否かを判定することができる。
【００３７】
本発明における被験菌は、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を含有し得る任意の試料から採取されたものであり得る。そのような試料としては、例えば生物学的試料または非生物学的試料が挙げられる。生物学的試料としては、例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ液、乳、涙、唾液、尿、便、生体組織などが挙げられる。非生物学的試料としては、医療機器、水試料、土壌試料、気体試料などが挙げられる。
【００３８】
本発明の検出方法は、種々の実施形態をとることが可能であり、例えば、寒天平板培養法および液体培養法が含まれる。
【００３９】
本発明で用いられる培地は、被験菌の増殖が可能な培地であれば特に限定されない。そのような培地としては、例えば、Pseudomonas属、Bacteroides属、Serratia属、Klebsiella属、Escherichia属などのグラム陰性桿菌の培養において使用され得る培地が挙げられる。固体培地を調製する場合には、寒天、アガロースなど通常使用されているものを使用することができる。また培養条件についても、被験菌の増殖が可能な条件であれば特に限定されない。例えば、培養温度を２０〜４０℃、培養時間を１５〜４８時間として、被験菌を増殖させることができる。
【００４０】
平板培養法で行う一実施形態では、本発明の検出方法における工程ａ）は、例えば、以下の工程：
１）培地表面に被験菌を塗布すること；
２）カルバペネム系β−ラクタム剤を含有するディスクおよび本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスクを、工程１）で被験菌を塗布した培地上に置くこと；および
３）メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の生育に十分な時間培養すること
を含む。
この場合、２つのディスク間に生育阻止帯が出現するか、またはカルバペネム系β−ラクタム剤を含有するディスクの周囲の生育阻止円がメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスクの方向に拡張した場合、被験菌がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であると判定される。
【００４１】
平板培養法で行う別の実施形態では、本発明の検出方法における工程ａ）は、例えば、以下の工程：
１）培地表面に被験菌を塗布すること；
２）カルバペネム系β−ラクタム剤を含有し本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含有しないディスク、ならびにカルバペネム系β−ラクタム剤および本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスクを、工程１）で被験菌を塗布した培地上に置くこと；および
３）メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の生育に十分な時間培養すること
を含む。
この場合、カルバペネム系β−ラクタム剤および本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスクの周囲の生育阻止円が、カルバペネム系β−ラクタム剤を含有し本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含有しないディスクの周囲の生育阻止円よりも大きい場合、被験菌がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であると判定される。
【００４２】
本発明において使用されるディスクの材質は、カルバペネム系β−ラクタム剤または本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含浸させ、固体培地上でそれらを拡散させることができる材質であれば特に限定されず、例えば濾紙が挙げられる。また、形状および大きさも、使用する平板培地の大きさなどに応じて適宜選択すればよく、例えば直径５〜１３ｍｍの円盤状のディスクが挙げられる。ディスクとして市販されているものを使用してもよい。
【００４３】
ディスクに含浸させるカルバペネム系β−ラクタム剤の量は、薬剤の固体培地での拡散性、培養時間（拡散時間）、被験菌の種類などを考慮して、使用する具体的な薬剤に応じて適宜決定することができる。例えば、１ディスク当りのカルバペネム系β−ラクタム剤の含有量は、当該薬剤に対する耐性を有しない細菌の生育は抑制されるが、耐性菌は生育できる範囲で設定することができ、予備検討を行って決定することができる。
【００４４】
またディスクに含浸させる本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤の量は、薬剤の固体培地での拡散性、培養時間（拡散時間）、メタロ−β−ラクタマーゼ阻害活性の強さ、被験菌の種類などを考慮して適宜決定することができる。例えば、１ディスク当りの本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤の含有量は、カルバペネム系β−ラクタム剤に対する耐性を有しない細菌の生育は抑制されるが、耐性菌は生育できる濃度でカルバペネム系β−ラクタム剤が存在する条件下で、耐性菌の生育を抑制することができる範囲で適宜設定することができ、予備検討を行って決定することができる。
【００４５】
液体培養法で行う一実施形態では、本発明の検出方法における工程ａ）は、例えば、以下の工程：
１）カルバペネム系β−ラクタム剤を含有し本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含有しない液体培地、ならびにカルバペネム系β−ラクタム剤および本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含有する液体培地を調製すること；
２）各培地に被験菌を入れること；および
３）メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の生育に十分な時間培養すること
を含む。
カルバペネム系β−ラクタム剤を含有し本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含有しない液体培地における生育が、カルバペネム系β−ラクタム剤および本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含有する液体培地における生育よりも良好である場合、被験菌がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であると判定される。
【００４６】
この実施形態において、被験菌の生育の程度は、濁度の測定など、通常用いられる手段により測定することができる。
【００４７】
培地に添加されるカルバペネム系β−ラクタム剤の量は、培養時間、被験菌の種類などを考慮して、使用する具体的な薬剤に応じて適宜決定することができる。例えば、カルバペネム系β−ラクタム剤の濃度は、当該薬剤に対する耐性を有しない細菌の生育は抑制されるが、耐性菌は生育できる範囲で設定することができ、予備検討を行って決定することができる。
【００４８】
また培地に添加される本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤の量は、培養時間、メタロ−β−ラクタマーゼ阻害活性の強さ、被験菌の種類などを考慮して適宜決定することができる。例えば、本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤の濃度は、カルバペネム系β−ラクタム剤に対する耐性を有しない細菌の生育は抑制されるが、耐性菌は生育できる濃度でカルバペネム系β−ラクタム剤が存在する条件下で、耐性菌の生育を抑制することができる範囲で適宜設定することができ、予備検討を行って決定することができる。
【００４９】
本発明はまた、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の検出用キットを提供する。本発明の検出用キットは、少なくとも本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤を含む。このようなキットはさらに、少なくとも１種類のカルバペネム系β−ラクタム剤、薬剤を格納する容器、培地、説明書などを含んでもよい。
【００５０】
次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
1  酸化グラフェン（Graphene oxide, GO）の特性評価
Hummer's法で作製したGOを、機器分析によりその形状と特性を確認した。
【００５２】
1.1  実験
1.1.1  機器分析
＜透過型電子顕微鏡（TEM)（JEOL, JEM-14000Plus, 出力電圧：100 kV)＞
イオン交換水にGOを加え、超音波洗浄機（BRANSON, 1510 J - DTH）を使用して超音波処理を行い、GOを分散させて、GO希薄溶液を調製した。GO希薄溶液を、TEM観察用基板である、エラスチックカーボン支持膜へマイクロピペッターを用いて滴下した。これを自然乾燥後、6時間真空乾燥することにより、観察用サンプルを作製した。作製したサンプルについて、透過型電子顕微鏡（TEM）で観察を行った。
【００５３】
＜原子間力顕微鏡（AFM)（Agilent Technologies, Agilent 5500)＞
GO分散液を少量取り、大過剰のイオン交換水で希釈し、マイカ基板上に少量滴下して真空乾燥で乾燥させた。乾燥が完了した後、原子間力顕微鏡(AFM)で観察を行った。
【００５４】
＜X線光電子分光（XPS)（Thermo Fisher Scientific, Theta Probe)＞
白金板を5 mm×5 mmの大きさに切り、アセトン・メタノール・イオン交換水の順で洗浄した。それをイオン交換水に浸して冷却し、窒素を吹きかけて白金板上の水分を取り除いた。そこに、GO分散液を少量滴下して真空乾燥で乾燥させ、測定を行った。
【００５５】
＜フーリエ変換赤外分光光度計（FT-IR)（PerkinElmer, Spectrum One S型 FT-IF)＞
GOの構造を同定するために、錠剤（KBr）法により、GOの赤外吸収スペクトル測定を行った。
【００５６】
＜元素分析（Yanaco, MICRO CORDER JM 10)＞
GOを乾燥させてサンプルを作製し、炭素、水素、及び窒素の元素分析を熊本大学工学部付属光学機器センターに依頼した。測定は、MICRO CORDER JM 10により行った。
【００５７】
1.2  結果と考察
1.2.1  GOのTEM観察結果
GOのTEM測定を行い、GOのサイズおよび形状を確認した。GOのTEM画像およびサイズ分布のヒストグラムを図１に示す。GOは、約1〜5μmのサイズが多く、角のあるシート状の形状が観察された。
【００５８】
1.2.2  GOのAFM観察結果
GOのAFM測定を行い、GOのサイズおよび厚みを測定した。GOのAFM画像を図２に示す。この画像から、厚みが1.0〜1.3 nmのシート状のGOが確認された。GOは、シート状の形状で厚みが約1 nm前後であるという報告があり、今回使用したGOは単層に剥離されていると判断した。
【００５９】
1.2.3  GOのXPS測定結果
GOのXPS測定結果からC1sのピーク分離を行った。結果を図３および表１に示す。図３より、ヒドロキシル基、カルボキシル基、およびエポキシ基の置換基のピークが確認された。また、エポキシ基の割合が31.4%と最も高かった。
【００６０】
【表１】
2019195315.tif 000002
【００６１】
1.2.4  GOのFT-IR測定結果
GOの官能基を確認するために、FT-IR測定を行った。結果を図４に示す。FT-IRスペクトルの測定結果より、3400 cm-1にO-H伸縮振動、1740 cm-1にカルボキシル基由来のC=O伸縮振動、1630 cm-1にグラファイト由来のC=C振動、1260 cm-1にC-OH伸縮振動、1080 cm-1にC-O-C伸縮振動が確認された。
前述したXPS測定結果と合わせて、使用したGOは、多彩な酸素官能基（エポキシ基、カルボキシル基、およびヒドロキシル基）を持つことが確認された。
【００６２】
1.2.5  GOの元素分析結果
GOの元素分析を行い、酸化の度合いを確認した。結果を表２に示す。表２より、酸素の含有率は52.5%であり、酸素に対する炭素の比（C/O）が0.87であるため、十分に酸化していると判断した。
【００６３】
【表２】
2019195315.tif 000003
【００６４】
2  RGOの作製とその特性評価
Hummer's法で作製したGOの分散液を調製し、光還元によって還元型GO（Reduced Graphene oxide, RGO）を作製した。また機器分析により、その形状と特性を確認した。
【００６５】
2.1  実験
2.1.1  機器分析
＜X線光電子分光（XPS)（Thermo Fisher Scientific, Theta Probe)＞
白金板を5 mm×5 mmの大きさに切り、アセトン、メタノール、イオン交換水の順で洗浄した。洗浄後の白金板をイオン交換水に浸して冷却し、窒素を吹きかけて白金板上の水分を取り除いた。そこに、RGO分散液を少量滴下して真空乾燥で乾燥させ、測定を行った。
【００６６】
＜フーリエ変換赤外分光光度計（FT-IR)（PerkinElmer, Spectrum One S型 FT-IF)＞
RGOの構造を同定するために、RGO分散液をコンビニエバポレータと真空乾燥で乾固させ、錠剤（KBr）法により、赤外吸収スペクトル測定を行った。
【００６７】
＜元素分析（Yanaco, MICRO CORDER JM 10)＞
RGOを乾燥させてサンプルを作製し、炭素、水素、及び窒素の元素分析を熊本大学工学部付属光学機器センターに依頼した。測定は、MICRO CORDER JM 10により行った。
【００６８】
2.1.2  GOの光還元
GO 10 mgをイオン交換水10 mLに添加し、超音波処理を2時間行い、1 mg/mLのGO分散液を作製した。この分散液を撹拌しながら、30 cm離した水銀灯（全光）で6時間光照射した。光照射後の分散液を2時間超音波処理し、重量既知の遠心管に移した。10000 rpmで30分間遠心分離を行い、上澄みをRGO分散液として回収した。
【００６９】
2.2  結果と考察
2.2.1  RGOのXPS測定結果
RGOの結合の様子および官能基の置換状態を確認するために、XPSによる測定を行った。RGOのXPS測定結果からC1sのピーク分離を行った。測定結果を図５に示す。また、光還元前後の官能基の割合を表３に示す。光還元では、主にエポキシ基が減少するとされており、実際に、還元前は31.4%であったエポキシ基の割合が還元後に13.3%まで低下したことが確認された。これらの結果から、還元が起こったと判断した。
【００７０】
【表３】
2019195315.tif 000004
【００７１】
2.2.2  RGOのFT-IR測定結果
RGOの官能基を確認するために、FT-IR測定を行った。光還元前後の結果を図６に示す。FT-IRスペクトルの測定結果より、3400 cm-1にO-H伸縮振動、1740 cm-1にカルボキシル基由来のC=O伸縮振動、1630 cm-1にグラファイト由来のC=C振動、1230 cm-1にC-OH伸縮振動、1080 cm-1にC-O-C伸縮振動が確認された。
【００７２】
2.2.3  RGOの元素分析結果
RGOの元素分析を行い、GOの酸化の度合いを確認した。光還元前後の結果を表４に示す。表４より、還元後の酸素の含有率は、還元前の52.5%から28.2%まで減少しているため、還元されたと判断した。
【００７３】
【表４】
2019195315.tif 000005
【００７４】
3  ナノ酸化グラフェン（nGO）の作製と特性評価
プレートレットグラファイトナノファイバー（Platelet graphite nanofibers, PGNF）を出発原料として、modified Hummer's法でnGOの作製を行った。このnGOについて、機器分析によりその形状および特性を確認した。
【００７５】
3.1  実験
3.1.1  試薬
Stacked Graphene Platelet       STREM CHEMICALS
濃硫酸                          和光純薬
塩酸                            和光純薬
ペルオキソ二硫酸カリウム        ナカライテスク
五酸化二リン                    ナカライテスク
過マンガン酸カリウム            和光純薬
過酸化水素                      和光純薬
アセトン                        ナカライテスク
マイカ                          ニラコ
エラスチックカーボン支持膜      応研商事
【００７６】
3.1.2  機器分析
＜透過型電子顕微鏡（TEM)（JEOL, JEM-14000Plus 出力電圧：100 kV)＞
イオン交換水にnGOを加え、超音波洗浄機（BRANSON, 1510J-DTH）を使って超音波処理をし、nGOを分散させて希薄溶液とし、TEM観察用基板であるエラスチックカーボン支持膜へマイクロピペッターを用いて滴下した。自然乾燥後、6時間真空乾燥を行い、観察用サンプルを作製し、透過型電子顕微鏡（TEM）で観察を行った。
【００７７】
＜原子間力顕微鏡（AFM)（Agilent Technologies , Agilent 5500）＞
nGO分散液を少量取り、イオン交換水で大過剰希釈し、マイカ基板上に少量滴下して真空乾燥で乾燥した。乾燥が完了したのち、原子間力顕微鏡（AFM）で観察を行った。
【００７８】
＜X線光電子分光（XPS)（Thermo Fisher Scientific, Theta Probe）＞
白金板を5 mm×5 mmの大きさに切り、アセトン、メタノール、イオン交換水の順で洗浄した。洗浄後の白金板をイオン交換水に浸して冷却し、窒素を吹きかけて白金板上の水分を取り除いた。そこに、nGO分散液を少量滴下して真空乾燥で乾燥させ、測定を行った。
【００７９】
＜フーリエ変換赤外分光光度計（FT-IR)（PerkinElmer, Spectrum One S型 FT-IF)＞
nGOの構造を同定するために、精製後のnGO分散液をコンビニエバポレータと真空乾燥で乾固させ、錠剤（KBr）法により、赤外吸収スペクトル測定を行った。
【００８０】
＜元素分析（Yanaco, MICRO CORDER JM 10）＞
nGOを乾燥させてサンプルを作製し、炭素、水素、及び窒素の元素分析を熊本大学工学部付属光学機器センターに依頼した。測定は、MICRO CORDER JM 10 により行った。
【００８１】
3.1.3  modified Hummer's法によるnGOの作製
濃硫酸5 mLを80℃に加熱し、ペルオキソ二硫酸カリウム0.15 g、五酸化二リン0.15 gを加え、完全に溶解するまで加熱撹拌した。次にPGNF 0.2 gを加え、溶液を80℃に保ち、4.5時間加熱撹拌した。その後、溶液を自然冷却し、イオン交換水100 mLで希釈し、ブフナー漏斗を用いて吸引濾過を行い、イオン交換水100 mLで洗浄した。得られた黒色粉末を真空乾燥し、酸化PGNFを得た。濃硫酸25 mLを氷浴撹拌しながら酸化PGNFを加え、その後、過マンガン酸カリウム1.0 gをゆっくりと加えた。35℃の湯浴へ移し、8時間加熱撹拌した。溶液を氷浴中で500 mL三角フラスコへ移し、撹拌しながらイオン交換水100 mLをゆっくりと加えて希釈した。その後、30%過酸化水素水5 mLをゆっくりと加えると、気泡が発生し、溶液は暗めの黄色へと変化した。この溶液を3000 rpmで10分間遠心分離し、上澄みを捨て、沈殿物を3.4%塩酸で3回洗浄し、その後桐山漏斗を用いて、アセトンで3回洗浄した。真空乾燥後、得られた黒色粉末100 mgを再度イオン交換水100 mLに加え超音波処理を2時間行った。12000 rpmで20分間遠心分離し、上澄みを精製nGOとして回収した。
【００８２】
3.2  結果と考察
3.2.1  nGOのTEM観察結果
作製したnGOをTEMにて観察した。さらに、nGOのサイズを計測し、サイズに関するヒストグラムを作成した。nGOのTEM画像およびサイズ分布のヒストグラムを図７に示す。ヒストグラムに示されているとおり、作製したnGOの多くは20〜50 nm程度の大きさであり、平均サイズは32 nmであった。
【００８３】
3.2.2  nGOのAFM観察結果
nGOのAFM測定を行い、GOのサイズおよび厚みを測定した。nGOのAFM画像を図８に示す。nGOは丸みを帯びており、厚みが0.8〜1.0 nm程のものが多く確認された。また、横幅は30 nm程のものが多く確認された。酸化グラフェンは、シート状の形状で厚みが約1nm前後であることがこれまでの報告により明らかにされている。従って、今回作製したnGOは単層に剥離されていると判断した。
【００８４】
3.2.3  nGOのXPS測定結果
nGOの結合の様子および官能基の置換状態を確認するために、XPSによる測定を行った。nGOのXPS測定結果からC1sのピーク分離を行った。結果を図９に示す。また、nGOの官能基の割合を表５に示す。ヒドロキシル基やカルボキシル基等の酸素含有基のピークが確認された。その中でも、今回作製したnGOでは、エポキシ基の割合が最も高いことが明らかとなった。
【００８５】
【表５】
2019195315.tif 000006
【００８６】
3.2.4  nGOのFT−IR測定結果
nGOの官能基を確認するために、FT-IR測定を行った。測定結果を図１０に示す。FT-IRスペクトルの測定結果より、3400 cm-1にO-H伸縮振動、1740 cm-1にカルボキシル基由来のC=O伸縮振動、1630 cm-1にグラファイト由来のC=C振動、1260 cm-1にC-OH伸縮振動、1080 cm-1にC-O-C伸縮振動が確認された。
前述したXPS測定結果と合わせて、作製したnGOは、多彩な酸素官能基（エポキシ基、カルボキシル基、およびヒドロキシル基）を持つことが判明した。
【００８７】
3.2.5  nGOの元素分析結果
nGOの元素分析を行い、nGOの酸化の度合いを確認した。測定結果を表６に示す。表６より、酸素の含有率は、52.1%であり、C/Oが0.87であるため、十分に酸化していると判断した。
【００８８】
【表６】
2019195315.tif 000007
【００８９】
4  RnGOの作製と特性評価
modified Hummer's法で作製したnGOの分散液を調製し、光還元によって還元型nGO（Reduced nano Graphene oxide, RnGO）を作製した。また機器分析により、その形状と特性を確認した。
【００９０】
4.1  実験
4.1.1  機器分析
＜X線光電子分光（XPS)（Thermo Fisher Scientific, Theta Probe）＞
白金板を5 mm×5 mmの大きさに切り、アセトン、メタノール、イオン交換水の順で洗浄した。洗浄後の白金板をイオン交換水に浸して冷却し、窒素を吹きかけて白金板上の水分を取り除いた。そこに、RnGO分散液を少量滴下して真空乾燥で乾燥させ、測定を行った。
【００９１】
＜フーリエ変換赤外分光光度計（FT-IR)（PerkinElmer, Spectrum One S型 FT-IF）＞
RnGO修飾体の構造を同定するために、RnGO分散液をコンビニエバポレータと真空乾燥で乾固させ、錠剤（KBr）法により、赤外吸収スペクトル測定を行った。
【００９２】
＜元素分析（Yanaco, MICRO CORDER JM 10）＞
RnGOを乾燥させてサンプルを作製し、炭素、水素、及び窒素の元素分析を熊本大学工学部付属光学機器センターに依頼した。測定は、MICRO CORDER JM 10により行った。
【００９３】
4.1.2  nGOの光還元
nGO 10 mgをイオン交換水10 mLに添加し、超音波処理を2時間行い、1 mg/mLのnGO分散液を作製した。この分散液を撹拌しながら、30 cm離した水銀灯（全光）で6時間光照射した。光照射後の分散液を2時間超音波処理し、重量既知の遠心管に移した。10000 rpmで30分間遠心分離を行い、上澄みをRnGO分散液として回収した。
【００９４】
4.2  結果と考察
4.2.1  RnGOのXPS測定結果
RnGOの結合の様子および官能基の置換状態を確認するために、XPSによる測定を行った。RnGOのXPS測定結果からC1sのピーク分離を行った。測定結果を図１１に示す。また、光還元前後の官能基の割合を表７に示す。光還元では、主にエポキシ基が減少するとされており、実際に還元前は23.1%であったエポキシ基の割合が還元後に7.4%まで低下したことが確認された。これらの結果から、還元が起こったと判断した。
【００９５】
【表７】
2019195315.tif 000008
【００９６】
4.2.2  RnGOのFT-IR測定結果
RnGOの官能基を確認するために、FT-IR測定を行った。光還元前後の結果を図１２に示す。FT-IRスペクトルの測定結果より、3400 cm-1にO-H伸縮振動、1720 cm-1にカルボキシル基由来のC=O伸縮振動、1610 cm-1にグラファイト由来のC=C振動、1100 cm-1にC-OH伸縮振動を確認が確認された。nGOでは明確に確認できたC-O-C伸縮振動の1010 cm-1付近のピークは、還元後にピーク強度が弱くなった。前述したXPS測定結果からも分かるように、還元後にC-O-Cが大幅に減少したためと考えられる。
【００９７】
4.2.3  RnGOの元素分析結果
RnGOの元素分析を行い、RnGOの酸化の度合いを確認した。光還元前後の結果を表８に示す。表８より、還元後の酸素の含有率は、還元前の52.1%から20.2%まで減少しているため、還元されたと判断した。
【００９８】
【表８】
2019195315.tif 000009
【００９９】
5  酵素に対する活性阻害活性測定
加水分解酵素であるα-キモトリプシン（α-ChT）、メタロ-β-ラクタマーゼ（IMP-1）、および酸化還元酵素である乳酸脱水素酵素の3つの酵素に対する今回作製した様々なGOの活性阻害実験を行った。その測定結果から酵素活性が半分になる阻害剤濃度IC50を算出した。さらに、Lineweaver-Burkプロットから、阻害様式を決定した。
【０１００】
5.1  実験
5.1.1  試薬
Kanamycin Monosulfate                           ナカライテスク
BactoTMTrypton                                  日本ベクトン・ディックソン
BactoTMYeast Extract                            日本ベクトン・ディックソン
Sodium chloride                                 シグマアルドリッチ
Sodium Hydroxide                                ナカライテスク
Agar Purified powder                            ナカライテスク
Potassium Chloride                              和光純薬
Magnesium Sulfate Heptahydrate                  和光純薬
Magnesium Chloride Hexahydrate                  和光純薬
Isopropyl-β-D-thigalactopyranoside (IPTG)      ナカライテスク
Zinc Sulfate Heptaphydrate                      和光純薬
Chelex 100 Sodium form                          SIGMA
Tris (hydroxymethyl) aminomethane               ナカライテスク
Hydrochloric acid                               ナカライテスク
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)                    ナカライテスク
Glycine                                         和光純薬
Polyvinylpyrrolidone (PVP)                      シグマアルドリッチ
Citric Acid, Anhydrous                          ナカライテスク
Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250            和光純薬
30(w/v)%-Acrylamide/Bis Mixed Solution (29:1)   ナカライテスク
2-propanol                                      ナカライテスク
Ammonium peroxodisulfate (APS)                  和光純薬
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)    和光純薬
Cephalothin sodium salt                         シグマアルドリッチ
Nitrocefin                                      OXOZD
ジメチルスルホキシド（DMSO)                     和光純薬
【０１０１】
5.1.2  実験基材
HiTrapTMSP HP                                   GE Healthcare
HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 75 prep grade          GE Healthcare
Amicon Ultra-15                                 Millipore
Amicon Ultra-0.5                                Millipore
e-PAGEL                                         アトー
Millex-HV 0.45 μM                              Millipore
Millex-HV 0.22 μM                              Millipore
テルモシリンジ  ラテックスフリー電子線滅菌済10 mL    TERUMO
テルモ注射器  ガンマ線滅菌済21G×1  1/2"(0.80×38 mm)    TERUMO
Disposabale Conical Tubes 50 mL                 nunc
Disposabale Conical Tubes 15 mL                 nunc
Pure YieldTM Plasmid Miniprep System             Promega
【０１０２】
5.1.3  機器
オートクレーブ  SX-500                          TOMY
振盪培養装置  Excella E24R                      New Brunswink Scientific
インキュベートシェーカー  Max Q5000             Barnstead Lab-Line
インキュベーター  CN-25C                        三菱
超音波破砕機  Astraton 3000                     Misonix
バイオロジカルセーフティキャビネット            日本エアーテック
ハイスピード冷却遠心機  Kubota 7700             久保田製作所
微量高速冷却遠心機  MX-301                      トミー精工
多目的冷却遠心機  CAX-370                       トミー精工
ボルテックスミキサー  GENIE2                    Sientific Industries
AKTA prime plus                                 GE Healthcare
AKTA purifier                                   GE Healthcare
e-spect                                         Malcon
UV/VIS Spectrophotometer V-530                  JASCO
レシオビーム分光光度  U-1500                    HITACHI
pH/COND METER                                   HORIBA
高純度蒸留水製造装置  STORAGE SYSTEM            Barnstead
Nanopure DiamondTM FISTREEM III Glass Still     Barnstead
【０１０３】
5.1.4  試料溶液の調製
5.1.4.1  電気泳動用試料調製溶液
Trisを30.3 g、グリシンを144.1 g秤量し、Nano Pure DiamondTM FISTREEMIIIで精製した蒸留水（nanopure water）に溶解させ、1 Lにメスアップした。その後、SDSを10 g加え、電気泳動用の溶液とした。電気泳動を行う際は10倍希釈してから用いた。
【０１０４】
5.1.4.2  タンパク質定量用色素試薬
15 mLのNanopure water、10 mLの20%(w/v) PVP、50 mLの40%(w/v)クエン酸、15 mLの0.2%(w/v) CBB R-250をこの順番で加え、タンパク質定量用色素溶液（CBB染色液）とした。
【０１０５】
5.1.4.3  15％ポリアクリルアミドゲルの作成（4枚分）
大小2枚のガラス板を、キムワイプを使って80%エタノールでよく拭き、乾燥させてからスペーサーをはさみ固定した。Nanopure waterを加え、水漏れがないことを確認した。50 mLビーカー内に30%のアクリルアミド/ビス混合溶液12 mL、1.5 M Tris-HCl (pH8.8)溶液6 mL、10% SDS溶液240μL、Nanopure water 5.5 mL、10% APS溶液240μL、TEMED溶液10μLを混ぜ合わせ、素早く溶液をガラス板に流し込み、静かに2-プロパノールを重層した。30分静置してゲルを固めたのち、2-プロパノールを捨てた。次に新しいビーカー内に30%のアクリルアミド/ビス混合溶液2 mL、1.5 M Tris-HCl (pH8.8)溶液1 mL、10% SDS溶液120μL、Nanopure water 8.8 mL、10% APS溶液120μL、TEMED溶液10μLを混ぜ合わせ、固まったゲル上に流し入れ、コームを差し込み、30分静置してゲルを完全に固めた。乾燥を防ぐために、濡らしたキムタオルで包み、冷蔵庫内で保存した。
【０１０６】
5.1.5  細胞培養用培地の調製
Luria-Bertani (LB) 液体培地：Trypton 1.0 g、Yeast Extract 0.5 g、NaCl 0.5 gをそれぞれ秤量し、nanopure water 100 mLに溶解させ、1 MのNaOH 0.3 mLを加えた。その後、121℃のオートクレーブで加熱溶解・滅菌を20分間行い、放冷した。
LB寒天培地：LB液体培地と同様に溶液を調製し、そこにAgar 1.4 gを加えた。これを、121℃のオートクレーブで30分間加熱溶解・滅菌した。溶液の温度が人肌程度の温度まで下がったところで、抗生物質（Km）を加え、安全キャビネット内で6枚のシャーレに分注し、放冷した。
【０１０７】
5.1.6  酵素（IMP-1）の抽出と精製
E. coli BL21 (DE3)/pET9a/d-IMP-1（pET9a/d-IMP-1は、Serratia marcescens TN9106株由来のIMP-1遺伝子をテンプレートとして、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を除いたIMP-1遺伝子を増幅させ、pET9aに組込んだプラスミドである。pET9a/d-IMP-1をヒートショック法によりE. coli BL21 (DE3)に導入して、本菌株を作製した。）を、50μg/mL Kmを含むLB寒天培地で、37℃で一晩培養した。500 mLの培養フラスコに、50μg/mL Kmを含む100 mLのLB培地を加え、形成した菌のシングルコロニーを一つ釣菌し、37℃、180 rpmで一晩振盪培養した（前培養）。8 Lの培養フラスコに50μg/mL Kmを含む2 LのLB培地を4本用意し、それぞれに培養液10 mLを加え、OD600が0.4〜0.6になるまで（約6時間）37℃、150 rpmで振盪培養した（本培養）。その後、培養液にIPTGが0.1 mMとなるように加え、25℃、150 rpmで一晩振盪培養し、IMP-1の発現を誘導した。
IPTG 0.19 gを、4 mLのnanopure waterに溶解し、4本の8 L培養フラスコに1 mLずつ加えた。誘導後、培養液を500 mLの遠心チューブに移し、4℃、5,000 Gで30分間遠心して菌体を回収した。これを20 mM Tris-HCl (pH7.5)に懸濁し、50 mLチューブに移し、さらに、4℃、5,000 Gで30分間遠心した。湿菌重量1 gに対して1 mLの比率で20 mM Tris-HCl (pH7.5)を加えて再懸濁した。懸濁液をビーカーに移し、氷上で5秒ON、25秒OFFの条件下で菌体を60回超音波で破砕した（30分）。破砕した菌体液を50 mLの遠心チューブに移し、4℃、30,000 Gで30分間遠心し、上清液（粗酵素溶液）を得た。
カラムによる精製は4℃の冷蔵庫内で行った。上清液を0.45μmのフィルターでフィルターろ過した後、SP Sepharose High Performance（SP-HP)を用いて、0 Mから0.5 Mまで塩化ナトリウムで濃度勾配をかけた20 mM Tris-HCl (pH7.5)で溶出させ、10 mL毎に分取した。280 nmの吸収強度が存在する画分について、SDS-Poly Acrylamide Gel Electrophoresis（SDS-PAGE)を行い、タンパク質の存在が確認できた画分を集めた。限外ろ過し、2 mL以下になるまで濃縮した。濃縮した液をHiloadTM 16/60 SuperdexTM 75 per gradeを用いて、0.3 M NaClを含む20 mM Tris-HCl (pH7.5)で溶出させ、5 mL毎に分取した。SDS-PAGEを行い、単一バンドであることを確認した後、この溶液を精製酵素溶液（IMP-1）とした。
【０１０８】
5.1.7  酵素の定量
IMP-1の酵素濃度は280 nmの吸光度を測定し、モル吸光係数をΔε280＝49,000（M-1cm-1）とし、Lambert-Beerの式を用いて決定した。
Lambert-Beerの式：Absorbance (Abs.) =ε (M-1cm-1)×c (M)×ｌ (cm)
【０１０９】
5.1.8  阻害実験
酵素の阻害活性の評価は、分光光度法によって行った。0.5 M NaClを含む50 mM Tris-HCl (pH7.5) 2.8 mLを1 cmのUV測定セルに入れ、酵素溶液10μLおよび阻害剤100μLを加えた。酵素溶液としては、約3μM IMP-1溶液を用いた。阻害剤としては、それぞれ初期濃度として2000μg/mLのGO、RGO、nGO、およびRnGO分散液を用いた。阻害剤を加えない場合はイオン交換水100μLを加えた。酵素溶液および阻害剤を加えた後、30℃の保温槽内で5分間放置し、温度を一定にするとともに、酵素と阻害剤を十分に相互作用させた。この溶液に3 mM Nitrocefin溶液を100μL加えて素早く混ぜ、Nitrocefinの加水分解による491 nmの吸光度の変化を60秒間経時的に測定した。
【０１１０】
5.1.9  酵素に対するGO、RGO、nGO、およびRnGOの阻害定数IC50値の決定
阻害実験の結果より、阻害剤を含まない場合の1分間当たりの吸光度の増加値（[E]0）および阻害剤を含む場合の1分間当たりの吸光度の増加値（[E]）を求め、阻害剤濃度（[I]）に対する[E]/[E]0をプロットした。このプロットより、次式に基づいて近似曲線を描き、IC50値を求めた。阻害剤は酵素のみと相互作用すると仮定した。
【０１１１】
【数１】
2019195315.tif 000010
【０１１２】
上式より、
【０１１３】
【数２】
2019195315.tif 000011
【０１１４】
となる。ここで、
【０１１５】
【数３】
2019195315.tif 000012
【０１１６】
より、Kiは、
【０１１７】
【数４】
2019195315.tif 000013
【０１１８】
となり、
【０１１９】
【数５】
2019195315.tif 000014
【０１２０】
と変更できる。この時、[E]/[E]0は残存活性となる。よって、[E]/[E]0vs [I]の近似曲線を描き、IC50値を求めた。
【０１２１】
【数６】
2019195315.tif 000015
【０１２２】
E：酵素
I：阻害剤
EI：酵素−阻害剤複合体
[E]：酵素濃度
[E]0：全酵素濃度
[I]：阻害剤濃度
[EI]：酵素−阻害剤複合体濃度
Kiapp：みかけのKi値
【０１２３】
5.1.10  阻害様式
阻害様式の評価は、分光光度法によって行った。0.5M NaClを含む50 mM Tris-HCl (pH7.5)2.8 mLを1 cmのUV測定セルに入れ、酵素溶液10μLおよび阻害剤100μLを加えた。酵素溶液としては、約3μM IMP-1溶液を用いた。阻害剤としては、GO、RGO、nGO、およびRnGO分散液を、それぞれ終濃度1μg/nLとなるように加えた。酵素溶液および阻害剤を加えた後、30℃の保温槽内で5分間放置し、温度を一定にするとともに、酵素と阻害剤を十分に相互作用させた。この溶液に終濃度200μM、100μM、50μM、または10μMとなるようにNitrocefin溶液100μLを加えて素早く混ぜ、Nitrocefinの加水分解による491 nmの吸光度の変化を60秒間経時的に測定した。
測定した吸光度の増加から、Lambert-Beer式により、1分間当たりのモル濃度の変化Δv (mM/min)を算出した。このとき、Δε491＝20,000 (M-1cm-1)とした。また、基質であるNitrocefin濃度を[S]として、ｙ軸を1/v、ｘ軸を1/[S]とするグラフを描き、阻害様式を決定した。
【０１２４】
5.2  結果と考察
5.2.1  酵素に対するGO、RGO、nGO、およびRnGOの阻害定数IC50値の決定
まず、阻害剤濃度に対する[E]/[E]0をプロットしたグラフを作成した。RGO、nGO、およびRnGOのグラフを図１３に示す。また作成したグラフから算出したGO、RGO、nGO、およびRnGOのIMP-1に対するIC50値を表９に示す。
GOおよびnGOのIC50値を比較した結果、サイズが小さくなると阻害効果が高まることが明らかとなった。nGOはサイズ効果によって活性中心に作用しやすくなり、また同じ濃度ではGOよりもnGOの方が分子数が多いため、nGOによる阻害効果がGOよりも高くなったと考えられる。さらに、光還元前後（GO vs RGO、nGO vs RnGO）で阻害効果を比較すると、還元によりさらに阻害効果が向上することが明らかとなった。IMP-1の活性中心は疎水的であることが判明している。そのため、疎水性の高いRGOおよびRnGOは、より強い阻害効果を示したと考えられる。
【０１２５】
【表９】
2019195315.tif 000016
【０１２６】
5.2.2  阻害様式
測定したGO、RGO、nGO、およびRnGOのIMP-1に対するLineweaver-Burkプロット図を作成した（図１４）。その結果、GOおよびRGOの阻害様式は非競合阻害であり、nGOおよびRnGOの阻害様式は競合阻害であることが明らかとなった。サイズが小さいnGOおよびRnGOでは、同濃度のGOおよびRGOと比較して、ベーサル面の面積は変わらないが、エッジが増加する。nGOおよびRnGOにおいて阻害効果が向上し、また阻害様式が競合阻害となったことから、エッジ部分が酵素の活性中心と反応して阻害が起こっていると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明により、カルバペネム系β−ラクタム剤と組み合わせてなる抗菌薬、またはカルバペネム系β−ラクタム剤と組み合わせて使用される抗菌薬が提供される。また本発明により、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の検出手段が提供される。
【図１】
2019195315.tif 000017
【図２】
2019195315.tif 000018
【図３】
2019195315.tif 000019
【図４】
2019195315.tif 000020
【図５】
2019195315.tif 000021
【図６】
2019195315.tif 000022
【図７】
2019195315.tif 000023
【図８】
2019195315.tif 000024
【図９】
2019195315.tif 000025
【図１０】
2019195315.tif 000026
【図１１】
2019195315.tif 000027
【図１２】
2019195315.tif 000028
【図１３】
2019195315.tif 000029
【図１４】
2019195315.tif 000030