(57)【要約】【課題】  確実に腫瘍細胞と正常細胞とを判別することができる腫瘍細胞の判別方法の提供。【解決手段】  ５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）のような蛍光色素と、酸化チタン粒子のような光散乱粒子とを別々に生体内に投与して光をあてると、蛍光色素単独で得られる発光に比較し、より確実に腫瘍細胞を正常細胞との区別できる強度の発光が得られる。さらに、その発光時間は、蛍光色素と光散乱粒子とを別々に生体内に投与することにより延長される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞と正常細胞とを判別する方法であって、
（ａ）腫瘍選択性を有する蛍光色素を前記腫瘍細胞内に取込ませる工程と、
（ｂ）光散乱粒子を前記腫瘍細胞表面に吸着させる、および／または前記腫瘍細胞内に取込ませる工程と、
（ｃ）前記蛍光色素が前記腫瘍細胞において蛍光を発するタイミングで前記蛍光色素に蛍光を生じる波長の光を前記腫瘍細胞に照射する工程と
を少なくとも含んでなる、腫瘍細胞の判別方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）が、腫瘍選択性を有する蛍光色素を生体内に投与し、当該蛍光色素を前記腫瘍細胞内に取込ませる工程であり、かつ
前記工程（ｂ）が、光散乱粒子を生体内に投与し、前記腫瘍細胞表面に吸着させる、および／または前記腫瘍細胞内に取込ませる工程である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍細胞が、上皮性腫瘍細胞、非浸潤性の腫瘍細胞、または上皮内癌の実質を構成する腫瘍細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光を生じる波長の光が可視光である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光を、内視鏡を用いて観察して、および／または、検出器を用いて検出して、腫瘍細胞を判別する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍細胞が、膀胱癌、尿路上皮癌、大腸癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、または胆道癌の実質を構成する腫瘍細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光によって、腫瘍の領域を正常領域と区別する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光色素と光散乱粒子は結合されていない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍選択性を有する蛍光色素が、５−アミノレブリン酸類およびヒペリシン類からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記光散乱粒子が、酸化チタン、リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、アルミナ、水酸化アルミニウム、シリカ、およびポリスチレン群から選ばれる少なくとも１種の粒子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記光散乱粒子が、生体親和性高分子を表面に結合してなるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体親和性高分子が、ポリエチレングリコールである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記光散乱粒子が、腫瘍細胞と結合可能な分子を表面にさらに備えてなるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍細胞の判別システムであって、
（１）腫瘍選択性を有する蛍光色素と、光散乱粒子とを含んでなり、前記蛍光色素と光散乱粒子とが結合されていない診断薬、
（２）腫瘍細胞内に取り込まれた前記蛍光色素と、腫瘍細胞表面に吸着された、および／または腫瘍細胞内に取込まれた前記光散乱粒子とに対して、前記蛍光色素に蛍光を生じる波長の光を照射可能な光源、および
（３）上記光源により照射された結果、腫瘍細胞において発生した蛍光を観察または検出する光学機器
を備えてなる、腫瘍細胞の判別システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞と正常細胞とを判別する方法、そのために用いられる診断薬および増感剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍の治療において、腫瘍領域を全てまたは部分的に切り取る治療が外科療法（手術療法）である。腫瘍領域を全て適切に取り切ることが当該治療の望まれる目的となるが、そのためには腫瘍の実質を構成する腫瘍細胞を明確に正常細胞と区別し、判別することが必要となりかつ重要となる。切除の範囲が適切でないと、腫瘍領域が残った場合には再発転移に繋がる恐れがあり、他方、腫瘍が波及していない部分まで過剰に切り取ると生体機能が損なわる可能性が高まり、術後障害などＱＯＬの低下につながる恐れがあるからである。
【０００３】
近年、患者の負担が少ないことから内視鏡による腫瘍の外科治療が行われており、生体内において、腫瘍細胞と正常細胞、または腫瘍領域と正常領域を区別し、判別することも求められるに至っている。
【０００４】
腫瘍領域または腫瘍細胞と正常領域または正常細胞とを判別する手法として、特に内視鏡下の生体内において判別するために腫瘍細胞をイメージング、すなわち画像化・可視化する技術が提案されている。例えば、ＷＯ９１／０１７２７号公報（特許文献１）は、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を用いた腫瘍細胞の検出および治療方法を開示する。ここで、ＡＬＡは、それ自体光感受性を有さないが、腫瘍細胞内でヘム生合成経路の一連の酵素群によりプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）に代謝活性化され、これが細胞外に排出され光励起により発光する。ＡＬＡのこのような性質を利用して腫瘍細胞を画像化・可視化する。さらにＰｐＩＸの光励起により発生する一重項酸素が細胞を変性・壊死させることから、腫瘍の治療にも用いることが出来るとされている。
【０００５】
このような腫瘍細胞において特異的に構造変換され、光励起により蛍光の発光が可能となる物質がその後提案されている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，６：６４６３（２０１５）（非特許文献１））。
【０００６】
ＡＬＡのような蛍光色素を用い、より効率よく腫瘍細胞を画像化・可視化する提案、さらに治療効率を上げる提案がいくつかなされている。例えば、特開２０１１−１３０７号公報（特許文献２）は、ＡＬＡと、複数の波長の光を組み合わせて、ＰｐＩＸの蓄積部を判別し、病変部組織を壊死させる方法を提案している。
【０００７】
また、特開２００９−９１３４５号公報（特許文献３）は、その表面に生体親和性高分子を結合した酸化チタンナノ粒子であって、さらにＡＬＡを結合した粒子を開示している。この粒子は、癌患者の体内に投与されると癌組織に効率的に到達して蓄積され、患部に超音波や光を照射することにより癌の診断および治療を可能にする。しかしながら、この特許文献が開示する酸化チタン粒子とＡＬＡは、結合して一体化して用いられることを前提としており、それを分離して用いることの開示または示唆はない。
【０００８】
また、ＷＯ２０１２／１５３４９３号公報（特許文献４）は、ＡＬＡと、ランタニド粒子等の赤外域光にてアップコンバージョンを起こす粒子を組み合わせた、光線力学的治療剤および光線力学的診断剤を開示する。この文献が開示する手法は、深部癌をその対象としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ９１／０１７２７号公報
【特許文献２】特開２０１１−１３０７号公報
【特許文献３】特開２００９−９１３４５号公報
【特許文献４】ＷＯ２０１２／１５３４９３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，６：６４６３（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、今般、蛍光色素と光散乱粒子とを別々に生体内に投与することで、蛍光色素単独で得られる蛍光に比較し、より確実に腫瘍細胞を正常細胞と区別できる強度の蛍光が得られるとの知見を得た。さらに、その蛍光の発光時間は、蛍光色素と光散乱粒子とを別々に生体内に投与することで延長されるとの知見を得た。本発明は、これら知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明は、腫瘍細胞と正常細胞とを、または腫瘍領域と正常領域とを判別する方法、そのために用いられる診断薬および増感剤の提供をその目的としている。さらに、本発明は腫瘍細胞の判別システムの提供をその目的としている。
【００１３】
そして、本発明による腫瘍細胞の判別方法は、腫瘍細胞と正常細胞とを判別する方法であって、
（ａ）  腫瘍選択性を有する蛍光色素を前記腫瘍細胞内に取込ませる工程と、
（ｂ）  光散乱粒子を前記腫瘍細胞表面に吸着させる、および／または前記腫瘍細胞内に取込ませる工程と 、
（ｃ）  前記蛍光色素が前記腫瘍細胞において蛍光を発するタイミングで前記蛍光色素に蛍光を生じる波長の光を前記腫瘍細胞に照射する工程と
を少なくとも含んでなる。
【００１４】
さらに、上記判別方法がｉｎ  ｖｉｖｏで行われる場合、本発明による判別方法は、
前記工程（ａ）が、腫瘍選択性を有する蛍光色素を生体内に投与し、当該蛍光色素を前記腫瘍細胞内に取込ませる工程であり、かつ
前記工程（ｂ）が、光散乱粒子を生体内に投与し、前記腫瘍細胞表面に吸着させる、および／または前記腫瘍細胞内に取込ませる工程とされる。
【００１５】
また、本発明による診断薬は、上記本発明による判別方法に用いるための診断薬であって、腫瘍選択性を有する蛍光色素と、光散乱粒子とを含んでなり、前記蛍光色素と光散乱粒子とが結合されていないものである。
【００１６】
また、本発明による増感剤は、上記本発明による判別方法に用いるための増感剤であって、光散乱粒子を含んでなるものである。
【００１７】
さらに本発明による腫瘍細胞の判別システムは、
（１）腫瘍選択性を有する蛍光色素と、光散乱粒子とを含んでなり、前記蛍光色素と光散乱粒子とが結合されていない診断薬、
（２）腫瘍細胞内に取り込まれた前記蛍光色素と、腫瘍細胞表面に吸着された、および／または腫瘍細胞内に取込まれた前記光散乱粒子と、に対して、前記蛍光色素に蛍光を生じる波長の光を照射可能な光源、および
（３）上記光源により照射された結果、腫瘍細胞において発生した蛍光を観察または検出する光学機器
を備えてなるものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば腫瘍細胞における蛍光色素の発光の増強、およびその時間延長が可能であり、その結果腫瘍識別性の向上を図ることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】共培養システムを模擬した側面図及び平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
判別
本発明が提供する方法は、腫瘍細胞と正常細胞とを判別する方法であり、その一つの態様によれば、ヒトを含む動物の体内において、各種腫瘍の実質を構成する腫瘍細胞を正常細胞から可視光下で判別することを可能にする。ここで、「腫瘍細胞と正常細胞とを判別する」とは、何らかの手段によって、腫瘍細胞を正常細胞と区別し、特定の細胞を腫瘍細胞として判定することを意味する。具体的には、腫瘍細胞において詳細を後記する蛍光色素が発光し、正常細胞において当該色素は発光しない。これにより、発光した領域の細胞を腫瘍細胞として判定し、正常細胞と区別することができる。本発明によれば、蛍光色素は、当該色素単独で投与されたときと比較して、増強され、より明るく発光する。従って、例えば大きく切開せずに行う内視鏡による手術において、内視鏡が有する可視光光源下で、同一視野および／または同一領域にある腫瘍細胞を正常細胞から判別することを可能にする。そして、好ましくは、可視光の内視鏡下で腫瘍領域を切除する外科療法を行うことが出来る。
【００２１】
本発明の腫瘍細胞における蛍光の増強は、蛍光色素と光散乱粒子との個別投与による併用により得られる。酸化チタンに蛍光色素が結合した特開２００９−９１３４５号公報（特許文献３）の態様と比較し、本発明により得られる蛍光は腫瘍細胞で選択的に強く、かつ発光時間が長い。強い発光は、微小な腫瘍をも正常細胞から判別でき、また腫瘍領域と正常領域との境界を明確に示す。例えば、本発明の好ましい態様によれば、１ｍｍ以下の微小な腫瘍を可視化して確実な切除を可能にする。また、上皮内癌のような平坦な癌を可視化して確実な切除を可能にする。さらに、発光時間が長いことが外科的手術に有利なことは明らかである。
【００２２】
本発明おいて、蛍光色素と光散乱粒子は、特開２００９−９１３４５号公報（特許文献３）に記載のような両者が結合された形態をとらない。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、蛍光色素と光散乱粒子との間に一定以上の物理的距離があることで、光源、例えば内視鏡等から照射された照射光と、照射光より光散乱粒子によって生じる散乱光が蛍光色素に効果的に届いて蛍光強度を上げ、次に該蛍光より光散乱粒子の側方または後方へ効果的に散乱することで、照射光が入射してきた方向に該発光が増強され、結果として非常に明るい蛍光観察ができるものと考えられる。本発明は、また、個別投与は、特許文献３と比較して、蛍光色素と光散乱粒子の複合化を必要とせず、また蛍光色素と光散乱粒子の組み合わせの自由度が高まり、汎用性の高い技術となる点でも有利である。
【００２３】
腫瘍細胞
本発明による方法によって判別される腫瘍細胞は、蛍光色素が選択性を有する種類である限り限定されないが、本発明の一つの態様によれば、上皮性腫瘍細胞、非浸潤性の腫瘍細胞、または上皮内癌の実質を構成する腫瘍細胞に好ましく適用される。上皮性腫瘍は、腫瘍の中でも上皮にできる腫瘍であり、癌ステージ初期において表層領域に形成される非浸潤性の腫瘍や上皮内癌を含む。このような腫瘍で、１ｍｍ以下の微小な腫瘍は、正常領域とは区別し難く、見分けにくい腫瘍であり、本発明はこのような腫瘍に有利に適用できる。加えて、上皮内癌は平坦で正常な領域とは区別し難く、見分けにくい癌であり、本発明はこのような癌においても癌の領域を正常領域と区別する場合に有利に適用できる。
【００２４】
本発明の一つの態様によれば、本発明による判別方法が適用される癌としては、膀胱癌、尿路上皮癌、大腸癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、胆道癌、気管支癌、肺癌および脳腫瘍が挙げられる。これら癌は、内視鏡下における手術の対象とされるものであり、これら癌に本発明は有利に適用できる。
【００２５】
蛍光色素
本発明において用いられる「腫瘍選択性を有する蛍光色素」は、まず「腫瘍選択性」を有する。この性質は、腫瘍細胞に結合する性質または集中する特性を意味する。これに加え「腫瘍選択性」の用語は、この色素自体は、腫瘍細胞に結合または集中する性質を有さないが、例えば元の構造は蛍光する性質を有さず、腫瘍細胞における代謝の結果、蛍光構造を獲得する性質を有するものも、つまり腫瘍において選択的に蛍光を発光するような性質も含む意味に用いる。
【００２６】
また本発明において「蛍光色素」も、それ自体、蛍光を発光する性質を有するものは無論、それに加えて上記のように何らかの代謝を受けて蛍光構造を有する至るものも含む意味に用いる。
【００２７】
蛍光色素に発光を与える光は、蛍光を生じる波長を有するものであれば限定されないが、好ましい態様によれば、可視光が、特別な画像化・可視化の手段を用いず腫瘍細胞を判別できることが好ましい。蛍光色素としてＡＬＡを用いる場合は、細胞内で代謝されることで蛍光性のＰｐＩＸに変換され、特に腫瘍細胞において蓄積する。このＰｐＩＸを励起するために照射する光の波長としては、３８０ｎｍ〜４２０ｎｍ、好ましくは４００ｎｍ〜４１０ｎｍ、特に好ましくは４０３ｎｍ〜４０７ｎｍ、最も好ましくは４０５ｎｍが挙げられる。また、蛍光色素に発光を生じさせる光は、蛍光を生じる波長を有するものであれば限定されないが、光散乱粒子によって蛍光色素からの蛍光をより効率的に増強できる波長が好ましい。
【００２８】
照射する光源としては、公知のものを使用することができ、例えば紫色ＬＥＤ、好ましくはフラッシュライト型紫色ＬＥＤや、半導体レーザー等のレーザー光を挙げることができるが、装置がコンパクトになり、コスト面や可搬性において有利である紫色ＬＥＤ、中でもフラッシュライト型紫色ＬＥＤや、紫色半導体ダイオードがより好ましい。
【００２９】
蛍光色素としてＡＬＡを用いる場合に、特に腫瘍細胞において蓄積するＰｐＩＸを検出するために、赤色の蛍光、具体的には６１０ｎｍ〜６５０ｎｍ、好ましくは６２５ｎｍ〜６３８ｎｍの波長の蛍光を検出することで、腫瘍細胞の判別ができる。
【００３０】
本発明の好ましい態様によれば、「腫瘍選択性を有する蛍光色素」の具体例として、５−アミノレブリン酸類、ポルフィリン類、ヒペリシン類、および酵素切断色素からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。より好ましい態様によれば、腫瘍選択性を有する蛍光色素は５−アミノレブリン酸類である。
【００３１】
本発明において、用語「５−アミノレブリン酸類（ＡＬＡ類）」は、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体、またはこれらの塩を含む意味に用いるものとする。ここで、既述のとおりＡＬＡは公知の化合物であり、それ自身は可視光の吸収も弱く光照射で蛍光も活性酸素も発生しない。しかしながら、体内に投与されると光増感物質であるプロトポルフィリンに代謝され、蛍光物質となる。ＡＬＡ類を投与した場合のプロトポルフィリンの蓄積は、がん、異形成、細菌・真菌感染領域、ウイルス感染細胞などの病変部に特異的であり、また、ＡＬＡ類は安全性も高い化合物であるため、本発明において好ましく用いられる。
【００３２】
本発明においてＡＬＡの誘導体は、下記一般式で表すことが出来る；
Ｒ１Ｒ２ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を表し、
Ｒ３は、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を表す）。
【００３３】
従って、ＡＬＡ誘導体の具体例としては、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル、ＡＬＡヘキシルエステル等を挙げることができる。また、ＡＬＡ誘導体として、エステル基とアシル基を有するＡＬＡ誘導体を例示することができる。エステル基とアシル基を有するＡＬＡ誘導体としては、メチルエステル基とホルミル基、メチルエステル基とアセチル基、メチルエステル基とｎ−プロパノイル基、メチルエステル基とｎ−ブタノイル基、エチルエステル基とホルミル基、エチルエステル基とアセチル基、エチルエステル基とｎ−プロパノイル基、エチルエステル基とｎ−ブタノイル基の組み合わせもまた好ましい例として挙げられる。
【００３４】
本発明においてＡＬＡおよびその誘導体は塩の形態であってもよく、薬学的に許容される無機酸または有機酸の酸付加塩が好ましい。無機酸の付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩を挙げることができ、有機酸の付加塩としては、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等を挙げることができる。さらに、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩等も挙げることができる。
【００３５】
本発明の好ましい態様によれば、好ましいＡＬＡ類として、はＡＬＡ、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル、及びこれらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩が挙げられる。
【００３６】
また、本発明において、ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。また、ＡＬＡ類は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産のいずれの方法によっても製造することができる。
【００３７】
光散乱粒子
本発明において用いられる「光散乱粒子」とは、上記した蛍光色素の蛍光を、可視光下において増強するものを意味する。蛍光の増強に関わる光の物理的な現象としては、光の散乱、反射、干渉、屈折、および回折などが挙げられる。この中で光の散乱としては、レイリー散乱やミー散乱等の現象が挙げられるが、特にミー散乱によって上記した蛍光色素の蛍光を、可視光下において増強するものと考えられる。散乱に関わる重要な因子としては、光散乱粒子を構成する物質物性に由来する屈折率が高いことが挙げられる。また、光の波長と同等〜１／１０程度の大きさであることが好ましい。可視光とは一般的に４００ｎｍ〜７００ｎｍの波長域の光のことを示す。
【００３８】
本発明における好ましい態様によれば、光散乱粒子は、酸化チタン、リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、アルミナ、水酸化アルミニウム、シリカ、およびポリスチレン群から選ばれる少なくとも１種の粒子を含んでなり、より好ましくは、腫瘍細胞へ到達しやすく光の散乱効果の高い、低密度かつ光屈折率を有する酸化チタン、ポリスチレンである。さらにこれらの粒子は生体親和性高分子がその表面に結合してなるものが、さらに好ましい。ここで、「表面に結合」とは、生体親和性高分子の少なくとも一部が、好ましくは多座配位結合により、最も好ましくは二座配位結合により、該生体親和性高分子が有する官能基を介して粒子の表面に結合しており、かつ官能基を介しての結合によらず、粒子の表面に吸着している生体親和性高分子が存在していることを許容し、これを包含する意味に用い、あるいは官能基を介して結合している生体親和性高分子に物理的結合（例えば、吸着、絡まりつく等）により粒子の表面に留まる生体親和性高分子が存在していることを許容し、これを包含する意味に用いる。
【００３９】
本発明のより好ましい態様によれば、光散乱粒子は酸化チタンであり、かつ生体親和性高分子が多座配位結合により少なくとも部分的に表面に結合されたものである。
【００４０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明において用いられる光散乱粒子は、動的光散乱法により測定した平均粒子径６０ｎｍ〜４００ｎｍを有するものであり、好ましい下限は７０ｎｍであり、より好ましい下限は８０ｎｍであり、また好ましい上限は３１０ｎｍであり、より好ましい上限は２００ｎｍである。
【００４１】
また、光散乱粒子の表面に少なくとも部分的に結合されている生体親和性高分子の詳細は後記する酸化チタンについて好ましい生体親和性高分子と同様であってよいが、本発明の好ましい態様によれば、生体親和性高分子はポリエチレングリコールである。
【００４２】
本発明の一つの好ましい態様によれば、光散乱粒子は、酸化チタン粒子と、その表面に結合した生体親和性高分子とを備える。一つの態様によれば、酸化チタン粒子と、生体親和性高分子との結合は、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を介して形成される。このような官能基を介した結合は酸化チタンとの間で配位結合を形成するため、酸化チタン粒子が高い触媒活性を備えているにも関わらず、分散性を保持できる。この結合は、体内における安全性の観点から、体内への投与後２４〜７２時間程度の間、結合が確保される多座配位結合であることが、より好ましい。前述した官能基のうち、多座配位結合を形成する官能基は、ジオール基、サリチル酸基、である。多座配位結合であることで、生理条件での分散が安定し、生体親和性高分子の遊離が抑えられ、正常細胞へのダメージが低減される。
【００４３】
本発明の好ましい態様によれば、上記生体親和性高分子は、酸化チタン粒子を水系溶媒中で分散させることができれば特に限定されないが、電荷を有するものとしては、アニオン性またはカチオン性を有する生体親和性高分子、また、電荷を有さずに水和によって分散性を与えるものとしてはノニオン性を有する生体親和性高分子が挙げられ、これらの少なくとも一種を含んでなる。
【００４４】
本発明の好ましい態様によれば、前記生体親和性高分子は重量平均分子量２０００〜１０００００である。生体親和性高分子の重量平均分子量はサイズ排除クロマトグラフィーを用いて求めた値である。前記分子量をこの範囲とすることで、生体親和性高分子のもつ電荷あるいは水和の作用によって、酸化チタン粒子の分散が困難とされる中性付近の水系溶媒中であって酸化チタン粒子を高度に分散させることができる。より好ましい範囲は５０００〜１０００００であり、さらに好ましくは５０００〜４００００である。
【００４５】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる生体親和性高分子としては、アニオン性生体親和性高分子として酸化チタン粒子を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能である。カルボキシル基を有するものとしては、例えばカルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリカルボン酸類、およびカルボキシル基単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、生体親和性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸等のポリカルボン酸類、およびアクリル酸／マレイン酸やアクリル酸／スルフォン酸系モノマーの共重合体（コポリマー）がより好適に使用され、さらに好ましくはポリアクリル酸である。
【００４６】
また、アニオン性生体親和性高分子として、ポリアクリル酸を用いる場合、分散性の観点からポリアクリル酸の重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００であり、さらに好ましくは５０００〜２００００である。その構造は特に限定されないが、直鎖構造、分岐構造、くし型構造などがあげられる。
【００４７】
本発明の好ましい態様によれば、生体親和性高分子は、アミノ基を有するものであってもよく、その具体例としてはポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアミン類、およびアミン単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。さらに生体親和性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミン類がより好適に使用され、さらに好ましくはポリエチレンイミンである。
【００４８】
カチオン性生体親和性高分子として、ポリエチレンイミンを用いる場合、分散性の観点からポリエチレンイミンの重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００であり、さらに好ましくは５０００〜２００００である。その構造は特に限定されないが、直鎖構造、分岐構造、くし型構造などがあげられる。
【００４９】
本発明の別の態様によれば、生体親和性高分子は、ノニオン性生体親和性高分子であり、好ましくは水酸基および／またはポリオキシアルキレン基を有する高分子が挙げられる。そのような生体親和性高分子の具体例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、デキストランあるいはそれらを含有するコポリマーが挙げられ、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストランであり、さらに好ましくはポリエチレングリコールである。
【００５０】
ノニオン性生体親和性高分子として、ポリエチレングリコールを用いる場合、分散性の観点からポリエチレングリコールの重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００である。その構造は特に限定されないが、直鎖構造、分岐構造、くし型構造などがあげられる。
【００５１】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン粒子は、アナターゼ型酸化チタンまたはルチル型酸化チタンおよびアモルファス型酸化チタンであり、最も好ましくはアモルファス型酸化チタンである。本発明の一つの態様によれば、酸化チタン粒子は、溶媒に分散されて分散液の形態とされてなるのが好ましい。
【００５２】
本発明の好ましい態様によれば、光散乱粒子はさらに腫瘍細胞と結合可能な分子を表面に備えてなる。ここで、腫瘍細胞と結合可能な分子とは、腫瘍細胞との結合を促進する分子であれば特に限定されないが、具体例としては、タンパク質、ペプチド、核酸、葉酸、あるいはその他の腫瘍細胞結合性の高分子または低分子が挙げられ、より好ましくはタンパク質、ペプチド、核酸であり、さらに好ましくはタンパク質である。抗体は種々のタンパク質の中で好適に用いられる。また、表面に備えてなる態様については、光散乱粒子と、腫瘍細胞と結合可能な分子とが結合することによる形態を含み、該結合は物理結合であっても化学結合であってもよい。該化学結合においては、例えば光散乱粒子として酸化チタン粒子を用いる場合は、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を介して形成される。このような官能基を介した結合は、酸化チタンと配位結合を形成するため、酸化チタン粒子が高い触媒活性を備えているにも関わらず、腫瘍細胞と結合可能な分子と光散乱粒子との結合が生体内で保持できる。腫瘍細胞と結合可能な分子と光散乱粒子との結合は、体内における安全性の観点から、体内への投与後２４〜７２時間程度の間、結合が確保される多座配位結合であることが、より好ましい。前述した官能基のうち、多座配位結合を形成する官能基は、ジオール基、サリチル酸基、である。多座配位結合であることで、生理条件での分散が安定し、腫瘍細胞と結合可能な分子の遊離が抑えられ、正常細胞へのダメージが低減される。
【００５３】
本発明の好ましい態様によれば、そのようなタンパク質としては、抗上皮成長因子受容体抗体等の抗体、上皮成長因子等の成長因子、レクチン等の糖タンパク質およびそれらの組換え体等が挙げられる。
【００５４】
判別方法
以下、本発明による判別方法の各工程をさらに詳細に説明する。
工程（ａ）
本工程は、腫瘍選択性を有する蛍光色素を腫瘍細胞内に取込ませる工程である。この取込みの工程は、具体的には、蛍光色素と腫瘍細胞とが接触する態様で行われればよい。蛍光色素が、それ自体は蛍光する性質を有さず、腫瘍細胞において代謝等を受けて蛍光構造を有するに至るものである場合、蛍光色素がそのような代謝を受け得る状態で接触すればよい。
【００５５】
本発明の別の態様によれば、判定方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏのみならずｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができ、ｉｎ  ｖｉｖｏの場合、この工程（ａ）は、腫瘍選択性を有する蛍光色素を生体内に投与し、腫瘍細胞に蛍光色素を取込ませる工程とする。ここで、蛍光色素の生体内への投与は、全身性の投与であっても、局所投与であってもよい。本発明の一つの態様によれば、全身性の投与としては、経口投与、静脈注射、動脈注射、腹腔投与、点滴等があげられ、局所投与としては、膀胱内注入、腸内注入、胃注入等を含む、内視鏡やカテーテルもしくは注射器により各領域の腫瘍近傍で注入される投与ルートが考えられる。
【００５６】
工程（ｂ）
本工程は、光散乱粒子を腫瘍細胞表面に吸着させる、および／または腫瘍細胞内に取込ませる工程である。光散乱粒子の吸着および取込みは、蛍光色素の発光を増強する限り限定されず、例えば、光散乱粒子を腫瘍細胞表面に接触させて吸着させ、あるいは浸透させて取り込ませることが出来る。
【００５７】
本発明の別の態様によれば、判定方法をｉｎ  ｖｉｖｏで行う場合、この工程（ｂ）は、光散乱粒子を生体内に投与し、腫瘍細胞表面に吸着させる、および／または腫瘍細胞内に取込ませる工程とする。ここで、光散乱粒子の生体内への投与は、全身性の投与であっても、局所投与であってもよいが、好ましくは体内動態の観点から局所投与である。このような局所投与について限定はされないが、本発明の一つの態様によれば、投与後にすぐ腫瘍に光散乱粒子が直接接触できるような投与ルートが考えられ、例えば膀胱内注入、腸内注入、胃注入等を含む、内視鏡やカテーテルもしくは注射器により各領域の腫瘍近傍で注入される投与ルートが考えられる。
【００５８】
本発明において、工程（ａ）と（ｂ）の順序は、蛍光色素の発光増強の効果が得られる限り問わない。本発明の一つの態様によれば、蛍光色素が、それ自体は蛍光を発光する性質を有さず、腫瘍細胞において代謝等を受けて蛍光構造を有するに至るものである場合、その蛍光構造を獲得するまでに一定の時間を要することがある。この時間を勘案すれば、例えば、工程（ａ）を先に実施し、蛍光色素を腫瘍細胞内に取り込ませた後、工程（ｂ）を実施して光散乱粒子を腫瘍細胞表面に吸着または腫瘍細胞内に取り込ませる順序が効率的であると考えられる。
【００５９】
工程（ｃ）
本工程は、蛍光色素が腫瘍細胞において蛍光を発するタイミングで蛍光色素に蛍光を生じる波長の光を前記腫瘍細胞に照射する工程である。本発明の好ましい態様によれば、蛍光色素に蛍光を生じる波長の光は、可視光である。
【００６０】
上記のとおり、蛍光色素が、それ自体は蛍光する性質を有さず、腫瘍細胞において代謝等を受けて蛍光構造を有するに至るものである場合、その蛍光構造を獲得するまでに一定の時間を要することがある。例えばＡＬＡは、体内に投与されてから光増感物質であるプロトポルフィリンに代謝され、蛍光物質となるまでに２時間以上を要する。本発明にあっては、発光に至る前から光を照射することを排除するものではないが、蛍光を発するタイミングで蛍光色素が蛍光を生じる波長の光を腫瘍細胞に照射することが効率的である。
【００６１】
本工程において光を照射すると腫瘍細胞は蛍光を発光し、正常細胞は蛍光をほとんど発さない。この蛍光の有無、強度差およびその位置によって、腫瘍細胞と正常細胞とを判別する。
【００６２】
蛍光の観察または検出
本発明の一つの態様によれば、光源から照射された光により、腫瘍細胞または腫瘍領域において発生した蛍光は、ヒトの目により観察される。この態様にあって蛍光は、観察画像として提供されるが、この画像は光学機器を通じて得られるのが通常である。具体的には、内視鏡、膣拡大鏡（コルポスコープ）、デジタルカメラ、および蛍光顕微鏡などを通じて得られる画像を、目視で観察する。
【００６３】
また、本発明の別の態様によれば、蛍光または蛍光の特定成分を、機器を通じて検出して、それを観察してもよい。このような蛍光または蛍光の特定成分に対応する情報の観察は、蛍光の有無だけでなく、強度や発生位置を精度よく認識できるため好ましい。このための機器としては、光学機器、例えば光学分光検出器が挙げられる。光学分光検出器を適用すれば、適切な蛍光スペクトルを検出可能となる。蛍光または蛍光の特定成分に対応する情報、例えば蛍光強度を、同一視野または同一領域の異なる検出位置において比較することにより、腫瘍細胞と正常細胞とを、または腫瘍領域と正常領域とを効率よく判別することができる。
【００６４】
さらに、本発明の好ましい態様によれば、上記の目視可能な画像と、上記の機器を通じて検出された蛍光または蛍光の特定成分に対応する情報を組み合わせることで、より有利に腫瘍細胞と正常細胞とを、または腫瘍領域と正常領域とを判別することが出来る。体内における基準位置を決め、蛍光または蛍光の特定成分に対応する情報、例えば相対的な蛍光スペクトルを、目視可能な画像と重ねることで、腫瘍細胞と正常細胞とを、または腫瘍領域と正常領域とを効率よく判別することができる。
【００６５】
本発明の一つの態様によれば、蛍光を観察または検出するための光学機器は、光源から照射された光の方向とは異なる方向からの蛍光を観察または検出されるものであることが、より好ましい。このような光学機器としては、例えば、光ファイバ、レンズ、および光学分光検出器の組み合わせを好適に利用可能である。
【００６６】
本発明の一つの態様によれば、観察または検出の結果を受けて、例えば、腫瘍領域を切除する外科治療を行う。好ましい態様によれば、外科治療を内視鏡下において行う。内視鏡にはその照明としての可視光光源を有するが、この可視光を発光の光源として用いることができ、正確かつ効率的に腫瘍領域を切除することができる点で極めて有利である。
【００６７】
診断薬、増感剤および腫瘍細胞の判定システム
以上から明らかなとおり、本発明の別の態様によれば、本発明による判別方法に用いるための腫瘍細胞診断薬が提供され、この診断薬は、腫瘍選択性を有する蛍光色素と、光散乱粒子と含んでなり、蛍光色素と光散乱粒子とが結合されていないことを特徴とするものである。
【００６８】
また、本発明の別の態様によれば、本発明による判別方法に用いるための腫瘍細胞診断増感剤が提供され、この増感剤は、上記した光散乱粒子を含んでなるものである。ここで、好ましくは光散乱粒子は、酸化チタン、リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、アルミナ、水酸化アルミニウム、シリカ、およびポリスチレン群から選ばれる少なくとも１種であり、かつ生体親和性高分子が二座配位結合により少なくとも部分的に表面に結合されたものであり、より好ましくは、ポリエチレングリコールである。
【００６９】
また、本発明の別の態様によれば、腫瘍細胞の判定システムが提供され、この判定システムは、次の（１）乃至（３）を備えてなる、腫瘍細胞の判別システムである。
（１）腫瘍選択性を有する蛍光色素と、光散乱粒子とを含んでなり、前記蛍光色素と光散乱粒子とが結合されていない診断薬、
（２）腫瘍細胞内に取り込まれた前記蛍光色素と、腫瘍細胞表面に吸着された、および／または腫瘍細胞内に取込まれた前記光散乱粒子と、に対して、前記蛍光色素に蛍光を生じる波長の光を照射可能な光源、および
（３）上記光源により照射された結果、腫瘍細胞において発生した蛍光を観察または検出する光学機器。
【実施例】
【００７０】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７１】
操作１：光散乱粒子（１）の作製
チタンテトラエトキシドをアセトニトリル／エタノール溶液に加えて、０．１ｍｍｏｌ／ｌチタンテトラエトキシド溶液を調製した。この溶液にエタノールおよび０．１ｍｍｏｌ／ｌアンモニア水を混合し、室温で６０分間攪拌して十分に加水分解を行った。このとき、目的の平均粒子径に応じてアンモニア水量を溶液の０．０１〜１ｖ／ｖ％の範囲で４種調節した。加水分解後、８０℃で３時間以上攪拌を行い、加熱還流した。加熱還流により得られた固形成分を回収するため、２００００ｇ、１０分間で遠心分離を行い、メタノールで固形成分約２０ｗ／ｖ％に濃度調整して４種の光散乱粒子（１）（i）〜（iv）の分散液を得た。
【００７２】
４種の光散乱粒子（１）（i）〜（iv）について、超純水を用いて固形成分０．００５ｗ／ｖ％に濃度調整し、動的光散乱測定装置（スペクトリス社製、ゼータサイザーナノＺＳ）を用い、動的光散乱法でキュミュラント解析により平均粒子径を測定した。その結果、平均粒子径はそれぞれ（i）８６．５ｎｍ、（ii）１３３．５ｎｍ、（iii）２０４．４ｎｍ、そして（iv）３３０ｎｍであった。また、ＰＤＩ（多分散度）はそれぞれ、（i）０．０４７、（ii）０．０１７、（iii）０．０１７、そして（iv）０．０１７であった。
【００７３】
操作２：光散乱粒子の表面に分散剤を結合させた粒子（２）の作製
ＰＥＧとしてポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量；３３６５９−日本油脂製）１ｇに超純水５ｍｌを添加し加水分解後得られた溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、超純水を用いてそれぞれ濃度が５０ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍｍｏｌ／ｌとなるように混合し調製した。調製した溶液に４−アミノサリチル酸（富士フイルム和光純薬工業）を濃度０．１Ｍになるよう混合し、室温にて２４時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液をスペクトラ／ポア  ＣＥ  透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移し、室温で２４時間透析を行った。透析後、凍結乾燥して得られた粉末に２５ｍｇ／ｍｌとなるようジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：富士フイルム和光純薬工業）を添加して混合し、４−アミノサリチル酸結合ＰＥＧ溶液とした。
【００７４】
次にＤＭＦを用いて４−アミノサリチル酸結合ＰＥＧ溶液が終濃度１．５ｍｇ／ｍｌ、操作１で得られた平均粒子径の異なる粒子（１）（i）〜（iv）が終濃度で固形成分０．５ｗ／ｖ％となるよう調整し、２０ｍｌの反応溶液とした。この反応溶液を１３０℃で１６時間加熱した。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを完全に乾燥するまで除去した。以後、クリーンベンチ内で無菌操作とし、滅菌済み超純水を添加して混合した光散乱粒子溶液を滅菌済みの５０ｍｌチューブに移した後、２００００ｇ、１０分間で遠心分離を行い、溶液の９０ｖ／ｖ％を除去して滅菌済み超純水に交換する操作を８回繰り返した。最終的に終濃度で固形成分１．０ｗ／ｖ％となるよう調整し、１０ｍｌの溶液とした。このようにして得られた、生体親和性高分子を結合させた光散乱粒子（２）（i）〜（iv）を作製した。
【００７５】
生体親和性高分子を結合させた光散乱粒子（２）（i）〜（iv）について、操作１と同様にキュミュラント解析により平均粒子径を測定した。その結果、平均粒子径はそれぞれ粒子（１）（i）（平均粒子径８６．５ｎｍ）から作製した光散乱粒子（２）（i）：８３．３ｎｍ、（ii）（平均粒子径１３３．５ｎｍ）から作製した光散乱粒子（２）（ii）：１２９ｎｍ、（iii）（平均粒子径２０４．４ｎｍ）から作製した光散乱粒子（２）（iii）：１９８．６ｎｍ、そして（iv）（平均粒子径３３０ｎｍ）から作製した光散乱粒子（２）（iv）：３０４．４ｎｍ、であった。また、ＰＤＩ（多分散度）はそれぞれ、（i）０．０４３、（ii）０．０１９、（iii）０．００８、そして（iv）０．０１９であった。
【００７６】
操作３：腫瘍細胞および不死化正常細胞の準備
細胞の培養はすべて、ＣＯ２インキュベータ（パナソニック  ＭＣＯ−２３０ＡＩＣＵＶ−ＰＪ）を用い、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２、加湿条件下で行った。また、遠心分離はすべて、卓上遠心機（ＫＯＫＵＳＡＮ  Ｈ−３６）を用いて、２２０×ｇ、６分間の条件で行った。
【００７７】
（１）腫瘍細胞（Ｔ２４、ヒト膀胱癌細胞株）の準備
Ｔ２４細胞（Ｔ２４、ＪＣＲＢ０７１１）を準備した。この細胞株をＭＥＭ培地（ＭＥＭ，  ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で継代培養した。３日、あるいは４日後に対数増殖期になった前記培養細胞を、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で剥離し、ＭＥＭ培地で反応を停止後、遠心分離した。この細胞ペレットをＭＥＭ培地で懸濁した。細胞懸濁液は細胞密度を測定し、６ウェルプレートに３．６×１０４  ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ウェルにて播種し３日間培養した。
【００７８】
（２）腫瘍細胞（ＵＭ−ＵＣ−３、ヒト膀胱癌細胞株）の準備
ＵＭ−ＵＣ−３細胞（ＵＭＵＣ３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７４９）を準備した。この細胞株をＥ−ＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ）、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で継代培養した。３日、あるいは４日後に対数増殖期になった前記培養細胞を、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で剥離し、Ｅ−ＭＥＭ培地で反応を停止後、遠心分離した。この細胞ペレットをＥ−ＭＥＭ培地で懸濁した。細胞懸濁液は細胞密度を測定し、６ウェルプレートに３．６×１０４  ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ウェルにて播種し、３日間培養した。
【００７９】
（３）腫瘍細胞（ＤＬＤ−１、ヒト大腸癌細胞株）の準備
ＤＬＤ−１細胞（ＤＬＤ−１、ＪＣＲＢ９０９４）を準備した。この細胞株をＲＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭＩ−１６４０  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で継代培養した。３日、あるいは４日後に対数増殖期になった前記培養細胞を、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で剥離し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で反応を停止後、遠心分離した。この細胞ペレットをＲＰＭＩ−１６４０培地で懸濁した。細胞懸濁液は細胞密度を測定し、６ウェルプレートに２．９×１０５  ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ウェルにて播種し、１日間培養した。
【００８０】
（２）不死化正常細胞（ＷＩ−３８、ＶＡ１３  ｓｕｂ  ２  ＲＡ、ヒト胎児肺細胞株）の準備
正常二倍体線維芽細胞株ＷＩ−３８の不死化細胞株ＷＩ−３８細胞（ＷＩ−３８  ＶＡ１３  ｓｕｂ  ２  ＲＡ、ＪＣＲＢ９０５７）を準備した。この細胞株をＭＥＭ培地（ＭＥＭ，  ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で継代培養した。３日、あるいは４日後に対数増殖期になった前記培養細胞を、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で剥離し、ＭＥＭ培地で反応を停止後、遠心分離した。この細胞ペレットをＭＥＭ培地で懸濁した。細胞懸濁液は細胞密度を測定し、６ウェルプレートに５．０×１０４  ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ウェルにて播種し、３日間培養した
【００８１】
操作４：蛍光色素と光散乱粒子（２）（ii）の個別投与によるＴ２４膀胱癌細胞における蛍光の増強効果
ＡＬＡ水溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）をＭＥＭ培地（ＭＥＭ，  ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に混和し、２ｍｍｏｌ／ｌのＡＬＡ溶液とした。また、光散乱粒子（２）（ii）の水溶液をＭＥＭ培地に混和し、０．００１ｗ／ｖ％の光散乱粒子溶液とした。
【００８２】
評価は次のように行った。操作３で得られた６ウェルプレートのＴ２４細胞の培地をアスピレータにて除去し、ＰＢＳ（−）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２ｍｌ加えた。再びアスピレータにてＰＢＳ（−）を除去し、ＡＬＡ溶液を２ｍｌ加え２時間培養した。次に、６ウェルプレートのＡＬＡ溶液をアスピレータにて除去し、光散乱粒子溶液を２ｍｌ加え２時間培養した。さらに、６ウェルプレートの粒子溶液をアスピレータにて除去し、ＨＢＳＳ（−）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２ｍｌ加えて洗浄し、再びアスピレータにて除去し、ＨＢＳＳ（−）を２ｍｌ加えて蛍光の観察および検出に用いた。
【００８３】
観察および検出は倒立型蛍光顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ−Ｅ、Ｎｉｋｏｎ）を用いて行った。ハロゲン光源ランプと４５０ｎｍのダイクロイックミラーを用いて、励起光を半値幅２５ｎｍ、４１０ｎｍのバンドパスフィルタを通して照射し、蛍光を６００ｎｍのロングパスフィルタを通した。接眼レンズは１０倍、また対物レンズは２０倍、開口数０．７５のものを使用した。照射絞りはＮＤ＝８、露光時間は４００ｍｓ、ゲインは１４．０ｘにそれぞれ設定した。蛍光像は冷却ＣＣＤカラーカメラ（ＤＳ−Ｆｉ３、Ｎｉｋｏｎ）によりデジタル画像として取得した。取得された画像から、画像解析装置ＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲ  ｖｅｒ．４．６０（Ｎｉｋｏｎ）により、ダークノイズ分の輝度を減算した後、蛍光が取得される全画素の平均輝度をもとめ、蛍光強度を計算することで蛍光を検出した。また、取得された画像を目視で観察した。
【００８４】
相対蛍光強度は上記で取得された蛍光強度を用いて次式を用いて算出した。
［相対蛍光強度］＝［各条件での蛍光強度］／［蛍光色素のみ投与の場合における観察光照射直後の蛍光強度］
【００８５】
結果は表１に示されるとおりであった。
【表１】
2019018007.tif 000002
【００８６】
表１より明らかなように、蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与の場合では、観察光照射直後において蛍光色素のみ投与の場合よりも非常に高い相対蛍光強度が得られた。また、観察光照射後１５０秒においても同様に蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与の場合の方が高い相対蛍光強度が得られた。このような高い相対蛍光強度は、蛍光色素とは別に投与された光散乱粒子（２）（ｉｉ）により可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。また、観察の結果からも、光散乱粒子ありの方が、明らかに長い時間明るさを維持できることが確認できた。
【００８７】
以上から、本発明において蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）を個別投与で用いることで、従来の蛍光色素のみより蛍光が増強されて、より明るく長い時間においてＴ２４膀胱癌細胞を判別できることが明らかとなった。
【００８８】
操作５：蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与によるＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞における蛍光の増強効果
ＡＬＡ水溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）をＥ−ＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ））に混和し、２ｍｍｏｌ／ｌのＡＬＡ溶液とした。また、光散乱粒子（２）（ｉｉ）の水溶液（１ｗ／ｖ％）をＥ−ＭＥＭ培地に混和し、０．００１ｗ／ｖ％の光散乱粒子溶液とした。
【００８９】
評価は次のように行った。操作３で得られた６ウェルプレートのＵＭ−ＵＣ−３細胞の培地をアスピレータにて除去し、操作４のＰＢＳ（−）をＥ−ＭＥＭ培地に、ＨＢＳＳ（−）をＭＥＭ培地（ｎｏ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｎｏ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に変更した条件で評価を行い、蛍光検出に用いた。
【００９０】
検出は操作４と同様に倒立型蛍光顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ−Ｅ、Ｎｉｋｏｎ）を用いて行い、取得された画像から、ダークノイズ分の輝度を減算した後、蛍光が取得される細胞の単位面積あたりの平均輝度をもとめ、蛍光強度を計算した。相対蛍光強度は上記で取得された蛍光強度を用いて次式を用いて算出した。
［相対蛍光強度］＝［各条件での単位面積あたりの蛍光強度］／［蛍光色素のみ投与の場合における単位面積当たりの蛍光強度］
【００９１】
結果は表２に示されるとおりであった。
【表２】
2019018007.tif 000003
【００９２】
表２より明らかなように、蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与の場合では、観察光照射直後において蛍光色素のみ投与の場合よりも非常に高い相対蛍光強度が得られた。これは、別に投与された光散乱粒子（２）（ｉｉ）により可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。以上から、本発明において蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）を個別投与で用いることで、従来の蛍光色素のみより蛍光が増強されて、より明るくＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞を判別できることが明らかとなった。
【００９３】
操作６：蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与によるＤＬＤ−１大腸癌細胞おける蛍光の増強効果
ＡＬＡ水溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）をＲＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭＩ−１６４０  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に混和し、２ｍｍｏｌ／ｌのＡＬＡ溶液とした。また、光散乱粒子（２）（ｉｉ）の水溶液をＲＰＭＩ−１６４０培地に混和し、０．００１ｗ／ｖ％の光散乱粒子溶液とした。
【００９４】
評価は次のように行った。操作３で得られた６ウェルプレートのＤＬＤ−１細胞の培地をアスピレータにて除去し、操作４のＰＢＳ（−）をＲＰＭＩ−１６４０培地に、ＨＢＳＳ（−）をＲＰＭＩ−１６４０培地（ｎｏ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｎｏ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に変更した条件で評価を行い、蛍光の検出に用いた。
【００９５】
検出は操作５と同様に倒立型蛍光顕微鏡を用い、取得された画像から蛍光強度を求め、相対蛍光強度を算出した。
【００９６】
結果は表３に示されるとおりであった。
【表３】
2019018007.tif 000004
【００９７】
表３より明らかなように、蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与の場合では、観察光照射直後において蛍光色素のみ投与の場合よりも非常に高い相対蛍光強度が得られた。これは、別に投与された光散乱粒子（２）（ｉｉ）により可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。以上から、本発明において蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）を個別投与で用いることで、従来の蛍光色素のみより蛍光が増強されて、より明るくＤＬＤ−１大腸癌細胞を判別できることが明らかとなった。
【００９８】
操作７：蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｖ）の個別投与によるＴ２４膀胱癌細胞における蛍光の増強効果
ＡＬＡ水溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）をＭＥＭ培地（ＭＥＭ，  ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に混和し、２ｍｍｏｌ／ｌのＡＬＡ溶液とした。また、光散乱粒子（２）（ｉｖ）の水溶液をＭＥＭ培地に混和し、０．０１、０．１および０．５ｗ／ｖ％の光散乱粒子溶液とした。
【００９９】
操作３で得られたウェルプレートのＴ２４細胞の培地をアスピレータにて除去し、操作４と同様の条件で評価を行い、蛍光を検出し、相対蛍光強度を算出した。
【０１００】
結果は表４に示されるとおりであった。
【表４】
2019018007.tif 000005
【０１０１】
表４より明らかなように、蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｖ）の個別投与の場合では、特に光散乱粒子濃度０．１ｗ／ｖ％の際に、観察光照射直後において蛍光色素のみ投与の場合よりも非常に高い相対蛍光強度が得られた。このような高い相対蛍光強度は、蛍光色素とは別に投与された光散乱粒子（２）（ｉｖ）により可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。以上から、本発明において蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｖ）を個別投与で用いることで、従来の蛍光色素のみより蛍光が増強されて、より明るくＴ２４膀胱癌細胞を判別できることが明らかとなった。
【０１０２】
操作８：蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の同時投与によるＴ２４膀胱癌細胞における蛍光の増強効果
ＡＬＡ水溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）をＭＥＭ培地に混和（ＭＥＭ，  ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））し、４ｍｍｏｌ／ｌのＡＬＡ溶液とした。また、光散乱粒子（２）（ｉｉ）の水溶液をＭＥＭ培地に混和し、０．００１、０．００２および０．０２ｗ／ｖ％の光散乱粒子溶液とした。
【０１０３】
評価は次のように行った。操作３で得られた６ウェルプレートのＴ２４細胞の培地をアスピレータにて除去し、ＰＢＳ（−）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２ｍｌ加えた。再びアスピレータにてＰＢＳ（−）を除去し、ＡＬＡ溶液１ｍｌと光散乱粒子溶液１ｍｌを混合した２ｍｌ混合溶液を加え３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２の条件で２時間培養した。次に、６ウェルプレートの細胞の混合溶液をアスピレータにて除去し、ＨＢＳＳ（−）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２ｍｌ加えて洗浄し、再びアスピレータにて除去し、ＨＢＳＳ（−）を２ｍｌ加えて検出に用いた。
【０１０４】
検出は操作４と同様に倒立型蛍光顕微鏡を用い、取得された画像から蛍光強度を求め、相対蛍光強度を算出した。
【０１０５】
結果は表５に示されるとおりであった。
【表５】
2019018007.tif 000006
【０１０６】
表５より明らかなように、蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の同時投与の場合では、特に光散乱粒子濃度０．０００５（ｗ／ｖ）％の際に、観察光照射直後において蛍光色素のみ投与の場合よりも非常に高い相対蛍光強度が得られた。このような高い相対蛍光強度は、蛍光色素とは別に投与された光散乱粒子（２）（ｉｉ）により可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。
【０１０７】
以上から、本発明において蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）を同時投与で用いることで、従来の蛍光色素のみより蛍光が増強されて、より明るくＴ２４膀胱癌細胞を判別できることが明らかとなった。
【０１０８】
操作９：蛍光色素（ヒペリシン）と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与によるＴ２４膀胱癌細胞における蛍光の増強効果
ジメチルスルホキシド（富士フイルム和光純薬工業）を溶媒としたヒペリシン（富士フイルム和光純薬工業）溶液（１００ｍｍｏｌ／ｌ）をＭＥＭ培地（ＭＥＭ，  ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に混和し、１μｍｏｌ／ｌのヒペリシン溶液とした。また、光散乱粒子（２）（ｉｉ）の水溶液をＭＥＭ培地に混和し、０．００１ｗ／ｖ％の光散乱粒子溶液とした。
【０１０９】
評価は次のように行った。操作３で得られた６ウェルプレートのＴ２４細胞の培地をアスピレータにて除去し、ＭＥＭ培地を２ｍｌ加えた。再びアスピレータにてＭＥＭ培地を除去し、ヒペリシン溶液を２ｍｌ加え３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２の条件で１時間培養した。次に、６ウェルプレートの細胞のヒペリシン溶液をアスピレータにて除去し、光散乱粒子溶液を２ｍｌ加え３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２の条件で２時間培養した。さらに、６ウェルプレートの細胞の光散乱粒子溶液をアスピレータにて除去し、ＭＥＭ培地（ｎｏ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｎｏ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を２ｍｌ加えて洗浄し、再びアスピレータにて除去し、ＭＥＭ培地を２ｍｌ加えて検出に用いた。
【０１１０】
検出は操作５と同様に倒立型蛍光顕微鏡を用い、取得された画像から蛍光強度を求め、相対蛍光強度を算出した。
【０１１１】
結果は表６に示されるとおりであった。
【表６】
2019018007.tif 000007
【０１１２】
表６より明らかなように、蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与の場合では、観察光照射直後においてヒペリシンのみ投与の場合よりも非常に高い相対蛍光強度が得られた。これは、別に投与された光散乱粒子（２）（ｉｉ）により可視光散乱が強められ、ヒペリシンから発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。以上から、本発明においてヒペリシンと光散乱粒子（２）（ｉｉ）を個別投与で用いることで、従来のヒペリシンのみより蛍光が増強されて、より明るくＴ２４膀胱癌細胞を判別できることが明らかとなった。
【０１１３】
操作１０：蛍光色素と光散乱粒子（２）（ii）の個別投与によるＴ２４癌細胞及びＷＩ−３８不死化正常細胞判別の効果
ＡＬＡ水溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）をＭＥＭ培地（ＭＥＭ，  ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に混和し、２ｍｍｏｌ／ｌのＡＬＡ溶液とした。また、光散乱粒子（２）（ii）の水溶液をＭＥＭ培地に混和し、０．００１ｗ／ｖ％の光散乱粒子溶液とした。
【０１１４】
操作３で得られた６ウェルプレートのＴ２４細胞およびＷＩ−３８細胞の培地をぞれぞれアスピレータにて除去し、操作４と同様に、検出を行い、相対蛍光強度を算出した。
【０１１５】
結果は表７に示されるとおりであった。
【表７】
2019018007.tif 000008
【０１１６】
表７より明らかなように、蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与の場合では、Ｔ２４細胞株においてＷＩ−３８細胞株よりも非常に高い相対蛍光強度が得られた。また、すべての条件において、蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与の場合で、Ｔ２４細胞株を用いた際に最も高い相対蛍光強度が得られた。このような高い相対蛍光強度は、蛍光色素とは別に投与された光散乱粒子（２）（ｉｉ）により可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。さらに蛍光色素の癌選択性と、腫瘍細胞および不死化正常細胞における粒子の細胞取込み性の違いによって、Ｔ２４細胞株を用いた際に最も高い相対蛍光強度が得られたものと考えられる。
【０１１７】
以上から、本発明において蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）を個別投与で用いることで、従来の蛍光色素のみより蛍光が増強されて、不死化正常細胞よりも明るくＴ２４膀胱癌細胞を判別できることが明らかとなった。
【０１１８】
操作１１：蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与による、同一視野にＴ２４膀胱癌細胞及びＷＩ−３８不死化正常細胞が存在する場合の判別の効果
図１を用いて、本実施例に係る、同一視野に腫瘍細胞と不死化正常細胞を存在させるための共培養について説明する。共培養には、ＣｙｔｐＳｅｌｅｃｔ  ＴＭ  ２４−ｗｅｌｌｌ  細胞共培養システム（コスモ・バイオ製）１を用いた。Ｔ２４細胞株をＭＥＭ培地（ＭＥＭ，ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で継代培養した。３日、あるいは４日後に対数増殖期になった前記培養細胞を、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で剥離し、ＭＥＭ培地で反応を停止後、遠心分離した。この細胞ペレットをＭＥＭ培地で懸濁した。細胞懸濁液は細胞密度を測定し、細胞フリーな領域を作成するための直径８ｍｍインサート２を入れたウェルに４．４×１０４  ｃｅｌｌｓ／０．２２５ｍｌ／ウェルにて播種し、２日間培養してインサート２の周りの領域３にモノレイヤーを形成させた。
【０１１９】
ＷＩ−３８細胞をＭＥＭ培地で継代培養した。３日、あるいは４日後に対数増殖期になった前記培養細胞を、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で剥離し、ＭＥＭ培地で反応を停止後、遠心分離した。この細胞ペレットをＭＥＭ培地で懸濁した。細胞懸濁液は細胞密度を測定し、インサート２を除いたウェル１に１．０×１０５  ｃｅｌｌｓ／０．５ｍｌ／ウェルにて播種し、１日間培養した。
【０１２０】
ＡＬＡ水溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）をＭＥＭ培地（ＭＥＭ，  ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に混和し、２ｍｍｏｌ／ｌのＡＬＡ溶液とした。また、光散乱粒子（２）（ｉｉ）の水溶液をＭＥＭ培地に混和し、０．００１ｗ／ｖ％の光散乱粒子溶液とした。
【０１２１】
評価は次のように行った。前記共培養プレートの培地をアスピレータにて除去し、ＭＥＭ培地を０．５ｍｌ加えた。再びアスピレータにてＭＥＭ培地を除去し、ＡＬＡ溶液を０．５ｍｌ加え２時間培養した。次に、共培養プレートのＡＬＡ溶液をアスピレータにて除去し、光散乱粒子溶液を０．５ｍｌ加え２時間培養した。さらに、共培養プレートの細胞の粒子溶液をアスピレータにて除去し、ＭＥＭ培地（ｎｏ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｎｏ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を０．５ｍｌ加えて洗浄し、再びアスピレータにて除去し、ＭＥＭ培地を０．５ｍｌ加えて検出に用いた。
【０１２２】
検出は操作４と同様に倒立型蛍光顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ−Ｅ、Ｎｉｋｏｎ）を用いて行い、視野領域が横３３００μｍ×縦２２００μｍの大きさの画像を取得し、操作５と同様に相対蛍光強度を算出した。
【０１２３】
結果は表８に示されるとおりであった。
【表８】
2019018007.tif 000009
【０１２４】
表８から明らかなように、蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与の場合では、ＷＩ−３８細胞株とＴ２４細胞株の相対蛍光強度の差が大きく得られた。これは、蛍光色素とは別に個別投与された光散乱粒子（２）（ｉｉ）により可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。
【０１２５】
以上から、同一平面上に不死化正常細胞と腫瘍細胞が存在する場合に、本発明において蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）を個別投与で用いることで、従来の蛍光色素のみより蛍光が増強されて、不死化正常細胞と腫瘍細胞の蛍光値の差がより大きくなることで判別し、腫瘍細胞の領域を確実に判定できることが明らかとなった。
【０１２６】
操作１２：蛍光色素と光散乱粒子（シリカ粒子）の個別投与によるＴ２４膀胱癌細胞における蛍光の増強効果
ＡＬＡ水溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）をＭＥＭ培地（ＭＥＭ，  ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に混和し、２ｍｍｏｌ／ｌのＡＬＡ溶液とした。また、粒子径１００ｎｍのシリカ粒子（ｓｉｃａｓｔａｒ、Ｓｉｌｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ、Ｐｌａｉｎ、２５ｍｇ／ｍｌ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ製）の水溶液をＭＥＭ培地に混和し、０．０１ｗ／ｖ％のシリカ粒子溶液とした。
【０１２７】
評価は、操作３で得られた６ウェルプレートのＴ２４細胞の培地をアスピレータにて除去し、操作４のＰＢＳ（−）をＭＥＭ培地に、ＨＢＳＳ（−）をＭＥＭ培地（ｎｏ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｎｏ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に、それぞれ変更した条件で行い、蛍光検出に用いた。
【０１２８】
検出は操作５と同様に倒立型蛍光顕微鏡を用い、取得された画像から蛍光強度を求め、相対蛍光強度を算出した。
【０１２９】
結果は表９に示されるとおりであった。
【表９】
2019018007.tif 000010
【０１３０】
表９より明らかなように、観察光照射直後において蛍光色素のみ投与の場合よりも非常に高い相対蛍光強度が得られた。これは、別に投与されたシリカ粒子により可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。以上から、本発明において蛍光色素とシリカ粒子を個別投与で用いることで、従来の蛍光色素のみより蛍光が増強されて、より明るくＴ２４膀胱癌細胞を判別できることが明らかとなった。
【０１３１】
操作１３：蛍光色素と光散乱粒子（ポリスチレン粒子）の個別投与によるＴ２４膀胱癌細胞における蛍光の増強効果
ＡＬＡ水溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）をＭＥＭ培地（ＭＥＭ，  ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に混和し、２ｍｍｏｌ／ｌのＡＬＡ溶液とした。また、粒子径１００ｎｍのポリスチレン粒子（Ｐｏｌｙｂｅａｄ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ２．５％Ｓｏｌｉｄ−Ｌａｔｅｘ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ製）の水溶液をＭＥＭ培地に混和し、０．０１ｗ／ｖ％のポリスチレン粒子溶液とした。
【０１３２】
操作３で得られた６ウェルプレートのＴ２４細胞の培地をアスピレータにて除去し、操作１２と同様の条件で評価を行い、蛍光検出および相対蛍光強度を算出した。
【０１３３】
結果は表１０に示されるとおりであった。
【表１０】
2019018007.tif 000011
【０１３４】
表１０より明らかなように、観察光照射直後において蛍光色素のみ投与の場合よりも非常に高い相対蛍光強度が得られた。これは、別に投与されたポリスチレン粒子により可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。以上から、本発明において蛍光色素とポリスチレン粒子を個別投与で用いることで、従来の蛍光色素のみより蛍光が増強されて、より明るくＴ２４膀胱癌細胞を判別できることが明らかとなった。
【０１３５】
操作１４：腫瘍細胞と結合可能な分子（抗体）を表面に備えた光散乱粒子の作製とその蛍光の増強効果
操作２で得られた、光散乱粒子（２）（ｉｉ）が固形成分０．５％となるよう５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で調整した。さらに、マウス抗ヒト上皮成長因子受容体モノクローナル抗体（Ａｂ−２（Ｃｌｏｎｅ２２５）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）が終濃度５０μｇ／ｍｌとなるよう混合して、４℃にて２４時間振とう撹拌して光散乱粒子（２）（ｉｉ）表面に抗体を物理的に吸着させた。その後、１５０００ｇ、３０分間で遠心分離を行い、溶液の９０％を除去して超純水に交換する操作を３回繰り返した。氷冷下で超音波分散を繰り返し、マウス抗ヒト上皮成長因子受容体モノクローナル抗体を表面に物理的に吸着させた光散乱粒子（２）（ｉｉ）を得た。このように操作２で得られた光散乱粒子（２）（ｉｉ）をもとにして作製した光散乱粒子（２）（ｖ）について、超純水を用いて固形成分０．０１％に濃度調整し、操作１と同様にキュミュラント解析により平均粒子径を測定した結果、光散乱粒子（２）（ｖ）の平均粒子径は１１５ｎｍであった。
【０１３６】
ＡＬＡ水溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）をＭＥＭ培地（ＭＥＭ，  ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に混和し、２ｍｍｏｌ／ｌのＡＬＡ溶液とした。また、光散乱粒子（２）（ｖ）の水溶液（１ｗ／ｖ％）をＭＥＭ培地に混和し、０．００１ｗ／ｖ％の光散乱粒子溶液とした。
【０１３７】
操作３で得られた６ウェルプレートのＴ２４細胞の培地をアスピレータにて除去し、操作１２と同様の条件で評価を行い、蛍光検出および相対蛍光強度を算出した。
【０１３８】
結果は表１１に示されるとおりであった。
【表１１】
2019018007.tif 000012
【０１３９】
表１１より明らかなように、観察光照射直後において蛍光色素のみ投与の場合かつ蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与の場合よりも非常に高い相対蛍光強度が得られた。これは、個別投与された光散乱粒子（２）（ｖ）が腫瘍細胞と結合可能な分子を表面に備えたことから、光散乱粒子（２）（ｖ）の、腫瘍細胞表面への吸着および／または腫瘍細胞への取り込みが促進されたため、可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。以上から、本発明において蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｖ）を個別投与で用いることで、従来の蛍光色素のみおよび蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与の場合より蛍光が増強されて、より明るくＴ２４膀胱癌細胞を判別できることが明らかとなった。
【０１４０】
操作１５：腫瘍細胞と結合可能な分子（ヒト上皮成長因子）を表面に備えた光散乱粒子の作製とその蛍光の増強効果
操作２で得られた、光散乱粒子（２）（ｉｉ）が固形成分０．５％となるよう５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ５．５）で調整した。さらに、ヒト上皮成長因子ｒｈＥＧＦ（Ａｎｉｍａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ−ｆｒｅｅ、富士フイルム和光純薬製）が終濃度５０μｇ／ｍｌとなるよう混合して、４℃にて２４時間振とう撹拌してｒｈＥＧＦを光散乱粒子（２）（ｉｉ）の表面に備えた。その後、１５０００ｇ、３０分間で遠心分離を行い、溶液の９０％を除去して超純水に交換する操作を３回繰り返した。氷冷下で超音波分散を繰り返し、ｒｈＥＧＦを表面に備えた光散乱粒子（２）（ｉｉ）を得た。このように操作２で得られた粒子（２）（ｉｉ）をもとにして作製した光散乱粒子（２）（ｖｉ）について、超純水を用いて固形成分０．０１％に濃度調整し、操作１と同様にキュミュラント解析により平均粒子径を測定した結果、光散乱粒子（２）（ｖｉ）の平均粒子径は１０２ｎｍであった。
【０１４１】
ＡＬＡ水溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）をＭＥＭ培地（ＭＥＭ，  ＧｌｕｔａＭＡＸｔｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に混和し、２ｍｍｏｌ／ｌのＡＬＡ溶液とした。また、光散乱粒子（２）（ｖｉ）の水溶液（１ｗ／ｖ％）をＭＥＭ培地に混和し、０．００１ｗ／ｖ％の粒子溶液とした。
【０１４２】
操作３で得られた６ウェルプレートのＴ２４細胞の培地をアスピレータにて除去し、操作１２と同様の条件で評価を行い、蛍光検出および相対蛍光強度を算出した。
【０１４３】
結果は表１２に示されるとおりであった。
【表１２】
2019018007.tif 000013
【０１４４】
表１２より明らかなように、観察光照射直後において蛍光色素のみ投与の場合かつ蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与の場合よりも非常に高い相対蛍光強度が得られた。これは、個別投与された光散乱粒子（２）（ｖｉ）が腫瘍細胞と結合可能な分子を表面に備えたことから、光散乱粒子（２）（ｖｉ）の、腫瘍細胞表面への吸着および／または腫瘍細胞への取り込みが促進されたため、可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。以上から、本発明において蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｖｉ）を個別投与で用いることで、従来の蛍光色素のみおよび蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）の個別投与の場合より蛍光が増強されて、より明るくＴ２４膀胱癌細胞を判別できることが明らかとなった。
【０１４５】
操作１６：光散乱粒子の表面に生体親和性高分子を結合させた粒子（３）の作製
ＰＥＧとしてモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルのうち、（ｉ）平均分子量１００００（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−１００ＧＳ、日本油脂製）、（ｉｉ）平均分子量２００００（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＧＳ、日本油脂製）、（ｉｉｉ）平均分子量４００００（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−４００ＧＳ、日本油脂製）をそれぞれジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：富士フイルム和光純薬工業）に添加して混合し、それぞれＰＥＧ溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）を調製した。また、ドーパミン塩酸塩（富士フイルム和光純薬工業）をＤＭＦに溶解し、ドーパミン塩酸塩溶液とした。次に、１０ｖ／ｖ％のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（富士フイルム和光純薬工業）を含むＤＭＦ溶媒中で、終濃度４ｍＭとなるようドーパミン塩酸塩溶液と、終濃度４０ｇ／ｌのＰＥＧ溶液（ｉ）または終濃度８０ｇ／ｌのＰＥＧ溶液（ｉｉ）、もしくは終濃度１６０ｇ／ｌのＰＥＧ溶液（ｉｉｉ）となるよう各ＰＥＧ溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）をそれぞれ混合し、３０℃にて３時間撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液をドーパミン結合ＰＥＧ溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）とした。ドーパミン結合率は、Ｃ１８カラムと電気化学検出器を具備した疎水性クロマトグラフィーシステム（ＨＴＥＣ−５００、エイコム社）を用いて、メーカーより指定のドーパミン検出条件に従い、０．１Ｎ塩酸水溶液で希釈したドーパミン結合ＰＥＧ溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）中のドーパミン量を測定し、反応前後のドーパミン量の変化から反応前を０％とした時のドーパミン結合率を算出した結果、それぞれドーパミン結合ＰＥＧ溶液（ｉ）のドーパミン結合率９３％、ドーパミン結合ＰＥＧ溶液（ｉｉ）のドーパミン結合率９２％、ドーパミン結合ＰＥＧ溶液（ｉｉｉ）のドーパミン結合率９０％であり、十分にドーパミンがＰＥＧと結合していることが確認された。
【０１４６】
次にＤＭＦを用いてドーパミン結合ＰＥＧ溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）が終濃度１．５ｍｇ／ｍｌ、操作１で得られた平均粒子径１３３．５ｎｍの光散乱粒子（１）（ｉｉ）が終濃度で固形成分０．５ｗ／ｖ％となるよう調整し、操作２と同様に反応及び調整し、１０ｍｌの溶液とした。このようにして得られた、生体親和性高分子を結合させた光散乱粒子（３）（ｉ）〜（ｉｉｉ）を作製した。
【０１４７】
生体親和性高分子を結合させた光散乱粒子（３）（ｉ）〜（ｉｉｉ）について、超純水を用いて固形成分０．００５ｗ／ｖ％に濃度調整し、操作２と同様にキュミュラント解析により平均粒子径を測定した。その結果、平均粒子径はそれぞれドーパミン結合ＰＥＧ溶液（ｉ）を用いて作製した生体親和性高分子を結合させた光散乱粒子（３）（ｉ）：１４２．９ｎｍ、ドーパミン結合ＰＥＧ溶液（ｉｉ）を用いて作製した生体親和性高分子を結合させた光散乱粒子（３）（ｉｉ）：１４９．４ｎｍ、ドーパミン結合ＰＥＧ溶液（ｉｉｉ）を用いて作製した生体親和性高分子を結合させた光散乱粒子（３）（ｉｉｉ）：１５６．４ｎｍ、であった。また、ＰＤＩ（多分散度）はそれぞれ、（３）（ｉ）０．０４４、（３）（ｉｉ）０．０１１、および（３）（ｉｉｉ）０．０４２であった。
【０１４８】
操作１７：蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）および（３）（ｉｉ）の個別投与によるＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞における検出器を用いた蛍光の増強効果
ＡＬＡ水溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）をＥ−ＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ））に混和し、２ｍｍｏｌ／ｌのＡＬＡ溶液とした。また光散乱、粒子（２）（ｉｉ）および光散乱粒子（３）（ｉｉ）の水溶液をＥ−ＭＥＭ培地に混和し、それぞれ０．００１ｗ／ｖ％の光散乱粒子溶液とした。
【０１４９】
操作３で得られた６ウェルプレートのＵＭ−ＵＣ−３細胞の培地をアスピレータにて除去し、操作５と同様の条件で評価を行い、検出に用いた。
【０１５０】
検出は光学分光検出器（ＵＳＢ２０００小型ファイバ光学分光器、Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて、室温下、暗所にて行った。励起光は波長４０５ｎｍのＬＥＤ光源ランプ（Ｍ４０５Ｆ１、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）と接続したφ＝１ｍｍ、開口数０．５の光学ファイバ（Ｍ５９Ｌ０１、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を経由して、さらに焦点距離＝４．３４ｍｍ、開口数＝０．５７のコリメートレンズ（Ｆ２３０ＳＭＡ−Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を通し、上面垂直方向より６ウェルプレートの細胞へ励起光を照射して、そこから生じた蛍光を上面５０度方向に設置した焦点距離＝１０．９ｍｍ、開口数＝０．２５のコリメートレンズ（Ｆ２２０ＳＭＡ−Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を通し、さらにφ＝１ｍｍ、開口数０．５の光学ファイバー（Ｍ５９Ｌ０１、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を経由して、上記光学分光検出器で検出した。励起光の出力はＬＥＤドライバ（ＤＣ４１００、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を用い５００ｍＡに設定した。励起光の波長４０５ｎｍの照射パワー密度を、光強度測定器（ＰＭ１６０、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を用いて測定した結果、照射対象の６ウェルプレートの高さにおいて、１０ｍＷ／ｃｍ２であった。上記光学分光検出器の設定はＰＣ制御にて行い、制御計測ソフトウェア（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｓｕｉｔｅ、Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて露光時間１００ｍｓ、測定平均回数は１回、波長スペクトル範囲は２００ｎｍ〜８００ｎｍにそれぞれ設定し、上記光学分光検出器で検出した波長スペクトルを取得した。測定サンプルに光を照射した際に取得された波長スペクトルから、ダークノイズ分の波長スペクトルを減算した後、蛍光ピークを示す波長６３５ｎｍの強度値を求めた。また、コントロールとして蛍光色素を投与しなかった細胞のみに光を照射した際に取得された波長スペクトルから、ダークノイズ分の波長スペクトルを減算した後、波長６３５ｎｍの強度値を求めた。参照強度として、上記と同様に波長６００ｎｍにおける強度値を測定サンプルおよびコントロールについてそれぞれ求め、測定サンプルの値からコントロールの値を減算して参照強度とした。次に、この参照強度をコントロールの波長６３５ｎｍの強度値に加算した値をそれぞれの測定サンプルにおけるバックグラウンドの強度値とした。そして、測定サンプルの波長６３５ｎｍの強度値から、それぞれの測定サンプルにおけるバックグラウンドの強度値を減算した差分をもとめ、蛍光検出強度を計算した。相対蛍光強度は上記で取得された蛍光検出強度を用いて次式を用いて算出した。
［相対蛍光検出強度］＝［各条件での蛍光検出強度］／［蛍光色素のみ投与の場合における光照射直後の蛍光検出強度］
【０１５１】
結果は表１３に示されるとおりであった。
【表１３】
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【０１５２】
表１３より明らかなように、蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）および光散乱粒子（３）（ｉｉ）の個別投与の場合では、光照射直後において蛍光色素のみ投与の場合よりも非常に高い相対蛍光検出強度が得られた。これは、別に個別投与された光散乱粒子（２）（ｉｉ）および光散乱粒子（３）（ｉｉ）により可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。さらに、培養した腫瘍細胞の上面垂直方向より６ウェルプレートの細胞へ励起光を照射して、そこから生じた蛍光を上面５０度方向から計測することで、蛍光色素から発せられる蛍光が増強されることを確認できた。これは、上面から細胞へ可視光域の励起光を照射したにも関わらず、別に個別投与された光散乱粒子（２）（ｉｉ）および光散乱粒子（３）（ｉｉ）により可視光散乱が強められ、蛍光色素から発せられる蛍光が増強された結果と考えられる。以上から、本発明において蛍光色素と光散乱粒子（２）（ｉｉ）および光散乱粒子（３）（ｉｉ）を個別投与で用いることで、検出器を用いた系において、従来の蛍光色素のみより蛍光が増強されて、より高い検出強度でＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞を判別できることが明らかとなった。
【図１】
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