(57)【要約】【課題】電界殺菌処理などにより死滅した死菌の殺菌機序を、個々の微生物に対して解析できる、殺菌処理の情報取得方法を提供する。【解決手段】殺菌処理後の菌を電子顕微鏡を用いて撮像し、菌の細胞表層の撮像画像から、死菌の所定のデータを得、殺菌処理による殺菌機序の情報を得る、殺菌処理の情報取得方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺菌処理後の菌を電子顕微鏡を用いて撮像し、菌の細胞表層の撮像画像から、死菌の所定のデータを得、殺菌処理による殺菌機序の情報を得る、殺菌処理の情報取得方法。
【請求項２】
殺菌処理後の菌を溶媒で懸濁し、
懸濁液を遠心分離し、
遠心分離後の上清をメンブレンフィルターを用いてろ過して菌をメンブレンフィルターに吸着し、
メンブレンフィルターに菌を固定し、
菌をメンブレンフィルターごと回収し、
回収したメンブレンフィルターを臨界点乾燥溶液に浸漬させ、
メンブレンフィルターを凍結させ、
凍結したメンブレンフィルターを臨界点乾燥させ、
臨界点乾燥させたメンブレンフィルターに存在する菌を電子顕微鏡を用いて撮像し、
菌の細胞表層の撮像画像から、死菌の所定のデータを得、殺菌処理による殺菌機序の情報を得る、
殺菌処理の情報取得方法。
【請求項３】
前記撮像画像から、細胞表層に細孔形状及び突起構造が出現し、細胞表層全体が粗面化しているとき、電界殺菌処理の電界により菌が死滅したとの情報を得る、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記死菌の細胞表層の細孔のサイズが約０．０１〜０．５μｍである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記撮像画像から、菌の細胞表層の全体にわたり、細孔形状が露出したひだ状の突起が存在するとき、電界殺菌処理の電界により菌が死滅したとの情報を得る、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
前記撮像画像から、菌の細胞が断片化され、断片化細胞内に孔が存在しているとき、電界殺菌処理の電界により菌が死滅したとの情報を得る、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記撮像画像から、菌の細胞径が約０．４〜１．０μｍであるとき、電界殺菌処理の電界により菌が死滅したとの情報を得る、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
メンブレンフィルターに固定した菌それぞれの殺菌機序の情報を得る、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項で用いる死菌画像の撮像方法であって、
殺菌処理後の菌を溶媒で懸濁し、
懸濁液を遠心分離し、
遠心分離後の上清をメンブレンフィルターを用いてろ過して菌をメンブレンフィルターに吸着し、
メンブレンフィルターに菌を固定し、
菌をメンブレンフィルターごと回収し、
回収したメンブレンフィルターを臨界点乾燥溶液に浸漬させ、
メンブレンフィルターを凍結させ、
凍結したメンブレンフィルターを臨界点乾燥させ、
臨界点乾燥させたメンブレンフィルターに存在する菌を電子顕微鏡を用いて撮像する、
死菌画像の撮像方法。
【請求項１０】
前記臨界点乾燥溶液がt-ブタノールである、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
遠心分離後の上清に対して除塵処理を行い、除塵処理後の上清に対して前記メンブレンフィルターを用いてろ過を行う、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
メンブレンフィルターの孔径が０．１〜０．４５μｍである、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記懸濁液を７０００〜１５０００Ｇで５〜１５分間遠心分離する、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、殺菌処理の情報取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食中毒の原因とならないよう、微生物学的な観点から安全性の高い飲食品を提供するには、原材料や製品に含まれる微生物の殺菌を十分に行うことが重要である。
従来の殺菌方法として、加熱殺菌が一般的に知られている。しかし、殺菌のために原材料や製品を加熱すると、変質や加熱臭が発生し、栄養成分や風味が損なわれる場合がある。
【０００３】
そこで、加熱殺菌に代わる殺菌方法として、電界殺菌が注目を集めている。
電界殺菌とは、原材料や製品を電極で挟み、交流高電圧を印加することで、電気的な殺菌作用により、混入した微生物を殺菌する方法である。電界殺菌方法は、従来の加熱のみによる殺菌方法に比べて、熱による変色や加熱臭の発生、栄養成分の減少を抑えることができる。
さらに、点滴や注射液など、安全性の高い液体医薬品を提供するために、電界殺菌の利用も検討されている。
【０００４】
一般に、飲食品の種類や混入している微生物の種類によって、電界殺菌条件を適宜設定しなければならない。そして、設定した電界殺菌条件により殺菌効果が十分であるかを確認する必要がある。さらに、殺菌や抗菌の知見を深めるためには、殺菌処理により微生物がどのように死滅したのかを解明することも重要である。
【０００５】
殺菌処理後の死菌を観察するには、死菌を回収する必要がある。従来の死菌の回収方法としては、死菌を含む懸濁液を遠心分離し、分離され沈降したペレットから死菌を回収する方法が一般的である。また、特許文献１には、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）標本作製のために、微生物試料を液体透過性膜上に採取・設置した後、少なくとも固定工程若しくは洗浄・固定工程、洗浄工程、並びに脱水工程を、液体透過性膜の下部より吸引しながら行う、微生物試料の処理方法が記載されている。
上記の方法などにより、生菌や加熱殺菌により死滅した死菌の回収は可能である。しかしこれまで、従来法により、電界殺菌により死滅した死菌を回収したとの報告はされていない。
【０００６】
一方で、殺菌処理により死滅した菌の殺菌機序の解析方法としては、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）等の各種のストレス応答反応（バイオインジケーター）の多層的な解析が主流である。
しかし、バイオインジケーターを利用した解析方法は、簡便性や迅速性に欠ける。さらに、バイオインジケーターを利用した解析方法は、細胞集団の解析方法である。そのため、個々の細胞の殺菌機序を個別に解析することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２８６５９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、電界殺菌処理などにより死滅した死菌の殺菌機序を、個々の死菌に対して解析できる、殺菌処理の情報取得方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題に鑑み、本発明者は鋭意検討を行った。その結果、電界殺菌処理により死滅した死菌の懸濁液を従来法の条件で遠心分離しても、電界殺菌処理により死滅した死菌がペレットには移行しないことを見出した。さらに、懸濁液を従来法とは異なる条件で遠心分離した場合、電界殺菌処理により死滅した死菌が上清を浮遊することを見出した。そこで、電界殺菌処理により死滅した死菌が浮遊する遠心分離後の上清をメンブレンフィルターを用いてろ過して死菌をメンブレンフィルターに吸着し、メンブレンフィルターに死菌を固定することにより、電界殺菌処理により死滅した死菌を特異的に回収できることを見出した。
さらに、電界殺菌処理後の死菌は、他の殺菌方法により死滅した死菌や生菌とは大きく異なる、特徴的な細胞形状を有することを見出した。そして、このような特徴的な細胞形状を判断基準とすることで、電界殺菌処理などにより死滅した死菌の殺菌機序を、個々の微生物に対して解析できることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成に至ったものである。
【００１０】
本発明は、殺菌処理後の菌を電子顕微鏡を用いて撮像し、菌の細胞表層の撮像画像から、死菌の所定のデータを得、殺菌処理による殺菌機序の情報を得る、殺菌処理の情報取得方法に関する。
【００１１】
また本発明は、殺菌処理による殺菌機序の情報を得るための、死菌画像の撮像方法であって、殺菌処理後の菌を溶媒で懸濁し、懸濁液を遠心分離し、遠心分離後の上清をメンブレンフィルターを用いてろ過して菌をメンブレンフィルターに吸着し、メンブレンフィルターに菌を固定し、菌をメンブレンフィルターごと回収し、回収したメンブレンフィルターを臨界点乾燥溶液に浸漬させ、メンブレンフィルターを凍結させ、凍結したメンブレンフィルターを臨界点乾燥させ、臨界点乾燥させたメンブレンフィルターに存在する菌を電子顕微鏡を用いて撮像する、死菌画像の撮像方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、特定の遺伝子或いはタンパク質の発現を解析するバイオインジケーターの解析をすることなく、細胞表面の形状から、電界殺菌処理などにより死滅した死菌とそれ以外の死菌や生菌とを区別し、電界殺菌処理などにより死滅した死菌の殺菌機序、殺菌強度、安全性などを個々の死菌に関する情報を得、解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１（Ａ）は、本発明の殺菌処理の情報取得方法により取得した、電界殺菌処理後の黄色ブドウ球菌の死菌の電子顕微鏡写真である。図１（Ｂ）は、本発明の殺菌処理の情報取得方法により取得した、電界殺菌処理後の別の黄色ブドウ球菌の死菌の電子顕微鏡写真である。図１（Ｃ）は、本発明の殺菌処理の情報取得方法により取得した、電界殺菌処理後の大腸菌の死菌の電子顕微鏡写真である。
【図２】図２（Ａ）は、黄色ブドウ球菌の生菌の電子顕微鏡写真である。図２（Ｂ）は、加熱殺菌処理後の黄色ブドウ球菌の死菌の電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
電界殺菌処理により死滅した死菌は、その細胞形状が大きく崩壊し、生菌や他の原因により死滅した菌と明確に区別できる。よって本発明において、電界殺菌処理などにより細胞形状が大きく崩壊した死菌を回収し、回収した死菌の細胞形状を撮像し所定の情報を得ることで、細胞形状が大きく崩壊した死菌の殺菌機序を解析することができる。
【００１５】
電界殺菌処理などにより細胞の構造が大きく変化（崩壊）した死菌について、電界殺菌処理により死滅した死菌を具体例として図１（Ａ）〜（Ｃ）を参照しながら説明する。しかし本発明は、細胞の構造が大きく変化（崩壊）した死菌である限り、電界殺菌処理により死滅した死菌に限定するものではない。
【００１６】
電界殺菌処理後の死菌は、他の殺菌方法（例えば、加熱殺菌、アルコール殺菌）により死滅した死菌とは大きく異なる、特徴的な形状を有する（図１（Ａ）〜（Ｃ）参照）。
具体的には、細胞表層は、約０．０１〜０．５μｍの細孔状であり、かつ突起構造を有する。また、ひだ状の突起が、細胞表層の全体にわたり存在するのも、電界殺菌処理後の死菌特有の特徴である。図１（Ａ）〜（Ｃ）に示す死菌はいずれも、これらのような構造が細胞表層の全体にわたり存在し、表面が粗面化している。
さらに、電界殺菌処理後の死菌の多くは断片化され、細胞表層に孔が存在する（図１（Ａ）〜（Ｃ）参照）。この孔から、細胞内物質が細胞外に漏洩している。
さらに、電界殺菌処理後の死菌は、電界殺菌処理前の生菌よりも細胞径は小さくなる傾向がある。例えば、電界殺菌処理前の黄色ブドウ球菌の生菌の細胞径は約０．８〜１．０μｍである。これに対して、電界殺菌処理後の黄色ブドウ球菌の死菌の細胞径は、約０．４〜１．０μｍであり、その多くは約０.４〜０.５μｍである（図１（Ａ）〜（Ｃ）参照）。
【００１７】
これに対して、生菌は、前述の電界殺菌により死滅した死菌とは異なり、細胞表面にはひだ状の突起は存在せず、全体が滑らかである（図２（Ａ）参照）。また、熱が原因で死滅した死菌には、細胞表面に微細な孔が存在するが、生菌と同様細胞表面は全体が滑らかである（図２（Ｂ）参照）。また、黄色ブドウ球菌の生菌及び加熱殺菌処理後の死菌はいずれも、細胞がブドウの房状に連結している。
生菌については、これまでの知見として、グラム陽性菌、グラム陰性菌に関わらず、細胞表層が非常になめらかであり、細胞表面に凹凸はほとんど認められない。さらに、死菌であったとしても、例えば酸刺激や乾燥刺激等により死滅した菌は生菌と同様に表面が滑らかであり、電界殺菌処理後の死菌とは異なり細胞形状に大きな変化は認められない。
【００１８】
以上のように、電界殺菌により死滅した死菌は、細胞形状が大きく変化し、細胞表面には細孔形状やひだ状の突起が存在する。しかし、それ以外の微生物（生菌、並びに電界殺菌以外の機序により死滅した死菌）では、このような形状の細胞は確認されない。
よって、後述の方法により撮像した死菌の画像から、ひだや突起等の有無を確認することで、死菌の死因が電界殺菌による細胞内外の電位差であるか否かを判断することができる。また、電界が原因で死滅した菌と熱が原因で死滅した菌との間でも、細胞表面の形状が大きく異なる。
さらに、後述の方法により撮像した死菌の画像から、ＨＳＰなどのバイオインジケーターを解析することなく、個々の死菌の死滅原因を解析することもできる。
【００１９】
次に、本発明の殺菌処理の情報取得方法に用いる菌の画像の撮像方法について説明する。しかし本発明は、これに制限するものではない。
本発明の好ましい実施態様では、殺菌処理の情報を取得する殺菌処理後の菌を溶媒で懸濁し、懸濁液を遠心分離し、遠心分離後の上清をメンブレンフィルターを用いてろ過して菌をメンブレンフィルターに吸着し、メンブレンフィルターに菌を固定し、電界殺菌処理により死滅した死菌など、殺菌処理後の菌をメンブレンフィルターごと回収する。そして、回収したメンブレンフィルターに対して、電子顕微鏡を用いた画像の撮影のために必要な処理を行い、電子顕微鏡を用いて死菌画像を撮像する。
【００２０】
懸濁液の調製に用いる溶媒に特に制限はなく、適宜選択することができる。例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Polyoxyethylene sorbitan monolaulate）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート（Polyoxyethylene sorbitan monopalmitate）、モノパルミタートモノステアラート（monopalmitate monostearate）及びモノステアラートモノオレアート（monostearate monooleate）からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤を含有する水溶液が挙げられる。
また、死菌を遠心分離後の上清に移行させるために、溶媒の濃度を適宜設定することが好ましい。例えば、0.05〜0.2質量％が好ましい。
【００２１】
調製した懸濁液を遠心分離し、上清を回収する。上清には、前述のように細胞形状が大きく変化した死菌が含まれている。
細胞形状が大きく変化した死菌を分離できれば、遠心分離条件に特に制限はなく、遠心分離により細胞が損傷を受けて崩壊しない範囲で適宜設定することができる。例えば、７０００〜１５０００Ｇで５〜１５分間遠心分離することが好ましく、１００００〜１５０００Ｇで１０〜１５分間することがより好ましく、１５０００Ｇで１５分間することがさらに好ましい。懸濁液を冷却しながら遠心分離を行うことが好ましいこの遠心分離条件は、例えば特開２００８−２８６５９１号公報等に示される従来法における条件（10,000Ｇで10分間程度）よりも、遠心分離の度合いが大きい。このような条件を採用することにより、細胞形状が大きく変化した死菌を上清中に移行させることができる。
本発明において、遠心分離前の懸濁液には、電界殺菌などにより細胞形状が大きく変化した死菌に加え、細胞のサイズが大きい生菌や死菌、微生物の細胞片などが含まれる。このような懸濁液に対して、遠心分離を行わずに後述するメンブレンフィルターを用いたろ過を行うと、容易に目詰まりが起きてしまい、死菌の回収効率が大きく低下する。これに対して、メンブレンフィルターを用いてろ過を行う前に懸濁液の遠心分離を行うことで、細胞のサイズが大きい生菌や死菌、微生物の細胞片等の夾雑物の多くはペレットとして分離できる。その結果、後段のメンブレンフィルターを用いたろ過を効率的に行うことができる。さらに、従来法における条件よりも遠心分離の度合いを高めることで、生菌などの夾雑物の大部分が上清に残らず、死菌と生菌との識別能を上げることができる。そのため、残渣の少ない鮮明な死菌画像の撮像を行うことができる。
【００２２】
遠心分離後の上清に対してメンブレンフィルターを用いてろ過を行い、ろ液中の死菌をメンブレンフィルターに吸着させる。本発明においてメンブレンフィルターの孔径は、殺菌処理前後の細胞のサイズを比較し、適宜設定することができる。
具体的には、黄色ブドウ球菌の生菌の細胞径は約０．８〜１．０μｍである。これに対して、電界殺菌処理後の死菌をＳＥＭで観察したところ、細胞形状が大きく変化しており、死菌の多くは、約０．４〜０．５μｍである。よって、細胞形状が大きく変化した死菌の大きさが生菌の約半分程度であることを考慮して、メンブレンフィルターの孔径を設定することが好ましい。具体的には、メンブレンフィルターの孔径は、０．１〜０．４５μｍが好ましい。
【００２３】
本発明において、メンブレンフィルターを用いたろ過を行う前に、上清に含まれる細胞形状が大きく変化した死菌を、細胞のサイズが大きい生菌や死菌、微生物の細胞片などと分離するために、除塵処理を行うことが好ましい。除塵処理とメンブレンフィルターを用いたろ過とを段階的に行うことで、メンブレンフィルターの目詰まりを抑制し、目的の死菌をメンブレンフィルターに吸着させるために要する時間を短縮することができる。
除塵処理は、通常の除塵目的のフィルター、例えばストマフィルター等のデプスタイプのフィルターを用いて行うことができる。除塵処理に用いることができるフィルターは、遠心処理でも落としきれなかったサイズの大きい残渣や、一部生菌の透過を阻止するが、粒径が小さい本発明で回収する死菌は透過できるよう、適宜選択することができる。
【００２４】
上述の工程を経ることで、細胞形状が大きく変化した死菌をメンブレンフィルターに吸着させることができる。そして、吸着した死菌をメンブレンフィルターに固定し、死菌が固定されたメンブレンフィルターごと回収することで、目的の死菌を回収することができる。そして、回収したメンブレンフィルターには死菌が吸着及び固定しているので、回収したメンブレンフィルターをＳＥＭなどの電子顕微鏡で観察することで、目的の死菌の撮像を容易に行うことができる。
【００２５】
メンブレンフィルターに吸着した死菌を固定する方法に特に制限はない。例えば、グルタールアルデヒドなどの固定液に、目的の死菌が吸着したメンブレンフィルターを浸漬し、メンブレンフィルターに死菌を固定する。そして、脱水溶液を滴下し、メンブレンフィルターに固定した死菌を脱水する。脱水処理後、メンブレンフィルターを回収する。
より具体的には、ろ過後のメンブレンフィルターに前固定（予備固定）として2％グルタールアルデヒドを通液し、その後、100mM HEPESを用いてメンブレンフィルター及び吸着した死菌を洗浄する。その後、メンブレンフィルターをディスポーサブルディッシュに菌体を吸着させた表面が上になるように、かつ死菌がはがれ落ちないように極力静かに、メンブレンフィルターの下面が空気を巻き込まないように設置する。空気を巻き込んでしまった場合は、適宜ピンセットで空気抜きを行う。その後、4℃に冷却した2％グルタールアルデヒドを、メンブレンフィルター表面の菌がはがれないように、ディスポーサブルディッシュの壁面に当たるように、緩やかに４〜５ｍＬ滴下する。その後、4℃で18時間以上固定する。固定の際、メンブレンフィルターが浮き上がり、メンブレンフィルターに菌体（死菌）が固定されないことがあるため、一定時間毎にメンブレンフィルターが固定液（グルタールアルデヒド）に完全に浸漬されているかを確認する。メンブレンフィルターが浮かび上がっている場合は、メンブレンフィルター外周部をピンセットで押さえつけ、完全に固定液に浸漬させる。そして、メンブレンフィルターに固定した死菌に対して５０〜１００容量％の数段階の濃度区の脱水溶液（エタノール上昇系が好ましい）を低濃度から段階的に順次滴下し、メンブレンフィルターに固定した死菌を脱水する。脱水処理後、メンブレンフィルターを回収する。
【００２６】
従来の殺菌方法で死滅する死菌は、懸濁液を遠心分離すると、死菌はペレットに移行する。これに対し本発明では、懸濁液の遠心分離後の上清をろ過し、死菌が吸着したメンブレンフィルターを回収する。したがって、前述の工程を経て回収したメンブレンフィルターは、所定の処理を行うことで電子顕微鏡での撮像に供することができる。
電子顕微鏡を用いた撮像方法に特に制限はなく、常法により行うことができる。以下、死菌の撮像方法について具体的に説明する。しかし本発明は、これに制限するものではない。
例えば、脱水処理後のメンブレンフィルターをディスポーサブルディッシュに移し、t-ブタノール（試薬特級）などの臨界点乾燥溶液に完全に浸漬させ、凍結させる。その後、凍結したメンブレンフィルターをディスポーサブルディッシュごと臨界点乾燥器に設置し臨界点乾燥を行う。臨界点乾燥前にメンブレンフィルターを臨界点乾燥溶液に浸漬させることで、死菌の細胞表層の微細構造（鞭毛や繊毛など）を保護ないし維持したまま、乾燥させることができる。なお本発明において「臨界点乾燥」とは、脱水後の試料を液化炭酸ガスと共に圧力容器中に入れて加温する方法であり、常法により行うことができる。
臨界点乾燥溶液を完全に揮散させた後、メンブレンフィルターをSEM試料台に観察面が上になるように載置し、イオンスパッターで白金バナジウムを蒸着させる。その後、常温ＳＥＭやクライオ(FIB)ＳＥＭなどにより、死菌を撮像することができる。
【００２７】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の殺菌処理の情報取得方法並びに死菌画像の撮像方法を開示する。
【００２８】
＜１＞殺菌処理後の菌を電子顕微鏡を用いて撮像し、菌の細胞表層の撮像画像から、死菌の所定のデータを得、殺菌処理による殺菌機序の情報を得る、殺菌処理の情報取得方法。
【００２９】
＜２＞殺菌処理後の菌を溶媒で懸濁し、
懸濁液を遠心分離し、
遠心分離後の上清をメンブレンフィルターを用いてろ過して菌をメンブレンフィルターに吸着し、
メンブレンフィルターに菌を固定し、
菌をメンブレンフィルターごと回収し、
回収したメンブレンフィルターを臨界点乾燥溶液に浸漬させ、
メンブレンフィルターを凍結させ、
凍結したメンブレンフィルターを臨界点乾燥させ、
臨界点乾燥させたメンブレンフィルターに存在する菌を電子顕微鏡を用いて撮像し、
菌の細胞表層の撮像画像から、死菌の所定のデータを得、殺菌処理による殺菌機序の情報を得る、
殺菌処理の情報取得方法。
【００３０】
＜３＞前記撮像画像から、細胞表層に細孔形状及び突起構造が出現し、細胞表層全体が粗面化しているとき、電界殺菌処理の電界により菌が死滅したとの情報を得る、前記＜１＞又は＜２＞項記載の方法。
＜４＞前記死菌の細胞表層の細孔のサイズが約０．０１〜０．５μｍである、前記＜３＞項記載の方法。
＜５＞前記撮像画像から、菌の細胞表層の全体にわたり、細孔形状が露出したひだ状の突起が存在するとき、電界殺菌処理の電界により菌が死滅したとの情報を得る、前記＜１＞又は＜２＞項記載の方法。
＜６＞前記撮像画像から、菌の細胞が断片化され、断片化細胞内に孔が存在しているとき、電界殺菌処理の電界により菌が死滅したとの情報を得る、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の方法。
＜７＞前記撮像画像から、菌の細胞内物質が、前記孔から細胞外に漏洩しているとき、電界殺菌処理の電界により菌が死滅したとの情報を得る、前記＜６＞項記載の方法。
＜８＞前記撮像画像から、菌の細胞径が約０．４〜１．０μｍ、好ましくは約０.４〜０.５μｍであるとき、電界殺菌処理の電界により菌が死滅したとの情報を得る、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の方法。
＜９＞メンブレンフィルターに固定した菌それぞれの殺菌機序の情報を得る、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞前記撮像画像から、ひだ、ないし突起の有無を確認することで、死菌の死因が電界殺菌による細胞内外の電位差であるか否かを判断する、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
【００３１】
＜１１＞前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項で用いる死菌画像の撮像方法であって、
殺菌処理後の菌を溶媒で懸濁し、
懸濁液を遠心分離し、
遠心分離後の上清をメンブレンフィルターを用いてろ過して菌をメンブレンフィルターに吸着し、
メンブレンフィルターに菌を固定し、
菌をメンブレンフィルターごと回収し、
回収したメンブレンフィルターを臨界点乾燥溶液に浸漬させ、
メンブレンフィルターを凍結させ、
凍結したメンブレンフィルターを臨界点乾燥させ、
臨界点乾燥させたメンブレンフィルターに存在する菌を電子顕微鏡を用いて撮像する、
死菌画像の撮像方法。
【００３２】
＜１２＞前記臨界点乾燥溶液がt-ブタノールである、前記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項記載の方法。
＜１３＞遠心分離後の上清に対して除塵処理を行い、除塵処理後の上清に対して前記メンブレンフィルターを用いてろ過を行う、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
＜１４＞デプスタイプのフィルターを用いて前記除塵処理を行う、前記＜１３＞項記載の方法。
＜１５＞前記除塵処理により、上清に含まれる細胞形状が大きく変化した死菌を、細胞径の大きい生菌及び死菌、並びに微生物の細胞片などと分離する、前記＜１３＞又は＜１４＞項記載の方法。
＜１６＞メンブレンフィルターの孔径が０．１〜０．４５μｍである、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項記載の方法。
＜１７＞前記懸濁液を７０００〜１５０００Ｇで５〜１５分間、好ましくは１００００〜１５０００Ｇで１０〜１５分間、より好ましくは１５０００Ｇで１５分間遠心分離する、前記＜１＞〜＜１６＞のいずれか１項記載の方法。
＜１８＞前記溶媒が、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート、モノパルミタートモノステアラート及びモノステアラートモノオレアートからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤を含有する水溶液である、前記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１項記載の方法。
＜１９＞前記溶媒の濃度が0.05〜0.2質量％である、前記＜１＞〜＜１９＞のいずれか１項記載の方法。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
（１）供試菌の調製
黄色ブドウ球菌  NBRC 12732及び大腸菌  ATCC 8739をそれぞれ液体培地（ニュートリエントブロス）10ｍLに1白金耳量接種し、37℃、120rpmで24時間振盪培養を行った。その後、培養液100μLを液体培地（ニュートリエントブロス）10mLに接種し、37℃、120rpmで２〜４時間振盪培養（本培養）を行った。
本培養菌液を20倍に希釈したニュートリエントブロスを用いて、菌数を1〜3×105CFU/mLになるように調整し、菌液を調製した。
【００３５】
（２）殺菌試験
圧電性ポリ乳酸で作成したニットを伸長させると電界が発生する。この電界で菌を死滅させられることが知られている。
圧電性ポリ乳酸で作成したニットを引張機に150g加重で設置した。設置後、前記菌液200μLを10〜15スポット試験布上及びJIS L 1902指定の普通布に接種した。その後圧電性ポリ乳酸製ニットは引張機により10mmのストロークで、普通布は静置条件において、37℃で18時間培養した。
培養後の各試験布は抽出液を用いて、布上の菌を回収し、培養法にて生菌数を測定した。
【００３６】
（３）死菌の回収
0.2〜0.05質量％Tween80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）水溶液20ｍＬに、電界殺菌処理後の菌を懸濁した。そして、高速冷却遠心機（ヤマト科学）及びアングルローターF-35-6-30を用いて、１５０００Ｇで１５分間、4℃に冷却しながら懸濁液を遠心分離した。
遠心分離後の上清を回収し、ストマフィルター（アズワン）でろ過し、除塵処理を行った。その後、ポアサイズ0.2μｍのアイソポアＧＴＴＰ０４７００及びディスポーサブルシリンジを用いて全量ろ過し、死菌をメンブレンフィルター上に吸着させた。
ろ過後のメンブレンフィルターに0.1MHEPES1mLを通液してメンブレンフィルターを洗浄し、さらに2％グルタールアルデヒド1mLを通液し前固定を行った。通液後のメンブレンフィルターを、ろ過面が上になるようにディスポーザブルディッシュに設置した。メンブレンフィルターに直接固定液がかからないようにディスポーザブルディッシュの壁面に2％グルタールアルデヒド4mLを滴下し、メンブレンフィルターが浮かび上がらないようにピンセットなどで押さえながら、4℃で18時間固定した。
その後、固定液全量を回収廃棄した後、フィルター表面に直接かからないようにしながら、エタノール上昇系（50、70、80、90、95、100（1回目）、100（2回目）％）で各30分間4℃で脱水した。
【００３７】
（４）死菌の撮像
脱水処理後のメンブレンフィルターは4mlのt-ブタノールに完全に浸漬させてディスポーサブルディッシュごと−20℃で30分以上凍結させた。凍結後のディスポーサブルディッシュ及びメンブレンフィルターは臨界点乾燥器ES-2030（日立）を用いて臨界点乾燥を行った。乾燥後のメンブレンフィルターはSEM試料台（日新EM）に固定し、イオンスパッターE-1030（日立）を用いて３０ｍＡで80秒白金蒸着した。白金蒸着後のメンブレンフィルターはSEM S-4300E（日立）を用いて観察及び撮影を行った。
【００３８】
その結果を図１に示す。図１に示すように、遠心分離後の上清から回収した電界殺菌処理後の菌は、グラム陽性、グラム陰性に関わらず細胞が断片化されている。また細胞表層が粗面化し、細胞を覆うようにひだ状の構造物（突起）が露出している。さらに、生菌では認められない細胞表層の細孔（ポア）が認められ、細胞内物質が細胞外に漏洩している。細胞表層のひだ状構造は、それ以外の部位と比較して盛り上がった状態であり、細胞骨格様の構造として存在している。
さらに、黄色ブドウ球菌の死菌は、ブドウの房状の連結が認められなくなる（図１（Ａ）及び（Ｂ）参照）。
【００３９】
以上のように、電界殺菌により死滅した菌は、生菌や他の殺菌処理により死滅した死菌の公知の細胞の形状とは大きく異なる。よって、本発明の方法によれば、バイオインジケーターの解析をすることなく、電界殺菌処理により死滅した死菌の殺菌機序、殺菌強度、安全性などを個々の死菌に関する情報を得、解析することができる。
【図１】
2019195283.tif 000002
【図２】
2019195283.tif 000003