(57)【要約】【課題】希少細胞を保持するが、しかし他の種類の細胞のフィルターを通して通過を可能にする、孔サイズ、孔密度又は他の物理的性質を有するフィルターを通して、処理されるか、又は希釈され得る生物学的サンプルを濾過することを含んで成る、生物学的サンプルから希少細胞を単離又は抽出する方法に関する。【解決手段】この方法はまた、生物学的サンプル中の希少細胞の存在を診断同定し、そして診断目的、例えば疾患早期診断、すなわち癌の早期診断のために、それらの診断同定及び分子特性決定を用い、そして治療を選択し、誘導し、モニターし、そして特に標的治療を選択し、そしてそれらに対する応答及び／又は耐性をモニターするために、濾過によるそれらの希少細胞の抽出又は単離の後、希少細胞に対して行われる複数分析も包含する。濾過による希少細胞の単離及び抽出の後、実施される濾過段階及び種々の複数分析を達成するための道具、装置及び／又は試薬を包含するキットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
希少細胞に関連する状態、障害又は疾患を同定し、診断し、又は予後診断を提供する方法であって、
（ａ）生物学的サンプルをフィルターに通し、そしてフィルター上のその単離された希少細胞を回収することにより希少細胞を単離するか又は抽出し；ここで前記フィルターは、希少細胞を保持するが、しかし他の種類の細胞の通過を可能にする、孔サイズ、孔密度又は他の物理的特性を有し；
（ｂ）前記単離された又は抽出された希少細胞の細胞形態を決定し、そして／又は前記単離された希少細胞を免疫標識し、そして／又は前記単離された希少細胞上の分子分析を実施し；そして
（ｃ）前記単離された又は抽出された希少細胞の細胞形態及び／又は免疫標識及び／又は分子分析に基づいて、希少細胞の存在及び／又は数及び／又は特性に関連する状態、障害又は疾患、及び／又は状態、障害又は疾患の段階を同定し、診断し、又は予後診断を提供することを含んで成る方法。
【請求項２】
前記生物学サンプルが、血液、体液、粘液、又は粘膜から得られたサンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、遺伝子疾患若しくは障害、又は炎症、変性、心血管及び感染性状態、障害若しくは疾患から成る群から選択される疾患を包含する、非癌性又は非腫瘍性状態若しくは障害を、対象自体有するか又は有する疑いがあるか、又はそれらの状態又は障害を有する胎児を有する対象から得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的サンプルが、癌、又は非癌性増殖性状態、障害又は疾患を有するか、あるいは非癌性増殖性状態、障害又は疾患を有する疑いがあるか、又は有する危険性がある対象から得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的サンプルが、炎症性及び／又は変性状態、障害又は疾患を有するか、あるいは炎症性及び／又は変性状態、障害又は疾患を有する疑いがあるか、又は有する危険性がある対象から得られる；又は
前記生物学的サンプルが、心血管性状態、障害又は疾患を有するか、あるいは心血管性状態、障害又は疾患を有する疑いがあるか、又は有する危険性がある対象から得られる；又は
前記生物学的サンプルが、感染状態、障害又は疾患を有するか、あるいは感染状態、障害又は疾患を有する疑いがあるか、又は有する危険性がある対象から得られる、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）生物学的サンプルをポリカーボネートフィルターに通すことにより希少細胞を単離又は抽出し、そしてポリカーボネートフィルター上のその単離又は抽出された希少細胞を回収することを含んで成るか、又は
（ａ）生物学的サンプルをＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルターに通すことにより希少細胞を単離又は抽出し、そしてＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルター上のその抽出又は単離された希少細胞を回収することを含んで成る、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
濾過により単離又は抽出された前記希少細胞が、（ｂ）におけるように、又は培養のために、さらなる分析の前に支持体に移される、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記単離又は抽出された希少細胞が、（ｂ）の前に培養される、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記単離又は抽出された希少細胞が、（ｂ）の前に固定されるか；又は
前記単離又は抽出された希少細胞が、（ｂ）の前にフィルター上で染色又は免疫染色される、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｂ）前記単離又は抽出された希少細胞の細胞形態を決定することを含んで成る、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（ｂ）前記単離された希少細胞を免疫標識することを含んで成る、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｂ）前記単離された希少細胞に対する分子分析を実施することを含んで成る、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｂ）前記単離又は抽出された希少細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡの分子分析を含んで成る、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
（ｂ）前記単離又は抽出された希少細胞のタンパク質、ペプチド又はポリペプチドの分子分析を含んで成る、請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
希少細胞の有無の検出方法であって、
（ａ）生物学的サンプルをフィルターに通し、そしてフィルター上のその単離された希少細胞を回収することにより希少細胞を単離か又は抽出し；ここで前記フィルターは、希少細胞を保持するが、しかし他の種類の細胞の通過を可能にする、孔サイズ、孔密度又は他の物理的特性を有し；
（ｂ）任意には、前記単離又は抽出された希少細胞を培養し；
（ｃ）任意には、前記単離又は抽出された希少細胞、又は任意には、培養された希少細胞を固定するか又は染色し；
（ｄ）希少細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はマイクロＲＮＡの免疫標識、及び／又はin situ分子分析、及び／又は分子分析により、及び／又は希少細胞タンパク質分子の分子分析により、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）からの単離又は抽出された希少細胞を分析することを含んで成る方法。
【請求項１６】
前記単離又は抽出された希少細胞が溶解され、そして（ｄ）前記溶解された希少細胞におけるＡＬＫ突然変異の有無を検出することを含んで成り、ここで前記工程がさらに、対象のための治療法を選択し、治療法の有効性を追跡し、又はＡＬＫ突然変異の有無に基づいて、治療法に対する耐性を検出することを包含し；
前記単離又は抽出された希少細胞が溶解され、そして（ｄ）前記溶解された希少細胞におけるＫ−ＲＡＳ及び／又はＥＧＦＲ突然変異の有無を検出することを含んで成り、ここで前記工程がさらに、対象のための治療法を選択し、治療法の有効性を追跡し、又はＫ−ＲＡＳ及び／又はＥＧＦＲ突然変異の有無に基づいて、治療法に対する耐性を検出することを包含し；
前記単離又は抽出された希少細胞が溶解され、そして（ｄ）前記溶解された希少細胞におけるＢ−ＲＡＦ及び／又はＨＥＲ２突然変異の有無を検出することを含んで成り、ここで前記工程がさらに、対象のための治療法を選択し、治療法の有効性を追跡し、又はＢ−ＲＡＦ及び／又はＨＥＲ２突然変異の有無に基づいて、治療法に対する耐性を検出することを包含し；又は
（ｄ）希少細胞の上皮から間葉への移行の状態を決定し；希少細胞が転移性又は侵襲性細胞に関連する遺伝子発現徴候を有するかどうかを決定するか；又は希少細胞が転移又は侵襲に関連する決定基を発現するかどうかを決定することにより、前記単離又は抽出された希少細胞を分析することを含んで成る、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
異なった時点で同じ対象から得られる生物学的サンプルを用いて、請求項１５又は１６に記載の方法を反復することを含んで成る個別化された医学療法であって、
前記生物学的サンプルが、希少細胞に関連する状態についての治療の間、又は希少細胞に関連する状態、障害又は疾患についての異なった治療レジメンの間、異なった点で、治療の前後、同じ患者から得られ；
前記個別化された医学治療がさらに、（ｅ）治療レジメンの有効性を決定するためにか、又は治療レジメンに対する耐性を検出するために、異なった時点で得られたサンプル間の希少細胞の数を比較することを含んで成り、ここで検出された希少細胞の相対数の低下が、治療レジメンの相対的有効性を示し、そして検出される希少細胞の相対数の上昇が、治療レジメンに対する耐性又は治療レジメンの無効力を示し；そして任意には、
（ｆ）（ｅ）に基づいて対象についての効果的な個別化された標的治療法を選択することを含んで成る治療法。
【請求項１８】
希少細胞の分子特性に対する候補薬物又は候補治療の効果を評価し、そして薬物又は治療を付与しない対照と比較して、対象における希少細胞の数を減じる薬物又は治療を選択し、そして対照と比較して、希少細胞の相対数を減じるか、又は希少細胞の分子又は免疫学的特性を改変する薬物又は治療を選択することを含んで成る、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
生物学的サンプルをフィルターに通して、そしてフィルター上の単離された希少細胞を回収することにより単離又は抽出された１又は２以上の希少細胞を含んで成る組成物であって、ここで前記フィルターは、希少細胞を保持するが、しかし他の種類の細胞の通過を可能にする、孔サイズ、孔密度又は他の物理的特性を有する、組成物。
【請求項２０】
体液から希少細胞を抽出又は単離するための１又は２以上のフィルター、
濾過の前に、体液を処理するための１又は２以上の緩衝液、希釈剤又は他の剤、
希少細胞が体液から抽出又は単離された後に、その希少細胞を懸濁し、洗浄し、又は他方では処理するための１又は２以上の緩衝液、
フィルターから単離又は抽出された希少細胞を、異なった支持体上にトランスファーするための１又は２以上のトランスファー緩衝液、
１又は２以上の細胞形態及び／又は細胞化学染色試薬又は他の細胞染料、又はそのための緩衝液、
希少細胞を免疫標識するための１又は２以上の抗体又は他の試薬、又はそのための緩衝液、
フィルター又は他の支持体上の希少細胞のin situ分析のための１又は２以上の試薬、
希少細胞を溶解するための１又は２以上の溶解剤又は溶解緩衝液、
希少細胞タンパク質の分子分析のための１又は２以上の抗体又は他の試薬、又はそのための緩衝液、
ＰＣＲ包含をする、希少細胞核酸の分子分析のための１又は２以上のプローブ、プライマー、ヌクレオチド、酵素又は他の試薬、
の少なくとも１つを含んで成るキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１２年５月２４日に提出された米国特許仮出願第６１／６５１，４３７号に対する優先権を３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下で主張するものであり、それは参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、濾過による生物学的サンプルからの希少細胞の単離、及びそれらの希少細胞及びそれらの成分の続く分析を包含する。希少細胞は、他の種類の細胞とは異なる特徴を有するか、又は他の種類の細胞とは異なる頻度で生物学的サンプルに出現する。このタイプの希少細胞は、希少腫瘍又は希少癌細胞、希少な種類の内皮細胞、希少胎児細胞、及び希少な感染白血球細胞（白血球）を包含する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の記載
希少細胞（rare cells）。希少細胞は、ヒト又は動物から得られた生物学的サンプルにおいて絶対的又は相対的低量で存在する。希少細胞の存在は、特定の疾患、障害又は状態と、しばしば相関する。例えば、希少細胞は、腫瘍又は癌を有する対象の血液に見出される。
【０００４】
希少細胞の種類（kinds of rare cells）。多くの様々な種類の希少細胞が存在し、そして希少細胞は非排他的には、次のものであり得る：
−上皮細胞及びそれらの前駆細胞、間葉細胞及びそれらの前駆細胞、成熟及び未成熟上皮細胞及びそれらの前駆細胞、繊維芽細胞及びそれらの前駆細胞、及びメラニン細胞及びそれらの前駆細胞；
−単球及びマクロファージ及びそれらの前駆細胞、活性化されたリンパ球及びそれらの前駆細胞、血漿細胞及びそれらの前駆細胞、好酸球及びそれらの前駆細胞、好塩基球及びそれらの前駆細胞、及び巨核球及びそれらの前駆細胞；
−任意のサブタイプの幹細胞；
−任意の起源及びタイプの胎児細胞、例えばリンパ系、赤血球、骨髄、幹胎児細胞、栄養膜細胞、例えば細胞栄養芽細胞及び合胞体、及び胚細胞；及び
−任意の起源及びタイプの及び任意の程度の分化の腫瘍細胞、例えば幹腫瘍細胞、腫瘍微小塞栓、凝集腫瘍細胞、任意のタイプの集団腫瘍細胞、及び任意の起源及びタイプの異型細胞。
【０００５】
いくつかの種類の希少細胞は、病理学的細胞である。そのような病理学的細胞の例としては、次のものを挙げることができる：腫瘍又は癌細胞、例えば肺癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胃癌、食道癌、及び任意のタイプの癌、肉腫、骨髄腫、黒色腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、白血病及びリンパ腫に由来するか又は起因する細胞。
【０００６】
希少細胞はまた、生物学的サンプル中の希少細胞の数が病理学的に高められるか、又は低められる状態にも関連している。それらは、次の細胞を包含する：
−癌を有する患者、又は心血管疾患、例えば心臓発作を有する患者の血液における病理学的に高い数値で存在する内皮細胞；
−細胞内ウィルス、細菌又は他の病原体、例えばＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＰＶ、赤痢菌、リーシュマニア（leishmania）、結核の桿菌、感染された単球、感染されたマクロファージ、感染されたリンパ球、活性化されたリンパ球を担持する細胞；及び
−遺伝子疾患に関連する突然変異を担持する細胞、例えば異数性２１、１３、１８、ＸＸＹ、ＸＯ、サラセミア、嚢胞性線維症、脊髄性筋萎縮症、デュシェーヌ病、ハンチントン病等により影響される胎児からの胎児細胞、及び遺伝子突然変異、又は特定の病理、例えばウィルス感染、炎症、慢性変性疾患、アルツハイマー病、糖尿病、代謝障害に対する感受性に関連する分子特性を担持する細胞。
【０００７】
希少細胞はまた、非病理学的状態、例えば妊娠にも関連している。
【０００８】
希少細胞は典型的には、体液における細胞集団中に、約１０3〜約１０10個の細胞、約１０4〜約１０10個の細胞、約１０5〜約１０10個の細胞、約１０6〜約１０10個の細胞、約１０7〜約１０10個の細胞、又は約１０8〜約１０10個の細胞当たり１個の細胞として存在することができる。希少細胞は典型的には、１ｍｌの体液中、５００個未満の細胞、２００個未満の細胞、１００個未満の細胞、５０個未満の細胞、又はさらに１０個未満の細胞として存在することをできる。例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、典型的には、血液１ｍｌ当たり、約６×１０6個の白血球、約２×１０8個の血小板及び約４×１０9個の赤血球間に、１〜１０又は１〜５００個のＣＴＣが存在することが知られている[７５]。
【０００９】
希少細胞を単離するための従来の方法
希少細胞は、生物学的サンプルから抽出又は単離され得る。抽出された細胞は、他の細胞からの単離を伴わないで、液体サンプルから抽出された細胞である。単離された希少細胞は、液体サンプルに存在する他の種類の細胞から単離された希少細胞である。生物学的サンプルから抽出された又は単離された非希少細胞に対する希少細胞の割合は変化し、従って、抽出された又は単離された希少細胞の純度は可変であり得る。
【００１０】
いくつかの方法が生物学的サンプルから希少細胞を抽出又は単離するために提案されており；特にいくつかの方法が血液から腫瘍又は胎児の細胞を単離するために報告されている。しかしながら、それらの方法は、（ｉ）最小の損失か、又はまったくの損失なしでの希少細胞の抽出又は単離、（ｉｉ）最小の選択バイアスか、又はまったくの選択バイアスなしでの希少細胞の抽出又は単離、及び（ｉｉｉ）多重分析方法へのそれらの容易な又は同時使用を可能にする手段での希少細胞の抽出又は単離の三重課題に対処していない。
【００１１】
サンプル中のいくらかの希少細胞を単に回収する方法は、続く分析方法における単離又は抽出された希少細胞の使用を定量的に損なう。それらの方法はまた、選択バイアスも導くことができる。
【００１２】
選択バイアスは、抽出又は単離方法がサンプル中の１又はいくつかのタイプの選択された希少細胞の損失を導く場合に生じる。例えば、抗上皮細胞抗体への希少腫瘍細胞の結合により血液サンプルから腫瘍細胞を単離する方法は、抗体に結合する上皮細胞抗原を発現しない希少腫瘍細胞の損失をもたらす。
【００１３】
厳しい抽出又は単離方法、又は他方で、単離された又は抽出された希少細胞の検出できる特性を変える方法は、続く分析方法へのそれらの使用を損なう。
【００１４】
希少細胞の診断的重要性。希少細胞の検出及び特性化、並びに診断及び治療におけるこれらの使用は、ヒト及び動物の臨床診療及び研究のためにますます重要であると予想される。希少細胞は、個別化された医学又は治療診断、すなわち患者の特定の遺伝子特性、及び患者の希少細胞の特性に基づいて患者のための個別化された診断療法への使用のために特に価値がある。この設定によれば、希少細胞は、それらの診断的同定及び広範な特性化を提供する複数の手法により分析される必要がある。例としては、癌に罹患した患者の血液から単離された希少細胞は、予後及び／又は治療診断値を有する遺伝子突然変異の検出を目的とした分子分析により特徴づけられ得る。しかしながら、遺伝子突然変異を標的とする分子分析のみが血液中の腫瘍細胞の有無を診断することを目的とした分析を伴わないで実施される場合、その試験の結果はバイアスにより影響される。事実であれば、所定の患者の血液から単離された希少細胞が腫瘍細胞を含まない場合、単離された希少細胞における遺伝子突然変異の不在が、循環腫瘍細胞における遺伝子突然変異の不在を示さないであろう。従って、生物学的サンプルから抽出された又は単離された希少細胞に対して実施される多重分析は、標的化された治療を選択するために使用される信頼できる情報を得るために、それらの有効性に従うために、及び可能性ある薬物耐性を検出するために必要とされる。
【００１５】
さらに、血液又は他の生物学的サンプルから抽出された又は単離された希少細胞は、非排他的には、外科的及び半外科的介入、生検、腹式穿刺、胸腔穿刺、穿刺、脊椎穿刺、羊水穿刺、絨毛膜標本採取及び臍帯穿刺を含む、侵襲性外科又は半外科方法を通して得られるサンプルに代わるものとして使用され得る。この設定によれば、希少細胞は、診断及び／又は治療診断使用並びに広範な分子及び／又は遺伝子特性化のために、複数分析により調べられる必要がある貴重な材料を提供する。
【００１６】
肺癌由来の希少細胞。肺癌は最も普及している新生物であり、且つ世界の腫瘍関連死亡の主要原因である[１−５]。切除される肺癌の管理及び転移性腫瘍のより効果的治療における最近の進歩にもかかわらず、肺癌患者の治療率は低いままである。しかしながら、肺癌における発癌性ドライバー変異の最近の発見及び標的療法の高まる開発が、進行期患者の新たな有望な結果を示している[６−８]。それらの療法の中で、ゲフィチニブ及びエルロチニブ、すなわち腺癌の１０〜２０％で活性化チロシン変異を示す、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して生じたチロシン−キナーゼ阻害剤が使用される[７，９]。つい最近は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）（２ｐ２３）及び棘皮動物微小管関連タンパク質様−４（ＥＭＬ４）（２ｐ２１）遺伝子を包含するゲノム変化が、ＡＬＫ小分子阻害剤（クリゾチニブ）に対して卓越した好反応を有する一部の肺癌患者に同定された[７，１０−１３]。ＡＬＫ−遺伝子再は配置が、ほとんどの腫瘍においてＫＲＡＳ及びＥＧＦＲ関連変異のないほとんどのシリーズによれば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣｓ）の１〜７％で見出された[１０、１２−１４]。固形又は腺房成長パターン、篩状構造、粘性細胞（印環細胞又は杯細胞）の存在、多くの脂肪外粘液、鱗状成長の欠如、及び重要な核多形性の欠如を提供する特定の組織学的特徴が、このサブセットのＡＬＫ−陽性肺腺癌を特徴づける[１４]。さらに、ＡＬＫ再配置を有する腫瘍の患者は、若く、ほとんどのシリーズにおいて、より頻繁には男性であり、そして禁煙者／かつての軽い禁煙者では決してなかった[１２、１４]。
【００１７】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、シリーズ及び方法によれば、肺癌患者の４０％以上で単離され得る[１５−１７]。さらに、疾患の後期及び初期の両段階での肺癌患者の予後は、ＣＴＣの存在及び数に相関する[１５、１６]。ＣＴＣは、異なった直接的及び間接的方法により単離され得る[１８、１９]。ゲノム変化、特に、ＥＧＦＲ遺伝子に生じる突然変異が、ＮＳＣＬＣ患者において単離されたＣＴＣに示されている[２０]。
【００１８】
発明者は、ＣＴＣが肺癌の手術を受けた患者において初期段階の疾患においてさえ、異なった方法により単離され得ることを、以前に示している[１５，２１]。さらに、ＣＴＣの存在及び数は、悪い予後に関連した[１５]。興味あることには、それらのサイズに従ってＣＴＣを単離した直接的方法（ＩＳＥＴ、上皮腫瘍の細胞のサイズによる単離）を用いることにより、発明者は、悪性特徴によるＣＴＣの良好な特性決定を可能にした悪性細胞病理学的基準を定義した「２２、２３」。さらに、ＮＳＣＬＣ患者からＩＳＥＴにより単離されたＣＴＣに免疫細胞化学（ＩＣＣ）アプローチを適用することにより、我々のグループ及び別のグループは、可変数のＣＴＣが上皮−間葉転換（ＥＭＴ）表現型を表示することを示した[１７、２１、２４、２５]。
【００１９】
肺癌患者から単離されたＣＴＣにおけるＡＬＫ−遺伝子再配置の評価はまだ、報告されたことはない。これは、肺生検及び腫瘍組織除去に関連する可能性ある病的状態を回避することにおける肺癌患者の非侵襲性プレ検診のための適切な臨床的目標である。
【００２０】
栄養膜性希少細胞。母体血液から栄養膜細胞を単離するための非侵襲性方法は、例えば、２０１０年１月２６日に発行された米国特許第７，６５１，８３８号に記載のように、報告されている。しかしながら、完全に非侵襲性で且つ安全（例えば、流産誘発の危険性を伴わないで）なアプローチを通して子宮頸サンプルから栄養膜細胞を入手する方法についての必要性がある。そのような方法は、遺伝的欠陥、疾患又は障害の非侵襲性出生前診断のためにこのアプローチが有用であるためには、妊婦から栄養細胞を一貫して回収しなければならない（Imudia AN, Kumar S, Diamond MP, DeCherney AH, Armant DR.Transcervical retrieval of fetal cells in the practice of modern medicine: a review of the current literature and future direction. Fertil Steril. 2010: 93:1725-30）。例えば、妊婦中の胎児のトリソミー２１の診断が、遊離ＤＮＡを抽出し、そして次の次世代配列決定により、遊離性胎児ＤＮＡを分析することにより達成され得る。遊離性胎児ＤＮＡの量が少な過ぎる場合、胎児異数性の有無についての信頼できる結果が得られず、従って、循環胎児細胞が非侵襲性出生前診断の実施のために分析され得る。米国特許第７，６５１，８３８号は、非侵襲性方法を通しての血液からの栄養膜細胞の単離を記載する。栄養膜細胞は、子宮頸サンプルから単離されるか又は抽出され得るが、しかしそれは、子宮頸サンプル、子宮頸粘液、又は粘膜から得られたサンプルから栄養膜細胞を、いかにして、一貫して且つ非侵襲的に（流産誘発の危険性なしに）入手するかは知られていない（Imudia AN, et al Fertil Steril. 2010: 93:1725-30）。
【００２１】
本発明者は、本明細書に開示される濾過及び他の単離及び分析方法を用いて、生物学的サンプル、例えば血液及び粘膜分泌物から希少細胞を抽出することにより、上記課題を解決しようとした。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
発明の簡単な要約
本明細書に開示される方法は、生物学的サンプルから希少細胞を抽出するか、又は単離するための最も適切な手段として濾過を用いることによりそれらの問題や課題を解決する。濾過によるそれらの抽出又は単離の後、希少細胞は、複数の又はさらに同時分析方法のために適切な状態で存在する。この方法は、生物学的サンプルから希少細胞を効果的に単離するか又は抽出し、希少細胞を同定し、そして次に、診断目的のために、及び治療を選択し、ガイドし、モニターするために、及び特に、標的化された治療を選択し、そしてそれらに対する応答及び／又は耐性をモニターするために、希少細胞を分子的に特徴づける。
【００２３】
本発明は、希少細胞を分析するか又は特徴づけるための種々のモードを包含する。それらは、（ｉ）診断又は治療診断目的のために、及び続く療法の選択のために、濾過により単離された希少細胞の定量及び定性分析への使用；（ｉｉ）濾過により単離された同じ希少細胞に対して実施される複数の分析を包含する「定性分析」、同じサンプルに対する複数の分析は、希少細胞が豊富でない状態、又は少数の希少細胞を含む生物学的サンプルに関連する問題を回避し；（ｉｉｉ）希少細胞の培養及びＲＮＡ分析を可能にする、濾過による固定されていない（新鮮な）希少細胞の単離を包含する「定性分析」；及び（ｉｖ）侵襲性癌の初期診断のためへの濾過により単離された循環腫瘍細胞の使用；及び（ｖ）遺伝子患者の非侵襲性診断のためへの子宮頸粘膜サンプルから単離された栄養膜細胞の使用を包含する。
【００２４】
その側面の１つによれば、本発明は、希少細胞に関連する状態、障害又は疾患を同定し、診断し、又は予後診断を提供する方法に関し、ここで前記方法は、（ａ）生物学的サンプルをフィルターに通し、そしてフィルター上のその単離された希少細胞を回収することにより希少細胞を単離するか又は抽出し；ここで前記フィルターは、希少細胞を保持するが、しかし他の種類の細胞の通過を可能にする、孔サイズ、孔密度又は他の物理的特性を有し；（ｂ）前記単離された又は抽出された希少細胞の細胞形態を決定し、そして／又は前記単離された希少細胞を免疫標識し、そして／又は前記単離された希少細胞上の分子分析を実施し；そして（ｃ）前記単離された又は抽出された希少細胞の細胞形態、及び／又は免疫標識及び／又は分析に基づいて、希少細胞の存在及び／又は数、及び／又は特性に関連する状態、障害又は疾患及び／又は段階を同定し、診断し、又は予後診断を提供することを含んで成る。この方法は、対象の生物学的サンプルにおける希少細胞を単離し、抽出し、濃縮するか、又は他方では、精製するために使用され得る。生物学的サンプルは、希少細胞を含むか又は含むことが疑われている何れかのものであり得る。それらは、血液又は他の細胞外流体、血液以外の体液、例えば羊水、房水及び硝子体液、胆汁、血清、血漿、母乳、脳脊髄液、耳垢（耳垢）、内リンパ、外リンパ、女性精液、胃液、粘液、例えば鼻水、痰及び粘膜から集められた他の材料、腹水、胸水、唾液、皮脂（皮脂）、精液、汗、涙、膣分泌、嘔吐物、及び尿を包含する。そのような生物学的サンプルは好ましくは、非侵襲的に得られるが、しかしながら、サンプルはまた、生検組織から、又は固体又は半固体組織サンプルから製造された細胞懸濁液から得られる。
【００２５】
生物学的サンプルは、興味ある対象、例えば癌又は腫瘍を有することが知られているか、癌又は腫瘍を有することが疑わしいか、又は癌又は腫瘍を進行する危険性がある対象から得られる。サンプルはまた、希少細胞に関連するか又は希少細胞により引起される任意の他の状態、障害又は疾患、例えば非癌性増殖性状態、障害又は疾患を有するか、有することが疑われるか又はその危険性を有することが知られている対象からも得られる。例えば、生物学的サンプルは、炎症性及び／又は変性状態、障害又は疾患を有するか、又は炎症性及び／又は変性状態、障害又は疾患を有する疑いがあるか、又は有する危険性がある対象から得られるか；又は生物学的サンプルは、心血管性状態、障害又は疾患を有するか、又は心血管性状態、障害又は疾患を有する疑いがあるか、又は有する危険性がある対象から得られるか；又は生物学的サンプルは、感染状態、障害又は疾患を有するか、又は感染状態、障害又は疾患を有する疑いがあるか、又は有する危険性がある対象から得られる。
【００２６】
上記開示される方法における段階（ａ）においては、希少細胞は、生物学的サンプルを、ポリカーボネートフィルター、ＰＥＴ(ポリエチレンテレフタレート)、又は他の適切な多孔性フィルター又は材料に通し、そしてポリカーボネートフィルター上の希少細胞を回収することにより、単離されるか、抽出されるか、濃縮されるか、又は他方では、精製され得る。
【００２７】
生物学的サンプルは、新鮮であり得、例えば対象から最近採取されたサンプル、貯蔵されたサンプル、例えば保存された、冷蔵された又は凍結されたサンプル、又は別の処理、例えば固定化を受けたサンプルであり得る。生物学的サンプルに依存して、粘液溶解剤、抗凝固剤、プロテアーゼにより処理され得るか、又はサンプルに希少細胞を保存する条件下で生物学的サンプルにおける特定タイプの細胞を選択的に除く溶解剤により処理され得る。
【００２８】
フィルターに通す前、生物学的サンプルは、希釈されるか又は他方では、処理され、希少細胞の単離、抽出、濃縮又は精製を促進され得る。
【００２９】
本明細書に記載される濾過方法により、単離され、抽出され、濃縮されるか、又は他方では、精製される希少細胞は、（ｂ）におけるように、さらなる分析の前に、又は培養のために、支持体に移され得る。
【００３０】
希少細胞は、濾過によるそれらの単離又は抽出の後、分子分析のために個別に収集され、又は濾過により生物学的サンプルから単離された又は抽出された複数の又はすべての希少細胞は、（ｂ）における分析のために収集され得る。さらに、単離された又は抽出された希少細胞は、（ｂ）における分析の前に、培養されるか、又は拡張され得る。例えば、希少細胞は、特定薬物又は剤、例えば生物、化学又は放射線剤の存在及び不在下で培養され、そのように処理されなかった希少細胞に比較し、薬物又は剤に対するそれらの応答が決定され得る。この方法は、特定患者から単離された希少細胞に標的化された治療法を選択し、そして治療に対する患者の応答をモニターするか、又は特定の薬物又は剤による治療に対する耐性の進行をモニターするために使用され得る。
【００３１】
（ｂ）における分析の前に、単離された又は抽出された希少細胞は、それらを単離するために使用されるフィルター上でin situ固定されるか、又は染色されるか、又はフィルターからの除去の後、固定されるか、又は染色され得る。例えば、単離された又は抽出された希少細胞は、フィルター又は別の支持体上での染色又は免疫染色の後又は前、in situ分子分析により（ｂ）において分析され得るか；又は（ｂ）単離された希少細胞（又は続いて、培養されるか又は増殖された希少細胞）が移されるフィルター又は別の支持体上での単離された又は抽出された希少細胞のin situ細胞形態分析を包含することができる。単離された又は抽出された細胞はまた、それらの細胞を支持体に固定する必要がない他の方法によっても分析されるか又は評価され得る。
【００３２】
本明細書に開示される方法によれば、（ｂ）希少細胞又は培養された希少細胞が適用されるフィルター又は別の支持体上の単離された又は抽出された希少細胞のタンパク質、核酸又は他の成分のin situ分子分析を含んで成ることができる。例えば、（ｂ）における分子分析は、単離された又は抽出された希少細胞のタンパク質、ペプチド又はポリペプチド；単離された又は抽出された希少細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ；又はポリペプチド又は核酸を除く、希少細胞の他の成分の分子分析を包含することができる。
【００３３】
本明細書に開示される方法はまた、さらに、（ｂ１）細胞形態分析、免疫標識、又はin situ分子分析の後、単離された又は抽出された希少細胞のイメージを可視化すること、及び／又は（ｂ２）細胞形態分析、免疫標識又はin situ分子分析の後、単離された又は抽出された希少細胞のイメージを記録することを包含することができる。
【００３４】
別の実施形態によれば、本発明は、（ａ）生物学的サンプルをフィルターに通し、そしてフィルター上のその単離された希少細胞を回収することにより希少細胞を単離するか又は抽出し；ここで前記フィルターは、希少細胞を保持するが、しかし他の種類の細胞の通過を可能にする、孔サイズ、孔密度又は他の物理的特性を有し；（ｂ）任意には、前記単離された又は抽出された希少細胞を培養し；（ｃ）任意には、前記単離された又は抽出された希少細胞、又は任意には、培養された希少細胞を固定するか又は染色し；（ｄ）希少細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はマイクロＲＮＡの免疫標識、及び／又はin situ分子分析、及び／又は分子分析により、及び／又は希少細胞タンパク質分子の分子分析により、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）からの単離された又は抽出された希少細胞を分析することを含んで成る、希少細胞の有無の検出方法に向けられる。この方法は、上記に記載される同じ種類の生物学的サンプルを使用し、そして上記に記載される生物学的サンプルの希釈又は前処理の後、希少細胞を単離するか又は抽出することができる。濾過の後、希少細胞はまた、固定されるか、又は新鮮のまま使用されるか、又は上記に記載される他の処理または段階にゆだねられ得る。段階（ｄ）によれば、単離され、濃縮され、抽出されたか、又は他方では、精製された希少細胞は溶解されるか、又は損なわれないまま使用され得る。
【００３５】
単離された又は抽出された希少細胞が溶解される場合、（ｄ）は、溶解された希少細胞における状態、障害又は疾患に関連する変異タンパク質及び／又は変異ＲＮＡ、及び／又はＤＮＡ変異を検出することを包含する。例えば、希少細胞は、希少細胞内に含まれるポリペプチド又は他の免疫学的成分を単離するために溶解されるか、検出される成分を単離するか、濃縮するか又は他方では、精製するために溶解されるか、又は分子分析のために核酸を単離するために溶解され得る。
【００３６】
この方法はさらに、溶解された希少細胞における変異ＤＮＡ、及び／又は変異ＲＮＡ及び／又は変異タンパク質の検出に基づいて、治療の有効性を評価するか、又は治療に対する可能性ある耐性を検出するために、個別化された医薬のための標的化された治療を選択することを包含する。例えば、希少細胞の溶解の後、（ｄ）は、溶解された希少細胞におけるＡＬＫ突然変異の有無を検出し、ここで前記工程がさらに、対象のための治療法を選択し、治療法の有効性を追跡し、又はＡＬＫ突然変異の有無に基づいて、治療法に対する耐性を検出し；溶解された希少細胞におけるＫ−ＲＡＳ及び／又はＥＧＦＲ突然変異の有無を検出し、ここで前記工程がさらに、対象のための治療法を選択し、治療法の有効性を追跡し、又はＫ−ＲＡＳ及び／又はＥＧＦＲ突然変異の有無に基づいて、治療法に対する耐性を検出し；又は溶解された希少細胞におけるＢ−ＲＡＦ及び／又はＨＥＲ２突然変異の有無を検出し、ここで前記工程がさらに、対象のための治療法を選択し、治療法の有効性を追跡し、又はＢ−ＲＡＦ及び／又はＨＥＲ２突然変異の有無に基づいて、治療法に対する耐性を検出することを包含する。
【００３７】
本発明はまた、異なった時点で同じ対象から得られる生物学的サンプルを用いて、上記に開示される工程を反復することを含んで成る個別化医学療法も企画する。例えば、希少細胞サンプルは、薬物又は他の剤による治療の前に、再び又は数度、その治療の間、及び再び治療が終結した後、対象から単離され得る。これは、治療の有効性の経時的評価を可能にする。
【００３８】
従って、生物学的サンプルは、希少細胞に関連する状態についての治療の間、又は希少細胞に関連する状態、障害又は疾患についての異なった治療レジメンの間、異なった点で、治療の前後、同じ患者から得られる。この個別化医学療法はまた、治療レジメンの有効性を決定するためにか、又は治療レジメンに対する耐性を検出するために、異なった時点で得られたサンプル間の希少細胞の数を比較し、ここで検出された希少細胞の相対数の低下が、治療レジメンの相対的有効性を示し、そして検出される希少細胞の相対数の上昇が、治療レジメンに対する耐性又は治療レジメンの無効力を示し；そして任意には、（ｆ）（ｅ）に基づいて対象についての効果的な個別化された標的治療法を選択することをさらに含んで成る（ｅ）及び／又は（ｆ）も包含することができる。
【００３９】
希少細胞の種類、同一性又は起源は、例えば、免疫学的に、それらのタンパク質、核酸、又は他の成分の染色により、物理的外観により、又は分子分析により決定され得る。例えば、（ｄ）は、希少細胞の上皮から間葉への移行の状態を決定することにより単離された又は抽出された希少細胞を分析し；幹希少細胞の状態を決定することにより単離された又は抽出された希少細胞を分析し；又は希少細胞が転移性又は侵襲性細胞に関連する遺伝子発現徴候を有するかどうかを決定するか、又は希少細胞が転移又は侵襲に関連する決定基を発現するかどうかを決定することにより、前記単離された又は抽出された細胞を分析することを含んで成る。
【００４０】
本明細書に記載される方法はまた、さらに、（ｄ）に基づいて希少細胞に関連する状態、障害又は疾患の早期診断を行うこと、あるいは前記状態の予後診断を行なうことも包含することができる。例えば、上記に記載される方法は、（ｄ）に基づいて希少細胞に関連する癌及び／又は侵襲性癌の早期診断の実施を包含することができ；癌及び／又は侵襲性癌が発生する器官の早期診断の実施を包含することができ；又は（ｄ）に基づいて希少細胞に関連する感染性状態、障害又は疾患の早期診断の実施を包含することができる。
【００４１】
本明細書に開示される方法は、さらに、希少細胞の分子特性に対する候補薬物又は候補治療の効果を評価し、そして薬物又は治療を付与しない対照と比較して、対象における希少細胞の数を減じる薬物又は治療を選択し、そして対照と比較して、希少細胞の相対数を減じるか、又は希少細胞の分子又は免疫学的特性を改変する薬物又は治療を選択することを含んで成る。
【００４２】
本明細書に開示される方法はまた、さらに、希少細胞に関連する状態、障害又は疾患を進行する対象の素因及び／又は危険性を評価することを含んで成り、ここで基線又は対照値に比較して、希少細胞の相対数の上昇が前記状態、障害又は疾患を進行する素因又は高められた危険性を示すか、又は基線又は対照値に比較して、希少細胞における分子又は免疫学的変化が、前記状態、障害又は疾患を進行する素因又は高められた危険性を示す。例えば、それらは、遺伝的状態、障害又は疾患；癌、腫瘍又は新生物状態、障害又は疾患；又は感染性状態、障害又は疾患を進行する対象の素因及び／又は危険性を評価することを含んで成る。
【００４３】
本明細書に開示される方法の他に、本発明はまた、体液から希少細胞を抽出するか又は単離するための１又は２以上のフィルター、濾過の前に、体液を処理するための１又は２以上の緩衝液、希釈剤又は他の剤、希少細胞が体液から抽出されるか又は単離された後、その希少細胞を懸濁し、洗浄し、又は他方では、処理するための１又は２以上の緩衝液、フィルターからの単離された又は抽出された希少細胞を、異なった支持体上にトランスファーするための１又は２以上のトランスファー緩衝液、１又は２以上の細胞形態及び／又は細胞化学染色試薬又は他の細胞染料、又はそのための緩衝液、希少細胞を免疫標識するための１又は２以上の抗体又は他の試薬、又はそのための緩衝液、フィルター又は他の支持体上の希少細胞のin situ分析のための１又は２以上の試薬、希少細胞を溶解するための１又は２以上の溶解剤又は溶解緩衝液、希少細胞タンパク質の分子分析のための１又は２以上の抗体又は他の試薬、又はそのための緩衝液、希少細胞核酸の分子分析（ＰＣＲを包含する）のための１又は２以上のプローブ、プライマー、ヌクレオチド、酵素又は他の試薬、の少なくとも１つを含んで成るキットにも向けられる。
【００４４】
本発明はまた、生物学的サンプルをフィルターに通して、そしてフィルター（前記フィルターは、希少細胞を保持するが、しかし他の種類の細胞の通過を可能にする、孔サイズ、孔密度又は他の物理的特性を有する）上の単離された希少細胞を回収することにより単離されたか、濃縮されたか、抽出されたか、又は他方では、精製された１又は２以上の希少細胞を含んで成る組成物にも向けられる。
【００４５】
濾過段階、及び濾過の後、実施される種々の種類の複数分析の両者を達成するための道具、装置及び／又は試薬を含むキットが、上記方法を促進するためにアセンブリーされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】図１は、Ａ（ケース１）及びＢ（ケース２）を示す。Ａ１及びＢ１。幾つかの膜補強（矢印）を伴って強く且つ細胞質染色（評点３＋）を示す循環腫瘍細胞（５Ａ４ｍＡｂを用いてのＡＬＫ免疫染色、免疫ペルオキシダーゼ、元の倍率×１０００；バー：１６μｍ）。Ａ２及びＢ２。二重カラー２ｐ２３  ＬＳＩ  ＡＬＫ遺伝子座特異的スプリットプローブによりハイブリダイズされた循環細胞核。２種のプローブ（３′、赤；５′、緑）は、赤及び緑シグナル（矢じり）の明確な分離を示し、これが２ｐ２３  ＡＬＫ遺伝子座における再配置を示す。プローブは、再配置を有さない核におけるオーバーラップするシグナルを与える（矢印）。単離された３′シグナル（赤）がまた観察される（アスタリスク）（元の倍率×１０００；バー：１６μｍ）。Ａ３及びＢ３。ＩＳＥＴ方法により単離された悪性細胞形態基準を示す循環細胞（元の倍率×１０００；ＭＧＧ染色；バー１６μｍ）。Ｃ。組織腫瘍において負のＦＩＳＨ  ＡＬＫ及び負のＩＨＣ  ＡＬＫを有する１人の患者。Ｃ１。染色を示さない循環腫瘍細胞（評点０）（５Ａ４ｍＡｂを用いてのＡＬＫ免疫染色、免疫ペルオキシダーゼ、元の倍率×１０００；バー：１６μｍ）。Ｃ２。二重カラー２ｐ２３  ＬＳＩ  ＡＬＫ遺伝子特異的スプリットプローブによりハイブリダイズされた循環細胞核。２種のプローブ（３′、赤；５′、緑）が、再配置のない核におけるオーバーラップするシグナルを与えた（矢印）。スプリットシグナルは、それらの腫瘍細胞には検出されなかった（元の倍率×１０００：バー：１６μｍ）。Ｃ３。ＩＳＥＴ方法により単離された悪性細胞形態基準を示す循環細胞（元の倍率×１０００；ＭＧＧ染色；バー：１６μｍ）。Ｄ。ＩＳＥＴ方法により単離されたＨ２２２１３細胞。Ｄ１。幾つかの膜補強（矢印）を伴って強く且つ細胞質染色（評点３＋）を示す５Ａ４  ｍＡｂを用いてのＡｌＫ免疫染色（免疫ペルオキシダーゼ、元の倍率×１０００）。Ｄ２。末梢血液中にスパイクされ、そしてさらに、ＩＳＥＴ方法により単離されたＨ２２２８腫瘍細胞系に対して二重カラー２ｐ２３  ＬＳＩ  ＡＬＫ遺伝子座特異的スプリットプローブを用いてのＦＩＳＨ。２種のプローブ（３′、赤；５′、緑）は、赤及び緑シグナルの明確な分離を示し（矢じり）、これは２ｐ２３  ＡｌＫ遺伝子座における再配置を示す。プローブは、再配置なしで核におけるオーバーラップシグナルを与えた（矢印）。単離された３′シグナル（赤）がまた観察される（アスタリクス）（元の倍率×１０００；バー：１６μｍ）。Ｄ３。血液濾過の後、ＭＧＧにより染色されたＨ２２２８細胞（元の倍率×１０００；ＭＧＧ染色；バー：１６μｍ）。
【００４７】
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ａ（ケース３）、Ｂ（ケース４）及びＣ（ケース５）を示す。Ａ１−Ｃ１。幾つかの膜補強（矢印）を伴って強く且つ細胞質染色（評点３＋）を示す循環腫瘍細胞（５Ａ４ｍＡｂを用いてのＡＬＫ免疫染色、免疫ペルオキシダーゼ、元の倍率×１０００；バー：１６μｍ）。Ａ２−Ｃ２。二重カラー２ｐ２３  ＬＳＩ  ＡＬＫ遺伝子座特異的スプリットプローブによりハイブリダイズされた循環細胞核。２種のプローブ（３′、赤；５′、緑）は、赤及び緑シグナル（矢じり）の明確な分離を示し、これが２ｐ２３  ＡＬＫ遺伝子座における再配置を示す。プローブは、再配置を有さない核におけるオーバーラップするシグナルを与える（矢印）。単離された３′シグナル（赤）がまた観察される（アスタリスク）（元の倍率×１０００；バー：１６μｍ）。Ａ３−Ｃ３。ＩＳＥＴ方法により単離された悪性細胞形態基準を示す循環細胞（元の倍率×１０００；ＭＧＧ染色；バー１６μｍ）。
【００４８】
【図２】図２は、悪性特徴を有する循環性非血液細胞、すなわちＣＯＰＤを有する患者においてＩＳＥＴ方法を用いて検出された循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）の細胞形態分析を示す。
【００４９】
（Ａ）及び（Ｂ）  進行した肺癌のＣＯＰＤを有する患者におけるＩＳＥＴ方法により単離され、そしてＭＧＧ染色プロトコルにより同定されたＣＴＣ。（Ａ）悪性細胞形態特徴を有する単離されたＣＴＣ（二重矢印：フィルターの孔）。（Ｂ）悪性細胞形態特徴を有する９種のＣＴＣから構成されるクラスター（ＣＴＭ）（元の倍率×１０００：バー：８μｍ；二重矢印：フィルターの孔）。
【００５０】
（Ｃ）及び（Ｄ）  ＣＯＰＤを有する患者に関してＩＳＥＴ方法を用いて、濾過された血液上に観察される、免疫染色されたＣＴＣ。（Ｃ）ＣＯＰＤを有する患者においてのみパン−サイトケラチン抗原を強く発現するＣＴＣ。（Ｄ）ＣＯＰＤを有する患者においてパン−サイトケラチン及びビメンチン抗原を同時発現するＣＴＣ（元の倍率×４００；バー：１６μｍ；パン−サイトケラチン抗体（ＫＬ１）による免疫ホスファターゼ染色及び抗ビメンチン抗体による免疫ペルオキシダーゼ染色；二重矢印：フィルターの孔）。
【００５１】
【図３】図３は、子宮頸サンプルにおける栄養膜細胞（Ａ）及び合胞体栄養細胞（Ｂ）のＩＳＥＴを用いての検出を示す。単離された細胞の胎児性質は、有益なマーカーＤ５Ｓ６１５（Ａ）及びＤ２１Ｓ１１（Ｂ）によるＳＴＲ−遺伝子型決定により確認された。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
発明の詳細な記載
サンプル。生物学的サンプルは、静脈及び動脈の血液、リンパ液、尿、精液、腹水、脳脊髄液、胸膜液、唾液、痰、鼻液、関節液、涙液、尿道及び尿管からの液体、胆液、膵液、胃液、腸液、直腸液、膣液を非排他的に含んで成る生体液、粘膜及び器官、例えば口、喉頭、咽頭、子宮、子宮頸部、膣、食道、胃、小腸及び大腸の粘膜から非排他的に集められたサンプル、乳房、前立腺、肝臓、肺、骨髄及び他の器官からサンプルを非排他的に含んで成る、生検又は他の外科的介入により非排他的に集められたサンプルを、非排他的に含んで成る。
【００５３】
フィルター及び濾過。希少細胞を単離するか又は抽出するために使用され得るフィルターは、定義される希少細胞の抽出又は単離に適合される厚さ、孔サイズ及び密度を有する、ポリカーボネート、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）又は他の材料の膜を、非排他的に含んで成る。公開米国特許出願第２００９／０２２６９５７号においてPaterlini−Brechotにより開示される、フィルター、濾過装置、濾過方法、緩衝液及び他の用品は、参照により本明細書に組込まれる。
【００５４】
それらは、（ｉ）少なくとも１つの基本的濾過領域を含むフィルターの使用を包含する方法、ここで各基本的濾過領域が限定された表面積を有し；及び（ｉｉ）前記各基本的濾過領域及び基本的濾過領域の数が濾過される液体のタイプ、分離される生物学的粒子のタイプ、及び濾過される液体の体積の関数として選択されることを包含する。
【００５５】
従って、本発明は、精製又は分析のために及びたぶん、診断のために、生物学的粒子及びそれらを含む流体を分離する方法に関し、分離される生物学的粒子の性質に適切な多孔性のフィルターを通して少なくとも１つの垂直濾過段階を含んで成り、結果的に、前記生物学的粒子がフィルターにより保護され、ここで少なくとも１つの基本的濾過域を含んで成るフィルターが使用され、各基本的濾過域は制限された表面を有し、そして各基本的濾過域の表面及び基本的濾過域の数が、濾過される流体の性質、分離される生物学的粒子の性質、及び濾過される流体の体積に従って選択されることを特徴とする。
【００５６】
前記方法の各基本的濾過域は、０．６ｃｍ〜３ｃｍの直径を有するディスクの表面に等しい表面を有し、そして基本的濾過域の数は、濾過域に対する濾過される流体の体積の比率が４０ｍｌ／ｃｍ2未満、及び好ましくは０．１４ｍｌ／ｃｍ2以上になるよう選択される。
【００５７】
好ましくは、各基本的濾過域が、０．８ｃｍ以上か又は０．８ｃｍに等しい直径を有するディスクの表面に等しい表面を有する。
【００５８】
好ましくは、フィルターは、３μｍ〜１００μｍのサイズに調整された孔、及び３×１０3〜５×１０6個の孔／ｃｍ2の孔密度を有する。
【００５９】
好ましくは、濾過は、０．０５バール〜１バールへの圧力の低下により、場合によっては、１バール未満への圧力の上昇により実施される。
【００６０】
濾過を行うためには、基本的濾過域を配置することにより、濾過残留物を分析する手段に関連する適切なバッジを形成するフィルターを用いることが好ましい。
【００６１】
好ましくは、フィルターを形成するバッジは、濾過される液体を含み、そして減菌するか、又はＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質を消化する酵素からそれを開放するために、使用の前に、処理される少なくとも１つのチャンバーを包含する使い捨ての濾過モジュールに組込まれる。
【００６２】
分離されるべき生物学的粒子は、例えば細胞である。この場合、細胞含有流体の濾過の前に、濾過のための流体サンプルは、細胞含有液体、例えば生物学的流体、又は細胞培養物のサンプルから、分離される細胞により予備富化することにより、及び／又はそれを希釈することにより分離され得る。
【００６３】
細胞を含む流体は血液であり得、そして好ましくは、この場合、フィルターは５μｍ〜２５μｍの調整された孔を有する。
【００６４】
前記工程は、生物学的流体、例えば血液、尿、腹水、脳脊髄液、乳、胸膜溢出、子宮頸部を洗浄するための流体、生検、外科的な方法又は口内洗浄により得られる細胞懸濁液における、診断目的のための細胞、例えば腫瘍、胎児、内皮、線維芽細胞、筋肉、神経又は単球細胞、細胞株、臓器細胞、前駆体又は造血細胞の検出のために、又は動物又は植物細胞の検出のために使用され得る。
【００６５】
本発明はまた、前記工程を実施するための濾過モジュールにも関し、ここで前記モジュールは、少なくとも１つの開口を含むベースによりその下部に閉じられた少なくとも１つの区画を含むチャンバーブロック；少なくとも１つの穴を含むフィルター支持ドロワー、各穴はチャンバーブロックにおける開口部に対向して配置され；チャンバーブロックの下面と支持ドロワーとの間に把持されるフィルターを含んで成る。
【００６６】
このモジュールにおいては、チャンバーブロックのベースにおける各開口の寸法、及びフィルター支持ドロワーにおける各穴の寸法は、チャンバーブロックのベースにおける開口部、フィルター支持ドロワーにおける関連する穴から成る各対が限定された表面の基本的濾過域を定義し、そしてそこで、各区画の有用な体積が区画ベースに位置する基本的濾過域の数に比例するようにされる。
【００６７】
好ましくは、基本的濾過域の表面は、０．６ｃｍ〜３ｃｍの相当直径を有するディスクのその域に等しく、そして区画のベースの含まれる開口部の表面の合計に対する各区画の有用な体積の比率は、４０ｍｌ／ｃｍ2未満、及び好ましくは０．１４ｍｌ／ｃｍ2以上、及び前記範囲のすべての中間値及び下位範囲である。
【００６８】
好ましくは、チャンバーブロックのベースにおける少なくとも１つの開口部の寸法及びフィルター支持ドロワーにおける対応する穴の寸法は、対応する基本的濾過域の表面が直径０．８ｃｍのディスクのその域以上か又は等しいようにされる。
【００６９】
好ましくは、少なくとも１つの区画は少なくとも１つの取り外し可能な分離壁により部分区画に分割され、その結果、少なくとも１つの部分区画は、そのベースに、少なくとも１つの開口部を含み、そして部分区画のベースにおける開口部の表面の合成に対する前記部分区画の比率は、４０ｍｌ／ｃｍ2未満、及び好ましくは０．１４ｍｌ／ｃｍ2以上、及び上記範囲のすべての中間値及び下位範囲である。
【００７０】
好ましくは、濾過モジュールは、チャンバーブロックのベースと、チャンバーブロックのベースにおける穴に対応する少なくとも１つの穴を含むフィルターとの間に配置される溝付き密封ジョイントを含み、前記穴は少なくとも１つの突出するリップにより囲まれている。
【００７１】
さらに、濾過モジュールは好ましくはまた、フィルター支持体と、そのフィルター支持体における穴の反応側に少なくとも１つの開口部を含むフィルターとの間にプレートジョイントも含む。
【００７２】
フィルターはバッチを形成することができ、その中心部は少なくとも１つの多孔性領域を含み、そしてその周囲はフィルター支持体上でのその位置を割出すための手段を含むフレームを形成する。
【００７３】
割出し手段は例えば、フィルター支持体上に提供される、対応する直径のスタッズと協力するよう企画された異なった直径の少なくとも２つの穴である。
【００７４】
好ましくは、フィルター中の少なくとも中心多孔性部分は、１ｃｍ2当たり３μｍ〜１０μｍの孔３×１０3〜５×１０6個を含む。すべての中間孔サイズ値及び下位範囲は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、８７．５、９０、９２．５、９５、９７．５及び１００μｍを包含するこの範囲内に企画される。すべての中間孔密度範囲及び下位範囲はまた、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ｘ１０3、１０4、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ｘ１０4、１０5、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ｘ１０5、１０6及び１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ｘ１０6個の孔/ｃｍ2内に企画される。
【００７５】
好ましくは、濾過モジュールはまた、区画の上部開口を閉じるための少なくとも１つのストッパーも含む。
【００７６】
好ましくは、チャンバーブロックは、その下部で、外側に延び、そして少なくとも１つのアセンブリーピンと協力し、フィルター支持体とチャンバーブロックとの間へのフィルターの把持を可能にするリムを含み、前記アセンブリーピンはチャンバーブロックのリム上に延びる破断できる端を含む。
【００７７】
好ましくは、すべてのそのパーツは、滅菌操作に適し、そしてＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ又はプロテイナーゼを含まないようにそれらをするよう企画された材料から製造される。
【００７８】
最終的に、本発明は、フィルター支持体とチャンバーブロックとの間のフィルターに対して圧力をかけるよう企画された、開放位置と把持位置との間を移動できる少なくとも１つのカムを含む、濾過機上に濾過モジュールを保持するための濾過モジュール支持体に関する。
【００７９】
好ましくは、少なくとも１つのカムは、濾過モジュールが破断できる一端に少なくとも１つの固定ピンを含む場合、少なくとも１つの固定ピンの端が、少なくとも１つのカムによりフィルターに圧力が適用される場合、切断されるように企画される。
【００８０】
支持ブロックは、濾過機の一部を形成する。
【００８１】
好ましくは、濾過モジュールはまた、支持ブロックに関連して濾過モジュールの方向を指図するために、支持ブロック上の補完的手段と協力するよう企画された手段も含み、そして支持ブロックは、支持ブロックに関連して濾過モジュールの方向を割出すために、濾過モジュール上の手段と協力するよう企画された手段を含む。
【００８２】
本発明に従って、流体に含まれる生物学的粒子を単離するための方法は、単離される粒子の性質に適合する特性を有するフィルター上で流体を濾過することから成る。生物学的粒子は、細胞、赤血球細胞、血小板凝集体、フィブリン又は組織廃棄物であり得る。濾過される流体は特に、処理の前に、濾過操作による単離の促進を受けた生物学的流体のサンプルから得られる流体である。後でより詳細に説明されるであろうこの事前操作は、特に単離される粒子が細胞である場合、一般的に、１又は複数の以下の操作を含む：単離される細胞を前富化するよう企画された化学的処理、希釈、単離される細胞の濾過による分離を促進するよう企画された化学的処理。
【００８３】
同様に、濾過のための流体のサンプルを調製するためのそれらの条件として、本発明者は、検出される細胞を単離する方法において良好な信頼性を達成するためには、濾過される流体の体積に、フィルターの特定の特性を適合させることが必要であることを注目した。特に、フィルターは、基本的濾過域に分割されるべきであり、各域は０．６ｃｍ〜３ｃｍ、及び好ましくは０．８ｃｍ以上及びさらに良好には、０．８ｃｍ〜１．５ｃｍ、及び前記範囲のすべての中間値及び下位範囲の直径のディスクの表面に等しい表面を有する。基本的濾過域は例えば、ディスの形状で存在することができる。
【００８４】
さらに、各基本的濾過域を通して通過する、濾過される流体の量は、１ｍｌ〜１００ｍｌであり、そして好ましくは、この体積は８ｍｌ〜１５ｍｌである。それらの範囲は、上記範囲中のすべての中間値を及び下位範囲を包含する。
【００８５】
従って、特定サンプルを濾過するためには、装置は、濾過されるサンプルの体積に比例してフィルター上の多数の基本的濾過域を定義するために使用されるべきである。
【００８６】
一般的に、濾過されるサンプルの体積は、一方では、最初に採取され得る生物学的流体の体積、及び他方では、分離される生物学的粒子の性質に特に依存する可能な希釈に依存する。採取される体積は特に、採取される流体の性質及び流体が採取される患者の年齢に依存する。当業者は、採取される流体の性質及び流体が採取される患者に依存して採取される体積をいかにして決定するかを知っている。
【００８７】
希釈は、採取される流体に見出され得る、単位体積当たりの粒子の数に特に依存する。実際、濾過が満足のゆく条件下で実施される場合、濾過される流体の単位体積当たり単離される粒子の数は、フィルターの目詰まりを避けるために大き過ぎるべきではない。さらに、工程が多数の細胞と共に混合された特定の希少細胞の検出を意図するものである場合、単離体積当たりの細胞の数は、フィルターに求められる細胞を見つける合理的可能性を達成するために、単位体積当たりの細胞の数は、少な過ぎるべきではない。当業者はまた、問題の流体の性質及び求められる細胞の型に依存して、それらの希釈率をいかにして決定するかを知っている。
【００８８】
患者から採取される生物学的サンプルは例えば、血液、尿、腹水、脳脊髄液、乳又は胸膜溢出であり得；それはまた、子宮頸部の洗浄からの流体、又は患者からの生物学的サンプルの採取に起因する任意の他の流体でもあり得る。
【００８９】
分析方法はまた、患者から直接採取されなかったサンプル、及び例えば、スメア又は生検、又はヒト又は動物組織サンプルから製造された細胞培養培地、又はさらに、ヒト又は動物細胞系培養培地から採取されたサンプルにおける細胞を調べるためにも使用され得る。
【００９０】
採取される生物学的流体が血液である場合、採取される量は一般的に、１ｍｌ〜２０ｍｌであり、そして血液は、それらの条件下で、１〜２０の基本的濾過域上で濾過される、濾過のための流体のサンプルを得るために、１：５〜１：２０に変化する比率で希釈される。それらの値は、上記範囲のすべての中間値及び下位範囲を包含する。
【００９１】
すべての他の流体に関しては、サンプルはほぼ５ｍｌ〜１０ｍｌであり、そして１：２〜１：１０の比率で希釈されるか、又はそれらは希釈され得ない。それらのサンプルは、特に１：１０の比率で希釈された１０ｍｌのサンプルである場合、５又はそれ以上の多くの数の基本的濾過域上で濾過される。それらの値は、上記範囲のすべての中間色を包含する。
【００９２】
求められる細部は特に、希少細胞、例えば腫瘍細胞、胎児細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋細胞、神経細胞、単球細胞、細胞株、器官細胞（肝臓、腎臓等）、前駆体及び造血細胞である。例として与えられるこの列挙は、限定的ではない。
【００９３】
濾過の前に、細胞は、密度勾配型の処理により又は対象でない細胞の溶解により、又は免疫介在方法により、正又は負のスクリーニングにより、増殖を求められる細胞を刺激することにより、等により前−富化され得る。
【００９４】
このリストは限定的ではなく、そして当業者は、単離しようとする細胞の性質に適した前−富化方法を、いかにして選択するかを知っている。
【００９５】
同様に、前−富化処理として、細胞を含む流体サンプルは、濾過操作により分離を促進するために、求められる細胞の性質に従って試薬により処理され得る。
【００９６】
処理の目的は、生物学的サンプルが血液を含み、そして例えばサポニン及びＥＤＴＡから成る場合、赤血球細胞を溶解し、そして血液を抗凝固することであり得る。
【００９７】
処理の目的はまた、濾過が固定された細胞を単離することを意図する場合、例えばホルムアルデヒドの添加により、有核細胞を規定することであり得る。この場合、処理の目的は、富化を可能にすることである。
【００９８】
濾過が固定されていない細胞の単離を意図する場合、生物学的サンプルは、試薬により、及び生物学的膜を剛性に一時的にするために適切な条件下で（例えば、多糖、ＤＭＳＯの添加による、冷却することにより、等により）、処理され得る。
【００９９】
当業者は、求められる細胞の性質に従って最も適切な方法をいかにして選択するかを知っている。
【０１００】
次に、求められる最終物への濾過を適切にするために、希釈され、前富化されるか、又は試薬により処理され得る生物学的サンプルは、１μｍ〜１００μｍのサイズの調整された、そして分離される粒子の性質に適切なポリカーボネート又は同等の材料から製造されたフィルターを通して濾過される。すべての中間値及び下位範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、８７．５、９０、９２．５、９５、９７．５及び１００μｍを包含するこの範囲内に企画される。このサイズは好ましくは、３μｍ〜２５μｍであり、そして特に、腫瘍細胞又は上皮細胞が単離される場合、約８μｍである。
【０１０１】
孔密度は、分離されるべき粒子の性質に適合される。好ましくは、フィルターの孔密度は、５×１０3〜５×１０6個の孔／ｃｍ2及びより良好には、５×１０4×〜５×１０5子の孔／ｃｍ2である。それらの範囲内のすべての中間値及び下位範囲は、以下の特定の値と同様に企画される：１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ｘ１０3、１０4、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ｘ１０4、１０5、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ｘ１０5、１０6及び１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ｘ１０6の孔/ｃｍ2。
【０１０２】
濾過は、０．０５バール〜１バール、及び好ましくは、ほぼ０．１バールの圧力の低下で実施される。この範囲のすべての中間値及び下位範囲は、次の範囲内に企画される：０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０及び１．０バール。濾過はフィルター上に位置する流体に対する圧力のわずかな上昇により助けられる。しかしながら、この圧力の上昇は、１バール末端である。それらの条件は特に、細胞分離のために適切である。
【０１０３】
この工程は、異なった目的のために、例えば生物学的流体中の懸濁下での希少細胞を調査するために、診断を可能にするために、又は溶液中の要素の良好な状態での分析を可能にするために流体を精製するために、使用され得る。
【０１０４】
前記工程が細胞を調査し、そしてそれらを分析するために使用される場合、濾過の後、流体を濾過するために使用されたフィルターは回収され、濾過域が明確に同定され、そしてリンクが、それらの濾過域と、濾過されたサンプルとの間で行われることを確認する。次に、フィルターは、濾過域で回収することが可能であった細胞を分析するために使用される。
【０１０５】
それら自体知られているそれらの分析方法は、例えば次のタイプのものである：細胞学的染色（ヘマトキシリン、エオシン、等）、免疫標識（免疫組織化学、免疫蛍光）ＰＮＡ、ＦＩＳＨ，ＰＲＩＮＳ、ＰＣＲin situ又は他の分子技法、分光光度法、レーザー顕微解剖、続くＤＮＡ（ＤＮＡ抽出、遺伝子型判定、定量的ＰＣＲ、突然変異分析、ＣＧＨ（比較ゲノムハイブリダイゼーション））、ＲＮＡ(転写体のＰＣＲによる抽出及び分析、定量的ＰＣＲ)及びタンパク質（タンパク質抽出、マイクロ配列決定、等）に対する標的化された分子分析。
【０１０６】
分子分析は、フィルター上に保持され、そしてサザン技法に類似する技法によりスライド上に転置され、定義される基準（異なった性質をマーキングするか又はそれを行わないで、細胞の形態学的特徴）に従って、フィルター又はスライドから、それぞれ顕微解剖され、そして個々の又はプールされた分析にゆだねられる、富化細胞に対して実施され得る。
【０１０７】
細胞はまた、それらのＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を抽出し、そして分析するために、適切な緩衝液により洗浄することにより、フィルターから分離され得る。
【０１０８】
次に、濾過により単離される要素は、顕微鏡により試験され、そしてフィルター上に得られるイメージの分析が手動的に、又は自動化された手段、特にイメージ分析装置を用いることにより実施され得る。
【０１０９】
前記工程はまた、生物学的流体、例えば分析されるべきＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質を、溶液に含む尿を精製するためにも使用され得る。流体を精製する目的は、分析を妨げる可能性ある、流体に存在するすべての生物学的粒子を排除することである。この場合、フィルターは保持されず、そしてそれは分析される、濾過された流体である。
【０１１０】
この濾過方法、及びサンプル調製及び分析方法は、前に言及されたように、たぶん極めて少量で特定の細胞の存在に関連する病状を検出する診断のために使用され得る。特に、前記工程は、外科手術の間、患者の血液中に放出された可能性がある癌細胞を検出するために使用され得る。当業者は、特定の病状を検出するためにどんな細胞を調査するかを知っている。
【０１１１】
支持体。支持体は、非多孔性固体支持体、例えばスライド、ペトリ皿又は培養ウェル、又は次の任意のタイプの培養、処理又は分析のために細胞の支持体として使用され得るガラス又はプラスチック、又は任意の固体材料から製造される任意の他の支持体を表す：タンパク質、ＲＮＡ又はＤＮＡ分析を包含する、細胞形態、免疫標識、in situ分子分析、及びタンパク質、ＲＮＡ又はＤＮＡ分析を包含する、分子分析のための細胞の収集。
【０１１２】
濾過。希少細胞を抽出し、単離し、精製し、又は濃縮するための生物学的サンプルの濾過は、定義された希少細胞の抽出又は単離のために適合された孔のサイズ及び密度を有する、ポリカーボネート、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、又は他の材料による膜を非排他的に用いることにより、及び希少細胞を単離するか又は抽出するためにフィルター下に適用される圧力の降下を用いることにより実施され得る。
【０１１３】
生物学的サンプルの垂直濾過による細胞の抽出は、さらなる分析のために、例えば希少細胞の検出及び特性決定、及び診断のために、それらの積層化を可能にし、そしてそれらを利用可能にする。生物学的サンプルの垂直濾過による細胞の単離は、それらの細胞の富化及びさらなる分析、例えば希少細胞の検出、特性決定及び／又は診断のために、それらを利用可能にするために、より少ない細胞からの希少細胞の単離を可能にする。典型的には、血液の濾過による希少細胞の単離は、それらのサイズが６〜９ミクロンであるように、体内の最小細胞である、大部分の好中球、及び成熟リンパ球及び赤血球（赤血球は核を含まず、従って、それらは真の細胞とは見なされず、そして一般的に、濾過の前に、溶解される）の分離、及び好中球及び成熟リンパ球よりも大きな細胞、例えば活性化リンパ球、単球、マクロファージ、幹細胞、腫瘍細胞、癌細胞、腫瘍微小塞栓、成熟及び未成熟内皮細胞、上皮細胞、好中球及び成熟リンパ球以外の間葉系細胞、 メラノサイト、骨髄芽球、前骨髄球、巨核芽球、巨核球、及び一般的に、好中球及び成熟リンパ球ではない体内のすべての細胞のフィルター上での保持を可能にする。さらに、血液の濾過による希少細胞の単離はまた、フィルターの反対側に、濾過により単離された希少細胞とは異なる、生物学的サンプル中の血漿及び白血球、又は他の成分の収集を可能にする。血清は、遊離ＤＮＡ及びＲＮＡ、及びタンパク質、例えば癌患者における遊離腫瘍ＤＮＡ及び腫瘍ＲＮＡ、及び腫瘍マイクロＲＮＡ及びタンパク質、及び妊娠女性における遊離胎児ＤＮＡ、胎児ＲＮＡ及び胎児マイクロＲＮＡ、及びタンパク質を含む。用語「遊離」（ｆｒｅｅ）とは、「外部細胞」（outside cells）、従って血漿における遊離核酸を示す。遊離腫瘍DNAは、癌患者における腫瘍変異の診断のために使用され、そして遊離胎児ＤＮＡは、異数性及び他の遺伝性疾患、胎児の性別、ＲｈＤ状態、父性テストの出生前診断のために使用される。希少細胞及び血漿と同時での白血球の収集は、個人の遺伝的背景についての情報を分析し、そして得るために有用であり得る。遊離腫瘍ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はタンパク質は、腫瘍マス及び／又は腫瘍転移及び／又は循環腫瘍細胞区画からの溶解された、たぶんアポドーシス腫瘍細胞に由来すると思われる。遊離腫瘍ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はタンパク質の分析は、血漿からＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はタンパク質を抽出し、そして分子分析により突然変異を探すことにより行われる。例えば、肺癌患者におけるＫ−Ｒａｓ突然変異の存在のすばやい分析は、血漿から遊離ＤＮＡを抽出し、そしてＰＣＲ、ＣａｓｔＰＣＲ、Ｃｏｋｄ  ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ及び他の標的分子試験により突然変異誘発されたＫ−Ｒａｓ分子を探すことにより行われ得る。従って、循環腫瘍細胞におけるＫ−Ｒａｓ変異の分析は、血漿ＤＮＡにおけるＫＲａｓ変異の分析に関連付けることができる。さらに、その研究は、安価である、血漿におけるＫＲａｓ変異の調査で開始することができ、そして変異が見出されない場合、それは、それよりも高価である、循環腫瘍細胞中のＫＲａｓ変異の調査を続けることができる。
【０１１４】
胎児の性別の診断は、血漿ＤＮＡの分析により、容易に且つ低費用で行われる。しかしながら、血漿中の遊離胎児ＤＮＡの量が低い場合、Ｙ特異的分子分析による負のシグナルは、信頼できる結果の入手を可能にしない。この場合、より高価な、循環胎児細胞の分析を加える可能性が、胎児の性別の信頼できる診断の入手を可能にするであろう。
【０１１５】
ＨＢＶ、ＨＣＶ又はＨＩＶ、又は細菌又は他の病原体により引起されるそれらの感染性患者の検出は、血漿から分子、例えばＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ、及び／又はマイクロＲＮＡ及び／又はタンパク質を検出し、そしてウィルス又は細菌又は他の病原体ＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ、及び／又はマイクロＲＮＡ及び／又はタンパク質の存在を、分子分析により探すことにより実施され得る。補完的試験として、病原体に対して特異的なＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ、及び／又はマイクロＲＮＡ及び／又はタンパク質が、循環希少細胞において探求され得る。
【０１１６】
特定の場合、希少細胞中の変異又は感染分子、血漿中の変異又は感染分子、及び個人のゲノム特徴に対する情報を、同時に入手することも有用である。この場合、循環希少細胞を単離するための濾過の後、血漿及び白血球の収集が非常に有用である。例えば、感染した患者においては、血漿中の循環希少細胞における感染分子、例えばＴＢＣ細胞からのＤＮＡを見出し、そして白血球中の遺伝的感受性形質を見出すことが有用である。例えば、遺伝的起源の癌患者においては、血漿及び白血球中の循環腫瘍細胞における突然変異、例えばＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を見出すことが有用であろう。例えば、妊婦においては、男性胎児のみに影響を与える遺伝病であるデュシェンヌ病の存在について胎児細胞中の希少細胞を分析し、胎児が男であるかどうかを知るために遊離胎児ＤＮＡにおけるＹ配列を見出し、そして母性白血球中のキャリヤー状態を見出すことが有用である。例えば、妊婦においては、後期発生の優勢遺伝病であるハンチントン病の存在について循環胎児希少細胞を分析し、遊離胎児ＤＮＡ中のハンチントン変異配列を見出し、そして母性白血球中のハンチントン変異の存在を見出すことが有用である。実際、変異は優性であるので、両親のいずれか１人における変異の存在は、影響を受ける胎児の５０％に危険性を与える。遺伝子分析が、胎児に影響があることを発見した場合、変異が母性白血球の分析を通して、母親により運ばれて来たかどうかを調べることは有用であろう。
【０１１７】
それらの例は、排他的ではない。一般的に、循環希少細胞を単離し、そして即時分析、又は貯蔵及び後での分析のために血漿及び白血球を同時に収集する可能性は、非侵襲性個別医療において高い可能性及び価値を有する。
【０１１８】
濾過される生物学的サンプルへのフィルターの孔サイズの適合は、識別サイズの細胞、例えば腫瘍微小塞栓及び合胞体栄養細胞、細胞及び多核細胞群、及び個々の細胞よりも大きなサイズを有する細胞材料の選択的単離、従って、２０−２５ミクロンよりも大きな直径の孔を用いての濾過による、高純度（白血球及び他の小細胞による低い汚染か、又は汚染が存在しない）での血液又は他の流体からのそのような材料の効果的単離、従って、濾過による、すべての白血球及び赤血球の排除を可能にする。
【０１１９】
同様に、所定の腫瘍型の及び／又は所定の患者における特定サイズの腫瘍細胞を研究することにより、及び／又は単離される特定サイズの特定希少細胞を研究することにより、単離された腫瘍及び／又は希少細胞の回収率及び純度を最大するよう、孔サイズ、孔密度及び他の化学的又は物理的特徴を適合することが可能である。例えば、胎児細胞サイズは、１０〜３０ミクロンで変化できる。合胞体栄養細胞サイズは一般的に、１００ミクロン以上である。丸くはないが、しかし細長い細胞である成熟内皮細胞のサイズは、１０〜２０ミクロン当たり約４０又は５０ミクロンである。従って、興味ある孔サイズ範囲は、５〜３０ミクロンであり、そして大きな孔サイズは、すべての白血球の排除を可能にする。実際、マイクロファージ及び単球である大きな白血球は、一般的に２０ミクロンよりも大きくないサイズを有する。孔のサイズは、孔密度に非常に密接に適合されるべきであり、そしてフィルター材料は、希少細胞の収集を可能にする孔間でなければならないので、１ｃｍ２あたり０．５〜２．０Ｅ５の孔の範囲で存在する。
【０１２０】
腫瘍細胞サイズ。定義による腫瘍細胞は、それらはタンパク質を生成し、そして増殖できるので、「休止細胞」（resting cells）ではなく、従って、それらのクロマチンは開放されており、そして大多数（数として）の白血球であり、そして従って腫瘍細胞よりも小さい、成熟リンパ球及び成熟好中球のような成熟白血球のクロマチンのように決して圧縮されない。個々の腫瘍細胞サイズは、腫瘍型に依存して、１０ミクロン〜５０ミクロン又はそれ以上に変化することができる。小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）由来の腫瘍細胞のサイズ：リンパ球のサイズの１．５〜３倍（１２〜２４ミクロン）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）由来の腫瘍細胞のサイズ：リンパ球のサイズの３倍以上（２４ミクロン）。腫瘍微小塞栓サイズは一般的に、１００ミクロンよりも大きい。
【０１２１】
濾過の利点。濾過による希少細胞の抽出又は単離は、他の抽出／単離方法よりもいくつかの利点を有する：
それは、非常に高い感度で希少細胞の単離、例えば１ｍｌの血液において、濾過の前に、スパイクされ得、従って数百万の白血球及び数十億の赤血球と共に混合され得る１個の希少細胞の収集を可能にする。
【０１２２】
それは、希少細胞により発現される抗原から独立して希少細胞の抽出又は単離を可能し、従って希少細胞の損失を導く分離のバイアスの回避を可能にする。
【０１２３】
それは、形態学的、免疫標識、in situ分子分析、及び他の非希少細胞の妨害なしでの分子分析を包含する、希少細胞の多重分析を促進する。
【０１２４】
それは、それらの多重分析、例えば形態学的、免疫標識、in situ分子分析、及び他の非希少細胞の妨害を有さない分子分析を容易にする、単離された希少細胞の純度の調節を可能にする。
【０１２５】
それは、単一細胞又は単一細胞群として、又は追加の分子分析のために残留する非希少細胞と共に混合される細胞として、個々の希少細胞の収集を可能にする。
【０１２６】
それは、数百万の小白血球及び数十億の赤血球を除くことにより、希少細胞の検出及び計数を高速化する。
【０１２７】
それは、さらなる分析のために固定された又は新鮮な細胞の抽出又は単離を可能にする。
【０１２８】
濾過の他のモード。種々の濾過モードが、それらが他の種類の細胞からの希少細胞の単離、及び／又はさらなる分析のためにフィルター上への希少細胞の積層化を可能にする限り、使用され得る。例えば、フィルターを通過する他の種類の細胞から希少細胞を分離するための力は、重力、正又は負の圧力、又は遠心力であり得る。
【０１２９】
サンプルの前処理。生物学的サンプルは、赤血球を溶解するために使用される剤、例えばサポニン、塩化アンモニウム、溶菌抗体、低張液、抗凝固剤、例えばＥＤＴＡ、ヘパリン、クマジン、その他のビタミンＫ拮抗薬、第Ｘａ因子拮抗薬、トロンビン阻害剤;アスピリン（サリチル酸）、血小板凝固を妨げる他の剤（http://en.wikipedia.org/wiki/Antiplatelet_drug, ２０１３年、５月２１日にアクセスされた）、粘液溶解薬及び固定剤（下記を参照のこと）により、濾過の前及び／又は後、希釈され、そして／又は処理され得る。
【０１３０】
濾過により生物学的サンプルから抽出された又は単離された希少細胞は、固定された細胞又は新鮮細胞であり得る。濾過により生物学的サンプルから抽出された又は単離された、固定された又は新鮮細胞は、分析、分子分析又は培養のために、スライド、ペトリ皿、ウェル又は試験管又は他の支持体を非排他的に包含する支持体に移転され得る。支持体へのフィルターからの細胞の移転は、収集及び／又は離脱手段及び／又は緩衝液を用いることにより得られる。例えば、フィルターからのすべての細胞を、スライド又は固体支持体に移転し、そして希少細胞の損失を回避するために、市販の接着剤スライド、例えばSuperFrost Ultra Plus（登録商標）slidesor Clearcell（登録商標）及びAdcell（登録商標）BioAdhesion Slidesを使用し、そして／又はフィルターへの細胞の付着を防ぐ剤、例えばシリコン処理剤、例えばSigmacote（登録商標）又は類似物により、濾過の前に、フィルターを処理することが可能である。フィルター上に収集されるすべての細胞を、スライド又は何れか他の支持体に移転し、そして希少細胞の損失を回避するために、フィルターの裏、従って細胞に付着しないスライドに適用される溶液による移転を助けることがまた可能であり、そしてフィルターから細胞を離脱するであろう固体表面の方への孔を通しての緩衝液の流束を創造し、その結果、それらはスライド又は他の固体支持体に付着できる。スライド又は他の固体支持体へのフィルター上に集められた細胞及び希少細胞の移転のこの工程はまた、フィルターの裏に適用される正の空気及び／又は液体圧力を用いることにより改善され得る：空気及び／又は液体は、孔を通過し、そして細胞のスライド又は他の固体支持体への移転を助けるであろう。フィルターからの細胞及び希少細胞を離脱し、そしてスライド又は固体支持体にそれらを移転するそれらのすべてのプロトコルは、フィルター上の細胞が乾燥されない場合、従って、移転が濾過後すぐに行われる場合、良好に作動するであろう。
【０１３１】
濾過による固定された細胞の抽出又は単離は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ＲＣＬ２、水銀、例えばＢ５及びツェンカー固定液、メチルアルコール、エチルアルコール、ピクリン酸塩、例えばブアン液、リゴー固定液、等を、非排他的に含んで成る固定剤を用いて、濾過の前に、それらの細胞を固定することにより実施される。
【０１３２】
濾過による生物学的サンプルから抽出された又は単離された新鮮希少細胞は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ＲＣＬ２、水銀、例えばＢ５及びツェンカー固定液、メチルアルコール、エチルアルコール、ピクリン酸塩、例えばブアン液、リゴー固定液等を、非排他的に含んで成る固定剤を用いて、濾過の後、固定され得る。
【０１３３】
希少細胞の培養。生物学的サンプルから抽出された又は単離された希少細胞は、それらの数を増やすために、及びそれらの検出及び／又は診断及び／又は特徴付けを促進するために培養され得る。培養プロトコルは、希少細胞の純度を高めるために、非希少細胞の増殖に対する希少細胞の増殖を選択的に刺激する手段を包含することができる。非希少細胞の増殖に対する希少細胞の増殖を選択的に刺激する手段は、希少細胞の増殖を刺激する特定の増殖因子及び／又は剤、他の細胞型との希少細胞の同時培養及び／又は希少細胞の増殖を助けるフィルダー層の使用、及び非希少細胞の増殖及び／又は生存性を阻止する手段、例えば阻害抗体、細胞周期のブロッカー、プロアポトーシス因子、ｓｉＲＮＡ、及び非希少細胞の増殖及び／又は排除のブロックを得るためにそれらの希少細胞を特異的に標的かするする任意のタイプの薬物を、非排他的に包含する。
【０１３４】
希少細胞の特徴付け。希少細胞検出及び／又は診断及び／又は特徴付けは、細胞形態及び／又は免疫標識及び／又は分子分析を通して得られる。細胞形態及び／又は免疫標識分析は、損なわれていない細胞、すなわち原形質膜及び／又は細胞質限界、及び／又は核限界が認識できる細胞に対して、in situで実施される。
【０１３５】
細胞形態分析は、ヘマトキシリン及び／又はエオシンによる染色、メイグリュンワルド及び/又はギムザ染色、パパニコロー染色、フォイルゲン染色及びすべてのタイプの染色、及び細胞形態学的詳細を分析し、そして細胞成分を分析し、そして／又は定量化することを目的とする化学論的染色を、非排他的に包含する。細胞形態分析は、PAS、スーダン、アルシアンブルー染色、カルシウム、脂質、多糖類、酵素及び他の分子を、非排他的に包含する細胞成分を明らかにすることができる酵素及び非酵素方法を、非排他的に包含する細胞化学分析を、非排他的に包含する。免疫標識は、上皮抗原、間葉抗原、器官特異的抗原、腫瘍特異的抗原、胎児特異的抗原は、幹細胞特異的抗原、転写因子、変異タンパク質及び任意のタンパク質及び/又はペプチド、及び／又はこの検出が細胞同定及び／又は診断及び／又は特徴付けを助けることができる細胞成分に対する抗体を、非排他的に包含する抗体により、細胞成分を標識することを、非排他的に包含する。免疫標識はまた、免疫細胞化学、免疫蛍光、免疫−ＰＣＲ、及び免疫学的リンク及び細胞標的物を明らかにするために使用される手段に結合される抗体を通して細胞構造のすべてのタイプの標識を、非排他的に包含する。
【０１３６】
ＦＩＳＨ（蛍光in situハイブリダイゼーション）、ＰＲＩＮＳ（プライムされたin situ標識）、ＴＵＮＥＬ（末梢デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識）、免疫ＰＣＲ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、in situＰＣＲ、及び分子プローブを非排他的に用いる他の方法を、非排他的に包含する分子分析は、損なわれていない細胞に対して、in situで実施され得る。
【０１３７】
in situ染色及び／又は免疫標識、及び／又はin situ分子分析の後、希少細胞のイメージ分析が実施され得、そしてイメージは、細胞溶解を示唆する、さらなる希少細胞分子分析の前に、情報を得るために保存され、そして／又は移され得る。
【０１３８】
ＰＣＲ、逆転写酵素−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、全ゲノム増幅、配列決定、高処理配列決定、キャスト−ＰＣＲ、コールドＰＣＲ、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、ＣＧＨアレイ、マイクロアレイ分析、メチル化分析、多型分析、等を、非排他的に包含する分子分析は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ及びタンパク質分子を非排他的に包含する分子成分を分析するために、その構造が破壊され、そして／又は溶解された細胞に対して行われ得る。
【０１３９】
ＰＣＲ、逆転写酵素−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、全ゲノム増幅、配列決定、高処理配列決定、キャスト−ＰＣＲ、コールドＰＣＲ、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、ＣＧＨアレイ、マイクロアレイ分析、メチル化分析、多型分析、等を、非排他的に包含する分子分析は、個々の細胞、又は個々の細胞群、又は生物学的サンプルから濾過を通して抽出された又は単離されたすべての細胞を標的とすることができる。
【０１４０】
形態学的基準及び／又は免疫標識に従って同定された個々の細胞又は細胞群に対する標的化された分析は、目的の細胞を含むフィルター部分、又は支持体への移転後の細胞のレザー顕微解剖、続いて細胞タンパク質の溶解、及び細胞ＤＮＡ（ゲノム及び／又はミトコンドリアＤＮＡ）、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ及びタンパク質分子の分子分析を用いることによって実施され得る。他方では、濾過により抽出された又は単離された希少細胞は、フィルターから分離され得、そして形態学的基準及び／又は免疫標識に従って同定された個々の細胞又は細胞群は、磁場（磁場に基づいてのシリコン生物システム又は他の方法）により、又は手動又は自動毛管マイクロピペットにより単離され得る。他方では、濾過により抽出された又は単離されたすべての細胞は、フィルター上で、又は支持体への移転の後、適切な緩衝液を用いることにより溶解され、ＰＣＲ、逆転写酵素−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、全ゲノム増幅、配列決定、高処理配列決定、キャスト−ＰＣＲ、コールドＰＣＲ、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、ＣＧＨアレイ、マイクロアレイ分析、メチル化分析、多型分析、等を、非排他的に用いることにより、それらのＤＮＡ(ゲノム及び／又はミトコンドリアＤＮＡ）、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はタンパク質分子分析が行われ得る。
【０１４１】
非侵襲性治療診断。他の側面の中で、本発明は、血液からの循環腫瘍細胞の単離、及び非侵襲性治療診断のためのそれらの使用を可能にする。治療診断は、特定の「標的化された」（targeted）治療の処方を導くためへの診断結果の使用である。それらの手順は、応答するか否か、所定の治療に対するそれらの感受性を予測するために、腫瘍細胞に存在する特定の分子バイオマーカーを利用する。癌治療は高価であり、そしてしばしば、毒性であるので、治療診断は、患者への悪影響のために医療費負担を最小限にすることが重要である。治療診断バイオマーカーは現在、一次腫瘍及び転移組織において見出される。しかしながら、一次腫瘍下での腫瘍細胞は遺伝的に不均一であり、そして生検は最適な標的治療法を設定するために有用な遺伝子情報を担持する腫瘍細胞クラスターを見逃していることが示されている。転移は、より良好な基準であると思われるが、しかしそれらの生検を得ることは困難である。実際、癌患者の物理的な条件が、それらの侵襲処置にリンクされる高罹患率のために、侵襲性アプローチ（手術又は生検）を通して一次腫瘍又は転移からサンプルを得ることを妨げる。さらに、腫瘍細胞の遺伝的特徴は、標的治療を逃れる新規の「腫瘍細胞変異体」を検出するために、治療の間、それらに従うことを標的治療の圧力下で変更することができる。しかしながら、癌細胞の遺伝的特徴の侵襲性追跡調査は、関連する罹患率のために、臨床的状況下で、実行不可能である。最後に、介入の前に、腫瘍量を低め、そして腫瘍を良好に除去するために手術前に目的の標的療法を適用するために、特定患者の腫瘍細胞の遺伝的特性を非侵襲的に研究することが有用である。
【０１４２】
標的治療は現在、多くの一般的な癌（乳癌、肺癌、結腸直腸癌、等）のために利用でき、そして症例に比例してのそれらの有効性を示している。しかしながら、腫瘍応答の実証された予測因子の不在下で、それらの高価な標的療法は、比例しての恩恵を伴わないで関連する費用の大幅な増加を伴って、大多数の患者に処方されるか、又は処方されず、患者へのそれらの療法からの恩恵が妨げられる。
【０１４３】
従って、治療診断バイオマーカーの実施は、印象的な治療改善を導くことが予測される。しかしながら、腫瘍組織（一次腫瘍、転移）に向けられる治療診断は、衰弱した患者において実施され得ず、非常に費用がかかり、そしてしばしば、不完全なデータを提供する侵襲性（外科的又は半外科的）手順を意味する。従って、非侵襲的に得られる腫瘍細胞及び腫瘍微小塞栓の分析は、臨床腫瘍学において最も重要なものである。
【０１４４】
希少細胞の遺伝的特徴付け。腫瘍細胞の遺伝的特徴付けに基づく情報は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環腫瘍微小塞栓（ＣＴＭ）、及び生物学的流体（尿、腹水、精液、脳脊髄液（CSF）、唾液、痰、等）から収集された腫瘍細胞から、非排他的に得られる。
【０１４５】
腫瘍細胞の遺伝的特性を研究する方法は、検出される遺伝的異常に従って変化する。それらは、目的の遺伝子又は配列、及び／又は全エキソーム（exome）又は全ゲノム／トランスクリプトーム配列に標的化された、細胞学、細胞化学、免疫細胞化学分析、ＦＩＳＨ、ＰＲＩＮＳ、免疫ＰＣＲ、ＤＮＡ及びＲＮＡ抽出及び分析に依存することができる。
【０１４６】
いくつかの治療診断バイオマーカーは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び大腸癌について特に検証されて来た。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、膜受容体チロシンキナーゼである。ＥＧＦＲの過剰発現又は過活性が、多くの癌に見られる。ＥＧＦＲ変異は、ＮＳＣＬＣを有するすべての患者の１０％〜１５％で、及びＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、例えばゲフィチニブ（AstraZeneca）又はエルロチニブ（Roche）に対して臨床学的に応答する患者の８０％で検出される。既知のＥＧＦＲ変異は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインのエキソン１８〜２１に位置する変異を包含する。それらの変異は、特に肺癌において十分に記載されている。Ｌ８５８Ｒ変異又はエキソン１９欠失変異を有する一次腫瘍の患者は、野生型ＫＲＡＳ腫瘍を有する患者よりも、ＥＧＦＲ阻害剤に対して良好な応答を有する[１３]。Ｌ８５８Ｒ変異及びエキソン１９欠失変異は、最も頻繁なＥＧＦＲ変異の中で、それぞれ、すべてのＥＧＦＲ変異の約４３％及び４８％の頻度で肺腫瘍に存在する（http://www.mycancergenome.org, ２０１３年、５月２１日にアクセスされた）。
【０１４７】
ＫＲＡＳ（Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウィルス癌遺伝子相同体としても知られている）は、内膜に位置する２１ｋＤａのＧＴＰアーゼをコードする。このタンパク質は、ＥＧＦＲの上流のシグナルトランスダクション経路のコア成分である。ＫＲＡＳ変異は、肺腺癌の１５−２５％で発生する（http://www.mycancergenome.org, ２０１３年、５月２１日にアクセスされた）。ＫＲＡＳのより頻繁な変異が、ＫＲＡＳキナーゼ活性の構成的活性かをもたらす。点突然変異は、ＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２におけるコドン１２（すべてのＫＲＡＳ変異の８２％）及び１３（すべてのＫＲＡＳ変異の１７％）で発生する。標準的配列決定は、すべてのコドン１２及び１３の変異を１つの試験で検出する（Ｇ１２Ｃ:ｃ３４Ｇ＞Ｔ,Ｇ１２Ｒ:ｃ３４Ｇ＞Ｃ,Ｇ１２Ａ:ｃ３５Ｇ＞Ｃ,Ｇ１２Ｄ:ｃ３５Ｇ＞Ａ,Ｇ１２Ｖ:ｃ３５Ｇ＞Ａ,Ｇ１２Ｓ:ｃ３４Ｇ＞Ａ,Ｇ１３Ｃ:ｃ３７Ｇ＞Ｔ,Ｇ１３Ｄ:ｃ３８Ｇ＞Ａ）。
【０１４８】
野生型ＫＲＡＳは、ＮＳＣＬＣ患者におけるＥＧＦＲ阻害剤の効力のために必要とされる［１３］。野生型ＫＲＡＳはまた、転移性結腸直腸癌の患者における抗−ＥＧＦＲ治療抗体（Eli Lilly, Bristol-Myers Squibb, Merck Serono）の効力のためにも必要とされる「１４，１５」。コドン６１及び１４６における変異がまた報告されているが、しかしそれらは、マイナーな割合のＫＲＡＳ変異（１〜４％）を表し、そしてそれらの臨床関連性は不明のままである［１５］。
【０１４９】
最近、ＫＲＡＳ変異を有するＮＳＣＬＣ患者は、効果的な治療法を有さない。Ganetespib (Synta Pharmaceuticals)は、第III相臨床試験を継続中であるシャペロンＨｓｐ９０の小分子阻害剤である。第II相試験は、単剤療法として週１度、投与されるganetespibによる処置の８週間後で、ＫＲＡＳ−変異体ＮＳＣＬＣを有する患者の６０％以上で、腫瘍の収縮を示した（International Association for the Study of Lung Cancer, 14th World Conference on Lung Cancer）。
【０１５０】
より最近では、末分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）（２ｐ２３）及び棘皮動物微小管関連タンパク質様−４（ＥＭＬ４）（２ｐ２１）遺伝子を包含するゲノム変化が、下位組の肺癌患者に同定された。それらの患者は、ＡＬＫ小分子阻害剤Crizotinib（Pfizer）に対する卓越した好反応を有する［１６，１７，１８，１９］。実際、Crizotinibが現在、第III 相臨床試験下で試験され、そして第II相試験の予備結果が、ＡＬＫ再配置肺腫瘍において印象的な９０％の病勢制御率を明確にした［２０］。この再配置は、ＥＧＦＲ及びＫＲＡＳ関連変異を有さないほとんどのシリーズ、特に後期腺癌において、ＮＳＣＬＣの１〜７％に見出された［２１］。
【０１５１】
２種の他の卓越した治療診断バイオマーカーが、他のタイプの癌において検証されている。ヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ２）は、細胞膜表面−結合受容体チロシンキナーゼであり、そして通常、細胞増殖及び分化を導くシグナルトランスダクション経路に包含される。ＨＥＲ２遺伝子座は、乳癌の２０〜３０％で増幅され、そしてこの増幅の存在は、標的療法トラスツズマブ（抗−ＨＥＲ２、Ｒｏｃｈｅ）に対する腫瘍応答の指標である［２２］。
【０１５２】
Zelboraf（Roche）は、Ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウィルス癌遺伝子相同体Ｂ１（ＢＲＡＦ）遺伝子Ｖ６００Ｅ変異を有するメラノーマ患者の治療のために食品医薬品局（ＦＤＡ）により最近、承認された非常に効果的な薬物である。この変異はまた、肺癌患者の１％で存在するので、肺癌患者は、将来的にこの薬の対象となって来ている。臨床試験により検証された又は進行中の他の治療診断バイオマーカーは、次のものを包含する：
−乳癌及び卵巣癌：ＥＲ、ＰＲ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＡＣ２
−消化管癌：ｃ−ｋｉｔ、ＣＤＣ４、ｐ５３
−非小細胞肺癌：ＲＯＳ１、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＶＥＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ
−ＭＴＯＲ、ＭＥＫ、ＳＴＡＴ３、ＡＫＴ、ＲＥＴ融合体
−前立腺癌：組換えＴＭＰＲＳＳ２／ＥＲＧ。
【０１５３】
腫瘍細胞の非侵襲性治療診断分析に関しては、本発明により処方される現在の末解決問題点は次のものである：
腫瘍細胞は、それらの損失を回避するために、及び最大の純度を伴って、すなわち最少の汚染性非腫瘍細胞を伴って（分子分析により得られる異なった負の結果を回避するために）、非常に敏感な態様で、生物学的サンプルから抽出されるか、又は単離されるべきである。
【０１５４】
さらに、非侵襲的に得られる腫瘍細胞は、希少な、低く表される材料であり；さらに、それらは非侵襲治療診断試験として使用されるために、いくつかの分析及び分子分析の対象である必要がある。それらの末解決問題は、臨床腫瘍学における非侵襲性治療診断試験の開発及び広範な適用を妨げる。本発明は、次の段階を包含する工程を介して、上述の問題に対する解決策を記載する：
（ｉ）材料（ポリカーボネート、ＰＥＴ、等）、厚さ、孔サイズ及び孔密度の特徴が、単離される腫瘍細胞の型及び数に、及び非侵襲的に腫瘍細胞及び腫瘍微小塞栓を単離するために処理される生物学的流体に特異的に合わせて調整される膜を用いることによる生物学的サンプルの濾過。
【０１５５】
（ｉｉ）細胞学的染色、免疫染色、ＦＩＳＨ、Ｔｕｎｅｌ、ＰＲＩＮＳ、免疫ＰＣＲ、及び治療診断試験として細胞溶解なしで実施される任意のタイプの分析による単離された細胞の染色／標識。
【０１５６】
（ｉｉｉ）細胞イメージの走査及び高密度記録を包含する、染色された／標識された細胞のイメージ分析。イメージは、診断目的のために分析され、貯蔵され、そして／又は診断工程において助ける専門家に情報的に移され得る。
【０１５７】
（ｉｖ）非侵襲的に集められた新鮮な又は固定された細胞の腫瘍細胞−標的化溶解。標的化アプローチは、レーザー捕獲顕微解剖（ＬＣＭ）段階を包含する。ＬＣＭは、濾過による単離の後、単一の腫瘍細胞（又は腫瘍細胞群）の単離を可能にする。この方法は、純粋腫瘍ＤＮＡの遺伝子分析への取り組みを可能にする。腫瘍細胞は不均一であり、そして正常組織（組織中の、及びフィルター上の）と共に混合されるので、ＬＣＭは現在、ＣＴＣの集団間の変異体ＣＴＣの百分率を評価するための利用できる方法である。ＬＣＭに変わるものとして、顕微操作システム、ＤＥＰＡｒｒａｙ（Silicon Biosystem）又はCellCelector（ＡＬＳ）が存在する。溶解の後、細胞は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はタンパク質分析を受ける。
【０１５８】
（ｖ）非変異配列と共に混合される変異配列を標的化する分子分析（冷ＰＣＲ、Ｃａｓｔ  ＰＣＲ、等）を包含するそれらの分子（ＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はタンパク質）分析のために濾過により抽出された又は単離されたすべての固定又は新鮮細胞の非標的化溶解。
【０１５９】
（ｖｉ）１又はいくつかのバイオマーカーに標的化されるか、又は全エキソン又はゲノム配列に適用されるＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はタンパク質に対処される治療診断分子分析。
【０１６０】
この方策の利点は、以下の通りである：
（ａ）最大の感度及び純度を伴って、及び免疫標識に基づく及び／又はマーカーに基づく捕獲システムに由来する、希少細胞の選択のバイアスの不在下で、生物学的サンプルから希少細胞を単離するための最適化されたアプローチ。
【０１６１】
（ｂ）非侵襲的に収集された同じ希少細胞に対して、いくつかの診断及び／又は予後及び／又は治療診断分析を実施する可能性。例えば、肺癌患者においては、非侵襲的に収集された同じ細胞から、ＡＬＫ分析（ＦＩＳＨ）、及びＫＲＡＳ及びＥＧＦＲ分子分析（細胞溶解後のＤＮＡ分析）の結果を得ることが可能であろう。例えば、感染性疾患の患者においては免疫系の細胞、例えば活性化されたリンパ球、又は単球及びマクロファージから、細胞内ウィルス（ＨＩＶ、等）又は微生物学的剤（シゲラ（Shigella）、ＴＢＣ菌（TBC bacillus）、リーシュマニア（Leishmania）、等）に対して特異的なＦＩＳＨ分析の結果、及び感染剤に対して特異的なＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はタンパク質分析の結果を得ることが可能であろう。
【０１６２】
例えば、妊婦においては、単離された胎児希少細胞から、雄胎児細胞の存在を分析し、そして変異分子の存在又は不在、従って胎児性遺伝的障害の存在又は不在を示す、溶解された細胞に対して実施されるＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はタンパク質変異分析を得るために、細胞病理学的及び／又は免疫標識及び／又はin situ分子分析（Ｙ特異的プローブによるＦＩＳＨ又はＰＲＩＮＳ）の結果を得ることが可能である。
【０１６３】
（ｃ）濾過により抽出された又は単離された腫瘍細胞又は他の希少細胞の存在、又は不在、及び数についての診断及び／又は予後及び／又は治療診断情報を入手し、そして分析される生物学的サンプルの希少細胞中のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はタンパク質変異の存在又は不在、及び病理学的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はタンパク質分子の存在又は不在についての診断及び／又は予後及び／又は治療診断情報の入手を可能にする細胞溶解に進む前、細胞病理学及び／又は免疫標識及び／又はin situ分子分析のイメージを貯蔵する可能性。
【０１６４】
例えば、癌患者においては、腫瘍細胞の存在を診断し、そしてin situ免疫学的及びin situ分子分析によりそれらを特徴付け、そして溶解された細胞に対して実施されるＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はタンパク質変異分析を得るために、非侵襲的に収集された同じ腫瘍細胞から、細胞病理学及び／又は免疫標識及び／又はin situ分子分析の結果の貯蔵されたイメージを得ることが可能であろう。
【０１６５】
例えば、感染性疾患を有する患者においては、感染された細胞の存在を診断し、そしてそれらを、in situ免疫学的及びin situ分子分析により特徴付け、そして感染剤の分子の存在又は不在、従って感染剤の存在又は不在及び数を示すであろう、溶解された細胞からＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はタンパク質分析を入手するために、単離された希少細胞から、細胞病理学的及び／又は免疫標識及び／又はin situ分子分析の結果の貯蔵されたイメージを、非侵襲的に入手することが可能であろう。
【０１６６】
例えば、妊婦においては、胎児細胞の存在を診断し、そしてin situ免疫学的及びin situ分子分離により、それらを特徴付け、そして変異分子の存在又は不在、従って胎児遺伝子性疾患の存在又は不在を示す、溶解された細胞に対して実施されるＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はタンパク質変異分析を入手するために、単離された胎児希少細胞から、細胞病理学的及び／又は免疫標識及び／又はin situ分子分析の結果の貯蔵されたイメージを、非侵襲的に入手することが可能であろう。
【０１６７】
それらの利点は、希少細胞を標的化し、そして非侵襲性治療診断分析のための工程を含んで成る任意の方法によっては、現在、提供されない。
【実施例】
【０１６８】
実施例１：濾過により血液から富化された新鮮な固定されていない腫瘍細胞の多重分析
濾過。新鮮な腫瘍細胞を、公開された米国特許出願第２００９−０２２６９５７号に記載のように、濾過により血液から抽出し、そして富化した。
【０１６９】
抽出された、非固定細胞を染色し、それらの形態を決定し、そしてそれらの核酸を抽出し、そして全ゲノム増幅の後、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲにより分析した。
【０１７０】
血液から腫瘍希少細胞を抽出し、そして富化するために、血液サンプルを、赤血球細胞溶解のための緩衝液を用いて、２０倍に希釈する。溶解を、穏やかな撹拌下で、５分間、室温で進行せしめる。
【０１７１】
次に、処理された血液サンプルを、すぐに、−６ミリバールの圧力下で濾過する。約２００μｌの溶液がウェルに残るように、濾過が完全に完了する前、濾過を停止する。
【０１７２】
富化された新鮮腫瘍細胞材料を、１ｍｌの細胞培養培地（ＤＭＥＭ ＨＥＰＥＳ  １％ウシ胎児血清）を、ピペットで３度、軽く採取することにより集める。
【０１７３】
次に、集められた材料を、１０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、そして上清液を注意して除く。ペレットを、細胞培養培地に再懸濁する。
【０１７４】
次に、抽出された細胞を、ＤＭＥＭ  １０％ウシ胎児血清を用いて培養することができる。次に、抽出された又は培養された細胞を用いて、機能的アッセイを行い、例えば増殖アッセイ又は付着アッセイにより、分泌されたタンパク質について試験することができる。
【０１７５】
個々の腫瘍細胞を、（ｉ）単純な細胞サイズ基準又は免疫標識に基づいて顕微鏡下で（マイクロ）ピペットを用いて；又は（ｉｉ）細胞ソーター、例えばDEParray (Silicon Biosystems)を用いて、単離できる。
【０１７６】
単一細胞を単離した後、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡレベルでの核酸の分子分析を進めることができる。
【０１７７】
ＤＮＡ分析。新鮮な単一細胞のＤＮＡ分析のために、細胞を、３−１０μｌの溶解緩衝液（１００ｍモル/Ｌ のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８;４００μｇ/ｍＬのプロテイナーゼＫ）を用いて、１５分間、溶解する。プロテイナーゼＫは、９４℃で１５分間、不活性化される。
【０１７８】
他方では、細胞を、熱安定性プロテイナーゼ、例えばprepGem (ZyGem)及びその関連する緩衝液（Ｇｏｌｄ緩衝液）を用いて、７５℃で５分間、溶解し、続いて９５℃で５分間、不活性化する。新鮮な単一細胞からのＤＮＡの下流プロセッシングは、実施例Ｘに記載される固定された、顕微解剖された細胞のその１つと同一である。
【０１７９】
ＲＮＡ分析。ＲＮＡ分析のために、新鮮又は固定細胞、又は新鮮又は固定単一細胞を、４００ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、１０００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ及び２．５ＵのＲＮＡアーゼ阻害剤を含む緩衝液に溶解する。逆転写のために、溶解された細胞からのＲＮＡを、７０℃で１０分間、変性する。逆転写を、１０単位のＭＭＬＶ、１０単位の阻害剤、ランダムプライマー、ｄＮＴＰ、及び酵素と共に供給される１×濃度の逆転写緩衝液の溶液４０μｌにおいて実施する。反応を典型的には、室温で１５分間、及び４２℃で３０分間インキュベートする。次に、酵素を７０℃で１０分間、不活性化し、そして氷上で急冷し、その後、市販のキット（Life Technologies, Illumina）を用いて、ＰＣＲによる転写体−特異的増幅又は全ｃＤＮＡ増幅を行う。
【０１８０】
特定の例によれば、ＡＬＫ遺伝子組換えは、Taqmanアッセイ（hs03654556、Hs03654557、 Hs03654558、Hs03654560、Hs03654559、Life technologies）を用いて、又は標準ＰＣＲにより検出され得る。ＥＭＬ４−ＡＬＫ組換え転写体３ａ及びｂ変異体の検出においては、次のプライマーを用いてことができる：
前方向プライマー:5'-GCATAAAGATGTCATCATCAACCAAG-3'（配列番号１）
逆方向プライマー:5'-TCTTGCCAGCAAAGCAGTAGTTGG-3'（配列番号２）
【０１８１】
腫瘍細胞を、上皮マーカーに対する抗体、及び／又は治療診断のために重要なタンパク質（ＨＥＲ２、ＡＬＫ、等）に対する抗体を用いて、多重免疫標識により同定する。循環腫瘍細胞を標的化する分析は、細胞切断モジュール（MMI, Zurich, Switzerland）を備えたＮｉｋｏｎ  ＴＥ  ２０００Ｕ（Ｎｉｋｏｎ  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、単一細胞レーザー捕獲顕微解剖（ＬＣＭ）の後、可能にされる。
【０１８２】
顕微解剖された各細胞を、２〜１５μｌの溶解緩衝液（１００ｍモル／ｌのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８；４００μ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）に溶解することができる。プロテイナーゼＫを、９４℃で１５分間、不活性化する。他方では、前記細胞を、熱安定性プロテアーゼ、例えばｐｒｅｐＧｅｍ（ＺｙＧｅｍ）及びその関連緩衝液（Ｇｏｌｄ緩衝液）を用いて、７５℃で１５分間、溶解し、続いて９５℃で５分間、不活性化する。
【０１８３】
ＷＧＡを、プライマー伸長前増幅（ＰＥＰ）又は市販キット（Rubicon Genomics, Sigma, Qiagen, Silicon Biosystems）を用いて、実施できる。
【０１８４】
プライマー伸長前増幅（ＰＥＰ）のために、ランダムプライマー（ｇｅｎＰＥＰ）の４００μＭ溶液５μｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2を含む１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１０μｌ、４種のｄＮＴＰ（それぞれ、２ｍＭ）の混合物０．６μｌ、及び１μｌ（５Ｕ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、６０μｌの最終体積で、溶解された細胞に添加する。
【０１８５】
Ｒｕｂｉｃｏｎ  ＧｅｎｏｍｉｃｓからのＰｉｃｏＰｌｅｘを用いてのＷＧＡのために、５μｌの前増幅カクテルを最初に、溶解された細胞（合計体積１５μｌ）に添加し、そして前増幅を、その製造業者の説明書に従って実施する。
【０１８６】
次に、６０μｌの増幅カクテルを添加し、そして増幅を、その製造業者の説明書に従って実施する。ＷＧＡ生成物を、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄ４０１４キットを用いて、その製造業者の説明書に従って精製することができる。
【０１８７】
遺伝子−特異的増幅を、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ６μｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５〜２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭの各デオキシヌクレオチド、０．５μｌのプライマー及び２ＵのＴａｑ  Ｇｏｌｄ  （Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む溶液６０μｌ下で実施する。２μｌのＰＣＲｏｕｔｅｒ生成物を、「内部」遺伝子−特異的プライマー及び同じＰＣＲプロトコルを用いて、２０μｌ下で再増幅した。
【０１８８】
ＰｉｃｏＰｌｅｘからのＷＧＡ生成物を用いて、ネステッドＰＣＲは、すべての遺伝子について必要ではないかも知れない。さらに、それらのＷＧＡ生成物は、高処理配列決定及びＣＧＨマイクロアレイ分析と適合できる。
プライマー配列及びサイクリング条件は、下記表１に示される：
【０１８９】
【表１】
2019074538.tif 000002
【０１９０】
遺伝子−特異的ＰＣＲの後、遺伝子の変異状態を、従来の配列決定、フラグメント分析、ＳＮＰアッセイ（Ｉａｑｍａｎアッセイ）、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、キャストＰＣＲ、又はＨＲＭ分析を用いて決定する。
【０１９１】
分子分析または、濾過スポット上に存在するすべての細胞の溶解の後、レーザー捕獲顕微解剖なしで実施され得る。希少細胞富化及び純度を、定義される希少細胞の純度を高めるよう適合された孔密度を有するフィルターを用いて改善することができる。
【０１９２】
白血球からの野生型ＤＮＡと共に混合される腫瘍細胞ＤＮＡを、少なくとも４５μｌの体積で、タンパク質溶解の後、集める。抽出されたＤＮＡを、いくつかのＷＧＡ反応に分割するか、又は１つのＷＧＡ反応のために精製し、そして使用することができる。
【０１９３】
単一細胞に関して、ＷＧＡを、プライマー伸長前増幅（ＰＥＰ）又は市販のキット（Rubicon Genomics, Sigma, Qiagen, Silicon Biosystems）を用いて、実施することができる。
【０１９４】
ＷＧＡの後、敏感な遺伝子変異−特異的アッセイを用いて、非変異ＤＮＡ間の変異ＤＮＡの存在を評価することができる。これは、異なった方法、例えばデジタルＰＣＲ、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ又はキャスト−ＰＣＲを用いて達成され得る。
【０１９５】
キャスト−ＰＣＲの場合、２μｌの精製されたＷＧＡ  ＤＮＡ（約２０ｎｇのＤＮＡ）が、典型的な２０μｌのキャスト及び反応に使用され得る。
【０１９６】
実施例２：循環腫瘍細胞の遺伝学的特性化及び循環腫瘍細胞における、治療診断変異の検出：
肺癌。好ましい実施の形態によれば、希少細胞を、肺癌患者の血液から、濾過により単離し、腫瘍細胞を、細胞形態分析により、単離された希少細胞間で同定し、そしてＡＬＫ特異的抗体及び分子プローブにより特徴づけることができる。
【０１９７】
ＡＬＫ−遺伝子再配置、肺腺癌患者からの循環腫瘍細胞及び腫瘍組織に対する比較分析
この作業の目的は、１）肺腺癌を有する８７人の患者においてＩＳＥＴにより単離された、悪性細胞病理学的基準を有するＣＴＣにおけるＡＬＫ状態を評価することとして、及び２）ＣＴＣ及びその対応する腫瘍組織に見出されるＡＬＫ状態を比較することとして、下記に記載される。このためには、ＡＬＫ−遺伝子再配列についての二重免疫化学及びＦＩＳＨアプローチに基づくアッセイが使用され、そしてＣＴＣ及び対応する腫瘍組織サンプルの両者に適用された。
【０１９８】
患者及びサンプル
ＮＳＣＬＣのために手術を受ける患者のためのＩＳＥＴ方法を用いてのこれまでの研究によれば、細胞形態悪性特徴を有するＣＴＣを、２０８の症例のうち７６（３７％）で検出した。
【０１９９】
本研究のために、本発明者は、一次腺癌を有する４０の症例を、この後者の集団から選択した。さらに、２０１１年５月〜１２月の間、研究に包含される４７人の肺腺癌患者は、悪性特徴を有するＣＴＣを有した。それらの８７人の患者の中で、３４人は、固定緩衝液（細胞固定例を含む）を用いることにより、ＴＳＥＴにより、及び米国公開特許出願第２００９−０２２６９５７号に記載のように、異なった時点で、すなわち手術の前、及び手術の後、７及び１５日で、収集され、そして処理された血液サンプル（１０ｍｌ）を有した。すべての患者は、この研究に参加するためにインフォームドコンセントを与えた。選択された８７人の患者の主要臨床病理学的特徴が表２に要約されている。
【０２００】
【表２】
2019074538.tif 000003
【０２０１】
腫瘍は、７th  ｐＴＮＭ分類、及び肺腺癌の最後の組織学的分類に従って分類された［２６、２７］。ＦＩＳＨ分析は、ＡＬＫ遺伝子のためのブレーク−アパートプローブを用いて、腫瘍サンプルに対して行われた（Vysis LSI ALK Dual Color, Abbott Molecular, Abbott Park, IL）（補足データ）。適切に解釈されるためには、腫瘍細胞核は、少なくとも１つの共局在シグナルを有すべきである。ＡＬＫ−再配置として考慮されるためには、解釈できる腫瘍細胞核の少なくとも１５％が異常プローブハイブリダイゼーションパターンを保有すべきである［２８］。免疫組織化学（ＩＨＣ）が、室温で４５分間インキュベートされたＡＬＫタンパク質（１：５０、５Ａ４；Abcam, Cambridge,UK）に対する一次抗体を用いて、脱パラフィン切片に対して行われた（補足データ）。ｉ）ＥＧＦＲ変異ホットスポット、ｉｉ）ＫＲＡＳ変異ホットスポット、及びｉｉｉ）ＢＲＡＦ変異についての標的変異分析が、これまでに記載されたようにして、パイロシーケンシングにより、凍結された腫瘍組織切片から抽出されたＤＮＡから行われた［２９、３０］（補足データ）。
【０２０２】
ＴＳＥＴフィルター上での免疫細胞化学（ＩＣＣ）及び蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）。
ＩＣＣ及びＦＩＳＨを、６のスポットに対してＭＧＧ染色することにより検出される悪性特徴を有するＣＴＣを含むその対応するフィルターの染色されていないスポット上でＩＳＥＴ方法により単離されたＣＴＣに対して行った［１５］。フィルター当たり、２つのスポットをＩＣＣのために使用し、そして２つのスポットをＦＩＳＨのために使用した。ＩＣＣのために、スポットを、室温で３０分間、ＡＬＫタンパク質（1:50, 5A4; Abcam, Cambridge, UK）に対する一次抗体と共にインキュベートした。反応を、３，３′−ジアミノベンジジンにより可視化し、続いてヘマトキシリンにより対比染色した。細胞質染色は、ＡＬＫに対して陽性であると見なされた［３０］（補足データ）。複数のスポットに対して行われるＦＩＳＨは、ＡＬＫ遺伝子（Vysis LSI ALK Dual Color, Abbott Molecular, Abbott Park, IL）のためのブレーク−アパートプローブを、その製造業者の説明書に従って使用した。スプリットシグナル又は単独の３′シグナルを示す細胞は、ＡＬＫ再配置に対して陽性であると見なされた［３１］。フィルターを独立して試験し、そして臨床、ＩＨＣ、ＩＣＣデータ及び組織遺伝子型を盲検した。我々は、手術の前、及び手術の７及び１５日後、血液サンプリングを受けた３４人の患者のＣＴＣに対するＡＬＫ検出についてのＩＣＣ及びＦＩＳＨ結果の再現性を試験した。
【０２０３】
１４〜５００の解釈できる腫瘍細胞核を、各患者について分析した。正しく解釈されるために、腫瘍細胞核は、少なくとも１つの共局在シグナルを有すべきである。ＡＬＫ−再配置として見なされるためには、解釈できる腫瘍細胞核の少なくとも１５％が、異常プローブハイブリダイゼーションパターンを保有すべきである。
【０２０４】
ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）から入手されるヒトＮＳＣＬＣ細胞系Ｈ２２２８を、ＡＬＫ再配置陽性対照として使用した［３２］。細胞を、これまでに記載されたように、１０％ウシ胎児血清により補充されたＲＰＭＩ１６４０培地において培養し、そして維持した［３２］。約５０個の細胞を、健康な対象から採取された１０ｍｌの血液サンプル中に混合した。次に、サンプルを、これまでに記載されたようにして、ＩＳＥＴ方法を用いて濾過した［２３］。次に、抗−ＡＬＫ抗体と共に、ブレーク−アパートプローブ及びＩＣＣを用いてＦＩＳＨを、上記のようにして実施した。
【０２０５】
陽性ＡＬＫ免疫染色が、ムチン生成と共に固体優勢構造を有する腺癌に対応する５個の腫瘍に見出された。それらの５個の例は、数個の細胞における膜強化を伴って、前に定義されたようなすべての腫瘍細胞に対して強い陽性の細胞質染色（評点＋３）を示した［３１］。連続切片上の同じパラフィンブロックに対して行われたＦＩＳＨ分析は、ＡＬＫ−再配置腺癌を実証した。他の８２の腫瘍は、ＡＬＫ免疫染色、及びＦＩＳＨ分析を用いてのＡＬＫ−再配置に対して陰性であった。１０の腫瘍（１２％）は、ＥＧＦＲ変異誘発された（１つのエキソン１８、１６のエキソン１９及び３のエキソン２１変異）、そして２０の腫瘍（２４％）がＫＲＡＳ変異誘発された（エキソン２の１８のコドン１２及びエキソン２の２つのコドン１３）。ＢＲＡＦ変異は検出されなかった。５つのＡＬＫ−再配置腫瘍は、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ及びＢＲＡＦ野生型であった。
陽性ＡＬＫ免疫染色が、腫瘍にＡＬＫ−再配置を有する患者に対応する５人の患者において単離されたＣＴＣに見出された（図１Ａ、Ａ１及びＢ１、及び図１Ｂ）。それらの５人の患者の臨床病理学的データが、表３に詳述されている。
【０２０６】
【表３】
2019074538.tif 000004
【０２０７】
５Ａ４クローンを用いての抗−ＡＬＫ  ＩＣＣは、ほとんどの細胞において膜強化を有するＣＴＣの１００％の強い細胞質染色（評点計）を示した（図１、Ａ１及びＢ１、及び図１Ｂ）。ＡＬＫ  ＦＩＳＨは、それらの５例において有益であった（図１、Ａ２及びＢ２、及び図１Ｂ）。すべてのＣＴＣは、異常シグナルパターンを有し、そして少なくとも３つのシグナルは、各例において細胞当たりに観察され、遺伝子増幅又は異数性の何れかと一致した（図１、Ａ２及びＢ２、及び図１Ｂ）。さらに、ＦＩＳＨは、ＡＬＫトランスロケーションの存在を確認し、すべての例は細胞当たり５′及び３′プローブのブレーク−アパート及び複数シグナルを有した（図１、Ａ２及びＢ２、及び図１Ｂ）。５例の何れも、ＦＩＳＨプローブのパートの損失を有さなかった。最終的に、それらの５人の患者に関して、ＭＧＧにより染色されたＣＴＣは、これまでに記載されるように、悪性特徴を有するＣＴＣを示した（図１、Ａ３及びＢ３、及び図１Ｂ）［２２］。ＡＬＫ−ＩＣＣ及びＡＬＫ−ＦＩＳＨの陽性は、最初の検出の７及び１５日後、ＩＳＥＴを用いて単離されたＣＮＨＣ−ＭＦにより、各患者に関して、調整された。
【０２０８】
抗−ＡＬＫ抗体による陽性免疫染色、及びＦＩＳＨ分析を用いてのＡＬＫ−再配置は、ＭＧＧ染色に基づく悪性特徴を有するＣＴＣを示す８２人の他の選択された肺癌患者には実証されなかった（図１、Ｃ１−Ｃ３）。ＩＳＥＴ方法により濾過されるよりも、血液サンプルにおいて希釈されたＡＬＫ−再配置Ｈ２２２８細胞は、強い陽性ＡＬＫ免疫染色及びＡＬＫトランスロケーションを実証した（図１、Ｄ１−Ｄ３）。
【０２０９】
ＩＣＣ及びＦＩＳＨによるＡＬＫの検出のための結果の再現性を、手術の前、及び手術の７及び１５日後、血液サンプリングを受けた３４人の患者からの血液サンプルの１０２のフィルターのＣＴＣに対して試験した。含まれる３４人の患者のうち、５人の患者は、ＡＬＫ陽性腫瘍組織を有し、そして２９人の患者はＡＬＫ陰性腫瘍組織を有した。陽性結果は、ＡＬＫ陽性腫瘍を有する５人の各患者から得られた３種の異なった血液サンプルからのＣＴＣについて、ＩＣＣ及びＦＩＳＨにより一貫して得られた。ＡＬＫについての負の結果は、ＡＬＫ陰性腫瘍を有する２９人の各患者から得られた３種の異なった血液サンプルからのＣＴＣに対するＩＣＣ及びＦＩＳＨにより一貫して得られた。
【０２１０】
補足データ：患者及びサンプル
ＦＩＳＨ分析を、ＡＬＫ遺伝子についてブレーク−アパートプローブを用いて、腫瘍サンプルに対して実施した（Vysis LSI ALK Dual Color, Abbott Molecular, Abbott Park, IL）（補正データ）。スライドを、６３倍の対物レンズを用いて落射蛍光顕微鏡（B×51、Olympus，  Tokyo，Japan）上で読み取り（ＭＩ、ＥＬ、ＣＢ）、そしてイメージを、Soft Imagingシステム（Cell、Olympus）ソフトウェアを用いて分析した。結果は、臨床的及び免疫組織化学的データ及び遺伝子型について独立して盲検評価された。３人の病理学者の間での不一致が認められる場合、スライドは、コンセンサスを得るために再検討された。少なくとも５０の解釈できる腫瘍細胞核が、各腫瘍について分析された。適切に解釈されるためには、腫瘍細胞核は、少なくとも１つの共局在シグナルを有すべきである。
【０２１１】
免疫組織化学法（ＩＨＣ）を、室温で４５分間インキュベートされたＡＬＫタンパク質（1:50, 5A4; Abcam, Cambridge, UK）に対する一次抗体を用いて、脱パラフィン切片上で実施した。染色の強さ、及び陽性細胞の百分率を、次の通りに、半定量的に評価した：０＝腫瘍細胞の染色なしか、又は１０％以下でのかすかな染色；１＋＝腫瘍の１０％以上でわずかな染色；２＋＝中程度の染色；３＋＝強い染色。陽性ＡＬＫ発現は、１＋〜３＋として見なされた。検体における免疫組織化学染色は、臨床データ及び遺伝子型を、３人の病理学者（ＭＩ、ＶＨ及びＰＨ）により、独立して盲検評価された。３人の病理学者間の不一致が認められた場合、スライドは、コンセンサスを得るために再検討された。
【０２１２】
ｉ）コドン７１９、７６８、７９０及び８５８−８６１におけるＥＧＦＲ変異ホットスポット、及びエキソン１９における欠失及び複雑な変異、ｉｉ）コドン１２、１３及び６１におけるＫＲＡＳ変異ホットスポット、及びｉｉｉ）コドン６００及び４６４−４６９におけるＢＲＡＦ変異についての標的変異分析を、これまでに記載のようにして、パイロシーケンシングにより、凍結された腫瘍組織切片から抽出されたＤＮＡから実施した［２９、３０］。ＰＣＲ増幅を、その対応するTherascreen（登録商標）パイロキット(Therascreen（登録商標）EGFR Pyro（登録商標）キット、CE-IVD, Ref. 971480; therascreen（登録商標）KRAS Pyro（登録商標） キット、CE-IVD, 参考文献971460; Therascreen（登録商標）BRAF Pyro（登録商標）キット、CE-IVD, 参考文献971470; Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、その製造業者のプロトコルに従って実施した。ＰＣＲ生成物（１０μｌ）を、PyroMark Q24 MDx Vacuum Workstation (Qiagen)を用いて、その製造業者の標準プロトコルに従って、パイロシーケンシング分析のために２４ウェル形式下で処理した。プレートを、配列決定のために、PyroMark Q24 System (Qiagen)に直接移した。データを、PyroMark Q24 Software (Qiagen)により、自動的に分析した。
【０２１３】
補足データ：ＩＳＥＴフィルター上での免疫細胞化学（ＩＣＣ）及び蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ＩＣＣに関しては、熱誘導エピトープ回収を、ＡＬＫ用標的回収溶液（ｐＨ９）（Dako, Carpinteria, CA）により実施した。スポットを、３％過酸化水素により２０分間、処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻止し、続いて脱イオン水により２−４分間、洗浄した。次に、スポットを、ＡＬＫタンパク質（1:50, 5A4; Abcam, Cambridge, UK）に対する一次抗体と共に、室温で３０分間、インキュベートした。反応を、３、３′−ジアミノベンジジンにより可視化し、続いてヘマトキシリンにより対比染色した。細胞質染色は、ＡＬＫに関して陽性であるとして見なされた［３０］。染色の強さ及び陽性細胞の百分率を、上記のようにして、３人の病理学者（ＭＩ、ＶＨ及びＰＨ）により、半定量的に評価した。フィルターを、独立して試験し、そして臨床、ＩＨＣデータ、及び組織及び細胞遺伝子型について盲検した。３人の病理学者間での不一致が認められる場合、スライドはコンセンサスを得るために再検討された。
【０２１４】
本発明者は、ＡＬＫ状態が下位組の肺癌患者において細胞形態学的アプローチにより特徴付けられるＣＴＣにおいて非侵襲的に検出され得ることを、二重ＩＣＣ−ＦＩＳＨアッセイを用いて示した。さらに、それらの結果は、一連の８７人の肺腺癌患者において、ＣＴＣにおける及びその対応する腫瘍組織サンプルにおけるＡＬＫ状態間の厳密な相関性を示した。それらの患者のうち５人は、西洋人の間で、ＡＬＫ−遺伝子再配置に関連することが以前報告された臨床病理学的特徴を有し、そしてＣＴＣ、及び対応する切除された腫瘍サンプルの両者においてＡＬＫ−遺伝子再配置を示した［２８］。逆に、ＡＬＫ−遺伝子再配置を有するＣＴＣは、ＡＬＫ標的療法とは無関係に、ＡＬＫ−陽性肺癌患者の予後についての関連性にそれらの関心を集中する最近のＦＩＳＨ研究により示されるように、ＡＬＫ−遺伝子再配置を有さない腫瘍を有する患者には決して見出されなかった［３３−３５］。それらの研究のいくつかは、プレ−ＡＬＫ阻害剤により処置されなかった患者においては、ＡＬＫ−陽性患者は最短の生存性を有し、そして高い転移の危険性と関連していたことを実証した［３３、３５］。さらに、ＡＬＫ−陽性患者は、ＡＬＫ−陰性患者よりも、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤処置に対して、より耐性であった［３３］。逆に、最近の研究は、野生型ＥＧＦＲ  ＡＬＫ−陽性肺腺癌患者がより良好な成果を有したことを示している［３３］。逆に、最近の研究は、野生型ＥＧＦＲ  ＡＬＫ−陽性肺腺癌患者がより良好な成果を有したことを示している［３４］。現在の研究においては、５人のＥＧＦＲ野生型ＡＬＫ陽性患者の５年の追跡は、手術を受けた２人の第II期患者に関しては再発を示さず、ところが３人の第III ｂ／ＩＶ期患者は、診断の６ヶ月以内に死亡した。アジュバント療法、特にＡＬＫ再配置に対する標的療法は、それらの患者においては管理されなかった。
【０２１５】
ＣＴＣ単離及び特性決定を通してのＡＬＫ−遺伝子再配置を検出するための非侵襲性アッセイは、臨床学的考慮に基づかれている。クリゾチニブによる治療は、信頼できる技術的アプローチによる腫瘍サンプルの系統的プレスクリーニングを意味する、実証されたＡＬＫ−遺伝子再配置を有する腫瘍に制限されるべきである。しかしながら、肺癌患者からの腫瘍組織は、標的療法の使用のために患者の層別化を目的とした、病理学的試験及び増加するリストの免疫／分子分析の両者を実施するのに十分な量で必ずしも入手できない。アポトーシス細胞に由来され得、そして腫瘍細胞侵襲性質を欠いている、血漿中の遊離腫瘍ＤＮＡ／ＲＮＡとは矛盾して、ＣＴＣは、「液体生検」を表し、そして非侵襲性治療診断のための理想的標的を構成することができる。
【０２１６】
本発明者は、ＣＴＣを単離するためにＩＳＥＴアプローチを使用した。なぜならば、彼ら及び他のものは、この方法がＮＳＣＬＣ患者におけるＣＴＣ単離のために高い感受性を表すことを示しているからである［１５−１７］。以前に指摘したように、ＩＳＥＴによるＣＴＣ単離は、細胞サイズに依存し、そして任意の細胞マーカーには無関係である。従って、上皮マーカーを発現する腫瘍細胞、及びＥＭＴのために、上皮抗原を失ったそれらの腫瘍細胞は、ＩＳＥＴにより効果的に単離される［１７，２１，２４，２５］。さらに、ＩＣＣ及び分子分析、例えばＦＩＳＨは、ＩＳＥＴを用いて単離され、そして特徴付けられたＣＴＣにおいて開発され得る［１７、１８，２１、２３−２５］。興味深いことには、それは、手術の前、及び手術の７日及び１５日後、試験された３４人の下位群の患者及び腫瘍組織についての５人のＡＬＫ−陽性患者に対するＩＣＣ及びＦＩＳＨによるＡＬＫの検出についての結果の再現性を実証された。一致した結果が、各患者から得られた３種のサンプルにおいて盲検的に得られた。それらの結果は、フィルター上のＡＬＫについてのＩＣＣ及びＦＩＳＨ分析の技術的再現性を確認し、そしてＣＴＣ分析による患者の動的リアルタイム追跡の実現可能性を示す。
【０２１７】
肺腫瘍組織におけるＡＬＫ−遺伝子再配置の信頼できる評価は、診断及び技術的な課題として認識されている［３１、３６］。腫瘍サンプル上のＡＬＫ状態は、ＦＩＳＨ免疫組織化学及び／又は逆転写酵素−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて評価され得る［３１、３５−３９］。ＦＩＳＨは、クリゾチニブによる現在の臨床試験において適格性基準として使用される診断方法である［３８］。ヒトＡＬＫタンパク質に対して特異的な抗体（抗体クローンＡＬＫ１）を有するＨＣは、遺伝子検査は不要と見なされるような感度及び特異性を有する、下位組の末分化大細胞リンパ腫におけるＡＬＫ再配置についての診断である［３８］。ＮＳＣＬＣにおいては、再配置されたＡＬＫ遺伝子からのＡＬＫタンパク質の発現は低い。しかしながら、新規ＡｌＫ−特異的抗体の開発及び使用が、非常に興味ある結果を提供している。
【０２１８】
発明者は、最近、正確に２０／２０ＮＳＣＬＣ腫瘍組織を分類することが示されている、抗−ＡＬＫ抗体、すなわちクローン５Ａ４を使用した［３６］。５人のＡＬＫ−再配置された症例においては、５０％以下の腫瘍細胞が腫瘍においてＡＬＫ−ＦＩＳＨ陽性であり、ところがそれらの細胞の１００％はＩＨＣによれば、ＡＬＫ陽性であったことが注目された。しかしながら、ＡＬＫについてのＩＨＣは腫瘍の特定領域において不均質であり、そして一部の細胞のみがかすかに染色され（１＋）、ところが他の細胞は強く染色された（３＋）。従って、最近の研究に記載されるように、ＡＬＫ遺伝子再配置についてのＩＨＣとＦＩＳＨとの間の相関性が腫瘍の一部の領域でのみ観察され得［４０］、ＦＩＳＨ陽性細胞と、「ＩＨＣ  ３＋のみ」陽性細胞との間の良好で且つより適切な比較の問題を提起する。予備的データとして、本発明の研究は、ＣＴＣに対して実施されるＩＣＣは、ＡＬＫ−再配置及び他のゲノム変更、例えばＥＧＦＲ変異を検出するための有望なツールであり得ることを示している。この点に関して、いくつかのＥＧＦＲ変異が、特定の抗体を用いて下位組の肺腺癌においてＩＨＣにより示され得る［３１、４１］。我々は、そのようなＥＧＦＲ変異がこの下位組の肺癌におけるＣＴＣに対するＩＣＣアプローチを用いても示され得ることを推測できる。本研究において検出されるすべてのＣＴＣは、ＡＬＫ−ＦＩＳＨ陽性であり、そしてＡＬＫに対する特異的抗体を用いてのＩＣＣによれば、強い陽性であることは注目に値する。この特異的ゲノム変更を有するＣＴＣは、促進された移動性を有し、そして攻撃的組の腫瘍細胞を表す。ＡＬＫ−遺伝子再配置がまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出され得る［３０、３６］。ＲＴ−ＰＣＲは、種々のサイズの複数転写体の増幅を提供するために高品質のＲＮＡを必要とする挑戦的アプローチである［３６］。最終的に、定量的リアルタイムＰＣＲアプローチが、ＡＬＫ転写体、及び得られる有望な結果を定量化するために最近、開発されて来た［３６］。発明者は、ＲＴ−ＰＣＲアプローチを用いてＡＬＫ再配置を見出そうとはしなかった。なぜならば、ＩＳＥＴにより単離されたＣＴＣから実質的に抽出できるＲＮＡの量及び質は、濾過の前血液希釈のために使用される市販の緩衝液はホルムアルデヒドを含むので、試験のためには十分ではないと思われるからである。しかしながら、この方法は、固定されたＣＴＣに比較して、変わらない感度で新鮮なＣＴＣを単離するために開発された新規ＩＳＥＴ緩衝液を用いて試験され得る。
【０２１９】
非侵襲性ＣＴＣベースの試験の使用は、標的療法に対する耐性に関与する可能性ある新規ゲノム変更を同定するために、患者のリアルタイム分子療法診断追跡の実施を可能にすることができる［４２］。この点において、クリゾチニブに対する獲得耐性の出現は、ＡＬＫ陽性肺癌患者の臨床診療における新規挑戦である［１１、４３、４４］。実際、新規ゲノム変更は、クリゾチニブ治療中に発生する可能性があり、そして最初の標的治療を非効率にすることができる。従って、リアルタイムモニタリングは、ＩＳＥＴにより単離され、そして形態学的アプローチにより、診断的に特徴づけられたＣＴＣについての分子試験を通して可能性ある追加のゲノム変更を検出することを目的に開発された。
【０２２０】
発明者は、ＩＳＥＴにより単離され、そして悪性特徴を有するＣＴＣとして特徴づけられたＣＴＣにおけるＡＬＫ−遺伝子再配置の検出の実現可能性を示した。ＩＣＣ及びＦＩＳＨ分子アプローチを用いての一貫性のある結果が見出され、そして重要なことには、８７人の試験された患者における腫瘍組織に比較して、また、ＣＴＣにおいて一貫した結果が見出された。それらの結果は、肺癌患者の非侵襲性ＡＬＫ状態プレスクリーニングの評価のためにＣＴＣベースの治療診断アプローチを提供する。
【０２２１】
実施例３：侵襲性癌の早期診断への本発明の適用
「センチネル」（sentinel）循環腫瘍細胞は、慢性閉塞性肺疾患の患者における肺癌の早期診断を可能にする。
【０２２２】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、侵襲性癌の非常に早期の段階で循環すると思われ；しかしながら、それらは、侵襲性癌として、最初の顕著な特徴を報告されたことはない。我々は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の前腫瘍状態を有する１６８人の患者のうち、ＩＳＥＴ（腫瘍細胞のサイズによる単離）、すなわち高い感受性の「細胞病理学ベースの」ＣＴＣ−プラットフォームにより検出されるＣＴＣを有することが見出された約３人を報告している。毎年実施されるＣＴスキャンは、ＣＴＣが血液中に出現したわずか１〜４年後、肺結節を検出し、これはその外科的切除、及び初期段階のＮＳＣＬＣの病理学的診断を導く。次に、ＩＳＥＴを、手術の９又は１２ヶ月後、反復し、そしてＣＴＣの消出を示した。それらの３症例は、概念の証明として、「危険性のある」患者における侵襲性肺癌の初期指標として使用されるＣＴＣの可能性を示す。
【０２２３】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、血液における「循環希少細胞」（ＣＲＣ）のグループに属し、この検出は、非侵襲的予測医学に新しい経路を開くことができる。ＣＲＣは、それらのレベルは１ｍｌの血液当たり１（又はそれよりも低い）ほどであるので、現在の血液分析によって検出できず、従って、１つの細胞は平均１千万の白血球及び５０億の赤血球と混合される。さらに、ＣＲＣは異なったタイプのものであり、上皮及び間葉ＣＴＣ、炎症性疾患及び医原性介入により広がる上皮非腫瘍細胞、内皮細胞、幹細胞及び胎児細胞（妊婦における）を包含する。従って、ＣＴＣの特異的検出は、他のＣＲＣからのそれらの鑑別診断、及び感度及び診断特異性の二重の技術的課題を意味する［４５］。
【０２２４】
それらの技術的困難性のために、ＣＴＣについての診断ではなく、循環上皮細胞の検出方法が、主に転移性癌を有する患者における予後／予測マーカーを開発するために使用されて来た［４６］。しかしながら、臨床学的、分子及び動物研究からデータの組合せが、侵襲性癌がそれらの進行の非常に初期の段階で腫瘍細胞に広がることを、最近示しており、このことは、ＣＴＣ検出のための敏感且つ診断アプローチがそれらの早期診断のための助けになる可能性がある［４７、４８］。
【０２２５】
肺癌は攻撃的で且つ高い侵襲性の疾患である。その早期診断は、９４００万人の禁煙者が米国で主要な死亡原因である疾患についてのリスクが高いので、重要な問題である［４９］。肺癌のリスクが高い５３、４５４人を研究した国立肺検診試験は、低線量ＣＴＣ検診が、２０％の肺癌の死亡率の減少と関連していることを、最近示している「４９」。しかしながら、この結果は、検診された２６，３０９人の患者のうち、７１９１人が陽性であることが見出されたが、しかしわずか６４９人が肺癌を有することが判明したので、印象的な９６．４％の偽陽性結果に関連した。さらに、肺癌を有する患者の合計数は１０６０であり、これはＣＴ検診によっては見逃された４１１人の偽陰性を包含する。
【０２２６】
この設定で、本発明者は、肺癌の高度に侵襲性の特性が弱点として使用され、そしてＣＴＣの感受性及び診断検出を介してその早期診断を可能にすることができることを推論した。従って、細胞病理学的診断を可能にする、損なわれていないＣＴＣの非常に敏感な単離のための直接的なアプローチであるＩＳＥＴ（腫瘍細胞のサイズによる単離）が使用された［４６、５０、５１］。
【０２２７】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、すなわち肺癌のための危険因子として見なされる病状を有する、イメージングによる肺腫瘍検出の前に、血液にＣＴＣを有することが見出されている３人の患者が説明される。
【０２２８】
この報告は、ＣＴＣの敏感且つ診断的同定が侵襲性癌の早期診断のための有望な試験を提供することを、ヒトにおいて最初に示している。
【０２２９】
症例報告
症例１
１９９５年、患者ＸＢ（男性、４９歳）は、肺機能試験、５０〜７９％の間のＦＥＶ１（１秒での強制呼気量）及び胸部Ｘ線に基づいて、中程度（ＧＯＬＤ２）の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）と診断された。彼は４５ＰＹ（パックイヤー：４５年間、１日１パックのタバコ）、喫煙した。１４年後（２００９年１０月）、彼は、ＩＳＥＴにより試験され、そして細胞病理学的分析により同定される１０ｍｌの血液に６７ＣＴＣ及び３ＣＴＭ（循環腫瘍微小塞栓）を有することが見出された。同じ日に実施された低線量スパイラルＣＴスキャンは、ＣＯＰＤの診断を確認したが、しかし肺結節を示すことには失敗した。次に、ＣＴスキャンを、その後、毎年企画し、そして１年後（２０１０年１０月）、右下肺葉に直径１．５ｃｍの肺結節の存在を、最初に示した。手術が１ヶ月後、行われた。病理学的分析及び癌の病期分類は、リンパ節又は遠隔転移への広がりを有さない菅状乳頭線癌ステージＩＡを示した（ｐＴ1ａＮ0Ｍ0）。腫瘍の遺伝子型判定は、コドン１２にＫ−Ｒａｓ変異を示した。患者は何れの追加の治療も受けなかった。彼は、手術後９ヶ月でＩＳＥＴにより試験され、そしてＣＴＣは彼の血液には見出されなかった。
【０２３０】
症例２
患者ＡＣ（男性、５４歳）は、肺機能試験、３０〜４９％のＦＥＶ１及び胸部Ｘ線に基づいて、１９９８年、重度（ＧＯＬＤ３）のＣＯＰＤと診断された。彼は６０ＰＹ、喫煙した。１１年後（２００９年５月）、彼は、ＩＳＥＴにより試験され、そして細胞病理学的分析により同定される１０ｍｌの血液に４３ＣＴＣ及び１ＣＴＭを有することが見出された。同じ日に実施された低線量スパイラルＣＴスキャンは、ＣＯＰＤの診断を確認したが、しかし肺結節を示すことには失敗した。次に、ＣＴスキャンを、毎年反復し、そして３年後（２０１２年９月）、左上肺葉に直径２．４ｃｍの肺結節の存在を、最初に示した。患者は手術を１ヶ月後、受けた。病理学的分析及び癌の病期分類は、リンパ節又は遠隔転移への広がりを有さない菅状乳頭線癌ステージＩＡを示した（ｐＴ1ａＮ0Ｍ0）。腫瘍ＤＮＡの分析は、コドン１２にＫ−Ｒａｓ変異を示した。患者は何れの追加の治療も受けなかった。彼は、手術後１２ヶ月でＩＳＥＴにより試験され、そしてＣＴＣは彼の血液には見出されなかった。
【０２３１】
症例３
１９９９年、患者ＢＭ（男性、４７歳）は、肺機能試験、５０〜７９％の間のＦＥＶ１（１秒での強制呼気量）及び胸部Ｘ線に基づいて、中程度（ＧＯＬＤ２）のＣＯＰＤと診断された。彼は５５ＰＹ（パックイヤー：３年間、１日１パックのタバコ）、喫煙した。９年後（２００８年２月）、彼は、ＩＳＥＴにより試験され、そして細胞病理学的分析により同定される１０ｍｌの血液に３２ＣＴＣ及び１ＣＴＭを有することが見出された。同じ日に実施されたＣＴスキャンは、ＣＯＰＤの診断を確認したが、しかし肺結節を示すことには失敗した。次に、ＣＴスキャンを、その後、毎年実施し、そして４年後（２０１２年８月）、右上肺葉に直径１．４ｃｍの肺結節の存在を、最初に示した。手術が１ヶ月後、行われた。病理学的分析及び癌の病期分類は、リンパ節又は遠隔転移への広がりを有さない菅状乳頭線癌ステージＩＡを示した（ｐＴ1ａＮ0Ｍ0）。腫瘍の遺伝子型判定は、コドン１２にＫ−Ｒａｓ変異を示した。患者は何れの追加の治療も受けなかった。彼は、手術後１２ヶ月でＩＳＥＴにより試験され、そしてＣＴＣは彼の血液には見出されなかった。
【０２３２】
方法
ＩＳＥＴ方法は、８ミクロンの孔を有するポリカーボネート膜上で循環ＣＴＣ及びＣＴＭを富化するエンジン式血液濾過ベースのアプローチである［５０、５１］。末梢血液（１０ｍｌ）を、緩衝されたＥＤＴＡに収集し、４℃で維持し、そして収集の１時間以内で処理した。膜上の７個のスポットを、免疫細胞化学のために処理し、そして３個のスポットを、細胞分析のためにMay Grunwald Giemsa (MGG)染色により処理した。免疫細胞化学を、室温で４５分間、フィルターに適用される、パン−サイトケラチン抗体（マウス、クローンＫＬ−１、Immunotech、Marseille）及び抗−ビメンチン（マウス、クローンＶ９、Ｄａｋｏ、Ｐａｒｉｓ）による二重免疫標識を用いて、前述のようにして実施した。
【０２３３】
ＩＳＥＴを用いれば、患者は、ＭＧＧ染色に基づいての単離された細胞の細胞病理学的分析、及び前に定義された基準に従っての、特徴的悪性特性を有する細胞の検出に基づいてＣＴＣに関して陽性として見なされた［５１］（図２）。
【０２３４】
結果
ＩＳＥＴを用いれば、１６８（１．８％）のＣＯＰＤ患者のうち３人が、ＩＳＥＴによる単離、及び前に定義された基準に従って特徴的悪性特性を有する細胞の検出を可能にするＭＧＧ染色による単離された細胞の細胞病理学的分析に基づいて、ＣＴＣに関して陽性であることが見出された［５１］。
【０２３５】
それらの追跡において肺癌を進行している、ＩＳＥＴに基づいての細胞病理学分析により検出されるバースラインでＣＴＣを有する３人のＣＯＰＤ患者は、単離されるか又はシートに分類された、３２〜６７のＣＴＣを有することが見出された（図２）。ＣＴＣは、大きな核、散乱核溝、ヘテロクロマチン塊、及び高い核／細胞質比を伴っての中程度の量の細胞質を明らかにした（図２）。さらに、それらの患者は次の通りに、時折りＣＴＭを示した：患者１は３，９及び１５のＣＴＣから構成される３個のＣＴＭを有し；患者２は、２０の細胞と共に１つのＣＴＭを有し；そして患者３は、１２のＣＴＣと共に１つのＣＴＭを有した。時折り発生するの塊は、頻繁な複数の核小体及び核オーバーラッピングと共に、核異型、中程度〜顕著な核の大小不同（anisonucloosis）を示す楕円形又は多角形ＣＴＣの三次元凝集性シートを明らかにした。その対応する免疫染色された細胞は主に、パン−サイトケラチンのみを発現した（図２）。しかしながら、少数のＣＴＣは、弱い関連性のサイトケラチン発現と共にビメンチンを強く発現した（図２）。
【０２３６】
より良性の細胞形態学的特長を有する単離細胞をまた、１６８人（１．８％）のＣＯＰＤ患者のうち３人にＩＳＥＴにより検出した。しかしながら、それらの３人の患者も又はＣＯＰＤを有する他の１６２人の患者も、続く追跡の間（平均追跡時間：４８ヶ月）、肺結節の進行を示さなかった。ＣＴＣは、検出できる病状を有さない４２人の対照喫煙者及び３５人の非喫煙の健康な個人においては検出されなかった。
【０２３７】
議論
肺癌は、高い侵襲性癌であることが知られており、そして７５％以上の患者が診断での手術の対象とならない［７５］。その高い割合及び侵襲性特性のために、それは世界中の癌関連死の主要原因である［５３］。この分野では、診断及び非侵襲性バイオマーカーの発見が、低線量スパイラルＣＴスキャン検診及び早期の外科的介入の次の段階を示すことが重要である可能性がある。肺癌の高度な悪性挙動性が侵襲能力に結合されるので、ＣＴＣの高感度診断検出の使用がＣＴスキャン調査を補完し、そしてＣＴスキャン検診に関連する誤った陽性及び陰性結果の低減を助けると思われた。従って、発明者は、ＣＯＰＤを有する１６８人の患者集団を標的にした。ＣＯＰＤは、米国において死因の第３位であり、そして喫煙比率の上昇により、２０３０年までに世界の死亡原因の第４位になると予測される。ＣＯＰＤは、肺癌の新生物発生前の状態として見なされ、そして全体として、ＣＯＰＤ患者の２．２％が、毎年肺癌を発症すると計算されている。しかしながら、ＣＯＰＤの進行は、肺発癌に対する感受性を４〜６倍まで高め、この観察は、ＣＯＰＤ及び肺癌の両者における共有機構であると思われる。従って、ＤＯＰＤの早期診断は、早期ＣＯＰＤ疾患過程における禁煙が疾患の進行を遅くし、そして羅患率及び死亡率を低めるので、重要である［５４］。
【０２３８】
いくつかの方法が、可変の感度及び特異性を伴って、循環腫瘍細胞の単離及び検出に適用されて来た［４５］。しかしながら、発明者は、肺癌の早期診断の設定によれば、細胞病理学的診断アプローチのみが、ＣＴスキャン検診をまた包含する、肺癌の早期診断のための組合されたアプローチに使用される「センチネルＣＴＣ／ＣＴＭ」を明らかにするのに適切である可能性があると考えた。
【０２３９】
ＩＳＥＴは、それらの免疫細胞病理学的及び分子分析も可能にする高感度態様で、血液から損なわれていないＣＴＣを単離する、血液サンプルの直接的且つ迅速な治療である。
【０２４０】
本明細書に報告される３種の症例は、ＣＴスキャンによる肺結節の検出の１〜４年前、適切な数のＣＴＣ／ＣＴＭを明らかにした。不運なことには、ＩＳＥＴフィルターは、−２０℃で貯蔵されず、ＣＴＣ／ＣＴＭにおけるＤＮＡ変異の研究を不可能にする。しかしながら、それらのデータは、ＣＴＣが「in situ」癌の段階早期の侵襲性癌により拡散されるを示す、動物モデルにおいて得られる結果を、ヒトにおいて、初めて検証する。この設定下で、ＣＴＣもＣＴＭも、検出できる病状を有さない４２人の喫煙者に及び３５人の禁煙の健康な個人に、ＴＳＥＴにより見出されなかったことを注目することはまた重要である。全体的に、癌を有さない５６２人の対象は、異なったグループ下でＩＳＥＴにより研究されており、そして彼らの血液にＣＴＣを有さないことが示されている。
【０２４１】
最初に本明細書に示されるように、肺癌を発症する危険性の約３人の患者は、肺結節がイメージングにより同定される１〜４年前、ＩＳＥＴ及び細胞病理学により検出されるＣＴＣを有することが見出された。それらの３人の患者においては、肺癌は、すばやい外科的切除を可能にする早期段階（ＩＡ）で診断され；次に、彼らは、手術の後、数ヶ月でＣＴＣを有さないことが示された。危険性のある患者における肺癌の早期診断のための信頼できるツールとして、ＣＴＣの診断同定の可能性を評価するために、より大規模な研究が現在、必要とされる。
【０２４２】
実施例４：経子宮頸サンプルから子宮頸栄養膜の単離及び特性決定のためへの本発明の適用
栄養膜。好ましい実施形態によれば、栄養膜細胞は、経子宮頸サンプルからの濾過により抽出され、細胞形態学的分析により同定され、そしてそれらのゲノムは、レーザー顕微解剖及び完全ゲノム増幅の後、ＰＣＲにより、それぞれ特徴づけられ得る。
【０２４３】
経子宮頸サンプルを、子宮頸部の中央開口部において回転される細胞採取用ブラシツールを用いて、妊娠の第２週〜第１５週の間に妊婦から採取した。経子宮頸サンプルを、同定試薬を補充されたＰＢＳ溶液中に移した。サンプルを、濾過の前に、数ヶ月間、４℃で貯蔵することができる。
【０２４４】
経子宮頸サンプルを、濾過の前に、それらの細胞充実度に従って、減菌蒸留水により希釈し、そして細胞形態学的染色により分析する。
【０２４５】
単一の栄養膜細胞を、レーザー捕獲顕微解剖により収集し、そして分子分析を、出版物（Saker et al, Prenatal Diagnosis 2006）により報告されるように、遺伝子型判定及び遺伝子分析のために実施する。
【０２４６】
妊婦の初期での妊婦における子宮頸栄養膜の非侵襲性単離のための新規アプローチ。
現代の妊婦検診の主要目的は、胎児損失の１〜２％の危険性に結合される［５５］、侵襲性出生前診断を、完全に安全な［非侵襲性］により置換することである。胎児ＤＮＡを、次の３種の源から非侵襲的に取得することができる：分娩又は流産後に血液中に保持されない、母体血液中の循環胎児細胞、特に循環赤血球及び栄養膜細胞；子宮膜から子宮頸部へのトランジットにおける経子宮頸栄養膜；及び母体血液中を循環する全細胞遊離ＤＮＡの一部である遊離胎児ＤＮＡ。胎児細胞の非侵襲的回収は、純粋（母性ＤＮＡと混合されていない）胎児ＤＮＡを提供することが予測され、羊水穿刺及びＣＶＳの非侵襲性且つ完全に信頼できる代替物の開発を可能にする。しかしながら、循環胎児細胞及び子宮頸栄養膜は、非常にまれであり、そしてそれらの単離は技術的挑戦である。細胞遊離胎児ＤＮＡを標的とする非常に強力な次世代配列決定アプローチは現在、利用でき、そして信頼でき、且つ非侵襲的出生前異数性の検出を提供することが証明されている［５６，５７，５８，５９，６０］。しかしながら、それらの方法は、純粋な胎児ＤＮＡを標的としないので、羊水穿刺及びＣＶＳを置換することはできない。さらに、それらのアプローチは、妊娠の早期で適用され得ず、そして洗練された高価な技術を必要とする。
【０２４７】
我々のチームは、循環栄養膜細胞が、栄養膜は末梢血液白血球よりも大きいので、ＩＳＥＴ（上皮腫瘍／栄養膜細胞のサイズによる単離）により母体血液から容易に抽出され得ることを実証した。さらに、単離された細胞を遺伝的に分析し、そして非侵襲的出生前診断（ＮＩ−ＰＮＤ）におけるそれらの有用性が、２種の劣勢疾患、脊髄性筋萎縮症及び嚢胞性線維症のために実証された［６１、６２］。
【０２４８】
子宮頸管内膜における胎児細胞の存在は、１９７１年、Shettleにより最初に示された。栄養膜細胞は、子宮腔における退縮性絨毛膜絨毛から、及びそれから子宮頸部に向かって脱落されると思われる［６３、６４］。子宮腔は、脱落膜と壁側との融合に続いて、１１〜１２週の妊娠期間で消出し、従ってそれらの希少細胞の収集の可能性は、一過性であることが予測され、そして妊娠初期条件に制限される。経子宮頸細胞（ＴＣＣ）サンプリングと呼ばれる、子宮頸部、及び子宮腔の下極からの胎児細胞の収集は、母体血液からの胎児細胞の単離に代わるものであり、そしてＮＩ−ＰＮＤのための純粋な胎児ＤＮＡの追加の源を提供する。ＴＣＣが単独で、脱落され、そして現在の妊娠を越えては保持されない栄養膜（細胞−及び合胞体栄養細胞）である事実は、大きな利点である。異なったＴＣＣサンプリングアプローチが開発され、そして次のものを包含する：子宮内洗浄、子宮頸管粘液吸引、及び細胞採取用ブラシを用いての子宮頸管サンプリング。最良のＴＣＣサンプリング法の確認を目的とする多くの研究は、子宮及び子宮頸管洗浄が、５週ほどの早い妊娠期間の胎児細胞を一貫して得るための最も効果的方法であることを確立した［６５，６６，６７，６８，６９，７０］。しかしながら、それらは最小限の又は半侵襲性として説明されて来たが、それらの方法に関する主要な関心は、胎児損失の危険性である［７１、７２］。ほとんどの研究においては、サンプルは、妊娠の終了直前に採取され、従って、進行中の妊娠への影響は十分に検討されていない。
【０２４９】
理想的なサンプリング法は、合併症を負わせるべきではなく、進行中の妊娠に対して負の影響をもつべきではなく、病院外で実行するのに容易であるべきであり、そして費用対効果が高くあるべきである。安全な方法を、材料及び方法セッション（サンプルの収集）に記載のように採用した。最も重要なことは、この方法の安全性は、それが日常的に妊娠初期の間に実行されるという事実により実証される。
【０２５０】
この研究においては、子宮頸サンプルを収集するための安全なサンプリングアプローチは、それがサイズに応じて、要素、例えば精子及び白血球を排除するのでのみならず、またそれはレーザー顕微解剖及び何れか他のタイプの細胞分析を助ける細胞の最適層を形成するので、ＩＳＥＴ、すなわち希少細胞を研究する非常に実用的な方法と組合される。胎児細胞の認識を促進するユニーク染色方法を利用することにより、単一の細胞栄養膜、及び合胞体栄養細胞を顕微解剖し、そして遺伝子型判定によりそれらの胎児性質を証明することが可能であった。血液から単離された栄養膜の場合のように、細胞がＮＩ−ＰＮＤのための使用に適していることが、本明細書にまた示されている。遺伝病の非侵襲的出生前診断のための羊水穿刺及びＣＶＳに変わる真の非侵襲性代替手段の一部として使用できる胎児細胞を一貫して且つ非侵襲的に取得する新規アプローチが提供される。
【０２５１】
材料及び方法
サンプルの収集：
ＴＣＣサンプルを、絨毛サンプリングの直前、単一遺伝子疾患を有する胎児をキャリーする危険性のある妊婦（Hopital Necker-Enfants Malades）から、及び妊娠の選択的終了（ＴＯＰ）を受ける女性（Antoine Beclere）から収集した。すべての女性は、７〜１２週の妊娠期間であった。細胞は、従来のＴＣＣサンプリング法とは異なり、細胞採取用ブラシを用いて得られ、我々の研究においては、ブラシは子宮頸管に挿入されないで、むしろ外部ｏｓで回転された。細胞採取用ブラシは、１０ｍｌのメタノール含有保存剤溶液に移された。
【０２５２】
アルシアンブルーによるサンプルの染色及び固定：
１ｍｌの各サンプルを、１ｍｌの１．１％アルシアンブルー８ＧＸ／３％氷酢酸溶液（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）と共に混合し、そして３０−５０分間インキュベートした。次に、サンプルを、水により２５倍に希釈し、全体積を５０ｍｌにした。各サンプルを十分に混合し、そして５分間インキュベートした。
【０２５３】
ＩＳＥＴによるサンプルの濾過
ＩＳＥＴを、単なるわずかな変更を伴って、前述のようにして実施した［６１］。手短には、希釈されたサンプル（５０ｍｌ）を、較正された８μｍの直径の円筒形の孔を有するポリカーボネートフィルターを通して濾過した。１ｍｌのサンプルからの細胞を、フィルター上で１０の直径０．６ｃｍのスポット上に濃縮した。
【０２５４】
レッド核染色法による細胞核の染色：
フィルター上の濃縮された細胞中の核を染色するために、各スポットを、０．１％核ファーストレッド染色／５％硫酸アルミニウム溶液（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）により被覆し、２分間インキュベートし、そして次に、水により十分にすすいだ。フィルターを空気下で乾燥した。
【０２５５】
フィルターの分析及びレーザー顕微解剖：
典型的には、サンプル当たり２つのフィルターを構成し、そして従って、平均２ｍｌの各サンプルを処理した。アルシアンブルーにより染色されなかった、及び細胞栄養膜−様又は合胞体栄養細胞−様形態を示す単一細胞を、Nikon TE 2000-U (Nikon Paris, France and MMI Zurich, Switzerland)レーザー装備の顕微鏡を用いてレーザー捕獲顕微解剖によりフィルターから取得した。各単一細胞を、ＰＣＲに適した微量遠心管の蓋上に放した。
【０２５６】
分子分析：
各顕微解剖された細胞を、１５μｌの溶解緩衝液（１００ｍモル／ｌのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８；４００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）に、６０℃で２時間、溶解し、続いて、プロテイナーゼＫを９４℃で１５分間、不活性化した。プライマー伸長前増幅（ＰＥＰ）［７３］のために、溶解された細胞に、ランダムプライマー（Kit genPEP 75 OD, Genetix, Boston, USA）の４００μＭ溶液５μｌ、６μｌのＰＣＲ緩衝液（２５ ｍＭの ＭｇＣｌ2/ゼラチン(１ ｍｇ/ｍＬ)、１００ ｍＭ のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ ８．３、５００ ｍＭの ＫＣｌ）、４種のｄＮＴＰ（それぞれ、２ｍＭでの）の混合物３μｌ、及び１μｌ（５Ｕ）のＴａｑポリメラーゼ（Applied Biosystem, Foster City, CA, USA）を、６０μｌの最終体積で添加した。単一細胞遺伝子型判定を、父系及び母系ゲノムＤＮＡの分析を通して有益であることが見出されたＳＴＲプライマーを用いることにより実施し、胎児ゲノムを有する細胞を同定した。増幅を、６ μL のＰＥＰ生成物、１０ ｍＭ のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、 ５０ ｍＭの ＫＣｌ、 ２．５ ｍＭ のＭｇＣｌ2、 ２００ μＭ の各デオキシヌクレオチド、０．５ μＭ の各ＳＴＲ 「外部」プライマー及び ２ ＵのTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を含む溶液６０μｌにおいて行った。１０倍に希釈されたＰＣＲ外積２μｌを、「内部」フルオレセイン化ＳＴＲプライマー及び同じＰＣＲプロトコルを用いて、２０μｌの最終体積で再増殖した。次に、１μｌの２０倍に希釈された内部ＰＣＲ生成物を、１３．５μｌの脱イオン化されたＨｉ−Ｄｉホルムアミド及び０．５μｌのGenescan 400 HD (ROX)マーカー(Applied Biosystems)と共に混合し、そしてABI Prism 3100自動配列決定機 (Applied Biosystems)中に負荷した。プロファイルを、Genescan及びGenotypeソフトウェアプログラム（Applied Biosystems）を用いて分析した。
【０２５７】
ＳＭＡ及び嚢胞性線維症の非侵襲的出生前診断を、以前に記載のようにして実施した［６２］。
【０２５８】
侵襲性診断を、Hopital Necker-Enfants Malades, Laboratoire de Genetique Medicale, Parisで行った。
【０２５９】
結果
合計２１の子宮頸サンプルをスクリーンし、ここで細胞採取用ブラシを用いて、妊娠７−１２週の妊婦から、外部ｏｓのレベルで、細胞を単独で取得した。それらの中で、１４人が、単一遺伝子疾患を有する胎児をキャリーする危険性を提供するので、絨毛サンプリング（ＣＶＳ）のために予定され、そして７人の女性が妊娠の選択的終了（ＴＯＰ）を受けようとした。
【０２６０】
子宮頸サンプルは典型的には、種々の母性細胞を含む。図３に示されるように、外子宮頸扁平上皮細胞は、顕微鏡画像で容易に認識される。しかしながら、子宮頸管細胞及び胎児細胞栄養層は、類似する形態を有し、そして従って、区別することは非常に困難である。アルシアンブルーは子宮頸部の円柱上皮細胞を産生する粘液と反応し、そして従って、未染色のまま存続する胎児細胞の認識を促進するために使用された。栄養膜−様形態を示す細胞、すなわち大きな、不規則の高色素性核を有する丸形細胞（図３）が求められた。この形態において、我々は単一細胞栄養層を単離することができ、この胎児遺伝子型を、有益なＳＴＲマーカーの蛍光ＰＣＲ分析により確認した（図３、表４）。
【０２６１】
【表４】
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【０２６２】
合胞体栄養細胞層は、密な核を有し、そして多核化され、そして従って、分子分析のためにはあまり従順ではないと言われている。さらに、合胞体栄養細胞層は、かなり大きな断片であり、従って、混合細胞集団（胎児及び母性）の可能性が高められるはずである。しかしながら、サンプル当たりに回収される胎児細胞の数を増大するために、我々はまた、遺伝子型が再び、ＳＴＲ分析により決定された多核断片を顕微解剖し始めた（図３、表４）。我々は、純粋な胎児性質が認識された合胞体栄養細胞層を単離することができたが（表４）、大部分の断片は、予想通り、胎児及び母性要素を含み、そして従って、この研究から排除された。
【０２６３】
我々は、すべての２１のサンプルに、胎児細胞（細胞膜細胞層又は細胞栄養層のいずれか、及び合胞体栄養細胞層）を同定し、これは、処理されたサンプル１ｍｌ当たり０．５〜６の胎児細胞の頻度であった（表４）。
【０２６４】
嚢胞性線維症（ＣＦ）の非侵襲性診断のための我々の以前に公開されたプロトコルが子宮頸部から単離された胎児細胞に都合よく適用され得ることを示すために、典型的な診断が６つのＣＦ家族のために行われた（表４）。ＣＦの非侵襲性診断は、ＤｅｌＦ５０８変異の存在に基づく［６２］。我々は、すべての胎児が完全にＤｅｌＦ５０８変異を欠いていたか、又はキャリアのみであったと判断した（表４）。我々の結果は、絨毛サンプリングにより確認された。
【０２６５】
議論
循環胎児希少細胞の単離のための適切な技法を開発するためのレースは、母性血流に制限されていない。母性血清における遊離胎児ＤＮＡを標的とする次世代完全ゲノム配列決定アプローチは特に異数性検出において有望であると思われるが、検出され得る遺伝性障害の範囲は、胎児ＤＮＡが母性ＤＮＡと混合されるので、単純に制限される。子宮頸部から胎児細胞の獲得は、代替源を提供し、そして利点を有し、例えば子宮頸部に見出される唯一のタイプの胎児細胞は、現妊娠を持続しないことが知られている栄養膜である。主要課題は、母性血流又は子宮頸部におけるそれらの希少細胞の回収及び単離にある。経子宮頸細胞（ＴＣＣ）サンプリングは、子宮頸内膜及び子宮腔の下極から胎児細胞を回収するために開発された異なった方法を組合す。しかしながら、主要欠点は、それらの技法が最小限侵襲性又は半侵襲性であり、そして胎児損失の危険性を担持する事実である。少なくとも侵襲性ＴＣＣサンプリング法は、典型的には、子宮頸管粘液を取得するために、子宮頸管中に約２ｃｍ挿入される細胞採取用ブラシを使用する。しかしながら、長期追跡を包含する、通常の進行中の妊娠における大規模な研究が、この方法が安全であるとみなされ得る前、行われる必要がある。注目すべきはまた、著者が、抗原性マーカーで免疫蛍光顕微鏡を用いて胎児細胞を同定したが、しかし遺伝子型判定によりそれらの胎児性質を検証しなかったという事実である。妊娠初期の間に、日常に投与される、完全に非侵襲性で且つ安全なサンプリング法は、子宮頸部から細胞を採取し（ヘラ）、そして次に、細胞採取用ブラシが、子宮膣部と子宮頸部が出会う変換区域から細胞を取得するために、子宮頸部の中央開口部で回転される。我々は我々の研究において栄養膜細胞を分離するためにこのアプローチの採用を選択し、そしてそれを、単に膜上に細胞を積層し、そして従って、それらを顕微解剖のために維持する、我々の研究室で開発された技術であるＩＳＥＴと共に組合した。我々は、我々が試験したすべてのサンプルに胎児細胞及び従って、遺伝子検査のための純粋胎児ＮＤＡ源を見出すことができた。我々は、母性血液の場合のように、細胞は遺伝子分析及び診断に適しており、そして従って、種々の遺伝子検査のための可能性を実証することを示す。完全に非侵襲的に、及び妊娠の間、安全であることが実証された、臨床学的に許容されるサンプリング法（採血及び我々の安全な子宮頸試験）により、２種の源から胎児細胞の単離が、遺伝病のための早期の、安全で、且つ信頼できる診断試験の開発のための道を開くことができた。
【０２６６】
本発明は次の特定の実施形態を包含する：
１．希少細胞に関連する状態、障害又は疾患を同定し、診断し、又は予後診断を提供する方法であって、
（ａ）生物学的サンプルをフィルターに通し、そしてフィルター上のその単離された希少細胞を回収することにより希少細胞を単離するか又は抽出し；ここで前記フィルターは、希少細胞を保持するが、しかし他の種類の細胞の通過を可能にする、孔サイズ、孔密度又は他の物理的特性を有し；
（ｂ）前記単離された又は抽出された希少細胞の細胞形態を決定し、そして／又は前記単離された希少細胞を免疫標識し、そして／又は前記単離された希少細胞上の分子分析を実施し；そして
（ｃ）前記単離された又は抽出された希少細胞の細胞形態、及び／又は免疫標識及び／又は分析に基づいて、希少細胞の存在及び／又は数、及び／又は特性に関連する状態、障害又は疾患及び／又は段階を同定し、診断し、又は予後診断を提供することを含んで成る方法。
【０２６７】
２．前記生物学的サンプルが、希少細胞、及び分子分析のために希少細胞から分離される白血球及び血漿の分離及び回収を可能にする態様で任意に濾過され得る血液である、実施形態１の方法。
【０２６８】
３．前記生物学的サンプルが、血液以外の生物学的流体である、実施形態１又は２の方法。
【０２６９】
４．前記生物学的サンプルが、粘液であるか、又は粘膜から得られる、実施形態１〜３の何れか１の方法。
【０２７０】
５．前記生物学的サンプルが、癌又は腫瘍を有するか、又は腫瘍又は癌を有する危険性を有する疑いがある対象から得られる、実施形態１〜４の何れか１の方法。
【０２７１】
６．前記生物学的サンプルが、癌、又は非癌性増殖性状態、障害又は疾患を有するか、又は非癌性増殖性状態、障害又は疾患を有する疑いがあるか、又は有する危険性がある対象から得られる、実施形態１〜５の何れか１の方法。
【０２７２】
７．前記生物学的サンプルが、炎症性及び／又は変性状態、障害又は疾患を有するか、又は炎症性及び／又は変性状態、障害又は疾患を有する疑いがあるか、又は有する危険性がある対象から得られる、実施形態１〜６の何れか１の方法。
【０２７３】
８．前記生物学的サンプルが、心血管性状態、障害又は疾患を有するか、又は心血管性状態、障害又は疾患を有する疑いがあるか、又は有する危険性がある対象から得られる、実施形態１〜７の何れか１の方法。
【０２７４】
９．前記生物学的サンプルが、感染状態、障害又は疾患を有するか、又は感染状態、障害又は疾患を有する疑いがあるか、又は有する危険性がある対象から得られ、実施形態１〜８の何れか１の方法。
【０２７５】
１０．（ａ）生物学的サンプルをポリカーボネートフィルターに通すことにより希少細胞を単離するか又は抽出し、そしてポリカーボネートフィルター上のその単離された希少細胞を回収することを含んで成る、実施形態１〜９の何れか１の方法。
【０２７６】
１１．（ａ）生物学的サンプルをＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルターに通すことにより希少細胞を単離するか又は抽出し、そしてＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルター上のその単離された希少細胞を回収することを含んで成る、実施形態１〜１０の何れか１の方法。
【０２７７】
１２．（ａ）生物学的サンプルを、任意の多孔性材料から製造されたフィルターに通すことにより希少細胞を単離するか又は抽出し、そして前記フィルター上のその単離された希少細胞を回収することを含んで成る、実施形態１〜１１の何れか１の方法。
【０２７８】
１３．前記生物学的サンプルが、（ａ）の前に、希釈される、実施形態１〜１２の何れか１の方法。
【０２７９】
１４．前記生物学的サンプルが、（ａ）の前に、新鮮である、実施形態１〜１３の何れか１の方法。
【０２８０】
１５．前記生物学的サンプルが、（ａ）の前に、固定される、実施形態１〜１４の何れか１の方法。
【０２８１】
１６．前記生物学的サンプルが、（ａ）の前に、細胞溶解剤により処理される、実施形態１４又は１５の方法。
【０２８２】
１７．前記生物学的サンプルが、（ａ）の前に、粘液溶解剤により処理される、実施形態１４又は１５の方法。
【０２８３】
１８．前記生物学的サンプルが、（ａ）の前に、タンパク質分解剤により処理される、実施形態１４又は１５の方法。
【０２８４】
１９．前記生物学的サンプルが、（ａ）の前に、抗凝集剤により処理される、実施形態１１４又は１５の方法。
【０２８５】
２０．濾過により単離された又は抽出された前記希少細胞が、（ｂ）におけるように、又は培養のために、さらなる分析の前に、支持体に移される、実施形態１〜１９の何れか１の方法。
【０２８６】
２１．前記希少細胞が、濾過によるそれらの抽出又は単離の後、分子分析のために個々に収集される、実施形態１〜２０の何れか１の方法。
【０２８７】
２２．濾過により抽出されるか又は単離されたすべての細胞は、（ｂ）における使用のために収集される、実施形態１〜２１の何れか１の方法。
【０２８８】
２３．前記単離された又は抽出された希少細胞が、（ｂ）の前に、培養される、実施形態１〜２２の何れか１の方法。
【０２８９】
２４．前記単離された又は抽出された希少細胞が、培養され、そして特定の薬物、及びそれらの異なった用量に対するそれらの感受性を試験するために使用される、実施形態１〜２３の何れか１の方法。
【０２９０】
２５．前記単離された又は抽出された希少細胞が、患者に施される治療又は標的治療を選択し、そしてそれらに対する応答及び／又は耐性をモニターするために使用される、実施形態１〜２４の何れか１の方法。
【０２９１】
２６．前記単離された又は抽出された希少細胞が、（ｂ）の前に、固定される、実施形態１〜２５の何れか１の方法。
【０２９２】
２７．前記単離された又は希少細胞が、（ｂ）の前に、フィルター上で染色されるか、又は免疫染色される、実施形態１〜２６の何れか１の方法。
【０２９３】
２８．前記単離された又は抽出された希少細胞が、染色又は免疫染色の後又は前、in situ分子分析により、（ｂ）において分析される、実施形態１〜２７の何れか１の方法。
【０２９４】
２９．（ｂ）がフィルター又は他の支持体上での単離された又は抽出された希少細胞のin situ細胞形態学的分析を包含する、実施形態１〜２８の何れか１の方法。
【０２９５】
３０．（ｂ）がフィルター又は他の支持体上での単離された又は抽出された希少細胞のin situ免疫標識を包含する、実施形態１〜２９の何れか１の方法。
【０２９６】
３１．（ｂ）がフィルター上の単離された又は抽出された希少細胞のタンパク質、核酸、又は他の成分のin situ分子分析を包含する、実施形態１〜３０の何れか１の方法。
【０２９７】
３２．（ｂ）が、単離された又は抽出された希少細胞のタンパク質、ペプチド又はポリペプチドの分子分析を包含する、実施形態１〜３１の何れか１の方法。
【０２９８】
３３．（ｂ）が、単離された又は抽出された希少細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡの分子分析を包含する、実施形態１〜３２の何れか１の方法。
【０２９９】
３４．（ｂ１）細胞形態学的分析、免疫標識又はin situ分子分析の後、単離された又は抽出された希少細胞のイメージを可視化することを、さらに包含する、実施形態１〜３３の何れか１の方法。
【０３００】
３５．（ｂ２）細胞形態学的分析、免疫標識又はin situ分子分析の後、単離された又は抽出された希少細胞のイメージを記録することを、さらに包含する、実施形態１〜３４の何れか１の方法。
【０３０１】
３６．希少細胞の有無の検出方法であって、
（ａ）生物学的サンプルをフィルターに通し、そしてフィルター上のその単離された希少細胞を回収することにより希少細胞を単離するか又は抽出し；ここで前記フィルターは、希少細胞を保持するが、しかし他の種類の細胞の通過を可能にする、孔サイズ、孔密度又は他の物理的特性を有し；
（ｂ）任意には、前記単離された又は抽出された希少細胞を培養し；
（ｃ）任意には、前記単離された又は抽出された希少細胞、又は任意には、培養された希少細胞を固定するか又は染色し；
（ｄ）希少細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はマイクロＲＮＡの免疫標識、及び／又はin situ分子分析、及び／又は分子分析により、及び／又は希少細胞タンパク質分子の分子分析により、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）からの単離された又は抽出された希少細胞を分析することを含んで成る方法。
【０３０２】
３７．前記単離された又は抽出された希少細胞が、（ｄ）のために又は（ｄ）の間、溶解される、実施形態３６の方法。
【０３０３】
３８．前記単離された又は抽出された希少細胞が、溶解され、そして（ｄ）溶解された希少細胞における状態、障害又は疾患に関連する、変異誘発されたタンパク質、及び／又は変異誘発されたＲＮＡ及び／又はＤＮＡ変異の検出を包含する、実施形態３６又は３７の方法。
【０３０４】
３９．溶解された希少細胞中の変異誘発されたＤＮＡ、及び／又は変異誘発されたＲＮＡ、及び／又は変異誘発されたタンパク質の検出に基づいて、治療効果を評価するか、又は治療に対する可能性ある耐性を検出するために、個別化医療のための標的治療を選択することをさらに包含する、実施形態３８の方法。
【０３０５】
４０．前記単離され、そして抽出された希少細胞が、溶解され、そして（ｄ）前記溶解された希少細胞中のＡＬＫ変異の存在又は不在を検出することを包含する、実施形態３６〜３９の何れか１の方法。
【０３０６】
４１．前記単離された又は抽出された希少細胞が溶解され、そして（ｄ）前記溶解された希少細胞におけるＡＬＫ突然変異の有無を検出することを含んで成り、ここで前記工程がさらに、対象のための治療法を選択し、治療法の有効性を追跡し、又はＡＬＫ突然変異の有無に基づいて、治療法に対する耐性を検出することを包含する、実施形態３６〜４０の何れか１の方法。
【０３０７】
４２．前記単離された又は抽出された希少細胞が溶解され、そして（ｄ）前記溶解された希少細胞におけるＫ−ＲＡＳ及び／又はＥＧＦＲ突然変異の有無を検出することを含んで成り、ここで前記工程がさらに、対象のための治療法を選択し、治療法の有効性を追跡し、又はＫ−ＲＡＳ及び／又はＥＧＦＲ突然変異の有無に基づいて、治療法に対する耐性を検出することを包含する、実施形態３６〜４１の何れか１の方法。
【０３０８】
４３．前記単離された又は抽出された希少細胞が溶解され、そして（ｄ）前記溶解された希少細胞におけるＢ−ＲＡＦ及び／又はＨＥＲ２突然変異の有無を検出することを含んで成り、ここで前記工程がさらに、対象のための治療法を選択し、治療法の有効性を追跡し、又はＢ−ＲＡＦ及び／又はＨＥＲ２突然変異の有無に基づいて、治療法に対する耐性を検出することを包含する、実施形態３６〜４２の何れか１の方法。
【０３０９】
４４．同じ対象から異なった時点で得られた生物学的サンプルを用いて、実施形態３６〜４３の何れか１つの方法を反復することを包含する個別化医学療法。
【０３１０】
４５．前記生物学的サンプルが、希少細胞に関連する状態についての治療の間、又は希少細胞に関連する状態、障害又は疾患についての異なった治療レジメンの間、異なった点で、治療の前後、同じ患者から得られる、実施形態４４の個別化医学療法。
【０３１１】
４６．前記個別化医学治療がさらに、
（ｅ）治療レジメンの有効性を決定するためにか、又は治療レジメンに対する耐性を検出するために、異なった時点で得られたサンプル間の希少細胞の数を比較することを含んで成り、ここで検出された希少細胞の相対数の低下が、治療レジメンの相対的有効性を示し、そして検出される希少細胞の相対数の上昇が、治療レジメンに対する耐性又は治療レジメンの無効力を示し；そして任意には、
（ｆ）（ｅ）に基づいて対象についての効果的な個別化された標的治療法を選択することを含んで成る、実施形態４５の個別化医学療法。
【０３１２】
４７．（ｄ）前記単離された又は抽出された希少細胞の分析が、その希少細胞のタイプ及び／又は起源を決定することを包含する、実施形態３６〜４３の何れか１の方法。
【０３１３】
４８．（ｄ）前記単離された又は抽出された希少細胞の分析が、その希少細胞の上皮から間葉への移行の状態を決定することを包含する、実施形態３６〜４３及び４７の何れか１の方法。
【０３１４】
４９．（ｄ）前記単離された又は抽出された希少細胞の分析が、その幹希少細胞の状態を決定することを包含する、実施形態３６〜４３及び４７〜４８の何れか１の方法。
【０３１５】
５０．（ｄ）前記単離された又は抽出された希少細胞が、希少細胞が転移性又は侵襲性細胞に関連する遺伝子発現徴候を有するかどうかを決定するか、又は希少細胞が転移又は侵襲に関連する決定基を発現するかどうかを決定することにより、前記単離された又は抽出された細胞を分析することを含んで成る、実施形態３６〜４３及び４７〜４９の何れか１の方法。
【０３１６】
５１．（ｄ）に基づく希少細胞に関連する状態、障害又は疾患の早期診断を行うことをさらに包含する、実施形態３６〜４３及び４７〜５０の何れか１の方法。
【０３１７】
５２．（ｄ）に基づく希少細胞に関連する癌及び/又は侵襲性癌の早期診断を行うことをさらに包含する、実施形態３６〜４３及び４７〜５１の何れか１の方法。
【０３１８】
５３．前記癌及び／又は侵襲性癌が起因する器官の早期診断を行うことをさらに包含する、実施形態３６〜４３及び４７〜５２の何れか１の方法。
【０３１９】
５４．（ｄ）に基づく希少細胞に関連する感染状態、障害又は疾患の早期診断を行うことをさらに包含する、実施形態３６〜４３及び４７〜５３の何れか１の方法。
【０３２０】
５５．希少細胞の分子特性に対する候補薬物又は候補治療の効果を評価し、そして薬物又は治療を付与しない対照と比較して、対象における希少細胞の数を減じる薬物又は治療を選択し、そして対照と比較して、希少細胞の相対数を減じるか、又は希少細胞の分子又は免疫学的特性を修正する薬物又は治療を選択することを含んで成る、実施形態３６〜４３及び４７〜５４の何れか１の方法。
【０３２１】
５６．さらに、希少細胞に関連する状態、障害又は疾患を発症する対象の素因及び／又は危険性を評価することを含んで成り、ここで基線又は対照値に比較して、希少細胞の相対数の上昇が前記状態、障害又は疾患を発症する素因又は高められた危険性を示すか、又は基線又は対照値に比較して、希少細胞における分子又は免疫学的変化が、前記状態、障害又は疾患を進行する素因又は高められた危険性を示す、実施形態３６〜４３及び４７〜５５の何れか１の方法。
【０３２２】
５７．前記状態、障害又は疾患が遺伝性疾患である、実施形態３６〜４３及び４７〜５６の何れか１の方法。
【０３２３】
５８．前記状態、障害又は疾患が癌又は腫瘍性疾患である、実施形態３６〜４３及び４７〜５７の何れか１の方法。
【０３２４】
５９．前記状態、障害又は疾患が感染状態、障害又は疾患である、実施形態３６〜４３及び４７〜５６の何れか１の方法。
【０３２５】
６０．体液から希少細胞を抽出するか又は単離するための１又は２以上のフィルター、
濾過の前に、体液を処理するための１又は２以上の緩衝液、希釈剤又は他の剤、
希少細胞が体液から抽出されるか又は単離された後、その希少細胞を懸濁し、洗浄し、又は他方では、処理するための１又は２以上の緩衝液、
フィルターからの単離された又は抽出された希少細胞を、異なった支持体上にトランスファーするための１又は２以上のトランスファー緩衝液、
１又は２以上の細胞形態及び／又は細胞化学染色試薬又は他の細胞染料、又はそのための緩衝液、
希少細胞を免疫標識するための１又は２以上の抗体又は他の試薬、又はそのための緩衝液、
フィルター又は他の支持体上の希少細胞のin situ分析のための１又は２以上の試薬、
希少細胞を溶解するための１又は２以上の溶解剤又は溶解緩衝液、
希少細胞タンパク質の分子分析のための１又は２以上の抗体又は他の試薬、又はそのための緩衝液、
希少細胞核酸の分子分析（ＰＣＲを包含する）のための１又は２以上のプローブ、プライマー、ヌクレオチド、酵素又は他の試薬、の少なくとも１つを含んで成るキット。
【０３２６】
６１．生物学的サンプルをフィルターに通して、そしてフィルター（前記フィルターは、希少細胞を保持するが、しかし他の種類の細胞の通過を可能にする、孔サイズ、孔密度又は他の物理的特性を有する）上の単離された希少細胞を回収することにより単離された又は抽出された１又は２以上の希少細胞を含んで成る組成物。
【０３２７】
６２．実施形態６１の組成物を含むフィルター又は他の支持体。
【０３２８】
６３．実施形態３６〜４３及び４７〜５９の段階ｄ）に基づいて、腫瘍細胞に関連する肺癌の早期診断を行うことをさらに包含する、実施形態３６〜４３及び４７〜５９の何れか１の方法。
【０３２９】
６４．実施形態３６〜４３及び４７〜５９の段階ｄ）に基づいて、内皮細胞に関連する心血管疾患の存在及び／又は重症度の早期診断を行うことをさらに包含する、実施形態３６〜４３及び４７〜５９の何れか１の方法。
【０３３０】
参照による組込み
本開示により引用されるか又は言及される各文書、特許、特許出願又は特許出版物は、特に本文中の参考文献の引用を取り巻く特定の主題に関して、その全体が参照により組み込まれる。しかしながら、そのような参照が背景技術を構成し、そして引用された文献の正確性及び適切性に挑戦する権利が確保されているとは認められない。
【０３３１】
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76. Coumans, F. A. W., et al., Filtration Parameters Influencing Circulating Tumor Cell Enrichment from Whole Blood, PLOS ONE 8(4): e61774 (April 2013)
【図１Ａ】
2019074538.tif 000006
【図１Ｂ】
2019074538.tif 000007
【図２】
2019074538.tif 000008
【図３】
2019074538.tif 000009
【配列表】
2019074538000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月28日(2019.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌と診断されていない個体の血液からサイズによって単離された循環希少細胞に対して行われる多重分析の方法であり、対象が癌を有する危険性又は癌を発症する危険性を有するものと決定するための指標を提供する単離された希少循環腫瘍細胞の高感度診断検出及びの計数を可能にする方法であって、前記方法は、
（ａ）前記個体から血液サンプルを得て、前記血液サンプルを抗凝固剤で処理し；
（ｂ）濾過により抗凝固された血液サンプルを処理して、循環希少細胞を高感度で単離し、ここで、フィルターは希少細胞を保持するが、他の種類の細胞の通過を可能にする孔サイズ、孔密度を有し；
（ｃ）フィルターを通過しない循環希少細胞を回収し；
（ｄ）任意には、回収された循環希少細胞を培養し；
（ｅ）細胞形態分析、免疫標識分析、及び分子分析からなる群から選択される少なくとも１つの分析方法を含む多重分析を行うことによって、循環希少細胞中の循環腫瘍細胞を検出及び計数し；
（ｆ）（ｅ）の結果に基づいて、対象が癌を発症する危険性があると決定するための指標を提供する
ことを含む方法。
【請求項２】
前記フィルターが、３μｍ〜１００μｍのサイズに調整された孔、及び３×１０３〜９×１０６個の孔／ｃｍ２の孔密度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フィルターが、ポリカーボネート又はＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）を含み、５μｍ〜２５μｍの調整された孔を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記フィルターが、成熟リンパ球又は好中球より大きい腫瘍細胞を保持する孔サイズ又は孔密度を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
回収され、単離された循環希少細胞の固定又は染色をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記固定又は染色の前に、回収された循環希少細胞を培養することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
濾過によって単離された循環希少細胞が、さらなる分析又は培養の前に支持体に移される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
濾過によって単離された循環希少細胞が、さらなる分析の前にスライドに移される、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍細胞が、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、マイクロＲＮＡ分析、及びタンパク質分析からなる群から選択される少なくとも１つの分子分析方法を含む多重分析による濾過によって回収された循環希少細胞中で同定される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍細胞が、癌が起因する期間の早期診断を可能にする細胞形態分析、免疫標識分析又は分子分析を含む多重分析を使用することによって希少細胞中に検出される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
血漿及び／又は白血球が、循環希少細胞の単離と同時に回収される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記血漿及び／又は白血球が、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、及びタンパク質分析からなる群から選択される少なくとも１つの分析方法に供される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
治療の有効性又は無効力を判断するために、異なった時点で得られた腫瘍細胞の存在及び数を決定することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法によって検出された腫瘍細胞に基づいて標的治療法を選択することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的治療法に対する対象の応答を決定するために、異なった時点で得られた腫瘍細胞の存在及び数を決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的治療に対する耐性の発生をモニター及び検出するために、前記方法が異なった時点で反復される、請求項１４又は１５に記載の方法。