(57)【要約】【課題】環境ストレス下、特に高浸透圧環境下での植物体の生育を可能とする組成物、及び前記組成物を付着させた状態で、高浸透圧環境下で生育させる、植物体の生育方法を提供する。【解決手段】配列番号１で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas corrugata  KDO-1株、配列番号２で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するArthrobacter sp.  KDO-2株、配列番号３で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas sp.  KDO-3株、配列番号４で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas stutzeri  KDO-4株、及び配列番号５で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するRhizobium tarimense  KDO-5株を含有し、高浸透圧環境下での植物体の生育を可能とする、高浸透圧耐性改善用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas corrugata  KDO-1株、配列番号２で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するArthrobacter sp.  KDO-2株、配列番号３で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas sp.  KDO-3株、配列番号４で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas stutzeri  KDO-4株、及び配列番号５で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するRhizobium tarimense  KDO-5株を含有し、高浸透圧環境下での植物体の生育を可能とする、高浸透圧耐性改善用組成物。
【請求項２】
含有する微生物全量に対する存在比率が、Pseudomonas corrugata  KDO-1株が２０〜４０％であり、Arthrobacter sp.  KDO-2株が１０〜３０％であり、Pseudomonas sp.  KDO-3株が１〜２０％であり、Pseudomonas stutzeri  KDO-4株が１０〜３０％であり、Rhizobium tarimense  KDO-5株が５〜２５％である、請求項１に記載の高浸透圧耐性改善用組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の高浸透圧耐性改善用組成物を根に付着させた状態で、高浸透圧環境下で植物体を生育させる、植物体の生育方法。
【請求項４】
無菌状態で水耕栽培した植物体の根に、前記高浸透圧耐性改善用組成物を付着させた後に土壌へ移植し、高浸透圧環境下で生育させる、又は、
無菌状態で水耕栽培した植物体の根に、前記高浸透圧耐性改善用組成物を付着させた状態で、高浸透圧環境下で水耕栽培を行う、
請求項３に記載の植物体の生育方法。
【請求項５】
前記植物体が、ナス科植物である、請求項３又は４に記載の植物体の生育方法。
【請求項６】
前記植物体が、トマトである、請求項３又は４に記載の植物体の生育方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を有効成分とし、高浸透圧環境下での植物体の生育を可能とする組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の中には、植物と共生し、その生育を助ける働きをするものがある。例えば、マメ科植物の根に共生する根粒菌は、大気中の窒素を植物が利用可能な窒素化合物に変換する。この根粒菌による窒素固定により、マメ科植物は肥料分の少ない土壌でも生育が可能となる。近年、植物体の免疫を高めたり、生育を促進したり、栄養素の欠乏を補ったり、様々な環境ストレスに対する耐性を高めたりする作用を有する共生微生物があることがわかってきた。そこで、このような共生微生物を利用し、必須栄養素が欠乏している土壌や塩濃度の高い土壌等の厳しい環境下でも植物の生育を可能にしようという試みがなされている。
【０００３】
例えば、水不足の解決方法として、植物の耐塩性を高めて海水を農業用水に利用することが試みられている。植物の耐塩性を高める方法としては、遺伝子組換え技術を用いて、塩耐性機構に関与する遺伝子を導入する方法が挙げられるが、農作物の場合、遺伝子組換え技術を利用せずに耐塩性を高められる方法が好まれる傾向にある。そこで、遺伝子組換え技術を使用せずに植物の耐塩性を高める方法として、植物体への耐塩性付与効果を有する薬剤や微生物を植物体に投与する方法が検討されてきている。耐塩性付与効果を有する微生物としては、例えば、パエニバチルス・フクイネンシス（Paenibacillus fukuinensis）（例えば、特許文献１参照。）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−７５８８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、微生物を有効成分とし、環境ストレス下、特に高浸透圧環境下での植物体の生育を可能とする組成物、及び前記組成物を付着させた状態で、高浸透圧環境下で生育させる、植物体の生育方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物及びは、下記［１］〜［７］である。
［１］  配列番号１で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas corrugata  KDO-1株、配列番号２で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するArthrobacter sp.  KDO-2株、配列番号３で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas sp.  KDO-3株、配列番号４で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas stutzeri  KDO-4株、及び配列番号５で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するRhizobium tarimense   KDO-5株を含有し、高浸透圧環境下での植物体の生育を可能とする、高浸透圧耐性改善用組成物。
［２］  含有する微生物全量に対する存在比率が、Pseudomonas corrugata   KDO-1株が２０〜４０％であり、Arthrobacter sp.  KDO-2株が１０〜３０％であり、Pseudomonas sp.  KDO-3株が１〜２０％であり、Pseudomonas stutzeri  KDO-4株が１０〜３０％であり、Rhizobium tarimense  KDO-5株が５〜２５％である、前記［１］の高浸透圧耐性改善用組成物。
［３］  前記［１］又は［２］の高浸透圧耐性改善用組成物を根に付着させた状態で、高浸透圧環境下で植物体を生育させる、植物体の生育方法。
［４］  無菌状態で水耕栽培した植物体の根に、前記高浸透圧耐性改善用組成物を付着させた後に土壌へ移植し、高浸透圧環境下で生育させる、又は、
無菌状態で水耕栽培した植物体の根に、前記高浸透圧耐性改善用組成物を付着させた状態で、高浸透圧環境下で水耕栽培を行う、
前記［３］の植物体の生育方法。
［５］  前記植物体が、ナス科植物である、前記［３］又は［４］の植物体の生育方法。
［６］  前記植物体が、トマトである、前記［３］又は［４］の植物体の生育方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物は、植物体の表面に付着することによって植物体の高浸透圧耐性を向上させることができるため、当該組成物を植物体に接種させて共生させることにより、高浸透圧環境下における生育性を高めることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
＜高浸透圧耐性改善用組成物＞
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物は、植物体の表面に付着して共生することにより、当該植物体の高浸透圧耐性を改善する効果を有する微生物を有効成分とする。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物が有効成分とする微生物は、後記実施例に示す通り、元々土壌に含まれている多種多様な微生物の中から、植物体の根の表面に共生することによって当該植物体が高浸透圧の栽培用溶液を用いた水耕栽培における生育を可能とする共生微生物群として得られたものである。
【０００９】
具体的には、本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物は、５種の微生物、すなわち、配列番号１で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas corrugata  KDO-1株、配列番号２で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するArthrobacter sp.  KDO-2株、配列番号３で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas sp.  KDO-3株、配列番号４で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas stutzeri  KDO-4株、及び配列番号５で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するRhizobium tarimense  KDO-5株を有効成分とする。以降において、これらの特定の５種の微生物は、「高浸透圧耐性改善共生菌」ということがある。
【００１０】
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物における前記５種の微生物のそれぞれの存在比（菌数比）としては、特に限定されるものではない。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物におけるPseudomonas corrugata  KDO-1株の微生物全量に対する存在比率は、２０〜４０％が好ましく、２５〜３５％がより好ましい。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物におけるArthrobacter sp.  KDO-2株の微生物全量に対する存在比率は、１０〜３０％が好ましく、１５〜２５％がより好ましい。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物におけるPseudomonas sp.  KDO-3株の微生物全量に対する存在比率は、１〜２０％が好ましく、５〜１５％がより好ましい。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物におけるPseudomonas stutzeri  KDO-4株の微生物全量に対する存在比率は、１０〜３０％が好ましく、１５〜２５％がより好ましい。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物におけるRhizobium tarimense  KDO-5株の微生物全量に対する存在比率は、５〜２５％が好ましく、１０〜２０％がより好ましい。特に、本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物が含有する前記５種の各微生物の微生物全量に対する存在比率は、Pseudomonas corrugata  KDO-1株が２０〜４０％であり、Arthrobacter sp.  KDO-2株が１０〜３０％であり、Pseudomonas sp.  KDO-3株が１〜２０％であり、Pseudomonas stutzeri  KDO-4株が１０〜３０％であり、Rhizobium tarimense  KDO-5株が５〜２５％であることが好ましく、Pseudomonas corrugata  KDO-1株が２５〜３５％であり、Arthrobacter sp.  KDO-2株が１５〜２５％であり、Pseudomonas sp.  KDO-3株が５〜１５％であり、Pseudomonas stutzeri  KDO-4株が１５〜２５％であり、Rhizobium tarimense  KDO-5株が５〜２５％であることがより好ましい。
【００１１】
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物は、植物体に対する高浸透圧耐性改善効果を損なわない限り、前記の５種の高浸透圧耐性改善共生菌以外の微生物を含有していてもよい。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物が含有する微生物全体に占める前記５種の高浸透圧耐性改善共生菌の総量の存在比率は、５０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がよりさらに好ましい。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物としては、植物体の根の表面に付着した際により安定して共生できることから、前記の５種の高浸透圧耐性改善共生菌以外の微生物を含有していないものが特に好ましい。
【００１２】
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物は、有効成分とする高浸透圧耐性改善共生菌をそれぞれ混合することにより調製できる。例えば、本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物は、各高浸透圧耐性改善共生菌を生存した状態で維持可能な溶媒中に分散させた液状組成物であってもよく、当該溶媒を寒天等で固体状としたものに各高浸透圧耐性改善共生菌を付着させた固体状組成物であってもよい。その他、各高浸透圧耐性改善共生菌を生存した状態で乾燥粉末としたものをそれぞれ混合した粉末状組成物であってもよい。各高浸透圧耐性改善共生菌を生存した状態で維持可能な溶媒としては、例えば、水、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）、トリスバッファーやリン酸バッファー等の各種バッファー、微生物培養用培地、植物の水耕栽培に用いられる液肥等が挙げられる。
【００１３】
例えば、本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物は、高浸透圧耐性改善共生菌の種類ごとにそれぞれ独立して培養し、得られた培養物を混合することによって調製することができる。各高浸透圧耐性改善共生菌の培養は、それぞれの栄養特性に応じた適切な培養培地を用いて、各菌種の標準株（Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）の培養と同様にして行うことができる。また、栄養特性が類似しており、同じ培養培地で培養可能な微生物ごとに分けてそれぞれ培養し、得られた培養物を混合することによって調製することもでき、組成物全体を１種類の培養培地で培養して増殖させて調製してもよい。例えば、Ｒ２Ａ培地（日本ベクトン・ディッキンソン）で１５０ｒｐｍの振とう速度、温度が２５℃で１６時間培養することにより、前記の５種の高浸透圧耐性改善共生菌を培養することができる。
【００１４】
各高浸透圧耐性改善共生菌の培養に用いられる培養培地は、一般的に微生物の培養に用いられる微生物培養用培地の中から適宜選択して用いることができる。当該微生物培養用培地としては、例えば、ＬＢ（Luria-Bertani）培地、ＴＢＳ（Tryptic Soy Broth）培地、麦芽エキス培地、オートミール培地、ＹＭ（Yeast Malt peptone）培地、ＹＰＤ（Yeast Peptone D-Glucose）培地、ＮＢ（nutrient broth）培地、Ｒ２Ａ培地、ＰＧＹ培地、ＧＹＭＰ培地（グルコース １％、酵母エキス ０．５％、麦芽エキス ０．３％、ペプトン ０．５％、ｐＨ６．０）、ＭＲＳ（de Man-Rogosa-Sharpe）培地、ＰＳＡ（Potato Sucrose Agar）培地、ＳＷＳ（Seawater Starch Agar）培地等が挙げられる。
【００１５】
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を植物体の表面に付着させ、有効成分である高浸透圧耐性改善共生菌を当該植物体と共生させることにより、植物体の高浸透圧耐性が改善され、高浸透圧環境下でも生育が可能となる。ここで、「高浸透圧環境下」とは、根等の植物体の表面から植物体内に取り込まれる水分の浸透圧が、無菌状態では同じ生物種の植物体の生育率が７５％以下となる浸透圧である環境下を意味する。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物としては、高浸透圧耐性向上前の植物体の７０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられるものが好ましく、６０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられるものがより好ましく、５０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられるものがさらに好ましい。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物としては、なかでも、４０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられるものが好ましく、高浸透圧耐性向上前の植物体の３０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられるものがより好ましく、高浸透圧耐性向上前の植物体の２０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられるものがさらに好ましく、高浸透圧耐性向上前の植物体の１０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられるものがよりさらに好ましい。
【００１６】
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を植物体の表面に付着させる方法としては、特に限定されるものではない。例えば、植物体の少なくとも一部分を、当該高浸透圧耐性改善用組成物を含む浸漬用溶液に浸漬させることによって、当該高浸透圧耐性改善用組成物中の高浸透圧耐性改善共生菌を当該植物体の表面に付着させることができる。浸漬用溶液に浸漬させる植物体の部分は、浸漬させた状態の植物体が、通常の浸透圧環境下であれば生育可能な部分であればよく、例えば、根、茎、葉、地下茎等のいずれの部分であってもよい。本発明の高浸透圧耐性改善共生菌は元々土壌に含まれていた微生物であるため、本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物は、植物体の根に付着させることが好ましい。
【００１７】
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を付着させる植物体は、無菌的に栽培されたものであることが好ましい。例えば、滅菌処理した種子を無菌的な環境下で栽培された植物体を用いることにより、本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物以外の微生物の付着を防止し、本発明の高浸透圧耐性改善共生菌による共生効果をより効率よく得ることができる。種子の滅菌処理は、次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬させる方法や、塩素ガスを用いる方法等の常法により行うことができる。
【００１８】
生育の初期段階の植物体は、充分に生育した植物体よりもストレスに対する耐性が低く、環境ストレスの影響を受けやすい。このため、種子や球根の段階から高浸透圧環境下で生育させた場合には、高い浸透圧ストレスにより、高浸透圧耐性改善処理を施しても高浸透圧耐性を獲得できずに枯死してしまう植物体が多い。このため、本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を付着させる植物体は、少なくとも発根及び発芽が完了するまで正常に生育可能な浸透圧で栽培したものが好ましい。なお、「正常に生育可能な浸透圧」とは、複数の植物体を生育させた場合の生育率が８０％以上である浸透圧を意味する。植物体の発根及び発芽、及びその後の生育は、本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を付着させること以外は、常法により行うことができる。
【００１９】
発芽・発根後に直ちに本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を付着させる処理を行ってもよいが、生育するほど塩ストレスに対する耐性も高くなる。このため、幼苗を、発芽後少なくとも１週間、好ましくは３週間程度生育させた後に当該高浸透圧耐性改善用組成物を付着させる処理を行うことが好ましい。
【００２０】
植物体の生育に対する影響が比較的少ないことから、植物体の根のみを、本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を含む溶液（以下、「高浸透圧耐性改善処理用溶液」ということがある。）に浸漬させることが好ましい。高浸透圧耐性改善処理用溶液は、根から摂取させる各種栄養分を含有する液肥に本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を含有させた溶液であることが好ましい。例えば、植物体の根の付け根部分を、ロックウール、寒天培地、土壌等の固体支持体で支持させ、根の下の部分を液肥に浸漬させる水耕栽培容器を使用し、液肥に本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を含有させることにより、根の部分のみを高浸透圧耐性改善共生菌を含む高浸透圧耐性改善処理用溶液に浸漬させた状態で植物体を生育させることができる。使用する液肥の組成は、生育させる植物体の生物種に応じて適宜調節することができる。例えば、ＭＳ（Murashige-Skoog）培地、Ｂ５（Gamborg's B5）培地、Ｗｈｉｔｅ培地、又はこれらの改変培地等を用いることができる。
【００２１】
高浸透圧耐性改善処理用溶液の浸透圧は、特に限定されるものではなく、高浸透圧耐性付与効率が充分となるように、使用する高浸透圧耐性改善用組成物に含まれる高浸透圧耐性改善共生菌の種類や植物体の種類に応じて適宜調節することができる。例えば、初期生育時に用いた溶液（初期生育用溶液）に本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を混合させたものを高浸透圧耐性改善処理用溶液としてもよく、栽培工程で用いる栽培用溶液に高浸透圧耐性改善用組成物を混合させたものを高浸透圧耐性改善処理用溶液としてもよく、塩類組成が初期生育用溶液と栽培用溶液のいずれとも異なる溶液を高浸透圧耐性改善処理用溶液としてもよい。高浸透圧耐性改善処理用溶液の浸透圧は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、マンニトール、スクロース等の濃度を高くすることにより高めることができる。高浸透圧耐性改善処理用溶液の浸透圧としては、１０質量％  ＰＥＧ水溶液と同等以上の浸透圧が好ましく、１５質量％  ＰＥＧ水溶液と同等以上の浸透圧がより好ましく、栽培用溶液の浸透圧と同じ浸透圧がさらに好ましい。
【００２２】
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を根等の表面に付着させた植物体は、高浸透圧環境下で生育させることができる。具体的には、浸透圧の高い栽培用溶液を用いて栽培することができる。栽培用溶液の浸透圧は、正常に生育可能な浸透圧より高ければよく、栽培する植物体の種類やその高浸透圧耐性に応じて適宜決定することができる。浸透圧の高い栽培用溶液としては、同種の植物体の栽培に一般的に使用される栽培用溶液に、ＰＥＧ等の浸透圧を調節する物質を適量配合して浸透圧を高めた溶液を用いることができる。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を付着させた植物体の栽培用溶液の浸透圧としては、１０質量％  ＰＥＧ水溶液と同等以上の浸透圧が好ましく、１５質量％  ＰＥＧ水溶液と同等以上の浸透圧がより好ましく、２０質量％  ＰＥＧ水溶液と同等以上の浸透圧がさらに好ましく、２５質量％  ＰＥＧ水溶液と同等以上の浸透圧がよりさらに好ましく、２５質量％  ＰＥＧ水溶液と同等以上であり、かつ３５質量％  ＰＥＧ水溶液と同等以下である浸透圧が特に好ましい。
【００２３】
また、一般的に植物体に対する乾燥ストレスは、主に乾燥による高浸透圧状態により引き起こされる。このため、本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を根等の表面に付着させた植物体は、乾燥耐性をも獲得するため、乾燥環境下での生育にも適している。なお、「乾燥環境下」とは、植物体を栽培する環境の空気中又は土壌中の水分量（湿度）が、正常に生育可能な水分量（湿度）よりも低い環境下を意味し、「正常に生育可能な水分量（湿度）」とは、複数の同種の野生型の植物体を生育させた場合の生育率が８０％以上である湿度（％）を意味する。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を根等の表面に付着させた植物体を栽培する環境の空気中又は土壌中の水分量（湿度）としては、複数の同種の野生型の植物体を生育させた場合の生育率が７０％以下である湿度（％）が好ましく、複数の同種の野生型の植物体を生育させた場合の生育率が６０％以下である湿度（％）がより好ましく、複数の同種の野生型の植物体を生育させた場合の生育率が５０％以下である湿度（％）がさらに好ましく、複数の同種の野生型の植物体を生育させた場合の生育率が３０％以下である湿度（％）がよりさらに好ましい。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を付着させた植物体を乾燥ストレス下で栽培する場合に用いられる栽培用溶液は、当該植物体と同種の植物体の栽培に一般的に使用される栽培用溶液をそのまま用いることができる。
【００２４】
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を付着させた植物体の栽培用溶液としては、植物体の生育に必要な各種栄養成分を含有している溶液であれば特に限定されるものではない。当該栄養成分は、栽培する植物体の種類に応じて適宜調整することができる。特に、窒素、リン、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、硫黄、鉄、マンガン、銅、モリブデン、ホウ素等の植物体の生育に必要な元素を塩類として含有していることが好ましい。その他、植物体の種類によっては、アルミニウムや珪素等の元素を塩類として含有する場合もある。また、植物体の生育段階に応じて栽培用溶液の組成を変更してもよい。
【００２５】
当該栽培用溶液としては、例えば、市販されている液肥に塩化ナトリウムをはじめとする不足の塩類を添加した溶液や、それにＰＥＧ等の浸透圧を調節する物質を適量配合して浸透圧を高めた溶液を用いることができる。
【００２６】
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を付着させた後の植物体のその後の栽培は、水耕栽培で行ってもよく、土壌等で栽培してもよい。例えば、無菌状態で水耕栽培した植物体の根に、本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を付着させた状態で、高浸透圧環境下又は乾燥環境下で水耕栽培を行うことができる。当該水耕栽培は、栽培用溶液の浸透圧を正常に生育可能な浸透圧より高くする、又は栽培環境の湿度を正常に生育可能な湿度よりも低くする以外は、一般的な水耕栽培方法によって行うことができる。例えば、比較的多量の栽培用溶液を栽培用槽にためる湛液型水耕法で行ってもよく、緩やかな傾斜を持つ平面上に培養液を少量ずつ流下させる薄膜水耕法で行ってもよい。また、無菌状態で水耕栽培した植物体の根に、本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物を付着させた後に土壌へ移植し、高浸透圧環境下で生育させてもよい。具体的には、土壌へ散布する水の浸透圧を正常に生育可能な浸透圧より高くしたり、土壌へ散布する水の量を正常に生育可能な水量よりも低減させる。
【００２７】
本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物により高浸透圧耐性を改善する植物体としては、被子植物であってもよく、裸子植物であってもよく、シダ類やコケ類であってもよい。また、単子葉植物であってもよく、双子葉植物であってもよい。具体的には、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、アワ等のイネ科の植物；トマト、ナス、パプリカ、ピーマン、ジャガイモ、タバコ等のナス科の植物；シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、紫キャベツ、メキャベツ（プチヴェール）、ハクサイ、チンゲンサイ、ケール、クレソン、小松菜、ブロッコリー、カリフラワー、カブ、ワサビ、マスタード等のアブラナ科の植物；キュウリ、ニガウリ、カボチャ、メロン、スイカ、等のウリ科の植物；ブドウ等のブドウ科の植物；レモン、オレンジ、ネーブルオレンジ、グレープフルーツ、ミカン、ライム、スダチ、ユズ、シイクワシャー、タンカン等のミカン科の植物；リンゴ、サクラ、ウメ、モモ、イチゴ、ビワ、アンズ、プラム（スモモ）、プルーン、アーモンド、ナシ、洋ナシ、イチゴ、ラズベリー、ブラックベリー、カシス、クランベリー、ブルーベリー等のバラ科の植物；ダイズ、インゲンマメ、エンドウマメ、ソラマメ、エダマメ、リョクトウ、ヒヨコマメ等のマメ科の植物；ハス（レンコン）等のハス科の植物；ゴマ等のゴマ科の植物；ホウレンソウ、ビート、テンサイ、キヌア、ヒユ、アマランサス、ケイトウ等のアカザ科の植物；ナツメヤシ、アブラヤシ、ココヤシ、アサイー等のヤシ科の植物；バナナ、バショウ、マニラアサ等のバショウ科の植物；ワタ、オクラ等のアオイ科の植物；ユーカリ等のフトモモ科の植物；フウチョウソウ、セイヨウフウチョウソウ等のフウチョウソウ科の植物等が挙げられる。本発明に係る高浸透圧耐性改善用組成物により高浸透圧耐性を改善する植物体としては、特に、ナス科の植物が好ましく、トマト（Solanum lycopersicum）がより好ましい。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］
トマト（甘福、カネコ種苗）を用い、土壌から抽出された微生物から、浸透圧耐性を高める共生効果を有する植物共生菌群を選抜した。
【００３０】
＜微生物懸濁液の調製＞
沖縄にて採取された土壌１ｇを、緩衝液で懸濁し、十分に撹拌し、微生物懸濁液として用いた。
【００３１】
＜ポットの作成＞
天面と底面が開口した円柱状のポットに、スクロース含有ＭＳ寒天培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースと０．９％（ｗ／ｖ）アガーを加えた培地）を注入して固めることにより、植物体を育成するためのポットを作製した。当該ポットを、スクロース含有ＭＳ培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースを加えた液体培地）を入れた８つの容器にそれぞれ複数個ずつ設置した。
【００３２】
＜植物体の水耕栽培＞
前記ポットを複数個用意し、スクロース含有ＭＳ培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースを加えた液体培地）を入れた１つの容器に全て設置した。各ポットは、底面はスクロース含有ＭＳ培地に浸っているが天面は浸っていない状態となるように設置した。これらのポットの上部に種子を播種し、２５℃、明期１６時間と暗期８時間の長日条件のインキュベーター内で１４日間育成した。
【００３３】
＜高濃度ＰＥＧストレス及び微生物の接種（第１選抜工程）＞  
１４日間水耕栽培後に、当該ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地に、ＰＥＧの最終濃度が１０質量％となるように滅菌済の高濃度ＰＥＧ水溶液を添加し、さらに１００μＬの微生物懸濁液を添加した。その後、当該ポットを１４日間栽培した。
高濃度ＰＥＧストレス下での１４日間の栽培後、生育している植物体の根と地上部（葉と茎）を切断し、根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液とした。
２０μＬの当該微生物回収溶液を２ｍＬの２種類の培地にて、３０℃で一晩、振とう培養（２００ｒｐｍ）を行った。培養後の培養液中の菌数は、いずれも１０７ＣＦＵ以上であった。得られた各培養物を混合したものを、微生物混合液とした。
【００３４】
＜高濃度ＰＥＧストレス及び微生物の接種（第２選抜工程）＞  
前記＜植物体の水耕栽培＞と同様にして、ポットにて１４日間水耕栽培した植物体を用意した。当該ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地に、ＰＥＧの最終濃度が１５質量％となるように滅菌済の高濃度ＰＥＧ水溶液を添加し、さらに前記第１選抜工程で調製した微生物混合液を１００μＬ添加した。その後、当該ポットを１４日間栽培した。
高濃度ＰＥＧストレス下での１４日間の栽培後、前記第１選抜工程と同様にして、生育している植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製し、これを培養して微生物混合液を調製した。
【００３５】
＜高濃度ＰＥＧストレス及び微生物の接種（第３選抜工程）＞  
前記＜植物体の水耕栽培＞と同様にして、ポットにて１４日間水耕栽培した植物体を用意した。当該ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地に、ＰＥＧの最終濃度が２０質量％となるように滅菌済の高濃度ＰＥＧ水溶液を添加し、さらに前記第２選抜工程で調製した微生物混合液を１００μＬ添加した。その後、当該ポットを１４日間栽培した。
高濃度ＰＥＧストレス下での１４日間の栽培後、前記第１選抜工程と同様にして、生育している植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製し、これを培養して微生物混合液を調製した。
【００３６】
＜高濃度ＰＥＧストレス及び微生物の接種（第４選抜工程）＞  
前記＜植物体の水耕栽培＞と同様にして、ポットにて１４日間水耕栽培した植物体を用意した。当該ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地に、ＰＥＧの最終濃度が２５質量％となるように滅菌済の高濃度ＰＥＧ水溶液を添加し、さらに前記第３選抜工程で調製した微生物混合液を１００μＬ添加した。その後、当該ポットを１４日間栽培した。
高濃度ＰＥＧストレス下での１４日間の栽培後、前記第１選抜工程と同様にして、生育している植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製し、これを培養して微生物混合液を調製した。
【００３７】
＜高濃度ＰＥＧストレス及び微生物の接種（第５選抜工程）＞  
前記＜植物体の水耕栽培＞と同様にして、ポットにて１４日間水耕栽培した植物体を用意した。当該ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地に、ＰＥＧの最終濃度が３０質量％となるように滅菌済の高濃度ＰＥＧ水溶液を添加し、さらに前記第４選抜工程で調製した微生物混合液を１００μＬ添加した。その後、当該ポットを１４日間栽培した。
高濃度ＰＥＧストレス下での１４日間の栽培後、前記第１選抜工程と同様にして、生育している植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製し、これを培養して微生物混合液を調製した。
【００３８】
トマトの野生株では、ＰＥＧの最終濃度１０質量％の環境下では、ほとんど生育できなかったが、選抜された微生物混合物を根に共生させたトマトは、ＰＥＧの最終濃度が３０質量％の栽培用溶液中でも生育可能であった。これらの結果から、に高濃度ＰＥＧストレス下で生育していた植物体に共生していた微生物混合物又はこれらの分泌物質が、植物の高浸透圧耐性を向上させる作用を有していること、すなわち当該微生物混合物は、高浸透圧ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生菌群であることがわかった。
【００３９】
＜微生物の同定＞
この微生物回収溶液から菌体を回収し、回収した菌体の一部からゲノムＤＮＡを、GenElute Bacterial Genomic DNA kit（Sigma-Aldrich、St. Louis, MO, USA）を用いて得た。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’、配列番号６）とリバースプライマー（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’、配列番号７）を用いて、16S rDNAをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの温度条件は、９５℃、３分間の加熱工程後、９５℃、３０秒間の変性工程、５０℃、３０秒間のアニーリング工程、及び７２℃、１分３０秒間の伸長工程からなるサイクルを３０サイクル行った後、最後に７２℃、５分間の伸長反応を加える条件で行った。得られたＰＣＲ産物を、１．２％のアガロースゲル電気泳動により確認し、QIAquick gel extraction kit (Quiagen, Germantown, MD, USA)を用いてゲルから抽出した。抽出されたＰＣＲ産物を、TOPO-TA cloning kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)を用いてプラスミド中に挿入し、大腸菌に形質転換を行った。アンピシリン含有ＬＢ平板培地上で一晩培養した大腸菌コロニーをランダムに２４個取り、アンピシリン含有ＬＢ液体培地に移植して培養した。QIAprep spin miniprep kit (Quiagen)を用いて培養された大腸菌からプラスミドを精製した。精製されたプラスミドに対して、BigDye terminator v3.1 Cycle sequence kit (Life Techonologies)を用いたThermalcycle反応を行い、DNAシークエンサー(ABI 3130xL)にて当該プラスミドに組み込まれた16S rDNAの塩基配列を決定し、高濃度ＰＥＧストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生菌群（微生物混合物）を構成する微生物を同定した。この結果、５種類の16S rDNA（KDO-1株〜KDO-5株）が同定された。
【００４０】
配列が決定された５種類の16S rDNAの塩基配列についてそれぞれＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索を行った。この結果、配列番号１で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するKDO-1株は、Pseudomonas corrugata strain E60（アクセッション番号：ＨＱ４０７２３７．１）と16S rDNAの配列相同性が９９．７％であったことから、Pseudomonas corrugataの新規株であると考えられた。配列番号２で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するKDO-2株は、Arthrobacter sp. S10507（アクセッション番号：ＫＦ９５６５５５．１）と16S rDNAの配列相同性が９９．９％であったことから、Arthrobacter sp.の新規株であると考えられた。配列番号３で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するKDO-3株は、Pseudomonas sp. 40M1 FL01（アクセッション番号：ＫＭ３５７３８２．１）と16S rDNAの配列相同性が９９．８％であったことから、Pseudomonas sp.の新規株であると考えられた。配列番号４で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するKDO-4株は、Pseudomonas stutzeri（アクセッション番号：ＦＲ６６７８８９．１）と16S rDNAの配列相同性が９８．９％であったことから、Pseudomonas stutzeriの新規株であると考えられた。配列番号５で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するKDO-5株は、Rhizobium tarimense strain PL-41（アクセッション番号：ＮＲ＿１１７８５０．１）と16S rDNAの配列相同性が９９．３％であったことから、Rhizobium tarimenseの新規株であると考えられた。
【００４１】
また、同定した２４個の形質転換体に挿入されていた16S rDNAの割合から、これら５種類の微生物の存在比を調べたところ、Pseudomonas corrugata  KDO-1株は３１．６％であり、Arthrobacter sp.  KDO-2株は２１．０％であり、Pseudomonas sp.  KDO-3株は１０．５％であり、Pseudomonas stutzeri  KDO-4株は２１．０％であり、Rhizobium tarimense  KDO-5株は１５．８％であった。
【００４２】
当該微生物混合物は、新規に獲得された混合物であり、植物体の耐塩性を顕著に高められる非常に有用な微生物混合物である。そこで、出願人は、微生物として、Pseudomonas corrugata  KDO-1株、Arthrobacter sp.  KDO-2株、Pseudomonas sp.  KDO-3株、Pseudomonas stutzeri  KDO-4株、及びRhizobium tarimense  KDO-5株のみからなる微生物混合物を、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター(ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ)（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に新規微生物混合物として寄託する。
【配列表】
2019062753000001.app