(57)【要約】      （修正有）【課題】癌タイプの識別と診断支援に使用可能な、クロス染色とマルチバイオマーカー方法を提供する。【解決手段】組織切片の画像を先にＨ＆Ｅ染色組織画像とＩＨＣ染色組織画像の二組に分け、次に、別々のＩＨＣ染色組織画像とＨ＆Ｅ染色組織画像に対して、クロス染色画像登録・融合処理を行うことによって、複数フレームのクロス染色組織画像を得、更に、特別に設計されたバイオマーカーの性能認識プロセスを通じて、得た前記複数フレームのクロス染色組織画像に腫瘍認識と定量分析を実行して、最後に、該組織検体が罹患した癌の細胞種類とその比率を自動的認識可能になる、という技術特徴を有しているクロス染色とマルチバイオマーカー方法。【選択図】図２Ａ
2019211461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロス染色とマルチバイオマーカー方法であって、癌タイプの識別と診断支援に使用可能で、
（１）ある乳管組織を含む組織検体を取得してから、複数枚の組織切片を作成することと、
（２）前記複数枚の組織切片を、少なくとも一つのヘマトキシリン−エオシン染色（Ｈ＆Ｅ  ｓｔａｉｎ）群と、少なくとも複数の免疫組織染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｓｔａｉｎ，ＩＨＣ  ｓｔａｉｎ）群とを含む複数の染色組織切片群に分割することであって、そのうち、該複数のＩＨＣ染色群は少なくとも、Ｅ−カドヘリンのＩＨＣ染色群、癌タンパク質ｐ６３のＩＨＣ染色群、サイトケラチンＣＫ１４のＩＨＣ染色群、及びサイトケラチンＣＫ５／６のＩＨＣ染色群を含むことと、
（３）該ヘマトキシリン−エオシン染色群における組織切片に対して、ヘマトキシリン−エオシン染色処理を実行して複数枚のＨ＆Ｅ染色組織切片を得、且つ該複数の免疫組織染色群における組織切片に免疫組織染色処理を行うことで、複数枚のＩＨＣ染色組織切片を得ることと、
（４）複数枚の該Ｈ＆Ｅ染色組織切片と複数枚の該ＩＨＣ染色組織切片を複数フレームのＨ＆Ｅ染色組織画像と複数フレームのＩＨＣ染色組織画像に転換させることと、
（５）これらのＨ＆Ｅ染色組織画像とＩＨＣ染色組織画像にクロス染色画像登録・融合を行うことと、
（６）あらゆるＩＨＣ染色組織画像とＨ＆Ｅ染色組織画像は全部、前記クロス染色画像登録・融合を完成して、複数フレームのクロス染色組織画像を得るまで、該ステップ（５）を繰り返すこと、及び、
（７）得る該複数フレームのクロス染色組織画像に対して、腫瘍認識と定量分析を行うことで、該組織検体が罹患した癌細胞のタイプとその比率を自動的に識別することと、の各ステップを含むことを特徴とする、
クロス染色とマルチバイオマーカー方法。
【請求項２】
対応する少なくとも一種類のたんぱく質を含有する組織切片を選択するように、前記免疫組織染色処理をする前に、少なくとも一種類のたんぱく質地図を参照することを特徴とする請求項１に記載のクロス染色とマルチバイオマーカー方法。
【請求項３】
該たんぱく質は、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、癌タンパク質ｐ６３、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、サイトケラチンＨＭＣＫ、サイトケラチンＣＫ１４、サイトケラチンＣＫ７、サイトケラチンＣＫ５／６とサイトケラチンＣＫ８／１８からなることを特徴とする請求項２に記載のクロス染色とマルチバイオマーカー方法。
【請求項４】
該ステップ（１）は、（１１）該組織検体を取得してから、該組織検体をワックスブロックに作成することと、（１２）該ワックスブロックに切片処理（Ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）をすることで、複数枚の組織切片を得ること、及び、（１３）各組織切片に固定処理（Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）をすること、の詳細なステップを含むことを特徴とする請求項１に記載のクロス染色とマルチバイオマーカー方法。
【請求項５】
前記クロス染色画像登録・融合は、（５１）一フレームのＨ＆Ｅ染色組織画像や一つのバイオマーカーを含む一フレームのＩＨＣ染色組織画像を取得することと、及び、（５２）該Ｈ＆Ｅ染色組織画像と前記バイオマーカーを含む該ＩＨＣ染色組織画像に画像登録、且つ画像融合を行うこと、の処理ステップを含むことを特徴とする請求項１に記載のクロス染色とマルチバイオマーカー方法。
【請求項６】
前記癌は乳癌であって、該ステップ（７）には、該組織検体に基底様乳癌（Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＢＣ）があるかどうかを判断する下記の詳細なステップを含み、（７１）該クロス染色組織画像にあるＥ−カドヘリンは陽性反応するかどうかを判断し、そうであれば、ステップ（７２）を実行し、そうでなければ、ステップを終了することと、（７２）該クロス染色組織画像に、該乳管組織の筋上皮細胞（Ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌たんぱく質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４とサイトケラチンＣＫ５／６が全部陰性反応するかどうかを判断し、そうであれば、ステップ（７３）を実行する、そうでなければ、終了することと、（７３）該組織検体に基底様乳癌（Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＢＣ）があるとを判定することと、を含むことを特徴とする請求項１に記載のクロス染色とマルチバイオマーカー方法。
【請求項７】
前記癌は乳癌であって、該ステップ（７）には、該組織検体に非浸潤性乳管癌（Ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ，ＤＣＩＳ）があるかどうかを判断する下記の詳細なステップ、（７１）該クロス染色組織画像にあるＥ−カドヘリンが陽性反応するかどうかを判断し、そうであれば、ステップ（７２Ａ）を実行する、そうでなければ、ステップを終了することと、（７２Ａ）該クロス染色組織画像に、該乳管組織の上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌たんぱく質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４とサイトケラチンＣＫ５／６が全部陰性反応すると同時に、該乳管組織の筋上皮細胞（Ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌たんぱく質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４とサイトケラチンＣＫ５／６が陽性反応するかどうかを判断し、そうであれば、ステップ（７３Ａ）を実行し、そうでなければ、終了することと、（７３Ｂ）該組織検体に非浸潤性乳管癌（Ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ，ＤＣＩＳ）があると判定することと、を含むことを特徴とする請求項１に記載のクロス染色とマルチバイオマーカー方法。
【請求項８】
前記癌は乳癌であって、該ステップ（７）には、該組織検体に異型乳管過形成（Ａｔｙｐｉｃａｌ  ｄｕｃｔａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ、ＡＤＨ）があるかどうかを判断する下記の詳細なステップを含み、（７１）該クロス染色組織画像にあるＥ−カドヘリンが陽性反応するかどうかを判断し、そうであれば、ステップ（７２Ｂ）を実行する、そうでなければ、ステップを終了することと、（７２Ｂ）該クロス染色組織画像に、該乳管組織の筋上皮細胞（Ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌たんぱく質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４とサイトケラチンＣＫ５／６が全部陽性反応すると同時に、該乳管組織の上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌たんぱく質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４とサイトケラチンＣＫ５／６が部分的陽性反応や部分的陰性反応するかどうかを判断し、そうであれば、ステップ（７３Ｂ）を実行し、そうでなければ、終了することと、（７３Ｂ）該組織検体に異型乳管過形成（Ａｔｙｐｉｃａｌ  ｄｕｃｔａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ、ＡＤＨ）があると判定することと、を含むことを特徴とする請求項１に記載のクロス染色とマルチバイオマーカー方法。
【請求項９】
前記癌は乳癌であって、該ステップ（７）には、該組織検体に上皮過形成（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）があるかどうかを判断する下記の詳細なステップを含み、（７１）該クロス染色組織画像にあるＥ−カドヘリンが陽性反応するかどうかを判断し、そうであれば、ステップ（７２Ｃ）を実行する、そうでなければ、ステップを終了することと、（７２Ｃ）該クロス染色組織画像に、該乳管組織の筋上皮細胞（Ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌たんぱく質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４とサイトケラチンＣＫ５／６が全部陽性反応すると同時に、該乳管組織の上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌たんぱく質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４とサイトケラチンＣＫ５／６が陽性反応するかどうかを判断し、そうであれば、ステップ（７３Ｃ）を実行し、そうでなければ、終了することと、（７３Ｃ）該組織検体に、３層以上の上皮過形成があるかどうかを判断し、そうであれば、ステップ（７４Ｃ）を実行する、そうでなければ、ステップ（７５Ｃ）を実行することと、（７４Ｃ）該組織検体に上皮過形成（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）があると判定することと、（７５Ｃ）該組織検体が正常組織であると判定することと、を含むことを特徴とする請求項１に記載のクロス染色とマルチバイオマーカー方法。
【請求項１０】
前記癌は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌や食道癌の何れか一種であることを特徴とする請求項１に記載のクロス染色とマルチバイオマーカー方法。
【請求項１１】
前記クロス染色とマルチバイオマーカー方法は市販の画像登録とクロス画像注釈システムに応用可能であることを特徴とする請求項１に記載のクロス染色とマルチバイオマーカー方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の検出・診断技術分野、特に癌の診断支援に使用されるクロス染色とマルチバイオマーカー方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳癌とは、乳管細胞や小葉細胞の異常分裂による悪性腫瘍であって、感染した局部の乳房に加え、リンパ節によって他の臓器に転移する可能性も高い。一般的に、非浸潤性乳管癌（Ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ，ＤＣＩＳ）、異型乳管過形成（Ａｔｙｐｉｃａｌ  ｄｕｃｔａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ，ＡＤＨ）、基底様乳癌（Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＢＣ）に分類される前記乳癌の治療の面では、病理学を基礎に、少なくとも一組の組織切片の画像から、非浸潤性乳癌（ＤＣＩＳ）、基底様乳癌（ＢＣ）及び／又は異型乳管過形成（ＡＤＨ）を有効に識別した後、医者はそれから適切な治療方法を作成することができる。
【０００３】
図１は乳癌治療の流れ図である。臨床的に、医者にて乳癌患者のために提出された治療工程は普通、患者の乳房Ｘ線撮影や超音波検査画像によって、医者が臨床経験に基づいて、患者の乳房に腫瘍または嚢腫があるかどうかを判断するステップＳ１’と、検査結果によって乳房が正常な状況にある場合は、定期にフォローアップするステップＳ２ａ’と、もし検査結果にて、乳房に腫瘍や嚢腫ができたと表示した場合は、医者が引き続いて患者に針生検（ｃｏｒｅ  ｎｅｅｄｌｅ  ｂｉｏｐｓｙ）を行って組織切片を作成するステップＳ２’と、組織切片の染色画像に対する分析の結果によって、医者が前記乳癌がＤＣＩＳであるかＡＤＨであるかを判断可能であるステップＳ３’と、前記乳癌がＡＤＨであれば、直接に手術して腫瘍を除去するステップＳ４’と、前記ステップＳ４’で除去された腫瘍が病理学的分析を通過した後、幸いにも、全部ＡＤＨであると判断した場合、手術後、患者に定期的にフォローアップするステップＳ７’と、を有する。
【０００４】
また逆に、除去された腫瘍が、病理学的分析を通過した後、残念ながらその一部がＤＣＩＳになったと判断した場合は、患者が、多発性腫瘍を確認するために、さらなる核磁気共鳴（ＭＲＩ）を受けるステップＳ５’と、多発性腫瘍であれば、患者が、完全な乳房切除術を受けるステップＳ６’とを含み、幸いにも多発性腫瘍でなければ、患者は乳房の一部のみを切ればよく、最後に、前記ステップＳ７’の術後の連続治療では、完全な乳房切除術を受けた患者は、乳房再建手術を考えてもよく、部分乳房切除術を受けている患者は、引き続き放射線療法またはホルモン治療を受けなければならない。
【０００５】
図１を見ると、「組織切片の病理学的分析の正確性」は、後続のステップＳ４’からステップＳ７’までの治療方案の選択に深刻な影響を与えることが分かる。これを考慮して、画像アライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）や登録（ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）技術が組織切片の染色画像に対する判断に広く応用されている。例えば、米国特許番号ＵＳ９，８１８，１９０に掲示した完全なスライド画像登録とクロス画像注釈システム（Ｗｈｏｌｅ  ｓｌｉｄｅ  ｉｍａｇｅ  ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｉｍａｇｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）は、複数の組織切片の染色画像に対する特徴アライメントに応用可能であり、そのうち、一つがソース画像、一つが目的画像であるように定義された二つの画像は、同じ座標システムでその内容に対して、画像特徴分析を行ってもよい。
【０００６】
例えば、米国特許番号ＵＳＵＳ９，８１８，１９０に掲示した内容によると、Ｈ＆Ｅ染色を経た組織切片画像をソース画像に、ＩＨＣ染色を経た組織切片画像を目的画像に定義することができ、次に、ユーザは、Ｈ＆Ｅ染色された組織切片画像から一つの特徴区域を選択やマークすると、システムはＩＨＣ染色された組織切片画像にて、同じ特徴区域を自動に選択やマークする。簡単に言うと、前記完全なスライド画像登録とクロス画像注釈システムの助けを借り、医者は、組織切片の染色画像から患者の乳癌タイプを早くて確実に判断することが可能になる。
【０００７】
残念ながら、前記完全なスライド画像登録とクロス画像注釈システムは、ＩＨＣ染色された組織切片画像及び／又はＨ＆Ｅ染色された組織切片画像の色によって、患者の乳癌タイプ、腫瘍のサイズや病巣の数を自発に判断できない。以上を考慮し、本案の発明者は、研究創作に努めた結果、本発明の癌の診断支援に使用されるクロス染色とマルチバイオマーカー方法の開発を遂に完成した。  
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、癌の診断支援に使用されるクロス染色とマルチバイオマーカー方法の提供を目的として、組織切片の画像を先にＨ＆Ｅ染色組織画像とＩＨＣ染色組織画像の二組に分け、次に、別々のＩＨＣ染色組織画像とＨ＆Ｅ染色組織画像に対して、クロス染色画像登録・融合処理を行うことによって、複数フレームのクロス染色組織画像を得、更に、特別に設計されたバイオマーカーの性能認識プロセスを通じて、得た前記複数フレームのクロス染色組織画像に腫瘍認識と定量分析を実行して、最後に、該組織検体が罹患した癌の細胞種類とその比率を自動的認識可能とする技術特徴を有しているクロス染色とマルチバイオマーカー方法を提供する。
本発明を組み合わせて使う場合、医者は、人工認識方法で検体が罹患した癌の細胞種類を識別しなくてもよいので、人工認識による如何なる判断ミスも避けることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の前記目的に達成するために、本案の発明者に提供された癌の診断支援に使用されるクロス染色とマルチバイオマーカー方法に関する一つの実施形態では、（１）ある乳管組織を含む組織検体を取得してから、複数枚の組織切片を作成することと、（２）前記複数枚の組織切片を、少なくとも一つのヘマトキシリン−エオシン染色（Ｈ＆Ｅ  ｓｔａｉｎ）群と少なくとも複数の免疫組織染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｓｔａｉｎ，ＩＨＣ  ｓｔａｉｎ）群を含む複数枚の染色組織切片群に分割することと、そのうち、該複数のＩＨＣ染色群は少なくとも、Ｅ−カドヘリンのＩＨＣ染色群、癌タンパク質ｐ６３のＩＨＣ染色群、サイトケラチンＣＫ１４のＩＨＣ染色群、及びサイトケラチンＣＫ５／６のＩＨＣ染色群を含む、（３）該ヘマトキシリン−エオシン染色群における組織切片に対して、ヘマトキシリン−エオシン染色処理を実行して複数枚のＨ＆Ｅ染色組織切片を得、且つ該免疫組織染色群における組織切片に免疫組織染色処理を行うことで、複数枚のＩＨＣ染色組織切片を得ることと、（４）複数枚の該Ｈ＆Ｅ染色組織切片と複数枚の該ＩＨＣ染色組織切片を複数フレームのＨ＆Ｅ染色組織画像と複数フレームのＩＨＣ染色組織画像に転換させることと、（５）これらのＨ＆Ｅ染色組織画像とＩＨＣ染色組織画像にクロス染色画像登録・融合を行うことと、（６）あらゆるＩＨＣ染色組織画像とＨ＆Ｅ染色組織画像は全部、前記クロス染色画像登録・融合を完成して、複数フレームのクロス染色組織画像を得るまで、該ステップ（５）を繰り返すこと、及び、（７）得る該複数フレームのクロス染色組織画像に対して、腫瘍認識と定量分析を行うことで、該組織検体が罹患した癌細胞のタイプとその比率を自動に識別することと、の各ステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】乳癌治療の流れ図である。
【図２Ａ】本発明のクロス染色とマルチバイオマーカー方法の流れ図である。
【図２Ｂ】本発明のクロス染色とマルチバイオマーカー方法の流れ図である。
【図３Ａ】本発明のクロス染色とマルチバイオマーカー方法の概略流れ図である。
【図３Ｂ】本発明のクロス染色とマルチバイオマーカー方法の概略流れ図である。
【図４Ａ】画像登録・融合の実行工程図である。
【図４Ｂ】画像登録・融合の実行工程図である。
【図４Ｃ】画像登録・融合の実行工程図である。
【図５Ａ】ステップＳ７の流れに関する詳細な説明図である。
【図５Ｂ】ステップＳ７の流れに関する詳細な説明図である。
【図５Ｃ】ステップＳ７の流れに関する詳細な説明図である。
【図５Ｄ】ステップＳ７の流れに関する詳細な説明図である。
【図６】乳管の横断面を示す図である。
【図７】四枚のクルス染色組織画像を示す実際的画像図である。
【図８】四枚のクルス染色組織画像を示す実際的画像図である。
【図９】四枚のクルス染色組織画像を示す実際的画像図である。
【図１０】四枚のクルス染色組織画像を示す実際的画像図である。
【図１１】四枚のクルス染色組織画像を示す実際的画像図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下は、本発明に提出した癌の診断支援に使用されるクロス染色とマルチバイオマーカー方法をより明確に説明するために、図面を参照しながら、本発明に関する好ましい実施形態を詳細に説明する。
【００１２】
本発明のクロス染色とマルチバイオマーカー方法の流れ図である図２Ａと図２Ｂを参照する。本発明のクロス染色とマルチバイオマーカー方法は、主に癌タイプの識別と診断支援に使用される。
本発明のクロス染色とマルチバイオマーカー方法の概略流れ図である図３Ａと図３Ｂを同時に参照する。図２Ａによると、本発明の方法は、乳管組織を含む組織検体を取得してから、複数枚の組織切片に作成するように、ステップＳ１を先に実行する。図３Ａから見ると、まず得た前記組織検体をワックスブロックに作成する必要があり、その後、該ワックスブロックに切片処理（Ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）をすることで、複数枚の組織切片を得ることができるようになる、注意すべき点は、これらの組織切片に染色処理をする前、各組織切片に固定処理（Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）をする必要がある点である。
【００１３】
次に、ステップＳ２では、前記複数枚の組織切片を、少なくとも一つのヘマトキシリン−エオシン染色（Ｈ＆Ｅ  ｓｔａｉｎ）群と、少なくとも複数の免疫組織染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｓｔａｉｎ，ＩＨＣ  ｓｔａｉｎ）群とを含む複数の染色組織切片群に分割し、癌タイプの検出の面では、医者は対応する少なくとも一種類のたんぱく質地図を参照した上、対応する少なくとも一種類のたんぱく質を含有する組織切片を選択する。
ここで、前記たんぱく質は、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、癌タンパク質ｐ６３、平滑筋アクチン（Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ，ＳＭＡ）、高分子量サイトケラチン（Ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，ＨＭＣＫ）、サイトケラチンＣＫ１４、サイトケラチンＣＫ７、サイトケラチンＣＫ５／６とサイトケラチンＣＫ８／１８からなる。簡単に言えば、乳癌診断に応用時、該複数のＩＨＣ染色群は少なくとも、Ｅ−カドヘリンのＩＨＣ染色群、癌タンパク質ｐ６３のＩＨＣ染色群、サイトケラチンＣＫ１４のＩＨＣ染色群、及びサイトケラチンＣＫ５／６のＩＨＣ染色群を含む。
【００１４】
続いて、ステップＳ３では、該ヘマトキシリン−エオシン染色群における組織切片に対して、ヘマトキシリン−エオシン染色処理を実行して複数枚のＨ＆Ｅ染色組織切片を得、且つ該複数の免疫組織染色群における組織切片に免疫組織染色処理を行うことで、複数枚のＩＨＣ染色組織切片を得る。特に、そのうち第一組の免疫組織染色群のＩＨＣ染色組織切片はＥ−カドヘリンの染色組織切片で、第二組の免疫組織染色群のＩＨＣ染色組織切片は癌タンパク質ｐ６３の染色組織切片で、第三組の免疫組織染色群のＩＨＣ染色組織切片はサイトケラチンＣＫ１４の染色組織切片で、且つ第四組の免疫組織染色群のＩＨＣ染色組織切片はサイトケラチンＣＫ５／６の染色組織切片である。
更に、図２Ａと図３Ｂに参照する。本発明の方法は、複数枚の該Ｈ＆Ｅ染色組織切片と複数枚の該ＩＨＣ染色組織切片を複数フレームのＨ＆Ｅ染色組織画像と複数フレームのＩＨＣ染色組織画像に転換させるように、引き続いてステップＳ４を実行する。
（６）あらゆるＩＨＣ染色組織画像とＨ＆Ｅ染色組織画像は全部、前記クロス染色画像登録・融合を完成して、複数フレームのクロス染色組織画像を得るまで、該ステップ（５）を繰り返す。
（７）得る該複数フレームのクロス染色組織画像に対して、腫瘍認識と定量分析を行うことで、該組織検体が罹患した癌細胞のタイプとその比率を自動に識別する。
【００１５】
更に図２Ｂと図３Ｂを参照する。ステップＳ５では、これらのＨ＆Ｅ染色組織画像とＩＨＣ染色組織画像にクロス染色画像登録・融合を行う。
図４Ａ、図４Ｂと図４Ｃは、画像登録・融合の実行工程図であり、図３Ｂと図４Ａ、図４Ｂと図４Ｃを参照する。一フレームのＥ−カドヘリンの染色組織画像、一フレームの癌タンパク質ｐ６３の染色組織画像と一フレームのサイトケラチンＣＫ１４の染色組織画像は取り出され、そして一フレームのＨ＆Ｅ染色組織画像と画像登録・融合される。ここで、強調すべき点は、あるソース画像（Ｓｏｕｒｃｅ  ｉｍａｇｅ）によって、ある目的画像（Ｔａｒｇｅｔ  ｉｍａｇｅ）にアライメントや登録をするのに類似した技術、例えばＬｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅｓ、ＵｎｗａｒｐＪ、ｂＵｎｗａｒｐＪ、Ｅｌａｓｔｉｃ、ＣｗＲ、ＣＬＡＨＥ＋ｂｕｎｗａｒｐＪ、ＴｒａｋＥＭ２などの方法が既に、組織切片の染色画像に対する判断に広く応用されている。しかし、本発明方法のステップＳ５では、ソース画像と目的画像の画像アライメントに対して、非常に厳しい精度要件があるため、文献一、即ちＷａｎｇ  ｅｔ．ａｌ、“Ｒｏｂｕｓｔ  ｉｍａｇｅ  ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｉｍａｇｅｓ”、Ｎａｔｕｒｅ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ４：６０５０（ＳＣＩ、ＪＣＲ  ２０１５（７／６３）  ｉｎ  ＭＵＬＴＩＤＩＳＣＩＰＬＩＮＡＲＹ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、  ＩＦ＝５．２２８）に提出した画像登録技術の使用が推奨される点である。
【００１６】
ソース画像と目的画像との画像アライメントや登録を完了した後、図４Ａ、図４Ｂと図４Ｃに示すように、Ｅ−カドヘリンの染色組織画像とＨ＆Ｅ染色組織画像とは、画像融合技術で一フレームのクロス染色組織画像に組み合わせられる。癌タンパク質ｐ６３の染色組織画像とＨ＆Ｅ染色組織画像とは、画像融合技術で一フレームのクロス染色組織画像に組み合わせられ、且つサイトケラチンＣＫ１４の染色組織画像とＨ＆Ｅ染色組織画像とは、画像融合技術で一フレームのクロス染色組織画像に組み合わせられる。図に表示されないが、サイトケラチンＣＫ５／６の染色組織画像とＨ＆Ｅ染色組織画像とも、画像融合技術によって一フレームのクロス染色組織画像に組み合わせられる。
該ステップＳ５を完了した後、本発明の方法は、あらゆるＩＨＣ染色組織画像とＨ＆Ｅ染色組織画像を全部、一フレームのＨ＆Ｅ染色組織画像と、前記クロス染色画像の登録・融合を完了して、複数フレームのクロス染色組織画像を得るまで、ステップＳ６を次第に実行し、更に該ステップ（５）を繰り返す。
【００１７】
最後に、本発明の方法は、図２Ｂと図３Ｂに示すように、ステップＳ７を実行し、得た該複数フレームのクロス染色組織画像に対して、腫瘍認識と定量分析をし、それにより、該組織検体が罹患した癌細胞の種類を自動に認識する。例えば、四種類のバイオマーカーの免疫化学反応を同時に識別することで、該組織検体が罹患した乳癌のタイプとその比率を自動に認識することが可能になる。
図５Ａと図５ＤはステップＳ７の詳細ステップの流れ図であり、そのうち、図５Ａにて、該ステップＳ７に、該組織検体が基底様乳癌（Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＢＣ）を罹患したかどうかを判断するための詳細ステップが含まれることを示した。
図５Ａで描かれた詳細ステップの実行工程を説明する前に、乳管の組織構造を紹介する必要がある。図６は乳管の横断面を示す図であり、図６から見ると、乳管の上皮組織（ｄｕｃｔａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）は主に、管腔上皮細胞（Ｌｕｍｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ、ＬＥＰ  ｃｅｌｌｓ）と筋上皮細胞（Ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ、ＭＥＰ  ｃｅｌｌｓ）からなることが分かる。
【００１８】
先ず、該クロス染色組織画像におけるＥ−カドヘリンが陽性反応をするかどうかを判断するためのステップＳ７１を実行し、そうであれば、該クロス染色組織画像において、該乳管組織の筋上皮細胞（Ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌タンパク質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４及びサイトケラチンＣＫ５／６が陰性反応をすると判断するステップＳ７２を行い、ステップＳ７２による判断結果が「是」である場合、ステップＳ７３にて該組織検体に乳癌（Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＢＣ）が含有されると判定する。
図７は四枚のクロス染色組織画像と一枚のＩＨＣ染色画像を示す実際的画像図である。そのうち、図７における画像（ａ）はＥ−カドヘリンの染色組織画像で、画像（ｂ）は癌タンパク質ｐ６３の染色組織画像で、画像（ｃ）はサイトケラチンＣＫ１４の染色組織画像で、画像（ｄ）はサイトケラチンＣＫ５／６の染色組織画像で、且つ画像（ｅ）はＨ＆Ｅ染色組織画像である。この四枚のＩＨＣ染色画像を該Ｈ＆Ｅ染色組織画像と対応する四枚のクロス染色組織画像に作成した後、この四枚のクロス染色組織画像に対する観察を通じて、該組織検体に基底様乳癌（ＢＣ）が含まれることが判断できる。
【００１９】
図５Ｂは該ステップＳ７に、該組織検体が非浸潤性乳管癌（Ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ，ＤＣＩＳ）を罹患したかどうかを判断するための詳細ステップが含まれることを示す。まず、該クロス染色組織画像におけるＥ−カドヘリンが陽性反応をするかどうかを判断するためのステップＳ７１Ａを実行し、そうであれば、該クロス染色組織画像において、該乳管組織の上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌タンパク質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４及び／又はサイトケラチンＣＫ５／６が前記陰性反応をするとともに、該乳管組織の筋上皮細胞（Ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌タンパク質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４及びサイトケラチンＣＫ５／６が陽性反応をするかどうかと判断するステップＳ７２Ａを行う。ステップＳ７２Ａによる判断結果が「是」である場合、ステップＳ７３Ａにて該組織検体に非浸潤性乳管癌（Ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ，ＤＣＩＳ）が含有されると判定する。
図８は四枚のクロス染色組織画像と一枚のＩＨＣ染色画像を示す実際的画像図である。そのうち、図８における画像（ａ）はＥ−カドヘリンの染色組織画像で、画像（ｂ）は癌タンパク質ｐ６３の染色組織画像で、画像（ｃ）はサイトケラチンＣＫ１４の染色組織画像で、画像（ｄ）はサイトケラチンＣＫ５／６の染色組織画像で、且つ画像（ｅ）はＨ＆Ｅ染色組織画像である。この四枚のＩＨＣ染色画像を該Ｈ＆Ｅ染色組織画像と対応する四枚のクロス染色組織画像に作成した後、この四枚のクロス染色組織画像に対する観察を通じて、該組織検体に非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）が含まれることが判断できる。
【００２０】
また、図５Ｃは該ステップＳ７に、該組織検体が異型乳管過形成（Ａｔｙｐｉｃａｌ  ｄｕｃｔａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ，ＡＤＨ）を罹患したかどうかを判断するための詳細ステップが含まれることを示す。まず、該クロス染色組織画像におけるＥ−カドヘリンが陽性反応をするかどうかを判断するためのステップＳ７１Ｂを実行し、そうであれば、該クロス染色組織画像において、該乳管組織の筋上皮細胞（Ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌タンパク質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４及びサイトケラチンＣＫ５／６が全部陽性反応をすると同時に、該乳管組織の上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）のサイトケラチンＣＫ１４及び／又はサイトケラチンＣＫ５／６が部分的に陽性反応や部分的に陰性反応をするかどうかを判断するステップＳ７２Ｂを行う。ステップＳ７２Ｂによる判断結果が「是」である場合、ステップＳ７３Ｂにて該組織検体に異型乳管過形成（Ａｔｙｐｉｃａｌ  ｄｕｃｔａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ，ＡＤＨ）が含有されると判定する。
図９は四枚のクロス染色組織画像と一枚のＩＨＣ染色画像を示す実際的画像図である。そのうち、図９における画像（ａ）はＥ−カドヘリンの染色組織画像で、画像（ｂ）は癌タンパク質ｐ６３の染色組織画像で、画像（ｃ）はサイトケラチンＣＫ１４の染色組織画像で、画像（ｄ）はサイトケラチンＣＫ５／６の染色組織画像で、且つ画像（ｅ）はＨ＆Ｅ染色組織画像である。この五枚のＩＨＣ染色画像を該Ｈ＆Ｅ染色組織画像と対応する五枚のクロス染色組織画像に作成した後、この五枚のクロス染色組織画像に対する観察を通じて、該組織検体に異型乳管過形成（ＡＤＨ）が含まれることが判断できる。
【００２１】
更に、図５Ｄは該ステップＳ７に、該組織検体が上皮過形成（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）を罹患したかどうかを判断するための詳細ステップが含まれることを示す。まず、該クロス染色組織画像におけるＥ−カドヘリンが陽性反応をするかどうかを判断するためのステップＳ７１Ｃを実行し、そうであれば、該クロス染色組織画像において、該乳管組織の筋上皮細胞（Ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌タンパク質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４及びサイトケラチンＣＫ５／６が全部陽性反応をすると同時に、該乳管組織の上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）のサイトケラチンＣＫ１４及び／又はサイトケラチンＣＫ５／６が陽性反応をするかどうかを判断するステップＳ７２Ｃを行う。ステップＳ７２Ｃによる判断結果が「是」である場合、ステップＳ７３Ｃにて該組織検体に３層以上の上皮過形成が発生するかどうかを続いて判定する。ステップＳ７９Ｃによる判断結果が「是」であれば、ステップＳ７４Ｃにて、該組織検体に上皮過形成（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）を有するかどうかを判定する。逆に、ステップＳ７５Ｃにて、該組織検体が正常組織であるように判定する。
【００２２】
図１０は四枚のクロス染色組織画像と一枚のＩＨＣ染色画像を示す実際的画像図である。図１０における画像（ａ）はＥ−カドヘリンの染色組織画像で、画像（ｂ）は癌タンパク質ｐ６３の染色組織画像で、画像（ｃ）はサイトケラチンＣＫ１４の染色組織画像で、画像（ｄ）はサイトケラチンＣＫ５／６の染色組織画像で、且つ画像（ｅ）はＨ＆Ｅ染色組織画像である。この五枚のＩＨＣ染色画像を該Ｈ＆Ｅ染色組織画像と対応する五枚のクロス染色組織画像に作成した後、この五枚のクロス染色組織画像に対する観察を通じて、該組織検体に上皮過形成が含まれることが判断できる。
図１１は四枚のクロス染色組織画像を示す実際的画像図である。図１１における画像（ａ）はＥ−カドヘリンの染色組織画像で、画像（ｂ）は癌タンパク質ｐ６３の染色組織画像で、画像（ｃ）はサイトケラチンＣＫ１４の染色組織画像で、画像（ｄ）はサイトケラチンＣＫ５／６の染色組織画像で、且つ画像（ｅ）はＨ＆Ｅ染色組織画像である。この五枚のＩＨＣ染色画像を該Ｈ＆Ｅ染色組織画像と対応する五枚のクロス染色組織画像に作成した後、この五枚のクロス染色組織画像に対する観察を通じて、該組織検体が正常の乳管上皮組織であると判断できる。  
【００２３】
図５Ａ〜図５Ｄの流れ図に基づき、我々は乳癌タイプの分類方法を下記表（１）に整理して表示する。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
追加説明として、図５Ｂの流れ図によって、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）を判断する方法を下記表（２）、表（３）と表（４）に整理して表示する。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
【表３】
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【００２８】
【表４】
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【００２９】
表（１）を参照する。ＩＨＣ染色の反応表現がはっきりと部分的陽性反応及び／又は部分的陰性反応と区別できない場合においては、該組織検体が上皮過形成（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）や異型乳管過形成（ＡＤＨ）を罹患したかどうかを判断することが確かに難しい。そういう場合、本発明の方法は該組織検体に異型乳管過形成があるかどうかの判定に優先する。
【００３０】
特定の状況では、例えば、筋上皮細胞（Ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）のケラチン細胞やタンパク質のＩＨＣ染色反応が陰性に表したが、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）のケラチン細胞やタンパク質のＩＨＣ染色反応が部分的陽性に表すのに類似した特定の状況において、本発明の方法は該組織検体に基底様乳癌（ＢＣ）があるかどうかを判定する。
一方、組織検体は普通、中核針生検（ｃｏｒｅ  ｎｅｅｄｌｅ  ｂｉｏｐｓｙ）によって取得されるので、検体を取得する工程中、誤操作で組織切片の画像に境界が明確に表示されることができなくなってしまう可能性がある。従って、そういう場合には、システムが該乳管組織の上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌たんぱく質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４とサイトケラチンＣＫ５／６が全部陰性反応をすることを認識したが、筋上皮細胞（Ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の癌たんぱく質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４とサイトケラチンＣＫ５／６が全部陰性反応をするかどうかを順調に識別できない場合、システムは該組織検体に非浸潤性乳管癌（ＤＩＣＳ）があるかどうかの判定に優先する。
【００３１】
強調すべき点は、本発明は図５Ａから図５Ｄにて、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、癌たんぱく質ｐ６３、サイトケラチンＣＫ１４とサイトケラチンＣＫ５／６という四種類のバイオマーカーに対する認識を通じて、該組織検体が罹患した癌細胞のタイプを認識する工程を手本として示したが、これはステップＳ７の詳細実行ステップの構成を限定する意図ではない点である。例えば、サイトケラチンＣＫ１４、ＣＫ８、ＣＫ１８は全部乳腺細胞の過形成を表してもよく、それで、ＣＫ８やＣＫ１８でＣＫ１４を置換することが可能である。もう一方では、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）とサイトケラチンＣＫ５／６とも筋上皮前駆細胞の過形成を表すことができるので、ＳＭＡでＣＫ５／６を置換してもよい。
【００３２】
同時に、上記の説明によると、更に本発明のクロス染色とマルチバイオマーカー方法を、乳癌を除いた、例え卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌や食道癌などの癌の認識に応用してもよいことが分かる。本発明を採用する場合、医者は上記の何れかの癌を有する組織検体に、以下の項目を実現しやすくなる。
（１）腫瘍の診断と鑑別
（２）癌の腫瘍細胞に対する病理学的タイピング
（３）腫瘍の正確な組織学分類の特定
（４）病巣の数の確認
（５）医者の癌治療方案のために有力な支援の提供
【００３３】
上記は、本発明の癌の診断支援に使用されるクロス染色とマルチバイオマーカー方法をはっきり説明しただけではない。本発明は以下（１）（２）の利点を有する。
【００３４】
（１）本発明は、組織切片の画像を先にＨ＆Ｅ染色組織画像とＩＨＣ染色組織画像の二組に分け、次に、別々のＩＨＣ染色組織画像とＨ＆Ｅ染色組織画像に対して、クロス染色画像登録・融合処理を行うことによって、複数フレームのクロス染色組織画像を得、更に、特別に設計されたバイオマーカーの性能認識プロセスを通じて、得た前記複数フレームのクロス染色組織画像に腫瘍認識と定量分析を実行して、最後に、該組織検体が罹患した癌の細胞種類とその比率を自動的認識可能になった、という技術特徴を有しているクロス染色とマルチバイオマーカー方法を提供し、本発明を組み合わせて使う場合、医者は、人工認識方法で検体が罹患した癌の細胞種類を識別しなくてもよいので、人工認識による如何なる判断ミスを避けることができるようになる。
【００３５】
（２）本発明のクロス染色とマルチバイオマーカー方法は、市販の何れかの画像アライメントとクロス画像注釈システム、例えば、ライカのＬｅｉｃａ  ＢｉｏｓｕｓｔｅｍｓやＰｏｌａｒｉｓによるＶｅｃｔｒａ全自動定量病理イメージングシステムと合わせて癌の診断支援に使用してもよい。
【００３６】
強調すべき点は、以上、本発明の実現可能な実施形態を詳細に説明したが、これらの実施形態は、本発明の範囲を限定することを意図していないという点である。発明の要旨を逸脱しない均等実施形態や変更も、本案の特許請求の範囲に含まれるものである。
【符号の説明】
【００３７】
Ｓ１−Ｓ４  ステップ    
Ｓ５−Ｓ７  ステップ  
Ｓ７１−Ｓ７３  ステップ  
Ｓ７１Ａ−Ｓ７３Ａ  ステップ  
Ｓ７１Ｂ−Ｓ７３Ｂ  ステップ  
Ｓ７１Ｃ−Ｓ７５Ｃ  ステップ
Ｓ１’  ステップ  
Ｓ２ａ’  ステップ  
Ｓ２’−Ｓ７’  ステップ
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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