(57)【要約】【課題】糖化蛋白質の酵素法測定に適し、ロイコ型色素を安定化できる化合物を含有する試薬の提供。【解決手段】糖化蛋白質の酵素法による測定に使用する試薬であって、ロイコ型色素を含み、さらに、下記式（Ｉ）の化合物を含む試薬。2019062891.tif 000009  式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数８−１７の炭化水素鎖を表す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素法による糖化蛋白質の測定に使用する試薬であって、
ロイコ型色素を含み、
さらに、下記式（Ｉ）の化合物を含む、試薬。
【化１】
2019062891.tif 000008
式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数８−１７の炭化水素鎖を表す。
【請求項２】
糖化蛋白質が、糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
糖化蛋白質が、ヘモグロビンＡ１ｃである、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項４】
前記試薬は、式（Ｉ）の化合物を、少なくとも、前記ロイコ型色素の安定化剤として含む、請求項１から３のいずれかに記載の試薬。
【請求項５】
前記ロイコ型色素が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４'−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、又はこれらの塩である、請求項１から４のいずれかに記載の試薬。
【請求項６】
ペルオキシダーゼを含む試薬と、該試薬とは別の試薬として請求項１から５のいずれかに記載の試薬とを備える、糖化蛋白質を酵素法により測定するためのキット。
【請求項７】
下記（１）から（５）を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、
試料と請求項１から５のいずれかに記載の試薬とを混合することを含む、測定方法。
（１）試料中のヘモグロビンを変性させること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼと反応によりＮ末端糖化ペプチドを生成させること。
（３）Ｎ末端糖化ペプチドとフルクトシルペプチドオキシダーゼとの反応により過酸化水素を生成させること。
（４）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応によりロイコ型色素を発色させること。
（５）発色シグナルを測定してヘモグロビンＡ１ｃ量及びヘモグロビン量を算出すること。
【請求項８】
下記（１）から（４）を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、
試料と請求項１から５のいずれかに記載の試薬とを混合することを含む、測定方法。
（１）試料中のヘモグロビンを変性させること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンと糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼとの反応により過酸化水素を生成させること。
（３）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応によりロイコ型色素を発色させること。
（４）発色シグナルを測定してヘモグロビンＡ１ｃ量及びヘモグロビン量を算出すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、糖化蛋白質の測定に関し、より具体的には、ロイコ型色素の安定化を含む糖化蛋白質の測定に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中のグルコースと種々の蛋白質との反応産物である糖化蛋白質の濃度は、中長期にわたる血糖レベルの指標である。特に、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、グリコアルブミン、フルクトサミン等は臨床検査において頻繁に測定される物質であり、糖尿病の診断や、治療状態の監視に広く用いられている。β鎖Ｎ末端が糖化されたヘモグロビンであるＨｂＡ１ｃの全ヘモグロビンに対する比率ＨｂＡ１ｃ％は、血糖レベルの監視に用いられるほか、糖尿病の診断に関わる重要な検査項目である。
【０００３】
ＨｂＡ１ｃ％の測定は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、ボロン酸アフィニティ法、免疫比濁法、酵素法などにより行われる。その中で酵素法試薬は、最も安価にＨｂＡ１ｃ％を測定できる方法論として社会的に注目されている。
【０００４】
酵素法試薬を用いたＨｂＡ１ｃ％の測定の１例として、下記（１）〜（４）の工程を含む方法が挙げられる。
（１）ヘモグロビンを変性させ、吸光度法により定量する工程、
（２）プロテアーゼによりＨｂＡ１ｃの糖化されたＮ末端付近を加水分解する工程、
（３）酵素により、加水分解により生じた糖化されたＮ末端をもつオリゴペプチドを酸化して過酸化水素を生成する工程、
（４）過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応で発色基質であるロイコ型色素を発色させ、ＨｂＡ１ｃを吸光度法により定量する工程。
【０００５】
ＨｂＡ１ｃのような微量成分の測定には、高感度発色剤であるロイコ型色素：ＤＡ−６４やＤＡ−６７が用いられる。これらの発色剤は優れた感度を有する一方で酸素、光、水などに曝露することにより着色するという欠点も有している。特に、測定試薬が乾燥試薬ではなく溶液試薬である場合、こうした劣化は顕著である。この課題を解決するために、特許文献１−３において発色剤の酸化を防ぐ目的で発色剤溶液に還元剤を添加し安定化を図る技術が開示されている。また、特許文献４において界面活性剤の添加により発色剤の安定化を図る技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５２７４５９０号公報
【特許文献２】特許第３６０４１９８号公報
【特許文献３】特開２０１３−１０４００７号公報
【特許文献４】特許第５６１６４９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示は、一態様において、糖化蛋白質の酵素法測定に適し、ロイコ型色素を安定化できる化合物を含有する試薬、及びそれを用いた糖化蛋白質の測定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、一態様において、糖化蛋白質の酵素法による測定に使用する試薬であって、ロイコ型色素を含み、さらに、下記式（Ｉ）の化合物を含む試薬に関する（以下、「本開示に係る試薬」ともいう）。
【０００９】
【化１】
2019062891.tif 000002
式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数８−１７の炭化水素鎖を表す。
【００１０】
本開示は、他の一態様において、ペルオキシダーゼを含む試薬と、該試薬とは別の試薬として本開示に係る試薬とを備える、糖化蛋白質を酵素法により測定するためのキットに関する。
【００１１】
本開示は、他の一態様において、下記（１）から（５）を含むＨｂＡ１ｃの測定方法であって、試料と本開示に係る試薬とを混合することを含む測定方法に関する。
（１）試料中のヘモグロビンを変性させること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼと反応によりＮ末端糖化ペプチドを生成させること。
（３）Ｎ末端糖化ペプチドとフルクトシルペプチドオキシダーゼとの反応により過酸化水素を生成させること。
（４）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応によりロイコ型色素を発色させること。
（５）発色シグナルを測定してＨｂＡ１ｃ量及びヘモグロビン量を算出すること。
【００１２】
本開示は、他の一態様において、下記（１）から（４）を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、試料と本開示に係る試薬とを混合することを含む測定方法に関する。
（１）試料中のヘモグロビンを変性させること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンと糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼとの反応により過酸化水素を生成させること。
（３）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応によりロイコ型色素を発色させること。
（４）発色シグナルを測定してＨｂＡ１ｃ量及びヘモグロビン量を算出すること。
【発明の効果】
【００１３】
本開示によれば、ロイコ型色素の安定性が向上するから、糖化蛋白質の測定、例えば、ＨｂＡ１ｃの測定において、精度の低下を抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、テスト化合物の、加熱処理によるロイコ型色素の自然発色の抑制効果を評価したグラフである。
【図２】図２は、テスト化合物の加熱処理によるロイコ型色素の自然発色抑制効果の濃度依存性を評価したグラフである。
【図３】図３は、テスト化合物のヘモグロビン変性能を評価したグラフである。
【図４】図４は、テスト化合物のプロテアーゼ反応促進能を評価したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、糖化蛋白質の酵素法測定に用いるロイコ型色素の安定性が、所定の炭素数のアルキル基を有するスルホベタインの存在下で向上する、という知見に基づく。本開示によれば、試薬溶液中のロイコ型色素の安定性を向上できる。
【００１６】
本開示において、糖化蛋白質の測定とは、一実施形態において、糖化蛋白質量を測定することを含み、その他の一実施形態において、糖化蛋白質量及び蛋白質量を測定することを含み、さらにその他の一実施形態において、糖化蛋白質量及び蛋白質量を測定してそれらの比を求めることを含みうる。
【００１７】
本開示に係る測定方法において測定する糖化蛋白質は、フルクトサミン、糖化アルブミン、糖化ヘモグロビンなどが挙げられ、一実施形態において、糖化アルブミン又は糖化ヘモグロビンである。
糖化ヘモグロビンとしては、以下のものが挙げられる。
ＨｂＡ１ｃ：Ｈｂβ鎖Ｎ末端が糖化されたもの
ＧＨｂＬｙｓ：ＨｂのＬｙｓのアミノ基が糖化されたもの
ＧＨｂα：Ｈｂのα鎖Ｎ末端が糖化されたもの
【００１８】
［ロイコ型色素の安定化能を有する化合物］
本開示に係る試薬は、ロイコ型色素及び下記式（Ｉ）の化合物を含有する。下記式（Ｉ）の化合物は、ロイコ型色素を安定化することができる。よって、本開示に係る試薬は、一又は複数の実施形態において、下記式（Ｉ）の化合物を、ロイコ型色素を安定化するのに有効量、含有する。
【００１９】
【化２】
2019062891.tif 000003
式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数８−１７の炭化水素基を表す。
【００２０】
式（Ｉ）において、Ｒの炭素数は、糖化蛋白質の酵素法測定を阻害しない観点及びロイコ型色素の安定性向上の観点から、１２から１６が好ましく、１４がより好ましい。Ｒの炭化水素基は、同様の観点から、アルキル基が好ましく、直鎖アルキル基が好ましい。Ｒは、同様の観点から、ドデシル基及びテトラデシル基が好ましく、テトラデシル基がより好ましい。
【００２１】
本開示に係る試薬における式（Ｉ）の化合物の含有量は、糖化蛋白質の酵素法測定を阻害しない観点及びロイコ型色素の安定性向上の観点から、一又は複数の実施形態において、０．１ｇ／Ｌ以上が好ましく、１ｇ／Ｌ以上がより好ましく、５ｇ／Ｌ以上がさらに好ましく、１０ｇ／Ｌ以上がさらにより好ましく、２０ｇ／Ｌ以上がさらにより好ましい。また、式（Ｉ）の化合物の含有量は、例えば、５０ｇ／Ｌ以下、又は４０ｇ／Ｌ以下である。
【００２２】
［ロイコ型色素］
本開示におけるロイコ型色素としては、微量検出に使用できる高感度なものが好ましい。一又は複数の実施形態において、フェノチアジン系色素、トリフェニルメタン系色素、ジフェニルアミン系色素、ｏ−フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、ロイコ型色素の安定性向上の観点から、フェノチアジン系色素が好ましい。
フェノチアジン系色素としては、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩が挙げられ、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ−６７）が挙げられる。
トリフェニルメタン系色素としては、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン又はその塩が挙げられ、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン６ナトリウム（ＴＰＭＰＳ）が挙げられる。
ジフェニルアミン系色素としては、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４'−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン（ＤＡ−６４）が挙げられる。
【００２３】
本開示に係る試薬におけるロイコ型色素の含有量は、十分な測定感度の確保の観点から、一又は複数の実施形態において、０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上がより好ましく、０．０３ｍｍｏｌ／Ｌ以上がさらに好ましい。また、ロイコ型色素の含有量は、ロイコ型色素の安定性向上の観点から、２ｍｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましい。
【００２４】
本開示に係る試薬におけるロイコ型色素に対する式（Ｉ）の化合物の含有量比（モル比、式（Ｉ）の化合物の物質量／ロイコ型色素の物質量）は、十分な安定化効果を得る観点から、一又は複数の実施形態において、５以上が好ましく、５０以上がより好ましく、１０００以上がさらに好ましい。また、ロイコ型色素の含有量比は、十分な測定感度の確保の観点から、１００００以下が好ましく、５０００以下がより好ましい。
【００２５】
本開示に係る試薬は、溶液試薬の形態であってもよく、乾燥試薬の形態であってもよい。溶液試薬の場合、本開示に係る試薬ｐＨは、一又は複数の実施形態において、５以上が好ましく、６以上がより好ましい。本開示に係る試薬ｐＨは、一又は複数の実施形態において、９以下が好ましく、８以下がより好ましい。なお、ｐＨは、２５℃の温度でｐＨメータにて測定した値である。
【００２６】
本開示に係る試薬によれば、一又は複数の実施形態において、試薬の保存期間を長くできる。また、その他の一又は複数の実施形態において、感度変化を小さくすることで校正の回数を減らすことができる。さらにその他の一又は複数の実施形態において、試薬を高い温度（例えば、２〜５０℃）での保存も可能となる。
【００２７】
本開示に係る試薬を用いた糖化蛋白質の測定におけるロイコ型色素の発色シグナルからＨｂＡ１ｃ等の糖化蛋白質量やヘモグロビン等の蛋白質量の算出は、一又は複数の実施形態において、公知の方法により行うことができる。
【００２８】
［実施形態Ａ］
本開示に係る試薬は、限定されない実施形態Ａにおいて、下記（１）から（５）を含むＨｂＡ１ｃの測定方法において、試料に混合される試薬として使用されうる。
（１）試料中のヘモグロビンを変性させること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼと反応によりＮ末端糖化ペプチドを生成させること。
（３）Ｎ末端糖化ペプチドとフルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ）との反応により過酸化水素を生成させること。
（４）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）との反応によりロイコ型色素を発色させること。
（５）発色シグナルを測定してＨｂＡ１ｃ量及びヘモグロビン量を算出すること。
【００２９】
なお、本開示において、試薬の「試料との混合」とは、試料へ試薬を添加すること、及び、試薬へ試料を添加することを含む。
本開示に係る試薬は、本実施形態Ａの一又は複数の実施形態において、少なくとも、上記（４）のロイコ型色素を供給するために、試料に混合される。すなわち、上記（１）から（５）を含むＨｂＡ１ｃの測定方法におけるロイコ型色素は、本開示に係る試薬に含まれるものが使用される。本開示に係る試薬は、本実施形態Ａのその他の一又は複数の実施形態において、少なくとも、上記（４）においてロイコ型色素を発色させるために、試料に混合される。
【００３０】
実施形態Ａが２試薬系で行われる場合、一般的に、試料に、第１試薬及び第２試薬の２つの試薬がこの順で添加されるか、又は試料とこれらの試薬とが混合される。限定されない一又は複数の実施形態において、第１試薬の添加又は混合によって、上記（１）のヘモグロビンの変性が行われ、第１試薬の添加又は混合後かつ第２試薬の添加又は混合前にヘモグロビン量測定のための吸光度が測定される。第１試薬の組成によっては、第１試薬の添加によって上記（１）及び（２）が行われ、第２試薬が添加されるか又は第２試薬と混合されることで（１）から（４）すべてが進行する。よって、ＨｂＡ１ｃ量測定のための吸光度の測定は、第２試薬の添加又は混合直前又は直後と第２試薬の添加又は混合一定時間経過後に測定される。吸光度の変化値に基づきＨｂＡ１ｃ量が算出される。
【００３１】
限定されない一又は複数の実施形態において、本開示に係る試薬は下記構成Ａ１及びＡ２の第２試薬、下記構成Ａ３及びＡ４の第１試薬として使用されうる。但し、本開示に係る試薬は、これらの実施形態には限定されない。第１試薬及び第２試薬は、さらにその他の成分（例えば、さらなる緩衝剤、変性剤、又はロイコ型色素安定剤など）を含んでもよい。
構成Ａ１
第1試薬：ＦＰＯＸ、ＰＯＤ、変性剤、緩衝剤
第2試薬：プロテアーゼ、式（Ｉ）の化合物、ロイコ型色素、緩衝剤
構成Ａ２
第1試薬：プロテアーゼ、ＰＯＤ、変性剤、緩衝剤
第2試薬：ＦＰＯＸ、式（Ｉ）の化合物、ロイコ型色素、緩衝剤
構成Ａ３
第1試薬：ＦＰＯＸ、式（Ｉ）の化合物、ロイコ型色素、緩衝剤
第2試薬：プロテアーゼ、ＰＯＤ、緩衝剤
構成Ａ４
第1試薬：プロテアーゼ、式（Ｉ）の化合物、ロイコ型色素、緩衝剤
第2試薬：ＦＰＯＸ、ＰＯＤ、緩衝剤
【００３２】
したがって、本開示に係る試薬は、さらに、緩衝剤、プロテアーゼ、及びフルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ）の少なくとも１つを含みうる。
【００３３】
実施形態Ａにおける緩衝剤としては、中性付近に調整でき、反応系を損なわないものが使用できる。緩衝剤の限定されない例として、N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid（ＢＥＳ）、3-Morpholinopropanesulfonic acid（ＭＯＰＳ）、N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid （ＴＥＳ）、2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid（ＨＥＰＥＳ）、N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine（ＴＲＩＣＩＮＥ）、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)（ＰＩＰＥＳ）、Piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid) dehydrate（ＰＯＰＳＯ）、炭酸、リン酸、ホウ酸、グリシン、アラニン、ロイシン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、タウリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、プロリン、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、バリン、システイン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、オルニチン、トリプトファン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ジメチルアミノエタノール、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、Ｎ−メチルアミノエタノール、クレアチニン、イミダゾール、バルビタール、アンモニア、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等が挙げられる。
【００３４】
実施形態Ａにおけるプロテアーゼとしては、中性付近で活性をもち、糖化ヘモグロビンと反応してＮ末端糖化ペプチド（本開示において、糖化アミノ酸を含む）を生成できるものを使用できる。産生生物種や酵素ファミリーは特に限定されない。プロテアーゼの限定されない例として、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミックプロテアーゼ、アスパラティックプロテアーゼ、メタロプロテアーゼなどが挙げられる。エンドプロテアーゼよりエキソプロテアーゼの方が好ましい。
【００３５】
実施形態Ａにおけるフルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ）は、Ｎ末端糖化ペプチド（糖化アミノ酸を含む）を基質とし、検出可能な中間生成物である過酸化水素を産生するものを使用できる。産生生物種などは特に限定されない。アマドリアーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと呼ばれるものも使用でき、本開示において、ＦＰＯＸに含まれうる。
【００３６】
実施形態Ａにおけるペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）は、過酸化水素と反応して発色基質であるロイコ型色素を発色させるものを使用できる。産生生物種などは特に限定されない。限定されない例として、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼが挙げられる。
【００３７】
実施形態Ａにおける変性剤は、ヘモグロビンを変性でき、第１試薬に含まれる酵素の活性を大きく損なわないものを使用できる。変性剤の限定されない例として、下記（１）から（８）が挙げられる。なお、（１）〜（７）は亜硝酸塩と併用してもよい。
（１）３−ラウリルジメチルアミノ酪酸
（２）３−ミリスチルジメチルアミノ酪酸
（３）ラウリルジメチルアミノプロパンスルホン酸
（４）ミリスチルジメチルアミノプロパンスルホン酸
（５）ラウリルアミドプロピルジメチルアミノ酪酸
（６）ミリスタミドプロピルベタイン
（７）ｎ−ドデシル−βＤ−マルトシド
（８）ＷＳＴ−３
あるいは、実施形態Ａにおける変性剤は、上記（１）から（８）に替えて、式（Ｉ）の化合物であってもよい。式（Ｉ）の化合物は、ヘモグロビンを変性でき、また、プロテアーゼの反応を促進することができる。
【００３８】
実施形態Ａにおける測定対象試料は、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを含む試料が挙げられる。測定対象試料は、限定されない一又は複数の実施形態において、全血、血球等の赤血球を含む試料や、該試料を溶血させた試料が挙げられる。測定対象試料が赤血球を含む試料である場合、第１試薬で溶血してもよく、第１試薬とは別の手段で溶血させて溶血試料としてもよい。赤血球の溶血は既存の方法で実施できる。例えば、浸透圧を用いる方法（例、水）、界面活性剤を用いる方法、凍結する方法、超音波を用いる方法などがある。
【００３９】
本開示において発色シグナルとしては、一又は複数の実施形態において、吸光度、反射率及び透過率等が挙げられる。
【００４０】
ＨｂＡ１ｃ量の算出は、一又は複数の実施形態において、測定により得られた発色シグナルを、所定の換算要素に基づきＨｂＡ１ｃ量に換算することを含む。所定の換算要素に基づくＨｂＡ１ｃ量の換算は、一又は複数の実施形態において、測定により得られた吸光度等の発色シグナルを、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの換算ルールに基づいてＨｂＡ１ｃ量に換算することにより行うことができる。（ｉｖ）は、（ｉ）〜（ｉｉｉ）と組み合わせて行ってもよい。
（ｉ）試料中にある既知の検量物質に基づき検量線を求め、ＨｂＡ１ｃ由来の吸光度を検量線に基づきＨｂＡ１ｃ量に換算すること
（ｉｉ）ロイコ型色素を検量物質（校正用物質）とし、ロイコ型色素の検量線を求め、ロイコ型色素の吸光度を該ロイコ型色素の検量線に基づきＨｂＡ１ｃ量に換算すること
（ｉｉｉ）異なる波長で求めた吸光度比をとって、吸光度比に対する検量線に基づきＨｂＡ１ｃ量に換算すること
（ｉｖ）試料と試薬との混合直後及び混合から所定の時間経過後に測定した吸光度の差を取って吸光度変化量を求め、吸光度変化量に対する検量線に基づきＨｂＡ１ｃ量に換算すること
（ｉ）における既知の検量物質としては、一又は複数の実施形態において、既知量のＨｂＡ１ｃを含む校正用標準物質が挙げられる。既知量のＨｂＡ１ｃを含む校正用標準物質としては、一又は複数の実施形態において、全血又は血球の凍結品、それらを精製したＨｂＡ１ｃを含むＨｂ溶液、又はそれらに緩衝液組成物及びＨｂの安定剤等を含む物質等が挙げられる。既知の検量物質としては、一又は複数の実施形態において、公的機関が提供している一次標準物質又は常用標準物質、キットに付属している校正物質等が挙げられる。
（ｉｖ）における混合直後としては、一又は複数の実施形態において、試料と試薬との混合から５秒〜３０秒程度が挙げられる。所定の時間経過後としては、一又は複数の実施形態において、試料と試薬との混合から１分〜３分程度が挙げられる。
なお、上記形態では、発色シグナルが吸光度である場合の一例であって、吸光度以外の反射率及び透過率であっても同様に行うことができる。
【００４１】
［実施形態Ｂ］
本開示に係る試薬は、限定されない実施形態Ｂにおいて、下記（１）から（４）を含むＨｂＡ１ｃの測定方法において、試料に混合される試薬として使用されうる。
（１）試料中のヘモグロビンを変性させること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンと糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ（直接型ＦＰＯＸ）との反応により過酸化水素を生成させること。
（３）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応によりロイコ型色素を発色させること。
（４）発色シグナルを測定してＨｂＡ１ｃ量及びヘモグロビン量を算出すること。
【００４２】
本開示に係る試薬は、本実施形態Ｂの一又は複数の実施形態において、少なくとも、上記（３）のロイコ型色素を供給するために、試料に混合される。すなわち、上記（１）から（４）を含むＨｂＡ１ｃの測定方法におけるロイコ型色素は、本開示に係る試薬に含まれるものが使用される。本開示に係る試薬は、本実施形態Ｂのその他の一又は複数の実施形態において、少なくとも、上記（３）においてロイコ型色素を発色させるために、試料に混合される。
【００４３】
実施形態Ｂは、実施形態Ａにおけるフルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ）が糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ（直接型ＦＰＯＸ）となり、プロテアーゼが反応系に不要となった形態である。
【００４４】
限定されない一又は複数の実施形態において、本開示に係る試薬は下記構成Ｂ１及びＢ２の第２試薬、並びに下記構成Ｂ３及びＢ４の第１試薬として使用されうる。但し、本開示に係る試薬は、これらの実施形態には限定されない。第１試薬及び第２試薬は、さらにその他の成分を含んでもよい。
構成Ｂ１
第１試薬：ＰＯＤ、変性剤、緩衝剤
第２試薬：直接型ＦＰＯＸ、式（Ｉ）の化合物、ロイコ型色素、緩衝剤
構成Ｂ２
第１試薬：直接型ＦＰＯＸ、変性剤、緩衝剤
第２試薬：ＰＯＤ、式（Ｉ）の化合物、ロイコ型色素、緩衝剤
構成Ｂ３
第１試薬：ＰＯＤ、式（Ｉ）の化合物、ロイコ型色素、変性剤、緩衝剤
第２試薬：直接型ＦＰＯＸ、緩衝剤
構成Ｂ４
第１試薬：直接型ＦＰＯＸ、式（Ｉ）の化合物、ロイコ型色素、変性剤、緩衝剤
第２試薬：ＰＯＤ、緩衝剤
【００４５】
構成Ｂ１の場合、限定されない一又は複数の実施形態において、第１試薬の添加によって、上記（１）のヘモグロビンの変性が行われ、第１試薬の添加後かつ第２試薬の添加前にヘモグロビン量測定のための吸光度が測定される。第２試薬が添加されることで（２）及び（３）が進行する。よって、ＨｂＡ１ｃ量測定のための吸光度の測定は、第２試薬の添加直前又は直後と第２試薬の添加一定時間経過後に測定される。吸光度の変化値に基づきＨｂＡ１ｃ量が算出される。
【００４６】
したがって、本開示に係る試薬は、さらに、糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ（直接型ＦＰＯＸ）を含みうる。
【００４７】
実施形態Ｂにおける緩衝剤、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、変性剤、測定対象試料、発色シグナル及びＨｂＡ１ｃの算出方法は、実施形態Ａと同様である。
【００４８】
実施形態Ｂにおける糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ（直接型ＦＰＯＸ）は、改良されたＦＰＯＸであって、糖化ヘモグロビンに基質特異性を有する（糖化ヘモグロビンに直接作用する）ＦＰＯＸである（ＷＯ２０１５−００５２５７及びＷＯ２０１５−０６０４２９）。
【００４９】
［キット］
本開示は、その他の態様において、ペルオキシダーゼを含む試薬と、該試薬とは別の試薬として本開示に係る試薬とを備える、糖化蛋白質を酵素法により測定するためのキットに関する。
本開示に係るキットは、糖化蛋白質の酵素法測定用の２試薬系のキットであってもよく、３試薬系のキットであってもよい。２試薬系のキットの構成としては、限定されない一又は複数の実施形態において、上記構成Ａ１からＡ４、及びＢ１が挙げられる。
【００５０】
［測定方法］
本開示は、その他の態様において、下記（１）から（５）を含むＨｂＡ１ｃの測定方法であって、少なくとも下記（４）のロイコ型色素を供給するために、本開示に係る試薬を混合することを含む測定方法に関する。
（１）試料中のヘモグロビンを変性させること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼと反応によりＮ末端糖化ペプチドを生成させること。
（３）Ｎ末端糖化ペプチドとフルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ）との反応により過酸化水素を生成させること。
（４）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）との反応によりロイコ型色素を発色させること。
（５）発色シグナルを測定してＨｂＡ１ｃ量及びヘモグロビン量を算出すること。
【００５１】
本開示は、その他の態様において、下記（１）から（４）を含むＨｂＡ１ｃの測定方法であって、少なくとも下記（３）のロイコ型色素を供給するために、本開示に係る試薬を混合することを含む測定方法に関する。
（１）試料中のヘモグロビンを変性させること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンと糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ（直接型ＦＰＯＸ）との反応により過酸化水素を生成させること。
（３）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応によりロイコ型色素を発色させること。
（４）発色シグナルを測定してＨｂＡ１ｃ量及びヘモグロビン量を算出すること。
【００５２】
本開示に係る測定方法については、上記実施形態Ａ及びＢで説明したとおりである。
【００５３】
本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
〔１〕  酵素法による糖化蛋白質の測定に使用する試薬であって、
ロイコ型色素を含み、
さらに、下記式（Ｉ）の化合物を含む、試薬。
【化３】
2019062891.tif 000004
式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数８−１７の炭化水素鎖を表す。
〔２〕  糖化蛋白質が、糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである、〔１〕に記載の試薬。
〔３〕  糖化蛋白質が、ヘモグロビンＡ１ｃである、〔１〕又は〔２〕に記載の試薬。
〔４〕  前記試薬は、式（Ｉ）の化合物を、少なくとも、前記ロイコ型色素の安定化剤として含む、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の試薬。
〔５〕  前記ロイコ型色素が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４'−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、又はこれらの塩である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の試薬。
〔６〕  ペルオキシダーゼを含む試薬と、該試薬とは別の試薬として〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の試薬とを備える、糖化蛋白質を酵素法により測定するためのキット。
〔７〕  下記（１）から（５）を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、
試料と〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の試薬とを混合することを含む、測定方法。
（１）試料中のヘモグロビンを変性させること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼと反応によりＮ末端糖化ペプチドを生成させること。
（３）Ｎ末端糖化ペプチドとフルクトシルペプチドオキシダーゼとの反応により過酸化水素を生成させること。
（４）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応によりロイコ型色素を発色させること。
（５）吸光度を測定してヘモグロビンＡ１ｃ量及びヘモグロビン量を算出すること。
〔８〕  下記（１）から（４）を含むヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、
試料と〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の試薬とを混合することを含む、測定方法。
（１）試料中のヘモグロビンを変性させること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンと糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼとの反応により過酸化水素を生成させること。
（３）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応によりロイコ型色素を発色させること。
（４）吸光度を測定してヘモグロビンＡ１ｃ量及びヘモグロビン量を算出すること。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例で、下記化合物を使用した。
オクチルスルホベタイン（スルホベタインＣ８）：Ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（東京化成工業社製）
デシルスルホベタイン（スルホベタインＣ１０）：Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（東京化成工業社製）
ラウリルスルホベタイン（スルホベタインＣ１２）：Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（東京化成工業社製）
テトラデシルスルホベタイン（スルホベタインＣ１４）：Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（東京化成工業社製）
ヘキサデシルスルホベタイン（スルホベタインＣ１６）：Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（東京化成工業社製）
オクタデシルスルホベタイン（スルホベタインＣ１８）：Ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（東京化成工業社製）
ＤＡ−６７（ロイコ型色素）：１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（東京化成工業社製）
【００５５】
［ロイコ型色素の安定化評価１］
本実験は、ロイコ型色素の安定化に寄与するスルホベタインを確認するために行なった。１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＰＩＰＥＳバッファ（ｐＨ６．８）にロイコ型色素（ＤＡ−６７）を０．０４５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、この溶液２０ｍＬに表１に示す安定化剤を添加して試薬を調製し、調製した試薬を２５℃２４時間の加熱処理を行った。その後、生化学自動分析装置（ＪＣＡ−ＢＭ−６０１０、日本電子社製）を用いて、以下の測定パラメータにより精製水を検体として測定することにより試薬の着色量を測定した。２５℃２４時間の加熱処理前の試薬についても同様の着色量の測定を行い、加熱処理前と加熱処理後の着色量の差から加熱処理による、この吸光度の変化の大きさからロイコ型色素に対する安定化能力を評価した。その結果を、表１及び図１に示す。
＜第１試薬＞
ＰＩＰＥＳバッファ（ｐＨ６．４）
＜第２試薬＞
プロテアーゼ（商品名ＮＥＰ−２０９、東洋紡社製）：２Ｕ／ｍＬ
ＤＡ−６７：４５μｍｏｌ／Ｌ
表１に示すスルホベタイン：１ｇ／Ｌ
ＰＩＰＥＳバッファ（ｐＨ６．８）
試薬着色量の評価に用いた測定パラメータは以下の通りである。
測定主波長：６５８ｎｍ
測定副波長：６９４ｎｍ
検体（精製水）分注量：８μＬ
第１試薬分注量：９６μＬ
第２試薬分注量：２４μＬ
第１測光ポイント：１７−１９
第２測光ポイント：２１
【００５６】
【表１】
2019062891.tif 000005
【００５７】
図１及び表１に示すとおり、実施例１−５では、比較例１に比べて着色率が低減された。特に実施例３−５における着色率の低減が顕著であった。
【００５８】
［ロイコ型色素の安定化評価２］
本実験は、スルホベタインの濃度に依存してロイコ型色素の安定性が向上することを確認するため行なった。１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＰＩＰＥＳバッファ（ｐＨ６．８）にロイコ型色素（ＤＡ−６７）を０．０４５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、この溶液５ｍＬに表２に示す安定化剤を添加して試薬を調製し、調製した試薬を、２５℃２４時間の加熱処理を行った。その後、生化学自動分析装置（ＪＣＡ−ＢＭ−６０１０、日本電子社製）を用いて、以下の測定パラメータにより精製水を検体として測定することにより試薬の着色量を測定した。２５℃ ２４時間の加熱処理前の試薬についても同様の着色量の測定を行い、加熱処理前と加熱処理後の着色量の差から加熱処理による、この吸光度の変化の大きさからロイコ型色素に対する安定化能力を評価した。その結果を、表２及び図２に示す。
【００５９】
試薬着色量の評価に用いた測定パラメータは以下の通りである。
測定主波長：６５８ｎｍ
測定副波長：６９４ｎｍ
検体（精製水）分注量：８μＬ
第一試薬分注量：９６μＬ
第二試薬分注量：２４μＬ
第１測光ポイント：１７−１９
第２測光ポイント：２１
その結果を表２及び図２に示す。
【００６０】
【表２】
2019062891.tif 000006
【００６１】
図２及び表２に示す通り、スルホベタインＣ１２及びスルホベタインＣ１４の添加量が多いほど、ロイコ型色素に対して発色抑制を示した。すなわち、ロイコ型色素を安定化させた。
【００６２】
［ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の測定１］
本実験は、スルホベタインを添加した酵素試薬により、ＨｂＡ１ｃ％が高精度に測定可能であることを示すために行なった。糖尿病患者由来の血球検体（３７検体）を、市販の測定試薬、及び、実施例１３−２０の安定化剤を添加した試薬（下記第１試薬及び第２試薬）で測定し、測定値を相関分析することにより、これら実施例の臨床検査への実用可能性を評価した。結果を下記表３に示す。
なお、ヘモグロビン濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度は、異なる波長（測定主波長及び測定副波長）で求めた吸光度比をとって、吸光度比に対する検量線に基づき換算して求めた。
＜試料＞
糖尿病患者由来の血球検体（３７検体）
＜校正用試料＞
市販のＨｂＡ１ｃキャリブレータ（アークレイ社製）
＜第１試薬＞
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ：１５Ｕ／ｍＬ
フルクトシルペプチドオキシダーゼ（商品名ＦＰＯ−３０２、東洋紡社製）：３Ｕ／ｍＬ
第２試薬と同じスルホベタイン（各種）：３ｇ／Ｌ
ＰＩＰＥＳバッファ（ｐＨ６．４）
＜第２試薬＞
プロテアーゼ（商品名ＮＥＰ−２０９、東洋紡社製）：２Ｕ／ｍＬ
ＤＡ−６７：４５μｍｏｌ／Ｌ
スルホベタインＣ１２／Ｃ１４（下記表３の濃度）
ＰＩＰＥＳバッファ（ｐＨ６．８）
＜測定方法１：ヘモグロビン濃度＞
測定主波長：５９６ｎｍ
測定副波長：６９４ｎｍ
検体分注量：８μＬ
第１試薬分注量：９６μＬ
第２試薬分注量：２４μＬ
第１測光ポイント：１７―１９
＜測定方法２：ヘモグロビンＡ１ｃ濃度＞
測定主波長：６５８ｎｍ
測定副波長：６９４ｎｍ
検体分注量：８μＬ
第１試薬分注量：９６μＬ
第２試薬分注量：２４μＬ
第１測光ポイント：２１
第２測光ポイント：４０−４２
＜測定方法３：ＨｂＡ１ｃ値（ＮＧＳＰ）の算出＞
測定方法１と測定方法２により測定したヘモグロビン濃度をＣHb、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度をＣHbA1cとするとき、
ＨｂＡ１ｃ＝ＣHbA1c／ＣHb×０．９１５×１００＋２．１５
により算出した。
【００６３】
【表３】
2019062891.tif 000007
【００６４】
表３に示すとおり、同一の検体（３７検体）について、市販の測定キットによるＨｂＡ１ｃ値の測定値と、実施例１３−２０の安定化剤添加条件によるＨｂＡ１ｃ値の測定値との相関分析の結果は、良好な相関性を示した。
【００６５】
［ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の測定２］
本実験は、前記とは異なる構成の試薬でも、前記と同様の測定性能が得られることを示すために行った。その結果、下記の構成の試薬は、前記の構成の試薬と同等の性能であることが確かめられた。
＜校正用試料＞
市販のＨｂＡ１ｃキャリブレータ（アークレイ社製）
＜第１試薬＞
ＤＡ−６７：１０μｍｏｌ／Ｌ
プロテアーゼ（商品名ＮＥＰ−２０９、東洋紡社製）：８Ｕ／ｍＬ
スルホベタイン（Ｃ１２又はＣ１４）：３０ｇ／Ｌ
ＰＩＰＥＳバッファ（ｐＨ６．８）
＜第２試薬＞
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ：６０Ｕ／ｍＬ
フルクトシルペプチドオキシダーゼ（商品名ＦＰＯ−３０２、東洋紡社製）：１２Ｕ／ｍＬ
ＰＩＰＥＳバッファ（ｐＨ６．４）
＜測定方法１：ヘモグロビン濃度＞
測定主波長：５９６ｎｍ
測定副波長：６９４ｎｍ
検体分注量：８μＬ
第１試薬分注量：９６μＬ
第２試薬分注量：２４μＬ
第１測光ポイント：１７―１９
＜測定方法２：ヘモグロビンＡ１ｃ濃度＞
測定主波長：６５８ｎｍ
測定副波長：６９４ｎｍ
検体分注量：８μＬ
第１試薬分注量：９６μＬ
第２試薬分注量：２４μＬ
第１測光ポイント：２１
第２測光ポイント：４０−４２
＜測定方法３：ＨｂＡ１ｃ値（ＮＧＳＰ）の算出＞
測定方法１と測定方法２により測定したヘモグロビン濃度をＣHb、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度をＣHbA1cとするとき、
ＨｂＡ１ｃ＝ＣHbA1c／ＣHb×０．９１５×１００＋２．１５
により算出した。
【００６６】
［スルホベタインのヘモグロビン変性能及びプロテアーゼ反応促進能の評価］
ＨｂＡ１ｃ％を酵素法試薬で測定するためには、ヘモグロビンの精確な定量のために、また、プロテアーゼによる加水分解を促進するために、ヘモグロビンが適切に変性されることが好ましい。そこで、本実験は、スルホベタインＣ１２及びＣ１４について、下記条件でＨｂ変性能及びプロテアーゼ反応促進能を評価するために行なった。
＜ヘモグロビン変性能の評価方法＞
生化学自動分析装置（ＪＣＡ−ＢＭ−６０１０、日本電子社製）を用いて、検体分注後、第２試薬が分注されるまでの５分間のヘモグロビンの吸光度変化を観察した。測定結果を図３に示す。
＜測定パラメータ＞
測定主波長：５９６ｎｍ
測定副波長：６９４ｎｍ
検体分注量：８μＬ
第１試薬分注量：９６μＬ
第２試薬分注量：２４μＬ
＜試料＞
健常人全血を精製水により２３倍に希釈した検体
＜第１試薬＞
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ：１５Ｕ／ｍＬ
フルクトシルペプチドオキシダーゼ（商品名ＦＰＯ−３０２、東洋紡社製）：３Ｕ／ｍＬ
スルホベタイン（Ｃ１２または１４）：３ｇ／Ｌ
ＰＩＰＥＳバッファ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．４）
＜第２試薬＞
プロテアーゼ（商品名ＮＥＰ−２０９、東洋紡社製）：２Ｕ／ｍＬ
ＤＡ−６７：４５μｍｏｌ／Ｌ
第１試薬と同じスルホベタイン：３ｇ／Ｌ
ＰＩＰＥＳバッファ：１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８）
＜プロテアーゼ反応促進能の評価方法＞
生化学自動分析装置（ＪＣＡ−ＢＭ−６０１０、日本電子社製）と、プロテアーゼ律速であるような測定試薬を用いて、検体分注後、第二試薬が分注されるまでの発色試薬由来の吸光度変化を観察した。測定結果を図４に示す。
＜測定パラメータ＞
測定主波長：６５８ｎｍ
測定副波長：６９４ｎｍ
検体分注量：８μＬ
第１試薬分注量：９６μＬ
第２試薬分注量：２４ μＬ
＜試料＞
健常人全血を精製水により２３倍に希釈した検体
＜第１試薬＞
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ：１５Ｕ／ｍＬ
フルクトシルペプチドオキシダーゼ（商品名ＦＰＯ−３０２、東洋紡社製）：３Ｕ／ｍＬ
スルホベタイン（Ｃ１２／Ｃ１４）：３ｇ／Ｌ
ＰＩＰＥＳバッファ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．４）
＜第２試薬＞
プロテアーゼ（商品名ＮＥＰ−２０９、東洋紡社製）：２Ｕ／ｍＬ
ＤＡ−６７：４５μｍｏｌ／Ｌ
第１試薬と同じスルホベタイン：３ｇ／Ｌ
ＰＩＰＥＳバッファ：１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８）
【００６７】
図３及び図４に示すとおり、スルホベタインＣ１２とＣ１４はＨｂ変性能及びプロテアーゼ反応促進能を有することが示された。
【図１】
2019062891.tif 000010
【図２】
2019062891.tif 000011
【図３】
2019062891.tif 000012
【図４】
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