(57)【要約】【課題】新たな死菌化微生物の製造方法を提供する。【解決手段】生存する微生物を含む菌体液に、アクリルアミド又はメタクリルアミドの少なくとも一方を混合して混合物を得る工程を含み、１）前記混合物のアクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、２）前記混合物のメタクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下、又は、３）前記混合物のアクリルアミドとメタクリルアミドとの合計の濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、かつ、メタクリルアミドの濃度が２０ｗｔ％以下、である死菌化微生物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生存する微生物を含む菌体液に、アクリルアミド又はメタクリルアミドの少なくとも一方を混合して混合物を得る工程を含み、
１）前記混合物のアクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、
２）前記混合物のメタクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下、又は
３）前記混合物のアクリルアミドとメタクリルアミドとの合計の濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、かつ、メタクリルアミドの濃度が２０ｗｔ％以下、
である死菌化微生物の製造方法。
【請求項２】
前記混合物において、アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドが重合によってゲル化していない状態で、前記混合物を１時間以上インキュベートする工程を含む、請求項１に記載の死菌化微生物の製造方法。
【請求項３】
前記菌体液に、前記アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドを混合した後に、混合物を凍結する工程を含む、請求項１又は請求項２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項４】
前記微生物がニトリルヒドラターゼを産生する微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記微生物が、シュードノカルディア・サーモフィラ、又はニトリルヒドラターゼ活性を有する遺伝子組換え大腸菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記菌体液又は混合物を５０℃以上で加熱する工程を含まない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記菌体液に前記アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドを混合する前に、微生物を含む菌体液を培養する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
生存する微生物を含む菌体液に、アクリルアミド又はメタクリルアミドの少なくとも一方を混合して混合物を得る工程を含み、
１）前記混合物のアクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、
２）前記混合物のメタクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下、又は
３）前記混合物のアクリルアミドとメタクリルアミドとの合計の濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、かつ、メタクリルアミドの濃度が２０ｗｔ％以下、
である微生物を死菌化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、死菌化微生物の製造方法及び微生物を死菌化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物が有する酵素活性は種々の化合物の製造に利用されている。微生物が有する酵素活性を維持しつつ、微生物を死菌化して触媒として利用する方法は、製造において簡便に利用できる方法の一つである。最も初期に行われた方法は、微生物を加熱して死菌化する方法であるが、加熱によって酵素活性が十分に維持できないという課題が存在した。
この課題を解決するために、微生物の酵素活性の失活を抑制しつつ死菌化する方法について種々の方法が報告されており、例えば、特定のｐＨに調整してから加熱する方法（特許文献１）や、アルコールやアセトンを使用して死菌化を行う方法（特許文献２）が報告されている。
【０００３】
死菌化微生物が維持している酵素活性を利用して工業生産されている化合物として、アミド化合物が挙げられる。アミド化合物の製造には、ニトリルヒドラターゼの活性値の高められた変異体等の微生物が使用されているが、これら菌体は死菌化されてから、使用又は保存等される。
ニトリルヒドラターゼは、種々の化合物のニトリル基を水和によりアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であり、酵素反応を利用した工業的なアミド化合物の製造プロセスにおいて利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１６１１０８号
【特許文献２】特開２００２−３５５０２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、加熱による死菌化は、酵素活性が低下するリスクが高く、また活性が低下しないように特許文献１のようにｐＨを調整したり、糖質を添加したりすると、工程数が多くなったり、添加した糖質が不純物となる場合がある。また、特許文献２のように有機溶媒を使用する方法は、後工程で不純物となり不都合を生じる場合がある。このように、新たな死菌化微生物の製造方法の開発が望まれていた。
【０００６】
そこで、本開示は、加熱処理や有機溶媒による処理によって死菌化をするのではない死菌化微生物の製造方法及び微生物を死菌化する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、以下の態様を含む。
＜１＞  生存する微生物を含む菌体液に、アクリルアミド又はメタクリルアミドの少なくとも一方を混合して混合物を得る工程を含み、
１）前記混合物のアクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、
２）前記混合物のメタクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下、又は
３）前記混合物のアクリルアミドとメタクリルアミドとの合計の濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、かつ、メタクリルアミドの濃度が２０ｗｔ％以下、
である死菌化微生物の製造方法。
＜２＞  前記混合物において、アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドが重合によってゲル化していない状態で、前記混合物を１時間以上インキュベートする工程を含む、＜１＞に記載の死菌化微生物の製造方法。
＜３＞  前記菌体液に、前記アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドを混合した後に、混合物を凍結する工程を含む、＜１＞又は＜２＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜４＞  前記微生物がニトリルヒドラターゼを産生する微生物である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜５＞  前記微生物が、シュードノカルディア・サーモフィラ、又はニトリルヒドラターゼ活性を有する遺伝子組換え大腸菌である、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜６＞  前記菌体液又は混合物を５０℃以上で加熱する工程を含まない、＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜７＞  前記菌体液に前記アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドを混合する前に、微生物を含む菌体液を培養する工程をさらに含む、＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜８＞  生存する微生物を含む菌体液に、アクリルアミド又はメタクリルアミドの少なくとも一方を混合して混合物を得る工程を含み、
１）前記混合物のアクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、
２）前記混合物のメタクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下、又は
３）前記混合物のアクリルアミドとメタクリルアミドとの合計の濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、かつ、メタクリルアミドの濃度が２０ｗｔ％以下、
である微生物を死菌化する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本開示は、新たな死菌化微生物の製造方法及び微生物を死菌化する方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、生存する微生物を含む菌体液に、アクリルアミド又はメタクリルアミドの少なくとも一方を混合して混合物を得る工程を含み、
１）前記混合物のアクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、
２）前記混合物のメタクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下、又は、
３）前記混合物のアクリルアミドとメタクリルアミドとの合計の濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、かつ、メタクリルアミドの濃度が２０ｗｔ％以下、
である、死菌化微生物の製造方法及び微生物を死菌化する方法を提供する。
【００１０】
本開示において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても当該工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本開示において、記載される各要素は、その数について特に明記されない限りは、一つ存在しても、複数存在しても構わない。
本開示において、「ｗｔ％」は重量％を意味し、組成物中の各成分の量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００１１】
＜生存する微生物を含む菌体液＞
本開示において、生存する微生物を含む菌体液は、生存している微生物と液体とを含んでいればよく、特に限定はされない。
生存している微生物を含む菌体液は、例えば、微生物を培養して得られた培養物でもよいし、培養物から遠心分離などの適当な方法で微生物を分離し、培地や緩衝液などに再懸濁したものでもよい。
液体としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地などの微生物用の培地、各種緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝）を例示することができる。微生物用の培地は、死菌化の対象とする微生物の種類によって適宜選択することができる。
【００１２】
生存する微生物を含む菌体液に含まれる微生物は特に限定はされず、死菌化微生物の使用目的に応じて死菌化の対象とする微生物を選択すればよい。例えば、化合物を製造するための触媒として利用可能な酵素を産生する微生物を、製造する化合物または製造方法に応じて選択すればよい。
例えば、アミド化合物を製造する目的では、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物を選択することが好ましい。ニトリルヒドラターゼを産生する微生物を、ニトリルヒドラターゼ活性を維持しつつ死菌化し、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換する反応の触媒として利用することができる。
微生物は１種類を含んでもよいし、２種類以上の微生物を含んでいてもよい。複数の種類の微生物を含む場合、微生物が有する酵素は同じでもよいし異なっていてもよい。あるいは、１種類の微生物が２種類以上の酵素を含んでいてもよい。
【００１３】
生存している微生物を含む菌体液における生菌の濃度は特に限定されないが、１０５ｃｆｕ／ｍＬ〜１０１５ｃｆｕ／ｍＬの範囲とすればよく、好ましくは１０６ｃｆｕ／ｍＬ〜１０１４ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは１０７ｃｆｕ／ｍＬ〜１０１３ｃｆｕ／ｍＬ、特に好ましくは１０８ｃｆｕ／ｍＬ〜１０１２ｃｆｕ／ｍＬ、最も好ましくは１０９ｃｆｕ／ｍＬ〜１０１１ｃｆｕ／ｍＬの範囲とすればよい。
生菌の濃度は、対照とする微生物の種類に応じて通常の方法で測定可能である。例えば、一定量の試料を希釈し、寒天培地等に塗布し、発育したコロニー数を数える方法によって測定することができる。
【００１４】
本開示の死菌化微生物の製造方法に特に好適な微生物として、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物を挙げることができる。ニトリルヒドラターゼはニトリルを水和してアミドへ変換する酵素であり、アクリルアミドやニコチンアミドの工業生産に利用されている。
本開示におけるニトリルヒドラターゼ生産微生物は、ニトリルヒドラターゼを生産する能力を有する微生物である。ニトリルヒドラターゼ生産微生物は、天然の微生物であってもよく、その例としては、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、サーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属、バイテリジューム（Bacteridium）属、又はブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物が挙げられる。
【００１５】
あるいは、ニトリルヒドラターゼ生産微生物は、外来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を有する宿主微生物（以下、「ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物」）であってもよい。外来のニトリルヒドラターゼ遺伝子は、天然生物、例えば天然微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子であってもよく、又はこうした天然生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子に対してヌクレオチド配列の改変を加えた改変ニトリルヒドラターゼ遺伝子であってもよい。ニトリルヒドラターゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主微生物内に導入することにより、ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物を得ることができる。
【００１６】
ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物の宿主微生物としては、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるものではなく、枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も挙げられる。ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物の例として、シュードノカルディア・サーモフィラのニトリルヒドラターゼ遺伝子を大腸菌に導入したＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現  茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター  中央第６  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。
【００１７】
ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物としては、高活性、高安定性のニトリルヒドラターゼを有するという点で、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物（例えばシュードノカルディア・サーモフィラ）、シュードノカルディア属微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主微生物で高発現させた組換え微生物（形質転換体）、およびシュードノカルディア属微生物のニトリルヒドラターゼを改変した改変ニトリルヒドラターゼを発現させた組換え微生物が好ましい。これらの組換え微生物は、ニトリルヒドラターゼの安定性をより高め、菌体当たりの活性をより高める観点から好ましい。
【００１８】
また、微生物内にニトリルヒドラターゼを高発現できる、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ−１、該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で高発現させた組換え微生物も同様に好ましい。
ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物が、シュードノカルディア・サーモフィラ、又はニトリルヒドラターゼ生産能を有する組換え大腸菌であることも、また好ましい。
【００１９】
＜死菌化処理工程＞
本開示において「死菌化」は、生存している微生物を死菌とすることをいう。本開示における死菌化は、生存している微生物を含む菌体液に、アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドを混合することによって、死菌化前の菌体液に含まれていた目的とする微生物の生菌数に対して、死菌化後の生菌数が１％以下、特に好ましくは０．１％以下、最も好ましくは０％である状態を達成することをいう。
【００２０】
死菌化処理工程においては、生存する微生物を含む菌体液に、アクリルアミド又はメタクリルアミドの少なくとも一方を混合して混合物を得る。前記混合物において、１）混合物のアクリルアミド濃度は０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下であるか、２）混合物のメタクリルアミド濃度は０．５ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下であるか、又は、３）混合物のアクリルアミドとメタクリルアミドとの合計の濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下（但し、メタクリルアミドの濃度が２０ｗｔ％以下）である。
【００２１】
混合物中のアクリルアミド及び／又はメタクリルアミドの濃度を０．５ｗｔ％以上とすることによって、微生物を殺傷し死菌化することができる。混合物中のアクリルアミド若しくはメタクリルアミドの濃度、又はアクリルアミド若しくはメタクリルアミドの合計の濃度を、１．０ｗｔ％以上、１．５ｗｔ％以上、２．０ｗｔ％以上、２．５ｗｔ％以上、３．０ｗｔ％以上、３．５ｗｔ％以上、４．０％以上、４．５％以上、５．０％以上、５．５％以上、６．０％以上、６．５％以上、７．０％以上、７．５％以上、８．０％以上、８．５％以上、９．０％以上、９．５％以上、１０．０％以上、１０．５％以上、１１．０％以上、１１．５％以上、１２．０％以上、１２．５％以上、又は１３．０％以上とすることによって、より短時間に効率良く死菌化を達成することができる。アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドの濃度は、製造スケジュール及び製造コスト等を考慮して適宜選択すればよい。
【００２２】
混合物中のアクリルアミド及び／又はメタクリルアミドの濃度の上限は特にないが、製造コストの観点から、混合物のアクリルアミドの濃度は、２ｗｔ％〜４０ｗｔ％であることが好ましく、３ｗｔ〜３０ｗｔ％であることがさらに好ましく、４ｗｔ〜２０ｗｔ％であることが特に好ましく、４ｗｔ〜１５ｗｔ％であることが最も好ましい。
混合物のメタクリルアミドの濃度は、２ｗｔ％〜２０ｗｔ％であることが好ましく、３ｗｔ〜１５ｗｔ％であることがさらに好ましく、４ｗｔ〜１５ｗｔ％であることが特に好ましい。
アクリルアミドとメタクリルアミドとの両方を用いる場合には、アクリルアミド及びメタクリルアミドを合計して濃度を計算し、合計された濃度の好ましい範囲はアクリルアミドを用いた場合の好ましい濃度範囲と同様であるが、メタクリルアミドの濃度の上限は２０ｗｔ％である。
【００２３】
生存している微生物を含む菌体液に、アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドを混合する方法は特に限定されない。例えば、微生物を含む液体に、予め所定の濃度に調製したアクリルアミド及び／又はメタクリルアミドの溶液を加えればよい。当業者は、微生物を含む液体に、アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドを混合して所望のアクリルアミド及び／又はメタクリルアミド濃度の混合物を容易に得ることができる。
【００２４】
混合を行う際の生存する微生物を含む菌体液及び／又は混合を行う環境の温度は特に限定はされないが、酵素活性を維持する観点から、５０℃以上としないことが好ましい。
混合は、例えば、室温で混合してもよいし、１０℃〜４５℃、１５℃〜４２℃、１８℃〜４２℃、２０℃〜４０℃で行ってもよい。菌体液の温度についても同様である。
【００２５】
本開示の死菌化微生物の製造方法において、製造された死菌における目的の酵素の活性は、死菌化を行う前の酵素活性を１００％としたときの７０％以上が保持されることが好ましく、８０％以上保持されることがさらに好ましく、９０％以上保持されることが特に好ましい。
酵素活性の測定は、対象の酵素に応じて公知の方法で行えばよい。
例えば、酵素がニトリルヒドラターゼである場合には、死菌化を行う前のニトリルヒドラターゼ活性を１００％としたときの７０％以上のニトリルヒドラターゼが保持されることが好ましく、８０％以上保持されることがさらに好ましく、９０％以上保持されることが特に好ましい。ニトリルヒドラターゼの活性は、国際公開第２００７／０４０２６７号の実施例１に記載の方法に従って測定することができる。
【００２６】
本開示の死菌化微生物の製造方法においては、生存している微生物を含む菌体液にアクリルアミド及び／又はメタクリルアミドを混合して得られる混合物において、アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドは重合によってゲル化していないことが好ましい。
アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドは、モノマーである場合に効率よく生菌を死菌とする高い殺菌効果を有している。アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドがポリマーである場合には、殺菌効果は低下する。あるいは、アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドが部分的にポリマーである場合でも、モノマーの残存率が低い場合には殺菌効果が発揮され難いと考えられる。
アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドの重合を抑制する観点から、前記混合物はビスアクリルアミド又はアクリルアミド及び／又はメタクリルアミドの重合を促進する重合開始剤若しくは重合促進剤を含まないことが好ましい。
【００２７】
ビスアクリルアミドとしては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス アクリルアミドが挙げられ、アクリルアミドの重合を促進する重合開始剤又は重合促進剤としては、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’− テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を挙げることができる。
【００２８】
死菌化処理工程においては、混合物をインキュベートしてもよい。インキュベート時間は製造のスケジュールに応じて設定すればよく、特に限定はされない。例えば、１分以上、３分以上、５分以上、１０分以上、１５分以上、２０分以上、３０分以上、４５分以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、又は１２時間以上インキュベートしてもよい。
インキュベートの時間の上限を設けることを必要とはしないが、製造時間の短縮の観点から、死菌化が達成された時点で中止すればよい。また、製造スケジュールの柔軟性を高める観点からは死菌化処理工程の時間が長いことも好ましい。例えば、インキュベート時間２４時間以下、４８時間以下、７２時間以下、９６時間以下である。
【００２９】
混合物のインキュベートの温度は、限定はされないが、１０℃〜４５℃とすることが好ましく、１５℃〜４２℃がさらに好ましく、１８℃〜４２℃が特に好ましく、２０℃〜４０℃であることが最も好ましい。酵素活性を維持する観点から、インキュベートは５０℃以上としないことが好ましい。
インキュベートにおいて、混合物は静置してもよいし、振盪又は撹拌を行ってもよく、もしくは静置、振盪および撹拌を組み合わせて行ってもよい。
【００３０】
＜他の工程＞
本開示に係る死菌化微生物の製造方法は、生存する微生物を含む菌体液に、アクリルアミド又はメタクリルアミドの少なくとも一方を混合して混合物を得で、１）混合物のアクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下であるか、２）混合物のメタクリルアミド濃度が０．５ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下であるか、又は３）アクリルアミドとメタクリルアミドとの合計の濃度が０．５ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下であって、かつメタクリルアミドの濃度が２０ｗｔ％以下である、死菌化処理工程に加えて、１つ又は複数の他の工程を含んでいてもよい。本開示に係る死菌化微生物の製造方法が含んでいてもよい他の工程の例を以下に記載するが、これらに限定することを意図するものではない。
【００３１】
＜培養工程＞
本開示の死菌化微生物の製造方法は、生存する微生物を含む菌体液を調製する培養工程を含んでいてもよい。
微生物を、分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法で培養することにより、所望の量の微生物を調製することができる。培地は微生物の種類によって適宜選択すればよく、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地等の通常の液体培地に、微生物を植菌した後、適当な培養温度で適当な時間培養することにより微生物を増殖させることができる。
微生物の増殖性を良好に維持するために、培養工程においては、培地がアクリルアミド及び／又はメタクリルアミドを含まず、アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドは培養工程の後に混合されることが好ましい。
【００３２】
例えば、ニトリルヒドラターゼを産生する遺伝子組換え大腸菌の場合、ＬＢ培地又はＭ９培地等の大腸菌の培養に利用される培地を用いて２０℃〜４０℃で３時間〜７２時間培養することによって微生物を増殖させることができる。また、遺伝子組換え大腸菌の一般的な培養条件を適用することができる。
【００３３】
本開示の死菌化微生物の製造方法が培養工程を含む場合、培養工程は死菌化処理工程の前に行われる。
【００３４】
＜凍結工程＞
本開示の死菌化微生物の製造方法においては、目的とする酵素を含む、死菌化処理工程後の混合物を凍結する凍結工程を含んでいてもよい。
凍結工程を行うことによって、目的とする酵素の活性をより安定的に維持することができる。
前記混合物は、そのまま凍結してもよいし、濾過などの公知の手段によって濃縮後に凍結してもよい。あるいは、バイオリアクターとして使用するための容器に充填した状態で凍結してもよい。
凍結は一般的な温度範囲で行えばよい。例えば、−８０℃〜０℃で凍結を行えばよく、さらに好ましくは−８０℃〜−２０℃の範囲で凍結を行えばよい。
【００３５】
＜集菌工程＞
本開示の死菌化微生物の製造方法においては、培養工程後の生菌、又は、死菌化処理後の死菌化微生物を集菌する工程を含んでいてもよい。集菌は、遠心分離又は濾過などの通常用いられる方法で行うことができる。
集菌工程において集菌された菌体は、そのまま後工程に供してもよいし、適当な培地又は緩衝液に再懸濁して後工程に供してもよい。
【００３６】
＜保存＞
死菌化処理工程後の混合物は、アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドを含有した状態で保存を行えば、雑菌による汚染を抑制することができる。また、死菌化処理工程後の混合物を保存する場合には、一般的には凍結して保存するが、アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドを含有した状態で保存を行うことによって、凍結することなく目的の酵素活性を維持した状態で１４日程度の間保存をすることが可能である。混合物を１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日以上凍結することなく保存できることは、製造スケジュールの柔軟性および製造工程の簡略化の観点から好ましいことである。
【００３７】
死菌化処理工程後の混合物は、そのまま凍結してもよいし、遠心分離もしくは濾過などの公知の手段によって濃縮後に凍結してもよい。あるいは、バイオリアクターとして使用するための容器に充填した状態で保存してもよい。
保存温度は、０℃〜３０℃が好ましく、３℃〜２５℃がさらに好ましく、４℃〜２０℃が特に好ましい。
【００３８】
保存を行った場合に、目的の酵素の活性は、保存前の酵素活性を１００％としたときの７０％以上保持されることが好ましく、８０％以上保持されることがさらに好ましく、９０％以上保持されることが特に好ましい。
酵素活性の測定は、対象の酵素に応じて公知の方法で行えばよい。
例えば、酵素がニトリルヒドラターゼである場合には、保存前のニトリルヒドラターゼ活性を１００％としたときの７０％以上のニトリルヒドラターゼが保持されることが好ましく、８０％以上保持されることがさらに好ましく、９０％以上保持されることが特に好ましい。
【実施例】
【００３９】
＜ニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒の調製＞
特開２００１−３４００９１号の実施例１に記載された方法に従い、特開平０９−２７５９７８で得られたｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし、特開平０９−２７５９７８の表３にＮｏ．３クローンとして示されるニトリルヒドラターゼ生産微生物を取得した。このクローンＮｏ．３は、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を改変して発現するニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から６番目のＬｅｕをＡｌａに置換した遺伝子（ヌクレオチド上のコドンの変化はＣＴＧからＧＴＧへの変化）を、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換した形質転換体である。ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドを保有する大腸菌は、ＭＴ−１０８２２株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５）として、前述のとおり特許生物寄託センターに寄託されている。
【００４０】
＜実施例１＞
５００ｍＬのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍＬを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した後、上記のＮｏ．３クローン菌体を一白金耳で植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間振盪培養した。
【００４１】
培地組成  酵母エキストラクト        ５．０  ｇ／Ｌ
ポリペプトン              １０．０  ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                  ５．０  ｇ／Ｌ
塩化コバルト・六水和物    １０．０ｍｇ／Ｌ
硫酸第二鉄・七水和物      ４０．０ｍｇ／Ｌ
ｐＨ７．５
【００４２】
培養後の培養液について、同様の組成の微生物を含まない培地により菌濃度が１０１０ｃｆｕ／ｍＬとなるように調製した後、最終濃度として４ｗｔ％となるようにアクリルアミドを混合した。添加後、２．０ｍＬセイフロックチューブに培養液を１．０ｍＬ分注し、２０℃で７２時間インキュベートした。インキュベート後、微生物を生理食塩水で２回洗浄を行い、１．０ｍＬの生理食塩水に懸濁した。懸濁液をコロニー数が１００個以下となるように適宜希釈し、その０．１ｍＬを寒天培地に塗布した。塗布後、３７℃で２４時間インキュベートした後、コロニー数を計測し、生菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）を算出した。
【００４３】
＜実施例２＞
１０１０ｃｆｕ／ｍＬの培養液に、アクリルアミド濃度が最終濃度として８ｗｔ％となるようにアクリルアミドを混合したこと以外は、実施例１と同様の処理を行った。
【００４４】
＜実施例３＞
１０１０ｃｆｕ／ｍＬの培養液に対して、メタクリルアミド濃度が最終濃度として８ｗｔ％となるようにメタクリルアミドを混合し、２０℃で９６時間インキュベートしたこと以外は、実施例１と同様の処理を行った。
【００４５】
＜比較例１＞
１０１０ｃｆｕ／ｍＬの培養液に対して、アクリルアミド濃度が最終濃度として０．１ｗｔ％となるようにアクリルアミドを混合したこと以外は、実施例１と同様の処理を行った。
【００４６】
＜比較例２＞
１０１０ｃｆｕ／ｍＬの培養液に対して、メタクリルアミド濃度が最終濃度として０．１ｗｔ％となるようにメタクリルアミドを混合したこと以外は、実施例３と同様の処理を行った。
【００４７】
＜生菌数の確認結果１＞
実施例１〜３および比較例１、２の生菌数の測定結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
2019176834.tif 000002
【００４９】
表１の結果より、アクリルアミド及び／又はメタクリルアミドは所定量を混合することで微生物を死菌化できることがわかった。
【００５０】
＜実施例４＞
アクリルアミドを混合した後のインキュベートを３時間行ったこと以外は、実施例１と同様の処理を行った。
【００５１】
＜実施例５＞
アクリルアミドの添加後のインキュベートを６時間行ったこと以外は、実施例１と同様の処理を行った。
【００５２】
＜実施例６＞
アクリルアミドの添加後のインキュベートを２４時間行ったこと以外は、実施例１と同様の処理を行った。
【００５３】
＜実施例７＞
アクリルアミドの添加後のインキュベートを３０℃で行ったこと以外は、実施例４と同様の処理を行った。
【００５４】
＜実施例８＞
アクリルアミドの添加後のインキュベートを３０℃で行ったこと以外は、実施例５と同様の処理を行った。
【００５５】
＜実施例９＞
アクリルアミドの添加後のインキュベートを３０℃で行ったこと以外は、実施例６と同様の処理を行った。
【００５６】
＜実施例１０＞
アクリルアミドの添加後のインキュベートを４０℃で行ったこと以外は、実施例４と同様の処理を行った。
【００５７】
＜実施例１１＞
アクリルアミドの添加後のインキュベートを４０℃で行ったこと以外は、実施例５と同様の処理を行った。
【００５８】
＜実施例１２＞
アクリルアミドの添加後のインキュベートを４０℃で行ったこと以外は、実施例６と同様の処理を行った。
【００５９】
＜生菌数の確認結果２＞
実施例４〜１１の生菌数の測定結果を表２に示す。
【００６０】
【表２】
2019176834.tif 000003
【００６１】
表２に示すように、２０〜４０℃で３〜２４時間、アクリルアミド濃度が８ｗｔ％となるようにして処理を行った場合、いずれの条件でも死菌化可能であることがわかった。
【００６２】
＜実施例１３＞
実施例１と同様の手法で１０１０ｃｆｕ／ｍＬの培養液を調製し、該培養液に対して、最終濃度として８ｗｔ％となるようにアクリルアミドを混合した。混合後、２．０ｍＬセイフロックチューブに培養液を分注し、３０℃、１２０ｒｐｍの条件で２４時間インキュベートした。インキュベート後、実施例１と同様の手法で寒天培地に培養し、微生物を生理食塩水で２回洗浄を行った後、寒天培地に塗布した。塗布後、３７℃で２４時間計測した後、コロニー数を計測した。また、インキュベート直前の培養液（分注直後）と２４時間のインキュベート後の培養液に対して、下記の反応条件でニトリルヒドラターゼ活性を確認した。また、ＷＯ２００７／０４０２６７の実施例１に記載の方法に従い、活性測定を行った。
【００６３】
具体的には、アクリルアミド又はメタクリルアミドを添加した直後の混合液又はインキュベート終了直後の混合液１００ｍｇを純水で１０ｇに希釈し、この希釈液１ｇをさらに５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．１）で１０ｇに希釈した。次いでアクリロニトリル３．２ｍＬを添加して２０℃に維持しながら１５分間反応を行った。１０ｍＭリン酸水溶液を８０ｇ添加して反応を停止し、ＨＰＬＣ分析により反応液中のアクリルアミド濃度を測定した。ＨＰＬＣ分析におけるカラムとして、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ（１５０×６φｍｍ）を使用し、３％アセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸水溶液を移動層とした。アクリルアミドおよびアクリロニトリルは２１０ｎｍの吸光度により検出し、濃度を測定した。次に該懸濁液の乾燥菌体重量濃度を求め、単位乾燥菌体重量当たりのアクリルアミド生成量を算出した。
アクリルアミド又はメタクリルアミドを添加した直後の混合液の単位乾燥菌体重量当たりのアクリルアミド生成量を酵素活性１００％として、インキュベート終了直後の単位乾燥菌体重量当たりのアクリルアミド生成量と比較した。
【００６４】
＜実施例１４＞
１０１０ｃｆｕ／ｍＬの培養液に対して、アクリルアミド濃度が最終濃度として１０ｗｔ％となるようにアクリルアミドを添加したこと以外は、実施例１３と同様の処理を行った。
【００６５】
＜実施例１５＞
１０１０ｃｆｕ／ｍＬの培養液に対して、アクリルアミド濃度が最終濃度として１２．５ｗｔ％となるようにアクリルアミドを添加したこと以外は、実施例１３と同様の処理を行った。
【００６６】
＜実施例１６＞
アクリルアミドの添加後のインキュベートを５℃で撹拌を行わない条件で行った点以外は、実施例１３と同様の処理を行った。
【００６７】
＜実施例１７＞
アクリルアミドの添加後のインキュベートを５℃で撹拌を行わない条件で行った点以外は、実施例１４と同様の処理を行った。
【００６８】
＜実施例１８＞
アクリルアミドの添加後のインキュベートを５℃で撹拌を行わない条件で行った点以外は、実施例１５と同様の処理を行った。
【００６９】
＜実施例１９＞
１０１０ｃｆｕ／ｍＬの培養液に対して、メタクリルアミド濃度が最終濃度として１０ｗｔ％となるようにメタクリルアミドを添加したこと以外は、実施例１３と同様の処理を行った。
【００７０】
＜生菌数の確認結果及び酵素安定性の確認結果＞
実施例１３〜１９の生菌数の確認結果及び酵素安定性の確認結果を下記の表３に示す。なお、表中の「酵素安定性」の項目は、各々の実施例におけるインキュベート直前の培養液（分注直後）の活性に対する２４時間のインキュベート後の培養液の活性の比率（％）を意味する。
【００７１】
【表３】
2019176834.tif 000004
【００７２】
表３の結果から、所定量のアクリルアミドを添加することで、２４時間経過しても約８０％又はそれ以上の活性を維持しつつ、死菌化可能であることがわかった。
【００７３】
実施例１６、１７及び１８で得られた死菌化微生物を、追加の処理をせずに５℃で１２日間保存し、保存後の酵素活性を上記方法にて測定した。その結果、死菌化処理前の酵素活性に対する酵素安定性はそれぞれ８９％、８６％及び８４％であった。死菌化処理後の酵素活性に対しては、それぞれ９３％、９９％及び９３％の酵素活性が維持され、高い保存安定性が認められた。