(57)【要約】      （修正有）【課題】初期段階で前癌性組織と悪性組織とを診断するために、癌グレーディングのための高速及び高信頼性の診断方法が必要。【解決手段】参照癌細胞サンプルのグリカン分布パターンをプロファイリングするステップと；プロファイリングされた参照癌細胞サンプルを吸着剤によって吸着するステップと；プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した吸着剤の量を測定するステップと；参照癌細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した吸着剤の量との参照相関を取得して、所与の癌グレードの指数を形成するステップとを含む。所与の癌グレードに対する指数、およびテスト細胞サンプルの癌をグレーディングするための方法も提供される。【選択図】図１
2019211481.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所与の癌グレードの指数を確立するための方法であって、
参照癌細胞サンプルを提供するステップであって、前記参照癌細胞サンプルは前記所与の癌グレードであり、かつ前記参照癌細胞サンプルの表面に係留された糖タンパク質のグリカン鎖を含み、前記参照癌細胞サンプルは結腸癌サンプルである、ステップと、
第１の吸着剤および第２の吸着剤を提供するステップであって、前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤の炭素数は２０から４６の間であり、かつ前記第１の吸着剤の炭素数は前記第２の吸着剤の炭素数よりも少ない、ステップと、
前記参照癌細胞サンプルの表面に係留された糖タンパク質の前記グリカン鎖のグリカン分布パターンをプロファイリングするステップと、
プロファイリングされた前記参照癌細胞サンプルを前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップと、
それぞれ、プロファイリングされた前記参照癌細胞サンプルに付着した前記第１の吸着剤の量を測定し、プロファイリングされた前記参照癌細胞サンプルに付着した前記第２の吸着剤の量を測定するステップと、
前記参照癌細胞サンプルの前記グリカン分布パターンと、プロファイリングされた前記参照癌細胞サンプルに付着した前記第１の吸着剤の量との第１の参照相関を取得し、かつ前記参照癌細胞サンプルの前記グリカン分布パターンと、プロファイリングされた前記参照癌細胞サンプルに付着した前記第２の吸着剤の量との第２の参照相関を取得するステップであって、前記第１の参照相関および前記第２の参照相関が前記所与の癌グレードの指数を形成する、ステップとを含み、
前記プロファイリングするステップ、吸着するステップおよび測定するステップは、
前記参照癌細胞サンプルに一連のバイアス電圧を加えるステップと、
前記バイアス電圧を加えることによって前記参照癌細胞サンプルを前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤によって吸着し、前記参照癌細胞サンプルに加えた前記バイアス電圧を放出した後、前記参照癌細胞サンプルを前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤によって吸着し、変動する時間長の加水分解反応による酸触媒加水分解後、前記参照癌細胞サンプルを前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップと、
前記バイアス電圧を加えることによって前記参照癌細胞サンプルに付着した前記第１の吸着剤の量および前記参照癌細胞サンプルに付着した前記第２の吸着剤の量を測定し、前記参照癌細胞サンプルに加えた前記バイアス電圧を放出した後、前記参照癌細胞サンプルに付着した前記第１の吸着剤の量および前記参照癌細胞サンプルに付着した前記第２の吸着剤の量を測定し、変動する時間長の加水分解反応による酸触媒加水分解後、前記参照癌細胞サンプルに付着した前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤の量を測定するステップと、
前記参照癌細胞サンプルに係留された糖タンパク質の前記グリカン鎖を段階的に加水分解するために、変動する時間長の加水分解反応を行うステップと、
を含み、
前記加水分解反応は、２超から６．５のｐＨ値を有する加水分解試薬によって行われ、前記参照癌細胞サンプルは、前記プロファイリングするステップ、吸着するステップおよび測定するステップの前に２４時間、脱着剤中に浸漬される、
方法。
【請求項２】
前記第１の吸着剤または前記第２の吸着剤はｎ−アルカンまたはｎ−アルキルエステルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一連のバイアス電圧は約５００Ｖ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
正常細胞サンプルを提供するステップであって、前記正常細胞サンプルは前記正常細胞サンプルの表面に係留された糖タンパク質の固有のグリカン鎖を含む、ステップと、
前記正常細胞サンプルの表面に係留された糖タンパク質の前記グリカン鎖のグリカン分布パターンをプロファイリングするステップと、
プロファイリングされた前記正常細胞サンプルを前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップと、
それぞれ、プロファイリングされた前記正常細胞サンプルに付着した前記第１の吸着剤の量を測定し、プロファイリングされた前記正常細胞サンプルに付着した前記第２の吸着剤の量を測定するステップと、
前記正常細胞サンプルの前記グリカン分布パターンと、プロファイリングされた前記正常細胞サンプルに付着した前記第１の吸着剤の量との第１の対照相関を取得し；前記正常細胞サンプルの前記グリカン分布パターンと、プロファイリングされた前記正常細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量との第２の対照相関を取得するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法によって確立される、所与の癌グレードに対する指数。
【請求項６】
テスト細胞サンプルの癌をグレーディングするための方法であって、
前記テスト細胞サンプルを提供するステップであって、前記テスト細胞サンプルは前記テスト細胞サンプルの表面に係留された糖タンパク質のグリカン鎖を含む、ステップと、
第１の吸着剤および第２の吸着剤を提供するステップであって、前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤の炭素数は２０から４６の間であり、かつ前記第１の吸着剤の炭素数は前記第２の吸着剤の炭素数よりも少ない、ステップと、
前記テスト細胞サンプルの表面に係留された前記グリカン鎖のグリカン分布パターンをプロファイリングするステップと、
プロファイリングされた前記テスト細胞サンプルを前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤によって吸着するステップと、
プロファイリングされた前記テスト細胞サンプルに付着した前記第１の吸着剤の量を測定し、プロファイリングされた前記テスト細胞サンプルに付着した前記第２の吸着剤の量を測定するステップと、
前記テスト細胞サンプルの前記グリカン分布パターンと、プロファイリングされた前記テスト細胞サンプルに付着した前記第１の吸着剤の量との第１のテスト相関を取得し；前記テスト細胞サンプルの前記グリカン分布パターンと、プロファイリングされた前記テスト細胞サンプルに付着した前記第２の吸着剤の量との第２のテスト相関を取得するステップと、
前記第１のテスト相関および前記第２のテスト相関と、所与の癌グレードの指数とを比較することによって、前記テスト細胞サンプルの癌グレードを決定するステップとを含み、
前記プロファイリングするステップ、吸着するステップ、および測定するステップは、
前記試験細胞サンプルに一連のバイアス電圧を加えるステップと、
前記バイアス電圧を加えることによって前記試験細胞サンプルを前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤によって吸着し、前記試験細胞サンプルに加えた前記バイアス電圧を放出した後、前記試験細胞サンプルを前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤によって吸着し、変動する時間長の加水分解反応による酸触媒加水分解後、前記試験細胞サンプルを前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤によって吸着するステップと、
前記バイアス電圧を加えることによって前記試験細胞サンプルに付着した前記第１の吸着剤および前記試験細胞サンプルに付着した前記第２の吸着剤の量を測定し、前記試験細胞サンプルに加えた前記バイアス電圧を放出した後、前記試験細胞サンプルに付着した前記第１の吸着剤の量および前記試験細胞サンプルに付着した前記第２の吸着剤の量を測定し、前記バイアス電圧は約５００Ｖ未満であり、変動する時間長の加水分解反応による酸触媒加水分解後、前記試験細胞サンプルに付着した前記第１の吸着剤および前記第２の吸着剤の量を測定するステップと、
前記試験細胞サンプルに係留された糖タンパク質の前記グリカン鎖を段階的に加水分解するために、変動する時間長の加水分解反応を行うステップと、
を含み、
前記加水分解反応は、２超から６．５のｐＨ値を有する加水分解試薬によって行われる、
方法。
【請求項７】
前記癌は結腸癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎癌、神経内分泌腫瘍、または口腔癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の吸着剤または前記第２の吸着剤はｎ−アルカンまたはｎ−アルキルエステルである、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は癌の診断に関する。特に、本開示は癌グレーディングのための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在は、病理学者が疾患の診断の責任を負う。ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および免疫組織化学（ＩＨＣ）は、適用されるルーチン法である。
【０００３】
たとえば、結腸癌の従来の診断方法は、病変および固形腫瘍の検出のために結腸内視鏡検査またはＳ状結腸鏡検査を使用する。生検は癌の悪性度を診断するために最もよく用いられ、ポリープまたは固形腫瘍から取られた組織切片はＨ＆Ｅ染色またはＩＨＣ染色を受ける。残念ながら、正確に病理組織学的検査を行うこと、および癌の合理的なグレーディング、および早期の癌検出はかなり困難である。考えられる要素は、検出区域の小腺形成のパーセンテージのカウント、および初期段階における高分化良性組織、前癌性、および悪性組織の形態分化の程度のレベルの決定を含む。
【０００４】
組織切片の癌グレーディングは、組織切片の形態の検査および組織切片における小腺形成のパーセンテージだけに基づくものではなく、癌グレーディングの結果は少なくとも３人の病理学者によって一貫して確証される必要がある。人為的動作によってもたらされる誤差、機器の検出限界、および個々の病理学者の診断による不適切な病理検査によって、偽陰性または偽陽性の結果が得られる可能性はなおも高い。しかし、癌グレーディングの結果は、癌患者に対するフォローアップ療法の戦略に影響するだろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特に、初期段階で前癌性組織と悪性組織とを診断するために、癌グレーディングのための高速診断および高信頼性の方法が非常に重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は所与の癌グレードの指数を確立するための方法を提供し、この方法は、
参照癌細胞サンプルを提供するステップであって、この参照癌細胞サンプルは所与の癌グレードを有し、かつ参照癌細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖を含む、ステップと、
第１の吸着剤および第２の吸着剤を提供するステップであって、この第１の吸着剤および第２の吸着剤の炭素数は２０から４６であり、かつ第１の吸着剤の炭素数は第２の吸着剤の炭素数よりも少ない、ステップと、
参照癌細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖のグリカン分布パターンをプロファイリングするステップと、
プロファイリングされた参照癌細胞サンプルを第１の吸着剤および第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップと、
それぞれ、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第１の吸着剤の量を測定し、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量を測定するステップと、
参照癌細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第１の吸着剤の量との第１の参照相関を取得し；参照癌細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量との第２の参照相関を取得するステップであって、この第１の参照相関および第２の参照相関が所与の癌グレードの指数を形成する、ステップとを含む。
【０００７】
加えて本開示は、上述の方法によって確立された所与の癌グレードの指数を提供する。
【０００８】
加えて本開示は、テスト細胞サンプルの癌をグレーディングするための方法を提供し、この方法は、
テスト細胞サンプルを提供するステップであって、このテスト細胞サンプルはテストサンプルの表面に係留されたグリカン鎖を含む、ステップと、
第１の吸着剤および第２の吸着剤を提供するステップであって、この第１の吸着剤および第２の吸着剤の炭素数は２０から４６の間であり、かつ第１の吸着剤の炭素数は第２の吸着剤の炭素数よりも少ない、ステップと、
テスト細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖のグリカン分布パターンをプロファイリングするステップと、
プロファイリングされたテスト細胞サンプルを第１の吸着剤および第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップと、
それぞれ、プロファイリングされたテスト細胞サンプルに付着した第１の吸着剤の量を測定し、プロファイリングされたテスト細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量を測定するステップと、
テスト細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされたテスト細胞サンプルに付着した第１の吸着剤の量との第１のテスト相関を取得し；テスト細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされたテスト細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量との第２のテスト相関を取得するステップと、
第１のテスト相関および第２のテスト相関と、上述の所与の癌グレードの指数とを比較することによって、テスト細胞サンプルの癌グレードを決定するステップとを含む。
【０００９】
前述は、以下の本開示の詳細な説明がより良く理解され得るように、本開示の比較的広い特徴および技術的利点を概説したものである。本開示の付加的な特徴および技術的利点がこの後に説明されており、本開示の請求項の主題を形成する。開示される概念および特定の実施形態は、本開示の目的を実施するために他の構造またはプロセスを変更または設計するための根拠として利用されてもよいことが、当業者に認識されるべきである。こうした同等の構成は、添付の請求項に示される本開示の趣旨または範囲から逸脱しないことも当業者に認識されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１に示される、酸触媒加水分解（ａｃｈ）の手順（図１Ｂ）と、ワックス物理吸着動力学（ＷＰＫ）をＦＴＩＲイメージングと合わせた手順（図１Ａ）とを示す図である。
【図２】ｐＨ＝３のＨＣｌ（ａｑ）溶液で異なる時間長だけ処理した後の、ＣＣＤ−１８Ｃｏ（ａ）、ＳＷ−１１１６（ｂ）、ＳＷ−４８０（ｃ）、ＳＷ４０３（ｄ）、ＬｏＶｏ（ｅ）、およびＨＴ−２９（ｆ）細胞の細胞サンプルと、異なるｎ−アルキル基を有するｎ−アルカンとのワックス物理吸着能力の時間プロファイルを示す図である。
【図３】ヒト結腸組織切片の表面に付着したＰａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）残留物およびミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）残留物の分布を提示する、ＷＰＫ−ＦＴＩＲイメージングを用いることによるスペクトル画像を示す図である。良性腫瘍の高分化（ＷＤ）形態区域Ｂ１−Ｂｎ、Ｂ１０−Ｂｎ、Ｂ１４−Ｂｎ、およびＢ１０−Ｐｒｅの前癌性区域。組織悪性区域の低分化形態（ＰＤ）区域Ｂ１０−ＭａおよびＢ１４−Ｍａ。（ａ）Ｂ１−Ｂｎ、（ｂ）Ｂ１０−Ｂｎ、（ｅ）Ｂ１４−ＢｎのＷＤ組織良性区域、および（ｃ）Ｂ１０−Ｐｒｅの前癌性区域。（ｃ）Ｂ１０−Ｍａおよび（ｆ）Ｂ１４−ＭａのＰＤ組織悪性区域。（良性区域（Ｂｎ）、前癌性区域（Ｐｒｅ）、悪性区域（Ｍａ））。
【図４】異なる時間長の加水分解後の良性組織切片Ｂ１−Ｂｎ区域のワックス残留物の時間プロファイルを示す図である。
【図５】異なる時間長の加水分解後の良性組織切片におけるＢ１０−Ｂｎ区域に付着したワックス残留物の量の時間プロファイルを示す図である。
【図６】異なる時間長の加水分解後の前癌性組織切片Ｂ１０−Ｐｒｅ区域に付着したワックス残留物の量の時間プロファイルを示す図である。
【図７】異なる時間長の加水分解後の悪性組織切片Ｂ１０−Ｍａ区域に付着したワックス残留物の量の時間プロファイルを示す図である。
【図８】異なる時間長の加水分解後の良性組織切片Ｂ１４−Ｂｎ区域に付着したワックス残留物の量の時間プロファイルを示す図である。
【図９】異なる時間長の加水分解後の悪性組織切片Ｂ１４−Ｍａ区域に付着したワックス残留物の量の時間プロファイルを示す図である。
【図１０】異なる時間長の加水分解後の口腔癌細胞の低グレードサンプル（ＳＣＣ−１５）と、口腔癌細胞の高グレードサンプル（ＯＥＣ−Ｍ１）とに付着したワックス（ｎ−Ｃ２２Ｈ４６、ｎ−Ｃ２５Ｈ５２、ｎ−Ｃ２８Ｈ５８、ｎ−Ｃ３０Ｈ６２、ミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２））残留物の量の時間プロファイルを示す図である。
【図１１】実施例３に示されるとおり、段階的に増加するバイアス電圧を加えたときの口腔癌細胞（ＯＥＣ−Ｍ１、ＳＣＣ−１５、ＳＣＣ−２５、ＯＣ−２、ＯＣ−３）のＷＰＫ−ＦＴＩＲイメージングを用いることによって、第１および第２の吸着剤の量の分極率プロファイルを示す図である。
【図１２】実施例３に示されるとおり、ＷＰＫ−ＦＴＩＲイメージングを用いることによって、段階的に増加するバイアス電圧を加えたときの口腔癌細胞（ＯＥＣ−Ｍ１、ＳＣＣ−１５、ＳＣＣ−２５、ＯＣ−２、ＯＣ−３）の破壊バイアスの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
図面に示される本開示の実施形態または実施例を、ここで特定の言語を用いて説明する。これによって本開示の範囲を限定することは意図されないことが理解されるだろう。記載される実施形態の任意の変化または変更、およびこの文書に記載される原理の任意のさらなる適用は、本開示が関係する技術分野における通常の当業者が一般的に想起するものとみなされる。
【００１２】
さまざまな構成要素を説明するために、本明細書において第１、第２、第３などの用語が用いられることがあるが、これらの構成要素はこれらの用語によって制限されないことが理解されるだろう。これらの用語は、単に１つの構成要素を別の構成要素と区別するために用いられるものである。よって、以下に考察される第１の構成要素は、本発明の概念の教示から逸脱することなく第２の構成要素と名付けられ得る。
【００１３】
本明細書において用いられる用語は、単に特定の実施形態例を説明する目的のためのものであり、本発明の概念に限定されることは意図されていない。状況が明らかに別様を示さない限り、本明細書において用いられる単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数形も含むことが意図される。この明細書において用いられるときの「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記述される特徴、整数、ステップ、動作、構成要素、または成分の存在を指すが、１つまたはそれ以上の他の特徴、整数、ステップ、動作、構成要素、成分、またはそれらの群の存在または付加を除外するものではないことがさらに理解されるだろう。
【００１４】
本開示は所与の癌グレードの指数を確立するための方法を提供し、この方法は、
参照癌細胞サンプルを提供するステップであって、この参照癌細胞サンプルは所与の癌グレードを有し、かつ参照癌細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖を含む、ステップと、
第１の吸着剤および第２の吸着剤を提供するステップであって、この第１の吸着剤および第２の吸着剤の炭素数は２０から４６であり、かつ第１の吸着剤の炭素数は第２の吸着剤の炭素数よりも少ない、ステップと、
参照癌細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖のグリカン分布パターンをプロファイリングするステップと、
プロファイリングされた参照癌細胞サンプルを第１の吸着剤および第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップと、
それぞれ、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第１の吸着剤の量を測定し、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量を測定するステップと、
参照癌細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第１の吸着剤の量との第１の参照相関を取得し；参照癌細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量との第２の参照相関を取得するステップであって、この第１の参照相関および第２の参照相関が所与の癌グレードの指数を形成する、ステップとを含む。
【００１５】
本明細書において用いられる「癌グレード」という用語は、正常な細胞および正常な組織と比較したときの癌細胞および組織に対する異常さのレベルまたは程度を説明するものである。本明細書において用いられる「所与の癌グレード」という用語は、病理学における現在の医学検査の結果に従って検査および定義された癌グレードを示す。
【００１６】
本明細書において用いられる「指数」という用語は、特定の癌グレードを表すマーカーを示す。本開示による指数は、癌グレードを表す客観的な臨床指標を提供するために役立つ。
【００１７】
本明細書において用いられる「参照癌細胞サンプル」という用語は、現在の医学検査によって定義された所与の癌グレードの癌細胞のサンプルを示す。参照癌細胞サンプルの癌グレードは、好ましくはこの分野の熟練した医師によって検査または定義されたものであり、かつコンセンサスに基づくものである。たとえば、参照癌細胞サンプルの癌グレードは、顕微鏡下での細胞外観の異常およびその生育速度の偏差によって決定される。加えて、Ｈ＆Ｅ染色またはＩＨＣ染色が癌グレードの決定のために適用されてもよい。
【００１８】
参照癌細胞サンプルは、参照癌細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖を含む。グリカン鎖は通常、糖タンパク質として糖鎖付加を通じてタンパク質に連結する。タンパク質の糖鎖付加は最も一般的な翻訳後修飾であり、タンパク質のフォールディングおよびアンフォールディング、細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用、ならびに細胞分化を含む非常に重要な生理的プロセスに関与する。タンパク質の異常な糖鎖付加は、グリカン鎖の不完全な合成および新合成に強く関係しており、それは癌化発生の際に糖タンパク質の分岐、短縮、または伸長したグリカン鎖をより多く生成する。たとえば結腸癌細胞において、細胞膜に係留するタンパク質に連結されたグリカン鎖の長さは、癌グレードとともに増加することが実証されている。理論によって限定されることは意図しないが、糖タンパク質のグリカン鎖の伸長は癌グレードを表すと考えられる。
【００１９】
好ましくは、本開示による癌は良性、前悪性、または悪性の固形腫瘍であり得る。本明細書において言及される癌の種類は、たとえば脳癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、胆嚢／胆管癌、肝癌、膵癌、結腸癌、卵巣癌、絨毛癌、子宮体部癌、子宮頸部癌、腎盂／尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、腎癌、神経内分泌腫瘍、陰茎癌、精巣癌、胎児性腺癌、ウィルムス腫瘍、皮膚癌、悪性メラノーマ、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング腫瘍、軟部肉腫、神経内分泌腫瘍、または口腔癌などを含む。より好ましくは、癌は結腸癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎癌、神経内分泌腫瘍、または口腔癌である。
【００２０】
好ましくは、参照癌細胞サンプルは、本開示による癌の細胞系統の１つである。より好ましくは、参照癌細胞サンプルは結腸癌、乳癌、前立腺癌、腎癌、神経内分泌腫瘍、または口腔癌に由来する細胞系統である。
【００２１】
本明細書において用いられる「吸着剤」という用語は、細胞表面、特に癌細胞表面に吸着できる試薬を示す。好ましくは、本開示による吸着剤は、癌細胞の表面に係留されたグリカン鎖に吸着する。理論によって限定されることは意図しないが、吸着剤とグリカン鎖との物理吸着は、ファンデルワールス力相互作用および双極子誘起双極子相互作用に基づく物理吸着のタイプに関係することが強く示唆されると考えられる。吸着剤とグリカン鎖との間により強い物理吸着が確立されるほど、より多量の吸着剤が癌細胞表面に付着することが観察される。ファンデルワールス力相互作用および双極子誘起双極子相互作用に基づいて、グリカン鎖の鎖長は吸着剤の鎖長に近く、類似している。
【００２２】
本開示による吸着剤の炭素数は２０から４６の間であり、好ましくは２０から３４の間であり、より好ましくは２２から３０の間である。本開示によると、この方法は第１の吸着剤および第２の吸着剤を提供するステップを含み、第１の吸着剤の炭素数は第２の吸着剤の炭素数よりも少ない。本開示の一実施形態において、第１の吸着剤または第２の吸着剤は、ｎ−アルカンまたは末端にｎ−アルキル基を有するエステルである。好ましくは、第１の吸着剤または第２の吸着剤としてのｎ−アルカンの炭素数は２２、２５、２８、３０、３２、または３４であり、たとえばｎ−ドコサン、ｎ−ペンタコサン、またはｎ−トリアコンタンなどである。別の態様において、第１の吸着剤または第２の吸着剤としてのｎ−アルキルエステルの炭素数は２０から４６の間であり、より好ましくは２２、２５、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、または４６であり、たとえばミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）などである。
【００２３】
本開示の好ましい実施形態の１つにおいては、癌細胞の表面に係留された異なるグリカン鎖に吸着するために、異なるｎ−アルキル基を有する一連の吸着剤が適用される。たとえば、本開示による方法においては、炭素数２２、２５、２８、および３０を有する一連の吸着剤が適用される。
【００２４】
好ましくは、本開示による吸着剤は好ましくは溶液として調合される。好ましくは、本開示による吸着剤の濃度は約１ｗｔ％から約１０ｗｔ％の間であり、好ましくは約２．５ｗｔ％から約７．５ｗｔ％の間である。
【００２５】
好ましくは、本開示による癌細胞は、たとえばガラススライド、金属コートされたガラススライド、または石英スライドなどの固体基体上に固定される。固体基体上に癌細胞を固定する方式は、この分野における熟練した医師に公知である。
【００２６】
本開示による方法は、参照癌細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖のグリカン分布パターンをプロファイリングするステップを含む。本明細書において用いられる「グリカン分布パターン」という用語は、細胞サンプルのグリカン鎖のタイプ、好ましくは細胞サンプルの表面に係留されたタンパク質に連結したグリカン鎖のタイプを示す。グリカン分布パターンは、鎖長、単糖の種類、単糖の数、およびグリカン分岐の程度レベル、グリカンの疎水性、親水性、または分極率を含むがこれらに限定されず、好ましくは鎖長である。グリカン分布パターンは、任意の特定のグリカン鎖ではなく、細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖の分布を表す。
【００２７】
本開示による方法は、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルを第１の吸着剤および第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップと、それぞれプロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第１の吸着剤および第２の吸着剤の量を測定するステップとを含む。第１の吸着剤のｎ−アルキル基の炭素数は第２の吸着剤の炭素数よりも少ないことに鑑みて、これら２つの吸着剤は異なる長さのグリカン鎖を吸着できる。正常サンプルおよび悪性サンプルを含む、１つの細胞サンプルに係留された１つのグリカン鎖と１つの吸着剤との物理吸着容量は劇的に異なる。１つの吸着剤のアルキル基と、１つの細胞サンプルの表面に係留されたタンパク質に連結した１つのグリカン鎖との鎖長が互いに近いとき、それらの間の物理吸着能力は強くなり、より多量の吸着剤が細胞サンプルに付着する。
【００２８】
１つの細胞サンプルに付着する１つの吸着剤の量を測定する方式は、実施例に示されるプロセスを含むが、これに限定されない。本開示の好ましい実施形態の１つにおいては、ワックス物理吸着動力学技術が適用される。簡単にいうと、１つの細胞サンプルに付着する吸着剤が脱着剤にさらされ、フーリエ変換赤外分光法イメージング技術を用いることによって、細胞サンプルに付着した吸着剤の量が測定される。たとえば、脱着剤はキシレンまたはヘキサンである。
【００２９】
本開示のいくつかの実施形態において、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量は、第１の吸着剤の量よりも多い。プロファイリングされた参照癌細胞サンプルにおいてより多量の第２の吸着剤が見出されるのは、正常細胞サンプルよりも癌細胞の表面の方が、より長いグリカン鎖が係留された集団面積が大きいからである。反対に、正常細胞表面には悪性細胞サンプルに比べて比較的短いグリカン鎖が見出される。
【００３０】
本開示による方法は、参照癌細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第１の吸着剤の量との第１の参照相関を取得し；参照癌細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量との第２の参照相関を取得するステップを含み、この第１の参照相関および第２の参照相関が所与の癌グレードの指数を形成する。
【００３１】
本開示の一実施形態において、プロファイリングするステップ、吸着するステップ、および測定するステップは、
参照癌細胞サンプルに係留されたグリカン鎖を段階的に加水分解するために、変動する時間長の加水分解反応を行うステップ、
変動する時間長だけ加水分解された参照癌細胞サンプルを、第１の吸着剤および第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップ、
変動する時間長だけ加水分解された参照癌細胞サンプルに付着した第１の吸着剤および第２の吸着剤の量をそれぞれ測定するステップを含む。
【００３２】
細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖を加水分解するために、細胞サンプルの加水分解反応が行われる。変動する時間長を伴う一連の加水分解反応の後に、細胞サンプルに付着した第１の吸着剤および細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量を測定することによって、第１の参照相関および第２の参照相関が取得される。本開示の一実施形態において、加水分解反応は酸触媒加水分解を採用する。細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖の鎖長は、加水分解時間の増加とともに加水分解によって短くされる。本開示の一実施形態において、加水分解反応の時間長は０秒から約１５秒の間であり、好ましくは０秒から約１１秒の間である。好ましくは、加水分解時間のステップサイズは約０．５秒から約５秒の間、より好ましくは約１秒から約２秒の間に設定される。別の態様において、酸触媒加水分解のための試薬は無機酸である。好ましくは、加水分解反応は約−１から約６．５の間、好ましくは約２から約５の間のｐＨ値の試薬によって行われる。
【００３３】
本開示の好ましい実施形態の１つにおいて、第１の参照相関または第２の参照相関は、各加水分解反応において３０００〜２８００ｃｍ−１の中間ＩＲ範囲において、加水分解された参照癌細胞サンプルに付着した第１または第２の吸着剤の３０００〜２８００ｃｍ−１の中間ＩＲ範囲における各赤外吸収帯を積分することによって取得される。
【００３４】
本開示の別の実施形態において、プロファイリングするステップ、吸着するステップ、および測定するステップは、
参照癌細胞サンプルに一連のバイアス電圧を加えるステップ、
バイアス電圧を加えたときの参照癌細胞サンプルを第１の吸着剤および第２の吸着剤によってそれぞれ吸着し、バイアス電圧を加えないときの参照癌細胞サンプルを第１の吸着剤および第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップ、
それぞれ、バイアス電圧を加えたときの参照癌細胞サンプルに付着した第１の吸着剤および参照癌細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量を測定し、バイアス電圧を加えないときの参照癌細胞サンプルに付着した第１の吸着剤および参照癌細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量を測定するステップを含む。
【００３５】
理論によって限定されることは意図しないが、伝導性の基体に固定された所与の細胞サンプルに所与のバイアス電圧が加えられるとき、特に所与の細胞サンプルの細胞表面のグリカン鎖に対して、余分な分極が誘起されると考えられる。特定の癌グレードの所与の細胞サンプルのグリカン分布パターンは、特徴的誘起最大膜分極と呼ばれる特定のバイアス電圧における吸着剤残留物の最大量と、段階的に増加するバイアス電圧を加えられたときの誘起分極プロファイルとを示す。さらに、誘起される分極は、細胞サンプルに付着した吸着剤の量の３０００〜２８００ｃｍ−１の中間ＩＲスペクトル範囲における赤外吸光度に比例および相関する。細胞サンプルの特徴的最大分極に達する前に、細胞サンプルに付着したグリカン鎖と吸着剤との物理吸着能力が強くなる。その後、加えられるバイアス電圧が細胞サンプルの特徴的最大分極のバイアス電圧よりも大きくなるとき、物理吸着容量は減少する。本開示の一実施形態においては、一連のバイアス電圧が段階的に増加して加えられる。各物理吸着容量は、段階的に増加する一連のバイアス電圧の各々を加えるときに細胞サンプルに付着した各吸着剤の３０００〜２８００ｃｍ−１の範囲における赤外吸光度を測定することによって決定される。さらに、所与のバイアス電圧が加えられるときに細胞サンプルに付着した吸着剤の量が、バイアス電圧を加えないときの細胞サンプルのものと同じであることによって、破壊電圧が決定される。糖タンパク質の糖鎖付加の変化レベル、および最終的には癌グレードを詳述するために、所与の細胞サンプルの物理吸着容量を使用できる。本開示の一実施形態において、破壊バイアス電圧は、細胞サンプルに付着した吸着剤の量と、バイアス電圧を加えないときの細胞サンプルのそれとを比較することによって決定される。
【００３６】
好ましくは、バイアス電圧は約０Ｖから約５００Ｖの間、より好ましくは約０Ｖから約３００Ｖの間、さらにより好ましくは約０Ｖから約２００Ｖの間である。一連のバイアス電圧は、５Ｖ、１０Ｖ、または２０Ｖの電圧増加を伴って細胞サンプルに加えられる。
【００３７】
バイアス電圧を加える方式は実施例に示されるプロセスを含むが、これに限定されない。電界の強度は、それぞれ伝導性基体およびダミー伝導性基体に固定された細胞サンプルに正のバイアス電圧および接地を加えることによって生成される。たとえば、２つの電極間の距離は５ｍｍ、さらにより好ましくは約１ｍｍから約２０ｍｍの間に設定され、さらには接地電極を有さなかった。
【００３８】
バイアス電圧によってプロファイリングされた参照癌細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされた参照癌細胞サンプルに付着した第１および第２の吸着剤の量との第１および第２の参照相関が取得される。
【００３９】
本開示の好ましい実施形態の１つには、対照アッセイが含まれる。この方法はさらに、
正常細胞サンプルを提供するステップであって、この正常細胞サンプルは正常細胞サンプルの表面に係留された固有のグリカン鎖を含む、ステップと、
正常細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖のグリカン分布パターンをプロファイリングするステップと、
プロファイリングされた正常細胞サンプルを第１の吸着剤および第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップと、
それぞれ、プロファイリングされた正常細胞サンプルに付着した第１の吸着剤の量を測定し、プロファイリングされた正常細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量を測定するステップと、
それぞれ、正常細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされた正常細胞サンプルに付着した第１の吸着剤の量との第１の対照相関を取得し；正常細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされた正常細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量との第２の対照相関を取得するステップとを含む。
【００４０】
好ましくは、正常細胞サンプルのグリカン分布パターンと、参照癌細胞サンプルのものとは異なる。対照アッセイに対するプロファイリング、吸着、測定、および取得を行う方式は、上述の所与の癌グレードの参照癌細胞サンプルの説明と同様である。
【００４１】
本開示の一実施例においては、酸触媒加水分解（ａｃｈ）とワックス物理吸着動力学とを合わせたもの（ａｃｈ−ＷＰＫ）およびＦＴＩＲイメージングを用いることによって、ヒト正常結腸線維芽細胞（ＣＣＤ−１８Ｃｏ）、ヒト結腸癌細胞系統（ＳＷ−１１１６、ＳＷ−４８０、ＳＷ４０３、ＬｏＶｏ、ＨＴ−２９）、ヒト結腸組織切片、およびヒト口腔癌細胞系統（ＳＣＣ−１５、ＳＣＣ−２５、ＯＣ−２、ＯＣ−３、およびＯＥＣ−Ｍ１）を検査する。ａｃｈ−ＷＰＫプロセスの間に、各細胞サンプル表面に付着した各吸着剤の量の時間プロファイルが示される。より高い癌グレードの細胞サンプルに付着する吸着剤の最大量は、より低い癌グレードのものよりも長い加水分解時間にて生じる。他方で、良性腫瘍の組織切片サンプルまたは正常線維芽細胞に付着する吸着剤の量は、加水分解時間の増加とともに指数関数的減少を示す。さらに、より高グレードの悪性結腸腫瘍は、加水分解反応の間にＰａｒａｐｌａｓｔ吸着剤（またはｎ−ペンタコサン）の２つまたはそれ以上の付着最大量を示すことがあり、これは悪性腫瘍内でいくつかの癌グレードが発生したことを示す。結果的に、細胞サンプルに付着する吸着剤の最大量における加水分解時間を用いて、所与の癌グレードの指数を確立することができる。
【００４２】
本開示の一実施例においては、バイアス電圧を加えたときの細胞サンプルと、異なる癌グレードの口腔癌サンプルに付着する吸着剤残留物の量との物理吸着能力に基づいて、破壊バイアス電圧または最大誘起膜分極と口腔癌の癌グレードとの相関が確立される。伝導性基体に固定された口腔癌細胞サンプルの表面に付着したＰａｒａｐｌａｓｔ（もしくはｎ−ペンタコサン）またはミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）の相対量は、段階的に増加するバイアス電圧を加えるときに準ガウス分布を提示し、付着する吸着剤の最大量におけるバイアス電圧は、口腔癌細胞系統のＳＣＣ−２５、ＳＣＣ−１５、ＯＣ−２、ＯＣ−３、およびＯＥＣ−Ｍ１に対してそれぞれ３０Ｖ、３０Ｖ、７０Ｖ、５０Ｖ、および７０Ｖにて見出される。さらに、ＳＣＣ−２５、ＳＣＣ−１５、ＯＣ−２、ＯＣ−３、およびＯＥＣ−Ｍ１細胞に対する破壊バイアス電圧は、それぞれ８５Ｖ、９０Ｖ、１６５Ｖ、１６７Ｖ、および１８３Ｖである。この結果は、口腔癌細胞に対する病理学的癌グレーディングに一致する。
【００４３】
加えて本開示は、上述の方法によって確立された所与の癌グレードの指数を提供する。本明細書において用いられる「指数」という用語は、特定の状態を表すマーカーを示す。本発明による指数は、所与のサンプルに対する癌グレードを表す客観的な臨床値を提供するために役立つ。好ましくは、この指数はサンプルの所与の癌グレードをグレーディングするために用いられる。より好ましくは、この指数は、所与のサンプルに付着する第１の吸着剤対第２の吸着剤の量の赤外吸光度比率に基づいている。
【００４４】
好ましくは、上述の異なる癌グレードの複数の指数を含む指数グループが提供される。好ましくは、所与の癌に対するすべての癌グレードの指数が確立される。
【００４５】
本開示はさらに、テスト細胞サンプルの癌をグレーディングするための方法を提供し、この方法は、
テスト細胞サンプルを提供するステップであって、このテスト細胞サンプルはテスト細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖を含む、ステップと、
第１の吸着剤および第２の吸着剤を提供するステップであって、この第１の吸着剤および第２の吸着剤の炭素数は２０から４６であり、かつ第１の吸着剤の炭素数は第２の吸着剤の炭素数よりも少ない、ステップと、
テスト細胞サンプルの表面に係留されたグリカン鎖のグリカン分布パターンをプロファイリングするステップと、
プロファイリングされたテスト細胞サンプルを第１の吸着剤および第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップと、
それぞれ、プロファイリングされたテスト細胞サンプルに付着した第１の吸着剤の量を測定し、プロファイリングされたテスト細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量を測定するステップと、
テスト細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされたテスト細胞サンプルに付着した第１の吸着剤の量との第１のテスト相関を取得し；テスト細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされたテスト細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量との第２のテスト相関を取得するステップと、
第１のテスト相関および第２のテスト相関と、上述の所与の癌グレードの指数とを比較することによって、テスト細胞サンプルの癌グレードを決定するステップとを含む。
【００４６】
本明細書において用いられる「テスト細胞サンプル」という用語は、未知の癌グレードのサンプルを示す。テスト細胞サンプルは癌患者に由来する生検または組織を含むが、これに限定されない。テスト細胞サンプルは癌細胞を含む。プロファイリング、吸着、測定、および取得を行う方式は、上述の参照癌細胞サンプルの説明と同様である。
【００４７】
テスト細胞サンプルの癌グレードは、第１のテスト相関および第２のテスト相関と、上述の指数とを比較することによって調べられる。第１のテスト相関および第２のテスト相関が、それぞれ第１の参照相関および第２の参照相関と類似または同一であるとき、テスト細胞サンプルの癌グレードは所与の癌グレードと同じであると識別される。
【００４８】
好ましくは、プロファイリングするステップ、吸着するステップ、および測定するステップは、
テスト細胞サンプルに係留されたグリカン鎖を段階的に加水分解するために、変動する時間長の加水分解反応を行うステップと、
変動する時間長だけ加水分解されたテスト細胞サンプルを、第１の吸着剤および第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップと、
変動する時間長だけ加水分解されたテスト細胞サンプルに付着した第１の吸着剤および第２の吸着剤の量をそれぞれ測定するステップとを含む。
【００４９】
好ましくは、変動する時間長だけ加水分解されたテスト細胞サンプルに付着した第１の吸着剤およびテスト細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量を測定することによって、第１のテスト相関および第２のテスト相関が取得される。
【００５０】
好ましくは、プロファイリングするステップ、吸着するステップ、および測定するステップは、
テスト細胞サンプルに一連のバイアス電圧を加えるステップ、
バイアス電圧を加えたときのテスト細胞サンプルを第１の吸着剤および第２の吸着剤によってそれぞれ吸着し、バイアス電圧を加えないときのテスト細胞サンプルを第１の吸着剤および第２の吸着剤によってそれぞれ吸着するステップ、
それぞれ、バイアス電圧を加えたときのテスト細胞サンプルに付着した第１の吸着剤およびテスト細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量を測定し、バイアス電圧を加えないときのテスト細胞サンプルに付着した第１の吸着剤およびテスト細胞サンプルに付着した第２の吸着剤の量を測定するステップを含む。
【００５１】
好ましくは、バイアス電圧を用いることによってプロファイリングされたテスト細胞サンプルのグリカン分布パターンと、プロファイリングされたテスト細胞サンプルに付着した第１および第２の吸着剤の量との第１および第２のテスト相関が取得される。
【００５２】
以下の実施例は、当業者が本開示を実施することを助けるために提供される。
【実施例】
【００５３】
実施例１
癌細胞
酸触媒加水分解
ヒト正常結腸線維芽細胞（ＣＣＤ−１８Ｃｏ）と、結腸癌細胞系統（ＳＷ−１１１６、ＳＷ−４８０、ＳＷ４０３、ＬｏＶｏ、ＨＴ−２９）とをｌｏｗ−ｅスライドに固定した。細胞サンプルを所与の時間長だけ０．００１Ｎ  ＨＣｌ（ａｑ）（ｐＨ＝３）に浸漬した。次いで、Ｄ．Ｉ．水洗浄によってＨＣｌ（ａｑ）を除去した。サンプルを乾燥して、ＦＴＩＲイメージングの測定に用い得るようにした。
【００５４】
ワックス物理吸着動力学に基づくＦＴＩＲイメージング
組織サンプルを５３℃から６２℃の範囲のジメチルベンゼン（キシレン、Ｃ８Ｈ１０）の溶剤に２４時間浸漬して、組織切片に埋め込まれたパラフィンを除去し、ｌｏｗ−ｅスライドに固定されたサンプルの赤外スペクトルをスペクトルバックグラウンドとして取得した。
【００５５】
５．５ｗｔ％のミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）またはＰａｒａｐｌａｓｔ（もしくはｎ−ペンタコサン）（吸着剤として）を有するキシレン溶液にサンプルを５分間浸漬することによってロウ引きし、次いでサンプルを４５℃にて１０分間加熱して、サンプルに付着したキシレン残留物を蒸発させた。５秒間キシレンを用いることによってロウ引きしたサンプルを部分的に脱ロウし、次いでキシレンを完全に蒸発させるために室温に置いた。ＦＴＩＲイメージングシステムによって、サンプルの空間分解赤外スペクトルを取得した。バックグラウンドを差し引いた後のシグナルは、サンプル表面に付着した吸着剤残留物の量を表す。
【００５６】
酸触媒加水分解（ａｃｈ）およびワックス物理吸着動力学に基づくＦＴＩＲイメージングの手順を図１に示す。
【００５７】
その結果を図２に示す。ＳＷ−１１１６、ＳＷ−４８０、ＳＷ４０３、ＬｏＶｏ、およびＨＴ−２９に対するａｃｈ−ＷＰＫのＦＴＩＲイメージングの結果は、増加するＰａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）残留物を示し、それぞれ３ｓ、３ｓ、８ｓ、３ｓ、および４ｓの加水分解において最大量のＰａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）残留物を観察する。
【００５８】
図３に示すとおり、結腸組織切片のいくつかの領域を良性腫瘍（Ｂ１）、高分化悪性新生物Ｉ（Ｂ１０）、低分化悪性新生物ＩＩ（Ｂ１４）として検査した。組織切片にＷＰＫ−ＦＴＩＲイメージングのプロセスを受けさせた。Ｐａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）およびミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）の２つの吸着剤を使用した。
【００５９】
結腸組織切片にａｃｈ−ＷＰＫおよびＦＴＩＲイメージングを受けさせた。その結果を図４〜９に示す。癌グレードと、所与の組織切片の複合糖質の変化した糖鎖付加のレベルとの相関を取得するために、ａｃｈ処理を用いて一連の時間長の加水分解によってグリカンを段階的に脱グリコシル化して、加水分解サンプルの物理吸着能力と、組織切片区域に付着したＰａｒａｐｌａｓｔ（もしくはｎ−ペンタコサン）またはミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）残留物の相対量とを相関させた。
【００６０】
一連の時間長の加水分解後のＢ１−Ｂｎの吸着剤残留物の時間プロファイルは、一連の異なる加水分解時間長後の組織切片表面に付着したＰａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）およびミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）残留物の単一指数関数的減衰を示す。図４に示すとおり、ワックス残留物の量に対するＡＣＨ−ＷＰＫ−ＦＴＩＲスペクトル画像および時間プロファイルは、脱グリコシル化のためにより長時間処理する間にＰａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）残留物が少なくなることを示し、これは酸触媒加水分解による脱グリコシル化後にグリカンの鎖長が短くなると、組織切片がＰａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）およびミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）との物理吸着能力を失うことを示す。
【００６１】
図５に示すとおり、Ｂ１０−Ｂｎ区域においても、ＡＣＨ−ＷＰＫ−ＦＴＩＲ画像およびＰａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）残留物の時間プロファイルは加水分解処理前に単一指数関数的減衰を示すが、ミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）残留物は明確に変化しない。図６に示すとおり、Ｂ１０−Ｐｒｅは加水分解処理の間にミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）残留物の量の減少を示すが、Ｐａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）残留物の量の増加が観察される。図７に示すとおり、Ｂ１０−Ｍａ区域に付着したワックス残留物のＡＣＨ−ＷＰＫ−ＦＴＩＲスペクトル画像および時間プロファイルは、加水分解中の３ｓにてＰａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）残留物の最大量を示し、これは加水分解処理後の脱グリコシル化の際にグリカン鎖の長さが短くなったことを示す。よって、３秒間の加水分解後の残りの加水分解グリカン鎖の鎖長はＰａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）の鎖長と類似していることが提唱され、かつより長時間の加水分解によってグリカン鎖の鎖長が短くなるためにミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）残留物の減少が観察される。さらに、図８および図９に示すとおり、時間プロファイルにおける良性悪性区域に対して、それぞれ２秒間および１秒間の加水分解処理後に最大量の残留Ｐａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）が観察され、これはＢ１４−ＢｎおよびＢ１４−Ｍａの区域において高グレード癌の発生が進行したことを示す。
【００６２】
実施例２
口腔癌細胞系統ＳＣＣ−１５（低グレード）およびＯＥＣ−Ｍ１（高グレード）を、実施例１に記載したＡＣＨ−ＷＰＫとＦＴＩＲイメージングとを合わせたプロセスを受け、細胞サンプルのグリカン鎖を加水分解するために０．０１ＮのＨＣｌ（ａｑ）（ｐＨ＝２）を用い、グリカン吸着剤としてｎ−Ｃ２２Ｈ４６（ｎ−ドコサン（ｄｅｃｏｔｈａｎｅ））、ｎ−Ｃ２５Ｈ５２（ｎ−ペンタコサン）、ｎ−Ｃ２８Ｈ５８（ｎ−オクタコサン）、およびミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）を用いた。
【００６３】
その結果を図１０に示す。細胞表面に付着したｎ−Ｃ２２Ｈ４６、ｎ−Ｃ２５Ｈ５２、ｎ−Ｃ２８Ｈ５８、およびミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）残留物の相対量に基づいてヒト口腔癌細胞の癌グレードを検査するために、ＡＣＨ−ＷＰＫとＦＴＩＲイメージングとを合わせたものを使用する。ワックス残留物の時間プロファイルは、より長い時間長の加水分解の後に、より高グレードの癌細胞サンプルがより短いｎ−アルキル鎖長を有するｎ−アルカン吸着剤の最大残留物量を示すことを明らかにする。
【００６４】
実施例３
口腔癌細胞系統のＯＥＣ−Ｍ１、ＳＣＣ−１５、ＳＣＣ−２５、ＯＣ−２、およびＯＣ−３をｌｏｗ−ｅスライドに固定した。
【００６５】
ワックス物理吸着動力学に基づくＦＴＩＲイメージング
サンプルをキシレン溶剤に２０分間浸漬することによって洗浄し、細胞表面遊離有機物を確実に除去し、スペクトルバックグラウンドとしてサンプルのＦＴＩＲスペクトルを取得した（図１１に示す）。
【００６６】
５．５ｗｔ％のミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）またはＰａｒａｐｌａｓｔ（もしくはｎ−ペンタコサン）のキシレン溶液（吸着剤として）にサンプルを２分間浸漬することによってロウ引きし、その後サンプルスライド上のキシレン溶剤を室温にて１０分間完全に蒸発させるための手順を行った。サンプルを純キシレン溶剤に５秒間（ＯＥＣ−Ｍ１、ＳＣＣ−１５、およびＳＣＣ−２５）または７秒間（ＯＣ−２およびＯＣ−３）浸漬することによってサンプルを脱ロウし、次いでキシレンを完全に蒸発させるために室温に置いた。ロウ引き前の細胞サンプルの吸光度を引いた後に３０００〜２８００ｃｍ−１のスペクトル範囲における吸収曲線の下の面積を積分することによって、細胞サンプルに付着したワックス残留物の量と残留ワックスの吸光度とを相関させた。
【００６７】
段階的に増加するバイアス電圧
伝導性スライドに固定したサンプルに外部からバイアス電圧を加え、所与のバイアス電圧を加えたサンプルに、上述のＷＰＫとＦＴＩＲイメージングとを合わせた手順を受けさせた。
【００６８】
次に、外部から加えたバイアス電圧をサンプルから放出し、サンプルに再びＷＰＫとＦＴＩＲイメージングとを合わせた手順を受けさせた（電圧放出の手順を表すためにＲ＊を用いる）。
【００６９】
２０Ｖの電圧ステップサイズを有する１０Ｖから１７０Ｖ（ＯＥＣ−Ｍ１）、９０Ｖ（ＳＣＣ−１５およびＳＣＣ−２５）、または１５０Ｖ（ＯＣ−２およびＯＣ−３）のバイアス電圧を、口腔癌細胞系統の細胞サンプルに外部から加えた。
【００７０】
その結果を図１１に示す。バイアス電圧補助ＷＰＫの結果は、外部からバイアス電圧を加えることによってワックス吸着剤と細胞サンプルとの間の物理吸着能力が向上することを示す。外部印加電圧範囲において、細胞サンプルの所与の癌グレードに対する特定の電圧において細胞サンプルに付着する最大残留ワックスとして定義される最大誘起膜分極率も示す。癌細胞系統の細胞サンプルは、特定の電圧が加えられたときにＰａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）およびミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）の物理吸着能力の劇的な減少を示し、この特定の電圧を所与の細胞サンプルの破壊電圧と定義する。
【００７１】
破壊バイアス電圧
最大誘起膜分極および細胞サンプルの破壊の電圧を走査するために、上述のとおり１〜１０Ｖの電圧ステップサイズによって電圧を０Ｖから３００Ｖに段階的に増加させることによってバイアス電圧を加える手順をサンプルに受けさせた。
【００７２】
その結果を図１２に示す。癌細胞ＯＥＣ−Ｍ１、ＳＣＣ−１５、ＳＣＣ−２５、ＯＣ−２、およびＯＣ−３に対してそれぞれ１８３Ｖ、８５Ｖ、９０Ｖ、１６５Ｖ、および１６７Ｖにて破壊バイアスを加えた後、細胞サンプルとＰａｒａｐｌａｓｔ（またはｎ−ペンタコサン）およびミツロウ（Ｃ４６Ｈ９２Ｏ２）との物理吸着能力は徐々に減少する。
【００７３】
本開示およびその利点を詳細に説明したが、添付の請求項によって定義される本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、ここで動作手順のさまざまな変化、置換および変更が行われ得ることが完全に理解されるだろう。たとえば上記で考察したプロセスの多くは、異なる方法論において実施されたり、他のプロセスで置換されたり、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００７４】
さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、機械、製造、および物質の組成、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることは意図されない。通常の当業者が本開示から容易に認識するであろうとおり、本明細書に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を行うか、または実質的に同じ結果を達成する、既存であるかまたは後に開発されるプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、またはステップが、本開示に従って使用されてもよい。したがって、添付の請求項はその範囲にこうしたプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、またはステップを含むことが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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