(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞壁を有する植物細胞に直鎖核酸分子を非侵襲的に送達する方法の提供。【解決手段】細胞壁を有する植物細胞を用意する工程、ＰＥＧでナノ粒子の表面を被覆して「ＰＥＧ化された」ナノ粒子を製造する工程、少なくとも１つの対象とする直鎖核酸分子で、ＰＥＧ化されたナノ粒子を被覆する工程、細胞壁を有する植物細胞と、対象とする直鎖核酸分子（単数または複数）で被覆されたＰＥＧ化されたナノ粒子を互いに接触させて配置する工程、ならびに細胞壁を含む細胞へのナノ粒子および対象とする直鎖核酸分子（単数または複数）の取り込みを可能にする工程を含んでもよい、細胞壁を有する植物細胞に対象とする分子を導入するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象とする直鎖核酸分子を、細胞壁を有する植物細胞に導入する方法であって、
細胞壁を有する植物細胞を用意する工程、
対象とする直鎖核酸分子でナノ粒子を被覆する工程、
細胞壁を有する植物細胞と被覆されたナノ粒子とを互いに接触させて配置する工程、な
らびに
細胞壁を含む細胞へのナノ粒子および対象とする直鎖核酸分子の取り込みを可能にする
工程
を含む方法。
【請求項２】
ナノ粒子が、ポリエチレングリコールで被覆されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞壁を含む植物細胞のコンパートメントへのナノ粒子の取り込みを可能にすることを
さらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞内コンパートメント標的化タンパク質でナノ粒子を被覆することをさらに含む、請
求項３に記載の方法。
【請求項５】
コンパートメントが、細胞質ゾル、核、液胞膜、色素体、エチオプラスト、有色体、白
色体、脂肪体、タンパク質プラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の管腔から
なる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞壁を有する植物細胞が、市販の作物種由来の植物細胞である、請求項１に記載の方
法。
【請求項７】
植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、キャノーラ、ナタネ、綿、パーム、ピ
ーナッツ、大豆、オリザ種、シロイヌナズナ種、トウゴマ種、およびサトウキビ細胞から
なる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、鞘および茎
からなる群から選択される組織由来である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
細胞壁を有する植物細胞が、培養細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ナノ粒子が、半導体ナノ粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
半導体ナノ粒子が量子ドットである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ナノ粒子の表面を誘導体化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
対象とする直鎖核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、および遺伝子からなる群
から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
対象とする直鎖核酸分子が遺伝子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子が、外来タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、請求
項１４に記載の方法。
【請求項１６】
対象とする直鎖核酸分子が、ヌクレアーゼでの核酸分子の消化から得られる、請求項１
に記載の方法。
【請求項１７】
ヌクレアーゼで消化された核酸分子が、プラスミド、コスミド、人工染色体、酵母人工
染色体、および細菌人工染色体からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象とする直鎖核酸分子を安定に組み込んでいる細胞を選択することをさらに含む、請
求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
選択された細胞が再生可能な細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
再生可能な細胞から植物を再生することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象とする直鎖核酸分子を植物材料に導入する方法であって、
植物細胞、植物組織、および植物からなる群から選択される植物材料を用意する工程、
ナノ粒子をポリエチレングリコールで被覆する工程、
ナノ粒子を対象とする直鎖核酸分子で被覆する工程、
細胞壁を有する植物細胞と被覆されたナノ粒子を互いに接触させて配置する工程、なら
びに
植物材料へのナノ粒子および対象とする直鎖核酸分子の取り込みを可能にする工程
を含む方法。
【請求項２２】
植物材料が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、鞘および茎
からなる群から選択される植物組織である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
形質を植物に遺伝子移入するための方法であって、
植物細胞を用意する工程、
ポリエチレングリコールでナノ粒子を被覆する工程、
植物に形質を発現させるための手段でナノ粒子を被覆する工程、
植物細胞と被覆されたナノ粒子を互いに接触させて配置する工程、
植物細胞へのナノ粒子および植物に形質を発現させるための手段の取り込みを可能にす
る工程、
形質転換された植物細胞から植物全体を再生する工程、ならびに
植物を繁殖させる工程
を含む方法。
【請求項２４】
形質が、対象とするタンパク質の発現、雄性不稔、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌性
病害に対する抵抗性、真菌性病害に対する抵抗性、およびウイルス性病害に対する抵抗性
からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、「植物における安定な形質転換のためのＰＥＧ化量子ドットを用いた直鎖Ｄ
ＮＡ分子送達」について、２０１０年７月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３６
２，２２４号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ナノ粒子を用いて、細胞壁を有する植物細胞に直鎖核酸分子を非侵襲的に送
達する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ナノ粒子は、ＤＮＡを特異的な動物細胞に送達するために活用されている固有の特徴を
有する。ある種のＤＮＡ被覆ナノ粒子が細胞壁を有しない細胞とともにインキュベートさ
れたとき、細胞がナノ粒子を取り込み、ＤＮＡにコードされた遺伝子を発現開始すること
が見出されている。また、３〜５ｎｍのサイズ範囲内にある半導体ナノ粒子（例えば、量
子ドット（「ＱＤ」））は、細胞内に分子を送達するための担体として使用されている。
ＤＮＡおよびタンパク質は、ＱＤ表面に付着するある種のリガンドに連結することができ
る。例えば、Patolskyら, (2003) J. Am. Chem. Soc. 125: 13918を参照されたい。カル
ボン酸またはアミンで被覆されたＱＤは、標準的なバイオコンジュゲーションプロトコー
ルを用いることによって、チオール基（例えば、Dubertretら, (2002) Science 298: 175
9; Akermanら, (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12617; Mitchellら, (1999)
J. Am. Chem. Soc. 121: 8122を参照されたい）、またはＮ−ヒドロキシスクシニミル（
「ＮＨＳ」）エステル基を含む分子と交差連結することができる。例えば、Pinaudら, (2
004) J. Am. Chem. Soc. 126: 6115; Bruchezら, (1998) Science 281: 2013を参照され
たい。ＱＤの表面に分子を付着させる代替法は、ストレプトアビジンで被覆されたＱＤと
ビオチン化タンパク質、オリゴヌクレオチド、または抗体のコンジュゲーションを介する
ものである。例えば、Dahanら, (2003) Science 302: 442; Pinaudら, (2004) J. Am. Ch
em. Soc. 126: 6115; Wuら, (2003) Nature Biotechnol. 21: 41; Jaiswalら, (2003) Na
ture Biotechnol. 21:47; およびManssonら, (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 3
14: 529を参照されたい。
【０００４】
植物への外来核酸分子の送達は、植物細胞壁の存在のためにチャレンジしている。現在
の方法は、植物の遺伝形質転換用の侵襲的送達による。植物細胞において、細胞壁は、外
来的に適用される分子の送達に対する障壁である。多くの侵襲的細胞送達法、例えば、微
粒子銃送達（遺伝子銃）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、および
アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換は、壁のある植物細胞に遺伝子お
よび小分子送達を達成させるために使用されているが、タンパク質の送達はマイクロイン
ジェクションによってのみ達成されている。植物細胞への核酸分子のナノ粒子送達が望ま
れる場合、細胞壁は、植物のプロトプラストへの該粒子の添加前に除かれる。例えば、To
rneyら, (2007) Nature Nanotechnol. 2: 295-300を参照されたい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書において、細胞壁を有する植物細胞に、対象とする分子を導入するためのナノ
粒子および直鎖化された核酸分子を使用するための方法および組成物が記載されている。
本開示の方法のいくつかの実施形態は、安定に形質転換され、遺伝子修飾された稔性植物
を生成するために用いてもよい。いくつかの実施形態では、直鎖核酸分子の特徴的性質は
、トランスジェニック標的生物用の制御結果を有する場合がある異質な核酸配列なしに、
対象とする特異的遺伝子配列の送達を可能にする。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、直鎖核酸分子を用いてＰＥＧ化してもよい。具
体的な実施形態では、ナノ粒子は、量子ドット（「ＱＤ」）などの半導体ナノ粒子であり
得る。いくつかの実施形態では、直鎖核酸分子は、直鎖化されたプラスミドＤＮＡであっ
てもよい。他の実施形態では、直鎖核酸分子は、ホスホイノスリシン−Ｎ−アセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＰＡＴ）および／または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードする配
列を含んでもよい。
【０００７】
また、細胞壁を有する植物細胞に対象とする分子を導入するための方法が開示され、こ
の方法は、細胞壁を有する植物細胞を用意する工程、ＰＥＧでナノ粒子の表面を被覆して
「ＰＥＧ化された」ナノ粒子を製造する工程、少なくとも１つの対象とする直鎖核酸分子
で、ＰＥＧ化されたナノ粒子を被覆する工程、細胞壁を有する植物細胞と、対象とする直
鎖核酸分子（単数または複数）で被覆されたＰＥＧ化されたナノ粒子を互いに接触させて
配置する工程、ならびに細胞壁を含む細胞へのナノ粒子および対象とする直鎖核酸分子（
単数または複数）の取り込みを可能にする工程を含んでもよい。
【０００８】
さらに、形質を植物に遺伝子移入するための方法が開示されている。いくつかの実施形
態では、この方法は、植物細胞を用意する工程、ＰＥＧでナノ粒子の表面を被覆して、Ｐ
ＥＧ化されたナノ粒子を製造する工程、植物に形質を発現させるための手段で、ＰＥＧ化
されたナノ粒子を被覆する工程、植物細胞と、この植物に形質を発現させるための手段で
被覆されたＰＥＧ化されたナノ粒子を互いに接触させて配置する工程、形質転換された植
物細胞を生成するために、植物細胞へのナノ粒子および植物に形質を発現させるための手
段の取り込みを可能にする工程、形質転換された植物細胞から植物全体を再生する工程、
ならびに植物を繁殖させる工程を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明の方法
に従って遺伝子移入され得る形質は、限定されないが、雄性不稔；除草剤抵抗性；虫害抵
抗性；ならびに細菌性病害、真菌性病害、および／またはウイルス性病害に対する抵抗性
から選択される形質を含む。
【０００９】
また、植物の植物体形質転換に使用してもよい本発明の方法が開示されている。いくつ
かの実施形態では、植物は、シロイヌナズナ属の植物、例えば、シロイヌナズナ（A. tha
liana）から選択してもよい。具体的な実施形態では、植物体形質転換によって形質転換
される植物は、コロンビア（Columbia）生態型のシロイヌナズナ（A. thaliana）植物か
ら選択され得る。
【００１０】
さらに、遺伝子修飾（ＧＭ）された植物細胞、およびそれらの細胞を生成するための方
法が開示され、ここで、植物細胞は、本発明の方法を介して、そこに導入される１または
複数の核酸を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの対象とする遺伝子、お
よび選択可能なマーカーを含むプラスミドは、本発明に従ってナノ粒子を介して、細胞壁
を有する植物細胞に導入してもよい。さらなる実施形態では、少なくとも１つの対象とす
る遺伝子および／または選択可能なマーカーを安定に組み込んでいる安定な形質転換体を
選択してもよい。代替の実施形態では、ここで、少なくとも１つの対象とする遺伝子を含
む植物細胞は、対象とする分子を含む他の細胞を生成するために繁殖してもよい。他の実
施形態では、ここで、対象とする分子を含む植物細胞は、対象とする分子を含む植物全体
を再生するために用いてもよい再生可能な細胞であってもよい。
【００１１】
さらに、組織培養において使用するための、対象とする分子を含む再生可能な植物細胞
を創作する方法が開示されている。組織培養は、再生可能な細胞と実質的に同じ遺伝子型
を有する植物を再生することができる場合がある。このような組織培養における再生可能
な細胞は、例えば、胚；原形質体；分裂組織細胞；カルス；花粉；葉；葯；根；根端；花
；種子；鞘；または茎であってもよい。なおさらに、いくつかの実施形態は、本発明の組
織培養から再生された植物を提供する。
【００１２】
所望の形質または対象とする核酸分子を含む安定化された植物系を生成するための方法
がさらに開示され、ここで、所望の形質または対象とする核酸分子は、植物細胞壁を通し
てナノ粒子を取り込むことによって最初に導入してもよい。安定化された植物系を生成す
る方法は、当業者に周知であり、限定されないが、自殖；戻し交雑；ハイブリッド生産；
集団交雑（crosses to populations）などの技術を含んでもよい。したがって、また、細
胞壁を通したナノ粒子の取り込みによって、植物細胞（またはその先行物（predecessor
））に最初に導入される所望の形質または対象とする核酸分子を含む植物および植物細胞
が開示されている。細胞壁を通したナノ粒子の取り込みによって、植物または細胞（また
はその先行物）に最初に導入される所望の形質または対象とする核酸分子を含む植物細胞
は、他の異なる植物細胞との交配に使用され、所望の特徴を有する第１世代（Ｆ１）のハ
イブリッド細胞；種子；および／または植物を生成することができる。
【００１３】
上記される例示的な態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態が、以
下の説明を考慮して明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】非直鎖化プラスミドｐＤＡＢ３８３１の略図を含む図である。
【図２】ＫｐｎＩ制限酵素を用いて直鎖化されたプラスミドｐＤＡＢ３８３１の略図を含む図である。
【図３】直鎖ＤＮＡを形質転換したシロイヌナズナ（Arabidopsis）ゲノムを有するナノ粒子からのホスホイノスリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）ＤＮＡ配列とＮＣＢＩデータベースからのＰＡＴ配列との間の配列アラインメントを含む図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
配列表
配列番号１は、ＹＦＰ遺伝子：ＴＧＴＴＣＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＣＧを
増幅するために用いられたフォワードプライマー配列を示す。
配列番号２は、ＹＦＰ遺伝子：ＴＡＴＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡを
増幅するために用いられたリバースプライマー配列を示す。
配列番号３は、ＰＡＴ遺伝子：ＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＴＴＧＡＧＡＴＴＡＧを
増幅するために用いられたフォワードプライマー配列を示す。
配列番号４は、ＰＡＴ遺伝子：ＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＧを
増幅するために用いられたリバースプライマー配列を示す。
【００１６】
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
非侵襲的な遺伝子移入を可能にする本発明の方法は、所望の形質を有する遺伝子修飾さ
れた植物を生成するために非常に有用であり得る。非侵襲的な遺伝子移入は、場所に対し
て、細胞内に分子部位の特定の標的化および編集を促進することができ、所望のインプッ
ト、アウトプット、および農業的形質を作物に組み込むことが挙げられる。また、記載さ
れている方法は、植物の一過性の形質転換について非ＧＭＯオプションとして有用であり
得、樹木または野菜作物への形質の遺伝子移入および病害抵抗性に関する技術を拡張する
が、現在は、この技術は制限されている。
【００１７】
最近の特許出願（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／９７８，０５９）は、特に、環状プラスミド
ＤＮＡを送達するために、様々なナノ粒子積載量を用いたナノ粒子に基づくＤＮＡ送達の
非侵襲的手段を示し、シロイヌナズナ植物のＴ１種子にトランス遺伝子の安定な組み込み
を明確に示している。植物において生成される環状プラスミドＤＮＡを含むトランスジェ
ニック植物は、所望の除草剤耐性表現型を提示し、同時に少なくとも４倍、現場レベルの
グルホシネートアンモニウムで噴霧された場合、高レベルの耐性を示した。Ｕ．Ｓ．Ｓ．
Ｎ．６０／９７８，０５９は、特に、環状プラスミドＤＮＡを用いた、正に帯電した金ナ
ノ粒子によるシロイヌナズナにおける遺伝形質転換を示した。本研究は、特に、植物の安
定な遺伝形質転換のための直鎖核酸分子の使用を記載する。
【００１８】
Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／９７８，０５９は、特に、正に帯電したナノ粒子を媒介したプ
ラスミドＤＮＡ送達を記載する。しかしながら、直鎖プラスミドに基づく送達を用いたト
ランス遺伝子の安定なゲノム組み込みの実証は、今まで報告されていない。本開示は、植
物における安定な遺伝形質転換のための正に帯電したナノ粒子を媒介した直鎖核酸分子の
使用を記載する。分子分析は、本発明の方法によって、ｐａｔ遺伝子およびｙｆｐ遺伝子
を用いて形質転換されたトランスジェニックＴ１シロイヌナズナ植物におけるＰＡＴと一
緒のＹＦＰの発現を示した。Ｔ１トランスジェニック植物は、稔性となり、種子を生産す
る。これらの種子は、繁殖させてもよく、分離比分析は、分子分析およびタンパク質分析
とともに実施することができる。
【００１９】
直鎖核酸分子は、それを環状プラスミドＤＮＡから区別する特徴的な性質を有する。例
えば、直鎖核酸分子は、ベクター骨格および細菌抗菌性選択可能なマーカーを含まない十
分に画定された遺伝子カセットを有してもよい。
【００２０】
除草剤であるグルホシネートアンモニウム（ＧＬＡ）は、トランスジェニックをスクリ
ーニングするために、現場レベル濃度で噴霧してもよい。本発明の方法を用いて生産され
たシロイヌナズナＴ１苗木は、例えば、発芽後の最初の７日間、隔日で、現場レベル投薬
量のグルホシネートの５回塗布に対する除草剤抵抗性を示した。これらのトランスジェニ
ック植物からのゲノムＤＮＡは、ＰＣＲによってｐａｔおよびｙｆｐの存在について分析
され、結果はｐａｔおよびｙｆｐ標的ＤＮＡ配列を示した。ＰＣＲ産物の配列決定の結果
は、本発明の方法を用いて生産されたＴ１シロイヌナズナにおけるｐａｔおよびｙｆｐト
ランス遺伝子の正確な配列を表した。
【００２１】
ＩＩ．用語
以下に続く説明および表において、多数の用語が使用される。そのような用語が示す範
囲を含めて明細書および特許請求の範囲の明確かつ一致した理解を与えるために、以下の
定義が提供される：
戻し交雑：本明細書において使用するとき、用語「戻し交雑」は、育種家がハイブリッ
ド後代をもとの親（例えば、Ｆ１ハイブリッドの親の遺伝型の内の１つを有する第１世代
ハイブリッドＦ１）の内の１つと繰り返し交雑させるプロセスであり得る。
【００２２】
胚：本明細書において使用するとき、用語「胚」は、成熟種子内に含まれる小植物を意
味することができる。
【００２３】
ナノ粒子：本明細書において使用するとき、用語「ナノ粒子」は、少なくとも１つのナ
ノスケール次元、例えば、１００ｎｍ未満である顕微粒子を意味することができる。本発
明の使用に適したナノ粒子は、サイズが１ｎｍ〜０．８４μｍであってもよい。ナノ粒子
の１つの種類は「量子ドット」（ＱＤ）である。量子ドットは、中央値径が１ｎｍ〜１０
ｎｍ、例えば、２〜４ｎｍであってもよい。ナノ粒子の他の種類には、限定されないが、
金ナノ粒子；金被覆ナノ粒子；多孔性ナノ粒子；メソ多孔性ナノ粒子；シリカナノ粒子；
ポリマーナノ粒子、例えばデンドリマー；タングステンナノ粒子；ゼラチンナノ粒子；ナ
ノシェル；ナノコア；ナノスフェア；ナノロッド；磁気ナノ粒子；およびそれらの組み合
わせが挙げられる。
【００２４】
利用可能なナノ粒子のうち、発光性半導体ナノ結晶（ＱＤ）は、生物学的画像および感
知における多数の実証された応用を提供する。それらの利用性は、巨大タンパク質と匹敵
する、固有の光物理的特徴および大きさの組み合わせに由来する。親水性ＣｄＳｅ−Ｚｎ
Ｓ  ＱＤの流体力学半径は、５ｎｍ（分子リガンドと交換されるナノ結晶キャップについ
て）からブロックコポリマー内にカプセル化されるナノ結晶について２０ｎｍまで変化す
る。単一のＱＤは、いくつかの生体分子（例えば、抗体；ペプチド；および核酸分子）に
コンジュゲートされ、結合力が増大した多機能性ＱＤバイオコンジュゲートを提供するこ
とができる。さらに、化学物質および光崩壊に対するそれらの強い抵抗性は、特定の生物
学的プロセスの長期間の蛍光モニタリングを潜在的に可能にできる。NieおよびEmory (19
97) Science 275: 1102-6。金属親和性自己集合およびビオチン−アビジン結合に基づく
、複数の非共有コンジュゲーションスキームは、さらなる精製を必要とせずに、同じ複合
体内に同時に適用することができ、細胞内環境においてさえ安定である多機能性ＱＤバイ
オコンジュゲートを生成することができる。Yezhelyevら, (2008) J. Am. Chem. Soc. 13
0(28):9006-12。ＱＤあたり平均１０個のＹＦＰと名目上５０個の細胞透過性ペプチド（
ＣＰＰ）を利用することによって、少なくとも３００ｋＤａの分子量と１５０オングスト
ロームの空間的伸張を有するタンパク質積荷の細胞内送達を達成することができる。同文
献。ＱＤ−ｂ−ＰＥコンジュゲートに関する送達された積荷は、非常に広範囲の大きさお
よび分子量を有し；例えば、コンジュゲートあたり平均２．５個のストレプトアビジン−
ｂ−ＰＥを有し、送達された集合体は、１０３ｋＤａを潜在的に超える分子量、および５
００オングストロームに達する全体寸法を有する。より高いｂ−ＰＥ価を有するコンジュ
ゲートが用いられる場合、分子量および大きさは、大幅に増加し得る。
【００２５】
核酸分子：ヌクレオチドのポリマー形態であり、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、人
工染色体（ＡＣＥ）、および合成形態、ならびに前述の混合されたポリマーのセンス鎖と
アンチセンス鎖の両方を含むことができる。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオ
キシリボヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態を意味する。
「核酸分子」は、本明細書において使用するとき、「核酸」および「ポリヌクレオチド」
と同義である。核酸分子は、通常、他に指定がなければ、長さは少なくとも１０塩基であ
る。この用語は、一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡを含む。核酸分子は、天然に生じるヌ
クレオチド結合および／または天然に生じないヌクレオチド結合によって連結された天然
に生じるヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドのいずれか、またはそれらのヌクレ
オチドの両方を含んでもよい。
【００２６】
作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係にある場合、
第１の核酸配列が第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターが
コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可
能に連結されている。組換え的に生成される場合、作動可能に連結された核酸配列は連続
的であってもよく、２つのタンパク質コード領域を接続することを必要とする場合、同じ
読み取り枠であってもよい。しかしながら、核酸は、作動可能に連結させるために、連続
的である必要はない。
【００２７】
ＰＥＧ化された：本明細書において使用するとき、用語「ＰＥＧ化された」は、ナノ粒
子の表面が改善された生体適合性のためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて修
飾されたナノ粒子（例えば、量子ドット）を意味することができる。ＰＥＧ化されたナノ
粒子は、特定の細胞および組織への送達効率性を増大させるために、様々な標的リガンド
、例えば、ペプチドおよび抗体でさらに被覆してもよい。ＰＥＧは、立体安定化効果を介
して、例えば、タンパク質の非特異的な吸着を減らすことによって、被覆されたナノ粒子
の血中循環時間を伸ばすために、種々の薬物；リポソーム；および高分子ミセルを有する
ナノ粒子にコンジュゲートされている。
【００２８】
量子ドット：本明細書において使用するとき、用語「量子ドット」（ＱＤ）（またナノ
結晶としても知られていることがある）は、３つ空間方向の全部において、伝導帯電子、
価電子帯ホール、または励起子（伝導帯電子と価電子帯ホールの上下限）の動作を制限す
る半導体ナノ構造を意味することができる。この制限は、例えば、（外部電極、薬物使用
、緊張、不純物などによって発生した）静電ポテンシャル；（例えば、コア−シェルナノ
結晶系における）異なる半導体材料間の接触面の存在；半導体表面（例えば、半導体ナノ
結晶）の存在；またはそれらの組み合わせに起因し得る。量子ドットは、離散的な量子化
エネルギースペクトルを有してもよい。対応する波動関数は、量子ドット内に空間的に局
在化してもよいが、結晶格子を長期間にわたって拡張し得る。量子ドットは、小さな有限
数（例えば、１〜１００オーダー）の伝導帯電子；価電子帯ホール；または励起子（すな
わち、有限数の基本電荷）を含む。
【００２９】
量子ドットは、ＩＩ〜ＶＩ、ＩＩＩ〜Ｖ、またはＩＶ〜ＶＩ物質の周期群で構成される
結晶であってもよい、特別な種類の半導体材料である。それらの大きさは、例えば、直径
にして２〜１０ナノメートル（１０〜５０原子）の範囲であり得る。いくつかの実施形態
では、量子ドットは、セレン化カドミウム硫化鉛コアシェル（ＣｄＳｅ／ＺｎＳ）で作ら
れてもよく、バルク材の性質とは特徴において異なる、ある範囲の有用な電気的性質およ
び光学的性質を有する。量子ドットナノ粒子は、インビボおよびインビトロにおいて、造
影剤として調べられている。これは、それらの高量子収率；高いモル減衰係数；および光
退色に対する高い抵抗性のためである。
【００３０】
グリホセート抵抗性：ある投薬量のグリホセートに対する抵抗性は、その投薬量のグリ
ホセートまで植物が生存する（すなわち、植物が枯れることのない）能力を意味する。い
くつかの場合において、耐性植物は、一時的に黄変になってもよく、または他にいくらか
のグリホセート誘導性障害（例えば、分げつ過剰および／または生育阻害）を呈するが、
回復され得る。
【００３１】
安定化された：本明細書において使用するとき、用語「安定化された」は、同じ品種の
自殖植物の一世代から次世代へ再生可能に継代される植物の特徴を意味することができる
。
【００３２】
トランス遺伝子：本明細書において使用するとき、用語「トランス遺伝子」は、外因性
の核酸配列を意味することができる。一例において、トランス遺伝子は、遺伝子配列（例
えば、除草剤抵抗性遺伝子）；産業的もしくは医薬的に有用な化合物をコードする遺伝子
；または所望の農業的形質をコードする遺伝子である。なお別の例において、トランス遺
伝子は、アンチセンス核酸配列であり、ここで、アンチセンス核酸配列の発現は、標的核
酸配列の発現を阻害する。トランス遺伝子は、トランス遺伝子に作動可能に連結された制
御配列を含んでもよい（例えば、プロモーター）。いくつかの実施形態では、ナノ粒子を
媒介した形質転換によって導入されるべき対象とする核酸分子はトランス遺伝子である。
しかしながら、他の実施形態では、対象とする核酸分子は、内因性の核酸配列であり、こ
こで、内因性の核酸配列のさらなるゲノムコピーは望まれ；または、宿主生物における標
的核酸分子に対してアンチセンス配向にある核酸分子である。
【００３３】
取り込み：本明細書において使用するとき、用語「取り込み」は、細胞壁または細胞膜
を通して、ナノ粒子（例えば、量子ドット）などの粒子の移動を意味することができ、こ
こで、移動は、粒子が取り込まれる細胞以外の何かによって粒子に与えられるモーメント
の結果としては単独に生じるのではない。粒子に与えられるモーメントの結果として単独
で細胞壁または細胞膜を通して粒子の移動を生じるデバイスまたは方法の非制限的な例は
、微粒子銃、遺伝子銃、マイクロインジェクション、および／またはインペールフェクシ
ョン（impalefection）技術である。
【００３４】
ＩＩＩ．植物細胞の安定な形質転換のためのナノ粒子を用いたＤＮＡ分子送達
Ａ．概要
本発明は、例えば、遺伝形質転換および安定なトランスジェニック植物の開発のための
直鎖化プラスミドＤＮＡのナノ粒子を媒介した移動を用いた植物形質転換のための新規な
方法を記載する。ある種の実施形態による方法は、トランスジェニック生物の迅速な生成
だけでなく、他の形質転換法と比較したとき、所望のゲノム修飾のためのいくつかの可能
性も提供することができる。本発明の実施形態は、ナノ粒子を媒介した直鎖化プラスミド
ＤＮＡ送達を介して生産される、最初に報告される安定に形質転換された植物をもたらし
た。遺伝子修飾の開示された方法は、植物の遺伝形質転換の伝統的な方法からの逸脱であ
り、トランスジェニック作物の生成に非常に有用であり得る。
【００３５】
Ｂ．ＤＮＡ分子
特定のタンパク質またはＲＮＡ産物（例えば、干渉ＲＮＡ（「ＲＮＡｉ」））をコード
する遺伝子の単離および特徴付けを可能にしている分子生物学的技術の到来により、植物
生物学の分野の科学者らは、例えば、特定のやり方で細胞の形質を変えるために外来遺伝
子、または天然もしくは内在遺伝子（おそらく異なるプロモーターによって駆動される）
の追加的もしくは修飾されたバージョンを含み、発現するために細胞のゲノムを操作する
ことに強い関心を進展させた。このような外来の追加的および／または修飾された遺伝子
は、本明細書において総称として「トランス遺伝子」と称される。トランス遺伝子は、例
えば、対象とするタンパク質をコードしてもよく、またはＲＮＡｉに転写されてもよい。
最近の１５から２０年間にわたって、トランスジェニック細胞を生成するためのいくつか
の方法が開発されており、具体的な実施形態において、本発明は、細胞壁を通してナノ粒
子の取り込みを介して、細胞壁を有する植物細胞に１または複数の直鎖核酸分子を導入す
ることにより、形質転換型の細胞およびそれらを生成する方法に関する。本発明のいくつ
かの実施形態において、トランス遺伝子は、直鎖化発現ベクターに含まれてもよい。
【００３６】
細胞形質転換は、特定の細胞で機能する発現ベクターの構築を伴ってもよい。このよう
なベクターは、調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、終止配列または
それらの組み合わせ）の制御下の、またはそれに作動可能に連結された遺伝子を含む核酸
配列を含んでもよい。したがって、発現ベクターは、１つまたは複数のそのように作動可
能に連結した遺伝子／調節エレメントの組み合わせを含有できる。ベクター（単数または
複数）は、プラスミドの形態であってよく、細胞壁を含む植物細胞の遺伝物質にトランス
遺伝子（単数または複数）を組み込むために、本明細書において記載される形質転換法を
用いて形質転換された細胞を提供するために単独でまたは他のプラスミドと組み合わせて
用いてもよい。
【００３７】
実施形態において、対象とする核酸分子は、直鎖核酸分子であってもよい。直鎖核酸分
子は、例えば、制限エンドヌクレアーゼでの環状プラスミドの消化によって生成してもよ
い。制限エンドヌクレアーゼは、プラスミドヌクレオチド配列内の１または複数の認識部
位でプラスミドを開裂する。したがって、プラスミドは、特定の制限エンドヌクレアーゼ
での消化によって、１または複数の特定の直鎖核酸分子の生成を可能にするように設計し
てもよい。あるいは、所定のプラスミドヌクレオチド配列は、１または複数の特定の直鎖
核酸分子の生成を可能にする１または複数の特定の制限エンドヌクレアーゼの認識部位に
ついて探索することができる。環状プラスミドまたは直鎖核酸分子内の特定の場所で開裂
する制限部位を選択することによって、前駆体核酸分子から１または複数の配列を欠損し
ている、得られる直鎖核酸分子を生成することができる。例えば、異質な核酸配列（例え
ば、ベクター骨格；選択マーカー、例えば細菌選択マーカー；および標的細胞のゲノムＤ
ＮＡに相同である不要な核酸配列）を欠損している直鎖核酸分子を生成してもよい。ある
いは、異質な核酸配列を欠損している直鎖核酸分子を合成してもよい。
【００３８】
対象とする分子が１または複数の遺伝子を含む実施形態において、その遺伝子（単数ま
たは複数）は優性または劣性対立遺伝子であってもよい。例えば、その遺伝子（単数また
は複数）は、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌抵抗性の抵抗性、真菌抵抗性、ウイルス性
病害抵抗性、雄の妊性、雄性不稔、栄養価の増大、および産業利用としてこのような形質
を与えてもよい。これらの形質および他の形質を付与する遺伝子は、当該技術分野におい
て知られ、任意の遺伝子は、本発明の方法に従って、細胞壁を含む細胞に導入してもよい
。
【００３９】
直鎖化およびナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクター：マーカー遺伝子
発現ベクターは、マーカーを含む形質転換細胞がネガティブ選択（すなわち、選択可能
なマーカー遺伝子を含まない細胞の増殖阻害）、またはポジティブ選択（すなわち、遺伝
子マーカーによってコードされる産物についてのスクリーニング）のいずれかによって回
収されるようにする例えば調節エレメントに作動可能に連結された少なくとも１つの遺伝
子マーカーを任意に含むことができる。形質転換のための多数の選択可能なマーカー遺伝
子は、当該技術分野において周知であり、例えば、限定されないが、抗生物質もしくは除
草剤であり得る選択的化学物質を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、または阻害
剤に非感受性であり得る変化した標的をコードする遺伝子を含む。また、特定のポジティ
ブ選択方法は当該技術分野において知られている。
【００４０】
ある種の核酸分子を用いた植物の形質転換に適していてもよい１つの選択可能なマーカ
ー遺伝子は、カナマイシンへの抵抗性を付与する、場合により植物調節シグナルの制御下
でネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子である。例えばFral
eyら, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 4803を参照されたい。使用してもよ
い別の選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質ハイグロマイシンへの抵抗性を付与するハ
イグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。例えば、Vanden Elzenら, (198
5) Plant Mol. Biol., 5: 299を参照されたい。
【００４１】
本発明の方法に用いてもよい追加的な選択可能なマーカー遺伝子は、細菌起源のもの、
例えば、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトラン
スフェラーゼ、アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼ、およびブレオマ
イシンなどの抗生物質に対する抵抗性を付与するものを含む。Hayfordら, (1988) Plant 
Physiol. 86: 1216; Jonesら, (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86; Svabら, (1990) Plant
Mol. Biol. 14: 197; およびHilleら, (1986) Plant Mol. Biol. 7: 171を参照されたい
。他の選択可能なマーカー遺伝子はグリホセート；グルホシネート；またはブロモキシニ
ルなどの除草剤への抵抗性を付与してもよい。Comaiら, (1985) Nature 317:741-744; Go
rdon-Kammら, (1990) Plant Cell 2:603-618; およびStalkerら, (1988) Science 242:41
9-423を参照されたい。
【００４２】
本発明の方法に用いてもよい他の選択可能なマーカー遺伝子は、細菌起源のものではな
いものを含む。これらの遺伝子は、例えば、限定されないが、マウスジヒドロ葉酸還元酵
素；植物５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素；および植物アセト乳酸合
成酵素を含む。Eichholtzら, (1987) Somatic Cell Mol. Genet. 13:67; Shahら, (1986)
Science 233:478; およびCharestら, (1990) Plant Cell Rep. 8:643を参照されたい。
【００４３】
植物の形質転換に適したマーカー遺伝子の他の種類は、抗生物質などの毒性物質への抵
抗性についての形質転換細胞の直接的な遺伝的選択よりも形質転換されたと仮定される植
物細胞のスクリーニングを必要とする場合がある。これらの遺伝子は、特定の組織におけ
る遺伝子発現の空間分布を定量または可視化するために特に有用であり、遺伝子発現の調
査のためにそれらが遺伝子または遺伝子制御配列に融合され得るため、しばしば「レポー
ター遺伝子」と称される。形質転換細胞をスクリーニングするために通常使用される遺伝
子としては、限定されないが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）；β−ガラクトシダーゼ
；ルシフェラーゼ；およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられ
る。Jefferson, (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387; Teeriら, (1989) EMBO J. 8:343
; Konczら, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84:131; およびDeBlockら, (1984) E
MBO J. 3 : 1681を参照されたい。近年、植物組織の破壊を必要としないＧＵＳ活性を可
視化するためのこれらのインビボ法が利用可能になっている。Molecular Probes publica
tion 2908 (1993) Imagene Green(商標), 1-4頁; およびNalewayら, (1991) J. Cell Bio
l. 115: 151a。
【００４４】
より最近になって、蛍光タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、
ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、およびＹＦＰ）が、原核細胞および真核細胞における遺伝子発現の
ためのマーカーとして利用されている。Chalfieら, (1994) Science 263: 802を参照され
たい。したがって、蛍光タンパク質および蛍光タンパク質の突然変異は、いくつかの実施
形態において、スクリーニング可能なマーカーとして使用され得る。
【００４５】
ナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクター：プロモーター
発現ベクターに含まれる遺伝子は、調節エレメント、例えばプロモーターを含むヌクレ
オチド配列によって駆動してもよい。プロモーターのいくつかの種類は、単独またはプロ
モーターとの組み合わせで使用され得る他の調節エレメントと同様に、形質転換の技術分
野において今や周知である。
【００４６】
プロモーターは、転写の開始点より上流であってもよく、ＲＮＡポリメラーゼおよび／
または転写を開始する他のタンパク質の認識および結合に関与してもよいＤＮＡの領域で
ある。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始できるプロモーターであり
得る。発生調節下のプロモーターの例としては、葉；根；種子；繊維；木部導管；仮導管
；または厚壁組織などのある種の組織において転写を優先的に開始するプロモーターが挙
げられる。このようなプロモーターは、「組織優先的」と称される。ある種の組織におい
てだけ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と称される。「細胞型」特異的プ
ロモーターは、１または複数の器官、例えば根または葉における維管束細胞でのある種の
細胞型において主に発現を駆動する。「誘導可能な」プロモーターは、環境制御下にある
場合があるプロモーターであり得る。誘導可能なプロモーターによる転写に影響し得る環
境条件の例としては、限定されないが、嫌気性条件または光の存在が挙げられる。組織特
異的、組織優先的、細胞型特異的、および誘導可能なプロモーターは、「非構成的」プロ
モーターの種類を構成する。「構成的」プロモーターは、大部分の環境条件下で活性であ
ってよいプロモーターである。
【００４７】
１．誘導可能なプロモーター
誘導可能なプロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得
る。場合により、誘導可能なプロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可
能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る
。誘導可能なプロモーターにより、転写速度は誘導剤に反応して増加する。
【００４８】
任意の誘導可能なプロモーターは、本発明の実施形態において用いることができる。Wa
rdら, (1993) Plant Mol. Biol. 22: 361-366を参照されたい。例示的な誘導可能なプロ
モーターは、限定されないが、銅に反応するＡＣＥＩ系由来のもの（Mettら, (1993) Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 4567-4571）；ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤に
反応するトウモロコシ由来のＩｎ２遺伝子（Hersheyら, (1991) Mol. Gen Genetics 227:
229-237; およびGatzら, (1994) Mol. Gen. Genetics 243: 32-38）；ならびにＴｎ１０
由来のＴｅｔ抑制因子（Gatzら, (1991) Mol. Gen. Genetics 227: 229-237）を含む。特
に有用な誘導可能なプロモーターは、植物が通常は反応しない誘導剤に反応するプロモー
ターであってもよい。このような例示的な誘導可能なプロモーターは、ステロイドホルモ
ン遺伝子由来の誘導可能なプロモーターであり、その転写活性はグルココルチコステロイ
ドホルモンによって誘導され得る。Schenaら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8
8: 0421。
【００４９】
２．構成的プロモーター
構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得る、
または構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得
るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。
【００５０】
様々な構成的プロモーターを、本発明の実施形態において利用することができる。例示
的な構成的プロモーターは、限定されないが、ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーターなどの
植物ウイルス由来のプロモーター（Odellら, (1985) Nature 313: 810-812）；イネアク
チン遺伝子由来のプロモーター（McElroyら, (1990) Plant Cell 2: 163-171）；ユビキ
チン（Christensenら, (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632、およびChristensenら, (
1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689）; ｐＥＭＵ（Lastら, (1991) Theor. Appl. Gene
t. 81: 581-588）; ＭＡＳ（Veltenら, (1984) EMBO J. 3:2723-2730）；トウモロコシＨ
３ヒストン（Lepetitら, (1992) Mol. Gen. Genetics 231: 276-285、およびAtanassova
ら, (1992) Plant Journal 2(3): 291-300）；ならびにＡＬＳプロモーター、Ｘｂａ１／
ＮｃｏＩ断片５’からセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子（または
前記Ｘｂａ１／ＮｃｏＩ断片と類似のヌクレオチド配列）を含む。国際ＰＣＴ公開第ＷＯ
９６／３０５３０号を参照されたい。
【００５１】
３．組織特異的または組織優先的プロモーター
組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得
る。場合により、組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可
能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る
。組織特異的プロモーターに作動可能に連結した対象とする遺伝子を用いて形質転換され
た植物は、特定の組織においてトランス遺伝子のタンパク質産物を排他的または優先的に
産生され得る。
【００５２】
任意の組織特異的または組織優先的プロモーターを、本発明の実施形態において利用す
ることができる。例示的な組織特異的または組織優先的プロモーターは、限定されないが
、例えば、ファゼオリン遺伝子由来のプロモーターなどの根優先プロモーター（Muraiら,
(1983) Science 23: 476-82、およびSengupta-Gopalanら, (1985) Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 82: 3320-4）；例えばｃａｂまたはｒｕｂｉｓｃｏ由来のプロモーターなど
の葉特異的および光誘導プロモーター（Simpsonら, (1985) EMBO J. 4(11): 2723-2729、
およびTimkoら, (1985) Nature 318: 579-82）；例えば、ＬＡＴ５２由来のプロモーター
などの葯特異的プロモーター（Twellら, (1989) Mol. Gen. Genetics 217: 240-5）、例
えば、Ｚｍ１３由来のプロモーターなどの花粉特異的プロモーター（Guerreroら, (1993)
Mol. Gen. Genetics 244: 161-8）および例えば、ａｐｇ由来のプロモーターなどの小胞
子優先的プロモーター（Twellら, (1993) Sex. Plant Reprod. 6: 217-24）を含む。
【００５３】
トランス遺伝子によって生成されるタンパク質の、葉緑体；空胞；ペルオキシソーム；
グリオキシソーム；細胞壁；もしくはミトコンドリアなどの細胞内コンパートメントへの
輸送、またはアポプラストへの分泌は、対象とするタンパク質をコードする遺伝子のシグ
ナル配列から５’および／または３’領域をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連
結することによって達成してもよい。その遺伝子の５’および／または３’末端での標的
化配列は、例えば、タンパク質合成およびプロセシング中に、コードされたタンパク質が
どこで最終的にコンパートメント化され得るかを決定することができる。代わりに、その
ような細胞内コンパートメント標的化タンパク質は、所望の細胞内コンパートメントに対
象とする核酸分子で被覆されたナノ粒子を指向するために直接ナノ粒子に連結してもよい
。
【００５４】
シグナル配列の存在は、細胞内小器官もしくは細胞内コンパートメントのいずれか、ま
たはアポプラストへの分泌にポリペプチドを指向してもよい。多数のシグナル配列が当該
技術分野において知られている。例えば、Beckerら, (1992) Plant Mol. Biol. 20: 49; 
Close, P.S., Master's Thesis, Iowa State University (1993), Knoxら, (1987) Plant
Mol. Biol. 9: 3-17; Lernerら, (1989) Plant Physiol. 91: 124-9; Fontesら, (1991)
Plant Cell 3: 483-96; Matsuokaら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 834;
Gouldら, (1989) J. Cell. Biol. 108: 1657; Creissenら, (1991) Plant J. 2: 129; K
alderonら, (1984) Cell 39: 499-509; Steifelら, (1990) Plant Cell 2: 785-93を参照
されたい。
【００５５】
外来タンパク質遺伝子および農学的遺伝子
本発明の実施形態によるトランスジェニック植物は、商業的な量で外来タンパク質を生
成し得る。したがって、形質転換された植物の選択および繁殖のための技術は、従来の方
法で収穫される複数のトランスジェニック植物を生産する。次に、外来タンパク質は対象
とする組織から、またはバイオマス全体から抽出され得る。植物バイオマスからのタンパ
ク質抽出は、例えば、HeneyおよびOrr, (1981) Anal. Biochem. 114: 92-6で検討されて
いる既知の方法によって達成され得る。
【００５６】
本発明のいくつかの態様において、外来タンパク質の商業的生産のために提供される植
物材料は、植物、植物組織、または植物細胞であってもよい。いくつかの態様において、
対象とするバイオマスは植物種子であってよい。より高レベルの発現を示すトランスジェ
ニック植物について、遺伝子地図は、例えば、組み込まれたＤＮＡ分子の近似の染色体位
置を同定する従来のＲＦＬＰ、ＰＣＲおよびＳＳＲ分析を介して作成してもよい。この点
に関する例示的な方法について、GlickおよびThompson, Methods in Plant Molecular Bi
ology and Biotechnology CRC Press, Boca Raton 269: 284 (1993)を参照されたい。染
色体位置に関する地図情報は、例えば対象のトランスジェニック植物の所有権の保護、ま
たはバイオセーフティ評価において有用であり得る。認可されていない繁殖が行われ、他
の生殖質との交雑物が作製され得る場合、組み込み領域の地図は、疑われる植物について
の同様の地図と、後者が対象の植物と共通の起源を有するかどうかを決定するために比較
され得る。地図の比較は、ハイブリダイゼーション、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ、ＳＳＲおよび配
列決定を含み得、その全ては従来型の技術である。
【００５７】
同様に、農業的遺伝子は、形質転換された細胞またはそれらの後代において発現され得
る。より具体的には、植物は、農業的目的での種々の表現型を発現するために本発明の方
法を介して遺伝子操作され得る。この点において使用され得る例示的な遺伝子として、限
定されないが、以下に分類されるものが挙げられる。
【００５８】
１．有害生物または病害への抵抗性を付与する遺伝子：
Ａ）植物の病害抵抗性遺伝子。植物の防御は、植物における病害抵抗性遺伝子（Ｒ）の
産物と病原体中の対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子の産物との間の特定の相互作用によ
ってしばしば活性化される。植物種は、特定の病原体株に抵抗性である植物を操作するた
めにクローン化された抵抗性遺伝子を用いて形質転換され得る。例えばJonesら, (1994) 
Science 266: 789（クラドスポリウム・フルバム（Cladosporium fulvum）への抵抗性の
ためのトマトＣｆ−９遺伝子のクローニング）；Martinら, (1993) Science 262: 1432（
シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）病原型への抵抗性のためのトマトＰ
ｔｏ遺伝子。トマトはプロテインキナーゼをコードする）；Mindrinosら, (1994) Cell 7
8: 1089（シュードモナス・シリンゲへの抵抗性のためのＲＳＰ２遺伝子）を参照された
い。
【００５９】
Ｂ）例えばダイズシストセンチュウ（soybean cyst nematode）などの有害生物への抵
抗性を付与する遺伝子。例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／３０５１７号；国際ＰＣＴ
公開第ＷＯ９３／１９１８１号を参照されたい。
【００６０】
Ｃ）バチルス・チューリンゲンシスタンパク質、その誘導体、またはそれをモデル化し
た合成ポリペプチド。例えば、Geiserら, (1986) Gene 48: 109（Ｂｔδ−エンドトキシ
ン遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列）を参照されたい。さらに、δ−エンド
トキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、例えばＡＴＣＣ受入番号４００９８；６７１
３６；３１９９５；および３１９９８でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入することができる。
【００６１】
Ｄ）レクチン。例えば、Van Dammeら, (1994) Plant Molec. Biol. 24: 25（いくつか
のクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列を参
照されたい）。
【００６２】
Ｅ）例えばアビジンなどのビタミン結合タンパク質。国際ＰＣＴ公開第ＵＳ９３／０６
４８７号（害虫に対する殺幼虫剤（larvicide）としてのアビジンおよびアビジン相同体
の使用）を参照されたい。
【００６３】
Ｆ）酵素阻害剤、例えばプロテアーゼもしくはプロテイナーゼ阻害剤、またはアミラー
ゼ阻害剤。例えば、Abeら, (1987) J. Biol. Chem. 262: 16793（イネシステインプロテ
イナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）；Huubら, (1993) Plant Molec. Biol. 21: 985（
タバコプロテイナーゼ阻害剤ＩをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）；Sumitaniら
, (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1243（ストレプトマイセス・ニトロスポレウ
ス（Streptomyces nitrosporeus）アルファ−アミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）お
よび米国特許第５，４９４，８１３号を参照されたい。
【００６４】
Ｇ）例えばエクジステロイドまたは幼若ホルモン、それらの変異体、それらに基づく模
倣物、またはそれらのアンタゴニストもしくはアゴニストなどの昆虫特異的ホルモンまた
はフェロモン。例えば、Hammockら, (1990) Nature 344: 458（クローン化された幼若ホ
ルモンエステラーゼ、幼若ホルモンの不活性化因子のバキュロウイルス発現）を参照され
たい。
【００６５】
Ｈ）影響を受けた有害生物の生理機能を発現によって破壊する昆虫特異的ペプチドまた
は神経ペプチド。例えば、Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269: 9（発現クローニングは
昆虫利尿ホルモン受容体をコードするＤＮＡを産出する）；およびPrattら, (1989) Bioc
hem. Biophys. Res. Comm. 163: 1243（アロスタチンはディプロプテラ パンタタ（Diplo
ptera puntata）において同定され得る）を参照されたい。米国特許第５，２６６，３１
７号（昆虫特異的な麻痺性神経毒をコードする遺伝子）も参照されたい。
【００６６】
Ｉ）天然でヘビ、スズメバチまたは任意の他の生物によって産生される昆虫特異的毒液
。例えば、Pangら, (1992) Gene 116: 165（サソリ昆虫毒性ペプチドをコードする遺伝子
の植物における異種性発現）を参照されたい。
【００６７】
Ｊ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノ
イド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質性分子の高度集積に関連する酵素。
【００６８】
Ｋ）生物学的に活性な分子、例えば天然または合成での、解糖系酵素；タンパク質分解
酵素；脂肪分解酵素；ヌクレアーゼ；シクラーゼ；トランスアミナーゼ；エステラーゼ；
ヒドロラーゼ；ホスファターゼ；キナーゼ；ホスホリラーゼ；ポリメラーゼ；エラスター
ゼ；キチナーゼ；またはグルカナーゼの翻訳後修飾を含む修飾に関与する酵素。国際ＰＣ
Ｔ公開第ＷＯ９３／０２１９７号（カルラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）を参照された
い。キチナーゼをコードする配列を含むＤＮＡ分子は、例えばＡＴＣＣから受入番号３９
６３７および６７１５２で得ることができる。Kramerら, (1993) Insect Biochem. Molec
. Biol. 23: 691（タバコイモムシキチナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
）；およびKawalleckら, (1993) Plant Molec. Biol. 21: 673（パセリｕｂｉ４−２ポリ
ユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列）も参照されたい。
【００６９】
Ｌ）シグナル伝達を刺激する分子。例えば、Botellaら, (1994) Plant Molec. Biol. 2
4: 757（リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンについてのヌクレオチド配列）；お
よびGriessら, (1994) Plant Physiol. 104: 1467（トウモロコシカルモジュリンｃＤＮ
Ａクローンのヌクレオチド配列）を参照されたい。
【００７０】
Ｍ）疎水性モーメントペプチド。例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１６７７６号（
真菌性植物病原体を抑制するタキプレシンのペプチド誘導体）；および国際ＰＣＴ公開第
ＷＯ９５／１８８５５号（病害抵抗性を付与する合成抗菌性ペプチド）を参照されたい。
【００７１】
Ｎ）膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤。例えば、Jaynesら, (1993) P
lant Sci 89: 43（青枯病菌（Pseudomonas solanacearum）に抵抗性のトランスジェニッ
クタバコ植物を提供するセクロピン−β溶解性ペプチド類似物の異種性発現）を参照され
たい。
【００７２】
Ｏ）ウイルス性侵襲性タンパク質またはそれら由来の複合毒素。例えば、形質転換され
た植物細胞におけるウイルス被覆タンパク質の蓄積は、被覆タンパク質遺伝子が由来し得
るウイルスによって、および関連するウイルスによってもたらされるウイルス感染および
／または病害の進行への抵抗性を与える。Beachyら, (1990) Ann. rev. Phytopathol. 28
: 451を参照されたい。被覆タンパク質媒介抵抗性は形質転換植物に、アルファルファモ
ザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス、ジャガイモウイル
スＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎壊疽ウイルスおよびタバ
コモザイクウイルスに対して与えられている。同文献。
【００７３】
Ｐ）昆虫特異的抗体またはそれら由来の免疫毒素。したがって、昆虫の消化管において
重要な代謝機能を標的とする抗体は、影響される酵素を不活性化し、昆虫を死滅させても
よい。Taylorら, Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microb
e Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994)（一本鎖抗体断片の生成を介するトラン
スジェニックタバコにおける酵素の不活性化）を参照。
【００７４】
Ｑ）ウイルス特異的抗体。例えば、Tavladorakiら, (1993) Nature 366: 469（組換え
抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物はウイルス攻撃から防御される）を参照さ
れたい。
【００７５】
Ｒ）病原体または寄生生物によって天然で生成される発生停止タンパク質。例えば、真
菌エンドα−１，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−
ガラクツロナーゼを可溶化することによって真菌のコロニー形成および植物栄養素の放出
を促進する。Lambら, (1992) Bio/Technology 10: 1436を参照されたい。Toubartら, (19
92) Plant J. 2: 367（マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺
伝子のクローニングおよび特徴付け）も参照されたい。
【００７６】
Ｓ）植物によって天然で生成される発生停止タンパク質。例えば、Logemannら, (1992)
Bio/Technology 10: 305（オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェ
ニック植物は真菌性病害への抵抗性が増大している）を参照されたい。
【００７７】
２．除草剤への抵抗性を付与する遺伝子
Ａ）成長点または分裂組織を阻害する、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素
などの除草剤。この分類の例示的な遺伝子は、例えば、Leeら, (1988) EMBO J. 7: 1241
、 およびMikiら, (1990) Theor. Appl. Genet. 80: 449によってそれぞれ記載される突
然変異体ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素をコードする。
【００７８】
Ｂ）例えば、突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳ
Ｐ）遺伝子（組換え核酸の導入および／または種々の形態の天然ＥＰＳＰ遺伝子のインビ
ボ突然変異誘発を介して）；それぞれａｒｏＡ遺伝子およびグリホセートアセチルトラン
スフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子；他のホスホノ化合物、例えば、ストレプトマイセス ハ
イグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス ビリジク
ロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含むストレプトマイセス種由来のグル
ホシネートホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子；およびピ
リジノキシまたはフェノキシプロプリオン酸ならびにシクロヘキソン類（ＡＣＣａｓｅ阻
害剤をコードする遺伝子）によって付与されるグリホセート抵抗性。例えば、米国特許第
４，９４０，８３５号および米国特許第６，２４８，８７６号（植物にグリホセート抵抗
性を付与し得るＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列）を参照されたい。突然変異体ａｒｏ
Ａ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受入番号３９２５６で得ることができる。
米国特許第４，７６９，０６１号（突然変異体ａｒｏＡ遺伝子のヌクレオチド配列）も参
照されたい。欧州特許出願第０３３３０３３号および米国特許第４，９７５，３７４号は
、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤への抵抗性を付与し得るグルタミン合成酵素遺伝
子のヌクレオチド配列を開示している。例示的なＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧
州出願第０２４２２４６号、およびDeGreefら, (1989) Bio/Technology 7: 61（ＰＡＴ活
性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生成）において
提供される。フェノキシプロプリオン酸、ならびにセトキシジムおよびハロキシホップな
どのシクロヘキソン類への抵抗性を付与する遺伝子の例は、Marshallら, (1992) Theor. 
Appl. Genet. 83: 435によって記載されているＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡ
ｃｃ１−Ｓ３遺伝子を含む。グリホセート抵抗性を付与できるＧＡＴ遺伝子は、例えば、
ＷＯ２００５０１２５１５に記載されている。２，４−Ｄ、ｆｏｐおよびピリジロキシオ
ーキシン除草剤への抵抗性を付与する遺伝子は、例えばＷＯ２００５１０７４３７に記載
されている。
【００７９】
Ｃ）トリアジン（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ
遺伝子）などの光合成を阻害する除草剤。例えばPrzibilaら, (1991)Plant Cell 3:169（
突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドでのクラミドモナスの形質転換）を参
照されたい。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，８１０，６４８
号に開示され、これらの遺伝子を含むＤＮＡ分子はＡＴＣＣ受入番号５３４３５；６７４
４１；および６７４４２で入手可能である。Hayesら, (1992) Biochem. J. 285: 173（グ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現）も参
照されたい。
【００８０】
３．次のような付加価値のある形質を付与するまたはそれに寄与する遺伝子
Ａ）例えば、植物のステアリン酸含有量を増加させるためにステアリルＡＣＰ不飽和化
酵素のアンチセンス遺伝子を用いて植物を形質転換することによる、修飾された脂肪酸代
謝。Knultzonら, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 2624を参照されたい。
【００８１】
Ｂ）フィチン酸塩含有量の減少。フィターゼをコードする遺伝子の導入は、フィチン酸
塩の分解を増強し、形質転換された植物により多くの遊離リン酸塩を増やしてもよい。例
えば、Van Hartingsveldtら, (1993) Gene 127: 87（クロコウジカビ（Aspergillus nige
r）フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）を参照されたい。フィチン酸塩含有量を減ら
す遺伝子を導入してもよい。例えばトウモロコシにおいて、これはクローニング、および
続く、フィチン酸の低レベルによって特徴付けられるトウモロコシ突然変異体に関与し得
る単一対立遺伝子に関連するＤＮＡの再導入によって達成され得る。Raboyら, (1990) Ma
ydica 35: 383を参照されたい。
【００８２】
Ｃ）例えば、デンプンの分枝様式を変化させる酵素をコードする遺伝子を用いて植物を
形質転換することによって生じた修飾された炭水化物組成物。例えば、Shirozaら, (1988
) J. Bacteol. 170: 810（連鎖球菌突然変異体フルクトース転移酵素遺伝子のヌクレオチ
ド配列）；Steinmetzら, (1985) Mol. Gen. Genet. 20: 220（レバンスクラーゼ遺伝子）
；Penら, (1992) Bio/Technology 10: 292（α−アミラーゼ）；Elliotら, (1993) Plant
Molec. Biol. 21: 515（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；Sogaardら
, (1993) J. Biol. Chem. 268: 22480（オオムギα−アミラーゼ遺伝子）；およびFisher
ら, (1993) Plant Physiol. 102: 1045（トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参
照されたい。
【００８３】
Ｃ．ナノ粒子
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞壁を含む細胞（例えば、植物細胞）に対象
とする直鎖核酸分子を導入する方法が提供される。いくつかの実施形態において、この方
法は、対象とする直鎖核酸分子を用いて被覆させたナノ粒子を細胞と接触させて配置し、
細胞壁を通したナノ粒子の取り込みを可能にすることを含んでもよい。具体的な実施形態
において、ナノ粒子は、可逆的にまたは不可逆的に、対象とする直鎖核酸分子を含み、そ
れで被覆され、またはその他の方法でそれに結合および／または担持してもよい。ある種
の実施形態において、対象とする直鎖核酸分子は、細胞壁を有する植物細胞との接触前に
ナノ粒子に導入され、または細胞壁を有する植物細胞にナノ粒子の導入と同時であっても
よい。本発明の実施形態において使用され得るナノ粒子の例は、限定されないが、量子ド
ットを単独で、または半導体ナノ粒子；正に帯電したナノ粒子；金ナノ粒子；金被覆ナノ
粒子；多孔性ナノ粒子；メソ多孔性ナノ粒子；シリカナノ粒子；ポリマーナノ粒子、例え
ばデンドリマー；タングステンナノ粒子；ゼラチンナノ粒子；ナノシェル；ナノコア；ナ
ノスフェア；ナノロッド；および磁気ナノ粒子と組み合わせて含む。
【００８４】
本発明の実施形態によれば、細胞壁を有する植物細胞は、損傷を受けていない細胞壁全
体を含む任意の植物細胞であってもよい。細胞壁を有する植物細胞の例は、限定されない
が、藻類；タバコ；ニンジン；トウモロコシ；キャノーラ；ナタネ；綿；パーム；ピーナ
ッツ；大豆；サトウキビ；オリザ種（Oryza sp.）；シロイヌナズナ種（Arabidopsis sp.
）；およびトウゴマ種（Ricinus sp.）を含む。本発明の実施形態は、任意の組織、また
は、限定されないが、胚；分裂組織細胞；カルス；花粉、例えば、半数体および２倍半数
体の小胞体；葉；葯；根；根端；花；種子；鞘；茎；および組織培養物を含めて、その中
に見出されるあらゆる箇所由来の細胞壁を含む細胞を含んでもよい。
【００８５】
本発明の実施形態において、対象とする直鎖核酸分子は、本発明に係る細胞壁を有する
植物細胞に送達され得る任意の核酸分子であってもよい。対象とする核酸分子は、限定さ
れないが、ＤＮＡ；ＲＮＡ；ＲＮＡｉ分子；遺伝子；プラスミド；コスミド；ＹＡＣ；お
よびＢＡＣを含んでもよい。対象とする核酸分子は、細胞壁を有する植物細胞に、例えば
、限定されないが、ポリペプチド；酵素；ホルモン；糖ペプチド；糖類；脂肪；シグナル
伝達ペプチド；抗体；ビタミン；メッセンジャー；セカンドメッセンジャー；アミノ酸；
ｃＡＭＰ；薬剤；除草剤；殺菌剤；抗生物質；および／またはそれらの組み合わせと同時
に導入してもよい。
【００８６】
本発明の具体的な実施形態において、ナノ粒子の表面は、例えば、標的化された取り込
みを可能にできるように、またはナノ粒子の表面への他の物質の可逆的もしくは不可逆的
結合を可能にできるように官能化してもよい。非限定的な例として、ナノ粒子（例えば、
量子ドット）の表面は、例えば、さらに官能化または誘導体化され得るアルカンチオレー
トの自己集合化単分子層で官能化してもよい。さらなる非限定的な例において、ナノ粒子
の表面は、それ自体がさらに官能化または誘導体化され得るリンカーを用いて誘導体化し
てもよい。一実施形態において、ナノ粒子はＰＥＧ化してもよい。他の実施形態において
、ナノ粒子は、１または複数のコア（活性もしくは不活性）；ステリック被覆（活性もし
くは不活性）；切断可能な結合および／または標的化分子もしくはリガンドを含んでもよ
く、またはそれで多官能化してもよい。
【００８７】
量子ドットなどのナノ粒子は、Dubertretら, (2002) Science 298: 1759のプロトコー
ルを用いて、または当業者の裁量に従ってそれから修飾されたプロトコールによって、Ｐ
ＥＧにより官能化してもよい。例えば、ＴＯＰＯ（トリ−オクチルホスフィンオキシド）
被覆されたＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットをクロロホルム中のＰＥＧ−ＰＥとともに懸濁し
、次に、溶媒の蒸発、および得られたＰＥＧ化量子ドットを水に可溶化してもよい。
【００８８】
本発明の態様において、ナノ粒子は、細胞の様々な部分に取り込まれ得る。ナノ粒子が
取り込まれ得る位置の例は、限定されないが、細胞質ゾル；核；液胞膜；色素体；エチオ
プラスト；有色体；白色体；脂肪体；タンパク質プラスト；アミロプラスト；葉緑体；お
よび二重膜の管腔を含む。他の実施形態では、細胞壁を含む細胞へのナノ粒子の取り込み
は、シンプラスト的またはアポプラスト的経路を介して行ってもよい。
【００８９】
Ｄ．安定に形質転換された植物細胞
本発明に係る安定に形質転換された植物細胞は、ナノ粒子を媒介した形質転換によって
、対象とする直鎖核酸分子を用いて形質転換され得る任意の植物細胞であってもよい。し
たがって、植物細胞は、双子葉植物または単子葉植物から単離し、またはそこから培養し
てもよい。また、植物細胞は、植物組織または植物全体に存在してもよい。本発明に係る
双子葉植物由来の安定に形質転換された植物細胞の非制限的な例は、アルファルファ；豆
類；ブロッコリ；キャベツ；ニンジン；カリフラワー；セロリ；白菜；綿；キュウリ；ナ
ス；レタス；メロン；エンドウ；コショウ；ピーナッツ；ジャガイモ；カボチャ；ダイコ
ン；ナタネ；ホウレンソウ；大豆；スカッシュ；サトウダイコン；ヒマワリ；タバコ；ト
マト；およびスイカを含む。本発明に係る単子葉植物由来の安定に形質転換された植物細
胞の非制限的な例は、コーン；タマネギ；イネ；ソルガム；小麦；ライ麦；キビ；サトウ
キビ；オートムギ；ライ小麦；スイッチグラスおよび芝草を含む。
【００９０】
本発明に係るトランスジェニック植物は、本発明の方法によって生成される安定に形質
転換された植物細胞から再生することができる。このような植物は、任意の方法で使用ま
たは生育してもよく、対象とする核酸分子の存在が望ましい。したがって、トランスジェ
ニック植物は、とりわけ、ナノ粒子を媒介して形質転換を介した直鎖核酸分子を用いて形
質転換し、当業者に知られている任意の方法によって植え付けられ、生育されることによ
って、１または複数の所望の形質を有するように操作され得る。
【００９１】
以下の実施例は、ある種の特定の特徴および／または実施形態を例証するために提供さ
れる。これらの実施例は、例示された特定の特徴または実施形態に本発明を限定するよう
に構築してはならない。
［実施例］
【実施例１】
【００９２】
植物細胞形質転換のためのナノ粒子の調製
プラスミドＤＮＡの調製
ｐＤＡＢ３８３１プラスミドＤＮＡ（図１）を単離し、直鎖ＤＮＡ／ＰＥＧ化量子ドッ
ト（ＰＱＤ）を介した植物形質転換のために調製された。このプラスミドは、シロイヌナ
ズナユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０）によって駆動されるＰＡＴ選択可能
なマーカー遺伝子およびカッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶ）によ
って駆動されるフィラジウム黄色蛍光タンパク質遺伝子（ＰｈｉＹＦＰ）を含む。このプ
ラスミドを含む大腸菌（Escherichia coli）株を植菌し、３７℃にてアンピシリンを含む
Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス中で濁るまで増殖させた。Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍ
ｉｄ  Ｍｉｄｉ−Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＤ
ＮＡを単離した。単離されたＤＮＡを制限酵素消化により直鎖化した。制限酵素であるＫ
ｐｎＩを用いてこのＤＮＡを消化し、これにより直鎖化されたプラスミドＤＮＡをもたら
した。
【００９３】
直鎖ＤＮＡ−ＰＱＤ複合体の形成
量子ドットは、Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｐｒｉｎｇｄａｌｅ，
ＡＺ）から得られた。２ｍｇのＴＯＰＯ（トリ−オクチルホスフィンオキシド）被覆され
たＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットは、クロロホルム中の０．１５ｇｍ（５．５ｕＭｏｌ）の
ＰＥＧ−ＰＥ（１．２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−
［メトキシ−ポリ（エチレングリコール）］）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ
ｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）とともに懸濁され、次に溶媒を蒸発させ、水に可溶化さ
れた。ＰＥＧコンジュゲーションを完了し、細胞毒性から保護した。
【００９４】
ＰＱＤを直鎖プラスミドＤＮＡにコンジュゲートした。２ｍｇのＰＱＤは、４ｍｇのＨ
Ｓ−ＰＥＧ−ＯＣＨ３（Ｐｒｏｃｈｉｍｉａ，Ｚａｃｉｓｚｅ，Ｐｏｌａｎｄ）とともに
一晩約６０〜７０℃にて懸濁された。溶媒を真空オーブン中で除去した。次に、残渣を１
ｍＬの水（１８Ｍ）に懸濁させた。最終段階は、赤色の残渣からオレンジ色、光学的に澄
んだ透明な溶液への変化によって達成される。形質転換実験のためにＨ３ＣＯ−ＰＥＴ−
ＳＨ−ＱＤ上で直鎖化プラスミドＤＮＡを被覆するため、０．０２ｍｇの精製された直鎖
化プラスミドＤＮＡ（ｐＤＡＢ３８３１）は、２ｍＬの水中で得られたＰＱＤコンジュゲ
ートとともに２時間、２３℃にて暗所でインキュベートされた。Torneyら, (2007) Natur
e Nanotechnol. 2: 295-300。
【実施例２】
【００９５】
シロイヌナズナ花芽の形質転換
植物体遺伝形質転換について、ｐＤＡＢ３８３１プラスミドをＫｐｎＩ制限酵素を用い
て消化し、ＤＮＡを直鎖化した。制限酵素消化後、直鎖化されたＤＮＡは、特定の比のＰ
ＥＧ、ＱＤ、および直鎖ＤＮＡに用いられた。
【００９６】
直鎖化ＤＮＡを量子ドット、ＰＥＧと混合し、３０分間インキュベートした。次に、ナ
ノ粒子と直鎖化されたプラスミドＤＮＡ溶液からなるナノ複合体は、０．０２〜０．０４
％のＳｉｌｗｅｔ−Ｌ７７を含む水中の５％ショ糖溶液を含む作業溶液と混合した。
【００９７】
植物体形質転換のための植物材料
種子の同期された発芽は、Ｔ０植物における花発生の均質性を確実するために重要であ
る。シロイヌナズナ（A. thaliana）ｃｖ．コロンビア種子は、０．１％（ｗ／ｖ）寒天
溶液中に懸濁され、４℃にて４８時間インキュベートし、層別化を完了した。６０ｍｇの
種子を計量し、１５ｍＬチューブに移した。１３ｍＬの０．１％（ｗ／ｖ）寒天溶液を添
加し、種子が均一に分散するまでボルテックスを行った。これは、４．６ｍｇ種子／１ｍ
Ｌの０．１％（ｗ／ｖ）寒天溶液（または約２３０種子／ｍＬ）の種子溶液濃度を作製す
る。６本のチューブ（７２ｍＬ溶液）を調製し、各トレイに１８（３１／２インチ）ポッ
トを含む４平面に植え付けた。種子溶液を４℃にて４８時間インキュベートし、層別化を
完了した。各ポットは、個別に、ポットあたり１．０ｍＬの層状化種子溶液で植え付けら
れた。全てのポットを植え付けたとき、繁殖ドームをトレイに配置し、土壌水分を保持し
た。ドームを植え付け日後の５日に除いた。種子を発芽させ、植物を長日条件下（１６時
間明／８時間暗）、１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２秒の光度にて、一定の温度（２２℃）
および湿度（４０〜５０％）下でＣｏｎｖｉｒｏｎ（登録商標）（モデルＣＭＰ４０３０
およびＣＭＰ３２４４、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔ
ｅｄ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ，Ｃａｎａｄａ）において生育した。植物は
、植物を植え付けた後の１０〜１４日間、Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液、続いてＤＩ水で水を与
え、湿らせてはないが、土壌水分を保持した。植え付けの日から４週間後、花を摘み、二
番花のより均等な生育を生じさせた。植え付け後の第５週で、形質転換プロセスのために
植物を調製した。
【００９８】
植物体形質転換
シロイヌナズナ（A. thaliana）ｃｖ．コロンビアの直鎖ＤＮＡ／ＰＱＤを媒介した形
質転換は、CloughおよびBentの変更したプロトコールを用いて完了した。CloughおよびBe
nt (1998) Plant J. 16:735-43。２０ｍＬの懸濁液は、０．５ｍｇの直鎖ＤＮＡおよび４
ｎＭのＰＱＤの濃度で直鎖ＤＮＡ／ＰＱＤ複合体溶液を用いて作製され、シロイヌナズナ
植物（大部分は、いくつかの受精した長角果（fertilized silique）を有する未成熟な花
房）の処置に使用された。植物を浸漬する前に、０．０５％（ｗ／ｖ）（２５０μＬ／５
００ｍＬ）〜０．００５％の濃度にしたＳｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７を直鎖ＤＮＡ／ＰＱＤ溶
液に添加し、十分に混合した。植物の上記地上部分は、穏やかに撹拌しながら、直鎖ＤＮ
Ａ／ＰＱＤ溶液に３０秒間浸漬された。処理された植物は、それらの側に３０分間、暗く
して２２〜２４℃にて置かれた。植物は、上述される条件下、Ｃｏｎｖｉｒｏｎに移され
、成熟するまで生育させ、種子を回収した。
【００９９】
選択トレイ（１０．５’’×２１’’×１’’トレイ）を用いて、バルク回収種子をＴ
０植物からスクリーニングし、各トレイでは約１０，０００個の種子があった。２つの対
照を用いて、選択噴霧が正しく行われたことを確認した；Ｃｏｌ−０負の形質転換体対照
、および正の形質転換体対照としてＰＡＴ（ホスピノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ）選択可能なマーカーのために同型の種子でスパイクされたコロンビアＣｏｌ−０野生
型。同期を達成するために、種子は、植え付け前の４８時間、０．１％（ｗ／ｖ）寒天溶
液に層状化された。選択トレイあたり１０，０００個の種子を与えるために、２００ｍｇ
の種子を０．１％（ｗ／ｖ）寒天溶液に添加し、種子が均一に懸濁されるまでボルテック
スした。次に、層状化された種子は、ＳｕｎｓｈｉｎｅミックスＬＰ５で満たされた選択
トレイ上に植え付けられ、Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液を用いて地下潅漑された。有効である選
択噴霧について、４０ｍＬの懸濁された種子が選択トレイに均一に植え付けられることは
重要である。植え付け後、繁殖ドームを各選択トレイ上に配置し、植物を選択のために生
育した。繁殖ドームは、植え付け後の約５日で除かれた。
【実施例３】
【０１００】
形質転換されたシロイヌナズナの分析
形質転換された植物の選択
新たに回収されたＴ１種子は、室温にて７日間乾燥させた。Ｔ１種子は２６．５×５１
ｃｍの発芽トレイに植え付けられ、各々は、予め４０ｍＬの０．１％（ｗ／ｖ）アガロー
ス溶液に懸濁され、４℃にて２日間保存され、休眠要件を完了し、同期された種子発芽を
確認された、層状化されたＴ１種子の２００ｍｇアリコート（約１０，０００個の種子）
を受け入れた。
【０１０１】
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  ＬＰ５は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでＨｏ
ａｇｌａｎｄ溶液で地下潅漑され、次に重力排水された。層状化された種子の各４０ｍＬ
アリコートは、ピペットを用いてバーミキュライトに均一に植え付けられ、４〜５日間、
湿式ドームで覆われた。ドームは、グルホシネートの発芽後噴霧を用いて、初期の形質転
換体の選択前１日に取り除かれた。
【０１０２】
植え付け後の７日（ＤＡＰ）に、Ｔ１植物（それぞれ子葉および２−４−ｌｆ段階）は
、１塗布あたり２８０ｇ  ａｅ／ｈａグルホシネートの有効速度で送達するために、Ｄｅ
Ｖｉｌｂｉｓｓ圧縮された空気噴霧チップを用いて、１０ｍＬ／トレイ（７０３Ｌ／ｈａ
）の噴霧体積で、Ｌｉｂｅｒｔｙ除草剤（２００ｇ  ａｅ／Ｌグルホシネート、Ｂａｙｅ
ｒ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）の０．２％（ｗ／ｖ
）溶液を用いて５日以内に連続して５回噴霧された。生き残ったもの（活性に生育してい
る植物）は、最終噴霧後の４〜７日に同定され、鉢植え媒体（Ｍｅｔｒｏ  Ｍｉｘ  ３６
０）を用いて調製された３インチのポットに個別に移された。移された植物は、３〜４日
間、湿式ドームで覆われ、以前の通り２２℃の生育チャンバーに置かれ、または温室に直
接移された。ドームは、その後、取り出され、植物は、温室（２２±５℃、５０±３０％
ＲＨ、１４時間明：１０時間暗、最小５００μＥ／ｍ２ｓ１自然＋追加の光）内で生育さ
れた。
【０１０３】
分子分析および生化学分析
分子分析は、植物ゲノムへのＰＡＴおよびＹＦＰ組み込みについて行われた。ＰＣＲ増
幅産物を配列決定し、トランス遺伝子配列と比較された。
【０１０４】
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ｃｖコロンビア）のＴ１後代におけるトラ
ンス遺伝子のゲノム組み込みのための分子分析および証拠
シロイヌナズナ（A. thaliana）トランスジェニック植物由来のゲノムＤＮＡは、製造
業者の指示書に従って、植物ＤＮＡＺＯＬ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、
６週齢の植物の葉材料から抽出された。ＰＣＲプライマーは、ＹＦＰおよびＰＡＴトラン
ス遺伝子を検出するために設計された。ＹＦＰプライマーは配列番号１および配列番号２
として示される。ＰＡＴプライマーは配列番号３および配列番号４として示される。
【０１０５】
トランス遺伝子のｇＤＮＡ  ＰＣＲ増幅
ＰＡＴおよびＹＦＰについてのＰＣＲ増幅反応は、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ（商標）
キット（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて完了された。遺伝
子産物は、５０μＬの全反応体積において増幅された。ＰＣＲ反応は、１００ｎｇゲノム
ＤＮＡ鋳型、１×ＥｘＴａｑ反応緩衝液、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１０ｐＭｏｌの各プラ
イマー、および０．０２５単位／μＬのＥｘＴａｑを含んだ。以下のＰＣＲ条件を用いた
：９６℃で５分間の１サイクル、および以下の条件：９４℃で１５秒間、６５℃で３０秒
間、７２℃で１分間、および最終伸長７２℃で７分間の３１サイクル。ＰＣＲ増幅産物は
、０．８％ＴＡＥアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色に
よって視覚化された。ＤＮＡ断片は、ＱＩＡＥＸ（商標）ＩＩゲル精製キット（Ｑｉａｇ
ｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、アガロースゲルから精製された。
【０１０６】
ＰＣＲ断片は、高度なＳａｎｇｅｒ配列決定技術（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｕｎｔ
ｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、ＰＡＴフォワードプライマー（配列番号３）とＹＦＰフ
ォワードプライマー（配列番号１）により配列決定された。配列データは、Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｈｅｒソフトウェアを用いて分析された。
【０１０７】
ＰＡＴおよびＹＦＰのＰＣＲアンプリコンの配列決定結果は、これらの遺伝子について
予期されたヌクレオチド配列と合致していた。これらの結果は、ｐＤＡＢ３８３１からの
ＰＡＴ配列およびＹＦＰ配列は、ＰＥＧ化量子ドットおよび直鎖ＤＮＡ形質転換プロトコ
ールを用いて、シロイヌナズナのｇＤＮＡに安定に組み込まれたことを明示する。
【０１０８】
ＰＡＴおよびＹＦＰ（黄色蛍光タグ、Ｅｖｒｏｇｅｎ）遺伝子産物についてのＰＣＲは
、１００ｎｇのゲノム鋳型ＤＮＡ、１×ＥｘＴａｑ反応緩衝液（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ）
、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌのプライマー、および０．０２５単位／μＬのＥ
ｘＴａｑを含む、全反応体積が５０μＬの混合物において増幅された。以下のＰＣＲ条件
を用いた：９６Ｃで５分間の１サイクル、および以下のＰＣＲプログラム：９４℃で１５
秒間；６５℃で３０秒間；７２℃での１分間の３１サイクル。最終伸長は、７２℃で７分
間行い、ＰＣＲ産物の合成を完了した。ゲル画像は、ＢｉｏＲａｄゲルイメージングシス
テムを用いて得られた。図１および２。増幅された断片は、製造業者の指示書に従って、
ゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いてゲル精製された。
【０１０９】
ＰＣＲ断片は、高度のＳａｎｇｅｒ配列決定技術（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＰＡＴフォワードプライマーおよびＹＦＰフォワードプラ
イマーにより配列決定され、配列はＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェア（カンパニー）を
用いて分析された。
【０１１０】
本結果は、ＰＡＴおよびＹＦＰ配列が実施例１における正に帯電したナノ粒子を媒介し
た直鎖化ＤＮＡ送達を通じて送達され、したがって、シロイヌナズナのＴ１植物のゲノム
ＤＮＡにおけるトランス遺伝子の安定なゲノム組み込みの証拠を与えることを明示する。
【実施例４】
【０１１１】
培養植物細胞への直鎖核酸分子のナノ粒子を媒介した送達
単一細胞植物材料を調製する。
例えば、ＢＹ２細胞およびＮＴ１細胞の両方を用いる。ＢＹ２細胞は、緑色でない、増
殖が速いタバコ細胞株である。ＮＴ１細胞は、タバコから単離された光独立栄養細胞であ
る。形質転換の３から４日前、１週齢の懸濁培養は、２５０ｍＬフラスコに５０ｎＭのＤ
ＡＳ−ＰＭＴＩ−１（微小管阻害剤）および０．５〜０．１％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含
む４０ｍｌのＮＴ１ＢまたはＬＳＢＹ２培地に、２ｍｌのＮＴ１またはＢＹ２培養物を移
すことによって、新鮮な培地に継代培養される。単一細胞は、微小管阻害剤処理後の４日
または７日のいずれかで回収される。使用されるＢＹ２単一細胞は、生存細胞をカウント
するために、Ｂｅｃｋｍａｎフローサイトメータにより処理される。細胞は、単一細胞が
細胞の細胞質を通じて分布した大多数の色素体（アミロプラスト）を含むことを決定する
ために、共焦点画像システムに接続された微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用い
て調べられる。細胞は、３．０ＯＤ６００の懸濁液１ｍＬを移すことによって、１４日ご
とに一度継代培養される。形質転換の標的細胞として培養細胞が用いられる。
【０１１２】
ナノ粒子調製および細胞の処理
プラスミドＤＮＡは、直鎖ＤＮＡ／ＰＥＧ化された量子ドット（ＰＱＤ）を媒介した植
物形質転換のために単離および調製される。プラスミドは、シロイヌナズナユビキチン１
０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０）によって駆動されるＰＡＴ選択可能なマーカー遺伝子
、およびカッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶ）によって駆動される
フィラジウム黄色蛍光タンパク質遺伝子（ＰｈｉＹＦＰ）を含む。プラスミドを含む大腸
菌（Escherichia coli）株は植菌され、３７℃にてアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅ
ｒｔａｎｉブロス中で濁るまで増殖される。ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  
Ｍｉｄｉ−Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離され
る。単離されたＤＮＡは、制限酵素消化を介して直鎖化される。制限酵素であるＫｐｎＩ
を用いてＤＮＡを消化し、それにより直鎖化されたプラスミドＤＮＡをもたらす。
【０１１３】
量子ドットは、Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｐｒｉｎｇｄａｌｅ，
ＡＺ）から得られる。２ｍｇのＴＯＰＯ（トリ−オクチルホスフィンオキシド）被覆され
たＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットは、クロロホルム中の０．１５ｇｍ（５．５ｕＭｏｌ）の
ＰＥＧ−ＰＥ（１．２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−
［メトキシ−ポリ（エチレングリコール）］）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ
ｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）とともに懸濁され、次に溶媒を蒸発させ、水に可溶化さ
れる。ＰＥＧコンジュゲーションを完了し、細胞毒性から保護する。
【０１１４】
ＰＱＤを直鎖プラスミドＤＮＡにコンジュゲートする。２ｍｇのＰＱＤは、４ｍｇのＨ
Ｓ−ＰＥＧ−ＯＣＨ３（Ｐｒｏｃｈｉｍｉａ，Ｚａｃｉｓｚｅ，Ｐｏｌａｎｄ）とともに
一晩約６０〜７０℃にて懸濁される。溶媒を真空オーブン中で除去する。次に、残渣を１
ｍＬの水（１８Ｍ）に懸濁させる。最終段階は、赤色の残渣からオレンジ色、光学的に澄
んだ透明な溶液への変化によって達成される。形質転換実験のためにＨ３ＣＯ−ＰＥＴ−
ＳＨ−ＱＤ上で直鎖化プラスミドＤＮＡを被覆するため、０．０２ｍｇの精製された直鎖
化プラスミドＤＮＡ（ｐＤＡＢ３８３１）は、２ｍＬの水中で得られたＰＱＤコンジュゲ
ートとともに２時間、２３℃にて暗所でインキュベートされる。Torneyら, (2007) Natur
e Nanotechnol. 2: 295-300。
【０１１５】
１〜３μＬ／ｍＬのＰＱＤの濃度は、２４ウェルマイクロタイタープレート中の５００
μＬの細胞に添加され、２０分間、暗所で振とう機上で穏やかに回転させる。ナノ粒子は
細胞壁を通じて運搬される。
【実施例５】
【０１１６】
多官能化されたナノ粒子を媒介したシロイヌナズナの植物体形質転換
シロイヌナズナについての植物体形質転換は、CloughおよびBent(1998)から修飾された
ものを用いて行うことができる。多官能化されたナノ粒子上のＤＮＡ、ならびにホーミン
グタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）およびＮＬＳ単位の分子の濃度は、形質転換効
率の増加を達成するために最適化される。
【０１１７】
植物材料：健康なシロイヌナズナ植物は、開花するまで土壌において、ポットに入れて
長日下で生育される。第１の束は刈り取られ、多数の第２の束の増殖を促す。植物は、刈
り取られた後のおよそ４〜６日で準備される。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
・コロンビア（Ｃｏｌ−０）生態型は、花の植物体形質転換のためにバックグラウンド（
Ｔ０植物）として選択される。種子の同調された発芽は、Ｔ０植物における花芽発生の均
質性を確実にするために重要である。野生型種子は、０．１％寒天溶液に懸濁され、４℃
にて４８時間インキュベートし、層別化を完了する。薬包紙上で６０ｍｇの種子を計量し
、１５ｍＬチューブに移す。１３ｍＬの０．１％寒天溶液を添加し、種子が均一に分散す
るまでボルテックスを行う。これは、４．６ｍｇ種子／１ｍＬ溶液（または約２３０種子
／ｍＬ）の濃度を作製する。６本のチューブ（７２ｍＬ溶液）を調製し、各トレイに１８
（３１／２インチ）ポットを含む４平面に植え付け、全２ポットを植え付ける。溶液を４
℃にて４８時間インキュベートし、層別化を完了する。各ポットは、個別に、ポットあた
り１．０ｍＬの層状化種子溶液で植え付けられる。全てのポットを植え付けたとき、繁殖
ドームをトレイに配置し、土壌水分を保持する。ドームを植え付け日後の５日に除く。種
子を発芽させ、植物を長日条件下（１６時間明／８時間暗）、１２０〜１５０μｍｏｌ／
ｍ２秒の光度にて、一定の温度（２２℃）および湿度（４０〜５０％）下でＣｏｎｖｉｒ
ｏｎ（登録商標）（モデルＣＭＰ４０３０およびＣＭＰ３２４４、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ，
Ｃａｎａｄａ）において生育する。植物は、植物を植え付けた後の１０〜１４日間、Ｈｏ
ａｇｌａｎｄ溶液、続いてＤＩ水で水を与え、湿らせてはないが、土壌水分を保持する。
植え付けの日から４週間後、花を摘み、二番花のより均等な生育を生じさせる。植え付け
後の第５週で、形質転換プロセスのために植物を調製する。
【０１１８】
花の処理のためのナノコンジュゲート調製：２〜１２０ｎｍサイズ範囲のナノ粒子／量
子ドットは処置のために選択され、Derufusら(2007)に従って、断片精製されたｐＤＡＢ
３１３８およびホーミングペプチド単位を用いて多官能化される。６５５または７０５ｎ
ｍの発光極大を有し、ＰＥＧおよびアミノ基を用いて修飾された量子ドットは、Ｑｕａｎ
ｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＩＴＫアミノ）から得られる。ＱＤ濃度は、
供給者によって提供される減衰係数を用いて、５９５ｎｍでの光学的吸収によって測定さ
れる。使用される架橋剤は、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６−（３
’−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート）（Ｐｉｅｒｃｅ）お
よびスルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ
キサン−１−カルボキシレート）（Ｓｉｇｍａ）である。アミノ修飾されたＱＤは、スル
ホ−ＬＣ−ＳＰＤＰおよびスルホ−ＳＭＣＣ架橋剤を用いて、チオールを含むプラスミド
ＤＮＡおよびホーミングペプチドにコンジュゲートされる。ＱＤは、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌ
ｔｒａ−４（１００ｋＤａカットオフ）フィルターを用いて、５０ｍＭリン酸ナトリウム
、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２に再懸濁される。架橋剤（１０００倍過剰）を
ＱＤに添加し、１時間反応させる。試料は、１０ｍＭのＥＤＴＡを補足された類似の緩衝
液にＮＡＰ−５重力カラム（過剰の架橋剤を除去するため）上で濾過される。直鎖化プラ
スミドＤＮＡ、ｐＤＡＢ３８３１は、０．１ＭのＤＴＴを用いて１時間処理され、ＥＤＴ
Ａ含有緩衝液にＮＡＰ−５カラム上で濾過される。ペプチドは、典型的には、凍結乾燥粉
末から使用される。ペプチドおよび直鎖化プラスミドＤＮＡは、濾過されたＱＤに添加さ
れ、一晩４℃にて反応させる。３つのＡｍｉｃｏｎフィルターを用いて、生成物は、Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回、高塩緩衝液（１．０Ｍ塩化ナトリ
ウム、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）で２回、ＰＢＳでさらに２回濾過さ
れる。高塩洗浄は、ＰＢＳ洗浄だけでは取り除かれない、静電的に結合されたＤＮＡおよ
びペプチドを除くために必要とされる。スルホ−ＳＭＣＣは、１つの末端に、アミド結合
を形成するために、アミノ修飾されたＱＤと反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ
ＨＳ）エステルを有し、他の末端に、チオエーテルを形成するために、チオール化された
プラスミドＤＮＡと反応するマレイミド基を有する。また、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰは、
任意の１級アミン含有分子と急速に反応して、安定なアミド結合を形成するアミン反応性
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含む。
【０１１９】
植物体形質転換およびＴ１抵抗性植物のスクリーニング：最終体積が２５０〜５００ｍ
Ｌの懸濁液は、ナノ粒子、ホーミングペプチドおよびプラスミドＤＮＡ（ＮＨｐＤ）コン
ジュゲート溶液を用いて作製され、次にシロイヌナズナ植物（大部分は、いくつかの受精
した長角果を有する未成熟な花房）を処置に用いる。植物を浸漬する前に、０．０５％（
２５０ｕｌ／５００ｍl）〜０．００５％の濃度にしたＳｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７をＮＨｐ
Ｄコンジュゲート溶液に添加し、十分に混合する。植物の上記地上部分は、穏やかに撹拌
しながら、ＮＨｐＤコンジュゲート溶液に２〜３０秒間浸漬される。処理された植物は、
１６〜２４時間、２２〜２４℃にてドームまたはカバー下に保持される。植物は、Ｃｏｎ
ｖｉｒｏｎに移され、成熟するまで生育させ、種子を回収する。選択トレイ（１０．５’
’×２１’’×１’’トレイ）を用いて、バルク回収種子をＴ０植物からスクリーニング
し、各トレイでは約１０，０００個の種子がある。２つの対照を用いて、選択噴霧が正し
く行われたことを確認する、Ｃｏｌ−０負の形質転換体対照、および正の形質転換体対照
としてＰＡＴ（ホスピノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）選択可能なマーカーのた
めに同型の種子でスパイクされたコロンビアＣｏｌ−０野生型。同期を達成するために、
種子は、植え付け前の４８時間、０．１％（ｗ／ｖ）寒天溶液に層状化される。選択トレ
イあたり１０，０００個の種子を与えるために、２００ｍｇの種子を０．１％（ｗ／ｖ）
寒天溶液に添加し、種子が均一に懸濁されるまでボルテックスする。次に、層状化された
種子は、ＳｕｎｓｈｉｎｅミックスＬＰ５で満たされた選択トレイ上に植え付けられ、Ｈ
ｏａｇｌａｎｄ溶液を用いて地下潅漑される。有効である選択噴霧について、４０ｍＬの
懸濁された種子が選択トレイに均一に植え付けられることは重要である。植え付け後、繁
殖ドームを各選択トレイ上に配置し、先に言及した条件を用いた選択のために、種子を生
育する。繁殖ドームは、植え付け後の約５日で除かれる。苗木は、植え付け後の５日、さ
らに植え付け、苗木噴霧後の１０日に、１塗布あたり２８０ｇ／ｈａグルホシネートの有
効速度で送達するために、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ圧縮された空気噴霧チップを用いて、１０
ｍＬ／トレイ（７０３Ｌ／ｈａ）の噴霧体積中のグルホシネートアンモニウム（Ｂａｙｅ
ｒ  ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅｓからのＬＩＢＥＲＴＹ（登録商標）除草剤）の０．２％（
ｖ／ｖ）溶液（２０μｌ／１０ｍｌ  ｄＨ２Ｏ）を用いて噴霧される。調製するためのＬ
ｉｂｅｒｔｙ（登録商標）の量は以下のように計算される：（７０３Ｌ／ｈａ噴霧体積＝
２８０ＧＰＡ）。（２８０ｇ  ａｉ／ｈａ）×（１ｈａ／７０３Ｌ）×（１Ｌ／２００ｇ
ａｉグルホシネート）＝０．２０％溶液（または２０μＬ／１０ｍＬ）。１０ｍＬの溶
液は、噴霧されるべき各トレイのために２０ｍＬシンチレーションバイアルにピペットで
入れる。噴霧は、水平および垂直の塗布パターンを用いて送達される。第２の噴霧後の４
〜７日に、除草剤抵抗性植物を同定する。
【図１】
2019176872.tif 000002
【図２】
2019176872.tif 000003
【図３】
2019176872.tif 000004
【配列表】
2019176872000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月27日(2019.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象とする直鎖核酸分子を、細胞壁を有する植物細胞に導入する方法であって、
細胞壁を有する植物細胞を用意する工程、
対象とする直鎖核酸分子でナノ粒子を被覆する工程であって、前記ナノ粒子が、ポリエチレングリコールで被覆されている、工程、
細胞壁を有する植物細胞と被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程、ならびに
細胞壁を含む前記細胞への前記ナノ粒子および前記対象とする直鎖核酸分子の取り込みを行わせる工程であって、前記取り込みが、前記細胞の前記細胞壁を通した前記ナノ粒子および前記対象とする直鎖核酸分子の移動を意味し、前記移動が、前記粒子が取り込まれる細胞以外の何かによって前記粒子に与えられるモーメントの結果として単独に生じるものではない、工程を含む方法。
【請求項２】
細胞壁を含む植物細胞のコンパートメントへナノ粒子を取り込ませることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞内コンパートメント標的化タンパク質でナノ粒子を被覆することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
コンパートメントが、細胞質ゾル、核、液胞膜、色素体、エチオプラスト、有色体、白色体、脂肪体、タンパク質プラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の管腔からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞壁を有する植物細胞が、市販の作物種由来の植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、キャノーラ、ナタネ、綿、パーム、ピーナッツ、大豆、オリザ種、シロイヌナズナ種、トウゴマ種、およびサトウキビ細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、鞘および茎からなる群から選択される組織由来である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
細胞壁を有する植物細胞が、培養細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ナノ粒子が、半導体ナノ粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
半導体ナノ粒子が量子ドットである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ナノ粒子の表面を誘導体化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
対象とする直鎖核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、および遺伝子からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
対象とする直鎖核酸分子が遺伝子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子が、外来タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象とする直鎖核酸分子が、ヌクレアーゼでの核酸分子の消化から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ヌクレアーゼで消化された核酸分子が、プラスミド、コスミド、人工染色体、酵母人工染色体、および細菌人工染色体からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象とする直鎖核酸分子を安定に組み込んでいる細胞を選択することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
選択された細胞が再生可能な細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
再生可能な細胞から植物を再生することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象とする直鎖核酸分子を植物材料に導入する方法であって、
植物細胞、植物組織、および植物からなる群から選択される植物材料を用意する工程、
ナノ粒子をポリエチレングリコールで被覆する工程、
ナノ粒子を対象とする直鎖核酸分子で被覆する工程、
細胞壁を有する植物細胞と被覆されたナノ粒子を互いに接触させる工程、ならびに
植物材料へのナノ粒子および対象とする直鎖核酸分子の取り込みを行わせる工程であって、前記取り込みが、前記細胞の前記細胞壁を通した前記ナノ粒子および前記対象とする直鎖核酸分子の移動を意味し、前記移動が、前記粒子が取り込まれる細胞以外の何かによって前記粒子に与えられるモーメントの結果として単独に生じるものではない、工程を含む方法。
【請求項２１】
植物材料が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、鞘および茎からなる群から選択される植物組織である、請求項２０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本開示は以下の［１］から［２４］を含む。
［１］対象とする直鎖核酸分子を、細胞壁を有する植物細胞に導入する方法であって、
細胞壁を有する植物細胞を用意する工程、
対象とする直鎖核酸分子でナノ粒子を被覆する工程、
細胞壁を有する植物細胞と被覆されたナノ粒子とを互いに接触させて配置する工程、ならびに
細胞壁を含む細胞へのナノ粒子および対象とする直鎖核酸分子の取り込みを可能にする工程を含む方法。
［２］ナノ粒子が、ポリエチレングリコールで被覆されている、上記［１］に記載の方法。
［３］細胞壁を含む植物細胞のコンパートメントへのナノ粒子の取り込みを可能にすることをさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［４］細胞内コンパートメント標的化タンパク質でナノ粒子を被覆することをさらに含む、上記［３］に記載の方法。
［５］コンパートメントが、細胞質ゾル、核、液胞膜、色素体、エチオプラスト、有色体、白色体、脂肪体、タンパク質プラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の管腔からなる群から選択される、上記［４］に記載の方法。
［６］細胞壁を有する植物細胞が、市販の作物種由来の植物細胞である、上記［１］に記載の方法。
［７］植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、キャノーラ、ナタネ、綿、パーム、ピーナッツ、大豆、オリザ種、シロイヌナズナ種、トウゴマ種、およびサトウキビ細胞からなる群から選択される、上記［６］に記載の方法。
［８］植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、鞘および茎からなる群から選択される組織由来である、上記［６］に記載の方法。
［９］細胞壁を有する植物細胞が、培養細胞である、上記［１］に記載の方法。
［１０］ナノ粒子が、半導体ナノ粒子である、上記［１］に記載の方法。
［１１］半導体ナノ粒子が量子ドットである、上記［１０］に記載の方法。
［１２］ナノ粒子の表面を誘導体化することをさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［１３］対象とする直鎖核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、および遺伝子からなる群から選択される核酸配列を含む、上記［１］に記載の方法。
［１４］対象とする直鎖核酸分子が遺伝子を含む、上記［１３］に記載の方法。
［１５］遺伝子が、外来タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、上記［１４］に記載の方法。
［１６］対象とする直鎖核酸分子が、ヌクレアーゼでの核酸分子の消化から得られる、上記［１］に記載の方法。
［１７］ヌクレアーゼで消化された核酸分子が、プラスミド、コスミド、人工染色体、酵母人工染色体、および細菌人工染色体からなる群から選択される、上記［１６］に記載の方法。
［１８］対象とする直鎖核酸分子を安定に組み込んでいる細胞を選択することをさらに含む、上記［１３］に記載の方法。
［１９］選択された細胞が再生可能な細胞である、上記［１８］に記載の方法。
［２０］再生可能な細胞から植物を再生することをさらに含む、上記［１９］に記載の方法。
［２１］対象とする直鎖核酸分子を植物材料に導入する方法であって、
植物細胞、植物組織、および植物からなる群から選択される植物材料を用意する工程、
ナノ粒子をポリエチレングリコールで被覆する工程、
ナノ粒子を対象とする直鎖核酸分子で被覆する工程、
細胞壁を有する植物細胞と被覆されたナノ粒子を互いに接触させて配置する工程、ならびに
植物材料へのナノ粒子および対象とする直鎖核酸分子の取り込みを可能にする工程を含む方法。
［２２］植物材料が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、鞘および茎からなる群から選択される植物組織である、上記［２１］に記載の方法。
［２３］形質を植物に遺伝子移入するための方法であって、
植物細胞を用意する工程、
ポリエチレングリコールでナノ粒子を被覆する工程、
植物に形質を発現させるための手段でナノ粒子を被覆する工程、
植物細胞と被覆されたナノ粒子を互いに接触させて配置する工程、
植物細胞へのナノ粒子および植物に形質を発現させるための手段の取り込みを可能にする工程、
形質転換された植物細胞から植物全体を再生する工程、ならびに
植物を繁殖させる工程を含む方法。
［２４］形質が、対象とするタンパク質の発現、雄性不稔、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌性病害に対する抵抗性、真菌性病害に対する抵抗性、およびウイルス性病害に対する抵抗性からなる群から選択される、上記［２３］に記載の方法。
本明細書において、細胞壁を有する植物細胞に、対象とする分子を導入するためのナノ粒子および直鎖化された核酸分子を使用するための方法および組成物が記載されている。本開示の方法のいくつかの実施形態は、安定に形質転換され、遺伝子修飾された稔性植物を生成するために用いてもよい。いくつかの実施形態では、直鎖核酸分子の特徴的性質は、トランスジェニック標的生物用の制御結果を有する場合がある異質な核酸配列なしに、対象とする特異的遺伝子配列の送達を可能にする。
【外国語明細書】
2019176872000001.pdf