(57)【要約】      （修正有）【課題】操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度でＣ７９７Ｓ変異の検出を可能にする、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キット、及びヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法の提供。【解決手段】ヒトＥＧＦＲのｃＤＮＡの相補鎖側に対応する配列番号２（agtccaggaggＧagcc）に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ。
【請求項２】
前記蛍光色素が、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、及びポリメチン色素誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ、並びに、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のいずれかを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットを含む、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キット。
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は、
（ｉｉｉ）配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用フォワードプライマーを更に含む、請求項３に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キット。
【請求項５】
請求項１又は請求項２に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブを試料中の一本鎖核酸と接触させて、前記ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させること、
前記ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、
前記シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドのＴｍ値を決定すること、及び、
前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の変異の存在を検出すること、
を含む、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法。
【請求項６】
前記一本鎖核酸が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のいずれかを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットを用いたＰＣＲにより得られた二本鎖核酸を解離した産物である、請求項５に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法。
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は、
（ｉｉｉ）配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記一本鎖核酸が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のいずれかを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセット、並びに、配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用フォワードプライマーを用いたＰＣＲにより得られた二本鎖核酸を解離した産物である、請求項５に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法。
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は、
（ｉｉｉ）配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記試料が、全血、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪、毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液、又はこれらの懸濁液である、請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キット、及びヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）は、肺癌等の癌において重要な役割を果たすことから、ＥＧＦＲの機能を抑制して癌を治療することを目的とする薬剤が開発されている。そのような薬剤としては、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられ、例えばエルロチニブ、ゲフィチニブ、及びＡＺＤ９２９１などが知られている。
しかし、近年、ヒトＥＧＦＲにおけるある種の変異が、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を付与することが報告されており、例えば、ヒトＥＧＦＲにおけるＣ７９７Ｓ変異は、ＡＺＤ９２９１に耐性を示すことが報告されている（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ.（２００８）  ４１５,１９７−２０６
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１, ５６０−５６２（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
癌の治療剤としてヒトＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を投与する前に、対象の患者においてＥＧＦＲにＣ７９７Ｓ変異を有するか否かを調べることは、適切な治療を提供する観点から有効であると考えられる。
しかしながら、非特許文献１では、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異をダイレクトシークエンス法で検出しており、ダイレクトシークエンス法には、変異の検出感度が低いという問題がある。
また、非特許文献２では、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異の検出にｄｄＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ）及びＮＧＳ（次世代シーケンシング）の技術を用いているため、変異を高感度で検出できるものの、操作が煩雑で、高価な装置（すなわち、ｄｄＰＣＲ装置及びＮＧＳ装置）を必要とする問題がある。
【０００５】
本開示は、上記に鑑みてなされたものであり、操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度でＣ７９７Ｓ変異の検出を可能にする、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キット、及びヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法の提供を目的とし、該目的を達成することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための手段は以下のとおりである。
＜１＞  配列番号２に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ。
＜２＞  前記蛍光色素が、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、及びポリメチン色素誘導体からなる群から選択される、＜１＞に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ。
＜３＞  ＜１＞又は＜２＞に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ、並びに、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のいずれかを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットを含む、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キット。（ｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は、（ｉｉｉ）配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
＜４＞  配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用フォワードプライマーを更に含む、＜３＞に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キット。
＜５＞  ＜１＞又は＜２＞に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブを試料中の一本鎖核酸と接触させて、前記ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させること、前記ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、前記シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドのＴｍ値を決定すること、及び、前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の変異の存在を検出すること、を含む、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法。
＜６＞  前記一本鎖核酸が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のいずれかを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットを用いたＰＣＲにより得られた二本鎖核酸を解離した産物である、＜５＞に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法。（ｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は、（ｉｉｉ）配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
＜７＞  前記一本鎖核酸が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のいずれかを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセット、並びに、配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用フォワードプライマーを用いたＰＣＲにより得られた二本鎖核酸を解離した産物である、＜５＞に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法。（ｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は、（ｉｉｉ）配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
＜８＞  前記試料が、全血、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪、毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液、又はこれらの懸濁液である、＜５＞〜＜７＞のいずれか１つに記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法。
【発明の効果】
【０００７】
本開示によれば、操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度でＣ７９７Ｓ変異の検出を可能にする、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キット、及びヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（Ａ）は核酸混合物の融解曲線の一例を示すグラフであり、（Ｂ）は核酸混合物の微分融解曲線の一例を示すグラフである。
【図２】ヒトＥＧＦＲのＤＮＡ配列におけるプローブ及びプライマー（セット）の位置関係を模式的に示した図である。
【図３】ヒトＥＧＦＲの野生型のヌクレオチド配列を有するテンプレート（ＷＴ、配列番号１６）、又はヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異を含むヌクレオチド配列を有するテンプレート（Ｍｔ、配列番号１７）に対する、プローブ（配列番号１及び配列番号２）のＴｍ値を示す図である。
【図４】配列番号１及び配列番号２のプローブの検出感度を示す図である。
【図５】プローブＲ１（配列番号１）を用いた場合の、配列番号３及び５、配列番号３及び６、配列番号４及び５、配列番号４及び６、配列番号７及び８、配列番号７及び１０、配列番号８及び９、又は配列番号９及び１０の各リバースプライマーセットを使用した場合におけるＴｍ値を示す図である。
【図６】プローブＲ２（配列番号２）を用いた場合の、配列番号７及び８、配列番号７及び１０、配列番号９及び８、又は配列番号９及び１０の各リバースプライマーセットを使用した場合におけるＴｍ値を示す図である。
【図７】ヒトゲノムＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）と合成ＤＮＡを用いてヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異（Ｍｔ）の検出限界を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本開示を実施するための形態について説明する。ただし、本開示は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１０】
本開示において、「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。本開示に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
また、本明細書において組成物中のある成分の量について言及する場合、組成物中に当該成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に別途定義しない限り、当該量は、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
また、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
【００１１】
本開示において、検出対象となる試料中の試料核酸、本開示のプローブ及びプライマーを含む本明細書に記載される全ての核酸配列又はヌクレオチド配列への言及は、特に断らない限り、それらの相補配列、及び当該核酸配列又はヌクレオチド配列とその相補配列とから形成される二本鎖についても言及できるものとする。
本開示において、「核酸」とは、全ての種類のＤＮＡ及びＲＮＡを意味する。
本開示において、「核酸」と「ヌクレオチド」とは、互換的に使用する場合がある。
【００１２】
本開示において「Ｔｍ」又は「Ｔｍ値」とは、二本鎖ＤＮＡの５０％が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度をいい、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が吸光度全上昇分の５０％に達した時点の温度と定義される。二本鎖核酸、例えば二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度が加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって解離が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。
本開示において、Ｔｍ値は、以下に詳細を説明する蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて測定することができる。
【００１３】
本明細書においてＴｍ値を算出する場合、得られたＴｍ値は、特に断らない限り、ソフトウェア「Ｍｅｌｔｃａｌｃ  ９９  ｆｒｅｅ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用い、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ ｅｑ．［ｍＭ］５０の条件で算出した値とする。このソフトウェアは、当業界で公知のものであり、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ.５４, Ｎｏ.６, ｐｐ.９９０-９９９ （２００８）等でもプローブの設計に使用されている。
【００１４】
本開示において、ヌクレオチド配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合、ヌクレオチド配列の３’末端にある塩基を１番目として数える。同様に「５’末端から数えて１〜３番目」という場合、ヌクレオチド配列の５’末端にある塩基を１番目として数える。
また、本開示において、例えば「ヒトＥＧＦＲのコード領域の２３９０番目の塩基」とは、ヒトＥＧＦＲのタンパク質をコードする１番目の塩基から数えて２３９０番目の塩基を意味する。これは、コード領域（すなわち、エキソン）がイントロンによって分断されていても同様に適用される。すなわち、イントロンが存在していたとしても、ヒトＥＧＦＲタンパク質をコードする塩基配列のみを数え上げて２３９０番目に位置すれば足りることを意味する。それゆえ、例えば「ヒトＥＧＦＲのコード領域の２３９０番目の塩基」は、ｃＤＮＡ配列又はｍＲＮＡ配列のみならず、スプライシング前の塩基配列や、ゲノム配列おいても同様に適用され、ヒトＥＧＦＲタンパク質をコードする配列のみを数え上げて２３９０番目に位置することを意味する。
なお、本明細書において、塩基配列の文脈で使用される「コード領域」とは、タンパク質に翻訳される塩基配列の領域をいう。
【００１５】
本開示において、「オリゴヌクレオチド」の構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられる。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類の構成単位から構成されてもよいし、複数種類の構成単位から構成されてもよい。
【００１６】
本開示においてハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００１７】
本明細書において、「変異」とは、野生型の塩基配列の一部の塩基が置換、欠失、重複又は挿入されることによって生じる新たな塩基配列を意味する。
【００１８】
本開示において、「ヒトＥＧＦＲ」とは、ヒト由来のＥＧＦＲを意味し、ヒト由来のＥＧＦＲのゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、及びタンパク質の全てを包含する概念である。より具体的には、ヒトＥＧＦＲのゲノム配列は、アクセッションナンバー：ＮＧ＿００７７２６（ＲＥＧＩＯＮ: ５００１．．１９３３０７）で表され、ヒトＥＧＦＲのｍＲＮＡ配列は、アクセッションナンバー：ＮＭ＿００５２２８で表され、ヒトＥＧＦＲのｃＤＮＡ配列は、アクセッションナンバー：ＣＣＤＳ５５１４．１で表され、ヒトＥＧＦＲのタンパク質のアミノ酸配列は、アクセッションナンバー：ＮＰ＿００５２１９で表される。
【００１９】
本開示において、「ヒトＥＧＦＲのＧ２３９０Ｃ変異」とは、野生型のヒトＥＧＦＲのｍＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡのコード領域の２３９０番目の塩基であるＧ（グアニン）がＣ（シトシン）に置換された変異をいう。なお、ヒトＥＧＦＲの２３９０番目の塩基は、ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列の７９７番目のアミノ酸のコドンの第２番目の塩基である。従って、「ヒトＥＧＦＲのＧ２３９０Ｃ変異」は、「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異」に対応する。
本開示において、「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異」とは、野生型のヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列の７９７番目のアミノ酸であるＣ（システイン）がＳ（セリン）に置換された変異をいう。なお、ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列の７９７番目のアミノ酸は、ヒトＥＧＦＲの２３８９番目〜２３９１番目の塩基に対応するコドンによって指定される。従って、「ヒトＥＧＦＲのＧ２３９０Ｃ変異」は、「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異」の原因の１つとして挙げられる。
また、本開示において、「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異」とは、野生型のヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列の７９７番目のアミノ酸であるＣ（システイン）がＳ（セリン）に置換された変異の原因が、ヒトＥＧＦＲのＧ２３９０Ｃ変異であることを意味する。
【００２０】
本開示において、「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖（一本鎖）、ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖の相補ＤＮＡ鎖（一本鎖）、及びｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖とｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖の相補ＤＮＡ鎖とにより形成される二本鎖、のいずれを指称することもできる。ｃＤＮＡは、公知の方法で、ｍＲＮＡから逆転写することにより得ることができる。
典型的には、「コード領域」を含む文脈において使用される「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖の相補ＤＮＡ鎖（一本鎖）を意味する。
【００２１】
＜ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ＞
本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブは、配列番号２に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである。
【００２２】
癌の治療剤としてヒトＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を投与する前に、対象の患者においてＥＧＦＲにＣ７９７Ｓ変異を有するか否かを調べることは、適切な治療を提供する観点から有効であると考えられる。
しかしながら、従来の方法では、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異の検出感度が低いという問題、あるいは、変異を高感度で検出できるものの、操作が煩雑で、高価な装置（すなわち、ｄｄＰＣＲ装置及びＮＧＳ装置）を必要とする問題があった。
これに対し、本開示は、上記ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブを用いることにより、操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度でＣ７９７Ｓ変異の検出を可能にすることができる。
これは、Ｇ２３９０Ｃ変異を含むヒトＥＧＦＲのヌクレオチド配列を有するプローブの結合力が、野生型のヌクレオチド配列と、変異が導入されたヌクレオチド配列との間で、異なることに基づく。すなわち、Ｇ２３９０Ｃ変異を含むヒトＥＧＦＲのヌクレオチド配列を有するプローブは、変異が導入されたヌクレオチド配列との間では完全な相補性を有する（パーフェクトマッチ）のに対し、野生型のヌクレオチド配列との間では、コード領域の２３９０番目の塩基で相補性が完全には一致しない（ミスマッチ）。これにより、Ｇ２３９０Ｃ変異を含むヒトＥＧＦＲのヌクレオチド配列を有するプローブは、変異が導入されたヌクレオチド配列との間では結合力が強くＴｍ値が高いのに対し、野生型のヌクレオチド配列との間では結合力が弱くＴｍ値が低くなる。本開示は、このＴｍ値の差異に基づき、操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度でＣ７９７Ｓ変異の検出を可能にすることができる。
【００２３】
本開示において、配列番号２に示す塩基配列は、「agtccaggaggGagcc」である。なお、配列番号２の配列は、ヒトＥＧＦＲのｃＤＮＡの相補鎖側に対応する配列である。
上記配列番号２において、大文字で表されるＧは、ヒトＥＧＦＲのコード領域における２３９０番目の塩基（Ｇ２３９０Ｃ変異）に対応する。
プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。あるいは、プライマーは、プライマー合成を受託する企業（例えば、株式会社日本遺伝子研究所など）に依頼することもできる。
オリゴヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端を蛍光色素で標識する方法は、例えば、過剰量の蛍光標識したヌクレオチドを基質としてＰＣＲのポリメラ−ゼ反応溶液に含有させる方法などが挙げられる。あるいは、蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光標識オリゴヌクレオチド合成を受託する企業（例えば、Ｊ−Ｂｉｏ２１センター（日鉄住金環境株式会社）など）に依頼することもできる。
【００２４】
本開示の蛍光色素は、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、及びポリメチン色素誘導体からなる群から選択される蛍光色素が挙げられる。市販の蛍光色素としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｃｙ３及びＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）等が挙げられる。
【００２５】
好ましくは、蛍光標識オリゴヌクレオチドは、相補配列にハイブリダイズしていない場合には蛍光を発し、相補配列にハイブリダイズしてハイブリッドを形成した場合には蛍光が減少（例えば、消光）する。
このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般に蛍光消光プローブと称される。蛍光消光プローブは、オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端の塩基が蛍光色素で標識化され、標識化される塩基は、シトシン（Ｃ）である。この場合、蛍光消光プローブがハイブリダイズする検出目的配列において、蛍光消光プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基又は当該対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（Ｇ）となるように、蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このような蛍光消光プローブは、一般にグアニン消光プローブと称され、いわゆるＱ  Ｐｒｏｂｅ（登録商標）としても知られている。
【００２６】
このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のシトシン（Ｃ）が検出目的配列におけるグアニン（Ｇ）に近づくことによって、蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなグアニン消光プローブを使用すれば、シグナルの変動に基づき、グアニン消光プローブが標的配列とハイブリダイズしているか解離しているかを容易に確認することができる。蛍光色素は、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。
【００２７】
従って、蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて形成されたハイブリッドの蛍光のシグナル（例えば、蛍光強度）を解析することにより、二本鎖であるハイブリッドが一本鎖へ解離した割合、及びＴｍ値などを測定することができる。
【００２８】
蛍光色素は、特定の波長で発光するため、そのような波長を蛍光強度の検出に利用することができる。例えば、下記の蛍光色素において好ましい検出波長は、以下の通りである。Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（検出波長：４５０ｎｍ〜４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長：５８５ｎｍ〜７００ｎｍ）、及びＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（検出波長：５１５ｎｍ〜５５５ｎｍ）。
【００２９】
なお、Ｑ  Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ法、ＲＦＬＰ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法、ＭＧＢ  ｐｒｏｂｅ法等が挙げられる。
【００３０】
＜ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キット＞
本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キットは、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ、並びに、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のいずれかを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットを含む。（ｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は、（ｉｉｉ）配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【００３１】
好ましくは、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットは、配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
好ましくは、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットは、配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
好ましくは、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットは、配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００３２】
好ましくは、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キットは、配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用フォワードプライマーを更に含む。
【００３３】
「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ」は、前掲の通りである。
【００３４】
本開示において、配列番号７に示す塩基配列は、「CGTTAttcccggacatagtccaggaggC」である。
本開示において、配列番号８に示す塩基配列は、「CTCGAtgttcccggacatagtccaggaggG」である。
本開示において、配列番号９に示す塩基配列は、「CTATGcggacatagtccaggaggC」である。
本開示において、配列番号１０に示す塩基配列は、「TCAGAccggacatagtccaggaggG」である。
本開示において、配列番号１１に示す塩基配列は、「agcgtggacaacccccacgt」である。
【００３５】
配列番号７〜配列番号１０において、３’末端に大文字で示されている塩基は、ヒトＥＧＦＲのコード領域の２３９０番目の塩基に対応する。それゆえ、配列番号７及び９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにより野生型のヒトＥＧＦＲの配列を増幅させ、配列番号８及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲによりＧ２３９０Ｃ変異を有するヒトＥＧＦＲの配列を増幅させることができる。
また、配列番号７〜配列番号１０において、５’末端に大文字で示されている５文字の塩基は、ヒトＥＧＦＲのＤＮＡ配列には存在しない人工的に付加した配列である。この人工的配列の付加により、ＰＣＲにより標的以外の配列が増幅することを抑制することができる。
【００３６】
ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセット、及び任意にヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用フォワードプライマーは、野生型のヒトＥＧＦＲの核酸配列、及び存在する場合にはＧ２３９０Ｃ変異を有するヒトＥＧＦＲの核酸配列を増幅させるために使用される。
【００３７】
ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キットは、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出に好ましく使用することができる。そのような検出方法の詳細は、以下の「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法」において説明する。
【００３８】
＜ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法＞
本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の検出方法は、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブを試料中の一本鎖核酸と接触させて、前記ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させること（工程Ａ）、前記ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること（工程Ｂ）、前記シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドのＴｍ値を決定すること（工程Ｃ）、及び、前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の変異の存在を検出すること（工程Ｄ）、を含む。
【００３９】
好ましくは、前記一本鎖核酸は、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のいずれかを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットを用いたＰＣＲにより得られた二本鎖核酸を解離した産物である。（ｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は、（ｉｉｉ）配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【００４０】
より好ましくは、前記一本鎖核酸は、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のいずれかを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセット、並びに、配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用フォワードプライマーを用いたＰＣＲにより得られた二本鎖核酸を解離した産物である。（ｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は、（ｉｉｉ）配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【００４１】
好ましくは、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットは、配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
好ましくは、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットは、配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
好ましくは、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットは、配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００４２】
（工程Ａ）
工程Ａは、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブを試料中の一本鎖核酸と接触させて、前記ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させることを含む。
【００４３】
「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ」は、前掲の通りである。
【００４４】
試料は、例えば生体試料であってよい。生体試料としては、全血、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪、毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液、又はこれらの懸濁液等が挙げられる。
また、生体試料から単離した核酸を試料として用いてもよい。例えば、全血からのゲノムＤＮＡの単離には、市販のゲノムＤＮＡ単離キットを使用することができる。
また、生体試料に含まれるＤＮＡを遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物を試料として用いてもよい。あるいは、生体試料に含まれるＲＮＡから逆転写ＰＣＲ反応によりｃＤＮＡを生成し、このｃＤＮＡを遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物を試料として用いてもよい。
【００４５】
核酸増幅法は、特に制限されない。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等が挙げられ、中でもＰＣＲ法が好ましい。
【００４６】
核酸の増幅において、増幅反応液における試料の添加割合は特に制限されない。具体例として、上記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、添加割合の下限は、０．０１体積％以上であることが好ましく、０．０５体積％以上であることがより好ましく、０．１体積％以上であることがさらに好ましい。また、上記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、添加割合の上限は、２体積％以下であることが好ましく、１体積％以下であることがより好ましく、０．５体積％以下であることがさらに好ましい。
【００４７】
また、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブを用いた光学的検出を行う場合、上記反応液における生体試料の添加割合は、例えば、０．１体積％〜０．５体積％に設定することが好ましい。この範囲であれば、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止でき、光学的手法による測定精度を向上できる。また、生体試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上できることも期待される。
【００４８】
また、核酸増幅反応の開始前に、上記反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、沈殿物又は濁りの発生による影響をより一層低減でき、かつ、増幅効率もさらに向上する。
上記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１質量％〜２質量％であり、好ましくは０．１質量％〜１質量％であり、より好ましくは０．２質量％〜０．８質量％である。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられ、特に制限されない。これらのアルブミンはいずれか１種類を使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００４９】
以下、増幅についてＰＣＲ法を例に挙げて説明するが、本開示は、この例に制限されない。
【００５０】
まず、鋳型（テンプレート）核酸、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセット、及びヒトＥＧＦＲのＤＮＡのコード領域の２３９０番目より上流の領域にアニーリングし得るフォワードプライマー（好ましくは、配列番号１１に示す塩基配列を有するプライマー）を含むＰＣＲ反応液を調製する。
ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されない。例えば、上記プライマーセットを用いたときのフォワードプライマー及び２つのリバースプライマーの合計の添加割合は、０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
また、２つのリバースプライマーの合計の添加割合は、０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。フォワードプライマーの添加割合は、０．０５μｍｏｌ／Ｌ〜５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
【００５１】
ＰＣＲ反応液におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーセットの含有比率は特に限定されない。増幅効率及び野生型又は変異型への特異性を高くする観点から、前記フォワードプライマーの合計モル量と前記リバースプライマーセットの合計モル量との比は、１：１〜１：１０であることが好ましく、１：２〜１：５であることがより好ましく、１：３〜１：４．５であることがさらに好ましい。
【００５２】
また、前記リバースプライマーセットに含まれる、野生型のヒトＥＧＦＲのＤＮＡのコード領域の２３９０番目の塩基を含む領域を特異的に増幅するためのリバースプライマー（好ましくは、配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）と、Ｇ２３９０Ｃ変異を有するヒトＥＧＦＲのＤＮＡのコード領域の２３９０番目の塩基を含む領域を特異的に増幅するためのリバースプライマー（好ましくは、配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）とのＰＣＲ反応液における含有比率は特に限定されない。増幅効率及び特異性を高くする観点から、０．５：２〜１：０．５であることが好ましく、０．８〜１．２：１．２〜０．８であることがさらに好ましい。特に好ましくは１：１である。
【００５３】
ＰＣＲ反応液におけるその他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も特に制限されない。他の組成成分としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等のヌクレオチド、溶媒等が挙げられる。ＰＣＲ反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。
【００５４】
ＤＮＡポリメラーゼは特に制限されない。例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４８８９８１８号明細書及び米国特許第５０７９３５２号明細書を参照）（Ｔａｑポリメラーゼ（商品名））、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９１／０９９５０号を参照）（rTth DNA polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９２／９６８９号を参照）（Pfu DNA polymerase；Strategene社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（欧州特許第０４５５４３０号明細書を参照）（Ｖｅｎｔ（商標）；New England Biolabs社製）等が商業的に入手可能である。中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
ＰＣＲ反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
【００５５】
ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ等）が挙げられる。ＰＣＲ反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
溶媒としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ（2-morpholinoethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（3-morpholinopropanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）等の緩衝液が挙げられ、典型的な実施態様においては、市販のＰＣＲ用緩衝液やＰＣＲキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。
また、ＰＣＲ反応液には、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＮａＮ３、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等が含まれていてもよい。
【００５６】
ＰＣＲは、通常、二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（解離工程）、プライマーの鋳型核酸へのアニーリング（アニーリング工程）、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーからの核酸配列の伸長（伸長工程）の３工程を含む。各工程の条件は特に制限されない。解離工程の条件は、例えば、９０℃〜９９℃、１秒間〜１２０秒間が好ましく、９２℃〜９５℃、１秒間〜６０秒間がより好ましい。アニーリング工程の条件は、例えば、４０℃〜７０℃、１秒間〜３００秒間が好ましく、５０℃〜７０℃、５秒間〜６０秒間がより好ましい。また、伸長工程の条件は、例えば、５０℃〜８０℃、１秒間〜３００秒間が好ましく、５０℃〜８０℃、５秒間〜６０秒間がより好ましい。サイクル数も特に制限されない。３工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されない。
例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、より好ましくは５０サイクル以下である。各工程の温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。なお、アニーリング工程と伸長工程とを同じ温度条件とし、２工程でＰＣＲを行ってもよい。
【００５７】
以上のようにして、野生型のヒトＥＧＦＲのＤＮＡのコード領域の２３９０番目の塩基を含む領域、及び存在する場合にはＧ２３９０Ｃ変異を有するヒトＥＧＦＲのＤＮＡのコード領域の２３９０番目の塩基を含む領域についての増幅産物を得ることができる。
【００５８】
このようにして得られた増幅産物は、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブとハイブリダイズさせて、ハイブリッドを形成させることができる。
ハイブリッド形成工程では、上記増幅工程で得られた増幅産物の一本鎖増幅核酸と、ヒトＥＧＦＲのＤＮＡのコード領域の２３９０番目の塩基を含む領域にハイブリダイズ可能な本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブとのハイブリッドを形成させる。上記一本鎖増幅核酸は、例えば、反応液を加熱し、上記増幅工程で得られた増幅産物である二本鎖増幅核酸を解離することで調製することができる。
【００５９】
本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブを反応液に添加するタイミングは特に制限されない。例えば、増幅工程前、増幅工程の開始時、増幅工程の途中、及び増幅工程後のいずれであってもよい。中でも、増幅工程前又は増幅工程の開始時に添加することが、増幅反応とハイブリダイゼーションとを連続的に行うことができるため好ましい。すなわち、上記増幅工程と上記ハイブリッド形成工程とが同時に進行することが、処理効率の観点から好ましい。
上記反応液におけるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブの添加割合は特に制限されない。例えば、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブを１０ｎｍｏｌ／Ｌ〜４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、２０ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することがより好ましい。
【００６０】
上記一本鎖増幅核酸と本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブとのハイブリダイゼーションの手法及び条件には、特に制限はない。二本鎖増幅核酸を解離して一本鎖増幅核酸にすること、一本鎖核酸同士をハイブリダイズすることを目的として当業界で既知の条件をそのまま適用すればよい。
例えば、解離における加熱温度は、上記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒間〜１０分間であり、好ましくは１秒間〜５分間である。また、解離した一本鎖増幅核酸と本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブとのハイブリダイズは、例えば、解離後、解離における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、例えば４０℃〜５０℃である。
【００６１】
上記増幅工程において、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブと、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用リバースプライマーセットと、任意にヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異増幅用フォワードプライマーとを共存させる場合、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブがＤＮＡポリメラーゼの反応対象となって本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ自体が伸長することを予防するために、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブの３’末端側に前掲の蛍光色素が付加されているか、リン酸基が付加されていることが好ましい。
【００６２】
また、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブと同じ配列を有するが蛍光標識されていないプローブを併用してもよい。これにより、例えば、検出する蛍光強度を調節することができる等の利点が得られる。このような未標識プローブは、その３’末端にリン酸基が付加されていてもよい。
【００６３】
（工程Ｂ）
工程Ｂは、前記ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定することを含む。
【００６４】
ハイブリッドの解離状態を示すシグナルの測定は、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、標識した蛍光色素の波長に応じて適宜設定することが好ましい。標識した蛍光色素に応じた波長とすることで、検出感度を高めることができる。例えば、蛍光色素として、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅを用いる場合には、検出波長が４５０ｎｍ〜４８０ｎｍであることが好ましく、ＴＡＭＲＡを用いる場合には、検出波長が５８５ｎｍ〜７００ｎｍであることが好ましく、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ用いる場合には、検出波長が５１５ｎｍ〜５５５ｎｍであることが好ましい。
【００６５】
上記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動は、反応液の温度を変化させて行う。例えば、一本鎖増幅核酸と本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブとのハイブリッドを含む上記反応液を加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖増幅核酸とハイブリダイズした状態では蛍光が減少（又は消光）し、解離した状態では蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（又は消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定することにより、解離に基づくシグナルの変動を測定することができる。
【００６６】
シグナルの変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、好ましくは２５℃〜７０℃であってよく、終了温度が４０℃〜１０５℃であってよい。
また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば０．１℃／秒〜２０℃／秒であってよく、好ましくは０．３℃／秒〜５℃／秒である。
【００６７】
なお、以上の説明では、上記蛍光強度測定工程においてハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度変動を測定するものとしたが、ハイブリッド形成時における蛍光強度の変動を測定するようにしてもよい。つまり、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、温度降下に伴う蛍光強度の変動を測定してもよい。
【００６８】
具体例として、単独で蛍光強度を示し、かつハイブリッド形成により蛍光強度を示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖増幅核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発するが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光が減少（又は消光）する。したがって、例えば、反応液の温度を徐々に降下させて、温度降下に伴う蛍光強度の減少を測定することができる。
【００６９】
（工程Ｃ）
工程Ｃは、前記シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドのＴｍ値を決定することを含む。
【００７０】
Ｔｍ値の決定は、例えば、以下のようにして行うことができる。例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、得られた蛍光強度の変動から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出する。変化量を（−ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。また、変化量を（ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も高い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。
【００７１】
（工程Ｄ）
工程Ｄは、前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の変異の存在を検出することを含む。
【００７２】
工程Ｄでは、工程Ｃにおいて決定されたＴｍ値に基づいて、ヒトＥＧＦＲ遺伝子におけるＧ２３９０Ｃ変異を検出することができる。
例えば、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ及び検出目的配列により形成されたハイブリッドのＴｍ値が、基準値として予め決定しておいたヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異を有する塩基配列と完全に相補的なハイブリッドのＴｍ値と同じ又は同程度であれば、前記検出目的配列は、Ｃ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型であると判断できる。
また、例えば、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ及び検出目的配列により形成されたハイブリッドのＴｍ値が、基準値として予め決定しておいた野生型の塩基配列とのハイブリッドのＴｍ値と同じ又は同程度であれば、前記検出目的配列は、野生型であると判断できる。
ここで、Ｔｍ値が同程度とは、測定試料を用いて得られたＴｍ値が、基準値のＴｍ値の±１０℃以内、好ましくは±５℃以内、より好ましくは±２℃以内、更に好ましくは±１℃以内であることを意味する。
【００７３】
典型的な実施態様において、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブと野生型由来の検出目的配列とは、ヒトＥＧＦＲのコード領域の２３９０番目の一塩基が異なるミスマッチを有する。それゆえ、前記ミスマッチに起因して、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブと野生型の塩基配列とのハイブリッドのＴｍ値は、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブとヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異を有する塩基配列とのハイブリッドのＴｍ値よりも、低くなる。
【００７４】
野生型のヒトＥＧＦＲの核酸配列と、及びＧ２３９０Ｃ変異型のヒトＥＧＦＲの核酸配列とが混在している場合に、Ｇ２３９０Ｃ変異の有無の判定を行うためには、温度と蛍光強度の微分値との関係で表される融解曲線（微分融解曲線ともいう）において、野生型ヒトＥＧＦＲ及びＧ２３９０Ｃ変異型ヒトＥＧＦＲのそれぞれのＴｍ値のピーク面積を算出して、それらを比較することによって行うこともできる。
【００７５】
まず、例えば、野生型の核酸（Ｗｔ）とＧ２３９０Ｃ変異型の核酸（Ｍｔ）との核酸混合物を含む試料について、融解曲線解析装置を用いて融解曲線を得る。
図１（Ａ）に、ある１つの核酸混合物の温度と吸光度または蛍光強度等の検出信号（検出シグナル）との関係で表された融解曲線、及び同図（Ｂ）微分融解曲線を示す。この微分融解曲線からピークを検出することにより、核酸Ｗｔの融解温度ＴｍＷ及び核酸Ｍｔの融解温度ＴｍＭを検出して、ＴｍＷ及びＴｍＭを含む温度範囲の各々を設定する。
【００７６】
ＴｍＷを含む温度範囲ΔＴＷとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で検出信号の微分値が最小となる温度を下限、検出信号のピークの裾野に対応する温度を上限とする温度範囲を設定することができる。また、ＴｍＭを含む温度範囲ΔＴＭとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で検出信号の微分値が最小となる温度を上限、検出信号のピークの裾野に対応する温度を下限とする温度範囲を設定することができる。
なお、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、同一の幅（例えば、１０℃）または異なる幅（例えば、温度範囲ΔＴＷが１０℃、温度範囲ΔＴＭが７℃）となるように設定してもよい。また、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、それぞれの融解温度ＴｍからプラスＸ℃、マイナスＸ℃の幅（Ｘ℃は例えば１５℃以内、望ましくは１０℃以内）というように設定してもよい。
【００７７】
次に、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭの各々について、微分融解曲線の温度範囲の下限に対応する点と上限に対応する点とを通る直線と微分融解曲線とで囲まれた面積（図１（Ｂ）の斜線部分）を求める。面積の求め方の一例として、具体的に以下のように求めることができる。温度Ｔにおける検出信号の微分値をｆ（Ｔ）とし、温度Ｔにおけるベース値をＢ（Ｔ）として、下記（１）式により求める。
【００７８】
面積Ｓ＝｛ｆ（Ｔｓ＋１）−Ｂ（Ｔｓ＋１）｝＋｛ｆ（Ｔｓ＋２）−Ｂ（Ｔｓ＋２）｝＋｛ｆ（Ｔｅ−１）−Ｂ（Ｔｅ−１）｝      ・・・（１）
ただし、Ｔｓは各温度範囲における下限値、Ｔｅは上限値である。また、各温度Ｔにおけるベース値Ｂ（Ｔ）は、下記（２）式により求まる値であり、検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を検出信号の微分値から減算することにより、検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。
【００７９】
Ｂ（Ｔ）＝ａ×（Ｔ−Ｔｓ）＋ｆ（Ｔｓ）      ・・・（２）
ただし、ａ＝｛ｆ（Ｔｅ）−ｆ（Ｔｓ）｝／（Ｔｅ−Ｔｓ）である。
【００８０】
上記（１）式及び（２）式に従って、前記核酸混合物について、温度範囲ΔＴＷにおける面積ＳＷ及び温度範囲ΔＴＭにおける面積ＳＭを求め、面積比によって野生型のヒトＥＧＦＲと、Ｇ２３９０Ｃ変異型のヒトＥＧＦＲの存在の有無を判定することができる。
面積比は、下記（３）式により求めることができる。
【００８１】
面積比（％）＝（ＳＭ／ＳＷ）×１００          ・・・（３）
例えば、ヒトＥＧＦＲ遺伝子のＧ２３９０Ｃ変異型の存在の有無の判定は、上記（３）式の面積比のカットオフ値を１０％と設定し、１０％以上であればＧ２３９０Ｃ変異型のヒトＥＧＦＲが存在する（陽性）であると判定してもよい。カットオフ値は、希望する検出感度及び特性に応じて適宜設定すればよい。
【実施例】
【００８２】
以下、本開示を実施例により更に具体的に説明するが、本開示はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」は質量基準である。
【００８３】
図２には、一実施態様における、ヒトＥＧＦＲのＤＮＡ配列におけるプローブ及びプライマー（セット）の位置関係を模式的に示した。図２において、配列番号１４は、ヒトＥＧＦＲのＤＮＡ由来の配列を示し、配列番号２はプローブを示し、配列番号９及び１０はリバースプライマーセットを示し、配列番号１１はフォワードプライマーを示す。
配列番号２における丸部分は、一実施態様における蛍光色素の標識部位を示し、「×」部分は、ヒトＥＧＦＲのＧ２３９０Ｃ変異に対応する塩基部分である。
配列番号９及び１０の３’末端部分に対応する塩基Ｇは、ヒトＥＧＦＲのＧ２３９０Ｃ変異に対応する塩基部分である。
【００８４】
＜プローブのスクリーニング＞
ヒトＥＧＦＲのＧ２３９０Ｃ変異の有無によってＴｍ値に差があり、かつ、野生型（ＷＴ）のＥＧＦＲ及びＧ２３９０Ｃ変異型（Ｍｔ）のＥＧＦＲの両方にそれぞれ単一のＴｍ値のピークを示すプローブのスクリーニングを行った。
プローブの相補鎖として、野生型ヒトＥＧＦＲのコード領域の２３９０番目の塩基を含むヌクレオチド配列（配列番号１２）、及びＧ２３９０Ｃ変異型ヒトＥＧＦＲのコード領域の２３９０番目の塩基を含むヌクレオチド配列（配列番号１３）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に製造委託して人工的に合成したものを得た。配列番号１２及び配列番号１３の塩基配列を下記表１に示す。
【００８５】
【表１】
2019062834.tif 000003
【００８６】
また、配列番号１に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンがＴＡＭＲＡ蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、配列番号２に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンがＴＡＭＲＡ蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドを日鉄住金環境株式会社に製造委託して人工的に合成したものを得た。配列番号１及び２の塩基配列、及び蛍光色素の位置を下記表２に示す。
【００８７】
【表２】
2019062834.tif 000004
【００８８】
下記表３に示す組成で反応液を調製し、下記表４に示す温度条件でＴｍ値の測定を行った。なお、Ｔｍ値の測定は自動遺伝子解析装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）を用いて行った。
【００８９】
【表３】
2019062834.tif 000005
【００９０】
【表４】
2019062834.tif 000006
【００９１】
Ｔｍ値の測定結果を図３に示す。図３は、前記ｉ−ｄｅｎｓｙ（アークレイ社製）から出力されたデータである。図３に示されているように、プローブとして配列番号１又は配列番号２のオリゴヌクレオチドを用いた場合には、ヒトＥＧＦＲにＧ２３９０Ｃ変異の有無でＴｍ値に差があり、かつ、野生型（ＷＴ）のＥＧＦＲ及びＧ２３９０Ｃ変異型（Ｍｔ）ＥＧＦＲの両方でそれぞれ単一のＴｍ値のピークを有することが示された。従って、配列番号１及び配列番号２は、本開示のプローブとして特に有用であることが示された。
＜プローブの検出感度＞
配列番号１又は配列番号２のオリゴヌクレオチドであるプローブの検出感度を調べた。
下記表５〜１０に示す反応液を調製した。
【００９２】
【表５】
2019062834.tif 000007
【００９３】
【表６】
2019062834.tif 000008
【００９４】
【表７】
2019062834.tif 000009
【００９５】
【表８】
2019062834.tif 000010
【００９６】
【表９】
2019062834.tif 000011
【００９７】
【表１０】
2019062834.tif 000012
【００９８】
表１０において、「ＥＧＦＲ−Ｇ２３９０Ｃ−Ｍｔ ５％（１００００ｃｐ／μｌ）」は、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡのうち、５％がヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型（ＥＧＦＲ−Ｇ２３９０Ｃ−Ｍｔ）であり、残りがＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡであることを示す。
また、「ＥＧＦＲ−Ｇ２３９０Ｃ−Ｍｔ １％（１００００ｃｐ／μｌ）」は、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡのうち、１％がヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型（ＥＧＦＲ−Ｇ２３９０Ｃ−Ｍｔ）であり、残りがＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡであることを示す。
【００９９】
上記反応液を用いて、下記表１１に示す条件でＰＣＲ反応を行った後、Ｔｍ値を解析した。
ＰＣＲ反応及びTm解析は自動遺伝子解析装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）を用いた。
【０１００】
【表１１】
2019062834.tif 000013
【０１０１】
上記Ｔｍ値の解析結果を図４に示す。
配列番号１のプローブを使用した場合、野生型を示す低い温度のＴｍにピークが見られたが、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型に対応する高いＴｍのピークは見られなかった。従って、配列番号１のプローブは、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型の検出感度が不良であることが示された。
一方、配列番号２のプローブを使用した場合、野生型を示す低い温度のＴｍのピーク、及びヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型に対応する高いＴｍのピークの両方が見られた。従って、配列番号２のプローブは、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型の検出感度が良好であることが示された。
【０１０２】
＜プライマーのスクリーニング＞
ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異を特異的かつ高感度に検出し得るプライマーセットについて検討した。この検討に用いたプローブ及びプライマーの塩基配列、及びプローブ蛍光色素に関する情報は、下記表１２に記載した通りである。
【０１０３】
【表１２】
2019062834.tif 000014
【０１０４】
また、以下の表１３〜表１８に示す組成で反応液を調製した。なお、Ｐ−ｍｉｘには、Ｐ−ｍｉｘＣ、又はＰ−ｍｉｘＤのいずれかを使用した。
【０１０５】
【表１３】
2019062834.tif 000015
【０１０６】
【表１４】
2019062834.tif 000016
【０１０７】
【表１５】
2019062834.tif 000017
【０１０８】
【表１６】
2019062834.tif 000018
【０１０９】
【表１７】
2019062834.tif 000019
【０１１０】
【表１８】
2019062834.tif 000020
【０１１１】
表１２において、「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ」は、Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から入手した。「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（１００００ｃｐ／μｌ）」は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡが１００００ｃｐ（コピー）／μｌであることを示す。
また、「ＥＧＦＲ−Ｇ２３９０Ｃ−Ｍｔ ５％（１００００ｃｐ／μｌ）」は、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡのうち、５％がヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型合成ＤＮＡ（ＥＧＦＲ−Ｇ２３９０Ｃ−Ｍｔ）であり、残りが野生型合成ＤＮＡであることを示す。
また、「ＥＧＦＲ−Ｇ２３９０Ｃ−Ｍｔ １％（１００００ｃｐ／μｌ）」は、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡのうち、１％がヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型合成ＤＮＡ（ＥＧＦＲ−Ｇ２３９０Ｃ−Ｍｔ）であり、残りが野生型合成ＤＮＡであることを示す。
野生型合成ＤＮＡの塩基配列は配列番号１４であり、変異型合成ＤＮＡの塩基配列は配列番号１５の通りである。野生型および変異型の合成ＤＮＡはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に製造委託して人工的に合成したものを得た。
【０１１２】
上記反応液を用いて、下記表１９に示す条件でＰＣＲ反応を行った後、Ｔｍ値の解析を行った。
ＰＣＲ反応及びＴｍ解析は自動遺伝子解析装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）を用いた。
【０１１３】
【表１９】
2019062834.tif 000021
【０１１４】
上記Ｔｍ値の解析結果を図５及び図６に示す。
図５には、プローブ「３Ｔ-ＥＧＦＲ-Ｇ２３９０Ｃ-Ｒ１」（配列番号１、Ｒ１）を用いた場合の結果が示されている。この結果、リバースプライマーセットとして配列番号９及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドを用いた場合に野生型のＴｍのピークを検出できたが、他のプライマーセットを用いた場合には野生型のＴｍのピークを検出できない、又はＴｍのピークが弱く、野生型の検出能力が不十分であることが示された（評価：×）。
また、図５においては、プローブ「３Ｔ-ＥＧＦＲ-Ｇ２３９０Ｃ-Ｒ１」（配列番号１）を用いた場合、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型（Ｍｔ）のＴｍのピークを検出できず、Ｃ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型の検出能力が不十分であることが示された。
【０１１５】
プローブ「３Ｔ-ＥＧＦＲ-Ｇ２３９０Ｃ-Ｒ１」（配列番号１）を用いた場合のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型（Ｍｔ）の検出能力についてのまとめを下記表２０に示す。「Ｎ／Ａ」は、測定していないことを表し、「×」は、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型（Ｍｔ）の検出能力が不十分であったことを示す。
【０１１６】
【表２０】
2019062834.tif 000022
【０１１７】
表２０に記載されているように、プローブ「３Ｔ-ＥＧＦＲ-Ｇ２３９０Ｃ-Ｒ１」（配列番号１）を用いた場合のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型（Ｍｔ）の検出能力は、いずれのリバースプライマーセットを用いた場合でも不十分であることが示された。
【０１１８】
図６には、プローブ「３ＰＢ-ＥＧＦＲ-Ｇ２３９０Ｃ-Ｒ２」（配列番号２、Ｒ２）を用いた場合の結果が示されている。この結果、リバースプライマーセットとして配列番号７及び配列番号８のオリゴヌクレオチドのセット、配列番号９及び配列番号８のオリゴヌクレオチドのセット、又は配列番号９及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドのセットを用いた場合に、野生型のＴｍのピーク、及びＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型（Ｍｔ）のピークの両方が、検出された。従って、プローブ「３ＰＢ-ＥＧＦＲ-Ｇ２３９０Ｃ-Ｒ２」（配列番号２）を用いた場合、上記３種類のオリゴヌクレオチドのセット（リバースプライマーセット）は、野生型、及びＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型の検出能力に優れることが示された（評価：○）。
他方、リバースプライマーセットとして配列番号７及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドのセットを用いた場合には、野生型のＴｍのピークが単一でなく、偽陽性が発生したことから、本開示のリバースプライマーセットとして不適切であると判断された（評価：×）。
【０１１９】
また、配列番号７及び配列番号８のオリゴヌクレオチドのセット、配列番号９及び配列番号８のオリゴヌクレオチドのセット、又は配列番号９及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドのセットのリバースプライマーセットは、野生型にＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型が５％含まれているテンプレートを用いた場合にも、検出能力に優れることが示された（評価：○）。
更に、配列番号９及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドのセットを用いた場合には、野生型にＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型が１％含まれているテンプレートを用いた場合にも、検出能力に優れることが示された（評価：○）。
【０１２０】
プローブ「３ＰＢ-ＥＧＦＲ-Ｇ２３９０Ｃ-Ｒ２」（配列番号２）を用いた場合のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型（Ｍｔ）の検出能力についてのまとめを下記表２１に示す。Ｎ／Ａは、測定していないことを表し、「×」は、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型（Ｍｔ）の検出能力が不十分であったことを示し、「○」は、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型（Ｍｔ）の検出能力が十分であったことを示す。
【０１２１】
【表２１】
2019062834.tif 000023
【０１２２】
表２１に示されているように、プローブ「３ＰＢ-ＥＧＦＲ-Ｇ２３９０Ｃ-Ｒ２」（配列番号２）を用いた場合、リバースプライマーセットとして配列番号７及び配列番号８のオリゴヌクレオチドのセット、配列番号９及び配列番号８のオリゴヌクレオチドのセット、又は配列番号９及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドのセットは、Ｃ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型の検出能力に優れることが示された。
【０１２３】
＜最小検出感度に基づく性能評価＞
上記実施例において優れた効果を示したプローブ、及びプライマーセットを用いて、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異の最小検出感度を検討した。上記検討に用いたプローブ及びプライマーの塩基配列、及びプローブ蛍光色素に関する情報は、下記表２２に記載した通りである。
【０１２４】
【表２２】
2019062834.tif 000024
以下の表２３〜表２７に示す組成で反応液を調製した。
【０１２５】
【表２３】
2019062834.tif 000025
【０１２６】
【表２４】
2019062834.tif 000026
【０１２７】
【表２５】
2019062834.tif 000027
【０１２８】
【表２６】
2019062834.tif 000028
【０１２９】
【表２７】
2019062834.tif 000029
【０１３０】
「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（１００００ｃｐ／μｌ）」は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡが１００００ｃｐ（コピー）／μｌであることを示す。
また、「ＥＧＦＲ−Ｇ２３９０Ｃ−Ｍｔ ０．３％（１００００ｃｐ／μｌ）」は、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡのうち、０．３％がヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型（ＥＧＦＲ−Ｇ２３９０−Ｍｔ）であり、残りがＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡであることを示す。同様に、Ｍｔについての「％」部分は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡに含まれるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型（ＥＧＦＲ−Ｇ２３９０Ｃ−Ｍｔ）の割合を示す。
【０１３１】
上記反応液を用いて、下記表２８に示す条件でＰＣＲ反応を行った後、Ｔｍ値の解析を行った。
ＰＣＲ反応及びＴｍ解析は自動遺伝子解析装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）を用いた。
【０１３２】
【表２８】
2019062834.tif 000030
【０１３３】
上記Ｔｍ値の解析結果を図７に示す。この結果、ヒトＥＧＦＲの野生型の塩基配列を有するテンプレートに、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異型の塩基配列を有するテンプレートが０．０５％（Ｍｔ  ０．０５％）以上含まれている場合に、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異が良好に検出されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本開示によれば、操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度なＣ７９７Ｓ変異の検出を可能にする、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用プローブ及びヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｇ２３９０Ｃ）変異検出用キットを提供することができる。
【図１】
2019062834.tif 000031
【図２】
2019062834.tif 000032
【図３】
2019062834.tif 000033
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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