(57)【要約】【課題】グリピカン−３に対する高親和性モノクローナル抗体およびその使用の提供。【解決手段】ＧＰＣ３を結合する高親和性モノクローナル抗体のパネルの同定が本明細書に記載されている。開示された抗体は、がん細胞の表面上の天然ＧＰＣ３、加えて可溶性ＧＰＣ３を認識する。最も高い親和性の抗体（ＹＰ７）はさらに特徴づけられ、それが、ＧＰＣ３の発現が低いがん細胞を検出する能力があるという点において非常に感受性が高いことが示された。ＹＰ７はまた、インビボで有意なＨＣＣ腫瘍成長阻害を示した。ＰＥ３８に融合した、本明細書に開示された抗体を含む免疫毒素は、ＧＰＣ３発現細胞に対する非常に高い結合親和性を示し、ＧＰＣ３発現がん細胞成長を有意に阻害した。したがって、本明細書に開示された高親和性モノクローナル抗体は、ＧＰＣ３発現がんの診断および処置に用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、その全体が参考として本明細書に援用される、２０１２年６月１日に出願した米国仮出願第６１／６５４，２３２号の利益を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、グリピカン−３（ＧＰＣ３）に特異的な高親和性抗体、ならびにがんの診断および処置のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
肝臓がんは、世界中で５番目に最もよく見られる悪性腫瘍であり（Ｈｏ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５：２７５−２８４、２０１１）、肝細胞がん腫（ＨＣＣ）が最もよく見られる型である。胆管がん腫（ＣＣＡ）は、原発性肝臓がんの別の主要な型である。外科的切除は、その疾患の処置のための標準的方法を提供するが、患者のほんの一部のみがその手順に適格である。肝臓がんは、ほとんどの化学療法薬に応答しない。したがって、抗体治療などの新規な免疫治療の差し迫った必要性がある。グリピカン−３（ＧＰＣ３）が、ＨＣＣにおいて高度に発現していることを考慮すれば、ＧＰＣ３が肝臓がん治療のための魅力的な標的を表すことは、示唆されている（Ｃａｐｕｒｒｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５：８９−９７、２００３；ＣａｐｕｒｒｏおよびＦｉｌｍｕｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：３７２、２００５；ＨｏおよびＫｉｍ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４７：３３３−３３８、２０１１；ＡｌｌｅｇｒｅｔｔａおよびＦｉｌｍｕｓ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １１：５４３−５４８、２０１１）。
【０００４】
ＧＰＣ３遺伝子は、７０ｋＤａの前駆コアタンパク質をコードし、それは、フーリンによって切断されて４０ｋＤａアミノ（Ｎ）末端タンパク質および３０ｋＤａの膜結合型カルボキシル（Ｃ）末端タンパク質を生じ得る。Ｃ末端は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞膜に付着している。ＧＰＣ３は、抗体免疫治療（Ｉｓｈｉｇｕｒｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：９８３２−９８３８、２００８；Ｎａｋａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３７８：２７９−２８４、２００９；Ｎａｋａｎｏら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ２１：９０７−９１６、２０１０）および細胞に基づいた免疫治療（Ｎａｋａｔｓｕｒａら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：８６３０−８６４０、２００４；Ｋｏｍｏｒｉら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：２６８９−２６９７、２００６）の両方についての標的として示唆されている。しかしながら、ＧＰＣ３発現は、ＨＣＣおよび他のがん（例えば、卵巣明細胞がん腫およびメラノーマ）において非常に不均一である（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ、１０２：１６２２−１６２９、２０１１）。理想的な治療モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、低レベルの標的抗原を発現する腫瘍細胞を排除すべきである。その領域における研究は、がんの治療および診断のために腫瘍細胞における低発現のＧＰＣ３を検出するのに用いることができる高親和性ｍＡｂが存在しないことにより、妨げられてきた。
【０００５】
Ｆｉｌｍｕｓおよび共同研究者らは、ＧＰＣ３のＣ末端に特異的な、広く用いられる１Ｇ１２  ｍＡｂを開発し、ＨＣＣ患者において血清ＧＰＣ３を検出するためのＥＬＩＳＡ方法を確立した（Ｃａｐｕｒｒｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５：８９−９７、２００３）。Ｈｉｐｐｏらは、ＧＰＣ３のＮ末端に特異的なｍＡｂを開発した（Ｈｉｐｐｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４：２４１８−２４２３、２００４）。どちらの研究も、ＨＣＣ培養上清またはがん患者の循環血における可溶性ＧＰＣ３タンパク質を検出したが、Ｎ末端サブユニットまたはＣ末端サブユニットが実際に、可溶性ＧＰＣ３形式を表しているかどうか明らかではない（ＣａｐｕｒｒｏおよびＦｉｌｍｕｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：３７２、２００５）。血清ＧＰＣ３の濃度が、一般的に、患者において高くないこと、および容易に入手できるｍＡｂのいずれも、おそらくそのｍＡｂのＧＰＣ３に対する低親和性のせいで、血清ＧＰＣ３を測定するのに用いることができないことを、以前の研究が示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃａｐｕｒｒｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５：８９−９７、２００３
【非特許文献２】ＣａｐｕｒｒｏおよびＦｉｌｍｕｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：３７２、２００５
【非特許文献３】ＨｏおよびＫｉｍ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４７：３３３−３３８、２０１１
【非特許文献４】ＡｌｌｅｇｒｅｔｔａおよびＦｉｌｍｕｓ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １１：５４３−５４８、２０１１
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｇｕｒｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：９８３２−９８３８、２００８
【非特許文献６】Ｎａｋａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３７８：２７９−２８４、２００９
【非特許文献７】Ｎａｋａｎｏら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ２１：９０７−９１６、２０１０
【非特許文献８】Ｎａｋａｔｓｕｒａら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：８６３０−８６４０、２００４
【非特許文献９】Ｋｏｍｏｒｉら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：２６８９−２６９７、２００６
【非特許文献１０】Ｓｕｚｕｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ、１０２：１６２２−１６２９、２０１１
【非特許文献１１】Ｈｉｐｐｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４：２４１８−２４２３、２００４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
細胞表面および可溶性のＧＰＣ３タンパク質に高親和性で結合するモノクローナル抗体のパネルが本明細書で開示されている。本明細書で提供される抗体は、ＩｇＧ抗体などの免疫グロブリン分子、ならびに、抗体フラグメントおよびヒト化モノクローナル抗体およびフラグメントを包含する。さらに、ＧＰＣ３に結合する（例えば特異的に結合する）抗体を含む組成物、これらの抗体をコードする核酸分子、その核酸分子を含む発現ベクター、およびその核酸分子を発現する単離された宿主細胞が提供される。本明細書に開示された抗体、および毒素などのエフェクター分子を含む免疫結合体もまた提供される。
【０００８】
本明細書で提供される抗体および組成物は、ＧＰＣ３を発現するがん、例えば、ＨＣＣ、メラノーマ、肺の扁平上皮がん腫、または卵巣明細胞がん腫の診断を確認するためなどの様々な目的に用いることができる。したがって、がんと診断された被験体由来の試料を、ＧＰＣ３を結合するモノクローナル抗体と接触させる工程、およびその抗体のその試料への結合を検出する工程により、被験体におけるがんの診断を確認する方法が本明細書に提供される。抗体の対照試料への結合と比較しての、その試料への抗体の結合の増加により、がん診断が確認される。いくつかの実施形態において、方法はさらに、ＧＰＣ３特異的抗体を特異的に認識する二次抗体をその試料に接触させる工程、および二次抗体の結合を検出する工程を含む。
【０００９】
同様に、被験体においてＧＰＣ３を発現するがんを検出する方法が本明細書に提供される。方法は、被験体由来の試料を、本明細書に記載されたモノクローナル抗体と接触させる工程、およびその抗体のその試料への結合を検出する工程を含む。対照試料と比較しての、その試料への抗体の結合の増加が、被験体におけるがんを検出する。いくつかの実施形態において、方法はさらに、ＧＰＣ３特異的抗体を特異的に認識する二次抗体をその試料に接触させる工程、および二次抗体の結合を検出する工程を含む。
【００１０】
ＧＰＣ３を発現するがんを有する被験体を選択する工程、および治療的有効量の、ＧＰＣ３に特異的なモノクローナル抗体、またはその抗体を含む免疫結合体をその被験体に投与する工程により、がん、例えば、ＨＣＣ、メラノーマ、肺の扁平上皮がん腫、または卵巣明細胞がん腫を有する被験体を処置する方法がさらに提供される。
【００１１】
ＧＰＣ３を発現するがんを有する被験体を選択する工程、および治療的有効量の、本明細書に開示された抗体、免疫結合体、または組成物をその被験体に投与する工程により、被験体において腫瘍成長を阻害するための方法もまた提供される。
【００１２】
本発明の前述の、および他の目的、特徴、および利点は、添付の図を参照して進める、以下の詳細な説明からより明らかになるだろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
グリピカン−３（ＧＰＣ３）を結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
（ｉ）前記抗体の重鎖が、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０を含み、前記抗体の軽鎖が、配列番号４４、配列番号１４のアミノ酸残基５６〜５８、および配列番号４５を含むか；または
（ｉｉ）前記抗体の重鎖が、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３を含み、前記抗体の軽鎖が、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４５を含む、
単離されたモノクローナル抗体。
（項目２）
（ｉ）前記抗体の重鎖が、配列番号１２のアミノ酸残基２６〜３３、５１〜６０、および９９〜１０６を含み、前記抗体の軽鎖が、配列番号１４のアミノ酸残基２７〜３８、５６〜５８、および９５〜１０３を含むか；
（ｉｉ）前記抗体の重鎖が、配列番号８のアミノ酸残基２６〜３３、５１〜６０、および９９〜１０６を含み、前記抗体の軽鎖が、配列番号１０のアミノ酸残基２７〜３８、５６〜５８、および９５〜１０３を含むか；
（ｉｉｉ）前記抗体の重鎖が、配列番号１６のアミノ酸残基２６〜３３、５１〜６０、および９９〜１０６を含み、前記抗体の軽鎖が、配列番号１８のアミノ酸残基２７〜３８、５６〜５８、および９５〜１０３を含むか；または
（ｉｖ）前記抗体の重鎖が、配列番号２０のアミノ酸残基２６〜３３、５１〜６０、および９９〜１０６を含み、前記抗体の軽鎖が、配列番号２２のアミノ酸残基２７〜３８、５６〜５８、および９５〜１０３、配列番号２４のアミノ酸残基２７〜３８、５６〜５８、および９５〜１０３、もしくは配列番号２６のアミノ酸残基２７〜３８、５６〜５８、および９５〜１０３を含む、
項目１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
（項目３）
（ｉ）前記抗体の重鎖が、配列番号１２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６８、および１０１〜１０６を含み、前記抗体の軽鎖が、配列番号１４のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０３を含み；
（ｉｉ）前記抗体の重鎖が、配列番号８のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６８、および１０１〜１０６を含み、前記抗体の軽鎖が、配列番号１０のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０３を含むか；
（ｉｉｉ）前記抗体の重鎖が、配列番号１６のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６８、および１０１〜１０６を含み、前記抗体の軽鎖が、配列番号１８のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０３を含むか；または
（ｉｖ）前記抗体の重鎖が、配列番号２０のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６８、および１０１〜１０６を含み、前記抗体の軽鎖が、配列番号２２のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０３、配列番号２４のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０３、もしくは配列番号２６のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０３を含む、
項目１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
（項目４）
（ｉ）前記重鎖のアミノ酸配列が、配列番号１２と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であり、前記軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号１４と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるか；
（ｉｉ）前記重鎖のアミノ酸配列が、配列番号８と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であり、前記軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号１０と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるか；
（ｉｉｉ）前記重鎖のアミノ酸配列が、配列番号１６と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であり、前記軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号１８と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるか；または
（ｉｖ）前記重鎖のアミノ酸配列が、配列番号２０と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であり、前記軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号２２、２４、もしくは２６と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一である、
項目１〜３のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
（項目５）
（ｉ）前記抗体の重鎖が配列番号１２を含み、前記抗体の軽鎖が配列番号１４を含むか；
（ｉｉ）前記抗体の重鎖が配列番号８を含み、前記抗体の軽鎖が配列番号１０を含むか；
（ｉｉｉ）前記抗体の重鎖が配列番号１６もしくは配列番号３７を含み、前記抗体の軽鎖が配列番号１８を含むか；または
（ｉｖ）前記抗体の重鎖が配列番号２０を含み、前記抗体の軽鎖が配列番号２２、２４、もしくは２６を含む、
項目１〜４のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
（項目６）
ＧＰＣ３を結合する単離されたモノクローナル抗体であって、前記抗体が、
（ｉ）配列番号１２、配列番号８、配列番号１６、配列番号３７、もしくは配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメイン；または
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、もしくは配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン；または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方
を含む、単離されたモノクローナル抗体。
（項目７）
前記抗体がＶＨ単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィド安定化可変フラグメント（ｄｓＦｖ）である、項目１〜６のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
（項目８）
前記抗体がＩｇＧである、項目１〜６のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
（項目９）
前記抗体が標識されている、項目１〜８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
（項目１０）
前記標識が蛍光標識、酵素標識、または放射性標識である、項目９に記載の単離されたモノクローナル抗体。
（項目１１）
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
（項目１２）
薬学的に許容され得るキャリア中に、治療的有効量の、項目１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を含む、組成物。
（項目１３）
項目１〜１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体およびエフェクター分子を含む、単離された免疫結合体。
（項目１４）
前記エフェクター分子が毒素である、項目１３に記載の単離された免疫結合体。
（項目１５）
前記毒素がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはそのバリアントである、項目１４に記載の単離された免疫結合体。
（項目１６）
前記毒素が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＥ３８である、項目１５に記載の単離された免疫結合体。
（項目１７）
配列番号３５の残基２〜５９７、配列番号２８の残基２〜５９７、配列番号３１の残基２〜５９７、または配列番号３３の残基２〜５９７のアミノ酸配列を含む、項目１３〜１６のいずれか一項に記載の単離された免疫結合体。
（項目１８）
前記エフェクター分子が検出可能な標識である、項目１３に記載の単離された免疫結合体。
（項目１９）
薬学的に許容され得るキャリア中に、治療的有効量の、項目１３〜１８のいずれか一項に記載の単離された免疫結合体を含む、組成物。
（項目２０）
がんを有する被験体を処置する方法であって、ＧＰＣ３を発現するがんを有する被験体を選択する工程、および治療的有効量の、項目１２または項目１９に記載の組成物を前記被験体に投与し、それにより前記被験体における前記がんを処置する工程を含む、方法。
（項目２１）
腫瘍成長または転移を阻害する方法であって、ＧＰＣ３を発現するがんを有する被験体を選択する工程、および治療的有効量の、項目１２または項目１９に記載の組成物を前記被験体に投与し、それにより腫瘍成長または転移を阻害する工程を含む、方法。
（項目２２）
被験体ががんを有するかどうかを決定する方法、または被験体におけるがんの診断を確認する方法であって、
前記被験体由来の試料を項目１〜１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体に接触させる工程；および
前記抗体の前記試料への結合を検出する工程
を含み、前記抗体の対照試料への結合と比較しての前記抗体の前記試料への結合の増加により、前記被験体ががんを有すると同定されるか、または前記被験体におけるがんの診断が確認される、方法。
（項目２３）
前記モノクローナル抗体が直接標識されている、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記モノクローナル抗体を特異的に結合する二次抗体を前記試料に接触させる工程、および
二次抗体の結合を検出する工程
をさらに含み、前記二次抗体の対照試料への結合と比較しての前記二次抗体の前記試料への結合の増加により、前記被験体におけるがんが検出されるか、または前記被験体におけるがんの診断が確認される、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記がんが、肝細胞がん腫（ＨＣＣ）、メラノーマ、肺の扁平上皮がん腫、または卵巣明細胞がん腫である、項目２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
項目１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体をコードする、単離された核酸分子。
（項目２７）
（ｉ）前記モノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号１１を含み、前記モノクローナル抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号１３を含むか；
（ｉｉ）前記モノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号７を含み、前記モノクローナル抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号９を含むか；
（ｉｉｉ）前記モノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号１５もしくは配列番号３６を含み、前記モノクローナル抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号１７を含むか；または
（ｉｖ）前記モノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号１９を含み、前記モノクローナル抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号２１、配列番号２３、もしくは配列番号２５を含む、
項目２６に記載の単離された核酸分子。
（項目２８）
項目２６または項目２７に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目２９）
項目２６〜２８のいずれか一項に記載の核酸分子または発現ベクターで形質転換された、単離された宿主細胞。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅ：ＧＰＣ３に対する新しいモノクローナル抗体の知見。（図１Ａ）ＧＰＣ３の概略構造。ヒトＧＰＣ３遺伝子は、５８０個のアミノ酸の７０ｋＤａ前駆タンパク質をコードする。細胞膜における成熟型において、ＧＰＩアンカーが、Ｃ末端シグナルに取って代わっている（推定切断部位：Ｓ５６０）。そのコアタンパク質は、ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基によってまとめられている。ヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖がそのポリペプチドコアに付着している。成熟ＧＰＣ３のＣ末端に対応する免疫化ペプチドが示されている。（図１Ｂ）ハイスループットフローサイトメトリースクリーニング。陽性上清に関して得られた代表的なヒストグラム（上のパネル）および陰性上清に関して得られた代表的なヒストグラム（下のパネル）。各ハイブリドーマを、フローサイトメトリー分析における抗原陽性Ａ４３１／Ｇ１細胞および抗原陰性Ａ４３１細胞の１：１混合物を組み入れた同時結合アッセイにより、ＧＰＣ３特異的ｍＡｂ産生について試験した。（図１Ｃ）Ａ４３１／Ｇ１およびＨｅｐ３Ｂを用いた、５つの選択されたマウスハイブリドーマクローン（ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ８、ＹＰ９、およびＹＰ９．１）（実線）および１Ｇ１２（対照抗ＧＰＣ３  ｍＡｂ）（中央の点線）のフローサイトメトリー分析。塗りつぶされたピーク：アイソタイプ対照。（図１Ｄ）組換えＧＰＣ３タンパク質における５つのハイブリドーマクローンのＥＬＩＳＡ分析。ＧＰＣ３：組換えＧＰＣ３−ヒトＦｃ；ＧＰＣ３ΔＨＳ：ＨＳを含まない組換えＧＰＣ３；対照：ＢＳＡ；１Ｇ１２：市販の抗ＧＰＣ３  ｍＡｂ。（図１Ｅ）ＹＰ７およびＹＰ９のウェスタンブロット分析。ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ａ４３１／Ｇ１（Ａ４３１．ＧＰＣ３＋）、およびＡ４３１の３０μｇの細胞全体の溶解産物を負荷し、各ハイブリドーマ上清で探索した。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｅ：ＧＰＣ３に対する新しいモノクローナル抗体の知見。（図１Ａ）ＧＰＣ３の概略構造。ヒトＧＰＣ３遺伝子は、５８０個のアミノ酸の７０ｋＤａ前駆タンパク質をコードする。細胞膜における成熟型において、ＧＰＩアンカーが、Ｃ末端シグナルに取って代わっている（推定切断部位：Ｓ５６０）。そのコアタンパク質は、ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基によってまとめられている。ヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖がそのポリペプチドコアに付着している。成熟ＧＰＣ３のＣ末端に対応する免疫化ペプチドが示されている。（図１Ｂ）ハイスループットフローサイトメトリースクリーニング。陽性上清に関して得られた代表的なヒストグラム（上のパネル）および陰性上清に関して得られた代表的なヒストグラム（下のパネル）。各ハイブリドーマを、フローサイトメトリー分析における抗原陽性Ａ４３１／Ｇ１細胞および抗原陰性Ａ４３１細胞の１：１混合物を組み入れた同時結合アッセイにより、ＧＰＣ３特異的ｍＡｂ産生について試験した。（図１Ｃ）Ａ４３１／Ｇ１およびＨｅｐ３Ｂを用いた、５つの選択されたマウスハイブリドーマクローン（ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ８、ＹＰ９、およびＹＰ９．１）（実線）および１Ｇ１２（対照抗ＧＰＣ３  ｍＡｂ）（中央の点線）のフローサイトメトリー分析。塗りつぶされたピーク：アイソタイプ対照。（図１Ｄ）組換えＧＰＣ３タンパク質における５つのハイブリドーマクローンのＥＬＩＳＡ分析。ＧＰＣ３：組換えＧＰＣ３−ヒトＦｃ；ＧＰＣ３ΔＨＳ：ＨＳを含まない組換えＧＰＣ３；対照：ＢＳＡ；１Ｇ１２：市販の抗ＧＰＣ３  ｍＡｂ。（図１Ｅ）ＹＰ７およびＹＰ９のウェスタンブロット分析。ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ａ４３１／Ｇ１（Ａ４３１．ＧＰＣ３＋）、およびＡ４３１の３０μｇの細胞全体の溶解産物を負荷し、各ハイブリドーマ上清で探索した。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｅ：ＧＰＣ３に対する新しいモノクローナル抗体の知見。（図１Ａ）ＧＰＣ３の概略構造。ヒトＧＰＣ３遺伝子は、５８０個のアミノ酸の７０ｋＤａ前駆タンパク質をコードする。細胞膜における成熟型において、ＧＰＩアンカーが、Ｃ末端シグナルに取って代わっている（推定切断部位：Ｓ５６０）。そのコアタンパク質は、ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基によってまとめられている。ヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖がそのポリペプチドコアに付着している。成熟ＧＰＣ３のＣ末端に対応する免疫化ペプチドが示されている。（図１Ｂ）ハイスループットフローサイトメトリースクリーニング。陽性上清に関して得られた代表的なヒストグラム（上のパネル）および陰性上清に関して得られた代表的なヒストグラム（下のパネル）。各ハイブリドーマを、フローサイトメトリー分析における抗原陽性Ａ４３１／Ｇ１細胞および抗原陰性Ａ４３１細胞の１：１混合物を組み入れた同時結合アッセイにより、ＧＰＣ３特異的ｍＡｂ産生について試験した。（図１Ｃ）Ａ４３１／Ｇ１およびＨｅｐ３Ｂを用いた、５つの選択されたマウスハイブリドーマクローン（ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ８、ＹＰ９、およびＹＰ９．１）（実線）および１Ｇ１２（対照抗ＧＰＣ３  ｍＡｂ）（中央の点線）のフローサイトメトリー分析。塗りつぶされたピーク：アイソタイプ対照。（図１Ｄ）組換えＧＰＣ３タンパク質における５つのハイブリドーマクローンのＥＬＩＳＡ分析。ＧＰＣ３：組換えＧＰＣ３−ヒトＦｃ；ＧＰＣ３ΔＨＳ：ＨＳを含まない組換えＧＰＣ３；対照：ＢＳＡ；１Ｇ１２：市販の抗ＧＰＣ３  ｍＡｂ。（図１Ｅ）ＹＰ７およびＹＰ９のウェスタンブロット分析。ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ａ４３１／Ｇ１（Ａ４３１．ＧＰＣ３＋）、およびＡ４３１の３０μｇの細胞全体の溶解産物を負荷し、各ハイブリドーマ上清で探索した。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｅ：ＧＰＣ３に対する新しいモノクローナル抗体の知見。（図１Ａ）ＧＰＣ３の概略構造。ヒトＧＰＣ３遺伝子は、５８０個のアミノ酸の７０ｋＤａ前駆タンパク質をコードする。細胞膜における成熟型において、ＧＰＩアンカーが、Ｃ末端シグナルに取って代わっている（推定切断部位：Ｓ５６０）。そのコアタンパク質は、ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基によってまとめられている。ヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖がそのポリペプチドコアに付着している。成熟ＧＰＣ３のＣ末端に対応する免疫化ペプチドが示されている。（図１Ｂ）ハイスループットフローサイトメトリースクリーニング。陽性上清に関して得られた代表的なヒストグラム（上のパネル）および陰性上清に関して得られた代表的なヒストグラム（下のパネル）。各ハイブリドーマを、フローサイトメトリー分析における抗原陽性Ａ４３１／Ｇ１細胞および抗原陰性Ａ４３１細胞の１：１混合物を組み入れた同時結合アッセイにより、ＧＰＣ３特異的ｍＡｂ産生について試験した。（図１Ｃ）Ａ４３１／Ｇ１およびＨｅｐ３Ｂを用いた、５つの選択されたマウスハイブリドーマクローン（ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ８、ＹＰ９、およびＹＰ９．１）（実線）および１Ｇ１２（対照抗ＧＰＣ３  ｍＡｂ）（中央の点線）のフローサイトメトリー分析。塗りつぶされたピーク：アイソタイプ対照。（図１Ｄ）組換えＧＰＣ３タンパク質における５つのハイブリドーマクローンのＥＬＩＳＡ分析。ＧＰＣ３：組換えＧＰＣ３−ヒトＦｃ；ＧＰＣ３ΔＨＳ：ＨＳを含まない組換えＧＰＣ３；対照：ＢＳＡ；１Ｇ１２：市販の抗ＧＰＣ３  ｍＡｂ。（図１Ｅ）ＹＰ７およびＹＰ９のウェスタンブロット分析。ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ａ４３１／Ｇ１（Ａ４３１．ＧＰＣ３＋）、およびＡ４３１の３０μｇの細胞全体の溶解産物を負荷し、各ハイブリドーマ上清で探索した。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｅ：ＧＰＣ３に対する新しいモノクローナル抗体の知見。（図１Ａ）ＧＰＣ３の概略構造。ヒトＧＰＣ３遺伝子は、５８０個のアミノ酸の７０ｋＤａ前駆タンパク質をコードする。細胞膜における成熟型において、ＧＰＩアンカーが、Ｃ末端シグナルに取って代わっている（推定切断部位：Ｓ５６０）。そのコアタンパク質は、ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基によってまとめられている。ヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖がそのポリペプチドコアに付着している。成熟ＧＰＣ３のＣ末端に対応する免疫化ペプチドが示されている。（図１Ｂ）ハイスループットフローサイトメトリースクリーニング。陽性上清に関して得られた代表的なヒストグラム（上のパネル）および陰性上清に関して得られた代表的なヒストグラム（下のパネル）。各ハイブリドーマを、フローサイトメトリー分析における抗原陽性Ａ４３１／Ｇ１細胞および抗原陰性Ａ４３１細胞の１：１混合物を組み入れた同時結合アッセイにより、ＧＰＣ３特異的ｍＡｂ産生について試験した。（図１Ｃ）Ａ４３１／Ｇ１およびＨｅｐ３Ｂを用いた、５つの選択されたマウスハイブリドーマクローン（ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ８、ＹＰ９、およびＹＰ９．１）（実線）および１Ｇ１２（対照抗ＧＰＣ３  ｍＡｂ）（中央の点線）のフローサイトメトリー分析。塗りつぶされたピーク：アイソタイプ対照。（図１Ｄ）組換えＧＰＣ３タンパク質における５つのハイブリドーマクローンのＥＬＩＳＡ分析。ＧＰＣ３：組換えＧＰＣ３−ヒトＦｃ；ＧＰＣ３ΔＨＳ：ＨＳを含まない組換えＧＰＣ３；対照：ＢＳＡ；１Ｇ１２：市販の抗ＧＰＣ３  ｍＡｂ。（図１Ｅ）ＹＰ７およびＹＰ９のウェスタンブロット分析。ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ａ４３１／Ｇ１（Ａ４３１．ＧＰＣ３＋）、およびＡ４３１の３０μｇの細胞全体の溶解産物を負荷し、各ハイブリドーマ上清で探索した。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃ：ＹＰ７結合特性の特徴づけ。（図２Ａ）内因性ＧＰＣ３発現ヒト細胞系のパネルを用いたフローサイトメトリー分析。４つのＨＣＣ細胞系（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ４、およびＨｕｈ７）、４つのＣＣＡ細胞系（ＨｕＣＣＴ１、ＫＭＢＣ、ＫＭＣＨ、およびＭｚ−ＣｈＡ−１）、１つの卵巣ＣＣＣ細胞系（ＴＯＶ−２１Ｇ）、および１つのメラノーマ細胞系（ＵＡＣＣ−６２）へのＹＰ７の結合が示されている。（図２Ｂ）細胞表面会合型ＧＰＣ３に対するＹＰ７の結合親和性測定。ＭＦＩ：平均蛍光強度。スキャッチャードプロットおよびＫＤ値を、Ｐｒｉｓｍを用いて計算した。（図２Ｃ）組換えＧＰＣ１タンパク質、組換えＧＰＣ３タンパク質、および組換えＧＰＣ５タンパク質におけるＹＰ７の結合。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃ：ＹＰ７結合特性の特徴づけ。（図２Ａ）内因性ＧＰＣ３発現ヒト細胞系のパネルを用いたフローサイトメトリー分析。４つのＨＣＣ細胞系（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ４、およびＨｕｈ７）、４つのＣＣＡ細胞系（ＨｕＣＣＴ１、ＫＭＢＣ、ＫＭＣＨ、およびＭｚ−ＣｈＡ−１）、１つの卵巣ＣＣＣ細胞系（ＴＯＶ−２１Ｇ）、および１つのメラノーマ細胞系（ＵＡＣＣ−６２）へのＹＰ７の結合が示されている。（図２Ｂ）細胞表面会合型ＧＰＣ３に対するＹＰ７の結合親和性測定。ＭＦＩ：平均蛍光強度。スキャッチャードプロットおよびＫＤ値を、Ｐｒｉｓｍを用いて計算した。（図２Ｃ）組換えＧＰＣ１タンパク質、組換えＧＰＣ３タンパク質、および組換えＧＰＣ５タンパク質におけるＹＰ７の結合。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃ：ＹＰ７結合特性の特徴づけ。（図２Ａ）内因性ＧＰＣ３発現ヒト細胞系のパネルを用いたフローサイトメトリー分析。４つのＨＣＣ細胞系（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ４、およびＨｕｈ７）、４つのＣＣＡ細胞系（ＨｕＣＣＴ１、ＫＭＢＣ、ＫＭＣＨ、およびＭｚ−ＣｈＡ−１）、１つの卵巣ＣＣＣ細胞系（ＴＯＶ−２１Ｇ）、および１つのメラノーマ細胞系（ＵＡＣＣ−６２）へのＹＰ７の結合が示されている。（図２Ｂ）細胞表面会合型ＧＰＣ３に対するＹＰ７の結合親和性測定。ＭＦＩ：平均蛍光強度。スキャッチャードプロットおよびＫＤ値を、Ｐｒｉｓｍを用いて計算した。（図２Ｃ）組換えＧＰＣ１タンパク質、組換えＧＰＣ３タンパク質、および組換えＧＰＣ５タンパク質におけるＹＰ７の結合。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｅ：肝臓がんにおけるＧＰＣ３タンパク質発現。（図３Ａ）ウェスタンブロッティングで検出された肝臓がん細胞系におけるＧＰＣ３発現。ＨＣＣ：肝細胞がん腫；ＣＣＡ：胆管がん腫；１Ｇ１２：ＧＰＣ３に対する市販のｍＡｂ；Ｍｚ：Ｍｚ−ＣｈＡ−１；ＳＫ：ＳＫ−Ｈｅｐ−１。（図３Ｂ）卵巣明細胞がん腫（ＣＣＣ）のウェスタンブロット。ＴＯＶ−２１Ｇ：卵巣ＣＣＣ系。（図３Ｃ）培養上清から免疫沈降されて、ウェスタンブロッティングにより分析された可溶性ＧＰＣ３タンパク質。ＹＰ７を用いて、培養上清における可溶性ＧＰＣ３タンパク質をプルダウンした。Ｈ：マウスＩｇＧ重鎖；Ｌ：マウスＩｇＧ軽鎖；Ｃ末端：Ｃ末端サブユニット（約３０ｋＤａ）；ＩＰ：免疫沈降。（図３Ｄ）９つのＨＣＣおよび９つのＣＣＡの原発性肝臓腫瘍組織におけるウェスタンブロッティングによるＧＰＣ３発現分析。（図３Ｅ）ＨＣＣ組織におけるＧＰＣ３の免疫組織化学法。円形は、低倍率における、明瞭なＧＰＣ３陽性があるかまたはない腫瘍巣（ａ、ｃ）を識別する。矢印は、より高い倍率における、ＧＰＣ３陽性があるかまたはない腫瘍（ｂ、ｄ）を識別する。ａ、ｃ：１００×；ｂおよびｄ：ａおよびｃそれぞれのより高い倍率（４００×）。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｅ：肝臓がんにおけるＧＰＣ３タンパク質発現。（図３Ａ）ウェスタンブロッティングで検出された肝臓がん細胞系におけるＧＰＣ３発現。ＨＣＣ：肝細胞がん腫；ＣＣＡ：胆管がん腫；１Ｇ１２：ＧＰＣ３に対する市販のｍＡｂ；Ｍｚ：Ｍｚ−ＣｈＡ−１；ＳＫ：ＳＫ−Ｈｅｐ−１。（図３Ｂ）卵巣明細胞がん腫（ＣＣＣ）のウェスタンブロット。ＴＯＶ−２１Ｇ：卵巣ＣＣＣ系。（図３Ｃ）培養上清から免疫沈降されて、ウェスタンブロッティングにより分析された可溶性ＧＰＣ３タンパク質。ＹＰ７を用いて、培養上清における可溶性ＧＰＣ３タンパク質をプルダウンした。Ｈ：マウスＩｇＧ重鎖；Ｌ：マウスＩｇＧ軽鎖；Ｃ末端：Ｃ末端サブユニット（約３０ｋＤａ）；ＩＰ：免疫沈降。（図３Ｄ）９つのＨＣＣおよび９つのＣＣＡの原発性肝臓腫瘍組織におけるウェスタンブロッティングによるＧＰＣ３発現分析。（図３Ｅ）ＨＣＣ組織におけるＧＰＣ３の免疫組織化学法。円形は、低倍率における、明瞭なＧＰＣ３陽性があるかまたはない腫瘍巣（ａ、ｃ）を識別する。矢印は、より高い倍率における、ＧＰＣ３陽性があるかまたはない腫瘍（ｂ、ｄ）を識別する。ａ、ｃ：１００×；ｂおよびｄ：ａおよびｃそれぞれのより高い倍率（４００×）。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｅ：肝臓がんにおけるＧＰＣ３タンパク質発現。（図３Ａ）ウェスタンブロッティングで検出された肝臓がん細胞系におけるＧＰＣ３発現。ＨＣＣ：肝細胞がん腫；ＣＣＡ：胆管がん腫；１Ｇ１２：ＧＰＣ３に対する市販のｍＡｂ；Ｍｚ：Ｍｚ−ＣｈＡ−１；ＳＫ：ＳＫ−Ｈｅｐ−１。（図３Ｂ）卵巣明細胞がん腫（ＣＣＣ）のウェスタンブロット。ＴＯＶ−２１Ｇ：卵巣ＣＣＣ系。（図３Ｃ）培養上清から免疫沈降されて、ウェスタンブロッティングにより分析された可溶性ＧＰＣ３タンパク質。ＹＰ７を用いて、培養上清における可溶性ＧＰＣ３タンパク質をプルダウンした。Ｈ：マウスＩｇＧ重鎖；Ｌ：マウスＩｇＧ軽鎖；Ｃ末端：Ｃ末端サブユニット（約３０ｋＤａ）；ＩＰ：免疫沈降。（図３Ｄ）９つのＨＣＣおよび９つのＣＣＡの原発性肝臓腫瘍組織におけるウェスタンブロッティングによるＧＰＣ３発現分析。（図３Ｅ）ＨＣＣ組織におけるＧＰＣ３の免疫組織化学法。円形は、低倍率における、明瞭なＧＰＣ３陽性があるかまたはない腫瘍巣（ａ、ｃ）を識別する。矢印は、より高い倍率における、ＧＰＣ３陽性があるかまたはない腫瘍（ｂ、ｄ）を識別する。ａ、ｃ：１００×；ｂおよびｄ：ａおよびｃそれぞれのより高い倍率（４００×）。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｅ：肝臓がんにおけるＧＰＣ３タンパク質発現。（図３Ａ）ウェスタンブロッティングで検出された肝臓がん細胞系におけるＧＰＣ３発現。ＨＣＣ：肝細胞がん腫；ＣＣＡ：胆管がん腫；１Ｇ１２：ＧＰＣ３に対する市販のｍＡｂ；Ｍｚ：Ｍｚ−ＣｈＡ−１；ＳＫ：ＳＫ−Ｈｅｐ−１。（図３Ｂ）卵巣明細胞がん腫（ＣＣＣ）のウェスタンブロット。ＴＯＶ−２１Ｇ：卵巣ＣＣＣ系。（図３Ｃ）培養上清から免疫沈降されて、ウェスタンブロッティングにより分析された可溶性ＧＰＣ３タンパク質。ＹＰ７を用いて、培養上清における可溶性ＧＰＣ３タンパク質をプルダウンした。Ｈ：マウスＩｇＧ重鎖；Ｌ：マウスＩｇＧ軽鎖；Ｃ末端：Ｃ末端サブユニット（約３０ｋＤａ）；ＩＰ：免疫沈降。（図３Ｄ）９つのＨＣＣおよび９つのＣＣＡの原発性肝臓腫瘍組織におけるウェスタンブロッティングによるＧＰＣ３発現分析。（図３Ｅ）ＨＣＣ組織におけるＧＰＣ３の免疫組織化学法。円形は、低倍率における、明瞭なＧＰＣ３陽性があるかまたはない腫瘍巣（ａ、ｃ）を識別する。矢印は、より高い倍率における、ＧＰＣ３陽性があるかまたはない腫瘍（ｂ、ｄ）を識別する。ａ、ｃ：１００×；ｂおよびｄ：ａおよびｃそれぞれのより高い倍率（４００×）。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｅ：肝臓がんにおけるＧＰＣ３タンパク質発現。（図３Ａ）ウェスタンブロッティングで検出された肝臓がん細胞系におけるＧＰＣ３発現。ＨＣＣ：肝細胞がん腫；ＣＣＡ：胆管がん腫；１Ｇ１２：ＧＰＣ３に対する市販のｍＡｂ；Ｍｚ：Ｍｚ−ＣｈＡ−１；ＳＫ：ＳＫ−Ｈｅｐ−１。（図３Ｂ）卵巣明細胞がん腫（ＣＣＣ）のウェスタンブロット。ＴＯＶ−２１Ｇ：卵巣ＣＣＣ系。（図３Ｃ）培養上清から免疫沈降されて、ウェスタンブロッティングにより分析された可溶性ＧＰＣ３タンパク質。ＹＰ７を用いて、培養上清における可溶性ＧＰＣ３タンパク質をプルダウンした。Ｈ：マウスＩｇＧ重鎖；Ｌ：マウスＩｇＧ軽鎖；Ｃ末端：Ｃ末端サブユニット（約３０ｋＤａ）；ＩＰ：免疫沈降。（図３Ｄ）９つのＨＣＣおよび９つのＣＣＡの原発性肝臓腫瘍組織におけるウェスタンブロッティングによるＧＰＣ３発現分析。（図３Ｅ）ＨＣＣ組織におけるＧＰＣ３の免疫組織化学法。円形は、低倍率における、明瞭なＧＰＣ３陽性があるかまたはない腫瘍巣（ａ、ｃ）を識別する。矢印は、より高い倍率における、ＧＰＣ３陽性があるかまたはない腫瘍（ｂ、ｄ）を識別する。ａ、ｃ：１００×；ｂおよびｄ：ａおよびｃそれぞれのより高い倍率（４００×）。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂ：ＨＣＣ異種移植片モデルにおけるＹＰ７の抗腫瘍活性。（図４Ａ）ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスにＨｅｐＧ２細胞を皮下に接種した。腫瘍が１００ｍｍ３の平均体積に達した時、マウスに５ｍｇ／ｋｇのＹＰ７を週２回、２週間半、投与した。矢印：ＹＰ７注射；＊ｐ＜０．０５。（図４Ｂ）処置群（ＹＰ７）および未処置群（ビヒクル）におけるＨＣＣ腫瘍を有する代表的なマウス。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂ：ＨＣＣ異種移植片モデルにおけるＹＰ７の抗腫瘍活性。（図４Ａ）ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスにＨｅｐＧ２細胞を皮下に接種した。腫瘍が１００ｍｍ３の平均体積に達した時、マウスに５ｍｇ／ｋｇのＹＰ７を週２回、２週間半、投与した。矢印：ＹＰ７注射；＊ｐ＜０．０５。（図４Ｂ）処置群（ＹＰ７）および未処置群（ビヒクル）におけるＨＣＣ腫瘍を有する代表的なマウス。
【図５】図５は、ＩＭＧＴ（太字）およびＫａｂａｔ（下線）を用いて決定された場合のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の位置を示す、ＹＰ６クローン４（配列番号１５）、ＹＰ６クローン７（配列番号３６）、ＹＰ８（配列番号１５）、ＹＰ７（配列番号７）、ＹＰ９（配列番号１９）、およびＹＰ９．１（配列番号１１）のＶＨ配列のヌクレオチドアラインメントである。
【図６】図６は、ＩＭＧＴ（太字）およびＫａｂａｔ（下線）を用いて決定された場合のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の位置を示す、ＹＰ６クローン４（配列番号１６）、ＹＰ６クローン７（配列番号３７）、ＹＰ８（配列番号１６）、ＹＰ７（配列番号８）、ＹＰ９（配列番号２０）、およびＹＰ９．１（配列番号１２）のＶＨ配列のアミノ酸アラインメントである。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂは、ＩＭＧＴ（太字）およびＫａｂａｔ（下線）を用いて決定された場合のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の位置を示す、ＹＰ６（配列番号１７）、ＹＰ８（配列番号１７）、ＹＰ９クローン９（配列番号２１）、ＹＰ９クローン１（配列番号２５）、ＹＰ９クローン１０（配列番号２３）、ＹＰ９．１（配列番号１３）、およびＹＰ７（配列番号９）のＶＬ配列のヌクレオチドアラインメントを示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂは、ＩＭＧＴ（太字）およびＫａｂａｔ（下線）を用いて決定された場合のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の位置を示す、ＹＰ６（配列番号１７）、ＹＰ８（配列番号１７）、ＹＰ９クローン９（配列番号２１）、ＹＰ９クローン１（配列番号２５）、ＹＰ９クローン１０（配列番号２３）、ＹＰ９．１（配列番号１３）、およびＹＰ７（配列番号９）のＶＬ配列のヌクレオチドアラインメントを示す。
【図８】図８は、ＩＭＧＴ（太字）およびＫａｂａｔ（下線）を用いて決定された場合のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の位置を示す、ＹＰ６（配列番号１８）、ＹＰ８（配列番号１８）、ＹＰ９クローン９（配列番号２２）、ＹＰ９クローン１（配列番号２６）、ＹＰ９クローン１０（配列番号２４）、ＹＰ９．１（配列番号１４）、およびＹＰ７（配列番号１０）のＶＬ配列のアミノ酸アラインメントである。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｄは、ＧＰＣ３特異的免疫毒素のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。（図９Ａ）ＹＰ７ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号２７）およびアミノ酸配列（配列番号２８）。（図９Ｂ）ＹＰ８ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号３０）およびアミノ酸配列（配列番号３１）。（図９Ｃ）ＹＰ９ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号３２）およびアミノ酸配列（配列番号３３）。（図９Ｄ）ＹＰ９．１ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号３４）およびアミノ酸配列（配列番号３５）。図９Ａ〜９Ｄにおいて、ＶＨ配列は下線が引かれ、ＶＬ配列は太字で示され、ＰＥ３８配列はイタリック体で、かつ下線が引かれている。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｄは、ＧＰＣ３特異的免疫毒素のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。（図９Ａ）ＹＰ７ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号２７）およびアミノ酸配列（配列番号２８）。（図９Ｂ）ＹＰ８ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号３０）およびアミノ酸配列（配列番号３１）。（図９Ｃ）ＹＰ９ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号３２）およびアミノ酸配列（配列番号３３）。（図９Ｄ）ＹＰ９．１ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号３４）およびアミノ酸配列（配列番号３５）。図９Ａ〜９Ｄにおいて、ＶＨ配列は下線が引かれ、ＶＬ配列は太字で示され、ＰＥ３８配列はイタリック体で、かつ下線が引かれている。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｄは、ＧＰＣ３特異的免疫毒素のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。（図９Ａ）ＹＰ７ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号２７）およびアミノ酸配列（配列番号２８）。（図９Ｂ）ＹＰ８ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号３０）およびアミノ酸配列（配列番号３１）。（図９Ｃ）ＹＰ９ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号３２）およびアミノ酸配列（配列番号３３）。（図９Ｄ）ＹＰ９．１ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号３４）およびアミノ酸配列（配列番号３５）。図９Ａ〜９Ｄにおいて、ＶＨ配列は下線が引かれ、ＶＬ配列は太字で示され、ＰＥ３８配列はイタリック体で、かつ下線が引かれている。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、ＧＰＣ３特異的免疫毒素のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。（図９Ａ）ＹＰ７ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号２７）およびアミノ酸配列（配列番号２８）。（図９Ｂ）ＹＰ８ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号３０）およびアミノ酸配列（配列番号３１）。（図９Ｃ）ＹＰ９ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号３２）およびアミノ酸配列（配列番号３３）。（図９Ｄ）ＹＰ９．１ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列（配列番号３４）およびアミノ酸配列（配列番号３５）。図９Ａ〜９Ｄにおいて、ＶＨ配列は下線が引かれ、ＶＬ配列は太字で示され、ＰＥ３８配列はイタリック体で、かつ下線が引かれている。
【図１０】図１０は、ＧＰＣ３発現細胞系Ｇ１（左）、ＨｅｐＧ２（中央）、およびＨｅｐ３Ｂ（右）に対する抗ＧＰＣ３免疫毒素（ＹＰ７ＩＴ、ＹＰ８ＩＴ、ＹＰ９ＩＴ、およびＹＰ９．１ＩＴ）の結合親和性を示す一連のグラフである。これらの細胞系上での免疫毒素結合は、フローサイトメトリーによって測定される蛍光（幾何平均値）により示されている。
【図１１】図１１は、ＧＰＣ３発現細胞系Ｇ１（左）、ＨｅｐＧ２（中央）、およびＨｅｐ３Ｂ（右）に対する抗ＧＰＣ３免疫毒素（ＹＰ７ＩＴ、ＹＰ８ＩＴ、ＹＰ９ＩＴ、およびＹＰ９．１ＩＴ）の細胞傷害性を示す一連のグラフである。細胞増殖をＷＳＴ−８変換によって評価した。４５０ｎｍにおける試料の吸光度を、６５０ｎｍの参照波長と共に測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
配列表
添付の配列表に列挙される核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定されているように、ヌクレオチド塩基に対する標準的な文字の省略形、およびアミノ酸に対する３文字コードを用いて示される。各核酸配列の片方の鎖だけが示されるが、相補鎖は、表示される鎖に対する任意の参照によって含められると理解される。配列表は、２０１３年５月２１日に作成された、６８．６ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出されており、それは、本明細書中に参考として援用される。添付の配列表においては以下のとおりである：
配列番号１は、ＰＥ３８のアミノ酸配列である。
【００１５】
配列番号２は、ＰＥ−ＬＲのアミノ酸配列であるである。
【００１６】
配列番号３は、ＰＥ−ＬＲ／６Ｘのアミノ酸配列である。
【００１７】
配列番号４は、免疫原性が低減したＰＥのアミノ酸配列である。
【００１８】
配列番号５は、ＰＥ−ＬＲ／８Ｍのアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号６は、ＧＰＣ３ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号７は、ＹＰ７  ＶＨドメインのヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号８は、ＹＰ７  ＶＨドメインのアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号９は、ＹＰ７  ＶＬドメインのヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号１０は、ＹＰ７  ＶＬドメインのアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号１１は、ＹＰ９．１  ＶＨドメインのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号１２は、ＹＰ９．１  ＶＨドメインのアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号１３は、ＹＰ９．１  ＶＬドメインのヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号１４は、ＹＰ９．１  ＶＬドメインのアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号１５は、ＹＰ８およびＹＰ６のクローン４のＶＨドメインのヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号１６は、ＹＰ８およびＹＰ６のクローン４のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号１７は、ＹＰ８およびＹＰ６のＶＬドメインのヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号１８は、ＹＰ８およびＹＰ６のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号１９は、ＹＰ９  ＶＨドメインのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号２０は、ＹＰ９  ＶＨドメインのアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号２１は、ＹＰ９クローン９のＶＬドメインのヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号２２は、ＹＰ９クローン９のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号２３は、ＹＰ９クローン１０のＶＬドメインのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号２４は、ＹＰ９クローン１０のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号２５は、ＹＰ９クローン１のＶＬドメインのヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号２６は、ＹＰ９のクローン１のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号２７は、ＹＰ７ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号２８は、ＹＰ７ＳｃＦｖ−ＰＥ３８  免疫毒素のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号２９は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ（ＰＥ）のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号３０は、ＹＰ８ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号３１は、ＹＰ８ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号３２は、ＹＰ９ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号３３は、ＹＰ９ＳｃＦｖ−ＰＥ３８  免疫毒素のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号３４は、ＹＰ９．１ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号３５は、ＹＰ９．１ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素のアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号３６は、ＹＰ６クローン７のＶＨドメインのヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号３７は、ＹＰ６クローン７のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号３８は、Ｈ−ＣＤＲ１コンセンサスアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）である。
【００５２】
配列番号３９は、Ｈ−ＣＤＲ２コンセンサスアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）である。
【００５３】
配列番号４０は、Ｈ−ＣＤＲ３コンセンサスアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）である。
【００５４】
配列番号４１は、Ｈ−ＣＤＲ１コンセンサスアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）である。
【００５５】
配列番号４２は、Ｈ−ＣＤＲ２コンセンサスアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）である。
【００５６】
配列番号４３は、Ｈ−ＣＤＲ３コンセンサスアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）である。
【００５７】
配列番号４４は、Ｈ−ＣＤＲ１コンセンサスアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）である。
【００５８】
配列番号４５は、Ｈ−ＣＤＲ３コンセンサスアミノ酸配列（ＩＭＧＴおよびＫａｂａｔ）である。
【００５９】
配列番号４６は、Ｈ−ＣＤＲ１コンセンサスアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）である。
【００６０】
配列番号４７は、Ｈ−ＣＤＲ２コンセンサスアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）である。
【００６１】
（詳細な説明）
Ｉ．省略形
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
ＣＡＲ  キメラ抗原受容体
ＣＣＡ  胆管がん腫
ＣＣＣ  明細胞がん腫
ＣＤＲ  相補性決定領域
ＣＴＬ  細胞傷害性Ｔリンパ球
ＥＬＩＳＡ  酵素結合免疫吸着測定法
ＦＡＣＳ  蛍光活性化細胞ソーティング
ＧＰＣ３  グリピカン３
ＧＰＩ  グリコシルホスファチジルイノシトール
ＨＣＣ  肝細胞がん腫
ＨＳ  ヘパラン硫酸
ＩＣ５０  阻害濃度５０
Ｉｇ  免疫グロブリン
ＩＨＣ  免疫組織化学法
ＩＰ  免疫沈降
ＩＴ  免疫毒素
ＫＬＨ  キーホールリンペットヘモシアニン
ｍＡｂ  モノクローナル抗体
ＭＦＩ  平均蛍光強度
ＰＥ  フィコエリトリン
ＰＥ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素
ｓ．ｃ．  皮下
ＶＨまたはＶＨ  可変重鎖
ＶＬまたはＶＬ  可変軽鎖
【００６２】
ＩＩ．用語および方法
別段述べられない限り、専門用語は、慣例的用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓによる出版，１９９４（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ
ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．による出版，１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．による出版，１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）に見られ得る。
【００６３】
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語の説明が以下に提供される：
抗体：抗原（例えば、ＧＰＣ３またはそのフラグメント）のエピトープを認識して結合する（例えば、特異的に認識し、それに特異的に結合する）、少なくとも軽鎖免疫グロブリン可変領域または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンド。免疫グロブリン分子は、重鎖および軽鎖から構成され、その各々が、可変重鎖（ＶＨ）領域および可変軽鎖（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域を有する。まとめると、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原への結合に関与する。
【００６４】
抗体には、当該分野で周知のインタクトな免疫グロブリンならびに抗体のバリアントおよび部分（例えば、単一ドメイン抗体（例えばＶＨドメイン抗体）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」））が含まれる。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合された融合タンパク質であり、それらの鎖は、ｄｓＦｖでは、それらの鎖の会合を安定化するジスルフィド結合を導入するように変異されている。用語「抗体」は、遺伝的に操作された形態（例えば、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロ結合体抗体（例えば、二重特異性抗体））も包含する。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７もまた参照のこと。
【００６５】
通常、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖には２つのタイプ、ラムダ（λ）およびカッパー（κ）が存在する。抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。
【００６６】
重鎖および軽鎖の各々が、定常領域および可変領域を含む（それらの領域は、「ドメイン」としても知られる）。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、一体となって抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照のこと）およびＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：２０７−９，  ２００１を参照のこと；およびｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｈｕｍａｎＩｇにおいてオンラインで)によって定義されている。種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は
、ヒトなどの種内で比較的保存されている。構成要素である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、３次元空間にＣＤＲを配置し、整列させるように働く。
【００６７】
ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、通常、Ｎ末端から順番にナンバリングされたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称され、また、しばしば、特定のＣＤＲが位置する鎖によって特定される。したがって、ＶＨＣＤＲ３（またはＨ−ＣＤＲ３）は、それが見られる抗体の重鎖の可変ドメインに位置するのに対し、ＶＬＣＤＲ１（またはＬ−ＣＤＲ１）は、それが見られる抗体の軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ１である。例えばＧＰＣ３に結合する抗体は、一般に、特異的なＶＨ領域配列およびＶＬ領域配列、ひいては、特異的なＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは、抗体ごとに異なるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置だけが、抗原結合に直接関わる。これらのＣＤＲ内の位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。
【００６８】
「ＶＨ」または「ＶＨ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの可変領域を含む、免疫グロブリン重鎖の可変領域のことを指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの可変領域を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域のことを指す。
【００６９】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンまたは単一抗体の軽鎖遺伝子および／または重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、ミエローマ細胞と免疫脾臓細胞との融合によってハイブリッド抗体を形成する細胞を作製することによって、作製される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
【００７０】
「キメラ抗体」は、ヒトなどの１つの種由来のフレームワーク残基、およびＧＰＣ３に特異的に結合するマウス抗体などの別の種由来のＣＤＲ（一般に抗原結合性を付与する）を有する。
【００７１】
「ヒト」抗体（「完全ヒト」抗体とも呼ばれる）は、ヒトフレームワーク領域、およびヒト免疫グロブリン由来のすべてのＣＤＲを含む抗体である。１つの例において、フレームワークおよびＣＤＲは、同じ起源のヒト重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列に由来する。しかしながら、１つのヒト抗体のフレームワークは、異なるヒト抗体のＣＤＲを含むように操作され得る。「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域、および非ヒト（例えば、マウス、ラットまたは合成）免疫グロブリンの１つ以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。１つの実施形態において、そのすべてのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリンにおいてドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％（例えば、約９５％またはそれ以上）同一でなければならない。ゆえに、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分（おそらくＣＤＲを除く）が、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンまたはヒト化抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから得られたアミノ酸による限られた数の置換を有し得る。ヒト化モノクローナル抗体または他のモノクローナル抗体は、抗原結合性または他の免疫グロブリンの機能に対して実質的に影響しない追加の保存的アミノ酸置換を有し得る。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子操作を用いて構築され得る（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。
【００７２】
結合親和性：抗原に対する抗体の親和性。１つの実施形態において、親和性は、Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１０１−１０６，１９７９に記載されたＳｃａｔｃｈａｒｄ法の変法によって計算される。別の実施形態において、結合親和性は、抗原／抗体の解離速度によって測定される。別の実施形態において、高結合親和性は、競合ラジオイムノアッセイによって測定される。別の実施形態において、結合親和性は、ＥＬＩＳＡによって測定される。別の実施形態において、抗体親和性は、フローサイトメトリーによって測定される。抗原（例えば、ＧＰＣ３）に「特異的に結合」する抗体は、この抗原に高親和性で結合しかつ他の無関係の抗原に有意に結合しない抗体である。
【００７３】
化学療法因子：異常な細胞成長を特徴とする疾患の処置における治療上の有用性を備えた任意の化学因子。そのような疾患としては、腫瘍、新生物およびがん、ならびに乾癬などの肥厚成長を特徴とする疾患が挙げられる。１つの実施形態において、化学療法因子は、肝臓がん（例えばＨＣＣ）または別の腫瘍（例えば、卵巣がんまたはメラノーマ）の処置において有用な薬剤である。１つの実施形態において、化学療法因子は、放射性化合物である。当業者は、有用な化学療法因子を容易に識別することができる（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎにおけるＳｌａｐａｋ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８６；Ａｂｅｌｏｆｆ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，（著作権）２０００  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，ＩｎｃにおけるＰｅｒｒｙら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈ．１７；  Ｂａｌｔｚｅｒ，Ｌ．，Ｂｅｒｋｅｒｙ，Ｒ．（ｅｄｓ）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２ｎｄ
ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｄ．Ｓ．，Ｋｎｏｂｆ，Ｍ．Ｆ．，Ｄｕｒｉｖａｇｅ，Ｈ．Ｊ．（ｅｄｓ）：Ｔｈｅ
Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４ｔｈ  ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，１９９３を参照のこと）。併用化学療法は、がんを処置するための２つ以上の薬剤の投与である。一例は、例えば、放射性化合物または化学的化合物と併用されるＧＰＣ３に結合する抗体の投与である。
【００７４】
保存的バリアント：「保存的」アミノ酸置換は、ＧＰＣ３へのタンパク質（例えば抗体）の親和性に実質的に影響しないかまたはその親和性を低下させない置換である。例えば、ＧＰＣ３に特異的に結合するモノクローナル抗体は、多くとも約１個、多くとも約２個、多くとも約５個、多くとも（ｍｏｓｔ）約１０個、または多くとも約１５個の保存的置換を含み得、ＧＰＣ３ポリペプチドに特異的に結合し得る。「保存的バリアント」という用語は、抗体がＧＰＣ３に特異的に結合するのであれば、置換されていない親アミノ酸の代わりに、置換されたアミノ酸を使用することも含む。非保存的置換は、活性またはＧＰＣ３への結合性を低下させる置換である。
【００７５】
機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、当業者に周知である。以下の６つの群が、互いに保存的置換であると考えられるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００７６】
相補性決定領域（ＣＤＲ）：天然のＩｇ結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一体となって規定するアミノ酸配列。Ｉｇの軽鎖および重鎖の各々は、それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と命名された３つのＣＤＲを有する。
【００７７】
接触：直接的な物理的会合の配置；固体の形態と液体の形態での両方を含む。
【００７８】
細胞傷害性：生物の残りの部分の細胞とは対照的に、標的化されるように意図された細胞に対する、免疫毒素などの分子の毒性。１つの実施形態において、対照的に、用語「毒性」は、免疫毒素の標的化部分によって標的化されるように意図された細胞である細胞以外の細胞に対する免疫毒素の毒性のことを指し、用語「動物毒性」は、免疫毒素によって標的化されるように意図された細胞以外の細胞に対する免疫毒素の毒性による動物に対する免疫毒素の毒性のことを指す。
【００７９】
縮重バリアント：本開示の文脈では、「縮重バリアント」とは、遺伝暗号の結果として縮重した配列を含む、ＧＰＣ３ポリペプチドまたはＧＰＣ３に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドをいう。２０種の天然のアミノ酸が存在し、そのほとんどが、２つ以上のコドンによって指定される。それゆえ、縮重ヌクレオチド配列によってコードされるＧＰＣ３ポリペプチドまたはＧＰＣ３に結合する抗体のアミノ酸配列が変更されない限り、そのヌクレオチド配列のすべてが、含まれる。
【００８０】
診断：病理学的状態（例えば、肝臓がん、卵巣がん、メラノーマまたは肺がんであるがこれらに限定されない）の存在または性質を特定すること。診断方法は、その感度および特異性が異なる。診断アッセイの「感度」は、検査で陽性と出る罹患個体のパーセンテージ（真陽性のパーセント）である。診断アッセイの「特異性」は、１−偽陽性率であり、ここで、偽陽性率は、検査で陽性と出る疾患を有しない個体の割合と定義される。特定の診断方法は、ある状態の確定診断を提供しない可能性があるが、その方法が、診断に役立つ陽性の指標を提供する場合、その方法で十分である。「予後」は、肝臓がんまたは転移などの病理学的状態の発生の確率（例えば、重症度）である。
【００８１】
エフェクター分子：キメラ分子が標的としている細胞に対して所望の効果を有するように意図されたキメラ分子の一部。エフェクター分子は、エフェクター部分（ＥＭ）、治療薬もしくは診断薬、または類似の用語としても知られる。
【００８２】
治療薬としては、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸または誘導体、糖タンパク質、放射性同位体、脂質、炭水化物または組換えウイルスのような化合物が挙げられる。核酸の治療用部分および診断用部分は、アンチセンス核酸、一本鎖または二重鎖ＤＮＡとの共有結合性架橋のための誘導体化オリゴヌクレオチド、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドを含む。あるいは、抗ＧＰＣ３抗体などの標的化部分に連結された分子は、被包系（例えば、治療用組成物（例えば、薬物、核酸（例えば、アンチセンス核酸）または循環系への直接的な露出から保護され得る別の治療部分）を含むリポソームまたはミセル）であり得る。抗体に付着されたリポソームを調製する手段は、当業者に周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７３５号；およびＣｏｎｎｏｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２８：３４１−３６５，１９８５を参照のこと）。診断用剤または診断用部分は、放射性同位体および他の検出可能な標識を含む。そのような目的のために有用な検出可能な標識もまた、当該分野で周知であり、それらとしては、放射性同位元素（例えば、３５Ｓ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎおよび１２５Ｉ）、フルオロフォア、化学発光剤および酵素が挙げられる。
【００８３】
エピトープ：抗原決定基。これらは、抗原性である、すなわち、特定の免疫応答を誘発する、分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、ポリペプチド（例えば、ＧＰＣ３）上の特定の抗原性エピトープに特異的に結合する。
【００８４】
フレームワーク領域：ＣＤＲ間に挿入されるアミノ酸配列。フレームワーク領域としては、可変軽鎖フレームワーク領域および可変重鎖フレームワーク領域が挙げられる。フレームワーク領域は、抗原結合にとって適切な配向でＣＤＲを保持するように働く。
【００８５】
グリピカン−３（ＧＰＣ３）：グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーにより細胞表面に付着しているヘパラン硫酸（ＨＳ）プロテオグリカンのグリピカンファミリーのメンバー（ＦｉｌｍｕｓおよびＳｅｌｌｅｃｋ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０８：４９７−５０１、２００１）。ＧＰＣ３遺伝子は、約７０ｋＤａのコアタンパク質をコードし、それは、フーリンによって切断され、Ｎ末端４０ｋＤａフラグメントおよびＣ末端３０ｋＤａフラグメントを生じ得る。２つのＨＳ鎖は、ＧＰＣ３のＣ末端部分に付着している。ＧＰＣ３および他のグリピカンファミリータンパク質は、細胞分裂および細胞成長制御において役割を果たす。ＧＰＣ３は、ＨＣＣ、ならびにメラノーマ、肺の扁平上皮がん腫、および卵巣の明細胞がん腫を含むいくつかの他のヒトがんにおいて高度に発現しているが（ＨｏおよびＫｉｍ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４７（３）：３３３−３３８、２０１１）、正常組織においては発現していない。ＧＰＣ３は、ＳＧＢ、ＤＧＳＸ、ＭＸＲ７、ＳＤＹＳ、ＳＧＢＳ、ＯＣＩ−５、ＳＧＢＳ１、およびＧＴＲ２−２としても知られている。
【００８６】
ヒトＧＰＣ３の４つの既知のアイソフォームがある（アイソフォーム１〜４）。ＧＰＣ３の４つのアイソフォームの核酸配列およびアミノ酸配列は知られており、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１６４６１７およびＮＰ＿００１１５８０８９（アイソフォーム１）；ＮＭ＿００４４８４およびＮＰ＿００４４７５（アイソフォーム２）；ＮＭ＿００１１６４６１８およびＮＰ＿００１１５８０９０（アイソフォーム３）；ならびにＮＭ＿００１１６４６１９およびＮＰ＿００１１５８０９１（アイソフォーム４）が挙げられる。本開示のいくつかの実施形態において、本明細書に開示された抗体は、４つのヒトＧＰＣ３アイソフォームまたはその保存的バリアントのうちの１つまたは複数を結合する。
【００８７】
ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答：ヒト被験体に投与されたマウス抗体の可変領域および定常領域に対するその患者における免疫応答。抗体の反復投与によって、患者の血清からその抗体がクリアランスされる速度が増大し得、また、患者においてアレルギー反応が誘発され得る。
【００８８】
肝細胞がん腫（ＨＣＣ）：典型的には、ウイルス性肝炎、肝臓毒素、または肝硬変（アルコール依存によって引き起こされる場合が多い）に起因する炎症性肝臓を有する患者において起こる、肝臓の原発性悪性疾患。ＨＣＣはまた悪性ヘパトーマとも呼ばれる。
【００８９】
宿主細胞：ベクターが伝播され得、そのＤＮＡが発現され得る、細胞。その細胞は、原核生物または真核生物の細胞であり得る。この用語は、対象の宿主細胞の任意の子孫も含む。複製中に生じる変異が存在し得るので、すべての子孫が、親細胞と同一でない可能性があることが理解される。しかしながら、用語「宿主細胞」が使用されるとき、そのような子孫も含まれる。
【００９０】
免疫応答：刺激に対する免疫系の細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞または単球）の応答。１つの実施形態において、その応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。１つの実施形態において、免疫応答は、Ｔ細胞応答（例えば、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答）である。別の実施形態において、その応答は、Ｂ細胞応答であり、特定の抗体の産生をもたらす。
【００９１】
免疫結合体：抗体またはその機能的フラグメントへのエフェクター分子の共有結合。そのエフェクター分子は、検出可能な標識または免疫毒素であり得る。毒素の特定の非限定的な例としては、アブリン、リシン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ、例えば、ＰＥ３５、ＰＥ３７、ＰＥ３８およびＰＥ４０）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素もしくはそれらの改変された毒素、または直接もしくは間接的に細胞の成長を阻害するかもしくは細胞を殺滅する他の毒性物質が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＰＥおよびＤＴは、代表的には、肝臓毒性によって死をもたらす、高度に毒性の化合物である。しかしながら、ＰＥおよびＤＴは、その毒素の天然の標的化構成要素（例えば、ＰＥのドメインＩａおよびＤＴのＢ鎖）を除去し、それを抗体などの異なる標的化部分で置き換えることによって、免疫毒素として使用するための形態に改変され得る。「キメラ分子」は、エフェクター分子に結合体化（連結）された、リガンドまたは抗体などの標的化部分である。用語「結合体化された」または「連結された」とは、２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチド分子にすることを指す。１つの実施形態において、抗体は、エフェクター分子に接続される。別の実施形態において、エフェクター分子に接続された抗体は、体内での半減期を延長するために、タンパク質またはペプチドに対して脂質または他の分子とさらに接続される。その連結は、化学的手段または組換え手段によるものであり得る。１つの実施形態において、その連結は、化学的であり、ここで、抗体部分とエフェクター分子との反応は、それらの２つの分子間に形成される共有結合を作製することにより、１つの分子を形成する。ペプチドリンカー（短いペプチド配列）が、必要に応じて、抗体とエフェクター分子との間に含められ得る。本来、免疫結合体は、別個の機能性を備える２つの分子（例えば、抗体およびエフェクター分子）から調製されたので、それらは、時折、「キメラ分子」とも称される。ゆえに、用語「キメラ分子」は、本明細書中で使用されるとき、エフェクター分子に結合体化（連結）された、リガンドまたは抗体などの標的化部分のことを指す。
【００９２】
単離：「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸、タンパク質（抗体を含む）または細胞小器官）は、その構成要素が天然に存在する環境（例えば、細胞）内の他の生物学的構成要素、すなわち、他の染色体のおよび染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞小器官から実質的に分離されているか、または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語は、宿主細胞内の組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸も包含する。
【００９３】
標識：その分子の検出を容易にするために別の分子（例えば、抗体またはタンパク質）に直接または間接的に結合体化される検出可能な化合物または組成物。標識の特定の非限定的な例としては、蛍光タグ、酵素の連結および放射性同位元素が挙げられる。１つの例において、「標識された抗体」とは、抗体における別の分子の組み込みのことを指す。例えば、標識は、検出可能なマーカー（例えば、放射標識されたアミノ酸の組み込み、または標識されたアビジン（例えば、光学的方法または比色法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分とポリペプチドとの結合）である。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は、当該分野で公知であり、それらを使用してよい。ポリペプチドに対する標識の例としては、以下：放射性同位体または放射性ヌクレオチド（例えば、３５Ｓ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎおよび１２５Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニド燐光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）または磁性物質（例えば、ガドリニウムキレート）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために様々な長さのスペーサーアームによって結合される。
【００９４】
リンカー：ある場合には、リンカーは、可変重鎖と可変軽鎖とを間接的に結合するように働く抗体結合フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント）内のペプチドである。「リンカー」は、抗体などの標的化部分を、細胞毒素または検出可能な標識などのエフェクター分子に連結するように働くペプチドのことも指し得る。
【００９５】
用語「結合体化する」、「接続する」、「結合する」または「連結する」とは、２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチド分子にすること、またはｓｃＦｖなどのポリペプチドに放射性核種もしくは他の分子を共有結合的に結合することを指す。特定の文脈において、それらの用語は、抗体部分などのリガンドをエフェクター分子に接続することに対する言及を包含する。その連結は、化学的手段または組換え手段による連結であり得る。「化学的手段」とは、抗体部分とエフェクター分子との間の反応（それにより、それらの２つの分子の間に共有結合が形成されて１つの分子が形成される）のことを指す。
【００９６】
哺乳動物：この用語は、ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を包含する。同様に、用語「被験体」は、ヒト被験体と動物被験体の両方を包含する。
【００９７】
メラノーマ：メラノサイト（メラニン色素を産生する細胞）から起こるがんの一形態。メラノサイトは、主に皮膚に見られるが、腸および眼にも存在する。皮膚におけるメラノーマとしては、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、末端部黒子様黒色腫および悪性黒子（メラノーマ）が挙げられる。上記タイプのいずれもが、メラニンを産生し得るか、またはメラニン欠乏であり得る。同様に、任意のサブタイプが、高悪性度の挙動、および局所的な再発の傾向のマーカーである線維形成（神経親和性を有する高密度線維反応）を示し得る。他のメラノーマとしては、明細胞肉腫、粘膜黒色腫（ｍｕｃｏｓａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ）およびブドウ膜黒色腫が挙げられる。
【００９８】
新形成、悪性疾患、がんまたは腫瘍：新形成は、過剰な細胞分裂から生じる組織または細胞の異常増殖である。新形成増殖は、腫瘍を生じ得る。個体内の腫瘍の量は、その腫瘍の数、体積または重量として測定され得る「腫瘍量」である。転移しない腫瘍は、「良性」と称される。周囲の組織を浸潤し、かつ／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と称される。血液学的腫瘍の例としては、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（緩徐進行型および高悪性型）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病および骨髄形成異常が挙げられる。
【００９９】
肉腫およびがん腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫および他の肉腫、滑膜腫（ｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん腫、リンパ系悪性腫瘍、膵がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん腫、扁平上皮がん腫、基底細胞がん腫、腺がん、汗腺がん腫、甲状腺髄様がん腫、甲状腺乳頭がん腫、褐色細胞腫、皮脂腺がん腫、乳頭状がん腫、乳頭状腺がん、髄様がん腫、気管支原性がん腫、腎細胞がん腫、ヘパトーマ、胆管がん腫、絨毛がん腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱がん腫およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫）が挙げられる。
【０１００】
いくつかの例において、腫瘍は、ＨＣＣまたは肝芽腫などの肝臓がん、メラノーマ、肺の扁平上皮がん腫などの扁平上皮がん腫、卵巣の明細胞がん腫などの明細胞がん腫、甲状腺がん、ウィルムス腫瘍、神経芽腫、または精巣胚細胞性腫瘍である。
【０１０１】
作動可能に連結される：第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的関係性で配置されるとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、同じ読み枠において連続している。
【０１０２】
卵巣明細胞がん腫：全ての卵巣悪性疾患の５％未満の発生率である、上皮卵巣がんの弁別的な組織病理学的亜型。顕微鏡下で見ると、この型の腫瘍の細胞の内部がはっきり見える。
【０１０３】
医薬品：被験体または細胞に適切に投与されたときに、所望の治療効果または予防効果を誘導することができる化学的化合物または組成物。
【０１０４】
薬学的に許容され得るキャリア：薬学的に許容され得る有用なキャリアは、従来のキャリアである。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５には、本明細書中に開示される抗体の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。
【０１０５】
一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口用の製剤は、通常、薬学的かつ生理的に許容され得る流体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセルの形態）の場合、従来の無毒性固体キャリアとしては、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。投与される薬学的組成物は、生物学的に中性のキャリアに加えて、少量の無毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）を含み得る。
【０１０６】
疾患を予防する、処置するまたは回復させる：疾患を「予防する」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置する」とは、疾患または病理学的状態が発症し始めた後に、それらの徴候または症状を回復させる治療的介入（例えば、腫瘍量の減少、または転移の数もしくは（ｏｆ）サイズの減少）のことを指す。「回復させる」とは、がんなどの疾患の徴候または症状の数または重症度の減少のことを指す。
【０１０７】
精製された：精製されたという用語は、絶対的純度を要求しない；むしろ、それは相対的用語として意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド調製物は、そのペプチドまたはタンパク質が、それの天然環境において細胞内にあるそのペプチドまたはタンパク質より、より濃縮されているものである。１つの実施形態において、調製物は、そのタンパク質またはペプチドが、その調製物の総ペプチド含量または総タンパク質含量の少なくとも５０％に相当するように精製されている。実質的精製は、他のタンパク質または細胞構成要素からの精製を意味する。実質的に精製されたタンパク質は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％純粋である。したがって、一つの特定の非限定的例において、実質的に精製されたタンパク質は、他のタンパク質または細胞構成要素の９０％を含まない。
【０１０８】
組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するか、または２つの別途分離された配列のセグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有する、核酸である。この人工的な組み合わせは、化学的合成によって、または単離された核酸のセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作法によって、達成されることが多い。
【０１０９】
組換え毒素：細胞標的化部分が毒素に融合されたキメラタンパク質（Ｐａｓｔａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１１７３−１１７７，１９９１）。細胞標的化部分が、抗体のＦｖ部分である場合、その分子は、組換え免疫毒素と呼ばれる（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３３９：３９４−３９７，１９８９）。その毒素部分は、ほとんどの正常細胞上に存在する毒素レセプターに結合できないように遺伝的に変更されている。組換え免疫毒素は、抗原結合ドメインによって認識される細胞を選択的に殺滅する。これらの組換え毒素および免疫毒素は、がん、例えば、ＧＰＣ３を発現しているがんを処置するために使用され得る。
【０１１０】
試料（または生物学的試料）：被験体から得られる、ゲノムＤＮＡ、（ｍＲＮＡを含む）ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの組合せを含有する生物学的検体。例として、末梢血、組織、細胞、尿、唾液、組織バイオプシー、細針吸引物、外科検体、および剖検材料が挙げられるが、それらに限定されない。一例において、試料としては、ＨＣＣ組織バイオプシーなどの腫瘍バイオプシーが挙げられる。
【０１１１】
配列同一性：アミノ酸配列間または核酸配列間の類似性は、別途、配列同一性と称される、配列間の類似性に関して表現される。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性もしくは相同性）に関して測定されることが多い；そのパーセンテージが高いほど、その２つの配列はより似ている。ポリペプチドまたは核酸分子のホモログまたはバリアントは、標準的な方法を用いてアラインメントされたとき、比較的高い程度の配列同一性を有する。
【０１１２】
比較するために配列をアラインメントする方法は、当該分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが：Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ
Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０８８１，１９８８；およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：１１９，１９９４には、配列アラインメント法および相同性の計算に関する詳細な考察が提供されている。
【０１１３】
ＮＣＢＩベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、いくつかの供給源（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびインターネット上を含む）から入手可能である。どのようにしてこのプログラムを用いて配列同一性を決定するのかの説明は、インターネット上のＮＣＢＩのウェブサイトにおいて入手可能である。
【０１１４】
ＧＰＣ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体のＶＬまたはＶＨのホモログおよびバリアントは、代表的には、デフォルトのパラメータに設定されたＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ２．０，ｇａｐｐｅｄ  ｂｌａｓｔｐを用いた抗体のアミノ酸配列との完全長のアラインメントに対してカウントされるとき、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有することを特徴とする。約３０アミノ酸より長いアミノ酸配列を比較する場合、デフォルトのパラメータ（１１というギャップ存在コスト（ｇａｐ  ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｃｏｓｔ）および１という１残基当たりのギャップコスト（ｐｅｒ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｇａｐ  ｃｏｓｔ））に設定されたデフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて、Ｂｌａｓｔ２配列関数が使用される。短いペプチド（およそ３０アミノ酸未満）をアラインメントするとき、そのアラインメントは、デフォルトのパラメータ（オープンギャップ９、伸長ギャップ１ペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０行列を使用するＢｌａｓｔ２配列関数を用いて行われるべきである。参照配列に対してさらにより高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価されるとき、高いパーセンテージ同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を示す。全体の配列より小さい配列が、配列同一性のために比較されるとき、ホモログおよびバリアントは、代表的には、１０〜２０アミノ酸という狭い範囲にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照配列との類似性に応じて、少なくとも８５％または少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有し得る。そのような狭い範囲に対して配列同一性を測定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトにおいて利用可能である。当業者は、これらの配列同一性の範囲が、単に指針として提供されることを認識する；提供される範囲に入らない非常に有意なホモログを得ることができることも全く可能である。
【０１１５】
扁平上皮がん腫：皮膚、眼、様々な内部器官の表面、ならびにいくつかの腺の中空器官および管の裏打ちを形成する薄い平らな細胞である扁平上皮細胞から起こる、がんの１タイプ。扁平上皮がん腫は、類表皮がん腫とも称される。扁平上皮がんの１タイプは、肺の扁平上皮がん腫である。
【０１１６】
被験体：ヒト被験体と動物被験体（ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む）の両方を含むカテゴリーである、生存している多細胞脊椎動物。
【０１１７】
治療有効量：処置される被験体において所望の効果を達成するのに十分な特定の物質の量。例えば、これは、腫瘍の成長を阻害するかまたは抑制するのに必要な量であり得る。１つの実施形態において、治療有効量は、腫瘍を排除するか、腫瘍のサイズを減少させるか、または腫瘍の転移を防止するのに必要な量である。被験体に投与されたときに、所望のインビトロ効果を達成すると示された標的組織濃度（例えば、腫瘍において）を達成する投与量が一般に使用される。
【０１１８】
毒素：細胞に対して細胞傷害性である分子。毒素としては、アブリン、リシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、サポリン、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）もしくはゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）またはそれらの改変された毒素が挙げられる。例えば、ＰＥおよびＤＴは、代表的には、肝臓毒性によって死をもたらす、高度に毒性の化合物である。しかしながら、ＰＥおよびＤＴは、その毒素の天然の標的化構成要素（例えば、ＰＥのドメインＩａまたはＤＴのＢ鎖）を除去し、それを抗体などの異なる標的化部分で置き換えることによって、免疫毒素として使用するための形態に改変され得る。
【０１１９】
ベクター：宿主細胞に導入され、それにより、形質転換された宿主細胞をもたらす、核酸分子。ベクターは、宿主細胞においてその複製を可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子および当該分野で公知の他の遺伝的エレメントも含み得る。
【０１２０】
別段説明されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに対して与えられたすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量の値が、近似値であり、説明のために提供されていることが、さらに理解されるべきである。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料が、下記に記載される。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の全体が、参考として援用される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が優先するものとする。さらに、その材料、方法および例は、単なる例示であって、限定すると意図されない。
【０１２１】
ＩＩＩ．序論
肝細胞がん腫（ＨＣＣ）および胆管がん腫（ＣＣＡ）は、原発性肝臓がんの２つの主要な型である。グリピカン−３（ＧＰＣ３）は、ＨＣＣおよび他のがんにおける新しい標的である。しかしながら、腫瘍細胞は、ＧＰＣ３のそれらの発現において不均一である。低ＧＰＣ３発現レベルを示す細胞を標的にするために用いられ得る高親和性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が存在しないことにより、ＧＰＣ３標的化がん治療は妨げられてきた。
【０１２２】
細胞表面結合についてＧＰＣ３特異的ｍＡｂ（ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ８、ＹＰ９、およびＹＰ９．１）のパネルを効率的に単離したハイスループットのフローサイトメトリースクリーニング方法が本明細書に開示されている。その抗体は、フローサイトメトリー、イムノブロッティング、および免疫組織化学法によりヒト肝臓がん（ＨＣＣおよびＣＣＡ）細胞系および組織においてＧＰＣ３タンパク質発現を特徴づけるために用いられた。最も高い親和性の抗体（ＹＰ７）は、非ＨＣＣ細胞系においてＧＰＣ３発現を評価するために用いられ、マウスにおいて腫瘍異種移植片に対する抗腫瘍細胞傷害活性について評価された。
【０１２３】
本明細書に開示されたｍＡｂは、がん細胞上の天然型のＧＰＣ３、ならびに可溶性ＧＰＣ３に対して高親和性で結合する。ＹＰ７は、細胞表面会合型ＧＰＣ３を、平衡解離定数ＫＤ＝０．３ｎｍｏｌ／Ｌで結合し、ＨＣＣに対して非常に特異的であったが、ＣＣＡまたは正常組織のいずれに対しても特異的ではなかった。ＹＰ７抗体は、それが低発現がん細胞においてＧＰＣ３を検出した点において感受性が非常に高く、マウスにおいて有意なＨＣＣ腫瘍成長阻害を示した。ＰＥ３８に融合した、本明細書に開示された抗体（ＹＰ７、ＹＰ８、ＹＰ９クローン９、またはＹＰ９．１）を含む免疫毒素は、ＧＰＣ３発現細胞に対して非常に高い結合親和性を示し、ＧＰＣ３発現がん細胞成長を有意に阻害した。したがって、本明細書に開示された高親和性ｍＡｂは、ＧＰＣ３発現がん診断および治療のために用いることができる。
【０１２４】
ＩＶ．ＧＰＣ３を結合する高親和性モノクローナル抗体
細胞表面および可溶性のＧＰＣ３タンパク質に高親和性で結合する、モノクローナル抗体のパネルが本明細書に開示されている。ＹＰ７抗体、ＹＰ８抗体、ＹＰ９抗体、およびＹＰ９．１抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が下記に示されている。表１〜４は、ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴによって決定される場合の、各抗体についてのＣＤＲのヌクレオチド位置およびアミノ酸位置を列挙する。図５〜８は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのヌクレオチドアラインメントおよびアミノ酸アラインメントを示す。
【０１２５】
ＹＰ７  ＶＨヌクレオチド配列（配列番号７）
GAGGTGCAGCTTGTTGAGACTGGTGGAGGAATGGTGCAGCCTGAAGGGTCATTGAAACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATAAGAATGCCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAATAAAACTAATAATTATGCAACATATTATGCCGATTCAGTGAAAGCCAGGTTTACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAGCATGCTCTATCTGCAAATGAACAACTTGAAAATTGAGGACACAGCCATGTACTATTGTGTGGCTGGTAACTCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
【０１２６】
ＹＰ７  ＶＨアミノ酸配列（配列番号８）
EVQLVETGGGMVQPEGSLKLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSQSMLYLQMNNLKIEDTAMYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSA
【０１２７】
ＹＰ７  ＶＬヌクレオチド配列（配列番号９）
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGTTGTGTCAATTGGAGAGAAGGTTACTATGACCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGCAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAACAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCAGTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAACTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGTTGGAGCTGAAA
【０１２８】
ＹＰ７  ＶＬアミノ酸配列（配列番号１０）
DIVMSQSPSSLVVSIGEKVTMTCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASSRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYNYPLTFGAGTKLELK
【０１２９】
【表１Ａ】
2019062910.tif 000002
【０１３０】
【表１Ｂ】
2019062910.tif 000003
【０１３１】
【表１Ｃ】
2019062910.tif 000004
【０１３２】
【表１Ｄ】
2019062910.tif 000005
【０１３３】
ＹＰ９．１  ＶＨ  ＤＮＡ配列（配列番号１１）
GAGGTGCAGCTTGTTGAGACTGGCGGAGGATTGGTGCAGCCTGAAGGGTCATTGAAACTCTCATGTGCAACGTCTGGATTCAACTTCAATACCAATGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCGTAAGAAATAAAACTAATAATTATGCAACATATTATGCCGATTCAGTGAAAGACAGGTTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAGAATGGTCTTTCTGCAAATGAATAACTTGAAAACTGAGGACACAGCCATCTATTACTGTGTGGCGGGGAACTCGTTTGCTTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTCCT
【０１３４】
ＹＰ９．１  ＶＨタンパク質配列（配列番号１２）
EVQLVETGGGLVQPEGSLKLSCATSGFNFNTNAMNWVRQAPGKGLEWVARVRNKTNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQRMVFLQMNNLKTEDTAIYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSP
【０１３５】
ＹＰ９．１  ＶＬ  ＤＮＡ配列（配列番号１３）
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAGGGTTACTATGAACTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTTTTATATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGTATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAACTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
【０１３６】
ＹＰ９．１  ＶＬタンパク質配列（配列番号１４）
DIVMSQSPSSLAVSVGERVTMNCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPG
QSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYNYPLTFGAGTKLELK
【０１３７】
【表２Ａ】
2019062910.tif 000006
【０１３８】
【表２Ｂ】
2019062910.tif 000007
【０１３９】
【表２Ｃ】
2019062910.tif 000008
【０１４０】
【表２Ｄ】
2019062910.tif 000009
【０１４１】
ＹＰ８  ＶＨヌクレオチド配列（配列番号１５）
GAGGTGCAGCTTGTTGGAAGTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTGAAGGGTCATTGAAACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAAGACCAATGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAATAAAACTAATAATTATGCAACATATTATGCCGACTCAGTGAAAGACAGGTTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAGCATGCTCTATCTGCAAATGAACAACTTGAAAACTGAAGACACAGCCATGTATTTCTGTGTGGCCGGTAACTCGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
【０１４２】
ＹＰ８  ＶＨアミノ酸配列（配列番号１６）
EVQLVGSGGGLVQPEGSLKLSCAASGFTFKTNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRNKTNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYFCVAGNSFAYWGQGTLVTVSA
【０１４３】
ＹＰ８  ＶＬヌクレオチド配列（配列番号１７）
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTGTGAACTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAACAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCAACTAGGGAATATGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAACTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
【０１４４】
ＹＰ８  ＶＬアミノ酸配列（配列番号１８）
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTVNCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTREYGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYNYPLTFGAGTKLELK
【０１４５】
【表３Ａ】
2019062910.tif 000010
【０１４６】
【表３Ｂ】
2019062910.tif 000011
【０１４７】
【表３Ｃ】
2019062910.tif 000012
【０１４８】
【表３Ｄ】
2019062910.tif 000013
【０１４９】
ＹＰ９  ＶＨヌクレオチド配列（配列番号１９）
GAGGTCCAGCTTGTTGAGACTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTAAAGGGTCATTGAAACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATACCAATGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGCAATGGGTTGCTCGCGTAAGAAATAAAACTAATAATTATGCAACATATTATGCCGATTCCGTGAAAGACAGGTTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAGCATGCTCTATCTGCAAATGAACAACTTGAAAACTGAAGACACGGCCATTTATTACTGTGTGGGGGGTAACTCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
【０１５０】
ＹＰ９  ＶＨアミノ酸配列（配列番号２０）
EVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTNAMNWVRQAPGKGLQWVARVRNKTNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAIYYCVGGNSFAYWGQGTLVTVSA
【０１５１】
ＹＰ９クローン９のＶＬヌクレオチド配列（配列番号２１）
GACATTGTGATGTCCCAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAACAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCACCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
【０１５２】
ＹＰ９クローン９のＶＬアミノ酸配列（配列番号２２）
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYHQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK
【０１５３】
ＹＰ９クローン１０のＶＬヌクレオチド配列（配列番号２３）
GACATTGTGATGTCCCAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAACAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCACCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATATCTATCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
【０１５４】
ＹＰ９クローン１０のＶＬアミノ酸配列（配列番号２４）
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYHQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYIYPLTFGAGTKLELK
【０１５５】
ＹＰ９クローン１のＶＬヌクレオチド配列（配列番号２５）
GACATTGTGATGTCCCAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAACAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCACCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
【０１５６】
ＹＰ９クローン１のＶＬアミノ酸配列（配列番号２６）
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYHQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLEIK
【０１５７】
【表４Ａ】
2019062910.tif 000014
【０１５８】
【表４Ｂ】
2019062910.tif 000015
【０１５９】
【表４Ｃ】
2019062910.tif 000016
【０１６０】
【表４Ｄ】
2019062910.tif 000017
【０１６１】
ＹＰ６抗体のＶＬドメインのシーケンシングは、ＹＰ６  ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、ＹＰ８  ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１７および配列番号１８）と同一であることを決定した。ＹＰ６抗体のＶＨドメインのシーケンシングは、クローン４およびクローン７と呼ばれる２つのクローンを同定した。ＹＰ６クローン４  ＶＨドメイン配列は、ＹＰ８  ＶＨドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１５および配列番号１６）と同一である。ＹＰ６クローン７  ＶＨドメイン配列は、クローン４配列と、Ｈ−ＣＤＲ３のすぐ後の１アミノ酸残基だけ、異なる（トリプトファンからロイシンへの変化）。ＹＰ６  ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ、本明細書において配列番号３６および配列番号３７として示す（図５および図６も参照のこと）。
【０１６２】
図６および図８に示されているように、各抗体のＣＤＲ配列は非常に類似している。したがって、ＶＬおよびＶＨのＣＤＲのコンセンサス配列（ＩＭＧＴおよびＫａｂａｔの両方）が決定された。
HCDR1 （IMGT）:
GFX1FX2X3NA、ここで、X1=TまたはN、X2=KまたはN、そしてX3=TまたはK（配列番号38）
HCDR2 （IMGT）:
XRNKTNNYAT、ここで、X=IまたはV（配列番号39）
HCDR3 （IMGT）:
VXGNSFAY、ここで、X=AまたはG（配列番号40）
HCDR1 （Kabat）:
XNAMN、ここで、X=TまたはK（配列番号41）
HCDR2 （Kabat）:
RX1RNKTNNYATYYADSVKX2、ここで、X1=IまたはV、そしてX2=DまたはA（配列番号42）
HCDR3 （Kabat）:
GNSFAY（配列番号43）
LCDR1 （IMGT）:
QSLLYSNNQKNY（配列番号44）
LCDR2 （IMGT）:
WAS（配列番号14の残基56〜58）
LCDR3 （IMGT）:
QQYYXYPLT、ここで、X=S、IまたはN（配列番号45）
LCDR1 （Kabat）:
KSSQSLLYSNNQKNYLA（配列番号46）
LCDR2 （Kabat）:
WASX1REX2、ここで、X1=TまたはS、そしてX2=SまたはY（配列番号47）
LCDR3 （Kabat）:
QQYYXYPLT、ここで、X=S、IまたはN（配列番号45）
【０１６３】
細胞表面または可溶性のＧＰＣ３などのＧＰＣ３を結合する（例えば、特異的に結合する）単離されたモノクローナル抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、抗体の重鎖は、ＩＭＧＴによって決定された場合の配列番号８、１２、１６、２０、または３７由来の１つまたは複数（例えば、３つ全部）のＣＤＲ配列などの配列番号８（ＹＰ７）、配列番号１２（ＹＰ９．１）、配列番号１６（ＹＰ８およびＶＰ６クローン４）、配列番号３７（ＹＰ６クローン７）、または配列番号２０（ＹＰ９）として本明細書に示されたアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。他の実施形態において、抗体は、Ｋａｂａｔ方法を用いて決定された場合の配列番号８、１２、１６、２０、または３７由来の１つまたは複数（例えば、３つ全部）のＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体の軽鎖は、ＩＭＧＴによって決定された場合の配列番号１０、１４、１８、２２、２４、または２６由来の１つまたは複数（例えば、３つ全部）のＣＤＲ配列などの配列番号１０（ＹＰ７）、配列番号１４（ＹＰ９．１）、配列番号１８（ＹＰ８およびＹＰ６）、配列番号２２（ＹＰ９、クローン９）、配列番号２４（ＹＰ９、クローン１０）、または配列番号２６（ＹＰ９、クローン１）として本明細書に示されたアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。他の実施形態において、抗体は、Ｋａｂａｔ方法を用いて決定された場合の配列番号１０、１４、１８、２２、２４、または２６由来の１つまたは複数（例えば、３つ全部）のＣＤＲ配列を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、ＧＰＣ３を結合する抗体の重鎖は、配列番号８のアミノ酸残基２６〜３３、５１〜６０、および９９〜１０６を含む；ならびに／またはその抗体の軽鎖は、配列番号１０のアミノ酸残基２７〜３８、５６〜５８、および９５〜１０３を含む。他の実施形態において、重鎖は、配列番号８のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６８、および１０１〜１０６を含む；ならびに／またはその抗体の軽鎖は、配列番号１０のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０３を含む。いくつかの例において、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である；および／または軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である。特定の例において、抗体の重鎖は、配列番号８を含み、および／または抗体の軽鎖は配列番号１０を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、ＧＰＣ３を結合する抗体の重鎖は、配列番号１２のアミノ酸残基２６〜３３、５１〜６０、および９９〜１０６を含む；ならびに／またはその抗体の軽鎖は、配列番号１４のアミノ酸残基２７〜３８、５６〜５８、および９５〜１０３を含む。他の実施形態において、重鎖は、配列番号１２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６８、および１０１〜１０６を含む；ならびに／またはその抗体の軽鎖は、配列番号１４のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０３を含む。いくつかの例において、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である；および／または軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である。特定の例において、抗体の重鎖は、配列番号１２を含み、および／または抗体の軽鎖は配列番号１４を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、ＧＰＣ３を結合する抗体の重鎖は、配列番号１６のアミノ酸残基２６〜３３、５１〜６０、および９９〜１０６を含む；ならびに／またはその抗体の軽鎖は、配列番号１８のアミノ酸残基２７〜３８、５６〜５８、および９５〜１０３を含む。他の実施形態において、重鎖は、配列番号１６のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６８、および１０１〜１０６を含む；ならびに／またはその抗体の軽鎖は、配列番号１８のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０３を含む。いくつかの例において、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である；および／または軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である。特定の例において、抗体の重鎖は、配列番号１６もしくは配列番号３７を含み、および／または抗体の軽鎖は配列番号１８を含む。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、ＧＰＣ３を結合する抗体の重鎖は、配列番号２０のアミノ酸残基２６〜３３、５１〜６０、および９９〜１０６を含む；ならびに／またはその抗体の軽鎖は、配列番号２２、２４、もしくは２６のアミノ酸残基２７〜３８、５６〜５８、および９５〜１０３を含む。他の実施形態において、重鎖は、配列番号２０のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６８、および１０１〜１０６を含む；ならびに／またはその抗体の軽鎖は、配列番号２２、２４、もしくは２６のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０３を含む。いくつかの例において、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である；および／または軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２２、２４、もしくは２６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である。特定の例において、抗体の重鎖は、配列番号２０を含み、および／または抗体の軽鎖は配列番号２２、２４、もしくは２６を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０を含み、抗体の軽鎖は、配列番号４４、配列番号１４のアミノ酸残基５６〜５８、および配列番号４５を含む。他の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３を含み、抗体の軽鎖は、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４５を含む。
【０１６９】
ＧＰＣ３を結合する（例えば特異的に結合する）単離されたモノクローナル抗体であって、その抗体が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、もしくは配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメイン、および／または配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、もしくは配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む、モノクローナル抗体もまた提供される。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、抗体のＶＨドメインは配列番号８を含み、および／または抗体のＶＬドメインは配列番号１０を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、抗体のＶＨドメインは配列番号１２を含み、および／または抗体のＶＬドメインは配列番号１４を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、抗体のＶＨドメインは配列番号１６を含み、および／または抗体のＶＬドメインは配列番号１８を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、抗体のＶＨドメインは配列番号３７を含み、および／または抗体のＶＬドメインは配列番号１８を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、抗体のＶＨドメインは配列番号２０を含み、および／または抗体のＶＬドメインは配列番号２２、２４、もしくは２６を含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、ＧＰＣ３を結合する（例えば特異的に結合する）モノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、ＧＰＣ３を結合する（例えば特異的に結合する）モノクローナル抗体は、ＶＨ単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィド安定化可変フラグメント（ｄｓＦｖ）である。他の実施形態において、抗体は免疫グロブリン分子である。特定の例において、抗体はＩｇＧである。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、開示された抗体は、ＧＰＣ３（可溶性または細胞表面ＧＰＣ３）を、約１ｎＭまたはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する。いくつかの実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、約１ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．１５ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０４ｎＭ、約０．０３ｎＭ、約０．０２ｎＭ、または約０．０１ｎＭの結合親和性でＧＰＣ３を結合する。
【０１７８】
本明細書に開示された、単離されたヒトモノクローナル抗体は、蛍光標識、酵素標識、または放射性標識などで標識することができる。
【０１７９】
治療的有効量の開示された抗体および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物がさらに本明細書で提供される。
【０１８０】
本明細書に開示されたヒトモノクローナル抗体およびエフェクター分子を含む免疫結合体もまた提供される。エフェクター分子は、例えば、毒素または検出可能な標識であり得る。いくつかの実施形態において、免疫結合体は、本明細書に開示された抗ＧＰＣ３抗体のうちの１つのＶＨおよびＶＬドメイン、ならびにＰＥ、またはＰＥ３８などのそのバリアントなどの毒素を含む。いくつかの例において、免疫結合体は、ＰＥ３８に融合した、ＹＰ７のＶＨおよびＶＬ、ＹＰ８のＶＨおよびＶＬ、ＹＰ９  クローン９のＶＨおよびＶＬ、またはＹＰ９．１のＶＨおよびＶＬを含む。非限定的例において、免疫結合体のアミノ酸配列は、配列番号２８の残基２〜５９７、配列番号３１の残基２〜５９７、配列番号３３の残基２〜５９７、または配列番号３５の残基２〜５９７を含む。免疫結合体の例は、下記のセクションＶＩにおいて、より詳細に論じられている。治療的有効量の、本明細書に開示された免疫結合体、および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物もまた提供されている。
【０１８１】
開示されたモノクローナル抗体をコードする単離された核酸分子がさらに本明細書で提供されている。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７、１１、１５、１９、または３６のうちの１つまたは複数のＣＤＲをコードする部分などの配列番号７、１１、１５、１９、または３６の少なくとも一部を含む。いくつかの例において、ヒトモノクローナル抗体の重鎖は、配列番号７、１１、１５、１９、または３６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９、１３、１７、２１、２３、または２５のうちの１つまたは複数のＣＤＲをコードする部分などの配列番号９、１３、１７、２１、２３、または２５の少なくとも一部を含む。いくつかの例において、ヒトモノクローナル抗体の軽鎖は、配列番号９、１３、１７、２１、２３、または２５のヌクレオチド配列を含む。
【０１８２】
いくつかの例において、単離された核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結されている。
【０１８３】
本明細書に開示された単離された核酸分子を含む発現ベクターもまた提供される。その核酸分子またはベクターを含む単離された宿主細胞もまた本明細書に提供される。いくつかの例において、宿主細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などのＴ細胞である。
【０１８４】
Ｖ．抗体および抗体フラグメント
本明細書に開示されたモノクローナル抗体は、任意のアイソタイプであり得る。モノクローナル抗体は、例えば、ＩｇＭ、またはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２などのＩｇＧ抗体であり得る。ＧＰＣ３を特異的に結合する抗体のクラスは、周知の手順に従って、別のクラスとスイッチすることができる（例えば、ＩｇＧはＩｇＭへスイッチすることができる）。クラススイッチングはまた、ＩｇＧ１からＩｇＧ２へなど、あるＩｇＧサブクラスから別のサブクラスへ変換するために用いることもできる。
【０１８５】
抗体フラグメント（例えば、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨドメイン抗体）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ）もまた、本開示によって包含される。これらの抗体フラグメントは、その抗原に選択的に結合する能力を保持する。これらのフラグメントとしては：
（１）Ｆａｂ（抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含み、ホール抗体をパパイン酵素で消化することによって作製され、インタクトな軽鎖および一方の重鎖の一部をもたらすことができる、フラグメント）；
（２）Ｆａｂ’（抗体分子のこのフラグメントは、ホール抗体をペプシンで処理した後、還元することにより得られ、インタクトな軽鎖および重鎖の一部をもたらすことができる；抗体分子１つあたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる）；
（３）（Ｆａｂ’）２（ホール抗体をペプシン酵素で処理することによって（その後の還元は行わない）得ることができる、抗体のフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって保持される２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である）；
（４）Ｆｖ（２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝的に操作されたフラグメント）；
（５）単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）（遺伝的に融合された一本鎖分子として、好適なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む、遺伝的に操作された分子）；
（６）単鎖抗体の二量体（ｓｃＦＶ２）（ｓｃＦＶの二量体として定義される）（「ミニ抗体」としても公知）；および
（７）ＶＨ単一ドメイン抗体（重鎖可変ドメインからなる抗体フラグメント）
が挙げられる。
【０１８６】
これらのフラグメントを作製する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８を参照のこと）。
【０１８７】
いくつかの場合には、抗体フラグメントは、抗体のタンパク分解性加水分解によって、またはそのフラグメントをコードするＤＮＡの宿主細胞（例えば、大腸菌）内での発現によって、調製され得る。抗体フラグメントは、従来の方法によるホール抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって生成され、それにより、Ｆ（ａｂ’）２と表される５Ｓフラグメントがもたらされ得る。このフラグメントは、チオール還元剤、および必要に応じて、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基に対するブロック基を用いてさらに切断され、それにより、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントがもたらされ得る。あるいは、ペプシンを用いた酵素的切断は、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントを直接生成する（米国特許第４，０３６，９４５号および米国特許第４，３３１，６４７号を参照のこと）。
【０１８８】
それらのフラグメントが、インタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、抗体を切断する他の方法（例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成する重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的手法）も使用してよい。
【０１８９】
当業者は、抗体の保存的バリアントが作製され得ることを了解する。ｄｓＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントにおいて使用されるそのような保存的バリアントは、正しいフォールディングおよびＶＨ領域とＶＬ領域との間の安定化のために必要とされる不可欠なアミノ酸残基を保持し、その分子の低ｐＩおよび低毒性を保つために残基の電荷特性を保持する。収量を高めるために、アミノ酸置換（例えば、多くとも１つ、多くとも２つ、多くとも３つ、多くとも４つ、または多くとも５つのアミノ酸置換）が、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域において行われ得る。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、当業者に周知である。以下の６つの群が、互いに保存的置換であると考えられるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０１９０】
ＶＩ．免疫結合体
ＧＰＣ３に特異的な開示されるモノクローナル抗体は、治療薬またはエフェクター分子に結合体化され得る。免疫結合体としては、抗体への治療薬の共有結合が存在する分子が挙げられるが、これらに限定されない。治療薬は、特定の標的分子または標的分子を有する細胞に向けられた特定の生物学的活性を有する薬剤である。当業者は、治療薬が、様々な薬物（例えば、ビンブラスチン、ダウノマイシンなど）、細胞毒（例えば、天然のまたは改変されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはジフテリア毒素）、それ自体が薬理学的組成物を含む被包剤（例えば、リポソーム）、放射性物質（例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓ）ならびに他の標識、標的部分およびリガンドを含み得ることを認識する。
【０１９１】
特定の治療薬の選択は、特定の標的分子または標的細胞、および所望の生物学的作用に依存する。したがって、例えば、その治療薬は、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の死をもたらすために使用される細胞毒であり得る。逆に、非致死性の生物学的応答の惹起が望まれる場合、その治療薬は、非致死性の薬理学的物質、または非致死性の薬理学的物質を含むリポソームに結合体化され得る。
【０１９２】
本明細書に記載された治療薬および抗体に関して、当業者は、配列が異なるが、同じエフェクター部分または抗体配列をコードする核酸などの機能的に等価の核酸を含有する様々なクローンを容易に構築することができる。したがって、本開示は、抗体ならびにその結合体および融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【０１９３】
エフェクター分子は、当業者に公知の任意の数の手段を用いて、目的の抗体に連結され得る。共有結合性の結合手段と非共有結合性の結合手段の両方を使用してよい。エフェクター分子を抗体に結合させるための手順は、エフェクターの化学構造に応じて変化する。ポリペプチドは、代表的には、抗体上の好適な官能基との反応のために利用可能な種々の官能基；例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ２）またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基を含み、それにより、エフェクター分子の結合がもたらされる。あるいは、抗体は、さらなる反応性の官能基を露出するためにまたは結合するために誘導体化される。その誘導体化は、いくつかの公知のリンカー分子のうちのいずれかの結合を含み得る。そのリンカーは、抗体をエフェクター分子に接続するために使用される任意の分子であり得る。そのリンカーは、抗体とエフェクター分子の両方と共有結合を形成することができる。好適なリンカーは、当業者に周知であり、それらとしては、直鎖もしくは分枝鎖の炭素リンカー、複素環式炭素リンカーまたはペプチドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。抗体およびエフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーは、その側基を介して（例えば、システインとのジスルフィド結合を介して）、構成要素であるアミノ酸に、または末端のアミノ酸のアルファ炭素アミノ基およびカルボキシル基に、接続され得る。
【０１９４】
いくつかの状況では、免疫結合体がその標的部位に達したときに、エフェクター分子が抗体から取り除かれることが望ましい。それゆえ、これらの状況では、免疫結合体は、標的部位の近傍で切断可能な結合を含む。抗体からエフェクター分子を放出するリンカーの切断は、酵素活性、または免疫結合体が標的細胞内もしくは標的部位の近傍において供される条件によって促され得る。
【０１９５】
種々の放射性診断化合物、放射性治療化合物、標識（例えば、酵素または蛍光分子）薬物、毒素および他の物質を抗体に結合させることについて報告されている多数の方法に照らして、当業者は、所与の物質を抗体または他のポリペプチドに結合させるために適した方法を決定することができる。
【０１９６】
本明細書中に開示される抗体または抗体フラグメントは、誘導体化され得るか、または別の分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結され得る。一般に、それらの抗体またはその一部は、標的抗原への結合が誘導体化または標識によって悪影響を受けないように、誘導体化される。例えば、その抗体は、１つ以上の他の分子実体（例えば、別の抗体（例えば、二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出物質、医薬品、および／またはその抗体もしくは抗体部分と別の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグ）との会合を媒介し得るタンパク質もしくはペプチドに機能的に連結され得る（化学的結合、遺伝的融合、非共有結合性会合またはその他によって）。
【０１９７】
誘導体化抗体の１タイプは、２つ以上の抗体（二重特異性抗体を作製するような、同じタイプまたは異なるタイプの抗体）を架橋することによって作製される。好適な架橋剤としては、適切なスペーサーによって分離された２つの識別可能で反応性の基を有するヘテロ二官能性である架橋剤（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性である架橋剤（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）が挙げられる。そのようなリンカーは、市販される。
【０１９８】
ＧＰＣ３に結合する（例えば、特異的に結合する）抗体は、検出可能な部分で標識され得る。有用な検出物質としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）クロリド、フィコエリトリン、ランタニド燐光体などをはじめとした蛍光性の化合物が挙げられる。ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの生物発光マーカーもまた有用である。抗体は、検出に有用な酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなど）でも標識され得る。抗体が検出可能な酵素で標識されるとき、識別され得る反応産物を産生するためにその酵素が使用する追加の試薬を加えることによってその抗体は検出され得る。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼという物質が存在するとき、過酸化水素およびジアミノベンジジンを加えることにより、視覚的に検出可能な有色の反応産物がもたらされる。抗体は、ビオチンでも標識され得、そしてそれは、アビジンまたはストレプトアビジンの結合を間接的に測定することによって検出され得る。アビジン自体が、酵素または蛍光標識で標識され得ることに注意すべきである。
【０１９９】
抗体は、ガドリニウムなどの磁性物質で標識され得る。抗体は、ランタニド（例えば、ユウロピウムおよびジスプロシウム）およびマンガンでも標識され得る。超常磁性酸化鉄などの常磁性粒子もまた、標識として有用である。抗体は、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）でも標識され得る。いくつかの実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために様々な長さのスペーサーアームによって結合される。
【０２００】
抗体は、放射標識されたアミノ酸でも標識され得る。その放射標識は、診断目的と治療目的の両方のために使用され得る。例えば、その放射標識は、Ｘ線、発光スペクトルまたは他の診断法によって、ＧＰＣ３を検出するために使用され得る。ポリペプチドに対する標識の例としては、以下の放射性同位体または放射性ヌクレオチド：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
また、抗体は、化学基（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基もしくはエチル基または炭水化物基）を用いて誘導体化され得る。これらの基は、その抗体の生物学的特徴を改善するため（例えば、血清半減期を延長するため、または組織結合性を高めるため）に有用であり得る。
【０２０２】
毒素を本明細書に記載されたモノクローナル抗体と共に用いて、免疫毒素を作製することができる。例示的な毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、およびそれらのサブユニット、ならびに、ボツリヌス毒素Ａ型〜Ｆ型が挙げられる。これらの毒素は、商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から容易に入手することができる。企図される毒素としてはまた、本明細書に記載された毒素のバリアントも挙げられる（例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および第４，６８９，４０１号参照）。１つの実施形態において、毒素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）である（米国特許第５，６０２，０９５号）。本明細書で用いられる場合、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素」は、完全長の天然（天然に存在する）ＰＥ、または改変されているＰＥを指す。そのような改変としては、ドメインＩａの除去、ドメインＩｂ、ＩＩ、およびＩＩＩの様々なアミノ酸欠失、単一アミノ酸置換、ならびにカルボキシル末端における１つまたは複数の配列の付加が挙げられ得るが、それらに限定されない（例えば、Ｓｉｅｇａｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２５６〜１４２６１、１９８９参照）。
【０２０３】
本明細書に記載されたモノクローナル抗体と共に用いられるＰＥとしては、天然配列、天然配列の細胞傷害性フラグメント、ならびに天然ＰＥおよびそれの細胞傷害性フラグメントの保存的に改変されたバリアントが挙げられ得る。ＰＥの細胞傷害性フラグメントとしては、標的細胞におけるその後のタンパク質分解性または他のプロセシングが有るかまたは無い、細胞傷害性であるものが挙げられる。ＰＥの細胞傷害性フラグメントとしては、ＰＥ４０、ＰＥ３８、およびＰＥ３５が挙げられる。ＰＥおよびそのバリアントの追加の説明について、例えば、米国特許第４，８９２，８２７号；第５，５１２，６５８号；第５，６０２，０９５号；第５，６０８，０３９号；第５，８２１，２３８号；および第５，８５４，０４４号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９９／５１６４３号；Ｐａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：３３５８−３３６２、１９９１；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９４７０−９４７５、１９８８；Ｐａｓｔａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３３３：Ｃ１−Ｃ６、１９９７を参照されたい。
【０２０４】
完全長ＰＥ配列は配列番号２９として本明細書に示されている：
AEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQTQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK
【０２０５】
いくつかの例において、ＰＥは、以下のアミノ酸配列を含むＰＥ３８である：
GGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(配列番号１)                                        
【０２０６】
非限定的に、ＰＥ−ＬＲ、ＰＥ−６Ｘ、ＰＥ−８Ｘ、ＰＥ−ＬＲ／６Ｘ、およびＰＥ−ＬＲ／８Ｘなどの、プロテアーゼ抵抗性ＰＥバリアントおよび免疫原性が低下したＰＥバリアントもまた本明細書で企図される（例えば、Ｗｅｌｄｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  １１３（１６）：３７９２−３８００、２００９；Ｏｎｄａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５（３２）：１１３１１−１１３１６、２００８；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００７／０１６１５０号、同第ＷＯ  ２００９／０３２９５４号、および同第ＷＯ  ２０１１／０３２０２２号参照（それらは、参照により本明細書に組み入れられている））。
【０２０７】
いくつかの例において、ＰＥは、以下のアミノ酸配列を有するＰＥ−ＬＲ（Ｗｅｌｄｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  １１３（１６）：３７９２−３８００、２００９；ＰＣＴ公開第ＷＯ
２００９／０３２９５４号）などのリソソーム分解に抵抗性であるバリアントである：RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(配列番号
２)
【０２０８】
他の例において、ＰＥは、以下のアミノ酸配列を有するＰＥ−ＬＲ／６Ｘ（ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２０１１／０３２０２２号）と名付けられたバリアントである：
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEGGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWAGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAAGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYATSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEESGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDSEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(配列番号
３)
【０２０９】
他の例において、ＰＥバリアントは、以下の配列を有するＰＥなどの免疫原性が低下したＰＥである：
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGXVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEXGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWXGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAXGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYXTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEXGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDXEXAISALPDYASQPGKPPREDLK(X=G、Aま
たはS;配列番号４)
【０２１０】
他の例において、ＰＥは、以下のアミノ酸配列を有するＰＥ−ＬＲ／８Ｍ（ＰＣＴ公開特許第ＷＯ  ２０１１／０３２０２２号）と名付けられたバリアントである：
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGAVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEGGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWAGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAAGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYATSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEESGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDSEAAISALPDYASQPGKPPREDLK(配列番号
５)
【０２１１】
ＰＥの置換は、配列番号２９として本明細書に示された完全長ＰＥのアミノ酸配列を参照して本明細書に定義される。ＰＥの置換は、特定の位置に存在するアミノ酸残基、続いて、その残基がその特定の置換において取って代わられているアミノ酸という表示により本明細書で記載される。このことにおいて、ＰＥの特定の実施形態のアミノ酸配列の位置は、その特定の実施形態のアミノ酸配列の位置として、または配列番号２９によって定義された場合の位置として、本明細書で言及される。したがって、置換は、それぞれのアミノ酸配列における実際の位置が異なる場合があるという理解を以て、配列番号２９の６１３アミノ酸配列の示された位置に対応するＰＥの特定の実施形態のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の置き換えを指す。２つまたはそれより多くの位置における複数の置換の場合、その２つまたはそれより多くの置換は同じ場合もあるし、異なる場合もある  −  置換されることになっているその２つまたはそれより多くのアミノ酸残基の各アミノ酸残基は、明確に他に指示がない限り、同じかまたは異なるアミノ酸残基で置換することができる。
【０２１２】
ＰＥの改変は、ＰＥの細胞傷害性フラグメントを含む、任意の以前に記載されたバリアント（例えば、ＰＥ３８、ＰＥ−ＬＲ、およびＰＥ−ＬＲ／８Ｍ）において存在してもよい。改変されたＰＥは、ＰＥの１つまたは複数のＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープ内の１つまたは複数のアミノ酸残基について、上記のような任意の置換（複数可）を含んでもよい。
【０２１３】
本明細書に記載された抗体は、表面上にＧＰＣ３を発現する細胞へ、いくつでも異なる診断用または治療用化合物を標的化するためにも用いることができる。したがって、本開示の抗体は、細胞表面ＧＰＣ３を発現する細胞に直接送達されるべきである薬物に直接的に、またはリンカーを介して、付着することができる。これは、治療、診断、または研究を目的として行うことができる。治療薬としては、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸または誘導体、糖タンパク質、放射性同位体、脂質、炭水化物、または組換えウイルスのような化合物が挙げられる。核酸治療用および診断用の部分としては、アンチセンス核酸、一本鎖または二重鎖ＤＮＡとの共有結合性架橋のための誘導体化オリゴヌクレオチド、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０２１４】
あるいは、抗ＧＰＣ３抗体に連結された分子は、好ましくは循環系への直接的曝露から防御される薬物、核酸（例えば、アンチセンス核酸）、または別の治療用部分などの治療用組成物を含有するリポソームまたはミセルなどの封入系であり得る。抗体に付着したリポソームを調製する手段は、当業者に周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７３５号；Ｃｏｎｎｏｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２８：３４１−３６５、１９８５参照）。
【０２１５】
また、本明細書中に記載される抗体は、検出可能な標識に共有結合的または非共有結合的に連結され得る。そのように使用するのに適した検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。有用な標識としては、磁気ビーズ、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて通常使用されるその他のもの）および比色標識（例えば、コロイド金または色ガラス）、またはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズが挙げられる。
【０２１６】
そのような標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出され、蛍光マーカーは、光検出器を用いて検出されることにより、放射された照度が検出され得る。酵素標識は、代表的には、その酵素に基質を提供し、その基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を検出することによって検出され、比色標識は、単純に有色の標識を可視化することによって検出される。
【０２１７】
ＶＩＩ．組成物および使用方法
キャリア中にＧＰＣ３に結合する（例えば、特異的に結合する）開示される抗体のうちの１つまたは複数を含む組成物が提供される。免疫結合体または免疫毒素を含む組成物も提供される。それらの組成物は、被験体に投与するための単位剤形で調製され得る。投与の量およびタイミングは、所望の結果を達成するために、処置している臨床医の判断による。その抗体は、全身性投与または局所（例えば、腫瘍内）投与のために製剤化され得る。１つの例において、抗体は、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化される。
【０２１８】
投与するための組成物は、水性キャリアなどの薬学的に許容され得るキャリアに溶解された抗体の溶液を含み得る。種々の水性キャリア、例えば、緩衝食塩水などが使用され得る。これらの溶液は、滅菌されており、通常、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌法によって滅菌され得る。それらの組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容され得る補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含み得る。これらの製剤における抗体の濃度は、広く変動し得、選択される特定の投与様式および被験体の要望に従って、主に液量、粘度、体重などに基づいて選択され得る。
【０２１９】
静脈内投与用の代表的な薬学的組成物は、１日あたり被験体１人あたり約０．１〜１０ｍｇの抗体を含む。特に、その薬剤が隔離された部位に投与される場合、および循環系またはリンパ系（例えば、体腔または器官の管腔）に投与されない場合、１日あたり被験体１人あたり０．１から約１００ｍｇまでの投薬量が使用され得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）のような刊行物に詳細に記載されている。
【０２２０】
抗体は、凍結乾燥された形態で提供され得、投与前に滅菌水で再水和され得るが、それらは、既知濃度の滅菌された溶液としても提供される。次いで、その抗体溶液は、０．９％塩化ナトリウム，ＵＳＰを含む輸液バッグに加えられ、そしていくつかの場合には、０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与される。１９９７年のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）の承認以来、米国で販売されている抗体薬の投与について当該分野においてかなりの経験が入手可能である。抗体は、静脈内プッシュまたはボーラスではなく緩徐な注入によって投与され得る。１つの例において、より多い負荷用量が投与され、続いて、低レベルの維持用量が投与される。例えば、４ｍｇ／ｋｇという最初の負荷用量が、およそ９０分間にわたって注入された後、先の用量が十分に許容されていた場合、４〜８週間にわたって１週間に１回、２ｍｇ／ｋｇという維持用量が、３０分間にわたって注入され得る。
【０２２１】
制御放出の非経口製剤が、埋没物、油性注射剤または微粒子系として作製され得る。タンパク質送達系の概観については、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｊ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，（１９９５）を参照のこと。微粒子系としては、ミクロスフェア、微小粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェアおよびナノ粒子が挙げられる。マイクロカプセルは、細胞毒または薬物などの治療用タンパク質を中央のコアとして含む。ミクロスフェアでは、治療薬は、粒子全体に分散されている。約１μｍより小さい粒子、ミクロスフェアおよびマイクロカプセルは、一般にそれぞれナノ粒子、ナノスフェアおよびナノカプセルと称される。毛細血管は、およそ５μｍの直径を有するので、ナノ粒子だけが静脈内に投与される。微小粒子は、代表的には、直径がおよそ１００μｍであり、皮下または筋肉内に投与される。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．２１９−３４２（１９９４）；およびＴｉｃｅ＆Ｔａｂｉｂｉ，Ｔｒｅａｔｉｓｅ  ｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３１５−３３９，（１９９２）を参照のこと。
【０２２２】
本明細書中に開示される抗体組成物のイオン制御放出のために、ポリマーが使用され得る。制御された薬物送達において使用するための様々な分解可能および分解不可能な重合体マトリックスが当該分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：５３７−５４２，１９９３）。例えば、ブロック共重合体であるポロキサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）４０７は、低温では粘稠性であるが流動性の液体として存在するが、体温では半固体のゲルを形成する。それは、組換えインターロイキン−２およびウレアーゼの製剤化および持続性送達にとって有効なビヒクルであると示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：４２５−４３４，１９９２；およびＰｅｃら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４（２）：５８−６５，１９９０）。あるいは、ヒドロキシアパタイトは、タンパク質の制御放出のためのマイクロキャリアとして使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２：２１５−２２４，１９９４）。さらに別の態様では、リポソームは、脂質のカプセルに入っている薬物の制御放出ならびに薬物標的化のために使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ（１９９３））。治療用タンパク質の制御された送達のためのさらなる系が数多く知られている（米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，１８８，８３７号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９５７，７３５号；米国特許第５，０１９，３６９号；米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，５１４，６７０号；米国特許第５，４１３，７９７号；米国特許第５，２６８，１６４号；米国特許第５，００４，６９７号；米国特許第４，９０２，５０５号；米国特許第５，５０６，２０６号；米国特許第５，２７１，９６１号；米国特許第５，２５４，３４２号および米国特許第５，５３４，４９６号を参照のこと）。
【０２２３】
Ａ．治療方法      
本明細書に開示された抗体、組成物、および免疫結合体は、ＨＣＣ、メラノーマ、卵巣明細胞がん腫、または肺腫瘍細胞の扁平上皮がん腫などの腫瘍細胞の成長を遅らせるかもしくは阻害するために、または腫瘍細胞の転移を阻害するために投与することができる。これらの適用において、治療的有効量の抗体が、がん細胞の成長、複製、もしくは転移を阻害するのに、またはがんの徴候もしくは症状を阻害するのに十分な量で被験体に投与される。好適な被験体としては、非限定的にＨＣＣ、メラノーマ、卵巣明細胞がん腫、または肺の扁平上皮がん腫などの、ＧＰＣ３を発現するがんと診断された被験体が挙げられ得る。
【０２２４】
一つの非限定的実施形態において、ＧＰＣ３を発現するがんを有する被験体を選択する工程、および治療的有効量の、本明細書に開示された抗体、組成物、または免疫結合体をその被験体に投与する工程により、がんを有する被験体を処置する方法が本明細書に提供される。
【０２２５】
ＧＰＣ３を発現するがんを有する被験体を選択する工程、および治療的有効量の、本明細書に開示された抗体、組成物、または免疫結合体をその被験体に投与する工程により、腫瘍の成長または転移を阻害する方法もまた本明細書に提供される。
【０２２６】
治療的有効量のヒトＧＰＣ３特異的抗体または免疫結合体は、疾患の重症度および患者の健康の一般的な状態に依存する。抗体の治療的有効量は、症状（複数可）の自覚的軽減かまたは臨床医もしくは他の有資格オブザーバーによって認められるような客観的に同定可能な改善のいずれかを提供する量である。
【０２２７】
本明細書に開示された抗体および免疫結合体の投与はまた、他の抗がん剤または治療的処置（例えば、腫瘍の外科的切除）の投与を伴うことができる。任意の好適な抗がん剤は、本明細書に開示された抗体、組成物、および免疫結合体と組み合わせて投与することができる。例示的な抗がん剤としては、例えば有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、インターカレート抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物学的応答調節物質、抗ホルモン（例えば、抗アンドロゲン）、および抗血管新生剤などの化学療法因子が挙げられるが、それらに限定されない。他の抗がん処置としては、放射線治療、およびがん細胞を特異的に標的にする他の抗体が挙げられる。
【０２２８】
アルキル化剤の非限定的例としては、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード、またはクロラムブシル）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジン）が挙げられる。
【０２２９】
代謝拮抗剤の非限定的例としては、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート）、ピリミジン類似体（例えば、５−ＦＵまたはシタラビン）、およびプリン類似体、例えば、メルカプトプリンまたはチオグアニンが挙げられる。
【０２３０】
天然産物の非限定的例としては、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドまたはテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣ）、および酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）が挙げられる。
【０２３１】
種々の作用物質の非限定的例としては、白金配位錯体（例えば、シスプラチンとしても知られているシス−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩ）、置換尿素（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、および副腎皮質（ａｄｒｅｎｏｃｒｏｔｉｃａｌ）抑制剤（例えば、ミトタンおよびアミノグルテチミド）が挙げられる。
【０２３２】
ホルモンおよびアンタゴニストの非限定的例としては、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール（ｍａｇｅｓｔｒｏｌ  ａｃｅｔａｔｅ））、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）、およびアンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロン（ｔｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）およびフルオキシメステロン）が挙げられる。最も一般的に用いられる化学療法薬の例としては、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチナム、シスプラチナム、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（またはドセタキセルなどの他のタキサン）、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６が挙げられるが、いくつかのより新しい薬物としては、ゲムシタビン（ジェムザール）、ハーセプチン、イリノテカン（カンプトサール、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ−５７１、タキソテール、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼベリン、およびカルシトリオールが挙げられる。
【０２３３】
用いることができる免疫調節物質の非限定的例としては、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、γ−インターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．のＩｍｒｅｇより）、ＳＫ＆Ｆ  １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
【０２３４】
いくつかの型のがんについての別の一般的な処置は、外科的処置、例えば、がんまたはその一部の外科的切除である。処置の別の例は、放射線療法、例えば、外科的切除の前に腫瘍を根絶させるかまたはそれを縮小させるのを助けるための腫瘍部位への放射性物質またはエネルギー（例えば、外部ビーム療法）の投与である。
【０２３５】
Ｂ．診断方法および検出方法
ＧＰＣ３の発現をインビトロまたはインビボで検出するための方法が本明細書中に提供される。いくつかの場合には、ＧＰＣ３発現は、生物学的サンプルにおいて検出される。そのサンプルは、任意のサンプルであり得、それらとしては、バイオプシー、オートプシーおよび病理検体由来の組織が挙げられるがこれらに限定されない。生物学的サンプルには、組織の切片、例えば、組織学的目的のために採取された凍結切片も含まれる。生物学的サンプルには、さらに、血液、血清、血漿、痰、髄液または尿などの体液が含まれる。生物学的サンプルは、代表的には、哺乳動物、例えばヒトまたは非ヒト霊長類から得られる。
【０２３６】
１つの実施形態において、被験体由来の試料を、本明細書に開示されたモノクローナル抗体に接触させる工程、およびその抗体のその試料への結合を検出する工程により、被験体ががんを有するかどうかを決定する方法が提供される。抗体の対照試料への結合と比較して、抗体の試料への結合が増加していることにより、被験体ががんを有すると同定される。
【０２３７】
別の実施形態において、がんと診断された被験体由来の試料を、本明細書に開示されたモノクローナル抗体に接触させる工程、およびその抗体のその試料への結合を検出する工程により、被験体におけるがんの診断を確認する方法が提供される。抗体の対照試料への結合と比較して、抗体の試料への結合が増加していることにより、被験体におけるがんの診断が確認される。
【０２３８】
開示された方法のいくつかの例において、モノクローナル抗体は直接的に標識されている。
【０２３９】
いくつかの例において、方法は、そのモノクローナル抗体を特異的に結合する二次抗体を試料に接触させる工程、および二次抗体の結合を検出する工程をさらに含む。二次抗体の対照試料への結合と比較して、二次抗体の試料への結合が増加していることにより、被験体におけるがんが検出されるか、または被験体におけるがんの診断が確認される。
【０２４０】
いくつかの例において、がんは、ＨＣＣ、メラノーマ、卵巣明細胞がん腫、もしくは肺の扁平上皮がん腫、またはＧＰＣ３を発現する任意の他の型のがんである。
【０２４１】
いくつかの例において、対照試料は、がんを有しない被験体由来の試料である。特定の例において、試料は血液または組織試料である。
【０２４２】
いくつかの場合には、ＧＰＣ３に結合する（例えば、特異的に結合する）抗体は、検出可能な標識で直接標識される。別の実施形態において、ＧＰＣ３に結合する（例えば、特異的に結合する）抗体（一次抗体）は、標識されず、ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体に結合し得る二次抗体または他の分子が、標識される。当業者に周知であるように、特定の種およびクラスの一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体が選択される。例えば、一次抗体が、ヒトＩｇＧである場合、二次抗体は、抗ヒトＩｇＧであり得る。抗体に結合し得る他の分子としては、プロテインＡおよびプロテインＧ（この両方ともが商業的に入手可能である）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４３】
上記抗体または二次抗体に適した標識は、上に記載されており、それらとしては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、磁性物質および放射性材料が挙げられる。好適な酵素の非限定的な例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の非限定的な例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光材料の非限定的な例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。非限定的かつ例示的な発光材料は、ルミノールであり；非限定的かつ例示的な磁性物質は、ガドリニウムであり、非限定的かつ例示的な放射性標識としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０２４４】
代替の実施形態において、ＧＰＣ３は、検出可能な物質で標識されたＧＰＣ３標準物質およびＧＰＣ３に特異的に結合する標識されていない抗体を利用する競合イムノアッセイによって、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このアッセイでは、生物学的サンプル、標識されたＧＰＣ３標準物質およびＧＰＣ３に特異的に結合する抗体が混合され、標識されていない抗体に結合した標識されたＧＰＣ３標準物質の量が測定される。生物学的サンプル中のＧＰＣ３の量は、ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体に結合した標識されたＧＰＣ３標準物質の量に反比例する。
【０２４５】
本明細書中に開示されるイムノアッセイおよび方法は、いくつかの目的のために使用され得る。１つの実施形態において、ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体は、細胞培養物中の細胞内のＧＰＣ３の産生を検出するために使用され得る。別の実施形態において、その抗体は、生物学的サンプル（例えば、組織サンプルまたは血液もしくは血清サンプル）中のＧＰＣ３の量を検出するために使用され得る。いくつかの例では、ＧＰＣ３は、細胞表面ＧＰＣ３である。他の例では、ＧＰＣ３は、可溶性ＧＰＣ３である。
【０２４６】
１つの実施形態において、生物学的サンプル（例えば、血液サンプルまたは組織サンプル）中のＧＰＣ３を検出するためのキットが提供される。例えば、被験体におけるがんの診断を確認するために、組織学的検査用の組織サンプルを得るためにバイオプシーが行われ得る。あるいは、可溶性ＧＰＣ３タンパク質またはフラグメントの存在を検出するために、血液サンプルを得てもよい。ポリペプチドを検出するためのキットは、代表的には、ＧＰＣ３に特異的に結合するモノクローナル抗体（例えば、本明細書中に開示される抗体のいずれか）を備える。いくつかの実施形態において、抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖフラグメント、ＶＨドメインまたはＦａｂ）がそのキットに含められる。さらなる実施形態において、その抗体は、標識される（例えば、蛍光標識、放射性標識または酵素標識で）。
【０２４７】
１つの実施形態において、キットは、ＧＰＣ３に結合する抗体を使用する手段を開示している指示材料を備える。その指示材料は、書面、電子的形態（例えば、コンピュータディスケットまたはコンパクトディスク）、または視覚によるもの（例えば、ビデオファイル）であり得る。そのキットは、そのキットが意図されている特定の用途を容易にする追加の構成要素も備え得る。したがって、例えば、そのキットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識に対する酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）をさらに備え得る。そのキットは、特定の方法を実施するために日常的に使用されるバッファーおよび他の試薬をさらに備え得る。そのようなキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
【０２４８】
１つの実施形態において、診断キットは、イムノアッセイを含む。イムノアッセイの詳細は、使用される特定の形式によって変化し得るが、生物学的サンプル中のＧＰＣ３を検出する方法は、通常、免疫学的に反応性の条件下でＧＰＣ３ポリペプチドと特異的に反応する抗体とその生物学的サンプルとを接触させる工程を包含する。その抗体は、免疫学的に反応性の条件下で特異的に結合することが可能になることで免疫複合体を形成し、その免疫複合体（結合した抗体）の存在が、直接または間接的に検出される。
【０２４９】
細胞表面マーカーの存在または非存在を判定する方法は、当該分野で周知である。例えば、上記抗体が、他の化合物（酵素、磁気ビーズ、コロイド状の磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物または薬物を含むがこれらに限定されない）に結合体化され得る。その抗体は、イムノアッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または免疫組織化学的アッセイであるがこれらに限定されない）においても利用され得る。その抗体は、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）のためにも使用され得る。ＦＡＣＳは、細胞を分離するためまたは分取するために、他の洗練された検出レベル中でも複数のカラーチャネル、小角光散乱検出チャネルおよび鈍角光散乱検出チャネル、ならびにインピーダンスチャネルを使用する（米国特許第５，０６１，６２０号を参照のこと）。本明細書中に開示されるようなＧＰＣ３に結合するいずれのモノクローナル抗体も、これらのアッセイにおいて使用することができる。したがって、それらの抗体は、従来のイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学、ウェスタンブロットまたは免疫沈降を含むがこれらに限定されない）において使用され得る。
【０２５０】
Ｃ．操作された細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
開示されたモノクローナル抗体はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ：キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても知られている）を発現するように操作されたＣＴＬを産生するために用いることができる。一般的に、ＣＡＲは、結合部分、細胞外ヒンジおよびスペーサーエレメント、膜貫通領域、およびシグナル伝達機能を果たす内部ドメインを含む（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０：９５６３０４、２０１０）。多くの場合、結合部分は、ｓｃＦｖなどのモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントである。いくつかの異なる内部ドメインが、ＣＡＲを作製するために用いられている。例えば、内部ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγなどの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有するシグナル伝達鎖からなり得る。場合によっては、内部ドメインは、ＣＤ２８および／またはＣＤ１３７などの少なくとも１つの追加の補助刺激性ドメインの細胞内部分をさらに含む。
【０２５１】
ＣＡＲを発現するＣＴＬは、腫瘍細胞などの特定の細胞型を標的にするために用いることができる。したがって、本明細書に開示されたモノクローナル抗体は、ＧＰＣ３特異的抗体の抗原結合フラグメントを含有するＣＡＲを発現するＣＴＬを操作するために用いることができ、それにより、その操作されたＣＴＬを、ＧＰＣ３発現腫瘍細胞へ標的化することができる。操作されたＴ細胞は、いくつかの型のがんについての養子治療のために以前に用いられている（例えば、Ｐａｒｋら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５（４）：８２５−８３３、２００７参照）。ＣＡＲを発現するＣＴＬは、ＨＬＡに拘束されないので、ＣＡＲを発現するＴ細胞の使用は、標準的なＣＴＬに基づいた免疫療法より万能であり、それゆえに、その標的抗原を発現した腫瘍を有するいかなる患者についても用いることができる。
【０２５２】
したがって、ｓｃＦｖなどのＧＰＣ３特異的抗体結合フラグメントを含むＣＡＲが本明細書に提供される。そのＣＡＲをコードする単離された核酸分子およびベクター、ならびにその核酸分子またはベクターを含む、ＣＴＬなどの宿主細胞もまた提供される。ＧＰＣ３特異的抗体結合フラグメントで構成されるＣＡＲを発現するＣＴＬは、ＨＣＣ、メラノーマ、卵巣明細胞がん腫、または肺の扁平上皮がん腫などのＧＰＣ３を発現するがんの処置のために用いることができる。したがって、ＧＰＣ３を発現するがんを有する被験体を選択する工程、および治療的有効量の、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲを発現するＣＴＬを被験体に投与する工程により、がんを有する被験体を処置する方法が本明細書に提供される。
【０２５３】
Ｄ．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントで構成される組換えタンパク質である。したがって、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原を結合する。二重特異性抗体は、ＣＴＬ（例えば、ＣＤ３などのＣＴＬ受容体構成要素）と腫瘍抗原との両方を同時に標的にすることにより、がん免疫療法のために用いることができる。本明細書に開示されたＧＰＣ３特異的モノクローナル抗体は、ＧＰＣ３とＣＴＬとの両方を標的にする二重特異性抗体を作製するために用いることができ、それにより、ＧＰＣ３発現がんを処置するための手段を提供することができる。
【０２５４】
ＧＰＣ３特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む二重特異性モノクローナル抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、二重特異性モノクローナル抗体は、ＣＤ３などのＴ細胞受容体の構成要素を特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに含む。二重特異性抗体をコードする単離された核酸分子およびベクター、ならびにその核酸分子またはベクターを含む宿主細胞もまた提供される。ＧＰＣ３特異的抗体またはその抗原結合フラグメントを含む二重特異性抗体は、ＨＣＣ、メラノーマ、卵巣明細胞がん腫、または肺の扁平上皮がん腫などのＧＰＣ３を発現するがんの処置のために用いることができる。したがって、ＧＰＣ３を発現するがんを有する被験体を選択する工程、および治療的有効量の、ＧＰＣ３標的化二重特異性抗体をその被験体に投与する工程により、がんを有する被験体を処置する方法が本明細書に提供される。
【０２５５】
以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例証するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載された特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２５６】
（実施例１）
材料および方法
この実施例は、実施例２に記載された研究についての材料および実験方法を記載する。
【０２５７】
細胞系
６つのヒトＨＣＣ細胞系（ＳＫ−Ｈｅｐ１、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ−１、Ｈｕｈ−４、およびＨｕｈ−７）および５つのヒトＣＣＡ細胞系（ＨｕＣＣＴ１、ＯＺ、Ｍｚ−ＣｈＡ−１、ＫＭＢＣ、およびＫＭＣＨ）を、下記の研究に用いた。ＴＯＶ−２１Ｇ細胞系（ヒト卵巣明細胞がん腫細胞系）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手した。Ａ４３１／Ｇ１は、ヒトＧＰＣ３を安定的に発現する、トランスフェクションされたＡ４３１ヒト上皮がん腫細胞系である。Ｙｕら（Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １：１４１−１４９、２０１０）に記載されているように、それらの細胞系を培養した。
【０２５８】
モノクローナル抗体作製
マウスハイブリドーマテクロノジーは、ペプチド合成、マウス免疫、マウス脾臓細胞の細胞融合、ハイブリドーマ選択および増殖、ならびにペプチドまたはタンパク質を用いる上清スクリーニングを含んだ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。簡単に述べれば、５０個の残基からなるペプチド（ＤＧＭＩＫＶＫＮＱＬＲＦＬＡＥＬＡＹＤＬＤＶＤＤＡＰＧＮＳＱＱＡＴＰＫＤＮＥＩＳＴＦＨＮＬＧＮＶＨＳ；配列番号６）を合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、キャリアタンパク質である、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に、Ｎ末端に導入されるシステイン残基を介するマレイミド化学作用により結合体化した。５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、続いて、２回目および３回目の免疫後、試験採血し、マウスに実施された２つの融合体は、最高抗体価（ＧＰＣ３発現がん細胞において＞１０，０００）を示した。ハイブリドーマ細胞を、フローサイトメトリーによって（下記のように）スクリーニングした。最も陽性が強い５個のクローンを、サブクローニングのために選択し、免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプを決定し、クローンをさらに増殖させた。最も高い親和性および最も特異性の高い結合を示したＹＰ７クローンを、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腹水産生およびプロテインＡ精製を経ての精製（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）のために選択した。
【０２５９】
ハイスループットフローサイトメトリー
１μｇ／ｍＬの各ｍＡｂを含有するマウスハイブリドーマ上清と共に細胞をインキュベートした。フィコエリトリン（ＰＥ）と結合体化されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて、結合を検出した。肝臓細胞に会合した蛍光を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて測定した。ハイブリドーマのスクリーニングについて、Ａ４３１細胞とＡ４３１／Ｇ１細胞との１：１混合物（９６ウェルプレート中のウェルあたり１０，０００個の細胞）を、マウスハイブリドーマ上清の１：５希釈液とともにインキュベートした。ＰＥと結合体化されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて、結合を検出した。内蔵型オートサンプラーを備えたＧｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｐｌｕｓ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて、蛍光を測定した。Ａ４３１／Ｇ１およびＡ４３１についての幾何平均値を、Ｇｕａｖａ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、個々のクローンについて同時に測定した。１５またはそれより高い結合比を有するクローンを、細胞会合型ＧＰＣ３タンパク質に特異的であるとみなし、ＨｅｐＧ２細胞を用いるさらなるフローサイトメトリーのために選択した。
【０２６０】
スキャッチャードプロットおよびＫＤ値を、以前に記載されているように（Ｈｏら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：６０７−６１７、２００５）、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて計算した。
【０２６１】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェル平底プレートを、１μｇ／ｍｌの野生型または突然変異体ＧＰＣ３（ヘパラン硫酸を含まないＧＰＣ３突然変異体であるＧＰＣ３ΔＨＳ）タンパク質と共に、ＰＢＳ中、４℃で一晩、インキュベートし、続いて、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）でブロッキングした。組換えＧＰＣ３タンパク質を作製し（Ｙｕら、Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １：１４１−１４９、２０１０）、組換えＧＰＣ１タンパク質および組換えＧＰＣ５タンパク質を購入した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。マウス血清を、ＰＢＳＴバッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中に１：５希釈し、同じプレート内で、室温で１時間、インキュベートした。結合した抗体を検出するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と結合体化されたヤギ抗マウスＩｇＧの１：１０，０００希釈液を加えた。アッセイを、記載されているように開発した（Ｈｏら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：６０７−６１７、２００５）。
【０２６２】
免疫沈降およびウェスタンブロット分析
培養細胞の上清を、１μｇ／ｍＬの精製されたマウスハイブリドーマ抗体またはマウスモノクローナルＩｇＧ対照と４℃で一晩、回転させながらインキュベートした。新鮮なプロテインＡビーズ（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、あらかじめ、２％ＳＤＳおよびプロテアーゼインヒビター（「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ−ＥＤＴＡ
Ｆｒｅｅ」プロテアーゼインヒビター錠剤、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する免疫沈降アッセイバッファーで、３回洗浄した。ビーズを、試料混合物とインキュベートし、４℃で２時間、回転させ、３回洗浄し、ローディングバッファーおよび免疫沈降アッセイバッファーを含有する溶液とインキュベートし、９９℃で５分間、還元した。上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、続いて、標準方法を用いてウェスタンブロットを行った（Ｙｕら、Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１：１４１−１４９、２０１０）。
【０２６３】
凍結かつ固定された肝臓腫瘍試料を、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ）（Ｙｕら、Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１：１４１−１４９、２０１０）から入手し、ウェスタンブロットを実施した。
【０２６４】
免疫組織化学法
ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を、６μｇ／ｍＬのＹＰ７を用いて、以前に公開されたプロトコール（ＭａｎおよびＴａｖａｓｓｏｌｉ、Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  ４：１３９−１４１、１９９６）に従って、免疫組織化学染色に供した。免疫染色を、以前に記載されているように、ＹＰ７およびアイソタイプ対照マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を用いて行った。免疫染色された切片は、２人の研究者により独立的に評価された。
【０２６５】
動物試験
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）におけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコールの下、全てのマウスを飼育し、処置した。動物試験の前にＨｅｐＧ２細胞系について、２ラウンドのインビボ継代を実施した。１千万個の細胞を２００μｌのＰＢＳ中に懸濁し、４〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕヌードマウス（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）の皮下に接種した。腫瘍体積が、約１００ｍｍ３（Ｖ＝ａｂ2／２、式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長さおよび幅を表す）に達した時、マウスに５ｍｇ／ｋｇのＹＰ７を週２回、２週間半、静脈注射した。
【０２６６】
（実施例２）
ＧＰＣ３発現細胞に高親和性で結合するモノクローナル抗体
この実施例は、ＧＰＣ３の発現が低レベルであるがん細胞を検出する能力がある高親和性のＧＰＣ３特異的モノクローナル抗体の同定を記載する。
【０２６７】
マウス免疫のための免疫原としてのペプチドの設計
免疫のためのペプチドを設計するために、３Ｄ構造が入手できないため、ＧＰＣ３タンパク質の一次構造を分析した。細胞表面上の成熟ＧＰＣ３タンパク質は、ヘパラン硫酸鎖によって修飾されており、ＧＰＩアンカーによって細胞膜に付着している（図１Ａ）。ＧＰＣ３遺伝子は、ヒトＸ染色体上（Ｘｑ２６）に位置し、転写され、４つのｍＲＮＡアイソフォームへ選択的にスプライスされる（ＨｏおよびＫｉｍ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ
４７：３３３−３３８、２０１１）。全てのアイソフォームは、同じＣ末端サブユニットを共有するが、それらのＮ末端サブユニットはわずかに異なる。それらの分布および機能的意義は確立されていない。最も一般的なアイソフォーム（アイソフォーム２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４４７５およびＪＱ９４３６８６）は、５８０個のアミノ酸を有する７０ｋＤａのコアタンパク質をコードする（Ｈｏ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ
２５：２７５−２８４、２０１１；ＨｏおよびＫｉｍ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４７：３３３−３３８、２０１１）。アイソフォーム１（ＮＰ＿００１１５８０８９）、アイソフォーム３（ＮＰ＿００１１５８０９０）、およびアイソフォーム４（ＮＰ＿００１１５８０９１）と名付けられた選択的にスプライスされたフォームをコードする３つのバリアントが、ＧｅｎＢａｎｋにおいて同定されている。
【０２６８】
ＧＰＣ３のＣ末端サブユニットは、長さが約３０ｋＤａである。ｂｉｇ−ＰＩ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒを用いたタンパク質配列に基づいて、セリン５６０が、ＧＰＩについての切断部位と予想された（ＡｌｌｅｇｒｅｔｔａおよびＦｉｌｍｕｓ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １１：５４３−５４８、２０１１）。各アイソフォームの認識を可能にする、細胞表面ＧＰＣ３のＣ末端に対応する５０マーペプチド（残基５１１〜５６０）を合成した。追加のシステイン残基を、そのペプチドのＮ末端に導入した。したがって、このペプチドに対して惹起されたｍＡｂは、膜結合型ＧＰＣ３のＣ末端を結合する。
【０２６９】
細胞表面会合型ＧＰＣ３に対するモノクローナル抗体のスクリーニング
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを３回、免疫し、ペプチド−ＫＬＨ結合体でブーストした。細胞表面上のＧＰＣ３の天然立体構造に対する血清抗体価を、実施例１に記載されているように、ＧＰＣ３発現細胞を用いるフローサイトメトリーにより測定した。全てのマウスについての抗体価は、３回の免疫後、＞１０，０００であり、非染色細胞のピークと共に、血清の１：１０，０００希釈液における、重複していない染色細胞ピークとして観察された。脾臓細胞融合を、その２匹の最良のマウスに関して行った。
【０２７０】
細胞表面会合型ＧＰＣ３タンパク質を認識するｍＡｂの１０枚の９６ウェルプレートの一次スクリーニングを実施するために、各上清試料について試験するための抗原としてＧＰＣ３陰性細胞（Ａ４３１）とＧＰＣ３陽性細胞（Ｇ１、またはＧＰＣ３で安定的にトランスフェクションされたＡ４３１であるＡ４３１／Ｇ１）との混合物が用いられる、フローサイトメトリーに基づいたアッセイを開発した（図１Ｂ）。この迅速なスクリーニング方法の使用により、Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター上で９６０個のクローンを２４時間以内にスクリーニングすることが可能になった。１５またはそれより高い結合比（Ｇ１／Ａ４３１）をもつクローンを、ＨｅｐＧ２細胞を用いるフローサイトメトリー分析のために選択した。１２個のクローンを、限界希釈によりサブクローニングした。それらの中で、５個（ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ８、ＹＰ９、およびＹＰ９．１）を回収し、ＩｇＧ１（γ１・κ）とアイソタイプを決定した。標準ＥＬＩＳＡにおいてそのペプチドに対して最高の結合シグナルをもつｍＡｂは、細胞表面会合型ＧＰＣ３に対して非常に弱い結合を示すかまたは全く結合しない。まとめて考えると、その新しい方法は、細胞表面ＧＰＣ３に対する高い結合親和性をもつｍＡｂを単離するのに成功した。
【０２７１】
細胞上のＧＰＣ３  ｍＡｂの親和性および特異性
５個の選択されたｍＡｂ（ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ８、ＹＰ９、およびＹＰ９．１）を、１μｇ／ｍｌでの４つの細胞系（Ａ４３１、Ａ４３１／Ｇ１、ＨｅｐＧ２、およびＨｅｐ３Ｂ）を用いて、結合について分析した。図１Ｃに示されているように、全部が、試験された２つのＧＰＣ３発現細胞系（Ａ４３１／Ｇ１およびＨｅｐ３Ｂ）に結合した。逆に、ＧＰＣ３陰性Ａ４３１細胞系にはどれも結合せず、それがＧＰＣ３特異性であること、および細胞表面ＧＰＣ３に対する結合が１Ｇ１２より一般的に高かったことを示唆した（ＣａｐｕｒｒｏおよびＦｉｌｍｕｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：３７２、２００５）。その後、組換えＧＰＣ３およびＧＰＣ３ΔＨＳ（ヘパラン硫酸を含まない突然変異体）タンパク質との反応性をＥＬＩＳＡにおいて試験した。ＧＰＣ３コアタンパク質単独であるＧＰＣ３ΔＨＳと比較して、野生型ＧＰＣ３においてより強い結合シグナルが観察されたが、１Ｇ１２は、どちらも同じように結合した（図１Ｄ）。この結果は、これらの新しいｍＡｂが、細胞表面上のヘパラン硫酸を有する天然型のＧＰＣ３タンパク質を認識することを示唆している。
【０２７２】
図１Ｅは、Ａ４３１／Ｇ１細胞系において発現した組換えＧＰＣ３タンパク質とのＹＰ７およびＹＰ９の強い免疫反応性、およびＡ４３１細胞系溶解産物における他の細胞タンパク質とは反応しないことを示すウェスタンブロット分析を示す。これらのｍＡｂはまた、ＨＣＣ細胞系における内因性ＧＰＣ３タンパク質と、様々な程度で反応した。（１Ｇ１２を含む）試験されたそれらの中で、ＹＰ７は、両方のＨＣＣ細胞系（ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ）におけるＧＰＣ３タンパク質との最も強い反応性を示し、それは、ＨＣＣ細胞系およびＣＣＡ細胞系のパネルを用いるさらなる分析のために選択された。
【０２７３】
図２Ａに示されているように、ＹＰ７は、フローサイトメトリー分析において、全てのＨＣＣ細胞系（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ４、およびＨｕｈ７）を結合する。対照的に、ＹＰ７は、ＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞系（最初、ＨＣＣ細胞系と報告されたが、最近、非ＨＣＣ細胞系と再定義された）と反応しなかった（Ｙｕら、Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１：１４１−１４９、２０１０）。図２Ａはまた、ＹＰ７が、試験されたＣＣＡ系（ＨｕＣＣＴ１、ＫＭＢＣ、ＫＭＣＨ、およびＭｚ−ＣｈＡ−１）のいずれとも結合しなかったことを示している。ＹＰ７の高いｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ＝０．３ｎＭ）が、細胞上に発現した天然型のＧＰＣ３タンパク質に関して決定された（図４Ｂ）。特徴的な構造を共有する６個のグリピカン（ＧＰＣ１〜６）が、哺乳動物において同定されている（ＨｏおよびＫｉｍ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４７：３３３−３３８、２０１１）。ＹＰ７が他のグリピカンと交差反応性であるかどうかを評価するために、それを、ＥＬＩＳＡによりＧＰＣ１、ＧＰＣ５、およびＧＰＣ３を用いて試験した。ＹＰ７はＧＰＣ３を結合したが、ＧＰＣ１もＧＰＣ５も結合しなかった（図２Ｃ）。
【０２７４】
肝臓がん細胞に関するＹＰ７の結合特異性を評価するために、イムノブロッティングを、ＨＣＣ細胞およびＣＣＡ細胞のパネルに関して実施した（図３Ａ）。ＹＰ７は、５つのうちの５つ（１００％）（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、およびＨｕｈ７）のＨＣＣ細胞系において強いＧＰＣ３シグナルを示した。ＳＫ−Ｈｅｐ−１は、ＧＰＣ３陰性であった。４つのＣＣＡ細胞系（ＫＭＣＨ、ＫＭＢＣ、Ｍｚ−ＣｈＡ−１、およびＯｚ）のいずれにおいてもＧＰＣ３タンパク質が検出されなかった。ウェスタンブロッティングにおけるＹＰ７の反応性プロファイルは、フローサイトメトリーデータ（図２Ａ）とよく一致し、ＹＰ７が、内因性ＧＰＣ３タンパク質を特異的かつ同等に検出することを示唆した。ＹＰ７は、卵巣明細胞がん腫（ＣＣＣ）であるＴＯＶ−２１Ｇにおいて発現したＧＰＣ３を検出したが、１Ｇ１２は、それを明らかには検出しなかった（図３Ｂ）。その１Ｇ１２の難点は以前に報告されており、ＴＯＶ−２１Ｇ細胞における非常に低い発現レベルのＧＰＣ３に起因しており（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ、１０２：１６２２−１６２９、２０１１）、したがって、１Ｇ１２を凌ぐ、高親和性ｍＡｂの有用性を描き出している。総合すれば、これらの結果は、ＹＰ７がＨＣＣおよび他のＧＰＣ３発現がん（例えば、卵巣ＣＣＣ）における天然型のＧＰＣ３に対する優れた結合親和性および特異性をもち、かつ非常に低い発現レベルでの内因性ＧＰＣ３を検出することができることを実証している。
【０２７５】
ＹＰ７による可溶性および組織ＧＰＣ３タンパク質の検出
以前の研究により、培養上清および患者血清における可溶性ＧＰＣ３タンパク質の存在が示された（Ｃａｐｕｒｒｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５：８９−９７、２００３；Ｈｉｐｐｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４：２４１８−２４２３、２００４）。それの診断可能性を調べるために、ＹＰ７を、培養上清および患者試料における可溶性ＧＰＣ３タンパク質を用いて試験した。ＹＰ７を用いて、４つの細胞系（Ａ４３１、Ａ４３１／Ｇ１、ＨｅｐＧ２、およびＨｅｐ３Ｂ）由来の培養上清において可溶性タンパク質をプルダウンし、かつ探索した（図３Ｃ）。Ａ４３１／Ｇ１およびＨｅｐ３Ｂプルダウンタンパク質において、可溶性ＧＰＣ３タンパク質がスメア化バンドとして検出され、様々な数のヘパラン硫酸鎖で修飾されたＧＰＣ３タンパク質に対応する広範囲な高分子量タンパク質を示した（Ｃａｐｕｒｒｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５：８９−９７、２００３；ＣａｐｕｒｒｏおよびＦｉｌｍｕｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：３７２、２００５；Ｈｉｐｐｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４：２４１８−２４２３、２００４）。ヘパラン硫酸を有するＧＰＣ３（スメア）に加えて、３０ｋＤａバンドが、両方の培養上清において検出され、Ｃ末端サブユニット単独が、可溶性ＧＰＣ３タンパク質において存在することを示した。
【０２７６】
ＹＰ７を免疫組織化学的適用について評価するために、９つのＨＣＣおよび９つのＣＣＡ患者組織（Ｙｕら、Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１：１４１−１４９、２０１０）をウェスタンブロッティングに用いた（図３Ｄ）。高ＧＰＣ３タンパク質発現が、９つのうちの４つ（４４％）のＨＣＣ組織において、約７０ｋＤの予想されたサイズをもつバンドとして見出された。９つのいずれの（０％）ＣＣＡ組織においてもＧＰＣ３発現は見出されなかった。
【０２７７】
以前の研究より、卵巣明細胞がん腫、メラノーマ、および非小細胞肺腺がんなどの他のがんにおいてＧＰＣ３発現が示されたが、その発現プロファイリングは一般的に確証的ではなかった（ＨｏおよびＫｉｍ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４７：３３３−３３８、２０１１）。公開のマイクロアレイデータに基づいたＮＣＩ−６０セットにおけるＧＰＣ３陽性細胞系の全部においてＹＰ７を試験した（表５）。非ＨＣＣがん細胞におけるＧＰＣ３タンパク質発現は全体として一貫性があるが、非ＨＣＣ細胞における細胞表面発現は、一般的に、ＨＣＣ細胞のそれより低いことが決定された。ＹＰ７は、ヒトメラノーマ細胞系である、ＵＡＣＣ−６２を結合した。ＧＰＣ３は、メラノーマについての可能性のある治療標的として示唆されている（Ｈｏ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５：２７５−２８４、２０１１；ＨｏおよびＫｉｍ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４７：３３３−３３８、２０１１）。しかしながら、ＧＰＣ３発現メラノーマについての細胞系モデルは確立されておらず、メラノーマに対するＧＰＣ３標的化抗体治療は、おそらく良い細胞モデルおよび高親和性抗ＧＰＣ３  ｍＡｂの欠如のせいで、調べられていない。これらのデータは、ＵＡＣＣ−６２が、メラノーマにおいてＧＰＣ３を研究するための有用な細胞モデルであり得ること、およびＹＰがメラノーマ治療のための好適な抗体であることを示している。
【表５】
2019062910.tif 000018
【０２７８】
ＹＰ７のヒト肝臓組織への結合もまた、免疫組織化学法（ＩＨＣ）によって調べた。図３Ｅに示されているように、浸潤性ＨＣＣは、ＧＰＣ３の明瞭な膜または細胞質発現を示し、一方、正常細胞は、明瞭な免疫染色を欠いた（図３Ｅ）。この観察は、ＹＰ７によって染色されたＧＰＣ３が肝臓腫瘍、特にＨＣＣのＩＨＣについての好適なマーカーであるという信念を支持している。総合すれば、ＨＣＣ細胞および組織のウェスタンブロット分析により、ＹＰ７が、細胞表面型と可溶性（脱落）型の両方における内因性ＧＰＣ３タンパク質に対して特異性および感受性が非常に高いことが示されており、ＹＰ７が、血清ＧＰＣ３タンパク質およびＨＣＣ組織におけるＧＰＣ３発現を評価するための診断剤として用いられ得ることを示している。
【０２７９】
ＹＰ７の抗腫瘍活性
ＹＰ７を可能性のあるがん治療用物質として探求するために、ＨｅｐＧ２細胞を用いてヌードマウスにおけるモデルを確立することにより、ＨＣＣマウス異種移植片において腫瘍成長阻害を調べた（図４）。腫瘍が７日目に１００ｍｍ３の平均体積に達した時、マウスに５ｍｇ／ｋｇのＹＰ７を週２回、２週間、投与した。ＹＰ７は、ＨｅｐＧ２腫瘍の成長を有意に阻害し、測定された腫瘍体積は２週間の間にわたってほとんど一定の値であったが、非処置マウスへ接種された腫瘍は、この期間中、急速に成長し続けた。したがって、ＹＰ７は、マウスにおけるＨｅｐＧ２異種移植片に対して強い抗腫瘍活性を示した。
【０２８０】
考察
本明細書に記載されているように、ＧＰＣ３発現腫瘍細胞および組織に非常に特異性が高い、ＧＰＣ３に対する高親和性ｍＡｂを作製した。ＹＰ７は、ＨＣＣ（例えば、ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ−４）、卵巣明細胞がん腫（例えば、ＴＯＶ−２１Ｇ）、およびメラノーマ細胞（例えば、ＵＡＣＣ−６２）における低発現レベルのＧＰＣ３を検出した。これらの結果は、ＹＰ７が、ＧＰＣ３発現腫瘍細胞を標的にするがん診断法および治療のための非常に有望な候補であることを示している。
【０２８１】
ｍＡｂ産生のためのハイブリドーマテクノロジーは、この３７年間、十分確立されており（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７、１９７５）、リツキシマブのデビュー以来、１１個のｍＡｂががん治療用に承認されている（ＳｈｕｐｔｒｉｎｅおよびＳｕｒａｎａ、Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  ２２：３−１３、２０１２）。しかしながら、治療抗体のハイスループット開発における大きな障害は、短い時間枠（２４〜４８時間）内で何百個から何千個というハイブリドーマ上清をスクリーニングすることの実行可能性に関わる（ＣｈｉａｒｅｌｌａおよびＦａｚｉｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３０：１３０３−１０、２００８）。ＥＬＩＳＡは、ペプチドバックボーンまたは部分的に変性したタンパク質抗原に特異的なｍＡｂを単離するための好適な方法であるが、がん細胞上の天然型の抗原を認識するｍＡｂを捕らえるのに常に実用的とは限らない（Ｙｏｋｏｙａｍａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２．５．１−２．５．２５、２００６）。インタクトな細胞会合型抗原との抗体反応性を評価するために、フローサイトメトリー方法が理想的であるが、伝統的な装置は、ハイスループットアッセイ用に設計されていない。この点を踏まえ、本明細書に開示された研究についての最初のスクリーニングの間、オートサンプラーを有するフローサイトメーターを用いた。
【０２８２】
これらの新しいｍＡｂは、ＧＰＣ３発現がん処置および診断のための大きな潜在的可能性を秘めている。ヒト化（Ｇｅｔｔｓら、ＭＡｂｓ  ２：６８２−６９４、２０１０）および抗体毒素／薬物結合体の開発（Ｐａｓｔａｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：５５９−５６５、２００６）は、がん治療のためにそれらを発展させることができる。免疫毒素などの免疫結合体は、一般的に、毒素送達のために非常に高い親和性Ｆｖを必要とし、なぜなら、患者は、毒素媒介性副作用を避けるために、ホールＩｇＧ抗体単独よりずっと低い用量で、かつより少ないサイクル数で処置されるからである（Ｐａｓｔａｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：５５９−５６５、２００６）。さらに、抗体Ｆｖは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞および抗体Ｆｖに基づいた遺伝子治療において適用することができる。本明細書に開示されたｍＡｂ抗体はまた、血清ＧＰＣ３の測定、がん検出および処置フォローアップのためのＩＨＣ、インビボ腫瘍画像化、ならびに循環腫瘍細胞の単離などの診断方法において有用性がある。
【０２８３】
（実施例３）
ＧＰＣ３特異的免疫毒素
４個の組換え免疫毒素を、標準技術に従って、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素フラグメントＰＥ３８（配列番号１）に融合したＹＰ７、ＹＰ８、ＹＰ９（クローン９）、またはＹＰ９．１  ｓｃＦｖを用いて作製した。簡単に述べれば、各免疫毒素構築物において、抗体ＶＨドメインを、ＶＬドメインに、ペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号２８のアミノ酸残基１１９〜１３３）をコードするリンカー配列を用いて融合した。抗体ＶＬドメインを、ＰＥ３８に、短いリンカー配列（ＡＳＧＧ；配列番号２８のアミノ酸残基２４７〜２５０）を用いて融合した。図９Ａ〜９Ｄは、それぞれ、ＹＰ７ＳｃＦｖ−ＰＥ３８、ＹＰ８ＳｃＦｖ−ＰＥ３８、ＹＰ９ＳｃＦｖ−ＰＥ３８、およびＹＰ９．１ＳｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素（ＹＰ７ＩＴ、ＹＰ８ＩＴ、ＹＰ９ＩＴ、およびＹＰ９．１ＩＴとも呼ばれる）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。免疫毒素のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列番号２７、２８、および３０〜３５として本明細書で示されている。
【０２８４】
ＧＰＣ３を発現する細胞（Ｇ１、ＨｅｐＧ２、およびＨｅｐ３Ｂ細胞）に対する免疫毒素の結合親和性を、フローサイトメトリーにより評価した。細胞を収集し、培養培地（１０％  ＦＢＳ、１％  ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、および抗生物質を追加したＤＭＥＭ）中に再懸濁した。細胞を、培養培地中に段階希釈された免疫毒素とのインキュベーション前に、氷上で冷却した。次に、細胞を、冷ＰＢＳで１回洗浄し、培養培地中に２００倍希釈されたウサギ抗ＰＥ３８抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と氷上で６０分間、インキュベートした。その後、細胞を、冷ＰＢＳで１回洗浄し、培地中に２００倍希釈されたＲＰＥ−ヤギ抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐ−２７７１ＭＰ）とともに氷上で６０分間、インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中で再び、１回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機械（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において分析を行った。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）で分析した。図１０に示されているように、４つ全ての免疫毒素は、ＧＰＣ３発現がん細胞に対する非常に高い結合親和性を示した。例えば、ＹＰ９．１ＳｃＦｖ−ＰＥ３８は、Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２細胞に対するピコモル濃度の結合親和性（Ｋｄ＝４０〜５０ｐＭ）を有する。各免疫毒素の結合親和性は、下記の表６に要約されている。
【０２８５】
ＧＰＣ３発現細胞に対する高い結合親和性を確認した後、免疫毒素を細胞傷害性について評価した。細胞（Ｇ１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、およびＨｅｐ３Ｂ細胞）を、培養培地（１０％  ＦＢＳ、１％  ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、および抗生物質を追加したＤＭＥＭ）中２０００細胞／１８０μｌ／ウェルの濃度で、９６ウェルプレートに蒔いた。免疫毒素を培養培地中に段階希釈し、生じた混合物の２０μｌを、各ウェルに加えた。プレートを３７℃で３日間、インキュベートした。細胞増殖を、Ｃｅｌｌ
Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いてＷＳＴ−８変換により評価した。１０μｌの体積のＷＳＴ−８（５ｍｍ  ＷＳＴ−８、０．２ｍｍ  １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート、および１５０ｍｍ  ＮａＣｌ）を各ウェルに加え、インキュベーションを、３７℃で４時間、行った。試料の４５０ｎｍにおける吸光度を、６５０ｎｍの参照波長と共に測定した。図１１に示されているように、全ての免疫毒素は、３つ全てのＧＰＣ３発現細胞系の細胞増殖を有意に阻害した。Ｇ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、およびＨｅｐＧ２細胞についての各免疫毒素の阻害濃度５０（ＩＣ５０）は表６に要約されている。
【０２８６】
【表６】
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【０２８７】
これらのデータは、ＹＰ７、ＹＰ８、ＹＰ９、およびＹＰ９．１の免疫毒素の全てが、ＧＰＣ３発現細胞に対する非常に高い結合親和性を有し、かつＧＰＣ３発現がん細胞の増殖を有意に阻害する能力があることを示している。特に、ＹＰ９．１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８免疫毒素は、最も高い結合親和性およびがん細胞増殖の最も大きい阻害を示した。
【０２８８】
（実施例４）
被験体においてがんを検出し、または被験体における癌の診断を確認するためのＧＰＣ３特異的モノクローナル抗体
この実施例は、被験体におけるがんの検出のための、ＧＰＣ３を結合するモノクローナル抗体の使用を記載する。この実施例はさらに、被験体におけるがんの診断を確認するためのこれらの抗体の使用を記載する。
【０２８９】
試料（例えば、バイオプシー）を、ＧＰＣ３陽性がん（すなわち、ＨＣＣ、メラノーマ、肺の扁平上皮がん腫、または卵巣明細胞がん腫などのＧＰＣ３を発現または過剰発現するがん）を有すると診断されたかまたは有するのではないかと疑われる患者から得る。がんを有しない患者から採取された試料は、対照として用いることができる。試料においてＧＰＣ３発現細胞の存在を検出するために免疫組織化学法（ＩＨＣ）を実施する。ＩＨＣ方法は、当該分野において周知である。例えば、蛍光マーカーに結合体化されたＧＰＣ３特異的抗体は、ＧＰＣ３を直接検出するために用いることができる。対照試料と比較しての患者試料の蛍光強度の増加により、その試料におけるＧＰＣ３発現細胞の存在が検出される。試料におけるＧＰＣ３陽性細胞の検出により、その患者がＧＰＣ３陽性がんを有することが示されるか、またはその被験体におけるがんの診断が確認される。
【０２９０】
（実施例５）
がんの処置のためのＧＰＣ３特異的モノクローナル抗体
この実施例は、ＨＣＣ、メラノーマ、肺の扁平上皮がん腫、または卵巣明細胞がん腫などのＧＰＣ３を発現または過剰発現するがんの処置のためのＧＰＣ３特異的モノクローナル抗体の使用を記載する。ＧＰＣ３陽性がんと診断された患者は、当該分野における標準手順に従って処置することができる。
【０２９１】
この実施例では、ＧＰＣ３陽性がんと診断された患者に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）に連結されたＧＰＣ３特異的モノクローナル抗体を含む免疫結合体が投与される。ＰＥ免疫結合体の調製法は、当該分野において以前に報告されており（例えば、米国特許第７，０８１，５１８号および米国特許出願公開第２００５／０２１４３０４号を参照のこと）そして実施例３において上記されている。一部の患者では、その免疫結合体は、静脈内ボーラス注射によって１日おきに合計３〜６回投与される。他の患者では、その免疫結合体は、１０日間にわたって連続的な静脈内注入によって投与される。患者に投与される免疫結合体の用量は、患者の体重および性別、ならびに投与の様式および時間経過に応じて変動する。処置の後、がんの進行（腫瘍の成長および転移を含む）および疾病の他の臨床的徴候について患者を評価する。
【０２９２】
開示された本発明の原理が適用され得る多数の可能な実施形態を考えれば、例証された実施形態が、本発明の好ましい例だけにすぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことは認識されるはずである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神内に入る全てを本発明者らの発明と主張する。
【図１Ａ】
2019062910.tif 000020
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2019062910.tif 000026
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
2019062910000001.app
【外国語明細書】
2019062910000001.pdf