(57)【要約】【課題】粒子クラスタを単離するためのマイクロ流体方法およびシステムの提供。【解決手段】入口および出口を画定する基体、複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを形成するように基体上で入口と出口との間に配置された構造体のセットであって、各粒子クラスタ捕捉ゾーンが構造体のサブセットを含み、そのサブセットが、粒子クラスタ捕捉ゾーン中の構造体の一つである分割障壁によって二つの出力流路へと等分割される入力流路を画定する、構造体のセット、ならびに、入口から粒子クラスタ捕捉ゾーンの入力流路へとおよび粒子クラスタ捕捉ゾーンの出力流路から出口へと流体を導くように基体上に画定された複数のマイクロ流体チャネル。【選択図】図１Ａ
2019211483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
入口および出口を画定する基体；
複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを形成するように該基体上で該入口と該出口との間に配置された構造体のセットであって、
各粒子クラスタ捕捉ゾーンが該構造体のサブセットを含み、該サブセットが、該粒子クラスタ捕捉ゾーン中の該構造体の一つである分割障壁によって二つの出力流路へと分割される入力流路を画定するように配置されており、
該構造体のサブセットが、第一のタイプの粒子1個の通過を許して該第一のタイプの粒子2個以上のクラスタの通過を阻止するのに十分な大きさの断面を各出力流路が有するようにさらに配置されている、構造体のセット；ならびに
該入口から該粒子クラスタ捕捉ゾーンの該入力流路へとおよび該粒子クラスタ捕捉ゾーンの該出力流路から該出口へと流体を導くように該基体上に画定された複数のマイクロ流体チャネル
を含む、マイクロ流体装置。
【請求項２】
構造体が二列以上で配置され、各列の構造体が隣接列の構造体から横方向にオフセットされて複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを形成している、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項３】
構造体のサブセットが、二列で配置された三つの三角柱構造体を含み、第一および第二の三角柱構造体が、それらの間に入力流路を画定するように該第一の三角柱構造体の一角が該第二の三角柱構造体の一角に隣接する状態で第一列に配置され、かつ第三の三角柱構造体が、該第一列に位置する第一および第二の三角柱構造体の隣接する角と角との間に第三の三角柱構造体の鋭い縁が配置されるように該第一列の該第一および第二の三角柱構造体からオフセットされた状態で第二列に配置され、分割障壁が、該第三の三角柱構造体の該鋭い縁である、請求項2記載のマイクロ流体装置。
【請求項４】
第一のタイプの粒子が細胞であり、第三の三角柱構造体の鋭い縁が、第一および第二の三角柱構造体の隣接する角と角との概ね中間にあり、該第一および第二の三角柱構造体の隣接する角それぞれと該第三の三角柱構造体の該鋭い縁との間の距離が少なくとも10ミクロンである、請求項3記載のマイクロ流体装置。
【請求項５】
分割障壁が約10ミクロン未満のコーナー半径を有する、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項６】
分割障壁を形成する構造体の壁が90°以下の角度で突き合う、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項７】
全構造体が同じ断面形状を有する、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項８】
構造体のセットにおける複数の構造体が二つ以上の異なる断面形状を含む、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項９】
構造体の一つまたは複数が、三角形、菱形または円形からなる群から選択される断面形状を有する、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項１０】
各構造体が少なくとも10ミクロンの高さを有する、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項１１】
基体に結合された冷却装置をさらに含み、該冷却装置が、前記マイクロ流体装置を約0〜15℃の温度まで冷却するように構成されている、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項１２】
粒子クラスタ中の粒子が、細胞または細胞に結合したビーズを含む、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項１３】
マイクロ流体装置中の複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを通じて第一の方向に沿って流体試料を流す工程であって、各粒子クラスタ捕捉ゾーンが、入力流路を画定するように配置された複数の構造体を含み、該入力流路が、該粒子クラスタ捕捉ゾーン中の構造体の一つである分割障壁によって二つの出力流路へと分割される、工程；
該流体試料からの粒子クラスタを、該粒子クラスタ捕捉ゾーンの一つにおける該分割障壁でトラップさせる工程；および
該トラップされた粒子クラスタを解放するために、該複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを通じて該第一の方向とは反対である第二の方向に沿って第二の流体を流す工程
を含む、マイクロ流体装置を使用して流体試料から粒子クラスタを単離する方法。
【請求項１４】
粒子クラスタが細胞クラスタを含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
細胞クラスタが循環腫瘍細胞（CTC）クラスタである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
流体試料が個々の粒子をさらに含み、該流体試料を流す間に、該個々の粒子が、粒子捕捉ゾーンの分割障壁によってトラップされることなく複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを通り抜ける、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
個々の粒子が赤血球および／または白血球を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
各粒子クラスタ捕捉ゾーンについて、二つの流出流体流が90°以下の角度で分けられる、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
マイクロ流体装置を流体試料の凝固点〜約15℃の温度まで冷却する工程をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項２０】
複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを通過する流体試料の全流量が約250ml/hr未満である、請求項13記載の方法。
【請求項２１】
各粒子クラスタ捕捉ゾーンについて、該粒子クラスタ捕捉ゾーンを通過する流体試料の流量が約10マイクロリットル/hr未満である、請求項13記載の方法。
【請求項２２】
各粒子クラスタ捕捉ゾーンについて、各流出流体流を通る流体試料の剪断流が約50s-1未満である、請求項13記載の方法。
【請求項２３】
粒子クラスタが、第一のタイプの粒子2個以上のクラスタを含み、構造体のサブセットが、第一のタイプの粒子1個の通過を許して粒子クラスタの通過を阻止するのに十分な大きさの断面を各出力流路が有するようにさらに配置されている、請求項13記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子クラスタを単離するためのマイクロ流体方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
循環腫瘍細胞クラスタおよび腫瘍−リンパ球混合クラスタの存在は、患者における転移プロセスの予後判定において潜在的に重要な因子であると理解されている。したがって、そのような細胞クラスタの単離および回収は、癌の疾患進行および治療応答の研究を実施することを可能にし得る。マイクロ流体技術が、診断および生物医学的研究のために全血から稀少細胞を単離し、回収するための不可欠なツールとして台頭するようになった。しかし、マイクロ流体チップ上にトラップされた細胞クラスタの回収は難題であるといえる。理由は、細胞クラスタを定位置に固定する方法が、細胞挙動を変化させることができる抗原抗体反応の使用に頼り得るからである。加えて、細胞は、マイクロ流体チップを構成する材料、試料流速およびチップ上の任意の表面コーティングに依存して、様々な強さで特異的／非特異的結合を活動的に形成し得る。特定の場合、これらの結合は非常に強く、付着した細胞の溶解を生じさせない限り、流速の増大によって断つことはできず、したがって、細胞の自然な状態を必然的に乱す特殊な表面コーティングおよび薬品をチップに塗布することが必要となる。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本開示は、流体試料から粒子、たとえば細胞のクラスタを単離するための装置および方法に関する。概して、第一の局面において、本開示の主題は、入口および出口を画定する基体；複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを形成するように基体上で入口と出口との間に配置された構造体のセットであって、各粒子クラスタ捕捉ゾーンが構造体のサブセットを含み、該サブセットが、構造体の該サブセットにおける構造体の一つである分割障壁によって二つの出力流路へと分割、たとえば等分割される入力流路を画定する、構造体のセット；ならびに、入口から粒子クラスタ捕捉ゾーンの入力流路へとおよび粒子クラスタ捕捉ゾーンの出力流路から出口へと流体を導くように基体上に画定された複数のマイクロ流体チャネルを含む、マイクロ流体装置として具現化されることができる。
【０００４】
概して、もう一つの局面において、本開示の主題は、マイクロ流体装置を、装置の作動中、相対的に低い温度、たとえば0〜15℃まで冷却することによってマイクロ流体装置の壁への粒子、たとえば細胞クラスタおよび細胞の非特異的結合を最小限にするための技術として具現化されることができる。
【０００５】
マイクロ流体装置は以下の特徴の一つまたは複数を含むことができる。たとえば、いくつかの実施形態において、構造体のサブセットは、第一のタイプの粒子1個の通過を許して第一のタイプの粒子2個以上のクラスタの通過を阻止するのに十分な大きさの断面を各出力流路が有するようにさらに配置されている。いくつかの実施形態において、構造体は二列以上で配置され、各列の構造体は隣接列の構造体から横方向にオフセットされて複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを形成している。構造体のサブセットは、二列で配置された三つの三角柱構造体を含むことができ、第一および第二の三角柱構造体は、それらの間に入力流路を画定するように第一の三角柱構造体の一角が第二の三角柱構造体の一角に隣接する状態で第一列に配置され、かつ第三の三角柱構造体は、第一列に位置する第一および第二の三角柱構造体の隣接する角と角との間に第三の三角柱構造体の鋭い縁が配置されるように第一列の第一および第二の三角柱構造体からオフセットされた状態で第二列に配置され、分割障壁が第三の三角柱構造体の鋭い縁である。粒子は細胞であり得、第三の三角柱構造体の鋭い縁は、第一および第二の三角柱構造体の隣接する角と角との概ね中間にあることができ、第一および第二の三角柱構造体の隣接する角それぞれと第三の三角柱構造体の鋭い縁との間の距離は少なくとも10ミクロンであることができる。
【０００６】
いくつかの実施形態において、分割障壁は約10ミクロン未満のコーナー半径を有する。いくつかの実施形態において、分割障壁を形成するように突き合う構造体の壁は90°以下の角度にある。
【０００７】
いくつかの実施形態において、全構造体が同じ断面形状を有する。いくつかの実施形態において、構造体のセットにおける構造体は二つ以上の異なる断面形状を含む。いくつかの実施形態において、構造体の一つまたは複数は、三角形、菱形、正方形、長方形、楕円形または円形からなる群から選択される断面形状を有する。いくつかの実施形態において、構造体の一つまたは複数は、三角柱、立方体、長方形角柱、斜方六面体、円柱または楕円中からなる群から選択される形状を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、各構造体は、少なくとも10ミクロン、たとえば20、30、40、50、60、70、80、90もしくは100ミクロンまたはさらに大きい、たとえば200もしくは300ミクロンの高さを有する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、装置は、基体に結合された冷却装置を含み、冷却装置は、マイクロ流体装置を約0〜15℃の温度まで冷却するように構成されている。
【００１０】
いくつかの実施形態において、粒子クラスタ中の粒子は、細胞、たとえば白血球、赤血球、腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞（CTC）、胎児細胞、上皮細胞またはビーズ、たとえば磁性もしくはポリマービーズ、たとえば細胞に結合したビーズを含む。
【００１１】
もう一つの局面において、本開示の主題は、以下の工程を含む、マイクロ流体装置を使用して流体試料から粒子クラスタを単離する方法として具現化されることができる：マイクロ流体装置中の複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを通じて第一の方向に沿って流体試料を流す工程であって、各粒子クラスタ捕捉ゾーンが、入力流路を画定するように配置された複数の構造体を含み、入力流路が、粒子クラスタ捕捉ゾーン中の構造体の一つである分割障壁によって二つの出力流路へと等分割される、工程、流体試料からの粒子クラスタを、粒子クラスタ捕捉ゾーンの一つにおける分割障壁でトラップさせる工程、および、トラップされた粒子クラスタを解放するために、複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを通じて第一の方向とは反対である第二の方向に沿って第二の流体を流す工程。
【００１２】
方法は以下の特徴の一つまたは複数を含むことができる。たとえば、いくつかの実施形態において、粒子クラスタは細胞クラスタを含む。細胞クラスタは循環腫瘍細胞（CTC）クラスタであり得る。
【００１３】
いくつかの実施形態において、流体試料はさらに、個々の粒子を含み、流体試料を流す間に、個々の粒子は、粒子捕捉ゾーンの分割障壁によってトラップされることなく複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを通り抜ける。個々の粒子は赤血球および／または白血球を含み得る。
【００１４】
いくつかの実施形態において、各粒子クラスタ捕捉ゾーンについて、二つの流出流体流は90°以下の角度で分けられる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、方法は、マイクロ流体装置を流体試料の凝固点〜約15℃の温度まで冷却する工程をさらに含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを通過する流体試料の全流量は約250ml/hr未満、たとえば200、150、100、100、50または25ml/hrである。
【００１７】
いくつかの実施形態において、各粒子クラスタ捕捉ゾーンについて、粒子クラスタ捕捉ゾーンを通過する流体試料の流量は約10マイクロリットル/hr未満、たとえば9、8、7、6、5、4、3、2または1マイクロリットル/hrである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、各粒子クラスタ捕捉ゾーンについて、各流出流体流を通る流体試料の剪断流は約10、20、30、40または50s-1未満である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、粒子クラスタは、第一のタイプの粒子2個以上のクラスタを含み、構造体のサブセットは、第一のタイプの粒子1個の通過を許して粒子クラスタの通過を阻止するのに十分な大きさの断面を各出力流路が有するようにさらに配置される。
【００２０】
本開示の目的に関して、粒子クラスタとは、たとえば化学結合（たとえば、とりわけイオン結合、共有結合、ファンデルワールス力）、磁力および/または静電力によっていっしょに保持された粒子2個以上の群をいうものと理解される。
【００２１】
本開示の目的に関して、個々の粒子とは、他の粒子といっしょに保持されていない粒子をいうものと理解される。
【００２２】
本開示の目的に関して、分割障壁とは、粒子クラスタ捕捉ゾーンの一部であり、粒子クラスタを保持するように寸法決定され、配置されている構造体または構造体の一部分、たとえば縁をいうものと理解される。分割障壁は、粒子クラスタ捕捉ゾーン中、二つの出口流路の間に位置する。
【００２３】
本明細書に記載される主題の実施形態はいくつかの利点を含むことができる。たとえば、本明細書に記載される装置は、抗体抗原反応を要することなく、細胞クラスタをトラップして単離するために使用することができる。したがって、そのような抗体抗原反応が細胞挙動を変化させる心配なく、細胞クラスタを研究し得る。加えて、ひとたびトラップされれば、細胞の自然な状態を乱し得るまたは損傷し得る高い剪断力または他の技術を使用する必要なく、単離された細胞クラスタを容易に取り出すことができる。そのうえ、装置の温度、ひいては流体試料および流体試料内の粒子の温度を周囲温度に対して下げることにより、非特異的結合の発生を減らすことができ、それが、単離される細胞または細胞クラスタの純度の向上につながり得る。
【００２４】
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または均等である方法および材料を使用して本発明を実施または検査することができるが、適当な方法および材料を以下に記す。本明細書中で挙げられるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は参照により全体として本明細書に組み入れられる。矛盾する場合、本明細書が、定義を含め、優先する。加えて、材料、方法および例は例示でしかなく、限定的であることを意図したものではない。
【００２５】
[本発明1001]
入口および出口を画定する基体；
複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを形成するように該基体上で該入口と該出口との間に配置された構造体のセットであって、
各粒子クラスタ捕捉ゾーンが該構造体のサブセットを含み、該サブセットが、該粒子クラスタ捕捉ゾーン中の該構造体の一つである分割障壁によって二つの出力流路へと分割される入力流路を画定するように配置されており、
該構造体のサブセットが、第一のタイプの粒子1個の通過を許して該第一のタイプの粒子2個以上のクラスタの通過を阻止するのに十分な大きさの断面を各出力流路が有するようにさらに配置されている、構造体のセット；ならびに
該入口から該粒子クラスタ捕捉ゾーンの該入力流路へとおよび該粒子クラスタ捕捉ゾーンの該出力流路から該出口へと流体を導くように該基体上に画定された複数のマイクロ流体チャネル
を含む、マイクロ流体装置。
[本発明1002]
構造体が二列以上で配置され、各列の構造体が隣接列の構造体から横方向にオフセットされて複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを形成している、本発明1001のマイクロ流体装置。
[本発明1003]
構造体のサブセットが、二列で配置された三つの三角柱構造体を含み、第一および第二の三角柱構造体が、それらの間に入力流路を画定するように該第一の三角柱構造体の一角が該第二の三角柱構造体の一角に隣接する状態で第一列に配置され、かつ第三の三角柱構造体が、該第一列に位置する第一および第二の三角柱構造体の隣接する角と角との間に第三の三角柱構造体の鋭い縁が配置されるように該第一列の該第一および第二の三角柱構造体からオフセットされた状態で第二列に配置され、分割障壁が、該第三の三角柱構造体の該鋭い縁である、本発明1002のマイクロ流体装置。
[本発明1004]
第一のタイプの粒子が細胞であり、第三の三角柱構造体の鋭い縁が、第一および第二の三角柱構造体の隣接する角と角との概ね中間にあり、該第一および第二の三角柱構造体の隣接する角それぞれと該第三の三角柱構造体の該鋭い縁との間の距離が少なくとも10ミクロンである、本発明1003のマイクロ流体装置。
[本発明1005]
分割障壁が約10ミクロン未満のコーナー半径を有する、本発明1001のマイクロ流体装置。
[本発明1006]
分割障壁を形成する構造体の壁が90°以下の角度で突き合う、本発明1001のマイクロ流体装置。
[本発明1007]
全構造体が同じ断面形状を有する、本発明1001のマイクロ流体装置。
[本発明1008]
構造体のセットにおける複数の構造体が二つ以上の異なる断面形状を含む、本発明1001のマイクロ流体装置。
[本発明1009]
構造体の一つまたは複数が、三角形、菱形または円形からなる群から選択される断面形状を有する、本発明1001のマイクロ流体装置。
[本発明1010]
各構造体が少なくとも10ミクロンの高さを有する、本発明1001のマイクロ流体装置。
[本発明1011]
基体に結合された冷却装置をさらに含み、該冷却装置が、前記マイクロ流体装置を約0〜15℃の温度まで冷却するように構成されている、本発明1001のマイクロ流体装置。
[本発明1012]
粒子クラスタ中の粒子が、細胞または細胞に結合したビーズを含む、本発明1001のマイクロ流体装置。
[本発明1013]
マイクロ流体装置中の複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを通じて第一の方向に沿って流体試料を流す工程であって、各粒子クラスタ捕捉ゾーンが、入力流路を画定するように配置された複数の構造体を含み、該入力流路が、該粒子クラスタ捕捉ゾーン中の構造体の一つである分割障壁によって二つの出力流路へと分割される、工程；
該流体試料からの粒子クラスタを、該粒子クラスタ捕捉ゾーンの一つにおける該分割障壁でトラップさせる工程；および
該トラップされた粒子クラスタを解放するために、該複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを通じて該第一の方向とは反対である第二の方向に沿って第二の流体を流す工程
を含む、マイクロ流体装置を使用して流体試料から粒子クラスタを単離する方法。
[本発明1014]
粒子クラスタが細胞クラスタを含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
細胞クラスタが循環腫瘍細胞（CTC）クラスタである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
流体試料が個々の粒子をさらに含み、該流体試料を流す間に、該個々の粒子が、粒子捕捉ゾーンの分割障壁によってトラップされることなく複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを通り抜ける、本発明1013の方法。
[本発明1017]
個々の粒子が赤血球および／または白血球を含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
各粒子クラスタ捕捉ゾーンについて、二つの流出流体流が90°以下の角度で分けられる、本発明1013の方法。
[本発明1019]
マイクロ流体装置を流体試料の凝固点〜約15℃の温度まで冷却する工程をさらに含む、本発明1013の方法。
[本発明1020]
複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを通過する流体試料の全流量が約250ml/hr未満である、本発明1013の方法。
[本発明1021]
各粒子クラスタ捕捉ゾーンについて、該粒子クラスタ捕捉ゾーンを通過する流体試料の流量が約10マイクロリットル/hr未満である、本発明1013の方法。
[本発明1022]
各粒子クラスタ捕捉ゾーンについて、各流出流体流を通る流体試料の剪断流が約50s-1未満である、本発明1013の方法。
[本発明1023]
粒子クラスタが、第一のタイプの粒子2個以上のクラスタを含み、構造体のサブセットが、第一のタイプの粒子1個の通過を許して粒子クラスタの通過を阻止するのに十分な大きさの断面を各出力流路が有するようにさらに配置されている、本発明1013の方法。
本発明の他の特徴および利点が以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】粒子クラスタを単離するためのマイクロ流体装置の例を示す模式図である。
【図１Ｂ】粒子クラスタを単離するためにマイクロ流体装置を使用する段階を示す模式図である。
【図１Ｃ】粒子クラスタを単離するためにマイクロ流体装置を使用する段階を示す模式図である。
【図１Ｄ】粒子クラスタを単離するためにマイクロ流体装置を使用する段階を示す模式図である。
【図２】マイクロ流体装置の粒子クラスタ捕捉ゾーンのトップビューを示す模式図である。
【図３】粒子クラスタ捕捉ゾーン中の粒子クラスタに作用する力および粒子クラスタ捕捉ゾーン中の流体速度を示す模式図である。
【図４】図4A〜4Cは、構造体が様々な輪郭を有する粒子クラスタ捕捉ゾーンのいくつかの例を示す模式図である。
【図５】複数の粒子クラスタ捕捉ゾーン中に配置された三角形構造体を含むマイクロ流体装置の走査型電子顕微鏡写真である。
【図６】粒子クラスタ捕捉ゾーンを有するチップ上の様々な領域に通じる複数のマイクロ流体チャネルを含むように作製されているマイクロ流体チップの写真である。
【図７】クラスタ回収および純度を改善するために冷却を用いる、粒子クラスタ捕捉ゾーンを含むマイクロ流体装置を使用する概念を示す模式図である。
【図８】粒子クラスタ捕捉ゾーンを含むマイクロ流体装置を血液試料が様々な全流量で通過するときの血液試料からのクラスタの捕捉率を示すプロットである。
【図９】粒子クラスタ捕捉ゾーンを含むマイクロ流体装置を使用して、血液中に癌細胞クラスタを有することが見いだされた患者の割合を示すプロットである。
【図１０】マイクロ流体装置の粒子クラスタ捕捉ゾーンからの細胞クラスタの解放率を示すプロットである。
【図１１】緩衝液を室温および4℃の装置に通した後の、装置の粒子クラスタ捕捉ゾーンを示す模式図である。
【図１２】粒子クラスタ捕捉ゾーンを有するマイクロ流体装置で処理された細胞（「解放後」）およびマイクロ流体装置で処理されない細胞（「スパイク前」）の細胞生存率を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
図1Aは、流体試料から粒子クラスタを単離することができるマイクロ流体装置100の例を示す模式図である。装置100は基体102を含み、基材の上に複数の柱状構造体106が配置されている。特に、柱状構造体106は、基体102の最上面に複数のクラスタ捕捉ゾーン104を形成するように配置されている。装置100の作動中、ユーザが、一つまたは複数の粒子クラスタ110（たとえば循環腫瘍細胞クラスタ）を含む流体試料108（たとえば血液）を装置100に導入して、その流体試料が粒子クラスタ捕捉ゾーン104を通って流れるようにする。捕捉区域102内の各クラスタ捕捉ゾーン104は、流体試料の流入流体流を二つの別々の開口部に送って、二つの流出流体流を形成する漏斗部分を含む。各粒子クラスタ捕捉ゾーン104中の開口部は、ゾーン104内の一つの柱状構造体106の分割障壁を中心に配置されている。流体試料中の粒子クラスタ110が一つの粒子クラスタ捕捉ゾーン104の漏斗部分に流れ込むと、粒子クラスタは鋭い縁のところでトラップされ得る。粒子クラスタは、摩擦力および剪断流力を含む力の均衡のせいで、分割障壁上で定位置に保持される。しかし、粒子クラスタ捕捉ゾーン104の開口部には、個々の粒子（すなわち、クラスタ中でいっしょに保持されていない粒子、たとえば白血球および／または赤血球）がトラップされることなく通り抜け続けることを許す間隙が残り得る。したがって、複数の粒子クラスタ捕捉ゾーン104は、流体試料中の個々の粒子から粒子クラスタを単離するフィルタとして働く。いくつかの実施形態において、分割障壁の各側に流路を形成する構造体は、第一のタイプの粒子1個の通過を許しかつ第一のタイプの粒子のクラスタの通過を阻止するのに十分な大きさの断面を各流路が有するように配置され得る。流体試料108が粒子クラスタ捕捉ゾーン104を通過し、一つまたは複数の粒子クラスタ110がトラップされたのち、装置100中の流体の流れを逆転させて（同じ初期流体試料または異なる流体を使用して）、粒子クラスタ捕捉ゾーン104中でトラップされた粒子クラスタを解放することができる。
【００２８】
図1B〜1Dは、粒子クラスタを単離するための処理の様々なステージにおいて図1Aのマイクロ流体装置のトップビューを示す三つの一連の模式図である。第一の「クラスタ捕捉」ステージ（図1B）において、粒子クラスタ110を含む流体試料（たとえば血液）を、複数の粒子クラスタ捕捉ゾーン104中に配置されている構造体106に第一の方向で導入する。すると、一つまたは複数の粒子クラスタ110はクラスタ粒子捕捉ゾーンでトラップされる。流体試料を構造体に通して流したのち、「洗浄」ステージで、流体試料と同じ方向の第二の溶液（たとえば緩衝液）によって装置100を洗浄して、装置100から流体試料を除去する（図1Cを参照）。その後、「解放」ステージ中、第三の溶液（たとえば別の緩衝液）を構造体106に逆方向に通して、トラップされた粒子クラスタ110を解放する（図1Dを参照）。そして、解放された粒子クラスタをさらなる研究のために捕集することができる。いくつかの実施形態において、溶液を逆方向に通して、トラップされた粒子クラスタを解放することを含む第三のステージは実施されず、トラップされた粒子クラスタは捕捉装置そのものの中で研究される。または、粒子クラスタを単離し、トラップする目的は、逆に、個々の粒子を研究するために、流体試料から粒子クラスタを除去することである。
【００２９】
図2は、図1Aのクラスタ捕捉ゾーン104の一つのトップビューである。概して、装置100中の他の粒子捕捉ゾーンは、図2に示すものと同じ配置を有し、基体102の最上面に反復パターンで配置されている。したがって、粒子クラスタ捕捉ゾーン104は、装置100中の構造体106のサブセットを含む。本例において、粒子クラスタ捕捉ゾーン104は三つの構造体106a、106b、106cを含み、これらの構造体が入力流路200を画定し、この入力流路は二つの出力流路202a、202bに分割される。サブセットにおける二つの構造体（106a、106b）は、第一列（たとえばクラスタ捕捉ゾーン104の上部）に配置され、第三の構造体106cは、第一列に隣接する第二列（たとえば、クラスタ捕捉ゾーン104の下部）に配置されている。粒子クラスタ捕捉ゾーン104それぞれを形成するために、装置の構造体106は二列以上に配置され（図1Aを参照）、各後続列の構造体は直前列の構造体から横方向にオフセットされている。
【００３０】
第一列の二つの構造体106a、106bは、入力流路200および入力流路200内に含まれた粒子を出力流路202a、202bに向けて送る漏斗領域206を画定する。すなわち、構造体106a、106bの壁は、入力流路200の幅が捕捉ゾーン104の上部から下部の構造体106cに向かって狭まるように配置されている（すなわち、第一の三角柱構造体106aの一角が第二の三角柱構造体106bの一角に隣接するように配置されている）。
【００３１】
上部構造体106aおよび106bの間の空間または間隙が下部構造体106cの分割障壁204によって分けられて二つの別々の開口部206a、206bを形成している。概して、分割障壁204は、二つの上部構造体106a、106bの間隙の実質的に中央に整合している。各開口部が出力流路202a、202bの一つに通じる。したがって、入力流路200が構造体106cの分割障壁204に向かって移動するとき、流路200は、二つの出力流路202a、202bの間でほぼ均等に分割される。粒子クラスタ250が入力流路200に沿って移動するとき、そのクラスタは、構造体106cの分割障壁204に到達し、その地点で摩擦力（たとえば構造体106a、106b、106cの一つまたは複数から生じる）と剪断流力（たとえば流体流から生じる）のと均衡によってトラップされる。
【００３２】
図3は、粒子クラスタ捕捉ゾーンの一部分のトップビューを示す模式図であり、図中、粒子クラスタ350に影響する様々な力を示す矢印がオーバレイされている。図3中、ゾーンの上列の三角柱構造体106a、106bそれぞれの半分だけが示されているが、図3中、下列の三角柱構造体106cの全体が示されている。加えて、粒子クラスタ捕捉ゾーンを通過する流体流量が位置に依存してどのように変化するかの例を示すために、三角構造体間の領域がヒートマップによって示されている。本例において、流量は0〜60μm/secで変化するが、他の範囲の流量もまた可能である。
【００３３】
粒子クラスタ350が下部三角柱構造体106cの分割障壁に到達すると、粒子クラスタ350は、図3に示す力の動的均衡により、分割障壁のところでトラップされる。これらの力は、粒子クラスタ350が上列の三角構造体106a、106bの側面に接触することによって生じる摩擦力FF；出力流路に沿う流体の剪断流から生じる剪断力FD（抵抗力とも呼ばれる）；および三角柱構造体の角／壁の存在による反力FRを含む。下部三角柱構造体の分割障壁は、二つの隣接する上部三角柱構造体の間隙の概ね中央にあるため、粒子クラスタ350が受ける剪断力FDは二つの出力流路202a、202bの間で均衡する（図2を参照）。その結果、粒子クラスタ350は、二つの開口部の一方へと逸れることを阻止される。しかし、分割障壁が間隙の中央にないならば、粒子クラスタ350が受ける剪断流は出力流路の一方または他方に沿ってより大きくなり、粒子は、対応する開口部へと送られ、おそらくは、その中で絞られるであろう。
【００３４】
下部三角構造体106cの分割障壁のところで粒子クラスタ350を均衡させる剪断流力に加えて、漏斗壁からの摩擦力FFが粒子クラスタ350の動きを制限する。さらには、漏斗壁と粒子クラスタ350との接触が、粒子クラスタが非対称形状を有するならばクラスタ350が受け得るであろうトルクまたは横移動を釣り合わせる。粒子クラスタ350が下部構造体106cの分割障壁に遭遇すると、捕捉ゾーン104中の各構造体の鋭い縁の一つまたは複数による反力FRが、流体剪断力に対して拮抗力を提供する。反力FRは、摩擦力が単独では粒子クラスタ350を動的均衡状態に維持するのに十分なほど大きくないとき、剪断力を均衡させることができる。装置中を活動的に流れる流体のせいで、この均衡は「動的」とみなされる。
【００３５】
特に、略球形を有する個々の粒子は、下部三角柱構造体106cの分割障壁に到達すると、出力流路202a、202bの一方またはもう一方に逸れる。理由は、粒子の丸い形状が、粒子が安定な平衡状態を得ることを妨げて、粒子が分割障壁から転がり落ちるようにするからである。対照的に、粒子クラスタに作用する様々な力は、クラスタ中の粒子間の界面を分割障壁と整合させ得、粒子クラスタが安定な平衡状態にとどまることができるようにする。
【００３６】
力を動的に均衡させて粒子クラスタをトラップする利点は、粒子クラスタを相対的に容易に解放することができることである。特に、摩擦力のみによって粒子クラスタを捕捉するならば、粒子クラスタをその捕捉状態から押し退けるためには同じ量の摩擦力が必要になるであろう。しかし、流体流を逆転させると（すなわち、流体が入力流路に対して反対方向に流れると）、反力は存在しなくなる。したがって、トラップされた粒子クラスタを押し退けるために必要な力の総計は、順方向流の下で粒子クラスタをトラップする力の総計よりも少ない。
【００３７】
図3のヒートマップ部分は、粒子クラスタ捕捉ゾーン中の流体流速の変化を示す。入力流路が漏斗を下って下部三角柱構造体106cまで移動するとき、流体が流れることができる区域は狭まる。その結果、流体流速は増す。図3の例に示すように、粒子クラスタ捕捉ゾーン内の最大流体流速に対応する領域は、各三角柱構造体の角が突き合うところ、すなわち流体流区域がもっとも狭いところにもっとも近い区域で起こる。対照的に、流体流速は、角が突き合う領域から離れるとともに、すなわち、流体流区域が広くなるとともに低下する。
【００３８】
図1〜3に示す構造体106は三角柱形状を有するが、構造体106は、分割障壁として使用される構造体の部分（たとえば角）が粒子クラスタと比較して相対的に小さくて、入力流体流からの剪断力を均衡させることができる反力を提供する限り、他の形状を有してもよい。たとえば、約5〜25ミクロンである循環腫瘍細胞（CTC）の場合、分割障壁は、CTCのクラスタが少なくとも一つの寸法に沿って分割障壁の曲率半径の少なくとも2.5倍の大きさである平均サイズを有するよう、約1〜2ミクロンの曲率半径を有するべきである。代替的または追加的に、分割障壁を形成するように突き合う構造体の壁は互いに対して90°以下の角度であり得る。たとえば、正三角柱が構造体として使用される場合、分割障壁を形成するように突き合う構造体の壁は互いに対して60°の角度であろう。いくつかの実施形態において、分割障壁はまっすぐな縁であることができる（縁の長さがトラップされる粒子クラスタに対して短い限り）。したがって、本明細書の中で構造体に関して使用される用語「分割障壁」は、必ずしも、鋭い点になる構造体の部分をいうわけではない。
【００３９】
図4は、構造体が様々な輪郭を有する粒子クラスタ捕捉ゾーンのいくつかの例を示す模式図である（装置のトップビューから見た図。すなわち、構造体は、紙面の中へと延びる厚さをも有する）。構造体は斜方六面体形であることができ（トップビューにおける構造体の輪郭が菱形である図4Aを参照）、斜方六面体形の角が、粒子クラスタを摩擦力、剪断力および反力によって均衡させることができる分割障壁として働くようになっている。いくつかの実施形態において、構造体は非常に薄いものであることができる。たとえば、図4Bは、薄い長方形角柱である構造体で構成された粒子クラスタ捕捉ゾーンを示す。長方形角柱構造体の短辺は、約1〜2μmである縁を有し得る。図4Cは、構造体が円形の輪郭を有する粒子クラスタ捕捉ゾーンの例である。円の曲率半径は約1〜2ミクロンである。したがって、図4Cの例において、分割障壁は構造体そのもの全体に相当する。構造体の角が分割障壁として使用される場合、分割障壁の曲率半径は、好ましくは10ミクロン未満、たとえば5ミクロン、2ミクロン、1ミクロンまたは0.5ミクロンである。他の曲率半径を代わりに使用してもよい。いくつかの実施形態においては、各粒子クラスタ捕捉ゾーン内の全構造体または、粒子クラスタ捕捉ゾーン中で使用される、マイクロ流体装置内の全構造体が同じ形状を有する。または、粒子クラスタ捕捉ゾーン内の構造体は異なる形状を有してもよい。たとえば、いくつかの粒子クラスタ捕捉ゾーンは、三角柱形状を有する構造体を含み得るが、他の粒子クラスタ捕捉ゾーンは、斜方六面体形状または薄い長方形角柱形状を有する構造体を含み得る。
【００４０】
もう一つの例において、粒子クラスタ捕捉ゾーンを形成する分割障壁は第一の形状（たとえば三角柱）であってもよいが、粒子クラスタ捕捉ゾーンのその他の二つの構造体は第二の異なる形状（たとえば長方形角柱、斜方六面体または円柱）であってもよい。いくつかの実施形態においては、各粒子クラスタ捕捉ゾーン内の全構造体またはマイクロ流体装置内の全構造体が同じ形状およびサイズを有する。または、粒子クラスタ捕捉ゾーン内の構造体は、同じ形状（たとえば円柱、長方形角柱、三角柱、斜方六面体、立方体）および異なるサイズ（たとえば異なる直径、異なる体積、異なる断面積、流体試料流の方向に対して平行または垂直な平面に沿って測定される異なる面積）を有してもよい。たとえば、粒子クラスタ捕捉ゾーン中の各構造体は円柱であってもよく、分割障壁に相当する円柱の直径は粒子クラスタ捕捉ゾーン内のその他の二つの構造体の直径よりも小さくてもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、マイクロ流体装置は、粒子クラスタ捕捉ゾーンの中に通じる、および／またはそこから通じるさらなるマイクロ流体チャネルを含むことができる。図5は、複数の粒子クラスタ捕捉ゾーン中に配置された三角柱構造体を含むマイクロ流体装置の走査型電子顕微鏡写真である。写真中のスケールバーは100μmを表す。図5に示すように、マイクロ流体装置はまた、三角構造体に流体結合された一連のマイクロ流体チャネルを含む。特に、入口マイクロ流体チャネル500は、第一の細長い障壁502により、複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを形成する三角柱構造体に流入する二つのさらなるマイクロ流体チャネル504a、504bへと分割されている。同様に、粒子クラスタ捕捉ゾーンの出力における二つのマイクロ流体チャネル506a、506bは、第二の細長い障壁508を巻きながら合流して、出口マイクロ流体チャネル510を形成している。
【００４２】
流体処理能力を高めるために、粒子クラスタ捕捉ゾーンを含む複数のマイクロ流体チャネルおよび領域がマイクロ流体装置上に形成されることができる。たとえば、図6は、粒子クラスタ捕捉ゾーンを有するチップ上の様々な領域に通じる複数のマイクロ流体チャネルを含むように作製されているマイクロ流体チップの例の写真である。流体試料は、入力管600を使用してチップに送り込まれる。チップはまた、粒子クラスタ捕捉ゾーンの出力に流体結合した複数のマイクロ流体チャネルを含む。流体は、出力管602を使用してチップから取り出される。図6の挿絵は、複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを含む区域にマイクロ流体チャネルを結合し得る方法の拡大図を示す。したがって、図6の例示的装置に示すもののような構成を使用することにより、より多量の流体試料を粒子クラスタ捕捉ゾーンによってろ過し得る。
【００４３】
図1の構造体106のような粒子クラスタ捕捉ゾーン中の構造体の高さ／厚さは、基体102の最上面から計測して、約10μm〜約500μmの範囲、たとえば約50μm、約100μm、約150μm、約200μm、約250μm、約300μm、約350μm、約400μmまたは約450μmであり得る。他の高さを使用することもできる。構造体106の表面積は、基体102の最上面に対して平行な平面に沿って計測して、約78μm2〜0.125mm2の範囲、たとえば約200μm2、約500μm2、約1000μm2、約5000μm2、約0.01mm2、約0.05mm2または約0.1mm2の範囲であり得る。他の面積を使用することもできる。
【００４４】
図2を参照すると、粒子捕捉ゾーン104中の開口部206a、206bの幅（流路202a、202bに対して垂直な平面に沿って計測）は、概して、流路202a、202bを通過する流れから生じる剪断力が、分割障壁204のところでトラップされたクラスタ粒子上で均衡されることを保証するために、ほぼ同じである。間隙の幅は、トラップされる粒子クラスタを形成する別々の粒子のサイズに基づいて設定され得る。すなわち、幅は、粒子2個以上を有するクラスタが開口部206a、206bの一つまたは複数を通り抜けることを阻止するため、クラスタを構成する粒子1個の直径にほぼ等しく設定され得る。たとえば、約12μmのおおよその直径を有するCTC細胞から形成されたCTC粒子クラスタの場合、各間隙の幅は、約8〜14μmの範囲、たとえば10μm、11μm、12μmまたは13μmであり得る。他の細胞直径の場合、他の幅を使用することもできる。しかし、いくつかの例においては、開口部206a、206bの幅が互いに異なるよう、分割障壁204の位置は間隙の中央でなくてもよい。そのような場合、小さいほうの開口部を通過する剪断流は、広いほうの開口部を通過する剪断流よりも少なくなり、クラスタにかかる力の不均衡のせいで粒子クラスタがトラップされないおそれがある。
【００４５】
試料流体が粒子クラスタ捕捉ゾーンに通される速度は、トラップされたクラスタを解放するために洗浄流体が逆方向に適用される速度と比べて相対的に低い。流体試料の場合には、粒子クラスタにかかる剪断力がクラスタを粒子クラスタ捕捉ゾーンの出力流路に押し通すほど高くならないよう、低めの流量が使用される。しかし、トラップされた粒子を解放する場合、装置壁に弱く結合しているおそれのある個々の粒子を洗い流し、同じく装置壁に弱く結合しているおそれのあるクラスタを解放しやすくするために、はるかに高い流量が使用される。たとえば、捕捉ステージ中に粒子クラスタ捕捉ゾーンを含む装置を通過する流体試料の全体積流量は、たとえば約0.1ml/hr〜約3ml/hrの範囲であることができるが、トラップされたクラスタを解放するとき装置を通過する緩衝液の全体積流量は、たとえば20ml/hr〜約250ml/hrの範囲であることができる。当然、装置を通過する全流量は、装置の流路の全サイズおよび／または総数に基づいて増減することができる。流体が各粒子クラスタ捕捉ゾーンを通って流れる速度は、全流体流量をマイクロ流体装置中の粒子クラスタ捕捉ゾーンの数で割ることによって決まる。たとえば、特定のマイクロ流体装置が4000の粒子クラスタ捕捉ゾーンを含み、クラスタ捕捉ステージ中に装置を通過する全流量が2.5ml/hrであると仮定すると、各粒子クラスタ捕捉ゾーンを通過する平均流量は約0.625μl/hrである。捕捉ステージ中に粒子クラスタ捕捉ゾーン装置を通過する流体試料の流量は、たとえば約0.1μl/hr〜約10μl/hrの範囲であることができ、0.5μl/hr、1μl/hr、2μl/hr、4μl/hr、6μl/hrまたは8μl/hrを含む。捕捉ステージ中の流体試料の他の流量もまた可能である。粒子クラスタ捕捉ゾーンを通過する流体試料の流量はまた、剪断力に対応する。たとえば、各粒子クラスタ捕捉ゾーンについて、「捕捉」ステージ中、各出力流路中の流体試料の剪断流は、約50s-1未満、たとえば40s-1、30s-1、20s-1、10s-1、10s-1または0.5s-1であり得る。他の剪断流値が使用されてもよい。
【００４６】
粒子クラスタは、細胞、たとえばCTC、白血球、赤血球、白血球とCTCの凝集体、循環上皮細胞（CEC）、血漿細胞、巨核球、前駆細胞、核小体、ヘム（産生）細胞またはヘム（産生）細胞のサブセットを含むことができる。CTCの場合、細胞クラスタは腫瘍組織から分離すると考えられている。概して、CTC中の細胞は、それらの界面における化学結合によっていっしょに保持され、そのような結合は組織生成中に形成し得る。いくつかの実施形態において、粒子クラスタは、ビーズ、たとえばポリスチレンビーズまたは磁性ビーズを含む。ビーズは、分析対象物、たとえば細胞および／または互いに結合するよう、抗体とコンジュゲートしていてもよい。
【００４７】
装置中の流体の相対的に遅い流れのせいで、いくつかの実施形態においては、重力が流体試料からの粒子を基体との界面の近くに蓄積させて、装置の目詰まりを生じさせる場合がある。そのような目詰まりを避けるためには、装置の側面を下にして配置して、重力が、基材に向かう方向ではなく、マイクロ流体装置の出力の方向にかかるようにすることができる。
【００４８】
非特異的粒子結合を阻止するためのマイクロ流体装置の処理
先に説明したように、粒子クラスタ捕捉ゾーンを含むマイクロ流体装置は、粒子クラスタが装置の表面に結合することを要することなく、流体試料から粒子クラスタをトラップし、次いで単離するために使用することができる。しかし、そのような場合、他の望ましくない粒子がマイクロ流体装置の領域に特異的または非特異的に結合し、それにより、単離される粒子クラスタの純度を下げてしまう。代替的または追加的に、粒子クラスタそのものがマイクロ流体装置の部分に非特異的に結合して、溶液を初期流体試料流の方向とは逆方向に通したとき、トラップされたクラスタの解放をより困難にし得る。
【００４９】
この非特異的結合を回避または阻止するために使用することができる技術がいくつかある。たとえば、マイクロ流体装置表面への粒子の望まれない結合の量を制限するための一つの技術は、溶液および溶液内に含まれる粒子の温度を下げることを含む。流体試料内の粒子が細胞である場合、より低い温度（周囲温度、たとえば室温に対して）が細胞−表面結合形成の減少につながる。したがって、形成する結合が少なくなると、装置表面に結合する細胞は少なくなる。したがって、特定のタイプの細胞をトラップし、単離するように構成されたマイクロ流体装置において、装置表面に偶然に結合する望まれない細胞の数を減らし、それによって所望の細胞の単離純度を高めることができる。
【００５０】
冷却技術は、粒子クラスタ捕捉ゾーンを含むマイクロ流体装置において非常に効果的であることができる。本明細書に説明するように、粒子クラスタ捕捉ゾーンは、粒子クラスタを機械的に、すなわち機械的力の均衡に基づいてトラップするように構成されている。装置を室温で作動させるとき、細胞を含むクラスタは、装置の壁と非特異的結合を活動的に形成し得る。したがって、トラップされたクラスタを解放するために溶液を装置に通すと、最終的には相対的に多数のクラスタが装置表面に付着し得る。しかし、装置を、周囲室温よりも低く、かつ装置内の流体試料の凝固点よりも高い温度で作動させると、装置表面に非特異的に結合する粒子クラスタの数を減らすことができ、より高い割合のクラスタを装置から回収することが可能になる。クラスタ回収率を高めることに加え、より低い温度はまた、装置壁への個々の細胞の非特異的結合を減らすことができ、回収されるクラスタの純度を改善することが可能になる。
【００５１】
非特異的結合を減らすための温度は様々であることができるが、粒子／細胞が含まれる溶液の凝固点よりも高く、かつ周囲室温よりも低いべきである。たとえば、温度範囲は、約0℃〜15℃、たとえば2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、12℃または14℃であることができる。他の温度を使用することもできる。
【００５２】
図7は、クラスタ回収および純度を改善するために冷却を用いる、粒子クラスタ捕捉ゾーンを含むマイクロ流体装置を使用する概念を示す模式図である。図7に示すように、流体試料702、たとえば25℃の全血を、本明細書に記載されるような粒子クラスタ捕捉ゾーンを含むマイクロ流体装置100に導入する。本例において、マイクロ流体装置100は熱電冷却ユニット704と接触しているが、任意の適用可能な冷却機構を使用し得る。冷却ユニット704はチップを4℃まで冷却する。装置100は相対的に薄いため、熱伝達プロセスが流体および流体内の粒子も冷却ユニットの温度、すなわち約4℃まで冷却すると考えられる。動作中、まず第一ステージで流体試料を粒子クラスタ捕捉ゾーンに通す（図7の「I−捕捉」を参照）。次いで、第二ステージで、リン酸緩衝液（PBS）を流体試料と同じ方向に粒子クラスタ捕捉ゾーンに通す（図7の「II−洗浄」を参照）。最後に、第三ステージで、PBSを反対方向に粒子クラスタ捕捉ゾーンに通す（図7の「III−解放」を参照）。各ステージ中、クラスタおよび／または個々の粒子の結合が最小限になるよう、装置を低めの温度に維持する。
【００５３】
装置壁への細胞結合を阻止するためにマイクロ流体装置を冷却する技術は、本明細書に記載される装置に限定されない。代わりに、冷却技術は、非特異的または特異的のいずれかの細胞結合の減少が求められる他の様々なマイクロ流体装置にも適用され得る。
【００５４】
加えて、マイクロ流体装置を冷却することに加えて、またはそれに代えて、細胞および細胞クラスタの結合を減らすための他の技術を使用することができる。たとえば、いくつかの場合、装置動作中に流体試料に暴露される装置の表面を、細胞結合を減らすコーティング、たとえばゲルコーティングでコートすることができる。たとえば、Shahらによって「Biopolymer System for Cell Recovery from Microfluidic Cell Capture Devices」、Analytical Chemistry, Volume 84, pp. 3682-3688 (2012）（参照により全体として本明細書に組み入れられる）に述べられているようなゲルコーティング技術を、マイクロ流体装置のマイクロ流体チャネルおよびクラスタ粒子捕捉ゾーンの表面に適用することができる。
【００５５】
他の技術は、粒子クラスタ捕捉ゾーン中の構造体の内壁の表面を抗細胞結合性にするために使用することができる特定の表面処理を含む。そのような技術は当業者に公知である。
【００５６】
マイクロ流体装置作製
一例として、本明細書に記載されるマイクロ流体装置（たとえばマイクロ流体装置100）は、以下のソフトリソグラフィー法を使用して製造することができる。まず、装置100の形体を画定する型を得る。たとえば、型は、公知の方法にしたがって二つのフォトリソグラフィーマスクを使用して二つのフォトレジスト層（たとえばSU8、Microchem, Newton, MA）をシリコンウェーハに適用し、次いでパターニングすることによって形成することができる。マスクは、装置100の様々な局面、たとえば入力マイクロ流体チャネル、粒子クラスタ捕捉ゾーンおよび出力マイクロ流体チャネルを画定する形体を含むことができる。次いで、パターニングされたフォトレジストを有するウェーハをマスタ型として使用して、マイクロ流体パーツを形成し得る。次いで、ポリマー（たとえばポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリメチルメタクリレート（PMMA）またはポリカーボネート（PC））溶液をマスタ型に塗布し、硬化させる（たとえば加熱により）。硬化後、ポリマー層は凝固し、マスタ型から剥離させることができる。凝固したポリマー層は、粒子クラスタ捕捉ゾーンの流体チャネルおよび流体経路に対応する凹みを含む。次いで、ポリマー層を、ガラススライドのような基体に結合させる。たとえば、ポリマー層の下面をプラズマ処理してポリマーの結合性を高めることができる。次いで、プラズマ処理したポリマー層をガラススライドに載せ、加熱して結合を誘発し得る。ポリマーをガラススライドに結合したのち、カバースライド（たとえばガラススライド）をポリマー層の上に接着して、マイクロ流体チャネルおよび粒子クラスタ捕捉ゾーンを封じ込め得る。また、カバーへの結合の前に、カバースライドに接触するポリマー層の表面をプラズマ処理してもよい。
【００５７】
上記マイクロ流体装置100の例は、ガラスの基体層、マイクロ流体チャネルおよび粒子クラスタ捕捉ゾーンを画定するポリマー層ならびにガラス製のカバー層を含む。他の実施形態において、基体層および／またはカバー層はポリマー基体または他の類似材料であることができる。
【００５８】
前記技術はマイクロ流体装置の作製法の単なる一例である。他の技術を代用してもよい。たとえば、ホットエンボス法、LIGAまたは射出成形法のような技術を使用して、粒子クラスタ捕捉ゾーンを含むマイクロ流体装置の一つまたは複数の層を作製してもよい。
【００５９】
マイクロ流体工学
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるマイクロ流体装置のマイクロ流体チャネルおよび／または粒子クラスタ捕捉ゾーンは、より大きな任意選択のマイクロ流体チャネルネットワークの一部である。そのようなマイクロ流体ネットワークは、小さな量の液体の管理および操作（たとえば分離、隔離）を容易にし、標的分析対象物を複雑な親標本から単離しやすくするために使用することができる。単離プロセス中、マイクロ流体要素が、重要な機能、たとえば生物学的流体の取り扱いまたは試料との磁性粒子の再現可能な混合を提供する。マイクロ流体チャネルネットワークおよびそれらの作製に関するさらなる情報は、米国特許出願公開公報第2011/0091987号、米国特許第8,021,614号および米国特許第8,186,913号に見いだすことができる。これらはいずれも参照により全体として本明細書に組み入れられる。
【００６０】
用途
生物学的研究においては、たとえば標的粒子および細胞集団を操作し、分離するための、より正確かつ効率的な方法の必要性がますます増大している。免疫学および癌医学から幹細胞生物学にまで及ぶ学問は、詳細な特性決定のために、特定の粒子および細胞サブセットの非汚染集団の識別に大きく依存している。臨床的に、微生物学者は、診断目的のため、日常的に細菌細胞および白血球サブセットを単離する。転移性黒色腫の免疫治療のための新たな潜在的標的を提示する腫瘍抗原特異的制御性T細胞を癌患者の循環血液中に見いだすことができる。環境センシングは、特定の細菌細胞汚染に関して水、食品および飲料加工の監視を要する。ワクチン開発者らは、主に、細胞表面に提示されるペプチドフラグメント中、1個以下のアミノ酸だけ互いに異なり得る稀少細胞である抗原特異的Tリンパ球を取り扱う。このような様々な用途において、ある共通の問題が提起される：不均一で複雑な流体内に存在する細胞の分集団を単離し、分離し、特性決定する必要性である。これらの試料の処理中、標的細胞集団は、後続の発現プロファイリングおよび分子研究を可能にするために細胞の生理学的状態の変化を防ぎながら細心の注意で取り扱われなければならない。そのうえ、関心対象の細胞は、きわめて低い頻度でしか存在しないこともあり（循環腫瘍細胞または疾患特異的Tリンパ球の場合、しばしば10,000,000個中1個未満）、課題の困難さを増す。
【００６１】
本明細書に記載される粒子クラスタ捕捉ゾーンを含む装置は、上述の研究および分析のために、流体試料中に見られる細胞クラスタを単離する手段として使用することができる。たとえば、いくつかの実施形態において、患者から抽出された血液試料は、患者における癌転移の発生を示すことができる、いくつかの循環腫瘍細胞（CTC）クラスタを含む場合があるまたは含まない場合がある。CTCクラスタの存在の識別に関心があるユーザは、マイクロ流体装置を使用して、血液試料中に存在するCTCクラスタを、クラスタの一部ではない個々の細胞（たとえば個々の白血球または個々の赤血球）から単離することができる。そして、ひとたび細胞クラスタが単離されたならば、ユーザは、単離されたクラスタに対して分析を実施し得る（たとえば、血液試料中に存在するCTCクラスタの数をカウントして、患者を診断し得る、疾患進行を研究し得る、または治療に対する患者の応答を研究し得る）。本明細書に記載される装置は、CTCクラスタの単離を含む使用に限定されず、粒子クラスタの計数、選別、濃縮および配列または流体試料からの望まれない粒子クラスタの除去を要する広い範囲の用途に使用することができる。
【００６２】
したがって、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、CTCクラスタのような稀少細胞を連続的に高速で選別、分離、計数および分析するやり方を提供する。ある特定の細胞クラスタが稀少細胞クラスタであるかどうかは、少なくとも二つの異なる方法で見ることができる。細胞クラスタを稀少と特性決定する第一のやり方では、稀少細胞クラスタは、所与の試料の有意な分画として自然には発生しない任意の細胞であるということができる。たとえば、ヒトまたはmanlillalian血液の場合、稀少細胞クラスタは、対象者の正常な血液細胞（たとえば非癌赤血球および非癌白血球）以外の任意の細胞クラスタであり得る。この見解では、血液中に存在する癌または他の細胞は稀少細胞とみなされるであろう。細胞クラスタを稀少と特性決定する第二のやり方は、試料中に細胞クラスタが出現する頻度を考慮に入れ得る。たとえば、稀少細胞クラスタは、血液1mlあたり約1〜50個の頻度で出現する細胞クラスタであり得る。または、非稀少細胞を含む所与の集団内の稀少細胞クラスタ頻度は、およそ細胞100個中細胞クラスタ1個未満；およそ細胞1,000個中細胞クラスタ1個未満；およそ細胞10,000個中細胞クラスタ1個未満；およそ細胞100,000個中細胞クラスタ1個未満；およそ細胞1,000,000個中細胞クラスタ1個未満；およそ細胞10,000,000個中細胞クラスタ1個未満；およそ細胞100,000,000個中細胞クラスタ1個未満；またはおよそ細胞1,000,000,000個中細胞クラスタ1個未満の頻度を含むことができるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００６３】
特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定しない以下の実施例において本発明をさらに説明する。
【００６４】
以下の実施例で考察されるデータを得るための実験を以下のように実施した。まず、SU-8およびマスクを用いるソフトリソグラフィーを使用して、マイクロ流体チャネルおよび粒子クラスタ捕捉ゾーンの設計をシリコンマスタ中にエッチングすることにより、マイクロ流体チャネルおよび粒子クラスタ捕捉ゾーンの型を作製した。次いで、非硬化PDMSを型に注加し、65℃で約8時間、硬化させた。次いで、チャネルの輪郭を含むPDMSをガラス基体に接着した。基体への接着の前に、装置ごとにPDMSをO2プラズマで処理した。カバーガラスをPDMS層の表面に接着した。カバー層は、入口マイクロ流体チャネルおよび出口マイクロ流体チャネルにそれぞれ流体結合されることができる開口部を含むものであった。次いで、入口および出口管をカバー層中の開口部に結合した。
【００６５】
二つのタイプの実験：装置性能を特性決定するための細胞スパイク実験および患者試料中のCTCクラスタの識別を実施した。細胞スパイク実験においては、癌細胞株、たとえばLNCaP、H1650、MDA-MB-213細胞株を使用して人造細胞クラスタを創製した。これらの人造クラスタを細胞トラッカ蛍光プローブで染色し、健康なドナーから得られた全血中にスパイクした。次いでスパイクした血液を、チップを使用して処理した。正確な流量制御を要する実験においては（たとえば、CTCクラスタ捕捉率に対する流量の影響を決定するために）、体積流量を正確に制御することができるシリンジポンプを使用した。他の細胞スパイク実験においては、流量制御が重要ではない定圧供給源を使用した。スパイクした血液を処理したのち、チップをリン酸緩衝液2.5ml/hrで1時間洗浄した。次いで、蛍光顕微鏡を使用して細胞の画像化およびカウントを実施してチップを特性決定した。
【００６６】
患者試料からのCTCクラスタを識別する実験においては、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）抗凝血性チューブを使用して患者から血液を捕集した。これらの実験の場合、定圧供給源を使用し、0.43psiに設定した。この圧力は、約2.5ml/hrの体積流量を与えたが、血液ヘマトクリット／粘度とともに変化した。血液沈降および凝固を防ぐため、血液試料を絶えず振とうした。マイクロ流体チップを使用して血液を処理したのち、リン酸緩衝液2.5ml/hrで1時間洗浄した。免疫染色を実施するために、細胞を、まず4％パラホルムアルデヒド（PFA）中に固定し、次いで、カクテル抗体染色を使用して核、白血球およびCTCに関して染色した。次いで、蛍光顕微鏡を使用して、染色されたCTCクラスタを画像化した。細胞をチップから解放するときには、入口管と出口管とを交換することにより、溶液流を逆転させた。解放実験の場合、CTCクラスタ解放プロセスの効率を高めるために、装置を熱電冷却器上で作動させた。解放実験のいくつかにおいては、細胞を解放する前に、CTCクラスタを容易に識別することができるよう、チップ上の表面腫瘍マーカに関して細胞を染色した。
【００６７】
実施例1―クラスタ捕捉率
図8は、粒子クラスタ捕捉ゾーンを含むマイクロ流体装置を血液試料が様々な全流量で通過するときの血液試料からのCTCクラスタの捕捉率を示すプロットである。図8に示すように、装置を通過する流体試料の全流量を増すと、特に小さめのクラスタ（すなわち少なめの細胞を含むクラスタ）の場合、装置による細胞クラスタの捕捉効率は低下した。この理由は、大きな流量では、クラスタが受ける剪断力がはるかに大きく、小さめのクラスタは、機械的力によって均衡されることなく、粒子クラスタ捕捉ゾーン中の開口部に「押し」通されるからである。図8のプロットに示すように、高い捕捉効率を達成するためには、低めの全流量がより適している。特に、粒子クラスタが細胞5個以上を有する場合、2.5ml/hrの低さの流量が、そのような粒子クラスタの100％を捕捉するのに適している。
【００６８】
実施例2―クラスタ検出技術の比較
図9は、粒子クラスタ捕捉ゾーンを含むマイクロ流体装置を使用して、血液中にCTCクラスタを有することが見いだされた患者の割合を示すプロットである。転移性癌を有する患者および転移性癌を有しない患者から血液試料を採取した。CTCクラスタを、免疫染色によって識別し、蛍光顕微鏡法を使用して、手作業でまたは自動走査システムを用いるのいずれかでカウントした。これらの結果から見てとれるように、本明細書に記載されるマイクロ流体装置は、流体試料から細胞クラスタを識別するのに有用である。
【００６９】
実施例3―CTCクラスタ解放
図10は、緩衝液をマイクロ流体装置に通して逆方向に流す「解放」ステージののち、マイクロ流体装置の粒子クラスタ捕捉ゾーンからのCTCクラスタの解放率を示すプロットである。実験は、室温（約20〜23℃）のマイクロ流体装置および4℃まで冷却したマイクロ流体装置を用いて実施した。図10に示すように、室温では、緩衝液の逆流量が250ml/hrに達したときのみ、トラップされたクラスタの解放率が40％近くに達した。他方、装置を冷却したとき、解放率の有意な増加が見られ、緩衝液を250ml/hrで装置中に流したとき、80％までの解放率が示された。したがって、装置の冷却は、細胞結合を減らすのに有用な技術であるといえる。
【００７０】
図11は、緩衝液を室温の装置中に流した解放ステージおよび緩衝液を4℃の装置中に流した解放ステージの後の粒子クラスタ捕捉ゾーンを示す模式図である。室温プロセスに対応する模式図に示されるように、マイクロ流体装置の表面への非特異的結合のせいで多数のCTCクラスタが付着したまま残った。対照的に、冷却プロセスに対応する模式図は、装置に結合したままの細胞クラスタを非常に少ししか示さない。顕微鏡写真の右側のプロットは、装置を室温および4℃で作動させることから得られた相対産物純度を示す。プロットから見てとれるように、装置を4℃まで冷却すると、捕捉された細胞クラスタの純度を有意に改善することができる。
【００７１】
実施例4―細胞生存率
図12は、粒子クラスタ捕捉ゾーンを有するマイクロ流体装置を用いて処理された細胞（「解放後」）およびマイクロ流体装置中で処理されなかった細胞（「スパイク前」）の場合の細胞生存率を示すプロットである。細胞生存率は、Life TechnologiesのLIVE/DEAD（登録商標）細胞生存率アッセイを使用して測定した。このプロットから見てとれるように、装置に通した後でも、装置に導入しなかった場合と同じ数の細胞が生存していた。
【００７２】
他の態様
本発明をその詳細な説明に関連して説明したが、前記詳細な説明は、実例を示すことを意図したものであり、特許請求の範囲によって決定される発明の範囲を限定することを意図したものではないことが理解されよう。他の局面、利点および変形が以下の特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
2019211483.tif 000003
【図１Ｂ】
2019211483.tif 000004
【図１Ｃ】
2019211483.tif 000005
【図１Ｄ】
2019211483.tif 000006
【図２】
2019211483.tif 000007
【図３】
2019211483.tif 000008
【図４】
2019211483.tif 000009
【図５】
2019211483.tif 000010
【図６】
2019211483.tif 000011
【図７】
2019211483.tif 000012
【図８】
2019211483.tif 000013
【図９】
2019211483.tif 000014
【図１０】
2019211483.tif 000015
【図１１】
2019211483.tif 000016
【図１２】
2019211483.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月29日(2019.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
入口および出口を画定する基体；
複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを形成するように該基体上で該入口と該出口との間に配置された構造体のセットであって、
各粒子クラスタ捕捉ゾーンが該構造体のサブセットを含み、該サブセットが、該粒子クラスタ捕捉ゾーン中の該構造体の一つである分割障壁および該分割障壁の各側に配置された該サブセットの少なくとも二つの他の構造体によって二つの出力流路へと分割される入力流路を画定するように配置されており、
該構造体のサブセットが、第一のタイプの粒子1個の通過を許して該第一のタイプの粒子2個以上のクラスタの通過を阻止するのに十分な大きさの断面を各出力流路が有するようにさらに配置され、かつ
該クラスタが該入力流路に沿って移動するとき、該クラスタは、該分割障壁に到達し、剪断流力と、該サブセットの該少なくとも二つの他の構造体から生じる摩擦力と、該分割障壁からの反力との間の均衡によってトラップされる、
前記構造体のセット；ならびに
該入口から該粒子クラスタ捕捉ゾーンの該入力流路へとおよび該粒子クラスタ捕捉ゾーンの該出力流路から該出口へと流体を導くように該基体上に画定された複数のマイクロ流体チャネル
を含む、マイクロ流体装置。
【請求項２】
構造体が二列以上で配置され、各列の構造体が隣接列の構造体から横方向にオフセットされて複数の粒子クラスタ捕捉ゾーンを形成している、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項３】
構造体のサブセットが、二列で配置された三つの三角柱構造体を含み、第一および第二の三角柱構造体が、それらの間に入力流路を画定するように該第一の三角柱構造体の一角が該第二の三角柱構造体の一角に隣接する状態で第一列に配置され、かつ第三の三角柱構造体が、該第一列に位置する第一および第二の三角柱構造体の隣接する角と角との間に第三の三角柱構造体の鋭い縁が配置されるように該第一列の該第一および第二の三角柱構造体からオフセットされた状態で第二列に配置され、分割障壁が、該第三の三角柱構造体の該鋭い縁である、請求項2記載のマイクロ流体装置。
【請求項４】
第一のタイプの粒子が細胞であり、第三の三角柱構造体の鋭い縁が、第一および第二の三角柱構造体の隣接する角と角との概ね中間にあり、該第一および第二の三角柱構造体の隣接する角それぞれと該第三の三角柱構造体の該鋭い縁との間の距離が少なくとも10ミクロンである、請求項3記載のマイクロ流体装置。
【請求項５】
分割障壁が約10ミクロン未満のコーナー半径を有する、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項６】
分割障壁を形成する構造体の壁が90°以下の角度で突き合う、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項７】
全構造体が同じ断面形状を有する、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項８】
構造体のセットにおける複数の構造体が二つ以上の異なる断面形状を含む、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項９】
構造体の一つまたは複数が、三角形、菱形または円形からなる群から選択される断面形状を有する、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項１０】
各構造体が少なくとも10ミクロンの高さを有する、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項１１】
基体に結合された冷却装置をさらに含み、該冷却装置が、前記マイクロ流体装置を約0〜15℃の温度まで冷却するように構成されている、請求項1記載のマイクロ流体装置。
【請求項１２】
粒子クラスタ中の粒子が、細胞または細胞に結合したビーズを含む、請求項1記載のマイクロ流体装置。