(57)【要約】      （修正有）【課題】加熱処理等により損傷した虫由来ＤＮＡを、核酸増幅反応により増幅させ検出するための手段を提供する。【解決手段】虫に由来するＤＮＡを増幅するためのプライマーセットであって、特定の配列からなる塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むプライマーと特定の配列からなる塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むプライマーとのプライマー対Ａと、特定の配列からなる塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むプライマーと特定の配列からなる塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むプライマーとのプライマー対Ｂと、特定の配列からなる塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むプライマーと特定の配列からなる塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むプライマーとのプライマー対Ｃと、のうち１つ以上を含むプライマーセット。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
虫に由来するＤＮＡの断片を増幅するためのプライマーセットであって、
配列番号１の塩基配列
ＧＧＴＣＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＧ
のうち３’末端から１０塩基以上の連続した塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含む第１ポリヌクレオチドを含む第１プライマーと、
配列番号２の塩基配列
ＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣＡＴＧ
のうち３’末端から１０塩基以上の連続した塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含む第２プライマーと
を含むプライマー対Ａ、
配列番号３の塩基配列
ＧＣＣＡＧＴＴＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣ
のうち３’末端から１０塩基以上の連続した塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含む第３ポリヌクレオチドを含む第３プライマーと、
配列番号４の塩基配列
ＴＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡ
のうち３’末端から１０塩基以上の連続した塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含む第４ポリヌクレオチドを含む第４プライマーと
を含むプライマー対Ｂ、及び、
配列番号５の塩基配列
ＡＴＴＡＣＧＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＹ
（ＹはＣ又はＴ或いはＣ及びＴの混合塩基である）
のうち３’末端から１０塩基以上の連続した塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含む第５ポリヌクレオチドを含む第５プライマーと、
配列番号６の塩基配列
ＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＹ
（ＹはＣ又はＴ或いはＣ及びＴの混合塩基である）
のうち３’末端から１０塩基以上の連続した塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含む第６ポリヌクレオチドを含む第６プライマーと
を含むプライマー対Ｃ
のうち１つ以上を含むプライマーセット。
【請求項２】
前記プライマー対Ａ、前記プライマー対Ｂ、及び、前記プライマー対Ｃのうち２つ以上を含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記プライマー対Ａ、前記プライマー対Ｂ、及び、前記プライマー対Ｃを含む、請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
虫に由来するＤＮＡを鋳型とし、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプライマーセットに含まれるプライマー対を用いて核酸増幅反応を行う工程１と、
工程１での核酸増幅反応の増幅産物の塩基配列を解析する工程２と
を含むことを特徴とする、虫の種類を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品等に異物として含まれ得る虫に由来するＤＮＡの断片を増幅するためのプライマーセット、及び、それを用いた虫の種類を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
万一食品に虫異物が混入した場合には、原因究明と再発防止が欠かせない。食品に混入した虫異物への対応は、迅速さと正確さが重要である。従来は、熟練者が顕微鏡等で形態観察することで迅速な同定を行い、必要に応じてＤＮＡ配列解析による同定結果の検証やさらに細かな種等の同定を行なってきた。
【０００３】
しかしながら、形態観察による虫種の同定では、熟練技術が必要、外国の珍しい虫への対応が難しい、加工等により原形をとどめない虫への対応が難しいといった欠点がある。
【０００４】
一方、ＤＮＡ配列解析による虫種の同定では、虫異物由来ＤＮＡ分子のうち、虫種を識別可能な塩基配列情報を取得し、データベースと配列を比較することで虫種を識別することができ、形態観察の様な熟練度を必要とすることなく、正確かつ細かな同定が可能である。そのため、近年、虫種を識別する目的で、ＤＮＡの塩基配列情報を客観的な指標とする同定方法が提案されている。
【０００５】
例えば、非特許文献１（動物ＤＮＡバーコーディング法：Ｈｅｂｅｒｔ  ２００３）の方法は、動物の遺伝子の各分類レベル間での差異が多く見出される領域を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、得られた目的の断片長の増幅断片（標的増幅産物）の塩基配列情報を取得しデータベースと比較すること（塩基配列解析）によって動物種を同定する方法である。この方法が標的とする塩基配列であるシトクロムｃオキシダーゼ  サブユニットＩ（ＣＯＩ）コード遺伝子領域の前半部分は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースが特に充実している。既存の虫種の同定法は、多くがこの方法を用いている。
【０００６】
また、非特許文献２（Ｓｈｏｋｒａｌｌａ  ２０１５）に示されたプライマー対（フォワードプライマー：Ｂ＿Ｆ、リバースプライマー：ＨＣ０２１９８）は非特許文献１よりも多くの虫種を同定可能と考えられる。
【０００７】
また、非特許文献３（Ｈａｊｉｂａｂａｅｉ  ２０１１）、非特許文献４（Ｈａｊｉｂａｂａｅｉ  ２０１２）、非特許文献５（Ｃｌａｒｋｅ  ２０１４）に示されたプライマー対（フォワードプライマー−リバースプライマーの組み合わせはそれぞれＬｅｐＦ１−ＥＰＴ‐ｌｏｎｇ‐ｕｎｉｖＲ、ＢＥ  Ｆｏｒｗａｒｄ−ＢＥ  Ｒｅｖｅｒｓｅ、ｌｎｓ１６Ｓ＿１Ｆ−ｌｎｓ１６Ｓ＿１ｓｈｏｒｔＲ）は増幅断片長がそれぞれ約１８０、３５０、２００塩基と短いため、ＤＮＡの損傷に対応することが可能である。
【０００８】
その他、同様の技術を用いた特許文献には、特許文献１〜３がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−１９４６１２号公報
【特許文献２】特開２００８−９９６４４号公報
【特許文献３】特開２００３−２６５１８１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 270, 313-321. (2003)
【非特許文献２】Scientific Reports 5, Article number: 9687 (2015)
【非特許文献３】PLoS ONE 6, e17497. (2011)
【非特許文献４】BMC Ecology 12:28. (2012)
【非特許文献５】Molecular Ecology Resources 14, 1160-1170. (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、上記先行技術文献に記載の方法は以下の課題があることを見出した。
【００１２】
非特許文献１に記載のＤＮＡバーコーディング法は、ＰＣＲによる標的増幅産物の断片長が約６５０塩基と長いため、加熱等による虫異物由来ＤＮＡの損傷に対応することが困難である。また、食品等に混入しうる虫を同定しようとした場合、一部の虫種を増幅できない問題がある。
【００１３】
非特許文献２に記載の方法もまた、標的増幅産物の断片長が約４６０塩基と長いため、同様に加熱等による虫異物由来ＤＮＡの損傷に対応することが困難である。また、調査対象は環境中の虫であり、食品等に混入しうる虫にまで適用できるかはわかっていない。
【００１４】
非特許文献３、４及び５に記載の方法は、調査対象とするのが環境中の虫であり、食品等に混入しうる虫にまで適用できるかは不明である。
【００１５】
特許文献１〜３に記載の方法もまた、標的増幅産物の断片長が３００塩基より長いため、同様に加熱等による虫異物由来ＤＮＡの損傷に対応することが困難である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、ＣＯＩコード遺伝子領域上にあるＤＮＡバーコーディング法に用いられる塩基配列、及び１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ）コード遺伝子領域の塩基配列中に、食品等に混入し得る虫に共通する塩基配列を見出して、標的増幅産物の断片長が１００−２００塩基以下となるように虫種同定用プライマー対をそれぞれ設計した。具体的には、虫のＣＯＩコード遺伝子領域上の、長さ１８０ｂｐの領域を増幅するプライマー対Ａと、虫のＣＯＩコード遺伝子領域上の、長さ１３５ｂｐの領域を増幅するプライマー対Ｂと、虫の１６Ｓコード遺伝子領域上の、長さ２００ｂｐの領域を増幅するプライマー対Ｃとを設計した。
【００１７】
これらプライマー対を用いて虫由来ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、得られた増幅断片の塩基配列解析することによって、多くの虫種を同定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）虫に由来するＤＮＡの断片を増幅するためのプライマーセットであって、
配列番号１の塩基配列
ＧＧＴＣＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＧ
のうち３’末端から１０塩基以上の連続した塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含む第１ポリヌクレオチドを含む第１プライマーと、
配列番号２の塩基配列
ＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣＡＴＧ
のうち３’末端から１０塩基以上の連続した塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含む第２プライマーと
を含むプライマー対Ａ、
配列番号３の塩基配列
ＧＣＣＡＧＴＴＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣ
のうち３’末端から１０塩基以上の連続した塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含む第３ポリヌクレオチドを含む第３プライマーと、
配列番号４の塩基配列
ＴＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡ
のうち３’末端から１０塩基以上の連続した塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含む第４ポリヌクレオチドを含む第４プライマーと
を含むプライマー対Ｂ、及び、
配列番号５の塩基配列
ＡＴＴＡＣＧＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＹ
（ＹはＣ又はＴ或いはＣ及びＴの混合塩基である）
のうち３’末端から１０塩基以上の連続した塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含む第５ポリヌクレオチドを含む第５プライマーと、
配列番号６の塩基配列
ＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＹ
（ＹはＣ又はＴ或いはＣ及びＴの混合塩基である）
のうち３’末端から１０塩基以上の連続した塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含む第６ポリヌクレオチドを含む第６プライマーと
を含むプライマー対Ｃ
のうち１つ以上を含むプライマーセット。
（２）前記プライマー対Ａ、前記プライマー対Ｂ、及び、前記プライマー対Ｃのうち２つ以上を含む、（１）のプライマーセット。
（３）前記プライマー対Ａ、前記プライマー対Ｂ、及び、前記プライマー対Ｃを含む、（２）のプライマーセット。
（４）虫に由来するＤＮＡを鋳型とし、（１）〜（３）のいずれかのプライマーセットに含まれるプライマー対を用いて核酸増幅反応を行う工程１と、
工程１での核酸増幅反応の増幅産物の塩基配列を解析する工程２と
を含むことを特徴とする、虫の種類を同定する方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のプライマーセットは、飲食品に混入した虫異物等の、加熱処理を受けた虫に由来するＤＮＡ中の標的領域の増幅に有用である。
【００２０】
本発明の、虫の種類を同定する方法は、加熱処理を受けた虫の種類の同定に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】非特許文献２−５のプライマー対及び本発明のプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃを用い各虫のＤＮＡ試料を鋳型としたＰＣＲによる標的増幅産物の確認結果を示す。
【図２】非特許文献２、４のプライマー対及び本発明のプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃを用い、異なる条件で加熱を受けたＤＮＡ試料を鋳型としたＰＣＲによる標的増幅産物の確認結果を示す。
【図３】プライマー対Ｄを用い各虫のＤＮＡ試料を鋳型としたＰＣＲによる標的増幅産物の確認結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
＜１．用語＞
本発明において「虫」とは、節足動物門のうち陸上で生息するものを指す。昆虫に加え、ムカデ等の多足類、クモ類を含む。本発明における「虫」は、特に、飲食品や他の製品に異物として混入する可能性のある虫であり、ハエ目、チャタテムシ目、ゴキブリ目、甲虫目、カメムシ目、アザミウマ目、チョウ目、クモ目及びオオムカデ目から選択される目に属する１種以上の虫である。
【００２３】
本発明において「虫に由来するＤＮＡ」とは、虫体又は虫体の部分に由来するＤＮＡである。ここで「虫体又は虫体の部分」とは、典型的には、飲食品や他の製品に異物として混入した虫の虫体又は虫体の部分が例示できる。「虫体又は虫体の部分」は、変形しているために形態観察では同定できない虫体又は虫体の部分や、加熱等の加工処理された飲食品や他の製品中の虫体又は虫体の部分であってもよい。
【００２４】
「動物ＤＮＡバーコーディング領域」とは、非特許文献１のプライマー対が標的とする塩基配列であり、ＣＯＩコード遺伝子領域の前半部分に存在する。
【００２５】
「塩基配列データベース」とは、主に、様々な生物の塩基配列データを蓄積・提供している公共の又は商用の塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）を指すが、様々な虫由来ＤＮＡをそれぞれ決定して得た塩基配列データを独自に集積したデータベースでもよい。
【００２６】
本発明において「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を指し、典型的にはＤＮＡを指す。ＲＮＡにおいては、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）と読み替えることができる。ＤＮＡとしては、任意の位置のＴをＵに置換して合成したＵを含むＤＮＡも使用することができる。ポリヌクレオチドはイノシン（Ｉ）等の修飾ヌクレオチドを一部に含んでいてもよい。
【００２７】
ポリヌクレオチドは一本鎖として存在していてもよいし、二本鎖として存在していてもよい。ポリヌクレオチドが二本鎖として存在する場合は、少なくとも一方の鎖が、以下に規定する所定の特徴を備えるポリヌクレオチドであればよい。
【００２８】
ポリヌクレオチドの製造方法は特に限定されず、ポリヌクレオチド合成装置を利用して製造することができる。
【００２９】
本発明において「塩基配列Ｘと相同な塩基配列Ｙ」、或いは、「塩基配列Ｘと塩基配列Ｙとが相同である」、というとき、塩基配列Ｘの相補配列からなるＤＮＡ鎖と、塩基配列ＹからなるＤＮＡ鎖とが、核酸増幅反応のアニーリング条件においてハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するのに十分な水素結合を形成することができる組み合わせを指し、塩基配列ＸとＹとが部分的に異なっていてもよい。例えば、塩基配列Ｘの相補配列からなるポリヌクレオチドと、塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドとが、１０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、２０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、又は３０ヌクレオチド中に１ミスマッチ等、いくつかのミスマッチが存在していてもよい。典型的には、塩基配列Ｘと「相同な」塩基配列Ｙというとき、塩基配列ＸとＹとが以下の関係のいずれかを満たすことを指す。
【００３０】
（Ａ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘにおいて１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及
び／又は挿入された塩基配列である。
（Ｂ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘと７０％以上の同一性を有する塩基配列である。
（Ｃ）塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドが、配列番号Ｘと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができる。
（Ｄ）塩基配列Ｘと塩基配列Ｙの一方における任意の位置のチミン（Ｔ）が、他方におけるウラシル（Ｕ）に置換されている。
【００３１】
前記（Ａ）において「１若しくは数個」とは好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個又は２個を指し、最も好ましくは１個である。
【００３２】
前記（Ｂ）において、同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳＩＳ、及びＢＬＡＳＴ）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアラインメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２，１９７７及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，１９９０を参照されたい。
【００３３】
前記（Ｂ）において、同一性はより好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性である。
【００３４】
前記（Ｃ）において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばＧｒｅｅｎ
ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，４ｔｈ  Ｅｄ（２０１２），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション工程では、ナトリウム濃度が２５〜５００ｍＭ、好ましくは２５〜３００ｍＭであり、温度が４０〜６８℃、好ましくは４０〜６５℃である。より具体的には、ハイブリダイゼーションは、１〜７×ＳＳＣ、０．０２〜３％  ＳＤＳ、温度４０℃〜６０℃で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行なっても良く、洗浄工程は、例えば０．１〜２×ＳＳＣ、０．１〜０．３％  ＳＤＳ、温度５０〜６５℃で行うことができる。
【００３５】
＜２．プライマーセット＞
本発明のプライマーセットは、虫に由来するＤＮＡの断片を増幅するためのプライマーセットであって、プライマー対Ａ、プライマー対Ｂ及びプライマー対Ｃのうち１つ以上、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つを含む。
【００３６】
まずプライマー対Ａについて説明する。
プライマー対Ａは、
配列番号１の塩基配列のうち３’末端から１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の連続した塩基配列（塩基配列１’とする）と同一又は相同な
塩基配列（塩基配列１’’とする）を３’末端に含む第１ポリヌクレオチドを含む第１プライマーと、
配列番号２の塩基配列のうち３’末端から１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の連続した塩基配列（塩基配列２’とする）と同一又は相同な塩基配列（塩基配列２’’とする）を３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含む第２プライマーと
を含む。
【００３７】
第１プライマーについて説明する。
塩基配列１’と塩基配列１’’とは、好ましくは３’末端から３塩基までの領域、より好ましくは３’末端から５塩基までの領域、より好ましくは３’末端から８塩基までの領域、より好ましくは３’末端から１０塩基までの領域（塩基配列１’の長さが１５塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から１５塩基までの領域、塩基配列１’の長さが２０塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から２０塩基までの領域）が同一であり、残りの５’末端側の領域が相同である。「相同」の意味は既述の通りである。塩基配列１’は、特に好ましくは、配列番号１の塩基配列の全体である。第１ポリヌクレオチドが、塩基配列１’’を「３’末端に含む」とは、第１ポリヌクレオチドの塩基配列の全体が塩基配列１’’のみからなる場合と、塩基配列１’’と塩基配列１’’の５’末端に接続された別の塩基配列とを含む場合の両方を包含する。前記別の塩基配列は、核酸増幅反応を実質的に阻害しないものであればよく、その塩基数としては例えば２０塩基以下、好ましくは１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは１又は２塩基である。第１ポリヌクレオチドは、特に好ましくは、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００３８】
第１プライマーは第１ポリヌクレオチドからなるものであってもよいし、第１ポリヌクレオチドに、増幅産物の検出のための標識用タグ、標識物質、固定化用タグ等の有用な化学構造が付加されたものであってもよい。
【００３９】
第２プライマーについて説明する。
塩基配列２’と塩基配列２’’とは、好ましくは３’末端から３塩基までの領域、より好ましくは３’末端から５塩基までの領域、より好ましくは３’末端から８塩基までの領域、より好ましくは３’末端から１０塩基までの領域（塩基配列２’の長さが１５塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から１５塩基までの領域、塩基配列２’の長さが２０塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から２０塩基までの領域）が同一であり、残りの５’末端側の領域が相同である。「相同」の意味は既述の通りである。塩基配列２’は、特に好ましくは、配列番号２の塩基配列の全体である。第２ポリヌクレオチドが、塩基配列２’’を「３’末端に含む」とは、第２ポリヌクレオチドの塩基配列の全体が塩基配列２’’のみからなる場合と、塩基配列２’’と塩基配列２’’の５’末端に接続された別の塩基配列とを含む場合の両方を包含する。前記別の塩基配列は、核酸増幅反応を実質的に阻害しないものであればよく、その塩基数としては例えば２０塩基以下、好ましくは１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは１又は２塩基である。第２ポリヌクレオチドは、特に好ましくは、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４０】
第２プライマーは第２ポリヌクレオチドからなるものであってもよいし、第２ポリヌクレオチドに、増幅産物の検出のための標識用タグ、標識物質、固定化用タグ等の有用な化学構造が付加されたものであってもよい。
【００４１】
第１プライマーと第２プライマーとを含むプライマー対Ａは、虫のミトコンドリアゲノム上にあるＣＯＩコード遺伝子領域における、虫に特異的な塩基配列（非保存領域）を増
幅でき、且つ、虫種に共通するプライマー設計の可能な領域（保存領域）にアニーリングできるように設計された。プライマー対Ａを用い、虫由来ＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応により増幅される核酸断片の長さは主に１８０ｂｐであり、加えてプライマーに挟まれた配列の挿入・欠失や、プライマーの５’末端に接続された塩基配列の長さによる変動がある。プライマー対Ａによる増幅領域は、加工等によりＤＮＡが損傷を受けていても標的増幅産物が得られ易く、且つ、虫種を識別可能なレベルの非保存領域の長さを有する。また、プライマー対Ａによる増幅領域は、多くの虫種で塩基配列データベースが充実しているため、塩基配列に基づく虫異物の虫種同定を行うのに適している。
【００４２】
次に、プライマー対Ｂについて説明する。
プライマー対Ｂは、
配列番号３の塩基配列のうち３’末端から１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の連続した塩基配列（塩基配列３’とする）と同一又は相同な塩基配列（塩基配列３’’とする）を３’末端に含む第３ポリヌクレオチドを含む第３プライマーと、
配列番号４の塩基配列のうち３’末端から１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の連続した塩基配列（塩基配列４’とする）と同一又は相同な塩基配列（塩基配列４’’とする）を３’末端に含む第４ポリヌクレオチドを含む第４プライマーと
を含む。
【００４３】
第３プライマーについて説明する。
塩基配列３’と塩基配列３’’とは、好ましくは３’末端から３塩基までの領域、より好ましくは３’末端から５塩基までの領域、より好ましくは３’末端から８塩基までの領域、より好ましくは３’末端から１０塩基までの領域（塩基配列３’の長さが１５塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から１５塩基までの領域、塩基配列３’の長さが２０塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から２０塩基までの領域）が同一であり、残りの５’末端側の領域が相同である。「相同」の意味は既述の通りである。塩基配列３’は、特に好ましくは、配列番号３の塩基配列の全体である。第３ポリヌクレオチドが、塩基配列３’’を「３’末端に含む」とは、第３ポリヌクレオチドの塩基配列の全体が塩基配列３’’のみからなる場合と、塩基配列３’’と塩基配列３’’の５’末端に接続された別の塩基配列とを含む場合の両方を包含する。前記別の塩基配列は、核酸増幅反応を実質的に阻害しないものであればよく、その塩基数としては例えば２０塩基以下、好ましくは１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは１又は２塩基である。第３ポリヌクレオチドは、特に好ましくは、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４４】
第３プライマーは第３ポリヌクレオチドからなるものであってもよいし、第３ポリヌクレオチドに、増幅産物の検出のための標識用タグ、標識物質、固定化用タグ等の有用な化学構造が付加されたものであってもよい。
【００４５】
第４プライマーについて説明する。
塩基配列４’と塩基配列４’’とは、好ましくは３’末端から３塩基までの領域、より好ましくは３’末端から５塩基までの領域、より好ましくは３’末端から８塩基までの領域、より好ましくは３’末端から１０塩基までの領域（塩基配列４’の長さが１５塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から１５塩基までの領域、塩基配列４’の長さが２０塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から２０塩基までの領域）が同一であり、残りの５’末端側の領域が相同である。「相同」の意味は既述の通りである。塩基配列４’は、特に好ましくは、配列番号４の塩基配列の全体である。第４ポリヌクレオチドが、塩基配列４’’を「３’末端に含む」とは、第４ポリヌクレオチドの塩基配列の全体
が塩基配列４’’のみからなる場合と、塩基配列４’’と塩基配列４’’の５’末端に接続された別の塩基配列とを含む場合の両方を包含する。前記別の塩基配列は、核酸増幅反応を実質的に阻害しないものであればよく、その塩基数としては例えば２０塩基以下、好ましくは１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは１又は２塩基である。第４ポリヌクレオチドは、特に好ましくは、配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４６】
第４プライマーは第４ポリヌクレオチドからなるものであってもよいし、第４ポリヌクレオチドに、増幅産物の検出のための標識用タグ、標識物質、固定化用タグ等の有用な化学構造が付加されたものであってもよい。
【００４７】
第３プライマーと第４プライマーとを含むプライマー対Ｂは、虫のミトコンドリアゲノム上にあるＣＯＩコード遺伝子領域における、虫に特異的な塩基配列（非保存領域）を増幅でき、且つ、虫種に共通するプライマー設計の可能な領域（保存領域）にアニーリングできるように設計された。プライマー対Ｂを用い、虫由来ＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応により増幅される核酸断片の長さは主に１３５ｂｐであり、加えてプライマーに挟まれた配列の挿入・欠失や、プライマーの５’末端に接続された塩基配列の長さによる変動がある。プライマー対Ｂによる増幅領域は、加工等によりＤＮＡが損傷を受けていても標的増幅産物が得られ易く、且つ、虫種を識別可能なレベルの非保存領域の長さを有する。また、プライマー対Ｂによる増幅領域は、多くの虫種で塩基配列データベースが充実しているため、塩基配列に基づく虫異物の虫種同定を行うのに適している。なお、ＣＯＩコード遺伝子の、プライマー対Ｂによる増幅領域は、プライマー対Ａによる増幅領域とは重複しない。
【００４８】
次に、プライマー対Ｃについて説明する。
プライマー対Ｃは、
配列番号５の塩基配列のうち３’末端から１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上の連続した塩基配列（塩基配列５’とする）と同一又は相同な塩基配列（塩基配列５’’とする）を３’末端に含む第５ポリヌクレオチドを含む第５プライマーと、
配列番号６の塩基配列のうち３’末端から１０塩基以上、好ましくは１２塩基以上の連続した塩基配列（塩基配列６’とする）と同一又は相同な塩基配列（塩基配列６’’とする）を３’末端に含む第６ポリヌクレオチドを含む第６プライマーと
を含む。
【００４９】
配列番号５におけるＹはＣ又はＴ或いはＣ及びＴの混合塩基であり、Ｃ及びＴの混合塩基であることが好ましい。ＹがＣ及びＴの混合塩基である場合、第５ポリヌクレオチドは、ＹがＣであるポリヌクレオチド分子と、ＹがＴであるポリヌクレオチド分子との混合物である。
【００５０】
同様に、配列番号６におけるＹはＣ又はＴ或いはＣ及びＴの混合塩基であり、Ｃ及びＴの混合塩基であることが好ましい。ＹがＣ及びＴの混合塩基である場合、第５ポリヌクレオチドは、ＹがＣであるポリヌクレオチド分子と、ＹがＴであるポリヌクレオチド分子との混合物である。
【００５１】
第５プライマーについて説明する。
塩基配列５’と塩基配列５’’とは、好ましくは３’末端から３塩基までの領域、より好ましくは３’末端から５塩基までの領域、より好ましくは３’末端から８塩基までの領域、より好ましくは３’末端から１０塩基までの領域（塩基配列５’の長さが１５塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から１５塩基までの領域）が同一であり、残りの５’末端側の領域が相同である。「相同」の意味は既述の通りである。塩基配列５’は、
特に好ましくは、配列番号５の塩基配列の全体である。第５ポリヌクレオチドが、塩基配列５’’を「３’末端に含む」とは、第５ポリヌクレオチドの塩基配列の全体が塩基配列５’’のみからなる場合と、塩基配列５’’と塩基配列５’’の５’末端に接続された別の塩基配列とを含む場合の両方を包含する。前記別の塩基配列は、核酸増幅反応を実質的に阻害しないものであればよく、その塩基数としては例えば２０塩基以下、好ましくは１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは１又は２塩基である。第５ポリヌクレオチドは、特に好ましくは、配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００５２】
第５プライマーは第５ポリヌクレオチドからなるものであってもよいし、第５ポリヌクレオチドに、増幅産物の検出のための標識用タグ、標識物質、固定化用タグ等の有用な化学構造が付加されたものであってもよい。
【００５３】
第６プライマーについて説明する。
塩基配列６’と塩基配列６’’とは、好ましくは３’末端から３塩基までの領域、より好ましくは３’末端から５塩基までの領域、より好ましくは３’末端から８塩基までの領域、より好ましくは３’末端から１０塩基までの領域（塩基配列６’の長さが１２塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から１２塩基までの領域）が同一であり、残りの５’末端側の領域が相同である。「相同」の意味は既述の通りである。塩基配列６’は、特に好ましくは、配列番号６の塩基配列の全体である。第６ポリヌクレオチドが、塩基配列６’’を「３’末端に含む」とは、第６ポリヌクレオチドの塩基配列の全体が塩基配列６’’のみからなる場合と、塩基配列６’’と塩基配列６’’の５’末端に接続された別の塩基配列とを含む場合の両方を包含する。前記別の塩基配列は、核酸増幅反応を実質的に阻害しないものであればよく、その塩基数としては例えば２０塩基以下、好ましくは１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは１又は２塩基である。第６ポリヌクレオチドは、特に好ましくは、配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００５４】
第６プライマーは第６ポリヌクレオチドからなるものであってもよいし、第６ポリヌクレオチドに、増幅産物の検出のための標識用タグ、標識物質、固定化用タグ等の有用な化学構造が付加されたものであってもよい。
【００５５】
第５プライマーと第６プライマーとを含むプライマー対Ｃは、虫のミトコンドリアゲノム上にある１６Ｓコード遺伝子領域における、虫に特異的な塩基配列（非保存領域）を増幅でき、且つ、虫種に共通するプライマー設計の可能な領域（保存領域）にアニーリングできるように設計された。プライマー対Ｃを用い、虫由来ＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応により増幅される核酸断片の長さは主に２００ｂｐであり、加えてプライマーに挟まれた配列の挿入・欠失や、プライマーの５’末端に接続された塩基配列の長さによる変動がある。プライマー対Ｃによる増幅領域は、加工等によりＤＮＡが損傷を受けていても標的増幅産物が得られ易く、且つ、虫種を識別可能なレベルの非保存領域の長さを有する。また、プライマー対Ｃによる増幅領域は、多くの虫種で塩基配列データベースが充実しているため、塩基配列に基づく虫異物の虫種同定を行うのに適している。
【００５６】
なお、配列番号１〜６の各塩基配列は、検出しようとする多くの虫種においてミスマッチ数が一定以下、好ましくは７塩基以下、より好ましくは５塩基以下となるように設計されている。
【００５７】
上記のプライマー対Ａ、プライマー対Ｂ及びプライマー対Ｃは、それぞれ、虫のミトコンドリアゲノム上にあるＣＯＩコード遺伝子領域又は１６Ｓコード遺伝子領域の所定の領域を核酸増幅反応により増幅できるように論理的に設計したことに加え、プライマーの塩
基配列を工夫した中で最良の形態と判断されたプライマー対について、ＰＣＲ反応条件を鋭意検討し、最終的には実際の性能評価試験を行い、意図した感度と特異性を発揮していることを確認したものである。なお、理論上は首尾よく設計されたプライマー・プローブであっても、必要な感度と特異性を保有し得ない場合があることが周知である。例えば、配列番号４と配列番号７からなるプライマー対Ｄは、研究段階において、ＤＮＡバーコーディング領域内に設計されたプライマー対であるものの、実際に核酸増幅反応を行うと、一部のゴキブリ目の虫で標的増幅産物が得られなかったため、虫種同定用プライマー対としては不適当であった。このように、単に論理的にプライマーを設計すれば必要な特異性を確保できるとは限らない。
【００５８】
本発明のプライマーセットは、上記のプライマー対Ａ、プライマー対Ｂ及びプライマー対Ｃのうち１つ以上、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つを含む。プライマーセットが２つのプライマー対を含む場合、検出しようとする虫由来ＤＮＡにおける増幅領域の１つが加熱処理等の加工により切断されているため核酸断片の増幅ができない場合でも、プライマー対の残る１つによる標的領域の核酸断片の増幅が可能であるため、同定不能となる可能性を低減することができる。プライマーセットが３つのプライマー対を含む場合、検出しようとする虫由来ＤＮＡにおける増幅領域の１つ又は２つが加熱処理等の加工により切断されている場合でも、プライマー対の残る２つ又は１つによる標的領域の核酸断片の増幅が可能であるため、同定不能となる可能性を低減することができる。
【００５９】
＜３．虫の種類を同定する方法＞
本発明の、虫の種類を同定する方法は、
虫に由来するＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットに含まれるプライマー対を用いて核酸増幅反応を行う工程１と、
工程１での核酸増幅反応の増幅産物の塩基配列を解析する工程２と
を含むことを特徴とする。
【００６０】
本発明のこの実施形態では、工程１での核酸増幅反応の増幅産物の塩基配列を工程２において解析し、塩基配列データベースで検索することで、ＤＮＡの起源となった虫の種類を同定する。ここで虫の種類を「同定する」とは、ＤＮＡの起源となった虫がどの生物分類群に属するかを推定することを指す。ここで「生物分類群」とは、一般的な生物分野において生物の分類に使用されている分類群を指し、例えば、目レベル、科レベル、属レベル又は種レベルの生物分類群を指す。
【００６１】
工程１において鋳型として用いるＤＮＡは、調べようとする虫試料から抽出したＤＮＡを用いることができる。使用する虫試料は微量でよく、例えば０．１ｍｇ程度であってもよい。虫試料からのＤＮＡの抽出は、例えばＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた方法等の、既存の方法を適宜使用できる。
【００６２】
工程１における核酸増幅反応は、一般的なＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法に従って行うことができる。ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであればよい。市販のＤＮＡポリメラーゼを利用することが可能である。また、プライマー濃度、サイクル数、温度、時間、緩衝液の組成等は、用いるＤＮＡポリメラーゼや、各プライマーの濃度等に応じて、適宜選択することができる。
【００６３】
プライマーセットがプライマー対Ａ、プライマー対Ｂ及びプライマー対Ｃのうち２種又は３種を含む実施形態では、工程１は、プライマー対毎に行うことができる。
【００６４】
核酸増幅反応では、鋳型ＤＮＡに、使用するプライマー対の標的塩基配列が存在する場合に、標的塩基配列を含む核酸断片が増幅産物として生じる。
【００６５】
工程２において増幅産物の塩基配列は、通常は自動塩基配列決定機（例えばサーモフィッシャーサイエンティフィック社製 310 Genetic Analyzer等）を用いて解析することができる。
【００６６】
工程２で解析により得られた増幅産物の塩基配列からの、ＤＮＡの起源となった虫の種類の同定の方法は特に限定されない。例えば、増幅産物の塩基配列を、塩基配列データベースで検索し、検索の結果最も同一性の高い塩基配列を有する虫種を、ＤＮＡの起源となった虫種であると同定することができる。塩基配列データベースの検索は、例えばｂｌａｓｔｎを用いたＧｅｎＢａｎｋ登録配列検索システム (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch)や、ＢＯＬＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ (http://www.boldsystems.org/index.php/IDS_OpenIdEngine)で行う。或いは、工程２で解析により得られた増幅産物の塩基配列を、既知の虫種の対応する塩基配列と比較し、配列同一性が一定の閾値以上である場合に、ＤＮＡの起源となった虫が、前記既知の虫種であると同定することができる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６８】
実施例１：プライマー設計に用いる配列の入手とプライマー設計
ＣＯＩコード遺伝子領域、１６Ｓコード遺伝子領域のそれぞれについて、各種虫の塩基配列情報を集めて、３種類の虫異物同定用プライマー対を設計した。
【００６９】
＜試料の調製＞
食品に混入しうる異物のモデルサンプルとして、周囲の環境から下記の表１に示す２４試料を入手した。虫の一部０．１ｍｇ−３ｍｇをバイオマッシャーＩＩ（株式会社ニッピ）で粉砕後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液を２０μＬ加え、タッチミキサーで攪拌後、５５℃に調温した恒温水槽で１−３時間加温した。その後はＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）のプロトコルに従ってＤＮＡ抽出を行なった。
【００７０】
＜ＰＣＲ＞
上記２４種の虫ＤＮＡを鋳型として、非特許文献１の動物ＤＮＡバーコーディング法によりＣＯＩコード遺伝子領域の配列情報を得るためのＰＣＲを行なった。プライマー対として、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせを使用した。
【００７１】
反応液組成は、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、４．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、１．０μＭ  フォワードプライマー、１．０μＭ
リバースプライマーで、１．２５Ｕの  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧＯＬＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２μＬの抽出ＤＮＡ溶液を加え、５０μＬの溶液になるように調製した。
【００７２】
ＰＣＲサイクルは、９５℃、１０分間の変性後、９５℃、１分間の変性→４０℃、１分間のアニーリング→７２℃、１分３０秒間のプライマーの伸長反応のサイクルを４０サイクル行い、最後に７２℃、１０分間の伸長反応を行なった。
【００７３】
＜ＰＣＲ増幅産物の有無及び断片長の確認＞
増幅反応後のそれぞれのＰＣＲ反応液の一部を自動電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所社）に供した。増幅されたＤＮＡの断片長を確認し、標的増幅産物が得られたことを確認した。
【００７４】
＜ＰＣＲ増幅産物の塩基配列解析＞
標的増幅産物が得られたＰＣＲ反応液からＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＰＣＲ増幅産物を精製した。塩基配列解析はユーロフィンジェノミクス株式会社に依頼した。それぞれのＰＣＲ増幅産物の塩基配列をダイレクトシーケンス法により決定した。
【００７５】
結果、表１に示すように、２４試料から１７配列を得た。目以上のレベルでは８分類に分けられた。１７種の配列の各々に便宜上「配列ＩＤ」を割り当てた。配列ＩＤが同じである場合、決定された配列が同じであることを示す。
【００７６】
＜ＰＣＲ増幅産物の塩基配列解析＞
上記で決定された塩基配列と同一性が高い塩基配列を、塩基配列データベースを用いて検索した。検索には、ＮＣＢＩのｂｌａｓｔｎ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch）を用いた。表１に、上記で決定された各塩基配列と最も同一性が高い塩基配列のアクセッション番号を示す。
【００７７】
【表１】
2019062815.tif 000003
【００７８】
＜プライマーの設計＞
ＣＯＩコード遺伝子領域上の虫異物同定用プライマーの設計には、上記で得られた配列ＩＤ１〜１７の１７配列を用いた。１６Ｓコード遺伝子領域は、ＧｅｎＢａｎｋから表２に示す、目レベルで異なる１４虫種について入手して用いた。それぞれから保存性の高い領域を選択し、プライマーの位置・塩基配列を調整した。設計したプライマー対をそれぞれＡ、Ｂ、Ｃと名付け、表３に配列を示す。プライマー対Ｃにおいて「Ｙ」はＣ及びＴの混合塩基を示す。すなわち本実施例において、プライマー対Ｃでは、フォワードプライマーを構成する配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド分子は、Ｙ＝Ｃであるポリヌクレオチド分子と、Ｙ＝Ｔであるポリヌクレオチド分子との混合物であり、リバースプライマーを構成する配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチド分子も、Ｙ＝Ｃであるポリヌクレオチド分子と、Ｙ＝Ｔであるポリヌクレオチド分子との混合物である。
【００７９】
プライマー対Ａの配列番号１、プライマー対Ｂの配列番号４は、それぞれ、非特許文献１に記載のＤＮＡバーコーディング法に用いられているフォワードプライマー、リバースプライマーと同一である。
【００８０】
配列番号２は、各虫のＣＯＩコード遺伝子領域上にある、配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列にアニーリングすることができる。配列番号１、配列番号２はそれぞれプライマー対Ａのフォワードプライマー、リバースプライマーとして用いる。
【００８１】
配列番号３は、各虫のＣＯＩコード遺伝子領域上にある、配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列にアニーリングすることができる。配列番号３、配列番号４はそれぞれプライマー対Ｂのフォワードプライマー、リバースプライマーとして用いる。
【００８２】
配列番号５，６は、虫それぞれの１６Ｓコード遺伝子領域上にある、配列番号５，６それぞれの塩基配列に相補的な塩基配列にアニーリングすることができる。配列番号５、配列番号６はそれぞれプライマー対Ｃのフォワードプライマー、リバースプライマーとして用いる。
【００８３】
【表２】
2019062815.tif 000004
【００８４】
【表３】
2019062815.tif 000005
【００８５】
実施例２:異物サンプルの同定
実施例１で設計した３種類のプライマー対Ａ，Ｂ，Ｃと、非特許文献１に記載のプライマー対（配列番号１の塩基配列からなるプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるプ
ライマーとの組み合わせ）について、虫異物同定能を比較した。
【００８６】
＜試料の調製＞
食品に混入しうる異物のモデルサンプルとして、表４に示す、７目３８種の虫試料を住化テクノサービス株式会社から入手した。ＤＮＡ抽出は実施例１と同様に行なった。
【００８７】
＜ＰＣＲ＞
反応液組成はプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃ共通で、１×ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社）、０．５μＭ  フォワードプライマー、０．５μＭ  リバースプライマーで、２μＬの抽出ＤＮＡ溶液を加え、２０μＬの溶液になるように調製した。
【００８８】
ＰＣＲサイクルは、９５℃、１５分間の変性後、９５℃、３０秒間の変性→１分間のアニーリング→７２℃、３０秒間の伸長反応のサイクルを４５サイクル行なった。アニーリング温度は、プライマー対Ａ、Ｂを用いるＰＣＲではともに４０℃、プライマー対Ｃを用いるＰＣＲでは５０℃に設定した。
【００８９】
また、実施例１で作製したプライマー対の比較対象として、非特許文献１の動物ＤＮＡバーコーディング法を行なった。ＰＣＲ条件は、実施例１と同様に行なった。
【００９０】
【表４】
2019062815.tif 000006
【００９１】
＜ＰＣＲ増幅産物の有無及び断片長の確認＞
実施例１と同様に行なった。リンゴコカクモンハマキ、コナガ、チャノコカクモンハマキ、カシノシマメイガでは、プライマー対Ｃを用いるＰＣＲサイクルのアニーリング温度をそれぞれ５８、５８、５８、５４℃に設定して得られたＰＣＲ増幅産物を用いた。
【００９２】
＜ＰＣＲ増幅産物の塩基配列解析＞
ＰＣＲ産物からの塩基配列取得は、実施例１と同様に行なった。
塩基配列データベースでの検索は、まず、ＮＣＢＩのｂｌａｓｔｎ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch）を用いた。配列の一致率が１００％未満だった場合、塩基配列データベースの検索にはＢＯＬＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ (http://www.boldsystems.org/index.php/IDS_OpenIdEngine)も追加した。最も塩基配列の一致率が高かった虫種を、ＤＮＡの起源となった虫種と同定した。
【００９３】
それぞれの試料からそれぞれのプライマー対で得られた標的増幅産物について、塩基配列データベースでの検索によって同定した虫種が入手した虫種の名前と一致した場合、同定結果が合致したと判定した。また、プライマー対Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれ結果のうち、２／３が合致していた場合、Ａ＋Ｂ＋Ｃの同定結果が合致したと判定した。
【００９４】
＜実験結果＞
３８虫種について、標的増幅産物の得られた割合、及び、塩基配列解析し同定結果が試料名と一致した割合を表５に示す。
【００９５】
【表５】
2019062815.tif 000007
【００９６】
プライマー対Ａ、Ｂ、Ｃの各々単独での同定結果が試料名と一致した割合は８７％、９２％、７４％であり、非特許文献１のプライマー対による７１％以下よりも高かった。また、プライマー対Ａ、Ｂ、Ｃを組合せることで、同定結果と試料名の一致率は９２％とさらに高くなった。すなわち、３種類の方法を組み合わせることによって、同定精度が高まることが確認された。
【００９７】
プライマー対Ａ＋Ｂ＋Ｃで同定できなかった３種（ヒラタチャタテ、シラホシカメムシ、バクガ）は、それぞれ同定できなかった原因が異なったものの、いずれもＧｅｎＢａｎｋデータベースが充実すれば同定できる可能性がある。
【００９８】
ヒラタチャタテはプライマー対Ｃでは正しく同定できた。しかし、プライマー対Ａ、Ｂそれぞれを用いた場合、該当する種の配列がＧｅｎＢａｎｋデータベースに存在したにもかかわらず、異種由来配列でより高い一致率の配列が存在した。
【００９９】
シラホシカメムシはプライマー対Ａでは複数の塩基配列が混在して配列を決定できなかった。プライマー対Ｂでは該当する種の配列がＧｅｎＢａｎｋデータベースに存在したにもかかわらず、異種由来配列でより高い一致率の配列が存在した。プライマー対Ｃでは塩基配列が決定できたが、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに、該当する種の配列が存在しなか
った。
【０１００】
バクガはプライマー対Ａで正しく同定できた。しかし、プライマー対Ｂでは該当する種の配列がＧｅｎＢａｎｋデータベースに存在したにも関わらず、異種由来配列でより高い一致率の配列が存在した。プライマー対Ｃでは塩基配列が決定できたが、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに該当する種の配列が存在しなかった。
【０１０１】
これら３種は互いに異なる目だったことから、本発明の方法は、特定の分類の虫での同定に適さないという傾向はない。
【０１０２】
この他、試料名が明確ではない虫試料として、形態観察からクモ及びムカデと推測された試料をそれぞれ入手し、同様の手順で同定を試みた。クモ試料はプライマー対Ｃ、ムカデ試料はプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃを用いた。結果、クモ、ムカデ試料からそれぞれのプライマー対で明瞭な標的増幅産物が一本得られた。各標的増幅産物の塩基配列をｂｌａｓｔｎで検索し、最上位で一致した塩基配列との一致率を確認した結果、クモ試料ではヨーロッパイヅツグモの塩基配列と93%で一致し、ムカデ試料ではトビズムカデの塩基配列と80〜96％で一致した。これらの試料名が明確ではない虫試料については、同定結果の正しさについて検証できないものの、クモ、ムカデも本発明の方法で同定可能であることが確認された。
【０１０３】
実施例３：非特許文献２−５の、様々な虫種に対する増幅の有無の確認
実施例１で設計した３種類のプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃと、非特許文献２、３、４、５に記載のプライマー対について、虫異物同定能を比較した。
【０１０４】
虫ＤＮＡ試料は、実施例２の表４で示した異物のモデルサンプルのうち、表６に示す、目レベルで異なる７試料を用いた。いずれも実施例２において、プライマー対Ａ，Ｂ，Ｃのいずれでも同定結果と試料名が合致した試料である。
【０１０５】
【表６】
2019062815.tif 000008
【０１０６】
非特許文献２、３、４、５に記載のプライマー対の配列は表７の通りである。配列番号８、１０及び１１において「Ｉ」はイノシンを表す。配列番号８、１０、１１及び１２に
おいて、「Ｒ」はＡ及びＧの混合塩基を示し、配列番号８、１０、１１及び１２で示される各プライマーを構成するポリヌクレオチド分子は、各位置のＲについて、Ｒ＝Ａであるポリヌクレオチド分子と、Ｒ＝Ｇであるポリヌクレオチド分子との混合物である。配列番号８及び１０において、「Ｙ」はＣ及びＴの混合塩基を示し、配列番号８及び１０で示される各プライマーを構成するポリヌクレオチド分子は、各位置のＹについて、Ｙ＝Ｃであるポリヌクレオチド分子と、Ｙ＝Ｔであるポリヌクレオチド分子との混合物である。
【０１０７】
【表７】
2019062815.tif 000009
【０１０８】
＜ＰＣＲ＞
非特許文献２，３，４のプライマー対の反応液組成は、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．２μＭ  フォワードプライマー、０．２μＭ  リバースプライマーで、２Ｕ  のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑと２μＬの抽出ＤＮＡ溶液を加え、２５μＬの溶液になるように調製した。
【０１０９】
非特許文献２，３，４のプライマー対のＰＣＲサイクルは、９５℃、５分間の変性後、９４℃、４０秒間の変性→１分間のアニーリング→７２℃、３０秒間のプライマーの伸長反応のサイクルを３５サイクル行い、最後に７２℃、５分間の伸長反応を行なった。アニーリングの温度は、非特許文献２、４はともに４６℃、非特許文献３は４３．５℃に設定した。
【０１１０】
非特許文献５のプライマー対のＰＣＲ反応液は、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  II（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．５μＭ  フォワードプライマー、０．５μＭ  リバースプライマーで、０．５Ｕの  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧＯＬＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１μＬの抽出ＤＮＡ溶液を加え、１０μＬの溶液になるように調製した。
【０１１１】
非特許文献５のプライマー対のＰＣＲサイクルは、９４℃、１０分間の変性後、９４℃、３０秒間の変性→４５℃、３０秒間のアニーリング→７２℃、４５秒間のプライマーの伸長反応のサイクルを３５サイクル行い、最後に７２℃、１０分間の伸長反応を行なった。
【０１１２】
＜実験結果＞
ＰＣＲ増幅産物のゲル電気泳動の結果を図１に示す。７試料のいずれからも標的増幅産物のみが得られたのは、非特許文献２、４のプライマー対を用いたＰＣＲであった。非特許文献３のプライマー対を用いたＰＣＲでは、７試料のうちヒラタチャタテ、アズキゾウムシ、ミカンキイロアザミウマの３試料で標的増幅産物が得られなかった。また、非特許
文献５のプライマー対を用いたＰＣＲでは、ヒラタチャタテで標的増幅産物が得られなかっただけでなく、アズキゾウムシ、クサギカメムシ、ミカンキイロアザミウマ、スジコナマダラメイガで非標的増幅産物が多く得られ、これら５試料はいずれも塩基配列解析しても配列情報が得られない可能性が高いと考えた。一方、プライマー対Ａ、Ｂ、Ｃを用いたＰＣＲでは、唯一ミカンキイロアザミウマの１試料について、プライマー対Ａを用いたＰＣＲで標的増幅産物が得られなかった以外は、いずれも標的増幅産物のみが得られた。
【０１１３】
この結果から、非特許文献３、５のプライマー対は本発明のプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃに比べ、食品から混入しうる虫異物に対応できないと考えられた。
【０１１４】
７試料全てで標的産物の得られた非特許文献２，４のプライマー対については、引き続き加熱可能を受けた異物サンプルの増幅が可能かを確認した。
【０１１５】
実施例４：加熱加工を受けた異物サンプルの増幅確認
実施例１で設計した３種類のプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃと、非特許文献２、４のプライマー対について、加熱加工処理したモデル異物サンプルを用いて虫異物同定能を比較した。
【０１１６】
＜ＤＮＡ試料の作製＞
加熱した虫ＤＮＡ試料としては、１．５ｍＬチューブに３０μＬの実施例３で使用したクサギカメムシＤＮＡ試料を分注し、それぞれ１２１℃で５分間、１０分間、２０分間又は３０分間の加熱を行なった試料を用いた。
【０１１７】
加熱加工を受けた虫異物サンプルとしては、モデルとして作製したレトルト白粥にあらかじめ混入させたクサギカメムシの肢を用いた。具体的には、クサギカメムシの肢１本（３ｍｇ）を白米１５ｇ、水１３５ｇと共にレトルトパウチに封入し、１１８℃、２５分の加熱を行なって作製した。試料は２袋作製した。冷却後、それぞれの試料から肢を取り出して水で洗浄後、実施例２と同様の方法でＤＮＡ抽出を行い、ＤＮＡ試料を得た。
【０１１８】
＜ＰＣＲ＞
本発明のプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃを用い、実施例２の方法でＰＣＲを行なった。
非特許文献２，４のプライマー対を用い、実施例３の方法でＰＣＲを行なった。
【０１１９】
＜実験結果＞
非特許文献２、４のプライマー対、本発明のプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃをそれぞれ用いたＰＣＲによる増幅産物のゲル電気泳動による確認結果を図２に示す。
【０１２０】
非特許文献２のプライマー対を用いたＰＣＲにより標的増幅産物が得られたのは、１２１℃で５分間又は１０分間加熱したＤＮＡ試料を鋳型とした場合のみであった。非特許文献４のプライマー対を用いたＰＣＲにより標的増幅産物が得られたのは、１２１℃で５分間加熱したＤＮＡ試料を鋳型とした場合のみであった。一方、本発明のプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃを用いたＰＣＲでは、いずれのＤＮＡ試料を鋳型とした場合であっても標的増幅産物が得られた。この結果から、本発明のプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃを用いるＰＣＲは、非特許文献２、４のプライマー対を用いるＰＣＲと異なり、加熱処理を受けたＤＮＡでも標的増幅産物を得ることができることが確認された。
【０１２１】
実施例５：プライマー対Ｄの特異性確認
理論上は首尾よく設計されたプライマーであっても、必要な感度と特異性を保有し得ない場合があることを、下記の配列番号４と配列番号７からなるプライマー対Ｄによって示す。
【０１２２】
＜プライマーの設計＞
実施例１で入手した２４種の動物ＤＮＡバーコーディング領域１７配列について、実施例１と同様に調整して得られたプライマー対をＤと名付けた。プライマー対Ｄの各プライマー配列は下記の通りである。
【０１２３】
【表８】
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【０１２４】
＜試料＞
実施例１に記載された、試料１０、１１（いずれもゴキブリ目）、１８（チョウ目）、２４（ハチ目）のＤＮＡ溶液を用いた。
【０１２５】
＜ＰＣＲ＞
反応液組成は実施例２でのプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃを用いるＰＣＲの反応液組成と同様とした。アニーリング及び伸長反応の温度は、４０℃又は４５℃に設定した。
【０１２６】
＜ＰＣＲ増幅産物の有無及び断片長の確認＞
実施例１と同様に行なった。
【０１２７】
＜実験結果＞
結果、図３に示すように、プライマー対Ｄを用いるＰＣＲでは、チョウ目の試料１８、ハチ目の試料２４のＤＮＡを鋳型とした場合に標的増幅産物が得られたものの、ゴキブリ目の試料のうち試料１０のＤＮＡを鋳型とした場合には標的増幅産物が得られなかった。ゴキブリ目の２つの試料１０、１１は、動物ＤＮＡバーコーディング領域の配列が同一であるにもかかわらず、片方で結果が得られなかったことから、プライマー対Ｄは安定した結果が得られないと判断した。
【０１２８】
本発明のプライマー対Ａ、Ｂ、Ｃはいずれも論理的設計だけでなく、更なる工夫を施した上で、意図した標的増幅産物が得られることを確認したものである。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明は、飲食品及び他の製品に混入した虫異物の虫種を同定するために利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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