(57)【要約】【課題】失禁関連皮膚炎抑制剤を探索するのに有効なスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】下記の工程を有することを特徴とする、失禁関連皮膚炎を抑制する薬剤のスクリーニング方法である。（ａ）プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の細菌を含む培地に、候補の薬剤を添加する工程、（ｂ）添加した薬剤の存在下で、前記細菌を培養する工程、（ｃ）所定時間経過後にアンモニア濃度を測定する工程、（ｄ）添加する候補の薬剤を変更して、前記（ａ）〜前記（ｃ）の工程を繰り返す工程、および（ｅ）添加した候補の薬剤ごとのアンモニア濃度の測定値を対比し、前記アンモニア濃度の測定値が低い薬剤を、失禁関連皮膚炎を抑制する薬剤として認定する工程。【選択図】図１
2019062806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を有することを特徴とする、失禁関連皮膚炎を抑制する薬剤のスクリーニング方法：
（ａ）プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の細菌を含む培地に、候補の薬剤を添加する工程、
（ｂ）添加した薬剤の存在下で、前記細菌を培養する工程、
（ｃ）所定時間経過後にアンモニア濃度を測定する工程、
（ｄ）添加する候補の薬剤を変更して、前記（ａ）〜前記（ｃ）の工程を繰り返す工程、および
（ｅ）添加した候補の薬剤ごとのアンモニア濃度の測定値を対比し、前記アンモニア濃度の測定値が低い薬剤を、失禁関連皮膚炎を抑制する薬剤として認定する工程。
【請求項２】
前記（ｂ）工程と前記（ｃ）工程の間に、さらに下記の（ｂ２）工程を含む請求項１記載のスクリーニング方法：
（ｂ２）前記培地に尿素を添加し、前記細菌をさらに培養する工程。
【請求項３】
前記プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の細菌として、Proteus  mirabilisおよびProteus  vulgarisの少なくともいずれか一方を用いる請求項１記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な失禁関連皮膚炎抑制剤を選び出す方法（スクリーニング方法）に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿や便の失禁を有する者（特に高齢者）は、尿や便への曝露に起因する皮膚障害である失禁関連皮膚炎（Incontinence-associated dermatitis、ＩＡＤ）の問題を抱えることが多い。おむつを着用する失禁者が失禁すると、尿や便が皮膚に長時間付着することになる。そして、細菌産生ウレアーゼが尿中尿素を分解しアンモニアを発生させる結果、皮膚を保護する正常なバリア機能が失われ、ＩＡＤ発生原因（消化酵素・細菌）が影響を及ぼしやすい状態になり、IAD（炎症、水疱、糜爛など）が発生する。
【０００３】
前記ＩＡＤは、失禁を治療することによって根本的解決を図ることが可能であるが、治療に時間が必要で、必ずしも容易でない。また、寝たきりで機能性失禁を伴う者の多くは排泄の自律が困難であるため、その多くはおむつを使用している。小まめにおむつを外して、皮膚を洗浄して尿便を取り除き、皮膚に保護クリームを塗布した後、新たなおむつを装着する方法も有効である。しかし、患者が失禁してから、看護者が失禁したことに気づき、洗浄するまでにある程度の時間がかかるため、ＩＡＤを完全に防ぐことは現実的に困難である。
【０００４】
ＩＡＤの予防には、抗菌剤による細菌の抑制やウレアーゼ阻害剤によるウレアーゼの抑制が試みられてきた。そのため、従来、失禁関連皮膚炎抑制剤の探索には、細菌を用いた抗菌効果の検定や、尿素に対して、単離されたウレアーゼとともに被験物質を作用させたウレアーゼ阻害効果の検討が行われてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１７−５１９７７３号公報
【特許文献２】特表２００５−５２４４４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、現状においては、抗菌剤やウレアーゼ阻害剤だけではＩＡＤを予防することはできない。そのため、ＩＡＤを予防する効果的な物資を探索する方法、すなわちＩＡＤ抑制剤としての効果の有無及び程度を的確に評価できる方法が求められていた。
【０００７】
そこで、本発明の主たる課題は、失禁関連皮膚炎抑制剤を探索するのに有効なスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決した本発明は次記のとおりである。
（１）下記の工程を有することを特徴とする、失禁関連皮膚炎を抑制する薬剤をスクリーニング方法：
（ａ）プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の細菌を含む培地に、候補の薬剤を添加する工程、
（ｂ）添加した薬剤の存在下で、前記細菌を培養する工程、
（ｃ）所定時間経過後にアンモニア濃度を測定する工程、
（ｄ）添加する候補の薬剤を変更して、前記（ａ）〜前記（ｃ）の工程を繰り返す工程、および
（ｅ）添加した候補の薬剤ごとのアンモニア濃度の測定値を対比し、前記アンモニア濃度の測定値が低い薬剤を、失禁関連皮膚炎を抑制する薬剤として認定する工程。      
【０００９】
（作用効果）
本発明は、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の細菌を用いて、アンモニア濃度を測定することで、細菌によるアンモニア発生を抑制する物質をスクリーニングする評価方法を提供するものである。本発明のスクリーニング方法は、評価の指標として、細菌を用いた抗菌効果の検定や、尿素に対して、単離されたウレアーゼとともに被験物質を作用させたウレアーゼ阻害効果の検討を行うものでなく、培地内の細菌により産生されたアンモニアの濃度を用いるものである。このように、細菌によるアンモニア濃度を指標に用いることで、抗菌力やウレアーゼ産生阻害力だけでなく、そのほかのメカニズムによって細菌のアンモニア発生を抑制する薬剤を、失禁関連皮膚炎抑制剤として選別することができる。
【００１０】
（２）前記（ｂ）工程と前記（ｃ）工程の間に、さらに下記の（ｂ２）工程を含むことができる。
（ｂ２）前記培地に尿素を添加し、前記細菌をさらに培養する工程。
【００１１】
（作用効果）
培地に尿素を追加することで、ウレアーゼの産生により適した環境になる。そのため、尿素を追加しない場合と比べて、添加薬剤の効能がより分かりやすい。
【００１２】
（３）前記プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の細菌として、Proteus mirabilisおよびProteus vulgarisの少なくともいずれか一方を用いることができる。
【００１３】
（作用効果）
Proteus mirabilisおよびProteus vulgarisは、ウレアーゼ産生能が高いという特徴を有する。そのため、他の細菌を用いた場合と比べて、添加薬剤の効能がより分かりやすい。
【発明の効果】
【００１４】
以上のとおり本発明によれば、失禁関連皮膚炎抑制剤を探索するのに有効なスクリーニング方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係る実験例を表したグラフである。
【図２】本発明に係る比較例を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（スクリーニング方法の用途）
本発明に係るスクリーニング方法は、失禁患者のＩＡＤを抑制する薬剤を決定する際に有用である。スクリーニングによって選定した薬剤は、使い捨ておむつ等の吸収性物品の排尿部位や排便部位に添加すると良い。それによって、微生物によるアンモニアの生成を防ぐことができるため、ＩＡＤを抑制することができる。
【００１７】
（説明の進め方）
本発明に係るスクリーニング方法は、（ａ）添加工程、（ｂ）培養工程、（ｃ）測定工程、（ｄ）反復工程、（ｅ）選別工程を有する。以下、この工程の順序にしたがって、説明を行う。
【００１８】
（プロテウス属の細菌）
本発明は、ウレアーゼ産生能を有する細菌であれば特に限定されないが、ウレアーゼ産生能が高い細菌として、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の細菌を用いることが好ましい。好適には、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris等を用いることができる。
【００１９】
前記細菌は事前に培地で培養することが好ましい。この培地としては、例えばＬＢ培地（ルリア−ベルターニ（Luria-Bertani）培地。以下、同じ。）等を用いることができる。この培養は、振盪培養法にて、好気的な条件下において温度３０℃〜４０℃で１〜７２時間行い、吸光度（ＯＤ、Optical Density。以下、同じ。）が、例えばＯＤ600＝０.１〜１００になるまで行うと良い。ここで、ＯＤ600とは、波長６００μｍの光を当てたときの光の透過度をいう。ＯＤ600が０.１よりも低いと、評価に十分な量の細菌培養液を作成できないという問題がある。また、ＯＤ600が１００よりも高いと、死菌が著しく増え、以降の細菌の増殖に至らないという問題がある。
【００２０】
吸光度が前記の所定値に達した後は、生理食塩水、蒸留水等を用いて、細菌培養液を２〜５０倍に希釈する。
【００２１】
（ａ）添加工程
前記のように調整したプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の細菌を含む培地に対して、候補の薬剤を添加する。
【００２２】
（ｂ）培養工程
前記薬剤添加後は、その薬剤の存在下で、前記細菌の培養を行う。培養条件は任意に設定することができるが、例えば、培養用シェーカーを用いて、好気的な条件下において温度３０℃〜４０℃で１〜７２時間、振盪培養する。そのほか、静置発酵法等を行っても良い。
【００２３】
（ｂ２）尿素添加工程
振盪培養後、前記培地に尿素を添加しても良い。尿素を添加することによって、前記細菌がウレアーゼを産生しやすい環境になるため、薬剤による抑制効果をより明らかにすることができる。尿素を添加する場合は、１〜３００ｍｇ/ｍＬ程度とすることが好ましく、５〜５０ｍｇ/ｍＬとすることがより好ましく、１０〜３０ｍｇ/ｍＬとすることがさらに好ましい。尿素の添加量が１ｍｇ/ｍＬよりも少ないと、尿素を添加するメリットを得られにくいという問題がある。また、尿素の添加量が１０００ｍｇ/ｍＬよりも高いと、尿素が溶液中に溶解できず析出してしまう、という問題がある。
【００２４】
（ｃ）測定工程
その後、培地中のアンモニア濃度を測定する。このアンモニア濃度の測定は、例えば、アンモニアメーター（株式会社東興科学研究所製、商品名：ハンディアンモニアメーター、型番：TiN-9001i）等を用いて行うことができる。
【００２５】
アンモニアメーターでアンモニア濃度を測定する手順は、例えば、培地に1% pH調整液（10mol/L NaOH水溶液）を添加し、スターラーで攪拌しながらアンモニア電極を培地に入れて測定する。
そのほか、培地の一部を取り出し、希釈してから濃度測定してもよい。詳しくは、培地の一部を滅菌後生理食塩水にて1から100倍に希釈し、1% pH調整液を添加後、スターラーで攪拌しながらアンモニア電極を培地に入れて測定する。（原液アンモニア濃度）＝（希釈後アンモニア濃度）×（希釈率）により算出が可能である。
【００２６】
なお、前述の尿素添加工程を経る場合は、尿素を添加した直後にアンモニア濃度を計測するのではなく、約１〜７２時間経過後に測定することが好ましい。尿素を添加した効果を十分に得るためである。
【００２７】
（ｄ）反復工程
添加する薬剤を変更して、前記（ａ）添加工程〜（ｃ）測定工程を行う。この反復回数は任意に設定することができるが、少なくとも１回は反復することが好ましい。複数のアンモニア濃度の測定結果を得ることで、測定結果の比較が可能になるからである。
なお、（ａ）添加工程において複数の薬剤を添加した場合は、反復工程において、すべての薬剤を変更しても良いし、一部の薬剤を変更しても良い。
【００２８】
（ｅ）選別工程
最後に、（ａ）添加工程〜（ｄ）反復工程によって得られた複数のアンモニア濃度の測定値を対比し、測定値が低い薬剤を、失禁関連皮膚炎を抑制する薬剤として選定する。例えば、アンモニア濃度が５０ｍｇ/Ｌ以下となる薬剤を選定すると良い。
このようにして選定した薬剤は、使い捨ておむつなどの吸収性物品の排尿部位や排便部位に添加すると良い。
【実験例】
【００２９】
（実施例１）
実験には、ウレアーゼ産生能の高いプロテウス属のProteus mirabilis ＮＢＲＣ13300を用いた。
まず、２４時間前から１ｍＬのＬＢ培地で前記Proteus mirabilisを前培養した。その後、前培養液をＬＢ培地３０ｍＬに加え、培養用シェーカー（タイテック株式会社製、レシプロシェイカーNR-１）を用いて、恒温槽（東京理科器械株式会社製、INCUBATOR FMS）内で振盪培養（３７℃、一晩）した。そして、培養された前記細菌を機器（株式会社トミー精工社製、LC-100）で遠心した後（２０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）、新しいＬＢ培地にてＯＤ600を１．０に調整した。そして、１ｍＬＬＢ培地に生理食塩水９ｍＬを加え、細胞培養液を１０倍に希釈した。
【００３０】
次に、１ｍＬの蒸留水（Ａ）を添加した。
その後、ＬＢ培地に含まれた細菌を４時間培養した。４時間培養後のＯＤ値（濁度）を測定したところ、ＯＤ600が約１．１５であった。
その後、蒸留水（Ｂ）を１ｍＬ添加し、２時間細菌を培養した後、アンモニア濃度を測定した。
【００３１】
（実施例２）
蒸留水（Ｂ）の代わりに、２００ｍｇ/Ｌの尿素を１ｍＬ（最終濃度２０μｇ/ｍＬ）添加した。他の条件は実施例１と同様である。なお、４時間培養後のＯＤ値（ＯＤ600）は、約１．１であった。
【００３２】
（実施例３）
蒸留水（Ａ）の代わりに、抗菌剤として１．２８ｇ/Ｌの塩化ベンザルコニウム（benzalkonium chloride）を１ｍＬ（最終濃度１２８μｇ/ｍＬ）添加した。他の条件は実施例１と同様である。なお、４時間培養後のＯＤ値（ＯＤ600）は、約０．７であった。
【００３３】
（実施例４）
蒸留水（Ａ）の代わりに、抗菌剤として１．２８ｇ/Ｌの塩化ベンザルコニウム（benzalkonium chloride）を１ｍＬ（最終濃度１２８μｇ/ｍＬ）添加した。それとともに、蒸留水（Ｂ）の代わりに、２００ｍｇ/Ｌの尿素を１ｍＬ（最終濃度２０μｇ/ｍＬ）添加した。他の条件は実施例１と同様である。なお、４時間培養後のＯＤ値（ＯＤ600）は、約０．６であった。
【００３４】
（参考例１）
参考例として、前述の細菌、尿素、抗菌剤のいずれも添加していないＬＢ培地のアンモニア濃度を示した。
【００３５】
（比較例）
細菌によって産生されたウレアーゼにより、アンモニアが生成されるため、失禁関連皮膚炎抑制剤の探索にpH測定を行う方法も考えられる。
したがって、実施例１〜実施例４において、アンモニア濃度を計測する代わりにｐＨ値を計測し、その結果を比較例１〜４とした。
すなわち、実施例１に対応するpH値が比較例１であり、実施例２に対応するpH値が比較例２であり、実施例３に対応するpH値が比較例３であり、実施例４に対応するpH値が比較例４である。
【００３６】
（参考例２）
前記参考例１において、アンモニア濃度を計測する代わりに、ｐＨ値を計測した。
【結果】
【００３７】
図１、図２のグラフに示す。
【評価】
【００３８】
（実施例について）
抗菌剤を添加した実施例３（または実施例４）は、抗菌剤を添加していない実施例１（または実施例２）よりも、アンモニア濃度が１/３〜１/４程度に低下した。これは、抗菌剤によって、細菌の一部が死滅したためと考えられる。
【００３９】
実施例２（または実施例４）は、尿素を添加していない実施例１（または実施例３）よりも、アンモニア濃度が高くなった。これは、細菌の栄養源が増え、ウレアーゼの産生量が増えたためと考えらえる。
【００４０】
（比較例について）
比較例１〜４のpH値については、抗菌剤を添加していない比較例１よりも、抗菌剤を添加した比較例３の値が高くなった。また、抗菌剤を添加せずに尿素を添加した比較例２よりも、抗菌剤と尿素を添加した比較例４の値が高くなった。
さらに、培地に細菌を添加していない参考例２のpH値が、細菌を添加した比較例１のpH値よりも高く、約２倍の値となった。
【００４１】
（考察）
実施例１〜４および参考例１の測定値は、抗菌剤や尿素を添加することで当然に予想される結果であったが、指標としてアンモニア濃度を用いることで、当該結果を確かに確認することができた。
他方、比較例１〜４および参考例２の測定値は、抗菌剤を添加することで当然に予想される値からかけ離れたものであった。失禁関連皮膚炎の発生を抑制するため、どのような薬剤を用いるかを検討する際には、ウレアーゼ産生菌に候補となる薬剤を添加し、pHの上昇が抑制されているかを確認する方法、すなわち、評価の指標にpHを用いることが考えられるが、pHの上昇には、アンモニアの発生以外の他の要因も関係することが分かり、評価の指標としてpHを用いることができないことが分かった。
したがって、失禁関連皮膚炎を抑制する薬剤をスクリーニング方法においては、pH値を指標とするのではなく、アンモニア濃度を指標とすることが好ましい。
【図１】
2019062806.tif 000003
【図２】
2019062806.tif 000004