(57)【要約】【課題】簡易な方法で、複数の微生物の中から炭酸カルシウムを生成する微生物を選択するスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】複数の微生物を含むサンプルの中から炭酸カルシウムを生成する微生物をスクリーニングする方法であって、前記サンプルを、尿素及びカルシウムイオンを含む培地で培養する培養工程と、前記培養工程において培養された微生物の中から、白色膜が形成されたコロニーを選定する選定工程と、を含む、方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の微生物を含むサンプルの中から炭酸カルシウムを生成する微生物をスクリーニングする方法であって、
前記サンプルを、尿素及びカルシウムイオンを含む培地で培養する培養工程と、
前記培養工程において培養された微生物の中から、周囲に白色膜が形成されたコロニーを選定する選定工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記培地中の尿素の濃度が、０．１〜１ｍｏｌ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地中のカルシウムイオンの濃度が、０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養工程の前に、尿素及びカルシウムイオンを所定の培地に添加する添加工程を含み、
前記尿素を添加する前に、前記尿素をフィルター滅菌で滅菌する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
複数の微生物の中から炭酸カルシウムを生成する微生物をスクリーニングするための培地であって、尿素及びカルシウムイオンを含む、スクリーニング用培地。
【請求項６】
前記培地中の尿素の濃度が、０．１〜１ｍｏｌ／Ｌである、請求項５に記載の培地。
【請求項７】
前記培地中のカルシウムイオンの濃度が、０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌである、請求項５または６に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭酸カルシウムを生成する微生物のスクリーニング方法及びこれに用いる培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地盤改良、液状化防止、法面保護、護岸（海岸、河岸、用水路岸等）、防草、簡易舗装道路や滑走路造成等の分野で、微生物、特にウレアーゼ産生菌を利用した環境負荷の小さな土木技術の開発が進められている。
【０００３】
具体的には、土壌中のウレアーゼ産生菌によって尿素を分解し、発生した二酸化炭素とカルシウムイオンの反応で生成した炭酸カルシウムを地盤の固化等に活用するものである。ここで、ウレアーゼ産生菌を活用するにあたり、対象とする土壌中にウレアーゼ産生菌が存在するのか否か、存在した場合どのくらいの量が存在するかを事前に知ることは、きわめて重要である。
【０００４】
ウレアーゼ産生菌を利用した地盤改良技術において、従来法では土壌中の微生物を培養し、高いウレアーゼ活性を有する微生物を単離している。この手法では、土壌微生物の寒天培地上での培養に７２時間程度、寒天培地上に現れた大量の微生物種をそれぞれ１つずつ新しい寒天培地に移し替えてさらに７２時間培養、それにより単離された微生物種について１つずつウレアーゼ活性試験を行い、高ウレアーゼ活性微生物を見つけ出すスクリーニング作業を行っていた。さらに、単離された高ウレアーゼ活性微生物を用いてその後の実験を行っても、十分な炭酸カルシウム析出や固化が見られないケースが多くあった。
【０００５】
このように従来技術は多くの時間を要する上に、これらの作業は基本的に人手作業であるため、多くの人手と費用をも必要とせざるをえず、そのために環境負荷が小さいという利点を持つウレアーゼ産生菌を利用した技術が土木産業をはじめとする産業界に普及する妨げの一つとなっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１６９９４０号公報
【特許文献２】特開２０１２−９２６４８号公報
【特許文献３】特表２００８−５２４０９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
土壌などから採取された複数の微生物の中から炭酸カルシウムを生成する微生物を選択するスクリーニング方法において、従来はウレアーゼ（尿素分解）活性を指標として有用微生物を単離しており、その従来法では、（１）寒天培地上での培養、（２）微生物の単離、（３）ウレアーゼ活性試験、という３段階の煩雑なステップが必要であり、多くの時間、人手、費用がかかるという課題があった。さらに、単離された高ウレアーゼ活性微生物が必ずしも炭酸カルシウム生成に適しているわけではないという問題があった。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、簡易な方法で、複数の微生物の中から炭酸カルシウムを生成する微生物を選択するためのスクリーニング方法を提供することにある。また、本発明の目的は、そのスクリーニング方法に使用する培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的は、複数の微生物を含むサンプルの中から炭酸カルシウムを生成する微生物をスクリーニングする方法であって、
前記サンプルを、尿素及びカルシウムイオンを含む培地で培養する培養工程と、
前記培養工程において培養された微生物の中から、周囲に白色膜が形成されたコロニーを選定する選定工程と、
を含む、方法により達成される。
【００１０】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は以下の通りである。
（１）前記培地中の尿素の濃度が、０．１〜１ｍｏｌ／Ｌである
（２）前記培地中のカルシウムイオンの濃度が、０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌである
（３）前記サンプルの微生物は、海水中で生育する微生物である
（４）前記サンプルの微生物は、淡水中で生育する微生物である
（５）前記培養工程の前に、尿素及びカルシウムイオンを所定の培地に添加する添加工程を含み、前記尿素を添加する前に、前記尿素をフィルター滅菌で滅菌する
【００１１】
また、上記目的は、複数の微生物の中から炭酸カルシウムを生成する微生物をスクリーニングするための培地であって、尿素及びカルシウムイオンを含む、スクリーニング用培地により達成される。
【００１２】
本発明のスクリーニング用培地の好ましい態様は以下の通りである。
（１）前記培地中の尿素の濃度が、０．１〜１ｍｏｌ／Ｌである
（２）前記培地中のカルシウムイオンの濃度が、０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌである
（３）前記サンプルの微生物は、海水中で生育する微生物である
（４）前記サンプルの微生物は、淡水中で生育する微生物である
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、簡易な方法で、複数の微生物の中から炭酸カルシウムを生成する微生物を選択するためのスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】試験体塗布前の本発明の培地を示す写真である。
【図２】陽性対照Pararhodobacter sp.の培養後の写真である（左：全体図、右：蓋側から撮った拡大図）。
【図３】陰性対照E. coliの培養後の写真である。
【図４】陽性対照Pararhodobacter sp. (Paraと略記)と陰性対照E. coliを同時に接種して培養した後の写真である。
【図５】陽性対象検体Sporosarcina sp.の培養後の写真である。
【図６】陰性対象検体Virgibacillus sp.の培養後の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。上述したように、本発明のスクリーニング方法は、複数の微生物を含むサンプルを、尿素及びカルシウムイオンを含む培地で培養する培養工程と、培養工程において培養された微生物の中から、周囲に白色膜が形成されたコロニーを選定する選定工程と、を含む。
【００１６】
＜複数の微生物を含むサンプル＞
スクリーニングの対象となる複数の微生物を含むサンプルは、砂、サンゴ砂、真砂土等の砂質土から、粘土質土、泥炭土のような有機質が多い土壌まで広い範囲の陸及び海の土壌を対象とすることができる。すなわち、サンプルに含まれる微生物は、海水中で生育する微生物であっても淡水中で生育する微生物であってもよい。
【００１７】
＜スクリーニング対象微生物＞
スクリーニングによって存在の有無が確認される微生物は、尿素分解酵素であるウレアーゼを菌体内に含むか菌体外に放出することにより尿素を炭酸イオンとアンモニアに加水分解し、加水分解した結果生成される炭酸イオンとカルシウムイオンとの反応により炭酸カルシウムを生成できる全ての微生物を対象とする。このようなウレアーゼ産生菌として例えば、Pararhodobacter sp.、Sporosarcina (Bacillus) pasteurii、P. vulgaris、L. fermentum、P. prevotii、E. aerofaciens、Klebsiella aerogenes、Sporosarcina pasteurii、Helicobacter pylori、Proteus mirabilis等が例示できる。
【００１８】
＜スクリーニング用培地＞
本発明のスクリーニング方法で使用するスクリーニング用培地は、尿素及びカルシウムイオンを含む。尿素を含んでいることにより、尿素を分解して炭酸イオンを生成することができる微生物、具体的にはウレアーゼ活性を有する微生物のみを選択的に増殖させることができる。そして、カルシウムイオンを含んでいることにより、ウレアーゼ活性を有する微生物が尿素を分解して生成した炭酸イオンとカルシウムイオンが結合して炭酸カルシウムを生成し、その炭酸カルシウムは微生物のコロニーの周りに白色膜となって視認または顕微鏡にて確認することができる。これにより、培養された複数の微生物の中から、炭酸カルシウムを生成する微生物を選定することができる。また、ウレアーゼ産生菌の中には尿素を分解することはできるが、炭酸カルシウムを生成できないものも存在するので、炭酸カルシウム生成能を検出するためにも重要である。
【００１９】
本発明のスクリーニング用培地は、尿素及びカルシウムイオンに加えて、炭酸カルシウムを生成する微生物を培養させるための成分を含み、その成分としては、例えば、アミノ酸源（ペプトンやトリプトンなど）、エキス類（酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ポテトエキスなど）、ゲル化剤（寒天など）、ビタミン源、糖類（グルコースなど）、ミネラル源（塩化ナトリウムやリン酸鉄などの無機塩など）、水（蒸留水、人工海水など）などが挙げられる。
【００２０】
具体的には、尿素及び／またはカルシウムイオンを添加する基本となる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を使用することができ、例えば、クリステンゼン培地、ゾベル（ＺｏＢｅｌｌ２２１６Ｅ）培地、普通寒天培地、ＳＣＤ寒天培地等が例示できる。培地の形態は固体培地が好ましく、特に寒天培地が好ましいがゼラチン培地等寒天培地以外の固体培地も使用することができる。
【００２１】
培地における尿素の濃度は、通常は０．０１〜１ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜０．９ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２〜０．８ｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．３〜０．７ｍｏｌ／Ｌである。なお、本発明において、「ｍｏｌ／Ｌ」とは、培地に含まれる水１Ｌ当たりのｍｏｌ数のことをいう。
【００２２】
培地中のカルシウムイオンの濃度は、通常は０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０２〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０３〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。カルシウムイオンを付与するための成分としては、塩化カルシウムなどのカルシウム塩を使用することができる。
【００２３】
培地のｐＨは、例えば、６．５〜８、好ましくは７〜７．６の範囲である。
【００２４】
上記の尿素は加熱すると分解してしまうので、尿素を添加する前の滅菌には、加熱以外の滅菌方法、具体的にはフィルター滅菌等の分離滅菌あるいはガンマ線をはじめとする電磁波滅菌を用いることが好ましい。
【００２５】
＜スクリーニング方法＞
上述したように、本発明のスクリーニング方法は、複数の微生物を含むサンプルを、尿素及びカルシウムイオンを含む培地で培養する培養工程と、培養工程において培養された微生物の中から、周囲に白色膜が形成されたコロニーを選定する選定工程と、を含む。
【００２６】
培養工程では、まず、土壌等から採取したサンプルを、例えば、水と撹拌した後の上澄み液として、上記のスクリーニング用培地に塗布する。塗布と同時に、コーンラージ棒などを使用して、サンプルを培地全体に広げる。その後、インキュベーター内で培養を行う。培養時の温度は、例えば、２０〜５０℃、好ましくは２５〜３５℃であり、培養時間は、例えば、２４〜１２０時間、好ましくは４８〜９６時間である。
【００２７】
培養後、培地に複数種存在するコロニーのうち、炭酸カルシウムを生成する微生物のコロニーの周りには炭酸カルシウムから形成される白色（白濁を含む）膜が形成される。上記選定工程では、白色膜を有するコロニーを目視または顕微鏡により確認する。大抵の場合、目視により白色膜を容易に確認可能である。これにより、サンプル中に炭酸カルシウムを生成する微生物が存在するかどうか、またその多少を判断することが可能である。
【００２８】
本発明は、従来の方法と異なり、１回の培養工程で、複数の微生物を含むサンプルの中から炭酸カルシウムを生成する微生物をスクリーニングすることができる。したがって、簡易な方法でスクリーニングを行うことが可能である。さらに、ウレアーゼ活性は低いにもかかわらず炭酸カルシウム生成能力は高い微生物も検出することができるため、従来と比較してより簡易でかつ高度なスクリーニング方法といえる。
【実施例】
【００２９】
＜実施例１＞
陽性対照として、尿素を分解し、発生した二酸化炭素とカルシウムイオンの反応で炭酸カルシウムを生成することがわかっている微生物であるPararhodobacter sp.を以下の手順で保存菌体から前培養し、陽性対照試験検体として用意した。
【００３０】
２００ｍｌのビーカーに人工海水（八洲薬品株式会社製、商標アクアマリン）を１８０ｍＬ入れ、ポリペプトン、酵母エキス、ＦｅＰＯ４を加え、撹拌した。そして、その溶液を２００ｍｌのメスフラスコに移し、人工海水でメスアップした。これを三角フラスコに移し、１．０ｍｏｌ／Ｌの塩酸でｐＨが７．６になるように調整し、オートクレーブにより滅菌処理した。このようにして用意したＺｏＢｅｌｌ２２１６Ｅ培地の成分を表１に示す。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
上記の手順で作製した前培養用培地のストックから、培地５ｍＬを試験管に分取し、別途用意したPararhodobacter sp.の保存菌体をプラスチック製の白金耳で少量掻き取り、液体培地に接種した後、シリコ栓で蓋をした。試験管を３０℃に設定した恒温槽内の振盪機に斜めに固定し、１６０ｒｐｍで２４時間振盪培養した。この培養液を人工海水により希釈することで１，０００，０００倍希釈溶液まで作製し、陽性対照Pararhodobacter sp.の試験検体を用意した。
【００３３】
次に陰性対照として、尿素を分解せず、したがって二酸化炭素も発生させず、カルシウムイオンが存在しても炭酸カルシウムを生成しないことがわかっている微生物であるE. coliを以下の手順で保存菌体から前培養し、比較用の試験検体として用意した。
【００３４】
２００ｍｌのビーカーに蒸留水を１８０ｍＬ入れ、トリプトン、酵母エキス、ＮａＣｌを加え、撹拌した。そして、その溶液を２００ｍｌのメスフラスコに移し、蒸留水でメスアップした。これを三角フラスコに移し、オートクレーブにより滅菌処理した。このようにして用意したＬＢ培地の成分を表２に示す。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
上記の手順で作製した前培養用培地のストックから、培地５ｍＬを試験管に分取し、別途用意したE. coliの保存菌体をプラスチック製の白金耳で少量掻き取り、液体培地に接種した後、シリコ栓で蓋をした。試験管を３７℃に設定した恒温槽内の振盪機に斜めに固定し、１６０ｒｐｍで２０時間振盪培養した。この培養液を蒸留水により希釈することで１，０００，０００倍希釈溶液まで作製し、陰性対照E. coliの試験検体を用意した。
【００３７】
次に、以下のようにして、本発明の炭酸カルシウム析出培地を作製した。２００ｍｌのビーカーに人工海水（八洲薬品株式会社製、商標アクアマリン）を１６０ｍｌ入れ、ポリペプトン、酵母エキス、ＦｅＰＯ４，ＣａＣｌ２を加え、撹拌した。これを三角フラスコに移し、１．０ｍｏｌ／Ｌの塩酸でｐＨが７．６になるように調整した。そして、寒天を加え、オートクレーブにより滅菌処理した。
【００３８】
クリーンベンチ内で人工海水に溶かしたｐＨ７．６に調整済みの５ｍｏｌ／Ｌの尿素溶液２０ｍＬのフィルター滅菌を行った。上記培地のオートクレーブ滅菌後、三角フラスコを振盪させ６０℃程度まで冷えたのち、フィルター滅菌した尿素を０．５Ｍとなるように滅菌済み培地に添加し，人工海水で最終溶液量を２００ｍＬにした。これを滅菌シャーレに１０ｍＬずつ培地を注ぎ、冷え固まるまで待った。
【００３９】
【表３】
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【００４０】
次に、前培養した陽性対照Pararhodobacter sp.の試験検体と、前培養した陰性対照E. coliの比較用試験検体を用いて以下の実験を行った。
【００４１】
（１）陽性対照Pararhodobacter sp.の試験検体１０μLのみを本発明の培地に塗布したプレート
（２）陰性対照E. coliの比較用試験検体１０μLのみを本発明の培地に塗布したプレート
（３）Pararhodobacter sp.の試験検体１０μLと陰性対照E. coliの比較用試験検体１０μLの両方を同時に塗布したプレート
【００４２】
試験検体を本発明の培地に塗布すると同時にコーンラージ棒で希釈溶液を培地全体に広げ、その後、培地を３０℃のインキュベーターに移し、７２時間培養した。７２時間培養後した結果を以下に示す。
【００４３】
図２を見ると、黄色い菌の周りに白い膜が付着していて、これは炭酸カルシウムのＨＡＬＯであると考えられる。陽性対照Pararhodobacter sp.の周りに炭酸カルシウムが析出していると考えられる。図３を見ると陰性対照E. coliの周りには白い膜は観察できなかった。
【００４４】
図４に陽性対照Pararhodobacter sp.と陰性対照E. coliを同時に接種した結果を示す。蓋側から撮った右の図と合わせてみると、Pararhodobacter sp.の周りにＨＡＬＯが析出し、E. coliに変化は見られない。この結果より、炭酸カルシウムを生成するPararhodobacter sp.と生成しないE. coliの目視による識別が可能である。
【００４５】
＜実施例２＞
陽性対照として、尿素を分解するウレアーゼ活性は低いが、発生した二酸化炭素とカルシウムイオンの反応で炭酸カルシウムを生成する炭酸カルシウム固化能力が高いことがわかっている微生物であるSporosarcina sp.を以下の手順で保存菌体から前培養し、陽性対照試験検体として用意した。
【００４６】
１００ｍｌのビーカーに蒸留水を９０ｍＬ入れ、ポリペプトン、酵母エキス、グルコースを加え、撹拌した。そして、その溶液を１００ｍｌのメスフラスコに移し、蒸留水でメスアップした。これを三角フラスコに移し、オートクレーブにより滅菌処理した。このようにして用意した標準液体培地の成分を表４に示す。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
上記の手順で作製した前培養用培地のストックから、培地５ｍＬを試験管に分取し、別途用意したSporosarcina sp.の保存菌体をプラスチック製の白金耳で少量掻き取り、液体培地に接種した後、シリコ栓で蓋をした。試験管を３０℃に設定した恒温槽内の振盪機に斜めに固定し、１６０ｒｐｍで２４時間振盪培養した。この培養液を蒸留水により希釈することで１，０００，０００倍希釈溶液まで作製し、陽性対照Sporosarcina sp.の試験検体を用意した。
【００４９】
次に陰性対照として、尿素を分解するウレアーゼ活性は高いが、発生した二酸化炭素とカルシウムイオンの反応で炭酸カルシウムを生成する炭酸カルシウム固化能力が低いことがわかっている微生物であるVirgibacillus sp.を、陽性対象のSporosarcina sp.と同じ手順で保存菌体から前培養し、比較用の試験検体として用意した。
【００５０】
そして、この前培養用培地のストックから、培地５ｍＬを試験管に分取し、別途用意したVirgibacillus sp.の保存菌体をプラスチック製の白金耳で少量掻き取り、液体培地に接種した後、シリコ栓で蓋をした。試験管を３７℃に設定した恒温槽内の振盪機に斜めに固定し、１６０ｒｐｍで２４時間振盪培養した。この培養液を蒸留水により希釈することで１，０００，０００倍希釈溶液まで作製し、陰性対照のVirgibacillus sp.試験検体を用意した。
【００５１】
次に、以下のようにして、本発明の炭酸カルシウム析出培地を作製した。１００ｍｌのビーカーに蒸留水を８０ｍｌ入れ、ポリペプトン、酵母エキス、グルコース，ＣａＣｌ２を加え、撹拌した。これを三角フラスコに移し、１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨでｐＨが７．０になるように調整した。そして、寒天を加え、オートクレーブにより滅菌処理した。
【００５２】
クリーンベンチ内で蒸留水に溶かしたｐＨ７．０に調整済みの５ｍｏｌ／Ｌの尿素溶液２０ｍＬのフィルター滅菌を行った。上記培地のオートクレーブ滅菌終了後、三角フラスコを振盪させ６０℃程度まで冷えたのち、フィルター滅菌した尿素を０．５ Ｍとなるように滅菌済み培地に添加し，蒸留水で最終容量を１００ｍＬにした。これを滅菌シャーレに１０ｍＬずつ培地を注ぎ、冷え固まるまで待った。
【００５３】
【表５】
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【００５４】
次に、前培養した陽性対照Sporosarcina sp.の試験検体と、前培養した陰性対照Virgibacillus sp.の比較用試験検体を用いて以下の実験を行った。
【００５５】
（１）陽性対照Sporosarcina sp.の試験検体１０μLのみを本発明の培地に塗布したプレート
（２）陰性対照Virgibacillus sp.の比較用試験検体１０μLのみを本発明の培地に塗布したプレート
【００５６】
試験検体を本発明の培地に塗布すると同時にコーンラージ棒で希釈溶液を培地全体に広げ、その後、培地を３０℃のインキュベーターに移し、７２時間培養した。７２時間培養後した結果を以下に示す。
【００５７】
図５を見ると、菌の周りに白い膜が付着していて、これは炭酸カルシウムのＨＡＬＯであると考えられる。陽性対照Sporosarcina sp.の周りに炭酸カルシウムが析出していると考えられる。図６を見ると陰性対照Virgibacillus sp.の周りには白い膜は観察できなかった。
【００５８】
図５と図６の比較により炭酸カルシウムを生成するSporosarcina sp.と生成しないVirgibacillus sp.の目視による識別が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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