(57)【要約】【課題】ラットの遺伝子組換えの提供。【解決手段】ラット胚性幹（ＥＳ）細胞を含む多能性細胞及び分化全能性細胞を作製するために組成物及び方法が提供される。ラットにおいて遺伝子組換えの生殖系列伝達の効率または頻度を改善するために組成物及び方法が提供される。そのような方法及び組成物は、フィーダー細胞層と、ラットＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞株の集団とを含む試験管内培養物を含み、その際、試験管内培養の条件はＥＳ細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）またはその活性のある変異体若しくは断片を有する培地を含む。そのようなラットＥＳ細胞株を樹立する種々の方法がさらに提供される。本明細書で提供される遺伝子組換えしたラットからトランスジェニックラットを生成する種々の方法と共に、遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞を選択する方法も提供される。種々のキット及び製造物品がさらに提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
非ヒトの多能性細胞、分化全能性細胞及び胚性幹（ＥＳ）細胞、特にラットの多能性細胞、分化全能性細胞及び／またはラットのＥＳ細胞、及びそれらの作製方法。ラットの多能性細胞、分化全能性細胞及びＥＳ細胞を作製する方法が提供される。ラットの多能性細胞、分化全能性細胞及びＥＳ細胞を標的とする方法が提供される。ラット細胞における遺伝子組換えの生殖系列伝達を達成する方法が提供される。ラットの多能性細胞、分化全能性細胞及びＥＳ細胞を導出する、増殖させる及び維持する方法が提供される。
【０００２】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への言及
全米情報交換標準コード（ＡＳＣＩＩ）に従った２０１４年２月２０日の作成日で２Ｋｂのサイズの４４１９１４ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔのファイル名での配列表の正式なコピーがＥＦＳ−Ｗｅｂを介してテキストファイルとして本明細書と同時に提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出される配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
ラットは、薬剤発見における適用を含むが、これらに限定されない多数の適用に有益なモデルである。ラットの有用性は、遺伝子組換えしたラットを得ることの困難さ、特に遺伝子組換えしたラットの開発方法における、及びラットのゲノムにおける遺伝子組換えの生殖系列伝達を生じるプロトコールを含むが、これらに限定されない遺伝子組換えプロトコールで使用することができる有用なラット細胞を生成することにおける困難さによって幾分軽くなってきている。
【０００４】
遺伝子組換えが生殖系列を介して伝達され得るように遺伝子組換えすることができるラット細胞（たとえば、胚性幹細胞）に対する当該技術におけるニーズがある。ラットにおける遺伝子組換えの生殖系列伝達の改善された頻度に対する当該技術におけるニーズがある。
【０００５】
Ｆ０を生成することが可能であるラットの種々の系統に由来するドナーラットの多能性細胞、分化全能性細胞及び／またはＥＳ細胞、または完全にドナー細胞に由来するＦ０ラットに対する当該技術におけるニーズがある。生殖系列の遺伝子組換えを含むラットを生成することが可能であるドナーラットの多能性細胞、分化全能性細胞及び／またはＥＳ細胞に対する当該技術におけるニーズがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ラットの胚性幹（ＥＳ）細胞を含むラットの多能性細胞及び／または分化全能性細胞を作製するために組成物及び方法が提供される。ラットにおける遺伝子組換えの生殖系列伝達の効率及び頻度を改善するための組成物及び方法が提供される。種々の態様では、方法及び組成物は、フィーダー細胞層とラットＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞株を含む試験管内培養物を含み、その際、試験管内培養条件はラットＥＳ細胞の多能性の維持を可能にする。ラットＥＳ細胞株を樹立する種々の方法がさらに提供される。遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞からトランスジェニックラットを生成する種々の方法が本明細書で提供されると共に、遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞を選択する方法も提供される。種々のキット及び製造物品がさらに提供される。
【０００７】
非限定の実施形態は以下のとおりである。
（１）ＡＣＩまたはＤＡから選択される系統の単離されたラットＥＳ細胞であって、単離されたラットＥＳ細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である単離されたラットＥＳ細胞。
（２）細胞がＡＣＩラットに由来する実施形態１の単離されたラットＥＳ細胞。
（３）細胞がダークアグーチ（ＤＡ）ラット２に由来する実施形態１または２の単離されたラットＥＳ細胞。
（４）細胞が正倍数体であり、標的とされた遺伝子組換えを生殖系列を介して伝達することが可能である実施形態１、２または３の単離されたラットＥＳ細胞。
（５）ラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む実施形態４の単離されたラットＥＳ細胞。
（６）ラットＥＳ細胞が少なくとも６０％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する実施形態４の単離されたラットＥＳ細胞。
（７）ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す実施形態１〜６のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（８）ラットＥＳ細胞が、連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である実施形態１〜８のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（９）ラットＥＳ細胞が、１以上、２以上または３以上の標的とされた遺伝子組換えを含む実施形態１〜８のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（１０）標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む実施形態４〜９のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（１１）標的とされた遺伝子組換えが非相同のポリヌクレオチドの細胞のゲノムへの少なくとも１回の挿入を含む実施形態９の単離されたラットＥＳ細胞。
（１２）非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む実施形態１１の単離されたラットＥＳ細胞。
（１３）（ａ）選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または（ｂ）ラットＥＳ細胞が選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの少なくとも２コピーを含む実施形態１２の単離されたラットＥＳ細胞。
（１４）選択マーカーが野生型の選択マーカーに比べて高い活性を有する実施形態１２の単離されたラットＥＳ細胞。
（１５）ＬＩＦポリペプチド、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培養にてフィーダー細胞層上に置かれると、ラットＥＳ細胞が球形様のコロニーを形成する実施形態１〜１４のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（１６）ラットＥＳ細胞が、試験管内で培養されると、フィーダー細胞層にゆるく接着する実施形態１〜１５のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（１７）細胞が多能性の維持のために傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としない実施形態１〜１６のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（１８）細胞がオス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞である実施形態１〜１７のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（１９）細胞がメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である実施形態１〜１９のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（２０）標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率及び生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地でラットＥＳ細胞を少なくとも１１回まで継代することができる実施形態１〜１９のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（２１）ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する実施形態１〜２０のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（２２）ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏ１またはそれらの組み合わせから選択される１以上の多能性マーカーを発現しない実施形態１〜２１のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（２３）ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２またはそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉性マーカーを発現しない実施形態１〜２２のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（２４）ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７またはそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉性マーカーを発現しない実施形態１〜２３のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（２５）ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６またはそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない実施形態１〜２４のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（２６）細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む多能性マーカーを発現する実施形態１〜２５のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（２７）ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせの１以上から選択されるラットＥＳＣ特異的な遺伝子の１以上の発現を特徴とする実施形態１〜２６のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞。
（２８）ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成するラットＥＳ細胞の単離された集団。
（２９）ラットＥＳ細胞がＡＣＩラットに由来する実施形態２８のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（３０）ラットＥＳ細胞がダークアグーチ（ＤＡ）ラット２に由来する実施形態２８のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（３１）ラットＥＳ細胞が生殖系列を介してゲノムを伝達することが可能である実施形態２８〜３０のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（３２）ラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する実施形態２８〜３１のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（３３）ラットＥＳ細胞が少なくとも６０％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する実施形態２８〜３１のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（３４）ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す実施形態２８〜３１のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（３５）ラットＥＳ細胞が、連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である実施形態２８〜３４のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（３６）ラットＥＳ細胞が、１以上、２以上または３以上の標的とされた遺伝子組換えを含み、生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である実施形態２８〜３５のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（３７）標的とされた遺伝子組換えがラットのＲｏｓａ２６遺伝子座にある実施形態３６のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（３８）標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む実施形態３６のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（３９）標的とされた遺伝子組換えが非相同のポリヌクレオチドの細胞のゲノムへの少なくとも１回の挿入を含む実施形態３６のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（４０）非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む実施形態３９のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（４１）（ａ）選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または（ｂ）ラットＥＳ細胞が選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの少なくとも２コピーを含む実施形態４０のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（４２）選択マーカーが野生型の選択マーカーに比べて高い活性を有する実施形態４０のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（４３）ＬＩＦポリペプチド、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培養にてフィーダー細胞層上に置かれると、細胞が球形様のコロニーを形成する実施形態２８〜４２のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（４４）細胞が、試験管内で培養されると、フィーダー細胞層にゆるく接着する実施形態２８〜４３のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（４５）細胞が多能性の維持のために傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としない実施形態２８〜４４のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（４６）ラットＥＳ細胞がオス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞である実施形態２８〜４４のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（４７）ラットＥＳ細胞がメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である実施形態２８〜４４のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（４８）標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率及び生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地でラットＥＳ細胞を少なくとも１１回まで継代することができる実施形態２８〜４７のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（４９）ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する実施形態２８〜４８のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（５０）ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏ１またはそれらの組み合わせから選択される１以上の多能性マーカーを発現しない実施形態２８〜４９のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（５１）ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２またはそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉性マーカーを発現しない実施形態２８〜５０のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（５２）ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７またはそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉性マーカーを発現しない実施形態２８〜５１のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（５３）ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６またはそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない実施形態２８〜５２のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（５４）ラットＥＳ細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む多能性マーカーを発現する実施形態２８〜５３のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（５５）ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせの１以上から選択されるラットＥＳＣ特異的な遺伝子の１以上の発現を特徴とする実施形態２８〜５４のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（５６）集団が少なくとも１０４個の細胞を含む実施形態２８〜５５のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（５７）ラットＥＳ細胞が
ａ．ラットＥＳ細胞の少なくとも９０％が正倍数体である；
ｂ．ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が少なくとも１つの多能性マーカーを発現し、少なくとも１つの多能性マーカーはＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む；
ｃ．ラットＥＳ細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットＥＳ細胞株のゲノムを子孫に伝達する；
ｄ．ラットＥＳ細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する；
ｅ．ラットＥＳ細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、球形様のコロニーを形成する；（ｆ）ラットＥＳ細胞はＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＬＩＦ及びＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層を含む培地にて試験管内で培養されると多能性を維持する；
ｆ．ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す；
ｇ．傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要とすることなく、ラットＥＳ細胞が試験管内で多能性を維持する；
ｈ．ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する；
ｉ．ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する；
ｊ．ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏｌから選択される１以上の分化マーカーを発現しない；
ｋ．ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２またはそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉性マーカーを発現しない；
ｌ．ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７またはそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉性マーカーを発現しない；
ｍ．ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６またはそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない；を含む１以上の特徴を有する実施形態２８〜５６のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（５８）（ａ）ラットＥＳ細胞がラット胚盤胞に由来する、（ｂ）ラットＥＳ細胞がラット桑実胚期の胚に由来する、及び／または（ｃ）ラットＥＳ細胞株が過排卵ラットに由来する実施形態２８〜５７のいずれか１つのラットＥＳ細胞の単離された集団。
（５９）フィーダー細胞層と、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞の集団と、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地とを含む試験管内培養物であって、ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、ラットＥＳ細胞が球形様のコロニーを形成する試験管内培養物。
（６０）ラットＥＳ細胞がフィーダー細胞層にゆるやかに接着する実施形態５９または６０の試験管内培養物。
（６１）ラットＥＳ細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である実施形態５９、６０または６１の試験管内培養物。
（６２）ラットＥＳ細胞がＡＣＩラットに由来する実施形態５９、６０または６１の試験管内培養物。
（６３）ラットＥＳ細胞がダークアグーチ（ＤＡ）ラット２に由来する実施形態５９、６０または６１の試験管内培養物。
（６４）ラットＥＳ細胞が生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である実施形態５９〜６３のいずれか１つの試験管内培養物。
（６５）ラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む実施形態６４の試験管内培養物。
（６６）ラットＥＳ細胞が少なくとも６０％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する実施形態６４の試験管内培養物。
（６７）ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す実施形態５９〜６６のいずれか１つの試験管内培養物。
（６８）ラットＥＳ細胞が、連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である実施形態５９〜６７のいずれか１つの試験管内培養物。
（６９）ラットＥＳ細胞が、１以上、２以上または３以上の標的とされた遺伝子組換えを含む実施形態５９〜６８のいずれか１つの試験管内培養物。
（７０）標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む実施形態６９の試験管内培養物。
（７１）標的とされた遺伝子組換えが非相同のポリヌクレオチドの細胞のゲノムへの少なくとも１回の挿入を含む実施形態６９の試験管内培養物。
（７２）非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む実施形態７１の試験管内培養物。
（７３）（ａ）選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または（ｂ）ラットＥＳ細胞が選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの少なくとも２コピーを含む実施形態７２の試験管内培養物。
（７４）選択マーカーが野生型の選択マーカーに比べて高い活性を有する実施形態７２の試験管内培養物。
（７５）細胞が多能性の維持のために傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としない実施形態５９〜７４のいずれか１つの試験管内培養物。
（７６）細胞がオス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞である実施形態５９〜７５のいずれか１つの試験管内培養物。
（７７）細胞がメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である実施形態５９〜７５のいずれか１つの試験管内培養物。
（７８）標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率及び生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地でラットＥＳ細胞を少なくとも１１回まで継代することができる実施形態５９〜７７のいずれか１つの試験管内培養物。
（７９）ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する実施形態５９〜７８のいずれか１つの試験管内培養物。
（８０）ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏ１またはそれらの組み合わせから選択される１以上の多能性マーカーを発現しない実施形態５９〜７９のいずれか１つの試験管内培養物。
（８１）ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２またはそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉性マーカーを発現しない実施形態５９〜８０のいずれか１つの試験管内培養物。
（８２）ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７またはそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉性マーカーを発現しない実施形態５９〜８１のいずれか１つの試験管内培養物。
（８３）ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６またはそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない実施形態５９〜８２のいずれか１つの試験管内培養物。
（８４）細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む多能性マーカーを発現する実施形態５９〜８３のいずれか１つの試験管内培養物。
（８５）ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせの１以上から選択されるラットＥＳＣ特異的な遺伝子の１以上の発現を特徴とする実施形態５９〜８４のいずれか１つの試験管内培養物。
（８６）ＬＩＦの濃度が５０Ｕ／ｍＬ〜１５０Ｕ／ｍＬである実施形態５９〜８４のいずれか１つの試験管内培養物。
（８７）ＬＩＦの濃度が１００Ｕ／ｍＬである実施形態５９〜８５のいずれか１つの試験管内培養物。
（８８）ＬＩＦがマウスに由来するまたは配列番号１に対して少なくとも９２％の配列同一性を含む実施形態５９〜８７のいずれか１つの試験管内培養物。
（８９）ラットＥＳ細胞が傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としないで多能性を維持することが可能である実施形態５９〜８８のいずれか１つの試験管内培養物。
（９０）フィーダー細胞層がＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされない実施形態５９〜８９のいずれか１つの試験管内培養物。
（９１）フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む実施形態５９〜９０のいずれか１つの試験管内培養物。
（９２）ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１を含む実施形態５９〜９１のいずれか１つの試験管内培養物。
（９３）ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１を含む実施形態５９〜９２のいずれか１つの試験管内培養物。
（９４）ラットＥＳ細胞の集団がラット胚盤胞期の胚またはラット桑実胚期の胚に由来する実施形態５９〜９３のいずれか１つの試験管内培養物。
（９５）胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚がさらにラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を含む実施形態９４の試験管内培養物。
（９６）ラットＥＳ細胞の集団がラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の単離された増殖物を含む実施形態９４の試験管内培養物。
（９７）ラットの胚性幹（ＥＳ）細胞株を生成する方法であって、（ａ）フィーダー細胞層と胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚とを試験管内で培養することと、（ｂ）ラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を第２のフィーダー細胞層を十分に含む試験管内培養物に移し、マウスのＬＩＦまたはマウスのＬＩＦの活性のある変異体を有する培地を含む条件下で該増殖物を培養し、それによってラットＥＳ細胞の多能性を維持し、それからラットＥＳ細胞株を樹立することとを含み、その際、胚盤胞期のまたは桑実胚期のラット胚の透明帯は取り除かれており、培養条件はラットＥＳ細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）または配列番号１に対して少なくとも９１％の配列同一性を有し、且つＬＩＦ活性を有する配列、及びＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を有する培地を含む方法。
（９８）ラットＥＳ細胞株が少なくとも５回継代される実施形態９７の方法。
（９９）ラットＥＳ細胞株が少なくとも１０回継代される実施形態９７または９８の方法。
（１００）培地が約５０Ｕ／ｍＬ〜約１５０Ｕ／ｍＬのマウスＬＩＦを含む実施形態９７、９８または９９の方法。
（１０１）培地が約１００Ｕ／ｍＬのマウスＬＩＦを含む実施形態９７〜１００のいずれか１つの方法。
（１０２）フィーダー細胞層がＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされない実施形態９７〜１０１のいずれか１つの方法。
（１０３）フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む実施形態９７〜１０２のいずれか１つの方法。
（１０４）ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１を含む実施形態９７〜１０３のいずれか１つの方法。
（１０５）ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１を含む実施形態９７〜１０４のいずれか１つの方法。
（１０６）（ａ）ラットＥＳ細胞株がＡＣＩラットに由来するまたはダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する；（ｂ）ラットＥＳ細胞株が桑実胚期のまたは胚盤胞期のラット胚に由来する；及び／または（ｃ）ラットＥＳ細胞株が過排卵させたラットからの桑実胚期のまたは胚盤胞期のラット胚に由来する実施形態９７〜１０５のいずれか１つの方法。
（１０７）培地がさらに、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤またはＡＬＫ阻害剤の少なくとも１つを含む実施形態９７〜１０６のいずれか１つの方法。
（１０８）ＦＧＦ受容体阻害剤がＰＤ１８４３５２を含み、ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２を含み、またはＡＬＫ阻害剤がＡ−８３−０１を含む実施形態１０７の方法。
（１０９）少なくとも１つのラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する実施形態９７〜１０８のいずれか１つの方法。
（１１０）標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率が少なくとも６０％である実施形態９７〜１０９のいずれか１つの方法。
（１１１）そのゲノムの中に非相同のポリヌクレオチドを安定的に組み入れているラットの胚性幹（ＥＳ）細胞を選択する方法であって、（ａ）ラットＥＳ細胞の試験管内集団を提供することと、（ｂ）ラットＥＳ細胞にて活性のあるプロモータに操作可能に連結された選択マーカーを含む非相同のポリヌクレオチドを少なくとも１つのラットＥＳ細胞に導入することと、（ｃ）交互に入れ替える第１と第２の培養培地にてラットＥＳ細胞集団を試験管内で培養し、それによってそのゲノムの中に非相同のポリヌクレオチドを安定的に統合しているラットＥＳ細胞を選択することとを含み、その際、第１の培養培地は第１の期間、有効量の選択剤を含み、第２の培養培地は選択剤を含まず、試験管内の培養条件は多能性を維持するのに十分である方法。
（１１２）第１と第２の培養培地が２４時間ごとに交互に入れ替えられる実施形態１１１の方法。
（１１３）選択マーカーが抗生剤への耐性を付与する実施形態１１１または１１２の方法。
（１１４）抗生剤がＧ４１８を含む実施形態１１１〜１１３のいずれか１つの方法。
（１１５）選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、プロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）及び単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）またはそれらの組み合わせを含む実施形態１１１〜１１４のいずれか１つの方法。
（１１６）（ａ）選択マーカーが野生型選択マーカーに比べて高い活性を有する、及び／または（ｂ）選択マーカーの複数のコピーがラットＥＳ細胞のゲノムに安定的に組み込まれる実施形態１１１〜１１５のいずれか１つの方法。
（１１７）選択マーカーが非弱毒化選択マーカーである実施形態１１６の方法。
（１１８）単離されたラット胚性幹（ＥＳ）細胞を遺伝子組換えする方法であって、実施形態１〜５８のいずれか１つの単離されたラットＥＳ細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞を形成することを含む方法。
（１１９）遺伝子組換えしたラットを作製する方法であって、
（ａ）実施形態１〜５８のいずれか１つの単離されたラット胚性幹（ＥＳ）細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞を形成することと；
（ｂ）標的とされた遺伝子組換えを含むラットＥＳ細胞の少なくとも１つをラット宿主胚に導入してＦ０胚を作出することと；
（ｃ）Ｆ０胚を代理母に移植することと；
（ｄ）代理母にてＦ０胚を出産予定日まで妊娠維持させることと；
（ｅ）標的とされた遺伝子組換えを有するＦ０ラットを特定することとを含む方法。
（１２０）オスＦ０ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるＦ１子孫を作出することをさらに含む実施形態１１９の方法。
（１２１）オスＦ０ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるＦ１子孫を作出することをさらに含む実施形態１２０の方法。
（１２２）Ｆ１子孫のオスラットをＦ１子孫のメスラットと交配させ、遺伝子組換えについてホモ接合体であるＦ２子孫を得ることをさらに含む実施形態１１９の方法。
（１２３）遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも３％が遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する実施形態１１９〜１２２のいずれか１つの方法。
（１２４）遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも１０％が遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する実施形態１１９〜１２３のいずれか１つの方法。
（１２５）遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも６０％が遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する実施形態１１９〜１２４のいずれか１つの方法。
（１２６）遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞がラット宿主胚と同じラット系統に由来する実施形態１１９〜１２５のいずれか１つの方法。
（１２７）遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞がラット宿主胚と異なるラット系統に由来する実施形態１１９〜１２７のいずれか１つの方法。
（１２８）集団におけるラットＥＳ細胞が、
ａ．ラットＥＳ細胞の少なくとも９０％が正倍数体である；
ｂ．ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が少なくとも１つの多能性マーカーを発現し、少なくとも１つの多能性マーカーはＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む；
ｃ．ラットＥＳ細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットＥＳ細胞株のゲノムを子孫に伝達する；
ｄ．ラットＥＳ細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する；
ｅ．ラットＥＳ細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、ラットＥＳ細胞が球形様のコロニーを形成する；
ｆ．ラットＥＳ細胞がＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＬＩＦ及びＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層を含む培地にて試験管内で培養されると多能性を維持する；
ｇ．ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す；
ｈ．傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要とすることなく、ラットＥＳ細胞が試験管内で多能性を維持する；
ｉ．ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する；
ｊ．ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する；
ｋ．ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏｌから選択される１以上の分化マーカーを発現しない；
ｌ．ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２またはそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉性マーカーを発現しない；
ｍ．ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７またはそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉性マーカーを発現しない；及び／または
ｎ．ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６またはそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない；を含む、上記クレームのいずれかのラットＥＳ細胞の単離された集団、上記クレームのいずれかの試験管内培養物、または上記クレームのいずれかの方法。
【０００８】
特許または出願のファイルはカラーで実行された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を伴った本特許または特許出願公開のコピーは要請及び必要な料金の支払いがあると特許庁によって提供されるであろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ＡＣＩラットまたはダークアグーチ（ＤＡ）ラットから選択される系統の単離されたラットＥＳ細胞であって、前記単離されたラットＥＳ細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である、前記単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２）
ラットＥＳ細胞がＡＣＩラットに由来する項目１に記載の単離されたラットＥＳ細胞。（項目３）
ラットＥＳ細胞がＤＡラットに由来する項目１に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目４）
ラットＥＳ細胞が正倍数体であり、生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である項目１、２または３に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目５）
ラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む項目４に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目６）
ラットＥＳ細胞が少なくとも６０％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目４に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目７）
ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す項目１〜６のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目８）
ラットＥＳ細胞が連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目１〜７のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目９）
ラットＥＳ細胞が１以上、２以上または３以上の標的とされた遺伝子組換えを含む項目１〜８のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１０）
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目９に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１１）
標的とされた遺伝子組換えが細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも１回の挿入を含む項目９に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１２）
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む項目１１に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１３）
（ａ）選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非減衰性の選択マーカー遺伝子を含む、または（ｂ）ラットＥＳ細胞が選択マーカーをコードする少なくとも２コピーのポリヌクレオチドを含む項目１２に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１４）
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目１２に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１５）
ラットＥＳ細胞が、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培養物におけるフィーダー細胞層上に置かれると、球形様のコロニーを形成する項目１〜１４のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１６）
ラットＥＳ細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する項目１〜１５のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１７）
ラットＥＳ細胞が多能性を維持するために傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としない項目１〜１６のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１８）
ラットＥＳ細胞がオス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞である項目１〜１７のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１９）
ラットＥＳ細胞がメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である項目１〜１７のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２０）
ラットＥＳ細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地にて少なくとも１１回まで継代することができる項目１〜１９のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２１）
ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する項目１〜２０のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２２）
ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏ１及びそれらの組み合わせから選択される１以上の多能性マーカーを発現しない項目１〜２１のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２３）
ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２及びそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉マーカーを発現しない項目１〜２２のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２４）
ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７及びそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉マーカーを発現しない項目１〜２３のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２５）
ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６及びそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない項目１〜２４のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２６）
細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ及びそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目１〜２５のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２７）
ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、及びそれらの組み合わせの１以上から選択されるラットＥＳ細胞に特異的な遺伝子の１以上の発現を特徴とする項目１〜２６のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２８）
ラットＥＳ細胞の単離された集団であって、前記ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置くと球形様のコロニーを形成する、前記ラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目２９）
ラットＥＳ細胞がＡＣＩラットに由来する項目２８に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３０）
ラットＥＳ細胞がダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する項目２８に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３１）
ラットＥＳ細胞が、生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である項目２８〜３０のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３２）
ラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目２８〜３１のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３３）
ラットＥＳ細胞が少なくとも６０％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目２８〜３１のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３４）
ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す項目２８〜３３のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３５）
ラットＥＳ細胞が連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目２８〜３４のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３６）
ラットＥＳ細胞が１以上、２以上または３以上の標的とされた遺伝子組換えを含み、生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することができる項目２８〜３５のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３７）
標的とされた遺伝子組換えがラットのＲｏｓａ２６遺伝子座におけるものである項目３６に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３８）
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目３６に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３９）
標的とされた遺伝子組換えが細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも１回の挿入を含む項目３６に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４０）
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む項目３９に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４１）
（ａ）選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または
（ｂ）ラットＥＳ細胞が選択マーカーをコードする少なくとも２コピーのポリヌクレオチドを含む項目４０に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４２）
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目４０に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４３）
細胞が、ＬＩＦポリペプチド、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培養物におけるフィーダー細胞上に置かれると、球形様のコロニーを形成する項目２８〜４２のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４４）
細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する項目２８〜４３のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４５）
細胞が多能性を維持するために傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としない項目２８〜４４のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４６）
ラットＥＳ細胞がオス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞である項目２８〜４５のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４７）
ラットＥＳ細胞がメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である項目２８〜４５のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４８）
ラットＥＳ細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地にて少なくとも１１回まで継代することができる項目２８〜４７のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４９）
ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する項目２８〜４８のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５０）
ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏ１及びそれらの組み合わせから選択される１以上の多能性マーカーを発現しない項目２８〜４９のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５１）
ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２及びそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉マーカーを発現しない項目２８〜５０のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５２）
ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７及びそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉マーカーを発現しない項目２８〜５１のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５３）
ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６及びそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない項目２８〜５２のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５４）
ラットＥＳ細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ及びそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目２８〜５３のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５５）
ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、及びそれらの組み合わせから選択される１以上のラットＥＳ細胞に特異的な遺伝子の発現を特徴とする項目２８〜５４のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目５６）
集団が少なくとも１０４個の細胞を含む項目２８〜５５のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５７）
ラットＥＳ細胞が、
ａ．ラットＥＳ細胞の少なくとも９０％が正倍数体である；
ｂ．ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が少なくとも１つの多能性マーカーを発現し、少なくとも１つの多能性マーカーはＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む；
ｃ．ラットＥＳ細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットＥＳ細胞株のゲノムを子孫に伝達する；
ｄ．ラットＥＳ細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、ラットＥＳ細胞が球形様のコロニーを形成する；及び／または
ｅ．ラットＥＳ細胞はＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＬＩＦ及びＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層を含む培地にて試験管内で培養すると多能性を維持する；を含む１以上の特徴を有する項目２８〜５６のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５８）
（ａ）ラットＥＳ細胞がラット胚盤胞に由来する、（ｂ）ラットＥＳ細胞がラット桑実胚期の胚に由来する、及び／または（ｃ）ラットＥＳ細胞が過排卵ラットに由来する項目２８〜５７のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５９）
フィーダー細胞層と、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞の集団と、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地とを含む試験管内培養物であって、ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、ラットＥＳ細胞が球形様のコロニーを形成する、前記試験管内培養物。
（項目６０）
ラットＥＳ細胞がフィーダー細胞層にゆるやかに接着する項目５９に記載の試験管内培養物。
（項目６１）
ラットＥＳ細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である項目５９または６０に記載の試験管内培養物。
（項目６２）
ラットＥＳ細胞がＡＣＩラットに由来する項目５９〜６１のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６３）
ラットＥＳ細胞がダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する項目５９〜６１のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６４）
ラットＥＳ細胞が生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である項目５９〜６３のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６５）
ラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む項目６４に記載の試験管内培養物。
（項目６６）
ラットＥＳ細胞が少なくとも６０％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目６４に記載の試験管内培養物。
（項目６７）
ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す項目５９〜６６のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６８）
ラットＥＳ細胞が、連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目５９〜６７のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６９）
ラットＥＳ細胞が、１以上、２以上または３以上の標的とされた遺伝子組換えを含む項目５９〜６８のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７０）
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目６９に記載の試験管内培養物。
（項目７１）
標的とされた遺伝子組換えがラットＥＳ細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも１回の挿入を含む項目６９に記載の試験管内培養物。
（項目７２）
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーである項目７１に記載の試験管内培養物。
（項目７３）
（ａ）選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または（ｂ）ラットＥＳ細胞が選択マーカーをコードする少なくとも２コピーのポリヌクレオチドを含む項目７２に記載の試験管内培養物。
（項目７４）
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目７２に記載の試験管内培養物。
（項目７５）
細胞が多能性を維持するために傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としない項目５９〜７４のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７６）
ラットＥＳ細胞がオス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞である項目５９〜７５のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７７）
ラットＥＳ細胞がメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である項目５９〜７５のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７８）
ラットＥＳ細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地にて少なくとも１１回まで継代することができる項目５９〜７７のいずれか１項に記載の試験管内培養物。（項目７９）
ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する項目５９〜７８のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８０）
ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏ１及びそれらの組み合わせから選択される１以上の多能性マーカーを発現しない項目５９〜７９のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８１）
ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２及びそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉マーカーを発現しない項目５９〜８０のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８２）
ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７及びそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉マーカーを発現しない項目５９〜８１のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８３）
ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６及びそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない項目５９〜８２のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８４）
細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目５９〜８３のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８５）
ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせから選択されるラットＥＳＣに特異的な遺伝子の１以上の発現を特徴とする項目５９〜８４のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８６）
ＬＩＦの濃度が約５０Ｕ／ｍｌ〜約１５０Ｕ／ｍｌである項目５９〜８５のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８７）
ＬＩＦの濃度が約１００Ｕ／ｍｌである項目５９〜８５のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８８）
ＬＩＦがマウスに由来するまたは配列番号１に対して少なくとも９１％の配列同一性を含む項目５９〜８７のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８９）
フィーダー細胞層がＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされない項目５９〜８８のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９０）
フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む項目５９〜８９のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９１）
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１を含む項目５９〜９０のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９２）
ＧＳＫ-３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１を含む項目５９〜９１のいずれか１項に記載
の試験管内培養物。
（項目９３）
ラットＥＳ細胞の集団がラット胚盤胞期の胚またはラット桑実胚期の胚に由来する項目５９〜９２のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９４）
胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚がさらにラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を含む項目９３に記載の試験管内培養物。
（項目９５）
ラットＥＳ細胞の集団がラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の単離された増殖物を含む項目９３に記載の試験管内培養物。
（項目９６）
ラットの胚性幹（ＥＳ）細胞株の生成方法であって、
（ａ）フィーダー細胞層と胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚とを試験管内で培養すること、その際、胚盤胞期のまたは桑実胚期のラット胚の透明帯は取り除かれており、培養条件はラットＥＳ細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）または配列番号１に対して少なくとも９１％の配列同一性を有し、且つＬＩＦ活性を有する配列、及びＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を有する培地を含むことと、
（ｂ）ラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を第２のフィーダー細胞層を十分に含む試験管内培養物に移すことと、
（ｃ）マウスＬＩＦまたはマウスＬＩＦの活性のある変異体を有する培地を含む条件下で前記増殖物を培養し、それによってラットＥＳ細胞の多能性を維持し、それからラットＥＳ細胞株を樹立することとを含む、前記方法。
（項目９７）
ラットＥＳ細胞株が少なくとも５回継代される項目９６に記載の方法。
（項目９８）
ラットＥＳ細胞株が少なくとも１０回継代される項目９６または９７に記載の方法。
（項目９９）
培地が約５０Ｕ／ｍＬ〜約１５０Ｕ／ｍＬのマウスＬＩＦを含む項目９６、９７または９８に記載の方法。
（項目１００）
培地が約１００Ｕ／ｍＬのマウスＬＩＦを含む項目９６〜９９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０１）
第１及び第２のフィーダー細胞層がＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされない項目９６〜１００のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０２）
第１及び第２のフィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む項目９６〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０３）
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１を含む項目９６〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０４）
ＧＳＫ-３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１を含む項目９６〜１０３のいずれか１項に記
載の方法。
（項目１０５）
（ａ）ラットＥＳ細胞株がＡＣＩラットに由来するまたはダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する；及び／または（ｂ）ラットＥＳ細胞株が過排卵させたラットからの桑実胚期のまたは胚盤胞期のラット胚に由来する項目９６〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０６）
培地がさらに、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤またはＡＬＫ阻害剤の少なくとも１つを含む項目９６〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０７）
ＦＧＦ受容体阻害剤がＰＤ１８４３５２を含み、ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２を含み、またはＡＬＫ阻害剤がＡ−８３−０１を含む項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
ラットＥＳ細胞株が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目９６〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０９）
標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率が少なくとも６０％である項目９６〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１０）
そのゲノムの中に非相同のポリヌクレオチドを安定的に組み入れているラットの胚性幹（ＥＳ）細胞の選択方法であって、（ａ）ラットＥＳ細胞の試験管内集団を提供することと、（ｂ）前記ラットＥＳ細胞にて活性のあるプロモータに操作可能に連結された選択マーカーを含む非相同のポリヌクレオチドを少なくとも１つのラットＥＳ細胞に導入することと、（ｃ）交互に入れ替える第１と第２の培養培地にて前記ラットＥＳ細胞集団を試験管内で培養し、それによってそのゲノムの中に前記非相同のポリヌクレオチドを安定的に統合しているラットＥＳ細胞を選択することとを含み、その際、前記第１の培養培地は第１の期間、有効量の選択剤を含み、前記第２の培養培地は選択剤を含まず、試験管内の培養条件が多能性を維持するのに十分である、前記方法。
（項目１１１）
第１の培養培地と第２の培養培地が２４時間ごとに交互に入れ替えられる項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
選択マーカーが抗生剤への耐性を付与する項目１１０または１１１に記載の方法。
（項目１１３）
抗生剤がＧ４１８を含む項目１１０〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１４）
選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、プロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）及び単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）またはそれらの組み合わせを含む項目１１０〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１５）
（ａ）選択マーカーが野生型選択マーカーに比べて高い活性を有する、及び／または（ｂ）選択マーカーの複数のコピーがラットＥＳ細胞のゲノムに安定的に組み込まれる項目１１０〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１６）
選択マーカーが非弱毒化選択マーカーである項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
単離されたラット胚性幹（ＥＳ）細胞の遺伝子組換え方法であって、項目１〜２７のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞を形成することを含む、前記方法。
（項目１１８）
遺伝子組換えしたラットの作製方法であって、
（ａ）項目１〜２７のいずれか１項に記載の単離されたラット胚性幹（ＥＳ）細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞を形成することと；
（ｂ）標的とされた遺伝子組換えを含むラットＥＳ細胞の少なくとも１つをラット宿主胚に導入してＦ０胚を作出することと；
（ｃ）Ｆ０胚を代理母に移植することと；
（ｄ）代理母にてＦ０胚を出産予定日まで妊娠維持させることと；（ｅ）標的とされた遺伝子組換えを有するＦ０ラットを特定することとを含む、前記方法。
（項目１１９）
オスＦ０ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるＦ１子孫を作出することをさらに含む項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
Ｆ１子孫のオスラットをＦ１子孫のメスラットと交配させ、遺伝子組換えについてホモ接合体であるＦ２子孫を得ることをさらに含む項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも３％が遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する項目１１８〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２２）
遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも１０％が遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する項目１１８〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２３）
遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも６０％が遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する項目１１８〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２４）
遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞がラット宿主胚と同じラット系統に由来する項目１
１８〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２５）
遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞がラット宿主胚と異なるラット系統に由来する項目１１８〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２６）
集団におけるラットＥＳ細胞が、
(ａ)ラットＥＳ細胞の少なくとも９０％が正倍数体である；
(ｂ)ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が少なくとも１つの多能性マーカーを発現し、前記少なくとも１つの多能性マーカーはＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む；
(ｃ)ラットＥＳ細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットＥＳ細胞株のゲノムを子孫に伝達する；
(ｄ)ラットＥＳ細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する；
(ｅ)ラットＥＳ細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、球形様のコロニーを形成する；
(ｆ)ラットＥＳ細胞がＧＳＫ３阻害剤と、ＭＥＫ阻害剤と、ＬＩＦと、ＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層とを含む培地にて試験管内で培養されると多能性を維持する；
(ｇ)ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す；
(ｈ)傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要とすることなく、ラットＥＳ細胞が試験管内で多能性を維持する；
(ｉ)ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する；
(ｊ)ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する；
(ｋ)ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏｌから選択される１以上の分化マーカーを発現しない；
(ｌ)ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２またはそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉性マーカーを発現しない；
(ｍ)ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７またはそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉性マーカーを発現しない；及び／または
(ｎ)ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６またはそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない；を含む、上記項目のいずれかに記載のラットＥＳ細胞の単離された集団、上記項目のいずれかに記載の試験管内培養物、または上記項目のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ディッシュにてごく普通に解離し、浮かぶ小型の球状コロニーとして増殖するｒＥＳＣを示す図である。
【図２】ｒＥＳＣによって発現された種々の多能性マーカーを示す。ＡはＯｃｔ−４（緑色）を表し；ＢはＳｏｘ−２（赤色）を表し；ＣはＤＡＰＩ（青色）を表し；ＤはｒＥＳＣによって発現された多能性マーカーの重ね合わせを表す。
【図３】ｒＥＳＣが明るいレベルのアルカリホスファターゼ（多能性マーカー）を発現し（左）、ＤＡ．２Ｂ細胞株の核型は４２Ｘ，Ｙ（右）であることを示す図である。ｒＥＳＣは四倍体になることが多いので核型分析を行った；分裂中期の染色体の広がりを数えることによって細胞株を予備スクリーニングし、次いで最も正常な数を持つ細胞株の核型分析を本式に行った。
【図４】図１のｒＥＳＣのさらに綿密な視野を示す。
【図５】胚盤胞の注入及び生殖系列を介したｒＥＳＣのゲノムの伝達によるキメラの作出；親ＡＣＩ．Ｇ１ｒＥＳＣを用いた胚盤胞の注入によって作出したキメラを示す図であり、高い比率のキメラが普通アルビノの鼻先を有する。
【図６】図５における星印（＊）で標識したＡＣＩ／ＳＤキメラが父親であるアルビノの同腹仔を伴ったＦ１アグーチの仔を示す図である。
【図７】パネルＡは同じ間隔でマウスにおけるようにＳｅｔｄ５とＴｈｕｍｐｄ３遺伝子の間にあるラットＲｏｓａ２６遺伝子座の標的化を示す図である。パネルＡはマウスのＲｏｓａ２６遺伝子座の構造を示す。ｍＲｏｓａ２６の転写物は２または３のエクソンから成る。パネルＢはｒＲｏｓａ２６遺伝子座の構造を示し；ラットの遺伝子座はマウスのエクソン１の相同のエクソン（Ｅｘ１ａ）に加えて第２のエクソン１（Ｅｘ１ｂ）を含有し、ラットでは第３のエクソンは同定されていない。パネルＣは標的とされたｒＲｏｓａ２６対立遺伝子を示し；５ｋｂの相同性アームはそれぞれＤＡｒＥＳＣに由来するゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによってクローニングされた；標的とされた対立遺伝子はｒＲｏｓａ２６イントロンにて１１７ｂｐの欠失を置き換えるＳＡ−ｌａｃＺ−ｈＵＢ−ネオカセットを含有する。
【図８Ａ】（Ａ）Ｘ−ｇａｌで処理した１４週齢の野生型ラットの対照脳を示す。対照脳はＬａｃＺについて低いレベルのバックグラウンド染色を示した（背面写真
【図８Ｂ】（Ｂ）ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体ラット（１４週齢）の脳におけるＬａｃＺの発現を示す。ＬａｃＺレポーターはｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体の脳全体にわたって普遍的に発現された
【図８Ｃ】（Ｃ）Ｘ−ｇａｌで処理した１４週齢の野生型ラットの対照の心臓及び胸腺（差し込み図）を示す。対照の心臓及び胸腺はＬａｃＺについて低いレベルのバックグラウンド染色を示した。
【図８Ｄ】（Ｄ）１４週齢のｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体ラットの心臓及び胸腺（差し込み図）におけるＬａｃＺの発現を示す。ＬａｃＺレポーターはｒＲＯＳＡ２６ヘテロ接合体の心臓及び胸腺全体にわたって普遍的に発現された。
【図８Ｅ】（Ｅ）Ｘ−ｇａｌで処理した１４週齢の野生型ラットの対照肺を示す。対照肺はＬａｃＺについて低いレベルのバックグラウンド染色を示した。
【図８Ｆ】（Ｆ）１４週齢のｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体ラットの肺におけるＬａｃＺの発現を示す。ＬａｃＺレポーターはｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体の肺全体にわたって普遍的に発現された。
【図８Ｇ−Ｈ】（Ｇ）及び（Ｈ）ｅ１２．５の胚におけるＬａｃＺの発現を示す。低いレベルのバックグラウンドＬａｃＺ染色を示す野生型の対照胚（Ｈ）とは対照的に、ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体の胚は胚全体にわたるＬａｃＺレポーターの普遍的な発現を示した。
【図８Ｉ−Ｊ】（Ｉ）及び（Ｊ）ｅ１４．５の胚におけるＬａｃＺの発現を示す。低いレベルのバックグラウンドＬａｃＺ染色を示す野生型の対照胚（Ｊ）とは対照的に、ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体のラット胚は胚全体にわたるＬａｃＺレポーターの普遍的な発現を示した。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｂは、ＡＣＩ．Ｇ１ラットのＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真である。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂは、ＡＣＩ．Ｇ１ラットのＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真である。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＤＡ．２ＢラットのＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真である。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＤＡ．２ＢラットのＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真である。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ＤＡ．Ｃ２ラットのＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ＤＡ．Ｃ２ラットのＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本方法及び組成物は、方法及び組成物の一部、しかしすべてではない実施形態が示される添付の図面を参照して今や下文でさらに完全に記載される。実際、これらの方法及び組成物は多数の異なる形態で具現化されてもよく、本明細書で言及される実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は本開示が適用可能な法的要件を満たすように提供される。全体を通して類似の番号は類似の要素を参照する。
【００１１】
前述の記載及び関連する図面にて提示された教示の利益を有する本方法及び組成物が関係する当該技術の当業者に、本明細書で言及される方法及び組成物の多数の改変及び他の実施形態が思い浮かぶであろう。従って、方法及び組成物は開示される特定の実施形態に限定されるべきではなく、他の実施形態が添付のクレームの範囲内に含まれることが理解されるべきである。特定の用語が本明細書で採用されるけれども、それらは一般的な且つ記述的な意味のみで使用され、限定の目的では使用されない。
【００１２】
Ｉ．概説
ラットは長い間、循環器疾患、代謝、毒性学、神経生物学及び行動のような生物医学の幾つかの分野で好まれる齧歯類のモデル生物である。数百系統のラットが開発されており、一部は、たとえば、高血圧症、糖尿病及び癌のような複雑なヒト疾患の優れたモデルである。しかしながら、制御された方法でラットのゲノムを操作することの困難さによってこれらのモデルの遺伝学を理解することにおける進歩は大幅に妨げられている。部位特異的変異誘発の使用を介して、当該遺伝子に突然変異を生じることは可能ではあるが、この方法は不正確で高価なままである。ラットＥＳ細胞の標的化及び生殖系列伝達は達成するには困難な課題のままである。
【００１３】
ラットの２つの近交系からのラットのＥＳ細胞（ｒＥＳＣ）の単離が本明細書で記載される。ＤＡ系及びＡＣＩ系からｒＥＳＣが導出された。これらの細胞は多能性マーカーを発現し、正常な４２Ｘ、Ｙの核型を呈する。胚盤胞期のＳＤ宿主胚への微量注入によって高比率のキメラを作出し、双方の系統について生殖系列を介したｒＥＳＣゲノムの伝達が立証された。プラスミドの標的化ベクターを用いて、我々は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座のラット同等物で標的とされた突然変異を作出し、我々は双方の系統で標的とされた対立遺伝子の生殖系列伝達を達成した、これらのヘテロ接合体動物は調べた全段階であらゆる組織でＬａｃＺを発現する。
【００１４】
種々の態様では、ＡＣＩドナーＥＳ細胞から好ましい数のオス子孫を得るためにＥＳ細胞はＡＣＩ系から導出した。一実施形態では、オス子孫の量は約５０％である。
【００１５】
種々の態様では、主としてメス子孫を得るためにＥＳ細胞はＤＡ系から導出した。
【００１６】
ＩＩ．ラットの胚性幹（ＥＳ）細胞
ラットに由来する胚性幹細胞を含む種々の組成物及び方法が本明細書で提供される。幹細胞は無限に自己複製する能力を持つ細胞集団であり、多能性である。「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」は胚または胎児から得られる幹細胞を含む。本明細書で提供される種々のラットＥＳ細胞は以下の特性：
（ａ）ラットＥＳ細胞がラット宿主胚に移植されると、ラットＥＳ細胞株のゲノムが子孫に伝達されることを意味する、生殖系列適格性を有する；
（ｂ）標的とされた遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞がラット宿主胚に移植されると、ラットＥＳ細胞株のゲノム内の標的とされた遺伝子組換えが子孫に伝達されることを意味する、少なくとも１つの標的とされた遺伝子組換えに続いて生殖系列適格性を有する；
（ｃ）試験管内で多能性を有する；
（ｄ）試験管内で分化全能性を有する；
（ｅ）試験管内で培養するとフィーダー細胞層にゆるく接着する；
（ｆ）試験管内で培養すると試験管内でフィーダー細胞層上に置かれた際、球形様のコロニーを形成する；
（ｇ）白血病阻害因子（ＬＩＦ）を発現するように遺伝子組換えされないフィーダー細胞層を含み、培養培地が十分な濃度のＬＩＦを含む条件下で試験管内で培養すると多能性を維持する；
（ｈ）フィーダー細胞層を含み、培養培地がマウスＬＩＦまたはその活性のある変異体若しくは断片を含む条件下で試験管内で培養すると多能性を維持する；
（ｉ）以下を特徴とする分子署名を含む
（ｉ）接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせを含むラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現；
（ｉｉ）接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせ含むラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の発現；
（ｉｉｉ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１４で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｉｖ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１４で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｖ）表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現；
（ｖｉ）表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の発現；
（ｖｉｉ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｖｉｉｉ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｉｘ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１２で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｘ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１２で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｘｉ）パート（ｉ）〜（ｘ）のラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の発現の任意の組み合わせ；
（ｘｉｉ）列記された多能性マーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８について表１５で示されるような多能性マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の多能性のランク付けの欄を参照；
（ｘｉｉｉ）列記された中胚葉マーカーの少なくとも２、３または４について表１５で示されるような中胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の中胚葉のランク付けの欄を参照；
（ｘｉｖ）列記された内胚葉マーカーの少なくとも２、３、４、５または６について表１５で示されるような内胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の内胚葉のランク付けの欄を参照；
（ｘｖ）列記された神経マーカーの少なくとも２または３について表１５で示されるような神経マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の神経のランク付けの欄を参照；
（ｘｖｉ）列記された栄養外胚葉マーカーについて表１５で示されるような栄養外胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の栄養外胚葉のランク付けの欄を参照；
（ｘｖｉｉ）表１５で示されるような多能性マーカー、中胚葉マーカー、内胚葉マーカー、神経マーカー及び／または栄養外胚葉マーカーの１以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）の相対的な発現レベル。
（ｘｖｉｉｉ）表１５で示されるマーカーのそれぞれの相対的な発現レベル。
（ｘｉｘ）ｘｉｉ〜ｘｉｉｘで示された署名の任意の組み合わせ；及び／または
（ｘｘ）ｉ〜ｘｉｉｘで示された署名の任意の組み合わせ；
（ｊ）Ｆ０ラットを作出する能力を有する；
（ｋ）継代培養され、未分化状態を維持することが可能である；
（ｌ）正常なラット細胞と同じ数の染色体を有する；
（ｍ）傍分泌ＬＩＦのシグナル伝達を必要とせずに試験管内で多能性を維持する；及び／または
（ｎ）多能性を維持しながらそれらが無限に分裂することを意味する、自己複製能を有する；のいずれかの１以上を有することができる。
【００１７】
（ａ）〜（ｎ）で要点が述べられた特徴の１以上が本明細書で提供される単離されたラットＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞集団またはラットＥＳ細胞株にて存在することができ、その際、ラットＥＳ細胞は標的とされた遺伝子組換えを受けていない。他の実施形態では、（ａ）〜（ｎ）で要点が述べられた特徴の１以上が、１以上の標的とされた遺伝子組換えを有する本明細書で提供される単離されたラットＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞集団またはラットＥＳ細胞株にて存在することができる。標的とされた遺伝子組換えはラットＥＳ細胞のゲノムにおける変化を含み、たとえば、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、突然変異またはそれらの組み合わせを含む。他の例では、標的とされた遺伝子組換えはラットＥＳ細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも１回の挿入を含む。そのような標的とされた遺伝子組換えのさらなる記載は本明細書のどこかで議論される。
【００１８】
特定の実施形態では、本明細書で提供される種々のラットＥＳ細胞及び細胞株は、ラットＥＳ細胞がラット宿主胚に移植されると、ラットＥＳ細胞株のゲノムが子孫に伝達されることを意味する、生殖系列適格性である。そのような子孫への伝達（すなわち、Ｆ１集団）はラットＥＳ細胞が標的とされた遺伝子組換えを受けていない場合に生じることができる。加えて、標的とされた遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞も、標的とされた遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞がラット宿主胚に移植されると、ラットＥＳ細胞株の標的とされた遺伝子組換えが子孫に伝達される（すなわち、Ｆ１集団）ことを意味する、生殖系列適格性である。従って、種々の態様では、本明細書で記載されるラットＥＳ細胞及び方法を用いて、標的とされた遺伝子組換えを受けていないラットＥＳ細胞及び標的とされた遺伝子組換えを受けているラットＥＳ細胞の双方に由来するラット細胞のゲノムの高頻度のまたは高効率の生殖系列伝達を得る。種々の実施形態では、生殖系列伝達の頻度は、１：６００を上回る、１：５００を上回る、１：４００を上回る、１：３００を上回る、１：２００を上回る、または１：１００を上回る。種々の実施形態では、生殖系列伝達の頻度は、１％を上回る、２％を上回る、３％を上回る、４％を上回る、５％を上回る、６％を上回る、７％を上回る、８％を上回る、９％を上回る、１０％を上回る、約１６％まで、２５％を上回る、５０％を上回る、６０％を上回る、６５％を上回る、７０％を上回る、７５％を上回るまたはそれ以上である。種々の実施形態では、生殖系列伝達の頻度は、９％〜１６％の範囲である。種々の態様では、Ｆ１生成におけるドナーｒＥＳＣに由来する子孫の比率は、１％以上、２％以上、３％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、３％〜約１０％以上；３％以上〜約６３％、約１０％〜約３０％、約１０％〜約５０％、約３０％〜約７０％、約３０％〜約６０％、約２０％〜約４０％、約２０％〜６５％、または約４０％〜７０％である。従って、標的とされた遺伝子組換えを受けていない本明細書で提供されるラットＥＳ細胞または代わりに、標的とされた遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞はそのゲノムをＦ１集団に伝達する能力を有する。
【００１９】
標的とされた遺伝子組換えを受けていないラットＥＳ細胞または標的とされた遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞は多能性及び／または分化全能性であることができる。「多能性の」または「多能性」は、３つの胚葉：外胚葉、中胚葉または内胚葉のいずれかに分化する能力を有する幹細胞を指す。細胞能力は他の細胞型に分化する細胞の能力を記載する一般用語である。たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＨａｎｓら、（２００７）．“Ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａｎ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ”．Ｈｕｍａｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｓ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ａｓｈｇａｔｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｔｄ．ｐ．２８を参照のこと。用語「分化全能性」または「分化全能性の」は分裂し、生物における分化した細胞のすべてを生じる単一細胞の能力である。たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｓｔｅｒｎ、Ｐ．（２００９）．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．５３（２−３）：３９３−４０９を参照のこと。特定の実施形態では、本明細書で開示される種々のＥＳ細胞は多能性及び／または分化全能性のいずれかである。
【００２０】
種々の方法を用いてラットＥＳ細胞が多能性であるかどうかを決定することができる。たとえば、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない種々の多能性マーカーの発現についてＥＳ細胞をアッセイすることができる。そのようなマーカーの存在またはレベルについてアッセイする種々の方法については、たとえば、Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｋ．ら，Ｃｅｌｌ，６０：４６１−４７２（１９９０），Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｈ．Ｒ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２１８５−２１９５（１９９０）及びＮａｎｏｇ（Ｍｉｔｓｕｉ，Ｋ．ら，Ｃｅｌｌ，１１３：６３１−６４２（２００３），Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．ら，Ｃｅｌｌ，１１３：６４３−６５５（２００３）を参照のこと。本明細書で提供される図２及び図３を参照のこと。他の多能性マーカーには、たとえば、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、Ｄｐｐａ２、Ｆｇｆ４、Ｒｅｘ１、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ及び／またはＳａｌｌ３を含む少なくとも１、２、３、４または５の多能性マーカーの存在が挙げられる。他の多能性マーカーには、たとえば、Ｔ／Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｆｌｋ１、Ｎｏｄａｌ、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ２、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｈｈｅｘ１、Ｓｏｘ７、及び／またはＰａｘ６を含む少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の多能性マーカーの非存在が挙げられる。
【００２１】
特定の実施形態では、これらのマーカーの発現及び／または発現のレベルはＲＴ−ＰＣＲを用いて決定することができる。たとえば、ＡＬＰ組織染色キット（Ｓｉｇｍａ）及びベクターレッドアルカリホスファターゼ基質キットＩ（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ）等を含む、アルカリホスファターゼのレベル及び／または存在を測定するための種々のキットが利用可能である。追加のアッセイには、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、免疫組織化学、免疫蛍光が挙げられる。特定の実施形態では、ラットＥＳ細胞は、たとえば、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つの多能性マーカー、好ましくはこれらマーカーの３つすべての発現を特徴とする。
【００２２】
本明細書で提供される種々のラットＥＳ細胞（すなわち、標的とされた遺伝子組換えを受けていないラットＥＳ細胞及び／または標的とされた遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞）は、試験管内での培養条件で維持されながら多能性及び／または分化全能性を維持することが可能である。従って、本明細書で提供される種々のラットＥＳ細胞は、一部の実施形態では、未分化状態を維持しながら継代培養することができる。ラットＥＳ細胞を培養する種々の方法が本明細書のどこかでさらに詳細に議論される。
【００２３】
本明細書で提供されるラット胚性幹細胞は、本明細書のどこかで詳細に議論される種々の単離、精製及び培養増殖の技法を用いてラットの胚から単離されている。用語「細胞」は本明細書で使用されるとき、個々の細胞、細胞株またはそのような細胞に由来する培養物を指す。「単離された」ラットＥＳ細胞またはラット胚はその天然の環境から取り出されている。用語「単離された」は、成分が天然の状態で見いだされる構成成分の７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含まないことを意味することができる。本明細書で提供されるとき、ラットＥＳ「細胞株」は、単一のラットＥＳ細胞から発生した単離されたラット細胞の集団を含んでいるので、所与の細胞株の中での細胞の集団は、増殖の間でまたは標的とされた遺伝子組換えの間で生じる突然変異または核型の変化について以外、均一な遺伝的性質を有する。たとえば、どこかで示されるように、開示されるラットＥＳ細胞は高レベルの正倍数性を特徴とする。にもかかわらず、一部の細胞株では、単一細胞からの細胞株の増殖における核型の変化のために、正倍数性のレベルは１００％未満である。さらに、ラットＥＳ細胞の所与の集団は少なくとも１０３、１０４、１０×１０４、１０×１０５、１０×１０６、１０×１０７、１０×１０８、１０×１０９、または１０×１０１０以上の細胞を含むことができる。一部の細胞集団は所望の改変された細胞の選択を可能にするのに十分な細胞を有するが、細胞株で発生する突然変異または核型の変化の可能性を減らすために過剰に多くの数を有さない。たとえば、一部の細胞集団は１０３〜１０６の細胞を有する。
【００２４】
本明細書のどこかで議論されるように、ラットＥＳ細胞株の標的とされた遺伝子組換えのための種々の方法が提供される。そのような方法が実施される場合、ラットＥＳ細胞株の範囲内で少なくとも１つの細胞が標的とされた遺伝子組換えを含有する。種々の培養法及び／または選択法を介して１以上の所望の標的とされた遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞が提供される。
【００２５】
特定の実施形態では、ラットＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞の集団またはラットＥＳ細胞株（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は正倍数体であるので、半数体の数の正確な倍数である染色体数を有する。さらなる実施形態では、ラットＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞の集団またはラットＥＳ細胞株（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は二倍体なので、相同染色体の半数体２セットを有する。ラットＥＳ細胞集団またはラットＥＳ細胞若しくはラットＥＳ細胞株の所与の集団に由来する細胞の集団（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）を参照する場合、所与の集団での細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は正倍数体及び／または二倍体である。他の例では、ラットＥＳ細胞集団または所与のラットＥＳ細胞株に由来する細胞の集団（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）を参照する場合、所与の集団での細胞の少なくとも約５０％〜９５％、約６０％〜９０％、約６０％〜９５％、約６０％〜８５％、約６０％〜８０％、約７０％〜８０％、約７０％〜８５％、約７０％〜約９０％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約１００％、約９０％〜約９９％、約９０％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９０％〜約９５％は正倍数体及び／または二倍体である。
【００２６】
その上さらなる実施形態では、ラットＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞の集団またはラットＥＳ細胞株（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は４２本の染色体を有する。ラットＥＳ細胞集団または所与のラットＥＳ細胞株に由来する細胞の集団（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）を参照する場合、所与の集団での細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は４２本の染色体を有する。他の例では、ラットＥＳ細胞集団または所与のラットＥＳ細胞株に由来する細胞の集団（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）を参照する場合、所与の集団内での細胞の少なくとも約５０％〜９５％、約６０％〜９０％、約６０％〜９５％、約６０％〜８５％、約６０％〜８０％、約７０％〜８０％、約７０％〜８５％、約７０％〜約９０％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約１００％、約９０％〜約９９％、約９０％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９０％〜約９５％は４２本の染色体を有する。
【００２７】
さらなる実施形態では、本明細書で提供されるラットＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞の集団またはラットＥＳ細胞株（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は試験管内でフィーダー細胞層上の置かれると球形様のコロニーを形成する。「球形様」の形態は個々のＥＳ細胞の形状ではなく、培養物におけるラットＥＳ細胞コロニーの形状を指す。ラットＥＳ細胞コロニーは球形様である。フィーダー細胞層にゆるく接着するコロニーは丸く見える（丸い形態を有する）。自由に浮かんでいるコロニーは球形様である。ラットＥＳ細胞のコロニーは球形様であり、非常に密であるということは細胞間の境界は非常に見にくいことを意味する。コロニーの縁は明るく且つくっきりして見える。個々の核は細胞が非常に小さい（ので核が細胞の容積のほとんどを占める）ので区別するのが難しい。マウスのＥＳ細胞は細長いコロニーを形成し、フィーダー細胞に強く接着する。ｍＥＳＣの形態は系統によって異なり、たとえば、Ｂ６のコロニーはＦ１Ｈ４のコロニーよりも丸くドーム形状であるが、依然としてｒＥＳＣよりも細長い。ヒトのＥＳ細胞のコロニーはｍＥＳＣよりも平坦で広く広がる。本ラットＥＳコロニーは平坦ではなく、ヒトのＥＳ細胞のコロニーには似ていない。
【００２８】
その上さらなる実施形態では、ラットＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞の集団またはラットＥＳ細胞株（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は円形の形態を有する。円形の形態スケールを以下に提供するが、１０のスコアは完璧な円形を表し、１のスコアは楕円形を表す。
円形の形態スケール：
１０＝構造の中心を通って走り、長さが等しい長手軸と縦軸を有する構造を持つ円形。
９＝構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの０．９９９９〜０．９３５７の間である長手軸と縦軸を有する構造。
８＝構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの０．９３５７〜０．８７５の間である長手軸と縦軸を有する構造。
７＝構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの０．８７５〜０．８１２５の間である長手軸と縦軸を有する構造。
６＝構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの０．８１２５〜０．７５０の間である長手軸と縦軸を有する構造。
５＝構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの０．７５０〜０．６８７５の間である長手軸と縦軸を有する構造。
４＝構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの０．６８７５〜０．６２５の間である長手軸と縦軸を有する構造。
３＝構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの０．６２５〜０．５６２５の間である長手軸と縦軸を有する構造。
２＝円形の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの０．５６２５〜０．５２３の間である長手軸と縦軸を有する構造。
１＝構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの０．５２３〜０．５００の間である長手軸と縦軸と定義される楕円形。
【００２９】
非限定の一実施形態では、所与の集団での細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するラットＥＳ細胞集団または所与のラットＥＳ細胞株に由来する細胞の集団（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は、１０、９または８の円形形態スコアを有する。他の実施形態では、所与の集団内での細胞の少なくとも約５０％〜９５％、約６０％〜９０％、約６０％〜９５％、約６０％〜８５％、約６０％〜８０％、約７０％〜８０％、約７０％〜８５％、約７０％〜約９０％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約１００％、約９０％〜約９９％、約９０％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９０％〜約９５％を有するラットＥＳ細胞集団または所与のラットＥＳ細胞株に由来する細胞の集団（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は、１０、９または８の円形形態スコアを有する。
【００３０】
非限定の別の実施形態では、所与の集団での細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するラットＥＳ細胞集団または所与のラットＥＳ細胞株に由来する細胞の集団（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は、７、６、５、４または３の円形形態スコアを有する。非限定の他の実施形態では、所与の集団内での細胞の少なくとも約５０％〜９５％、約６０％〜９０％、約６０％〜９５％、約６０％〜８５％、約６０％〜８０％、約７０％〜８０％、約７０％〜８５％、約７０％〜約９０％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約１００％、約９０％〜約９９％、約９０％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９０％〜約９５％を有するラットＥＳ細胞集団または所与のラットＥＳ細胞株に由来する細胞の集団（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は、７、６、５、４または３の円形形態スコアを有する。
【００３１】
その上さらなる実施形態では、ラットＥＳ細胞（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）を試験管内でフィーダー細胞層上の置くと球形様のコロニーが生じる。球形の形態スケールを以下に提供するが、１０のスコアは完璧な球形を表し、１のスコアは三次元楕円構造を表す。
球形様構造の形態スケール：
１０＝球形はそれぞれ構造の中心を通って走り、等しい長さであるＸ軸及びＹ軸及びＺ軸を有する構造である。
９＝構造の中心を通って走り、軸の１つが他の軸の少なくとも１つの長さの０．９９９９〜０．９３５７の間であるＸ軸及びＹ軸及びＺ軸を有する構造。
８＝構造の中心を通って走り、軸の１つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの０．９３５７〜０．８７５の間であるＸ軸及びＹ軸及びＺ軸を有する構造。
７＝構造の中心を通って走り、軸の１つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの０．８７５〜０．８１２５の間であるＸ軸及びＹ軸及びＺ軸を有する構造。
６＝構造の中心を通って走り、軸の１つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの０．８１２５〜０．７５０の間であるＸ軸及びＹ軸及びＺ軸を有する構造。
５＝構造の中心を通って走り、軸の１つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの０．７５０〜０．６８７５の間であるＸ軸及びＹ軸及びＺ軸を有する構造。
４＝構造の中心を通って走り、軸の１つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの０．６８７５〜０．６２５の間であるＸ軸及びＹ軸及びＺ軸を有する構造。
３＝構造の中心を通って走り、軸の１つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの０．６２５〜０．５６２５の間であるＸ軸及びＹ軸及びＺ軸を有する構造。
２＝構造の中心を通って走り、軸の１つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの０．５６２５〜０．５２３の間であるＸ軸及びＹ軸及びＺ軸を有する構造。
１＝構造の中心を通って走り、軸の１つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの０．５２３〜０．５００の間であるＸ軸及びＹ軸及びＺ軸を有する構造。
【００３２】
非限定の一実施形態では、試験管内で細胞がフィーダー細胞層上に置かれると生じるコロニーの少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するラットＥＳ細胞集団または所与のラットＥＳ細胞株に由来する細胞の集団（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は、１０、９または８の球形様形態を有する。他の実施形態では、試験管内で細胞がフィーダー細胞層上に置かれると生じるコロニーの少なくとも約５０％〜９５％、約６０％〜９０％、約６０％〜９５％、約６０％〜８５％、約６０％〜８０％、約７０％〜８０％、約７０％〜８５％、約７０％〜約９０％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約１００％、約９０％〜約９９％、約９０％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９０％〜約９５％を有するラットＥＳ細胞集団または所与のラットＥＳ細胞株に由来する細胞の集団（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は、１０、９または８の球形様形態を有する。
【００３３】
非限定の別の実施形態では、試験管内で細胞がフィーダー細胞層上に置かれると生じるコロニーの少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するラットＥＳ細胞集団または所与のラットＥＳ細胞株に由来する細胞の集団（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は、７、６、５、４または３の球形様形態を有する。他の実施形態では、試験管内で細胞がフィーダー細胞層上に置かれると生じるコロニーの少なくとも約５０％〜９５％、約６０％〜９０％、約６０％〜９５％、約６０％〜８５％、約６０％〜８０％、約７０％〜８０％、約７０％〜８５％、約７０％〜約９０％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約１００％、約９０％〜約９９％、約９０％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９０％〜約９５％を有するラットＥＳ細胞集団または所与のラットＥＳ細胞株に由来する細胞の集団（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は、７、６、５、４または３の球形様形態を有する。
【００３４】
本明細書で提供される所与のラットＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞の集団またはラットＥＳ細胞株は、オス（ＸＹ）のラットＥＳ細胞、オス（ＸＹ）のラットＥＳ細胞の集団またはオス（ＸＹ）のラットＥＳ細胞株であることができる。他の実施形態では、本明細書で提供されるラットＥＳ細胞の集団またはラットＥＳ細胞株は、メス（ＸＸ）のラットＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞のメス（ＸＸ）の集団またはメス（ＸＸ）のラットＥＳ細胞株であることができる。任意のそのようなラットＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞の集団またはラットＥＳ細胞株は上記で記載されたような正倍数性及び／または二倍体性を含むことができる。
【００３５】
本明細書で提供される種々のラットＥＳ細胞は、ＡＣＩラット系統、ダークアグーチ（ＤＡ）ラット系統、ウィスターラット系統、ＬＥＡラット系統、スプラーグドーリー（ＳＤ）ラット系統、またはフィッシャーＦ３４４若しくはフィッシャーＦ６のようなフィッシャーラット系統を含むが、これらに限定されない任意のラット系統に由来することができる。種々のラットＥＳ細胞は、上記で引用された２以上の系統の交雑に由来する系統からも得ることができる。一実施形態では、ラットＥＳ細胞はＤＡ系統及びＡＣＩ系統から選択される系統に由来する。特定の実施形態では、ラットＥＳ細胞はＡＣＩラット系統に由来する。ＡＣＩラット系統は、黒アグーチを有し、白色の腹と脚を持ち、ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴とする。そのような系統はＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む種々の供給元から入手可能である。他の実施形態では、種々のラットＥＳ細胞は、アグーチの被毛とＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴とするダークアグーチ（ＤＡ）ラット系統に由来する。そのような系統はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む種々の供給元から入手可能である。さらなる実施形態では、本明細書で提供される種々のラットＥＳ細胞はラット近交系に由来する。
【００３６】
特定の実施形態では、種々のラットＥＳ細胞株はＡＣＩラットに由来し、本明細書で記載されるようなＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞を含む。別の実施形態では、ラットＥＳ細胞株はＤＡラットに由来し、本明細書で記載されるようなＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株またはＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株を含む。
本明細書で提供される所与のラットＥＳ細胞はラットの胚発生の任意の段階でラット胚から得ることができる。ラットの胚発生の代表的な段階を表１にて以下でまとめる。ラットＥＳ細胞を導出するのに採用されるラット胚は、桑実胚期の胚、胚盤胞期の胚または桑実胚期の胚と胚盤胞期の胚の間での発生段階のラット胚であることができる。従って特定の実施形態では、採用されるラット胚は５及び７のＷｉｔｓｃｈｉの段階であるまたはその間である。他の実施形態では、採用されるラット胚は５、６または７のＷｉｔｓｃｈｉの段階である。
【００３７】
一実施形態では、ラットＥＳ細胞はラットの胚盤胞から得られる。他の実施形態では、ラットＥＳ細胞は過排卵させたラットに由来する胚盤胞から得られる。他の実施形態では、ラットＥＳ細胞は、その後、桑実胚期、胚盤胞期、５と７の間のＷｉｔｓｃｈｉの段階での胚または５、６または７のＷｉｔｓｃｈｉの段階での胚に発生するまで試験管内で培養される８細胞期の胚から得られる。その時点で胚はプレートに載せられる。桑実胚期の胚は内部空洞のない細胞の密な球を含む。胚盤胞期の胚は眼に見える内部空洞（胞胚腔）を有し、内部細胞塊（ＩＣＭ）を含有する。ＩＣＭはＥＳ細胞を形成する。
【表１】
2019062924.tif 000002
【００３８】
さらに提供されるのは、特徴とされる種々のラットＥＳ細胞（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）である。
ラットＥＳ細胞は以下を特徴とする：
（ｉ）接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせを含むラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現；
（ｉｉ）接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせ含むラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の発現；
（ｉｉｉ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１４で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｉｖ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１４で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｖ）表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現；
（ｖｉ）表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の発現；
（ｖｉｉ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｖｉｉｉ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｉｘ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１２で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｘ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１２で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｘｉ）パート（ｉ）〜（ｘ）のラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の発現の任意の組み合わせ；
（ｘｉｉ）列記された多能性マーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８について表１５で示されるような多能性マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の多能性のランク付けの欄を参照；
（ｘｉｉｉ）列記された中胚葉マーカーの少なくとも２、３または４について表１５で示されるような中胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の中胚葉のランク付けの欄を参照；
（ｘｉｖ）列記された内胚葉マーカーの少なくとも２、３、４、５または６について表１５で示されるような内胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の内胚葉のランク付けの欄を参照；
（ｘｖ）列記された神経マーカーの少なくとも２または３について表１５で示されるような神経マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の神経のランク付けの欄を参照；
（ｘｖｉ）列記された栄養外胚葉マーカーについて表１５で示されるような栄養外胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の栄養外胚葉のランク付けの欄を参照；
（ｘｖｉｉ）表１５で示されるような多能性マーカー、中胚葉マーカー、内胚葉マーカー、神経マーカー及び／または栄養外胚葉マーカーの１以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）の相対的な発現レベル。
（ｘｖｉｉｉ）表１５で示されるマーカーのそれぞれの相対的な発現レベル。
（ｘｉｘ）ｘｉｉ〜ｘｉｉｘで示された署名の任意の組み合わせ；及び／または
（ｘｘ）ｉ〜ｘｉｉｘで示された署名の任意の組み合わせ。
【００３９】
一実施形態では、前桑実胚期の胚に移植した場合、ラットＥＳ細胞（標的とされた遺伝子組換えを受けていない及び／または標的とされた遺伝子組換えを有する）は、Ｆ０世代の細胞の少なくとも９０％に寄与し、Ｆ０世代の細胞の少なくとも９５％に寄与し、Ｆ０世代の細胞の少なくとも９６％に寄与し、Ｆ０世代の細胞の少なくとも９７％に寄与し、Ｆ０世代の細胞の少なくとも９８％に寄与し、またはＦ０世代の細胞の少なくとも９９％に寄与することができる。
【００４０】
ＩＩＩ．ラット胚性幹（ＥＳ）細胞の導出及び増殖
本明細書で開示されるラットＥＳ細胞を得るために種々の方法が提供される。特定の実施形態では、そのような方法は、（ａ）フィーダー細胞層と単離されたラット胚性幹（ＥＳ）細胞の集団とを含む試験管内培養物を提供することと、（ｂ）単離されたラットＥＳ細胞の多能性及び／または分化全能性を維持するのに十分である条件下で試験管内で培養することと含む。そのような方法はそれによってラットＥＳ細胞集団及び／またはラットＥＳ細胞株の増殖を可能にする。
【００４１】
一実施形態では、ラット胚性幹細胞株を培養する方法が提供される。そのような方法はフィーダー細胞層とラットＥＳ細胞株とを試験管内で培養することを含み、その際、培養条件はラットＥＳ細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）またはその活性のある変異体若しくは断片を有する培地を含む。種々の方法はさらに、ラットＥＳ細胞株の細胞を継代し、試験管内で培養することを含み、その際、各その後の試験管内培養物は、ラットＥＳ細胞の多能性を維持し、マウスＬＩＦまたはその活性のある変異体若しくは断片を有する培地を含む条件下でフィーダー細胞層上でラットＥＳ細胞を培養することを含む。
【００４２】
（ｉ）培養条件
種々の方法及び組成物で採用される培養培地はラットＥＳ細胞を維持するであろう。用語「維持すること」及び「維持」は本明細書でまとめられるラットＥＳ細胞の特徴または表現型の少なくとも１以上の安定的な保護を指す。そのような表現型には多能性及び／または分化全能性、細胞の形態、遺伝子発現のプロファイル及び本明細書で記載されるラット幹細胞の他の機能的な特徴を維持することを挙げることができる。用語「維持する」はまた、幹細胞の増殖または培養される幹細胞の数の増加を包含することもできる。用語はさらに、幹細胞が分裂し、数を増やし続けても増やし続けなくてもよい一方で、幹細胞が多能性のままであることを可能にする培養条件を熟考する。
【００４３】
用語「フィーダー細胞」または「フィーダー細胞層」は、試験管内で増殖し、培養にて別の当該細胞の増殖を支援するのに使用される少なくとも１つの因子を培養培地に分泌する細胞の培養を指す。本明細書で採用されるフィーダー細胞はラットＥＳ細胞の多能性を維持するのに役立ち、特定の実施形態では、本明細書で記載される他の特徴または表現型の１以上を維持するのに役立つ。たとえば、妊娠１２〜１６日目の間で得られるマウス胚性線維芽細胞を含むマウス胚性線維芽細胞含む種々のフィーダー細胞を使用することができる。特定の実施形態では、フィーダー細胞層は有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む。
【００４４】
ラットＥＳ細胞の試験管内培養物はさらに有効量の白血病阻害因子（ＬＩＦ）またはその活性のある変異体若しくは断片を含む。白血病阻害因子（ＬＩＦ）はＩＬ−６受容体ファミリーに属する。ＬＩＦは、ＬＩＦ特異的なサブユニットｇｐ１９０またはＬＩＦＲ及びＩＬ−６受容体ファミリーの他のメンバーと共有するサブユニットｇｐ１３０で構成されるヘテロ二量体膜受容体に結合する。ＬＩＦはマウスにて胚性幹細胞の分化を阻害し、幹細胞の自己複製能に寄与する。ヒト及びマウスのＬＩＦは７９％の配列相同性を共有し、種交差活性を示す。ラットＬＩＦ（ｒｔＬＩＦ）は２０２のアミノ酸残基を含有する２２．１ｋＤａのタンパク質であり、マウスのＬＩＦと９１％のアミン酸配列同一性を示す（Ｔａｋａｈａｍａら．１９９８）。種々の種に由来するＬＩＦポリペプチドの間で保存されている６つの考えられるアスパラギン結合のグリコシル化（Ｎ−グリコシル化）部位及びラットＬＩＦに特異的であるＡｓｎ１５０の追加部位がある。マウスのＬＩＦの三次構造及びその機能は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＡｉｋａｗａら、（１９９８）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１３１８−１３２５及びＳｅｎｔｕｒｋら、（２００５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ，ｅｄｉｔｏｒ  Ｇｉｌ  Ｍｏｒ．，ＵＳ５，７５０，６５４及びＤ．Ｐ．Ｇｅａｒｉｎｇ、（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９８７−１２−２０にてさらに詳細に記載されている。マウスＬＩＦの部分配列は受入番号Ｐ０９０５６のもとでＳｗｉｓｓＰｒｏｔウェブサイトにて報告されている。
【００４５】
マウスＬＩＦの活性は、Ｍ１骨髄性白血病細胞の分化を誘導する能力によって評価される。比活性は、１×１０６単位／ｍｌ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔのカタログ番号０３−００１１）及び１×１０７単位／ｍｌ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔのカタログ番号０３−００１１−１００）であり、５０単位が培地１ｍｌにおけるＭ１コロニーの５０％で分化を誘導するのに必要とされるマウスＬＩＦの量として定義される。その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ら、（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：６８４−６８７．；Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｄ．ら、（１９８８）、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２：２１６−２２１；Ｎｉｗａ，Ｈ．ら、（２００９）、Ｎａｔｕｒｅ、４６０：１１８−１２２；Ｘｕ，Ｊ．ら、（２０１０）、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３４：７９１−７９７；Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｎ．ら、（２０１０）、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ．１２：３６９−３７６；及びＭｅｔｃａｌｆ、Ｄ．（２００３）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２１：５−１４も参照のこと。「ＬＩＦの有効量」は、試験管内培養物におけるラットＥＳ細胞が未分化で多能性状態のままでいることを可能にするＬＩＦの濃度を含む。多能性状態のままでいる細胞についてアッセイするのに使用することができる種々のマーカーが本明細書のどこかで議論される。
【００４６】
本明細書で提供される種々の方法及び組成物にて採用されるＬＩＦポリペプチドは哺乳類、齧歯類、ヒト、ラットまたはマウスを含む任意の生物に由来することができる。一実施形態では、ＬＩＦポリペプチドはマウスに由来する。その上さらなる実施形態では、マウスＬＩＦポリペプチドはその全体が参照によって本明細書に組み入れられ、配列番号１にても示される、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号Ｐ０９０５６で示されるアミノ酸配列を含む。
【００４７】
他の実施形態では、配列番号１またはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号Ｐ０９０５６で示されるようなマウスＬＩＦポリペプチドの活性のある変異体または断片を使用することができる。そのような活性のある変異体または断片（配列番号１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する活性のある変異体を含む）は本明細書のどこかでさらに詳細に議論される。
【００４８】
ＬＩＦポリペプチドまたは活性のあるその変異体若しくは断片を種々の方法で試験管内培養物に提供することができる。一実施形態では、有効量のＬＩＦポリペプチドまたは活性のあるその変異体若しくは断片が培養培地に加えられる。他の実施形態では、ＬＩＦポリペプチドまたは活性のあるその変異体若しくは断片を過剰発現するようにフィーダー細胞が遺伝子組換えされている。そのようなフィーダー細胞には、マトリクス関連のＬＩＦを発現するγ線照射したまたはマイトマイシン−Ｃ処理したＤＩＡ−Ｍマウスの線維芽細胞から調製されるフィーダー細胞が挙げられる。そのような遺伝子組換えされたフィーダー細胞を生成し、使用する方法は、たとえば、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられるＢｕｅｈｒら、（２００３）、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ、６８：２２２−２２９，Ｒａｔｈｊｅｎら、（１９９０）、Ｃｅｌｌ、６２：１１０５−１１１５及びＢｕｅｈｒら、（２００８）、Ｃｅｌｌ、１３５：１２８７−１２９８にて見いだすことができる。フィーダー細胞で発現される非相同のＬＩＦはフィーダー細胞と同じ生物に由来することができ、またはフィーダー細胞のそれとは異なる生物に由来することができる。加えて、フィーダー細胞で発現される非相同のＬＩＦはフィーダー層が支えているＥＳ細胞と同じまたは異なる生物に由来することができる。
【００４９】
さらに他の実施形態では、本明細書で開示される種々の方法で採用されるフィーダー細胞は非相同のＬＩＦポリペプチドまたは活性のあるその変異体若しくは断片を発現するように遺伝子組換えされない。従って、特定の実施形態では、方法にて採用される有糸分裂上不活化されたマウスの胚性線維芽細胞の単層は非相同のＬＩＦポリペプチドを発現するように遺伝子組換えされない。
【００５０】
他の実施形態では、ＬＩＦポリペプチドまたは活性のあるその変異体若しくは断片が培養培地に加えられる。ＬＩＦが培養培地に加えられる場合、ＬＩＦは、哺乳類、齧歯類、ヒト、ラットまたはマウスを含む任意の生物に由来することができる。一実施形態では、培養培地に存在するＬＩＦはマウスに由来する。その上さらなる実施形態では、マウスのＬＩＦポリペプチドは配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、配列番号１で示されるようなマウスＬＩＦポリペプチドの活性のある変異体または断片を使用することができる。そのような活性のある変異体または断片（配列番号１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する活性のある変異体を含む）は本明細書のどこかでさらに詳細に議論される。
【００５１】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるラットＥＳ細胞及びラットＥＳ細胞株は傍分泌のＬＩＦのシグナル伝達を必要としないで試験管内で多能性を維持する。
【００５２】
特定の実施形態では、ＬＩＦまたはその活性のある変異体若しくは断片はラットＥＳ細胞を維持する濃度で培養培地に存在する。ＬＩＦポリペプチドまたはその活性のある変異体若しくは断片は、約２５Ｕ／ｍｌ〜約５０Ｕ／ｍｌで、約５０Ｕ／ｍｌ〜約１００Ｕ／ｍｌで、約１００Ｕ／ｍｌ〜約１２５Ｕ／ｍｌで、約１２５Ｕ／ｍｌ〜約１５０Ｕ／ｍｌで、約１５０Ｕ／ｍｌ〜約１７５Ｕ／ｍｌで、約１７５Ｕ／ｍｌ〜約２００Ｕ／ｍｌで、約２００Ｕ／ｍｌ〜約２２５Ｕ／ｍｌで、約２２５Ｕ／ｍｌ〜約２５０Ｕ／ｍｌで、約２５０Ｕ／ｍｌ〜約３００Ｕ／ｍｌ〜約３００Ｕ／ｍｌ〜約３２５Ｕ／ｍｌで、約３２５Ｕ／ｍｌ〜約３５０Ｕ／ｍｌで、約３５０Ｕ／ｍｌ〜約４００Ｕ／ｍｌで、約４００Ｕ／ｍｌ〜約４２５Ｕ／ｍｌで、約４２５Ｕ／ｍｌ〜約４５０Ｕ／ｍｌで、約４５０Ｕ／ｍｌ〜約４７５Ｕ／ｍｌで、約４７５Ｕ／ｍｌ〜約５００Ｕ／ｍｌで、約７５Ｕ／ｍｌ〜約５００Ｕ／ｍｌ以上で培養培地に存在する。他の実施形態では、ＬＩＦポリペプチドまたはその活性のある変異体若しくは断片は、約２５Ｕ／ｍｌ〜約５０Ｕ／ｍｌで、約２５Ｕ／ｍｌ〜約１００Ｕ／ｍｌで、約７５Ｕ／ｍｌ〜約１２５Ｕ／ｍｌで、約５０Ｕ／ｍｌ〜約１５０Ｕ／ｍｌで、約９０Ｕ／ｍｌ〜約１２５Ｕ／ｍｌで、約９０Ｕ／ｍｌ〜約１１０Ｕ／ｍｌで、約８０Ｕ／ｍｌ〜約１５０Ｕ／ｍｌで、約８０Ｕ／ｍｌ〜約１２５Ｕ／ｍｌで培養培地に存在する。特定の実施形態では、ＬＩＦポリペプチドまたはその活性のある変異体若しくは断片は、約１００Ｕ／ｍｌで培養培地に存在する。
【００５３】
マウスのＬＩＦを採用する場合、ＬＩＦポリペプチドまたはその活性のある変異体若しくは断片はラットＥＳ細胞を維持する濃度で培養培地に存在する。マウスＬＩＦポリペプチドまたはその活性のある変異体若しくは断片は、約２５Ｕ／ｍｌ〜約５０Ｕ／ｍｌで、約５０Ｕ／ｍｌ〜約１００Ｕ／ｍｌで、約１００Ｕ／ｍｌ〜約１２５Ｕ／ｍｌで、約１２５Ｕ／ｍｌ〜約１５０Ｕ／ｍｌで、約１５０Ｕ／ｍｌ〜約１７５Ｕ／ｍｌで、約１７５Ｕ／ｍｌ〜約２００Ｕ／ｍｌで、約２００Ｕ／ｍｌ〜約２２５Ｕ／ｍｌで、約２２５Ｕ／ｍｌ〜約２５０Ｕ／ｍｌで、約２５０Ｕ／ｍｌ〜約３００Ｕ／ｍｌ〜約３００Ｕ／ｍｌ〜約３２５Ｕ／ｍｌで、約３２５Ｕ／ｍｌ〜約３５０Ｕ／ｍｌで、約３５０Ｕ／ｍｌ〜約４００Ｕ／ｍｌで、約４００Ｕ／ｍｌ〜約４２５Ｕ／ｍｌで、約４２５Ｕ／ｍｌ〜約４５０Ｕ／ｍｌで、約４５０Ｕ／ｍｌ〜約４７５Ｕ／ｍｌで、約４７５Ｕ／ｍｌ〜約５００Ｕ／ｍｌで、約７５Ｕ／ｍｌ〜約５００Ｕ／ｍｌ以上で存在する。他の実施形態では、マウスＬＩＦポリペプチドまたはその活性のある変異体若しくは断片は、約２５Ｕ／ｍｌ〜約５０Ｕ／ｍｌで、約２５Ｕ／ｍｌ〜約１００Ｕ／ｍｌで、約７５Ｕ／ｍｌ〜約１２５Ｕ／ｍｌで、約５０Ｕ／ｍｌ〜約１５０Ｕ／ｍｌで、約９０Ｕ／ｍｌ〜約１２５Ｕ／ｍｌで、約９０Ｕ／ｍｌ〜約１１０Ｕ／ｍｌで、約８０Ｕ／ｍｌ〜約１５０Ｕ／ｍｌで、約８０Ｕ／ｍｌ〜約１２５Ｕ／ｍｌで存在する。特定の実施形態では、マウスＬＩＦポリペプチドまたはその活性のある変異体若しくは断片は、約１００Ｕ／ｍｌで存在する。
【００５４】
採用される培養培地はラットＥＳ細胞を維持する。そのようなものとして、特定の実施形態では、種々の方法及び組成物で採用される培養培地は、少なくとも５、１０または１５の継代の期間、細胞株におけるラットＥＳ細胞のすべてまたはほとんど（すなわち、５０％を超えて）の多能性を維持するであろう。一実施形態では、培養培地は多能性を維持するのを助ける１以上の化合物を含む。一実施形態では、培養培地はＭＥＫ経路阻害剤及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）阻害剤を含む。培地はさらに、たとえば、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤及び／またはＡＬＫ（ＴＧＦｂ受容体）阻害剤を含む、ＥＳ細胞を維持するのに役立つ追加の成分を含むことができる。ＦＧＦ受容体阻害剤の非限定例にはＰＤ１８４３５２が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤の非限定例にはＹ−２７６３２が挙げられ、ＡＬＫ（ＴＧＦｂ受容体）阻害剤の非限定例にはＡ−８３−０１が挙げられる。特定の実施形態では、凍結保存されたｒＥＳＣを融解する場合またはトリプシンによる解離の後ｒＥＳＣを再びプレートに播く場合、１０μＭのＲＯＣＫｉと共に２ｉ培地（表２）を使用する。
【００５５】
他の実施形態では、培地は、ＭＥＫ経路阻害剤及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）阻害剤から成る阻害剤の組み合わせを含む。
【００５６】
非限定の一実施形態では、培養培地はＣＨＩＲ９９０２１を含むＧＳＫ−３阻害剤を含み、及び／またはＰＤ０３２５９０１を含むＭＥＫ阻害剤を含む。他の実施形態では、培地はＣＨＩＲ９９０２１及びＰＤ０３２５９０１から成る阻害剤の組み合わせを含む。これらの化合物のいずれかは、たとえば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔから入手することができる。特定の実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１は、約０．５μ〜約３μＭ、約０．５μ〜約３．５μＭ、約０．５μＭ〜約４μＭ、約０．５μＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約１．５μＭ、約１．５μＭ〜約２μＭ、約２μＭ〜約２．５μＭ、約２．５〜約３μＭ、３μＭ〜約３．５μＭの濃度で培養培地に存在する。さらなる実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１は約３μＭの濃度で培養培地に存在する。他の実施形態では、ＰＤ０３２５９０１は約０．４μＭ〜約１μＭ、約０．４μＭ〜約１．５μＭ、約０．４μＭ〜約２μＭ、約０．４μＭ〜約０．８μＭ、０．８μＭ〜約１．２μＭ、約１．２〜約１．５μＭの濃度で培養培地に存在する。さらなる実施形態では、ＰＤ０３２５９０１は約１μＭの濃度で培養培地に存在する。特定の実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１は約３μＭの濃度で培養培地に存在し、ＰＤ０３２５９０１は約１μＭの濃度で存在する。
【００５７】
非限定の一実施形態では、本明細書で開示される種々の方法及び組成物で採用される培養培地が表２にて示される。本出願の文脈の範囲内で、表２で記載される培地は２ｉ培地と呼ばれる。
【表２】
2019062924.tif 000003
【００５８】
採用することができる追加の培地には、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＬｉら、（２００８）、Ｃｅｌｌ、１３５：１２９９−１３１０，Ｙａｍａｍｏｔｏら、（２０１２）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒａｔｓ、２１：７４３−７５５，Ｕｅｄａら、（２００８）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、３（６）：ｅ２８００，Ｍｅｅｋら、（２０１０）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、４（１２）：ｅ１４２２５；Ｔｏｎｇら、（２０１０）、Ｎａｔｕｒｅ、４６７：２１１−２１３；ＵＳ２０１２／０１４２０９２，Ｂｕｅｈｒら、（２００８）、Ｃｅｌｌ１３５：１２８７−１２９８，Ｌｉら、（１３５）Ｃｅｌｌ１２９９−１３１０にて開示されたものが挙げられる。そのような培地を採用する場合、ＬＩＦの濃度及び供給源は本明細書でまとめられるように改変することができる。特定の実施形態では、種々の培養培地は、マウスＬＩＦまたはその活性のある変異体若しくは断片との組み合わせで使用され、一層さらなる実施形態では、種々の培養培地は、約５０Ｕ／ｍｌ〜約１００Ｕ／ｍｌ、約５０Ｕ／ｍｌ〜約１５０Ｕ／ｍｌまたは約１００Ｕ／ｍｌの濃度でのマウスＬＩＦまたはその活性のある変異体若しくは断片を含む。
【００５９】
ラットＥＳ細胞の培養の温度は、ＥＳ細胞株の作出及びＥＳ株の培養と維持の双方について通常、約３５℃〜約３７．５℃で実施される。特定の実施形態では、温度は３７．０℃である。培養は通常７．５％のＣＯ２で実施される。
【００６０】
（ｉｉ）ラットＥＳ細胞株を樹立すること
ラットの胚性幹（ＥＳ）細胞株を生成する方法が提供される。そのような方法は、（ａ）第１のフィーダー細胞層と桑実胚期の胚、胚盤胞期の胚、または桑実胚期の胚と胚盤胞期の胚の間での発生段階のラット胚とを試験管内で培養し、その際、ラット胚の透明帯は取り除かれており、培養条件はラットＥＳ細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）またはその活性のある変異体若しくは断片を有する培地を含むこと；及び（ｂ）ラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を第２のフィーダー細胞層を十分に含む試験管内培養物に移し、ラットＥＳ細胞の多能性を維持し、マウスのＬＩＦまたはその活性のある変異体若しくは断片を有する培地を含む条件下で該増殖物を培養し、それによってラットＥＳ細胞株を樹立することとを含む。種々の方法はさらにラットＥＳ細胞株の細胞を試験管内で継代し、培養することを含み、その際、各その後の培養は、ラットＥＳ細胞の多能性を維持し、マウスのＬＩＦまたはそのある変異体若しくは断片を有する培地を含む条件下でフィーダー細胞層上にてラットＥＳ細胞を培養することを含む。そのような方法によって作製されたラットＥＳ細胞株も提供される。
【００６１】
本明細書で議論される種々の特徴を有するラットＥＳ細胞株を樹立する方法の非限定例は実施例３にて示される。手短には、ラット胚（すなわち、桑実胚期の胚、胚盤胞期の胚、または桑実胚期の胚と胚盤胞期の胚の間での発生段階のラット胚）をメスラットの子宮から流し出す。特定の実施形態では、胚盤胞胚または８細胞胚が得られる。透明帯を取り除き、特定の実施形態では、有糸分裂上不活化されたマウスの胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含むフィーダー細胞（本明細書のどこかで議論されるような）上でラット胚を培養する。桑実胚期の胚、胚盤胞期の胚、または桑実胚期の胚と胚盤胞期の胚の間での発生段階のラット胚の細胞を、ラットＥＳ細胞を維持し、それによってＥＳ細胞の多能性及び／または分化全能性を維持するのに十分である条件下にて試験管内で培養する。培地にてマウスのＬＩＦまたはその活性のある変異体若しくは断片を含むＬＩＦを有する上記で議論された種々の培地を含む種々の培地をこの段階で採用することができる。
【００６２】
増殖物（細胞の不定形で未分化の塊）の存在について培養物をモニターする。増殖物がいったん適当な大きさに達すると、所与の増殖物を新しいフィーダープレートに移し、培養する。移動は、複数のコロニーを作出するためにトリプシンを用いた酵素的解離によって達成される。この移動を一般に「継代１」と呼ぶ。各細胞株が増殖する速度は様々である。ラットＥＳ細胞の多能性及び分化全能性を維持するために必要に応じて培地を交換する。胚性幹細胞の形態を有するコロニーの存在について培養物をモニターする。そのような形態には以下の特徴：（ａ）フィーダー細胞の単層上に生じる丸く円形の盛り上がり；（ｂ）細胞の境界を見るのが難しいようにきつく一緒に詰まっている細胞；（ｃ）さらに小さな細胞のサイズ；（ｄ）少量の細胞質及び拡大した核；（ｅ）試験管内でフィーダー細胞層上に置いた場合球形様のコロニーを形成する；の１以上が挙げられる。いったんそのようなコロニーが出現すると、ほぼ５０％の集密度に達するまで培養を継続することができる。次いでコロニーを新しいフィーダープレートに移す。移動は、コロニーの数を増やすためにトリプシンを用いた酵素的解離によって達成される。これは「継代２」と呼ばれる。ほぼ５０％の集密度に達するまでフィーダー細胞と共に細胞を培養し続け、その時点で細胞は細胞株を維持するためにさらなる継代を受けることができ、または細胞株を凍結することができる。それぞれ参照によって本明細書に組み入れられるＴｏｎｇら、（２０１０）、Ｎａｔｕｒｅ、４６７（９）：２１１−２１５；Ｌｉら、（２００８）、Ｃｅｌｌ１３５：１２９９−１３１０，及びＢｕｅｈｒら、（２００８）Ｃｅｌｌ１３５：１２８７−１２９８も参照のこと。従って、特定の実施形態では、本明細書で開示される種々のラットＥＳ細胞、細胞株及び細胞集団は継代培養すること及び未分化の状態を維持することが可能である。
【００６３】
非限定の一実施形態では、ラットＥＳ細胞の導出は以下のように生じる。０日目に、メスラットを安楽死させ、卵管及び子宮角を切除し、温かいＮ２Ｂ２７培地を含有する組織培養ディッシュに入れる。培地を子宮角及び卵管を介して流し出し、胚盤胞を培地に押し出す。胚盤胞を回収し、ＫＳＯＭ＋２ｉ（１μＭのＰＤ０３２５９０１，３μＭのＣＨＩＲ９９０２１）を含有する胚培養ディッシュに移す。ＫＳＯＭはＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入することができ、カタログ番号はＭＲ−１０６−Ｄである。本明細書で言及される２ｉ培地は表２で示された培地を含む。細胞を７．５％のＣＯ２にて３７℃で一晩培養する。
【００６４】
非限定の他の実施形態では、ラットＥＳ細胞は８細胞胚または凍結された８細胞胚に由来する。胚を室温にて１０分間、Ｍ２培地で培養し、次いでＫＳＯＭ＋２ｉに移し、一晩培養する。
【００６５】
ラットＥＳ細胞の導出の非限定例は以下のとおりである：１日目における空洞を作った胚の２ｉ培地（表２）への移動及び一晩の培養。培養はＫＳＯＭ＋２ｉにて空洞をなくし続ける。２日目にて空洞を作っていようがいまいが、残りの胚すべてを２ｉ培地に移す。２ｉ培地にて培養を一晩続ける。３日目に、胚を酸タイロードと共にインキュベートして透明帯を取り除き、２ｉ培地で３回洗浄して酸タイロードを取り除く。各胚を別々のウェルのフィーダープレートに分配し、各ウェルは有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含有する。２ｉ培地にて細胞を一晩培養する。４日目及び５日目に増殖物である細胞の不定形の未分化の塊の存在について細胞をプレートに入れた胚をモニターする。増殖物は、プレートに入れた胚のサイズのおよそ２倍であればいつでも移せる。毎日、消費した培地を取り除き、新鮮な２ｉ培地で置き換える。増殖物を新しいフィーダーのウェルに移し、再び消費した培地を取り除き、ウェルをＰＢＳで洗浄する。ＰＢＳを取り除き、トリプシンを加え、約１０分間インキュベートする。３０μｌの２ｉ培地と１０％ＦＢＳの添加によってトリプシンの反応を止める。細胞を穏やかに解離させ、内容物全体をフィーダープレートのウェルに移す。これは継代１（Ｐ１）と呼ばれる。細胞を２ｉ培地にて一晩培養する。５〜８日目に、各細胞株がどれくらい速く増殖するかに応じて２ｉ培地を毎日交換し、ＥＳＣの形態を持つコロニーの存在について培養物をモニターする。そのようなＥＳＣの形態は本明細書のどこかで詳細に議論される。コロニーが約５０％の集密度に増殖するまで培養が続く。次いでコロニーをトリプシン処理し、フィーダーウェルに入れる前に継代する。これは継代２と呼ばれる。およそ５０％の集密度になるまで各細胞株を養い、モニターすることが継続される。細胞をいつものようにトリプシン処理する。２ｉ培地＋１０％ＦＢＳでトリプシンを止める。遠心分離によって細胞を沈殿させ、４００μｌの凍結培地（７０％２ｉ、２０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ）に細胞を入れる。次いで細胞を凍結することができる。これは継代３と呼ばれる。
【００６６】
（ｉｉｉ）ラットＥＳ細胞株を維持すること及び継代すること
さらに提供されるのはラットの胚性幹細胞株を維持するまたは培養する方法である。方法は、フィーダー細胞層とラットＥＳ細胞株を試験管内で培養することを含み、その際、培養条件は、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）またはその活性のある変異体または断片を有する培地を含む。そのような方法は上記でまとめられたような培養培地及びフィーダー細胞層を採用する。一実施形態では、ラットＥＳ細胞株は少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０回以上継代することができる。特定の実施形態では、標的とされた遺伝子組換えの標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地にてラットＥＳ細胞株を少なくとも１１回まで継代することができる。
【００６７】
ラットＥＳ細胞株を養い、モニターする。特定の実施形態では、培養物がおよそ３０％、４０％、５０％または６０％の集密度である場合、継代が発生する。他の実施形態では、培養物が５０％の集密度である場合、継代が発生する。各細胞株がどれくらい速く増殖するかに応じて、継代は２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、９５または１００時間ごとに発生することができる。他の実施形態では、継代間の時間は、２４時間〜９６時間の間、約３０〜５０時間の間、約２５〜７５時間の間、約５０〜９６時間の間、約２５〜７５時間の間、約３５〜８５時間の間、または約４０〜７０時間の間の範囲に及ぶ。一実施形態では、本明細書で開示されるようなラットＥＳ細胞、細胞株または細胞集団は約２４時間〜約３６時間の範囲である倍増時間を有する。一実施形態では、ラットＥＳ細胞は２５時間の倍増時間を有する。
【００６８】
本明細書でまとめられるように導出され、維持される場合、種々のラットＥＳ細胞株は１以上の以下の特性を有する：
（ａ）ラットＥＳ細胞がラット宿主胚に移植されると、ラットＥＳ細胞株のゲノムが子孫に伝達されることを意味する、生殖系列適格性を有する；
（ｂ）ラットＥＳ細胞がラット宿主胚に移植されると、ラットＥＳ細胞株のゲノム内の標的とされた遺伝子組換えが子孫に伝達されることを意味する、標的とされた遺伝子組換えに続いて生殖系列適格性を有する；
（ｃ）試験管内で多能性を有する；
（ｄ）試験管内で分化全能性を有する；
（ｅ）試験管内で培養するとフィーダー細胞層にゆるく接着する；
（ｆ）試験管内で培養すると試験管内でフィーダー細胞層上に置かれた際、球形様のコロニーを形成する；
（ｇ）白血病阻害因子（ＬＩＦ）を発現するように遺伝子組換えされないフィーダー細胞層を含み、培養培地が十分な濃度のＬＩＦを含む条件下で試験管内で培養すると多能性を維持する；
（ｈ）フィーダー細胞層を含み、培養培地がマウスＬＩＦまたはその活性のある変異体若しくは断片を含む条件下で試験管内で培養すると多能性を維持する；
（ｉ）以下を特徴とする分子署名を含む：
（ｉ）接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせを含むラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現；
（ｉｉ）接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせ含むラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の発現；
（ｉｉｉ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１４で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｉｖ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１４で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｖ）表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現；
（ｖｉ）表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の発現；
（ｖｉｉ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｖｉｉｉ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｉｘ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１２で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｘ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１２で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｘｉ）パート（ｉ）〜（ｘ）のラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の発現の任意の組み合わせ；
（ｘｉｉ）列記された多能性マーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８について表１５で示されるような多能性マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の多能性のランク付けの欄を参照；
（ｘｉｉｉ）列記された中胚葉マーカーの少なくとも２、３または４について表１５で示されるような中胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の中胚葉のランク付けの欄を参照；
（ｘｉｖ）列記された内胚葉マーカーの少なくとも２、３、４、５または６について表１５で示されるような内胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の内胚葉のランク付けの欄を参照；
（ｘｖ）列記された神経マーカーの少なくとも２または３について表１５で示されるような神経マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の神経のランク付けの欄を参照；
（ｘｖｉ）列記された栄養外胚葉マーカーについて表１５で示されるような栄養外胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の栄養外胚葉のランク付けの欄を参照；
（ｘｖｉｉ）表１５で示されるような多能性マーカー、中胚葉マーカー、内胚葉マーカー、神経マーカー及び／または栄養外胚葉マーカーの１以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）の相対的な発現レベル。
（ｘｖｉｉｉ）表１５で示されるマーカーのそれぞれの相対的な発現レベル。
（ｘｉｘ）ｘｉｉ〜ｘｉｉｘで示された署名の任意の組み合わせ；及び／または
（ｘｘ）ｉ〜ｘｉｉｘで示された署名の任意の組み合わせ；
（ｊ）Ｆ０ラットを作出する能力を有する；
（ｋ）継代培養され、未分化状態を維持することが可能である；
（ｌ）正常なラット細胞と同じ数の染色体を有する；及び／または
（ｍ）傍分泌ＬＩＦのシグナル伝達を必要とせずに試験管内で多能性を維持する；
（ｎ）多能性を維持しながらそれらが無限に分裂することを意味する、自己複製能を有する。
【００６９】
所与のラットＥＳ細胞株のそのような特性は、継代５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０以上を含む継代のいずれか１つにて存在することができる。
【００７０】
従って、非限定の一実施形態では、フィーダー細胞層とラットＥＳ細胞の集団とを含む試験管内培養が提供され、その際、試験管内培養の条件はラットＥＳ細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）またはその活性のある変異体または断片を有する培地を含む。特定の実施形態では、そのような条件下で培養されたラットＥＳ細胞は少なくとも１０回の継代の期間にわたって細胞集団の少なくとも５０％の多能性を維持し、少なくとも１０回の継代の期間にわたって細胞集団の少なくとも６０％の多能性を維持し、少なくとも１０回の継代の期間にわたって細胞集団の少なくとも７０％の多能性を維持し、少なくとも１０回の継代の期間にわたって細胞集団の少なくとも７５％の多能性を維持し、少なくとも１０回の継代の期間にわたって細胞集団の少なくとも８０％の多能性を維持し、少なくとも１０回の継代の期間にわたって細胞集団の少なくとも８５％の多能性を維持し、少なくとも１０回の継代の期間にわたって細胞集団の少なくとも９０％の多能性を維持し、または少なくとも１０回の継代の期間にわたって細胞集団の少なくとも９５％の多能性を維持する。
【００７１】
さらに本明細書で提供されるのは、本明細書で開示される種々のラットＥＳ細胞、細胞集団及び細胞株を含む試験管内培養物と同様にそれら種々のＥＳ細胞のための培養キットである。たとえば、上記で議論されたように、特定の実施形態では、本明細書で提供される種々のラットＥＳ細胞は以下の特徴：（１）試験管内で培養するとフィーダー細胞層にゆるく接着する；（２）試験管内で培養すると、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する；（３）白血病阻害因子（ＬＩＦ）を発現するように遺伝子組換えされないフィーダー細胞層を含み、培養培地が十分な濃度のＬＩＦを含む条件下にて試験管内で培養すると多能性を維持する；及び／または（４）継代されること及び未分化の状態を維持することが可能である；の１以上を有する。さらにこれらの試験管内培養物のいずれかのラットＥＳ細胞集団は、たとえば、集団内の細胞の少なくとも７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が正倍数体である、二倍体である及び／または４２本の染色体を有する細胞の集団を含むことができる。
【００７２】
試験管内でラットの胚性幹細胞を培養する方法の１つは、（ａ）フィーダー細胞層と単離されたラットの胚性幹（ＥＳ）細胞の集団を含む試験管内培養物を提供することと、（ｂ）単離されたラットの胚性幹（ＥＳ）細胞の多能性または分化全能性を維持するのに十分な条件下で試験管内培養物を培養することとを含み、その際、ラットＥＳ細胞はフィーダー細胞層にゆるく接着するコロニーを形成する。「ゆるい接着」または「ゆるく接着する」は、培養ディッシュをある時間（最低８時間）そのままにしておくと、一部のコロニーがディッシュを穏やかに動かしても接着を維持することができるようにフィーダーに接着することを意味する。ウェルが小さいほど（培地があまり動かない）、ゆるい接着は速く生じることができる。いずれの場合も、（ａ）ディッシュ内の培地を回転させることまたはフィーダーの表面全体にわたって培地を穏やかにピペッティングすることによってこれらのコロニーは遊離させることができる。これらのゆるく接着するコロニーの形態は依然として球形である。そのような例では、ラットＥＳ細胞は試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する。そのような球形様のコロニーを、たとえば、図１にて示す。
【００７３】
（ｉｖ）キット及び試験管内培養物
本明細書で提供されるラットＥＳ細胞及びラットＥＳ細胞株はキットまたは製造物品の中に含有されることができる。特定の実施形態では、キットまたは製造物品は本明細書で開示されるＥＳ細胞株またはＥＳ細胞集団のいずれかを含む。キットはさらに、ラットＥＳ細胞の多能性を維持する培地を含む、ラットＥＳ細胞を維持する培養培地を含むことができる。そのような培地は、本明細書のどこかでさらに詳細に議論されるように、マウスＬＩＦまたはその活性のある変異体または断片を有する培養培地を含むことができる。キット内の培地はさらに、ＭＥＫ阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含むことができる、または代わりにキット内の培地はさらに、ＭＥＫ阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤から成る阻害剤の組み合わせを含むことができる。特定の実施形態では、キット内の培地はＰＤ０３２５９０１を含むＭＥＫ阻害剤及び／またはＣＨＩＲ９９０２１を含むＧＳＫ３阻害剤を含む。本明細書で議論される種々の培地のいずれかをキット内に含有することができる。
【００７４】
さらに提供されるのは、本明細書で開示されるラットＥＳ細胞株またはＥＳ細胞集団のいずれかと、本明細書で開示される種々の培地のいずれかと、フィーダー細胞の集団とを含むキットまたは製造物品である。一実施形態では、キットまたは製造物品におけるフィーダー細胞はＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされない及び／またはフィーダー細胞は有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を含む。本明細書で開示される他のフィーダー細胞のいずれかをキットまたは製造物品にて採用することができる。
【００７５】
ＩＶ．ラット胚性幹（ＥＳ）細胞の遺伝子組換え
本明細書で開示される種々のラットＥＳ細胞及びラットＥＳ細胞株は少なくとも１つの標的とされた遺伝子組換えを含有するように操作することができる。従って、本明細書で開示されるような単離されたラット胚性幹（ＥＳ）細胞を遺伝子組換えするために種々の方法が提供される。方法は、本明細書で開示される単離されたラットＥＳ細胞のゲノムに標的とされた遺伝子組換えを導入して遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞を形成することを含む。標的とされた遺伝子組換えは、たとえば、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、突然変異またはそれらの組み合わせを含むラットＥＳのゲノムへの操作を含むことができる。一実施形態では、標的とされた遺伝子組換えはラットＥＳ細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの挿入を含む。本明細書で使用されるとき、配列への参照における「非相同の」は、異種を起源とする配列、または同種に由来するならば、意図的なヒトの介入によって組成及び／またはゲノム遺伝子座におけるネイティブな形態から実質的に操作される配列である。
【００７６】
態様の１つでは、試験管内での１以上の遺伝子組換えに続いて多能性を持続することが可能であり、遺伝子組換えしたゲノムをＦ１の生殖系列に伝達することが可能である単離されたラットＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞株が提供される。従って、ラットＥＳ細胞は、試験管内での１以上の一連の遺伝子組換え（たとえば、２、３、４、５または６以上の一連の遺伝子組換え）に続いてその多能性を維持して複数の細胞型になる。他の実施形態では、たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上を含む複数の標的とされた遺伝子組換えが所与のラットＥＳ細胞にて行われる。そのようなものとして、たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上を含む複数の非相同のポリヌクレオチドもゲノムに統合することができる。
【００７７】
一実施形態では、１〜１５の一連の遺伝子組換えのいずれか１つに続いて、遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞は、分化培地に暴露されると複数の細胞型に分化することが可能である。一実施形態では、１〜１５の一連の遺伝子組換えのいずれか１つに続いて、遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞は、培養にて未分化の状態で維持されることが可能である。一実施形態では、未分化の状態で遺伝子組換えされ、培養されたラットＥＳ細胞は、ラット宿主胚にてドナー細胞として採用されると、胚に定植し、１〜１５の遺伝子組換えを含む胚盤胞を形成する。一実施形態では、胚盤胞は、妊娠に好適な条件下で代理母に移植されると１〜１５の遺伝子組換えを含むＦ０ラット子孫になる。
【００７８】
ラットＥＳ細胞のゲノム内で標的とされた遺伝子組換えを行う種々の方法を使用することができる。たとえば、一例では、標的とされた遺伝子組換えは相同組換え事象を介して標的とされた遺伝子組換えを生成する系を採用する。他の例では、標的とされたゲノム位置で一本鎖または二本鎖の切断を生成するヌクレアーゼ剤を用いてラットＥＳ細胞を操作することができる。次いで一本鎖または二本鎖の切断を非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）によって修復する。そのような系は、たとえば、機能的な遺伝子組換えの標的とされた喪失を生成するのに使用される。たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＴｅｓｓｏｎら、（２０１１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９：６９５−６９６を参照のこと。そのような剤には、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（ＷＯ２０１０／０７９４３０；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒら．（２０１０）、ＰＮＡＳ  １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７；Ｓｃｈｏｌｚｅ及びＢｏｃｈ（２０１０）、Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  １：４２８−４３２；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７−７６１；Ｌｉら．（２０１０）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４；並びにＭｉｌｌｅｒら．（２０１１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９：１４３−１４８；ＵＳ２０１１／０２３９３１５Ａ１，２０１１／０２６９２３４Ａ１，２０１１／０１４５９４０Ａ１，２００３／０２３２４１０Ａ１，２００５／０２０８４８９Ａ１，２００５／００２６１５７Ａ１，２００５／００６４４７４Ａ１，２００６／０１８８９８７Ａ１，並びに２００６／００６３２３１Ａ１（それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる）；亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（それぞれ参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２００６０２４６５６７；ＵＳ２００８０１８２３３２；ＵＳ２００２００８１６１４；ＵＳ２００３００２１７７６；ＷＯ／２００２／０５７３０８Ａ２；  ＵＳ２０１３０１２３４８４；ＵＳ２０１００２９１０４８；及びＷＯ／２０１１／０１７２９３Ａ２）；メガヌクレアーゼ（Ｅｐｉｎａｔら，（２００３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３１：２９５２−６２；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら，（２００２）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、１０：８９５−９０５；Ｇｉｍｂｌｅら，（２００３）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３４：９９３−１００８；Ｓｅｌｉｇｍａｎら，（２００２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３８７０−９；Ｓｕｓｓｍａｎら，（２００４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１；Ｒｏｓｅｎら，（２００６）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：４７９１−８００；Ｃｈａｍｅｓら，（２００５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１７８；Ｓｍｉｔｈら，（２００６）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：ｅ１４９；Ｇｒｕｅｎら，（２００２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ２９；Ｃｈｅｎ及びＺｈａｏ，（２００５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１５４；ＷＯ２００５１０５９８９；ＷＯ２００��０７８６１９；ＷＯ２００６０９７８５４；ＷＯ２００６０９７８５３；ＷＯ２００６０９７７８４；及びＷＯ２００４０３１３４６を参照）；及びＣＡＳ／ＣＲＩＳＰＥＲ系（それぞれ参照によって本明細書に組み入れられるＭａｌｉ  Ｐら．（２０１３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３−６；  Ｊｉｎｅｋ  Ｍら．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２、Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６−２１；    Ｈｗａｎｇ  ＷＹら．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
２０１３、Ｍａｒ；３１（３）：２２７−９；Ｊｉａｎｇ  Ｗら．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１３  Ｍａｒ；３１（３）：２３３−９；及びＣｏｎｇ  Ｌら．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３、Ｆｅｂ．１５；３３９（６１２１）：８１９−２３）が挙げられる。
【００７９】
他の実施形態では、相同組換え標的化ベクターを用いることによって標的とされた遺伝子組換えを行うことができる。そのような例では、標的化ベクターは挿入ポリヌクレオチドを含み、さらに挿入ポリヌクレオチドに隣接する上流と下流の相同性アームを含む。挿入ポリヌクレオチドに隣接する相同性アームは標的とされたゲノム遺伝子座の中でのゲノム領域に相当する。参照を容易にするために、標的とされたゲノム遺伝子座の中での相当するゲノム領域は本明細書では「標的部位」と呼ばれる。従って、一実施例では、標的化ベクターは、標的とされたゲノム遺伝子座に位置する第１と第２の標的部位に相当する第１と第２の相同性アームが隣接する第１の挿入ポリヌクレオチドを含むことができる。標的化ベクターはそれによって、細胞のゲノムの中での相同性アームと相当する標的部位の間で生じる相同組換え事象を介した標的とされたゲノム遺伝子座への挿入ポリヌクレオチドの統合に役立つ。
【００８０】
本明細書で使用されるとき、相同性アームと標的部位は、２つの領域が互いに十分なレベルの配列同一性を共有し、相同組換え反応の基質として作用する場合、互いに「対応する」または「対応している」。「相同性」によって対応する配列と同一であるまたはそれに対する配列同一性を共有するＤＮＡ配列を意味する。標的化ベクターで見いだされる所与の標的部位と対応する相同性アームとの間での配列同一性は相同組換えが起きるのを可能にする程度の配列同一性であることができる。たとえば、標的化ベクターの相同性アーム（またはその断片）と標的部位（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または１００％の配列同一性であるので、配列は相同組換えを受ける。さらに、相同性アームと対応する標的部位の間での相同性の対応する領域は、切断される認識部位での相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであることができる。
【００８１】
特定の実施形態では、単離されたラットＥＳ細胞、細胞株または細胞集団は少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％の相同組換え効率を示す。一実施形態では、ラットＥＳ細胞を用いる相同組換え効率は４％を超える。
【００８２】
特定の実施形態では、ラットＥＳ細胞で標的とされた遺伝子組換えを生成する場合、選択マーカーが採用される。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは標的とされた遺伝子組換えをゲノムに導入するように設計される標的化ベクターに存在することができ、またはそれは別々のプラスミド若しくはベクターにて見いだすことができる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを発現カセット内に含有することができる。そのような発現カセットの種々の成分は本明細書のどこかでさらに詳細に議論される。
本明細書で開示される方法及び組成物にて種々の選択マーカーを使用することができる。そのような選択マーカーは、たとえば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストシジン、プロマイシンまたはネオマイシンのような抗生剤に対する耐性を付与することができる。そのような選択マーカーには、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、プロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、及びブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）が挙げられる。さらに他の実施形態では、選択マーカーは誘導性プロモータに操作可能に連結され、選択マーカーの発現は細胞にとって毒性である。そのような選択マーカーの非限定例には、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ヒポキサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）及び単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）が挙げられる。たとえば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＳａｎｔｅｒｒｅら、（１９８４）、Ｇｅｎｅ、３０：１４７−５６；Ｊｏｙｎｅｒ（１９９９）、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ
Ｓｅｒｉｅｓ，２９３；Ｓａｎｔｅｒｒｅら、（１９８４）、Ｇｅｎｅ、３０：１４７−５６；Ｂｅｒｎａｒｄら、（１９８５）、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１５８：２３７−４３；Ｇｉｏｒｄａｎｏ及びＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ、（１９９０）、Ｇｅｎｅ，８８：２８５−８；Ｉｚｕｍｉら、（１９９１）、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９７：２２９−３３）を参照のこと。特定の実施形態では、ｎｅｏＲ選択可能マーカーは、参照によって本明細書に組み入れられるＢｅｃｋら、（１９８２）、Ｇｅｎｅ，１９：３２７−３６のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である。ｎｅｏＲ選択マーカーはそれぞれ参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ７，２０５，１４８または６，５９６，５４１にて使用されたものである。
【００８３】
特定の実施形態では、採用される選択マーカーは非弱毒化選択マーカーである。「非弱毒化選択マーカー」は、ネイティブなポリペプチドの活性を保持する選択マーカーを含み、または選択マーカーはポリペプチドネイティブな形態と比べたとき高い活性を有する。選択マーカーの活性における上昇は、たとえば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上の上昇を含む、活性における統計的に有意な上昇を含むことができる。従って、非弱毒化選択マーカーは宿主細胞で発現されると、弱毒化選択マーカーを採用する場合よりも、高濃度の選択剤の存在下でさらに高い比率の宿主細胞が生き残るのを可能にするであろう。非弱毒化選択マーカーには、たとえば、ネオマイシン非弱毒化選択マーカーが挙げられる。たとえば、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられるＢｅｃｋら、（１９８２）、Ｇｅｎｅ，１９：３２７−３６またはＵＳ７，２０５，１４８若しくは６，５９６，５４１を参照のこと。
【００８４】
他の例では、弱毒化選択マーカー及び／または野生型（ネイティブな）選択マーカーと比べたとき高い活性の選択マーカーは、ラットＥＳ細胞のゲノム内での非弱毒化、弱毒化またはネイティブの選択マーカーのコピー数を増やすことから生じることができる。そのようなものとして、所与のラットＥＳ細胞はそのゲノムの中に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のコピーの所与の選択マーカー（すなわち、非弱毒化選択マーカー、弱毒化選択マーカーまたはネイティブの（野生型）選択マーカー）を含むことができる。
【００８５】
採用される種々の選択マーカーは、ラットＥＳ細胞で活性のあるプロモータに操作可能に連結されたポリヌクレオチドによってコードされる。特定の実施形態では、選択マーカーの活性における上昇は選択マーカーの発現における上昇から生じることができる。従って、プロモータを用いて所与の選択マーカーの発現レベルを高めることができる。当該プロモータには、ＣＭＶプロモータ、ＰＧＫプロモータ及びＣＡＧプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、選択マーカーを発現させるのにヒトのユビキチン（ｈＵｂ）プロモータを使用する。たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、（２００３）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１：６５２−６５９を参照のこと。
【００８６】
一実施形態では、外来性の核酸による単回のエレクトロポレーションに続いてラットＥＳ細胞はその多能性を維持して複数の細胞型になる。別の実施形態では、外来性の核酸による２回目のエレクトロポレーションに続いて、外来性の核酸による３回目のエレクトロポレーションに続いて、外来性の核酸による４回目のエレクトロポレーションに続いて、外来性の核酸による５回目のエレクトロポレーションに続いて、外来性の核酸による６回目のエレクトロポレーションに続いて、外来性の核酸による７回目のエレクトロポレーションに続いて、外来性の核酸による８回目のエレクトロポレーションに続いて、外来性の核酸による９回目のエレクトロポレーションに続いて、外来性の核酸による１０回目のエレクトロポレーションに続いて、外来性の核酸による１１回目のエレクトロポレーションに続いて、外来性の核酸による１２回目のエレクトロポレーションに続いて、外来性の核酸による１３回目のエレクトロポレーションに続いて、外来性の核酸による１４回目のエレクトロポレーションに続いて、及び／または外来性の核酸による１５回目のエレクトロポレーションに続いて、ラットＥＳ細胞はその多能性を維持して複数の細胞型になる。他の実施形態では、連続回のエレクトロポレーション（すなわち、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上のエレクトロポレーション）に続いてラットＥＳ細胞は標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である。
【００８７】
（ｉ）ラットの胚性幹細胞に配列を導入すること
本明細書で提供される方法は、標的とされた遺伝子組換えを行うのに必要とされるような種々の成分を含む１以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの構築物を細胞に導入することを含む。「導入すること」は配列が細胞の内部へのアクセスを獲得するような方法で細胞に配列（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を提示することを意味する。本明細書で提供される方法は、標的とされたゲノム統合系の成分を細胞に導入する特定の方法に依存せず、ポリヌクレオチドが少なくとも１つの細胞の内部へのアクセスを獲得することのみに依存する。種々の細胞型にポリヌクレオチドを導入する方法は当該技術で既知であり、それには、安定的な形質移入法、一時的な形質移入法及びウイルスが介在する方法が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法には、エレクトロポレーション、細胞質内注入、ウイルス感染（アデノウイルス、レンチウイルス及びレトロウイルスのベクターを含む）、形質移入、脂質介在性の形質移入及び／またはＮｕｃｌｅｏｆａｃｔｉｏｎ（商標）が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら、（２００９）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、６（５）：３２９−３３０；Ｙｕｓａら、（２００９）、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６：３６３−３６９；Ｗｏｌｔｊｅｎら、（２００９）、Ｎａｔｕｒｅ、４５８，７６６−７７０を参照のこと。そのような方法には、生体外の形質移入によるようなＤＮＡの直接送達（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６，１９８９，Ｎａｂｅｌ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ３２６：７１１−７１３，１９８７）、注入による任意でＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅによる（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）（それぞれ参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ５，９９４，６２４；５，９８１，２７４；５，９４５，１００；５，７８０，４４８；５，７３６，５２４；５，７０２，９３２；５，６５６，６１０；５，５８９，４６６及び５，５８０，８５９）、微量注入を含む（参照によって本明細書に組み入れられるＨａｒｌａｎｄ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０１：１０９４−１０９９，１９８５；ＵＳ５，７８９，２１５）；エレクトロポレーションによる（参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ５，３８４，２５３；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５，１９８４）；リン酸カルシウム沈殿による（Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７，１９７３；Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５−２７５２，１９８７；Ｒｉｐｐｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０）；ＤＥＡＥデキストラン、その後ポリエチレングリコールを用いることによる（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０，１９８５）；直接音波負荷による（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８���：８４６３−８４６７，１９８７）；リポソーム介在性の形質移入による（Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０，１９８２；Ｆｒａｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６，１９８７；Ｗｏｎｇら，Ｇｅｎｅ，１０：８７−９４，１９８０；Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５−３７８，１９８９；Ｋａｔｏら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１−３３６４，１９９１）；及び受容体が介在する形質移入（Ｗｕ及びＷｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：８８７−８９２，１９８８；Ｗｕ及びＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２，１９８７）；及びそのような方法の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されず、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み入れられる。
【００８８】
一部の実施形態では、方法及び組成物で採用される細胞はゲノムの中に安定的に組み入れられたＤＮＡ構築物を有する。「安定的に組み入れられる」または「安定的に導入される」は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに統合し、その子孫に遺伝で伝わることが可能であるような細胞へのポリヌクレオチドの導入を意味する。ＤＮＡ構築物の安定的な組み入れまたは標的とされた遺伝子組換えを生成するために採用される種々の成分のために任意のプロトコールが使用され得る。
【００８９】
形質移入プロトコールと同様に細胞にポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列を導入するプロトコールは変化し得る。非限定の形質移入法には、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍら．（１９７３）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２（２）：４５６−６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉら．（１９７７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４（４）：１５９０−４及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６−９７）、デンドリマー、またはＤＥＡＥデキストラン若しくはポリエチルアミンのようなポリマーを含む化学薬品に基づく形質移入法が挙げられる。非化学的な方法には、エレクトロポレーション、ソノポレーション、及び光学形質移入が挙げられる。粒子に基づく形質移入には、遺伝子銃の使用、磁気支援の形質移入（Ｂｅｒｔｒａｍ，Ｊ．（２００６）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７，２７７−２８）が挙げられる。ウイルス法も形質移入に使用することができる。
【００９０】
ラットＥＳ細胞に非相同のポリヌクレオチドを導入する方法の非限定例が次に来る。本明細書で記載されるようなラットＥＳ細胞をエレクトロポレーションに先立って約２４時間〜約４８時間継代する。エレクトロポレーションの約２４時間前に、培地をＲＶＧ２ｉ＋ＲＯＣＫｉ（１０μＭのＹ−２７６３２）に交換する。ラットＥＳ細胞をトリプシン処理し、ラットＥＳ細胞を単離する。ラットＥＳ細胞を浮遊させ、７５μ１当たり２×１０６〜約１０×１０６個の最終細胞濃度を達成する。非相同のポリヌクレオチド含む約５０λのＤＮＡに約７５λのラットＥＳ細胞を加え、１２５λのＥＰ緩衝液を加える。非限定の一実施形態では、エレクトロポレーションは以下のパラメータ：４００Ｖ；４００Ｖ；Ω；１００μＦで実施される。次いで細胞をＲＶＧ２ｉ及び１０μＭのＲＯＣＫｉにて培養し、フィーダー細胞上に移すことができる。
【００９１】
（ｉｉ）標的とされた遺伝子組換えを有するラットの胚性幹細胞を選択すること
標的とされた遺伝子組換えをゲノムに安定的に組み入れているラットＥＳ細胞を選択し、維持するために種々の方法が提供される。非限定の一実施例では、非相同のポリヌクレオチドをラットＥＳ細胞に導入する場合、方法は、（ａ）ラットＥＳ細胞の試験管内集団を提供することと、（ｂ）ラットＥＳ細胞にて活性のあるプロモータに操作可能に連結された選択マーカーを含む非相同のポリヌクレオチドを少なくとも１つのラットＥＳ細胞に導入することと、（ｃ）交互に入れ替える第１と第２の培養培地にてラットＥＳ細胞集団を試験管内で培養することとを含むことができ、その際、第１の培養培地は第１の時間の間有効量の選択剤を含み、第２の培養培地は選択剤を含まず、試験管内培養の条件は多能性または分化全能性を維持し、それによって非相同のポリヌクレオチドをゲノムに安定的に統合しているラットＥＳ細胞を選択する。標的とされた遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞を所与の集団にて選択することができる種々の方法はラットＥＳ細胞が多能性を維持するのを可能にする試験管内培養の系を採用することができる。従って、本明細書で議論される試験管内培養の培地及びフィーダー細胞のいずれかを採用することができる。
【００９２】
特定の実施形態では、第１と第２の培養培地は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０時間以上ごとに交互に入れ替える。特定の実施形態では、第１と第２の培養培地は２４時間ごとに交互に入れ替える。
【００９３】
適当な選択マーカーを使用することができ、相当する選択剤が培養培地と共に有効な濃度で存在するであろう。そのような選択マーカーには本明細書で議論されるネイティブな選択マーカー、弱毒化選択マーカーまたは非弱毒化選択マーカーが挙げられる。一実施形態では、採用される選択マーカーは、たとえば、Ｇ４１８を含む抗生剤に耐性を付与する。非限定の選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）を含む。
【００９４】
選択剤の濃度は、培養物内に存在するラットＥＳ細胞の多能性を維持しながら選択マーカーを有するラットＥＳ細胞の選択を可能にするようなものである。たとえば、Ｇ４１８を採用する場合、選択培地におけるＧ４１８の濃度は約５０μｇ／ｍｌ〜約１２５μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ〜約１２５μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ〜約１２５μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ〜約１２５μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ〜約１２５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約１２５μｇ／ｍｌ、約１１０μｇ／ｍｌ〜約１２５μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約６５μｇ／ｍｌ〜約８５μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ〜約８０μｇ／ｍｌの範囲であることができる。一実施形態では、培養物におけるＧ４１８の濃度は７５μｇ／ｍｌである。
【００９５】
選択にて採用される培地はラット胚性幹細胞が多能性を保持するのを可能にする。そのような培地は本明細書のどこかで詳細に議論される。
【００９６】
ラットＥＳ細胞のゲノムへの選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの導入に続いていつでも選択プロトコールを開始することができる。特定の実施形態では、選択プロトコールはラットＥＳ細胞への選択マーカーの導入の１０、１５、２０、２４、３０、３５、４０、５０、６０時間以上で開始する。一実施形態では、選択プロトコールは選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの導入の約２日後に開始する。
【００９７】
Ｇ４１８を採用する非限定の選択プロトコールは以下のとおりである。２日目（選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの導入の２日後）にてラットＥＳ細胞の集団は２ｉ培地及び７５μｇ／ｍｌのＧ４１８においてインキュベートされた細胞である。３日目にてラットＥＳ細胞の集団はＧ４１８を含まない２ｉ培地においてインキュベートされた細胞である。４日目にてラットＥＳ細胞の集団は２ｉ培地及び７５μｇ／ｍｌのＧ４１８においてインキュベートされる。５日目にてラットＥＳ細胞の集団はＧ４１８を含まない２ｉ培地においてインキュベートされた細胞である。６日目にてラットＥＳ細胞の集団は２ｉ培地及び７５μｇ／ｍｌのＧ４１８においてインキュベートされる。７日目にてラットＥＳ細胞の集団はＧ４１８を含まない２ｉ培地においてインキュベートされる。８日目にてラットＥＳ細胞の集団は７５μｇ／ｍｌのＧ４１８を含まない２ｉ培地においてインキュベートされる。９日目にてラットＥＳ細胞の集団はＧ４１８を含まない２ｉ培地においてインキュベートされる。１０日目にてラットＥＳ細胞の集団は２ｉ培地及び７５μｇ／ｍｌのＧ４１８においてインキュベートされた細胞である。１１日目にてラットＥＳ細胞の集団はＧ４１８を含まない２ｉ培地においてインキュベートされた細胞である。１２日目にて増殖とスクリーニングのためにコロニーを採取する。
【００９８】
選択マーカーを有するラットＥＳ細胞の選択に続いてコロニーを増殖させることができる。特定の実施形態では、増殖の期間は、細胞の多能性を維持する培養条件にて約１、２、３、４、５日以上である。非限定の一実施形態では、選択されたコロニーは３日間増殖させる。さらなる実施形態では、採用される培地は２ｉ培地である。次いで各クローンを継代し、さらに増殖させることができる。
【００９９】
標的とされた遺伝子組換えの１以上を有するラットＥＳ細胞及びＥＳ細胞株は以下の特性の１以上を有することができる：
（ａ）ラットＥＳ細胞がラット宿主胚に移植されると、ラットＥＳ細胞株のゲノム内の標的とされた遺伝子組換えが子孫に伝達されることを意味する、標的とされた遺伝子組換えに続いて生殖系列適格性を有する；
（ｂ）試験管内で多能性を有する；
（ｃ）試験管内で分化全能性を有する；
（ｄ）試験管内で培養するとフィーダー細胞層にゆるく接着する；
（ｅ）試験管内で培養すると試験管内でフィーダー細胞層上に置かれた際、球形様のコロニーを形成する；
（ｆ）白血病阻害因子（ＬＩＦ）を発現するように遺伝子組換えされないフィーダー細胞層を含み、培養培地が十分な濃度のＬＩＦを含む条件下で試験管内で培養すると多能性を維持する；
（ｇ）フィーダー細胞層を含み、培養培地がマウスＬＩＦまたはその活性のある変異体若しくは断片を含む条件下で試験管内で培養すると多能性を維持する；
（ｈ）以下を特徴とする分子署名を含む
（ｉ）接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせを含むラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現；
（ｉｉ）接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせ含むラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の発現；
（ｉｉｉ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１４で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｉｖ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１４で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｖ）表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現；
（ｖｉ）表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の発現；
（ｖｉｉ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｖｉｉｉ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１３で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｉｘ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１２で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の１以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｘ）Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞と比べたとき、表１２で示されるようなラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の発現における少なくとも２０倍の上昇；
（ｘｉ）パート（ｉ）〜（ｘ）のラットＥＳ細胞特異的な遺伝子の発現の任意の組み合わせ；
（ｘｉｉ）列記された多能性マーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８について表１５で示されるような多能性マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の多能性のランク付けの欄を参照；
（ｘｉｉｉ）列記された中胚葉マーカーの少なくとも２、３または４について表１５で示されるような中胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の中胚葉のランク付けの欄を参照；
（ｘｉｖ）列記された内胚葉マーカーの少なくとも２、３、４、５または６について表１５で示されるような内胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の内胚葉のランク付けの欄を参照；
（ｘｖ）列記された神経マーカーの少なくとも２または３について表１５で示されるような神経マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の神経のランク付けの欄を参照；
（ｘｖｉ）列記された栄養外胚葉マーカーについて表１５で示されるような栄養外胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表１５の栄養外胚葉のランク付けの欄を参照；
（ｘｖｉｉ）表１５で示されるような多能性マーカー、中胚葉マーカー、内胚葉マーカー、神経マーカー及び／または栄養外胚葉マーカーの１以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）の相対的な発現レベル。
（ｘｖｉｉｉ）表１５で示されるマーカーのそれぞれの相対的な発現レベル。
（ｘｉｘ）ｘｉｉ〜ｘｉｘで示された署名の任意の組み合わせ；及び／または
（ｘｘ）ｉ〜ｘｉｘで示された署名の任意の組み合わせ；
（ｉ）Ｆ０ラットを作出する能力を有する；
（ｊ）継代培養され、未分化状態を維持することが可能である；
（ｋ）正常なラット細胞と同じ数の染色体を有する； 
（ｌ）傍分泌ＬＩＦのシグナル伝達を必要とせずに試験管内で多能性を維持する；及び／または
（ｍ）多能性を維持しながらそれらが無限に分裂することを意味する、自己複製能を有する。
【０１００】
（ｉｉｉ）発現カセット
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」及び「核酸断片」は本明細書では相互交換可能に使用される。これらの用語はヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドは、任意で合成の、非天然のまたは変化させたヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態でのポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはそれらの混合物の１以上の断片から構成され得る。ポリヌクレオチドは、天然に存在する分子及び合成の類似体及びこれらの組み合わせ含むデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステム及びループ構造等を含むが、これらに限定されない配列のあらゆる形態も包含する。
【０１０１】
さらに提供されるのは組換えポリヌクレオチドである。用語「組換えポリヌクレオチド」及び「組換えＤＮＡ構築物」は本明細書では相互交換可能に使用される。組換え構築物は、天然では一緒に見いだされない核酸配列、たとえば、調節配列及びコーディング配列の人工的なまたは非相同の組み合わせを含む。他の実施形態では、組換え構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコーディング配列、または同じ供給源に由来するが、天然で見いだされるものとは異なる方法で配置される調節配列及びコーディング配列を含み得る。そのような構築物をそれだけで用いてもよいし、またはベクターと併せて用いてもよい。ベクターを使用するのであれば、そのときは、ベクターの選択は当業者に周知であるように宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に左右される。たとえば、プラスミドベクターを使用することができる。宿主細胞を上手く形質転換する、選択する、及び増殖させるのに必要とされ、本明細書で提供される単離された核酸断片のいずれかを含む遺伝要素。とりわけ、ＤＮＡのサザン解析、ｍＲＮＡ発現のノーザン解析、タンパク質発現の免疫ブロット解析または表現型解析によってスクリーニングが達成され得る。
【０１０２】
特定の実施形態では、ラット細胞における発現のための発現カセットにて本明細書で記載される成分の１以上を提供することができる。カセットは本明細書で提供されるポリヌクレオチドに操作可能に連結される５’及び３’の調節配列を含むことができる。「操作可能に連結される」は２以上の要素の間での機能的な連結を意味する。たとえば、当該ポリヌクレオチドと調節配列（すなわち、プロモータ）との間の操作可能な連結は、当該ポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的な連結である。操作可能に連結された要素は隣接してもよいし、非隣接であってもよい。２つのタンパク質コーディング領域の連結を指すのに使用される場合、操作可能に連結されるはコーディング領域が同一の読み取りフレーム内にあることを意味する。別の例では、タンパク質をコードする核酸配列は、適正な転写調節を保持するように調節配列（たとえば、プロモータ、エンハンサ、サイレンサの配列等）に操作可能に連結され得る。カセットはさらに、ラットＥＳ細胞に同時に導入される少なくとも１つの追加の当該ポリヌクレオチドを含有する。或いは、追加の当該ポリヌクレオチドを複数の発現カセットにて提供することができる。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節のもとにある組換えポリヌクレオチドの挿入のための複数の制限部位及び／または組換え部位と共に提供される。発現カセットはさらに選択マーカー遺伝子を含有し得る。
【０１０３】
発現カセットは、転写の５’〜３’方向で転写及び翻訳の開始領域（すなわち、プロモータ）、本明細書で提供される組換えポリヌクレオチド及び哺乳類細胞または当該宿主細胞にて機能的な転写及び翻訳の終結領域（すなわち、終結領域）を含むことができる。調節領域（すなわち、プロモータ、転写調節領域及び翻訳終結領域）及び／または本明細書で提供されるポリヌクレオチドは宿主細胞または互いに対してネイティブであり得る／類似し得る。或いは、調節領域及び／または本明細書で提供されるポリヌクレオチドは宿主細胞または互いに対して非相同であり得る。たとえば、非相同のポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモータはポリヌクレオチドが由来する種とは異なる種に由来する、または同一／類似の種に由来するのであれば、一方若しくは双方が元々の形態及び／またはゲノム遺伝子座から実質的に操作される、若しくはプロモータは操作可能に連結されたポリヌクレオチドのためのネイティブなプロモータではない。或いは、調節領域及び／または本明細書で提供される組換えポリヌクレオチドは完全に合成であり得る。
【０１０４】
終結領域は転写開始領域と共にネイティブであってもよく、操作可能に連結された組換えポリヌクレオチドと共にネイティブであってもよく、宿主細胞と共にネイティブであってもよく、またはプロモータ、組換えポリヌクレオチド、宿主細胞、若しくはそれらの組み合わせに対する別の供給源（すなわち、外来性または非相同性）に由来してもよい。
【０１０５】
発現カセットの調製において、適正な配向でＤＮＡ配列を提供するように種々のＤＮＡ断片が操作され得る。この目的に向かって、アダプターまたはリンカーを採用してＤＮＡ断片を連結してもよいし、または他の操作を含めて好都合な制限部位、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去等を提供してもよい。この目的で、試験管内の変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、たとえば、転移及び塩基変換が含められ得る。
【０１０６】
本明細書で提供される発現カセットにて多数のプロモータを使用することができる。所望の結果に基づいてプロモータを選択することができる。発現カセットにおける異なるプロモータの使用によって異なる適用を向上させ、当該ポリヌクレオチドの発現のタイミング、位置及び／またはレベルを調節することができることが認識される。そのような発現構築物は所望であれば、プロモータ調節領域（たとえば、誘導性の、構成的な、環境的にまたは発生的に調節された、または細胞若しくは組織に特異的な／選択性の発現を付与するもの）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写終結部位及び／またはポリアデニル化シグナルも含有し得る。
【０１０７】
（ｉｖ）標的とされた遺伝子組換えを有するＦ０ラット胚及びＦ１子孫を生成すること
本明細書で提供される種々の方法及び組成物を用いて遺伝子組換えしたラットを生成することができる。そのような方法は一般に、（ａ）本明細書で開示される単離されたラットＥＳ細胞のゲノムに標的とされた遺伝子組換えを導入して遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞を形成することと、（ｂ）遺伝子組換えを有する遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞の少なくとも１つをラット宿主胚に移植してＦ０胚を作出することと、（ｃ）Ｆ０胚を代理母に移植することと、（ｄ）Ｆ０胚を代理母にて出産予定日まで妊娠維持させることと、（ｅ）遺伝子組換えを有するＦ０ラットを特定することとを含む。
【０１０８】
遺伝子組換えした遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞を同一のラット系統に由来するまたは異なるラット系統に由来するラット宿主胚に移植することができる。たとえば、遺伝子組換えしたＤＡ系ラットＥＳ細胞をＤＡ系ラット宿主胚に移植することができ、またはＳＤ系宿主胚、ＡＣＩ系宿主胚、若しくは他の非相同のラット宿主胚に移植することができる。同様に、遺伝子組換えしたＡＣＩ系ラットＥＳ細胞をＡＣＩ系ラット宿主胚に導入することができ、またはＳＤ系宿主胚、ＤＡ系宿主胚、若しくは他の非相同のラット宿主胚に導入することができる。同様に、代理母は遺伝子組換えしたラット細胞と同じラット系統に由来することができ、及び／またはラット宿主胚または代理母は遺伝子組換えしたラット細胞及び／またはラット宿主胚とは異なるラット系統に由来することができる。非限定の一実施形態では、遺伝子組換えしたラット細胞はＤＡ系に由来し、宿主ラット胚はＳＤ宿主胚に由来し、代理母はＤＡ系に由来する。非限定の別の実施形態では、遺伝子組換えしたラット細胞はＡＣＩ系に由来し、宿主ラット胚はＳＤ系に由来し、代理母はＤＡ系に由来する。
【０１０９】
その上さらなる実施形態では、キメララット（Ｆ０）を交配して標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるＦ１子孫を作出することができる。加えて、Ｆ１子孫のオスラットをＦ１子孫のメスラットと交配して遺伝子組換えについてホモ接合体であるＦ２子孫を作出することができる。
【０１１０】
本明細書で提供される方法及び組成物は、遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％以上がＦ１子孫に遺伝子組換えを伝達するのを可能にする。
一部の実施形態では、標的とされた遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞は、相当する生物に由来する前桑実胚期の胚、たとえば、８細胞期のマウス胚に導入される。たとえば、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ７，５７６，２５９，ＵＳ７，６５９，４４２，ＵＳ７，２９４，７５４，及びＵＳ２００８−００７８０００Ａ１を参照のこと。他の実施形態では、ドナーのラットＥＳ細胞は宿主胚の４細胞期、８細胞期にて移植され得る。
【０１１１】
遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞を含むラット胚を胚盤胞期までインキュベートし、次いで代理母に移植してＦ０を作出する。本明細書で記載されるような対立遺伝子の操作（ＭＯＡ）アッセイを介して遺伝子組換えしたゲノム遺伝子座を運ぶラットを特定することができる。遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞に由来する得られたＦ０世代を野生型ラットと交配してＦ１世代の子孫を得る。特定のプライマー及び／またはプローブによる遺伝子型分析に続いて、遺伝子組換えしたゲノム遺伝子座についてヘテロ接合体であるＦ１ラットを互いに交配して遺伝子組換えしたゲノム遺伝子座についてホモ接合体であるラットを作出する。
【０１１２】
さらに提供されるのは、本明細書で提供されるラットＥＳ細胞の１つを含む少なくとも１つのヘテロ接合体幹細胞を有する内部細胞塊を含むＦ０ラット胚である。他の実施形態では、Ｆ０ラット胚の子孫が提供され、その際、Ｆ０の子孫の少なくとも５０％、６０％、７０％以上は本明細書で開示されるような遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞に由来する。
【０１１３】
態様の１つでは、桑実胚期のラット胚、胚盤胞期のラット胚または桑実胚期の胚と胚盤胞期の胚の間での発生段階のラット胚から導出すること、ラット細胞、及び多能性及び／または分化全能性を維持するのに十分な条件下でラット胚に由来するラット細胞を培養することを含む、ラットＥＳ細胞を作製する方法が提供される。一実施形態では、多能性及び／または分化全能性を維持するのに十分な条件には２ｉ培地が含まれる。
【０１１４】
態様の１つでは、当該核酸配列でラットＥＳ細胞ゲノムを操作し、操作したラットＥＳ細胞を形成する工程と、操作したラットＥＳ細胞をドナーラットＥＳ細胞として採用することと、ラットのドナーＥＳ細胞をラットの宿主胚と組み合わせることと、ドナーＥＳ細胞及びラットの宿主胚を培養することと、培養した宿主胚を用いて遺伝子組換えしたラットを作製することとを含む、遺伝子組換えしたラットを作製する方法が提供される。
【０１１５】
態様の１つでは、当該核酸配列でラットＥＳ細胞ゲノムを操作し、操作したラットＥＳ細胞を形成する工程と、操作したラットＥＳ細胞をドナーラットＥＳ細胞として採用することと、ラットのドナーＥＳ細胞をラットの宿主胚と組み合わせることと、ドナーＥＳ細胞及びラットの宿主胚を培養することと、培養した宿主胚を用いて遺伝子組換えしたラットを作製することとを含む、遺伝子組換えしたラットＦ１子孫を作製する方法が提供され、その際、子孫は、遺伝子組換えしたドナーラットＥＳ細胞に約３％、約１０％以上、または約６３％以上由来する。
【０１１６】
一実施形態では、培養した宿主胚をラット代理母に移植し、培養した宿主胚は代理母にて妊娠維持される。
【０１１７】
態様の１つでは、細菌の人工染色体上にて当該核酸配列によって多能性ラット細胞を遺伝子組換えして遺伝子組換えしたラット多能性細胞を形成することと、代理母にてラット宿主胚と共に遺伝子組換えしたラット多能性細胞を用いて遺伝子組換えを含む子孫を生成することと、任意で子孫を交配することとを含む、ラット多能性細胞に由来する遺伝子組換えを高頻度でラット子孫に伝達する方法が提供される。
【０１１８】
態様の１つでは、ラットＥＳ細胞を作製する方法が提供され、その際、該方法は、凍結した８細胞期胚を胚盤胞期まで培養することと、培養した胚盤胞からラット細胞を導出することと、多能性及び／または分化全能性を維持するのに十分な条件下で該ラット細胞を培養することとを含む。
【０１１９】
Ｖ．変異体、断片及び配列同一性
開示されたＬＩＦポリペプチド、特にマウスＬＩＦポリペプチドの活性のある変異体及び断片が本明細書で提供される。「変異体」は実質的に類似の配列を指す。本明細書で使用されるとき、「変異体ポリペプチド」は、ネイティブのタンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端における１以上のアミノ酸の欠失（いわゆる切り詰め）；ネイティブのタンパク質の１以上の内部部位における１以上のアミノ酸の欠失及び／または付加；またはネイティブのタンパク質での１以上の部位における置換によるネイティブのタンパク質に由来するポリペプチドを意味するように意図される。変異体ポリペプチドはネイティブのポリペプチドの所望の生物活性を持ち続け、すなわち、それらはラット及び／またはマウスの胚性幹細胞の分化を阻害し、幹細胞の自己複製能に寄与する。本明細書で開示されるポリペプチド（すなわち、配列番号１またはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号Ｐ０９０５６）の変異体は通常、参照配列に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するであろう。
【０１２０】
用語「断片」は、特定の数の隣接するアミノ酸を含むアミノ酸の部分を指す。特定の実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチドの断片は完全長ポリペプチドの生物活性を保持し得るので、ラット及び／またはマウスの胚性幹細胞の分化を阻害し、幹細胞の自己複製能に寄与し得る。本明細書で開示されるポリペプチド配列（すなわち、配列番号１またはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号Ｐ０９０５６）の断片は少なくとも１０、１５、２５、３０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００の隣接するアミノ酸、または完全長タンパク質に存在するアミノ酸の総数までの隣接するアミノ酸を含み得る。
【０１２１】
本明細書で使用されるとき、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定された比較ウインドウにわたって最大の対応について並べた場合同一である２つの配列における残基に言及する。タンパク質に関して配列同一性の比率が使用される場合、同一ではない残基は保存的アミノ酸置換によって異なることが多く、アミノ酸残基は類似の化学的特性（たとえば、電荷または疎水性）を持つ他のアミノ酸残基で置換されるので分子の機能的特性を変化させないことが認識される。配列が保存的置換で異なる場合、パーセント配列同一性を上方に調整して置換の保存的性質について補正し得る。そのような保存的置換によって異なる配列は「配列類似性」または「類似性」を有すると言う。この調整を行う手段は当業者に周知である。通常、これには、完全な一致ではなく部分的な一致として保存的置換をスコア化し、それによって配列同一性比率を高めることが関与する。従って、たとえば、同一のアミノ酸に１のスコアを与え、非保存的置換にはゼロのスコアを与えると、保存的置換はゼロと１の間のスコアが与えられる。たとえば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）における実施として保存的置換のスコア化を算出する。
【０１２２】
本明細書で使用されるとき、「配列同一性の比率」は比較ウインドウにわたって２つの最適に並べられた配列を比較することによって決定される値を意味し、その際、２つの配列の最適な配列比較について、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は参照配列（付加または欠失を含まない）に比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比率は、双方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、比較のウインドウにおける位置の総数で一致した位置の数を割り、結果に１００を乗じて配列同一性の比率を得ることによって算出される。
【０１２３】
言及されない限り、本明細書で提供される配列の同一性／類似性の値は、以下のパラメータ：５０のＧＡＰ加重及び３の長さ加重及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア化マトリクスを用いたヌクレオチド配列用の％同一性及び％類似性；８のＧＡＰ加重及び２の長さ加重及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリクスを用いたアミノ酸配列用の％同一性及び％類似性；またはそれらの同等のプログラム；を用いたＧＡＰバージョン１０を用いて得られる値を指す。「同等のプログラム」は、任意の２つの当該配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成される相当する配列比較と比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致及び同一のパーセント配列同一性を有する配列比較を生成する配列比較プログラムを意味する。
【０１２４】
限定目的ではなく、説明目的のために以下の実施例が提供される。
【０１２５】
実施例
実施例１：ラットＥＳ細胞の導出
ｒＥＳＣの特徴づけ。図１にて示すように、ｒＥＳＣはディッシュにてごく普通に分離し、浮いている小型の球形のコロニーとして増殖する（近接撮影、図４）。Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ：ｒＥＳＣはＯｃｔ−４（図２Ａ）及びＳｏｘ２（図２Ｂ）を含む多能性マーカーを発現し、高レベルのアルカリホスファターゼを発現する（図３、左のパネル）。ＤＡ株の核型は４２Ｘ，Ｙである（図４、右のパネル）。ｒＥＳＣは四倍体になることが多いので、分裂中期の染色体の広がりを数えることによって細胞株を事前にスクリーニングし、次いで最も正常なカウントを持つ細胞株の核型を正式に調べた。
ＡＣＩの胚盤胞は市販の過排卵メスから得た；ＤＡの胚盤胞は商業的に得た凍結８細胞期胚から培養した。酸タイロードによって透明帯を取り除き、有糸分裂上不活化されたＭＥＦ上に胚盤胞を置いた。増殖物を採取し、常法を用いて増殖させた。胚盤胞はすべてプレートに入れ、２ｉ培地を用いて培養し、増殖させた（参照によって本明細書に組み入れられるＬｉら、（２００８）、Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ，Ｃｅｌｌ、１３５：１２９９−１３１０）。
【表３】
2019062924.tif 000004
【０１２６】
実施例２：ラットの作出
胚盤胞の注入及び生殖系列を介したｒＥＳＣゲノムの伝達によってキメララットを作出した。親ＡＣＩ．Ｇ１ｒＥＳＣを用いた胚盤胞の微量注入によって作出したキメラを図５に示す。図５にて星印（＊）で標識したＡＣＩ／ＳＤキメラを父親とするアルビノ同腹仔を伴ったＦ１アグーチの仔を図６にて示す。
【０１２７】
親ｒＥＳＣの生殖系列伝達。アルビノＳＤ胚盤胞への微量注入によって多能性について３つの正倍数体のｒＥＳＣ細胞株を評価した。ｒＥＳＣの寄与を示すアグーチの被毛色によってキメラが特定された。各細胞株についてキメラの大半はＦ１子孫にｒＥＳＣのゲノムを伝達した（表４）。
【表４】
2019062924.tif 000005
【０１２８】
実施例３：ｒＥＳＣの標的化：ラットのＲｏｓａ２６遺伝子座
ｒＲｏｓａ２６遺伝子座はマウスにおけるように同じ間隔でＳｅｔｄ５及びＴｈｕｍｐｄ３の間にある。ｒＲｏｓａ２６遺伝子座（図７、パネルＢ）はｍＲｏｓａ２６遺伝子座（図７、パネルＡ）とは異なる。ｍＲｏｓａ２６の転写物は２または３のエクソンから成る。ラットの遺伝子座はマウスエクソン１に相同なエクソン（Ｅｘ１ａ）に加えて第２のエクソン１（Ｅｘｂ１b）を含有する。ラットでは第３のエクソンが同定されている。ｒ
Ｒｏｓａ２６対立遺伝子の標的化は図７（下）に示され、ＤＡのｒＥＳＣに由来するゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによって５ｋｂの相同性アームがそれぞれクローニングされた。標的とされた対立遺伝子はｒＲｏｓａ２６イントロンにおける１１７ｂｐの欠失を置き換えるＳＡ−ｌａｃＺ−ｈＵｂ−ｎｅｏカセットを含有する。
【０１２９】
ｒＲｏｓａ２６遺伝子座での標的化効率を測定した（表５）。線形化ベクターをエレクトロポレーションでＤＡまたはＡＣＩのｒＥＳＣに入れ、形質移入したコロニーを、常法を用いて２ｉ培地＋Ｇ４１８にて培養した。個々のコロニーを採取し、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）アッセイを用いてスクリーニングした（参照によって本明細書に組み入れられるＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄら．（２００３）、Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：６５２−６６０）。
【表５】
2019062924.tif 000006
【０１３０】
標的とされたＲｏｓａ２６ｒＥＳＣを用いたキメラの作出及び生殖系列伝達。再確認され、標的とされたｒＲｏｓａ２６クローンをＳＤの胚盤胞に微量注入し、常法を用いて、偽妊娠させたＤＳレシピエントメスに移した。毛色によってキメラを特定し、Ｆ０のオスキメラをＳＤメスと交配した。標的とされたＲｏｓａ２６対立遺伝子の存在について生殖系列（アグーチ）Ｆ１仔の遺伝子型を分析し、２２のアグーチ仔のうち９がＲｏｓａ２６遺伝子座にてヘテロ接合体として遺伝子型分析された（表６）。
【表６】
2019062924.tif 000007
【０１３１】
実施例３：ラット胚性幹細胞の導出
過排卵プロトコール、ラット
０日目：妊娠メスウマ血清を注射：ＩＰ、２０Ｕ（０．４ｍｌ）
１日目：動きなし
２日目：（４６時間後）：ｈＣＧ、ＩＰ、５０Ｕ（１ｍｌ）による注射
−単一のメス交配を設定
３日目：膣栓のチェック。メスに膣栓があった。これが０．５日目
６日目（ｅ３．５）：メスを安楽死させ、胚を流し出した。
【０１３２】
ＥＳ細胞の導出プロトコール（過排卵）
０日目
（１）メスラットをＣＯ２で安楽死させた。
（２）７０％エタノールで前面腹部を拭き取り、ハサミを用いて前面腹壁を開き、内臓をさらした。
（３）卵管及び子宮角を取り出し、温かいＮ２Ｂ２７培地を含有する組織培養ディッシュに入れた。多量の血液を出来るだけ洗い流し、Ｎ２Ｂ２７を伴った新しいディッシュに移した。
（４）１ｍｌの注射器と鈍い２７ｇの針を用いて子宮角及び卵管から培地を流し出して胚盤胞を培地に押し出した。
（５）口ピペットで胚盤胞を回収し、ＫＳＯＭ＋２ｉ（１μＭＰＤ０３２５９０１，３μＭのＣＨＩＲ９９０２１）を含有する胚培養ディッシュに移す。ＫＳＯＭはＭｉｌｌｉｐｏｒｅによって製造された培養培地である。カタログ番号はＭＲ−１０６−Ｄである。
（６）３７℃、７．５％ＣＯ２にて一晩培養した。
【０１３３】
ＥＳ細胞の導出プロトコール（凍結胚）
０日目
（１）Ｍ２培地にて凍結８細胞期胚（商業的に入手）を融解した。
１０分間、室温で培養した。
（２）ＫＳＯＭ＋２ｉに移し、一晩培養した。
【０１３４】
ＥＳ細胞の導出プロトコール（双方について同じ）
１日目
（１）空洞を作った胚を２ｉ培地に移し、一晩培養する。
（２）ＫＳＯＭ＋２ｉにて空洞のない胚を培養し続けた。
２日目
（１）残りの胚すべてを２ｉ培地に移した（それらが空洞を作っていようといまいと）。（２）一晩培養した；早期の胚を２ｉ培地にて培養し続けた。
３日目
（１）胚を３０〜６０秒間、酸タイロードに移して透明帯を取り除いた。
（２）２ｉ培地で３回、胚を洗浄して酸タイロードを取り除いた。
（３）９６穴のフィーダープレートの別々のウェル（ウェルは有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含有する）に各胚を分配した。
（４）２ｉ培地で一晩培養した。
４〜５日目
（１）増殖物（細胞の不定形で未分化の塊）の存在についてプレートの胚をモニターした。増殖物はプレートの胚のほぼ２倍の大きさである場合いつでも移せる。
（２）毎日：費やした培地を微量ピペットで取り除き、新鮮な２ｉ培地で置き換える。
（３）増殖物を新しいフィーダーウェルに移した：
ａ．費やした培地を取り除き、ＰＢＳでウェルを穏やかに洗浄する。
ｂ．ＰＢＳを取り除き、３０μｌの０．０５％トリプシンを加え、１０分間インキュベートする。
ｃ．３０μｌの２ｉ＋１０％ＦＢＳを加えることによってトリプシン反応を停止した。
ｄ．微量ピペットで細胞を穏やかに解離させ、ウェルの内容物全体を２４穴フィーダープレートの新しいウェルに移した。これが継代１（Ｐ１）だった。
ｅ．２ｉ培地で一晩培養した。
５〜８日目（タイミングは各細胞株がどれくらい速く増殖するかに左右される）
（１）毎日培地を交換し（２ｉ培地）、ＥＳＣの形態を持つコロニーの存在についてモニターした。
（２）コロニーが現れるとコロニーが約５０％の集密度に増殖するまで培養し続けた。
（３）６穴ディッシュにて細胞株当たり１ウェルでフィーダー上に載せる前にトリプシン処理し、コロニーを継代した。これが継代２（Ｐ２）だった。
進行中
（１）ほぼ５０％の集密度まで各細胞株を養い、モニタリングし続けた。
（２）いつものように細胞をトリプシン処理した。
（３）２ｉ＋１０％ＦＢＳでトリプシンを止め；遠心分離によって細胞をペレットにした（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ卓上遠心機で１２００ｒｐｍ、５分間）。
（４）上清を吸引し、４００μｌの凍結培地（７０％２ｉ，２０％ＦＢＳ，１０％ＤＭＳＯ）にて細胞を穏やかに再浮遊させた。
（５）２つのバイアルに細胞を分配し、−８０℃で凍結する。これが継代３（Ｐ３）だった。
（６）長期の保存には、バイアルを液体Ｎ２貯蔵に移した。
２ｉ培地は表７にて以下のように調製した。
【表７】
2019062924.tif 000008
【０１３５】
材料：
妊娠メスウマ血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）
ヒト妊娠尿絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）
メスラット（５〜１２週齢）
オスラット（１２週齢〜８ヵ月齢）、ケージ当たり１匹
注射器／針
６：００〜１８：００に照明のつく動物室
手順：
１日目：８：００〜１０：００ＡＭ
２０ＩＵのＰＭＳＧ（０．４ｍｌ）をＩＰでメスに注射する。
使用しなかったＰＭＳＧを捨てる。
３日目：８：００〜１０：００ＡＭ（ＰＭＳＧ注射の４８時間後）
５０ＩＵのＨＣＧ（１ｍｌ）をＩＰでメスに注射する。
交配ケージにおけるオス当たりメス１匹を入れる。
使用しなかったＨＣＧを捨てる。
４日目：８：００〜１０：００ＡＭ（ＨＣＧ注射の２４時間後）
膣栓についてメスをチェックする。
ホルモンの供給者
ＰＭＳＧ：Ｓｉｇｍａ＃Ｇ−４８７７（１０００ＩＵ）。５０ＩＵ／ｍｌの最終［］にＰＢＳにて再懸濁する。１ｍｌのアリコートで−２０℃にて保存。
ＨＣＧ：Ｓｉｇｍａ＃ＣＧ−５（５０００ＩＵ）。５０ＩＵ／ｍｌの最終［］にＰＢＳにて再懸濁する。１ｍｌのアリコートで−２０℃にて保存。
【０１３６】
実施例４：ラット胚性幹細胞株の核型分析
本明細書で生成されたラットＥＳ細胞株の核型を分析した、結果を表８〜１１にて要約する。
【表８】
2019062924.tif 000009
【表９】
2019062924.tif 000010
【表１０】
2019062924.tif 000011
【表１１】
2019062924.tif 000012
【０１３７】
実施例５：ラット胚性幹細胞へのベクターのエレクトロポレーション
１．エレクトロポレーションの２４〜４８時間前にラットＥＳ細胞を継代した。
２．エレクトロポレーションの２４時間前に培地をＲＶＧ２ｉ＋ＲＯＣＫｉ（１０μＭのＹ−２７６３２）に交換した。
３．トリプシン処理の３０分前に培地を交換した。
４．エレクトロポレーションされるＤＮＡを等分した。
５．ＤＮＡを室温で＞１０分温めた。
６．ＤＮＡを６２℃で５分間加熱した。ＤＮＡを氷上に置いた。
７．トリプシン処理した細胞
ａ．浮かんでいるコロニーを回収した。プレートを洗浄して浮かんでいるものを出来るだけ多く回収した。
ｂ．７５０ｒｐｍで３分間、コロニーをペレットにした。
ｃ．５〜１０ｍｌのＰＢＳでペレットを１回洗浄した及び再スピン／ペレット
ｄ．上清を吸引した；５００λのトリプシン、０．０５％＋１％ニワトリ血清を加えた。
ｉ．試験管当たり１０ｃｍプレート１枚分のコロニーを超えてプールしなかった。トリプシン処理の間に試験管の底に多すぎるコロニーが詰め込まれると、それらは凝集し、細胞のほとんどが失われるであろう。
ｅ．３７℃で４分間。コロニーを数回ピペッティングして凝集を出来るだけ抑える。
ｆ．工程を１〜２回繰り返す；３７℃で４分間。
ｇ．５００λのＲＶＧ２ｉ＋１０％ＦＢＳでトリプシンを止めた。
８．細胞をペレットにした：１２００ｒｐｍで５分間。
９．１０ｍｌのＰＢＳに細胞を再浮遊させた。２０λの２つのアリコートを数えて総細胞数を決定する。
１０．細胞をペレットにした（５分間／１２００ｒｐｍ）；総細胞数と再浮遊総容量を計算して正しい細胞濃度を達成する（標的＃７５μｌのＥＰ緩衝液）。
１１．最少容量のＥＰ緩衝液に再浮遊させた；総容量を測定し、ＥＰ緩衝液で目標容量に合わせる。エレクトロポレーション用緩衝液はＭｉｌｌｉｐｏｒｅによって販売されている。カタログ番号はＥＳ−００３−Ｄである。参照によって本明細書に組み入れられるＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、（２００３）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１：６５２−６５９を参照のこと。
１２．５０λのＤＮＡに７５λの細胞を加える。１２５λの細胞／ＤＮＡ溶液をＢＴＸ４８穴キュベットのウェルの１つに移す。
ａ．同じカラムにおける空のウェルを１２５λのＥＰ緩衝液で満たす。
１３．ＢＴＸエレクトロポレータにて１回キュベットをパルスした。
ａ．設定：４００Ｖ；Ω；１００μＦ（設定は変わり得る）
１４．１５分間キュベットを氷上に置き、回復させた。
１５．細胞を取り出し５ｍｌのＲＶＧ２ｉ＋１０μＭのＲＯＣＫｉに入れた。
１６．２０ｍｌのＲＶＧ２ｉ＋１０μＭのＲＯＣＫｉを伴った１５ｃｍのプレートに加えた。プレートは２×ｎｅｏＲ  ＭＥＦ（プロジェクトに応じて他のＭＥＦ）を有する。ｎｅｏＲ選択可能マーカーは、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられるＢｅｃｋら、（１９８２）、Ｇｅｎｅ，１９：３２７−３６またはＵＳ７，２０５，１４８または６，５９６，５４１のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である。
１７．３７℃でインキュベートした。４８時間後選択を開始する。
使用したＲＯＣＫ阻害剤はＹ−２７６３２だった。
【０１３８】
実施例６：ラット胚性幹細胞における標的とされた遺伝子組換えを選択すること
１．エレクトロポレーションの２４〜４８時間前にラットＥＳ細胞を継代した。
２．エレクトロポレーションの２４時間前に培地をＲＶＧ２ｉ＋ＲＯＣＫｉ（１０μＭのＹ−２７６３２）に交換した。
３．トリプシン処理の３０分前に培地を交換した。
４．エレクトロポレーションされるＤＮＡを等分した。
５．ＤＮＡを室温で＞１０分温めた。
６．ＤＮＡを６２℃で５分間加熱した。ＤＮＡを氷上に置いた。
７．トリプシン処理した細胞
ｈ．浮かんでいるコロニーを回収した。プレートを洗浄して浮かんでいるものを出来るだけ多く回収した。
ｉ．７５０ｒｐｍで３分間、コロニーをペレットにした。
ｊ．５〜１０ｍｌのＰＢＳでペレットを１回洗浄した及び再スピン／ペレット
ｋ．上清を吸引した；５００λのトリプシン、０．０５％＋１％ニワトリ血清を加える。
ｉ．試験管当たり１０ｃｍプレート分１枚分のコロニーを超えてプールしなかった。トリプシン処理の間に試験管の底に多すぎるコロニーが詰め込まれると、それらは凝集し、細胞のほとんどが失われるであろう。
ｌ．３７℃で４分間。コロニーを数回ピペッティングして凝集を出来るだけ抑える。
ｍ．工程１〜２を３７℃で４回繰り返す。
ｎ．５００λのＲＶＧ２ｉ＋１０％ＦＢＳでトリプシンを止めた。
８．細胞をペレットにした：１２００ｒｐｍで５分間。
９．１０ｍｌのＰＢＳに細胞を再浮遊させた。２０λの２つのアリコートを数えて総細胞数を決定する。
１０．細胞をペレットにした（５分間／１２００ｒｐｍ）；総細胞数と再浮遊総容量を計算して正しい細胞濃度を達成する（標的＃／７５μｌのＥＰ緩衝液）。
１１．最少容量のＥＰ緩衝液に再浮遊させた；総容量を測定し、ＥＰ緩衝液で目標容量に合わせた。
１２．５０λのＤＮＡに７５λの細胞を加える。１２５λの細胞／ＤＮＡ溶液をＢＴＸ４８穴キュベットのウェルの１つに移す。
ａ．同じカラムにおける空のウェルを１２５λのＥＰ緩衝液で満たす。
１３．ＢＴＸエレクトロポレータにて１回キュベットをパルスした。
ａ．設定：４００Ｖ；Ω；１００μＦ（設定は変わり得る）
１４．１５分間キュベットを氷上に置き、回復させた。
１５．細胞を取り出し５ｍｌのＲＶＧ２ｉ＋１０μＭのＲＯＣＫｉに入れた。
１６．２０ｍｌのＲＶＧ２ｉ＋１０μＭのＲＯＣＫｉを伴った１５ｃｍのプレートに加えた。プレートは２×ｎｅｏＲ  ＭＥＦ（プロジェクトに応じて他のＭＥＦ）を有した。
１７．３７℃でインキュベートした。４８時間後選択を開始する。
１８．Ｇ４１８の選択プロトコールは以下のとおりだった：
ａ．２日目（ＥＰ後２番目の日）：２ｉ培地＋７５μｇ／ｍｌのＧ４１８にて細胞をインキュベートした。
ｂ．３日目：Ｇ４１８を含まない２ｉ培地にて細胞をインキュベートした。
ｃ．４日目：２ｉ培地＋７５μｇ／ｍｌのＧ４１８にて細胞をインキュベートした。
ｄ．５日目：Ｇ４１８を含まない２ｉ培地にて細胞をインキュベートした。
ｅ．６日目：２ｉ培地＋７５μｇ／ｍｌのＧ４１８にて細胞をインキュベートした。
ｆ．７日目：Ｇ４１８を含まない２ｉ培地にて細胞をインキュベートした。
ｇ．８日目：２ｉ培地＋７５μｇ／ｍｌのＧ４１８にて細胞をインキュベートした。
ｈ．９日目：Ｇ４１８を含まない２ｉ培地にて細胞をインキュベートした。
ｉ．１０日目：２ｉ培地＋７５μｇ／ｍｌのＧ４１８にて細胞をインキュベートした。
ｊ．１１日目：Ｇ４１８を含まない２ｉ培地細胞をインキュベートした。
ｋ．１２日目：コロニーを採取してスクリーニングのために増殖させた。各コロニーを０．０５％トリプシン＋１％ニワトリ血清にて１０分間解離させ、次いで、９６穴フィーダープレートの１ウェルに入れた。
１９．２ｉ培地にて３日間コロニーを増殖させた。
２０．クローンを１：１で継代し、新しい９６穴フィーダープレートに入れた。
２１．２ｉ培地にて３日間コロニーを増殖させた。
２２．各クローンについて、トリプシンにてコロニーを解離させた。各クローンの２／３を凍結し、−８０℃で保存する。残りの１／３をラミニンプレート（１０μｇ／ｍｌのラミニンで被覆した９６穴プレート）に入れた。
２３．ラミニンプレートが集密になったら、クローンの遺伝子型分析のためにスクリーニング研究室に渡した。
【０１３９】
実施例７：ラット胚性幹細胞の分子署名
表１３に列記された遺伝子は、マウスＥＳ細胞における相当する遺伝子よりもラットＥＳ細胞にて２０倍高いレベルで発現された。表１２に列記された遺伝子は、マウスＥＳ細胞における相当する遺伝子よりもラットＥＳ細胞にて２０倍低いレベルで発現された。
【０１４０】
表１２及び１３におけるマイクロアレイのデータは以下のように生成した。ラットＥＳ細胞（ＡＣＩ．Ｇ２及びＤＡ．２Ｂ）及びマウスＥＳ細胞（Ｆ１Ｈ４）を２ｉ培地にて３継代について集密になるまで培養した。Ｆ１Ｈ４細胞はフィーダーの非存在下でゼラチン被覆したプレートで培養した。Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞は１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ及びＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃのヘテロ接合体胚に由来した(たとえば、その全体が参照によ
って本明細書に組み入れられるＵＳ７，２９４，７５４及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，Ｗ．Ｔ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．，Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．，Ｈｉｃｋｅｙ，Ｊ．Ｆ．，Ｅｓｃａｒａｖａｇｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｓａｕ，Ｌ．，Ｄｏｒｅ，Ａ．Ｔ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓ．，Ａｄａｍｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｍ．Ｇ．，Ｇａｌｅ，Ｎ．Ｗ．，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．（２００７）を参照のこと）。
【０１４１】
試料の調製には以下のプロトコールを用いた。
【０１４２】
材料には、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｐ；ＲＮＡ溶解緩衝液（Ｚｙｍｏ  Ｋｉｔ）；及び１．５ｍＬのエッペンドルフチューブが含まれた。
【０１４３】
試料のＩＤで１．５ｍＬのエッペンドルフチューブを標識した。プレート上で増殖した細胞を３７℃のＰＢＳですすいだ。ＰＢＳを取り除き、３００uｌのＴｒｉｚｏｌを加え
た。スクレーパーを用いてＴｒｉｚｏｌ中の細胞を壊した。１．５ｍＬのエッペンドルフチューブにおけるＴｒｉｚｏｌ中にて溶解した細胞を回収した。浮遊液で増殖した細胞については、３７℃のＰＢＳで細胞をすすいだ。細胞を１．５ｍｌのチューブに回収し、細胞を遠心分離し、ＰＢＳを取り除き、３００uｌのＴｒｉｚｏｌを加えた。細胞をピペッ
トで上下にかき回し、細胞を壊した。１０１〜１０５の細胞によるＦＡＣＳのために細胞を選別し、容量を１００uｌ未満に濃縮した。４容量のＲＮＡ溶解緩衝液を加え、ピペッ
ティングによって混合した。試料については、３２０uｌのＲＮＡ溶解緩衝液を８０uｌの試料に加えた。試料を−２０℃で保存した。
【０１４４】
ＲＮＡ−Ｓｅｑを用いてマウス及びラットの遺伝子の発現レベルを測定した。配列決定の読み取りをＴｏｐｈａｔによってマウス及びラットの参照ゲノムに対してマッピングし、ＲＰＫＭ（マッピングされた１００万断片当たりのエクソンのキロベース当たりの断片）をマウス及びラットの遺伝子について算出した。遺伝子記号に基づいた相同性の遺伝子を選択し、次いでｔ−検定を用いてマウスとラットの間で遺伝子の発現レベルを比較した。
【０１４５】
ｍｉＲ−６３２はラットＥＳＣで最も高く発現された上位１０に入るが、それはマウスＥＳ細胞では発現されなかった。従ってこれらの遺伝子について匹敵するデータはない。胚発生における他の遺伝子及びその既知の機能と比べた発現のレベルに基づいて、ｍｉＲ−６３２の発現はラットＥＳ細胞のマーカーとして用いた。
【表１２−１】
2019062924.tif 000013
【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
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【表１２−８】
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【表１２−９】
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【表１２−１０】
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【表１２−１１】
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【表１２−１２】
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【表１２−１３】
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【表１２−１４】
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【表１２−１５】
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【表１２−１６】
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【表１２−１７】
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【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【表１３−６】
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【表１３−７】
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【表１４】
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【０１４６】
ラットＥＳ細胞についての多能性のマーカー／遺伝子を採用する追加の分子署名も開発されている。表１５は、遺伝子のリスト及びＲＮＡのプロファイリングデータに由来するその発現ランクを提供する。ラットＥＳ細胞からｍＲＮＡを単離し、種々の多能性マーカーの発現レベルを互いに対して比較した。列記されている「多能性遺伝子」は他のグループがＥＳ細胞のマーカーとして使用している（ほとんどマウスで、しかしラットでも）遺伝子である。中胚葉、内胚葉及び神経は似たように定義される。「ランク」によって我々の実験における発現を指し；ランクが高ければ高いほど（１が最高）、発現が高い。たとえば、１３のＯｃｔ４のランクは、アッセイされた遺伝子すべてのうちで、１２の遺伝子を除いてすべてよりそれが高く発現されたことを意味する。この実験のバックグラウンドは３０を下回る発現値だった；６１０７の遺伝子が３０以上の発現値を有した。
【表１５】
2019062924.tif 000038
【０１４７】
本明細書で言及された出版物及び特許出願はすべて本発明が関係する技術における当業者のレベルを示す。出版物及び特許出願はすべて、各個々の出版物及び特許出願が参照によって組み入れられるように具体的に且つ個々に指示されるかのような同程度に参照によって本明細書に組み入れられる。任意の実施形態の文脈から明らかではない限り、本発明の態様、工程または特徴を任意の他のものとの組み合わせで使用することができる。範囲に対する参照は範囲内での、範囲内での部分的な範囲内での任意の整数を含む。複数の範囲に対する参照はそのような範囲の組み合わせを含む。
（項目１）
ＡＣＩまたはＤＡから選択される系統の単離されたラットＥＳ細胞であって、前記単離されたラットＥＳ細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達している及び伝達することが可能である、前記単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２）
細胞がＡＣＩラットに由来する項目１に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目３）
細胞がダークアグーチ（ＤＡ）ラット２に由来する項目１または２に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目４）
細胞が正倍数体であり、生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である項目１、２または３に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目５）
ラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む項目４に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目６）
ラットＥＳ細胞が少なくとも６０％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目４に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目７）
ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す項目１〜６のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目８）
ラットＥＳ細胞が連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目１〜８のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目９）
ラットＥＳ細胞が１以上、２以上または３以上の標的とされた遺伝子組換えを含む項目１〜８のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１０）
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目４〜９のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１１）
標的とされた遺伝子組換えが細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも１回の挿入を含む項目９に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１２）
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む項目１１に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１３）
（ａ）選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または（ｂ）ラットＥＳ細胞が選択マーカーをコードする少なくとも２コピーのポリヌクレオチドを含む項目１２に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１４）
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目１２に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１５）
ラットＥＳ細胞が、ＬＩＦポリペプチド、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培養物におけるフィーダー細胞層上に置かれると、球形様のコロニーを形成する項目１〜１４のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１６）
ラットＥＳ細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する項目１〜１５のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１７）
細胞が多能性を維持するために傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としない項目１〜１６のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１８）
細胞がオス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞である項目１〜１７のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１９）
細胞がメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である項目１〜１９のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２０）
ラットＥＳ細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地にて少なくとも１１回まで継代することができる項目１〜１９のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２１）
ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する項目１〜２０のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２２）
ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏ１またはそれらの組み合わせから選択される１以上の多能性マーカーを発現しない項目１〜２１のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２３）
ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２またはそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉マーカーを発現しない項目１〜２２のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２４）
ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７またはそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉マーカーを発現しない項目１〜２３のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２５）
ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６またはそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない項目１〜２４のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２６）
細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目１〜２５のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２７）
ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせの１以上から選択されるラットＥＳＣに特異的な遺伝子の１以上の発現を特徴とする項目１〜２６のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２８）
ラットＥＳ細胞の単離された集団であって、前記ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置くと球形様のコロニーを形成する、前記ラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目２９）
ラットＥＳ細胞がＡＣＩラットに由来する項目２８に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３０）
ラットＥＳ細胞がダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する項目２８に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３１）
ラットＥＳ細胞が、生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である項目２８〜３０のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３２）
ラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目２８〜３１のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３３）
ラットＥＳ細胞が少なくとも６０％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目２８〜３１のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３４）
ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す項目２８〜３１のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３５）
ラットＥＳ細胞が連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目２８〜３４のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３６）
ラットＥＳ細胞が１以上、２以上または３以上の標的とされた遺伝子組換えを含み、生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することができる項目２８〜３５のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３７）
標的とされた遺伝子組換えがラットのＲｏｓａ２６遺伝子座におけるものである項目３６に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３８）
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目３６に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３９）
標的とされた遺伝子組換えが細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも１回の挿入を含む項目３６に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４０）
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む項目３９に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４１）
（ａ）選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または（ｂ）ラットＥＳ細胞が選択マーカーをコードする少なくとも２コピーのポリヌクレオチドを含む項目４０に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４２）
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目４０に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４３）
細胞が、ＬＩＦポリペプチド、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培養物におけるフィーダー細胞上に置かれると、球形様のコロニーを形成する項目２８〜４２のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４４）
細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する項目２８〜４３のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４５）
細胞が多能性を維持するために傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としない項目２８〜４４のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４６）
ラットＥＳ細胞がオス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞である項目２８〜４４のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４７）
ラットＥＳ細胞がメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である項目２８〜４４のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４８）
ラットＥＳ細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地にて少なくとも１１回まで継代することができる項目２８〜４７のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４９）
ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する項目２８〜４８のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５０）
ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏ１またはそれらの組み合わせから選択される１以上の多能性マーカーを発現しない項目２８〜４９のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５１）
ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２またはそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉マーカーを発現しない項目２８〜５０のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５２）
ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７またはそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉マーカーを発現しない項目２８〜５１のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５３）
ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６またはそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない項目２８〜５２のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５４）
ラットＥＳ細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目２８〜５３のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５５）
ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせの１以上から選択されるラットＥＳＣに特異的な遺伝子の１以上の発現を特徴とする項目２８〜５４のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５６）
集団が少なくとも１０４個の細胞を含む項目２８〜５５のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５７）
ラットＥＳ細胞が、
ａ．ラットＥＳ細胞の少なくとも９０％が正倍数体である；
ｂ．ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が少なくとも１つの多能性マーカーを発現し、少なくとも１つの多能性マーカーはＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む；
ｃ．ラットＥＳ細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットＥＳ細胞株のゲノムを子孫に伝達する；
ｄ．ラットＥＳ細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する；
ｅ．ラットＥＳ細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、ラットＥＳ細胞が球形様のコロニーを形成する；（ｆ）ラットＥＳ細胞はＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＬＩＦ及びＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層を含む培地にて試験管内で培養すると多能性を維持する；
ｆ．ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す；
ｇ．傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要とすることなく、ラットＥＳ細胞が試験管内で多能性を維持する；
ｈ．ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する；
ｉ．ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する；
ｊ．ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏｌから選択される１以上の分化マーカーを発現しない；
ｋ．ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２またはそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉性マーカーを発現しない；
ｌ．ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７またはそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉性マーカーを発現しない；及び／または
ｍ．ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６またはそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない；を含む１以上の特徴を有する項目２８〜５６のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５８）
（ａ）ラットＥＳ細胞がラット胚盤胞に由来する、（ｂ）ラットＥＳ細胞がラット桑実胚期の胚に由来する、及び／または（ｃ）ラットＥＳ細胞株が過排卵ラットに由来する項目２８〜５７のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５９）
フィーダー細胞層と、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞の集団と、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地とを含む試験管内培養物であって、ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、ラットＥＳ細胞が球形様のコロニーを形成する、前記試験管内培養物。
（項目６０）
ラットＥＳ細胞がフィーダー細胞層にゆるやかに接着する項目５９または６０に記載の試験管内培養物。
（項目６１）
ラットＥＳ細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である項目５９、６０または６１に記載の試験管内培養物。
（項目６２）
ラットＥＳ細胞がＡＣＩラットに由来する項目５９、６０または６１に記載の試験管内培養物。
（項目６３）
ラットＥＳ細胞がダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する項目５９、６０または６１に記載の試験管内培養物。
（項目６４）
ラットＥＳ細胞が生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である項目５９〜６３のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６５）
ラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む項目６４に記載の試験管内培養物。
（項目６６）
ラットＥＳ細胞が少なくとも６０％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目６４に記載の試験管内培養物。
（項目６７）
ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す項目５９〜６６のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６８）
ラットＥＳ細胞が、連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目５９〜６７のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６９）
ラットＥＳ細胞が、１以上、２以上または３以上の標的とされた遺伝子組換えを含む項目５９〜６８のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７０）
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目６９に記載の試験管内培養物。
（項目７１）
標的とされた遺伝子組換えが細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも１回の挿入を含む項目６９に記載の試験管内培養物。
（項目７２）
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーである項目７１に記載の試験管内培養物。
（項目７３）
（ａ）選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または（ｂ）ラットＥＳ細胞が選択マーカーをコードする少なくとも２コピーのポリヌクレオチドを含む項目７２に記載の試験管内培養物。
（項目７４）
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目７２に記載の試験管内培養物。
（項目７５）
細胞が多能性を維持するために傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としない項目５９〜７４のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７６）
細胞がオス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞である項目５９〜７５のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７７）
細胞がメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である項目５９〜７５のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７８）
ラットＥＳ細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地にて少なくとも１１回まで継代することができる項目５９〜７７のいずれか１項に記載の試験管内培養物。（項目７９）
ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する項目５９〜７８のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８０）
ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏ１またはそれらの組み合わせから選択される１以上の多能性マーカーを発現しない項目５９〜７９のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８１）
ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２またはそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉マーカーを発現しない項目５９〜８０のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８２）
ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７またはそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉マーカーを発現しない項目５９〜８１のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８３）
ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６またはそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない項目５９〜８２のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８４）
細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目５９〜８３のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８５）
ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせの１以上から選択されるラットＥＳＣに特異的な遺伝子の１以上の発現を特徴とする項目５９〜８４のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８６）
ＬＩＦの濃度が５０Ｕ／ｍｌ〜１５０Ｕ／ｍｌである項目５９〜８４のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８７）
ＬＩＦの濃度が１００Ｕ／ｍｌである項目５９〜８５のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８８）
ＬＩＦがマウスに由来するまたは配列番号１に対して少なくとも９２％の配列同一性を含む項目５９〜８７のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８９）
ラットＥＳ細胞が、傍分泌ＬＩＦのシグナル伝達を必要とせずに多能性を維持することが可能である項目５９〜８８のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９０）
フィーダー細胞層がＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされない項目５９〜８９のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９１）
フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む項目５９〜９０のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９２）
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１を含む項目５９〜９１のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９３）
ＧＳＫ-３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１を含む項目５９〜９２のいずれか１項に記載の
試験管内培養物。
（項目９４）
ラットＥＳ細胞の集団がラット胚盤胞期の胚またはラット桑実胚期の胚に由来する項目５９〜９３のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９５）
胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚がさらにラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を含む項目９４に記載の試験管内培養物。
（項目９６）
ラットＥＳ細胞の集団がラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の単離された増殖物を含む項目９４に記載の試験管内培養物。
（項目９７）
ラットの胚性幹（ＥＳ）細胞株の生成方法であって、（ａ）フィーダー細胞層と胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚とを試験管内で培養することと、（ｂ）ラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を第２のフィーダー細胞層を十分に含む試験管内培養物に移し、マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）またはマウスＬＩＦの活性のある変異体を有する培地を含む条件下で前記増殖物を培養し、それによってラットＥＳ細胞の多能性を維持し、それからラットＥＳ細胞株を樹立することとを含み、その際、胚盤胞期のまたは桑実胚期のラット胚の透明帯は取り除かれており、培養条件はラットＥＳ細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）または配列番号１に対して少なくとも９１％の配列同一性を有し、且つＬＩＦ活性を有する配列、及びＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を有する培地を含む、前記方法。
（項目９８）
ラットＥＳ細胞株が少なくとも５回継代される項目９７に記載の方法。
（項目９９）
ラットＥＳ細胞株が少なくとも１０回継代される項目９７または９８に記載の方法。
（項目１００）
培地が約５０Ｕ／ｍＬ〜約１５０Ｕ／ｍＬのマウスＬＩＦを含む項目９７、９８または９９に記載の方法。
（項目１０１）
培地が約１００Ｕ／ｍＬのマウスＬＩＦを含む項目９７〜１００のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０２）
フィーダー細胞層がＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされない項目９７〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０３）
フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む項目９７〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０４）
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１を含む項目９７〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０５）
ＧＳＫ-３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１を含む項目９７〜１０４のいずれか１項に記載
の方法。
（項目１０６）
（ａ）ラットＥＳ細胞株がＡＣＩラットに由来するまたはダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する；（ｂ）ラットＥＳ細胞株が桑実胚期のまたは胚盤胞期のラット胚に由来する；及び／または（ｃ）ラットＥＳ細胞株が過排卵させたラットからの桑実胚期のまたは胚盤胞期のラット胚に由来する項目９７〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０７）
培地がさらに、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤またはＡＬＫ阻害剤の少なくとも１つを含む項目９７〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０８）
ＦＧＦ受容体阻害剤がＰＤ１８４３５２を含み、ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２を含み、またはＡＬＫ阻害剤がＡ−８３−０１を含む項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
少なくとも１つのラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目９７〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１０）
標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率が少なくとも６０％である項目９７〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１１）
そのゲノムの中に非相同のポリヌクレオチドを安定的に組み入れているラットの胚性幹（ＥＳ）細胞の選択方法であって、（ａ）ラットＥＳ細胞の試験管内集団を提供することと、（ｂ）前記ラットＥＳ細胞にて活性のあるプロモータに操作可能に連結された選択マーカーを含む非相同のポリヌクレオチドを少なくとも１つのラットＥＳ細胞に導入することと、（ｃ）交互に入れ替える第１と第２の培養培地にて前記ラットＥＳ細胞集団を試験管内で培養し、それによってそのゲノムの中に前記非相同のポリヌクレオチドを安定的に統合しているラットＥＳ細胞を選択することとを含み、その際、前記第１の培養培地は第１の期間、有効量の選択剤を含み、前記第２の培養培地は選択剤を含まず、試験管内の培養条件が多能性を維持するのに十分である、前記方法。
（項目１１２）
第１の培養培地と第２の培養培地が２４時間ごとに交互に入れ替えられる項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
選択マーカーが抗生剤への耐性を付与する項目１１１または１１２に記載の方法。
（項目１１４）
抗生剤がＧ４１８を含む項目１１１〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１５）
選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、プロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）及び単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）またはそれらの組み合わせを含む項目１１１〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１６）
（ａ）選択マーカーが野生型選択マーカーに比べて高い活性を有する、及び／または（ｂ）選択マーカーの複数のコピーがラットＥＳ細胞のゲノムに安定的に組み込まれる項目１１１〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１７）
選択マーカーが非弱毒化選択マーカーである項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
単離されたラット胚性幹（ＥＳ）細胞の遺伝子組換え方法であって、項目１〜５８のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞を形成することを含む、前記方法。
（項目１１９）
遺伝子組換えしたラットの作製方法であって、
（ａ）項目１〜５８のいずれか１項に記載の単離されたラット胚性幹（ＥＳ）細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞を形成することと；
（ｂ）標的とされた遺伝子組換えを含むラットＥＳ細胞の少なくとも１つをラット宿主胚に導入してＦ０胚を作出することと；
（ｃ）Ｆ０胚を代理母に移植することと；
（ｄ）代理母にてＦ０胚を出産予定日まで妊娠維持させることと；
（ｅ）標的とされた遺伝子組換えを有するＦ０ラットを特定することとを含む、前記方法。
（項目１２０）
オスＦ０ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるＦ１子孫を作出することをさらに含む項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
オスＦ０ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるＦ１子孫を作出することをさらに含む項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
Ｆ１子孫のオスラットをＦ１子孫のメスラットと交配させ、遺伝子組換えについてホモ接合体であるＦ２子孫を得ることをさらに含む項目１１９に記載の方法。
（項目１２３）
遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも３％が遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する項目１１９〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２４）
遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも１０％が遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する項目１１９〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２５）
遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも６０％が遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する項目１１９〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２６）
遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞がラット宿主胚と同じラット系統に由来する項目１１９〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２７）
遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞がラット宿主胚と異なるラット系統に由来する項目１１９〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２８）
集団におけるラットＥＳ細胞が、
(ａ)ラットＥＳ細胞の少なくとも９０％が正倍数体である；
(ｂ)ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が少なくとも１つの多能性マーカーを発現し、前記少なくとも１つの多能性マーカーはＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む；
(ｃ)ラットＥＳ細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットＥＳ細胞株のゲノムを子孫に伝達する；
(ｄ)ラットＥＳ細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する；
(ｅ)ラットＥＳ細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、球形様のコロニーを形成する；
(ｆ)ラットＥＳ細胞がＧＳＫ３阻害剤と、ＭＥＫ阻害剤と、ＬＩＦと、ＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層とを含む培地にて試験管内で培養されると多能性を維持する；
(ｇ)ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す；
(ｈ)傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要とすることなく、ラットＥＳ細胞が試験管内で多能性を維持する；
(ｉ)ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する；
(ｊ)ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する；
(ｋ)ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏｌから選択される１以上の分化マーカーを発現しない；
(ｌ)ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２またはそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉性マーカーを発現しない；
(ｍ)ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７またはそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉性マーカーを発現しない；及び／または
(ｎ)ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６またはそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない；を含む、上記項目のいずれかに記載のラットＥＳ細胞の単離された集団、上記項目のいずれかに記載の試験管内培養物、または上記項目のいずれかに記載の方法。
【図１】
2019062924.tif 000039
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
2019062924.tif 000051
【図８Ｇ−Ｈ】
2019062924.tif 000052
【図８Ｉ−Ｊ】
2019062924.tif 000053
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2019062924.tif 000055
【図１０Ａ】
2019062924.tif 000056
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2019062924.tif 000059
【配列表】
2019062924000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月6日(2019.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラット胚性幹（ＥＳ）細胞において標的とされた遺伝子組換えを作製する方法であって、
（ａ）白血病阻害因子（ＬＩＦ）を発現するように組換えされていないフィーダー細胞の層と、５０Ｕ／ｍＬ〜１５０Ｕ／ｍＬのＬＩＦ、ならびに、ＭＥＫ阻害剤およびＧＳＫ３阻害剤からなる阻害剤を含むが、ＦＧＦＲ阻害剤を含まない、培地と、を含む条件下で、ラットＥＳ細胞の集団を培養することと；
（ｂ）該ラットＥＳ細胞を、該標的とされた遺伝子組換えを含むように組換えすることであって、該ラットＥＳ細胞は該標的とされた遺伝子組換えを生殖系列を介して伝達することが可能である、ことと
を含む、方法。
【請求項２】
工程（ａ）における前記ラットＥＳ細胞の集団を作製することをさらに含む請求項１に記載の方法であって、該ラットＥＳ細胞の集団を作製することが、
（ｉ）白血病阻害因子（ＬＩＦ）を発現するように組換えされていないフィーダー細胞の第１の層と、桑実胚期または胚盤胞期のラット胚とを試験管内で培養することであって、該桑実胚期または胚盤胞期のラット胚の透明帯は除去されており、該培養の条件は、ラットＥＳ細胞の多能性を維持し、かつ、５０Ｕ／ｍＬ〜１５０Ｕ／ｍＬのＬＩＦ、ならびに、ＭＥＫ阻害剤およびＧＳＫ３阻害剤からなる阻害剤を含むが、ＦＧＦＲ阻害剤を含まない、培地を含む、ことと；
（ｉｉ）工程（ｉ）から得られたラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を、ＬＩＦを発現するように組換えされていないフィーダー細胞の第２の層を含む試験管内培養ウェルに移すことと；
（ｉｉｉ）５０Ｕ／ｍＬ〜１５０Ｕ／ｍＬのＬＩＦ、ならびに、ＭＥＫ阻害剤およびＧＳＫ３阻害剤からなる阻害剤を含むが、ＦＧＦＲ阻害剤を含まない、培地を含む条件下で該増殖物を培養することと
を含む、方法。
【請求項３】
（ｅ）工程（ｂ）からの前記組換えされたラットＥＳ細胞の少なくとも１つをラット宿主胚に導入してＦ０胚を作出することと；
（ｆ）該Ｆ０胚を代理母に移植することと；
（ｇ）該代理母にて該Ｆ０胚を出産予定日まで妊娠維持させることと；
（ｈ）前記標的とされた遺伝子組換えを有するＦ０ラットを特定することと
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ラット宿主胚に導入した前記組換えされたラットＥＳ細胞が、該ラット宿主胚と同じラット系統に由来する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ラット宿主胚に導入した前記組換えされたラットＥＳ細胞が、該ラット宿主胚と異なるラット系統に由来する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）前記標的とされた遺伝子組換えを含むオスＦ０ラットを野生型メスラットと交配させて、該標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるＦ１子孫を作出することと；
必要に応じて
（ｊ）該Ｆ１子孫のオスラットを、該Ｆ１子孫のメスラットと交配させて、該標的とされた遺伝子組換えについてホモ接合体であるＦ２子孫を得ることと
をさらに含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的とされた遺伝子組換えを有する前記Ｆ０ラットの少なくとも３％が、該標的とされた遺伝子組換えを前記Ｆ１子孫に伝達し、
必要に応じて、該標的とされた遺伝子組換えを有する該Ｆ０ラットの少なくとも１０％が、該標的とされた遺伝子組換えを該Ｆ１子孫に伝達する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的とされた遺伝子組換えを有する前記Ｆ０ラットの少なくとも６０％が、該標的とされた遺伝子組換えを前記Ｆ１子孫に伝達する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（Ｉ）前記ラットＥＳ細胞がｃ−Ｍｙｃを発現しない；および／または
（ＩＩ）前記ラットＥＳ細胞が正常な核型を有する；および／または
（ＩＩＩ）前記ラットＥＳ細胞が培養において球形様の自由に浮かぶコロニーを形成する、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（Ｉ）前記ラットＥＳ細胞がＡＣＩラットに由来するか、もしくは、ダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する；および／または
（ＩＩ）前記ラットＥＳ細胞が、過排卵ラット由来の桑実胚期もしくは胚盤胞期の胚に由来する、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的とされた遺伝子組換えが、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えする工程が、２以上の標的とされた組換えを含むように前記ラットＥＳ細胞を組換えすることを含み、該ラットＥＳ細胞は該２以上の標的とされた遺伝子組換えを生殖系列を介して伝達することが可能である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ラットＥＳ細胞が、オス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞またはメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ラットＥＳ細胞が、以下の特徴：
（ａ）該ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−β、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２およびＵｔｆ１から選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する；
（ｂ）該ラットＥＳ細胞が、Ｅｃａｔ１およびＲｅｘｏ１から選択される１つ以上の多能性マーカーを発現しない；
（ｃ）該ラットＥＳ細胞が、ＢｒａｃｈｙｕｒｙおよびＢｍｐｒ２から選択される１つ以上の中胚葉性マーカーを発現しない；
（ｄ）該ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７およびＳｏｘ７から選択される１つ以上の内胚葉性マーカーを発現しない；
（ｅ）該ラットＥＳ細胞が、ＮｅｓｔｉｎおよびＰａｘ６から選択される１つ以上の神経マーカーを発現しない；
（ｆ）該ラットＥＳ細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２およびアルカリホスファターゼから選択される１つ以上の多能性マーカーを発現する；ならびに
（ｇ）該ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質１（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）ならびにｍｉＲ−６３２から選択される１つ以上のラットＥＳＣ特異的遺伝子を発現する、
の１つ以上を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地が７５Ｕ／ｍＬ〜１２５Ｕ／ｍＬのＬＩＦを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記培地が９０Ｕ／ｍＬ〜１１０Ｕ／ｍＬのＬＩＦを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記培地が１００Ｕ／ｍＬのＬＩＦを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記フィーダー細胞が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記培地中のＬＩＦが、マウスＬＩＦであるか、または、配列番号１に対して少なくとも９１％の配列同一性を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、および／または、前記ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＭＥＫ阻害剤が０．８μＭ〜１．２μＭの濃度のＰＤ０３２５９０１であり、前記ＧＳＫ３阻害剤が、２．５μＭ〜３μＭまたは３μＭ〜３．５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１であり、
必要に応じて、該ＭＥＫ阻害剤の濃度が１μＭであり、そして、該ＧＳＫ３阻害剤の濃度が３μＭである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記培地中のＬＩＦの濃度が１００Ｕ／ｍＬであり、前記ＭＥＫ阻害剤が１μＭの濃度のＰＤ０３２５９０１であり、そして、前記ＧＳＫ３阻害剤が、３μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記培地がさらに、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地および神経基本培地を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記培地が、
１×ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地；
１×神経基本培地；
１％  ペニシリン／ストレプトマイシン；
４ｍＭ  Ｌ−グルタミン；
０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール；
１×  Ｎ２補完剤；
１×  Ｂ２７補完剤；
１００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦ；
１μＭ  ＰＤ０３２５９０１；および
３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換えする工程が、１回以上のエレクトロポレーションを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的とされた遺伝子組換えが、相同組換え事象を介して生成される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的とされた遺伝子組換えが、挿入ポリヌクレオチドに隣接する上流と下流の相同性アームを含む標的化ベクターを用いることによって生成され、該相同性アームは標的とされたゲノム遺伝子座の中でのゲノム領域に相当する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的とされた遺伝子組換えが、標的とされたゲノム遺伝子座において一本鎖または二本鎖の切断を生成するヌクレアーゼ剤を用いて生成される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヌクレアーゼ剤が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組換えする工程が、
（ｉ）前記ラットＥＳ細胞に、該ラットＥＳ細胞において活性なプロモータに操作可能に連結された選択マーカーを含む非相同ポリヌクレオチドを導入することと；
（ｉｉ）交互に入れ替える第１と第２の培養培地にて、該ラットＥＳ細胞を試験管内で培養し、それによって、該ゲノムの中に該非相同のポリヌクレオチドが安定的に統合しているラットＥＳ細胞を選択することであって、該第１の培養培地は、第１の期間、有効量の選択剤を含み、該第２の培養培地は、選択剤を含まず、該試験管内の培養条件は多能性を維持するのに十分である、ことと
を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１と第２の培養培地が、２４時間ごとに交互に入れ替えられ、前記選択マーカーが、抗生剤への耐性を付与し、
必要に応じて、該選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、プロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）およびブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）の１つ以上を含み、そして、
必要に応じて、該抗生剤がＧ４１８である、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記選択マーカーが以下の特徴：
（ａ）該選択マーカーが非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む；
（ｂ）該選択マーカーが、野生型選択マーカーに比べて高い活性を有する；および
（ｃ）前記ラットＥＳ細胞が、前記ゲノムの中に安定的に統合された該選択マーカーの複数のコピーを含む、
の１つ以上を有する、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）白血病阻害因子（ＬＩＦ）を発現するように組換えされていないフィーダー細胞層と；
（ｂ）５０Ｕ／ｍＬ〜１５０Ｕ／ｍＬのＬＩＦ、ならびに、ＭＥＫ阻害剤およびＧＳＫ３阻害剤からなる阻害剤を含む培地であって、ＦＧＦＲ阻害剤を含まない、培地と；
（ｃ）標的とされた遺伝子組換えを含む１以上のラットＥＳ細胞、の集団であって、該ラットＥＳ細胞は、該標的とされた遺伝子組換えを生殖系列を介して伝達することが可能である、ラットＥＳ細胞の集団と
を含む、試験管内培養物。
【請求項３４】
前記培地が７５Ｕ／ｍＬ〜１２５Ｕ／ｍＬのＬＩＦを含む、請求項３３に記載の試験管内培養物。
【請求項３５】
前記培地が９０Ｕ／ｍＬ〜１１０Ｕ／ｍＬのＬＩＦを含む、請求項３４に記載の試験管内培養物。
【請求項３６】
前記培地が１００Ｕ／ｍＬのＬＩＦを含む、請求項３５に記載の試験管内培養物。
【請求項３７】
前記フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の試験管内培養物。
【請求項３８】
前記培地中のＬＩＦが、マウスＬＩＦであるか、または、配列番号１に対して少なくとも９１％の配列同一性を有する、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の試験管内培養物。
【請求項３９】
前記ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、および／または、前記ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の試験管内培養物。
【請求項４０】
前記ＭＥＫ阻害剤が０．８μＭ〜１．２μＭの濃度のＰＤ０３２５９０１であり、前記ＧＳＫ３阻害剤が、２．５μＭ〜３μＭまたは３μＭ〜３．５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１であり、
必要に応じて、該ＭＥＫ阻害剤の濃度が１μＭであり、そして、該ＧＳＫ３阻害剤の濃度が３μＭである、請求項３９に記載の試験管内培養物。
【請求項４１】
前記培地中のＬＩＦの濃度が１００Ｕ／ｍＬであり、前記ＭＥＫ阻害剤が１μＭの濃度のＰＤ０３２５９０１であり、そして、前記ＧＳＫ３阻害剤が、３μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１である、請求項４０に記載の試験管内培養物。
【請求項４２】
前記培地がさらに、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地および神経基本培地を含む、請求項３３〜４１のいずれか一項に記載の試験管内培養物。
【請求項４３】
前記培地が、
１×ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地；
１×神経基本培地；
１％  ペニシリン／ストレプトマイシン；
４ｍＭ  Ｌ−グルタミン；
０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール；
１×  Ｎ２補完剤；
１×  Ｂ２７補完剤；
１００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦ；
１μＭ  ＰＤ０３２５９０１；および
３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１
を含む、請求項４２に記載の試験管内培養物。
【請求項４４】
前記標的とされた遺伝子組換えが、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む、請求項３３〜４３のいずれか一項に記載の試験管内培養物。
【請求項４５】
前記ラットＥＳ細胞が、該ラットＥＳ細胞において活性なプロモータに操作可能に連結された選択マーカーを含む非相同ポリヌクレオチドを含み、該選択マーカーが以下の特徴：
（ａ）該選択マーカーが、プロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む；
（ｂ）該選択マーカーが、野生型選択マーカーに比べて高い活性を有する；および
（ｃ）該ラットＥＳ細胞が、前記ゲノムの中に安定的に統合された該選択マーカーの複数のコピーを含む、
の１つ以上を有する、請求項４４に記載の試験管内培養物。
【請求項４６】
（Ｉ）前記ラットＥＳ細胞がｃ−Ｍｙｃを発現しない；および／または
（ＩＩ）前記ラットＥＳ細胞が正常な核型を有する；および／または
（ＩＩＩ）前記ラットＥＳ細胞が培養において球形様の自由に浮かぶコロニーを形成する、
請求項３３〜４５のいずれか一項に記載の試験管内培養物。
【請求項４７】
（ａ）前記ラットＥＳ細胞がＡＣＩラットに由来するか、もしくは、ダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する；および／または
（ｂ）前記ラットＥＳ細胞が、桑実胚期もしくは胚盤胞期の胚に由来する、
請求項３３〜４６のいずれか一項に記載の試験管内培養物。
【請求項４８】
前記ラットＥＳ細胞が、オス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞またはメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である、請求項３３〜４７のいずれか一項に記載の試験管内培養物。
【請求項４９】
前記ラットＥＳ細胞が、以下の特徴：
（ａ）該ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−β、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２およびＵｔｆ１から選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する；
（ｂ）該ラットＥＳ細胞が、Ｅｃａｔ１およびＲｅｘｏ１から選択される１つ以上の多能性マーカーを発現しない；
（ｃ）該ラットＥＳ細胞が、ＢｒａｃｈｙｕｒｙおよびＢｍｐｒ２から選択される１つ以上の中胚葉性マーカーを発現しない；
（ｄ）該ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７およびＳｏｘ７から選択される１つ以上の内胚葉性マーカーを発現しない；
（ｅ）該ラットＥＳ細胞が、ＮｅｓｔｉｎおよびＰａｘ６から選択される１つ以上の神経マーカーを発現しない；
（ｆ）該ラットＥＳ細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２およびアルカリホスファターゼから選択される１つ以上の多能性マーカーを発現する；ならびに
（ｇ）該ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質１（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）ならびにｍｉＲ−６３２から選択される１つ以上のラットＥＳＣ特異的遺伝子を発現する、
の１つ以上を有する、請求項３３〜４８のいずれか一項に記載の試験管内培養物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
実施例
実施例１：ラットＥＳ細胞の導出
ｒＥＳＣの特徴づけ。図１にて示すように、ｒＥＳＣはディッシュにてごく普通に分離し、浮いている小型の球形のコロニーとして増殖する（近接撮影、図４）。Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ：ｒＥＳＣはＯｃｔ−４（図２Ａ）及びＳｏｘ２（図２Ｂ）を含む多能性マーカーを発現し、高レベルのアルカリホスファターゼを発現する（図３、左のパネル）。ＤＡ株の核型は４２Ｘ，Ｙである（図３、右のパネル）。ｒＥＳＣは四倍体になることが多いので、分裂中期の染色体の広がりを数えることによって細胞株を事前にスクリーニングし、次いで最も正常なカウントを持つ細胞株の核型を正式に調べた。
ＡＣＩの胚盤胞は市販の過排卵メスから得た；ＤＡの胚盤胞は商業的に得た凍結８細胞期胚から培養した。酸タイロードによって透明帯を取り除き、有糸分裂上不活化されたＭＥＦ上に胚盤胞を置いた。増殖物を採取し、常法を用いて増殖させた。胚盤胞はすべてプレートに入れ、２ｉ培地を用いて培養し、増殖させた（参照によって本明細書に組み入れられるＬｉら、（２００８）、Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  胚盤胞ｓ，Ｃｅｌｌ、１３５：１２９９−１３１０）。
【表３】
2019062924.tif 000060
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
実施例３：ｒＥＳＣの標的化：ラットのＲｏｓａ２６遺伝子座
ｒＲｏｓａ２６遺伝子座はマウスにおけるように同じ間隔でＳｅｔｄ５及びＴｈｕｍｐｄ３の間にある。ｒＲｏｓａ２６遺伝子座（図７、パネルＢ）はｍＲｏｓａ２６遺伝子座（図７、パネルＡ）とは異なる。ｍＲｏｓａ２６の転写物は２または３のエクソンから成る。ラットの遺伝子座はマウスエクソン１に相同なエクソン（Ｅｘ１ａ）に加えて第２のエクソン１（Ｅｘｂ１b）を含有する。ラットでは第３のエクソンが同定されている。ｒＲｏｓａ２６対立遺伝子の標的化は図７、パネルＣ）に示され、ＤＡのｒＥＳＣに由来するゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによって５ｋｂの相同性アームがそれぞれクローニングされた。標的とされた対立遺伝子はｒＲｏｓａ２６イントロンにおける１１７ｂｐの欠失を置き換えるＳＡ−ｌａｃＺ−ｈＵｂ−ｎｅｏカセットを含有する。