(57)【要約】【課題】操作が簡便で、かつ高価な分析機器を使用しなくても、高い精度で角層細胞等の対象を観察することができる方法を提供することを課題とする。【解決手段】蛍光色素化合物で標識した蛍光標識ポリリジンを対象に吸着させて、観察を行う。【選択図】図１
2019101025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素化合物で標識した蛍光標識ポリリジン。
【請求項２】
蛍光色素化合物が、３，６−ジアミノ−９−［２，４−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム／３，６−ジアミノ−９−［２，５−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム又はその誘導体である、
請求項１に記載の蛍光標識ポリリジン。
【請求項３】
蛍光色素化合物が、９−［２−カルボキシ−４（オア５）−［［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−カルボニル］フェニル]−３，６−ビス−（ジメチルアミ
ノ）−キサンチリウム インナーソルト又はその誘導体である、請求項１に記載の蛍光標
識ポリリジン。
【請求項４】
蛍光色素化合物の導入率が蛍光標識ポリリジン全量の０．１〜１０重量％である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光標識ポリリジン。
【請求項５】
ポリリジンが、ε−ポリリジン及び／又はその塩である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光標識ポリリジン。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光標識ポリリジンを含有する、観察用試薬。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光標識ポリリジンを対象に吸着させる工程を含む、対象の観察方法。
【請求項８】
対象が角層細胞、毛髪、微生物、及び繊維製品からなる群から選択される、請求項７に記載の観察方法。
【請求項９】
吸着工程がｐＨ６〜８の条件下で行われる、請求項７又は８に記載の観察方法。
【請求項１０】
対象がダメージ毛髪である、請求項８又は９に記載の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光色素化合物で標識した蛍光標識ポリリジン、及びこれを用いる対象の観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚外用薬や化粧料を効率的よく開発するため、生体表面組織の状態を精度よく観察することが重要である。従来その一般的な方法として、細胞採取用ブラシやテープストリッピング等の公知の手法により採取した生体材料を染色剤で染色したのち、顕微観察することが行われている。
このうち皮膚角層細胞の観察を目的とする場合には、例えば頬部や上腕内側部よりテープストリッピング法にて採取された角層細胞を、ゲンチアナバイオレット−ブリリアントグリーン染色、ローダミンＢ−メチレンブルー染色、ヘマトキシリン−エオジン染色などの染色方法で角層細胞を染色したのち、顕微鏡観察する方法が広く行われている。
しかしながら、これらの染色方法は操作手順が煩雑で、かつ染色に時間がかかるうえ測定者の技量に負うところが大きく、しばしば染色が不十分となり安定した顕微鏡観察が行えない問題があった。
【０００３】
この解決策として、例えば特許文献１では、上記した染色法と併せて、タンニン酸、クロム塩類、アルミニウム塩類、グルタールアルデヒド、ホルマリンの群から選ばれる一種または二種以上を媒染剤として使用した角層細胞の染色方法が提案されている。また、特許文献２では、染色剤を水と混和可能な有機溶剤を含有する溶媒に溶解したのち、角層細胞の染色に供する方法が提案されている。
【０００４】
これらの他に、染色剤を用いずに角層細胞を直接観察する方法も提案されている。例えば、特許文献３では、紫外線下、顕微鏡乃至はビデオマイクロスコープを介して観察する方法が、特許文献４ではテープストリッピングにて採取した角層細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察する方法が提案されている。
【０００５】
ところで、ε−ポリ−Ｌ−リジンは、Ｌ−リジンのε位のアミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合により直鎖状に連なったポリマーである。ε−ポリ−Ｌ−リジンは、抗菌作用を示すことが知られており、保存料として食品添加物や化粧品原料等に実用化されている（非特許文献１）。また、ε−ポリ−Ｌ−リジンは、正電荷を帯びていることから、負に帯電している物と相互作用する。そして、角層細胞等にも吸着することが示唆されていたが、その吸着挙動については明らかではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１２５８５４号公報
【特許文献２】特開２００３−２０２３３６号公報
【特許文献３】特開２００３−３１５３３１号公報
【特許文献４】特開２０１７−１１１０６５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hiraki, J. Antibact. Antifung. Agents, Vol. 23, No.6, pp.349-354, 1995
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
角層細胞の観察方法に関して、特許文献１及び２の方法では、従来の染色方法を改良しながらも依然として操作手順は煩雑である。また、特許文献３及び４の方法では、高価な光学機器を要するため、大学等の小規模な研究室では利用が困難である。
このような問題に鑑み、本発明の課題は、操作が簡便で、かつ高価な分析機器を使用しなくても、高い精度で角層細胞を始めとする生体組織の観察方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、蛍光化合物で標識した蛍光標識ポリリジンを対象に吸着させることにより、蛍光染色された対象を容易に蛍光顕微鏡で観察できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］蛍光色素化合物で標識した蛍光標識ポリリジン。
［２］蛍光色素化合物が、３，６−ジアミノ−９−［２，４−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム／３，６−ジアミノ−９−［２，５−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム又はその誘導体である、［１］に記載の蛍光標識ポリリジン。
［３］蛍光色素化合物が、９−［２−カルボキシ−４（オア５）−［［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−カルボニル］フェニル]−３，６−ビス−（ジメチル
アミノ）−キサンチリウム インナーソルト又はその誘導体である、［１］に記載の蛍光
標識ポリリジン。
［４］蛍光色素化合物の導入率が蛍光標識ポリリジン全量の０．１〜１０重量％である、［１］〜［３］のいずれかに記載の蛍光標識ポリリジン。
［５］ポリリジンが、ε−ポリリジン及び／又はその塩である、［１］〜［４］のいずれかに記載の蛍光標識ポリリジン。
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載の蛍光標識ポリリジンを含有する、観察用試薬。［７］［１］〜［５］のいずれかに記載の蛍光標識ポリリジンを対象に吸着させる工程を含む、対象の観察方法。
［８］対象が角層細胞、毛髪、微生物、及び繊維製品からなる群から選択される、［７］に記載の観察方法。
［９］吸着工程がｐＨ６〜８の条件下で行われる、［７］又は［８］に記載の観察方法。［１０］対象がダメージ毛髪である、［８］又は［９］に記載の観察方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の蛍光標識ポリリジンを用いれば、煩雑な染色操作や高価な分析機器を用いることなく、簡便な操作で精度よく、角層細胞を始めとする生体細胞や毛髪等の生体組織、微生物、天然繊維や化学繊維及び合成繊維等の繊維素材、天然樹脂や合成樹脂等の工業素材の状態を、観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】蛍光標識ポリリジンの概略図。
【図２】蛍光標識ポリリジンの概略図。
【図３】実施例２の、蛍光標識ポリリジンで染色した角層細胞の蛍光顕微鏡による観察写真。
【図４】実施例３の、蛍光標識ポリリジンで染色した角層細胞の蛍光顕微鏡による観察写真。
【図５】実施例４の、蛍光標識ポリリジンで染色した角層細胞の蛍光顕微鏡による観察写真。比率はアミノ基モル濃度比を表す。
【図６】実施例５の、蛍光標識ポリリジンで染色した角層細胞の蛍光顕微鏡による観察写真。比率はアミノ基モル濃度比を表す。
【図７】実施例６の、蛍光標識ポリリジンで染色した角層細胞の蛍光顕微鏡による観察写真。
【図８】実施例７の、蛍光標識ポリリジンで染色した角層細胞の蛍光顕微鏡による観察写真。
【図９】実施例８の、蛍光標識ポリリジンで染色した角層細胞の蛍光顕微鏡による観察写真。比率はアミノ基モル濃度比を表す。
【図１０】実施例８の、蛍光標識ポリリジンで染色した角層細胞の蛍光顕微鏡による観察写真。比率はアミノ基モル濃度比を表す。
【図１１】実施例９の蛍光標識ポリリジンで染色した毛髪の蛍光顕微鏡による観察写真。
【図１２】実施例１０の蛍光標識ポリリジンで染色した毛髪の蛍光顕微鏡による観察写真。
【図１３】実施例１１の蛍光標識ポリリジンで染色した毛髪の蛍光顕微鏡による観察写真。比率はアミノ基モル濃度比を表す。
【図１４】実施例１２の蛍光標識ポリリジンで染色した毛髪の蛍光顕微鏡による観察写真。
【図１５】実施例１３の蛍光標識ポリリジンで染色した微生物の蛍光顕微鏡による観察写真。
【図１６】実施例１４の蛍光標識ポリリジンで染色した微生物の蛍光顕微鏡による観察写真。比率はアミノ基モル濃度比を表す。
【図１７】実施例１６の蛍光標識ポリリジンで染色した角層細胞の蛍光顕微鏡による観察写真。
【図１８】実施例１７の蛍光標識ポリリジンで染色した角層細胞の蛍光顕微鏡による観察写真。比率はアミノ基モル濃度比を表す。
【図１９】実施例１８の蛍光標識ポリリジンで染色した毛髪の蛍光顕微鏡による観察写真。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一の形態は、蛍光色素化合物で標識した蛍光標識ポリリジンである。すなわちポリリジンに蛍光色素化合物が結合したものであり、かかる結合は共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合等特に限定されない。
【００１４】
本発明において、ポリリジンはα−ポリリジン、ε−ポリリジンのいずれでもよく特に限定されるものではないが、毒性の低さ、入手の容易さからε−ポリリジンが好ましい。また、通常はＬ−リジンのポリマーである。
また、ポリリジンは、通常はリジンのホモポリマーであるが、本発明の効果を損なわない限りにおいて、他のアミノ酸をモノマーとして含んでもよい。
また、ポリリジンの大きさは、特に限定されないが、重量平均分子量が好ましくは３０００以上、より好ましくは４０００以上であり、好ましくは１００００以下、より好ましくは８０００以下、さらに好ましくは６０００以下であり、３０００〜６０００の範囲が特に好ましい。なお、ここで重量平均分子量は、ＧＰＣ−ＬＡＬＬＳ法により測定された値である。
【００１５】
ε−ポリリジンは、例えば特許第１２４５３６１号に記載の方法で製造することができる。具体的には、ストレプトマイセス・アルプラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスを、その組成が、グルコース５重量％、酵母エキス０．５重量％、硫酸アンモニウム１重量％、リン酸水素二カリウム０．０８重量％、リン酸二水素カリウム０．１３６重量％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５重量％、硫酸亜鉛・７水和物０．００４重量％、
及び硫酸鉄・７水和物０．０３重量％であり、ｐＨが６．８に調整された培地にて培養し、得られた培養物からε−ポリリジンを分離・回収する。
他にも、化学的手法によりポリリジンを製造してもよい。
【００１６】
また、ε−ポリリジンは、遊離の形であってもよいし、塩酸、硫酸、リン酸及び臭化水素酸から選ばれた少なくとも１種の無機酸、または酢酸、プロピオン酸、フマル酸、リンゴ酸及びクエン酸から選ばれた少なくとも１種の有機酸の塩の形であってもよい。
ポリリジン塩は常法により製造される。例えば含水メタノール溶液に前記ε−ポリリジンを溶解させ、これに前記酸を加え、溶液が中和点を過ぎたところで、冷アセトンを加えて沈澱した塩を乾燥させることによって得られる。
【００１７】
本発明において、蛍光色素化合物は、ポリリジンと結合するものであれば特に限定されず、任意のものを用いればよい。
蛍光色素化合物の例としては、Ａｌｅｘａ類、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はその誘導体、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）又はその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ））、テキサスレッド、ＢＯＤＩＰＹ類、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＨＱ類等が挙げられる。これらのうち、３，６−ジアミノ−９−［２，４−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム／３，６−ジアミノ−９−［２，５−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム（商品名Alexa Fluor488（Thermo Fisher Scientific社製））またはその誘導体、及び９−［２−カルボキシ−４（オア５）−［［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−カルボニル］フェニル]−３，６−ビス−（ジメチルアミノ
）−キサンチリウム インナーソルト（商品名NHS-Rhodamine（Therrmo Fisher Scientific社製））又はその誘導体が、入手のし易さ、取り扱いの簡便さから、好ましい。これら
の蛍光色素化合物は常法によりポリリジンに反応させることにより、共有結合、イオン結合、配位結合、又は水素結合等でポリリジンを蛍光標識する。これらの蛍光色素化合物はポリリジンの有するアミノ基を介して錯体を形成し、蛍光標識ポリリジンを得ることができる（図１及び図２）。
【００１８】
本発明において、蛍光色素化合物のポリリジンへの導入率は、蛍光標識ポリリジン全量の好ましくは０．１〜１０重量％であり、より好ましくは０．３〜３重量％である。この範囲より導入率が小さいと蛍光検出をし難い場合があり、またこの範囲より大きいとポリリジンの対象への吸着が困難になる場合がある。
【００１９】
ポリリジンは塩基性アミノ酸Ｌ−リジンのホモポリマーであり、等電点以下の水中では側鎖アミノ基が正電荷を帯びることから、負電荷を帯びた物質に電気的に吸着してイオン複合体を形成する。また、炭化水素リッチな構造から、疎水性相互作用による対象への吸着も生じ得る。
そのため、本発明の蛍光標識ポリリジンは、ポリリジンが吸着し得る対象の観察用試薬として好適に用いることができる。かかる対象としては、特に限定されないが、角層細胞を始めとする生体細胞や毛髪等の生体組織、微生物、天然繊維や化学繊維及び合成繊維等の繊維素材、天然樹脂や合成樹脂等の工業素材などを好適に挙げられる。
【００２０】
本発明の他の形態は、本発明の蛍光標識ポリリジンを対象に吸着させる工程を含む、対象の観察方法である。前記吸着工程は、通常は水溶液の態様で蛍光標識ポリリジンを対象に接触させることにより行われる。
吸着工程を行う条件は、特に限定されないが、ｐＨ６〜８が好ましい。また、温度は４〜４０℃が好ましい。また、蛍光標識ポリリジンは０．００１〜０．０１重量％の濃度の水溶液で適用することが好ましい。かかる適用時間は、前記濃度にもよるが、５〜６０分
間で十分に吸着が行われる。
【００２１】
通常は、蛍光標識ポリリジンを対象に接触させて吸着した後、余剰の蛍光標識ポリリジンを洗浄等により除去した後に、蛍光顕微鏡や蛍光観察用デジタルマイクロスコープ等にて蛍光検出することにより、ポリリジンの対象上での分布状況を観察する。
観察対象は、特に限定されないが、角層細胞を始めとする生体細胞や毛髪等の生体組織、微生物、天然繊維や化学繊維及び合成繊維等の繊維素材、天然樹脂や合成樹脂等の工業素材などを好適に挙げられる。
【実施例】
【００２２】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
＜実施例１＞蛍光標識ポリリジンの調製１
ε−Ｌ−ポリリジン（以降「ＰＬＬ」と記す、Ｍｎ：４０９０、Ｍｗ：４７００、１０質量％水溶液、ＪＮＣ株式会社製）を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）溶液で希釈
して１０ｍｇ／ｍＬとした。これに、Alexa Fluor 488 5-TFP ester （Thermo Fisher Scientific）１００μｇ／１００μＬを加えて室温にて１時間反応させた。反応液を遠心限外ろ過（Amicon Ultra 3K）に供し、未反応の蛍光色素を除去し、蛍光標識されたポリリ
ジンAlexa Fluor 488-PLL（ＡＦ−ＰＬＬ）を得た。得られたＡＦ−ＰＬＬは精製水で所
定の濃度に希釈して、以降の吸着実験に供した。
【００２４】
＜実施例２＞角層細胞への吸着１
角質チェッカー（日本アッシュ）を用いたテープストリッピングにより、健常人上腕内側より最外層角層の角層細胞を非侵襲的に採取した。これにＡＦ−ＰＬＬ水溶液（５０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて所定の時間インキュベートした。反応後、水洗した後に、角層に吸着したＡＦ−ＰＬＬを蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ−ＦＬ（Thermo Fisher Scientific）により観察した。
反応時間ごとの染色結果を図３に示す。ＡＦ−ＰＬＬにより角層細胞が均一に染色された。また、反応時間に依存して蛍光強度が大きくなり吸着量が増加し、約６０分でほぼ飽和した。
【００２５】
＜実施例３＞濃度依存性１
ＡＦ−ＰＬＬ水溶液の濃度を変えて（０〜１００μｇ／ｍＬ）、実施例２と同様に角層細胞を染色し（室温、２時間）、観察した。
結果を図４に示す。ＡＦ−ＰＬＬの濃度に依存して、蛍光強度の増大が認められた。
【００２６】
＜実施例４＞非標識ＰＬＬによる競合阻害１
ＡＦ−ＰＬＬと非標識ＰＬＬとを所定の割合で含有する水溶液（ＡＦ−ＰＬＬ濃度：５０μｇ／ｍＬ）を角層細胞に添加し、実施例２と同様に角層細胞を染色（室温、２時間）した後、観察した。
結果を図５に示す。ＡＦ−ＰＬＬの角層細胞への吸着は、非標識ＰＬＬにより競合的に阻害された。この結果から、蛍光検出により観察されるのがＰＬＬの角層細胞への吸着挙動であることが確認された。
【００２７】
＜実施例５＞Ｌ−リジンモノマーの影響
ＡＦ−ＰＬＬとＬ−リジンとを所定の割合で含有する水溶液（ＡＦ−ＰＬＬ濃度：５０μｇ／ｍＬ）を角層細胞に添加し、実施例２と同様に角層細胞を染色（室温、２時間）した後、観察した。
結果を図６に示す。１００倍濃度のＬ−リジンモノマー共存下でもＡＦ−ＰＬＬの吸着
はほとんど阻害されなかった。
【００２８】
＜実施例６＞ｐＨ依存性
種々の緩衝剤を用いてＡＦ−ＰＬＬ水溶液（５０μｇ／ｍＬ）のｐＨを２．５〜９．０に調整し、実施例２と同様に角層細胞を染色（室温、２時間）した後、観察した。
結果を図７に示す。酸性領域（ｐＨ２．５〜５．０）では蛍光が検出されず、ＡＦ−ＰＬＬの吸着は阻害されていた。一方、中性領域（ｐＨ６．０〜８．０)ではＡＦ−ＰＬＬ
の吸着は阻害されなかった。アルカリ性領域（ｐＨ９．０）では吸着は阻害される傾向であったが、用いる緩衝液により吸着挙動が異なっていた。
【００２９】
＜実施例７＞塩濃度の影響
ＮａＣｌを０〜１．０ｍｏｌ／Ｌで含有するＡＦ−ＰＬＬ水溶液（５０μｇ／ｍＬ）を調製し、実施例２と同様に角層細胞を染色（室温、２時間）した後、観察した。
結果を図８に示す。０．１ｍｏｌ／Ｌ以上ではＮａＣｌ濃度に依存して蛍光強度の減弱が認められ、１ｍｏｌ／Ｌではほぼ完全に吸着が阻害された。
実施例６及び７の結果から、ポリリジンと角層細胞との間の相互作用の少なくとも一部は、ポリリジンのアミノ基とのイオン結合を介したものであると推測できる。
【００３０】
＜実施例８＞カチオン化合物の影響
種々のカチオン性界面活性剤を含有するＡＦ−ＰＬＬ水溶液（５０μｇ／ｍＬ）を調製し、実施例２と同様に角層細胞を染色（室温、２時間）した後、観察した。
結果を表１並びに図９及び１０に示す。いずれのカチオン性界面活性剤においても、炭素鎖長が長くなるほど、蛍光強度の減弱が認められ、ポリリジンと角層細胞との相互作用が阻害されることが認められた。
【００３１】
【表１】
2019101025.tif 000003
【００３２】
＜実施例９＞毛髪への吸着１
市販のテスト用毛束（ビューラックス）、および健常人より採取した毛髪を角質チェッカー（日本アッシュ）に瞬間接着剤で固定したのち、精製水またはＡＦ−ＰＬＬ水溶液（１００μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて２時間インキュベートした。反応後、水洗した後に、毛髪に吸着したＡＦ−ＰＬＬを蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ−ＦＬ（Thermo Fisher Scientific）により観察した。
染色結果を図１１に示す。ＡＦ−ＰＬＬにより毛髪が均一に染色された。なお、毛髪には自家蛍光を示すものもあり、精製水においてもわずかに蛍光が観察された。
【００３３】
＜実施例１０＞濃度依存性２
ＡＦ−ＰＬＬ水溶液の濃度を変えて（０〜１００μｇ／ｍＬ）、実施例９と同様に毛髪を染色し（室温、２時間）、観察した。
結果を図１２に示す。ＡＦ−ＰＬＬの濃度に依存して、蛍光強度の増大が認められた。
【００３４】
＜実施例１１＞非標識ＰＬＬによる競合阻害２
ＡＦ−ＰＬＬと非標識ＰＬＬとを所定の割合で含有する水溶液（ＡＦ−ＰＬＬ濃度：１００μｇ／ｍＬ）を毛髪に添加し、実施例９と同様に毛髪を染色（室温、２時間）した後、観察した。
結果を図１３に示す。ＡＦ−ＰＬＬの毛髪への吸着は、非標識ＰＬＬにより競合的に阻害された。この結果から、蛍光検出により観察されるのがＰＬＬの毛髪への吸着挙動であることが確認された。
【００３５】
＜実施例１２＞ダメージ毛髪への吸着１
ダメージ毛髪は、市販のテスト用毛束をブリーチ処理して作製した。ブリーチ剤処理は、使用直前に１剤（アルカリ剤）と２剤（酸化剤）を混合して、テスト用毛束に塗布した。３０分程放置し、水洗した後、実施例９と同様に毛髪を染色（室温、２時間）した後、観察した。
結果を図１４に示す。ダメージ毛髪ではＡＦ−ＰＬＬにより蛍光輝度の顕著な上昇が認められた。また、ダメージ毛髪では自家蛍光の増加も観察された。
【００３６】
＜実施例１３＞微生物への吸着
サブロー平板培地にて２５℃／３日培養したSaccharomyces cerevisiae（NBRC10217）
を、滅菌綿棒を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）６ｍＬに懸濁し、〜１０７  ＣＦＵ／ｍＬの微生物懸濁液を得た。得られた微生物懸濁液を滅菌ピペットで適当量採取して、１．５ｍＬ容マイクロチューブ（Eppendorf製）に分注した後、１０ ｍｇ/ｍＬ  Ａ
Ｆ−ＰＬＬを５０ μＬ加え（最終濃度が５００μg／ｍＬ）、トータル１ｍＬの反応液を調製した。比較対照のため、ＡＦ−ＰＬＬ水溶液に代えて同量の精製水を添加した試験区を調製した。これらを室温にて２時間インキュベートした後、遠心分離機（Eppendorf製
）にて遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分）して上清を除去した。沈殿の菌体に１ｍＬのＰＢＳを加えて懸濁し、再度遠心分離し上清液を除去した。これを更に２回繰り返して洗浄した後、微生物に吸着したＡＦ−ＰＬＬを蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ−ＦＬ（Thermo Fisher Scientific）により観察した。
染色結果を図１５に示す。ＡＦ−ＰＬＬを作用させることにより、微生物の形に沿うように蛍光が検出され、ＡＦ−ＰＬＬにより微生物が染色されることが観察された。
【００３７】
＜実施例１４＞非標識ＰＬＬによる競合阻害３
実施例１３と同様の方法で〜１０７ＣＦＵ/ｍＬに調製した微生物懸濁液を９５０μＬ
取り、１０ ｍｇ/ｍＬのＡＦ−ＰＬＬを１０ μＬ（最終濃度１００μｇ/ｍＬ）と２５０
ｍｇ/ｍＬの非標識ＰＬＬを４０ μＬ（最終濃度１０ ｍｇ/ｍＬ）それぞれ加え（標識
ポリリジン：非標識ポリリジン＝１：１００）、実施例１３と同様に微生物を染色（室温、２時間）した後、観察した。
結果を図１６に示す。ＡＦ−ＰＬＬの微生物への吸着は、非標識ＰＬＬにより競合的に阻害された。この結果から、蛍光検出により観察されるのがＰＬＬの微生物への吸着挙動であることが確認された。
【００３８】
＜実施例１５＞蛍光標識ポリリジンの調製２
蛍光色素化合物をNHS-Rhodamineとした以外は実施例１と同様の処理を行い、蛍光標識
されたポリリジンRhodamine-PLL（Ｒｈｏ−ＰＬＬ）を得た。得られたＲｈｏ−ＰＬＬは
精製水で所定の濃度に希釈して、以降の吸着実験に供した。
【００３９】
＜実施例１６＞角層細胞への吸着２
蛍光標識されたポリリジンをＲｈｏ−ＰＬＬ水溶液（濃度０〜２００μｇ／ｍＬ）とした以外は、実施例２と同様に角層細胞を染色（室温、２時間）した。反応後、水洗した後に、角層に吸着したＲｈｏ−ＰＬＬを、蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ−ＦＬ（ＲＦＰフィルター装着）により観察した。
結果を図１７に示す。前述したＡＦ−ＰＬＬ同様に、Ｒｈｏ−ＰＬＬの濃度に依存して蛍光強度の増大が認められた。
【００４０】
＜実施例１７＞非標識ＰＬＬによる競合阻害４
Ｒｈｏ−ＰＬＬと非標識ＰＬＬとを所定の割合で含有する水溶液（Ｒｈｏ−ＰＬＬ濃度：２０μｇ／ｍＬ、および２００μｇ／ｍＬ）を角層細胞に添加し、実施例２と同様に角層細胞を染色（室温、２時間）した後、蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ−ＦＬ（ＲＦＰフィルター装着）により観察した。
結果を図１８に示す。前述したＡＦ−ＰＬＬ同様に、Ｒｈｏ−ＰＬＬの角層細胞への吸着は、非標識ＰＬＬにより競合的に阻害された。この結果から、蛍光検出により観察されるのがＰＬＬの角層細胞への吸着挙動であることが確認された。
【００４１】
＜実施例１８＞ダメージ毛髪への吸着２
蛍光標識されたポリリジンをＲｈｏ−ＰＬＬ水溶液（Ｒｈｏ−ＰＬＬ濃度；１００μｇ／ｍＬ）とした以外は、実施例１２と同様に毛髪を染色（室温、２時間）した後、蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ−ＦＬ（ＲＦＰフィルター装着）により観察した。
結果を図１９に示す。ダメージ毛髪では、前述したＡＦ−ＰＬＬ同様に、Ｒｈｏ−ＰＬＬにより蛍光輝度の顕著な上昇が認められた。しかしながら、Ｒｈｏ−ＰＬＬではＡＦ−ＰＬＬとは異なり、毛髪自身の自家蛍光はほとんど観察されず安定した観察が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の蛍光標識ポリリジンを用いれば、煩雑な染色操作や高価な分析機器を用いることなく、簡便な操作で精度よく、角層細胞を始めとする生体細胞や毛髪等の生体組織、微生物、天然繊維や化学繊維及び合成繊維等の繊維素材、天然樹脂や合成樹脂等の工業素材の状態を、観察することができるため、非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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