(57)【要約】      （修正有）【課題】複数のミツバチ伝染病や蜂病の原因菌を一度に簡便に検出することを可能にする検出方法の提供。【解決手段】ミツバチからＤＮＡを抽出する工程と、各原因菌を検出するための複数のプライマー対であって、各原因菌に関連付けられたタグ配列が結合した第１のプライマーと、標識物質結合物質が結合した第２のプライマーからなるプライマー対を用いて、前記抽出したＤＮＡを増幅する工程と、増幅産物を、前記標識物質結合物質と反応して検出を可能にする標識物質を有する展開液を用いて、前記タグ配列に相補的な配列を有する２以上のプローブを有する固相担体上に展開する工程と、前記固相担体上に生成した、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリダイズ産物を検出する工程とを有する。前記蜂病は、アメリカ腐蛆病、ヨーロッパ腐蛆病（強毒株）、ヨーロッパ腐蛆病（弱毒株）、ノゼマ病、アカリンダニ症、及び、チョーク病からなる群から選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミツバチに感染して蜂病を発症させる複数の原因菌を一度に検出する方法であって、
前記ミツバチからＤＮＡを抽出する工程と、
各原因菌を検出するための複数のプライマー対であって、各原因菌に関連付けられたタグ配列が結合した第１のプライマーと、標識物質結合物質が結合した第２のプライマーからなるプライマー対を用いて、前記抽出したＤＮＡを増幅する工程と、
増幅産物を、前記標識物質結合物質と反応して検出を可能にする標識物質を有する展開液を用いて、前記タグ配列に相補的な配列を有する２以上のプローブを有する固相担体上に展開する工程と、
前記固相担体上に生成した、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリダイズ産物を検出する工程と
を有し、前記蜂病は、アメリカ腐蛆病、ヨーロッパ腐蛆病（強毒株）、ヨーロッパ腐蛆病（弱毒株）、ノゼマ病、アカリンダニ症、及びチョーク病からなる群から選択される、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記プライマー対は、配列ＩＤ番号１と２の組み合わせ、配列ＩＤ番号３と４の組み合わせ、配列ＩＤ番号５と６の組み合わせ、配列ＩＤ番号７と８の組み合わせ、配列ＩＤ番号９と１０の組み合わせ、または配列ＩＤ番号１１と１２の組み合わせである、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記展開液は、７９．６６％（ｖ／ｖ）以上の水、２０％（ｖ／ｖ）未満のホルムアミド、０．２９％（ｗ／ｖ）未満のリン酸水素ナトリウム、及び０．０５％（ｗ／ｖ）未満のアジ化ナトリウムを有する、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記ミツバチは、セイヨウミツバチ（Apis mellifera）、トウヨウミツバチ（Apis cerana）、ニホンミツバチ（Apis cerana japonica）、オオミツバチ（Apis dorsata）、ヒマラヤオオミツバチ（Apis laboriosa）、サバミツバチ（Apis koschevnikovi）、コミツバチ（Apis florea）、クロコミツバチ（Apis andreniformis）、キナバルヤマミツバチ（Apis nuluensis）、またはクロオビミツバチ（Apis nigrocincta）である、方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記標識物質結合物質と前記標識物質の組み合わせは、ビオチン−標識アビジン、ジゴキシゲニン−標識抗ジゴキシゲニン抗体、またはＦＩＴＣ−標識抗ＦＩＴＣ抗体である、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記原因菌が、Paenibacillus larvae、Melissococcus plutonius、Nosema ceranae、Ascosphaera apis、またはAcarapis woodiである、方法。
【請求項７】
ミツバチに感染して蜂病を発症させる複数の原因菌を一度に検出するためのキットであって、
各原因菌を検出するための複数のプライマー対であって、各原因菌に関連付けられたタグ配列と前記原因菌の塩基配列の少なくとも一部に相補的な配列とを有する第１のプライマーと、標識物質結合物質が結合した第２のプライマーからなるプライマー対と、
前記タグ配列に相補的な配列を含む２以上のプローブを有する固相担体と、
前記標識物質結合物質と反応して検出を可能にする標識物質を有する展開液と
を有し、前記蜂病は、アメリカ腐蛆病、ヨーロッパ腐蛆病（強毒株）、ヨーロッパ腐蛆病（弱毒株）、ノゼマ病、アカリンダニ症、及びチョーク病からなる群から選択される、キット。
【請求項８】
請求項７記載のキットにおいて、前記プライマー対は、配列ＩＤ番号１と２の組み合わせ、配列ＩＤ番号３と４の組み合わせ、配列ＩＤ番号５と６の組み合わせ、配列ＩＤ番号７と８の組み合わせ、配列ＩＤ番号９と１０の組み合わせ、または配列ＩＤ番号１１と１２の組み合わせである、キット。
【請求項９】
請求項７記載のキットにおいて、前記展開液は、７９．６６％（ｖ／ｖ）以上の水、２０％（ｖ／ｖ）未満のホルムアミド、０．２９％（ｗ／ｖ）未満のリン酸水素ナトリウム、及び０．０５％（ｗ／ｖ）未満のアジ化ナトリウムを有する、キット。
【請求項１０】
請求項７記載のキットにおいて、前記ミツバチは、セイヨウミツバチ（Apis mellifera）、トウヨウミツバチ（Apis cerana）、ニホンミツバチ（Apis cerana japonica）、オオミツバチ（Apis dorsata）、ヒマラヤオオミツバチ（Apis laboriosa）、サバミツバチ（Apis koschevnikovi）、コミツバチ（Apis florea）、クロコミツバチ（Apis andreniformis）、キナバルヤマミツバチ（Apis nuluensis）、またはクロオビミツバチ（Apis nigrocincta）である、キット。
【請求項１１】
請求項７記載のキットにおいて、前記標識物質結合物質と前記標識物質の組み合わせは、ビオチン−標識アビジン、ジゴキシゲニン−標識抗ジゴキシゲニン抗体、またはＦＩＴＣ−標識抗ＦＩＴＣ抗体である、キット。
【請求項１２】
請求項７記載のキットにおいて、前記原因菌が、Paenibacillus larvae、Melissococcus plutonius、Nosema ceranae、Ascosphaera apis、またはAcarapis woodiである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸クロマトグラフィーを利用した、蜂病を発症させる原因菌を検出する方法及びその検出キットに関する。より具体的には、核酸クロマトグラフィーを利用することで、複数の原因菌を一度に検出することを可能にする検出方法及びその検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ミツバチは、蜂蜜を生産する昆虫という側面だけでなく、種々の植物における花粉媒介者として重要な昆虫である。そのため、健全な蜂蜜生産や交配用ミツバチを安定的に供給するためには、ミツバチの感染症対策が重要な課題の一つとなっている。
【０００３】
ところで、家畜であるミツバチには法定伝染病を含む数多くの蜂病が存在しており、この蜂病の病原因子としては、細菌、真菌、微胞子虫、ダニ類等、多岐に渡る病原因子が確認されている。そのため、単に蜂病といってもその病原因子の検出には長時間を要し、またどのような病原因子に起因する蜂病なのかを判別するには経験や熟練を必要とするため、正確な蜂病診断が困難な場合が多い。
【０００４】
したがって、蜂病やミツバチ感染症の専門家ではなくても、数多くの蜂病やミツバチ感染症を迅速かつ正確に識別可能な検出技術が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蜂病感染の初期診断は、熟練した養蜂専門家がミツバチや巣内環境等の疾病状況を目視によって観察する経験則に依存している。また近年では、ＰＣＲ法などの遺伝子工学的手法を利用して、ミツバチ個体からＤＮＡを抽出し、ミツバチ感染症の病原因子を検出する方法によって、蜂病を初期診断する技術も普及している。
【０００６】
しかしながら、ミツバチ個体からＤＮＡを抽出し、その後に電気泳動すると長時間を要してしまう。またこのような遺伝子工学的手法では、種々の蜂病のそれぞれに応じて、ＰＣＲのプライマーの選択、反応液の組成や温度条件等の検討が必要となるため、養蜂現場において簡単に利用できる技術ではないというデメリットも存在する。
【０００７】
また野外で簡便に蜂病の原因菌を検出する検査キットとしては、抗体反応を利用したヨーロッパ腐蛆病用の製品が市販されているが、このキットは１種類の蜂病しか判定できないだけでなく、擬似陽性を示すことが多く、ほとんど普及していない。
【０００８】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、複数のミツバチ伝染病や蜂病の原因菌を一度に簡便に検出することを可能にする検出方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明はまた、上記検出方法に用いられる検出キットを提供することを目的とする。  
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、核酸増幅産物を核酸クロマト紙に展開するだけで容易に増幅の有無を確認できる核酸クロマトグラフィー技術に着目し、この技術を基盤技術として用いることで、複数のミツバチ伝染病や蜂病の原因菌を一度に検出し得る可能性を得た。また、本発明者らは、核酸クロマトグラフィー技術を用いることで、核酸抽出から原因菌の検出までが簡便かつ素早く、また原因菌の検出に用いる核酸の濃度測定が不要になる可能性も得た。
【００１１】
そして、本発明者らは、核酸クロマトグラフィー技術を用いて複数のミツバチ伝染病や蜂病の原因菌を一度に検出するため、各原因菌の塩基配列を詳細に調べることにより、偽陽性や検出の見落としがなくなるような配列、並びにそのための最適な展開液を見出した。
【００１２】
具体的には、本発明の第一の主要な観点によれば、ミツバチに感染して蜂病を発症させる複数の原因菌を一度に検出する方法であって、前記ミツバチからＤＮＡを抽出する工程と、各原因菌を検出するための複数のプライマー対であって、各原因菌に関連付けられたタグ配列が結合した第１のプライマーと、標識物質結合物質が結合した第２のプライマーからなるプライマー対を用いて、前記抽出したＤＮＡを増幅する工程と、増幅産物を、前記標識物質結合物質と反応して検出を可能にする標識物質を有する展開液を用いて、前記タグ配列に相補的な配列を有する２以上のプローブを有する固相担体上に展開する工程と、前記固相担体上に生成した、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリダイズ産物を検出する工程とを有し、前記蜂病は、アメリカ腐蛆病、ヨーロッパ腐蛆病（強毒株）、ヨーロッパ腐蛆病（弱毒株）、ノゼマ病、アカリンダニ症、及びチョーク病からなる群から選択される、方法が提供される。
【００１３】
また、本発明の第二の主要な観点によれば、ミツバチに感染して蜂病を発症させる複数の原因菌を一度に検出するためのキットであって、各原因菌を検出するための複数のプライマー対であって、各原因菌に関連付けられたタグ配列と前記原因菌の塩基配列の少なくとも一部に相補的な配列とを有する第１のプライマーと、標識物質結合物質が結合した第２のプライマーからなるプライマー対と、前記タグ配列に相補的な配列を含む２以上のプローブを有する固相担体と、前記標識物質結合物質と反応して検出を可能にする標識物質を有する展開液とを有し、前記蜂病は、アメリカ腐蛆病、ヨーロッパ腐蛆病（強毒株）、ヨーロッパ腐蛆病（弱毒株）、ノゼマ病、アカリンダニ症、及びチョーク病からなる群から選択される、キットが提供される。
【００１４】
このような構成によれば、５種類のミツバチ伝染病または蜂病の原因菌を、一度の試験で同時に検出することが可能となる。また、核酸クロマト紙および各原因菌の遺伝子を一度の反応で増幅するためのプライマーや所定の薬品を用いることにより、プロトコールに従って短時間で正確な検出が可能となる。
【００１５】
また、本発明の一実施形態によれば、上記の方法及びキットにおいて、前記プライマー対は、配列ＩＤ番号１と２の組み合わせ、配列ＩＤ番号３と４の組み合わせ、配列ＩＤ番号５と６の組み合わせ、配列ＩＤ番号７と８の組み合わせ、配列ＩＤ番号９と１０の組み合わせ、または配列ＩＤ番号１１と１２の組み合わせであることが好ましい。
【００１６】
また、本発明の他の一実施形態によれば、上記の方法及びキットにおいて、前記展開液は、７９．６６％（ｖ／ｖ）以上の水、２０％（ｖ／ｖ）未満のホルムアミド、０．２９％（ｗ／ｖ）未満のリン酸水素ナトリウム、及び０．０５％（ｗ／ｖ）未満のアジ化ナトリウムを有することが好ましい。
【００１７】
さらに、本発明の一実施形態において、上記の方法及びキットにおいて、前記ミツバチは、セイヨウミツバチ（Apis mellifera）、トウヨウミツバチ（Apis cerana）、ニホンミツバチ（Apis cerana japonica）、オオミツバチ（Apis dorsata）、ヒマラヤオオミツバチ（Apis laboriosa）、サバミツバチ（Apis koschevnikovi）、コミツバチ（Apis florea）、クロコミツバチ（Apis andreniformis）、キナバルヤマミツバチ（Apis nuluensis）、またはクロオビミツバチ（Apis nigrocincta）であることが好ましい。
【００１８】
また、本発明の他の一実施形態によれば、上記の方法及びキットにおいて、前記標識物質結合物質と前記標識物質の組み合わせは、ビオチン−標識アビジン、ジゴキシゲニン−標識抗ジゴキシゲニン抗体、またはＦＩＴＣ−標識抗ＦＩＴＣ抗体であることが好ましい。
【００１９】
さらに、本発明の一実施形態によれば、上記の方法及びキットにおいて、前記原因菌が、Paenibacillus larvae、Melissococcus plutonius、Nosema ceranae、Ascosphaera apis、またはAcarapis woodiであることが好ましい。
【００２０】
なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明の一実施形態におけるＰＣＲ反応条件を示す模式図である。
【図２】図２Ａは、本発明の一実施形態において、核酸クロマト紙を用いてミツバチ伝染病の罹患の有無を判定した結果の写真である。青い（太い）バンドが出現していると、その現れた場所に関連付けられた原因菌に陽性であることを示す。また、図２Ｂに示した模式図は各原因菌の核酸クロマト紙上での出現位置を示す。
【図３】図３Ａは、本発明の一実施形態において、複数のミツバチ感染症に罹患した個体サンプルでの複数感染の区別を検証した結果を示す。図３Ａの右部分が本願発明に係る方法を用いた場合であり、図３Ａの左部分が電気泳動を用いた場合である。図３Ｂは、各疾患に罹患した個体サンプルを用いた場合のＰＣＲ増幅産物の電気泳動バンドピークを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本願発明に係る一実施形態および実施例を、図面を参照して説明する。  
本願発明に係る一実施形態において、ミツバチに感染して蜂病を発症させる複数の原因菌を一度に検出する方法が提供され、原因菌が検出される対象となるミツバチとしては種々のミツバチを用いることができ、特に限定されるものではないが、好ましくはそのようなミツバチは養蜂に用いられるミツバチであり、さらに好ましくはセイヨウミツバチ（Apis mellifera）、トウヨウミツバチ（Apis cerana）、ニホンミツバチ（Apis cerana japonica）、オオミツバチ（Apis dorsata）、ヒマラヤオオミツバチ（Apis laboriosa）、サバミツバチ（Apis koschevnikovi）、コミツバチ（Apis florea）、クロコミツバチ（Apis andreniformis）、キナバルヤマミツバチ（Apis nuluensis）、またはクロオビミツバチ（Apis nigrocincta）である。
【００２３】
本願発明に係る一実施形態においては、このようなミツバチに感染して蜂病を発症させる原因菌の核酸を、当該核酸に特異的なプライマーを用いて増幅する。検出の対象となる原因菌は、上記のミツバチに感染して蜂病の原因になる菌をいい、その蜂病としては、例えば、アメリカ腐蛆病、ヨーロッパ腐蛆病（強毒株）、ヨーロッパ腐蛆病（弱毒株）、ノゼマ病、アカリンダニ症、及びチョーク病などが挙げられる。また原因菌としては、具体的には、例えば、Paenibacillus larvae、Melissococcus plutonius、Nosema ceranae、Ascosphaera apis、またはAcarapis woodiを挙げることができる。本願発明に係る一実施形態においては、このような原因菌の１またはそれ以上を一度の試験で検出することができる。
【００２４】
また、本願発明に係る一実施形態において、検出対象となる原因菌を保有するミツバチのサンプルとしては、上記原因菌の核酸を含む試料であればよく、例えば、ミツバチの成虫や幼虫をすりつぶして種々の公知の核酸抽出液と混合し、本技術分野においてよく知られた手法によって核酸を抽出したものをサンプルとして用いることができる。
【００２５】
また、本願発明に係る一実施形態において、ミツバチに感染して蜂病を発症させる複数の原因菌を一度に検出するために、ミツバチから抽出されたＤＮＡを増幅する。この際、増幅用プライマーとしては、各原因菌を検出するための複数のプライマー対であって、各原因菌に関連付けられたタグ配列が結合した第１のプライマーと、標識物質結合物質が結合した第２のプライマーからなるプライマー対を用いることができる。
【００２６】
例えば、ある蜂病の原因菌の配列にハイブリダイズ可能な相補的な配列をプライマーとして用いる場合、５塩基、１０塩基、１５塩基、２０塩基等の任意の塩基数の相補的配列に、その原因菌に関連付けられたタグ配列を結合して得たプライマーを第１のプライマーとすることができる。このタグ配列は、原因菌の相補的配列とは無関係に、各塩基部位が任意の塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）の混合物から構成される配列である。好ましくはＮ（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの混合物）を用いる。このタグ配列の塩基配列の長さは、複数の疾患を区別することができ、かつタグ間での混同が起きないような配列長を有していれば任意の長さの配列であってもよく、好ましくは５〜５０塩基であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基であり、検出対象となる疾患の種類やそのプライマーとして用いる相補的配列、その相補的配列の構成塩基など、各実験の環境に応じて適宜設計可能である。オリゴヌクレオチドプローブは、このタグ配列と相補的な配列を含むように設計される。
【００２７】
また、上述の相補的配列に、標識物質結合物質を結合して得たプライマーを第２のプライマーとすることができる。この標識物質結合物質は、展開液に含まれる標識物質と結合して増幅産物を可視化させることができるものであり、例えば、これに限られるものではないが、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはＦＩＴＣなどを用いることができ、それぞれ標識物質としての標識アビジン、標識抗ジゴキシゲニン抗体、または標識抗ＦＩＴＣ抗体と結合することができる。
【００２８】
本願発明に係る一実施形態において、第１のプライマーと第２のプライマーは、原因菌の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、増幅可能なように適宜選択されることができる。また、上記原因菌のＤＮＡ配列は公知であり、プライマーとして使用できる相補的な配列は、そのＤＮＡ配列に基づいて周知の手法によって適宜設定することができる。
【００２９】
このような第１のプライマーと第２のプライマーとを用いてミツバチから抽出したＤＮＡを増幅することで、ミツバチに感染して蜂病を発症させる複数の原因菌を一度に検出することができる。そして、そのような第１のプライマーと第２のプライマーとの組み合わせは、好ましくは配列ＩＤ番号１と２の組み合わせ、配列ＩＤ番号３と４の組み合わせ、配列ＩＤ番号５と６の組み合わせ、配列ＩＤ番号７と８の組み合わせ、または配列ＩＤ番号９と１０の組み合わせ、配列ＩＤ番号１１と１２の組み合わせである。
【００３０】
また、本願発明に係る一実施形態において、増幅産物を、前記標識物質結合物質と反応して検出を可能にする標識物質を有する展開液を用いて、前記タグ配列に相補的な配列を有する２以上のプローブを有する固相担体上に展開する。展開液は、増幅反応液に含まれる核酸増幅産物が固相担体中で展開が容易になるようになるものであれば良く、その媒体は、例えば、水、水と相溶する有機溶媒、または水と有機溶媒との混合液などであっても良い。この有機溶媒としては、低級アルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステルやアセトン等が挙げられる。
【００３１】
また、展開液には、ｐＨを調整するための緩衝成分を含むことができ、例えば酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＢＳ等を用いて、ｐＨ６．０以上、７．０以上、または８．０以下に調整することができる。また、増幅反応液に展開液と共に界面活性剤やカラーリング液等の、増幅産物のクロマト紙への展開や可視化等を補助する物質を添加することもでき、または必要に応じて濃度調整をして展開媒体とすることも可能である。
【００３２】
本願発明に係る一実施形態において、展開液は、７９．６６％（ｖ／ｖ）以上の水、２０％（ｖ／ｖ）未満のホルムアミド、０．２９％（ｗ／ｖ）未満のリン酸水素ナトリウム、及び０．０５％（ｗ／ｖ）未満のアジ化ナトリウムを有するものとすることができるが、その組成はこれに限られるものではない。例えば、他の実施形態において、水、ホルムアミド、リン酸水素ナトリウム、アジ化ナトリウムの各用量をそれぞれ増減させて適切な展開液とすることができる。また、本願発明に係る一実施形態において、展開液は、１０ｍＭのリン酸塩、０．２％（ｖ／ｖ）のｔｗｅｅｎ、０．４％（ｗ／ｖ）のカゼイン、２０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、及び１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを水で調整してｐＨ７．４の２０μＬ溶液とすることができる。
【００３３】
本願発明に係る一実施形態において、展開液には標識物質を含むことができる。これにより、増幅産物に導入された標識物質結合物質に標識物質が結合し、標識物質を有する二本鎖核酸を得ることが可能となる。また、他の実施形態においては、核酸配列を増幅する際に標識物質を加えておき、標識物質を有する二本鎖核酸を得ることもできる。
【００３４】
本願発明に係る一実施形態において、標識物質は、肉眼で検出可能な発光または発色を有する物質であることが好ましい。例えば、本願発明に係る一実施形態において、標識物質として染料、顔料、化学発光物質等を用いることもでき、上述のような標識物質結合物質と結合する標識アビジン、標識抗ジゴキシゲニン抗体、または標識抗ＦＩＴＣ抗体を採用することもできる。
【００３５】
また、本願発明に係る一実施形態において、「固相担体」は、上述の原因菌に関連付けられたタグ配列に相補的な配列を有する２以上のプローブを有するものであればよい。また、その形状は適宜設計可能であり、好ましくは本技術分野において周知のクロマトグラフィー紙と同等である。本願発明に係る一実施形態において、この固相担体の一端に上記の核酸増幅産物を含む展開液が適用されると、固相担体上におけるプローブが配置された箇所に、当該プローブに相補的な配列を有するタグを有する増幅産物がライン状になって固定されることになる。すなわち、本願発明は複数の蜂病の原因菌を一度に検出することが可能なものであるため、この固相担体上には各原因菌に対応した複数のプローブが適切な距離に配置される。また、本願発明に係る一実施形態において、各プローブ及び当該プローブに結合したタグの見分けが容易になるように、固相担体上に位置マーカーを配置することも可能である。この位置マーカーによって、対象の原因菌が存在しているのかどうかを目視にて簡便に検出することが可能となる。また、本願発明に係る一実施形態において、展開液を固相担体に適用する時間は任意の時間であっても良く、例えば５分以上、１０分以上、または１２分以上とすることもできるが、これに限られるものではない。また、固相担体上に、展開液が十分に適用されたことを目視で確認するためのライン（フローコントロールライン）を配置し、このフローコントロールラインに展開液が達していない場合には適用時間を増やすことも可能である。
【００３６】
本願発明に係る一実施形態において、プローブは、上述の原因菌に関連付けられたタグ配列に相補的な配列を有していればよく、その長さは特に限定されないが、各タグ配列と特異的にハイブリダイゼーション反応が行われるように、好ましくは１０塩基以上、さらに好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、または好ましくは５０塩基以下である。
【００３７】
本願発明に係る一実施形態において、上述したような第１及び第２のプライマーからなるプライマー対、固相担体、及び展開液を組み合わせることにより、ミツバチに罹患した複数の疾患を一度に検出するためのキットとすることも可能である。
【実施例】
【００３８】
以下に、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実験手法および材料
以下に、本発明において用いる実験手法および材料について説明する。なお、本実施形態において、以下の実験手法を用いているが、これら以外の実験手法を用いても、同様の結果を得ることができる。
【００４０】
１．ＤＮＡ抽出
幼虫または成虫１〜３匹程度をマイクロチューブに加えてよく潰し、０．２％水酸化ナトリウム溶液を１００μｌ添加し、ピペッティングして撹拌した。その後、マイクロチューブをヒートブロックにて９８℃、８分間インキュベートした。マイクロチューブが冷めた後、１１％トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液を１４μｌ添加し、よく撹拌した。
【００４１】
上記のようにして得た抽出液を撹拌し、そのうち１μｌを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲに用いた。なお、抽出液に多量の沈殿物が含まれる場合は、４℃、５０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００４２】
２．ＰＣＲ反応
新しいＰＣＲ反応用チューブに、１μＬの調製したゲノムＤＮＡ溶液、０．６μＬの滅菌水、４μＬの５×Primer Set1（配列ＩＤ番号１〜８及び１０〜１４の混合物）、４μＬの５×Primer Set2（配列ＩＤ番号９）、１０μＬの２×PCR Buffer（ＴＯＹＯＢＯ）、０．４μＬのKOD -Multi & Epi-（ＴＯＹＯＢＯ）を入れ、全体で２０μＬにしてよく混ぜた。
【００４３】
GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems）を使用して、サーマルサイクラーの設定を行い、調製したチューブをセットしてＰＣＲ反応をスタートさせた。反応条件は図１のとおりにした。
【００４４】
また、各原因菌由来の遺伝子を増幅するためのプライマー及びポジティブコントロール用のプライマーは表１のものを用いた。
【００４５】
【表１】
2019062745.tif 000002
【００４６】
３．核酸クロマト展開による反応
新しいＰＣＲ反応用チューブに、１０μＬのＰＣＲ反応液、１０μＬの滅菌水、２０μＬの展開液、２μＬのカラーリング液を入れ、よく混ぜた。核酸クロマト、展開液、及びカラーリング液は室温で用いた。またカラーリング液は使用直前によく撹拌した。展開液の組成は以下のとおりであり、水で調整してｐＨ７．４の２０μＬ溶液とした。
１０ｍＭのリン酸塩、
０．２％（ｖ／ｖ）のｔｗｅｅｎ、
０．４％（ｗ／ｖ）のカゼイン、
２０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、
１５０ｍＭのＮａＣｌ、
０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム
以上のようにして得た溶液を含むＰＣＲチューブに核酸クロマトを挿し、５分以上静置した。このクロマト反応は常温で行った。
【００４７】
４．核酸クロマト反応による結果判定
ＰＣＲチューブに浸漬させた核酸クロマトを５分以上静置した後、目視で確認および判定した。判定時にフローコントロールラインを確認し、ラインに達してない場合は時間を追加した。
【００４８】
アメリカ腐蛆病、ヨーロッパ腐蛆病（強毒株）、ヨーロッパ腐蛆病（弱毒株）、ノゼマ病、アカリンダニ症、及びチョーク病のそれぞれに罹患したミツバチを用いて上記核酸クロマト反応を行った結果のクロマト紙を図２Ａに示す。図２Ａに示したとおり、原因菌に対して陽性の場合には、検体中に検出対象遺伝子が存在するため、対応する位置に青色の陽性ライン（太いバンド）が出現した。また、原因菌に対して陰性の場合には、検体中に検出対象遺伝子が存在しないため、反応ライン出現位置にはポジティブコントロールのみが出現する。また、各原因菌の核酸クロマト紙上での出現位置は図２Ｂに示した模式図のとおりである。
【００４９】
複数感染の場合の電気泳動による区別との比較
続いて、複数の蜂病の原因菌に感染した場合を想定して、本願発明に係る方法を用いた場合に複数感染の区別ができるかどうかを確認した。また比較として、各疾患に罹患した個体サンプルから得られたＤＮＡを用いて、上記プライマーで増幅させた場合のＰＣＲ増幅産物を単に電気泳動して得られるバンドのピークを示した。図３Ｂは、上から順に、アメリカ腐蛆病、ヨーロッパ腐蛆病（弱毒株）、ヨーロッパ腐蛆病（強毒株）、ノゼマ病、チョーク病、アカリンダニ症、及びミツバチゲノムのＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果のバンドピークを示す。
【００５０】
アメリカ腐蛆病、ヨーロッパ腐蛆病（強毒株）、ノゼマ病、アカリンダニ症、及びチョーク病にそれぞれ罹患した個体を混合したものをＭｉｘ１とし、またアメリカ腐蛆病、ヨーロッパ腐蛆病（強毒株）、ノゼマ病、及びアカリンダニ症にそれぞれ感染した個体を混合したものをＭｉｘ２とした。また、ＰＣＲ反応の反応条件は図３Ａに示したとおりである。
【００５１】
図３Ａに示されるとおり、本願発明に係る方法を用いて複数感染サンプルを調べると、上述のように各疾患のバンドが別々の場所に現れるため、複数の蜂病の原因菌に感染したサンプルを用いた場合であっても、どの原因菌に感染したのかが目視にて確認することができた。一方、ＰＣＲ増幅産物の電気泳動した場合には、各原因菌が示すバンドピークが原因菌間で重複しているため、複数の蜂病の原因菌に感染した個体を想定した場合には、感染した原因菌のバンドピークが重なってしまい、どの原因菌に感染したのかを確認することができなかった。
【００５２】
その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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