(57)【要約】      （修正有）【課題】マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析により、β−ラクタマーゼを高感度で検出する、分析方法を提供する。【解決手段】分析対象試料に、マトリックスとして下記式（Ｉ）で表される化合物を混合し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析を実施する。式（Ｉ）において、Ｒは炭素数３〜１１のアルキル基である。分析対象試料は、β−ラクタマーゼが含まれているか否かを判定すべき物質である。分析対象としては、例えば細菌および細菌からの抽出物が含まれる。2019143975.tif 000006【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象試料に、マトリックスとして下記式（Ｉ）で表される化合物を混合し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析を実施して、前記分析対象試料に含まれるβ−ラクタマーゼを検出する、分析方法：
【化１】
2019143975.tif 000004
式（Ｉ）において、Ｒは炭素数３〜１１のアルキル基を表す。
【請求項２】
前記分析対象試料が、細菌または細菌からの抽出物を含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
細菌のβ−ラクタム系抗菌薬耐性評価方法であって、
評価対象の細菌のコロニーに、マトリックスとして下記式（Ｉ）で表される化合物を混合して細菌とマトリックスとの混合物を調製する工程；
前記混合物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析に供する工程；
分析結果に基づいて前記細菌に含まれるβ‐ラクタマーゼの存在量を求める工程；および
前記β‐ラクタマーゼの存在量がしきい値を超えた場合に、前記細菌がβ―ラクタム系抗菌薬耐性を有すると判断する工程、
を含む、β−ラクタム系抗菌薬耐性評価方法：
【化２】
2019143975.tif 000005
式（Ｉ）において、Ｒは炭素数３〜１１のアルキル基を表す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分析方法に関し、詳細には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）による、β‐ラクタマーゼの検出に関する。さらに、本発明は細菌のβ‐ラクタム系抗菌薬耐性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質を主力とした各種抗菌薬の発達により、細菌等の感染症の発生は著しい減少をみている。その一方で、薬剤の大量使用に伴って抗菌薬に耐性を示す病原菌が急速に増加している。いくつかの種類の細菌がβ-ラクタマーゼを産生することにより、β−ラクタム系（ペニシリン系およびセファロスポリン系）抗菌薬に対して耐性を示すことが知られている。β−ラクタマーゼはβ−ラクタム系抗菌薬のβラクタム環を加水分解して不活化する細菌産生酵素であり、水溶性（親水性）タンパク質であることが知られている。
【０００３】
β−ラクタマーゼは、臨床検査および薬剤耐性研究において重要な位置付けにある。β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法として、微量液体希釈法、ディスク拡散法、ＰＣＲ法等が確立されているが、菌の培養等に時間およびコストを要する。特に、細菌による感染症の治療や院内感染の予防においては、迅速にターゲットを同定して抗生物質を投与することが重要であり、より簡便にβ−ラクタマーゼ産生菌を検出可能な手法の開発が求められている。
【０００４】
質量分析法は、多数の夾雑物中に含まれる目的物質を検出・定量可能な手法であり、質量分析により、細菌中の特定の物質の有無および分子量を特定し、菌の種類や薬剤耐性等を識別する方法が報告されている。特に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）は、インタクトなタンパク質の検出が可能であり、短時間で菌種を同定可能な臨床微生物学的検査手法として注目されている。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより細菌からβ−ラクタマーゼが検出されれば、その細菌はβ−ラクタマーゼ産生菌であり、β−ラクタム系抗菌薬に耐性を示すことを判別できる。しかし、これまでＭＡＬＤＩ−ＭＳによるβ−ラクタマーゼの分析に関する報告は限定的である（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】C. Fenselau et al., 2008, Appl. Environ. Microbiol., Vol. 74, 904-906.
【非特許文献２】J. E. Johanna et al., 2007, Anal. Bioanal Chem., Vol. 389, 1633-1638.
【非特許文献３】J. Thacker et al., ASMS Annual Conference 2016, TP684.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１では、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより、芽胞中のβ−ラクタマーゼを分析しているものの、実験プロトコルの詳細はマトリックス情報含め開示されていない。非特許文献２および非特許文献３では、β−ラクタマーゼの発現性を高めた菌種の使用や、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等の誘導剤の使用により、β−ラクタマーゼを高濃度に発現させ、培養後の菌からタンパク質の抽出および精製を行った後に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析を行っている。このときマトリックスとしては、主に、シナピン酸（ＳＡ）が用いられている。臨床検査への応用には、より簡便に、細菌に含まれる低濃度のβ−ラクタマーゼを高感度で検出できることが要求される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記に鑑み本発明者が検討の結果、特定のマトリックスを用いたＭＡＬＤＩ−ＭＳにより、β−ラクタマーゼを高感度に検出可能であることを見出し、本発明に至った。
【０００８】
本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）による分析方法に関し、分析対象試料に、マトリックスとして下記式（Ｉ）で表される化合物を混合し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析対象試料中のβ−ラクタマーゼを検出する。
【０００９】
【化１】
2019143975.tif 000002
【００１０】
式（Ｉ）において、Ｒは炭素数３〜１１のアルキル基である。Ｒの炭素数は、５〜１１が好ましく、５〜９がより好ましく、７が特に好ましい。
【００１１】
分析対象試料は、例えば大腸菌等の細菌を含む。
【００１２】
さらに、本発明はＭＡＬＤＩ−ＭＳによる細菌のβ−ラクタム系抗菌薬耐性の評価方法に関する。β−ラクタム系抗菌薬耐性の評価においては、評価対象の細菌のコロニーに、マトリックスとして上記式（Ｉ）で表される化合物を混合して細菌とマトリックスとの混合物を調製する。混合物をマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析に供し、分析結果に基づいて細菌に含まれるβ‐ラクタマーゼの存在量を求める。β‐ラクタマーゼの存在量がしきい値を超えた場合に、細菌がβ―ラクタム系抗菌薬耐性を有すると判断する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の分析方法によれば、細菌等に含まれるβ−ラクタマーゼを簡便な方法で高感度に検出できる。本発明の分析方法を応用することにより、細菌がβ‐ラクタム系抗菌耐性を有しているか否かを評価することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実験例１（β−ラクタマーゼ標品）のマススペクトルである。
【図２】実験例２（β−ラクタマーゼ精製品）のマススペクトルである。
【図３】実験例３（β−ラクタマーゼ精製品とB. subtilisとの混合物）のマススペクトルである。
【図４】実験例４（β−ラクタマーゼ精製品とS. epidermidisとの混合物）のマススペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［マトリックス］
本発明においては、分析対象試料を、下記式（Ｉ）で表される２，４，６−トリヒドロキシフェニルアルキルケトンと混合し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）により分析が行われる。
【００１６】
【化２】
2019143975.tif 000003
【００１７】
式（Ｉ）において、Ｒは炭素数３〜１１のアルキル基である。炭素数３〜１１のアルキル基としては、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、およびウンデシル基が挙げられる。アルキル基Ｒは直鎖状でもよく分岐状でもよい。アルキル基Ｒの炭素数は５〜１１が好ましく、５〜９がより好ましく、７が特に好ましい。すなわち、本発明で用いられる特に好ましいマトリックスは、式（Ｉ）におけるＲがヘプチル基である１−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）オクタン−１−オンである。
【００１８】
上記の化合物は溶媒と混合してマトリックス溶液として使用することが好ましい。マトリックス溶液中の上記化合物の濃度は、例えば、１ｍｇ／ｍＬ〜飽和濃度とすればよい。この範囲内のより小さな濃度でも、β−ラクタマーゼの検出感度の向上に寄与させることができる。マトリックス溶液中の上記化合物の濃度は、例えば、１〜３０ｍｇ／ｍＬ程度が好ましい。
【００１９】
［分析対象試料］
質量分析対象試料は、β−ラクタマーゼを含有するか否かの判断、またはβ−ラクタマーゼの含有量の定量が求められる試料である。β−ラクタマーゼは、基質特異性やアミノ酸配列に基づいて、クラスＡ（ペニシリナーゼ）、クラスＢ（カルバペネマーゼ）、クラスＣ（セファロスポリナーゼ）およびクラスＤ（オキサシリナーゼ）に分類される（Ambler分類）。本発明では、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによりインタクトな分子を検出するため、いずれのクラスのβ−ラクタマーゼにも適用できる。
【００２０】
β−ラクタマーゼを含有するか否かの判断を必要とする試料としては、典型的には細菌が挙げられる。β−ラクタマーゼを含む細菌は、プラスミド上または染色体上に、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子を保有しており、β−ラクタム系抗菌薬耐性を示す。元来、β−ラクタマーゼを発現する細菌種はごく少数であるが、細菌は、染色体ＤＮＡの変異やプラスミドの伝播によりβ−ラクタマーゼ発現性を獲得する。グラム陽性菌およびグラム陰性菌のいずれも本発明の分析対象となり得る。
【００２１】
グラム陽性菌の例としては、以下が挙げられる：リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リステリア・ウェルシメリ（Listeria welshimeri）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、スタフィロコッカス・ラグダネンシス（Staphylococcus lugdunensis）、スタフィロコッカス・シュライフェリ（Staphylococcus schleiferi）、スタフィロコッカス・カプレ（Staphylococcus caprae）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ヴィリダンス型連鎖球菌（Streptococcus viridans）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、セレウス菌（Bacillus cereus）、バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・ラルヴェ（Bacillus larvae）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Mycobacterium ulcerans）、マイコバクテリウム・カナサシイ（Mycobacterium kanasasii）、トリ型結核菌（Mycobacterium avium）、パラ結核菌（Mycobacterium paratuberculosis）、マイコバクテリウム・スクロフラセム（Mycobacterium scrofulaceam）、マイコバクテリウム・ミクロティ（Mycobacterium microti）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Mycobacterium africanum）、マイコバクテリウム・カネッティイ（Mycobacterium canettii）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellulare）、マイコバクテリウム・シミエ（Mycobacterium simiae）、マイコバクテリウム・シュルガイ（Mycobacterium szulgai）、マイコバクテリウム・ゼノピ（Mycobacterium xenopi）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Mycobacterium fortuitum）、マイコバクテリウム・ケロネイ（Mycobacterium chelonei）、マイコバクテリウム・マリナム（Mycobacterium marinum）、ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroids）、およびロドコッカス・エクイ（Rhodococcus equi）。
【００２２】
グラム陰性菌の例としては、以下が挙げられる：淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitides）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenzae）、クレブシェラ肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、大腸菌（Escherichia coli）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloaceae）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、腸炎菌（Salmonella enteritidis）、およびチフス菌（Salmonella typhi）等が挙げられる。
【００２３】
本発明においては、細菌をそのまま分析対象試料とすることができる。細菌を分析対象とする場合は、例えば、細菌培養コロニーをマトリックスと混合して、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析を行う。細菌のコロニーは、そのままＭＡＬＤＩプレートに滴下し、ＭＡＬＤＩプレート上でマトリックスと混合してもよい（on-target mix法）。また、細菌のコロニーとマトリックスとを混合した後、ＭＡＬＤＩプレートに滴下してもよい。
【００２４】
細菌からの抽出物を分析用試料としてもよい。例えば、細菌を溶菌して抽出されたタンパク質を分析対象としてもよい。また、細菌からの抽出物をカラム等により精製したものを分析用試料としてもよい。
【００２５】
細菌からの抽出物の分析では、細菌をそのまま分析する場合に比べて、試料中に含まれる夾雑物の種類および量が少ないため、より高感度の分析が可能となる。一方、細胞をそのまま用いる場合は、分析対象にβ−ラクタマーゼが含まれているか否か、換言すれば、細菌がβ−ラクタム系抗菌薬耐性を示すか否かを、より短時間かつ低コストで分析可能である。
【００２６】
本発明においては、マトリックスとして上記の式（Ｉ）で表される２，４，６−トリヒドロキシフェニルアルキルケトンを用いることにより、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる低濃度のβ−ラクタマーゼの検出が可能となることに加えて、試料中に多数の夾雑物が含まれている場合でもβ−ラクタマーゼを高感度で検出できる。そのため、細菌からのタンパク質の抽出や精製操作を行わずに、細菌をそのまま分析する場合でも、細菌中のβ−ラクタマーゼを検出可能である。
【００２７】
マトリックスとして２，４，６−トリヒドロキシフェニルアルキルケトンを用いることにより、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるβ−ラクタマーゼの検出感度が向上する理由は定かではないが、β−ラクタマーゼの選択的なイオン化が促進されることがその一因であると推定される。式（Ｉ）で表される２，４，６−トリヒドロキシフェニルアルキルケトンは、主に疎水性ペプチドや疎水性タンパク質のイオン化能増強効果が高いことが報告されている（例えば、ＷＯ２０１４／１３６７７９号）。β−ラクタマーゼは一般に水溶性（親水性）タンパク質であることが知られているが、例えば疎水性アミノ酸残基や、一部の疎水性部位、高次構造における疎水性領域等が、疎水性である２，４，６−トリヒドロキシフェニルアルキルケトンと相互作用を示すことにより、イオン化が促進される可能性が考えられる。
【００２８】
［分析方法］
本発明の分析方法では、上記の分析対象試料およびマトリックスを用いること以外は、一般的なＭＡＬＤＩ−ＭＳと同様に実施すればよい。質量分析装置は、ＭＡＬＤＩ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)イオン源が組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間)型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置等が挙げられる。
【００２９】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおいては、まず、ターゲットプレート上に、分析対象試料とマトリックスとの混合物を準備する。分析対象試料とマトリックスとを事前に混合してターゲットプレート上へ滴下してもよく、ターゲットプレート上の同じ位置に分析対象試料およびマトリックスを滴下してターゲットプレート上で混合してもよい（on-target mix法）。on-target mix法の場合、分析対象試料とマトリックスの滴下の順序は任意であり、両者を同時に滴下してもよい。
【００３０】
前述のように、マトリックスは溶媒と混合してマトリックス溶液として用いることが好ましい。溶媒としては、アセトニトリル（ＡＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスホキシド（ＤＭＳＯ）、水、およびこれらの混合物等が好ましく用いられる。混合溶媒としては、ＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液、ＡＣＮ水溶液、ＭｅＯＨ−ＴＦＡ、ＭｅＯＨ水溶液、ＥｔＯＨ−ＴＦＡ水溶液、ＥｔＯＨ水溶液、ＴＨＦ−ＴＦＡ水溶液、ＴＨＦ水溶液、ＤＭＳＯ−ＴＦＡ水溶液、ＤＭＳＯ水溶液等が挙げられる。マトリックスと分析対象試料との混合物に溶媒を加えてもよい。
【００３１】
ターゲットプレート上の分析対象試料とマトリックスとの混合物の体積（溶媒を含む体積）は、例えば０．１μＬ〜２μＬ程度である。質量分析の前に、ターゲットプレート上の混合液から溶媒を除去することが好ましい。溶媒の除去は、例えば、自然乾燥等により行えばよい。
【００３２】
分析対象試料とマトリックスとの混合物をＭＡＬＤＩ−ＭＳに供し、分析結果としてマススペクトルを得る。この分析結果に基づいて、分析対象試料中にβ−ラクタマーゼが含まれるか否かを判別できる。すなわち、検出対象のβ−ラクタマーゼの分子量（一般に２００００〜４２０００Ｄａ程度）に対応するｍ／ｚにピークが確認された場合は、分析対象試料にβ−ラクタマーゼが含まれていると判断できる。β−ラクタマーゼの分子量は型により異なるが、データベースとの照合等により、検出されたピークがβ−ラクタマーゼによるものであるか否かを確認すればよい。多くの型のβ−ラクタマーゼは分子量が２００００〜４２０００Ｄａであり、試料中にこれらのβ−ラクタマーゼが含まれている場合は、ｍ／ｚ ２００００〜４２０００の範囲にマススペクトルのピークが確認される。マトリックスとして２，４，６−トリヒドロキシフェニルアルキルケトンを用いる本発明の方法は、特にｍ／ｚ ２００００〜４２０００の範囲にピークを示すβ−ラクタマーゼの高感度検出に適している。
【００３３】
細菌または細菌からの抽出物のＭＡＬＤＩ−ＭＳのマススペクトルにおいて、β−ラクタマーゼ由来のピークが確認された場合、分析対象の細菌がβ−ラクタマーゼを含んでおり、β−ラクタム系抗菌薬耐性を示すと判断できる。すなわち、β‐ラクタム系抗菌薬耐性の評価においては、マススペクトルにおけるβ−ラクタマーゼ由来のピークに基づいて、評価対象の細菌中のβ−ラクタマーゼ存在量を求めることができる。細菌中のβ‐ラクタマーゼの存在量が、予め定められたしきい値を超える場合に、評価対象の細菌は、β‐ラクタム系抗菌薬耐性を有すると判断すればよい。
【００３４】
さらに、マススペクトルのスペクトル形状やｍ／ｚの値に基づいて、β−ラクタマーゼの種類を同定することもできる。データベースとの照合により、β−ラクタマーゼの種類の同定を行ってもよい。また、得られたマススペクトルに基づいて、β−ラクタム耐性菌の同定を行ってもよい。
【実施例】
【００３５】
以下の各実験例では、クラスＡに分類されるＴＥＭ−１型β−ラクタマーゼ（約２９０００Ｄａ）の標品溶液試料（０．４８ｍｇ／ｍＬ；Thermo Fisher Scientific社  PV3575）を用い、各種のマトリックスと混合して、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析を行った。
【００３６】
［実験例１］
マトリックス溶液として、１−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）オクタン−１−オン（アルキル化トリヒドロキシアセトフェノン：ＡＴＨＡＰ；ＮＡＲＤ社）５０％ＡＣＮ・０．１％ＴＦＡ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。比較対象のマトリックス溶液として、シナピン酸（ＳＡ；ＬａｓｅｒＢｉｏ社）、α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ；ＬａｓｅｒＢｉｏ社）、および２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ；ＬａｓｅｒＢｉｏ社）のそれぞれについて、５０％ＡＣＮ・０．１％ＴＦＡ溶液を調製した。
【００３７】
β−ラクタマーゼの標品溶液０．５μＬをターゲットプレートのウェル上に滴下後、上記マトリックス溶液０．５μＬを滴下し（on-target mix法）、溶媒を乾燥した後、試料／マトリックス混合結晶を、AXIMA Performance（登録商標）（島津製作所）のリニアモード、ポジティブイオンモ−ドで分析した。マススペクトルを図１に示す。
【００３８】
［実験例２］
β−ラクタマーゼの標品溶液試料を、Zip Tip C18（Merck Millipore社）を用いて精製し、５０％ＡＣＮ・０．１％ＴＦＡ溶液で溶出した。精製後に得られた試料を、５０％ＡＣＮ・０．１％ＴＦＡ溶液で段階希釈し、β−ラクタマーゼ濃度が、１６ｐｍｏｌ／μＬ、１．６ｐｍｏｌ／μＬ、０．１６ｐｍｏｌ／μＬ、および０．０１６ｐｍｏｌ／μＬとなる試料溶液を調製した。
【００３９】
マトリックス溶液として、実施例１と同様に調製したＡＴＨＡＰおよびＳＡを用い、実験例１と同様にon-target mixにより得られた試料／マトリックス混合結晶に対し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析を実施した。マススペクトルを図２に示す。図２の左側は、１ウェルに含まれるβ−ラクタマーゼ量を表している。後述の図３および図４においても同様である。
【００４０】
［実験例３］
枯草菌(B. subtilis)は、保存用エタノールを乾固した後、２０μＬのギ酸中に懸濁させた。
【００４１】
実験例２と同様に、β−ラクタマーゼの標品溶液のZip Tip C18による精製および段階希釈を行い、β−ラクタマーゼ濃度が、２０ｐｍｏｌ／μＬ、２ｐｍｏｌ／μＬ、および０．２ｐｍｏｌ／μＬとなる試料溶液を調製した。マトリックス溶液として、実施例１と同様に調製したＡＴＨＡＰ、ＳＡおよびＣＨＣＡを用いた。濃度を調整したβ−ラクタマーゼ溶液０．５μＬをターゲットプレート上に滴下後、上記の細菌懸濁液０．５μＬを滴下した。溶媒を乾燥後、１μＬのマトリックスを滴下し、溶媒を乾燥後に得られた試料／マトリックス混合結晶に対し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析を実施した。マススペクトルを図３に示す。
【００４２】
［実験例４］
枯草菌に代えて表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）を用いたこと以外は実験例３と同様にして、ＡＴＨＡＰ、ＳＡ、ＣＨＣＡおよびＤＨＢの４種類のマトリックスを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析を実施した。マススペクトルを図４に示す。
【００４３】
［実験例の結果の評価］
図１に示す結果から、マトリックスとしてＡＴＨＡＰを用いることにより、他の３種のマトリックスで検出困難だったβ−ラクタマーゼのピークを感度良く検出できることが分かる。
【００４４】
図２に示すように、Zip Tipにより精製したβ−ラクタマーゼを分析対象試料とした実験例２では、マトリックスとしてＳＡを用いた場合も、８ｐｍｏｌのβ−ラクタマーゼが検出され、前述の非特許文献２および非特許文献３におけるＭＡＬＤＩ−ＭＳによるβ−ラクタマーゼの検出結果を再現した。マトリックスとしてＳＡを用いた場合は、０．８ｐｍｏｌ以下のβ−ラクタマーゼは検出されなかったのに対して、マトリックスとしてＡＴＨＡＰを用いた場合は、０．０８ｐｍｏｌのβ−ラクタマーゼのイオンが検出された。この結果から、マトリックスとしてＡＴＨＡＰを用いることにより、ＳＡと比較して、β−ラクタマーゼの検出感度が（検出限界として）１００倍向上したことが分かる。
【００４５】
図３および図４に示すように、細菌懸濁液とβ−ラクタマーゼとを混合した試料を分析対象とした実験例３および実験例４においても、実験例１，２と同様、マトリックスとしてＡＴＨＡＰを用いることにより、他のマトリックスを用いる場合と比較して検出感度が大幅に（検出限界として10〜100倍）向上した。
【００４６】
以上の結果に示されるように、ＭＡＬＤＩマトリックスとして、２，４，６−トリヒドロキシフェニルアルキルケトンを用いることにより、細菌等に含まれる夾雑物の存在下でもβ−ラクタマーゼの検出感度が向上する。すなわち、本発明によれば、細菌を分析対象試料とした場合でも、細菌に含まれるβ−ラクタマーゼを高感度で検出可能であり、細菌がβ−ラクタム系抗菌薬耐性を示すか否かを判別できることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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