(57)【要約】【課題】  標的物質、または、該標的物質と特異的に結合する媒介用物質が被吸着物質として吸着されたとき、これら物質の構造安定性の低下を抑制し得る免疫測定用組成物等を提供する。【解決手段】  グルコースユニットのＣ６位の水酸基の一部が、アニオン性基によって置換された微細繊維状セルロースの水分散体を備えた免疫測定用組成物であって、前記微細繊維状セルロースが、（ａ）前記微細繊維状セルロースの数平均繊維径が２〜１５０ｎｍである、（ｂ）前記微細繊維状セルロースが、セルロースＩ型結晶構造を有する、（ｃ）前記微細繊維状セルロースの数平均アスペクト比が１０〜１０００である、を満たし、且つ、免疫測定の際、特定の反応を可能にするように構成された、免疫測定用組成物。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースユニットのＣ６位の水酸基の一部が、アニオン性基によって置換された微細繊維状セルロースの水分散体を備えた免疫測定用組成物であって、
前記微細繊維状セルロースが、下記（ａ）〜（ｃ）を満たし、
（ａ）前記微細繊維状セルロースの数平均繊維径が２〜１５０ｎｍである
（ｂ）前記微細繊維状セルロースがセルロースＩ型結晶構造を有する
（ｃ）前記微細繊維状セルロースの数平均アスペクト比が１０〜１０００である
且つ、免疫測定の際、下記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の少なくとも１つの反応を可能にするように構成された、免疫測定用組成物。
（Ａ）タンパク質を有する標的物質と、該標的物質に特異的に結合する抗原または抗体を有する媒介用物質とのうちのいずれか一方である被吸着物質が、前記微細繊維状セルロースに物理的に吸着する反応
（Ｂ）前記（Ａ）の反応において前記被吸着物質が前記媒介用物質である場合、前記微細繊維状セルロースに吸着した前記媒介用物質に前記標的物質が結合する反応
（Ｃ）前記（Ａ）の反応において前記被吸着物質が前記標的物質である場合には前記微細繊維状セルロースに吸着した前記標的物質に、前記（Ａ）の反応において前記被吸着物質が前記媒介用物質である場合には前記（Ｂ）の反応において前記微細繊維状セルロースに吸着した前記媒介用物質に結合した前記標的物質に、標識された抗原または抗体を有する標識用物質が、直接的または間接的に特異的に結合する反応
【請求項２】
１００質量部の前記水分散体に対する前記微細繊維状セルロースの含有量が、０．００１〜１０質量部である、請求項１に記載の免疫測定用組成物。
【請求項３】
前記微細繊維状セルロースの、該微細繊維状セルロースに吸着する前記被吸着物質に対する質量比である（前記微細繊維状セルロース）／（前記被吸着物質）の値が、０．０１〜１０である、請求項１または２に記載の免疫測定用組成物。
【請求項４】
前記標識用物質が、酵素、蛍光色素、蛍光タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種により修飾されることによって標識された抗原または抗体を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の免疫測定用組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の免疫測定用組成物を備えた、免疫測定用診断薬。
【請求項６】
直接競合方式、間接競合方式、または、サンドイッチ方式による免疫測定用である、請求項５に記載の免疫測定用診断薬。
【請求項７】
固体支持体と、請求項１〜４のいずれかに記載の免疫測定用組成物とを備え、
前記固体支持体に前記免疫測定用組成物が物理的に吸着してなる、免疫測定用デバイス。
【請求項８】
前記固体支持体が、ウェル、プレート、チューブ、または、チップである、請求項７に記載の免疫測定用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定用組成物、免疫測定用診断薬、及び、免疫測定用デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、免疫測定法が用いられている。免疫測定法は、体液性免疫反応である抗原抗体反応を利用して、酵素、抗原、抗体といったタンパク質を有する生体物質を測定対象物質（標的物質）として検出（定性）、定量する方法の総称である。免疫測定法によれば、標的物質を特異的に測定することができるため、例えば、タンパク質や核酸に例示される高分子物質から、医薬品やステロイドホルモンに例示される低分子物質まで、幅広い分子量の範囲にわたって物質の測定が可能である。
【０００３】
一方、近年、医療現場において、診断薬、診断デバイスやキット等を用いた免疫測定法を利用して、被検者の周辺にて迅速かつ簡便に被検者の検査を行い、得られた検査結果を活かして適切な診療、処置、看護を行うことによって、疾病の予防や健康増進に寄与することが期待されている。このためには、迅速かつ正確に測定を行うことが必要とされ、測定に用いる試薬や測定方法などについて、多くの改善、努力がなされている。
【０００４】
免疫測定法の例として、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、ラテックス凝集法などが用いられている。これらは、いずれも、上記標的物質に特異的に相互作用（結合）する物質（標識用物質）を利用し、標的物質と標識用物質との反応によって生じた比色、発光、発色、吸光、蛍光、凝集状態等を目視や機器を用いて観察、計測することによって、定性、定量を行う方法である。
【０００５】
例えば、免疫測定法においては、無機系または有機系の担体に、上記標的物質を固定、吸着、または担持させたうえで、標的物質と相互作用を生じた時に着色して標識となるような抗体や基質等（標識用物質）を存在させておくことによって、これに、標的物質を含む測定対象試料を添加した際、標識としての着色が生じるか否かを、直接的に観察することができる。
【０００６】
一方、近年、感染症の迅速検査や在宅検査に対する要望、需要が増しており、検査に用いる試薬の汎用性や安定性向上の要望が高まっている。さらに、検出精度や感度向上も要望されており、例えば、標的物質や、標的物質と標識用物質とを媒介する物質（媒介用物質）が、標識用物質や他の試薬等によって安定性や活性が損なわれないことも要望されている。
【０００７】
そこで、免疫測定用デバイスとして、例えば、上記標的物質や媒介用物質と結合する物質を、プラスチックを含む支持体に共有結合させたものが提案されている（特許文献１参照）。
【０００８】
しかし、かかるデバイスでは、共有結合を介して支持体に上記物質を固定化するためには、合成化学的操作を伴うため、手間がかかり、また、所望の検出精度や感度が得られないおそれがある。
【０００９】
一方、免疫測定用組成物として、セルロース誘導体を用いることも提案されている。例えば、セルロースの水酸基の一部がカルボキシル基及びアミノ基のいずれか１種以上の置換基によって置換されたセルロース粒子の水分散体を用い、該セルロース粒子に、上記標的物質や媒介用物質を吸着させる方法が提案されている（特許文献２参照）。
【００１０】
セルロースは、生分解性を有する天然由来材料であり、その汎用性は高く、また、化学的および熱的安定性が比較的高い材料である。また、セルロースは、タンパク質といった生体物質に対し、非特異的な相互作用や吸着を起こし難いため、精製・分離用カラムの充填剤や、酵素、微生物、細胞の固定化担体・吸着材・膜材料等に用いられている。
よって、セルロースを用いた免疫測定用組成物は、それ自身、化学的及び熱的に安定なものとなり、また、これに吸着される標的物質等に対しても化学的及び熱的な安定性を損い難いものとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第５２５２０３５号公報
【特許文献２】特許第５９５２５２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、特許文献２の免疫用組成物では、これに吸着された標的物質等の構造安定性が十分とはいい難い。構造安定性が十分でないと、吸着された標的物質が標識用物質と特異的に結合することが困難となり、その結果、精度良く定性・定量を行うことが困難となるおそれがある。
【００１３】
上記事情に鑑み、本発明は、標的物質、該標的物質と特異的に結合する媒介用物質が被吸着物質として吸着されたとき、これら物質の構造安定性の低下を抑制し得る免疫測定用組成物、これを用いた免疫測定用診断薬、及び、免疫測定用デバイスを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第１の態様は、
グルコースユニットのＣ６位の水酸基の一部が、アニオン性基によって置換された微細繊維状セルロースの水分散体を備えた免疫測定用組成物であって、
前記微細繊維状セルロースが、下記（ａ）〜（ｃ）を満たし、
（ａ）前記微細繊維状セルロースの数平均繊維径が２〜１５０ｎｍである
（ｂ）前記微細繊維状セルロースが、セルロースＩ型結晶構造を有する
（ｃ）前記微細繊維状セルロースの数平均アスペクト比が１０〜１０００である
且つ、免疫測定の際、下記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の少なくとも１つの反応を可能にするように構成された、免疫測定用組成物である。
（Ａ）タンパク質を有する標的物質と、該標的物質に特異的に結合する抗原または抗体を有する媒介用物質とのうちのいずれか一方である被吸着物質が、前記微細繊維状セルロースに物理的に吸着する反応
（Ｂ）前記（Ａ）の反応において前記被吸着物質が前記媒介用物質である場合、前記微細繊維状セルロースに吸着した前記媒介用物質に前記標的物質が結合する反応
（Ｃ）前記（Ａ）の反応において前記被吸着物質が前記標的物質である場合には前記微細繊維状セルロースに吸着した前記標的物質に、前記（Ａ）の反応において前記被吸着物質が前記媒介用物質である場合には前記（Ｂ）の反応において前記微細繊維状セルロースに吸着した前記媒介用物質に結合した前記標的物質に、標識された抗原または抗体を有する標識用物質が、直接的または間接的に特異的に結合する反応
【００１５】
本発明の第２の態様は、
上記第１の態様の免疫測定用組成物を備えた、免疫測定用診断薬である。
【００１６】
本発明の第３の態様は、
固体支持体と、上記第１の態様の免疫測定用組成物とを備え、
前記固体支持体に前記免疫測定用組成物が物理的に吸着してなる、免疫測定用デバイスである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、標的物質、または、該標的物質と特異的に結合する媒介用物質が吸着されたとき、これら物質の構造安定性の低下を抑制し得る免疫測定用組成物、これを用いた免疫測定用診断薬、及び、免疫測定用デバイスが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施形態の免疫測定用組成物において、アニオン変性微細繊維状セルロースに標的物質に含まれるタンパク質が物理的に吸着する状態を模式的に示す概略図
【図２】標的物質の構造が変化する状態を、模式的に示す概略図
【図３】標的物質が酵素である場合に、酵素が構造変化すると該酵素に基質が結合できなくなることを模式的に示す概略図
【図４】本実施形態の免疫測定用組成物が直接競合方式による免疫測定に用いられる際の反応の一例を模式的に示す概略図
【図５】本実施形態の免疫測定用組成物が間接競合方式による免疫測定に用いられる際の反応の一例を模式的に示す概略図
【図６】本実施形態の免疫測定用組成物がサンドイッチ方式による免疫測定に用いられる際の反応の一例を模式的に示す概略図
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２０】
本実施形態の免疫測定用組成物は、
グルコースユニットのＣ６位の水酸基の一部が、アニオン性基によって置換された微細繊維状セルロースの水分散体を備えた免疫測定用組成物であって、
前記微細繊維状セルロースが、下記（ａ）〜（ｃ）を満たし、
（ａ）前記微細繊維状セルロースの数平均繊維径が２〜１５０ｎｍである
（ｂ）前記微細繊維状セルロースが、セルロースＩ型結晶構造を有する
（ｃ）前記微細繊維状セルロースの数平均アスペクト比が１０〜１０００である
且つ、免疫測定の際、下記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の少なくとも１つの反応を可能にするように構成されている。
（Ａ）タンパク質を有する標的物質と、該標的物質に特異的に結合する抗原または抗体を有する媒介用物質とのうちのいずれか一方である被吸着物質が、前記微細繊維状セルロースに物理的に吸着する反応
（Ｂ）前記（Ａ）の反応において前記被吸着物質が前記媒介用物質である場合、前記微細繊維状セルロースに吸着した前記媒介用物質に前記標的物質が結合する反応
（Ｃ）前記（Ａ）の反応において前記被吸着物質が前記標的物質である場合には前記微細繊維状セルロースに吸着した前記標的物質に、前記（Ａ）の反応において前記被吸着物質が前記媒介用物質である場合には前記（Ｂ）の反応において前記微細繊維状セルロースに吸着した前記媒介用物質に結合した前記標的物質に、標識された抗原または抗体を有する標識用物質が、直接的または間接的に特異的に結合する反応
【００２１】
本実施形態で用いられる微細繊維状セルロースは、セルロース分子中のグルコースユニットのＣ６位にアニオン性基を有するもの（以下、「アニオン変性微細繊維状セルロース」という場合があり、「ＴＯＣＮ」という場合もある。）である。
【００２２】
セルロース分子中のグルコースユニットにアニオン性基が導入されたアニオン変性微細繊維状セルロースは、アニオン性の電荷を有する。一方、アニオン変性微細繊維状セルロースに吸着する被吸着物質が、標的物質、または、標的物質に特異的に結合する媒介用物質であると、これらは、いずれもタンパク質を有している、すなわち、遊離アミノ基を有している。よって、例えば図１に示すように、水分散体中に被吸着物質が添加されると、これらの等電点よりも、水分散体のｐＨの方が酸性側の場合には、これらが正の電荷を有し、アニオン変性微細繊維状セルロースのアニオン性基と、被吸着物質のアミノ基との静電的相互作用により、物理的な結合が形成され易くなる（図１の右上）。これによって、被吸着物質を微細繊維状セルロースの表面に吸着させることができる。
一方、水分散体のｐＨの方が塩基性側の場合には、被吸着物質が負の電荷を有し、アニオン変性微細繊維状セルロースのアニオン性基と、被吸着物質のアミノ基との静電的相互作用が生じ難くなり、物理的な結合が形成され難くなるため（図１の右下）、被吸着物質がアニオン変性微細繊維状セルロースに吸着させることが困難となる。
【００２３】
また、アニオン変性微細繊維状セルロースがアニオン性基を有することによって、該アニオン変性微細繊維状セルロース同士が互いに静電的に反発する静電的反発作用が生じる。これにより、水分散体中、または、後述するように緩衝液が添加された水分散体中において、アニオン変性微細繊維状セルロースが凝集、沈殿することなく、長期的に安定に分散された状態を保持することができる。
【００２４】
セルロースＩ型結晶構造を有するアニオン変性微細繊維状セルロースは、水不溶性である。セルロースＩ型結晶構造は、アニオン変性微細繊維状セルロースの表面に被吸着物質を吸着させる場（領域）を与える。また、アニオン変性微細繊維状セルロースが水不溶性であることにより、溶媒、検体、試料等との分離や洗浄等の操作が、簡便となる。
【００２５】
数平均繊維径が２〜１５０ｎｍであり、数平均アスペクト比が１０〜１０００であるアニオン変性微細繊維状セルロースは、微細繊維であり、且つ、高い比表面積を有している。よって、被吸着物質をより多く吸着することができる。また、物理的な結合によって吸着した被吸着物質の構造安定性を保持することができる。さらに、吸着した被吸着物質の活性低下を抑制できる。
【００２６】
アニオン変性微細繊維状セルロースのアニオン性基としては、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、及び硫酸基からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
なお、アニオン性基は、塩型も含む概念である。例えば、アニオン性基がカルボキシル基または硫酸基である場合、かかるカルボキシル基及び硫酸基は、酸型（−ＣＯＯＨ、−ＯＳＯ３Ｈ）だけでなく、塩型、すなわち、カルボン酸塩基及び硫酸塩基（−ＣＯＯＸ、−ＯＳＯ３Ｘ、ただし、Ｘは、カルボン酸及び硫酸と塩を形成する陽イオン）も含む概念である。アニオン性基がリン酸基またはスルホン酸基である場合についても、同様に、かかるリン酸基またはスルホン酸基は、酸型だけでなく塩型も含む概念である。
【００２７】
アニオン性基としては、例えば、カルボキシル基及び／または硫酸基が好ましい。
【００２８】
カルボキシル基を含有する微細繊維状セルロースとしては、例えば、セルロース分子中のグルコースユニットのＣ６位の水酸基が酸化されてなる酸化セルロースナノファイバーや、セルロース分子中のグルコースユニットのＣ６位の水酸基がカルボキシメチル化されてなるカルボキシメチル化セルロースナノファイバーが挙げられる。
【００２９】
酸化セルロースナノファイバーとしては、セルロース分子中のグルコースユニットのＣ６位の水酸基が選択的に酸化されてカルボキシル基に変性されたものが挙げられる。かかるカルボキシル基酸化セルロースナノファイバーは、木材パルプ等の天然セルロースをＮ−オキシル化合物の存在下、共酸化剤を用いて酸化させ、解繊（微細化）処理することによって得られる。Ｎ−オキシル化合物としては、一般に酸化触媒として用いられるニトロキシラジカルを有する化合物が用いられ、例えば、ピペリジンニトロキシオキシラジカルであり、特に２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）または４−アセトアミド−ＴＥＭＰＯが好ましい。ＴＥＭＰＯで酸化された微細繊維状セルロースは、一般にＴＥＭＰＯ酸化セルロースナノファイバーと称されている。なお、酸化セルロースナノファイバーは、カルボキシル基と共に、アルデヒド基又はケトン基を有していてもよいが、アルデヒド基及びケトン基を実質的に有していないことが好ましい。
【００３０】
硫酸基を含有する微細繊維状セルロースとしては、例えば、セルロース分子中のグルコースユニットのＣ６位の水酸基が硫酸化されてなる硫酸化セルロースナノファイバーや、セルロース分子中のグルコースユニットのＣ６位の水酸基が硫酸エステル化されてなる硫酸エステル化セルロースナノファイバーが挙げられる。
【００３１】
硫酸化セルロースナノファイバーとしては、セルロース分子中のグルコースユニットのＣ６位の水酸基が選択的に硫酸化されて硫酸基に変性されたものが挙げられる。かかる硫酸化セルロースナノファイバーは、木材パルプ等の天然セルロースを硫酸化試薬の存在下、硫酸化し、解繊（微細化）処理することによって得られる。
硫酸エステル化セルロースナノファイバーとしては、セルロース分子中のグルコースユニットのＣ６位の水酸基が選択的に硫酸エステル化されて硫酸基に変性されたものが挙げられる。かかる硫酸エステル化セルロースナノファイバーは、木材パルプ等の天然セルロースを硫酸化試薬の存在下、硫酸エステル化し、解繊（微細化）処理することによって得られる。
硫酸化試薬としては、例えばスルファミン酸が用いられる。硫酸化試薬で硫酸化された微細繊維状セルロースは、一般に硫酸化セルロースナノファイバーと称されている。硫酸化試薬で硫酸エステル化された微細繊維状セルロースは、一般に硫酸エステル化セルロースナノファイバーと称されている。なお、硫酸化セルロースナノファイバー、硫酸エステル化セルロースナノファイバーは、硫酸基、硫酸エステル基と共に、アルデヒド基又はケトン基を有していてもよいが、アルデヒド基及びケトン基を実質的に有していないことが好ましい。
【００３２】
アニオン変性微細繊維状セルロースは、上記で例示した１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３３】
アニオン変性微細繊維状セルロースにおけるアニオン性基の量は、特に限定されず、例えば、０．０５〜３．０ｍｍｏｌ／ｇでもよく、０．５〜２．５ｍｍｏｌ／ｇでもよい。
【００３４】
アニオン性基の量は、例えば、カルボキシル基の場合、乾燥質量を精秤したアニオン変性微細繊維状セルロースを試料として、これの０．５〜１質量％スラリーを６０ｍＬ調製し、０．１Ｍの塩酸水溶液によってｐＨを約２．５とした後、０．０５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、電気伝導度測定を行い、ｐＨが約１１になるまで滴下を続け、電気伝導度の変化が緩やかな弱酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム量（Ｖ）から、下記式に従い求めることができる。リン酸基についても、同様の電気伝導度測定により測定することができる。
その他のアニオン性基についても公知の方法で測定すればよい。
アニオン性基量(ｍｍｏｌ／ｇ)＝Ｖ(ｍＬ)×〔０．０５／セルロース試料質量(ｇ)〕
【００３５】
例えば、硫酸基の場合、前記カルボキシル基の場合と同様の方法によって求めることができる。
【００３６】
アニオン変性微細繊維状セルロースは、ナノメートルレベルの繊維径を持つセルロース繊維（即ち、セルロースナノファイバー）であり、その数平均繊維径は、上記のように２〜１５０ｎｍであり、例えば、３〜１５０ｎｍでもよく、３〜１００ｎｍでもよく、３〜８０ｎｍでもよい。
【００３７】
数平均繊維径は、次のようにして測定することができる。すなわち、固形分率で０．０５〜０．１質量％のアニオン変性微細繊維状セルロースの水分散体を調製し、その水分散体を、親水化処理済みのカーボン膜被覆グリッド上にキャストして、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の観察用試料とする。そして、構成する繊維の大きさに応じて５０００倍、１００００倍あるいは５００００倍のいずれかの倍率で電子顕微鏡画像による観察を行う。その際に、得られた画像内に縦横任意の画像幅の軸を想定し、その軸に対し、２０本以上の繊維が交差するよう、試料及び観察条件（倍率等）を調節する。そして、この条件を満たす観察画像を得た後、この画像に対し、１枚の画像当たり縦横２本ずつの無作為な軸を引き、軸に交錯する繊維の繊維径を目視で読み取っていく。このようにして、最低３枚の重複しない表面部分の画像を、電子顕微鏡で撮影し、各々２つの軸に交錯する繊維の繊維径の値を読み取る（したがって、最低２０本×２×３＝１２０本の繊維径の情報が得られる）。このようにして得られた繊維径のデータにより、数平均繊維径を算出する。
【００３８】
アニオン変性微細繊維状セルロースの数平均アスペクト比は、１０〜１０００であり、例えば、５０〜１０００でもよく、１００〜１０００でもよい。
【００３９】
数平均アスペクト比は、以下の方法で測定することができる。すなわち、アニオン変性微細繊維状セルロースを親水化処理済みのカーボン膜被覆グリッド上にキャストした後、２質量％ウラニルアセテートでネガティブ染色したＴＥＭ像（倍率：１００００倍）から、アニオン変性微細繊維状セルロースの短幅の方の数平均幅、及び、長幅の方の数平均幅を観察し、これらの値を用いて数平均アスペクト比を下記式に従い算出する。
数平均アスペクト比＝長幅の方の数平均幅（ｎｍ）／短幅の方の数平均幅（ｎｍ）
【００４０】
アニオン変性微細繊維状セルロースは、解繊処理を行うことにより得られる。解繊処理は、前述するアニオン性基を導入してから実施してもよく、導入前に実施してもよい。解繊処理としては、例えば、高速回転下でのホモミキサー、高圧ホモジナイザー、超音波分散処理機、ビーター、ディスク型レファイナー、コニカル型レファイナー、ダブルディスク型レファイナー、グラインダー等を用いて、アニオン変性セルロース繊維の水分散液（水分散体）を処理することにより行うことができる。これにより、アニオン変性微細繊維状セルロースの水分散体を得ることができる。
【００４１】
前述したように、水不溶性の観点から、アニオン変性微細繊維状セルロースは、セルロースＩ型結晶構造を有する。アニオン変性微細繊維状セルロースを構成するセルロースがＩ型結晶構造を有することは、例えば、広角Ｘ線回折像測定により得られる回折プロファイルにおいて、２シータ（θ）＝１４°〜１７°付近と、２シータ＝２２°〜２３°付近の２つの位置に典型的なピークをもつことから同定することができる。
【００４２】
本実施形態の免疫測定用組成物には、上述したアニオン変性微細繊維状セルロース及び水の他、本発明の効果を阻害しない範囲において、他の添加剤を含んでいてもよい。かかる添加剤としては、例えば、無機系及び／又は有機系のフィラー類、粘土鉱物類、色素等の着色剤、塩類、ｐＨ調整剤、油剤、水溶性高分子、界面活性剤等が挙げられる。その他、耐光剤、酸化防止剤、防腐剤、無機物等も挙げられる。
【００４３】
本実施形態の免疫測定用組成物において、アニオン変性微細繊維状セルロースに吸着される被吸着物質は、タンパク質を有する、すなわち、アニオン変性微細繊維状セルロースのアニオン性基と物理的に吸着するアミノ基を有する。
【００４４】
被吸着物質は、その有するアミノ基と、アニオン変性微細繊維状セルロースのアニオン性基との静電的相互作用によってアニオン変性微細繊維状セルロースに物理的に吸着するものである。
被吸着物質は、標的物質または媒介用物質である。
【００４５】
標的物質は、測定対象となる物質である。
媒介用物質は、標的物質と特異的に結合し、且つ、アニオン変性微細繊維状セルロースと物理的に吸着することによって、標的物質とアニオン変性微細繊維状セルロースとを媒介するものである。
【００４６】
被吸着物質が標的物質である場合、該標的物質は、特に限定されない。標的物質としては、タンパク質を有するものであれば、特に制限されず、当業者が所望する任意のタンパク質を有するものであってよい。該タンパク質としては、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウイルス由来のタンパク質であってもよく、さらには人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。上記タンパク質としては、例えば、医療用、研究用、または産業用に有用な生物学的活性を有するタンパク質を好適に利用できる。そのようなタンパク質としては、例えば、抗体結合タンパク質、抗体、抗原、受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、酵素、アルブミン、金属タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、膜タンパク質、プロテオグリカン、レクチン及び細胞膜レセプターが挙げられる。さらに、上記タンパク質は、そのタンパク質を構成するアミノ酸の一部がアセチル化、リン酸化、メチル化等の官能基が付加されたもの、糖類、蛋白質、脂質等で修飾されたものであっても構わない。上記タンパク質は、何らかの物質と特異的に相互作用しうるタンパク質であることが好ましい。相互作用としては、例えば特異的な結合が挙げられる。これのうち、標的物質は、上記のうち、抗体及び／または抗原が好ましい。
【００４７】
被吸着物質が媒介用物質である場合、該媒介用物質（第１の媒介用物質）は、特に限定されない。
媒介用物質としては、上記した標的物質と同様のものが挙げられる。
すなわち、媒介用物質としては、タンパク質を有するものであれば、特に制限されず、当業者が所望する任意のタンパク質を有するものであってよい。該タンパク質としては、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウイルス由来のタンパク質であってもよく、さらには人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。上記タンパク質としては、例えば、医療用、研究用、または産業用に有用な生物学的活性を有するタンパク質を好適に利用できる。そのようなタンパク質としては、例えば、抗体結合タンパク質、抗体、抗原、受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、酵素、アルブミン、金属タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、膜タンパク質、プロテオグリカン、レクチン及び細胞膜レセプターが挙げられる。さらに、上記タンパク質は、そのタンパク質を構成するアミノ酸の一部がアセチル化、リン酸化、メチル化等の官能基が付加されたもの、糖類、蛋白質、脂質等で修飾されたものであっても構わない。上記タンパク質は、何らかの物質と特異的に相互作用しうるタンパク質であることが好ましい。相互作用としては、例えば特異的な結合が挙げられる。これのうち、標的物質は、タンパク質であることが好ましく、該タンパク質としては、上記のうち、抗体及び／または抗原が好ましい。
これのうち、媒介用物質は、上記のうち、抗体及び／または抗原が好ましい。
【００４８】
上記の通り、被吸着物質は、アニオン変性微細繊維状セルロースに対して物理的に吸着し得るものであり、タンパク質に由来するアミノ基を有している。一方、アニオン変性微細繊維状セルロースは、アニオン性基を有している。水中でアミノ基は正に帯電し、アニオン性基は負に帯電するため、静電的相互作用（引力）が発生し、これによって、被吸着物質は、アニオン変性微細繊維状セルロースに対して物理的に吸着し得る。
【００４９】
ここで、被吸着物質が、固定支持体に対して共有結合を介して結合することによって固定される場合には、この共有結合が、固定支持体と、被吸着物質の活性中心との間で生じ、被吸着物質の活性（すなわち、標識用物質との直接または間接的な結合）が損なわれるおそれがある。また、被吸着物質の構造変化が生じ、この構造変化によって活性が損なわれるおそれがある。例えば、被吸着物質が酵素である場合を図２、図３に示すが、図２に示すように、酵素に構造変化が生じると、図３に示すように、本来この酵素に特異的に結合することが可能な基質が、酵素に結合することができない。
また、共有結合によって固定支持体に被吸着物質を結合させる特許文献１のような場合には、前述したように、共有結合を発生させるためには、合成化学的操作を伴うため、手間がかかる。
これに対し、本実施形態の免疫測定用組成物は、固定支持体に固定されなくても、被吸着物質が吸着されるため、共有結合を発生させる必要がない。また、後述するように、固定支持体に固定されて使用される場合であっても、自身の粘性によって固定支持体に物理的に吸着されて固定され得るため、共有結合を発生させる必要がない。よって、特許文献１のような共有結合を発生させることなく、すなわち、合成化学的操作を用いることなく、アニオン変性微細繊維状セルロースに被吸着物質を吸着させることができる。よって、被吸着物質の活性低下や構造変形を抑制することができる。
【００５０】
本実施形態の免疫測定用組成物において、水分散体中のアニオン変性微細繊維状セルロースの含有量は特に限定されず、適宜設定され得る。
例えば、１００質量部の水分散体に対するアニオン変性微細繊維状セルロースの含有量が、０．００１〜１０質量部であることが好ましく、０．００１〜５質量部であることがより好ましく、０．００１〜２質量部であることがより好ましい。
アニオン変性微細繊維状セルロースの上記含有量が５質量部よりも大きいと、診断薬用組成物の粘度が増大するため、後処理が煩雑になり、短時間での免疫測定に支障をきたおそれがある。一方、アニオン変性微細繊維状セルロースの上記含有量が０．００１質量部よりも小さいと、被吸着物質に対してアニオン変性微細繊維状セルロースの量が少なくなり過ぎて、アニオン変性微細繊維状セルロースの表面に吸着されない被吸着物質が多く存在し、その結果、かかる吸着されていない遊離の被吸着物質同士の相互作用が生じ、その構造安定性や活性が低下するおそれがある。
しかし、１００質量部の水分散体に対するアニオン変性微細繊維状セルロースの含有量が、０．００１〜１０質量部であることによって、免疫測定がより短時間となり、吸着による被吸着物質の構造変化を抑制し得る。
【００５１】
本実施形態の免疫測定用組成物において、アニオン変性微細繊維状セルロースの、該アニオン変性微細繊維状セルロースに吸着する被吸着物質に対する質量比である（アニオン変性微細繊維状セルロース）／（被吸着物質）の値は、特に限定されないが、０．０１〜１０が好ましく、０．１〜５．４がより好ましい。
上記質量比が１０よりも大きいと、被吸着物質がアニオン変性微細繊維状セルロースに吸着した後、この吸着した物質に、さらに別のアニオン変性微細繊維状セルロースが多数吸着するおそがあり、その結果、吸着した被吸着物質の構造安定性を保持できないおそれがある。
一方、上記質量比０．０１よりも小さいと、被吸着物質に対するアニオン変性微細繊維状セルロースの量が少なくなり過ぎて、アニオン変性微細繊維状セルロースの表面に吸着されない被吸着物質が多く存在し、その結果、免疫測定における所望の分析精度や感度が得られないおそれがある。
これに対し、上記質量比が、０．０１〜１０であることによって、吸着した被吸着物質の構造安定性の低下を抑制し、分析精度や感度の低下を抑制し得る。
【００５２】
本実施形態の免疫測定用組成物においては、水分散体が、アニオン変性微細繊維状セルロース及び水を含有していればよい。かかる水分散体には、免疫測定が行われる際、または、行われる前に予め、水の他に、種々の溶質や溶媒が添加されて、これを含有していてもよい。
かかる溶媒としては、例えば、免疫測定の際に通常用いられる種々の緩衝液が挙げられる。すなわち、添加される溶質として、免疫測定の際に通常用いられる種々の緩衝液を調製するための塩類が挙げられる。
かかる緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、等が挙げられる。具体的には、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）−塩酸緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−1-ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝液等が挙げられる。
【００５３】
本実施形態においては、アニオン変性微細繊維状セルロースのアニオン性基に被吸着物質のアミノ基が吸着されるのであれば、免疫測定用組成物のｐＨは特に限定されず、適宜設定され得る。
例えば、前述した図１に示すように、アニオン変性微細繊維状セルロースのアニオン性基に被吸着物質のアミノ基が吸着される際、免疫測定用組成物のｐＨ、すなわち、水分散体のｐＨが、吸着される標的物質または媒介用物質の等電点よりも小さい程、これらのアミノ基が正に帯電し易くなるため、上記アニオン性基に物理的に吸着し易くなる。
かかる観点を考慮すれば、免疫測定用組成物のｐＨは、等電点よりも小さいことが好ましい。
また、免疫測定を行う際、免疫測定用組成物のｐＨが変化しない方が、アニオン変性微細繊維状セルロースのアニオン性基に被吸着物質のアミノ基がより安定して吸着され易くなる。
かかる観点を考慮すれば、免疫測定用組成物における水分散体は、緩衝液にアニオン変微細繊維状セルロースが分散された緩衝液分散体であることが好ましい。
これらの観点を考慮すれば、免疫測定用組成物のｐＨは、４．０〜９．０であることが好ましい。すなわち、免疫測定用組成物は、ｐＨ４．０〜９．０の緩衝液を含有すること、換言すれば、ｐＨ４．０〜９．０の緩衝液中にアニオン変性微細繊維状セルロースが分散されてなることが好ましい。このｐＨの範囲において、標的物質または媒介用物質の等電点に応じて、免疫測定用組成物のｐＨが設定されればよい。
かかる緩衝液としては、前述した緩衝液が挙げられる。緩衝液中の溶質の濃度も特に限定されるものではなく、一般的に緩衝液として用いられる種々の濃度を採用し得る。
【００５４】
本実施形態の免疫測定用組成物は、これに被吸着物質として標的物質が吸着されるものである。
本実施形態の免疫測定用組成物は、このように標的物質が吸着された状態で、該標的物質に、標識された抗原または抗体を有する標識用物質が直接的または間接的に結合されるものである。
本実施形態の免疫測定用組成物は、これに被吸着物質として媒介用物質が吸着されるものであり、該媒介用物質が吸着された状態で、該媒介用物質に標的物質が結合されるものである。
本実施形態の免疫測定用組成物は、このように媒介用物質に標的物質が結合された状態で、該標的物質に、直接的または間接的に標識用物質が結合されるものである。
【００５５】
標的物質に標識用物質が直接的に結合するとは、標的物質と標識用物質とがそのまま特異的に結合することをいう。
標的物質に標識用物質が間接的に結合するとは、標的物質に、標識用物質以外の物質であって、標的物質と標識用物質との双方に特異的に結合する物質（第２の媒介用物質）が特異的に結合し、この第２の媒介用物質に、標識用物質が特異的に結合することによって、この媒介用物質を介して標的物質と標識用物質とが結合することをいう。
【００５６】
標識用物質は、標的物質と特異的に結合し得る抗原または抗体を有するものであって、この結合によって標識機能を発揮し得るものであれば良く、特に限定されない。
標識用物質としては、例えば、被吸着物質との間で直接的または間接的に、酵素−基質、抗原−抗体、ホルモン−レセプター、糖鎖−レクチン、ビオチン−アビジンといった複合体を形成する反応（酵素反応や特異的結合反応）といった、種々の反応に関与するタンパク質を有する物質が挙げられる。
かかる標識用物質としては、上記の反応によって検出される物質（標識源）によって標識されたタンパク質が用いられ、例えば、酵素、抗体タンパク質、レセプタータンパク質、サイトカイン、レクチンおよびアビジンからなる群から選択される少なくとも１種といった標識によって標識されたタンパク質が挙げられる。より好ましくは、かかる標識機能を発揮するタンパク質によって標識された抗体及び抗原である。
【００５７】
上記検出可能な標識源としては、例えば、酵素、蛍光物質等が挙げられる。
【００５８】
標識源としての酵素は、他のタンパク質と結合すると、構造変化を生じ、その構造変化を標識とするものである。かかる標識酵素としては、西洋ワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシターゼ（β−ＧＡＬ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）、ルシフェラーゼ、エクオリン等が挙げられる。
これらのうち、価格や検出方法（発色、発光、蛍光）に対する基質の一般性の観点から、上記酵素としては、西洋ワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）が好ましい。
これらの酵素によって標識された標識用物質を検出する方法としては、化学発光酵素測定法、生物発光酵素測定法、化学発光測定法等が挙げられる。
【００５９】
化学発光酵素測定法や生物発光酵素測定法は、標識用物質に、発光基質を加え、標識用物質が標的物質や媒介用物質（第２の媒介用物質）との酵素反応が生じた際の発光基質の発光を検出するものである。
化学発光酵素測定法に用いる発光物質としては、ＡＭＰＰＤ（３−（２‘−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’ホスオリオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンナトリウム）、ＡＭＰＧＤ（３−（２‘−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−4−（３’’−β−Ｄ−ガラクトピラノシロキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン）、インドキシル誘導体、過シュウ酸エステル、ルシゲニン等が挙げられる。
生物発光酵素測定法に用いる発光物質としては、ルシフェリン誘導体等が挙げられる。
【００６０】
化学発光測定法は、標識用物質に、発光物質を加え、標識用物質が標的物質や媒介用物質（第２の媒介用物質）との化学反応が生じた際の発光物質の発光または蛍光を検出するものである。
化学発光測定法に用いられる発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルミノールなどが挙げられる。
化学発光測定法に用いられる蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴｅｘａｓＲｅｄ、フィコエリスリン、赤色タンパク質、量子ドット、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等が挙げられる。
【００６１】
標識源としての蛍光物質としては、蛍光色素、蛍光タンパク質が挙げられる。
蛍光色素は特に限定されないが、例えば、標的物質のアミノ基に対する修飾のし易さの観点から、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）が好ましい。
蛍光タンパク質も特に限定されず、蛍光を発する能力を有するタンパク質であれば、いかなるものであってもよく、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やその誘導体が好ましい。
【００６２】
標識用物質は、標的物質と直接的または間接的に結合する。標的物質が抗原である場合、標識用物質は、標識された抗体であり、該標識された抗体が、標的物質の抗原決定基（エピトープ）と結合する。標的物質が抗体である場合、標識用物質は、標識された抗原であり、該標識された抗原が、標的物質の抗原結合部位（パラトープ）と結合する。
ここで、直接的とは、標識用物質が標識された抗原または抗体である場合、標識用物質が、標的物質が抗原である場合の抗原決定基または抗体である場合の抗原結合部位に結合することを意味する。
間接的とは、標識用物質が、標的物質が抗原または抗体である場合、これにさらに結合した別の抗原または抗体（第２の媒介用物質）を介して標的物質と結合することを意味する。
【００６３】
標識用物質は、酵素、蛍光色素、蛍光タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種により修飾されることによって標識された抗原または抗体を有することが好ましい。
標識用物質がこれらから選択される少なくとも１種により修飾された抗原または抗体を有することによって、免疫測定の際、標的物質が定性、定量され易くなるため、本実施形態の免疫測定用組成物が、より有用なものとなる。
【００６４】
このような本実施形態の免疫測定用組成物は、免疫測定の際、下記（Ａ）、（Ｃ）の反応、または、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の反応を可能にする。
（Ａ）タンパク質を有する標的物質と、該標的物質に特異的に結合する抗原または抗体を有する媒介用物質とのうちのいずれか一方である被吸着物質が、前記微細繊維状セルロースに物理的に吸着する反応
（Ｂ）前記（Ａ）の反応において前記被吸着物質が前記媒介用物質である場合、前記微細繊維状セルロースに吸着した前記媒介用物質に前記標的物質が結合する反応
（Ｃ）前記（Ａ）の反応において前記被吸着物質が前記標的物質である場合には前記微細繊維状セルロースに吸着した前記標的物質に、前記（Ａ）の反応において前記被吸着物質が前記媒介用物質である場合には前記（Ｂ）の反応において前記微細繊維状セルロースに吸着した前記媒介用物質に結合した前記標的物質に、標識された抗原または抗体を有する標識用物質が、直接的または間接的に特異的に結合する反応
【００６５】
次に、本実施形態の免疫測定用組成物が免疫測定に適用される態様について示す。具体的には、免疫測定用組成物が免疫測定用診断薬に適用される態様について示す。すなわち、本実施形態の免疫測定用診断薬について説明する。
本実施形態の免疫測定用診断薬は、本実施形態の免疫測定用組成物を備える。
【００６６】
本実施形態の免疫測定用診断薬は、測定対象試料中の標的物質の定性及び／または定量を行うためのものである。すなわち、測定対象試料中の標的物質の存在の有無、及び／または、測定対象試料中の標的物質の量を測定するためのものである。
この定性及び／または定量においては、上記（Ａ）、（Ｃ）の反応、または、上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の反応を伴う。
【００６７】
本実施形態の免疫測定用診断薬は、公知の免疫測定用に用いられ、特に限定されない。免疫測定の方式としては、直接方式、間接方式、直接競合方式、間接競合方式、サンドイッチ方式等が挙げられる。直接方式では、一般に、担体に標的物質を固定させ、担体に固定させた標的物質に、標識用物質を結合させる。間接方式では、一般に、担体に標的物質を固定させ、担体に固定させた標的物質に、媒介用物質（第２の媒介用物質）を結合させ、さらに、該媒介用物質に標識用物質を結合させる。
本実施形態の免疫測定用診断薬は、このうち、直接競合方式、間接競合方式、または、サンドイッチ方式による免疫測定用であることが好ましい。
本実施形態の免疫測定用診断薬は、これらの免疫測定用であることによって。より確実に標的物質の定性、定量が可能となる。
【００６８】
直接競合方式では、一般に、以下のようにして標的物質の定性及び／または定量が行われる。すなわち、図４に示すように、標的物質と特異的に結合するタンパク質を有する媒介用物質を被吸着物質として担体に固定させる。担体に固定させた媒介用物質に、標的物質（測定対象）が含まれる測定対象試料を添加すると共に、標識された標的物質を標識用物質として添加する。これによって、担体に固定された媒介用物質に、測定対象に含まれる標的物質と、標識用物質としての標的物質とを競合的に結合させる。これらの固定、反応においては、各終了後、未反応の物質を洗浄、除去する工程を適宜行ってもよい。そして、担体に固定された媒介用物質に結合した標識用物質（標識された標的物質）の標識機能に基づいて、測定対象である標的物質を定性及び／または定量する。この場合、測定対象試料に含まれる標的物質の量が増加すると、その分、担体に固定された媒介用物質と結合する標識用物質（標識された標的物質）の量が減る。すなわち、担体に固定された媒介用物質と結合することによって発揮される標識用物質（標識された標的物質）が標識する量が減少する、という関係が示される。
標的物質が抗原である場合には、標的物質と特異的に結合（抗原抗体反応）する抗体を媒介用物質として用い、標識された抗原（すなわち、標的物質）を、標識用物質として用い得る。
標的物質が抗体である場合には、標的物質と特異的に結合（抗原抗体反応）する抗原を媒介用物質として用い、標識された抗体（すなわち、標的物質）を、標識用物質として用い得る。
【００６９】
本実施形態の免疫測定組成物を直接競合方式に適用させる場合には、例えば、水分散体中のアニオン変性微細繊維状セルロース（担体に相当）に媒介用物質を物理的に吸着させ、吸着させた媒介用物質に、測定対象試料に含まれる標的物質と、標識用物質（標識された標的物質）とを競合的に結合させる。
【００７０】
間接競合方式では、一般に、以下のようにして標的物質の定性及び／または定量が行われる。すなわち、図５に示すように、標的物質を被吸着物質として担体に固定させる。担体に固定させた標的物質に、標的物質（測定対象）が含まれる測定対象試料を添加すると共に、標的物質と特異的に結合するタンパク質を有し、標識された標識用物質を添加する。これによって、担体に固定された標的物質と、測定対象に含まれる標的物質とに、標識用物質を競合的に結合させる。これらの固定、反応においては、各終了後、未反応の物質を洗浄、除去する工程を適宜行ってもよい。そして、担体に固定された標的物質に結合した標識用物質の標識機能に基づいて、標的物質を定性及び／または定量する。この場合、測定対象試料に含まれる標的物質の量が増加すると、該標的物質と結合する標識用物質が増加する一方、担体に固定された標的物質と結合する標識用物質の量が減る。すなわち、担体に固定された標的物質と結合することによって発揮される標識用物質の標識する量が減少する、という関係が示される。
標的物質が抗原である場合には、標的物質と特異的に結合（抗原抗体反応）する抗体を媒介用物質として用い、媒介用物質と特異的に結合（抗体反応）する、標識された抗体を、標識用物質として用い得る。
標的物質が抗体である場合には、標的物質と特異的に結合（抗原抗体反応）する抗原を媒介用物質として用い、媒介用物質と特異的に結合（抗原抗体反応）する、標識された抗体を、標識用物質として用い得る。
【００７１】
本実施形態の免疫測定組成物を間接競合方式に適用させる場合には、例えば、水分散体中のアニオン変性微細繊維状セルロース（担体に相当）に標的物質を物理的に吸着させ、アニオン変性微細繊維状セルロースに吸着させた標的物質と、測定対象試料に含まれる標的物質とに、標識用物質を競合的に結合させる。
また、例えば、水分散体中のアニオン変性微細繊維状セルロース（担体に相当）に媒介用物質を物理的に吸着させ、吸着させた媒介用物質に標的物質を結合させることによって、アニオン変性微細繊維状セルロースに標的物質を間接的に固定する。アニオン変性微細繊維状セルロースに間接的に固定させた標的物質に、測定対象試料に含まれる標的物質と、標識用物質とを競合的に結合させる。
【００７２】
サンドイッチ方式では、一般に、以下のようにして標的物質の定性及び／または定量が行われる。すなわち、図６に示すように、標的物質と特異的に結合するタンパク質を有する媒介用物質を被吸着物質として担体に固定させる。担体に固定させた媒介用物質に、標的物質が含まれる測定対象試料を添加し、該測定対象試料に含まれる標的物質を結合させる。その後、さらに、標識用物質を添加し、媒介用物質に結合させた標的物質に標識用物質を結合させる。これらの固定、反応においては、各終了後、未反応の物質を洗浄、除去する工程を適宜行ってもよい。そして、標的物質に結合した標識用物質の標識機能に基づいて、標的物質を定性及び／または定量する。この場合、標的物質の量が増加すると、標識用物質が示す標識量も増加する関係を示す。
標的物質が抗原である場合には、標的物質と特異的に結合（抗原抗体反応）する抗体を媒介用物質として用い、媒介用物質と特異的に結合（抗体反応）する、標識された抗体を、標識用物質として用い得る。
標的物質が抗体である場合には、標的物質と特異的に結合（抗原抗体反応）する抗原を媒介用物質として用い、媒介用物質と特異的に結合（抗原抗体反応）する、標識された抗体を、標識用物質として用い得る。
【００７３】
本実施形態の免疫測定組成物をサンドイッチ方式に適用させる場合には、例えば、水分散体中のアニオン変性微細繊維状セルロース（担体に相当）に媒介用物質を物理的に吸着させ、アニオン変性微細繊維状セルロースに吸着させた媒介用物質に標的物質を結合させ、媒介用物質に結合させた標的物質に、さらに標識用物質を結合させる。
前記標的物質と結合する第２の抗原または抗体は、前述の通り、検出可能な標識された抗原または抗体を用いることが好ましい。
【００７４】
本実施形態の免疫測定用組成物及び免疫測定用診断薬は、上記したアニオン変性微細繊維状セルロースと水とを混合して水分散体とすることによって製造される。この水分散体には、前述した他の添加剤が添加されてもよい。また、緩衝液を調製するための添加剤が水に添加されて、水分散体が、アニオン変性微細繊維状セルロースが緩衝液に分散されてもよい。
【００７５】
また、本実施形態の免疫測定用組成物及び免疫測定用診断薬は、上記水分散体中のアニオン変性微細繊維状セルロースに、上記（Ａ）、（Ｃ）の反応、または、上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の反応をさせることによって、アニオン変性微細繊維状セルロースに直接的または媒介用物質を介して標的物質が固定され、さらに、該標的物質に標識用物質が固定されたものとして製造し得る。
また、本実施形態の免疫測定用組成物及び免疫測定用診断薬は、上記水分散体中のアニオン変性微細繊維状セルロースに、上記（Ａ）、（Ｂ）の反応をさせることによって、アニオン変性微細繊維状セルロースに直接的または媒介用物質を介して標的物質が固定されたものとして製造し得る。
また、本実施形態の免疫測定用組成物及び免疫測定用診断薬は、上記（Ａ）の反応をさせることによって、アニオン変性微細繊維状セルロースに直接的に標的物質が固定されたものとして製造し得る。
また、本実施形態の免疫測定用組成物及び免疫測定用診断薬は、上記（Ａ）の反応をさせることによって、アニオン変性微細繊維状セルロースに媒介用物質を固定されたものとして製造し得る。
【００７６】
本実施形態の免疫測定用組成物および免疫測定用診断薬は、例えば、免疫測定用デバイスなどの、検査および診断デバイスやキットなどに用いることができる。
【００７７】
次に、本実施形態の免疫測定用デバイスについて説明する。
本実施形態の免疫測定用デバイスは、固体支持体と、本実施形態の免疫測定用組成物とを備え、前記固体支持体に前記免疫測定用組成物が物理的に吸着してなる。
【００７８】
本実施形態の免疫測定用デバイスは、抗原−抗体や酵素−基質といった反応や認識機構を利用して、測定対象試料中の様々な標的物質を検出、計測するセンシングデバイスである。このセンシングデバイスの構成要素として、本実施形態の免疫測定用組成物を用いる。
【００７９】
前記固体支持体としては、ウェル、プレート、チューブ、または、チップであることが好ましい。
固定用支持体がこれらであることによって、免疫測定の際、免疫測定し易くなる。
固体支持体は、マイクロ流路またはキャピラリーを有していてもよい。
固定用支持体としては、より具体的には、例えば、マイクロウェルプレート等が挙げられる。
【００８０】
本実施形態の免疫測定用デバイスとしては、例えば、固体支持体の表面に、本実施形態の免疫測定用組成物を付着させることによって作製される。本実施形態の免疫測定用組成物は、固定支持体に付着し得る程度の粘性を有している。よって、この粘性によって、本実施形態の免疫測定用組成物は、固定支持体に付着し得る。本実施形態の免疫測定用デバイスにおいては、固定支持体と免疫測定用組成物とが、被吸着用物質が吸着される担体として機能する。
固定支持体に吸着され易いという点においても、前述したように、免疫測定用組成物において、例えば、１００質量部の水分散体に対するアニオン変性微細繊維状セルロースの含有量が、０．００１〜１０質量部であることが好ましく、０．００１〜５質量部であることがより好ましく、０．００１〜２質量部であることがより好ましい。
【００８１】
このように、固定支持体に吸着された本実施形態の免疫測定用組成物のアニオン変性微細繊維状セルロースに、被吸着物質が物理的に吸着する反応（Ａ）、及び、被吸着物質が媒介用物質である場合に、該媒介用物質にさらに標的物質が結合する反応（Ｂ）、及び、（Ａ）、（Ｂ）の反応においてアニオン変性微細繊維状セルロースに直接的または間接的に吸着された標的物質に標識用物質を直接的または間接的に結合する反応（Ｃ）が生じること可能とする、免疫測定用デバイスが作製される。
【００８２】
このように、本実施形態の免疫測定用デバイスに備えられた本実施形態の免疫測定用組成物に対して上記の反応が行われ、かかる反応の反応生成物として本実施形態の免疫測定用組成物及び免疫測定用診断薬が製造されてもよい。
【００８３】
上記の通り、本実施形態の免疫測定用デバイスは、固体支持体と、本実施形態の免疫測定用組成物とを備え、前記固体支持体に前記免疫測定用組成物が物理的に付着されてなることによって、固体支持体に吸着された免疫測定用組成物に、さらに被吸着物質が吸着されたとき、かかる被吸着物質の構造安定性の低下を抑制し得る。
【００８４】
本実施形態の免疫測定用組成物、免疫測定用診断薬及び免疫測定用デバイスは、上記の通りであるが、本発明の免疫測定用組成物、免疫測定用診断薬及び免疫測定用デバイスに特に限定されるものではなく、適宜設計変更可能である。
【実施例】
【００８５】
以下、実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００８６】
（使用試薬）
・アニオン変性微細繊維状セルロースの水分散体：
セルロースＩ型結晶構造を有する、ＴＥＭＰＯ酸化セルロースナノファイバー（ＴＯＣＮ）の１．１質量％水分散体（第一工業製薬株式会社製の「レオクリスタＩ−２ＳＸ」）
数平均繊維径＝４ｎｍ、数平均アスペクト比＝２８０、アニオン性基量＝１．９ｍｍｏｌ／ｇ
【００８７】
・シリカ微粒子：（Ｎｙａｃｏｌ  Ｎａｎｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製のＮｅｘＳｉｌ  ５）、１５質量％のコロイダルシリカ、表面電荷＝負
平均粒径＝５ｎｍ
【００８８】
・フルオレセインイソチオイソシアネート（ＦＩＴＣ）：株式会社同仁化学研究所製のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−４−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ−Ｉ）
・リゾチーム（Ｌｙｚ、卵白由来）：分子量＝１４，３００Ｄａ、和光純薬工業株式会社製のリゾチーム、卵白由来（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ｆｒｏｍ  Ｅｇｇ  Ｗｈｉｔｅ）
等電点＝１１
・ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製のアルブミン、ウシ血清由来（Ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）
等電点＝４．７
・西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ（ＨＲＰ）：和光純薬工業株式会社製のペルオキシダーゼ、西洋わさび由来（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ｆｒｏｍ  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）
等電点７．２
・リン酸：ナカライテスク株式会社製
・ホウ酸：和光純薬工業株式会社製
・酢酸：和光純薬工業株式会社製
・水酸化ナトリウム：（和光純薬工業株式会社製）
・リン酸水素二ナトリウム：（和光純薬工業株式会社製）
・リン酸二水素カリウム：（和光純薬工業株式会社製）
【００８９】
・抗リゾチームポリクローナル抗体：Ｂｉｏｓｓ製のＡｎｔｉ−ＬＹＳＯＺＹＭＥ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ
・抗ウサギＩｇＧ抗体（全分子）抗体−ＦＩＴＣ標識ヤギ宿主抗体：ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製のＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）−ＦＩＴＣ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｇｏａｔ
【００９０】
上記試薬は、特に精製せずに使用した。
【００９１】
（使用機器）
・微量高速冷却遠心機ＭＸ−３０７（株式会社トミー精工）
【００９２】
（実験例１）ＴＯＣＮ（実施例）、未変性微細繊維状セルロース（比較例）へのタンパク質（標的物質または媒介用物質に相当）の吸着評価
【００９３】
（１）０．１８質量％ＴＯＣＮ水分散体の調製
容器に、２質量％ＴＯＣＮ水分散体を５ｇと水５０ｍＬを加えて密栓し、卓上型超音波洗浄機（Ｗ−１１３、本多電子株式会社製）を用いて２８Ｈｚの超音波処理を２時間行うことによって混合し、０．１８質量％のＴＯＣＮ水分散体を調製した。
【００９４】
（２）ＦＩＴＣで標識されたタンパク質（ＦＩＴＣ標識タンパク質）の調製
・ＦＩＴＣによるリゾチーム（Ｌｙｚ、卵白由来）の標識
＜１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）の調製＞
１００ｍＭのＨ３ＢＯ３水溶液を１００ｍＬ、１００ｍＭのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ水溶液を３００ｍＬ調製し、ｐＨ計を用いて、ｐＨが９．２になるまで、Ｈ３ＢＯ３水溶液にＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ水溶液を添加することによって、１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）を調製した。得られたホウ酸緩衝液を、４℃で保存した。
＜ＦＩＴＣ−リゾチーム（Ｌｙｚ、卵白由来）溶液の調製＞
得られたホウ酸緩衝液５０ｍＬに、リゾチーム（Ｌｙｚ、卵白由来）を１００ｍｇ、ＦＩＴＣを１ｍｇ加え、５０ｍＬのスクリュー管瓶内で、０℃で１２時間撹拌することによって、ＦＩＴＣ−リゾチーム（Ｌｙｚ、卵白由来）溶液を調製した。
＜透析＞
ＦＩＴＣ−リゾチーム（Ｌｙｚ、卵白由来）溶液をディスポーザブル透析カセットに入れ、１Ｌのイオン交換水中にて０℃で冷却しながら撹拌した。イオン交換水は２時間おきに３回交換し、一晩透析した。
＜凍結乾燥＞
得られたＦＩＴＣ−リゾチーム（Ｌｙｚ、卵白由来）溶液をディスポーザブル透析カセットから回収し、２つに分けてそれぞれ５０ｍＬのナスフラスコに入れ、−７８℃で５時間冷凍した後、遮光して凍結乾燥を行った。その後、得られた粉末状のＦＩＴＣ−リゾチーム（Ｌｙｚ、卵白由来）を回収することによって、ＦＩＴＣ標識タンパク質を調製した。
【００９５】
・ＦＩＴＣによるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の標識
＜２０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液の調製＞
５００ｍＭの炭酸緩衝液４０ｍＬに、ウシ血清アルブミン８００ｍｇを加え、溶解させることによって、２０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を調製した。得られた溶液を４℃で保存した。
＜２ｍｇ／ｍＬＦＩＴＣ溶液の調製＞
５００ｍＭの炭酸緩衝液１２ｍＬに、ＦＩＴＣを２４ｍｇ加え、溶解させることによって、２ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ溶液を調製した。得られた溶液を４℃で保存した。
＜ＦＩＴＣ標識ウシ血清アルブミンの調製＞
５０ｍＬスクリュー管瓶に、２０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液と２ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ溶液とを加え、０℃で１２時間撹拌することによって、ＦＩＴＣ−ウシ血清アルブミン溶液を得た。
＜透析＞
ＦＩＴＣ−ウシ血清アルブミン溶液をディスポーザブル透析カセットに入れ、１Ｌのリン酸緩衝液中にて０℃で冷却しながら撹拌した。リン酸緩衝液は２時間おきに３回交換し、一晩透析した。その後、さらにイオン交換水を用いて透析を行った。具体的には、１Ｌのイオン交換水中にて０℃で冷却しながら撹拌した。イオン交換水は２時間おきに３回交換し、１日透析した。
＜凍結乾燥＞
ＦＩＴＣ−ウシ血清アルブミン溶液をディスポーザブル透析カセットから回収し、２つに分けてそれぞれ５０ｍＬのナスフラスコに入れ、１２時間冷凍保存した。翌日、遮光した状態で１２時間凍結乾燥を行い、粉末状のＦＩＴＣ−ウシ血清アルブミンを回収することによって、ＦＩＴＣ標識タンパク質を調製した。
【００９６】
・ＦＩＴＣの西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ（ＨＲＰ）への標識
＜５００ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）の調製＞
５００ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液を６０ｍＬ、５００ｍＭの炭酸水素ナトリウム水溶液を５００ｍＬ調製した。ｐＨ計を用いて、ｐＨ９．５になるまで、上記炭酸ナトリウム水溶液に上記炭酸水素ナトリウム水溶液を添加することによって、５００ｍＭの炭酸緩衝液を調製した。得られた緩衝液を４℃で保存した。
＜ＦＩＴＣ−西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ（ＨＲＰ）溶液の調製＞
５００ｍＭの炭酸緩衝液５０ｍＬに、西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ（ＨＲＰ）を８０ｍｇ、ＦＩＴＣを１．７ｍｇ加え、５０ｍＬのスクリュー管瓶内で、０℃で１２時間撹拌することによって、ＦＩＴＣ−西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ（ＨＲＰ）溶液を調製した。
＜透析＞
ＦＩＴＣ−西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ（ＨＲＰ）溶液をディスポーザブル透析カセットに入れ、１Ｌのイオン交換水にて０℃で冷却しながら撹拌した。イオン交換水は２時間おきに３回交換し、一晩透析した。
＜凍結乾燥＞
前述したＦＩＴＣ−リゾチームと同様の方法で、凍結乾燥を行った。すなわち、得られたＦＩＴＣ−西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ（ＨＲＰ）溶液をディスポーザブル透析カセットから回収し、２つに分けてそれぞれ５０ｍＬのナスフラスコに入れ、−７８℃で５時間冷凍した後、遮光して凍結乾燥を行った。その後、得られた粉末状のＦＩＴＣ−西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ（ＨＲＰ）を回収することによって、ＦＩＴＣ標識タンパク質を調製した。
【００９７】
（３）４０ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液の調製
４０ｍＭのリン酸水溶液、４０ｍＭのホウ酸水溶液、４０ｍＭの酢酸水溶液、２００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を下記に示すように調製し、これらを混合することによって、４０ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液を調製した。
リン酸を０．１４ｍＬ計量し、５０ｍＬメスフラスコを用いてイオン交換水によってメスアップすることによって、４０ｍＭのリン酸水溶液を調製した。
ホウ酸を０．１２３ｇ計量し、５０ｍＬメスフラスコを用いてイオン交換水によってメスアップすることによって、４０ｍＭのホウ酸水溶液を調製した。
酢酸を０．１２ｍＬ計量し、５０ｍＬメスフラスコを用いてイオン交換水によってメスアップすることによって、４０ｍＭの酢酸水溶液を調製した。
水酸化ナトリウムを０．４ｇ計量し、５０ｍＬメスフラスコを用いて超純粋によってメスアップすることによって、２００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を調製した。
４０ｍＭのリン酸水溶液を５０ｍＬと、４０ｍＭのホウ酸水溶液を５０ｍＬと、４０ｍＭの酢酸水溶液を５０ｍＬとを混合して混合液を得た後、得られた混合液に、２００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を少量ずつ滴下し、ｐＨを３、４、５、７．４に調整することによって、各ｐＨに調整されたＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液を得た。
【００９８】
（４）５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の調製
５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム・二水和物水溶液を２００ｍＬ、５０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム水溶液を６００ｍＬ調製し、ｐＨ計を用いて、ｐＨが７．４になるまで、リン酸二水素ナトリウム・二水和物水溶液に、リン酸水素二ナトリウム水溶液を添加することによって、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。得られた緩衝液を４℃で保存した。
【００９９】
（５）タンパク質の吸着評価
＜ＦＩＴＣ−リゾチーム（Ｌｙｚ、卵白由来）、ＦＩＴＣ−ウシ血清アルブミンのＴＯＣＢへの吸着＞
０．１８質量％のＴＯＣＮ溶液３００μＬと、各ＦＩＴＣ標識タンパク質を溶解した０．１ｍｇ／ｍＬのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液１ｍＬとを、１．５ｍＬのマイクロチューブに入れ、混合した後、室温で１２時間静置することによって、溶液中でＴＯＣＮにＦＩＴＣ標識タンパク質を吸着させた。
＜蛍光測定による、ＴＯＣＮに吸着したＦＩＴＣ標識タンパク質の吸着量の測定＞
得られた溶液の蛍光値を蛍光光度計（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）で測定した。測定後、９０００ｇ、２０分間、遠心分離を行い、上澄み液を他のマイクロチューブに移した。上澄み液を、さらに、９０００ｇ、６０分間、遠心分離を行い、上澄み液の蛍光値を上記蛍光光度計で測定した。そして、下記計算式により、遠心前後の蛍光値から、ＴＯＣＮに吸着したＦＩＴＣ標識タンパク質の吸着率を算出した。
吸着率（％）＝（Ｃａ-Ｃｂ）／Ｃａ×１００
Ｃａ：遠心分離前の上澄み液の蛍光値
Ｃｂ：遠心分離後の上澄み液の蛍光値
結果を表１に示す。
【０１００】
【表１】
2019211347.tif 000003
【０１０１】
表１に示すように、ＴＯＣＮに対しては、いずれのｐＨの緩衝液においても、Ｌｙｚは７５％以上の吸着率を示した。ＴＯＣＮに対しては、等電点が中性付近であるＨＲＰや酸性側のＢＳＡであっても、緩衝液のｐＨが５以下であると、ｐＨが７．４の場合よりも、高い吸着率を示した。
この結果、セルロース分子中のグルコースユニットにアニオン性基が導入されたＴＯＣＮは、アニオン性であり、負の電荷を有するため、タンパク質のアミノ基との静電的相互作用により、物理的な結合を形成し、これによってＴＯＣＮにタンパク質が吸着することが示された。
このように、標的物質または媒介用物質体を、アニオン変性微細繊維状セルロースの表面に物理的に吸着させることが可能となることが示された。
【０１０２】
（実験例２）ＴＯＣＮ（実施例）及びシリカ微粒子（比較例）に吸着したタンパク質（標的物質または媒介用物質に相当）における構造安定性（α−ヘリックス構造の比率）評価
【０１０３】
（１）ＣＤスペクトル測定用試料の調製
１．５ｍＬのマイクロチューブに、実験例１にて調製した０．１８質量％ＴＯＣＮ水分散体を３００μＬ加え、続いて、０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液を１ｍＬ加え、室温で振とうした後、室温で一晩静置したものを、ＴＯＣＮに吸着した後のタンパク質のＣＤスペクトル測定用試料として用いた。また、濃度を０．００７質量％とすること以外は実験例１と同様にしてＴＯＣＮ水分散体を調製し、上記と同様にして、ＴＯＣＮに吸着した後のタンパク質のＣＤスペクトル測定用試料を調製した。
タンパク質溶液には、溶質であるタンパク質として、リゾチーム（卵白由来）、ウシ血清アルブミン、ワサビ由来ペルオキシターゼを用い、溶媒として、ｐＨ４、またはｐＨ５の４０ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液を用いた。
一方、０．１８質量％ＴＯＣＮ水分散体に代えて、０．１８質量％となるようにシリカ微粒子を水に分散させた水分散体（０．１８質量％シリカ微粒子水分散体）を用いること以外は、０．１８質量％ＴＯＣＮ水分散体を用いた場合と同様にして、シリカ微粒子に吸着後のタンパク質のＣＤスペクトル測定用試料を調製した。
また、ＴＯＣＮにもシリカ微粒子にも吸着させないタンパク質溶液をそのまま、ＴＯＣＮ及びシリカ微粒子に吸着する前の未吸着のタンパク質のＣＤスペクトル測定用試料として用いた。
【０１０４】
（２）ＣＤスペクトルの測定
ＴＯＣＮ、シリカ微粒子のそれぞれのタンパク質の吸着前後のＣＤ測定用試料について、α−ヘリックス（２次構造）の比率を測定した。
具体的には、円二色性分散計Ｊ−７６５（日本分光株式会社製）を用い、各ＣＤスペクトル測定用試料について、α−ヘリックス構造が負の極大ピークを示す波長２２２ｎｍにおける楕円率を測定し、α−ヘリックス構造の比率（含有率）を、下記計算式（ｉ）、（ｉｉ）によって算出した。結果を表２に示す。
【０１０５】
・計算式（ｉ）
［θ］２２２＝（θｏｂｓ／ｌ／Ｃ／ｎ×１００]
θｏｂｓ：楕円率の測定値（ｄｅｇ）、
ｌ：光路長（ｃｍ）、
Ｃ：タンパク質のモル濃度（ｍｏｌ／ｄｍ３）、
ｎ：タンパク質のアミノ酸残基数、
［θ］２２２：２２２ｎｍにおける平均残基モル楕円率（ｄｅｇ・ｃｍ２／ｄｍｏｌ）
【０１０６】
・計算式（ｉｉ）
ｆＨ［％］＝−｛（［θ］２２２＋２３４０）／３０３００｝×１００
ｆＨ：α−ヘリックス構造の含有率
【０１０７】
【表２】
2019211347.tif 000004
【０１０８】
表２に示すように、ＴＯＣＮに吸着したタンパク質のα−ヘリックス構造の比率は、未吸着のタンパク質の場合に比べ、半分以上の値を示した。
一方、シリカ微粒子に吸着したタンパク質は、α−ヘリックス構造の比率が、未吸着のタンパク質の場合に比べ、半分未満の値にまで低下した。
よって、ＴＯＣＮに吸着する場合の方が、シリカ微粒子に吸着する場合よりも、吸着後のタンパク質の２次構造の変化が少ないことが示された。
よって、免疫測定に用いられた際、ＴＯＣＮに吸着した標的物質または媒介用物質の方が、シリカ微粒子に吸着した標的物質または媒介用物質よりも、α−ヘリックス構造の比率の減少が小さく、２次構造の変化が抑制されることが示された。すなわち、ＴＯＣＮに吸着した後においても、標的物質または媒介用物質は、これらの構造を安定に保持できることが示され、吸着後においてもこれらの活性や特性が損なわれることなく保持、維持され得ることが示された。
【０１０９】
（実験例４）免疫測定試験
標的物質として、抗原としてのリゾチーム（卵白由来）を用い、１次抗体として、抗リゾチームポリクローナル抗体を用い、標識用物質として、２次抗体としての抗ウサギＩｇＧ抗体（全分子）抗体−ＦＩＴＣ標識ヤギ宿主抗体を用いた。
【０１１０】
＜１０ｍＭのリン酸緩衝液の調製＞
１０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム・二水和物水溶液、及び、１０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム水溶液を調製した。ｐＨ計を用いて、ｐＨ７．４になるまで、１０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム・二水和物水溶液に１０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム水溶液を添加することによって、１０ｍＭのリン酸緩衝液を調製した。水溶液は４℃で保存した。
（１）１次抗体溶液の調製
１μｇ／１μＬの１次抗体溶液（溶媒：１０ｍＭのリン酸緩衝液）１０μＬに１０ｍＭのリン酸緩衝液を９９９０μＬ加え、１０００倍希釈して１μｇ／１ｍＬの１次抗体溶液を調製した。
【０１１１】
（２）２次抗体溶液の調製
１μｇ／１μＬの２次抗体溶液（溶媒：１０ｍＭのリン酸緩衝液）１０μＬに１０ｍＭのリン酸緩衝液を４９９０μＬ加え、５００倍希釈して２μｇ／１ｍＬの２次抗体溶液を調製した。
【０１１２】
（３）抗原（標的物質）溶液の調製
リゾチーム（卵白由来）を１．０ｍｇ測り、１０ｍＭのリン酸緩衝液を１０ｍＬ加えて、１．０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（卵白由来）溶液を１０ｍＬ調製した。調製した１．０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（卵白由来）溶液を５００μＬとり、１０ｍＭのリン酸緩衝液を２４９．５ｍＬ加え、２μｇ／ｍＬのリゾチーム（卵白由来）溶液を調製した。
【０１１３】
（４）ＴＯＣＮへの抗原（標的物質）の吸着、及び、吸着した抗原に対する１次抗体及び２次抗体の結合
【０１１４】
（ａ）マイクロチューブに、０．１８質量％ＴＯＣＮ水分散体１０μＬと、２μｇ／ｍＬのリゾチーム（卵白由来）溶液２５０μＬとを加えて１晩静置し、抗原であるリゾチーム（卵白由来）をＴＯＣＮに吸着させた。
（ｂ）（ａ）で得られた液を遠心分離（６０００ｇ、１時間）し、上澄み液を除去することによって、ＴＯＣＮに吸着してないリゾチーム（卵白由来）を除去した。
（ｃ）（ｂ）で得られた沈殿物に、１次抗体溶液を１ｍＬ加え、上記卓上型超音波洗浄機を用いて２８Ｈｚの超音波処理を１時間行った後、１晩静置した。
（ｄ）（ｃ）で得られた液に対して、１０ｍＭのリン酸緩衝液を１ｍＬ加え、上記と同様に２８Ｈｚの超音波処理を１時間行った後、遠心分離（６０００ｇ、１時間）し、上澄み液を除去した。沈殿物に対して、さらに、上記と同様、１０ｍＭのリン酸緩衝液を１ｍＬ加え、２８Ｈｚの超音波処理を１時間行った後、遠心分離（６０００ｇ、１時間）し、上澄み液を除去することを２回繰り返した。このようにして、リン酸緩衝液による洗浄を３回行うことによって、未反応の１次抗体を除去した。
（ｅ）（ｄ）で得られた洗浄後の沈殿後に、２次抗体溶液を１ｍＬ加えた。これによって、沈殿物に含有されているＴＯＣＮを該溶液中に分散させた。
（ｆ）（ｄ）と同様に、リン酸緩衝液を用いて洗浄を３回行い、未反応の２次抗体を除去した。これによって、ＴＯＣＮに抗原（標的物質）が吸着され、吸着された抗原に１次抗体が結合され、抗原に結合した１次抗体にさらに２次抗体が結合された複合体が得られた。
【０１１５】
（５）ＴＯＣＮへの１次抗体の吸着、及び、吸着した１次抗体に対する２次抗体の結合（抗原を用いない）
上記（４）「ＴＯＣＮへの抗原（標的物質）の吸着、及び、吸着した抗原に対する１次抗体及び２次抗体の結合」において、（ａ）にてリゾチームを添加しないこと以外は、これと同様にして、（ａ）〜（ｆ）の操作を行った。これによって、ＴＯＣＮに１次抗体が吸着され、吸着された１次抗体にさらに２次抗体が結合された複合体が得られた。
【０１１６】
（６）蛍光測定による化学発光免疫測定
得られた各複合体について、ＶｅｒｓａＦｌｕｏｒ蛍光光度計（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用い、蛍光値を測定した。結果を表３に示す。なお、表３の蛍光値は、３回（ｎ＝３）測定した値の平均値である。
【０１１７】
【表３】
2019211347.tif 000005
【０１１８】
（７）蛍光測定による化学発光免疫測定
表３に示すように、微細繊維状セルロースにリゾチーム（卵白由来）を吸着させた試料の蛍光値と吸着をさせていない蛍光値との比較により、微細繊維状セルロースに標的物質の抗原が吸着し、さらに１次抗体と２次抗体が結合することにより、標的物質を定性的に検出できることが明示された。また、これらの蛍光値と抗原のリゾチーム（卵白由来）の検量線との比較から、抗原の吸着量を定量できることが示された。
【図１】
2019211347.tif 000006
【図２】
2019211347.tif 000007
【図３】
2019211347.tif 000008
【図４】
2019211347.tif 000009
【図５】
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【図６】
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