(57)【要約】      （修正有）【課題】３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）生産能力の向上した３ＨＢ生産菌、及び３ＨＢの製造方法における３ＨＢ生産性を向上する方法の提供。【解決手段】親株であるＫＭ−１株の変異処理で分離した、ＫＭ−１株よりも３ＨＢ利用能が低下し、３−ＨＢ生産能を有するハロモナス・エスピー３ＨＢｗｕ＿４Ａ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６７１）。ハロモナス・エスピー３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源とを含む培地で好気培養し、その培養条件を微好気培養に変更し、微好気発酵工程で得られる培養液から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ヒドロキシ酪酸生産能を有するハロモナス・エスピー３ＨＢｗｕ＿４Ａ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６７１）。
【請求項２】
ハロモナス・エスピー３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源とを含む培地で好気培養する好気発酵工程、
好気発酵工程の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記ハロモナス・エスピー３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を培養し、培養液にて３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生する微好気発酵工程、
微好気発酵工程で得られる培養液から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する回収工程、
を順に行う３−ヒドロキシ酪酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシ酪酸生産性の新規微生物に関し、３−ヒドロキシ酪酸の製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
３ヒドロキシ酪酸やその塩（以下３ＨＢと称する、また、３ＨＢと称する場合、特にその単量体を指すものとする）は、もともと人の体内に存在する物質であるため生体親和性が高く、糖質に代わる画期的なエネルギー源として期待されている。また、３ＨＢは単なるエネルギー源という役割だけでなく、様々な遺伝子の発現やタンパク質の活性に影響するシグナル伝達物質としての作用があることがわかってきた。３ＨＢは、例えば、遺伝子発現調節作用によって、ヒストン脱アセチル化酵素を阻害することによって認知機能や、長期持続記憶を改善することが知られ、アルツハイマーの予防に有効性が確認されている。例えば、ココナツオイルに多く含まれる中鎖脂肪酸の摂取および体内での代謝により生成される３ＨＢが、脳や体内において糖質をうまく利用できないアルツハイマー病、糖尿病の患者の症状を改善させる効果を持つことが知られている。また、３ＨＢは体内において糖質よりも速やかにエネルギーに変換されること、細胞への脂肪や糖の吸収を抑制する効果を有することから、アスリート向けのエネルギー物質、ダイエット・健康食品分野への応用が期待できる。
【０００３】
また、これらの用途のほか、３ＨＢは生分解性樹脂の原料として用いられることが知られており、工業的用途においても利用価値が高まりつつある物質である。
【０００４】
このような３ＨＢは、各種微生物にポリ３ヒドロキシ酪酸（以下ＰＨＢと称する）を生産させたのち、得られたＰＨＢを酵素等により分解することにより得ることができる（特許文献１）。また、このような微生物としてハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＭ−１株が、好気条件でＰＨＢを蓄積し、微好気条件に移行することでＰＨＢを分解して生成した３ＨＢを培養液中に分泌産生することが見出されている（特許文献２）。尚、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株は、平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１６として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９５である。当該ハロモナス・エスピーＫＭ−１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ４７７０１５として登録されている（以下単にＫＭ−１株と称する）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１６８５９５号公報
【特許文献２】特開２０１３−０８１４０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記微生物は、生産したＰＨＢを一旦体内に蓄積するため、その蓄積量には限界があるため、さらに３ＨＢ生産能力の向上した３ＨＢ生産菌が求められている。
【０００７】
すなわち、本発明は、より３ＨＢ生産能力の向上した３ＨＢ生産菌を提供し、３−ヒドロキシ酪酸の製造方法における３ＨＢ生産性を向上することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するための本発明の新規微生物は、３−ヒドロキシ酪酸生産能を有するハロモナス・エスピー３ＨＢｗｕ＿４Ａ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６７１）（以下単に３ＨＢｗｕ＿４Ａ株と称する）である。
【０００９】
また、本発明の３−ヒドロキシ酪酸の製造方法の特徴構成は、
３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源とを含む培地で好気培養する好気発酵工程、
好気発酵工程の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を培養し、培養液にて３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生する微好気発酵工程、
微好気発酵工程で得られる培養液から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する回収工程、
を順に行う点にある。
【００１０】
すなわち、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の菌学的性質を調べたところ、上記ＫＭ−１株と比して３ＨＢを資化し生育する能力が低下しており、菌体内へのＰＨＢ蓄積能力が大きく向上していることが明らかになった。
【００１１】
したがって、この３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を用いて、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源とを含む培地で好気培養する好気発酵工程、好気発酵工程の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を培養し、培養液にて３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生する微好気発酵工程、微好気発酵工程で得られる培養液から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する回収工程、を順に行う３−ヒドロキシ酪酸の製造方法を行うと、ＫＭ−１株よりも多量のＰＨＢが蓄積され、さらに、高い生産量の３ＨＢとして回収されることになるから、３ＨＢ生産性を大きく向上することができた。
【発明の効果】
【００１２】
したがって、３ＨＢ生産性を大きく向上することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】３ＨＢｗｕ＿４Ａ株とＫＭ−１株の３ＨＢ培地における増殖度を示すグラフ
【図２】３ＨＢｗｕ＿４Ａ株とＫＭ−１株のスクロース培地における増殖度を示すグラフ
【図３】３ＨＢｗｕ＿４Ａ株とＫＭ−１株によるＰＨＢ生産性を示すグラフ
【図４】３ＨＢｗｕ＿４Ａ株とＫＭ−１株による３ＨＢ生産性を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明の３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を説明する。また、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を用いた３−ヒドロキシ酪酸の製造方法を説明する。尚、以下に好適な実施例を記すが、これら実施例はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。
【００１５】
〔３ＨＢｗｕ＿４Ａ株〕
本発明者らは、以下のようにして、親株であるＫＭ−１株に対して変異原性基質アナログであるＮ４−アミノシチジン処理による突然変異導入を行い、変異体ライブラリを得た。得られた変異体ライブラリを通常のグルコースを単一炭素源として含むＳＯＴ培地上に展開して得られるコロニーについて、３ＨＢを含有する培地に移植し培養した時に、顕著に増殖が弱まった菌株を単離した。以下に３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の単離方法について具体的に示す。
【００１６】
〔突然変異導入〕
基質アナログ処理は、以下の手順にて行った。
０．１  ｍＭのＮ４−アミノシチジンを含むグルコースを単一の炭素源とするＳＯＴ培地（培地１）を用いてＫＭ−１株の振盪培養を行った後、得られた培養液の１／１００体積量をＮ４−アミノシチジンを含有する同組成の新しいＳＯＴ培地に植え継ぎ、１回目と同一の条件にて振盪培養を行った。同様の継代培養操作を６回繰り返し実施した後に得られた培養液を変異体ライブラリとした。
【００１７】
〔スクリーニング〕
（１）  得られた変異体ライブラリを、単一の炭素源としてグルコースを含有するＳＯＴ培地（培地１）に展開し、グルコースの存在下で増殖することが確認されたコロニー約５０００個を得た。
【００１８】
（２）  次に上記約５０００個のコロニーを、レプリカプレーティング法により単一の炭素源として３ＨＢを含有するＳＯＴ培地（培地２）に移す操作を行った。３ＨＢ培地においてインキュベートを行った結果、十分に増殖が確認された多数のコロニー群の中から、増殖が弱まった８６個のコロニーを３ＨＢ利用能が低下した候補株として一次選抜した。
【００１９】
（３）  次に得られた８６個の候補株について、グルコースを含有するＳＯＴ培地（培地１）で別途増殖させたマスタープレートから３ＨＢを含有する新しいＳＯＴ培地（培地２）につまようじを用いて移植し、同一プレート上においてＫＭ−１株とともにインキュベートを行い増殖能の比較を行った。その結果、大部分はＫＭ−１株との明確な増殖の差が観察されず偽陽性であることが判明したが、ＫＭ−１株よりも有意に増殖が弱く３ＨＢ利用能が低下した１株を選抜した。
【００２０】
この１株について、３ＨＢを含有するＳＯＴ培地（培地２）を用いた液体培養により、ＯＤ値（ＯＤ６００）を経時的に測定したところ、図１より、ＫＭ−１株と比較して有意に増殖能が低下していることを確認した。一方、図２より、スクロースを含有するＰＨＢ・３ＨＢ生産用培地（培地３）を用いた液体培養では、ＫＭ−１株と比較してＯＤ値の最終到達レベルが顕著に上昇していることを確認した。これを新規微生物ハロモナス・エスピー３ＨＢｗｕ＿４Ａ株として得た。この３ＨＢｗｕ＿４Ａ株は、下記菌学的性質により、親株のＫＭ−１株から変異した新規菌株であることが明らかであり、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、新規微生物ハロモナス３ＨＢｗｕ＿４Ａ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６７１）として寄託されている。
【００２１】
上記各培地は、以下の組成のものを用いた。
【００２２】
（培地１）単一の炭素源としてグルコースを含有するＳＯＴ培地
成分                  ：  培地中の終濃度  
グルコース            ：１０．０  ｇ／Ｌ
ＮａＨＣＯ３           ：  １２．６  ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＣＯ３           ：  ５．３  ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４           ：  ２．０  ｇ／Ｌ
ＮａＮＯ３             ：  １２．５  ｇ／Ｌ
Ｋ２ＳＯ４             ：  １．０  ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    ：  ０．２  ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ    ：  ０．０５３  ｇ／Ｌ
Ｆｅ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ   ：  ０．０１  ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＥＤＴＡ          ：  ０．０８  ｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３  ：  ２．８６  ｍｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４              ：  １．８１  ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４            ：  ０．２２２  ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ：  ０．０７９  ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ：  ０．３９  ｍｇ／Ｌ
Ｃｏ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ  ：  ０．０４９  ｍｇ／Ｌ
【００２３】
（培地２）単一の炭素源として３ＨＢを含有するＳＯＴ培地
成分                  ：  培地中の終濃度
３ＨＢ                ：  ３０  ｇ／Ｌ
ＮａＨＣＯ３            ：  １２．６  ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＣＯ３            ：  ５．３  ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４            ：  ２．０  ｇ／Ｌ
ＮａＮＯ３            ：  １２．５  ｇ／Ｌ
Ｋ２ＳＯ４              ：  １．０  ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    ：  ０．２  ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ    ：  ０．０５３  ｇ／Ｌ
Ｆｅ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ：  ０．０１  ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＥＤＴＡ          ：  ０．０８  ｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３              ：  ２．８６  ｍｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４             ：  １．８１  ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４             ：  ０．２２２  ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ    ：  ０．０７９  ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ：  ０．３９  ｍｇ／Ｌ
Ｃｏ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ  ：  ０．０４９  ｍｇ／Ｌ
【００２４】
（培地３）  炭素源としてスクロースを含むＰＨＢ・３ＨＢ生産用液体培地
成分                  ：  培地中の終濃度
スクロース              ：  ２００  ｇ／Ｌ
ＮａＨＣＯ３            ：  ２．５２  ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＣＯ３            ：  １０．６  ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４            ：  ２．０  ｇ／Ｌ
Ｋ２ＳＯ４              ：  １．０  ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    ：  ０．２  ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ    ：  ０．０５３  ｇ／Ｌ
Ｆｅ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ：  ０．０１  ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＥＤＴＡ          ：  ０．０８  ｇ／Ｌ
グルタミン酸ナトリウム  ：  ２５  ｇ／Ｌ
酵母エキス            ：  ０．１  ｇ／Ｌ
【００２５】
（３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の分類学上の位置）
得られた３ＨＢｗｕ＿４Ａ株は、親株ＫＭ−１株の突然変異体である。
ＫＭ−１株の分類学的性質は、好気性、生育温度２０から３７℃、生育可能ｐＨは８．０−１１．０であり、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株も同様の性質を持つことを確認した。
また、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の１６Ｓリボゾーム配列（１５３５ｂｐの塩基配列）について、ＤＤＢＪにてＢＬＡＳＴプログラムを用いた分析結果から、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  属の菌株の１０種類以上と９６−９９％の相同性を示したことからＨａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．と同定した。
【００２６】
（３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の科学的性質）
この３ＨＢｗｕ＿４Ａ株は、ＫＭ−１株とともに、各種炭素源（グルコース、スクロース、グリセロール、エタノール等）の資化能を有し、高濃度塩存在下で培養可能であり、好気培養によって著量のポリ３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を菌体内に蓄積する。さらに好気条件から微好気条件への移行により、蓄積したＰＨＢを加水分解し３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）を菌体外に分泌する。ＫＭ−１株は３ＨＢの資化性を有するが、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株はその資化性がＫＭ−１株と比較して低下した菌株として単離された。
【００２７】
〔３ＨＢ製造方法〕
以下に３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を用いた３−ヒドロキシ酪酸の製造方法を説明する。尚、以下に好適な実施例を記すが、これら実施例はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。
【００２８】
３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を培養して、３ＨＢ又はその塩を生産する場合に、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株用の培地に含有させる有機炭素源として、単糖や二糖類を用いる。
【００２９】
具体的には以下の工程に従って、培養を行う。
（１）３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源とを含む培地で好気培養する好気発酵工程、
（２）好気発酵工程の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を培養し、培養液にて３ＨＢ又はその塩を産生する微好気発酵工程、
（３）微好気発酵工程で得られる培養液から、３ＨＢ又はその塩を回収する回収工程。
＜Ａ：３ＨＢ生産菌＞
３ＨＢ生産菌としては、上記３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を下記により培養したものを用いる。
【００３０】
＜Ｂ：培地＞
好気発酵工程にて用いる培地は、無機塩と及び有機炭素源を含有する。培地のｐＨは特に限定されないが、上述した３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の生育条件を満たすｐＨであることが好ましく、具体的にはｐＨ５〜１２程度にすればよい。より好ましくはｐＨ８〜１１の培地である。アルカリ性の培地を用いれば、他の菌のコンタミネーションをより効果的に防止することができ、また分泌された３ＨＢがクロトン酸へ変化するのを抑制するので好ましい。
【００３１】
好気発酵工程にて用いる培地に配合する無機塩は、特に限定されることは無く、例えばリン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。
【００３２】
例えば、ナトリウムを無機塩として用いる場合は、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３等を用いればよい。
【００３３】
これらの無機塩は、上述の３ＨＢ生産菌にとって窒素源やリン源となるような化合物を用いることが好ましい。
【００３４】
窒素源は、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、アンモニウム塩、グルタミン酸等を用いればよく、特に限定はされないが、例えばＮａＮＯ３、ＮａＮＯ２、ＮＨ４Ｃｌ等の化合物を用いればよい。
【００３５】
窒素源の使用量は、菌体の生育に影響を及ぼすことなく、本発明の実施形態に係る３ＨＢ又はその塩の生産目的が達成される範囲において適宜設定すればよく、具体的には、培養初期の培地１００ｍｌ当たり通常であれば硝酸塩として５００ｍｇ程度以上とすればよく、より好ましくは１０００ｍｇ程度以上、更に好ましくは１２５０ｍｇ程度以上である。
【００３６】
リン源は、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等を用いればよく、特に限定はされないが、例えばＫ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４等の化合物を用いればよい。
【００３７】
リン源の使用量も、上記の窒素源の使用量と同様の観点から適宜設定すればよく、具体的には、リン酸二水素塩として培地１００ｍｌ当たり通常は５０〜４００ｍｇ程度とすればよく、より好ましくは１００〜２００ｍｇ程度である。
【００３８】
これらの無機塩は単一で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３９】
その他の化合物等も含めた無機塩は、総量で通常は０．１〜２．５Ｍ程度となる濃度で用いればよく、好ましくは０．２〜１．０Ｍ程度、より好ましくは０．２〜０．５Ｍ程度である。
【００４０】
培地に配合する有機炭素源は、特に限定はされないが、例えばトリプトン、酵母エキス、可溶性デンプン、エタノール、ｎ−プロパノール、酢酸、酢酸ナトリウム、プロピオン酸、廃グリセロール、廃蜜糖、木材糖化液、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等の六炭糖；リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボース等の五炭糖；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等の二糖；エリスリトール、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられる。
【００４１】
本発明の実施形態に係る３ＨＢの製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の培地で、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を培養するので、他の菌体の混入、増殖の恐れ等がほとんどない。従って、上述の培地に対して滅菌処理等を行っても行わなくともよく、且つ、簡便な設備で培養することも可能である。
【００４２】
＜Ｃ：好気発酵工程＞
好気発酵工程における上述の３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の培養は、好気培養を採用する。好気発酵工程における好気培養は、当該菌体が増殖し、且つ、該菌体内にＰＨＢが著量蓄積するような条件となる好気培養である限り、特に限定はされない。
【００４３】
具体的には、５ｍｌ程度の培地に３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を植菌し、通常３０〜３７℃程度、攪拌速度は１２０〜２５０ｒｐｍ程度で１晩振盪しながら前培養を行う。続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、ジャーファーメンター等に入った培地中に１００倍程度に希釈し本培養する。
【００４４】
本培養は通常２０〜４５℃程度で可能であるが、３０〜４２℃程度で行うことが好ましい。なお、培養環境は培地が空気に触れる環境とすればよく、培地表面に積極的に酸素を含む気体を吹き付ける方法や培地中に係る気体を吹き込む方法を採用してもよい。
【００４５】
好気発酵工程では、このような培養条件で３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を好気培養すればよい。具体的に好気培養時の培地中の溶存酸素濃度は、特に限定はされないが、通常は０ｍｇ／Ｌ以上とすればよく、７ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。
【００４６】
好気発酵工程での培養方法は、回分培養、半回分培養、連続培養等の培養方法が挙げられ、特に限定はされないが、３ＨＢ又はその塩又は３ＨＢ又はその塩を効率よく製造するには、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株に他の菌が混入する可能性が極めて低いことを考慮して長期の連続培養も可能である。そして、培養環境も特に限定はされず、非滅菌環境下であっても滅菌環境下であってもよい。
【００４７】
＜Ｄ：微好気発酵工程＞
本発明の実施形態に係る３ＨＢの製造方法における微好気発酵工程は、前記３ＨＢｗｕ＿４Ａ株をｐＨ８．０以上のアルカリ性領域に調整および維持して培養し、培養液にて３ＨＢｗｕ＿４Ａ株に酸素供給を積極的には行わない条件下で３ＨＢ又はその塩を産生する工程である。３ＨＢｗｕ＿４Ａ株に積極的に酸素供給を行わずに培養を継続すると、系内の酸素が消費され無酸素に近い状態となるが、絶対嫌気とまではならない酸素濃度数％の環境が維持されるため、微好気培養に適した環境を維持できる。
【００４８】
培養を継続した場合、有機酸の生成により、培地のｐＨは下がる傾向がある。この様な培地のｐＨは適宜公知のｐＨ測定用装置又はこれが付随したジャーファーメンター等によって確認することができる。
【００４９】
用語「調整及び維持」とは、上述のようなｐＨの確認を行いながら、ｐＨ調整剤を添加してｐＨの好適な状態を保つことを意味する。
【００５０】
微好気工程にて調整及び維持するｐＨは好ましくは８．０以上とする。これにより、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株による３ＨＢ生産性を高く維持することができる。
【００５１】
ｐＨ調整剤としては、特に限定はされないが、例えば水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩等が挙げられる。より具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム、炭酸水素マグネシウム、アンモニア水等が挙げられる。
【００５２】
ｐＨの調製時期は、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株内でのＰＨＢの蓄積量がほぼ一定となる時期であれば特に限定されないが、例えば、好気発酵工程によって得られる３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の菌体中のＰＨＢの蓄積量が乾燥菌体１００重量部当たり１５重量部程度以上となる時期等が挙げられる。
【００５３】
また、好気発酵工程によって得られる３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の菌体の乾燥菌体重量が培地１Ｌ当たり３０重量部程度以上となる時期であってもよい。
【００５４】
具体的な３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の菌体中のＰＨＢの蓄積量は、下記の実施例に示す方法を採用して測定する。
【００５５】
＜Ｅ：回収工程＞
回収工程において、「培地中に３ＨＢを生産させる」とは、好気発酵工程〜微好気発酵工程にて培養して得られた３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の菌体内から、その培地中に３ＨＢを分泌させることを意味する。
【００５６】
そして、「培地中に３ＨＢの塩を生産する」とは、好気発酵工程及び微好気発酵工程にて培養して得られた３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の菌体内から、その培地中に３ＨＢの塩を分泌させることのみならず、好気発酵工程及び微好気発酵工程にて培養して得られた３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の菌体内から培地中に分泌された３ＨＢが、培地中に存在する陽イオン成分と反応して、３ＨＢの塩を形成することも意味する。
【００５７】
陽イオン成分とは、培地中に含まれているものであれば、特に限定はされないが、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、モリブデンイオン、アンモニウムイオン、マンガンイオン等が挙げられる。
【００５８】
本発明の実施形態に係る３ＨＢの製造方法における回収工程は、上記微好気発酵工程で得られた培地中から、３ＨＢ又はその塩を回収する工程である。ここで、回収とは培地中に３ＨＢ又はその塩が存在している時に上述の微好気発酵工程の培養を停止し、３ＨＢ又はその塩を含む培地と、上記３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の菌体を分離すればよい。
【００５９】
具体的な分離の手法は、遠心操作、濾過等の公知の固液分離の操作を採用すればよい。また、培養の停止方法も特に限定はされず、例えば、上記微好気発酵工程によって得られる３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を加熱、酸処理等の方法によって殺菌する方法、遠心操作、濾過等の公知の固液分離手段を用いて培地と前記３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の菌体を分離する方法等が挙げられる。
【００６０】
培地中の３ＨＢ又はその塩の存在を確認する方法は、菌種、培地成分、培養条件等により変わり得るものであるので、これらの要素を考慮して適宜決定する。例えば、継時的に培地を採取し、これをＨＰＬＣ等の分析方法を供して、培養を停止する時間を決定することもできる。
【００６１】
なお、回収される３ＨＢの塩は、培地中に含まれる無機塩に基づくナトリウム、カルシウム等のアルカリ金属；アルカリ土類金属陽イオン等と反応したアルカリ金属塩として回収される。従って、３ＨＢを製造するには、回収した培地を晶析等の常法に供すればよい。
【００６２】
また、回収した培地を適切なカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製工程に供してもよい。これら以外の他の方法として、回収した培地のｐＨを適宜変更して、所望の３ＨＢ又はその塩のいずれかを精製工程に供してもよい。また、回収した培地に低級アルコール類を添加し、エステル化反応を経て、３ＨＢエステルとして蒸留等で精製することも可能である。
【００６３】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、本発明が実施例に限定されないことは言うまでも無い。
【００６４】
〔ＰＨＢ生産性試験〕
上記好気発酵工程を、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株にて行った場合とＫＭ−１株で行った場合とでＰＨＢの生産性がどの程度異なるかについて調べた。
【００６５】
図３において、各菌株は、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源とを含む培地で好気培養する好気発酵工程を行い、培養液を得た。具体的には、スクロースを炭素源として含む培地（培地３）を収容したバッフル付きのフラスコ培養容器に各菌株を添加して、２００ｒｐｍ以上の回転速度で振盪しつつ好気発酵工程を行う。これにより、各菌株により糖質を資化させ、ＰＨＢを生産させることができ、各菌株体内にＰＨＢを蓄積する。
【００６６】
図３より、ＫＭ−１株のＰＨＢ蓄積量は、培養開始２０時間〜３０時間で増加速度が落ち、４７時間後の最大ピークが３６ｇ／Ｌであるのに対して、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株を用いた場合、途中の増加速度低下がみられず、４７時間後の最大ピークが６０ｇ／Ｌに達し、ＫＭ−１株に比してきわめて高いＰＨＢ生産性を示すことが明らかになった。
【００６７】
〔３ＨＢ生産性試験〕
次に、好気発酵工程から微好気発酵工程に移行することにより、各菌株体内に蓄積したＰＨＢを３ＨＢに変換し、培養液中への３ＨＢの分泌生産を行った。微好気培養への移行にあたっては、振盪速度を培養液の均一性を保つための必要最低限の速度まで低下させ、培地中の酸素濃度を十分に低いレベルに維持することにより、３ＨＢの分泌生産が可能となる。
【００６８】
図３より、ＫＭ−１株のＰＨＢ蓄積量は、培養開始４７時間（好気発酵から微好気発酵への移行時）における３６ｇ／Ｌから培養開始５５時間（微好気培養８時間）における１２ｇ／Ｌまで低下した。一方、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株のＰＨＢ蓄積量は、培養開始４７時間（好気発酵から微好気発酵への移行時）における６０ｇ／Ｌから培養開始５５時間（微好気培養８時間）における２０ｇ／Ｌまで低下したことから、ＫＭ−１株に比して高いＰＨＢ生産性のみならず高い３ＨＢ生産性が期待できることが明らかになった。
【００６９】
図４より、培養開始４７時間から５５時間（微好気発酵への移行後８時間）にかけて、ＫＭ−１株の培養液中の３ＨＢ生産濃度は２９ｇ／Ｌにとどまったのに対し、３ＨＢｗｕ＿４Ａ株の培養液中の３ＨＢ生産濃度は４８ｇ／Ｌに達し、ＫＭ−１株に比して高い３ＨＢ生産性を示すことが明らかになった。
【００７０】
上記のＰＨＢ生産および３ＨＢ生産試験には、スクロースを炭素源として含む培地（培地３）を用いた。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
３ＨＢ生産性を大きく向上することができ、エネルギー物質、ダイエット・健康食品分野、工業的用途への応用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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