(57)【要約】      （修正有）【課題】コルチゾールの検出に利用可能な新たな核酸分子を提供する。【解決手段】本発明のコルチゾール結合核酸分子は、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、コルチゾール結合核酸分子。（ａ）特定の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチド【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、コルチゾール結合核酸分子。
（ａ）配列番号１から２０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチド
【請求項２】
前記結合核酸分子が、塩基が修飾基で修飾された修飾塩基を含む、請求項１記載のコルチゾール結合核酸分子。
【請求項３】
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミン塩基を含む、請求項２記載のコルチゾール結合核酸分子。
【請求項４】
前記修飾チミン塩基が、下記式（１）または（２）で表される修飾チミン塩基を含む、請求項３記載のコルチゾール結合核酸分子。
【化１】
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【化２】
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【請求項５】
前記修飾塩基が、修飾基で修飾された修飾プリン塩基を含む、請求項２から４のいずれか一項に記載のコルチゾール結合核酸分子。
【請求項６】
前記修飾プリン塩基が、下記式（３）で表される修飾プリン塩基である、請求項５記載のコルチゾール結合核酸分子。
【化３】
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【請求項７】
前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、下記（ｅ）のポリヌクレオチドである、請求項１から６のいずれか一項に記載のコルチゾール結合核酸分子。
（ｅ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、下記式（４−１）から（４−２０）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチド
【化４−１】
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【化４−２】
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【化４−３】
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【化４−４】
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【化４−５】
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【化４−６】
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【化４−７】
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【化４−８】
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【化４−９】
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【化４−１０】
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【化４−１１】
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【化４−１２】
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【化４−１３】
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【化４−１４】
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【化４−１５】
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【化４−１６】
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【化４−１７】
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【化４−１８】
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【化４−１９】
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【化４−２０】
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【請求項８】
相補鎖を含み、
前記相補鎖が、前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のコルチゾール結合核酸分子。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のコルチゾール結合核酸分子を含むことを特徴とする、コルチゾール検出試薬。
【請求項１０】
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のコルチゾールを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、請求項１から８のいずれか一項に記載のコルチゾール結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のコルチゾールと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のコルチゾールを検出することを特徴とする、コルチゾールの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コルチゾール結合核酸分子、コルチゾール検出用センサ、コルチゾール検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ストレスが、疲労や鬱の一因となり得ることから、ストレスのチェックが重要視されている。しかしながら、ストレス状態か否かは、例えば、本人が気づいていない、または、主観的であるが故に他人によって判断することが難しいという問題がある。このため、ストレスを客観的に判断する方法の確立が求められている。
【０００３】
血液、尿、唾液等の体液中のコルチゾール濃度は、ストレスと相関することが明らかとなっている。このため、採取が容易な唾液中のコルチゾール濃度を測定することにより、ストレス度合いを測定することが試みられている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】田中  喜秀、脇田  慎一、「ストレスと疲労のバイオマーカー」、２０１１年、日薬理誌（Folia  Pharmacol.  Jpn.）、vol.137、１８５−１８８ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の目的は、コルチゾールの分析に利用可能な、新たなコルチゾール結合核酸分子、コルチゾール検出用センサ、コルチゾール検出方法を試験する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のコルチゾール結合核酸分子（以下、「核酸分子」ともいう）は、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号１から２０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチド
【０００７】
本発明のコルチゾール検出試薬（以下、「検出試薬」ともいう）は、前記本発明のコルチゾール結合核酸分子を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明のコルチゾールの検出方法（以下、「検出方法」ともいう）は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のコルチゾールを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、前記本発明のコルチゾール結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のコルチゾールと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のコルチゾールを検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のコルチゾール核酸分子は、コルチゾールに結合可能である。このため、本発明のコルチゾール結合核酸分子によれば、例えば、試料中のコルチゾールとの結合の有無によって、優れた精度でコルチゾールを検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例における候補アプタマーのコルチゾールに対する結合能を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例におけるアプタマーのコルチゾールに対する検出感度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（１）コルチゾール結合核酸分子
本発明のコルチゾール結合核酸分子は、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号１から２０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチド
【００１２】
本発明において、ある配列に対して他の配列が相補的であるとは、例えば、両者間でアニーリングが生じ得る配列であることを意味する。前記アニーリングを、ステム形成ともいう。本発明において、相補的とは、例えば、２種類の配列をアラインメントした際の相補性が、例えば、９０％以上であること、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上であり、より好ましくは９９％以上であり、特に好ましくは１００％、すなわち完全相補である。また、核酸分子内において、ある配列に対して他の配列が相補的であるとは、一方の５’側から３’側に向かう配列と、他方の３’側から５’側に向かう配列とを対比させた際に、互いの塩基が相補的であることを意味する。
【００１３】
本発明の核酸分子は、コルチゾールに対する結合力を示す解離定数が、例えば、１．１７μｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００１４】
本発明において、「コルチゾールに結合する」とは、例えば、コルチゾールに対する結合能を有している、または、コルチゾールに対する結合活性を有しているともいう。本発明のコルチゾール結合核酸分子と前記コルチゾールとの結合は、例えば、蛍光偏光法、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface  Plasmon  resonance）解析等により決定できる。
【００１５】
前記コルチゾールは、下記式（５）で表わされる。前記コルチゾールは、例えば、異性体、塩、水和物、溶媒和物等の誘導体でもよい。以下、前記コルチゾールに関する記載は、前記誘導体に援用できる。
【化５】
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【００１６】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。また、本発明の核酸分子は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡから構成されてもよい。本発明の核酸分子がＤＮＡから構成される場合、本発明の核酸分子は、例えば、ＤＮＡ分子、ＤＮＡアプタマーということができる。
【００１７】
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記配列番号１から２０のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記配列番号１から２０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。また、前記（ａ）のポリヌクレオチドは、前記配列番号１から２０のいずれかの塩基配列の部分配列を含むヌクレオチドでもよいし、前記部分配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記部分配列は、特に制限されず、例えば、前記配列番号１から２０のいずれかの塩基配列において、５’末端および３’末端の少なくとも一方の配列を欠失した配列でもよいし、中間領域の配列を欠失した配列でもよい。前記配列番号１から２０のポリヌクレオチドを、下記表１Ａ〜Ｂに示す。なお、下記表１Ａ〜Ｂにおける「修飾塩基」は、一例であり、前記配列番号１から２０のポリヌクレオチドにおいて、各塩基は、後述のように、天然塩基でもよいし、修飾塩基でもよい。
【００１８】
【表１Ａ】
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【表１Ｂ】
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【００１９】
前記（ｂ）において、「同一性」は、特に制限されず、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、コルチゾールに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００２０】
本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｃ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチド
【００２１】
前記（ｃ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドであり、前記コルチゾールに結合する範囲であればよい。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００２２】
前記（ｃ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００２３】
本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｄ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｄ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記コルチゾールに結合するポリヌクレオチド
【００２４】
前記（ｄ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ）のポリヌクレオチドが、コルチゾールに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）の塩基配列において、例えば、１〜１６個、１〜１２個、１〜１０個、１〜８個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、１個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００２５】
本発明の核酸分子における前記（ｂ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｅ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｅ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記（ｅ）のポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｅ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、下記式（４−１）から（４−２０）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチド
【化４−１】
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【化４−２】
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【化４−３】
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【化４−４】
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【化４−５】
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【化４−６】
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【化４−７】
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【化４−８】
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【化４−９】
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【化４−１０】
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【化４−１１】
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【化４−１２】
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【化４−１３】
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【化４−１４】
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【化４−１５】
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【化４−１６】
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【化４−１７】
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【化４−１８】
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【化４−１９】
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【化４−２０】
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【００２６】
前記（ｅ）のポリヌクレオチドにおいて、前記（ａ）の塩基配列が配列番号１〜２０の塩基配列の場合、前記（ｅ）のポリヌクレオチドは、例えば、それぞれ、下記（ｅ１）〜（ｅ２０）のポリヌクレオチドである。
（ｅ１）配列番号１の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−１）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ２）配列番号２の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−２）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ３）配列番号３の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−３）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ４）配列番号４の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−４）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ５）配列番号５の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−５）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ６）配列番号６の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−６）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ７）配列番号７の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−７）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ８）配列番号８の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−８）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ９）配列番号９の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−９）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ１０）配列番号１０の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−１０）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ１１）配列番号１１の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−１１）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ１２）配列番号１２の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−１２）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ１３）配列番号１３の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−１３）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ１４）配列番号１４の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−１４）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ１５）配列番号１５の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−１５）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ１６）配列番号１６の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−１６）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ１７）配列番号１７の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−１７）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ１８）配列番号１８の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−１８）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ１９）配列番号１９の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−１９）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｅ２０）配列番号２０の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記式（４−２０）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
【００２７】
前記（ｅ）において、「同一性」は、特に制限されず、例えば、前記（ｂ）と同様である。前記（ｅ）のポリヌクレオチドにおいて、「二次構造を形成可能」とは、例えば、前記（ｅ）のポリヌクレオチドが、前記式（４−１）〜（４−２０）におけるステム構造およびループ構造を形成可能であることをいう。
【００２８】
前記（ｅ１）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ１−１）〜（ｅ１−６）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ１−１）〜（ｅ１−６）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ１）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ１−１）〜（ｅ１−６）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。前記水素結合を形成可能な塩基の組合せは、例えば、Ａ−Ｔ、Ｔ−Ａ、Ａ−Ｕ、Ｕ−Ａ、Ｇ−Ｃ、またはＣ−Ｇがあげられる（以下、同様）。前記塩基対は、いわゆるゆらぎ塩基対（wobble base pair）でもよい。前記ゆらぎ塩基対を形成可能な組み合わせは、例えば、Ｔ−Ｇ、Ｇ−Ｕ、Ｉ（イノシン）−Ｕ、Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｃ等があげられる（以下、同様）。
（ｅ１−１）配列番号１の塩基配列の１４〜１９番目の塩基に対応する塩基と４６〜５１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１−２）配列番号１の塩基配列の２１〜２３番目の塩基に対応する塩基と４２〜４４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１−３）配列番号１の塩基配列の２６〜２７番目の塩基に対応する塩基と３８〜３９番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１−４）配列番号１の塩基配列の５２〜５３番目の塩基に対応する塩基と７７〜７８番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１−５）配列番号１の塩基配列の５５〜５９番目の塩基に対応する塩基と７１〜７５番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１−６）配列番号１の塩基配列の６１〜６３番目の塩基に対応する塩基と６７〜６９番目の塩基に対応する塩基
【００２９】
前記（ｅ２）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ２−１）〜（ｅ２−５）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ２−１）〜（ｅ２−５）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ２）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ２−１）〜（ｅ２−５）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ２−１）配列番号２の塩基配列の８〜９番目の塩基に対応する塩基と３３〜３４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ２−２）配列番号２の塩基配列の１１〜１３番目の塩基に対応する塩基と３０〜３２番目の塩基に対応する塩基
（ｅ２−３）配列番号２の塩基配列の１６〜１７番目の塩基に対応する塩基と２６〜２７番目の塩基に対応する塩基
（ｅ２−４）配列番号２の塩基配列の３６〜４０番目の塩基に対応する塩基と４７〜５１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ２−５）配列番号２の塩基配列の５９〜６６番目の塩基に対応する塩基と７５〜８２番目の塩基に対応する塩基
【００３０】
前記（ｅ３）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ３−１）〜（ｅ３−２）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ３−１）〜（ｅ３−２）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ３）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ３−１）〜（ｅ３−２）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ３−１）配列番号３の塩基配列の２４〜３２番目の塩基に対応する塩基と４９〜５７番目の塩基に対応する塩基
（ｅ３−２）配列番号３の塩基配列の５８〜６６番目の塩基に対応する塩基と７５〜８３番目の塩基に対応する塩基
【００３１】
前記（ｅ４）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ４−１）〜（ｅ４−５）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ４−１）〜（ｅ４−５）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ４）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ４−１）〜（ｅ４−５）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ４−１）配列番号４の塩基配列の１９〜２３番目の塩基に対応する塩基と８４〜８８番目の塩基に対応する塩基
（ｅ４−２）配列番号４の塩基配列の２４〜２８番目の塩基に対応する塩基と７７〜８１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ４−３）配列番号４の塩基配列の３１〜３４番目の塩基に対応する塩基と４３〜４６番目の塩基に対応する塩基
（ｅ４−４）配列番号４の塩基配列の４８〜５２番目の塩基に対応する塩基と７２〜７６番目の塩基に対応する塩基
（ｅ４−５）配列番号４の塩基配列の５３〜５７番目の塩基に対応する塩基と６３〜６７番目の塩基に対応する塩基
【００３２】
前記（ｅ５）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ５−１）〜（ｅ５−６）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ５−１）〜（ｅ５−６）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ５）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ５−１）〜（ｅ５−６）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ５−１）配列番号５の塩基配列の９〜１１番目の塩基に対応する塩基と８１〜８３番目の塩基に対応する塩基
（ｅ５−２）配列番号５の塩基配列の１３〜１４番目の塩基に対応する塩基と７８〜７９番目の塩基に対応する塩基
（ｅ５−３）配列番号５の塩基配列の１５〜１６番目の塩基に対応する塩基と７５〜７６番目の塩基に対応する塩基
（ｅ５−４）配列番号５の塩基配列の２５〜２８番目の塩基に対応する塩基と６１〜６４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ５−５）配列番号５の塩基配列の３１〜３５番目の塩基に対応する塩基と５３〜５７番目の塩基に対応する塩基
（ｅ５−６）配列番号５の塩基配列の３８〜４０番目の塩基に対応する塩基と４６〜４８番目の塩基に対応する塩基
【００３３】
前記（ｅ６）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ６−１）〜（ｅ６−５）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ６−１）〜（ｅ６−５）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ６）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ６−１）〜（ｅ６−５）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ６−１）配列番号６の塩基配列の８〜９番目の塩基に対応する塩基と３３〜３４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ６−２）配列番号６の塩基配列の１１〜１２番目の塩基に対応する塩基と３１〜３２番目の塩基に対応する塩基
（ｅ６−３）配列番号６の塩基配列の４８〜５０番目の塩基に対応する塩基と５４〜５６番目の塩基に対応する塩基
（ｅ６−４）配列番号６の塩基配列の５７〜５９番目の塩基に対応する塩基と７７〜７９番目の塩基に対応する塩基
（ｅ６−５）配列番号６の塩基配列の６１〜６４番目の塩基に対応する塩基と７２〜７５番目の塩基に対応する塩基
【００３４】
前記（ｅ７）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ７−１）〜（ｅ７−６）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ７−１）〜（ｅ７−６）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ７）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ７−１）〜（ｅ７−６）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ７−１）配列番号７の塩基配列の２〜５番目の塩基に対応する塩基と４９〜５２番目の塩基に対応する塩基
（ｅ７−２）配列番号７の塩基配列の７〜１０番目の塩基に対応する塩基と４４〜４７番目の塩基に対応する塩基
（ｅ７−３）配列番号７の塩基配列の１４〜１７番目の塩基に対応する塩基と３８〜４１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ７−４）配列番号７の塩基配列の１８〜１９番目の塩基に対応する塩基と３５〜３６番目の塩基に対応する塩基
（ｅ７−５）配列番号７の塩基配列の５３〜５６番目の塩基に対応する塩基と７８〜８１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ７−６）配列番号７の塩基配列の５８〜６０番目の塩基に対応する塩基と７４〜７６番目の塩基に対応する塩基
【００３５】
前記（ｅ８）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ８−１）〜（ｅ８−５）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ８−１）〜（ｅ８−５）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ８）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ８−１）〜（ｅ８−５）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ８−１）配列番号８の塩基配列の８〜１０番目の塩基に対応する塩基と７３〜７５番目の塩基に対応する塩基
（ｅ８−２）配列番号８の塩基配列の１２〜１５番目の塩基に対応する塩基と６９〜７２番目の塩基に対応する塩基
（ｅ８−３）配列番号８の塩基配列の１７〜１８番目の塩基に対応する塩基と６６〜６７番目の塩基に対応する塩基
（ｅ８−４）配列番号８の塩基配列の３２〜３５番目の塩基に対応する塩基と４９〜５２番目の塩基に対応する塩基
（ｅ８−５）配列番号８の塩基配列の３６〜３９番目の塩基に対応する塩基と４４〜４７番目の塩基に対応する塩基
【００３６】
前記（ｅ９）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ９−１）〜（ｅ９−４）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ９−１）〜（ｅ９−４）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ９）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ９−１）〜（ｅ９−４）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ９−１）配列番号９の塩基配列の１５〜１７番目の塩基に対応する塩基と４１〜４３番目の塩基に対応する塩基
（ｅ９−２）配列番号９の塩基配列の２１〜２３番目の塩基に対応する塩基と３７〜３９番目の塩基に対応する塩基
（ｅ９−３）配列番号９の塩基配列の２６〜２８番目の塩基に対応する塩基と３２〜３４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ９−４）配列番号９の塩基配列の４５〜４８番目の塩基に対応する塩基と５８〜６１番目の塩基に対応する塩基
【００３７】
前記（ｅ１０）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ１０−１）〜（ｅ１０−６）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ１０−１）〜（ｅ１０−６）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ１０）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ１０−１）〜（ｅ１０−６）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ１０−１）配列番号１０の塩基配列の９〜１１番目の塩基に対応する塩基と８１〜８３番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１０−２）配列番号１０の塩基配列の１３〜１４番目の塩基に対応する塩基と７８〜７９番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１０−３）配列番号１０の塩基配列の１５〜１６番目の塩基に対応する塩基と７５〜７６番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１０−４）配列番号１０の塩基配列の２５〜２７番目の塩基に対応する塩基と６２〜６４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１０−５）配列番号１０の塩基配列の２９〜３２番目の塩基に対応する塩基と５８〜６１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１０−６）配列番号１０の塩基配列の３７〜４１番目の塩基に対応する塩基と５３〜５７番目の塩基に対応する塩基
【００３８】
前記（ｅ１１）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ１１−１）〜（ｅ１１−７）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ１１−１）〜（ｅ１１−７）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ１１）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ１１−１）〜（ｅ１１−７）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ１１−１）配列番号１１の塩基配列の８〜９番目の塩基に対応する塩基と３３〜３４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１１−２）配列番号１１の塩基配列の１１〜１２番目の塩基に対応する塩基と３１〜３２番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１１−３）配列番号１１の塩基配列の１６〜１８番目の塩基に対応する塩基と２５〜２７番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１１−４）配列番号１１の塩基配列の３９〜４２番目の塩基に対応する塩基と６７〜７０番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１１−５）配列番号１１の塩基配列の４３〜４４番目の塩基に対応する塩基と６３〜６４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１１−６）配列番号１１の塩基配列の４５〜４７番目の塩基に対応する塩基と５９〜６１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１１−７）配列番号１１の塩基配列の４９〜５１番目の塩基に対応する塩基と５６〜５８番目の塩基に対応する塩基
【００３９】
前記（ｅ１２）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ１２−１）〜（ｅ１２−７）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ１２−１）〜（ｅ１２−７）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ１２）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ１２−１）〜（ｅ１２−７）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ１２−１）配列番号１２の塩基配列の１〜７番目の塩基に対応する塩基と４６〜５２番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１２−２）配列番号１２の塩基配列の９〜１０番目の塩基に対応する塩基と４３〜４４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１２−３）配列番号１２の塩基配列の１２〜１３番目の塩基に対応する塩基と４０〜４１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１２−４）配列番号１２の塩基配列の１７〜１９番目の塩基に対応する塩基と３５〜３７番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１２−５）配列番号１２の塩基配列の２４〜２６番目の塩基に対応する塩基と３２〜３４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１２−６）配列番号１２の塩基配列の５６〜５７番目の塩基に対応する塩基と７８〜７９番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１２−７）配列番号１２の塩基配列の５８〜６２番目の塩基に対応する塩基と７２〜７６番目の塩基に対応する塩基
【００４０】
前記（ｅ１３）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ１３−１）〜（ｅ１３−５）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ１３−１）〜（ｅ１３−５）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ１３）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ１３−１）〜（ｅ１３−５）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ１３−１）配列番号１３の塩基配列の１０〜１５番目の塩基に対応する塩基と５３〜５８番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１３−２）配列番号１３の塩基配列の１７〜１８番目の塩基に対応する塩基と５０〜５１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１３−３）配列番号１３の塩基配列の２５〜２７番目の塩基に対応する塩基と３９〜４１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１３−４）配列番号１３の塩基配列の２９〜３０番目の塩基に対応する塩基と３４〜３５番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１３−５）配列番号１３の塩基配列の６１〜６４番目の塩基に対応する塩基と７４〜７７番目の塩基に対応する塩基
【００４１】
前記（ｅ１４）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ１４−１）〜（ｅ１４−７）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ１４−１）〜（ｅ１４−７）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ１４）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ１４−１）〜（ｅ１４−７）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ１４−１）配列番号１４の塩基配列の１４〜１６番目の塩基に対応する塩基と４５〜４７番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１４−２）配列番号１４の塩基配列の１８〜１９番目の塩基に対応する塩基と４２〜４３番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１４−３）配列番号１４の塩基配列の２２〜２６番目の塩基に対応する塩基と３７〜４１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１４−４）配列番号１４の塩基配列の２７〜２８番目の塩基に対応する塩基と３３〜３４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１４−５）配列番号１４の塩基配列の４８〜５２番目の塩基に対応する塩基と７４〜７８番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１４−６）配列番号１４の塩基配列の５５〜５６番目の塩基に対応する塩基と７２〜７３番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１４−７）配列番号１４の塩基配列の６０〜６３番目の塩基に対応する塩基と６７〜７０番目の塩基に対応する塩基
【００４２】
前記（ｅ１５）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ１５−１）〜（ｅ１５−７）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ１５−１）〜（ｅ１５−７）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ１５）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ１５−１）〜（ｅ１５−７）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ１５−１）配列番号１５の塩基配列の１４〜１６番目の塩基に対応する塩基と４６〜４８番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１５−２）配列番号１５の塩基配列の２３〜２６番目の塩基に対応する塩基と３７〜４０番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１５−３）配列番号１５の塩基配列の２７〜２８番目の塩基に対応する塩基と３４〜３５番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１５−４）配列番号１５の塩基配列の４９〜５０番目の塩基に対応する塩基と７７〜７８番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１５−５）配列番号１５の塩基配列の５２〜５５番目の塩基に対応する塩基と７２〜７５番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１５−６）配列番号１５の塩基配列の５７〜５８番目の塩基に対応する塩基と７０〜７１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１５−７）配列番号１５の塩基配列の６０〜６２番目の塩基に対応する塩基と６６〜６８番目の塩基に対応する塩基
【００４３】
前記（ｅ１６）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ１６−１）〜（ｅ１６−６）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ１６−１）〜（ｅ１６−６）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ１６）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ１６−１）〜（ｅ１６−６）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ１６−１）配列番号１６の塩基配列の１〜５番目の塩基に対応する塩基と５５〜５９番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１６−２）配列番号１６の塩基配列の７〜９番目の塩基に対応する塩基と５１〜５３番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１６−３）配列番号１６の塩基配列の１０〜１５番目の塩基に対応する塩基と４３〜４８番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１６−４）配列番号１６の塩基配列の１７〜１８番目の塩基に対応する塩基と４１〜４２番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１６−５）配列番号１６の塩基配列の２４〜２６番目の塩基に対応する塩基と３２〜３４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１６−６）配列番号１６の塩基配列の６１〜６３番目の塩基に対応する塩基と７９〜８１番目の塩基に対応する塩基
【００４４】
前記（ｅ１７）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ１７−１）〜（ｅ１７−３）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ１７−１）〜（ｅ１７−３）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ１７）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ１７−１）〜（ｅ１７−３）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ１７−１）配列番号１７の塩基配列の７〜１４番目の塩基に対応する塩基と５５〜６２番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１７−２）配列番号１７の塩基配列の１８〜２０番目の塩基に対応する塩基と４７〜４９番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１７−３）配列番号１７の塩基配列の３４〜３７番目の塩基に対応する塩基と４３〜４６番目の塩基に対応する塩基
【００４５】
前記（ｅ１８）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ１８−１）〜（ｅ１８−４）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ１８−１）〜（ｅ１８−４）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ１８）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ１８−１）〜（ｅ１８−４）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ１８−１）配列番号１８の塩基配列の８〜１２番目の塩基に対応する塩基と４９〜５３番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１８−２）配列番号１８の塩基配列の１５〜１６番目の塩基に対応する塩基と４４〜４５番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１８−３）配列番号１８の塩基配列の２６〜２７番目の塩基に対応する塩基と３３〜３４番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１８−４）配列番号１８の塩基配列の５５〜５７番目の塩基に対応する塩基と６１〜６３番目の塩基に対応する塩基
【００４６】
前記（ｅ１９）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ１９−１）〜（ｅ１９−４）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ１９−１）〜（ｅ１９−４）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ１９）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ１９−１）〜（ｅ１９−４）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ１９−１）配列番号１９の塩基配列の９〜１４番目の塩基に対応する塩基と６１〜６６番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１９−２）配列番号１９の塩基配列の２３〜２５番目の塩基に対応する塩基と５８〜６０番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１９−３）配列番号１９の塩基配列の３０〜３２番目の塩基に対応する塩基と４９〜５１番目の塩基に対応する塩基
（ｅ１９−４）配列番号１９の塩基配列の３４〜３７番目の塩基に対応する塩基と４４〜４７番目の塩基に対応する塩基
【００４７】
前記（ｅ２０）のポリヌクレオチドにおいて、前記「二次構造を形成可能」とは、例えば、下記（ｅ２０−１）〜（ｅ２０−４）の塩基がステム構造を形成し、下記（ｅ２０−１）〜（ｅ２０−４）以外の塩基が、ループ構造を形成することを意味する。各ループ構造における塩基は、保存されていることが好ましい。前記（ｅ２０）のポリヌクレオチドにおいて、下記（ｅ２０−１）〜（ｅ２０−４）の塩基は、例えば、ステム構造を形成すればよく、ステム構造において向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。
（ｅ２０−１）配列番号２０の塩基配列の１〜６番目の塩基に対応する塩基と５４〜５９番目の塩基に対応する塩基
（ｅ２０−２）配列番号２０の塩基配列の８〜９番目の塩基に対応する塩基と５１〜５２番目の塩基に対応する塩基
（ｅ２０−３）配列番号２０の塩基配列の１２〜１４番目の塩基に対応する塩基と４５〜４７番目の塩基に対応する塩基
（ｅ２０−４）配列番号２０の塩基配列の２４〜２７番目の塩基に対応する塩基と３２〜３５番目の塩基に対応する塩基
【００４８】
前記（ｅ）のポリヌクレオチドにおいて、前記同一性は、前記（ｅ）のポリヌクレオチドにおけるステム構造を除いた領域の塩基配列、すなわち、前記（ｅ）のポリヌクレオチドにおけるループ構造を構成する塩基配列が、前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいてループ構造を形成する塩基配列に対して、前述の同一性の範囲を満たすことが好ましい。このため、前記（ｅ１）〜（ｅ２０）のポリヌクレオチドは、例えば、各ポリヌクレオチドにおいてループ構造を形成する塩基配列が、それぞれ、前記配列番号１〜２０の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいてループ構造を形成する塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有することが好ましい。
【００４９】
本発明の核酸分子における前記（ｄ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｆ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｆ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記（ｆ）のポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｆ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−１）から（４−２０）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、前記コルチゾールに結合するポリヌクレオチド
【００５０】
前記（ｆ）のポリヌクレオチドにおいて、前記（ａ）の塩基配列が配列番号１〜２０の塩基配列の場合、前記（ｆ）のポリヌクレオチドは、例えば、それぞれ、下記（ｆ１）〜（ｆ２０）のポリヌクレオチドである。
（ｆ１）配列番号１の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−１）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ２）配列番号２の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−２）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ３）配列番号３の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−３）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ４）配列番号４の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−４）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ５）配列番号５の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−５）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ６）配列番号６の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−６）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ７）配列番号７の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−７）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ８）配列番号８の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−８）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ９）配列番号９の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−９）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ１０）配列番号１０の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−１０）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ１１）配列番号１１の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−１１）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ１２）配列番号１２の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−１２）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ１３）配列番号１３の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−１３）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ１４）配列番号１４の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−１４）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ１５）配列番号１５の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−１５）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ１６）配列番号１６の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−１６）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ１７）配列番号１７の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−１７）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ１８）配列番号１８の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−１８）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ１９）配列番号１９の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−１９）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
（ｆ２０）配列番号２０の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（４−２０）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチドである。
【００５１】
前記（ｆ）において、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記（ｄ）と同様である。前記（ｆ）のポリヌクレオチドにおいて、「二次構造を形成可能」とは、例えば、前記（ｆ）のポリヌクレオチドが、前記式におけるステム構造およびループ構造を形成可能であることをいい、例えば、前記（ｅ）のポリヌクレオチドにおける説明を援用でき、具体的には、前記（ｆ１）〜（ｆ２０）のポリヌクレオチドは、それぞれ、前記（ｅ１）〜（ｅ２０）のポリヌクレオチドの説明を援用できる。ステム構造およびループ構造については、後述する。
【００５２】
前記（ｆ）のポリヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基の欠失等は、前記（ａ）のポリヌクレオチドにおけるステム構造を除いた領域の塩基配列、すなわち、前記（ａ）のポリヌクレオチドにおけるループ構造を構成する塩基配列に生じていることが好ましい。このため、前記（ｆ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドにおけるループ構造を構成する塩基配列おいて、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加されていることが好ましい。前記（ｆ１）〜（ｆ２０）のポリヌクレオチドは、例えば、それぞれ、前記配列番号１〜２０の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおけるループ構造を形成する塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなることが好ましい。
【００５３】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明の核酸分子は、例えば、以下、アプタマーともいう。
【００５４】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記（ａ）〜（ｆ）の２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。ここで、前記リンカーとは、例えば、ポリヌクレオチド間の配列であり、前記付加配列とは、例えば、末端に付加された配列である。
【００５５】
本発明の核酸分子が、例えば、複数のポリヌクレオチドを含む場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上、２〜２０、２〜１０、２または３である。
【００５６】
前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜２４塩基長、１〜２０塩基長、３〜１２塩基長、５〜９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
【００５７】
本発明の核酸分子において、前記（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【００５８】
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【００５９】
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、相補鎖ということができる。前記相補鎖は、例えば、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
【００６０】
前記相補鎖は、例えば、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドということもできる。前記相補鎖の塩基配列は、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的であればよく、前記（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドの塩基配列に応じて、適宜設計できる。前記相補鎖は、例えば、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドの一部に相補的な配列を有していればよく、前記相補的な配列のみから構成されてもよいし、前記相補的な配列を含んでもよい。前記相補鎖は、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドのどの領域に対して相補的でもよく、好ましくは、５’末端領域または３’末端領域に相補的である。また、例えば、前記（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドが、その５’末端または３’末端にリンカーを有し、前記相補的な配列は、前記リンカーに相補的であることが好ましい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１０〜３０塩基長、１５〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。前記相補鎖の長さは、特に制限されず、例えば、１０〜３０塩基長、１５〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。具体例として、前記相補鎖は、例えば、下記配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。また、前記相補鎖は、例えば、その５’末端および３’末端の少なくとも一方が標識されていてもよく、好ましくは、５’末端が標識されている。前記標識は、特に制限されず、例えば、ＴＹＥ６６５である。
配列番号２１：GCCGCGTCGAGT
【００６１】
本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記核酸分子の長さは、特に制限されない。前記核酸分子の長さの下限は、例えば、１５塩基長、３５塩基長、５５塩基長、７５塩基長である。前記核酸分子の長さの上限は、例えば、１０００塩基長であり、２００塩基長、１００塩基長、９０塩基長、８０塩基長である。前記核酸分子の長さの範囲は、例えば、１５〜１０００塩基長、３５〜２００塩基長、５５〜９０塩基長、７５〜８０塩基長である。
【００６２】
前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、１〜３０個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１または２個である。
【００６３】
前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド残基における塩基として、天然塩基を含んでもよいし、修飾塩基を含んでもよい。前記天然塩基（非人工塩基）は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられ、好ましくは、シトシン（ｃ）、およびチミン（ｔ）である。
【００６４】
本発明において、「アデニン」とは、例えば、前記天然塩基であるアデニン（ａ）の他に、その７位の窒素原子が、炭素原子に置換されているプリン誘導体を含む。
【００６５】
前記ポリヌクレオチドが前記修飾塩基を有する場合、その部位および個数は、特に制限されない。本発明の核酸分子が前記修飾塩基を有する場合、前記配列番号５〜１３、および１６〜２０のポリヌクレオチドにおいては、例えば、チミンの一部または全部が、修飾塩基である。前記チミンが修飾塩基の場合、前記修飾塩基は、チミン塩基が修飾された修飾チミン塩基であることが好ましい。前記配列番号５〜１３、および１６〜２０のポリヌクレオチドにおける下線部のチミンが修飾塩基の場合、前記修飾塩基は、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミン塩基であることが好ましい。本発明の核酸分子が前記修飾塩基を有する場合、前記配列番号７、８、１６、および２０のポリヌクレオチドにおいては、例えば、アデニンの一部または全部が、修飾塩基である。前記アデニンが修飾塩基の場合、前記修飾塩基は、プリン塩基が修飾された修飾プリン塩基であることが好ましい。前記配列番号７、８、１６、および２０のポリヌクレオチドにおける下線部のアデニンが修飾塩基の場合、前記修飾塩基は、プリン塩基が修飾基で修飾された修飾プリン塩基であることが好ましい。
【００６６】
前記修飾塩基は、例えば、塩基が修飾基で修飾されたものである。前記修飾基により修飾される塩基（被修飾塩基）は、例えば、前記天然塩基である。前記天然塩基は、例えば、プリン塩基、ピリミジン塩基等があげられる。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、修飾ウラシルがあげられる。
【００６７】
前記修飾塩基は、例えば、前記被修飾塩基が、直接、前記修飾基で修飾されてもよいし、前記被修飾塩基が、間接的に、前記修飾基で修飾されてもよい。後者の場合、例えば、前記被修飾塩基が、リンカーを介して、前記修飾基で修飾される形態があげられる。前記リンカーは、特に制限されない。
【００６８】
前記被修飾塩基の前記修飾基による修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられ、７位が好ましい。前記プリン塩基の修飾部位が７位の場合、７位の窒素原子は、炭素原子に置換されていることが好ましい。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられ、５位が好ましい。前記ピリミジン塩基の５位が修飾される場合、チミンは、５位の炭素にメチル基を有することから、例えば、５位の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよいし、５位の炭素に結合したメチル基の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよい。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「−ＣＨ３」または「−Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
【００６９】
前記修飾塩基が修飾プリン塩基である場合、前記修飾基は、アデニン残基が好ましい。すなわち、前記修飾プリン塩基は、例えば、塩基が前記アデニン残基で修飾されている。前記アデニン残基が前記被修飾塩基を修飾する部位（前記アデニン残基における被修飾塩基との結合部位）は、特に制限されず、前記アデニン残基における６位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記アデニン残基で修飾される前記被修飾塩基は、特に制限されないが、例えば、プリン塩基が好ましく、プリン塩基の７位の原子が、前記アデニン残基で修飾されていることが好ましい。前記修飾塩基が修飾チミンである場合、前記修飾基は、グアニン残基またはアデニン残基が好ましい。すなわち、前記修飾塩基は、例えば、塩基が前記グアニン残基または前記アデニン残基で修飾されている。前記グアニン残基または前記アデニン残基が前記被修飾塩基を修飾する部位は、特に制限されず、例えば、前記グアニン残基または前記アデニン残基における６位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記グアニン残基または前記アデニン残基で修飾される前記被修飾塩基は、特に制限されないが、例えば、チミンが好ましく、チミンの５位の炭素に結合したメチル基の炭素が、前記グアニン残基または前記アデニン残基で修飾されていることが好ましい。前記修飾基は、例えば、その一部がさらに置換または修飾されてもよい。
【００７０】
前記修飾基が前記グアニン残基または前記アデニン残基の場合、例えば、以下に示すように、前記リンカーを介して、前記修飾基により前記被修飾塩基が修飾されていることが好ましい。
［ヌクレオチド残基］−［リンカー］−［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］−［リンカー］−［グアニン残基］
【００７１】
前記リンカーは、特に制限されず、例えば、以下のように、前記ヌクレオチド残基と前記アデニン残基または前記グアニン残基との間の式で表されるが、これには限定されない。下記式において、(CH2)nにおけるｎの数値は、例えば、１〜１０、２〜１０、２である。
［ヌクレオチド残基］  =C-C(=O)-NH-(CH2)n-  ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］  =C-C(=O)-NH-(CH2)n-  ［グアニン残基］
［ヌクレオチド残基］  -C=C-C(=O)-NH-(CH2)n-  ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］  =C-C(=O)-NH-CH2-CH2-  ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］  =C-C(=O)-NH-CH2-CH2-  ［グアニン残基］
［ヌクレオチド残基］  -C=C-C(=O)-NH-CH2-CH2-  ［アデニン残基］
【００７２】
前記式において、前記リンカーの一端［＝Ｃ］および［−Ｃ］は、例えば、ヌクレオチド残基における被修飾塩基の炭素と、それぞれ、二重結合または単結合を形成し、前記リンカーの他端［ＣＨ２−］は、例えば、グアニン残基またはアデニン残基のアミン（−ＮＨ）（例えば、６位の炭素に結合したアミン）と結合している。
【００７３】
前記グアニン残基により修飾された修飾チミン塩基は、下記式（１）で表される修飾チミン塩基が好ましい。
【化１】
2019176775.tif 000026
【００７４】
前記アデニン残基により修飾された修飾チミン塩基は、下記式（２）で表される修飾チミン塩基が好ましい。
【化２】
2019176775.tif 000027
【００７５】
前記アデニン残基により修飾されたプリン塩基は、下記式（３）で表される修飾プリン塩基が好ましい。
【化３】
2019176775.tif 000028
【００７６】
前記式（１）の修飾チミン塩基は、例えば、チミン塩基の５位の炭素に結合しているメチル基が、下記式（６）の修飾基により置換されているということもできる。
【化６】
2019176775.tif 000029
【００７７】
前記式（２）の修飾チミン塩基は、例えば、チミン塩基の５位の炭素に結合しているメチル基が、下記式（７）の修飾基により置換されているということもできる。
【化７】
2019176775.tif 000030
【００７８】
前記式（３）の修飾プリン塩基は、例えば、アデニン塩基の７位の窒素原子が炭素原子に置換され、さらに、前記炭素原子が、下記式（８）の修飾基により修飾されているということもできる。
【化８】
2019176775.tif 000031
【００７９】
前記ポリヌクレオチドにおける前記グアニン残基で修飾されたチミジンヌクレオチド残基の具体例として、例えば、下記式（９）に示す残基（以下、「ＮＧ７」ともいう）があげられる。前記ポリヌクレオチドにおける前記アデニン残基で修飾されたチミジンヌクレオチド残基の具体例として、例えば、下記式（１０）に示す残基（以下、「ＫＳ９」ともいう）があげられる。また、前記ポリヌクレオチドにおける前記アデニン残基で修飾されたアデノシンヌクレオチド残基の具体例として、例えば、下記式（１１）に示す残基（以下、「ＭＫ４」ともいう）があげられる。なお、本発明は、これには限定されない。
【化９】
2019176775.tif 000032
【化１０】
2019176775.tif 000033
【化１１】
2019176775.tif 000034
【００８０】
前記表１Ａ〜Ｂのポリヌクレオチドにおいて、例えば、前記配列番号５、６、１２、１３、および１９の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおける下線部のチミンが、前記ＫＳ９のヌクレオチド残基であることが好ましい。前記表１Ａ〜Ｂのポリヌクレオチドにおいて、例えば、配列番号７〜１１、１６〜１８、および２０の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおける下線部のチミンが、前記ＮＧ７のヌクレオチド残基であることが好ましい。前記表１Ａ〜Ｂのポリヌクレオチドにおいて、例えば、配列番号７、８、１６、および２０の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおける下線部のアデニンが、前記ＭＫ４のヌクレオチド残基であることが好ましい。前記表１Ａ〜Ｂのポリヌクレオチドにおいて、例えば、配列番号７、８、１６、および２０の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおける下線部のチミンが、前記ＮＧ７であり、下線部のアデニンが、前記ＭＫ４のヌクレオチド残基であることが好ましい。
【００８１】
本発明の核酸分子が、例えば、ＫＳ９を有する場合、前記ポリヌクレオチドの合成には、例えば、下記式（１２）で表されるヌクレオチド三リン酸（以下、「ＫＳ９モノマー」ともいう）を、モノマー分子として使用することができる。本発明の核酸分子が、例えば、ＮＧ７を有する場合、前記ポリヌクレオチドの合成には、例えば、下記式（１３）で表されるヌクレオチド三リン酸（以下、「ＮＧ７モノマー」ともいう）を、モノマー分子として使用することができる。本発明の核酸分子が、例えば、ＭＫ４を有する場合、前記ポリヌクレオチドの合成には、例えば、下記式（１４）で表されるヌクレオチド三リン酸（以下、「ＭＫ４モノマー」ともいう）を、モノマー分子として使用することができる。前記ポリヌクレオチドの合成において、例えば、前記モノマー分子は、ホスホジエステル結合により、他のヌクレオチド三リン酸と結合する。前記ＫＳ９モノマーの製造方法は、公知の方法で製造でき、例えば、特開２００４−２３８３５３号公報を参照できる。前記ＮＧ７モノマーの製造方法は、公知の方法で製造でき、例えば、国際公開２０１８／０５２０６３号を参照できる。前記ＭＫ４モノマーの製造方法は、公知の方法で製造でき、例えば、国際公開２０１８／０５２０６４号を参照できる。
【化１２】
2019176775.tif 000035
【化１３】
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【化１４】
2019176775.tif 000037
【００８２】
前記修飾基としては、この他に、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、ベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、トリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
【００８３】
前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’−デアザアデニン等があげられ、前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’−デアザグアニン等があげられ、前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’−メチルシトシン（５−Ｍｅ−ｄＣ）等があげられ、前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルチミン、５’−トリプタミノカルボニルチミン、５’−イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられ、前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’−イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。例示した前記修飾ウラシルは、チミンの修飾塩基ということもできる。
【００８４】
前記ポリヌクレオチドは、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
【００８５】
本発明の核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
【００８６】
前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
【００８７】
前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
【００８８】
前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１〜９１個または１〜７８個、前述の範囲と同様である。
【００８９】
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜５０個、１〜３０個、１〜１０個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
【００９０】
本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
【００９１】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜５０塩基長、１〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
【００９２】
本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
【００９３】
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法、遺伝子工学的手法等の公知の方法により合成できる。
【００９４】
本発明の核酸分子は、前述のように、前記コルチゾールに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記コルチゾールへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、前記コルチゾールに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
【００９５】
（２）コルチゾール検出用センサ
本発明の検出用センサは、コルチゾールの検出用センサであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出用センサは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、特に制限されない。本発明の検出用センサを使用すれば、例えば、前記核酸分子と前記コルチゾールとを結合させることで、前述のように、前記コルチゾールを検出できる。
【００９６】
本発明の検出用センサは、例えば、さらに担体を有し、前記担体に前記核酸分子が配置されている。前記核酸分子は、前記担体に固定化されていることが好ましい。前記担体への前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。本発明の検出用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明の核酸分子および後述の検出方法を援用できる。
【００９７】
（３）検出方法
本発明の検出方法は、前述のように、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のコルチゾールを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のコルチゾール結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のコルチゾールと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のコルチゾールを検出することを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のコルチゾール検出用センサを使用してもよい。
【００９８】
本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、コルチゾールに特異的に結合することから、例えば、コルチゾールと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のコルチゾールを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のコルチゾールの有無またはコルチゾールの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。
【００９９】
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、唾液、尿、血漿および血清等があげられる。
【０１００】
前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【０１０１】
前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中のコルチゾールと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記コルチゾールと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のコルチゾールの有無または量を分析する工程を含む。
【０１０２】
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【０１０３】
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃、１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分、３０〜６０分である。
【０１０４】
前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
【０１０５】
前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のコルチゾールと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のコルチゾールの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のコルチゾールの量を分析（定量）できる。
【０１０６】
そして、前記コルチゾールと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にコルチゾールは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にコルチゾールが存在すると判断できる。
【０１０７】
前記コルチゾールと前記核酸分子との結合の分析方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、ＳＰＲ、蛍光偏光法等があげられる。また、前記結合は、例えば、前記コルチゾールと前記核酸分子との複合体の検出でもよい。
【０１０８】
前記蛍光偏光法による前記コルチゾールと前記核酸分子との結合の検出は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【０１０９】
前記蛍光偏光法は、一般に、偏光励起光を前記標識物質に照射した際、前記標識物質から発せられる蛍光が、前記標識物質で標識された分子の分子量に応じて異なった偏光度を示すという特性に基づく測定方法である。本発明においては、例えば、前記標識物質で標識化した前記核酸分子（標識化核酸分子）を使用することで、前記蛍光偏光法により前記コルチゾールと前記核酸分子との結合を検出することができる。具体的には、前記標識化核酸分子が一本鎖の場合、前記標識化核酸分子は、コルチゾールと未結合の状態とコルチゾールと結合した状態を比較した場合、前者は、相対的に分子量が小さいため、相対的に偏光度が低く、一方、後者は、相対的に分子量が大きいため、相対的に偏光度が高い。このため、例えば、試料と接触させる前の前記標識化核酸分子の偏光度と、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の前記偏光度とを比較することで、コルチゾールと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。また、前記標識化核酸分子が二本鎖の場合、前記標識化核酸分子は、コルチゾールと未結合の状態とコルチゾールと結合した状態を比較した場合、前者は、相対的に分子量が大きいため、相対的に偏光度が高く、一方、後者は、相対的に分子量が小さいため、相対的に偏光度が低い。このため、例えば、試料と接触させる前の前記標識化核酸分子の偏光度と、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の前記偏光度とを比較することで、コルチゾールと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。さらに、コルチゾールと未結合の前記標識化核酸分子およびコルチゾールと結合した前記標識化核酸分子の少なくとも一方の偏光度を評価基準として、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の偏光度を評価することでも、コルチゾールと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。
【０１１０】
前記蛍光偏光法によれば、例えば、前記本発明の核酸分子を、前記標識物質で標識化するのみで、センサとして容易に使用できる。また、前記標識物質は、その種類によって検出波長が異なるため、例えば、試料の種類に応じて前記標識物質を選択することで、前記試料由来の蛍光の影響を低減することもできる。
【０１１１】
前記標識化核酸分子は、例えば、前記本発明の核酸分子が前記標識物質で標識化されていればよく、その標識方法は、特に制限されない。
【０１１２】
前記標識化核酸分子としては、例えば、前記本発明の核酸分子に前記標識物質が連結した形態があげられる。この形態は、例えば、前述の記載が援用でき、前記本発明の核酸分子に、前記標識物質が直接的に連結してもよいし、前述のようにリンカー等を介して前記標識物質が間接的に連結してもよい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、０〜１０塩基長、０〜７塩基長、０〜５塩基長である。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよく、好ましくは、５’末端である。
【０１１３】
前記標識化核酸分子としては、この他に、例えば、前記本発明の核酸分子と、これに相補的であって且つ標識物質が連結した相補鎖（以下、「標識化相補鎖」ともいう）とを含み、前記核酸分子と前記標識化相補鎖とがハイブリダイズしたハイブリッド分子があげられる。
【０１１４】
前記相補鎖は、例えば、前述のように、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドの一部に相補的な配列を有していればよく、前記相補的な配列のみから構成されてもよいし、前記相補的な配列を含んでもよい。前記相補鎖は、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドのどの領域に対して相補的でもよく、好ましくは、５’末端領域または３’末端領域に相補的である。また、前記（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドが、例えば、その５’末端または３’末端にリンカーを有し、前記相補的な配列は、前記リンカーに相補的であることが好ましい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１０〜３０塩基長、１５〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。前記相補鎖の長さは、特に制限されず、例えば、１０〜３０塩基長、１５〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。具体例として、前記相補鎖は、例えば、配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。
【０１１５】
前記標識化相補鎖において、前記標識物質は、例えば、前記相補鎖のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよい。前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の３’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の５’末端に連結することが好ましく、前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の５’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の３’末端に連結することが好ましい。
【０１１６】
前記標識物質は、特に制限されず、前述した例示を援用でき、中でも前記蛍光物質および前記色素が好ましい。
【０１１７】
前記蛍光偏光法を採用する場合、本発明の検出方法は、例えば、前記試料と前記標識化核酸分子とを接触させ、前記試料中のコルチゾールと前記標識化核酸分子とを結合させる接触工程と、前記標識化核酸分子に偏光励起光を照射して、前記標識化核酸分子の偏光度を測定する測定工程と、前記測定工程における測定結果と評価基準とを比較し、コルチゾールと前記標識化核酸分子との結合を検出する工程を検出する検出工程を含むことが好ましい。
【０１１８】
前記測定工程において、前記偏光励起光の波長および前記偏光度の検出波長は、特に制限されず、例えば、前記標識物質の種類に応じて適宜設定できる。具体例として、前記標識物質がＴＹＥ６６５の場合、前記偏光励起光の波長は、例えば、６２０〜６８０ｎｍであり、偏光度の検出波長は、例えば、６６０〜８００ｎｍである。前記偏光励起光の照射時間は、特に制限されず、例えば、１ナノ〜５ナノ秒があげられる。
【０１１９】
前記検出工程において、前記評価基準は、例えば、予め決定してもよいし、測定ごとに決定してもよい。前記評価基準としては、例えば、コルチゾール未結合の基準、コルチゾール結合の基準が設定できる。前者の基準は、例えば、コルチゾールが結合していない前記標識化核酸分子のみの偏光度であり、後者の基準は、例えば、コルチゾールが結合した前記標識化核酸分子の偏光度である。
【０１２０】
前者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも高ければ、コルチゾールが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのコルチゾールが存在すると判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または低ければ、コルチゾールが存在しないと判断できる。前者の基準は、例えば、前記接触工程前の前記標識化核酸分子の偏光度でもよい。
【０１２１】
また、後者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも低ければ、コルチゾールが存在しないと判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または高ければ、コルチゾールが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのコルチゾールが存在すると判断できる。
【０１２２】
また、前記基準は、コルチゾールの量と偏光度との相関関係であってもよい。例えば、複数の既知濃度のコルチゾールと所定量の前記標識化核酸分子とを接触させ、各濃度のコルチゾールに結合した前記標識化核酸分子の偏光度を測定することにより、前記相関関係を示す相関式が得られる。そして、この相関式と、前記測定工程における測定値とから、前記試料におけるコルチゾールの量を判断することができる。
【０１２３】
また、本発明の核酸分子として、前記本発明のコルチゾール検出用センサを使用する場合、例えば、酸化還元反応の検出または蛍光発生の検出によって、前記コルチゾールの検出を行うことができる。
【０１２４】
（４）検出試薬および検出キット
本発明の検出キットは、前記本発明のコルチゾール結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記コルチゾールの検出等を行うことができる。
【０１２５】
本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のセンサを含んでもよい。また、前記本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、緩衝液、使用説明書等があげられる。
【０１２６】
本発明の検出キットにおいて、例えば、前記核酸分子および前記緩衝液等のその他の構成要素は、それぞれ別個の容器に収容されてもよいし、同一の容器に混合または未混同で収容されてもよい。前記核酸分子と前記その他の構成要素とが同一の容器に混合して収容されている場合、本発明のキットは、検出試薬ということもできる。
【０１２７】
＜ストレス評価試薬および評価キット＞
本発明のストレス評価試薬は、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のストレス評価キットは、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の評価試薬および評価キットは、前記本発明の核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の評価試薬および評価キットを使用すれば、後述するように、例えば、ストレス評価を行うことができる。本発明の評価試薬および評価キットは、例えば、前記本発明の核酸分子、検出試薬、検出方法等の説明を援用できる。
【０１２８】
＜ストレス評価方法＞
本発明のストレス評価方法は、前述のように、被検者の試料と前記本発明の核酸分子とを接触させる接触工程、前記試料中のコルチゾールと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のコルチゾールを検出する検出工程、および前記検出工程における前記コルチゾール量を、基準値と比較することにより、ストレスに関する情報を取得する取得工程を含むことを特徴とする。本発明の評価方法は、前記本発明核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。
【０１２９】
本発明の評価方法は、例えば、本発明の核酸分子および本発明の検出方法等の説明を援用できる。また、本発明の評価方法において、前記接触工程および前記検出工程は、前記本発明の検出方法の説明を援用できる。
【０１３０】
前記被検者は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、前述のように、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳類があげられる。
【０１３１】
前記基準値は、例えば、ストレスを負荷していない状態（非負荷状態）および／またはストレスを負荷した状態（負荷状態）の健常者から単離した試料を用いて、得ることができる。前記基準値は、例えば、前記被検者の試料と同時に測定してもよいし、予め測定してもよい。前記非負荷状態および前記負荷状態は、例えば、公知のストレステストにより実施できる。
【０１３２】
前記取得工程において、前記被検者のストレスに関する情報の取得方法は、特に制限されず、前記基準値の種類によって適宜決定できる。具体例として、前記被検者の試料におけるコルチゾールの量が、前記非負荷状態の健常者の試料におけるコルチゾールの量より高い場合、前記負荷状態の健常者の試料におけるコルチゾール量と同じ場合（有意差がない場合）、および／または、前記負荷状態の健常者の試料におけるコルチゾール量より有意に高い場合、前記被検者は、ストレス状態であるとの情報を取得できる。また、前記被検者の試料におけるコルチゾールの量が、前記非負荷状態の健常者の試料におけるコルチゾールの量より低い場合、前記非負荷状態の健常者の試料におけるコルチゾール量と同じ場合（有意差がない場合）、および／または、前記負荷状態の健常者の試料におけるコルチゾール量より有意に低い場合、前記被検者は、非ストレス状態であるとの情報を取得できる。
【０１３３】
＜コルチゾール関連疾患の試験試薬および試験キット＞
本発明のコルチゾール関連疾患の試験試薬（診断試薬）は、前述のように、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のコルチゾール関連疾患の試験キット（診断キット）は、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の試験試薬および試験キットは、前記本発明の核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の試験試薬および試験キットを使用すれば、後述するように、例えば、コルチゾール関連疾患の罹患可能性の試験を行うことができる。本発明の試験試薬および試験キットは、例えば、前記本発明の核酸分子、検出試薬、検出方法等の説明を援用できる。
【０１３４】
＜コルチゾール関連疾患の罹患可能性を試験する方法＞
本発明のコルチゾール関連疾患の罹患可能性を試験する方法は、前述のように、被検者の試料と前記本発明の核酸分子とを接触させる接触工程、前記試料中のコルチゾールと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のコルチゾールを検出する検出工程、および前記検出工程における前記コルチゾールの量を、基準値と比較することにより、コルチゾール関連疾患の罹患の可能性を試験する試験工程を含むことを特徴とする。本発明の評価方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。
【０１３５】
本発明の試験方法は、例えば、本発明の核酸分子および本発明の検出方法、評価方法等の説明を援用できる。また、本発明の試験方法において、前記接触工程および前記検出工程は、前記本発明の検出方法の説明を援用できる。
【０１３６】
本発明の試験方法によれば、例えば、コルチゾール関連疾患（以下、「関連疾患」ともいう）の発症の可能性、関連疾患の発症の有無、関連疾患の進行度および予後の状態等を評価できる。前記関連疾患は、例えば、前記コルチゾールの増加または減少により生じる疾患である。具体例として、前記コルチゾールの減少により生じる関連疾患としては、例えば、アジソン病、先天性副腎低形成症、先天性副腎皮質過形成症、下垂体腫瘍、下垂体性副腎皮質機能低下症、視床下部性副腎皮質機能低下症等があげられる。前記コルチゾールの増加により生じる関連疾患としては、例えば、クッシング病、クッシング症候群、グルココルチコイド不応症等があげられる。
【０１３７】
前記基準値は、特に制限されず、例えば、健常者、関連疾患患者および関連疾患のステージごとの関連疾患患者のコルチゾールの量があげられる。予後の評価の場合、前記基準値は、例えば、同じ被検者の治療後（例えば、治療直後）のコルチゾールの量であってもよい。
【０１３８】
前記基準値は、例えば、健常者および／または関連疾患患者から単離した試料（以下、「基準試料」ともいう。）を用いて、得ることができる。また、予後の評価の場合、例えば、同じ被検者から治療後に単離した基準試料を用いてもよい。前記基準値は、例えば、前記被検者の試料と同時に測定してもよいし、予め測定してもよい。
【０１３９】
前記試験工程において、被検者の関連疾患の罹患危険度の評価方法は、特に制限されず、前記関連疾患および前記基準値の種類によって適宜決定できる。具体例として、コルチゾールの増加により生じる疾患の場合、前記被検者の試料におけるコルチゾールの量が、前記健常者の基準試料におけるコルチゾールの量よりも有意に高い場合、前記関連疾患患者の基準試料におけるコルチゾールの量と同じ場合（有意差がない場合）、および／または、前記関連疾患患者の基準試料におけるコルチゾールの量よりも有意に高い場合、前記被検者は、関連疾患に罹患する危険性があるまたは危険性が高いと評価できる。また、前記被検者の試料におけるコルチゾールの量が、前記健常者の基準試料におけるコルチゾールの量と同じ場合（有意差が無い場合）、前記健常者の基準試料におけるコルチゾールの量よりも有意に低い場合、および／または、前記関連疾患患者の基準試料におけるコルチゾールの量よりも有意に低い場合、前記被検者は、関連疾患に罹患する危険性が無いまたは危険性が低いと評価できる。他方、コルチゾールの減少により生じる疾患の場合、前記被検者の試料におけるコルチゾールの量が、前記健常者の基準試料におけるコルチゾールの量よりも有意に低い場合、前記関連疾患患者の基準試料におけるコルチゾールの量と同じ場合（有意差がない場合）、および／または、前記関連疾患患者の基準試料におけるコルチゾールの量よりも有意に低い場合、前記被検者は、関連疾患に罹患する危険性があるまたは危険性が高いと評価できる。また、前記被検者の試料におけるコルチゾールの量が、前記健常者の基準試料におけるコルチゾールの量と同じ場合（有意差が無い場合）、前記健常者の基準試料におけるコルチゾールの量よりも有意に高い場合、および／または、前記関連疾患患者の基準試料におけるコルチゾールの量よりも有意に高い場合、前記被検者は、関連疾患に罹患する危険性が無いまたは危険性が低いと評価できる。
【実施例】
【０１４０】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
【０１４１】
［実施例１］
各アプタマーについて、コルチゾールに対する結合能を確認した。
【０１４２】
（１）アプタマー
前記表１Ａ〜Ｂのポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。前記配列番号５、６、１２、１３、および１９のアプタマーは、前記表１Ａ〜Ｂにおいて下線で示すチミンが、前記ＫＳ９のヌクレオチド残基（前記式（１０）で示すヌクレオチド残基）である。前記配列番号７、８、１６、および２０のアプタマーは、前記表１Ａ〜Ｂにおいて下線で示すチミンが、前記ＮＧ７のヌクレオチド残基（前記式（９）で示すヌクレオチド残基）であり、下線で示すアデニンが、前記ＭＫ４のヌクレオチド残基（前記式（１１）で示すヌクレオチド残基）である。前記配列番号９〜１１、１７、および１８のアプタマーは、前記表１Ａ〜Ｂにおいて下線で示すチミンが、前記ＮＧ７のヌクレオチド残基（前記式（９）で示すヌクレオチド残基）である。各ポリヌクレオチドは、ＤＮＡとした。配列番号１〜２０の塩基配列の各アプタマーの推定二次構造は、それぞれ、前記式（４−１）〜（４−２０）の通りである。ただし、各アプタマーの二次構造は、これに限定されない。
【０１４３】
（２）相補鎖
前記配列番号２１のポリヌクレオチドを合成し、相補鎖とした。前記相補鎖の５’末端は、ＴＹＥ６６５で標識した。
【０１４４】
（３）サンプルの調製
まず、チューブに、２× SB1T buffer  ２５μＬを添加し、さらに、１００ｎｍｏｌ／Ｌの実施例のアプタマー溶液  ５μＬと、１００ｎｍｏｌ／Ｌの相補鎖溶液  ５μＬを添加した。前記２× SB1T bufferの組成は、８０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、および０．０２％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．５とした。
【０１４５】
得られた混合液を、ヒートブロックで９５℃、５分間インキュベートした。つぎに、前記混合液を、室温（約２５℃、以下同様）で１５分静置し、その温度を室温に戻すことにより、前記実施例のアプタマーと、前記相補鎖とで二本鎖を形成させた。さらに、前記混合液に蒸留水  １４．５μＬを添加し、撹拌した。そして、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解した１０ｍｍｏｌ／Ｌ  コルチゾール液  ０．５μＬを添加し、攪拌することにより、サンプルを調製した。前記サンプルにおけるＤＭＳＯの濃度は、１％（ｖ／ｖ）である。
【０１４６】
なお、前記サンプルの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｎｍｏｌ／Ｌ  アプタマー、１０ｎｍｏｌ／Ｌ  相補鎖、１００μｍｏｌ／Ｌ  コルチゾール、１％  ＤＭＳＯであり、ｐＨは、７．５である。
【０１４７】
前記撹拌後、前記サンプルを室温で３０分静置した。つぎに、前記サンプル  ５０μＬをプレート（Greiner 384 well flat bottom black plate）に移し、光学分析機器（Tecan infinite M1000 pro）を用いて、偏光度を測定した。測定時の励起波長は、６３５ｎｍとし、蛍光波長は、６７０ｎｍを測定した。そして、前記実施例のアプタマーおよびコルチゾール未添加の相補鎖のみのサンプル（without(w/o) aptamer）の偏光度を２０ｍＰとし、コルチゾール添加前のサンプルの偏光度（Ａ）から、コルチゾール添加後のサンプルの偏光度（Ｂ）を引くことにより、各サンプルの偏光度の相対値（ΔＦＰ＝Ａ−Ｂ）を算出した。これらの結果を図１に示す。
【０１４８】
図１は、蛍光偏光度の結果を示すグラフである。図１において、横軸は、比較例（without(w/o) aptamer）および実施例のアプタマーの種類を示し、縦軸は、蛍光偏光度（ΔＦＰ）を示す。図１に示すように、実施例のアプタマーは、コルチゾールに結合した。中でも、配列番号１１および１７のアプタマーの蛍光偏光度が高く、コルチゾールに対して優れた結合能を示した。
【０１４９】
［実施例２］
本発明の核酸分子が、コルチゾールに対して優れた結合性を示すことを確認した。
【０１５０】
前記配列番号１１のアプタマーを使用し、本発明のコルチゾール結合アプタマーの検出感度の測定を行った。具体的には、実施例のアプタマーとして、配列番号１１のアプタマーのみを用い、前記サンプルの調製において、サンプル中のコルチゾールの終濃度が、０．１、１、１０、１００、または１０００μｍｏｌ／Ｌとなるようにコルチゾール液を添加した以外は、前記実施例１と同様にして試験を行った。これらの結果を図２に示す。
【０１５１】
図２は、検出感度を示すグラフである。図２において、横軸は、コルチゾールの濃度を示し、縦軸は、蛍光偏光度（ΔＦＰ）を示す。図２に示すように、配列番号１１のアプタマーは、コルチゾール濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌという低濃度であっても検出できた。また、これらの結果を用い、４パラメーターロジスティック曲線を算出したところ、配列番号１１のアプタマーにおける解離定数（Ｋｄ値）は１．１７μｍｏｌ／Ｌであった。
【０１５２】
これらの結果から、本発明の核酸分子は、コルチゾールに対して優れた結合性を示すことがわかった。
【０１５３】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
【０１５４】
＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、コルチゾール結合核酸分子。
（ａ）配列番号１から２０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチド
（付記２）
前記結合核酸分子が、塩基が修飾基で修飾された修飾塩基を含む、付記１記載のコルチゾール結合核酸分子。
（付記３）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミン塩基を含む、付記２記載のコルチゾール結合核酸分子。
（付記４）
前記修飾チミン塩基が、下記式（１）または（２）で表される修飾チミン塩基を含む、付記３記載のコルチゾール結合核酸分子。
【化１】
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【化２】
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（付記５）
前記修飾塩基が、修飾基で修飾された修飾プリン塩基を含む、付記２から４のいずれかに記載のコルチゾール結合核酸分子。
（付記６）
前記修飾プリン塩基が、下記式（３）で表される修飾プリン塩基である、付記５記載のコルチゾール結合核酸分子。
【化３】
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（付記７）
前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、下記（ｅ）のポリヌクレオチドである、付記１から６のいずれかに記載のコルチゾール結合核酸分子。
（ｅ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、下記式（４−１）から（４−２０）で表されるいずれかの二次構造を形成可能であり、コルチゾールに結合するポリヌクレオチド
【化４−１】
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【化４−２】
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【化４−３】
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【化４−４】
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【化４−５】
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【化４−６】
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【化４−７】
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【化４−８】
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【化４−９】
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【化４−１０】
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【化４−１１】
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【化４−１２】
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【化４−１３】
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【化４−１４】
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【化４−１５】
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【化４−１６】
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【化４−１７】
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【化４−１８】
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【化４−１９】
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【化４−２０】
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（付記８）
相補鎖を含み、
前記相補鎖が、前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、付記１から７のいずれかに記載のコルチゾール結合核酸分子。
（付記９）
前記相補鎖が、配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、付記８記載のコルチゾール結合核酸分子。
（付記１０）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記１から９のいずれかに記載のコルチゾール結合核酸分子。
（付記１１）
付記１から１０のいずれかに記載のコルチゾール結合核酸分子を含むことを特徴とする、コルチゾール検出用センサ。
（付記１２）
付記１から１０のいずれかに記載のコルチゾール結合核酸分子を含むことを特徴とする、コルチゾール検出試薬。
（付記１３）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のコルチゾールを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記１から１０のいずれかに記載のコルチゾール結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のコルチゾールと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のコルチゾールを検出することを特徴とする、コルチゾールの検出方法。
（付記１４）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも１つである、付記１３記載のコルチゾールの検出方法。
（付記１５）
付記１から１０のいずれかに記載のコルチゾール結合核酸分子を含むことを特徴とする、ストレス評価試薬。
（付記１６）
被検者の試料と付記１から１０のいずれかに記載のコルチゾール結合核酸分子とを接触させる接触工程、
前記試料中のコルチゾールと前記コルチゾール結合核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のコルチゾールを検出する検出工程、および
前記検出工程における前記コルチゾール量を、基準値と比較することにより、ストレスに関する情報を取得する取得工程を含むことを特徴とする、ストレス評価方法。
（付記１７）
付記１から１０のいずれかに記載のコルチゾール結合核酸分子を含むことを特徴とする、コルチゾール関連疾患の試験試薬。
（付記１８）
被検者の試料と付記１から１０のいずれかに記載のコルチゾール結合核酸分子とを接触させる接触工程、
前記試料中のコルチゾールと前記コルチゾール結合核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のコルチゾールを検出する検出工程、および
前記検出工程における前記コルチゾール量を、基準値と比較することにより、コルチゾール関連疾患の罹患の可能性を試験する試験工程を含むことを特徴とする、コルチゾール関連疾患の罹患可能性を試験する方法。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
以上のように、本発明のコルチゾール結合核酸分子は、コルチゾールと結合可能である。このため、本発明のコルチゾール結合核酸分子によれば、例えば、試料中のコルチゾールとの結合の有無によって、優れた精度で、コルチゾールを検出できる。したがって、本発明のコルチゾール結合核酸分子は、例えば、予防医学、健康管理、感染症等の診断、およびストレスの診断等の分野におけるコルチゾールの検出に、極めて有用なツールといえる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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