(57)【要約】【課題】本発明の課題は、グルコース応答性および移植後の血糖値の低下能のうち、少なくともいずれか一方を向上させる、膵島を含む組成物、膵島又は膵島細胞を含む細胞構造体、膵島移植キット、膵島細胞移植治療剤、及び血糖低下剤を提供すること、並びにグルコース応答性を向上させることができる、膵島を含む組成物、膵島を含むキット、膵島細胞移植治療剤、及び血糖低下剤を提供することである。【解決手段】本発明によれば、Ａ：生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体、及びＢ：膵島、を含む組成物、並びに膵島と、少なくとも１種類の幹細胞からなるスフェロイドとを含む組成物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵島と、少なくとも１種類の幹細胞からなるスフェロイドとを含み、スフェロイドの個数が、膵島の個数に対して０．５：１〜１０：１である組成物。
【請求項２】
前記幹細胞として、体性幹細胞を少なくとも含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記幹細胞として、間葉系幹細胞を少なくとも含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
スフェロイドが、１種類の幹細胞からなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記膵島が、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記スフェロイドが、直径１００μｍ〜５００μｍの球状である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
複数個の前記膵島と、複数個の前記スフェロイドとを、液体培地中に含む組成物である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
複数個の前記膵島と、複数個の前記スフェロイドとが、液体培地中で細胞塊を形成している、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
複数個の前記膵島と、複数個の前記スフェロイドとが、液体培地中で浮遊している、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
下記式で表されるＳＩが１．７以上である、請求項１から９の何れか一項に記載の組成物。
ＳＩ＝２０ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養時のインスリン量／３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養時のインスリン量
【請求項１１】
生体への膵島移植のために使用する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
膵島と、少なくとも１種類の幹細胞からなるスフェロイドとを含み、スフェロイドの個数が、膵島の個数に対して０．５：１〜１０：１であるキット。
【請求項１３】
前記幹細胞として、体性幹細胞を少なくとも含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記幹細胞として、間葉系幹細胞を少なくとも含む、請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項１５】
スフェロイドが、１種類の幹細胞からなる、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
前記膵島が、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
前記スフェロイドが、直径１００μｍ〜５００μｍの球状である、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
生体への膵島移植のために使用する、請求項１２から１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
請求項１から１１の何れか一項に記載の組成物、又は請求項１２から１８の何れか一項に記載のキットを含む、膵島移植治療剤。
【請求項２０】
投与部位が皮下又は筋肉内である、請求項１９に記載の膵島移植治療剤。
【請求項２１】
請求項１から１１の何れか一項に記載の組成物、又は請求項１２から１８の何れか一項に記載のキットを含む、血糖低下剤。
【請求項２２】
投与部位が皮下又は筋肉内である、請求項２１に記載の血糖低下剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵島を含む組成物、膵島又は膵島細胞を含む細胞構造体、膵島移植キット、膵島細胞移植治療剤、及び血糖低下剤に関する。本発明はさらに、膵島を含む組成物、膵島を含むキット、膵島移植治療剤、及び血糖低下剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を図る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織を、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。近年では、細胞を使った治療が徐々に実現されつつある。例えば、自家細胞を用いた培養表皮、自家軟骨細胞を用いた軟骨治療、間葉系幹細胞を用いた骨再生治療、筋芽細胞を用いた心筋細胞シート治療、角膜上皮シートによる角膜再生治療、及び神経再生治療などが挙げられる。
【０００３】
特許文献１には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献１に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。特許文献１の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて高い細胞生存活性が実証されている。特許文献２には、生体親和性を有する高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞移植用細胞構造体が記載されている。特許文献２の実施例においては、細胞移植用細胞構造体を用いて血管形成が評価されている。
【０００４】
糖尿病患者のうち重症糖尿病患者は、生涯にわたってインスリン注射を受ける必要がある。糖尿病患者をインスリン注射から解放する治療法として、インスリンを産生する膵島を、糖尿病患者の肝臓内に移植して永久定着させる移植治療が行われている。膵臓中の膵島には、インスリンを分泌するβ細胞が存在しており、膵島を移植することで、インスリン分泌が可能になると考えられている。
【０００５】
また自己の膵臓からインスリン分泌ができない患者に対して、膵島移植という移植治療が行われている。膵臓中の膵島には、インスリンを分泌するβ細胞が存在しており、膵島を移植することで、インスリン分泌が可能になると考えられている。膵島移植の方法としては、現在、門脈から膵島を血液中に注入するエドモントンプロトコル法による膵島移植が行われている。
【０００６】
非特許文献１には、インビトロでのグルコース応答性試験において、膵島のみの場合には培養１０日後にグルコース応答性が消失するが、分散した膵島細胞と間葉系幹細胞の場合、及び膵島細胞と間葉系幹細胞の融合体の場合には培養１０日後でもグルコース応答性が維持されることが示されている（page 5, 右欄4-6行目、Fig.5-b）。また、非特許文献１において、Vivoでの血糖値は、膵島のみの場合（Group3）と、膵島と間葉系幹細胞とを共培養した場合(Group 6)とについて同様であった（Fig.8a）。非特許文献２には、in vivoでは膵島のみを移植した場合には血糖値が低下しないのに対し、間葉系幹細胞を膵島と共に移植することにより血糖値が低下することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号
【特許文献２】特開２０１４−１２１１４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yanai G et al. (2013) Electrofusion of Mesenchymal Stem Cells and Islet Cells for Diabetes Therapy: A Rat Model. PLOS ONE, Volume 8, Issue 5, e64499
【非特許文献２】Ito T et al. (2010) Mesencymal stem Cell and Islet Co-Transplantation Promotes Graft Revascularization and Function. Transplantation , Volume 89, Number 12, 1438-1445
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
膵島の移植方法としては、現在、門脈から膵島を血液中に注入するエドモントンプロトコルという方法による膵島移植が行われているが、移植後のインスリン離脱率が低いことが課題となっている。原因の一つとして、移植後の膵島の細胞活性（グルコース応答性）を維持できないことが挙げられる。膵島細胞のグルコース応答性を維持することができれば、移植後の血糖値を低下することができ、移植後のインスリン離脱率を上げることができると考えられる。
【００１０】
特許文献１及び特許文献２においては、膵島を移植することについては記載がなく、また膵島細胞と幹細胞とを組み合わせて細胞構造体とすることについても記載がない。また特許文献１及び特許文献２においては、膵島細胞又は膵島を用いた実施例の記載はなく、移植後の膵島細胞のグルコース応答性に関する記載もない。非特許文献１においては、分散した膵島細胞と間葉系幹細胞の場合、及び膵島細胞と間葉系幹細胞の融合体の場合には培養１０日後でもグルコース応答性が保たれることがインビトロの試験により示されているが、インビボでの移植後の膵島のグルコース応答性が十分であるかどうか、血糖値の低下が十分であるかどうか、については不明である。非特許文献２においては、膵島と間葉系幹細胞とを移植することによって血糖値が低下することが示されているが、移植膵島の個数を減らすためにも、膵島のグルコース応答性を更に改善する方法が求められている。
【００１１】
上記の通り、移植後の膵島のグルコース応答性をさらに向上する手法、または、血糖値を低下させる手法、の開発が望まれている。本発明は、グルコース応答性および移植後の血糖値の低下能のうち、少なくともいずれか一方を向上させる、膵島を含む組成物、膵島又は膵島細胞を含む細胞構造体、及び膵島移植キットを提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記組成物、細胞構造体又は膵島移植キットを含む、膵島細胞移植治療剤、及び血糖低下剤を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、グルコース応答性を向上させることができる、膵島を含む組成物、及び膵島を含むキットを提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記組成物又はキットを含む、膵島細胞移植治療剤、及び血糖低下剤を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、膵島又は膵島細胞に高分子ブロックを混合して培養することにより、高分子ブロックを使用しない場合よりもグルコース応答性が向上することを示した。また、膵島と高分子ブロックとの混合物を糖尿病マウスに移植すると、膵島でのインスリン産生量が向上し、血糖値を低下させられることを明らかにした。さらに本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、膵島と、間葉系幹細胞等の幹細胞のスフェロイドとを含む組成物を使用することにより、膵島と、分散した幹細胞とを含む組成物を使用する場合よりも、移植後の膵島のグルコース応答性が向上することを示した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１３】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）Ａ：生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体、及び
Ｂ：膵島、
を含む組成物。
（２）上記膵島が、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である、（１）に記載の組成物。
（３）上記細胞として、少なくとも間葉系幹細胞を含む、（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）上記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、（１）から（３）の何れかに記載の組成物。
（５）上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、（１）から（４）の何れかに記載の組成物。
（６）上記細胞構造体の厚さ又は直径が１００μｍ以上３ｃｍ以下である、（１）から（５）の何れかに記載の組成物。
（７）上記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、（１）から（６）の何れかに記載の組成物。
（８）上記リコンビナントペプチドが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（７）に記載の組成物。
（９）上記生体親和性高分子ブロックにおいて、上記生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、（１）から（８）の何れかに記載の組成物。
（１０）上記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、（１）から（９）の何れかに記載の組成物。
【００１４】
（１１）生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞と、膵島とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体。
（１２）上記膵島が、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である、（１１）に記載の細胞構造体。
（１３）上記細胞として、少なくとも間葉系幹細胞を含む、（１１）又は（１２）に記載の細胞構造体。
（１４）上記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、（１１）から（１３）の何れかに記載の細胞構造体。
（１５）生体親和性高分子ブロックと、少なくとも２種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体であって、上記細胞として、少なくとも膵島細胞及び幹細胞を含む細胞構造体。
（１６）上記膵島細胞が、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞を含む、（１５）に記載の細胞構造体。
（１７）上記幹細胞として、少なくとも間葉系幹細胞を含む、（１５）又は（１６）に記載の細胞構造体。
（１８）上記細胞構造体が、膵島細胞及び幹細胞を含む全細胞について細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、（１５）から（１７）の何れかに記載の細胞構造体。
（１９）上記細胞構造体が、膵島細胞及び幹細胞を含む全細胞に対し、１０個数％以上９０個数％以下の膵島細胞を含む、（１５）から（１８）の何れかに記載の細胞構造体。
【００１５】
（２０）下記式で表されるＳＩが３．０以上である、（１１）から（１９）の何れかに記載の細胞構造体。
ＳＩ＝２０ｍＭグルコース培地で培養時のインスリン量／３ｍＭグルコース培地で培養時のインスリン量
（２１）上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、（１１）から（２０）の何れかに記載の細胞構造体。
（２２）上記細胞構造体の厚さ又は直径が１００μｍ以上３ｃｍ以下である、（１１）から（２１）の何れか記載の細胞構造体。
（２３）上記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、（１１）から（２２）の何れかに記載の細胞構造体。
（２４）上記リコンビナントペプチドが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（２３）に記載の細胞構造体。
（２５）上記生体親和性高分子ブロックにおいて、上記生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、（１１）から（２４）の何れかに記載の細胞構造体。
（２６）上記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、（１１）から（２５）の何れかに記載の細胞構造体。
【００１６】
（２７）Ａ：生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体、及び
Ｂ：膵島、
を含む、膵島移植キット。
（２８）上記膵島が、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である、（２７）に記載の膵島移植キット。
（２９）上記細胞が、間葉系幹細胞を含む、（２７）又は（２８）に記載の膵島移植キット。
（３０）上記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１ μｇ以上１ μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、（２７）から（２９）の何れかに記載の膵島移植キット。
（３１）上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、（２７）から（３０）の何れかに記載の膵島移植キット。
（３２）上記細胞構造体の厚さ又は直径が１００μｍ以上３ｃｍ以下である、（２７）から（３１）の何れかに記載の膵島移植キット。
（３３）上記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、（２７）から（３２）の何れかに記載の膵島移植キット。
（３４）上記リコンビナントペプチドが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（３３）に記載の膵島移植キット。
（３５）上記生体親和性高分子ブロックにおいて、上記生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、（２７）から（３４）の何れかに記載の膵島移植キット。
（３６）上記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、（２７）から（３５）の何れかに記載の膵島移植キット。
【００１７】
（３７）（１）から（１０）の何れかに記載の組成物、（１１）から（２６）の何れかに記載の細胞構造体又は（２７）から（３６）の何れかに記載の膵島移植キットを含む、膵島細胞移植治療剤。
(３８)投与部位が皮下又は筋肉内である、（３７）に記載の細胞移植治療剤。
（３９）（１）から（１０）の何れかに記載の組成物、（１１）から（２６）の何れかに記載の細胞構造体又は（２７）から（３６）の何れかに記載の膵島移植キットを含む、血糖低下剤。
（４０）投与部位が皮下または筋肉内である、（３９）に記載の血糖低下剤。
【００１８】
さらに本発明によれば、以下の発明が提供される。
（４１）（１）から（１０）の何れかに記載の組成物、（１１）から（２６）の何れかに記載の細胞構造体又は（２７）から（３６）の何れかに記載の膵島移植キットを、膵島又は膵島細胞の移植を必要とする患者に移植する工程を含む、細胞移植方法。
（４２）（１）から（１０）の何れかに記載の組成物、（１１）から（２６）の何れかに記載の細胞構造体又は（２７）から（３６）の何れかに記載の膵島移植キットを、血糖低下を必要とする患者に移植する工程を含む、血糖低下方法。
【００１９】
（４３）膵島細胞移植治療において使用するための、（１）から（１０）の何れかに記載の組成物。
（４４）膵島細胞移植治療において使用するための、（１１）から（２６）の何れかに記載の細胞構造体。
（４５）膵島細胞移植治療において使用するための、（２７）から（３６）の何れかに記載の膵島移植キット。
（４６）血糖低下処置において使用するための、（１）から（１０）の何れかに記載の組成物。
（４７）血糖低下処置において使用するための、（１１）から（２６）の何れかに記載の細胞構造体。
（４８）血糖低下処置において使用するための、（２７）から（３６）の何れかに記載の膵島移植キット。
【００２０】
（４９）  膵島細胞移植治療剤の製造のための、（１）から（１０）の何れかに記載の組成物、（１１）から（２６）の何れかに記載の細胞構造体又は（２７）から（３６）の何れかに記載の膵島移植キットの使用。
（５０）  血糖低下剤の製造のための、（１）から（１０）の何れかに記載の組成物、（１１）から（２６）の何れかに記載の細胞構造体又は（２７）から（３６）の何れかに記載の膵島移植キットの使用。
【００２１】
さらに本発明によれば、以下の発明が提供される。
（５１）膵島と、少なくとも１種類の幹細胞からなるスフェロイドとを含む組成物。
（５２）上記幹細胞として、体性幹細胞を少なくとも含む、（５１）に記載の組成物。
（５３）上記幹細胞として、間葉系幹細胞を少なくとも含む、（５１）又は（５２）に記載の組成物。
（５４）スフェロイドが、１種類の幹細胞からなる、（５１）から（５３）のいずれか一に記載の組成物。
（５５）上記膵島が、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である、（５１）から（５４）のいずれか一に記載の組成物。
（５６）上記スフェロイドが、直径１００μｍ〜５００μｍの球状である、（５１）から（５５）のいずれか一に記載の組成物。
【００２２】
（５７）複数個の上記膵島と、複数個の上記スフェロイドとを、液体培地中に含む組成物である、（５１）から（５６）のいずれか一に記載の組成物。
（５８）複数個の上記膵島と、複数個の上記スフェロイドとが、液体培地中で細胞塊を形成している、（５１）から（５７）のいずれか一に記載の組成物。
（５９）複数個の上記膵島と、複数個の上記スフェロイドとが、液体培地中で浮遊している、（５１）から（５７）のいずれか一に記載の組成物。
（６０）下記式で表されるＳＩが１．７以上である、（５１）から（５９）の何れか一に記載の組成物。
ＳＩ＝２０ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養時のインスリン量／３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養時のインスリン量
（６１）生体への膵島移植のために使用する、（５１）から（６０）のいずれか一に記載の組成物。
【００２３】
（６２）膵島と、少なくとも１種類の幹細胞からなるスフェロイドとを含む、キット。
（６３）上記幹細胞として、体性幹細胞を少なくとも含む、（６２）に記載のキット。
（６４）上記幹細胞として、間葉系幹細胞を少なくとも含む、（６２）又は（６３）に記載のキット。
（６５）スフェロイドが、１種類の幹細胞からなる、（６２）から（６４）のいずれか一に記載のキット。
（６６）上記膵島が、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である、（６２）から（６５）のいずれか一に記載のキット。
（６７）上記スフェロイドが、直径１００μｍ〜５００μｍの球状である、（６２）から（６６）のいずれか一に記載のキット。
（６８）生体への膵島移植のために使用する、（６２）から（６７）のいずれか一に記載のキット。
【００２４】
（６９）（５１）から（６１）の何れか一に記載の組成物、又は（６２）から（６８）の何れか一に記載のキットを含む、膵島移植治療剤。
（７０）投与部位が皮下又は筋肉内である、（６９）に記載の膵島移植治療剤。
（７１）（５１）から（６１）の何れか一に記載の組成物、又は（６２）から（６８）の何れか一に記載のキットを含む、血糖低下剤。
（７２）投与部位が皮下又は筋肉内である、（７１）に記載の血糖低下剤。
【００２５】
さらに本発明によれば、以下の発明が提供される。
（７３）（５１）から（６１）の何れか一に記載の組成物、又は（６２）から（６８）の何れか一に記載のキットを、膵島の移植を必要とする患者に移植する工程を含む、膵島移植方法。
（７４）（５１）から（６１）の何れか一に記載の組成物、又は（６２）から（６８）の何れか一に記載のキットを、血糖低下を必要とする患者に移植する工程を含む、血糖低下方法。
（７５）膵島移植治療において使用するための、（５１）から（６１）の何れか一に記載の組成物。
（７６）膵島移植治療において使用するための、（６２）から（６８）の何れかに記載のキット。
（７７）血糖低下処置において使用するための、（５１）から（６１）の何れか一に記載の組成物。
（７８）血糖低下処置において使用するための、（６２）から（６８）の何れか一に記載のキット。
（７９）  膵島移植治療剤の製造のための、（５１）から（６１）の何れか一に記載の組成物又は（６２）から（６８）の何れか一に記載のキットの使用。
（８０）  血糖低下剤の製造のための、（５１）から（６１）の何れか一に記載の組成物又は（６２）から（６８）の何れか一に記載のキットの使用。
【発明の効果】
【００２６】
本発明による膵島を含む組成物、膵島又は膵島細胞を含む細胞構造体、膵島移植キット、膵島細胞移植治療剤、及び血糖低下剤によれば、グルコース応答性および移植後の血糖値の低下能のうち、少なくともいずれか一方を向上させることができる。
本発明による膵島を含む組成物、膵島を含むキット、膵島移植治療剤、及び血糖低下剤によれば、グルコース応答性を向上させることができ、また血糖値を低下させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、実施例における溶媒を凍結する際の温度プロファイルを示す。
【図２】図２は、糖尿病マウスへの細胞構造体及び細胞塊と膵島の皮下移植後の血糖値を測定した結果を示す。
【図３】図３は、糖負荷試験での血糖値正常化能力の検証（膵島２００個の場合）の結果を示す。
【図４】図４は、糖負荷試験での血糖値正常化能力の検証（膵島４００個の場合）の結果を示す。
【図５】図５は、糖尿病マウス皮下移植の４週間後における組織切片像を示す。上段はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）を示し、下段はインスリン免疫染色を示す。
【図６】図６は、膵島２００個の移植後の血糖値を示す。
【図７】図７は、膵島２００個の糖負荷試験の結果を示す。
【図８】図８は、膵島４００個の糖負荷試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の第一の態様は、上記（１）〜（５０）に記載した態様である。先ず、本発明の第一の態様について説明する。
［組成物、細胞構造体、及び膵島移植キット］
本発明の組成物は、
Ａ：生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体、及び
Ｂ：膵島、
を含む組成物である。
【００２９】
本発明の細胞構造体は、
生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞と、膵島とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体；又は
生体親和性高分子ブロックと、少なくとも２種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体であって、上記細胞として、少なくとも膵島細胞及び幹細胞を含む細胞構造体：
である。
なお、本発明の細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。
本発明の膵島移植キットは、
Ａ：生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体、及び
Ｂ：膵島、
を含む、膵島移植キットである。
【００３０】
本発明で言う組成物とは、細胞構造体と膵島とを含む組成物であり、細胞構造体と膵島とを含む任意の混合物を意味する。本発明の組成物としては、（ｉ）膵島が、細胞構造体の一部として細胞構造体に含まれて細胞構造体を形成している場合、（ｉｉ）膵島が、細胞構造体とは別個に存在している場合、又は（ｉｉｉ）膵島の一部が細胞構造体の一部として細胞構造体に含まれて細胞構造体を形成しているが、残りの膵島は細胞構造体とは別個に存在している場合、の何れでもよく、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の全てが本発明の範囲内のものである。また、本発明で言う膵島移植キットとは、細胞構造体と膵島とを、別個の形態で、但し一緒に組み合わせた状態で含むキットを意味する。
【００３１】
本発明の組成物、細胞構造体、及び膵島移植キットは、「生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体」を含むものであり、更に膵島細胞又は膵島を細胞構造体中に含むか、膵島を細胞構造体と組み合わせて含むものである。本発明の組成物、細胞構造体、及び膵島移植キットは、上記の構成を有することにより、移植後に膵島の高いグルコース応答性を達成することができる。
【００３２】
なお、特許文献１及び特許文献２においては、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されているが、膵島細胞及び幹細胞という特定の組み合わせを細胞構造体中に使用することの記載はない。本発明の細胞構造体のうち、「生体親和性高分子ブロックと、少なくとも２種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体であって、上記細胞として、少なくとも膵島細胞及び幹細胞を含む細胞構造体」については、高分子ブロック中に膵島細胞及び幹細胞の両方を含めることによって、高いグルコース応答性を達成することができることが特徴である。なお、本明細書中後記の実施例における比較例Ａ１（膵島のみ）と比較例Ａ３（膵島と生体親和性高分子ブロックからなる細胞構造体）との対比、並びに比較例Ａ４（膵島細胞のみ）と比較例Ａ６（膵島細胞と生体親和性高分子ブロックからなる細胞構造体）との対比から分かるように、膵島又は膵島細胞を単独で使用する場合と比較して、生体親和性高分子ブロックを使用した場合は、グルコース応答性は低下することが示されている。従って、膵島細胞と幹細胞と生体親和性高分子ブロックとを組み合わせた細胞構造体が、高いグルコース応答性を示すことは、生体親和性高分子ブロックを使用するとグルコース応答性は低下するという知見とは正反対であり、全く予想外な顕著な効果である。
【００３３】
（１）生体親和性高分子ブロック
本発明の組成物、細胞構造体及び膵島移植キットは、生体親和性高分子ブロックを含む。生体親和性高分子ブロックについて以下に説明する。
（１−１）生体性親和性高分子
生体性親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン及びＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的にはリコンビナントペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、及びキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、１．「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
【００３４】
リコンビナントペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン又はリコンビナントゼラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
【００３５】
本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基く、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ４）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００３６】
本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明の細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００３７】
本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明の細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００３８】
（１−２）架橋
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際及び生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られている。本発明ではグルタルアルデヒドを使用しない架橋方法を使用することが好ましい。本発明では、アルデヒド類又は縮合剤を使用しない架橋方法を使用することがより好ましい。即ち、本発明における生体親和性高分子ブロックは、好ましくは、グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックであり、より好ましくは、アルデヒド類又は縮合剤を含まない生体親和性高分子ブロックである。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
【００３９】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基及びグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００４０】
架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、更に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００４１】
（１−３）リコンビナントゼラチン
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、US特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００４２】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然セラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００４３】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下であり、より好ましくは２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であり、最も好ましくは１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である。
【００４４】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成及び配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００４５】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００４６】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
【００４７】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００４８】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは６、更に好ましくは８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００４９】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００５０】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍとして好ましくは２〜１０、好ましくは３〜５である。ｎは３〜１００が好ましく、１５〜７０がさらに好ましく、５０〜６５が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。
【００５１】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、  式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００５２】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。
【００５３】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。
【００５４】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００５５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
である。
【００５６】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００５７】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００５８】
（１−４）生体親和性高分子ブロック
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状及びシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状及び多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。
【００５９】
本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは１μｍ以上１０００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上７００μｍ以下であり、さらに好ましくは１０μｍ以上３００μｍ以下であり、さらに好ましくは１０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、さらに好ましくは５０μｍ以上１１０μｍ以下である。生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、より優れたグルコール応答性を達成することができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
【００６０】
ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６〜１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３〜１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５〜５３μｍの大きさのブロックとすることができる。
【００６１】
（１−５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子の多孔質体を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、顆粒の形態の生体親和性高分子ブロックを得ることができる。
【００６２】
生体親和性高分子の多孔質体を製造する際に、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下となる凍結工程を含めることによって、形成される氷は球状となる。この工程を経て、氷が乾燥されることで、球状の等方的な空孔（球孔）を持つ多孔質体が得られる。溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以上となる凍結工程を含まずに、凍結されることで、形成される氷は柱／平板状となる。この工程を経て、氷が乾燥されると、一軸あるいは二軸上に長い、柱状あるいは平板状の空孔（柱／平板孔）を持つ多孔質体が得られる。
【００６３】
本発明においては好ましくは、
生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度（“溶媒融点−３℃”）以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ；及び
上記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂ：
を含む方法により、生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
本発明ではさらに好ましくは、上記工程ｂで得られた多孔質体を粉砕することによって、顆粒の形態の生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
【００６４】
より好ましくは、上記工程ａにおいて、生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より７℃低い温度（“溶媒融点−７℃”）以下となる凍結処理により凍結することができる。
【００６５】
（２）膵島及び膵島細胞
本発明の組成物、細胞構造体、及び膵島移植キットは、膵島又は膵島細胞を含む。
膵島とは、別名ランゲルハンス氏島とも呼ばれる、平均約２０００個の膵島細胞より構成される細胞塊である。膵島は、グルカゴンを分泌するα細胞、インスリンを分泌するβ細胞、ソマトスタチンを分泌するδ細胞、グレリンを分泌するε細胞、及び膵ポリペプチドを分泌するＰＰ（pancreatic polypeptide；膵ポリペプチド）細胞の５種の細胞から構成される。
【００６６】
本発明で言う膵島細胞とは、上記の５種類のうちの少なくとも１種類を含むものであればよいが、少なくともβ細胞を含むことが好ましい。膵島細胞としては、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、及びＰＰ細胞の全てを含む混合物でもよい。
また、本発明の膵島細胞は、分化により膵島細胞になったものであってもよい。例えば、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞、間葉系幹細胞などの体性幹細胞を分化させて得られた膵島細胞も含むものとする。
本発明で使用する膵島又は膵島細胞としては、患者に移植した際に、患者の病的状態を回復することができる程度の生存性と機能とを有することが好ましい。膵島又は膵島細胞の機能としては、インスリンを分泌し、かつ移植後においてもグルコース応答性が維持されていることが好ましい。グルコース応答性については本明細書中後記する。
【００６７】
（３）膵島細胞以外の細胞
本発明では、膵島細胞以外の細胞を用いる場合がある。
Ａ：生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体、及び
Ｂ：膵島、
を含む、本発明の組成物及び膵島移植キットにおいては、上記の「少なくとも１種の細胞」として、膵島細胞、及び／又は膵島細胞以外の細胞を用いることができるが、好ましくは膵島細胞以外の細胞を用いることができる。
【００６８】
また、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞と、膵島とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている本発明の細胞構造体においては、上記の「少なくとも１種の細胞」として、膵島細胞、及び／又は膵島細胞以外の細胞を用いることができるが、好ましくは膵島細胞以外の細胞を用いることができる。
【００６９】
さらに、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも２種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体であって、上記細胞として、少なくとも膵島細胞及び幹細胞を含む細胞構造体においては、膵島細胞以外の細胞として、幹細胞が使用される。
【００７０】
膵島細胞以外の細胞は、細胞移植を行えるものであれば任意の細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する細胞は１種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、幹細胞（例えば、万能細胞、又は体性幹細胞）、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。
【００７１】
前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、又は毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。上記の中でも、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を使用することができ、好ましくは、ＭＳＣである。
【００７２】
（４）細胞構造体
本発明においては、生体親和性高分子ブロックと細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって細胞移植のために適した厚みを有することが可能となる。さらに、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元に配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞構造体が形成され、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を可能となる。
【００７３】
本発明の細胞構造体においては、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。生体親和性高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、生体親和性高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も生体親和性高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
【００７４】
また、生体親和性高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての生体親和性高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、生体親和性高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した生体親和性高分子ブロック間の距離、即ち、生体親和性高分子ブロックとその生体親和性高分子ブロックから最短距離に存在する生体親和性高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、好ましくは１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上２００μｍ以下であり、更に好ましくは５０μｍ以上１１０μｍ以下である。
【００７５】
なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではなく、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を可能とすることを意味するものである。
【００７６】
本発明における細胞構造体の厚さ又は直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、１００μｍ以上が好ましく、２００μｍ以上がより好ましく、２１５μｍ以上であることがさらに好ましく、４００μｍ以上がさらに好ましく、７３０μｍ以上であることが最も好ましい。厚さ又は直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、１００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは２００μｍ以上２ｃｍ以下である。細胞構造体の厚さ又は直径を上記の範囲内とすることにより、より優れたグルコール応答性を達成することができる。
但し、上記（ｉｉ）膵島が、細胞構造体とは別個に存在している実施態様の場合には、細胞構造体の厚さ又は直径は、膵島の大きさと同程度であることが好ましい。具体的には、好ましくは１００μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは、１５０μｍ以上３００μｍ以下、更に好ましくは、１５０μｍ以上２５０μｍ以下である。
【００７７】
本発明の細胞構造体においては、好ましくは、生体親和性高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域とがモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さ又は直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さ又は直径」とする。
【００７８】
本発明における細胞構造体では、細胞と生体親和性高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞１個当りの生体親和性高分子ブロックの比率が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、より好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。本発明の細胞構造体が、２種以上の細胞を含む場合、上記の「細胞１個当り」とは、「全部の細胞について細胞１個当り」を意味する。例えば、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも２種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体であって、上記細胞として、少なくとも膵島細胞及び幹細胞を含む細胞構造体の場合には、膵島細胞及び幹細胞を含む全細胞について細胞１個当り０．００００００１ μｇ以上１ μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含むことが好ましい。なお、「生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞と、膵島とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体」の場合、膵島に含まれる細胞（膵島細胞）は、上記「細胞１個当り」の「細胞」には含まれないものとする。
【００７９】
細胞と生体親和性高分子ブロックの比率を上記範囲とすることより、細胞をより均一に存在させることができるので好ましい。下限を上記範囲とすることにより、上記用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する生体親和性高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、生体親和性高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後述する培地に含まれる成分が挙げられる。
【００８０】
生体親和性高分子ブロックと、少なくとも２種の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体であって、上記細胞として、少なくとも膵島細胞及び幹細胞を含む細胞構造体の場合には、細胞構造体が、膵島細胞及び幹細胞を含む全細胞に対し、１０個数％以上９０個数％以下の膵島細胞を含むことが好ましく、２０個数％以上８０個数％以下の膵島細胞を含むことがより好ましく、３０個数％以上７０個数％以下の膵島細胞を含むことがさらに好ましく、４０個数％以上６０個数％以下の膵島細胞を含むことが特に好ましい。高いグルコース応答性を達成する観点から、膵島細胞の比率は上記範囲とすることが好ましい。
【００８１】
本発明の細胞構造体は、下記式で表されるＳＩが好ましくは３．０以上であり、より好ましくは３．１以上である。ＳＩの上限値は特に限定されないが、一般的には、５０以下であり、より好ましくは２０以下である。
ＳＩ＝２０ｍＭグルコース培地で培養時のインスリン量／３ｍＭグルコース培地で培養時のインスリン量
【００８２】
インスリン量の測定は、以下の方法により測定することができる。細胞構造体を、最初の１時間は３ｍＭグルコース培地で培養してインスリン分泌量を安定させ、次の１時間は３ｍＭグルコース培地で培養して低濃度グルコース中でのインスリン分泌量を測定し、最後の１時間は２０ｍＭグルコース培地で培養して高濃度グルコース中でのインスリン分泌量を測定する。培地としては３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）を用い、この培地にグルコース溶液を添加することで２０ｍＭグルコース培地を作製することができる。測定には、細胞容器（２４ウェルプレートにフィルター付きインサートがセットになった6.5mm Transwell（登録商標）with 5.0μm Pore Polycarbonate Membrane Insert, Sterile(Corning社製)など）のウェルに、それぞれのグルコース濃度の培地４００μＬを加え、細胞構造体５個を含む３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）１００μＬを、１ｍｌの同培地でウォッシュし、細胞構造体５個を含む上記培地１００μＬをインサート上に置く。１時間ごとにインサートを移動させ、インサート移動後のウェル中の培地４００μＬを回収し、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸収アッセイ）によりインスリンを定量する。ＥＬＩＳＡはＲａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ社製）を用いることができる。
【００８３】
（５）細胞構造体の製造方法
本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞と、さらに所望により膵島を混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、上記細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは生体親和性高分子ブロックを形成したのち、細胞、及び所望により膵島とを混合する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと、細胞含有培養液と、所望により膵島との混合物をインキュベートすることによって、本発明の細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と生体親和性高分子ブロックとをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性基材からなるモザイク状の配列形成を促進又は制御することが好ましい。
【００８４】
用いられる容器としては、細胞低接着性材料又は細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。
【００８５】
上記の方法で得られた細胞構造体（モザイク細胞塊）は、例えば、
（ａ）別々に調製した細胞構造体（モザイク細胞塊）同士を融合させる、又は
（ｂ）分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、
などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
【００８６】
例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地又は増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。
【００８７】
別々に調製した細胞構造体同士を融合させる場合には、例えば、複数個の生体親和性高分子ブロックと複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部又は全部に、一又は複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させることができる。上記（ａ）に記載の通り本発明の細胞構造体の複数個を融合させることによって得られる細胞構造体も、本発明の範囲内である。
【００８８】
上記融合前の各細胞構造体の厚さ又は直径は好ましくは１０μｍ以上１ｃｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上２０００μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以上１５００μｍ以下、最も好ましくは、２０μｍ以上１３００μｍ以下である。融合後の厚さ又は直径は好ましくは４００μｍ以上３ｃｍ以下であり、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下であり、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
但し、上記（ｉｉ）膵島が、細胞構造体とは別個に存在している実施態様の場合には、前述した通り、融合後の細胞構造体の厚さ又は直径は、膵島の大きさと同程度であることが好ましい。具体的には、好ましくは１００μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは、１５０μｍ以上３００μｍ以下、更に好ましくは、１５０μｍ以上２５０μｍ以下であり、融合前の各細胞構造体の厚さ又は直径の好ましい範囲は、融合後の細胞構造体の厚さ又は直径の上記好適な範囲内である。
【００８９】
生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞と、膵島とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体の製造方法としては、例えば、(i)前述の方法により、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞とを用い、膵島を含まない細胞構造体を製造した後、得られた細胞構造体と、膵島をインキュベートすることにより、細胞構造体を製造する方法、(ii)生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞と、膵島とをインキュベートすることにより、細胞構造を製造する方法が挙げられる。本発明の細胞構造体を血糖低下剤として用いる際に、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種の細胞と、膵島とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に、複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が特に好ましく、そのなかでも、上記(i)の方法で製造した細胞構造体がより好ましい。
【００９０】
［膵島細胞移植治療剤及び血糖低下剤］
本発明の組成物、細胞構造体又は膵島移植キットは、膵島細胞移植治療剤又は血糖低下剤として使用することができる。
本発明の組成物、細胞構造体又は膵島移植キットを膵島細胞移植治療剤として使用する場合には、糖尿病患者、膵臓全摘出された患者などに投与することができる。本発明の組成物、細胞構造体又は膵島移植キットを血糖低下剤として使用する場合には、例えば、インスリン依存型糖尿病患者及び膵臓全摘出された患者のような、血糖が正常値より高く、血糖低下を必要とする患者に投与することができる。
【００９１】
移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。本発明の細胞構造体は、細胞シートといった細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
移植部位は特に限定されず、皮下、肝臓内、筋肉内、大網内、腎被膜下などを挙げることができるが、膵島細胞移植治療剤として使用する場合には、皮下や筋肉内に移植することが好ましい。
【００９２】
本発明の膵島細胞移植治療剤及び血糖低下剤における膵島細胞数及び膵島数は、所望の治療効果が生じるよう算定された膵島細胞数及び膵島数に設定することができる。本発明の膵島細胞移植治療剤及び血糖低下剤について、１回の投与当たりの膵島細胞数は患者の体重１ｋｇ当たりで、好ましくは約５．０×１０６〜 １．２×１０８ 個／ｋｇ体重であり、より好ましくは、約８．０×１０６ 〜 ８．０×１０７個／ｋｇ体重であり、さらに好ましくは約１．２×１０７ 〜 ４．０×１０７ 個／ｋｇ体重である。また、１回の投与当たりの膵島数は、患者の体重１ｋｇ当たりで、好ましくは約５０００〜６００００個／ｋｇ体重であり、より好ましくは、約８０００〜 ４００００個／ｋｇ体重であり、さらに好ましくは約１２０００〜 ２００００個／ｋｇ体重である。
【００９３】
本発明によれば、本発明の組成物、細胞構造体又は膵島移植キットを、膵島又は膵島細胞の移植を必要とする患者に移植する工程を含む細胞移植方法が提供される。本発明によれば、本発明の組成物、細胞構造体又は膵島移植キットを、血糖低下を必要とする患者に移植する工程を含む細胞移植方法が提供される。
更に本発明によれば、細胞移植治療剤の製造のための、本発明の組成物、細胞構造体又は膵島移植キット使用が提供される。本発明によれば、血糖低下剤の製造のための、本発明の組成物、細胞構造体又は膵島移植キット使用が提供される。
【００９４】
本発明の第二の態様は、上記（５１〜（８０）に記載した態様である。以下に、本発明の第二の態様について説明する。
【００９５】
［組成物及びキット］
本発明の組成物は、膵島と、少なくとも１種類の幹細胞からなるスフェロイドとを含む組成物である。本発明のキットは、膵島と、少なくとも１種類の幹細胞からなるスフェロイドとを含む、キットである。
【００９６】
本発明で言う組成物とは、膵島と、少なくとも１種類の幹細胞からなるスフェロイドとを含む任意の組成物を意味し、その形態は特に限定されない。例えば、複数個の膵島と、複数個のスフェロイドとを、液体中に含む液体組成物でもよいし、あるいは複数個の膵島と、複数個のスフェロイドとを含む、細胞のみからなる組成物でもよい。好ましくは、本発明の組成物は、複数個の膵島と、複数個のスフェロイドとを、液体中に含む液体組成物であり、さらに好ましくは、複数個の膵島と、複数個のスフェロイドとを、液体培地中に含む組成物である。本発明の組成物が、複数個の膵島と、複数個のスフェロイドとを、液体培地中に含む組成物である場合、複数個の膵島と、複数個のスフェロイドとが、液体培地中で細胞塊を形成していてもよいし、複数個の膵島と、複数個のスフェロイドとが、液体培地中で浮遊していてもよい。また、複数個の膵島と、複数個のスフェロイドとが、液体培地中で細胞塊を形成する状態と、液体培地中で浮遊している状態とが混在していてもよい。
【００９７】
本発明で言うキットとは、膵島と、少なくとも１種類の幹細胞からなるスフェロイドとを含む、別個の形態で、但し一緒に組み合わせた状態で含むキットを意味する。
本発明の組成物及びキットの特徴の一つは、少なくとも１種類の幹細胞からなるスフェロイドを用いることである。本発明においては、分散した状態の幹細胞を使用するのではなく、スフェロイドを形成した幹細胞を使用することにより、グルコース応答性を向上できるという効果を奏する。幹細胞からなるスフェロイドを膵島と組み合わせて使用することにより上記効果を奏することは全く予想外なことである。
【００９８】
一般的に、細胞をスフェロイド化する場合の目的としては、（１）細胞の分化を誘導する目的、又は（２）細胞に極性を持たせる目的がある。（１）としては、例えば、間葉系幹細胞をスフェロイド状態で培養することで、軟骨細胞に分化させることができる。（２）としては、例えば、肝細胞をスフェロイド状態で培養することによって、肝細胞が生体内で本来保持している極性を回復することができる。しかし、本発明において膵島と共に用いる幹細胞には、これらの２つの目的は必要ではない。間葉系幹細胞を分化させることを意図する必要はなく、また１種類の細胞を使用する場合には極性も関係ない。従って、本発明においては、膵島と一緒に使用する幹細胞をスフェロイド化しようとする動機付けは存在しない。
【００９９】
（１）膵島
本発明の組成物及びキットは、膵島を含む。
膵島とは、別名ランゲルハンス氏島とも呼ばれる、平均約２０００個の膵島細胞より構成される細胞塊である。膵島は、グルカゴンを分泌するα細胞、インスリンを分泌するβ細胞、ソマトスタチンを分泌するδ細胞、グレリンを分泌するε細胞、及び膵ポリペプチドを分泌するＰＰ（pancreatic polypeptide；膵ポリペプチド）細胞の５種の細胞から構成される細胞の集合体である。
本発明で使用する膵島としては、患者に移植した際に、患者の病的状態を回復することができる程度の生存性と機能とを有することが好ましい。膵島の機能としては、インスリンを分泌し、かつ移植後においてもグルコース応答性が維持されていることが好ましい。グルコース応答性については本明細書中後記する。
【０１００】
本発明の組成物及びキットにおける膵島の個数は特に限定されないが、所望の治療効果が生じるよう算定された膵島の個数に設定することができる。
【０１０１】
本発明の組成物及びキットは、生体への膵島移植のために使用することができる。本発明の組成物及びキットを、生体への膵島移植のために使用することにより、生体の血糖値を低下することができる。なお、生体の血糖値の測定は常法により行うことができ、例えば、マウス等の実験動物の血糖値であれば、グルコースパイロット（岩井化学社製）等の市販のグルコース濃度測定装置を使用して測定することができ、ヒトの血糖値についても、ワンタッチウルトラビュー（ジョンソン＆ジョンソン）、アキュチェック（ロシュ・ダイアグノスティックス）等の市販のグルコース濃度測定装置により測定することができる。
【０１０２】
（２）幹細胞からなるスフェロイド
本発明の組成物及びキットは、少なくとも１種類の幹細胞からなるスフェロイドを含む。
幹細胞は、細胞移植を行えるものであれば任意の細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する幹細胞は１種でもよいし、複数種の幹細胞を組合せて用いてもよいが、１種類の幹細胞を使用することが好ましい。即ち、本発明においては、１種類の幹細胞からなるスフェロイドを使用することが好ましい。
【０１０３】
使用する幹細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。幹細胞としては、例えば、万能細胞、又は体性幹細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。上記の中でも、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を使用することができ、好ましくは、ＭＳＣである。
【０１０４】
スフェロイドとは、細胞同士が三次元的に凝集化した細胞の集合体を意味する。本願発明にかかるスフェロイドは、他の成分を含まず、細胞のみにより、細胞同士が三次元的に凝集化した細胞の集合体であることが好ましい。
スフェロイドの大きさ及び形状は特に限定されないが、膵島の大きさと同等であることが好ましい。スフェロイドの形状及び大きさとしては、特に限定されないが、例えば、直径１００μｍ〜５００μｍの球状とすることができ、さらに好ましくは直径１００μｍ〜３００μｍの球状とすることができる。スフェロイドの大きさの測定方法としては、スフェロイドが球状の場合には、球状のスフェロイドを球に近似し、近似した球の直径を測定することによりスフェロイドの大きさを測定することができる。
【０１０５】
スフェロイドは、幹細胞を培地にて所定の数（例えば、５×１０1ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に調整した後、培地中の幹細胞を適当な培養容器で培養することにより、製造することができる。培地としては、幹細胞が増殖できる培地（増殖培地）を使用することが好ましい。幹細胞の増殖培地としては、MSCGM BulletKit（登録商標）（タカラバイオ社製）、StemPro MSC SFM XenoFree 培地（life technologies, A10675-01）などを使用することができるが、特に限定されない。培養容器は、幹細胞を培養できるものであれば特に限定されないが、細胞低接着性材料又は細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。Ｕ字型のプレート（例えば、スミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）を使用することにより、球状のスフェロイドを製造することができる。
【０１０６】
本発明の組成物及びキットにおけるスフェロイド１個の細胞数は、５×１０１ｃｅｌｌｓ〜１×１０４ｃｅｌｌｓが好ましく、１×１０２ｃｅｌｌｓ〜５×１０３ｃｅｌｌｓがより好ましく、２×１０２ｃｅｌｌｓ〜２×１０３ｃｅｌｌｓがさらに好ましい。
本発明の組成物及びキットにおけるスフェロイドの個数は、膵島の個数に対して、０．１：１〜２０：１であることが好ましく、０．５：１〜１０：１であることがより好ましく、１：１〜５：１であることがより好ましい（なお、「０．５：１」とは、膵島の個数を１とした場合にスフェロイドの個数が０．５であることを意味する）。
【０１０７】
（３）組成物
本発明の組成物は、下記式で表されるＳＩが、好ましくは１．７以上であり、より好ましくは２．０以上である。ＳＩの上限値は特に限定されないが、一般的には、５０以下であり、より好ましくは２０以下である。
ＳＩ＝２０ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養時のインスリン量／３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養時のインスリン量
【０１０８】
インスリン量の測定は、以下の方法により測定することができる。本発明の組成物を用いて形成した細胞塊を、最初の１時間は３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養してインスリン分泌量を安定させ、次の１時間は３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養して低濃度グルコース中でのインスリン分泌量を測定し、最後の１時間は２０ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養して高濃度グルコース中でのインスリン分泌量を測定する。培地としては３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）を用い、この培地にグルコース溶液を添加することで２０ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地を作製することができる。測定には、細胞容器（２４ウェルプレートにフィルター付きインサートがセットになった6.5mm Transwell（登録商標）with 5.0μm Pore Polycarbonate Membrane Insert, Sterile(Corning社製)など）のウェルに、それぞれのグルコース濃度の培地４００μＬを加え、細胞塊５個を含む３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）１００μＬを、１ｍＬの同培地でウォッシュし、細胞塊５個を含む上記培地１００μＬをインサート上に置く。１時間ごとにインサートを移動させ、インサート移動後のウェル中の培地４００μＬを回収し、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay；酵素結合免疫吸収アッセイ）によりインスリンを定量する。ＥＬＩＳＡはＲａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ社製）を用いることができる。
【０１０９】
本発明の組成物の製造方法は特に限定されない。例えば、所定数のスフェロイドと所定数の膵島とを、液体培地を含む培養容器において混合し、さらに所望により培養することにより本発明の組成物を製造することができる。本明細書中上記の通り、本発明の組成物が、複数個の膵島と複数個のスフェロイドとを液体培地中に含む組成物である場合、膵島とスフェロイドとは液体培地中で細胞塊を形成していてもよいし、液体培地中で浮遊していてもよいし、これらが混在していてもよい。ここで用いる培養容器としては、細胞低接着性材料又は細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。
【０１１０】
［膵島移植治療剤及び血糖低下剤］
本発明の組成物又はキットは、膵島移植治療剤又は血糖低下剤として使用することができる。即ち、本発明によれば、本発明の組成物又はキットを含む膵島移植治療剤、並びに本発明の組成物又はキットを含む血糖低下剤が提供される。
【０１１１】
本発明の組成物又はキットを膵島細胞移植治療剤として使用する場合には、糖尿病患者、膵臓全摘出された患者などに投与することができる。本発明の組成物又はキットを血糖低下剤として使用する場合には、例えば、インスリン依存型糖尿病患者及び膵臓全摘出された患者のような、血糖が正常値より高く、血糖低下を必要とする患者に投与することができる。
【０１１２】
移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。
移植部位は特に限定されず、皮下、肝臓内、筋肉内、大網内、腎被膜下などを挙げることができるが、膵島移植治療剤として使用する場合には、皮下や筋肉内に移植することが好ましい。
【０１１３】
本発明の膵島移植治療剤及び血糖低下剤における膵島数は、所望の治療効果が生じるよう算定された膵島数に設定することができる。本発明の膵島移植治療剤及び血糖低下剤について、１回の投与当たりの膵島数は、患者の体重、症状の度合い等により適宜設定することができ、患者の体重１ｋｇ当たりで、一般的には約１×１０２〜１×１０５個／ｋｇ体重である。
【０１１４】
本発明によれば、本発明の組成物又はキットを、膵島の移植を必要とする患者に移植する工程を含む膵島移植方法が提供される。本発明によれば、本発明の組成物又はキットを、血糖低下を必要とする患者に移植する工程を含む細胞移植方法が提供される。
更に本発明によれば、膵島移植治療剤の製造のための、本発明の組成物又はキットの使用が提供される。本発明によれば、血糖低下剤の製造のための、本発明の組成物又はキットの使用が提供される。
【０１１５】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１１６】
［実施例Ａ１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：  ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
【０１１７】
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
【０１１８】
[実施例Ａ２] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製円筒カップ状容器を用意した。PTFE製円筒カップ状容器は、曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのPTFEで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップ状容器の内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
【０１１９】
PTFE厚・円筒形容器にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所社製）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。ＣＢＥ３水溶液の最終濃度は４質量％であり、水溶液量８ｍＬである。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。得られた凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。上記により多孔質体を得た。
【０１２０】
多孔質体を作製する際、それぞれの水溶液は、底面から冷却されるため、円中心部の水表面温度が最も冷却されにくい。従って、円中心部の水表面部分が、溶液内で最も温度の高い液温となるため、円中心部の水表面部分の液温を測定した。以下、円中心部の水表面部分の液温のことを内部最高液温と称する。
【０１２１】
[実施例Ａ３]凍結工程での内部最高液温の測定
溶媒を凍結する際の温度プロファイルを図１に示す。融点以下で未凍結状態を経た後、凝固熱が発生し温度上昇が始まり、この段階で実際に氷形成が始まる。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していき、この段階では、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この段階では、液体部分はなくなり氷となる。測定している温度は氷内部の固体温度となり、液温ではなくなる。上記の通り、凝固熱が発生する瞬間の内部最高液温を見れば、内部最高液温が未凍結状態で「溶媒融点−３℃」を経た後に凍結したかどうかが分かる。
【０１２２】
凝固熱が発生する瞬間の未凍結状態での内部最高液温は、−８．８℃であった。凝固熱が発生する瞬間の内部最高液温を見れば、内部最高液温が未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下であることが分かる。
【０１２３】
[実施例Ａ４] リコンビナントペプチドブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
実施例Ａ２で得られたＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル社製、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６μｍ〜１８０μｍの顆粒形態のＣＢＥ３ブロックを得た。その後、窒素下で１６０℃で熱架橋（架橋時間は８〜４８時間）を施して、リコンビナントペプチドブロックを得た。以下、すべて５３〜１０６μｍのブロックを用いた。
【０１２４】
[実施例Ａ５]  リコンビナントペプチドブロックを用いた細胞構造体の作製（ラット膵島＋ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ））
増殖培地（タカラバイオ社製：MSCGM BulletKitTM）で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）にて５万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例Ａ４で作製したＣＢＥ３ブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。この混合液２００μＬを、ラット膵島（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）１０個を入れたスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（２００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ程度の球状の、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣとラット膵島からなる細胞構造体を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞構造体は球状であった。
【０１２５】
[比較例Ａ１]  細胞塊の作製（ラット膵島）
ラット膵島（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）１０個を３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）２００μＬ入れたスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）に入れ、卓上プレート遠心機で遠心（２００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径３００μｍ程度の球状の、ラット膵島からなる細胞塊を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞塊は球状であった。
【０１２６】
[比較例Ａ２] 細胞塊の作製（ラット膵島＋ｈＭＳＣ）
増殖培地（タカラバイオ社製：MSCGM BulletKitTM）で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）にて５万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。この細胞懸濁液２００μＬを、ラット膵島（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）１０個を入れたスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（２００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径５００μｍ程度の球状の、ｈＭＳＣとラット膵島からなる細胞塊を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞塊は球状であった。
【０１２７】
[比較例Ａ３] ブロックあり細胞塊の作製（ラット膵島＋ブロック）
実施例Ａ４で作製したＣＢＥ３ブロックを０．１ｍｇ／ｍＬになるように懸濁した３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）２００μＬを、ラット膵島（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）１０個を入れたスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（２００ｇ、５分）し、２４時間静置し、ＣＢＥ３ブロックとラット膵島からなる細胞塊を作製した。
【０１２８】
[実施例Ａ６]  リコンビナントペプチドブロックを用いた細胞構造体の作製（ラット膵島細胞＋ｈＭＳＣ）
ラット膵島（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）１０個を膵島用細胞分散液（コスモバイオ社製：ＰＮＩＤＭＥ）で分散させた膵島細胞を３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）にて５万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。そこに増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKitTM）で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を５万ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように加え、さらに実施例Ａ４で作製したＣＢＥ３ブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。この混合液２００μＬを、スミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（２００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ程度の球状の、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣとラット膵島細胞からなる細胞構造体を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞構造体は球状であった。
【０１２９】
[比較例Ａ４]  細胞塊の作製（ラット膵島細胞）
ラット膵島（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）１０個を膵島用細胞分散液（コスモバイオ社製：ＰＮＩＤＭＥ）で分散させた膵島細胞を３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）にて５万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。この細胞懸濁液２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（２００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径３００μｍ程度の球状の、ラット膵島細胞からなる細胞塊を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞構造体は球状であった。
【０１３０】
[比較例Ａ５] 細胞塊の作製（ラット膵島細胞＋ｈＭＳＣ）
ラット膵島（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）１０個を膵島用細胞分散液（コスモバイオ社製：ＰＮＩＤＭＥ）で分散させた膵島細胞を３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）にて５万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。この細胞懸濁液に、増殖培地（タカラバイオ社製：MSCGM BulletKitTM）で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を５万ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように加えた。この細胞懸濁液２００μＬを、スミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（２００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径５００μｍ程度の球状の、ｈＭＳＣとラット膵島からなる細胞塊を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞塊は球状であった。
【０１３１】
[比較例Ａ６] ブロックあり細胞塊の作製（ラット膵島細胞＋ブロック）
ラット膵島（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）１０個を膵島用細胞分散液（コスモバイオ社製：ＰＮＩＤＭＥ）で分散させた膵島細胞を３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。この細胞懸濁液に、実施例Ａ４で作製したＣＢＥ３ブロックを０．０３７５ｍｇ／ｍＬになるように加え、この懸濁液２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（２００ｇ、５分）し、２４時間静置し、ＣＢＥ３ブロックとラット膵島細胞からなる細胞塊を作製した。
【０１３２】
[実施例Ａ７]  ｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース応答性試験
実施例Ａ５及びＡ６で作製した細胞構造体と、比較例Ａ１〜Ａ６で作製した細胞塊について、グルコース濃度に応答してインスリンを分泌するグルコース応答性の有無を調べた。７日間培養した上記細胞構造体と細胞塊をそれぞれ１時間ごとにグルコース濃度の異なる培地に移し変え、培地中のインスリン量を定量することで算出した。
計３時間実施し、最初の１時間は３ｍＭグルコース培地でインスリン分泌量を安定させ、次の１時間は３ｍＭグルコース培地で低濃度グルコース中でのインスリン分泌量を測定し、最後の１時間は２０ｍＭグルコース培地で高濃度グルコース中でのインスリン分泌量を測定した。培地は３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）を用い、この培地にグルコース溶液を添加することで、２０ｍＭグルコース培地を作製した。
【０１３３】
測定には、２４ウェルプレートにフィルター付きインサートがセットになった6.5mm Transwell（登録商標）with 5.0μm Pore Polycarbonate Membrane Insert, Sterile(Corning社製)を用いた。まず、ウェルにそれぞれのグルコース濃度の培地４００μＬを加えた。実施例Ａ５、Ａ６で作製した細胞構造体と、比較例Ａ１〜Ａ６で作製した細胞塊それぞれ５個ずつを含んだ３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）１００μＬを、１ｍｌの同培地でウォッシュし、実施例Ａ５、Ａ６で作製した細胞構造体と、比較例Ａ１〜Ａ６で作製した細胞塊それぞれ５個ずつを含んだ同培地１００μＬをインサート上に置いた。
【０１３４】
１時間ごとにインサートを移動させ、インサート移動後のウェル中の培地４００μＬを回収し、ＥＬＩＳＡでのインスリン定量に用いた。ＥＬＩＳＡはＲａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ社製）を用いた。２回目の３ｍＭグルコース培地で培養時のインスリン量と２０ｍＭグルコース培地で培養時のインスリン量を求め、グルコース応答性の指標としてのＳＩ値（ＳＩ＝２０ｍＭグルコース培地で培養時のインスリン量／３ｍＭグルコース培地で培養時のインスリン量）をそれぞれ算出した。
その結果、実施例Ａ５で作製した膵島＋ｈＭＳＣの細胞構造体では、ＳＩが３．１２であったのに対し、比較例Ａ１の膵島細胞塊では１．２１、比較例Ａ２の膵島＋ｈＭＳＣ細胞塊では２．００、比較例Ａ３では０．９９であった。一方、実施例Ａ６の膵島細胞＋ｈＭＳＣの細胞構造体ではＳＩが３．５９であったのに対し、比較例Ａ４の膵島細胞塊では１．２３、比較例Ａ５の膵島細胞＋ｈＭＳＣ細胞塊では２．９３、比較例Ａ６では０．８５であった（表１）。
【０１３５】
これらの結果から、膵島においても、分散させた膵島細胞においても、ＣＢＥ３のみを加えた場合ではＳＩは低下するのに対し、ＭＳＣのみを加えた場合ではＳＩは少し向上し、さらにＣＢＥ３ブロックとＭＳＣを共に混合した細胞構造体の場合ではＳＩが最も高くなることが明らかになった。すなわち、ＣＢＥ３ブロックとＭＳＣを膵島や膵島細胞と共培養することで、グルコース応答性を向上することができる。
【０１３６】
【表１】
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【０１３７】
[実施例Ａ８] 移植用リコンビナントペプチドブロックを用いた細胞構造体の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ社製：MSCGM BulletKitTM）にて２５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例Ａ４で作製したＣＢＥ３ブロックを０．００２５ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径２００μｍ程度の球状の、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣ細胞からなる細胞構造体を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞構造体は球状であった。また、これは膵島と同程度の大きさであった。
【０１３８】
[比較例Ａ７]移植用細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ社製：MSCGM BulletKitTM）にて２５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径２００μｍ程度の球状の、ｈＭＳＣ細胞からなる細胞塊を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞塊は球状であった。また、これは膵島と同程度の大きさであった。
【０１３９】
[実施例Ａ９]糖尿病マウスの作製と血糖値測定
移植する膵島の効果を見るために、血糖値を高くした糖尿病マウスを作製した。
マウスはＮＯＤ／ＳＣＩＤ（チャールスリバー社製）のオス、６週齢のものを用いた。まず、ストレプトゾトシン（和光純薬社製）を２００ｍｇ／ｋｇ投与し、投与後３日後、７日後に血糖値を測定し、どちらも３００ｍｇ／ｄｌ以上になった個体を糖尿病マウスとした。血糖値はマウスの尾静脈から２８Ｇの注射針で静脈血を採取し、グルコース濃度測定装置グルコースパイロット（岩井化学社製）にて測定した。
【０１４０】
[実施例Ａ１０]糖尿病マウスへの細胞構造体及び細胞塊と膵島の皮下移植
実施例Ａ９で作製した、ストレプトゾトシン投与後７日目の糖尿病マウスを移植に用いた。糖尿病マウスを麻酔下で背部の体毛を除去し、それぞれ以下の方法で移植した。（１）〜（６）については、背部皮下に１８Ｇの注射針を差し込み、注射針の注入口に、２００μＬスケールのチップの先を取り付けた。チップ中には、あらかじめ以下の３種類の移植物をピペットで吸うことでそれぞれを入れておき、チップの先端に移植物を集めておいた。注射針にチップを取り付けた後、ピペットのダイヤルを回し、１００μＬの培地と共に移植物を皮下に注入した。（７）については、背部皮下を切開後、スパチュラに乗せた細胞塊１０個を、切開部から１ｃｍほど下部の皮下に置き、切開部を縫合した。移植後、３〜４日ごとに血糖値を測定した。
【０１４１】
（１）〜（６）の移植物は以下の３種類を３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）中で混合したものである。
（７）の移植物については、（３）を移植前に培養し、塊にしたものである。
（１）膵島２００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
（２）ｈＭＳＣ細胞塊（比較例Ａ７）４００個＋膵島２００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
（３）ｈＭＳＣ細胞構造体（実施例Ａ８）４００個＋膵島２００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
（４）膵島４００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
（５）ｈＭＳＣ細胞塊（比較例Ａ７）８００個＋膵島４００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
（６）ｈＭＳＣ細胞構造体（実施例Ａ８）８００個＋膵島４００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
（７）ｈＭＳＣ細胞構造体（実施例Ａ８）４００個＋膵島２００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
ただし、ｈＭＳＣ細胞構造体（実施例Ａ８）４０個＋膵島２０個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）を、スミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）で、２００μＬの３ｍＭグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）中、２．５時間培養して作製した塊を１０個
【０１４２】
その結果を図２に示した。移植後４週での血糖値は、（１）の膵島のみ２００個を移植した場合は３９８ｍｇ／ｄｌと血糖値は高いままであったが、（２）の細胞塊と膵島２００個の混合物を移植した場合は１８３ｍｇ／ｄｌ、（３）の細胞構造体と膵島２００個の混合物を移植した場合は１７４ｍｇ／ｄｌと、正常値まで血糖値を下げることができた。さらに、（７）の方法で培養してから移植した場合では、１２７ｍｇ／ｄｌと、さらに完全に正常値まで血糖値を下げることができた。このことから、膵島２００個を移植する場合、膵島のみでは、血糖値を下げられないのに対し、ＣＢＥ３ブロックを含むｈＭＳＣ細胞構造体と共に膵島を移植すると、血糖値を下げられることが明らかになった。さらに、移植前に培養して塊にすることで、さらに正常値まで血糖値を下げられることが分かった。
【０１４３】
[実施例Ａ１１]糖負荷試験での血糖値正常化能力の検証
糖を負荷した際に、血糖値を正常値に戻す能力をどれほど有しているかを検証するために、糖負荷試験を実施した。（１）〜（７）を移植したマウスについて、移植後４週で試験を実施した。まず、マウスを２０時間絶食状態にし、血糖値を測定し、その後マウスの体重あたり２ｍｇ/ｇのグルコースを腹腔注射した。注射後、１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後、１２０分後、１８０分後に血糖値を測定した。何も移植していない糖尿病マウス、ストレプトゾトシンを投与していない正常なマウスについても、同様に試験を実施した。
その結果を図３と図４に示した。図３は、膵島２００個の場合の（１）〜（３）と（７）の結果、図４は、膵島４００個の場合の（４）〜（６）の結果を示している。
【０１４４】
膵島２００個の場合、（１）の膵島のみ２００個を移植した場合は、何も移植していないマウスほど血糖値は高い状態でないものの、正常マウスと比べて、血糖値が下がりにくい結果となった。一方、（２）の細胞塊と膵島２００個の混合物を移植した場合は、（１）の膵島のみに比べ、血糖値を低下できるようになっていた。さらに、（３）の細胞構造体と膵島２００個の混合物を移植した場合は、正常マウスと同等の血糖低下能力を示し、正常マウスとほぼ同様の曲線を描いている結果となった。さらに、（７）の培養後に塊で移植した細胞構造体と移植した場合では、正常マウスよりも、血糖値は低いところを推移しており、正常マウスよりも血糖値を正常に戻す能力が高いことが分かった。
【０１４５】
膵島４００個の場合も同様に、（４）の膵島のみの場合、何も移植していないマウスほど血糖値は高い状態でないものの、正常マウスと比べて、血糖値が下がりにくい結果となった。一方、（５）の細胞塊と膵島を移植した場合は、正常マウスと同様の推移を示し、血糖値を低下させやすいことが分かった。さらに、（６）の細胞構造体と膵島の混合物を移植した場合は、グルコース注射直後は血糖値が上がるものの、すぐに正常値に下げられ、正常マウスよりも、低い血糖値の推移を示した。
【０１４６】
また、それぞれのグラフについて、グラフのカーブの下の部分の面積を求めた。グラフを測定時間ごとに区切り、時間（min）×血糖値（ｍｇ/ｄｌ）を足し合わせることで、面積を算出した。この面積が小さいほど、血糖値を正常値にする能力が高いと言える。
それぞれの面積は、（１）が４５６１４min・ｍｇ/ｄｌ、（２）が４３１０４min・ｍｇ/ｄｌ、（３）が３７６８２min・ｍｇ/ｄｌ、（４）が５１７９５min・ｍｇ/ｄｌ、（５）が３２７５２ min・ｍｇ/ｄｌ、（６）が２７４０５min・ｍｇ/ｄｌ、（７）が２６６５８min・ｍｇ/ｄｌであった。
【０１４７】
これらの結果から、膵島２００個、４００個どちらのパターンでも、膵島のみ、膵島とｈＭＳＣ細胞塊を移植した場合に比べ、ＣＢＥ３ブロックを含むｈＭＳＣ細胞構造体と共に膵島を移植した場合の方が、血糖値を正常にする能力が高いことが確認できた。また、膵島と細胞構造体を移植前に培養して塊にすることで、より効率よく血糖値を下げられることが分かった。
以上の結果を表２にまとめた。
【０１４８】
【表２】
2019056009.tif 000003
【０１４９】
[実施例Ａ１２]血清中ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ｃ−ペプチド）濃度の測定
移植した膵島がどの程度インスリンを分泌しているかを定量するため、インスリンを分泌する際に、同じ分子量産生するｃ−ｐｅｐｔｉｄｅについて定量を実施した。
移植後１週のマウスを麻酔下に置き、腹部大静脈から静脈血を採取した。これを、氷上で３０分静置後、１０００ｇ×２０分遠心し、上清の血清を採取した。血清は、後にｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ濃度をＲａｔ  ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ社製）で測定した。
【０１５０】
その結果、（１）の膵島のみを移植した場合は５１ｐＭ、（２）の細胞塊と膵島の混合物を移植した場合は４４ｐＭと低いｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ濃度であったのに対し、（３）の細胞構造体と膵島の混合物を移植した場合は８６ｐＭと高い値を示した。このことから、ＣＢＥ３ブロックを含むｈＭＳＣ細胞構造体と共に膵島を移植した方が、膵島からのインスリン分泌量が多くなることで血糖値を下げられることが明らかになった。つまり、（３）の膵島では、血中の高いグルコース濃度に応じてインスリン量を多く出せるというグルコース応答性が高いために、血糖値を下げられることが明らかになった。
【０１５１】
[実施例Ａ１３] 細胞構造体の採取と標本解析
解剖は移植から４週後に行った。背部の皮膚をはがし、移植部位の皮膚を採取した。
移植物が付着した皮膚について組織切片を作製した。組織を１０質量％ホルマリン緩衝液に浸漬し、ホルマリン固定を行った。その後、パラフィンで包埋し、移植物を含む皮膚の組織切片を作製した。切片はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）と、抗インスリン抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製：Ｉ２０１８））によるインスリン免疫染色を実施した。
【０１５２】
結果を図５に示した。（１）の膵島のみの場合では、切片で、移植した膵島を確認できず、膵島が生着しなかったと考えられる。（２）の細胞塊と膵島の混合物を移植した場合は、切片で移植した膵島を確認できるが、確認できる膵島の量は少なかった。インスリン免疫染色でも、染色される領域は少なかった。一方で、（３）の細胞構造体と膵島の混合物を移植した場合には、切片で、移植した膵島が多く確認でき、インスリン免疫染色でも染色された。更に、移植物中に血管が多く形成されていた。これは、（２）の細胞塊と膵島の混合物を移植した場合では見られない現象であった。（７）の細胞構造体と膵島を移植前に培養して塊としたものを移植した場合には、切片で、移植した膵島が多く確認でき、インスリン免疫染色でも染色される領域が多く、更に、移植物中に血管が多く形成されていた。
【０１５３】
[実施例Ｂ１] ｈＭＳＣスフェロイドの作製
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ社製：MSCGM BulletKit（登録商標））にて２５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、この細胞懸濁液２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径２００μｍ程度の球状のｈＭＳＣスフェロイドを作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、得られたｈＭＳＣスフェロイドは球状であった。また、これは膵島と同程度の大きさであった。
【０１５４】
[実施例Ｂ２] 膵島とｈＭＳＣスフェロイドとの細胞塊の作製
１日培養した実施例Ｂ１のｈＭＳＣスフェロイド２０個と、ラット膵島（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）１０個とを、３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）２００μＬを入れたスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）で混合培養した。その結果、膵島とｈＭＳＣスフェロイドの細胞塊（１個）が作製された。
【０１５５】
[比較例Ｂ１] 細胞塊の作製（ラット膵島＋ｈＭＳＣ）
増殖培地（タカラバイオ社製：MSCGM BulletKit（登録商標））で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）にて５万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。この細胞懸濁液２００μＬを、ラット膵島（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）１０個を入れたスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト社製、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（２００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径５００μｍ程度の球状の、ｈＭＳＣとラット膵島からなる細胞塊を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、得られた細胞塊は球状であった。
【０１５６】
[実施例Ｂ３]  ｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース応答性試験
実施例Ｂ２及び比較例Ｂ１で作製した細胞塊について、グルコース濃度に応答してインスリンを分泌するグルコース応答性の有無を調べた。１日間培養した上記の細胞塊をそれぞれ１時間ごとにグルコース濃度の異なる培地に移し変え、培地中のインスリン量を定量することで算出した。
【０１５７】
計３時間実施し、最初の１時間は３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地でインスリン分泌量を安定させ、次の１時間は３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で低濃度グルコース中でのインスリン分泌量を測定し、最後の１時間は２０ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で高濃度グルコース中でのインスリン分泌量を測定した。培地は３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）を用い、この培地にグルコース溶液を添加することで、２０ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地を作製した。
【０１５８】
測定には、２４ウェルプレートにフィルター付きインサートがセットになった6.5mm Transwell（登録商標）with 5.0μm Pore Polycarbonate Membrane Insert, Sterile(Corning社製)を用いた。まず、ウェルにそれぞれのグルコース濃度の培地４００μＬを加えた。実施例Ｂ２及び比較例Ｂ１で作製した細胞塊それぞれ１個を含んだ３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）１００μＬを、１ｍＬの同培地でウォッシュし、実施例Ｂ２及び比較例Ｂ１で作製した細胞塊をそれぞれ１個ずつ含んだ同培地１００μＬをインサート上に置いた。
【０１５９】
１時間ごとにインサートを移動させ、インサート移動後のウェル中の培地４００μＬを回収し、ＥＬＩＳＡでのインスリン定量に用いた。ＥＬＩＳＡはＲａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ社製）を用いた。２回目の３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養時のインスリン量と２０ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養時のインスリン量を求め、グルコース応答性の指標としてのＳＩ値（ＳＩ＝２０ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養時のインスリン量／３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース培地で培養時のインスリン量）をそれぞれ算出した。
【０１６０】
その結果、実施例Ｂ２で作製した膵島＋ｈＭＳＣスフェロイドの細胞塊では、ＳＩが２．０４であったのに対し、比較例Ｂ１の膵島＋ｈＭＳＣ細胞塊では１．４１であった。
これらの結果から、ｈＭＳＣと膵島を共培養した場合、ｈＭＳＣは懸濁液状態であるよりも、スフェロイドの方が膵臓のグルコース応答性を向上させることができることが分かった。
【０１６１】
[実施例Ｂ４]糖尿病マウスの作製と血糖値測定
移植する膵島の効果を見るために、血糖値を高くした糖尿病マウスを作製した。
マウスはＮＯＤ／ＳＣＩＤ（Non Obese Diabetes／Sevefe Combined ImmunoDeficiency）（チャールスリバー社製）のオス、６週齢のものを用いた。まず、ストレプトゾトシン（和光純薬社製）を２００ｍｇ／ｋｇ投与し、投与後３日後、７日後に血糖値を測定し、どちらも３００ｍｇ／ｄｌ（３００ｍｇ／１００ｍｌ）以上になった個体を糖尿病マウスとした。血糖値はマウスの尾静脈から２８Ｇの注射針で静脈血を採取し、グルコース濃度測定装置グルコースパイロット（岩井化学社製）にて測定した。
【０１６２】
[比較例Ｂ２]ｈＭＳＣ細胞懸濁液の作製
増殖培地（タカラバイオ社製：MSCGM BulletKit（登録商標））で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）にて２００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬおよび４００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。この細胞懸濁液１００μＬを、後の移植試験に用いた。
【０１６３】
[実施例Ｂ５]糖尿病マウスへの細胞塊と膵島の皮下移植
実施例Ｂ４で作製した、ストレプトゾトシン投与後７日目の糖尿病マウスを移植に用いた。糖尿病マウスを麻酔下で背部の体毛を除去し、背部皮下に１８Ｇの注射針を差し込み、注射針の注入口に、２００μＬスケールのチップの先を取り付けた。チップ中には、あらかじめ以下の２種類の移植物をピペットで吸うことでそれぞれを入れておき、チップの先端に移植物を集めておいた。注射針にチップを取り付けた後、ピペットのダイヤルを回し、１００μＬの培地と共に移植物を皮下に注入した。移植後、３〜４日ごとに血糖値を測定した。血糖値はマウスの尾静脈から２８Ｇの注射針で静脈血を採取し、グルコース濃度測定装置グルコースパイロット（岩井化学社製）にて測定した。
【０１６４】
移植物は以下の６種類を、１００μＬの３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース含有メディウム（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）中で混合したものである。（１）及び（３）において、膵島は３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース含有メディウム中に浮遊している状態であり、（２）及び（４）において、ｈＭＳＣスフェロイド及び膵島は３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース含有メディウム中に浮遊している状態であり、（５）及び（６）において、ｈＭＳＣ及び膵島は、３ｍｍｏｌ／Ｌグルコース含有メディウム中に浮遊している状態である。
【０１６５】
（１）膵島２００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
（２）ｈＭＳＣスフェロイド（実施例Ｂ１）４００個＋膵島２００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
（３）膵島４００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
（４）ｈＭＳＣスフェロイド（実施例Ｂ１）８００個＋膵島４００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
（５）ｈＭＳＣ  ２０万cells（比較例Ｂ２の２００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬを１００μＬ分）＋膵島２００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
（６）ｈＭＳＣ  ４０万cells（比較例Ｂ２の４００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬを１００μＬ分）＋膵島４００個（コスモバイオ社製：ＰＮＩ１４）（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞及びＰＰ細胞の集合体である）
【０１６６】
上記（１）、（２）及び（５）を移植した後に血糖値を測定した結果を図６に示した。移植後４週での血糖値は、（１）の膵島のみ２００個を移植した場合は３９８ｍｇ／ｄｌと血糖値は高いままであったが、（５）の細胞懸濁液と膵島を移植した場合は２６８ｍｇ／ｄｌ、（２）のｈＭＳＣスフェロイドと膵島２００個の混合物を移植した場合は１８３ｍｇ／ｄｌと、正常値まで血糖値を下げることができた。このことから、膵島２００個を移植する場合、膵島のみでは、血糖値を下げられないのに対し、ｈＭＳＣと共に膵島を移植すると、膵島のみよりも血糖値を下げられ、さらにｈＭＳＣをスフェロイドにして共に移植すると、さらに血糖値を正常値まで下げられることが確認できた。
【０１６７】
[実施例Ｂ６]糖負荷試験での血糖値正常化能力の検証
糖を負荷した際に、血糖値を正常値に戻す能力をどれほど有しているかを検証するために、糖負荷試験を実施した。（１）〜（６）を移植したマウスについて、移植後４週で試験を実施した。まず、マウスを２０時間絶食状態にし、血糖値を測定し、その後マウスの体重あたり２ｍｇ/ｇのグルコースを腹腔注射した。注射後、１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後、１２０分後、１８０分後に血糖値を測定した。何も移植していない糖尿病マウス、ストレプトゾトシンを投与していない正常なマウスについても、同様に試験を実施した。
【０１６８】
また、それぞれの血糖値の推移をグラフにし、そのグラフのカーブの下の部分の面積（Area Under Curve:AUC）を求めた。グラフを測定時間ごとに区切り、時間（min）×血糖値（ｍｇ/ｄｌ）を足し合わせることで、面積を算出した。この面積が小さいほど、血糖値を正常値にする能力が高いと言える。
【０１６９】
上記の測定結果を、図７と図８に示した。図７は、膵島２００個の場合の（１）、（２）及び（５）の結果を示し、図８は、膵島４００個の場合の（３）、（４）及び（６）の結果を示す。
【０１７０】
膵島２００個の場合、それぞれの面積は（１）が４５６１４min・ｍｇ/ｄｌ、（２）が４３１０４min・ｍｇ/ｄｌ、（５）が４４００３min・ｍｇ/ｄｌであった。
（１）の膵島のみ２００個を移植した場合では、何も移植していないマウスほど血糖値は高い状態でないものの、血糖値が低下しにくい結果となった。それに比べ、（５）の細胞懸濁液と膵島を移植した場合では、（１）の膵島のみに比べ血糖値が上昇しない結果となった。さらに（２）のスフェロイドと膵島２００個の混合物を移植した場合は、（５）よりも血糖値が低下する結果となった。
【０１７１】
膵島４００個の場合、それぞれの面積は（３）が５１７９５min・ｍｇ/ｄｌ、（４）が３２７５２min・ｍｇ/ｄｌ、（６）が３９４１０min・ｍｇ/ｄｌであった。
（３）の膵島のみの場合、何も移植していないマウスほど血糖値は高い状態でないものの、血糖値が低下しにくい結果となった。それに比べ、（６）の細胞懸濁液と膵島を移植した場合では、（３）の膵島のみに比べ血糖値が上昇しない結果となった。さらに、（４）のスフェロイドと膵島を移植した場合は、（６）に比べ、血糖値が正常値に低下する結果となった。
【０１７２】
これらの結果から、膵島２００個又は膵島４００個の何れの場合でも、膵島のみに比べ、膵島と細胞懸濁液を移植した場合の方が、さらに膵島とｈＭＳＣスフェロイドを移植した場合の方が、血糖値を正常にする能力が高いことが確認できた。
最後に、結果を表３にまとめる。
【０１７３】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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