(57)【要約】      （修正有）【課題】ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を生産するためのβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）の新規リコンビナント形態の提供及びＧＯＳの食品添加物としての使用。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する酵素的に活性なリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質及びラクトースを反応させてＧＯＳを生産し、食料添加物として使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列を有するリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質をコードする、単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１２又は１４に記載のアミノ酸配列を有するリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質をコードする、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項３】
リコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質をコードする請求項１に記載の単離されたＤＮＡであって、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９に記載の核酸配列を有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
リコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質をコードする請求項３に記載の単離されたＤＮＡであって、配列番号１３又は１５に記載の核酸配列を有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列を有する、酵素的に活性なリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質。
【請求項６】
膜結合型である、請求項５に記載の酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質。
【請求項７】
可溶性酵素である、請求項５に記載の酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質。
【請求項８】
酵素的に活性なリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質を真核生物宿主細胞において生産するための方法であって、適切なプロモーターのコントロール下において、プラスミドで該真核生物宿主細胞をトランスフォーメーションすることを含み、該プラスミドが、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列を有するｒＢＨＴタンパク質をコードする単離されたＤＮＡを含有する、方法。
【請求項９】
単離されたＤＮＡが、シグナルペプチドをコードするＤＮＡに連結されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
シグナルペプチドがS. cerevisiaeのα因子シグナルペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
適切なプロモーターがアルコールオキシダーゼプロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質が、２０℃で約８U/mgの比活性を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
真核生物宿主細胞が酵母細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
酵母細胞がPichia pastorisである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を生産するための方法であって、適切な条件下において、ラクトースを、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列を有する酵素的に活性なリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質と反応させてＧＯＳを生産することを含む、方法。
【請求項１６】
酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質が固体支持体に固定化されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
バッチ若しくは連続撹拌タンク反応器、充填層反応器又は限外ろ過膜反応器中で、ＧＯＳを生産する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
競合グルコース阻害を防ぐためのグルコース除去システムとして、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）生物をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
グルコース除去システムを酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質と同時に使用する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列を有するリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質を含む、改変ラクトース含有食料品又は食品副産物。
【請求項２１】
乳製品又は乳製品副産物である、請求項１８に記載のラクトース含有食料品又は食品副産物。
【請求項２２】
ベビーデザート、ベビージュース、ベビースナック、ベビーヨーグルト飲料、エネルギー飲料、フィットネスウォーター若しくはサーストクエンチャー、冷凍乳製品デザート、（ビタミン／ミネラル補強された）フルーツ飲料、フルーツパイフィリング、フルーツ調製物、乳児用調製粉乳、乳児用食事代替飲料、ゼリージャム、食事代替飲料、ミルク、ミルクベースの飲料、ミルク代用品、ミルク用シロップフレーバー、ヨーグルト又はホエーである、請求項１８に記載のラクトース含有食料品又は食品副産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月７日に出願された米国仮出願第６１／７３４，７４２号（Bruno-Barcenaら、表題「Beta-hexosyl-transferases and Uses Thereof」、代理人整理番号ＮＳ１２００９ＵＳＶ）（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の恩典を主張する。
【０００２】
１．  発明の分野
本発明は、一般的に、β−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＢＨＴ）の新規リコンビナント形態、及びガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を生産するためのその使用の発見に関する。
【０００３】
２．  発明の背景
２．１．  イントロダクション
食事、正常な腸内細菌叢及び健康の間の複雑な相互作用は、ヒトの胃腸管内の有益な微生物の選択的増殖を促進するための戦略の開発を促している。プロバイオティクスは、強力な抗病原特性及び抗炎症特性によって、ヒトの健康に良い影響を与える微生物である（２７）（表１）。
【０００４】
【表１】
2019062903.tif 000002
【０００５】
また、長年にわたるプロバイオティクス研究により、腸内細菌叢の選択的改変及びその関連生化学的活性は、選択的プレバイオティクスによって促進され得ることが示されている。Osborn DA, Sinn JK. Prebiotics in infants for prevention of allergic disease and food hypersensitivity. Cochrane Database of Systematic Reviews 2007。プレバイオティクスは、二重能力を有する非消化性オリゴ糖（ＮＤＯ）である。第１に、それらは、有害な細菌の腸内コロニー形成効率を低下させ、第２に、それらは、成長を促進する選択的基質として作用し、それにより特定のプロバイオティクス細菌の数を増加させる。
【０００６】
加えて、プロバイオティクスは、プレバイオティクスと組み合わせた場合に最も機能することを示す研究が増加している。Mayer et al. 2003 Research for creation of functional foods with Bifidobacteria. Acta Alimentaria 32 27-39。この複合的な送達形態は、シンバイオティクスとして公知である。Gibson GR, Roberfroid MB. 1995 Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota - Introducing the Concept of Prebiotics. Journal of Nutrition 125:1401-12。
【０００７】
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、プレバイオティクスの好ましい選択肢の１つと考えられており、胃腸管では、ＧＯＳは酵素耐性があり、消化されずに小腸を通過するが、大腸では、ＧＯＳは発酵されて、Lactobacillus acidophilus及びL. caseiなどの腸内ビフィズス菌の成長を活性化し、したがってプレバイオティクスとして作用し得る（２６、２７、３７）。
【０００８】
ＧＯＳは、そのアノマーＣ原子（Ｃ１又はＣ２）のコンフォメーション（これは、そのグリコシド結合が、胃又は小腸の消化酵素による加水分解から逃れることを可能にする）のために非消化性オリゴ糖である。遊離オリゴ糖は、全ての有胎盤哺乳類の乳中に見られ、乳児期におけるプレバイオティクス供給の天然例を提供する。International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP)による最新の定義によれば、「食品プレバイオティクスは、胃腸細菌叢の組成及び／又は活性の特異的変化をもたらすことにより、宿主の健康に利益を与える選択的に発酵された成分である」（３０）。ヒトの乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の組成は非常に複雑であるため、類似組成のオリゴ糖を含有する代替源が見つかる可能性は低い。乳幼児の結腸健康の改善は、母乳中のＧＯＳの存在に起因していた（２）。実際、ＧＯＳを追加した乳児用調製粉乳は、結腸細菌叢の代謝活性及び細菌数に関して、ヒト乳のビフィズス菌効果を再現した（６、２１）。ＧＯＳは、その構造がＨＭＯのコア分子に似ているので（３）、非乳オリゴ糖の中でも特に注目されている。しかしながら、ＧＯＳの濃度及び組成は、その生成に利用される方法及び酵素によって異なり、そのプレバイオティクス効果及び結腸プロバイオティック株の増殖に影響を与え得る（２９）。伝統的には、ＧＯＳは、中温性微生物由来のβ−ガラクトシダーゼを使用して生産されている。中温性β−ガラクトシダーゼは、反応をラクトース加水分解から遠ざけてＧＯＳ合成に向かわせるために、高い初期濃度のラクトースを必要とする。ラクトースは高温でより可溶性であるので、高い初期速度及び増加した半減期を示す耐熱性β−ガラクトシダーゼが、トランスガラクトシル化反応に有利な平衡に達するために利用されている（２７、３７）。しかしながら、グルコース及び／又はガラクトースによる競合阻害反応は、細胞を反応に組み込むことによって克服され得る未だ残る別の障害である（１６、２０、２５、２７、３５）。
【０００９】
担子菌酵母Sporobolomyces singularis（以前は、Bullera singularis）は、そのβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＢＨＴ、ＥＣ３．２．１．２１）の活性が原因で、ガラクトースを利用して成長することができず、ラクトースにより増殖する。ラクトース濃度が低く、ラクトース加水分解が非常に限定的であっても、ＢＨＴはトランスガラクトシル化活性を有することが研究により示されている。加えて、この酵素は、２０％超のラクトース濃度によって阻害されないようであり、理論上は最大７５％近くがＧＯＳに変換される可能性がある（１、９、１０、２８）。β−ガラクトシダーゼとは異なり、S. singularis由来のＢＨＴは、グリコシルヒドロラーゼ活性及びβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ活性を同時に行って、ガラクトースの細胞外蓄積を伴わずにラクトースをＧＯＳに変換する。トランスガラクトシル化イベント中に、２分子のラクトースが必要とされる：１分子が加水分解され、もう１つがガラクトースレセプターとして作用して、三糖ガラクトシルラクトース（β−Ｄ−Ｇａｌ（１−４）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１−４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ）及び残りのグルコースを生成する。ガラクトシルラクトースも新たなガラクトースのレセプターとして作用して、四糖ガラクトシルガラクトシルラクトース（β−Ｄ−Ｇａｌ（１−４）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１−４）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１−４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ）を生成し得、四糖及び次の生成物についても同様である。S. singularisに蓄積する三糖、四糖及び五糖は、ＧＯＳと総称されている（９、１０）。
【００１０】
実用的な関心に関して、リコンビナント分泌ＢＨＴは、ネイティブな酵素を上回るいくつかの利点（改善された大規模な生産及び精製を含む）を有し得る。現在のところ、S. singularis由来の活性酵素の精製は、細胞溶解とそれに続く複数のクロマトグラフィー工程を必要とする（１、４、１６）。E. coli  ＢＬ２１においてリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼを発現させようとする以前の試みでは、生産は高レベルであったが、酵素が不活性かつ不溶性であった（１６）。
【００１１】
３．  発明の概要
特定の非限定的な実施態様では、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列を有するリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質をコードする単離されたＤＮＡを提供する。リコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質をコードする単離されたＤＮＡは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９に記載の核酸配列を有し得る。
【００１２】
本発明はまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列を有する酵素的に活性なリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質を提供する。ｒＢＨＴタンパク質は、膜結合型であり得るか、又は可溶性酵素であり得る。
【００１３】
ＧＯＳを産生する酵素的に活性なｒＢＨＴは、ガラクトースによって阻害されてもよいし、又は阻害されなくてもよい。
【００１４】
本発明はまた、酵素的に活性なリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質を真核生物宿主細胞において生産するための方法であって、適切なプロモーターのコントロール下において、プラスミドで該真核生物宿主細胞をトランスフォーメーションすることを含み、該プラスミドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列を有するｒＢＨＴタンパク質をコードする単離されたＤＮＡを含有する方法を提供する。
【００１５】
いくつかの実施態様では、単離されたＤＮＡは、シグナルペプチドをコードするＤＮＡに連結されている。シグナルペプチドは、S. cerevisiaeのα因子シグナルペプチドであり得、適切なプロモーターは、アルコールオキシダーゼプロモーターであり得る。
【００１６】
いくつかの実施態様では、酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質は、２０℃で約８U/mgの比活性を有する。
【００１７】
真核生物宿主細胞は、酵母細胞、例えばPichia pastorisであり得る。
【００１８】
本発明はまた、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を生産するための方法であって、適切な条件下において、ラクトースを、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列を有する酵素的に活性なリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質と反応させてＧＯＳを生産することを含む方法を提供する。
【００１９】
酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質は、固体支持体に固定化され得る。固体支持体は、バッチ若しくは連続撹拌タンク反応器、充填層反応器又は限外ろ過膜反応器中にあり得る。あるいは、酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質は、バッチ若しくは連続撹拌タンク反応器、充填層反応器又は限外ろ過膜反応器中で直接使用され得る。前記方法は、競合グルコース阻害を防ぐためのグルコース除去システム、例えば一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）生物をさらに含み得る。グルコース除去システムを酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質と同時に使用し得る。
【００２０】
本発明はまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列を有するリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質を含む改変ラクトース含有食料品又は食品副産物を対象とする。ラクトース含有食料品又は食品副産物は、乳製品又は乳製品副産物、例えばホエーであり得る。いくつかの実施態様では、食料品又は食品副産物は、ベビーデザート、ベビージュース、ベビースナック、ベビーヨーグルト飲料、エネルギー飲料、フィットネスウォーター若しくはサーストクエンチャー、冷凍乳製品デザート、（ビタミン／ミネラル補強された）フルーツ飲料、フルーツパイフィリング、フルーツ調製物、乳児用調製粉乳、乳児用食事代替飲料、ゼリージャム、食事代替飲料、ミルク、ミルクベースの飲料、ミルク代用品、ミルク用シロップフレーバー、ヨーグルト又はホエーである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
４．  図面の簡単な説明
【図１Ａ】P. pastorisにおいて発現させた精製ｒＢＨＴのゲル電気泳動。（１Ａ）銀染色した精製ｒＢＨＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥ：レーン１、ｒＢＨＴ ０．５μg；レーン２、ｒＢＨＴ ０．１μg。（１Ｂ）抗ｒＢＨＴ抗血清によるウエスタンブロット分析。レーンＭは、マーカータンパク質の分子量（kDa）がパネルＡの右に示されていることを示す。（１Ｃ）ｒＢＨＴのザイモグラム。レーン１、E. coli  ＢＬＲ培養物において発現させた精製ｒＢＨＴ−６×ＨＩＳ；レーン２、非トランスフォーメーションメタノール誘導ＧＳ１１５由来のブロス；レーン３、メタノール誘導リコンビナントＧＳ１１５／ｒＢＨＴ由来のブロス。Ｘ−ＧＡＬの酵素切断から生じた青色の沈殿物の形成によって、活性を可視化した。
【図１Ｂ】P. pastorisにおいて発現させた精製ｒＢＨＴのゲル電気泳動。（１Ａ）銀染色した精製ｒＢＨＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥ：レーン１、ｒＢＨＴ ０．５μg；レーン２、ｒＢＨＴ ０．１μg。（１Ｂ）抗ｒＢＨＴ抗血清によるウエスタンブロット分析。レーンＭは、マーカータンパク質の分子量（kDa）がパネルＡの右に示されていることを示す。（１Ｃ）ｒＢＨＴのザイモグラム。レーン１、E. coli  ＢＬＲ培養物において発現させた精製ｒＢＨＴ−６×ＨＩＳ；レーン２、非トランスフォーメーションメタノール誘導ＧＳ１１５由来のブロス；レーン３、メタノール誘導リコンビナントＧＳ１１５／ｒＢＨＴ由来のブロス。Ｘ−ＧＡＬの酵素切断から生じた青色の沈殿物の形成によって、活性を可視化した。
【図１Ｃ】P. pastorisにおいて発現させた精製ｒＢＨＴのゲル電気泳動。（１Ａ）銀染色した精製ｒＢＨＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥ：レーン１、ｒＢＨＴ ０．５μg；レーン２、ｒＢＨＴ ０．１μg。（１Ｂ）抗ｒＢＨＴ抗血清によるウエスタンブロット分析。レーンＭは、マーカータンパク質の分子量（kDa）がパネルＡの右に示されていることを示す。（１Ｃ）ｒＢＨＴのザイモグラム。レーン１、E. coli  ＢＬＲ培養物において発現させた精製ｒＢＨＴ−６×ＨＩＳ；レーン２、非トランスフォーメーションメタノール誘導ＧＳ１１５由来のブロス；レーン３、メタノール誘導リコンビナントＧＳ１１５／ｒＢＨＴ由来のブロス。Ｘ−ＧＡＬの酵素切断から生じた青色の沈殿物の形成によって、活性を可視化した。
【図２Ａ】（２Ａ）ｐＨ、（２Ｂ）２０℃〜８０℃の温度、（２Ｃ）ガラクトース（黒丸）及びグルコース（黒四角）の濃度、（２Ｄ）２０℃〜５０℃の熱安定性に応じたｒＢＨＴ相対活性。サンプルを１２時間ごとに取り出し、２０℃で活性をアッセイした。（Ａ）について、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５〜１１）又はクエン酸緩衝液（ｐＨ２〜５）を使用した以外は、１．３mM ＯＮＰ−Ｇｌｕを含有する５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中、２０℃で酵素活性アッセイを行った。ゼロ時間に取得した値（１００％）を基準にして、酵素活性を計算した。試験した酵素の初期濃度は、２０℃のアッセイで０．２U/mlであった（Ｋｍ＝０．３７mM及びＶｍａｘ＝０．０９mM／分）。データは、２回の実験の平均を表す（信頼度±５％）。
【図２Ｂ】（２Ａ）ｐＨ、（２Ｂ）２０℃〜８０℃の温度、（２Ｃ）ガラクトース（黒丸）及びグルコース（黒四角）の濃度、（２Ｄ）２０℃〜５０℃の熱安定性に応じたｒＢＨＴ相対活性。サンプルを１２時間ごとに取り出し、２０℃で活性をアッセイした。（Ａ）について、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５〜１１）又はクエン酸緩衝液（ｐＨ２〜５）を使用した以外は、１．３mM ＯＮＰ−Ｇｌｕを含有する５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中、２０℃で酵素活性アッセイを行った。ゼロ時間に取得した値（１００％）を基準にして、酵素活性を計算した。試験した酵素の初期濃度は、２０℃のアッセイで０．２U/mlであった（Ｋｍ＝０．３７mM及びＶｍａｘ＝０．０９mM／分）。データは、２回の実験の平均を表す（信頼度±５％）。
【図２Ｃ】（２Ａ）ｐＨ、（２Ｂ）２０℃〜８０℃の温度、（２Ｃ）ガラクトース（黒丸）及びグルコース（黒四角）の濃度、（２Ｄ）２０℃〜５０℃の熱安定性に応じたｒＢＨＴ相対活性。サンプルを１２時間ごとに取り出し、２０℃で活性をアッセイした。（Ａ）について、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５〜１１）又はクエン酸緩衝液（ｐＨ２〜５）を使用した以外は、１．３mM ＯＮＰ−Ｇｌｕを含有する５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中、２０℃で酵素活性アッセイを行った。ゼロ時間に取得した値（１００％）を基準にして、酵素活性を計算した。試験した酵素の初期濃度は、２０℃のアッセイで０．２U/mlであった（Ｋｍ＝０．３７mM及びＶｍａｘ＝０．０９mM／分）。データは、２回の実験の平均を表す（信頼度±５％）。
【図２Ｄ】（２Ａ）ｐＨ、（２Ｂ）２０℃〜８０℃の温度、（２Ｃ）ガラクトース（黒丸）及びグルコース（黒四角）の濃度、（２Ｄ）２０℃〜５０℃の熱安定性に応じたｒＢＨＴ相対活性。サンプルを１２時間ごとに取り出し、２０℃で活性をアッセイした。（Ａ）について、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５〜１１）又はクエン酸緩衝液（ｐＨ２〜５）を使用した以外は、１．３mM ＯＮＰ−Ｇｌｕを含有する５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中、２０℃で酵素活性アッセイを行った。ゼロ時間に取得した値（１００％）を基準にして、酵素活性を計算した。試験した酵素の初期濃度は、２０℃のアッセイで０．２U/mlであった（Ｋｍ＝０．３７mM及びＶｍａｘ＝０．０９mM／分）。データは、２回の実験の平均を表す（信頼度±５％）。
【図３】４２℃でインキュベーションした部分精製ｒＢＨＴ（０．５U/gラクトース）の５mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を使用したラクトース（２％）からのガラクトシルラクトースの合成。ラクトース、グルコース、ガラクトース及びガラクトシルラクトースの濃度をg/l単位で示す。屈折率検出器からのシグナル強度測定値として、定量されていない残存ＧＯＳ種を示す。データは、２回の実験の平均を表す（信頼度±５％）。
【図４Ａ】４２℃（４Ａ）又は３０℃（４Ｂ）でインキュベーションしたP. pastoris休止細胞（０．５U/gラクトースで膜結合ｒＢＨＴを有する）の５mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を使用したラクトース（２０％）からのガラクトオリゴ糖の合成。ラクトース、グルコース、ガラクトース及びガラクトシルラクトースの濃度をg/l単位で示す。屈折率検出器からのシグナル強度測定値として、定量されていない残存ＧＯＳ種を示す。データは、２回の実験の平均を表す（信頼度±５％）。
【図４Ｂ】４２℃（４Ａ）又は３０℃（４Ｂ）でインキュベーションしたP. pastoris休止細胞（０．５U/gラクトースで膜結合ｒＢＨＴを有する）の５mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を使用したラクトース（２０％）からのガラクトオリゴ糖の合成。ラクトース、グルコース、ガラクトース及びガラクトシルラクトースの濃度をg/l単位で示す。屈折率検出器からのシグナル強度測定値として、定量されていない残存ＧＯＳ種を示す。データは、２回の実験の平均を表す（信頼度±５％）。
【図５】図５は、３０℃における、酵素活性と、糖（本明細書に記載されるｒＢＨＴによって産生されたＧＯＳ（（ＧＯＳ  ＮＣＳＵ））を含む）と、２つの市販の酵素Vivinal GOS及びOligomate 55NP（Yakalt Pharmaceuticals製）との比較を示す。セクション６．３の手順を参照のこと。
【図６Ａ】ＢＨＴに関するKyte及びDoolittleのハイドロパシープロット。予測膜アンカー／シグナル配列のアミノ酸配列を増幅した。膜貫通領域予測アルゴリズム（www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）も、内在性膜貫通タンパク質に典型的なＢＨＴ中の疎水性残基１〜１７のストレッチを予測し、SignalPアルゴリズム（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）は、同じ残基についてシグナル配列候補を予測し、残基１７〜１８及び残基２２〜２３に切断部位候補を予測した。天然膜アンカーとして機能する構築物１、２、３、４及び７では、シグナル配列を保持した。
【図６Ｂ】ＢＨＴに関するKyte及びDoolittleのハイドロパシープロット。予測膜アンカー／シグナル配列のアミノ酸配列を増幅した。膜貫通領域予測アルゴリズム（www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）も、内在性膜貫通タンパク質に典型的なＢＨＴ中の疎水性残基１〜１７のストレッチを予測し、SignalPアルゴリズム（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）は、同じ残基についてシグナル配列候補を予測し、残基１７〜１８及び残基２２〜２３に切断部位候補を予測した。天然膜アンカーとして機能する構築物１、２、３、４及び７では、シグナル配列を保持した。
【図７Ａ】ＢＨＴの配列分析。（７Ａ）ウェブベースSMARTプログラム（http://smart.embl-heidelberg.de）によって決定したS. singularis由来のＢＨＴポリペプチドの概略図。黒四角によって表されるリーダーペプチドをSignalPプログラムによって決定した。黒丸によって表される組成の複雑さが低いセグメントをSEGプログラム（http://mendel.imp.ac.at/METHODS/seg.server.html）によって決定した。BLASTによってのみ見出されたヒットは、グリコヒドロラーゼドメインによって示されている。黒三角は、NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)によって決定した３つの推定上のＮ−グリコシル化部位の位置を示す。（７Ｂ）RHYTHM膜貫通予測方法によって計算したリーダーペプチドの概略図。予測膜アンカー配列のアミノ酸配列を増幅した。膜接触アミノ酸は大きな太字であり、ヘリックス接触アミノ酸は大きな書体で下線が付されている。また、予測細胞質領域及び細胞外領域の位置も示されている。矢印は、切断部位候補を示す。（７Ｃ）ハイドロパシープロット。９アミノ酸の窓長にわたって親水性を計算するKyte-Doolittle法を使用して、プロットを作成した。アミノ酸数は、Ｘ軸の下に示されている。Ｙ軸上のゼロは、疎水性アミノ酸及び親水性アミノ酸を分ける。
【図７Ｂ】ＢＨＴの配列分析。（７Ａ）ウェブベースSMARTプログラム（http://smart.embl-heidelberg.de）によって決定したS. singularis由来のＢＨＴポリペプチドの概略図。黒四角によって表されるリーダーペプチドをSignalPプログラムによって決定した。黒丸によって表される組成の複雑さが低いセグメントをSEGプログラム（http://mendel.imp.ac.at/METHODS/seg.server.html）によって決定した。BLASTによってのみ見出されたヒットは、グリコヒドロラーゼドメインによって示されている。黒三角は、NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)によって決定した３つの推定上のＮ−グリコシル化部位の位置を示す。（７Ｂ）RHYTHM膜貫通予測方法によって計算したリーダーペプチドの概略図。予測膜アンカー配列のアミノ酸配列を増幅した。膜接触アミノ酸は大きな太字であり、ヘリックス接触アミノ酸は大きな書体で下線が付されている。また、予測細胞質領域及び細胞外領域の位置も示されている。矢印は、切断部位候補を示す。（７Ｃ）ハイドロパシープロット。９アミノ酸の窓長にわたって親水性を計算するKyte-Doolittle法を使用して、プロットを作成した。アミノ酸数は、Ｘ軸の下に示されている。Ｙ軸上のゼロは、疎水性アミノ酸及び親水性アミノ酸を分ける。
【図７Ｃ】ＢＨＴの配列分析。（７Ａ）ウェブベースSMARTプログラム（http://smart.embl-heidelberg.de）によって決定したS. singularis由来のＢＨＴポリペプチドの概略図。黒四角によって表されるリーダーペプチドをSignalPプログラムによって決定した。黒丸によって表される組成の複雑さが低いセグメントをSEGプログラム（http://mendel.imp.ac.at/METHODS/seg.server.html）によって決定した。BLASTによってのみ見出されたヒットは、グリコヒドロラーゼドメインによって示されている。黒三角は、NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)によって決定した３つの推定上のＮ−グリコシル化部位の位置を示す。（７Ｂ）RHYTHM膜貫通予測方法によって計算したリーダーペプチドの概略図。予測膜アンカー配列のアミノ酸配列を増幅した。膜接触アミノ酸は大きな太字であり、ヘリックス接触アミノ酸は大きな書体で下線が付されている。また、予測細胞質領域及び細胞外領域の位置も示されている。矢印は、切断部位候補を示す。（７Ｃ）ハイドロパシープロット。９アミノ酸の窓長にわたって親水性を計算するKyte-Doolittle法を使用して、プロットを作成した。アミノ酸数は、Ｘ軸の下に示されている。Ｙ軸上のゼロは、疎水性アミノ酸及び親水性アミノ酸を分ける。
【図８Ａ】各リコンビナントP. pastoris株による分泌タンパク質の濃度。ｒＢｈｔ及びｓｃＦｖ１３Ｒ４を含有するリコンビナント株のグラフ表示を、プロットの左（８Ａ）及び右（８Ｄ）にそれぞれ示す。（８Ｂ）分泌されたｒＢＨＴ−ＨＩＳ。（８Ｃ）分泌されたｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ。ＯＤ６００について分泌タンパク質の値を標準化し、平均±ＳＥを表した。以下のリコンビナント株から分泌タンパク質を分析した：（８Ａ及び８Ｂ）１列目、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；２列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ；３列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；４列目、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳ。（８Ｃ及び８Ｄ）１列目、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ；２列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（１−１１０）−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ；３列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−１１０）−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ；４列目、ＧＳ１１５：：ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ。
【図８Ｂ】各リコンビナントP. pastoris株による分泌タンパク質の濃度。ｒＢｈｔ及びｓｃＦｖ１３Ｒ４を含有するリコンビナント株のグラフ表示を、プロットの左（８Ａ）及び右（８Ｄ）にそれぞれ示す。（８Ｂ）分泌されたｒＢＨＴ−ＨＩＳ。（８Ｃ）分泌されたｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ。ＯＤ６００について分泌タンパク質の値を標準化し、平均±ＳＥを表した。以下のリコンビナント株から分泌タンパク質を分析した：（８Ａ及び８Ｂ）１列目、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；２列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ；３列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；４列目、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳ。（８Ｃ及び８Ｄ）１列目、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ；２列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（１−１１０）−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ；３列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−１１０）−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ；４列目、ＧＳ１１５：：ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ。
【図８Ｃ】各リコンビナントP. pastoris株による分泌タンパク質の濃度。ｒＢｈｔ及びｓｃＦｖ１３Ｒ４を含有するリコンビナント株のグラフ表示を、プロットの左（８Ａ）及び右（８Ｄ）にそれぞれ示す。（８Ｂ）分泌されたｒＢＨＴ−ＨＩＳ。（８Ｃ）分泌されたｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ。ＯＤ６００について分泌タンパク質の値を標準化し、平均±ＳＥを表した。以下のリコンビナント株から分泌タンパク質を分析した：（８Ａ及び８Ｂ）１列目、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；２列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ；３列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；４列目、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳ。（８Ｃ及び８Ｄ）１列目、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ；２列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（１−１１０）−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ；３列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−１１０）−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ；４列目、ＧＳ１１５：：ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ。
【図８Ｄ】各リコンビナントP. pastoris株による分泌タンパク質の濃度。ｒＢｈｔ及びｓｃＦｖ１３Ｒ４を含有するリコンビナント株のグラフ表示を、プロットの左（８Ａ）及び右（８Ｄ）にそれぞれ示す。（８Ｂ）分泌されたｒＢＨＴ−ＨＩＳ。（８Ｃ）分泌されたｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ。ＯＤ６００について分泌タンパク質の値を標準化し、平均±ＳＥを表した。以下のリコンビナント株から分泌タンパク質を分析した：（８Ａ及び８Ｂ）１列目、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；２列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ；３列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；４列目、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳ。（８Ｃ及び８Ｄ）１列目、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ；２列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（１−１１０）−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ；３列目、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−１１０）−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ；４列目、ＧＳ１１５：：ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ。
【図９Ａ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）分離及びウエスタンブロットにより、様々なP. pastoris  ＧＳ１１５リコンビナントによって発現された分泌、細胞結合又は精製ｒＢＨＴ−ＨＩＳを示す抗Ｈｉｓ抗血清が明らかになった。（９Ａ）全てのリコンビナントによって生成されたタンパク質無細胞抽出物（分泌タンパク質）を２０倍濃縮した。（９Ｂ）１×Laemmli緩衝液中でガラスビーズを用いて破砕したリコンビナント細胞の５つのＯＤ６００から、細胞結合タンパク質を得た。レーン１、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳ；レーン２、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；レーン３、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ；レーン４、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；及びレーン５、ＧＳ１１５コントロール。（９Ｃ）ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）で分離した、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによって発現されたｒＢＨＴ−ＨＩＳの銀染色。Ｍは、マーカーレーンを示す。マーカータンパク質の分子量（kDa）は、パネルの左に示されている。
【図９Ｂ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）分離及びウエスタンブロットにより、様々なP. pastoris  ＧＳ１１５リコンビナントによって発現された分泌、細胞結合又は精製ｒＢＨＴ−ＨＩＳを示す抗Ｈｉｓ抗血清が明らかになった。（９Ａ）全てのリコンビナントによって生成されたタンパク質無細胞抽出物（分泌タンパク質）を２０倍濃縮した。（９Ｂ）１×Laemmli緩衝液中でガラスビーズを用いて破砕したリコンビナント細胞の５つのＯＤ６００から、細胞結合タンパク質を得た。レーン１、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳ；レーン２、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；レーン３、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ；レーン４、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；及びレーン５、ＧＳ１１５コントロール。（９Ｃ）ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）で分離した、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによって発現されたｒＢＨＴ−ＨＩＳの銀染色。Ｍは、マーカーレーンを示す。マーカータンパク質の分子量（kDa）は、パネルの左に示されている。
【図９Ｃ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）分離及びウエスタンブロットにより、様々なP. pastoris  ＧＳ１１５リコンビナントによって発現された分泌、細胞結合又は精製ｒＢＨＴ−ＨＩＳを示す抗Ｈｉｓ抗血清が明らかになった。（９Ａ）全てのリコンビナントによって生成されたタンパク質無細胞抽出物（分泌タンパク質）を２０倍濃縮した。（９Ｂ）１×Laemmli緩衝液中でガラスビーズを用いて破砕したリコンビナント細胞の５つのＯＤ６００から、細胞結合タンパク質を得た。レーン１、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳ；レーン２、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；レーン３、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ；レーン４、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ；及びレーン５、ＧＳ１１５コントロール。（９Ｃ）ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）で分離した、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによって発現されたｒＢＨＴ−ＨＩＳの銀染色。Ｍは、マーカーレーンを示す。マーカータンパク質の分子量（kDa）は、パネルの左に示されている。
【図１０Ａ】可溶性ｒＢＨＴ、又は膜結合ｒＢＨＴを含有するP. pastoris休止細胞（０．５Ｕ ｒＢＨＴ／ｇラクトース）を使用したガラクトシルラクトース合成の時間経過。（１０Ａ）ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ（実線）によって発現された分泌ｒＢＨＴ−ＨＩＳ、及びＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）（破線）によって発現されたｒＢＨＴによる合成。（１０Ｂ）休止細胞ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ（黒四角）及びＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）（白四角）によるガラクトシルラクトース合成速度。アッセイは、２００g/Lラクトース及び精製酵素又はP. pastoris休止細胞の５mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を含有しており、３０℃でインキュベーションした。サンプルを定期的に取り出し、ＨＰＬＣによって分析した。ラクトース、グルコース、ガラクトース及びガラクトシルラクトースの濃度をg/L単位で示す。屈折率検出器からのシグナル強度測定値として、定量されていない残存ＧＯＳ種を示す。データは、２回の独立した実験の平均を表す。
【図１０Ｂ】可溶性ｒＢＨＴ、又は膜結合ｒＢＨＴを含有するP. pastoris休止細胞（０．５Ｕ ｒＢＨＴ／ｇラクトース）を使用したガラクトシルラクトース合成の時間経過。（１０Ａ）ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ（実線）によって発現された分泌ｒＢＨＴ−ＨＩＳ、及びＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）（破線）によって発現されたｒＢＨＴによる合成。（１０Ｂ）休止細胞ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ（黒四角）及びＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）（白四角）によるガラクトシルラクトース合成速度。アッセイは、２００g/Lラクトース及び精製酵素又はP. pastoris休止細胞の５mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を含有しており、３０℃でインキュベーションした。サンプルを定期的に取り出し、ＨＰＬＣによって分析した。ラクトース、グルコース、ガラクトース及びガラクトシルラクトースの濃度をg/L単位で示す。屈折率検出器からのシグナル強度測定値として、定量されていない残存ＧＯＳ種を示す。データは、２回の独立した実験の平均を表す。
【００２２】
５．  発明の詳細な説明
本発明は、限定されないが、Pichia pastorisにおいて発現されるコドン最適化合成ｒＢｈｔ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＪＦ２９８２８）を使用する方法を含め、S. singularis  ＢＨＴを発現させるためのいくつかの方法を報告する。本発明者らは、分泌リコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）によるラクトースからのＧＯＳ生産速度を、膜結合ｒＢＨＴを有するP. pastoris休止細胞と比較して調査した。
【００２３】
本明細書で意味する場合、「ｒＢＨＴタンパク質」は、全長ｒＢＨＴタンパク質並びにそのフラグメント及び／又は変異体（ｒＢＨＴ遺伝子の天然に存在する対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質を含む）、並びに天然に存在するｒＢＨＴタンパク質と比較していくつかの配列変化を含有し得る組換え生産されたｒＢＨＴタンパク質を含む。
【００２４】
「リコンビナント」タンパク質は、遺伝子工学のプロセスから生じるものである。「遺伝子工学」という用語は、高レベル若しくは低レベルで遺伝子を発現するか、又は突然変異型の遺伝子を発現する細胞を作製するのに使用されるリコンビナントＤＮＡ又は核酸法を指す。換言すれば、リコンビナントポリヌクレオチド分子で細胞をトランスフェクション、トランスフォーメーション又はトランスダクションし、それにより、その細胞による所望のポリペプチドの発現を変化させる。
【００２５】
「ガラクトオリゴ糖」又は「ＧＯＳ」は、β−Ｄ−Ｇａｌ（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ、β−Ｄ−Ｇａｌ（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ及びβ−Ｄ−Ｇａｌ（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌ（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃを含むＧａｌ−Ｇａｌ又は［Ｇａｌ］ｎ−Ｇｌｃ（１＜ｎ＜８）などの２つ以上の糖単位を有するガラクトース含有多糖を意味する。
【００２６】
５．１．  シグナル配列
可溶性分泌タンパク質及び細胞表面に発現するタンパク質は、真核生物細胞において、小胞体（ＥＲ）が結合した膜を介してタンパク質が挿入されるのを媒介する疎水性配列であるＮ末端「シグナル配列」を含むことが多い。Ｉ型膜貫通タンパク質は、シグナル配列も含む。本明細書で意味する場合、「シグナル配列」はアミノ末端疎水性配列であり、通常は、タンパク質の一部又は全部がＥＲ膜を介してＥＲ内腔に挿入された後に酵素的に除去される。したがって、シグナル配列は、分泌型タンパク質又は膜貫通型タンパク質の前駆体形態の一部として存在し得るが、成熟形態のタンパク質には一般的に存在しないことが当技術分野で公知である。タンパク質がシグナル配列を含むと言われる場合、前駆体形態のタンパク質はシグナル配列を含有するが、成熟形態のタンパク質はシグナル配列を含有しない可能性があることを理解すべきである。シグナル配列は、切断部位（−１位）のすぐ上流の隣接残基と、この酵素切断に重要な−３位の別の残基とを含有する。Nielsen et al. 1997 Protein Eng 10(l) l-6; von Heijne 1983 Eur J Biochem 133(1) 7-21; von Heijne 1985 J Mol Biol 184 99-105（シグナル配列及びその同定方法について記載されている部分は、参照により本明細書に組み込まれる）。Nielsen et al.（上掲）に記載されているように、シグナル配列を同定し得る。哺乳動物宿主細胞で機能的なシグナルペプチド又は配列の例としては、以下のものが挙げられる：Saccharomyces cerevisiaeのプレプロα接合因子シグナル配列、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されているインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Cosman et al. 1984 Nature 312 768-771)に記載されているインターロイキン−２レセプターのシグナル配列；欧州特許第０３６７５６６号に記載されているインターロイキン−４レセプターシグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されているＩ型インターロイキン−１レセプターシグナル配列；欧州特許第０４６０８４６号に記載されているＩＩ型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチド。多くの他のシグナル配列が当技術分野で公知である。
【００２７】
５．２．  ｒＢＨＴタンパク質
本発明は、ｒＢＨＴの分泌バージョン、可溶性バージョン、並びに細胞表面に発現され得る膜貫通ドメインを含むバージョンを包含する。このようなタンパク質を単離することができる（すなわち、ｒＢＨＴタンパク質が、調製物中に存在するタンパク質の少なくとも８０％又は少なくとも９０％を構成する精製タンパク質調製物の一部であり得る）。本発明は、下記ｒＢＨＴ核酸によってコードされるｒＢＨＴタンパク質をさらに含む。本明細書で意味する場合、ｒＢＨＴタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のアミノ酸配列を含むタンパク質並びにそのフラグメント、誘導体及び変異体（融合タンパク質を含む）を包含する。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のアミノ酸配列は、シグナル配列を含む。
【００２８】
５．３．  保存的置換
いくつかの実施態様では、置換は、保存的アミノ酸置換であり得る。生物学的活性に影響を及ぼす可能性が低い保存的アミノ酸置換の例としては、以下のものが挙げられる：セリンに代えてアラニン、イソロイシンに代えてバリン、グルタミン酸に代えてアスパラギン酸、セリンに代えてトレオニン、グリシンに代えてアラニン、トレオニンに代えてアラニン、アスパラギンに代えてセリン、バリンに代えてアラニン、グリシンに代えてセリン、フェニルアラニンに代えてチロシン、プロリンに代えてアラニン、アルギニンに代えてリジン、アスパラギンに代えてアスパラギン酸、イソロイシンに代えてロイシン、バリンに代えてロイシン、グルタミン酸に代えてアラニン、グリシンに代えてアスパラギン酸、及びこれらの変更の逆。例えば、Neurath et al., The Proteins, Academic Press, New York (1979)（その関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。さらに、以下のグループ内のあるアミノ酸の、同じグループ内の別のアミノ酸への交換は保存的置換である：（１）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、ノルロイシン及びフェニルアラニン；（２）ヒスチジン、アルギニン、リシン、グルタミン及びアスパラギン；（３）アスパラギン酸及びグルタミン酸；（４）セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びシステイン；及び（５）グリシン、プロリン及びアラニン。
【００２９】
５．４．  グリコシル化
ｒＢＨＴタンパク質は、様々な程度にグリコシル化されていてもよいし、又はグリコシル化されていなくてもよい。例示として、本発明のｒＢＨＴタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０を含むタンパク質に既に見られるものに加えて、１つ以上のＮ連結又はＯ連結グリコシル化部位を含み得る。当業者であれば、配列Ａｓｎ  Ｘｘｘ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘｘｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）の一部であるアスパラギン残基が、Ｎ−グリカン付加部位として機能し得ることを認識するであろう。加えて、Ｏ連結グリコシル化部位として機能し得る多くのセリン残基及びトレオニン残基がある。グリコシル化は、in vivo半減期を増加させ得るか、又は生物学的活性を変化させ得る。得られるタンパク質がグリコシルヒドロラーゼ及びβ−ヘキソシルトランスフェラーゼとして作用し得る限り、ｒＢＨＴタンパク質の変異体としてはまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０中に存在するよりも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個多いＮ連結及び／又はＯ連結グリコシル化部位を含むタンパク質が挙げられる。変異体ｒＢＨＴタンパク質としては、これらがグリコシルヒドロラーゼ及びβ−ヘキソシルトランスフェラーゼとして作用し得る限り、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０中に存在するよりも１個、２個、３個、４個又は５個少ないＮ連結及び／又はＯ連結グリコシル化部位を有するものが挙げられる。
【００３０】
本明細書で意味する場合、ｒＢＨＴタンパク質は、（上で説明した）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０の変異体及び／又はフラグメントであるアミノ酸配列を含み得る少なくとも１つのｒＢＨＴポリペプチドと、少なくとも１つの他の部分とを含む融合タンパク質であり得る。他の部分はまた、非タンパク質部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分又は細胞傷害性部分、細胞増殖抑制部分、発光部分及び／又は放射性部分など）であり得る。ＰＥＧの付加は、少なくともいくつかのタンパク質のin vivo半減期が増加させることが示されている。また、細胞傷害性部分、細胞増殖抑制部分、発光部分及び／又は放射性部分は、診断目的又は治療目的で抗体に融合されている。
【００３１】
様々な目的で（例えば、タンパク質のin vivo半減期を増加させるため、タンパク質の同定、単離及び／又は精製を容易にするため、タンパク質活性を増加させるため、並びにタンパク質のオリゴマー化を促進するためなど）、ｒＢＨＴ以外の様々なポリペプチドをｒＢＨＴポリペプチドに融合し得る。
【００３２】
多くのポリペプチドは、それらが一部であるリコンビナント融合タンパク質の同定及び／又は精製を容易にし得る。例としては、ポリアルギニン、ポリヒスチジン又はＨＡＴ（商標）（Clontech）（これは、固定化金属イオンに対して高い親和性を有する非隣接ヒスチジン残基の天然に存在する配列である）が挙げられる。例えば、固定化ニッケル又は固定化コバルトイオンを含むTALON（商標）樹脂（Clontech）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、これらのポリペプチドを含むｒＢＨＴタンパク質を精製し得る。例えば、Knol et al. 1996 J Biol Chem 27(26) 15358-15366を参照のこと。ポリアルギニンを含むポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーによる効果的な精製を可能にする。他の有用なポリペプチドとしては、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号及びHopp et al. 1988 Bio/Technology 6 1204に記載されている抗原性識別ペプチドが挙げられる。このようなペプチドの１つは、FLAG（商標）ペプチドであり、これは抗原性が高く、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供するので、発現されたリコンビナント融合タンパク質の迅速なアッセイ及び容易な精製を可能にする。米国特許第５，０１１，９１２号に記載されているように、４Ｅ１１という名称のマウスハイブリドーマは、特定の２価金属陽イオンの存在下でＦＬＡＧペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、アクセッションナンバーＨＢ９２５９でAmerican Type Culture Collectionに寄託されている。ＦＬＡＧペプチドに結合するモノクローナル抗体を親和性試薬として使用して、ＦＬＡＧペプチドを含むポリペプチド精製試薬を回収し得る。他の適切なタンパク質タグ及び親和性試薬は、以下のものである：１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の、固定化グルタチオンに対する親和性を利用するGST-Bind（商標）システム（Novagen）に記載されているもの；２）Ｔ７遺伝子１０タンパク質のアミノ末端の１１アミノ酸の、モノクローナル抗体に対する親和性を利用するT7-TAG（登録商標）アフィニティー精製キットに記載されているもの；又は３）ストレプトアビジンの工学的に作製された形態の、タンパク質タグに対する親和性を利用するSTREP-TAG（登録商標）システム（Novagen）に記載されているもの。上記タンパク質タグのいくつか及び他のものは、Sassenfeld 1990 TIBTECH 8: 88-93, Brewer et al., in Purification and Analysis of Recombinant Proteins, pp.239-266, Seetharam and Sharma (eds.), Marcel Dekker, Inc. (1991), and Brewer and Sassenfeld, in Protein Purification Applications, pp. 91 - 111, Harris and Angal (eds.), Press, Inc., Oxford England (1990)に記載されている。タンパク質タグが記載されているこれらの参考文献の部分は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、上記タグの２つ以上の融合物（例えば、ＦＬＡＧタグとポリヒスチジンタグとの融合物など）を本発明のｒＢＨＴタンパク質に融合し得る。
【００３３】
５．５．  ｒＢＨＴ核酸
本発明は、本明細書に記載されるｒＢＨＴタンパク質（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のアミノ酸配列を含むタンパク質並びにそのフラグメント及び／又は変異体を含む）をコードする単離された核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）を包含する。好ましくは、前記タンパク質は、配列番号１２又は１４のアミノ酸配列を有する。これらの核酸は、とりわけ、グリコシルヒドロラーゼ活性及びβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ活性を有するリコンビナントタンパク質を生産するのに有用である。このような核酸は、改変ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡであり得る。好ましくは、前記核酸は、ｒＢＨＴタンパク質をコードする連続したオープンリーディングフレームを含み得る。本発明の核酸分子としては、一本鎖形態及び二本鎖形態の両方のＤＮＡ及びＲＮＡ並びに対応する相補配列が含まれる。「単離された核酸」は、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノム中に存在する隣接遺伝子配列から分離された核酸であり、化学合成された核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）又はテンプレートから酵素的に合成された核酸（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物又はｃＤＮＡ）の場合、このようなプロセスから生じる核酸は、単離された核酸であると理解される。単離された核酸分子は、別個のフラグメントの形態の又はより大きな核酸構築物の成分としての核酸分子を指す。
【００３４】
本発明はまた、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９の配列を含む核酸若しくはそのフラグメント、又は中ストリンジェンシー条件下、場合により高ストリンジェンシー条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９のヌクレオチド配列（これは、全長ｒＢＨＴｃＤＮＡのヌクレオチド配列である）を含む核酸とハイブリダイゼーションする核酸であって、グリコシルヒドロラーゼ及びβ−ヘキソシルトランスフェラーゼとして作用し得るタンパク質をコードする核酸を含む。ハイブリダイゼーション技術は当技術分野で周知であり、Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11, 1989)及びCurrent Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4 1995)（その関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。フィルターハイブリダイゼーションの中ストリンジェンシー条件としては、約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ中、約４２℃〜５５℃の温度でのハイブリダイゼーション及び約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられる。高ストリンジェンシー条件は、約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄を使用する以外は上記のハイブリダイゼーション条件と定義される。ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液において、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣＩ、１０mM ＮａＨ２Ｐ０４及び１．２６mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び１５mMクエン酸ナトリウムである）に置き換えることができ、ハイブリダイゼーション完了後に洗浄（場合により、少なくとも２回の洗浄）を１５分間実施する。
【００３５】
当業者に公知であり、以下にさらに記載されているように（例えば、Sambrook et al上掲を参照のこと）、ハイブリダイゼーション反応及び二重鎖安定性を規定する基本原理を適用することによって所望のストリンジェンシーが達成されるように、必要に応じて洗浄温度及び洗浄塩濃度を調整し得ることを理解すべきである。公知の配列の核酸をハイブリダイゼーションする場合、（例えば、ＧＡＰを使用して）核酸配列をアラインメントし、１つ又は複数の最適な配列相補性領域を同定することによって、ハイブリッドの長さを決定し得る。長さが５０塩基対未満と予測されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）（Ｔｍは、以下の式にしたがって決定される）よりも５℃〜１０℃低くするべきである。長さが１８塩基対未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。長さが１８塩基対超のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００Ｎ）（式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である）。このような各ハイブリダイゼーション核酸は、少なくとも１５ヌクレオチド（又は少なくとも１８ヌクレオチド、又は少なくとも２０ヌクレオチド、又は少なくとも２５ヌクレオチド、又は少なくとも３０ヌクレオチド、又は少なくとも４０ヌクレオチド、又は少なくとも５０ヌクレオチド、又は少なくとも１００ヌクレオチド）の長さを有する。Sambrook et al.、上掲。
【００３６】
ｒＢＨＴ核酸としては、以下のポリヌクレオチドを含む核酸が挙げられる：（１）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９の全部、又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９のフラグメントであって、グリコシルヒドロラーゼ及びβ−ヘキソシルトランスフェラーゼとして作用し得るｒＢＨＴタンパク質をコードするフラグメント；（２）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．７％同一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、アラインメントウィンドウが少なくとも１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、４００、５００、６００、８００、１０００又は１２００ヌクレオチド長であり、前記配列が、グリコシルヒドロラーゼ及びβ−ヘキソシルトランスフェラーゼとして作用し得るｒＢＨＴタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（３）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９を基準にして単一ヌクレオチドの１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、６個以下、８個以下、１０個以下、１５個以下、２０個以下、２５個以下又は３０個以下の変更を含むポリヌクレオチドであって、変更が単一ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換であり得、グリコシルヒドロラーゼ及びβ−ヘキソシルトランスフェラーゼとして作用し得るｒＢＨＴタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び（４）本明細書に記載されるｒＢＨＴタンパク質（ｒＢＨＴタンパク質のフラグメント、誘導体及び変異体を含む）をコードするポリヌクレオチド。好ましい実施態様では、ｒＢＨＴタンパク質は、リーダー配列を異種分泌シグナルペプチドで置換することによって生産される。
【００３７】
５．６．  ｒＢＨＴタンパク質の作製方法
ｒＢＨＴタンパク質は、以下のように作製され得る。本明細書に記載されるｒＢＨＴタンパク質をコードする核酸をベクターに導入し得、これを宿主細胞に導入し得る。ｒＢＨＴタンパク質をコードする核酸を含むベクター及び宿主細胞は、本発明によって包含される。ｒＢＨＴタンパク質をコードする核酸を含有する宿主細胞を、ｒＢＨＴタンパク質を発現させ得るような条件下で培養し得る。次いで、細胞を培養した培地又は細胞から、発現させたｒＢＨＴタンパク質を得て、当技術分野で公知の多くの適切な手段のいずれかによって精製し得る。加えて、ｒＢＨＴタンパク質の遺伝子工学的生産方法としては、公知の方法にしたがって無細胞発現系、細胞宿主、組織及び動物モデルにおいてポリヌクレオチド分子を発現させることが挙げられる。
【００３８】
ベクターは、選択マーカーと、宿主における増殖のための複製起点とを含み得る。ベクターは、ｒＢＨＴタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された適切な転写調節配列又は翻訳調節配列（例えば、哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子又は昆虫遺伝子由来のもの）をさらに含み得る。このような調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボゾーム結合部位、並びに転写及び翻訳をコントロールする適切な配列が挙げられる。調節配列が、ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡに機能的に関連する場合、ヌクレオチド配列は作動可能に連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列がｒＢＨＴタンパク質をコードする配列の転写を指令する場合、プロモーターヌクレオチド配列はｒＢＨＴ核酸配列に作動可能に連結されている。ｒＢＨＴタンパク質が融合タンパク質である場合、融合タンパク質の一部をコードする核酸配列（例えば、シグナル配列）がベクターの一部であり得、付加シグナル配列を含むタンパク質＋ｒＢＨＴタンパク質がベクターによってコードされるように、ｒＢＨＴタンパク質をコードする核酸をベクターに挿入し得る。
【００３９】
ｒＢＨＴタンパク質の発現に適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞及び高等真核生物細胞が挙げられる。ベクター中の調節配列は、それらが宿主細胞において作動可能であるように選択される。適切な原核生物宿主細胞としては、Escherichia属、Bacillus属及びSalmonella属の細菌、並びにPseudomonas属、Streptomyces属及びStaphylococcus属のメンバーが含まれる。原核生物細胞（例えば、E. coli）における発現の場合、ｒＢＨＴタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、好ましくは、リコンビナントポリペプチドの発現を容易にするためのＮ末端メチオニン残基を含む。Ｎ末端メチオニンは、発現されたポリペプチドから場合により切断され得る。適切な酵母宿主細胞としては、Saccharomyces属、Pichia属及びKluveromyces属を含む属由来の細胞が挙げられる。好ましい酵母宿主は、S. cerevisiae及びP. pastorisである。昆虫宿主細胞における発現に適切な系は、例えば、Luckow and Summers (1988 BioTechnology 6 47-55)による概説（その関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。適切な哺乳動物宿主細胞としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（Gluzman et al. 1981 Cell 23 175-182）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Puck et al. 1958 PNAS USA 60 1275-1281）、ＣＶ−１（Fischer et al. 1970 Int J Cancer 5 21-27）、ヒト腎臓由来の２９３細胞（American Type Culture Collection (ATCC（登録商標）） catalog no. CRL-10852（商標））及びヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）（ATCC（登録商標）CCL 2）が挙げられる。本段落中で言及されている参考文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
細胞宿主で使用するための発現ベクターは、一般的に、１つ以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。このような遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、又は栄養要求性を与えるタンパク質をコードする。多種多様なこのようなベクターは、商業的供給源から容易に入手可能である。例としては、ｐＧＥＭベクター（Promega）、ｐＳＰＯＲＴベクター及びｐＰＲＯＥＸベクター（InVitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Stratagene）及びｐＱＥベクター（Qiagen）が挙げられる。酵母ベクターは、酵母プラスミド由来の複製起点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終結配列及び選択マーカー遺伝子を含有することが多いであろう。酵母及びE. coliの両方で複製可能なベクター（シャトルベクターと称される）も使用され得る。酵母ベクターの上記特徴に加えて、シャトルベクターは、E. coliにおける複製及び選択のための配列も含むであろう。ｒＢＨＴをコードするヌクレオチド配列の５’末端に酵母α因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含めることによって、酵母宿主において発現されたターゲットポリペプチドの直接分泌が達成され得る。Brake 1989 Biotechnology 13 269-280。
【００４１】
哺乳動物宿主細胞における使用に適切な発現ベクターの例としては、ｐｃＤＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（Invitrogen）、ｐＤＣ４０９（McMahan et al. 1991 EMBO J 10: 2821 -2832）及びｐＳＶＬ（Pharmacia Biotech）が挙げられる。哺乳動物宿主細胞において使用するための発現ベクターは、ウイルスゲノム由来の転写制御配列及び翻訳制御配列を含み得る。
【００４２】
ｒＢＨＴ  ＲＮＡを発現させるのに使用され得る一般的に使用されているプロモーター配列及びエンハンサー配列としては、限定されないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のものが挙げられる。哺乳動物発現ベクターを構築するための方法は、例えば、Okayama and Berg (1982 Mol Cell Biol 2: 161-170)、Cosman et al. (1986 Mol Immunol 23:935-941)、Cosman et al. (1984 Nature 312: 768-771)、欧州特許出願公開第０３６７５６６号及び国際特許出願第９１／１８９８２号に開示されている。これらの参考文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
５．７．  精製タグ
本明細書に記載される６×ＨＩＳタグに加えて、アフィニティタグ、例えば抗原性タグ（例えば、ＦＬＡＧ（Sigma-Aldrich, Hopp et al. 1988 Nat Biotech 6:1204-1210）、ヘマグルチニン（hemagluttanin）（ＨＡ）（Wilson et al., 1984 Cell 37:767）、インテイン融合発現系（New England Biolabs, USA) Chong et al. 1997 Gene 192(2), 271-281、又はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／グルタチオン、ポリＨｉｓ／Ｎｉ又はＣｏ（Gentz et al., 1989 PNAS USA 86:821-824）などの様々な精製方法が使用され得る。タンパク質のＮ末端にＧＳＴタグを含有する融合タンパク質も米国特許第５，６５４，１７６号（Smith）に記載されている。Strepavidin-DynaBeads（登録商標）（Life Technologies, USA）などの磁気分離技術も使用され得る。あるいは、光切断可能なリンカーが使用され得る（例えば、米国特許第７，５９５，１９８号（Olejnik & Rothchild））。他の多くのシステムが当技術分野で公知であり、本発明による使用に適切である。
【００４４】
５．８．  ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の作製方法
本発明の一実施態様では、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、例えば、ラクトース又はセロビオースなどの二糖基質を含む培地中でｒＢＨＴ発現細胞をインキュベーションすることによって生産される。一実施態様では、ＧＯＳは、グルコース除去システムを同時に用いて、ラクトースから生産される。グルコース除去システムは、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）生物であり得る。
【００４５】
５．９．  製剤
本発明の別の態様は、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含有する食料品又は栄養補助食品を生産するための、ｒＢＨＴタンパク質又はｒＢＨＴ発現細胞の使用に関する。食料品は、ヨーグルト、チーズ又は発酵乳製品などの日用食料品であり得る。ｒＢＨＴ又はｒＢＨＴ発現細胞を食料品又は栄養補助食品に部分的に追加し得る。噴霧乾燥（特に最小量の温度感受性物質を粉末形態で得るための迅速かつ穏やかな方法）を使用して、ｒＢＨＴを乾燥し得る。また、粒子をコーティングし、マトリックス中の固体物質を固定化し、マイクロカプセルを製造する噴霧乾燥機の能力を使用して、乾燥ｒＢＨＴをカプセル形態にし得る（www.buchi.com/Mini_ Spray_Dryer_B-290.179.0.html）。機能的ＧＲＡＳカプセル化剤及び技術を使用する他の薬物送達適用を使用し得る。ラクトースを含有する緩衝液中及び乳製品中で再水和したら、活性のｒＢＨＴ率について、乾燥ｒＢＨＴ錠剤及び粉末形態を分析し得る。
【００４６】
食料品の例としては、限定されないが、乳児用調製粉乳、乳製品、飲物及び栄養補助食品が挙げられる。以下の表２を参照のこと。
【００４７】
【表２】
2019062903.tif 000003
【００４８】
上記ｒＢＨＴタンパク質はいずれも、組成物の形態で（すなわち、生理学的に許容し得る担体、賦形剤又は希釈剤などの１つ以上のさらなる成分と共に）送達され得る。例えば、組成物は、本明細書に記載される可溶性ｒＢＨＴタンパク質と、緩衝液、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、低分子量ポリペプチド（例えば、１０未満のアミノ酸を有するものなど）、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、例えばグルコース、スクロース又はデキストリン、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、グルタチオン及び／又は他の安定剤、賦形剤及び／又は保存剤とを含み得る。組成物は、液体又は凍結乾燥粉末として製剤化され得る。医薬製剤で用いられ得る成分のさらなる例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1980)（その関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる）に示されている。
【００４９】
上記治療分子を含む組成物は、限定されないが、非経口投与、局所投与、経口投与、経鼻投与、経膣投与、直腸投与又は経肺投与（吸入による）を含む任意の適切な手段によって投与され得る。注射する場合、組成物は、ボーラス注射又は連続注入によって関節内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与又は皮下投与され得る。インプラント、皮膚パッチ又は坐剤による経皮送達及び持続放出のような（すなわち、疾患部位における）局所投与が意図される。吸入による送達としては、例えば、鼻腔吸入又は経口吸入、噴霧器の使用、エアロゾル形態での吸入などが挙げられる。体腔に挿入された坐剤を介した投与は、例えば、選択した体腔中に固体形態の組成物を挿入し、それを溶解させることによって達成され得る。他の代替手段としては、点眼薬、経口調製物、例えば丸薬、ロゼンジ、シロップ及びチューインガム、並びに局所調製物、例えばローション、ゲル、スプレー及び軟膏が挙げられる。ほとんどの場合、ポリペプチドである治療分子は局所投与され得るか、又は注射若しくは吸入によって投与され得る。
【００５０】
上記治療分子は、治療される症状の治療に有効であり得る任意の投与量、頻度及び期間で投与され得る。投与量は、治療分子の分子性質及び治療される障害の性質に依存する。所望の結果を達成するのに必要な限り、治療は継続され得る。治療の周期は、治療期間を通して一定でもよいし、又は一定ではなくてもよい。例えば、治療を最初に１週間間隔で行い、その後に隔週で行い得る。数日間、数週間、数カ月間又は数年間の期間を有する治療は、本発明によって包含される。治療を中断し、次いで再開し得る。
【００５１】
維持用量は、最初の治療後に投与され得る。投与量は、ミリグラム／体重１キログラム（mg/kg）として、又はミリグラム／皮膚表面１平方メートル（mg/m2）として、又は身長又は体重にかかわらず固定用量として測定され得る。これらは、当技術分野で標準的な投与量単位である。ヒトの皮膚表面積は、標準的な式を使用して身長及び体重から計算される。例えば、治療ｒＢＨＴタンパク質は、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kg又は約０．１mg/kg〜約１．０mg/kgの用量で投与され得る。あるいは、約１mg〜約５００mgの用量が投与され得る。あるいは、約５mg、１０mg、１５mg、２０mg、２５mg、３０mg、３５mg、４０mg、４５mg、５０mg、５５mg、６０mg、１００mg、２００mg又は３００mgの用量が投与され得る。
【００５２】
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、本明細書では、その冠詞の文法的対象の１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すのに使用される。一例として、「要素（an element）」は、１つ以上の要素を意味する。
【００５３】
本明細書を通して、「含む（comprising）」という単語又は「含む（comprises）」若しくは「含む（comprising）」などの変形は、述べられている要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程のグループを含み、いかなる他の要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程のグループも除外しないことを意味すると理解されよう。本発明は、適切には、特許請求の範囲に記載されている工程、要素及び／又は試薬を「含み（comprise）」得るか、これら「からなり（consist of）」得るか、又はこれら「から本質的になり（consist essentially of）」得る。
【００５４】
以下の実施例は本発明をさらに例証するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
６．  実施例
６．１．  材料及び方法
コドン最適化β−ヘキソシルトランスフェラーゼ遺伝子の設計。Clone Managerソフトウェア(Cary, NC)を使用してエキソンを結合することによって、S. singularisのβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ遺伝子（１６）（GenBankアクセッションナンバーＡＢ１２６３２４；１，７８２ｂｐ）のＤＮＡコード配列をアセンブルした。最小自由エネルギー（−６１９．９）、特定の制限部位（５’ＮｃｏＩ及び３’ＮｏｔＩ）及びＧＣ含量（４８．８９％）について最適化したP. pastoris及びE. coli選択コドンに基づいて、コード配列を再設計した。この再設計したバージョンの遺伝子をｒＢｈｔ（GenBankアクセッションナンバーＪＦ２９８２８）と名付け、合成し、ｐＧＳ２１ａ及びｐＵＣ５７に挿入して、それぞれｐＪＢ１００及びｐＪＢ１０７を作製した（表１）。ｒＢｈｔのＤＮＡ配列を確認した（GenScript, Piscataway, NJ）。
【００５６】
E. coliにおいて発現させるためのｒＢｈｔを含有するプラスミドの構築。以前に記載されているように（３２）、クローニング手順を行った。ｒＢＨＴのクローニング及び発現に使用したE. coli株を表３に記載する。New England Biolabs (Beverly, MA)から、制限エンドヌクレアーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼを入手した。ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩでプラスミドｐＪＢ１００及びｐＪＢ１０７を消化し、ｒＢｈｔ遺伝子を含有するフラグメントをNovagenプラスミドに挿入して、発現プラスミドｐＪＢ１０１、ｐＪＢ１０３、ｐＪＢ１０４、ｐＪＢ１０５及びｐＪＢ１０６を作製した（構築物の説明については、表３を参照のこと）。
【００５７】
E. coli  ＢＬＲにおけるｒＢＨＴ融合構築物の発現。pET system manual TB055 8th Edition 02/99 (Novagen)に記載されているように、発現を行った。簡潔に言えば、発現プラスミドをE. coli  ＢＬＲにトランスフォーメーションし、ＩＰＴＧ誘導後に、ｒＢＨＴ活性についてスクリーニングした。５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４及びｐＨ６）及び５０μg/ml細胞浸透性発色性基質Ｘ−ＧＡＬ中でＩＰＴＧ誘導ＢＬＲ細胞をインキュベーションすることによって、in vivo ｒＢＨＴ活性を評価した（表４）。発色を視覚化するために、培養物を３７℃で一晩インキュベーションした。内因性β−ガラクトシダーゼ活性を含有するＢＬ２１細胞をポジティブコントロールとして使用した。
【００５８】
抗ｒＢＨＴの生産。ｐＪＢ１０１を有するE. coli  ＢＬＲ細胞から発現及び精製したｒＢＨＴ−６×ＨＩＳを使用して、抗ｒＢＨＴ抗血清を生産した。製造業者の説明書（QIAGEN, Germany）にしたがってニッケルアガロースゲルクロマトグラフィーを使用することによって、無細胞抽出物画分中に存在するｒＢＨＴ−６×ＨＩＳの精製を実施し、次いで、製造業者の説明書（Bio-Rad, Richmond, CA）にしたがってゲルから電気溶出することによってさらに精製した。ウサギの免疫化（Cocalico Biologics Reamstown, PA）のために、純粋なタンパク質を使用した。研究で使用したさらなる抗体を表４に記載する。
【００５９】
電気泳動及びイムノブロッティング。Laemmliシステム（２３）で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド（polyacrylaminde）ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−４〜１２％）を通常どおりに行った。クーマシーブルー（Bio-Rad, Richmond, CA）又は銀染色（Bio-Rad, Richmond, CA）によって、タンパク質を可視化した。SeeBlue plus (Invitrogen, Carlsbad, CA)を分子量マーカーとして使用した。アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギ又はヤギ抗マウス抗体（Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA）を使用して検出を実施し、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウムクロリド）及びＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩）予混合溶液（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を使用して可視化した以外は以前に記載されているように（７）、デュプリケイトのＰＡＧＥゲルでイムノブロット分析を行った。
【００６０】
P. pastorisリコンビナント株の構築。プライマーＪＢＢ１及びＪＢＢ２を使用してｐＪＢ１０７からｒＢｈｔ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＰＩＣ９に含まれるSaccharomyces cerevisiaeのプレプロα接合因子シグナル配列とそれに続く６×ＨＩＳタグ及び改変ＴＥＶプロテアーゼ切断部位とインフレームでＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限部位を追加した（表２）。ＰＣＲ産物をｐＰＩＣ９のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限部位にライゲーションして、ｐＪＢ１０８を作製した（表３）。プライマー５’ＡＯＸ１及び３’ＡＯＸ１を使用して配列決定（Sequatech, Mountain View, CA）することによって、正しいインフレームライゲーションを確認した（表４）。
【００６１】
Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad, Richmond, CA)を使用してＳａｃＩ（Invitrogen's Pichia expression kit manual, version M）で線状化したｐＪＢ１０８でP. pastoris  ＧＳ１１５（表１）をエレクトロトランスフォーメーションした。３０℃のヒスチジン欠乏再生デキストロース（ＲＤＢ寒天プレート）上で、リコンビナントを選択した。Ｈｉｓ＋コロニーをランダムに選択し、プライマー５’ＡＯＸ１、３’ＡＯＸ１及びα因子を使用してＰＣＲによって、発現カセットのゲノム組み込みを検証した（表４）。InvitrogenのPichia expression kit manual, version Mに概説されている手順にしたがって、メタノール利用（ｍｕｔ＋）表現型のリコンビナントＧＳ１１５／ｒＢｈｔを決定した。
【００６２】
P. pastorisにおけるｒＢＨＴの生産。高レベルのリコンビナントｒＢＨＴ産生体を選択するために、酵母抽出物ペプトンデキストロース培地（ＹＰＤ）中で、６個のＨｉｓ＋分離株を３０℃及び２５０rpmで１２時間成長させ、次いでこれを使用して、初期ＯＤ６００＝０．１まで緩衝グリセロール複合培地１００mlに接種した。培養物がＯＤ６００＝１０を超えたら、培養物がＯＤ６００＝５０を超えるまで２４時間間隔で、メタノールを最終濃度０．５％まで追加し、この後、メタノールを１２時間ごとに追加した。ウサギ抗ｒＢＨＴを使用してウエスタンブロットによって、ＢＨＴ活性の存在について培地サンプルを２４時間ごとに分析して、最適な回収時間を決定した。選択したＧＳ１１５／ｒＢｈｔリコンビナントをＢＭＧＹ ０．５Ｌ中で通常どおり成長させ、メタノールで６日間誘導した。
【００６３】
分泌ｒＢＨＴの精製。硫酸アンモニウムで培養上清（５００ml）を分画した。６０％〜８０％硫酸アンモニウム間の沈殿物を５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に再懸濁した。脱塩し、Amicon MWCO 15 membrane (Amicon Inc., Beverly, MA)で濃縮した後、１／３０（５ml）Mono Qで予め平衡化したカラム(Quarternary amino ethyl) (Amersham Biosciences)に溶液をアプライした。次いで、緩衝液５０mlでカラムを洗浄し、０〜０．２Ｍ塩化ナトリウムの５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３カラム容量を直線勾配で用いて流速１ml／分で溶出した。溶出液を１mlずつ回収した。活性画分をプールし、濃縮し、１０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）に再懸濁し、次いで、同じ緩衝液で予め平衡化したBio-Gel HTヒドロキシアパタイトカラム(Bio-Rad, Richmond, CA) (1/10 2 ml)にアプライし、１０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で洗浄し、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で溶出した。比活性が最も高い画分は、８．２U/mgの比活性を有する純粋なｒＢＨＴを含有していた。全てのクロマトグラフィー画分で酵素活性をアッセイし（下記）、精製工程を２５℃で行った。
【００６４】
分子量の決定。限外ろ過によって２０倍濃縮した培養培地（０．５ml）を、５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、０．１Ｍ ＮａＣｌで予め平衡化したサイズ排除カラムSuperdex 200 (Amersham Biosciences) 1/30 (18 ml)にアプライした。流速０．５ml／分で画分０．５mlを回収し、下記のように基質としてＯＮＰ−Ｇｌｕを使用してザイモグラムによってｒＢＨＴ活性についてアッセイした。ｒＢＨＴ及び分子量標準の溶出を２８０nmでモニタリングした。以下の分子を使用して、カラムをキャリブレーションした：サイログロブリン、６６９kDa；フェリチン、４４０kDa；カタラーゼ、２３２kDa；乳酸デヒドロゲナーゼ、１４０kDa；ウシ血清アルブミン；６７kDa（GE, Healthcare）。ｌｏｇ分子量（Ｙ軸）対溶出体積（Ｘ軸）のキャリブレーションプロットから、ｒＢＨＴの分子量を推定した。全てのクロマトグラフィー工程を２５℃で行った。
【００６５】
酵素活性アッセイ。確立された条件下においてKuby法（１３、２２）の変法によって、ｒＢＨＴの初期反応速度を測定した。簡潔に言えば、１．３mM ＯＮＰ−Ｇｌｕ及び５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を含有する容量２５０μlで、反応を実施した。確立された条件下においてアッセイを１０分間行い、１容量の０．２５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を追加することによって停止させた。煮沸ｒＢＨＴ及び基質を含有する反応混合物は、ネガティブコントロールとして機能した。アッセイを常にデュプリケイトで実施した（信頼度±５％）。無細胞ブロスのサンプル及びタンパク質濃縮物を上記のように得た。５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で予め洗浄した（膜結合ｒＢＨＴを有する）休止細胞を、確立された条件下においてアッセイした。Ｘ−ＧＡＬが反応の基質であった場合、濃度は、５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）中で５０μg/mlであった。
【００６６】
酵素活性１単位（Ｕ）は、アッセイ条件下において１分間当たりに放出されたｏ−ニトロフェノール１μmolに等しい。比活性を単位／mgタンパク質と定義する。ｏ−ニトロフェノールのモル吸光係数は、ε＝０．０３３/mM/cm、ｐＨ４；ε＝０．０３６/mM/cm、ｐＨ５；ε＝０．０３８/mM/cm、ｐＨ６であった。４０５nmにおけるｏ−ニトロフェノールの吸光度（Ｙ軸）対ｏ−ニトロフェノール濃度（Ｘ軸）のキャリブレーションプロットから、放出されたｏ−ニトロフェノールの量を推定した。
【００６７】
また、ザイモグラムによって、酵素活性を可視化した。Gallagher（８）によって記載されているプロトコールの変法を使用して、ネイティブＰＡＧＥを実施した。E. coliの溶解物又はP. pastorisの上清由来のタンパク質を、５％（w/v）スクロース／１０μg/mlブロモフェノールブルーに可溶化し、ランニング緩衝液として５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）を利用して６％ネイティブポリアクリルアミドゲルで分離した。５時間にわたる６０ｍＡの電気泳動の間、冷水を再循環させたMighty Small Hoefer電気泳動装置内において、ゲルを低温に維持した。電気泳動後、洗浄緩衝液（５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０））でゲルを１０分間にわたって２回洗浄した。５０μg/mlＸ−ＧＡＬを含有する洗浄緩衝液に２０℃で浸漬したろ紙を重ねることによって、ザイモグラムを２４時間現像した。青色の沈殿物が、酵素の位置を示していた。
【００６８】
酵素反応速度。５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ５）中、４２℃で、０〜１．２U/mlの範囲の一連の酵素希釈物をアッセイした。１．３mM ＯＮＰ−Ｇｌｕを追加することによって酵素活性アッセイを開始し、４０５nmの吸光度を１分間隔で合計２０分間モニタリングした。実験的吸光度値を時間に対してプロットしたところ、少なくとも２０分間にわたって０．６U/mlまでは線形比例するが、１．０U/ml超の酵素濃度では、吸光度値は５分前にプラトーになることが示された。
【００６９】
５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ５）中でＯＮＰ−Ｇｌｕを０から１０．４mMまで変化させ、２０℃、３０℃、４０℃及び５０℃における初期反応速度を測定することによって、０．２U/ml ｒＢＨＴ（４２℃）のMichaelis-Menten定数（ｋｍ及びＶｍａｘ）を決定した。ヒル係数１のヒル方程式の非線形回帰を使用するOriginPro 7.5を用いて、各温度における速度定数を決定した。確立された条件下において得られた値は、以下のとおりであった（Ｔ、ｋｍ、Ｖｍａｘ）：（２０℃、０．３７mM、０．０９mM／分）、（３０℃、０．４８mM、０．１２mM／分）、（４０℃、０．７１mM、０．２３mM／分）及び（５０℃、１．３mM、０．４２mM／分）。回帰のフィッティング係数（Ｒ２）は、それぞれ２０℃、３０℃、４０℃及び５０℃において０．９８６９、０．９９０６５、０．９９１１５及び０．９８９９６であった。
【００７０】
ｒＢＨＴの特性決定。上記確立された条件下において、酵素活性アッセイを実施した。５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０〜１１．０）、５０mMクエン酸塩（ｐＨ２．０〜５．０）及び５０mMリン酸塩−クエン酸塩（ｐＨ２〜１１）を含む緩衝液中で、酵素活性に対するｐＨの影響を試験した（図２Ａ）。反応混合物中の濃度を変化させることによって、単糖（グルコース及びガラクトース）による競合阻害を調べた（図２Ｃ）。２０、３０、４０、５０、６０、７０又は８０℃における残存活性を測定することによって、温度及び熱安定性を決定した（図２Ｂ及び２Ｄ）。同様に、酵素活性アッセイを使用して、潜在的な阻害剤／活性化剤としての添加剤を評価した。最大１０mMの以下の添加剤を試験した：キレート剤（ＥＤＴＡ）、還元剤（ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、及び銅（Ｃｕ２＋））、及びイオン（一価の陽イオン；ＮＨ４＋、Ｃｓ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋及びＲｂ＋；二価の陽イオン；Ｂａ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋及びＺｎ２＋；三価の陽イオンＡｇ３＋）。沈殿を防ぐために、５０mMクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で、重金属（Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋及びＺｎ２＋）を試験した。加えて、１％（v/v）で反応混合物に追加した界面活性剤は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であった。１０％v/vで試験した溶媒は、エタノール、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ＰＥＧ４００及びグリセロールを含んでいた。
【００７１】
ＧＯＳの生産及び分析。精製ｒＢＨＴ又は（膜結合酵素を有する）P. pastoris休止細胞のいずれかを利用する標準的なトランスガラクトシル化反応を、ラクトース（２２g/L又は２００g/L）を含有する５mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中の基準量の酵素（０．５U/gラクトース）を３０℃又は４２℃で追加することによって開始した。
【００７２】
６５℃及び流速０．４ml／分のアイソクラティック条件下における高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan）によって、反応の生成物及び基質を分析した。移動相は５mM硫酸（Ｈ２ＳＯ４）であり、屈折率検出器にカップリングしたAlltech IOA-1000有機酸カラム(300 mm by 7.8 mm) (Alltech, IL)を使用した。ガラクトシルラクトース（Carbosynth (Berkshire, UK)）、ラクトース、グルコース及びガラクトース（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を使用して、カラムをキャリブレーションした。屈折率検出器からのシグナル強度測定値として、定量されていない残存ＧＯＳ種（四糖及び五糖）を報告する。
【００７３】
６．２．  結果
E. coliにおけるリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）の発現。E. coli  ＢＬ２１は、異種タンパク質の生産に最も広く使用されている宿主である。残念ながら、この宿主株は、β−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴと表記）の評価に干渉する活性内因性β−ガラクトシダーゼを含有する（材料及び方法を参照のこと）。ｐＥＴベースの発現系に適切な様々なE. coli株（ＢＬ２１、ＢＬＲ、ＮｏｖａＢｌｕｅ、Ｏｒｉｇａｍｉ及びＲｏｓｅｔｔａ（表３）を含む）をスクリーニングした後、E. coli  ＢＬＲは内因性β−ガラクトシダーゼ活性を欠くことを確認した。E. coli  ＣＣ１１８（ΔｌａｃＺ）株をコントロールとして使用した（３６）。
【００７４】
Ｃ末端６×ＨＩＳ又は４つの溶解性増強共発現パートナー（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、ＰｅｌＢリーダー及びＤｓｂＡ）の１つを含有するｐＥＴ発現プラスミドにｒＢｈｔ遺伝子を挿入して、ｐＪＢ１０１、ｐＪＢ１０３、ｐＪＢ１０４、ｐＪＢ１０５及びｐＪＢ１０６を得た（表３）。E. coli  ＢＬＲにトランスフォーメーションし、ＩＰＴＧで誘導することによって、全細胞又は無細胞抽出物のいずれかにおいて不活性ｒＢＨＴを発現させた。ｒＢＨＴ抗血清による融合タンパク質のイムノブロッティング分析により、全てのｒＢＨＴ融合タンパク質が予測分子量で検出され、最も強い反応性は不溶性画分で観察された。また、宿主依存的なタンパク質不溶性の可能性を除外するために、ｐＪＢ１０２（そのＴ７プロモーターをテトラサイクリン（ＴＥＴ）誘導性プロモーターで置換したｐＪＢ１０１）を有するE. coli  ＣＣ１１８において、ｒＢＨＴ発現を分析したが、失敗であることが分かった（データは示さず）。
【００７５】
P. pastoris由来のｒＢＨＴの発現及び精製。P. pastorisは翻訳後修飾を導入することができ、（E. coliが失敗する）多くの活性リコンビナントタンパク質を産生するその能力が周知である（１４）。したがって、本発明者らは、コドン最適化ｒＢｈｔ遺伝子を、アルコールオキシダーゼプロモーター（ＡＯＸ１）のコントロール下にあるｐＰＩＣ９に、S. cerevisiaeのα因子シグナル（タンパク質分泌のための配列）及びＮ末端６×ＨＩＳとそれに続くＴＥＶプロテアーゼ切断部位とインフレームで挿入した（ｐＪＢ１０８、表３）。ｐＪＢ１０８でP. pastoris  ＧＳ１１５をトランスフォーメーションし（ＧＳ１１５／ｒＢｈｔ）、６つのＧＳ１１５／ｒＢｈｔリコンビナントにおいてｒＢＨＴの活性を評価した。最高濃度の生物活性タンパク質を分泌するリコンビナント株をさらに研究した。ザイモグラムにより、活性ｒＢＨＴの存在を確認した：ＧＳ１１５／ｒＢｈｔのみが陽性シグナルを示した一方、ｐＪＢ１０１を有するE. coli  ＢＬＲ由来の細胞抽出物、及び非トランスフォーメーションＧＳ１１５由来の培養上清は陰性であった（図１Ｃ）。予想どおり、ＢＨＴにおけるタンパク質膜貫通領域はまた、細胞表面結合ｒＢＨＴ活性を示して、S. singularisにおけるネイティブなＢＨＴの位置（１５、１６）を模倣するＧＳ１１５／ｒＢｈｔ細胞をもたらした。
【００７６】
ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用してｒＢＨＴの精製を試みたが、ＨＩＳタグは存在せず、抗ＨＩＳ抗血清を使用したウエスタンブロット分析によってもタンパク質は検出されなかったが、これは、予測切断部位におけるＮ末端シグナル配列のプロセシングの可能性を示している（１６）。続いて、Mono Q及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して、ｒＢＨＴ酵素を精製した（２０℃で８．２U/mgの比活性）（表５）。
【００７７】
６．３．  P. pastorisにおいて発現させたｒＢＨＴの特性決定。
１．  ｒＢＨＴの見掛けの分子量。６×ＨＩＳ及びＴＥＶプロテアーゼ部位タグを含む完全にプロセシングされた非グリコシル化ｒＢＨＴの推定分子量は、６８kDaであった。５３〜１４６kDaの範囲の見掛けの分子量を有する二量体及び単量体として、この酵素を予め精製した。データは、タンパク質グリコシル化の変動を反映している（表５）（１、１６）。ここでは、酵素活性は、１１０kDaの実験的な見掛けの分子量を有する１つの単量体のピークとして溶出した。本発明者らは、ネイティブな酵素の最適ｐＨの酸性範囲（３．７〜６）内では、二量体形態が優勢であり得ると推測した（表５）。しかしながら、ｐＨ４．０におけるSuperdex 200カラムからの画分は同じプロファイルを示し、これは、単量体形態のリコンビナント酵素が安定であることを裏付けている。より高分子量の凝集体は、酵素活性アッセイ、ザイモグラム又はウエスタンブロットによって検出されなかった。カラム画分の精製及び抗ｒＢＨＴを使用したイムノブロット分析により、この酵素は、１１０kDaの見掛けの分子量を有する単一バンドとして泳動したことを確認した（図１Ａ及び図１Ｂ）。
【００７８】
２．  基質特異性。ＯＮＰ−Ｇａｌはβ−ガラクトシダーゼの基質として伝統的に使用されており、ＯＮＰ−Ｇａｌ、ＰＮＰ−Ｇａｌ及びＰＮＰ−Ｇｌｕは全て、ネイティブなＢＨＴ活性の検出のために以前の研究で使用されている（表５）。同じ実験条件において、ｒＢＨＴ（０．２U/ml）の酵素活性を上記基質間で比較した。このリコンビナント酵素は、ＯＮＰ−Ｇｌｕ及びＰＮＰ−Ｇｌｕに対して等しく活性であった。グリコン部分中にガラクトースを有する基質は、ＯＮＰ−Ｇｌｕの速度の約４１％（ＯＮＰ−Ｇａｌ）及び２３％（ＰＮＰ−Ｇａｌ）の速度で加水分解された。これらの結果は、ｒＢＨＴは特異性が糖と比べて狭く、基質としてグルコース糖誘導体を使用した場合に、Ｃ２及びＣ４における炭素結合位置の配置に関する柔軟性が高いことを示している。
【００７９】
３．  ｒＢＨＴの最適ｐＨ、温度及び熱安定性。ｒＢＨＴは、広いｐＨ範囲（ｐＨ３．５〜６）内で活性であり、ｐＨ４．０で最高値を示した（図２Ａ）。酵素活性のプロファイルは、７超又は３．５未満のｐＨ値で、最大酵素活性の５０％未満への急激な低下を示した。これらの結果は、報告された最適ｐＨ（１）と一致しており（表５の参考文献を参照のこと）、アルカリ性条件は、酵素の活性及び安定性に有害な影響を及ぼし得ることを示唆している。
【００８０】
２０℃〜８０℃の範囲の様々な温度で測定した初期反応速度は、この酵素が２０℃〜５０℃の温度範囲よりも活性であり、最適が４０℃〜５０℃に存在することを示していた（図２Ｂ）。３０℃未満の温度では、初期反応速度の５０％減少が観察され、５０℃超の温度は酵素を迅速かつ不可逆的に不活性化した。酵素反応速度を最大化する場合の最適温度はまた、Ｖｍａｘ／Ｋｍの最高値から求められ得る（３３）。２０℃〜４０℃の温度では、ＶｍａｘはＫｍよりも速い速度で増加し、その結果、Ｖｍａｘ／Ｋｍの値（０．２４２／分、２０℃；０．２５５／分、３０℃；０．３２４／分、４０℃；０．３２２／分、５０℃）はこの範囲全体で増加し、４０℃〜５０℃の温度で一定であった。したがって、Ｖｍａｘ／Ｋｍによって決定した場合の最適温度は４０℃〜５０℃の範囲内であったが、これは、各温度における初期反応速度の値を使用して確立した最適値を裏付けている。
【００８１】
図２Ｄに示されているように、２０℃〜５０℃において、ｒＢＨＴの熱安定性を評価した。２０℃及び３０℃では、この酵素は、元の活性の少なくとも９０％を６日間保持していたが、これは、ネイティブな酵素に関する以前に報告された結果（４）を裏付けている。４℃で６カ月間保存したｒＢＨＴの５つの独立したバッチは、初期活性の９５％を保持していた（データは示さず）。最適温度は４０℃〜５０℃に見られたが、４０℃超の温度におけるインキュベーションはｒＢＨＴに有害であった。４０℃では、この酵素は、初期活性の７０％を１２時間保持しており、この活性レベルがさらに３６時間だけ持続した。対照的に、５０℃では、最初の１２時間のインキュベーション期間内において、酵素活性は急激に低下した。
【００８２】
４．  ｒＢＨＴ活性に対する金属、塩、界面活性剤及び溶媒の効果。広範囲の添加物において、酵素阻害／活性化を試験した。マグネシウムは、いくつかのβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を劇的に増加させるにもかかわらず（２６）、ｒＢＨＴは、試験したイオン（ＮＨ４＋、Ｂａ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｓ＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｌｉ＋、Ｒｂ＋、Ｍｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎａ＋及びＺｎ２＋）のいずれについても要求を示さなかった。また、１及び５mMのイオンキレート剤ＥＤＴＡの存在下では、このリコンビナント酵素は完全に活性であったが、これは、上記知見及び以前の報告（１）を裏付けている。加えて、ジスルフィド架橋を破壊することが証明されている化合物、例えばＣｕ２＋及び還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）（１、１８、１９）は、活性に対して悪影響を及ぼさなかった。溶媒メタノール、エタノール、アセトン及びアセトニトリルは、酵素を部分的に阻害するに過ぎない（６６％〜８１％の相対活性を保持）。対照的に、１０％グリセロール又は１％ＳＤＳ（非イオン性界面活性剤）の追加は、酵素をほぼ完全に阻害した。
【００８３】
精製ｒＢＨＴを使用するＧＯＳ合成。酵素を特性決定してから、２％ラクトースのＧＯＳへのバイオトランスフォーメーションについて分泌ｒＢＨＴを試験した。反応条件は、５mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中、０．５Ｕ ｒＢＨＴ／ｇラクトース、４２℃であった。図３は、経時的なラクトース消費及びＧＯＳ蓄積を示す。最高生産速度は最初の１２時間に観察され、ガラクトシルラクトース及びグルコースが主生成物であった。ガラクトースは検出されなかったが、これは、それがトランスガラクトシル化反応に完全に組み込まれて、ＧＯＳが形成したことを示している。３０時間後、４．２g/Lのグルコースが蓄積し、ラクトース利用率（５４％）は最大であった。さらに、この時点で、７．８g/Lの三糖が蓄積し、利用されたラクトースの変換率が平均６７％に達した。反応が進行するにつれて、ガラクトースは酵素反応から逃れ、微量濃度で蓄積し始めた。競合酵素阻害は、ラクトースのバイオトランスフォーメーション効率を低下させ得るので、本発明者らは、反応混合物中の酵素活性に対するグルコース又はガラクトースの濃度変化の効果を調べた。５g/Lのグルコースが存在すると、ｒＢＨＴ活性が最大９０％低下したのに対して、確立された条件下では、最大７０g/Lのガラクトースによって酵素活性は影響を受けなかった（図２Ｃ）。
【００８４】
P. pastoris休止細胞（膜結合ｒＢＨＴを有する）によるＧＯＳ合成。競合阻害を回避するため、及び反応混合物からグルコースを同時に除去した場合に、ラクトースのＧＯＳへの変換が改善され得ることを確認するために、本発明者らは、P. pastoris  ＧＳ１１５／ｒＢｈｔの休止細胞による２０％ラクトースのバイオトランスフォーメーションを評価した。０．５Ｕ ｒＢＨＴ／ｇラクトースの５mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を含有する細胞密度に対して、膜結合ｒＢＨＴを有するP. pastoris  ＧＳ１１５／ｒＢｈｔを標準化した。反応を３０℃（P. pastorisの成長の最適温度）及び４２℃（分泌ｒＢＨＴに関して初期反応速度が最大となる温度）で１０日間行った。予想どおり、４２℃ではラクトース利用率が５１％であるのと比較して、３０℃では初期ラクトースの９０％がＧＯＳに変換され、二次生成物はなかった。これらの結果により、休止細胞は生理学的に活性であり、反応のグルコース副生成物を消費し、それにより競合阻害を回避することができたことが示された。しかしながら、最初の４８時間においては、４２℃におけるＧＯＳ形成の初期反応速度は、３０℃における速度の２倍であった。ガラクトシルラクトースの最終濃度は８０g/Lに達したが、これは、４２℃における１．６g/L／時の生産性に対応する（図４Ａ）。３０℃では、ラクトース利用率が６３％であった場合、ガラクトシルラクトースの濃度は１００g/Lであり、生産性は５日後に０．８g/L／時に達した（図４Ｂ）。
【００８５】
６．４．  考察
本研究では、本発明者らは、E. coli及びP. pastorisにおいて発現させるために、S. singularis由来のβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ遺伝子（アクセッションナンバーＡＢ１２６３２４）のＤＮＡ配列を最適化した。得られたｒＢｈｔ遺伝子を合成的に作製し（アクセッションナンバーＪＦ２９８２８）、E. coliにおいて発現させた。しかしながら、以前に観察されているように（１６）、この細菌宿主は、可溶性かつ活性のｒＢＨＴの産生に必須の翻訳後修飾を組み込む能力を欠いていた。続いて、ＡＯＸ１プロモーターのコントロール下にあるｒＢｈｔ遺伝子をP. pastorisの染色体に組み込んで、完全に活性な酵素（これは培養ブロス中で検出され、細胞表面に結合していた）を発現させるのに成功した。P. pastoris  ＧＳ１１５によるｒＢＨＴの分泌により、本発明者らは、S. singularis由来の純粋なＢＨＴを得るのに必要な複雑な精製工程を省くことができた。さらに、P. pastorisは、本来的には、非常に低レベルのネイティブなタンパク質のみを分泌するので、細胞外ｒＢＨＴの回収は、遠心分離又はろ過によって培地から全細胞を除去するような単純なものであった（５）。
【００８６】
リコンビナント酵素の分子量は、１１０kDaの触媒的に活性な単一ポリペプチドに相当し、より小さなポリペプチドもｒＢＨＴ凝集体も検出されなかった。翻訳後修飾は、タンパク質のフォールディング、構造安定性、オリゴマー形成及び基質認識において重要な役割を果たすので（１７、２４）、E. coliにおいて発現させ、アミノ酸配列によって予測した６８kDaタンパク質よりも分子量が大きかったことは驚くべきことではなかった。S.singularisによるネイティブなＢＨＴの翻訳後グリコシル化が以前に報告されており、キチナーゼ及びＥｎｄｏＨｆによる処理後に、７３．９〜６６．３kDaの精製タンパク質の分子量シフトが観察された（１６）。予測グリコシル化部位の将来的な突然変異誘発は、グリコシル化もｒＢＨＴの分子量シフトの原因であるかを決定するのに役立つはずである。
【００８７】
ここで報告したデータは、ネイティブなS. singularis  ＢＨＴに関する立証されたデータとｒＢＨＴの利用を比較したより大規模な研究の一部である（表５）。本発明者らの研究により、このリコンビナント酵素は、多くの場合にβ−ガラクトシドに必須の補因子又は還元剤を必要としないことが確認された。この酵素は、より低い温度（４０℃未満）で優れた熱安定性を示し、４０℃〜５０℃の温度及びｐＨ３．５〜６で最適活性を示した。加えて、この酵素はグルコース阻害によってコントロールされたが、ネイティブなＢＨＴについて以前に報告されているように（４、１６、２５、３５）、ｒＢＨＴはガラクトース又はＡｇ３＋に対して感受性ではなかった。
【００８８】
ラクトース利用率及び初期ラクトース濃度は、最終的なＧＯＳ蓄積の最大化に寄与する２つの重要な要因である。ここでは、本発明者らは、P. pastoris  ＧＳ１１５／ｒＢｈｔの生理学的に活性な休止細胞を用いて、ラクトース利用率が改善した（９０％）プロセスを実証した。これらの条件下において、この細胞は、３０℃では残存グルコースを消費してグルコース阻害を回避し、有意なプロセスの改善及びより高度の最終プレバイオティクス純度を確保する（図４Ｂ）。対照的に、２５℃超の温度は、ネイティブな膜結合ＢＨＴを含有するS. singularis休止細胞が残存グルコースを消費するのを妨げる（そしてこれが最終ＧＯＳ濃度及び純度を制限する）と報告した（Gosling et al.による総説（１１））。
【００８９】
４２℃でインキュベーションしたＧＳ１１５／ｒＢｈｔ休止細胞は、初期ラクトースの５１％をガラクトシルラクトース及び残存グルコースに変換したに過ぎなかった（図４Ａ）。これらのデータは、同じ条件下における分泌ｒＢＨＴによるガラクトシルラクトース形成と密接に似ていた（図３）。さらに、変換率及び利用率の値は、以前に報告されているS. singularisによるプロセスと同程度であった（表５）。典型的なラクトース利用率の値は、初期ラクトースの３０％〜４０％と報告されており（１１）、ある研究では、分泌ｒＢＨＴと比較して、ラクトース１グラム当たりに１０．８倍多い酵素を使用して、５０％のラクトース利用率が報告されている（表５）（４）。
【００９０】
S. singularisによるＧＯＳ合成が２０世紀半ばに発見されたことにより、ＧＯＳをより効率的に産生する優れたβ−ガラクトシダーゼの調査が促された（９、１０、３７）。しかしながら、研究されたこの酵素は、S. singularis由来のＢＨＴと比較してラクトース利用率の値が低く、望ましくない副生成物の最終濃度が高かった（１、４、１２、１６、２７、３４、３５）。それにもかかわらず、純粋なネイティブＢＨＴを得るのに必要な多段階の精製工程が困難なものであったために、S. singularis  ＢＨＴの工業的利用に関する進歩は要求よりも遅かった（１、４、１６）。P. pastoris由来の分泌又は膜結合酵素のいずれかである生物活性ｒＢＨＴは、ＧＯＳの生産に関して明確なプロセスの優位性を示す。今後の研究では、タンパク質発現収率、タンパク質安定性及び酵素活性を改善するためのタンパク質改変戦略を調査する。
【００９１】
以下の表６は、本発明に関連して調製した構築物を要約したものである。P. pastoris中に染色体成分として存在する以外は、全ての構築物をｐＰＩＣ９で調製した。
【００９２】
６．５．  ラクトースが豊富なホエー由来のガラクトオリゴ糖
２００９年において、世界的な乳製品市場は２９９７億ドルであり、２０１４年までに３７０９億ドルに成長する（２３．８％の増加）と予想されている。Global. Dairy Industry Profile: Global. Dairy Industry Profile: Global [serial online]. October 2010:1. Available from: Business Source Complete, Ipswich, MA. Accessed February 24, 2012. Global (2012)。牛乳及びチーズは、市場の３５．２％及び２８．３％をそれぞれ占めた。世界的なチーズの消費量は、２０１５年には２１００万トンに達すると予想されている。Lenoir-Wijnkoop I. & van Aalderen WM,B.G.K.D.S.A.N.MJ. Cost-effectiveness model for a specific mixture of prebiotics in The Netherlands. Eur J Health Econ (2010)。高ラクトース含量の牛乳及び副生成物が乳加工中に生成されることを考慮すると、乳製品市場の成長は重大な産業廃棄物処理問題を生み出す。高ラクトース含量の廃液は、非常に高い生物学的酸素要求量（ＢＯＤ）（これは、ラクトースを分解するのに必要な酸素の量が、生存に必要な酸素を他の生物から奪うのに十分な程多いことを意味する）を有する。したがって、多くの国々は、ラクトースを含有する液体を水域に直接廃棄するのを制限する環境保護法を制定している。Ganzle,M.G., Haase,G. & Jelen,P. Lactose: Crystallization, hydrolysis and value-added derivatives. International Dairy Journal 18, 685-694 (2008)。自治体の水処理プロセスへのさらなる負担は特に費用がかかり、乳製品経済に依存する国及び州にとって問題になる可能性がある（４〜６）。Affertsholt-Allen T. Market developments and industry challenges for lactose and lactose derivatives. IDF Symposium "Lactose and its Derivatives." Moscow. (lactose. ru/present/1Tage_Affertsholt-Allen. pdf. Accessed Sept 30, 2009) (2007); Markets and Markets. U.S. Digestive Health Ingredients Market Worth $495.3 million in 2015. (www. marketsandmarkets. com/PressReleases/us-digestive-health-ingredients-market. asp) (2010); UBIC consulting. THE WORLD GALACTO-OLIGOSACCHARIDE MARKET. (www. ubic-consulting. com/template/fs/documents/Dairy-Ingredients/Galacto-Oligosaccharide-Ingredient-Market. pdf) (2010)。例えば、チーズの製造は、２つの生成物（チーズ及びホエー）を生成する。チーズ１ポンドを作る場合、ホエー９ポンドが生成され、約５％ラクトースを含有するホエーの余剰が増加する（２００８年では１億８６００万トン）。このラクトース画分は、典型的な下水排水よりも約１７５倍大きいＢＯＤを有するので、未処理の廃棄物を水域に直接廃棄することができない。Smithers, G.W. Whey and whey proteins. "From Glitter to Gold". International Dairy Journal 18, 695-704 (2008)。この問題に対する従来の解決策は、高価なラクトース抽出プロセスを適用することによって、ラクトースが豊富な廃液をバイオレメディエーションすることであった（これは、１．５０ドル／kgの天井値でコモディティー商品として販売され得る）。毎年生産されるチーズホエーの５０％のみが、有用な製品、例えば食品成分及び動物飼料にリサイクルされる。経済的なリサイクルを可能にする臨界容積に達しないため、又はバイオトランスフォーメーションに関する技術的難易度が高いため、残りは廃棄されると考えられる。したがって、全体的なプロセスコストを削減し、米国の酪農産業経済を改善するために、ラクトースを商業的に実現可能な高付加価値製品に変換する戦略が必要である。
【００９３】
ここでは、本発明者らは、この産業問題に対する理想的な解決策として、新たな食品開発プロセスを適用することによって、汎用化学物質ラクトースの同時バイオトランスフォーメーション／バイオレメディエーションを提案する。本発明者らは、酵素反応によって、ラクトースをガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）と称されるガラクトシルラクトース誘導体に変換し得る方法を改良した。ＧＯＳは、消化器系内の有益な細菌の成長及び活性を刺激するプレバイオティクスとして分類されており、乳児用調製粉乳、栄養補助食品、ヨーグルト、焼成製品及び動物飼料などの食品製品に広く使用されている。コモディティー商品のラクトースとは異なり、ＧＯＳは高付加価値食品成分であり、このトランスフォーメーションの経済的価値は、ラクトースの現在の市場価格１．５０ドル／kgをＧＯＳの市場価格５．２０〜８．５０ドル／kgと比較することによって容易に実証される。ＧＯＳは、２０１０年において２億６５９０万ドルの価値があり、年間成長率は１８．３％であり、２０１０から２０１５年までに１３．２％の複合年間成長率で成長すると予想される消化を助ける健康食品成分のトレンドの一部である。
【００９４】
本発明者らは、効率的な宿主を利用して酵素を生産することによって反応の全体容量を５０倍減少させ、生産されるＧＯＳの容量及び純度を増加させ、ラクトースフリー製品を潜在的に作製することができるので、本発明者らのラクトース−ＧＯＳ変換方法は、既存のプロセスよりも非常に優れている。Euromonitor. Lactose-free Foods Maintain Their Global Appeal, March 1, 2011. Euromonitor (2011)。ラクトースフリー製品の世界市場は２００９年において３４億ドルであるが消費者は健康及び健康機能性食品に注目し続けているので、成長すると予想されている。他の乳製品は非常に価格志向型であるが、ラクトースフリー製品などの機能性食品は、高価格で販売することができる。
【００９５】
本明細書に記載される改善されたプロセスを使用することによって、米国及び世界中の乳業及び栄養補助食品の製造業者は、３つの点で明らかに利益を得ることができる：１）市場価値が高い健康促進食品成分／栄養補助食品である大量の上質なＧＯＳの作製、２）有益なラクトースフリー牛乳又はホエー製品の潜在的な同時作製、並びに３）ホエー及び牛乳副生成物のリサイクルによる環境負荷のコスト効果的な低減。
【００９６】
【表３】
2019062903.tif 000004
【００９７】
【表４】
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【００９８】
【表５】
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【００９９】
【表６】
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【０１００】
６．６．  β−ヘキソシルトランスフェラーゼ（β-hexosytransferase）の分泌は、シグナルドメインを置換することによって増強される
６．６．１．  要約
Sporobolomyces singularis由来のβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＢＨＴ）は、トランスガラクトシル化反応を触媒してガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を合成する能力が公知である。本発明者らは、Pichia pastorisのリコンビナント株（ＧＳ１１５：：αＭＦ−ＨＩＳ−ＴＥＶ−ｒＢｈｔ）による生物活性全長ポリペプチド（ｒＢＨＴ）の異種発現を以前に報告した。このリコンビナント株は、全長Ｂｈｔ遺伝子とそれに先立つSaccharomyces cerevisiaeのα接合因子プレプロシグナル（αＭＦ）、ヒスチジンタグ及びＴＥＶ切断部位を有する。メタノール誘導後、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ＨＩＳ−ＴＥＶ−ｒＢｈｔによって生成されるｒＢＨＴは部分的に分泌されたに過ぎず、タンパク質の大部分は依然として細胞膜に結合していた。分泌ｒＢＨＴの量を増加させるために、本研究では、２つの推定上の内因性構造ドメインを含有する特性決定されていないＢＨＴアミノ末端領域（アミノ酸１〜１１０）を調べる。このアミノ末端は、古典的分泌リーダーシグナルとして機能し得るドメイン（アミノ酸１〜２２）を含む一方、残りの２３〜１１０アミノ酸は、推定上の非古典的分泌シグナルを含有する。したがって、本発明者らは、ｒＢＨＴ−ＨＩＳを発現するリコンビナントP. pastoris  ＧＳ１１５株を作製することによってこれらのドメインを機能評価した。結果は、古典的リーダーシグナル（アミノ酸１〜２２）であるｒＢｈｔ（１−２２）がαＭＦの後ろにあると、シグナル干渉がタンパク質分泌に影響を与えるが、リーダーシグナル（アミノ酸１〜２２）をαＭＦ（αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４））で置換すると、分泌酵素及び膜結合酵素の両方のP. pastoris産生がそれぞれ５０倍及び１４倍増強されたことを示している。タンパク質分泌を促進するＢＨＴアミノ末端ドメインの役割を検証するために、本発明者らは、分泌されない代替タンパク質（抗β−ガラクトシダーゼ一本鎖可変抗体フラグメントｓｃＦｖ１３Ｒ４）を用いてこのドメインを試験した。ｒＢＨＴのαＭＦ及びアミノ末端ドメインとそれに続く抗体ｓｃＦｖ１３Ｒ４の組み合わせを発現するリコンビナントP. pastoris株は、ｒＢＨＴ−ＨＩＳを発現するリコンビナントによって得られる分泌強度と相関する結果を生み出すことができた。最後に、より効率的なリコンビナント（ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ及びＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４））から得られた活性ｒＢＨＴ−ＨＩＳ及びｒＢＨＴタンパク質を均一に精製し、酵素活性変化の可能性について評価した。ＧＯＳ生成速度によって示した場合、６×ＨＩＳタグ付き分泌酵素及びタグ無し分泌酵素の酵素活性は同程度であった。
【０１０１】
６．６．２．  イントロダクション
特に、ラクトースからラクトース誘導体を得るプレバイオティクス生産の分野では、機能性食品の生産に酵素を使用することについて関心が高まっている。Sporobolomyces singularisはラクトース及びグルコースを同化することができるが、ガラクトースを同化することができず、これは、Sporobolomyces singularisがラクトースのグルコース部分しか代謝することができないことを示している。また、利用されなかったガラクトースモノマーが、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の構成要素としてブロス中に見られ得るに過ぎない。この生理学的特徴が、β−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＢＨＴ）の発見につながった（Blakely and Mackenzi 1021-25;Phaff and Carmo-Sousa 193-207;Spencer, de Spencer, and Laluce 147-56;Gorin, Phaff, and Spencer 1341-44;Gorin, Spencer, and Phaff 2307-17）。S. singularis由来のＢＨＴによって合成されるＧＯＳなどのプレバイオティクスはＧＲＡＳとして認識されており、機能性食品添加物として広く使用されている（Tzortzis and Vulevic 207-44）。
【０１０２】
ラクトースからのＧＯＳ合成に加えて、ＢＨＴはまた、ＯＮＰ−Ｇｌｕ及びＰＮＰ−Ｇｌｕなどのβ−グリコシド結合の加水分解を触媒する（Blakely and Mackenzi 1021-25）。ＢＨＴは、ＧＯＳ産生を触媒することができる数少ない酵素の１つであり、産業的な利点（さらなるイオン及び補因子が無くても触媒が起こること、並びに初期ラクトース濃度に関係なくトランスガラクトシル化反応を実行する能力を含む）があるので、ＢＨＴの酵素能力は、競合技術に関して特に魅力的である（Gosling et al. 307-18;Blakely and Mackenzi 1021-25）。
【０１０３】
S. singularisでは、Ｂｈｔは、グルコースによって抑制される誘導性遺伝子であり、ラクトースなどの誘導因子が存在する場合、生成される酵素（ＢＨＴ）は細胞膜結合型として主に見られる。細胞内の位置が原因で、ＢＨＴの精製には複数のクロマトグラフィー工程が必要であり、１４％〜１６％の範囲の非常に低い収率でS. singularisから回収されている（Blakely and Mackenzi 1021-25;Cho, Shin, and Bucke 2107-11;Ishikawa et al. 331-39）。従来のタンパク質精製プロトコールは酵素の回収及びその技術的適用を制限するので、代替戦略が評価されている。第１のアプローチは、S. singularisを突然変異誘発による選択に曝すことから構成されていた。この方法論を適用することにより、グルコース抑制を欠き、１０倍多くの膜結合ＢＨＴを生成可能な新たな株が選択された；しかしながら、分泌酵素の産生が増加したという報告はない（Ishikawa et al. 331-39）。あるいは、本発明者らは最近、１９アミノ酸のシグナル配列（プレ配列）とそれに続く６６アミノ酸のプロ配列及び二塩基性Ｋｅｘ２エンドペプチダーゼプロセシング部位からなるαＭＦプレプロ分泌シグナルが前にある場合、P. pastoris  ＧＳ１１５が、生物学的に活性なリコンビナントｒＢＨＴポリペプチドを分泌することができると記載している（Kurjan and Herskowitz 933-43）。この研究では、無細胞抽出物及び膜結合関連活性の分析により、この酵素の大部分は、依然として細胞膜に結合していたことが示された。したがって、P. pastoris  ＧＳ１１５は、下流のプロセシングを容易にするであろう、生物活性ｒＢＨＴの生産及び分泌に適切な宿主であることを示し、分泌生物活性ｒＢＨＴ及び膜結合生物活性ｒＢＨＴの両方の生産が実現可能であることを実証している（Dagher et al., 2013）。
【０１０４】
ネイティブなＢＨＴタンパク質配列をさらに調査したところ、それは、アミノ末端に内因性の構造的特徴（適切な古典的分泌シグナル及び非古典的分泌シグナルとして機能し得るアミノ末端ドメインを含む）を含有することが示された。リーダーシグナルとしてのこれらの役割を裏付けることにより、細胞壁溶解酵素によるS. singularisの処理後において、放出されたＢＨＴの大部分はアミノ末端の古典的リーダーシグナルを欠いていたことが示された（Ishikawa et al. 331-39）。遺伝子発現及びタンパク質分泌の効率は、細胞結合及び分泌に関与するタンパク質構造要素によって影響を受け得るので、これらの機能は、P. pastoris  ＧＳ１１５によって発現される場合にはタンパク質の細胞局在性にも及び得る。
【０１０５】
本研究では、ＢＨＴアミノ末端ドメインの生理学的役割、及びP. pastoris  ＧＳ１１５によるタンパク質分泌とのそれらの関係を試験した。さらに、カルボキシル末端として一本鎖抗β−ガラクトシダーゼ抗体ｓｃＦｖ１３Ｒ４を含有するリコンビナントキメラを使用して、ｒＢＨＴアミノ末端ドメインの分泌の役割を検証した。抗体ｓｃＦｖ１３Ｒ４は、結合活性のためのジスルフィド架橋形成に無関係な分泌されない超安定一本鎖タンパク質の一例である（Martineau, Jones, and Winter 117-27）。このように、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）において、ｓｃＦｖ１３Ｒ４を異種発現させた（Visintin et al. 11723-28;Grage and Rehm 254-62;Bach et al. 79-93）。
【０１０６】
６．６．３．  結果
β−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＢＨＴ）のin silicoタンパク質配列分析。ＢＨＴポリペプチド（５９４アミノ酸）のカルボキシル末端部分（アミノ酸１１１〜５９４）は、β−グルコシダーゼと顕著な相同性を有する。このグリコヒドロラーゼＩ（ＧＨＩ）ドメインは、推定上の触媒酸／塩基触媒求核物質と、タンパク質のＮ−グリコシル化に潜在的に必要な３つのアスパラギン残基とを含有する（図７Ａ）。注目すべきことに、ＢＨＴアミノ末端は、最初の１１０アミノ酸に及ぶユニークな領域であることが明らかになった。この領域は、アミノ末端の古典的リーダーシグナルドメイン（アミノ酸１〜２２）とそれに続く低複雑度の予測（http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP）非古典的分泌シグナル（ＮＣ）（アミノ酸７２〜８３）（http://mendel.imp.ac.at/METHODS/seg.server.html）を含む。アミノ末端リーダーシグナル（アミノ酸１〜２２）をＮ領域（アミノ末端；アミノ酸１〜５）、Ｈ領域（疎水性；アミノ酸６〜１７）及びＣ領域（カルボキシル末端；アミノ酸１８〜２２）にさらに分けることができる（図７Ｂ）。Phobiusウェブベースプログラム（http://phobius.sbc.su.se/）及びSignalPアルゴリズム（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）などの別のアルゴリズムも、残基１７〜１８及び残基２２〜２３に推定上の古典的リーダーシグナル及び切断部位候補を予測した。さらに、この古典的リーダーシグナルは、Ｈ領域内の膜と接触する５つのアミノ酸（RHYTHM, http://proteinformatics.charite.de/rhythm/）と、膜タンパク質の局在化及び分泌を促進し得る電荷分布とを含有すると予測された（Boyd and Beckwith 1031-33）。Kyte及びDoolittleのハイドロパシープロットに示されているように、膜貫通領域予測アルゴリズム（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）も、内在性膜貫通タンパク質及び非細胞質領域（アミノ酸２３〜５９４）に典型的な疎水性残基のストレッチが、ＢＨＴの１〜１７及び１７７〜１９９にあると予想した（図７Ｃ）。これらの構造的特徴はまた、アミノ末端の古典的リーダーシグナルが、酵母分泌経路の通過中に膜アンカーとして作用し得ることを示している可能性がある。
【０１０７】
アミノ末端ドメインは、タンパク質分泌に関与する。２つのアミノ末端分泌ドメイン（古典的分泌シグナル及び非古典的分泌シグナル）の推定上の生理学的役割を調査するために、カルボキシル末端ＢＨＴドメイン（アミノ酸１１１〜５９４）及び一本鎖抗β−ガラクトシダーゼ抗体（ｓｃＦｖ１３Ｒ４）の発現を試験した。改変遺伝子の適切な組み合わせとそれに先立つｒＢｈｔアミノ末端ドメイン及び／又は強力な９．３kDa αＭＦプレプロ配列を染色体に組み込むことによって、安定なリコンビナントP. pastoris  ＧＳ１１５株を得た。ｒＢｈｔ及びｓｃＦｖ１３Ｒ４遺伝子の組み合わせを、検出及び精製支援用のカルボキシル末端６×ＨＩＳタグの前にあるＡＯＸ１プロモーターの下流に挿入した（図８Ａ及び８Ｄ）（材料及び方法を参照のこと）。
【０１０８】
リーダーシグナル（アミノ酸１〜２２）を強力なαＭＦプレプロ分泌シグナルで置換すると（ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ）、αＭＦ分泌シグナルが前にある全長ｒＢＨＴ−ＨＩＳの発現（ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳ）（０．４９μg/ml）と比較して、タンパク質分泌が１９倍超増加した（９．８０μg/ml）（図８Ｂ）。同様に、αＭＦの非存在下では、リーダーシグナルは、異種タンパク質の分泌を指令することができた（ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ）（６．３５μg/ml）。加えて、αＭＦ及びリーダーシグナルの両方の非存在下では、タンパク質分泌が検出されたが（ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ）（４．６５μg/ml）、これは、古典的リーダー及び非古典的分泌シグナルの両方が、タンパク質分泌を対象とする情報を含有することを示唆している。
【０１０９】
上記アミノ末端ドメインがタンパク質を分泌経路にターゲティングすることを検証するために、本発明者らは、抗体ｓｃＦｖ１３Ｒ４（シグナル配列を持たない細胞内タンパク質）を選択する。抗体ｓｃＦｖ１３Ｒ４キメラの略図を図（８Ｃ）に示す。（リーダー分泌シグナルを欠く）ＧＳ１１５：：ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳによって発現させた場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色及びウエスタンブロット分析によって、ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳを培養ブロス中で検出することができなかった（データは示さず）。ｓｃＦｖ１３Ｒ４をＢｈｔの古典的リーダー分泌シグナルに融合した場合（２５．１７μg/ml）、又はＢｈｔの非古典的シグナルに融合した場合（７．０３μg/ml）、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（１−１１０）−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ又はＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−１１０）−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳによるｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳの分泌は明白であった。同様に、ＢＨＴ−ＨＩＳの場合に見られるように、αＭＦによって駆動される分泌（ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｓｃＦｖ１３Ｒ４−ＨＩＳ）は、最高レベルの分泌タンパク質をもたらした（９１．０２μg/ml）。
【０１１０】
P. pastoris  ＧＳ１１５によって発現されるｒＢＨＴ−ＨＩＳの酵素活性及びウエスタンブロット分析。タンパク質発現が酵素活性と相関していたことを確認するために、基質としてＯＮＰ−Ｇｌｕを使用して、分泌ｒＢＨＴ−ＨＩＳ及び膜結合ｒＢＨＴ−ＨＩＳの活性を測定した（材料及び方法を参照のこと）。全てのリコンビナント株が検出可能な量のｒＢＨＴ−ＨＩＳを分泌し、活性の値は分泌タンパク質の増加を反映していた。ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによって分泌されたタンパク質は、完全アミノ末端領域（アミノ酸１〜１１０）によって分泌を駆動した場合の測定活性（ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ（０．６３mU/OD））よりも６倍高い３．７mU/ODの酵素活性を示した。同様に、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによって分泌されたタンパク質の測定酵素活性は、αＭＦ及びリーダーシグナルの両方を含有するリコンビナントから得られたもの（ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳ（０．０７mU/OD））よりも５３倍高かった。リコンビナントＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ（０．２６mU/OD）は、減少した量の活性分泌酵素を示している（表８）。
【０１１１】
各リコンビナントの休止細胞が示した膜結合酵素の活性も試験した。本発明者らは、膜結合型の活性が、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳ（１．４８mU/OD）と比較して、株ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ（２１．５２mU/OD）の場合は１５倍増加しており、株ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ（１．９４mU/OD）の場合は１．３倍増加していることを示すことにより、全分泌タンパク質と相関する活性の値を見出した。リコンビナントＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ（０．１５mU/OD）は減少した量の膜結合酵素を示しており、これは、このリコンビナントが、推定上の非古典的分泌経路を介してこのタンパク質をリダイレクトすることを裏付けている。全体的に、これらの結果は、αＭＦ及びＢＨＴリーダー分泌シグナルはいずれもｒＢＨＴ−ＨＩＳの分泌を完全に遂行することができないことを示しており、これは、アミノ酸１７７〜１９９において予測される膜貫通領域の存在に関係する可能性がある。
【０１１２】
抗ＨＩＳ抗体を使用した無細胞抽出物のウエスタンブロット分析により、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ及びＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによる分泌タンパク質の値を確認した（図９Ａ）。各場合において、約１１０kDaの分子量に相当する顕著なｒＢＨＴ−ＨＩＳのバンドが存在した。これらの結果は、以前に報告されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィーの泳動パターンと一致している（Dagher, Azcarate-Peril, and Bruno-Barcena）。ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ及びＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳから得られた細胞抽出物のウエスタンブロット分析も、約１１０kDaの分子量を示したが、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳは、９８〜６４kDaの顕著なバンド（これは、細胞内分解又は別のグリコシル化パターンを示している可能性がある）を示した（図９Ｂ）。
【０１１３】
ｒＢＨＴ加水分解活性。加えて、本発明者らは、それぞれＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ及びＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）由来のＨＩＳタグ付きタンパク質及びＨＩＳタグ無しタンパク質の両方について、分泌酵素を試験した。この酵素は同程度の結果をもたらし、広い温度範囲（１０〜５０℃）及びｐＨ値（２．８〜６）で活性であった。最大活性はｐＨ３．６〜５で観察され（最大活性の９１〜１００％）、続いてｐＨ２．６（最大の４３％）及びｐＨ６．８（最大の２９％）に至るまで着実に減少した。同様に、最適温度は４０〜４５℃の範囲内に見られたが（最大活性の９７〜１００％）、５０℃超及び２０℃未満の温度では急速に減少した（最大の２５％未満）（データは示さず）。４℃の５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）中では、この酵素は少なくとも６カ月間にわたって安定であり、活性は、−８０℃の保存によって影響を受けなかった。ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによって分泌された酵素の反応速度定数の値をヒル方程式から求めた（４２℃、ｐＨ４において、Ｋｍ０．７９mM及びＶｍａｘ３．９７mmol／分／酵素mg）。これらの知見は、本発明者らなどによる以前の報告（Blakely and Mackenzi 1021-25;Cho, Shin, and Bucke 2107-11;Gorin, Phaff, and Spencer 1341-44;Gorin, Spencer, and Phaff 2307-17;Ishikawa et al. 331-39;Sakai et al. 285-93;Shin, Park, and Yang 787-92;Shin and Yang 484-89;Dagher, Azcarate-Peril, and Bruno-Barcena）と一致していた。
【０１１４】
ｒＢＨＴの安定性。この酵素の長期安定性を調べるために、新たに誘導した全てのリコンビナント株を、２％グルコースを含有する緩衝液中でインキュベーションし、膜結合ｒＢＨＴ及び分泌ｒＢＨＴの加水分解活性を経時的に測定した。古典的分泌経路又は非古典的分泌経路を介して全てのリコンビナントから得られた分泌ｒＢＨＴ−ＨＩＳは、１週間の試験期間にわたって安定しており、初期活性の９５％超を保持していた。ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳ、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ及びＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによって発現された膜結合酵素を含有する休止細胞の場合に、同じ安定性が観察された。しかしながら、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによって発現された膜結合酵素を含有する休止細胞を試験すると活性が２４時間以内に減少し始め、これは、別の非古典的分泌経路を示している。
【０１１５】
ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによって生成されたｒＢＨＴ−ＨＩＳの精製及び特性決定。ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによって発現されたｒＢＨＴタンパク質を精製した。６×ＨＩＳタグをカルボキシル末端に配置することにより、元の酵素活性の７３％超を単一工程で回復することに成功し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後において、約１１０kDaの単一のポリペプチドバンドが見られた（図９Ｃ）。培養上清から６．５４倍のタンパク質を精製して酵素７．２４mgを回収し、４２℃及びｐＨ４における比活性は１８．４５ｍU/mgであった（表９）。また、同じ方法論にしたがって、本発明者らは、異なるリコンビナントによって分泌されたｒＢＨＴ−ＨＩＳを精製したところ、１８．４５〜１８．６５ｍU/mgの範囲の同程度の比活性を見出した。ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによる分泌ポリペプチドのアミノ末端配列を決定したところ、２つのさらなるアミノ末端アミノ酸（Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｘ−Ｙ残基）を含有する生成物に加えて、ｒＢＨＴ（２３−５９４）−ＨＩＳタンパク質全体がブロス中に存在していた（Ｖ−Ｘ−Ｙ−Ｐ−Ｇ残基）ことが示された。分泌中のアミノ酸Ａ−Ｅの切断の変動は、周囲のアミノ酸配列及び三次構造によって影響を受け得る（Cereghino and Cregg 45-66）。残りの非古典的配列は、新たな切断部位を導入しなかった。
【０１１６】
ｒＢＨＴトランスフェラーゼ活性に対するＨＩＳタグの影響。リコンビナントＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳ及びＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）をさらに用いて、ＨＩＳタグの存在がラクトースからのＧＯＳ合成に影響を与え得るかを比較評価した。２２０g/L初期ラクトース、０．５Ｕ ｒＢＨＴ／ｇラクトースを含有する反応混合物からＨＰＬＣによって、ＧＯＳ蓄積を定量的に分析し、３０℃でインキュベーションした。
【０１１７】
図１０Ａは、６×ＨＩＳタグ付き分泌酵素又はタグ無し分泌酵素のいずれかによって反応を触媒した場合の経時的なＧＯＳ蓄積及びラクトース消費が同程度であることを示している。両方の場合において、最大産生速度は最初の２５時間の間に観察され、ガラクトシルラクトースが主生成物であった。以前に記載された酵素競争グルコース阻害を１２５時間後に確認したところ、ガラクトシルラクトース（７５g/L）の蓄積は変動がなく、初期ラクトースの６０％が利用されて変換率は平均６７％に達した（Dagher, Azcarate-Peril, and Bruno-Barcena）。
【０１１８】
ＨＩＳタグ付き膜結合ｒＢＨＴ及びＨＩＳタグ無し膜結合ｒＢＨＴを発現する休止細胞を使用した場合も、同程度の経時的なＧＯＳ蓄積及びラクトース消費が確認された。（図１０Ｂ）は、カルボキシル末端ＨＩＳの存在が、ガラクトシルラクトース形成の初期反応速度に影響を与えなかったことを示している（１．８７及び１．７g/L/時）。以前に報告されているように、グルコースは、P. pastorisの休止細胞によって消費された一方、ガラクトースはＧＯＳの合成に使用された（収率６８％（g/g）（これは、理論収率７５％に近い））（Dagher, Azcarate-Peril, and Bruno-Barcena）。
【０１１９】
６．６．４．  考察
プレバイオティクスは機能性食品として販売されている炭水化物誘導体であり、有益な腸内細菌の成長を特異的に刺激して消費者の健康を改善すると積極的に宣伝されている。プレバイオティクス開発の基本的な原動力は、運転コストがより低いより効率的な生産プロセスの可能性である。しかしながら、化学的方法による特定の炭水化物誘導体の生産又は合成は複雑であり、反応性が類似するヒドロキシル基がいくつか存在するために、保護工程及び脱保護工程が必要である（Sears and Wong 2344-50）。したがって、酵素的アプローチの開発は実際的関心事項であり、酵素活性を改変するために、触媒機構のより深い知識を得るために、及びタンパク質分泌を増加させるために、遺伝的改変が広く使用されている。分泌されるタンパク質は、通常、２０〜３０アミノ酸のアミノ末端リーダーシグナルの後ろにあり、最終的には膜結合シグナルペプチダーゼによってプロセシングされる（Von Heijne 17-21）。P. pastorisによるタンパク質分泌は、最初のヌクレオチド配列の性質によって影響を受けるので、グリコシル化パターン、最終的な三次元構造、培養条件及び培地組成の検討だけではなく、コドンの最適化が必要なこともある（Damasceno, Huang, and Batt 31-39）。加えて、リーダードメイン内の荷電アミノ酸の分布は、膜タンパク質及び分泌タンパク質の局在化の促進において重要な役割を果たす（Boyd and Beckwith 1031-33）。
【０１２０】
以前に報告されているように、P. pastorisは、翻訳後修飾を効率的に組み込むその能力によって、ｒＢＨＴの発現についてはE. coliを上回る利点を提供するので、少量の生物活性ｒＢＨＴの異種生産が可能になった。ＢＨＴのin silico分析により、この酵素は膜貫通ドメインを含有することが示唆されたので、これが、P. pastorisによる酵素の分泌を増加させるかを研究する必要があった。ＢＨＴのユニークなタンパク質領域（１〜１１０アミノ酸）は、古典的リーダーシグナル（ＢＨＴ（１−２２））及び非古典的分泌シグナルドメイン（ＢＨＴ（２３−１１０））として機能すると予測された２つのドメインを含有する。古典的リーダーシグナルはまた、タンパク質が細胞膜においてその機能を実行するようにする（RHYTHM法及びハイドロパシープロットによる予測、図１）。特に、１７位の塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン）の存在は、分泌効率及びタンパク質の膜内配向に関与する可能性がある（図１）。
【０１２１】
ここで示されているデータは、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳによるタンパク質分泌の干渉は、αＭＦ及びリーダーシグナル（ＢＨＴ（１−２２））が同時に存在することが原因であることを示している。タンパク質分泌のレベルは、以前に報告されたＧＳ１１５：：αＭＦ−ＨＩＳ−ＴＥＶ−ｒＢｈｔによる値（Dagher, Azcarate-Peril, and Bruno-Barcena）と同程度であった。一方、それぞれαＭＦ又はＢＨＴ（１−２２）のいずれかを欠くリコンビナントＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ−ＨＩＳ及びＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによって、分泌タンパク質のより多くの蓄積が得られた。したがって、リーダーシグナルドメイン（ＢＨＴ（１−２２））は、αＭＦと同程度にシグナルペプチド介在機構（古典的分泌経路）に関与することを実証している。両リーダーシグナルは、個々に、膜結合ｒＢＨＴ及び分泌ｒＢＨＴのタンパク質発現を、リーダー配列を両方とも含有するＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ−ＨＩＳと比較して増加させることができた。分泌生物活性ｒＢＨＴタンパク質（５０倍増加）及び膜結合生物活性ｒＢＨＴタンパク質（１４倍増加）の最高値は、リコンビナントＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによって得られた（表３）。続いて、ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳから発現された生物活性タンパク質を精製したところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって非常に純粋なタンパク質が得られ、比活性は１８．４５U/mgであった（表４）。ｒＢＨＴの分子量（１１０kDa）は、細胞膜結合ｒＢＨＴ及び分泌ｒＢＨＴの間から逸脱しておらず、本発明者らの以前の研究（Dagher et al., 2013）のｒＢＨＴと比較して類似の酵素活性、熱安定性、再利用性及び保存安定性を示した。
【０１２２】
本発明者らは、リーダードメイン（ＢＨＴ（１−２２））及びαＭＦの両方を除去することにより、酵素の分泌が妨げられると予想した。しかしながら、αＭＦ及びＢＨＴ（１−２２）の両方を排除してもなお、少量の分泌タンパク質が示された。また、リーダードメインＢＨＴ（１−２２）が効率的な分泌シグナル（古典的分泌経路）として作用し、予測ＢＨＴ（２３−１１０）ドメインが代替的な分泌シグナル（非古典的分泌経路）として機能し得るという二重機能を１１０アミノ酸のユニークな領域が含有することを確認した。ウエスタンブロット分析はタンパク質分解を示しているが、これは、細胞内のタンパク質感度の増加を示している。測定した加水分解活性の大部分は、最大質量１１０kDa未満の複数のバンドとして検出され、分泌酵素の量に影響を与える可能性がある（図９Ａ〜９Ｃ）。本発明者らは、これらのシグナル配列が、分泌経路内のプロテアーゼからタンパク質を遠ざけることによって、分泌中にタンパク質を保護するように作用し得ると推測する。
【０１２３】
ＧＳ１１５：：αＭＦ−ｒＢｈｔ（２３−５９４）−ＨＩＳによってより大量のタンパク質が分泌されたが、おそらくは膜貫通ドメインがタンパク質カルボキシ末端ドメイン（アミノ酸１７７〜１９９）内に存在することによって膜内流動性が限定されると予測されるために、かなりの量が依然として膜に安定的に結合していた。したがって、分泌シグナルとしてのこれらのドメインの生理学的機能を確認するために、本発明者らは、ｒＢＨＴ（２３−５９４）ドメインを抗体ｓｃＦｖ１３Ｒ４タンパク質で置換することによって、新たなタンパク質キメラを作製した。古典的リーダーＢＨＴ（１−１１０）、続いて推定上の非古典的リーダー、推定上の非古典的リーダーＢＨＴ（２３−１１０）及びαＭＦドメインを、ｓｃＦｖ１３Ｒ４と共にアミノ末端の位置にインフレームで配置した。これらの新たなリコンビナントの分析は、抗体を分泌するように指令することによって、リーダー分泌機能を確認することができた。本発明者らの結果は、シグナル配列の選択が、リコンビナントＢＨＴ及びｓｃＦｖ１３Ｒ４を含むタンパク質の産生及び分泌の両方のレベルに対して強い影響を与えることを裏付けている。新たなより小さなリーダーシグナル（２２アミノ酸）は、αＭＦ（６６アミノ酸）と比較してサイズが有利であり、異種タンパク質の分泌を指令することができる新たなユニークな配列であることがここで実証されたという事実は注目に値する。このリーダーシグナルドメインは、細胞内酵素に組み込むことができる新たな特徴を追加し、さもなければ、機械的手段を使用する破壊又は化学的処理による透過処理によって細胞内酵素を抽出する必要がある（Panesar et al. 530-43）。
【０１２４】
ＢＨＴの継続的な分子開発は、新規特性、例えば特定のオリゴ糖の熱活性、低温安定性及び合成を有する酵素に関する食品産業問題を取り扱うのに役立つであろう。本知見は、トランスグリコシル化活性及び基質特異性に寄与する特徴を解明するためのさらなる構造分析の動機付けとなる。プレバイオティクス候補としての新規ＧＯＳを生産するために、触媒部位の突然変異誘発及び三次元構造に基づく合理的な突然変異誘発は、基質特異性を変化させる道を開くであろう。
【０１２５】
【表７】
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【０１２６】
【表８】
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【０１２７】
【表９】
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【０１２８】
６．７．  セクション６．６の参考文献
【表１０】
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【０１２９】
７．  参考文献
【表１１】
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【０１３０】
詳細な説明と関連して本発明を説明したが、上記説明は例示であり、本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。本発明の他の態様、利点及び改変は、以下に記載されている特許請求の範囲の範囲内である。本明細書で引用されている全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の各刊行物又は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
８．  配列表
【表１２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月8日(2019.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１２、１４又は２０に記載のアミノ酸配列を有するリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質をコードする、単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１２又は１４に記載のアミノ酸配列を有するリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質をコードする、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項３】
リコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質をコードする請求項１に記載の単離されたＤＮＡであって、配列番号１１、１３又は１９に記載の核酸配列と少なくとも９７％同一の核酸配列を有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
リコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質をコードする請求項３に記載の単離されたＤＮＡであって、配列番号１１又は１３に記載の核酸配列と少なくとも９７％同一の核酸配列を有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項５】
リコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質をコードする請求項１に記載の単離されたＤＮＡであって、配列番号１１、１３又は１９に記載の核酸配列を有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号１２、１４又は２０に記載のアミノ酸配列を有する、酵素的に活性なリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質。
【請求項７】
膜結合型である、請求項６に記載の酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質。
【請求項８】
可溶性酵素である、請求項６に記載の酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質。
【請求項９】
酵素的に活性なリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質を酵母宿主細胞において生産するための方法であって、適切なプロモーターのコントロール下にあるプラスミドで該酵母宿主細胞をトランスフォーメーションすることを含み、該プラスミドが、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｒＢＨＴタンパク質をコードする単離されたＤＮＡを含有する、方法。
【請求項１０】
適切なプロモーターがアルコールオキシダーゼプロモーターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質が、２０℃で８U/mgのβ−ヘキソシルトランスフェラーゼの比活性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
酵母細胞がPichia pastorisである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を生産するための方法であって、適切な条件下において、ラクトースを、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法により得た酵素的に活性なリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質と反応させてＧＯＳを生産することを含む、方法。
【請求項１４】
酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質が固体支持体に固定化されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
バッチ若しくは連続撹拌タンク反応器、充填層反応器又は限外ろ過膜反応器中で、ＧＯＳを生産する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
競合グルコース阻害を防ぐためのグルコース除去システムとして、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）生物をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
グルコース除去システムを酵素的に活性なｒＢＨＴタンパク質と同時に使用する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号１２、１４又は２０に記載のアミノ酸配列を有するリコンビナントβ−ヘキソシルトランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）タンパク質を含む、改変ラクトース含有食料品又は食品副産物。
【請求項１９】
乳製品又は乳製品副産物である、請求項１８に記載のラクトース含有食料品又は食品副産物。
【請求項２０】
ベビーデザート、ベビージュース、ベビースナック、ベビーヨーグルト飲料、エネルギー飲料、フィットネスウォーター若しくはサーストクエンチャー、冷凍乳製品デザート、フルーツ飲料、フルーツパイフィリング、フルーツ調製物、乳児用調製粉乳、乳児用食事代替飲料、ゼリージャム、食事代替飲料、ミルク、ミルクベースの飲料、ミルク代用品、ミルク用シロップフレーバー、ヨーグルト又はホエーである、請求項１８に記載のラクトース含有食料品又は食品副産物。
【請求項２１】
フルーツ飲料が、ビタミン／ミネラル補強されたフルーツ飲料である、請求項２０に記載のラクトース含有食料品又は食品副産物。
【外国語明細書】
2019062903000001.pdf