(57)【要約】      （修正有）【課題】試料の分析を行う領域において、充填される液滴の液滴径のばらつきを低減するカートリッジを提供する。【解決手段】複数の液滴を生成する生成手段１０２と、液滴が充填される領域であって、領域に液滴が流入する入口１０４の短辺がそれぞれ異なる第１の液滴充填領域および第２の液滴充填領域を含む領域と、を備えることを特徴とするカートリッジ１００。領域は３つ以上の複数の液滴充填領域１０５を含み、複数の液滴充填領域のうち少なくとも１つの液滴充填領域は、入口の短辺が異なることを特徴とするカートリッジ。【選択図】図１
2019211253.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の液滴を生成する生成手段と、
前記液滴が充填される領域であって、前記領域に前記液滴が流入する入口の短辺がそれぞれ異なる第１の液滴充填領域および第２の液滴充填領域を含む領域と、
を備えることを特徴とするカートリッジ。
【請求項２】
前記領域は３つ以上の複数の液滴充填領域を含み、前記複数の液滴充填領域のうち少なくとも１つの液滴充填領域は、前記入口の短辺が異なることを特徴とする請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項３】
前記領域に含まれる液滴充填領域は、前記入口の短辺が夫々全て異なることを特徴とする請求項２に記載のカートリッジ。
【請求項４】
前記領域に含まれる液滴充填領域は、前記入口の短辺の長さに基づいて並列して備えられていることを特徴とする請求項２または３に記載のカートリッジ。
【請求項５】
前記領域に含まれる液滴充填領域は、前記入口の短辺が短い順に並列して備えられていることを特徴とする請求項４に記載のカートリッジ。
【請求項６】
前記領域に含まれる液滴充填領域は、前記生成部から前記液滴が流れてくる上流側から前記入口の短辺が短い順に並列して備えられていることを特徴とする請求項５に記載のカートリッジ。
【請求項７】
前記領域に含まれる液滴充填領域は、前記入口の断面と前記入口とは異なる領域内部の断面とは断面積の大きさが異なることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項８】
前記領域に含まれる液滴充填領域は、前記入口の断面積に比べて終端部の断面積の方が小さいことを特徴とする請求項７に記載のカートリッジ。
【請求項９】
前記カートリッジは、第１の軸と第２の軸と、前記２つの軸で規定される底面に垂直な第３の軸とで形成される３次元空間上の前記底面に設置されたカートリッジであって、
前記領域に含まれる液滴充填領域は、前記入口の前記第３の軸方向の高さが２０〜２００［μｍ］の高さであることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１０】
液滴に含まれる対象物の分析に用いるカートリッジであって、
開口部を有する第１の部材及び第２の部材と、
前記第１の部材の前記開口部に対して備えられた、複数の前記液滴を生成する生成手段と、
前記液滴が充填される領域であって、前記領域に前記液滴が流入する入口の短辺がそれぞれ異なる第１の液滴充填領域および第２の液滴充填領域を含む領域と、
を備えることを特徴とするカートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の開示は、カートリッジに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、サンプル中に含まれる化合物や粒子といった分析対象物を分析する方法として、油中水型エマルジョンを反応場とした核酸試料デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ：ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が提案されている。デジタルＰＣＲ法において、サンプルを含む反応液を物理的に独立した多数の反応場に分割する方法として、反応液の液滴をオイル中に形成する方法、すなわち、油中水型エマルジョン（Ｗ／Ｏエマルジョン）を形成する方法がある。この方法では、油中水型エマルジョン中の１つ１つの液滴を反応場として用いる（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１２−５０３７７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、異なる径の液滴をカートリッジ内の同じ領域に充填された状態で分析が行われると、液滴同士の重なりによって分析結果の信頼度が低下してしまうという課題があった。
【０００５】
本明細書の開示は、試料の分析を行う領域において、充填される液滴の液滴径のばらつきを低減することを目的の一つとする。
【０００６】
なお、前記目的に限らず、後述する発明を実施するための形態に示す各構成により導かれる作用効果であって、従来の技術によっては得られない作用効果を奏することも本明細書の開示の他の目的の一つとして位置付けることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書の開示に係るカートリッジは、複数の液滴を生成する生成手段と、前記液滴が充填される領域であって、前記領域に前記液滴が流入する入口の短辺がそれぞれ異なる第１の液滴充填領域および第２の液滴充填領域を含む領域と、を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本明細書の開示によれば、試料の分析を行う領域において、充填される液滴の液滴径のばらつきを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】第１の実施形態に係るカートリッジの外観を示す図。
【図２】第１の実施形態における全体の処理手順の一例を示すフロー図。
【図３】第１の実施形態に係る一連の分析システムを示す図。
【図４】第１の実施形態に係るカートリッジの断面図。
【図５】異なる径の液滴を同一領域に充填した場合の一例を示す図。
【図６】第２の実施形態に係るカートリッジの外観を示す図。
【図７】本明細書に開示のカートリッジの構造の一例を示す図。
【図８】本明細書に開示のカートリッジの構造の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に、本発明の好ましい実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。ただし、発明の範囲は図示例に限定されるものではない。また、本明細書においては、カートリッジの底面をＸ軸とＹ軸で示し、Ｚ軸はカートリッジの高さ方向を示すものとする。すなわち、カートリッジは、第１の軸と第２の軸と、前記２つの軸で規定される底面に垂直な第３の軸とで形成される３次元空間上の前記底面に設置されたカートリッジである。
【００１１】
＜実施形態１＞
本実施形態に係るカートリッジは、試料の分析に用いることができるカートリッジである。ここでいう試料とは、検体そのものであってもよいし、検体に対して精製や濃縮、分析対象物の化学修飾や断片化など、分析のための前処理や調整を施したものであってもよい。分析対象物は、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素などが挙げられ、これらが共存していてもよい。分析対象物は、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素の少なくともいずれかが共有結合等で結合または付着した分子、マイクロ粒子、ナノ粒子、さらにはウイルス、細菌、細胞などであってもよい。分析方法の一例としては、デジタルＰＣＲ法が知られている。デジタルＰＣＲ法では、分析の対象とする核酸を含む試料を、核酸を増幅するための増幅試薬、核酸を検出するための蛍光試薬などと混合して希釈し、物理的に独立した多数の反応場に分割する。エマルジョンに含まれるそれぞれの液滴はデジタルＰＣＲ法において反応場として用いられることがある。そして、多数の反応場（液滴）のそれぞれにおいて独立にＰＣＲが行われ、核酸が増幅される。増幅後に蛍光試薬により核酸を検出し、当該蛍光試薬のシグナルが検出された反応場の数（陽性反応場数）と、増幅後にシグナルが検出されなかった反応場の数（陰性反応場数）とに基づいて、試料中の核酸の濃度を推定することができる。
【００１２】
以下、図１から図３を用いて本実施形態に係るカートリッジの構成および濃度分析システムを用いたデジタルＰＣＲの一連の処理を説明する。
【００１３】
図１は本実施形態に係るカートリッジ１００の外観を示す図である。
【００１４】
図１（ａ）はカートリッジ１００の平面図である。図１（ｂ）はカートリッジ１００のＡ−Ａ断面を示す断面図である。図１（ｃ）はカートリッジ１００のＢ−Ｂ断面を示す断面図である。なお、図１において、カートリッジ１００の黒い部分は樹脂等で形成される部分を示しているが、図１（ａ）においては内部の構造を示すために上面の樹脂（図１（ｂ）の液滴充填領域１０５上面の黒い部分）を便宜的に除いて示している。
【００１５】
以下、図１（ｂ）を用いてカートリッジ１００の構成を説明する。
【００１６】
第１の部材１０１は、液滴を生成するための第１の液体（水相）が注入される部材である。第１の部材１０１に注入された第１の液体は、生成部１０２へと送液される。生成部１０２は、複数の孔を有しており、注入された第１の液体が複数の孔を透過することで互いに物理的に独立した複数の反応場、すなわち液滴が生成される。液滴保持領域１０３は、第１の部材１０１と繋がっており生成部１０２で生成された液滴を保持する。入口部１０４は、液滴が流入する液滴充填領域１０５の入口の断面を示している。液滴充填領域１０５は、図１（ｃ）に示すように複数の領域に分岐しており、それぞれ異なる径の液滴が充填される。液滴堰き止め部１０６は液滴充填領域１０５の終端部に備えられており、各液滴充填領域の入口部１０４の断面積よりも終端部の断面積を小さくすることにより液滴充填領域１０５に充填される液滴の流出を防ぐ。第２の部材１０７は、第２の液体が注入および排出される部材である。本実施例に係るカートリッジ１００において、第１の部材１０１と第２の部材１０７はそれぞれ液滴保持領域１０３と液滴充填領域１０５の終端部の上面（Ｚ軸方向）に重なるように備えられているが、側面や下面に備えられていてもよい。
【００１７】
次に、図２のフローチャートを用いて本実施形態における全体の処理を説明する。
【００１８】
（Ｓ２０００）（第２の液体（油相）を注入する）
ステップＳ２０００において、図３に示す油相注入手段３０６によって第２の液体（油相）が注入されカートリッジ１００に充填される。第２の液体（油相）は、油と界面活性剤とを含む。油相は水相と相溶せず分離する溶剤から成り、典型的には脂肪族炭化水素やシリコーンオイル等のオイルから成る。
【００１９】
また、油相注入手段３０６には、シリンジ等の所定の容量の液体を吐出する手段や、流路内の空気を加圧または減圧するポンプやポンプとバルブの組み合わせなどを用いることができる。すなわち、油相注入手段３０６は、カートリッジ１００内に油を注入できる機能を有する任意の手段により実現される。
【００２０】
本ステップにおいて、第２の液体（油相）は第２の部材１０７の開口部から注入することにより、生成部１０２を透過せずにカートリッジ１００に充填することができるため充填時間は短くなる。なお、第２の液体（油相）は、第１の部材１０１の開口部から注入されてもよい。また、油相注入手段３０６によって注入される第２の液体（油相）は、カートリッジ１００全体を満たすように注入し、少なくとも生成部１０２が第２の液体（油相）に浸かる程度の量が注入されることが望ましい。
【００２１】
（Ｓ２０１０）（第１の液体（水相）を注入する）
ステップＳ２０１０において、水相注入手段３０５によって第１の液体（水相）が注入され、第１の部材１０１に充填される。第１の液体（水相）は反応液で構成され、反応液は水と試料と増幅試薬と蛍光試薬とを含有する。なお、反応液の構成はこれに限定されない。また、水相注入手段３０５には、シリンジ等の所定の容量の液体を吐出する手段や、流路内の空気を加圧または減圧するポンプやポンプとバルブの組み合わせなどを用いることができる。すなわち、水相注入手段３０５は、カートリッジ１００内に第１の液体（水相）を注入できる機能を有する任意の手段により実現される。
【００２２】
（Ｓ２０２０）（第１の液体（水相）から液滴を生成する）
ステップＳ２０２０において、駆動手段が第１の部材１０１からカートリッジ１００内を加圧する、もしくは第２の部材１０７からカートリッジ１００内を減圧することにより、カートリッジ１００内に充填された第２の液体（油相）を駆動させる。または、両方から圧力を加えることによりカートリッジ１００内に充填された第２の液体（油相）を駆動させる。
【００２３】
なお、カートリッジ１００が樹脂の薄い層などの機械強度の低い素材で形成されている場合は、破壊や剥離が生じないように第２の部材１０７から駆動手段により減圧することで連続相を駆動させることが望ましい。一方、カートリッジ１００が機械強度の高い素材であれば第１の部材１０１から加圧して連続相を駆動させてもよい。
【００２４】
また、第１の部材１０１と第２の部材１０７のうち駆動手段を用いる方の部材には耐圧栓をつけることで圧力の抜け漏れを防ぐことができる。なお、耐圧栓は必ずしも必要ではない。
【００２５】
また、駆動手段は水相注入手段３０５もしくは油相注入手段３０６を用いてもよいし、これらとは異なる手段を新たに用いてもよい。すなわち、駆動手段は圧力を加えることで液体の駆動が可能な手段であれば種々の手段を用いることができる。
【００２６】
そして、第２の液体（油相）の駆動に伴い、ステップＳ２０１０において生成部１０２上面に充填された第１の液体（水相）が生成部１０２を透過し液滴が生成される。すなわち、第２の液体（油相）を連続相、第１の液体（水相）を含む液滴を分散相とするエマルジョンが形成される。すなわち、生成部１０２は複数の液滴を生成する生成手段の一例に相当する。
【００２７】
生成部１０２は例えば、膜状の部材に孔が複数２次元的に配置された部材であり、連続気泡の多孔質体や、繊維を縦横に配置したメッシュ、単一部材に貫通孔を配置したマイクロチャンネルが使用される。生成部１０２として使用される物質の孔の直径は、およそ２０［μｍ］であると望ましいが上記に限定されない。また、生成部１０２は、第１の部材１０１に備えられていることが望ましい。さらには、第１の部材１０１の開口部に略平行に備えられていることが望ましい。なお、液滴生成が可能な位置であれば生成部１０２が備えられる位置は上記に限定されない。
【００２８】
さらに、エマルジョンの形成方法も上記に限定されない。
【００２９】
例えば、従来公知の乳化方法である撹拌装置や超音波破砕装置などにより機械的エネルギーを付与することでエマルジョンを形成する機械乳化法が挙げられる。また、マイクロ流路乳化法やマイクロ流路分岐乳化法などのマイクロ流路デバイスを用いた方法、乳化膜を用いる膜乳化法などが挙げられる。これらの方法は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。これらの中でも機械的乳化法や膜乳化法は、マイクロ流路デバイスを用いた方法に比べて液滴の液滴径のばらつき（分散）が大きくなる傾向にあるものの、スループット良くエマルジョンを形成できる。
【００３０】
また、エマルジョンを形成する装置の装置構成を単純にできること、液滴の液滴径のばらつきが比較的低いエマルジョンを形成できることなどから、膜乳化法が特に望ましい。
【００３１】
すなわち、生成部１０２は、乳化膜であることが望ましい。
【００３２】
膜乳化法としては、直接膜乳化法やポンピング乳化法などを用いることができる。直接膜乳化法とは、乳化膜を介して分散相を一定圧力で押し出すことにより、押し出される側をゆっくり流れている連続相中に、エマルジョンを形成する方法である。ポンピング乳化法とは、連続相を採取したシリンジと分散相を採取したシリンジとで乳化膜を挟み、２つのシリンジから液体を交互に押し出して乳化膜を通過させることによって、エマルジョンを調製する方法である。
【００３３】
なお、ポンピング乳化法においては、２つのシリンジの一方に連続相と分散相の混合物を採取しておき、もう一方のシリンジは空にしておいてもよい。ポンピング乳化法においては、それぞれシリンジと接続可能な一対のコネクターの間に乳化膜を挟み込んだポンピング式の乳化デバイスを用いることができる。
【００３４】
（Ｓ２０３０）（液滴充填領域に液滴を充填する）
ステップＳ２０３０において、生成された液滴を液滴充填領域１０５に充填する。具体的には、駆動手段が第１の部材１０１から加圧する、もしくは第２の部材１０７から減圧することによりエマルジョンを駆動し、エマルジョン中に分散相として存在する液滴を、液滴保持領域１０３を経由し液滴充填領域１０５へと充填する。なお、加圧と減圧の両方を行うことによりエマルジョンを駆動してもよい。
【００３５】
本実施例では、液滴充填領域１０５は２つの並列した液滴充填領域に分岐しており、図１（ｃ）のＢ−Ｂ断面図に示すように夫々のＺ軸方向の高さは７０［μｍ］と９０［μｍ］となっている。なお、本実施例において入口部１０４は矩形であり、Ｘ軸方向の長さはＺ軸方向の長さよりも長い。すなわち、Ｚ軸方向の高さは矩形の短辺に相当する。なお、Ｘ軸方向の長さの方が短くてもよく、その場合はＸ軸方向の幅が短辺となる。また、入口部１０４は必ずしも矩形である必要はなく円形でもよい。この場合、短径が短辺に相当し、円形が真円である場合には、直径が短辺に相当する。すなわち、液滴充填領域１０５は、液滴が充填される領域であって、領域に液滴が流入する入口の短辺がそれぞれ異なる第１の液滴充填領域および第２の液滴充填領域を含む領域の一例に相当する。液滴充填領域１０５のＺ軸方向の高さは、取り扱う分散相の平均液滴径およびその分散によって、低すぎると球体である分散相形状を変形させてしまい試料の分析精度に影響する。一方、高すぎると分散相が観察方向に重なり、観察が難しくなる。したがって、本分析システムにおいてはおおよそ２０〜２００［μｍ］の値であることが望ましい。なお、液滴充填領域１０５に含まれる各液滴充填領域の数、短辺の長さはこれに限定されない。液滴充填領域１０５に含まれる液滴充填領域の数が３つ以上の場合については他の実施例で後述する。
【００３６】
さらに、並列した複数の液滴充填領域は上流側の液滴充填領域ほど液滴充填領域１０５のＺ軸方向の高さを低くすることが望ましい。すなわち、液滴充填領域１０５に含まれる液滴充填領域は、前記入口の短辺の長さに基づいて並列して備えられていることが望ましい。液滴充填領域１０５のうち、上流側の液滴充填領域のＺ軸方向の高さを下流側の液滴充填領域より高くすると、上流側の液滴充填領域には小径の液滴も一緒に充填されるため、分析結果の信頼度が劣化してしまう可能性がある。具体的には、図５（ａ）に示すように液滴径が異なる液滴が同じ液滴充填領域に充填されると、液滴充填領域底面からの液滴間の接触点の高さが不均一になってしまうことがある。また、図５（ｂ）に示すように液滴充填領域内で液滴の上に他の液滴が重畳してしまうことがある。こういった場合、ステップＳ２０５０においてＺ軸方向（撮像方向）から液滴を観察する際に液滴同士が重なり、分析結果の信頼度が劣化してしまう可能性がある。
【００３７】
そのため、上流側の液滴充填領域のＺ軸方向の高さを低くし、小径の液滴を上流側の液滴充填領域に先に充填することで下流側の液滴充填領域には大径の液滴が充填され、液滴の重なりを防ぐことができる。すなわち、液滴充填領域１０５に含まれる液滴充填領域は、前記入口の短辺の長さが短い順に並列して備えられていることが望ましい。さらに、液滴充填領域１０５に含まれる液滴充填領域は、生成部から液滴が流れてくる上流側から入口の短辺が短い順に並列して備えられていることがより望ましい。
【００３８】
なお、高さの異なる複数の液滴充填領域の位置関係は上記に限定されない。
【００３９】
また、入口部１０４において断面のＺ軸方向の高さは液滴充填領域ごとに変えずに、Ｘ軸方向の幅を変えることによって充填される液滴を液滴径毎に分けてもよい。この場合、例えば高さは変えずに、Ｘ軸方向の幅を７０［μｍ］と９０［μｍ］とする。上記によれば、液滴を液滴径毎に分けて充填する場合に、液滴充填領域１０５に含まれる各液滴充填領域のＺ軸方向の高さを高くする必要がないので領域内で液滴が重畳することをより防ぐことができる。なお、入口部１０４のＺ軸方向の高さとＸ軸方向の幅の両方を変えてもよい。
【００４０】
また、液滴充填領域１０５は入口部１０４の断面積と、液滴充填領域内部の任意の断面の断面積とが異なる構成であってもよい。すなわち、入口部１０４の断面と入口１０４とは異なる領域内部の断面とは断面積の大きさが異なっていてもよい。例えば、図４（ａ）に示すように入口部１０４の断面積に対して液滴充填領域内部の断面積を大きくする。上記によれば、入口部１０４の断面積で液滴充填領域に流入する液滴の液滴径を絞り、かつ液滴充填領域内部により多くの液滴を充填することができる。これにより、液滴充填領域１０５内の液滴充填量が増加し分析結果の信頼度をより向上させることができる。なお、図４（ａ）においてはＺ軸方向の高さを変えてあるが、Ｘ軸方向の幅を変えることによって液滴充填領域内部の断面積を大きくする方が望ましい。もしくは、図４（ｂ）に示すように入口部１０４の断面積に対して液滴充填領域内部の断面積を小さくしてもよい。上記によれば、液滴が充填される際に入口部１０４から断面積が徐々に小さくなるため液滴充填領域終端部には液滴径の小さい液滴が充填され、入口部１０４付近には液滴径の大きい液滴が充填される。すなわち、各液滴充填領域内部でさらに領域毎に液滴径が揃うため分析時の液滴径のばらつきをより低減することができる。
【００４１】
液滴充填領域１０５に充填された液滴は終端部の液滴堰き止め部１０６によって流動が抑制される。液滴堰き止め部１０６は液滴充填領域１０５の終端部の断面積が充填される液滴の断面積より小さくなるような大きさで設けられる。すなわち、液滴充填領域１０５は、入口の断面積に比べて終端部の断面積の方が小さい。例えば、入口部１０４の断面積の大きさが７０［μｍ］で生成部１０２が生成する液滴の平均径が６０［μｍ］である場合には、断面積が４０［μｍ］の液滴堰き止め部１０６を液滴充填領域１０５の終端部に設ける。
【００４２】
上記のように液滴堰き止め部１０６を設けることにより、連続相は流れるが充填される液滴の流動は抑制することができる。すなわち、液滴が自由に動ける範囲を狭めることによって、液滴の流出を防止できるため観察可能な液滴量が増える。また、液滴堰き止め部１０６を設けることにより分析時に妨げとなる液滴の流動によるアーチファクトを低減することができるため無駄なく液滴を分析することができる。なお、本実施例では液滴堰き止め部１０６は、液滴充填領域１０５の下面に備えられているが、上面に備えられていてもよい。また、液滴堰き止め部１０６は、液滴充填領域１０５に含まれる液滴充填領域ごとに異なる断面積で設けてもよい。
【００４３】
なお、本実施例では、水相注入手段３０５もしくは油相注入手段３０６により圧力を加えることで連続相を駆動させたが、カートリッジ１００を任意の角度に傾けることにより連続相を駆動させてもよい。例えば、ステップＳ２０００においてカートリッジ１００を傾動手段（不図示）上に設置し、傾動手段上で液滴生成を行う。そして傾動手段を傾動させることにより連続相を駆動させ、液滴を液滴充填領域１０５に充填する。そしてその後温度調整手段３０１上に移送し、ＰＣＲ処理を行う。また、温度調整手段３０１を傾動させるような機構でもよい。傾動手段には、チルトステージなどを用いることができる。
【００４４】
この場合、カートリッジ１００に対して応力を加えなくてよいので、圧力変動による液滴の損失を防ぐことができ分析の信頼度を向上させることができる。
【００４５】
なお、チルトステージはカートリッジ１００を傾動させるための手段の一例であり、角度を傾けることで連続相を駆動できる手段であればこれに限定されない。さらに、連続相を駆動させるために傾ける角度も限定されない。
【００４６】
（Ｓ２０４０）（カートリッジに熱サイクルを付加する）
ステップＳ２０４０において、温度調整手段３０１によりステップＳ２０２０で生成された液滴に含まれる核酸試料に対するＰＣＲ処理が行われる。具体的には、温度調整手段３０１は、ペルチェ素子とコントローラを含み、カートリッジ１００の液滴充填領域１０５に保持された液滴内で核酸増幅反応を発生させている。温度調整手段３０１には、例えばサーマルサイクラーを用いることができる。核酸の増幅反応としては、液滴（反応場）をサーマルサイクルに供することで反応を進行させるＰＣＲ法やＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いることができる。また、液滴（反応場）をサーマルサイクルに供さずに温度調整することで反応を進行させるＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄＣｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法なども用いることができる。なお、温度調整手段３０１として用いられる装置や核酸増幅の方法は上記に限定されない。
【００４７】
（Ｓ２０５０）（液滴内の核酸増幅産物有無を観察する）
ステップＳ２０５０において、カートリッジ１００は観察ステージ３０８に移送され蛍光などの光が計測される。すなわち、Ｓ２０４０において増幅された試料中の分析対象物の分析が行われる。蛍光は照明手段３０９と観察手段３１０とで計測され、照明手段３０９は、所定の波長の光を液滴充填領域１０５に保持された複数の液滴に照射する。照明手段３０９としては、ＬＥＤライト、ハロゲンランプおよび蛍光灯などを用いることができる。観察手段３１０は、光が照射された複数の液滴のそれぞれから発せられたシグナルを検出し、液滴内増幅産物の有無を観察する。また、液滴径の測定を行う。観察手段３１０としては、フォトダイオードやラインセンサ、イメージセンサ（撮像素子）等を用いることができ、中でも、多数の液滴について一括してシグナルの検出ができる点で、イメージセンサを用いることが好ましい。イメージセンサとしては、ＣＣＤ（電荷結合素子）、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）イメージセンサを用いることができる。観察手段３１０は、イメージセンサを備えたデジタルカメラであってもよい。
【００４８】
なお、本ステップＳ２０５０において、観察時に液滴の流動を抑制するために観察ステージ３０８は傾動する機構を有していてもよい。
【００４９】
（Ｓ２０６０）（核酸増幅前の試料の核酸濃度を推定する）
ステップＳ２０６０において、Ｓ２０５０で行われた観察の結果から試料の全体積に対する増幅産物を含まない液滴の体積の割合からプロセッサ（不図示）が試料内の濃度推定を行う。
【００５０】
（分析対象物の濃度の計算）
分析対象物の濃度の計算は、従来行われているデジタル分析における濃度計算方法を採用して実施することができる。温度調整手段３０１における反応の前に、それぞれの反応場が含む分析対象物が１個または０個のいずれかであるとみなせる場合について説明する。この場合は、分析対象物が検出された反応場（陽性反応場）の数ｘを、観察手段３１０が分析対象物の検出の対象とした体積Ｖｓの反応液中に含まれていた分析対象物の数とみなすことができる。よって、下記式（１）により、反応液中の分析対象物の濃度λｒを計算することができる。なお、観察手段３１０が分析対象物の検出の対象とした体積Ｖｓは、観察手段３１０から取得される反応場のサイズに関する情報に基づいて算出することができる。
λｒ＝ｘ／Ｖｓ・・・式（１）
【００５１】
また、例えば、温度調整手段３０１における反応の前に、１つの反応場に複数個の分析対象物が入り得るとみなせる場合は、ポアソンモデルによる補正を行うことで、分析対象物の濃度を計算することができる。この場合は、温度調整手段３０１における反応の前にそれぞれの反応場に含まれていた分析対象物の平均個数Ｃを推定することにより、分析対象物の濃度算出を行う。具体的には、観察手段３１０が分析対象物の検出の対象とした反応場について、１つの反応場に含まれる分析対象物の平均個数をＣとすると、１つの反応場にｎ個の分析対象物が含まれる確率は、ポアソンモデルの式から、下記式（２）のように表される。
Ｐ（ｎ，Ｃ）＝（Ｃｎ−ｅ−Ｃ）／ｎ！  ・・・式（２）
【００５２】
ここで、１つの反応場が分析対象物を１つも含まない確率は、式（２）においてｎ＝０として、下記式（３）で表される。
Ｐ（０，Ｃ）＝ｅ−Ｃ  ・・・式（３）
【００５３】
温度調整手段３０１における反応の前に１つの反応場中に少なくとも１つの分析対象物が含まれていれば、その反応場からはシグナルを検出することができるが、反応の前にその反応場に含まれていた分析対象物の数の情報までは分からない。そこで、観察手段３１０が検出対象とした反応場の総数に対する、分析対象物が検出されなかった反応場の割合（シグナルが検出されなかった反応場の割合）に基づいて、式（３）を用いて、検出対象とした反応液中に含まれていた分析対象物の個数を推定する。
【００５４】
具体的には、シグナルが検出された反応場の個数またはシグナルが検出されなかった反応場の個数と、検出対象とした反応場の総数とから、シグナルが検出されなかった反応場の割合Ｆ０を算出する。そして、下記式（４）から、検出対象とした反応場に、温度調整手段３０１における反応の前に１つの反応場に含まれていた分析対象物の平均個数Ｃを推定する。
Ｃ＝−ｌｎ（Ｆ０）  ・・・式（４）
【００５５】
ここで、観察手段３１０が分析対象物の検出対象とした反応場の平均体積をｖとすると、下記式（５）により、反応液中の分析対象物の濃度λｒを計算することができる。なお、観察手段３１０が分析対象物の検出の対象とした平均体積ｖは、観察手段３１０から取得される反応場のサイズに関する情報に基づいて算出することができる。
λｒ＝Ｃ／ｖ  ・・・式（５）
【００５６】
なお、反応液中の分析対象物の濃度λｒは、分析対象物の平均個数Ｃと反応場の数を乗じて得られる分析対象物の総数と、反応場の平均体積ｖと反応場の数を乗じて得られる反応場の総体積と、に基づいて算出してもよい。
【００５７】
このようにして得られた、反応液中の分析対象物の濃度は、検体またはサンプルから反応液を調整した際の希釈倍率を用いることによって、検体またはサンプル中の分析対象物の濃度に換算することができる。
【００５８】
上記の処理によれば、試料の分析を行う領域において、入口の短辺の長さが異なる複数の液滴充填領域を設け、各液滴充填領域に異なる液滴径の液滴を充填することにより充填される液滴のばらつきを低減することができる。
【００５９】
＜実施形態２＞
図６に示す本実施形態に係るカートリッジ６００は、実施形態１と同様に試料の分析に用いることができるカートリッジ６００である。
【００６０】
本実施形態に係るカートリッジ６００は、ポリカーボネート等の透明性を有する樹脂あるいは、ガラスにより形成される。具体的には、例えば予め定められた厚みの複数の樹脂フィルムもしくはガラスを積層することによりカートリッジを形成する。
【００６１】
例えば、図７に示すようにそれぞれ［ｍｍ］単位の厚みを有する、流路形状が打ち抜かれた５層の樹脂フィルムを積層することによりカートリッジを形成する。積層するための各フィルムの接合方法には、樹脂のガラス転移点未満の低い処理温度で接合が可能な表面活性化接合や分子接着を用いることができる。
【００６２】
なお、カートリッジにはＰＣＲ処理の工程で１００℃程度の温度が加わるため、これらの材質のガラス転移点は１００℃より高いことが望ましい。
【００６３】
具体的には、まずカートリッジを形成するための樹脂やガラスを板状に生成する。次に、第２層〜第４層のようにＵ字を含む流路形状に板を打ち抜く。このとき、各フィルムの流路形状はトムソン型等により打ち抜かれており、全ての層を積層した際に打ち抜かれた流路が全て連通するように加工されている。そして、打ち抜かれた各層を積層し、ガラス転移点未満の低い処理温度で接合が可能な表面活性化接合や分子接着を用いて接合することにより連通した流路を有するカートリッジを製造する。
【００６４】
なお、図７もしくは上記に示すカートリッジの材質、流路形状および形成方法などは一例であり、これに限定されるものではない。
【００６５】
本実施形態に係るカートリッジ６００は、実施形態１と比較し液滴充填領域１０５をさらに複数の並列した液滴充填領域に分岐することによって液滴を液滴径毎により細かく分けて充填することを特徴とする。これにより、液滴の重なりによる分析の信頼度の劣化をより低減することができ、且つ、観察可能な液滴を密に充填することができる。以下、図６を用いて本実施形態の構成及び処理を説明する。
【００６６】
本実施形態に係るカートリッジ６００の構成は、実施形態１と同様である。しかし、入口部６０４と液滴充填領域６０５は、実施形態１と構成が異なるため、以下でその構成を説明する。その他の構成については、実施形態１と構成が同じであるため、説明を省略する。
【００６７】
図６は本実施形態に係るカートリッジ６００の構成を示す。図６（ａ）はカートリッジ６００の平面図である。図６（ｂ）はカートリッジ６００をＡ−Ａ断面で切った断面図である。図６（ｃ）はカートリッジ６００をＢ−Ｂ断面で切った断面図である。以下、図６（ｃ）を用いてカートリッジ６００の構成を説明する。
【００６８】
図６（ｃ）において、入口部６０４は、生成部６０２で生成された液滴の液滴径に基づいた大きさの短辺の長さを有しており、Ｚ軸方向の高さが７０［μｍ］、８０［μｍ］、９０［μｍ］となっている。また、液滴充填領域６０５も実施形態１とは異なり、本実施形態では８つに分岐されている。
【００６９】
なお、本実施形態における入口部６０４の短辺の長さ及び液滴充填領域６０５の分岐数は一例であり、上記に限定されない。例えば、液滴充填領域６０５は５つの液滴充填領域に分岐されていて、そのうち１つの液滴充填領域のＺ軸方向の高さが７０［μｍ］で、残り４つの液滴充填領域のＺ軸方向の高さが９０［μｍ］などでもよい。すなわち、液滴充填領域６０５は、３つ以上の複数の液滴充填領域を含み、複数の液滴充填領域のうち少なくとも１つの液滴充填領域は、入口の短辺が異なる構成であればよい。
【００７０】
このように、より細かく入口部６０４の高さを規定した液滴充填領域を設けることにより各液滴充填領域に充填される液滴の液滴径をさらに揃えることができる。また、各液滴充填領域に充填される液滴の液滴径が揃うことによって液滴径の違いによる液滴の重なりを防ぐことができる。さらに、液滴の重なりを防ぐことにより観察可能な液滴のみが液滴充填領域に充填されるため定量精度が向上する。なお、図８のＢ−Ｂ断面に示すように液滴充填領域の底面は液滴充填領域毎に必ずしも共通している必要はない。
【００７１】
また、入口部６０４の短辺は夫々全て異なる長さでもよい。すなわち、液滴充填領域６０５は、３つ以上の複数の液滴充填領域を含み、該複数の液滴充填領域の入口の短辺は夫々全て異なっていてもよい。
【００７２】
異なる短辺の長さの入口部６０４を有する液滴充填領域６０５の本数は、生成される液滴の液滴径分布に基づいて定めてもよい。例えば、生成される液滴の液滴径の平均が７０［μｍ］であった場合には、図６（ｃ）に示すように液滴充填領域６０５に含まれる８つの液滴充填領域のうち４つの液滴充填領域の入口部６０４の高さを７０［μｍ］とする。そして、残り４つの液滴充填領域の入口部６０４の高さを２つずつ夫々８０［μｍ］と９０［μｍ］とする。すなわち、液滴充填領域６０５に含まれる液滴充填領域について、液滴の液滴径分布に基づいて入口部６０４の短辺の長さと該短辺の長さを有する液滴充填領域の数を定める。上記のように、液滴径分布に基づいて液滴充填領域６０５に含まれる液滴充填領域の数を定めることで、最も多く生成される平均液滴径付近の液滴を無駄なく充填することができる。また、液滴径分布に加え、ＣＶ（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）値を用いて液滴充填領域の高さを定めてもよい。例えば、生成される液滴の平均液滴径が７０［μｍ］でＣＶ値が２０％の場合には、５６［μｍ］〜８４［μｍ］の範囲の高さの入口部６０４を有する液滴充填領域のみを備え、かつ平均液滴径付近の高さの入口部４０４を有する液滴充填領域の数を最も多くする。
【００７３】
上記によれば、さらに、液滴充填領域内での高さ方向の液滴同士の重畳を低減でき、且つ最も多く生成される平均液滴径付近の液滴を効率よく充填することができる。
【００７４】
なお、本実施形態における液滴径分布に基づいた液滴充填領域６０５の数及び入口部６０４のＺ軸方向の高さは一例であり、上記に限定されない。さらに、異なる短辺の長さの入口部６０４を有する液滴充填領域６０５の数は、液滴径分布に基づいて定めなくてもよく任意の数に定めることができる。例えば、予め生成される液滴の液滴径が予想できる場合には、その液滴径の液滴を無駄なく充填できるような液滴充填領域の数及び入口部６０４の高さに定める。
【００７５】
本実施形態によると、液滴径分布に基づいた短辺の長さの入口を有する複数の液滴充填領域に分岐することで、液滴の重なりによる分析の信頼度の劣化を低減することができる。さらに、液滴を密に充填することにより観察可能な反応場が増加するため分析結果の精度をより向上させることができる。
【符号の説明】
【００７６】
１０１  第１の部材
１０２  生成部
１０３  液滴保持領域
１０４  入口部
１０５  液滴充填領域
１０６  液滴堰き止め部
１０７  第２の部材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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