(57)【要約】【課題】ニトリルヒドラターゼ以外の夾雑物が低減されたニトリルヒドラターゼを含む清澄な菌体処理物を製造する方法及び前記菌体処理物を用いてアミド化合物を製造する方法を提供すること。【解決手段】ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程を有する、ニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物の製造方法、並びに前記菌体処理物とニトリル化合物とを混合することを含むアミド化合物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程を有する、ニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物の製造方法。
【請求項２】
ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程が、ニトリルヒドラターゼ生産微生物を破砕した破砕液に平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤を添加し、破砕液をろ過することを含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程が、ニトリルヒドラターゼ生産微生物を破砕した破砕液を、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤でプリコートされたろ材によりろ過することを含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ろ過助剤の平均粒径が２０μｍ〜５０μｍである、請求項１〜請求項３のうちいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記ろ過助剤が珪藻土である、請求項１〜請求項４のうちいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記珪藻土がラヂオライト（登録商標）である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理される前記破砕液のｐＨが４．５〜６．８である、請求項１〜請求項６のうちいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程の前に、前記破砕液に凝集剤を添加する工程を含む、請求項１〜請求項７のうちいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ニトリルヒドラターゼ生産微生物が、シュードノカルディア・サーモフィラ、又はニトリルヒドラターゼ生産能を有する組換え大腸菌である、請求項１〜請求項８のうちいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記菌体処理物がアミド化合物の製造に用いられる、請求項１〜請求項９のうちいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記アミド化合物が（メタ）アクリルアミドである、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜請求項９のうちいずれか一項に記載の製造方法によってニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物を製造すること、及び
前記菌体処理物とニトリル化合物とを混合すること、
を含む、アミド化合物の製造方法。
【請求項１３】
前記ニトリル化合物が（メタ）アクリロニトリルであり、前記アミド化合物が（メタ）アクリルアミドである、請求項１２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物の製造方法及びアミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニトリルヒドラターゼは、種々の化合物のニトリル基を水和によりアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であり、酵素反応を利用した工業的なアミド化合物の製造プロセスにおいて利用されている。
【０００３】
近年、菌体を超音波処理等で破砕した菌体処理物を用いて、ニトリル化合物からアミド化合物を製造するプロセスが知られている。例えば、特許文献１には、菌体破砕物を酸処理し、次いで、遠心分離により不溶物を除去したのち、アルカリ処理する工程を有する、ニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物の製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／００７７２５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物の製造においては、ニトリルヒドラターゼ以外の夾雑物の低減した清澄な菌体処理物であることが求められる。特許文献１には、ろ過助剤としてハイフロー  スーパーセルなどのセライトが利用されているが、特許文献１の方法は清澄な菌体処理物を得るという点で改善の余地があった。
【０００６】
上記状況に鑑み、本開示の一実施形態は、ニトリルヒドラターゼ以外の夾雑物が低減されたニトリルヒドラターゼを含む清澄な菌体処理物を製造する方法及び前記菌体処理物を用いてアミド化合物を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、以下の態様を含む。
＜１＞  ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程を有する、ニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物の製造方法。
＜２＞  ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程が、ニトリルヒドラターゼ生産微生物を破砕した破砕液に平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤を添加し、破砕液をろ過することを含む、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞  ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程が、ニトリルヒドラターゼ生産微生物を破砕した破砕液を、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤でプリコートされたろ材によりろ過することを含む、＜１＞に記載の製造方法。
＜４＞  前記ろ過助剤の平均粒径が２０μｍ〜５０μｍである、＜１＞〜＜３＞のうちいずれか１つに記載の製造方法。
＜５＞  前記ろ過助剤が珪藻土である、＜１＞〜＜４＞のうちいずれか１つに記載の製造方法。
＜６＞  前記珪藻土がラヂオライト（登録商標）である、＜５＞に記載の製造方法。
＜７＞  平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理される前記破砕液のｐＨが４．５〜６．８である、＜１＞〜＜６＞のうちいずれか１つに記載の製造方法。
＜８＞  前記破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程の前に、前記破砕液に凝集剤を添加する工程を含む、＜１＞〜＜７＞のうちいずれか１つに記載の製造方法。
＜９＞  前記ニトリルヒドラターゼ生産微生物が、シュードノカルディア・サーモフィラ、又はニトリルヒドラターゼ生産能を有する組換え大腸菌である、＜１＞〜＜８＞のうちいずれか１つに記載の製造方法。
＜１０＞  前記菌体処理物がアミド化合物の製造に用いられる、＜１＞〜＜９＞のうちいずれか１つに記載の製造方法。
＜１１＞  前記アミド化合物が（メタ）アクリルアミドである、＜１０＞に記載の製造方法。
＜１２＞  ＜１＞〜＜９＞のうちいずれか１つに記載の製造方法によってニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物を製造すること、及び
前記菌体処理物とニトリル化合物とを混合すること、
を含む、アミド化合物の製造方法。
＜１３＞  前記ニトリル化合物が（メタ）アクリロニトリルであり、前記アミド化合物が（メタ）アクリルアミドである、＜１２＞に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本開示によれば、ニトリルヒドラターゼ以外の夾雑物が低減されたニトリルヒドラターゼを含む清澄な菌体処理物を製造する方法及び前記菌体処理物を用いてアミド化合物を製造する方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程を有する、ニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物の製造方法（以下、「本開示に係る菌体処理物の製造方法」とも称する）を提供する。
【００１０】
本開示に係る菌体処理物の製造方法を用いることにより、夾雑物の低減したニトリルヒドラターゼを含む清澄な菌体処理物を製造することができる。この理由は必ずしも明らかではないが、次のように推定できる。ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液には、核酸、細胞壁、細胞膜といった微生物の細胞由来の成分が多量に含まれている。これらのうち、その粒径が可視光の波長よりも大きいものは、光を散乱して破砕液の濁度を増加し、また、粒径がさらに大きいものは破砕液中で沈殿する。このような破砕液中にはニトリルヒドラターゼが含まれてはいるが、この破砕液をアミド化合物の生産などに用いると、多量に存在する夾雑物によって、生成するアミド化合物（例えば（メタ）アクリルアミド）を含む水溶液を精製することなく重合する際、重合が適切に行われなかったり、発泡するなどの品質問題を生じる。本開示において、「夾雑物」とは、特に、濁度を増加させる夾雑物、及び菌体処理物をアミド化合物の製造に用いた場合にアミド化合物（例えば（メタ）アクリルアミド）を含む水溶液の発泡を生じさせる夾雑物を意味する。このため、破砕液に含まれるニトリルヒドラターゼを化学反応に利用するためには、夾雑物を低減することが必要である。夾雑物が低減した場合、溶液の濁度の低下として示される。
【００１１】
ろ過助剤は多孔質であって、その孔に所定粒径以上の粒径の夾雑物粒子を捕捉することができる。このため、濁度の低下やアミド化合物を含む水溶液の発泡を引き起こす夾雑物の粒子のうち少なくとも一部はろ過助剤の孔中に捕捉され、夾雑物の減少により溶液の濁度が低下する。ただし、夾雑物の粒子を溶液から除去する効果は、ろ過助剤の平均粒径により異なる。ろ過助剤の平均粒径が大きい場合には、ろ過助剤をろ過に用いた場合にろ過流速が大きくなるため、夾雑物の粒子を除去する効果が減少する傾向にある。一方、ろ過助剤の平均粒径が小さい場合には、これとは逆に夾雑物の粒子を除去する効果が増大する傾向にあるが、ろ過助剤の平均粒径が小さすぎると夾雑物の粒子を除去する効果はかえって小さくなる傾向となる。これは、平均粒径が小さすぎると、夾雑物の粒子を効率的に捕捉するのに必要な大きさの孔が確保されなくなるからだと考えられる。
このため、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程を有する、本開示に係る製造方法により、夾雑物が低減された、ニトリルヒドラターゼを含む清澄な菌体処理物を製造することが可能になる。以上のような理由が推定される。
【００１２】
本開示において、微生物の破砕液とは、微生物を破砕して得られる液体又はこれに後述する熱処理、酸処理、遠心分離、凝集剤添加、アルカリ処理、ｐＨ調整などの工程のうちの１つ又は複数を行った液体を意味する。微生物の破砕液においては、微生物の細胞中の構成要素はもはや細胞膜内に閉じ込められてはおらず、破砕液中に分散している。平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理される微生物の破砕液は、微生物の破砕によって得られた液体そのもの（以下、「原破砕液」とも称する）であってもよく、原破砕液に対して熱処理、酸処理、遠心分離、凝集剤添加、アルカリ処理、ｐＨ調整などの工程のうちの１つ又は複数を加えたものであってもよい。
【００１３】
本開示において、菌体処理物とは、微生物を処理することにより得られた、微生物由来の成分を含む組成物を意味する。菌体処理物中においても、微生物の細胞中の構成要素はもはや細胞膜内に閉じ込められてはおらず、菌体処理物中に分散している。菌体処理物中には、微生物由来の成分の全てが含まれる必要はなく、成分によってはその全量又は部分量が除去されていてもよい。本開示に係るニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物の製造方法は、ニトリルヒドラターゼを含む組成物の製造方法といってもよい。前記組成物は液体であってもよく、固形物であってもよい。
本開示におけるニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物においては、アミド化合物の製造プロセスなどに使用する観点から、ニトリルヒドラターゼ以外のタンパク質及び核酸などの夾雑物の含有量は低いことが好ましい。夾雑物が存在すると、アミド化合物（例えば（メタ）アクリルアミド）を製造した場合にアミド化合物を含む水溶液が発泡しやすくなる傾向がある。
【００１４】
本開示において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても当該工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本開示において、記載される各要素は、その数について特に明記されない限りは、一つ存在しても、複数存在しても構わない。
本開示において、組成物中の各成分の量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００１５】
＜ニトリルヒドラターゼ＞
本開示に係る菌体処理物の製造方法におけるニトリルヒドラターゼは、天然生物のニトリルヒドラターゼであってもよいし、天然生物のニトリルヒドラターゼに対してアミノ酸配列の改変を加えた改変ニトリルヒドラターゼであってもよい。天然生物のニトリルヒドラターゼとしては、例えば、微生物のニトリルヒドラターゼが挙げられる。より具体的には、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、サーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属、バイテリジューム（Bacteridium）属、又はブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物のニトリルヒドラターゼが挙げられる。
【００１６】
改変ニトリルヒドラターゼとしては、天然生物のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列に対して１個又は２個以上のアミノ酸残基の置換、欠失、削除又は挿入を行うことにより、アミド化合物耐性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた改変ニトリルヒドラターゼが挙げられる。
【００１７】
シュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物（例えばシュードノカルディア・サーモフィラ）のニトリルヒドラターゼ及びそれを改変した改変ニトリルヒドラターゼは、高活性且つ高安定性という観点から好ましい。また、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ−１のニトリルヒドラターゼ及びそれを改変した改変ニトリルヒドラターゼも好ましい。
【００１８】
＜ニトリルヒドラターゼ生産微生物＞
本開示におけるニトリルヒドラターゼ生産微生物は、ニトリルヒドラターゼを生産する能力を有する微生物である。ニトリルヒドラターゼ生産微生物は、天然の微生物であってもよく、その例としては、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、サーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属、バイテリジューム（Bacteridium）属、又はブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物が挙げられる。
【００１９】
あるいは、ニトリルヒドラターゼ生産微生物は、外来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を有する宿主微生物（以下、「ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物」）であってもよい。外来のニトリルヒドラターゼ遺伝子は、天然生物、例えば天然微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子であってもよく、又はこうした天然生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子に対してヌクレオチド配列の改変を加えた改変ニトリルヒドラターゼ遺伝子であってもよい。ニトリルヒドラターゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主微生物内に導入することにより、ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物を得ることができる。
【００２０】
ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物の宿主微生物としては、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるものではなく、枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も挙げられる。ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物の例として、シュードノカルディア・サーモフィラのニトリルヒドラターゼ遺伝子を大腸菌に導入したＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現  茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター  中央第６  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。
【００２１】
ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物としては、高活性、高安定性のニトリルヒドラターゼを有するという点で、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物（例えばシュードノカルディア・サーモフィラ）、シュードノカルディア属微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主微生物で高発現させた組換え微生物（形質転換体）、及びシュードノカルディア属微生物のニトリルヒドラターゼを改変した改変ニトリルヒドラターゼを発現させた組換え微生物が好ましい。これらの組換え微生物は、ニトリルヒドラターゼの安定性をより高め、菌体当たりの活性をより高める観点から好ましい。
【００２２】
また、微生物内にニトリルヒドラターゼを高発現できる、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ−１、該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で高発現させた組換え微生物も同様に好ましい。
ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物が、シュードノカルディア・サーモフィラ、又はニトリルヒドラターゼ生産能を有する組換え大腸菌であることも、また好ましい。
【００２３】
ニトリルヒドラターゼ生産微生物を、分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法で培養することにより、所望の量のニトリルヒドラターゼ生産微生物を調製することができる。例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地等の通常の液体培地に、ニトリルヒドラターゼ生産微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい。）で培養させることによりニトリルヒドラターゼ生産微生物を増殖させることができる。こうして増殖させたニトリルヒドラターゼ生産微生物は、以下に記載の破砕に供することができる。
【００２４】
＜破砕液＞
ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液は、ニトリルヒドラターゼ生産微生物を破砕して作製した原破砕液そのものでもよいし、これに熱処理、酸処理、遠心分離、凝集剤添加、アルカリ処理、ｐＨ調整などの工程のうちの１つ又は複数を行って得られたものであってもよい。
【００２５】
破砕されるニトリルヒドラターゼ生産微生物の存在形態としては特に制限はないが、例えば、ニトリルヒドラターゼ生産微生物を含む培養液そのものであってもよいし、前記培養液を遠心分離して回収した集菌体であってもよいし、さらに前記集菌体を生理食塩水等で洗浄したものであってもよい。集菌体に対して破砕を行った場合には、破砕物に生理食塩水等の適当な溶液を加えて原破砕液とすればよい。
【００２６】
ニトリルヒドラターゼ生産微生物を破砕する装置としては、ニトリルヒドラターゼ生産微生物を破砕可能であれば特に制限はないが、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ビーズショッカー、ホモゲナイザー、ダイノーミル、クールミルなどの摩砕装置などが挙げられる。これらの中でも、安価にスケールアップができるという点で、ホモゲナイザーが好ましい。ホモゲナイザーは、株式会社三和機械、株式会社イズミフードマシナリなどが市販している。
【００２７】
ニトリルヒドラターゼ生産微生物を破砕する時の温度は特に制限はないが、好ましくは０℃以上５０℃以下、より好ましくは０℃以上２５℃以下である。
【００２８】
また、ニトリルヒドラターゼ生産微生物を破砕する時のｐＨは特に制限はないが、好ましくはｐＨ４以上１０以下、より好ましくはｐＨ６以上８以下である。
【００２９】
ホモゲナイザーを用いてニトリルヒドラターゼ生産微生物を破砕する場合の圧力はニトリルヒドラターゼ生産微生物が破砕される圧力であれば特には制限が無いが、好ましくは１０ＭＰａ以上３００ＭＰａ以下、より好ましくは３０ＭＰａ以上１００ＭＰａ以下である。
【００３０】
得られた原破砕液に対しては、さらに熱処理、酸処理、遠心分離、凝集剤添加、アルカリ処理、ｐＨ調整などの工程のうちの１つ又は複数を行ってもよい。平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理される（例えば、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤を添加される）時の破砕液のｐＨは特に限定されず、例えば４．０〜８．０であってもよいが、得られる菌体処理物の清澄度をさらに向上させる観点及びろ過速度を向上させる観点からは、４．０〜６．８であることが好ましく、４．５〜６．８であることがさらに好ましい。なお、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理される時の破砕液のｐＨは、例えば、４．５〜５．５であってもよい。
【００３１】
国際公開第２０１１／００７７２５号（特許文献１）に記載された方法などの従来の方法においては、ろ過前に必要に応じて中和を行うことにより、ろ過の際の破砕液のｐＨを中性となるようにしていた。しかし、本開示に係る菌体処理物の製造方法においては、破砕液のｐＨは中性よりも上記範囲のように弱酸性であることが好ましい。破砕液のｐＨを弱酸性とすることで、濁度を増加させる夾雑物粒子及びろ材を詰まらせる夾雑物粒子をより効率的に平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤の孔に捕捉することができるからである。
【００３２】
＜ろ過助剤＞
ろ過助剤とは、一般に、ろ過抵抗の低減、ろ材の目詰まり低減、及びろ液の清澄度向上のうちの１つ以上の働きを有する物質をいう。本開示に係る菌体処理物の製造方法における平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤の種類は特に限定されず、珪藻土、火山岩に由来するパーライト、木質由来のセルロースなどが例として挙げられる。
珪藻土は、植物プランクトンである珪藻の化石である。他の藻類と異なり、珪藻は非晶質の水和珪酸（ＳｉＯ２・ｎＨ２Ｏ）からなる多孔質の硬い細胞壁で覆われている。これは珪殻とよばれ、直径０．１μｍ〜１μｍ程度の無数の孔が開いている。採掘された原料は、乾燥、分級、焼成などの操作を経て精製される。珪藻土からなるろ過助剤は、焼成品と、融剤焼成品とに大別され、それぞれ粒度の異なるさまざまな製品がある。融剤としては例えば炭酸ナトリウムが用いられる。本開示に係る菌体処理物の製造方法においては、焼成品と融剤焼成品のどちらを用いてもよいが、菌体処理物の清澄度をさらに向上させる観点からは焼成品を用いることが好ましい。
パーライトは、ガラス質火山岩の総称である。マグマが地表付近で急冷され、非晶質シリカを主成分とする火山岩が形成される。真珠岩は２％〜５％の結合水分を含有しており、これを細かく粉砕し、溶融温度に急熱すると、固体部分が溶融すると同時に水分がガス化し、発泡、膨張するという独特の性質を持つ。発泡したパーライトを粉砕して薄片状の粒子とし、粒度を調整したものをろ過助剤として用いることができる。
【００３３】
珪藻土からなるろ過助剤としては、例えば、昭和化学工業株式会社製のラヂオライト（登録商標）シリーズの製品、イメリス製のCelite（セライト）シリーズの製品（例えば、ハイフロスーパーセル（登録商標））が挙げられる。これらの中でもラヂオライト（登録商標）シリーズの製品、例えばラヂオライト＃１００、ラヂオライト＃３００、ラヂオライト＃５００、ラヂオライト＃７００、ラヂオライト＃８００、ラヂオライト＃１５００Ｈなどを用いることが好ましい。パーライトからなるろ過助剤としては、例えば、昭和化学工業株式会社製のトプコシリーズの製品、三井金属鉱業株式会社から入手可能なロカヘルプシリーズの製品などが挙げられる。
【００３４】
本開示に係る菌体処理物の製造方法におけるろ過助剤の平均粒径は１２μｍ〜１００μｍである。本開示において、ろ過助剤の平均粒径とはレーザー回折式粒度分布測定装置で測定した５０％平均粒子径である。つまり、レーザー回折式粒度分布測定装置で測定した場合に、全粒子数のうち小粒径側から数えて（全粒子数×０．５）個目の粒子に該当する粒子の粒子径である。レーザー式粒度分布測定装置としては株式会社島津製作所製のレーザ回折式粒子径分布測定装置ＳＡＬＤ−２３００を使用して測定する。
【００３５】
本開示に係る菌体処理物の製造方法において、菌体処理物の清澄度をさらに向上させる観点からは、ろ過助剤の平均粒径は２０μｍ〜８０μｍであることがより好ましく、２０μｍ〜５０μｍであることがさらに好ましい。
【００３６】
＜破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程＞
上述したように、ろ過助剤は、多孔質であって、その孔にろ過助剤の孔径に応じて決まる粒径以上の粒径の夾雑物粒子のうち少なくとも一部を捕捉することができる。このため、破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過することにより、ろ液の清澄度を向上させることができる。また、ろ材の詰まりを抑制することができ、さらに、ろ過抵抗を低減させることができる。
【００３７】
ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程は、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液に平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤を添加し、（平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤が添加された）破砕液をろ過することを含むものであってもよい。これは、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤のボディフィードに該当する。ボディフィードの場合、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤を含んだ破砕液をろ過することにより形成されるケークは、夾雑物の粒子とろ過助剤とが混在しており、空隙率が高く、ろ過抵抗の少ないものとなる。したがって、ろ過速度が著しく向上し、ろ材の詰まりは抑制される傾向にある。破砕液に添加される平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤（好ましくは平均粒径２０μｍ〜８０μｍのろ過助剤、より好ましくは平均粒径２０μｍ〜５０μｍのろ過助剤）の量は、特に限定されないものの、例えば平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤の添加前の破砕液の質量に対して３質量％〜３０質量％であってもよく、また、５質量％〜２０質量％であってもよい。
【００３８】
あるいは平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤はろ材表面にプリコートしてもよい。プリコートの場合、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤をろ材表面に堆積させ、例えば２ｍｍ〜６ｍｍの厚みの平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤からなる層（プリコート層）を形成させる。このプリコート層に破砕液を通じると、夾雑物の粒子のうち少なくとも一部が平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤の孔中に捕捉され、清澄度の高いろ液を得ることが可能となる。また、夾雑物の粒子によるろ材の詰まりも抑制され、ろ過操作後のケークをろ材から剥離する操作も容易である。このため、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程は、ニトリルヒドラターゼ生産微生物を破砕した破砕液を、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤でプリコートされたろ材によりろ過することを含むものであってもよい。
【００３９】
平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤はろ過と組み合わせて使用される。本開示に係る菌体処理物の製造方法は、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理された破砕液をろ過することを含む。
【００４０】
ろ過を行う場合のフィルタ（ろ材）は、例えば、通過可能な球粒子の最大径が２０μｍ〜１００μｍであるフィルタであってもよい。通過可能な球粒子の最大径は、３０μｍ〜８０μｍであることが好ましい。このようなフィルタとしては、金網や濾布などが挙げられる。例えば、２５０メッシュ〜１０００メッシュ、好ましくは３００メッシュ〜７００メッシュの金網や、通気度５０ｃｃ／ｍｉｎ／ｃｍ２〜１００００５０ｃｃ／ｍｉｎ／ｃｍ２、好ましくは１０００５０ｃｃ／ｍｉｎ／ｃｍ２〜８０００ｃｃ／ｍｉｎ／ｃｍ２の濾布などが挙げられる。金網や濾布などは、平畳織であっても、綾畳織であっても、逆綾畳織であってもよい。このような金網は、真鍋工業株式会社や株式会社奥谷金網製作所などから、濾布は中尾フィルター工業株式会社や敷島カンバス株式会社などから入手可能である。
フィルタは、メンブレンフィルタであってもよいが、大量処理のための大面積化及び耐久度の点からは金網フィルタや濾布の方が好ましい。
【００４１】
平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤によるプリコートを行う場合、プリコートされたフィルタの使用形式としては、キャンドルフィルター、リーフフィルター、フィルタープレス、プリコートフィルター（ドラムフィルタ）、バグフィルターなども使用可能である。
【００４２】
ろ過は特に圧力をかけず重力によりろ過してもよいが、ろ過速度を増加させてプロセス効率を向上させるために、例えば０．０５ＭＰａ〜１．０ＭＰａ、又は０．１ＭＰａ〜０．５ＭＰａ程度の圧力をフィルタ上流側の液体に加えてろ過を行ってもよい。ろ過により得られたニトリルヒドラターゼを含む溶液（以下、「ニトリルヒドラターゼ含有溶液」ともいう；ニトリルヒドラターゼ含有溶液は、ろ液をさらに後述のとおり濃縮したものであってもよい）は、ニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物であって、アミド化合物の製造などに使用することができる。
【００４３】
＜他の工程＞
本開示に係る菌体処理物の製造方法は、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程に加えて、１つ又は複数の他の工程を含んでいてもよい。上述したろ過処理の他に、本開示に係る菌体処理物の製造方法が任意に含んでいてもよい工程の例を以下に記載するが、本開示に係る菌体処理物の製造方法が含んでいてもよい工程はこれらに限定されない。
【００４４】
＜酸処理＞
ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液（例えば原破砕液）は、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤による処理を受ける前に、好ましくは酸処理を受ける。つまり、本開示に係る菌体処理物の製造方法は、好ましくは、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程の前に、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を酸処理する工程（以下、酸処理工程とも称する）を含んでいてもよい。前記酸処理は、破砕液を酸で処理する工程であって、この酸処理により、夾雑物の不溶化が促進される。あらかじめ、このような不溶物を形成しておくことにより、本開示に係る菌体処理物の製造方法による夾雑物除去効果はさらに向上する。
【００４５】
酸としては、本開示に係る菌体処理物の製造方法の効果を損なわない限り特に制限なく、硫酸等の強酸、弱酸のいずれも使用可能である。酸処理時に酵素活性の低下が少ないという点では弱酸が好ましい。
【００４６】
上記弱酸としては、アクリル酸、酢酸、リン酸などが挙げられる。これら弱酸の中でも、酢酸及びリン酸は劇物ではないため取扱い易い。
【００４７】
酸処理は、破砕液のｐＨを４以上６以下の範囲内とするものであることが好ましく、４.５以上５.５以下の範囲内とするものであることがより好ましい。
【００４８】
破砕液を酸で処理する際には、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液に酸（好ましくは酸溶液）を添加してもよいし、酸（好ましくは酸溶液）にニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を添加してもよいし、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液と酸（好ましくは酸溶液）の両方を徐々に容器に注いでもよい。また、破砕液を酸で処理する際には、破砕液全体のｐＨができる限り均一となるように、酸（好ましくは酸溶液）をゆっくりと破砕液に添加することが望ましい。
【００４９】
また、上記酸処理に先立って、酵素の活性が低下しない範囲で破砕液（例えば原破砕液）の熱処理を行ってもよい。つまり、本開示に係る菌体処理物の製造方法は、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を酸処理する工程の前に、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を熱処理する工程を含んでいてもよい。熱処理を行うと、破砕液を酸で処理した際、生じる不溶物をより沈殿しやすくすることができる。破砕液の熱処理温度は、好ましくは４５℃以上６５℃以下、より好ましくは５０℃以上６０℃以下である。破砕液の熱処理時間は、好ましくは５分以上１８０分以下、より好ましくは５分以上６０分以下である。
なお、熱処理は、ニトリルヒドラターゼ生産微生物を破砕する前に行っても構わない。
【００５０】
＜アルカリ処理＞
本開示に係る菌体処理物の製造方法は、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液に対してアルカリ処理を行う工程（以下、アルカリ処理工程とも称する）を含んでもよい。アルカリ処理により、夾雑物の不溶化が促進される。あらかじめ、このような不溶物を形成しておくことにより、本開示に係る菌体処理物の製造方法による夾雑物除去効果はさらに向上する。アルカリ処理を行う時期は、ろ液中に新たな夾雑物を生じさせない観点から、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程よりは前であることが好ましい。上記の酸処理工程を行う場合、アルカリ処理は酸処理工程の前に行っても、後に行ってもよい。
【００５１】
このアルカリ処理に使用するアルカリは、本開示に係る菌体処理物の製造方法の効果を損なわない限り特に制限ないが、安価なアルカリであるという点で水酸化ナトリウムが好ましい。アルカリ処理は、例えば、破砕液のｐＨを所望のｐＨに調整するのに必要な量の水酸化ナトリウム水溶液を上記混合液に添加することを含んでいてもよい。
【００５２】
アルカリ処理は、破砕液のｐＨを、７．５以上１０以下の範囲に調節する処理であることが好ましく、８．０以上９．５以下の範囲に調整する処理であることがさらに好ましい。また、アルカリ処理を行った場合には、破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程の前に、後述のｐＨ調整工程を行っても良い。
【００５３】
＜ｐＨ調整＞
本開示に係る菌体処理物の製造方法は、破砕液のｐＨを４．０〜８．０に調整する工程（以下、ｐＨ調整工程とも称する）を含んでいてもよい。この工程は、ろ過助剤で処理される時の破砕液のｐＨを調整することを目的とした工程である。このため、上記の酸処理及びアルカリ処理のうち一つ以上を行う場合には、それらの工程よりも後にｐＨ調整工程を行うことが好ましい。前述したように、得られる菌体処理物の清澄度をさらに向上させる観点及びろ過速度を向上させる観点からは、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理される時の破砕液のｐＨは４．０〜６．８であることが好ましく、４．５〜６．８であることがさらに好ましい。このため、ｐＨ調整工程は、好ましくは破砕液のｐＨを４．０〜６．８に調整する工程であり、より好ましくは４．５〜６．８に調整する工程である。なお、ｐＨ調整工程は、破砕液のｐＨを例えば４．５〜５．５に調整する工程であってもよい。
【００５４】
前述の酸処理工程が、ｐＨ調整工程を兼ねていてもよい。ｐＨの調整は、酸性物質、塩基性物質などを破砕液に必要に応じて添加するにより行うことができる。酸性物質としては、塩酸、硝酸などの無機酸、酢酸、クエン酸、酒石酸などの有機酸などが例として挙げられる。塩基性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどが例として挙げられる。破砕液のｐＨを調整する工程は、破砕液のｐＨを監視しながら、目標ｐＨに応じて選択された適切な酸性物質又は塩基性物質の水溶液を破砕液に添加することで行うことができる。なお、本開示において、破砕液のｐＨとは２５℃におけるｐＨを表す。
【００５５】
＜凝集剤の添加＞
本開示に係る菌体処理物の製造方法は、好ましくは、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程の前に、凝集剤を添加する工程（以下、凝集剤添加工程とも称する）を含んでいてもよい。前記酸処理工程を行う場合には、凝集剤を添加する工程は酸処理工程よりも後に行っても酸処理工程よりも前に行ってもよい。前記アルカリ処理工程を行う場合には、凝集剤を添加する工程はアルカリ処理工程よりも後に行ってもアルカリ処理工程よりも前に行ってもよい。凝集剤を添加する工程を含むことによって、濁度を増大させる夾雑物、アミド化合物の水溶液を発泡させる夾雑物などをより効率的に除去することが可能となる。前記ｐＨ調整工程を行う場合には、凝集剤を添加する工程はｐＨ調整工程よりも後に行ってもｐＨ調整工程よりも前に行ってもよいが、ろ過助剤で処理される時の破砕液のｐＨをより精密に調整することを可能にする観点からは、ｐＨ調整工程よりも前に行うことが好ましい。
【００５６】
凝集剤は特に限定されず、凝集剤の例としては、両性の水溶性ポリマー及び、カチオン性官能基を有するポリマーが挙げられ、より具体的な例としては、４級アンモニウム基含有両性水溶性高分子、３級アミノ基含有両性水溶性高分子ポリアミノアルキル（メタ）アクリレート、アミノアルキル（メタ）アクリレート四級塩重合物、アミノアルキル（メタ）アクリレート四級塩−アクリルアミド共重合物、ポリビニル−ピリジニウム−ハライド、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ヘキサメチレンジアミンとエピクロルヒドリンの重縮合物、ポリアルキレンイミンなどが挙げられる。本開示において（メタ）アクリレートの表記はアクリレート若しくはメタクリレート又はその両方を表し、（メタ）アクリロニトリルの表記はアクリロニトリル若しくはメタクリロニトリル又はその両方を表し、（メタ）アクリルアミドの表記はアクリルアミド若しくはメタクリルアミド又はその両方を表す。
【００５７】
破砕液に添加する凝集剤の量としては、夾雑物の凝集を効率よく生じさせる観点から、凝集剤との混合後における破砕液の全質量に対する凝集剤の濃度が０．０１質量％〜２．０質量％となる量であることが好ましく、混合後の濃度が０．０２質量％〜１．０質量％となる量であることがより好ましく、０．０５質量％〜０．５質量％となる量であることがさらに好ましい。ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液に凝集剤を添加する工程は、例えば、５質量％〜５０質量％、好ましくは１０質量％〜４０質量％の凝集剤溶液を破砕液に撹拌下で添加することによって行ってもよい。ニトリルヒドラターゼの活性保持の観点から、凝集剤の添加は、０℃〜４０℃で行うことが好ましく、１０℃〜３０℃で行うことがより好ましい。ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液に凝集剤を添加する工程は、凝集剤の添加後の破砕液を撹拌する工程を含んでいてもよい。
【００５８】
＜遠心分離＞
本開示に係る菌体処理物の製造方法は、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液に対して、ろ過する工程の前に遠心分離処理を行わなくても、上述のろ過助剤を清澄な菌体処理物を得ることができる。そのため、本開示に係る菌体処理物の製造方法においては、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程の前に、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液に対して遠心分離処理を行う必要性は無い。ただし、所望であれば、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程の前に、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液に対して遠心分離処理を行い、破砕液中に存在する不溶物を除去すること（以下、遠心分離工程とも称する）を含んでもよい。遠心分離処理により、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液中に存在する不溶物を分離除去することが可能となる。ここで、遠心分離処理により除去される不溶物は、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液中に存在する不溶物の少なくとも一部であればよい。遠心分離処理を行うことにより、濁度を増大させる夾雑物、アミド化合物の水溶液を発泡させる夾雑物などをより効率的に除去することが可能となる。
【００５９】
前記酸処理工程を行う場合には、遠心分離工程は、前記酸処理工程を行った後で行うことが好ましい。前記アルカリ処理工程を行う場合には、遠心分離工程は、前記アルカリ処理工程を行った後で行うことが好ましい。酸処理及びアルカリ処理のうち一つ以上によって生じた不溶物も遠心分離工程によって除去することが可能であるため、濁度を増大させる夾雑物、アミド化合物の水溶液を発泡させる夾雑物などをさらに効率的に除去することが可能となるためである。
【００６０】
前記ｐＨ調整工程を行う場合には、遠心分離工程はｐＨ調整工程よりも後に行ってもｐＨ調整工程よりも前に行ってもよいが、ろ過助剤で処理される時の破砕液のｐＨをより精密に調整することを可能にする観点からは、ｐＨ調整工程よりも前に行うことが好ましい。前記凝集剤添加工程を行う場合には、遠心分離工程は、前記凝集剤添加工程を行う前に行っても、前記凝集剤添加工程を行った後で行ってもよい。
【００６１】
なお、アミド化合物を含む水溶液の発泡性が大きいと、窒素などのガスを水溶液に吹き込む処理を行う場合に発泡が著しくなり、場合によっては、反応装置内から水溶液があふれ出し、その後の操作が困難となってしまう。このようなガスの吹き込みは、反応に悪影響を与える物質を除去することなどを目的に行われる。
【００６２】
遠心分離処理は、酸処理を行った直後から行ってもよいが、好ましくは酸処理から１時間〜７２時間後で、より好ましくは酸処理から３時間〜４８時間後で開始してもよい。遠心分離処理の処理時間は、不溶物の除去ができる限り特に制限はないが、好ましくは７２時間以下、より好ましくは４８時間以下である。
【００６３】
遠心分離処理の際の破砕液の温度は、好ましくは０℃以上５０℃以下、より好ましくは０℃以上２５℃以下である。
【００６４】
＜ろ液の濃縮＞
上述した、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕液を平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理し、ろ過する工程により得られたろ液は、さらにニトリルヒドラターゼの濃度を高めるための濃縮工程に供してもよい。濃縮工程に供することで、ニトリルヒドラターゼの濃度が増大した菌体処理物を得ることができる。濃縮は、ろ液中の液体成分を除去することにより行うことができる。濃縮は例えば、蒸発、又は逆浸透などの膜濃縮法により行うことができる。膜濃縮法を用いる場合、膜の公称分画分子量はニトリルヒドラターゼ生産微生物が生産するニトリルヒドラターゼの分子量よりも大きい分子量とすることができ、例えば公称分画分子量が４万〜１０万の範囲内の値である膜を用いることができる。このような膜としては、例えば、旭化成社製ペンシル型中空糸膜ＡＨＰ−００１３などを用いることができる。濃縮の際に付加する圧力は使用する膜に応じて選択すればよく、例えば、０．０１ＭＰａ〜０．５ＭＰａ、好ましくは０．０５ＭＰａ〜０．３ＭＰａの範囲内とすることができる。
濃縮工程によるろ液の濃縮度は、濃縮にかかる時間と求められるニトリルヒドラターゼ濃度に応じて設定すればよく、例えば２倍〜３０倍とすることができ、好ましくは５倍〜２０倍とすることができる。濃縮度は、濃縮後の溶液体積を濃縮前の溶液体積で除すことにより求めることができる。
【００６５】
＜アミド化合物の製造＞
上に説明した本開示に係る菌体処理物の製造方法により得られた菌体処理物であるニトリルヒドラターゼ含有溶液を用いることで、ニトリル化合物からアミド化合物を製造することができる。本開示に係るアミド化合物の製造方法は、例えば、ニトリル化合物と本開示に係る菌体処理物の製造方法により得られた菌体処理物とを混合することを含む。反応の詳細については原料となるニトリル化合物及び目的とするアミド化合物の種類に応じて適宜調整すればよい。例として、（メタ）アクリロニトリルから、（メタ）アクリルアミドを製造するプロセスを以下に記載する。他のアミド化合物も、対応するニトリル化合物から同様にして製造することができる。なお、ニトリルヒドラターゼ含有溶液は、ろ過後にさらに公知の精製処理などを経て調製した溶液であってもよい。
【００６６】
（メタ）アクリルアミドの製造は、通常、水性媒体中で行う。前記水性媒体は、リン酸塩等を含む緩衝剤、硫酸塩や炭酸塩等の無機塩、アルカリ金属の水酸化物、及びアミド化合物等から選択される１つ以上を適当な濃度で水中に溶解したものであり、水性媒体、原料としての（メタ）アクリロニトリル、及び触媒としてのニトリルヒドラターゼ含有溶液（菌体処理物）を混合して反応溶液とする。反応溶液を１０℃〜２０℃程度の温度で保持することにより、（メタ）アクリルアミドの生成反応が進行する。
【００６７】
混合するニトリルヒドラターゼ含有溶液の量は、反応のスケールなどを考慮して必要なユニット数のニトリルヒドラターゼが含まれるように設定すればよい。反応開始時における反応溶液中の（メタ）アクリロニトリルの濃度は特に制限されるものではないが、反応開始時におけるニトリル化合物の濃度を高く設定し過ぎると、反応を完結させるために多くの触媒量が必要となり、必要とされる反応器の容積が大きくなり、除熱のために必要な熱交換器等のサイズが大きくなるなど、設備面での経済的負担が大きくなる。
【００６８】
このため、アクリロニトリルを使用する場合には、反応開始時における反応溶液中のアクリロニトリルの濃度は、それが１００％の変換効率でアクリルアミドに変換された場合に、反応溶液の全質量に対する生成したアクリルアミドの濃度が４０質量％〜８０質量％となるような濃度であることが好ましい。
【００６９】
また、メタクリロニトリルを使用する場合には、反応開始時における反応溶液中のメタクリロニトリルの濃度は、それが１００％の変換効率でメタクリルアミドに変換された場合に、反応溶液の全質量に対する生成したメタクリルアミドの濃度が１０質量％〜４０質量％となるような濃度であることが好ましい。
【００７０】
（メタ）アクリルアミド生成反応の反応時間は、触媒使用量や温度等の条件にも左右されるが、通常は１時間〜１２０時間であり、好ましくは２時間〜４８時間である。
【００７１】
（メタ）アクリルアミド生成反応の反応様式については、特に限定するものではなく、回分式又は半回分式でもよいし、連続式でもよい。また、懸濁床、固定床、移動床などのうちいずれであってもよい。また、複数の形式の反応器を組み合わせて用いてもよい。
【００７２】
また、ニトリルヒドラターゼによって触媒される水和反応は、通常は常圧又は常圧近辺で行われるが、水性媒体中へのニトリル化合物の溶解度を高めるために加圧下で行うこともできる。また、反応温度に関しては、水性媒体の氷点以上であれば特に制限されるものではないが、通常は０℃〜５０℃で行うのが好ましく、より好ましくは１０℃〜４０℃である。また、生成物が反応溶液中に晶出したスラリー状態でも反応を行うことができる。また、水和反応における反応溶液のｐＨは、ニトリルヒドラターゼ活性が維持されている限りは特に制限されるものではないが、好ましくはｐＨ６〜１０の範囲であり、より好ましくはｐＨ７〜９の範囲である。
【００７３】
以上に説明したとおり、本開示に係る菌体処理物の製造方法によれば、ニトリルヒドラターゼ以外の夾雑物が低減されたニトリルヒドラターゼを含む清澄な菌体処理物を製造することができる。また、この菌体処理物は、（メタ）アクリルアミドなどのアミド化合物などの製造に用いることができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例に基づいて実施形態をさらに具体的に説明するが、本開示はこれにより何ら限定されるものではない。以下、特に断りのない限り、％及びｐｐｍはいずれも質量基準である。
【００７５】
[アクリルアミドの分析方法]
各実施例及び比較例におけるＨＰＬＣ分析は、カラムとして日本分光株式会社製のＦｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ Ｃ１８−５（２５０×４．６φｍｍ）を用い、４体積％のアセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用した。また、アクリルアミドは２２０ｎｍの吸光度により検出した。
【００７６】
[ニトリルヒドラターゼ生産微生物の培養物の調製]
特開２００１−３４００９１号の実施例１に記載された方法に従い、特開平０９−２７５９７８で得られたｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし、特開平０９−２７５９７８の表３にクローンＮｏ．３として示されるニトリルヒドラターゼ生産微生物を取得した。このクローンＮｏ．３は、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を改変して発現するニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から６番目のＬｅｕをＡｌａに置換した遺伝子（ヌクレオチド上のコドンの変化はＣＴＧからＧＴＧへの変化）を、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換した形質転換体である。ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドを保有する大腸菌は、ＭＴ−１０８２２株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５）として、前述のとおり特許生物寄託センターに寄託されている。
【００７７】
下記の組成の培地を５Ｌ調整し、２Ｌのバッフル付三角フラスコ１０本に５００ｍＬづつ添加し、１２１℃で２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した後、上記のクローンＮｏ．３の菌体（ニトリルヒドラターゼ生産微生物）を一白金耳で植菌し、３７℃で１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。
【００７８】
培地組成  酵母エキストラクト        ５．０ｇ／Ｌ
ポリペプトン              １０．０ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                  ５．０ｇ／Ｌ
塩化コバルト・六水和物    １０．０ｍｇ／Ｌ
硫酸第二鉄・七水和物      ４０．０ｍｇ／Ｌ
ｐＨ７．５
【００７９】
[ニトリルヒドラターゼ生産微生物の原破砕液の調製]
（ホモゲナイザーによるニトリルヒドラターゼ生産微生物の破砕）
上記ニトリルヒドラターゼ生産微生物の培養物の調製で調製した培養液５Ｌに含まれるニトリルヒドラターゼ生産微生物の細胞を、三和エンジニアリング株式会社製ホモゲナイザーＨ５０を用いて、温度１５℃、破砕圧力５０ＭＰａ、破砕時間１００分の条件で破砕し、細胞内に含まれるニトリルヒドラターゼを溶液中に遊離させ、原破砕液を作製した。
【００８０】
［熱処理］
上記原破砕液を１０Ｌのガラスビーカーに移し、原破砕液を充分に撹拌しながら、ガラスビーカーを５０℃の水浴恒温槽に浸漬した。原破砕液の液温が５０℃になってからさらに１５分間浸漬を続け、その後ビーカーを取り出し空冷した。
【００８１】
［凝集剤の添加］
和光純薬工業株式会社製ポリエチレンイミン（重量平均分子量１８００）を水に溶解し、３０質量％水溶液を作製した。この３０質量％ポリエチレンイミン水溶液を、酸処理後の破砕液に、添加後の破砕液中におけるポリエチレンイミンの濃度が０．１質量％となるように添加し、３０分撹拌した。
【００８２】
［ｐＨの調整］
３０質量％ポリエチレンイミン水溶液の添加後の破砕液を充分に撹拌しながら、破砕液のｐＨが５．０になるまで２Ｎの酢酸をゆっくり添加した。
【００８３】
［破砕液へのろ過助剤の添加及びろ過］
中和後の破砕液にろ過助剤として珪藻土（昭和化学工業株式会社製ラヂオライト（登録商標）＃１５００Ｈ）を破砕液の質量に対して１０質量％添加し、２０℃で撹拌した。撹拌後、３６０メッシュの金網を用いて、０．２ＭＰａで加圧ろ過を行い、ろ液を得た。ろ過開始から２５ｇのろ液が得られるまでの時間を計測し、２５ｇ通過所要時間とした。また、得られたろ液の清澄性を島津製紫可視分光光度計ＵＶ１６５０ＰＣを用いて波長６６０ｎｍで吸光度を測定することにより評価した。
【００８４】
［ろ液の濃縮］
旭化成社製ペンシル型中空糸膜ＡＨＰ−００１３を用いて、平均圧力０．１ＭＰａ、循環速度１．５ｍｍ／ｓｅｃの条件で、ろ液を１５倍濃縮し、菌体処理物を得た。
【００８５】
［アクリルアミドの製造］
第１反応器としての撹拌器を備えた１Ｌガラス製フラスコ、及び第二反応器としての内径５ｍｍのテフロン（登録商標）製チューブ２０ｍを準備した。第一反応器には、予め４００ｇの水を仕込んだ。
【００８６】
上記で得た菌体処理物（１５倍濃縮後したろ液）を０．３ｍＭのＮａＯＨ水溶液に０．０３質量％の濃度となるように懸濁し、懸濁液を得た。この懸濁液とアクリロニトリルとを、各々４９ｇ／ｈ（懸濁液）及び３１ｇ／ｈ（アクリロニトリル）の速度で、撹拌を行いながら、第１反応器に連続的にフィードした。さらに、第１反応器の液面レベルを一定に保つように、反応液を第１反応器から８０ｇ／ｈの速度で連続的に抜き出した。抜き出した反応液を８０ｇ／ｈの速度で第２反応器に連続的にフィードして、第２反応器内でさらに反応を進行させた。
【００８７】
上記の反応の間、第１反応器及び第２反応器は、いずれも、１０℃〜２０℃の温度の水浴中に浸漬し、各反応器内部の液温が１５℃となるように温度制御を行った。
【００８８】
０．３ｍＭのＮａＯＨ水溶液に対する菌体処理物の添加量を、第１反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が９０％以上となり、且つ第二反応器出口でのアクリロニトリル濃度が検出限界以下（１００ｐｐｍ以下）となるように調整した。アクリルアミドへの転化率はＨＰＬＣの分析結果から求めた。得られたアクリルアミド水溶液には、２Ｍのアクリル酸を添加してｐＨ７に調整した。
【００８９】
［アクリルアミド水溶液の発泡試験（発泡高さの測定）］
上記で得られたアクリルアミド水溶液３００ｇを５００ｍｌメスシリンダーに入れた。このアクリルアミド水溶液中に木下式ガラスボールフィルター５０３Ｇを導入し、メスシリンダーの底から、前記ガラスボールフィルタを通して、９００ｍｌ／ｍｉｎで空気を吹き込み５分間経過した時点の発泡の高さを測定した。
【００９０】
＜実施例２＞
ろ過助剤としてのラヂオライト（登録商標）＃１５００Ｈを同質量の昭和化学工業株式会社製ラヂオライト（登録商標）＃７００に置き換えた以外は実施例１と同様にして菌体処理物を得、得られた菌体処理物を用いて、実施例１と同様にしてアクリルアミドの製造及びアクリルアミド水溶液の発泡試験を行った。
【００９１】
＜実施例３＞
ろ過助剤としてのラヂオライト（登録商標）＃１５００Ｈを同質量の昭和化学工業株式会社製ラヂオライト（登録商標）＃５００に置き換えた以外は実施例１と同様にして菌体処理物を得、得られた菌体処理物を用いて、実施例１と同様にしてアクリルアミドの製造及びアクリルアミド水溶液の発泡試験を行った。
【００９２】
＜実施例４＞
上記の破砕液のｐＨ調整の際に、破砕液のｐＨを５．０ではなく６．０に調整した以外は実施例１と同様にして菌体処理物を得、得られた菌体処理物を用いて、実施例１と同様にしてアクリルアミドの製造及びアクリルアミド水溶液の発泡試験を行った。
【００９３】
＜実施例５＞
上記の破砕液のｐＨ調整の際に、破砕液のｐＨを５．０ではなく７．０に調整した以外は実施例１と同様にして菌体処理物を得、得られた菌体処理物を用いて、実施例１と同様にしてアクリルアミドの製造及びアクリルアミド水溶液の発泡試験を行った。
【００９４】
＜比較例１＞
ろ過助剤としてのラヂオライト（登録商標）＃１５００Ｈを同質量の昭和化学工業株式会社製ラヂオライト（登録商標）＃３０００に置き換えた以外は実施例１と同様にして菌体処理物を得、得られた菌体処理物を用いて、実施例１と同様にしてアクリルアミドの製造及びアクリルアミド水溶液の発泡試験を行った。
【００９５】
＜比較例２＞
ろ過助剤としてのラヂオライト（登録商標）＃１５００Ｈを同質量のイメリス社製セライトハイフロスーパーセル（登録商標）に置き換えた以外は実施例１と同様にして菌体処理物を得、得られた菌体処理物を用いて、実施例１と同様にしてアクリルアミドの製造及びアクリルアミド水溶液の発泡試験を行った。
【００９６】
実施例及び比較例における結果を、表１にまとめて示す。なお、珪藻土の平均粒径は、上述のとおり株式会社島津製作所製のレーザ回折式粒子径分布測定装置ＳＡＬＤ−２３００を使用して測定した５０％平均粒子径である。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
表２に示されるように、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で破砕液を処理し、ろ過した実施例１〜実施例５においては、良好なろ液濁度が得られ、アクリルアミド水溶液の発泡性も低かった。一方、ろ過助剤の平均粒径が１２μｍ〜１００μｍの範囲外である比較例１及び比較例２においては、ろ液の濁度が高く、多量の夾雑物粒子が存在していた。また、比較例１及び比較例２においては、アクリルアミド水溶液の発泡性も高かった。
実施例１、実施例４及び実施例５を比較すると、平均粒径１２μｍ〜１００μｍのろ過助剤で処理される破砕液のｐＨを４．５以上６．８以下に調整することによって、ろ液の濁度はさらに低下することが分かる。