(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、機器、環境、溶離液の影響等により不確実性（変動）を軽減した、サイズ排除クロマトグラフィにより取得されるクロマトグラムに基づく、測定試料と標準試料との類似度の計算方法を提供するものである。【解決手段】  サイズ排除クロマトグラフィにより取得されるクロマトグラムに基づく、測定試料と標準試料との類似度の計算方法であって、前記測定試料のクロマトグラムに対して、類似度計算を行う区間のドリフトを除去する工程と、基準となる成分ピークの溶出時間が前記標準試料のクロマトグラムと同一になるように時間軸を補正した後、時間間隔が前記標準試料のクロマトグラムと同一になるように再補正する工程と、を行った後、類似度計算を行う区間のドリフトが除去された前記標準試料のクロマトグラムとの間で類似度の計算を行うことを特徴とする前記方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイズ排除クロマトグラフィにより取得されるクロマトグラムに基づく、測定試料と標準試料との類似度の計算方法であって、
前記測定試料のクロマトグラムに対して、
類似度計算を行う区間のドリフトを除去する工程と、
基準となる成分ピークの溶出時間が前記標準試料のクロマトグラムと同一になるように時間軸を補正した後、時間間隔が前記標準試料のクロマトグラムと同一になるように再補正する工程と、を行った後、
類似度計算を行う区間のドリフトが除去された前記標準試料のクロマトグラムとの間で類似度の計算を行うことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
クロマトグラムを積分曲線に変換してから類似度の計算を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
類似度の計算を行う区間がクロマトグラム中に２以上あることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
類似度の計算を以下の式で算出することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【数１】
2019211386.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により取得されるクロマトグラムに基づく、測定試料と標準試料との類似度の計算方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＳＥＣは合成高分子やタンパク質等を分子サイズの違いによって分離・精製するのに使用されるが、試料の分子量分布を測定する方法としても使用されるため、製造における品質管理等にも利用することが可能である。また、分光分析の分野や質量分析の分野では、測定試料の特定／同定を目的として、「類似度」を用いた手法が頻繁に用いられている。これは比較対象となるスペクトルと、未知試料を測定して得られたスペクトルとを比較して、その類似性を数値で評価する手法である。
【０００３】
例えば、特許文献１は液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビンの分析に類似度の考えを適用し、クロマトグラムが正常であるか、異常であるかを判別する方法に適用した例である。この場合、ｘ値に相当する値は溶出時間となるが、液体クロマトグラフィの場合は、溶離液、カラムロット、装置の稼働状態、測定環境等様々な要因の組み合わせにより、溶出時間は必ずしも同じとはならない。ｘ値に不確定要素を含んだ場合、類似度計算の信頼性は劣ることとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９―２５１０１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、機器、環境、溶離液の影響等により不確実性（変動）を軽減した、ＳＥＣにより取得されるクロマトグラムに基づく、測定試料と標準試料との類似度の計算方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係るサイズ排除クロマトグラフィにより取得されるクロマトグラムに基づく、測定試料と標準試料との類似度の計算方法は、前記測定試料のクロマトグラムに対して、類似度計算を行う区間のドリフトを除去する工程と、基準となる成分ピークの溶出時間が前記標準試料のクロマトグラムと同一になるように時間軸を補正した後、時間間隔が前記標準試料のクロマトグラムと同一になるように再補正する工程と、を行った後、類似度計算を行う区間のドリフトが除去された前記標準試料のクロマトグラムとの間で類似度の計算を行うことを特徴とする。
【０００７】
また、本発明に係る計算方法の一態様においては、クロマトグラムを積分曲線に変換してから類似度の計算を行う。
【０００８】
また、本発明に係る計算方法の一態様においては、類似度の計算を行う区間がクロマトグラム中に２以上ある。
【０００９】
また、本発明に係る計算方法の一態様においては、類似度の計算を以下の式で算出する。
【００１０】
【数１】
2019211386.tif 000002
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、クロマトグラムのドリフト除去と時間軸の補正を行うため、不確実性を軽減して測定試料と標準試料との類似度の計算を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】基準となる成分ピークの溶出時間が標準試料のクロマトグラムと同一になるように時間軸を補正する方法について説明した図である。
【図２】時間間隔が前記標準試料のクロマトグラムと同一になるように再補正する方法について説明した図である。
【図３】時間軸の補正、時間間隔の再補正およびドリフト除去を行った前後のクロマトグラムを比較したものである。
【図４】本発明における、類似度計算の対象区間を例示した図である。図ａは高分子成分全て（１区間）、図ｂは２区間、図ｃは３区間の場合である。
【図５】実施例で用いたシステム構成を示した図である
【図６】実施例１での類似度計算の結果を示した図である。横軸は試料＃、縦軸は類似度（最大１０００）である。
【図７】実施例１での類似度計算の結果から上位５番目までの試料のクロマトグラム（時間補正、ドリフト除去処理後）を示した図である。
【図８】比較のため、実施例１での類似度計算の結果から上位５番目までの試料の未処理クロマトグラムを示した図である。
【図９】実施例２での類似度計算の結果から上位５番目までを示した図である。
【図１０】実施例３で用いた積分曲線、および、類似度計算の対象区間を示した図である。図ｂはそれに対応するクロマトグラムを示している。
【図１１】実施例３での類似度計算の結果から上位５番目までを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の計算方法は、測定試料のクロマトグラムに対して、類似度計算を行う区間のドリフトを除去する工程と、基準となる成分ピークの溶出時間が標準試料のクロマトグラムと同一になるように時間軸を補正した後、時間間隔が前記標準試料のクロマトグラムと同一になるように再補正する工程と、を行った後、類似度計算を行う区間のドリフトが除去された標準試料のクロマトグラムとの間で類似度の計算を行うものである。以下、本発明の一実施形態について説明する。
【００１４】
なお、本発明における「クロマトグラム」とは、サイズ排除クロマトグラフィにより取得されるクロマトグラムを指す。
【００１５】
類似度計算を行う区間のドリフトを除去する工程の一例としては、類似度計算を行う区間の少なくとも１以上の開始点（ｘ１、ｙ１）及び少なくとも１以上の終了点（ｘ２、ｙ２）［ｘ：時間、ｙ：出力］を決めて、直線式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）を算出し、クロマトグラムの各データ点（時間、出力）から前記直線式のｙ値を差し引く方法などが挙げられる。しかし、本工程はこの方法に限定されるものではない。開始点および終了点以外のピークが溶出していない複数の点を基に、多項式を算出し、クロマトグラムの各データ点（時間、出力）から前記多項式のｙ値を差し引く方法なども有用である。
【００１６】
前記開始点は、目的成分が溶出し始める時間以前であれば良いが、類似度計算の精度を向上させるには、目的成分以外の領域ができるだけ少ない方が良い。前記終了点は、目的成分が溶出し終わる時間以降で、かつ基準となる成分ピークが溶出する時間の前であれば良いが、類似度計算の精度を向上させるには、目的成分以外の領域ができるだけ少ない方が良い。
【００１７】
基準となる成分ピーク（以下、内部標準ピークと言うことがある）の溶出時間が標準試料のクロマトグラムと同一になるように時間軸を補正する方法について説明する。まず、標準試料クロマトグラムの内部標準の溶出時間（Ｔｓ）を、測定試料クロマトグラムの内部標準の溶出時間（Ｔｕ）で除した値を補正係数（Ｆｔ）とし、測定試料クロマトグラムのｘ値（時間）に補正係数（Ｆｔ）を乗じればよい（図１参照）。
【００１８】
時間間隔が前記標準試料のクロマトグラムと同一になるように再補正する方法について説明する。上述したように時間軸を補正するとクロマトグラムの時間間隔（サンプリングピッチ）は標準試料クロマトグラムのものとはずれてしまう。そこで、前後のデータ点を使用して補間処理を実施し、再補正を行う（図２参照）。
【００１９】
なお、内部標準ピークは溶媒由来のピーク、低分子成分等のピークでよく、ＳＥＣにおいて示差屈折計を検出器として用いる場合は、試料を溶解した溶媒由来のピークが目的成分とは逆の極性（負方向）のピークとして出現することが多く、溶媒ピークを内部標準として使用することが好適である。
【００２０】
「類似度計算を行う区間のドリフトを除去する工程」と、「基準となる成分ピークの溶出時間が標準試料のクロマトグラムと同一になるように時間軸を補正した後、時間間隔が前記標準試料のクロマトグラムと同一になるように再補正する工程」とはどちらの工程を先に行っても問題はない。
【００２１】
測定試料クロマトグラムについて、上述した全工程が終了したら（図３参照）、次に、類似度計算を行う区間のドリフトが除去された標準試料クロマトグラムとの間で類似度の計算を行う。なお、標準試料クロマトグラムのドリフトを除去する方法は、測定試料クロマトグラムに用いた方法と同一で問題はなく、本発明の実施に支障がないのであれば、更に標準試料クロマトグラムに対して他の工程処理を施しても問題はない。
【００２２】
「類似度」の計算方法は、式１で挙げるような方法が代表的であるが、２つのクロマトグラム間で波形の類似性の指標となれば良く、特に限定するものではない。式１を用いて計算される類似度は、最大で１０００であり、１０００に近いほど、クロマトグラムの同一性が高いことを示す。
【００２３】
また、類似度計算を行う区間については、複数設定し、各区間の類似度の値の平均値を取る、区間ごとに重みづけを行って計算しても問題ない。例えば、図４ｂのように複数の分子量分布を有する高分子試料などでは２つの区間に分けて類似度を計算してもよく、図４ｃのように１つのピークであるが、高分子試料の高分子側（第１区間）、低分子側（第３区間）、平均的な分子量区間（第２区間）のように３つの区間に分けて計算してもよい。
【００２４】
また、クロマトグラムから得られる積分曲線を用いても類似度計算を行うことは可能である。積分曲線は、全体に占めるある分子量の割合を示したもので、高分子成分の特性を示す指標の１つである。積分曲線による類似度計算を実施する場合、上述した全工程が終了したクロマトグラムに対して、指定の計算区間内で時間に対する出力値を積算して積分曲線に変換してから類似度計算を行えばよい。
【００２５】
本発明で算出された類似度は、予め設定しておいた基準値に対して、それを上回るか下回るかで品質を判定するといった利用が可能である。また、区間を複数設けている場合は、複数項目で条件を満たすか否かで判定するといった利用も可能である。
【００２６】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００２７】
図５に示すシステムを使用し、実際の測定を行った。システムは、溶離液１、溶媒脱気装置２（ＳＤ−８０２０）、送液ポンプ３，１１（ＤＰ−８０２０）、試料注入装置４（ＡＳ−８０２０）、カラムオーブン６（ＣＯ−８０２０）、示差屈折計１０（ＲＩ−８０２０）、抵抗管７、廃液部８及びデータ処理装置９（ＧＰＣ−８０２０ＩＩ）で構成した（かっこ付きはいずれも東ソー（株）製）。分析カラム５としては、東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ−Ｏｌｉｇｏ−ＰＷ（７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ×２）を使用し、ポリエチレングリコール（富士フイルム和光純薬（株）製）の分離を行った。その他の条件は下記の通りである。
データ収集サンプリングピッチ：２００ｍｓ
注入量                      ：５０μＬ
カラム温度                  ：４０℃
溶離液                      ：２００ｍＭ  ＮａＮＯ３  ＋２０％アセトニトリル
なお、ポリエチレングリコールは表１の比率で２種類を混合して評価試料とした。
ポリエチレングリコール  ２００（ＰＥＧ２００）１７ｍｇ／ｍＬ
ポリエチレングリコール  ３００（ＰＥＧ３００）１７ｍｇ／ｍＬ
【００２８】
【表１】
2019211386.tif 000003
【００２９】
流速に関しては、測定結果を意図的に変動させるため、１．０００、１．００５、１．０１０ｍＬ／ｍｉｎでそれぞれ２回ずつ測定を実施した。
【００３０】
【表２】
2019211386.tif 000004
【００３１】
（実施例１）
本実施例は、類似度の計算区間を１つ、Ｓａｍｐｌｅ＿Ｄを流速１．０００ｍＬ／ｍｉｎ（＃７）で測定して得られたクロマトグラムを標準試料のクロマトグラムとした。「溶媒由来のピーク」を内部標準成分とし、溶出時間（Ｔｓ）は２０．２２０分であった。類似度計算を行う区間は１３．０〜１９．６分とし、ドリフトの除去を行った。
【００３２】
その他のクロマトグラムについて、１３．０〜１９．６分のドリフトを除去し、内部標準成分の溶出時間（Ｔｕ）から補正係数（Ｆｔ）を算出し、時間軸の補正を行った後、時間データ間隔が２００ｍｓになるように補間処理を行った。
【００３３】
次に、標準試料のクロマトグラムと各クロマトグラムとの類似度を式１に基づいて算出した。結果を図６、図７（図中破線は標準試料クロマトグラム、実線は選択されたクロマトグラムを表す）に示す。流速が僅かに異なっていても、分子量分布が同一であるＳａｍｐｌｅ＿Ｄのクロマトグラムは類似度が高く、判別することができた。
【００３４】
比較のため、全く補正を行っていない生のクロマトグラムで比較した結果を図８に示す。＃８以外のクロマトグラムでは高分子成分の溶出位置が全く異なり、目視では類似性が高いものと判断することはできない。
【００３５】
（実施例２）
本実施例では、複数の計算区間による類似度計算を行った例を示す。類似度計算する工程以外は、全て実施例１と同じである。類似度の計算区間は、下記のように３つの領域に分けて計算を行った。
前半区間：１３．００〜１４．５０分
中盤区間：１４．５０〜１７．５０分
後半区間：１７．５０〜１９．５７分
分子排除クロマトグラフィでは分子量の高い成分が早く溶出するため、前半区間は分子量が高い画分、後半区間は分子量が低い画分、中盤区間は平均的な分子量の画分ということになる。図９は、実施例１で求めた全領域での類似度と各計算区間での類似度を示した図である。３区間の平均を取った値は、１つの区間で計算した類似度（実施例１）と同じ順位であることが分かった。
【００３６】
（実施例３）
本実施例ではクロマトグラムの積分曲線を基にした類似度計算の実証を行った。なお、実施例１で取得した、時間補正およびドリフト除去後のクロマトグラムを基に積分曲線を取得する操作を実施した。また、試料による積分曲線の違いを目視でも分かり易いように、最大値を１００にする規格化を実施した。
【００３７】
図１０にクロマトグラムとそれに対応する積分曲線の一例および計算区間を示す。本実施例では、高分子成分の高分子領域が溶出する１３．０〜１６．５分、低分子領域が溶出する１６．５〜１９．５分の２区間で計算した。なお、基準となる積分曲線は実施例１と同様に＃７とした。
【００３８】
２区間で類似度を計算し、その平均値を最終的な類似度とした。結果を図１１に示す。積分曲線を基に類似度計算（２区間）を行っても、１つの区間で計算した類似度（実施例１）と同じ順位であることが分かった。
【符号の説明】
【００３９】
１．溶離液
２．脱気装置
３．送液ポンプ（サンプル側）
４．試料注入バルブ
５．分析カラム
６．カラム恒温槽
７．抵抗管
８．廃液
９．システム制御及びデータ処理装置
１０．示差屈折計
１１．送液ポンプ（リファレンス側）
【図１】
2019211386.tif 000006
【図２】
2019211386.tif 000007
【図３】
2019211386.tif 000008
【図４】
2019211386.tif 000009
【図５】
2019211386.tif 000010
【図６】
2019211386.tif 000011
【図７】
2019211386.tif 000012
【図８】
2019211386.tif 000013
【図９】
2019211386.tif 000014
【図１０】
2019211386.tif 000015
【図１１】
2019211386.tif 000016