(57)【要約】【課題】本願は、グリソンスコア（Ｇｌｅａｓｏｎ Ｓｃｏｒｅ：ＧＳ）の新たな鑑別方法、並びに、該方法に使用するための試薬およびキットを提供することを目的とする。【解決手段】本発明者らは、前立腺がん領域におけるｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）遺伝子またはｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）遺伝子の単位面積あたりの発現量を指標にして、ＧＳを鑑別できることを見出した。この知見に基づき、本願は、前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本について、前立腺がん領域におけるＫＩＦ２５およびＮＯＬ４から選択される遺伝子の単位面積あたりの発現量を指標にして、ＧＳを鑑別する方法、並びに、該方法に使用するための試薬およびキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法であって、該被検標本の前立腺がん領域において、ｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）およびｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）から選択される遺伝子の単位面積あたりの発現量を指標にして、グリソンスコアを鑑別する方法。
【請求項２】
前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法であって、
（１）該被検標本の前立腺がん領域において、ｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）およびｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）から選択される遺伝子の単位面積あたりの発現量を測定する工程、および
（２）測定値を予め設定されたカットオフ値と比較する工程、
を含み、
該被検標本の前立腺がん領域の少なくとも一部において、測定値が該カットオフ値以上の場合、該被検標本におけるグリソンスコアは特定のスコア以上の可能性があると判定され、
該被検標本の前立腺がん領域の全体にわたって、測定値が該カットオフ値未満の場合、該被検標本におけるグリソンスコアは該特定のスコアより１つ下のスコア以下の可能性があると判定される方法。
【請求項３】
前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法であって、
（１）該被検標本において、ｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）およびｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）から選択される遺伝子の発現産物を標識する工程、
（２）該被検標本の前立腺がん領域において、単位面積あたりの標識由来のシグナル数、単位面積あたりの標識由来のシグナルを有する陽性がん細胞数、または、単位面積あたりの標識由来のシグナルを有する陽性がん細胞率を測定する工程、および
（３）測定値を予め設定されたカットオフ値と比較する工程、
を含み、
該被検標本の前立腺がん領域の少なくとも一部において、測定値が該カットオフ値以上の場合、該被検標本におけるグリソンスコアは特定のスコア以上の可能性があると判定され、
該被検標本の前立腺がん領域の全体にわたって、測定値が該カットオフ値未満の場合、該被検標本におけるグリソンスコアは該特定のスコアより１つ下のスコア以下の可能性があると判定される方法。
【請求項４】
該特定のスコアがスコア７であり、該特定のスコアより１つ下のスコアがスコア６である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法であって、
（１）該被検標本において、ｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）およびｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）から選択される遺伝子の発現産物を標識する工程、
（２）該被検標本の前立腺がん領域において、単位面積あたりの標識由来のシグナル数を測定する工程、および
（３）測定値をカットオフ値である４．０×１０個／ｍｍ２と比較する工程、
を含み、
該被検標本の前立腺がん領域の少なくとも一部において、測定値が該カットオフ値以上の場合、該被検標本におけるグリソンスコアはスコア７以上の可能性があると判定され、
該被検標本の前立腺がん領域の全体にわたって、測定値が該カットオフ値未満の場合、該被検標本におけるグリソンスコアはスコア６以下の可能性があると判定される方法。
【請求項６】
ｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）遺伝子の発現産物に結合する分子、または、ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）遺伝子の発現産物に結合する分子を含む、前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法に使用するための試薬。
【請求項７】
遺伝子の発現産物に結合する分子が、ＲＮＡに結合する核酸プローブである、請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
遺伝子の発現産物に結合する分子が、タンパク質に結合する抗体である、請求項６に記載の試薬。
【請求項９】
ｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）遺伝子の発現産物に結合する分子、または、ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）遺伝子の発現産物に結合する分子を含む、前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法に使用するためのキット。
【請求項１０】
遺伝子の発現産物に結合する分子が、ＲＮＡに結合する核酸プローブである、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
遺伝子の発現産物に結合する分子が、タンパク質に結合する抗体である、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、ＮＣＣＮ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ） 腫瘍学臨床診療ガイドラインおよびＤ’Ａｍｉｃｏ分類において規定されている前立腺がんのリスク分類に関与する主要評価項目グリソンスコア（Ｇｌｅａｓｏｎ Ｓｃｏｒｅ：ＧＳ）の鑑別方法に関連する。
【０００２】
とりわけ、本願は、前立腺がん診断のスクリーニングの一環として取り入れられている病理検査において、特定マーカー分子を可視化して検出することにより、前立腺がん患者の前立腺針生検組織または手術検体におけるＧＳの鑑別方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
前立腺がんは、世界的に罹患者数および死亡者数の増加傾向にある疾患である。日本においてもその傾向は認められており、国立がん研究センターによる２０１６年度のがん罹患数予測では、男性の全がん部位を対象とした罹患数で１位となっている（９２，６００人）[非特許文献１]。２０年前の日本における前立腺がん罹患者数は２万人未満であったが、近年の生活スタイルの欧米化に伴う罹患率の上昇および診断技術の向上に伴う発見率の上昇も重なり、急激に患者数が増加している。
【０００４】
前立腺がんにおいては、再発の可能性や生命予後（期待余命）などを推測評価するためにリスク分類が考案されており、それに基づき治療方針が決定されるが、過剰診療により、本来は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）監視療法で済ませておくべきケースにもかかわらず加療してしまい、患者のＱＯＬ （Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ） 低下を招くケースも散見されている。そのため、主要評価項目に関わる診断手法の確度を高めることが求められている。主要評価項目のなかでも、治療方針の判断に直結するがんの悪性度判断、すなわち前立腺がん診療ガイドラインにも明記されているＧＳの鑑別は重要である [非特許文献２]。
【０００５】
詳しい手順として、前立腺がんの診断スクリーニング手法としては、ＰＳＡ値の検査、直腸指診、経直腸的超音波検査などがあり、これらを経てがんの疑いが強い場合に前立腺針生検標本での病理診断が実施され、診断が確定される。その後、骨シンチグラフィーやＭＲＩ、ＣＴといった画像検査にて病期診断（ＴＮＭ分類）がなされ、それらの情報を元にリスク分類への層別化がなされ、前立腺がんの治療方針が決定される。そして、前立腺がんの治療方針は、ＮＣＣＮ腫瘍学臨床診療ガイドラインもしくはＤ’Ａｍｉｃｏの分類などに基づくリスク分類に基づき決定される [非特許文献３, ４]。リスク分類に用いられる主要評価項目は、ＰＳＡ量、ＧＳ、ＴＮＭ分類、であり、ＮＣＣＮガイドラインとＤ’Ａｍｉｃｏ分類に大きな差は無いと言っても良い。これらの主要診断項目により、前立腺がん患者は、超低リスク、低リスク、中間リスク、高リスク、超高リスク、転移性がんといったリスク分類がなされ、リスクに応じた治療方針が決定される。しかしながら、ＰＳＡ値は、カットオフ値に用いられることの多い４ｎｇ／ｍＬ前後の低値での正診効率が低い [非特許文献５]。陽性判定となる４〜１０ｎｇ／ｍＬの数値が得られたとしても実際にがんである確率は２０−３０％程度であり、グレーゾーンと言われ問題視されている。また、陽性判定域を大幅に超える２０ｎｇ／ｍＬの値が検出されたとしても、実際にがんが検出される確率は５０％未満であることから、低値のＰＳＡ判定陽性結果の信頼性が低いことは周知の事実となっている。このようなＰＳＡ検査における偽陽性判定が患者の不安を増長し、臨床症状からは本来不要と考えられる診療を開始してしまうことで、結果として患者のＱＯＬ低下につながることも少なくない。Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｔａｓｋ ＦｏｒｃｅはＰＳＡのルチン検査に対し反対勧告を提示している[非特許文献６]。そのようなこともあり、ＰＳＡ値によるスクリーニングを経た、ＧＳ鑑別や画像診断、さらに、これらに基づくＴＮＭ分類は重要となるが、ＴＮＭ分類の信頼性が十分とは言えない部分がある。
【０００６】
主要診断項目のうち、ＧＳの鑑別は、前立腺針生検組織や手術検体を用いて実施され、専門の病理医による判定に基づき確定される。ＧＳは優勢病変と随伴病変を判定し、その数値の合計で２〜１０の９段階に分類される。例えば、がん組織の優先病変がパターン（グリソングレード）４で、随伴病変がグリソングレード３の場合のＧＳは、これら優先病変と随伴病変のグリソングレードを足して、ＧＳ＝７（４＋３）というように表記される。
【０００７】
リスク分類において、ＧＳ６は低リスク、ＧＳ７は中間リスクに対応する。そのため、ＧＳ６とＧＳ７の鑑別は低リスクと中間リスクの分類にも直結し、患者のＱＯＬに関係する治療方法の決定に大きな影響を有するため、より重要度が高い。しかしながら、ＧＳの鑑別はＨＥ染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ染色）標本を用いての病理医による顕微鏡下等での目視観察によるため、個々の病理医の経験と能力に依存する傾向にある。したがって、病理医の判定は定量的でなく、画一性に欠ける。また、そもそも、ＨＥ染色標本下のＧＳ６とＧＳ７の鑑別は組織学上非常に困難であることから、ｄｉｇｉｔａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙのような定量・判定手法の開発が待ち望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】国立がん研究センター  2016年のがん統計予測公開（http://ganjoho.jp/reg_stat/statistics/stat/short_pred.html）
【非特許文献２】Minds（マインズ）ガイドラインセンター  前立腺がん診療ガイドライン2012年度版（http://minds.jcqhc.or.jp/n/med/4/med0032/G0000435/0002）
【非特許文献３】D’Amico AV: Biochemical outcome after radical prostatectomy, external beam radiation therapy, or interstitial radiation therapy for clinically localized prostate cancer. JAMA 280: 969-974, 1998.
【非特許文献４】NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines（登録商標）（https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/f_guidelines.asp）
【非特許文献５】Haas GP, Monyie JE and Pontes JE: The state of prostate cancer screening in the United States. Eur Urol 23: 337−47, 1993.
【非特許文献６】Moyer VA: Screening for prostate cancer: U.S. Preventive Services Task Force recommendation statement. Ann Intern Med 157: 120-134, 2012.
【非特許文献７】Atsunori O, Shigeto K, Tomoko F, Kenzo I,  Kohsuke S: Tissue microarrayを用いた癌の研究 Cytometry Research 17(2) : 5-9, 2007
【非特許文献８】Humphrey PA: Diagnosis of adenocarcinoma in prostate needle biopsy tissue. J Clin Pathol. 2007 Jan;60(1):35-42.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本願は、ＧＳの新たな鑑別方法、並びに、該方法に使用するための試薬およびキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前立腺がん領域におけるｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）遺伝子産物またはｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）遺伝子産物の単位面積あたりの発現量を指標にして、ＧＳを鑑別できることを見出した。この知見に基づき、本願は、前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本について、前立腺がん領域におけるＫＩＦ２５およびＮＯＬ４から選択される遺伝子の単位面積あたりの発現量を指標にして、ＧＳを鑑別する方法、並びに、該方法に使用するための試薬およびキットを提供する。
【００１１】
すなわち、本願は、以下を提供する。
〔１〕
前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法であって、該被検標本の前立腺がん領域において、ｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）およびｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）から選択される遺伝子の単位面積あたりの発現量を指標にして、グリソンスコアを鑑別する方法。
〔２〕
前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法であって、
（１）該被検標本の前立腺がん領域において、ｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）およびｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）から選択される遺伝子の単位面積あたりの発現量を測定する工程、および
（２）測定値を予め設定されたカットオフ値と比較する工程、
を含み、
該被検標本の前立腺がん領域の少なくとも一部において、測定値が該カットオフ値以上の場合、該被検標本におけるグリソンスコアは特定のスコア以上の可能性があると判定され、
該被検標本の前立腺がん領域の全体にわたって、測定値が該カットオフ値未満の場合、該被検標本におけるグリソンスコアは該特定のスコアより１つ下のスコア以下の可能性があると判定される方法。
〔３〕
前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法であって、
（１）該被検標本において、ｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）およびｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）から選択される遺伝子の発現産物を標識する工程、
（２）該被検標本の前立腺がん領域において、単位面積あたりの標識由来のシグナル数、単位面積あたりの標識由来のシグナルを有する陽性がん細胞数、または、単位面積あたりの標識由来のシグナルを有する陽性がん細胞率を測定する工程、および
（３）測定値を予め設定されたカットオフ値と比較する工程、
を含み、
該被検標本の前立腺がん領域の少なくとも一部において、測定値が該カットオフ値以上の場合、該被検標本におけるグリソンスコアは特定のスコア以上の可能性があると判定され、
該被検標本の前立腺がん領域の全体にわたって、測定値が該カットオフ値未満の場合、該被検標本におけるグリソンスコアは該特定のスコアより１つ下のスコア以下の可能性があると判定される方法。
〔４〕
該特定のスコアがスコア７であり、該特定のスコアより１つ下のスコアがスコア６である、〔２〕または〔３〕に記載の方法。
〔５〕
前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法であって、
（１）該被検標本において、ｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）およびｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）から選択される遺伝子の発現産物を標識する工程、
（２）該被検標本の前立腺がん領域において、単位面積あたりの標識由来のシグナル数を測定する工程、および
（３）測定値をカットオフ値である４．０×１０個／ｍｍ２と比較する工程、
を含み、
該被検標本の前立腺がん領域の少なくとも一部において、測定値が該カットオフ値以上の場合、該被検標本におけるグリソンスコアはスコア７以上の可能性があると判定され、
該被検標本の前立腺がん領域の全体にわたって、測定値が該カットオフ値未満の場合、該被検標本におけるグリソンスコアはスコア６以下の可能性があると判定される方法。
〔６〕
ｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）遺伝子の発現産物に結合する分子、または、ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）遺伝子の発現産物に結合する分子を含む、前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法に使用するための試薬。
〔７〕
遺伝子の発現産物に結合する分子が、ＲＮＡに結合する核酸プローブである、〔６〕に記載の試薬。
〔８〕
遺伝子の発現産物に結合する分子が、タンパク質に結合する抗体である、〔６〕に記載の試薬。
〔９〕
ｋｉｎｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２５（ＫＩＦ２５）遺伝子の発現産物に結合する分子、または、ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＮＯＬ４）遺伝子の発現産物に結合する分子を含む、前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法に使用するためのキット。
〔１０〕
遺伝子の発現産物に結合する分子が、ＲＮＡに結合する核酸プローブである、〔９〕に記載のキット。
〔１１〕
遺伝子の発現産物に結合する分子が、タンパク質に結合する抗体である、〔９〕に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ａは、実施例４で述べる組織マイクロアレイ（ＴＭＡ, ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）に用いたスライド（製品コード：ＨＰｒｏＡ０６０ＰＧ０１）における正常組織、隣接正常組織、がん領域の分布を示す。Ｂは、実施例４で述べるＴＭＡに用いたスライド（製品コード：ＨＰｒｏＡ０６０ＰＧ０１）におけるがん領域のＧＳ分布を示す。
【図２】Ａは、実施例４で述べるＴＭＡに用いたスライド（製品コード：ＨＰｒｏＡ１００ＰＧ０１）における正常組織、隣接正常組織、がん領域の分布を示す。Ｂは、実施例４で述べるＴＭＡに用いたスライド（製品コード：ＨＰｒｏＡ１００ＰＧ０１）におけるがん領域のＧＳ分布を示す。
【図３】ＴＭＡに用いたスライド中のコア（円形状組織切片）を総合倍率４０倍相当で拡大した視野を示す（Ｋｅｙｅｎｃｅ社のＢＺ−９０００顕微鏡システムを使用して撮影した）。
【図４Ａ】実施例７で述べるがん領域におけるＧＳの分布とＫＩＦ２５の陽陰性判定の関係を示す。
【図４Ｂ】実施例７で述べるがん領域におけるＧＳの分布とＮＯＬ４の陽陰性判定の関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、病理組織検査にＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＲＮＡ−ＩＳＨ）を組み込むことで、前立腺がんのＧＳを鑑別するための新たな方法を確立することを目指した。そして、ＲＮＡ−ＩＳＨの一例として、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社の開発したＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）を採用することで、従来技術では見出すことのできなかった事象について、組織標本中におけるＲＮＡの発現量を指標に解析を進めた。
【００１４】
標的としてＲＮＡを選択した理由は、標的となるｍＲＮＡ配列が同定できれば、ＲＮＡ−ＩＳＨにより、配列依存的に当該ｍＲＮＡを検出することが可能となるためである。さらに、標的となるｍＲＮＡ配列さえ同定できれば、ｍＲＮＡ配列情報に対応する翻訳産物であるタンパク質が同定できるので、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）や免疫蛍光染色（ＩＦ）といった手法等により、当該タンパク質を検出することが可能となる。
【００１５】
また本発明者らは、前立腺がんの確定診断やリスク分類に使用される前立腺針生検組織または手術検体についてＧＳを鑑別することに焦点を当てた鑑別方法の開発、特にはＧＳ６以下とＧＳ７以上を明確に鑑別することに焦点を当てた鑑別方法の開発を試みた。
【００１６】
前立腺がんで発現上昇するマーカー探索を進めることを目的に、前立腺がん細胞株であるＰＣ３細胞を含む合計４つの株化がん細胞に対し、がんの微小環境である低酸素下での培養を実施した後、ＲＮＡの発現プロファイリングをマイクロアレイにて取得し、低酸素誘導時に発現が上昇するＲＮＡを特定した。さらに、マイクロアレイの結果の妥当性をＲＴ−ｑＰＣＲで確認後、ヒト前立腺がん組織におけるＲＮＡの発現パターンを確認するために、前立腺がん組織を一枚のスライドに多数搭載したＴＭＡを用いて見出した鑑別マーカー候補のＲＮＡの発現パターン解析をＲＮＡ−ＩＳＨにて実施した。その結果、２６種類のＲＮＡが前立腺がん組織において高発現していることが確認された。加えて、株化がん細胞のマイクロアレイとＴＭＡについてＲＮＡｓｃｏｐｅを用いたＲＮＡ−ＩＳＨを実施することにより、ＧＳ鑑別マーカーとして、ＫＩＦ２５とＮＯＬ４を見出した。ＧＳが前立腺がん内部の微小環境の低酸素化と関連するという知見は存在しないため、低酸素誘導時に発現が上昇するＲＮＡからＧＳ鑑別マーカーが見出されたことは、驚くべきことであった。
【００１７】
ＲＮＡＳｃｏｐｅによるＫＩＦ２５またはＮＯＬ４のＲＮＡの染色の陽陰性とＴＭＡのＨＥ染色に基づくＧＳ６以下／ＧＳ７以上の鑑別との関係を検討したところ、前立腺がん領域におけるＫＩＦ２５またはＮＯＬ４のＲＮＡの単位面積あたりの発現量、具体的には、ＲＮＡに付した標識由来のシグナル数（ドット数）の面密度が４．０×１０個／ｍｍ２のとき、ＲＮＡＳｃｏｐｅによるＲＮＡ染色の陽陰性とＧＳ６以下／ＧＳ７以上の鑑別との間の一致率が７５％以上となった。そのため、ＫＩＦ２５またはＮＯＬ４の単位面積あたりの発現量を指標とする方法は、従来法のＧＳ鑑別と異なり、具体的な数値指標による客観的な鑑別が可能な方法であり、ＧＳ鑑別との一致率が７５％以上となるシグナル数（ドット数）の面密度４．０×１０個／ｍｍ２は、ＧＳ鑑別の数値指標として十分に機能するといえる。
【００１８】
これにより、ＫＩＦ２５またはＮＯＬ４の単位面積あたりの発現量を指標とすることで、ＧＳ６以下とＧＳ７以上の鑑別を具体的な数値指標をもとに行うことが可能となった。
【００１９】
ＫＩＦ２５やＮＯＬ４は、塩基配列だけでなく、アミノ酸配列も、公共データベースに登録されているため、ＲＮＡ−ＩＳＨだけにとどまらず、ＩＨＣやＩＦといった手法も利用することができる。そのため、様々なプラットフォームを経由して本願のＧＳ鑑別方法を臨床応用することが可能である。
【００２０】
また、コンピューターを用いて、前立腺がん組織におけるＫＩＦ２５やＮＯＬ４の発現パターンを画像解析することで、ＧＳ６以下とＧＳ７以上との鑑別をすることも可能である。
【００２１】
さらに、特定のＧＳに関連するＫＩＦ２５またはＮＯＬ４の単位面積あたりの発現量を指標とすることで、特定のスコアより１つ下のスコア以下と該特定のスコア以上との鑑別も可能である。
【００２２】
このような知見および考察等に基づき、本願は、前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてＧＳを鑑別する方法であって、該被検標本の前立腺がん領域において、ＫＩＦ２５およびＮＯＬ４から選択される遺伝子の単位面積あたりの発現量を指標にして、ＧＳを鑑別する方法を提供する。
【００２３】
ＧＳは、前立腺がんの悪性度の指標であり、優勢病変のパターン（１から５）と随伴病変のパターン（１から５）の合計で２（１＋１＝２）から１０（５＋５＝１０）の９段階に分類される。ＧＳ６以下は低リスク、ＧＳ７は中間リスク、ＧＳ８以上は高リスクの前立腺がんに対応する。本願の方法は、このようなＧＳの鑑別に使用できる。
【００２４】
本願の方法の1つの態様は以下のとおりである。
前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてＧＳを鑑別する方法であって、
（１）該被検標本の前立腺がん領域において、ＫＩＦ２５およびＮＯＬ４から選択される遺伝子の単位面積あたりの発現量を測定する工程、および
（２）測定値を予め設定されたカットオフ値と比較する工程、
を含み、
該被検標本の前立腺がん領域の少なくとも一部において、測定値が該カットオフ値以上の場合、該被検標本におけるＧＳは特定のスコア以上の可能性があると判定され、
該被検標本の前立腺がん領域の全体にわたって、測定値が該カットオフ値未満の場合、該被検標本におけるＧＳは該特定のスコアより１つ下のスコア以下の可能性があると判定される方法。
【００２５】
上記「前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本」とは、前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された切片標本を意味する。当該切片標本は、常法により作製することができる（病理技術研究会/編：「病理標本の作り方」， ｐｐ１９−３７, 文光堂,（１９９２）。特に、組織マイクロアレイスライドの作製は、小賀らの知見に基づく［非特許文献７］。
【００２６】
組織マイクロアレイスライドの作製法としては、例えば、パラフィンのブロックに円柱状の案内孔を整列して開け、対象から単離された前立腺がん組織を含む前立腺組織（例えば、前立腺針生検組織の円柱状組織片または手術検体を円柱状の針で切り出した円柱状組織片）をパラフィンのブロックの案内孔に挿入する。そうすると、円柱組織片が整列したアレイを有するパラフィンブロックが作製できるので、これを薄切し、スライドグラスに貼付することにより、標本を作製することができる。さらに、これをＨＥ染色処理することによって組織の構造を明らかにすることができる。ただし、本願方法は、マイクロアレイスライド上の円形組織のみに限定して適用されるものではない。また、ＨＥ染色処理された標本において、コア中の腺管の分布の不規則化、腺管を覆う基底細胞の消失（単層化）、または、核や核小体の腫大を観察することにより、前立腺がん領域を含有するコアの存否および領域の同定を行うことができる[非特許文献８]。
【００２７】
本願の方法では、該方法の実施者とは異なる者が作製した対象由来の切片標本を分析することもできるし、該方法の実施者自らが作製した対象由来の切片標本を分析することもできる。本願において、「対象」という用語は、「患者」、「個体」および「動物」と互換的に用いられる。
【００２８】
遺伝子の単位面積あたりの発現量の測定は、当業者に周知の方法によって行うことができる。例えば、遺伝子の発現産物を標識化した後、標識由来のシグナルを指標に、遺伝子の単位面積あたりの発現量を測定することができる。よって、上記（１）および（２）の工程は、例えば、以下の工程によって実施できる：
（ａ）該被検標本において、ＫＩＦ２５およびＮＯＬ４から選択される遺伝子の発現産物を標識する工程、
（ｂ）該被検標本の前立腺がん領域において、単位面積あたりの標識由来のシグナル数を測定する工程、および
（ｃ）測定値を予め設定されたカットオフ値と比較する工程。
ここで、「単位面積あたりの標識由来のシグナル数」という用語は、「標識由来のシグナル数の面密度」という用語と互換的に用いられる。単位面積は、常法により、算出することができる。例えば、対物ミクロメータまたは接眼ミクロメータを用いて視野中の距離を決定して算出することも可能であり、画像として処理し処理ソフトウェア（例えば、Ｋｅｙｅｎｃｅ社のＢＺ−９０００顕微鏡システム）により、スケールバーを挿入して視野中の距離を決定して算出することも可能である。
【００２９】
また本願では、単位面積あたりの標識由来のシグナル数の代わりに、単位面積あたりの標識由来のシグナルを有する陽性がん細胞数、または、単位面積あたりの標識由来のシグナルを有する陽性がん細胞率を測定することもできる。ここで、「単位面積あたりの標識由来のシグナルを有する陽性がん細胞率」とは、単位面積あたりの全細胞数に対する標識由来のシグナルを有する陽性がん細胞数の割合、または、単位面積あたりの全がん細胞数に対する標識由来のシグナルを有する陽性がん細胞数の割合を意味する。
【００３０】
本願において、遺伝子の発現産物には、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡ）またはタンパク質が含まれる。また本願において、遺伝子の発現産物に結合する分子には、標的ＲＮＡに結合するポリヌクレオチドである核酸プローブ、または、標的タンパク質に結合する抗体が含まれる。
【００３１】
ＫＩＦ２５遺伝子およびＮＯＬ４遺伝子の発現産物は当業者にとって周知である。例えば、ヒトＫＩＦ２５遺伝子の発現産物として、配列番号：１からなる塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション登録番号ＮＭ_０３０６１５、バージョン番号ＮＭ_０３０６１５．２）におけるチミンがウラシルである塩基配列を含むｍＲＮＡ、または、当該塩基配列によってコードされる配列番号：３からなるアミノ酸配列を含むタンパク質が知られている。また、例えば、ヒトＮＯＬ４遺伝子の発現産物として、配列番号：２からなる塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション登録番号ＮＭ_００３７８７、バージョン番号ＮＭ_００３７８７．４）におけるチミンがウラシルである塩基配列を含むｍＲＮＡ、または、当該塩基配列によってコードされる配列番号：４からなるアミノ酸配列を含むタンパク質が知られている。
【００３２】
遺伝子の発現産物を標識する方法は、当業者にとって周知である。例えば、遺伝子の発現産物に結合する分子であって標識化された分子を該発現産物に結合させることで、該発現産物を間接的に標識することができる。また例えば、遺伝子の発現産物に結合する分子（１次分子）および当該１次分子に結合する分子（２次分子）のような、１次分子からＮ次分子（Ｎは、２以上の整数であって、例えば、２、３、４）を使用することで、該発現産物を間接的に標識することができる。この場合、Ｎ次分子が標識化されている必要がある。ここで、Ｎ次分子とは、Ｎ−１次分子に結合する分子を意味する。
【００３３】
１次分子からＮ次分子は、標的に対して結合特異性を有する。ただし、その特異性は、多種類の標的に対する特異性であることも許容される。例えば、１次分子からＮ次分子は、ある標的に対して結合特異性を有する領域だけでなく、別の標的に対して結合特異性を有する領域も有する分子であることも許容される。
【００３４】
分子の標識化は、該分子に対して当業者に周知の標識物質を結合させることで行うことができる。標識物質は、特に制限はない。例えば、蛍光標識としては、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ, Ａｌｅｘａ （Ａｌｅｘａ４８８等）、 Ａｔｔｏ（Ａｔｔｏ５５０等）、 ＦＩＴＣ、 Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ, Ｃｙａｎｉｎｅ ３、 またはＣｙａｎｉｎｅ ５などがあげられ、酵素標識としては、ＨＲＰ （ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）または ＡＬＰ／ＡＰ （Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）などが挙げられ、その他の標識物としてＤＩＧ （Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）, Ｂｉｏｔｉｎ, Ａｖｉｄｉｎ, Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎなどが挙げられ、これら蛍光標識、酵素標識、その他の標識の中から任意に選択して単独で、または、複合体を作製し、標識として用いることもできる。
【００３５】
標識由来のシグナルおよび標識由来のシグナルを有する陽性がん細胞は、例えば、顕微鏡を用いて観察することができる。当業者は顕微鏡観察における各種条件を適宜選択することができる。条件として、例えば、２０−２２の視野数、４０倍から２００倍の総合倍率（接眼レンズの倍率と対物レンズの倍率の組み合わせは任意）、デジタルカメラ付き顕微鏡にあっては４０倍から２００倍の総合倍率に相当する倍率設定の条件が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本願の方法では、被検標本の前立腺がん領域の少なくとも一部に関して、少なくとも１回の測定によって、測定値を得ることができる。得られた測定値は予め設定されたカットオフ値と比較される。測定値とカットオフ値は、同じ単位で比較される。例えば、測定値の単位が、単位面積あたりの標識由来のシグナル数である場合、カットオフ値の単位も、単位面積あたりの標識由来のシグナル数である。
【００３７】
本願におけるカットオフ値は、ＧＳが特定のスコア以上であるか否かを区別できる値である。カットオフ値は、次のようにして設定することができる。ＧＳが特定のスコアの標本およびそれ以上のスコアの標本、並びに、ＧＳが該特定のスコアより１つ下のスコアの標本およびそれ以下のスコアの標本を複数準備する。それら複数の標本について、前立腺がん領域におけるＫＩＦ２５遺伝子またはＮＯＬ４遺伝子の単位面積あたりの発現量を測定する。発現量がある値（以下Ａと称する）以上かつＧＳが特定のスコア以上である標本数、および、発現量がＡ未満かつＧＳが該特定のスコアより1つ下のスコア以下である標本数の合計を総標本数で除した値、すなわち検査一致率が７５％以上（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または、１００％）となる、発現量の値Ａをカットオフ値とする。カットオフ値の算出においては、発現量がＡ以上を陽性、発現量がＡ未満を陰性と言い換えることもできる。
【００３８】
さらに、カットオフ値は、次のようにして設定することもできる。例えば、上述の複数の標本について、前立腺がん領域におけるＫＩＦ２５またはＮＯＬ４のＲＮＡに標識を付して、標識由来のシグナルの密度（染色密度）を、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＡＣＤ）社のスコアリングガイダンス（ｈｔｔｐｓ：／／ａｃｄｂｉｏ.ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ−ｓｕｐｐｏｒｔ／ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に基づきスコア化する。ＡＣＤ社のスコアリングガイダンスに基づくスコアが、あるスコア（以下スコアＸと称する）以上かつＧＳが特定のスコア以上である標本数、および、スコアＸ未満かつＧＳが該特定のスコアより1つ下のスコア以下である標本数の合計を総標本数で除した値、すなわち検査一致率が７５％以上（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または、１００％）となる場合における、スコアＸに対応する標識由来のシグナル数（ドット数）の面密度を算出し、算出された面密度の値をカットオフ値とする。カットオフ値の算出においては、ＡＣＤ社のスコアリングガイダンスに基づくスコアＸ以上を陽性、スコアＸ未満を陰性と言い換えることもできる。スコアＸとしては、例えばスコア１を採用することができる。
【００３９】
本願において、測定工程および比較工程は、人手によって行うことができるだけでなく、コンピューターを用いた画像解析によっても行うことができることは当業者には明らかである。カメラ付きデジタル顕微鏡（例えば、Ｋｅｙｅｎｃｅ社  ＢＺ−９０００顕微鏡システム）を用いて、面積計測機能およびセルカウント機能を使用することにより、単位面積あたりの標識由来のシグナル数を算出し、カットオフ値と比較することができる。
【００４０】
本願の方法では、被検標本の前立腺がん領域の少なくとも一部において、測定値がカットオフ値以上の場合、該被検標本におけるＧＳは特定のスコア以上の可能性があると判定される。一方、被検標本の前立腺がん領域の全体にわたって、測定値が該カットオフ値未満の場合、該被検標本におけるＧＳは該特定のスコアより１つ下のスコア以下の可能性があると判定される。このような被検標本のＧＳ鑑別結果は、該被検標本が由来する対象における前立腺がんを医師が診断や治療する際に役立つものである。例えば、医師は、被検標本のＧＳ鑑別結果に基づき、該被検標本が由来する対象における前立腺がんの状態を確定診断することができ、また、確定診断された対象に前立腺がん治療薬の治療的有効量を投与することによって対象を治療することができ、さらに、前立腺がん治療薬投与後に、本願方法を利用して、ＧＳをモニタリングすることで、治療が有効であったか否かを診断することができる。よって、本願の方法は、医師による対象の診断や治療に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。
【００４１】
本願の方法には、特定のスコアがスコア７であり、該特定のスコアより１つ下のスコアがスコア６である態様も含まれる。本願において、ＧＳ６以下とＧＳ７以上を鑑別する方法には、例えば以下の方法が含まれるが、これに限定されるものではない。
前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてＧＳを鑑別する方法であって、
（１）該被検標本において、ＫＩＦ２５およびＮＯＬ４から選択される遺伝子の発現産物を標識する工程、
（２）該被検標本の前立腺がん領域において、単位面積あたりの標識由来のシグナル数を測定する工程、および
（３）測定値をカットオフ値である４．０×１０個／ｍｍ２と比較する工程、
を含み、
該被検標本の前立腺がん領域の少なくとも一部において、測定値が該カットオフ値以上の場合、該被検標本におけるＧＳはスコア７以上の可能性があると判定され、
該被検標本の前立腺がん領域の全体にわたって、測定値が該カットオフ値未満の場合、該被検標本におけるＧＳはスコア６以下の可能性があると判定される方法。
【００４２】
ＧＳ６以下とＧＳ７以上とを鑑別することによって、被検標本におけるがんが、低リスクの前立腺がんであるか、または、中リスク以上の前立腺がんであるかを見分けることができる。このような被検標本における前立腺がんに関する判定結果は、該被検標本が由来する対象における前立腺がんの医師による診断に役立つため、医師は対象における前立腺がんのリスク分類に応じた治療方針を適切に策定することができる。例えば、被検標本のＧＳが６以下の可能性があると判定された場合、医師は、ＰＳＡ監視療法や経過観察の選択肢を患者に提示することができる。また、被検標本のＧＳが７以上の可能性があると判定された場合、医師は、該被検標本が由来する対象の治療法として、手術療法、放射線療法、ホルモン療法、化学療法、または、これらの併用を選択することができる。例えば医師は、前立腺がん治療薬の治療的有効量を投与することによって、対象を治療することができる。
【００４３】
本願では、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）法および免疫学的手法などの当業者に周知の方法を利用することができる。ＩＳＨ法としては、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）（ＵＳ７，７０９，１９８, ＵＳ ８，６０４，１８２, ＵＳ ８，９５１，７２６及び ＵＳ ８，６５８，３６１）等のＲＮＡ−ＩＳＨが例示できる。免疫学的手法としては、ＩＨＣおよびＩＦが例示できる。当業者であれば、通常のマニュアルに従って、これら方法を実施することができる。
【００４４】
本願は、ＫＩＦ２５遺伝子の発現産物に結合する分子、または、ＮＯＬ４遺伝子の発現産物に結合する分子を含む、前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法に使用するための試薬またはキットもまた提供する。当該方法としては、上述の方法が例示できる。ＫＩＦ２５遺伝子の発現産物に結合する分子を含む試薬またはキットは、ＮＯＬ４遺伝子の発現産物に結合する分子を含み得る。その逆も同じである。
【００４５】
ＫＩＦ２５遺伝子の発現産物に結合する分子、または、ＮＯＬ４遺伝子の発現産物に結合する分子に関する上記のような非医薬的用途は、種々の表現方法によって表現され得る。例えば、前立腺がん組織を含む前立腺組織から作製された被検標本についてグリソンスコアを鑑別する方法に使用するための試薬またはキットの製造におけるＫＩＦ２５遺伝子の発現産物に結合する分子、または、ＮＯＬ４遺伝子の発現産物に結合する分子の使用とも表現され得る。
【００４６】
上記遺伝子の発現産物に結合する分子としては、標的ＲＮＡに結合する核酸プローブ、または、標的タンパク質に結合する抗体が挙げられる。例えば、標的ＲＮＡに結合する核酸プローブは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）のようなＩＳＨ法等において使用され、標的タンパク質に結合する抗体は、ＩＨＣおよびＩＦのような免疫学的手法等において使用される。
【００４７】
上記遺伝子の発現産物に結合する分子、例えば核酸プローブや抗体は、当業者に周知の方法で製造することができる。実施者は、それらの製造を自ら行うこともできるし、他者に委託することもできる。また、市販の核酸プローブや抗体を購入して、本願の試薬やキットに供することもできる。
【００４８】
本願の標的タンパク質に結合する抗体は、当業者に周知な方法、例えば免疫学的手法、ファージディスプレイ法、ハイブリドーマ法等を利用して調製することができる。また本願の抗体は、標的抗原に結合する限り、特に制限はない。本願の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ）抗体、ヒト抗体、非ヒト動物抗体、全長抗体、低分子化抗体、抗体断片等が含まれる。
【００４９】
本願の標的ＲＮＡに結合する核酸プローブは、化学合成、生化学的切断／再結合等の当業者に周知な方法で調製することができる。また本願の核酸プローブは、標的ＲＮＡに結合する限り、特に制限はない。
【００５０】
ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）法を利用した方法に使用される試薬またはキットに含まれる、標的ＲＮＡに結合する核酸プローブは、ＺＺプローブと呼ばれる、２つの独立のＺ型プローブからなるプローブである。ＺＺプローブは、当業者にとって、周知である（ＵＳ７，７０９，１９８, ＵＳ ８，６０４，１８２, ＵＳ ８，９５１，７２６及び ＵＳ ８，６５８，３６１）。
【００５１】
ＺＺプローブにおける各Ｚ型プローブは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする領域およびＰｒｅＡｍｐｌｉｆｉｅｒ（ＰｒｅＡＭＰ）にハイブリダイズする領域を有する。より具体的には、各Ｚ型プローブは、標的ＲＮＡに相補的な１８−２５塩基の下部領域、スペーサー領域、ＰｒｅＡＭＰに相補的な１４塩基の上部領域（ｔａｉｌ領域）の３つのエレメントからなる。
【００５２】
ＺＺプローブにおける２つのＺ型プローブが、標的ＲＮＡにおける標的領域に連続的にハイブリダイズするように、各Ｚ型プローブの下部領域は設計される。つまり、ＺＺプローブにおける２つのＺ型プローブに由来する２つの下部領域が、標的ＲＮＡにおける標的領域に連続的にハイブリダイズする３６−５０塩基の結合領域を形成する。
【００５３】
また、ＺＺプローブにおける２つのＺ型プローブが、ＰｒｅＡＭＰに隣接してハイブリダイズするように、各Ｚ型プローブの上部領域は設計される。つまり、ＺＺプローブにおける２つのＺ型プローブに由来する２つの上部領域が、ＰｒｅＡＭＰに隣接してハイブリダイズする２８塩基の結合領域を形成する。
【００５４】
ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）法では、標的ＲＮＡの任意の標的領域にハイブリダイズする複数組のＺＺプローブを用いる。組数は、任意であり、約３組から約３０組、約１０組から約３０組、約２０組から約３０組等が例示できる。複数組のＺＺプローブにおいて、各ＺＺプローブは、それぞれ、標的領域上の異なる領域にハイブリダイズする。
【００５５】
例えば、ヒトＫＩＦ２５のＲＮＡを標的とする場合、配列番号：１の配列内のヌクレオチド２〜１４９４を標的領域とする３０組のＺＺプローブを使用することができ、また、ヒトＮＯＬ４のＲＮＡを標的とする場合、例えば、配列番号：２の配列内のヌクレオチド１８５１〜３８４９を標的領域とする３０組のＺＺプローブを使用することができるが、標的領域やＺＺプローブの組数は、これらに限定されるものではない。
【００５６】
ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）法を利用した方法に使用される試薬には、複数組（例えば約３組から約３０組）のＺＺプローブが含まれ得る。同様に、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）法を利用した方法に使用されるキットの1つの構成要素としての1つの容器には、複数組（例えば約３組から約３０組）のＺＺプローブが含まれ得る。さらに、該キットにおいて、以下に記載の少なくとも１つが追加の構成要素になり得る：
・ＺＺプローブおよびＡｍｐｌｉｆｉｅｒ（ＡＭＰ）にハイブリダイズするポリヌクレオチドであるＰｒｅＡＭＰ；
・ＰｒｅＡＭＰおよび標識プローブにハイブリダイズするポリヌクレオチドであるＡＭＰ；
・ＡＭＰにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって標識分子と結合しているポリヌクレオチドである標識プローブ；
・ＰＯＬＲ２ＡまたはＰＰＩＢのｍＲＮＡに結合するポジティブコントロールプローブ；
・ＤａｐＢのｍＲＮＡに結合するネガティブコントロールプローブ；および
・試薬（染色基質ＤＡＢやＦａｓｔ Ｒｅｄ）。
【００５７】
１組のＺＺプローブあたり１分子のＰｒｅＡＭＰが結合し、１分子のＰｒｅＡＭＰあたり複数分子（例えば２０分子）のＡＭＰが結合し、１分子のＡＭＰあたり複数分子（例えば２０分子）の標識プローブが結合できるように、ＺＺプローブ、ＰｒｅＡＭＰ、ＡＭＰ、および、標識プローブは設計される。
【００５８】
ＺＺプローブ、ＰｒｅＡＭＰ、ＡＭＰ、標識プローブ、ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、および、試薬（染色基質ＤＡＢやＦａｓｔ Ｒｅｄ）の製造は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＡＣＤ）社に委託することができる。
【００５９】
本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００６０】
本明細書に開示の主題の態様を説明するために、例示として以下の実施例を開示するが、本発明は、それらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
実施例１  株化がん細胞の低酸素誘導
複数の株化がん細胞（ＰＣ３，ＭＣＦ７，ＤＬＤ１，およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を１．０×１０５細胞／ｍｌになるように播種し、ＰＣ３とＤＬＤ１は１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）含有のＲＰＭＩ１６４０基本培地中で、ＭＣＦ７は１０％ＦＢＳ含有のＤ‘ＭＥＭ基本培地中で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は１０％ＦＢＳ含有のＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５培地中で、低酸素分圧下（１％酸素濃度）及び正常酸素分圧下（２０−２１％酸素濃度）で、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下で４８時間培養した。なお、ＰＣ３は前立腺癌細胞株であり、ＤＬＤ１大腸癌細胞株であり、ＭＣＦ７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は乳癌細胞株である。これら株化がん細胞は、いずれもＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｍａｎａｓｓａｓ, ＶＡ, ＵＳＡ）より購入した。
【００６２】
実施例２  低酸素誘導時に発現が上昇するＲＮＡのスクリーニング
実施例１で得られた各酸素分圧条件の各培養株化がん細胞について、ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（ＴａＫａＲａ）を用いて細胞を回収及び ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出を行った。次に、得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡについて、マイクロアレイを用いて網羅的なＲＮＡ発現パターンの解析を行った。この解析を行うにあたっては、アジレント社のＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ ＧＥ ８ｘ６０系 Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃａｔａｌｏｇ Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ０２８００４ 由来プローブを基本としながらオリジナルのプローブを追加設計し、カスタムアレイスライドを作製し、解析を進めた。基本的な解析プロトコルは、アジレント社のマニュアルに準拠し、実施した。
【００６３】
実験は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ（２重測定）で実施し、変動係数（ＣＶ）が２０％未満となる再現性のよいスポットデータを抽出して解析を進めた。微小環境にて発現上昇を認めるＲＮＡに着目し、各培養株化がん細胞において、正常酸素分圧下と比較して低酸素分圧下で発現上昇を認めるＲＮＡのみを選定し、さらに、前立腺がん細胞株ＰＣ３にのみ特徴的な発現上昇を示したＲＮＡおよび、がん種を問わずに発現の上昇を認める分子にグループ分けして、培養がん細胞株におけるＲＴ−ｑＰＣＲおよびＴＭＡでのＲＮＡ−ＩＳＨを進めた。
【００６４】
正常酸素分圧と低酸素分圧下で発現の変化を比較する手法は、固形がん内の微小環境が低酸素化するという期待に基づく固形がんマーカーの探索の分野において散見される。しかし、ＧＳは腺がんである前立腺がん患者のがん進行のリスク分類を表したものであり、ＧＳは前立腺がん内部の微小環境の低酸素化と関連がない。また、ＧＳが前立腺がん内部の微小環境の低酸素化と関連するという知見は存在しない。そのため、実施例２で発現の上昇が認められたＲＮＡからＧＳ鑑別マーカーが見出されたことは、驚くべきことである。
【００６５】
実施例３  培養がん細胞株におけるＲＴ−ｑＰＣＲ
実施例２で選択したＲＮＡについてその変動を定量的に確認すべく、ＲＴ−ｑＰＣＲでの追従実験を行った。タカラバイオ社のＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓで調製した各種細胞株由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートにＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ （Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）  （製品コード：ＲＲ０３７）を用い、オリゴ（ｄＴ）もしくは遺伝子特異的なプライマー配列の存在下で逆転写し、ｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡの一部をテンプレートに、ＰＣＲ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のｑＰＣＲＢＩＯ ＳｙＧｒｅｅｎ Ｍｉｘ Ｌｏ−ＲＯＸ（製品コード：ＰＢ２０−１１−０５）  によるＲＴ−ｑＰＣＲ反応を進めた。ＲＴ−ｑＰＣＲの反応条件としては、９５℃で１５秒（熱変性）および６３℃で３０秒（プライマーのアニーリング及び伸長反応）の連続反応を設定し、４３サイクル繰り返す条件で実施した。ＲＴ−ｑＰＣＲ反応およびＲＮＡ定量データの取得・解析は、ＢｉｏＲａｄ社のＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ（登録商標）ＲＴ−ｑＰＣＲ 解析システム（製品コード：１８５５２０１Ｊ１）にて実施した。この追従実験により、がん微小環境下に生じる低酸素状態において発現が誘導されるＲＮＡを６０種類選択した（データは示さない）。
【００６６】
実施例４  ＴＭＡの準備（ＨＥ染色とがん領域の特定）
ＴＭＡを実施するにあたり、正常組織、隣接正常組織、および前立腺がん領域のコアを配置されたＴＭＡを２種類準備した（購入元: 上海Ｏｕｔｄｏ社）。使用したＴＭＡスライドの元となる検体は、全てＦｏｒｍａｌｉｎ−Ｆｉｘｅｄ  Ｐａｒａｆｆｉｎ−Ｅｍｂｅｄｄｅｄ（ＦＦＰＥ）処理されたものである。これらのＴＭＡでは、由来患者によってはがん領域とその隣接組織（正常組織もしくは隣接正常組織）がペアで搭載されている（図１−図２）。
【００６７】
前立腺がん検体由来の組織という情報が紐付されていても、各コアにおけるがん領域と隣接正常組織や正常組織といったそれ以外の領域が詳細に区別されていないため、コア毎にＨＥ染色を行い、その染色結果を元に領域の判別を行った。領域の判別は、例として示しているコアにおいて点線で囲っている部分はがん領域と判定された部分であり、それ以外の領域は隣接正常組織もしくは正常組織である（図３）。また、購入したＴＭＡには前立腺がん患者の場合はＧＳ情報が紐付されており、コア毎にＧＳ情報と連結解析することが可能である。なお、正常組織、隣接正常組織、および前立腺がん領域の判定は、Ｈｕｍｐｈｅｒｙらの知見に基づく[非特許文献８]。
【００６８】
実施例５  ＴＭＡでのＲＮＡ−ＩＳＨ（ＲＮＡｓｃｏｐｅの準備）
ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ検出の問題点として、ＦＦＰＥ処理された病理組織中のＲＮＡの分解が進んでいること、またＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ＤＩＧ）のようなハプテンラベルした核酸プローブを活用する間接抗体検出手法の検出感度の限界が挙げられている。そのため、断片化が進んでいるＲＮＡに対しても高い検出感度を示すことが可能なＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）（ＡＣＤ社、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ, Ｉｎｃ.）を採用した。ＲＮＡｓｃｏｐｅの検出原理は、核酸プローブの連続したハイブリダイゼーションステップを経るＲＮＡ−ＩＳＨを採用している。基本的な検出プロトコルはＡＣＤ社のマニュアルに従って実施した。ただし、標的毎にプローブ配列を設計する必要があるため、マイクロアレイやＲＴ−ｑＰＣＲで標的としたＲＮＡ領域近傍でＲＮＡｓｃｏｐｅ用の標識プローブを準備した。
【００６９】
実施例６  ＲＮＡｓｃｏｐｅの実施とＧＳ鑑別マーカー候補ＲＮＡの選択
ＲＮＡ分子についてＧＳ鑑別マーカーとして特に期待できるＲＮＡを選択し、培養がん細胞株においてＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕ検出が可能であるかＲＮＡＳｃｏｐｅを用いて検討を実施した。さらに、ＲＮＡＳｃｏｐｅによりＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕ検出が可能であるか検出が可能と判断されたＲＮＡについて、前立腺がんのＴＭＡにおいてＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕ検出を実施した。その結果、非がん部位に比してがん部位での染色が強く認められるＲＮＡを２６種類見出した（表１）。
【００７０】
【表１】
2019062870.tif 000002
【００７１】
表１中に示されるそれぞれのがん細胞での発現変動数値は、マイクロアレイでの発現変動解析において、正常酸素分圧下における発現量を１とした際の低酸素状態におけるＲＮＡ分子の発現レベルを相対値で示したものである。＃Ｎ／Ａと表記している部分は、２倍未満の発現変動値しか示さなかったものである。
【００７２】
ＲＴ−ｑＰＣＲに用いた各種プライマー領域とその配列を表２に示す。
【００７３】
【表２】
2019062870.tif 000003
【００７４】
また、ＲＮＡＳｃｏｐｅで採用したターゲット領域（プローブ領域）及びＺＺプローブ数を表３に示す。
【００７５】
【表３】
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【００７６】
標的の標識プローブについては、表３に表すように、標的の遺伝子記号に対応する登録番号の配列においてプローブ領域を選択し、その領域内においてＡＣＤ社の既定の方法により、ＺＺプローブとして１１〜３０組作製した（Ｗａｎｇ Ｆ, ｅｔ ａｌ. （２０１２）. Ｊ ｏｆ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ, １４（１）, ２２-２９.）。例えば、ＫＩＦ２５の標識プローブは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション登録番号ＮＭ＿０３０６１５（配列番号：１）の配列内のヌクレオチド２〜１４９４をターゲット領域として選択し、ＺＺプローブを３０組作製した。ＮＯＬ４の標識プローブは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション登録番号ＮＭ＿００３７８７（配列番号：２）の配列内のヌクレオチド１８５１〜３８４９をターゲット領域として選択し、ＺＺプローブを３０組作製した。ＡＣＤ社の既定の方法に基づき、前処理を施した後、標的に特異性であることを確認した。陽性対照として、各組織においてユビキタスな発現が認められるＰＯＬＲ２Ａに特異的なプローブを用いた（アッセイコントロール）。陰性対照としては、ヒト組織での発現が認められない枯草菌由来のｍＲＮＡであるＤａｐＢに特異的なプローブを用いた。
【００７７】
実施例７  ＧＳの鑑別とＫＩＦ２５またはＮＯＬ４の発現の数値化
ＴＭＡスライドのＨＥ染色結果を基に、コア毎に正常組織又は隣接正常組織、過形成、及びがん領域という区別をつけた上で、コアのＧＳ情報と正常組織又は隣接正常組織、過形成、及びがん領域のＲＮＡｓｃｏｐｅの染色結果情報を集計し、さらに、標的遺伝子毎に評価を実施し集計した（表４Ａ−表４Ｃ）。
【００７８】
正常組織又は隣接正常組織、過形成、及びがん領域と標的ＲＮＡの染色の関係を表４Ａおよび表４Ｂに示す（スライドはＨＰｒｏＡ０６０ＰＧ０１）。表４Ｂは、表４Ａの続きである。括弧内は、スライド内の各組織の累計個数におけるスライド内の各組織の累計染色の割合を示す。
【００７９】
【表４Ａ】
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【００８０】
【表４Ｂ】
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【００８１】
正組織常又は隣接正常組織部位、過形成、及びがん領域と標的ＲＮＡの染色の関係を表４Ｃに示す（スライドはＨＰｒｏＡ１００ＰＧ０１）。
【００８２】
【表４Ｃ】
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【００８３】
当該染色の評価は、具体的には低倍率（例えば総合倍率４０倍）でＴＭＡコアを観察し、最も染色密度が高く、かつ、がん領域である領域を選出し、その領域を高倍率（例えば総合倍率２００倍）視野下で観察し、染色密度が高いものを「陽性」、それ以外のものを「陰性」とした。染色の評価は、ＡＣＤ社のスコアリングガイダンス（ｈｔｔｐｓ：／／ａｃｄｂｉｏ.ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ−ｓｕｐｐｏｒｔ／ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を参考に、切片標本の染色分布より、当該スコアの１以上を陽性と設定し、２名の研究者によるブラインド検査によりなされた。２名の陽陰性の判断は低倍率視野下においては１００％の一致、高倍率視野下においては、９５％の一致であった（データは示さない）。
【００８４】
ＧＳスコアをＧＳ６以下とＧＳ７以上に分類し、標的遺伝子毎の陽陰性のマトリックス解析を進めた（図４Ａ−図４Ｂ）。この陽陰性における、ＧＳ６以下とＧＳ７以上の鑑別の検査一致率は、７５％以上であった（表５Ａ−表５Ｂ）。加えて、このときの陽陰性の判断は染色密度（シグナル密度）で判断していることから、高倍率視野倍率（総合倍率２００倍相当）下の観察者の判断が一致したＴＭＡのコアの前立腺がん領域における標識由来のシグナル数（ドット数）の面密度を算出したところ、４．０×１０個／ｍｍ２以上であることが明らかとなり、４．０×１０個／ｍｍ２以上のとき、陽性とする基準が成り立つことが明らかとなった。
【００８５】
標識由来のシグナル数（ドット数）の面密度の算出は以下のとおりに行った。陽陰性判定ずみの切片標本を高倍率視野でデジタルカメラ付き顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社  ＢＺ−９０００顕微鏡システム）で撮影し、該システムが有する面積測定機能及びセルカウント機能（シグナルカウント機能）によるドットカウントを行い、カウントされたシグナル数（ドット数）を測定された面積で割ることで面密度を算出した。
【００８６】
ＧＳの評価（ＧＳ６以下／ＧＳ７以上）とＲＮＡＳｃｏｐｅによるＫＩＦ２５ＲＮＡの染色結果（陽陰性判定）のマトリックス解析の結果を表５Ａに示す（スライドはＨＰｒｏＡ０６０ＰＧ０１）。特異度：７７．８％（７例／９例）、感度：８６．５％（３２例／３７例）、検査一致率：８４．８％（３９例／４６例）。検査一致率の算出に用いた３９例は、ＧＳ６以下（低リスク）かつ陰性判定の７例およびＧＳ７以上（中〜高リスク）かつ陽性判定の３２例の合計である。
【００８７】
【表５Ａ】
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【００８８】
ＧＳの評価（ＧＳ６以下／ＧＳ７以上）とＲＮＡＳｃｏｐｅによるＮＯＬ４ＲＮＡの染色結果（陽陰性判定）のマトリックス解析の結果を表５Ｂに示す（スライドはＨＰｒｏＡ０６０ＰＧ０１）。特異度：０．０％（０例／９例）、感度：９４．６％（３５例／３７例）、検査一致率：７６．１％（３５例／４６例）。検査一致率の算出に用いた３５例は、ＧＳ６以下（低リスク）かつ陰性判定の０例およびＧＳ７以上（中〜高リスク）かつ陽性判定の３５例の合計である。
【００８９】
【表５Ｂ】
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【産業上の利用可能性】
【００９０】
本願の方法は、前立腺がん患者の前立腺針生検組織または手術検体におけるＧＳ鑑別をより確度の高いものとする方法であるため、前立腺がん患者のリスク分類およびそれに基づく診療方針の決定の一助を担うことを可能とする。また、本願の方法によって、前立腺がんの外科的切除の要・不要判断の基準がより明確化され、過剰診療に伴う患者のＱＯＬ低下を未然に防ぐことが可能となる。さらに、本願の方法によって、特に、若年層の期待余命が長い患者で治療方針が大きく変わる低リスクと中間リスクの境界となるＧＳ６とＧＳ７との明確な鑑別が可能となるため、前立腺がん患者のＱＯＬ改善に大きく寄与することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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