(57)【要約】【課題】より高い結晶化速度を有する新規ポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供すること。【解決手段】3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸単位と3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸以外の3-ヒドロキシアルカン酸単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体であって、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸単位のモル分率が、少なくとも７０モル％である、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体、及び3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸の単一重合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸単位と3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸以外の3-ヒドロキシアルカン酸単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体であって、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸単位のモル分率が、少なくとも７０モル％である、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
【請求項２】
3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸単位のモル分率が、実質的に１００モル％である、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
【請求項３】
3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸の単一重合体。
【請求項４】
3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸以外の3-ヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシブタン酸である、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
【請求項５】
3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸以外の3-ヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシヘキサン酸である、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸をモノマーユニットとする単一重合体、及び3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸を高分率で含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（PHA）は微生物が細胞内に蓄積するバイオポリエステルである。近年では、生分解性プラスチック素材としてのみならず、バイオマス由来のプラスチック素材として注目されている。
【０００３】
ポリエステルの加工工程において、ポリエステルの結晶化速度の高さは加工時間の短縮につながるため、非常に重要である。
最も一般的なPHAである、(R)-3-ヒドロキシブタン酸（3HB）を構成単位とするホモポリマー（以下、「P(3HB）」）は、高結晶性であるために硬くて脆く、実用性に乏しい。また、溶融温度（１８０℃）と熱分解温度（約２００℃）とが近いために、溶融時にポリマーが低分子量化してしまうなど成型加工時の劣化が問題となり、工業生産には向いていない。この物性を改善する手段の一つとして、3HBと他のモノマーとの共重合体化が種々検討されてきた。
【０００４】
例えば、3HBと(R)-3-ヒドロキシヘキサン酸（3HHx）とから成る共重合体（以下、P(3HB-co-3HHx)）は、近年、工業生産が検討されている（非特許文献１）。しかしながら、P(3HB-co-3HHx)は、第２成分である3HHx分率の増加に伴い溶融温度が低下するものの、これに伴って結晶化度及び結晶化速度も低下し、成形加工時における生産性が低い（非特許文献２）。また、3HBと4-ヒドロキシブタン酸（4HB）との共重合体（以下、P(3HB-co-4HB)）、3HBと3-ヒドロキシ吉草酸（3HV）との共重合体（以下、P(3HB-co-3HV)）も、それぞれ、第２成分である4HB、3HVの分率の増加に伴い、結晶化速度が低下することが報告されている（非特許文献３又は４）。
【０００５】
一方、α位に側鎖を持つ3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸（3H2MB）は、3HBや3HHxとは異なった結晶性が期待されるヒドロキシアルカン酸である。例えば、3H2MB単位を含む共重合体として、活性汚泥に酢酸、プロピオン酸等を添加することによって、3H2MB、3HB、3HV、3H2MV（3-ヒドロキシ-2-メチル吉草酸）及び3HHxから成る５成分共重合体（非特許文献５、６）や、3H2MB、3HB、3HV及び3H2MVから成る４成分共重合体（非特許文献７）が得られたことが報告されている。これらの多元共重合体中の3H2MB単位の分率は、それぞれ、１０ｍｏｌ％程度、１３ｍｏｌ％程度といずれも低い。
【０００６】
近年、本発明者らは、3HB単位と3H2MB単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体（以下、P(3HB-co-3H2MB）を報告している（特許文献１）。当該P(3HB-co-3H2MB)は、第２成分である3H2MBを低分率で含むものであるが、高い結晶化速度を有しながら低い温度で溶融するため、優れた溶融加工性を有する。
【０００７】
また、本発明者らは、大腸菌E. coli LSBJ（β酸化欠損株）を宿主に用いて、3H2MBが６０ｍｏｌ％で導入された3H2MB単位と3HHx単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体（以下、P(3H2MB-co-3HHx)）を得たことも報告している（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2016-155936号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Macromol. Biosci., (2004), 4, 238-242
【非特許文献２】Polymer 51 (2010) 4408-4418
【非特許文献３】J Mater Sci (2011) 46: 1281-1288
【非特許文献４】Journal of Material Science Letters 12 (1993) 1120-1121
【非特許文献５】Appl. Environ. Microbiol.75, (2009) 4676-4686
【非特許文献６】Journal of Biotechnology, 147 (2010) 172-179
【非特許文献７】Journal of Biotechnology, 134 (2008) 137-145
【非特許文献８】J. Polym. Res. (2017) 24:221
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明は、より高い結晶化速度を有する新規ポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、斯かる実状に鑑み鋭意検討した結果、炭素源と、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸（3H2MB）の前駆物質との存在下に、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が特定の微生物のβ酸化欠損株に導入された形質転換体を用いることにより、3H2MB単位を高分率で含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体、更には実質的に3H2MB単位のみから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体（すなわち、3H2MBの単一重合体）が効率よく得られ、また、これらの共重合体が従来のPHAと比較してより高い結晶化速度を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、（１）本発明は、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸単位と3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸以外の3-ヒドロキシアルカン酸単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体であって、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸単位のモル分率が、少なくとも７０モル％である、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。
（２）本発明は、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸単位のモル分率が、実質的に１００モル％である、（１）に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。
（３）本発明は、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸の単一重合体を提供する。
（４）本発明は、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸以外の3-ヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシブタン酸である、（１）に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。
（５）本発明は、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸以外の3-ヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシヘキサン酸である、（１）に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の3H2MB単位を高分率で含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体は、従来のポリヒドロキシアルカン酸共重合体と比較してより高い結晶化速度を有し、実質的に3H2MBのみから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体（3H2MBの単一重合体）は、今回初めて生合成に成功したポリエステルであり、非常に高い結晶化速度を有する。したがって、これらの共重合体では、加工時間の短縮が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、P(3H2MB-co-3HB)の生合成経路の概略図である。図１において、ｘ及びｙは繰り返し数であり、各々１〜20,000の整数を示す。
【図２】図２は、P(3H2MB)（表２のサンプル番号４）の1H NMRスペクトルである。以下、図面の簡単な説明において、P(3H2MB)は、表２のサンプル番号４の重合体を示す。構造式P(3H2MB)中の記号B〜Eはプロトンを表し、それぞれ、1H NMRスペクトルにおいて対応するシグナルとして観察される。
【図３】図３は、P(3H2MB)の13C NMRスペクトルである。構造式P(3H2MB)中の記号A〜Eはカーボンを表し、それぞれ、13C NMRスペクトルにおいて対応するシグナルとして観察される。
【図４】図４は、P(3H2MB)の示差走査熱量測定（DSC）の結果を示す図である。
【図５】図５は、P(3H2MB)のHoffman-Weeksプロットを示す図である。
【図６】図６は、P(3H2MB)の半結晶化時間（T1/2）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の新規なポリヒドロキシアルカン酸ポリヒドロキシアルカン酸共重合体は、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸（3H2MB）を高分率で含む共重合体（以下、P(3H2MB-co-3HA)と言うことがある）である。具体的には、3H2MB単位と、第２成分である3H2MB以外の3-ヒドロキシアルカン酸単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体であって、3H2MB単位のモル分率が少なくとも７０モル％である、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。
【００１６】
3H2MB以外の3-ヒドロキシアルカン酸としては、3-ヒドロキシプロパン酸（3HP）、3-ヒドロキシブタン酸（3HB）、4-ヒドロキシブタン酸（4HB）、3-ヒドロキシ吉草酸（3HV）、3-ヒドロキシヘキサン酸（3HHx）等が挙げられる。これらの3-ヒドロキシアルカン酸モノマーには異性体が存在するが、本発明のポリヒドロキシアルカン酸共重合体は、各々のモノマーの異性体を任意に組み合わせた共重合体を含む。P(3H2MB-co-3HA)としては、例えば、P(3H2MB-co-3HB)、P(3H2MB-co-3HHx)が挙げられる。
【００１７】
本発明の共重合体中の3H2MB単位の割合は、結晶化速度の点から、少なくとも７０モル％であり、好ましくは少なくとも７５モル％、より好ましくは少なくとも８０モル％、より好ましくは少なくとも８５モル％、より好ましくは少なくとも９０モル％、より好ましくは少なくとも９５モル％、更に好ましくは少なくとも９９モル％である。ただし、第２成分である3H2MB以外の3-ヒドロキシアルカン酸単位の割合が１モル％未満では、一般的に溶融温度が高くなりすぎ、そのため加工中に共重合体の分解を招くことがあるため、プラスチック材料としての実用性に欠ける。したがって、本発明の共重合体をプラスチック材料として用いる場合には、本発明の共重合体中の、3H2MB以外の3-ヒドロキシアルカン酸単位の割合は１モル％以上であることが好ましい。
【００１８】
また、本発明の新規なポリヒドロキシアルカン酸重合体は、実質的に3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸（3H2MB）単位から成る重合体であり、好ましくは3H2MBの単一重合体である。3H2MBの単一重合体は、P(3H2MB-co-3HA)と比べて更に結晶化速度が高い。プラスチック材料としての有用性は、P(3H2MB-co-3HA)と比較して劣るが、この高い結晶性の点から、例えば、結晶核剤としての用途が期待できる。
【００１９】
本発明の3H2MBを高分率で含む共重合体及び3H2MBの単一重合体は、特定の微生物のβ酸化欠損株を宿主に用いて製造される。
具体的には、炭素源と、3H2MBの前駆物質との存在下に、宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターに、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子、及びチグリン酸からチグリル-CoAへの変換反応を促進することによって3H2MB-CoAトランスフェラーゼの供給を増加させるための、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ（pct）遺伝子、並びに公知のモノマー供給遺伝子を挿入して得られるプラスミドを宿主細胞に導入することによって得られる。3H2MBの単一重合体は、当該製造法によって、本発明において初めて生合成されたものである。
図１に、本発明の代表的なポリヒドロキシアルカン酸共重合体P(3H2MB-co-3HB)の生合成経路の例を示す。後述するように、図１におけるグルコースは炭素源の一例であり、チグリン酸は3H2MB前駆物質の一例である。グルコースはピルビン酸、次いでアセチル-CoAに変換された後、このアセチル-CoAはβ-ケトチオラーゼ（PhaA）により２量化（PhaA）され、アセトアセチルCoAレダクターゼ（PhaB）によって還元されて、3HB-CoAに変換される。一方、チグリン酸はチグリル-CoAに変換され、チグリル-CoAは、エノイルCoAヒドラターゼ（PhaJ）により3H2MB-CoAに変換される。各々の経路で供給されたモノマーはポリヒドロキシアルカン酸重合酵素（PhaC）の基質として利用され、P(3H2MB-co-3HB)が合成される。
【００２０】
さらに、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子の上流には、フェイシン（phasin）と呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子が導入される（例えば、特開２０１３−４２６９７号参照）。フェイシンは、細菌の細胞内でPHA顆粒に共局在することが知られており、PHA顆粒の形成、安定化などに関わると考えられている。
【００２１】
宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターとしては、プロモーター、リボゾーム結合部位、遺伝子クローニング部位、ターミネーター等を有する公知のベクターを用いることができる。例えば、移動能を有するmob領域を持つベクターpBBR1MCS-2、pJRD215及びpLA2917が挙げられる。
【００２２】
ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子としては、例えば、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）61-3株、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・エスピー A33、アロクロマティウム・ビノサム（Allochromatium vinosum）、バシルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシルス・セレウス（Bacillus cereus）、バシルス・エスピー（Bacillus sp.）INT005、ランプロシスティス・ロゼオペルシシナ（Lamprocystis roseopersicina）、ノカルディア・コラリナ（Nocardia corallina）、ロドバクター・シャエロイデス（Rhodobactor shaeroides）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonnia eutropha）、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）NCIMB 40126、チオカプサ・フェニギー（Thiocapsa pfennigii）、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）、及びアエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）から選ばれる微生物に由来するものが挙げられる。これらの中で、Pseudomonas sp.61-3由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素は、細胞内に共重合体P(3HB-co-3HA)（3HA：C4〜C12の(R)-3-ヒドロキシアルカン酸）を蓄積する能力を有し、Aeromonas caviae由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素は、共重合体P(3HB-co-3HA)（3HA：C4〜C6の(R)-3-ヒドロキシアルカン酸）を蓄積する能力を有する点で、特に好ましい。
【００２３】
また、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子としては、上記のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の変異体をコードする遺伝子でもよい。このような変異体は、野生型のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸重合活性を有するタンパク質である。かかる変異体を用いることにより、ポリヒドロキシアルカン酸重合体の生産量が増加する。例えば、本発明に用いられるポリヒドロキシアルカン酸重合酵素変異体としては、微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素（PhaC）のＮ末端から１４９番目のアスパラギンからセリンへの置換、及び／又はPhaCの１７１番目のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含む変異体が挙げられる。
フェイシンは、Ｎ末端から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列を有する変異体も好ましく用いられる。例えば、フェイシンのＮ末端から４番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換してなる変異体が挙げられる（例えば、特開２０１３−４２６９７号参照）。フェイシンの変異体は、同様にポリヒドロキシアルカン酸重合体の生産性を向上させ、さらに、3H2MBの組成比を向上させる。
上記のPhaCの１４９番目のアミノ酸の置換、同酵素の１７１番目のアミノ酸の置換、及びフェイシンの４番目のアミノ酸の置換、のすべてを含む変異体も好ましい。
ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素及びフェイシンが由来する微生物は、例えばアエロモナス属微生物であり、具体的にはアエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）が挙げられる。
以下、PhaPの４番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されてなるPHA結合タンパク質を「PhaPAc D4N」、PhaCの１４９番目のアスパラギンがセリンに、かつPhaCの１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換されてなるポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の二重変異体を「PhaCAc NSDG」と表記することがある。
PhaPAc D4Nの製造法は、例えば、特開２０１３−４２６９７号に開示され、PhaCAc NSDGの製造法は、例えば、Tsuge T, et al., FEMS Microbial Lett 277 (2007) 217-222に詳述されている。
【００２４】
公知のモノマー供給遺伝子としては、例えば、Ralstonia eutropha由来のphbA、phbB、phaA、phaB（Peoples, O.P. and Sinskey, A.J., J. Biol. Chem. 264: 15293-15297 (1989)）、Aeromonas caviae由来のphaJ（Fukui, T. and Doi, Y., J. Bacteriol. 179: 4821-4830 (1997)）等が挙げられる。
【００２５】
宿主としては、糖類や油脂類を炭素源として使用した場合の増殖性が良好で、菌株の安全性が高く、菌体と培養液との分離が比較的容易である点から、例えば、大腸菌、ラルストニア属菌、シュードモナス属菌等の微生物細胞が挙げられる。
【００２６】
3H2MBの前駆物質としては、脂肪酸又はその誘導体であればよく、例えば、チグリン酸、アンゲリカ酸、2-メチルブタン酸、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸、イソロイシン、又はこれらの混合物が挙げられる。3H2MBの前駆物質の添加量は、約０．１〜約５．０ｇ/Ｌの範囲が好ましく、約０．５〜約２．０ｇ/Ｌの範囲がより好ましい。
【００２７】
炭素源としては、例えば、糖類、カルボン酸、油脂類等を用いることができる。糖類としては、グルコース、フルクトース、ガクトース、キシロース、アラビノース、サッカロース、マルトース、でんぷん、でんぷん加水分解物等が挙げられる。カルボン酸としては、酢酸、乳酸等が挙げられる。油脂類としては、植物油が好ましく、例えば大豆油、コーン油、綿実油、落花生油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、又はこられの分別油、例えばパームＷオレイン油（パーム油を２回無溶媒分別した低沸点画分）、パーム核油オレイン（パーム核油を１回無溶媒分別した低沸点画分）、又はこれらの油脂やその画分を化学的もしくは生化学的に処理した合成油、あるいはこれらの混合油が挙げられる。
【００２８】
培養温度は、菌の生育可能な温度、好ましくは１５〜４０℃、特に好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは２８〜３４℃である。培養時間は、特に限定されないが、例えばバッチ培養では１〜７日間が好ましく、また連続培養も可能である。培養培地は、本発明の宿主が利用できるものである限り特に限定されない。炭素源に加えて、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源等を含有する培地を使用することができる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸水素マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＣ等のビタミン類などが挙げられる。
【００２９】
本発明のPHAの菌体からの回収は、例えば、次の方法によって行うことができる。培養終了後、遠心分離器等で培養液から菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄した後、乾燥させた後、この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶媒を用いて共重合体を抽出する。次いで、この共重合体を含む有機溶媒溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノール、へキサン等の貧溶媒を加えて共重合体を沈殿させる。沈殿した共重合体から、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させ、共重合体を回収することができる。得られた共重合体の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法、核磁気共鳴法等により行うことができる。
【００３０】
後述する表２及び図４〜６に示すように、本発明の3H2MB単位を高分率で含むPHA、特に実質的に3H2MB単位のみから成る単一重合体では、従来のPHAと比較して、高温領域での短い半結晶化時間が観察された。半結晶化時間は、結晶化速度のより直接的な指標であり、高温領域において短い半結晶化時間を示すことは、より効率的な結晶化が起きていることを意味する。また、融点（Tm）と溶融状態から一定速度で冷却する過程で検出される結晶化温度（Tc)との温度差ΔTも同じく、結晶化挙動の指標として用いられる。本発明の3H2MB単位のみから成る単一重合体は、TmとTcとの温度差ΔTが54℃であり、3H2MB単位を高分率で含むPHA、例えばP(3H2MB-co-13 mol% 3HHx)のΔTは86℃であるのに対して、P(3HB)のΔTは110℃である。P(3H2MB-co-20 mol% 3HB)のΔTは59℃であるのに対して、同一条件で測定したP(3HB)のΔTは99℃である。このようにΔTが小さいことは、プラスチック材料としての加工時における大きな利点であり、本発明の共重合体が溶融加工性に優れていることを示すものである。
【００３１】
一般に、結晶性プラスチック材料は溶融成形して使用するが、溶融形成後の冷却過程で結晶化が進行する。例えば第２モノマーの組成比が高いPHAの共重合体では、第２モノマーの存在により結晶化が妨げられ、結晶化速度が低下する。したがって、このような結晶化速度の低下を補うために結晶核剤を添加するのが一般的である（Yoshio Inoue, FFI Journal, Vol.213, No.12, p.1092-1102(2008）)。本発明の3H2MB単位を高分率で含むPHA、特に3H2MBの単一重合体は、従来のPHAと比較して非常に高い結晶化速度を有することから、このような結晶核剤としての用途が期待される。
なお、本発明の共重合体合成においては結晶核剤の添加を必要としないが、結晶化速度を更に高くするために、公知の結晶核剤を添加してもよい。
【００３２】
また、本発明の3H2MB単位を高分率で含むPHAは、比較的柔らかい物性を有し、このことはプラスチック材料として加工上有利である。
【実施例】
【００３３】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００３４】
［材料及び調製方法］
（１）微生物
大腸菌E. coli LSBJ株（β酸化欠損株）を宿主に用いた。LSBJ株は、E. coli LS5218株（Spratt, S. et al., J. Bacteriol. 1981, 146, 1166）のβ酸化の一部を担うfadB遺伝子及びfadJ遺伝子が欠損した変異株である（Tappel et al., J. Biosci. Bioeng. 2012, 113, 480）。
【００３５】
（２）培地
（a）Lysogeny Broth（LB）培地
Bacto trypton 10 g、酵母エキス ５g、NaCl 10 gを脱イオン水１Lに溶かして、121℃で20分間オートクレーブして調製した。また、寒天培地は、上記成分に寒天 1.5〜2 %（vol/vol）となるよう加えオートクレーブ処理して調製した。抗生物質（カナマイシン：終濃度 50 μg/mL）は、液体培地、寒天培地ともにオートクレーブ処理後に添加した。
（b）M9培地
Na2HPO4・12H2O 17.1 g、KH2PO4 3 g、NH4Cl 0.5 g、NaCl 0.5 g、1M MgSO4 2 mL、1M CaCl2 0.1 mL、カナマイシン 50 mgを脱イオン水１Lに溶かして、121℃で20分間オートクレーブして調製した。
【００３６】
（３）プラスミド
（a）pBBR1phaPCJAc
プラスミドpBBR1phaPCJAcは、文献（Watanabe Y. et al., J. Biosci. Bioeng., 2012, 113, 286）に記載の方法によって作製したpBBR1phaPCJAcABReを制限酵素FseIで消化して得た10 kbの断片を、Mighty Cloning Reagent Set（Blunt End）（タカラバイオ株式会社製）で処理することによって得た。
（b）pBBREE32d13dPB P(D4N) NSDG
pBBREE32d13dPB P(D4N) NSDGは、pBBR1phaP(D4N)CJAcABRe D171Lを制限酵素KpnIとSgfIにより消化して得た1.2 kbの断片を、文献（Tsuge T. et al., FEMS Microbiol. Lett., 2007, 277, 217）に記載の方法によって、同酵素で消化することによって得たpBBREE32d13dPB NSDGベクターに挿入することにより作製した。
（c）pBBR1phaP(D4N)CJAc NSDG
pBBR1phaP(D4N)CJAc NSDGは、pBBREE32d13dPB P(D4N) NSDGを制限酵素KpnIとScaIで消化した際に生じた断片を、同酵素で消化して得たpBBR1phaPCJAcベクターに挿入することにより作製した。pBBR1phaP(D4N)CJAc_NSDGは、Aeromonas caviaeのPHAオペロンを有しており、phaPには4位のアスパラギン酸（D）がアスパラギン（N）に、phaCには149位のアスパラギン（N）がセリン(S)に、171位のアスパラギン酸（D）がグリシン(G)に変異している（Ushimaru et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 2015, 61, 63）。
（d）pTTQ19-PCT
pct遺伝子を含むNhe I-Mun I断片を、PCR法によってpTVpctC1STQKABReから増幅し、次いで、当該断片をpTTQ19のXba I-EcoR I部位に挿入することによって、pTTQ19-PCTを作製した（Furutate et al., J. Polym. Res. 2017, 24:221）。当該pTTQ19-PCTは、Megasphaera elsdenii由来のプロピオン酸CoAトランスフェラーゼ（pct）遺伝子を有している（同文献）。
【００３７】
実施例１  P(3H2MB)及びP(3H2MB-co-3HB)の製造
上記大腸菌E. coli LSBJ（β酸化欠損株）株に、プラスミドpBBR1phaP(D4N)CJAc_NSDGを加え、pTTQ19-PCTを導入した。
LB寒天培地上に形成された組換え大腸菌E. coli LSBJの単一コロニーを、50 mL振とうフラスコに入った20 mLのLysogeny Broth（LB）培地に植菌し、37℃、160ストローク/分で、一晩培養した。この培養液5 mLを、500 mL振とうフラスコに入った95 mLのM9改良培地（17.1 g/L Na2HPO4・12H2O, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 2 mL 1 M MgSO4・7H2O, 0.1 mL 1 M CaCl2, 2.5 g/L Bacto-yeast extract）に植菌し、30℃、130ストローク/分で、76時間培養した。この間、4時間目に発現誘導剤（IPTG）を0.4〜1 mM添加し、4時間目、28時間目、52時間目にグルコースとチグリン酸を、それぞれ1.25〜5 g/L、0.2〜3 g/Lずつ添加した。培養後、10分の遠心分離（5960 ×g）を行って菌体を回収し、水で洗浄後、凍結乾燥させた。
【００３８】
＜PHAの精製及び分画＞
PHAを蓄積させた乾燥菌体を100 mLの蓋付ガラス瓶に移し、100 mLのクロロホルムを加えスターラーで72時間攪拌した。撹拌後の溶液をNo.1濾紙（アドバンテック社製）でろ過し、ナス型フラスコに移し変えた。その後、ロータリーエバポレーターで完全に濾液を揮発させ、ポリマーを析出させた。
次いで、析出したポリマーを少量のメタノールで洗い取り、約20 mLのクロロホルムに完全に溶解させた後、400 mLのメタノールに少量ずつ滴下しながら撹拌を行い、精製した。精製した共重合体をNo.1濾紙で回収し、48時間、ドラフト中で乾燥させた。一部サンプルに関しては、再度ポリマーをクロロホルムに溶解させ貧溶媒であるヘキサンを加えて沈殿物を得た。再びヘキサンを添加し沈殿物を得ることを繰り返し、組成の異なる分画サンプルを得た。なお、ヘキサンは60%〜70%となるように添加した。
【００３９】
＜PHAの構造及び物性の分析法＞
（１）ガスクロマトグラフィー（GC）
菌体内のPHA含有率とその組成は、ガスクロマトグラフィーで決定した（Braunegg et al., 1978）。まず、得られた乾燥菌体を耐圧ガラス管に10〜15 mL秤量し、ここに硫酸メタノール溶液（硫酸：メタノール＝15 vol%：85 vol%）2 mL及びクロロホルム2 mLを加えて密栓し、100℃、140分間ヒートブロックで加熱し、メタノール分解した。加熱中は約30分ごとにサンプルを撹拌した。その後、室温まで冷却し、純水1 mLを加えて激しく撹拌した。静置後、二層に分離した下層（クロロホルム層）をパスツールピペットで吸引し、0.45 μm径のMillex-FH PVDFフィルター（ミリポア社製）でろ過した。ろ過後のクロロホルム層500 μLに内部標準物質である0.1 vol%カプリル酸メチル500 μLを加え混合したものをサンプルとした。GC装置は島津製作所製のガスクロマトグラフGC14Bを用い、カラムにはGLサイエンス社製NEUTRA-BOND-1（内径30 m×0.25 mm、膜厚0.4 μm）を用いた。キャリアガスとしてHe及びN2を用い、成分の検出には水素炎イオン化検出器を用いた。
【００４０】
（２）示差走査熱量（DSC）
DSCサンプルは、精製したポリマーを約10 mg秤り取り、5 mL容のサンプルバイアルに入れ、約1〜2 mLのクロロホルムに完全に溶解した。これをドラフト中で約３週間乾燥させることによりキャストフィルムを作製した。このキャストフィルムから約3 mgを秤量し、専用アルミニウムパンに入れたものをDSC測定サンプルとした。測定には、パーキンエルマー社製のPyris 1 DSCを使用した。測定は20 mL/分の窒素雰囲気下で行った。対照には試料の入っていないアルミニウムパンを用いた。測定の条件として、初めに25℃〜220℃まで20℃/分の昇温速度で加熱し、200℃で２分間保持した後、-500℃/分で-50℃まで急冷した。次に、-50℃で２分間保持した後、20℃/分の昇温速度で200℃に加熱した。なお、キャストフィルムは３週間以上室温下に置き、結晶形成を進行させたものを使用した。解析には、パーキンエルマー社製の解析ソフトData Analysisを用いた。測定した試料の融点Tmは最初に昇温した時のサーモグラムより決定した。ガラス転移温度Tgは二回目に昇温した際の熱容量変化の中点とした。
溶融したサンプルを一定速度での冷却する過程で検出される結晶化温度（Tc）は、まず25℃〜220℃まで20℃/分の昇温速度で加熱し、220℃で２分間保持した後、10℃/分又は20℃/分で降温させ、その過程での結晶化挙動を観察した。また、等温結晶化実験は、まずサンプルを220℃で5分間溶融させ、-500℃/分で所定温度に降温し、その温度を保持して結晶化の挙動を調べた。
【００４１】
＜サンプル調製＞
・メチルエステル化
ネジ口耐圧試験管にポリマーを所定量秤量し、硫酸メタノール溶液2 mL及びクロロホルム2 mLを加え、100℃で140分間、数回攪拌しながら加熱した。反応終了後、室温まで冷却し超純水1 mLを加え激しく撹拌し、静置後下層をサンプルとした。
＜測定条件＞
キャリアガスとしてヘリウムを用い、入り口圧は120 kPaした。
各装置の分析ラインの温度条件  GC：試料気化温度 280℃；カラム初期温度 100℃；カラム最終温度 280℃；カラム昇温速度 8℃/分；注入モード スプリット。
【００４２】
（３）GPC（ゲル浸透クロマトグラフィー）
菌体から精製したポリマーの数平均分子量（Mn）及び分子量分布（Mw/Mn）（Mw：重量平均分子量）をGPC測定によって求めた。標準物質としてポリスチレンを使用しているため、本発明で求めた分子量はポリスチレン換算相対分子量である。用いた５種類のポリスチレンの分子量は、3,790、30,300、219,000、756,000及び4,230,000である。
GPCサンプルは、精製したポリマーを約１mg/mLとなるようにクロロホルムに溶解し、孔径0.45 μmのMillex-FH PVDFフィルター（ミリポア社製）を取り付けたシリンジでろ過して調製した。
GPC測定には島津製作所社製のLC-VPシリーズ（システムコントローラー：SCL-10AVP、オートインジェクター：SIL-10A VP、送液ユニット：LC-10AD VP、カラムオーブン：CTO-10A、ディテクター：RID-10A）を使用し、カラムにはShodex社製のK-806M及びK-802を用いた。移動層にはクロロホルムを用い、総液流量は0.8 mL/分、カラム温度は40℃に設定し、サンプル注入量は50 μLとした。データの解析にはCLASS-VP用GPC（島津製作所社製)を用いた。ポリスチレンスタンダードから検量線を引き、これとサンプルデータとを照合することによりポリスチレン換算分子量及び分子量分布を算出した。
【００４３】
（４）1H-NMR及び13C-NMR
PHA 20 mgを1 mLのCDCl3に溶解し、測定サンプルとした。核磁気共鳴分光装置（Biospin AVANCE III 400A, Bruker）を使用した。
【００４４】
実施例２  P(3H2MB-co-3HHx)の製造
4時間目、28時間目、及び52時間目に、更にヘキサン酸を0.25〜1 g/Lずつ添加する以外は実施例１と同様にして、菌体を回収し、精製を行い、得られたPHAの構造及び物性を分析した。
【００４５】
結果
（i）GC
培養により得られた菌体についてGC測定を行った結果を表１に示す。結果は、３つ独立した培養物からの平均及び標準偏差である。
【００４６】
【表１】
2019119806.tif 000002
【００４７】
この結果から、pct遺伝子を導入することにより、PHA中の3H2MB分率が増加することがわかった。また、グルコースの添加量を少なくすることによっても、PHA中の3H2MB分率が上昇することが判明した。一方、グルコース1.25 g/Lとチグリン酸2 g/Lを３回添加しながら培養を行うと、P(3H2MB)の単一重合体が合成できることが明らかとなった。
3HHxを取り込ませるためにヘキサン酸を供給した場合は、3H2MBと3HHxとの二元共重合体が合成できた。
【００４８】
（ii）NMR
P(3H2MB)（サンプル番号４）の1H NMRスペクトルを図２に、13C NMRスペクトルを図３に示す。
図２及び図３より、3H2MB由来のピークを以下のように同定した。
3H2MB由来のピーク：
400 MHz 1H NMR (ppm, CDCl3): δ 1.1 (d, 3H), 1.2 (d, 3H), 2.7 (m, 1H), 5.1 (m,1H)、100 MHz 13C NMR (ppm, CDCl3): 12.2 (CH3), 16.4 (CH3), 44.3 (CH2), 71.3 (CH), 172.2 (C)。
【００４９】
（iii）分子量
各サンプルの物性測定結果を表２に示す。Tg：ガラス転移点；Tm：融点；Tc: 溶融状態から一定速度で冷却する過程で検出される結晶化温度；ΔT：TmとTcとの温度差；Mn：数平均分子量；Mw：重量平均分子量；Mw/Mn：多分散度。
【００５０】
【表２】
2019119806.tif 000003
【００５１】
（iv）熱物性
示差走査熱量計（DSC）によるP(3H2MB)の熱分析の結果を表２及び図４に示す。また、比較としてP(3HB)の熱分析の結果を、参考としてPET及びPP（ポリプロピレン）の熱分析の結果を示す。
P(3H2MB)においては、ガラス転移温度が15℃、融点が204℃に観察された。また、Hoffman-Weeksの方法に従って結晶化温度Tcで結晶化させたサンプル４の融点TmのTc依存性をTm=Tcの直線に外挿することによって、P(3H2MB)の平衡融点（Tm0）を予想した。図５はHoffman-Weeksプロットを示し、P(3H2MB)の平衡融点は220℃と予想された。一方、TmとTcとの温度差ΔTは、54℃であった。これは、比較対象であるP(3HB)のΔT（110℃：降温速度20℃/分）よりも十分に小さく、P(3HB)よりも効率的な結晶化が起きていることを示している。
各結晶化温度において結晶化させたP(3H2MB)の半結晶化時間（T1/2）を図６に示す。P(3HB)とは異なり、高温領域での短い半結晶化時間が観察された。一般に結晶性高分子では、TgとTm0の中点付近で短い半結晶化時間を観察することができる。P(3H2MB)の場合、TgとTm0の中点は117℃付近であるが、結晶化が瞬時に終了するため、140℃までしか等温結晶化における結晶化挙動が観察できなかった。このことは、P(3H2MB)において非常に効率的な結晶化が起きていることを示している。
また、P(3H2MB-co-20 mol% 3HB)（サンプル1-2）において、TmとTcとの温度差ΔTは59℃（降温速度10℃/分）であり、同条件のP(3HB)のΔTである99℃（降温速度10℃/分）より有意に低い値を示した。さらに、P(3H2MB-co-3HHx)（サンプル7〜9）においても、3HHx分率が13 mol%以下では、共重合体であるにもかかわらずP(3HB)より低いΔTを示した。このことから、これら共重合体においても効率的な結晶化が起きていることを示している。
このように、本発明のP(3H2MB)及び3H2MBを主成分とするPHAでは、溶融状態から冷却する過程においてP(3HB)よりも高温領域で結晶化が起こることがわかった。3H2MBを主成分とするPHAは、従来のPHAとは異なる新たな熱物性の傾向を示すことが明らかとなった。
【００５２】
実施例３  P(3H2MB-co-5 mol% 3HB)の力学的特性
P(3H2MB-co-5 mol% 3HB)（実施例１で作製したサンプル番号２の共重合体）のフィルムを作製し、ヤング率、破壊応力、破壊伸びを、引張試験によって決定した。
＜装置＞
引張試験機：AGS-H/EZTest（島津製作所）
分析ソフト：TRAPEZIUM 2（島津製作所）
＜サンプル調製＞
（a）キャストフィルムの作製
精製したポリマーを適量のクロロホルムの溶解し、フラットシャーレに展開した。ここで用いたポリマー重量は、シャーレの面積を考慮して、厚さが 150 μmになるように計算した。展開後、穴をあけたアルミホイルでシャーレにふたをして、クロロホルムが完全に気化するまで、平滑な場所に室温で静置した。乾燥後、シャーレからフィルムを丁寧に剥がし、一週間、室温で静置した。シャーレから剥がれにくいポリマーは、シャーレとポリマーの間に超純水を滴下することにより、剥離した。
（b）引張試験片の作製
作製したキャストフィルムを縦 20 mm、横3 mmに切断したものをサンプルとした。切断には剃刀を使用し、ポリマーの真上から押さえつけるように切断した。
＜測定条件＞
つかみ間距離 10 mm、引張速度10 mm/分とし、室温で測定した。
＜データ解析＞
ポリマーが破断しときの応力を破断応力、伸び率を破壊伸びとした。ヤング率は、応力−歪み曲線における開始点の傾きとした。
結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
表３より、P(3H2MB-co-5 mol% 3HB)は、P(3HB)に比べて、ヤング率や破断応力は低いが、破断伸びが向上している（約２倍）。これは、P(3H2MB)が比較的柔らかい物性を有することを意味しており、このことは加工上有利である。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の3H2MB単位を高分率で含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体は、従来のポリヒドロキシアルカン酸共重合体と比較して高い結晶化速度を有し、実質的に3H2MBのみから成る単一重合体は非常に高い結晶化速度を有し、これらの共重合体では加工時間の短縮が期待できることから、プラスチック材料等への応用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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