(57)【要約】【課題】雄性不稔性である不稔化植物及びその製造方法を提供する。【解決手段】不稔化植物の製造方法は、植物の、（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を、ゲノム編集技術を用いて改変する改変工程を備える方法であり、得られる植物が花粉の生産能を有さない。不稔化植物は、（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が欠損又は抑制されており、花粉の生産能を有さない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の、以下の（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、以下の（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を、ゲノム編集技術を用いて改変する改変工程を備え、
得られる植物が花粉の生産能を有さないことを特徴とする不稔化植物の製造方法。
（１）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（５）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項２】
前記ゲノム編集技術がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである請求項１に記載の不稔化植物の製造方法。
【請求項３】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、以下の（ａ）〜（ｄ）の少なくともいずれか一つのガイドＲＮＡ、又は、以下の（ｅ）〜（ｈ）の少なくともいずれか一つのガイドＲＮＡを用いる請求項２に記載の不稔化植物の製造方法。
（ａ）配列番号１５で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｂ）配列番号１６で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｄ）配列番号１８で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｅ）配列番号１９で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｆ）配列番号２０で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｇ）配列番号２１で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｈ）配列番号２２で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、前記（ａ）〜（ｄ）のガイドＲＮＡ、又は、前記（ｅ）〜（ｈ）のガイドＲＮＡを用いる請求項２又は３に記載の不稔化植物の製造方法。
【請求項５】
キク科の植物である請求項１〜４のいずれか一項に記載の不稔化植物の製造方法。
【請求項６】
Ｃａｓ９をコードする核酸と、
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれか一つの核酸、又は、以下の（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の少なくともいずれか一つの核酸と、
を含むことを特徴とするベクター。
（ｉ）配列番号１５で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｉ）配列番号１６で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｉｉ）配列番号１７で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｖ）配列番号１８で表される塩基配列を含む核酸
（ｖ）配列番号１９で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉ）配列番号２０で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉｉ）配列番号２１で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉｉｉ）配列番号２２で表される塩基配列を含む核酸
【請求項７】
前記ベクターが前記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸、又は、前記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の核酸を含む請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
Ｃａｓ９をコードする核酸を含む第１のベクターと、
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれか一つの核酸、又は、以下の（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の少なくともいずれか一つの核酸を含む第２のベクターと、
を備えることを特徴とするベクターセット。
（ｉ）配列番号１５で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｉ）配列番号１６で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｉｉ）配列番号１７で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｖ）配列番号１８で表される塩基配列を含む核酸
（ｖ）配列番号１９で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉ）配列番号２０で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉｉ）配列番号２１で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉｉｉ）配列番号２２で表される塩基配列を含む核酸
【請求項９】
前記第２のベクターが前記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸、又は、前記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の核酸を含む請求項８に記載のベクターセット。
【請求項１０】
以下の（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、以下の（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が欠損又は抑制されており、花粉の生産能を有さないことを特徴とする不稔化植物。
（１）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（５）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項１１】
以下の（７）〜（８）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、以下の（９）のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が欠損又は抑制されている請求項１０に記載の不稔化植物。
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（８）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（９）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
【請求項１２】
以下の（１０）〜（１３）のいずれかの変異型ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、以下の（１４）〜（１５）のいずれかの変異型ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を有し、花粉の生産能を有さないことを特徴とする不稔化植物。
（１０）配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（１１）配列番号５４で表される塩基配列からなる遺伝子
（１２）配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（１３）配列番号５６で表される塩基配列からなる遺伝子
（１４）配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（１５）配列番号５８で表される塩基配列からなる遺伝子
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不稔化植物及びその製造方法、ベクター、並びに、ベクターセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の栽培や遺伝情報の拡散を制御するため、植物の不稔化が望まれている。不稔化方法の一例として、例えば、花粉を生産する雄ずいや、花粉を受粉する雌ずいの形成を制御することにより不稔化する方法が試みられている。
キクは、鑑賞用や食用として、世界中で広く栽培される有用な植物である。キクの花器官の形成制御に関して、非特許文献１には、キククラスＣ遺伝子の１つを単離し、これをターゲットにアンチセンス植物を作出したことが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Aida, et al., “Chrysanthemum flower shape modification by suppression of chrysanthemum-AGAMOUS gene”, Plant biotechnology, vol.25, p55-59, 2008.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１で作出されたアンチセンス植物における、花の形態異常は軽微であり、花の形態異常が見られた個体の割合も、１０３個体中１個体と低い。このように非特許文献１に記載の植物体の不稔化は、実用上必ずしも十分ではない。
また、非特許文献１で作出されたアンチセンス植物では、頭花（多数の小花から構成される）の中のごく一部の小花の雌ずいの花弁化と、雄ずいの根本部分の花弁化とが報告されている。ただし、このアンチセンス植物では、雄ずいからの花粉の生産が確認されている。よって、このアンチセンス植物では、雄ずいの異常は軽微であった。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、雄性不稔性である不稔化植物及びその製造方法を提供する。また、雄性不稔性の植物を製造するためのベクター及びベクターセットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ゲノム編集技術を用いて、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を切断することで、花粉の生産能を有さない、すなわち雄性不稔性である植物が得られることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る不稔化植物の製造方法は、植物の、以下の（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、以下の（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を、ゲノム編集技術を用いて改変する改変工程を備える方法であり、得られる植物が花粉の生産能を有さない。
（１）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（５）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【０００８】
前記ゲノム編集技術がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであってもよい。
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、以下の（ａ）〜（ｄ）の少なくともいずれか一つのガイドＲＮＡ、又は、以下の（ｅ）〜（ｈ）の少なくともいずれか一つのガイドＲＮＡを用いてもよい。
（ａ）配列番号１５で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｂ）配列番号１６で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｄ）配列番号１８で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｅ）配列番号１９で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｆ）配列番号２０で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｇ）配列番号２１で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｈ）配列番号２２で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
【０００９】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、前記（ａ）〜（ｄ）のガイドＲＮＡ、又は、前記（ｅ）〜（ｈ）のガイドＲＮＡを用いてもよい。
上記第１態様に係る不稔化植物の製造方法において、植物はキク科の植物であってもよい。
【００１０】
本発明の第２態様に係るベクターは、Ｃａｓ９をコードする核酸と、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれか一つの核酸、又は、以下の（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の少なくともいずれか一つの核酸と、を含む。
（ｉ）配列番号１５で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｉ）配列番号１６で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｉｉ）配列番号１７で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｖ）配列番号１８で表される塩基配列を含む核酸
（ｖ）配列番号１９で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉ）配列番号２０で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉｉ）配列番号２１で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉｉｉ）配列番号２２で表される塩基配列を含む核酸
【００１１】
前記ベクターが前記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸、又は、前記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の核酸を含んでもよい。
【００１２】
本発明の第３態様に係るベクターセットは、Ｃａｓ９をコードする核酸を含む第１のベクターと、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれか一つの核酸、又は、以下の（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の少なくともいずれか一つの核酸を含む第２のベクターと、を備える。
（ｉ）配列番号１５で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｉ）配列番号１６で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｉｉ）配列番号１７で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｖ）配列番号１８で表される塩基配列を含む核酸
（ｖ）配列番号１９で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉ）配列番号２０で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉｉ）配列番号２１で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉｉｉ）配列番号２２で表される塩基配列を含む核酸
【００１３】
前記第２のベクターが前記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸、又は、前記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の核酸を含んでもよい。
【００１４】
本発明の第４態様に係る不稔化植物は、以下の（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、以下の（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が欠損又は抑制されており、花粉の生産能を有さない。
（１）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（５）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【００１５】
上記第４態様に係る不稔化植物は、以下の（７）〜（８）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、以下の（９）のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が欠損又は抑制されていてもよい。
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（８）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（９）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
【００１６】
本発明の第５態様に係る不稔化植物は、以下の（１０）〜（１３）のいずれかの変異型ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、以下の（１４）〜（１５）のいずれかの変異型ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を有し、花粉の生産能を有さない。
（１０）配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（１１）配列番号５４で表される塩基配列からなる遺伝子
（１２）配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（１３）配列番号５６で表される塩基配列からなる遺伝子
（１４）配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（１５）配列番号５８で表される塩基配列からなる遺伝子
【発明の効果】
【００１７】
上記態様の不稔化植物及びその製造方法によれば、雄性不稔性である不稔化植物を得られる。また、上記態様のベクター及びベクターセットによれば、雄性不稔性の植物を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】実施例１において作製されたｐＤｅＣａｓ９＿Ｋａｎ＿ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１＿４タンデムベクターの基本構成を示す図である。
【図１Ｂ】実施例１において作製されたｐＤｅＣａｓ９＿Ｋａｎ＿ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２＿４タンデムベクターの基本構成を示す図である。
【図２】実施例１において作製された不稔性形質転換体（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体）及び野生型キク（コントロール）の管状花の全体像（上）及びそれぞれの管状花の拡大像（下）である。
【図３】実施例１において作製された不稔性形質転換体（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２改変体）、並びに野生型キク（コントロール）の管状花（雄ずい）を示す画像である。
【図４】実施例１において不稔性形質転換体（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２改変体）の集合花（頭花）の全体像である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
≪不稔化植物の製造方法≫
本発明の一実施形態に係る不稔化植物の製造方法は、植物の、以下の（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、以下の（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を、ゲノム編集技術を用いて改変する改変工程を備える方法であり、得られる植物が花粉の生産能を有さない。
（１）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（５）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【００２０】
本実施形態の製造方法によれば、雄性不稔性の植物を製造することができる。
なお、一般に、「雄性不稔」とは、植物個体が有する花器官のうち一部又は全部の雄ずい稔性が失われた状態を意味する。雄ずいの不稔化は、植物体における雄ずいの形態観察により調べてもよく、正常個体の雌ずいと掛け合わせにより種子が形成されるかどうかによっても容易に調べることができる。
本実施形態の製造方法により得られる植物体は、雄ずいが正常に形成されず、花粉を生産できない、又は、雄ずいが他の器官（例えば、花弁等）に置き換わり花粉を生産できないことにより雄性不稔性となっている。
そのため、例えば、自家受粉しやすい植物間で交配種を得る場合に、本実施形態の製造方法を用いて、いずれか一方の植物を雄性不稔とすることで、交配種を容易に作出することができる。
また、本実施形態の製造方法を用いて、植物を雄性不稔とすることで、植物の栽培や遺伝情報の拡散を制御することができる。
【００２１】
なお、本実施形態の製造方法を用いて得られる不稔化植物としては、植物体のみならず、植物体を作出した場合に不稔化されているものであれば、細胞を包含する意味で用いられる。細胞は、組織又は器官の状態であってもよい。本実施形態の製造方法を用いて得られる不稔化植物とは、それらの後代若しくはクローンの生物又は細胞であってもよい。例えば、前記クローンの植物体としては挿し木または挿し芽等により得られた植物体が挙げられる。
【００２２】
＜ＣＡＧ遺伝子＞
被子植物の花の発生を説明するモデルとして、ＡＢＣモデルが知られている。ＡＢＣモデルでは、クラスＡ遺伝子、クラスＢ遺伝子、クラスＣ遺伝子の発現パターンの組合せによって、花器官の発生が制御される。クラスＡ遺伝子単独の発現領域では、萼が形成され、クラスＡ遺伝子とクラスＢ遺伝子の発現領域では、花弁が形成される。クラスＢ遺伝子とクラスＣ遺伝子の発現領域では雄ずいが形成され、クラスＣ遺伝子単独の発現領域では雌ずいが形成される。クラスＣ遺伝子としてはシロイヌナズナの  ＡＧＡＭＯＵＳ  （ＡＧ）が知られている。
しかし、上記モデルはシロイヌナズナやキンギョソウ等の一部の植物種を対象とした研究で明らかにされたものであり、他のあらゆる植物種においても上記モデルが同様に適用できるか、また、どの遺伝子が各クラスの遺伝子として機能しているかは不明である。
【００２３】
キクにおいても、これまでにクラスＣ遺伝子の一つと考えられる遺伝子が単離され、これをターゲットにアンチセンス植物を作出したことが報告されている。しかし、観察された花の形態異常は、極めて軽微なものであった。
【００２４】
発明者らは、栽培ギクであるイエギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）の『セイマリン』から、ＡＧＡＭＯＵＳのアミノ酸配列及び塩基配列に基づいてプライマーを設計し、計１４の遺伝子をクローニングした。これらの遺伝子は、コードされるアミノ酸配列の相同性に基づき、大きく２タイプに分類可能であり、更に４種類に分類可能であることを明らかにした。上記の２タイプを、ＣＡＧ ｔｙｐｅ１及びＣＡＧ ｔｙｐｅ２と名付け、上記の４種類をＣＡＧ ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔ、ＣＡＧ ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇ、ＣＡＧ ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔ、及びＣＡＧ ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇと名付けた。単離した１４遺伝子の上記分類と、各遺伝子にコードされるアミノ酸配列の配列番号を以下の表１に示す。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
本実施形態の製造方法において、標的となるＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子は、上述の（１）〜（３）のいずれかの遺伝子である。
【００２７】
一般に、何らかの生理機能を有するタンパク質は、本来の機能を損なうことなく、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加可能なことが知られている。
上述の（２）の遺伝子がコードするタンパク質では、配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において、欠失、置換又は付加されていてもよいアミノ酸の数は、１〜３０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００２８】
上述の（３）の遺伝子がコードするタンパク質では、配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列との同一性が、９０％以上１００％未満であることが好ましく、９５％以上１００％未満であることがより好ましく、９８％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９９％以上１００％未満であることが特に好ましい。
なお、アミノ酸配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本実施形態の製造方法において、アミノ酸配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られた値を採用できる。本実施形態の製造方法において、アミノ酸配列同士の同一性は、市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ等により得られた値を採用できる。
【００２９】
本実施形態の製造方法において、標的となるＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子は、上述の（４）〜（６）のいずれかの遺伝子である。
【００３０】
上述の（５）の遺伝子がコードするタンパク質では、配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において、欠失、置換又は付加されていてもよいアミノ酸の数は、１〜３０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００３１】
上述の（６）の遺伝子がコードするタンパク質では、配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列との同一性が、９０％以上１００％未満であることが好ましく、９５％以上１００％未満であることがより好ましく、９８％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９９％以上１００％未満であることが特に好ましい。
【００３２】
上述の（１）〜（６）の遺伝子がコードするタンパク質は、転写制御機能を有する。
なお、本明細書において、「転写制御機能」とは、転写因子が有する機能を意味する。タンパク質が転写制御機能を有しているかどうかは、公知の転写因子測定用試薬を用いた手法等により調べることができる。
【００３３】
上述の（１）の遺伝子において、配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、当該アミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもよく、転写制御機能を有する範囲において、当該アミノ酸配列からなるタンパク質に任意の配列が付加されていてもよい。
上述の（４）の遺伝子において、配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、当該アミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもよく、転写制御機能を有する範囲において、当該アミノ酸配列からなるタンパク質に任意の配列が付加されていてもよい。
前記任意の配列とは、例えば、リンカー配列、タグ配列、タンパク質安定化のための修飾配列等が挙げられる。
【００３４】
本実施形態の製造方法で標的となるＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質をコードするものであり、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかのポリヌクレオチドである。
（Ｉ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ＩＩ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、転写制御機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ＩＩＩ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、転写制御機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００３５】
また、本実施形態の製造方法で標的となるＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質をコードするものであり、以下の（ＩＶ）〜（ＶＩ）のいずれかのポリヌクレオチドである。
（ＩＶ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｖ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、転写制御機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ＶＩ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、転写制御機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００３６】
上述の（Ｉ）〜（ＶＩ）に示すポリヌクレオチドがコードするタンパク質としては、上述の（１）〜（６）の遺伝子がコードするタンパク質と同様である。
上述の（Ｉ）及び（ＩＶ）に示すポリヌクレオチドの塩基配列として具体的には、以下に示すとおりである。
【００３７】
上述の（Ｉ）における配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号３９で表される塩基配列であってもよい。
上述の（Ｉ）における配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４０で表される塩基配列であってもよい。
上述の（Ｉ）における配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４１で表される塩基配列であってもよい。
上述の（Ｉ）における配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４６で表される塩基配列であってもよい。
上述の（Ｉ）における配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４９で表される塩基配列であってもよい。
上述の（Ｉ）における配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号５０で表される塩基配列であってもよい。
上述の（Ｉ）における配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号５１で表される塩基配列であってもよい。
【００３８】
前記（ＩＶ）における配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４２で表される塩基配列であってもよい。
前記（ＩＶ）における配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４３で表される塩基配列であってもよい。
前記（ＩＶ）における配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４４で表される塩基配列であってもよい。
前記（ＩＶ）における配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４５で表される塩基配列であってもよい。
前記（ＩＶ）における配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４７で表される塩基配列であってもよい。
前記（ＩＶ）における配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４８で表される塩基配列であってもよい。
前記（ＩＶ）における配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号５２で表される塩基配列であってもよい。
【００３９】
＜改変工程＞
後述の実施例に示すとおり、ゲノム編集技術を用いて、上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又は上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を改変することで、花粉の生産能を有さない雄性不稔性の植物を作出できることを見出した。
【００４０】
なお、本実施形態において、ゲノム編集の対象となる植物としては、標的遺伝子である上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又は上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を有するものであればよい。
前記植物としては、被子植物であることが好ましく、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）の植物であることがより好ましい。キク科の植物としては、例えば、キク、ガーベラ、アスター、ヒマワリ等を挙げることが出来る。好ましいキクの種類としては、一般的に栽培ギク（例えば、輪菊、中ギク、小ギク、スプレーギク、ポットマム等）、イエギク等と称されるＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍが挙げられる。
【００４１】
また、本実施形態において、ゲノム編集の対象となる植物は、植物個体のみのならず細胞を包含する。細胞は、組織又は器官の状態であってもよい。
本実施形態において、ゲノム編集の対象となる植物は、植物体、植物細胞、植物培養細胞、又はカルスであることが好ましい。
【００４２】
また、本明細書において、「改変」とは、標的遺伝子の塩基配列が変化することを意味する。例えば、標的遺伝子の切断、切断後の外因性配列の挿入（物理的挿入又は相同指向修復を介する複製による挿入）による標的遺伝子の塩基配列の変化、切断後の非相同末端連結（ＮＨＥＪ：切断により生じたＤＮＡ末端どうしが再び結合すること）による標的遺伝子の塩基配列の変化（例えば、コーディング領域における１〜全塩基の欠失、置換又は挿入等）等が挙げられる。本実施形態の製造方法によれば、ゲノム編集技術を用いることで、標的遺伝子（具体的には、上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又は上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子）の改変により、標的遺伝子への変異の導入、又は、標的遺伝子の機能を欠損又は抑制することができる。
【００４３】
本実施形態の製造方法では、上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及び上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子のいずれか一方に変異が導入され、又は、機能が欠損又は抑制されることで、花粉の生産能を有さない雄性不稔性の植物体を得ることができる。
【００４４】
ゲノム編集技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮｓ）を用いた方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた方法等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、本実施形態の製造方法において用いられるゲノム編集技術としては、標的遺伝子を高効率で改変できることから、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであることが好ましい。
【００４５】
本実施形態におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた不稔化植物の製造方法について、以下に詳細を説明する。
まず、ゲノム編集の対象となる植物に、Ｃａｓ９及び上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又は上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを導入する。
導入方法としては、例えば、アグロバクテリウム属細菌等のバクテリアを介する方法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法が挙げられる。中でも、導入方法としては、アグロバクテリウム属細菌等のバクテリアを介する方法であることが好ましく、アグロバクテリウム属細菌を介する方法であることがより好ましい。
【００４６】
また、アグロバクテリウム属細菌を介する方法により導入する場合には、まず、宿主であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）へＣａｓ９及びガイドＲＮＡを組み込む必要がある。
組み込む方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウィスカー法等の公知の方法が挙げられる。
【００４７】
［標的配列］
上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又は上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子中の標的配列としては、近傍にＣａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列を有する領域から選定すればよい。
本明細書において、「ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）配列」とは、標的遺伝子（具体的には、上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又は上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子）中に存在し、Ｃａｓ９により認識可能な配列を意味し、ＰＡＭ配列の長さや塩基配列はＣａｓ９の由来となる細菌種によって異なる。
例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓでは「ＮＧＧ」（Ｎは任意の塩基を表す）の３塩基を認識する。
また、例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは２つのＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」（Ｎは任意の塩基を表す）の５〜６塩基をＰＡＭ配列として認識する。
【００４８】
本実施形態の製造方法において、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子中の標的配列として具体的には、配列番号１５〜１８に示す塩基配列が挙げられる。配列番号１５〜１８に示す塩基配列は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔ遺伝子及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇ遺伝子中の塩基配列である。このことから、配列番号１５〜１８に示す塩基配列の全てを標的配列とすることが好ましい。
【００４９】
また、本実施形態の製造方法において、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子中の標的配列として具体的には、配列番号１９〜２２に示す塩基配列が挙げられる。配列番号１９〜２２に示す塩基配列は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔ遺伝子及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子中の塩基配列である。このことから、配列番号１９〜２２に示す塩基配列の全てを標的配列とすることが好ましい。
【００５０】
［Ｃａｓ９］
一般に、「Ｃａｓ９」とは、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成するＣａｓタンパク質ファミリーの一つであり、外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断するエンドヌクレアーゼである。本明細書において、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、ＤＮＡ切断活性を有するものを意味する。
本実施形態の製造方法で用いられるＣａｓ９の種類は特別な限定はなく、Ｃａｓ９のホモログ又は改変体であってもよい。
【００５１】
本実施形態の製造方法で用いられるＣａｓ９として具体的には、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＳｐＣａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに由来するＳａＣａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＳｔＣａｓ９等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５２】
また、本実施形態の製造方法で用いられるＣａｓ９としては、Ｃａｓ９タンパク質であってもよく、Ｃａｓ９をコードする核酸であってもよい。Ｃａｓ９をコードする核酸を導入する場合、Ｃａｓ９をコードする核酸が発現ベクターにコードされている形であってもよい。上述のタンパク質をコードする核酸が発現ベクターにコードされている形で植物細胞又は植物体に導入する場合、導入後、植物細胞又は植物体内において発現させることができる。
【００５３】
発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ウイルスベクター等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしてより具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系のベクター等が挙げられる。特に、植物細胞又植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウム属細菌を介する方法である場合には、ｐＢＩ系又はｐＰＺＰ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとして具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等が挙げられる。ｐＰＺＰ系のバイナリーベクターとして具体的には、例えば、ｐＰＺＰ１００、ｐＰＺＰ２００、ｐＰＺＰ５００、ｐＰＺＰ３４２５等が挙げられる。
【００５４】
植物内に、Ｃａｓ９をコードする核酸を導入する場合、当該核酸は少なくとも核酸導入後に植物が再生可能な組織又は未分化細胞を含む組織において発現されることが好ましい。核酸導入後に植物が再生可能な組織として具体的には、例えば、葉等が挙げられる。未分化細胞を含む組織として具体的には、例えば、カルス、メリステム等が挙げられる。
当該核酸を葉若しくはカルス等において発現させる場合、葉若しくはカルス等において特異的に核酸を発現させる転写調節領域によって、核酸を発現させてもよい。又は、葉若しくはカルス等から成長及び分化した植物体全体で核酸を発現させる恒常的プロモーター等の転写調節領域によって、核酸を発現させてもよい。
恒常的プロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター等が挙げられる。
転写調節領域によって核酸を発現させる方法は公知であり、例えば、発現させるべき核酸をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに、転写調節領域を作動可能に連結されることが挙げられる。
【００５５】
なお、本明細書において、「作動可能に連結されている」とは、前記転写調節領域が核酸の発現を調節可能であることを意味する。
また、「転写調節領域」としては、転写開始や転写効率を制御可能な配列であり、例えば、プロモーター、エンハンサー、応答配列等が挙げられる。
また、「葉、カルス又は植物体全体において転写調節可能な転写調節領域」とは、植物体を構成する細胞において核酸の転写を調節可能であることを意味する。より詳しくは、植物体全体において転写調節可能な転写調節領域とは、前記核酸が、植物体の中でも特に、ゲノム編集後に植物体の再生が可能な組織に作用可能なように転写調節可能な転写調節領域である。
葉、カルス又は植物体全体において転写調節可能な転写調節領域としては、ゲノム編集後に植物体の再生が可能な葉、カルス又は植物体全体において遺伝子の発現をもたらし得る転写調節領域が好ましく、葉又はカルスにおいて特異的に核酸の発現をもたらし得る転写調節領域がより好ましい。
【００５６】
［ガイドＲＮＡ］
一般に、「ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ；ｇＲＮＡ）」とは、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成する、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ）と該ｃｒＲＮＡと一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを融合させたｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラのヘアピン構造を模倣したものを意味する。
本実施形態の製造方法で用いられるｇＲＮＡは、ガイド配列（具体的には、標的遺伝子である上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又は上述のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子中の標的配列）を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが融合した状態で合成されたｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラであってもよい。又は、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを別々に作製し、導入前にアニーリングしてｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラとしたものであってもよい。又は、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分及びｃｒＲＮＡの融合によって作製される一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。
【００５７】
本実施形態の製造方法で用いられるｇＲＮＡは、標的遺伝子中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは１８塩基以上２６塩基以下、より好ましくは２０塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。さらに、標的遺伝子と非相補的な塩基配列を含み、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
【００５８】
ｇＲＮＡは、単離又は合成されたＲＮＡであってもよく、発現ベクター内に組み込まれたＲＮＡの形であってもよい。発現ベクターとしては、上述のＣａｓ９において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードする核酸の形であってもよく、当該ｇＲＮＡをコードする核酸が発現ベクターにコードされている形であってもよい。
【００５９】
本実施形態の製造方法で用いられるＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡとして具体的には、以下の（ａ）〜（ｄ）の少なくともいずれか一つのｇＲＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１５で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｂ）配列番号１６で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｄ）配列番号１８で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
【００６０】
本実施形態の製造方法で用いられるＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を標的とするｇＲＮＡとして具体的には、以下の（ｅ）〜（ｈ）の少なくともいずれか一つのｇＲＮＡが挙げられる。
（ｅ）配列番号１９で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｆ）配列番号２０で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｇ）配列番号２１で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
（ｈ）配列番号２２で表される塩基配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ
【００６１】
中でも、本実施形態の製造方法で用いられるＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡとしては、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子を高効率で改変し、雄性不稔性を有する植物体を得られることから、上記（ａ）〜（ｄ）のｇＲＮＡを全て用いることが好ましい。又は、上記（ａ）〜（ｄ）のｇＲＮＡに含まれる塩基配列のうち、共通した塩基配列を含むｇＲＮＡを用いることが好ましい。
また、中でも、本実施形態の製造方法で用いられるＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を標的とするｇＲＮＡとしては、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を高効率で改変し、雄性不稔性を有する植物体を得られることから、上記（ｅ）〜（ｈ）のｇＲＮＡを全て用いることが好ましい。又は、上記（ｅ）〜（ｈ）のｇＲＮＡに含まれる塩基配列のうち、共通した塩基配列を含むｇＲＮＡを用いることが好ましい。
【００６２】
≪不稔化植物≫
本発明の一実施形態に係る不稔化植物は、以下の（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、以下の（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が欠損又は抑制されており、花粉の生産能を有さない。
【００６３】
（１）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【００６４】
（４）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（５）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【００６５】
本実施形態の不稔化植物は、上述の不稔化植物の製造方法により得られるものであり、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子のいずれか一方に変異が導入されることで、機能が欠損又は抑制されている。そのため、本実施形態の不稔化植物は、花粉の生産能を有さない雄性不稔性の植物体である。
【００６６】
中でも、本実施形態の不稔化植物としては、以下の（７）〜（８）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子、又は、以下の（９）のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が欠損又は抑制されているものが好ましい。
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（８）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（９）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
【００６７】
本実施形態の不稔化植物において、上記（７）のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能が欠損又は抑制されているものとして、より具体的には、例えば、以下の（１０）〜（１１）のいずれかの変異型ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子を有するもの等が挙げられる。これらは、後述の実施例に示すように、花粉の生産能を有さない雄性不稔性の植物体である。
【００６８】
（１０）配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（１１）配列番号５４で表される塩基配列からなる遺伝子
【００６９】
本実施形態の不稔化植物において、上記（８）のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能が欠損又は抑制されているものとして、より具体的には、例えば、以下の（１２）〜（１３）のいずれかの変異型ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子を有するもの等が挙げられる。これらは、後述の実施例に示すように、花粉の生産能を有さない雄性不稔性の植物体である。
【００７０】
（１２）配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（１３）配列番号５６で表される塩基配列からなる遺伝子
【００７１】
また、本実施形態の不稔化植物において、上記（９）のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が欠損又は抑制されているものとして、より具体的には、例えば、以下の（１４）〜（１５）のいずれかの変異型ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を有するものが挙げられる。これらは、後述の実施例に示すように、花粉の生産能を有さない雄性不稔性の植物体である。
【００７２】
（１４）配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（１５）配列番号５８で表される塩基配列からなる遺伝子
【００７３】
≪ベクター≫
本発明の一実施形態に係るベクターは、Ｃａｓ９をコードする核酸と、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれか一つの核酸、又は、以下の（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の少なくともいずれか一つの核酸と、を含む。
（ｉ）配列番号１５で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｉ）配列番号１６で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｉｉ）配列番号１７で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｖ）配列番号１８で表される塩基配列を含む核酸
（ｖ）配列番号１９で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉ）配列番号２０で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉｉ）配列番号２１で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉｉｉ）配列番号２２で表される塩基配列を含む核酸
【００７４】
本実施形態のベクターによれば、雄性不稔性の植物を製造することができる。
【００７５】
Ｃａｓ９をコードする核酸は、上述の不稔化植物の製造方法において例示されたものと同様である。
【００７６】
上記（ｉ）〜（ｉｖ）に示す核酸は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子中の標的配列を含む核酸、すなわちＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸である。
【００７７】
上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）に示す核酸は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子中の標的配列を含む核酸、すなわちＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸である。
【００７８】
よって、本実施形態のベクターを植物内に導入することで、Ｃａｓ９、及び、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが発現する。そのため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子が改変されて、雄性不稔性の植物を作出することができる。
【００７９】
植物へのベクターの導入方法等は、上述の不稔化植物の製造方法において例示されたものと同様である。
【００８０】
本実施形態のベクターにおいて、上記（ｉ）〜（ｉｖ）に示す４種類の核酸、又は、上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）に示す４種類の核酸を含むことが好ましい。これにより、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を高効率で改変し、雄性不稔性の植物を作出することができる。
【００８１】
また、本実施形態のベクターは、例えば、プロモーター配列を有する核酸、Ｃａｓ９をコードする核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｉ）に示す核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｉｉ）に示す核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｉｉｉ）に示す核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｉｖ）に示す核酸、及びターミネーター配列を有する核酸を含むベクターが挙げられ、これらが上流から順に連結されてなる核酸を含むベクターが好ましい。
【００８２】
又は、本実施形態のベクターは、例えば、プロモーター配列を有する核酸、Ｃａｓ９をコードする核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｖ）に示す核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｖｉ）に示す核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｖｉｉ）に示す核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｖｉｉｉ）に示す核酸、及びターミネーター配列を有する核酸を含むベクターが挙げられ、これらが上流から順に連結されてなる核酸を含むベクターが好ましい。
【００８３】
また、本実施形態のベクターは、Ｃａｓ９をコードする核酸、及び、上記（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれか一つの核酸、又は、上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の少なくともいずれか一つの核酸の他に、薬剤耐性配列等の配列を有していてもよい。
【００８４】
本実施形態のベクターは、周知の遺伝子組み換え技術を用いて、Ｃａｓ９をコードする核酸、及び、上記（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれか一つの核酸、又は、上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の少なくともいずれか一つの核酸を、ベクターに組み込むことで製造可能である。当該核酸を組み込む際には、市販の発現用ベクター作製キットを用いてもよい。
【００８５】
≪ベクターセット≫
本発明の一実施形態に係るベクターセットは、Ｃａｓ９をコードする核酸を含む第１のベクターと、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれか一つの核酸、又は、以下の（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の少なくともいずれか一つの核酸を含む第２のベクターと、を備える。
（ｉ）配列番号１５で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｉ）配列番号１６で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｉｉ）配列番号１７で表される塩基配列を含む核酸
（ｉｖ）配列番号１８で表される塩基配列を含む核酸
（ｖ）配列番号１９で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉ）配列番号２０で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉｉ）配列番号２１で表される塩基配列を含む核酸
（ｖｉｉｉ）配列番号２２で表される塩基配列を含む核酸
【００８６】
本実施形態のベクターセットによれば、雄性不稔性の植物を製造することができる。
【００８７】
Ｃａｓ９をコードする核酸は、上述の不稔化植物の製造方法において例示されたものと同様である。
上記（ｉ）〜（ｉｖ）に示す核酸は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子中の標的配列を含む核酸、すなわちＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸である。
上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）に示す核酸は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子中の標的配列を含む核酸、すなわちＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸である。
【００８８】
よって、本実施形態の第１のベクター及び第２のベクターを植物内に導入することで、Ｃａｓ９、及び、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが発現する。そのため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子が改変されて、雄性不稔性の植物を作出することができる。
植物へのベクターの導入方法等は、上述の不稔化植物の製造方法において例示されたものと同様である。
【００８９】
本実施形態の第２のベクターにおいて、上記（ｉ）〜（ｉｖ）に示す４種類の核酸、又は、上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）に示す４種類の核酸を含むことが好ましい。これにより、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を高効率で改変し、雄性不稔性の植物を作出することができる。
【００９０】
また、本実施形態のベクターセットにおいて、第１のベクターは、例えば、プロモーター配列を有する核酸、Ｃａｓ９をコードする核酸、及びターミネーター配列を有する核酸を含むベクターが挙げられ、これらが上流から順に連結されてなる核酸を含むベクターが好ましい。
また、本実施形態のベクターセットにおいて、第２のベクターは、例えば、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｉ）に示す核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｉｉ）に示す核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｉｉｉ）に示す核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｉｖ）に示す核酸、及びターミネーター配列を有する核酸を含むベクターが挙げられ、これらが上流から順に連結されてなる核酸を含むベクターが好ましい。
【００９１】
また、本実施形態のベクターセットにおいて、第２のベクターは、例えば、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｖ）に示す核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｖｉ）に示す核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｖｉｉ）に示す核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記（ｖｉｉｉ）に示す核酸、及びターミネーター配列を有する核酸を含むベクターが挙げられ、これらが上流から順に連結されてなる核酸を含むベクターが好ましい。
【００９２】
また、本実施形態のベクターセットにおいて、第１のベクター及び第２のベクターは、それぞれＣａｓ９をコードする核酸、及び、上記（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれか一つの核酸、又は、上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の少なくともいずれか一つの核酸の他に、薬剤耐性配列等の配列を有していてもよい。
【００９３】
また、本実施形態のベクターセットは、第２のベクターが上記（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれか一つの核酸を含む場合、上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の少なくともいずれか一つの核酸を含む第３のベクターを備えていてもよい。
又は、本実施形態のベクターセットは、第２のベクターが上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の少なくともいずれか一つの核酸を含む場合、上記（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれか一つの核酸を含む第３のベクターを備えていてもよい。
【００９４】
本実施形態のベクターセットにおいて、第１のベクター及び第２のベクターは、周知の遺伝子組み換え技術を用いて、それぞれＣａｓ９をコードする核酸、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれか一つの核酸、又は、以下の（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の少なくともいずれか一つの核酸を、ベクターに組み込むことで製造可能である。当該核酸を組み込む際には、市販の発現用ベクター作製キットを用いてもよい。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９６】
［実施例１］
１．ベクターの構築
ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子において、それぞれ４箇所の標的配列を選定した。ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の標的配列をｔａｒｇｅｔ  ａ、ｂ、ｃ、及びｄとし、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の標的配列をｔａｒｇｅｔ  ｅ、ｆ、ｇ、及びｈとして、以下の表２に示す。
次いで、以下の表２に示すそれぞれの標的配列にＢｂｓＩサイトが付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ｔａｒｇｅｔ  ａ−１、ｂ−１、ｃ−１、ｄ−１、ｅ−１、ｆ−１、ｇ−１、及びｈ−１）と、その相補鎖からなるオリゴヌクレオチド（ｔａｒｇｅｔ  ａ−２、ｂ−２、ｃ−２、ｄ−２、ｅ−２、ｆ−２、ｇ−２、及びｈ−２）とをそれぞれ混合した。次いで、混合物を９５℃で５分間熱し、ゆっくりと室温に戻してアニーリングさせた。
【００９７】
【表２】
2019062874.tif 000003
【００９８】
次いで、上記のアニーリングさせた２本鎖オリゴヌクレオチドをそれぞれ、ＢｂｓＩ処理したクローニングベクター（ｐＭＲ２１７＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡベクター、ｐＭＲ２１９＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡベクター、ｐＭＲ２０４＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡベクター、及びｐＭＲ２０５＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡベクター）にライゲーションした。
これにより、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１の標的配列を有するクローニングベクターとして、
ｐＭＲ２１７＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１＿ｔａｒｇｅｔ  ａ、
ｐＭＲ２１９＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１＿ｔａｒｇｅｔ  ｂ、
ｐＭＲ２０４＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１＿ｔａｒｇｅｔ  ｃ、及び、
ｐＭＲ２０５＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１＿ｔａｒｇｅｔ  ｄの４種類のプラスミドベクターを得た。
【００９９】
また、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２の標的配列を有するクローニングベクターとして、
ｐＭＲ２１７＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２＿ｔａｒｇｅｔ  ｅ、
ｐＭＲ２１９＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２＿ｔａｒｇｅｔ  ｆ、
ｐＭＲ２０４＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２＿ｔａｒｇｅｔ  ｇ、及び、
ｐＭＲ２０５＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２＿ｔａｒｇｅｔ  ｈの４種類のプラスミドベクターを得た。
これにより、ＡｔＵ６ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流に、ｔａｒｇｅｔ  ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、及びｈ（配列番号１５〜２２）で表される塩基配列がそれぞれ連結された８種類のベクターが得られた。
【０１００】
次いで、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１の標的配列を有する上述の４種類のプラスミドベクター（ｐＭＲ２１７＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１＿ｔａｒｇｅｔ  ａ、ｐＭＲ２１９＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１＿ｔａｒｇｅｔ  ｂ、ｐＭＲ２０４＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１＿ｔａｒｇｅｔ  ｃ、及び、ｐＭＲ２０５＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１＿ｔａｒｇｅｔ  ｄ）をＬＲ反応により、ｐＤｅＣａｓ９＿Ｋａｎベクター（ｐＤｅＣａｓ９；Fauser et al. 2014、の選抜マーカーがハイグロマイシンからカナマイシンに改変されたベクター。）（参考文献１：Fauser F, Schiml S, Puchta H (2014) Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana. Plant J 79: 348-359）に導入し、ｐＤｅＣａｓ９＿Ｋａｎ＿ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１＿４タンデムベクターを作製した。
【０１０１】
また、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２の標的配列を有する上述の４種類のプラスミドベクター（ｐＭＲ２１７＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２＿ｔａｒｇｅｔ  ｅ、ｐＭＲ２１９＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２＿ｔａｒｇｅｔ  ｆ、ｐＭＲ２０４＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２＿ｔａｒｇｅｔ  ｇ、及び、ｐＭＲ２０５＿ｐＤＯＲ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ−ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２＿ｔａｒｇｅｔ  ｈ）についても同様に、ＬＲ反応により、ｐＤｅＣａｓ９＿Ｋａｎベクターに導入し、ｐＤｅＣａｓ９＿Ｋａｎ＿ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２＿４タンデムベクターを作製した。ｐＤｅＣａｓ９＿Ｋａｎ＿ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１＿４タンデムベクター及びｐＤｅＣａｓ９＿Ｋａｎ＿ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２＿４タンデムベクターの基本構成を図１Ａ（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１）及び図１Ｂ（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２）にそれぞれ示す。
【０１０２】
これらのベクターを植物体に導入することで、Ｃａｓ９と、各標的配列に対するガイドＲＮＡとが植物体において発現し、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子を改変することができる。
【０１０３】
２．キク形質転換体の製造
次いで、作製したｐＤｅＣａｓ９＿Ｋａｎ＿ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１＿４タンデムベクター及びｐＤｅＣａｓ９＿Ｋａｎ＿ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２＿４タンデムベクターをそれぞれアグロバクテリウムに導入した。次いで、ベクターを導入したアグロバクテリウムを用いて、アグロバクテリウム法によりイエギクの『セイマリン』に導入し、形質転換体（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２改変体）を作製した。
【０１０４】
３．キク形質転換体の形質観察
次いで、得られた形質転換体（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体）及びコントロールとして準備した野生型のイエギクの管状花の全体像（上）及びそれぞれの管状花の拡大像（下）を図２に示す。図２の管状花の拡大像（下）において、白い矢印は、それぞれの雄ずいにおける花粉の形成有無を示している。
図２から、コントロールである野生型のイエギクでは、雄ずいにおいて花粉が形成されているのが観察された。一方、形質転換体（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体）では、雄ずいにおいて花粉の形成が観察されなかった。
【０１０５】
また、得られた形質転換体（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２改変体）、並びにコントロールとして準備した野生型のイエギクの雄ずいの形態を比較した画像を図３に示す。
図３から、コントロールである野生型のイエギクでは、雄ずいにおいて花粉が形成されているのが観察された。一方、形質転換体（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２改変体）では、雄ずいが発達しておらず、花粉の形成が観察されなかった。
【０１０６】
また、得られた形質転換体（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２改変体）の集合花（頭花）の全体像を図４に示す。
図４から、得られた形質転換体（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２改変体）において、集合花（頭花）全体で花粉の形成が観察されなかった。
【０１０７】
以上のことから、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子をゲノム編集技術により改変することで、雄性不稔性の植物を製造できることが明らかとなった。
【０１０８】
４．変異導入部位の解析
野生型のイエギク及び「２．」で得られた形質転換体（ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２改変体）からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックＰＣＲを行い、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２のゲノムＤＮＡを得た。なお、ゲノミックＰＣＲに使用したプライマーを以下の表３に示す。
【０１０９】
【表３】
2019062874.tif 000004
【０１１０】
次いで、得られたゲノムＤＮＡについてシークエンスを行った。その結果、以下の表４に示す３種の変異の導入が確認された。なお、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体では２種の変異型があり、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２改変体では１種の変異型が確認された。なお、表４において、配列番号６７は、変異型１のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１における５’末端から３５３番目から３７２番目までの塩基配列である。配列番号６８は、変異型２のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１における５’末端から５９８番目から６２０番目までの塩基配列である。配列番号６９は、変異型３のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２における５’末端から４０１番目から４２０番目までの塩基配列である。
【０１１１】
【表４】
2019062874.tif 000005
【０１１２】
ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体のうち、変異型１では、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１をコードする遺伝子（配列番号３９）の５’末端から３６８番目及び３６９番目の塩基が欠損しており、５’末端から３７２番目の塩基がシトシンからグアニンに置換しており、フレームシフトによるアミノ酸変異が生じていた。これにより、変異導入前は２４８アミノ酸からなるタンパク質（配列番号１）が、変異導入後はストップコドンが発生し、１３２アミノ酸からなる短いポリペプチド（配列番号５３）となっていた。なお、変異型１のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１の全長塩基配列を配列番号５４に示す。
【０１１３】
また、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１改変体のうち、変異型２では、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１をコードする遺伝子（配列番号４１）の５’末端から６１９番目の塩基がグアニンからアデニンに置換していた。その結果、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質（配列番号３）のＮ末端から２０７番目のアミノ酸がグリシンからアルギニンとなっており、１アミノ酸変異が生じていた。これにより、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１の機能が欠損又は抑制されたものと推察された。なお、変異型２のＣＡＧ  ｔｙｐｅ１の全長アミノ酸配列を配列番号５５に、全長塩基配列を配列番号５６に示す。
【０１１４】
また、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２改変体である変異型３では、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２をコードする遺伝子（配列番号４２）の５’末端から４０９番目の塩基がシトシンからチミンに置換しており、ナンセンス突然変異が生じていた。これにより、変異導入前は２６５アミノ酸からなるタンパク質（配列番号４）が、変異導入後はストップコドンが発生し、１３７アミノ酸からなる短いポリペプチド（配列番号５７）となっていた。なお、変異型３のＣＡＧ  ｔｙｐｅ２の全長塩基配列を配列番号５８に示す。
【０１１５】
以上のことから、本実施形態の製造方法で得られた雄性不稔性の植物では、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子に各種変異が導入されていることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本実施形態の不稔化植物及びその製造方法、ベクター、並びに、ベクターセットによれば、雄性不稔性の植物を得られる。
【図１Ａ】
2019062874.tif 000006
【図１Ｂ】
2019062874.tif 000007
【図２】
2019062874.tif 000008
【図３】
2019062874.tif 000009
【図４】
2019062874.tif 000010
【配列表】
2019062874000001.app