(57)【要約】      （修正有）【課題】アセンブラ配列を利用して短い標的核酸断片を含有する断片化標的核酸を増幅し、これらの短い断片をそれらの同定及び調査を可能にする長い配列に変換する方法の提供。【解決手段】Ａ．断片化標的核酸をアセンブラ配列と混合する工程；Ｂ．標的核酸断片を含む一群の第一核酸および前記アセンブラ配列を含む一群の第一二本鎖核酸を生成する工程；Ｃ．前記一群の第一核酸から前記アセンブラ配列を解離する工程；Ｄ．一群の第二二本鎖核酸を生成する工程；Ｅ．一群の前記第一核酸及び一群の前記第二核酸を解離する工程；Ｆ．一群の前記第一核酸及び前記第二核酸を３'方向に伸長する工程；並びにＧ．工程ＥおよびＦを繰り返すことにより、前記断片化された標的核酸を増幅する工程を含む、短い標的核酸断片を含有する断片化された標的核酸を増幅する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
短い標的核酸断片を含有する断片化された標的核酸を増幅する方法であって、
Ａ．前記断片化標的核酸をアセンブラ配列と混合する工程であって、前記アセンブラ配列が前記断片化された標的核酸と実質的に相補的である工程；
Ｂ．前記短い標的核酸断片を前記アセンブラ配列にアニーリングし、前記短い標的核酸断片を３'方向にポリメラーゼによって伸長し、一群の第一核酸および前記アセンブラ配列を含む一群の第一二本鎖核酸を生成する工程；
Ｃ．前記一群の第一核酸から前記アセンブラ配列を解離する工程；
Ｄ．前記アセンブラ配列と実質的に同一であり、関連核酸断片に対して、調査対象領域に３'の方向で位置するプライマーを、前記一群の第一核酸にアニールし、前記プライマーをポリメラーゼにより３'方向に伸長し、一群の第二核酸および一群の前記第一核酸を含む一群の第二二本鎖核酸を生成する工程；
Ｅ．一群の前記第一核酸及び一群の前記第二核酸を解離する工程；
Ｆ．一群の前記第一核酸および前記第二核酸を互いに、前記アセンブラ配列とアニーリングし、一群の前記第一及び前記第二核酸を３'方向に伸長する工程；および
Ｇ．工程ＥおよびＦを繰り返すことにより、前記断片化された標的核酸を増幅する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記アセンブラ配列が野生型アセンブラ配列である請求項１記載の方法。
【請求項３】
短い標的核酸断片を含有する断片化された標的核酸を増幅及び検出する方法であって、
Ａ．前記短い標的核酸断片を、前記短い標的核酸断片と前記断片化された標的核酸に実質的に相補的であるアセンブラ配列とを含む混合物中で、前記アセンブラ配列にアニーリングし、そして前記短い標的核酸断片を３'方向にポリメラーゼによって伸長し、一群の第一核酸および前記アセンブラ配列を含む一群の第一二本鎖核酸を生成し、そして必要に応じて前記一群の第一核酸を前記アセンブラ配列から解離する工程；
Ｂ．前記アセンブラ配列と実質的に同一であり、関連核酸断片に対して、調査対象領域の３'方向に位置するプライマーを、前記一群の第一核酸にアニーリングし、そして前記プライマーをポリメラーゼにより３'方向に伸長し、一群の第二核酸および前記一群の第一核酸を含む一群の第二二本鎖核酸を生成し、そして必要に応じて前記一群の第二二本鎖核酸を解離する工程；
Ｃ．一群の前記第一および前記第二核酸を互いに、前記アセンブラ配列とアニーリングし、前記一群の前記第一及び第二核酸を３'方向に伸長する工程；および
Ｄ．ステップＢおよびＣを繰り返すことにより前記断片化された標的核酸を増幅する工程；および
Ｅ．単一ヌクレオチドレベルまで遺伝子変異を検出できるアッセイを使用して増幅された標的核酸を検出する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１５日提出された仮特許出願シリアル６１／７９８,９８４号の非仮特許出願です。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、短い核酸断片を含む断片化された標的核酸を増幅する方法に関する。具体的には、アセンブラテンプレートを利用してこれらの短い核酸をアセンブル及び伸長し、さらなる操作のためのより大きな単位複製配列を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
標的核酸がひどく分解されている種類の試料が多くあり、標準的な分子診断アッセイで検出するのが困難となる。より具体的には、これらの標的核酸は、それらを検出するために使用されるアッセイの「フットプリント」より短いものである。例えば、非常に低いコピー数で標的を検出するためには、標的を増幅することが典型的である。さらに、多くの場合、非常に高度の特異性で標的を検出することが望まれる。多くの場合、これは単一のヌクレオチド変化の解明の場合である。増幅を用いる場合、ＰＣＲ反応と同様に、フォワードプライマー、リバースプライマーおよび検出プローブが存在する。一般に、これらのプライマーおよび検出プローブは最小で約２０ヌクレオチドの長さである。プライマーおよびプローブの重複がないと仮定すると、これらの３つのエレメント（すなわちアッセイのフットプリント）の結合を受け入れるために、標的は少なくとも６０ヌクレオチドの長さであることが必要となる。さらに、検出すべき所望の単一ヌクレオチド変化（ＳＮＶ）は、標的核酸配列中のどこででも発生する可能性がある。信頼できる検出のために、単一核酸変化は増幅された標的核酸の中に位置づけられるべきであり（すなわち、プライマー結合部位の内側にある単位複製配列の領域内）、プローブがこの領域に選択的にハイブリダイズすることを可能とする。これはアッセイの潜在的なフットプリントを、この種の検出のため最小おおよそ１００ヌクレオチド長まで効率的に増加させる。
【０００４】
多くの場合、標的配列内の既知または未知のＳＮＶを検出することは、調べる断片は１６０ヌクレオチド長程度であることが必要である。これは、主に、単位複製配列上のプローブ、プライマーおよびブロッキングプローブの配置のためである。
【０００５】
この要件の課題は、多くの種類の試料が、しばしば標的ＤＮＡまたはＲＮＡの部分的な分解のために、２０〜５０ヌクレオチド長ほどの短い断片を含むことである。ＲＮＡ配列がより容易に分解されるため、これはＲＮＡ配列に典型的である。これも、尿および血液試料、ならびにＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）およびＦＮａ（細針吸引）試料などの関連核酸が保存の際により分解される特定の種類の試料によく見られる。尿の場合、経腎処理のため、尿にたどり着いた核酸は、生来断片サイズが小さい。一般に、腎臓を通過する核酸断片は約２０〜５０ヌクレオチド長またはそれ以下である。
【０００６】
したがって、より効率的かつ正確な検出を可能にするために短い標的断片の長さを伸長する必要がある。これは、伸長された標的短断片は、適切な調査を可能にするために、その短い断片が誘導された当初の配列と同じ配列内容を有することを必要とする。本発明は、この必要性を満たすための方法を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、さらなる操作のためにより大きな単位複製配列を生成するため、標的核酸の短い核酸断片を結合、伸長するアセンブリテンプレートを利用して断片化された標的核酸を増幅するための方法を提供する。
【０００８】
本発明の一実施態様は、長さのため既存の技術で増幅することが困難である短い標的核酸断片を含有する断片化された標的核酸を増幅するための方法である。一実施形態では、断片化された標的核酸は、標的核酸と実質的に相補的な配列を有するが、大きく異なるアセンブラ配列と混合される。一群の短い標的核酸断片はアセンブラ配列にアニーリングされ、短い標的核酸断片は３'方向にポリメラーゼによって伸長され、一群の第一核酸およびアセンブラ配列を含む一群の第一二本鎖核酸を生成する。
【０００９】
一群の第一二本鎖核酸はアセンブラ配列から解離される。一群の第一核酸は、調査されるべき標的領域の５'側（アセンブラセンス）にあるアセンブラ配列の領域と同じ配列を有する第一プライマーにアニールされる。いくつかの例では、プライマー部位はアセンブラ配列のまさに５'−末端に位置する。プライマーは、その３'方向に伸長され、一群の第二核酸を生成する。第一および第二核酸が解離し、再度アセンブラ配列ならびにお互いにアニーリングされ、ポリメラーゼによりそれぞれの３'方向に伸長する。このステップが繰り返され、それにより、短い断片化された標的核酸が、アセンブラ配列の５'側の第一プライマーとアセンブラ配列の最も３'の領域に相補的である標的核酸フラグメントとによりもたらされる境界内で、伸長し、直線的に増幅される。
【００１０】
第二の実施態様では、アセンブリが達成されると、この方法はさらに、アセンブラ配列の存在下で、稀な遺伝的事象を検出することが可能なアッセイ方法を用いて、標的配列に特異的な遺伝子変異体を検出することを含む。
【００１１】
一実施形態では、アセンブラ配列は野生型アセンブラ配列である。
【００１２】
第二実施形態では、アセンブラ配列はゲノムＤＮＡまたは目的の標的に特異的なその一部である。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡまたはその一部はヒトゲノムＤＮＡである。他の実施形態では、ゲノムＤＮＡまたはその一部は、ウイルス、細菌、寄生虫、および真菌等の特定の生物に関連付られる。
【００１３】
第三実施形態では、アセンブラは、標的核酸配列のセグメントおよび/または他の任意であるが既知の配列であってもよい。
【００１４】
第四実施形態では、アセンブラ配列は、変異体ならびに野生型配列の両方の遺伝的変異を保有する。この適用では、アセンブリされると、変異体（遺伝子変異体配列）または野生型配列のいずれもが、アセンブラ配列に対する野生型配列の存在、またはアセンブラ配列に対する遺伝子変異を下流の分析方法を用いて決定することができる。また、並行反応において、野生型および遺伝子変異体コピー罹患率および/またはコピー数を決定することができる。
【００１５】
全ての場合において、アセンブラは、３'伸長を介して標的核酸の短い核酸断片を伸ばすことにより、標的核酸の領域を調べるために設計されている。
【００１６】
第六実施形態において、アセンブラ配列は二本鎖である。
【００１７】
第七実施形態では、アセンブリは、フォワードおよびリバースプライマーの両方を用いてＰＣＲ条件下で行われる。
【００１８】
第八実施形態では、増幅の多数の直線サイクルが、短い核酸断片を、フォワードおよびリバースプライマー両方の存在下で発生する指数関数的な増幅条件下でアセンブラが増幅する機会なしで、直線的にアセンブルするために使用される。
【００１９】
第九実施形態では、アセンブリは、アセンブラにハイブリダイズする短い核酸の能力を補助するために、より低い温度で行われる。一旦アセンブリが生じれば、増幅温度を上昇させてもよいし、他の試薬を指数関数的増幅をサポートするために追加してもよい。
【００２０】
第十実施形態では、二つのアセンブラ反応が、検討目的領域のプライマー３'を用いて、また別の反応において調査すべき目的領域のプライマー５'を用いて実施される。一旦アセンブリが二つの別々の反応混合物において生じれば、それらは、フォワードおよびリバースプライマーの両方を用いる指数関数的増幅反応のために合わせてもよい。
【００２１】
第十一実施形態では、断片化された核酸がより高濃度で存在する場合、アセンブラ反応はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と同時に行われてもよい。
【００２２】
別の実施形態では、アセンブラは、アセンブリのための核酸断片の予想される濃度より１０、１００、１,０００、１０,０００または１００,０００倍過剰である。
【００２３】
本発明の他の態様は、本明細書を通して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】本発明の一つの一態様の概略図である。
【図１−２】図１−１の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本開示全体を通して参照されるすべての特許、特許出願および刊行物は、その全体が本明細書中に参照により組み入れられる。本明細書中の用語の定義が複数ある場合には、本項の定義が優先する。
【００２６】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの多量体型を意味し、少なくとも２、または通常約５〜約２００、またはより一般的には約１００までの長さの、天然および非天然ヌクレオチドを包含する。したがって、この用語は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。また、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性とすることができ、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ホスホロジチオエートヌクレオチド、ホスホルアミデートヌクレオチド、およびメチルホスホネートヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本明細書で使用される用語「標的」、「標的配列」または「標的核酸」は、精製、単離、捕捉、固定化、増幅、同定、検出、定量、質量決定および/または配列決定などが望まれる、目的のポリヌクレオチド配列を含む核酸を意味する。標的配列は、その実際の配列の点では、既知であっても未知であってもよく、合成であってもまたは生物学的試料から得てもよい。
【００２８】
本明細書で使用される用語「プライマー」または「プライマー配列」は、増幅すべき各特定の配列に実質的に相補的であるように選択された配列を含む核酸である。より具体的には、プライマーはそれらのそれぞれの標的にハイブリダイズするために十分に相補的である。したがって、プライマー配列は、標的の正確な配列を反映する必要はない。非相補的な塩基またはより長い配列を、プライマー中に散在させることができるが、プライマー配列が標的核酸の配列に十分に相補的であり、ハイブリダイゼーションおよび伸長が可能であることが条件である。
【００２９】
さらに、プライマーは、ヌクレアーゼ耐性とすることができ、エキソヌクレアーゼによる分解を防止するために修飾されたプライマーを含む。いくつかの実施形態において、プライマーは、３'または５'エキソヌクレアーゼ活性から保護するために修飾されている。そのような修飾には、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの修飾、ホスホロチオエート骨格修飾、ホスホロジチオエート骨格修飾、ホスホロアミデート骨格修飾、メチルホスホネート骨格修飾、３'末端リン酸修飾および３'アルキル置換が挙げられるが、それらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、増幅反応において使用されるプライマーおよび/またはプローブは、１つまたは複数の修飾により、３'および/または５'エキソヌクレアーゼ活性から保護される。
【００３０】
当業者は、標的配列の伸長のために適切であるプライマーを設計し、製造することができる。本明細書で提供される方法および組成物における使用のためのプライマーの長さは、ヌクレオチド配列同一性や、これらの核酸がハイブリダイズされ、またはインビトロでの核酸伸長の間に使用される温度等のいくつかの要因に依存する。特定の配列同一性のプライマーの好ましい長さを決定するのに必要な検討事項は当業者に知られている。
【００３１】
本明細書で使用される用語「ブロッカーオリゴヌクレオチド」または「ブロッカー」は、修飾オリゴヌクレオチドまたは核酸に結合する薬剤、または修飾された核酸に結合する薬剤であって、複製を予防または阻害することができ、増幅反応においてプライマーおよび／またはプローブ中に組み込まれるものを意味する。ブロッカーオリゴヌクレオチドは、２'フルオロ（２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオシド）修飾、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド、またはすべて複製を阻害または防ぐ３'−修飾を有するヌクレオチドを含むことができる。
【００３２】
本明細書で使用される用語「試料」は、限定されるものではないが、生物の任意の部分から得られた血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、涙または唾液、尿、精液、糞便、喀痰、嘔吐物、胃吸引液、気管支吸引液、スワブ（鼻咽頭、直腸、眼、尿生殖器等）、臓器、筋肉、骨髄、ＦＦＰＥ組織、皮膚、腫瘍および/または細胞などのヒトまたは動物から単離された組織または液体；植物材料、細胞、流体等；個々の細菌、細菌の群やその培養物；食品；化粧品；薬/医薬品；バイオプロセスを経由して調製された材料（完成品及び中間原料）；水；限定されるものではないが、土壌、水、空気などの環境試料；上述された源由来の半精製または精製された核酸；限定されるものではないが、次世代配列決定、試料プロセッシング、ヌクレアーゼ消化、制限酵素消化、複製等の配列決定のためのテンプレート形成のようなプロセスの結果である核酸等、を含むが、これらに限定されるものではなく、本質的に所望の標的核酸を含むあらゆる試料を意味する。
【００３３】
本明細書で使用される用語「増幅すること（amplifying）」または「増幅（amplification）」とは、完全な標的核酸配列またはその一部と同一または相補的である核酸鎖、または標的核酸配列の代用として機能するユニバーサル配列を生成するプロセスを意味する。
【００３４】
本明細書で使用される用語「核酸」または「核酸配列」は、標準的なホスホジエステル結合または他の結合によって共有結合された含窒素複素環式塩基または塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含むオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド化合物を意味する。核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、キメラＤＮＡ・ＲＮＡポリマー又はそれらの類似体などが挙げられる。核酸では、骨格は、１つ以上の糖−ホスホジエステル結合、ぺプチド−核酸（ＰＮＡ）結合（国際公開第９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせなどの種々の結合で構成される。核酸中の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または２'メトキシおよび２'ハロゲン化物（２'−F等）置換等の置換を有する類似化合物である。
【００３５】
窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、ｕ）、イソシトシンおよびイソグアニンなどの非天然ヌクレオチド、それらの類似体（例えばイノシン；The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11th ed., 1992）、プリンまたはピリミジン塩基の誘導体（例えば、N4-メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン、デアザ−またはアザ−ピリミジン、様々な化学的な位置のいずれかで変更されたまたは交換された置換基を有するピリミジンまたはプリン、例えば、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ6−メチルグアニン、４−チオ-ピリミジン、4-アミノピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ4−アルキルピリミジン、または非置換または３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンなどのピラゾロ化合物（例えば、米国特許第５,３７８,８２５号明細書、同第６,９４９,３６７号明細書および国際公開第９３／１３１２１号））であればよい。
【００３６】
核酸は、骨格が１つ以上の位置で窒素含有塩基を有さない「脱塩基」位を含むことができる（米国特許第５,５８５,４８１号明細書）。例えば、１つまたは複数の脱塩基位が、独立したオリゴヌクレオチド配列を一緒につなげるリンカー領域を形成することができる。核酸は、従来のＲＮＡおよびＤＮＡに見られるように従来の糖、塩基、および結合のみを含んでいてもよく、従来の構成要素および置換を含むこともできる（例えば、２'メトキシ骨格で連結された通常の塩基、または従来の塩基および１つまたは複数の類似体の混合物を含むポリマー）。この用語は、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含み、ＲＮＡ模倣糖コンフォメーションにおいてロックされた二環式フラノースを有する１つまたは複数のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含み、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ中の相補的な配列のためのハイブリダイゼーション親和性を強化させる（Vester et al., 2004, Biochemistry 43(42):13233-41）。
【００３７】
本明細書中で使用される用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする（hybridize）」、「アニール（anneal）」または「アニーリング（annealing）」は、適切な条件下で、実質的に相補的な配列を有する核酸が、ワトソン・クリック塩基対合によって互いに結合するための能力を意味する。核酸のアニーリングまたはハイブリダイゼーション技術は、本技術分野で周知である。参照：Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. (1989); Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J.(1994)。本明細書で使用される用語「実質的に相補的」は、結合核酸の完全な相補性（いくつかの場合においては同一の配列を意味する）、ならびに核酸の所望の結合を達成するのに十分な相補性の両方を意味する。同様に、用語「相補的なハイブリッド」は、実質的に相補的なハイブリッドを包含する。
【００３８】
核酸配列を増幅する一般的な方法は、本技術分野において、十分に説明され、周知である。そのような方法はいずれも、本発明の方法で用いることができる。一部の実施形態において、増幅は、例えば、VogelsteinおよびKinzler（"Digital PCR," PNAS, 96:9236-9241(1999)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたもののようなデジタルＰＣＲ法を使用する。そのような方法は、標的領域の増幅に先立ち、標的領域を含む試料を希釈することを含む。希釈は、従来のプレート、マルチウェルプレート、ナノウェルへの希釈、及びマイクロパッド上への希釈または微小液滴などを含むことができる。（参照：Beer NR, et al., "On-chip, real time, single copy polymerase chain reaction in picoliter droplets," Anal. Chem. 79(22):8471-8475(2007); Vogelstein and Kinzler, "Digital PCR," PNAS, 96:9236-9241(1999);およびPohl and Shih, "Principle and applications of digital PCR," Expert Review of Molecular Diagnostics, 4(1):41-47 (2004)；これらのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）いくつかの実施形態において、増幅はデジタルＰＣＲによるものである。
【００３９】
いくつかの場合において、標的領域の増幅のために、本発明の方法で使用される酵素には、３'−５'エキソヌクレアーゼプルーフリーディング能力を有するＤＮＡポリメラーゼなどの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。この方法で使用することができる酵素の例としては、AmpliTaq、Phusion HS II、Deep Vent、およびKapa HiFiDNAポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
高忠実度酵素は、標的配列の高忠実度（高精度）増幅を可能にする。いくつかの実施形態において、用いられる酵素は、３'−５'エキソヌクレアーゼプルーフリーディング能力を有するＤＮＡポリメラーゼ等の高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを含む。この方法で使用することができる酵素としては、AmpliTaq、Phusion HS II、Deep Vent、およびKapa HiFiDNAポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
増幅産物は、当業者に公知の多くの方法、例えばこれらに限定されるものではないが、経口、電気化学検出、ゲル分析および配列決定などを用いて分析/検出することができる。さらに、産物は、リアルタイム増幅等の当業者に公知の多くの方法を用いて定量することができる。定量は、アクチンまたはGAPDHなどのいわゆる「ハウスキーピング遺伝子」と、または既知の量で反応に添加できる内部標準と比較することによって標準化することができる。そのような方法は周知であり、SambrookおよびRussell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3nd Ed.)(2001)に記載されている。
【００４２】
本明細書に記載の方法を実行するための機器類は容易に入手可能である。このような機器には、リアルタイムおよびエンドポイントＰＣＲアッセイ、エマルジョンＰＣＲ、固相ＰＣＲ、融解曲線分析、および配列決定分析のための機器が挙げられる。このような機器には、ライフテクノロジーズ7500 Fast Dxリアルタイム機器（高解像度融解曲線分析も可能）および3500x1キャピラリーゲル機器が含まれる。本発明の方法において有用である本技術分野で公知の他の機器も、本発明の方法を実施する際に当業者の使用のために考慮されている。
【００４３】
本発明は、さらなる操作および分析のためのより大きな単位複製配列を生成するため、標的核酸の短い核酸断片を組み合わせ、伸長するアセンブラテンプレートを利用する断片化された標的核酸を増幅するための方法を提供する。標的核酸断片はＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組み合わせであってもよい。
【００４４】
本発明の一実施態様では、アセンブリテンプレートまたはアセンブラ配列は、短い核酸断片をより長い配列に変換するために利用され、それらの識別および調査を可能にする。これは、高度に断片化された核酸試料中に存在する、ＳＮＶｓなどの小さな遺伝的変異を同定しようとするときに特に重要である。これは、目的の短い標的核酸断片配列を、これらの短い配列が伸長のためのプライマーとして機能するより長いアセンブラ配列にハイブリダイズすることにより達成されます。ＳＮＶｓを含む断片化された標的核酸はアセンブラ配列上のプライマーとして使用されるため、ＳＮＶｓは保存され、検出することができる。
【００４５】
例えば、本発明の方法は、長さが短いため既存の技術で増幅することが困難である短い核酸断片を含有する断片化された標的核酸の増幅のために提供される。断片化された標的核酸は、標的核酸と実質的に相補的な配列を有するが、標的核酸とは大きく異なる一本鎖アセンブラ配列と混合される。一群の短い標的核酸断片はアセンブラ配列にアニーリングされ、短い標的核酸断片は３'方向にポリメラーゼによって伸長され、一群の第一核酸およびアセンブラ配列を含む一群の第一二本鎖核酸を生成する。
【００４６】
一群の第一二本鎖核酸はアセンブラ配列から解離される。一群の第一核酸は、調べるべき標的領域の５'側（アセンブラセンス）にあるアセンブラ配列の領域と同じ配列を有する第一プライマーにアニールされる。例えば、目的の領域が医学的に重要な様々な変異と関連付けられるＥＧＦＲ遺伝子である場合、第一プライマーはＥＧＦＲ遺伝子領域の５'（アセンブラセンス）が選択され、第一プライマーに対して３'位（アセンブラセンス）にあるこれらの配列の調査を可能にする。いくつかの例では、第一プライマー部位はアセンブラ配列のまさに５'−末端に位置する。第一および第二核酸が解離される。第一および第二核酸は、その後互いにアニールし、それらはポリメラーゼでそれらの３'−末端から伸長される。同様に、第一核酸がポリメラーゼによりその３'−末端から伸長される場合、第一核酸はアセンブラにアニールすることもできる。同様に、第一プライマーがポリメラーゼによりその３'−末端から伸長される場合、第一プライマーは第一核酸にアニールすることもできる。
【００４７】
この工程が繰り返され、それにより、短い断片化された標的核酸が、アセンブラ配列の５'側の第一プライマーとアセンブラ配列の最も３'の領域に相補的である標的核酸フラグメントとによりもたらされる境界内で、伸長し、直線的に増幅される。所望により、線形増幅を複数回（例えば１０〜１５回、またはそれ以上）実行することができる。これに対応して、伸長された配列および再伸長された配列は、それらの間で、ならびにアセンブラ配列と再結合し、それらの長さを伸長し、より大きな標的核酸配列を生成することができる。プライマーがアセンブラ配列の３'−末端ですべてに配置されていない場合、標的核酸断片からのいくつかの伸長産物は上述の境界より長くなる。
【００４８】
短い標的核酸断片がアセンブラに安定に結合するように、所望の場合、アセンブラ配列（両鎖が存在する場合は複数の配列）への標的核酸断片の最初のアニーリング工程は、より低い温度で行うことができる。伸長の初回または上述したような最初の複数回の後、上述したようにプロセスを完了するために温度を上昇させることができる。
【００４９】
本発明の別の実施態様において、第二プライマーも、第一プライマーの反対方向に設けられ、調査すべき標的核酸領域の３'側（アセンブラセンス）に向けられる。しかし、第二プライマーは、分析下での混合物中に存在する最も３'の断片の位置よりもより３'となることはできない。方法は上記で概説したように進行するが、今回は第二プライマーが、第二プライマー結合部位にまたがるのに十分な長さである第二核酸に結合する。さらに、両方のプライマー部位に及ぶのに十分な長さとなるアセンブリされた断片が指数関数的に増幅される。
【００５０】
この方法の別の実施態様では、アセンブラ配列は二本鎖である。この場合、アセンブラは変性され、標的核酸断片がアセンブラの相補鎖にアニールされる（すなわち、断片がマイナスセンスである場合、それらはアセンブラのプラスセンスにアニールし、そして逆もまた同様である）。この方法は、上述したように進行し、第一および第二核酸を生成する（断片の両センスが存在する場合、第一核酸の両センスが生成されるが、第一プライマーがプラスセンスである場合、プラスセンスの第二核酸のみが生成される）。この時点で、第一および第二核酸は解離し、互いにアニールし（センスが決定するように）、及び/又は第一核酸はアセンブラ配列のプラス鎖にアニールされ、及び／又は第二核酸はアセンブラ配列のマイナス鎖にアニールされ、及び／又は第一プライマーは（反対センスの）第一核酸に結合し、第一及び第二核酸と第一プライマーとはポリメラーゼによってそれぞれの３'方向に伸長される。この工程が繰り返され、それにより短い断片化された標的核酸が伸長され、直線的に増幅される。
【００５１】
この方法の別の実施態様では、アセンブラ配列は二本鎖であり、第二プライマーがプロセスに利用される。この第二プライマーは、設計と用途の点で第一プライマーと類似するが、反応混合物中に今回存在するアセンブラ配列の他の鎖と対して設計される。プロセスは、両センスの第二核酸が生成され、両第二核酸が今度はアセンブラの反対のセンス鎖に結合し、第二プライマーが適切なセンスの第二核酸に結合することを除いて、上述のように進行する。解離、アニーリングおよび伸長の工程を繰り返すことにより断片を伸長し、直線的に増幅する。さらに、第一および第二プライマー両方の存在により、アセンブリされ両方のプライマー部位に及ぶのに十分な長さとなる断片が、指数関数的に増幅される。
【００５２】
この方法の別の実施態様では、アセンブラのプラスおよびマイナスセンス鎖の両方が使用されるが、標的核酸断片を伸長し、直線的に増幅する方法は、二つの異なる試験管で行われ、一方はプラスセンスアセンブラ配列とプラスセンス第一プライマーを含み、一方はマイナスセンスアセンブラ配列とマイナスセンス第二プライマーを含む。反応が完了した後、試験管の内容物は個別に操作でき（例えば指数関数的に増幅される）または合わせて一緒に操作できる（例えば指数関数的に増幅される）。
【００５３】
この方法の別の実施態様では、調査すべき標的核酸の境界内でプライマー対を用いる１つまたは複数のＰＣＲ反応または１つまたは複数の追加のＰＣＲ反応（第一および第二プライマーが既に存在する場合）は、上記のアセンブラ方法のいずれかを用いて同時に行うことができる。
【００５４】
上記の実施態様では、アセンブラ鎖または複数のアセンブラ鎖は、好ましくは標的核酸断片より１０、１００、１,０００、１０,０００、１００,０００またはそれより大きく過剰に好ましく存在する。いくつかの場合には、過剰は１０倍未満である。いくつかの場合には、断片の全てまたは一部は、アセンブラより過剰に存在する。
【００５５】
アセンブラ配列は、断片化された標的核酸と同一の遺伝種に由来し、そして高度に関連付られる。例えば、評価対象の断片化された標的核酸がヒトである場合、目的の領域内にアセンブラ配列は非常に密接に関連するゲノムの標的配列を含む。いくつかの例では、アセンブラはヒトゲノムＤＮＡまたはその一部である。他の場合では、アセンブラ配列は、ウイルス、細菌、寄生虫、および真菌等の特定の生物に関連するゲノムＤＮＡまたはその一部である。いくつかの例では、アセンブラは任意であるが既知の配列である。
【００５６】
アセンブラ配列は天然および合成配列から調製することができる。天然の配列は、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、およびＤＮＡ合成を用いて調製されたDNAまたはその類似体を含む。合成配列は、調製されたＤＮＡ、ＲＮＡまたはその類似体であり、それらがＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ伸長反応のためのテンプレートとして機能する必要がある。一実施形態では、ヒトゲノムＤＮＡがアセンブラ配列として使用される。他の実施形態では、同等のヒト配列が、DNA合成またはクローニング方法を用いて誘導される。典型的には、アセンブラ配列は、野生型および変異配列の両方からわずかな遺伝的多様性を含むが、断片化された標的核酸の遺伝的配列領域に対する特異性が維持されるように、断片化された標的核酸とハイブリダイズするために十分に高い配列相補性を保持する。
【００５７】
別の実施形態では、アセンブラ配列はＳＮＶｓ等珍しい変異を含まない野生型配列である。野生型アセンブラ配列を利用することによりこれらの変異の信頼性の高い検出を可能にする。いずれの場合にも、断片化された標的核酸配列は、高い特異性でアセンブラ配列にハイブリダイゼーションできる適切な相補性を有する。
【００５８】
一旦アセンブリが本発明の方法に従って生じると、今度はより長い標的核酸の分析を、珍しい遺伝的事象や珍しい変異体を検出できるように設計された方法などの、本技術分野で公知の種々の方法（非増幅法および増幅法の両方）を用いて行うことができる。
【００５９】
アセンブリさた標的核酸のその後の分析に使用される方法が、PCRに基づくもの等の増幅に基づく場合、例えば、アセンブラ配列の増幅は、米国特許出願国際公開第２０１２／１５１５６０号に記載されているセレクタアッセイ（Selector assay）により抑制することができる。セレクタアッセイは、変異配列の増幅への影響を最小限しながら、野生型配列を抑制するブロッカーを使用する。このアッセイの適用により、標的種の存在が０．１〜０．０１％またはそれより少ないものに相当する「野生型」バックグラウンドにおいて、稀な突然変異の検出を可能とする。したがってセレクタアッセイを使用すれば、１：１０,０００〜１：１００,０００の有病率における変異部位を検出することができる。アセンブラ配列が野生型配列であろうと、野生型配列の変異体であろうと、アセンブラ配列が既知であるかまたは確定することができる限りにおいて、セレクタアッセイは、アセンブラ配列の増幅を抑制するために利用することができる。
【００６０】
いくつかの例では、アセンブラの配列は標的核酸配列と比較して１つまたは複数のＳＮＶｓを含む。別のアセンブリ後の分析法では、セレクタのようなアッセイは、短い標的配列の関連ＳＮＶｓの増幅を可能にしつつ、アセンブラ配列の増幅を抑制するために使用することができ、別のアッセイは、アセンブラ配列を抑制しつつ、野生型配列を検出するために使用することができる。野生型の存在量と変異体の量を知りたい場合、アセンブラは変異体および野生型の両方とのミスマッチであるものとして製造することができる。潜在的な変異配列はアセンブリすることができ、並びに潜在的な野生型配列も同様である。アセンブラが両方をアセンブリする。セレクタアッセイ（または同等アッセイ）はアセンブラを抑制するが、変異体または野生型を抑制しないよう構成される。対立遺伝子特異的セレクタアッセイは、その後個々のＳＮＶの遺伝子座における変異体の量及び野生型の量を決定するために使用される。抑制は、アセンブリした配列とは異なるアセンブラ配列の領域（例えば１つまたは複数のヌクレオチドの遺伝的変異が見出される領域）に特異的なブロッキングオリゴマーを利用して達成される。
【００６１】
アセンブリ後の分析方法は、１つまたは複数のアセンブラ配列の存在下で行ってもよく、あるいは１つまたは複数のアセンブラ配列は混合物から選択的に除去し、分析を、今度は１つまたは複数のアセンブラ配列が存在しないか、または減少したレベルで存在するなかで行うこともできる。これは、標的核酸と１つまたは複数のアセンブラ配列間の識別をさらに増加させることによって、標的核酸の分析にさらなる利益をもたらす。アセンブラ配列を標的核酸配列から分離するための方法としては、次ものが含まれるがこれらに限定されるものではない：例えば、標的核酸とアセンブラの配列との間に区別可能なサイズの差がある場合の当技術分野で公知の方法（例えばゲル電気泳動、スピンカラム、磁気ビーズ精製技術、濾過および沈殿等）を利用するサイズ分離、またはビオチンおよびストレプトアビジン（例えば、アセンブラ配列をビオチンで予め標識し、アセンブリ後、ストレプトアビジン被覆ミクロスフェアによる特異的捕捉により混合物から除去することができる）、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン抗体（例えば、アセンブラ配列をジゴキシゲニンで予め標識し、アセンブリ後、抗ジゴキシゲニン抗体被覆ミクロスフェアによる特異的捕捉により混合物から除去することができる）、あるいは特定の核酸配列の捕捉（例えば、標的核酸配列に関連しないアセンブラ配列内の配列をミクロスフェア上の相補的配列に結合させ、反応混合物から除去することができる）などによる特異的分離。代替的には、アセンブリされた標的核酸配列を、標識されたヌクレオチド三リン酸または標識されたプライマーなどを介して、アセンブリ工程中に標識することができる。
【００６２】
上述した情報は、装置及び方法の実施形態を製造および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に与えるために設けられており、発明者が自分の発明で考慮する範囲を限定することを意図するものではない。（当業者に明らかである発明を実施するための）上記の態様の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書において引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、種々の方法で引用された洗浄工程の多くは任意であり、2つの核酸鎖をお互いに除去および／または分離するいくつかの工程も同様である。洗浄および／または分離工程の少なくとも一部を実施しないことにより、所望の結果を達成しながら、より速く、より簡単でより経済的なワークフローをもたらす。別の例では、例示の方法における特定のオリゴヌクレオチドおよび／または標的核酸の段階的な添加および／または結合は、併合してもよい。さらに、多種多様なポリメラーゼ、伸長条件及び当業者に公知の他の増幅プロトコルは、上述の方法のにおける様々な工程または工程の組み合わせにおいて使用することができる。当業者に明白である開示された方法への他の自明な変更も本発明に包含される。
【図１−１】
2019176860.tif 000002
【図１−２】
2019176860.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月21日(2019.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
短い標的核酸断片を含有する断片化された標的核酸を増幅する方法であって、
Ａ．前記断片化標的核酸をアセンブラ配列と混合する工程であって、前記アセンブラ配列が前記断片化された標的核酸と相補的である工程；
Ｂ．前記短い標的核酸断片を前記アセンブラ配列にアニーリングし、前記短い標的核酸断片を３'方向にポリメラーゼによって伸長し、標的核酸断片を含む一群の第一核酸および前記アセンブラ配列を含む一群の第一二本鎖核酸を生成する工程；
Ｃ．前記一群の第一核酸から前記アセンブラ配列を解離する工程；
Ｄ．前記アセンブラ配列の５'側末端にある前記アセンブラ配列と同一であり、標的領域に３'の方向で位置するプライマーを、前記一群の第一核酸にアニールし、前記プライマーをポリメラーゼにより３'方向に伸長し、一群の第二核酸および一群の前記第一核酸を含む一群の第二二本鎖核酸を生成する工程；
Ｅ．一群の前記第一核酸及び一群の前記第二核酸を解離する工程；
Ｆ．一群の前記第一核酸および前記第二核酸を互いに、前記アセンブラ配列とアニーリングし、一群の前記第一核酸及び前記第二核酸を３'方向に伸長する工程；および
Ｇ．工程ＥおよびＦを繰り返すことにより、前記断片化された標的核酸を増幅する工程
を含み、
前記アセンブラ配列に相対する標的核酸断片の過剰濃度が、前記標的核酸断片に対して１０、１０２、１０３、１０４又はそれ以上の過剰濃度である
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記アセンブラ配列が野生型アセンブラ配列である請求項１記載の方法。
【請求項３】
短い標的核酸断片を含有する断片化された標的核酸を増幅及び検出する方法であって、
Ａ．前記短い標的核酸断片を、前記短い標的核酸断片と前記断片化された標的核酸に相補的であるアセンブラ配列とを含む混合物中で、前記アセンブラ配列にアニーリングし、そして前記短い標的核酸断片を３'方向にポリメラーゼによって伸長し、標的核酸断片を含む一群の第一核酸および前記アセンブラ配列を含む一群の第一二本鎖核酸を生成する工程；
Ｂ．前記アセンブラ配列の５'側末端にある前記アセンブラ配列と同一であり、標的領域の３'方向に位置するプライマーを、前記一群の第一核酸にアニーリングし、そして前記プライマーをポリメラーゼにより３'方向に伸長し、一群の第二核酸および前記一群の第一核酸を含む一群の第二二本鎖核酸を生成し、そして前記一群の第二二本鎖核酸を解離する工程；
Ｃ．一群の前記第一核酸および前記第二核酸を互いに、前記アセンブラ配列とアニーリングし、前記一群の前記第一核酸及び第二核酸を３'方向に伸長する工程；および
Ｄ．ステップＢおよびＣを繰り返すことにより前記断片化された標的核酸を増幅する工程；および
Ｅ．単一ヌクレオチドレベルまで遺伝子変異を検出できるアッセイを使用して増幅された標的核酸を検出する工程
を含み、
前記アセンブラ配列に相対する標的核酸断片の過剰濃度が、前記標的核酸断片に対して１０、１０２、１０３、１０４又はそれ以上の過剰濃度である
ことを特徴とする方法。
【外国語明細書】
2019176860000001.pdf