(57)【要約】【課題】  酵素法により行う糖化蛋白質の測定方法であって、工程が簡便化された測定方法の提供。【解決手段】  一態様において、下記（１）から（３）を含む、試料中の糖化蛋白質の測定方法であって、下記（２）から（３）を行うために試料と混合する試薬が１つである測定方法に関する。  （１）試料中の蛋白質を変性すること。  （２）試料中の糖化蛋白質とアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。  （３）（１）及び（２）の後の試料の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）から（３）を含む、試料中の糖化蛋白質の測定方法であって、
下記（２）及び（３）を行うために試料と混合する試薬が１つである、測定方法。
（１）試料中の蛋白質を変性すること。
（２）試料中の糖化蛋白質とアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。  （３）（１）及び（２）の後の試料の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
【請求項２】
前記糖化蛋白質量の算出は、前記測定した発色シグナルを所定の換算要素に基づき糖化蛋白質量に換算することを含む、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記糖化蛋白質が、糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンであり、前記蛋白質が、ヘモグロビン又はアルブミンである、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
下記（１）から（４）を含む、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法であって、
下記（１）から（４）を行うために試料と混合する試薬が１つである、測定方法。
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。
（３）（１）及び（２）の後の試料の発色シグナルを測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
（４）（１）及び（２）の後の試料の発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
【請求項５】
下記（０）から（４）を含む、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法であって、
下記（２）から（４）を行うために試料と混合する試薬が１つである、測定方法。
（０）試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。
（３）（１）及び（２）の後の試料の発色シグナルを測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
（４）（１）及び（２）の後の試料の発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
【請求項６】
前記糖化蛋白質量の算出は、前記測定した発色シグナルを所定の換算要素に基づき糖化蛋白質量に換算することを含む、請求項４又は５に記載の測定方法。
【請求項７】
糖化ヘモグロビンが、ヘモグロビンＡ１ｃである、請求項２から６のいずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
前記アマドリアーゼが、糖化蛋白直接型アマドリアーゼである、請求項１から７のいずれかに記載の測定方法。
【請求項９】
添加する試薬が、変性剤、糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及び酸化発色剤を含有する、請求項１から８のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１０】
添加する試薬が、変性剤、糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ、及び還元発色剤を含有する、請求項１から８のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１１】
前記（２）が、試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼと反応によりＮ末端糖化ペプチドを生成させること、及び、Ｎ末端糖化ペプチドとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること、である、請求項２から１０のいずれか記載の測定方法。
【請求項１２】
添加する試薬が、変性剤、プロテアーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及び発色剤を含有する、請求項１から７及び１１のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１３】
添加する試薬が、変性剤、プロテアーゼ、フルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ、及び発色剤を含有する、請求項１から７及び１１のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の測定方法を実行する、糖化ヘモグロビンの測定装置又は測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、糖化蛋白質の測定に関し、より具体的には、アマドリアーゼを用いる糖化蛋白質の測定の方法、装置、システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質とグルコースなどの糖とが共存するとアマドリ化合物が形成されるため、アマドリ化合物量の測定により糖の量を知ることができる。糖の量は、人や動物の血液中や、食品などで測定されている。
特に糖化蛋白質量の測定は、糖尿病の診断や治療において重要である。糖化蛋白質量の測定方法としては、糖化蛋白質量のみを測定する方法や、糖化蛋白質量と蛋白質量を測定して比率を算出する方法などがあり、対象とする蛋白質も、特に限定しない場合や、特定の蛋白質に限定する場合や、特定の蛋白質の特定部位に限定する場合がある。
【０００３】
このような糖化蛋白質量の測定として、フルクトサミン、糖化アルブミン、糖化ヘモグロビン、及び、ヘモグロビンＡ１ｃなどがある。
例えば、フルクトサミンは血清や血漿中の蛋白質又はアルブミンの糖化量を測定し、糖化アルブミンは血清や血漿中のアルブミンの糖化量とアルブミン量の比率を測定する。糖化ヘモグロビンは血液中のヘモグロビンの糖化量を測定するか、ヘモグロビン量との比率を測定する。ヘモグロビンＡ１ｃは血液中のヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端糖化量（ＨｂＡ１ｃ量）を測定するか、ヘモグロビン量との比率を測定する。
これらの糖化蛋白質の測定方法として、糖化アミノ酸や糖化ペプチドに反応するアマドリアーゼを用いた酵素法が一般的に使用される。
【０００４】
フルクトサミンの測定法は特許３０３４６９８（特許文献１）、糖化アルブミンの測定法は特許４３４１８０９（特許文献２）及び特開２００８−２９５３０５（特許文献３）、糖化ヘモグロビン量のみの測定法は特許５８７８０９６（特許文献４）などに示されている。
【０００５】
その中でも、糖化ヘモグロビン比率の測定は、糖尿病の診断や治療において重要である。糖化ヘモグロビンの一つであるヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の測定は特に広く測定されている。
糖化ヘモグロビン比率の測定のためには、糖化ヘモグロビン量とヘモグロビン量を測定する方法が広く使われている。
糖化ヘモグロビン量の測定方法として、糖化アミノ酸や糖化ペプチドに反応するアマドリアーゼを用いた酵素法が一般的に使用されている。アマドリアーゼとしては、過酸化水素などを生成するフルクトシルペプチドオキシダーゼ（特許４２３１６６８、特許文献５）や、デヒドロゲナーゼ活性が向上したフルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ（ＷＯ２０１６−６３９８４、特許文献６）などがある。
【０００６】
従来の酵素法に用いられてきたアマドリアーゼは、糖化アミノ酸から糖化ペプチドに対して基質特異性を有している。このため、糖化ヘモグロビン量をアマドリアーゼにより測定する場合、アマドリアーゼが作用し易いように、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼなどで予め処理して糖化アミノ酸や糖化ペプチドに分解しておく必要があった（ＷＯ２００６−１２０９７６、特許文献７）。糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで分解する場合、測定に用いるアマドリアーゼがプロテアーゼで分解されないために、別の試薬として調製される必要があった。
一方、試料とアマドリアーゼとプロテアーゼとを混合した後にヘモグロビン量を測定することは、Ｈｂが試薬（特にプロテアーゼ）と反応してしまいＨｂの色調が変化すること、及び、アマドリアーゼの作用により糖化ヘモグロビン濃度に応じて生成する発色色素がＨｂの色調に重なって糖化ヘモグロビン値に影響が発生すること、などから困難であった。
【０００７】
酵素法による糖化ヘモグロビン量の測定の試薬は、現状では２試薬系又は３試薬系の試薬が用いられている。２試薬系の試薬の構成としては、以下の構成１〜４が挙げられる。  構成１
第1試薬：アマドリアーゼ、緩衝剤
第2試薬：プロテアーゼ、発色剤、緩衝剤
構成２
第1試薬：プロテアーゼ、緩衝剤
第2試薬：アマドリアーゼ、発色剤、緩衝剤
構成３
第1試薬：アマドリアーゼ、発色剤、緩衝剤
第2試薬：プロテアーゼ、緩衝剤
構成４
第1試薬：プロテアーゼ、発色剤、緩衝剤
第2試薬：アマドリアーゼ、緩衝剤
【０００８】
近年、アマドリアーゼが改良され、糖化蛋白質に対して基質特異性を有する（糖化蛋白質に直接作用する）アマドリアーゼが発見されるに至った（以下、「糖化蛋白直接型アマドリアーゼ」ともいう）（ＷＯ２０１５−００５２５７（特許文献８）及びＷＯ２０１５−０６０４２９（特許文献９））。糖化蛋白直接型アマドリアーゼを用いた糖化ヘモグロビン量の測定方法としては、例えば、下記（i）〜（ｉｉ）の工程を順次行うことを含む測定方法が開示されている。
（ｉ）試料中の糖化ヘモグロビンに糖化蛋白直接型アマドリアーゼに作用させて糖化ヘモグロビンを酸化する工程。
（ｉｉ）上記工程（ｉ）で生成された物質、又は、消費された物質を測定する工程。
【０００９】
なお、ヘモグロビン量の測定は、ヘモグロビンのヘムの赤色を測定する方法が用いられる。ヘモグロビンは酸化型や還元型があり、型によってヘムの荷電状態が変化し、スペクトルが変化するため、ある一定の型にするための変性剤を用いる必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許３０３４６９８号公報
【特許文献２】特許第４３４１８０９号公報
【特許文献３】特開２００８−２９５３０５号公報
【特許文献４】特許第５８７８０９６号公報
【特許文献５】特許第４２３１６６８号公報
【特許文献６】ＷＯ２０１６−６３９８４
【特許文献７】ＷＯ２００６−１２０９７６
【特許文献８】ＷＯ２０１５−００５２５７
【特許文献９】ＷＯ２０１５−０６０４２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
２試薬系の酵素法試薬で糖化蛋白質比率の測定を行う場合、２つの溶液を順次添加する工程が存在する。すなわち、試料と第１試薬とを混合する工程と、そこに第２試薬を混合する工程の２つの工程である。このため、２試薬系の試薬で糖化蛋白質比率の測定方法は、工程が煩雑であった。また、２工程あることで、分注や混合などの作業の時間がかかり時間短縮が難しい。
【００１２】
本開示は、一態様において、酵素法により行う糖化蛋白質の測定方法であって、工程が簡便化された測定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本開示は、一態様において、下記（１）から（３）を含む、試料中の糖化蛋白質の測定方法であって、下記（２）及び（３）を行うために試料と混合する試薬が１つである測定方法に関する。以下、この測定法方法を「本開示に係る測定方法」ともいい、下記（２）及び（３）を行うために試料と混合する試薬を「１試薬系試薬」ともいう。なお、本開示において、１試薬系試薬は、下記（１）から（３）を行うために試料と混合する試薬であってもよい。
（１）試料中の蛋白質を変性すること。
（２）試料中の糖化蛋白質とアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。  （３）（１）及び（２）の後の試料の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
【００１４】
本開示は、他の一態様において、本開示に係る測定方法を実行する、糖化蛋白質の測定装置又は測定システムに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本開示によれば、例えば、酵素法により行う糖化蛋白質の測定方法の工程を簡便化できる。本開示によれば、例えば、溶血試料に２試薬又は３試薬を添加する工程を、１試薬を混合する工程とすることができる。これにより、例えば、ヘモグロビンＡ１ｃ比率（ＨｂＡ１ｃ％）の測定にかかる時間を短縮できる。また、例えば、１試薬の混合であるから、糖化ヘモグロビン量の測定もヘモグロビン量の測定も同一の溶液内で行うことができるから、測定の正確性や精度を向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本開示に係る測定方法を実行する糖化蛋白質の測定装置又は測定システムの一例の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示において、糖化蛋白質の測定とは、一実施形態において、糖化蛋白質量を測定することを含み、その他の一実施形態において、糖化蛋白質量及び蛋白質量を測定することを含み、さらにその他の一実施形態において、糖化蛋白質量及び蛋白質量を測定してそれらの比を求めることを含みうる。
本開示において、「蛋白質」は、特に言及のない場合、「糖化蛋白質」を含みうる。
【００１８】
本開示において、１試薬系試薬の「試料との混合」は、試料へ１試薬系試薬を添加すること、及び、１試薬系試薬へ試料を添加することを含む。
本開示に係る測定方法は、一又は複数の実施形態において、蛋白質の変性、糖化蛋白質とアマドリアーゼとの反応、発色剤を発色、発色剤の吸光度の測定、及び、選択的に、変性した蛋白質の吸光度の測定が、試料と１試薬系試薬との一回の混合で、かつ、１容器（例えば、測光セル）内で行うことができる。
【００１９】
本開示において、１試薬系試薬により試料中の蛋白質を変性することとは、１試薬系試薬が試料中の蛋白質を変性し得る変性剤（又は変性作用を有する物質）を含むことをいう。後述するように、混合前の試料は、溶血等のために界面活性剤（変性剤）を含んでいてもよい。
【００２０】
本開示に係る測定方法において測定する糖化蛋白質は、フルクトサミン、糖化アルブミン、糖化ヘモグロビンなどが挙げられ、一実施形態において、糖化アルブミン又は糖化ヘモグロビンである。糖化ヘモグロビンとしては、Ｈｂβ鎖Ｎ末端が糖化されたヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）が挙げられる。
【００２１】
本開示に係る測定対象試料は、糖化蛋白質を含む試料が挙げられる。糖化蛋白質が糖化ヘモグロビンの場合、測定対象試料としては、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを含む試料が挙げられる。測定対象試料は、限定されない一又は複数の実施形態において、全血、血球等の赤血球を含む試料や、該試料を溶血させた試料が挙げられる。測定対象試料が赤血球を含む試料である場合、１試薬系試薬で溶血してもよく、１試薬系試薬とは別の手段で溶血させて溶血試料としてもよい。赤血球の溶血は既存の方法で実施できる。例えば、浸透圧を用いる方法（例、水）、界面活性剤を用いる方法、凍結する方法、超音波を用いる方法などがある。界面活性剤などの変性作用を有する物質を用いれば、溶血とともに蛋白質の変性も行える。
【００２２】
試料の発色シグナルからのＨｂＡ１ｃ等の糖化蛋白質量やヘモグロビン等の蛋白質量の算出は、一又は複数の実施形態において、公知の方法により行うことができる。
【００２３】
よって、本開示は、一態様において、下記（１）から（４）を含む、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法であって、下記（１）から（４）を行うために試料と混合する試薬が１つである測定方法に関する。
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。
（３）（１）及び（２）の後の試料の発色シグナルを測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
（４）（１）及び（２）の後の試料の発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
【００２４】
また、測定対象試料が赤血球を含む試料である場合には、１試薬系試薬とは別の手段で溶血及びヘモグロビンの変性を行ってもよい。すなわち、本開示は、一態様において、下記（０）から（４）を含む、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法であって、下記（２）から（４）を行うために試料と混合する試薬が１つである測定方法に関する。
（０）試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。
（３）（１）及び（２）の後の試料の発色シグナルを測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
（４）（１）及び（２）の後の試料の発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
【００２５】
［糖化蛋白直接型アマドリアーゼを用いた実施形態］
本開示に係る測定方法は、一実施形態において、アマドリアーゼとして糖化蛋白質に対して基質特異性を有する（糖化蛋白質に直接作用する）アマドリアーゼ（糖化蛋白直接型アマドリアーゼ）を使用する。
本開示において、「糖化蛋白直接型アマドリアーゼ」は、糖化蛋白質をプロテアーゼ等によりペプチドに分解しなくても糖化蛋白質の糖化部分を基質として反応可能なアマドリアーゼをいう。
【００２６】
糖化蛋白直接型アマドリアーゼとしては、糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ（直接型ＦＰＯＸ）、及び、糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ（直接型ＦＰＤＨ）が挙げられる（特許文献８及び９）。
【００２７】
［直接型ＦＰＯＸを用いる実施形態Ａ］
本開示に係る測定方法は、限定されない実施形態Ａにおいて、下記（１）から（４）を含み、下記（１）から（４）を行うために、あるいは、下記（２）から（４）を行うために、１つの試薬（１試薬系試薬）と試料とを混合することを含む、糖化蛋白質の測定方法である。
（１）試料中の蛋白質を変性すること。
（２）試料中の糖化蛋白質と直接型ＦＰＯＸとの反応により過酸化水素を生成させること。
（３）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）との反応により酸化発色剤を発色させること。
（４）発色した酸化発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
【００２８】
限定されない一又は複数の実施形態において、実施形態Ａにおける１試薬系試薬として、下記構成Ａ１〜Ａ３が挙げられる。但し、本開示に係る試薬は、これらの実施形態には限定されない。１試薬系試薬は、さらにその他の成分を含んでもよい。
構成Ａ１
１試薬系試薬：緩衝剤、変性剤、直接型ＦＰＯＸ、ＰＯＤ、酸化発色剤
構成Ａ２
１試薬系試薬：緩衝剤、直接型ＦＰＯＸ、ＰＯＤ、酸化発色剤
構成Ａ３
１試薬系試薬：緩衝剤、直接型ＦＰＯＸ、ＰＯＤ、ロイコ型色素、下記式（Ｉ）の化合物
【化１】
2019062890.tif 000002
式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数８−１７の炭化水素基を表す。
【００２９】
実施形態Ａにおける緩衝剤としては、中性付近に調整でき、反応系を損なわないものが使用できる。緩衝剤の限定されない例として、N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid（ＢＥＳ）、3-Morpholinopropanesulfonic acid（ＭＯＰＳ）、N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid（ＴＥＳ）、2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid（ＨＥＰＥＳ）、N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine（ＴＲＩＣＩＮＥ）、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)（ＰＩＰＥＳ）、Piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid)dehydrate（ＰＯＰＳＯ）、炭酸、リン酸、ホウ酸、グリシン、アラニン、ロイシン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、タウリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、プロリン、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、バリン、システイン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、オルニチン、トリプトファン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ジメチルアミノエタノール、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、Ｎ−メチルアミノエタノール、クレアチニン、イミダゾール、バルビタール、アンモニア、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等が挙げられる。
【００３０】
実施形態Ａにおけるペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）は、過酸化水素と反応して発色基質であるロイコ型色素などの酸化発色剤を発光させるものを使用できる。ＰＯＤが由来する生物種などは特に限定されない。限定されない例として、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼが挙げられる。
【００３１】
実施形態Ａの構成Ａ１における変性剤は、蛋白質を変性でき、酵素の活性を大きく損なわないものを使用できる。変性剤の限定されない例として、下記（１）から（８）が挙げられる。なお、（１）〜（７）は亜硝酸と併用してもよい。
（１）３−ラウリルジメチルアミノ酪酸
（２）３−ミリスチルジメチルアミノ酪酸
（３）ラウリルジメチルアミノプロパンスルホン酸
（４）ミリチルジメチルアミノプロパンスルホン酸
（５）ラウリルアミドプロピルジメチルアミノ酪酸
（６）ミリスタミドプロピルベタイン
（７）ｎ−ドデシル−βＤ−マルトシド
（８）ＷＳＴ−３（２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）
【００３２】
実施形態Ａの構成Ａ１及びＡ２における酸化発色剤は、糖化ヘモグロビン量、ヘモグロビン量の測定を行う場合、ロイコ型色素が好ましい。
前記ロイコ型色素としては、例えば、入手が容易なＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ−６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ−６７）、２，２'−アミノビス（３−エチルベンゾチアゾリノン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、ビス−（４−ジエチルアミノフェニル）−２−スルフォフェニルメタン（ＢＳＰＭ）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、ｏ−トリジン、３，３'−ジアミノベンジジン・４ＨＣｌ（ＤＡＢ）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（ＨＰＰＡ）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン・Ｎａ（ＴＭＢＺ−ＰＳ）、Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン・６Ｎａ（ＴＰＭ−ＰＳ）等が挙げられる。
【００３３】
実施形態Ａの構成Ａ１及びＡ２における酸化発色剤は、フルクトサミンや糖化アルブミンの測定の場合は、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、又は、ロイコ型色素を用いることができる。
トリンダー試薬の水素供与体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等が使用可能であり、具体例として、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリンナトリウム１水（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリンナトリウム１水（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム１水（ＭＡＯＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム１水（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム１水（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリンナトリウム（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリンナトリウム１水（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリンナトリウム２水（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン２ナトリウム（ＴＯＤＢ）等が挙げられる。
【００３４】
実施形態Ａの構成Ａ１及びＡ２は、さらに、色素安定剤、例えば、還元剤や界面活性剤などを含んでもよい。
【００３５】
実施形態Ａの構成Ａ３においては、変性剤と色素安定剤の２つの機能を発揮しうる式（Ｉ）の化合物が含まれる。式（Ｉ）において、Ｒの炭素数は、酵素法測定を阻害しない観点及びロイコ型色素の安定性向上の観点から、８から１７が好ましく、１２から１６がより好ましく、１４がさらに好ましい。Ｒの炭化水素基は、同様の観点から、アルキル基が好ましく、直鎖アルキル基が好ましい。Ｒは、同様の観点から、ドデシル基及びテトラデシル基が好ましく、テトラデシル基がより好ましい。
【００３６】
実施形態Ａにおける測定対象試料は、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを含む試料が挙げられる。測定対象試料は、限定されない一又は複数の実施形態において、全血、血球等の赤血球を含む試料や、該試料を溶血させた試料が挙げられる。測定対象試料が赤血球を含む試料である場合、１試薬系試薬で溶血してもよく、１試薬系試薬とは別の手段で溶血させて溶血試料としてもよい。赤血球の溶血は既存の方法で実施できる。例えば、浸透圧を用いる方法（例、水）、界面活性剤を用いる方法、凍結する方法、超音波を用いる方法などがある。
【００３７】
本開示において発色シグナルとしては、一又は複数の実施形態において、吸光度、反射率及び透過率等が挙げられる。
【００３８】
糖化蛋白質量の算出は、一又は複数の実施形態において、測定により得られた発色シグナルを、所定の換算要素に基づき糖化蛋白質量に換算することを含む。所定の換算要素に基づく糖化蛋白質量の換算は、一又は複数の実施形態において、測定により得られた吸光度等の発色シグナルを、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの換算ルールに基づいて糖化蛋白質量に換算することにより行うことができる。（ｉｖ）は、（ｉ）〜（ｉｉｉ）と組み合わせて行ってもよい。
（ｉ）試料中にある既知の検量物質に基づき検量線を求め、ＨｂＡ１ｃ由来の吸光度を検量線に基づきＨｂＡ１ｃ量に換算すること
（ｉｉ）発色色素を検量物質（校正用物質）とし、発色色素の検量線を求め、発色色素の吸光度を該発色色素の検量線に基づき糖化蛋白質量に換算すること
（ｉｉｉ）異なる波長で求めた吸光度比をとって、吸光度比に対する検量線に基づき糖化蛋白質量に換算すること
（ｉｖ）試料と試薬との混合直後及び混合から所定の時間経過後に測定した吸光度の差を取って吸光度変化量を求め、吸光度変化量に対する検量線に基づき糖化蛋白質量に換算すること
（ｉ）における既知の検量物質としては、一又は複数の実施形態において、既知量のＨｂＡ１ｃを含む校正用標準物質が挙げられる。既知量のＨｂＡ１ｃを含む校正用標準物質としては、一又は複数の実施形態において、全血又は血球の凍結品、それらを精製したＨｂＡ１ｃを含むＨｂ溶液、又はそれらに緩衝液組成物及びＨｂの安定剤等を含む物質等が挙げられる。既知の検量物質としては、一又は複数の実施形態において、公的機関が提供している一次標準物質又は常用標準物質、キットに付属している校正物質等が挙げられる。
（ｉｖ）における混合直後としては、一又は複数の実施形態において、試料と試薬との混合から５秒〜３０秒程度が挙げられる。所定の時間経過後としては、一又は複数の実施形態において、試料と試薬との混合から１分〜３分程度が挙げられる。
なお、上記形態では、発色シグナルが吸光度である場合の一例であって、吸光度以外の反射率及び透過率であっても同様に行うことができる。
【００３９】
実施形態Ａにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率（ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率）を測定する実施形態Ａａとして、下記（１）から（５）を含み、下記（１）から（５）を行うために１つの試薬（１試薬系試薬）と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Ａａ
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンと直接型ＦＰＯＸとの反応により過酸化水素を生成させること。
（３）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）との反応によりロイコ型色素を発色させること。
（４）発色したロイコ型色素の発色シグナルを測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
（５）変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
【００４０】
実施形態Ａにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率（ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率）を測定する実施形態Ａｂとして、下記（０）から（５）を含み、下記（２）から（５）を行うために１つの試薬（１試薬系試薬）と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Ａｂ
（０）試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンと直接型ＦＰＯＸとの反応により過酸化水素を生成させること。
（３）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）との反応によりロイコ型色素を発色させること。
（４）発色したロイコ型色素の発色シグナルを測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
（５）変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
【００４１】
実施形態Ａａ及びＡｂは、さらに、糖化ヘモグロビン量とヘモグロビン量とから糖化ヘモグロビン比率を算出することを含みうる。
また、実施形態Ａａ及びＡｂにおいて、糖化ヘモグロビンは、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンＡ１ｃである。
【００４２】
実施形態Ａにおける測定対象が糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質（例えば、糖化アルブミンなど）であり、糖化蛋白質比率（蛋白質量に対する糖化蛋白質量の比率）を測定する場合、一又は複数の実施形態において、本開示に係る測定で得られる糖化蛋白質量と、別の方法で得られる蛋白質量から糖化蛋白質比率を求めることができる。糖化ヘモグロビン比率もこの方法で求めてもよい。
蛋白質量を求める方法は、例えば、ビウレット反応法、Ｆｏｌｉｎ ｐｈｅｎｏｌ試薬を用いたＬｏｗｒｙ法、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０を用いたＢｒａｄｆｏｒｄ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）法などが挙げられ、アルブミンの場合には、ＢＣＧ法やＢＣＰ法が挙げられる。
【００４３】
［実施形態Ａの用事調製形態］
実施形態Ａにおける１試薬系試薬は、流通段階では試薬の安定性の観点などから、１つの試薬でなくてもよい。本開示に係る測定方法を行う段階で用事調製してもよい。このような実施形態における１試薬系試薬を調製するための、限定されない２試薬の構成として下記構成Ａ４からＡ９が挙げられる。但し、本開示に係る試薬は、これらの実施形態には限定されない。試薬は、さらにその他の成分を含んでもよい。
構成Ａ４
試薬１：緩衝剤、変性剤、直接型ＦＰＯＸ、ＰＯＤ
試薬２：緩衝剤、酸化発色剤
構成Ａ５
試薬１：緩衝剤、直接型ＦＰＯＸ、ＰＯＤ
試薬２：緩衝剤、変性剤、酸化発色剤
構成Ａ６
試薬１：緩衝剤、ＰＯＤ
試薬２：緩衝剤、変性剤、直接型ＦＰＯＸ、酸化発色剤
構成Ａ７
試薬１：緩衝剤、変性剤、ＰＯＤ
試薬２：緩衝剤、直接型ＦＰＯＸ、酸化発色剤
構成Ａ８
試薬１：緩衝剤、直接型ＦＰＯＸ、ＰＯＤ
試薬２：緩衝剤、酸化発色剤
構成Ａ９
試薬１：緩衝剤、ＰＯＤ
試薬２：緩衝剤、直接型ＦＰＯＸ、酸化発色剤
【００４４】
実施形態Ａの構成Ａ４からＡ９は、さらに、色素安定剤、例えば、還元剤や界面活性剤などを含んでもよい。また、構成Ａ４からＡ９における緩衝剤、変性剤、酸化発色剤は、上述のものが使用できる。また、構成Ａ４からＡ９において、変性剤及び／又は色素安定剤は、式（Ｉ）の化合物であってもよい。
【００４５】
本開示において「用事調製形態」とは、１又は複数の試料について本開示に係る測定方法をする場合に、１又は複数の試料用に、複数の試薬から１試薬系試薬を調製することを含む形態をいう。
【００４６】
［直接型ＦＰＤＨを用いる実施形態Ｂ］
本開示に係る測定方法は、限定されない実施形態Ｂにおいて、下記（１）から（３）を含み、下記（１）から（３）を行うために、あるいは、下記（２）から（３）を行うために、１つの試薬（１試薬系試薬）と試料とを混合することを含む、糖化蛋白質の測定方法である。
（１）試料中の蛋白質を変性すること。
（２）試料中の糖化蛋白質と直接型ＦＰＤＨとの反応により還元発色剤を発色させること。
（３）発色した還元発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
【００４７】
限定されない一又は複数の実施形態において、実施形態Ｂにおける１試薬系試薬として、下記構成Ｂ１及びＢ２が挙げられる。但し、本開示に係る試薬は、これらの実施形態には限定されない。１試薬系試薬は、さらにその他の成分を含んでもよい。
構成Ｂ１
１試薬系試薬：緩衝剤、変性剤、直接型ＦＰＤＨ、還元発色剤
構成Ｂ２
１試薬系試薬：緩衝剤、直接型ＦＰＤＨ、還元発色剤
【００４８】
実施形態Ｂにおける緩衝剤、変性剤、及び測定対象試料は、実施形態Ａと同様である。
【００４９】
実施形態Ｂにおける還元発色剤としては、テトラゾリウム塩などが使用できる。
テトラゾリウム塩としては、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド＜略称テトラゾリウムバイオレット＞、３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ビフェニレン）−ビス［２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド］＜略称ニトロブルーテトラゾリウム＞、３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ビフェニレン）−ビス（２，５−ジフェニルテトラゾリウムクロリド）＜略称ブルーテトラゾリウム＞、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド＜略称ＭＴＴ＞、３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−テトラゾリウムクロリド、２，２′，５，５′−テトラ−（ｐ−ニトロフェニル）−３，３′−（３−ジメトキシ−４−ジフェニレン）−ジテトラゾリウムクロリド＜略称ニトロブルーテトラゾリウム＞、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド、３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ビフェニレン）−ビス−［２，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）テトラゾリウムクロリド］、３，３′−（４，４′−ビフェニレン）−ビス（２，５−ジフェニルテトラゾリウムクロリド）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩化物＜略称ＩＮＴ＞、３，３′−［３，３′−ジメトキシ−（１，１′−ビフェニル）−４，４′−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル］−２Ｈテトラゾリウム塩化物＜略称ニトロ−ＴＢ＞、２−ベンゾチアゾイル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチルカルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム＜略称ＷＳＴ−４＞、２，２′−ジベンゾチアゾイル−５，５′−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ジフェニレン）ジテトラゾリウム２ナトリウム塩＜略称ＷＳＴ−５＞などが挙げられる。
これらの中でも、ＷＳＴ−４及びＷＳＴ−５は、水溶性が高く試薬として調整しやすい上に、長波長域に吸収を有しておりヘモグロビンなどの蛋白質の吸収の影響を受け難い特徴がある。
【００５０】
実施形態Ｂの構成Ｂ１及びＢ２は、さらに、色素安定剤が含まれてもよい。色素安定剤としては、アジ化ナトリウム（WO2003/029229）、ｐＨ調整剤（特開2009-072136）などが挙げられる。
【００５１】
実施形態Ｂの構成Ｂ１及びＢ２には、電子伝達剤が含まれてもよい。電子伝達剤としては、ジアホラーゼ、Ｎ−メチルフェナジン・メトサルフェート類（例えばＮ−メチルフェナジン・メトサルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジン・メトサルフェート（１−メトキシＰＭＳ）等）、メルドラブルー、メチレンブルーなどが挙げられる。
【００５２】
実施形態Ｂにおける発色シグナル及び糖化蛋白質量の測定は、実施形態Ａと同様である。
【００５３】
実施形態Ｂにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率（ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率）を測定する実施形態Ｂａとして、下記（１）から（４）を含み、下記（１）から（４）を行うために１つの試薬（１試薬系試薬）と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Ｂａ
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンと直接型ＦＰＤＨとの反応により還元発色剤を発色させること。
（３）発色した還元発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
（４）変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
【００５４】
実施形態Ｂにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率（ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率）を測定する実施形態Ｂｂとして、下記（０）から（４）を含み、下記（２）から（４）を行うために１つの試薬（１試薬系試薬）と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Ｂｂ
（０）試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンと直接型ＦＰＤＨとの反応により還元発色剤を発色させること。
（３）発色した還元発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
（４）変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
【００５５】
実施形態Ｂａ及びＢｂは、さらに、糖化ヘモグロビン量とヘモグロビン量とから糖化ヘモグロビン比率を算出することを含みうる。
また、本実施形態Ｂａ及びＢｂにおいて、糖化ヘモグロビンは、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンＡ１ｃである。
【００５６】
実施形態Ｂにおける測定対象が糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質（例えば、糖化アルブミンなど）であり、糖化蛋白質比率（蛋白質量に対する糖化蛋白質量の比率）を測定する場合、一又は複数の実施形態において、本開示に係る測定で得られる糖化蛋白質量と、別の方法で得られる蛋白質量から糖化蛋白質比率を求めることができる。糖化ヘモグロビン比率もこの方法で求めてもよい。蛋白質量を求める方法は、例えば、上述したものがあげられる。
【００５７】
［実施形態Ｂの用事調製形態］
実施形態Ｂにおける１試薬系試薬は、流通段階では試薬の安定性の観点などから、１つの試薬でなくてもよい。本開示に係る測定方法を行う段階で用事調製してもよい。このような実施形態における１試薬系試薬を調製するための、限定されない２試薬の構成として下記構成Ｂ３及びＢ４が挙げられる。
構成Ｂ３
試薬１：緩衝剤、変性剤、直接型ＦＰＤＨ
試薬２：緩衝剤、還元発色剤
構成Ｂ４
試薬１：緩衝剤、直接型ＦＰＤＨ
試薬２：緩衝剤、還元発色剤
【００５８】
実施形態Ｂの構成Ｂ３及びＢ４は、さらに、上述の色素安定剤及び／又は電子伝達剤を含んでもよい。
また、構成Ｂ３及びＢ４における緩衝剤、変性剤、及び還元発色剤は、上述のものが使用できる。
【００５９】
［アマドリアーゼ及びプロテアーゼを用いる実施形態］
本開示に係る測定方法は、その他の一実施形態において、アマドリアーゼとしてＮ末端糖化ペプチド及び糖化アミノ酸（以下、単に「糖化ペプチド」ともいう）に対して基質特異性を有するアマドリアーゼを使用する。該アマドリアーゼとしては、フルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ）、及び、フルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ（ＦＰＤＨ）が挙げられる。
フルクトサミンや糖化アルブミンの測定に用いられるアマドリアーゼとしては、リジンのεアミノ基が糖化されたアミノ酸及び／又はεアミノ基が糖化されたペプチドによく作用する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を用いることができる。例としては、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属又はデバリオマイゼス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属由来のオキシダーゼ等が挙げられる。
【００６０】
［ＦＰＯＸを用いる実施形態Ｃ］
本開示に係る測定方法は、限定されない実施形態Ｃにおいて、下記（１）から（５）を含み、下記（１）から（５）を行うために、あるいは、下記（２）から（５）を行うために、１つの試薬（１試薬系試薬）と試料とを混合することを含む、糖化蛋白質の測定方法である。
（１）試料中の蛋白質を変性すること。
（２）試料中の糖化蛋白質とプロテアーゼとの反応により糖化ペプチドを生成させること。
（３）糖化ペプチドとＦＰＯＸとの反応により過酸化水素を生成させること。
（４）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応により酸化発色剤を発色させること。
（５）発色した酸化発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
【００６１】
限定されない一又は複数の実施形態において、実施形態Ｃにおける１試薬系試薬として、下記構成Ｃ１からＣ３が挙げられる。但し、本開示に係る試薬は、これらの実施形態には限定されない。１試薬系試薬は、さらにその他の成分を含んでもよい。
構成Ｃ１
１試薬系試薬：緩衝剤、変性剤、プロテアーゼ、ＦＰＯＸ、ＰＯＤ、酸化発色剤
構成Ｃ２
１試薬系試薬：緩衝剤、プロテアーゼ、ＦＰＯＸ、ＰＯＤ、酸化発色剤
構成Ｃ３
１試薬系試薬：緩衝剤、プロテアーゼ、ＦＰＯＸ、ＰＯＤ、ロイコ型色素、式（Ｉ）の化合物
【００６２】
実施形態Ｃの構成Ｃ１からＣ３は、さらに、上述の色素安定剤を含んでもよい。
構成Ｃ１からＣ３における緩衝剤、変性剤、ＰＯＤ、酸化発色剤、ロイコ型色素、式（Ｉ）の化合物、及び測定対象試料については、実施形態Ａと同様である。
【００６３】
実施形態Ｃにおけるプロテアーゼとしては、中性付近で活性をもち、糖化ヘモグロビンと反応してＮ末端糖化ペプチド（本開示において、糖化アミノ酸を含む）を生成できるものを使用できる。産生生物種や酵素ファミリーは特に限定されない。プロテアーゼの限定されない例として、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミックプロテアーゼ、アスパラティックプロテアーゼ、メタロプロテアーゼなどが挙げられる。
実施形態Ｃにおけるプロテアーゼとしては、バチルス属、アスペルギルス属、ストレプトマイセス属などの微生物由来のプロテアーゼが挙げられる。その他、セリンプロテアーゼも好ましい。
また測定対象が糖化アルブミンである場合にはバチルス属及びストレプトマイセス属の微生物由来プロテアーゼがヒトアルブミンに対する作用が大きい為より好ましく、バチルス属由来プロテアーゼ、たとえばズブチリシン（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、ナガーゼ、プロテアーゼ−タイプ−ＶＩＩＩ、−ＩＸ、−Ｘ、−ＸＶ、−ＸＸＩＶ、−ＸＸＶＩＩ、−ＸＸＸＩ（以上シグマ社製）、サーモリシン（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、デュラザイム、バイオフィードプロ、アルカラーゼ、（以上ノボノルディスクバイオインダストリー社製）等が特に好ましく、ズブチリシン、ナガーゼ、プロテアーゼ−タイプ−ＸＸＶＩＩなどがより特に好ましい。
【００６４】
実施形態Ｃにおける発色シグナル及び糖化蛋白質量の測定は、実施形態Ａと同様である。
【００６５】
実施形態Ｃにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率（ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率）を測定する実施形態Ｃａとして、下記（１）から（６）を含み、下記（１）から（６）を行うために１つの試薬（１試薬系試薬）と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Ｃａ
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼとの反応により糖化ペプチドを生成させること。
（３）糖化ペプチドとＦＰＯＸとの反応により過酸化水素を生成させること。
（４）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応により酸化発色剤を発色させること。
（５）発色した酸化発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
（６）変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
【００６６】
実施形態Ｃにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率（ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率）を測定する実施形態Ｃｂとして、下記（０）から（６）を含み、下記（２）から（６）を行うために１つの試薬（１試薬系試薬）と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Ｃｂ
（０）試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼとの反応により糖化ペプチドを生成させること。
（３）糖化ペプチドとＦＰＯＸとの反応により過酸化水素を生成させること。
（４）生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応により酸化発色剤を発色させること。
（５）発色した酸化発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
（６）変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
【００６７】
実施形態Ｃａ及びＣｂは、さらに、糖化ヘモグロビン量とヘモグロビン量とから糖化ヘモグロビン比率を算出することを含みうる。
また、実施形態Ｃａ及びＣｂにおいて、糖化ヘモグロビンは、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンＡ１ｃである。
【００６８】
実施形態Ｃにおける測定対象が糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質（例えば、糖化アルブミンなど）であり、糖化蛋白質比率（蛋白質量に対する糖化蛋白質量の比率）を測定する場合、一又は複数の実施形態において、本開示に係る測定で得られる糖化蛋白質量と、別の方法で得られる蛋白質量から糖化蛋白質比率を求めることができる。糖化ヘモグロビン比率もこの方法で求めてもよい。蛋白質量を求める方法は、例えば、上述のものが挙げられる。
【００６９】
［実施形態Ｃの用事調製形態］
実施形態Ｃにおける１試薬系試薬は、流通段階では試薬の安定性の観点などから、１つの試薬でなくてもよい。本開示に係る測定方法を行う段階で用事調製してもよい。このような実施形態における１試薬系試薬を調製するための、限定されない２試薬の構成として下記構成Ｃ４からＣ１１が挙げられる。
構成Ｃ４
第１試薬：緩衝剤、変性剤、ＦＰＯＸ、ＰＯＤ
第２試薬：緩衝剤、プロテアーゼ、酸化発色剤
構成Ｃ５
第１試薬：緩衝剤、変性剤、プロテアーゼ、ＰＯＤ
第２試薬：緩衝剤、ＦＰＯＸ、酸化発色剤
構成Ｃ６
第１試薬：緩衝剤、変性剤、ＦＰＯＸ、酸化発色剤
第２試薬：緩衝剤、プロテアーゼ、ＰＯＤ
構成Ｃ７
第１試薬：緩衝剤、変性剤、プロテアーゼ、酸化発色剤
第２試薬：緩衝剤、ＦＰＯＸ、ＰＯＤ
構成Ｃ８
第１試薬：緩衝剤、ＦＰＯＸ、ＰＯＤ
第２試薬：緩衝剤、プロテアーゼ、酸化発色剤
構成Ｃ９
第１試薬：緩衝剤、プロテアーゼ、ＰＯＤ
第２試薬：緩衝剤、ＦＰＯＸ、酸化発色剤
構成Ｃ１０
第１試薬：緩衝剤、ＦＰＯＸ、酸化発色剤
第２試薬：緩衝剤、プロテアーゼ、ＰＯＤ
構成Ｃ１１
第１試薬：緩衝剤、プロテアーゼ、酸化発色剤
第２試薬：緩衝剤、ＦＰＯＸ、ＰＯＤ
【００７０】
実施形態Ｃの構成Ｃ４からＣ１１は、さらに、色素安定剤、例えば、還元剤や界面活性剤などを含んでもよい。また、構成Ｃ４からＣ１１における緩衝剤、変性剤、酸化発色剤、及び測定対象試料については、実施形態Ａと同様である。また、構成Ｃ４からＣ１１において、変性剤及び／又は色素安定剤は、式（Ｉ）の化合物であってもよい。
【００７１】
［ＦＰＤＨを用いる実施形態Ｄ］
本開示に係る測定方法は、限定されない実施形態Ｄにおいて、下記（１）から（４）を含み、下記（１）から（４）を行うために、あるいは、下記（２）から（４）を行うために、１つの試薬（１試薬系試薬）と試料とを混合することを含む、糖化蛋白質の測定方法である。
（１）試料中の蛋白質を変性すること。
（２）試料中の糖化蛋白質とプロテアーゼとの反応により糖化ペプチドを生成させること。
（３）糖化ペプチドとＦＰＤＨとの反応により還元発色剤を発色させること。
（４）発色した還元発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
【００７２】
限定されない一又は複数の実施形態において、実施形態Ｄにおける１試薬系試薬として、下記構成Ｄ１及びＤ２が挙げられる。但し、本開示に係る試薬は、これらの実施形態には限定されない。１試薬系試薬は、さらにその他の成分を含んでもよい。
構成Ｄ１
１試薬系試薬：緩衝剤、変性剤、プロテアーゼ、ＦＰＤＨ、還元発色剤
構成Ｄ２
１試薬系試薬：緩衝剤、ＦＰＤＨ、還元発色剤
【００７３】
実施形態Ｄの構成Ｄ１及びＤ２は、さらに、上述の色素安定剤及び／又は電子伝達剤を含んでもよい。
【００７４】
構成Ｄ１及びＤ２における緩衝剤、変性剤、還元発色剤、及び測定対象試料は、実施形態Ｂと同様であり、プロテアーゼは、実施形態Ｃと同様である。
【００７５】
実施形態Ｄにおける発色シグナル及び糖化蛋白質量の測定は、実施形態Ａと同様である。
【００７６】
実施形態Ｄにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率（ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率）を測定する実施形態Ｄａとして、下記（１）から（５）を含み、下記（１）から（５）を行うために１つの試薬（１試薬系試薬）と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Ｄａ
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼとの反応により糖化ペプチドを生成させること。
（３）糖化ペプチドとＦＰＤＨとの反応により還元発色剤を発色させること。
（４）発色した還元発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
（５）変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
【００７７】
実施形態Ｄにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率（ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率）を測定する実施形態Ｄｂとして、下記（０）から（５）を含み、下記（２）から（５）を行うために１つの試薬（１試薬系試薬）と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Ｄｂ
（０）試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼとの反応により糖化ペプチドを生成させること。
（３）糖化ペプチドとＦＰＤＨとの反応により還元発色剤を発色させること。
（４）発色した還元発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
（５）変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
【００７８】
実施形態Ｄａ及びＤｂは、さらに、糖化ヘモグロビン量とヘモグロビン量とから糖化ヘモグロビン比率を算出することを含みうる。
また、実施形態Ｄａ及びＤｂにおいて、糖化ヘモグロビンは、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンＡ１ｃである。
【００７９】
実施形態Ｄにおける測定対象が糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質（例えば、糖化アルブミンなど）であり、糖化蛋白質比率（蛋白質量に対する糖化蛋白質量の比率）を測定する場合、一又は複数の実施形態において、本開示に係る測定で得られる糖化蛋白質量と、別の方法で得られる蛋白質量から糖化蛋白質比率を求めることができる。糖化ヘモグロビン比率もこの方法で求めてもよい。蛋白質量を求める方法は、例えば、上述したものがあげられる。
【００８０】
［実施形態Ｄの用事調製形態］
実施形態Ｄにおける１試薬系試薬は、流通段階では試薬の安定性の観点などから、１つの試薬でなくてもよい。本開示に係る測定方法を行う段階で用事調製してもよい。このような実施形態における１試薬系試薬を調製するための、限定されない２試薬の構成として下記構成Ｄ３からＤ１０が挙げられる。
構成Ｄ３
第１試薬：緩衝剤、変性剤、ＦＰＤＨ
第２試薬：緩衝剤、プロテアーゼ、還元発色剤
構成Ｄ４
第１試薬：緩衝剤、変性剤、プロテアーゼ
第２試薬：緩衝剤、ＦＰＤＨ、還元発色剤
構成Ｄ５
第１試薬：緩衝剤、変性剤、ＦＰＤＨ、還元発色剤
第２試薬：緩衝剤、プロテアーゼ
構成Ｄ６
第１試薬：緩衝剤、変性剤、プロテアーゼ、還元発色剤
第２試薬：緩衝剤、ＦＰＤＨ
構成Ｄ７
第１試薬：緩衝剤、ＦＰＤＨ
第２試薬：緩衝剤、プロテアーゼ、還元発色剤
構成Ｄ８
第１試薬：緩衝剤、プロテアーゼ
第２試薬：緩衝剤、ＦＰＤＨ、還元発色剤
構成Ｄ９
第１試薬：緩衝剤、ＦＰＤＨ、還元発色剤
第２試薬：緩衝剤、プロテアーゼ
構成Ｄ１０
第１試薬：緩衝剤、プロテアーゼ、還元発色剤
第２試薬：緩衝剤、ＦＰＤＨ
【００８１】
実施形態Ｄの構成Ｄ３からＤ１０は、さらに、上述の色素安定剤及び／又は電子伝達剤を含んでもよい。
【００８２】
構成Ｄ３からＤ１０における緩衝剤、変性剤、還元発色剤、及び測定対象試料は、実施形態Ｂと同様であり、プロテアーゼは、実施形態Ｃと同様である。
【００８３】
［測定装置・測定システム］
本開示は、その他の態様において、本開示に係る測定方法を実行する、糖化蛋白質の測定装置又は測定システムに関する。
本開示に係る測定装置又はシステムは、一又は複数の実施形態において（図１）、反応容器（測光セル）に試料を供給するサンプリング部１、反応容器（測光セル）に１試薬系試薬を供給する試薬供給部２、測光セルの吸光度等の発色シグナルを測定する測光部３、サンプリング部１と試薬供給部２と測光部３を制御する制御部４、測光データ等を記録する記録部５、糖化蛋白質量等を算出する演算部６、及びデータ出力部７を備える。これらの各部は１つの装置に含まれてもよく、別個の装置に含まれシステムを構成してもよい。
【００８４】
糖化蛋白質量を測定する方法として、本開示に係る測定方法のほかに、ＨＰＬＣ法がある。ＨＰＬＣ法は、近年高速化し、１検体（のみ）なら約１分で測定でき、複数検体については、１０検体ごとに約５．５分の速度（１検体約３０秒）での測定が可能になった。  一方、酵素法は、従来の２試薬系の場合、１検体につき測定時間が８−１０分必要であった。但し、反応時間を並行に進ませ、サンプリング間隔での測光（測定）が可能であるから、検体数が多くなるほど１検体あたりの測定時間をサンプリング間隔の時間に近づけることができ、ＨＰＬＣよりも高速処理が可能となる。
本開示に係る測定方法であれば、一又は複数の実施形態において、試料と１試薬系試薬との混合から１０秒−１８０秒で測定でき、２試薬系よりもさらなる高速化が可能となる。
よって、一又は複数の実施形態において、本開示に係る装置は、一度に多数の検体を処理する大型の自動分析装置に好適である。
あるいは、本開示に係る測定方法は、一又は複数の実施形態において、１試薬系試薬を用いることにより従来の酵素法よりもかかる時間が短縮化できるから、測定対象試料が少ない小型の自動分析装置にも好適である。
【００８５】
本開示に係る装置又はシステムの限定されない一又は複数の実施形態を説明する。
サンプリング部１には、採血に使用した採血管をそのままセットしたり、あるいは、血液等を試料カップに移し替えたり、採血管にサンプリング用具をセットしたりすることで、検体がサンプリング部１に供給される。採血管をそのままセットする場合には、キャップを貫通することのできるピアスノズルを用いることも可能である。
サンプリング部１において、供給された検体から試料が反応容器（測光セル）に移動される。サンプリング量は、例えば、０．１−１０μＬが挙げられる。測光セルに直接移動させる場合には、希釈率の観点から、０．１−２μＬが好ましい。一方、検体から希釈槽を介して試料を測光セルに移動させてもよく、その場合のサンプリング量は、例えば、０．５−１０μＬである。
検体中の赤血球の溶血は、希釈槽を使用する場合には、希釈槽において、検体を精製水及び／又は界面活性剤を含む溶液など（以下、これらを「溶血溶液」ともいう）と混合することで溶血させることができる。溶血後、測定対象の試料として測光セルに移動する。したがって、本開示に係る装置又はシステムは、溶血溶液を供給する溶血溶液供給部を備えてもよい。
一方で、検体を直接測光セルに移動させてもよい。この場合、測光セルに溶血溶液を供給して溶血させてもよく、１試薬系試薬を供給することで溶血させてもよい。
いずれの場合も、溶血には、攪拌子による物理的な攪拌や、超音波による攪拌を利用できる。
【００８６】
測光セルには、試薬供給部２から１試薬系試薬が供給される。試薬供給部２には、１液として供給される１試薬系試薬の溶液がセットされてもよく、２液として（用事調製形態として）供給された試薬を必要な検体分だけ混合して作製された１試薬系試薬がセットされてもよい。例えば、１日分や数日分を作製してもよく、例えば、数検体分から数千検体分を作製してもよい。
【００８７】
測光セルへの試料と１試薬系試薬の供給は、いずれが先であってもよく、同時でもよい。全血試料の場合、試料と試薬の混合比率は、例えば、１：３０〜２０００の比率であり、好ましくは１：１００〜１０００、より好ましくは１：１５０〜５００である。血球試料の場合、試料と試薬の混合比率は、例えば、１：５０〜４０００の比率であり、好ましくは１：１００〜２０００、より好ましくは１：２５０〜１０００である。
【００８８】
本願明細書において、１試薬系試薬を用事調製してもよい。一又は複数の実施形態において、１試薬系試薬を試料との混合前５分以内に調製してもよい。この調製は、一又は複数の実施形態において、すべての試薬成分と接触させるために必要な最終的な工程をいう。特に限定されない一又は複数の実施形態において、酵素を含む第１試薬を、発色剤を含む第２試薬と組み合わせて１試薬系試薬を形成してもよい。試料と１試薬系試薬との混合後、測定までの時間は、例えば、１０秒から１８０秒の間に設定できる。混合後測定までの時間は、例えば、３０秒以上、４５秒以上、又は、６０秒以上である。また、混合後測定までの時間は、例えば、３０秒以下、４５秒以下、６０秒以下、９０秒以下、１２０秒以下、又は１８０秒以下である。
【００８９】
測定は、測光部３にて測光セルの吸光度等の発色シグナルを測定することで行われる。
糖化蛋白質の測定は、測定試薬添加後に速やかに１回目を測定し、測定終了時点で２回目を測定し、２回目と１回目の測光との差を測定値とする。
ヘモグロビンの測定は、Ｈｂの吸収のある波長で測定するが、糖化ヘモグロビンの発色反応に影響されない波長が好ましく、例えば、発色剤がＤＡ−６７の場合、例えば、５５０ｎｍ以下、好ましくは５００ｎｍ以下、より好ましくは４５０〜４８０ｎｍ付近で測定する。
測定セル、又は、溶血セルは、洗浄して何回も使用する形態でもよいが、一回で使い捨てる形態でもよい。
【００９０】
制御部４は、例えば、サンプリング部１、試薬供給部２、測光部３、及び選択的に溶血溶液供給部が、上述のように作動するように制御する。
【００９１】
測光部で測定されたデータは、記録部５で記録される。また、該データに基づき、演算部６で糖化蛋白質量、蛋白質量、及び／又は、糖化蛋白質比率が算出されて、記録部５に記録される。記録されたデータは、データ出力部から出力される。
演算部６は、測光部で得られた測定値（例えば、吸光度変化量）を、測定値に対する検量線に基づき糖化蛋白質量に換算して糖化蛋白質量を算出する。
【００９２】
本開示は以下の限定されない一又は複数の実施形態に関しうる。
〔１〕  下記（１）から（３）を含む、試料中の糖化蛋白質の測定方法であって、
下記（２）から（３）を行うために試料と混合する試薬が１つである、測定方法。
（１）試料中の蛋白質を変性すること。
（２）試料中の糖化蛋白質とアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。  （３）（１）及び（２）の後の試料の吸光度を測定して糖化蛋白質量を算出すること。〔２〕  前記糖化蛋白質が、糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンであり、前記蛋白質が、ヘモグロビン又はアルブミンである、〔１〕に記載の測定方法。
〔３〕  下記（１）から（４）を含む、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法であって、  下記（１）から（４）を行うために試料と混合する試薬が１つである、測定方法。
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。
（３）（１）及び（２）の後の試料の吸光度を測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
（４）（１）及び（２）の後の試料の吸光度を測定してヘモグロビン量を算出すること。
〔４〕  下記（０）から（４）を含む、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法であって、  下記（２）から（４）を行うために試料と混合する試薬が１つである、測定方法。
（０）試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
（１）試料中のヘモグロビンを変性すること。
（２）試料中の糖化ヘモグロビンとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。
（３）（１）及び（２）の後の試料の吸光度を測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
（４）（１）及び（２）の後の試料の吸光度を測定してヘモグロビン量を算出すること。
〔５〕  糖化ヘモグロビンが、ヘモグロビンＡ１ｃである、〔２〕から〔４〕のいずれかに記載の測定方法。
〔６〕  前記アマドリアーゼが、糖化蛋白直接型アマドリアーゼである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の測定方法。
〔７〕  添加する試薬が、変性剤、糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及び酸化発色剤を含有する、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の測定方法。
〔８〕  添加する試薬が、変性剤、糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ、及び還元発色剤を含有する、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の測定方法。
〔９〕  前記（２）が、試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼと反応によりＮ末端糖化ペプチドを生成させること、及び、Ｎ末端糖化ペプチドとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること、である、〔２〕から〔８〕のいずれか記載の測定方法。
〔１０〕  添加する試薬が、変性剤、プロテアーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及び発色剤を含有する、〔１〕から〔５〕及び〔９〕のいずれかに記載の測定方法。
〔１１〕  添加する試薬が、変性剤、プロテアーゼ、フルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ、及び発色剤を含有する、〔１〕から〔５〕及び〔９〕のいずれかに記載の測定方法。
〔１２〕  〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の測定方法を実行する、糖化ヘモグロビンの測定装置又は測定システム。
【００９３】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００９４】
［実施例１］
１試薬系試薬
糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ    ３０００Ｕ／Ｌ
ミリスチルジメチルアミノプロパンスルホン酸（東京化成工業）    ３ｇ／Ｌ
ＰＯＤ    １０ＫＵ／Ｌ
ＤＡ−６７（和光純薬工業）    ０．１ｍｍｏｌ/Ｌ
ＭＯＰＳ（同仁化学研究所）    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＯＨ    ｐＨ６．５
測定装置
ＢＭ−６０１０（日本電子製）
操作
人全血２μＬと１試薬系試薬１４８μＬとを混合し、３７℃で２分間インキュベーションする。
吸光度測定
糖化ヘモグロビン測定：１試薬系試薬の混合から約２０秒後と、約２分後との吸光度を、主波長６５４ｎｍ、副波長６９４ｎｍで測定し、約２分後の吸光度から約２０秒後の吸光度を差し引くことで、吸光度変化量を求める。
ヘモグロビン測定：１試薬系試薬の混合から約２分後の吸光度を、主波長４７８ｎｍ、副波長６９４ｎｍで測定する。
糖化ヘモグロビン量の算出
吸光度変化量に対する検量線に基づき糖化ヘモグロビン量に換算して糖化ヘモグロビン量を算出する。
【００９５】
［実施例２］
１試薬系試薬の用事調製用第１試薬（酵素試薬）
糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ    ４００Ｕ／Ｌ
ＰＯＤ    ２０ＫＵ／Ｌ
ＭＯＰＳ（同仁化学研究所）    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＯＨ    ｐＨ６．５
１試薬系試薬の用事調製用第２試薬（発色剤試薬）
ミリスチルジメチルアミノプロパンスルホン酸（東京化成工業）    ３０ｇ／Ｌ
ＤＡ-６７（和光純薬工業）    １．０ｍｍｏｌ/Ｌ
ＭＯＰＳ（同仁化学研究所）    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＯＨ    ｐＨ６．５
測定装置
ＢＭ−６０１０（日本電子製）
操作
第１試薬９ｍＬと第２試薬１ｍＬとを混合し、１試薬系試薬を作製する。
人全血２μＬと１試薬系試薬１４８μＬとを混合し、３７℃で２分間インキュベーションする。
吸光度測定
糖化ヘモグロビン測定：１試薬系試薬の混合から約２０秒後と、約２分後との吸光度を、主波長６５４ｎｍ、副波長６９４ｎｍで測定し、約２分後の吸光度から約２０秒後の吸光度を差し引くことで、吸光度変化量を求める。
ヘモグロビン測定：１試薬系試薬の混合から約２分後の吸光度を、主波長４７８ｎｍ、副波長６９４ｎｍで測定する。
糖化ヘモグロビン量の算出
吸光度変化量に対する検量線に基づき糖化ヘモグロビン量に換算して糖化ヘモグロビン量を算出する。
【００９６】
［実施例３］
１試薬系試薬の用事調製用第１試薬（酵素試薬）
フルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ    ５００Ｕ／Ｌ
１−メトキシＰＭＳ（同仁化学研究所）    １ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭＯＰＳ（同仁化学研究所）    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＯＨ    ｐＨ６．５
１試薬系試薬の用事調製用第２試薬（発色剤試薬）
メタロプロテアーゼ    ２００００ＫＵ／Ｌ
ミリスチルジメチルアミノプロパンスルホン酸（東京化成工業）    ３０ｇ／Ｌ
ＷＳＴ−４（同仁化学研究所）    １ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭＯＰＳ（同仁化学研究所）    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＯＨ    ｐＨ６．５
測定装置
ＢＭ−６０１０（日本電子製）
操作
第１試薬９ｍＬと第２試薬１ｍＬとを混合し、１試薬系試薬を作製する。
人全血２μＬと１試薬系試薬１４８μＬとを混合し、３７℃で２分間インキュベーションする。
吸光度測定
糖化ヘモグロビン測定：１試薬系試薬の混合から約２０秒後と、約２分後との吸光度を、主波長６９４ｎｍ、副波長８０５ｎｍで測定し、約２分後の吸光度から約２０秒後の吸光度を差し引くことで、吸光度変化量を求める。
ヘモグロビン測定：１試薬系試薬の混合から約２分後の吸光度を、主波長４７８ｎｍ、副波長６９４ｎｍで測定する。
糖化ヘモグロビン量の算出
吸光度変化量に対する検量線に基づき糖化ヘモグロビン量に換算して糖化ヘモグロビン量を算出する。
【００９７】
［実施例４］
１試薬系試薬の用事調製用第１試薬（酵素試薬）
フルクトシルペプチドオキシダーゼ    ５００Ｕ／Ｌ
ＰＯＤ    ２０ＫＵ／Ｌ
ＭＯＰＳ（同仁化学研究所）    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＯＨ    ｐＨ６．５
１試薬系試薬の用事調製用第２試薬（発色剤試薬）
メタロプロテアーゼ  ３００００ＫＵ／Ｌ
ミリスチルジメチルアミノプロパンスルホン酸（東京化成工業）    ３０ｇ／Ｌ
DA-６７（和光純薬工業）    １．０ｍｍｏｌ/Ｌ
ＭＯＰＳ（同仁化学研究所）    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＯＨ    ｐＨ６．５
測定装置
ＢＭ−６０１０（日本電子製）
操作
第１試薬９ｍＬと第２試薬１ｍＬとを混合し、１試薬系試薬を作製した。
人全血２μＬと１試薬系試薬１４８μＬとを混合し、３７℃でインキュベーションした。
吸光度測定
糖化ヘモグロビン測定：１試薬系試薬の混合から約２０秒後、約１分後、約２分後、約５分後の吸光度を、主波長６５８ｎｍ、副波長６９４ｎｍで測定し、約１分後、約２分後、約５分後の各吸光度から約２０秒後の吸光度を差し引くことで、それぞれの吸光度変化量を求めた。
ヘモグロビン測定：１試薬系試薬の混合から約２分後の吸光度を、主波長４７８ｎｍ、副波長６９４ｎｍで測定した。
糖化ヘモグロビン量の算出
吸光度変化量に対する検量線に基づき糖化ヘモグロビン量に換算して糖化ヘモグロビン量を算出した。
結果
約１分後、約２分後及び約５分後のいずれにおいても、同じ測定結果がえられた。
【図１】
2019062890.tif 000003