(57)【要約】【課題】本発明は泳動試料が直線的に電気泳動されず、電気泳動像が八の字に曲がるという現象を抑制することができ、さらに、広範な範囲の分子量の核酸において高い分離能を有するスラブ型電気泳動用ゲルを簡便に提供する。【解決手段】ゲル基材として少なくともアガロースを含むスラブ型電気泳動用ゲルであって、グルコマンナンを０．０５重量％以上含み、貫通孔を備える中空板をゲル内部に備え、上記貫通孔の開口部が電気泳動方向と面するように設けられ、上記貫通孔が電気泳動方向と平行に設けられている。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル基材として少なくともアガロースを含むスラブ型電気泳動用ゲルであって、
グルコマンナンを０．０５重量％以上含み、
貫通孔を備える中空板をゲル内部に備え、
上記貫通孔の開口部が電気泳動方向と面するように設けられ、上記貫通孔が電気泳動方向と平行に設けられている、スラブ型電気泳動用ゲル。
【請求項２】
上記グルコマンナンを０．０５重量％以上０．３重量％以下含む、請求項１に記載のスラブ型電気泳動用ゲル。
【請求項３】
上記アガロースを０．３重量％以上２．０重量％以下含む、請求項１または２に記載のスラブ型電気泳動用ゲル。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載のスラブ型電気泳動用ゲルを用いる、電気泳動方法。
【請求項５】
中空板並びに電気泳動用ゲルの原料としてグルコマンナンおよびアガロースを備える、スラブ型電気泳動用ゲル製造キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スラブ型電気泳動用ゲルおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を分子量の違いにより分離分析する方法はsodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel elelctrophoresis（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）として知られ、これまで多くの研究分野で汎用されている。このＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いられるゲルは自作することができ、例えば、非特許文献１にゲルの作製方法が記載されている。また、スラブ型ゲルのプレキャストゲルとして各種が市販されている。例えば、Mini-Proteanシリーズ(BioRad)、TruPageＴＭプレキャストゲル(Sigma-Aldrich)、e-PAGELミニサイズ既製ゲル(ATTO株式会社製)およびSuperSepＴＭ（和光純薬）等が挙げられる。また、２００ｂｐ程度までの低分子ＤＮＡを分離分析するためのＰＡＧＥも市販されており、NuPAGE（登録商標） (Thermo Fisher Sceintific)、SuperSepＴＭ DNA（和光純薬）等がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】One-demensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel elelctrophoresis, p207-217, J E. Celis and E Olsen in CELL BIOLOGY-A LABORATORY HANDBOOK, Edited by JE CELIS, Academic Press, Boston, 1994.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述のようなスラブ型電気泳動用ゲルについての従来技術では、泳動試料が直線的に電気泳動されず、電気泳動像が八の字に曲がるという現象が起きる場合があった。また、上述のような従来技術では、２００ｂｐ以上のＤＮＡの分離能が悪くなる場合があり、広範な範囲の分子量の核酸において高い分離能を有するスラブ型電気泳動用ゲルを簡便に作製することが求められていた。
【０００５】
本発明の一態様は、前記の問題点に鑑みてなされたものであり、泳動試料が直線的に電気泳動されず、電気泳動像が八の字に曲がるという現象（以下、「八の字現象」とも称する）を抑制することができるスラブ型電気泳動用ゲルを提供することを目的とした。さらに本発明の一態様は、広範な範囲の分子量の核酸において高い分離能を有するスラブ型電気泳動用ゲルを簡便に提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記の課題を解決するために、本発明者が鋭意研究を行った結果、アガロースとグルコマンナンとを含み、ゲルの内部に中空板を備えたスラブ型電気泳動用ゲルを用いることにより、電気泳動像が八の字に曲がることなく、泳動試料が直線的に電気泳動され、さらに、広範な範囲の分子量の核酸において高い分離能を有するスラブ型電気泳動用ゲルを簡便に作製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は以下の態様を含む。
〔１〕ゲル基材として少なくともアガロースを含むスラブ型電気泳動用ゲルであって、
グルコマンナンを０．０５重量％以上含み、
貫通孔を備える中空板をゲル内部に備え、
上記貫通孔の開口部が電気泳動方向と面するように設けられ、上記貫通孔が電気泳動方向と平行に設けられている、スラブ型電気泳動用ゲル。
〔２〕上記グルコマンナンを０．０５重量％以上０．３重量％以下含む、〔１〕に記載のスラブ型電気泳動用ゲル。
〔３〕上記アガロースを０．３重量％以上２．０重量％以下含む、〔１〕または〔２〕に記載のスラブ型電気泳動用ゲル。
〔４〕〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のスラブ型電気泳動用ゲルを用いる、電気泳動方法。
〔５〕中空板並びに電気泳動用ゲルの原料としてグルコマンナンおよびアガロースを備える、スラブ型電気泳動用ゲル製造キット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の一態様によれば、前記の問題点に鑑みてなされたものであり、泳動試料が直線的に電気泳動されず、電気泳動像が八の字に曲がるという現象を抑制することができるスラブ型電気泳動用ゲルを提供することができる。さらに本発明の一態様は、広範な範囲の分子量の核酸において高い分離能を有するスラブ型電気泳動用ゲルを簡便に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１の（Ａ）は、本発明の一実施形態のスラブ型電気泳動用ゲルを作製するための部材の一例を示す。図１の（Ｂ）は、本発明の一実施形態のスラブ型電気泳動用ゲルを作製するための部材を組み立てた際の横断面図を示す。図１の（Ｃ）は、本発明の一実施形態のスラブ型電気泳動用ゲルを作製するための部材を組み立てた際の上面図を示す。
【図２】本発明の一実施形態のスラブ型電気泳動用ゲルの作製において、ガラス間隙に注がれたゲル化溶液にコームを挿入した状態を示す模式図である。
【図３】図３の（Ａ）は、本発明の一実施形態のスラブ型電気泳動用ゲルの作製において、ゲルからコームを抜いた状態を示す模式図である。図３の（Ｂ）は、本発明の一実施形態において使用され得る中空板の断面図である。図３の（Ｃ）は、本発明の一実施形態において使用され得る、中空板で形成されたスペーサーの断面図である。
【図４】実施例１〜４の電気泳動の結果を示す図である。
【図５】比較例１の電気泳動の結果を示す図である。
【図６】実施例５の電気泳動の結果を示す図である。
【図７】一般に用いられるＳＤＳ−ＰＡＧＥ用電気泳動槽の横断面図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００１０】
本明細書において、スラブ型電気泳動用ゲルを単に「電気泳動用ゲル」または「ゲル」と称する場合もある。異なる組成のゲルにおいて同じ泳動試料を泳動させた場合、ゲル中にてサイズの異なる核酸のバンド間の距離が離れているゲルの方が、分離能が高いと言える。
【００１１】
〔１．スラブ型電気泳動用ゲル〕
本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルは、ゲル基材として少なくともアガロースを含むスラブ型電気泳動用ゲルであり、グルコマンナンを０．０５重量％以上含み、貫通孔を備える中空板をゲル内部に備え、上記貫通孔の開口部が電気泳動方向と面するように設けられ、上記貫通孔が電気泳動方向と平行に設けられている。
【００１２】
電気泳動用ゲルは、グルコマンナンを０．０５重量％以上含み、０．１重量％以上含むことが好ましく、０．２重量％以上含むことがより好ましい。グルコマンナンを０．０５重量％以上含むことで、強度に優れ、かつ高い分離能を有する電気泳動用ゲルを得ることができる。また、電気泳動用ゲルにおけるグルコマンナンの含有量の上限値は、０．３重量％以下であることが好ましく、０．１５重量％以下であることがより好ましい。電気泳動用ゲルにおけるグルコマンナンの含有量が０．３重量％以下であれば、低分子領域（２Ｋｂｐ以下）でのＤＮＡ分離能が向上するため好ましい。
【００１３】
グルコマンナンとして、市販品のグルコマンナンを用いてもよく、市販品を適宜精製したグルコマンナンを用いてもよい。
【００１４】
ゲル基材は、少なくともアガロースを用いる。ゲル基材としてさらに、アガー等の電気泳動用ゲルの原料として一般的に知られている原料を用いてもよい。アガロースおよびアガー等は、市販品を用いてもよい。市販のアガロースとしては、Agarose H（ニッポンジーン社製）およびAgarose S（ニッポンジーン社製）等が挙げられる。市販のアガーとしては、精製寒天末（ナカライテスク株式会社製）等が挙げられる。
【００１５】
アガロースの含有量は、０．３重量％以上であることが好ましい。アガロースの含有量が０．３重量％以上であれば、取扱い性に優れるゲルを得ることができる。また、アガロースの含有量は２．０重量％以下であることが好ましい。アガロースの含有量が２．０重量％以下であれば、濃度が均一なゲル化用溶液を容易に得ることができる。
【００１６】
本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルは、均一濃度ゲルであっても、多段式ゲルおよび濃度勾配ゲル等の濃度が均一ではないゲルであってもよい。多段式ゲルとは、１枚のゲルにおいて、複数の異なる組成のゲル層が含まれているゲルを意図する。グルコマンナンを含む電気泳動用ゲルは、強度に優れている。そのため、例えば、電気泳動用ゲルにゲルスロットを設けるためのスロットゲルとして使用することができる。本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルとして、複数の異なる組成のゲル層のうち、少なくとも１つのゲル層が、ゲル基材として少なくともアガロース、さらに、所定量のグルコマンナンを含んでいる多段式ゲルも包含される。すなわち、本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルとして、例えば、スロットゲルとして、ゲル基材として少なくともアガロース、さらに、所定の量のグルコマンナンを含むゲルを備え、分離ゲルとして、別の異なる組成のゲルを備えるゲルも包含される。
【００１７】
本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルがスロットゲルを備える多段式ゲルである場合、当該スロットゲルは、グルコマンナンの含有量が０．１重量％から０．３重量％であり、かつ、アガロースの含有量が０．８重量％から１．０重量％であることが好ましい。スロットゲルは、グルコマンナンの含有量が０．３重量％であり、かつ、アガロースの含有量が１．０重量％であることがより好ましい。
【００１８】
分離ゲルを構成するゲル層の組成を色々に選択しこれを組み合わせることにより、解析するＤＮＡのサイズに即し最適化された、広範な範囲の分子量の核酸において高い分離能を有する多段式ゲルを簡便に作製できる。多段式ゲルの構成として、例えば、（ｉ）任意の濃度のアガロースゲル層と任意の濃度のグルコマンナンゲル層とを組み合わせた多段式ゲル、（ｉｉ）任意の２つの濃度の異なるグルコマンナンゲル層を組み合わせた多段式ゲル、（ｉｉｉ）任意の３つの濃度の異なるアガロースゲル層を組み合わせた多段式ゲルが挙げられる。
【００１９】
所定の量のグルコマンナンを含む電気泳動用ゲルを用いることにより、濃度依存的に低分子領域でのＤＮＡ分離能を向上させることができる。さらに、グルコマンナンの濃度が異なるゲル層を複数組み合わせた電気泳動用ゲルを用いることにより広範な範囲の分子量領域でＤＮＡを分離分析できる。
【００２０】
また、加熱溶解した２つの任意のゲル化用溶液がゲル化しない温度（例えば、７０℃程度）で濃度勾配作製器を用いることにより、連続的な濃度勾配を有する濃度勾配ゲルを作製することができる。
【００２１】
この事は、実に多彩なＤＮＡ分離能をもつ、ゲル基材がアガロースであるスラブ型ゲルを自由自在に創作できることを意味する。その点から、本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルはアガロースゲルの概念を変える発明だと言える。本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルがプレキャストゲルとして商品化され市販されれば、新規の核酸（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）分離分析ゲルとして、核酸の解析に関わる多くの分野およびこれを支援する産業分野で貢献するものと発明者は考えている。
【００２２】
（中空板）
図３の（Ｂ）は、本発明の一実施形態において使用され得る中空板の断面図である。本発明の一実施形態において、中空板４は、中空板４の表面と裏面とを形成する一対の平板４ａ間に、支持部材４ｂにより貫通孔４ｃが形成されている構造体を意図する。当該貫通孔４ｃは、両方の端部において開口部を有しており、貫通孔４ｃにおいて中空板４は貫通している。中空板としては、例えば、プラスチック段ボール等が挙げられる。本発明の一実施形態において、ゲルの内部に設けられた中空板によってゲルが支えられているため、作製したゲルがガラス板から下方に脱落するのを防止することができる。
【００２３】
また、貫通孔が電気泳動方向と平行に設けられているため、中空板にはゲル内の泳動試料（例えば、ＤＮＡ）の移動を均一にする効果がある。中空板を用いない場合、ゲル内の泳動試料（例えば、ＤＮＡ）が八の字状に電気泳動されることがある。一般に、２枚のガラス板に挟まれたゲルを作製し、当該ゲルを泳動槽に装着する際、図７に示すように、電気泳動槽７１において、外側ガラス板７４と内側ガラス板７５との両端にくさび７２を打つ。この操作によりガラス板の中央が僅かに曲がるため、ゲル７３も曲がり、さらにゲル７３は僅かに下方に押し出される。つまり、ゲル７３の中央部の厚さが、ゲル７３の両端よりも薄くなる。この状態において、定電圧で泳動すると、ゲル７３の厚い箇所は薄い箇所に比べて電気抵抗が低下し通電されやすいため、電気泳動試料の八の字現象が起こることになる。中空板はガラス板の湾曲を防止するため、この現象を防止することができる。
【００２４】
ゲル内部に設けられる中空板の数は、ガラス板に納まる範囲内であれば特に限定されず、１つ以上であれば複数の中空板を設けてもよい。
【００２５】
中空板の大きさは、ガラス板の幅の範囲内であれば特に限定されず、用いる電気泳動槽の大きさおよびガラス板の大きさ等に合わせて適宜決定すればよい。
【００２６】
貫通孔の大きさも、ガラス板の幅の範囲内であれば特に限定されず、用いる電気泳動槽の大きさおよびコームの大きさに合わせて適宜決定すればよい。
【００２７】
本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルにおいて、中空板を設ける位置は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されるものではない。ただし、ガラス板の湾曲を防止し易く、かつ泳動試料の電気泳動に干渉し難い位置であるという理由により、電気泳動ゲルにおける電気泳動方向のできるだけ下流側に中空板が設けられていることが好ましい。
【００２８】
（その他の構成）
本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルは、電気泳動に必要な部材をさらに備えていてもよい。例えば、上記ゲルは、ゲルにウェルを形成するためのコームを備えていてもよい。また、上記ゲルは、ゲルを支持するためのガラス板および／またはスペーサーを備えていてもよい。
【００２９】
コームのそれぞれの櫛の幅は２．６ｍｍまたは３．４ｍｍ、櫛同士の間隔は１．４ｍｍまたは２．６ｍｍのものが汎用されているが、用いる電気泳動槽の大きさおよび所望のサンプル数等に合わせて、これらのサイズが任意であるコームを用いてもよい。コームをゲルに挿入する深さは５ｍｍから７ｍｍ程度が望ましいが、１０ｍｍ以下であれば任意の深さでよい。
【００３０】
上記ガラス板は、長さ１００ｍｍ×幅１００ｍｍ×厚さ１ｍｍのものが汎用されている。使用する電気泳動槽に合わせて、ガラス板のサイズを適宜決定できる。また、ガラス板の代わりに、アクリル板またはポリカーボネート板を用いてもよい。上述の汎用されているサイズのガラス板の代わりに使用する際は、そのサイズは、例えば、長さ１００ｍｍ×幅１００ｍｍ×厚さ２ｍｍである。また、ガラス板と、アクリル板またはポリカーボネート板との組み合わせでもよい。
【００３１】
冷却効果をもつ電気泳動槽を用いる場合は、ガラス板、アクリル板およびポリカーボネート板のいずれであってよく、これらの選択によってＤＮＡの分離能に影響はない。プラスチック板はガラス板よりも形成が容易で加工しやすく、低廉であり経済的でもある。また、ポリカーボネート板は軽量であり、且つ耐熱性に優れる。また、ポリカーボネートは、衝撃にも強く丈夫な素材としてガラスや他のプラスチックを凌ぐ。
【００３２】
また、冷却効果をもたない電気泳動槽を用いる場合も、ガラス板、アクリル板およびポリカーボネート板のいずれであってよく、これらの選択によってＤＮＡの分離能に影響はないが、ガラス板を用いることが好ましい。
【００３３】
本発明の一実施形態において、スペーサーやコームとして、中空板を利用してもよい。スペーサーとしては、例えば、図３の（Ｃ）に記載されるような、２つの貫通孔をもつ縦長のもの（例えば、長さ１００ｍｍ×幅８〜１０ｍｍ×厚さ２．５ｍｍ）がよい。また、コームとしては、例えば、図３の（Ｂ）に記載されるような、貫通孔４ｃに対し垂直に切断したプラスチック段ボール（例えば、長さ７５ｍｍ×幅８ｍｍ×厚さ２．５ｍｍ）が利用できる。中空板をコームとして用いる場合は、ゲル化用溶液がゲル化した後、電気泳動用ゲルに約１ｍｍ埋まるように中空板をゲル上層に挿入するとよい。中空板をゲル上層に挿入することにより、従来のように電気泳動用ゲルにウェルを作製する必要がなく、中空板の貫通孔にＤＮＡ溶液を直接注入し電気泳動を開始することができる。中空板をゲル上層に挿入し、ウェルとして用いると、この大きさで２１種のサンプルの分析が可能であり、従来のコームを用いた場合より、多くのサンプルを分析できる利点がある。ゲル下層とコームの各中空板とに挟まれたことにより、ゲルの脱落防止はより確実なものとなり、プレキャストゲルとして市販する際に有益な事項である。
【００３４】
（スラブ型電気泳動用ゲルの作製方法）
本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルの作製は、例えば、Molecular Cloning: A LABORATORY MANUAL, T. Maniatis, EF Fritsch, J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982を参考にして常法により実施してもよい。
【００３５】
図１〜図３は、タンパク質の分離分析に用いられるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル作製用部材を用いて、本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルを作製する方法を図示している。なお、以下に示す寸法は、タンパク質用のＰＡＧＥゲル作製用資材（和光純薬製、製品名：SuperSep Ace）および泳動槽（コスモバイオ株式会社製、製品名：DPE-1020  10x10ミニゲル用）を利用する場合の寸法を例示している。
【００３６】
図１の（Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル用のコーム１、スペーサー２、ガラス板３、及びプラスチック製の中空板４の外観を示す図である。中空板４として、例えば、商品名「養生プラダン」（PD-1892SY, ポリプロビレン製）を用いることができる。この商品は、弾力性の高いプラスチック段ボールであり、厚さ２．５ｍｍ、長さ１８２０ｍｍ、幅９１０ｍｍ、貫通孔の幅が３．５ｍｍである。これを回転式カッターで目的のサイズに切断し、厚さ２．５ｍｍ、長さ６３ｍｍ、幅７ｍｍの中空板４を得る。この板を両端の２ｍｍ厚のスペーサー２と７ｍｍ程度離してガラス板３に平行な位置でガラス板３に接着剤により装着する。中空板４の貫通孔が電気泳動用ゲルと垂直になるため、熱溶解したゲル溶液の流入が容易になる。また、中空板４は電気泳動において泳動パターンへの影響も無く物理的な障害ともならない。
【００３７】
次に、厚さ２ｍｍのスペーサー２にシリコングリースを塗付けた後、２枚のガラス板３で挟み込み、ダブルクリップで止める。図１の（Ｂ）および図１の（Ｃ）には、それぞれ、本発明の一実施形態の電気泳動用ゲルを作製するための部材を組み立てた際の横断面図および上面図を示す。図１の（Ｂ）および図１の（Ｃ）が示すように、スペーサー２を２枚のガラス板３で挟み込み、ダブルクリップで止めることにより、スペーサーの厚さに応じてガラス間隙を形成することができる。また、中空板４側のガラス板３の下部は接着テープでシールしておく。これにより、ゲル化用溶液を流し込むためのガラス間隙を作製することができる。なお、以下に述べる最下層ゲルをゲル化用溶液に直接浸すことにより事前に作製しておく場合、最下層ゲルをガラス間隙に設置することで、シール操作の代わりとすることができる。
【００３８】
このように組み立てられたガラス間隙にゲル化用溶液（例えば、ＴＡＥに加熱溶解させた１重量％アガロースＳ約１６ｍＬ）を、例えば、図２中、２点破線で示した位置まで（例えば、ガラス板先端から約１０ｍｍ）加え、室温に暫く放置することによりゲル化させる。これにより、最下層ゲルを作製することができる。この上層に、ＴＡＥに加熱溶解させた任意の濃度のグルコマンナンを含むアガロースＳを注ぐ。その後、図２のようにガラス間隙にコームを挿入し、ゲルをゲル化させる。このゲル作製のステップは最初の段階（すなわち、最下層ゲルを作製する段階）を省き、１段階で実施してもよい。
【００３９】
最後に、図３の（Ａ）に示すように、コーム１をゲルから脱着することにより、スロット５およびウェル６を備えた電気泳動用ゲルを作製することができる。
【００４０】
〔２．電気泳動方法〕
本発明の一実施形態に係る電気泳動方法は、本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルを用いる。
【００４１】
以下に、タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル用の泳動槽に、本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルを装着する場合を例示する。この時、ゲルのウェル側が陰極側、中空板側が陽極側になるようにする。その後、分析すべき電気泳動試料をウェルに注ぎＴＡＥ緩衝液を泳動槽に注ぎ、例えば、６０Ｖで２時間程度、泳動する。電気泳動試料と同時に色素Orange Gをロードしていれば、色素Orange Gがゲル先端に到達したタイミングで電気泳動を終了させてもよい。
【００４２】
次に、ガラス板の間にスパーテルを挿入してガラス板の一方を剥がす。さらに、中空板の直上をガラス板にそってスパーテルで切断し、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、ＵＶＰ装置にて紫外線照射し蛍光を写真撮影する。本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲルは強度に優れ、しなやかであるため、例えば写真撮影時に破損することはない。尚、ＤＮＡ溶液にＧｅｌＲｅｄを予め添加しておき、泳動後、直接、写真撮影することもできる。また、泳動用緩衝液はＴＡＥ緩衝液またはＴＰＥ緩衝液であっても構わない。
【００４３】
ゲルの理想的な厚さである４ｍｍの中空板をゲルプレートの同様に位置に設置すれば、サブマリン型ゲルの作製にも中空板を利用できる。中空板の設置は、電気泳動には影響はなく、サブマリンプレキャストゲルの作製においてゲルの脱落防止として同様に有効である。
【００４４】
〔３．スラブ型電気泳動用ゲル製造キット〕
本発明の一実施形態に係るスラブ型電気泳動用ゲル製造キットは、中空板並びに電気泳動用ゲルの原料としてグルコマンナンおよびアガロースを備える。それゆえ、上述のように、泳動試料が八の字に曲がることなく直線的に電気泳動され、さらに、広範な範囲の分子量の核酸において高い分離能を有する電気泳動用ゲルを簡便に作製できる。以下では、電気泳動用ゲル製造キットを単に「キット」とも称する。また、〔１．電気泳動用ゲル〕で既に説明した事項については、以下では説明を省略し、適宜、上述の記載を援用する。
【００４５】
上記キットは、緩衝液として、ＴＡＥ緩衝液またはＴＰＥ緩衝液をさらに備えていてもよい。電気泳動用ゲルの原料を当該緩衝液に溶解させてゲル化用溶液を得ることができる。当該ゲル化用溶液をゲル化させることにより、ゲルを作製することができる。
【００４６】
上記緩衝液は、使用される際の濃度に比べて高い濃度にて調製されたストック溶液であってもよい。例えば、ストック溶液は、使用される際の濃度に比べて５倍、１０倍、または５０倍の濃度であってもよい。当該ストック溶液を希釈して、ゲルの作製に使用することができる。
【００４７】
また、上記キットは、トリス−酢酸−エチレンジアミン四酢酸の粉末またはトリス−リン酸−エチレンジアミン四酢酸の粉末を備えていてもよい。これらの粉末を水に溶解させることによって、ＴＡＥ緩衝液またはＴＰＥ緩衝液を得ることができる。
【００４８】
上記キットは、中空板、電気泳動用ゲルの原料および緩衝液以外に、ゲルを作製するための部材を備えていてもよい。例えば、上記キットは、ゲル化用溶液が流し込まれるガラス間隙を形成するためのガラス板を備えていてもよい。また、上記キットは、ゲルにウェルを形成するためのコームを備えていてもよい。
【００４９】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５０】
（実施例１）
（１）ガラクトマンナンの精製
下記の〔ａ〕〜〔ｈ〕によりガラクトマンナンを精製した。
〔ａ〕タラガム由来のガラクトマンナン（VIDOGUM SP175、ユニテックフーズ社製）１ｇを１００ｍＬの精製水に加え、マイクロウェーブオーブンにて１００℃で２分間加熱し、ガラクトマンナンを溶解させた。これを室温まで冷却した後、５℃にて一晩放置した。
〔ｂ〕〔ａ〕により得られた溶液を遠心管に分取し、室温で８０００×ｇ、１０分間遠心した。
〔ｃ〕〔ｂ〕により得られた溶液から上清を遠心管に分取し、沈殿物を除去した。このとき、除去された沈殿物は約０．４ｇであった。
〔ｄ〕〔ｃ〕により沈殿物が除去された上清に酢酸２０ｍＬ（特級試薬、和光純薬製）を加えることにより酸性溶液とした。酸性溶液：エタノール＝１：１となるように１００％エタノールを当該酸性溶液にさらに加え、遠心管の蓋をし、上下に２〜３回程度、素早く振盪した。混合すると速やかに、白い繊維状の物質が出現した。
〔ｅ〕上記遠心管を室温で８０００×ｇ、１０分間遠心させ、得られた沈殿物を回収した。
〔ｆ〕当該沈殿物にエタノールを１０ｍＬ加え、よく振盪し、残存している酢酸を除去した。その後、再度、室温で８０００×ｇ、１０分間遠心させた。
〔ｇ〕得られた沈殿物を回収し、６０℃で１時間放置し、完全に乾燥させた。
〔ｈ〕乾燥させた上記得られた沈殿物を乳鉢に移し、乳棒で粉砕した。
【００５１】
（２）ゲルの作製および電気泳動
「養生プラダン」（PD-1892SY, アイリスオーヤマ社製）を回転式カッターで切断し、厚さ２．５ｍｍ、長さ６３ｍｍ、幅７ｍｍの中空板を得た。この中空板を、両端の２ｍｍ厚のスペーサーと７ｍｍ程度離してガラス板に平行な位置でガラス板に接着剤により装着した。
【００５２】
次に、２ｍｍのスペーサーにシリコングリースを塗付け２枚のガラス板で挟み込み、ダブルクリップで止めた。中空板側のガラス板の下部を接着テープでシールした。
【００５３】
このように組み立てられたガラス間隙に後述の組成のゲル化用溶液を１５．３ｍＬ加え、２ｍｍ厚の１６サンプル用コームを挿入し、室温に放置することでゲル化用溶液をゲル化させた。その後、コームをゲルから静かに外すことにより実施例１の電気泳動用ゲルを作製した。ゲルを泳動槽（スラブ型（第一化学薬品株式会社、商品名  カセット電気泳動槽「DAIICH」ミニ二連式））に装着し、各スロットに５μＬの電気泳動試料を静かに添加した。室温にて以下の条件で泳動後、ガラス板の間にスパーテルを挿入し一方側を持ち上げた。他方のガラス板に残っているゲルを静かに染色液に押し出した。
【００５４】
（３）ゲルの撮影
アガロースゲル撮影装置（ＵＶイルミネーター；Model BioDoc-It（登録商標） Imaging system, ＵＶＰ社製）を用いて電気泳動を行った後の電気泳動用ゲルを撮影した。
【００５５】
＜泳動等の条件＞
・ゲル化用溶液：アガロースが０．８重量％となるようにAgarose S（ニッポンジーン社製）を、アガーが０．２重量％となるように精製寒天末（ナカライテスク株式会社製）を、ガラクトマンナンが０．１重量％となるように、上述のように精製したガラクトマンナンを、グルコマンナンが０．０７５重量％となるように、コンニャク精粉（茂木食品工業株式会社、群馬県下仁田市）をそれぞれＴＡＥ緩衝液に加えた。
・ゲル板のサイズ（内寸）：幅１００ｍｍ、縦長１００ｍｍ、厚さ１ｍｍ
・電気泳動試料：レーン１；０．１〜２０ＫｂｐのＤＮＡ（Gene Ladder wide 2, ニッポンジーン社製）；レーン２；０．１〜１０ＫｂｐのＤＮＡ（Gene Ladder Fast 2, ニッポンジーン社製）；レーン３；０．１〜２ＫｂｐのＤＮＡ（Gene Ladder 100, ニッポンジーン社製）；レーン４；５０ｂｐのDNA Ladder（TAKARA社製）（これらの電気泳動試料には予めGelRedを添加した）
・泳動条件：泳動緩衝液；１×ＴＡＥ、６０Ｖ、１．５時間
実施例１より、ゲル基材として少なくともアガロースを含み、さらにグルコマンナンを含み、中空板を内部に備える電気泳動用ゲルを用いて電気泳動を行うと、２Ｋｂｐ領域までの低分子ＤＮＡの高い分離能が得られることがわかる。このことは、本発明の一実施形態に係る電気泳動方法により、今日、汎用されているサブマリン型ゲルを用いた電気泳動方法と同等のＤＮＡの分離能を得られることを示す。
【００５６】
（実施例２）
実施例１と同様に組み立てられたガラス間隙に、最下層ゲルが２ｃｍの高さとなるように、最下層ゲル用のゲル化用溶液を３．４ｍＬ加え、室温で２０分間放置することでゲル化用溶液をゲル化させた。その後、その上層の分離ゲル（Ａ）が３ｃｍの高さとなるように、分離ゲル（Ａ）用のゲル化用溶液を５．１ｍＬ加え、室温で２０分間放置することでゲル化用溶液をゲル化させた。さらにその上層の分離ゲル（Ｂ）が３ｃｍの高さとなるように、分離ゲル（Ｂ）用のゲル化用溶液を５．１ｍＬ加え、室温で２０分間放置することでゲル化用溶液をゲル化させた。そして最上層にストットゲルが１ｃｍ高さとなるように、スロットゲル用のゲル化用溶液を１．７ｍＬ加え、２ｍｍ厚の１６サンプル用コームを挿入し、室温に放置することでゲル化用溶液をゲル化させた。その後、コームをゲルから静かに外すことにより、実施例２の電気泳動用ゲルを作製した。
【００５７】
＜泳動等の条件＞
・最下層ゲル用のゲル化用溶液：アガロースが１．０重量％となるように、Agarose S（ニッポンジーン社製）をＴＡＥ緩衝液に加えた。
・分離ゲル（Ａ）用のゲル化用溶液：アガロースが０．８重量％となるようにAgarose S（ニッポンジーン社製）を、アガーが０．２重量％となるように精製寒天末（ナカライテスク株式会社製）を、ガラクトマンナンが０．１重量％となるように実施例１の精製方法でタラガムを精製することにより得られたガラクトマンナンを、グルコマンナンが０．０７５重量％となるようにコンニャク精粉（茂木食品工業株式会社、群馬県下仁田市）を、それぞれＴＡＥ緩衝液に加えた。
・分離ゲル（Ｂ）用のゲル化用溶液：アガロースが０．８重量％となるように、Agarose S（ニッポンジーン社製）をＴＡＥ緩衝液に加えた。
・電気泳動試料：実施例１と同じ
・泳動条件：泳動緩衝液；１×ＴＡＥ、６０Ｖ、１．５時間
実施例２を実施例１と比較すると、実施例２では、１００ｂｐ〜２Ｋｂの良好な分離に加え、２Ｋｂ〜１０Ｋｂまで高分子ＤＮＡ領域にも優れた分離能が得られることがわかる。このことは、中空板を備える多段式ゲルを用いることにより、ゲルの解析領域を最適化できることを意味している。
【００５８】
（実施例３）
実施例１と同様に組み立てられたガラス間隙に、分離ゲル（Ａ）が４．５ｃｍの高さとなるように、分離ゲル（Ａ）用のゲル化用溶液を７．７ｍＬ加え、室温で２０分間放置することでゲル化用溶液をゲル化させた。さらにその上層の分離ゲル（Ｂ）が４．５ｃｍの高さとなるように、分離ゲル（Ｂ）用のゲル化用溶液を７．７ｍＬ加え、２ｍｍ厚の１６サンプル用コームを挿入し、室温に放置することでゲル化用溶液をゲル化させた。その後、コームをゲルから静かに外すことにより、実施例３の電気泳動用ゲルを作製した。
【００５９】
＜泳動等の条件＞
・分離ゲル（Ａ）用のゲル化用溶液：アガロースが０．５重量％、アガーが０．２重量％、グルコマンナンが０．０５重量％となるように、それぞれ、Agarose S（ニッポンジーン社製）、精製寒天末（ナカライテスク株式会社製）、グルコマンナン（コンニャク製粉、茂木食品工業社製）をＴＡＥ緩衝液に加えた。
・分離ゲル（Ｂ）用のゲル化用溶液：アガロースが０．５重量％となるようにAgarose S（ニッポンジーン社製）を、アガーが０．２重量％となるように精製寒天末（ナカライテスク株式会社製）を、ガラクトマンナンが０．３重量％となるように、実施例１の精製方法でローカストビーンガム由来のガラクトマンナン（Locust bean gum（Sigma-Aldrich社製））を精製することにより得られたガラクトマンナン、グルコマンナンが０．０７５重量％となるようにコンニャク製粉（茂木食品工業社製）を、それぞれＴＡＥ緩衝液に加えた。
・電気泳動試料：実施例１と同じ
・泳動条件：泳動緩衝液；１×ＴＰＥ、６０Ｖ、２時間
実施例３では、実施例１、実施例２にない広範な分子量領域で高い分離能を示すＤＮＡ分離パターンが得られたことがわかる。
【００６０】
（実施例４）
実施例１と同様に組み立てられたガラス間隙に、最下層ゲルが２ｃｍの高さとなるように、最下層ゲル用のゲル化用溶液を３．４ｍＬ加え、室温で３０分間放置することでゲル化させた。その後、その上層の分離ゲル（Ａ）が２ｃｍの高さとなるように、分離ゲル（Ａ）用のゲル化用溶液を３．４ｍＬ加え、室温で３０分間放置することでゲル化させた。さらにその上層の分離ゲル（Ｂ）が２ｃｍの高さとなるように、分離ゲル（Ｂ）用のゲル化用溶液を３．４ｍＬ加え、室温で３０分間放置することでゲル化させた。その後、分離ゲル（Ｃ）が２ｃｍの高さになるように分離ゲル（Ｃ）を３．４ｍＬ加え、室温で３０分放置しゲル化させた。そして最上層にストットゲルが１ｃｍ高さとなるように、スロットゲル用のゲル化用溶液を１．７ｍＬ加えた後、２ｍｍ厚の１６サンプル用コームを挿入し、室温に放置することでゲル化させた。その後、コームをゲルから静かに外すことにより、実施例４の電気泳動用ゲルを作製した。
【００６１】
＜泳動等の条件＞
・スロットゲル用のゲル化用溶液：アガロースが１．０重量％、グルコマンナンが０．１重量％となるように、それぞれ、Agarose S（ニッポンジーン社製）、グルコマンナン（コンニャク製粉、茂木食品工業社製）をＴＡＥ緩衝液に加えた。
・最下層用ゲルのゲル化用溶液：アガロースが１．０重量％となるように、Agarose S（ニッポンジーン社製）をＴＡＥ緩衝液に加えた。
・分離ゲル（Ａ）用のゲル化用溶液：アガロースが２．０重量％となるようにAgarose S（ニッポンジーン社製）をＴＡＥ緩衝液に加えた。
・分離ゲル（Ｂ）用のゲル化用溶液：アガロースが０．８重量％となるようにAgarose S（ニッポンジーン社製）をＴＡＥ緩衝液に加えた。
・分離ゲル（Ｃ）用のゲル化用溶液：アガロースが０．６重量％となるようにAgarose S（ニッポンジーン社製）をＴＡＥ緩衝液に加えた。
・電気泳動試料：実施例１と同じ
・泳動条件：泳動緩衝液；１×ＴＡＥ、６０Ｖ、１時間３０分
実施例４では、５００ｂｐ〜１０ｋｂｐまでの各ＤＮＡがほぼ均等に配置するように分離され、これは実施例１〜３のゲルとは異なる泳動パターンであることがわかる。
【００６２】
（比較例１）
加熱溶解により後述の組成のゲル化用溶液を調製し、接着テープで３辺がシールされた２ｍｍ厚のガラス製のゲル板に流し込んだ。これに２ｍｍ厚の１６サンプル用コームをセットし、室温に放置することでゲル化用溶液をゲル化させた。コームをゲル板から静かに外した後、ゲルを泳動槽に装着し、各スロットに５μＬの電気泳動試料を静かに添加した。室温にて以下の条件で泳動後、ガラス板の間にスパーテルを挿入し一方側を持ち上げた。他方のガラス板に残っているゲルを静かに染色液に押し出し、写真撮影した。ゲルの撮影は、実施例１と同様に行った。
【００６３】
＜泳動等の条件＞
・ゲル化用溶液：アガロースが１重量％、グルコマンナンが０．２重量％になるように、それぞれアガロース（Agarose S, ニッポンジーン社製）、グルコマンナン（コンニャク製粉、茂木食品工業社製）をＴＡＥ緩衝液に加えた。
・泳動条件：泳動バッファー；ＴＡＥ、６Ｖ／ｃｍ、９０ｍｉｎ
・電気泳動試料：レーン１；０．１〜２０ＫｂｐのＤＮＡ(Gene Ladder wide 2, ニッポンジーン社製);レーン２；０．１〜１０ＫｂｐのＤＮＡ(Gene Ladder Fast 2, ニッポンジーン社製);レーン３；５０ｂｐ DNA Ladder (TAKARA社製);レーン４；０．１〜２ＫｂｐのＤＮＡ(Gene Ladder 100，ニッポンジーン社製)；一番左のレーン；ＰＣＲ増幅により調製した550 bp,700bpの２つを加えたLambda phage/HindIII I digest(λ/HindIII)（ニッポンジーン社製）
比較例１の結果より、中空板を備えていない電気泳動用ゲルでは、泳動試料が八の字に曲がって電気泳動されることがわかった。
【００６４】
（実施例５）
実施例１で用いた「養生プラダン」を、２つの貫通孔を有するように長さ１００ｍｍ×幅８ｍｍ×厚さ２．５ｍｍに切断することにより、スペーサーを作製した。実施例１で用いた「養生プラダン」を、貫通孔に対して垂直に長さ７５ｍｍ×幅８ｍｍ×厚さ２．５ｍｍに切断することにより、コームを作製した。実施例１において、これらのスペーサーおよびコームを用いたこと以外は実施例１と同様の電気泳動用ゲルの作製部材を用いて、電気泳動用ゲルを作製し、電気泳動を行った。なお、ゲル化溶液として、以下の組成の溶液を用いた。
【００６５】
＜泳動等の条件＞
・ゲル化用溶液：アガロースが０．５重量％、アガーが０．２重量％、グルコマンナンが０．１５重量％となるように、それぞれ、Agarose S（ニッポンジーン社製）、精製寒天末（ナカライテスク株式会社製）、グルコマンナン（コンニャク製粉、茂木食品工業社製）をＴＡＥ緩衝液に加えた。
・ＤＮＡサイズマーカー：実施例１と同じ
・泳動条件：泳動緩衝液；１×ＴＰＥ、６０Ｖ、１時間３０分
実施例５より、実施例１と同様に好適なＤＮＡ泳動像が得られ、さらにサンプル間の空間が無くなっていることがわかる。これらの結果から、スペーサーやコームが中空板からなる電泳動用ゲルの作製方法も有効であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、電気泳動を伴う解析が行われる様々な分野に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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