(57)【要約】【課題】アクロレイン存在下であってもニトリルヒドラターゼを用いるアミド化合物生成反応に対するアクロレインによる阻害を低減できるアミド化合物の製造方法を提供する。【解決手段】ニトリルヒドラターゼ、ニトリル化合物、アクロレイン、塩基性アミノ酸、及び水性媒体を含む溶液中でニトリル化合物を水和させてアミド化合物に変換する工程を含む、アミド化合物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ、ニトリル化合物、アクロレイン、塩基性アミノ酸、及び水性媒体を含む溶液中でニトリル化合物を水和させてアミド化合物に変換する工程を含む、アミド化合物の製造方法。
【請求項２】
前記塩基性アミノ酸が、リジン、ヒスチジン、オルニチン、及びポリリジンからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ニトリルヒドラターゼが、シュードノカルディア属由来のニトリルヒドラターゼ又はロドコッカス属由来のニトリルヒドラターゼである、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記溶液中のアクロレインの質量に対する塩基性アミノ酸の質量が５０質量％以上である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記溶液中におけるアクロレインの量が前記ニトリル化合物の量に対して１ｐｐｍ超である、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示はアミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミド化合物であるアクリルアミドの製造の原料として用いられるアクリルニトリルには、副生成物としてアクロレインが含まれうることが知られている。特許文献１は、アクリロニトリルの製造中に副生成物としてアクロレインが通常発生することを記載している。特許文献１はまた、アクリルアミドモノマー中のアクロレインの存在は、通常、アクリルアミドポリマーの架橋結合を生じ、水溶性ポリマーの調製中に少なくとも部分的に不溶性ポリマーを形成することを記載している。
【０００３】
特許文献２も、アクロレインがニトリルヒドラターゼによるアクリルアミドの合成反応を阻害することを記載している。特許文献２は、イオン交換樹脂などを用いて原料アクリロニトリル中のアクロレインの濃度を１ｐｐｍ以下とすることで、ニトリルヒドラターゼによる触媒作用に対するアクロレインによる阻害が起こらなくすることができることを記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−１３９２３３号公報
【特許文献２】特開２０１２−２９６９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特開２０１２−２９６９５号公報（特許文献２）に記載された方法は、原料アクリロニトリル中のアクロレイン濃度を１ｐｐｍ以下に制御することによりアクロレインによるニトリルヒドラターゼ活性阻害を回避するものであって、１ｐｐｍ超のアクロレイン存在下におけるニトリルヒドラターゼ活性に対する阻害を低減するものではない。アクロレイン除去のための操作を必要とせずに、ニトリルヒドラターゼ活性に対する阻害を低減できることが望ましい。そこで、本開示の一実施形態は、アクロレイン存在下においてもニトリルヒドラターゼを用いるアミド化合物生成反応に対するアクロレインによる阻害を低減できるアミド化合物の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、以下の態様を含む。
＜１＞  ニトリルヒドラターゼ、ニトリル化合物、アクロレイン、塩基性アミノ酸、及び水性媒体を含む溶液中でニトリル化合物を水和させてアミド化合物に変換する工程を含む、アミド化合物の製造方法。
＜２＞  前記塩基性アミノ酸が、リジン、ヒスチジン、オルニチン、及びポリリジンからなる群から選択される少なくとも１種を含む、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞  前記ニトリルヒドラターゼが、シュードノカルディア属由来のニトリルヒドラターゼ又はロドコッカス属由来のニトリルヒドラターゼである、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞  前記溶液中のアクロレインの質量に対する塩基性アミノ酸の質量が５０質量％以上である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜５＞  前記溶液中におけるアクロレインの量が前記ニトリル化合物の量に対して１ｐｐｍ超である、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本開示によれば、アクロレイン存在下においてもニトリルヒドラターゼを用いるアミド化合物生成反応に対するアクロレインによる阻害を低減できるアミド化合物の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても当該工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本開示において、記載される各要素は、その数について特に明記されない限りは、一つ存在しても、複数存在しても構わない。
本開示において、組成物中の各成分の量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【０００９】
本開示は、ニトリルヒドラターゼ、ニトリル化合物、アクロレイン、塩基性アミノ酸、及び水性媒体を含む溶液（以下、「反応溶液」とも称する）中でニトリル化合物を水和させてアミド化合物に変換する工程を含む、アミド化合物の製造方法（以下、「本開示に係るアミド化合物の製造方法」とも称する）を提供する。
【００１０】
本開示に係るアミド化合物の製造方法を用いることにより、ニトリルヒドラターゼを用いるアミド化合物生成反応に対するアクロレインによる阻害を低減できる。この理由は必ずしも明らかではないが、次のように推定できる。特開２０１２−１３９２３３号公報（特許文献１）及び特開２０１２−２９６９５号公報（特許文献２）に記載のとおり、ニトリル化合物を合成する過程では、通常、アクロレインが副生してしまう。アクロレインは高い反応性を有する物質であって、ニトリルヒドラターゼの塩基性アミノ酸残基中の窒素原子に付加して付加体を形成し、ニトリルヒドラターゼの活性を低下させると考えられる。遊離の塩基性アミノ酸が反応溶液中に存在する場合、アクロレインは遊離の塩基性アミノ酸に付加し、ニトリルヒドラターゼに対する付加が減少すると考えられる。このため、ニトリルヒドラターゼ、ニトリル化合物、アクロレイン、塩基性アミノ酸、及び水性媒体を含む溶液中でニトリル化合物を水和させてアミド化合物に変換する工程を含む本開示に係るアミド化合物の製造方法では、アミド化合物生成反応に対するアクロレインによる阻害を低減できると考えられる。
【００１１】
＜ニトリル化合物＞
本開示に係るアミド化合物の製造方法で用いられるニトリル化合物とは、溶液中でニトリルヒドラターゼによりアミド化合物へ変換される化合物であれば特に限定されない。ニトリル化合物の例としては、アセトニトリル、プロピオニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、クロトノニトリル、α−ヒドロキシイソブチロニトリルなどの炭素数２〜４のニトリル化合物が挙げられる。ニトリル化合物としては、アクリロニトリル及びメタクリロニトリルのうちの少なくとも１種を用いることが好ましい。
【００１２】
原料として用いられるニトリル化合物には、一般的にアクロレインが不純物として含まれている。アクロレインの存在はニトリルヒドラターゼ活性を阻害するものであるが、本開示に係るアミド化合物の製造方法によればアクロレイン存在下であってもアクロレインによるニトリルヒドラターゼ活性への阻害を低減することができる。上述のようにアクロレインは、一般には、意図的に添加する成分というよりはニトリル化合物の添加により付随的に添加されてしまう成分である。
ニトリル化合物中に不純物として含まれるアクロレインの割合は特に限定されない。原料として用いられるニトリル化合物中に含まれるアクロレインの割合が大きい方が、本開示に係るアミド化合物の製造方法がより顕著に発揮される傾向にある。このため、原料として用いられるニトリル化合物中に含まれるアクロレインの割合は、例えば、０．５ｐｐｍ以上であり、好ましくは１ｐｐｍ超であり、より好ましくは２ｐｐｍ以上であり、さらに好ましくは５ｐｐｍ以上である。アクロレインの割合が高い場合であっても、それに応じた量の塩基性アミノ酸を存在させればよいため、アクロレインの割合の上限は特に限定されないが、原料として用いられるニトリル化合物中に含まれるアクロレインの割合は、例えば、０．５ｐｐｍ〜１００００ｐｐｍであり、好ましくは２ｐｐｍ〜５００ｐｐｍであり、より好ましくは５ｐｐｍ〜４０００ｐｐｍである。ここで、ニトリル化合物中に含まれるアクロレインの割合がＸｐｐｍであるとは、アクリロニトリルの１ｋｇ（不純物も含む質量）中に含まれるアクロレインの質量がＸｍｇであることを意味している。
【００１３】
また、反応溶液中におけるアクロレインの割合は、例えば、０．２ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍであり、好ましくは１ｐｐｍ〜８００ｐｐｍであり、より好ましくは５ｐｐｍ〜６００ｐｐｍである。ここで、反応溶液中に含まれるアクロレインの割合がＸｐｐｍであるとは、反応溶液１ｋｇ中に含まれるアクロレインの質量がＸｍｇであることを意味している。
【００１４】
アクロレインの量は高速液体クロマトグラフィー法により測定できる。具体的には、高速液体クロマトグラフ装置をＵＶ検出器波長２１０ｎｍ、カラム温度４０℃で用い、分離カラムとしてＬ−Ｃｏｌｕｍｎ（登録商標）ＯＤＳ  Ｔｙｐｅ−Ｗａｔｅｒｓ（財団法人化学品検査協会製、カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）を用い、２０％（容積基準）アセトニトリル水溶液（リン酸にてｐＨ２．５に調整）を溶離液として用いた高速液体クロマトグラフィー法により測定できる。例えば、既知濃度のアクロレインを含む複数の標準試料を測定することにより検量線を作成し、この検量線を基にアクロレイン量を求めることができる。
【００１５】
反応溶液中のニトリル化合物の濃度は、ニトリル化合物によってニトリルヒドラターゼが失活しない範囲であれば特に限定されない。反応溶液の全質量に対するニトリル化合物の質量の割合は、好ましくは３質量％〜５０質量％以下であり、より好ましくは５質量％〜３０質量％であり、さらに好ましくは１０質量％〜２０質量％である。
【００１６】
＜ニトリルヒドラターゼ＞
本開示に係るアミド化合物の製造方法におけるニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力をもつ酵素をいう。本開示に係るアミド化合物の製造方法におけるニトリルヒドラターゼは反応溶液中に含まれているが、反応溶液の調製の過程においては精製されたニトリルヒドラターゼを反応溶液に添加してもよく、ニトリルヒドラターゼ生産能を有する微生物の菌体を反応溶液に添加してもよく、ニトリルヒドラターゼ生産能を有する微生物菌体の処理物を反応溶液に添加してもよい。また、本開示において反応溶液とは、溶質が完全に溶解している溶液のみを指すわけではなく、細胞や細胞内容物などの不溶物が懸濁、沈殿等している液体組成物をも含む意味で用いられる。ニトリルヒドラターゼは、例えば、内在性のニトリルヒドラターゼ遺伝子を有するニトリルヒドラターゼ生産微生物によって生産したものでもよいし、外来のニトリルヒドラターゼをプラスミドなどの発現ベクターに有するニトリルヒドラターゼ生産微生物によって生産したものであってもよい。また、ニトリルヒドラターゼは、天然生物のニトリルヒドラターゼであってもよいし、天然生物のニトリルヒドラターゼに対してアミノ酸配列の改変を加えた改変ニトリルヒドラターゼであってもよい。
【００１７】
天然生物のニトリルヒドラターゼとしては、例えば、微生物のニトリルヒドラターゼが挙げられる。より具体的には、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム( Agrobacterium)属、またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物のニトリルヒドラターゼが例として挙げられる。ニトリルヒドラターゼは、これらの中でも、シュードノカルディア属由来のニトリルヒドラターゼ又はロドコッカス属由来のニトリルヒドラターゼであることが好ましい。
【００１８】
あるいは、ニトリルヒドラターゼ生産微生物は、外来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を有する宿主微生物（以下、「ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物」）であってもよい。外来のニトリルヒドラターゼ遺伝子は、天然生物、例えば天然微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子であってもよく、又はこうした天然生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子に対してヌクレオチド配列の改変を加えた改変ニトリルヒドラターゼ遺伝子であってもよい。ニトリルヒドラターゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主微生物内に導入することにより、ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物を得ることができる。
【００１９】
ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物の宿主微生物としては、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるものではなく、枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も挙げられる。ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物の例として、シュードノカルディア・サーモフィラのニトリルヒドラターゼ遺伝子を大腸菌に導入したＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現  茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター  中央第６  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。
ニトリルヒドラターゼ生産組換え微生物が、シュードノカルディア・サーモフィラなどのシュードノカルディア属微生物をコードする遺伝子が導入されたニトリルヒドラターゼ生産能を有する組換え大腸菌、又はロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）などのロドコッカス属微生物であることも、また好ましい。
【００２０】
ニトリルヒドラターゼ生産微生物の菌体を、ニトリルヒドラターゼ、ニトリル化合物、アクロレイン及び塩基性アミノ酸を含む水性媒体中でニトリル化合物を水和させてアミド化合物に変換する工程（以後、「アミド化合物生成工程」とも称する）に用いる場合には、菌体は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学などの分野において公知の一般的な方法を利用して調製すればよい。例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地等の一般的な液体培地にニトリルヒドラターゼ生産微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい）で生育させ、続いて、ニトリルヒドラターゼ生産微生物を遠心分離によって培養液より分離、回収することにより、菌体を調製することができる。
【００２１】
ニトリルヒドラターゼ生産微生物の菌体処理物をアミド化合物生成工程に用いる場合には、菌体処理物は、１）ニトリルヒドラターゼ生産微生物の菌体の抽出物若しくは磨砕物、２）該抽出物若しくは磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離して得られる画分、３）前記菌体、前記菌体抽出物、前記菌体磨砕物、若しくは前記画分を適当な担体を用いて固定化した固定化物、などのいずれであってもよい。これらはニトリルヒドラターゼの活性を有している限りはアミド化合物生成工程で使用可能な菌体処理物に相当する。アミド化合物生成工程では、１種類の菌体処理物を用いてもよいし、２種類以上の異なる形態の菌体処理物を同時あるいは交互に用いてもよい。
【００２２】
精製されたニトリルヒドラターゼをアミド化合物生成工程に用いる場合には、例えば、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の菌体の抽出物若しくは磨砕物からニトリルヒドラターゼ活性画分を分離する。活性画分中のニトリルヒドラターゼが十分な純度を有している場合には活性画分又はこれに溶媒交換等したものを精製された酵素として用いることができる。活性画分中のニトリルヒドラターゼの純度が十分で無い場合には、液体クロマトグラフィー、ろ過などによりさらに精製したものを精製された酵素として用いることができる。
【００２３】
反応溶液中におけるニトリルヒドラターゼの濃度は、所望の反応速度に応じて、必要なユニット数のニトリルヒドラターゼを与える濃度とすればよい。例えば、ニトリルヒドラターゼ生産微生物の菌体を用いる場合には、乾燥菌体の質量が反応溶液の質量に対し、１０ｐｐｍ〜５００００ｐｐｍ、好ましくは５０ｐｐｍ〜３００００ｐｐｍとなるようにしてもよい。
【００２４】
＜水性媒体＞
本開示に係るアミド化合物の製造方法で用いられる水性媒体は、例えば、水、又はリン酸塩等の緩衝剤、硫酸塩や炭酸塩等の無機塩、アルカリ金属の水酸化物、アミド化合物等からなる群から選択される成分を適当な濃度で溶解させた水溶液である。水以外の追加成分については、ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生成工程を阻害しない限りは特に限定されない。
【００２５】
＜塩基性アミノ酸＞
本開示に係るアミド化合物の製造方法において用いられる塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンなどの標準アミノ酸、オルニチンなどの非標準アミノ酸、及びポリリジンなどのアミノ酸重合体からなる群から選択される少なくとも１種とすることができる。反応溶液中における塩基性アミノ酸の濃度は、原料としてのニトリル化合物中におけるアクロレイン濃度に応じて適宜調節可能であるが、例えば、０．５ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍであり、好ましくは１ｐｐｍ〜８００ｐｐｍであり、より好ましくは５ｐｐｍ〜６００ｐｐｍである。反応溶液中におけるアクロレイン濃度に対する塩基性アミノ酸の濃度の比（塩基性アミノ酸濃度／アクロレイン濃度）は、アクロレインによるアミド化合物生成反応の阻害をより効果的に低減する観点からは、３０質量％以上とすることが好ましく、５０質量％以上とすることが好ましく、８０質量％以上とすることがさらに好ましく、１５０質量％以上とすることが一層好ましく、２５０質量％以上とすることがより一層好ましい。ただし、塩基性アミノ酸の量が増えれば、その分コストが上昇することにもなるので、反応溶液中におけるアクロレイン濃度に対する塩基性アミノ酸の濃度の比（塩基性アミノ酸濃度／アクロレイン濃度）は、例えば３０質量％〜５００質量％、又は５０質量％〜４００質量％、又は８０質量％〜３５０質量％、又は１５０質量％〜３００質量％とすることができる。
【００２６】
＜アミド化合物生成工程＞
アミド化合物生成工程における反応条件は以下の通りである。反応溶液中のニトリル化合物の濃度は、反応を効率的に進ませるためになるべく高いことが好ましく、ニトリル化合物の飽和濃度であってもよい。この場合は、溶けきれないニトリル化合物が存在していてもよく、アミド化合物生成反応の進行と共にニトリル化合物が消費されるため、溶けきれていないニトリル化合物も反応の進行と共に反応溶液中に溶解する。反応溶液中におけるニトリル化合物の濃度を高くすることにより、反応をアミド化合物生成側に進みやすくできる。ただし、あまりに大過剰のニトリル化合物を供給しても、反応を完結させるために必要なニトリルヒドラターゼの量や反応器の容積が増大し、また、除熱のために大能力の熱交換器等が必要となるなど、設備面での経済的負担が大きくなる。このため、反応溶液中におけるニトリル化合物の量（溶けきれていない量も含む）は、ニトリル化合物の全量が対応するアクリルアミドに転化したと仮定した場合のアミド化合物の理論生成量が、反応溶液に対して４０質量％〜８０質量％の範囲となる量とすることが好ましい。
【００２７】
アミド化合物生成工程における反応時間は、酵素使用量や温度等の条件にも左右され得るが、例えば１時間〜８０時間、好ましくは２時間〜４０時間である。
アミド化合物生成工程における反応形式については、特に限定するものではなく、回分式、半回分式、及び連続式のいずれであってもよい。また、懸濁床、固定床、移動床などのいずれを用いてもよい。通常は撹拌機を備えた槽型反応器又はプラグフロー反応器での反応がより好ましく、また、複数の形式の反応器を組み合わせて用いてもよい。
【００２８】
また、水和反応であるアミド化合物生成反応は、通常は常圧又は常圧近辺で行われるが、ニトリル化合物の反応溶液中への溶解度を高めるために加圧下で行ってもよい。また、反応温度に関しては、水性媒体の氷点以上の温度であれば特に制限されるものではないが、通常は、０℃〜５０℃で行うのが好ましく、１０℃〜４０℃で行うことがより好ましい。生成物が反応液中に晶出したスラリー状態でも反応を行うことができる。また、アミド化合物生成反応における反応溶液のｐＨは、ニトリルヒドラターゼ活性が維持されている限りは特に制限されるものではないが、好ましくは６〜１０であり、より好ましくは７〜９である。
【００２９】
反応溶液を調製するにあたっては、ニトリルヒドラターゼ、ニトリル化合物、及び塩基性アミノ酸のそれぞれを水性媒体中に存在させる方法は特に限定されず、固体状態で水性媒体に添加してもよく、溶液の状態で水性媒体に添加してもよい。例えば、水性媒体を含むニトリルヒドラターゼ生産微生物の懸濁液にニトリル化合物及び塩基性アミノ酸を添加して、反応溶液を調製してもよい。反応溶液は不均一とならないように撹拌されることが好ましい。
【００３０】
アミド化合物生成工程により得られるアミド化合物は、原料として使用されるニトリル化合物に対応したアミド化合物である。アミド化合物の例としては、アセトアミド、プロピオンアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、ｎ−ブチルアミド、イソブチルアミド、クロトンアミド、α−ヒドロキシイソブチルアミドなどの炭素数２〜４のアミド化合物が挙げられる。
【００３１】
アミド化合物生成工程により得られたアミド化合物は、さらに精製して精製品を作製してもよく、また、アミド化合物が（メタ）アクリロニトリルなどの不飽和化合物の場合には重合してポリマーを作製してもよい。ポリマーを作製する際には、アミド化合物生成工程により得られたアミド化合物以外の単量体も混合することにより共重合体を作製することもできる。
【００３２】
上述のとおり、本開示に係るアミド化合物の製造方法によれば、ニトリルヒドラターゼを用いるアミド化合物生成反応に対するアクロレインによる阻害を低減することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例に基づいて実施形態をさらに具体的に説明するが、本開示はこれにより何ら限定されるものではない。以下、特に断りのない限り、％及びｐｐｍはいずれも質量基準である。
【００３４】
＜ニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒の調製＞
特開２００１−３４００９１号の実施例１に記載された方法に従い、特開平０９−２７５９７８で得られたｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし、特開平０９−２７５９７８の表３にクローンＮｏ．３として示されるニトリルヒドラターゼ生産微生物を取得した。このクローンＮｏ．３は、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を改変して発現するニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から６番目のＬｅｕをＡｌａに置換した遺伝子（ヌクレオチド上のコドンの変化はＣＴＧからＧＴＧへの変化）を、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換した形質転換体である。ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドを保有する大腸菌は、ＭＴ−１０８２２株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５）として、前述のとおり特許生物寄託センターに寄託されている。得られたニトリルヒドラターゼ生産微生物を用い下記の方法で湿菌体を得た。
【００３５】
５００ｍＬのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍＬを調製し、１２１℃で２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した後、上記のクローンＮｏ．３の菌体（ニトリルヒドラターゼ生産微生物）を一白金耳で植菌し、３７℃で１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。培養後、遠心分離（１５０００Ｇ×１５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００３６】
培地組成  酵母エキストラクト        ５．０ｇ／Ｌ
ポリペプトン              １０．０ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                  ５．０ｇ／Ｌ
塩化コバルト・六水和物    １０．０ｍｇ／Ｌ
硫酸第二鉄・七水和物      ４０．０ｍｇ／Ｌ
ｐＨ７．５
【００３７】
＜実施例１＞
上述の湿菌体を２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）により希釈した後、アクリルアミド、アクリロニトリル、アクロレイン及びヒスチジンを添加して反応溶液を調製した。反応溶液中におけるアクリルアミドの濃度は３０質量％、アクリルニトリルの濃度は１５質量％、アクロレインの濃度は３８７ｐｐｍ、ヒスチジンの濃度は３００ｐｐｍとなるように添加量を調整した。反応溶液は、２０℃で４時間反応させた。反応後、反応溶液５０μｌを採取し、５０ｍＭリン酸水溶液を９５０μｌ添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度をＷＯ２００７／０４０２６７の実施例１に記載の方法に従いＨＰＬＣ分析により測定した。具体的には、ＨＰＬＣ分析におけるカラムとしてＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ（１５０×６φｍｍ、株式会社ワイエムシィ製）を使用し、３％アセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸水溶液を移動相とした。アクリルアミドは２１０ｎｍの吸光度により検出し、濃度を測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。
なお、アクリロニトリルからアクリルアミドを生成する場合、ニトリルヒドラターゼの活性がアクリルアミドによる生成物阻害を受け、アクリルアミド生成反応の進行とともにニトリルヒドラターゼ活性が変化してしまう可能性がある。このため、この実験では、反応溶液中にアクリルアミドを最初から添加しておくことでアクリルアミド生成反応における状態をより精度良く再現している。
【００３８】
＜実施例２＞
反応溶液中におけるヒスチジン濃度を６００ｐｐｍとなるように添加したこと以外は、実施例１と同様の処理及び測定を行った。
【００３９】
＜実施例３＞
反応溶液中におけるヒスチジン濃度を１２００ｐｐｍとなるように添加したこと以外は、実施例１と同様の処理及び測定を行った。
【００４０】
＜実施例４＞
ヒスチジンの代わりにリジンを添加して、反応溶液中におけるリジン濃度が３００ｐｐｍとなるようにしたこと以外は、実施例１と同様の処理及び測定を行った。
【００４１】
＜実施例５＞
ヒスチジンの代わりにリジンを添加して、反応溶液中におけるリジン濃度が６００ｐｐｍとなるようにしたこと以外は、実施例１と同様の処理及び測定を行った。
【００４２】
＜実施例６＞
ヒスチジンの代わりにリジンを添加して、反応溶液中におけるリジン濃度が１２００ｐｐｍとなるようにしたこと以外は、実施例１と同様の処理及び測定を行った。
【００４３】
＜比較例１＞
ヒスチジンを添加しなかったこと以外は、実施例１と同様の処理及び測定を行った。
【００４４】
＜参考例＞
ヒスチジン及びアクロレインを両方とも添加しなかったこと以外は、実施例１と同様の処理及び測定を行った。
【００４５】
＜活性の評価＞
実施例１〜実施例６、比較例１、及び参考例のそれぞれにおけるアクリルアミドの生成速度を下記表１に示す。表１中、「活性」は、参考例におけるアクリルアミドの生成速度に対するそれぞれの実施例又は比較例におけるアクリルアミドの生成速度の比の値である。
【００４６】
【表１】
2019176835.tif 000002
【００４７】
表１の結果より、塩基性アミノ酸であるヒスチジン、リジンをニトリル化合物からアミド化合物への反応工程で配合することで、アクロレインによる活性阻害を抑制でき、さらに活性を向上させることがわかった。