(57)【要約】【課題】哺乳類動物受精卵に、より簡便且つより効率的に、さらには哺乳類動物受精卵又はその発生物の生存率をより高く保ちつつ、Cpf1タンパク質を導入する方法を提供すること、及び哺乳類動物受精卵又はその発生物を、Cpf1タンパク質を用いてより簡便且つ効率的に、さらには哺乳類動物受精卵又はその発生物の生存率をより高く保ちつつ、ゲノム編集する方法を提供すること。【解決手段】（工程1）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルス1又は複数回を、特定条件でかける工程、又は（工程2）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけた後、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かける工程、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（工程1）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルス1又は複数回を、以下の条件：
（条件1A）パルス1回当たりの時間が0.5ms以上2ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が15V〜100Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜400である条件、
（条件1B）パルス1回当たりの時間が2ms以上4ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜90Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜300である条件、
（条件1C）パルス1回当たりの時間が4ms以上6ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜80Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜150である条件、若しくは
（条件1D）パルス1回当たりの時間が6ms以上10ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜70Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜100である条件、
でかける工程、又は
（工程2）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけた後、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かける工程、
を含む、Cpf1タンパク質を含む受精卵の製造方法。
【請求項２】
前記工程2において、パルス1回当たりの時間が0.5ms以上10ms未満であり、且つ電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜100Vである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記工程2が、以下の条件：
（条件2A）パルス1回当たりの時間が0.5ms以上2ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜100Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜500である条件、
（条件2B）パルス1回当たりの時間が2ms以上4ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜90Vであり、且つ電前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜350である条件、
（条件2C）パルス1回当たりの時間が4ms以上6ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜80Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜180である条件、若しくは
（条件2D）パルス1回当たりの時間が6ms以上10ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜70Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜180である条件、
で行われる、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程2を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記液中のCpf1タンパク質の濃度が3〜5000ng/μLである、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記液がポリヌクレオチドを含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドがcrRNAである、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記哺乳動物が、ヒト、実験動物、及び家畜からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
（工程1）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルス1又は複数回を、以下の条件：
（条件1A）パルス1回当たりの時間が0.5ms以上2ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が15V〜100Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜400である条件、
（条件1B）パルス1回当たりの時間が2ms以上4ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜90Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜300である条件、
（条件1C）パルス1回当たりの時間が4ms以上6ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜80Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜150である条件、若しくは
（条件1D）パルス1回当たりの時間が6ms以上10ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜70Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜100である条件、
でかける工程、又は
（工程2）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけた後、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かける工程、
を含む、受精卵にCpf1タンパク質を導入する方法。
【請求項１０】
（工程1）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルス1又は複数回を、以下の条件：
（条件1A）パルス1回当たりの時間が0.5ms以上2ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が15V〜100Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜400である条件、
（条件1B）パルス1回当たりの時間が2ms以上4ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜90Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜300である条件、
（条件1C）パルス1回当たりの時間が4ms以上6ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜80Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜150である条件、若しくは
（条件1D）パルス1回当たりの時間が6ms以上10ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜70Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜100である条件、
でかける工程、又は
（工程2）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけた後、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かける工程、
を含む、ゲノム編集された受精卵又はその発生物の製造方法。
【請求項１１】
（工程1）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルス1又は複数回を、以下の条件：
（条件1A）パルス1回当たりの時間が0.5ms以上2ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が15V〜100Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜400である条件、
（条件1B）パルス1回当たりの時間が2ms以上4ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜90Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜300である条件、
（条件1C）パルス1回当たりの時間が4ms以上6ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜80Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜150である条件、若しくは
（条件1D）パルス1回当たりの時間が6ms以上10ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜70Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜100である条件、
でかける工程、又は
（工程2）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけた後、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かける工程、
を含む、受精卵又はその発生物のゲノム編集方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Cpf1タンパク質導入方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子改変動物は、現在、医学および生物学を含む様々な研究分野において、生物の基本的メカニズムの解明のために、あるいは、ヒトの疾患のモデルとして、使用されている。迅速な遺伝子改変動物の作製手段として、ZFN（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Zinc-Finger Nucleases））、TALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Transcription Activator-Like Effector Nucleases））およびCRISPR／Cas系（群生性等間隔短回文反復関連システム（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-Associated System））などの人工制限酵素を利用する系が、注目を集めている。これらの新しい技術はゲノム編集と呼ばれ、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）を利用せずに、幅広い生物のゲノムを改変することを可能にした。また、近年、ある種のヌクレアーゼ（Cpf1タンパク質）が、Casタンパク質と同様にゲノム編集に利用できることが報告されている。
【０００３】
ゲノム編集による遺伝子改変動物の作製は、通常、前核期胚に人工制限酵素の遺伝子をマイクロインジェクションすることにより行われる。マウスのゲノム編集も、Cas9 mRNAおよびgRNA（ガイドRNA）、または、これらのRNAを発現するプラスミドを受精卵の細胞質または前核に1つずつマイクロインジェクションすることにより実施されてきた（非特許文献１）。現在はこの方法が主流であるが、細胞の損傷を防ぐには、熟練された手技を要する。さらに、マイクロインジェクションでは、専用の機械を使用して前核期胚に1つずつ遺伝子を注入しなければならず、かなりの時間を必要とする。ブタ、ウシ、ヒツジ等の大型動物の遺伝子改変には、遺伝子改変されたドナー細胞を使用する体細胞核移植（SCNT）が現在最も広範に使用されているが、エピジェネティック修飾の初期化が不完全であるために出産前または後に仔が死亡することがあり、成功率は低い。
【０００４】
エレクトロポレーション法は、目的物質の細胞への導入操作を簡便且つ効率的にに行うことができる方法であり、多くの生物種で幅広く用いられてきた。ただ、その条件によっては細胞死等を引き起こしてしまう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wang, H. et al., Cell 153, 910-918 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、哺乳類動物受精卵に、より簡便且つより効率的に、さらには哺乳類動物受精卵又はその発生物の生存率をより高く保ちつつ、Cpf1タンパク質を導入する方法を提供することを課題とする。また、哺乳類動物受精卵又はその発生物を、Cpf1タンパク質を用いてより簡便且つ効率的に、さらには哺乳類動物受精卵又はその発生物の生存率をより高く保ちつつ、ゲノム編集する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、
（工程1）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルス1又は複数回を、特定条件でかける工程、又は
（工程2）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけた後、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かける工程、
により、上記課題を解決できることを見出した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００８】
項１．  
（工程1）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルス1又は複数回を、以下の条件：
（条件1A）パルス1回当たりの時間が0.5ms以上2ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が15V〜100Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜400である条件、
（条件1B）パルス1回当たりの時間が2ms以上4ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜90Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜300である条件、
（条件1C）パルス1回当たりの時間が4ms以上6ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜80Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜150である条件、若しくは
（条件1D）パルス1回当たりの時間が6ms以上10ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜70Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜100である条件、
でかける工程、又は
（工程2）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけた後、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かける工程、
を含む、Cpf1タンパク質を含む受精卵の製造方法。
【０００９】
項２．  
前記工程2において、パルス1回当たりの時間が0.5ms以上10ms未満であり、且つ電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜100Vである、項１に記載の製造方法。
【００１０】
項３．  
前記工程2が、以下の条件：
（条件2A）パルス1回当たりの時間が0.5ms以上2ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜100Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜500である条件、
（条件2B）パルス1回当たりの時間が2ms以上4ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜90Vであり、且つ電前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜350である条件、
（条件2C）パルス1回当たりの時間が4ms以上6ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜80Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜180である条件、若しくは
（条件2D）パルス1回当たりの時間が6ms以上10ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜70Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜180である条件、
で行われる、項１又は２に記載の製造方法。
【００１１】
項４．  
前記工程2を含む、項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【００１２】
項５．  
前記液中のCpf1タンパク質の濃度が3〜5000ng/μLである、項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【００１３】
項６．  
前記液がポリヌクレオチドを含有する、項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【００１４】
項７．  
前記ポリヌクレオチドがcrRNAである、項６に記載の製造方法。
【００１５】
項８．  
前記哺乳動物が、ヒト、実験動物、及び家畜からなる群より選択される少なくとも1種である、項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【００１６】
項９．  
（工程1）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルス1又は複数回を、以下の条件：
（条件1A）パルス1回当たりの時間が0.5ms以上2ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が15V〜100Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜400である条件、
（条件1B）パルス1回当たりの時間が2ms以上4ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜90Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜300である条件、
（条件1C）パルス1回当たりの時間が4ms以上6ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜80Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜150である条件、若しくは
（条件1D）パルス1回当たりの時間が6ms以上10ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜70Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜100である条件、
でかける工程、又は
（工程2）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけた後、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かける工程、
を含む、受精卵にCpf1タンパク質を導入する方法。
【００１７】
項１０．  
（工程1）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルス1又は複数回を、以下の条件：
（条件1A）パルス1回当たりの時間が0.5ms以上2ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が15V〜100Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜400である条件、
（条件1B）パルス1回当たりの時間が2ms以上4ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜90Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜300である条件、
（条件1C）パルス1回当たりの時間が4ms以上6ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜80Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜150である条件、若しくは
（条件1D）パルス1回当たりの時間が6ms以上10ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜70Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜100である条件、
でかける工程、又は
（工程2）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけた後、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かける工程、
を含む、ゲノム編集された受精卵又はその発生物の製造方法。
【００１８】
項１１．  
（工程1）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルス1又は複数回を、以下の条件：
（条件1A）パルス1回当たりの時間が0.5ms以上2ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が15V〜100Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜400である条件、
（条件1B）パルス1回当たりの時間が2ms以上4ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜90Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜300である条件、
（条件1C）パルス1回当たりの時間が4ms以上6ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜80Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜150である条件、若しくは
（条件1D）パルス1回当たりの時間が6ms以上10ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜70Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜100である条件、
でかける工程、又は
（工程2）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけた後、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かける工程、
を含む、受精卵又はその発生物のゲノム編集方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、哺乳類動物受精卵に、より簡便且つより効率的に、さらには哺乳類動物受精卵又はその発生物の生存率をより高く保ちつつ、Cpf1タンパク質を導入する方法を提供することができる。また、哺乳類動物受精卵又はその発生物を、Cpf1タンパク質を用いてより簡便且つ効率的に、さらには哺乳類動物受精卵又はその発生物の生存率をより高く保ちつつ、ゲノム編集する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】エレクトロポレーション装置を示す。
【図２】実施例1（一方の極性の電気パルスのみをかけた場合）の、パルス時間が1msの場合の結果を示す。縦軸は電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧を示し、横軸はパルス回数を示す。白抜きの丸で示されるプロットはゲノム編集が成功し且つ生存率が50％以上の場合を示し、グレーの丸で示されるプロットはゲノム編集が成功したものの生存率が50％未満の場合を示し、×で示されるプロットはゲノム編集が失敗した場合を示し、―で示されるプロットは生存率が0％の場合を示し、丸プロット内の数値及び×プロットの下の数値は生存率（％）を示す。プロット及び数値の意味は、図３〜９においても同様である。
【図３】実施例1（一方の極性の電気パルスのみをかけた場合）の、パルス時間が3msの場合の結果を示す。
【図４】実施例1（一方の極性の電気パルスのみをかけた場合）の、パルス時間が5msの場合の結果を示す。
【図５】実施例1（一方の極性の電気パルスのみをかけた場合）の、パルス時間が7msの場合の結果を示す。
【図６】実施例2（一方の極性の電気パルスのみをかけた後に、逆の極性の電気パルスをかけた場合）の、パルス時間が1msの場合の結果を示す。
【図７】実施例2（一方の極性の電気パルスのみをかけた後に、逆の極性の電気パルスをかけた場合）の、パルス時間が3msの場合の結果を示す。
【図８】実施例2（一方の極性の電気パルスのみをかけた後に、逆の極性の電気パルスをかけた場合）の、パルス時間が5msの場合の結果を示す。
【図９】実施例2（一方の極性の電気パルスのみをかけた後に、逆の極性の電気パルスをかけた場合）の、パルス時間が7msの場合の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００２２】
本明細書において、アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high−scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の「同一性」も上記に準じて定義される。
【００２３】
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００２４】
本明細書において、外来的に用いるDNA、RNAなどのヌクレオチドには、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。
【００２５】
本発明は、その一態様において、（工程1）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルス1又は複数回を特定条件でかける工程、又は
（工程2）Cpf1タンパク質及び哺乳動物受精卵を含む液に、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけた後、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かける工程、
を含む方法、例えばCpf1タンパク質を含む受精卵の製造方法、受精卵にCpf1タンパク質を導入する方法、ゲノム編集された受精卵又はその発生物の製造方法、受精卵又はその発生物のゲノム編集方法等に関する（本明細書において、「本発明の方法」と示すこともある。）。以下に、これらについて説明する。
【００２６】
Cpf1（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）タンパク質は、クラス2-タイプV-CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばcrRNA（CRISPR RNA）と複合体を形成した状態でDNAの標的部位に結合し、該標的部位を2本鎖切断できるものを各種使用することができる。
【００２７】
本明細書において、標的部位とは、PAM（Proto-spacer Adjacent Motif）配列及びその3´側に隣接する塩基配列（該塩基配列は、例えば15〜40塩基長、好ましくは17〜25塩基長）程度の配列からなるDNA鎖（標的鎖）とその相補DNA鎖（非標的鎖）からなる、対象受精卵内のDNA上の部位である。PAM配列としては、例えば、5´-TTN、5´-CTA、5´-TTTN等が知られている。
【００２８】
各種生物由来のCpf1タンパク質が知られており、Cpf1タンパク質としては例えばPrevotella属細菌由来のCpf1タンパク質、Francisella属細菌由来のCpf1タンパク質、Acidaminococcus属細菌由来のCpf1タンパク質、Lachnospiraceae属細菌由来のCpf1タンパク質等が挙げられる。各種Cpf1タンパク質のアミノ酸配列、及びそのコード配列の情報は、NCBI等の各種データベース上で容易に得ることができる。
【００２９】
Cpf1タンパク質は、その活性を損なわない限りにおいて、変異を有していてもよい。この観点から、Cpf1タンパク質は、その元となる野生型Cpf1タンパク質のアミノ酸配列と、例えば85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つその活性（crRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位又はその周辺部位を切断する活性）を有するタンパク質であってもよい。或いは、同様の観点から、Cpf1タンパク質は、その元となる野生型Cpf1タンパク質のアミノ酸配列に対して1若しくは複数個（例えば2〜100個、好ましくは2〜50個、より好ましくは2〜20個、さらに好ましくは2〜10個、よりさらに好ましくは2〜5個、特に好ましくは2個）のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つその活性（crRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位又はその周辺部位を切断する活性）を有するタンパク質であってもよい。なお、上記「活性」は、in vitro又はin vivoにおいて、公知の方法に従って又は準じて評価することができる。また、変異は、保存的置換であることが望ましい。
【００３０】
Cpf1タンパク質は、上記「活性」を有する限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。Cpf1タンパク質は、C末端がカルボキシル基（−COOH）、カルボキシレート（−COO−）、アミド（−CONH2）またはエステル（−COOR）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1−6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1−2アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキル基などのC7−14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。Cpf1タンパク質は、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。さらに、Cpf1タンパク質には、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイルなどのC1−6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など）で保護されているものも包含される。
【００３１】
Cpf1タンパク質は、上記「活性」を有する限りにおいて、公知のタンパク質タグ、シグナル配列等のタンパク質又はペプチドが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ等が挙げられる。シグナル配列としては、例えば核移行シグナル等が挙げられる。
【００３２】
Cpf1タンパク質は、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；  酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；  アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；  カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
【００３３】
Cpf1タンパク質は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
【００３４】
Cpf1タンパク質は、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術等を利用して作製することができる。或いは、Cpf1タンパク質としては、市販品をそのまま或いは適宜修飾して用いることもできる。
【００３５】
哺乳動物受精卵は、哺乳動物の受精卵である限り特に制限されない。
【００３６】
哺乳動物は、哺乳綱に分類されるあらゆる生物を含む。哺乳動物としては、例えば、霊長目（例えば、サル、ヒトなど）、齧歯目（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなど）、鯨偶蹄目（例えば、ブタ、イノシシ、ウシ、ヒツジ、ヤギ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギなどが挙げられる。哺乳動物としては、好ましくはヒト、実験動物、家畜が挙げられる。
【００３７】
受精卵は、受精後の卵または胚を意味し、受精卵（1細胞期）、2細胞期、4細胞期、8細胞期、柔実杯、胚盤胞、後期胚盤胞等の発生初期胚を包含する。受精卵の発生物のより多くの細胞においてCpf1が含まれるという観点から、受精卵としては、好ましくは1〜4細胞期の受精卵、より好ましくは1〜2細胞期の受精卵、さらに好ましくは1細胞期の受精卵が用いられる。また、受精卵としては、例えば受精の約3時間後以降の受精卵、受精後約20時間以内（好ましくは10時間以内）の受精卵が用いられる。さらに、受精卵としては、例えば受精の約3時間〜約20時間後、好ましくは約3時間〜約10時間後、より好ましくは約3時間〜7時間後、さらに好ましくは約3時間〜4時間後の受精卵が用いられる。受精卵は、体内または体外で受精した受精卵であり得、卵子または受精卵として冷凍保存されたものであってもよい。受精卵の調製、培養および保存の方法は、当分野で公知である。好ましくは、エレクトロポレーションに使用する前に、エレクトロポレーション用の溶液で受精卵を洗浄し、培養培地を除去する。受精卵は、通常、透明帯と呼ばれる保護膜を有する。透明帯は、酸性タイロード液、グルタチオン等の薬剤による処理により除去または薄化できるが、本発明の方法においては、透明帯は除去または薄化しても、しなくてもよい。好ましくは、薬剤処理により透明帯を除去または薄化していない受精卵を使用する。本発明において、「透明帯を除去または薄化していない受精卵」は、透明帯を除去または薄化するための薬剤による処理を受けていない受精卵を意味する。透明帯を除去または薄化するための薬剤には、酸性タイロードおよびグルタチオンが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
電気パルスをかける対象の液（以下、単に「パルス対象液」と示すこともある。）は、必要に応じて、ポリヌクレオチドを含有することができる。ポリヌクレオチドとしては、例えばCpf1によるゲノム編集に使用され得るポリヌクレオチド、具体的にはcrRNA、ドナーポリヌクレオチド、これらの発現カセット等が挙げられる。
【００３９】
crRNAは、クラス2-タイプV-CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばDNAの標的部位に結合し、且つCpf1タンパク質と結合することにより、Cpf1タンパク質を標的部位に誘導可能なものを各種使用することができる。
【００４０】
crRNAはDNA上の標的部位への結合に関与する相補配列を有しており、この相補配列が、非標的鎖のPAM配列相補配列を除いてなる配列に相補的（好ましくは、相補的且つ特異的）に結合することにより、crRNAはDNAの標的部位に結合することができる。
【００４１】
なお、「相補的」に結合とは、完全な相補関係（AとT（U）、及びGとC）に基づいて結合する場合のみならず、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係に基づいて結合する場合も包含される。ストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。かかる条件で洗浄してもハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。
【００４２】
具体的には、crRNA配列の内、標的配列に結合する相補配列は、標的鎖と例えば90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上、特に好ましくは100％の同一性を有する。
【００４３】
本発明の方法で用いられるcrRNAは、ゲノムDNAの任意部位を標的とするcrRNAである。crRNAの標的部位は、特に制限されず、ゲノム編集の目的に応じて適宜設定することができる。例えば、ある遺伝子のノックアウトが目的であれば、該遺伝子ORF内の任意部位や、該遺伝子プロモーター内を標的部位とすることができる。別の例として、ある遺伝子のノックインが目的であれば、安定的な発現、副作用リスクの抑制等の観点から、セーフ・ハーバー領域内の任意部位を標的部位とすることができる。なお、オフターゲット効果をより低減すべく、crRNAの標的部位の塩基配列の類似配列が、導入対象の細胞又は生物のゲノムDNA内に無いことを、確認しておくことが望ましい。
【００４４】
ドナーポリヌクレオチドは、Cpf1タンパク質による切断部位に組み込むことを目的としたポリヌクレオチドである。ドナーポリヌクレオチドは、特に制限されず、例えば直鎖状又は環状であり、1本鎖又は2本鎖であり、10〜100000塩基長である。
【００４５】
発現カセットは、受精卵又はその発生物の細胞内でcrRNA、ドナーポリヌクレオチド等を発現（転写）可能なDNAである限り特に制限されない。
【００４６】
発現カセットに含まれるプロモーターとしては、特に制限されず、pol II系プロモーターを使用することもできるが、比較的短いRNAの転写をより正確に行わせるという観点から、pol III系プロモーターが好ましい。pol III系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばマウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーター等が挙げられる。
【００４７】
crRNA発現カセットは、必要に応じて、他のエレメント（例えば、マルチクローニングサイト（MCS）、薬剤耐性遺伝子、複製起点など）を含んでいてもよい。例えば、crRNA発現カセットにおいて、5´側から、プロモーター、crRNA配列のコード配列の順に配置されている場合であれば、プロモーターとcrRNA配列のコード配列の間に（好ましくはいずれか一方或いは両方に隣接して）、crRNA配列のコード配列の3´側に（好ましくは隣接して）、MCSが配置されている態様が挙げられる。MCSは複数（例えば2〜50、好ましくは2〜20、より好ましくは2〜10）個の制限酵素サイトを含むものであれば特に制限されない。
【００４８】
薬剤耐性遺伝子としては、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４９】
発現カセットは、これのみで、或いは他の配列と共にベクターを構成していることが好ましい。ベクターの種類は、特に制限されず、例えば動物細胞発現プラスミド等のプラスミドベクター；  レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター等が挙げられる。
【００５０】
パルス対象液が含むポリヌクレオチドとしては、crRNAが好ましい。
【００５１】
パルス対象液が含むポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術等を利用して作製することができる。或いは、該ポリヌクレオチドとしては、市販品をそのまま或いは適宜修飾して用いることもできる。
【００５２】
Cpf1タンパク質のパルス対象液中の濃度は、例えば3〜5000ng/μl、好ましくは5〜2000ng/μl、より好ましくは10〜1000ng/μl、さらに好ましくは20〜500ng/μl、よりさらに好ましくは50〜200ng/μl、よりさらに好ましくは80〜150ng/μl、特に好ましくは80〜120ng/μlである。
【００５３】
ポリヌクレオチドのパルス対象液中の濃度は、例えば10〜1000ng/μl、好ましくは50〜500ng/μl、より好ましくは100〜350ng/μl、さらに好ましくは150〜250ng/μl、よりさらに好ましくは180〜220ng/μlである。
【００５４】
上記した哺乳動物受精卵、Cpf1タンパク質、及びポリヌクレオチド以外のパルス対象液成分は、特に制限されず、工程1又は工程2の間に受精卵が生存できる組成であれば特に制限されない。パルス対象液としては、例えばOpti-MEM I、PBS、HBS、HBSS、Hanks、HCMFなどの培地またはバッファーを使用することができる。パルス対象液は、好ましくは、溶液は血清を含まない。
【００５５】
工程1及び工程2においては、エレクトロポレーション法に従って電気パルスをかける。典型的には、哺乳動物受精卵及びCpf1タンパク質を含むパルス対象液をエレクトロポレーターの電極の間に満たして実施される。
【００５６】
エレクトロポレーターは、電気パルスの発生装置を意味し、工程1及び／又は工程2を実施できるものであれば特に制限されない。エレクトロポレーターは、例えば、BioRad社、BTX社、BEX社、Intracel社、Eppendorf社などから購入できる。
【００５７】
電極は、エレクトロポレーション法において使用され得るあらゆる電極を含む。電極としては、例えば、白金、金、アルミニウムなどの金属からなる電極が挙げられる。通常、2本の電極が約0.25mmないし約10mm、例えば約0.5mmないし約4mmまたは約1mmないし約2mmのギャップをあけて配置され、そのギャップにパルス対象液を満たすことができる。電極は、パルス対象液を入れるための容器と組み合わせたキュベット電極であってもよい。電極は、例えば、BioRad社、BTX社、BEX社、Intracel社、Eppendorf社などから購入できる。
【００５８】
工程1においては、パルス対象液に一方の極性の電気パルス1又は複数回を特定条件でかける。
【００５９】
一方の極性の電気パルスとは、パルス対象液中の受精卵の両側の電極（電極1及び電極2）の内の電極1を陽極として電極2を陰極とする場合、又は電極1を陰極として電極2を陽極とする場合である。
【００６０】
工程1における特定条件とは、
（条件1A）パルス1回当たりの時間が0.5ms以上2ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が15V〜100Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜400である条件、
（条件1B）パルス1回当たりの時間が2ms以上4ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜90Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜300である条件、
（条件1C）パルス1回当たりの時間が4ms以上6ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜80Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜150である条件、又は
（条件1D）パルス1回当たりの時間が6ms以上10ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜70Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜100である条件、
である。
【００６１】
条件1Aにおけるパルス1回当たりの時間は、好ましくは0.5ms以上1.5ms未満、より好ましくは0.8ms以上1.2ms未満である。
【００６２】
条件1Aにおける電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧は、好ましくは15V〜80V、より好ましくは15V〜60V、さらに好ましくは20V〜50Vである。
【００６３】
条件1Aにおける電気パルスの回数は、好ましくは1〜11、より好ましくは1〜7、さらに好ましくは3〜7である。
【００６４】
条件1Aにおける前記電圧と電気パルスの回数の積は、好ましくは20〜400、より好ましくは40〜380、さらに好ましくは50〜360である。
【００６５】
条件1Aで電気パルスをかける好ましい態様として、
（条件1Aa）電気パルスの回数が2〜8（好ましくは3〜7）であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が15〜60V（好ましくは20〜50V）である条件
で電気パルスをかける態様が挙げられる。
【００６６】
条件1Bにおけるパルス1回当たりの時間は、好ましくは2.5ms以上3.5ms未満、より好ましくは2.8ms以上3.2ms未満である。
【００６７】
条件1Bにおける電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧は、好ましくは15V〜70V、より好ましくは20V〜60V、さらに好ましくは20V〜50Vである。
【００６８】
条件1Bにおける電気パルスの回数は、好ましくは1〜11である。
【００６９】
条件1Bにおける前記電圧と電気パルスの回数の積は、好ましくは10〜290、より好ましくは20〜270、さらに好ましくは25〜240、よりさらに好ましくは30〜210、よりさらに好ましくは30〜150である。
【００７０】
条件1Bで電気パルスをかける好ましい態様として、
（条件1Ba）電気パルスの回数が1〜2であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が20〜60V（好ましくは25〜55V）である条件、
（条件1Bb）電気パルスの回数が3〜4であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が20〜50V（好ましくは15〜45V）である条件、
（条件1Bc）電気パルスの回数が5〜6であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が20〜50V（好ましくは15〜35V）である条件、
（条件1Bd）電気パルスの回数が7〜8であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が10〜40V（好ましくは15〜35V）である条件、
（条件1Be）電気パルスの回数が9〜10であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が10〜40V（好ましくは25〜35V）である条件、又は
（条件1Bf）電気パルスの回数が11〜12であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜30V（好ましくは5〜15V）である条件、
で電気パルスをかける態様が挙げられる。
【００７１】
条件1Cにおけるパルス1回当たりの時間は、好ましくは4.5ms以上5.5ms未満、より好ましくは4.8ms以上5.2ms未満である。
【００７２】
条件1Cにおける電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧は、好ましくは15V〜60V、より好ましくは20V〜50Vである。
【００７３】
条件1Cにおける電気パルスの回数は、好ましくは1〜11、より好ましくは1〜6である。
【００７４】
条件1Cにおける前記電圧と電気パルスの回数の積は、好ましくは20〜130、より好ましくは50〜130、さらに好ましくは80〜120である。
【００７５】
条件1Cで電気パルスをかける好ましい態様として、
（条件1Ca）電気パルスの回数が1〜2であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が30〜70V（好ましくは35〜55V、より好ましくは45〜55V）である条件、
（条件1Cb）電気パルスの回数が3〜4であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が15〜40Vである条件、又は
（条件1Cc）電気パルスの回数が5〜6であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が15〜40V（好ましくは15〜25）である条件、
で電気パルスをかける態様が挙げられる。
【００７６】
条件1Dにおけるパルス1回当たりの時間は、好ましくは6.5ms以上8ms未満、より好ましくは6.8ms以上7.2ms未満である。
【００７７】
条件1Dにおける電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧は、好ましくは15〜60Vである。
【００７８】
条件1Dにおける電気パルスの回数は、好ましくは1〜11、より好ましくいは1〜6である。
【００７９】
条件1Dにおける前記電圧と電気パルスの回数の積は、好ましくは20〜130、より好ましくは50〜130、さらに好ましくは80〜120である。
【００８０】
工程2においては、パルス対象液に、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけた後、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かける。
【００８１】
逆の極性の電気パルスとは、一方の極性の電気パルスをかける際に、パルス対象液中の受精卵の両側の電極（電極1及び電極2）の内の電極1を陽極として電極2を陰極とした場合であれば、電極1を陰極として電極2を陽極とする場合であり、一方の極性の電気パルスをかける際に、電極1を陰極として電極2を陽極とした場合であれば、電極1を陽極として電極2を陰極とする場合である。
【００８２】
工程2においては、電気パルス（一方の極性及び逆の極性の両方）を、以下の特定条件：
（条件2A）パルス1回当たりの時間が0.5ms以上2ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜100Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜500である条件、
（条件2B）パルス1回当たりの時間が2ms以上4ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜90Vであり、且つ電前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜350である条件、
（条件2C）パルス1回当たりの時間が4ms以上6ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜80Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜180である条件、若しくは
（条件2D）パルス1回当たりの時間が6ms以上10ms未満であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5V〜70Vであり、且つ前記電圧と電気パルスの回数の積が5〜180である条件、
でかけることが好ましい。
【００８３】
工程2における電気パルスの回数は、一方の極性の電気パルスの回数及び逆の極性の電気パルスの回数それぞれを意味し、これらの合計を意味するものではない。一方の極性の電気パルスの回数及び逆の極性の電気パルスの回数は、大きく異ならない方が望ましく、例えば逆の極性の電気パルスの回数は、一方の極性の電気パルスの回数±0〜3（好ましくは0〜1）の回数である。
【００８４】
条件2Aにおけるパルス1回当たりの時間は、好ましくは0.5ms以上1.5ms未満、より好ましくは0.8ms以上1.2ms未満である。
【００８５】
条件2Aにおける電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧は、好ましくは5V〜80V、より好ましくは5V〜60V、さらに好ましくは10V〜50Vである。
【００８６】
条件2Aにおける電気パルスの回数は、好ましくは1〜11、より好ましくは1〜9である。
【００８７】
条件2Aにおける前記電圧と電気パルスの回数の積は、好ましくは5〜250、より好ましくは5〜180、より好ましくは5〜160である。
【００８８】
条件2Aで電気パルスをかける好ましい態様として、
（条件2Aa）電気パルスの回数が1〜2であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜60V（好ましくは10〜55V）である条件、
（条件2Ab）電気パルスの回数が3〜4であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜50V（好ましくは10〜45V）である条件、
（条件2Ac）電気パルスの回数が5〜6であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜40V（好ましくは10〜35V）である条件、
（条件2Ad）電気パルスの回数が7〜8であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜30V（好ましくは10〜25V）である条件、又は
（条件2Ae）電気パルスの回数が9〜10であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜20V（好ましくは10〜15V）である条件、
で電気パルスをかける態様が挙げられる。
【００８９】
条件2Bにおけるパルス1回当たりの時間は、好ましくは2.5ms以上3.5ms未満、より好ましくは2.8ms以上3.2ms未満である。
【００９０】
条件2Bにおける電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧は、好ましくは15V〜70V、より好ましくは15V〜60V、さらに好ましくは15V〜45Vである。
【００９１】
条件2Bにおける電気パルスの回数は、好ましくは1〜11、より好ましくは1〜9である。
【００９２】
条件2Bにおける前記電圧と電気パルスの回数の積は、好ましくは5〜250、より好ましくは20〜180、より好ましくは35〜160である。
【００９３】
条件2Bで電気パルスをかける好ましい態様として、
（条件2Ba）電気パルスの回数が1〜2であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜60V（好ましくは15〜55V）である条件、
（条件2Bb）電気パルスの回数が3〜4であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜50V（好ましくは15〜45V）である条件、
（条件2Bc）電気パルスの回数が5〜6であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜40V（好ましくは15〜35V）である条件、
（条件2Bd）電気パルスの回数が7〜8であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜30V（好ましくは5〜25V）である条件、又は
（条件2Be）電気パルスの回数が9〜10であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜20V（好ましくは5〜15V）である条件、
で電気パルスをかける態様が挙げられる。
【００９４】
条件2Cにおけるパルス1回当たりの時間は、好ましくは4.5ms以上5.5ms未満、より好ましくは4.8ms以上5.2ms未満である。
【００９５】
条件2Cにおける電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧は、好ましくは5V〜80V、より好ましくは5V〜60V、さらに好ましくは10V〜45Vである。
【００９６】
条件2Cにおける電気パルスの回数は、好ましくは1〜11、より好ましくは1〜9である。
【００９７】
条件2Cにおける前記電圧と電気パルスの回数の積は、好ましくは15〜180である。
【００９８】
条件2Cで電気パルスをかける好ましい態様として、
（条件2Ca）電気パルスの回数が1〜2であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜60V（好ましくは15〜45V）である条件、
（条件2Cb）電気パルスの回数が3〜4であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜50V（好ましくは15〜35V）である条件、
（条件2Cc）電気パルスの回数が5〜6であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜40V（好ましくは15〜25V）である条件、
（条件2Cd）電気パルスの回数が7〜8であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜30V（好ましくは5〜25V）である条件、又は
（条件2Ce）電気パルスの回数が9〜10であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜20V（好ましくは5〜15V）である条件、
で電気パルスをかける態様が挙げられる。
【００９９】
条件2Dにおけるパルス1回当たりの時間は、好ましくは6.5ms以上8ms未満、より好ましくは6.8ms以上7.2ms未満である。
【０１００】
条件2Dにおける電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧は、好ましくは5V〜80V、より好ましくは5V〜60V、さらに好ましくは10V〜45Vである。
【０１０１】
条件2Dにおける電気パルスの回数は、好ましくは1〜11、より好ましくは1〜9である。
【０１０２】
条件2Dにおける前記電圧と電気パルスの回数の積は、好ましくは25〜180である。
【０１０３】
条件2Dで電気パルスをかける好ましい態様として、
（条件2Da）電気パルスの回数が1〜2であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜60V（好ましくは5〜45V）である条件、
（条件2Db）電気パルスの回数が3〜4であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜50V（好ましくは5〜45V）である条件、
（条件2Dc）電気パルスの回数が5〜6であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜40V（好ましくは5〜35V）である条件、
（条件2Dd）電気パルスの回数が7〜8であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜25Vである条件、
（条件2De）電気パルスの回数が9〜10であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜25V（好ましくは5〜25V）である条件、又は
（条件2Df）電気パルスの回数が9〜10であり、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧が5〜25V（好ましくは5〜15V）である条件、
で電気パルスをかける態様が挙げられる。
【０１０４】
本発明の方法は、より高い生存率を達成しつつCpf1を導入できるという観点から、工程2を含むことが好ましい。限定的な解釈を望むものではないが、その理由は次のように考えられる。一方の極性の電気パルスをかけると、受精卵に穴が空き、受精卵内の物質が電気パルスにより移動してしまい、受精卵内の物質の分布に変化が起こると考えられる。この分布に変化が起こってしまうと、受精卵の発生が正常に進まない可能性が高まり、生存率の低下につながると考えられる。そこで、一方の極性の電気パルスをかけた後に、工程2のように逆の極性の電気パルスをかけることにより、受精卵内の物質の分布を正常に近付けることができ、生存率の低下を防ぐことができると考えられる。
【０１０５】
工程1又は工程2の後は、必要に応じて、受精卵を培養してもよい。これにより、発生が進み、受精卵の発生物を得ることができる。また、工程1又は工程2の後は、受精卵をレシピエント動物に移植してもよい。これにより、発生が進み、受精卵の発生物を得ることができる。レシピエント動物は、通常、受精卵と同じ動物種の偽妊娠状態のメスであり、その卵管に受精卵を移植する。受精卵（胚）の発生段階によっては、子宮に移植する場合もあり得る。受精卵を移植されたレシピエント動物は、遺伝子改変動物を出産することができる。遺伝子改変動物の作製方法は当業者に公知であり、例えば、引用により本明細書の一部とするManipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition (Cold Spring Harbor Press) に記載の方法を用いる。
【０１０６】
上記した本発明の方法により、受精卵にCpf1タンパク質を導入することができ、これによりCpf1タンパク質を含む受精卵を得ることができる。また、Cpf1タンパク質を導入することにより、受精卵又はその発生物のゲノム編集を行うことができ、ゲノム編集された受精卵又はその発生物を得ることができる。
【実施例】
【０１０７】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【０１０８】
実施例1．マウス受精卵のゲノム編集1
実施例1は一方の極性の電気パルスのみをかけた場合の例である。
【０１０９】
＜1-1．Cpf1タンパク質の準備＞
Cpf1タンパク質（IDT社製、Alt-R(登録商標) A.s. Cpf1 Nuclease 2NLS（商品名））を使用した。
【０１１０】
＜1-2．crRNAの調製＞
HPRT遺伝子中の配列（5’−GGATGTTAAGAGTCCCTATCT−3’（配列番号1）を標的とするcrRNA（IDT社製、Alt-R(登録商標) CRISPR-Cpf1 crRNA）を使用した。
【０１１１】
＜1-3．受精卵＞
雌マウス（SLC社製、B6D2F1（系統名））から取り出した未受精卵と、雄マウス（SLC社製、B6D2F1（系統名））から調整した精子とを混ぜ、人工授精を3時間おこなった。回収した受精卵を、エレクトロポレーションに使用するまで、KSOM培地（アーク・リソース、日本）中で培養した。
【０１１２】
＜1-4．エレクトロポレーション＞
白金ブロック電極（長さ：10mm、幅：3mm、高さ：0.5mm、ギャップ：1mm）（ベックス社製）を外注して使用した（図１ａ）。CUY21EDIT II（ベックス社製）（図１ａ右）に接続した白金ブロック電極（図１ｃ）を、実体顕微鏡（図１ａ左）にセットした。図１ｂは、図１ａの四角で囲んだ部分の拡大図である。このシステムを使用することにより、約40個〜50個の受精卵を同時に処理することが可能である。エレクトロポレーションに先立ち、マウスの受精卵約10〜20個を手技により一列に並べた。図１ｄは、電極間のギャップに置かれた受精卵の顕微鏡像である。KSOM培地中で培養されている受精卵をOpti−MEM I（Life technologies）で3回洗浄し、血清含有培地を除去した。次いで、Cpf1タンパク質（100ng／μl）およびcrRNA（100ng／μl）を含有するOpti−MEM I溶液（5μl）を満たした白金ブロック電極のギャップに受精卵を並べ、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけて行った。パルス一回当たりの時間は1〜7msとし、電気パルスの電極間距離1mm当たりの電圧は10〜50Vとし、電気パルスの回数は1〜11回とした。エレクトロポレーションの後、すぐに受精卵を電極から回収し、M2培地で4回、KSOM培地で2回洗浄した。次いで、受精卵を、KSOM培地中、37℃で、5％CO2インキュベーター内で、胚盤胞期（E4.5）まで培養した。
【０１１３】
＜1-5．生存率の算出＞
胚盤胞期（E4.5）まで培養した後、胚盤胞を形成し且つ生存しているものを目視で判断し、その数を計測した。計測数に基づいて、生存率（＝（計測数／エレクトロポレーションに供した受精卵数）×100）を算出した。
【０１１４】
＜1-6．ゲノム編集の成否の判定＞
生存率を算出後、胚盤胞を回収し、そこから定法に従ってゲノムDNAを抽出した。得られたゲノムDNAにおけるCpf1/crRNA標的部位の周辺領域をシークエンシングした。標的部位付近からシークエンスピークに乱れが生じている場合、すなわち1つの位置に複数のピークが生じている場合を、標的部位が切断された結果indelが生じている、すなわちゲノム編集が成功していると判定した。
【０１１５】
＜1-7．結果＞
結果を図２〜５に示す。図２〜５に示されるように、一定条件下で、高い生存率（50％以上）を保ちながらもゲノム編集を成功させることができた。また、特定の条件下では、より高い生存率を達成できることも分かった。
【０１１６】
通常、エレクトロポレーション後、受精卵は発生が進むにつれてその生存率は大きく低下するところ、胚盤胞まで発生が進んでも生存率が50％以上であるという結果、さらには特定の条件下では胚盤胞における生存率が70％以上、80％以上、90％以上であるという結果は、驚くべき結果であった。
【０１１７】
実施例2．マウス受精卵のゲノム編集2
実施例2は一方の極性の電気パルスのみをかけた後に、逆の極性の電気パルスをかけた場合の例である。
【０１１８】
エレクトロポレーションを、一方の極性の電気パルスを1又は複数回かけて行った後に、逆の極性の電気パルスを1又は複数回かけて行った以外は、実施例1と同様にして行った。結果を図６〜９に示す。図６〜９に示されるように、一定条件下で、高い生存率を保ちながらもゲノム編集を成功させることができた。また、特定の条件下では、より高い生存率を達成できることも分かった。また、実施例1の結果との比較より、一方の極性の電気パルスのみをかけた後に、逆の極性の電気パルスをかけることにより、より高い生存率を達成しつつゲノム編集を成功できる傾向が見出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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