(57)【要約】      （修正有）【課題】S-ニトロソチオール（ＲＳＮＯという）付加物またはポリマーS-ニトロソチオール付加物のうちの少なくとも１つを有する前記ポリマーマトリックスを含むポリマーフィルムの提供。【解決手段】ポリマーフィルムは、ポリマーマトリックスへの共有結合；ポリマーマトリックス内での分散；またはその両方によりポリマーマトリックスと関連している分離したS-ニトロソチオール付加物またはポリマーS-ニトロソチオール付加物のうちの少なくとも１つを有するポリマーマトリックスを含み、その分離したS-ニトロソチオール付加物またはポリマーS-ニトロソチオール付加物のうちの少なくとも１つは、酸化窒素（ＮＯ）を放出することが可能である。ポリマーマトリックスは、ポリウレタンポリマーマトリックス、シリコーンゴムポリマーマトリックス、またはポリウレタンとシリコーンゴムとのコポリマーマトリックスである。【選択図】図１Ｂ
2019093208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーマトリックスと、５〜１０ｗｔ％の範囲で前記ポリマーマトリックス中に導入されるＳ-ニトロソ-Ｎ−アセチルペニシリン（ＳＮＡＰ）とからなるポリマーフィルムであって、
前記ＳＮＡＰは、酸化窒素（ＮＯ）を放出することが可能であり、前記ポリマーマトリックスは、シリコーンゴムポリマーマトリックス、熱可塑性シリコーン−ポリカーボネート−ウレタン及びシロキサンベースのポリウレタンエラストマーからなる群より選択され、
前記ポリマーフィルムは、３７℃の乾燥条件下において安定性を示し、かつ前記ＳＮＡＰから水分またはS-ニトロソチオール結合を光分解することが可能な光に曝露されると、少なくとも２日間にわたって制御可能なＮＯ放出速度を示す、ポリマーフィルム。
【請求項２】
前記ポリマーマトリックスが、１．２ｗｔ%±０．３の水吸収を有する前記シリコーン
ゴムポリマーマトリックス、１．５ｗｔ％±０．３の水吸収を有する前記熱可塑性シリコーン−ポリカーボネート−ウレタン及び１．２ｗｔ％±０．３の水吸収を有する前記シリロキサンベースのポリウレタンエラストマーからなる群より選択される疎水性ポリマーを含む、請求項１に記載のポリマーフィルム。
【請求項３】
前記ポリマーマトリックスが、前記シロキサンベースのポリウレタンエラストマーであり、
前記ＳＮＡＰが１０ｗｔ％の量で存在し、かつ
前記ＮＯが少なくとも２０日間にわたって放出される、請求項１に記載のポリマーフィルム。
【請求項４】
記前記ポリマーマトリックスが前記シロキサンベースのポリウレタンエラストマーであり、前記ＳＮＡＰが５ｗｔ％の量で存在し、かつ前記ＮＯが少なくとも２０日間にわたって放出される、請求項１に記載のポリマーフィルム。
【請求項５】
前記ＳＮＡＰが、前記ポリマーマトリックス内で分散しており、かつ前記ＳＮＡＰが１０ｗｔ％の量で存在する、請求項１に記載のポリマーフィルム。
【請求項６】
下部ポリマー層と、
前記下部ポリマー層の上に配置された上部ポリマー層と、
前記下部ポリマー層と前記上部ポリマー層との間にある少なくとも１つの活性中間層と
を含む装置であって、前記少なくとも１つの活性中間層が、請求項３に記載のポリマーフィルムを含む、装置。
【請求項７】
前記下部ポリマー層が、シロキサンベースのポリウレタンエラストマー、ポリ（塩化ビニル）、架橋ポリウレタン、架橋シリコーンゴム、およびポリテトラフルオロエチレンからなる群より選択され、かつ
前記上部ポリマー層が、シロキサンベースのポリウレタンエラストマー、ポリ（塩化ビニル）、架橋ポリウレタン、架橋シリコーンゴム、およびポリテトラフルオロエチレンからなる群より選択される、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
溶媒の蒸発によって、Ｓ-ニトロソ-Ｎ−アセチルペニシリン（ＳＮＡＰ）を含む熱可塑性シリコーン−ポリカーボネート−ウレタン又はシロキサンベースのポリウレタンエラストマーのポリマーフィルムを形成する工程であって、
前記熱可塑性シリコーン−ポリカーボネート−ウレタン又は前記シロキサンベースのポリウレタンエラストマーを溶媒中に溶解して溶液を形成すること、
前記溶液中に前記ＳＮＡＰを添加すること、
前記溶液を規定の時間攪拌すること、
前記溶液を乾燥させること、
を含むポリマーフィルムを形成する工程を備え、
前記ＳＮＡＰを含むポリマーフィルムは少なくとも３日間にわたって酸化窒素（ＮＯ）を放出することが可能である、ＮＯ放出性ポリマー組成物を製造するための方法。
【請求項９】
前記ポリマーフィルムが、ＳＮＡＰを含む前記シロキサンベースのポリウレタンエラストマーであり、ＮＯを少なくとも７日間にわたって放出することができる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶液を下部ポリマー層上に流延することと、
前記流延された溶液を乾燥させて前記下部ポリマー層上に前記ＮＯ放出性ポリマー組成物の層を形成することと
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
他のポリマーを前記ＮＯ放出性ポリマー組成物の前記層の上に被覆して上部ポリマー層を形成することをさらに含み、前記他のポリマーはＳＮＡＰを含まない、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／７６２，０１３号の利益を主張するものであり、その仮特許出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府により支援された研究または開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＥＢ−００４５２７およびＫ２５ＨＬ１１１２１３の下に、政府支援によりなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
酸化窒素（ＮＯ）は、いくつもの重要な生理学的機能（独特の血管拡張特性、抗癌力、抗菌特性、および抗血小板活性を含む）を有することが明らかにされている。ＮＯは安定なラジカルであるが、これはヘモグロビンおよび酸素との反応性が極めて高いものであり得、したがって標的部位へのＮＯの送達が困難になり得る。多様な生物医学的用途にＮＯの力を利用するためには、疎水性ＮＯ供与体のみならず安定な親水性ＮＯ供与体もまた最良であり得る。これらの用途には、ＮＯ放出性医薬、および（ＮＯの抗血小板活性に基づく）医用デバイス（例えば、血管内カテーテルおよび体外回路）のための血栓形成抵抗性疎水性ポリマーコーティングの調製が含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＮＯの利益にも関わらず、ポリマー系中でのＮＯ供与体の使用は、様々な理由から比較的制限されてきたという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ポリマーマトリックスへの共有結合、ポリマーマトリックス内での分散、またはその両方により前記ポリマーマトリックスと関連している分離したS-ニトロソチオール （ＲＳＮＯという）付加物またはポリマーS-ニトロソチオール付加物のうちの少なくとも１つを有する前記ポリマーマトリックスを含むポリマーフィルムであって、前記分離したS-ニトロソチオール 付加物または前記ポリマーS-ニトロソチオール付加物のうちの前記少なくとも１つは、酸化窒素（ＮＯ）を放出することが可能であり、前記ポリマーマトリックスは、ポリウレタンポリマーマトリックス、シリコーンゴムポリマーマトリックス、またはポリウレタンとシリコーンゴムとのコポリマーマトリックスであり、前記ポリマーフィルムは、３７℃で乾燥条件下において安定性を示し、かつ水分またはS-ニトロソチオール結合を光分解することが可能な光に曝露されると所定の時間量にわたり前記分離したS-ニトロソチオール 付加物または前記ポリマーS-ニトロソチオール付加物のうちの前記少なくとも１つからの遅延された制御可能なＮＯ放出速度を示す、ポリマーフィルム。
【０００６】
本開示の実施例の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面を参照することにより明らかになるであろう。以下の詳細な説明および図面において、同じ参照番号は、同様であるが事によると同一でない、構成要素に対応する。簡潔にするために、先に記述された機能を有する参照番号または特徴は、それらが現れる他の図面と関連して記述される場合もあるし、そうでない場合もある。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】シロキサンベースのポリウレタンエラストマー（例えば、Ｅｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）Ｅ２Ａｓ）コントロールで被覆された体外循環（ＥＣＣ）回路上の血栓形成を示す概略破断図である。
【図１Ｂ】窒素を含むＮＯを放出して血栓形成を低減するＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）／Ｅ２Ａｓで被覆されたＥＣＣ回路を示す概略破断図である。
【図２Ａ】Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）の構造を示している。
【図２Ｂ】S-ニトロソチオール（ＲＳＮＯ）分解のスキームを示しており、この分解は、金属イオン（例えば、Ｃｕ＋）、光、および熱により触媒され得、ジスルフィド（ＲＳＳＲ）生成物および酸化窒素（ＮＯ）を生じ得る。
【図３Ａ】３４０ｎｍでモニタリングされた１０ｗｔ％のＳＮＡＰを含有する種々のポリマーフィルムからのＳＮＡＰの拡散を示しており、フィルムは、室温２２℃において暗闇の中で４ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬された（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である）。
【図３Ｂ】３４０ｎｍでモニタリングされた１０ｗｔ％のＳＮＡＰを含有する種々のポリマーフィルムからのＳＮＡＰの拡散を示しており、フィルムは、３７℃において暗闇の中で４ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬された（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である）。
【図４Ａ】暗闇、周囲光、および１００Ｗ投光照明の中での、３７℃における１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２ＡｓフィルムのＮＯ放出挙動を示している（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である）。
【図４Ｂ】３７℃において１００Ｗ投光照明で連続的に照射された、シリコーンゴム（ＳＲ）中１０ｗｔ％ＳＮＡＰフィルム、ＣａｒｂｏＳｉｌ中１０ｗｔ％ＳＮＡＰフィルム、およびＥｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）Ｅ２Ａｓ中１０ｗｔ％ＳＮＡＰフィルムからのＮＯ放出を示している（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である）。
【図４Ｃ】連続的周囲光（ａｍｂ）または１００Ｗ投光照明下での、３７℃におけるＥｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）Ｅ２Ａｓ中５ｗｔ％ＳＮＡＰフィルムおよび１０ｗｔ％ＳＮＡＰフィルムからのＮＯ放出を示している（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である）。
【図５Ａ】Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）に溶解させた、１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓフィルム、１．０ｍＭ  ＳＮＡＰ、およびＥ２ＡｓのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示している（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である）。
【図５Ｂ】周囲光を用いて室温（２２℃）、暗闇の中で３７℃、周囲光下で３７℃、および１００Ｗ投光照明下で３７℃という様々な条件下においてＰＢＳ中でインキュベートされた１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓフィルムからの累積ＮＯ放出を示している（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である）。
【図６Ａ】３４０ｎｍでモニタリングされた、暗闇の中で１ｍＬのＰＢＳ中に浸かった１０ｗｔ％ＳＮＡＰドープＥ２Ａｓフィルムからの室温（ＲＴ、２２℃）または３７℃におけるＳＮＡＰの拡散を示している。
【図６Ｂ】暗闇の中で３７℃においてＰＢＳ中に浸った１０ｗｔ％ＳＮＡＰドープＥ２Ａｓフィルムからの、累積ＳＮＡＰ滲出と（ＮＯＡに基づくまたはＳＮＡＰに基づくＮＯ放出データからの）累積ＮＯ放出との比較を示している。ＳＮＡＰドープＥ２Ａｓフィルムからの酸化窒素放出は、ポリマー相内でのＳＮＡＰの熱分解および／もしくは光化学分解から、または水相中に滲出したＳＮＡＰから生じ得る。ＳＮＡＰドープＥ２Ａｓフィルムについて、ＮＯ放出総量のおよそ２６％がＳＮＡＰ滲出の結果であると考えられる。
【図７】ＵＶ−ｖｉｓにより３４０ｎｍでモニタリングされた、０枚、２枚、または４枚のＥ２Ａｓの上塗りを有するＥ２Ａｓ中１０ｗｔ％ＳＮＡＰフィルムからのＳＮＡＰの拡散を示すグラフであり、フィルムは、暗闇の中で３７℃において、１００μＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ（これは毎日ＵＶ−ｖｉｓ測定後に取り替えられた）中に浸漬された（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である）。
【図８】様々な温度および光条件下において乾燥剤と共に乾燥した状態で貯蔵されたＥ２Ａｓ中１０ｗｔ％ＳＮＡＰフィルムの安定性を示すグラフであり、フィルムは、ＵＶ−ｖｉｓにより３４０ｎｍでモニタリングされる様々な時間において残存する（初期レベルと比較した）ＳＮＡＰの量を測定するためにＤＭＡｃに溶解された（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である）。
【図９】暗闇の中での３７℃における１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ乾燥フィルムからのＮＯ放出挙動を示すグラフである。
【図１０】５ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓで被覆され、続いてＥ２Ａｓの上塗りで被覆された、体外回路（ＥＣＣ）チューブの概略図である。
【図１１Ａ】血液曝露前の、Ｅ２Ａｓ中５ｗｔ％ＳＮＡＰで被覆されたＥＣＣチューブの一部からの代表的なＮＯ表面フラックスプロファイルを示すグラフであり、ＮＯ放出は、周囲光下で３７℃において化学ルミネセンスにより測定された。
【図１１Ｂ】血液曝露後の、Ｅ２Ａｓ中５ｗｔ％ＳＮＡＰで被覆されたＥＣＣチューブの一部からの代表的なＮＯ表面フラックスプロファイルを示すグラフであり、ＮＯ放出は、周囲光下で３７℃において化学ルミネセンスにより測定された。
【図１２Ａ】ウサギ血栓形成モデルにおける４時間にわたる血液曝露の間の血小板数（例えば、消費量）に対する５ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓコーティングの時間依存的影響を示すグラフである（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）である）。
【図１２Ｂ】血漿フィブリノーゲンレベルに対する５ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓコーティングの時間依存的影響を示すグラフである（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）である）。
【図１３】５ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２ＡｓコーティングおよびＥ２Ａｓコントロールコーティングについてのインビトロフィブリノーゲン吸着アッセイの結果を示すグラフである（コーティング上の吸着されたヒトフィブリノーゲン（３ｍｇ／ｍＬ）のレベルを測定するためにヤギ抗ヒトフィブリノーゲンＦＩＴＣ複合体化抗体を使用した９６ウェルプレートにおける蛍光アッセイ、データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝２４）である）。
【図１４】ＮＩＨからのＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化されたウサギ血栓形成モデルにおける４時間にわたる血液曝露後のＳＮＡＰ／Ｅ２ＡｓＥＣＣおよびコントロールＥＣＣ上での血栓形成の２次元表現である（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）である）。
【図１５】ＳＮＡＰを含浸させたポリウレタンチューブ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｍｏｄｉｔｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なマイクロポリウレタンチューブ）のＮＯ放出プロファイルを示すグラフであり、このチューブは、１または２日間のいずれかにわたりＳＮＡＰ／アセトン溶液中に浸漬されていた。
【図１６Ａ】５ｗｔ％または１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓの活性層で被覆され、続いてＥ２Ａｓの上塗りで被覆されたカテーテルチューブの略図である。
【図１６Ｂ】図１６Ａの線１６Ｂ−１６Ｂに沿って取った、図１６Ａのカテーテルチューブの断面図である。
【図１７】暗闇の中での３７℃における５ｗｔ％および１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２ＡｓカテーテルのＮＯ放出プロファイルを示している（ｎ＝５）。
【図１８】血栓の２Ｄ表現を用いてＮＩＨのＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて計算されるヒツジにおける７日間にわたる植込み後のＳＮＡＰ／Ｅ２ＡｓカテーテルおよびＥ２Ａｓコントロールカテーテル上の血栓面積の定量を示すグラフである（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）である）（＊＝ｐ＜０．０５）。
【図１９】取り出された（ｅｘｐｌａｎｔｅｄ）ＳＮＡＰ／Ｅ２ＡｓカテーテルおよびＥ２Ａｓコントロールカテーテルの１ｃｍ片上の細菌付着（ＣＦＵ／ｃｍ２）の比較である（データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）である）（＊＝ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示に従う実施例は、生物医学的デバイスを製造するのに有用な新規のＲＳＮＯドープポリマー処方物を含む。新規ポリマー処方物は、均一のフィルムを形成し、３７℃でさえも４ヵ月にわたり（約１０％〜１５％のＮＯ喪失しか伴わない）ＲＳＮＯ安定性を示す。新規ポリマー処方物は、（例えば体外循環（ＥＣＣ）回路における）血栓（すなわち、凝血塊）形成を防止するためのコーティングとして使用され得る。図１Ａは、血栓形成を示すシロキサンベースのポリウレタンエラストマー（例えば、Ｅｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）Ｅ２Ａｓ）コントロールで被覆されたＥＣＣ回路１２を示す概略破断図である。図示されるように、赤血球１４および血小板１６は一緒に塊になる。それに対して、図１Ｂは、血栓形成を示さない、ＳＮＡＰをドープしたシロキサンベースのポリウレタンエラストマー（例えば、ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ）で被覆されたＥＣＣ回路の本開示に従う実施例１０を示す概略破断図である。図１Ｂに示されるように、ＮＯが生成され、そのため、赤血球１４および血小板１６は一緒に塊にならない。
【０００９】
血液／物質相互作用は、単純なカテーテル、ステントおよび移植片から複雑な体外人工臓器までの、何千人もの患者において毎日使用される様々な植込み可能医用デバイスの成功にとって重要である。血栓症は、血液接触性物質の臨床的適用と関連する主要な問題のうちの１つである。血液−表面相互作用の機構の十分な理解および何十年にもわたる生体工学的研究努力にも関わらず、理想的な非血栓形成性の人工装具表面は、未解決の問題のままである。この５０年で、表面誘導血栓症についてならびに全身的凝固阻止および表面変性によりそれを防ごうとする試みについて、多くのことが学ばれてきた。表面変性には、純粋な非常に平滑なシリコーンゴムまたはポリウレタンの使用、アルブミンおよび他の被覆タンパク質への表面の事前曝露、ならびにイオンおよび共有結合様式でのヘパリンの表面結合が含まれてきた。内皮を模倣した非血栓形成性表面を開発するための幅広い研究にも関わらず、これらの変性はいずれも成功していない。
【００１０】
酸化窒素（ＮＯ）は、血管壁への血小板の付着／活性化および凝集を阻害する能力を有する正常内皮により分泌される２つの強力な血管拡張剤のうちの１つであることが見出された。刺激された正常内皮からのＮＯフラックスは、０．５×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１〜４×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１の範囲内にあることが推定されている。酸化窒素は、凝集および最終的には血栓症の開始に繋がる循環血小板および循環単球の活性化に対するその阻害効果について広く研究されてきた。多様なＮＯ供与体（例えば、Ｓ−ニトロソチオール（ＲＳＮＯ）、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−ニトロソアミン、Ｎ−ジアゼニウムジオレートおよびニトロシル金属錯体）が、少なくとも過去１０年にわたり研究されてきた。
【００１１】
酸化窒素（ＮＯ）は、ポリマーコーティング内のポリマーに付加されたＮＯ付加物／供与体化学種から放出され得る。「酸化窒素付加物」（ＮＯ付加物）および「ＮＯ供与体」は、生理学的条件下においてＮＯの生物学的活性が意図された作用部位／標的部位で発現されることとなるようにＮＯを供与および／または放出し得る、化合物および官能基をいう。
【００１２】
本開示に従ういくつかの実施例は、ポリマーコーティング内にＮＯ供与体／付加物を含む。ＮＯ供与体／付加物は、任意の好適なやり方（その一例はドーピングである）でポリマーコーティング中に組み込まれ得る。好適なＮＯ付加物（その例としては離散付加物が挙げられる）は、一般的に、ポリマーマトリックス中への（共有結合および／または分散のいずれかによる）埋込み能力を示しかつ加工調製安定性を示すものである。
【００１３】
「離散ＮＯ付加物」は、本明細書において言及される場合、ポリマーマトリックス中に入れられた時に、約０．２×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１〜約２０×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１のＮＯの範囲にわたる治療的に意味のあるＮＯフラックスをポリマー相から放出するＮＯ付加物（その例はＲＳＮＯである）である。ポリマー主鎖に共有結合されたＮＯ放出性部分を有する化合物は、一般的に、「ポリマーＮＯ付加物」と称される。好適なポリマーＮＯ付加物の例としては、Ｓ−ニトロソチオール化ポリウレタン、Ｓ−ニトロソチオール化シリコーンゴム、および／またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。離散ＮＯ付加物のいくつかの例は、いくらかの親油性を示すが、１個以上のアルキル基での誘導体化によってより親油性にされ得るものである。
【００１４】
そういうものとして、本開示の実施例は、（例えば体外循環（ＥＣＣ）回路およびカテーテルチューブにおける）血栓形成を防止するための、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）をドープしたポリマーから形成される新規の酸化窒素（ＮＯ）放出性コーティングである。
【００１５】
様々な疎水性ポリマー物質が、本明細書に開示される材料、方法、およびデバイスの実施例において採用され得る。これらとしては、ポリウレタン（ＰＵ）、シリコーンゴム（ＳＲ）、ポリウレタンとシリコーンゴムとのコポリマー（例えば、Ｅ２Ａ）、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリカプロラクトン、および／またはそれらの混合物などの物質が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施例において、ポリマー物質は、疎水性および親水性の両方のドメインを含み得る。選択されるポリマーは、例えばポリマー内の共有結合されたおよび／または分散されたＳ−ニトロソチオール（ＲＳＮＯ）型ＮＯ付加物から、ＮＯを放出することが可能なものであろう。選択されるポリマーはまた、ポリマーコーティング／フィルムが使用されることになる用途およびその用途のための所望のＮＯ放出速度によって決まり得る。例として、より高い水吸収を有するポリマーは、迅速なＮＯ放出が望ましい用途において好適であり得、一方、より低い水吸収を有するポリマーは、ゆっくりとしたＮＯ放出が望ましい用途において好適であり得る。長期にわたるＮＯ放出が望ましい例においては、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）添加剤もまた、酸性環境を作ってＲＳＮＯ化学種をさらに安定化するためにポリマーコーティング／フィルム中に含まれ得る。
【００１６】
さらに、本開示の範囲内にあるものとして、ポリマー中にドープされた離散ＲＳＮＯを含む系であって、そのポリマーがそれに（例えば、共有結合により）付加されたＲＳＮＯをも有する系が企図される。例えば、付加されたＲＳＮＯ官能基を有する先に調製されたポリウレタンポリマーが、離散ＲＳＮＯまたは同様の化学種と混合されて、本開示により可能にされる長期ＮＯ放出性ポリマーを作り得る。
【００１７】
いくつかの実施例において、選択されるＮＯ付加物は、ポリマーが生理学的条件下において溶液および／または血液に曝露された時に、ＮＯを自発的に放出することが可能なものである。他の実施例において、選択されるＮＯ付加物は、ポリマーが特定の光条件に曝露された時に、気相ＮＯを自発的に放出することが可能なものである。ＮＯ付加物のいくつかの例としては、分離したS-ニトロソチオール （ＲＳＮＯ）が挙げられる。
【００１８】
シロキサンベースのポリウレタンエラストマー（その一例はＥ２Ａｓである）中にドープされたＳＮＡＰを含む本開示の実施例は、ＲＳＮＯ付加物を安定化するのを助け得ると考えられ、したがって、有利なことに、ＲＳＮＯ化学種からのより長いＮＯ放出およびより高い温度（例えば、３７℃）においてでさえも向上した貯蔵安定性を可能にし得ると考えられる。
【００１９】
ポリマーからのＮＯの自発的な放出は、ＮＯ付加物と周囲環境との間に起こる少なくとも１つのプロセスによって支配され得る。ＲＳＮＯ化学種について、これらとしては、温度、水分、および特定の光波長の存在が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＲＳＮＯ化学種中のＳ−Ｎ結合の光分解により、ＮＯガスが遊離される。光分解は、３００ｎｍ〜４００ｎｍの波長範囲または５００ｎｍ〜６００ｎｍの波長範囲のいずれかにある光によって起こり得る。この例において、ＮＯ放出効率は、一般的に、高い方の波長範囲においてより高い。
【００２０】
離散酸化窒素付加物は、ポリマーマトリックスに共有結合され得るかポリマーマトリックス中に分散され得るかのいずれかであるか、またはその両方であることが理解されるべきである。離散ＲＳＮＯのいくつかの例としては、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ、図２Ａに示す）、Ｓ−ニトロソシステイン（ＣｙｓＮＯ）など、および誘導体化された離散ＲＳＮＯが挙げられるが、これらに限定されない。誘導体化されたＲＳＮＯは、アルキル基（１つまたは複数）で修飾されたものであり得る。例として、誘導体は、ＳＮＡＰの自由なカルボキシル基に結合されたアルキル基を有し得、かつ／またはＳ−ニトロソペニシラミンのアミン基に結合されたより長い（すなわち、アセチルよりも長い）アルキルを有し得る。一例として、エステル結合が、所望のアルキル基とＳＮＡＰの自由なカルボキシル基との間で形成され得る。別の例として、長鎖アルキル（４個〜１０個の炭素原子を含む）は、長鎖アルキルがアミン窒素に結合されるようにＳＮＡＰのアセチル基を置き換え得る。他の例として、糖が、ＳＮＡＰのカルボキシル基に結合され得る（例えば、グルコース−ＳＮＡＰ、マンノース−ＳＮＡＰ、フルクトース−ＳＮＡＰなど）。
【００２１】
本開示の実施例に従うＳＮＡＰをドープしたＮＯ放出性のシロキサンベースのポリウレタンエラストマーコーティングを、インビトロでおよび短期インビボウサギ血栓形成モデル内で評価した。本開示の実施例に従う新規コーティングは、３７℃でＰＢＳ中に浸りながら、暗闇の中で２０日間にわたり０．５〜１×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１のＮＯを連続的に放出した。さらに、新規コーティングは、暗闇の中での（すなわち、ＲＳＮＯ結合を光分解し得る波長に曝露されていない）乾燥条件下（すなわち、乾燥剤の存在下）における３７℃での４ヵ月後に、ＳＮＡＰの約７８％を保持した。本明細書においてさらに述べられるように、新規コーティング物質の実施例を、血小板機能、凝固およびフィブリノーゲン吸着に対するコーティングの影響を調べるためのウサギ血栓形成モデルにおける４時間にわたる体外循環（ＥＣＣ）に使用される体外回路の内壁コーティングとして採用した。ＳＮＡＰドープＮＯ放出性コーティングを、カテーテルを製造するためにも使用し、そのカテーテルを、血栓および細菌付着に対する効果を評価するために７日間にわたりヒツジ静脈に植込んだ。
【００２２】
上に述べたように、酸化窒素（ＮＯ）は、いくつもの重要な生理学的役割（血小板の付着および活性化の防止、細菌の付着および増殖の阻害、血管拡張の向上、血管新生の促進、および創傷治癒の促進を含む）を果たす内因性のガス分子である。ＮＯの効果は、生理学的系中のＮＯの所在およびその濃度に強く依存する。例えば、健康な血管の内壁の内側を覆う内皮細胞は、０．５ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１〜４．０×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１の範囲にわたる推定ＮＯ表面フラックスを生じる。多くの血液接触性デバイス（血管移植片、ステント、血管内センサー、血管内カテーテル、および体外生命維持回路を含む）の機能は、血小板活性化および血栓形成により損なわれ得る。そのようなデバイスの血液適合性を改善するための１つのアプローチは、ＮＯ放出に関して内皮細胞を模倣するコーティング材の使用である。実際、近年、そのようなデバイスの生体適合性を改善するために使用され得るＮＯ放出性およびＮＯ生成性の物質を開発することへのかなりの関心がある。
【００２３】
酸化窒素はまた、抗微生物活性（細菌を殺すことおよびバイオフィルム形成を防止することを含む）も示す。生物医学的デバイスに関して、細菌感染およびバイオフィルム形成は、合併症を引き起こし得る問題である。細菌はまた、その細菌が中に住むことになる多糖マトリックスを当該生物が分泌した際に表面上にバイオフィルムを形成する能力を有する。このマトリックスは、栄養分ならびに宿主防衛および抗生物質からの保護の両方を提供する。バイオフィルムは、慢性感染症の原因として作用し得、その結果、回復時間を長引かせ得る。その多くの生物学的役割の中で、酸化窒素は、抗微生物剤としておよび創傷治癒過程の促進剤として機能する。酸化窒素は広域スペクトルの抗菌特性を有しており、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方を殺す。低レベルの酸化窒素が、体内に留置された医用デバイスの表面上に形成したバイオフィルムを効率的に分散させることも報告されている。
【００２４】
酸化窒素は生理学的条件下において極めて反応性が高く、したがって、ＮＯを貯蔵しかつ放出し得る官能基を有する多様なＮＯ供与体分子が潜在的生物医学的用途のために研究されてきた。そのような分子としては、有機硝酸エステル、金属−ＮＯ錯体、Ｎ−ジアゼニウムジオレート、およびＳ−ニトロソチオール（ＲＳＮＯ）が挙げられる。Ｓ−ニトロソヘモグロビンおよびＳ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）などの生理学的ＲＳＮＯは、インビボにおけるＮＯの内因性レザバであると考えられる。Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＳＮＡＣ）およびＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ、図２Ａ）などの他の合成ＲＳＮＯは、著しい抗細菌作用および抗血栓作用を示すことが明らかにされている。ＲＳＮＯが、血管拡張剤および強力な血小板凝集阻害剤の両方であることも証明されている。図２Ｂに示されるように、ＲＳＮＯは熱分解を受け、ＮＯを放出して対応するジスルフィド化学種（ＲＳＳＲ）を生じる。ＲＳＮＯからのＮＯ放出は、金属イオン（例えば、Ｃｕ＋）により、ならびに３４０ｎｍおよび／または５９０ｎｍにおけるＳ−ニトロソ吸収帯に相当するエネルギーでの照射を通して光により、触媒され得る。抗血小板剤としてのＮＯと比べたＲＳＮＯのより強力な活性は、ＮＯと比べたＲＳＮＯの向上した安定性から生じるのであり、ＲＳＮＯからのＮＯの生成は、ＲＳＮＯをＮＯに変換する触媒部位を含有する膜タンパク質により血小板表面において局所的に生じることが示唆されている。
【００２５】
ポリマー中へのＲＳＮＯの組み込みは、生物医学的デバイスにおけるコーティングとして適用可能になるこれらのＮＯ供与体の有用性を拡大し得、血液／デバイス界面において局在化されたＮＯ放出を提供し得る。種々のポリマーマトリックス（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７ヒドロゲルを含む）中に分散された小分子ＲＳＮＯからなるいくつかのＮＯ放出性ポリマーが提案されてきた。これらの物質は、ポリマーから組織への親水性ＲＳＮＯの拡散による創傷上での局所的ＮＯ送達のための潜在的用途を有する。実際のところ、ＧＳＮＯ含有ヒドロゲルの毎日の適用が、創傷治癒過程を促進することが明らかにされている。しかしながら、そのようなポリマーからの急速なＲＳＮＯの滲出は、ＮＯ／ＲＳＮＯ放出寿命を著しく短縮し得、数時間しか続き得ない。代替アプローチは、ＲＳＮＯ官能基をマトリックスに共有結合させたＲＳＮＯ修飾物質を合成することであった。ヒュームドシリカ粒子、デンドリマー、ポリウレタン、ポリエステル、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、キセロゲル、自己集合単分子層、およびポリ（ビニルメチルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭＭＡ）は全て、これまでにＲＳＮＯ官能基で修飾されたものである。ＲＳＮＯ修飾キセロゲルは、１４日までの間ＮＯを放出し、減少した血小板および細菌の付着を示すことが見出された。しかしながら、そのようなＲＳＮＯ修飾キセロゲルは、亀裂および不均一フィルムに繋がる合成上の厄介な問題、低いＲＳＮＯ変換効率（第３級ＲＳＮＯ修飾キセロゲルについては最大４０％）、およびそれらの貯蔵寿命を制限するであろう室温での熱不安定性を被る。今日までに報告された他のＲＳＮＯ修飾物質の多くは、熱開始ＮＯ放出および光開始ＮＯ放出の両方を示すが、これらの物質の多くは、それらの限られたＮＯ放出寿命または貯蔵の間のＲＳＮＯ官能基安定性の欠如または合成の間のＲＳＮＯへの低い変換率のため、臨床的に有用であることは証明されていない。
【００２６】
ポリマー／血液界面における局在化されたＮＯ送達を達成するために報告された別のアプローチは、固定化触媒（Ｃｕ（Ｉ／ＩＩ）または有機セレン化学種）により内因性ＲＳＮＯからＮＯが生成され得るＮＯ生成性コーティングを使用することである。例えば、最近になって、Ｃｕ０ナノ粒子を含有するＮＯ生成性コーティングが、体外循環（ＥＣＣ）についてウサギモデルを用いて評価された。しかしながら、血栓形成を減少させることにおける良好な有効性を達成するためには、ＳＮＡＰの連続的注入が、内因性ＲＳＮＯレベルを補うために必要とされた。
【００２７】
本開示は、ＲＳＮＯ化学種の持続注入を回避するために、ＲＳＮＯ化学種を貯蔵することが可能であるいくつかの生物医学的ポリマーを含む。本開示に従うＲＳＮＯドープコーティングは、ＮＯ生成性触媒もまた採用されるならば、内因性ＲＳＮＯレベルを潜在的に補うことができるだけでなく、ＮＯを有利に放出することもできる。
【００２８】
本開示において、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）をドープした５つの生物医学的グレードのポリマーを、ポリマー内のＳＮＡＰからのＮＯの放出を制御しかつさらにＳＮＡＰ自体の放出も制御するそれらの潜在能力について調査した。本明細書においてさらに述べられるように、ＳＮＡＰは、Ｅｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）Ｅ２Ａｓポリマー中で非常に安定であり、ＮＯを（熱反応および光化学反応により）局所的に送達し得かつＳＮＡＰをゆっくりと放出し得る均一コーティングを作る。Ｅ２Ａｓは、本開示の範囲内にあるものとして企図される好適なシロキサンベースのポリウレタンエラストマーの一例である。Ｅ２Ａｓは、Ｅ２Ａの溶液グレードである（下記表１参照）。ＳＮＡＰを含有するＥ２Ａｓポリマーを、体外回路（ＥＣＣ）の壁に被覆し、血小板数、血小板機能、凝塊面積、およびフィブリノーゲン吸着に対する影響を調べるためにウサギ体外循環モデルにおいて４時間にわたる血流に曝露した。４時間後に、血小板数は、Ｅ２Ａｓコントロール回路についてはベースラインの６０±６％であったのに比較して、ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ被覆ループについては１００±７％で保持された（ｎ＝４）。ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓコーティングはまた、コントロールと比較して血栓面積を減少させた（それぞれ、２．３±０．６ｃｍ２および３．４±１．１ｃｍ２）。本明細書においてさらに述べられるように、ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓカテーテルもまた、ヒツジ静脈における７日間にわたる植込み後の血栓面積および細菌付着を著しく減少させることができた。これらの結果は全て、新規ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓコーティングが、血管内カテーテル、移植片、および他の血液接触性医用デバイスの血栓形成抵抗性を改善する可能性を有することを示唆している。
【００２９】
本発明者らはまた、５つの生物医学的ポリマー（シリコーンゴム（ＳＲ）、Ｅｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）Ｅ２Ａｓ（Ａｏｒｔｅｃｈ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｓｃｏｒｅｓｂｙ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから市販されているシロキサンベースのポリウレタンエラストマー）、ＣａｒｂｏＳｉｌ（登録商標）（ＤＳＭ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡから市販されている熱可塑性シリコーン−ポリカーボネート−ウレタン）、Ｔｅｃｏｆｌｅｘ（商標）ＳＧ８０ＡおよびＴｅｃｏｐｈｉｌｌｉｃ（商標）ＳＰ−６０Ｄ−６０（両方ともＴｈｅ  Ｌｕｂｒｉｚｏｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｉｃｋｌｉｆｆｅ，Ｏｈｉｏから市販されているポリウレタン））を、ＳＮＡＰのための貯蔵レザバとして機能するそれらの潜在能力について調べた。Ｅｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）ポリマーは、優れた固有の生体適合性特性および生体安定性特性を有し、かつ低い血液タンパク質吸着レベルを示す。ＳＮＡＰドープポリマーの各々が、そのインビトロＮＯ／ＳＮＡＰ放出について特徴付けられる。本発明者らは、ＳＮＡＰ自体がＥｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）Ｅ２Ａｓポリマー中で少なくとも４ヵ月にわたり安定であり、（生理学的温度で）熱によりＮＯを放出しかつ（ポリマーから血液中へのＳＮＡＰの拡散により）内因性ＲＳＮＯレベルを補うためのレザバとしても機能し得るコーティングを作ることを見出した。この新規ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓポリマーを、例えば４時間にわたるＥＣＣ後の血小板の数および機能の保持ならびに血小板面積を評価するためのＥＣＣウサギ血栓形成モデルにより、潜在的生物医学的用途について試験した。
【００３０】
（Ｅ２Ａｓは別にして）他のシロキサンベースのポリウレタンエラストマーもまた、本開示における使用に好適なものとして企図されることが理解されるべきである。さらに、Ｅｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）のシロキサンベースのポリウレタンエラストマーの他のグレード（Ａｏｒｔｅｃｈ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｓｃｏｒｅｓｂｙ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから市販されている）も、本開示における使用に好適なものとして企図されることが理解されるべきである。下記表１は、Ｅｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）ポリマーの種々のグレードの特性表である。表１に示されるそれらの例に加えて、他の好適なポリマーとして、ＣａｒｂｏＳｉｌ（登録商標）、ＰｕｒｉＳｉｌ（商標）、またはシリコーンゴムが挙げられると考えられる。
【００３１】
【表１】
2019093208.tif 000003
【００３２】
種々のＳＮＡＰドープポリマーフィルムの予備的インビトロ特徴付け
５つの生物医学的ポリマーの全てにドープされたＳＮＡＰは、何らの観察可能な相分離もなしに、緑色の均一かつ透明なフィルムを生じた。１０ｗｔ％ＳＮＡＰフィルムは、ポリマーフィルム１ｍｇ当たりおよそ０．４２μｍｏｌのＳＮＡＰ（または６μｍｏｌ／ｃｍ２）を貯蔵し、一方、５ｗｔ％ＳＮＡＰフィルムは、ポリマーフィルム１ｍｇ当たりおよそ０．２１μｍｏｌのＳＮＡＰ（または３μｍｏｌ／ｃｍ２）を貯蔵した。
【００３３】
５ｗｔ％および１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／ポリマーフィルムを、室温（すなわち、２２℃）または３７℃において暗闇の中で４ｍＬのＰＢＳ中に浸漬した。５ｗｔ％および１０ｗｔ％のＳＮＡＰを含有する種々のポリマーフィルムからのＰＢＳ中へのＳＮＡＰの拡散を、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収を用いてモニタリングした。図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、室温（図３Ａ参照）および３７℃（図３Ｂ参照）におけるＰＢＳ中への浸漬の初日の間に、ＳＮＡＰの全てがＳＧ８０ＡおよびＳＰ−６０Ｄ−６０ポリマーフィルムから拡散した。ＳＰ−６０Ｄ−６０ポリマーは、親水性で水吸収が約６０ｗｔ％であるのに対して、ＳＧ８０Ａは、より疎水性であり、約６ｗｔ％の水吸収を有している（下記表２参照）。
【００３４】
表２は、本開示において使用された５つの生物医学的ポリマーの水吸収を説明するものである。ポリマーフィルム（２００ｍｇのポリマー）を、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）プレート上のＴｅｆｌｏｎ（登録商標）リング（直径＝２．５ｃｍ）中で流延した。小円板（直径＝０．７ｃｍ）を親フィルムから切り取り、計量し、３７℃で４８時間にわたりＰＢＳ中に浸漬した。湿潤フィルムを拭いて乾燥させ、再度計量した。ポリマーフィルムの水吸収を、次のとおり重量パーセントで表２に報告する：水吸収（ｗｔ％）＝（Ｗ湿潤−Ｗ乾燥）／Ｗ乾燥×１００（ここで、Ｗ湿潤およびＷ乾燥は、それぞれ、湿潤フィルムおよび乾燥フィルムの重量である。）
【００３５】
【表２】
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【００３６】
図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、浸漬の最初の２時間の間にＳＮＡＰの全てがより親水性のＳＰ−６０Ｄ−６０ポリマーから出て行き、より疎水性のＳＧ８０Ａは２４時間後にＳＮＡＰの全てを滲出させる。ＳＰ−６０Ｄ−６０ポリマーおよびＳＧ８０ＡポリマーからのＳＮＡＰの急速な喪失により、ＮＯの非常に大きな初期噴出が、浸漬の初日（０日目）の間に（酸化窒素分析器（ＮＯＡ）を用いて）化学ルミネセンスにより観察され、これらのフィルムは、１日後にはＳＮＡＰ／ＮＯ放出を全く示さなかった（データは示していない）。したがって、これらの２つのポリマーは、ＮＯ／ＳＮＡＰの迅速な噴出をもたらすものであり、ＮＯ／ＳＮＡＰのより長期の放出には好適ではないことが分かった。
【００３７】
それに対して、シリコーンゴム、ＣａｒｂｏＳｉｌ（登録商標）、およびＥ２Ａｓポリマーは、１日後に、浸漬緩衝液中に拡散する著しくより少ない量のＳＮＡＰを示す（図３Ａおよび図３Ｂ参照）。これらのポリマーの３つ全てについて、ＳＮＡＰ滲出の初期噴出が、浸漬の初日の間にポリマーによる急速な水吸収に対応して観察された。この初期噴出は、フィルム中に組み込まれたＳＮＡＰ分子全体の約１０％であった。浸漬のその後の日々の間、少量のＳＮＡＰが、これらのポリマーから滲出し続けた。シリコーンゴム、ＣａｒｂｏＳｉｌ（登録商標）（熱可塑性シリコーン−ポリカーボネート−ウレタン）、およびＥ２Ａｓ（シロキサンベースのポリウレタンエラストマー）は全て、それらの高いＰＤＭＳ含有量のため疎水性ポリマーであり、最低の水吸収も有する（上記表１参照）。ＳＮＡＰは僅かに疎水性である。したがって、ＳＮＡＰは、これらのより疎水性のポリマーフィルム中に留まることを好むはずである。さらに、これらのポリマーの疎水性特性はまた、少なくとも一つにはこれらのポリマーの極小の水吸収のため、緩衝液中へのＳＮＡＰの拡散を制限することにおいても著しい役割を果たすと考えられる。
【００３８】
この３つのＳＮＡＰドープポリマー（すなわち、シリコーンゴム、ＣａｒｂｏＳｉｌ（登録商標）、およびＥ２Ａｓポリマー）からの熱開始ＮＯ放出および光開始ＮＯ放出もまた、ＮＯＡ測定により調査した。酸化窒素放出は、３つ全てのフィルムの種類について、１００Ｗ投光照明を用いて開始／停止され得る。図４Ａは、暗闇の中、周囲光の中および１００Ｗ投光照明の中での、３７℃における１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２ＡｓフィルムのＮＯ放出挙動を図示している。図４Ａに示されるように、暗闇の中または周囲研究室光の下での１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２ＡｓフィルムからのＮＯ放出にほとんど差異はない。というのは、周囲蛍光照明は、ＲＳＮＯの分解に係わる波長（３４０ｎｍまたは５９０ｎｍ）を発しないからである。１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓフィルムについてのデータが示されているが、３つ全てのポリマーについて、１００Ｗ投光照明で連続的に照射されたフィルムについてのＮＯＡにより検出されたＮＯ放出総量は、フィルム中にドープされたＳＮＡＰの約１００％であったということが理解されるべきである。３７℃にて１００Ｗ投光照明で連続的に照射し、放出されたＮＯをＮＯＡを用いてモニタリングすることにより、これらの３つのフィルムからの光開始ＮＯ放出を調べた（図４Ｂ参照）。ＳＮＡＰをドープしたＥ２ＡｓフィルムおよびＣａｒｂｏＳｉｌ（登録商標）フィルムは、３日の期間にわたる光誘導ＮＯフラックスの漸減を示したのに対して、ＳＲベースのフィルムは、同じ条件下において２日間しかＮＯを放出しなかった。周囲光の下で３７℃においてインキュベートされた３種類全てのフィルムが、浸漬の初日に溶液中へのＳＮＡＰの放出に相当するＮＯの初期噴出を生じ、その後の日々において、ＮＯフラックスは１×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１〜２×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１の範囲であった。このＮＯフラックスは、血小板機能を阻害しかつ細菌を殺すために依然として潜在的に有用である。
【００３９】
ＮＯ放出は、１００Ｗ投光照明下におけるＥ２Ａｓ中１０ｗｔ％ＳＮＡＰからなるフィルムからのものがより有望であり得るようである。したがって、Ｅ２Ａｓ中のＳＮＡＰのｗｔ％を５ｗｔ％に変更してより詳細に調べた（図４Ｃ参照）。５ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓフィルムについては、ＮＯ放出およびＳＮＡＰ滲出パターンは同様であるが、ＮＯ放出がより短い時間にわたって起こる。ＳＮＡＰからのこうしたＮＯ放出と組み合わせたＥｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）ポリマーの生体安定性および生体適合性が、この処方物をさらなるインビトロ用途および可能性のある生物医学的用途にとって魅力的にしている。
【００４０】
＜ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ処方物の長期ＮＯ放出＞
ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓフィルムを用いて、これらのフィルムからの長期ＮＯ放出およびＳＮＡＰ滲出を調べるためにインビトロ調査を行った。経時的なＳＮＡＰ／Ｅ２ＡｓフィルムからのＮＯ放出を、ポリマー相内で分解されたＳＮＡＰの量に基づき（すなわち、所与の時点においてフィルムを溶解した後に残存するＳＮＡＰを測定することにより）決定した。１０ｗｔ％フィルム中のＳＮＡＰの初期濃度は、４２０ｎｍｏｌＳＮＡＰ／ｍｇフィルムであった。図５Ａは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）に再溶解させた１．０ｍＭ  ＳＮＡＰ溶液、Ｅ２Ａｓ中１０ｗｔ％ＳＮＡＰフィルム、およびＤＭＡｃに溶解させたＥ２ＡｓのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示している。
【００４１】
１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓフィルムを種々の条件下においてＰＢＳ中に浸漬すると、ＳＮＡＰの熱分解および／または光化学分解により３４０ｎｍの吸光度帯の減少が観察された。その吸光度減少に基づく累積ＮＯ放出を図５Ｂに示す。１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓフィルムは、浸漬の初日の間に、ＳＮＡＰの熱分解およびフィルムからの拡散に相当するＮＯの初期噴出を示した（図３Ａおよび図３Ｂ参照）。室温で浸漬されたフィルムは、最低のＮＯ放出フラックスを有していた。しかしながら、３７℃で暗闇の中または周囲光の下においてインキュベートされたフィルムは、室温でのフィルムよりも高いＮＯ放出を示した。これは、ＳＮＡＰの熱分解が増加したことによる。周囲光に曝露されたフィルムは、暗闇の中で浸漬されたフィルムとほぼ同じＮＯ放出プロファイルを生じる。３７℃において１００Ｗ投光照明で連続的に照射されるＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓフィルムからの酸化窒素放出は、ＳＮＡＰレザバを急速に枯渇させるそれらのより高いＮＯフラックスのため、３日間しかＮＯを放出しない。これらのフィルムは、ＳＮＡＰの熱分解および光開始分解の両方によるＮＯ放出を提供する。
【００４２】
ＳＮＡＰドープＥ２Ａｓからの酸化窒素放出は、ポリマー相内、またはＳＮＡＰがポリマーからの拡散により水相に入った後のいずれかにおける、ＳＮＡＰの熱分解および／または光化学分解から生じ得る。ＳＮＡＰ／Ｅ２ＡｓコーティングのＮＯ放出機構をより良く理解するために、ＰＢＳ中へのＳＮＡＰ拡散を、２０日の期間にわたりモニタリングした。図６Ａに示されるように、１０ｗｔ％ＳＮＡＰを含有するフィルムは、３７℃において、初日にＳＮＡＰ滲出の初期噴出を示す。この初期噴出後に、ＳＮＡＰは、ＳＮＡＰレザバがほとんど枯渇してしまうまで、Ｅ２Ａｓからゆっくりと拡散し続ける（２０日目に依然として測定可能な量のＳＮＡＰ滲出がある）。フィルムから滲出するＳＮＡＰの総モル数は、２０日の期間の間に放出される（ＮＯＡ測定により検出される）全ＮＯの約２７％を占める（図６Ｂ参照）。
【００４３】
さらに、ＳＮＡＰ喪失に対するポリマー上塗り数の影響も評価した。上塗りを何ら有さないＳＮＡＰドープＥ２Ａｓフィルムは、少なくとも２枚の上塗りを有するフィルムよりも高いレベルの緩衝液中へのＳＮＡＰ拡散を示す（図７参照）。上塗りの厚さは、ポリマーレザバからのＳＮＡＰの拡散速度の制御を可能にする。そういうものであるから、本明細書に開示される実施例において、ＳＮＡＰドープフィルムは、ポリマー上塗りで被覆され得る。上塗りに好適なポリマーの例としては、（ＮＯ供与体を中に含んでいない）シロキサンベースのポリウレタンエラストマー、ポリ（塩化ビニル）、架橋ポリウレタン、架橋シリコーンゴム、ポリテトラフルオロエチレンなどが挙げられる。いくつかの実施例において、上塗りのために使用されるポリマーは、下にあるフィルムのために使用される同じポリマーである。
【００４４】
＜ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓフィルムの安定性調査＞
乾燥貯蔵の間のＥ２ＡｓポリマーにドープされたＳＮＡＰの安定性も評価した。Ｅ２Ａｓに組み込まれたＳＮＡＰは、貯蔵の間に熱分解または光化学分解を受ける可能性があり得、したがって使用時に利用可能なＮＯ放出能力を制限し得る。したがって、１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓフィルムを、乾燥剤と共に冷凍庫中で暗闇の中で、乾燥剤と共に室温において暗闇の中または周囲光の中で乾燥した状態で、ならびに乾燥剤と共に３７℃および５０℃において暗闇の中で乾燥した状態で、貯蔵した。これらの安定性調査は、累積ＮＯ放出実験と類似のやり方で行われ、（本明細書に記載される）様々な時点でポリマー中に残存するＳＮＡＰの量を、フィルムをＤＭＡｃに溶解させて測定した。その結果は、ＳＮＡＰが、４ヵ月後にＥ２Ａｓポリマーマトリックス内で安定であることを示す。例えば２ヵ月後に、冷凍庫（−２０℃）中で暗闇の中で貯蔵された１０ｗｔ％ＳＮＡＰフィルムは、室温で貯蔵されたフィルムについての８９％および３７℃で貯蔵されたフィルムについての８２％と比較して、初期ＳＮＡＰ化学種の約９６％を維持する（図８参照）。図８に示される結果は、貯蔵の間のＳＮＡＰの向上した安定性を説明している。第３級ＲＳＮＯ（例えば、ＳＮＡＰ）は、硫黄原子の周りの立体障害により、第１級ＲＳＮＯよりも高い安定性を有している。Ｅ２Ａｓポリマーの安定化効果と組み合わせたＳＮＡＰの増大した熱安定性が、ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ物質の優れた貯蔵安定性をもたらす。
【００４５】
ＲＳＮＯの安定性を、そのようなＮＯ供与体を含有する粘性ポリマーマトリックス（ポリ（エチレングリコール）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７ヒドロゲル、ポリ（ビニルアルコール）およびポリ（ビニルピロリドン）を含む）について調査した。ＲＳＮＯは、以下の反応順序に従って分解する：
ＲＳＮＯ→ＲＳ・＋ＮＯ・（１）
ＲＳ・＋ＲＳＮＯ→ＲＳＳＲ＋ＮＯ・（２）
反応全体：２ＲＳＮＯ→ＲＳＳＲ＋２ＮＯ・（３）。
【００４６】
ポリマーマトリックスの粘性は、結合開裂およびラジカル対再結合に対するかご効果をもたらす。さらに、粘性ポリマーマトリックスはまた、ラジカル化学種の拡散を制限し、ＲＳＮＯを再形成する対再結合を促進する。したがって、Ｅ２Ａｓポリマーは、ＰＢＳ中へのＳＮＡＰの拡散を制限するだけでなく、Ｅ２Ａｓポリマーは、ＳＮＡＰ分解速度を低下させるさらなる安定化効果も提供するようである。
【００４７】
Ｅ２Ａマトリックス中のＳＮＡＰの貯蔵安定性を試験するためにある実験を行った。図９はその結果を図示している。具体的に言えば、図９は、暗闇の中での３７℃におけるＥ２Ａｓ中１０ｗｔ％ＳＮＡＰの乾燥フィルムからのＮＯ放出挙動を示している（ｎ＝１）。フィルムは３７℃で乾燥され、次いで３７℃で貯蔵された。フィルム中の全ＮＯのおよそ５％が貯蔵の最初の数時間の間に放出され、その後は非常に低いＮＯ放出レベルが続いた。これは、ＳＮＡＰがそのＮＯを３７℃での乾燥貯蔵の間ゆっくりと失う（乾燥状態での２ヵ月間にわたる貯蔵後にＳＮＡＰの１０〜１５％しか失わない）ことを示す本明細書に開示された他の貯蔵／安定性データ（図８参照）と一致している。
【００４８】
＜ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ被覆ＥＣＣループおよびウサギ血行動態に対する影響＞
Ｅ２Ａｓ中５ｗｔ％ＳＮＡＰとＥ２Ａｓの上塗りとで被覆された活性ＥＣＣループ（これの概略断面図が図１０に示されている）およびＥ２Ａｓのみで被覆されたコントロールループを調製した。一つにはＥＣＣ実験の短い継続期間のため、５ｗｔ％ＳＮＡＰをこれらの試験において使用した。上に記載したように、ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓコーティングは、浸漬の初日の間に溶液中へのＳＮＡＰ拡散の初期噴出を有する。短期ＥＣＣ実験の間のこの噴出の影響を低減するために、まず全てのループを生理食塩水中に一晩浸漬し、ＥＣＣ実験の前にその浸漬溶液を捨てた。被覆ＥＣＣループの試料から放出される酸化窒素を、（生理食塩水中への一晩の浸漬後の）血液曝露前のＮＯ放出について、ＮＯＡを用いて測定した。このＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ被覆ループのＮＯ放出は、（３７℃において周囲光の場合に）４時間にわたり約２×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１の平均フラックスを維持する（図１１Ａ参照）。流れる血液への４時間にわたる曝露後に、このＥＣＣループは、さらなる１時間の期間にわたり、少なくとも１．５×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１のＮＯフラックスを依然として示す（図１１Ｂ参照）。
【００４９】
ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ被覆ＥＣＣ回路の血行動態への影響もまた、ウサギＥＣＣモデルにおける４時間にわたる血液曝露の間、モニタリングした。平均動脈圧（ＭＡＰ）は、最初の１時間以内にＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓループおよびコントロールループの両方について著しく低下し、それぞれ、３５±２ｍｍＨｇおよび４６±２ｍｍＨｇまで低下した。ＭＡＰは、持続的ＩＶ流体維持によって、この４時間の間これらのレベルで維持された。ＥＣＣ血液流量は、ＳＮＡＰ／Ｅ２ＡｓＥＣＣについては低下し６４±５ｍＬ／分で留まったのであるが、コントロールについてはこの４時間の間ベースラインレベル（７６±６ｍＬ／分）で維持された。ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ回路についてのＭＡＰ低下およびよりゆっくりとした血液流量はコーティングから血液中に拡散したＳＮＡＰの血管拡張作用のせいである可能性がある。心拍数は、この４時間の間維持され、ＳＮＡＰ／Ｅ２ＡｓＥＣＣループとコントロールＥＣＣループとの間に著しい差異は何ら認められず、平均すると２０５±２拍／分であった。活性凝固時間は、恐らくは血管内流体の増加（血液希釈作用）のため、ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ回路およびコントロール回路の両方について、この４時間の期間の間増大した。ＭＡＰおよび流量に対する同様の影響が、ＳＮＡＰ注入の場合に観察された。
【００５０】
＜ウサギ血小板機能および血栓形成に対するＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓコーティングの影響＞
４時間にわたるＥＣＣを通じての血小板の活性化および機能を、血小板数（例えば、消費量、図１２Ａ参照）および血漿フィブリノーゲンレベル（図１２Ｂ参照）（これらの両方が、添加されたＩＶ流体による血液希釈について補正された）ならびに％血小板凝集を記録することにより評価した。ベースライン血小板数（×１０８血小板／ｍＬ）は、５ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ回路およびＥ２Ａｓコントロール回路について、それぞれ３．５±０．６および４．８±０．５であった。ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ回路については、血小板数は最初に僅かに増加し、ＥＣＣ上での４時間の終わりにベースラインレベルの１００±７％で維持された。コントロール回路についての血小板数は、血小板の時間依存的喪失を示し、４時間後にはベースラインの６０±６％まで減少した。血小板の機能的凝集のパーセントを、ＰＲＰのエキソビボコラーゲン刺激により決定し、光学的濁度により測定した。ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ回路およびコントロール回路を通る循環から採取された血液からの血小板は、４時間にわたる血液曝露の間、コラーゲン刺激血小板凝集に対して同様の反応を示し、両方とも５６±１２％を維持した（ベースライン値は６８±６％）。
【００５１】
図１２Ｂに示されるように、血漿フィブリノーゲンレベルは、コントロール回路についてはベースラインレベルで維持された。５ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ回路については、血漿フィブリノーゲンレベルは、ＥＣＣの最初の１時間の間にベースラインレベルの８３％まで低下し、４時間にわたるＥＣＣの間そのレベルに留まった。血漿フィブリノーゲンレベルのこの低下は、インビトロフィブリノーゲンアッセイ結果（図１３参照）により示されるように、表面へのフィブリノーゲン結合の結果であると考えられ得る。驚くべきことに、ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓコーティング上への増大したフィブリノーゲン吸着を伴っても、この物質は、コントロールよりも著しく少ない血小板喪失を依然として示したのであるが、このことは、産生されるＮＯのレベルが、血小板の活性化を通常は高めるであろう増大したフィブリノーゲン吸着に打ち勝つものであることを示唆している。
【００５２】
ＥＣＣ回路の血栓形成チャンバ（すなわち、ＥＣＣループ内の長さ８ｃｍの内径３／８インチＴｙｇｏｎ（登録商標）チューブ）における特異な血栓形成を測定するために、２次元（２Ｄ）画像解析を、４時間にわたる血液曝露後に行った。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いることにより血栓面積を解析した。この血栓面積は、各血栓形成チャンバ中の血栓形成の２Ｄ面積（ピクセル／ｃｍ２）である。血栓面積を定量した。データを図１４に示す。Ｅ２Ａｓポリマーの向上した固有の生体適合性の結果としてもたらされるものと考えられる比較的低い血栓面積をＥ２Ａｓコントロールも有していたが、ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ回路について、血栓面積はコントロールと比較して著しく減少する。
【００５３】
新規ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓコーティングの影響の１つは、血流中へのＳＮＡＰの拡散によって引き起こされる低血圧である。静脈内流体の同時投与がこれを妨げるが、場合によっては臨床的状況において困難をもたらし得る。ＳＮＡＰの適用は、低血圧、高血糖およびインスリン分泌障害、ならびに細胞生存能力の低下を引き起こすことが報告されている。しかしながら、小型の植込み可能デバイスのためのコーティングについてカテーテルとして使用される場合、表面積と（血液の）体積との比はかなり小さいであろうし、したがって、血液に失われるＳＮＡＰの量は、概して重大な問題ではないであろう。さらに、内因性のチオールおよびスーパーオキシドジスムターゼが、有害作用の多くを低減するであろう。またしかしながら、親チオールであるＮ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン（ＮＡＰ）は、最小限の副作用を伴って、水銀中毒およびシスチン尿症を処置するために臨床的に使用されてきた。本明細書に開示されるＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓコーティングは確かに低血圧作用を示すのであるが、当該コーティングによって送達されるＳＮＡＰの１日レベルは、上に記載した他の潜在的有害副作用を引き起こす報告されているレベルよりも十分に低い。
【００５４】
＜ＳＮＡＰドープポリマーを作製するための含浸方法＞
本開示はさらに、市販のＳＲまたはＰＵチューブにＳＮＡＰを添加するための方法を含む。市販のＳＲおよびＰＵには、医用グレードのチューブ（ＵＳ  ｐｌａｓｔｉｃｓ、Ｃｏｌｅ  Ｐａｌｍｅｒ、Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ、ＩＣＯＲａｌｌｙ、およびＴｈｅｒｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なものを含む）が含まれる。図１５は、１または２日間のいずれかにわたりＳＮＡＰ／アセトン溶液中に浸漬されたポリウレタン（ＰＵ）チューブのＮＯ放出プロファイルを示している。チューブは次いでアセトンですすがれ、ＮＯＡ試験の前に乾燥された。ＮＯＡ試験のために、チューブは３７℃においてＰＢＳ中に浸漬された。
【００５５】
この含浸アプローチは、既存の市販のカテーテル／チューブの壁内へのＳＮＡＰ化学種の組み込みを可能にする。このアプローチは、通常の高温押出条件下においてＳＮＡＰを押出してポリマーチューブにすることを試みた場合に高温におけるＮＯ供与体（例えば、ＳＮＡＰおよび関連化学種）の熱不安定性により起こり得る問題を回避する。本明細書に記載される含浸アプローチではアセトンが使用されたが、使用され得る他の溶媒（または溶媒混合物）としては、酢酸エチル、シクロヘキサン、イソプロパノール、メタノール、ブタノンなどが挙げられると考えられる。
【００５６】
＜カテーテルチューブ用途のためのＳＮＡＰドープポリマー＞
図１６Ａは、本開示の実施例に従って５ｗｔ％または１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓを用いて調製され、続いてＥ２Ａｓの上塗りが適用された、Ｅ２Ａｓカテーテルチューブの概略図である。図１６Ｂは、このカテーテルチューブの断面図であり、各種の層を図示している。一般的に、３層カテーテルは、Ｅ２Ａｓ溶液の５枚の下塗り、それぞれの活性溶液の２５枚の被膜、およびＥ２Ａｓ溶液の５枚の上塗りを浸漬被覆することにより調製された。このＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓカテーテルは、３７℃で暗闇の中においてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で維持された。
【００５７】
図１７は、このＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓカテーテルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での暗闇の中における３７℃での２０日間にわたるＮＯ放出を示している。図１７中の結果は、その特定された条件において、１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓカテーテルが２０日までの間ＮＯを放出できたこと、および５ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓカテーテルが７日までの間ＮＯを放出できたことを図示している。
【００５８】
Ｅ２Ａｓコントロールカテーテルおよび１０ｗｔ％ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓカテーテルは、７日間にわたりヒツジ静脈中に植込まれた。取り出し（ｅｘｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）後、ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓカテーテルは、Ｅ２Ａｓコントロールカテーテルに比べて著しくより少ない血栓を有し（図１８）かつ細菌付着が９０％減少する（図１９）ことが見出された。図１７〜１９は総じて、カテーテル構成におけるＳＮＡＰドープポリマーの潜在用途を証明している。
【００５９】
本開示をさらに説明するために、様々な実施例を本明細書に示す。これらの実施例は例示目的で提供され、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが理解されるべきである。
【００６０】
ＳＮＡＰドープポリマーおよび本明細書において先に記載されたデータは、この実施例の項に記載されている材料および技術を用いて作製されたものであることが理解されるべきである。この実施例の項に記載されている種々の試験手順もまた使用された。
【００６１】
＜材料＞
Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン（ＮＡＰ）、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム（２塩基）、リン酸カリウム（１塩基）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、硫酸およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。メタノール、塩酸および硫酸は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から入手した。Ｔｅｃｏｐｈｉｌｉｃ（商標）ＳＰ−６０Ｄ−６０およびＴｅｃｏｆｌｅｘ（商標）Ｓｇ−８０Ａは、Ｌｕｂｒｉｚｏｌ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）の製品であった。Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＲＴＶ３１４０  シリコーンゴム（ＳＲ）は、Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ  Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＷＩ）から購入した。ＣａｒｂｏＳｉｌ（登録商標）２０  ９０Ａは、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）からのものであった。Ｅｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）Ｅ２Ａｓは、ＡｏｒＴｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＰＬＣ（Ｓｃｏｒｅｓｂｙ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。＞９０％凝固可能タンパク質を含有するヒト血漿フィブリノーゲンは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の製品であり、変性ヒトフィブリノーゲンに対するフルオロセイン標識ヤギＩｇＧ（ポリクローナル）は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ（Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）から購入した。蛍光測定に使用した黒色ポリプロピレン９６ウェルマイクロタイタープレートは、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）から入手した。全ての水溶液を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて１８．２ＭΩ脱イオン水を用いて調製した。１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００μＭ  ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）を、全てのインビトロ実験のために使用した。
【００６２】
＜ＳＮＡＰの合成＞
先に報告された方法（Ｉ．Ｃｈｉｐｉｎｄａ，Ｒ．Ｈ．Ｓｉｍｏｙｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  ２００６，１１０，５０５２）の修正版を用いて、ＳＮＡＰを合成した。簡潔に述べると、等モル比のＮＡＰおよび亜硝酸ナトリウムを、２Ｍ  ＨＣｌおよび２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を含有する水とメタノールとの１：１混合物に添加した。３０分間にわたる撹拌後、反応容器を氷浴中で冷却して、緑色ＳＮＡＰ結晶を沈澱させた。結晶を濾過により収集し、水で洗浄し、風乾させた。この反応および結晶は、常に光から保護された。
【００６３】
＜ＳＮＡＰドープフィルムの調製＞
５ｗｔ％および１０ｗｔ％のＳＮＡＰを含有するポリマーフィルムを、溶媒エバポレーションにより調製した。１０ｗｔ％ＳＮＡＰフィルムについては、ＴＨＦに１８０ｍｇのそれぞれのポリマーを溶解させることにより流延溶液を調製した。ポリウレタン（ＳＰ−６０Ｄ−６０、ＳＧ−８０Ａ、ＣａｒｂｏＳｉｌ（登録商標）およびＥｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）Ｅ２Ａｓ）は３ｍＬのＴＨＦに溶解させ、ＳＲは１ｍＬのＴＨＦに溶解させた。次いで、ＳＮＡＰ（２０ｍｇ）をこのポリマー溶液に添加し、この混合物を１０分間撹拌した。５ｗｔ％ＳＮＡＰフィルムは、ＳＮＡＰ（１０ｍｇ）およびポリマー（１９０ｍｇ）を用いて同様に調製した。このフィルム溶液を、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）プレート上のＴｅｆｌｏｎ（登録商標）リング（直径＝２．５ｃｍ）中で流延し、周囲条件下で一晩乾燥させた。小円板（直径＝０．７ｃｍ）を親フィルムから切り取り、上塗り溶液（４ｍＬのＴＨＦ中の２００ｍｇのそれぞれのポリマー（ＳＮＡＰは添加されていない））で２回浸漬被覆し、一晩乾燥させた。そういうものであるから、各試料のための上塗りは、親フィルムと同じポリマーでできていた。各小円板の重量を、上塗り被覆前に記録した。全てのフィルムおよびフィルム溶液を光から保護した。最終フィルムは、厚さ約１５０μｍのＳＮＡＰドープ層および厚さ約５０μｍの上塗りを有していた。
【００６４】
＜ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ被覆ＥＣＣループの調製＞
インビトロウサギ調査において採用されたＥＣＣ構成は、１６ゲージおよび１４ゲージのＩＶポリウレタン血管カテーテル（Ｋｅｎｄａｌｌ  Ｍｏｎｏｊｅｃｔ  Ｔｙｃｏ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）、２つの長さ１６ｃｍの内径（ＩＤ）１／４インチＴｙｇｏｎ（登録商標）チューブ、およびより荒い血流のためより容易に血栓が形成し得る血栓形成チャンバを作る長さ８ｃｍのＩＤ３／８インチＴｙｇｏｎ（登録商標）チューブからなった。
【００６５】
先に述べたように、ＥＣＣ実験の短い継続期間（４時間）のため、ＮＯ放出性ＥＣＣループには、Ｅ２Ａｓ中５ｗｔ％ＳＮＡＰのみが被覆された。ＴＨＦ（１５ｍＬ）にＳＮＡＰ（１２５ｍｇ）およびＥ２Ａｓ（２３７５ｍｇ）を溶解することにより、ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ溶液を調製した。Ｅ２Ａｓコントロール溶液は、中Ｅ２Ａｓ（１５ｍＬ中２５００ｍｇ）からなった。ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓループは、まずＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ溶液の２枚の層で被覆され、続いてＥ２Ａｓコントロール溶液の１枚の被膜で被覆された。Ｅ２Ａｓコントロールループは、Ｅ２Ａｓコントロール溶液の２枚の被膜で被覆された。各被覆の間において、ＥＣＣループを暗闇の中で１時間風乾させた。完全に被覆されたＥＣＣは、ＴＨＦを用いて一緒に接着され、左頸動脈側から始まり、１６ゲージの血管カテーテル、一方の長さ１５ｃｍのＩＤ１／４インチチューブ、長さ８ｃｍの血栓形成チャンバ、もう一方の長さ１５ｃｍのＩＤ１／４インチチューブ、そして最後に１４ゲージの血管カテーテルを含んだ。２つのルアーロックＰＶＣコネクタを用いて血管カテーテルをチューブに繋ぎ合わせた。組み立てられたＥＣＣループを、少なくとも４８時間にわたり、光から保護しながら真空下で乾燥させた。ＥＣＣ実験の前に一晩の浸漬のためにループに生理食塩溶液を充填し、ウサギ実験の直前にこの溶液を捨てた。
【００６６】
＜ＳＮＡＰドープフィルムのインビトロ特徴付け＞
＜ＵＶ−Ｖｉｓスペクトル＞
室温で、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｌａｍｂｄａ  ３５，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＭＡ）を用いて、２００ｎｍ〜７００ｎｍの波長範囲において全てのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを記録した。ＳＮＡＰのＳ−ＮＯ基の存在は、π→π＊電子遷移およびｎＮ→π＊電子遷移に相当する特徴的な吸光度極大を３４０ｎｍおよび５９０ｎｍにおいてもたらす。
【００６７】
＜ＰＢＳ中に浸漬されたＳＮＡＰドープポリマーフィルムからのＳＮＡＰの拡散＞
上塗り被覆フィルムを、個々のバイアルに入れ、微量金属イオンにより触媒されるあらゆるＳＮＡＰ分解を最小限にするために１００μＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に浸漬した。フィルムを、室温（２２℃）または３７℃において暗闇の中でインキュベートした。様々な時点で、ＳＮＡＰ濃度の迅速な測定のために、ＰＢＳの１ｍＬアリコートのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを測定した。実験の継続期間の間、これらのアリコートは光から保護され、試料バイアルに直ちに戻された。フィルムは、毎日新しいＰＢＳ緩衝液に入れられた。３４０ｎｍにおけるＰＢＳ中のＳＮＡＰについてのモル吸光係数は、εＳＮＡＰ＝１０２４Ｍ−１ｃｍ−１であると決定された。
【００６８】
＜ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓフィルムからの累積ＮＯ放出＞
Ｅ２Ａｓ中１０ｗｔ％ＳＮＡＰフィルムを調製した後に、フィルム内のＳＮＡＰの初期濃度（ｎｍｏｌＳＮＡＰ／ｍｇフィルム）を決定するために、ＤＭＡｃに溶解させた個々のフィルムのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを記録した。次いで、同等のフィルムを、１００μＭ  ＥＤＴＡを含有する３ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を含んだ個々のバイアルに入れた。フィルムを、以下の様々な条件下でインキュベートした：周囲光下で室温、周囲光下で３７℃、暗闇の中で３７℃、および１００Ｗ投光照明下で３７℃。実験室中の蛍光灯を周囲光と呼ぶ。フィルムは、毎日新しいＰＢＳに入れられた。様々な時点で、フィルム中に存在するＳＮＡＰの迅速な測定のために、フィルムをＤＭＡｃに溶解させた。放出されたＮＯの量を、様々な時点で、分解されたＳＮＡＰの量から間接的に測定した。経時的な累積放出ＮＯ（［ＮＯ］ｔ）を、フィルム中の初期ＳＮＡＰ量（［ＳＮＡＰ］０）と時間ｔにおけるＳＮＡＰ量（［ＳＮＡＰ］ｔ）との間の差異によって計算した：［ＮＯ］ｔ＝［ＳＮＡＰ］０−［ＳＮＡＰ］ｔ（ここで、濃度は、ｎｍｏｌ／ｍｇフィルムの単位である）。この計算は、ＳＮＡＰの３４０ｎｍ吸収帯の減衰が、Ｓ−ＮＯ結合の溶血開裂および付随するＮＯ放出と直接関係しているという事実に基づいた。３４０ｎｍにおけるＤＭＡｃ中のＳＮＡＰについてのモル吸光係数は、εＳＮＡＰ＝１０２５Ｍ−１ｃｍ−１であると決定された。
【００６９】
＜ＮＯ放出測定＞
フィルムから放出される酸化窒素を、Ｓｉｅｖｅｒｓ化学ルミネセンス酸化窒素分析器（ＮＯＡ）２８０（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を用いて測定した。フィルムを、試料容器に入れ、１００μＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に浸漬した。酸化窒素を、Ｎ２スイープガスおよびバブラーを用いて連続的に緩衝液から取り除き、上部空間から化学ルミネセンス検出チャンバ中に一掃した。周囲光および光開始ＮＯ放出実験のために、透明ガラス試料容器を使用した。光分解実験のために、１００Ｗハロゲン投光照明（ＧＥ型式１７９８６）を試料セルから約６０ｃｍの所に設置した。フィルムは、ＮＯＡ測定と同じ条件（３７℃で周囲光または１００Ｗ投光照明照射）下においてＰＢＳ中でインキュベートされた。
【００７０】
＜ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ安定性調査＞
ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓフィルム（１０ｗｔ％ＳＮＡＰからなる）を、乾燥剤を加えたバイアル中で以下の条件下に置いた：周囲光を用いて室温、暗闇の中で室温、暗闇の中で３７℃、および冷凍庫（−２０℃）中で暗闇の中。４ヵ月の期間の間の様々な時点で、フィルムをＤＭＡｃに溶解させ、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを記録して、初期１０ｗｔ％ＳＮＡＰと比較した場合のフィルム中に残存するＳＮＡＰの％を決定した。
【００７１】
＜インビトロフィブリノーゲン吸着アッセイ＞
インビトロフィブリノーゲン吸着免疫蛍光アッセイを、９６ウェルフォーマットにおいて行った。ＥＣＣ回路を調製するために使用されたＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓポリマー溶液およびＥ２Ａｓコントロールポリマー溶液を、９６ウェルマイクロタイタープレートのマイクロウェルを被覆するためにも採用し、ＥＣＣループと同じ条件下で乾燥させた。簡潔に述べると、ヒトフィブリノーゲンを、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いてヒト血漿濃度に相当する３ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、次いで吸着実験のために使用した。１００μＬのこの溶液を各ウェルに加え、被覆ウェルをこの溶液と共に３７℃で１．５時間インキュベートした。この後に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含有するＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｂｌｏｃｋ  ＡＣＥ緩衝液（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）の１０倍希釈物からなる洗浄緩衝液（１００μＬ）を各回の洗浄のために用いる８回の洗浄工程が続いた。非特異的抗体結合を阻止するために、被覆ウェルを１００μＬの阻止緩衝液（Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｂｌｏｃｋ  ＡＣＥ緩衝液の４倍希釈物）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄緩衝液（１ウェル当たり１００μＬ）での３回のすすぎの後に、プレートのバックグラウンド蛍光測定を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２蛍光マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）により４８５ｎｍ（励起）および５２８ｎｍ（発光）において行った。吸着されたフィブリノーゲンを検出するために、フルオレセイン標識ヤギ抗ヒトフィブリノーゲン抗体をＳｅｒｏｔｅｃ  Ｂｌｏｃｋ  ＡＣＥ緩衝液の１０倍希釈物で希釈し（１：１０）、１００μＬのこの最終溶液を各ウェルに加えた。表面吸着されたフィブリノーゲンに、３７℃で１．５時間にわたり抗体を結合させた。非被覆ポリプロピレンへのヒトフィブリノーゲン吸着を、異なるプレート内の蛍光シグナルを正規化するための内部コントロールとして使用した。全ての測定を三重反復試験で行った。
【００７２】
＜ウサギＥＣＣ血栓形成実験＞
採用された全ての動物取扱手順および外科的手順は、大学および連邦政府の規則に従ってＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓにより承認されたものである。合計８匹のニュージーランド白ウサギ（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｂａｔｔｌｅ  Ｃｒｅｅｋ，ＭＩ）をこの調査で使用した。全てのウサギ（２．５ｋｇ〜３．５ｋｇ）に、５ｍｇ／ｋｇのキシラジン注射可能薬物（ＡｎａＳｅｄ（登録商標）Ｌｌｏｙｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ，Ｉｏｗａ）および３０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミン（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ，ＩＬ）の筋肉内注射で最初に麻酔をかけた。維持麻酔は、気管切開によってＡ．Ｄ．Ｓ．２０００  Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ（Ｅｎｇｌｅｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用いて行われた機械換気による１．５％〜３％の速度でのイソフルランガス吸入により投与した。最大吸気圧を１５ｃｍＨ２Ｏに設定し、人工呼吸器流量を８Ｌ／分に設定した。血圧安定性の維持を助けるために、乳酸加リンゲルのＩＶ流体を、１０ｍＬ／ｋｇ／時間の速度で投与した。血圧をモニタリングするためおよび血液試料を採取するために、ウサギの右頸動脈に、１６ゲージのＩＶ血管カテーテル（Ｊｅｌｃｏ（登録商標），Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を用いてカニューレを挿入した。血圧および導出される心拍数を、Ｓｅｒｉｅｓ  ７０００  Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ｍａｒｑｕｅｔｔｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を用いてモニタリングした。体温を、直腸プローブを用いてモニタリングし、水ジャケット付加熱用ブランケットを用いて３７℃に維持した。動静脈（ＡＶ）特注体外回路（ＥＣＣ）の設置の前に、ウサギ左頸動脈および右外頸静脈を分離し、ベースライン血行動態ならびに動脈血ｐＨ、ｐＣＯ２、ｐＯ２、総ヘモグロビンおよびメトヘモグロビンをＡＢＬ  ８２５血液−ガス分析器およびＯＳＭ３  Ｈｅｍｏｘｉｍｅｔｅｒ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，ＤＫ）を用いて測定した。さらに、血小板数および総白血球（ＷＢＣ）数のためにベースライン血液試料を採取し、これらをＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｚ１（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）によって測定した。血漿フィブリノーゲンレベルをＤａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＢＣＳ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を用いて測定し、活性凝固時間（ＡＣＴ）をＨｅｍｏｃｈｒｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｏｄｅｌ  ８０１（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）を用いてモニタリングし、そして血小板機能をＣｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ光学凝集測定器型式４９０（Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）を用いて評価した。
【００７３】
ベースライン血液測定後、ＡＶ特注ＥＣＣを、カニューレをＥＣＣ流入のために左頸動脈に挿入し、ＥＣＣ流出のために右外頸静脈に挿入することにより、所定の位置に設置した。ＥＣＣを通る流れを、ＥＣＣの動脈側および静脈側の締め具を緩めることにより開始し、回路中の血流を、超音波流量プローブおよび流量計（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  ＨＴ２０７，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）を用いてモニタリングした。実験の間、動物に対し、全身的血液凝固阻止は行われなかった。
【００７４】
ＥＣＣ上での４時間後に、回路を締め具で締め、動物から取り外し、６０ｍＬの生理食塩水ですすぎ、乾燥させた。ＥＣＣのより大きなチューブ（すなわち、血栓形成チャンバ）中のあらゆる残留血栓の写真を撮り、血栓の程度を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）からのＩｍａｇｅ  Ｊ画像化ソフトウェアを用いて定量した。安楽死の前に、全ての動物に、壊死性血栓症（ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）を防ぐために４００Ｕ／ｋｇのヘパリンナトリウムの１用量を投与した。これらの動物を、Ｆａｔａｌ  Ｐｌｕｓ（Ｖｏｒｔｅｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｄｅａｒｂｏｒｎ，ＭＩ）の１用量（１３０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウム）を用いて安楽死させた。全ての動物が、安楽死させられた後に肉眼的剖検（血栓塞栓事象のあらゆる徴候についての肺、心臓、肝臓および脾臓の調査を含む）を受けた。
【００７５】
＜血液サンプリング＞
ウサギ全血試料を、ＡＣＴ用には血液凝固阻止されていない１ｃｃ注射器中に、細胞数および凝集測定用には３ｃｃ体積を有する３．２％クエン酸ナトリウムバキュテナー（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中に、血液−ガス分析用には４０Ｕ／ｍＬのヘパリンナトリウム（ＡＰＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）を含有する１ｃｃ注射器中に採取した。ＥＣＣ血流の開始後に、これらのインビトロ測定のために、４時間の間１時間毎に血液試料を採取した。血小板、単球または血漿フィブリノーゲンのいかなる活性化も回避するために、採取から２時間以内に試料を使用した。
【００７６】
＜血小板凝集測定＞
ウサギ血小板凝集を、Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ光学凝集測定器を用いてＢｏｒｎ比濁法に基づいてアッセイした。簡潔に述べると、クエン酸塩添加血（１：１０の血液対３．２％クエン酸ナトリウム溶液）を採取し（６ｍＬ）、血小板を多量に含んだ血漿（ＰＲＰ）を、１５分にわたる１１０×ｇでの遠心分離により得た。血小板の乏しい血漿（ＰＰＰ）を、ＰＲＰを除去した血液試料の１５分にわたる２７３０×ｇでの別の遠心分離により得、凝集のためのブランクとして使用した。
【００７７】
ＰＲＰを３７℃で１０分間インキュベートし、次いで２５μｇ／ｍＬのコラーゲン（Ｃｈｒｏｎｏ−ＰＡＲ  ＃３８５  Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）を添加した。コラーゲン添加の３分後に、凝集の百分率を、Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ  Ａｇｇｒｏｌｉｎｋソフトウェアを用いて測定した。
【００７８】
＜ＳＮＡＰドープＥ２ＡｓカテーテルおよびＥ２Ａｓコントロールカテーテルの調製＞
長さ１８ｃｍの直径２ｍｍのステンレス鋼マンドレル（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｃａｒｒから購入）上にポリマー溶液を浸漬被覆することにより、カテーテルを調製した。Ｅ２Ａｓコントロールカテーテルについては、ポリマー溶液は、ＴＨＦに溶解させたＥ２Ａｓ（１５０ｍｇ／ｍＬ）からなった。各被覆の間に２分間の間隔をおいて浸漬被覆することにより、Ｅ２Ａｓ溶液の３５枚の被膜をマンドレル上に適用した。ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓカテーテルについては、２つの異なる溶液、すなわち、上塗り／下塗り溶液および活性溶液を、３層カテーテル（図１６参照）を作製するために調製した。上塗り／下塗り溶液は、ＴＨＦに溶解させたＥ２Ａｓ（１５０ｍｇ／ｍＬ）からなった。活性溶液は、１０ｗｔ％のＳＮＡＰおよび９０ｗｔ％のＥ２ＡｓをＴＨＦに溶解させて全体濃度を１５０ｍｇ／ｍＬとしたものから構成された。３層カテーテルを、Ｅ２Ａｓ溶液の５枚の下塗り、活性溶液の２５枚の被膜、およびＥ２Ａｓ溶液の５枚の上塗りを浸漬被覆することにより調製した。ヒツジ調査のために使用したカテーテルは、長さ１５ｃｍであった。
【００７９】
＜ヒツジへのカテーテルの長期（７日間）の植込み＞
＜ヒツジカテーテル植込み＞
全ての動物は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにより策定された「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより作成されＮＩＨにより公表された「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」に準拠したケアを受けた。この調査は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓによって承認された。
【００８０】
５匹の成体ヒツジを大型動物モデルにおいて利用した。全ての実験を無菌条件下で行った。最初の３匹のヒツジに対する手順は、局所麻酔薬として１％リドカインを皮下的に使用して行った。右および左頸静脈上に、小さな（１ｃｍ〜２ｃｍの）縦および横の切り目を作った。次いで修正Ｓｅｌｄｉｎｇｅｒ法を用いてカニューレを設置したのであるが、コントロール用（Ｅ２Ａｓ）または実験用（ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ）のいずれか一方のカニューレを、右頸静脈または左頸静脈のいずれかに設置した。次いで、皮膚ステープルを用いて皮膚を再接合した。
【００８１】
最後の２匹のヒツジに対する実験は、全身麻酔薬下で行った。プロポフォール（１ｍｇ／ｋｇ）を誘導のために使用し、続いてイソフルラン（０．１〜４％）麻酔薬を維持のために使用した。頸静脈の上に重なる小さな２〜３ｃｍの切り目を作った。次いで、右頸静脈および左頸静脈を分離し、直接可視化の下で、コントロール用（Ｅ２Ａｓ）または実験用（ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ）のいずれかのカニューレを設置した。次いで、ヒツジを回復させ、動物用ハウジングに戻した。
【００８２】
動物は、実験の残りの間中、動物用ハウジング中に留まった。カテーテルを開存性について毎日試験した。最初にカニューレを吸引することを試み、次いで１５ｍＬの生理食塩水でフラッシュした。最初に吸引することが困難であった場合は、１５ｍＬのノーマルセーラインを注入することを試み、プロセスおよび吸引およびフラッシングを再度試験した。開存性データは、７日間の間２４時間毎に記録した。
【００８３】
７日目に剖検を行った。上に記載された同じ麻酔プロトコルを用いてヒツジに麻酔をかけた。右頸静脈および左頸静脈をそれらの長さに沿って切離し、分離した。ヒツジをおよそ１００〜１５０ＩＵ／ｋｇのボーラス用量を用いてヘパリン化し、＞２００秒の活性凝固時間を確認した。次いで、それらの頸静脈を結紮し、長手方向に切り開いた。カテーテルを取り出し、さらなる分析のために滅菌生理食塩水に入れた。
【００８４】
＜カテーテル評価＞
取り出し（ｅｘｐｌａｎｔｉｎｇ）後、カテーテルをＰＢＳ中ですすいだ。Ｎｉｋｏｎ  Ｌ２４デジタルカメラを用いて、カテーテル全体の外部および長手方向に切った１ｃｍ片の内部の写真を撮影した。血栓の程度を、ＮＩＨからのＩｍａｇｅ  Ｊ画像化ソフトウェアを用いて定量した。生菌を定量するために、１ｃｍ片を長手方向に切り、１ｍＬのＰＢＳ緩衝液中で均質化した。最適均質化速度は、異なる均質化速度および時間を比較した別個の実験を用いて見出された。結果として生じたホモジェネートを、滅菌ＰＢＳ中で段階的に希釈した。各希釈物の三重反復試験アリコート（１０μＬ）を寒天プレート上に置いた。この寒天プレートを２４時間にわたり３７℃でインキュベートし、続いて、カテーテル表面積当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｃｍ２）を計算した。
【００８５】
＜統計分析＞
本開示の全体にわたって、データは、平均±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）として表される。種々のＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓポリマー群とＥ２Ａｓコントロールポリマー群との間の比較を、スチューデントｔ検定を用いた平均値の比較により分析した。全ての試験について、ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意であると見なした。
【００８６】
＜結論＞
本開示の実施例は、疎水性ポリウレタン、例えば、シロキサンベースのポリウレタンエラストマー（その一例はＥｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）Ｅ２Ａｓポリマーである）が、ＳＮＡＰのためのレザバとして機能する優れたマトリックスであり、結果として生じるフィルムが、ＮＯおよびＳＮＡＰの制御放出のために使用され得ることを明らかにした。ＳＮＡＰは、このポリマーフィルムからゆっくりと拡散し、このフィルム／コーティングからのＮＯ放出は、血液がＥＣＣループを通って流れる時に光分解および／または熱分解によって開始され得る。安定性調査は、３７℃での４ヵ月にわたる貯蔵の間でさえも、ＳＮＡＰがＥ２Ａｓマトリックス内で極めて安定であることを証明する。Ｅ２Ａｓポリマーはそれだけで優れた固有の生体適合特性を有しているが、Ｅ２Ａｓポリマーマトリックス中にＳＮＡＰを組み込むことで、ＮＯ／ＳＮＡＰの制御送達がもたらされてポリマー血液適合性がさらに改善される。ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓ被覆ＥＣＣループは、４時間にわたるＥＣＣ血流の間、血小板の数および機能を有意に維持したのであるが、凝塊面積もまた、対応するＥ２Ａｓ被覆コントロールループに比べて減少した。さらに、ＳＮＡＰ／Ｅ２Ａｓカテーテルから放出されるＮＯは、ヒツジへの７日間にわたる植込みの間、血栓および細菌の付着を有意に低減することができ、その結果、カテーテルの開存性を改善することができた。Ｅｌａｓｔ−Ｅｏｎ（商標）Ｅ２Ａｓポリマーフィルム／コーティング内にＳＮＡＰを組み込むことは、ＮＯ／ＳＮＡＰを局所的に送達するための簡単な方法を提供し、多様な血液接触性医用デバイスの血液適合性を改善する可能性を有している。
【００８７】
要約すると、本明細書に開示される実施例は、（例えば体外循環（ＥＣＣ）回路およびカテーテルチューブ中での）血栓形成を防止するための、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）をドープしたシロキサンベースのポリウレタンエラストマーを含む新規の酸化窒素（ＮＯ）放出性コーティングを含む。さらに、これらの処方物からのＮＯ放出は、非常に有効な細菌剤（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ）として機能するものと考えられる。
【００８８】
本明細書において提供される範囲は、示された範囲および示された範囲内の任意の値または部分範囲を含むことが理解されるべきである。例えば、約０．２×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１〜約２０×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１の範囲は、０．２×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１〜約２０×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１という明示的に記載された限界を含むだけでなく、それらの間の個々の値（例えば、１×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１、１４．５×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１など）およびそれらの間の部分範囲（例えば、０．７５×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１〜約１７×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１、約５×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１〜約１５×１０−１０ｍｏｌ  ｃｍ−２  分−１など）をも含むと解釈されるべきである。さらに、「約」または「およそ」などがある値を記述するために利用される場合、これは、示された値からの僅かな変化（＋／−１０％まで）を包含することが意味される。
【００８９】
本明細書の全体にわたる「一実施例」、「別の実施例」、「或る実施例」などへの言及は、その実施例と関連して記述される特定の要素（例えば、特徴、構造、および／または特性）が本明細書において記述される少なくとも１つの実施例に含まれ、他の実施例に存在してもよいし存在しなくてもよいことを意味している。さらに、いずれかの実施例のための記述された要素は、文脈が明らかに別のことを指示しない限り、様々な実施例において任意の好適なやり方で組み合わされ得ることが理解されるべきである。
【００９０】
さらに、本明細書に開示される実施例を説明および特許請求する際、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【００９１】
いくつかの実施例が詳細に説明されてきたが、開示された実施例は変更され得ることが当業者には明らかであろう。したがって、上述の説明は、非限定的であると見なされるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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