(57)【要約】【課題】高温環境下での植物体の生育を可能とする組成物、及び前記組成物を付着させた状態で、高温環境下で植物体を生育させる方法を提供する。【解決手段】Burkholderia Bacterium SHY-1株、Uncultured bacterium SHY-2株、Stenotrophomonas sp. SHY-3株、Comamonas sp. SHY-4株、Corynebacterium pseudotuberculosis SHY-5株、Flavobacterium sp. SHY-6株、Burkholderiales bacterium SHY-7株、Uncultured bacterium SHY-8株、Flavobacterium johnsoniae SHY-9株、16S rDNAを有するPseudomonas sp. SHY-10株、Pseudomonas geniculata SHY-11株、及びUncultured bacterium SHY-12株を含有し、高温環境下での植物体の生育を可能とする、高温耐性改善用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するBurkholderia Bacterium SHY-1株、配列番号２で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するUncultured bacterium SHY-2株、配列番号３で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するStenotrophomonas sp. SHY-3株、配列番号４で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するComamonas sp. SHY-4株、配列番号５で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するCorynebacterium pseudotuberculosis SHY-5株、配列番号６で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するFlavobacterium sp. SHY-6株、配列番号７で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するBurkholderiales bacterium SHY-7株、配列番号８で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するUncultured bacterium SHY-8株、配列番号９で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するFlavobacterium johnsoniae SHY-9株、配列番号１０で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas sp. SHY-10株、配列番号１１で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas geniculata SHY-11株、及び配列番号１２で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するUncultured bacterium SHY-12株を含有し、高温環境下での植物体の生育を可能とする、高温耐性改善用組成物。
【請求項２】
含有する微生物全量に対する存在比率が、Burkholderia Bacterium SHY-1株が４８〜７２％であり、Uncultured bacterium SHY-2株が６．０〜１１％であり、Stenotrophomonas sp. SHY-3株が４．５〜７．０％であり、Comamonas sp. SHY-4株が４．５〜７．０％であり、Corynebacterium pseudotuberculosis SHY-5株が３．０〜５．２％であり、Flavobacterium sp. SHY-6株が２．０〜４．０％であり、Burkholderiales bacterium SHY-7株が２．０〜４．０％であり、Uncultured bacterium SHY-8株が２．０〜４．０％であり、Flavobacterium johnsoniae SHY-9株が１．０〜２．０％であり、Pseudomonas sp. SHY-10株が１．０〜２．０％であり、Pseudomonas geniculata SHY-11株が１．０〜２．０％であり、Uncultured bacterium SHY-12株が１．０〜２．０％である、請求項１に記載の高温耐性改善用組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の高温耐性改善用組成物を根に付着させた状態で、高温環境下で植物体を生育させる、植物体の生育方法。
【請求項４】
無菌状態で水耕栽培した植物体の根に、前記高温耐性改善用組成物を付着させた後に土壌へ移植し、高温環境下で生育させる、又は、
無菌状態で水耕栽培した植物体の根に、前記高温耐性改善用組成物を付着させた状態で、高温環境下で水耕栽培を行う、
請求項３に記載の植物体の生育方法。
【請求項５】
前記植物体が、アブラナ科植物である、請求項３又は４に記載の植物体の生育方法。
【請求項６】
前記植物体が、シロイヌナズナである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の植物体の生育方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を有効成分とし、高温環境下での植物体の生育を可能とする組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の中には、植物と共生し、その生育を助ける働きをするものがある。例えば、マメ科植物の根に共生する根粒菌は、大気中の窒素を植物が利用可能な窒素化合物に変換する。この根粒菌による窒素固定により、マメ科植物は肥料分の少ない土壌でも生育が可能となる。近年、植物体の免疫を高めたり、生育を促進したり、栄養素の欠乏を補ったり、様々な環境ストレスに対する耐性を高めたりする作用を有する共生微生物があることがわかってきた。そこで、このような共生微生物を利用し、必須栄養素が欠乏している土壌や塩濃度の高い土壌等の厳しい環境下でも植物の生育を可能にしようという試みがなされている。
【０００３】
例えば、水不足の解決方法として、植物の耐塩性を高めて海水を農業用水に利用することが試みられている。植物の耐塩性を高める方法としては、遺伝子組換え技術を用いて、塩耐性機構に関与する遺伝子を導入する方法が挙げられるが、農作物の場合、遺伝子組換え技術を利用せずに耐塩性を高められる方法が好まれる傾向にある。そこで、遺伝子組換え技術を使用せずに植物の耐塩性を高める方法として、植物体への耐塩性付与効果を有する薬剤や微生物を植物体に投与する方法が検討されてきている。耐塩性付与効果を有する微生物としては、例えば、パエニバチルス・フクイネンシス（Paenibacillus fukuinensis）（例えば、特許文献１参照。）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−７５８８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、微生物を有効成分とし、環境ストレス下、特に高温環境下での植物体の生育を可能とする組成物、及び前記組成物を付着させた状態で、高温環境下で生育させる、植物体の生育方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る高温耐性改善用組成物及び植物体の生育方法は、下記［１］〜［８］である。
［１］  配列番号１で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するBurkholderia Bacterium SHY-1株、配列番号２で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するUncultured bacterium SHY-2株、配列番号３で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するStenotrophomonas sp. SHY-3株、配列番号４で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するComamonas sp. SHY-4株、配列番号５で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するCorynebacterium pseudotuberculosis SHY-5株、配列番号６で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するFlavobacterium sp. SHY-6株、配列番号７で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するBurkholderiales bacterium SHY-7株、配列番号８で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するUncultured bacterium SHY-8株、配列番号９で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するFlavobacterium johnsoniae SHY-9株、配列番号１０で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas sp. SHY-10株、配列番号１１で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas geniculata SHY-11株、及び配列番号１２で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するUncultured bacterium SHY-12株を含有し、高温環境下での植物体の生育を可能とする、高温耐性改善用組成物。
［２］  含有する微生物全量に対する存在比率が、Burkholderia Bacterium SHY-株が４８〜７２％であり、Uncultured bacterium SHY-株が６．０〜１１％であり、Stenotrophomonas sp. SHY-3株が４．５〜７．０％であり、Comamonas sp. SHY-4株が４．５〜７．０％であり、Corynebacterium pseudotuberculosis SHY-5株が３．０〜５．２％であり、Flavobacterium sp. SHY-6株が２．０〜４．０％であり、Burkholderiales bacterium SHY-7株が２．０〜４．０％であり、Uncultured bacterium SHY-8株が２．０〜４．０％であり、Flavobacterium johnsoniae SHY-9株が１．０〜２．０％であり、Pseudomonas sp. SHY-10株が１．０〜２．０％であり、Pseudomonas geniculata SHY-11株が１．０〜２．０％であり、Uncultured bacterium SHY-12株が１．０〜２．０％である、前記［１］の高温耐性改善用組成物。
［３］  前記［１］又は［２］の高温耐性改善用組成物を根に付着させた状態で、高温環境下で植物体を生育させる、植物体の生育方法。
［４］  無菌状態で水耕栽培した植物体の根に、前記高温耐性改善用組成物を付着させた後に土壌へ移植し、高温環境下で生育させる、又は、
無菌状態で水耕栽培したトマトの植物体の根に、前記高温耐性改善用組成物を付着させた状態で、高温環境下で水耕栽培を行う、
前記［３］の植物体の生育方法。
［５］  前記植物体が、アブラナ科植物である、前記［３］又は［４］の植物体の生育方法。
［６］  前記植物体が、シロイヌナズナである、前記［３］〜［５］のいずれかの植物体の生育方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る高温耐性改善用組成物は、植物体の表面に付着することによって当該植物体の高温耐性を向上させることができるため、当該組成物を植物体に接種させて共生させることにより、植物体の高温環境下における生育性を高めることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
＜高温耐性改善用組成物＞
本発明に係る高温耐性改善用組成物は、植物体の表面に付着して共生することにより、当該植物体の高温耐性を改善する効果を有する微生物を有効成分とする。本発明に係る高温耐性改善用組成物が有効成分とする微生物は、後記実施例に示す通り、元々土壌に含まれている多種多様な微生物の中から、植物体の根の表面に共生することによって当該植物体の高温環境下での生育を可能とする共生微生物群として得られたものである。
【０００９】
具体的には、本発明に係る高温耐性改善用組成物は、１２種の微生物、すなわち、配列番号１で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するBurkholderia Bacterium SHY-1株、配列番号２で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するUncultured bacterium SHY-2株、配列番号３で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するStenotrophomonas sp. SHY-3株、配列番号４で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するComamonas sp. SHY-4株、配列番号５で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するCorynebacterium pseudotuberculosis SHY-5株、配列番号６で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するFlavobacterium sp. SHY-6株、配列番号７で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するBurkholderiales bacterium SHY-7株、配列番号８で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するUncultured bacterium SHY-8株、配列番号９で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するFlavobacterium johnsoniae SHY-9株、配列番号１０で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas sp. SHY-10株、配列番号１１で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するPseudomonas geniculata SHY-11株、及び配列番号１２で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するUncultured bacterium SHY-12株を有効成分とする。以降において、これらの特定の１２種の微生物は、「高温耐性改善共生菌」ということがある。
【００１０】
本発明に係る高温耐性改善用組成物における前記１２種の微生物のそれぞれの存在比（菌数比）としては、特に限定されるものではない。本発明に係る高温耐性改善用組成物におけるBurkholderia Bacterium SHY-1株の微生物全量に対する存在比率は、４８〜７２％が好ましく、５５〜６５％がより好ましい。本発明に係る高温耐性改善用組成物におけるUncultured bacterium SHY-2株の微生物全量に対する存在比率は、６．０〜１１％が好ましく、７．２〜９．５％がより好ましい。本発明に係る高温耐性改善用組成物におけるStenotrophomonas sp. SHY-3株の微生物全量に対する存在比率は、４．５〜７．０％が好ましく、５．０〜６．２％がより好ましい。本発明に係る高温耐性改善用組成物におけるComamonas sp. SHY-4株の微生物全量に対する存在比率は、４．５〜７．０％が好ましく、５．０〜６．２％がより好ましい。本発明に係る高温耐性改善用組成物におけるCorynebacterium pseudotuberculosis SHY-5株の微生物全量に対する存在比率は、３．０〜５．２％が好ましく、３．５〜４．８％がより好ましい。本発明に係る高温耐性改善用組成物におけるFlavobacterium sp. SHY-6株の微生物全量に対する存在比率は、２．０〜４．０％が好ましく、２．４〜３．５％がより好ましい。
【００１１】
本発明に係る高温耐性改善用組成物におけるBurkholderiales bacterium SHY-7株の微生物全量に対する存在比率は、２．０〜４．０％が好ましく、２．４〜３．５％がより好ましい。本発明に係る高温耐性改善用組成物におけるUncultured bacterium SHY-8株の微生物全量に対する存在比率は、２．０〜４．０％が好ましく、２．４〜３．５％がより好ましい。本発明に係る高温耐性改善用組成物におけるFlavobacterium johnsoniae SHY-9株の微生物全量に対する存在比率は、１．０〜２．０％が好ましく、１．２〜１．６％がより好ましい。本発明に係る高温耐性改善用組成物におけるPseudomonas sp. SHY-10株の微生物全量に対する存在比率は、１．０〜２．０％が好ましく、１．２〜１．６％がより好ましい。本発明に係る高温耐性改善用組成物におけるPseudomonas geniculata SHY-11株の微生物全量に対する存在比率は、１．０〜２．０％が好ましく、１．２〜１．６％がより好ましい。本発明に係る高温耐性改善用組成物におけるUncultured bacterium SHY-12株の微生物全量に対する存在比率は、１．０〜２．０％が好ましく、１．２〜１．６％がより好ましい。
【００１２】
本発明に係る高温耐性改善用組成物は、植物体に対する高温耐性改善効果を損なわない限り、前記の１２種の高温耐性改善共生菌以外の微生物を含有していてもよい。本発明に係る高温耐性改善用組成物が含有する微生物全体に占める前記１２種の高温耐性改善共生菌の総量の存在比率は、５０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がよりさらに好ましい。本発明に係る高温耐性改善用組成物としては、植物体の根の表面に付着した際により安定して共生できることから、前記の１２種の高温耐性改善共生菌以外の微生物を含有していないものが特に好ましい。
【００１３】
本発明に係る高温耐性改善用組成物は、有効成分とする高温耐性改善共生菌をそれぞれ混合することにより調製できる。例えば、本発明に係る高温耐性改善用組成物は、各高温耐性改善共生菌を生存した状態で維持可能な溶媒中に分散させた液状組成物であってもよく、当該溶媒を寒天等で固体状としたものに各高温耐性改善共生菌を付着させた固体状組成物であってもよい。その他、各高温耐性改善共生菌を生存した状態で乾燥粉末としたものをそれぞれ混合した粉末状組成物であってもよい。各高温耐性改善共生菌を生存した状態で維持可能な溶媒としては、例えば、水、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）、トリスバッファーやリン酸バッファー等の各種バッファー、微生物培養用培地、植物の水耕栽培に用いられる液肥等が挙げられる。
【００１４】
例えば、本発明に係る高温耐性改善用組成物は、高温耐性改善共生菌の種類ごとにそれぞれ独立して培養し、得られた培養物を混合することによって調製することができる。各高温耐性改善共生菌の培養は、それぞれの栄養特性に応じた適切な培養培地を用いて、各菌種の標準株（Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）の培養と同様にして行うことができる。例えば、前記の１２種の高温耐性改善共生菌は、それぞれ、ＬＢ培地、ＴＳＢ培地、Ｒ２Ａ培地（日本ベクトン・ディッキンソン）等で１５０ｒｐｍの振とう速度、温度が２５℃で１６時間培養することにより、培養することができる。また、栄養特性が類似しており、同じ培養培地で培養可能な微生物ごとに分けてそれぞれ培養し、得られた培養物を混合することによって調製することもできる。
【００１５】
各高温耐性改善共生菌の培養に用いられる培養培地は、一般的に微生物の培養に用いられる微生物培養用培地の中から適宜選択して用いることができる。当該微生物培養用培地としては、例えば、ＬＢ（Luria-Bertani）培地、ＴＢＳ（Tryptic Soy Broth）培地、麦芽エキス培地、オートミール培地、ＹＭ（Yeast Malt peptone）培地、ＹＰＤ（Yeast Peptone D-Glucose）培地、ＮＢ（nutrient broth）培地、Ｒ２Ａ培地、ＰＧＹ培地、ＧＹＭＰ培地（グルコース １％、酵母エキス ０．５％、麦芽エキス ０．３％、ペプトン ０．５％、ｐＨ６．０）、ＭＲＳ（de Man-Rogosa-Sharpe）培地、ＰＳＡ（Potato Sucrose Agar）培地、ＳＷＳ（Seawater Starch Agar）培地等が挙げられる。
【００１６】
本発明に係る高温耐性改善用組成物を植物体の表面に付着させ、有効成分である高温耐性改善共生菌を当該植物体と共生させることにより、植物体の高温耐性が改善され、高温環境下でも生育が可能となる。ここで、「高温環境下」とは、日中最高気温の平均値が、無菌状態では同じ生物種の植物体の生育率が７５％以下となる温度である環境下を意味する。本発明に係る高温耐性改善用組成物としては、高温耐性向上前の植物体の７０％以下しか生育できない程度の温度環境下でも生育可能な程度にまで高温耐性を向上させられるものが好ましく、６０％以下しか生育できない程度の温度環境下でも生育可能な程度にまで高温耐性を向上させられるものがより好ましく、５０％以下しか生育できない程度の温度環境下でも生育可能な程度にまで高温耐性を向上させられるものがさらに好ましい。本発明に係る高温耐性改善用組成物としては、なかでも、高温耐性向上前の植物体の４０％以下しか生育できない程度の温度環境下でも生育可能な程度にまで高温耐性を向上させられるものが好ましく、３０％以下しか生育できない程度の温度環境下でも生育可能な程度にまで高温耐性を向上させられるものがより好ましく、２０％以下しか生育できない程度の温度環境下でも生育可能な程度にまで高温耐性を向上させられるものがさらに好ましく、高温耐性向上前の植物体の１０％以下しか生育できない程度の温度環境下でも生育可能な程度にまで高温耐性を向上させられるものがさらに好ましく、高温耐性向上前の植物体が完全に枯死する温度環境下でも生育可能な程度にまで高温耐性を向上させられるものがより好ましい。
【００１７】
本発明に係る高温耐性改善用組成物としては、植物体の根等の表面に当該組成物を付着させることにより、日中（明期）の最高気温が、当該高温耐性改善用組成物を付着させる前の植物体が正常に生育可能な最高気温よりも３℃以上、好ましくは５℃以上、より好ましくは８℃以上、さらに好ましくは１０℃以上、よりさらに好ましくは１５℃以上高い環境下でも栽培可能な程度にまで高温耐性を改善できるものが好ましい。また、本発明に係る高温耐性改善用組成物としては、当該組成物を根等の表面に付着させた植物体を、日中（明期）の最高気温が、２８℃以上、より好ましくは３１℃以上、さらに好ましくは３４℃以上、よりさらに好ましくは３７℃以上、さらに好ましくは４０℃以上である環境下でも栽培可能な程度にまで高温耐性を改善できるものが好ましい。
【００１８】
本発明に係る高温耐性改善用組成物を植物体の表面に付着させる方法としては、特に限定されるものではない。例えば、植物体の少なくとも一部分を、当該高温耐性改善用組成物を含む浸漬用溶液に浸漬させることによって、当該高温耐性改善用組成物中の高温耐性改善共生菌を当該植物体の表面に付着させることができる。浸漬用溶液に浸漬させる植物体の部分は、浸漬させた状態の植物体が、通常の温度環境下であれば生育可能な部分であればよく、例えば、根、茎、葉、地下茎等のいずれの部分であってもよい。本発明の高温耐性改善共生菌は元々土壌に含まれていた微生物であるため、本発明に係る高温耐性改善用組成物は、植物体の根に付着させることが好ましい。
【００１９】
本発明に係る高温耐性改善用組成物を付着させる植物体は、無菌的に栽培されたものであることが好ましい。例えば、滅菌処理した種子を無菌的な環境下で栽培された植物体を用いることにより、本発明に係る高温耐性改善用組成物以外の微生物の付着を防止し、本発明の高温耐性改善共生菌による共生効果をより効率よく得ることができる。種子の滅菌処理は、次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬させる方法や、塩素ガスを用いる方法等の常法により行うことができる。
【００２０】
生育の初期段階の植物体は、充分に生育した植物体よりもストレスに対する耐性が低く、環境ストレスの影響を受けやすい。このため、種子や球根の段階から高温環境下で生育させた場合には、高い高温ストレスにより、高温耐性改善処理を施しても高温耐性を獲得できずに枯死してしまう植物体が多い。このため、本発明に係る高温耐性改善用組成物を付着させる植物体は、少なくとも発根及び発芽が完了するまで正常に生育可能な温度以下で栽培したものが好ましい。なお、「正常に生育可能な温度」とは、複数の植物体を生育させた場合の生育率が８０％以上である環境温度を意味する。植物体の発根及び発芽、及びその後の生育は、本発明に係る高温耐性改善用組成物を付着させること以外は、常法により行うことができる。
【００２１】
発芽・発根後に直ちに本発明に係る高温耐性改善用組成物を付着させる処理を行ってもよいが、生育するほど高温ストレスに対する耐性も高くなる。このため、幼苗を、発芽後少なくとも１週間、好ましくは３週間程度生育させた後に当該高温耐性改善用組成物を付着させる処理を行うことが好ましい。
【００２２】
植物体の生育に対する影響が比較的少ないことから、植物体の根のみを、本発明に係る高温耐性改善用組成物を含む溶液（以下、「高温耐性改善処理用溶液」ということがある。）に浸漬させることが好ましい。この場合、高温耐性改善処理用溶液は、根から摂取させる各種栄養分を含有する液肥に本発明に係る高温耐性改善用組成物を含有させた溶液であることが好ましい。例えば、植物体の根の付け根部分を、ロックウール、寒天培地、土壌等の固体支持体で支持させ、根の下の部分を液肥に浸漬させる水耕栽培容器を使用し、液肥に本発明に係る高温耐性改善用組成物を含有させることにより、根の部分のみを高温耐性改善共生菌を含む高温耐性改善処理用溶液に浸漬させた状態で植物体を生育させることができる。使用する液肥の組成は、生育させる植物体の生物種に応じて適宜調節することができる。例えば、ＭＳ（Murashige-Skoog）培地、Ｂ５（Gamborg's B5）培地、Ｗｈｉｔｅ培地、又はこれらの改変培地等を用いることができる。
【００２３】
本発明に係る高温耐性改善用組成物を根等の表面に付着させた植物体は、高温環境下で生育させることができる。具体的には、例えば、本発明に係る高温耐性改善用組成物を根等の表面に付着させた植物体は、日中（明期）の最高気温が当該高温耐性改善用組成物を付着させる前の植物体が正常に生育可能な最高気温よりも好ましくは３℃以上、より好ましくは５℃以上、さらに好ましくは８℃以上、よりさらに好ましくは１０℃以上、特に好ましくは１５℃以上高い環境下で栽培する。
【００２４】
本発明に係る高温耐性改善用組成物を付着させた植物体の栽培用溶液としては、植物体の生育に必要な各種栄養成分を含有している溶液であれば特に限定されるものではない。当該栄養成分は、栽培する植物体の種類に応じて適宜調整することができる。特に、窒素、リン、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、硫黄、鉄、マンガン、銅、モリブデン、ホウ素等の植物体の生育に必要な元素を塩類として含有していることが好ましい。その他、植物体の種類によっては、アルミニウムや珪素等の元素を塩類として含有する場合もある。また、植物体の生育段階に応じて栽培用溶液の組成を変更してもよい。当該栽培用溶液としては、例えば、市販されている液肥に塩化ナトリウムをはじめとする不足の塩類を添加した溶液を用いることができる。
【００２５】
本発明に係る高温耐性改善用組成物を付着させた後の植物体のその後の栽培は、水耕栽培で行ってもよく、土壌等で栽培してもよい。例えば、無菌状態で水耕栽培した植物体の根に、本発明に係る高温耐性改善用組成物を付着させた状態で、高温環境下で水耕栽培を行うことができる。当該水耕栽培は、気温（植物体の地上部が接している空気の温度）が高い環境下で栽培する以外は、一般的な水耕栽培方法によって行うことができる。例えば、比較的多量の栽培用溶液を栽培用槽にためる湛液型水耕法で行ってもよく、緩やかな傾斜を持つ平面上に培養液を少量ずつ流下させる薄膜水耕法で行ってもよい。また、無菌状態で水耕栽培した植物体の根に、本発明に係る高温耐性改善用組成物を付着させた後に土壌へ移植し、高温環境下で生育させてもよい。
【００２６】
本発明に係る高温耐性改善用組成物により高温耐性を改善する植物体としては、被子植物であってもよく、裸子植物であってもよく、シダ類やコケ類であってもよい。また、単子葉植物であってもよく、双子葉植物であってもよい。具体的には、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、アワ等のイネ科の植物；トマト、ナス、パプリカ、ピーマン、ジャガイモ、タバコ等のナス科の植物；シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、紫キャベツ、メキャベツ（プチヴェール）、ハクサイ、チンゲンサイ、ケール、クレソン、小松菜、ブロッコリー、カリフラワー、カブ、ワサビ、マスタード等のアブラナ科の植物；キュウリ、ニガウリ、カボチャ、メロン、スイカ、等のウリ科の植物；ブドウ等のブドウ科の植物；レモン、オレンジ、ネーブルオレンジ、グレープフルーツ、ミカン、ライム、スダチ、ユズ、シイクワシャー、タンカン等のミカン科の植物；リンゴ、サクラ、ウメ、モモ、イチゴ、ビワ、アンズ、プラム（スモモ）、プルーン、アーモンド、ナシ、洋ナシ、イチゴ、ラズベリー、ブラックベリー、カシス、クランベリー、ブルーベリー等のバラ科の植物；ダイズ、インゲンマメ、エンドウマメ、ソラマメ、エダマメ、リョクトウ、ヒヨコマメ等のマメ科の植物；ハス（レンコン）等のハス科の植物；ゴマ等のゴマ科の植物；ホウレンソウ、ビート、テンサイ、キヌア、ヒユ、アマランサス、ケイトウ等のアカザ科の植物；ナツメヤシ、アブラヤシ、ココヤシ、アサイー等のヤシ科の植物；バナナ、バショウ、マニラアサ等のバショウ科の植物；ワタ、オクラ等のアオイ科の植物；ユーカリ等のフトモモ科の植物；フウチョウソウ、セイヨウフウチョウソウ等のフウチョウソウ科の植物等が挙げられる。これらのなかでも、アブラナ科の植物が好ましく、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）がより好ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２８】
［実施例１］
野生型シロイヌナズナを用い、土壌から抽出された微生物から、高温耐性を高める共生効果を有する植物共生菌群を選抜した。
【００２９】
＜微生物懸濁液の調製＞
愛知県豊橋市にて採取された土壌１ｇを、緩衝液で懸濁し、十分に撹拌し、微生物懸濁液として用いた。
【００３０】
＜ポットの作成＞
天面と底面が開口した９６穴プレートに、スクロース含有ＭＳ寒天培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースと０．９％（ｗ／ｖ）アガーを加えた培地）を注入して固めることにより、植物体を育成するための育苗用プレートを作製した。当該育苗用プレートを、スクロース含有ＭＳ培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースを加えた液体培地）を入れた８つの容器にそれぞれ複数個ずつ設置した。
【００３１】
＜種子の準備＞
種子は、一次滅菌として、７０％エタノールに３０秒間浸漬させた後、滅菌水ですすいだ。次いで、二次滅菌として、１％次亜塩素酸に浸漬させた状態で１分間撹拌した後、遠心分離処理により次亜塩素酸を除いた。次亜塩素酸処理後の種子は、滅菌水にて３回水洗した後、前記育苗用プレートの培地上部に播種して、４℃で２４時間暗所にて保存した。
【００３２】
＜植物体の水耕栽培＞
前記育苗用プレートを複数枚用意し、スクロース含有ＭＳ培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースを加えた液体培地）を入れた１つの培養容器に全て設置した。各育苗用プレートは、底面はスクロース含有ＭＳ培地に浸っているが天面は浸っていない状態となるように設置した。これらの育苗用プレートを、２５℃、明期１６時間と暗期８時間の長日条件のインキュベーター内で１４日間育成させた。
【００３３】
＜高温ストレス及び微生物の接種（第１選抜工程）＞  
１４日間水耕栽培後に、上記培養容器のスクロース含有ＭＳ培地に１００μＬの微生物懸濁液を添加した。その後、当該培養容器をインキュベーター内に移し、高温条件（明期（２８℃、１６時間）、暗期（２０℃、８時間））にて１４日間栽培した。
高温条件下での１４日間の栽培後、生育している植物体の根と地上部（葉と茎）を切断し、根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液とした。
【００３４】
＜高温ストレス及び微生物の接種（第２選抜工程）＞  
前記＜植物体の水耕栽培＞と同様にして、前記育苗用プレートにて１４日間水耕栽培した植物体を用意し、当該プレートの底面を浸した液体培地に、１００μＬの第１選抜工程で調製した微生物懸濁液を添加した。その後、当該培養容器を、冷却水の循環により培養容器下部を低温に保つ冷却機構を組み込んだインキュベーターに移した。当該インキュベーター内で、植物体地下部を低温にて保護しつつ、地上部は高温条件（明期（地上部３１℃／地下部２３℃、１６時間）、暗期（地上部２３℃／地下部２３℃、８時間））にて、１４日間栽培した。
高温条件下での１４日間の栽培後、前記第１選抜工程と同様にして、生育している植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製した。
【００３５】
＜高温ストレス及び微生物の接種（第３選抜工程）＞
育苗用プレートの底面を浸した液体培地に添加する微生物回収液を、第１選抜工程で調製した微生物回収溶液に代えて第２選抜工程で調製した微生物回収溶液を用い、かつ１４日間の栽培時の地上部の高温条件を、明期（地上部３４℃／地下部２６℃、１６時間）、暗期（地上部２６℃／地下部２６℃、８時間）の条件で行った以外は、第２選抜工程と同様にして育苗用プレートで１０〜１４日間水耕栽培し、栽培後に生育している植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製した。
【００３６】
＜高温ストレス及び微生物の接種（第４選抜工程）＞
育苗用プレートの底面を浸した液体培地に添加する微生物回収液を、第２選抜工程で調製した微生物回収溶液に代えて第３選抜工程で調製した微生物回収溶液を用い、かつ１４日間の栽培時の地上部の高温条件を、明期（地上部３７℃／地下部２９℃、１６時間）、暗期（地上部２９℃／地下部２９℃、８時間）の条件で行った以外は、第２選抜工程と同様にして育苗用プレートで１０〜１４日間水耕栽培し、栽培後に生育している植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製した。
【００３７】
＜高温ストレス及び微生物の接種（第５選抜工程）＞
育苗用プレートの底面を浸した液体培地に添加する微生物回収液を、第３選抜工程で調製した微生物回収溶液に代えて第４選抜工程で調製した微生物回収溶液を用い、かつ１４日間の栽培時の地上部の高温条件を、明期（地上部４０℃／地下部３２℃、１６時間）、暗期（地上部３２℃／地下部３２℃、８時間）の条件で行った以外は、第２選抜工程と同様にして育苗用プレートで１０〜１４日間水耕栽培し、栽培後に生育している植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製した。
【００３８】
＜高温ストレス及び微生物の接種（第６選抜工程）＞
育苗用プレートの底面を浸した液体培地に添加する微生物回収液を、第４選抜工程で調製した微生物回収溶液に代えて第５選抜工程で調製した微生物回収溶液を用い、かつ１４日間の栽培時の地上部の高温条件を、明期（地上部４０℃／地下部３３．５℃、１６時間）、暗期（地上部３５℃／地下部３３．５℃、８時間）の条件で行った以外は、第２選抜工程と同様にして育苗用プレートで１０〜１４日間水耕栽培し、栽培後に生育している植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製した。
【００３９】
微生物を接種していないシロイヌナズナは、第６選抜工程の高温条件では、全植物体が白化・枯死したのに対して、選抜された微生物混合物を根に共生させたシロイヌナズナは、全植物体の１０〜２０％が、明期（地上部４０℃／地下部３３．５℃、１６時間）、暗期（地上部３５℃／地下部３３．５℃、８時間）の条件の非常に高温の環境下でも生育が可能となった。つまり、第６選抜工程で回収した微生物回収溶液に含まれている微生物混合物又はこれらの分泌物質が、植物の耐塩性を向上させる作用を有していること、すなわち当該微生物混合物は、高温ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生菌群であることがわかった。
【００４０】
＜微生物混合物からゲノムＤＮＡの回収＞
第６選抜工程で調製した微生物回収溶液から菌体を回収し、回収した菌体の一部からゲノムＤＮＡを、GenElute Bacterial Genomic DNA kit（Sigma-Aldrich、St. Louis, MO, USA）を用いて得た。
【００４１】
＜16S rDNAの同定＞
回収されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’、配列番号１３）とリバースプライマー（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’、配列番号１４）を用いて、16S rDNAをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの温度条件は、９５℃、３分間の加熱工程後、９５℃、３０秒間の変性工程、５０℃、３０秒間のアニーリング工程、及び７２℃、１分３０秒間の伸長工程からなるサイクルを３０サイクル行った後、最後に７２℃、５分間の伸長反応を加える条件で行った。得られたＰＣＲ産物を、１．２％のアガロースゲル電気泳動により確認し、QIAquick gel extraction kit (Quiagen, Germantown, MD, USA)を用いてゲルから抽出した。抽出されたＰＣＲ産物を、TOPO-TA cloning kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)を用いてプラスミド中に挿入し、大腸菌に形質転換を行った。アンピシリン含有ＬＢ平板培地上で一晩培養した大腸菌コロニーをランダムに９６個取り、アンピシリン含有ＬＢ液体培地に移植して培養した。WizardR SV 96 Plasmid DNA Purification Systems（Promega）を用いて培養された大腸菌からプラスミドを精製した。精製されたプラスミドに対して、BigDye terminator v3.1 Cycle sequence kit (Life Techonologies)を用いたThermalcycle反応を行い、DNAシークエンサー(ABI 3130xL)にて当該プラスミドに組み込まれた16S rDNAの塩基配列を決定した。この結果、１２種類の微生物（SHY-1株〜SHY-12株）が同定された。
【００４２】
配列が決定された１２種類の微生物の16S rDNAの塩基配列についてそれぞれＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索を行った。この結果、配列番号１で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するSHY-1株は、Burkholderia Bacterium SZ6-4（アクセッション番号：ＨＱ６２４９９６．１）と16S rDNAの配列相同性が１００％であったことから、Burkholderia Bacteriumに属する菌株であると考えられた。配列番号２で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するSHY-2株は、Uncultured bacterium clone FE_0_42（アクセッション番号：ＪＸ９４５３３１．１）と16S rDNAの配列相同性が９９．８７％であったことから、Uncultured bacteriumの新規株であると考えられた。配列番号３で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するSHY-3株は、Stenotrophomonas sp. BMC（アクセッション番号：ＤＱ９９１１４４．２）と16S rDNAの配列相同性が９９．７３％であったことから、Stenotrophomonas sp.の新規株であると考えられた。配列番号４で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するSHY-4株は、Comamonas sp. PG4（アクセッション番号：ＪＦ３４５１７６．１）と16S rDNAの配列相同性が９９．８０％であったことから、Comamonas sp.の新規株であると考えられた。配列番号５で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するSHY-5株は、Corynebacterium pseudotuberculosis strain SigmaE（アクセッション番号：ＣＰ０２０３５６．１）と16S rDNAの配列相同性が１００％であったことから、Corynebacterium pseudotuberculosisに属する菌株であると考えられた。配列番号６で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するSHY-6株は、Flavobacterium sp. clone SGR147（アクセッション番号：ＪＱ７９３５０７．１）と16S rDNAの配列相同性が９８．１０％であったことから、Flavobacterium sp.の新規株であると考えられた。配列番号７で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するSHY-7株は、Burkholderiales bacterium enrichment culture clone AP-FeEnrich10（アクセッション番号：ＪＸ８２８４１８．１）と16S rDNAの配列相同性が９８．６６％であったことから、Burkholderiales bacteriumの新規株であると考えられた。配列番号８で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するSHY-8株は、Uncultured bacterium clone BJ201209-59（アクセッション番号：ＫＸ５０７７５３．１）と16S rDNAの配列相同性が９９．９３％であったことから、Uncultured bacteriumの新規株であると考えられた。配列番号９で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するSHY-9株は、Flavobacterium johnsoniae strain GSE09（アクセッション番号：ＣＰ０１６９０７．１）と16S rDNAの配列相同性が９９．８６％であったことから、Flavobacterium johnsoniaeの新規株であると考えられた。配列番号１０で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するSHY-10株は、Pseudomonas sp. BJQ-D4（アクセッション番号：ＦＪ６００３６１．１）と16S rDNAの配列相同性が９９．８７％であったことから、Pseudomonas sp.の新規株であると考えられた。配列番号１１で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するSHY-11株は、Pseudomonas geniculata strain H10（アクセッション番号：ＫＣ９３４８０６．１）と16S rDNAの配列相同性が９９．２６％であったことから、Pseudomonas geniculataの新規株であると考えられた。配列番号１２で表される塩基配列を含む16S rDNAを有するSHY-12株は、Uncultured bacterium clone WCD41（アクセッション番号：ＫＪ１２３７８１．１）と16S rDNAの配列相同性が９４．３４％であったことから、Uncultured bacteriumの新規株であると考えられた。
【００４３】
また、同定した７０個の形質転換体に挿入されていた16S rDNAの割合から、これら１２種類の微生物の存在比を調べたところ、Burkholderia Bacterium SHY-1株が６０．５６％であり、Uncultured bacterium SHY-2株が８．４５％であり、Stenotrophomonas sp. SHY-3株が５．６３％であり、Comamonas sp. SHY-4株が５．６３％であり、Corynebacterium pseudotuberculosis SHY-5株が４．２３％であり、Flavobacterium sp. SHY-6株が２．８２％であり、Burkholderiales bacterium SHY-7株が２．８２％であり、Uncultured bacterium SHY-8株が２．８２％であり、Flavobacterium johnsoniae SHY-9株が１．４１％であり、Pseudomonas sp. SHY-10株が１．４１％であり、Pseudomonas geniculata SHY-11株が１．４１％であり、Uncultured bacterium SHY-12株が１．４１％であった。
【００４４】
当該微生物混合物は、新規に獲得された混合物であり、植物体の耐塩性を顕著に高められる非常に有用な微生物混合物である。そこで、出願人は、微生物として、Burkholderia Bacterium SHY-1株、Uncultured bacterium SHY-2株、Stenotrophomonas sp. SHY-3株、Comamonas sp. SHY-4株、Corynebacterium pseudotuberculosis SHY-5株、Flavobacterium sp. SHY-6株、Burkholderiales bacterium SHY-7株、Uncultured bacterium SHY-8株、Flavobacterium johnsoniae SHY-9株、16S rDNAを有するPseudomonas sp. SHY-10株、Pseudomonas geniculata SHY-11株、及びUncultured bacterium SHY-12株のみからなる微生物混合物を、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター(ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ)（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に新規微生物混合物として寄託する。
【配列表】
2019062756000001.app