(57)【要約】【課題】大きさや形が均一なスフェロイドを大量に作製することができ、大型化や自動化に適したスフェロイド製造デバイス、及びスフェロイドの製造方法を提供する。【解決手段】スフェロイドを製造及び回収するためのデバイスであって、スフェロイドを培養するための第一の基板と、第一の基板の一方側に対向するように配置された第二の基板と、第二の基板へ回収溶液を流入させるための回収溶液流入部と、第二の基板上を流れる、スフェロイドを含有する回収溶液を回収するためのスフェロイド回収部と、を備え、第一の基板は、第一の基板の他方側の第一面と、第一の基板の一方側の第二面と、第一面と第二面との間を貫通する複数の孔を形成する複数の壁面と、を備え、第一の基板の第二面と第二の基板間の間隙ｇが、回収溶液流入部から回収溶液を流入させた際の、回収溶液の、第二の基板からの液滴高さＧより小さいデバイス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフェロイドを製造及び回収するためのデバイスであって、
スフェロイドを培養するための第一の基板と、前記第一の基板の一方側に対向するように配置された、培養したスフェロイドを回収するための第二の基板と、前記第二の基板へ回収溶液を流入させるための回収溶液流入部と、第二の基板上を流れる、スフェロイドを含有する回収溶液を回収するためのスフェロイド回収部と、を備え、
前記第一の基板は、
前記第一の基板の他方側の第一面と、
前記第一の基板の一方側の第二面と、
前記第一面と前記第二面との間を貫通する複数の孔を形成する複数の壁面と、を備え、
前記第一の基板の第二面と前記第二の基板間の間隙ｇが、回収溶液流入部から回収溶液を流入させた際の、前記回収溶液の、第二の基板からの液滴高さＧより小さいデバイス。
【請求項２】
第二の基板の水に対する接触角が５０°〜１２０°である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
少なくとも一部の材質が、ガラス、金属、シリコンウェハ、ポリジメチルシロキサン、ポリアミド系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリウレタン系樹脂、アセタール樹脂、アクリル系樹脂、エポキシ系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート系樹脂又はポリプロピレン系樹脂である、請求項１又は２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記孔は、前記第二面の開口部の面積に相当する円の直径が２００μｍから１ｃｍの範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
複数の前記壁面のそれぞれの少なくとも一部分は、前記第二面に対して１°より大きく、９０°より小さい角度の傾斜を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記孔に、前記第一面から、前記壁面を構成する材質の表面との接触角θｃが−１＜ｃｏｓθｃ≦０である培地が注入された場合に、前記孔の前記第二面の開口部の面積に相当する円の半径Ｒ（ｃｍ）が、下記式（Ｆ１）で定義される変数Ｘの値以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のデバイス。
（２／３）αＸ２＋ｐＸ＝２γＬ  …（Ｆ１）
［式（Ｆ１）中、αは前記培地の比重を表し、ｐは前記第二面の開口部の水圧（ｇｆ／ｃｍ２）を表し、γＬは前記培地の表面張力（ｇｆ／ｃｍ）を表す。］
【請求項７】
前記孔に、前記第一面から、前記壁面を構成する材質の表面との接触角θｃが０＜ｃｏｓθｃ＜１である培地が注入された場合に、下記式（Ｆ２）及び（Ｆ３）が満たされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
γＬｃｏｓθｃ−γＳ＞０  …（Ｆ２）
ｐ＝γＬ×（２／Ｒ）  …（Ｆ３）
［式（Ｆ２）及び（Ｆ３）中、γＬは前記培地の表面張力（ｇｆ／ｃｍ）を表し、γＳは前記材質の表面張力（ｇｆ／ｃｍ）を表し、ｐは前記第二面の開口部での水圧（ｇｆ／ｃｍ２）を表し、Ｒは前記孔の前記第二面の開口部の面積に相当する円の半径（ｃｍ）を表す。］
【請求項８】
スフェロイドの製造及び回収方法であって、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のデバイスの前記第一の基板の第一面に細胞を播種する工程１と、
前記工程１により前記第二面に形成される下向き水面上でスフェロイドを培養する工程２と、
前記回収溶液流入部から前記回収溶液を前記第二の基板からの液滴高さがＧになるように流入させる工程３と、
前記回収溶液が、前記下向き水面と、回収溶液流入部側からスフェロイド回収部側へ接触していくことにより、前記下向き水面上のスフェロイドが、前記第二の基板に移動し、更に、前記スフェロイド回収部へ移動する工程４と、
を含む、製造及び回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフェロイドを製造するためのデバイス、スフェロイドの製造及び回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフェロイドとは、細胞が凝集した細胞塊である。再生医療技術の研究開発や臨床応用において、大きさや形が均一なスフェロイドを大量に作製する需要がある。例えば、細胞移植を行う場合等には、スフェロイドを大量に準備することが必要となる。
【０００３】
例えば、特許文献１には、液滴中で大きさや形が均一なスフェロイドを大量に作製することができるスフェロイド作製用デバイスが記載されている。特許文献１に記載のデバイスでは、液滴中でスフェロイドを作製した後、デバイスを移動し、スフェロイドを含む液滴を回収用の溶液と接触させ、液滴を崩壊させてスフェロイドを回収するか、スフェロイドを含む液滴に圧力を加えて液滴を崩壊させてスフェロイドを回収する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１２９２６３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
今後、より大量のスフェロイドを作製するために、スフェロイド作製用デバイスを大型化し、培養面積を拡大することが考えられる。また、スフェロイド作製用デバイスを自動培養装置に組み込んでスフェロイドの製造を自動化することが考えられる。
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載のデバイスは、作製したスフェロイドを回収するためにデバイスを移動させる必要がある。ところが、特許文献１に記載のデバイスは、移動させるとスフェロイドを含む液滴が崩壊したり、培地がデバイスからこぼれたりしやすく、この傾向はデバイスを大型化した場合により顕著となる。このため、特許文献１に記載のデバイスは大型化や自動化に改良の余地がある。
【０００７】
そこで、本発明は、大きさや形が均一なスフェロイドを大量に作製することができ、大型化や自動化に適したスフェロイド製造デバイス、及びこれを用いたスフェロイドの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一の態様は、スフェロイドを製造及び回収するためのデバイスであって、スフェロイドを培養するための第一の基板と、前記第一の基板の一方側に対向するように配置された、培養したスフェロイドを回収するための第二の基板と、前記第二の基板へ回収溶液を流入させるための回収溶液流入部と、第二の基板上を流れる、スフェロイドを含有する回収溶液を回収するためのスフェロイド回収部と、を備え、前記第一の基板は、前記第一の基板の他方側の第一面と、前記第一の基板の一方側の第二面と、前記第一面と前記第二面との間を貫通する複数の孔を形成する複数の壁面と、を備え、前記第一の基板の第二面と前記第二の基板間の間隙ｇが、回収溶液流入部から回収溶液を流入させた際の、前記回収溶液の、第二の基板からの液滴高さＧより小さいデバイスである。
【０００９】
本発明の第二の態様は、スフェロイドの製造及び回収方法であって、上述したデバイスの第一の基板の第一面に細胞を播種する工程１と、前記工程１により前記第二面に形成される下向き水面上でスフェロイドを培養する工程２と、前記回収溶液流入部から前記回収溶液を前記第二の基板からの液滴高さがＧになるように流入させる工程３と、前記回収溶液が、前記下向き水面と、回収溶液流入部側からスフェロイド回収部側へ接触していくことにより、前記下向き水面上のスフェロイドが、前記第二の基板に移動し、更に、前記スフェロイド回収部へ移動する工程４を含む、スフェロイドの製造及び回収方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、大きさや形が均一なスフェロイドを大量に作製することができ、大型化や自動化に適したスフェロイド製造及び回収デバイス、及びこれを用いたスフェロイドの製造及び回収方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）は、実施例で作製したスフェロイド製造及び回収用デバイスの写真である。（ｂ）は、（ａ）のスフェロイド製造及び回収用デバイスのｂ−ｂ’線に沿った模式的な矢視断面図である。
【図２】（ａ）は、スフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板の一例を示す上面図である。第一の基板を第一面側から見た状態を示している。（ｂ）は、（ａ）に示す第一の基板のｂ−ｂ’線に沿った矢視断面図である。
【図３】第一の基板の第一面側に細胞を含む培地を入れた状態を示す断面図である。図２（ｂ）に示した第一の基板の断面図に相当する。
【図４】スフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板の第二面から突出した下向き水面の上でスフェロイドを培養している状態を示す模式断面図である。
【図５】壁面の表面の材質と培地との接触角θｃを説明する模式図である。
【図６】下向き水面にかかる力を説明する図である。
【図７】角度θ０を説明する図である。
【図８】下向き水面が、孔の第二面から突出しない状態で形成された場合を説明する模式図である。
【図９】下向き水面が、孔の第二面から突出した状態で形成された場合を説明する模式図である。
【図１０】図８及び図９よりも水圧が大きい場合を示す図である。
【図１１】下向き水面と水圧が釣り合っているときの第二面の開口部における表面張力を説明する図である。
【図１２】下向き水面が図９に示す状態である場合を説明する図である。
【図１３】（ａ）〜（ｄ）は、スフェロイド製造及び回収用デバイスで製造したスフェロイドを回収する様子を説明する模式断面図である。
【図１４】（ａ）は実施例で作製したスフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板を第二面側から観察した光学顕微鏡写真であり、第二面付近に焦点を合わせたものである。（ｂ）は（ａ）と同視野の光学顕微鏡写真であるが、第一面付近に焦点を合わせたものである。（ｃ）は作製したスフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板の第二面側を撮影した走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。（ｄ）は作製したスフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板を孔の軸線方向に切断した断面ＳＥＭ写真である。
【図１５】（ａ）〜（ｃ）は、スフェロイド製造及び回収用デバイスで製造したスフェロイドを回収する様子を示す写真である。
【図１６】（ａ）及び（ｂ）は、実施例において製造及び回収したスフェロイドの顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
【００１３】
［スフェロイド製造及び回収用デバイス］
一態様において、本発明は、スフェロイドを製造及び回収するためのデバイスであって、スフェロイドを培養するための第一の基板と、前記第一の基板の一方側に対向するように配置された、培養したスフェロイドを回収するための第二の基板と、前記第二の基板へ回収溶液を流入させるための回収溶液流入部と、第二の基板上を流れる、スフェロイドを含有する回収溶液を回収するためのスフェロイド回収部と、を備え、前記第一の基板は、前記第一の基板の他方側の第一面と、前記第一の基板の一方側の第二面と、前記第一面と前記第二面との間を貫通する複数の孔を形成する複数の壁面と、を備え、前記第一の基板の第二面と前記第二の基板間の間隙ｇが、回収溶液流入部から回収溶液を流入させた際の、前記回収溶液の、第二の基板からの液滴高さＧより小さいデバイスを提供する。
【００１４】
ここで、回収溶液としては、スフェロイドに有害でない限り種々の溶液が使用可能であるが、スフェロイドの培養に用いる培養液と同種の培養液であることが好ましい。
【００１５】
図１（ａ）は、本態様のスフェロイド製造及び回収用デバイスの一例を示す写真である。図１（ｂ）は、図１（ａ）のスフェロイド製造及び回収用デバイスのｂ−ｂ’線に沿った模式的な矢視断面図である。
【００１６】
図１（ｂ）に示すように、本態様のスフェロイド製造及び回収用デバイス１００は、スフェロイドを培養するための第一の基板１１０と、第一の基板１１０の一方側に対向するように配置された、培養したスフェロイドを回収するための第二の基板１２０と、第二の基板１２０へ回収溶液を流入させるための回収溶液流入部１３０と、第二の基板１２０上を流れる、スフェロイドを含有する回収溶液を回収するためのスフェロイド回収部１４０と、を備え、第一の基板１１０は、第一の基板１１０の他方側の第一面１１２と、第一の基板１１０の一方側の第二面１１１と、第一面１１２と第二面１１１との間を貫通する複数の孔を形成する複数の壁面１１３と、を備え、第一の基板１１０の第二面１１１と第二の基板１２０との間隙ｇが、回収溶液流入部１３０から回収溶液を流入させた際の、回収溶液の、第二の基板からの液滴高さＧより小さい。間隙ｇは、第一の基板１１０の第二面１１１と第二の基板１２０との間の距離と同義である。
【００１７】
本態様のスフェロイド製造及び回収用デバイス１００において、第一の基板１１０は、スフェロイドを培養するためのものである。より具体的には、第一の基板１１０は、第一の基板１１０の他方側の第一面１１２に細胞懸濁液を添加することにより、第一の基板１１０の一方側の第二面１１１に後述する下向き水面３１１を形成して、その上で細胞を培養し、スフェロイド４１０を製造するためのものである。第一の基板の詳細については後述する。
【００１８】
（第二の基板）
図１（ａ）及び（ｂ）に示すように、本態様のスフェロイド製造及び回収用デバイス１００は、第二の基板１２０を備えることを特徴の１つとする。スフェロイド製造及び回収用デバイス１００において、第二の基板１２０は、第一の基板１１０の一方側（第二面１１１側）に対向するように配置されている。第二の基板１２０は、製造したスフェロイドを回収するためのものである。
【００１９】
ここで、第二の基板１２０の作用についてより具体的に説明する。図１３（ａ）〜（ｄ）は、本態様のスフェロイド製造及び回収用デバイス１００で製造したスフェロイドを回収する様子を説明する模式断面図である。図１３（ａ）は、下向き水面３１１の内部（上）でスフェロイド４１０を培養している状態を示す図である。
【００２０】
図１３（ｂ）は、回収溶液を、回収溶液流入部１３０から、第二の基板１２０からの液滴高さがＧになるように流入させた状態を示す図である。図１３（ｂ）に示すように、回収溶液は、第１の基板１１０と第２の基板１２０との双方に接触し、下向き水面３１１を崩壊させる。その結果、スフェロイド４１０が第二の基板上に流出する。
【００２１】
続いて、図１３（ｃ）に示すように、下向き水面３１１の崩壊は、スフェロイド製造及び回収用デバイス１００の回収溶液流入部１３０側からスフェロイド回収部１４０側に向かって連鎖的に進行する。
【００２２】
そして、図１３（ｄ）に示すように、流出したスフェロイド４１０がスフェロイド回収部１４０に回収される。
【００２３】
以上のスフェロイドの回収は、スフェロイド製造及び回収用デバイス１００を移動させなくても実施することができる。このため、下向き水面３１１の意図しない崩壊や、培地がデバイスからこぼれる等の問題が生じにくく、デバイスの大型化や自動培養装置への組み込みも容易である。更に、スフェロイド４１０の回収において、スフェロイド４１０に与えるストレスを最小限に抑制することができ、高品質なスフェロイドを製造することができる。
【００２４】
第二の基板１２０は、回収溶液流入部１３０から流入させた回収溶液をスフェロイド回収部１４０へと誘導し、下向き水面３１１を崩壊させながらスフェロイドを回収することができればその形状や材質は特に限定されない。第二の基板１２０の形状は例えば平板状であってもよい。また、第二の基板１２０は、回収溶液が、回収溶液流入部１３０からスフェロイド回収部１４０に向かって流動しやすいよう、傾斜を有していてもよい。ただし、第二の基板１２０が傾斜を有している場合においてもｇ＜Ｇは満たされる必要がある。
【００２５】
第二の基板１２０の材質としては、一般的な細胞培養容器に用いられる材質を用いることができ、例えば、ガラス、金属、シリコンウェハ、ポリジメチルシロキサン、ポリアミド系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリウレタン系樹脂、アセタール樹脂、アクリル系樹脂、エポキシ系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリプロピレン系樹脂等が挙げられる。
【００２６】
間隙ｇは、スフェロイド４１０を効率よく回収することができる限り、第一の基板１１０の全面にわたって実質的に一定であることが好ましい。ここで、実質的に一定であるとは、設計上一定であることを意味し、加工精度等の要因により部分的に間隙ｇの大きさが異なることを許容することを意味する。
【００２７】
第一の基板１１０の第二面１１１と第二の基板１２０の間の間隙ｇが小さすぎると、下向き水面３１１が第二の基板１２０に接触してしまい、下向き水面３１１を維持することができない場合がある。したがって、間隙ｇは、少なくとも回収溶液流入部１３０の近傍において、第二面１１１の開口部の面積に相当する円の半径（以下、符号「Ｒ」で表し、「相当半径」という場合がある。）よりも大きいことが好ましい。ここで、回収溶液流入部１３０の近傍とは、回収溶液流入部１３０に最も近接した下向き水面３１１を含む領域を意味する。例えば、第二面１１１の開口部の相当半径が２５０μｍである場合、間隙ｇは、少なくとも回収溶液流入部１３０の近傍において、２５０μｍを超える大きさであることが好ましい。ただし、第二面１１１の開口部の相当半径が２５０μｍである場合であっても、下向き水面３１１が第二の基板１２０に接触しない限り、ｇを２５０μｍ以下にすることもできる。
【００２８】
また、培養したスフェロイド４１０の回収時には、スフェロイド４１０は、間隙ｇを回収部１４０に向かって移動することになる。このため、間隙ｇが小さすぎると、スフェロイド４１０が第一の基板１１０の第二面１１１又は第二の基板１２０に引っ掛かり、間隙ｇを移動することが困難な場合がある。この場合、スフェロイドを回収することが困難になる場合がある。このため、間隙ｇは、製造目的であるスフェロイド４１０の直径よりも大きいことが好ましい。
【００２９】
一方、間隙ｇが大きすぎると、回収溶液を回収溶液流入部１３０に流入させた場合に第二の基板１２０上に形成される液滴が、下向き水面３１１と接触することができず、下向き水面３１１を崩壊させることができない場合がある。この場合、スフェロイド４１０を回収することができない。そこで、間隙ｇは、回収溶液流入部１３０から回収溶液を流入させた際の、回収溶液の、第二の基板１２０からの液滴高さＧよりも小さく設定する。間隙ｇが高さＧよりも小さいとは、すなわち、回収溶液を回収溶液流入部から流入させた結果、回収溶液が第１の基板１１０と第２の基板１２０との双方に接触することを意味する。
【００３０】
液滴高さＧは、回収溶液流入部１３０に導入する回収溶液の量及び第二の基板１２０の接触角にも影響される。回収溶液の量は、デバイスの大きさに応じて適宜設定することができ、例えば１００μＬ〜１０ｍＬであってもよい。所定量の回収溶液を回収溶液流入部から流入させた結果、回収溶液は第二の基板１２０上に溜まり、高さＧの液滴を形成する。
【００３１】
また、第二の基板１２０の水に対する接触角が５０°〜１２０°であると、回収溶液を回収溶液流入部１３０に流入させた場合に第二の基板１２０上に形成される液滴が、下向き水面３１１と接触しやすい傾向にある。また、第二の基板１２０の水に対する接触角が上記の範囲であると、崩壊した下向き水面３１１上に存在していた培地やスフェロイド４１０が間隙ｇを回収部１４０に向かって効率よく移動しやすい。このため、スフェロイドの回収を効率よく行うことができる傾向にある。また、第二の基板１２０の水に対する接触角が上記の範囲であると、スフェロイドが第二の基板に接着することを抑制できる傾向にある。
【００３２】
第二の基板１２０の材質の水に対する接触角が上記の範囲から外れる場合には、例えば第二の基板１２０の表面に表面改質処理を行ったり、第二の基板１２０の表面に表面改質剤を被覆することにより、接触角を調整することができる。
【００３３】
表面改質剤としては、細胞に毒性を示さない限り特に限定されず、無機物、金属、合成ポリマー若しくは生体由来ポリマー又はこれらの組合せ等が挙げられる。より具体的には、例えば、シランカップリング剤、フッ素含有ポリマー等を第二の基板１２０の表面に塗布して被覆を形成することができる。
【００３４】
スフェロイド回収部１４０の形状は、図１３（ａ）〜（ｄ）等に示したものに限定されず、例えば、スフェロイド製造及び回収用デバイス１００を組み込む自動培養装置の構造等に応じて適宜変更することができる。
【００３５】
例えば、回収溶液を流入させて下向き水面３１１を崩壊させ、スフェロイドを第二の基板１２０上に流出させた後、第一の基板１１０及び第二の基板１２０の間隙ｇの出口から直接スフェロイドを回収してもよい。この場合、スフェロイド回収部１４０は間隙ｇの出口であるということもできる。
【００３６】
スフェロイド製造及び回収用デバイス１個あたりのスフェロイド回収部１４０の数は１個には限定されない。しかしながら、スフェロイドの回収を容易にする観点からは、一般的にはスフェロイド回収部１４０の数は少ないことが好ましい。したがって、スフェロイド製造及び回収用デバイス１個あたりのスフェロイド回収部１４０の数は１個であることが好ましい。
【００３７】
また、スフェロイド製造及び回収用デバイス１個あたりの回収溶液流入部１３０の数も１個には限定されない。しかしながら、スフェロイドの回収を容易にする観点からは、一般的には回収溶液流入部１３０の数は少ないことが好ましい。したがって、スフェロイド製造及び回収用デバイス１個あたりの回収溶液流入部１３０の数は１個であることが好ましい。
【００３８】
また、スフェロイド回収部１４０と回収溶液流入部１３０とをできるだけ離れた位置に設けることにより、スフェロイド回収部１４０と回収溶液流入部１３０との間に存在する下向き水面３１１の数を増加させることができる。その結果、回収溶液流入部１３０に回収溶液を流入させる最小限の操作により、崩壊させることができる下向き水面３１１の数を増加させることができる。このため、スフェロイド回収部１４０と回収溶液流入部１３０とをできるだけ離れた位置に設けることにより、効率よくスフェロイド４１０を回収することができる。
【００３９】
（第一の基板）
続いて、第一の基板について説明する。第一の基板は、第一の基板の他方側の第一面と、第一の基板の一方側の第二面と、第一面と第二面との間を貫通する複数の孔を形成する複数の壁面を備えるものであれば、特に限定されないが、以下のような形態であることが好ましい。
【００４０】
図２（ａ）は、スフェロイドを培養するための第一の基板１１０の一例を示す上面図である。図２（ａ）は、第一の基板１１０を第一面１１２側から見た状態を示している。また、図２（ｂ）は、図２（ａ）に示す第一の基板１１０のｂ−ｂ’線に沿った矢視断面図である。
【００４１】
図２（ｂ）に示すように、第一の基板１１０は、第一面１１２と、第二面１１１と、第一面１１２と第二面１１１との間を貫通する複数の孔を形成する複数の壁面１１３と、を備える。壁面１１３は、第一の基板１１０の第一面１１２と第二面１１１とを貫通する孔を形成する。また、壁面１１３は、第一面１１２及び第二面１１１に開口部を形成する。ここで、第一の基板１１０の第一面１１２はその前面が開口部を形成しており、平面部分が存在しないことが好ましい。
【００４２】
壁面１１３によって形成される孔は、第一面１１２側の開口部に比べて、第二面１１１側の開口部が小さくなるように設計される。孔の開口部の形状は円形であるとは限らず、また、略円形であったとしても真円でない場合がある。そこで、以下、孔の開口部の大きさを、開口部の面積に相当する円の直径（以下、符号「Ｄ」で表し、「相当直径」という場合がある。）を用いて比較する。ここで、開口部の面積に相当する円とは、開口部の面積と同じ面積を有する円を意味する。また、本明細書において、開口部の面積に相当する円の半径を符号「Ｒ」で表し、「相当半径」という場合がある。
【００４３】
続いて、第一の基板１１０の構造をより詳細に説明する。図３は、第一の基板１１０の第一面１１２側に細胞を含む培地３１０を入れた状態を示す断面図であり、図２（ｂ）に示した第一の基板１１０の断面図に相当する。図３に示すように、第一の基板１１０を適切に設計すると、添加した培地３１０が孔の第二面１１１側の開口部に下向き水面３１１を形成する。
【００４４】
図３において、角度θｉは壁面１１３が第二面１１１に対してなす角度である。角度θｉは、壁面１１３の全体にわたって一様でなくてもよい。角度θｉは壁面１１３の少なくとも一部分において１°より大きく９０°より小さいことが好ましく、３０°〜８０°であることがより好ましい。これにより孔に培地３１０が入りやすくなる。また、培地に添加した細胞が壁面１１３に留まらず、下向き水面の頂点付近まで沈降しやすくなる。この結果、スフェロイドを効率よく形成することができる。
【００４５】
図３において、厚さＴは、第一の基板１１０の厚さである。厚さＴは、培地３１０の重さに耐えられる厚さであればよい。例えば、厚さＴは、第二面１１１側の開口部の相当直径Ｄより大きくてもよい。
【００４６】
本態様のスフェロイド製造及び回収用デバイス１００において、壁面１１３によって形成される孔は、第一面１１２側の開口部に比べて、第二面１１１側の開口部が小さい。また、第二面１１１側の開口部の相当直径Ｄは所望のスフェロイドの直径の１〜１０倍程度であることが好ましい。第二面１１１側の開口部の相当直径Ｄの最小値が、スフェロイドの直径＋２ＳＤ（ここで、ＳＤはスフェロイドの直径の標準偏差を表す。）であれば、９５％以上のスフェロイドを回収することができる。
【００４７】
ここで、スフェロイドの直径は、スフェロイドを平面上に投影した場合の投影面積に相当する円の直径としてよい。孔の第二面１１１側の開口部の相当直径Ｄは、例えば２００μｍ〜１ｃｍであってもよい。
【００４８】
また、単位面積当たりの孔の数が多いほど単位面積当たり多くの細胞塊を作製できることから、第二面１１１側の開口部の相当直径Ｄは、所望のスフェロイドの直径の２〜５倍程度であることが好ましい。
【００４９】
図３において、幅Ｗは、一つの孔を形成する壁面１１３と、隣接する別の孔を形成する壁面１１３との間の幅である。幅Ｗは、第二面１１１に対して角度θｉをなす壁面１１３が終了する位置における幅である。隣接する孔を形成する二つの壁面１１３は、それぞれ第二面１１１から第一面１１２へ向かう斜面を有するところ、幅Ｗは、かかる斜面が角度θｉを有することを可能にする端部の幅であるともいえる。
【００５０】
図３は、培地３１０の高さがＨとなるまで第一面側から培地３１０を添加した状態を示す。図３では、第一の基板１１０の第一面１１２側に細胞を含む培地３１０を入れた状態を示す断面図であり、第一の基板１１０に形成された孔の第二面１１１側の開口部から培地３１０が突出するように培地３１０が注入される。
【００５１】
第二面１１１から突出した部分は下向き水面３１１を形成する。下向き水面３１１は、細胞を培養して、スフェロイドを形成する際に、三次元の細胞培養器として機能する。図４は、第二面１１１から突出した下向き水面３１１の上でスフェロイド４１０を培養している状態を示す模式断面図である。
【００５２】
下向き水面３１１は、所定の曲率半径を有する曲面で形成されている。下向き水面を囲む空気の圧力（Ｐａｉｒ）及び下向き水面に上方からかかる圧力の絶対値（Ｐ）の圧力差ΔＰ（Ｐ−Ｐａｉｒ）はヤング−ラプラスの関係式で表される。ヤング−ラプラスの関係式を下記式（１）に示す。下記式（１）において、培地上面にかかる大気圧と下向き水面にかかる大気圧（Ｐａｉｒ）はほぼ同じと考えて無視できる。
ΔＰ＝Ｈρ＝γＬ（１／ｒ１＋１／ｒ２）  …（１）
［式（４）中、Ｈは培地３１０の高さを表し、ρは培地３１０の密度を表し、γＬは培地３１０の表面張力（ｇｆ／ｃｍ）を表し、ｒ１及びｒ２は直交する曲率半径を表す。］
【００５３】
下向き水面３１１を球面と想定した場合には、ｒ１＝ｒ２となる。このような曲面は下向きに凸になるので、下向き水面３１１が形成される。
【００５４】
続いて、スフェロイド製造及び回収用デバイスの設計の詳細について説明する。スフェロイド製造及び回収用デバイス１００の材質、孔の開口部の相当直径Ｄの設計にあたっては以下の物理現象を考慮することが好ましく、特に、壁面１１３の表面の材質と培地３１０との接触角θｃ、及び、第二面１１１の表面と培地３１０との接触角を考慮することが好ましい。
【００５５】
以下、まず、接触角θｃに関係する物理現象に応じたスフェロイド製造及び回収用デバイス１００の設計について説明する。図５は、壁面１１３の表面の材質と培地３１０との接触角θｃを説明する模式図である。
【００５６】
図５中、θｃは固体（壁面１１３の表面の材質）に対する液体（培地３１０）の接触角を表し、γＳは固体の表面張力（ｇｆ／ｃｍ）を表し、γＳＬは固液表面張力（界面張力）（ｇｆ／ｃｍ）を表し、γＬは液体の表面張力（ｇｆ／ｃｍ）を表す。
【００５７】
ここで、接触角θｃは、固体と液体との性質から定まる。具体的には、壁面１１３の表面の材質と培地３１０の性質により決まる。
【００５８】
《接触角θｃが−１＜ｃｏｓθｃ≦０の範囲に含まれる場合》
以下、接触角θｃが−１＜ｃｏｓθｃ≦０の範囲に含まれる場合について説明する。この場合、一般的に、壁面１１３の表面の材質が疎水性の材質であるといえる。また、この場合、下向き水面の大きさは接触角θｃに影響されない。
【００５９】
図６は、下向き水面３１１にかかる力を説明する図である。図６では、下向き水面３１１の形状が半球であるものとする。また、第２面１１１は水平であるものとする。図６に示すように、下向き水面３１１にかかる力であって、重力と並行に働く力として、Ｆ０、Ｆ１及びＦ２が存在する。
【００６０】
Ｆ０は、下向き水面３１１にかかる重力であり、下記式（２）により表される。
Ｆ０＝体積×比重＝Ｖ・α  …（２）
［式（２）中、Ｖは下向き水面３１１の体積（ｃｍ３）を表し、αは培地３１０の比重を表す。］
【００６１】
また、Ｆ１は、下向き水面３１１が培地３１０から受ける水圧であり、下記式（３）により表される。
Ｆ１＝水圧×面積＝ｐ・Ｓ  …（３）
［式（３）中、ｐは第二面１１１の開口部における水圧（ｇｆ／ｃｍ２）を表し、Ｓは下向き水面３１１が形成される第二面１１１の開口部の面積を表す。］
【００６２】
また、大気圧の場合は下記式（４）により表される。
Ｆ１＝液上面から液滴までの深さ×液体の密度×面積＝ＨρＳ
［式（４）中、Ｈは培地３１０の上面から下向き水面３１１の下端までの深さ（ｃｍ）を表し、ρは培地３１０の密度（ｇ／ｃｍ３）を表し、Ｓは下向き水面３１１が形成される第二面１１１の開口部の面積を表す。］
【００６３】
また、Ｆ２は、下向き水面３１１の辺縁で発生する液体の表面張力に由来する力であり、下記式（５）により表される。図７は、式（５）中の角度θ０を説明する図である。
Ｆ２＝外周×液体表面張力×角度＝ＬγＬｓｉｎθ０  …（５）
［式（５）中、Ｌは第二面１１１の開口部の外周の長さ（ｃｍ）を表し、γＬは培地３１０の表面張力を表し、θ０は下向き水面３１１の辺縁部が第二面１１１となす角度を表す。］
【００６４】
ここで、第二面１１１の表面と培地３１０との接触角が図７に示す角度θ０よりも小さいと培地３１０が第二面１１１に回り込んで、下向き水面３１１が維持できない。
【００６５】
液体の表面張力γＬは、Ｗｉｌｈｅｌｍｙ法等の様々な方法で測定することができる。また、液体の販売元から情報を入手することができる。また、接触角θｃは、使用する液体（培地や緩衝液）と材料（壁面１１３の材質からなる材料）を用いて、液滴法や気液法よって測定することができる。
【００６６】
図８は、下向き水面３１１が、孔の第二面１１１から突出しない状態で形成された場合を説明する模式図である。図８に示すように、下向き水面３１１が壁面１１３の途中に形成されるための条件にγＳＬが関与する。γＳＬは固液表面張力（ｇｆ／ｃｍ）を表す。
【００６７】
また、図９は、下向き水面３１１が、孔の第二面１１１から突出した状態で形成された場合を説明する模式図である。図９のような場合には、下向き水面３１１が保持されるための条件にγＳＬは関与しない。この時γＳＬは第２表面の方向に想定される。そして、下記式（６）の関係が成り立つときに下向き水面３１１が保持される。
Ｆ０＋Ｆ１＜Ｆ２  …（６）
【００６８】
また、図８に示すように下向き水面３１１が壁面１１３の途中に形成される場合、上述した計算式により、Ｆ２は下記式（７）で表すことができる。
Ｆ２＝ＬγＳＬｓｉｎθｉ＋ＬγＬｓｉｎθ０  …（７）
［式（７）中、θｉは壁面１１３の傾斜角を表し、θ０は下向き水面３１１の辺縁部が第二面１１１となす角度を表す。］
【００６９】
よって、上記式（６）は、下記式（８）で表すことができる。
Ｖα＋ｐＳ＜ＬγＳＬｓｉｎθｉ＋ＬγＬｓｉｎθ０  …（８）
【００７０】
また、図９に示すように下向き水面３１１が第２面１１１と連続する場合、Ｆ２は下記式（９）で表すことができる。
Ｆ２＝ＬγＬｓｉｎθ０  …（９）
よって、上記式（６）は、下記式（１０）で表すことができる。
Ｖα＋ｐＳ＜ＬγＬｓｉｎθ０  …（１０）
【００７１】
ここで、ある接触角θｃをもつ素材を用いて、培地３１０を高さＨまで入れるとする。下向き水面３１１が崩壊を始めるときは、例えば、下向き水面３１１が第二面１１１から外側に突出し始める。この場合、下記式（１１）が成り立つ。このときの角度θ０は９０°（ｓｉｎ９０°＝１）である。
Ｆ０＋Ｆ１＝Ｆ２  …（１１）
【００７２】
ここで、下向き水面３１１の体積をＶ、第二面１１１側の開口部の相当半径をＲ、培地３１０の比重をαとすると、下記式（１２）のように表すことができる。式（１２）においては下向き水面３１１が半球であるとして、体積Ｖを球の体積÷２とした。
Ｆ０＝（（４／３）πＲ３÷２）×α＝（２／３）πＲ３・α  …（１２）
【００７３】
更に、開口部の面積Ｓ及び外周の長さＬを相当半径Ｒで表すと、下記式（１３）及び（１４）のように表すことができる。
Ｓ＝πＲ２  …（１３）
Ｌ＝２πＲ  …（１４）
【００７４】
そこで、上記式（１１）より、
（２／３）πＲ３・α＋ｐπＲ２＝２πＲＬγＬｓｉｎ９０°  …（１２）
ここで、ｓｉｎ９０°＝１であるため、
（２／３）αＲ２＋ｐＲ＝２γＬ  …（１３）
【００７５】
すなわち、上記式（１３）の相当半径Ｒが第二面１１１の開口部の最大相当半径である。また第二表面１１１の開口部の直径は２Ｒ以下に設定することが好ましい。
【００７６】
したがって、第一の基板１１０に形成された孔に、第一面１１２から、壁面１１３を構成する材質の表面との接触角θｃが−１＜ｃｏｓθｃ≦０である培地３１０が注入された場合に、孔の第二面１１１の開口部の面積に相当する円の半径Ｒ（ｃｍ）が、下記式（Ｆ１）で定義される変数Ｘの値以下であることが好ましい。また、細胞塊が重力から受ける力（Ｆｃ）も考慮することがより好ましい。
（２／３）αＸ２＋ｐＸ＝２γＬ  …（Ｆ１）
［式（Ｆ１）中、αは培地３１０の比重を表し、ｐは第二面１１１の開口部の水圧（ｇｆ／ｃｍ２）を表し、γＬは培地３１０の表面張力（ｇｆ／ｃｍ）を表す。］
【００７７】
このように、接触角θｃが−１＜ｃｏｓθｃ≦０（接触角９０°以上、θ０はθｃを超えられない）の範囲に含まれる場合には、第二面１１１の開口部の相当直径Ｄを、式（１３）で算出した相当半径Ｒの２倍以下にすることが好ましい。これにより、第一の基板１１０に下向き水面３１１を維持することができる。
【００７８】
《接触角θｃが０＜ｃｏｓθｃ＜１の範囲に含まれる場合》
以下、接触角θｃが０＜ｃｏｓθｃ＜１の範囲に含まれる場合について説明する。この場合、一般的に、壁面１１３の表面の材質が親水性の材質であるといえる。
【００７９】
図８及び図９を用いて液面と水圧との関係を説明する。図８に示す水圧ｐ１を基準にすると、図９は図８よりも水圧ｐ２が大きい場合（ｐ１＜ｐ２）を示す。図１０は、図８及び図９よりも水圧が大きい場合（ｐ１＜ｐ２＜ｐ３）を示す。
【００８０】
図８では、水圧ｐ１の大きさと液面とが釣り合っていて、液体は落下せず停止している。図９では、水圧ｐ２が水圧ｐ１より大きいため、液面がより第二面１１１に近くなっている。図９では水圧ｐ２の大きさと液面との間でバランスが成立している。
【００８１】
図６に示す高さＨを高くすればするほど（培地３１０の量を多くすればするほど）水圧が大きくなる。その結果、θ０が接触角θｃを超えた時点で、図１０に示すように培地３１０、第一の基板１１０及び空気が接する三重線が移動する。この結果、液面が第二面１１１の開口部からまわり込み、第二面１１１上の開口部から離れた位置に形成される。
【００８２】
図１０のような状態になると、第一の基板１１０の上部から培地３１０が持続的に供給される。その結果、下向き水面３１１が増大して滴下し、第一の基板１１０上の各孔に１つずつ下向き水面３１１を安定的に保持することが困難となる。したがって、下向き水面３１１は、図８又は図９で示す状態にあることが好ましい。
【００８３】
そこで、以下のような条件となるようにスフェロイド製造及び回収用デバイス１００を設計することが好ましい。
【００８４】
図１１は、下向き水面３１１と水圧が釣り合っているときの第二面１１１の開口部における表面張力を説明する図である。図１２は、下向き水面３１１が図９に示す状態である場合を説明する図である。
【００８５】
下向き水面３１１が図１０の状態にならないためには、固体の表面張力γＳが固液界面張力γＳＬと液面の表面張力（γＬｃｏｓθ０）の和を超えないことが必要である。すなわち、下記式（１４）が満たされることが必要である。
γＳ≦γＳＬ＋γＬｃｏｓθ０  …（１４）
【００８６】
式（１５）をＹｏｕｎｇの式（γＳ＝γＳＬ＋γＬｃｏｓθｃ）と比較すると、θ０≦θｃである場合に、下向き水面３１１が安定に維持されることがわかる。
【００８７】
図５に壁面１１３の材質と培地３１０との接触角θｃを説明する模式図を示す。図５中、θｃは固体（壁面１１３の表面の材質）に対する液体（培地３１０）の接触角を表し、γＳは固体の表面張力（ｇｆ／ｃｍ）を表し、γＳＬは固液表面張力（界面張力）（ｇｆ／ｃｍ）を表し、γＬは液体の表面張力（ｇｆ／ｃｍ）を表す。
【００８８】
ここで、接触角θｃは、固体と液体との性質から定まる。具体的には、壁面１１３の表面の材質と培地３１０の性質により決まる。
【００８９】
固体の表面張力γＳは、例えば、インターネット上の情報（http://www.surface-tension.de/solid-surface-energy.htm等）や、購入元等から入手することが好ましい。あるいは、Ｚｉｓｍａｎ法を用いて算出してもよい。また、液体の表面張力γＬは、Ｗｉｌｈｅｌｍｙ法等の様々な方法で測定することができる。また、液体の販売元から情報を入手することができる。また、接触角θｃは、使用する液体（培地や緩衝液）と材料（壁面１１３の材質からなる材料）を用いて、液滴法や気液法よって測定することができる。
【００９０】
したがって、γＳＬは、γＬとγＳの値を用いて、γＳＬ＝γＬｃｏｓθｃ−γＳの式に代入して導き出すことができる。
【００９１】
したがって、式（１４）は、
γＳ≦γＬｃｏｓθｃ−γＳ＋γＬｃｏｓθｃ  …（１５）
γＬｃｏｓθｃ−γＳ≧０  …（１６）
【００９２】
さらに、図１１に示すように、下向き水面３１１を囲む空気の圧力（Ｐａｉｒ）及び下向き水面に上方からかかる圧力の絶対値（Ｐ）の圧力差ΔＰ（Ｐ−Ｐａｉｒ）はヤング−ラプラスの関係式で表される。ヤング−ラプラスの関係式を下記式（１７）に示す。
Ｐ＝Ｐａｉｒ＋ΔＰ
＝Ｐａｉｒ＋γＬ（１／ｒ１＋１／ｒ２）  …（１７）
［式（１７）中、ｒ１及びｒ２は直交する曲率半径を表す。］
【００９３】
下向き水面を囲む空気の圧力（Ｐａｉｒ）を無視する場合には、
Ｐ＝ｐ＝Ｈρ＝γＬ（１／ｒ１＋１／ｒ２）  …（１８）
［式（１８）中、ｐは第二面１１１の開口部における水圧（ｇｆ／ｃｍ２）を表し、Ｈは培地３１０の上面から下向き水面３１１の下端までの深さ（ｃｍ）を表し、ρは培地３１０の密度（ｇ／ｃｍ３）を表し、ｒ１及びｒ２は直交する曲率半径を表す。］
【００９４】
このような曲面は下向きに凸になるので、下向き水面３１１が形成される。下向き水面３１１の表面を球面と想定した場合はｒ１＝ｒ２となる。よって
ｐ＝γＬ×（２／ｒ）  …（１９）
Ｈρ＝γＬ×（２／ｒ）  …（２０）
【００９５】
また、上述したように、第二面１１１に下向き水面３１１がまわりこみ始めた瞬間に、下向き水面３１１を保持することが困難になる。このことを踏まえ、接触角θｃが０＜ｃｏｓθｃ＜１の範囲において、θ０＝θｃとなった状態での諸条件と第二面１１１の開口部の相当直径Ｄとの関係を、図１１を参照して考察する。
【００９６】
大気圧下について、密度ρ、表面張力γＬの培地３１１と、表面張力がγＳである材質を壁面１１３の表面の材料に用い、高さＨ（ｃｍ）まで培地３１１を入れる場合について、式（１６）からｃｏｓθｃ＞γＳ／γＬを満たす材質を選択する。
【００９７】
曲率半径から想定される円の中心から下に垂直な補助線を引くと、
Ｄ＝２ｒ・ｓｉｎθ０  …（２１）
ここで、（２０）より、ｒ＝２ＨργＬであるから、
Ｄ＝４・γＬ・ｓｉｎθ０／Ｈρ  …（２２）
式（２２）に、下向き水面３１１が第二面１１１にまわりこみ始める限界、すなわちθ０＝θｃを代入すると、下向き水面３１１を保持できる最大直径Ｄ（ｍａｘ）は、下記式（２３）で表される。
Ｄ（ｍａｘ）＝４・γＬ・ｓｉｎθｃ／Ｈρ  …（２３）
【００９８】
すなわち、Ｄ（ｍａｘ）の値よりも小さい相当直径Ｄとなるように設計することが好ましい。したがって、第一の基板１１０に形成された孔に、第一面１１２から、壁面１１３を構成する材質の表面との接触角θｃが０＜ｃｏｓθｃ＜１である培地３１０が注入された場合に、下記式（Ｆ２）及び（Ｆ３）が満たされることが好ましい。
γＬｃｏｓθｃ−γＳ＞０  …（Ｆ２）
ｐ＝γＬ×（２／Ｒ）  …（Ｆ３）
［式（Ｆ２）及び（Ｆ３）中、γＬは培地３１０の表面張力（ｇｆ／ｃｍ）を表し、γＳは壁面１１３の表面の材質の表面張力（ｇｆ／ｃｍ）を表し、ｐは第二面１１１の開口部での水圧（ｇｆ／ｃｍ２）を表し、Ｒは孔の第二面１１１の開口部の面積に相当する円の半径（ｃｍ）を表す。］
【００９９】
このような条件で設計する際に、接触角θｃに関わらず（いいかえると基板１１０の材料が疎水性であるか親水性であるかに関わらず）、培地中のタンパク質の材質への吸着を考慮することが好ましい。このため、第二面１１１の開口部の大きさは、導き出された相当半径Ｒの最大値の２０〜８０％の値にすることが好ましい。さらに、培地３１０の高さＨに由来する水圧が、導き出された最大の水圧ｐの５０〜８０％の範囲になるように培地３１０の高さＨを調節して、培地量を調整することがより好ましい。
【０１００】
上述したように、接触角θｃに応じて相当直径Ｄを設計することにより、下向き水面３１１が適切に形成されるスフェロイド製造及び回収用デバイス１００を作製することができる。いいかえると、スフェロイド製造及び回収用デバイス１００に用いる材質と、細胞培養に使用する培地３１０の性質とに応じたスフェロイド製造及び回収用デバイス１００を設計・作製することができる。
【０１０１】
その結果、スフェロイド製造及び回収用デバイス１００によって細胞培養に適した下向き水面３１１が形成されるので、スフェロイド製造及び回収用デバイス１００を用いてスフェロイドを効率よく、大量に作製することができる。また、スフェロイド製造及び回収用デバイス１００を用いて適切な下向き水面３１１を形成させることにより、均一なスフェロイドを製造することができる。
【０１０２】
上述した説明では、接触角θｃの値がとる範囲に応じて、スフェロイド製造及び回収用デバイス１００を設計するときに用いる計算式を提示した。これは、スフェロイド製造及び回収用デバイス１００の材質、又は培地３１０の性質に応じて、複数の設計手法を適用することが好ましいためである。
【０１０３】
具体的な壁面１１３の表面の材質としては、例えば、ガラス、金属、シリコンウェハ、ポリジメチルシロキサン、ポリアミド系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリウレタン系樹脂、アセタール樹脂、アクリル系樹脂、エポキシ系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリプロピレン系樹脂等が挙げられる。
【０１０４】
壁面１１３には、細胞が接着しにくいことが好ましい。そこで、壁面１１３には表面改質処理が行われていてもよい。あるいは、壁面１１３に表面改質剤が被覆されていてもよい。
【０１０５】
表面改質剤としては、細胞に毒性を示さない限り特に限定されず、無機物、金属、合成ポリマー若しくは生体由来ポリマー又はこれらの組合せ等が挙げられる。より具体的には、例えば、シランカップリング剤、フッ素含有ポリマー等を壁面１１３に塗布して被覆を形成することができる。
【０１０６】
また、壁面１１３の形状は単一の角度を有する斜面に限られず、複数の異なる角度を有する斜面であってもよく、曲面であってもよい。また、孔の第一面１１２又は第二面１１１における開口部の形状は、真円、楕円等の円形であってもよく、四角形、六角形、八角形等の多角形であってもよい。
【０１０７】
他の形態として、例えば、特許第５０７４３８２号公報に開示された方法を用いた、少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造体の空洞部内に、細胞を含む培養液を注入し、前記培養液の一部を前記開口端より下側に突出させる基板も含まれる。あるいは、国際公開第２０１０／０３１１９４号公報に開示された方法である、培養液が第１表面から第２表面に連通する構造を有する基板も含まれる。
【０１０８】
［スフェロイドの製造及び回収方法］
一態様において、本発明は、スフェロイドの製造及び回収方法であって、上述したスフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板の第一面に細胞を播種する工程１と、工程１により第二面に形成される下向き水面上でスフェロイドを培養する工程２と、回収溶液流入部から回収溶液を、第二の基板からの液滴高さがＧになるように流入させる工程３と、回収溶液が、下向き水面と、回収溶液流入部側からスフェロイド回収部側へ接触していくことにより、下向き水面上のスフェロイドが、第二の基板に移動し、更に、スフェロイド回収部へ移動する工程４と、を含む、製造及び回収方法を提供する。
【０１０９】
本態様の製造及び回収方法において、工程３及び工程４は、図１３（ａ）〜（ｄ）を参照しながら上述したものと同様である。本態様の製造及び回収方法によれば、下向き水面の意図しない崩壊や、培地がデバイスからこぼれる等の問題を抑制しながら効率よくスフェロイドを製造及び回収することができる。また、スフェロイド製造及び回収用デバイスの大型化や自動培養装置への組み込みを行うことにより、スフェロイドの製造効率を向上させることも容易である。また、スフェロイドに与えるストレスを最小限に抑制しつつスフェロイドを回収することができるため、高品質なスフェロイドを製造及び回収することができる。
【実施例】
【０１１０】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１１１】
［スフェロイド製造及び回収用デバイスの作製］
実施例１のスフェロイド製造及び回収用デバイスを作製した。図１（ａ）に作製したスフェロイド製造及び回収用デバイスの写真を示す。第一の基板１１０における孔、孔の第一面１１１の開口部、孔の第二面１１２の開口部、壁面１１３の形状は図１４（ａ）〜（ｄ）に示す形状とした。図１４（ａ）は作製したスフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板を第二面１１２側から観察した光学顕微鏡写真であり、第二面１１２付近に焦点を合わせたものである。図１４（ｂ）は図１４（ａ）と同視野の光学顕微鏡写真であるが、第一面１１１付近に焦点を合わせたものである。図１４（ｃ）は作製したスフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板の第二面１１２側を撮影した走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。図１４（ｄ）は作製したスフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板を孔の軸線方向に切断した断面ＳＥＭ写真である。
【０１１２】
実施例１のスフェロイド製造及び回収用デバイスでは、一ピッチＰＩを１．００ｍｍとした。また、孔の第二面１１１の相当直径Ｄを０．５０ｍｍとした。また、壁面１１３の角度θｉを７８°とした。また、第一の基板１１０の厚さＴを１．１ｍｍとした。
【０１１３】
第一の基板１１０の材質としては、接触角θｃが約０°であるものを使用した。具体的には、ガラス基板を疎水性コートして使用した。
【０１１４】
また、第二の基板の材質としてはポリカーボネートを使用した。純水のポリカーボネートに対する接触角を液滴法により測定したところ、約９０°であった。
【０１１５】
［スフェロイドの培養及び回収］
実施例１のスフェロイド製造及び回収用デバイス１００を用いてスフェロイドを培養し、回収した。培地として、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いた。なお、この培地と純水は、接触角θｃについて近傍の値を示すものであった。
【０１１６】
まず、実施例１のスフェロイド製造及び回収用デバイス１００の第一の基板１１０の第一面１１２に、培地の高さＨが１ｃｍ以内になるように細胞を懸濁した培地を添加した。具体的には、マウスＥＳ細胞を７．８×１０６個／４０ｍＬの細胞密度で懸濁した培地を４０ｍＬ添加した。その後細胞を２日間培養した。
【０１１７】
続いて、培養したスフェロイドを回収した。まず、回収溶液流入部１３０に回収溶液を１ｍＬ注入した。回収溶液としては培地を用いた。図１５（ａ）は、回収溶液を注入した直後のスフェロイド製造及び回収用デバイス１００を示す写真である。
【０１１８】
回収溶液を注入した結果、回収溶液流入部１３０側からスフェロイド回収部１４０側に向かって、下向き水面３１１が順次崩壊していき、スフェロイドが第二の基板１２０上に放出された。図１５（ｂ）は、下向き水面３１１が崩壊し、培地が第一の基板１１０の第二面１１１と第二の基板１２０との間隙ｇを満たしていく状態を示す写真である。
【０１１９】
続いて、間隙ｇの培地は、スフェロイドと共にスフェロイド回収部１４０に流入した。この結果、スフェロイドが回収された。図１５（ｃ）はスフェロイドを含む回収溶液がスフェロイド回収部１４０に回収された状態を示す写真である。
【０１２０】
図１６（ａ）及び（ｂ）は、回収したスフェロイドの顕微鏡写真である。図１６（ａ）は倍率１０倍で観察した写真であり、図１６（ｂ）は、倍率７５倍で観察した写真である。その結果、大きさや形が均一なスフェロイドを大量に作製できたことが確認された。
【０１２１】
以上の結果から、実施例１のスフェロイド製造及び回収用デバイス１００を用いることにより、スフェロイド製造及び回収用デバイスを移動させなくても、スフェロイドを容易に回収することができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明によれば、大きさや形が均一なスフェロイドを大量に作製することができ、大型化や自動化に適したスフェロイド製造デバイス、及びこれを用いたスフェロイドの製造方法を提供することができる。
【符号の説明】
【０１２３】
１００…スフェロイド製造及び回収用デバイス、１１０…第一の基板、１２０…第二の基板、１３０…回収溶液流入部、１４０…スフェロイド回収部、１１１…第二面、１１２…第一面、１１３…壁面、３１０…培地、３１１…下向き水面、４１０…スフェロイド、Ｆ０，Ｆ１，Ｆ２…力、ｇ…間隙、Ｇ…液滴高さ、Ｄ…相当直径、Ｒ…相当半径、θｉ…角度、Ｔ…厚さ、Ｈ…高さ、ＰＩ…ピッチ、Ｗ…幅。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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