(57)【要約】【課題】外力支援型センサを用いて、利便性良く、高精度かつ安定的に標的物質を検出すること。【解決手段】標的物質Ｔの被検体液と、標的物質Ｔと結合体を形成する磁性粒子Ｍと標的物質Ｔと前記結合体を形成する光応答性物質Ｏを含む第１の検出材及び標的物質Ｔと前記結合体を形成する光応答性磁性粒子を含む第２の検出材の少なくともいずれかの検出材と、標的物質Ｔと前記検出材とを結合させる結合物質Ｂを含む含結合物質液とを用い、前記被検体液と前記含結合物質液とを混合させて混合液を調製後、前記混合液に前記検出材液を混合させて液体試料を調製する。【選択図】図１（ｃ）
2019211453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質の被検体液と、前記標的物質と結合体を形成する磁性粒子及び前記標的物質と前記結合体を形成する光応答性物質を含む第１の検出材及び前記標的物質と前記結合体を形成する光応答性磁性粒子を含む第２の検出材の少なくともいずれかの検出材を含む含検出材液と、前記標的物質と前記検出材とを結合させる結合物質を含む含結合物質液とを用い、前記被検体液と前記含結合物質液とを混合させて混合液を調製後、前記混合液に前記含検出材液を混合させて液体試料を調製する液体試料調製工程と、
前記液体試料が表面上に導入されるとともに裏面側又は前記表面側から照射される光の透過光を伝搬光として前記光が照射される側と反対の面側に伝搬可能とされる透光板、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面側から照射される光の反射光を前記伝搬光として前記表面上方に伝搬可能な反射板、前記液体試料が前記表面上に導入される導入板及び前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面に対して全反射条件で照射される光により前記表面上に近接場光を発生可能な検出板のいずれかで形成される液体試料導入板が配され、かつ、前記液体試料が前記液体試料導入板の前記表面上に保持可能とされる液体試料保持部に対し、前記液体試料導入板の表面上に前記液体試料を導入し保持する液体試料導入保持工程と、
前記液体試料導入板が前記透光板で形成されるときに前記液体試料導入板の前記裏面側から前記光を照射する裏面側光照射工程、前記液体試料導入板が前記透光板及び前記反射板のいずれかで形成されるときに前記液体試料導入板の前記表面側から前記光を照射する表面側光照射工程、前記液体試料導入板が前記導入板で形成されるときに前記液体試料導入板上に保持される前記液体試料に対して前記液体試料導入板の側面側から前記光を照射する側面側光照射工程及び前記液体試料導入板が前記検出板で形成されるときに前記表面に対して全反射条件で前記光を照射する全反射光照射工程のいずれかである光照射工程と、
前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向及び前記液体試料導入板から遠ざかる方向のいずれかの方向に移動させる第１の結合体移動工程並びに前記液体試料導入板の前記裏面側に配される磁場印加部からの磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で前記磁場印加部を前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、前記磁場印加部の移動に追従させて前記結合体を移動させる第２の結合体移動工程のいずれかである結合体移動工程と、
前記結合体移動工程に伴う前記結合体の移動を前記伝搬光又は前記近接場光に基づく光信号の信号変化により検出する光信号検出工程と、
を含むことを特徴とする標的物質検出方法。
【請求項２】
光応答性物質及び光応答性磁性粒子が、伝搬光又は近接場光の照射を受けて散乱光を発生させる請求項１に記載の標的物質検出方法。
【請求項３】
光応答性物質及び光応答性磁性粒子が、伝搬光又は近接場光の照射を受けて蛍光を発生させる請求項１に記載の標的物質検出方法。
【請求項４】
光応答性磁性粒子が、蛍光色素を含む磁性粒子である請求項３に記載の標的物質検出方法。
【請求項５】
光信号検出工程が伝搬光に基づく光信号の信号変化を検出する工程であるときに、光応答性物質及び光応答性磁性粒子が前記伝搬光の照射を受けて光吸収を生じる光吸収物質を含む請求項１に記載の標的物質検出方法。
【請求項６】
検出材として第２の検出材を用いるときに、光信号検出工程が伝搬光又は近接場光の照射を受けた光応答性磁性粒子から生じ、かつ、１つの標的物質に対し２つ以上の前記光応答性磁性粒子が結合した前記結合体に基づく光信号のみを信号変化の対象として検出する工程とされる請求項１に記載の標的物質検出方法。
【請求項７】
光応答性物質及び光応答性磁性粒子が、直径５０ｎｍ〜６，５００ｎｍの球状粒子である請求項２に記載の標的物質検出方法。
【請求項８】
結合体移動工程が第１の結合体移動工程であるときに、更に、液体試料導入保持工程後、結合体移動工程前に、引き寄せ磁場の印加により液体試料中の結合体の全部又は一部を一旦液体試料導入板の表面上に引き寄せる結合体引き寄せ工程を実施する請求項１から７のいずれかに記載の標的物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料中に存在する標的物質を磁場を利用して移動させたときの光信号の変化を利用して前記標的物質を検出する標的物質検出方法の好適な実施方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、溶液中に存在する微小物質、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、細菌等の生体関連物質を標的物質として、これらを検出・定量する方法の開発が進められている。
前記標的物質に磁性粒子を結合させた結合体を磁場の印加前後で比較観察することで前記標的物質の検出を行う外力支援型センサ（例えば、外力支援近接場照明バイオセンサ（External-Force-Assisted Near Field Illumination Biosensor）、非特許文献１，２参照）は、その一つであり、前記磁性粒子と結合した前記標的物質に基づく光信号が前記磁場の印加前後で移動する一方、検出に用いる検出チップ表面のキズ等に由来するノイズ信号が前記磁場の印加前後で移動しないことを利用して、前記ノイズ信号を排除した前記標的物質の高精度検出を可能とする。
【０００３】
前記外力支援型センサを用いた前記標的物質の検出場面では、前記磁性粒子、更に前記磁性粒子が検出用の光信号を生じさせない場合には、光応答性物質（金ナノ粒子等）に対する前処理が行われる。
例えば、インフルエンザウイルス、ノロウイルス等の抗原を前記標的物質とする場合、前記抗原と特異的に結合する結合物質（抗体）を、予め前記磁性粒子及び前記光応答性物質と結合させたものを準備し、これを温度管理された収容庫に保存しておくことが行われる。
このような前処理を行い、前記結合物質と結合された状態の前記磁性粒子及び前記光応答性物質を大量に保存しておくと、前記標的物質の検出を行う毎に、前記結合物質と前記磁性粒子及び前記光応答性物質とを結合させたものを準備する必要がなく、迅速に検出準備を完了させることができる。
そして、前記標的物質の検出場面では、前記標的物質の被検体液に対して、予め保存されていた前記結合物質と前記磁性粒子及び前記光応答性物質とを結合させたものを加え、前記磁性粒子と結合した状態の前記結合物質及び前記光応答性物質と結合した状態の前記結合物質を前記標的物質に結合させた結合体を得て、これを検出する。即ち、前記標的物質に結合された前記磁性粒子に基づき、前記標的物質を磁場の印加前後で移動させ、また、この移動状況を前記標的物質に結合された前記光応答性物質に基づく光信号により観察して、前記標的物質の検出を行うことができる。
【０００４】
しかしながら、前記結合物質と結合された状態の前記磁性粒子及び前記光応答性物質の保存物を用いると、前記標的物質の安定的な検出結果が得られないことが、その後の検討で明らかになってきた。
即ち、前記結合物質と前記磁性粒子及び前記光応答性物質とは、一旦、これらの間で結合が形成されても、保存状態により、これらの間の結合が解けてしまうものが出てくることが明らかになってきた。
こうした問題を解決するため、前記結合物質側の結合が安定する−２０℃〜−８０℃の低温環境下で冷凍保存しておくことが考えられるが、このような冷凍保存を行うと、前記結合物質と結合させるための前記磁性粒子及び前記光応答性物質が破損することとなるため、４℃で冷蔵保存せざるを得ない。
前記外力支援型センサでは、前記磁性粒子及び前記光応答性物質と結合していない前記標的物質が検出漏れの形で検出されないことから、前記結合物質と前記磁性粒子及び前記光応答性物質との間の結合が保存状態によって不安定であると、前記磁性粒子及び前記光応答性物質と前記標的物質との前記結合体の形成が不安定となり、結果として、前記標的物質の高精度かつ安定的な検出が困難となる。
つまり、前記結合物質と結合された状態の前記磁性粒子及び前記光応答性物質の前記保存物を用いると、用法用量が同じであっても、保存状態の影響を受けることで異なる検出結果が得られ、前記標的物質の高精度かつ安定的な検出が困難となる。
【０００５】
また、前記保存物を用いることは、用途が限定されるデメリットを持つ。
即ち、前記標的物質と結合する前記結合物質の種類は、前記標的物質の種類（ウイルスやタンパク質）毎に異なるため、一度、前記磁性粒子及び前記光応答性物質と結合させてしまうと、これら磁性粒子及び光応答性物質は、特定種類の前記標的物質を検出する用途にしか用いることができず、汎用性がなく利便性に欠けることとなる。
【０００６】
また、迅速性よりも正確性や安定性が優先される場面では、前記結合物質と結合された状態の前記磁性粒子及び前記光応答性物質の前記保存物を用いるメリットよりもデメリットが大きくなる。
例えば、水処理場では、処理後の水中に含まれる極めて微量（１Ｌ中、１，０００個〜１００，０００個程度）のウイルスを検査する必要性があるが、こうした検査は、１日に１度行えば足り、迅速性よりも検出結果の正確性及び安定性が優先されることから、前記保存物を用いるデメリットが大きくなる。また、大学等の研究機関で、特定疾患の発症と感染ウイルス数との関係性を調べる場合など、血液サンプルや尿サンプルに含まれる少量のウイルスを検査する必要があるが、こうした検査では、迅速性よりも検出結果の正確性及び安定性が優先されることから、前記保存物を用いるデメリットが大きくなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】安浦 雅人、藤巻 真「微量検出のための導波モードイメージセンサの開発」電気学会研究会資料  センサ・マイクロマシン部門総合研究会（２０１６年６月２９日，３０日）、ｐｐ．４５〜５２、一般社団法人電気学会（２０１６年）
【非特許文献２】M. Yasuura and M. Fujimaki, Sci. Rep. Vol. 6, pp. 39241-1-39241-7 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来技術における前記諸問題を解決し、前記外力支援型センサを用いて、利便性良く、高精度かつ安定的に標的物質を検出可能な標的物質検出方法を提供することを目的とする。
【０００９】
前記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討を行った結果、次の知見が得られた。
前記結合物質と結合された状態の前記磁性粒子及び前記光応答性物質の前記保存物を用いない方法として、次の２つの方法を考える。
先ず、前記磁性粒子及び前記光応答性物質に前記結合物質を結合させた後、これを保存せず、直ちに用いる第１の方法である。
しかしながら、前記第１の方法では、前記磁性粒子及び前記光応答性物質に対する前記結合物質の結合完了のタイミングを見計らって、前記外力支援型センサの検査準備を進める必要があり、ユーザに不便を与えるばかりか、前記結合完了のタイミングに対して前記検査準備が遅れると、前記保存物を用いる場合と同様のデメリットが生じる。
一方、前記標的物質を含む前記被検体液に対し、先に前記結合物質を加え、後に前記磁性粒子及び前記光応答性物質を加える第２の方法では、前記第１の方法における問題を生じさせずに、前記標的物質と前記結合物質を介した前記磁性粒子及び前記光応答性物質との結合体が高確率かつ安定的に得られる。
したがって、前記第２の方法によれば、前記外力支援型センサを用いて、利便性良く、高精度かつ安定的に前記標的物質を検出することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、次の通りである。即ち、
＜１＞  標的物質の被検体液と、前記標的物質と結合体を形成する磁性粒子及び前記標的物質と前記結合体を形成する光応答性物質を含む第１の検出材及び前記標的物質と前記結合体を形成する光応答性磁性粒子を含む第２の検出材の少なくともいずれかの検出材を含む含検出材液と、前記標的物質と前記検出材とを結合させる結合物質を含む含結合物質液とを用い、前記被検体液と前記含結合物質液とを混合させて混合液を調製後、前記混合液に前記含検出材液を混合させて液体試料を調製する液体試料調製工程と、前記液体試料が表面上に導入されるとともに裏面側又は前記表面側から照射される光の透過光を伝搬光として前記光が照射される側と反対の面側に伝搬可能とされる透光板、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面側から照射される光の反射光を前記伝搬光として前記表面上方に伝搬可能な反射板、前記液体試料が前記表面上に導入される導入板及び前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面に対して全反射条件で照射される光により前記表面上に近接場光を発生可能な検出板のいずれかで形成される液体試料導入板が配され、かつ、前記液体試料が前記液体試料導入板の前記表面上に保持可能とされる液体試料保持部に対し、前記液体試料導入板の表面上に前記液体試料を導入し保持する液体試料導入保持工程と、前記液体試料導入板が前記透光板で形成されるときに前記液体試料導入板の前記裏面側から前記光を照射する裏面側光照射工程、前記液体試料導入板が前記透光板及び前記反射板のいずれかで形成されるときに前記液体試料導入板の前記表面側から前記光を照射する表面側光照射工程、前記液体試料導入板が前記導入板で形成されるときに前記液体試料導入板上に保持される前記液体試料に対して前記液体試料導入板の側面側から前記光を照射する側面側光照射工程及び前記液体試料導入板が前記検出板で形成されるときに前記表面に対して全反射条件で前記光を照射する全反射光照射工程のいずれかである光照射工程と、前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向及び前記液体試料導入板から遠ざかる方向のいずれかの方向に移動させる第１の結合体移動工程並びに前記液体試料導入板の前記裏面側に配される磁場印加部からの磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で前記磁場印加部を前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、前記磁場印加部の移動に追従させて前記結合体を移動させる第２の結合体移動工程のいずれかである結合体移動工程と、前記結合体移動工程に伴う前記結合体の移動を前記伝搬光又は前記近接場光に基づく光信号の信号変化により検出する光信号検出工程と、を含むことを特徴とする標的物質検出方法。
＜２＞  光応答性物質及び光応答性磁性粒子が、伝搬光又は近接場光の照射を受けて散乱光を発生させる前記＜１＞に記載の標的物質検出方法。
＜３＞  光応答性物質及び光応答性磁性粒子が、伝搬光又は近接場光の照射を受けて蛍光を発生させる前記＜１＞に記載の標的物質検出方法。
＜４＞  光応答性磁性粒子が、蛍光色素を含む磁性粒子である前記＜３＞に記載の標的物質検出方法。
＜５＞  光信号検出工程が伝搬光に基づく光信号の信号変化を検出する工程であるときに、光応答性物質及び光応答性磁性粒子が前記伝搬光の照射を受けて光吸収を生じる光吸収物質を含む前記＜１＞に記載の標的物質検出方法。
＜６＞  検出材として第２の検出材を用いるときに、光信号検出工程が伝搬光又は近接場光の照射を受けた光応答性磁性粒子から生じ、かつ、１つの標的物質に対し２つ以上の前記光応答性磁性粒子が結合した前記結合体に基づく光信号のみを信号変化の対象として検出する工程とされる前記＜１＞に記載の標的物質検出方法。
＜７＞  光応答性物質及び光応答性磁性粒子が、直径５０ｎｍ〜６，５００ｎｍの球状粒子である前記＜２＞に記載の標的物質検出方法。
＜８＞  結合体移動工程が第１の結合体移動工程であるときに、更に、液体試料導入保持工程後、結合体移動工程前に、引き寄せ磁場の印加により液体試料中の結合体の全部又は一部を一旦液体試料導入板の表面上に引き寄せる結合体引き寄せ工程を実施する前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の標的物質検出方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来技術における前記諸問題を解決でき、前記外力支援型センサを用いて、利便性良く、高精度かつ安定的に標的物質を検出可能な標的物質検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１（ａ）】未結合の標的物質Ｔを示す説明図である。
【図１（ｂ）】標的物質Ｔに結合物質Ｂを結合させた状態を示す説明図である。
【図１（ｃ）】標的物質Ｔに結合物質Ｂを介して磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏを結合させた結合体を示す説明図である。
【図２】結合体が得られない状況を示す図である。
【図３】標的物質Ｔに結合物質Ｂを介して光応答性磁性粒子ＭＯが１つ結合した結合体を示す説明図である。
【図４】未結合の光応答性磁性粒子ＭＯを示す説明図である。
【図５】標的物質Ｔに結合物質Ｂを介して光応答性磁性粒子ＭＯが２つ結合した結合体を示す説明図である。
【図６】標的物質Ｔに結合物質Ｂを介して磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏが３つ結合した結合体を示す説明図である。
【図７】標的物質検出装置１の説明図である。
【図８】撮像デバイスで観察される観察視野内の液体試料導入板の表面上の様子を模式的に示す図である。
【図９】図８におけるＡ−Ａ線断面図である。
【図１０】結合体移動工程後、撮像デバイスで観察される観察視野内の液体試料導入板の表面上の様子を模式的に示す図（１）である。
【図１１】図１０におけるＡ−Ａ線断面図である。
【図１２】標的物質検出装置１Ａの説明図である。
【図１３】標的物質検出装置１Ｂの説明図である。
【図１４】結合体移動工程後、撮像デバイスで観察される観察視野内の液体試料導入板の表面上の様子を模式的に示す図（２）である。
【図１５】図１４におけるＡ−Ａ線断面図である。
【図１６】標的物質検出装置１０の説明図である。
【図１７】結合体移動工程後、撮像デバイスで観察される観察視野内の液体試料導入板の表面上の様子を模式的に示す図（３）である。
【図１８】図１７におけるＡ−Ａ線断面図である。
【図１９】標的物質検出装置２０の説明図である。
【図２０】標的物質検出装置２０Ａの説明図である。
【図２１】標的物質検出装置３０の説明図である。
【図２２】標的物質検出装置４０の説明図である。
【図２３】結合体移動工程前における、液体試料導入板の前記表面上の様子を示す図（１）である。
【図２４】結合体移動工程後における、液体試料導入板の前記表面上の様子を示す図（１）である。
【図２５】標的物質検出装置５０の説明図である。
【図２６】結合体移動工程前における、液体試料導入板の前記表面上の様子を示す図（２）である。
【図２７】結合体移動工程後における、液体試料導入板の前記表面上の様子を示す図（２）である。
【図２８】実施例１、比較例１及び比較例２に係る各標的物質検出方法による試験結果を最大希釈倍率により示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る標的物質検出方法は、標的物質に磁性粒子を結合させた結合体を磁場の印加前後で比較観察することで前記標的物質の検出を行う外力支援型センサを用いて実施することができる。
本発明に係る前記標的物質検出方法の説明に先立って、前記外力支援型センサを詳細に説明する。なお、以下では、前記外力支援型センサを「標的物質検出装置」と称して説明を行う。
【００１４】
（標的物質検出装置）
前記標的物質検出装置は、液体試料保持部と、光照射部と、磁場印加部と、光信号検出部とを有し、必要に応じて、その他の部を有する。
【００１５】
＜液体試料保持部＞
前記液体試料保持部は、液体試料導入板が配され、かつ、液体試料が前記液体試料導入板の表面上に保持される部である。
【００１６】
−液体試料導入板−
前記液体試料導入板は、前記液体試料が表面上に導入されるとともに裏面側又は前記表面側から照射される光の透過光を伝搬光として前記光が照射される側と反対の面側に伝搬可能とされる透光板、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面側から照射される光の反射光を前記伝搬光として前記表面上方に伝搬可能な反射板、前記液体試料が前記表面上に導入される導入板、及び、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面に対して全反射条件で照射される光により前記表面上に近接場光を発生可能な検出板のいずれかで形成される。
なお、前記伝搬光とは、一般に発生源から数百ｎｍ〜数μｍ以内の距離だけ離れた位置で急激な減衰を示す近接場光を含まない光とされるが、本明細書においても、前記近接場光を含まないことを意味し、前記液体試料導入板の前記表面から数百ｎｍ〜数μｍ以内の距離だけ離れた位置で急激な減衰を示すことのない光を意味する。また、前記近接場光とは、前記液体試料導入板の前記表面から数百ｎｍ〜数μｍ以内の距離だけ離れた位置で急激な減衰を示す光を意味する。
【００１７】
前記透光板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の透過型顕微鏡や公知の落射型顕微鏡の観察用ステージに用いられるガラス板、プラスチック板などの公知の透光板を用いることができる。
また、前記反射板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の落射型顕微鏡の観察用ステージに用いられるガラス板、プラスチック板、金属板などの公知の反射板を用いることができる。
また、前記導入板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記透光板、前記反射板を含み、この他の液体試料を導入するための公知の板状部材を用いることができる。
また、前記検出板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の表面プラズモン共鳴センサや公知の導波モードセンサに用いられる検出板などの公知の検出板を用いることができる。
【００１８】
前記液体試料導入板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記表面が前記結合体の吸着を抑制する吸着抑制剤で表面処理されていることが好ましい。このような表面処理が施されていると、前記結合体が前記液体試料導入板の前記表面に吸着されることが抑制され、前記磁場印加部による移動を補助することができる。
前記吸着抑制剤としては、特に制限はなく、前記結合体を構成する物質の種類に応じて、公知の吸着抑制剤から適宜選択することができる。
例えば、前記表面処理の手法として、前記標的物質が前記タンパク質である場合には、前記タンパク質の吸着を抑制する公知のブロッキング法を選択することができる。前記ブロッキング法としては、特に制限はなく、例えば、ポリエチレングリコールを用いる手法、エタノールアミンを用いる方法、スキムミルクを用いる方法、シランカップリング剤を用いる方法などが挙げられる。
【００１９】
前記液体試料保持部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記液体試料導入板そのもので構成されてもよく、また、前記液体試料をカバーガラス等の板状透光部材と前記液体試料導入板とで挟み、前記液体試料の液層を前記液体試料導入板の前記表面上に保持する構成でもよい。
また、前記液体試料保持部の構成としては、底面が前記液体試料導入板で構成される枡状の液体セルで構成することもできる。
なお、前記液体試料保持部としては、１つの前記液体試料導入板の前記表面上の領域を複数に分画してマルチチャンネル化させてもよい。
【００２０】
また、前記液体試料保持部としては、外部と前記液体試料導入板の表面上の空間との間で送液可能な流路が形成されることが好ましい。
即ち、前記標的物質検出装置によれば、前記液体試料導入板に吸着した夾雑物の存在を無視した前記標的物質の検出を行うことができることから、前記液体試料導入板の洗浄処理を逐次行うことなく次の検出を行うことができるため、前記液体試料保持部に前記流路が形成される場合、前記流路を介した前記液体試料の導入と排出とを通じて前記液体試料を交換するだけで次の検出を進めることができ、より一層、検出操作を効率化させることができる。
なお、本明細書において「洗浄処理」とは、前記液体試料導入板の前記表面に吸着した前記夾雑物を物理的な磨き処理や化学薬品を用いた剥離処理、溶解処理によって取り除く処理を意味し、前記液体試料の交換時に水で濯ぐ処理を含まない。
【００２１】
＜光照射部＞
前記光照射部は、裏面側光照射部、表面側光照射部、側面側光照射部及び全反射光照射部のいずれかで形成される。
【００２２】
前記裏面側光照射部は、前記液体試料導入板が前記透光板で形成されるときに前記液体試料導入板の前記裏面から前記光を照射可能とされる。
前記裏面側光照射部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の透過型顕微鏡に用いられる公知の光照射部と同様に構成することができる。
【００２３】
前記表面側光照射部は、前記液体試料導入板が前記透光板及び前記反射板のいずれかで形成されるときに前記液体試料導入板の前記表面側から前記光を照射可能とされる。
前記表面側光照射部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の落射型顕微鏡や実体顕微鏡に用いられる公知の光照射部と同様に構成することができる。
【００２４】
前記側面側光照射部は、前記液体試料導入板が前記導入板で形成されるときに前記液体試料導入板上に保持される前記液体試料に対して前記液体試料導入板の側面側から前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向で前記光を照射可能とされる。
前記側面側光照射部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の光照射部と同様に構成することができる。
【００２５】
前記全反射光照射部は、前記液体試料導入板が前記検出板で形成されるときに前記表面に対して全反射条件で前記光を照射可能とされる。前記表面における全反射は、前記検出板の前記表面において全反射条件を満たすことが可能であれば、前記光の入射方向に特に制限はない。例えば、前記検出板表面を導波路構造にすることで、前記検出板の前記表面側、前記裏面側又は前記側面側に形成したグレーティング、若しくは、前記表面側、前記裏面側又は前記側面側に配したプリズムを介して前記導波路構造に前記光を前記表面側から導入し、前記導波路構造内での全反射を利用して前記検出板表面での全反射条件を満たすことができる。また、前記プリズムは前記検出板の一部構造として形成されてもよい。
前記全反射光照射部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の全反射顕微鏡や公知の表面プラズモン共鳴センサや公知の導波モードセンサに用いられる公知の光照射部と同様に構成することができる。
【００２６】
なお、前記裏面側光照射部、前記表面側光照射部、前記側面側光照射部及び前記全反射光照射部における光源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知のランプ、ＬＥＤ装置、レーザ光照射装置などの発光装置を用いることができる。
また、前記裏面側光照射部、前記表面側光照射部及び前記全反射光照射部としては、前記光源以外の光学要素についても特に制限はなく、公知の光学顕微鏡、公知の表面プラズモン共鳴センサや公知の導波モードセンサに用いられる公知の光学要素を目的に応じて適宜採用して構成することができる。
【００２７】
＜磁場印加部＞
前記磁場印加部は、第１の磁場印加部及び第２の磁場印加部のいずれかで形成される。前記第１の磁場印加部及び前記第２の磁場印加部のいずれの磁場印加部も、前記液体試料導入部の前記表面上に導入された前記結合体を移動させる役割を有し、前記標的物質検出装置では、前記結合体の移動を前記標的物質の検出に利用する。
【００２８】
−第１の磁場印加部−
前記第１の磁場印加部は、前記液体試料導入板の前記表面側又は前記側面側に配されるとともに前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向及び前記液体試料導入板から遠ざかる方向のいずれかの方向に移動させる部材である。
前記第１の磁場印加部としては、このような部材であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の電磁石及び永久磁石を用いて構成することができる。なお、前記永久磁石を用いる場合、例えば、移動部材に前記永久磁石を保持し、前記永久磁石による前記磁場が前記液体試料導入板の前記表面上に及ぶ近接状態と前記永久磁石による前記磁場が前記液体試料導入板の前記表面上に及ばない離間状態との間で移動制御し、前記液体試料導入板の前記表面上に対する前記磁場の印加状態をオン−オフさせる構成とすることができる。また、例えば、公知の磁気シールド部材を、前記液体試料導入板の前記表面上に前記磁場を印加させる開放状態と前記液体試料導入板の前記表面上に前記磁場を印加させない遮蔽状態とで開閉制御し、前記液体試料導入板の前記表面上に対する前記磁場の印加状態をオン−オフさせる構成とすることができる。また、前記電磁石を用いる場合には、前記電磁石の励磁と消磁とを通じて前記液体試料導入板の前記表面上に対する前記磁場の印加状態のオン−オフ制御を行うことができる。
また、前記第１の磁場印加部としては、特に制限はないが、貫通孔が形成されている、或いはＵ字型などの不完全な環状、或いは複数の部材が環状乃至不完全な環状に配置された構成であることが好ましい。このように前記第１の磁場印加部を形成すると、前記表面側光照射部を用いた場合に前記貫通孔或いは前記環状乃至前記不完全な環状の内側を通じた前記液体試料導入板の前記表面側からの光照射が可能となるとともに、前記表面側光照射部、前記裏面側光照射部、前記側面側光照射部及び前記全反射光照射部のいずれの場合も前記液体試料導入板の前記表面上方に伝搬される前記伝搬光に基づく光信号を前記貫通孔或いは前記環状に配置された部材の内側を通じて前記光信号検出部で検出することが可能となる。なお、前記環状に配置された部材は、前記光照射や光信号の光路を妨げない配置であれば特に制限はなく、磁場の印加状態の制御が個別に行えるものでもよい。
【００２９】
−第２の磁場印加部−
前記第２の磁場印加部は、前記液体試料導入板の前記裏面側に配されるとともに前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面側に引き寄せ可能とされるとともに前記磁場を印加した状態で前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動可能とされる部材である。
前記第２の磁場印加部としては、このような部材であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の電磁石及び永久磁石を用いて構成することができる。例えば、スライド部材上に前記電磁石又は前記永久磁石を保持し、前記液体試料導入板の前記表面側光照射部、前記裏面側光照射部、前記側面側光照射部又は前記全反射光照射部における前記光照射部から前記光を照射する領域（検出領域）の近傍に前記電磁石又は前記永久磁石を位置させる初期状態と、前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に向けて前記電磁石又は前記永久磁石を移動させた状態との間で移動制御させることで構成することができる。なお、前記電磁石を用いる場合、前記移動制御中、連続的或いは断続的に励磁させた状態とする。また、前記移動制御中に励磁の強度を変化させてもよい。
また、複数の前記電磁石又は永久磁石を配置し、各部材における前記磁場の印可状態を制御することによっても、前記スライド部材上に前記電磁石又は前記永久磁石を保持して前記移動制御を行う構成と同等の効果を得ることができる。
また、前記第２の磁場印加部としては、特に制限はないが、貫通孔が形成されている、或いはＵ字型などの不完全な環状、或いは複数の部材が環状乃至不完全な環状に配置された構成であることが好ましい。このように前記第２の磁場印加部を形成すると、前記裏面側光照射部において前記貫通孔或いは前記環状乃至前記不完全な環状の内側を通じた前記液体試料導入板の裏面側からの光照射が可能となる。なお、前記環状に配置された部材は、前記光照射や光信号の光路を妨げない配置であれば特に制限はなく、磁場の印加状態の制御が個別に行えるものでもよい。
【００３０】
＜光信号検出部＞
前記光信号検出部は、前記液体試料導入板の前記表面側、前記裏面側又は前記側面側に配されるとともに前記第１の磁場印加部による前記磁場の印加及び前記第２の磁場印加部の移動に伴う前記結合体の移動を前記伝搬光又は前記近接場光に基づく光信号の信号変化により検出可能とされる。
【００３１】
前記光信号検出部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、フォトダイオード、光電子増倍管などの公知の光検出器や対物レンズ等の公知の光学要素を用いて構成することができる。
また、前記光信号検出部としては、特に制限はないが、前記液体試料導入板の前記表面上の検出領域の様子を２次元画像として取得可能とされることが好ましい。前記２次元画像を取得できると、光点や暗点として現れる前記２次元画像中の前記光信号の位置情報やサイズ情報を容易に取得することができ、前記結合体の移動前後の前記２次元画像同士を比較して、前記光信号が前記結合体に関与する情報であるのか、或いは、前記液体試料導入板の前記表面上のキズ、前記夾雑物、光源出力の揺らぎ等の前記結合体に関与しない情報であるのかを明確に区別することが可能となる。このような２次元画像の取得を可能とするには、前記光信号検出部として撮像デバイスを選択すればよい。さらには、前記２次元画像を連続的に撮像し、動画として観察を行うと、光点や暗点として現れる前記２次元画像中の前記光信号が移動する様子をより明確に識別することができる。
前記撮像デバイスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＣＤイメージセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサなどの公知のイメージセンサを用いることができる。
なお、前記光信号検出部により前記光信号を検出する方法としては、前記光信号検出部の結像可能範囲外及び前記近接場光の発生領域（前記液体試料導入板の前記表面から数百ｎｍ〜数μｍ上方の領域）外に存在する前記結合体の検出漏れを防ぐため、一旦、前記液体試料導入板の前記表面上ないし前記表面近傍に前記結合体を配した後に検出を実施する方法が好ましい。
また、前記標的物質を検出することとしては、前記標的物質の有無の検出、前記標的物質の存在量の検出（定量測定）、前記標的物質の存在状況のリアルタイム観察等が挙げられる。
【００３２】
前記磁場印加部による前記結合体の移動に伴う前記光信号検出部における検出について説明する。
前記光信号検出部で検出される前記伝搬光に基づく前記光信号には、公知の前記透過型顕微鏡や前記落射型顕微鏡で取得される光信号と同様に、前記液体試料導入板の前記表面上方に伝搬される前記伝搬光の前記液体試料に対する透過光や反射光の光信号１と、前記液体試料中の前記結合体に前記伝搬光が照射されたときに発生し、光信号１と識別可能な光信号２と、前記液体試料中の前記夾雑物に前記伝搬光が照射されたときに発生し、光信号１と識別可能な光信号３と、前記液体試料導入板の前記表面に存在するキズや前記表面に吸着した前記夾雑物に前記伝搬光が照射されたときに発生する光信号４などが存在する。また、前記光信号には、光源出力の揺らぎなどを原因とするノイズ信号も含まれる。
バックグラウンド信号として処理される光信号１を除き、光信号２〜４や前記ノイズ信号を区別することができない場合、検出精度の低下を招くこととなる。
しかしながら、前記標的物質検出装置では、前記結合体の前記第１の磁場印加部及び前記第２の磁場印加部で形成される前記磁場印加部に基づいて前記結合体を移動させ、その移動を前記伝搬光に基づく前記光信号の信号変化として検出するため、光信号２と光信号３，４及び前記ノイズ信号とを明確に区別することができる。
即ち、光信号３，４や前記ノイズ信号は、前記第１の磁場印加部による磁場の印加前後及び前記第２の磁場印加部の移動前後において変化しない光信号であるのに対し、光信号２は、前記磁性粒子を含む前記結合体に起因するため、前記第１の磁場印加部による磁場の印加前後及び前記第２の磁場印加部の移動前後において変化する光信号であることから、前記伝搬光に基づく前記光信号の信号変化を検出することで、前記結合体、延いては前記結合体を構成する前記標的物質の検出を高精度に行うことができる。
【００３３】
ここで、変化する前記光信号として着目される光信号２の態様としては、前記標的物質の検出に用いる検出材の種類や前記標的物質検出装置の光学系の種類に応じて様々な態様を取り得る。即ち、光信号２としては、前記光応答性物質又は前記光応答性磁性粒子が前記伝搬光の照射を受けたときに発する、散乱光、反射光、位相差、微分干渉に基づく透過光、前記光応答性物質又は前記光応答性磁性粒子の蛍光、燐光等の発光、及び前記磁性粒子又は前記光応答性物質の光吸収に基づく光信号等が挙げられる。なお、前記位相差、前記微分干渉に基づく透過光を光信号２として検出する場合、前記液体試料保持部、前記光照射部及び前記光信号検出部のそれぞれを、公知の位相差顕微鏡、公知の微分干渉顕微鏡における光学系にしたがって構成する。
また、光信号２の変化の態様としては、強度の増減、位相変化、位置移動、焦点ずれ、及び出現・消失が挙げられる。
【００３４】
また、前記光信号検出部で検出される前記近接場光に基づく前記光信号には、公知の表面プラズモン共鳴センサや公知の導波モードセンサで取得される光信号と同様に、前記液体試料中の前記結合体に前記近接場光が照射されたときに発生する光信号５と、前記液体試料中の前記夾雑物に前記近接場光が照射されたときに発生する光信号６と、前記液体試料導入板の前記表面に存在するキズや前記表面に吸着した前記夾雑物に前記近接場光が照射されたときに発生する光信号７などが存在する。また、前記光信号には、光源出力の揺らぎなどを原因とするノイズ信号も含まれる。
即ち、前記近接場光を利用する場合も、前記伝搬光を利用する場合と同様、光信号５〜７や前記ノイズ信号を区別することができない場合、検出感度の低下を招くこととなる。
しかしながら、前記標的物質検出装置では、前記結合体の前記第１の磁場印加部及び前記第２の磁場印加部で形成される前記磁場印加部に基づいて前記結合体を移動させ、その変化を前記近接場光に基づく前記光信号の信号変化として検出するため、光信号５と光信号６，７及び前記ノイズ信号とを明確に区別することができる。
即ち、光信号６，７や前記ノイズ信号は、前記第１の磁場印加部による磁場の印加前後及び前記第２の磁場印加部の移動前後において変化しない光信号であるのに対し、光信号５は、前記磁性粒子を含む前記結合体に起因するため、前記第１の磁場印加部による磁場の印加前後及び前記第２の磁場印加部の移動前後において変化する光信号であることから、前記近接場光に基づく前記光信号の信号変化を検出することで、前記結合体、延いては前記結合体を構成する前記標的物質の検出を高精度に行うことができる。
【００３５】
ここで、変化する前記光信号として着目される光信号５の態様としては、前記光応答性物質及び前記光応答性磁性粒子の種類や前記標的物質検出装置の光学系の種類に応じて様々な態様を取り得る。即ち、光信号５としては、前記結合体が前記近接場光の照射を受けたときに発する散乱光、蛍光等の発光、及び前記結合体の光吸収に基づく光信号等が挙げられる。
また、光信号５の変化の態様としては、強度の増減、位置移動、及び出現・消失が挙げられる。
【００３６】
＜その他の部＞
前記その他の部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、第３の磁場印加部、公知の透過型顕微鏡、公知の落射型顕微鏡、公知の全反射顕微鏡、公知の表面プラズモン共鳴センサ、公知の導波モードセンサ等に用いられる任意の部が挙げられる。
【００３７】
−第３の磁場印加部−
前記第３の磁場印加部は、前記磁場印加部が前記第１の磁場印加部で形成されるときに、更に、前記液体試料導入板の前記裏面側に配されるとともに前記液体試料導入板に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せ可能とされる部である。
【００３８】
前記磁場印加部が前記第２の磁場印加部で形成される場合、前記液体試料中の前記結合体が前記磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せられる。そのため、前記光信号検出部による前記光信号の検出を前記液体試料導入板の前記表面ないしその近傍に焦点を当てて行うことで、前記表面上に引き寄せられた前記結合体の移動状況を検出することができる。
しかしながら、前記磁場印加部が前記第１の磁場印加部で形成される場合、前記光信号検出部による前記光信号の検出を前記液体試料導入板の前記表面ないしその近傍に焦点を当てて行う際、必ずしも前記結合体が前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せられた状態ではなく、例えば、前記液体試料を前記液体試料導入板に導入させた直後においては、前記結合体が前記液体試料の液層中に浮遊した状態とされる。浮遊状態の前記結合体が前記光信号検出部で前記光信号を検出可能な結像可能範囲の外方や前記近接場光の発生領域の外方に存在すると、前記結合体が検出されないこととなる。
したがって、前記光信号検出部による前記光信号の検出を前記液体試料導入板の前記表面ないしその近傍に焦点を当てて行う際、前記液体試料を前記液体試料導入板に導入させた後、前記結合体が前記液体試料導入板の前記表面上に重力沈降することを待つ必要があり、検出の準備に時間を要することとなる。特に、前記結合体の比重が小さい場合、より長い時間を要することとなる。
そこで、前記第３の磁場印加部による前記磁場の印加により、前記液体試料の液層中に浮遊する前記結合体を前記液体試料導入板の前記表面側に引き寄せることで、検出の準備時間を短縮化させ、より効率的な検出を行うことができる。
【００３９】
前記第３の磁場印加部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の電磁石及び永久磁石を用いて構成することができる。
なお、前記第３の磁場印加部は、前記結合体を前記液体試料導入板の前記表面側に引き寄せた後、前記第１の磁場印加部による前記結合体の移動を妨げないよう、前記結合体を引き寄せる前記磁場の印加状態を弱める強度調整や停止するオン−オフ制御が求められる。この点、前記永久磁石を用いる場合、例えば、移動部材に前記永久磁石を保持し、前記永久磁石による前記磁場が前記液体試料の液層中に及ぶ近接状態と前記永久磁石による前記磁場が前記液体試料導入板の前記液体試料の液層中に及ばない離間状態との間で移動制御し、前記磁場の印加状態の前記強度調整又は前記オン−オフ制御を実施する構成とすることができる。また、前記電磁石を用いる場合には、前記電磁石の励磁と消磁とを通じて前記磁場の印加状態の強弱調整又はオン−オフ制御を行うことができる。また例えば、公知の磁気シールド部材を用いて、前記結合体に対して前記表面上に引き寄せる前記磁場を印加させた開放状態と前記結合体に対して前記表面上に引き寄せる前記磁場を印加させない遮蔽状態とで制御し、前記磁場の印加状態をオン−オフさせる構成とすることができる。
また、前記第３の磁場印加部としては、特に制限はないが、貫通孔が形成されている、或いはＵ字型などの不完全な環状、或いは複数の部材が環状乃至不完全な環状に配置された構成であることが好ましい。このように前記第３の磁場印加部を形成すると、前記裏面側光照射部において前記貫通孔或いは前記環状乃至前記不完全な環状の内側を通じた前記液体試料導入板の前記裏面側からの光照射が可能となる。なお、前記環状に配置された部材は、前記光照射や光信号の光路を妨げない配置であれば特に制限はなく、磁場の印加状態の制御が個別に行えるものでもよい。
また、前記第３の磁場印加部を有すると、前記液体試料導入板の前記表面上の前記検出領域に前記結合体を寄せ集めて濃縮することができ、より高精度に前記標的物質の検出を行うことができる。
【００４０】
（標的物質検出方法）
本発明の標的物質検出方法は、液体試料調製工程と、液体試料導入保持工程と、光照射工程と、結合体移動工程と、光信号検出工程とを含み、必要に応じて、その他の工程を含む。
【００４１】
＜液体試料調製工程＞
前記液体試料調製工程は、標的物質の被検体液と、前記標的物質と結合体を形成する磁性粒子及び前記標的物質と結合体を形成する光応答性物質を含む第１の検出材及び前記標的物質と前記結合体を形成する光応答性磁性粒子を含む第２の検出材の少なくともいずれかの検出材を含む含検出材液と、前記標的物質と前記検出材とを結合させる結合物質を含む含結合物質液とを用い、前記被検体液と前記含結合物質液とを混合させて混合液を調製後、前記混合液に前記含検出材液を混合させて液体試料を調製する工程である。
【００４２】
前記被検体液の具体的な例としては、血液、唾液、尿、液体薬品、環境水、上下水、飲料、食品のホモジナイズ溶液、ぬぐい液、粉末等の固体試料を水等の溶媒に溶解させた溶液、気相中のガスや微粒子などを捕集した気相濃縮液などが挙げられる。
また、前記標的物質としては、具体的な例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、カプシドタンパク質等のウイルス様粒子を含む各種タンパク質、エクソソームやマイクロベシクルやラージオンコソーム等の細胞外小胞、菌、汚染物質などが挙げられる。
【００４３】
前記検出材としては、前記磁性粒子と前記光応答性物質とを含む前記第１の検出材及び前記光応答性磁性粒子を含む前記第２の検出材のいずれも用いることができる。
即ち、前記検出材の役割は、前記標的物質と結合した状態で、前記磁場の印加に伴う移動と、前記伝搬光又は前記近接場光に基づく前記光信号とを生じさせることであり、これら２つの役割を、前記第１の検出材では前記磁性粒子と前記光応答性物質とがそれぞれ１つずつ担い、前記第２の検出材では前記２つの役割を前記光応答性磁性粒子のみで担う。
なお、本明細書において、「光応答性」とは、前記伝搬光又は前記近接場光の照射を受けて前記光信号検出工程で信号変化を検出可能な光信号を生じる性質を指す。
【００４４】
前記磁性粒子としては、前記役割を奏するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の磁気ビーズ等を用いることができる。
また、前記光応答性物質としては、前記役割を奏するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記伝搬光又は前記近接場光の照射を受けて散乱光を発生させる光散乱物質や、蛍光を発生させる蛍光物質や、光吸収を生じる光吸収物質を用いることができる。
前記光散乱物質及び前記光吸収物質としては、それぞれの性質を備えるように調製されたポリスチレンビーズ等の樹脂粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、金ナノロッド、金ナノスター等の金属ナノ粒子などの公知の粒子を用いることができる。また、前記蛍光物質としては、蛍光色素、量子ドット、蛍光ビーズ、量子ドット入りビーズ、蛍光染色剤などの公知の蛍光材料を用いることができる。
また、前記光応答性磁性粒子としては、前記役割を奏するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記伝搬光又は前記近接場光の照射を受けて散乱光を発生させるタイプの磁性粒子や、蛍光を発生させるタイプの磁性粒子や、光吸収を生じるタイプの磁性粒子を用いることができる。具体例としては、蛍光色素を含む磁性粒子や、散乱光又は光吸収を生じさせる有機ポリマーで表面修飾された磁性粒子が挙げられる。これらの中でも、前記蛍光色素を含む磁性粒子が粒径の均一性、入手容易性等の観点から好ましい。
【００４５】
これら前記被検体液、前記含結合物質液及び前記含検出材液では、前記被検体液に対して、前記含結合物質液及び前記含検出材液をどのような過程で加えるかが極めて重要であり、本発明では、前記被検体液と前記含結合物質液とを混合させた前記混合液を調製後、前記混合液に前記含検出材液を混合させることを技術の核とする。この点を図面を用いて詳しく説明する。
【００４６】
前記液体試料調製工程では、用意された図１（ａ）に例示される標的物質Ｔを含む前記被検体液に対し、先に結合物質Ｂを含む前記含結合物質液を加えて前記混合液を調製し、標的物質Ｔに結合物質Ｂを結合させる（図１（ｂ）参照）。
次に、前記混合液に対し、例えば、磁性粒子Ｍを含む液体と光応答性物質Ｏを含む液体との２液で構成されるか、磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏの双方を含む１液で構成される前記含検出材液を加えて、標的物質Ｔに対し、磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏを結合物質Ｂを介して結合させ、前記結合体を得る（図１（ｃ）参照）。なお、図１（ａ）は、未結合の標的物質Ｔを示す説明図であり、図１（ｂ）は、標的物質Ｔに結合物質Ｂを結合させた状態を示す説明図であり、図１（ｃ）は、標的物質Ｔに結合物質Ｂを介して磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏを結合させた結合体を示す説明図である。
【００４７】
一方、図１（ａ）に例示される標的物質Ｔを含む前記被検体液に対し、予め磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏに結合物質Ｂを結合させた状態で保存しておいた試料液や、磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏに結合物質Ｂを結合させてから時間が経過した試料液を加えて、標的物質Ｔに結合物質Ｂを介して磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏを結合させた結合体を得ようとすると、結合物質Ｂとの結合が解かれた磁性粒子Ｍや光応答性物質Ｏが存在するため、標的物質Ｔに結合物質Ｂを介して磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏを結合させた結合体が安定的に得られない（図２参照）。なお、図２は、結合体が得られない状況を示す図である。
したがって、標的物質Ｔを高精度かつ安定的に検出するためには、前記被検体液に対し、前記含結合物質液を加え、その後、前記含検出材液を加えることが肝要となる。
【００４８】
なお、図１，図２により、前記検出材として磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏ（前記第１の検出材）を用いた場合について説明したが、これらに代えて前記光応答性磁性粒子（前記第２の検出材）を用いる場合も、同様の結合状況となる。
ただし、前記光応答性磁性粒子（前記第２の検出材）を用いる場合は、前記光信号検出工程を、前記伝搬光又は前記近接場光の照射を受けた前記光応答性磁性粒子から生じ、かつ、１つの前記標的物質に対し２つ以上の前記光応答性磁性粒子が結合した前記結合体に基づく光信号のみを信号変化の対象として検出する工程として実施することが好ましい。
この点に関し、前記光応答性磁性粒子を用いる場合の留意事項を図３〜図５を参照しつつ説明する。なお、図３は、標的物質Ｔに結合物質Ｂを介して光応答性磁性粒子ＭＯが１つ結合した結合体を示す説明図であり、図４は、未結合の光応答性磁性粒子ＭＯを示す説明図であり、図５は、標的物質Ｔに結合物質Ｂを介して光応答性磁性粒子ＭＯが２つ結合した結合体を示す説明図である。
【００４９】
標的物質Ｔに結合物質Ｂを介して光応答性磁性粒子ＭＯが１つ結合した結合体（図３参照）においても、前記磁場の印加に伴う移動と、前記伝搬光又は前記近接場光に基づく前記光信号とを生じさせることができる。
しかしながら、この結合体から生じる光信号は、標的物質Ｔと未結合の光応答性磁性粒子ＭＯ（図４参照）から生じる光信号と区別することができないことから、ノイズ信号となり得る。
そのため、光応答性磁性粒子ＭＯ（前記第２の検出材）を用いる場合は、前記光信号検出工程を、前記伝搬光又は前記近接場光の照射を受けた光応答性磁性粒子ＭＯから生じ、かつ、１つの標的物質Ｔに対し２つ以上の光応答性磁性粒子ＭＯが結合した結合体（図５参照）に基づく光信号のみを信号変化の対象として検出する工程として実施することが好ましい。
なお、このような検出を行う場合の前記光信号検出部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１つの光応答性磁性粒子ＭＯから生じる光信号よりも１つの標的物質Ｔに２つ以上の光応答性磁性粒子ＭＯが結合した前記結合体から生じる光信号の方が信号サイズが大きいことを利用し、１つの光応答性磁性粒子ＭＯから生じる光信号の信号サイズよりも大きいサイズを閾値に設定することで閾値以上の光信号のみを検出する構成や、１つの光応答性磁性粒子ＭＯから生じる光信号よりも１つの標的物質Ｔに２つ以上の光応答性磁性粒子ＭＯが結合した前記結合体から生じる光信号の方が信号強度が強いことを利用し、１つ光応答性磁性粒子ＭＯから生じる光信号の信号強度よりも強い信号強度を閾値に設定することで閾値以上の光信号のみを検出する構成や、これら両方の構成を備えた構成などとすることが挙げられる。なお、信号強度としては、光信号を光点として検出する場合、輝度が高い方を強信号とし、光信号を暗点として検出する場合、輝度が低い方を強信号とする。
また、前記閾値の設定による構成に代えて、前記光照射部における前記光源出力の調整や前記光信号検出部の露光時間の調整などを行うことで、前記光信号検出部が１つの光応答性磁性粒子ＭＯから生じる光信号を検出限界以下の信号として検出しない構成としてもよい。
また、これらの構成を採用するにあたって必要となる、１つの光応答性磁性粒子ＭＯから生じる光信号の信号サイズ、信号強度、検出限界などの情報としては、例えば、事前に光応答性磁性粒子ＭＯのみを水等に分散させた試料に対する検出を行うことで把握することができる。
【００５０】
前記磁性粒子、前記光応答性物質及び前記光応答性磁性粒子について、引き続き説明する。
前記磁性粒子及び前記光応答性物質（前記第１の検出材）は、前記標的物質に対し１つずつ、最少２つ結合されていれば、その結合体を検出対象とすることができる。
しかしながら、前記標的物質の大きさに対し、前記磁性粒子及び前記光応答性物質の大きさが過大であり、前記標的物質に対して前記磁性粒子及び前記光応答性物質が２つだけ結合可能な状況であると、前記標的物質に結合する２つの粒子が２つとも前記磁性粒子となるか前記光応答性物質となって、検出対象から外れる危険性が増大する。
そのため、１つの前記標的物質に対し、前記磁性粒子及び前記光応答性物質が３つ以上結合可能であるように前記磁性粒子及び前記光応答性物質の大きさの上限を設定し、前記標的物質に結合する３つ以上の前記磁性粒子及び前記光応答性物質のうち、いずれか１つが残りの粒子と異なる種類となる機会を付与することが好ましい（図６参照）。なお、図６は、標的物質Ｔに結合物質Ｂを介して磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏが３つ結合した結合体を示す説明図である。
また、前記光応答性磁性粒子（前記第２の検出材）を用いる場合であっても、１つの前記標的物質に対し、前記光応答性磁性粒子を２つ結合させた結合体よりも３つ以上結合させた結合体の方が、前記光信号の信号強度が強まり、前記ノイズ信号（図３，４参照）との区別を容易にさせる。
つまり、前記磁性粒子及び前記光応答性物質（前記第１の検出材）と、前記光応答性磁性粒子（前記第２の検出材）とのいずれを用いる場合であっても、これらが１つの前記標的物質に対して３つ以上結合可能であるように、直径の上限を設定することが好適となる。
前記標的物質検出装置（前記外力支援型センサ）を用いて検出が求められる前記標的物質の大きさとしては、一般に１ｎｍ〜１，０００ｎｍ程度であり、１つの前記標的物質に対し、３つの前記磁性粒子、前記光応答性物質及び前記光応答性磁性粒子を結合させるためには、これらの直径が前記標的物質の直径の約６．５倍以内である必要があり、よって、前記直径の上限としては、６，５００ｎｍであることが好適であり、１，０００ｎｍであることがより好適である。
また、前記直径の下限に関し、前記散乱光を用いて前記光信号を発生させる場合、前記光応答性物質及び前記光応答性磁性粒子が小さすぎると、検出を行う光学系の検出限界を超えて検出できないおそれがある。そのため、前記直径の下限としては、５０ｎｍであることが好適である。前記直径が５０ｎｍ以上であると、可視光波長域（４００ｎｍ〜７００ｎｍ）の一般的な光源を用いて検出を行うことができる。
中でも、前記散乱光を用いて光信号を発生させる場合、光学系の検出限界が特に問題視されることから、前記散乱光を用いて前記光信号を発生させる場合に前記光応答性物質及び前記光応答性磁性粒子の直径が５０ｎｍ〜６，５００ｎｍであることが好適であり、５０ｎｍ〜１，０００ｎｍがより好適であるといえる。
なお、前記球状粒子としては、真球状に加え、楕円球状等のいびつな球状粒子も含み、前記いびつな球状粒子における前記直径としては、その粒子の最大径が該当する。
【００５１】
前記結合物質としては、特に制限はなく、前記標的物質及び前記検出材の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、前記標的物質と前記検出材との間で、公知の抗原−抗体反応、アプタマーによる結合、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ビオチン−アビジン結合、キレート結合、アミノ結合などによる結合を与える諸物質を用いることができる。具体的には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、アプタマー、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ペプチド、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン及びその誘導体（ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、ビオチンなどが挙げられる。
前記結合体の設定方法としては、前記標的物質と特異的に結合する前記結合物質を選択し、選択された前記結合物質との間で特異的な結合が形成されるように前記磁性粒子、前記光応答性物質及び前記光応答性磁性粒子に対して表面処理を行う方法が挙げられる。
【００５２】
前記液体試料の調製の場面では、１つの前記標的物質に対して前記磁性粒子、前記光応答性物質及び前記光応答性磁性粒子を３つ以上結合させる観点から、前記標的物質の含有数に対し、前記磁性粒子、前記光応答性物質及び前記光応答性磁性粒子の合計の含有数が３倍以上となるように調製を行うことが好ましい。
特に、前記磁性粒子、前記光応答性物質及び前記光応答性磁性粒子の合計の含有数が多ければ多い程、前記標的物質に対する結合数が増え、引いては、前記標的物質を高精度に検出することができる。したがって、前記標的物質の含有数に対し、前記標的物質との結合に飽和をもたらす含有数以上で前記磁性粒子、前記光応答性物質及び前記光応答性磁性粒子を含有させてもよい。なお、この場合、前記液体試料中に存在する前記標的物質の数は、検出前の段階では未知であるが、経験則から想定される前記標的物質の数からみて、過剰量導入すればよい。
【００５３】
前記液体試料調製工程は、（１）前記液体試料導入保持工程と独立して実施することも、（２）前記液体試料導入保持工程と関連して実施することもできる。
即ち、前記（１）の場合では、前記液体試料保持部に対する導入を行う前に、任意の混合容器を用いて前記液体試料調製工程を行い、調製された前記液体試料を前記液体試料導入工程に用いる（事前混合法）。また、前記（２）の場合では、前記液体試料保持部に前記原料を導入し、前記液体試料保持部内で前記液体試料調製工程を実施する。
これらの中でも、前記（１）の事前混合法によれば、前記混合容器内の前記磁性粒子及び前記磁性粒子を含む前記結合体を前記混合容器越しに磁石で集め、これらが前記磁石により流れ落ちないようにしつつ、前記液体試料中の検出に関与しない一部を分離することで、前記液体試料保持部に導入される前記液体試料に対して夾雑物等の混入を抑制することができるとともに、前記液体試料保持部に導入される前記液体試料において、前記結合体の濃縮を行うことができる。その結果、前記（２）の方法を適用する場合よりも、より高精度な検出を実施することができる。
【００５４】
前記結合体としては、重力沈降を促進させる重り物質を含むように調製してもよい。即ち、前記重り物質を含む前記結合体では、前記液体試料導入板の表面上に沈降させ易く、検出操作を開始するまでの時間を短縮化させることができ、特に、前記重り物質を含まない前記結合体の比重が小さい場合に用いることができる。
前記重り物質としては、このような性質を有する物質であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の金ナノ粒子などを挙げることができる。
前記重り物質としては、前記標的物質と結合させて前記結合体を形成することが好ましく、結合方法としては、例えば、物理吸着、抗原−抗体反応、アプタマーによる結合、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ビオチン−アビジン結合、キレート結合、アミノ結合などの公知の結合方法を用いることができる。
【００５５】
＜液体試料導入保持工程＞
前記液体試料導入保持工程は、前記液体試料が表面上に導入されるとともに裏面側又は前記表面側から照射される光の透過光を伝搬光として前記光が照射される側と反対の面側に伝搬可能とされる透光板、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面側から照射される光の反射光を前記伝搬光として前記表面上方に伝搬可能な反射板、前記液体試料が前記表面上に導入される導入板、及び、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面に対して全反射条件で照射される光により前記表面上に近接場光を発生可能な検出板のいずれかで形成される液体試料導入板が配され、かつ、前記液体試料が前記液体試料導入板の前記表面上に保持可能とされる液体試料保持部に対し、前記液体試料導入板の前記表面上に前記液体試料を導入し保持する工程である。
【００５６】
＜光照射工程＞
前記光照射工程は、前記液体試料導入板が前記透光板で形成されるときに前記液体試料導入板の前記裏面側から前記光を照射する裏面側光照射工程、前記液体試料導入板が前記透光板及び前記反射板のいずれかで形成されるときに前記液体試料導入板の前記表面側から前記光を照射する表面側光照射工程、前記液体試料導入板が前記導入板で形成されるときに前記液体試料導入板上に保持される前記液体試料に対して前記液体試料導入板の側面側から前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向で前記光を照射する側面側光照射工程、並びに、前記液体試料導入板が前記検出板で形成されるときに前記表面に対して全反射条件で前記光を照射する全反射光照射工程のいずれかの工程である。
なお、前記裏面側光照射工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記裏面側光照射部により実施することができる。
また、前記表面側光照射工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記表面側光照射部により実施することができる。
また、前記側面側光照射工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記側面側光照射部により実施することができる。
また、前記全反射光照射工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記全反射光照明部により実施することができる。
【００５７】
＜結合体移動工程＞
前記結合体移動工程は、前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向及び前記液体試料導入板から遠ざかる方向のいずれかの方向に移動させる第１の結合体移動工程並びに前記液体試料導入板の前記裏面側に配される磁場印加部からの磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で前記磁場印加部を前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、前記磁場印加部の移動に追従させて前記結合体を移動させる第２の結合体移動工程のいずれかの工程である。
なお、前記第１の結合体移動工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記第１の磁場印加部により実施することができる。
また、前記第２の結合体移動工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記第２の磁場印加部により実施することができる。
また、前記第１の結合体移動工程及び前記第２の結合体移動工程としては、それぞれ前記光信号検出工程を挟みながら繰り返し行うことで、検出精度を高めることができる。このように前記第１の結合体移動工程を繰り返し行う際、それぞれの結合体移動工程において、前記第１の磁場印加部を前記液体試料導入板に対する相対な位置を変更し、前記結合体を移動させる方向を変えて、前記結合体を移動させてもよい。同様の、異なる方向への結合体の移動は、前記第１の磁場印加部を複数個設置して、順番に異なる方向から磁場を印加することよっても実施可能である。また、同様に、前記第２の磁場印加部において、繰り返し前記第２の結合体移動工程を行う際、それぞれの前記第２の結合体移動工程において、前記磁場印加部を前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ異なる方向に移動させ、前記結合体を移動させる方向を変えて、前記結合体を移動させてもよい。さらには、前記第１の磁場印可部と前記第２の磁場印可部双方を有する前記標的物質検出装置においては、前記第１の結合体移動工程と前記第２の結合体移動工程を織り交ぜて実施することができる。
また、前記結合体移動工程において、磁場印加時に前記液体試料導入板を前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に動かすことによって、同様の効果を得てもよい。
【００５８】
＜光信号検出工程＞
前記光信号検出工程は、前記結合体移動工程に伴う前記結合体の移動を前記伝搬光又は前記近接場光に基づく光信号の信号変化により検出する工程である。
前記光信号検出工程では、前記検出材として前記第１の検出材を用いる場合、前記伝搬光又は前記近接場光に基づく光信号のうち、前記結合体が前記伝搬光又は前記近接場光を受けたときに前記光応答性物質から生じ、１つの前記標的物質に対し前記磁性粒子と前記光応答性物質が結合した前記結合体に基づく光信号のみを信号変化の対象として検出する。
また、前記光信号検出工程では、前記検出材として前記第２の検出材を用いる場合、前記伝搬光又は前記近接場光に基づく光信号のうち、前記結合体が前記伝搬光又は前記近接場光を受けたときに前記光応答性磁性粒子から生じ、１つの前記標的物質に対し２つ以上の前記光応答性磁性粒子が結合した前記結合体に基づく光信号のみを信号変化の対象として検出する。
なお、前記光信号検出工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記光信号検出部により実施することができる。
【００５９】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合体引き寄せ工程を挙げることができる。
【００６０】
−結合体引き寄せ工程−
前記結合体引き寄せ工程は、前記結合体移動工程が前記第１の結合体移動工程であるときに、更に、前記液体試料導入保持工程後、前記結合体移動工程前に、引き寄せ磁場の印加により前記液体試料中の前記結合体の全部又は一部を一旦前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せる工程である。
【００６１】
前記結合体移動工程が前記第１の結合体移動工程により実施される場合、前記光信号検出工程で前記光信号の検出を前記液体試料導入板の前記表面ないしその近傍に焦点を当てて行う際、必ずしも前記結合体が前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せられた状態ではなく、例えば、前記液体試料を前記液体試料導入板に導入させた直後においては、前記結合体が前記液体試料の液層中に浮遊した状態とされる。浮遊状態の前記結合体が前記光信号検出工程で前記光信号を検出可能な結像可能範囲の外方や前記近接場光の発生領域の外方に存在すると、前記結合体が検出されないこととなる。
したがって、前記光信号検出工程による前記光信号の検出を前記液体試料導入板の前記表面ないしその近傍に焦点を当てて行う際、前記液体試料を前記液体試料導入板に導入させた後、前記結合体が前記液体試料導入板の前記表面上に重力沈降することを待つ必要があり、検出の準備に時間を要することとなる。特に、前記結合体の比重が小さい場合、より長い時間を要することとなる。
そのため、前記結合体移動工程が前記第１の結合体移動工程であるときに、更に、前記結合体引き寄せ工程を実施して、検出の準備時間を短縮化させ、より効率的な検出を行うことが好ましい。
なお、前記結合体引き寄せ工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記第３の磁場印加部により実施することができる。
【００６２】
前記結合体引き寄せ工程を実施する場合で、かつ、前記第１の結合体移動工程を前記結合体を前記液体試料導入板から遠ざかる方向に移動させて実施する場合では、特に制限はないが、前記液体試料導入保持工程後、前記結合体引き寄せ工程、前記結合体移動工程及び前記光信号検出工程をこの順で複数回繰返して実施すること（交互磁場印加）が好ましい。
前記交互磁場印加によって、同一の前記結合体に起因する前記光信号が繰返し検出されることとなるため、検出の精度を向上させることができる。更には、前記交互磁場印加を周期的に実施し、同一の前記結合体に起因する前記光信号の周波数に対して公知のロックイン増幅器を適用することによって、この光信号を増幅することも可能であり、検出の感度を向上させることができる。
【００６３】
以下では、図面を参照しつつ、本発明の実施形態をより具体的に説明する。
【００６４】
〔第１の実施形態〕
第１の実施形態について図７等を参照しつつ説明する。第１の実施形態では、標的物質検出装置１を用いる。なお、図７は、標的物質検出装置１の説明図である。
図７に示すように標的物質検出装置１は、公知の透過型顕微鏡に準じて構成され、液体試料導入板２と、光照射部３と、第１の磁場印加部４と、撮像デバイス５ａ及び対物レンズ５ｂで構成される光信号検出部５とで構成される。なお、撮像デバイス５ａは、例えば、公知のＣＣＤイメージセンサ等で構成され、２次元画像の取得が可能とされる。
【００６５】
液体試料導入板２は、前記標的物質及び前記標的物質と前記結合体を形成する前記磁性粒子を含む液体試料が表面上に導入されるとともに裏面側から照射される光Ｌの透過光ＴＬを伝搬光として前記表面上方に伝搬可能とされる透光板で形成される。また、液体試料導入板２は、自身で液体試料保持部を構成し、前記表面上に前記液体試料が導入された後、前記液体試料を覆うようにカバーガラス等を配することで前記液体試料を保持する。
光照射部３は、液体試料導入板２の前記裏面側から光Ｌを照射可能とされる裏面側光照射部として構成される。
また、第１の磁場印加部４は、液体試料導入板２の前記表面側に配されるとともに液体試料導入板２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板２から遠ざかる方向に移動させるように構成される。ここで、第１の磁場印加部４は、中央に貫通孔が形成された環状の電磁石で形成され、光照射部３から照射される光Ｌの透過光ＴＬに基づく光信号が前記貫通孔を通じて光信号検出部５で検出可能とされる。
光信号検出部５は、液体試料導入板２の前記表面側に配されるとともに第１の磁場印加部４による前記磁場の印加前後における前記伝搬光に基づく光信号の信号変化を検出可能とされる。
【００６６】
標的物質検出装置１を用いて、第１の実施形態に係る標的物質検出方法を実施する。
先ず、前記標的物質を含む前記被検体液に対し、前記結合物質を含む前記含結合物質液を加えて前記混合液を調製後、前記混合液に前記検出材を含む前記含検出材液を加えて前記液体試料を調製する（液体試料調製工程、図１（ａ）〜（ｃ）参照）。
前記被検体液に対し、前記含結合物質液を加え、その後、前記含検出材液を加えることが肝要であり（図１，図２参照）、このような手順で液体試料調製工程を実施することで、前記標的物質を高精度かつ安定的に検出することができる。
【００６７】
次に、液体試料導入板２の前記表面上に前記液体試料を導入し、保持させる（液体試料導入保持工程）。
次に、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板２の前記表面上に重力沈降した後、液体試料導入板２の裏面側から光Ｌを照射し（光照射工程）、対物レンズ５ｂを調整して前記表面ないしその近傍を結像可能範囲内に入れ、撮像デバイス５ａで前記表面上の光信号を取得する（光信号検出工程）。ここで、結像可能範囲とは、焦点深度及びその近傍における光信号を取得可能な範囲を指す。
【００６８】
このときの撮像デバイス５ａで観察される観察視野内の液体試料導入板２の前記表面上の様子を模式的に図８に示す。
図８に示すように、観察視野内の液体試料導入板２の前記表面上には、例えば、液体試料導入板２の前記表面上方に伝搬される前記伝搬光の前記液体試料に対する透過光の光信号（バックグラウンド信号）とのコントラスト差により前記バックグラウンド信号と識別可能な４つの光信号ａ〜ｄが観察される。図８では、光信号ａ，ｄが光点として観察されることを示しており、光信号ｂ，ｃが暗点として観察されることを示している。
【００６９】
また、このときの光信号ａを発生させる物質ａ’と光信号ｂを発生させる物質ｂ’とを液体試料導入板２の側面から見たときの様子を図９に示す。なお、図９は、図８におけるＡ−Ａ線断面図である。また、図９中の矢印Ｂは、光信号を取得可能な結像可能範囲を示している。
図９に示すように、物質ａ’及び物質ｂ’は、液体試料導入板２の前記表面上に重力沈降された状態とされる。
【００７０】
次に、第１の磁場印加部４の前記電磁石を励磁して液体試料導入板２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により第１の磁場印加部４に向けて引き寄せ、前記結合体を液体試料導入板２から遠ざかる方向に移動させる（結合体移動工程）。
次に、結像可能範囲及び観察視野を維持したまま前記結合体を液体試料導入板２から遠ざかる方向に移動させた後の液体試料導入板２の前記表面上の光信号を撮像デバイス５ａで取得する（光信号検出工程）。
【００７１】
前記結合体移動工程後、撮像デバイス５ａで観察される観察視野内の液体試料導入板２の前記表面上の様子を模式的に図１０に示す。
前記結合体移動工程前の様子を示す図８と、前記結合体移動工程後の様子を示す図１０との比較を通じて理解されるように、光信号ａ，ｂは、前記結合体移動工程前後で光信号が変化し、光信号ｃ，ｄは、前記結合体移動工程前後で光信号が変化しない。
このことから、光信号ａ，ｂを発生させる物質ａ’，ｂ’は、第１の磁場印加部４に引き寄せられる前記磁性粒子を含む前記結合体であり、前記標的物質を含むものであることが分かる。
これに対し、前記結合体移動工程前後で変化が確認されない、光信号ｃ，ｄは、液体試料導入板２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号であることが分かる。
【００７２】
前記結合体移動工程後の光信号ａを発生させる物質ａ’と光信号ｂを発生させる物質ｂ’とを液体試料導入板２の側面から見たときの様子を図１１に示す。図１１は、図１０におけるＡ−Ａ線断面図である。また、図１１中の矢印Ｂは、光信号を取得可能な結像可能範囲を示している。
図１１に示すように、物質ａ’及び物質ｂ’は、第１の磁場印加部４での前記磁場の印加により、液体試料導入板２から遠ざかる方向に移動された状態とされる。
【００７３】
光信号ａは、前記結合体移動工程前後で光点のサイズが大きく観察される（図１０参照）。これは、物質ａ’が光信号検出部５の結像可能範囲内に存在するものの、前記結合体移動工程前における液体試料導入板２の前記表面にピントを合せた状態での焦点深度からは外れるため、光点のサイズが大きく観察されるものである（図１１参照）。
これに対し、光信号ｂは、前記結合体移動工程後、消失することが確認される（図１０参照）。これは、物質ｂ’が光信号検出部５の結像可能範囲外に移動したためである（図１１参照）。
【００７４】
以上のように、第１の実施形態に係る標的物質検出方法では、前記標的物質に基づく光信号を、液体試料導入板２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号と明確に区別して検出することができるため、前記標的物質を高精度に検出することができる。また、液体試料導入板２の前記表面上に前記夾雑物が吸着している場合でも、その存在を無視した検出を行うことができるため、必ずしも検出ごとに液体試料導入板２に対する前記洗浄処理を行う必要がなく、効率的な検出を行うことができる。
加えて、前記標的物質に対し、前記結合物質を介して前記検出材が高確率かつ安定的に結合されるため、前記標的物質を高精度かつ安定的に検出することができる。
【００７５】
次に、第１の実施形態の第１の変形例について図１２を用いて説明する。第１の変形例では、標的物質検出装置１Ａを用いる。なお、図１２は、標的物質検出装置１Ａの説明図である。
図１２に示すように、標的物質検出装置１Ａでは、標的物質検出装置１に対し、更に、第３の磁場印加部６を配して構成される。なお、この他は、標的物質検出装置１と同様であるため、説明を省略する。
【００７６】
第３の磁場印加部６は、液体試料導入板２の裏面側に配されるとともに液体試料導入板２に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板２の表面上に引き寄せ可能とされ、ここでは、貫通孔が形成された環状の電磁石で形成され、光照射部３が前記貫通孔を通じて液体試料導入板２の裏面側から光を照射可能とされる。
【００７７】
標的物質検出装置１Ａを用いる場合、標的物質検出装置１を用いた検出のように、前記液体試料導入保持工程後、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板２の前記表面上に重力沈降することを待つことなく、前記液体試料導入保持工程後、前記結合体移動工程前に、第３の磁場印加部６での引き寄せ磁場の印加により前記液体試料中の前記結合体の全部又は一部を一旦液体試料導入板２の表面上に引き寄せることができる（結合体引き寄せ工程）。
したがって、第１の実施形態の第１の変形例によれば、第１の実施形態が有する利点に加えて、検出に要する時間を短時間化させ、より効率的な前記標的物質の検出を行うことができる。
【００７８】
次に、第１の実施形態の第２の変形例について図１３を用いて説明する。第２の変形例では、標的物質検出装置１Ｂを用いる。なお、図１３は、標的物質検出装置１Ｂの説明図である。
図１３に示すように、標的物質検出装置１Ｂでは、標的物質検出装置１における第１の磁場印加部４に代えて、第１の磁場印加部７を配して構成される。なお、この他は、標的物質検出装置１と同様であるため、説明を省略する。
【００７９】
第１の磁場印加部７は、電磁石により構成されるとともに、液体試料導入板２の前記表面上の検出領域（前記裏面側において光照射部３による光の照射を受け、前記表面上方に前記伝搬光を生じさせる領域）に対して斜め上方に配され、液体試料導入板２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させる（第１の結合体移動工程）。
【００８０】
第１の磁場印加部７を用いて実施した前記第１の結合体移動工程後に、撮像デバイス５ａで観察される観察視野内の液体試料導入板２の前記表面上の様子を模式的に図１４に示す。なお、前記第１の結合体移動工程前における様子は、図８と同様である。
【００８１】
前記第１の結合体移動工程前の様子を示す図８と、前記第１の結合体移動工程後の様子を示す図１４との比較を通じて理解されるように、光信号ａ，ｂは、前記第１の結合体移動工程前後で光信号が変化し、光信号ｃ，ｄは、前記第１の結合体移動工程前後で光信号が変化しない。
したがって、第１の実施形態の第２の変形例によれば、第１の実施形態と同様に、光信号ａ，ｂを発生させる物質ａ’，ｂ’が前記標的物質を含み、光信号ｃ，ｄが液体試料導入板２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号であると判断することができる。
【００８２】
第１の磁場印加部７を用いて実施した前記第１の結合体移動工程後に、光信号ａを発生させる物質ａ’と光信号ｂを発生させる物質ｂ’とを液体試料導入板２の側面から見たときの様子を図１５に示す。なお、図１５は、図１４におけるＡ−Ａ線断面図である。また、図１５中の矢印Ｂは、光信号を取得可能な結像可能範囲を示している。
図１５に示すように、物質ａ’及び物質ｂ’は、第１の磁場印加部７による斜め上方からの引き寄せ磁場により、それぞれ、液体試料導入板２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分ｘ１，ｘ２と、液体試料導入板２から遠ざかる方向のベクトル成分ｙ１，ｙ２とを持つ方向に移動する。
したがって、第１の実施形態の第２の変形例では、物質ａ’及び物質ｂ’を液体試料導入板２から遠ざかる方向にのみ移動させる第１の実施形態と、前記第１の結合体移動工程後の様子が相違する。
【００８３】
この相違点は、前記標的物質の検出負担を軽減することにつながる。
即ち、図１０及び図１４を比較しつつ、光信号ａ，ｂに基づく前記標的物質の検出を試みた場合について検討すると、光信号ｂについては、両図とも光信号の消失する結果であり変わりがないが、光信号ａについては、図１０で示すケースではサイズ変化に基づく前記標的物質の検出のみとなり、移動に基づく前記標的物質の検出が行えないのに対し、図１４で示すケースではサイズ変化に基づく前記標的物質の検出に加え、移動に基づく前記標的物質の検出を行うことができる点で、図１４で示すケースの方が前記標的物質の検出を行い易い。
したがって、第１の実施形態の第２の変形例では、より一層、高精度に前記標的物質の検出を行うことができる。
【００８４】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態を図１６等を参照しつつ説明する。第２の実施形態では、標的物質検出装置１０を用いる。なお、図１６は、標的物質検出装置１０の説明図である。
図１６に示すように、標的物質検出装置１０は、公知の透過型顕微鏡に準じて構成され、液体試料導入板１２と、光照射部１３と、第２の磁場印加部１８と、撮像デバイス１５ａ及び対物レンズ１５ｂで構成される光信号検出部１５とで構成される。
液体試料導入板１２、光照射部１３及び光信号検出部１５は、第１の実施形態の標的物質検出装置１における液体試料導入板２、光照射部３及び光信号検出部５と同様に構成することができ、標的物質検出装置１０は、第１の磁場印加部４に代えて第２の磁場印加部１８を配する点で標的物質検出装置１と相違する。以下、相違点について説明する。
【００８５】
第２の磁場印加部１８は、液体試料導入板１２の前記裏面側に配されるとともに液体試料導入板１２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板１２の前記表面上に引き寄せ可能とされるとともに前記磁場を印加した状態で液体試料導入板１２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動可能とされる。ここで、第２の磁場印加部１８は、貫通孔が形成された環状の永久磁石と前記永久磁石をＸ１又はＸ２の方向にスライド移動させるスライド移動部材（不図示）とで形成され、光照射部１３が前記貫通孔を通じて液体試料導入板１２の裏面側から光を照射可能とされる。
前記結合体の移動は、第２の磁場印加部１８を磁場印加部として、第２の磁場印加部１８からの前記磁場の印加により液体試料導入板１２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を液体試料導入板１２の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で第２の磁場印加部１８を液体試料導入板１２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、第２の磁場印加部１８の移動に追従させて前記結合体を移動させることにより行う（第２の結合体移動工程）。また、第２の磁場印加部１８を、環状に配置された複数の部材により構成した場合、各部材毎に磁場印加状態を制御することでスライド移動部材を用いずに第２の結合体移動工程を行うことも可能である。
この第２の磁場印加部１８を用いる場合、前記第２の結合体移動工程において、前記磁場の印加により前記液体試料中の前記結合体の全部又は一部を液体試料導入板１２の表面上に引き寄せるため、前記液体試料導入保持工程後、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板１２の前記表面上に重力沈降することを待つ必要がない。
【００８６】
前記第２の結合体移動工程後に、撮像デバイス１５ａで観察される観察視野内の液体試料導入板１２の前記表面上の様子を模式的に図１７に示す。なお、前記第２の結合体移動工程前における様子は、図８と同様である。
前掲図８と、前記第２の結合体移動工程後の様子を示す図１７との比較を通じて理解されるように、光信号ａ，ｂは、前記第２の結合体移動工程前後で光信号が変化し、光信号ｃ，ｄは、前記第２の結合体移動工程前後で光信号が変化しない。
したがって、第２の実施形態によれば、光信号ａ，ｂを発生させる物質ａ’，ｂ’が前記標的物質を含み、光信号ｃ，ｄが液体試料導入板１２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号であると判断することができる。
【００８７】
前記第２の結合体移動工程後に、光信号ａを発生させる物質ａ’と光信号ｂを発生させる物質ｂ’とを液体試料導入板１２の側面から見たときの様子を図１８に示す。なお、図１８は、図１７におけるＡ−Ａ線断面図である。なお、図１８中の矢印Ｂは、光信号を取得可能な結像可能範囲を示している。
図１８に示すように、物質ａ’及び物質ｂ’は、第２の磁場印加部１８からの前記磁場の印加により液体試料導入板１２の前記表面上に引き寄せられた後、第２の磁場印加部１８の液体試料導入板１２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向への移動（図１６中の方向Ｘ１又はＸ２）に基づき、第２の磁場印加部１８の移動に追従して液体試料導入板１２の前記表面の面内方向と平行な方向に移動する。
なお、図１７，１８では、物質ａ’及び物質ｂ’が観察視野内で移動する例を示しているが、第２の磁場印加部１８を液体試料導入板１２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向で、かつ、矩形状の観察視野を律するいずれかの一辺の方向と平行な方向に、前記一辺の長さよりも長い距離で移動させると、前記観察視野内の物質ａ’及び物質ｂ’を観察視野外まで移動させることができ、光信号ａ，ｂの消失に基づく高精度の検出を行うことができる。
また、第１及び第２の実施形態における標的物質検出装置では、光学系を公知の正立顕微鏡の構成にしたがって、液体試料導入板２，１２の前記裏面側から光を照射し、前記表面側に透過する前記伝搬光に基づく前記光信号を光信号検出部５，１５で検出することとしているが、公知の倒立顕微鏡の構成にしたがって、前記液体試料導入板の前記表面側から光を照射し、前記裏面側に透過する前記伝搬光に基づく前記光信号を、前記裏面側に配された前記光信号検出部で検出することとしてもよい。
【００８８】
〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態を図１９等を参照しつつ説明する。第３の実施形態では、標的物質検出装置２０を用いる。なお、図１９は、標的物質検出装置２０の説明図である。
図１９に示すように標的物質検出装置２０は、公知の落射型顕微鏡に準じて構成され、液体試料導入板２２と、光照射部２３と、第１の磁場印加部２４と、撮像デバイス２５ａ、対物レンズ２５ｂ及びハーフミラー（ダイクロイックミラー等）２５ｃで構成される光信号検出部２５とで構成される。なお、撮像デバイス２５ａは、例えば、公知のＣＣＤイメージセンサ等で構成され、２次元画像の取得が可能とされる。また、ハーフミラー２５ｃは、反射によって液体試料導入板２２の前記表面上に照射光を導入するための光照射部２３の光学要素としても用いられる。
【００８９】
液体試料導入板２２は、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面側から照射される光Ｌの反射光ＲＬを前記伝搬光として前記表面上方に伝搬可能な反射板で形成される。また、液体試料導入板２２は、自身で前記液体試料保持部を構成し、前記表面上に前記液体試料が導入された後、前記液体試料を覆うようにカバーガラス等を配することで前記液体試料を保持する。
光照射部２３は、ハーフミラー２５ｃによる反射光により液体試料導入板２２の前記表面側から光Ｌを照射可能とされる表面側照射部として構成される。
また、第１の磁場印加部２４は、液体試料導入板２２の前記表面側に配されるとともに液体試料導入板２２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板２２から遠ざかる方向に移動させるように構成される。ここで、第１の磁場印加部２４は、中央に貫通孔が形成された環状の電磁石で形成されており、光照射部２３から照射される光Ｌが前記貫通孔を通じて液体試料導入板２２に照射可能とされるとともに光Ｌの反射光ＲＬに基づく光信号が前記貫通孔を通じて光信号検出部２５で検出可能とされる。
光信号検出部２５は、液体試料導入板２２の前記表面側に配されるとともに第１の磁場印加部２４による前記磁場の印加前後における前記伝搬光に基づく光信号の信号変化を検出可能とされる。
なお、液体試料導入板２２、光照射部２３及び光信号検出部２５（撮像デバイス２５ａ、対物レンズ２５ｂ、ハーフミラー２５ｃ）は、公知の落射型顕微鏡にしたがって構成することができる。
【００９０】
標的物質検出装置２０を用いて、第３の実施形態に係る標的物質検出方法を実施する。
先ず、前記標的物質を含む前記被検体液に対し、前記結合物質を含む前記含結合物質液を加えて前記混合液を調製後、前記混合液に前記検出材を含む前記含検出材液を加えて前記液体試料を調製する（液体試料調製工程、図１（ａ）〜（ｃ）参照）。
前記被検体液に対し、前記含結合物質液を加え、その後、前記含検出材液を加えることが肝要であり（図１，図２参照）、このような手順で液体試料調製工程を実施することで、前記標的物質を高精度かつ安定的に検出することができる。
【００９１】
次に、液体試料導入板２２の前記表面上に前記液体試料を導入し、保持させる（液体試料導入保持工程）。
次に、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板２２の前記表面上に重力沈降した後、光照射部２３から照射される光Ｌをハーフミラー２５ｃを介して液体試料導入板２２の前記表面側に照射し（光照射工程）、照射対物レンズ２５ｂを調整して前記表面ないしその近傍を結像可能範囲内に入れ、撮像デバイス２５ａで前記表面上の光Ｌの反射光ＲＬに基づく光信号を取得する（光信号検出工程）。
【００９２】
次に、第１の磁場印加部２４の前記電磁石を励磁して液体試料導入板２２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により第１の磁場印加部２４に向けて引き寄せ、前記結合体を液体試料導入板２２から遠ざかる方向に移動させる（第１の結合体移動工程）。
次に、結像可能範囲及び観察視野を維持したまま前記結合体を液体試料導入板２２から遠ざかる方向に移動させた後の液体試料導入板２２の前記表面上の光信号を撮像デバイス２５ａで取得する（光信号検出工程）。
【００９３】
このように実施される第３の実施形態では、前記光信号検出工程における前記第１の結合体移動工程前後における光信号が、前掲図８，１０のように得られ、前記標的物質に基づく光信号を、液体試料導入板２２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号と明確に区別して検出することができる。
したがって、第３の実施形態によれば、前記標的物質を高精度に検出することができる。また、液体試料導入板２２の前記表面上に前記夾雑物が吸着している場合でも、その存在を無視した検出を行うことができるため、必ずしも検出ごとに液体試料導入板２２に対する前記洗浄処理を行う必要がなく、効率的な検出を行うことができる。また、前記散乱光、前記反射光、前記蛍光、前記光吸収等の様々な現象に基づいて発生する光信号を識別信号として取り扱うことができ、幅広い分野での利用を期待することができる。また、光信号の変化の態様として、焦点ずれに加えて消失する現象を利用することもできるため、明確に光信号の変化を捉えることができる。
加えて、前記標的物質に対し、前記結合物質を介して前記検出材が高確率かつ安定的に結合されるため、前記標的物質を高精度かつ安定的に検出することができる。
【００９４】
次に、第３の実施形態の変形例を図２０を用いて説明する。第３の実施形態では、標的物質検出装置２０Ａを用いる。なお、図２０は、標的物質検出装置２０Ａの説明図である。
図２０に示すように、標的物質検出装置２０Ａでは、標的物質検出装置２０に対し、更に、第３の磁場印加部２６が配されるとともに第１の磁場印加部２４に代えて第１の磁場印加部２７が配された構成とされる。なお、この他は、標的物質検出装置２０と同様であるため、説明を省略する。
【００９５】
第３の磁場印加部２６は、電磁石で形成され、液体試料導入板２２の裏面側に配されるとともに液体試料導入板２２に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板２２の前記表面上に引き寄せ可能とされる。
第３の磁場印加部２６によれば、標的物質検出装置２０を用いた場合のように、前記液体試料導入保持工程後、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板２２の前記表面上に重力沈降することを待つことなく、前記液体試料導入保持工程後、前記結合体移動工程前に、第３の磁場印加部２６での引き寄せ磁場の印加により前記液体試料中の前記結合体の全部又は一部を一旦液体試料導入板２２の表面上に引き寄せることができる（結合体引き寄せ工程）。
したがって、第３の実施形態の変形例によれば、第３の実施形態が有する利点に加えて、検出に要する時間を短時間化させ、より効率的な前記標的物質の検出を行うことができる。
【００９６】
また、第１の磁場印加部２７は、電磁石により構成されるとともに、液体試料導入板２２の側方に配され、液体試料導入板２２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させる（第１の結合体移動工程）。
第１の磁場印加部２４に代えて第１の磁場印加部２７を用いる場合、前記光信号検出工程における前記第１の結合体移動工程前後における光信号が、前掲図８，１７のように得られ、前記標的物質に基づく光信号を、液体試料導入板２２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号と明確に区別して検出することができる。
【００９７】
〔第４の実施形態〕
次に、本発明の第４の実施形態を図２１等を参照しつつ説明する。第４の実施形態では、標的物質検出装置３０を用いる。なお、図２１は、標的物質検出装置３０の説明図である。
図２１に示すように、標的物質検出装置３０は、公知の落射型顕微鏡に準じて構成され、液体試料導入板３２と、光照射部３３と、第２の磁場印加部３８と、撮像デバイス３５ａ、対物レンズ３５ｂ及びハーフミラー３５ｃで構成される光信号検出部３５とで構成される。
液体試料導入板３２、光照射部３３及び光信号検出部３５は、第３の実施形態の標的物質検出装置２０における液体試料導入板２２、光照射部２３及び光信号検出部２５と同様に構成することができ、標的物質検出装置３０は、第１の磁場印加部２４に代えて第２の磁場印加部３８を配する点で標的物質検出装置２０と相違する。以下、相違点について説明する。
【００９８】
第２の磁場印加部３８は、液体試料導入板３２の前記裏面側に配されるとともに液体試料導入板３２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板３２の前記表面上に引き寄せ可能とされるとともに前記磁場を印加した状態で液体試料導入板３２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動可能とされる。ここで、第２の磁場印加部３８は、永久磁石と前記永久磁石をＸ１又はＸ２の方向にスライド移動させるスライド移動部材（不図示）とで形成される。
前記結合体の移動は、第２の磁場印加部３８を磁場印加部として、第２の磁場印加部３８からの前記磁場の印加により液体試料導入板３２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を液体試料導入板３２の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で第２の磁場印加部３８を液体試料導入板３２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、第２の磁場印加部３８の移動に追従させて前記結合体を移動させることにより行う（第２の結合体移動工程）。また、第２の磁場印加部３８を、環状に配置された複数の部材により構成した場合、各部材毎に磁場印加状態を制御することでスライド移動部材を用いずに第２の結合体移動工程を行うことも可能である。
この第２の磁場印加部３８を用いる場合、前記第２の結合体移動工程において、前記磁場の印加により前記液体試料中の前記結合体の全部又は一部を液体試料導入板３２の表面上に引き寄せるため、前記液体試料導入保持工程後、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板２の前記表面上に重力沈降することを待つ必要がない。
【００９９】
このように実施される第４の実施形態では、前記光信号検出工程における前記第２の結合体移動工程前後における光信号が、前掲図８，１７のように得られ、前記標的物質に基づく光信号を、液体試料導入板３２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号と明確に区別して検出することができる。
なお、図１７では、物質ａ’及び物質ｂ’が観察視野内で移動する例を示しているが、第２の磁場印加部３８を液体試料導入板３２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向で、かつ、矩形状の観察視野を律するいずれかの一辺の方向と平行な方向に、前記一辺の長さよりも長い距離で移動させると、前記観察視野の物質ａ’及び物質ｂ’を観察視野外まで移動させることができ、光信号ａ，ｂの消失に基づく高精度の検出を行うことができる。
【０１００】
なお、前記結合体に基づく光信号の態様として、図８，１０，１４，１７に例を挙げ、前記散乱光、前記反射光、蛍光等に起因する光信号であることの説明をしたが、これは、図面表示の便宜ためであり、前記光信号の態様としては、前記位相差、前記微分干渉などによる前記透過光に起因する光信号であってもよい。
また、前記結合体に基づく光信号の変化の態様として、図１０，１４，１７に例を挙げ、前記位置移動、前記焦点ずれ、前記消失として説明をしたが、前記光信号の変化の態様としては、強度の増減（前記焦点ずれに基づく強度低下等）、位相変化（位置移動後の位相変化）、出現（観察視野外からの位置移動）も挙げることができる。
【０１０１】
〔第５の実施形態〕
次に、本発明の第５の実施形態を図２２等を参照しつつ説明する。第５の実施形態では、標的物質検出装置４０を用いる。なお、図２２は、標的物質検出装置４０の説明図である。
図２２に示すように標的物質検出装置４０は、公知の導波モードセンサに準じて構成され、液体試料導入板４２と、光源４３ａ及び光学プリズム４３ｂで構成される光照射部と、第３の磁場印加部４６と第１の磁場印加部４７と、光信号検出部４５（撮像デバイス）とで構成される。なお、前記撮像デバイスは、例えば、公知のＣＣＤイメージセンサ等で構成され、２次元画像の取得が可能とされる。
第３の磁場印加部４６は、永久磁石と、この永久磁石を光学プリズム４３ｂから遠ざけたり近づけたりする（図２２中の方向Ｙ１，Ｙ２参照）ことによって磁場印加のオン−オフを制御するスライド移動部材（不図示）で形成され、液体試料導入板４２の裏面側に配されるとともに液体試料導入板４２に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板４２の前記表面上に引き寄せ可能とされる。
【０１０２】
液体試料導入板４２は、前記液体試料Ｅが前記表面上に導入されるとともに前記表面に対して全反射条件で照射される光Ｌの照射を受け、前記表面上方に近接場光を発生可能な検出板で形成される。また、液体試料導入板４２は、自身で前記液体試料保持部を構成し、前記表面上に前記液体試料Ｅが導入された後、前記液体試料を覆うようにカバーガラスＧを配することで前記液体試料Ｅを保持する。
前記光照射部は、光源４３ａから照射される光Ｌを光学プリズム４３ｂを介して液体試料導入板４２の前記表面に対して全反射条件で照射可能とされる全反射光照射部として構成される。なお、前記全反射光照射部は、例えば前記光学プリズム４３ｂに代わり、グレーティングを介して前記液体試料導入板４２の前記表面に対して全反射条件で前記光源４３ａから照射される光Ｌを導入する構成とすることもできる。
また、第１の磁場印加部４７は、永久磁石と、この永久磁石を光学プリズム４３ｂから遠ざけたり近づけたりする（図２２中の方向Ｘ１，Ｘ２参照）ことによって磁場印加のオン−オフを制御するスライド移動部材（不図示）で形成され、液体試料導入板４２の側方に配され、液体試料導入板４２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板４２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させるように構成される。
【０１０３】
標的物質検出装置４０を用いて、第５の実施形態に係る標的物質検出方法を実施する。
先ず、前記標的物質を含む前記被検体液に対し、前記結合物質を含む前記含結合物質液を加えて前記混合液を調製後、前記混合液に前記検出材を含む前記含検出材液を加えて前記液体試料を調製する（液体試料調製工程、図１（ａ）〜（ｃ）参照）。
前記被検体液に対し、前記含結合物質液を加え、その後、前記含検出材液を加えることが肝要であり（図１，図２参照）、このような手順で液体試料調製工程を実施することで、前記標的物質を高精度かつ安定的に検出することができる。
【０１０４】
次に、液体試料導入板４２の前記表面上に前記液体試料を導入し、保持させる（液体試料導入保持工程）。
次に、第３の磁場印加部４６におけるスライド移動部材を操作して磁場を印加し、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板４２の前記表面上に引き寄せた後、光源４３ａから照射される光Ｌを光学プリズム４３ｂを介して液体試料導入板４２の前記表面に対して全反射条件で照射し（光照射工程）、光信号検出部４５で前記表面上の前記近接場光に基づく光信号Ｓを取得する（光信号検出工程）。
【０１０５】
次に、第３の磁場印加部４６におけるスライド移動部材を操作して第３の磁場印加部４６からの磁場をオフし、第１の磁場印加部４７におけるスライド移動部材を操作して第１の磁場印加部４７からの磁場をオンにして液体試料導入板４２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により第１の磁場印加部４７に向けて引き寄せ、前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板４２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させる（第１の結合体移動工程）。
次に、観察視野を維持したまま前記結合体を移動させた後の液体試料導入板４２の前記表面上の光信号を光信号検出部４５で取得する（光信号検出工程）。
【０１０６】
このように実施される第５の実施形態では、前記光信号検出工程における前記第１の結合体移動工程前後における光信号が、図２３，２４のように得られ、前記標的物質に基づく光信号ｅ，ｇを、液体試料導入板４２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号ｆと明確に区別して検出することができる。なお、図２３が結合体移動工程前における、液体試料導入板４２の前記表面上の様子を示す図であり、図２４が結合体移動工程後における、液体試料導入板４２の前記表面上の様子を示す図である。
図２３，２４に示すように前記近接場光を利用して得られる光信号は、前記近接場光の減衰によりバックグランドが暗視野とされ、第５の実施形態では、光点の光信号に基づき、前記標的物質を検出する。また、図示しないが、観察視野外からの移動に基づく、光信号の出現も検出対象とすることができる。
また、液体試料導入板４２の前記表面上に前記夾雑物が吸着している場合でも、その存在を無視した検出を行うことができるため、必ずしも検出ごとに液体試料導入板４２に対する前記洗浄処理を行う必要がなく、効率的な検出を行うことができる。また、前記散乱光、前記蛍光等の現象に基づいて発生する光信号を識別信号として取り扱うことができる。また、光信号の変化の態様として、位置移動に加え、出現・消失の現象を利用することもできるため、明確に光信号の変化を捉えることができる。
加えて、前記標的物質に対し、前記結合物質を介して前記検出材が高確率かつ安定的に結合されるため、前記標的物質を高精度かつ安定的に検出することができる。
【０１０７】
〔第６の実施形態〕
次に、本発明の第６の実施形態を図２５等を参照しつつ説明する。第６の実施形態では、標的物質検出装置５０を用いる。なお、図２５は、標的物質検出装置５０の説明図である。
図２５に示すように、標的物質検出装置５０は、公知の導波モードセンサに準じて構成され、液体試料導入板５２と、光源５３ａ及び光学プリズム５３ｂで構成される光照射部と、第２の磁場印加部５８と、光信号検出部５５とで構成される。
液体試料導入板５２、前記光照射部及び光信号検出部５５は、第５の実施形態の標的物質検出装置４０における液体試料導入板４２、前記光照射部及び光信号検出部４５と同様に構成することができ、標的物質検出装置５０は、第１の磁場印加部４７及び第３の磁場印加部４６に代えて第２の磁場印加部５８を配する点で標的物質検出装置４０と相違する。以下、相違点について説明する。
【０１０８】
第２の磁場印加部５８は、液体試料導入板５２の前記裏面側に配されるとともに液体試料導入板５２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板５２の前記表面上に引き寄せ可能とされるとともに前記磁場を印加した状態で液体試料導入板５２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動可能とされる。ここで、第２の磁場印加部５８は、永久磁石と前記永久磁石をＸ１又はＸ２の方向にスライド移動させるスライド移動部材（不図示）とで形成される。
前記結合体の移動は、第２の磁場印加部５８を磁場印加部として、第２の磁場印加部５８からの前記磁場の印加により液体試料導入板５２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を液体試料導入板５２の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で第２の磁場印加部５８を液体試料導入板５２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、第２の磁場印加部５８の移動に追従させて前記結合体を移動させることにより行う（第２の結合体移動工程）。また、第２の磁場印加部５８を、環状に配置された複数の部材により構成した場合、各部材毎に磁場印加状態を制御することでスライド移動部材を用いずに第２の結合体移動工程を行うことも可能である。
この第２の磁場印加部５８を用いる場合、前記第２の結合体移動工程において、前記磁場の印加により前記液体試料中の前記結合体の全部又は一部を液体試料導入板５２の表面上に引き寄せるため、前記液体試料導入保持工程後、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板５２の前記表面上に重力沈降することを待つ必要がない。
【０１０９】
このように実施される第６の実施形態では、前記光信号検出工程における前記第２の結合体移動工程前後における光信号が、図２６，２７のように得られ、前記標的物質に基づく光信号ｈを、液体試料導入板５２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号ｉと明確に区別して検出することができる。なお、図２６が結合体移動工程前における、液体試料導入板５２の前記表面上の様子を示す図であり、図２７が結合体移動工程後における、液体試料導入板５２の前記表面上の様子を示す図である。
【０１１０】
なお、第５及び第６の実施形態の標的物質検出装置では、前記導波モードセンサの構成にしたがって構成されることとしたが、これら実施形態の変形例として、液体試料導入板４２，５２を前記表面プラズモン共鳴センサで用いられる前記検出板とし、光学系を前記表面プラズモン共鳴センサで用いられる光学系とすることで、これら実施形態と同様に、前記結合体の移動に基づく前記標的物質の検出を行うことができる。また、公知の全反射顕微鏡の光学系をはじめとする、全反射により生じる近接場光を照明に利用する光学系を用いることもできる。
【０１１１】
なお、上記実施の形態等で示した例は、発明を理解しやすくするために記載したもので
あり、本発明は、これらの形態に限定されるものではない。
また、前掲の各標的物質検出装置においては、前記液体試料導入板として、前記透光板、前記反射板、前記検出板を用いた構成とされるが、前記導入板を用いて構成してもよい。この場合、前記光照射部として前記側面側光照射部を採用し、前記液体試料導入板の前記表面側又は前記裏面側に配された前記光信号検出部において、前記結合体からの散乱光、反射光等を検出する構成とすることができる。或いは、前記液体試料導入板の前記側面（前記液体試料導入板の前記側面側光照射部が配される側と反対側の側面）側に配された前記光信号検出部において、前記結合体の光吸収、透過光等を検出する構成とすることができる。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
実施例１として前記標的物質検出装置（外力支援型センサ）を用いた前記標的物質の検出試験を次のように行った。
【０１１３】
実施例１では、図２２に示す第５の実施形態の標的物質検出装置４０の構成に準じて作製した標的物質検出装置を用いる。以下では、説明の便宜上、標的物質検出装置４０の説明に用いた符号と同一の符号で実施例１に用いた標的物質検出装置の各構成部を説明する。
具体的に、液体試料導入板４２としては、厚さ０．７２５ｍｍのＳｉＯ２基板上に厚さ２５ｎｍのＳｉ層と厚さ３４３ｎｍのＳｉＯ２層とをこの順番で積層した平面導波路チップを用いた。光源４３ａには緑色ＬＥＤ光源（Ｔｈｏｒｌａｂｓ社、型番Ｍ５３０Ｆ２）に対して、出射端にコリメートレンズを装着した６００μｍコア径の光ファイバを接続し、出射端の先に５００μｍ幅のエアスリットを配置したものを用いた。液体試料導入板４２の裏面には底角３５度のＳｉＯ２ガラス製のプリズム４３ｂを光学的に密着させて配し、液体試料導入板４２の表面に対して平行な角度でプリズム４３ｂの入射面に光源４３ａからの光を入射させることとした。
【０１１４】
前記標的物質としては、ペッパーマイルドモットウイルス（PMMoV、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構、MAFF番号104099）を用いた。
前記結合物質としては、抗ウサギ抗PMMoVポリクローナル抗体（Agdia、CAB 37501/500）を２.５ｐｇ／ｍＬの濃度で用いた。
前記磁性粒子としては、プロテインＧ修飾磁性粒子（直径２５ｎｍ、NANOCS、MP25-PG-0.5ML）を用いた。
前記光応答性物質としては、プロテインＧ修飾金ナノ粒子（直径６０ｎｍ、Cytodiagnostics、AC-60-18-05）を用いた。
【０１１５】
前記液体試料の調製は、次のように行った。
先ず、前記PMMoVをＰＢＳで希釈し被検体液とした。これに前記被検体液と等量で前記抗ウサギ抗PMMoVポリクローナル抗体を加え、４℃の温度条件下で一晩反応させ、前記標的物質と前記結合物質とを結合させた混合液を調製した。
次に、前記プロテインＧ修飾磁性粒子と前記プロテインＧ修飾金ナノ粒子とを、それぞれの最終濃度が１×１０６個／ｍＬ（前記プロテインＧ修飾磁性粒子）、５×１０６個／ｍＬ（前記プロテインＧ修飾金ナノ粒子）になるように前記混合液に加え、４℃の温度条件下で２時間反応させ、前記液体試料を調製した。
なお、前記PMMoVの希釈は、後掲の図２８に示すように１０倍ずつ多段階で行い、それぞれの希釈倍率で試験結果を得ることとしている。
【０１１６】
次に、前記液体試料を液体試料導入板４２上に直径８ｍｍの貫通穴を持つ厚さ２ｍｍのシリコンゴムシートを設置することで形成した前記液体試料保持部に導入した。
前記液体試料を導入後、カバーガラスＧを配して前記液体試料保持部に蓋をし、前記磁性粒子を液体試料導入板４２の表面上に第３の磁場印加部４６をオンすることによって引き寄せた。第３の磁場印加部４６にはスライド部材に固定したネオジウム磁石を用いた。
第３の磁場印加部４６による引き寄せ後、前記入射光の照射によって液体試料導入板４２の表面に近接場を形成し、光信号の測定を行った。
前記光信号は、４倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡を用いて、非冷却ＣＭＯＳカメラ（Basler社製、型番acA2440-35uc）にて観測した。つまり、光信号検出部４５（撮像デバイス）として、４倍の対物レンズを備えたＣＭＯＳカメラを用いたこととなる。
【０１１７】
その後、第３の磁場印加部４６をオフし、第１の磁場印加部４７としてスライド部材に固定したネオジウム磁石を用いて、第１の磁場印加部４７をオンして、前記液体試料導入板４２の前記表面の面内に平行な方向のベクトル成分を持つ磁場を印加し、前記磁場の印加前後における動光点の観測を行い、実施例１に係る標的物質検出方法を実施した。
【０１１８】
（比較例１）
前記液体試料の調製を次のように行ったこと以外は、実施例１に係る標的物質検出方法と同様にして、比較例１に係る標的物質検出方法を実施した。
先ず、前記抗ウサギ抗PMMoVポリクローナル抗体の溶液に、前記プロテインＧ修飾磁性粒子と前記プロテインＧ修飾金ナノ粒子を加え、４℃の温度条件で一晩反応させ、前記磁性粒子及び前記光応答性物質のそれぞれに前記結合物質を結合させた比較用混合液を調製した。なお、前記抗ウサギ抗PMMoVポリクローナル抗体、前記プロテインＧ修飾磁性粒子及び前記プロテインＧ修飾金ナノ粒子の添加量及び濃度は、実施例１に係る標的物質検出方法と同じ条件としている。
次に、前記プロテインＧ修飾磁性粒子及び前記プロテインＧ修飾金ナノ粒子を緩衝液で洗浄し、余剰の抗体を除いた後、前記結合物質が結合された保存用の前記磁性粒子及び前記光応答性物質として、前記比較用混合液を４℃の温度条件下で３日間保存した。
その後、前記比較用混合液に実施例１と同じ前記PMMoVをＰＢＳで希釈した被検体液を加え、３７℃の温度条件下で１時間反応させて前記液体試料を調製した。
【０１１９】
（比較例２）
更に、前記比較用混合液の保存期間を３日間から８日間に変更したこと以外は、比較例１に係る標的物質検出方法と同様にして、比較例２に係る標的物質検出方法を実施した。
【０１２０】
（試験結果）
実施例１、比較例１及び比較例２に係る各標的物質検出方法による試験結果を最大希釈倍率を用いて表す。前記最大希釈倍率は、前記磁場の印加前後における動光点の観測を行うことができた、前記PMMoVの最大希釈倍率を表したものである。
【０１２１】
図２８は、実施例１、比較例１及び比較例２に係る各標的物質検出方法による試験結果を最大希釈倍率により示したグラフである。
この図２８に示すように、実施例１に係る標的物質検出方法では、前記最大希釈倍率が１０１１であるのに対し、比較例１に係る標的物質検出方法では、前記最大希釈倍率が１０６に低下し、更に比較例２に係る標的物質検出方法では、前記PMMoVが検出されない結果となった。
この結果から、前記結合物質が結合された保存用の前記磁性粒子及び前記光応答性物質を用いると、保存期間に応じて、前記磁性粒子及び前記光応答性物質と前記結合物質との結合が解かれ、その結果、前記結合物質を介した前記磁性粒子及び前記光応答性物質と前記標的物質との結合体が形成されなくなり、延いては、前記標的物質の検出結果が前記磁性粒子及び前記光応答性物質の保存状態に左右される状況となることが分かる。
【符号の説明】
【０１２２】
Ｔ      標的物質
Ｂ      結合物質
Ｍ      磁性粒子
Ｏ      光応答性物質
ＭＯ      光応答性磁性粒子
１，１Ａ，１Ｂ，１０，２０，２０Ａ，３０，４０，５０    標的物質検出装置
２，１２，２２，３２，４２，５２    液体試料導入板
３，１３，２３，３３    光照射部
４，７，２４，２７，４７    第１の磁場印加部
５ａ，１５ａ，２５ａ，３５ａ    撮像デバイス
５ｂ，１５ｂ，２５ｂ，３５ｂ    対物レンズ
２５ｃ，３５ｃ    ハーフミラー
５，１５，２５，３５，４５，５５    光信号検出部
６，２６，４６    第３の磁場印加部
１８，３８，５８    第２の磁場印加部
４３ａ，５３ａ    光源
４３ｂ，５３ｂ    光学プリズム
Ｌ      光
ＴＬ      透過光
ＲＬ      反射光
ａ〜ｉ    光信号
ａ’，ｂ’    物質
Ｘ１，Ｘ２，Ｙ１，Ｙ２    方向
ｘ１，ｘ２，ｙ１，ｙ２    ベクトル成分
Ｇ      カバーガラス
Ｅ      液体試料
Ｓ      光信号
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図１（ｃ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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