(57)【要約】【課題】イオンペア試薬を使用することなく、２種以上のヌクレオチドを同時に定量する方法を提供すること。【解決手段】サンプル中の２種以上のヌクレオチドを液体クロマトグラフィー質量分析法により定量する方法であって、サンプルからヌクレオチド混合物を抽出する工程ａと、上記ヌクレオチド混合物に、同位体で標識した上記２種以上のヌクレオチドを内部標準物質として添加し、測定サンプルを調製する工程ｂと、順相カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより、上記測定サンプルから各ヌクレオチドを分離する工程ｃと、分離した各ヌクレオチドを質量分析法により同定する工程ｄと、同定した各ヌクレオチドのクロマトグラムピーク面積と内部標準物質のクロマトグラムピーク面積の比を求めて各ヌクレオチドを定量する工程ｅと、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の２種以上のヌクレオチドを液体クロマトグラフィー−質量分析法により定量する方法であって、
サンプルからヌクレオチド混合物を抽出する工程ａと、
前記ヌクレオチド混合物に、同位体で標識した前記２種以上のヌクレオチドを内部標準物質として添加し、測定サンプルを調製する工程ｂと、
順相カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより、前記測定サンプルから各ヌクレオチドを分離する工程ｃと、
分離した各ヌクレオチドを質量分析法により同定する工程ｄと、
同定した各ヌクレオチドのクロマトグラムピーク面積と内部標準物質のクロマトグラムピーク面積の比を求めて各ヌクレオチドを定量する工程ｅと、
を含む方法。
【請求項２】
サンプル中に含まれる細胞数を測定する工程と、
ヌクレオチドの定量結果から細胞あたりのヌクレオチドの分子数を算出する工程と、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが、組織、細胞および生体液からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ヌクレオチドが、ヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
同位体が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏおよび１８Ｏからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
液体クロマトグラフィーが、親水性相互作用型クロマトグラフィーである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
液体クロマトグラフィーが、スルホベタイン基で修飾された固定相を有する分離カラムを用いた親水性相互作用型クロマトグラフィーである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
順相カラムのカラム内壁の材質が、ポリエーテルエーテルケトンである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
質量分析法により同定する工程ｄにおいて、多重反応モニタリングをポジティブイオンモードで行う、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｅにおいて、各ヌクレオチドの検量線を予め作成し、作成した検量線に基づいて各ヌクレオチドを定量する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｅにおいて、検量線作成用サンプルとして、分析対象の各ヌクレオチドの標準物質、および内部標準物質としての同位体で標識した前記各ヌクレオチドを含むサンプルを用いる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｅにおいて、検量線作成用サンプルを揮発性のアンモニウム塩およびアセトニトリルを含む溶解液を用いて調製する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
液体クロマトグラフィー−質量分析法が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳと称される液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計を用いた分析法である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
液体クロマトグラフィーに用いる移動相が、重炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択されるいずれかを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
液体クロマトグラフィーに用いる移動相のｐＨが、８〜１１である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
液体クロマトグラフィーに用いる移動相の塩濃度が、１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
各ヌクレオチドの絶対量を測定することができる、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオチドの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレオシド三リン酸は、ＤＮＡやＲＮＡの構成因子、リン酸基の供与体、エネルギーの運搬体および酵素反応の補酵素であり、細胞シグナル伝達にも関わるなど、細胞の基本的な生物学的プロセスで重要な役割を果たしている（非特許文献１および２）。細胞はこれらの量的バランスを厳密に保つために、ヌクレオチド生合成のネガティブフィードバック（非特許文献１）や、リボヌクレオチド還元酵素によるデオキシリボヌクレオチドの選択的生成（非特許文献３）などの巧妙な制御システムを備えている。ヌクレオシド三リン酸の量的バランス異常は、遺伝子転写の阻害（非特許文献４）、タンパク質の翻訳阻害（非特許文献５）、発がんに繋がり得るDNAの突然変異誘発（非特許文献６および７）など、細胞に重大な影響を及ぼす。実際、Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ症候群、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ症候群、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｐａｔｈｙなど、いくつかの遺伝的疾患の原因が、ヌクレオチド合成に関わる遺伝子の欠損にあることが明らかになっている（非特許文献８）。一方、ヌクレオシド三リン酸のバランス異常は創薬の魅力的な標的でもある。５−フルオロウラシルやヒドロキシ尿素などに代表される代謝拮抗剤は、ヌクレオチド合成を阻害することでがん細胞を殺傷するし、近年も精力的にこの種の抗がん剤が開発されている（非特許文献９）。さらに、抗がん剤や抗ウイルス剤として種々のヌクレオシドやヌクレオチド類似体（５−フルオロウラシルなど）の開発が進められているが、これらの作用標的自体がヌクレオシド三リン酸のバランス異常であったり、副作用としてバランス異常を引き起こしたりする（非特許文献１０）。
【０００３】
液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による細胞内ヌクレオシド三リン酸の同時定量方法が報告されている。例えば、非特許文献１１では、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの同時定量を行っている。また、非特許文献１２および１３においては、ＡＴＰおよびｄＧＴＰも含めた８種類のヌクレオシド三リン酸の同時定量を行っている。
【０００４】
一方、特許文献１には、代謝的に同位体標識された生体分子を内部標準物質として添加し、タンパク質を質量分析により測定する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４７１４５８４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lane AN, Fan TW (2015) Nucleic Acids Res 43 (4):2466-2485
【非特許文献２】Spiegel AM (1988) Vitam Horm 44:47-101
【非特許文献３】Torrents E (2014) Front Cell Infect Microbiol 4:52
【非特許文献４】Papadopoulou C, Guilbaud G, Schiavone D, Sale JE (2015) Cell Rep 13 (11):2491-2503
【非特許文献５】Iglesias-Gato D, Martin-Marcos P, Santos MA, Hinnebusch AG, Tamame M (2011) Genetics 187 (1):105-122
【非特許文献６】Song S, Wheeler LJ, Mathews CK (2003) J Biol Chem 278 (45):43893-43896
【非特許文献７】Bester AC, Roniger M, Oren YS, Im MM, Sarni D, Chaoat M, Bensimon A, Zamir G, Shewach DS, Kerem B (2011) Cell 145 (3):435-446
【非特許文献８】Fasullo M, Endres L (2015) Int J Mol Sci 16 (5):9431-9449
【非特許文献９】Murase M, Iwamura H, Komatsu K, Saito M, Maekawa T, Nakamura T, Yokokawa T, Shimada Y (2016) Pharmacol Res Perspect 4 (1):e00206
【非特許文献１０】Jordheim LP, Durantel D, Zoulim F, Dumontet C (2013) Nat Rev Drug Discov 12 (6):447-464
【非特許文献１１】Chen P, Liu Z, Liu S, Xie Z, Aimiuwu J, Pang J, Klisovic R, Blum W, Grever MR, Marcucci G, Chan KK (2009) Pharm Res 26 (6):1504-1515
【非特許文献１２】Zhang W, Tan S, Paintsil E, Dutschman GE, Gullen EA, Chu E, Cheng YC (2011) Biochem Pharmacol 82 (4):411-417
【非特許文献１３】Kamceva T, Bjanes T, Svardal A, Riedel B, Schjott J, Eide T (2015) J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 1001:212-220
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１１においては、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの同時定量法を行っているが、ＡＴＰとｄＧＴＰはＨＰＬＣとＭＳのいずれにおいても分離されていない。非特許文献１２および１３を含めてみても、これらの同時定量法には以下の問題がある。第一の問題は、細胞抽出物のマトリックス効果を補正するために細胞マトリックスを使用しているか、標準添加法を用いる点である。細胞マトリックスを使用する場合、検量線サンプルの調製のために手間のかかる細胞抽出物中のヌクレオチドの除去処理が必要である。またヌクレオチドの除去処理によりマトリックスにアーティファクトが生じる可能性がある。またマトリックスは細胞株によって異なるので、分析する細胞株ごとに細胞マトリックスを調製しなければならない。標準添加法を用いる場合、サンプルごとに検量線を作成しなければならないが、これは分析のスループットの障害となる。第二の問題は、分析に時間がかかりすぎることであり、具体的には１サンプルの分析に４０分〜１００分以上かかることである。第三の問題は、非特許文献１１〜１３の方法で使用されるイオンペア試薬は、ＬＣ（液体クロマトグラフィー：Liquid Chromatography）のラインに残存しやすいため、それを必要としない測定対象の分析にイオンサプレッション、保持時間やピーク形状の変化といった悪影響を及ぼすという問題がある。
【０００８】
特許文献１においては、タンパク質以外の生体分子を測定した実施例はなく、複数のヌクレオチドを同時定量することについて具体的な記載はない。
【０００９】
検査、治療および創薬においては、細胞内ヌクレオチドの精度のよい同時定量法の開発が望まれている。本発明は、イオンペア試薬を使用することなく、２種以上のヌクレオチドを同時に定量する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、順相カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより、測定サンプルから各ヌクレオチドを分離する工程と、分離した各ヌクレオチドを質量分析法により同定する工程とによって、イオンペア試薬を使用することなく、２種以上のヌクレオチドを同時に定量できることを見出した。本発明は上記知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞サンプル中の２種以上のヌクレオチドを液体クロマトグラフィー−質量分析法により定量する方法であって、
サンプルからヌクレオチド混合物を抽出する工程ａと、
上記ヌクレオチド混合物に、同位体で標識した上記２種以上のヌクレオチドを内部標準物質として添加し、測定サンプルを調製する工程ｂと、
順相カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより、上記測定サンプルから各ヌクレオチドを分離する工程ｃと、
分離した各ヌクレオチドを質量分析法により同定する工程ｄと、
同定した各ヌクレオチドのクロマトグラムピーク面積と内部標準物質のクロマトグラムピーク面積の比を求めて各ヌクレオチドを定量する工程ｅと、
を含む方法。
【００１２】
＜２＞サンプル中に含まれる細胞数を測定する工程と、
ヌクレオチドの定量結果から細胞あたりのヌクレオチドの分子数を算出する工程と、
をさらに含む、＜１＞に記載の方法。
＜３＞サンプルが、組織、細胞および生体液からなる群より選択される、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞ヌクレオチドが、ヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸である、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載の方法。
＜５＞同位体が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏおよび１８Ｏからなる群から選択される、＜１＞から＜４＞のいずれか一に記載の方法。
【００１３】
＜６＞液体クロマトグラフィーが、親水性相互作用型クロマトグラフィーである、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載の方法。
＜７＞液体クロマトグラフィーが、スルホベタイン基で修飾された固定相を有する分離カラムを用いた親水性相互作用型クロマトグラフィーである、＜１＞から＜６＞のいずれか一に記載の方法。
＜８＞順相カラムのカラム内壁の材質が、ポリエーテルエーテルケトンである、＜１＞から＜７＞のいずれか一に記載の方法。
【００１４】
＜９＞質量分析法により同定する工程ｄにおいて、多重反応モニタリングをポジティブイオンモードで行う、＜１＞から＜８＞のいずれか一に記載の方法。
＜１０＞工程ｅにおいて、各ヌクレオチドの検量線を予め作成し、作成した検量線に基づいて各ヌクレオチドを定量する、＜１＞から＜９＞のいずれか一に記載の方法。
＜１１＞工程ｅにおいて、検量線作成用サンプルとして、分析対象の各ヌクレオチドの標準物質、および内部標準物質としての同位体で標識した上記各ヌクレオチドを含むサンプルを用いる、＜１＞から＜１０＞のいずれか一に記載の方法。
【００１５】
＜１２＞工程ｅにおいて、検量線作成用サンプルを揮発性のアンモニウム塩およびアセトニトリルを含む溶解液を用いて調製する、＜１＞から＜１１＞のいずれか一に記載の方法。
＜１３＞液体クロマトグラフィー−質量分析法が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳと称される液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計を用いた分析法である、＜１＞から＜１２＞のいずれか一に記載の方法。
＜１４＞液体クロマトグラフィーに用いる移動相が、重炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択されるいずれかを含む、＜１＞から＜１３＞のいずれか一に記載の方法。
【００１６】
＜１５＞液体クロマトグラフィーに用いる移動相のｐＨが、８〜１１である、＜１＞から＜１４＞のいずれか一に記載の方法。
＜１６＞液体クロマトグラフィーに用いる移動相の塩濃度が、１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである、＜１＞から＜１５＞のいずれか一に記載の方法。
＜１７＞各ヌクレオチドの絶対量を測定することができる、＜１＞から＜１６＞のいずれか一に記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法によれば、イオンペア試薬を使用することなく、２種以上のヌクレオチドを同時に定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、Ｍｏｌｍ−１３細胞からの抽出物中の測定対象物質およびその内部標準（ＩＳ）のＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。被験物質またはＩＳを示すピークを矢印で示している。
【図２】図２は、２００μｍｏｌ／Ｌまたは２０００μｍｏｌ／Ｌのチミジンで２４時間処理したＭｏｌｍ−１３細胞の細胞増殖の阻害性を示すグラフである。平均±ＳＤ（標準偏差：Standard Deviation）、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１対ビヒクル（ｔ検定）。
【図３】図３は、２００μｍｏｌ／Ｌまたは２０００μｍｏｌ／Ｌのチミジンで２４時間処理したＭｏｌｍ−１３細胞におけるｄＮＴＰおよびＮＴＰレベルの変化を示すグラフである。平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対ビヒクル（ｔ検定）。
【図４】図４は、２４時間の２０００μｍｏｌ／Ｌチミジン処理により誘導されたＭｏｌｍ−１３細胞におけるｄＮＴＰレベルの変化の推定メカニズムを表す図である。ＲＮＲ、リボヌクレオチドレダクターゼ；ｄＴ、チミジン。「増加」を示す矢印の幅は、チミジン処理によって誘導されたｄＮＴＰの変化量を反映する。
【図５】図５は、細胞当たりのヌクレオチドの数を算出するためのプロトコルの一例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
本発明のヌクレオチドの定量方法は、以下の工程を含み、サンプル中の２種以上のヌクレオチドを液体クロマトグラフィー−質量分析法により定量する方法である。
工程ａ：サンプルからヌクレオチド混合物を抽出する
工程ｂ：上記ヌクレオチド混合物に、同位体で標識した上記２種以上のヌクレオチドを内部標準物質として添加し、測定サンプルを調製する
工程ｃ：順相カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより、上記測定サンプルから各ヌクレオチドを分離する
工程ｄ：分離した各ヌクレオチドを質量分析法により同定する
工程ｅ：同定した各ヌクレオチドのクロマトグラムピーク面積と内部標準物質のクロマトグラムピーク面積の比を求めて各ヌクレオチドを定量する。
【００２０】
＜用語の説明＞
（定量）
本発明において「定量」とは、絶対定量および相対定量を含む概念である。本発明において「絶対定量」とは測定結果を量または濃度として得ることを目的とする定量方法であり、「相対定量」とは絶対定量以外の定量方法を指す。
【００２１】
（内部標準物質）
本発明において「内部標準物質」とは、質量分析法にて測定対象物質を定量するときに、サンプル中に一定量を加えられる物質をいう。本発明では、内部標準物質は、ヌクレオチド混合物抽出後の実験操作の誤差や、サンプル中マトリックスの影響により定量値が変動することを補正するため、サンプル中に一定量を加えることが好ましい。
【００２２】
（サンプル）
本発明におけるサンプルは特に限定されず、ヌクレオチドを含むサンプルであれば任意のサンプルを使用することができる。サンプルとしては、組織、生体液、細胞、またはそれらを処理して得られる試料などを使用することができるが、特に限定されない。サンプルの由来は特に限定されず、例えば、ヒトおよびマウスなどの哺乳類由来のサンプルを使用することができる。
【００２３】
組織としては、例えば、脳、脳の各部位（例えば、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、十二指腸、小腸、大腸、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、耳下腺、舌下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などが挙げられる。
【００２４】
生体液としては、例えば、血液（血漿、血清を含む）、尿、糞、唾液、涙液、浸潤液（腹水、組織液を含む）などが挙げられる。
【００２５】
細胞としては、生体から採取した細胞でも、株化した培養細胞でもよい。細胞の種類は特に限定されず、正常細胞およびがん細胞などの任意の細胞を使用することができる。
【００２６】
（ヌクレオチド）
測定対象物質となるヌクレオチドとしては、下記の２７種が挙げられる。なお、本発明においてヌクレオチドには、ＤＮＡやＲＮＡは含まれない。
【００２７】
ヌクレオシド三リン酸：９種
ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、
ＣＴＰ（シチジン三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン三リン酸）、
ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リン酸）、
ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）、ｄＴＴＰ（チミジン三リン酸）、ｄＵＴＰ（デオキシウリジン三リン酸）
【００２８】
ヌクレオシド二リン酸；９種
ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、ＧＤＰ（グアノシン二リン酸）、
ＣＤＰ（シチジン二リン酸）、ＵＤＰ（ウリジン二リン酸）、
ｄＡＤＰ（デオキシアデノシン二リン酸）、ｄＧＤＰ（デオキシグアノシン二リン酸）、
ｄＣＤＰ（デオキシシチジン二リン酸）、ｄＴＤＰ（チミジン二リン酸）、ｄＵＤＰ（デオキシウリジン二リン酸）
【００２９】
ヌクレオシド一リン酸；９種
ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）、ＧＭＰ（グアノシン一リン酸）、
ＣＭＰ（シチジン一リン酸）、ＵＭＰ（ウリジン一リン酸）、
ｄＡＭＰ（デオキシアデノシン一リン酸）、ｄＧＭＰ（デオキシグアノシン一リン酸）、
ｄＣＭＰ（デオキシシチジン一リン酸）、ｄＴＭＰ（チミジン一リン酸）、ｄＵＴＰ（デオキシウリジン一リン酸）
【００３０】
本発明においては、２種以上２７種類以下のヌクレオチドの同時定量を行うことができる。同時定量するヌクレオチドの種類の下限値は２種以上であれば特に限定されないが、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種類以上、または９種以上でもよい。同時定量するヌクレオチドの種類の上限値は２７種類以下であれば特に限定されないが、２０種以下、１８種以下、１６種以下、１４種以下、１２種以下、または１０種以下でもよい。
【００３１】
本発明の具体例としては、上記したヌクレオシド三リン酸の９種を同時定量すること、上記したヌクレオシド二リン酸の９種を同時定量すること、および上記したヌクレオシド一リン酸の９種を同時定量することが挙げられる。
ＤＮＡやＲＮＡ合成の直接の基質である、デオキシウリジン三リン酸を除く、上記したヌクレオシド三リン酸の８種を同時定量することが特に好ましい。
【００３２】
＜工程ａ：ヌクレオチドの抽出＞
本工程では、サンプルからヌクレオチド混合物を抽出する。抽出の手法は、従来この種の物質の抽出に用いられている方法を適宜採用することができる。例えば、サンプルを破砕および抽出する方法は、超音波破砕装置、細胞溶解液を用いる方法、または凍結融解法などが挙げられるが特に限定されない。
【００３３】
ヌクレオチドの抽出の一例を以下に記載する。まず、細胞は、遠心分離によりペレット化し、上清を除去することが好ましい。さらにペレットをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で再懸濁して、この操作を数回繰り返すことが好ましい。その後、上清を除去し沈殿したサンプルにアルコール（例えばメタノール）を添加し攪拌する。これにより、サンプルから代謝物を抽出することができる。この抽出操作の直前、途中または最後に適宜再懸濁させた懸濁液の一部を取り分け、細胞数の計測を行うことが好ましい。この細胞数の計測は、工程ｆで細胞当たりのヌクレオチドの分子数を算定するために行うことができる（図５）。
【００３４】
＜工程ｂ：内部標識物質の添加＞
この工程では、上記ヌクレオチド（代謝物）の混合物に、同位体で標識した２種以上のヌクレオチドを内部標準物質として添加し、測定サンプルを調製する。ヌクレオチドの同位体は通常この種の分析に用いられるものを適宜採用することが好ましい。安定な同位体には、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏなどが挙げられる。物質としては、代謝物に含まれることが予想されるヌクレオチドに対応した同位体を添加することが好ましい。例えば、ＡＴＰに対しては［１５Ｎ５，１３Ｃ１０］ＡＴＰ、ＧＴＰに対しては［１５Ｎ５，１３Ｃ１０］ＧＴＰ、ＣＴＰに対しては［１５Ｎ３，１３Ｃ９］ＣＴＰ、ＵＴＰに対しては［１５Ｎ２，１３Ｃ９］ＵＴＰ、ｄＡＴＰに対しては［１５Ｎ５，１３Ｃ１０］ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰに対しては［１５Ｎ５，１３Ｃ１０］ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰに対しては［１５Ｎ３，１３Ｃ９］ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰに対しては［１５Ｎ２，１３Ｃ１０］ｄＴＴＰが挙げられる。
【００３５】
サンプルは、その後、水を添加して激しく渦攪拌することが好ましい。これを遠心分離し、上清を採取し、蒸発乾固することが好ましい。
【００３６】
内部標準物質の添加量は特に限定されないが、１ｐｍｏｌ以上１００ｎｍｏｌ以下であることが好ましく、１０ｐｍｏｌ以上１０ｎｍｏｌ以下であることがより好ましく、１００ｐｍｏｌ以上１ｎｍｏｌ以下であることがさらに好ましい。
【００３７】
上記で得られたサンプルは、後述する液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により分離することができる。
【００３８】
＜工程ｃ：液体クロマトグラフィーによる分離＞
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は、当業者に公知のもの適宜選定して使用することができるが、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー：High Performance Liquid Chromatography）であることが好ましい。ＨＰＬＣ装置は、分離カラム、試料導入部、および移動相を分離カラムに送り込むポンプを備える。ＨＰＬＣ装置は、それ以外の要素、例えば、オートサンプラー、ヒーター、分離された成分を検出する検出器、脱気装置、カラムオーブン、データ処理装置などを備えていてもよい。検出器としては、例えば、ＵＶ検出器や蛍光検出器、示唆屈折率検出器、蒸発光散乱検出器、荷電化粒子検出器、電気化学検出器、電気伝導度検出器などが挙げられる。例えば、検出器は、カラムとイオン源（イオン化部）の間に接続することができる。
【００３９】
本発明において液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の分離モードは、順相カラムを用いた順相分配型のクロマトグラフィー（Normal Phase Liquid Chromatography：ＮＰＬＣ）が採用され、中でも、ＨＩＬＩＣ（親水性相互作用型クロマトグラフィー：Hydrophilic Interaction Chromatography）が好ましい。
【００４０】
ＮＰＬＣでは、溶出順は通常低極性化合物、高極性化合物の順である。ＨＩＬＩＣはＮＰＬＣに含まれる。特にＨＩＬＩＣ固有の特徴について触れると、ＨＩＬＩＣは、高極性固定相と、大部分が有機溶媒である疎水性の移動相との組み合わせによる保持モードであり、高極性化合物の分離に適している。さらに、ＨＩＬＩＣでは、極性の高い固定相を用い、高極性化合物ほど保持が強くなり、静電的相互作用、親水性分配などの様々な相互作用が関与する。
【００４１】
本発明においては、順相カラムのカラム内壁（接液部）の材質は、金属（例えば、ステンレスなど）、ポリエーテルエーテルケトン（ピーク：ＰＥＥＫ）などが好ましく、ポリエーテルエーテルケトンが特に好ましい。また、金属製のカラムの場合、マトリックスのカラム内壁への不可逆的な吸着などにより、ヌクレオチドの意図しないカラム内部への吸着が抑えられているカラムが好ましい。
【００４２】
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に用いる移動相としては、好ましくは塩基性である水溶液の移動相Ａおよび有機溶媒を含む移動相Ｂとを使用することができる。
【００４３】
移動相ＡのｐＨ値は、好ましくは７〜１１であり、より好ましくは８〜１１であり、さらに好ましくは８．４〜１０．４であり、特に好ましくは９．０〜９．８である。移動相Ａの塩濃度は、好ましくは１〜３００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである。ＬＣ−ＭＳによる測定では、通常、高い感度を出すために塩濃度を低く（例えば、５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ）することがある。本発明においてＬＣに用いる移動相Ａとして用いられる化合物種を挙げると、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、リン酸、アンモニア、重炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウムなどが挙げられ、中でも、揮発性のアンモニウム塩が好ましく、重炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムが特に好ましい。
【００４４】
移動相Ａには、アルカリを含有させてもよい。アルカリとしては、２８質量％アンモニア水が挙げられる。アルカリの濃度は適宜に調節すればよいが、例えば、２８質量％アンモニア水が０〜０．５容量％であることが好ましく、０〜０．２容量％であることがより好ましい。
【００４５】
移動相Ｂに用いられる有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、２−プロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、エタノールなどが挙げられ、好ましくはアセトニトリルまたはメタノールであり、より好ましくはアセトニトリルである。
【００４６】
移動相Ｂとして、アセトニトリルを使用する場合、移動相中のアセトニトリルの濃度は、好ましくは０〜９５容量％であり、より好ましくは０〜９０容量％であり、さらに好ましくは０〜８５容量％である。溶出は、移動相Ａと移動相Ｂの比率を経時的に変化させるグラジエント溶出により行っても、比率を固定するアイソクラティックで行ってもよい。
【００４７】
液体クロマトグラフィーに用いられる分離カラムの条件としては、特に制限されず、諸条件に応じて適宜選択することができる。分離カラムとしては、順相分配クロマトグラフィーに適用されるものを適宜用いることができるが、カラム充填剤（固定相）として、シリカゲルや、アルミナゲル、ジルコニアゲルなどの無機系充填剤、または、スチレン-ジビニルベンゼン共重合体、ポリメタクリレートなどの合成ポリマーゲルや、天然高分子ゲルなどの樹脂（ポリマー）系充填剤などを適用することができる。シリカゲルは表面修飾されていることが好ましく、例えば、ＮＨ２シリカゲル、ＣＮシリカゲル、ジオールシリカゲルなどが挙げられる。さらに、ＨＩＬＩＣにおいては、カラム充填剤にシリカゲルやポリマーなどを適用し、その表面に、中性のアミド基、電荷型のスルホエチル基、両性イオン型のスルホベタイン基（＊−Ｌ−Ｎ＋Ｒ２−Ｌｎ−ＳＯ３−：Ｒ＝ＣＨ３、Ｌ＝ＣＨ２、ｎ＝１〜６（好ましくは３）、＊は充填剤への導入部、ただし充填剤とＬとの間に所定の連結基が介在してもよい］、ジオール基、表面にヒドロキシル基、アミノ基、ホスホリルコリン残基が修飾され導入されていてもよい。中でも、本発明においては、スルホベタイン基で修飾されたカラム充填剤（固定相）を有する分離カラムが好ましい。
【００４８】
２種またはそれ以上の溶液を混合して移動相（分離溶液）を調製する場合、２種またはそれ以上の溶液中の揮発性のアンモニウム塩およびアセトニトリルの濃度は、混合後の移動相中の揮発性のアンモニウム塩およびアセトニトリルの濃度が好適な濃度となるよう、混合比率に応じて適宜設定することができる。例えば、揮発性のアンモニウム塩として重炭酸アンモニウムを用いる場合、２種またはそれ以上の溶液中の重炭酸アンモニウムおよびアセトニトリルの濃度は、混合後の移動相中の重炭酸アンモニウムおよびアセトニトリルの濃度が好適な濃度となるよう、混合比率に応じて適宜設定すればよい。
【００４９】
流速は、分離カラムの内径等の諸条件に応じて適宜選択できる。移動相の流速は、分離工程を通じて一定であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）に合わせて、移動相の流速を０．１〜１．５ｍＬ／分の範囲で適宜選択することができ、０．２〜１．０ｍＬ／分が好ましい。
また、液体クロマトグラフィーにおけるカラム温度は、当業者であれば、分析対象や使用する分析カラムの仕様に合わせて適宜選択することができる。例えば、４０〜７０℃であってよく、具体的には４０℃であってよい。
【００５０】
次の工程ｄとも関連することであるが、本発明においては、液体クロマトグラフ（ＬＣ）は質量分析計（ＭＳ）と一体化されていることが好ましく、液体クロマトグラフ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）を用いることが好ましい。具体的には、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳと称される液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計を用いた分析法であることが好ましい。
【００５１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでは、一般的には、次のような処理が行われる。液体クロマトグラフィーにより分離したサンプルをインターフェース（イオン源）を介してイオン化する。生成したイオンは第一の質量分析計（ＭＳ）で分離して特定の質量のイオンを解離・フラグメント化させる。そのイオンを第二の質量分析計で検出する。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法では、特定の質量のイオンのみを選択し、フラグメント化することができるため、微量成分定量分析に好適に対応することができる。
【００５２】
＜工程ｄ：ＭＳによる定量測定＞
本工程では、上記の液体クロマトグラフィーで分離したヌクレオチドの質量を質量分析法（mass spectrometry）により同定する。
質量分析計（mass spectrometer）は公知の質量分析計が使用できるが、特にＬＣ装置に直列に接続することが可能なものは簡便に使用できるので好ましい。用いられる質量分析計は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。２つまたはそれ以上の質量分析計は、直列に接続して用いることができる。すなわち、ＬＣ−ＭＳシステムは、例えば、直列に接続された２つまたはそれ以上の質量分析計を備える、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳであってよい。
【００５３】
質量分析計としては、磁場セクター型質量分析計（sector mass spectrometer）、四重極質量分析計（quadrupole mass spectrometer：ＱＭＳ）、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer：ＴＯＦ−ＭＳ）、イオントラップ質量分析計（ion trap mass spectrometer）、フーリエ変換質量分析計（Fourier transform mass spectrometer）などが挙げられる。本発明においては、なかでも、タンデム四重極質量分析計が好ましい。
【００５４】
質量分析計におけるイオン化法としては、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、光イオン化法（ＡＰＰＩ）、電子イオン化法（ＥＩ法）、化学イオン化法（ＣＩ法）、電界脱離法（ＦＤ法）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ法）、および音速イオン化法（ＳＳＩ）が挙げられるが、特にエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）が好ましい。
【００５５】
タンデム四重極質量分析計は、イオン源、四重極（Ｑ１）、コリジョンセル（Ｑ２）、四重極（Ｑ３）、検出器で構成される質量分析計である。測定対象物は、イオン源でイオン化され、プリカーサーイオンが生成され、その質量電荷比（ｍ／ｚ）によって、四重極（Ｑ１）で質量分離される。次いで、コリジョンセル（Ｑ２）内で窒素やアルゴンなどの不活性ガスと衝突させることでプロダクトイオンが生成される（衝突誘起解離：ＣＩＤ）。プロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）によって、四重極（Ｑ３）で再度、質量分離され、検出器で検出される。
【００５６】
ＭＳ/ＭＳは、プリカーサーイオンを衝突誘起解離させて得られたプロダクトイオンをモニターする手法が好ましい。これには、多重反応モニタリング（Multiple Reaction Monitoring：ＭＲＭ）あるいは選択反応モニタリング（Selected Reaction Monitoring：ＳＲＭ)があるが、本発明においては、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）が好ましい。
ＳＲＭは、プロダクトイオンスキャンにより得られた特定のプロダクトイオンのｍ／ｚを利用することで、選択性の高い高感度定量が行える。ここでは、Ｑ１でプリカーサーを選択し、コリジョンセルにおいてＣＩＤを行い、Ｑ３で特定のプロダクトイオンを選定し検出する。
【００５７】
ＭＲＭは、イオン化プローブでイオン化したさまざまなイオンに対し，Ｑ１において特定のプリカーサーイオンを選択し，コリジョンセルでそのイオンを壊し（ＣＩＤ），Ｑ３において壊したイオン（プロダクトイオン）の中から特定のイオンを検出する方法である。一度の測定で複数のチャンネルを設定することができる利点を有し、同時定量には好ましいモニタリング法である。例えば、市販品で、一分析最大５１２イベント×３２チャンネルの設定が可能である。
【００５８】
一方、アナライザは真空下に導入されたイオンを分離する部分である。イオン源では分子関連イオンであるポジティブイオンおよびネガティブイオン、また荷電していない中性分子も生成する。しかし、正負両イオンを同時に取り込むことは原理的に不可能である。そのため、正負イオンを同時にモニターするには時間で正負を切り替えて測定しなければならない。本発明においては、多重反応モニタリングをポジティブイオンモードで行うことが好ましい。
【００５９】
検出部は、分析部で選別されたイオンを電子増倍管またはマイクロチャンネルプレートで増感して検出する部位である。データ処理部は、得られたデータからマススペクトルを作製する部位である。
【００６０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの詳細な設定条件は実施例に示した例による。各保持時間（Retention Time）で、アイソクラティックとリニアグラジエントの溶出分を分離し、質量分析計に連動させることが好ましい。ＭＳ／ＭＳ分析は多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで、以下の条件で行うことが好ましい。
霧化ガス，窒素、イオン源温度，１０〜３００℃（好ましくは、５０〜２００℃）、脱溶媒温度，２００〜８００℃（好ましくは、３００〜６００℃）、脱溶媒ガス流量，８００〜１５００Ｌ／ｈ（好ましくは、１０００〜１５００Ｌ／ｈ）、キャピラリー電圧，０．５〜１０ｋＶ（好ましくは、１〜５ｋＶ）、コーン電圧，１〜５０Ｖ（好ましくは、１０〜５０Ｖ）、コーンガス流量，１０〜３００Ｌ／ｈ（好ましくは、５０〜２００Ｌ／ｈ）、衝突ガス，アルゴン
【００６１】
＜工程ｅ＞
本工程では、同定した各ヌクレオチドのクロマトグラムピーク面積と内部標準物質のクロマトグラムピーク面積の比を求めて各ヌクレオチドを定量する。
【００６２】
具体的に、ＡＴＰの絶対定量測定をする場合の例を下記に挙げる。工程ｃ、ｄの測定によりＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりＡＴＰのピークが得られたとする。このピークの位置と、同位体で標識した内部標準物質のピークとが一致しペアとなるものを確認する。内部標準物質のピークが同位体ＡＴＰのものだったとする。であれば、検出されたピークはＡＴＰのものと特定できる。他のヌクレオチドも同様にして種類が特定される。特定された各ヌクレオチドのクロマトグラムピーク面積を計測する。この面積の比を検出されたヌクレオチド間で求めれば、相対的な定量が可能となる。
【００６３】
本発明においては、各ヌクレオチドの検量線を予め作成し、作成した検量線に基づいて各ヌクレオチドを定量することが好ましい。これにより、例えば、ＡＴＰの検量線と照らし合わせることで、先に検出されたＡＴＰと同位体ＡＴＰのクロマトグラムピーク面積との比から、絶対量を測定することができる。同様にして、各ヌクレオチドの絶対定量が可能となる。検量線作成用サンプルとして、分析対象の各ヌクレオチドの標準物質、および内部標準物質としての同位体で標識した上記各ヌクレオチドを含むサンプルを用いることが好ましい。
【００６４】
また、検量線作成用サンプルを揮発性のアンモニウム塩およびアセトニトリルを含む溶解液を用いて調製することが好ましい。アンモニウム塩としては、重炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムが好ましい。アンモニウム塩の濃度は、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがさらに好ましい。アセトニトリルの濃度は、０容量％以上９５容量％以下であることが好ましく、０容量％以上９０容量％以下であることがより好ましく、０容量％以上８５容量％以下であることがさらに好ましい。ヌクレオチドおよび同位体で標識したヌクレオチド（内部標準物質）の濃度は特に限定されず、抽出物中のヌクレオチドの濃度に応じて調節すればよいが、一例として、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）については１ｎｍｏｌ／Ｌ〜１０，０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲で準備し、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）については１００ｎｍｏｌ／Ｌ〜１，０００，０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲で準備することが好ましい。
【００６５】
これにより、本発明によれば、細胞抽出物のマトリックス効果を補正するため別途の細胞マトリックスを調製して使用したり、標準添加法を用いたりするという煩雑な操作を必要としない。また、既知の酵素活性を前提とした、抽出液中のタンパク質の持つ活性を測定するといった不安定で余計な操作が多いと解される測定を必要としない。
【００６６】
＜工程ｆ＞
本発明の方法においては、その他の工程を含んでいてもよい。例えば、（工程ｆ１）サンプル中に含まれる細胞数を測定する工程と、（工程ｆ２）ヌクレオチドの定量結果から細胞あたりのヌクレオチドの分子数を算出する工程とを含むことが好ましい。これを概念的に説明すると、図５のようになる。本プロトコルでは、例えば、細胞を採取し処理する段階（工程ａ）で細胞数を測定する。一方、残りの細胞は、そこから代謝物を抽出し、内部標準物質を添加する（工程ｂ）。その後、上清を蒸発乾固して、再溶解し、測定に適したサンプルの形態とする。これを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにかけ、各ヌクレオチドの絶対量を測定する。
【００６７】
そこで、最初に取得した細胞数のデータと上記各ヌクレオチド（代謝物）の絶対量（ｍｏｌ）のデータから、細胞あたりのヌクレオチドの分子数を算出することができる。その算定は下記の式に従って決定される。
【００６８】
【数１】
2019211217.tif 000002
【００６９】
＜本発明のヌクレオチドの定量方法の応用＞
【００７０】
本発明によれば、精度がよく、正確であり、効率的な、ｄＮＴＰおよびＮＴＰの絶対定量のためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの方法が提供される。一回の計測にかかる時間は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの工程だけで、１５分から２５分程度である。代謝物の抽出の工程を含めるなら、ヌクレオチドの種類数にもよるが、８種の定量を行うとして、絶対定量が完了するまでに必要な時間は、８０分から１００分程度である。さらに、細胞あたりの分子数を求めるまでの工程では、細胞数の測定をヌクレオチドの定量と同時に行うことができるため効率的である。この場合でも、代謝物の抽出から細胞あたりの分子数を求めるまでに必要な時間は、９０分から１１０分程度である。
【００７１】
本発明の定量方法は、サンプルに、同位体標識されたヌクレオチドである内部標準物質を加える工程と、各サンプルからヌクレオチドを抽出、分画などする工程と、質量分析計で測定する工程と、質量分析計で得られた結果からヌクレオチドの非標識ピーク（サンプルの抽出物から相分離した同位体で標識していない各ヌクレオチドのピーク）と標識ピーク（同位体で標識した内部標準物質としての各ヌクレオチドのピーク）との強度比を求めて、ヌクレオチドを定量する工程とからなるものであってもよい。
【００７２】
また、本発明に係るチャートの読み取りや計算は、プログラムを利用することが好ましく、本発明による定量または解析方法の各工程をコンピュータ上で実行させることが好ましい。本発明に係るプログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ、磁気ディスク、半導体メモリなどの各種記録媒体を通じてコンピュータにインストールまたはダウンロードすることが可能である。
【００７３】
前述した通り、ヌクレオシド三リン酸などのヌクレオチドはＤＮＡやＲＮＡの構成因子、リン酸基の供与体、エネルギーの運搬体、酵素反応の補酵素であり、細胞シグナル伝達にも関わるなど、細胞の基本的な生物学的プロセスで重要な役割を果たしている。ヌクレオシド三リン酸の量的バランス異常は、細胞に重大な影響を及ぼし、Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ症候群、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ症候群、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｐａｔｈｙなど、いくつかの遺伝的疾患の原因が、ヌクレオチド合成に関わる遺伝子の欠損にあることが明らかになっている。
【００７４】
また前述した通り、ヌクレオシド三リン酸のバランス異常の測定は、創薬においても有用である。例えば、５-フルオロウラシルやヒドロキシ尿素などに代表される代謝拮抗剤は、ヌクレオチド合成を阻害することでがん細胞を殺傷するし、近年も精力的にこの種の抗がん剤が開発されている。さらに、抗がん剤や抗ウイルス剤として種々のヌクレオシドやヌクレオチド類似体（５−フルオロウラシルもその一種）の開発が進められている。これらの作用標的自体がヌクレオシド三リン酸のバランス異常であったり、副作用としてバランス異常を引き起こしたりする。
【００７５】
従って、本発明のヌクレオチドの定量方法は、遺伝学や細胞生物学の研究だけでなく、患者の疾患に関するメカニズム解析、薬や遺伝毒性物質に関する検査、薬効や副作用の評価に有用である。
【００７６】
本発明によれば、例えば、ゲノム複製必要量とヌクレオチドプールの定量的解析（検査）を行うことができる。細胞ヌクレオチドプールの量的バランス異常は、遺伝子疾患が潜んでいる可能性を示唆する。これまで、ヌクレオチドプール量の変化と細胞周期停止の定量的関係はほとんどわかっていない。本発明によれば、検体に含まれるヌクレオチドの量を、相対量ではなく、絶対量として測定することができる。この結果を利用して、ヒト細胞中ゲノムの複製に必要な量と対比するなどして、ヌクレオチドの量の異常などを詳しくかつ正確に知ることができる。これにより、より早期に遺伝子疾患やがんの病態を発見できる可能性がある。
【実施例】
【００７７】
以下に本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれにより限定して解釈されるものではない。
【００７８】
＜材料と方法＞
（材料）
ＲＰＭＩ１６４０培地、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、ライフテクノロジース社、米国、カリフォルニア州（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入した。ｄＡＴＰは、ＧＥヘルスケア社、イリノイ州、米国（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から購入した。［１５Ｎ５，１３Ｃ１０］ＡＴＰ、［１５Ｎ５，１３Ｃ１０］ＧＴＰ、［１５Ｎ３，１３Ｃ９］ＣＴＰ、［１５Ｎ２，１３Ｃ９］ＵＴＰ、［１５Ｎ５，１３Ｃ１０］ｄＡＴＰ、［１５Ｎ５，１３Ｃ１０］ｄＧＴＰ、［１５Ｎ３，１３Ｃ９］ｄＣＴＰ、および［１５Ｎ２，１３Ｃ１０］ｄＴＴＰは、シグマアルドリッチ社、ミズーリ州、米国（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から購入した。他の化学薬品は、富士フイルム和光純薬（Ｗａｋｏ）社（大阪府、日本）から購入した。チミジンの原液は超純水に溶解した。
【００７９】
（細胞の培養）
ヒト急性骨髄性白血病Ｍｏｌｍ−１３細胞を、１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃で加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。
【００８０】
（代謝物の抽出）
Ｍｏｌｍ−１３細胞（培地２ｍｌ中１×１０６個）をビヒクル［２％（ｖ／ｖ）超純水］またはチミジンで２４時間処理した。上記化学薬品の溶液を培地に直接添加した。細胞懸濁液を１５ｍＬの試験管に移し、懸濁液１５０μＬを細胞計数用に保存して、細胞生存数を決定した。残りの細胞懸濁液を遠心分離機ＬＣ−２００（トミー(Ｔｏｍｙ)社製、東京、日本）を用いて１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレット化し、上清をデカンテーションにより除去した。１０ｍＬの氷冷ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を添加した後、細胞ペレットを再懸濁し、遠心分離機ＭＸ−３０１（トミー（Ｔｏｍｙ）社製）を用いて１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して再度ペレット化した。デカンテーションにより上清を除去した後、１ｍＬの氷冷ＰＢＳを細胞ペレットに加え、再懸濁させた。１００μＬの懸濁液を細胞計数のために保存し、代謝物の抽出に使用した細胞数を決定した。細胞計数は、コールターカウンターＺ２（ベックマンコールター社製、カリフォルニア州、米国：Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。残りの懸濁液の１ｍＬを１．５ｍＬ試験管に移し、４℃で２，０００×ｇで２分間遠心分離してペレット化し、９００μＬの上清を除去した。代謝物を抽出するために、５００μＬのメタノールを残りのサンプルに添加し、激しく渦攪拌した。
【００８１】
（内部標準物質の添加）
さらに、上記で得たサンプル（６００μＬ）に、１０μＬの内部標準混合物（１０μｍｏｌ／Ｌ［１５Ｎ５，１３Ｃ１０］ＡＴＰ、１０μｍｏｌ／Ｌ［１５Ｎ５，１３Ｃ１０］ＧＴＰ、１０μｍｏｌ／Ｌ［１５Ｎ３，１３Ｃ９］ＣＴＰ、１０μｍｏｌ／Ｌ［１５Ｎ２，１３Ｃ９］ＵＴＰ、１０μｍｏｌ／Ｌ［１５Ｎ５，１３Ｃ１０］ｄＡＴＰ、１０μｍｏｌ／Ｌ［１５Ｎ５，１３Ｃ１０］ｄＧＴＰ、１０μｍｏｌ／Ｌ［１５Ｎ３，１３Ｃ９］ｄＣＴＰ、および１０μｍｏｌ／Ｌ［１５Ｎ２，１３Ｃ１０］ｄＴＴＰ）並びに１９０μＬの超純水を添加して、激しく渦攪拌した。１０，０００×ｇ、１５分間、４℃で遠心分離した後、７００μＬの上清を新しい１．５ｍＬの試験管に移し、遠心蒸発器ＣＶＥ−３１００（東京理化器械社製、東京、日本）を用いて３７℃で蒸発乾固した。乾燥したサンプルを、使用時まで−２０℃で保存した。
【００８２】
（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
乾燥したサンプルを、１０ｍｍｏｌ／Ｌの重炭酸アンモニウムとアセトニトリル［３５（ｖ）：６５（ｖ）］の混合物１００μＬに再溶解した。１６，０００×ｇで５分間遠心分離した後、７０μＬの上清をバイアルに移した。質量分光分析は、Ｈ−ｃｌａｓｓＢｉｏシステム（Ｗａｔｅｒｓ社製、マンチェスター、英国）を備えたＸｅｖｏ  ＴＱ−Ｓマイクロ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて行った。各試料２μＬを、流速０．５ｍＬ／分でＳｅＱｕａｎｔ（登録商標）  ＺＩＣ−ｐＨＩＬＩＣ  ＨＰＬＣカラム（５μｍ  ４．６×１５０ｍｍカラム（メルク  ミルポア社製、ダルムシュタット、ドイツ））で分離し、続いて、以下のように溶出した（（溶媒Ａ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウムおよび０．０５容量％アンモニア水；溶媒Ｂ、アセトニトリル）：０〜５分、６５％Ｂ〜４０％Ｂのリニアグラジエント；５〜７分、０％Ｂへのリニアグラジエント；７〜９分、０％Ｂでアイソクラティック（isocratic）；９〜９．１分、６５％Ｂへのリニアグラジエント；９．１〜１５分、６５％Ｂでアイソクラティック）。
【００８３】
多重反応モニタリング（ＭＲＭ）は、噴霧ガスとして窒素を用いたポジティブ（陽）イオンモードで行った。実験条件は以下のように設定した：
イオン源温度、１５０℃；
脱溶媒温度、５５０℃；
脱溶媒ガス流速、１２００Ｌ／時間；
キャピラリー電圧、２．０ｋＶ；
コーンガス流速、１１０Ｌ／時間；
衝突ガスはアルゴン。
【００８４】
ＭＲＭ（Multiple Reaction Monitoring）遷移（transition）の条件は以下のとおりである（Ｑ１＞Ｑ３）：
［コーン電圧（Ｖ）、衝突エネルギー（ｅＶ）］ATP, 508.1 > 136.0 (20, 35); GTP, 524.1 > 152.0 (20, 25); CTP, 484.1 > 112.0 (20, 20); UTP, 485.0 > 96.9 (20, 25); dATP, 492.1 > 136.0 (20, 20); dGTP, 508.1 > 152.0 (20, 20); dCTP, 468.0 > 112.0 (20, 15); dTTP, 483.0 > 81.0 (50, 15); [15N5,13C10]ATP, 523.1 > 146.0 (20, 35); [15N5,13C10]GTP, 539.1 > 162.1 (20, 25); [15N3,13C9]CTP, 496.1 > 119.0 (20, 20); [15N2,13C9]UTP, 496.0 > 101.9 (20, 25); [15N5,13C10]dATP, 507.1 > 146.0 (20, 20); [15N5,13C10]dGTP, 523.1 > 162.1 (20, 20); [15N3,13C9]dCTP, 480.1 > 119.0 (20, 15); [15N2,13C10]dTTP, 495.1 > 86.0 (50, 15)。
【００８５】
各代謝物の量は、標的代謝物とその同位体標識された内部標準物質のピーク面積比を計算することによって定量した。検量線は、同位体標識された内部標準物質を添加した（spiked）標準品の代謝物を使用することによって得た。
【００８６】
＜結果＞
（方法の開発）
８種の標準代謝物（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、およびＵＴＰ）および、それら各々の同位体標識代謝物を内部標準物質として使用した。同位体標識された標準物質の使用は、本発明の方法の利点の一つである。それは、同一の分離、イオン化および断片パターンを有し、高い精度と正確さを実現できるからである（Pitt JJ (2009) Clin Biochem Rev 30 (1):19-34）。これらの代謝物のＭＲＭ測定条件は手動で最適化した。細胞のｄＮＴＰレベルは、細胞のＮＴＰレベルより約２桁小さいことが報告されている（非特許文献１）。そのため、ｄＮＴＰとＮＴＰの間で異なる濃度範囲における検量線を得た。その結果、検量線は、ｄＮＴＰについては３〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲全体にわたり、ＮＴＰについては３００〜１００，０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲全体にわたって直線的であった。相関係数は、ｄＡＴＰが０．９９８３、ｄＧＴＰが０．９９７７、ｄＣＴＰが０．９９９０、ｄＴＴＰが０．９９８１、ＡＴＰが０．９９９５、ＧＴＰが０．９９９４、ＣＴＰが０．９９９７、ＵＴＰが０．９９９６であった。次に、精度と正確さを代謝物ごとに３つのレベルで計算した。８回の反復実験に基づいて精度および正確さを得ることができており、具体的には、すべての代謝物において０．６〜５．４％のＣＶ（変動係数：Coefficient of Variation）および−３．１〜２．５％のＢｉａｓ（偏り）の範囲であった（表１）。これらのデータは、本発明の方法が許容可能な精度と正確さを有することを示している。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
（細胞からの抽出物の利用）
本発明の方法を生物学的サンプルに適用できるかどうかを試験した。メタノールによるＭｏｌｍ−１３細胞からの代謝物の抽出の直後に、ｄＮＴＰおよびＮＴＰの同位体で標識された内部標準物質を、抽出物に添加することにより、その後の処理で発生するサンプル間のばらつきを是正することができる。蒸発乾固および再溶解後、本発明の方法を利用してｄＮＴＰおよびＮＴＰの検出を試みた。図１に示すように、ｄＮＴＰおよびＮＴＰを表す明白なピークが、それぞれの内部標準と同じ保持時間で観測された。これらのデータから、本発明の方法によれば、細胞サンプルからｄＮＴＰおよびＮＴＰを特異的に検出できることが分かる。
【００８９】
（細胞サンプルの定量分析）
次に、Ｍｏｌｍ−１３細胞からの抽出物中のｄＮＴＰおよびＮＴＰの絶対量の定量試験を行った。この実施例では、ヌクレオチドプールのバランス異常の誘発剤としてチミジンを使用した。Ｍｏｌｍ−１３細胞を２つの濃度でチミジンにより処理した。低濃度（２００μｍｏｌ／Ｌ）では細胞の増殖に有意に影響しなかったが、高濃度（２０００μｍｏｌ／Ｌ）ではコントロールとなるビヒクルと対比して増殖を６０％に阻害した（図２）。処理後、上記＜材料と方法＞の項で述べた代謝抽出物に使用された細胞数と、Ｍｏｌｍ−１３細胞における各代謝物の分子数の計算値を以下の式に従って決定した。
【００９０】
【数２】
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【００９１】
ビヒクル条件では、細胞内のｄＮＴＰ量は、ｄＡＴＰが分子数で４．６３×１０６、ｄＧＴＰが１．７２×１０６、ｄＣＴＰが４．２２×１０６、ｄＴＴＰが１．４０×１０７であった。チミジンは、用量依存的に細胞中のｄＴＴＰを増加させた。２０００μｍｏｌ／Ｌチミジンでの処理後に、細胞中のｄＴＴＰは１２．９倍（分子数／細胞で１．８１×１０８）という最も顕著な増加を示した。逆に、チミジンは、用量依存的に、細胞中のｄＣＴＰのレベルを低下させた（２０００μｍｏｌ／Ｌチミジンで分子数／細胞が２．０２×１０６）。細胞中のｄＧＴＰのレベルは２００μｍｏｌ／Ｌチミジンによって影響を受けなかったが、２０００μｍｏｌ／ＬチミジンはｄＧＴＰのレベルを４．６倍（分子数／細胞で７．８３×１０６）まで増加させた。ｄＡＴＰのレベルは、２００μｍｏｌ／Ｌのチミジンで処理した後に０．６９倍（分子数／細胞で３．１９×１０６）に減少したが、２０００μｍｏｌ／Ｌのチミジンで処理した後には１．４１倍（分子数／細胞で６．５２×１０６）に増加した。細胞内のＮＴＰの量は、ｄＮＴＰの１桁またはそれ以上であり、ＡＴＰの場合は分子数が２．２９×１０９、ＧＴＰの場合は分子数が５．０５×１０８、ｄＣＴＰの場合は分子数が２．０７×１０８、ＵＴＰの場合は分子数が５．２０×１０８であった。ＣＴＰのレベルはチミジンの処理によって用量に依存するように増加し、１．５６倍（分子数／細胞で３．２２×１０８）に増加した。ＧＴＰおよびＵＴＰのレベルは、２００μｍｏｌ／Ｌのチミジン処理によって変化しなかったが、２０００μｍｏｌ／Ｌのチミジンでは、これらのレベルを増加させた（ＧＴＰについて１．２１倍およびＵＴＰについて２．０２倍）。細胞中のＡＴＰレベルは、本実施例で採用した条件では変化を示さなかった。
【００９２】
上記の通り、安定同位体、ＨＩＬＩＣカラムおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、ヌクレオシド三リン酸などのヌクレオチドを同時絶対定量する簡便かつ信頼性の高い方法を確立することができた。本発明の方法を用いることにより、チミジン曝露によって生じた細胞内ヌクレオシド三リン酸の量的変化を定量的に捉えることができる。
【００９３】
（チミジンによるヌクレオチドプール撹乱メカニズム）
本発明において、チミジンによるヌクレオチドプール撹乱メカニズムとして以下のメカニズムが推測されるが、これに限定されるものではない。
チミジンは細胞内でピリミジンヌクレオチドのサルベージ（salvage）経路を介してｄＴＴＰに変換される。過剰のチミジン暴露は細胞内ｄＴＴＰを過剰に生成させ、ヌクレオチドプールのバランス異常を引き起こす。これにより、細胞周期チェックポイントを活性化し、細胞増殖を停止させる。細胞生物学の分野では、この原理は細胞周期の同調のために利用される（ダブルチミジンブロックとして知られる）。しかし、過剰のチミジンがヌクレオチドプールのバランスを崩す正確なメカニズムはほとんど分かっていない。本実施例において、２０００μｍｏｌ／ＬのチミジンにＭｏｌｍ−１３細胞を曝すと細胞の増殖を優位に阻害し（図２）、ｄＴＴＰだけでなくｄＧＴＰやｄＡＴＰのレベルを高め、ｄＣＴＰレベルのみを低減させた（図３）。チミジンで処理した群とビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）の群の細胞中のｄＮＴＰレベルの比率をとると、ｄＴＴＰ（１２．９倍）＞ｄＧＴＰ（４．６倍）＞ｄＡＴＰ（１．４１倍）＞ｄＣＴＰ（０．４８倍）の順であった。この結果は、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ：ribonucleotide reductase）によるデオキシリボヌクレオチドの生成制御の点から説明できる（図４）。ＲＮＲはＮＤＰを還元してｄＮＤＰを生成させ、反応物は細胞中でさらにリン酸化されてｄＮＴＰになる（ｄＴＴＰはｄＵＤＰから複数段階の反応を経て生成する）。ＲＮＲはその活性や基質選択性がアロステリックに制御されている。過剰なチミジンにＭｏｌｍ−１３細胞が曝されるとｄＴＴＰが誘導され、これが過剰になると、ｄＴＴＰが結合したＲＮＲはＧＤＰを選択的に還元してｄＧＤＰを生成させる。次いで、これがリン酸化してｄＧＴＰが生成する。その結果、細胞内のｄＧＴＰが増加すると、ｄＧＴＰのＲＮＲに対する結合が促進され、これはＡＤＰを選択的に還元してｄＡＤＰを生成させる。次いで、細胞中でこれがリン酸化されてｄＡＴＰが生成する。すると、ｄＡＴＰがＲＮＲの活性調節部位に結合し、ＲＮＲの反応を阻害する。このようにして、細胞の増殖に伴いｄＮＴＰを消費した結果、細胞中のｄＣＴＰのみが枯渇し、細胞増殖が停止するものと考えられる。本発明の方法は、ヌクレオチド代謝を撹乱する遺伝毒性物質や抗がん剤のメカニズム解明に有用である。
【００９４】
（ゲノム複製必要量とプールの定量的関係）
ゲノム複製必要量とプールの定量的関係は、以下のように推測できるが、これに限定されるものではない。
細胞ヌクレオチドプールに量的バランス異常が起こると、細胞周期チェックポイントが活性化して細胞周期がＧ０／Ｇ１期で停止する。しかしながら、プールの量の変化と細胞周期停止の定量的関係はほとんどわかっていない。２倍体であるヒト細胞中のゲノムの１回の複製に必要なｄＮＴＰの量は以下のように見積もられる。
【００９５】
【数３】
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【００９６】
ヒトゲノムのサイズは、Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 12に基づき３．２６×１０９ｂｐである。Ｘはヒトゲノムを構成する各塩基の割合で、それぞれ２９．３％（Ａ）、２０．７％（Ｇ）、２０．０％（Ｃ）、３０．０％（Ｔ）とする。上記の計算式より、２倍体であるヒト細胞中のゲノムの１回の複製に必要なｄＮＴＰの量はそれぞれ３．８２×１０９個（ｄＡＴＰ）、２．７０×１０９個（ｄＧＴＰ）、２．６１×１０９個（ｄＣＴＰ）、３．９１×１０９個（ｄＴＴＰ）である。これらの値と、本実施例で得たＭｏｌｍ−１３細胞中のｄＮＴＰの定量値を比較した結果を表２に示した。ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）条件において、細胞内ｄＮＴＰは２倍体ゲノムの倍加に必要な量の０．０６４−０．３５８％と非常に少ない。その理由の一つはおそらく、細胞のゲノムの完全性を保つために、不要なＤＮＡ複製反応によりゲノムに突然変異が生じることを防ぐためと解される。チミジンはｄＣＴＰのみを減少させたが、細胞内ｄＣＴＰが２倍体ゲノム分の０．１６２％から０．１０９％にまで減少しても、細胞増殖に影響が出なかった（図２および図３）。しかし、高用量チミジンの処理により細胞内のｄＣＴＰが２倍体ゲノムの０．０７７％にまで減少すると、顕著な増殖阻害作用が見られた。このことは、Ｍｏｌｍ−１３細胞の細胞周期チェックポイントを活性化するには細胞内ｄＣＴＰが２倍体ゲノム分の０．０７７％（分子数／細胞で２．０２×１０６）にまで低下する必要があることを示唆している。一方で、本実施例におけるヌクレオチドプールの定量値は、各条件における細胞内ヌクレオチド量の平均値であることに留意する必要がある。そのことを考慮してもなお、本発明の方法は、分子生物学その他の関連分野における定量分析に有用である。
【００９７】
【表２】
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【００９８】
本発明により、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いたデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の絶対定量が実現した。本発明によれば、ｄＮＴＰおよびＮＴＰを、ｄＮＴＰについては３〜１，０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲で、ＮＴＰについては３００〜１００，０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲で、それぞれ精度よくかつ正確に定量することができる。本発明の方法は、ヒト細胞サンプルに適用できる。本発明の方法は、処理時間が短く（１５分／１回の処理（ｒｕｎ））、適応範囲が広く、スループットが高い。従って、本発明の方法は、遺伝学的・分子生物学的研究だけでなく、遺伝毒性のある化合物や薬剤の作用機序の研究、抗がん剤のスクリーニング、臨床研究およびその他の分野の強力なツールとして応用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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