(57)【要約】      （修正有）【課題】全血を試料とすることができ、かつ高感度な血液中の標的特性の検出方法の提供。【解決手段】血液の検出方法が提供される。前記方法は、以下の工程を含む。基部１０２と少なくとも１つの応答電極１０４とを含む検出器１００が提供され、前記応答電極は、前記基部のゲート端部１１６から離間している。血球と標的とを含む血液が応答電極上に配置される。前記血液は第１の部分と第２の部分とに分離させられ、前記第１の部分は前記応答電極と接触し、前記第１の部分の血球数は前記第２の部分の血球数未満である。前記応答電極と前記基部の前記ゲート端部との間に電界が発生するように前記応答電極に電圧が印加され、前記基部から発生する検出電流を測定して前記標的の特性が検出される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出器を提供するステップであって、前記検出器は、基部と少なくとも１つの応答電極とを備え、前記応答電極は、前記基部のゲート端部に対して前記基部から離間しているステップと、
前記応答電極上に血液を配置するステップであって、前記血液は、複数の血球と複数の標的とを含むステップと、
前記血液を第１の部分と第２の部分とに分離するステップであって、前記第１の部分は前記応答電極と接触し、前記第１の部分の血球数は前記第２の部分の血球数未満であるステップと、
前記応答電極と前記基部の前記ゲート端部との間に電界が発生するように前記応答電極に電圧を印加するステップと、前記基部から発生する検出電流を測定して前記標的の特性を測定するステップとを含む、血液の検出方法。
【請求項２】
前記電界はＦであり、Ｆは０．１Ｖ／ｃｍ以上である、請求項１に記載の血液の検出方法。
【請求項３】
前記血液を前記第１の部分と前記第２の部分とに分離する方法は、前記血液が配置された前記検出器を逆さにして前記血液を重力によって前記第１の部分と前記第２の部分とに分離させるステップを含む、請求項１に記載の血液の検出方法。
【請求項４】
前記標的が疾患バイオマーカーを備える、請求項１に記載の血液の検出方法。
【請求項５】
前記疾患バイオマーカーが、心臓血管系疾患バイオマーカー、癌バイオマーカー、腎疾患バイオマーカー、または感染性疾患バイオマーカーを備える、請求項４に記載の血液の検出方法。
【請求項６】
前記検出器は、前記応答電極の表面上に配置された受容体をさらに備え、前記受容体は前記標的に特異的に結合し得る、請求項１に記載の血液の検出方法。
【請求項７】
前記検出器は、前記応答電極の表面上に配置された複数のタイプの受容体をさらに備え、また、各タイプの受容体は、その対応するタイプの標的に特異的に結合し得る、請求項１に記載の血液の検出方法。
【請求項８】
前記受容体が、抗体またはアプタマーを備える、請求項６に記載の血液の検出方法。
【請求項９】
前記受容体が、抗体またはアプタマーを備える、請求項７に記載の血液の検出方法。
【請求項１０】
前記応答電極と前記基部の前記ゲート端部とが同一平面上に位置する、請求項１に記載の血液の検出方法。
【請求項１１】
前記応答電極は、前記基部の前記ゲート端部の上に別個に配置される、請求項１に記載の血液の検出方法。
【請求項１２】
前記検出器は、高電子移動度トランジスタ、シリコンベースの電界効果トランジスタ、ナノワイヤ電界効果トランジスタ、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ、グラフェン電界効果トランジスタ、または二硫化モリブデン電界効果トランジスタを備える、請求項１に記載の血液の検出方法。
【請求項１３】
前記検出器は複数の応答電極を備え、前記複数の応答電極は互いに離間している、請求項１に記載の血液の検出方法。
【請求項１４】
前記検出器は、複数のスイッチ回路をさらに備え、各応答電極は対応するスイッチ回路に接続される、請求項１３に記載の血液の検出方法。
【請求項１５】
前記複数の応答電極はアレイ状に配置され、単一の前記ゲート端部に対して使用される、請求項１３に記載の血液の検出方法。
【請求項１６】
前記複数の応答電極は放射状に配置され、単一の前記ゲート端部に対して使用される、請求項１３に記載の血液の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料検出方法に関し、特に、血液検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液検出は健康診断における重要な検査項目の１つである。臨床的な血液検出においては、主な処理プロセスは３つの主要な工程に分けられ、それぞれ、血液サンプル抽出工程と、血液サンプル前処理工程と、検出工程とである。血球によって引き起こされる干渉を低減するため、通常、血液サンプルを前処理して血球と血漿とを分離し、次いで、血漿における標的を試験して正確な試験値を得る。
【０００３】
血球と血漿とを分離する現在の方法は、例えば、遠心分離方法と、濾過方法と、流体力学的方法とを含む。しかしながら、遠心分離方法は、サイズが大きいこと、小型化が難しいこと、時間がかかること、およびコストが高いこと等といった欠点がある。濾過方法は時間がかかる。流体力学的方法は、小型化が困難であり、また、プロセスの困難性を増大させる。
【０００４】
したがって、前処理をしない全血検出方法をいかにして開発するかは、当業者にとって重要な課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明は、検出限界が低く、かつ感度が高いという特性を有し、また、検出用ヒト全血を採用することができ、また、血球への干渉を低減することができる血液検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一実施形態において、本発明の血液検出方法は、以下の工程を含む。検出器が提供され、当該検出器は、基部と少なくとも１つの応答電極とを含み、当該応答電極は、基部のゲート端部に対して基部から離間している。血液は、応答電極上に配置され、当該血液は、複数の血球と複数の標的とを含む。血液は第１の部分と第２の部分とに分離され、当該第１の部分は応答電極と接触し、第１の部分の血球数は第２の部分の血球数よりも少ない。応答電極と基部のゲート端部との間に電界が発生するように応答電極に電圧が印加され、基部から発生した検出電流を測定して標的の特性を測定する。
【０００７】
本発明の一実施形態では、電界はＦであり、Ｆは０．１Ｖ／ｃｍ以上である。
【０００８】
本発明の一実施形態では、第１の部分と第２の部分とに血液を分離する方法は、血液が配置された検出器を逆さにして、血液を重力を介して第１の部分と第２の部分とに分離するステップを含み得る。
【０００９】
本発明の一実施形態では、標的は、例えば、疾患バイオマーカーである。
【００１０】
本発明の一実施形態では、疾患バイオマーカーは、例えば、心臓血管系疾患バイオマーカー、癌バイオマーカー、腎疾患バイオマーカー、または感染性疾患バイオマーカーである。
【００１１】
本発明の一実施形態では、検出器は、応答電極の表面上に配置された受容体をさらに含むことができ、当該受容体は標的に特異的に結合し得る。
【００１２】
本発明の一実施形態では、検出器は、応答電極の表面上に配置された複数のタイプの受容体をさらに備えることができ、また、各タイプの受容体は、その対応するタイプの標的に特異的に結合し得る。
【００１３】
本発明の一実施形態では、受容体は、例えば、抗体またはアプタマーである。
【００１４】
本発明の一実施形態では、応答電極と基部のゲート端部とは同一平面上に位置する。
【００１５】
本発明の一実施形態では、応答電極は、基部のゲート端部の上に別個に配置される。
【００１６】
本発明の一実施形態では、検出器は、例えば、高電子移動度トランジスタ、シリコンベースの電界効果トランジスタ、ナノワイヤ電界効果トランジスタ、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ、グラフェン電界効果トランジスタ、または二硫化モリブデン電界効果トランジスタである。
【００１７】
本発明の一実施形態では、検出器は、複数の応答電極を含むことができ、当該複数の応答電極は互いから離間している。
【００１８】
本発明の一実施形態では、検出器は、複数のスイッチ回路をさらに含むことができ、また、各応答電極は対応するスイッチ回路に接続される。
【００１９】
本発明の一実施形態では、複数の応答電極はアレイ状に配置され、また、単一のゲート端部に対して使用される。
【００２０】
本発明の一実施形態では、複数の応答電極は放射状に配置され、また、単一のゲート端部に対して使用される。
【発明の効果】
【００２１】
上記に基づき、本発明の血液検出方法は、検出用全血を直接採用することが可能であり、また、検出中の血球への干渉を低減することが可能である。さらに、本発明の血液検出方法では、互いに離間した応答電極とゲート端部とに電圧差が生じ、また、調整可能なパルス幅とパルス高さとを有するパルス電圧を応答電極に印加することによってキャパシタンス効果が生じ、遮蔽効果を克服し、高塩濃度の血液中の標的を直接検出する。また、本発明の検出方法はゲイン効果を有するため、微弱な電気信号を検出し得る。
【００２２】
本発明の上述した特徴及び利点をより理解しやすいものとするため、添付の図面とともに実施の形態を以下に詳細に説明する。
【００２３】
添付図面は本発明のさらに深い理解を提供するために含められ、また、本明細書に組み入れられて、本明細書の一部をなす。図面は本発明の実施形態例を示し、記述とともに本発明の本質の説明に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の一実施形態による検出器の頂面図である。
【図２】本発明の別の実施形態による応答電極―ゲート端部の断面図である。
【図３】本発明の別の実施形態による検出器の頂面図である。
【図４】本発明の別の実施形態による応答電極―ゲート端部の頂面図である。
【図５】本発明の別の実施形態による応答電極−ゲート端部の頂面図である。
【図６】実験例１と比較例１との、電流変化と時間との関係を示す図である。
【図７】実験例２〜実験例６のΔゲイン値と濃度との関係を示す図である。
【図８】実験例７〜実験例１０のΔゲイン値と濃度との関係を示す図である。
【図９】実験例１１〜実験例１５のΔゲイン値と濃度との関係を示す図である。
【図１０】実験例１６〜実験例１９のゲイン値と濃度との関係を示す図である。
【図１１】実験例２０〜実験例２２のゲイン値と濃度との関係を示す図である。
【図１２】実験例２３〜実験例２６のΔゲイン値と濃度との関係を示す図である。
【図１３】実験例２７〜実験例３０のΔゲイン値と濃度との関係を示す図である。
【図１４】実験例３１〜実験例３４のΔゲイン値と濃度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
図１は、本発明の一実施形態による検出器の頂面図である。
【００２６】
図１を参照すると、検出器１００は基部１０２と応答電極１０４とを含み、応答電極１０４と基部１０２とは、互いから離間している。検出器１００は、例えば、高電子移動度トランジスタ（ＨＥＭＴ）、シリコンベースの電界効果トランジスタ、ナノワイヤ電界効果トランジスタ、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ、グラフェン電界効果トランジスタ、または二硫化モリブデン電界効果トランジスタであるが、これに限定されるものではない。本実施形態では、検出器１００は、高電子移動度トランジスタと同様のトランジスタである。
【００２７】
基部１０２は、基板１０８と、ソース端部１１０と、ドレイン端部１１２と、ソース端部１１０とドレイン端部１１２との間に配置されたゲート端部１１６とを含む。本実施形態において、基板１０２の形成方法は、例えば、基板１０８上に、窒化ガリウム（ＧａＮ）層と窒化アルミニウムガリウム（ＡｌＧａＮ）層（図示せず）とを順次形成するステップと、基板１０８上に、リソグラフィプロセスを介して、ソース端部１１０と、ドレイン端部１１２と、ゲート端部１１６とを形成するステップとを含む。
【００２８】
基板１０８の材料は、例えば、シリコンまたはサファイアである。ＧａＮ層と窒化アルミニウムインジウム層（図示せず）との間の低次元ヘテロ構造界面は、キャリア輸送特性に優れる基部１０２を提供し得る。本実施形態において、ＧａＮ層上に形成される材料は、窒化アルミニウムインジウムであるが、本発明はこれに限定されるものではない。別の実施形態では、ＧａＮ層上に形成された材料は、窒化アルミニウムガリウム等の圧電特性を有する他の材料であり得る。ソース端部１１０とドレイン端部１１２との材料は、１つ以上の導電性材料を含むことができる。導電性材料は、例えば、金属材料、金属化合物、またはそれらの組み合わせである。ソース端部１１０とドレイン端部１１２とは、回路１３６を介して外部の電子デバイス（図示せず）にそれぞれ接続される。
【００２９】
さらに図１を参照すると、応答電極１０４は基板１０２上に配置される。応答電極１０４は、基部１０２の頂面に配置された電極体１２２を含み、電極体１２２は、金属材料によって形成される。応答電極１０４とゲート端部１１６とは、同一平面上に配置され、また、両者は互いに離間し、互いに向かい合って配置されてもよい。さらに具体的には、電極体１２２と基部１０２のゲート端部１１６とは同一平面上に配置され、また、両者は互いに離間し、互いに向かい合って配置されてもよく、また、電極体１２２と基部１０２とは電気的に接続されない。具体的には、電極体１２２とゲート端部１１６とは電気的に接続されない。電極体１２２の表面材料は、後に選択された受容体に結合し得る材料から選択されることに言及されるべきである。本実施形態では、電極体１２２の表面材料は、例えば、金である。
【００３０】
図２は、本発明の別の実施形態による応答電極―ゲート端部の断面図である。本実施形態では、応答電極１０４は、基部のゲート端部１１６の鉛直方向上方に配置され得る。
【００３１】
図３は、本発明の別の実施形態による検出器の頂面図である。図３に示す検出器２００は、図１に示す検出器１００と同様であり、その違いの差は、検出器２００は複数の応答電極２０４を有し、当該複数の応答電極２０４は基板２０８上で離間していることである。同一または同様の構成要素については、上記で詳細に説明したので、ここでは繰り返さない。
【００３２】
図３を参照すると、検出器２００は、複数の応答電極２０４を含み、また、当該複数の応答電極２０４は同一の基部２０２に対応する。
【００３３】
図４は、本発明の別の実施形態による応答電極―ゲート端部の頂面図である。本実施形態では、複数の応答電極２０４がアレイ状に配置され、また、単一のゲート端部２１６に対して使用される。図５は、本発明の別の実施形態による応答電極―ゲート端部の頂面図である。本実施形態では、複数の応答電極２０４が放射状に配置され、単一のゲート端部２１６に対して使用される。その結果、検出器２００は、同一のタイプまたは異なるタイプの検体に対して同時に複数の試験を行うことが可能であり、これは試験結果の信頼性を高めることができるだけでなく、試験に必要な時間も短縮できる。また、複数の応答電極２０４が同一の基部２０２を共有すること、および、使用した応答電極２０４のみが次の試験を行うために交換する必要があることから、試験のコストが削減され得る。
【００３４】
一実施形態では、検出器２００は複数のスイッチ回路２３２をさらに含み、また、各応答電極２０４は、対応するスイッチ回路２３２に接続されて、所望の応答電極２０４を選択的に制御するので、検出器２００は、異なる時刻に同一の検体を試験して濃度の変化量と時間とを観察する等の様々な測定方法に適する。いくつかの実施形態では、スイッチ回路２３２は、応答電極２０４の向かい合う２つの側部に配置される。応答電極２０４の側部に配置されたスイッチ回路２３２は、ゲート電圧Ｖｇに接続され、また、応答電極２０４の他方の側部に配置されたスイッチ回路２３２は、ゲート端部２１６に接続される。また、測定中、基部２０２のソース端部２１０は接地され、ドレイン電圧Ｖｄはドレイン端部２１２に印加される。
【００３５】
本発明はまた、上記検出器を用いた血液検出方法を提供する。次に、本発明の血液検出方法を、図１に示す検出器１００を介して説明する。
【００３６】
まず、検出器１００が提供され、当該検出器１００は、基部１０２と少なくとも１つの応答電極１０４とを含み、当該応答電極１０４は基部１０２のゲート端部１１６に対して基部１０２から離間している。本実施形態では、受容体１０６は、電極体１２２の表面に結合してもよく、当該受容体１０６は、試験される標的に特異的に結合してもよい。受容体１０６は、例えば、抗体またはアプタマーである。一実施形態では、検出器は、応答電極の表面上に配置された複数のタイプの受容体をさらに備えることができ、また、各タイプの受容体は、その対応するタイプの標的に特異的に結合し得る。１つ以上のタイプの受容体を電極のアレイに固定化し、多重化されたバイオマーカーの検出を容易し得る。例えば、８つの応答電極のアレイにおいて、８つの異なる受容体を固定化して、一滴の血液から８つの異なる標的バイオマーカーを検出し得る。
【００３７】
次に、応答電極１０４上に血液が位置され、当該血液は複数の血球と複数の標的とを含む。本実施形態では、血液は前処理されていない（すなわち、全血である）。本実施形態では、標的は疾患バイオマーカーである。一実施形態では、疾患バイオマーカーは、例えば、心臓血管系疾患バイオマーカー、癌バイオマーカー、腎疾患バイオマーカー、または感染性疾患バイオマーカーである。心臓血管系疾患バイオマーカーは、例えば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）、または心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）である。本実施形態では、心臓血管系疾患バイオマーカーは、それぞれの対応する受容体に特異的に結合し得る。
【００３８】
次に、血液は第１の部分と第２の部分とに分離され、当該第１の部分は応答電極１０４と接触し、また、第１の部分の血球数は第２の部分の血球数よりも少ない。本実施形態では、第１の部分と第２の部分とに血液を分離する方法は、例えば、血液が配置された検出器１００を逆さにし、重力を介して第１の部分と第２の部分とに血液を分離するステップを含む。具体的には、検出器１００を逆さにした場合、重力により血液中の血球が電極体１２２の表面から離れる。換言すると、血液中の血球と血漿とが重力により分離され得る。一実施形態では、血液の第１の部分は血漿の部分であり、第２の部分は血球の部分であり、また、応答電極１０４は少量の血球を含む血漿の部分とのみ直接接触する。本実施形態では、血液中の血球は、検出器１００を逆さにすることにより重力を用いて、応答電極１０４の表面から離れた状態となるが、本発明はこれに限定されるものではなく、他の方法を用いて血液中の血球が応答電極１０４の表面から離れた状態となってもよい。また、応答電極１０４が第１の部分に接触する場合、第１の部分（血漿の部分）内の標的は、電極体１２２の表面に結合した受容体１０６に特異的に結合する。
【００３９】
本実施形態では、応答電極１０４が血漿の部分にのみ直接接触することから、標的の検出中に血球の部分への干渉を回避してより正確な試験結果を得ることが可能である。
【００４０】
次に、応答電極１０４と基部１０２のゲート端部１１６との間に電界Ｆが発生するように、電圧Ｖが応答電極１０４に印加され、また、基部１０２から発生する検出電流Ｉが測定され、標的の特性（濃度等）が測定される。いくつかの実施形態では、印加電圧は、パルス電圧、交流バイアス電圧、直流バイアス電圧、または複数の波形を有する電圧であってもよい。具体的には、基部１０２に電圧を印加した後、応答電極１０４に電圧Ｖを印加して、応答電極１０４とゲート端部１１６との間に電圧差を発生させる。したがって、標的が対応する受容体に結合した場合、電圧Ｖを印加することによって生成される電圧差を介して、応答電極１０４とゲート端部１１６との間にキャパシタンス効果が生じ、当該キャパシタンス効果によってもたらされる電流値を得る。本実施形態では、電界Ｆは０．１Ｖ／ｃｍ以上である。一実施形態では、電界Ｆは０．１Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍ（０．１Ｖ／ｃｍ≦Ｆ≦１０Ｖ／ｃｍ）である。別の実施形態では、電界Ｆは０．５Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍ（０．５Ｖ／ｃｍ≦Ｆ≦１０Ｖ／ｃｍ）である。さらに別の実施形態では、電界Ｆは０．５Ｖ／ｃｍ〜１．０Ｖ／ｃｍ（０．５Ｖ／ｃｍ≦Ｆ≦１．０Ｖ／ｃｍ）である。印加された電界Ｆは、上記範囲内で、低い検出限界と高い感度とを有し得る。
【００４１】
キャパシタンス効果を用いて検出を行う場合には、反応が平衡状態に達する前の受容体と標的との動的情報を測定し得ることに言及されるべきである。換言すれば、反応が平衡状態に達する前に動的情報を測定することにより、平衡状態での測定の結果としてヒト血液が高塩濃度によって平衡に保たれた場合に生じる遮蔽効果を克服することが可能となり、ヒト血液用の複雑な希釈工程もまた不要となる。
【００４２】
本実施形態において、印加される電圧はパルス電圧であってもよい。パルス電圧のパルス幅とパルス高さとの大きさは、試験に必要な試験期間と電圧の大きさに応じて調整され得る。一実施形態では、受容体と心臓血管系疾患バイオマーカーとの反応が平衡に保たれるまでの時間がパルス幅に使用され、当該パルス幅は１０秒〜２秒以下であるが、本発明はこれに限定されない。実際の例では、パルス高さは、例えば０．５Ｖであるが、本発明はこれに限定されない。
【００４３】
一実施形態では、印加される電圧は単一パルス（ドレイン電圧＝２Ｖ、ゲート電圧＝０．５Ｖ、ゲートパルス幅＝０．５μｓ）または二相パルス（ドレイン電圧＝２Ｖ、ゲート電圧＝０．５Ｖ、ゲートサイクルパルス幅＝１ｍｓ）であり得る。一実施形態では、パルス電圧は連続的に印加され得る。
【００４４】
本実施形態では、検出電流をパルス幅に対して積分換算する等、トランジスタから発生した測定された検出電流は任意に換算され得る。この時点で電流と時間とが積分され、特定の時刻における基部１０２のソース端部１１０に蓄積された総電荷量が得られる。
【００４５】
本実施形態では、検査のため電圧を印加する前に、血液は血漿と血球とに分離されるが、本発明はこれに限定されない。別の実施形態では、電圧が印加された場合に血液は血漿の部分と血球の部分とに分離される。本実施形態では、応答電極は、少量の血漿を含む部分にのみ直接接触するため、標的の検出中に血球の部分への干渉がなくなり、したがってより正確な検査結果を得ることができる。また、本実施形態では、全血の前処理を行うことなく全血検査を直接行い得るので、全血検査のコストと時間とが削減され得る。
【００４６】
以下に、本発明が提供する血液検出方法とその特性とを実験例を用いて詳細に説明するが、以下の実験例は本発明を限定するものではない。また、以下の実験例におけるゲイン値は、平衡電流値と初期電流値（すなわち、バックグランド電流）との差（すなわち、平衡電流値−初期電流値＝ゲイン値）を示す。初期電流値は、応答電極に初期電圧を印加することによって得られる電流値を示し得る。本実施形態では、初期電圧はゲート電圧未満であり得るが、本発明はこれに限定されない。平衡電流値は、一定時間、応答電極にゲート電圧Ｖｇを印加することで得られた電流値を示し得る。
【実験例１】
【００４７】
実験例１では、図１に示す検出器１００が試験に使用される。ヒト全血を検出器の応答電極に滴下した後、検出器を逆さにし、異なる時刻における電流変化を検出した。
【比較例１】
【００４８】
実験例１と実質的に同一の方法で試験を行った。実験例１との違いは、ヒト全血が検出器の応答電極に滴下され、次に、検出器を逆さにすることなく、異なる時刻における電流値が直接検出されたということのみである。
【００４９】
図６に実験例１と比較例１との電流変化と時間との関係を示す。
【００５０】
図６から、実験例１の試験中、時間の経過と共に電気信号は変化しないことがわかる。一方、比較例１では、４分経過後に電気信号が大幅に減少している。上記の結果から、実験例１の試験中は検出装置が逆さになっているので、重力により血液中の血球と血漿との分離が容易になり、したがって血球からの干渉の課題は軽減され得ることがわかる。しかしながら、比較例１では、重力が血球の沈降を引き起こし、大量の血球が応答電極表面に近づくと、電気信号が干渉される。
【００５１】
本発明の血液検出方法を明確に説明するため、以下に３３の実験例を示す。
【００５２】
受容体が応答電極の電極体上に実際に結合していることを確実にするため、測定の前に、最初に以下の測定を行って受容体が応答電極の電極体の表面上に結合していることを確認することに言及されるべきである。
【００５３】
第一に、ＰＢＳ（またはヒト全血）を応答電極と基部との上に滴下し、緩衝液が応答電極の電極体と基部のゲート端部とを覆い、また、応答電極の電極体と基部のゲート端部とに接続され、５０μｓのパルス幅と、０．５Ｖのパルス高さとをそれぞれ有するパルス電圧を応答電極上に印加し、基部のソース端部を測定してＰＢＳ（またはヒト全血）によってもたらされる電流値を得る。次に、ＰＢＳ（またはヒト全血）を除去し、続いて、受容体が反応し、応答電極の電極体に結合するように、受容体（抗体またはアプタマー）を応答電極の電極体に滴下して加えた。次に、応答電極と基部との間にＰＢＳ（またはヒト全血）を滴下して加え、同条件のパルス電圧で基部のソース端部を測定し、受容体がもたらす電流値を得た。受容体がもたらす電流値とＰＳＢ（またはヒト全血）がもたらす電流値とが異なる場合、受容体は実際に応答電極の電極体の表面上に結合していると判断され得る。
【実験例２】
【００５４】
実験例２では、Ｃ反応性タンパク質の特異的なアプタマーが検出器の応答電極上に結合している、図３に示す検出器２００を試験に使用した。
【００５５】
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を介して４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む参照タンパク質溶液を調製し、参照タンパク質溶液を応答電極と基部との間隙に滴下して加えた。測定条件は以下の通りである：Ｖｄ＝２Ｖ、Ｖｇ＝１Ｖ、パルス時間＝１００μｓ。第１の電流Ｉ１を、基部のドレイン端部で測定した。
【００５６】
次に、応答電極と基部との間のウシ血清アルブミン溶液を溶出緩衝液で洗い流した。４％ウシ血清アルブミンを含む参照タンパク質溶液を溶媒として用い、Ｃ反応性タンパク質を溶質として用い、濃度０．５ｍｇ／ＬのＣ反応性タンパク質溶液を調製した。
【００５７】
次に、Ｃ反応性タンパク質溶液を応答電極上に滴下して加え、同一の測定条件（Ｖｄ＝２Ｖ、Ｖｇ＝１Ｖ、パルス時間＝１００μｓ）で測定を行い、第２の電流Ｉ２を得た。
【００５８】
最後に、第１の電流Ｉ１を第２の電流Ｉ２から差し引いて検出電流Ｉを得た。
【００５９】
実験例１において、ウシ血清アルブミンを溶媒として含む溶液を選択する目的は以下の通りであることに言及されるべきである。血清タンパク質が血液中で最も多くのタンパク質を構成するので、リガンド液体は実際のヒトの血液環境により近く、参照タンパク質溶液をバックグラウンド値として予め滴下して加えることで第１の電流Ｉ１が測定される。したがって、Ｃ反応性タンパク質溶液によってもたらされた第２の電流Ｉ２から参照タンパク質（ＢＳＡ）によって生成された第１の電流Ｉ１を差し引くことによって、Ｃ反応性タンパク質と受容体のみの組み合わせによってもたらされる検出電流Ｉを得られる。
【実験例３〜実験例６】
【００６０】
実験例２と実質的に同一の方法で試験を行った。実験例２との違いは、実験例３〜実験例６で調製したＣ反応性タンパク質溶液の濃度は、それぞれ１．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、５．０ｍｇ／Ｌ、および１０．０ｍｇ／Ｌであったということのみである。
【００６１】
図７は、実験例２〜実験例６のΔゲイン値と濃度との関係を示す図である。図７から、Ｃ反応性タンパク質の濃度の増加に伴ってΔゲイン値が増加し、顕著な相関が見られることが分かる。
【実験例７】
【００６２】
実験例１と実質的に同一の方法で試験を行った。実験例１との違いは、実験例７の検出器の応答電極上に、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）の特異的単クローン抗体が結合していたということのみである。また、実験例７では、４％ウシ血清アルブミンを含む参照タンパク質溶液を溶媒として用い、ｃＴｎＩを溶質として用い、０．０２４ｎｇ／ｍＬの濃度のｃＴｎ溶液を測定用に調製した。
【実験例８〜実験例１０】
【００６３】
実験例７と実質的に同一の方法で試験を行った。実験例７との違いは、実験例８〜実験例１０で調製したｃＴｎ溶液の濃度はそれぞれ０．２４ｎｇ／ｍＬ、２．４ｎｇ／ｍＬ、および２４ｎｇ／ｍＬであったということのみである。
【００６４】
図８は、実験例７〜実験例１０のΔゲイン値と濃度との関係を示す図である。図８から、ｃＴｎＩ濃度の増加に伴ってΔゲイン値が減少し、顕著な相関が見られることが分かる。
【実験例１１】
【００６５】
実験例１１では、Ｃ反応性タンパク質の特異的なアプタマーが検出器の応答電極上に結合している、図３に示す検出器２００を試験に使用した。
【００６６】
ヒト全血を応答電極と基部との間隙に滴下して加え、検出器を逆さにした。測定条件は以下の通りである：Ｖｄ＝２Ｖ、Ｖｇ＝１Ｖ、パルス時間＝１００μｓ。第１の電流Ｉ１を、基部のドレイン端部で測定した。
【００６７】
次に、応答電極と基部との間のヒト全血を溶出緩衝液で洗い流した。ヒト全血を溶媒として用い、Ｃ反応性タンパク質を溶質として用い、濃度１．２８ｍｇ／ＬのＣ反応性タンパク質溶液を調製した。
【００６８】
次に、Ｃ反応性タンパク質溶液を応答電極上に滴下して加え、検出器を逆さにした。同一の測定条件（Ｖｄ＝２Ｖ、Ｖｇ＝１Ｖ、パルス時間＝１００μｓ）で測定を行い、第２の電流Ｉ２を得た。
【００６９】
最後に、第１の電流Ｉ１を第２の電流Ｉ２から差し引いて検出電流Ｉを得た。
【実験例１２〜実験例１５】
【００７０】
実験例２と実質的に同一の方法で測定を行った。実験例２との違いは、実験例１２〜実験例１５で調製したＣ反応性タンパク質溶液の濃度はそれぞれ３．２６ｍｇ／Ｌ、４．２６ｍｇ／Ｌ、５．２６ｍｇ／Ｌ、および１１．２６ｍｇ／Ｌであったということのみである。
【００７１】
実験例１１〜実験例１５のΔゲイン値と濃度との関係を図９に示す。図９から、Ｃ反応性タンパク質の濃度の増加に伴ってΔゲイン値が増加し、顕著な相関が見られることが分かる。
【実験例１６】
【００７２】
実験例１１と実質的に同一の方法で測定を行った。実験例１１との違いは、実験例１６の検出器の応答電極上にＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）の特異的アプタマーが結合していたということのみである。また、実験例１６では、ヒト全血を溶媒として用い、Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ‐ｐｒｏＢＮＰ）を溶質として用い、濃度１００ｐｇ／ｍＬのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ溶液を調製した。
【実験例１７〜実験例１９】
【００７３】
実験例１６と実質的に同一の方法で測定を行った。実験例１６との違いは、実験例１７〜実験例１９で調製したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ溶液の濃度はそれぞれ４５０ｐｇ／ｍＬ、９００ｐｇ／ｍＬ、および１８００ｐｇ／ｍＬであったということのみである。
【００７４】
図１０は、実験例１６〜実験例１９のゲイン値と濃度との関係を示す。図１０から、ＮＴ‐ｐｒｏＢＮＰ濃度の増加に伴ってゲイン値が減少し、顕著な相関が見られることがわかる。
【実験例２０】
【００７５】
実験例１１と実質的に同一の方法で測定を行った。実験例１１との違いは、実験例２０の検出器の応答電極上に心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）の特異的アプタマーが結合していたということのみである。また、実験例１６では、ヒト全血を溶媒として用い、ｃＴｎＩを溶質として用い、濃度０．０２４ｎｇ／ｍＬのｃＴｎＩ溶液を調製した。
【実験例２１〜実験例２３】
【００７６】
実験例２０と実質的に同一の方法で測定を行った。実験例２０との違いは、実験例２１〜実験例２３で調製したｃＴｎＩ溶液の濃度はそれぞれ０．２４ｎｇ／ｍＬ、２．４ｎｇ／ｍＬ、および２４ｎｇ／ｍＬであったということのみである。
【００７７】
図１１は、実験例２０〜実験例２３のゲイン値と濃度との関係を示す。図１１から、ｃＴｎＩ濃度の増加に伴ってゲイン値が減少し、顕著な相関が見られることが分かる。
【実験例２４】
【００７８】
実験例１１と実質的に同一の方法で測定を行った。実験例１１との違いは、Ｃ反応性タンパク質の特異的単クローン抗体は、実験例２４の検出器の応答電極上に結合していたということのみである。また、実験例２４では、ヒト全血を溶媒として用い、Ｃ反応性タンパク質を溶質として用い、濃度０．５ｍｇ／ＬのＣ反応性タンパク質溶液を調製した。
【実験例２５〜実験例２７】
【００７９】
実験例２４と実質的に同一の方法で測定を行った。実験例２４との違いは、実験例２５〜実験例２７で調製したＣ反応性タンパク質溶液の濃度は、それぞれ１．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、および１０．０ｍｇ／Ｌであったということのみである。
【００８０】
図１２は、実験例２４〜実験例２７のΔゲイン値と濃度との関係を示す。図１２から、Ｃ反応性タンパク質濃度の増加に伴ってΔゲイン値が増加し、顕著な相関が見られることが分かる。
【実験例２８】
【００８１】
実験例１１と実質的に同一の方法で測定を行った。実験例１１との違いは、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の特異的単クローン抗体は、実験例２８の検出器の応答電極上に結合していたということのみである。また、実験例２８では、ヒト全血を溶媒として用い、ＢＮＰを溶質として用い、濃度１４０ｐｇ／ｍＬのＢＮＰ溶液を調製した。
【実験例２９〜実験例３２】
【００８２】
実験例２８と実質的に同一の方法で測定を行った。実験例２８との違いは、実験例２９〜実験例３２で調製したＢＮＰ溶液の濃度は、それぞれ６４４ｐｇ／ｍＬ、１５７０ｐｇ／ｍＬ、２９８０ｐｇ／ｍＬ、および３９００ｐｇ／ｍＬであったということのみである。
【００８３】
図１３は、実験例２８〜実験例３２のΔゲイン値と濃度との関係を示す。図１３から、ＢＮＰ濃度の増加に伴ってΔゲイン値が増加し、顕著な相関が見られることが分かる。
【実験例３３】
【００８４】
実験例１１と実質的に同一の方法で測定を行った。実験例１１との違いは、実験例３３の検出器の応答電極上に心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）の特異的単クローン抗体が結合していたということのみである。また、実験例３３では、ヒト全血を溶媒として用い、ｃＴｎＩを溶質として用い、濃度０．０２４ｎｇ／ｍＬのｃＴｎ溶液を調製した。
【実験例３４〜実験例３６】
【００８５】
実験例３３と実質的に同一の方法で測定を行った。実験例３３との違いは、実験例３４〜実験例３６で調製したｃＴｎＩ溶液の濃度は、それぞれ０．２４ｎｇ／ｍＬ、２．４ｎｇ/ｍＬ、および２４ｎｇ/ｍＬであったということのみである。
【００８６】
図１４は、実験例３３〜実験例３６のΔゲイン値と濃度との関係を示す。図１４から、ｃＴｎＩ濃度の増加に伴ってΔゲイン値が増加し、顕著な相関が見られることが分かる。
【００８７】
上記に基づき、本実施形態の血液検出方法は試験用全血を直接採用することが可能であり、また、試験中の血球への干渉を低減することが可能である。また、本実施形態の血液検出方法では、互いに離間した応答電極とゲート端部とに電圧差が生じ、また、調整可能なパルス幅とパルス高さとを有するパルス電圧を応答電極に印加することによってキャパシタンス効果が生じて、遮蔽効果を克服し、また、高塩濃度の血液中の標的が直接試験される。また、本実施形態の検出方法はゲイン効果を有するため、微弱な電気信号が検出され得る。
【００８８】
本発明を上記の実施形態を参照して説明してきたが、本発明の本質から逸脱することなく、記載された実施形態に対する変更を行い得ることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲は、上記の詳細な説明ではなく添付の請求項によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は、検出限界が低く、かつ感度が高いという特性を有し、また、検出用ヒト全血を採用することができ、また、血球への干渉を低減することができる血液検出方法を提供する。
【符号の説明】
【００９０】
１００、２００  検出器
１０２、２０２  基部
１０４ 、２０４  応答電極
１０６  受容体
１０８、２０８  基板
１１０、２１０  ソース端部
１１２、２１２  ドレイン端部
１１６、２１６  ゲート端部
１２２  電極体
１３６  回路
２３２  スイッチ回路
Ｖｄ  ドレイン電圧
Ｖｇ  ゲート電圧
【図１】
2019101027.tif 000003
【図２】
2019101027.tif 000004
【図３】
2019101027.tif 000005
【図４】
2019101027.tif 000006
【図５】
2019101027.tif 000007
【図６】
2019101027.tif 000008
【図７】
2019101027.tif 000009
【図８】
2019101027.tif 000010
【図９】
2019101027.tif 000011
【図１０】
2019101027.tif 000012
【図１１】
2019101027.tif 000013
【図１２】
2019101027.tif 000014
【図１３】
2019101027.tif 000015
【図１４】
2019101027.tif 000016
【外国語明細書】
2019101027000001.pdf