(57)【要約】【課題】  簡便な試料採取でも判定精度がよくかつ被験者に対して侵襲性の少ない排卵障害の検査方法を提供すること。【解決手段】  検体中の腸内細菌叢内における細菌を検出することを特徴とする排卵障害の検査方法；より好適には前記細菌が、以下の[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌である；さらに好適には、前記細菌が、以下の[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌であることが好適である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の腸内細菌叢内における細菌を検出することを特徴とする排卵障害の検査方法。
【請求項２】
前記細菌が、以下の[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌である、請求項１記載の方法。
[B1]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目Prevotellaceae科Prevotella属、
[B2]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目S24-7科、
[B3]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目Rikenellaceae科、
[B4]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目[Paraprevotellaceae]科、
[F1]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目、
[F2]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Lachnospiraceae科、
[F3]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目[Tissierellaceae]科WAL_1855D属、
[F4]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Ruminococcaceae科Oscillospira属、
[F5]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Lachnospiraceae科Anaerostipes属、
[F6]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Veillonellaceae科Dialister属、
[F7]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Ruminococcaceae科Ruminococcus属、
[F8]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Peptococcaceae科rc4-4属、
[F9]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Lachnospiraceae科Roseburia属、
[F10]：Firmicutes門Erysipelotrichi綱Erysipelotrichales目Erysipelotrichaceae科AllobacuLum属、
[F11]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Clostridiaceae科Candidatus Arthromitus属、
[F12]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Ruminococcaceae科Other、
[F13]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Peptococcaceae科Peptococcus属、
[A1]：Actinobacteria門Coriobacteriia綱Coriobacteriales目Coriobacteriaceae科Atopobium属、
[FS1]：Fusobacteria門Fusobacteriia綱Fusobacteriales目Leptotrichiaceae科Leptotrichia属、
[P1]：Proteobacteria門Betaproteobacteria綱Burkholderiales目Burkholderiaceae科Burkholderia属
【請求項３】
前記細菌が、前記[B1][B2]の２種類の組み合わせ、前記[F1][F3]の２種類の組み合わせ、又は前記[B1]〜[B4]の少なくとも１種以上及び前記[F1]〜[F13]の少なくとも１種以上の組み合わせである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率により排卵障害を判定する工程を含む、排卵障害の診断を補助する方法。
【請求項５】
排卵障害を判定するために、腸内細菌叢内の細菌占有率を測定する方法。
【請求項６】
検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率に基づき排卵障害を調節する物質を検出する方法。
【請求項７】
前記請求項６記載の検出方法は、以下の（１）及び（２）を含む検出方法。
（１）被験物質を摂取した被験者より採取された検体から、当該検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率を検出する第一検出工程、
（２）前記腸内細菌叢内における前記細菌の占有率の変動に基づき、当該被験物質が排卵障害を調節する物質か否かを判定して、排卵障害調節物質を検出する第二検出工程。
【請求項８】
前記被験物質が、食用素材である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法により排卵障害改善用の食用素材を検出し、当該排卵障害改善用の食用素材を含有する組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、排卵障害の検査方法、排卵障害の診断を補助する方法、排卵障害改善用の食用素材を含有する組成物の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常月経を有する女性では、通常、月経開始から１４日頃に卵巣から成熟した１つの卵子が排出され、排卵が行われる。排卵が正常に起きるためには、視床下部、下垂体、卵巣の３部位が連携しながらホルモンを分泌する必要がある。
しかし、外的要因又は内的要因によりこの排卵が正常に行われない状態が起こり、この状態を排卵障害（例えば、軽度〜重度の排卵障害、高プロラクチン性排卵障害）という。この排卵障害のうち、軽度から中等度の比較的軽い排卵障害が多いとされている。この比較的軽い排卵障害の要因として、例えば、過度のダイエットや、職場や家庭での心労といった身体的・精神的ストレスが挙げられる。そして、このような要因が引き金となり、いわゆるホルモンバランスが崩れ、排卵障害が起こるとされている。
【０００３】
この排卵障害は不妊症の原因の一つとなる。近年では、この排卵障害を原因とする女性の不妊症は増加傾向にある。
例えば、特許文献１には、大豆微粉末を有効成分とすることを特徴とする排卵障害、及び月経不順、不妊症、ホルモン異常、不妊不安、ストレスを含む排卵障害に基づく諸症状の改善・治療剤が提案されている。
【０００４】
ここで、排卵障害か否かを判定する場合、基礎体温をはかることが古くから行われている。これは、生理開始から排卵までの「低温期（約２週間）」と排卵から次の生理までの「高温期（約２週間）」と２相に体温変化が生じることを利用したものである。排卵がないと女性は低温期がずっと続くことになるので、この状態を排卵障害と判定している。
【０００５】
また、医師が被験者を排卵障害か否かを判定する場合、生理周期（約１ヶ月）のうち、複数回（具体的には、低温期、排卵期、高温期及び月経期の４回）、被験者が通院検査を行い、その検査結果に基づき医師が排卵障害を判定している。そして、排卵障害と判定するための検査方法として、例えば、内診・経腟超音波検査、子宮卵管造影検査、血液検査等が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−３０６４３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、基礎体温は日々測定する必要があり、また排卵障害の検査のために１ヶ月に複数回通院する必要がある。被験者にとって経済的、肉体的及び精神的な負担が多い。このため、できるだけ簡便な方法で精度良く排卵障害であるか否かを知りたいと被験者の要望がある。
また、排卵障害の検査方法のうち、非侵襲的な検査方法として超音波断層検査があるが、この超音波断層検査では排卵が「ある」ことを確認はできるが排卵が「ない」とは確認できない。このため、排卵が「ない」ことを確認することは基礎体温測定や血中ホルモン血液検査が主体であるのが実情である。この採血は出血と痛みが伴う侵襲的であり、医療従事者が行う必要もある。
また、被験者が排卵障害か否かは医師の経験的個人スキルにて判定しているため、排卵障害の診断結果にばらつきも生じやすい。
また、排卵障害用の薬剤を使用するにしても、まずは被験者が排卵障害であるか否かを判定することが重要である。
【０００８】
上述のように排卵障害を検査する手法が少ない又は限られている実情がある。当然ながら、簡便な試料採取でも判定精度がよくかつ被験者に対して侵襲性の少ない（いわゆる低侵襲性又は非侵襲性）排卵障害用の判定基準及びこれを利用した検査方法が未だ十分に提案されていない。
【０００９】
そこで、本技術は、簡便な試料採取でも判定精度がよくかつ被験者に対して侵襲性の少ない排卵障害の検査方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、排卵障害の判定基準について種々検討を行った結果、「排卵障害である（排卵なし）」女性、及び「排卵障害ではない（排卵あり）」女性の糞便検体に含まれる腸内細菌叢を確認したところ、「排卵障害である（排卵なし）」女性、及び「排卵障害ではない（排卵あり）」女性の両者間で特定の腸内細菌の占有率が変化していることに気づいた。その結果、本発明者らは、腸内細菌叢の特定の腸内細菌及びその占有率を排卵障害の判定基準に利用することで、排卵障害の検査に利用できることを見出し、本発明を完成させた。本発明は以下のとおりである。
【００１１】
〔１〕
検体中の腸内細菌叢内における細菌を検出することを特徴とする排卵障害の検査方法。
〔２〕
前記細菌が、以下の[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌である、前記〔１〕記載の方法。
[B1]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目Prevotellaceae科Prevotella属、
[B2]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目S24-7科、
[B3]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目Rikenellaceae科、
[B4]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目[Paraprevotellaceae]科、
[F1]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目、
[F2]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Lachnospiraceae科、
[F3]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目[Tissierellaceae]科WAL_1855D属、
[F4]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Ruminococcaceae科Oscillospira属、
[F5]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Lachnospiraceae科Anaerostipes属、
[F6]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Veillonellaceae科Dialister属、
[F7]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Ruminococcaceae科Ruminococcus属、
[F8]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Peptococcaceae科rc4-4属、
[F9]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Lachnospiraceae科Roseburia属、
[F10]：Firmicutes門Erysipelotrichi綱Erysipelotrichales目Erysipelotrichaceae科AllobacuLum属、
[F11]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Clostridiaceae科Candidatus Arthromitus属、
[F12]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Ruminococcaceae科Other、
[F13]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Peptococcaceae科Peptococcus属、
[A1]：Actinobacteria門Coriobacteriia綱Coriobacteriales目Coriobacteriaceae科Atopobium属、
[FS1]：Fusobacteria門Fusobacteriia綱Fusobacteriales目Leptotrichiaceae科Leptotrichia属、
[P1]：Proteobacteria門Betaproteobacteria綱Burkholderiales目Burkholderiaceae科Burkholderia属
〔３〕
前記細菌が、前記[B1][B2]の２種類の組み合わせ、前記[F1][F3]の２種類の組み合わせ、又は前記[B1]〜[B4]の少なくとも１種以上及び前記[F1]〜[F13]の少なくとも１種以上の組み合わせである、前記〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕
検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率により排卵障害を判定する工程を含む、排卵障害の診断を補助する方法。
〔５〕
排卵障害を判定するために、腸内細菌叢内の細菌占有率を測定する方法。
〔６〕
検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率に基づき排卵障害を調節する物質を検出する方法。
〔７〕
前記〔６〕記載の検出方法は、以下の（１）及び（２）を含む検出方法。
（１）被験物質を摂取した被験者より採取された検体から、当該検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率を検出する第一検出工程、
（２）前記腸内細菌叢内における前記細菌の占有率の変動に基づき、当該被験物質が排卵障害を調節する物質か否かを判定して、排卵障害調節物質を検出する第二検出工程。
〔８〕
前記被験物質が、食用素材である、前記〔７〕記載の方法。
〔９〕
前記〔８〕記載の方法により排卵障害改善用の食用素材を検出し、当該排卵障害改善用の食用素材を含有する組成物の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本技術によれば、簡便な試料採取でも判定精度がよくかつ被験者に対して侵襲性の少ない排卵障害の検査方法を提供することができる。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
次に、本発明の好ましい実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１４】
本技術は、検体中の腸内細菌叢内における細菌を検出することを特徴とする排卵障害の検査方法を提供するものである。
腸内細菌叢内の特定の腸内細菌（より好適には当該細菌の占有率）を排卵障害の判定基準に利用することにより、簡便な試料採取でも判定精度がよくかつ被験者に対して侵襲性の少ない排卵障害の検査方法、診断補助方法、診断方法及び判定方法、並びに排卵障害調節物質の検出方法等を提供できる。
【００１５】
本技術において、前記細菌が、以下の[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌であることが好適である。
さらに、本技術において、前記細菌が、前記[B1][B2]の２種類の組み合わせ、前記[F1][F3]の２種類の組み合わせ、又は前記[B1]〜[B4]の少なくとも１種以上及び前記[F1]〜[F13]の少なくとも１種以上の組み合わせであることが好適である。
以下に、本技術を詳細に説明する。
【００１６】
〔検査マーカー〕
本技術は、排卵障害の検査基準又は判定基準として、腸内細菌叢内の特定の腸内細菌及びその占有率を用いるものである。本技術で用いる細菌及びその占有率は、排卵障害の検出又は判定の目的に使用できるものであり、また排卵障害の指標とすることができ、また検査マーカー又は判定マーカーとして使用することも可能である。
より具体的には、本技術における排卵障害の検査基準等に用いる腸内細菌叢内の特定の腸内細菌は、(1)[Bacteroidetes]、(2)[Firmicutes]、(3)[Actinobacteria]、(4)[Fusobacteria]、及び(5)[Proteobacteria]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌からなるものである。
当該(1)[Bacteroidetes]、(2)[Firmicutes]、(3)[Actinobacteria]、(4)[Fusobacteria]、及び(5)[Proteobacteria]は、門レベルに分類される細菌を指すものである。
本技術の排卵障害の検査基準等に用いる細菌（以下、「本技術の各細菌」又は「前記各細菌」ともいう）は、より好適には、以下の[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌からなるものである。
当該[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]及び[P1]は、目、科又は属レベルのいずれかに分類される細菌を指すものである。
【００１７】
(1)[Bacteroidetes]として、
[B1]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目Prevotellaceae科Prevotella属、
[B2]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目S24-7科、
[B3]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目Rikenellaceae科、
[B4]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目[Paraprevotellaceae]科が挙げられる。
【００１８】
(2)[Firmicutes]として、
[F1]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目、
[F2]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Lachnospiraceae科、
[F3]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目[Tissierellaceae]科WAL_1855D属、
[F4]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Ruminococcaceae科Oscillospira属、
[F5]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Lachnospiraceae科Anaerostipes属、
[F6]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Veillonellaceae科Dialister属、
[F7]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Ruminococcaceae科Ruminococcus属、
[F8]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Peptococcaceae科rc4-4属、
[F9]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Lachnospiraceae科Roseburia属、
[F10]：Firmicutes門Erysipelotrichi綱Erysipelotrichales目Erysipelotrichaceae科AllobacuLum属、
[F11]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Clostridiaceae科Candidatus Arthromitus属、
[F12]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Ruminococcaceae科Other、
[F13]：Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Peptococcaceae科Peptococcus属が挙げられる。
【００１９】
(3)[Actinobacteria]として、
[A1]：Actinobacteria門Coriobacteriia綱Coriobacteriales目Coriobacteriaceae科Atopobium属が挙げられる。
(4)[Fusobacteria]として、
[FS1]：Fusobacteria門Fusobacteriia綱Fusobacteriales目Leptotrichiaceae科Leptotrichia属が挙げられる。
(5)[Proteobacteria]として、
[P1]：Proteobacteria門Betaproteobacteria綱Burkholderiales目Burkholderiaceae科Burkholderia属が挙げられる。
【００２０】
本技術において、被験者の検体から腸内細菌叢内における細菌を検出することによって、被験者が排卵障害に「該当する」と「該当しない」とに判定すること；被験者の検体に基づき被験者が規則正しい排卵が「ある」と「なし」とに判定することが可能である。すなわち、腸内細菌叢内に存在する細菌を検査マーカーとして使用することができる。
本技術の検査方法において、本技術の各細菌を用いることがより好適であり、当該検査マーカーに用いられる前記各細菌は、採取容易でかつ侵襲性の少ない検体から「排卵障害に該当する」と判定することを精度良く行うことができるので、優れている。
【００２１】
〔検体〕
本技術で用いる検体として、被験者由来で、腸内細菌が含まれる試料であれば特に限定されず、例えば、糞便、消化管液、消化管洗浄液、生体試料等が挙げられる。このうち、糞便が、被験者に対する負担が少なく侵襲性が少ないので好ましい。
なお、糞便の採取は、特に限定されないが、例えば、直腸便採取法（直腸スワブ等使用）、排泄便採取法（糞便用綿棒等使用）等が挙げられ、直腸スワブによる直腸便採取法が精度の観点から好ましい。
【００２２】
〔被験者〕
本技術における被験者は、女性である。被験者は、思春期〜性成熟期を被験者とすることが精度の観点から好適であり、４０歳未満が精度の観点から好ましい。本技術は、後記実施例に示すように、排卵障害あり及びなしと診断された女性とその腸内細菌叢との関係から導き出したものであるので、精度の高いものである。
【００２３】
なお、検体中の腸内細菌叢内における細菌を用いて排卵障害を検査する場合には、腸内細菌叢内における本技術の各細菌の存在の有無及びその占有率を公知の分析法を用いて測定する。この測定結果と後述する＜カットオフ値＞に基づき、検体から排卵障害の有無を判定でき、この判定を検査結果とすることができる。より具体的な腸内細菌叢の測定方法は、＜検体中に含まれる腸内細菌の全菌数の測定＞及び＜腸内細菌叢における各細菌の有無及び各占有率の測定＞に後述する。
本発明者らは、後記実施例に示すように腸内細菌叢内における特定の腸内細菌の占有率と、排卵障害の有無の被験者とに強い関連性があることから、当該細菌（より好適には当該細菌の占有率）を排卵障害の判定基準とし、この特定の腸内細菌の占有率をカットオフ値としている。
このため、本技術は、本技術の各細菌を測定し、検出することで排卵障害の有無を判定でき、これにより排卵障害を検査することもできる。
さらに、本技術は、この各細菌の占有率と以下の〔カットオフ値〕に基づき、より精度よく排卵障害を検査することができ、これにより、被験者が排卵障害か否かを精度よく判定できる。
なお、「排卵障害か否か」の判定は、「排卵障害あり」「排卵障害なし」の二段階判定であってもよいし、「排卵障害である」「排卵障害の可能性が高い」「排卵障害の可能性が低い」「排卵障害ではない」と複数の判定区分を設けた多段階判定であってもよい。
【００２４】
〔カットオフ値〕
本技術の検査マーカーにおいて、以下に示すカットオフ値を用いて、このカットオフ値を判定基準に排卵障害を検出することが、より精度の高い排卵障害の検査を行うことができるので好適である。
また、カットオフ値の値を上下に変更設定する又はカットオフ値を複数設定することで、さらに精度の高い判定を行うことも可能であり、また境界領域やカテゴリー分類等を設けた多段階判定にすることも可能である。
【００２５】
本技術において、カットオフ値を「以上（細菌検出ありも含む）」と設定している細菌の場合、当該設定細菌の占有率が「以上（細菌検出ありも含む）」に該当する被験者は「排卵障害である（排卵なし）」と判定され、「以上（細菌検出ありも含む）」に該当しない被験者は、「排卵障害ではない（排卵あり）」と判定される。
また、本技術において、カットオフ値を「以下（細菌不検出も含む）」と設定している細菌の場合、当該設定細菌の占有率が「以下（細菌不検出も含む）」に該当する被験者は「排卵障害である（排卵なし）」と判定され、「以下（細菌不検出も含む）」に該当しない被験者は、「排卵障害ではない（排卵あり）」と判定される。
このように、本技術では、カットオフ値に該当する被験者を、「排卵障害である被験者」と判定し、カットオフ値に該当しない被験者を、「排卵障害ではない被験者」と判定することが好適である。
【００２６】
本技術において「カットオフ値の精度を上げること」で、より精度の高い判定ができる。
なお、「カットオフ値の精度を上げること」とは、感度（陽性を正しく陽性と判断できる割合）から、偽陰性度（本来陽性であるものを陰性と判断する割合）を差し引いた値がより大きくなるカットオフ値を設定することであり、本技術では、カットオフ値を求めるために用いたＲＯＣ曲線において、各カットオフ値の曲線下の面積（ＡＵＣ）がより大きい値に設定することである。
【００２７】
また、後述する＜各カットオフ値＞に示すように、カットオフ値の精度の高さ順に沿って判定を設定することも可能である。より具体的には「さらに好ましいカットオフ値」をＨｉｇｈ設定、「より好ましいカットオフ値」をＭｉｄｄｌｅ設定、「好ましいカットオフ値」をＬｏｗ設定としておくことも可能である。一例として、例えば[B1]の場合、「好ましくは８．４１％以上」をＬｏｗ設定、「より好ましくは９．１５％以上」をＭｉｄｄｌｅ設定、「さらに好ましくは１０．０３％以上」をＨｉｇｈ設定しておくことも可能である。
このように設定してくことで、カットオフ値Ｈｉｇｈの場合「排卵障害の非常に強い疑いあり」、カットオフ値Ｍｉｄｄｌｅの場合「排卵障害の強い疑いあり」、カットオフ値Ｌｏｗの場合「排卵障害の疑いあり」と多段的に判定することも可能である。
【００２８】
また、本技術では、カットオフ値に「該当する」と「該当しない」とが混在した場合には、「該当する」を優先的に採用し、「排卵障害である被験者」と判定することが望ましい。
【００２９】
＜各カットオフ値＞
本技術のカットオフ値は、以下の（１）〜（６）に示す。
(1)[Bacteroidetes]
[B1]：Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目Prevotellaceae科Prevotella属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは８．４１％以上、より好ましくは９．１５％以上、さらに好ましくは１０．０３％以上である。
[B2]Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目S24-7科の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは１２．３０％以下、より好ましくは１１．４６％以下、さらに好ましくは７．７５％以下である。
[B3]Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目Rikenellaceae科の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．５９％以下、より好ましくは０．４８％以下、さらに好ましくは０．４１％以下である。
[B4]Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目[Paraprevotellaceae]科の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．９３％以下、より好ましくは０．７４％以下、さらに好ましくは０．４７％以下である。
【００３０】
(2)[Firmicutes]
[F1]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは１０．１２％以下、より好ましくは８．６６％以下、さらに好ましくは７．６２％以下である。
[F2]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Lachnospiraceae科の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは４．５８％以下、より好ましくは４．２０％以下、さらに好ましくは３．２５％以下である。
[F3]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目[Tissierellaceae]科WAL_1855D属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．５２％以上、より好ましくは１．４６％以上、さらに好ましくは２．２５％以上である。
[F4]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Ruminococcaceae科Oscillospira属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．８７％以下、より好ましくは０．７８％以下、さらに好ましくは０．５８％以下である。
[F5]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Lachnospiraceae科Anaerostipes属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．０６％以下、より好ましくは０．０５％以下、さらに好ましくは０．０３％以下である。
【００３１】
[F6]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Veillonellaceae科Dialister属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは１．４４％以上、より好ましくは１．５３％以上、さらに好ましくは３．１５％以上である。
[F7]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Ruminococcaceae科Ruminococcus属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは１．０８％以下、より好ましくは０．７５％以下、さらに好ましくは０．６１％以下である。
[F8]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Peptococcaceae科rc4-4属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．１４％以下、より好ましくは０．１１％以下、さらに好ましくは０．１０％以下である。
[F9]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Lachnospiraceae科Roseburia属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．０２％以下、より好ましくは０．０１％以下、さらに好ましくは「不検出」である。
【００３２】
[F10]Firmicutes門Erysipelotrichi綱Erysipelotrichales目Erysipelotrichaceae科AllobacuLum属：の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．０２８％以下、より好ましくは０．０１８％以下、さらに好ましくは０．０１５％以下である。
[F11]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Clostridiaceae科Candidatus Arthromitus属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．０２％以下、より好ましくは０．０１５％以下、さらに好ましくは０．０１％以下である。
[F12]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Ruminococcaceae科Otherの細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．０５％以下、より好ましくは０．０３％以下、さらに好ましくは０．０１％以下である。
[F13]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目Peptococcaceae科Peptococcus属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．０７％以上、より好ましくは０．０８％以上、さらに好ましくは０．１４％以上である。
【００３３】
(3)[Actinobacteria]
[A1]Actinobacteria門Coriobacteriia綱Coriobacteriales目Coriobacteriaceae科Atopobium属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．１０％以上であり、より好ましくは０．１１％以上、さらに好ましくは０．１４％以上である。
【００３４】
(4)[Fusobacteria]
[FS1]Fusobacteria門Fusobacteriia綱Fusobacteriales目Leptotrichiaceae科Leptotrichia属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．０８％以下、より好ましくは０．０５％以下、さらに好ましくは「不検出」である。
【００３５】
(5)[Proteobacteria]
[P1]Proteobacteria門Betaproteobacteria綱Burkholderiales目Burkholderiaceae科Burkholderia属の細菌の場合、当該カットオフ値は、好ましくは０．０９％以下、より好ましくは０．０８％以下、さらに好ましくは０．０７％以下である。
【００３６】
(6)[腸内細菌叢における特定細菌の組み合わせ]
本技術の検査マーカーは、以下の[B1]、[B2]、[F1]及び[F3]から選択される２種以上の細菌からなるものであることが好適である。より好ましくは[B1]、[B2]、[F1]、[F3]から選択される３種以上の細菌、さらに好ましくはこれら４種の細菌からなるものである。
[B1]Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目Prevotellaceae科Prevotella属、
[B2]Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目S24-7科、
[F1]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目、及び
[F3]Firmicutes門Clostridia綱Clostridiales目[Tissierellaceae]科WAL_1855D属。
【００３７】
また、本技術の検査マーカーは、前記[B1][B2]の２種類の組み合わせ、前記[F1][F3]の２種類の組み合わせ、又は前記[B1]〜[B4]の少なくとも１種以上と前記[F1]〜[F13]の少なくとも１種以上との組み合わせ、が好適である。
【００３８】
これら細菌の各カットオフ値は、上述の（１）〜（５）のとおりである。これら各カットオフ値をＬｏｗ設定にしていても、後記実施例に示すように、複数組み合わせることで、判定精度をより向上させることができる。また、同じ検体からこれら特定の複数組み合わせが容易である観点からも、優れている。
【００３９】
より排卵障害の判定精度を高めるための腸内細菌叢内の細菌の好適な組み合わせには、以下の［１］〜［３］が挙げられ、排卵障害の検出等の精度向上の観点から好適であるが、これに限定されるものではない。
［１］本技術の検査マーカーは、前記[B1]の細菌及び[B2]の細菌の組み合わせることが好ましく、さらに好ましくは上述したこれらカットオフ値を組み合わせることである。
よりさらに好ましくは、前記[B1]の細菌のカットオフ値（１０．０３％以上）及び[B2]の細菌のカットオフ値（７．７５％以下）を組み合わせることである。これにより一致率を９０％以上にできる。
［２］本技術の検査マーカーは、前記[F1]の細菌及び[F3]の細菌の組み合わせることが好ましく、さらに好ましくは上述したこれらカットオフ値を組み合わせることである。
よりさらに好ましくは、前記[F1]の細菌のカットオフ値（７．６２％以下）及び[F3]の細菌のカットオフ値（２．２５％以上）を組み合わせることである。これにより、一致率を９０％以上にすることができる。
［３］本技術の検査マーカーは、前記[B1]の細菌、[B2]の細菌、前記[F1]の細菌及び[F3]の細菌の組み合わせることが好ましく、さらに好ましくは上述したこれらカットオフ値を組み合わせることである。
よりさらに好ましくは、前記[B1]の細菌のカットオフ値（１０．０３％以上）、[B2]の細菌のカットオフ値（７．７５％以下）、前記[F1]の細菌のカットオフ値（７．６２％以下）及び[F3]の細菌のカットオフ値（２．２５％以上）を組み合わせることである。これにより、一致率を９５％以上にすることができる。
【００４０】
ここで、本技術において、後記実施例に示すように、規則正しく排卵が認められない被験者の糞便中の前記腸内細菌の菌数（より具体的には腸内細菌叢内における細菌占有率）と、規則正しく排卵が認められない被験者（すなわち、排卵障害である被験者）との間には優位な相関関係が見られた。
また、本技術において、規則正しく排卵が認められる被験者の糞便中の前記腸内細菌の菌数（より具体的には腸内細菌叢内における細菌占有率）と、規則正しく排卵が認められる被験者（すなわち、排卵障害ではない被験者）との間にも優位な相関関係が見られた。
なお、腸内細菌が排卵障害の検査に用いることの報告はなく、排卵障害の判定に関与できることが裏付けられた報告は全くないし、特定の腸内細菌及びその占有率が排卵障害の判定精度に強く関与することが裏付けされた報告も全くない。
【００４１】
さらに、上記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の各細菌（以下、「上記各細菌」又は「本技術の各細菌」ともいう。）における「排卵がない被験者の正確率」及び「排卵がある被験者の正確率」に基づき、全体での判定率（すなわち、一致率）を算出することで、より排卵障害の判定精度の高い検査マーカーとして使用できる各細菌を本発明者らは見出すことができた。
なお、当該一致率（１００％）は、ある細菌において、「該当した人数／排卵障害である被験者及び排卵障害ではない被験者の合計人数」×１００で算出されるものである。該当した人数とは、ある細菌において、「排卵障害である被験者：カットオフ値に該当する人数と、排卵障害ではない被験者：カットオフ値に該当しない人数との合計人数」である。
【００４２】
例えば、表４及び５において、排卵障害である被験者８人及び排卵障害ではない被験者２４人の合計３２人で腸内細菌叢の検査が行われている。
ある細菌の腸内細菌叢内における細菌占有率及び全被験者から、ある細菌において「排卵障害である」と判定するためのカットオフ値を設定する。
【００４３】
一例として、表４及び５を参照にし、前記[B1]細菌を検査マーカーとして、このカットオフ値と排卵障害判定についてより詳細に説明する。
【００４４】
前記[B1]の細菌のカットオフ値を８．４１％以上に設定した場合、排卵障害である被験者中８人がこのカットオフ値に該当し、正確率（感度ともいい、１００％）となる。
具体的には、「排卵障害である被験者で前記[B1]の細菌のカットオフ値に該当する者８人／排卵障害である被験者８人」から、排卵障害あり判定の正確率１００％となる。すなわち、前記[B1]細菌のカットオフ値８．４１％以上と設定すれば、被験者中での排卵なし判定精度１００％となる。
【００４５】
一方、この[B1]の細菌のカットオフ値（８．４１％以上）の場合、被験者中排卵障害ではない９人がこのカットオフ値に該当している。このカットオフ値に該当することは排卵障害ありの判定になるので、このカットオフ値に該当する「排卵障害ではない９人」は不正となり、不正確率（非特異性ともいい、３７．５％）になる。
具体的には、「排卵障害ではない被験者で前記[B1]の細菌のカットオフ値に該当する者９人／排卵障害ではない被験者２４人」から、不正確率３７．５％となる。
このことを言い換えると、前記[B1]の細菌のカットオフ値（８．４１％以上）を用いた場合、排卵障害ではない被験者中１５人はこのカットオフ値に該当せず、正確率（６２．５％）となる。
【００４６】
そして、前記[B1]の細菌のカットオフ値８．４１％以上と設定した場合、「排卵障害である被験者中で該当者８人及び排卵障害ではない被験者中で非該当者１５人の合計者２３人／全被験者３２人」から、全体での判定率（一致率ともいう）７１．９％が得られる。この一致率が高いほど、被験者を「排卵障害である」又は「排卵障害ではない」と判定するときに、判定の精度（正確率）が高いことになる。さらに、カットオフ値をＨｉｇｈの１０．０３％以上に設定することで全体での判定率（一致率ともいう）８１．３％が得られ、このように「カットオフ値の精度を上げる」ことでより高精度の判定を行うことができる。
ちなみに、バイオマーカーにおいて判定率７０％以上のものは精度の高い判定マーカーとされている。
【００４７】
そして、本発明者らは、糞便検体中には多数の腸内細菌が存在し、当然に判定不適切な細菌も多数含まれる中、上述のような緻密な試行錯誤を数多繰り返し行った。
その結果、前記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌が、排卵障害の検出のマーカーとして使用できることを本発明者らは見出した。
さらに、後記実施例に示すように、前記各細菌のなかで細菌の種々の組み合わせをさらに検討した結果、さらに精度の高い排卵障害の検出ができることも本発明者らは見出した。また、本技術の各細菌を排卵障害の検査マーカーとして用いると、腸内細菌叢を含む検体から容易に前記各細菌及びその占有率を測定できる。すなわち、本技術は、簡便な採取方法でかつ侵襲性の少ない採取方法と云える。
【００４８】
従って、本技術は、検体中の腸内細菌叢内における細菌を検出することを特徴とする。
さらに、本技術は、前記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌を用いて、排卵障害を検査することが好適である。
また、本技術の方法は、検体中の腸内細菌叢における細菌の占有率により排卵障害を判定する工程を含む、排卵障害の診断を補助する方法でもよい。さらに、本技術は、前記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の検査マーカー用細菌を用いて、排卵障害を判定する工程を含むものが好適である。
また、本技術の方法は、排卵障害を検査又は判定する目的で、腸内細菌叢内の細菌である上記各細菌を測定する細菌の測定方法でもよい。
【００４９】
本技術の方法は、さらに細菌測定工程を含むことが好適であり、この場合、被検中の腸内細菌叢中の上記各細菌の少なくとも１種以上及びその占有率を測定する測定工程、及び、上記各細菌の判定情報に基づき、排卵障害を検出する工程、及び当該検出結果から排卵障害を判定する判定工程を行うことが好適である。
本技術の方法として、排卵障害の診断を補助する方法及び排卵障害の診断方法が含まれてもよい。
本技術の方法には、さらに判定情報（又は検査結果）を通知又は表示を行う表示工程を含んでもよい。表示には、画面表示、紙印刷、データ表示、音声表示等が挙げられる。
当該判定情報は、例えば、判定結果（排卵障害あり・なし）、単数又は複数の細菌におけるカットオフ値及びその占有率の測定結果等が挙げられ、適宜選択することができる。
また、本技術の各細菌は、排卵障害の検査マーカーに用いることができ、またその使用に用いることができる。
また、本技術の上記各細菌は、排卵障害の検査キットに検査マーカーとして用いることができ、また当該検査キットを製造するための抗原抗体、１６ＳｒＲＮＡ配列等を得るために使用することができる。
【００５０】
また、本技術で用いられる上記各細菌及びその占有率の測定（以下、「本技術の細菌の測定」ともいう）は、公知の細菌測定方法又は公知の細菌検出方法を利用して行うことが可能であり、その手法は限定されない。これにより、上述の[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]及び[P1]から選択される１種又は２種以上の細菌の存在の有無及び腸内細菌叢中の占有率を測定できる。
また、本技術の方法は、上記各細菌の存在の有無の判定（定性）、上記各細菌の測定（定量）の何れも含まれてもよい。
本技術は、シーケンス解析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、マイクロアレイ法、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法等から選択される１種又は２種以上の方法を用いることが好ましい。さらに、シーケンス解析及び定量ＰＣＲ法を用いるシーケンサー分析法が、精度の観点から、好ましい。
【００５１】
本技術の細菌の測定手段又は方法は、例えば、予め予測した選択培地において腸内細菌を培養し濁度や吸光度を測定する方法、ＦＩＳＨ法、リアルタイムＰＣＲ法等が挙げられ、これらは細菌数（占有率）を測定する際に適している。
本技術の細菌の測定手段又は方法は、シーケンサー（第１世代〜第３世代等）、及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定装置等が挙げられる。シーケンサーでは、シングルリード法、ペアエンド法、マルチプレックス法等が挙げられる。これらは、腸内細菌叢の全菌数及び前記各判定のマーカーの細菌の占有率を精度良く測定でき、より精度の高い判定を行う際に適している。
なお、本技術の細菌を測定する場合、細菌由来の塩基配列又はその断片、菌体又はその破片から選ばれる１種又は２種以上のものを用いて細菌測定のための指標物質を作成してもよい。これにより、細菌測定に使用する指標物質（例えば、プライマー、マーカー等）を得ることができる。さらに標識として、放射性同位体、蛍光体、呈色剤等を用いてもよい。当該細菌由来のものから選ばれる１種又は２種以上のものを用いて本技術の細菌を測定できる。
【００５２】
＜検体中に含まれる腸内細菌叢の全菌数の測定＞
検体に含まれる腸内細菌叢の全菌数の測定は、公知の手法を利用して求めることができ、その手法は特に限定されない。
例えば、シーケンサー分析法において、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列中、検体に含まれる菌で共通の塩基配列部分に結合するプライマーを用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を解読する。この解読により、上記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]及び[P1]の細菌以外の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数も算出することができる。このため、検体中に含まれる全菌数は、例えば、検体で測定される全ての菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数の和としてもよい。また、顕微鏡等を用いて検体に含まれる菌を数えることによって、検体に含まれる全ての菌の数を求めてもよい。
本技術の方法を行う際に、細菌測定工程のなかに又はこの前処理工程として、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解読する工程を有することが好適である。
また、本技術に用いる検体は、採取後に培養操作が行われていない検体が望ましい。培養操作によって、各々の菌の増殖率が異なることによって、採取時の検体における各最近の割合が変化してしまうことを避けるためである。
【００５３】
＜腸内細菌叢内における上記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]及び[P1]の各細菌の有無及び各占有率の測定＞
検体に含まれる腸内細菌叢中の全細菌数に対する上記の各細菌の細菌割合（「占有率」ともいう）とは、検体に含まれる全菌数を「１００％」としたときの相対値である。
また当該各細菌の占有率が、上述した各カットオフ値と対比されることにより、排卵障害を検出又は判定できる。当該占有率が、カットオフ値に該当する場合は排卵障害であると検出又は判定され、また、カットオフ値に該当しない場合は排卵障害ではないと検出又は判定される。
また、上記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]及び[P1]の各細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数と、検体に含まれる全ての菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数から細菌割合（占有率）を求めることもできる。
なお、上記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]及び[P1]の細菌のうち検出されなかった細菌は、その細菌割合（又は占有率）は０％又は不検出とする。
【００５４】
本技術における各群の細菌の測定についてより具体的な一例を挙げるが、本技術はこれに限定されるものではない。
＜上記各細菌及びその占有率の測定工程＞
検体に含まれる菌のうち、上記各細菌に分類される菌数及び腸内細菌叢の全菌数は、公知手法を用いて求めることができ、その手法は特に限定されない。
例えば、細菌の分類については、リボソームを構成する小型のサブユニット（１６Ｓ）に存在するＲＮＡをコードする遺伝子（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子）の塩基配列に基づき、各々の細菌を、上記の各細菌又は、その他の細菌に分けることができる。
また、検体に含まれる上記各細菌の菌数の算出についても、例えば、検体中に含まれる、上記各細菌に由来する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量やコピー数を定量することにより行うこともできる。
細菌の菌数の算出について、以下に例を挙げるが、これに限定されるものではない。なお、検体に含まれる腸内細菌叢の全菌数の算出についても、同様にして行うことができ、これに限定されるものではない。
【００５５】
塩基配列に基づき菌数を算出するためには、先ず、検体に含まれる細菌のＤＮＡを検体から抽出する。検体からのＤＮＡの抽出は、公知の手法を用いて行うことができ、その手法は特に制限されない。例えば、フェノール・クロロホルムを用いる抽出法、フィルターを備えるスピンカラム法等が挙げられる。
【００５６】
検体から得られるＤＮＡについては、菌数の測定に必要なＤＮＡ量又はコピー数を得るために、核酸増幅反応を行うことが好ましい。ＤＮＡの増幅については、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等の公知の手法を用いて行うことができ、核酸増幅反応において用いるプライマーについても、公知の設計手法を用いて設計することができる。さらに、核酸増幅反応の際に、ＤＮＡの解析に必要な配列を増幅核酸鎖に組み込ませるように、プライマーを設計してもよい。
【００５７】
上記各細菌に分類される細菌の数は、例えば、上記ＤＮＡ溶液に含まれるＤＮＡを鋳型とする定量ＰＣＲ法やＴ−ＲＦＬＰ（Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism）法等によって測定することができる。
定量的ＰＣＲ法では、各々の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち特異的な配列部分に結合するプライマーを用い、核酸増幅反応を行うことにより、所望の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数を測定することができる。
またＴ−ＲＦＬＰ法では、末端に標識が付されたプライマーを用いて、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の各細菌に特異的な配列部分を含む増幅核酸鎖を生成し、得られた増幅核酸鎖を制限酵素で処理し断片化してサイズの異なるＤＮＡ断片とする。このＤＮＡ断片を電気泳動により分離し、泳動パターンにおける各々のピークの同定とピーク強度から、所望の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数を測定することができる。
【００５８】
また、上記ＤＮＡ溶液に含まれるＤＮＡについては、ＦＩＳＨ（Fluorescence in situ hybridization）法により、所望の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数を算出してもよい。この他、ＤＮＡマイクロアレイを用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数を算出することもできる。
【００５９】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数は、上述した方法の他に、シーケンサーを用いて検体から抽出されたＤＮＡの塩基配列を決定し、特定の配列を解読した回数から求めることもできる。また、シーケンサーを用いる方法の場合、同じ操作によって、検体に含まれる上記各細菌以外の菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数も併せて求めることができる。
【００６０】
シーケンサーを用いる方法としては、例えば、クローンライブラリー法、ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ（Denaturing/Temperature Gradient Gel Electrophoresis）法、メタゲノム解析法等がある。
クローンライブラリー法では、検体から抽出されたＤＮＡの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の、上記各細菌に特異的な配列部分を増幅して、得られた増幅核酸鎖をプラスミドに挿入して、増幅核酸鎖を含むプラスミドの塩基配列を解読する。
ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ法では、クローンライブラリー法と同様にＤＮＡを増幅し、得られた核酸鎖を電気泳動によって核酸鎖の配列に応じて分離し、バンドを切り出して、ゲル内のＤＮＡを回収して当該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
メタゲノム解析では、検体から得られたＤＮＡを断片化して、必要に応じて核酸増幅反応等を行った後、各々のＤＮＡ断片又は増幅核酸鎖の塩基配列を決定する。
【００６１】
上述した塩基配列の決定は、サンガー法の原理を利用したシーケンサーで行うこともでき、また、次世代シーケンサー（第二世代シーケンサーともいう）で行うこともできる。特にメタゲノム解析は、解読性能がより高い次世代シーケンサーで行うことが好ましい。メタゲノム解析のときに、マルチプレックス法、シングルリード法、ペアエンド法等が用いられている。シングルリード法は、ブリッジＰＣＲによりクラスター形成後にＤＮＡ断片の片側をシーケンシングする手法である。ペアエンド法は、ブリッジＰＣＲによりクラスター形成後に、断片の両側からシーケンシングする方法であり、ペアエンド法の方がより精度の高いデータが得られるので好ましい。また、マルチプレックス法は、ＤＮＡ断片にバーコード配列を付与することによって、複数サンプル由来のＤＮＡ配列を正確に識別する手法である。
【００６２】
シーケンサーを用いて解読された塩基配列から細菌を同定する場合には、解析ソフトウェアやデータベース等を利用する公知の解析方法を利用することができる。データベースとしては、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＮＡ、ＤＤＢＪ等が挙げられる。また、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に特化したデータベースであるGreengenes database 等も利用することができる。
検体から得られるＤＮＡの解析結果を、これらのデータベースに蓄積された細菌の塩基配列に対して相同性検索することにより、検体に含まれる細菌を同定することができる。いずれかの細菌に同定された配列のうち、上記各細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子として同定された配列のコピー数を、上記各細菌の数とすることができる。また、同定する際の相同性は９５％以上、より好ましくは９７％以上である。
【００６３】
〔その他の実施形態〕
本技術の別の側面として、ヒト腸内細菌叢内における細菌（好適には、上記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]及び[P1]の各細菌）を用いて、以下の検査キット、排卵障害調節物質を検出する方法若しくはスクリーニングする方法、排卵障害改善用の食品素材含有組成物の製造方法、排卵障害判定用制御部又は排卵障害判定用装置等を提供できる。
【００６４】
また、本技術は、検査キットを提供することができる。本技術の検査キットとして、検体中の前記腸内細菌を測定するためのプロトコールを含む検査キットが好適である。これにより、本技術の排卵障害の判定方法及び検査方法を実施することができる。当該キットには、腸内細菌叢を検出する測定試薬及びプロトコール（腸内細菌の測定方法、並びに排卵障害の判定方法、特に検査マーカー細菌のカットオフ値、測定結果に影響を与える要因とその影響の程度等が記載されたもの等）が含まれる。
判定基準には、前記腸内細菌の各細菌の標準菌数、排卵障害ありの可能性が高いと判断されるカットオフ値等が含まれる。当該カットオフ値は、早期発見目的、排卵障害調節物質の検出目的、スクリーニング目的、診断精度向上、排卵障害用薬投与患者の選定等といった診断の用途に併せて適宜変更することができる。当該検査マーカーとなる細菌、その占有率、及びそのカットオフ値の判定基準を用いて、被験者の排卵障害の状態を判定すればよい。この判定結果は、判定情報として医師の診断を補助するために利用できる。
本技術の検査マーカーの測定試薬として、前記腸内細菌数測定用試薬、ｍＲＮＡ検出用試薬、ＤＮＡ検出用試薬、抗原抗体反応用試薬等が挙げられる。
【００６５】
また、本技術は、検体中の腸内細菌叢内における細菌に基づき、排卵障害を調節する物質を検出する方法も提供することができる。当該排卵障害調節物質は、単数又は複数の被験物質から検出されるものである。
さらに、本技術の排卵障害調節物質の検出方法は、以下の（１）及び（２）を含む検出方法が好適である。
（１）被験物質を摂取した被験者より採取された検体から、当該検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率を検出する第一検出工程、
（２）前記腸内細菌叢内における前記判定マーカー細菌の占有率の変動に基づき、当該被験物質が排卵障害を調節する物質か否かを判定して、排卵障害調節物質を検出する第二検出工程を提供することができる。
前記細菌の占有率における「細菌」とは、上述した〔検査マーカー〕記載の各細菌が好適である。
前記第一検出工程において、当該占有率を検出するために、腸内細菌叢内における細菌の占有率を測定する測定工程を含んでいてもよい。
本技術の方法は、上述した〔検査マーカー〕の細菌を用いて、排卵障害を調節する物質を検出してもよい。
【００６６】
前記被験物質は、新規物質であってもよいし、既知物質であってもよい。
本技術の排卵障害調節物質の検出方法は、第一検出工程前に、複数種類の被験物質からなる被験物質群から１種類又は複数種類の被験物質を選択する工程を含んでもよい。なお、被験物質は、異なる複数種類の被験物質を混合させた混合物であってもよい。
また、被験物質は、例えば、十分な食経験あるいは安全性が確保された食用素材群（例えば、乳製品、穀物、野菜、魚肉類、油脂類、乳酸菌、ビフィズス菌等）等から選択してもよい。そして、複数種類の食用素材からなる食用素材群から１種類又は複数種類の食用素材を選択することができる。
前記排卵障害調節物質を検出する際に使用する検体は、特に限定されず、被験物質の摂取の有無を対比することができればよい。例えば、被験物質を摂取する前の検体及び摂取した後の検体であってもよく、被験物質を摂取した被験者の検体又は摂取しない被験者の検体であってもよい。
【００６７】
本技術において、排卵障害を調節する物質とは、排卵障害を正〜負にする物質であり、より具体的には、排卵障害改善物質（障害：−）、排卵障害悪化物質（障害：＋）、排卵障害に影響のない物質（障害：なし又は不明）等が挙げられる。
また、本技術において、被験物質投与の有無による上記各細菌の占有率の変動によって被験物質が排卵障害を調節する物質（正〜負）か否かを判定できる。
例えば、被験者に被験物質を摂取させることで、本技術の上記カットオフ値に該当しなくなった（すなわち排卵障害がなくなった）場合、この被験物質を排卵障害が改善できる物質と判定できる。また、被験物質を摂取させることで、上記カットオフ値に該当するようになった（すなわち排卵障害になった）場合、この被験物質を排卵障害悪化物質と判定できる。また、被験物質を摂取させてもカットオフ値に変化がない場合には、排卵障害に影響のない物質と判定できる。当該カットオフ値は、上記＜各カットオフ値＞から選択される１種又は２種以上から選択することができる。これにより、排卵障害調節物質を検出できる。
【００６８】
より詳細に一例を説明すると、排卵障害である被験者に対して被験物質を摂取させて採取された検体を測定した結果により、本技術の上記カットオフ値に該当しなくなった場合には、当該被験物質は排卵障害改善物質（障害−）と判定し、排卵障害改善物質として検出できる。
また、排卵障害ではない被験者に対して被験物質を摂取させて採取された検体を測定した結果により、上記カットオフ値に該当するようになった場合には、当該被験物質は排卵障害悪化物質（障害＋）と判定し、排卵障害悪化物質として検出できる。
また、被験物質を被験者に対して摂取させても、本技術の各細菌のカットオフ値に変化がなかった場合には、当該被験物質は排卵障害に影響しない物質と判定し、排卵障害に影響しない物質（障害なし）として検出できる。
なお、本技術の検出方法は、さらに被験物質の摂取量を調整することで、その摂取量によって排卵障害を調節できるか否かも検出できる。
【００６９】
本技術の排卵障害を調節する物質を検出方法の一例について以下に説明するが、これに限定されるものではない。
前記占有率の変動と、上述した＜各カットオフ値＞のカットオフ値とを考慮することで、被験物質がどのような排卵障害調節物質かを判定し、検出できる。
例えば、排卵障害である被験者であって、ある細菌がカットオフ値１０％以上で排卵障害であると判定される検査マーカーを用いて、一定期間被験物質摂取の有無を条件に検討を行う。なお摂取期間は任意で設定でき、１週間でも１ヶ月でもよい。
摂取後に被験者から検体を採取し、採取された検体から腸内細菌叢及び前記各細菌の占有率を測定する。
腸内細菌の測定結果から、被験物質摂取なしの場合と比較して被験物質摂取あり場合に、この細菌（カットオフ値が以上で設定されている細菌）の占有率が低下した場合には、この被験物質を排卵障害改善の可能性のある物質として判定し検出できる。さらに、摂取によりカットオフ値１０％未満に低下させた被験物質の場合には、この被験物質をより強い排卵障害改善物質として判定し検出できる。本技術は、占有率変動の度合いによっても効能の強弱を判定し検出できる。
このようにして、食用素材を摂取させたときの検体中の上述した〔検査マーカー〕の各細菌の変動を観ることによって、排卵障害を起こしやすい食用素材、排卵障害を改善できる食用素材、排卵障害に影響の少ない食用素材として判定し検出できる。
食用素材としては、通常の飲食品でもよいし、製品の原材料（例えば、脂質、タンパク質、糖質、食物繊維等）でもよい。より具体的には、例えば、野菜、海藻、コメ、コムギ、魚、牛肉、大豆等が挙げられる。
【００７０】
さらに、本技術は、検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率に基づき排卵障害改善用の食用素材を検出し、当該排卵障害改善用の食用素材を含有する組成物の製造方法であり、以下の工程を含む製造方法である。
本技術は、前記〔検査マーカー〕記載の細菌を用いて排卵障害改善用の食用素材を検出してもよい。
また、本技術の製造方法は、以下の工程を含む設計方法を含むことがより好適である。
（ａ）被験物質である食用素材を摂取した被験者より採取された検体から、当該検体中の腸内細菌叢における前記判定マーカー細菌の占有率を測定する測定工程、
（ｂ）前記腸内細菌叢内における前記判定マーカー細菌の占有率の変動に基づき、当該食用素材が排卵障害を改善する物質か否かを判定して、排卵障害改善物質を検出する検出工程
（ｃ）前記検出された排卵障害改善用の食用素材を組成物に配合することを設計する設計工程を提供することもできる。
【００７１】
さらに、本技術の設計方法は、複数種類の食用素材からなる食用素材群から１種類又は複数種類の食用素材を選択することを含んでもよい。
さらに、本技術は、前記設計方法を用いて、排卵障害改善用の食用素材を含有する組成物の製造方法を提供することもできる。
【００７２】
また、本技術は、検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率に基づき排卵障害改善用の食用素材を検出し、当該排卵障害改善用の食用素材を含有する組成物の製造方法であり、以下の工程を含む製造方法；
（ａ）被験物質である食用素材を摂取した被験者より採取された検体から、当該検体中の腸内細菌叢内における前記判定マーカー細菌の占有率を測定する測定工程、
（ｂ）前記腸内細菌叢内における前記判定マーカー細菌の占有率の変動に基づき、当該食用素材が排卵障害を改善する物質か否かを判定して、排卵障害改善物質を検出する検出工程
（ｃ）前記検出された排卵障害改善用の食用素材を組成物に配合することを設計する設計工程、
（ｄ）前記設計された排卵障害改善用の食用素材を、組成物に配合する配合工程を提供することもできる。
【００７３】
本技術により、組成物に排卵障害改善用の食用素材を配合することができ、これにより排卵障害改善用組成物を提供することができる。また、本技術により、排卵障害改善用の食用素材の配合量を調整した排卵障害改善用組成物を提供することもできる。
【００７４】
また、本技術は、排卵障害を判定するための制御部を提供することができる。これにより、被験者が排卵障害か否かを判定し検出することができる。
本技術の制御部は、前記〔検査マーカー〕記載の各細菌及び／若しくはその占有率により又は当該検査マーカーを用いて、排卵障害を判定することが好ましい。当該制御部は、上述した＜各カットオフ値＞や〔後記実施例〕のカットオフ値及び細菌の組み合わせの情報データを有すること、又はこれらを記憶している記憶部にアクセスできることが、より好適である。なお、測定された細菌結果（全菌数、各細菌数、占有率等）を、手動にて入力部から入力してもよい。入力部は記憶部又は制御部等に各入力データを送信する。
また、前記制御部は、上述した細菌を測定する細菌測定部にアクセスできることが、さらに好適である。当該制御部は、細菌を測定すること及びその結果（上記各細菌の占有率等）を解析することを制御することができる。
また、前記制御部は、上述した判定情報を制御すること、当該判定情報を通知又は表示を行う表示部にアクセスできることが好適である。当該制御部は、検査する細菌及びその占有率の測定、カットオフ値の設定を行うことができる。また当該制御部は、判定結果を表示部に表示させることができる。表示部として、ディスプレイ、スピーカー、紙媒体等が挙げられる。
【００７５】
本技術の方法を、装置のＣＰＵ等を含む制御部、及び記憶媒体（ＵＳＢメモリ、ＨＤＤ、ＣＤ、ネットワークサーバ等）等を備えるハードウエア資源にプログラムとして格納し、制御部によって実現させることも可能である。また、本技術は、本技術の設計方法として、コンピュータを機能させるためのプログラムとすることも可能である。
【００７６】
さらに、本技術は、排卵障害を判定する制御部を有する排卵障害検出制御装置であってもよい。これにより、被験者が排卵障害か否かを判定し検出することができる。
当該制御装置はパソコン等の演算処理能力を有する部分（例えばＣＰＵ等）を備えるものであればよく、また、他の測定装置（例えば、細菌測定装置等）や記憶装置（例えば、サーバー上又はインターネット上のデータベース等）とアクセス可能な状態であってもよい。
また、本技術は、細菌測定部及び制御部を有する排卵障害判定測定装置であり、これにより、被験者が排卵障害か否かを判定し検出することができる。
本技術は、当該細菌測定部が、検体中の腸内細菌叢の細菌を測定すること；当該制御部が、当該細菌測定部の結果に基づき被験者が排卵障害か否かを判定し排卵障害を検出すること；を行う排卵障害検出測定装置であってもよい。
さらに、本技術は、当該制御部が、排卵障害を調節する物質を検出する検出装置；排卵障害改善用の食用素材含有組成物の設計を行う設計装置及び排卵障害改善用の食用素材含有組成物の製造制御を行う製造制御装置であってもよい。
【００７７】
また、本技術は、以下の構成を採用することも可能である。
〔１〕
検体中の腸内細菌叢内における細菌を検出することを特徴とする排卵障害の検査方法。
好適には、前記細菌が、以下の[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌である。
〔２〕
腸内細菌叢内の細菌を用いる排卵障害の検査マーカー又は判定マーカーであり、
当該マーカーが、前記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌からなるものである、マーカー。
〔３〕
検体中の腸内細菌叢内における細菌を検出することを特徴とする、排卵障害の診断を補助する方法又は排卵障害の診断方法。
好適には、前記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌を用いることである。
〔４〕
検体中の腸内細菌叢内における細菌を検出する工程及び排卵障害を判定する工程を含む、排卵障害の診断を補助する方法又は排卵障害の診断方法。
前記〔１〕記載の細菌を排卵障害の検査マーカーとして用いることが好適である。
〔５〕
排卵障害の検査マーカー又は判定マーカーに用いるための、前記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌又はこの使用。
〔６〕
前記〔１〕記載の細菌由来の判定マーカーを含む、排卵障害の有無を確認するための検査キット。
【００７８】
〔７〕
排卵障害を検出又は判定する目的で、腸内細菌叢内の細菌を測定する方法であり、
前記〔１〕記載の細菌を検査マーカーとして測定する、細菌の測定方法。
〔８〕
検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率に基づき排卵障害を調節する物質を検出する方法。
〔９〕
前記〔８〕記載の検出方法は、以下の（１）及び（２）を含む検出方法。
（１）被験物質を摂取した被験者より採取された検体から、当該検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率を検出する第一検出工程、
（２）前記腸内細菌叢内における前記細菌の占有率の変動に基づき、当該被験物質が排卵障害を調節する物質か否かを判定して、排卵障害調節物質を検出する第二検出工程。
【００７９】
〔１０〕
検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率に基づき排卵障害改善用の食用素材を検出し、当該排卵障害改善用の食用素材を含有する組成物の設計方法。
〔１１〕
検体中の腸内細菌叢内における細菌の占有率に基づき排卵障害改善用の食用素材を検出し、当該排卵障害改善用の食用素材を含有する組成物の製造方法。
【００８０】
〔１２〕
前記〔８〕記載の検出方法により排卵障害改善用の食用素材を検出すること、及び／又は、前記〔９〕記載の設計方法により配合する排卵障害改善用の食用素材を設計することにより、当該排卵障害改善用の食用素材を含有する組成物を製造する方法。
より好適には、以下の（ａ）〜（ｄ）工程を含む、前記〔１１〕記載の組成物の製造方法。
（ａ）被験物質である食用素材を摂取した被験者より採取された検体から、当該検体中の腸内細菌叢内における前記細菌の占有率を測定する測定工程、
（ｂ）前記腸内細菌叢内における前記細菌の占有率の変動に基づき、当該食用素材が排卵障害を改善する物質か否かを判定して、排卵障害改善物質を検出する検出工程、
（ｃ）前記検出された排卵障害改善用の食用素材を組成物に配合することを設計する設計工程。
【００８１】
〔１３〕
前記〔１〕〜〔１２〕のいずれか１つにおいて、
採取された検体から前記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌を測定する測定工程、
前記測定結果と、前記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌のカットオフ値に基づき、排卵障害か否かを判定する判定工程、を含むことが好適である。
さらに、前記判定工程における前記測定結果が、前記[B1]〜[B4]、[F1]〜[F13]、[A1]、[FS1]、及び[P1]からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌の占有率であることが好適である。
【００８２】
〔１４〕
前記〔１〕〜〔１３〕のいずれか１つにおいて、前記[B1][B2]の２種類の組み合わせ、前記[F1][F3]の２種類の組み合わせ、又は前記[B1]〜[B4]の少なくとも１種以上及び前記[F1]〜[F13]の少なくとも１種以上の組み合わせが好適である。
〔１５〕
前記〔１〕〜〔１４〕のいずれか１つにおいて、細菌を測定する場合、シーケンサー分析法、シーケンス解析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法、マイクロアレイ法、イムノアッセイ法、ハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ブロッティング法を用いることが好適である。また、シーケンサー分析法がより好適である。
【実施例】
【００８３】
以下に実施例等を用いて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に限定されるものではない。
【００８４】
＜被験者＞
産婦人科外来、生殖内分泌外来を受診した、４０歳未満の女性患者で、規則正しく２５〜３０日周期で排卵が認められる患者（排卵あり：排卵障害ではない）とそうではない患者（排卵なし：排卵障害である）を対象に、直腸スワブ（直腸便用採取綿棒）を用いて直腸より便を採取（直腸便採取法）し（以下、直腸スワブ便検体）、以下の方法で菌叢の解析を行った。
排卵障害の有無は、基礎体温表並びに血液中のホルモン検査により確認した。
【００８５】
＜腸内細菌叢の測定＞
＜検体採取＞
排卵障害を有する患者８名、健常者２４名の直腸スワブ便検体からＤＮＡを以下の方法で抽出した。便を採取した直腸スワブの綿球の部分を切り取り、５００μＬのＲＴＦ溶液※１と１０００μＬの抽出液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，４ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ９．０）の混合液中に入れ、細胞破砕装置ＭμＬｔｉ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｈｏｃｋｅｒ（ＹＡＳＵＩ  ＫＩＫＡＩ）で１，４００ｒｐｍ  ５ｍｉｎ抽出処理を実施した。抽出液８００μＬ、０．１ｍｍ径のガラスビーズ３００ｍｇ、８００μＬのＴＥ飽和フェノール（和光純薬）を混合し、細胞破砕装置ＭμＬｔｉ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｈｏｃｋｅｒ（ＹＡＳＵＩ  ＫＩＫＡＩ）で２，７００ｒｐｍ  １８０ｓｅｃの破砕処理を実施した。１０，０００ｇで１０分間遠心後４００μＬの上清を取り、５００μＬのフェノール・クロロホルム溶液（和光純薬）を加えて混合し、１０，０００ｇで１０分間遠心後２５０μＬの上清を取得した。さらに２−プロパノールを２５０μＬ加え、イソプロパノール沈殿させたものを２０μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０）で溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
【００８６】
＜ＤＮＡの増幅＞
次に、上記ＤＮＡ溶液に含まれる細菌のゲノムに対して核酸増幅反応を行った。下記表１〜表３に、本実験例で用いたプライマーの配列を示す。表１に示すプライマーセットは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の第３〜４可変領域を増幅させるためのプライマーである。これらのプライマーについては、便宜的に第１プライマーセットとする。
【００８７】
【表１】
2019176754.tif 000002
【００８８】
表１中、「Ｒ」は、グアニン又はアデニンを意味する。「Ｗ」は、アデニン又はチミン若しくはウラシルを意味する。「Ｈ」は、アデニン又はシトシン又はチミン若しくはウラシルを意味する。「Ｖ」は、アデニン又はグアニン又はシトシンを意味する。
【００８９】
また、下記表２及び表３に示すプライマーセットは、次世代シーケンサー（Ｍｉｓｅｑ（イルミナ社製））を用いて塩基配列を解析するために必要な配列（アダプター領域及びインデックス領域）を増幅核酸鎖に組み込むためのプライマーセットである。表２に示すプライマーはフォワードプライマーであり、表３に示すプライマーは、リバースプライマーである。これらのプライマーは、便宜的に第２プライマーセットとする。なお、表１〜表３に示すプライマーは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のオリゴプライマー作成サービスにより得た。
【００９０】
【表２】
2019176754.tif 000003
【００９１】
【表３】
2019176754.tif 000004
【００９２】
上述したＤＮＡ溶液及び第１プライマーセットを含む総液量２５μＬの反応液を、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  ＨＳ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて調製した。核酸増幅反応は、サーマルサイクラー（Ｖｅｒｉｔｉ  ２００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））を用いて行い、９４℃−３分の後、９４℃−３０秒、５０℃−３０秒、７２℃−３０秒を１サイクルとし、これを２０回繰り返し、その後７２℃−１０分として、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンにより、増幅核酸鎖を確認した。
【００９３】
続いて、得られたＰＣＲ産物１μＬを鋳型とし、第２プライマーセットを用いて上述した条件と同様にＰＣＲ反応を行った。但し、サイクル数は１５回とした。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ９６  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （キアゲン社製）を用いてＰＣＲ産物を精製した。精製後のＰＣＲ産物については、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によりＤＮＡ濃度を測定した。
【００９４】
＜ＤＮＡのシークエンス＞
複数の糞便検体に由来するＰＣＲ産物を同じ濃度で混合したものをＭｉｓｅｑ  ｖ２  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（イルミナ社製）に供し、Ｍｉｓｅｑにてシークエンス解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＢＳ法）を実施した。
【００９５】
＜細菌の同定及び菌数の算出＞
上記シークエンス解析により得られたペアエンド配列をfastq-join （version.1.1.2-301）（http://code.google.com/p/ea-utils/wiki/FastqJoin）にて、ＱＩＩＭＥソフトウェア（version 1.6.0）（http://qiime.org/）にて９７％の相同性を有する配列ごとをＯＵＴ（Operational Taxonomy Unit）とした。各ＯＵＴの代表配列を下記データベースに対してＢＬＡＳＴ検索することにより、腸内細菌叢の構成を解析した。
データベース：Greengenes database 12_10
(http://greengenes.secondgenome.com/downloads/database/12_10)
【００９６】
＜腸内細菌叢の測定結果＞
上述した各検体の腸内細菌叢の全菌数について、上述した腸内細菌叢の構成解析の結果の総配列数を各糞便検体に含まれる全菌数とした。さらに腸内細菌叢のうち、上記相同性検索の結果により表４及び５に示す各細菌を同定し、各細菌の占有率を算出した。
【００９７】
＜考察＞
ＲＯＣ解析は統計解析ソフトＪＭＰ１３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）を使用して行った。当該ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）解析により本技術のカットオフ値を設定することができる。Bacteroidetes門Bacteroidia綱Bacteroidales目Prevotellaceae科Prevotella属を例として、本ソフトを用いたＲＯＣ解析方法を以下に示す。まず、占有率を多段階に設定し（０，５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０％等）、それをカットオフ値とした場合の、各段階の排卵なしに該当する被験者数と排卵ありに該当する被験者数並びにその合計数を求める。次に、カットオフ値毎の感度（排卵なしに該当する被験者数／各段階の合計数）並びに偽陰性度（１−特異度（排卵ありに該当する被験者数／各段階の合計数）を求める。その２変量の関係でロジスティック回帰を行い、ＲＯＣ曲線を求め（Ｘ軸には偽陰性度、Ｙ軸には感度をプロット）、各カットオフ値における曲線下の面積（ＡＵＣ）が最大となったところを、さらに好ましいカットオフ値と定めた。次点をより好ましいカットオフ値とし、３位のカットオフ値を好ましいカットオフ値と定めた。
さらに、各細菌の腸内細菌叢での占有率及び排卵障害あり（排卵なし）と排卵障害なし（排卵あり）の被験者との関係を検討した。
そして、各細菌の占有率と被験者と関係から、排卵障害か否かの基準となるカットオフ値を見出し、この結果を表４及び５に示す。この検討の詳細の一例は、上述したとおりである。これにより、簡便な試料採取でも判定精度がよくかつ被験者に対して侵襲性の少ない排卵障害の検査方法等を提供することができる。
【００９８】
【表４】
2019176754.tif 000005
【００９９】
【表５】
2019176754.tif 000006
【配列表】
2019176754000001.app