(57)【要約】【課題】固相核酸合成方法における脱保護工程においてトルエンに代わる新たな溶剤を見いだし、これを利用することでトルエンの使用による種々の問題を解決する。【解決手段】固相担体上にて、ヌクレオシドの５’位又は３’位の水酸基に保護基が結合した保護ヌクレオシドホスホロアミダイトを順次結合させる固相核酸合成方法であって、pKaが０．２〜０．８である酸とアセトニトリルとを含有する溶液中で、前記保護ヌクレオシドホスホロアミダイトから前記保護基を乖離する反応を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体上にて、ヌクレオシドの５’位又は３’位の水酸基に保護基が結合した保護ヌクレオシドホスホロアミダイトを順次結合させる固相核酸合成方法であって、
pKaが０．２〜０．８である酸とアセトニトリルとを含有する溶液中で、前記保護ヌクレオシドホスホロアミダイトから前記保護基を乖離する反応を行う脱保護工程を含む、固相核酸合成方法。
【請求項２】
前記保護基は、トリチル基若しくはその誘導体、又は９−フェニルキサンテン−９−イル基若しくはその誘導体である、請求項１記載の固相核酸合成方法。
【請求項３】
前記酸は、トリクロロ酢酸及び/又はトリフルオロ酢酸である、請求項１記載の固相核酸合成方法。
【請求項４】
前記固相担体は多孔質樹脂ビーズである、請求項１記載の固相核酸合成方法。
【請求項５】
前記脱保護工程は、前記多孔質樹脂ビーズを充填したカラム内で前記溶液を流すことにより行われる、請求項４記載の固相核酸合成方法。
【請求項６】
前記溶液の流速を４００〜２０００ｃｍ／ｈとする、請求項５記載の固相核酸合成方法。
【請求項７】
前記カラムへ充填した前記多孔質樹脂ビーズからなる層の長さは、流路方向に４〜５０ｃｍ（但し、当該多孔質樹脂ビーズが前記溶液で膨潤した状態で計測した場合の数値）である、請求項５記載の固相核酸合成方法。
【請求項８】
pKaが０．２〜０．８である酸とアセトニトリルとを含有し、固相担体上にて、ヌクレオシドの５’位又は３’位の水酸基に保護基が結合した保護ヌクレオシドホスホロアミダイトを順次結合させる固相核酸合成方法における、前記保護ヌクレオシドホスホロアミダイトから前記保護基を乖離する反応に使用される、固相核酸合成用溶液組成物。
【請求項９】
前記酸は、トリクロロ酢酸及び/又はトリフルオロ酢酸である、請求項８記載の固相核酸合成用溶液組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラスビーズや多孔質樹脂ビーズ等を固相担体として使用し、当該固相担体上で核酸を合成する固相核酸合成方法及び当該固相核酸合成方法に使用する溶液組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
固相核酸合成方法は、ホスホロアミダイト法とも呼称され、ガラスや多孔質樹脂からなる固相担体上にてヌクレオチド鎖を合成し、任意の配列を有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを合成する方法である。具体的に、3’-OH基がホスホロアミダイトで誘導体化され、5’-OH基がジメトキシトリチル基（保護基）で保護されたヌクレオシドを5'方向に一塩基ずつカップリングを行い伸長する合成方法である。
【０００３】
より具体的な合成工程は、トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液又はジクロロ酢酸／トルエン溶液を用いて保護基をヌクレオシドから脱離させる脱保護工程と、脱保護したヌクレオシドの5’末端と次のヌクレオシドのホスホロアミダイト基とを反応させるカップリング工程と、未反応の5’-OH基が次のカップリング工程時に反応しないようアセチル化するキャッピング工程と、隣接するヌクレオシド間の結合を酸化して３価のリンから５価のリン酸エステルに変換する酸化工程と含む。これら脱保護工程、カップリング工程、キャッピング工程及び酸化工程をこの順でくり返すことで、任意の配列を有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを合成する。
【０００４】
また、固相核酸合成方法では、全ての合成工程を終えたあと最後の脱トリチル化を行い、固相担体からの脱離、さらに側鎖に結合した保護基を除去する。なお、合成したオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、切り出し、生成、脱塩濃縮及び凍結乾燥といった定法に従って処理される。
【０００５】
ここで、特許文献１及び２に開示されるように、脱保護反応においては、特に３〜１０％のジクロロ酢酸(DCA)/トルエン溶液を用いることが通例となっている。トルエンは、一般に染料、香料、火薬（TNT）、有機顔料、合成クレゾール、甘味料、漂白剤、ＴＤＩ、テレフタル酸、合成繊維、可塑剤などの合成原料、ベンゼン原料、キシレン原料、石油精製、医薬品、塗料・インキ溶剤等に使用される。トルエンは、作業環境中の有害な有機溶剤である。例えば工業的に溶剤としてトルエンが使用される際には、その取り扱いに十分に留意する必要があり、高収率で回収する必要がある。
【０００６】
また、固相核酸合成方法における脱保護工程においてトルエンが使用されると、その次の工程であるカップリング工程等にトルエンが持ち込まれる場合ある（キャリーオーバー）。例えば、脱保護工程の後、固相担体を洗浄する工程を挟んだとしても、トルエンのキャリーオーバーを確実に防止するのは非常に困難である。
【０００７】
カップリング工程等においては、トルエン以外の有機溶媒、例えばアセトニトリルが溶剤として使用されている。脱保護工程以外のカップリング工程等にトルエンが持ち込まれると、カップリング工程等に使用されたアセトニトリルとトルエンとの混合物が回収されることとなる。アセトニトリルとトルエンとの混合物からアセトニトリルを高純度で精製するのは非常に困難であり、高純度のアセトニトリルを精製して再利用する場合には非常にコストを要することとなる。
【０００８】
なお、非特許文献１には、液相における核酸合成方法において、３質量％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液を用いて脱保護反応を行うことが開示されている。しかしながら、固相核酸合成方法においては、特許文献１に開示されるように、アセトニトリルを有機溶媒として使用した場合には脱保護反応が進行しなかったことが開示されており、固相核酸合成方法でアセトニトリルを使用する例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】US 6,538,128
【特許文献２】US 7,273,933
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J. Org. Chem, Vol. 71, No. 20, P7907-7910, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のように、固相核酸合成方法においてトルエンを使用することで、トルエンの環境に対する有害性、トルエン回収に係るコスト、他の有機溶剤との分離の困難性といった問題があった。そこで、本発明は、このような実情に鑑みて、固相核酸合成方法における脱保護工程においてトルエンに代わる新たな溶剤を見いだし、これを利用することでトルエンの使用による種々の問題を解決した優れた固相核酸合成方法及び当該固相核酸合成方法に使用する溶液組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した目的を達成するため本発明者らが鋭意検討した結果、アセトニトリル溶媒と所定の強度の酸とを組み合わせた溶液を使用することで保護基をヌクレオシドから脱離させる脱保護反応が進行することを見いだし本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。
【００１３】
［１］固相担体上にて、ヌクレオシドの５’位又は３’位の水酸基に保護基が結合した保護ヌクレオシドホスホロアミダイトを順次結合させる固相核酸合成方法であって、
pKaが０．２〜０．８である酸とアセトニトリルとを含有する溶液中で、前記保護ヌクレオシドホスホロアミダイトから前記保護基を乖離する反応を行う脱保護工程を含む、固相核酸合成方法。
［２］前記保護基は、トリチル基若しくはその誘導体、又は９−フェニルキサンテン−９−イル基若しくはその誘導体である、［１］記載の固相核酸合成方法。
［３］前記酸は、トリクロロ酢酸及び/又はトリフルオロ酢酸である、［１］記載の固相核酸合成方法。
［４］前記固相担体は多孔質樹脂ビーズである、［１］記載の固相核酸合成方法。
［５］前記脱保護工程は、前記多孔質樹脂ビーズを充填したカラム内で前記溶液を流すことにより行われる、［４］記載の固相核酸合成方法。
［６］前記溶液の流速を４００〜２０００ｃｍ／ｈとする、［５］記載の固相核酸合成方法。
［７］前記カラムへ充填した前記多孔質樹脂ビーズからなる層の長さは、流路方向に４〜５０ｃｍ（但し、当該多孔質樹脂ビーズが前記溶液で膨潤した状態で計測した場合の数値）である、［５］記載の固相核酸合成方法。
［８］pKaが０．２〜０．８である酸とアセトニトリルとを含有し、固相担体上にて、ヌクレオシドの５’位又は３’位の水酸基に保護基が結合した保護ヌクレオシドホスホロアミダイトを順次結合させる固相核酸合成方法における、前記保護ヌクレオシドホスホロアミダイトから前記保護基を乖離する反応に使用される、固相核酸合成用溶液組成物。
［９］前記酸は、トリクロロ酢酸及び/又はトリフルオロ酢酸である、［８］記載の固相核酸合成用溶液組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る固相核酸合成方法では、ヌクレオシドから保護基を乖離する反応に有機溶剤としてトルエンに代えてアセトニトリルを使用する。本発明に係る固相核酸合成方法によれば、トルエンの使用に起因する環境に対する有害性や回収コストの増大といった種々の問題を回避することができる。
【００１５】
また、本発明に係る固相核酸合成用溶液組成物は、ヌクレオシドから保護基を乖離する反応に使用する有機溶剤としてトルエンに代えてアセトニトリルを含有している。本発明に係る固相核酸合成用溶液組成物によれば、トルエンに起因する環境に対する有害性や回収コストの増大といった種々の問題を回避することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明に係る固相核酸合成方法及び固相核酸合成用溶液組成物について詳細に説明する。
【００１７】
固相核酸合成方法とは、固相担体上において、ヌクレオチド単位がホスホジエステル結合で連結してなるヌクレオチド鎖を合成する方法を意味する。固相核酸合成方法では、ヌクレオシドの５’位又は３’位の水酸基に保護基が結合し、３’位の水酸基がホスホロアミダイト化された構造を有する保護ヌクレオシドホスホロアミダイトを利用してヌクレオチド鎖を合成していく。ただし、本方法でヌクレオチド鎖を合成していく際、ヌクレオチド単位を１つずつ連結していく方法でも良いし、複数のヌクレオチド単位を含む保護ヌクレオシドホスホロアミダイトを用いて複数のヌクレオチド単位を一度に連結していく方法でもよい。いずれの方法においても、隣接するヌクレオチド単位の間にホスホジエステル結合を形成するが、その前に保護ヌクレオシドホスホロアミダイトにおける保護基を乖離する反応工程が含まれる。この保護ヌクレオシドホスホロアミダイトにおける保護基を乖離する反応を行う工程を脱保護工程と称する。
【００１８】
本発明に係る固相核酸合成方法では、当該脱保護工程をpKaが０．２〜０．８である酸とアセトニトリルとを含有する溶液（固相核酸合成用溶液組成物）を使用する。言い換えると、保護ヌクレオシドホスホロアミダイトにおける保護基を乖離する反応をpKaが０．２〜０．８である酸とアセトニトリルとを含有する溶液中で行う。従来の固相核酸合成方法において脱保護反応は、ジクロロ酢酸（pKaは１．２５）のトルエン溶液（３〜１０％ジクロロ酢酸溶液）を使用していた。本発明に係る固相核酸合成方法においては、トルエンに代えてアセトニトリルを利用するため、ジクロロ酢酸よりも酸性度が高く、且つ、ヌクレオチド鎖を分解しない程度の強度の酸を利用する。このような性質の酸としてpKaが０．２〜０．８である酸を規定している。
【００１９】
本発明に係る固相核酸合成用溶液組成物とは、上述した脱保護工程に使用される溶媒組成物であって、pKaが０．２〜０．８である酸とアセトニトリルとを含有する溶液を意味する。
【００２０】
より具体的に、pKaが０．２〜０．８である酸としては、例えば、トリクロロ酢酸（pKaは０．６６）、トリフルオロ酢酸（pKaは０．２）、ベンゼンスルホン酸（pKaは０．７)、ピラジン（pKaは０．３７)及び2,4,6-トリニトロフェノール（pKaは０．４２）等を挙げることができる。
【００２１】
本発明に係る固相核酸合成方法における脱保護工程では、これら例示列挙した酸を含むpKaが０．２〜０．８である酸を単独で、或いは複数組み合わせて使用することもできる。複数の酸を組み合わせて使用する場合、pKaが０．２〜０．８である酸のなかから選ばれる複数の酸を組み合わせて使用しても良いし、少なくとも１種類の酸をpKaが０．２〜０．８である酸とし、pKaがこの範囲から外れる1種以上の酸を（pKaがこの範囲を超える酸、又は下回る酸のいずれも）と組み合わせて使用しても良い。pKaが０．２〜０．８である酸と組み合わせても良い。pKaがこの範囲から外れる酸としては、特に限定されないが、例えば、ジクロロ酢酸（pKaは１．２５）、2-アミノエタンスルホン酸（pKaは１．５）及び2-ピリジンカルボン酸（pKaは０．９９）等を挙げることができる。
【００２２】
ただし、複数種類の酸を組み合わせて使用する場合、上述したように、保護基を乖離する反応がアセトニトリル溶液において進行し、且つ、ヌクレオチド鎖を分解せずに核酸合成が進行する酸を選択することが好ましい。アセトニトリル溶液において保護基を乖離する反応が進行するかは、例えば、ジメチルトリチル基（保護基）を有するヌクレオチド鎖を、評価対象の酸を含有するアセトニトリル溶液に添加し、所定時間経過後、ジメチルトリチル基の乖離をジメチルトリチル基に由来する発色で評価することができる。また、ヌクレオチド鎖を分解せずに核酸合成が進行するかは、評価対象の酸を含有するアセトニトリル溶液の存在下に所定の核酸配列を合成し、合成された核酸の純度（％）に基づいて評価することができる。
【００２３】
また、脱保護工程にてpKaが０．２〜０．８である酸の濃度は、特に限定されないが、例えば３〜１０質量％とすることができ、３〜９質量％とすることが好ましく、５〜７質量％とすることがより好ましい。ただし、酸の濃度についても、上述したように、保護基を乖離する反応の反応効率及び/又は核酸合成反応の反応効率に基づいて適宜規定することができる。
【００２４】
特に、pKaが０．２〜０．８である酸としてトリクロロ酢酸を使用する場合、アセトニトリル溶液中のトリクロロ酢酸濃度は、例えば５〜９質量％とすることができ、６〜８質量％とすることが好ましく、７質量％とすることがより好ましい。また、pKaが０．２〜０．８である酸としてトリフルオロ酢酸を使用する場合、アセトニトリル溶液中のトリフルオロ酢酸濃度は、例えば３〜９質量％とすることができ、５〜７質量％とすることが好ましく、６質量％とすることがより好ましい。
【００２５】
ここで、保護基としては、特に限定されず、酸により脱離するトリチル系保護基及び/又はシリル系保護基を挙げることができる。トリチル系保護基とは、トリチル基若しくはその誘導体を含む意味である。また、保護基としては、９−フェニルキサンテン−９−イル基若しくはその誘導体とすることもできる。これら使用可能な保護基については、例えば米国特許第6,538,128に開示されるように、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル及び９−ｐ−メトキシフェニルキサンテン−９−イルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
また、より具体的に、トリチル系保護基としては、例えば、任意の置換基（例えば、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子等から選ばれる置換基（２個以上の置換基が一緒になって環を形成していてもよい））で置換されていてもよいトリチル基が挙げられ、具体的には、トリチル基（Ｔｒ）、モノメトキシトリチル基（例えば、４−メトキシトリチル基（ＭＭＴｒ））、ジメトキシトリチル基（例えば、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ））、９−フェニルキサンテン−９−イル基（ピクシル基）等が挙げられ、好ましくは、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）である。特に、保護基としては、トリチル系保護基が好ましく、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）がより好ましい。
【００２７】
さらに、より具体的に、シリル系保護基としては、例えば、任意の置換基（例えば、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、フェニル基等から選ばれる置換基）でトリ置換されたシリル基が挙げられ、具体的には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ジメチルメトキシシリル基、メチルジメトキシシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等が挙げられ、好ましくは、トリメチルシリル基である。
【００２８】
さらにまた、９−フェニルキサンテン−９−イル基（ピキシル基）若しくはその誘導体（例えば４’−ジメトキシピキシル）については、例えば、Nucleosides, Nucleotide and Nucleic Acids, 30:12-19, 2011に開示されるように、下記式で示される官能基を使用することができる。
【００２９】
【化１】
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【００３０】
ところで、本発明に係る固相核酸合成方法は、上述したように、pKaが０．２〜０．８である酸とアセトニトリルとを含有する溶液を使用した脱保護工程を含む限り、公知の様々な合成法を適用することができる。すなわち、固相担体上に結合したヌクレオシド、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに、ヌクレオチドを順次結合させることにより、伸長されたオリゴヌクレオチドを得る。核酸合成反応としては、Ｈ−ホスホネイト法、ホスホエステル法、固相ホスホロアミダイト法などが挙げられるが、なかでも、核酸の合成能力が高く、高純度の核酸が得られることから、固相ホスホロアミダイト法が好ましい。
【００３１】
固相ホスホロアミダイト法による核酸合成反応では、先ず、固相担体を反応カラムに充填する或いは固相担体を充填した反応カラムを準備する。次に、当該核酸合成反応では、固相担体を充填した反応カラムに上述したpKaが０．２〜０．８である酸のアセトニトリル溶液を供給して脱保護工程を行う。
【００３２】
ここで、固相担体とは、合成する核酸の３‘末端側を、リンカー分子を介して或いは直接固定できる構造体であれば特に限定されないが、例えば、ガラス系多孔質担体、又はポリスチレン系多孔質担体及びアクリルアミド系多孔質担体などの多孔質樹脂担体等が挙げられる。特に多孔質樹脂担体を使用することが好ましく、なかでも、ポリスチレン系多孔質担体を使用することが更に好ましい。
【００３３】
「ポリスチレン系多孔質担体」とは、主にスチレン又はその誘導体の構造単位から構成される樹脂からなる多孔質担体であり、中でも、アミノ基及び／又はヒドロキシ基を有するポリスチレン系多孔質担体が好ましい。ポリスチレン系多孔質担体としては、例えば、スチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体粒子からなる多孔質担体（特開２００５−０９７５４５号公報、特開２００５−３２５２７２号公報及び特開２００６−３４２２４５号公報を参照）、又はスチレン−（メタ）アクリロニトリル−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体からなる多孔質担体（特開２００８−０７４９７９号公報を参照）等が挙げられる。
【００３４】
「アクリルアミド系多孔質担体」とは、主にアクリルアミド又はその誘導体の構造単位から構成される樹脂からなる多孔質担体であり、中でも、アミノ基及び／又はヒドロキシ基を有するアクリルアミド系多孔質担体が好ましく、ヒドロキシ基を有するアクリルアミド系多孔質担体が好ましい。
【００３５】
さらに、固相担体としては、特許第５４７９８２８号公報に開示されるように、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる担体を挙げることができる。「第一の芳香族モノビニル化合物」とは、スチレン又はその置換体を意味する。「ジビニル化合物」とは、芳香族ジビニル化合物、ジ（メタ）アクリル酸エステル又はそれらの置換体を意味する。「（メタ）アクリロニトリル」とは、「アクリロニトリル」若しくは「メタクリロニトリル」、又は「アクリロニトリルとメタクリロニトリルの両方」を意味する。「第二の芳香族モノビニル化合物」とは、「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」を含有することを特徴とする、スチレンまたはその置換体を意味する。
【００３６】
固相担体の形状は、特に限定されず、平板状、粒子状、繊維状等いずれの形状であってもよいが、反応カラムへの充填効率を高くすることができ、該反応容器が破損し難いという点から、好ましくはビーズ（粒子）の形状が好ましい。「ビーズ」とは、厳密な球状を呈することを意味するのではなく、一定形状（例えば、楕円球状などの略球状、多面体形状、円柱形状、金平糖形状などの異型形状など）を有していればよいことを意味する。
【００３７】
特に、多孔質樹脂ビーズ等の樹脂製担体は、トルエンに対しては膨潤の程度が高く、アセトニトリルに対しては比較的に膨潤の程度が低いといった特徴がある。本発明に係る固相核酸合成方法においては、脱保護工程において従来のトルエンに代えてアセトニトリルを有機溶剤として使用しているため、多孔質樹脂担体を用いても膨潤の程度を低く抑えることができる。したがって、本発明に係る固相核酸合成方法においては、特に多孔質樹脂担体、更に多孔質樹脂ビーズを使用することが好ましい。多孔質樹脂ビーズを使用しても膨潤の程度を低く抑えることができるため、反応カラムに充填した状態で通液した場合において圧力上昇を抑えることができるためである。
【００３８】
換言すると、本発明に係る固相核酸合成方法においては、脱保護工程において、多孔質樹脂ビーズを充填した反応カラムに対して同じ圧力で通液する場合、トルエン溶液と比較して速い流速でアセトニトリル溶液を通液することができる。なお、反応カラムに対してかけられる圧力には許容上限があるため、トルエン溶液を使用した場合には、アセトニトリル溶液を使用した場合と同等の流速を達成しない場合がある。
【００３９】
例えば、本発明に係る固相核酸合成方法においては、トルエン溶液を使用した場合には４００ｃｍ／ｈでの通液が限界であった反応カラム（カラム長＝１０ｃｍ）に対しても、アセトニトリル溶液の流速を４００ｃｍ／ｈ以上として脱保護工程を行うことができる。すなわち、上述のようにアセトニトリル溶液を使用することで多孔質樹脂ビーズの膨潤を低く抑えることができるため、アセトニトリル溶液の流速を４００ｃｍ／ｈ以上としても反応カラムの圧力許容上限にならず、アセトニトリル溶液の通液が可能となる。ここでカラム長とは、反応カラムへ充填した多孔質樹脂ビーズからなる層の長さであって、多孔質樹脂ビーズが溶液で膨潤した状態で計測した場合の数値を意味する。
【００４０】
特に、本発明に係る固相核酸合成方法においては、多孔質樹脂ビーズを充填した反応カラム（カラム長＝４ｃｍ）に対してアセトニトリル溶液の流速を２０００ｃｍ／ｈとしても脱保護工程を行うことができる。すなわち、本発明に係る固相核酸合成方法においては、アセトニトリル溶液の流速を４００〜２０００ｃｍ／ｈとすることができ、好ましくは８００〜２０００ｃｍ／ｈとすることができ、より好ましくは１２００〜２０００ｃｍ／ｈとすることができる。
【００４１】
以上のように、固相担体としては多孔質樹脂ビーズを使用した場合には、従来のトルエン溶液を使用した場合と比較してアセトニトリル溶液の流速を比較的に速くすることができる。このため、本発明に係る固相核酸合成方法においては、脱保護工程に要する時間を短くすることができ、酸による保護基の乖離反応以外の副反応の発生を防止し、合成される核酸の純度及び収量を高めることができる。
【００４２】
さらに、本発明に係る固相核酸合成方法では、上述のように、脱保護工程においてアセトニトリル溶液を使用することで反応カラムに充填された多孔質樹脂ビーズの膨潤を抑えることができるため、反応カラムにおける多孔質樹脂ビーズの充填量を多くすることができる。例えば、反応カラムに対して圧力の許容上限で通液する場合、本発明に係る固相核酸合成方法によれば、トルエン溶液を使用する場合と比較して多孔質樹脂ビーズの充填量を多くする、すなわちカラム長を長くすることができる。例えば、トルエン溶液を使用した場合にはカラム長の上限が１０ｃｍであった場合であっても（通液速度４００ｃｍ／ｈ）、本発明に係る固相核酸合成方法によれば、カラム長を４〜５０ｃｍとすることができる。
【００４３】
以上のように、固相担体としては多孔質樹脂ビーズを使用した場合には、従来のトルエン溶液を使用した場合と比較して反応カラムのカラム長を長くすることができる。このため、本発明に係る固相核酸合成方法においては、一回のロットでより多くの核酸合成反応をおこなうことができ生産性を大幅に向上することができる。
【００４４】
なお、多孔質樹脂ビーズとしては、特に限定されず、従来公知のものを使用することができる。多孔質樹脂ビーズの平均粒径としては、特に限定されないが、レーザー回折（散乱式）により測定される平均粒径が１μｍよりも小さいと、カラムに充填して使用した場合に背圧が高くなりすぎる、又は送液速度が遅くなるという不具合が生じるおそれがある。他方、平均粒径が１０００μｍよりも大きいと、カラムに充填したとき、ビーズ間の空隙が大きくなり、一定容量のカラムに効率よくビーズを充填することが困難となるおそれがある。従って、多孔質樹脂ビーズの平均粒径としては、好ましくは１〜１０００μｍ、より好ましくは５〜５００μｍ、更に好ましくは１０〜２００μｍである。
【００４５】
また、多孔質樹脂ビーズの多点ＢＥＴ法により測定した比表面積は、特に限定されないが、比表面積が０．１ｍ２／ｇより小さいと有機溶媒中での膨潤度が低くなりすぎ、合成反応が起こりにくくなるおそれある。他方、比表面積が５００ｍ２／ｇより大きいと、細孔径が小さくなるため、合成反応が起こりにくくなるおそれがある。従って、多孔質樹脂ビーズの比表面積としては、好ましくは０．１〜５００ｍ２／ｇ、より好ましくは１０〜３００ｍ２／ｇ、更に好ましくは５０〜２００ｍ２／ｇである。
【００４６】
さらに、多孔質樹脂ビーズの水銀圧入法により測定される平均細孔径は、特に限定されないが、孔径が小さすぎる場合、合成反応の場が小さくなり所望の反応が起き難くなる、又はヌクレオチド長が所望の数より少なくなるおそれがある。他方、多孔質樹脂ビーズの平均細孔径が大きすぎる場合には、反応場であるビーズ表面のヒドロキシ基と反応に関わる物質との接触機会が少なくなるため、歩留まりが低下するおそれがある。従って、多孔質樹脂ビーズの平均細孔径としては、好ましくは１〜２００ｎｍ、より好ましくは５〜１００ｎｍ、更に好ましくは２０〜７０ｎｍである。
【００４７】
また、多孔質樹脂ビーズは、核酸合成に寄与する官能基を有するものが好ましい。「核酸合成に寄与する」とは、核酸合成の開始点になりえる、リンカー付加が可能な官能基であり、具体的には、アミノ基、ヒドロキシ基等が挙げられる。具体的な多孔質樹脂ビーズについては、特開２０１１−０８８８４３号公報及び特開２０１３−１７７３７１号公報に記載のもの等が挙げられる。さらに、多孔質樹脂ビーズとしては、特にＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）（日東電工株式会社製）として市販されている低膨潤性ポリスチレン粒子を使用することができる。ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）を用いた核酸固相合成方法は、不純物によるピーク面積が少なく、ラボスケールから大量合成系までの幅広いスケールにおいて高収率・高純度が保証される。
【００４８】
次に、固相ホスホロアミダイト法による核酸合成反応では、脱保護工程の後、pKaが０．２〜０．８である酸を反応系から除去するため、反応カラムに洗浄液を供給して酸を除去する（洗浄工程）。本発明に係る固相核酸合成方法においては、脱保護工程において、後述するカップリング工程等で使用する有機溶剤と同じくアセトニトリル溶液を使用しているため、pKaが０．２〜０．８である酸を反応系から除去する条件であればよい。また、本発明に係る固相核酸合成方法においては、脱保護工程及びその後の洗浄工程では有機溶剤としてアセトニトリル以外の他の有機溶剤（トルエン等）を使用する必要が無い。したがって、本発明に係る固相核酸合成方法によれば、脱保護工程及びその後の洗浄工程で使用したアセトニトリルを回収して、簡便な精製によって再利用することができる。
【００４９】
次に、固相ホスホロアミダイト法による核酸合成反応では、定法に従い、テトラゾール等により活性化した、３’末端に該当するヌクレオシドホスホロアミダイトをヒドロキシメチル基に結合させるカップリング、未反応ヒドロキシ基のキャップ、ホスファイトの酸化の各工程を順次行い、更にこの一連の工程を目的配列になるまで繰り返す。そして、目的の配列を合成し終わった後、固相担体をアンモニア水等に浸漬してヌクレオチド鎖との連結部分を切断し、目的の配列を有するヌクレオチド鎖を得ることができる。
【００５０】
なお、固相核酸合成方法により合成されるヌクレオチド鎖とは、ヌクレオチドがホスホジエステル結合により連結された鎖状の化合物を意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる。本明細書において「核酸」には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）等のプリン塩基及びチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）等のピリミジン塩基を含有するオリゴヌクレオチドのみでなく、これらの修飾核酸塩基を含有する修飾オリゴヌクレオチドも含まれる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるもではない。
【００５２】
〔実施例１〕
本実施例では、ジメチルトリチル基（保護基）が結合したTが担持されたNitto Phase HLを用いて、各種溶剤と酸物質と組み合わせて保護基の乖離反応を検討した。本実施例では、候補の溶剤としてアセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、DMF、DMSO、ヘキサン、メタノール及びエタノールを用意した。また、酸物質として、ジクロロ酢酸（DCA）、トリクロロ酢酸（TCA）、トリフルオロ酢酸（TFA）、p-トルエンスルホン酸（PTSA）及び塩酸を準備した。
【００５３】
実験手順1：それぞれの候補溶剤とそれぞれの酸物質を以下の手法に従い混合した。
3% DCA を含む各候補溶剤の溶液調製：50mlメスフラスコに1.5mlのDCAをメスピペットで加えた。50mlメスフラスコに各溶液を加えメスアップした。
3% DCA を含むトルエンと各候補溶剤の50%混合溶液調製：50mlメスフラスコに1.5mlのDCAをメスピペットで加えた。トルエンと各溶剤とを1:1の割合した混合溶液を加えメスアップした。
9% TCA を含む各候補溶剤の溶液調製：50mlメスフラスコに1.5mlのTCAをメスピペットで加えた。50mlメスフラスコに各溶液を加えメスアップした。
3% TFA を含む各候補溶剤の溶液調製：50mlメスフラスコに1.5mlのTFAをメスピペットで加えた。50mlメスフラスコに各溶液を加えメスアップした。
PTSAを含む各候補溶剤の溶液調製：50mlメスフラスコにPTSAを951.3mg量り加えた。50mlメスフラスコに各溶液を加えメスアップした。
塩酸を含む各候補溶剤の溶液調製：100mlメスフラスコに0.1mlの4N 塩酸をメスピペットで加え、各種溶剤でメスアップした。
【００５４】
実験手順2：アルミ皿にdTが担持されたNitto Phase HLを10mg天秤で量り、50mlメスフラスコに加えた。実験手順1で作製した各種酸性物質を含む溶剤でメスアップし、7分間静置した。
【００５５】
実験手順3： 反応後、溶液中のポリマービーズをフィルターにてろ別した。ろ液の吸光度（412nm）を分光光度計で測定した。
【００５６】
結果：各種溶剤と酸の組み合わせによるDMT基の脱保護反応性を発色にて評価した結果を以下の表１にまとめた。なお、表１において、（＊1）は、トルエンと各溶剤とを1:1の割合した混合溶液での評価である。また、表１中、○は3% DCA/トルエンと比較し±20%以内の吸光度、△は同50%以下、×は同5%以下を示している。
【００５７】
【表１】
2019013173.tif 000003
【００５８】
表１に示したように、DCA以外の酸物質は、アセトニトリルを溶剤とした場合、3% DCA/トルエンを使用した場合と同等に脱保護作用を有することが明らかとなった。本実施例では、これらトリクロロ酢酸（TCA）、トリフルオロ酢酸（TFA）、p-トルエンスルホン酸（PTSA）及び塩酸を脱保護反応に使用する、DCAの代替物質として一次スクリーニングした。
【００５９】
〔実施例２〕
本実施例では、実施例１で一次スクリーニングしたトリクロロ酢酸（TCA）、トリフルオロ酢酸（TFA）、p-トルエンスルホン酸（PTSA）及び塩酸を脱保護工程に使用した固相核酸合成を行い、このときの合成された核酸の純度を評価した。
【００６０】
<実験手順>
本実施例における核酸合成は、AKTA10合成装置（アマシャムバイオサイエンス（Amersham Biosciences））を使用した。カラムサイズは1.2mL ステンレスカラム（直径1cm, 高さ1.5cm）を使用した。合成する核酸配列を5’-ATA CCG ATT AAG CGA AGT TT-3’（配列番号１）とした。固相担体として350〜370μmol/gのNitto Phase HL（日東電工株式会社）を使用した。その他、核酸合成条件として、末端の塩基における保護基（DMT基）を外し、また、アミン洗浄に0.1N ジアザビシクロウンデセンにより３０分処理した。また、活性化剤は5- エチルチオ -1 テトラゾール（ETT）を使用した。本実施例では、脱保護工程において反応カラムに対する流速を線速度；400cm/hとした。
【００６１】
本実施例において切り出し反応は、先ず、核酸合成後のNitto Phase HL 50mgをねじ口プラスチックシューブに移した。次に、ねじ口プラスチックシューブに28%アンモニア水溶液1mLを加えて、55℃で16時間静置した。その後、50%エタノールを用いてビーズをろ別し、メスフラスコに入れ、全量が5mLとなるようにメスアップした。
【００６２】
本実施例では、アニオン交換カラムを用いて合成した核酸を分析した。具体的には、Chromeleon Thermo Fisher Scientific DNApac PA200 Lot.014-27-136を使用した。カラム温度を30℃とし、260nmで同定した。サンプル濃度を1.5OD/mLとし、サンプル量を2μLとした。また、溶離液E1を20mM トリスバッファ（pH 8.0）とし、溶離液E2を溶離液E1に1.25M NaCl（pH 8.0）を加えたものとした。なお、溶離液E1及びE2は表２に示したようにカラムへ供給した。
【００６３】
【表２】
2019013173.tif 000004
【００６４】
合成対象の核酸の純度を計算した結果を表３に示した。なお、純度（％）は以下のように計算した。すなわち、合成目的物のピーク面積を分子として、不純物ピークを含む全ピーク面積を分母として純度を（％）を算出した。
【００６５】
【表３】
2019013173.tif 000005
【００６６】
表３に示したように、酸物質としてTCAを含むアセトニトリル溶液を用いた場合には、酸物質としてDCAを含むトルエン溶液を用いた場合と同等の核酸合成結果を得ることができた。また、酸物質としてTFAを含むアセトニトリル溶液を用いた場合も、良好な核酸合成結果を得ることができた。
なお、アセトニトリル溶液におけるTCAの濃度を7%或いは5%とした場合も9%と同等の結果が得られた。
【００６７】
しかしながら、酸物質としてp-トルエンスルホン酸及び塩酸を使用した場合には、目的とする鎖長の核酸を合成できないことが明らかとなった。
【００６８】
実施例１及び２の結果より、アセトニトリル溶液を使用して脱保護工程を行う場合には、pKaが０．２〜０．８である酸（TCAのpKaは０．６６、TFAのpKaは０．２）、を用いれば良いことが明らかとなった。なお、DCAのpKaは１．２５であり、p-トルエンスルホン酸のpKaは−２．８であり、塩酸のpKaは−８．０である。
【００６９】
〔実施例３〕
本実施例では、核酸合成反応に使用するカラムの長さを4cmから8cmへスケールアップした以外は実施例２と同様にして固相核酸合成を行い、このときの合成された核酸の純度を評価した。なお、本実施例では、脱保護工程には3% DCA/トルエン溶液（線速度：400cm/h）又は9% TCA/アセトニトリル（線速度：800cm/h）を使用した。
【００７０】
多孔質樹脂ビーズ（例えばNitto Phase HL）を固相担体として使用する場合、脱保護溶液にDCA/トルエン溶液を使用すると送液速度は400cm/hが上限となる。これは、多孔質樹脂ビーズがトルエン溶剤に膨潤、軟化するため、高流速でかかる圧力により球形を保てなくなり、流路をふさぐためである。これに対して、TCA/アセトニトリル溶液を用いる場合は、多孔質樹脂ビーズのアセトニトリル中での膨潤度が小さいため、高流速でも球形を保つことができる。したがって、脱保護溶液としてTCA/アセトニトリル溶液を用いた場合、送液速度を800cm/h以上で使用することが可能となる。本実施例では、脱保護溶液としてTCA/アセトニトリル溶液を高流速で使用することで、酸接触時間を短縮でき核酸合成純度が向上するか検討した。
結果を表４に示した。なお、表４における純度は実施例２と同様にして算出した。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
表４に示したように、従来法の3% DCA/トルエンを用いて脱保護を行った場合には、純度が79.3%となり、高さ1.5cmのカラムを用いて合成した場合に比べ低下することが明らかとなった。これは、カラム長が長くなり、核酸と酸物質との接触時間が増大し、脱プリン化反応等により純度が低下したものとの考えられる。一方、表４に示したように、9% TCA/アセトニトリル溶液を用いた場合は、高流速で使用できることで酸接触時間を短縮でき、DCA/トルエン溶液を使用した場合と比較し4%以上の純度向上が認められた。
【００７３】
また、本実施例では、実施例１で使用した溶剤について、多孔質樹脂ビーズであるNitto Phase HLに対する膨潤作用を定量的に検証した。すなわち、Nitto Phase HL 1gを量りとり10mLメスシリンダーに入れ、上述した各溶剤に浸漬した。一晩静置し、膨潤後の体積を測定した。結果を表５に示した。
【００７４】
【表５】
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【００７５】
表５に示したように、多孔質樹脂ビーズは、トルエンと比較してアセトニトリルにより膨潤しにくいことが定量的に明らかとなった。
【配列表】
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