(57)【要約】【課題】低電位印加で目的物質の測定が可能なバイオセンサに利用可能な変異型電子受容タンパク質を提供すること。【解決手段】３つのヘム結合ドメインを有するシトクロムタンパク質において、Ｎ末端側から数えて１番目の第１ヘム結合ドメインおよび２番目の第２ヘム結合ドメインが欠損した変異型シトクロムタンパク質、好ましくは第１および第２のヘム結合ドメインを含む領域が欠損した変異型シトクロムタンパク質。【選択図】図１
2019013166.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つのヘム結合ドメインを有するシトクロムタンパク質において、Ｎ末端側から数えて１番目の第１ヘム結合ドメインおよび２番目の第２ヘム結合ドメインが欠損した、変異型シトクロムタンパク質。
【請求項２】
前記第１および第２ヘム結合ドメインを含む領域が欠損した、請求項１に記載の変異型シトクロムタンパク質。
【請求項３】
前記第１および第２ヘム結合ドメインを含む領域が配列番号４の４３〜１９５の領域に相当する、請求項２に記載の変異型シトクロムタンパク質。
【請求項４】
シトクロムタンパク質がシトクロムＣタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異型シトクロムタンパク質。
【請求項５】
シトクロムＣタンパク質がブルクホルデリア属微生物に由来する、請求項４に記載の変異型シトクロムタンパク質。
【請求項６】
シトクロムＣタンパク質がブルクホルデリア・セパシアに由来する、請求項５に記載の変異型シトクロムタンパク質。
【請求項７】
改変前のシトクロムタンパク質が、配列番号４と６０％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異型シトクロムタンパク質。
【請求項８】
配列番号４のアミノ酸番号３１４〜４２５のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸番号３３０〜４２５のアミノ酸配列、またはこれらのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列（ただし、アミノ酸番号３３４〜３３８のＣＸＸＣＨモチーフは改変されない）からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型シトクロムタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異型シトクロムタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡを含む組み換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異型シトクロムタンパク質および酸化還元酵素の触媒サブユニットタンパク質を含む、酸化還元酵素・シトクロム複合体。
【請求項１３】
酸化還元酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１２に記載の酸化還元酵素・シトクロム複合体。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の酸化還元酵素・シトクロム複合体を含むバイオセンサ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のバイオセンサに試料を添加し、電位を印加して応答電流を測定し、応答電流に基づいて試料に含まれる測定対象物質の濃度を算出することを特徴とする、測定対象物質の測定方法。
【請求項１６】
印加電位が銀・塩化銀電極に対して０〜＋３００ｍＶである、請求項１５に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は低電位でも電子授受が可能な変異型シトクロムタンパク質に関する。本発明の変異型シトクロムタンパク質はバイオセンサ等に好適に使用することができ、生化学分野、医療分野等で有用である。
【背景技術】
【０００２】
電子受容タンパク質としてはシトクロムタンパク質が知られており、酸化還元酵素の触媒サブユニットと複合体を形成させて電気化学的センサとして使用されている。
例えば、特許文献１には、ブルクホルデリア属の微生物に由来する、グルコースデヒドロゲナーゼの触媒サブユニット（αサブユニット）とシトクロムＣサブユニット（βサブユニット）の複合体をバイオセンサとして使用することが開示されている（特許文献１）。このようなバイオセンサは生体試料中のグルコース濃度などの測定に使用されるが、より精度よく測定するためにはタンパク質を改変するなどにより、測定感度を向上させることが求められる。
これまでに、電気化学的センサタンパク質の変異体としては主に触媒サブユニットの変異体が研究されており、シトクロムタンパク質の変異体はほとんど研究されてこなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO 2005/023111
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
酸化還元電流を観測するバイオセンサを用いた目的物質の測定においては、試料中に含まれる還元物質の影響を低減するために、酵素および酵素複合体と電極間の電子授受が観測される範囲で酸化還元電位を下げることが望ましい。
【０００５】
しかしながら、従来の天然のシトクロムタンパク質を電子受容タンパク質として用いて酸化還元電流を観測する場合には電極に大きな電位の印加を要する。例えば、特許文献１の実施例７では銀・塩化銀電極に対して＋３５０ｍＶの電位を印加しており、この電位においてはアスコルビン酸やアセトアミノフェンのような還元性物質が酸化されることによる測定値への正バイアスが生じることが懸念される。
【０００６】
このような問題点を鑑み、本発明は、低電位印加で目的物質の測定が可能なバイオセンサに利用可能な変異型電子受容サブユニットタンパク質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために、アミノ末端から数えて１番目の第１ヘム結合領域および２番目の第２ヘム結合領域を含む領域を欠損させた変異型シトクロムＣタンパク質を作製し、これを用いてバイオセンサの評価を行った。その結果、驚くべきことに、第１および第２ヘム結合領域を含む領域を欠損させた変異型シトクロムＣタンパク質はヘム結合領域が１つ（第３のヘム結合領域）しかないにもかかわらず触媒サブユニットから電子を受容することができ、従来よりも低電位で目的物質に応じた電流を流すことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］３つのヘム結合ドメインを有するシトクロムタンパク質において、Ｎ末端側から数
えて１番目の第１ヘム結合ドメインおよび２番目の第２のヘム結合ドメインが欠損した、変異型シトクロムタンパク質。
［２］前記第１および第２のヘム結合ドメインを含む領域が欠損した、［１］に記載の変異型シトクロムタンパク質。
［３］前記第１および第２のヘム結合ドメインを含む領域が配列番号４の４３〜１９５の領域に相当する、［２］に記載の変異型シトクロムタンパク質。
［４］シトクロムタンパク質がシトクロムＣタンパク質である、［１］〜［３］のいずれかに記載の変異型シトクロムタンパク質。
［５］シトクロムＣタンパク質がブルクホルデリア属微生物に由来する、［４］に記載の変異型シトクロムタンパク質。
［６］シトクロムＣタンパク質がブルクホルデリア・セパシアに由来する、［５］に記載の変異型シトクロムタンパク質。
［７］改変前のシトクロムタンパク質が、配列番号４と６０％以上のアミノ酸配列同一性を有する、［１］〜［６］のいずれかに記載の変異型シトクロムタンパク質。
［８］配列番号４のアミノ酸番号３１４〜４２５のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸番号３３０〜４２５のアミノ酸配列、またはこれらのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列（ただし、アミノ酸番号３３４〜３３８のＣＸＸＣＨモチーフは改変されない）からなる、［１］〜［７］のいずれかに記載の変異型シトクロムタンパク質。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載の変異型シトクロムタンパク質をコードするＤＮＡ。
［１０］［９］に記載のＤＮＡを含む組み換えベクター。
［１１］［１０］に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換細胞。
［１２］［１］〜［８］のいずれかに記載の変異型シトクロムタンパク質および酸化還元酵素の触媒サブユニットタンパク質を含む、酸化還元酵素・シトクロム複合体。
［１３］酸化還元酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである、［１２］に記載の酸化還元酵素・シトクロム複合体。
［１４］［１２］または［１３］に記載の酸化還元酵素・シトクロム複合体を含むバイオセンサ。
［１５］［１４］に記載のバイオセンサに試料を添加し、電位を印加して応答電流を測定し、応答電流に基づいて試料に含まれる測定対象物質の濃度を算出することを特徴とする、測定対象物質の測定方法。
［１６］印加電位が銀・塩化銀電極に対して０〜＋３００ｍＶである、［１５］に記載の測定方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来より低い電位（例えば、銀・塩化銀電極に対して０〜＋３００ｍＶ、好ましくは０〜＋１５０ｍＶ、より好ましくは０〜＋１００ｍＶ）で作動する電気化学的バイオセンサの構築が可能であり、試料中の還元物質による干渉を抑えて、グルコース等の測定対象物質の正確な測定をすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】野生型βサブユニットを含むグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）複合体を含むグルコースセンサ、またはＮ末側欠損型βサブユニットを含むＧＤＨ複合体を含むグルコースセンサを用いたクロノアンペアメトリーの結果を示す図（印加電位は０，＋１００，＋４００ｍＶ）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の変異型シトクロムタンパク質は、３つのヘム結合ドメインを有するシトクロムタ
ンパク質の変異体であって、Ｎ末端側から数えて１番目の第１ヘム結合ドメインおよび２番目の第２のヘム結合ドメインが欠損した、変異型シトクロムタンパク質である。
【００１２】
シトクロムタンパク質はヘム結合ドメインを３つ有しており、本明細書では、Ｎ末側から数えて１，２，３番目のヘム結合ドメインをそれぞれ第１、第２、第３のヘム結合ドメインと呼ぶ。ヘム結合ドメインは一般的にＣＸＸＣＨ（配列番号５）（Ｘは任意のアミノ酸）で表され、本発明の変異型シトクロムタンパク質では第１および第２のヘム結合ドメインが欠損するように改変されている。
【００１３】
ここで、「第１および第２のヘム結合ドメインが欠損するように改変されている」とは、第１および第２のＣＸＸＣＨモチーフが欠損されていることを意味する。
【００１４】
ＣＸＸＣＨモチーフの欠損には、ＣＸＸＣＨモチーフを含む領域の欠損も含まれ、第１ヘム結合ドメインを含む領域と第２ヘム結合ドメインを含む領域のそれぞれが欠損していてもよいし、第１および第２ヘム結合ドメインを含む領域が欠損していてもよい。
【００１５】
シトクロムタンパク質としては、シトクロムＣタンパク質が好ましく、配列番号４で表されるブルクホリデリア・セパシアのシトクロムＣタンパク質（グルコースデヒドロゲナーゼのβサブユニット）が挙げられる。
以下、ブルクホリデリア・セパシアのシトクロムＣタンパク質を代表例として説明する。
【００１６】
配列番号４においては、第１のヘム結合ドメイン（アミノ酸番号４３〜４７）、第２のヘム結合ドメイン（アミノ酸番号１９１〜１９５）、第３のヘム結合ドメイン（アミノ酸番号３３４〜３３８）が存在する。これら第１ヘム結合ドメインおよび第２ヘム結合ドメインが欠損されるが、第１および第２ヘム結合ドメインを含む領域（アミノ酸番号４３〜１９５）が欠損していてもよい。
【００１７】
第３のヘム結合ドメインが維持され、変異型シトクロムＣタンパク質としての機能を発揮する限り、すなわち、電子授受機能が損なわれない限り、第１および第２ヘム結合ドメインを含む領域（アミノ酸番号４３〜１９５）は少なくともこの領域が欠損していればよく、配列番号４におけるその前後のアミノ酸を含めて欠損してもよい。例えば、配列番号４のＮ末側からアミノ酸番号１９５までが欠損してもよく、例えば、第１および第２ヘム結合ドメインを含む領域が欠損した変異型シトクロムＣタンパク質として配列番号４のアミノ酸番号３１４〜４２５または３３０〜４２５からなる変異型シトクロムＣタンパク質が挙げられる。ただし、これらの配列において、Ｎ末端側及び／またはＣ末端側に任意のタグ配列やシグナル配列（例えば、配列番号４のアミノ酸番号１〜２７）などが付加されてもよい。
【００１８】
なお、本発明の変異型シトクロムタンパク質は配列番号４のアミノ酸番号３１４〜４２５からなるアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸番号３３０〜４２５からなるアミノ酸配列そのものに限定されず、電子授受機能が損なわれない限り、これらの配列において、第３のヘム結合ドメイン（アミノ酸番号３３４〜３３８）以外の１または数個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入された配列でもよい。ここで、「１又は数個」とは、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。また、置換は保存的な置換が好ましく、「保存的置換」とは、酸性アミノ酸同士の置換、中性アミノ酸同士の置換、塩基性アミノ酸同士の置換など、性質が類似したアミノ酸同士の置換をいう。また、配列番号４のアミノ酸番号３１４〜４２５からなるアミノ酸配列のＮ末側には、配列番号４のアミノ酸番号１９６〜３１３からなるアミノ酸配列のＣ末側配列の一部が付加されてよいし、配列番号４のアミノ酸番号３３０〜４２５からなるアミノ酸配列のＮ末側には、配列番号４のアミノ酸番
号１９６〜３２９からなるアミノ酸配列のＣ末側配列の一部が付加されてよい。
なお、本発明の変異型シトクロムＣタンパク質は、第３のヘム結合ドメイン（アミノ酸番号３３４〜３３８）が保持され、電子授受機能が損なわれない限り、配列番号４のアミノ酸番号３１４〜４２５からなるアミノ酸配列または配列番号４の３３０〜４２５からなるアミノ酸配列と、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【００１９】
なお、配列番号４はブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株が保持するＧＤＨ  βサブユニットのアミノ酸配列であるが、ＫＳ１株は、平成１２年９月２５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現独立行政法人製品評価技術基盤機構(ＮＩＴＥ)〒292-0818  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号第ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０６として寄託されている。
【００２０】
本発明において、上記改変が導入される前のシトクロムＣタンパク質は配列番号４で表されるブルクホリデリア・セパシアのシトクロムＣタンパク質に限定されず、第１、第２、第３のヘム結合ドメインを有するものであればよいが、例えば、配列番号４のホモログが使用でき、好ましくは配列番号４と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０%以上の同一性を有する配列番号４のホモログが使用できる。
【００２１】
配列番号４と６０％以上の配列同一性を有するシトクロムＣタンパク質のアミノ酸配列としては、ブルクホリデリア属のシトクロムＣタンパク質が好ましく、Burkholderia cepacia J2315株のシトクロムタンパク質（配列番号６）、Burkholderia cenocepaciaのシトクロムＣタンパク質（配列番号７）、Burkholderia multivoransのシトクロムＣタンパク質（配列番号８）、Burkholderia ubonensisのシトクロムＣタンパク質（配列番号９）、Burkholderia stagnalisのシトクロムＣタンパク質（配列番号１０）、Burkholderia thailandensisのシトクロムＣタンパク質（配列番号１１）が例示される。
また、ブルクホリデリア属以外のシトクロムタンパク質であってもよく、例えば、Ralstonia solanacearumのシトクロムタンパク質（配列番号１２）やRalstonia pickettiiのシ
トクロムタンパク質（配列番号１３）が例示される。ただし、これらに限定はされず、その他の生物由来のシトクロムＣタンパク質でもよい。配列番号４と６０％以上の配列同一性を有するシトクロムＣタンパク質のアミノ酸配列の例をNational Center for Biotechnology Information（NCBI）のProtein Databaseのアクセション番号にて以下に示す。こ
れらの配列ではヘム結合ドメインが３つ存在し、アミノ末端側から数えて１、２番目の第１ヘム結合ドメインおよび第２ヘム結合ドメインを欠損させることで本発明の変異型シトクロムタンパク質が得られる。
【００２２】
WP_006403391.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia]
AAQ06608.1 glucose dehydrogenase beta subunit [Burkholderia cepacia]
WP_006396899.1 cytochrome C [Burkholderia multivorans]（配列番号８）
SAJ95286.1 gluconate 2-dehydrogenase (acceptor) [Burkholderia multivorans]
WP_006412653.1 cytochrome C [Burkholderia multivorans]
WP_060041792.1 cytochrome C [Burkholderia multivorans]
WP_060112921.1 cytochrome C [Burkholderia multivorans]
WP_060182288.1 cytochrome C [Burkholderia multivorans]
WP_060151834.1 cytochrome C [Burkholderia multivorans]
WP_048804658.1 cytochrome C [Burkholderia multivorans]
WP_059786407.1 cytochrome C [Burkholderia multivorans]
WP_035955019.1 cytochrome C [Burkholderia multivorans]
WP_059585013.1 cytochrome C [Burkholderia anthina]
WP_006482958.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia cepacia complex]（配列番
号６）
WP_048988065.1 cytochrome C [Burkholderia cenocepacia] （配列番号７）
WP_084751507.1 cytochrome C [Burkholderia cenocepacia]
WP_077186512.1 cytochrome C [Burkholderia cenocepacia]
WP_069351905.1 cytochrome C [Burkholderia cenocepacia]
WP_059783319.1 cytochrome C [Burkholderia sp. NRF60-BP8]
WP_060263394.1 cytochrome C [Burkholderia cenocepacia]
WP_059836247.1 cytochrome C [Burkholderia sp. MSMB1835]
WP_059556637.1 cytochrome C [Burkholderia seminalis]
WP_063551853.1 cytochrome C [Burkholderia territorii]
WP_060310848.1 cytochrome C [Burkholderia anthina]
WP_034187893.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia cepacia complex]
WP_059789576.1 cytochrome C [Burkholderia sp. MSMB1072]
WP_059500343.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia cepacia complex]
WP_034204695.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia cepacia complex]
WP_011882359.1 cytochrome C [Burkholderia vietnamiensis]
WP_060968838.1 cytochrome C [Burkholderia anthina]
WP_077204198.1 cytochrome C [Burkholderia cenocepacia]
WP_050012790.1 cytochrome C [Burkholderia cenocepacia]
WP_011547563.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia]
WP_014724780.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia]
WP_059453668.1 cytochrome C [Burkholderia vietnamiensis]
WP_034195126.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia]
WP_027812584.1 cytochrome C [Burkholderia cenocepacia]
WP_059720348.1 cytochrome C [Burkholderia vietnamiensis]
WP_059548127.1 cytochrome C [Burkholderia vietnamiensis]
WP_044843288.1 cytochrome C [Burkholderia sp. USM B20]
WP_059577619.1 cytochrome C [Burkholderia vietnamiensis]
WP_059459380.1 cytochrome C [Burkholderia vietnamiensis]
WP_059451171.1 cytochrome C [Burkholderia territorii]
WP_027780832.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_077217239.1 cytochrome C [Burkholderia cenocepacia]
WP_059539736.1 cytochrome C [Burkholderia diffusa]
WP_059507572.1 cytochrome C [Burkholderia territorii]
AOJ19136.1 cytochrome C [Burkholderia cenocepacia]
WP_027806162.1 cytochrome C [Burkholderia cenocepacia]
WP_060107812.1 cytochrome C [Burkholderia territorii]
WP_059822261.1 cytochrome C [Burkholderia sp. MSMB1826]
WP_059464697.1 cytochrome C [Burkholderia diffusa]
WP_059240315.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_059734410.1 cytochrome C [Burkholderia vietnamiensis]
WP_069227164.1 cytochrome C [Burkholderia diffusa]
WP_060118353.1 cytochrome C [Burkholderia territorii]
WP_069617959.1 cytochrome C [Burkholderia sp. A2]
WP_060347293.1 cytochrome C [Burkholderia territorii]
WP_059702517.1 cytochrome C [Burkholderia vietnamiensis]
WP_060126789.1 cytochrome C [Burkholderia territorii]
WP_069260162.1 cytochrome C [Burkholderia metallica]
WP_059978049.1 cytochrome C [Burkholderia territorii]
WP_059691288.1 cytochrome C [Burkholderia sp. RF4-BP95]
WP_040140035.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia cepacia complex]
WP_011349243.1 cytochrome C [Burkholderia lata]
WP_059533875.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia cepacia complex]
WP_059547167.1 cytochrome C [Burkholderia latens]
WP_057924955.1 cytochrome C [Burkholderia ambifaria]
WP_059607236.1 cytochrome C [Burkholderia sp. LA-2-3-30-S1-D2]
WP_039351157.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia]
WP_046548033.1 cytochrome C [Burkholderia contaminans]
WP_006752013.1 cytochrome C [Burkholderia ambifaria]
WP_014899067.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_006756339.1 cytochrome C [Burkholderia ambifaria]
WP_059819259.1 cytochrome C [Burkholderia sp. MSMB0856]
WP_011354899.1 cytochrome C [Burkholderia lata]
WP_039320755.1 cytochrome C [Burkholderia sp. A9]
WP_035974222.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia cepacia complex]
WP_071332428.1 cytochrome C [Burkholderia contaminans]
WP_059684703.1 cytochrome C [Burkholderia sp. FL-7-2-10-S1-D7]
WP_048252126.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_069251790.1 cytochrome C [Burkholderia lata]
WP_011658978.1 cytochrome C [Burkholderia ambifaria]
WP_012366204.1 cytochrome C [Burkholderia ambifaria]
WP_072438780.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia]
WP_031400525.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia]
WP_034180248.1 cytochrome C [Burkholderia pyrrocinia]
WP_043184377.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_059729924.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_059713002.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]（配列番号９）
WP_065501791.1 cytochrome C [Burkholderia stabilis]
WP_059615074.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_085037374.1 cytochrome C [Burkholderia sp. CAMPA 1040]
WP_060359188.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_060333590.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059522548.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_059766841.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059637760.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_040131620.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia cepacia complex]
WP_060052348.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_021162032.1 MULTISPECIES: glucose dehydrogenase [Burkholderia]
WP_059666051.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_060375463.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_060371861.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_059697397.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_047903070.1 cytochrome C [Burkholderia pyrrocinia]
WP_027791850.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_059552416.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060232513.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_059687063.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_060226065.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_060125713.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_059923490.1 cytochrome C [Burkholderia stagnalis]（配列番号１０）
WP_059565670.1 cytochrome C [Burkholderia stagnalis]
OJD09200.1 cytochrome C [Burkholderia sp. DNA89]
WP_060237338.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomultivorans]
WP_059707234.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_060362538.1 cytochrome C [Burkholderia stagnalis]
WP_060159353.1 cytochrome C [Burkholderia stagnalis]
WP_069748432.1 cytochrome C [Burkholderia stabilis]
WP_059677336.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_059730424.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059813883.1 cytochrome C [Burkholderia cepacia]
WP_059993161.1 cytochrome C [Burkholderia stagnalis]
WP_060236459.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_076476708.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_010089725.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060195541.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059971786.1 cytochrome C [Burkholderia pyrrocinia]
WP_060367052.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060016611.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059924260.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060048488.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059892434.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059488090.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059483872.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059865488.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059633519.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060287380.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059853060.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059968663.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059752176.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059532869.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059660535.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059590294.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_026043943.1 cytochrome C [Burkholderia pyrrocinia]
WP_060264220.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060019510.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059946330.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_042588017.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia]
WP_084908871.1 cytochrome C [[Pseudomonas] mesoacidophila]
WP_071751088.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060094261.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059885808.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059878406.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_071852856.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060161154.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059796027.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059835010.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059911385.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059744627.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_045565069.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060276465.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060052180.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059877204.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059918860.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059674217.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059626644.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059706954.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059610359.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_071751781.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060345076.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060056668.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059867004.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059846198.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059956839.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059801215.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060374144.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060228155.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060449283.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
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WP_059659999.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
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WP_059776014.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
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WP_060328321.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
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WP_071773630.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_059828379.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060088886.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_060248705.1 cytochrome C [Burkholderia ubonensis]
WP_036661765.1 cytochrome C [Pandoraea sp. SD6-2]
WP_059573013.1 cytochrome C [Burkholderia sp. TSV86]
WP_006027348.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderia]
WP_069235777.1 cytochrome C [Burkholderia sp. Bp7605]
WP_059514380.1 cytochrome C [Burkholderia sp. TSV85]
WP_063533919.1 cytochrome C [Burkholderia sp. MSMB1589WGS]
WP_059929957.1 MULTISPECIES: cytochrome C [pseudomallei group]
WP_060819951.1 cytochrome C [Burkholderia sp. BDU19]
WP_059646659.1 MULTISPECIES: cytochrome C [pseudomallei group]
WP_038746875.1 cytochrome C [Burkholderia sp. ABCPW 111]
WP_059669953.1 cytochrome C [Burkholderia sp. MSMB1498]
WP_038801472.1 cytochrome C [Burkholderia oklahomensis]
WP_060356553.1 cytochrome C [Burkholderia sp. MSMB617WGS]
WP_059582413.1 MULTISPECIES: cytochrome C [pseudomallei group]
WP_085508044.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_010118598.1 cytochrome C [Burkholderia oklahomensis]
WP_059597682.1 cytochrome C [Burkholderia sp. BDU6]
WP_025405690.1 cytochrome C [Burkholderia thailandensis]
WP_038742304.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_009900297.1 cytochrome C [Burkholderia thailandensis]（配列番号１１）
WP_004532924.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_058034623.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_038758421.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_038760788.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_004540659.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_085547264.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_076883397.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_059473995.1 cytochrome C [Burkholderia sp. BDU5]
WP_041191039.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_043296725.1 cytochrome C [Burkholderia thailandensis]
WP_063597172.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_066496408.1 cytochrome C [Burkholderia sp. BDU8]
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WP_004539114.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_004524074.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_017881863.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_009897184.1 cytochrome C [Burkholderia thailandensis]
WP_004536717.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_076885712.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_066570748.1 cytochrome C [Burkholderia sp. ABCPW 14]
WP_076903220.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_076936464.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_076893617.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_043299328.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_038785043.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_041220968.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_076891198.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_076883909.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_004528232.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_085539130.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_038784065.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_038760183.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_038730591.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_038765827.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_076855330.1 cytochrome C [Burkholderia pseudomallei]
WP_004199672.1 cytochrome C [Burkholderia mallei]
KGC89207.1 cytochrome C family protein [Burkholderia pseudomallei]
EDO93432.1 glucose dehydrogenase, beta subunit [Burkholderia pseudomallei Pasteur 52237]
WP_011205494.1 cytochrome C subunit II [Burkholderia pseudomallei]
KGV82938.1 cytochrome C family protein [Burkholderia pseudomallei MSHR4375]
CDU31054.1 putative cytochrome C subunit II [Burkholderia pseudomallei]
KGV67566.1 cytochrome C family protein [Burkholderia pseudomallei MSHR4299]
EDK84065.1 cytochrome C family protein [Burkholderia mallei 2002721280]
WP_074287454.1 cytochrome C [Burkholderia sp. GAS332]
WP_035557403.1 cytochrome C [Burkholderia sp. 9120]
WP_084534186.1 cytochrome C [Paraburkholderia dilworthii]
WP_017774215.1 cytochrome C [Paraburkholderia kururiensis]
WP_030100524.1 cytochrome C [Burkholderia sp. K24]
WP_028194542.1 cytochrome C [Paraburkholderia fungorum]
WP_046573324.1 cytochrome C [Paraburkholderia fungorum]
WP_042300635.1 cytochrome C [Paraburkholderia kururiensis]
WP_084166897.1 cytochrome C [Paraburkholderia caledonica]
SDI05126.1 cytochrome C, mono-and diheme variants [Paraburkholderia phenazinium]WP_051120977.1 cytochrome C [Paraburkholderia bryophila]
WP_073428494.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Burkholderiaceae]
WP_074300113.1 cytochrome C [Paraburkholderia phenazinium]
WP_074768708.1 cytochrome C [Paraburkholderia fungorum]
WP_075465130.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_039597687.1 cytochrome C [Ralstonia sp. A12]
WP_055334967.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_078223437.1 cytochrome C [blood disease bacterium A2-HR MARDI]
WP_013213209.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_063393008.1 cytochrome C [Ralstonia mannitolilytica]
WP_003265144.1 cytochrome C, partial [Ralstonia solanacearum]（配列番号１２）
WP_039568931.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_045786290.1 cytochrome C [Ralstonia mannitolilytica]
WP_064802148.1 cytochrome C [Ralstonia insidiosa]
WP_021195198.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Ralstonia]
WP_004629446.1 cytochrome C, mono- and diheme variants family [Ralstonia pickettii]
WP_012435095.1 cytochrome C [Ralstonia pickettii]
WP_003279246.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_048931829.1 cytochrome C [Ralstonia sp. MD27]
WP_027677928.1 cytochrome C [Ralstonia sp. UNC404CL21Col]
WP_012761509.1 cytochrome C [Ralstonia pickettii]（配列番号１３）
WP_045204557.1 cytochrome C [Burkholderiaceae bacterium 26]
CUV46938.1 Gluconate 2-dehydrogenase cytochrome C subunit [Ralstonia solanacearum]
WP_024973348.1 cytochrome C [Ralstonia pickettii]
AKZ27209.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_020749403.1 oxidoreductase dehydrogenase (cytochrome C subunit) [Ralstonia solanacearum]
WP_024976325.1 cytochrome C [Ralstonia pickettii]
WP_049842155.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_028852719.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_071895582.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
SFP41323.1 cytochrome C, mono-and diheme variants [Ralstonia sp. NFACC01]
WP_064477581.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_058908222.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_009238766.1 MULTISPECIES: cytochrome C [Ralstonia]
CUV21878.1 Gluconate 2-dehydrogenase cytochrome C subunit [Ralstonia solanacearum]
WP_011000726.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_071507651.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_065857157.1 cytochrome C [Ralstonia pickettii]
WP_019717689.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_071012822.1 cytochrome C [Ralstonia solanacearum]
WP_020831436.1 2-Keto-D-gluconate dehydrogenase [Ralstonia solanacearum]
CUV55668.1 Gluconate 2-dehydrogenase cytochrome C subunit [Ralstonia solanacearum]
【００２３】
本発明の変異型シトクロムＣタンパク質は、上述したような配列番号４と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、配列番号６〜１３のいずれかのアミノ酸配列において、アミノ末端側から数えて１、２番目の第１および第２のヘム結合ドメインが欠損するように改変されたものも含まれる。例えば、配列番号６〜１３のいずれかのアミノ酸配列において、第１および第２のヘム結合ドメインが欠損したもの、配列番号６〜１３のいずれかのアミノ酸配列において、第１、第２のヘム結合ドメインを含む領域（配列番号４のアミノ酸番号４３〜１９５に相当する領域）が欠損したものでもよい。
【００２４】
なお、改変のもととなる配列番号６〜１３のアミノ酸配列は改変部位および第３のヘム結合ドメイン以外において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入された配列でもよい。
【００２５】
したがって、本発明の変異型シトクロムＣタンパク質は、電子授受機能を保持する限り、配列番号６〜１３のいずれかのアミノ酸配列において第１および第２のヘム結合ドメインが欠損したアミノ酸配列、または、配列番号６〜１３のいずれかのアミノ酸配列において第１および第２のヘム結合ドメインを含む領域（配列番号４のアミノ酸番号４３〜１９５に相当する領域）が欠損したアミノ酸配列において、さらに、第３のヘム結合ドメイン以外の位置で、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入された配列を有するタンパク質でもよい。ここで、「１又は数個」とは、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。また、置換は保存的な置換が好ましく、「保存的置換」とは、酸性アミノ酸同士の置換、中性アミノ酸同士の置換、塩基性アミノ酸同士の置換など、性質が類似したアミノ酸同士の置換をいう。
【００２６】
＜酸化還元酵素・シトクロム複合体＞
本発明の変異型シトクロムタンパク質は、酸化還元酵素の触媒サブユニットとともに使用することができ、酸化還元反応により生じた電子を受け取り、その電子を電極へ渡すことができる。したがって、本発明の変異型シトクロムタンパク質を含む酸化還元酵素・シトクロム複合体は電気化学センサとして使用できる。電気化学センサは好ましくは変異型シトクロムタンパク質とグルコース酸化還元酵素を含むグルコースセンサである。
【００２７】
＜酸化還元酵素＞
酸化還元酵素は、測定対象物質を酸化還元しうる酵素であればよいが、触媒サブユニットとして、ピロロキノリンキノン（PQQ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）のうち少なくとも一方を含む酵素の触媒サブユニットを挙げることができる。例えば、PQQを含
む酸化還元酵素として、PQQグルコースデヒドロゲナーゼ（PQQGDH）が挙げられ、FADを含む酸化還元酵素として、FADを含んだαサブユニットを持つシトクロムグルコースデヒド
ロゲナーゼ（CyGDH）、グルコースオキシダーゼ（GOD）が挙げられる。その他、コレステロールオキシダーゼ、キノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ（QHEDH (PQQ Ethanol dh)、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（Sorbitol DH）、Ｄ-フルクトースデヒドロゲナーゼ（Fructose DH）、セロビオースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００２８】
この中ではグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が好ましい。
グルコースデヒドロゲナーゼはグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り特に制限されず、公知のものを含め種々の生物に由来するグルコースデヒドロゲナーゼ触媒サブユニットが使用できる。変異型シトクロムタンパク質と同じ微生物由来とすることもできるが、具体的には、例えば、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株由来の配列番号３のアミノ酸配列を有するαサブユニットタンパク質が使用できる。しかし、ＧＤＨのαサブユニットとして機能し得る限り、配列番号３のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、ＧＤＨのαサブユニットとして機能し得る限り、ＫＳ１株以外のαサブユニットのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１又は数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。なお、グルコースデヒドロゲナーゼのαサブユニットタンパク質の酵素活性や基質特異性を向上させる変異は数多く知られており、それらの変異を有するグルコースデヒドロゲナーゼのαサブユニットタンパク質が使用できる。
【００２９】
また、グルコースデヒドロゲナーゼ複合体は、本発明の変異型シトクロムタンパク質と触媒サブユニットに加え、γサブユニットをさらに含んでもよい。γサブユニットとしてはγサブユニットとして機能する限り特に制限されず、公知のものを含め種々の生物に由来するγサブユニットが使用できる。変異型シトクロムタンパク質と同じ微生物由来とすることもできるが、具体的には、例えば、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株由来の配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質が使用できる。しかし、γサブユニットとして機能し得る限り、配列番号２からなるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、γサブユニットとして機能し得る限り、ＫＳ１株以外のγサブユニットのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１又は数個」とは、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。尚、γサブユニットとして機能するとは、αサブユニットとともに複合体を形成したときに同複合体のＧＤＨ活性を高める機能をいう。
【００３０】
＜ＤＮＡ＞
本発明はまた、変異型シトクロムタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。変異型シトクロムタンパク質を含むＤＮＡは変異型シトクロムタンパク質のアミノ酸配列に基づき、その塩基配列が特定されうるが、例えば、野生型シトクロムタンパク質をコードするＤＮＡにおいて、第１および第２ヘム結合ドメインまたはこれらを含む領域が欠損するように塩基配列を改変することで得ることができる。
例えば、ブルクホリデリア・セパシアのシトクロムタンパク質をコードするＤＮＡの具体例として、グルコースデヒドロゲナーゼβサブユニットをコードする、配列番号１の塩基番号２３８６〜３６６０からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、βサブユニ
ットをコードするＤＮＡは、配列番号１の塩基番号２３８６〜３６６０からなる塩基配列を有するＤＮＡに限られず、当該塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、βサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
変異型シトクロムタンパク質をコードするＤＮＡとして、例えば、配列番号５の塩基番号３３７２〜３６６０もしくは３３２５〜３６６０からなる塩基配列を有するＤＮＡや当該塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、変異型シトクロムタンパク質として機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３１】
所望の変異を有する変異型シトクロムタンパク質は、シトクロムタンパク質をコードするＤＮＡに、部位特異的変異法によって所望のアミノ酸欠失を導入したり、ＰＣＲ法で特定領域のみを増幅させたりすることによって変異ＤＮＡを構築し、これを適当な発現系を用いて発現させることによって、取得することができる。
【００３２】
変異型シトクロムタンパク質を含む酸化還元酵素・シトクロム複合体を使用する場合、酸化還元酵素の触媒サブユニットをコードするＤＮＡを変異型シトクロムタンパク質をコードするＤＮＡとともに用いることが好ましい。
酸化還元酵素の触媒サブユニットをコードするＤＮＡは特に制限されず、目的に応じて適宜選択して使用することができるが、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼαサブユニットをコードするＤＮＡとして、配列番号１の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、αサブユニット遺伝子は、配列番号１の塩基配列の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００３３】
酸化還元酵素・シトクロム複合体にグルコースデヒドロゲナーゼγサブユニットを含める場合、酸化還元酵素のγサブユニットをコードするＤＮＡを変異型シトクロムタンパク質をコードするＤＮＡおよび触媒サブユニットをコードするＤＮＡとともに用いることが好ましい。
γサブユニットをコードするＤＮＡの具体例としては、配列番号１の塩基番号２５８〜７６１からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。またγサブユニットをコードするＤＮＡは、配列番号１の塩基番号２５８〜７６１からなる塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、γサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００３４】
前記ストリンジェントな条件としては、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件、具体的には、ハイブリダイゼーション反応の後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃の条件下で洗浄する条件が挙げられる。
【００３５】
シトクロムタンパク質をコードするＤＮＡ、酸化還元酵素の触媒サブユニットをコードするＤＮＡ等は、ブルクホルデリア・セパシア等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲやハイブリダイゼーション法などによって取得することができる。
ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨ γサブユニット遺伝子、αサブユニット
遺伝子、及びβサブユニット遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１に示す。この塩基配列には３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、５’末端側から、１番目のＯＲＦはγサブユニット（配列番号２）をコードし、２番目のＯＲＦはαサブユニット（配列番号３）をコードし、３番目のＯＲＦはβサブユニット（配列番号４）をコードしている。
【００３６】
変異型シトクロムタンパク質、活性サブユニットはそれぞれ別々にＤＮＡを発現させてもよいし、変異型シトクロムタンパク質をコードするＤＮＡと活性サブユニットをコードするＤＮＡをポリシストロニックに含むＤＮＡを用いて発現させてもよい。
【００３７】
＜ベクター＞
変異型シトクロムタンパク質、活性サブユニットの遺伝子の取得、変異の導入、遺伝子の発現等に用いるベクターとしては、宿主微生物で機能するベクターであれば特に制限されないが、例えばエシェリヒア属細菌で機能するベクター、具体的にはｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＢＲ１２２等が挙げられる。遺伝子の発現に用いるプロモーターも宿主に応じて適宜選択できるが、例えばｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＰL、ｔｅｔ、ＰｈｏＡ等が
挙げられる。
【００３８】
＜形質転換体＞
上記のようなＤＮＡまたはそれを含むベクターを宿主微生物に導入して形質転換体を得ることで、変異型シトクロムタンパク質や酸化還元酵素・シトクロム複合体を発現させることができる。形質転換は公知の方法を採用でき、例えばカルシウム処理によるコンピテントセル法、プロトプラスト法又はエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３９】
宿主微生物としてはタンパク質発現に使用されるものであれば特に制限されないが、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリス等の酵母、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ等の糸状菌が挙げられるが、これらに限られない。
【００４０】
＜バイオセンサ＞
本発明の変異型シトクロムタンパク質は酸化還元反応を利用する電気化学的バイオセンサに使用できる。バイオセンサの種類は組み合わせる酸化還元酵素の種類によって様々な用途とすることができ、例えば、酸化還元酵素としてグルコース酸化還元酵素を用いる場合はグルコースセンサとすることができ、酸化還元酵素として乳酸デヒドロゲナーゼを用いる場合は乳酸センサとすることができる。
【００４１】
この中ではグルコースセンサが好ましく、グルコースセンサを作製する場合、酵素電極の試薬層に本発明の変異型シトクロムタンパク質と酸化還元酵素の触媒サブユニットを含有させることが好ましい。さらにγサブユニットを含有させてもよい。これにより、試料中のグルコースを触媒サブユニットにより酸化し、このとき生じた電子を変異型シトクロムタンパク質が受容し、電極に伝達することで、試料中のグルコース濃度に応じた応答電流が流れ、その電流値によりグルコース濃度を算出することができる。
【００４２】
グルコースセンサとして具体的には、作用極として、本発明の変異型シトクロムタンパク質とグルコースデヒドロゲナーゼの触媒サブユニットを含む複合体が金電極、白金電極、カーボン電極等の電極表面上に固定化された酵素電極を用いるグルコースセンサが挙げられる。センサは、目的とする被検物質の濃度を電気化学的に測定する測定系をいうが、作用極（酵素電極）、対極（白金等）、および参照極（Ａｇ／ＡｇＣｌ等）の３電極を含む計が好ましい。慣用の簡易血糖値システムにおいて用いられているような、作用極と対極とから構成される２電極系でもよい。センサはさらに、緩衝液および被検試料を入れる恒温セル、作用極に電位を印加する電源、電流計、記録計等を含むことが好ましい。センサは、バッチ型であってもフロー型であってもよい。特にフロー型のセンサとしては、血糖値を連続で計測できるセンサであってもよい。すなわち、連続的に供給される血液試料、あるいは同透析試料、あるいは血液中あるいは細胞間質液中に本発明の酵素を固定した二
電極系あるいは三電極系を挿入して計測するセンサであってもよい。このような酵素センサの構造は、当該技術分野においてよく知られており、例えばＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ−Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｐ．Ｆ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｉｓａｏ  Ｋａｒｕｂｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒｏｇｅ  Ｓ．  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７に記載されている。
【００４３】
本発明のグルコースセンサを用いるグルコースの濃度の測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。センサの恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極として本発明の変異型シトクロムタンパク質とグルコース酸化還元酵素の触媒サブユニットタンパク質を固定化した酵素電極を用い、対極としては例えば白金電極を、参照電極としては例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いる。作用極に一定の電位（例えば、銀・塩化銀電極に対して０〜＋３００ｍＶ、好ましくは０〜＋１５０ｍＶ、より好ましくは０〜＋１００ｍＶ）を印加して、電流が定常になった後、恒温セルにグルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００４４】
本発明の変異型シトクロムタンパク質とＧＤＨ触媒サブユニットを含むＧＤＨ複合体は、グルコースアッセイキットの構成要素として用いることもできる。グルコースアッセイキットには、本発明の変異型シトクロムタンパク質とＧＤＨ触媒サブユニットを含むＧＤＨ複合体以外に、発色又は発光試薬、希釈用緩衝液、標準物質、使用説明書などが含まれてよい。
【００４５】
例えば、ブルクホルデリア・セパシアの野生型ＧＤＨを用いたグルコースセンサ及びグルコースアッセイキットは、米国特許公開第２００４／００２３３３０Ａ１に記載されている。本発明の変異型シトクロムタンパク質を含むＧＤＨも、同様にして使用することができる。
【実施例】
【００４６】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００４７】
〔実施例１〕変異型ＧＤＨ βサブユニット遺伝子の構築
変異型ＧＤＨ βサブユニット遺伝子の構築に用いるプラスミドとしては、特開２０１２
−０９０５６３に記載のプラスミドｐＴｒｃ９９Ａγαβにおいて、αサブユニットに変異を導入したｐＴｒｃ９９Ａγα（ＱＹＹ）βを使用した。同プラスミドは、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０６）染色体ＤＮＡから単離された、ＧＤＨ  γサブユニット構造遺伝子とαサブユニット構造遺伝子、βサブユニット構造遺伝子を連続して含み、このうちαサブユニット構造遺伝子について、３２６残基目のセリン、３６５残基目のセリン、４７２残基目のアラニンをコードするコドンがそれぞれグルタミン、チロシン、チロシンをコードするものに置換されたＤＮＡ断片が、ベクターｐＴｒｃ９９Ａのクローニング部位に挿入されてなるプラスミドである。本プラスミド中のＧＤＨの各構造遺伝子は、ｔｒｃプロモーターによって制御される。ｐＴｒｃ９９Ａγαβは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
【００４８】
まず、上記プラスミドＤＮＡを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、ＧＤＨのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットのシグナル配列までをコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【００４９】
〔フォワードプライマー〕
５’−ＡＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＣ−３’（配列
番号１４）
〔リバースプライマー〕
５’−ＡＴＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡ−３’（配列番号１５）
【００５０】
ＰＣＲ反応は、以下の反応組成で、９５℃、３０秒の後、９５℃  ３０秒、５５℃  １分、７２℃  ２分を２５サイクル繰り返し、７２℃  ５分の反応を行った後、４℃で保持した。
【００５１】
〔反応液組成〕
ｐＴｒｃ９９Ａγα（ＱＹＹ）β（１００ｎｇ／μｌ）  ０．５μｌ
１０×反応緩衝液                          ２μｌ
フォワードプライマー（１００ｎｇ／μｌ）  ０．５μｌ
リバースプライマー（１００ｎｇ／μｌ  ）  ０．５μｌ
ｄＮＴＰ                                  ０．４μｌ
蒸留水                                  １５．７μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ                        ０．４μｌ
合計                                    ２０μｌ
【００５２】
また、βサブユニットの第３ヘム結合ドメイン、すなわち配列番号４のアミノ酸番号３１４〜４２５または３３０〜４２５の領域をコードするＤＮＡ断片を、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより増幅した。なお、フォワードプライマーにはどちらも５‘末端側にβサブユニットのシグナル配列に相当する配列が付加されている。
【００５３】
〔フォワードプライマー  ３１４〜４２５増幅用〕
５’−ＴＴＧＣＣＧＧＧＣＴＴＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＧＣＧＣＧＧＴＧＴＣＧＣＧＣＴＣＧＣＧ−３’（配列番号１６）
〔フォワードプライマー  ３３０〜４２５増幅用〕
５’−ＴＴＧＣＣＧＧＧＣＴＴＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＡＴＴＡＴＣＴＣＧＧＣＡＡＣＴＧＣＧＣＧＡＣＧ−３’（配列番号１７）
〔リバースプライマー〕
５’−ＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＧＴＣＣＴＧ−３’（配列番号１８）
【００５４】
ＰＣＲ反応は、以下の反応組成で、９５℃、３０秒の後、９５℃  ３０秒、５５℃  １分、７２℃  ３０秒を２５サイクル繰り返し、７２℃  ５分の反応を行った後、４℃で保持した。
【００５５】
〔反応液組成〕
ｐＴｒｃ９９Ａγα（ＱＹＹ）β（１００ｎｇ／μｌ）  ０．５μｌ
１０×反応緩衝液                          ２μｌ
フォワードプライマー（１００ｎｇ／μｌ）  ０．５μｌ
リバースプライマー（１００ｎｇ／μｌ  ）  ０．５μｌ
ｄＮＴＰ                                  ０．４μｌ
蒸留水                                  １５．７μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ                        ０．４μｌ
合計                                    ２０μｌ
【００５６】
上記操作で得られたＤＮＡ断片をそれぞれ精製したのち、これらを混合して鋳型とし、以
下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ  ＰＣＲにより結合、増幅した。なお、リバースプライマーにはヒスチジンタグの配列がデザインされており、これにより変異型βサブユニットのＣ末端にヒスチジンタグが付加されることとなる。
【００５７】
〔フォワードプライマー〕
５’−ＡＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＣ−３’（配列番号１４）
〔リバースプライマー〕
５’−ＧＴＡＣＧＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号１９）
【００５８】
ＰＣＲ反応は、以下の反応組成で、９５℃、３０秒の後、９５℃  ３０秒、５５℃  １分、７２℃  ４分を２５サイクル繰り返し、７２℃  ５分の反応を行った後、４℃で保持した。
【００５９】
〔反応液組成〕
γサブユニット〜βサブユニットシグナル配列までのＰＣＲ産物（１００ｎｇ／μｌ）
１μｌ
βサブユニット  ３１４〜４２５までのＰＣＲ産物
またはβサブユニット  ３３０〜４２５までのＰＣＲ産物（１００ｎｇ／μｌ）
１μｌ
１０×反応緩衝液                          ２μｌ
フォワードプライマー（１００ｎｇ／μｌ）  ０．５μｌ
リバースプライマー（１００ｎｇ／μｌ  ）  ０．５μｌ
ｄＮＴＰ                                  ０．４μｌ
蒸留水                                  １４．２μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ                        ０．４μｌ
合計                                    ２０μｌ
【００６０】
得られたＰＣＲ産物を精製後、Ｎ末端側をＮｃｏＩ、Ｃ末端側をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に処理したｐＴｒｃ９９Ａにライゲーションした。得られた組換えベクターでエシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換し、カルベニシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転換体を液体のＬＢ培地で培養してプラスミドを抽出し、その挿入ＤＮＡ断片を解析したところ、γサブユニット、αサブユニット、βサブユニットのシグナル配列に続き、βサブユニットの３１４〜４２５残基目をコードする遺伝子または同３３０〜４２５残基目をコードする遺伝子が挿入されていることが確認された。これらのプラスミドを、それぞれｐＴｒｃ９９Ａγα（ＱＹＹ）β３１４−Ｈｉｓ、ｐＴｒｃ９９Ａγα（ＱＹＹ）β３３０−Ｈｉｓと命名した。これらのプラスミド中のＧＤＨの各構造遺伝子は、βサブユニットのＣ末端にヒスチジンタグを有し、ｔｒｃプロモーターによって制御される。また、いずれもアンピシリン耐性遺伝子を保持している。
【００６１】
〔実施例２〕変異型ＧＤＨ βサブユニットを含むブルクホルデリア・セパシアのＧＤＨ
の発現
実施例１で得られた発現プラスミドを用いて、変異型ＧＤＨ βサブユニット遺伝子を含
むＧＤＨを製造した。
【００６２】
変異型ＧＤＨ βサブユニット遺伝子を含むＧＤＨ発現プラスミドおよびシトクロムｃ成
熟に必須の遺伝子群を有するプラスミドｐＢＢＪＭｃｃｍを導入したエシェリヒア・コリ
ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、３ｍｌのＬＢ培地（カルベニシリン５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌ含有）で、試験管を用いて３７℃で一晩振とう培養した。それらの培養液を、培養液１リットル当たりの組成が表１となるように調製された培地５０ｍｌ（カルベニシリン５０μｇ／ｍｌおよびカナマイシン５０μｇ／ｍｌ含有）を含む３００ｍｌの坂口フラスコに２本に１％植菌し、２５℃で２８時間振とう培養した。なお、宿主が恒常的にシトクロムｃを成熟させることができる場合、例えば、ｃｃｍ遺伝子がゲノムに相同的組み換えなどで挿入され、恒常的に発現している形質転換株などでは、ｐＢＢＪＭｃｃｍのようなベクタは不要である。
【００６３】
【表１】
2019013166.tif 000003
【００６４】
前記で培養した培養液から菌体を集め、得られた湿菌体１ｇあたり５ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（メルク・ミリポア）を添加、懸濁し、菌体を溶解させた。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒ．ｐ．ｍ、２０分、４℃）して残渣を除去し、粗酵素サンプルとした。
【００６５】
また、γα（ＱＹＹ）β３１４−Ｈｉｓについては、粗酵素サンプルを０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に対して一晩透析したのち、同バッファーで平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン）を充てんしたカラムに添加し、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５４ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１４０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、精製酵素サンプルを得た。
【００６６】
〔実施例３〕変異型ＧＤＨ βサブユニットを含むブルクホルデリア・セパシアのＧＤＨ
の機能解析
ＧＤＨ活性の測定は、ＰＭＳ／ＤＣＩＰ系およびルテニウム（Ｒｕ）／ＭＴＴ系で行った。前者は一般的なＧＤＨ活性を、後者はβサブユニットを介してメディエータへと電子伝達が行われた場合のＧＤＨ活性を示す。
【００６７】
ＰＭＳ／ＤＣＩＰ系での活性測定は以下のように行った。２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）中で、酵素サンプル、終濃度０．６ｍＭのメチルフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、終濃度０．０６ｍＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、終濃度４ｍＭまたは４０ｍＭのグルコースを添加し、分光光度計を用いてＤＣＩＰ由来の吸収波長である６００ｎｍの吸光度の１分間当たりの変化量を測定した
。
また、Ｒｕ／ＭＴＴ系での活性測定は以下のように行った。２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）中で、酵素サンプル、終濃度２％のヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物、終濃度１ｍＭの３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、終濃度４ｍＭまたは４０ｍＭのグルコースを添加し、分光光度計を用いてＭＴＴから生じるホルマザン由来の吸収波長である５６５ｎｍの吸光度の１分間当たりの変化量を測定した。
粗酵素サンプルの活性測定の結果を、表２に示す。
【００６８】
【表２】
2019013166.tif 000004
【００６９】
表中、野生型βサブユニットを含む酵素には及ばないものの、両変異体ともＲｕ／ＭＴＴ系でＧＤＨ活性を示しており、これらの変異体がβサブユニットを介してメディエータへの電子伝達を行うことが示唆された。また、野生型酵素ではβサブユニットを含まないγα複合体ではＰＭＳ／ＤＣＩＰを電子受容体としたときには酵素活性は約45U/mgであり（Biochimica et Biophysica Acta, 1645(2), 133-138.）、βサブユニットを含む場合の値（約300U/mg：Journal of Biotechnology, 123(2), 127-136.）の約１５％の酵素活性し
か観察されないが、本変異シトクロムｃを含む複合体は野生型βサブユニット複合体を含む場合とほとんど同じ活性を示した。したがって、この変異βサブユニットがαサブユニットから電子を正常に受け取り、これをPMS/DCIPに電子を受け渡していることが見出された。
【００７０】
また、γα（ＱＹＹ）β３１４について精製を行い、上記手順に従って４０ｍＭグルコースに対する酵素活性を、別途調製した野生型βサブユニットを含むγα（ＱＹＹ）βともども測定した。結果を表３に示す。
【００７１】
【表３】
2019013166.tif 000005
【００７２】
精製酵素においてもγα（ＱＹＹ）β３１４はＲｕ／ＭＴＴ系でＧＤＨ活性を示しており、ＰＭＳ／ＤＣＩＰ系でのＧＤＨ活性との比は野生型βサブユニットを含む酵素複合体と同様であった。このことから、当該変異体が野生型βサブユニットを含む酵素複合体と同様、βサブユニットを介してメディエータへの電子伝達を行うことが示唆された。
【００７３】
〔実施例４〕グルコースセンサの作製
金表面に単分子膜形成分子を介して変異型βサブユニットを含むGDHを固定化した酵素電
極を作製した。単分子膜形成分子としては、以下のDSHを用いた。
【化１】
2019013166.tif 000006
【００７４】
具体的には、金ワイヤ（径０．５ｍｍ、長さ６〜７ｃｍ）をピランハ溶液（200μl）に室温で２時間浸漬し、その後、アセトンで洗浄し、DSHのアセトン溶液（濃度20μM）に浸漬し、２５℃で２４時間インキュベートしてDSHのチオール基を金表面に結合させた。続い
て、アセトンで洗浄し、上記ＧＤＨα、βサブユニット複合体(濃度0.03mg/ml)）を含む
リン酸バッファー（300μl）に浸漬し、４℃で一晩インキュベートしてDSHの官能基を介
して酵素複合体を結合させ、酵素電極を得た。
【００７５】
〔実施例５〕グルコース濃度の測定
上記酵素電極を用いて、0mM（バックグラウンド）、1mM、 5mMまたは50mMのグルコース水溶液に対する応答電流値の測定をクロノアンペアメトリーにより行った。グルコース測定は、対極（Ptワイヤ）、参照極（銀/塩化銀）を用い、作用極への印加電位を０Ｖ、＋０
．１Ｖ、＋０．４Ｖ（vs.銀/塩化銀）とし、３７℃で行った。
【００７６】
＜結果＞
銀塩化銀電極に対して400mV印加した電流値のグルコース濃度特性を基準に、0mVおよび100mVの電流値を比較した。
その結果、図１に示されるように、印加電位0mVにおいては比較例（点線）でグルコース
濃度依存的な酸化電流が観測されなかったのに対し、実施例（実線）では酸化電流のグル
コース濃度依存が見られた。
印加電位100mVで比較例でもグルコース濃度依存的な酸化電流の観測がされたが、400mVの応答電流を基準とした電流値出力は実施例の方が高かった。
以上から実施例のtruncated βサブユニットを用いたセンサにおいて、野生型βサブユニットを用いたセンサより低い酸化電位で触媒電流を取得可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の変異型シトクロムタンパク質を用いたバイオセンサは、低電位での電流測定が可能であり、グルコースセンサ等のバイオセンサに好適に使用することができる。
【図１】
2019013166.tif 000007
【配列表】
2019013166000001.app