(57)【要約】      （修正有）【課題】メラノーマの転移抑制剤を提供。【解決手段】被転移組織におけるＥｖａ１タンパク質の機能を抑制する活性を有する物質、特に抗体依存性細胞傷害活性を有さない抗体であるメラノーマ転移阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被転移組織におけるＥｖａ１タンパク質の機能を、抑制する活性を有する物質を、有効成分とする、メラノーマの転移抑制剤。
【請求項２】
前記物質がＥｖａ１タンパク質に対する抗体である、請求項１に記載のメラノーマの転移抑制剤。
【請求項３】
前記抗体がＡＤＣＣ活性を有さない抗体である、請求項２に記載のメラノーマの転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノーマの転移抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は、細胞の異常増殖に基づく疾患であり、その最大の特徴は周辺組織への浸潤と他臓器への転移である。特に、メラノサイト（メラニン色素産生細胞）が癌化して生じるメラノーマ（悪性黒色腫）は、早期の段階から転移が生じ易い。その一方で、化学療法や放射線療法には抵抗性を示すため、治療が困難な悪性度の高い腫瘍として知られている。また、悪性腫瘍患者の死因の多くは、原発巣の増大ではなく、腫瘍細胞の遠隔転移に伴う多臓器不全であることもよく知られている。
【０００３】
然るに、メラノーマ等の悪性腫瘍の治療において、その転移制御は重要課題の一つであり、そのメカニズムの解明は悪性腫瘍の克服に必要不可欠である。そして、現在までに転移に関わる様々な分子機構が報告されてきたが、有効な治療標的は見出されておらず、転移を抑制する方法は未だ確立されていない。
【０００４】
Ｅｖａ１（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）タンパク質は、一回膜貫通型の細胞膜タンパク質であり、細胞骨格系に関わる分子である。また、このタンパク質は、肺小細胞癌、膵癌、乳頭状甲状腺癌等において発現していることが報告されており（非特許文献１〜４）、さらに神経膠芽腫（ＧＢＭ）に存在するＧＢＭ幹細胞（ＧＩＣ）で、Ｅｖａ１タンパク質の発現は亢進していることが、本発明者らによって明らかにされている（特許文献１、非特許文献１）。
【０００５】
一方、マウスＢ１６メラノーマ細胞（Ｂ１６細胞）において、通常、Ｅｖａ１タンパク質は発現していない。しかしながら、肺に転移する過程で、Ｂ１６細胞がＥｖａ１タンパク質の発現を獲得していることを、本発明者らは見出している（特許文献２）。
【０００６】
さらに、かかるマウスＢ１６メラノーマ細胞血行性肺転移モデルにおいて、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する高親和性Ｅｖａ１タンパク質抗体は、Ｂ１６細胞が形成した肺転移腫瘍に対して高い抗腫瘍効果を奏することも、本発明者らは明らかにしている（特許文献２）。なお、この効果は、前記抗体が有するＡＤＣＣ活性によるものと推測される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０４３７４７号
【特許文献２】国際公開第２０１７／０２２６６８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１６  Ｊａｎ  １；７６（１）：１７１−８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、メラノーマの転移に関与する分子を見出し、当該分子を標的とする当該転移の抑制方法、及びそれに用いられる薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上述のとおり、Ｅｖａ１タンパク質を通常発現していないメラノーマ（Ｂ１６細胞）が、肺に転移する過程で、当該タンパク質の発現を獲得していること等を、見出している（特許文献２）。これらの知見に着目し、Ｅｖａ１タンパク質の発現とメラノーマの転移との関連について解明すべく、本発明者らは鋭意研究を更に重ねた。
【００１１】
より具体的には、メラノーマにおけるＥｖａ１タンパク質の発現をｓｈＲＮＡを用いて抑制し、当該腫瘍細胞をマウスに接種した。その結果、肺への転移が顕著に抑えられ、メラノーマの転移には、当該腫瘍細胞における前記Ｅｖａ１タンパク質の発現獲得が必要であることが明らかになった。
【００１２】
その一方で、本発明者らは、ノックアウト法によりＥｖａ１タンパク質遺伝子を削除したマウスに、メラノーマを接種した。その結果、驚くべきことに、肺への転移が完全に阻害され、メラノーマの転移には、当該腫瘍細胞が転移する組織等（被転移組織）における前記Ｅｖａ１タンパク質の発現も必要であることが明らかになった。
【００１３】
このように、メラノーマの転移においては、メラノーマのみならず、被転移組織においても、Ｅｖａ１タンパク質が発現していることが必要であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、被転移組織におけるＥｖａ１タンパク質を標的とした、メラノーマの転移抑制剤に関し、より具体的には、以下を提供する。
＜１＞被転移組織におけるＥｖａ１タンパク質の機能を、抑制する活性を有する物質を、有効成分とする、メラノーマの転移抑制剤。
＜２＞前記物質がＥｖａ１タンパク質に対する抗体である、＜１＞に記載のメラノーマの転移抑制剤。
＜３＞前記抗体がＡＤＣＣ活性を有さない抗体である、＜２＞に記載のメラノーマの転移抑制剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、被転移組織におけるＥｖａ１タンパク質を標的とし、メラノーマの転移を抑制することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｓｈＲＮＡを発現させたメラノーマ（Ｂ１６細胞）を接種し、接種してから１４日後の当該マウスの肺を観察した結果を示す、写真である。図中、「Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡ」は、Ｅｖａ１に対するｓｈＲＮＡを発現させたメラノーマを接種した結果を示し、「ｃｏｎｔｓｈＲＮＡ」は、コントロールｓｈＲＮＡを発現させたメラノーマを接種した結果を示す。
【図２】ｓｈＲＮＡを発現させたメラノーマを接種し、接種してから１４日後の当該マウスの肺において形成された当該メラノーマのコロニー数を示す、グラフである。図中の表記は、図１のそれらと同様である。
【図３】メラノーマ（Ｂ１６細胞）を接種してから１４日後のマウスの肺を観察した結果を示す、写真である。図中、「Ｅｖａ１ＫＯ」は、Ｅｖａ１遺伝子をノックアウトしたマウスにメラノーマを接種した結果を示し、「野生型」は、野生型マウスにメラノーマを接種した結果を示す。
【図４】メラノーマを接種してから１４日後のマウスの肺において、形成された当該メラノーマのコロニー数を示す、グラフである。図中の表記は、図３のそれらと同様である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜メラノーマの転移抑制剤＞
後述の実施例に示すとおり、本発明者らは、Ｅｖａ１遺伝子を削除したマウスにおいてメラノーマの転移が阻害されること、すなわち、メラノーマの転移には、当該腫瘍細胞が転移する組織等（被転移組織）におけるＥｖａ１タンパク質の発現が必要であることを明らかにした。本発明は、かかる知見に基づき完成されたものであり、以下を提供するものである。
【００１８】
被転移組織におけるＥｖａ１タンパク質の機能を、抑制する活性を有する物質を、有効成分とする、メラノーマの転移抑制剤。
【００１９】
本発明において「メラノーマ」とは、メラノサイト（メラニン色素産生細胞）が癌化して生じる、悪性黒色腫とも称される腫瘍を意味し、その種類としては、特に制限されないが、悪性黒子型、末端黒子型、結節型、表在拡大型のいずれであってもよい。「メラノーマの転移」とは、メラノーマが原発巣から異なる部位ヘ到達し、該部位において腫瘍が二次的に生じることを意味する。「メラノーマの転移抑制」とは、メラノーマの転移を完全に抑制すること（すなわち、阻害すること）のみならず、部分的に抑制することをも含む意である。
【００２０】
本発明において「被転移組織」とは、メラノーマが転移し得る組織であればよく、特に限定されるものではないが、例えば、肺組織、リンパ組織、皮膚組織、消化管組織、肝臓組織、脳組織、骨組織が挙げられる。また、本発明に係る「被転移組織」には、当該組織において転移に関わるホスト細胞も含まれる。かかるホスト細胞としては、例えば、マクロファージ等の単球、骨髄由来細胞（骨髄由来幹細胞等）といった血液系細胞が挙げられる。
【００２１】
本発明において、「Ｅｖａ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）１タンパク質」は、一回膜貫通型の細胞膜タンパク質であり、ＭＰＺＬ２（Ｍｙｅｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｚｅｒｏ−ｌｉｋｅ  ２）とも称される細胞骨格系に関わる分子である。ヒト由来のものであれば典型的には配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号：１に記載のヌクレオチド配列がコードするタンパク質）である。マウス由来のものであれば典型的には配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号：３に記載のヌクレオチド配列がコードするタンパク質）である。しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し、それにコードされるタンパク質のアミノ酸配列もそれに伴い改変される。したがって、本発明に係る「Ｅｖａ１タンパク質」は、前記典型的なアミノ酸配列からなるタンパク質に特定されることなく、このような天然の変異体も含まれる。
【００２２】
本発明において、Ｅｖａ１タンパク質の機能の抑制には、当該タンパク質の機能（活性）の抑制のみならず、Ｅｖａ１タンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子の発現の抑制（翻訳及び転写の抑制）の双方を含む意味である。
【００２３】
「被転移組織におけるＥｖａ１タンパク質の機能を抑制する活性を有する物質」としては、例えば、Ｅｖａ１タンパク質に対する抗体、Ｅｖａ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド、Ｅｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡが挙げられる。
【００２４】
なお、後述の実施例において示すとおり、被転移組織において、Ｅｖａ１タンパク質を欠失させることによって、当該組織へのメラノーマの転移が抑制されることが明らかになり、ひいては被転移組織におけるＥｖａ１タンパク質の機能の抑制と、メラノーマの転移抑制との間に因果関係があることも明らかになった。したがって、抗体等を含め、これらＥｖａ１タンパク質の機能を抑制する活性を有する物質を用いることにより、メラノーマの転移を抑制できることは明白である。
【００２５】
（抗体）
本発明において「抗体」は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また免疫グロブリンの全てのクラス及びサブクラスが含まれる。さらに「抗体」には、その機能的断片も含まれる。抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、Ｅｖａ１タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体が挙げられる。
【００２６】
本発明において「Ｅｖａ１タンパク質に対する抗体（以下「抗Ｅｖａ１タンパク質抗体」とも称する）」としては、上述のＥｖａ１タンパク質に結合すればよく、特に制限はないが、Ｅｖａ１タンパク質の細胞外領域に結合する抗体が好ましく、Ｅｖａ１タンパク質のＩｇＶドメインに結合する抗体がより好ましい。なお、Ｅｖａ１タンパク質の細胞外領域は、典型的には、配列番号：２又は４の記載のアミノ酸配列において、２７〜１５１位のアミノ酸配列からなる領域であり、またＩｇＶドメインは、典型的には、配列番号：２又は４の記載のアミノ酸配列において、４２〜１２５位のアミノ酸配列からなる領域である。
【００２７】
また、「抗Ｅｖａ１タンパク質抗体」は、Ｅｖａ１タンパク質を発現している正常な細胞への傷害がもたらされにくいという観点から、ＡＤＣＣ活性を有していないことが好ましい。なお、「ＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞障害活性）」とは、標的細胞の細胞表面抗原に抗体が結合した際、その抗体のＦｃ領域にエフェクター細胞（ＮＫ細胞、単球等の免疫細胞）がさらに結合することにより、当該細胞が活性化され、それに伴い、因子を放出して標的細胞を殺傷する活性を意味する。抗体がＡＤＣＣ活性を有していないことは、当業者であれば、公知のＡＤＣＣ活性評価を用い判定することができる（例えば、特許文献２に記載の方法  参照）。
【００２８】
また、「抗Ｅｖａ１タンパク質抗体」は、その由来、種類、形状等は特に限定されない。具体的には、非ヒト動物由来の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びこれら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が望ましい。
【００２９】
「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。
【００３０】
「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９６／０２５７６参照）。
【００３１】
「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用することが可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２，２５５−２５８、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５，１３，６５−９３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ１９９１，２２２，５８１−５９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７，１５，１４６−１５６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７：７２２−７２７、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。
【００３２】
また、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体には、望ましい活性（Ｅｖａ１タンパク質への結合活性、メラノーマに対する転移抑制活性、及び／又は他の生物学的特性など）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。アミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、又はペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、さらに、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ２１：３４５−３５１（２００８））。
【００３３】
さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
【００３４】
抗Ｅｖａ１タンパク質抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（Ｅｖａ１タンパク質又はその部分ペプチド、又はこれらを発現する細胞等）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、例えば、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられ、組換えＤＮＡ法としては、例えば、上記本発明の抗体又はペプチドをコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば、哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を組換え抗体として産生させる手法が挙げられる（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。
【００３５】
（ドミナントネガティブペプチド）
「Ｅｖａ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド」としては、例えば、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列の置換、欠失、付加及び／又は挿入が施されたポリペプチドが挙げられ、より具体的には、Ｅｖａ１タンパク質の細胞外領域からなるペプチド、Ｅｖａ１タンパク質のＩｇＶドメインからなるペプチドが挙げられる。
【００３６】
（ＲＮＡ）
Ｅｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡとしては、例えば、当該転写産物と相補的なＲＮＡが挙げられ、より具体的には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡ（ｌｏｎｇ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡが挙げられる。
【００３７】
相補的なＲＮＡは、Ｅｖａ１遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムにより決定することができる。また鎖長としては、Ｅｖａ１遺伝子の発現を抑制することができれば特に制限はなく、ｓｉＲＮＡの長さとしては、例えば、１５〜４９ヌクレオチドであり、好しくは１５〜３５ヌクレオチドであり、さらに好しくは２１〜３０ヌクレオチドである。ｍｉＲＮＡの長さとしては、例えば、２１〜２５ヌクレオチドである。ｌｎｃＲＮＡの長さとしては、例えば、２００ヌクレオチド以上である。また、アンチセンスの長さとしては、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド以上であり、好ましくは１００ヌクレオチド以上であり、さらに好ましくは５００ヌクレオチド以上である。通常、用いられるアンチセンスＲＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００３８】
また、Ｅｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡは、該ＲＮＡをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが挿入され前記ＲＮＡを発現することが可能なベクターにて、本発明のメラノーマ転移抑制剤に含有されていてもよい。
【００３９】
以上、本発明のメラノーマ転移抑制剤の有効成分となる物質について説明したが、これらがメラノーマの転移を抑制し得るかどうかは、当業者であれば、公知のメラノーマ転移モデル動物（例えば、後述の実施例に示すような、マウスＢ１６メラノーマ細胞血行性肺転移モデル）を用いて、判定することができる。
【００４０】
（メラノーマ転移抑制剤の他の成分等）
本発明のメラノーマ転移抑制剤は、上述の被転移組織におけるＥｖａ１タンパク質の機能を、抑制する活性を有する物質に加え、他の成分を含むことができる。他の成分としては、例えば、薬理学上許容される、担体、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩が挙げられる。また、必要に応じて液体又は凍結乾燥した形態で製形化してもよい。
【００４１】
担体としては、凍結乾燥した製剤の場合、マンニトール、ラクトース、サッカロース、ヒトアルブミン等を例として挙げることができ、液状製剤の場合には、生理食塩水、注射用水、リン酸塩緩衝液、水酸化アルミニウム等を例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【００４２】
また、本発明の薬剤の製品（医薬品）又はその説明書は、メラノーマの転移を伴う疾患の治療又は予防に用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装等に表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。メラノーマの転移を伴う疾患の治療又は予防に用いられる旨の表示においては、本発明の被転移組織におけるＥｖａ１タンパク質の機能を抑制する活性を有する物質を投与することにより、メラノーマの転移が抑制されることについての情報を含むことができる。
【００４３】
＜メラノーマの転移抑制方法＞
本発明はまた、上述の物質を、メラノーマ罹患動物に投与する工程を含む、該動物におけるメラノーマの転移を抑制する方法を提供する。
【００４４】
当該方法において投与される物質については、上述のとおりである。また、当該物質が投与される動物としては、メラノーマを罹患していればよく、ヒトであってもよく、非ヒト動物（等）であってもよい。非ヒト動物としては特に制限はなく、家畜、ペット、実験用動物が挙げられ、より具体的には、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌが挙げられる。
【００４５】
本発明の物質の投与形態としては特に制限はなく、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与、局所投与、経口投与が挙げられる。
【００４６】
本発明の医薬組成物を投与する場合、その投与量は、対象の種類、年齢、体重、症状、健康状態等に応じて、適宜選択されるが、例えば、本発明の医薬組成物の投与量（有効成分換算量）は、有効成分の種類に応じて異なるが、例えば、有効成分が抗体又はペプチドである場合には、通常、１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、有効成分がＲＮＡ又はＤＮＡである場合には、通常、０．１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、１日あたりの投与又は摂取の回数としても、特に制限はなく、前記のような様々な要因を考慮して、適宜選択することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４８】
（実施例１）  メラノーマの転移における、Ｅｖａ１タンパク質発現獲得の重要性
特許文献２において本発明者らが報告したように、マウスＢ１６メラノーマ細胞（Ｂ１６細胞）は、通常Ｅｖａ１タンパク質を発現していない。しかしながら、Ｂ１６細胞を接種したマウスにおいて、当該細胞は肺に転移する過程でＥｖａ１タンパク質の発現を獲得する。
【００４９】
そこで、メラノーマにおけるＥｖａ１タンパク質の発現と、転移との関連について調べるべく、以下に示すとおり、ｓｈＲＮＡにより、メラノーマにおけるＥｖａ１タンパク質の発現を抑制した。そして、当該抑制によるメラノーマの転移への影響を分析した。
【００５０】
＜ｓｈＲＮＡ発現ベクターの調製＞
メラノーマにおいてＥｖａ１タンパク質の発現を抑えるべく、先ず、ショートヘアピン（ｓｈ）配列を、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  ｓｉＲＮＡ  Ｗｉｚａｒｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｒｎａｗｉｚａｒｄ．ｃｏｍ／）を用いて作製した。そして、当該ｓｈ配列を、ｐｓｉＲＮＡ−ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ  Ｇ１発現ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）に挿入し、Ｅｖａ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡ（Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡ）を発現するベクター（Ｅｖａ１ｓｈ）を調製した。なお、Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡは、マウスＥｖａ１遺伝子において、「５’−ＧＣＡＧＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＴＴ−３’（配列番号：５）」を標的とする。
【００５１】
また、Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡの代わりに、ＥＧＦＰ遺伝子に対するｓｈＲＮＡ（ｃｏｎｔｓｈＲＮＡ）を、ｐｓｉＲＮＡ−ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ  Ｇ１発現ベクターに挿入したベクター（ｃｏｎｔｓｈ）も調製し、コントロールとして用いた。なお、ｃｏｎｔｓｈＲＮＡの標的配列は、５’−ＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡ−３’（配列番号：６）である。
【００５２】
＜Ｂ１６細胞の調製＞
Ｂ１６細胞（マウスＢ１６／ＢＬ６メラノーマ、ＲＩＫＥＮ  ＲＢＣより受領）を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタマックス、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（全てナカライテスク社製）にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下、維持した。
【００５３】
そして、前記ｓｈＲＮＡ発現ベクターを、ＡＭＡＸＡヌクレオフェクター装置（Ｌｏｎｚａ社製）を用いて、Ｂ１６細胞に導入し、ハイグロマイシンＢの存在下で培養することによって、前記ｓｈＲＮＡを恒常的に発現するメラノーマを樹立した。
【００５４】
＜マウスＢ１６メラノーマ細胞血行性肺転移モデルの調製＞
各ｓｈＲＮＡを恒常的に発現するメラノーマを、５〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに１×１０５個  尾静脈内投与した。そして、メラノーマを接種してから１４日後に肺を採取し、形成されたメラノーマのコロニー数を計測した（ｎ＝５）。
【００５５】
なお、コロニー数の計測は、Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ．ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００２年、７０巻、７９１〜７９８ページに記載の方法に沿って行った。そして、得られた結果を、マイクロ社製ソフト  エクセルを用いスチューデントｔ検定法によって解析してＰ値を算出し、コントロール群（ｃｏｎｔｓｈＲＮＡを発現するメラノーマを接種したマウス）との差の有意性について評価した。
【００５６】
その結果、図１及び２に示した結果から明らかなように、Ｅｖａ１タンパク質の発現を抑制していないコントロールでは肺への転移が検出されたのに対し、前記発現を抑制したメラノーマでは転移を殆ど検出することができなかった。すなわち、Ｅｖａ１タンパク質の発現を抑制することによって、メラノーマの転移腫瘍形成能は著しく低減することが明らかになった。
【００５７】
（実施例２）  被転移組織における、Ｅｖａ１タンパク質発現の重要性
次に、被転移組織におけるＥｖａ１タンパク質の発現と、転移との関連について調べるべく、以下に示すとおり、Ｅｖａ１ノックアウトマウスにおけるメラノーマの転移について調べた。
【００５８】
＜Ｅｖａ１ノックアウトマウス＞
Ｅｖａ１ノックアウトマウス（Ｅｖａ１ＫＯ）は、ノックイン法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｃｌｓｔ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ａｒｇ／ｍｅｔｈｏｄｓ．ｈｔｍｌ）により作製した（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＤＢ１０３１Ｋ）。なお、Ｅｖａ１ＫＯの遺伝的背景は、Ｃ５７ＢＬ／６である。また、前記アクセッション番号は、理化学研究所ＣＤＢ（日本）における当該ノックアウトマウスの管理番号を示す。
【００５９】
そして、Ｂ１６細胞を、５〜８週齢のＥｖａ１ＫＯに１×１０５個  尾静脈内投与し、１４日後に肺を採取し、形成されたメラノーマのコロニー数を計測した（ｎ＝５）。また、コントロールとして野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）にもＢ１６細胞を接種し、同様の解析を行なった。なお、コロニー数の計測及び統計解析については、上記実施例１と同様にして行なった。
【００６０】
その結果、図３及び４に示した結果から明らかなように、野生型マウスでは肺への転移が検出されたのに対し、Ｅｖａ１ノックアウトマウスにおいては転移を検出することができなかった。すなわち、ホスト（被転移組織）側のＥｖａ１タンパク質の発現を抑制することによっても、メラノーマの転移腫瘍形成を阻害できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
以上説明したように、本発明によれば、被転移組織におけるＥｖａ１タンパク質の機能を抑制することによって、メラノーマの転移を抑制することが可能となる。したがって、本発明は、メラノーマの治療、予防（再発予防）等において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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