(57)【要約】【課題】本願発明は、新規なＳＲＣＡＰ発現を抑制する組成物を提供することを課題とする。【解決手段】本願発明は、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の乳酸菌及び／又はラクトバチルス属の乳酸菌の水溶性画分を有効成分とするＳＲＣＡＰ発現抑制用組成物を提供する。また、前記ラクトバチルス属の乳酸菌が、ラクトバチルス・ヘルベティカスおよびラクトバチルス・ガセリからなる群から選択される１つ以上であるＳＲＣＡＰ発現抑制用組成物を提供する。【選択図】図２
2019210242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス属の乳酸菌及び／又はラクトバチルス属の乳酸菌の水溶性画分を有効成分とするＳＲＣＡＰ発現抑制用組成物。
【請求項２】
前記ラクトバチルス属の乳酸菌が、ラクトバチルス・ヘルベティカス及びラクトバチルス・ガセリからなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のＳＲＣＡＰ発現抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の乳酸菌および/またはラクトバチルス属の乳酸菌の水抽出物を有効成分とするＳＲＣＡＰ発現抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＲＣＡＰはＳＮＦ２／ＳＷＩ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙに属する、Ｓｎｆ２−Ｒｅｌａｔｅｄ  ＣＢＰ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ−ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＣＲＥＢ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎとして同定されたタンパク質であり、多くの転写因子のａｃｔｉｖａｔｏｒとして機能する（非特許文献１）。ＳＲＣＡＰはＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ活性を有し、ＤＮＡの二重らせん構造の解消およびクロマチン構造の再構築に関わり、転写の調整に関与する（非特許文献２）。また、ＳＲＣＡＰのエクソン３４における変異はＦｌｏａｔｉｎｇ−Ｈａｒｂｏｒ症候群の責任遺伝子として知られている（非特許文献３）。    一方、ＳＲＣＡＰはＰ３００／ＣＢＰ（Ｃｒｅｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と相互作用していることが知られ、細胞間認識に関与するＮｏｔｃｈ−１の転写因子としての機能も有する（非特許文献４，５）。Ｃ型肝炎ウイルスのｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３（ＮＳ３）はＳＲＣＡＰと相互作用することによりＰ３００／ＣＢＰとＳＲＣＡＰの相互作用を減弱させる（非特許文献５）。
このようにＳＲＣＡＰはウイルス由来のＮＳと相互作用することから、ＳＲＣＡＰの発現を抑制することは、ＮＳを有するウイルスが感染後に細胞内での増殖を阻害することが期待される。また、ＳＲＣＡＰはｈｅｌｉｃａｓｅであり細胞分裂や転写の調整に影響することが考えられることから、その発現抑制は、ガン細胞、Ｃ型肝炎等のウイルスが感染した細胞、及び炎症性細胞など増殖の抑制が望まれる細胞に対して増殖抑制効果が期待される。
一方、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡに代表されるｇｅｎｅｔｉｃａｌな手法を除き、阻害剤などによってＳＲＣＡＰの発現を抑制する技術は無く、本願の提供する解決手段はいずれの文献にも開示も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Johnston H, Kneer J, Chackalaparampil I, Yaciuk P, Chrivia J.  J. Biol. Chem 1999; 274: 16370-16376
【非特許文献２】Wong, M.M., Cox, L.K., and Chrivia, J.C. 2007；J. Biol. Chem. 282：26132-26139.
【非特許文献３】Nikkel SM, Dauber A, de Munnik S, Connolly M, Hood RL, Caluseriu O, Hurst J, Kini U, Nowaczyk MJ, Afenjar A, Albrecht B, Allanson JE, Balestri P, Ben-Omran T, Brancati F, Cordeiro I, da Cunha BS, Delaney LA, Destree A, Fitzpatrick D, Forzano F, Ghali N, Gillies G, Harwood K, Hendriks YM, Heron D, Hoischen A, Honey EM, Hoefsloot LH, Ibrahim J, Jacob CM, Kant SG, Kim CA, Kirk EP, Knoers NV, Lacombe D, Lee C, Lo IF, Lucas LS, Mari F, Mericq V, Moilanen JS, Moller ST, Moortgat S, Pilz DT, Pope K, Price S, Renieri A, Sa J, Schoots J, Silveira EL, Simon ME, Slavotinek A, Temple IK, van der Burgt I, de Vries BB, Weisfeld-Adams JD, Whiteford ML, Wierczorek D, Wit JM, Yee CF, Beaulieu CL; FORGE Canada Consortium, White SM, Bulman DE, Bongers E, Brunner H, Feingold M, Boycott KM.   Orphanet J. Rare Dis. 2013;8:63-71.
【非特許文献４】Eissenberg JC, Wong M, Chrivia JC. Mol Cell Biol. 2005 25:6559-69.
【非特許文献５】Iwai, A., Takegami, T., Shiozaki, T., Miyazaki, T. PLoS One 6, e20718
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本願発明は、新規なＳＲＣＡＰ発現を抑制する組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者らは、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡに代表されるｇｅｎｅｔｉｃａｌな手法以外で、ＳＲＣＡＰの発現を抑制する技術が無いか鋭意検討したところ、ラクトバチルス属の乳酸菌または乳酸菌由来の成分にＳＲＣＡＰ発現抑制作用があることをつきとめ、本願発明を完成するに至った。
すなわち、本願発明は以下の構成を有する。
〔１〕ラクトバチルス属の乳酸菌及び／又はラクトバチルス属の乳酸菌の水溶性画分を有効成分とするＳＲＣＡＰ発現抑制用組成物。
〔２〕前記ラクトバチルス属の乳酸菌が、ラクトバチルス・ヘルベティカス及びラクトバチルス・ガセリからなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする〔１〕に記載のＳＲＣＡＰ発現抑制用組成物。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、従来にないＳＲＣＡＰの発現を抑制する組成物を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５水溶出画分（実施例品４）をＨＥｐ−２細胞に添加した場合と無添加の場合の当該細胞における蛋白質発現の相関図を示す。
【図２】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５水溶出画分（実施例品４）をＨＥｐ−２細胞へ１００、２００、４００μｇ／ｍＬの濃度で添加した際のＳＲＣＡＰ遺伝子の発現量を示す。遺伝子発現量は、コントロール群（乳酸菌非添加細胞）の遺伝子発現量を１とした相対値で表した（以下、図３、５、６、７において同じ）。また、棒グラフの上部に、コントロール群の遺伝子発現率を１００％としたときの各試験群の遺伝子発現抑制率（％）を示した。
【図３】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５水溶出画分（実施例品４）をＲＳウイルス感染ＨＥｐ−２細胞へ１００、２００、４００μｇ／ｍＬの濃度で添加した際の、ＲＳウイルス由来Ｆ−ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の発現量を示す。また、棒グラフの上部に、コントロール群の遺伝子発現率を１００％としたときの各試験群の遺伝子発現抑制率（増殖抑制率）（％）を示した。
【図４】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５水溶出画分（実施例品４）についての、ＳＲＣＡＰ遺伝子の発現抑制率（％）とＲＳウイルス増殖抑制率（％）との相関を示す。
【図５】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５のｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０によるメタノール溶出画分をＨＥｐ−２細胞へ１００、２００、４００μｇ／ｍＬの濃度で添加した際の当該細胞のＳＲＣＡＰ遺伝子の発現量を示す。
【図６】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５のｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０によるメタノール溶出画分をＨＥｐ−２細胞へ１００、２００、４００μｇ／ｍＬの濃度で添加した際の当該細胞のＲＳウイルス由来Ｆ−ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の発現量を示す。
【図７】ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１をＳＷ４８０細胞に１００μｇ／ｍＬで添加した際の当該細胞のＳＲＣＡＰ発現量を示す。
【図８】ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１をＳＷ４８０細胞に５０、１００、２００μｇ／ｍＬで添加した際の当該細胞の細胞増殖活性（細胞数）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のヒト細胞の増殖抑制に関与するタンパク質の発現を調整する組成物の有効成分は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の乳酸菌および/またはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の乳酸菌の水溶性画分である。
【０００９】
（ラクトバチルス属に属する乳酸菌）
本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌は、ラクトバチルス属に分類される乳酸菌であり、本発明のＳＲＣＡＰ遺伝子抑制作用を有するものであればいずれの種や株であってもよく、種としては、具体的にはラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス等を例示できるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明のラクトバチルス属に属する乳酸菌の菌株としては、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４４５として寄託）、ＳＢＴ２１６１株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７０７として寄託）、ＳＢＴ２１９５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１５３８として寄託）、ＳＢＴ２１９６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１６７６として寄託）、ＳＢＴ００６４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０７９として寄託）、ＳＢＴ０４０２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５５９として寄託）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）が好ましい。
【００１０】
（ラクトバチルス属の乳酸菌の調製）
ラクトバチルス属に属する乳酸菌は、乳酸菌培養の常法に従って培養し、所望の量を調製すればよい。調製の一態様を以下に示す。還元脱脂乳培地を用いてラクトバチルス属に属する乳酸菌を培養し、得られた培養物を遠心分離により集菌することにより菌体を得る。得られた菌体をそのまま用いてもよいし、濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供した菌体を用いることもできる。菌体は加熱乾燥などにより死菌体にしたもの用いることもできる。
【００１１】
（ラクトバチルス属の乳酸菌の水溶性画分）
本発明のラクトバチルス属に属する乳酸菌の水溶性画分の調製法の一態様を以下に示す。ラクトバチルス属の菌体の凍結乾燥末を緩衝液に懸濁し、８０℃、３０分間程度加熱して加熱菌体を得る。これを遠心分離により上清を除いた後、純水を加え、氷上で超音波により菌体を破砕する。破砕液を遠心分離とフィルター処理により沈殿を除き、ラクトバチルス属に属する乳酸菌の水溶性画分を得る。これを乾固し秤量した抽出物を可能な限り少量の純水で再懸濁し、疎水性吸着カラムに吸着させた後、純水で親水性分子を溶出し水溶出画分を得る。この水溶出画分は、溶媒を乾固させ粉末化したものとすることもできる。本発明のラクトバチルス属の乳酸菌の水溶性画分は、このようにして得られる水溶性画分が好ましく、さらに好ましくは、水溶性画分を疎水性カラムに吸着させて水で溶出した、より親水性の画分である。
【００１２】
（利用方法）
上記したとおり、本発明の組成物は濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供した菌体、加熱乾燥などにより得られる死菌体も有効性分とすることができることから、製剤、飲食品、飼料の原料として広く用いることができる。製剤化に際しては製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して用いることができ、これらの乾燥物、濃縮物、ペースト状物も含有される。また、ラクトバチルス属に属する乳酸菌のＳＲＣＡＰ遺伝子発現抑制作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能であり、これらを経口的に投与することが望ましい。
本発明のＳＲＣＡＰ遺伝子発現抑制剤はどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
本発明の組成物の摂取量は、投与対象者のガン、Ｃ型肝炎、アレルギー等の症状、年齢などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、通常成人の場合、０．０１〜５，０００ｍｇ程度摂取すればよい。
本発明のＳＲＣＡＰ発現抑制用組成物を含む飲食品は、ＳＲＣＡＰ発現抑制用飲食品としての利用価値があり、本飲食品を摂取することにより、各種のウイルス感染からの予防ができ、また感染した場合でも軽症に抑えられ、また早い回復が期待できる。
動物用飼料に含まれる場合は、これを摂取した動物も同様の効果が期待できる。
また、ＳＲＣＡＰはｈｅｌｉｃａｓｅであり細胞分裂や転写の調整に影響すると考えられることから、本発明のＳＲＣＡＰ発現抑制用組成物を含む医薬は、各種のウイルス感染の治療又は予防用医薬、各種のガンの治療又は予防用医薬として利用することができる。
【００１３】
（ＳＲＣＡＰ遺伝子発現抑制作用の評価方法）
一般的に、遺伝子の「発現」という用語は、その遺伝子の翻訳産物すなわちタンパク質の産生のことを指すが、そのほかにも、その遺伝子の転写産物すなわちｍＲＮＡの産生のことを指すこともある。本発明では、遺伝子の「発現」と言えば特にことわりがない限りタンパク質のレベルにおける発現、ｍＲＮＡのレベルにおける発現（遺伝子の転写）のいずれをも指すものとする。
したがって、本発明におけるＳＣＲＡＰ遺伝子の発現の抑制作用は、特にことわりがない限り、タンパク質量の減少、ｍＲＮＡ量の減少、遺伝子の転写量の減少と同義で用いられる。
本実施例では、本発明の有効成分であるラクトバチルス属の乳酸菌菌体またはその水溶性画分を試験対象細胞に添加した場合と無添加の場合とでＳＲＣＡＰ遺伝子の発現量に違いがあるかどうかを検出する方法により評価した。
【００１４】
（ウイルス増殖能・細胞増殖抑制能の評価方法）
実施例に記載の方法で評価が可能である。すなわち、細胞増殖抑制能の場合は、本発明の有効成分であるラクトバチルス属の乳酸菌菌体またはその水溶性画分を試験対象細胞に添加した場合と無添加の場合とで細胞増殖作用に違いがあるかどうかを検出する方法により評価できる。
また、ウイルス増殖抑制能は、ウイルス感染細胞におけるウイルス由来遺伝子の発現量について、本発明の有効成分の添加有無により違いがあるかどうかを検出することにより評価できる。
【実施例】
【００１５】
以下に、本発明の効果を確認する試験に用いる乳酸菌、および乳酸菌水溶性画分、及び比較試験に用いる乳酸菌メタノール画分の調製方法を示す。
【００１６】
（実施例品１）ラクトバチルス・ガセリ菌体
ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）ＳＢＴ２０５５をＭＲＳ  ｂｒｏｔｈで１６時間培養した後、遠心分離により菌体を分離した。菌体はＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）で２回、超純水で１回洗浄した後、凍結乾燥しＳＢＴ２０５５菌体とした。
【００１７】
（実施例品２）ラクトバチルス・ガセリ加熱菌体
実施例品１の凍結乾燥菌末をＰＢＳ（−）に懸濁し、８０℃、３０分間加熱したものを加熱菌体とした。
【００１８】
（実施例品３）ラクトバチルス・ガセリ由来水溶性画分
実施例品２に純水を加え、氷上で超音波により菌体を破砕した。破砕液を５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離と０．２２μｍのフィルターを用いて沈殿を除き、得られた液体をラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５由来水溶性画分とした。
【００１９】
（実施例品４）ラクトバチルス・ガセリ水溶出画分
秤量した抽出物（実施例品３）を可能な限り少量の純水で再懸濁し、１０ｍＬの体積の疎水性吸着カラムｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０（三菱ケミカル社製）に吸着させた後、３カラム体積（３０ｍＬ）の純水で親水性分子を溶出し水溶出画分とし、遠心濃縮器を用いて溶媒を乾固させ、抽出物を秤量し、これを実施例品４とした。
【００２０】
（比較例品１）ラクトバチルス・ガセリのメタノール溶出画分
実施例品４の水溶出画分を得た後のＨＰ−２０カラムに３０ｍＬのメタノールをアプライし、実施例品４より疎水性が高い物質群を回収し、遠心濃縮後、メタノール抽出画分を得て、これを比較例品１とした。
【００２１】
（実施例品５）ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１をＭＲＳ  ｂｒｏｔｈで１６時間培養した後、遠心分離により菌体を分離した。菌体はＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）で２回、超純水で１回洗浄した後、凍結乾燥し、これを実施例品５とした。
【００２２】
〔試験例１〕ラクトバチルス・ガセリによるＳＲＣＡＰ発現抑制作用の検証１
（１）試験方法
１０ｃｍ  ｄｉｓｈに播種したＨＥｐ−２細胞に対し、５０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙの時点でラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５由来の水溶性画分（実施例品４）を、終濃度２．４ｍｇ／ｍＬとなるよう加え、３日間培養した。ネガティブコントロール（ＮＣ）として同量の滅菌水を加えたものを用いた。
細胞をＰＢＳで５回洗浄した後、文献（Ｍａｓｕｄａ  Ｔ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｍ，Ｉｓｈｉｈａｍａ  Ｙ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００８；７：７３１−７４０）により、１ｍＬの溶解バッファー（１２ｍＭ  デオキシコール酸ナトリウム、１２ｍＭサルコシン酸ナトリウム、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いて氷上で細胞を溶解した。
細胞溶解物を９５℃、５分加熱変性後、超音波発生装置により破砕した。これを１５，０００ｒｐｍ３０分遠心することにより不溶成分を除去し、上清を可溶化タンパク質群として回収後、ＢＣＡ  ａｓｓａｙによりタンパク定量を行った。
可溶化タンパク質１００μｇを含む溶液に終濃度１００ｍＭになるようＤＴＴ溶液を加え室温で３０分静置後、終濃度が５０ｍＭになるようＩＡＡ溶液を添加し暗所で３０分静置することで、タンパク質の還元アルキル化を行った。その溶液に５倍量の５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液を添加し、溶液を弱塩基性にした後、修飾により自己消化を抑制された質量分析グレードのトリプシンを総タンパク質量の１／１００（１μｇ）を添加し３７℃１６時間インキュベートすることでタンパク質を消化した。
消化されたタンパク質溶液と等量の酢酸エチルを加え、さらに終濃度０．５％となるようにトリフルオロ酢酸を添加した。激しく攪拌後、デオキシコール酸を含む上層を１５，０００ｒｐｍ  ２分の遠心ぶりにより除去し、ペプチド群が含まれる水層（下層）を回収後、遠心濃縮器により溶媒を乾固させた。
乾固したものを０．１％トリフルオロ酢酸を含む水で再溶解し、あらかじめ平衡化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー（ＳＤＢ）、またはオクタデシルシリル（ＯＤＳ）基を有するシリカゲルが充填された脱塩・濃縮チップで精製した。得られた溶出液を遠心濃縮器で乾固させ、０．１％ギ酸、５％アセトニトリルからなる水溶液２０μＬへ再懸濁させて、これをＬＣ−ＭＳサンプルとした。
リニアイオントラップ電場型ＦＴ質量分析装置であるＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を用いてプロテオミクス解析を行った。流速は３００ｎＬ／ｍｉｎ、分離カラムはカラム長１５ｃｍのＯＤＳを用いた。
データ解析はＭａｘＱｕａｎｔおよびＰｅｒｓｅｕｓソフトウェアにより、定量は非ラベル化定量方法（ＬＦＱ）を採用した（Cox J, Mann M.  Nat. Biotechnol. 2008 Dec;26(12):1367-72.及びCox J, Hein MY, Luber CA, Paron I, Nagaraj N, Mann M.  Mol Cell Proteomics. 2014 Sep;13(9):2513-26.）。
【００２３】
（２）試験結果
合計１２５０種類のタンパク質を同定した。図１に実施例品４をＨＥｐ−２細胞への添加有無による当該細胞のタンパク質発現変化を示した（縦軸：ＳＢＴ２０５５乳酸菌水溶出画分を添加、横軸：２．４ｍｇ／ｍＬの濃度でＳＢＴ２０５５乳酸菌水溶出画分を無添加）。
（＊）LFQvalueは、図１より横軸（添加）：25.0723、縦軸(無添加）：20.5851であり、これらは「log2-transformed」でlog2に変換された値である。
【００２４】
〔試験例２〕ラクトバチルス・ガセリによるＳＲＣＡＰ発現抑制作用の検証２
（１）試験方法
ＨＥｐ−２細胞を３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で、５００μｌずつ２４ｗｅｌｌ細胞培養プレートに播種して、一晩培養したものを試験に供した（１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。ＳＢＴ２０５５水溶出画分（実施例品４）を終濃度が１００、２００、４００μｇ／ｍＬの条件で添加した。ネガティブコントロールには乳酸菌成分を含まないＰＢＳ（−）を添加した。添加後、２４時間培養し、培養上清を除去して再びＳＢＴ２０５５水溶出画分（実施例品４）を同濃度で添加し、４８時間培養した。
培養上清を除去して、Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ｗｅｌｌに０．４ｍｌ添加して細胞を溶解した。溶液の２０％量のクロロホルムを添加し、３０秒間チューブを激しく振とうした。室温で３分間保持した後、１３，０００ｇ、４℃、１５分間遠心し、上層を別チューブに回収した。回収した上層に対して等量のイソプロパノールを添加し、穏やかにチューブを転倒攪拌した。室温で５分間以上静置し、２０，０００ｇ、４℃、１０分遠心した。上清を除去し、０．５ｍｌの７５％エタノール水溶液をチューブに添加して、穏やかに転倒攪拌した。２０，０００ｇ、４℃、５分間遠心し、上清を除去した上で、３０分間以上自然乾燥させた。その後、ＤＥＰＣ処理水を２０μｌ添加し、５５℃で１０分間加熱した。２６０ｎｍ吸光度測定によってＲＮＡ濃度を算出した。また、上記ＲＮＡ抽出はＴｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔによる方法に限定されず、ＲＮＡＥａｓｙ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）などの抽出キットを用いることもできる。
ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ）など逆転写酵素によるポリメラーゼ反応により、取得したＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成した。ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲキット（日本ジェネティクス）などのＤＮＡポリメラーゼを用いて、リアルタイムＰＣＲ法によりＳＲＣＡＰの遺伝子について発現を評価した。内在性コントロールとしてはヒトＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。試験に使用したプライマーの塩基配列は以下に示す。
SRCAP-forward: CTCCACTGCTACCTCGTTTGGT（配列表配列番号１）
SRCAP-reverse: GGAAAATCCGTTCCAGGCGTTC（配列表配列番号２）
GAPDH-forward: GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG（配列表配列番号３）
GAPDH-reverse: ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA（配列表配列番号４）
【００２５】
（２）試験結果
図２にＳＢＴ２０５５水溶出画分（実施例品４）をＨＥｐ−２細胞へ１００、２００、４００μｇ／ｍＬの濃度で添加した際のＳＲＣＡＰ遺伝子の発現量変化を示す。
その結果、１００、２００、４００μｇ／ｍＬの濃度で添加した際、それぞれ３２、３９、５２％のＳＲＣＡＰ遺伝子の発現の阻害が見られた。
このことからラクトバチルス・ガセリの水溶性画分は、濃度依存的にＳＲＣＡＰ遺伝子発現を阻害をすることがわかった。
【００２６】
〔試験例３〕ラクトバチルス・ガセリによるウイルス増殖抑制効果に関する試験
ＨＥｐ−２細胞にＲＳウイルスを感染させ、感染細胞におけるＲＳＶ由来Ｆ−ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子を検出することによりラクトバチルス・ガセリのウイルス増殖抑制効果を検証した。
（１）ＨＥｐ−２細胞へのＲＳウイルス感染実験
Ｄ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）  ｗｉｔｈ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ（シグマアルドリッチ社）に対して、Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ社）を５−１０％量、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｗａｋｏ、ｆｉｎａｌ  １００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ−１００μｇ／ｍｌ）を１％量添加したものを培養用培地とした。培地はあらかじめ３７℃に加温して使用した。また、その他の試薬類に関しても、あらかじめ３７℃に加温して使用し、全ての細胞培養は３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで実施した。
ＨＥｐ−２細胞を３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で、５００μｌずつ２４ｗｅｌｌ細胞培養プレートに播種して、一晩培養したものを試験に供した（１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。
培養用培地からＦＢＳを除いたものを感染用培地とした。２４ｗｅｌｌプレートに播種したＨＥｐ−２細胞に対してＳＢＴ２０５５水溶出画分（実施例品４）を終濃度が１００、２００、４００μｇ／ｍＬの条件で添加した。ネガティブコントロールには乳酸菌成分を含まないＰＢＳ（−）を添加した。添加後、２４時間培養し、培養上清を除去して、０．６ｍｌのＰＢＳ（−）でｗｅｌｌを２回洗浄した上で、ＲＳＶ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ（以下ＲＳＶ）を懸濁した感染用培地を０．５ｍｌずつ添加した（ＲＳＶの最終力価は０．０００６７  ＴＣＩＤ５０／ｃｅｌｌ）。感染直後にも、抽出成分を同濃度で添加した。感染後、４８時間培養した。
【００２７】
（２）ＲＳＶ由来Ｆ−ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の検出試験方法
培養上清を除去して、Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ｗｅｌｌに０．４ｍｌ添加して細胞を溶解した。溶液の２０％量のクロロホルムを添加し、３０秒間チューブを激しく振とうした。室温で３分間保持した後、１３，０００ｇ、４℃、１５分間遠心し、上層を別チューブに回収した。回収した上層に対して等量のイソプロパノールを添加し、穏やかにチューブを転倒攪拌した。室温で５分間以上静置し、２０，０００ｇ、４℃、１０分遠心した。上清を除去し、０．５ｍｌの７５％エタノール水溶液をチューブに添加して、穏やかに転倒攪拌した。２０，０００ｇ、４℃、５分間遠心し、上清を除去した上で、３０分間以上自然乾燥させた。その後、ＤＥＰＣ処理水を２０μｌ添加し、５５℃で１０分間加熱した。２６０ｎｍ吸光度測定によってＲＮＡ濃度を算出した。また、上記ＲＮＡ抽出はＴｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔによる方法に限定されず、ＲＮＡＥａｓｙ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）などの抽出キットを用いることもできる。
ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ）など逆転写酵素によるポリメラーゼ反応により、取得したＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成した。ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲキット（日本ジェネティクス）などのＤＮＡポリメラーゼを用いて、リアルタイムＰＣＲ法によりＲＳＶのＦタンパク質の遺伝子（ＲＳＶＦ）について発現を評価した。内在性コントロールとしてはヒトＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。試験に使用したＲＳＶＦプライマーの塩基配列は以下に示す。
使用したＤＮＡプライマー
RSVF-forward: GGAACAAGTTGTTGAGGTTTATGAATATGC（配列表配列番号５）
RSVF-reverse: TTCTGCTGTCAAGTCTAGTACACTGTAGT（配列表配列番号６）
【００２８】
（３）試験結果
図３にＳＢＴ２０５５水溶出画分（実施例品４）を１００、２００、４００μｇ／ｍＬの濃度（菌体相当量）で添加した際の、ＲＳウイルス由来Ｆ−ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の相対的な発現量を示す。乳酸菌成分を添加しないネガティブコントロール（ＮＣ）に対し、ＳＢＴ２０５５水溶出画分（実施例品４）を１００、２００、４００μｇ／ｍＬの濃度で添加した際、濃度依存的にそれぞれ８２、９４、９９．９６％のＲＳウイルス増殖阻害が認められた。
（４）考察
前述のとおり、図２の結果より、ＳＢＴ２０５５水溶出画分（実施例品４）はＳＲＣＡＰの発現を添加濃度依存的に抑制することがわかった。
図４に、ラクトバチルス・ガセリ水溶出画分についての、ＳＲＣＡＰ遺伝子の発現抑制率とＲＳウイルス増殖抑制率との相関を示す。ＳＲＣＡＰ遺伝子の発現抑制率と、ＲＳウイルス増殖抑制率の間には明瞭な正の相関が認められた。近似直線の傾きから（ＲＳウイルス増殖抑制率）／（ＳＲＣＡＰ遺伝子発現抑制率）＝１．１９２となり、ウイルス増殖抑制率とＳＲＣＡＰ発現抑制率はほぼ１：１の関係にあることが示された。このことは、ウイルスタンパク質と結合し得るＳＲＣＡＰ遺伝子の発現抑制が、ＲＳウイルスを抑制している一因となっていることを示唆する。
【００２９】
〔比較試験例１〕ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５由来のメタノール溶出画分によるＲＳウイルス増殖抑制作用とＳＲＣＡＰ発現抑制作用
比較試験例として、ラクトバチルス・ガセリ由来のメタノール溶出画分について、試験例３と同様の試験を行い、当該成分には、ウイルス増殖抑制効果が無いことを確認した。
（１）試験方法
ラクトバチルス・ガセリのメタノール溶出画分（比較例品１）をＨＥｐ−２細胞へ１００、２００、４００ｕｇ／ｍＬの濃度で添加した以外は、実施例品４による試験例３と同様の手法で試験を行った。
【００３０】
（２）試験結果
図５に比較例品１をＨＥｐ−２細胞へ１００、２００、４００μｇ／ｍＬの濃度で添加した際のＳＲＣＡＰの遺伝子発現量を、図６にウイルス増殖抑制率を示す。メタノール溶出画分を２００、４００μｇ／ｍＬ（菌体相当量）で添加した際、２９％、４１％のウイルス増殖阻害が認められたが、ＳＲＣＡＰ抑制効果は認められなかった。
本結果より、ラクトバチルス・ガセリのＨＰ−２０カラムのメタノール溶出画分にはＳＲＣＡＰ遺伝子発現抑制効果は認められず、ＲＳＶの抑制も濃度依存的とは言えないことからＳＲＣＡＰの抗ＲＳＶへの関与は認められない。
【００３１】
〔試験例４〕ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）によるＳＲＣＡＰ遺伝子の発現抑制と細胞増殖抑制効果
ラクトバチルス・ヘルベティカスによるヒト大腸ガン細胞の増殖抑制効果とＳＲＣＡＰ発現抑制作用を検証するための試験を行った。
（１）試験方法
（ｉ）ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体の調整
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１７１をＭＲＳ  ｂｒｏｔｈで１６時間培養した後、遠心分離により菌体を分離した。菌体はＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）で２回、超純水で１回洗浄した後、凍結乾燥し、ＳＢＴ２１７１菌体とした。
ヒト大腸ガン細胞ＳＷ４８０を６ｃｍ  ｄｉｓｈに播種し５０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙの時点で、ＳＢＴ２１７１菌体を最終濃度５０、１００、２００μｇ／ｍＬとなるように添加し（ＳＢＴ２１７１群）、コントロールとして、ＳＢＴ２１７１菌体を含まないＰＢＳのみを添加した（コントロール群）。両群ともに３ｄｉｓｈずつ設置し、培養１日ごとに細胞数を計測してｇｒｏｗｔｈ  ａｓｓａｙを行った。また、ＲＮＡｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いてＷ４８０細胞のＳＲＣＡＰ遺伝子の発現量を測定した。内在性コントロール遺伝子としてヒトＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。
【００３２】
（２）試験結果
図７にＳＷ４８０細胞にＳＢＴ２１７１を１００μｇ／ｍＬで添加した際の当該細胞のＳＲＣＡＰ遺伝子発現量を示す。遺伝子発現量は、コントロール群（ＳＢＴ２１７１非添加細胞群）の遺伝子発現量を１とした相対値で表した。ＳＢＴ２１７１添加群はコントロール群に対して、有意にＳＲＣＡＰ遺伝子の発現量を抑制することが認められた。
また、図８にＳＷ４８０細胞にＳＢＴ２１７１を５０、１００、２００μｇ／ｍＬで添加した際の細胞のｇｒｏｗｔｈ  ａｓｓａｙ結果を示す。これによりＳＢＴ２１７１はヒト大腸ガンＳＷ４８０の増殖を抑制することが明らかとなった。
（３）考察
以上より、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）は、ＳＲＣＡＰ遺伝子の発現を抑制し、ガン細胞の増殖を抑制することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のラクトバチルス属の乳酸菌または乳酸菌水溶性画分を有効成分とするＳＲＣＡＰ発現抑制用組成物は、ＳＲＣＡＰの発現を抑制し、ガン細胞の増殖に起因する各種のガン疾患、ＲＳウイルスやＣ型等の各種肝炎ウイルス肝炎ウイルスが感染した細胞の増殖に起因するウイルス性疾患、及び炎症性細胞の増殖に起因する花粉症等の各種アレルギー症状の予防や治療に広く利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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