(57)【要約】      （修正有）【課題】幹細胞および幹細胞に由来する細胞を単離するための方法の提供。【解決手段】目的の細胞を培養動物細胞の混合物から単離する方法であって、前記目的の細胞が幹細胞または幹細胞に由来する細胞であり、前記方法が、前記目的の細胞および少なくとも１つの他の細胞型を含み基体に接着している培養動物細胞の混合物を、前記培養動物細胞の混合物中の前記少なくとも１つの他の細胞型に対して前記目的の細胞を選択的に前記基体から剥離するのに十分な剥離力に供するステップを含み、それによって前記目的の細胞を前記培養動物細胞の混合物から単離する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の細胞を培養動物細胞の混合物から単離する方法であって、前記目的の細胞が幹細
胞または幹細胞に由来する細胞であり、前記方法が、前記目的の細胞および少なくとも１
つの他の細胞型を含み基体に接着している培養動物細胞の混合物を、前記培養動物細胞の
混合物中の前記少なくとも１つの他の細胞型に対して前記目的の細胞を選択的に前記基体
から剥離するのに十分な剥離力に供するステップを含み、それによって前記目的の細胞を
前記培養動物細胞の混合物から単離する、方法。
【請求項２】
幹細胞を前記培養動物細胞の混合物から単離するステップを含む、請求項１に記載の方
法。
【請求項３】
前記幹細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項２
に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞が成体幹細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの他の細胞型が、フィーダー細胞、親体細胞、部分的に再プログラ
ム化された細胞、自発的に分化した幹細胞、および／または直接分化した細胞である、請
求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞がｉＰＳ細胞であり、前記少なくとも１つの他の細胞型が、親体細胞および
／または部分的に再プログラム化された細胞である、請求項２〜５のいずれか１項に記載
の方法。
【請求項７】
前記幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、前記少なくとも１つの他の細胞型がフ
ィーダー細胞である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、前記少なくとも１つの他の細胞型が自
発的に分化した幹細胞である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、前記少なくとも１つの他の細胞型が、
直接分化した細胞、場合により、分化系列決定済みの細胞、前駆細胞、または最終分化細
胞である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が、凝集塊の部分として培養物中で成長する、請求項２〜９のいずれか１項
に記載の方法。
【請求項１１】
前記幹細胞が、幹細胞の凝集塊の部分として前記基体から剥離する、請求項１０に記載
の方法。
【請求項１２】
前記単離された幹細胞が、少なくとも１つの多能性マーカーの発現を維持している、請
求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞が、２つ以上の異なる細胞型を生成する能力を保持している、請求項２〜１
２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞を選択的に剥離するのに十分である剥離力が、７０から１６０ｄｙｎｅ／ｃ
ｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞を選択的に剥離するのに十分である剥離力が、８０から１２５ｄｙｎｅ／ｃ
ｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養動物細胞の混合物から幹細胞由来の分化系列決定済みの細胞を単離するステッ
プを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記幹細胞由来の分化系列決定済みの細胞が、幹細胞由来の神経分化決定済みの細胞で
ある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞由来の神経分化決定済みの細胞が神経ロゼット細胞である、請求項１７に記
載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの他の細胞型が、幹細胞、フィーダー細胞、親体細胞、部分的に再
プログラム化された細胞、自発的に分化した幹細胞、前駆細胞、および／または最終分化
細胞である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記幹細胞由来の分化系列決定済みの細胞を選択的に剥離するのに十分である剥離力が
、４０から１６０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす、請求項１６〜１９の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養動物細胞の混合物から幹細胞由来の前駆細胞を単離するステップを含む、請求
項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記幹細胞由来の前駆細胞が、幹細胞由来の神経前駆細胞または造血前駆細胞である、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離された幹細胞由来の前駆細胞が、２つ以上の神経細胞型を生成することができ
る幹細胞由来の神経前駆細胞である、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの他の細胞型が、幹細胞、フィーダー細胞、親体細胞、部分的に再
プログラム化された細胞、自発的に分化した幹細胞、分化系列決定済みの細胞、および／
または最終分化細胞である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記幹細胞由来の前駆細胞を選択的に剥離するのに十分である剥離力が、２０から７０
ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす、請求項２１〜２４のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項２６】
前記培養動物細胞の混合物から幹細胞由来の最終分化細胞を単離するステップを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記幹細胞由来の最終分化細胞が心筋細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの他の細胞型が、幹細胞、フィーダー細胞、親体細胞、部分的に再
プログラム化された細胞、自発的に分化した幹細胞、分化系列決定済みの細胞、および／
または前駆細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記幹細胞由来の前駆細胞を選択的に剥離するのに十分である剥離力が、２０から７０
ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす、請求項２６〜２８のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項３０】
前記目的の細胞が、前記少なくとも１つの他の細胞型に比べてより低い剥離力で剥離す
る、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記目的の細胞が、前記少なくとも１つの他の細胞型に比べてより高い剥離力で剥離す
る、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記単離された目的の細胞が生存可能である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の
方法。
【請求項３３】
前記単離された目的の細胞が、分裂し、子孫細胞を生成する能力を維持している、請求
項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
複数の目的の細胞が少なくとも９０％の純度で単離される、請求項１〜３３のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記動物細胞の混合物中の前記目的の細胞の少なくとも７０％が単離される、請求項１
〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記目的の細胞が、前記動物細胞の混合物中の細胞の４０％未満、場合により前記動物
細胞の混合物中の細胞の１０％未満を構成する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の
方法。
【請求項３７】
前記目的の細胞が、前記動物細胞の混合物中の細胞の少なくとも６０％、場合により前
記動物細胞の混合物中の細胞の少なくとも９０％を構成する、請求項１〜３６のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記培養動物細胞が、哺乳動物細胞、場合によりヒト細胞である、請求項１〜３７のい
ずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記単離された細胞を培養するステップをさらに含む、請求項１〜３８のいずれか１項
に記載の方法。
【請求項４０】
前記単離された細胞を、フローサイトメトリー、生化学的分析、および／または遺伝子
発現分析によって評価するステップをさらに含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載
の方法。
【請求項４１】
前記動物細胞の前記混合物に、検出可能な標識および／または親和性試薬を付着させる
ステップを含まない、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記剥離力が、流体学的力、遠心力、および／または磁力によって印加される、請求項
１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
マイクロ流体装置中で行われる、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記培養動物細胞の混合物が前記剥離力に１〜６０分間さらされる、請求項１〜４３の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記培養動物細胞の混合物が前記剥離力に２〜２０分間さらされる、請求項１〜４３の
いずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の情報］
本出願は、２０１１年６月２１日出願の米国仮特許出願第６１／４４９，３２３号の利
権を主張するものであり、その開示全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、部分的に、米国立総合医科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）から許可番号第ＲＯ１
ＧＭ０６５９１８−０１号、米国国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）から第ＤＢＩ−０６４９８３３号、および国立癌研究所（Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から第ＲＣ１ＣＡ１４４８２５号の支
援でなされた。米国政府は、本発明に対するある種の権利を有する。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、幹細胞および幹細胞に由来する細胞を単離するための方法に関する。詳しく
は、本発明は、選択的な剥離力の使用に基づく、幹細胞および幹細胞に由来する細胞を単
離するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
線維芽細胞および他の体細胞からのヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞の産生は、多数
の治療的取組みのための自己および同種間の細胞源、ならびにヒトの発生および疾患の新
規なモデルを生成するための、極めて有望な戦略を代表する２〜４。再プログラム化のブ
レークスルーは１、３、５、線維芽細胞において、Ｏｃｔ３／４（Ｐｏｕ５ｆ１としても
知られている）、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃという４因子のレトロウイルス
の形質導入を伴い、その後、レトロウイルスおよびレンチウイルス１、２、７、８、トラ
ンスポゾン９、隣接ｌｏｘＰ挿入（ｌｏｘＰ−ｆｌａｎｋｅｄ）レンチウイルス１０、非
組込みアデノウイルス１１、１２、およびプラスミド１３、タンパク質１４、ならびにＲ
ＮＡ１５、１６を用いて、再プログラム化方法における開発が進められている６。再プロ
グラム化された細胞は、典型的にはマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）または同質遺伝子の
ヒト線維芽細胞フィーダー層上で培養され、引き続き増殖のために、多能性細胞様コロニ
ーの機械的解離によってフィーダー層に移植される１、３、１７。残りの親細胞またはフ
ィーダー層の細胞は、実験上の変動性、病原性の汚染、および潜在的な免疫原性を引き起
こす１８。
【０００５】
ｉＰＳ細胞培養物は、未分化の幹細胞、非誘導および部分的に誘導された親細胞、なら
びに自発的に分化した誘導体の存在のために、しばしば不均質である１９。自発的な分化
の不可避の問題は、細胞分割比が低い２０、２１、フィーダー培養物が最適ではない２２
、成長因子２３、およびフィーダー層フリーの基体の品質２４から生じる。最良の細胞培
養条件下でさえ、ある程度の自発的な分化はよくあることであり、外見上ランダムな経路
に沿っておこる２５〜２９。自発的に分化した（ＳＤ）−ｉＰＳ細胞は、多能性の低下を
示し、しばしばｉＰＳ細胞培養物に夾雑し、培養物の過成長をもたらし、残りの多能性幹
細胞の質を損なう２３、３０、１９。細胞夾雑の問題はまた、特定の系統を産生するため
の定方向分化のプロトコールにおいて明らかである３１。例えば、神経系列への分化は段
階的なプロセスであり、神経ロゼットなどの中間段階は、線維芽細胞様の細胞および残り
の未分化の多能性幹細胞が夾雑しているため、手作業の選別を要する３２、３３。
【０００６】
高品質のｉＰＳ細胞および胚性幹（ｈＥＳ）細胞の培養物を増殖させるための現在の方
法は、主に、手作業の単離２６、２７、３４〜３７のみか、または酵素的な解離方法との
組合せに頼っている。未分化の多能性コロニー同様、複能性（ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔ
）神経ロゼットおよびニューロスフィアは、典型的には目視および定性的な測定基準に基
づいて選別され、神経前駆細胞へのさらなる分化のために移植される３１、３２、３８。
このような方法は、手間がかかり、多くの時間を要し、熟練作業を必要とし、未分化の細
胞を形態学的に見分ける能力に大いに依存する。さらに、品質管理がないことは、再現性
およびこれら培養物の一貫性に影響を及ぼす。大容量の酵素的継代のための多くの試薬が
開発されている一方で、このような方法はｉＰＳ細胞に対して選択的ではなく、そのため
望ましくない細胞がしばしば移植される３５、３６、３９。さらに、多くの酵素的方法は
、手作業または機械的な継代に比べて、核型異常を引き起し得る３４〜３７。酵素的継代
における他の技術的不都合には、解離させたｉＰＳ細胞を、クローンの生存を改善するた
めにフィーダー細胞上に再プレーティングすることによって、多細胞のコロニーとして再
凝集させる必要性が含まれる２０。抗体標識した表現型マーカーに基づくフローサイトメ
トリー選別２１、２３は、未分化の集団の純度を大幅に濃縮することができるが、この方
法は、ｉＰＳ細胞を単一細胞に解離することを必要とし、これによって収縮仲介性のプロ
グラムされた細胞死が誘発され４０、４１、プレーティングされた細胞は緊密に固まった
コロニーを形成することができない（図１Ｄ）。さらに、抗体標識の使用は、治療適用に
はあまり望ましくない。
【０００７】
ｉＰＳ細胞の精製に対する現在の技術は、継代手順が依然としてボトルネックであり、
数々の他の弱点に悩まされているので、手間のかかる手作業の単離、ｉＰＳ細胞の単一細
胞への酵素的解離、および／または抗体もしくは他の試薬での標識化を必要とせずに、未
分化（ＵＤ）−ｉＰＳ細胞のコロニーを、夾雑性の親細胞、フィーダー細胞、または分化
した細胞から、より効果的に分離することができる改善された技術を開発する必要性が大
いにある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、部分的に、細胞の表現型の状態によって決定される、幹細胞（例えば、未分
化の幹細胞）および幹細胞に由来する細胞に付随する、独特の「接着シグネチャー」の本
発明者らの実証に基づくものである。本発明は、剥離力を用いて１または複数の目的の細
胞型を選択的に単離するための、幹細胞および幹細胞誘導体の、他の細胞に比べた、接着
強度における違いを利用するものである。有利には、本発明の方法は、ハイスループット
分析、リアルタイムイメージング、インライン生化学の、遺伝学的な、および／または細
胞数測定の処理に適用できる。
【０００９】
したがって、一態様として、本発明は、幹細胞または幹細胞に由来する細胞である目的
の細胞を動物細胞（例えば、培養動物細胞）の混合物から単離する方法であって、目的の
細胞および少なくとも１つの他の細胞型を含む、基体に接着している動物細胞の混合物を
、動物細胞の混合物中の少なくとも１つの他の細胞型に対して、目的の細胞を選択的に基
体から剥離するのに十分である剥離力にさらすステップを含み、それによって目的の細胞
を動物細胞の混合物から単離する方法を提供する。
【００１０】
実施形態において、この方法は、幹細胞を動物細胞の混合物から単離するステップを含
む。場合により、幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であ
る。場合により、幹細胞は成体幹細胞である。
【００１１】
目的の細胞が幹細胞である実施形態において、少なくとも１つの他の細胞型は、フィー
ダー細胞、親体細胞、部分的に再プログラム化された細胞、自発的に分化した幹細胞、お
よび／または直接分化した細胞である。
【００１２】
実施形態において、目的の細胞は、凝集塊の部分として培養物中で成長する幹細胞であ
る。
【００１３】
実施形態において、目的の細胞は、幹細胞の凝集塊の部分として基体から剥離する幹細
胞である。
【００１４】
実施形態において、単離された目的の細胞は、少なくとも１つの多能性マーカーの発現
を維持し、かつ／または２以上の異なる細胞型を生成する能力を保持している、単離され
た幹細胞である。
【００１５】
実施形態において、目的の細胞は幹細胞であり、幹細胞を選択的に剥離するのに十分で
ある剥離力は、７０から１６０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の、場合により８０から１２５ｄ
ｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす。
【００１６】
実施形態において、この方法は、動物細胞の混合物から、幹細胞由来の分化系列決定済
みの細胞、場合により、神経ロゼット細胞などの幹細胞由来の神経分化決定済みの細胞を
単離するステップを含む。
【００１７】
目的の細胞が幹細胞由来の分化系列決定済みの細胞である場合、実施形態において、少
なくとも１つの他の細胞型は、幹細胞、フィーダー細胞、親体細胞、部分的に再プログラ
ム化された細胞、自発的に分化した幹細胞、前駆細胞、および／または最終分化細胞であ
る。
【００１８】
実施形態において、幹細胞由来の分化系列決定済みの細胞を選択的に剥離するのに十分
である剥離力は、４０から１６０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす。
【００１９】
実施形態において、この方法は、動物細胞の混合物から幹細胞由来の前駆細胞を単離す
るステップを含み、場合により、幹細胞由来の前駆細胞は幹細胞由来の神経前駆細胞、ま
たは造血前駆細胞である。
【００２０】
実施形態において、目的の細胞は幹細胞由来の前駆細胞であり、少なくとも１つの他の
細胞型は、幹細胞、フィーダー細胞、親体細胞、部分的に再プログラム化された細胞、自
発的に分化した幹細胞、分化系列決定済みの細胞、および／または最終分化細胞である。
【００２１】
実施形態において、幹細胞由来の前駆細胞を選択的に剥離するのに十分である剥離力は
、２０〜７０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす。
【００２２】
実施形態において、目的の細胞は、幹細胞由来の最終分化細胞、場合により心筋細胞で
ある。
【００２３】
実施形態において、目的の細胞は幹細胞由来の最終分化細胞であり、少なくとも１つの
他の細胞型は、幹細胞、フィーダー細胞、親体細胞、部分的に再プログラム化された細胞
、自発的に分化した幹細胞、分化系列決定済みの細胞、および／または前駆細胞である。
【００２４】
実施形態において、幹細胞由来の前駆細胞を選択的に剥離するのに十分である剥離力は
、２０〜７０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす。
【００２５】
本発明の実施形態において、目的の細胞は、少なくとも１つの他の細胞型に比べて、よ
り低い剥離力で剥離する。
【００２６】
実施形態において、目的の細胞は、少なくとも１つの他の細胞型に比べて、より高い剥
離力で剥離する。
【００２７】
実施形態において、単離された目的の細胞は生存可能であり、かつ／または分裂し、子
孫細胞を生成する能力を維持している。
【００２８】
実施形態において、複数の目的の細胞が少なくとも９０％の純度で単離される。
【００２９】
実施形態において、動物細胞の混合物中の目的の細胞の少なくとも７０％が単離される
。
【００３０】
実施形態において、目的の細胞が、動物細胞の混合物中の細胞の４０％未満、場合によ
り動物細胞の混合物中の細胞の１０％未満を構成する。
【００３１】
実施形態において、目的の細胞が、動物細胞の混合物中の細胞の少なくとも６０％、場
合により動物細胞の混合物中の細胞の少なくとも９０％を構成する。
【００３２】
実施形態において、当該細胞は、哺乳動物細胞、場合によりヒト細胞である。
【００３３】
実施形態において、この方法は、単離された細胞を培養するステップ、ならびに／また
はフローサイトメトリー、生化学的分析、および／または遺伝子発現分析によって単離さ
れた細胞を評価するステップをさらに含む。
【００３４】
実施形態において、この方法は、動物細胞の混合物に、検出可能な標識および／または
親和性試薬を付着させるステップを含まない。
【００３５】
実施形態において、剥離力は、水力学的力、遠心力、および／または磁力によって印加
される。
【００３６】
実施形態において、この方法は、マイクロ流体装置において行われる。
【００３７】
実施形態において、培養動物細胞の混合物は剥離力に１から６０分間、場合により２か
ら２０分間さらされる。
【００３８】
本発明の、前述の、および他の態様を、次に、本明細書に記載する他の実施形態に関し
てより詳しく記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】ｈｉＰＳＣおよび分化した細胞の接着シグネチャーにおける変化を示す図である。
【図１Ｂ】ＩＭＲ９０−線維芽細胞、再プログラム化されたＵＤ−ｈｉＰＳＣ、ＳＤ−ｈｉＰＳＣ、および神経ロゼット（定方向分化）における形態学的変化を示す図である。矢じりは自発的に分化した細胞を示し、点線で囲んだ丸はロゼットを指し示す。
【図１Ｃ】ＩＭＲ９０における、多能性マーカーである、ＳＳＥＡ４およびＯＣＴ４、ＵＤ−ｈｉＰＳＣ、ならびにＳＤｈｉＰＳＣの発現を示す図である。神経マーカーであるネスチンは、ロゼットおよび神経分化決定済みの細胞に発現するが、汚染細胞中に非存在である。
【図１Ｄ】マトリゲル（商標）によりコーティングされた組織培養物表面上にプレーティングした、ＦＡＣＳにより選別された９７％超がＴＲＡ−１−６０＋であるｈｉＰＳＣの形態を示す図である。単一細胞の解離により、コロニーの損失および著しい細胞死がもたらされた。
【図１Ｅ】拡大したヒト皮膚線維芽細胞および上皮細胞様線維芽細胞由来のｈｉＰＳＣの形態を示す図である。
【図１Ｆ】再プログラム化されたＩＭＲ９０由来のｈｉＰＳＣによって発現された、多能性マーカーであるＴＲＡ−１−６０およびＮＡＮＯＧ（上パネル）ならびにＴＲＡ−１−８１（下パネル）を示す図である。
【図１Ｇ】ｈｉＰＳＣ由来神経ロゼットの発現マーカーおよび形態を示す図である。
【図１Ｈ】ｈｉＰＳＣ由来神経前駆細胞の発現マーカーおよび形態、ならびにこれらの神経系統（Ｔｕｊ１およびＭＡＰ２）への分化を示す図である。
【図２Ａ】ラミニン、フィブロネクチン、およびマトリゲル（商標）上で培養したｈｉＰＳＣおよびＩＭＲ９０細胞上に発現したインテグリンのフローサイトメトリー測定を示す図である（＊ｐ＜０．０５  ｈｉＰＳＣ対ＩＭＲ９０、＊＊ｐ＜０．０５  ラミニン対フィブロネクチン、＊＊＊ｐ＜０．０５  ラミニン対マトリゲル（商標））。
【図２Ｂ】ラミニン、フィブロネクチン、およびマトリゲル（商標）上で培養したｈｉＰＳＣによって発現されたインテグリンのフローサイトメトリー測定を示す図である。ヒストグラムは、インテグリンおよび対応するイソ型対照の蛍光強度分布を表す。％は全て、イソ型抗体に対する５〜６％の受容体の細胞の発現に相当する（バックグラウンド）。
【図２Ｃ】ラミニン、フィブロネクチン、およびマトリゲル（商標）上で培養したＩＭＲ９０線維芽細胞によって発現されたインテグリンのフローサイトメトリー測定を示す図である。ヒストグラムは、インテグリンおよび相当するイソ型対照の蛍光強度分布を表す。
【図２Ｄ】インテグリン特異的阻止抗体を用いたラミニンマトリクス上のインテグリンが介在する接着のブロックを示す図である（＊ｐ＜０．０５インテグリン対イソ型）。
【図２Ｅ】インテグリン特異的阻止抗体を用いたフィブロネクチンマトリクス上のインテグリンが介在する接着のブロックを示す図である（＊ｐ＜０．０５インテグリン対イソ型）。
【図３Ａ】１６時間の剪断応力を適用した接着細胞凝集塊分画またはｈｉＰＳＣおよびＩＭＲ９０細胞の示す剥離プロファイルを示す図である。実験上の点をＳ字形にあてはめて、５０％剥離のτ５０に対する剪断応力を得た。
【図３Ｂ】フィブロネクチンおよびラミニン基体上の、未分化のｈｉＰＳＣ（ＩＭＲ９０に由来）、ｈＥＳＣ（Ｈ７およびＨ１）、ＩＭＲ９０ならびにＭＥＦ細胞に対する接着強度（τ５０）測定を示す図である。棒グラフは、平均値±Ｓ．Ｄ．を表す（＃ｐ＜０．０５  幹細胞対ＩＭＲ９０ｓ、＄ｐ＜０．０５  幹細胞対ＭＥＦ）。
【図３Ｃ】マトリゲル（商標）上のＭＥＦに比べた、未分化ｈＥＳＣ（Ｈ７およびＨ１）に対する接着強度測定を示す図である。棒グラフは、平均値±Ｓ．Ｄ．を示す（＊ｐ＜０．０５幹細胞対ＭＥＦ）。
【図３Ｄ】未分化のｈｉＰＳＣ（皮膚の線維芽細胞に由来、１１ｂ）およびラミニン基体上のヒト皮膚線維芽細胞に対する接着強度測定を示す図である。棒グラフは、平均値±Ｓ．Ｄ．を表す（＊ｐ＜０．０５  幹細胞対線維芽細胞）。
【図３Ｅ】ビンキュリンおよびタリンの、ラミニン基体上のＩＭＲ９０細胞およびＵＤ−ｈｉＰＳＣにおける局所接着に対するリクルートを示す免疫染色を示す図である。
【図３Ｆ】直径２０、５６、および１７０μｍのフィブロネクチン接着性アイランド上のマイクロパターン化したｈｉＰＳＣ凝集塊の位相差画像を示す図である。挿入図は、ＤＡＰＩ染色された核を有する単一細胞凝集塊を示す。
【図３Ｇ】サイズ１０μｍのフィブロネクチンの接着性アイランド上のマイクロパターン化したｈｉＰＳＣを示す図である。一夜で、単一細胞として接着した細胞、および著しい細胞の損失が観察された。
【図３Ｈ】マイクロパターン化した基体上の、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１に対して染色された、ｈｉＰＳＣの未分化状態を示す免疫蛍光画像を示す図である。
【図３Ｉ】ラミニンおよびフィブロネクチン上の多能性マーカーに対して（一晩）染色された未分化状態のｈｉＰＳＣを示す免疫蛍光画像を示す図である。ＩＭＲ９０細胞を陰性対照として用いた。
【図３Ｊ】接着細胞凝集塊分画対、直径２０μｍ（上パネル）および１７０μｍ（下パネル）のアイランド上でｈｉＰＳＣに対して適用した剪断応力を示す図である。
【図４Ａ】フィブロネクチン（ＦＮ）およびラミニン（ＬＭ）上で培養した、それぞれの未分化（ＵＤ）細胞に比べた、自発的に分化した（ＳＤ）ｈｉＰＳＣ（ＩＭＲ９０に由来）およびｈＥＳＣ（Ｈ７）に対する接着強度測定を示す図である。棒グラフは平均値±Ｓ．Ｄ．を表す（＊ｐ＜０．０５  未分化の細胞対分化した細胞）。
【図４Ｂ】フィブロネクチン上で培養した、ＵＤ−ｈｉＰＳＣ（白矢じり）と異なる、ＳＤ−ｈｉＰＳＣ（黒矢じり）における局所接着に対するビンキュリンおよびタリンのリクルートを示す免疫染色を示す図である。バー、５０μｍ。
【図４Ｃ】分化２％および９０％で、およびラミニン上で培養した未分化の細胞に比べた、自発的に分化したｈｉＰＳＣ（ＩＭＲ９０に由来）に対する接着強度測定を示す図である。棒グラフは、平均値±Ｓ．Ｄ．を表し、水平方向の点線はＵＤ−ｈｉＰＳＣの平均接着強度を示す。
【図４Ｄ】ラミニン上の、ＵＤ−ｈｉＰＳＣ、ｈｉＰＳＣ由来の神経ロゼット、およびｈｉＰＳＣ由来の神経前駆細胞（ＮＰ）に対する接着強度測定を示す図である。棒グラフは、平均値±Ｓ．Ｄ．を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図４Ｅ】ラミニンおよびマトリゲル（商標）基体上の、ｈｉＰＳＣおよびＨ９ｈＥＳＣに由来する神経前駆細胞（ＮＰ）に対する接着強度測定を示す図である。棒グラフは、平均値±Ｓ．Ｄ．を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図５Ａ】同時培養した細胞での、μＳＨＥＡＲ（マイクロ幹細胞高効率接着ベース回収装置（ｍｉｃｒｏ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅ））を表す図である。
【図５Ｂ】マイクロ流体チャネル中で同時培養した、ＵＤ−ｈｉＰＳＣ（白矢じり、小型の上皮コロニー）およびＩＭＲ９０細胞（黒矢じり、細長い細胞）を示す図である。
【図５Ｃ】生存可能なｈｉＰＳＣ（白矢じり）およびＩＭＲ９０（黒矢じり）細胞に対する生存／死滅染色を示す図である。生存細胞は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭホワイトに対して緑色に染まり、死滅細胞はエチジウムホモダイマーに対して赤色に染まる。
【図５Ｄ】ＵＤ−ｈｉＰＳＣ細胞（一夜培養物）は、ＯＣＴ４およびＳＳＥＡ４に対して陽性に染まったためマイクロ流体装置中で未分化のままであったことを示す図である。
【図５Ｅ】低密度のＩＭＲ９０線維芽細胞と同時培養したラミニン基体からのＵＤ−ｈｉＰＳＣコロニーの選択的剥離を示す図である。
【図５Ｆ】高密度のＩＭＲ９０細胞と同時培養したラミニン基体からのＵＤ−ｈｉＰＳＣコロニーの選択的剥離を示す図である。コロニーは８５〜１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力で選択的に剥離された。
【図５Ｇ】ラミニンおよびフィブロネクチンからのＵＤ−ｈｉＰＳＣコロニー（白矢印）の選択的剥離を示す図である。コロニーは８５〜１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力で選択的に剥離された。
【図５Ｈ】マトリゲル（商標）からのＵＤ−ｈｉＰＳＣコロニー（白矢印）の選択的剥離を示す図である。コロニーは８５〜１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力で選択的に剥離された。
【図５Ｉ】低接着強度のｈｉＰＳＣを選択的に剥離する能力を示す、ｈｉＰＳＣ／ＩＭＲ９０同時培養物からの予備染色したＵＤ−ｈｉＰＳＣ（白矢印）の選択的剥離を示す図である。
【図６】剥離したｈｉＰＳＣ（ＴＲＡ−１６−６０およびＣＭＰＴＸに対して陽性）ならびにＩＭＲ９０細胞（ＣＭＰＴＸのみに対して陽性）を示すフローサイトメトリープロットを示す図である。剪断応力８５〜１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２では、選択的に剥離されたｈｉＰＳＣは純度９９％をもたらし、剪断応力２５０ｄｙｎｅ／ｃｍ２ではｈｉＰＳＣおよびＩＭＲ９０両方の細胞が剥離された。ポストμＳＨＥＡＲベースの剥離では、装置中の残りの細胞をトリプシン処理し、分析した（右上パネル）。用いた対照は、フローベースに暴露されなかった装置中の同時培養した集団であり、細胞は全てトリプシン処理から回収された（右下パネル）。
【図７Ａ】それぞれ同時培養したＩＭＲ９０およびＭＥＦ細胞から、剪断応力８５〜１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２で剥離された、ｈｉＰＳＣおよびｈＥＳＣ（Ｈ７）の濃縮のフローサイトメトリーベースの測定を示す棒グラフである。図はまた、ポストμＳＨＥＡＲベースの剥離の装置における残りの幹細胞も表す。
【図７Ｂ】ＭＥＦ（黒塗りの矢印）の存在下、ラミニンからのＵＤ−ｈＥＳＣコロニーの選択的剥離を示す図である。
【図８Ａ】ＩＭＦ９０線維芽細胞と同時培養したラミニン基体からのＵＤ−ｈｉＰＳＣコロニーの５日間同時培養物および選択的剥離を示す図である。コロニーは、８５〜１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力で選択的に剥離された。
【図８Ｂ】５日間培養物から剪断応力８５〜１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２で剥離されたｈｉＰＳＣの濃縮のフローサイトメトリー測定を示す図である。
【図９Ａ】コロニーとしてマトリゲル（商標）接着上で培養された剥離されたＵＤ−ｈｉＰＳコロニー（２日目）、およびコロニーの膨張（１４日目）によって示される保持された自己複製の性質を示す図である。
【図９Ｂ】マトリゲル（商標）上で培養された、剥離および回収されたＵＤ−ｈｉＰＳＣコロニーは未分化の特徴を保持したことを示す（５日目および１４日目）、多能性マーカーＳＳＥＡ４およびＯＣＴ４に対する免疫蛍光染色を示す図である。
【図９Ｃ】μＳＨＥＡＲ単離したｈｉＰＳＣは胚様体（ＥＢ）を産生することを示す図である。回転培養上で１４日後、新たな７日間ＥＢをプレーティングした。
【図９Ｄ】回収したＥＢは２１日目までに、中胚葉（α−平滑筋アクチン）、外胚葉（ＰＡＸ６）、および内胚葉（α−フェトプロテイン）である３つの一次胚葉層に全て自発的に分化することを示す図である。核はＨｏｅｃｈｓｔで染色した。
【図１０Ａ】未分化の細胞（白矢じり）を示すＯＣＴ４およびＳＳＥＡ４に対する免疫染色を示す図であり、発現陰性はμＳＨＥＡＲにおいて分化した（黒塗りの矢じり）ｈｉＰＳＣを示す。
【図１０Ｂ】μＳＨＥＡＲを用いた、剪断応力１００ｄｙｎｅ／ｃｍ２での、ＳＤ−ｈｉＰＳＣ（黒塗りの矢じり）からのＵＤ−ｈｉＰＳＣコロニー（白矢じり）の選択的剥離を示す図である（上パネル）。下パネルは、細胞型に関係なく細胞が全て剥離した場合の、トリプシン様酵素（ＴｒｙｐＬＥ）を用いたＵＤ−ｈｉＰＳＣおよび分化した細胞の剥離を表す。
【図１０Ｃ】μＳＨＥＡＲを用いて自発的に分化した培養物から剪断応力８５〜１５０ｄｙｎｅ／ｃｍ２で剥離したＵＤ−ｈｉＰＳＣおよびＵＤ−ｈＥＳＣ（Ｈ７）の濃縮に対するフローサイトメトリー測定を表す棒グラフを示す図である。プロットはまた、μＳＨＥＡＲベースの単離後、装置中の残りの未分化の幹細胞も示す。
【図１０Ｄ】剥離したＵＤ−ｈｉＰＳＣ（ＴＲＡ−１−６０およびＣＭＰＴＸに対して陽性）ならびにＳＤ−ｈｉＰＳＣ（ＣＭＰＴＸのみに対して陽性）を示す、フローサイトメトリー結果を示す図である。棒グラフは、剪断応力８５−１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２で選択的に剥離された、回収された細胞中のＳＤ−ｈｉＰＳＣおよびＳＤ−ｈＥＳＣ（Ｈ７）の汚染のフローサイトメトリー測定を示す。
【図１０Ｅ】ＵＤ−ｈｉＰＳＣに対して一定の濃縮効率での、９６ウェルプレートから６ウェルプレートの単一ウェルに相当する培養面積からのμＳＨＥＡＲのスケールアップを示す図である。装置の断面図。
【図１１Ａ】μＳＨＥＡＲベースの、および従来の酵素法を用いた１０継代の経過にわたる、剥離したＵＤ−ｈｉＰＳＣ（ＴＲＡ−１−６０およびＣＭＰＴＸに対して陽性）、ならびにＳＤ−ｈｉＰＳＣ（ＣＭＰＴＸのみに対して陽性）を示すフローサイトメトリー散布図を示す図である。示したプロットは３回の反復を表す。
【図１１Ｂ】１０継代の経過にわたって、μＳＨＥＲＥ、ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ、ディスパーゼ、またはＡｃｃｕｔａｓｅによって繰返し継代した場合の未分化の細胞の濃縮効率を示す図である。＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３。同じバッチ（Ｐ０）からのｈｉＰＳＣを継代法に暴露し、回収した培養物を５〜６日間増殖させた後、次の処置ラウンドを行った。開始のｈｉＰＳＣ培養物（Ｐ０）は、多能性マーカーＴＲＡ−１−６０に関して９０％陽性であった。
【図１１Ｃ】ＳｔｅｍＡｄｈｅｒｅ（商標）上で培養した、自発的に分化した（＜１０％）ｈｉＰＳＣを示す図である。結果として得られた、接種されたコロニーは生存が劣り（浮遊コロニー、左）、未分化細胞と一緒に分化した細胞の接着があった（中、右）。分化した細胞は、多能性マーカーＯＣＴ４およびＳＳＥＡ４を発現しなかった。
【図１１Ｄ】μＳＨＥＡＲまたは手作業の選別を用いた繰返し継代後の、マトリゲル（商標）上、ｍＴｅＳＲ１中で培養した細胞に対する成長曲線を示す図である。各継代に対して、０日目に等しい数の細胞で開始して１０継代にわたって曲線をプロットする（５×１０４細胞）。１、３、５、および７日目にウェル３個から、各継代に対して、細胞の計数値を報告する（×１０５細胞）。データを、平均値±Ｓ．Ｄ．で報告する。
【図１１Ｅ】μＳＨＥＡＲ、手作業の選別、またはＴｒｙｐＬＥで継代後、ｍＴｅＳＲ（登録商標）培地中マトリゲル（商標）上の２４時間後の細胞生存を示す図である。＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３。
【図１１Ｆ】未分化のコロニーとしてマトリゲル（商標）接着上で培養した剥離コロニー（１００ｄｙｎｅ／ｃｍ２、２日目、白矢印）、または部分的に分化したコロニー（７５０ｄｙｎｅ／ｃｍ２、２日目、黒塗りの矢印）を示す図である。
【図１１Ｇ】装置ベースの繰返し１０継代に暴露したＵＤ−ｈｉＰＳＣコロニーは、マトリゲル（商標）上で培養した場合、コロニーの膨張によって示される、高い核対細胞質比および自己複製の性質を保持したことを示す図である。
【図１１Ｈ】マトリゲル（商標）上で培養した、剥離および回収したＵＤ−ｈｉＰＳＣコロニーは、１０継代にわたって未分化の特徴を保持したことを示す、多能性マーカーであるＳＳＥＡ４およびＯＣＴ４に対する免疫蛍光染色を示す図である。
【図１１Ｉ】マトリゲル（商標）上で培養した、剥離したＵＤ−ｈｉＰＳＣコロニーは、μＳＨＥＡＲを用いて少なくとも１０継代の間、幹細胞性を保持したことを示す、多能性マーカーであるＳＳＥＡ４およびＯＣＴ４に対する免疫蛍光染色を示す図である。
【図１２】装置により継代したｈｉＰＳＣと、手作業により選別したｈｉＰＳＣとの、それぞれの方法を用いた１０継代の終わりの、胚性幹細胞関連遺伝子８４個に対する発現の相対的な比較を示す図である。図は、手作業（ｘ軸）とμＳＨＥＡＲ（ｙ軸）との間の各遺伝子の相対的な発現レベル（２−ΔＣｔ）の対数プロットを示す。点線は、遺伝子発現閾値において２倍の変化があったことを示す。
【図１３Ａ】完全に再プログラム化されたｈｉＰＳＣになることができなかった数々の細胞を示す図である。黒塗りの矢印は部分的に再プログラム化された細胞を意味し、白矢印は再プログラム化されたｈｉＰＳＣを示す。
【図１３Ｂ】ＩＭＲ９０模倣性の拡大した細胞および球形の上皮様細胞は、いかなる多能性マーカーも示さないことを示す図である。
【図１３Ｃ】接着強度分析により、ＵＤ−ｈｉＰＳＣに比べて、部分的に再プログラム化された細胞では著しく高い接着強度が明らかになり、親ＩＭＲ９０細胞よりも低かったことを示す図である。
【図１３Ｄ】局所接着タンパク質の局在は、明確なアクチン張力繊維および拡大した残りの親細胞に対する局所接着に局在するビンキュリンの存在を示し、形質導入された球形の細胞は、無視できる張力繊維または局所接着に対するビンキュリンの局在を表したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は様々な形態において具体化され得ることを理解されたく、本明細書に記載する
実施形態に限定されないことを解釈されたい。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹
底的かつ完全であるように、また当業者に対して本発明の範囲を完全に伝達するように提
供するものである。
【００４１】
別段の規定がなければ、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は全て、本発明
が属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細
書における本発明の記載において用いられる用語は、特定の実施形態のみを記載する目的
であり、本発明を限定しようとするものではない。
【００４２】
文脈による別段の指摘がなければ、本明細書に記載する本発明の様々な特徴をあらゆる
組合せで用いることができることが特に意図される。
【００４３】
さらに、本発明は、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載するあらゆ
る特徴または特徴の組合せを、除外し、または省略することができることも企図するもの
である。
【００４４】
説明のために、ある方法がステップＡ、Ｂ、およびＣを含むと本明細書が記載する場合
、あらゆるＡ、Ｂ、もしくはＣ、またはこれらの組合せは省略され得、個々に、もしくは
あらゆる組合せにおいて請求権を放棄され得ることが特に意図される。別の一例として、
細胞が、特定の特徴であるＸ、Ｙ、およびＺを有すると本明細書が記載する場合、あらゆ
るＸ、Ｙ、Ｚ、またはこれらの組合せは、個々に、またはあらゆる組合せにおいて省略さ
れ、請求権を放棄され得ることが特に意図される。
【００４５】
本明細書で用いられる、「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、または「その（ｔｈ
ｅ）」は、一つ、または一つを超えるものを意味し得る。例えば、「一つの（ａ）」細胞
は、単一の細胞または複数の細胞を意味し得る。
【００４６】
本明細書で用いられる、「約」の語は、例えば、投与量（例えば、脂肪酸の量）などの
測定可能な値に言及する場合、特定する量の、±２０％、±１０％、±５％、±１％、±
０．５％、またはさらに±０．１％の変動を含むことを意味する。
【００４７】
本明細書で用いられる、移行句である「から本質的になる」は、請求項の範囲が、請求
項において具陳される特定の材料またはステップ、および本発明の「基本的かつ新規な１
以上の特徴に大いに影響を及ぼさないもの」を包含するものと解釈されることを意味する
。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ、５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９、５５１〜５２、１９０  Ｕ．Ｓ．
Ｐ．Ｑ．  ４６１、４６３（ＣＣＰＡ  １９７６年）（オリジナルにおいて強調）を参照
されたく、ＭＰＥＰ§２１１１．０３．も参照されたい。このように、「から本質的にな
る」の語は、本明細書の請求項において用いられる場合、「含む」と同等であると解釈さ
れるものではない。
【００４８】
本発明を実践する上で用いられる細胞は、一般的に、哺乳動物細胞および／または鳥類
細胞を含めた動物細胞である。哺乳動物細胞は、それだけには限定されないが、ヒト、非
ヒトの哺乳動物、非ヒトの霊長動物（例えば、サル、チンパンジー、ヒヒ）、イヌ、ネコ
、マウス、ハムスター、ラット、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、およびヤギの細胞
を含む。鳥類細胞は、それだけには限定されないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル
、ガチョウ、ウズラ、およびキジの細胞、ならびにペットとして飼われている鳥類（例え
ば、インコ、オウム、コンゴウインコ、コカトゥー（ｃｏｃｋａｔｏｏ）など）からの細
胞を含む。特定の実施形態において、細胞は実験動物の種からのものである。適切な動物
細胞は、オスおよびメスの両方からの、ならびに胎児、乳児、新生児、若年、青年、成年
、および老年の動物を含めた全ての年齢の動物からの細胞を含む。
【００４９】
「動物細胞の混合物」は、２タイプ以上の（例えば、２、３、４、５、６タイプ以上の
）動物細胞を意味する。本発明の実施形態によると、動物細胞の混合物は、（例えば、培
養物中の）接着性の動物細胞の混合物である。
【００５０】
本明細書で用いられる、「目的の細胞」または「目的の細胞型」の語は、あらゆる理由
で単離するのが望ましい細胞または細胞型を意味するが、細胞の使用目的を示すものでは
ない。例えば、実施形態において、単離される「目的の細胞」は、夾雑した細胞（例えば
、インビボの移植を意図する前駆細胞の培養物中における幹細胞）であり、これは場合に
より廃棄されることがある。
【００５１】
本明細書で用いられる、「接着強度」は、細胞が基体に付着する（例えば、接着する）
強度を意味し、基体から細胞を分離するのに必要とされる剪断応力に比例する。基体に対
する細胞の接着強度は、インテグリン受容体の量および空間分布、ならびに細胞骨格エレ
メントに対して結合するインテグリンの会合を含めた数々の性質の関数である。実施形態
において、一個の細胞が、別の細胞に比べて「より高く」、「より大きく」または「増大
した」（および同様の語）の接着強度を有する場合、接着強度は、少なくとも約１．５、
２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍高い（例えば、剥離力によって決定して
）。実施形態において、一個の細胞が、別の細胞に比べて「より低く」、「より小さく」
または「低減した」（および同様の語）の接着強度を有する場合、第1の細胞の接着強度
は、約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満であり、または第
２の細胞の接着強度未満である。
【００５２】
本明細書で用いられる、「基体」の語は、それに対して細胞が（例えば、培養されて）
接着する表面を意味する。基体は、ガラスおよび／またはプラスチックであってよい。適
切な基体の例には、制限はなく、スライドガラス、カバーガラス、培養皿、培養ビン、マ
ルチウェルプレート、および／または装置に適合するカセット（例えば、マイクロ流体装
置で用いるためのカセット）が含まれる。「基体」は、例えば、制限なく、ラミニン、コ
ラーゲン（例えば、コラーゲンＩＶ）、ビトロネクチン、フィブロネクチン、エンタクチ
ン、ブレビスタチンを含めた細胞外マトリックスタンパク質、および／または、ポリ［２
−メタクリロイロキシ）エチルジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキ
シド］（ＰＭＥＤＳＡＨ）などの合成ポリマーコーティングで場合によりコーティングさ
れていてよい。適切な細胞外マトリクスの処方は、イスビトロネクチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ）、マトリゲル（商標）、およびラミニン−５１１など、市販されている。さら
なる選択肢として、フィーダー細胞は、基体上で成長することができる。
【００５３】
本明細書で用いられる、「剥離力」の語は、細胞を、それに対して細胞が接着している
基体から、剥離し、除去し、または分離するのに十分である力を意味する。剥離力には、
制限はなく、水力学的力、遠心力、および／または磁力を含めたあらゆる適切な方法によ
って適用することができる。剥離力は、場合により、それらの細胞の数（ａ  ｐｌｕｒａ
ｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｓ）における５０％剥離をもたらす剪断応力（τ、力
／面積）（τ５０）を生成する力に関して記載することができる。実施形態において、剥
離力は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ｄ
ｙｎｅ／ｃｍ２を超え、および／または 約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１０
０、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７
０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、もしくは５０
０ｄｙｎｅ／ｃｍ２未満である壁剪断応力をもたらす（下限が上限未満である限り、低値
と高値との全ての組合せを含む）。実施形態において、剥離力は約１０から約４０、５０
、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０
、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、３００
、３５０、または４００ｄｙｎｅ／ｃｍ２までである壁剪断応力をもたらす。実施形態に
おいて、剥離力は約２０から約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、
１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、
１９０、２００、２２５、２５０、３００、３５０、または４００ｄｙｎｅ／ｃｍ２まで
である壁剪断応力をもたらす。実施形態において、剥離力は約３０から約４０、５０、６
０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１
４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、３００、３
５０、または４００ｄｙｎｅ／ｃｍ２までである壁剪断応力をもたらす。実施形態におい
て、剥離力は約４０から約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１
１５、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２
００、２２５、２５０、３００、３５０、または４００ｄｙｎｅ／ｃｍ２までである壁剪
断応力をもたらす。実施形態において、剥離力は約５０から約６０、７０、８０、９０、
１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、
１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、３００、３５０、または４００ｄｙ
ｎｅ／ｃｍ２までである壁剪断応力をもたらす。実施形態において、剥離力は約６０から
約７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１４０、１５
０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、３００、３５０、また
は４００ｄｙｎｅ／ｃｍ２までである壁剪断応力をもたらす。実施形態において、剥離力
は約７０から約８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０
、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、３００
、３５０、または４００ｄｙｎｅ／ｃｍ２までである壁剪断応力をもたらす。実施形態に
おいて、剥離力は約８０から約９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５
、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０
、３００、３５０、または４００ｄｙｎｅ／ｃｍ２までである壁剪断応力をもたらす。実
施形態において、剥離力は約８０から約９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０
、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５
、２５０、３００、３５０、または４００ｄｙｎｅ／ｃｍ２までである壁剪断応力をもた
らす。実施形態において、剥離力は約９０から約１００、１０５、１１０、１１５、１２
０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２
５、２５０、３００、３５０、または４００ｄｙｎｅ／ｃｍ２までである壁剪断応力をも
たらす。実施形態において、剥離力は約１００から約１０５、１１０、１１５、１２０、
１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、
２５０、３００、３５０、または４００ｄｙｎｅ／ｃｍ２までである壁剪断応力をもたら
す。実施形態において、剥離力は約１１０から約１２０、１２５、１３０、１４０、１５
０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、３００、３５０、また
は４００ｄｙｎｅ／ｃｍ２までである壁剪断応力をもたらす。実施形態において、剥離力
は約１２０から約１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、
２２５、２５０、３００、３５０、または４００ｄｙｎｅ／ｃｍ２までである壁剪断応力
をもたらす。さらに、剥離力は、一貫した力として適用することができ、または（例えば
、ある範囲内で）変動的であり得る。
【００５４】
本明細書で用いられる、「選択的に剥離する」（および同様の語）は、基体に付着して
いる細胞の混合物中の少なくとも１つの他の細胞型に比べて、それに対して細胞が付着し
ている基体からの、細胞の混合物内部の特定の細胞型の優先的な剥離を意味する。本発明
の実施形態において、選択的な剥離を実現するために、目的の細胞型の５０％剥離（τ５
０）をもたらす壁剪断応力は、接着細胞の混合物中の少なくとも１つの他の細胞型に対す
るτ５０に比べて、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１
０倍低く、または高い。このように、単離される目的の細胞は、細胞の混合物中の少なく
とも１つの他の細胞型よりも高く、または低いτ５０で選択的に剥離し得る。実施形態に
おいて、少なくとも１つの他の細胞型に対して、少なくとも約５０％、２倍、３倍、４倍
、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、
６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍以上の目的の細胞型が剥離する。代表的な実
施形態において、基体に接着する細胞の混合物中の少なくとも１つの他の細胞型に比べて
、特定の細胞型を「選択的に剥離する」剥離力は、第１の細胞型の少なくとも約６０％、
７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以
上の剥離をもたらし、かつ／または基体からの細胞の混合物中少なくとも１つの他の細胞
型の約４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１
％以下より少ない剥離をもたらす。
【００５５】
本明細書で用いられる、本発明の方法によって生成される「単離された」細胞は、部分
的に、または完全に、本発明の方法の使用の前に、細胞（例えば、培養物中の接着細胞）
の混合物中で細胞が会合している他の成分（例えば、細胞の混合物中の他の型の細胞）か
ら、分離され、濃縮され、かつ／または精製されている細胞である。当業者であれば、「
単離された」複数の細胞または細胞の集団は、本発明の方法を使用する前の出発材料中の
細胞の濃度に比べて、目的の細胞の濃度においていくらかの濃縮または増大が存在する限
り、１００％純粋である必要がないことを理解されよう。実施形態において、「単離され
た」細胞の濃度は、本発明の方法を実践することによって、少なくとも約２倍、３倍、４
倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５
０倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、８００倍、１０００倍以上
増大する。本発明の実施形態において、「単離された」複数の細胞、または細胞の集団は
、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９
６％、９７％、９８％、９９％以上純粋である。
【００５６】
本明細書で用いられる「全能性」は、生物体全体を形成する潜在能力を有する細胞を意
味する。
【００５７】
本明細書で用いられる「多能性」は、本質的に完全な分化多用途性、例えば、本質的に
あらゆる動物の細胞型（例えば、内胚葉、中胚葉、および外肺葉のあらゆる３つの胚葉層
に由来する細胞）に成長する潜在能力を有する細胞を意味する。多能性細胞は自己複製性
であってよく、休眠中または静止状態のままであってよい。全能性細胞と異なり、多能性
細胞は、通常、新たな胚盤胞または胚盤葉を形成することはできない。多能性細胞は、一
般に、１つまたは複数の多能性マーカーを発現する。多能性のマーカーは当技術分野にお
いてよく知られており、制限なく、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、
ＳＳＥＡ４（ヒト）、ＳＳＥＡ１（マウス）、ＳＳＥＡ３、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−
１−８１、アルカリホスファターゼ、ＣＤ３０（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏ
ｎ  ３０）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、テロメラーゼ、およびＲ
ｅｘ−１（これらの語は他の種からのホモログも包含する）を含む。
【００５８】
本明細書で用いられる「複能性」は、相当する動物の細胞型のサブセット（例えば、２
つ以上の細胞型）のうちのいずれをも生成する潜在能力を有する細胞を意味する。多能性
細胞と異なり、複能性細胞には、相当する動物の全ての細胞型を形成する潜在能力がない
。複能性細胞の例には、分化系列決定済みの細胞および前駆細胞が含まれる。特定の系列
に関連するマーカーは当技術分野ではよく知られており、制限なく、神経マーカー（例え
ば、ネスチン、ＣＤ１３３、および／またはＭｕｓａｓｈｉ−１）、造血マーカー（例え
ば、ＣＤ３４および／またはｃ−Ｋｉｔ）、膵臓系列マーカー（例えば、ネスチンおよび
／またはビメンチン）、骨格筋マーカー（例えば、ＭｙｏＤ、Ｐａｘ７、ミオゲニン、Ｍ
Ｒ４、および／またはミオシン軽鎖）、心筋マーカー（例えば、ＭｙｏＤ、Ｐａｘ７、お
よび／またはミオシン重鎖）などが含まれる。
【００５９】
本明細書で用いられる「幹細胞」の語は、制限なく、（例えば、胚盤胞もしくは初期桑
実期胚の内部細胞塊の胚盤葉上層組織に由来し、かつ／または体細胞核移植によって生成
された）胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、ならびに／あるいは成体幹
細胞（例えば、体性幹細胞および／または生殖幹細胞）を含む。本発明の実施形態におい
て、幹細胞は成体幹細胞ではない。幹細胞は、一般に、自己複製のための潜在能力（未分
化状態を維持しながら細胞分裂の多くのサイクルを経験する能力）および多能性、または
ある場合には複能性によって特徴づけられる。本発明の実施形態において、幹細胞は、少
なくとも約２、４、６、８、１０、２０、４０、６０、８０、１００以上の細胞の凝集塊
（例えば、細胞−細胞接着もしくは接合によって接続されている細胞）において成長する
。実施形態において、幹細胞は、細胞凝集塊において成長または培養されない場合、アポ
トーシスを表す。
【００６０】
「未分化の幹細胞」は、一般的に、多能性細胞または複能性細胞である。当業者であれ
ば、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、典型的に多能性とみなされ、１つまたは複数の（例え
ば、１、２、３、４、５つ以上の）多能性マーカーを発現することを（この語が当技術分
野において理解され、本明細書に記載される通りに）理解されよう。一方、成体幹細胞は
、典型的に複能性であり、特定の系列に関連する１つまたは複数の（例えば、１、２、３
、４、５つ以上の）マーカーを発現する。しかし、いくつかの成体幹細胞（例えば、臍帯
血から単離された幹細胞）は多能性であり、多能性に関連する１つまたは複数の（例えば
、１、２、３、４、５つ以上の）マーカーを発現することができる。成体幹細胞はしばし
ば、その起源の組織によって呼ばれ、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪細胞由来幹細胞、
内皮幹細胞、および歯髄幹細胞は成体幹細胞の非制限的な例である。
【００６１】
本明細書で用いられる「幹細胞に由来する」細胞および同様の語は、分化の過程の結果
として幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）から生成される細胞を意味する。このような細
胞には、制限なく、自発的に分化し、直接分化した幹細胞（例えば、分化系列決定済みの
細胞、前駆細胞、および／または最終分化細胞）、ならびに分化の中間段階における細胞
が含まれる。当業者であれば、幹細胞から様々な細胞型に分化するプロセスは連続体であ
り、中間の特徴を有する細胞がしばしば存在することを理解されよう。
【００６２】
本明細書で用いられる「自発的に分化した幹細胞」または「自発的に分化した細胞」は
、自発的な（例えば、定方向ではない）分化の過程の結果として、未分化の幹細胞に由来
する細胞である。自発的に分化した細胞は、幹細胞培養物の問題となる汚染物質であり、
培養物および培養した幹細胞の使用に障害を生じさせる。「自発的に分化した幹細胞」ま
たは「自発的に分化した細胞」は、ランダムな経路に沿って分化すると考えられ、未分化
の幹細胞に比べて、多能性の低下および少なくとも１つの多能性マーカーの発現の低下を
一般的に有する。いくつかの場合において、「自発的に分化した幹細胞」は、拡大した、
線維芽細胞様の細胞として出現する。
【００６３】
「直接分化した幹細胞」または「直接分化した細胞」の語は、例えば、培養培地成分の
操作によって、特定の経路に沿って分化するよう指示されている細胞を意味する。直接分
化した細胞には、分化系列決定済みの細胞、前駆細胞、および最終分化細胞、ならびに分
化の中間段階における細胞が含まれる。
【００６４】
本明細書で用いられる「分化系列決定済みの細胞」の語は、マーカーを発現し始め、か
つ／または形態、構造、潜在性（例えば、特定の系列に沿って分化する能力）、および／
もしくは特定の系列に関連する他の特徴を発現し始めているがまだ「前駆」細胞ではない
細胞を示す。このように、「分化系列決定済みの細胞」は、幹細胞と前駆細胞との間の中
間体とみることができる。分化系列決定済みの細胞の例には、制限なく、神経分化決定済
みの細胞（例えば、神経ロゼット細胞）、造血分化決定済みの細胞、骨格筋分化決定済み
の細胞、心筋分化決定済みの細胞、膵臓分化決定済みの細胞などが含まれる。一つの説明
として、神経ロゼット細胞は、タンパク質マーカーのネスチンを発現するが、放射状の凝
集塊として成長し、一方、神経前駆細胞は個々の細長い細胞として成長する。このように
、神経ロゼット細胞は、幹細胞と神経前駆細胞との間の中間の特徴を発現する。
【００６５】
本明細書で用いられる「前駆細胞」は、典型的に、最終分化の前に、限られた回数だけ
分裂することができる複能性細胞を意味する。「前駆細胞」は、幹細胞に比べて潜在性お
よび自己複製能の低下を典型的に有する幹細胞の初期の子孫である。前駆細胞の非制限的
な例には、神経前駆細胞、造血前駆細胞、心筋前駆細胞、骨格筋前駆細胞、膵臓前駆細胞
などが含まれる。
【００６６】
「フィーダー」細胞の語は、当技術分野においてよく知られており、他の細胞（例えば
、幹細胞）と一緒に培養され、他の細胞の生存能および／または成長を支持する細胞（例
えば、線維芽細胞、骨髄間質細胞など）を包含する。
【００６７】
「親体」細胞または「親」細胞の語は、再プログラム化されるとｉＰＳ細胞を生成する
細胞を意味する。当技術分野において知られている通り、ｉＰＳ細胞は、特定の遺伝子の
発現を誘発し、かつ／または特定の核酸および／もしくは細胞の再プログラム化をもたら
すタンパク質を導入することによって、他の体細胞、典型的には非多能性の体細胞（例え
ば、線維芽細胞などの成体体細胞）などの細胞に由来する。ｉＰＳ培養物は、非多能性の
親細胞および／または部分的に再プログラム化された細胞によって頻繁に汚染されている
。親細胞は、形態（細長い）および／または１つもしくは複数の多能性マーカーの発現の
低下または欠如（当技術分野において知られており、本明細書に記載する通り）など、一
般に、当技術分野において知られている方法によって同定することができる。典型的には
、部分的に再プログラム化された細胞は、再プログラム化因子の全てではなく、いくつか
を取り上げている（例えば、細胞を再プログラム化するために導入された核酸の全てでは
なくいくつかで形質転換されている）。さらに、部分的に再プログラム化された細胞は、
親細胞に比べて丸く、または拡大のあまりない形態を有することが多いが、一般に多能性
マーカーを発現しない。
【００６８】
本発明者らは、幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）および幹細胞の誘導体に関連する特
徴的な「接着シグネチャー」は、これらの細胞を相互に、および／または基体に接着して
いる動物細胞の混合物中の他の細胞から、それに対して細胞が付着している（例えば、培
養されている）基体に対する接着強度の違いに基づいて、選択的に剥離および単離するの
に用いることができるという驚くべき発見をした。このように、それによって幹細胞が決
定済み細胞、前駆細胞、および最終分化細胞などの誘導体を形成するプロセスは、細胞の
接着の特徴（例えば、接着強度）における変化に反映され、このような細胞を単離するた
めのベースとして（例えば、夾雑した細胞を除去するために）用いることができる。細胞
の混合物中に存在する少なくとも１つの他の細胞型（例えば、夾雑した１以上の細胞型）
に対して、目的の細胞の基体に対する接着強度における十分な違い（高いまたは低い）が
存在し、それゆえ、基体に接着している細胞の混合物中の少なくとも１つの他の細胞型に
比べて、目的の細胞を選択的に基体から剥離する剥離力を印可することができる場合には
、基体に接着している細胞の混合物から目的の細胞を単離することができる。
【００６９】
実施形態において、目的の細胞は、細胞の混合物中の少なくとも１つの他の細胞型（例
えば、１、２、３、４、５つ以上の他の細胞型）に比べて、より低い剥離力で選択的に基
体から剥離する。非限定的な例には、細胞の混合物が接着している（例えば、培養されて
いる）基体に対して幹細胞よりも高い接着強度を有する、線維芽細胞、線維芽細胞様細胞
、および／または自発的に分化した幹細胞を含む細胞の混合物からの幹細胞（例えば、未
分化の幹細胞）の選択的な剥離が含まれる。別の一例として、ｉＰＳ細胞は、基体に対し
てｉＰＳ細胞よりも高い接着強度を有する親細胞および部分的に再プログラム化された細
胞に対して、基体に接着している細胞の混合物から選択的に剥離し、単離することができ
る。場合により、次いで、より高い力を適用して、基体に依然として接着している少なく
とも１つの他の細胞型を剥離することができる。
【００７０】
実施形態において、目的の細胞は、基体に接着している細胞の混合物中で、少なくとも
１つの他の細胞型（例えば、１、２、３、４、５つ以上の他の細胞型）に比べて、より高
い剥離力で選択的に基体から剥離する。この実施形態にしたがって、少なくとも１つの他
の細胞型は、より低い剥離力で基体から剥離する。実施形態において、目的の細胞は、次
いで、より高い剥離力を適用することによって基体から剥離され得る。あるいは、目的の
細胞は、基体に依然として接着しており、培養され得、かつ／または、例えば、生化学的
、タンパク質マーカー、遺伝子発現、および／もしくは遺伝子分析を含めた、さらなる分
析にさらされ得る。目的の細胞が基体に対してより高い接着強度を有する非限定的な例に
は、幹細胞の自発的な分化が、幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）よりも低い接着強度を
有する夾雑した神経前駆細胞様細胞を基体にもたらす場合が含まれる。
【００７１】
本発明の実施形態において、目的の細胞型の５０％剥離をもたらす壁剪断応力（τ５０
）は、細胞の混合物中の少なくとも１つの他の細胞型に対するτ５０に比べて、少なくと
も約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍高い。実施形態において、
目的の細胞型の５０％剥離をもたらす壁剪断応力（τ５０）は、細胞の混合物中の少なく
とも１つの他の細胞型に対するτ５０に比べて、約７０％、６０％、５０％、４０％、３
０％、２０％、１０％以下より少ない。
【００７２】
本発明者らは、幹細胞および幹細胞に由来する細胞は、このような細胞を相互に、およ
び基体に接着している他の細胞（例えば、培養物中の接着細胞）から単離するために活用
することができる特徴的な接着シグネチャーを有することを見出した。例えば、本発明の
方法は、例えば、夾雑した細胞を除去し、細胞を継代し、および／または珍しい細胞を単
離するなど、幹細胞および／または幹細胞に由来する細胞を単離する方法における使用を
見出すものである。したがって、本発明の方法は、一度（例えば、目的の細胞を同定する
ために）、または２回以上（例えば、継代細胞培養物中、例えば、２、３、４、５、６回
以上）行うことができる。
【００７３】
一態様として、本発明は、目的の細胞が幹細胞または幹細胞に由来する細胞であり、方
法が、基体に接着している動物細胞の混合物、目的の細胞および少なくとも１つの他の細
胞型（例えば、目的の細胞ではない細胞）を含む細胞の混合物を、細胞の混合物中の少な
くとも１つの他の細胞型に対して、目的の細胞を選択的に基体から剥離するのに十分であ
る剥離力にさらし、それによって目的の細胞を細胞の混合物から単離することを含む、目
的の細胞を動物細胞（例えば、培養動物細胞）の混合物から単離する方法を提供する。
【００７４】
代表的な実施形態において、目的の細胞は幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）である。
幹細胞には、制限なく、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、および／または成体幹細胞が含まれる。
実施形態において、幹細胞は成体幹細胞ではない。実施形態において、幹細胞は、多能性
に関連する１つまたは複数のマーカーを発現する。実施形態において、幹細胞は多能性で
ある。実施形態において、幹細胞は複能性である。
【００７５】
細胞の混合物中の少なくとも１つの他の細胞型は、例えば、汚染物質（例えば、目的の
細胞ではない細胞）として、細胞の混合物中に存在し得るあらゆる他の細胞型を含むこと
ができる。実施形態において、少なくとも１つの他の細胞型は、フィーダー細胞、親体細
胞、部分的に再プログラム化された細胞（例えば、ｉＰＳ細胞を再プログラム化および生
成するのに用いられるプロセスからの）、自発的に分化した幹細胞、および／または直接
分化した細胞（例えば、分化系列決定済みの細胞、前駆細胞、最終分化細胞）、ならびに
／あるいは印可される剥離力によって、目的の細胞を選択的に基体から剥離および単離す
ることができるように、基体に対する接着強度に十分な違いのあるあらゆる他の細胞であ
る。代表的な実施形態において、本発明の方法は、幹細胞の亜集団が基体に対する接着強
度に基づいて区別され得る場合、幹細胞の様々な亜集団から幹細胞の亜集団を単離するの
に用いられる。
【００７６】
このように、本発明は、例えば、細胞の継代などのために夾雑した細胞を除去するため
の、幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）を単離する方法における使用を見出す。説明のた
めに、本発明の実施形態によると、幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）はｉＰＳ細胞であ
り、少なくとも１つの他の細胞型は、親体細胞（例えば、線維芽細胞）および／または部
分的に再プログラム化された細胞である。
【００７７】
他の例示的な実施形態において、幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）は、ＥＳ細胞、ｉ
ＰＳ細胞、および／または成体幹細胞であり、少なくとも１つの他の細胞型はフィーダー
細胞である。
【００７８】
実施形態において、幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、お
よび／または成体幹細胞であり、少なくとも１つの他の細胞型は自発的に分化した幹細胞
である。
【００７９】
さらなる代表的な実施形態において、幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）は、ＥＳ細胞
、ｉＰＳ細胞、および／または成体幹細胞であり、少なくとも１つの他の細胞型は、直接
分化した細胞、場合により、分化系列決定済みの細胞、前駆細胞、および／または最終分
化細胞である。
【００８０】
別の一説明として、本発明の方法は、インビボの移植用に調製されている細胞（例えば
、前駆細胞および／または最終分化細胞などの直接分化した細胞）の集団から幹細胞を除
去するのに用いることができる。このように、本発明の実施形態において、目的の細胞は
夾雑した細胞である。
【００８１】
基体に対して接着性の細胞の混合物（例えば、培養細胞の混合物）中の少なくとも１つ
の他の細胞型に比べて、幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）を選択的に剥離するのに十分
であるあらゆる剥離力を用いることができる。代表的な実施形態において、剥離力は、約
７０または８０から約１５０または１６０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたら
す。実施形態において、剥離力は、約８０から１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応
力をもたらす。他の例示的な剥離力を本明細書に記載する。
【００８２】
本発明は、接着細胞として培養物中で成長する細胞で実践すると有利であり得る。例え
ば、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞（例えば、未分化状態における）は、一般的に、接着性の
培養物として成長し、例えば、継代および／または単離のために、単一細胞に分けられた
場合に生存性を失う。実施形態において、本発明を実践して、細胞凝集塊として培養物中
で成長する細胞を単離することができる。さらに、本発明の実施形態において、目的の細
胞（例えば、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）は、細胞の凝集塊の部分として基体から剥離す
る。
【００８３】
本発明の方法によって単離される細胞は、一般的に、その機能を保持している。例えば
、実施形態において、本発明の方法にしたがって単離される幹細胞（例えば、未分化の幹
細胞）は、１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５つ以上の）多能性マーカーの
発現を維持している。実施形態において、本発明の方法にしたがって単離される幹細胞（
例えば、未分化の幹細胞）は、２つ以上の異なる細胞型を生成する能力を保持している。
実施形態において、本発明の方法にしたがって単離される幹細胞（例えば、未分化の幹細
胞）は、内胚葉、中胚葉、および外肺葉を生成する能力である。さらなる実施形態におい
て、本発明の方法にしたがって単離される幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）は、多能性
または複能性である。
【００８４】
本発明の方法は、幹細胞に由来する細胞、例えば、幹細胞由来の分化系列決定済みの細
胞を単離する方法における使用を見出すものでもある。分化系列決定済みの細胞は、それ
だけには限定されないが、幹細胞由来の神経分化決定済みの細胞、幹細胞由来の造血分化
決定済みの細胞、幹細胞由来の骨格筋分化決定済みの細胞、幹細胞由来の心筋細胞、幹細
胞由来の膵臓分化決定済みの細胞、または、内胚葉、中胚葉、もしくは外胚葉に由来する
あらゆる他の系列を含めた、対象のあらゆる細胞系列からであってよい。分化系列決定済
みの細胞を同定する方法は当技術分野において知られており、例えば、マーカー発現、お
よび／または形態、構造、潜在性（例えば、特定の系列に沿って分化する能力）、ならび
に／あるいは特定の系列に関連する他の特徴を含む。実施形態において、神経分化決定済
みの細胞は、マーカーであるネスチンおよび／またはＭｕｓａｓｈｉ−１を発現する。場
合により、神経系列細胞は、培養物中で特徴的な放射状の凝集塊に一般的に成長する、神
経ロゼット細胞である。
【００８５】
分化系列決定済みの細胞を単離する場合（例えば、夾雑した細胞を除去するために）、
少なくとも１つの他の細胞型は、細胞の混合物中に存在するあらゆる細胞型であってよく
、例えば、幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）、フィーダー細胞、親体細胞、部分的に再
プログラム化された細胞、自発的に分化した幹細胞、別のタイプの分化系列決定済みの細
胞、前駆細胞、最終分化細胞、および／または剥離力を適用することによって、目的の細
胞を基体から選択的に剥離および単離することができるように、基体に対する接着強度に
十分な違いのあるあらゆる他の細胞である。
【００８６】
一つの説明的および非限定的な例として、この方法を用いて、神経分化決定済みの細胞
（例えば、神経ロゼット細胞）を、基体に対して接着している細胞の混合物から単離する
ことができる。典型的には、細胞の混合物中に存在する少なくともいくつかの幹細胞（例
えば、未分化の幹細胞）は、神経分化決定済みの細胞と一緒に単離される。いくつかの実
施形態において、神経分化決定済みの細胞は（存在するあらゆる幹細胞と一緒に）培養す
ることができ、場合により、神経分化決定済みの細胞を神経前駆細胞に分化させるように
、培地および／または他の培養条件を操作してもよい。さらなる選択肢として、神経前駆
細胞を、次いで、本発明による方法を用いて、培養物中に存在するあらゆる幹細胞（例え
ば、未分化の幹細胞）から単離して除去してもよい。
【００８７】
別の一例として、分化系列決定済みの細胞（例えば、神経分化決定済みの細胞）の培養
物は、拡大した、線維芽細胞様細胞が夾雑し得る。これらの細胞は、基体に対する接着強
度に基づいて区別することができ、本発明の方法にしたがって単離することができる。例
えば、神経ロゼット細胞は、比較的低い剥離力を適用することによって（本明細書に記載
する通り）、線維芽細胞様細胞から、選択的に剥離および単離することができる。
【００８８】
基体に対して接着している細胞の混合物中の少なくとも１つの他の細胞型に比べて、分
化系列決定済みの細胞を選択的に剥離するのに十分であるあらゆる剥離力を用いることが
できる。代表的な実施形態において、剥離力は、約２０から約１６０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の
範囲の壁剪断応力をもたらす。実施形態において、剥離力は、約７０または８０から約１
５０または１６０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす。実施形態において、
剥離力は、約８０から１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす。他の例示
的な剥離力を本明細書に記載する。
【００８９】
幹細胞由来の前駆細胞を接着性の動物細胞（例えば、培養動物細胞）の混合物から単離
する方法もまた、本発明によって企図される。前駆細胞に由来する幹細胞は、制限なく、
幹細胞由来の神経前駆細胞、造血前駆細胞、心筋前駆細胞、骨格筋前駆細胞、膵臓前駆細
胞、または内胚葉、中胚葉、もしくは外胚葉に由来するあらゆる他の系列を含めた、当技
術分野において知られているあらゆる細胞系列からのものであってよい。前駆細胞を同定
する方法は当技術分野において知られており、例えば、例えば、マーカー発現、および／
または形態、構造、潜在性（例えば、特定の系列に沿って分化する能力）、ならびに／あ
るいは特定の前駆細胞に関連する他の特徴を含む。例えば、幹細胞由来の神経前駆細胞は
、場合によりマーカーであるネスチンを発現し得、Ｔｕｊ−１および／またはＭＡＰ２を
発現する神経細胞に分化し得る。実施形態において、本発明の方法にしたがって単離され
る幹細胞由来の前駆細胞は、その機能を保持しており、例えば、複能性である（例えば、
２つ以上の系列特異的な細胞型に分化することができる）。
【００９０】
幹細胞由来の前駆細胞を単離するために本発明を実践する方法において、少なくとも１
つの他の細胞型は、細胞の混合物中に存在するあらゆる他の細胞型であってよい。例えば
、少なくとも１つの他の細胞型は、幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）、フィーダー細胞
、親体細胞、部分的に再プログラム化された細胞、自発的に分化した幹細胞、分化系列決
定済みの細胞、別の前駆細胞型、最終分化細胞、および／または剥離力を適用することに
よって、基体から目的の細胞を選択的に剥離および単離することができるように、基体に
対する接着強度に十分な違いのあるあらゆる他の細胞であってよい。
【００９１】
代表的な一例として、細胞の混合物中の残りの幹細胞（例えば、未分化の幹細胞）から
前駆細胞を単離して除くのが有利であり得る。当技術分野において、インビボで対象中に
移植した場合、残りの幹細胞は奇形腫を形成し得るという懸念がある。したがって、本発
明を実践して、移植に用いることができる前駆細胞の集団に対して奇形腫形成の危険性を
低減するために、前駆細胞を単離し、夾雑した幹細胞の集団を低減することができる。
【００９２】
基体に対して接着している細胞の混合物中の少なくとも１つの他の細胞型に比べて、前
駆細胞を選択的に剥離するのに十分であるあらゆる剥離力を用いることができる。代表的
な実施形態において、剥離力は、約１０から１２０または１３０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲
の壁剪断応力をもたらす。実施形態において、剥離力は、約２０から７０または８０ｄｙ
ｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす。またさらなる実施形態において、剥離力は
、約２０から４０、５０、または６０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす。
他の例示的な剥離力を本明細書に記載する。
【００９３】
本発明を実践して、（例えば、接着細胞の培養物中の）細胞の混合物から、最終分化細
胞を単離することもできる。最終分化細胞は、当技術分野において知られているあらゆる
分化した細胞、例えば、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、血液細胞、肝細胞、皮膚細
胞、内皮細胞、膵臓細胞、肝細胞、神経細胞、または内胚葉、中胚葉、もしくは外胚葉に
由来するあらゆる他の細胞であってよい。最終分化細胞を同定する方法は当技術分野にお
いて知られており、例えば、マーカー発現、形態、機能、および／または構造上の特徴を
含む。例えば、心筋は、一般的に、ＭｙｏＤ、Ｐａｘ７、および／またはミオシン重鎖を
発現する。
【００９４】
本発明の方法にしたがって最終分化細胞を単離する場合、少なくとも１つの他の細胞型
は、細胞の混合物中に存在することがあるあらゆる細胞（例えば、夾雑した細胞）であっ
てよい。代表的な実施形態において、少なくとも１つの他の細胞型は、幹細胞（例えば、
未分化の幹細胞）、フィーダー細胞、親体細胞、部分的に再プログラム化された細胞、自
発的に分化した幹細胞、分化系列決定済みの細胞、前駆細胞、別の最終分化細胞型、およ
び／または剥離力を適用することによって、基体から目的の細胞を選択的に剥離および単
離することができるように、基体に対する接着強度に十分な違いのあるあらゆる他の細胞
である。
【００９５】
基体に接着している細胞の混合物中に存在する少なくとも１つの他の細胞型に比べて、
最終分化細胞を選択的に剥離するのに十分であるあらゆる剥離力を用いることができる。
代表的な実施形態において、剥離力は、約２０から１２０または１３０ｄｙｎｅ／ｃｍ２
の範囲の壁剪断応力をもたらす。実施形態において、剥離力は、約７０から１２０または
１３０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす。実施形態において、剥離力は、
約２０から７０または８０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁剪断応力をもたらす。またさらな
る実施形態において、剥離力は、約２０から４０または５０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲の壁
剪断応力をもたらす。他の例示的な剥離力を本明細書に記載する。
【００９６】
本発明を実践する上で、（例えば、培養物中の）あらゆる２つの接着細胞を、基体に対
して十分に異なる接着強度で分離することができる。本発明の実施形態において、目的の
細胞は、少なくとも１つの他の細胞型に比べて低い剥離力で剥離する。例えば、幹細胞（
例えば、未分化の幹細胞）は、より低い剥離力で選択的に剥離され得るので、夾雑した線
維芽細胞または線維芽細胞様細胞、および自発的に分化した細胞から幹細胞を単離するこ
とができる。
【００９７】
あるいは、目的の細胞は、少なくとも１つの他の細胞型に比べて高い剥離力で剥離する
ことができる。説明のために、少なくともいくつかの神経前駆細胞は、（例えば、未分化
の）幹細胞または神経分化決定済みの細胞に対して低い接着力を有する。このように、い
くつかの実施形態によると、より低い剥離力で神経前駆細胞から最初に剥離することによ
って、幹細胞および／または神経分化決定済みの細胞を、神経前駆細胞から単離すること
ができる。幹細胞および／または神経分化決定済みの細胞を、次いで、培養し、分析にか
けてもよく、および／またはより高い剥離力を適用することによって剥離してもよい。
【００９８】
本発明の方法にしたがって単離した細胞は、一般的に、生存可能で、かつ／または分裂
し子孫細胞を生成する能力を保持している。例えば、本発明の実施形態において、少なく
とも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９
９％以上の細胞が生存可能であり、かつ／または分裂し子孫細胞を生成する能力を保持し
ている。
【００９９】
さらに、本発明の実施形態において、細胞は、高い効率で、および／または高い純度レ
ベルで単離される。本発明の実施形態において、基体に接着している動物細胞の混合物中
、目的の細胞の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％以上が単離される。実施形態において、複数の目的の細胞が、
少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％以上の純度で単離される。
【０１００】
さらに、本明細書に提供する単離方法は、極めて頑強であることが見出されており、細
胞の混合物中の広範囲の出発濃度で存在する細胞を単離することができる。例えば、本発
明の実施形態において、目的の細胞は、動物細胞の混合物中、約５０％、４０％、３０％
、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％以下より少
ない細胞を構成する。実施形態において、目的の細胞は、動物細胞の混合物中、少なくと
も約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９
％以上の細胞を構成する。
【０１０１】
本発明の方法にしたがって単離した細胞は、例えば、さらなる培養、移植、ならびに／
あるいは測定（例えば、フローサイトメトリー、生化学的分析、遺伝子発現分析、および
／またはあらゆる他の適切な分析による測定）などの、あらゆる目的に用いることができ
る。
【０１０２】
剥離力を、あらゆる適切な方法を用いて細胞の混合物に適用することができる。非限定
的な例として、剥離力を、水力学的力、遠心力、および／または磁力によって、適用する
ことができる。実施形態において、剥離力を適用する方法は、検出可能な標識および／ま
たは親和性試薬で細胞を標識化することを伴わない。
【０１０３】
剥離力を、所望のレベルの剥離および単離を実現するためのあらゆる適切な期間、適用
することができる。実施形態において、剥離力を、少なくとも約０．５、１、２、３、４
、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０分、および／または約５、
６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５
、５０、５５、６０、７５、９０、１０５、または１２０分未満適用する（下限が上限未
満である限り、低値および高値の全ての組合せを含む）。代表的な実施形態において、期
間は約２分から２０分までである。実施形態において、期間は約５分から１５分までであ
る。
【０１０４】
代表的な実施形態において、この方法は、マイクロ流体装置または回転盤装置において
行われる。
【０１０５】
本発明は、本発明の方法によって生成される、単離された細胞、ならびに細胞の単離さ
れた集団および培養物をさらに提供する。
【０１０６】
本発明を、以下の実施例においてより詳しく記載するが、実施例における多くの改変お
よび変形は当業者には明らかであるので、実施例は単なる説明を意図するものである。
【実施例１】
【０１０７】
［材料と方法］
＜細胞培養物＞
ｈｉＰＳＣ（ｉＭＲ９０）は、ＡｒｕｎＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．からのも
のであり、ＥＦ１αプロモーターによって駆動されるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、
ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４、およびｃ−ＭＹＣをコードするレンチウイルスの６個のベクター
で構成されるｖｉＰＳ（商標）Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ  Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、同社によって確証された。簡潔に述
べると、ＩＭＲ９０ヒト胎児肺線維芽細胞（女性、ＡＴＣＣ）を、製造元のプロトコール
にしたがって、再プログラム化用に形質導入した（各ベクターのＭＯＩ＝１０）。形質導
入した線維芽細胞を、不活化したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上に接種してコロニー
を形成させ、出現したｈｉＰＳＣのコロニーをＭＥＦ上の機械的解離によって、手作業で
継代した。ｈｉＰＳＣは明瞭な境界、高比率の核対細胞質、突出した核小体、アルカリホ
スファターゼ活性、細胞表面マーカーＳＳＥＡ４の発現陽性、胚様体形成、および奇形腫
形成を示した。ｈｉＰＳＣをフィーダーフリーの培養系に移すために、コロニーを、ｍＴ
ｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、機械的
解離によって、マトリゲル（商標）（１：１００希釈、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
上へ手作業で継代した。試験で用いたｈｉＰＳＣは、２６〜４８継代の間であり、マトリ
ゲル（商標）上、ｍＴｅＳＲ（登録商標）培地中で、フィーダーフリーの未分化コロニー
（ＵＤ−ｈｉＰＳＣ）として通常どおり培養し、ディスパーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）で酵素的
に継代した後、掻き取った。ヒト皮膚線維芽細胞由来のｈｉＰＳＣ（１１ｂ、健常男性ド
ナー）をＨａｒｖａｒｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得、上記の通り
培養した。試験で用いたｈＥＳＣは、３５継代（ＨＩ、Ｗｉｃｅｌｌ）、５４継代（Ｈ７
、Ｗｉｃｅｌｌ）のものであり、先に記載した通り、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中Ｍ
ａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養した。ＩＭＲ９０ヒト胎児肺線維芽細胞（１５〜２
０継代）、ヒト皮膚線維芽細胞（一次成体皮膚、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）
、およびＭＥＦ（一次単離したもの、２継代）を、１％Ｌ−グルタミン、１％非必須アミ
ノ酸、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含
有するダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。表１に列挙する抗体を用いて、免疫染
色およびフローサイトメーター測定を行った。
【表１】
2019013237.tif 000002
【０１０８】
＜神経ロゼット、前駆細胞、および分化した神経細胞の誘導＞
神経ロゼットおよびその後の神経前駆細胞、ならびに分化した神経細胞は、ｈＥＳＣ５
３を用いて先に記載した方法に基づく、フィーダーフリーの、ｈｉＰＳＣの多能性コロニ
ー（４０継代または５２継代）からのものであった。簡潔に述べると、ｈｉＰＳＣを、デ
ィスパーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）により酵素的に、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳＴＥＭ
ＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に細胞を掻き取った後、ＢＤマトリゲル（商標
）（１：１００希釈；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に１：２に継代した。４日間、
１日おきに培地を交換した。５日目、培地を神経誘導培地（Ｎ−２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および５
０Ｕ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ−１２）に切り替え、１日おきに交換した。神経誘
導培地中で１週間後、神経ロゼットを手作業で単離し、次いで、神経増殖培地（Ｂ−２７
（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、１
０ｎｇ／ｍＬ白血病抑制因子（ＬＩＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン
（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および５０Ｕ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬペニシ
リン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補ったＮｅｕｒｏ
ｂａｓａｌ（登録商標）培地）中ＢＤマトリゲル（商標）（１：２００希釈）上で増殖さ
せ、培地を１日おきに交換した。分化４週間後、神経前駆細胞を、神経ロゼット培養物か
ら手作業で単離し、神経増殖培地中ＢＤ  マトリゲル（商標）上の接着性の単層として増
殖させた。セルスクレーパーにより手作業で数代継代した後、ＢＤマトリゲル（商標）（
１：２００希釈）上のｈｉＰＳＣ由来神経前駆細胞のコンフルエント培養物を、神経増殖
培地からＦＧＦ２を除去し、培地を２〜３日ごとに交換することによって、２週間、成熟
したβ−ＩＩＩチューブリン（ＴＵＪ１）／ＭＡＰ２陽性神経細胞に分化させた。
【０１０９】
＜ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）マイクロパターン化アレイのデザインおよび
製作＞
１０μｍ、２０μｍ、５６μｍ、および１７０μｍを有するＰＤＭＳマイクロパターン
化アレイを、ケイ素アレイマスターから製作した（Ｇａｌｌａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｅｌｌ、１６巻、４３２９〜４３４０頁（２００５年）；Ｄｕｍｂａｕｌｄら、Ｊ．
Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２２３巻、７４６〜４５６頁（２０１０年）；Ｆｕら、Ｎ
ａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、７巻、７３３〜７３６頁（２０１０年））。Ｔｉ（１００Å）そ
の後Ａｕ（１００Å）でコーティングしたガラス製のカバーガラス上のマイクロコンタク
トプリンティングを、ヘキサデカンチオール／（ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−（ＣＨ２）
１１ＳＨ）の化学的性質を用いて実現した（Ｇａｌｌａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ、１６巻、４３２９〜４３４０頁（２００５年）；Ｄｕｍｂａｕｌｄら、Ｂｉｏｌ．
Ｃｅｌｌ、１０２巻、２０３〜２１３頁（２０１０年））。カバーガラスを細胞外マトリ
ックス（ＥＣＭ）タンパク質（フィブロネクチンまたはラミニン、カルシウム／マグネシ
ウム含有ＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした（Ｇａ
ｌｌａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、１６巻、４３２９〜４３４０頁（２００５
年）；Ｄｕｍｂａｕｌｄら、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、１０２巻、２０３〜２１３巻（２０１
０年））。１％変性ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）で３０分間ブロックし、リン酸緩
衝食塩水（ＰＢＳ）中２時間、タンパク質を溶出した後、ＩＭＲ９０細胞またはｈｉＰＳ
の単一細胞の懸濁液をＲＯＣＫ−阻害剤であるＹ２７３６２（１０μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ）もしくはＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ（２μＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ（登録商標））を
含有するｍＴｅＳＲ１培地中に接種した。簡潔に述べると、ｈｉＰＳ細胞を、０．０５％
トリプシンで１分間処理し、コロニーとして掻き取った。次いで、細胞をｍＴｅＳＲ（登
録商標）１中Ｙ２７３６２−ＲＯＣＫ阻害剤で単一細胞として調製し、一晩、マイクロパ
ターン化したスタンプ上に１００，０００細胞／ｍｌとして接種した。
【０１１０】
＜細胞接着力測定＞
回転円盤系（Ｇａｒｃｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３巻、１０９８８〜１
０９９３頁（１９９８年）；Ｇａｌｌａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、１６巻、
４３２９〜４３４０頁（２００５年））を用いて細胞接着強度を測定した。一晩培養した
接着細胞を有するカバーガラスを、注文制作の装置中、米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）（ＡＳ
ＴＭ規格Ｆ２６６４−１１）にしたがって、２ｍＭデキストロース含有ＰＢＳ中、５分間
、一定速度で回転させた。適用した剪断応力は（τ）、式τ＝０．８ｒ（ρμω３）１／
２によって与えられ、式中、ｒは半径方向位置であり、ρおよびμはそれぞれ液体の密度
および粘度であり、ωは回転速度である。回転後、細胞を３．７％ホルムアルデヒド中で
固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００中で透過処理し、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）で染色し、Ｌｕｄｌモーターステージ、Ｓｐｏｔ−ＲＴカメラ、およびＩ
ｍａｇｅ−Ｐｒｏ（登録商標）分析システムを装備したＮｉｋｏｎ  ＴＥ３００顕微鏡に
おいて１０×対物レンズを用いて特定の半径方向位置で計数した。６１視野を分析し、細
胞凝集塊計数を、ディスク中央の細胞凝集塊計数の数値に対して標準化し、この場合、適
用した力はゼロであった。次いで、接着細胞凝集塊の分画（ｆ）をＳ字形曲線ｆ＝１／（
１＋ｅｘｐ［ｂ（τ−τ５０）］）にあてはめ、式中、τ５０は５０％剥離に対する剪断
応力であり、ｂは変曲点勾配である。τ５０は、細胞の集団に対する接着強度の平均値を
表す。接着強度の応答を、飽和性のフィブロネクチンまたはラミニン濃度（５０μｇ／ｍ
ｌ）またはマトリゲル（商標）（１：８０希釈）でコーティングしたマイクロパターン化
アイランド上で分析した。
【０１１１】
＜局所接着アセンブリー＞
局所接着タンパク質の免疫蛍光染色を、先に記載されている通りに行った（Ｇａｌｌａ
ｎｔら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、１６巻、４３２９〜４３４０頁（２００５年））
。簡潔に述べると、細胞を、氷冷したカルシウムおよびマグネシウム含有のＰＢＳで予備
洗浄し、氷冷した細胞骨格安定化バッファー（５０ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのショ糖
、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１μｇ  ｍｌ−１  アプロチニン、１μｇ  ｍｌ−１  ロイペプ
チン、１μｇ  ｍｌ−１  ペプスタチン、および１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル
）中１分間インキュベートした後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００（Ｒｏｃｈ
ｅ）を補った細胞骨格安定化バッファー中で２回インキュベートした（１回１分）。洗剤
で抽出した細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＰＢＳで洗浄し、ビン
キュリン（Ｕｐｓｔａｔｅ）またはタリン（Ｓｉｇｍａ）に対する一次抗体とインキュベ
ートし、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−コンジュゲートした抗体（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）で検出した。
【０１１２】
＜マイクロ流体装置の製作＞
ＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＩ）マイクロ流体装
置を、ネガティブフォトレジスト（ＳＵ−８  ２０５０、厚さ５０μｍ、ＭｉｃｒｏＣｈ
ｅｍ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）およびＵＶ光フォトリソグラフィーを用いて、先に報告され
ている通りに製作した（ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２１巻
、２７〜４０頁（２０００年））。パターン化したネガティブモールドを、次いで、真空
乾燥機中、気相トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル−１−トリク
ロロシラン（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｒｉｓｔ
ｏｌ、ＰＡ）に暴露してＰＤＭＳの接着を防止した。脱気したＰＤＭＳ混合物（比率１０
：１）の厚さ５ｍｍの層を型上に鋳造し、７０℃で２時間硬化させた。ＰＤＭＳ鋳造装置
をはがし、次いで、入口−出口の孔用に穿孔し、酸素プラズマに２０秒間暴露することに
よりガラス製のカバーガラスに結合させた。
【０１１３】
＜マイクロ幹細胞高効率接着ベース回収（μＳＨＥＡＲ）に基づく単離＞
ＥＣＭタンパク質でコーティングする前に、マイクロ流体チャンネルおよびチューブを
７０％エタノールで滅菌し、ＰＢＳで徹底的に洗い流した。５０μｇ／ｍｌ（フィブロネ
クチンもしくはラミニン）のＥＣＭタンパク質または１：８０マトリゲル（商標）を、滅
菌装置を通して流し、室温で１時間インキュベートした。多能性幹細胞の小型コロニーお
よび線維芽細胞の単一細胞懸濁液を予備混合し、２００μｌピペットチップを用いて入口
のリザーバ中にピペッティングし、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間、装置中で培養した後
、剥離実験を行った。装置入口を、ポリエチレン配管（カタログ番号ＢＢ３１６９５−Ｐ
Ｅ／４、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｍｏｄｉｔｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いてシリンジ
ポンプに接続し、出口チューブを回収チューブ中に空けた。ＰＢＳを、あらかじめ決定し
た流速で装置を通して流して、望ましい液体剪断応力に適合させ、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ顕微
鏡によって細胞の剥離をモニタリングした。このマイクロ液体の流れ構造では、適用した
壁剪断応力（τ）は、式τ=１２（μＱ／ｗｈ２）によって規定され、式中、ｗおよびｈ
はそれぞれチャンネルの幅および高さであり、μは液体粘度であり、Ｑは液体の流速であ
る（Ｌｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７６巻、５２５７〜５２６４頁（２００４年））。
細胞／コロニーを、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７３６３（または２μＭのＴｈｉａｚ
ｏｖｉｖｉｎ）含有ｍＴｅＳＲ（登録商標）培地中、マトリゲル（商標）コーティングし
た組織培養プレート上にプレーティングした。精製効率を決定するためのフローサイトメ
トリー試験では、収集したコロニーまたは細胞を、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ（登録商標）Ｓｔａ
ｉｎＡｌｉｖｅ（商標）−ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）−４８８マウス抗ヒトＴＲＡ−１−６
０抗体およびＣＭＰＴＸ−Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ色素の懸濁液中に直ちに再
懸濁し、４５分間染色し、洗浄し、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０１１４】
＜多能性幹細胞の特性分析＞
核型分析を、各試料に対して、２０個の分裂中期スプレッドに対してＣｅｌｌＬｉｎｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって行った。集団の倍加時間および生
存を決定するために、μＳＨＥＡＲから剥離したコロニーを単一細胞に解離し、マトリゲ
ル（商標）コーティングした１２ウェルプレートにプレーティングした。あらかじめ決定
した時間に、ウェルを洗浄し、細胞を計数した。ウルトラハイスループット強制的凝集方
法を用いて、剥離し、拡大したｈｉＰＳＣから胚様体（ＥＢ）を形成させ（Ｂｒａｔｔ−
Ｌｅａｌら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、３２巻、４８〜５６頁（２０１１年）、２４時
間後、細胞凝集物を回転起動シェーカー（６５ＲＰＭ）上の懸濁培養物に移した。ＥＢを
細胞チャンバー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）中でプレーティングすることによって分化を続け
、２１日後、分化した細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．０５％Ｔｒｉｔｏ
ｎ（商標）−Ｘ１００で浸透化し、α−フェトプロテイン、α−平滑筋アクチン、および
ＰＡＸ６に対する抗体で染色した。
【０１１５】
＜遺伝子発現分析＞
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（商標）およびＲＮｅａｓ
ｙ（登録商標）Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造元のプロトコールにした
がって、ＲＮＡを単離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成を、ＲＴ２  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ
Ｋｉｔ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った後、ヒト胚性幹細胞ＰＣＲアレ
イ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、製造元の推奨するプロトコールにしたがい
、それぞれＢｉｏＲａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ（商標）および  ＢｉｏＲａｄ  ＭｙｉＱ（
商標）リアルタイムサーマルサイクラーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。個々のＣ
ｔ値を、最初に、ＧＡＰＤＨに対して内部的に標準化し、その後、ｌｏｇ２変換および階
層的凝集塊分割を含むＧｅｎｅｓｉｓソフトウエア（Ｇｒａｚ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  
ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で分析した。
【０１１６】
＜統計＞
インテグリンのプロファイリングに対して、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ８．５．１を用いて一
元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った後、ボンフェローニ補正を行った。対応のある両
側のスチューデントのｔ検定を行って、接着ブロッキング、接着強度、およびμＳＨＥＡ
Ｒアッセイにおける２群間の有意差を決定した。全ての検定において、ｐ＜０．０５を統
計上有意とみなした。別段の記載がなければ、実験は全て３回繰返し、棒グラフは平均値
±ＳＤを表す。
【実施例２】
【０１１７】
［誘導した再プログラム化および分化を有する「接着シグネチャー」における変化］
再プログラム化のプロセスの間、線維芽細胞および他の親細胞に由来するｈｉＰＳＣは
、間葉から上皮への移行を経て細胞形態における著しい変化を受け、多能性状態を示す表
現型をもたらす（Ｓａｍａｖａｒｃｈｉ−Ｔｅｈｒａｎｉら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅ
ｌｌ、７巻、６４〜７７頁（２０１０年））。ｈＥＳＣ同様、ｈｉＰＳＣは、哺乳動物胎
児の胚盤葉上層上皮に類似の超微細構造の特徴を有する小型の上皮コロニーに成長する（
Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７巻、２４０〜２４８頁（２０１０年））
。本発明者らは、フィーダーフリーのＵＤ−ｈｉＰＳＣが接着力の特徴を表すか、または
親ヒト線維芽細胞（ＩＭＲ９０）、ＳＤ−ｈｉＰＳＣ、および定方向分化によって得られ
た神経前駆細胞とは異なる「接着シグネチャー」を表すかを評価するために試験をデザイ
ンした（図１Ａ）。
【０１１８】
細胞の、その周囲のマトリックスに対する接着強度は、細胞外マトリックス分子にライ
ゲーションしているインテグリン受容体の量および空間分布と、細胞骨格エレメントに結
合しているインテグリンの会合との複合関数である（Ｇａｒｃｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．、２７３巻、１０９８８〜１０９９３頁（１９９８年）；ＧｅｉｇｅｒおよびＢ
ｅｒｓｈａｄｓｋｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３巻、５８４〜４
９２頁（２００１年）；Ｇａｌｌａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、１６巻、４３
２９〜４３４０頁（２００５年））。これら接着の特徴の合成関数は、細胞の接着シグネ
チャーを構成し、様々な状態における細胞の表現型を規定するのに用いられ得る。ＩＭＲ
９０系統および一次皮膚線維芽細胞を含めたヒト線維芽細胞は、再プログラム化用の、最
も一般的な体細胞源の一つを代表する（Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９１７〜１９２０頁
（２００７年）；Ｌｉｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４６２巻、３１５〜３２２頁（２００
９年））。ＩＭＲ９０および皮膚線維芽細胞は、緊密に充填された上皮のコロニーとして
存在した再プログラム化された状態のＵＤ−ｈｉＰＳＣに比べて、直接的な細胞−細胞接
着および明確な細胞の極性のない、細長い形態を表した（図１Ｂおよび１Ｅ）。ＵＤ−ｈ
ｉＰＳＣと異なり、部分的に自発的に分化したコロニーは、間葉系様および上皮様の形態
を有する領域を表した（図１Ｂ）。ＩＭＲ９０親細胞は、多能性マーカーであるＯＣＴ４
およびＳＳＥＡ４の非存在によってさらに特徴づけられ、ＯＣＴ４およびＳＳＥＡ４は、
数ある中でも、ｈｉＰＳＣの未分化状態を規定するものであった（図１Ｃ）。派生したｈ
ｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＮＡＮＯＧ、およびＴＲＡ−１
−８１に対して陽性であり（図１Ｃおよび１Ｆ）、したがって完全に再プログラム化され
た細胞を表していた（Ｃｈａｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２７巻、１０３３
〜１０３７頁（２００９年））。自発的な分化が生じるにつれ、上皮のＵＤ−ｈｉＰＳＣ
から間葉系のＳＤ−ｈｉＰＳＣに移行する細胞は、ＯＣＴ４およびＳＳＥＡ４の発現の著
しい低下または完全な非存在によって示される通り、多能性を失った（図１Ｃ）。再プロ
グラム化に起因する著しい形態の変化のため、本発明者らは、人工多能性細胞が、親体細
胞に比べた場合、接着の特徴における著しい変化を表すか否かを評価した。さらに、ヒト
神経ロゼットは、ｈｉＰＳＣ３３の定方向分化によって得られた初期の複能性神経幹細胞
の別のグループであるが、丸型のＵＤ−ｈｉＰＳＣおよび周囲の、拡大した線維芽細胞様
細胞とは異なる、放射状パターンの上皮細胞様の形態を表した（図１Ｂ）。ネスチン（図
１Ｃ）およびＭｕｓａｓｈｉ−１（図１Ｇ）を発現するロゼットは、手作業で単離され、
細長い上皮の形態を有し、ＯＣＴ−４発現のない神経前駆細胞にさらに分化した（図１Ｈ
）。
【０１１９】
親線維芽細胞および再プログラム化された状態によって発現されるインテグリンプロフ
ァイルにおける変化を調べた。ＩＭＲ９０線維芽細胞およびｈｉＰＳＣを、フィブロネク
チンまたはラミニン上で培養し、いくつかのαおよびβインテグリンサブユニットの発現
に対して分析した。線維芽細胞およびＵＤ−ｈｉＰＳＣの、フィブロネクチン、ラミニン
、およびマトリゲル（商標）に対する接着に伴う、インテグリンα５、α６、およびβ１
の発現における違いが観察された（図２Ａ）。フローサイトメトリー分析により、細胞が
フィブロネクチン、ラミニン、またはマトリゲル（商標）上のいずれかで培養されたかに
かかわらず、ｈｉＰＳＣに比べて、ＩＭＲ９０線維芽細胞によるα５インテグリンの３０
〜３５％高い発現が明らかになった。（ｐ＜０．０５、図２Ａ）。これとは対照的に、ｈ
ｉＰＳＣは、全てのマトリクスに対して、ＩＭＲ９０細胞よりも６０〜７０％多いα６イ
ンテグリンを発現した（図２Ａ〜２Ｃ）。ｈｉＰＳＣによるβ１サブユニットの発現は、
ＩＭＲ９０細胞に比べてマトリゲル（商標）上で培養した場合にのみ有意に高かった。ブ
ロッキング抗体を用いた接着阻害試験により、β１インテグリンは、ＩＭＲ９０およびｈ
ｉＰＳＣのこれらマトリクスに対する接着の媒介に関与していたことが明らかになった（
図２Ｄ）。α６インテグリンのブロッキングにより、ｈｉＰＳＣのラミニンに対する接着
は有意に低下したが、ＩＭＲ９０細胞の接着は阻害されなかった（図２Ｄ〜２Ｅ）。さら
に、α５インテグリンのブロッキングにより、ｈｉＰＳＣおよびＩＭＲ９０細胞のフィブ
ロネクチンに対する接着が有意に低下したが、ラミニンに対する接着は変化がなかった（
図２Ｄ〜２Ｅ）。ｈｉＰＳＣにおけるα６β１インテグリンの高発現は、ｈＥＳＣの先の
試験と一致する（Ｍｅｎｇら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、２４巻、１０５６〜１０６５頁（２０
１０年））。
【０１２０】
様々な次元のＥＣＭ−コーティングした接着性アイランド上の、親線維芽細胞およびｈ
ｉＰＳＣに対する定常状態の接着強度を、回転ディスク装置を用いて評価した（Ｇａｒｃ
ｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３巻、１０９８８〜１０９９３頁（１９９８年
）；Ｇａｌｌａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、１６巻、４３２９〜４３４０頁（
２００５年）；Ｄｕｍｂａｕｌｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２２３巻、７４
６〜７５６頁（２０１０年））。この装置は、ある範囲の明確な水力学的力を接着細胞に
適用し、接着強度の高感度な測定を提供するものである。接着細胞を層流にさらして、水
力学的な壁剪断応力（τ、力／面積）に比例する剥離力を作り出す。適用された剥離力は
、試料の表面に沿って放射状の位置に対して直線的に変化し、一回の実験で、ある範囲の
力の適用をもたらす。接着強度の応答を、フィブロネクチンもしくはラミニンの飽和濃度
（５０μｇ／ｍｌ）、またはマトリゲル（商標）（１：８０希釈）でコーティングした接
着表面上で分析した。
【０１２１】
再プログラム化の前および後の状態に伴う細胞の形態および拡大性において違いがあっ
たため、本発明者らは、ｈｉＰＳＣが親線維芽細胞よりも低い接着強度（５０％剥離に対
する剪断応力（τ５０））を表すか否かを評価した。図３Ａは、ｈｉＰＳＣおよびＩＭＲ
９０細胞に対する剥離のプロファイルを表しており、各プロファイルは、剪断応力を増大
させると接着細胞／凝集塊の分画にＳ字形の低下があることを示している。ＩＭＲ９０細
胞に比べて、ｈｉＰＳＣに対するＳ字形プロファイルにおける著しい左方向のシフトは、
再プログラム化されたｈｉＰＳＣに対する接着強度の低下を示している。接着強度分析に
より、親ＩＭＲ９０線維芽細胞に比べて（５６０±８．９ｄｙｎｅ／ｃｍ２）、フィブロ
ネクチン上のｈｉＰＳＣに対する接着強度（８１±７．６ｄｙｎｅ／ｃｍ２）はおよそ７
倍低いことが明らかになった（ｐ＝０．０００２、図３Ｂ）。接着強度試験を、ラミニン
（図３Ｂ）およびマトリゲル（商標）（図３Ｃ）上で培養したＩＭＲ９０（親細胞として
）およびＭＥＦに比べて、ｈｉＰＳＣ（ＩＭＲ９０）およびｈＥＳＣ（Ｈ１，Ｈ７）の間
で行った。全体的な接着強度は、いずれかの線維芽細胞性の細胞に比べてｈＰＳＣでは著
しく低く（ｐ＜０．０２）（図３Ｃ）、ｈｉＰＳＣに対する再プログラム化の前と後との
状態の間の接着の性質における劇的なシフトを指摘しており、これらの結果はｈＥＳＣで
観察されたものと同等であった。これらの結果は、ｈＰＳＣおよび下層のマトリックスの
継代数に非依存的であった。皮膚の線維芽細胞に由来するｈｉＰＳＣ（男性ドナー、ＯＳ
Ｋファクター、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の接着強度
は、ｈｉＰＳＣ（ＩＭＲ９０）と同様であり、親ヒト皮膚線維芽細胞より有意に低く（図
３Ｄ）、接着シグネチャーは真のｈｉＰＳＣに対して独特であり、源、再プログラム化因
子の数、または親線維芽細胞のタイプに依存しないが、むしろ多能性幹細胞の表現型状態
に依存することを明らかに示していた。まとめると、これらの結果は、ｈＰＳＣと親細胞
との接着シグネチャー間の違いを指摘している。
【０１２２】
再プログラム化が誘発する形態学的変化により、細胞骨格構造および局所接着アセンブ
リーにおける変更の試験が導かれた。線維芽細胞は、細胞の長軸に平行の明確なアクチン
張力繊維を保有していた（図３Ｅ）。これとは対照的に、再プログラム化されたｈｉＰＳ
Ｃは、細胞−細胞接合部に局在するアクチン繊維を著しく少なく表した（図３Ｅ）。細胞
骨格タンパク質であるタリンおよびビンキュリンは、接着機能の中心的な制御因子として
出現している（Ｇａｌｌａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、１６巻、４３２９〜４
３４０頁（２００５年）；Ｂａｌａｂａｎら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、３巻、４
６６〜４７２頁（２００１年）；Ｄｕｍｂａｕｌｄら、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、１０２巻、
２０３〜２１３頁（２０１０年））。ＩＭＲ９０線維芽細胞において、ビンキュリンおよ
びタリンは局所接着で強度に濃縮された（図３Ｅ）。ｈｉＰＳＣは局所接着をほとんど表
さず、ビンキュリンおよびタリン染色は細胞質にわたって散在し、または細胞−細胞接合
部、ときには小型の糸状仮足を突出する先端部に局在していた（図３Ｅ）。局所接着に対
する所見は、フィブロネクチン、ラミニン、およびマトリゲル（商標）をコーティングし
た表面上で培養した細胞に対して同様であった。接着力における違いは、ｈｉＰＳＣに比
べて、ＩＭＲ９０細胞における局所接着に対するビンキュリンおよびタリンの局在の増大
に直接相関し、それゆえｈＰＳＣにおける固有の「接着シグネチャー」を示すものである
。
【０１２３】
線維芽細胞は、典型的に個々の拡大した細胞として存在するが、ｈｉＰＳＣ細胞の多細
胞性、コロニーサイズ、および細胞−細胞接着が、接着強度などの生物物理学的性質にど
のように影響を及ぼすかは明らかではない。ｈｉＰＳＣの生存および未分化の表現型が、
Ｅ−カドヘリンベースの細胞−細胞接着を有する上皮様コロニーとして存在するのが最適
である（Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７巻、２４０〜２４８頁（２０１
０年）；Ｏｈｇｕｓｈｉら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７巻、２２５〜２３９頁（
２０１０年））。マイクロパターン化した基体を用いて、凝集塊／コロニーサイズに対す
るｈｉＰＳＣの接着強度の機能的依存、および上皮細胞の凝集塊数を調べた。様々な寸法
の（直径１０、２０、５６、および１７０μｍ）円形の接着性アイランドのアレイを操作
して、ほぼ１００倍の範囲の入手可能な接着面積を調べた（図３Ｆ）。より大型のアイラ
ンド上には、ｈｉＰＳＣのコロニーは良好に接着し、高い（＞９５％）生存性率を表した
が、ｈｉＰＳＣは、１０μｍ接着性アイランド上には個々の細胞としてゆるく接着し、一
夜培養物中では生存しなかった（図３Ｇ）。コロニーサイズ、したがってコロニーあたり
の細胞数は接着面積とともに増大し（図３Ｇ、表２）、接着性のマイクロパターン化した
アイランド上で培養したｈｉＰＳＣはＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、および
ＴＲＡ−１−８１の発現を保持していた（図３Ｈおよび３Ｉ）。ｈｉＰＳＣの接着強度は
コロニーサイズに非依存的であり、接着面積における７０倍の増大および凝集塊の多細胞
性における１４倍の増大にわたって、接着強度における有意差は観察されなかった（図３
ｊ）。接着強度がコロニーサイズに依存しないことは驚くべきことではない、というのは
コロニーサイズが増大しても細胞の形態は変化せず、コロニーあたりの細胞数だけが変化
するからである。
【表２】
2019013237.tif 000003
【０１２４】
ＳＤ−ｈｉＰＳＣおよびＳＤ−ｈＥＳＣに対して接着強度分析を行い（＞９０％分化；
フローサイトメトリーによってＴＲＡ−１−６０＋約１０％）、図４Ａに示す通り、ＵＤ
−ｈｉＰＳＣの接着値が１００ｄｙｎｅ／ｃｍ２未満であったのに比べて、ＳＤ−ｈｉＰ
ＳＣのフィブロネクチン（３４０±３６ｄｙｎｅ／ｃｍ２）およびラミニン（３３０±２
２ｄｙｎｅ／ｃｍ２）に対する接着強度において有意な増大（ｐ＜０．００６）があった
。同様の接着強度の違いが、ラミニンに対するＵＤ−ｈＥＳＣ（Ｈ７、１２０±１７ｄｙ
ｎｅ／ｃｍ２）に比べて、ラミニンおよびフィブロネクチン（３３０±１４ｄｙｎｅ／ｃ
ｍ２）に対するＳＤ−ｈＥＳＣ（Ｈ７）に対して観察された。引き続き、局所接着分析を
、部分的に自発的に分化した領域を有するｈｉＰＳＣ細胞培養物に対して行った。ＳＤ−
ｈｉＰＳＣにおいて、未分化のコロニーまたはコロニーの部分に比べて、分化した領域に
明確なアクチンストレスならびにビンキュリンおよびタリンの局所接着への局在化が容易
に観察され（図４Ｂ）、未分化コロニーではビンキュリンおよびタリンが糸状仮足のみに
存在し、または細胞質にわたって拡散していた。重要なのは、分化細胞を２％または９０
％含む培養物間に違いが観察されなかったため、未分化の細胞と分化した細胞との間の接
着強度における違いは、自発的な分化のレベルに依存しなかったことである（図４Ｃ）。
【０１２５】
定方向分化した細胞の接着シグネチャーを、ｈｉＰＳＣおよびｈＥＳＣに由来する複能
性の神経ロゼットおよび神経前駆細胞の接着強度を評価することによって決定した。ｈｉ
ＰＳＣの定方向分化の３週間以内に形成された神経ロゼットは、神経ロゼットが由来する
未分化のｈｉＰＳＣに匹敵する接着強度を表したが、夾雑した線維芽細胞様細胞に比べて
有意に低い強度を有していた（ｐ＜０．０５、図４Ｄ）。選別し、２週間さらに分化させ
た場合、ロゼットは神経前駆細胞を形成し、それらは、未分化のｈｉＰＳＣの半分の接着
強度を示した（図４Ｄ）、多能性幹細胞のタイプおよびマトリックスに非依存的であった
（図４Ｅ）。まとめると、これらの分析は、ＵＤ−ｈＰＳＣと親との、またはＳＤ−ｈＰ
ＳＣとの間の、およびＵＤ−ｈＰＳＣと直接分化した前駆細胞との間の接着強度における
有意な差を実証している。
【実施例３】
【０１２６】
［夾雑した親細胞およびフィーダー細胞からの再プログラム化されたｈｉＰＳ細胞の、迅
速な、拡張可能な、水力学的単離］
独特の接着シグネチャーおよびｈｉＰＳＣの再プログラム化の前と後との状態の間の接
着強度における違いを活用して、細胞の不均質な集団間で目的の細胞を単離および濃縮す
る新規な戦略を開発した。単純なマイクロ流体系経由の液体剪断応力を用いた、２つの（
またはそれを超える）別々の細胞集団の接着力ベースの分離は、ラベルフリーの分離技術
を代表するものであり、ラベルフリーの分離技術は、最小の細胞プロセシング、または電
気的もしくは磁気的な分離の場への暴露を必要とし、これらの自然な細胞−細胞の微小環
境中で細胞を剥離するのに用いることができる。この技術を、本明細書においてμＳＨＥ
ＡＲ（高効率な接着ベースのマイクロ幹細胞回収：ｍｉｃｒｏ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｈ
ｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）と
呼ぶ。ハイスループットのマイクロ流体装置は、百万倍少ない体積の剥離バッファーで層
流を提供し、剥離した細胞の優れた回収を提供することを含めた、従来の水力学的選別ア
ッセイを上回るいくつかの利点を提供する（Ｌｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７６巻、５
２５７〜５２６４頁（２００４年））。マイクロ流体装置はまた、剥離プロセスの直接的
かつ持続的な視覚化も可能にする。安価な、内蔵型の、使い捨てのマイクロ流体装置上に
細胞を容易に充填することで、細胞を剥離および回収するための無菌の環境が確実になり
、フローサイトメーターなどの現存する分離技術に対する優れた代替を表す。
【０１２７】
平行プレートマイクロ流体装置（μＳＨＥＡＲ）を用いて、ｈｉＰＳＣをコロニーとし
て導入し、これを親線維芽細胞の存在下または非存在下で培養した（図５Ａ）。マイクロ
流体装置内では、ｈｉＰＳＣの小型の上皮コロニー（高比率の核−細胞質）および拡大し
たＩＭＲ９０細胞の領域との同時培養物が形態学的に明らかであった（図５Ｂ）。ｍＴｅ
ＳＲ（登録商標）１培地中でＲＯＣＫ阻害剤とともに一夜培養した細胞型は両方とも、依
然として生存可能であり、これら固有の形態を保持していた（図５Ｃ）。ｈｉＰＳＣ細胞
は、多能性マーカーであるＯＣＴ４およびＳＳＥＡ４の発現の陽性によって実証される通
り、フィブロネクチンまたはラミニン上で依然として未分化であり（図５Ｄ）、一方、Ｉ
ＭＲ９０細胞はこのような多能性マーカーを発現しなかった。マイクロ流体装置中で層流
を適用すると、接着性のＩＭＲ９０細胞およびＵＤ−ｈｉＰＳＣコロニー上に液体剪断応
力が産生された。図５Ｅおよび５Ｆに示す通り、ｈｉＰＳＣコロニーは流体の流れを適用
して４分以内に８５〜１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力で剥離を開始し、１０±３分で
ラミニンコーティングされた表面から完全に剥離するが、より強力な接着の性質を有する
親線維芽細胞は依然として付着していた。同様の結果が、フィブロネクチン（図５Ｇ）お
よびマトリゲル（商標）基体（図５Ｈ〜５Ｉ）上で培養した細胞で得られ、したがって剥
離力は細胞の表現型の関数であり、下層のＥＣＭに対して大いに非感受性であることが指
摘された。
【０１２８】
μＳＨＥＡＲを用いて、混合した培養物からのＵＤ−ｈｉＰＳＣの単離および精製の効
率を定量するために、３つの異なる剪断応力を用いて、ＵＤ−ｈｉＰＳＣ３９％の初期ベ
ースライン純度で、線維芽細胞−ｈｉＰＳＣ同時培養の集団を剥離した（剥離時間に決定
して）。次いで、剥離した細胞をＳｔａｉｎＡｌｉｖｅ（商標）−ＤｙＬｉｇｈｔ（商標
）４８８コンジュゲートしたＴＲＡ−１−６０抗体で、生存するＵＤ−ｈｉＰＳＣに対し
て染色した。回収した細胞集団全体を、細胞トラッカーレッド（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅ
ｒ  Ｒｅｄ）色素（ＣＭＰＴＸ）でさらに染色して、剥離した集団中の、非ＵＤ−ｈｉＰ
ＳＣ汚染を評価した。回収した細胞のフローサイトメトリー分析（図６）により、最高９
９％の純度（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）ＴＲＡ−１−６０＋およびＣＭＰＴＸ＋）で８５〜
１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２で剥離した場合、トリプシンを用いて剥離した試料に比べて（ベ
ースライン純度、３９％）、ｈｉＰＳＣの著しい濃縮が明らかになった。２５０〜３５０
ｄｙｎｅ／ｃｍ２の範囲のより高速の流れに暴露した試料は、ＩＭＲ９０の剥離および汚
染がもたらされ、最高１８％の細胞がＩＭＲ９０細胞（ＣＭＰＴＸ＋）に対して陽性であ
ったが、それに比べて８５〜１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２では線維芽細胞の汚染は１％未満で
あった。本発明者らは、７５０〜８５０ｄｙｎｅ／ｃｍ２に暴露した剥離した試料中では
、剪断流のない条件下でトリプシン処理した試料同様、ＩＭＲ９０細胞が高比率であるこ
とを観察した（図６）。
【０１２９】
培養物の純度の、μＳＨＥＡＲベースの単離に対する効果を評価するために、高低両極
端の同時培養比率のｈｉＰＳＣとＩＭＲ９０細胞とを調べた。同時培養物中ｈｉＰＳＣ高
比率で比較的少数のｈｉＰＳＣおよびＩＭＲ９０細胞を接種し（開始のＴＲＡ−１−６０
＋ｈｉＰＳＣおよそ６０％、図７Ａ）、または同時培養物中ｈｉＰＳＣ低比率で（開始の
ＴＲＡ−１−６０＋ｈｉＰＳＣおよそ４０％、図７Ａ）もしくはｈｉＰＳＣ高比率で複数
の各細胞型をプレーティングした（開始のＴＲＡ−１−６０＋ｈｉＰＳＣおよそ６０％）
（図７Ａ）。８５〜１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力に暴露した場合、得られた剥離力
はｈｉＰＳＣの選択的単離をもたらし、全ての条件に対して＞９６％の濃縮であった（ｐ
＜０．０５）。マイクロ流体装置流体中の液体剥離後の残りの接着性ｈｉＰＳＣのパーセ
ント値をさらに調べ、トリプシン処理した残りの細胞の３％未満がｈｉＰＳＣであったこ
とが見出され（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８−ＴＲＡ−１−６０＋およびＣＭＰＴＸ＋
）、μＳＨＥＡＲによるｈｉＰＳＣの回収率が著しく高いことを指摘していた（図７Ａ）
。同様の結果がｈＥＳＣ（Ｈ７）で観察され、通常用いられるフィーダー層の線維芽細胞
と同時培養した場合、＞９５％の濃縮であった（ＭＥＦ、図７Ａ〜７Ｂ）。ＩＭＲ９０細
胞およびＭＥＦの両方とも、ｈＰＳＣとは著しく異なる同様の接着強度を表すことから、
これらの結果は、接着強度における違いを利用して、２つの細胞型が極端な比率であって
も、線維芽細胞−幹細胞混合培養物からインタクトなコロニーとして、精製されたｈｉＰ
ＳＣまたはｈＥＳＣを選択的に単離することができることを指摘している。
【０１３０】
ｈＰＳＣは、所定では継代前に５〜７日間培養されるので、５〜７日間のμＳＨＥＡＲ
による同時培養物からのｈｉＰＳＣの選択的単離の効率を評価した。図８Ａに示す通り、
ｈｉＰＳＣを上首尾に剥離し、１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力に暴露して８分以内に
インタクトなコロニーとして回収し、ｈｉＰＳＣ細胞は９３．８±４．９％の有意な濃縮
であり（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８−ＴＲＡ−１−６０＋およびＣＭＰＴＸ＋）、こ
れに対して開始のｈｉＰＳＣ集団は５０％であった（図８Ｂ）。マイクロ流体装置中では
残りのｈｉＰＳＣ細胞は３．０±１．２％しか観察されなかった。まとめると、これらの
試験は、ＵＤ−ｈｉＰＳＣおよびＵＤ−ｈＥＳＣは、μＳＨＥＡＲを用いて、親線維芽細
胞またはＭＥＦ−フィーダー細胞から選択的に単離され得ることを明確に実証している。
【０１３１】
μＳＨＥＡＲベースのｈｉＰＳＣ単離に対する一考察は、剥離および濃縮したｈｉＰＳ
Ｃのコロニーを効率的に再培養し、これらの多能性の性質を保持し、安定な核型を維持す
ることができるか否かということである。これらの点を調べるために、水力学的に剥離し
た後回収したコロニーを、ＲＯＣＫ阻害剤を補充したｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で
マトリゲル（商標）をコーティングした組織培養プレート上に接種し、最高１４日間培養
した。回収された細胞凝集塊は、最初、緊密に固まったコロニー中で、自己複製する能力
のある小型のコロニーとして接着し（２日目、図９Ａ）、分化のいかなる形態学的兆候も
なかった（１４日目、図９Ａ）。コロニーは、５日目（図９Ｂ、上パネル）および１４日
目（図９Ｂ、下パネル）、剥離／回収および培養したコロニー中、ＯＣＴ４およびＳＳＥ
Ａ４発現によって実証される通り、これらの多能性の表現型を保持していた。核型分析の
ために、μＳＨＥＡＲ単離したｈｉＰＳＣを２ラウンドの精製に暴露し、マトリゲル（商
標）をコーティングしたプレート上で８〜１０日培養し、染色体異常を表さなかった（４
６、ＸＸ）。μＳＨＥＡＲ単離および培養したｈｉＰＳＣコロニーは、胚様体を容易に産
生し（ＥＢ、図９Ｃ）、中胚葉（α−平滑筋アクチン）、外胚葉（ＰＡＸ６）、および内
胚葉（α−フェトプロテイン）を表す細胞型に分化し（図９Ｄ）、μＳＨＥＡＲベースの
単離はｈｉＰＳＣの正常の機能に有害作用を及ぼさないことを実証していた。
【実施例４】
【０１３２】
［μＳＨＥＡＲは幹細胞性に影響を及ぼさずに未分化のｈｉＰＳＣを分化した細胞から選
択的に単離する］
培養物中でｈＰＳＣが自発的に分化することは、このような細胞を除去し、未分化の表
現型の大多数の多能性細胞を保存するために、培養物の毎日の集中的な手作業の維持を必
要とする、一般的かつ重大な問題である（Ｈｅｎｇら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄ
ｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｍｉｎ．、４０巻、２５５〜２５７頁（２００４年）；Ｍｏｏｎら、
Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１３巻、５〜１４頁（２００６年）；Ｃｈｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５巻、３３９２〜３３９７頁（２００８年））。分
化細胞に比べた、未分化のｈｉＰＳＣの独特の接着シグネチャーに基づいて、本発明者ら
は、これら２つの表現型状態間の接着力における違いを、未分化の多能性幹細胞を自発的
に分化した細胞から効果的に分離するのに利用することができるか否かを評価した。様々
なレベルに分化（６％、１０％、１５％、または７０％分化、ＴＲＡ−１−６０陰性）し
たＳＤ−ｈｉＰＳＣ培養物をランダムなコロニーに解離し、マイクロ流体装置中に接種し
、一夜培養した。目視検査により、接着性の分化した細胞は未分化の細胞よりも拡大して
いたことが明白であり、多能性マーカーでの免疫染色は、多能性マーカーを発現しないＳ
Ｄ−ｈｉＰＳＣに比べて、ＯＣＴ４＋とＳＳＥＡ４＋ＵＤ−ｈｉＰＳＣとの間を明確に区
別していた（図１０Ａ）。ｈｉＰＳＣ−ＩＭＲ９０の同時培養試験と一致して、ＵＤ−ｈ
ｉＰＳＣは、ＳＤ−ｈｉＰＳＣを剥離する前にインタクトなコロニーとして選択的に剥離
され（図１０Ｂ）、μＳＨＥＡＲの単一かつ頑強にｈＰＳＣを精製する戦略として機能す
る能力が実証された。この選択的な精製は、一般に用いられている酵素的な調製物（例え
ば、ＴｒｙｐＬＥ）では観察されなかった（図１０Ｂ）。回収されたＳＤ−ｈｉＰＳＣお
よびＳＤ−ｈＥＳＣの定量分析（表３）は、ＳＤｈｉＰＳＣのレベルに無関係に、＞９７
％がＵＤ−ｈｉＰＳＣ（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８−ＴＲＡ−１−６０＋およびＣＭ
ＰＴＸ＋）で、生の未分化ｈＰＳＣを有意に（ｐ＜０．０００２）濃縮する能力をさらに
実証しており、この方法を、未分化細胞を夾雑した細胞型から濃縮する頑強な方法とする
ものであった。
【表３】
2019013237.tif 000004
【０１３３】
未分化の幹細胞のＨ７ｈＥＳＣに対する濃縮はｈｉＰＳＣに匹敵し（図１０Ｃ）、μＳ
ＨＥＡＲは広範囲のｈＰＳＣに適用可能であることが実証された。μＳＨＥＡＲ精製後の
装置には残りのＵＤ−ｈｉＰＳＣまたはＵＤｈＥＳＣは２〜３％しか存在せず（図１０Ｃ
）、８５〜１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力で剥離した試料中、夾雑した自発的に分化
した細胞（ＴＲＡ−１−６０陰性およびＣＭＰＴＸ＋）は５％未満であり（図１０Ｄ）、
高い回収率を実証した。９６ウェルから６ウェルまでの同等のプレートの範囲の広範囲の
組織培養物表面積にまたがって、μＳＨＥＡＲのハイスループットの潜在性を試験し（図
１０Ｅ）、同様の高レベルの濃縮効率が観察され（９５〜９９％）、幹細胞に対するルー
チンの細胞培養プラットフォームのレベルでμＳＨＥＡＲを行う潜在性を実証するもので
あった。
【０１３４】
精製した細胞の厳密な特性分析を行って、１０％という低い自発的に分化した集団で開
始して、各々５〜７日おきに、１０継代の経過にわたってμＳＨＥＡＲの効率を評価した
。図１１Ａに示す通り、μＳＨＥＡＲベースの単離は、１０継代にわたって繰返し高純度
（＞９７％）をもたらした。これとは対照的に、通常用いられる溶液または酵素的に継代
する５個の取組み（ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ、Ａｃｃｕｔａｓｅ、およびディスパーゼ）
は、未分化の細胞を選択的に濃縮することができず、自発的な分化のレベルは、継代の繰
返しにわたって持続的に増大した（図１１Ｂ）。Ｅ−カドヘリン（例えば、ＳｔｅｍＡｄ
ｈｅｒｅ（商標））などの規定された培養基体の使用も、ｈｉＰＳＣ継代に対して探索し
た（Ｎａｇａｏｋａら、ＢＭＣ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１０巻、６０頁（２０１０年））
。しかし、ＳＤ−ｈｉＰＳＣはこれらの基体に依然として接着していたため、これらのコ
ーティングされている基体はＵＤ−ｈｉＰＳＣに対して選択的ではなかったことが観察さ
れた（図１１Ｃ）。これらの結果は、現存するｈＰＳＣの継代方法をしのぐμＳＨＥＡＲ
の高い選択性を明らかに実証していた。μＳＨＥＡＲは細胞をコロニーとして単離するの
で、得られる生存効率（およそ８０％）は、ＴｒｙｐＬＥ（＜３０％）ベースの継代より
も有意に高く、手作業の継代に匹敵するものであった（図１１Ｄ）。μＳＨＥＡＲ精製し
たｈｉＰＳＣの倍加時間は１０継代にわたっておよそ３３〜３５時間であり（図１１Ｅ）
、手作業の継代を用いた通常の培養物中に維持されているｈｉＰＳＣの倍加時間に等しか
った（３２〜３４時間）。
【０１３５】
ＲＯＣＫ阻害剤を補ったｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で、マトリゲル（商標）をコ
ーティングしたプレート上で収集し、培養した場合、８５〜１２５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪
断応力で剥離された回収されたコロニーは、培養したｈｉＰＳＣ細胞の２日目（１継代）
および７０日目（１０継代）の画像によって明らかである通り、未分化のコロニーとして
出現し（図１１Ｆ〜１１Ｇ）、分化した細胞の兆候はなかった。これとは対照的に、高い
剪断応力（７５０ｄｙｎｅ／ｃｍ２）を適用すると、全てのＳＤ−ｈｉＰＳＣコロニーの
完全な剥離がもたらされ、回収されたコロニーは多くの分化した細胞を有しており（２日
目、１継代、図１１Ｆ）、したがってＵＤ−ｈｉＰＳＣの選択的剥離は、これらの表現型
状態間の接着強度における違いを利用することができる剪断応力の範囲のみで生じること
が確認された。回収および培養された未分化のコロニーは、１継代と１０継代との間の規
則的な間隔でのＯＣＴ４およびＳＳＥＡ４の発現によって明らかにされるように、これら
コロニーの自己複製能および多能性を保持していた（図１１Ｈ〜１１Ｉ）。ＰＣＲアレイ
を用いて、μＳＨＥＡＲ継代した、および手作業で継代した１０継代後の（Ｐ１０）ｈｉ
ＰＳＣに対して詳細な遺伝子発現分析も行い、開始のＰ０集団と比較した。ヒートマップ
分析により、幹細胞性、自己複製、多能性、および関連の成長因子の維持に関与する遺伝
子の発現プロファイルは、継代方法には非依存的に、Ｐ１０はＰ０に全体的に類似してい
たことが指摘された。分化および系統に特異的な遺伝子に対する全体の発現プロファイル
は、開始のＰ０細胞に比べて、μＳＨＥＡＲおよび手作業で継代した両方のｈｉＰＳＣに
同等または下方制御のいずれかであった。この結果と一致して、階層凝集塊分析は、μＳ
ＨＥＡＲで継代したｈｉＰＳＣは、手作業で継代した細胞と緊密に凝集塊形成したことを
示していた。より重要なことに、μＳＨＥＡＲで継代したｈｉＰＳＣの複製は、一緒に凝
集塊形成し、水力学的な剥離の取組みの頑強な再現性を示していた。１０継代後の遺伝子
発現プロファイルの散布図分析により、ｈｉＰＳＣに対するμＳＨＥＡＲと伝統的な手作
業の継代との間の高度な類似性が明らかになった（図１２）。さらに、核型分析により、
マトリゲル（商標）をコーティングしたプレート上の１０ラウンドの継代に暴露されたμ
ＳＨＥＡＲで継代したｈｉＰＳＣは、染色体異常を表さなかったことが実証された（４６
ＸＸ）。
【実施例５】
【０１３６】
［部分的に再プログラム化された細胞の特性分析］
再プログラム化された培養物は、再プログラム化プロセスの終わりに、完全に再プログ
ラム化されたｈｉＰＳＣになれなかった数々の細胞と異質であったことが観察された（図
１３Ａ）。いかなる多能性マーカーも表さない、ＩＭＲ９０模倣性の拡大した細胞および
丸型の上皮様細胞が観察された（図１３Ｂ）。拡大した細胞は、丸型の部分的に再プログ
ラム化された細胞よりも比較的にかなり低い頻度であった（およそ１：１００）。接着強
度分析により、ＵＤ−ｈｉＰＳＣに比べて部分的に再プログラム化された細胞に対して有
意に高い接着強度が明らかにされ（１９６±３２ｄｙｎｅ／ｃｍ２）、親ＩＭＲ９０細胞
よりも低かった（図１３Ｃ）。局所接着タンパク質の局在化を、完全に再プログラム化さ
れたｈｉＰＳＣを手作業で除去した後に得られた残りの再プログラム化培養物中で決定し
た。この分析は、拡大した残りの親細胞に対して局所接着に局在する明白なアクチン張力
線維およびビンキュリンの存在を示し、形質導入された丸型の細胞（多能性に関して陰性
）は、再プログラム化されたｈｉＰＳＣ同様、張力線維またはビンキュリンの、局所接着
に対する無視できる局在化を表していた（図１３Ｄ）。接着力における違いは、完全に再
プログラム化されたｈｉＰＳＣを、部分的な再プログラム化または再プログラム化されて
いない細胞から同定および濃縮するのに利用することができる誘導再プログラム化を有す
る個々の「接着シグネチャー」を示すものである。
【０１３７】
前述は本発明を説明するものであり、本発明を限定するものと解釈してはならない。本
発明は以下の特許請求の範囲によって規定されるが、特許請求の範囲の同等物も本明細書
に含まれる。
【０１３８】
本明細書に引用する、全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参考文
献が示される文章および／または段落に関連する教示に対して、その全文が参照によって
援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2019013237.tif 000021
【図３Ｅ】
2019013237.tif 000022
【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
2019013237.tif 000025
【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2019013237.tif 000034
【図５Ｃ】
2019013237.tif 000035
【図５Ｄ】
2019013237.tif 000036
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６】
2019013237.tif 000042
【図７Ａ】
2019013237.tif 000043
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2019013237.tif 000048
【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
2019013237.tif 000050
【図１０Ａ】
2019013237.tif 000051
【図１０Ｂ】
2019013237.tif 000052
【図１０Ｃ】
2019013237.tif 000053
【図１０Ｄ】
2019013237.tif 000054
【図１０Ｅ】
2019013237.tif 000055
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
2019013237.tif 000059
【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
2019013237.tif 000061
【図１１Ｇ】
2019013237.tif 000062
【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１２】
2019013237.tif 000065
【図１３Ａ】
2019013237.tif 000066
【図１３Ｂ】
2019013237.tif 000067
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2019013237.tif 000069
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月1日(2018.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の細胞を培養動物細胞の混合物から単離する方法であって、前記目的の細胞が幹細胞または幹細胞に由来する細胞であり、前記方法が、前記目的の細胞および少なくとも１つの他の細胞型を含み基体に接着している培養動物細胞の混合物を、前記培養動物細胞の混合物中の前記少なくとも１つの他の細胞型に対して前記目的の細胞を選択的に前記基体から剥離するのに十分な剥離力に供するステップを含み、それによって前記目的の細胞を前記培養動物細胞の混合物から単離する、方法。
【外国語明細書】
2019013237000001.pdf