(57)【要約】【課題】血液と接触する環境下であっても、気泡が発生することなく、ゲル化を良好に行える、変性多糖を含有する組成物を提供する。【解決手段】デキストランおよびカルボキシメチル化プルランから選ばれる少なくとも１種の多糖にヒドロキシアリール基が導入された変性多糖（Ａ）と、ペルオキシダーゼ（Ｃ）と、基質（Ｅ）を消費して過酸化水素を生成する酸化酵素（Ｄ）と、前記酸化酵素（Ｄ）に対応する基質（Ｅ）とを含有する組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デキストランおよびカルボキシメチル化プルランから選ばれる少なくとも１種の多糖にヒドロキシアリール基が導入された変性多糖（Ａ）と、
ペルオキシダーゼ（Ｃ）と、
基質（Ｅ）を消費して過酸化水素を生成する酸化酵素（Ｄ）と、
前記酸化酵素（Ｄ）に対応する基質（Ｅ）と
を含有する組成物。
【請求項２】
樹脂にヒドロキシアリール基が導入された変性樹脂（Ｂ）（ただし、前記変性多糖（Ａ）を除く）をさらに含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記変性樹脂（Ｂ）が、ヒドロキシアリール基変性コンドロイチン硫酸、ヒドロキシアリール基変性ヘパラン硫酸、ヒドロキシアリール基変性ケラタン硫酸、ヒドロキシアリール基変性ヒアルロン酸、ヒドロキシアリール基変性ヘパリン、ヒドロキシアリール基変性キトサン、ヒドロキシアリール基変性コラーゲン、およびヒドロキシアリール基変性ゼラチンから選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記変性多糖（Ａ）のヒドロキシアリール基が、チラミン由来である請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記変性樹脂（Ｂ）のヒドロキシアリール基が、チラミン由来である請求項２または３に記載の組成物。
【請求項６】
前記酸化酵素（Ｄ）がグルコースオキシダーゼであり、前記基質（Ｅ）がグルコースである請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ペルオキシダーゼ（Ｃ）が、西洋ワサビペルオキシダーゼである請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物中に含まれる変性多糖（Ａ）の、ヒドロキシアリール基の酸化カップリングによる架橋構造を有するゲル。
【請求項９】
請求項８に記載のゲルを５０質量％以上含有する成形体。
【請求項１０】
請求項９に記載の成形体を有する医療用器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変性多糖を含有する組成物およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨等の生体組織の一部が損なわれた場合、その損なわれた箇所にハイドロゲルなどを細胞外マトリックスとして用いた治療が行われている。このようなハイドロゲルとしては、酵素および過酸化水素を触媒系として用い、多糖にヒドロキシフェニル基が導入された変性多糖をヒドロキシフェニル基において酸化カップリングさせることで形成される高分子ネットワーク（ゲル）が知られている。
【０００３】
このようなゲルの中でも、デキストランにヒドロキシフェニル基が導入された変性多糖、およびコンドロイチン硫酸にヒドロキシフェニル基が導入された変性多糖から形成されるゲル（特許文献１）や、カルボキシメチル化プルランにヒドロキシフェニル基が導入された変性多糖、およびコンドロイチン硫酸にヒドロキシフェニル基が導入された変性多糖から形成されるゲル（非特許文献１）においては、軟骨に多く含まれているII型コラーゲンが発現しやすいことが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許９１３２２０１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Scientific Reports 6, Article number: 20014 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らの検討によれば、特許文献１に挙げられた変性多糖を、手術時の環境と同様の、血液と接触する環境下でゲル化しようすると、気泡が発生したり、ゲル化速度が遅かったりと、実用上多くの問題があることが明らかになった。
【０００７】
本発明は、血液と接触する環境下であっても、気泡が発生することなく、ゲル化を良好に行える、変性多糖を含有する組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述したように、血液と接触する環境下では、ゲル化速度を速めるために多量の過酸化水素を使用すると気泡が多く発生して良好なゲルを形成できず、一方、気泡を減らすために少量の過酸化水素を使うと架橋反応が進行せず、ゲルを形成できない。気泡が発生する理由は、血液中に含まれるカタラーゼが、ゲル化を進める過酸化水素を分解するためであると考えられる。カタラーゼは、過酸化水素を不均化して酸素と水に変える反応を触媒する酵素である。
【０００９】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、以下の構成を有する組成物により前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、例えば以下の［１］〜［１０］である。
【００１０】
［１］デキストランおよびカルボキシメチル化プルランから選ばれる少なくとも１種の多糖にヒドロキシアリール基が導入された変性多糖（Ａ）と、ペルオキシダーゼ（Ｃ）と、基質（Ｅ）を消費して過酸化水素を生成する酸化酵素（Ｄ）と、前記酸化酵素（Ｄ）に対応する基質（Ｅ）とを含有する組成物。
［２］樹脂にヒドロキシアリール基が導入された変性樹脂（Ｂ）（ただし、前記変性多糖（Ａ）を除く）をさらに含有する前記［１］に記載の組成物。
［３］前記変性樹脂（Ｂ）が、ヒドロキシアリール基変性コンドロイチン硫酸、ヒドロキシアリール基変性ヘパラン硫酸、ヒドロキシアリール基変性ケラタン硫酸、ヒドロキシアリール基変性ヒアルロン酸、ヒドロキシアリール基変性ヘパリン、ヒドロキシアリール基変性キトサン、ヒドロキシアリール基変性コラーゲン、およびヒドロキシアリール基変性ゼラチンから選ばれる少なくとも１種である前記［２］に記載の組成物。
［４］前記変性多糖（Ａ）のヒドロキシアリール基が、チラミン由来である前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の組成物。
［５］前記変性樹脂（Ｂ）のヒドロキシアリール基が、チラミン由来である前記［２］または［３］に記載の組成物。
［６］前記酸化酵素（Ｄ）がグルコースオキシダーゼであり、前記基質（Ｅ）がグルコースである前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の組成物。
［７］前記ペルオキシダーゼ（Ｃ）が、西洋ワサビペルオキシダーゼである前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の組成物。
［８］前記［１］〜［７］のいずれか１項に記載の組成物中に含まれる変性多糖（Ａ）の、ヒドロキシアリール基の酸化カップリングによる架橋構造を有するゲル。
［９］前記［８］に記載のゲルを５０質量％以上含有する成形体。
［１０］前記［９］に記載の成形体を有する医療用器具。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、血液と接触する環境下であっても、気泡が発生することなく、ゲル化を良好に行える、変性多糖を含有する組成物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態について好適態様も含めて説明する。
［組成物］
本発明の組成物は、デキストランおよびカルボキシメチル化プルランから選ばれる少なくとも１種の多糖にヒドロキシアリール基が導入された変性多糖（Ａ）と、ペルオキシダーゼ（Ｃ）と、基質（Ｅ）を消費して過酸化水素を生成する酸化酵素（Ｄ）と、前記酸化酵素（Ｄ）に対応する基質（Ｅ）とを含有する。
【００１３】
前記組成物では、基質（Ｅ）が酸化酵素（Ｄ）により消費されて、過酸化水素が穏やかに継続的に生成し、生成した過酸化水素がペルオキシダーゼ（Ｃ）により速やかに分解されてヒドロキシラジカルが生成し、次いで、変性多糖（Ａ）中のヒドロキシアリール基が酸化され、前記基同士の酸化カップリング（架橋）が起こり、ゲル化が進行すると考えられる。
【００１４】
このような組成であれば、ゲル化速度を速めるために多量の過酸化水素を使用する必要が無いので、気泡の発生を抑制することができ、しかもゲル化を良好に進めることができる。本発明では前記機構に基づき酸化カップリングが進行すると考えられることから、II型コラーゲンが発現しやすいゲルの生成において、前記組成物が血液と接触する環境下であっても、気泡が発生することなく、ゲル化を良好に行えると考えられる。
【００１５】
本明細書において「変性」とは、変性前の物質が有するアルコール性水酸基等の官能基に、連結基を介さずまたを介して、ヒドロキシアリール基が結合していることを意味する。前記連結基としては、例えば、炭化水素基および置換炭化水素基が挙げられる。置換炭化水素基は、炭化水素基において一部がエステル結合、エーテル結合、アミド結合、硫酸エステル結合、スルホン酸エステル結合、リン酸エステル結合、ウレタン結合、カルボニル基、ヒドロキシ基等に置き換えられた基である。
【００１６】
＜変性多糖（Ａ）＞
変性多糖（Ａ）は、デキストランおよびカルボキシメチル化プルランから選ばれる少なくとも１種の多糖（以下「多糖（ａ１）」ともいう）にヒドロキシアリール基が導入された化合物である。
【００１７】
ヒドロキシアリール基を有するデキストランおよび／またはヒドロキシアリール基を有するカルボキシメチル化プルランを構成成分とする組成物から形成されるゲルは、例えば、関節腔内でII型コラーゲンを他の型よりも多く発現させることができることから、関節症の治療に有効である。II型コラーゲンは、軟骨に多く含まれるコラーゲンであることから、本発明の組成物は、関節症の治療に有効である。
【００１８】
デキストランおよびカルボキシメチル化プルランには、それぞれ、本発明の作用効果を大きく損なうものでなければヒドロキシアリール基以外の置換基が導入されていてもよい。また、これらは塩であってもよい。多糖における置換基および塩の具体例は、＜変性樹脂（Ｂ）＞の欄に記載する。
【００１９】
変性多糖（Ａ）および後述する変性樹脂（Ｂ）におけるヒドロキシアリール基の炭素数は、通常は６〜５０、好ましくは６〜３０である。前記ヒドロキシアリール基において、芳香核に結合する水酸基数は通常は１以上、好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２である。このように、ヒドロキシアリール基は、モノヒドロキシアリール基に限定されるわけではなく、同様にヒドロキシフェニル基も、モノヒドロキシフェニル基に限定されるわけではない。
【００２０】
前記ヒドロキシアリール基としては、例えば、ヒドロキシフェニル基、ヒドロキシナフチル基、ヒドロキシアントラセニル基が挙げられる。ヒドロキシアリール基は、アルキル基等の置換基を有してもよい。ヒドロキシアリール基において、水酸基に対して少なくとも１つのオルト位置の炭素原子には水素原子が結合していることが好ましい。
【００２１】
変性多糖（Ａ）は、好ましくは、ヒドロキシアリール基が、直接または有機基を介して、エステル結合、ウレタン結合またはアミド結合により多糖（ａ１）に結合した化合物である。エステル結合およびウレタン結合は、多糖（ａ１）に含まれうる水酸基またはカルボキシ基が結合していた炭素原子と結合していることが好ましく、アミド結合は、多糖（ａ１）に含まれうるカルボキシ基が結合していた炭素原子と結合していることが好ましい。前記カルボキシ基は、塩またはエステルであってもよい。
【００２２】
前記有機基としては、例えば、炭素数１〜２０のアルカンジイル基、前記アルカンジイル基にエーテル結合および２価のアミノ基（−ＮＨ−等）から選ばれる少なくとも１種が付加又は挿入され、必要に応じてさらにカルボキシ基又はそのエステルが導入された置換アルカンジイル基、ペプチド結合を有する有機基、具体的には、ジペプチド等のオリゴペプチドまたはそのエステル体に由来する基が挙げられる。
【００２３】
前記ヒドロキシアリール基は、チラミン由来の基であることが好ましい。
変性多糖（Ａ）としては、ヒドロキシフェニル基変性デキストランおよびヒドロキシフェニル基変性カルボキシメチル化プルランから選ばれる少なくとも１種が好ましい。ここでヒドロキシフェニル基変性デキストランとは、デキストランにヒドロキシフェニル基が導入された化合物を意味する。他の用例も同様である。
【００２４】
多糖（ａ１）にヒドロキシアリール基を導入する方法としては、例えば、多糖（ａ１）と、多糖（ａ１）が有する官能基と反応しうる官能基（例：カルボキシ基、その酸ハロゲン化物、アミノ基、アルコール性水酸基、エポキシ基、オキセタニル基）およびヒドロキシアリール基を有する化合物とを、反応させる方法；多糖（ａ１）が有するアルコール性水酸基を、カルボニル化試薬を用いて、炭酸エステル誘導体基に変換した後、得られた多糖の炭酸エステル誘導体と、ヒドロキシアリール基を有するアミン化合物とを反応させる方法が挙げられる。
【００２５】
多糖（ａ１）中のアルコール性水酸基と反応しうるカルボキシ基又はその酸ハロゲン化物とヒドロキシアリール基とを有する化合物としては、例えば、４−ヒドロキシフェニル酢酸、４−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、４−ヒドロキシフェニルブタン酸、２−（２，５−ジヒドロキシフェニル）酢酸、フェノールフタリン、ジフェノール酸、およびこれらの酸ハロゲン化物が挙げられる。
【００２６】
多糖（ａ１）がカルボキシ基、その塩又はエステルを有する場合、当該基と反応可能なアミノ基とヒドロキシアリール基とを有する化合物としては、例えば、チラミン等のヒドロキシアリール基を有するアミン化合物が挙げられる。チラミンの他、ヒドロキシアリール基を有するアミノ酸、その脱水縮合物およびその酸アルコキシ化物が挙げられ、好ましくはジペプチド等のオリゴペプチドであり、これらにおいて、カルボキシ基はエステル化していてもよい。ヒドロキシアリール基を有するアミノ酸としては、例えば、ｏ−チロシン、ｍ−チロシン、チロシン、２−（４−ヒドロキシフェニル）グリシン、および３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アラニン等のα−アミノ酸が挙げられる。
【００２７】
以下、変性多糖（Ａ）の製造方法の一実施態様について説明する。
例えば、多糖（ａ１）が有するアルコール性水酸基を、カルボニル化試薬を用いて、炭酸エステル誘導体基に変換した後、得られた多糖の炭酸エステル誘導体と、ヒドロキシアリール基を有するアミン化合物とを反応させる。
【００２８】
カルボニル化試薬としては、例えば、クロロギ酸ニトロフェニル、クロロギ酸フェニル、クロロギ酸トリクロロメチル、炭酸ビス（トリクロロメチル）が挙げられる。カルボニル化試薬の量は特に限定されず、例えば、多糖（ａ１）１００質量部に対して１〜１００質量部である。中間体である炭酸エステル誘導体が安定である場合は、一旦単離した後に次の反応を行ってもよい。
【００２９】
ヒドロキシアリール基を有するアミン化合物としては、例えば、チラミンが挙げられ、その他、前述した、ヒドロキシアリール基を有するアミノ酸、その脱水縮合物およびその酸アルコキシ化物が挙げられる。前記アミン化合物の量は特に限定されず、例えば、多糖（ａ１）の炭酸エステル誘導体１００質量部に対して１〜１００質量部である。
【００３０】
前記反応は、塩基性化合物の存在下で行うことが好ましい。塩基性化合物としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、ピペリジンが挙げられる。
【００３１】
前記反応は、溶媒中で行うことが好ましい。溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテルが挙げられる。多糖の溶媒中への溶解性を向上させるため、塩化リチウム等を用いてもよい。
【００３２】
前記反応の反応温度は、それぞれの工程において、通常は−１０〜５０℃、好ましくは−５〜３０℃であり、反応時間は、通常は０．１〜２４時間である。前記反応は、窒素、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下で行ってもよい。
【００３３】
変性多糖（Ａ）において、多糖（ａ１）にヒドロキシアリール基が導入されている。変性多糖（Ａ）におけるヒドロキシアリール基による置換度（ＤＳ）は、通常は０．１〜１００であり、好ましくは１〜５０、より好ましくは２〜２０である。置換度は、1Ｈ ＮＭＲより求めることができる。変性多糖の置換度とは、変性多糖の構成単糖１００単位あたりに導入されたヒドロキシアリール基の平均数を示す。変性多糖（Ａ）はこのような置換度を有することにより、ゲル化速度が向上する。
【００３４】
前記置換度は、例えば、前述した反応の反応時間、反応温度、各反応成分の濃度を変えることによって制御することができる。例えば、反応時間を短くする、反応温度を下げる、各反応成分の濃度を低くすることで、前記置換度を低くすることができる。
【００３５】
変性多糖（Ａ）の絶対分子量測定による数平均分子量は、通常は１，０００〜１０，０００，０００、好ましくは３，０００〜１，０００，０００、より好ましくは５，０００〜５００，０００である。
変性多糖（Ａ）は１種または２種以上用いることができる。
【００３６】
本発明の組成物中の変性多糖（Ａ）の含有量は、通常は０．０５〜４９質量％、好ましくは０．５〜３９質量％、より好ましくは１〜２９質量％である。このような態様であると、生体に対して低浸襲性な条件でゲル化が可能な組成物となる。
【００３７】
＜変性樹脂（Ｂ）＞
本発明の組成物は、II型コラーゲンがより発現しやすいゲルを生成させるために、樹脂（以下「樹脂（ｂ１）」ともいう）にヒドロキシアリール基が導入された変性樹脂（Ｂ）を更に含有することが好ましく、ただし、変性樹脂（Ｂ）からは前記変性多糖（Ａ）を除く。
【００３８】
変性樹脂（Ｂ）としては、ヒドロキシアリール基を有する高分子が好ましく、例えば、多糖（ただし、デキストランおよびカルボキシメチル化プルランを除く）、タンパク質等の生体高分子にヒドロキシアリール基が導入された高分子が挙げられる。
【００３９】
多糖としては、例えば、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン等のグリコサミノグリカン、キサンタンガム、セルロース、グアーガム、フルクタン、マンナン、カラギーナン、キチン、キトサン、ペクチン、デンプン、グリコーゲン、デキストリン、ゲランガム、アルギン酸が挙げられる。
【００４０】
前記例示の多糖には、それぞれ、本発明の作用効果を大きく損なうものでなければヒドロキシアリール基以外の置換基が導入されていてもよい。置換基としては、例えば、メチル基、エチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシエチルメチル基、ヒドロキシプロピルメチル基、カルボキシメチル基、アセチル基、ステアロキシ基、グリセロール、プロピレングリコールが挙げられる。このような多糖としては、例えば、アセチル化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアロキシヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルグアーガム、エチルグアーガム、ヒドロキシエチルグアーガム、ヒドロキシプロピルグアーガム、ヒドロキシエチルメチルグアーガム、ヒドロキシプロピルメチルグアーガムが挙げられる。
【００４１】
多糖は、塩であってもよく、例えば、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の周期表第２族金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩が挙げられる。具体的には、カルボキシ基を有する多糖の金属塩が挙げられる。
【００４２】
タンパク質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの中では、コラーゲン、ゼラチンが好ましい。
変性樹脂（Ｂ）は、好ましくは、ヒドロキシアリール基が、直接または有機基を介して、エステル結合、ウレタン結合またはアミド結合により樹脂（ｂ１）に結合した化合物である。エステル結合およびウレタン結合は、樹脂（ｂ１）に含まれうる水酸基またはカルボキシ基が結合していた炭素原子と結合していることが好ましく、アミド結合は、樹脂（ｂ１）に含まれうるカルボキシ基が結合していた炭素原子と結合していることが好ましい。前記カルボキシ基は、塩またはエステルであってもよい。前記有機基の具体例は、＜変性多糖（Ａ）＞の欄に記載した。
前記ヒドロキシアリール基は、チラミン由来の基であることが好ましい。
【００４３】
変性樹脂（Ｂ）としては、ヒドロキシアリール基変性コンドロイチン硫酸、ヒドロキシアリール基変性ヘパラン硫酸、ヒドロキシアリール基変性ケラタン硫酸、ヒドロキシアリール基変性ヒアルロン酸、ヒドロキシアリール基変性ヘパリン、ヒドロキシアリール基変性キトサン、ヒドロキシアリール基変性コラーゲン、およびヒドロキシアリール基変性ゼラチンから選ばれる少なくとも１種が好ましい。変性多糖（Ａ）との組合せにより、関節腔内でII型コラーゲンを他の型よりも多く発現させるゲルを形成できることから、ヒドロキシアリール基変性コンドロイチン硫酸およびヒドロキシアリール基変性ヘパリンから選ばれる少なくとも１種がより好ましい。
【００４４】
樹脂（ｂ１）にヒドロキシアリール基を導入する方法としては、例えば、アルコール性水酸基およびカルボキシ基等の官能基を有する樹脂（ｂ１）と、前記官能基と反応しうる官能基（例：カルボキシ基、その酸ハロゲン化物、アミノ基、アルコール性水酸基、エポキシ基、オキセタニル基）およびヒドロキシアリール基を有する化合物とを、反応させる方法；樹脂（ｂ１）として多糖を用いる場合は、多糖が有するアルコール性水酸基を、カルボニル化試薬を用いて、炭酸エステル誘導体基に変換した後、得られた多糖の炭酸エステル誘導体と、ヒドロキシアリール基を有するアミン化合物とを反応させる方法が挙げられる。
【００４５】
カルボキシ基又はその酸ハロゲン化物とヒドロキシアリール基とを有する化合物、アミノ基とヒドロキシアリール基とを有する化合物の具体例は、＜変性多糖（Ａ）＞の欄に記載した。アルコール性水酸基とヒドロキシアリール基とを有する化合物としては、例えば、特開２００４−３５９６００号公報、および特開２０１１−０３２２１１号公報に記載の化合物が挙げられる。
【００４６】
以下、変性樹脂（Ｂ）の製造方法の一実施態様について説明する。
例えば、カルボキシ基又はその酸ハロゲン化物を有する多糖と、ヒドロキシアリール基を有するアミン化合物とを、反応させる。
【００４７】
ヒドロキシアリール基を有するアミン化合物としては、例えば、チラミンが挙げられ、その他、前述した、ヒドロキシアリール基を有するアミノ酸、その脱水縮合物およびその酸アルコキシ化物が挙げられる。前記アミン化合物の量は特に限定されず、多糖１００質量部に対して、通常は０．１〜１００質量部、好ましくは０．５〜３０質量部、より好ましくは１〜１０質量部の量で用いることができる。
【００４８】
前記反応において、縮合剤を用いてもよい。縮合剤としては、例えば、１，１’−カルボニルジイミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩が挙げられる。縮合剤と共に、触媒を用いてもよい。触媒としては、例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールが挙げられる。縮合剤および触媒は、それぞれ１種または２種以上用いることができる。
【００４９】
また、前記反応において、ｐＨ緩衝剤を用いてもよい。ｐＨ緩衝剤としては、例えば、生化学用途で一般的に用いられる、両性イオン構造を持つ緩衝剤として市販されているグッド緩衝剤、例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸１水和物（ＭＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）等のモルホリノアルカンスルホン酸が挙げられる。ｐＨ緩衝剤は１種または２種以上用いることができる。
【００５０】
前記反応は、溶媒中で行うことが好ましい。溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドが挙げられる。
【００５１】
前記反応の反応温度は、通常は０〜９０℃、好ましくは５〜４０℃であり、反応時間は、通常は１〜１５０時間、好ましくは２０〜１００時間である。前記反応は、窒素、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下で行ってもよい。
【００５２】
変性樹脂（Ｂ）において、樹脂（ｂ１）にヒドロキシアリール基が導入されている。変性樹脂（Ｂ）におけるヒドロキシアリール基による置換度（ＤＳ）は、通常は０．１〜１００であり、好ましくは１〜３０、より好ましくは２〜１５である。置換度は、1Ｈ ＮＭＲまたは紫外線分光分析より求めることができる。変性樹脂の置換度とは、樹脂（ｂ１）が多糖である場合は、変性樹脂の構成単糖１００単位あたりに導入されたヒドロキシアリール基の平均数を示し、樹脂（ｂ１）がタンパク質である場合は、変性樹脂のアミノ酸残基１００単位あたりに導入されたヒドロキシアリール基の平均数を示す。変性樹脂（Ｂ）はこのような置換度を有することにより、ゲル化速度が向上する。
【００５３】
変性樹脂（Ｂ）の絶対分子量測定による数平均分子量は、通常は１，０００〜１０，０００，０００、好ましくは３，０００〜１，０００，０００、より好ましくは５，０００〜５００，０００である。
【００５４】
変性樹脂（Ｂ）は１種または２種以上用いることができる。
本発明の組成物中の変性樹脂（Ｂ）の含有量は、変性樹脂（Ｂ）を用いる場合、変性多糖（Ａ）１００質量部に対して、通常は１〜１０００質量部、好ましくは１０〜５００質量部、より好ましくは５０〜２００質量部である。このような態様であると、生体に対して低浸襲性な条件でゲル化が可能な組成物となる。
【００５５】
＜ペルオキシダーゼ（Ｃ）＞
ペルオキシダーゼ（Ｃ）は、変性多糖（Ａ）および変性樹脂（Ｂ）中のヒドロキシアリール基による架橋反応を促進するために用いられる。
【００５６】
ペルオキシダーゼ（Ｃ）の起源は、例えば、ウシ肝臓、ウマ血球、ヒト血球、M. lysodeikticus、西洋ワサビ（ホースラディッシュ）、大豆、ダイコン、カブ、甲状腺、牛乳、腸、白血球、赤血球、酵母、Caldariomyces fumago、Steptococcus faecalisが挙げられる。これらの中でも、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）が好ましい。
【００５７】
ペルオキシダーゼ（Ｃ）は１種または２種以上用いることができる。
本発明の組成物において、ペルオキシダーゼ（Ｃ）の量は、反応性の点から、好ましくは０．０１〜３００Ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜５０Ｕ／ｍｌである。なお、Ｕとは酵素活性の単位を示し、至適条件下、温度３０℃で毎分１マイクロモルの基質を変化させることができる酵素量を示す。
【００５８】
＜酸化酵素（Ｄ）＞
酸化酵素（Ｄ）は、基質（Ｅ）を消費して過酸化水素を生成する酵素である。本発明の組成物では、例えば、酸化酵素（Ｄ）が基質（Ｅ）を、酸素の存在下（例：空気中の酸素）に酵素処理することによって、過酸化水素を生成させることができる。
【００５９】
酸化酵素（Ｄ）としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼが挙げられる。これらの酵素は、用途に応じて適宜選択できるが、ゲル化速度が大幅に向上することから、グルコースオキシダーゼが好ましい。
【００６０】
酸化酵素（Ｄ）は１種または２種以上用いることができる。
本発明の組成物中の酸化酵素（Ｄ）の含有量は、反応性の点から、０．０１Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、１Ｕ／ｍｌ以上がより好ましく；１，０００Ｕ／ｍｌ以下が好ましく、５００Ｕ／ｍｌ以下がより好ましい。
【００６１】
過酸化水素は生体内でも生成する物質ではあるが、生体内ではすぐに消失する物質である。過酸化水素を生体に大量に適用すると、血液と接触した際に気泡が多く発生する。本発明の構成であれば、酸化酵素（Ｄ）および基質（Ｅ）により過酸化水素が生成することから、過酸化水素を大量に使用しなくともよく、したがって気泡の問題を解決することができる。
【００６２】
＜基質（Ｅ）＞
基質（Ｅ）は、酸化酵素（Ｄ）により消費されて過酸化水素を生成する物質であり、酸化酵素（Ｄ）に対応して選択される物質である。例えば、酸化酵素（Ｄ）が、グルコースオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼまたはコレステロールオキシダーゼである場合、基質（Ｅ）は、それぞれ、グルコース、コリン、アミノ酸、アルコール、ピルビン酸またはコレステロールである。本発明では、ゲル化速度が大幅に向上することから、グルコースオキシダーゼとグルコースとの組合せが好ましい。
【００６３】
基質（Ｅ）は１種または２種以上用いることができる。
本発明の組成物中の基質（Ｅ）の含有量は、変性多糖（Ａ）に含まれるヒドロキシアリール基１ｍｏｌに対して、または組成物中に変性樹脂（Ｂ）を含有する場合は変性多糖（Ａ）に含まれるヒドロキシアリール基および変性樹脂（Ｂ）に含まれるヒドロキシアリール基の合計１ｍｏｌに対して、通常は０．１〜１０００ｍｏｌ、好ましくは０．１〜１００ｍｏｌ、より好ましくは１〜５０ｍｏｌである。例えば、組成物中に含まれる基質（Ｅ）および酸化酵素（Ｄ）の含有量を調整することで、ゲル化時間をコントロールすることができる。
【００６４】
＜水＞
本発明の組成物は、水を含有することが好ましい。また、本発明の組成物は、さらに塩化ナトリウムを含有してもよい。このように本発明の組成物は、リン酸緩衝生理食塩水のような塩化ナトリウム水溶液を含有してもよい。
【００６５】
本発明の組成物中の水の含有量は、通常は５０〜９９．９質量％、好ましくは６０〜９９質量％、より好ましくは７０〜９０質量％である。このような態様であると、生体に対して低浸襲性な条件でゲル化が可能な組成物となり、さらに得られるゲルの機械的強度が優れる傾向にある。
【００６６】
＜その他の成分＞
本発明の組成物は、ゲルの用途に応じた機能発現物質を含有してもよい。これにより、得られるゲル中に機能発現物質を含ませることができる。機能発現物質としては、例えば、薬剤、細胞が挙げられる。機能発現物質を含有するゲルは、医学用器具等の幅広い分野で用いることができる。
【００６７】
本発明の組成物は、前述した変性多糖（Ａ）および変性樹脂（Ｂ）以外の多糖をさらに含有してもよい。この多糖としては、例えば、＜変性多糖（Ａ）＞および＜変性樹脂（Ｂ）＞の欄に記載した、ヒドロキシアリール基により変性されていない多糖が挙げられる。多糖は１種または２種以上用いることができる。
【００６８】
本発明の組成物では、酸化酵素（Ｄ）および基質（Ｅ）により過酸化水素が生成することから、過酸化水素を含有しなくともよいが、気泡の発生が問題にならない範囲であれば、前記生成する過酸化水素の他、別途、過酸化水素を含有してもよい。気泡の発生をより低減する観点からは、本発明の組成物は、過酸化水素を含有しないことが好ましい。
【００６９】
＜組成物の態様＞
本発明の組成物のｐＨ（架橋反応時のｐＨ）は、通常は２〜１３、好ましくは３〜１１、より好ましくは５〜９である。このような範囲であると、生体に対して低浸襲性な条件でゲル化が可能な組成物となることから好ましい。
【００７０】
本発明の組成物を用いることにより、ゲルを形成することができる。例えば、一実施態様において、前記成分を水中で混合して、変性多糖（Ａ）および好ましくは変性樹脂（Ｂ）を架橋して、ハイドロゲルを形成する。
【００７１】
本発明の組成物は、以下に説明するゲルの原料組成物として好適に用いることができる。また、本発明の組成物は、例えば、変形性関節症の治療に用いられる軟骨の代替材、関節腔内の潤滑剤や、損傷被覆材として用いることができる。変形性関節症は膝、肩、股、腰、足首、手首、指などの体の各関節に発生しうるが、本発明の組成物はいずれの関節にも適用しうる。
【００７２】
［ゲル］
本発明のゲルは、上述した組成物中に含まれる変性多糖（Ａ）の、ヒドロキシアリール基の酸化カップリングによる架橋構造を有し、すなわち変性多糖（Ａ）の架橋体を含有する。組成物中に変性樹脂（Ｂ）が含まれる場合は、前記ゲルは、変性多糖（Ａ）および変性樹脂（Ｂ）の、ヒドロキシアリール基の酸化カップリングによる架橋構造を好ましくは有し、すなわち変性多糖（Ａ）および変性樹脂（Ｂ）の架橋体を好ましくは含有する。
【００７３】
一実施態様において、前記ゲルは、水分を通常は５０〜９９．９質量％、好ましくは６０〜９９質量％、より好ましくは７０〜９０質量％含有するハイドロゲルである。前記ハイドロゲルは、前記架橋体を通常は５０〜０．１質量％、好ましくは４０〜１質量％、より好ましくは３０〜１０質量％含有する。前記ハイドロゲルは、機械的強度および柔軟性に優れる。
【００７４】
本発明のゲルおよびハイドロゲルは、例えば、軟骨等の生体組織の一部が損なわれた場合の、人工軟骨等として好適に用いることができる。
本発明のハイドロゲルは、前述した本発明の組成物における架橋反応を進めることにより得ることができる。また、前記ハイドロゲルを適宜乾燥するなどして水分を除去することにより、キセロゲルを得ることができる。例えば、一実施態様において、前記成分（Ａ）および（Ｃ）〜（Ｅ）または前記成分（Ａ）〜（Ｅ）を水中で混合し、変性多糖（Ａ）のヒドロキシアリール基を架橋反応させて、ハイドロゲルを形成する。前記成分（Ａ）〜（Ｅ）は、それぞれの水溶液として用いてもよい。
【００７５】
ハイドロゲル形成時の水溶液温度（架橋反応温度）は、通常は４〜５０℃、好ましくは１０〜４５℃、より好ましくは２０〜４０℃であり、反応時間は、通常は４８時間未満、好ましくは２４時間未満であり、好ましくは０．１時間以上である。反応時の圧力は、特に限定されず、加圧、常圧（大気圧）および減圧のいずれでもよいが、常圧が好ましい。本発明の組成物を用いることにより、室温程度の温和な条件で、ハイドロゲルを形成することができる。
【００７６】
［成形体および医療用器具］
本発明の成形体は、上述したゲルを含有する。例えば、本発明のゲルが、所望の形状に成形された成形体である。前記成形体において、ゲルの量は、通常は５０質量％以上、好ましくは６０質量％以上、さらに好ましくは７０質量％以上である。
【００７７】
本発明の医療用器具は、前記成形体を有する。前記医療用器具は、機械的強度および柔軟性に優れる前記成形体を有することから、医療用器具の中でも特にインプラント材料に好適に用いることができる。インプラント材料としては、例えば、軟骨等の生体組織の一部が損なわれた場合に用いられるインプラント材料が挙げられる。
【実施例】
【００７８】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
［合成例１］
窒素雰囲気下、フラスコに、デキストラン（品名「デキストラン４０」、名糖工業株式会社製）４０ｇ、ジメチルホルムアミド１６００ｍｌ、および塩化リチウム３０．９ｇを加え、９０℃で９０分間攪拌した。得られた溶液を０℃に冷却し、ピリジン９．２ｍｌとクロロギ酸ニトロフェニル２３．８ｇを加え、０℃で１時間撹拌した。次いで、前記フラスコに、冷やしたエタノール２０００ｍｌを加え、析出物を濾別し、濾物を冷やしたエタノールで洗浄し、乾燥した。
【００７９】
窒素雰囲気下、フラスコに、乾燥後の濾物をジメチルホルムアミド７４０ｍｌで溶解した溶液を入れ、次いでチラミン９．１ｇを入れ、室温で３時間撹拌した。次いで、前記フラスコに、冷やしたエタノール８００ｍｌを加え、析出物を濾別し、濾物を純水に溶解させ透析した。
【００８０】
このようにして、チラミンで変性したデキストラン（Ａ１）を得た。得られたチラミンで変性したデキストラン（Ａ１）を1Ｈ ＮＭＲにて分析したところ、そのＤＳは１２であった。
【００８１】
［合成例２］
フラスコに、ヘパリンナトリウム（ヒドラス化学株式会社より入手）２０ｇのＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ、ｐＨ＝６．０）２００ｍｌ溶液を準備し、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２．８８ｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド２．２７ｇを加え、２３℃で３０分間攪拌した。次いで、前記フラスコに、ジメチルホルムアミド６０ｍｌに溶解したチラミン０．６９ｇを加え、２３℃で３日間攪拌した。
【００８２】
攪拌後の溶液を５日間透析した。１〜４日目は５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液をバッファーに使用し、５日目は純水をバッファーに使用した。透析後の溶液を凍結乾燥した。
このようにして、チラミンで変性したヘパリン（Ｂ１）を得た。得られたチラミンで変性したヘパリン（Ｂ１）を紫外線分光分析にて算出したところ、そのＤＳは４．３であった。
なお、紫外線分光分析によるＤＳの算出には、チラミンの２７５ｎｍ光の吸光度の値を用いて検量線を作成し、この検量線を用いてＤＳを算出した。
【００８３】
［調製例１］
サンプル瓶に、下記表１に示す量の、チラミンで変性したデキストラン（Ａ１）および／またはチラミンで変性したヘパリン（Ｂ１）、ならびにリン酸緩衝生理食塩水（品名「ＰＢＳ（−）」、和光純薬工業株式会社（製））を入れ、ミックスローターで８時間攪拌することで、ポリマー溶液１およびポリマー溶液２を調製した。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
［実験例１〜１４］
バイアル瓶に、下記表２に示す量の、ポリマー溶液１、ポリマー溶液２、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（和光純薬製、商品コード「１６９−１０７９１」、ＨＲＰと略す）水溶液（濃度：１５０Ｕ／ｍｌ）、過酸化水素水（濃度：８８２ｍＭ）、グルコース水溶液（濃度：８８２ｍＭ）、グルコースオキシダーゼ水溶液（濃度：１０００Ｕ／ｍｌ）およびリン酸緩衝生理食塩水（品名「ＰＢＳ（−）」、和光純薬工業株式会社（製））を加え、さらに、血液中に含まれる成分であるカタラーゼ水溶液（２３００Ｕ／ｍｌ、和光純薬工業社製カタラーゼ牛肝臓由来を使用）を加え、ボルテックスミキサーで５秒間攪拌した。攪拌後、J. Am. Chem. Soc. 2007;129 p9918-9926に記載のバイアル傾斜法により、ゲル化時間を下記基準で評価した。また、ゲル化過程での発泡の有無について目視にて評価した。評価結果を表２に示す。
Ａ：２３℃２４時間未満でゲル化した。
Ｂ：２３℃２４時間以上、４８時間未満でゲル化した。
Ｃ：２３℃４８時間以上たってもゲル化しなかった。
【００８６】
【表２】
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【００８７】
実験例１〜４が実施例であり、実験例５〜１４が比較例である。