(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡ修復促進剤、特に紫外線の作用に起因して生じるＤＮＡ損傷の修復促進作用を有するＤＮＡ修復促進剤、及び前記ＤＮＡ修復促進剤を含有する日焼け用又は紫外線防御用の外用組成物の提供。【解決手段】クロモジ(Lindera)属に属する植物の加工物を含有するＤＮＡ修復促進剤。前記ＤＮＡ修復促進剤を含有する日焼け用又は紫外線防御用の外用組成物。前記植物の加工物は植物の枝の加工物であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロモジ(Lindera)属に属する植物の加工物を含むことを特徴とするＤＮＡ修復促進剤。
【請求項２】
前記加工物が、クロモジ(Lindera)属に属する植物の枝の加工物である請求項１記載のＤＮＡ修復促進剤。
【請求項３】
前記損傷ＤＮＡが紫外線照射によるものである請求項１または２に記載するＤＮＡ修復促進剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載するＤＮＡ修復促進剤を含有する、日焼け用または紫外線防御用の外用組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載するＤＮＡ修復促進剤を含有する、紫外線曝露後に用いられる外用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡ修復促進剤、特に紫外線の作用に起因して生じるＤＮＡ損傷の修復を促進する作用を有するＤＮＡ修復促進剤に関する。また本発明は当該ＤＮＡ修復促進剤を有効成分とする外用組成物、特に日焼け若しくは日焼けを予防するために用いられる外用組成物、または日焼け後に用いられる外用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は生体の最外層に位置する器官であり、絶えず紫外線などの環境因子や活性酸素からストレスを受けている。地表に届く紫外線はその波長からＵＶＢ（２９０−３２０nm）およびＵＶＡ（３２０−４００nm）に分類される。そのうちＵＶＢは、ＵＶＡよりも量は少ないものの、細胞の核内に存在するＤＮＡに直接吸収されることでＤＮＡに損傷を与えるなど、皮膚に与える影響はＵＶＡと比較して１０００倍も高いことが知られている。一方、ＵＶＡは細胞内に活性酸素を産生させることで間接的にＤＮＡに損傷を与えることが知られている。このように損傷したＤＮＡとして代表的なものとして、ＤＮＡ中の隣り合うピリミジン塩基が共有結合して形成されるシクロブタン型ピリミジン二量体（Cyclobutane Pyrimidine Dimer：ＣＰＤ）、及び６−４光産物などが挙げられる。
【０００３】
通常、細胞にはこうした損傷ＤＮＡを修復する機構が本来的に備わっているが、修復しきれないほどにＤＮＡ損傷が生じた場合、または生体内でＤＮＡ修復が正常に行われなかった場合、細胞は自ら死（アポトーシス）へと向かうか、皮膚傷害が残ったり、または細胞ががん化してしまう場合がある。また、ＤＮＡ修復能は加齢とともに低下することが知られており、こうした皮膚におけるＤＮＡ修復能の低下は、シミ、シワ、またはタルミ等の皮膚老化（光老化）の原因になることが知られている。これらのことからＤＮＡ修復を促進する作用を有する素材には、紫外線や活性酸素による皮膚老化を予防または改善する作用が期待できる。
【０００４】
このような紫外線や活性酸素による皮膚、特に細胞や細胞内ＤＮＡへの影響（ＤＮＡ損傷）を予防、緩和・低減、改善または治療するものとして、例えば、レスベラトロール誘導体（例えば特許文献１〜３等）、ゼニアオイ抽出物（例えば特許文献４）、スギノリ抽出物（特許文献５）、テンニンカ抽出物（特許文献６）、及びクコの実の乳酸菌発酵物（特許文献７）などが知られている。
【０００５】
一方、クロモジ(Lindera)属に属する植物の抽出物には、美肌、新陳代謝亢進、肌荒れ防止、皮膚老化防止、ニキビ改善、及び消炎作用（以上、特許文献８）、並びにメラニン産生抑制作用及び色素沈着抑制作用（以上、特許文献９）等があることは知られているが、損傷ＤＮＡの修復を促進する作用については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５３８０７９号公報
【特許文献２】特開２００８−８８１２３号公報
【特許文献３】特表２０１０−５３５２２１号公報
【特許文献４】特開２００４−３５９６０３号公報
【特許文献５】特開２００６−２７３７６１号公報
【特許文献６】特開２０１０−１５０１９５号公報
【特許文献７】特開２０１６−６７２４８号公報
【特許文献８】特開昭６２−２３８２０７号公報
【特許文献９】特開平７−２７７９４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来より植物抽出物を有効成分とする外用組成物が、その安全性や皮膚への刺激の穏やかさを期待して種々開発されているが、前述するＤＮＡ修復促進剤についても、今まで知られていなかった植物を原料として新たに開発することが求められている。
【０００８】
本発明は、当該従来の実情に鑑みてなされたものであり、ＤＮＡ修復促進剤、特に紫外線の作用に起因して生じるＤＮＡ損傷の修復を促進する作用を有するＤＮＡ修復促進剤を提供することを目的とする。また本発明はＤＮＡ修復促進作用を有する外用組成物、特に日焼けによるＤＮＡ損傷を予防または改善するために用いられる外用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、このような現状に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、クロモジ(Lindera)属に属する植物に優れたＤＮＡ修復促進作用があることを見出した。かかるＤＮＡ修復促進作用によれば、紫外線照射によって生じる皮膚細胞、特に線維芽細胞におけるＤＮＡ損傷を予防または改善することができ、ＤＮＡ損傷によって生じる、皮膚劣化（水分量の低下、柔軟性・弾力性の低下、皺、くすみ、シミ等）、細胞のがん化等を予防または改善することが可能になる。また、本発明者らは、クロモジ(Lindera)属に属する植物に、前記ＤＮＡ修復促進作用に加えて、線維芽細胞増殖促進作用があることを見出し、当該線維芽細胞増殖促進作用に基づいて、さらに前記皮膚劣化に対して有効に作用することを確認した。
【００１０】
本発明は、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねて完成したものであり、下記の実施形態を有するものである。
（Ｉ）ＤＮＡ修復促進剤
（Ｉ−１）クロモジ(Lindera)属に属する植物の加工物を含むことを特徴とするＤＮＡ修復促進剤。
（Ｉ−２）前記加工物が、クロモジ(Lindera)属に属する植物の枝及び葉の少なくとも１つを含む部位または全木の加工物である（Ｉ−１）記載のＤＮＡ修復促進剤。
（Ｉ−３）前記加工物がクロモジ(Lindera)属に属する植物の溶媒抽出物である（Ｉ−１）または（Ｉ−２）記載のＤＮＡ修復促進剤。
（Ｉ−４）前記損傷ＤＮＡが紫外線照射によるものである（Ｉ−１）〜（Ｉ−３）のいずれかに記載するＤＮＡ修復促進剤。
【００１１】
（ＩＩ）外用組成物、及びその製造方法
（ＩＩ−１）（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）のいずれかに記載するＤＮＡ修復促進剤を含有する、日焼け用または紫外線防御用の外用組成物。
（ＩＩ−２）（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）のいずれかに記載するＤＮＡ修復促進剤を含有する、紫外線曝露後に用いられる外用組成物。
（ＩＩ−３）外用組成物が化粧品、外用医薬品または外用医薬部外品である（ＩＩ−１）または（ＩＩ−２）に記載する外用組成物。
（ＩＩ−４）（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）のいずれかに記載するＤＮＡ修復促進剤を、外用組成物に配合が許容されている基剤、担体または添加剤とともに配合し、製剤化する工程を有する（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）のいずれかに記載する外用組成物の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＤＮＡ修復促進剤は、紫外線、特にＵＶＢ曝露によって生じる真皮繊維芽細胞のＤＮＡ損傷に対する修復能力や修復スピードを高めることで、損傷ＤＮＡ量を低減する作用を有している。本発明のＤＮＡ修復促進剤は、化粧品、医薬品、医薬部外品などの外用組成物に添加配合されることで、これらの外用組成物にＤＮＡ修復促進作用を付与することができる。その結果、本発明のＤＮＡ修復促進剤を含有する外用組成物は、によれば、そのＤＮＡ修復促進作用により、紫外線による皮膚劣化（水分量の低下、柔軟性・弾力性の低下、皺、くすみ、シミ）の発生やその進行を抑制することができる。また紫外線曝露による皮膚細胞の異常、特に皮膚がん発生のリスクを低減することも可能である。
【００１３】
また本発明の外用組成物は、前記ＤＮＡ修復促進作用に加えて、真皮線維芽細胞の増殖を促進する作用を有する。当該作用によりコラーゲンやエラスチンなどの細胞外マトリックスの産生が促進されて、しわを含む皮膚老化を防止かつ抑制することができる。また、真皮繊維芽細胞は、紫外線、特にＵＶＢ曝露によって著しく減少する。しかし、本発明の外用組成物によれば、真皮線維芽細胞の増殖を促進しその増殖能を高めることで、紫外線曝露による真皮繊維芽細胞数の減少を有意に抑制することができる。このため、この点からも本発明の外用組成物は、紫外線による皮膚劣化（水分量の低下、柔軟性・弾力性の低下、皺、くすみ、シミ）の発生やその進行の抑制に貢献することができる。
【００１４】
また本発明のＤＮＡ修復促進剤及び外用組成物の有効成分であるクロモジ(Lindera)属に属する植物の加工物は、天然物由来の成分であり、経験的に安全性が確認されているものであるから、人又は動物に対して内服又は外用しても安全である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実験例１においてクロモジ枝の熱水抽出物（被験物質１）及びクロモジ枝の含水エタノール抽出物（被験物質２）を用いて、ヒト線維芽細胞のＤＮＡ損傷に対するクロモジのＤＮＡ修復促進作用を評価した結果を示す。図１（Ａ）は、クロモジ枝の熱水抽出物（被験物質１）の結果を示す。各図において、「control」は、被験物質を用いないコントロール実験の結果を示す。図１（Ｂ）は、クロモジ枝の含水エタノール抽出物（被験物質２）の結果を示す。各図において、縦軸は、ヒト線維芽細胞における損傷ＤＮＡ（シクロブタン型ピリミジン二量体：ＣＰＤ）の残存量（相対値％）を意味する。また、横軸で示す修復時間（hour）は、ヒト線維芽細胞を紫外線（ＵＶＢ）照射後、被験物質で接触処理した時間（被験物質曝露時間）に相当する。
【図２】実験例２においてクロモジ枝の含水エタノール抽出物（被験物質２）を用いて、ヒト線維芽細胞のＤＮＡ損傷に対するクロモジのＤＮＡ修復促進作用を評価した結果を示す。図中、「control」は、被験物質を用いないコントロール実験の結果を示す。縦軸と横軸は図１と同じ。。
【図３】実験例３においてクロモジ枝及び葉の熱水抽出物（被験物質１及び３）を用いて、ヒト線維芽細胞増殖作用を評価した結果を示す。縦軸は被験物質不含有培地で培養した場合の線維芽細胞数を１００とした相対細胞数％（細胞増殖率）を、横軸は、被験物質濃度％（w/v）を意味する。
【図４】実験例３においてクロモジ枝及び葉の含水エタノール抽出物（被験物質２及び５）を用いて、ヒト線維芽細胞増殖作用を評価した結果を示す。縦軸と横軸は図３と同じ。
【図５】実験例４においてクロモジ枝の熱水抽出物（被験物質１）（図５（Ａ））及びクロモジ枝の含水エタノール抽出物（被験物質２）（図５（Ｂ））を用いて、紫外線（UVB）照射によるヒト線維芽細胞の増殖能低下に与えるクロモジの作用を評価した結果を示す。縦軸は被験物質不含有培地を用いて紫外線（UVB）非照射下で培養した場合（control、 UV(-)）の線維芽細胞数を１００とした相対細胞数％（細胞増殖率）を、横軸は、培地中の被験物質濃度％（w/v）を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（Ｉ）ＤＮＡ修復促進剤
本発明のＤＮＡ修復促進剤はクロモジ(Lindera)属に属する植物の加工物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１７】
本発明に用いられるクロモジ属（Lindera）に属する植物（クロモジ植物）としては、例えば、クロモジ（Lindera  umbellata  Thunb.）、オオバクロモジ（Lindera  umbella  var. membranacea (Maxim.) Momiyam）、ヒメクロモジ（Lindera  umbella  var.lancea    Momjyama）、ケクロモジ（Lindera  sericea(Sieb.et  Zucc.)Blume）、ウスゲクロモジ（Lindera  sericea  var.glabrata  Blume）、シロモジ（Lindera  triloba(Sieb.et  Zucc.)Blume）、アメリカクロモジ（Lindera  benzoin(L.)Blume）、ヤマコウバシ（Lindera  glauca  Blume）、ダンコウバイ（Lindera  obtusiloba  Blume）、テンダイウヤク（Lindera  strychnifolia(Sieb.et Zucc.)F.Vill.）などが挙げられる。これらの中でも、特にクロモジ（Lindera  umbellata  Thunb.）が好ましい。本明細書において単にクロモジという場合は、クロモジ（Lindera  umbellata  Thunb.）を意味するものである。
【００１８】
上記植物の部位としては、例えば、幹、枝、枝葉、葉、根、根茎、根皮、茎、花、種子、果皮、果肉、果実、地上部、地下部、全木などが挙げられる。これらの中でも、枝、枝葉及び葉が好ましく、これらを含む部位（地上部、全木）であってもよい。より好ましくは枝、枝葉、及びこれらを含む部位である。また本発明において、クロモジ植物の部位として樹皮は含まれないことが好ましい。
【００１９】
本発明において、前記植物の加工物としては、前記植物部位を人工的に処理したものを挙げることができ、例えば前記植物部位を乾燥処理した物（乾燥物）、乾燥に加えて／または乾燥することなく、裁断、破砕または粉砕したものを挙げることができる。また前記植物部位を、そのまま或いは乾燥ないし粉砕後に溶媒抽出に供して得られる溶媒抽出物であってもよい。
【００２０】
抽出に用いられる溶媒としては、前記植物部位から少なくとも本発明の作用（ＤＮＡ修復促進作用）を有する成分が抽出できるものであればよく、その限りにおいて特に制限されるものではない。例えば、水；並びに低級アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブチルアルコール等）；多価アルコール（エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール）；アセトン、及び酢酸エチルエステル等の有機溶媒を挙げることができる。これらの有機溶媒は１種単独で使用してもよいし、また２種以上を任意に組み合わせて使用することもできる。なかでも有効成分の抽出効率の点から、水、または水と前記有機溶媒との組み合わせを用いることが好ましい。水と前記有機溶媒との組み合わせとしては、好ましくは水と低級アルコールとの組み合わせ（含水アルコール）、特に水とエタノールとの組み合わせ（含水エタノール）を挙げることができる。この場合の有機溶媒含量としては、制限されないものの８０体積％以下であることが好ましく、例えば１〜７０体積％の範囲から適宜選択して用いられる。
【００２１】
溶媒抽出の方法やその条件は、特に制限されることなく、一般的な方法及び条件を採用することができる。例えば、前記植物部位の乾燥物を適当に裁断した後、その全質量に対して１〜５０倍、好ましくは５〜２０倍量の抽出溶媒を加え、１〜２４時間程度、室温〜使用溶媒の沸点の範囲で浸漬・加熱抽出を行うことができる。通常常圧で実施できるが、必要に応じて加圧下に抽出を行ってもよい。なお、有効成分の抽出効率の点から、抽出溶媒として水を用いる場合には、抽出温度は３０〜１００℃であることが好ましく、より好ましくは５０〜１００℃、特に好ましくは８０〜１００℃である。また、抽出溶媒が含水エタノールである場合には、抽出温度は５〜７０℃の範囲で適宜選択することができる。
【００２２】
抽出後には、濾過等により固液分離し、得られた抽出液を、必要に応じてさらに減圧濃縮したり、濃縮乾固したりして、抽出溶媒を除去して、ペースト状または乾燥状態の抽出物として調製することができる。乾燥手段は、凍結乾燥、減圧乾燥または噴霧乾燥であってもよい。抽出物（溶液、ペースト、乾燥物）は、粗精製の状態で使用することもできるが、本発明の効果を妨げない範囲で、必要に応じて、脱臭または脱色等の精製処理を行うこともできる。かかる精製処理方法としては、制限されないものの、イオン交換樹脂や活性炭による処理を例示することができる。
【００２３】
斯くして調製されるクロモジ植物の加工物は、後述する実験例にて示すように、少なくとも真皮線維芽細胞に対して当該細胞が有するＤＮＡ修復機能を促進する作用を有する。ここで「ＤＮＡ修復機能」とは、好ましくは紫外線曝露、なかでもＵＶＢ曝露によって生じる真皮線維芽細胞核内のＤＮＡ損傷、特にＤＮＡのピリミジン塩基が共有結合することで生じるシクロブタン型ピリミジン二量体（ＣＰＤ）形成によるＤＮＡ損傷を修復する機能を意味し、クロモジ植物の加工物によれば、皮膚細胞が有する当該ＤＮＡ修復機能を促進することができる。ここで「促進」には、ＤＮＡ修復機能（能力）の増強、ＤＮＡ修復スピードの増強、及びＤＮＡ修復頻度（回数）の増加などの意味が含まれる。またＤＮＡ修復機能が促進されることにより、結果としてＤＮＡが損傷してしまう程度や頻度を低減することが可能になる。
【００２４】
本発明のＤＮＡ修復促進剤は、化粧料、外用医薬品、または外用医薬部外品などの外用組成物に、ＤＮＡ修復促進作用を付与することを目的として配合することができる。このため、本発明のＤＮＡ修復促進剤におけるクロモジ植物の加工物の割合は１００％であってもよく、上記目的に則して適宜調整することができる。本発明のＤＮＡ修復促進剤を外用組成物に配合する場合は、通常化粧料、外用医薬品、または外用医薬部外品に用いられる他の成分を同時に配合することができる。
【００２５】
本発明のＤＮＡ修復促進剤の有効成分であるクロモジ植物の加工物は、後述する実験例１及び２に示す結果から真皮線維芽細胞に限らず活性酸素等によって生じるＤＮＡ損傷をも修復する機能を促進する作用を有するものと考えられる。このため、本発明のＤＮＡ修復促進剤は、飲食物、医薬品、または医薬部外品などの内用組成物にＤＮＡ修復促進作用を付与することを目的として、配合することもできる。本発明のＤＮＡ修復促進剤をかかる内用組成物に配合する場合は、通常飲食物、内用医薬品、または内用医薬部外品に用いられる他の成分を同時に配合することができる。
【００２６】
（ＩＩ）外用組成物
本発明は、前述するＤＮＡ修復促進剤を含有する外用組成物である。言い換えれば、前述するクロモジ植物の加工物を有効成分として含有する外用組成物である。本発明の外用組成物は、クロモジ植物の加工物が有するＤＮＡ修復促進作用に起因して、特に紫外線曝露による真皮線維芽細胞核内のＤＮＡ損傷の修復を促進する機能に優れている。このため、本発明の外用組成物によれば、ＤＮＡ損傷を原因とする真皮線維芽細胞の増殖低下や機能低下によって生じる皮膚の劣化現象（水分量の低下、柔軟性・弾力性の低下、たるみ、皺など）を予防または改善することが可能である。
【００２７】
本発明のＤＮＡ修復促進剤を外用組成物に配合する場合、外用組成物１００質量％中に含まれるクロモジ植物の加工物の割合は、当該外用組成物がＤＮＡ修復促進作用を有することを限度として特に制限されるものではない。なお、クロモジ植物の加工物を含有する組成物のＤＮＡ修復促進作用は、後述する実験例１の記載に基づいて評価することができる。具体的には、ＵＶＢ照射直後の線維芽細胞のＤＮＡ中のＣＰＤ量を１００とした場合に、ＵＶＢ照射終了から所定時間経過後の線維芽細胞のＤＮＡ中のＣＰＤ量の割合（ＣＰＤ残存率％）が、当該所定時間中、クロモジ植物の加工物を含有する組成物で処理することで処理しない場合よりも低くなる場合は、当該組成物にはＤＮＡ修復促進作用があると判断することができる。クロモジ植物の加工物が、例えばクロモジの溶媒抽出物である場合、好ましくはクロモジの枝または葉の溶媒抽出物である場合、外用組成物１００質量％中に含まれるクロモジ植物の加工物の割合は、固形分換算で、０.００３６９〜０．０７９２質量％の範囲になるように配合するのが好ましく、特に好ましくは０．０３９６〜０．０７９２質量％である。
【００２８】
本発明において外用組成物とは、化粧品、医薬品、及び医薬部外品等の区別なく、皮膚に外用されるものが全て含まれ、入浴剤も対象に含まれる。外用組成物の形態も特に制限されず、例えば、ローション（水溶液、アルコール水溶液等）、懸濁剤（カーマインローションを含む）、エマルション（乳液剤）、軟膏剤、クリーム剤、ジェル剤、フォーム剤、エアゾール剤、スプレー剤、ミスト剤、不織布に液剤を含浸させたシート剤、錠剤、散剤（パウダー）、顆粒剤、固形剤（ケーキ状剤）等の一般的な外用組成物の形状を例示することができる。
【００２９】
本発明の外用組成物が化粧品である場合、化粧品としては下記のものを例示することができる。なお、本発明が対象とする化粧品には薬用化粧品等の薬機法における定義では医薬部外品に分類されるものも含まれる。
（化粧品）
化粧水、乳液、オイル、ジェル、クリーム、フォーム剤、美容液、収斂用化粧品（カーマインローションなど）、パック、マスク、ハンドクリーム、ボディローション、ボディークリーム等の基礎化粧品（スキンケア製品）；メイク落とし（クレンジング料）、洗顔料、ボディーシャンプー、ボディソープ等の洗浄用化粧品；化粧下地、ファウンデーション、フェイスパウダー（おしろいを含む）、アイシャドー、ノーズシャドー、頬紅、リップクリーム、口紅、リップグロス等のメイクアップ化粧料；サンオイルやサンクリーム等の日焼け用化粧品；サンスクリーン等の日焼け止め用化粧品；制汗料、身体用芳香料、冷感スプレー、入浴剤等が挙げられる。
【００３０】
これらの中でも、好ましい化粧品としては紫外線曝露による皮膚細胞のＤＮＡ損傷に対して保護する必要性（ニーズ）が高い化粧品を挙げることができる。かかる化粧品としては紫外線を浴びて日焼けする際に皮膚に塗布して使用されるサンオイルやサンクリーム等の日焼け用組成物、及び紫外線から肌を守るために紫外線防御剤（紫外線吸収剤または／及び紫外線散乱剤）が配合された化粧品（これを「紫外線防御化粧品」または「紫外線防御用の外用組成物」と称する）を挙げることができる。当該紫外線防御化粧品には、レジャー時に使用されるサンスクリーン等の日焼け止め用の化粧品に限らず、日常的に浴びる紫外線を防御するために用いられる化粧下地、ファウンデーション、フェイスパウダー、頬紅、リップクリーム、口紅、リップグロス等のメイクアップ化粧料が含まれる。
【００３１】
また好ましい化粧品としては、紫外線曝露による皮膚細胞のＤＮＡ損傷に対して修復する必要性（ニーズ）が高い化粧品を挙げることができる。かかる化粧品としては紫外線曝露後に使用される基礎化粧品（スキンケア製品）、洗浄用化粧品、冷感スプレー、及び入浴剤等が挙げられる。好ましくはカーマインローション等の収斂用化粧品、パック、マスク、美容液等のように、紫外線曝露後の肌の火照りを冷やしたり、または肌を整えるために使用される化粧品である。
【００３２】
これらの化粧品に前述するＤＮＡ修復促進剤が配合されていると、紫外線曝露によって生じる真皮線維芽細胞におけるＤＮＡ損傷を修復する能力に優れるため、紫外線曝露による皮膚の劣化現象を抑制し、またその進行を予防することが可能にある。
【００３３】
本発明の化粧品の製造方法は、本発明のＤＮＡ修復促進剤を成分として配合する工程を有する方法であれば特に限定されず、それ以外は従来公知の方法を使用することができる。例えば、ＤＮＡ修復促進剤を、化粧品に通常配合される基剤、担体（例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、界面活性剤、溶解補助剤、緩衝剤、流動化剤、コーティング剤、可塑剤等）または添加剤（酸化防止剤、保存剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、着色剤、清涼化剤、香料等）とともに、また必要に応じて他の活性成分とともに配合し、所望の外用組成物の剤型に応じて、常法により乳化、可溶化、分散化、固形化、または成形化等の製剤化処理をすることにより製造することができる。
【００３４】
前記他の活性成分としては、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤（以上、紫外線防御剤）、保湿成分、美白成分、収斂成分、細胞賦活化成分、抗炎症成分、抗菌または殺菌成分、ビタミン類、ペプチドまたはその誘導体、血行促進作用成分、角質軟化成分などを例示することができる。
【００３５】
なかでも紫外線防御剤は、本発明が対象とする紫外線防御化粧品の配合成分の一つである。紫外線吸収剤としては、パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸エチル、パラアミノ安息香酸グリセリル、パラジメチルアミノ安息香酸アミル、パラジメチルアミノ安息香酸２−エチルヘキシル、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル、及び４-［N,N-ジ（3-ヒドロキシプロピル）アミノ］安息香酸エチル（以上、安息香酸エステル系）；サリチル酸グリコール、サリチル酸エチルヘキシル、及びサリチル酸ホモメンチル（以上、サリチル酸系）；シノキサート、メトキシケイヒ酸エチルヘキシル、エチルヘキサン酸ジメトキシケイヒ酸グリセリル、パラメトキシケイヒ酸イソプロピル、及びフェルラ酸（以上、ケイ皮酸系）；ジヒドロキシベンゾフェノン、テトラヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルホン酸、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルホン酸ナトリウム、ジヒドロキシジメトキシベンゾフェノン、及びジヒドロキシジメトキシベンゾフェノンジスルホン酸ナトリウム（以上、ベンゾフェノン系）；その他、アントラニル酸メンチル、ジメチコンジエチルベンザルマロネート、テレフタリリデンジカンフルスルホン酸、エチルヘキシルトリアゾン、ビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、ビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、ｔ−ブチルメトキシジベンゾイルメタン、メチレンビスベンゾトリアゾリルテトラメチルブチルフェノール、ドロメトリゾールトリシロキサン、及びフェニルベンズイミダゾールスルホン酸、オクトクリレンを挙げることができる。これらは１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは、メトキシケイヒ酸エチルヘキシル、ビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、メチレンビスベンゾトリアゾリルテトラブチルフェノール、オクトクリレン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、エチルヘキシルトリアゾン、及びビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジンなどのようにＵＶＢに対して吸収作用を有する紫外線吸収剤である。紫外線散乱剤としては、酸化チタン（ルチル、アナターゼ）、酸化ジルコニウム、酸化鉄、酸化クロム、酸化亜鉛、アルミナ、酸化マグネシウム、及び硫酸バリウム等の無機顔料を例示することができる。これらは１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。紫外線吸収剤及び紫外線散乱剤は、それぞれ単独で紫外線防御化粧品に配合することもできるが、両者を併用して配合することもできる。かかる紫外線防御剤を含有する本発明の紫外線防御化粧品は、ＵＶＢに対する防御能として、ＳＰＦ（Sun Protection Factor）が１〜５０＋である化粧品であることが好ましい。好ましくはＳＰＦが２０以上、より好ましくは４０以上、さらに好ましくは４５以上、特に好ましくは５０以上（５０＋）である紫外線防御化粧品である。
【００３６】
本発明の化粧品の使用方法は、化粧品の種類、使用対象者の皮膚の状態や紫外線曝露情況などに応じて選択することができ、本発明の効果を損なわない限り、特に制限されない。例えば、紫外線曝露を受ける前、例えば外出前や屋外に出る前に適量（例えば、０．００５〜１ｇ）を対象とする皮膚に適用（塗布、噴霧）することもできるし、また紫外線曝露を受ける後、例えば入浴後や就寝前に適量（例えば、０．００５〜１ｇ）を対象とする皮膚に適用（塗布、噴霧、貼付）することもできる。本発明の化粧品は、顔、首周り、手、腕、足、脚、胴、背中、肩、頭皮等、局所的または全身の皮膚に適用することができる。１回当たりの適用量については、制限されないが、クロモジ植物の加工物が、例えばクロモジの溶媒抽出物である場合、好ましくはクロモジの枝または葉の溶媒抽出物である場合、固形換算で、皮膚１cm２あたり、０.０１０９〜０．２０４ｍｇ程度になる量に設定調整することができる。
【００３７】
（医薬品）
本発明の外用組成物が医薬品である場合、その形状としては、外用製剤が取り得る形状であればよく、例えば液状、流動状、ゲル状、半固形状（軟膏剤、クリーム剤）、固体状、シート状等を挙げることができる。これらの医薬品は、前述するＤＮＡ修復促進剤を、各種の形状（剤型）に応じて、薬学的に許容される基剤、担体（例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、界面活性剤、溶解補助剤、緩衝剤、流動化剤、コーティング剤、可塑剤等）、または添加剤（酸化防止剤、保存剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、着色剤、清涼化剤、香料等）とともに、また必要に応じて他の活性成分（例えば、保湿成分、美白成分、収斂成分、細胞賦活化成分、抗炎症成分、抗菌または殺菌成分、ビタミン類、ペプチドまたはその誘導体、血行促進作用成分、角質軟化成分など）とともに配合し、常法により乳化、可溶化、分散化、固形化、または成形化等の製剤化処理をすることにより製造することができる。
【００３８】
本発明の医薬品の使用方法は、医薬品の形状、使用対象者の皮膚の状態などに応じて選択することができ、本発明の効果を損なわない限り、特に制限されない。例えば、１日に１回若しくは２〜５回程度の複数回、適当量（例えば、０．００５〜１ｇ）を対象とする皮膚に適用（塗布、噴霧、貼付）することができる。本発明の医薬品は、顔、首周り、手、腕、足、脚、胴、背中、肩、頭皮等、局所的または全身の皮膚に適用することができる。１回当たりの適用量については、制限されないが、クロモジ植物の加工物が、例えばクロモジの溶媒抽出物である場合、好ましくはクロモジの枝または葉の溶媒抽出物である場合、固形換算で、皮膚１cm２あたり、０.０１０９〜０．２０４ｍｇ程度になる量に設定調整することができる。
【００３９】
以上説明する本発明の外用組成物は、それに配合されているＤＮＡ修復促進剤の作用に起因して、紫外線曝露によって生じる真皮線維芽細胞におけるＤＮＡ損傷を修復する能力に優れるため、紫外線曝露による皮膚の劣化現象（水分量の低下、柔軟性・弾力性の低下、たるみ、皺、くすみ、シミなど）の発生を抑制し、またその進行を予防することが可能である。また紫外線曝露による皮膚細胞の異常、特に皮膚がん発生のリスクを低減することも可能である。さらに本発明の外用組成物は、前記ＤＮＡ修復促進作用に加えて、真皮線維芽細胞増殖促進作用を有する。真皮繊維芽細胞は、紫外線、特にＵＶＢ曝露によって著しく減少するのに対して、本発明の外用組成物によれば、真皮線維芽細胞の増殖を促進しその増殖能を高めることで、紫外線曝露による真皮繊維芽細胞数の減少を有意に抑制することができ、この点からも前記紫外線による皮膚劣化の発生やその進行の抑制に貢献する。
【実施例】
【００４０】
以下に、実験例を挙げて本発明を詳述する。ただし、これらの実験例は例示であって、本発明の構成及び効果はこれらによって限定的に解釈されるものではない。また下記の実験の実施は、特に言及しない限り、大気圧及び室温（２５±５℃）条件下で行った。
【００４１】
最初に、本実施例で用いた植物抽出物の調製方法について説明する。
試料の調製
クロモジ(Lindera)属に属する植物として、島根県内に自生しているクロモジ（Lindera umbellala Thunb.）を用いた。
【００４２】
（1）クロモジ枝の熱水抽出物
クロモジの枝乾燥物１０９．０ｇを室温条件下で熱水２Ｌに浸漬し、３０分間加熱状態を維持した。なお、枝乾燥物として、クロモジの枝を乾燥させてから粗く粉砕したものを使用した。次いで、ろ紙ろ過により固液分離して得た抽出液より溶媒を留去し、熱水抽出物１．２０ｇ（収率：１．１％）を得た。これを５０ｍｇ採取し、１ｍＬの純水に溶解・懸濁したのち、遠心分離し、得られた上澄み液を、クロモジ枝の熱水抽出物（被験物質１）とした。被験物質１の蒸発残留物は３．４１％（ｗ／ｖ）であった。
【００４３】
（2）クロモジ枝の含水エタノール抽出物
クロモジの枝乾燥物１０８．９ｇを室温条件下で６０％（ｖ／ｖ）含水エタノールに浸漬し、ロータリーシェーカーで撹拌しながら一晩抽出した。次いで、ろ紙ろ過により固液分離して得た抽出液より溶媒を留去し、含水エタノール抽出物１．２０ｇ（収率：１．１％）を得た。これを５０ｍｇ採取し、１ｍＬの６０％（ｖ／ｖ）含水エタノールに溶解・懸濁したのち、遠心分離し、得られた上澄み液をクロモジ枝の含水EtOH抽出物（被験物質２）とした。被験物質２の蒸発残留物は３．４８％（ｗ／ｖ）であった。
【００４４】
（3）クロモジ葉の熱水抽出物
クロモジの葉乾燥物４３．５ｇを室温条件下で熱水８７０ｍＬに浸漬し、３０分間加熱状態を維持した。なお、葉乾燥物として、クロモジの葉を乾燥させてから粗く粉砕したものを使用した。次いで、ろ紙ろ過により固液分離して得た抽出液より溶媒を留去し、熱水抽出物３．２８ｇ（収率：７．５％）を得た。これを５０ｍｇ採取し、１ｍＬの純水に溶解・懸濁したのち、遠心分離し、得られた上澄み液をクロモジ葉の熱水抽出物（被験物質３）とした。被験物質３の蒸発残留物は４．５１％（ｗ／ｖ）であった。
【００４５】
（4）クロモジ葉の含水エタノール抽出物
クロモジの枝乾燥物４３．９ｇを室温条件下で８７０ｍＬの６０％（ｖ／ｖ）含水エタノールに浸漬し、ロータリーシェーカーで撹拌しながら一晩抽出した。次いで、ろ紙ろ過により固液分離して得た抽出液より溶媒を留去し、含水エタノール抽出物４．１６ｇ（収率：９．５％）を得た。これを５０ｍｇ採取し、１ｍＬの６０％（ｖ／ｖ）含水エタノールに溶解・懸濁したのち、遠心分離し、得られた上澄み液をクロモジ葉の含水エタノール抽出物（被験物質４）とした。被験物質４の蒸発残留物は４．１７％（ｗ／ｖ）であった。
【００４６】
実験例１：ＤＮＡ修復促進作用（その１）
前述する被験物質１及び２を用いて、ヒト線維芽細胞のＤＮＡ損傷に対するクロモジのＤＮＡ修復促進作用を評価した。
【００４７】
（１）試験方法
正常ヒト線維芽細胞を９６ウェルプレートビーディーファルコン（平底黒色ウェル／透明ボトム）に１００００細胞／ウェルの割合で播種した。１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地０．１ｍＬに、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２濃度及び３７℃に保たれたＣＯ２インキュベータで２日間培養した。９６ウェルプレートの各ウェルの培地を１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に置換したのち、三共電気社製ＵＶ−Ｂランプ15WGL15Eを用いて発生させたＵＶＢをプレートの上方３０ｃｍから照射した。このとき対照用のウェルはアルミシールを貼りＵＶＢが照射されないようした。３１０ｎｍにおけるＵＶＢの輝度はＵＶＰ社製Radiometer Sensor UVX-31により測定し、総曝露量９ｍＪ／ｃｍ２となるよう露光時間を調節した。ＵＶＢ照射後、各ウェルのＰＢＳを、速やかに被験物質１または２を０．０６８０％（ｗ／ｖ）の割合で含む１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地（被験物質含有培地）１００μＬに置換したのち、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２濃度及び３７℃に保たれたＣＯ２インキュベータで１時間、４時間、及び７時間培養した。なお、コントロール実験として、前記ＵＶＢ照射後、ウェルのＰＢＳを被験物質１及び２を含まない１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地（対照培地）１００μＬに置換して、上記と同様に５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２濃度及び３７℃に保たれたＣＯ２インキュベータで１時間、４時間、及び７時間培養した。
【００４８】
つぎに、細胞固定液〔メチルアルコール−アセトン混合溶媒（メチルアルコール／アセトン（体積比）＝１／１）、−２０℃〕１００μＬを、前記９６ウェルプレートのウェルに加え、この９６ウェルプレートを室温で１０分間放置することにより、ウェル中の線維芽細胞を固定化した。次いで、各ウェルを洗浄液１（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水、0.05%(v/v) Tween20。以下、組成同じ。）で３回洗浄した。洗浄後、各ウェル中に、２Ｍ塩酸水溶液１００μＬを加え、この９６ウェルプレートを３０分間室温で放置することにより、ＤＮＡ変性処理を行なった。その後、再び、前記９６ウェルプレートの各ウェルを、洗浄液１で３回洗浄した。洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェル中に、１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水で４０倍希釈した細胞染色蛍光試薬Cytotoxic fluorotest Wako(富士フイルム和光純薬)を６０μＬ加え、２分間常温で放置してから、プレートリーダーで４２０ｎｍの光で励起した、４６０ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００４９】
その後、前記９６ウェルプレートの各ウェルを前記と同じ洗浄液１で３回洗浄し、洗浄後の各ウェルに、ブロッキング溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製、製品名：SuperBlock Blocking Buffer in PBS）１５０μＬを添加した後、この９６ウェルプレートを３７℃で５分間静置して、ブロッキングを行なった。その後、当該９６ウェルプレートの各ウェルを、洗浄液１で３回洗浄した。洗浄後の各ウェルに、一次抗体として、シクロブタン型ピリミジン二量体（ＣＰＤ）の抗体である抗ＣＰＤ抗体〔コスモバイオ（株）製、商品名：Anti-Cyclobutane pyrimidine dimmers（CPDs）、コード番号：NMDND001〕を含む一次抗体溶液の１０００倍希釈物６０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置した。静置後、９６ウェルプレートを、前記洗浄液１で３回洗浄した。
【００５０】
洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔インビトロジェン（株）製、商品名：Biotin-Goat F(ab’)2 anti-mouse IgG(H+L)（カタログ番号62-6340）〕を含む二次抗体溶液の１０００倍希釈物６０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置した。静置後の９６ウェルプレートを、洗浄液1で３回洗浄した。洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、三次試薬として西洋ワサビパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（インビトロジェン（株）製、商品名：HRP-Streptavidin Conjugate（カタログ番号43-4323））を含む三次試薬溶液（１００００倍希釈物）を１００μＬ加え、この９６ウェルプレートを、３７℃で３０分間静置した。その後、前記９６ウェルプレートの各ウェルを、洗浄液１１００μＬで３回洗浄し、更にクエン酸緩衝液（組成：２５ｍＭクエン酸、５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、ｐＨ５．０）１５０μＬで１回洗浄した。
【００５１】
洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、１００ｍｌあたり４０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社、商品名：o-Phenylenediamine（製品番号P5412））と２０μＬの過酸化水素水（富士フイルム和光純薬株式会社、３５％（ｖ／ｖ））を含むクエン酸緩衝液を１００μＬ加え、この９６ウェルプレートを、３７℃で３０分間静置した。その後、前記９６ウェルプレートの各ウェルに、２Ｎ硫酸水溶液５０μＬを加え反応を停止した。
【００５２】
次いで、各ウェル中のｏ−フェニレンジアミンを基質とした西洋ワサビパーオキシダーゼの反応生成物に基づく波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。次にＵＶ−Ｂを照射したウェルの波長４９２ｎｍでの蛍光強度の値からＵＶＢ非照射のウェルの波長４９２ｎｍでの蛍光強度の平均値を差し引いた値を算出した。さらに、前述の方法で測定した各ウェルの励起波長４２０ｎｍにおける細胞染色蛍光試薬に基づく蛍光強度によって、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を正規化し、ウェル間の誤差を補正した。
【００５３】
斯くしてＵＶＢの照射直後のヒト線維芽細胞中のＤＮＡに含まれる損傷ＤＮＡ（ＣＰＤ）の量を１００％として、ＵＶＢの照射終了後、被験物質１または２に接触処理した時から所定時間（１、４及び７時間）経過したときのＣＰＤ残存率（％）を求めた。
【００５４】
（２）試験結果
被験物質１（クロモジ枝の熱水抽出物）による結果を図１（Ａ）に、被験物質２（クロモジ枝の含水エタノール抽出物）による結果を図１（Ｂ）に示す。図１（Ａ）に示すように、被験物質１（クロモジ枝の熱水抽出物）を０．０６８０％（ｗ／ｖ）含む培地でＵＶ−Ｂ照射後の線維芽細胞を培養した場合、対照培地で培養した場合（コントロール）と比べて残存するＣＰＤ量が少なくなっており、さらにその減少速度も速いことがわかる。特に４時間の処理（修復時間）で有意にＣＰＤの残存量が少なくなっている。また、被験物質２（クロモジ枝の含水エタノール抽出物）を０．０６９６％（ｗ／ｖ）を含む培地でＵＶＢ照射後の線維芽細胞を培養した場合も同様に、対照培地で培養した場合（コントロール）と比べて残存するＣＰＤ量が少なくなっており、さらにその減少速度も速いことがわかる。特に１時間の処理（修復時間）で有意にＣＰＤの残存量が少なくなっている。これらの結果から、クロモジ枝には、紫外線照射によって損傷したヒト線維芽細胞中のＤＮＡの修復を促進する作用を有する成分が含まれていることが判明した。従って、クロモジ枝そのものまたはその加工物は損傷ＤＮＡの修復を促進する作用を発揮するＤＮＡ修復促進剤として有用である。
【００５５】
実験例２：ＤＮＡ修復促進作用（その２）
前述する被験物質２を用いて、ヒト線維芽細胞のＤＮＡ損傷に対するクロモジのＤＮＡ修復促進作用を評価した。試験方法は、ヒト線維芽細胞に対するＵＶＢ照射の総曝露量が１２ｍＪ／ｃｍ２である点、被験物質含有培地として被験物質２（クロモジ枝含水エタノール抽出物）を０．０３４８（ｗ／ｖ）の割合で含む１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地を用いる点、評価時間が被験物質添加から４時間後と８時間後である点以外は、実験例１で行った試験方法と同様に実施した。
【００５６】
結果を図２に示す。
図２に示すように、ＵＶＢ照射後の線維芽細胞の培養に使用する培地に配合する被験物質の濃度が０．０３４８（ｗ／ｖ）と低くても、実験例１と同様に損傷ＤＮＡの修復を促進する作用を発揮することが確認された。
【００５７】
実験例３：線維芽細胞増殖作用
前述する被験物質１、２、３及び４を用いて、クロモジのヒト線維芽細胞に対する増殖作用を評価した。
【００５８】
（１）試験方法
正常ヒト線維芽細胞を９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルの割合で播種した。これを１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地０．１ｍＬ中で、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２濃度及び３７℃に保たれたＣＯ２インキュベータで１６時間培養した後、ウェルに被験物質〔被験物質１（クロモジ枝の熱水抽出物）、被験物質２（クロモジ枝の含水エタノール抽出物）、被験物質３（クロモジ葉の熱水抽出物）、被験物質４（クロモジ葉の含水エタノール抽出物）〕をそれぞれ添加した。被験物質を添加後、再び前記と同じ条件で２４時間培養したのち、各ウェルに１００μＬずつ細胞核蛍光染色試薬を添加した。なお、当該細胞核蛍光染色試薬は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地２０ｍＬあたり４０μＬのHoechst 33342（株式会社同仁化学研究所製、品番346-07951）を添加し混合することで調製することができる。次いで、２０分間ＣＯ２インキュベータでインキュベートして染色したのち蛍光染色画像を撮影して、総細胞数をカウントして、コントロール実験における総細胞数（コントロール値）を１００としたときの相対値を、細胞増殖率％として算出した。ここでコントロール実験として、正常ヒト線維芽細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地で培養後、被験物質を添加することなく、上記と同様に正常ヒト線維芽細胞を培養した後、細胞を細胞核蛍光染色試薬で染色して総細胞数をカウントした（コントロール値）。
【００５９】
（２）試験結果
被験物質１（クロモジ枝の熱水抽出物）、及び被験物質３（クロモジ葉の熱水抽出物）の結果を図３に、被験物質２（クロモジ枝の含水エタノール抽出物）及び被験物質４（クロモジ葉の含水EtOH抽出物）の結果を図４に示す。これらの図に示すように、クロモジ枝抽出物（熱水抽出物、含水エタノール抽出物）及びクロモジ葉抽出物（熱水抽出物、含水エタノール抽出物）のいずれにもヒト線維芽細胞を増殖する作用が認められた。特に、ヒト線維芽細胞に対して熱水抽出物は０．０２２６％（ｗ／ｖ）以下の低濃度で、また含水エタノール抽出物は０．０００５２１％（ｗ／ｖ）以下の低濃度で有意に増殖作用を発揮することが確認された。
【００６０】
実験例４：紫外線照射線維芽細胞に対する細胞増殖作用
紫外線照射により線維芽細胞の増殖能は著しく低下する。ここでは前述する被験物質１及び２を用いて、紫外線照射によるヒト線維芽細胞の増殖能低下に対するクロモジの作用を評価した。
【００６１】
（１）試験方法
正常ヒト線維芽細胞を９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルの割合で播種した。これを１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地０．１ｍＬの中で、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２濃度及び３７℃に保たれたＣＯ２インキュベータで１６時間培養した後、ウェルに被験物質〔被験物質１（クロモジ枝の熱水抽出物）、被験物質２（クロモジ枝の含水エタノール抽出物）〕をそれぞれ添加した。被験物質を添加後、前記と同条件で３時間培養した。
【００６２】
次いで、各ウェルの被験物質含有培地を１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に置換したのち、三共電気社製ＵＶ−Ｂランプ１５ＷＧＬ１５Ｅを用いて発生させたＵＶＢをプレートの上方３０ｃｍから照射した。この時の３１０ｎｍにおけるＵＶＢの輝度はＵＶＰ社製Radiometer Sensor UVX-31により測定し、総曝露量は２４ｍＪ／ｃｍ２となるよう露光時間を調節した。ＵＶＢ照射後、各ウェルのＰＢＳを速やかに１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地０．１ｍＬに置換したのち、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２濃度及び３７℃に保たれたＣＯ２インキュベータで２４時間培養した。
【００６３】
培養後、各ウェルに１００μＬずつ細胞核蛍光染色試薬（実験例３と同じ）を添加した。次いで、２０分間ＣＯ２インキュベータでインキュベートして染色したのち蛍光染色画像を撮影して、総細胞数をカウントして、コントロール実験における総細胞数（コントロール値）を１００としたときの相対値を、細胞増殖率％として算出した。ここでコントロール値は、正常ヒト線維芽細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地で培養後、被験物質を添加することなく、上記と同様に培養し、しかもＵＶＢ照射することなく細胞を細胞核蛍光染色試薬で染色して総細胞数をカウントして求めた。また比較試験として、被験物質を添加しない以外は、前記と同様に実験を行った。つまり、正常ヒト線維芽細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地で培養後、被験物質を添加することなく、上記と同様に培養し、次いでＵＶＢ照射した後に細胞を細胞核蛍光染色試薬で染色して総細胞数を求めた（比較値）。
【００６４】
（２）試験結果
被験物質１（クロモジ枝の熱水抽出物）による結果を図５（Ａ）に、被験物質２（クロモジ枝の含水エタノール抽出物）による結果を図５（Ｂ）に示す。両図の比較実験の結果（比較値）からわかるように、紫外線照射によってヒト線維芽細胞の増殖能は著しく低下する。これに対して、あらかじめクロモジで処理してヒト線維芽細胞の増殖能を上げておくことで、紫外線照射による細胞増殖能低下を抑制することができた。特に、ヒト線維芽細胞に対して、クロモジ枝の熱水抽出物が０．００２１３〜０．０３４１％の範囲で、クロモジ枝の含水エタノール抽出物が０．００２１８〜０．０１７４％の範囲で、有意に細胞数が増加することが確認された。なお、クロモジによるヒト線維芽細胞増殖促進効果がどういう作用機序によって生じるかについては明らかでない。特開２０１７−１２４９８４号公報によると、セラミドを分解するセラミダーゼの活性を阻害することで線維芽細胞が賦活化することが示唆されている。しかし、それを実証したデータはなく、むしろ、一般的にはセラミダーゼの活性化により細胞増殖が亢進することが知られている（Ceramidases, roles in sphingolipid ,etabolism and in health and disease.  Dv Biol Regul. 2017, 63, 122-131）。また、セラミドの代謝産物であるスフィンゴシン−１−リン酸がヒト真皮線維芽細胞の増殖を促進することが報告されている（Sphingosine-1-Phosphate and Its Potentially Paradoxical Effects on Critical Parameters of Cutaneous Wound Healing.  J Invest Dermatol. 2003, 120 (4): 693-700）。これらのことから、何ら拘束されるものではないが、一つの可能性として、セラミダーゼが活性化することでセラミドが代謝され、その結果、スフィンゴ−１−リン酸の濃度が上昇することで細胞増殖が促進されているとも考えられる。
【図１】
2019202973.tif 000002
【図２】
2019202973.tif 000003
【図３】
2019202973.tif 000004
【図４】
2019202973.tif 000005
【図５】
2019202973.tif 000006