(57)【要約】【課題】肥厚性瘢痕の形成を抑制するための組成物を提供すること。【解決手段】Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩を少なくとも１種含む、肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩を少なくとも１種含む、肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項２】
メカニカルストレスの影響を受けやすい部位における肥厚性瘢痕の形成を抑制するために用いられる、請求項１に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項３】
前記メカニカルストレスの影響を受けやすい部位は、腹部、胸部、上腕部、顔部及び軟部組織からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項２に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、２〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを含む、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるアミノ酸配列からなるジペプチドを含む、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、天然のコラーゲン由来のポリペプチド、リコンビナントポリペプチド又は合成されたポリペプチドである、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項７】
経口投与剤、サプリメント、食品又は飲料である、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項８】
経皮投与剤、局所投与剤、静脈投与剤又は化粧品である、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚等の創傷（具体的には、切傷、擦過傷、火傷等の急性創傷及び褥瘡等の慢性創傷）の治癒過程は、一般的に、凝固止血期、炎症期、増殖期、組織再構築期、成熟期の５つのステップに分類される。増殖期には、創傷部位に線維芽細胞及び毛細血管が侵潤し、線維芽細胞の増殖及び膠原繊維の生成が促進される。その結果、増殖期では、創傷部位に肉芽組織が形成される。
【０００３】
増殖期において形成された肉芽組織は、その後の組織再構築期及び成熟期においてやがて退縮し、最終的に治癒組織に置き換わる。しかし、増殖期において肉芽組織が過剰に形成される等、創傷の治癒過程に異常をきたした場合には、肥厚性瘢痕（ケロイドを含む）を形成することが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】小川  令ら、「創傷治癒における物理的刺激の役割とその分子メカニズム−メカノバイオロジーとメカノセラピー−」、創傷、５（３）：１０２−１０７、２０１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
皮膚の美観の観点又は生活の質（ＱＯＬ）の観点から肥厚性瘢痕の形成を抑制する方法が検討されている。しかしながら、上述の肉芽組織の形成は、そのメカニズムがまだ十分に理解されていない。従来の技術では、肥厚性瘢痕の形成を抑制する方法としては、創傷部位の安静、固定及び圧迫等、物理的な処置を行う方法が知られているに留まっている（例えば、創傷、５（３）：１０２−１０７、２０１４（非特許文献１））。そのため、肥厚性瘢痕の形成を抑制するための組成物等の開発が望まれている。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、肥厚性瘢痕の形成を抑制するための組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を進めた結果、特定の配列を有するポリペプチドが、肥厚性瘢痕の形成を有効に抑制することを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００８】
［１］Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩を少なくとも１種含む、肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
［２］メカニカルストレスの影響を受けやすい部位における肥厚性瘢痕の形成を抑制するために用いられる、［１］に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
［３］上記メカニカルストレスの影響を受けやすい部位は、腹部、胸部、上腕部、顔部及び軟部組織からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［２］に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
［４］上記ポリペプチドは、２〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
［５］上記ポリペプチドは、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるアミノ酸配列からなるジペプチドを含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
［６］上記ポリペプチドは、天然のコラーゲン由来のポリペプチド、リコンビナントポリペプチド又は合成されたポリペプチドである、［１］〜［５］のいずれかに記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
［７］経口投与剤、サプリメント、食品又は飲料である、［１］〜［６］のいずれかに記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
［８］経皮投与剤、局所投与剤、静脈投与剤又は化粧品である、［１］〜［６］のいずれかに記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【０００９】
［９］Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩の少なくとも１種の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む、肥厚性瘢痕の形成を抑制する方法。
［１０］肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物を製造するための、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩の少なくとも１種の使用。
［１１］肥厚性瘢痕の形成を抑制するための、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩の少なくとも１種。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、肥厚性瘢痕の形成を抑制するための組成物を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例において用いた腹壁切創モデルのマウスを示す写真である。
【図２】図２は、創傷部位の組織変化を示す写真である。
【図３】図３は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドを腹腔内投与又は経口投与した後のマウスにおける当該ジペプチドの血液内濃度の経時変化を示すグラフである。
【図４】図４は、マウスへの投与日程を示す模式図である。
【図５】図５は、創傷部位の組織変化を示す写真である。
【図６】図６は、肉芽組織におけるコラーゲンの分布を示す写真である。
【図７】図７は、腹壁切創モデルのマウスにおける創傷部位の治癒後の腹部を示す写真である。
【図８】図８は、腹壁切創モデルのマウスにおける腹壁側から見た創傷部位の経時変化を示す写真である。
【図９】図９は、肉芽組織におけるコラーゲンの分布を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態（以下、「本実施形態」とも記す。）を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。ここで、本明細書において「Ａ〜Ｂ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｂ以下）を意味し、Ａにおいて単位の記載がなく、Ｂにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位とＢの単位とは同じである。
また、「Ｐｒｏ」、「Ｈｙｐ」及び「Ｇｌｙ」は、それぞれプロリン、４−ヒドロキシプロリン及びグリシンを意味する。
【００１３】
≪肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物≫
本実施形態に係る肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、単に「ポリペプチド」という場合がある。）、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩を少なくとも１種含む。
上記ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中にＰｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を含む。そのため、例えば上記ポリペプチドを、経皮投与又は経口投与すると、体内で分解され、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるアミノ酸配列からなるジペプチドが生成される。そして、生成された当該ジペプチドが血中から創傷部位に到達することによって、肥厚性瘢痕の形成を抑制できると本発明者らは考えている。
【００１４】
本実施形態において「肥厚性瘢痕」とは、外傷後に、傷口（以下、「創傷部位」と表記する場合がある。）を修復しようとしてできた線維組織が過剰に産生されることによって形成された隆起状の傷跡を意味する。肥厚性瘢痕のうち正常な皮膚にも広がっていく瘢痕のことを特に「ケロイド」と呼ぶ。
【００１５】
本実施形態において「肥厚性瘢痕の形成抑制」、「肥厚性瘢痕の形成を抑制する」とは、創傷治癒過程の増殖期における肉芽組織の過剰な増殖又は膠原繊維の過剰な生成を抑制すること、創傷治癒過程の組織再構築期及び成熟期における肉芽組織の退縮を促進すること等によって、肥厚性瘢痕の形成が抑制されることを意味する。ここで、「創傷」とは、例えば、切傷、擦過傷、火傷等の急性創傷又は褥瘡等の慢性創傷等を意味する。
【００１６】
本実施形態において「ポリペプチド」とは、２以上のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される鎖状分子を意味する。本実施形態では、２〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドを「オリゴペプチド」と呼ぶ。なかでも、２つのアミノ酸がペプチド結合することによって形成されるオリゴペプチドを「ジペプチド」と呼ぶ。３つのアミノ酸がペプチド結合することによって形成されるオリゴペプチドを「トリペプチド」と呼ぶ。
【００１７】
上記ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中にＰｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有する。上記ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中にＰｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を１〜５００個有してもよいし、１〜１０個有していてもよい。
【００１８】
本実施形態において、上記ポリペプチドは、２〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを含むことが好ましく、２〜１５アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを含むことがより好ましい。オリゴペプチドとすることによって、例えば経皮投与又は経口投与した場合、体内における分解及び体内への吸収が促進され、効率よく創傷部位にＰｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるアミノ酸配列からなるジペプチドを供給することが可能になる。上記オリゴペプチドとしては、例えば、以下のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが挙げられる。
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ  （配列番号１）
【００１９】
本実施形態の他の側面では、上記ポリペプチドは、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるアミノ酸配列からなるジペプチドを含むことが好ましく、Ｐｒｏ−Ｈｙｐで示されるアミノ酸配列からなるジペプチドを含むことがより好ましい。ジペプチドとすることによって、経皮投与、経口投与等に加えて、局所投与であっても効率よく創傷部位に当該ジペプチドを供給することが可能になる。
【００２０】
また、上記ポリペプチドは、入手方法、製造方法は特に制限されないが、例えば、天然のコラーゲン由来のポリペプチド、リコンビナントポリペプチド又は合成されたポリペプチドであってもよい。
【００２１】
「天然のコラーゲン」としては、例えば、牛、豚等の哺乳動物、鳥類などに由来するコラーゲン、サメ、鯛、ティラピア等の魚類に由来するコラーゲン等が挙げられる。これらは、上記哺乳動物や鳥類の骨、皮、腱などの部分、上記魚類の骨、皮、鱗部分等の結合組織から得ることができる。具体的には、上記骨、皮、鱗等に脱脂処理、脱灰処理、又は抽出処理等の従来公知の処理を施せばよい。
【００２２】
「天然のコラーゲン由来のポリペプチド」としては、例えば、天然のコラーゲンを酵素処理等によって加水分解することで得られるポリペプチドが挙げられる。上記酵素処理に用いる酵素としては、例えば、コラゲナーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ等が挙げられる。上述の酵素は、これらを単独で、又は複数組み合わせて用いることができる。上記チオールプロテアーゼとしては、植物由来のキモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシン、動物由来のカテプシン、カルシウム依存性プロテアーゼ等が挙げられる。また、上記セリンプロテアーゼとしては、トリプシン、カテプシンＤ等が挙げられる。上記酸性プロテアーゼとしては、ペプシン、キモトリプシン等が挙げられる。なお、使用する酵素としては、得られたポリペプチドを医薬又は特定保健用食品等に利用することを考慮すると、病原性微生物由来の酵素以外の酵素（例えば、非病原性の微生物に由来する酵素）を用いることが好ましい。上記酵素の由来となる非病原性の微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ等が挙げられる。上記酵素は、１種の上記非病原性の微生物に由来する酵素を用いてもよいし、複数種の上記非病原性の微生物に由来する酵素を組み合わせて用いてもよい。酵素処理の具体的な方法は、従来から知られている方法を用いればよい。
また、非リボソーム型ペプチド合成酵素等を用いてペプチドを合成してもよい。
【００２３】
「リコンビナントポリペプチド」とは、大腸菌、酵母、培養細胞等を宿主として、遺伝子組換え技術を用いて人工的に作製したポリペプチドを意味する。リコンビナントポリペプチドの製造方法としては、従来から知られている方法を用いればよい。具体的には、例えば以下の方法が挙げられる。まず、目的のポリペプチドをコードする塩基配列を有するベクター及びアミノ酸のヒドロキシル化を行う酵素（例えば、Ｌ−プロリンｃｉｓ−４−水酸化酵素）をコードする塩基配列を有するベクターを宿主である大腸菌に導入し、形質転換を行う。形質転換した大腸菌を所定の培地で培養することによって、当該大腸菌に目的のポリペプチドを合成させる。
また、以下のような方法も可能である。まず、遺伝子組換え技術を用いてペプチド結合形成酵素を有する大腸菌を作製し、当該酵素を当該大腸菌に合成させた後に単離する。単離された上記酵素とアミノ酸とを反応させることによって、目的とするアミノ酸配列を有するポリペプチドを合成する。アミノ酸のヒドロキシル化においては、従来技術である、Ｌ−プロリンｃｉｓ−４−水酸化酵素を用いた方法を採用してもよい。
【００２４】
「合成されたポリペプチド」とは、原料であるアミノ酸を逐次結合させていくことによって生成されるポリペプチドを意味する。アミノ酸からの合成方法としては、例えば、固相合成法と液相合成法が挙げられる。固相合成法としては、例えば、Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法等が挙げられる。本実施形態に係るポリペプチドは、いずれの方法で合成してもよい。
【００２５】
例えば、上記ポリペプチドは、プロリンを担体ポリスチレンに固定し、アミノ基の保護としてｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ基（Ｆｍｏｃ基）又はｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｏｘｙ  Ｃａｒｂｏｎｙｌ基（Ｂｏｃ基）を使用する公知の固相合成法により合成することができる。すなわち、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いた脱水反応によってＦｍｏｃ基でアミノ基を保護したプロリンにヒドロキシプロリンを結合（ペプチド結合）させる。その後、上記固相を溶媒でよく洗い、残ったヒドロキシプロリン等を除去する。この後、固相に結合しているプロリンの保護基を除去（脱保護）することにより、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの配列を含むジペプチドを合成することができる。続いて、同様の方法で、このジペプチドのヒドロキシプロリン残基におけるアミノ基にグリシンを結合（ペプチド結合）させることで、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙの配列を含むトリペプチドを得ることができる。このようにして、アミノ酸を順次結合していくことで、目的のポリペプチドを合成することができる。
【００２６】
本実施形態においてポリペプチドの「化学修飾体」とは、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸残基におけるアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシ基が化学修飾されたポリペプチドを意味する。化学修飾を受けたポリペプチドは、水に対する溶解性、等電点等を変化させることができる。具体的には、ヒドロキシプロリン残基のヒドロキシ基については、Ｏ−アセチル化等の化学修飾が挙げられる。グリシン残基のα−カルボキシル基については、エステル化、アミド化等の化学修飾が挙げられる。プロリン残基のα−アミノ基については、ポリペプチジル化、スクシニル化、マレイル化、アセチル化、脱アミノ化、ベンゾイル化、アルキルスルホニル化、アリルスルホニル化、ジニトロフェニル化、トリニトロフェニル化、カルバミル化、フェニルカルバミル化、チオール化等の化学修飾が挙げられる。また、エチレンジアミン化、スペルミン化等を行うことで、特定のペプチドを塩基性にすることもできる。
【００２７】
ポリペプチドの化学修飾の具体的手段及び処理条件は、通常のポリペプチドの化学修飾技術が適用される。ヒドロキシプロリン残基のヒドロキシ基の化学修飾について、例えば、Ｏ−アセチル化は水溶媒中又は非水溶媒中で無水酢酸を作用させること等により、行うことができる。グリシン残基のα−カルボキシル基の化学修飾について、例えば、エステル化はメタノールへの懸濁後に乾燥塩化水素ガスを通気すること等により行うことができる。グリシン残基のα−カルボキシル基の化学修飾について、アミド化はカルボジイミド等を作用させることにより行うことができる。
【００２８】
本実施形態においてポリペプチドの「薬学上許容される塩」とは、薬学上許容され、元となるポリペプチドの所望の薬理活性（肥厚性瘢痕の形成抑制性）を有する塩を意味する。薬学上許容される塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩及び臭化水素酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩及びマレイン酸塩等の有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩及びカルシウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が挙げられる。常法に従って、特定のペプチドを薬学上許容される塩にすることができる。
【００２９】
本実施形態における肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物は、上記ポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩を少なくとも１種含む。すなわち、上記肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物は、単一の上記ポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩と、当該組成物を構成する他の成分（例えば、後述する賦形剤、結合剤、溶剤等）とを含んでいてもよい。また、上記肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物は、上記ポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩の複数種を含んでいてもよい。なお、上記肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物が上記ポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩の複数種を含むとき、上記肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物は上述の他の成分を更に含んでいてもよい。
【００３０】
例えば、上記肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物は、第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドの化学修飾体とを含んでいてもよい。上記肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物は、第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドの化学修飾体と、第３のポリペプチドの薬学上許容される塩とを含んでいてもよい。また、上記肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物は、複数種のポリペプチドを含むポリペプチド混合物であってもよい。上記ポリペプチド混合物であって、コラーゲンを加水分解することによって得られるポリペプチド混合物を「コラーゲンの加水分解物」と呼ぶことがある。
【００３１】
上記ポリペプチド混合物は、市販されているものを用いてもよい。市販品としては、例えば、新田ゼラチン株式会社製のイクオスＨＤＬ−５０ＳＰ（商品名）、ＳＣＰ−５２００（商品名）、コラペプＪＢ（商品名）及びイクオスＨＤＬ−１２ＳＰ（商品名）、ＴＹＰＥ−Ｓ（商品名）、コラペプＰＵ（商品名）等が挙げられるがこの限りではない。
【００３２】
上記ポリペプチド混合物は、その重量平均分子量が１３０〜７０００であることが好ましく、１５０〜６５００であることがより好ましい。上記重量平均分子量は、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めることが可能である。
具体的には、以下の条件にてゲル濾過クロマトグラフィーによる測定を行い、重量平均分子量を求めることが可能である。
移動相            ：０．１％トリフルオロ酢酸含有４５％アセトニトリル（５５％水）
固定相            ：ＴＳＫ−Ｇｅｌ−２０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨ製）
流速              ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、
カラム温度        ：４０℃、
分析時間          ：１５分、
インジェクション量：１０μｌ、
検出波長          ：２１４ｎｍ
【００３３】
上記肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物は、メカニカルストレスの影響を受けやすい部位における肥厚性瘢痕の形成を抑制するために用いられることが好ましい。ここで「メカニカルストレス」とは、皮膚、軟部組織等において自然の状態で生じている物理的な力を意味する。当該物理的な力としては、例えば、圧力、張力、せん断応力、静水圧、浸透圧等が挙げられる。ここで、「軟部組織」とは、骨格以外の支持組織を意味し、例えば、腱、靭帯、筋膜、脂肪組織、血管、筋肉等（例えば、横紋筋、平滑筋）が挙げられる。
【００３４】
上述のメカニカルストレスの影響を受けやすい部位としては、皮膚又は軟部組織において伸縮が起きやすい部位であることが好ましい。
本実施形態において、メカニカルストレスの影響を受けやすい部位は、腹部、胸部、上腕部、顔部及び軟部組織からなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。
【００３５】
ここで、メカニカルストレスの影響を受けやすい部位における創傷治癒の過程について腹部の創傷を例に説明する。腹部には張力等のメカニカルストレスがかかっているため、腹部に創傷が形成されると、張力によって創傷部位が広がる。張力等のメカニカルストレスの影響によって広がった創傷部位を治癒するには、（１）肉芽組織によって創傷部位を埋めること及び（２）メカニカルストレスの影響によって広がった創傷部位を当該メカニカルストレスに抗して収縮させることが重要になる。このような場合、通常はまず肉芽組織が増殖し創傷部位を被覆する。次に、創傷部位の収縮及びそれに伴い肉芽組織の退縮が起こり、最終的に創傷が治癒する。このとき、肉芽組織の増殖が過剰になると、組織再構築期及び成熟期における肉芽組織の退縮が十分に起こらず肥厚性瘢痕を形成することになる。
【００３６】
従来、肥厚性瘢痕の形成を抑制する方法としては、創傷部位の安静、固定及び圧迫等、物理的な処置を行う方法が知られているだけであった。しかし、本実施形態に係る肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物を用いると、有効成分である上記ジペプチド等がメカニカルストレスの影響によって広がった創傷部位の収縮をまず促進する。その結果、創傷部位を被覆する肉芽組織の量が少なくてすむため、肉芽組織の増殖が結果的に抑制される。最終的に、組織再構築期及び成熟期において肉芽組織の退縮が十分に起こり肥厚性瘢痕の形成が抑制される、と本発明者らは考えている。
【００３７】
上記肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物は、経口投与剤、サプリメント、食品又は飲料であってもよい。
【００３８】
経口投与剤の剤形としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、粉剤、液剤が挙げられる。
【００３９】
経口投与剤のための医薬担体としては、例えば、賦形剤（結晶性セルロース、乳糖、砂糖、コーンスターチ、リン酸カリウム、ソルビット、グリシン等）、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドン等）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（バレイショデンプン等）及び湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）等の慣用のものを挙げることができる。
【００４０】
サプリメントとしては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、粉剤、液剤が挙げられる。
【００４１】
食品としては、例えば、キャンディー、ガム、錠菓及びスナック等の菓子類、アイスクリーム及びシャーベット等の冷菓類、もち及びインスタント米飯等の米飯類、うどん、ラーメン及びパスタ等の麺類、即席スープ及びポタージュ等のスープ類が挙げられる。また当該食品は、特定保健用食品であってもよい。
【００４２】
飲料としては、例えば、果実飲料、茶系飲料、コーヒー飲料、清涼飲料水、乳飲料、乳酸菌飲料、炭酸飲料、栄養飲料等が挙げられる。
【００４３】
本実施形態における肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物が経口投与剤、サプリメント、食品又は飲料である場合、上記ポリペプチドの含有割合は、肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物の全体を基準として、０．０００１〜１００質量％であることが好ましく、０．００１〜８０質量％であることがより好ましい。経口摂取用サプリメントに用いる場合、錠剤では０．００１〜８０質量％が好ましく、顆粒剤では０．００１〜８０質量％が好ましく、カプセル剤では０．１〜３０質量％が好ましく、散剤及び粉剤では０．００１〜１００質量％が好ましく、液剤では０．１〜３０質量％が好ましい。また、食品に用いる場合、キャンディ及びガムでは０．００１〜３０質量％が好ましく、錠菓では０．００１〜８０質量％が好ましく、スナック類、冷菓類及び米飯類では０．０００１〜３０質量％が好ましく、麺類では０．０００１〜２０質量％が好ましく、スープ類では０．０００１〜５０質量％が好ましい。さらに、飲料に用いる場合は、果実飲料、茶系飲料、コーヒー飲料、清涼飲料水、乳飲料、乳酸菌飲料及び栄養補給飲料では、０．０００１〜５０質量％が好ましい。
【００４４】
また、上記肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物は、経皮投与剤、局所投与剤、静脈投与剤又は化粧品であってもよい。
【００４５】
経皮投与剤又は局所投与剤の剤形としては、例えば、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、液剤、塗布剤、乳剤、噴霧剤、滴剤、貼付剤、ドレッシング剤、注射剤等が挙げられる。上記経皮投与剤は、必要に応じて適当な賦形剤を加えることができる。賦形剤は、一般的に医薬品、医療用機器、医薬部外品等に用いられるものであれば種類を問わない。賦形剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、グリセロール、キトサン、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。
【００４６】
静脈投与剤の剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤等が挙げられる。注射剤及び点滴剤には、溶液、懸濁液、乳濁液、及び必要時に溶剤に溶解又は懸濁して用いる固形の薬剤が含まれる。上記静脈投与剤は、上記ポリペプチドを溶剤に溶解、懸濁又は乳化させて用いられる。溶剤として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類等及びそれらの組み合わせが挙げられる。さらに上記静脈投与剤は、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリソルベート８０（登録商標）等）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤等を含んでいてもよい。
【００４７】
化粧品としては、例えば、化粧水、乳液、美容液、パック、ファンデーション等が挙げられる。
【００４８】
本実施形態における肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物が経皮投与剤、局所投与剤、静脈投与剤又は化粧品である場合、上記ポリペプチドの含有割合は、肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物の全体を基準として、０．０００００１〜１００質量％であることが好ましく、０．００１〜２０質量％であることがより好ましい。経皮投与又は局所投与する場合、クリーム剤、ゲル剤及び軟膏剤では０．０００１〜１０質量％が好ましく、液剤、乳剤、噴射剤及び貼付剤では０．０００１〜２０質量％が好ましく、ドレッシング剤では０．０１〜５質量％が好ましく、注射剤では０．０００１〜０．５質量％が好ましい。また、静脈投与する場合、注射剤及び点滴剤では、０．０００１〜０．５質量％が好ましい。化粧品に用いる場合、化粧水及び乳液では、０．０００１〜５質量％が好ましく、美容液及びパックでは、０．０００１〜１００質量％が好ましく、ファンデーションなどのメイクアップ商品では、０．０００００１〜１質量％が好ましい。
【００４９】
≪肥厚性瘢痕の形成を抑制する方法≫
本実施形態に係る肥厚性瘢痕の形成を抑制する方法は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩の少なくとも１種の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む。
【００５０】
ここで「有効量」とは、肥厚性瘢痕の形成を抑制するために必要な上記ポリペプチド、その化学修飾体及びその薬学上許容される塩の合計量を意味する。
【００５１】
上記対象としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、サル及びヒト等の哺乳動物が挙げられる。上記対象は、ヒトであることが好ましい。
【００５２】
上記ポリペプチドの投与経路は、例えば、経口投与、経皮投与、局所投与、静脈投与、腹腔内投与等が挙げられる。
【００５３】
上記ポリペプチドの投与量は、対象の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類等によって異なる。上記ポリペプチドを経口投与する場合、当該投与量は、例えば、成人１日あたり０．０１〜５００００ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、１〜５００ｍｇ／ｋｇであることがより好ましい。
また、上記ポリペプチドがＰｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるアミノ酸配列からなるジペプチドであって、他の投与単位を用いる場合、経口投与による投与量は、例えば、成人１日あたり０．０００１〜７００００μｍｏｌ／ｋｇであってもよいし、０．０１〜７００μｍｏｌ／ｋｇであってもよい。
【００５４】
上記ポリペプチドを経皮投与する、局所投与する、静脈投与する又は腹腔内投与する場合、当該投与量は、例えば、成人１日あたり０．０１〜１５０ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、１〜１５ｍｇ／ｋｇであることがより好ましい。
また、上記ポリペプチドがＰｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるアミノ酸配列からなるジペプチドであって、他の投与単位を用いる場合、経皮投与、局所投与、静脈投与又は腹腔内投与による投与量は、例えば、成人１日あたり０．０１〜６０００μｍｏｌ／ｋｇであってもよいし、１〜６０μｍｏｌ／ｋｇであってもよい。
【００５５】
上記ポリペプチドの投与の頻度は、特に制限されないが、例えば、１週間に一度であってもよいし、３日に一度であってもよいし、１日に１度であってもよい。
【００５６】
本実施形態に係る肥厚性瘢痕の形成を抑制する方法は、上記ポリペプチド等の有効量を対象に投与することと併せて、他の処置が施されてもよい。当該他の処置としては、創傷部位の縫合、創傷部位の圧迫、湿潤療法等が挙げられる。
【００５７】
≪他の実施態様≫
本実施形態の他の態様として、肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物を製造するための、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩の少なくとも１種の使用が挙げられる。
本実施形態の別の他の態様として、肥厚性瘢痕の形成を抑制するための、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩の少なくとも１種が挙げられる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５９】
≪腹壁正中切開モデル（Ｍｏｄｅｌ−１）のマウスを用いた実験≫
＜Ｍｏｄｅｌ−１のマウスの作製＞
８−１０週齢の雌のＣ５７  ＢＬ／６Ｎマウスを用いた。マウス１頭あたり２００μＬ（０．０６５ｍｇ／体重１ｇ）の麻酔薬ソムノペンチル（Ｓｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ製）を腹腔内に投与した。次に、手術用ハサミを用いてマウス腹部の皮膚を１．５ｃｍ正中切開した（創傷部位の形成）。ここで、当該腹部は、皮膚の伸縮が起きやすい部位であり、メカニカルストレスの影響を受けやすい部位である。切開後は皮膚の張力を解除するため、切開した皮膚（以下、「創傷部位」という場合がある。）の上端より０．２５ｃｍの部分及び下端より０．２５ｃｍの部分を縫合した（図１の上側）。その後、皮膚を３Ｍ社製のテガターム（商品名、商標）で被包し、さらに創傷部位の自傷を防ぐため、パンツ型のシリコンプロテクターを装着した。このようにして作製されたＭｏｄｅｌ−１のマウスを用いて以下の実験を行った。
【００６０】
＜予備実験＞
（１）創傷部位の組織変化の観察
Ｍｏｄｅｌ−１のマウスを用いて、創傷部位の形成後何も投与せずに、当該創傷部位の組織変化を観察した。具体的には、Ｍｏｄｅｌ−１のマウス（Ｎ＝４）に創傷部位の形成後３、５、７及び１０日目のそれぞれに、マウスを麻酔下で脱血死させた。創傷部位を含む腹壁組織を摘出し、伸展させた後、５％ホルムアルデヒド溶液に一晩浸漬することにより固定を行った。固定後の組織は常法に従ってパラフィン包埋した後、ミクロトームにて組織切片を作製した。その後作製した組織切片に対してマッソントリクローム染色を実施した。この染色により、細胞質は赤色に、コラーゲン線維は青色に染め分けられる。染色した組織切片を顕微鏡下で観察した。創傷部位の形成後３日目では、創傷部位における組織の結合は不完全で観察には不向きであった（図示せず）。しかし、創傷部位の形成後５日目以降では表皮の接合、肉芽組織による創傷部位における組織の癒合が進行していた（図２）。創傷部位の完治は約２週間目以降となるため、創傷部位の組織変化（肉芽組織の変化）の観察は、創傷部位の形成後５、７、１０日目（Ｄａｙ５、７、１０）が適当と判断した。
【００６１】
（２）Ｐｒｏ−Ｈｙｐの投与後の血液内移行
創傷部位を形成していないＣ５７  ＢＬ／６Ｎマウス（８−１０週齢、雌）（各群、Ｎ＝４）へ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのアミノ酸配列からなるジペプチド（以下、単に「Ｐｒｏ−Ｈｙｐ」と表記する場合がある。）の生理食塩水溶液（５００ｎｍｏｌ／２００μＬ）を注射により腹腔内投与（単回投与）するか、又はＰｒｏ−Ｈｙｐの生理食塩水溶液（２５００ｎｍｏｌ／２００μＬ）をゾンデを用いて経口投与（単回投与）した。投与後、経時的に採血し、血液内に出現するＰｒｏ−ＨｙｐをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で測定した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の測定条件は以下の通りである。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の測定条件
採取した血液を生理食塩水で２倍希釈後、２０℃、５００×ｇ、１５分間の条件で遠心分離を行った。遠心分離を行った後に回収した上清に３倍量の１００％エタノールを加えた。１００％エタノールを加えた上記上清を２０℃にて１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、除タンパク処理を行った。続いて、除タンパク処理を行った試料を５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで１０倍に希釈し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。ＬＣの条件として、ガードカラムとして、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１  ＵＧ１２０  １０ｍｍ×Ｉ．Ｄ．  ２．０ｍｍ  （ＯＳＡＫＡ  ＳＯＤＡ）を用い、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  ＰＦＰ    １５０ｍｍ×Ｉ．Ｄ．  ２．１ｍｍ，  ５μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ製）のカラムを用いて分析を行った。分析条件は、移動相Ａ  ＭｅＯＨ、移動相Ｂ  ２ｍＭ  酢酸アンモニウム含有２％ギ酸水溶液、インジェクション量５μＬ、グラジェントは、下記表１のように行った。
【００６２】
【表１】
2019210264.tif 000002
【００６３】
ＭＳ／ＭＳ条件としては、タンデム型質量分析装置（ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ製））を用いて、イオン化法：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＥＳＩ、スプレー電圧：３０００Ｖ、ベーポライザー：３００℃、シースガス：３０、Ａｕｘガス：１５、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ温度：２５０℃、ＭＲＭ条件：Ｐａｒｅｎｔ  Ｍａｓｓ  ２２９．１、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｍａｓｓ  ７０、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎエネルギー：２９ｅｖ、Ｓ−Ｌｅｎｓ：６８で行った。
【００６４】
測定結果を図３に示す。図３の結果から腹腔内投与群及び経口投与群ともに、投与後１５分でＰｒｏ−Ｈｙｐの血中濃度はピークを迎えたが、投与してから１時間後には減少し、投与してから３時間後には、ベースラインレベルに減少したことが明らかになった。また、腹腔内投与は、消化管吸収を介さずに、血中移行するため非常に高い濃度に達した。一方、経口投与では血中移行量は腹腔内投与に比べて少ないものの、確実に血中移行することが示された。この結果から、腹腔内投与だけではなく、経口投与によっても循環血液を介し創傷部位へのジペプチドの移行が推測された。この実験では、創傷部位を形成していないＣ５７  ＢＬ／６Ｎマウスを用いたが、同系統のマウスから作製されたＭｏｄｅｌ−１のマウス及びＭｏｄｅｌ−２のマウスにおいても同様の結果が得られると考えられる。
【００６５】
＜肥厚性瘢痕の形成抑制試験＞
（１）創傷部位における肉芽組織の経過観察
創傷部位を形成したＭｏｄｅｌ−１のマウス（各群、Ｎ＝５）の腹腔内に、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの生理食塩水水溶液（５００ｎｍｏｌ／２００μＬ）又はＰｒｏ−Ｈｙｐを含まない生理食塩水を投与した。手術日（創傷部位を形成した日、Ｄａｙ０）を含め、毎日１回、マウス１頭あたり各溶液２００μＬを７日間にわたり投与した（図４）。創傷部位の形成後５、７及び１０日目（Ｄａｙ５、７、１０）のそれぞれに、マウスを麻酔下で脱血死させた。創傷部位を含む腹壁組織を摘出し、伸展させた。その後、５％ホルムアルデヒド溶液に一晩浸漬することにより固定を行った。固定後の組織は常法に従ってパラフィン包埋した後、ミクロトームにて組織切片を作製した。その後作製した組織切片に対してマッソントリクローム染色を実施した。この染色により、細胞質は赤色に、コラーゲン線維は青色に染め分けられる。染色した組織切片を顕微鏡下で観察した。
【００６６】
結果を図５に示す。創傷部位の形成後５日目になると表皮の治癒は殆ど完了しているが、腹腔側の治癒はなお進行中であった。全体的に、対照群（生理食塩水投与群、比較例）では創傷部位の肉芽組織は大きく（図５の楕円で示された部分）、創傷部位の離開の指標となる腹直筋間の距離（図５の太線の長さ）は広い。一方、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ投与群（実施例）では、肉芽組織は小さく、腹直筋間の距離は短くなっていた。この結果から、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを投与することによって、創傷部位における肉芽組織の増殖を抑制することが示唆された。
【００６７】
（２）腹直筋間の距離の計測
マッソントリクローム染色像より、病理学的所見から治癒に伴う腹直筋間の乖離部を腹直筋間の距離として、画像解析ソフト（商品名：ＢＺ−ａｎａｌｙｚｅｒ：Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用いて計測した。結果を表２に示す。表２中の腹直筋間の距離は、各群５頭のマウスで求めた平均値を示している。腹直筋間の距離（例えば、図５）は、対照群では実験期間を通し大きな変動はなかった。一方、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ投与群における腹直筋間の距離は時間依存的に短縮し、創傷部位の形成後７日目、１０日目とも、対照群に対して有意な差を認めた。
【００６８】
【表２】
2019210264.tif 000003
【００６９】
（３）肉芽組織の面積の計測
上述のマッソントリクローム染色像より、病理学的所見から治癒過程で形成された肉芽組織の面積を、画像解析ソフト（商品名：ＢＺ−ａｎａｌｙｚｅｒ：Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用いて、計測した。結果を表３に示す。表３中の肉芽組織の面積は、各群５頭のマウスで求めた平均値を示している。対照群での肉芽組織の面積は、創傷部位の形成後７日目にピークを迎えその後減少するのに対し、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ群では時間依存的に減少が認められた。Ｐｒｏ−Ｈｙｐ群は、創傷部位の形成後７日目、１０日目に対照群に対して有意な差を認めた。
【００７０】
【表３】
2019210264.tif 000004
【００７１】
（４）肉芽組織内におけるコラーゲンの分布
上記（１）に記載の方法に従い作製した組織切片を使用して、ピクロシリウスレッドによる染色を実施した。これにより肉芽組織内のコラーゲン線維を赤色に染色できる。染色後、組織切片における肉芽組織の写真撮影を行った。結果を図６に示す。
創傷部位の形成後５日目の初期の肉芽組織内のコラーゲンは細く、細網線維状に分布し、その後時間経過に伴い染色性が強くなり、創傷部位の形成後１０日目では太いコラーゲン束を形成していた。この結果から、創傷治癒の進行に伴い肉芽組織内の細胞の足場となるコラーゲン線維は脆弱で細いコラーゲン（ＩＩＩ型コラーゲン）から太く成熟したもの（Ｉ型コラーゲン）に変化していることが示唆された。
【００７２】
（５）肉芽組織内におけるコラーゲンの面積
ピクロシリウスレッド染色画像を、画像処理ソフト（商品名：Ｉｍａｇｅ  Ｊ、アメリカ国立衛生研究所製）を用いて二値化した。色閾値（≧１５０）に濃染された線維性コラーゲンを成熟コラーゲン（Ｉ型コラーゲン）としてその分布面積を測定し、肉芽組織内における単位面積あたりの成熟コラーゲンの分布面積として算出した。結果を表４に示す。表４中のコラーゲン分布密度は、各群５頭のマウスで求めた平均値を示している。実験期間中、対照群の肉芽組織内のコラーゲン密度に大きな変動はなかった。一方、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ群では時間依存的にコラーゲン分布密度の増加を認め、肉芽組織内のコラーゲンの成熟はＰｒｏ−Ｈｙｐ群で顕著に起きていた。
【００７３】
【表４】
2019210264.tif 000005
【００７４】
（６）Ｐｒｏ−Ｈｙｐ投与後の目視による腹壁側から見た創傷部位の観察
Ｐｒｏ−Ｈｙｐ投与後の目視による創傷部位の観察像を対照群と比較した（図７）。創傷部位の形成後１０日後のマウスについて、観察を行った。対照群では切開後の組織修復部は蛇行した白色調の肉芽が太く残存していた（図７の左側の写真における矢印が示す部分）。一方、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ投与群はスムースな直線を示し、肉芽組織の少ない治り方をしていた（図７の右側の写真における矢印が示す部分）。すなわち、Ｐｒｏ−Ｈｙｐで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ジペプチド）を投与することで、肥厚性瘢痕の形成を抑制できることが示された。
【００７５】
≪腹壁円形切除モデル（Ｍｏｄｅｌ−２）のマウスを用いた実験≫
＜Ｍｏｄｅｌ−２のマウスの作製＞
腹壁正中切開モデル（Ｍｏｄｅｌ−１）において、肉芽組織の形成は創傷部位における皮膚組織と腹直筋組織とに見られ、どちらの組織に由来するのかの分別が難しい場合がある。本実施例では、張力がかかる腹膜層に形成される肉芽組織を検討することが目的であるため、皮膚層からの治癒反応の影響が最小限で、筋肉の張力に直接的影響を受ける腹膜層間に形成される肉芽組織形成の新規モデル（Ｍｏｄｅｌ−２）を、以下の手順で作製した。８−１０週齢の雌のＣ５７  ＢＬ／６Ｎマウスを用いた。マウス１頭あたり２００μＬ（０．０６５ｍｇ／体重１ｇ）の麻酔薬ソムノペンチル（Ｓｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ製）を腹腔内投与することにより麻酔を導入した。麻酔を導入した後、手術用ハサミを用いて腹部の皮膚を１．５ｃｍ正中切開した。ここで、当該腹部は、皮膚の伸縮が起きやすい部位であり、メカニカルストレスの影響を受けやすい部位である。その後、腹壁中央部分を外径３ｍｍの先丸ピンセットで摘み上げ、腹壁中央部分の組織を先曲り極小手術バサミで円形に完全切除した（図１の下側）。切開後は皮膚の張力を解除するため、切開した皮膚（創傷部位）の上端より０．２５ｃｍの部分及び下端より０．２５ｃｍの部分を縫合した。その後、皮膚をテガタームで被包し、更に創傷部位の自傷を防ぐため、パンツ型のシリコンプロテクターを装着した。このようにして作製されたＭｏｄｅｌ−２のマウスを用いて以下の実験を行った。
【００７６】
＜創傷部位の収縮の評価実験＞
Ｍｏｄｅｌ−２のマウス（各群、Ｎ＝５）において、腹壁に創傷部位（円形欠損創）を形成した後、図４と同様の投与スケジュールで７日間のＰｒｏ−Ｈｙｐの生理食塩水溶液（５００ｎｍｏｌ／２００μＬ）の投与を行った。このとき対照群にはジペプチドを含まない生理食塩水を投与した。手術日（創傷部位を形成した日、Ｄａｙ０）を含め、毎日１回、マウス１頭あたり各溶液２００μＬを７日間にわたり腹腔内投与した（図４）。対象群には生理食塩水２００μＬを同様に投与した（図４）。創傷部位を形成した日から１０日目（Ｄａｙ１０）の腹壁側から見た創傷部位を比較した。結果を図８に示す。対照群に比べＰｒｏ−Ｈｙｐ群では創傷部位は縮小し、平たんとなったものが多く、治癒は進行していた。残存する創傷部位の面積を測定すると、対照群に比べ創傷部位の収縮は有意に進行していた（表５）。なお、表５中の創傷部位の面積は、各群５頭のマウスで求めた平均値を示している。
【００７７】
【表５】
2019210264.tif 000006
【００７８】
≪マウス胎児由来の皮膚線維芽細胞を用いた実験≫
＜コラーゲンゲルの収縮度合の評価＞
線維芽細胞をコラーゲンゲル包埋培養し、コラーゲンゲルの収縮度合を測定した。マウス胎児由来の皮膚線維芽細胞である３Ｔ３−Ｌ１細胞株を、１０％ＦＢＳ（牛胎児血清；ＧＩＢＣＯ製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｈｉｇｈ−Ｇｌｕｃｏｓｅ）（ＷＡＫＯ製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。ブタ由来Ｉ型コラーゲン溶液（新田ゼラチン株式会社製）、１０倍濃度Ｄ−ＭＥＭ溶液（新田ゼラチン株式会社製）及び再構成用緩衝液（新田ゼラチン株式会社製）を、冷却下、８：１：１の体積割合で混合した。そこにトリプシン溶液を用いて回収した上記の細胞ペレットの播種密度が２．５×１０５個／ｗｅｌｌとなるように、また、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ濃度が各最終濃度になるように調製した溶液を加えて混合し、３００μＬずつ２４ｗｅｌｌプレートに注いだ。なお、ブランクにはＰｒｏ−Ｈｙｐ及び細胞を添加しないコラーゲンゲルを用いた。その後３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間インキュベートしてコラーゲンをゲル化させた。その後、Ｄ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ−Ｇｌｕｃｏｓｅ）４００μＬを静かに重層し、滅菌したスパーテルを用いてコラーゲンゲルを壁面から剥がし、ゲルを培地中に浮遊させた。さらに６９時間インキュベートした後、コラーゲンゲルの写真をスキャナーで取り込み、画像処理ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を用いてゲルの収縮度合を判定した。ゲル収縮度合は、ゲルの片方をウェルの壁面に接するように寄せ、その反対側の壁との距離を測定することで判定した。結果を表６に示す。Ｐｒｏ−Ｈｙｐの添加により濃度依存的に線維芽細胞を包含したコラーゲンゲルが収縮したことから、Ｐｒｏ−Ｈｙｐに線維芽細胞を介したコラーゲン線維を収縮させる作用があることが明らかになった。すなわち、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを腹腔に投与すると、張力等のメカニカルストレスによって広がった創傷部位において、線維芽細胞を介したコラーゲン線維の収縮が誘導され結果的に創傷部位の収縮を促進することが示唆された。
【００７９】
【表６】
2019210264.tif 000007
【００８０】
＜各種ポリペプチド投与による肉芽組織の形成＞
本実験では、腹壁円形切除モデル（Ｍｏｄｅｌ−２）のマウスを用いた。表７に記載の各種ポリペプチドの生理食塩水溶液を用い、腹腔内投与を１日１回、７日間行い（図４）、肉芽組織の形態を比較した。また、コラーゲン加水分解物に含まれるポリペプチドの重量平均分子量は、以下の条件によるゲル濾過クロマトグラフィーによって算出した。
（ゲル濾過クロマトグラフィーの測定条件）
移動相            ：０．１％トリフルオロ酢酸含有４５％アセトニトリル（５５％水）
固定相            ：ＴＳＫ−Ｇｅｌ−２０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨ製）
流速              ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、
カラム温度        ：４０℃、
分析時間          ：１５分、
インジェクション量：１０μｌ、
検出波長          ：２１４ｎｍ
【００８１】
創傷部位の形成後７日目（Ｄａｙ７）の創傷部位における組織の薄切切片をマッソントリクローム染色し、肉芽組織を観察した。結果を図９に示す。対照群（生理食塩水）では肉芽組織の形成は軽微で、コラーゲン線維の分布が疎となっているのに対し、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、各コラーゲン加水分解物の投与群ではいずれもコラーゲン線維が密であり組織として成熟している可能性が示唆された。すなわち、この実験によってＰｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ等のジペプチドだけでなく、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを投与すれば、張力等のメカニカルストレスによって広がった創傷部位において、線維芽細胞を介したコラーゲン線維の収縮が誘導され、結果的に創傷部位の収縮を促進することが示唆された。
【００８２】
【表７】
2019210264.tif 000008
【００８３】
上述した一連の実験結果から、以下のようなメカニズムで肥厚性瘢痕の形成が抑制されることが示唆された。
（１）まず、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（例えば、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのジペプチド）を投与すると、メカニカルストレス（張力等）によって広がった創傷部位において、線維芽細胞を介したコラーゲン線維の収縮が誘導され、結果的に創傷部位の収縮を促進する（表６及び図９）。
（２）収縮された創傷部位は、少量の肉芽組織で被覆することができるため、肉芽組織の増殖が結果的に抑制される（図８）。
（３）その結果、肉芽組織が過剰に増殖することはなく、最終的に、修復過程において肉芽組織の退縮が十分に起こり、肥厚性瘢痕の形成が抑制される（図７）。
【００８４】
従来、創傷の治癒には、肉芽組織の増殖が必須であると考えられていた。しかし、創傷部位の収縮を促進できる「質が改善された肉芽組織」であれば、肉芽組織の増殖を抑制しながら（すなわち、肥厚性瘢痕の形成を抑制しながら）、創傷の治癒が進行することを本発明者らははじめて見出した。さらに本発明者らは、肉芽組織の質を改善し、肥厚性瘢痕の形成を抑制するために、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（例えば、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのジペプチド）を投与することを初めて見出した。当該ポリペプチドを用いることで肥厚性瘢痕の形成を抑制するという優れた効果は、従来の技術常識では予測不可能であり、且つ極めて異質な効果であると本発明者らは考えている。
【００８５】
以上のように本発明の実施形態及び実施例について説明を行なったが、上述の各実施形態及び各実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。
【００８６】
今回開示された実施の形態及び実施例はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した実施の形態及び実施例ではなく特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味、及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図１】
2019210264.tif 000009
【図２】
2019210264.tif 000010
【図３】
2019210264.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月9日(2019.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるジペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、その化学修飾体又はその薬学上許容される塩を少なくとも１種含む、肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物であって、
前記ポリペプチドは、２〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドであり、
前記ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中に前記ジペプチド配列を１〜１０個有しており、
前記化学修飾体は、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸残基におけるアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシ基が化学修飾されたポリペプチドである、肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項２】
メカニカルストレスの影響を受けやすい部位における肥厚性瘢痕の形成を抑制するために用いられる、請求項１に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項３】
前記メカニカルストレスの影響を受けやすい部位は、腹部、胸部、上腕部、顔部及び軟部組織からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項２に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ又はＨｙｐ−Ｇｌｙで示されるアミノ酸配列からなるジペプチドを含む、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、天然のコラーゲン由来のポリペプチド、リコンビナントポリペプチド又は合成されたポリペプチドである、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項６】
経口投与剤、サプリメント、食品又は飲料である、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。
【請求項７】
経皮投与剤、局所投与剤、静脈投与剤又は化粧品である、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の肥厚性瘢痕の形成抑制用組成物。