(57)【要約】【課題】  大腸癌患者から取得した腫瘍組織における遺伝子発現量から、当該大腸癌患者における異時性転移の有無を予測する方法を提供すること。【解決手段】  大腸癌ステージ２患者の異時性転移の有無を予測する方法であって、前記患者から取得した大腸癌組織におけるＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定する工程と、前記測定した発現量から、異時性転移の有無を予測するためのスコアを算出する工程とを有し、前記算出したスコアが基準値よりも小さい場合に、前記患者に異時性転移が起きないことを示す、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸癌ステージ２患者の異時性転移の有無を予測する方法であって、
前記患者から取得した大腸癌組織におけるＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定する工程と、
前記測定した発現量から、異時性転移の有無を予測するためのスコアを算出する工程と
を有し、前記算出したスコアが基準値よりも小さい場合に、前記患者に異時性転移が起きないことを示す、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記スコアは、前記少なくとも１つの遺伝子の発現量を正規化することによって算出する、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記基準値は、異時性転移の有無が判明した大腸癌ステージ２患者から取得された大腸癌組織における、前記測定する工程において用いた遺伝子と同じ遺伝子の発現量に基いて決定される、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記測定する工程は、ＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰから選択される２つの遺伝子の発現量を測定する、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記２つの遺伝子は、ＩＬ２ＲＢ及びＧＮＬ３Ｌ、ＩＬ２ＲＢ及びＳＬＣ３５Ａ２、ＩＬ２ＲＢ及びＵＢＥ２Ｉ、ＴＹＭＰ及びＧＮＬ３Ｌ、ＴＹＭＰ及びＳＬＣ３５Ａ２、並びにＴＹＭＰ及びＵＢＥ２Ｉからなる群から選択される、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記測定する工程は、ＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰのすべての遺伝子の発現量を測定する、方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、前記異時性転移は前記組織取得後３年以内における転移である、方法。
【請求項８】
ＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰから選択される少なくとも１つの遺伝子に特異的に結合するプローブを有する、大腸癌ステージ２患者の異時性転移の有無を予測するためキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、大腸癌の異時性転移に関連する遺伝子、及びそれを用いた異時性転移を予測する方法に関する。より詳細には、大腸癌ステージ２患者の大腸癌組織に特異的に発現する遺伝子群の発現情報を統計解析することによって得た、大腸癌の異時性転移の予測に有用な遺伝子群、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は日本人の中で罹患率が高い癌であり、主要部位別の統計でも、男性２位、女性１位となっている。この大腸癌の発癌過程としては、癌の発生及び進行に伴って複数の癌関連遺伝子が関与する多段階の過程が知られており、具体的には、ＡＰＣ等の癌抑制遺伝子異常により大腸ポリープができ、癌遺伝子ｒａｓの変異による活性化、癌抑制遺伝子ｐ５３の変異による不活性化等の異常が加わると、大腸ポリープは肥大化及び癌化する。さらに、他の癌遺伝子の異常により、癌が浸潤や転移するようになる。そのため、大腸癌と診断されても、その詳細は、腫瘍組織を除去すれば問題のない良性のものから、小さくても転移しやすい悪性度の高いものまで多様である。中でも、腫瘍組織が小さくても転移し易い悪性度の高いものが多く存在するため、切除後の肝転移や肺転移が重大な問題となっている。
【０００３】
また、大腸癌に限らず、癌全般において、手術時の所見と組織の病理学的検査だけではなく、分子生物学的判断を加えて、癌診断の精度を向上させることは重要であり、癌の予後判定を正確に行って手術後の患者のＱＯＬを高めることの社会的意義は極めて大きい。
【０００４】
さらに、大腸癌の予後予測や転移可能性の予測に関する情報は、大腸癌の転移に対する薬剤選択において、抗体医薬感受性を示唆する可能性があり、個々の大腸癌組織の発現プロファイルを解析することは、今後、個別化医療を行う上で非常に重要な情報となる可能性がある。
【０００５】
したがって、大腸癌腫瘍組織の切除後の予後予測の精度の向上と、それに基づく合理的なフォローアップの確立が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、大腸癌患者から取得した腫瘍組織における遺伝子発現量から、当該大腸癌患者における異時性転移の有無を予測する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明はまた、上記方法に用いられるキットを提供することを目的とする。  
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは１０年余にわたり１０００例に近い消化器癌を対象としてＲＮＡによる制御系ネットワークの変形解析を進めて分子生物学に立脚した予後予測法の開発を試み、異時性転移に関連する候補遺伝子を特定することに成功した。また、本発明者らは、特に大腸癌ステージ２患者において、レトロスペクティブな解析を行い、クラスター解析を行った結果、候補遺伝子を絞ることができ、またプロスペクティブサンプルでクラスター解析を行うことにより、異時性転移の予測可能性を確認することができた。
【０００９】
そして、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、５つの遺伝子の発現量を測定することにより、大腸癌ステージ２患者の異時性転移を予測することができることを見出した。
【００１０】
具体的には、本発明の第一の主要な観点によれば、大腸癌ステージ２患者の異時性転移の有無を予測する方法であって、前記患者から取得した大腸癌組織におけるＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定する工程と、前記測定した発現量から、異時性転移の有無を予測するためのスコアを算出する工程とを有し、前記算出したスコアが基準値よりも小さい場合に、前記患者に異時性転移が起きないことを示す、方法が提供される。
【００１１】
このような構成によれば、大腸癌ステージ２患者の腫瘍組織を取得するだけで、将来における癌転移の可能性を見出すことが可能となる。
【００１２】
また、本発明の一実施形態によれば、このような方法において、前記スコアは、前記少なくとも１つの遺伝子の発現量を正規化することによって算出する。
【００１３】
また、本発明の他の一実施形態によれば、このような方法において、前記基準値は、異時性転移の有無が判明した大腸癌ステージ２患者から取得された大腸癌組織における、前記測定する工程において用いた遺伝子と同じ遺伝子の発現量に基いて決定される。
【００１４】
また、本発明の別の一実施形態によれば、このような方法において、前記測定する工程は、ＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰから選択される２つの遺伝子の発現量を測定する。この場合、前記２つの遺伝子は、ＩＬ２ＲＢ及びＧＮＬ３Ｌ、ＩＬ２ＲＢ及びＳＬＣ３５Ａ２、ＩＬ２ＲＢ及びＵＢＥ２Ｉ、ＴＹＭＰ及びＧＮＬ３Ｌ、ＴＹＭＰ及びＳＬＣ３５Ａ２、並びにＴＹＭＰ及びＵＢＥ２Ｉからなる群から選択されることが好ましい。さらに好ましくは、前記測定する工程は、ＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰのすべての遺伝子の発現量を測定する。
【００１５】
さらに、本発明の他の一実施形態によれば、このような方法において、前記異時性転移は前記組織取得後３年以内における転移である。
【００１６】
また、本発明の第二の主要な観点によれば、ＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰから選択される少なくとも１つの遺伝子に特異的に結合するプローブを有する、大腸癌ステージ２患者の異時性転移の有無を予測するためキットが提供される。
【００１７】
なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の一実施形態における異時性転移予測候補遺伝子の発現量Ｔ検定の結果を示す表である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態において、５つの異時性転移予測遺伝子を用いて得た発現解析結果を示す写真および表である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態において、５つの異時性転移予測遺伝子を用いて得たスコア値のしきい値と予測確率の関係を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の一実施形態において、２つの異時性転移予測遺伝子を用いて得た異時性転移予測結果を示す表である。
【図５】図５は、本発明の一実施形態において、１つの異時性転移予測遺伝子を用いて得た異時性転移予測結果を示す表である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本願発明に係る一実施形態および実施例を、図面を参照して説明する。  
本願発明に係る一実施形態において、大腸癌ステージ２患者の異時性転移の有無を予測する方法では、前記患者から取得した大腸癌組織におけるＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰから選択される少なくとも１つの遺伝子が用いられる。ここで、ＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、及びＵＢＥ２Ｉは、異時性転移が起きない患者と比較して、異時性転移が発生する大腸癌患者において過剰発現している遺伝子であり、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰは、異時性転移が起きない患者と比較して、異時性転移が発生する大腸癌患者において発現が低下している遺伝子である。
【００２０】
また、当該患者から大腸癌組織を取得する手法は、大腸癌を切除するために行われる外科的手術や、癌の診断または病変の拡大の程度を調べるために行われるバイオプシーであっても良く、患者から大腸癌組織が取得されるあらゆる手法を採用することができる。
【００２１】
本願発明に係る一実施形態において、異時性転移の有無を予測するためのスコアは、患者から取得した大腸癌組織における、上記の遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定し、その発現量をサイクル数等で正規化することで算出される。例えば、かかる正規化は以下の計算式で算出される。
スコア値＝Σ（ΔΔＣｔ（転移あり群で発現量が上昇する遺伝子））−Σ（ΔΔＣｔ（転移あり群で発現量が低下する遺伝子））
そのため、例えばＧＮＬ３Ｌ遺伝子だけを用いて本願発明に係る方法を実施する場合には、（スコア値）＝（ΔΔＣｔ（ＧＮＬ３Ｌ））となる。なお、ΔＣｔを算出するために用いられるコントロール遺伝子は、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ、ＴＢＰ等に代表されるハウスキーピング遺伝子等の本技術分野において周知の任意のコントロール遺伝子を用いることができる。
【００２２】
本願発明に係る一実施形態において、上記のようにして算出したスコア値と基準値とを比較して、スコア値が基準値よりも小さい場合には異時性転移が起きず、スコア値が基準値よりも大きい場合には異時性転移が起きることを示すことができる。この基準値は任意のスコア値であっても良く、例えば、感度（sensitivity）、特異度（specificity）、陽性的中率（positive predictive value, PPV）、陰性的中率（negative predictive value, NPV）を考慮し、異時性転移があることを予測するのか、異時性転移がないことを予測するのか等の異時性転移の有無を予測するための遺伝子マーカーとして機能するような任意の状況に応じた基準値を採用することができる。したがって、例えば、異時性転移があることだけを予測したいのであれば、ＰＰＶが高くなるようなスコア値を基準値とすることも可能である。また、異時性転移の有無のいずれをも予測する場合には、感度および特異度が下がり過ぎない値で、ＰＰＶ及びＮＰＶが高く保たれているスコア値を基準値として採用することができる。
【００２３】
また、本願発明に係る一実施形態において、この基準値は上記のとおり感度、特異度、ＰＰＶ、ＮＰＶを考慮して決定することができるため、すでに異時性転移の有無が判明している大腸癌ステージ２患者から取得された大腸癌組織を用いて、スコア値を算出するために用いた遺伝子と同じ遺伝子の発現量に基いて決定することができる。
【００２４】
また、遺伝子の発現量は、各遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを用いて、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法など公知の遺伝子発現量測定法を用いて測定することができる。
【００２５】
また、本願発明に係る一実施形態において、「異時性転移」とは、腫瘍の原発部位が発見されてから１年または６ヶ月以降に確認された転移を指し、好ましくは、大腸癌組織を取得してから３年以内の転移を指す。また、その転移部位は肝転移、肺転移、腹膜転移等のすべての器官への転移を含む。
【００２６】
本願発明に係る一実施形態において、大腸癌ステージ２患者の異時性転移の有無を予測するためのキットを提供することができ、そのキットは、ＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰから選択される少なくとも１つの遺伝子に特異的に結合するプローブを有し、本技術分野において周知の試薬等を有することもできる。
【００２７】
このようなプローブは、各遺伝子の塩基配列内の少なくとも１５塩基長〜全塩基長、好ましくは１８塩基長〜全塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズするように、公知のプローブ設計方法に従って上記各塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。
【００２８】
当該プローブは、各遺伝子と特異的にハイブリダイズするものであれば、完全に相補的である必要はない。かかるポリヌクレオチドとして、好ましくは各遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補ポリヌクレオチドと比較して、塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドである。
【００２９】
また、当該プローブは、遺伝子を容易に検出できるように、慣用されている放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素で標識されていてもよい。
【実施例】
【００３０】
以下に、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
実験手法および材料
以下に、本発明において用いる実験手法および材料について説明する。なお、本願の一実施形態において、以下の実験手法を用いているが、これら以外の実験手法を用いても、同様の結果を得ることができる。
【００３２】
検体
対象試料は、術後３〜５年を経て予後判定が明瞭であるステージ２大腸癌凍結試料を用いた。
【００３３】
ＲＮＡ抽出とリアルタイムＰＣＲ
ＴＲＩＺＯＬを用いて大腸癌組織からＲＮＡを抽出した。バイオアナライザーによる濃度測定及びクオリティチェックを行い、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてＴａｑＭａｎｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行なった。以下にその手順を示す。
【００３４】
抽出したＲＮＡサンプルは、ＤＷで１００ｎｇ／μＬ濃度に調整した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、マニュアルにしたがってｃＤＮＡを合成した。上記調整のＲＮＡ溶液２０μＬを使用し、全体量４０μＬで合成を行った。温度条件は、２５℃１０分、３７℃１２０分、８５℃５秒、４℃Ｈｏｌｄ。反応終了後、ＤＷ６０μＬを加え、全量１００μＬとした。
【００３５】
１００μＬに調整した逆転写反応液にＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １００μＬ加えて撹拌し、２００μＬの反応液を調製した。反応液を１００μＬずつ分取し、ＴａｑＭａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙプレートに注入した（ｃＤＮＡ濃度は、１０００ｎｇ ｃＤＮＡ当量／Ｆｉｌｌポート）。測定には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ７９００ ＨＴ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、５０℃２分、９４．５℃１０分、（９７℃３０秒、５９．７℃１分）／４０ｃｙｃｌｅｓで行った。測定は同じ反応液を使用し、二重測定で行った。
【００３６】
反応後、ＲＱ Ｍａｎａｇｅｒ １．２ソフトウエアを用いて、それぞれのサンプルのＣｔ値を得た。
【００３７】
データ処理
異時性転移予測マーカーの候補となる３８遺伝子の発現量を、５つのコントロール遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ、ＴＢＰ）毎に正規化を行った。１マーカー遺伝子あたり５つのデータが得られる。臨床情報から転移あり群と転移なし群とに分類し、それぞれの発現量に差があるかどうかを調べるためＴ検定を行った。
【００３８】
スコア値は以下の式で計算した。
スコア値＝Σ（ΔΔＣｔ（転移あり群で発現量が上昇する遺伝子））−Σ（ΔΔＣｔ（転移なし群で発現量が低下する遺伝子））
【００３９】
結果
３８遺伝子と５コントロール遺伝子の発現解析
それぞれの遺伝子の発現量を別個に５つのコントロール遺伝子で正規化を行い、転移あり群と転移なし群とで比較検討した。Ｔ検定の結果、５つの遺伝子（ＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰ）と３つのコントロールの組み合わせについて、有意差（ｐ<．０１）があった（図１）。このうち、５つの遺伝子について、最も有意差のあるコントロールを１つ選択すると、ＧＮＬ３Ｌ ｖｓ ＧＡＰＤＨ、ＳＬＣ３５Ａ２ ｖｓ ＧＡＰＤＨ、ＵＢＥ２Ｉ ｖｓ ＧＡＰＤＨ、ＩＬ２ＲＢ ｖｓ ＧＵＳＢ、ＴＹＭＰ ｖｓ ＧＵＳＢの５つの組み合わせであった。これらの５つの発現情報を用いて、クラスター解析を行なった（図２）。スコア値を−１．９で分類すると、ＰＰＶ：３３．７％、ＮＰＶ：８８．７％、Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ：４９．３％、Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ：８０．４％であった。つまり、発現パターンによって転移ありと転移なしとを大まかに分けることが可能であるとわかった。
【００４０】
スコア化による転移の有無の予測
全症例３９８（転移あり６７、転移なし３３１）を、トレーニングセット（ｎ＝１９９；転移あり３４、転移なし１６５）とテストセット（ｎ＝１９９；転移あり３３、転移なし１６６）とに分けて解析を行なった。その結果、トレーニングセットにおいてＰＰＶ：５０．０％、ＮＰＶ：７８．８％、ＡＣＣ：７３．９％で、テストセットにおいてＰＰＶ：４８．５％、ＮＰＶ：８１．９％、ＡＣＣ：７６．４％であった。
【００４１】
スコア値のしきい値と予測確率の関係を図３に示す。しきい値をどの値に設定するかで、正診率、ＰＰＶ、ＮＰＶが変化するが、−２．５から０の間で設定するのが、臨床応用的に有用であると考えられる。
【００４２】
２マーカー遺伝子による転移予測
同じ２セット（トレーニングセットとテストセット）の分類サンプルを使って、５遺伝子のうち、２遺伝子を使って判別ができるかどうか検討した。組み合わせは、転移ありの患者で発現が増加している遺伝子と低下している遺伝子との組み合わせで、ＩＬ２ＲＢとＧＮＬ３Ｌ、ＩＬ２ＲＢとＳＬＣ３５Ａ２、ＩＬ２ＲＢとＵＢＥ２Ｉ、ＴＹＭＰとＧＮＬ３Ｌ、ＴＹＭＰとＳＬＣ３５Ａ２、ＴＹＭＰとＵＢＥ２Ｉ、の６つの組み合わせである。
【００４３】
その結果、トレーニングセットでは、ＰＰＶ：２９．１％〜３６．４％、ＮＰＶ：８６．７％〜８８．３％、ＡＣＣ：７１．４％〜７８．４％、テストセットでは、ＰＰＶ：２６．１％〜４０．０％、ＮＰＶ：８６．２％〜８９．９％、ＡＣＣ：７２．４％〜８０．９％、であった（図４）。この結果から、ＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰから選択される２つの遺伝子を用いた場合であっても、大腸癌ステージ２患者の異時性転移の有無を予測することが可能であることがわかった。
【００４４】
１マーカー遺伝子による転移予測
続いて、ＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰの遺伝子について、それぞれ１つの遺伝子だけを用いた場合に異時性転移の有無を確認できるかどうかを検証した。
【００４５】
その結果、トレーニングセットでは、ＰＰＶ：１８．８％〜３４．５％、ＮＰＶ：８３．２％〜８６．２％、ＡＣＣ：７１．９％〜７８．４％、テストセットでは、ＰＰＶ：２４．３％〜３７．０％、ＮＰＶ：８５．１％〜８７．１％、ＡＣＣ：７３．９％〜７９．９％、であった（図５）。この結果から、ＧＮＬ３Ｌ、ＳＬＣ３５Ａ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＩＬ２ＲＢ、及びＴＹＭＰから選択される１つの遺伝子だけを用いた場合であっても、大腸癌ステージ２患者の異時性転移の有無を予測することが可能であることがわかった。
【００４６】
その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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