(57)【要約】【課題】  本発明は、外原規コメヌカエキスを含有する化粧品よりも、優れた美白作用を有する化粧品を提供することを解決すべき課題とするものである。【解決手段】  本発明のこの課題は、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを、２０μｇ／ｍＬを超えた濃度で含有する化粧品によって達成される。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０μｇ／ｍＬを超えた濃度のコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを含有することを特徴とする化粧品。
【請求項２】
３０μｇ／ｍＬ以上の濃度のコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを含有することを特徴とする請求項１に記載の化粧品。
【請求項３】
４０μｇ／ｍＬ以上の濃度のコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを含有することを特徴とする請求項１に記載の化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品に関するものであり、さらに詳細には、美白効果が高い化粧品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コメヌカから水、1，3−ブチレングリコール、又はその混液にて抽出して得られるエキスである医薬部外品原料規格２００６収載のコメヌカエキス（以下、「外原規コメヌカエキス」という。）には美白作用があり、化粧品や医薬部外品の原料として、広く用いられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、外原規コメヌカエキスの美白作用は十分なものではないという問題があった。
【０００４】
したがって、本発明は、外原規コメヌカエキスを含有する化粧品よりも優れた美白作用を有する化粧品を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、かかる目的を達成するため、鋭意、研究を重ねた結果、メラニンを作るメラニン産生細胞を培養し、０．０１％濃度のコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを加えてみたところ、細胞生存率の低下は全くなく、シミのもとになるメラニンが約１６％に減少することを見出した。
【０００６】
本発明はかかる知見に基づくものであり、本発明の前記目的は、所定濃度のコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを含有した化粧品によって達成される。
【０００７】
本発明者の研究によれば、化粧品や医薬部外品の美白成分として、広く用いられている外原規コメヌカエキスと同濃度のコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスをメラニン産生細胞に添加した場合に、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスは、外原規コメヌカエキスに比して、高い美白効果を有することが確認されている。
【０００８】
また、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスをメラニン産生細胞に添加しても、メラニン産生細胞の生存率に変化がないことも見出されている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、外原規コメヌカエキスを含有する化粧品よりも優れた美白作用を有する化粧品を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の外観に対するコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの影響を示す顕微鏡写真である。
【図２】図２は、対照群と、濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群および濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群のメラニンを定量した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、対照群、濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群、濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群、濃度が４０μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群、濃度が６０μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群および濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群のメラニンを定量した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、対照群、濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群、濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群、濃度が４０μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群、濃度が６０μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群および濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群の細胞生存を示すグラフである。
【図５】図５は、対照群と、濃度が７０μｇ/mLとなるように、外原規コメヌカエキスをＢ１６マウスメラノーマ細胞に添加した群と、濃度が７０μｇ/mLとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスをＢ１６マウスメラノーマ細胞に添加した群のメラニンの定量結果を示すグラフである。
【図６】図６は、対照群におけるＢ１６マウスメラノーマ細胞の生存率と、外原規コメヌカエキスを添加した群におけるＢ１６マウスメラノーマ細胞の生存率と、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群および対照群におけるＢ１６マウスメラノーマ細胞の生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、化粧品に含有されているコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの濃度は２０μｇ／ｍＬを超えていることが必要である。
本発明において、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの濃度が３０μｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの濃度が４０μｇ／ｍＬ以上であるとさらに好ましい。
【００１２】
以下、本発明の効果をより一層明らかにするために、実施例を掲げる。
【実施例】
【００１３】
［試料の調製］
コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの調製
コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの抽出は、日本分光株式会社製の超臨界システムを用いて行った。
【００１４】
つけもと株式会社製のコメヌカ（炒り糠）の粉末を適量、超臨界システムの抽出容器に詰め、ＣＯ２の流速を３．０ｍＬ／分、圧力を２０ＭＰａ、温度を４０℃に設定して、超臨界ＣＯ２を処理し、排出されたエキスを常温常圧下で回収した。
【００１５】
こうして得られたコメヌカエキスを和光純薬株式会社製のエタノールで１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、ろ過滅菌して、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを作製した。
【００１６】
得られた濃度１０ｍｇ／ｍＬのコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスをエタノールで所定濃度になるように、希釈し、実験に供した。
【００１７】
外原規コメヌカエキスの調製
外原規コメヌカエキスとして、一丸ファルコス株式会社製の「ファルコレックス  コメヌカＢＫ」を濾過滅菌して、外原規コメヌカエキスを作製した。
【００１８】
［メラニン産生細胞の培養］
実験には、美白物質の選別試験に汎用される代表的なメラニン産生細胞の１つであるＢ１６マウスメラノーマ細胞を使用した。
【００１９】
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞としては国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所JCRB細胞バンクより購入した。
【００２０】
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞は、ＣＯ２濃度が５％で、３７℃の環境下にて、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ；Biological Industries, CT）を含有するEagle’s MEM（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社, MO）を培地とし、２５ｃｍ２フラスコ中で培養した。
【００２１】
［Ｂ１６マウスメラノーマ細胞への試料の添加］
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞がコンフレントになる前に０．２５％トリプシンと１ｍＭの ＥＤＴＡ（和光純薬工業株式会社製）との混液を用いて、２５ｃｍ２フラスコから剥離し、６穴培養プレートに２．４×１０５cells/wellの密度で播種した。
【００２２】
播種の翌日に、１０％ＦＢＳ含有培地に、細胞のメラニン産生を刺激する作用があることが知られている３−イソブチルー１−メチルキサンチン（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）（和光純薬工業株式会社製「ＩＢＭＸ」）を１００μＭの濃度で加えた。
【００２３】
対照群の細胞には、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスも、外原規コメヌカエキスも添加せず、１００μＭのＩＢＭＸのみを加えた１０％ＦＢＳ含有培地を２mL/well供した。
【００２４】
無刺激群の細胞には、ＩＢＭＸを加えていない１０％ＦＢＳ含有培地を２mL/well供した。
【００２５】
［Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の撮影］
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞へ試料を添加してから、３日後に、各wellの細胞を顕微鏡下にて撮影した。このとき、メラニンの色を識別しやすいよう、位相差は外して撮影した。
【００２６】
［メラニンの定量］
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の撮影直後、各wellの細胞を２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（和光純薬工業株式会社製「ＰＢＳ」）で1回洗い、１ＭのNaOHを２５０μＬ／well加えて溶解した。溶出したメラニンをピペッティングにより均一にしてから、各well から１１５μＬを採って、９６穴プレートに移した。
【００２７】
これに先立って、標準メラニン（和光純薬工業株式会社製）を１ＭのNaOHに１００μｇ／ｍＬの濃度で溶解し、検量線用として１ＭのNaOHで、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬおよび４０μｇ／ｍＬに希釈した液を、上記９６穴プレートに移した。この９６穴プレート上の各液につき、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。この際、バックグラウンドを消去するため、６３０ｎｍの吸光度を差し引くように設定した。
【００２８】
各群のメラニン量は下記の式によって、対照群を１００％としたときの割合で表わした。
メラニン量の割合（％）＝〔（試料添加細胞の個別の値−無刺激群の平均値）／（対照群の平均値−無刺激群の平均値）〕×１００
【００２９】
［細胞生存率の測定］
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を９６穴培養プレートに、６穴培養プレートに播種したときと同じ密度になるよう、８×１０３cells/wellで播種した。
【００３０】
播種の翌日、１０％ＦＢＳ含有培地にＩＢＭＸを１００μＭの濃度で加えた。
【００３１】
この培地に各試料を試験する濃度となるように添加し、細胞に２００μＬ/well供した（ｎ＝３）。
【００３２】
一方、対照群の細胞には、試料を添加せず、１００μＭの濃度のＩＢＭＸのみを加えた１０％ＦＢＳ含有培地を２００μＬ/well供した。
【００３３】
その３日後、各wellの細胞をＰＢＳで1回洗い、株式会社  同仁化学研究所製の０．０５％の3−(4, 5−ジメチル−2−チアゾリル)−2, 5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（3−(4, 5−Dimethyl−2−thiazolyl) −2, 5−diphenyl−2H−tetrazolium Bromide）を混合した１０％ＦＢＳ含有培地を１００μＬ/well加え、ＣＯ２濃度５％、３７℃の環境下で、２時間にわたり培養した。
【００３４】
培養終了後、各wellの細胞を２００μＬのＰＢＳで１回洗い、形成されたホルマザンを１００μＬ/wellのDimethyl sulfoxide（和光純薬工業株式会社製「ＤＭＳＯ」）により溶解した。
【００３５】
溶媒のみの測定値を他の試料の測定値から差し引くためのブランクとしてＤＭＳＯを１００μＬ入れたwellを設けた。
【００３６】
９６穴プレート上の各液につき、マイクロプレートリーダーで５４５ｎｍの吸光度を測定した。バックグラウンドを消去するため、６３０ｎｍの吸光度を差し引くよう設定した。
【００３７】
「各wellの細胞生存率は下記の式により、対照群を１００％としたときの割合で表した。
細胞生存率（％）＝（試料添加細胞の個別の値／対照群の平均値）×１００
【００３８】
［統計処理］
測定値はt-検定により、対照群と各試料添加群の間または各群間での有意差の有無を確認した。
【００３９】
実施例１（コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスのメラニン産生抑制効果）
濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを、１００μＭのＩＢＭＸと同時に、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞に添加するとともに、濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを、１００μＭのＩＢＭＸと同時に、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞に添加した。
【００４０】
試料の添加から３日経過後に、細胞を顕微鏡で観察した。観察結果は、図１に示されている。
【００４１】
図１に示されるように、ＩＢＭＸを添加していない無刺激群では透明な細胞が多数を占めていたのに対し、１００μＭのＩＢＭＸを添加したが、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加していない対照群では、黒色の細胞が明らかに増えていることが観察された。
【００４２】
一方、濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群においては、対照群と差異は認められなかったが、濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群にあっては、対照群に比べ明らかに黒色の細胞が減少していた。
【００４３】
顕微鏡観察の後、各群のメラニンを定量した結果が図２に示されている。
【００４４】
図２においては、対照群のメラニン量を１００％としたときの各群のメラニン量が示されている。
【００４５】
図２に示されているように、濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群と対照群とのメラニン量に有意差は認められなかったが、濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群のメラニン量は対照群の１１．８％であり、有意に、かつ極めて顕著に減少していることが認められた。
【００４６】
これらの結果から、濃度が１０μｇ／ｍＬのコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスは、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞のメラニン産生にほとんど影響を与えないが、濃度が１００μｇ／ｍＬのコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスでは、メラニンの産生を非常に強く抑制する効果を持っていることが判明した。
【００４７】
実施例２（コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの濃度ごとのメラニン産生抑制効果）
実施例１にから、濃度が１０μｇ／ｍＬ以下のコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスはメラニン産生を抑制する効果はほとんどなく、一方、濃度が１００μｇ／ｍＬのコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスはメラニン産生を顕著に低下させることが判明した。
【００４８】
そこで、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの濃度と、メラニン産生抑制効果との関係を調べた。
【００４９】
濃度が１００μMのＩＢＭＸと同時に、濃度が２０μｇ/mLとなるように、濃度が４０μｇ/mLとなるように、濃度が６０μｇ/mLとなるように、濃度が１００μｇ/mLとなるように、それぞれ、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスをＢ１６マウスメラノーマ細胞に添加した。
【００５０】
コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの添加から３日が経過後に、各群のメラニンを定量した。
定量結果は図３に示されている。
【００５１】
図３においては、対照群のメラニン量を１００％としたときの各群のメラニン量が示されている。
【００５２】
濃度が２０μｇ/mLとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスをＢ１６マウスメラノーマ細胞に添加した群では、メラニン量は２９．８％であったが、対照群との間の差は危険率５％未満という有意水準を満たさなかった（p=0.0516）。
【００５３】
濃度が４０μｇ/mL以上になるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスをＢ１６マウスメラノーマ細胞に添加した群では、いずれも、対照群に対して有意にメラニン量が減少していた。
【００５４】
この結果から、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスのＢ１６マウスメラノーマ細胞のメラニン産生を低下させる最小濃度は、２０μg/mLと４０μg/mLの間、約３０μg/mLであることが明らかになった。
【００５５】
図４には、それぞれの群における細胞死亡率が示されている。
【００５６】
図４に示されるように、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の生存率は、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの添加濃度が１０μｇ/mLから１００μg/mLのいずれの群においても、対照群と同等であった。
【００５７】
この実験結果から、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの添加によるメラニン産生抑制効果が、細胞毒性によるものではないことが判明した。
【００５８】
実施例３（外原規コメヌカエキスとコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスのメラニン産生抑制効果の比較）
美白作用があり、化粧品や医薬部外品の原料として、広く用いられている外原規コメヌカエキスのメラニン産生抑制効果と、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスのメラニン産生抑制効果とを対比した。
【００５９】
濃度が１００μMのＩＢＭＸと同時に、濃度が７０μｇ/mLとなるように、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスをＢ１６マウスメラノーマ細胞に添加するとともに、濃度が７０μｇ/mLとなるように、外原規コメヌカエキスをＢ１６マウスメラノーマ細胞に添加した。
【００６０】
ここに、外原規コメヌカエキスとして、５０％の1, 3−ブチレングリコール（BG）水溶液が溶媒となっているものを用いたので、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキス添加した群と対照群の細胞にも同じ濃度になるようコメヌカ超臨界ＣＯ２エキス添加群と対照群の細胞にも同じ濃度になるように、1, 3−ブチレングリコール（BG）を別途添加した。
【００６１】
添加から３日経過後、各群のメラニンを定量した。定量結果は図５に示されている。
【００６２】
図５に示されるように、外原規コメヌカエキスを添加した群およびコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群のメラニン量は対照群のメラニン量に対して、いずれも有意に減少していた。
【００６３】
対照群のメラニン量を１００％としたとき、外原規コメヌカエキスを添加した群のメラニン量は５０．７％であったのに対し、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキス添加した群は３２．４％まで減少しており、外原規コメヌカエキスを添加した群とコメヌカ超臨界ＣＯ２エキス添加した群との間のメラニン量の差は有意であった。
【００６４】
外原規コメヌカエキスは美白作用があるとして広く知られているが、この実験結果から、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞のメラニン産生を低下させる効果は、外原規コメヌカエキスよりもコメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの方が高く、より高い美白効果が期待することができることが判明した。
【００６５】
図６は、外原規コメヌカエキスを添加した群、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群および対照群におけるＢ１６マウスメラノーマ細胞の生存率を示すものである。
【００６６】
図６に示されるように、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の生存率は、外原規コメヌカエキスを添加した群と、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスを添加した群と、対照群との間に有意差はなかった。
【００６７】
このことは、外原規コメヌカエキスの添加によるメラニン産生抑制効果と、コメヌカ超臨界ＣＯ２エキスの添加によるメラニン産生抑制効果が、細胞毒性によるものではないことを示している。
【００６８】
本発明は、以上の実施態様、実施例に限定されることなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内で種々の変更が可能であり、それらも本発明の範囲内に包含されるものであることはいうまでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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