(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ＶＥＧＦ／ＤＬＬ４二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびこれらの使用の提供。【解決手段】ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含むポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１ではなく、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、該結合タンパク質は、ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合する。また、該結合タンパク質は、癌、腫瘍および／または異常なＤＬＬ４および／もしくはＶＥＧＦ発現または活性によって特徴付けられる他の血管新生依存性疾患の診断、監視、阻害、予防および／または処置において使用される。【選択図】図１
2019202994.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含むポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１ではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１であり、
結合タンパク質が、ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合し、ＶＤ１およびＶＤ２が、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３からの３つのＣＤＲを独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２の少なくとも１つが、配列番号３９からの３つのＣＤＲを含む結合タンパク質。
【請求項２】
ＶＤ１およびＶＤ２が、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３を独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２の少なくとも１つが配列番号３９を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含むポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１またはＣＬではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
ｎは、０または１であり、
結合タンパク質が、ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合し、ＶＤ１およびＶＤ２が、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２または５４からの３つのＣＤＲを独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２の少なくとも１つが、配列番号４０からの３つのＣＤＲを含む結合タンパク質。
【請求項４】
ＶＤ１およびＶＤ２が、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２または５４を独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２の少なくとも１つが配列番号４０を含む、請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
重鎖および／もしくは軽鎖上の（Ｘ１）ｎが（Ｘ１）０であり、ならびに／または重鎖および／もしくは軽鎖上の（Ｘ２）ｎが（Ｘ２）０である、請求項１または３に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、第一のポリペプチド鎖が、第一のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、
ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ２ではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１であり、
第二のポリペプチド鎖が、第二のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、
ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１またはＣＬではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
ｎは、０または１であり、
結合タンパク質が、ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合し、ＶＤ１およびＶＤ２重鎖可変ドメインが、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３からの３つのＣＤＲを独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２重鎖可変ドメインの少なくとも１つが、配列番号３９からの３つのＣＤＲを含み、ＶＤ１およびＶＤ２軽鎖可変ドメインは、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２または５４からの３つのＣＤＲを独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２軽鎖可変ドメインの少なくとも１つが、配列番号４０からの３つのＣＤＲを含む結合タンパク質。
【請求項７】
ＶＤ１およびＶＤ２重鎖可変ドメインが、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３を独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２重鎖可変ドメインの少なくとも１つが、配列番号３９を含み、ＶＤ１およびＶＤ２軽鎖可変ドメインが、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２または５４を独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２軽鎖可変ドメインの少なくとも１つが、配列番号４０を含む、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
Ｘ１が、配列番号１−３８のいずれか１つまたはＧ／Ｓベースの配列を含む、請求項１、３または６に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
結合タンパク質が、２つの第一のポリペプチド鎖と２つの第二のポリペプチド鎖を含む、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
Ｆｃ領域が、可変配列Ｆｃ領域である、請求項１、３または６に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ由来のＦｃ領域である、請求項１、３または６に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
第一のポリペプチド鎖のＶＤ１と第二のポリペプチド鎖のＶＤ１が、それぞれ、異なる第一および第二の親抗体またはこれらの結合部分由来である、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
第一のポリペプチド鎖のＶＤ２と第二のポリペプチド鎖のＶＤ２が、それぞれ、異なる第一および第二の親抗体またはこれらの結合部分由来である、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
第一および第二の親抗体が、同一の標的または異なる標的上の異なるエピトープに結合する、請求項１２または１３に記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
第一の親抗体またはその結合部分が、第二の親抗体またはその結合部分が第二の標的に結合する効力とは異なる効力で第一の標的に結合する、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
第一の親抗体またはその結合部分が、第二の親抗体またはその結合部分が第二の標的に結合する親和性とは異なる親和性で第一の標的に結合する、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、２つのポリペプチド鎖が、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、
ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１ではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１であり、
２つのポリペプチド鎖が、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、
ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１またはＣＬではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
ｎは、０または１であり、
結合タンパク質が、ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合し、ＶＤ１およびＶＤ２重鎖可変ドメインが、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３からの３つのＣＤＲを独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２重鎖可変ドメインの少なくとも１つが、配列番号３９からの３つのＣＤＲを含み、ＶＤ１およびＶＤ２軽鎖可変ドメインが、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２または５４からの３つのＣＤＲを独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２軽鎖可変ドメインの少なくとも１つが、配列番号４０からの３つのＣＤＲを含む結合タンパク質。
【請求項１８】
ＶＤ１およびＶＤ２重鎖可変ドメインが、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３を独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２重鎖可変ドメインの少なくとも１つが、配列番号３９を含み、ＶＤ１およびＶＤ２軽鎖可変ドメインが、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２または５４を独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２軽鎖可変ドメインの少なくとも１つが、配列番号４０を含む、請求項１７に記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１；または少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１のＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４に対する結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する、請求項１、３、６または１７に記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約１０−２ｓ−１；最大約１０−３ｓ−１；最大約１０−４ｓ−１；最大約１０−５ｓ−１；または最大約１０−６ｓ−１のＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４に対する解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する、請求項１、３、６または１７に記載の結合タンパク質。
【請求項２１】
表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約１０−７Ｍ；最大約１０−８Ｍ；最大約１０−９Ｍ；最大約１０−１０Ｍ；最大約１０−１１Ｍ；または最大約１０−１２ＭのＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４に対する平衡解離定数（ＫＤ）を有する、請求項１、３、６または１７に記載の結合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１、３、６または１７に記載の結合タンパク質を含む結合タンパク質コンジュゲートであって、結合タンパク質コンジュゲートが薬剤をさらに含み、薬剤が、免疫接着分子、造影剤、治療剤または細胞毒性剤である結合タンパク質コンジュゲート。
【請求項２３】
造影剤が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識またはビオチンである、請求項２２に記載の結合タンパク質コンジュゲート。
【請求項２４】
結合タンパク質が、結晶化された結合タンパク質である、請求項１、３、６または１７に記載の結合タンパク質。
【請求項２５】
請求項１、３、６、１７または２２に記載の結合タンパク質アミノ酸配列をコードする単離された核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項２７】
ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶ、ｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯ、ｐＥＦ６  ＴＯＰＯ、ｐＨｙｂＥ、ｐＢＯＳまたはｐＢＪである、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
宿主細胞が、原核細胞である、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
宿主細胞が、真核細胞である、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
真核細胞が、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞または真菌細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の宿主細胞を培地中で培養することを含む、結合タンパク質を産生する方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法によって産生されるタンパク質。
【請求項３４】
請求項１、３、６、１７、２２または３３のいずれか一項に記載の結合タンパク質および医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３５】
少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
追加の薬剤が、免疫接着分子、造影剤、治療剤、細胞毒性剤、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、ビオチン、代謝抑制剤、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、トキシンまたはアポトーシス剤、化学療法剤；造影剤、血管新生阻害剤、共刺激阻害剤、キナーゼ阻害剤（限定されないが、ＫＤＲおよびＴＩＥ−２阻害剤を含む。）、共刺激分子調節剤（限定されないが、抗Ｂ７．１、抗Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ２０を含む。）、接着分子遮断剤（限定されないが、抗ＬＦＡ−１抗体、抗Ｅ／Ｌセレクチン抗体、小分子阻害剤を含む。）、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ；抗ＤＬＬ４  ｍＡｂ；抗サイトカイン抗体またはその機能的断片（限定されないが、抗ＩＬ−１８、抗ＴＮＦまたは抗ＩＬ−６／サイトカイン受容体抗体を含む。）、メトトレキサート、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、検出可能な標識またはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋肉遮断剤、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化剤、イムノグロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン置換薬、放射性医薬、抗うつ剤、抗精神病薬、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、エピネフリンまたは類似体、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗高血圧薬、利尿薬、アドレナリン受容体アンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬、レニン阻害剤、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、血管拡張剤、アルファ−２アゴニスト、クロニジン、メチルドーパ、ヒドララジン、プラゾシン、レセルピン、モキソニジン、グアンファシン、ペリンドプリル／インダパミド、ロフェキシジン、メチロシン、抗凝固薬、ワーファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ダルテパリン、アルガトロバン、ビバリルジン、レピルジンおよびデキストロースの少なくとも１つを含む、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
追加の薬剤が、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸；２−ＣｄＡ；２−クロロデオキシアデノシン；５−アザシチジン；５−フルオロウラシル；５−ＦＵ；６−メルカプトプリン；６−ＭＰ；６−ＴＧ；６−チオグアニン；アブラキサン；抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ；抗ＤＬＬ４  ｍＡｂ；Ａｃｃｕｔａｎｅ（Ｒ）；アクチノマイシン−Ｄ；Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ａｄｒｕｃｉｌ（Ｒ）；Ａｆｉｎｉｔｏｒ（Ｒ）；Ａｇｒｙｌｉｎ（Ｒ）；Ａｌａ−Ｃｏｒｔ（Ｒ）；アルデスロイキン；アレムツズマブ；ＡＬＩＭＴＡ；アリトレチノイン；Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ（Ｒ）；Ａｌｋｅｒａｎ（Ｒ）；オールトランスレチノイン酸；アルファインターフェロン；アルトレタミン；アメトプテリン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アナグレリド；Ａｎａｎｄｒｏｎ（Ｒ）；アナストロゾール；アラビノシルシトシン；Ａｒａ−Ｃ  Ａｒａｎｅｓｐ（Ｒ）；Ａｒｅｄｉａ（Ｒ）；Ａｒｉｍｉｄｅｘ（Ｒ）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（Ｒ）；Ａｒｒａｎｏｎ（Ｒ）；三酸化ヒ素；Ａｒｚｅｒｒａ（ＴＭ）；アスパラギナーゼ；ＡＴＲＡ；Ａｖａｓｔｉｎ（Ｒ）；アザシチジン；ＢＣＧ；ＢＣＮＵ；ベンダムスチン；ベバシズマブ；ベキサロテン；ＢＥＸＸＡＲ（Ｒ）；ビカルタミド；ＢｉＣＮＵ；Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（Ｒ）；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブスルファン；Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（Ｒ）；Ｃ２２５；カルシウムロイコボリン；Ｃａｍｐａｔｈ（Ｒ）；Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（Ｒ）；カンプトセシン−１１；カペシタビン；ＣａｒａｃＴＭ）；カルボプラチン；カルムスチン；カルムスチンウエハー；Ｃａｓｏｄｅｘ（Ｒ）；ＣＣ−５０１３；ＣＣＩ−７７９；ＣＣＮＵ；ＣＤＤＰ；ＣｅｅＮＵ；Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（Ｒ）；セツキシマブ；クロラムブシル；シスプラチン；シトロボラム因子；クラドリビン；コルチゾン；Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（Ｒ）；ＣＰＴ−１１；シクロホスファミド；Ｃｙｔａｄｒｅｎ（Ｒ）；シタラビン；シタラビンリポゾーマル；Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（Ｒ）；Ｃｙｔｏｘａｎ（Ｒ）；ダカルバジン；ダコゲン；ダクチノマイシン；ダルベポエチンアルファ；ダサチニブ；ダウノマイシン；ダウノルビシン；塩酸ダウノルビシン；ダウノルビシンリポゾーマル；ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（Ｒ）；デカドロン；デシタビン；Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｆ（Ｒ）；Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（Ｒ）；デニロイキン；ジフチトクス；ＤｅｐｏＣｙｔ（ＴＭ）；デキサメタゾン；酢酸デキサメタゾン；リン酸デキサメタゾンナトリウム；デキサゾン；デクスラゾキサン；ＤＨＡＤ；ＤＩＣ；ジオデックス；ドセタキセル；Ｄｏｘｉｌ（Ｒ）；ドキソルビシン；ドキソルビシンリポゾーマル；Ｄｒｏｘｉａ（ＴＭ）；ＤＴＩＣ；ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（Ｒ）；Ｄｕｒａｌｏｎｅ（Ｒ）；Ｅｆｕｄｅｘ（Ｒ）；Ｅｌｉｇａｒｄ（ＴＭ）；Ｅｌｌｅｎｃｅ（ＴＭ）；Ｅｌｏｘａｔｉｎ（ＴＭ）；Ｅｌｓｐａｒ（Ｒ）；Ｅｍｃｙｔ（Ｒ）；エナラプリル；エピルビシン；エポエチンアルファ；エルビタックス；エルロチニブ；エルウィニア  Ｌ−アスパラギナーゼ；エストラムスチン；エチオール；Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（Ｒ）；エトポシド；リン酸エトポシド；Ｅｕｌｅｘｉｎ（Ｒ）；エベロリムス；Ｅｖｉｓｔａ（Ｒ）；エキセメスタン；Ｆａｒｅｓｔ���ｎ（Ｒ）；Ｆａｓｌｏｄｅｘ（Ｒ）；Ｆｅｍａｒａ（Ｒ）；フィルグラスチム；フロクスウリジン；Ｆｌｕｄａｒａ（Ｒ）；フルダラビン；Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（Ｒ）；フルオロウラシル；フルオロウラシル（クリーム）；フルオキシムエステロン；フルタミド；フォリン酸；ＦＵＤＲ（Ｒ）；フルベストラント；ゲフィチニブ；ゲムシタビン；ゲムツズマブオゾガマイシン；ジェムザール；Ｇｌｅｅｖｅｃ（ＴＭ）；Ｇｌｉａｄｅｌ（Ｒ）ウエハー；ＧＭ−ＣＳＦ；ゴセレリン；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＭＣＳＦ）；Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ（Ｒ）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）；ヘキサドロール；Ｈｅｘａｌｅｎ（Ｒ）；ヘキサメチルメラミン；ＨＭＭ；Ｈｙｃａｍｔｉｎ（Ｒ）；Ｈｙｄｒｅａ（Ｒ）；Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ  Ａｃｅｔａｔｅ（Ｒ）；ヒドロコルチゾン；リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム；コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム；リン酸ハイドロコートン；ヒドロキシウレア；イブリツモマブ；イブリツモマブチウキセタン；Ｉｄａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｌｆｅｘ（Ｒ）；インターフェロン−アルファ；インターフェロン−アルファ−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）；イホスファミド；インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）；インターロイキン−２（ＩＬ−２）；メシル酸イマチニブ；イミダゾールカルボキサミド；Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（Ｒ）；Ｉｒｅｓｓａ（Ｒ）；イリノテカン；イソトレチノイン；イキサベピロン；Ｉｘｅｍｐｒａ（ＴＭ）；ＫＡＤＣＹＣＬＡ（Ｒ）；キドロラーゼ（ｔ）Ｌａｎａｃｏｒｔ（Ｒ）；ラパチニブ；Ｌ−アスパラギナーゼ；ＬＣＲ；レナリドミド；レトロゾール；ロイコボリン；リューケラン；Ｌｅｕｋｉｎ（ＴＭ）；ロイプロリド；ロイコクリスチン；Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（ＴＭ）；リポゾーマルＡｒａ−Ｃ；Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｅｄ（Ｒ）；ロムスチン；Ｌ−ＰＡＭ；Ｌ−サルコリジン；Ｌｕｐｒｏｎ（Ｒ）；Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（Ｒ）；Ｍａｔｕｌａｎｅ（Ｒ）；マキシデックス；メクロレタミン；塩酸メクロレタミン；Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ（Ｒ）；Ｍｅｄｒｏｌ（Ｒ）；Ｍｅｇａｃｅ（Ｒ）；メゲストロール；酢酸メゲストロール；メルファラン；メルカプトプリン；メスナ；Ｍｅｓｎｅｘ（ＴＭ）；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メチルプレドニゾロン；Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ（Ｒ）；マイトマイシン；マイトマイシン−Ｃ；ミトキサントロン  Ｍ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（Ｒ）；ＭＴＣ；ＭＴＸ；Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（Ｒ）；ムスチン；Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ｍｙｌｅｒａｎ（Ｒ）；Ｍｙｌｏｃｅｌ（ＴＭ）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（Ｒ）；Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（Ｒ）；ネララビン；Ｎｅｏｓａｒ（Ｒ）；Ｎｅｕｌａｓｔａ（ＴＭ）；Ｎｅｕｍｅｇａ（Ｒ）；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）；Ｎｅｘａｖａｒ（Ｒ）；ニフェジピン；Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（Ｒ）；ニロチニブ；ニルタミド；Ｎｉｐｅｎｔ（Ｒ）；Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｕｓｔａｒｄ  Ｎｏｖａｌｄｅｘ（Ｒ）；Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（Ｒ）；エヌプレート；オクトレオチド；酢酸オクトレオチド；オフタツムマブ；Ｏｎｃｏｓｐａｒ（Ｒ）；Ｏｎｃｏｖｉｎ（Ｒ）；Ｏｎｔａｋ（Ｒ）；Ｏｎｘａｌ（��Ｍ）；オプレルベキン；Ｏｒａｐｒｅｄ（Ｒ）；Ｏｒａｓｏｎｅ（Ｒ）；オキサリプラチン；パクリタキセル；タンパク質に結合したパクリタキセル；パミドロネート；パニツムマブ；Ｐａｎｒｅｔｉｎ（Ｒ）；Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（Ｒ）；パゾパニブ；Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ（Ｒ）；ＰＥＧインターフェロン；ペグアスパラガーゼ；ペグフィルグラスチム；ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（ＴＭ）；ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ；ＰＥＭＥＴＲＥＸＥＤ；ペントスタチン；フェニルアラニンマスタード；Ｐｌａｔｉｎｏｌ（Ｒ）；Ｐｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ（Ｒ）；プレドニゾロン；プレドニゾン；Ｐｒｅｌｏｎｅ（Ｒ）；プロカルバジン；ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ）；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｒ）；カルムスチンインプラントを伴うＰｒｏｌｉｆｅｐｒｏｓｐａｎ  ２０；Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（Ｒ）；ラロキシフェン；Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（Ｒ）；Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（Ｒ）；Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒ）；リツキシマブ；Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（Ｒ）；ロミプロスチム；Ｒｕｂｅｘ（Ｒ）；塩酸ルビドマイシン；Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ（Ｒ）；Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ  ＬＡＲ（Ｒ）；サーグラモスティム；Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ（Ｒ）；Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（Ｒ）；ソラフェニブ；ＳＰＲＹＣＥＬ（ＴＭ）；ＳＴＩ−５７１；ストレプトゾシン；ＳＵ１１２４８；スニチニブ；Ｓｕｔｅｎｔ（Ｒ）；Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  Ｔａｒｃｅｖａ（Ｒ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（Ｒ）；Ｔａｓｉｇｎａ（Ｒ）；Ｔａｘｏｌ（Ｒ）；Ｔａｘｏｔｅｒｅ（Ｒ）；Ｔｅｍｏｄａｒ（Ｒ）；テモゾロミド  テムシロリムス；テニポシド；ＴＥＳＰＡ；サリドマイド；Ｔｈａｌｏｍｉｄ（Ｒ）；ＴｈｅｒａＣｙｓ（Ｒ）；チオグアニン；Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ  Ｔａｂｌｏｉｄ（Ｒ）；チオホスファミド；Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（Ｒ）；チオテパ；ＴＩＣＥ（Ｒ）；Ｔｏｐｏｓａｒ（Ｒ）；トポテカン；トレミフェン；Ｔｏｒｉｓｅｌ（Ｒ）；トシツモマブ；トラスツズマブ；Ｔｒｅａｎｄａ（Ｒ）；トレチノイン；Ｔｒｅｘａｌｌ（ＴＭ）；Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（Ｒ）；ＴＳＰＡ；ＴＹＫＥＲＢ（Ｒ）；ＶＣＲ；Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（ＴＭ）；Ｖｅｌｂａｎ（Ｒ）；Ｖｅｌｃａｄｅ（Ｒ）；ＶｅＰｅｓｉｄ（Ｒ）；Ｖｅｓａｎｏｉｄ（ＴＭ）；Ｖｉａｄｕｒ（ＴＭ）；Ｖｉｄａｚａ（Ｒ）；ビンブラスチン；硫酸ビンブラスチン；Ｖｉｎｃａｓａｒ  Ｐｆｓ（Ｒ）；ビンクリスチン；ビノレルビン；酒石酸ビノレルビン；ＶＬＢ；ＶＭ−２６；ボリノスタット；ヴォトリエント；ＶＰ−１６；Ｖｕｍｏｎ（Ｒ）；Ｘｅｌｏｄａ（Ｒ）；Ｚａｎｏｓａｒ（Ｒ）；Ｚｅｖａｌｉｎ（ＴＭ）；Ｚｉｎｅｃａｒｄ（Ｒ）；Ｚｏｌａｄｅｘ（Ｒ）；ゾレドロン酸；ゾリンザ；またはＺｏｍｅｔａ（Ｒ）；ロイコボリン；５−ＦＵ；テモゾロミド；ゲムシタビン；パクリタキセル；レゴラフェニブ；およびペルツズマブの少なくとも１つを含む、請求項３５または３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
対象における疾患または障害を処置するための医薬の調製における、請求項１、３、６、１７、２２または３３に記載の結合タンパク質の使用。
【請求項３９】
疾患または障害が、原発性または転移性癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、尿路癌、腎臓癌、膀胱癌、尿路上皮癌、女性生殖管癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛癌、妊娠性絨毛性疾患、男性生殖管癌、前立腺癌、精嚢癌、精巣癌、生殖細胞腫瘍、内分泌腺癌、甲状腺癌、副腎癌、下垂体癌、皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、脳の腫瘍、神経の腫瘍、目の腫瘍、髄膜の腫瘍、星状細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、網膜芽腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経鞘腫、および髄膜腫、造血器悪性腫瘍から生じる固形腫瘍、白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、胃癌、膀胱癌、前立腺癌、直腸癌、造血器悪性腫瘍、無βリポタンパク質血症、先端チアノーゼ、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、結腸直腸癌、ヘアリー細胞白血病、悪性リンパ腫、悪性組織球増殖症、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、膵臓癌腫、腫瘍随伴症候群、悪性の高カルシウム血症、肉腫、固形腫瘍、黄斑変性症、１型糖尿病、糖尿病性網膜症、アテローム性動脈硬化症、または血管過剰増殖、浮腫または異常なＤＬＬ４もしくはＶＥＧＦ活性によって特徴付けられる任意の他の血管新生依存性または非依存性疾患である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
対象への投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、眼内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、結腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口内、舌下、鼻内または経皮である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４１】
ＶＥＧＦおよびＤＬＬ４またはその断片に結合し得る結合タンパク質を生成するための方法であって、
ａ）ＶＥＧＦおよびＤＬＬ４から選択される第一の標的に結合し得る、第一の親抗体またはその結合部分をコードする核酸を得る工程；
ｂ）ＶＥＧＦおよびＤＬＬ４から選択される第二の標的に結合し得る、第二の親抗体またはその結合部分をコードする核酸を得る工程；
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）の核酸を使用して、請求項１、３、６、１７、２２または３３のいずれか一項に記載のポリペプチド鎖をコードする核酸構築物を調製する工程；
ｄ）単離された宿主細胞中でポリペプチド鎖を発現させる工程
を含み、それにより、ＶＥＧＦおよびＤＬＬ４に結合し得る結合タンパク質を生成する方法。
【請求項４２】
請求項１、３、６、１７、２２または３３のいずれか一項に記載の結合タンパク質を生成する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｆｃ領域が、可変配列Ｆｃ領域である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ由来のＦｃ領域である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
第一の親抗体またはその結合部分が、第二の親抗体またはその結合部分が第二の標的に結合する親和性および／または効力とは異なる親和性および／または効力で第一の標的に結合する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
イムノアッセイによって試験試料中の少なくとも１つのＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片の存在を検出するための方法であって、
イムノアッセイが、試験試料を少なくとも１つの結合タンパク質および少なくとも１つの検出可能な標識に接触させることを含み、少なくとも１つの結合タンパク質が、請求項１、３、６、１７、２２または３３のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含む方法。
【請求項４７】
少なくとも１つ検出の可能な標識が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識またはビオチンを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも１つの検出可能な標識が、少なくとも１つの結合タンパク質上にある、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
（ｉ）第一の複合体を形成するために、試験試料を、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片上のエピトープに結合する少なくとも１つの結合タンパク質に接触させること；
（ｉｉ）第二の複合体を形成するために、第一の複合体を、結合タンパク質に結合し、または結合タンパク質が結合しない、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片上のエピトープに結合する少なくとも１つの検出可能な標識に接触させること；および
（ｉｉｉ）第二の複合体における検出可能な標識によって生じたシグナルに基づいて、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片の存在を検出すること
をさらに含み、ＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片の存在が、検出可能な標識によって生じたシグナルと直接的に相関する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
（ｉ）第一の複合体を形成するために、試験試料を、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片上のエピトープに結合する少なくとも１つの結合タンパク質に接触させること；
（ｉｉ）第二の複合体を形成するために、第一の複合体を、結合タンパク質への結合について、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片と競合する少なくとも１つの検出可能な標識に接触させること；および
（ｉｉｉ）第二の複合体における検出可能な標識によって生じたシグナルに基づいて、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片の存在を検出すること
をさらに含み、ＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片の存在が、検出可能な標識によって生じたシグナルと間接的に相関する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
試験試料が患者由来であり、方法が、患者を診断し、予後診断しまたは患者の治療的もしくは予防的処置の有効性を評価することをさらに含み、
方法が、患者の治療的または予防的処置の有効性を評価することをさらに含む場合、有効性を改善するために必要な、患者の治療的または予防的処置を改変することを場合によりさらに含む、請求項４６から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
方法が、自動化システムまたは半自動化システムにおける使用に適合される、請求項４６から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
方法が、試料中のＤＬＬ４とＶＥＧＦの両方の存在を検出する、請求項４６から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
イムノアッセイによって試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片の量または濃度を決定するための方法であって、イムノアッセイが、
（ａ）試験試料を、少なくとも１つの結合タンパク質および少なくとも１つの検出可能な標識に接触させること；ならびに
（ｂ）検出可能な標識によって生じたシグナルと、少なくとも１つの結合タンパク質および少なくとも１つの検出可能な標識と接触させた、既知の量もしくは濃度のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片を含む対照または較正物質によって生じたシグナルとを比較すること
を含み、較正物質は、場合により、一連の較正物質の一部であり、ここで、較正物質のそれぞれは、異なる量もしくは濃度のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片を有することによって、その一連の他の較正物質と異なっていて、
少なくとも１つの結合タンパク質は、請求項１、３、６、１７、２２または３３のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含む方法。
【請求項５５】
少なくとも１つの検出可能な標識が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識またはビオチンを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも１つの検出可能な標識が、少なくとも１つの結合タンパク質上にある、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
（ｉ）第一の複合体を形成するために、試験試料を、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片上のエピトープに結合する少なくとも１つの結合タンパク質に接触させること；
（ｉｉ）第二の複合体を形成するために、第一の複合体を、結合タンパク質が結合しない、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片上のエピトープに結合する少なくとも１つの検出可能な標識に接触させること；および
（ｉｉｉ）第二の複合体における検出可能な標識によって生じたシグナルに基づいて、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片の量または濃度を決定すること
をさらに含み、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片の量または濃度が、検出可能な標識によって生じたシグナルと直接的に比例する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
（ｉ）第一の複合体を形成するために、試験試料を、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片上のエピトープに結合する少なくとも１つの結合タンパク質に接触させること；
（ｉｉ）第二の複合体を形成するために、第一の複合体を、結合タンパク質への結合について、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片と競合する少なくとも１つの検出可能な標識に接触させること；および
（ｉｉｉ）第二の複合体における検出可能な標識によって生じたシグナルに基づいて、試験試料中のＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片の量または濃度を決定すること
をさらに含み、ＶＥＧＦもしくはＤＬＬ４またはその断片の存在が、検出可能な標識によって生じたシグナルと間接的に比例する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
試験試料が患者由来であり、方法が、患者を診断し、予後診断しまたは患者の治療的もしくは予防的処置の有効性を評価することをさらに含み、
方法が、患者の治療的または予防的処置の有効性を評価することをさらに含む場合、方法は、有効性を改善するために必要な、患者の治療的または予防的処置を改変することを場合によりさらに含む、請求項５４から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
方法が、自動化システムまたは半自動化システムにおける使用に適合される、請求項５４から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
方法が、試料中のＤＬＬ４とＶＥＧＦの量または濃度を決定する、請求項５４から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
ＤＬＬ４、ＶＥＧＦもしくはこれらの両方の存在、量または濃度について試験試料をアッセイする際に使用するためのキットであって、
（ａ）ＶＥＧＦおよび／もしくはＤＬＬ４またはその断片について試験試料をアッセイするための取扱説明書；ならびに
（ｂ）請求項１、３、６、１７、２２または３３のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含む少なくとも１つの結合タンパク質
を含むキット。
【請求項６３】
配列番号５５から６３および７４から選択されるＶＨ配列を含む結合タンパク質。
【請求項６４】
配列番号６４−７３から選択されるＶＬ配列を含む結合タンパク質。
【請求項６５】
配列番号５５−６３および７４から選択されるＶＨ配列と配列番号６４−７３から選択されるＶＬ配列を含む結合タンパク質。
【請求項６６】
ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含むポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１ではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１であり、
結合タンパク質が、ＶＥＧＦとＤＬＬ４に結合し、さらに、結合タンパク質が、
（ａ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約５．４２×１０−５ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）および／もしくは最大約７．４０×１０−９Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＶＥＧＦ；または
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約２．６３×１０−３ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）および／もしくは最大約３．４０×１０−８Ｍもしくは５．００×１０−８Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＤＬＬ４
に結合する結合タンパク質。
【請求項６７】
ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含むポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１ではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
ｎは、０または１であり、
結合タンパク質が、ＶＥＧＦとＤＬＬ４に結合し、さらに、結合タンパク質が、
（ａ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約５．４２×１０−５ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）および／もしくは最大約７．４０×１０−９Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＶＥＧＦ；または
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約２．６３×１０−３ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）および／もしくは最大約３．４０×１０−８Ｍもしくは５．００×１０−８Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＤＬＬ４
に結合する結合タンパク質。
【請求項６８】
第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、第一のポリペプチド鎖が、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、
ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１ではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１であり、
第二のポリペプチド鎖が、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、
ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１ではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
ｎは、０または１であり、
結合タンパク質が、ＶＥＧＦとＤＬＬ４に結合し、さらに、結合タンパク質が、
（ａ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約５．４２×１０−５ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）および／もしくは最大約７．４０×１０−９Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＶＥＧＦ；または
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約２．６３×１０−３ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）および／もしくは最大約３．４０×１０−８Ｍもしくは５．００×１０−８Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＤＬＬ４
に結合する結合タンパク質。
【請求項６９】
４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、２つのポリペプチド鎖が、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、
ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１ではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１であり、
２つのポリペプチド鎖が、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、
ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１ではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
ｎは、０または１であり、
結合タンパク質が、ＶＥＧＦとＤＬＬ４に結合し、さらに、結合タンパク質が、
（ａ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約５．４２×１０−５ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）および／もしくは最大約７．４０×１０−９Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＶＥＧＦ；または
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約２．６３×１０−３ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）および／もしくは最大約３．４０×１０−８Ｍもしくは５．００×１０−８Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＤＬＬ４
に結合する結合タンパク質。
【請求項７０】
４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、２つのポリペプチド鎖が、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、
ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１ではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１であり、
２つのポリペプチド鎖が、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、
ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１ではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
ｎは、０または１であり、
（ｉ）結合タンパク質が、ＶＥＧＦとＤＬＬ４に結合し、
（ｉｉ）ＶＤ１およびＶＤ２重鎖可変ドメインが、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１もしくは５３からの３つのＣＤＲを独立して含み、ＶＤ１および／もしくはＶＤ２重鎖可変領域の少なくとも１つが、配列番号３９からの３つのＣＤＲを含み、ならびに／またはＶＤ１およびＶＤ２軽鎖可変ドメインが、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および５４からの３つのＣＤＲを独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２軽鎖可変領域の少なくとも１つが、配列番号４０からの３つのＣＤＲを含み、
（ｉｉｉ）結合タンパク質が、
（ａ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約５．４２×１０−５ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）および／もしくは最大約７．４０×１０−９Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＶＥＧＦ；または
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約２．６３×１０−３ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）および／もしくは最大約３．４０×１０−８Ｍもしくは５．００×１０−８Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＤＬＬ４
に結合する結合タンパク質。
【請求項７１】
結合タンパク質がＶＥＧＦとＤＬＬ４に結合し、重鎖可変ドメインが配列番号５５−６３および７４を含む、請求項６６から７０に記載の結合タンパク質。
【請求項７２】
結合タンパク質がＶＥＧＦとＤＬＬ４に結合し、軽鎖可変ドメインが配列番号６４−７３を含む、請求項６６から７０に記載の結合タンパク質。
【請求項７３】
結合タンパク質がＶＥＧＦとＤＬＬ４に結合し、重鎖可変ドメインが配列番号５５−６３および７４を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号６４−７３を含む、請求項６６から７０に記載の結合タンパク質。
【請求項７４】
（Ｘ１）ｎが配列番号１−３８から選択される、請求項１、３、６、１７、２２、３３または６６から７０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項７５】
ＶＤ１重鎖可変ドメインとＶＤ１軽鎖可変ドメインが、存在する場合、および／またはＶＤ２重鎖可変ドメインとＶＤ２軽鎖可変ドメインが、存在する場合、それぞれ配列番号３９と４０からの３つのＣＤＲを含む、請求項１、３、６、１７、２２、３３または６６から７０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項７６】
ｈ１Ａ１１．１−Ｌ−ＡＶ（配列番号５５と６４を含む。）；ｈ１Ａ１１．１−Ｓ−ＡＶ（配列番号５６と６５を含む。）；ｈ１Ａ１１．１−ＧＳ１０−ＡＶ（配列番号５７と６６を含む。）；ｈ１Ａ１１．１−ＧＳ１４−ＡＶ（配列番号５８と６７を含む。）；ＡＶ−Ｌ−ｈ１Ａ１１．１（配列番号５９と６８を含む。）；ＡＶ−Ｓ−ｈ１Ａ１１．１（配列番号６０と６９を含む。）；ＡＶ−ＧＳ６−ｈ１Ａ１１．１（配列番号６１と７０を含む。）；ＡＶ−ＧＳ１０−ｈ１Ａ１１．１（配列番号６２と７１を含む。）；ＡＶ−ＧＳ１４−ｈ１Ａ１１．１（配列番号６３と７２を含む。）；またはｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ（配列番号７３と７４を含む。）である、請求項１、３、６、１７、２２、３３または６６から７０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項７７】
結合タンパク質は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）アッセイにおいてＥＣ５０が最大約５．０４ｎＭで、ＤＬＬ４発現細胞に結合する、請求項１、３、６、１７、２２、３３、６６から７０または７６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項７８】
結合タンパク質は、ＤＬＬ４のＮｏｔｃｈ競合ＥＬＩＳＡアッセイまたは競合ＦＡＣＳアッセイにおいてＩＣ５０が最大約３５０３ｎＭで、Ｎｏｔｃｈ１への結合に干渉する、請求項１、３、６、１７、２２、３３、６６から７０または７６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項７９】
結合タンパク質は、ＮｏｔｃｈレポーターアッセイにおいてＩＣ５０が最大約７．４７ｎＭで、Ｎｏｔｃｈ１活性化を妨げる、請求項１、３、６、１７、２２、３３、６６から７０または７６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項８０】
結合タンパク質は、捕捉ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＥＣ５０が最大約２．５０ｎＭで、ＶＥＧＦに結合する、請求項１、３、６、１７、２２、３３、６６から７０または７６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項８１】
結合タンパク質は、ＶＥＧＦ競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＩＣ５０が最大約３７．２ｎＭで、細胞生存／増殖に干渉する、請求項１、３、６、１７、２２、３３、６６から７０または７６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項８２】
結合タンパク質は、ＶＥＧＦの内皮細胞増殖アッセイにおいてＩＣ５０が最大約４．２ｎＭで、ＶＥＧＦＲへの結合に干渉する、請求項１、３、６、１７、２２、３３、６６から７０または７６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項８３】
結合タンパク質で処置されていないマウスと比較して、雌性マウスにおけるＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌腫瘍異種移植片のサイズを少なくとも約４７％減少させ、腫瘍増殖を少なくとも約４２％遅延させる、請求項１、３、６、１７、２２、３３、６６から７０または７６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項８４】
結合タンパク質で処置されていないマウスと比較して、雌性マウスにおけるＵ８７−ＭＧ膠芽細胞腫腫瘍異種移植片のサイズを少なくとも約６４％減少させ、腫瘍増殖を少なくとも約４８％遅延させる、請求項１、３、６、１７、２２、３３、６６から７０または７６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項８５】
テモゾロミドと組み合わせて、結合タンパク質で処置されていないマウスと比較して、雌性マウスにおけるＵ８７−ＭＧ膠芽細胞腫腫瘍異種移植片のサイズを少なくとも約６５％減少させ、腫瘍増殖を少なくとも約４５％遅延させる、請求項１、３、６、１７、２２、３３、６６から７０または７６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項８６】
配列番号７３と７４を含む結合タンパク質。
【請求項８７】
Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１  ＬＡＬＡ変異体由来のＦｃ領域である、請求項１、３、６または１０に記載の結合タンパク質。
【請求項８８】
１つ以上のアミノ酸、
１つ以上の多糖および／またはポリソルベート、ならびに
約０．１−１００ｍｇ／ｍｌ濃度の結合タンパク質
を含む医薬組成物であって、
医薬組成物のｐＨが約５．０−７．０であり、
結合タンパク質が、それぞれ独立してＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む第一および第二のポリペプチド鎖を含み、
ＶＤ１は、第一の可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の可変ドメインであり、
Ｃは、定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１であり、
第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインが、第一の機能的標的結合部位を形成し、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインが、第二の機能的標的結合部位を形成し、結合タンパク質がＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合することができる医薬組成物。
【請求項８９】
少なくとも１つのアミノ酸が、ヒスチジンであり、約１０−２０ｍＭまたは約１５ｍＭの濃度で存在する、請求項８８に記載の医薬組成物。
【請求項９０】
組成物のｐＨが、約５．５−６．０または約５．５または約６．０である、請求項８８または８９に記載の医薬組成物。
【請求項９１】
少なくとも１つの多糖が、ショ糖であり、約０−８．０重量／体積（ｗ／ｖ）％の濃度で存在する、請求項８８から９０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９２】
ポリソルベートが、ポリソルベート８０であり、約０−０．０６ｗ／ｖ％の濃度で存在する、請求項８８から９１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９３】
少なくとも１つのアミノ酸が、アルギニンであり、約０−１．５ｗ／ｖ％の濃度で存在する、請求項８８から９２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９４】
結合タンパク質が、約１−１００ｍｇ／ｍｌ、または約１−１５ｍｇ／ｍｌ、または約１−７．５ｍｇ／ｍｌ、または約２．５−７．５ｍｇ／ｍｌ、または約５−７．５ｍｇ／ｍｌ、または約２５−１００ｍｇ／ｍｌ、または約２０−６０ｍｇ／ｍｌ、または約２５−５０ｍｇ／ｍｌ、または約２５ｍｇ／ｍｌ、または約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項８８から９３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９５】
結合タンパク質が、約０．１−６０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１−２５ｍｇ／ｍｌ、または約１．０−６０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５−６０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１−２．０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５−２．０ｍｇ／ｍｌ、または約１−５ｍｇ／ｍｌ、または約１−７．５ｍｇ／ｍｌ、または約１−１５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌ、または約１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項８８から９３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９６】
医薬組成物が、凍結乾燥される、請求項８８から９５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９７】
医薬組成物が、水和されまたは凍結乾燥され再水和されている、請求項８８から９６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９８】
医薬組成物が、デキストロースおよび／または生理食塩水を含む水和溶液中にある、請求項９７に記載の医薬組成物。
【請求項９９】
デキストロースが約５ｗ／ｖ％の濃度であり、および／または生理食塩水が約０．９ｗ／ｖ％の濃度である、請求項９８に記載の医薬組成物。
【請求項１００】
医薬組成物が、約１５ｍＭのヒスチジン、約０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、約４．０％（ｗ／ｖ）のショ糖、および約２５ｍｇ／ｍｌの結合タンパク質または約１−１５ｍｇ／ｍｌの結合タンパク質を含み、ｐＨが約６．０であり、結合タンパク質が配列番号７３と配列番号７４を含む、請求項８８から９９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０１】
結合タンパク質が、
（ｉ）配列番号３９からの３つのＣＤＲと配列番号４０からの３つのＣＤＲを含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号４１からの３つのＣＤＲと配列番号４２からの３つのＣＤＲ、
配列番号４３からの３つのＣＤＲと配列番号４４からの３つのＣＤＲ、
配列番号４５からの３つのＣＤＲと配列番号４６からの３つのＣＤＲ、
配列番号４７からの３つのＣＤＲと配列番号４８からの３つのＣＤＲ、
配列番号４９からの３つのＣＤＲと配列番号５０からの３つのＣＤＲ、
配列番号５１からの３つのＣＤＲと配列番号５２からの３つのＣＤＲ、または
配列番号５３からの３つのＣＤＲと配列番号５４からの３つのＣＤＲ
を含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項８８から１００のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０２】
結合タンパク質が、
（ｉ）配列番号３９および／または配列番号４０を含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号４１から５４からなる群から選択される配列を含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項８８から１０１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０３】
結合タンパク質が、第一のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む第一のポリペプチド鎖であって、
ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１である
第一のポリペプチド鎖を含み、
結合タンパク質が、第二のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む第二のポリペプチド鎖であって、
ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、
ｎは、（Ｘ１）ｎについて０または１であり、
ｎは、（Ｘ２）ｎについて０である
第二のポリペプチド鎖を含み、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインが、第一の機能的標的結合部位を形成し、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインが、第二の機能的標的結合部位を形成する、請求項８８から１０２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０４】
結合タンパク質が、
（ｉ）配列番号３９と配列番号４０を含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号４１と配列番号４２、
配列番号４３と配列番号４４、
配列番号４５と配列番号４６、
配列番号４７と配列番号４８、
配列番号４９と配列番号５０、
配列番号５１と配列番号５２、または
配列番号５３と配列番号５４
を含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項８８から１０３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０５】
結合タンパク質が、２つの第一のポリペプチド鎖と２つの第二のポリペプチド鎖を含み、４つの機能的標的結合部位を形成する、請求項８８から１０４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０６】
結合タンパク質が、
（ａ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約７．４０×１０−９Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＶＥＧＦ；および／または
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約３．４０×１０−８Ｍまたは５．００×１０−８Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＤＬＬ４
に結合することができる、請求項８８から１０５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０７】
（ａ）結合タンパク質におけるリンカーＸ１が、配列番号１−３８のいずれか１つもしくはＧ／Ｓベースの配列を含み、
（ｂ）結合タンパク質におけるリンカーＸ１が、ＣＬではなく、
（ｃ）結合タンパク質のＦｃ領域が、可変配列Ｆｃ領域であり、
（ｄ）Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１  ＬＡＬＡ変異体由来のＦｃ領域であり、
（ｅ）結合タンパク質のＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥもしくはＩｇＤまたはこれらのバリアント由来のＦｃ領域であり、および／または
（ｆ）結合タンパク質が、結晶化された結合タンパク質である、
請求項８８から１０６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０８】
結合タンパク質が、
配列番号５５と配列番号５６、
配列番号５７と配列番号５８、
配列番号５９と配列番号６０、
配列番号６１と配列番号６２、
配列番号６３と配列番号６４、
配列番号６５と配列番号６６、
配列番号６７と配列番号６８、
配列番号６９と配列番号７０、
配列番号７１と配列番号７２、または
配列番号７３と配列番号７４
を含む、請求項８８から１０７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０９】
結合タンパク質が
（ｉ）配列番号３９からの３つのＣＤＲおよび配列番号４０からの３つのＣＤＲを含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号４１からの３つのＣＤＲおよび配列番号４２からの３つのＣＤＲを含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項８８から１０８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１０】
結合タンパク質が、
（ｉ）配列番号３９と配列番号４０を含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号４１と配列番号４２を含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項８８から１０９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１１】
結合タンパク質が、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ（配列番号７３と７４を含む。）を含む、請求項８８から１１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１２】
Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１  ＬＡＬＡ変異体由来のＦｃ領域である、請求項８８から１１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１３】
少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含む、請求項８８から１１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１４】
少なくとも１つの追加の薬剤が、免疫接着分子、造影剤、治療剤、細胞毒性剤、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、ビオチン、代謝抑制剤、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、トキシンまたはアポトーシス剤、化学療法剤；造影剤、血管新生阻害剤、キナーゼ阻害剤（限定されないが、ＫＤＲおよびＴＩＥ−２阻害剤を含む。）、共刺激分子調節剤（限定されないが、抗Ｂ７．１、抗Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ２０を含む。）、接着分子阻害剤（限定されないが、抗ＬＦＡ−１抗体、抗Ｅ／Ｌセレクチン抗体、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ；抗ＤＬＬ４  ｍＡｂ；小分子阻害剤を含む。）、抗サイトカイン抗体またはその機能的断片（限定されないが、抗ＩＬ−１８、抗ＴＮＦまたは抗ＩＬ−６／サイトカイン受容体抗体を含む。）、メトトレキサート、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、検出可能な標識またはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋肉遮断剤、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化剤、イムノグロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン置換薬、放射性医薬、抗うつ剤、抗精神病薬、刺激物質、喘息薬、βアゴニスト、吸入用ステロイド、エピネフリンまたは類似体、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗高血圧薬、利尿薬、アドレナリン受容体アンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬、レニン阻害剤、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、血管拡張剤、アルファ−２アゴニスト、クロニジン、メチルドーパ、ヒドララジン、プラゾシン、レセルピン、モキソニジン、グアンファシン、ペリンドプリル／インダパミド、ロフェキシジン、メチロシン、抗凝固薬、ワーファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ダルテパリン、アルガトロバン、ビバリルジン、レピルジンおよびデキストロースの少なくとも１つを含む、請求項１１３に記載の医薬組成物。
【請求項１１５】
少なくとも１つの追加の薬剤が、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸；２−ＣｄＡ；２−クロロデオキシアデノシン；５−アザシチジン；５−フルオロウラシル；抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ；抗ＤＬＬ４  ｍＡｂ；５−ＦＵ；６−メルカプトプリン；６−ＭＰ；６−ＴＧ；６−チオグアニン；アブラキサン；Ａｃｃｕｔａｎｅ（Ｒ）；アクチノマイシン−Ｄ；Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ａｄｒｕｃｉｌ（Ｒ）；Ａｆｉｎｉｔｏｒ（Ｒ）；Ａｇｒｙｌｉｎ（Ｒ）；Ａｌａ−Ｃｏｒｔ（Ｒ）；アルデスロイキン；アレムツズマブ；ＡＬＩＭＴＡ；アリトレチノイン；Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ（Ｒ）；Ａｌｋｅｒａｎ（Ｒ）；オールトランスレチノイン酸；アルファインターフェロン；アルトレタミン；アメトプテリン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アナグレリド；Ａｎａｎｄｒｏｎ（Ｒ）；アナストロゾール；アラビノシルシトシン；Ａｒａ−Ｃ  Ａｒａｎｅｓｐ（Ｒ）；Ａｒｅｄｉａ（Ｒ）；Ａｒｉｍｉｄｅｘ（Ｒ）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（Ｒ）；Ａｒｒａｎｏｎ（Ｒ）；三酸化ヒ素；Ａｒｚｅｒｒａ（ＴＭ）；アスパラギナーゼ；ＡＴＲＡ；Ａｖａｓｔｉｎ（Ｒ）；アザシチジン；ＢＣＧ；ＢＣＮＵ；ベンダムスチン；ベバシズマブ；ベキサロテン；ＢＥＸＸＡＲ（Ｒ）；ビカルタミド；ＢｉＣＮＵ；Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（Ｒ）；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブスルファン；Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（Ｒ）；Ｃ２２５；カルシウムロイコボリン；Ｃａｍｐａｔｈ（Ｒ）；Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（Ｒ）；カンプトセシン−１１；カペシタビン；Ｃａｒａｃ（ＴＭ）；カルボプラチン；カルムスチン；カルムスチンウエハー；Ｃａｓｏｄｅｘ（Ｒ）；ＣＣ−５０１３；ＣＣＩ−７７９；ＣＣＮＵ；ＣＤＤＰ；ＣｅｅＮＵ；Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（Ｒ）；セツキシマブ；クロラムブシル；シスプラチン；シトロボラム因子；クラドリビン；コルチゾン；Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（Ｒ）；ＣＰＴ−１１；シクロホスファミド；Ｃｙｔａｄｒｅｎ（Ｒ）；シタラビン；シタラビンリポゾーマル；Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（Ｒ）；Ｃｙｔｏｘａｎ（Ｒ）；ダカルバジン；ダコゲン；ダクチノマイシン；ダルベポエチンアルファ；ダサチニブ；ダウノマイシン；ダウノルビシン；塩酸ダウノルビシン；ダウノルビシンリポゾーマル；ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（Ｒ）；デカドロン；デシタビン；Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｆ（Ｒ）；Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（Ｒ）；デニロイキン；ジフチトクス；ＤｅｐｏＣｙｔ（ＴＭ）；デキサメタゾン；酢酸デキサメタゾン；リン酸デキサメタゾンナトリウム；デキサゾン；デクスラゾキサン；ＤＨＡＤ；ＤＩＣ；ジオデックス；ドセタキセル；Ｄｏｘｉｌ（Ｒ）；ドキソルビシン；ドキソルビシンリポゾーマル；Ｄｒｏｘｉａ（ＴＭ）；ＤＴＩＣ；ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（Ｒ）；Ｄｕｒａｌｏｎｅ（Ｒ）；Ｅｆｕｄｅｘ（Ｒ）；Ｅｌｉｇａｒｄ（ＴＭ）；Ｅｌｌｅｎｃｅ（ＴＭ）；Ｅｌｏｘａｔｉｎ（ＴＭ）；Ｅｌｓｐａｒ（Ｒ）；Ｅｍｃｙｔ（Ｒ）；エナラプリル；エピルビシン；エポエチンアルファ；エルビタックス；エルロチニブ；エルウィニア  Ｌ−アスパラギナーゼ；エストラムスチン；エチオール；Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（Ｒ）；エトポシド；リン酸エトポシド；Ｅｕｌｅｘｉｎ（Ｒ）；エベロリムス；Ｅｖｉｓｔａ（Ｒ）；エキセメス���ン；Ｆａｒｅｓｔｏｎ（Ｒ）；Ｆａｓｌｏｄｅｘ（Ｒ）；Ｆｅｍａｒａ（Ｒ）；フィルグラスチム；フロクスウリジン；Ｆｌｕｄａｒａ（Ｒ）；フルダラビン；Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（Ｒ）；フルオロウラシル；フルオロウラシル（クリーム）；フルオキシムエステロン；フルタミド；フォリン酸；ＦＵＤＲ（Ｒ）；フルベストラント；ゲフィチニブ；ゲムシタビン；ゲムツズマブオゾガマイシン；ジェムザール；Ｇｌｅｅｖｅｃ（ＴＭ）；Ｇｌｉａｄｅｌ（Ｒ）ウエハー；ＧＭ−ＣＳＦ；ゴセレリン；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＭＣＳＦ）；Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ（Ｒ）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）；ヘキサドロール；Ｈｅｘａｌｅｎ（Ｒ）；ヘキサメチルメラミン；ＨＭＭ；Ｈｙｃａｍｔｉｎ（Ｒ）；Ｈｙｄｒｅａ（Ｒ）；Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ  Ａｃｅｔａｔｅ（Ｒ）；ヒドロコルチゾン；リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム；コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム；リン酸ハイドロコートン；ヒドロキシウレア；イブリツモマブ；イブリツモマブチウキセタン；Ｉｄａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ  ｌｆｅｘ（Ｒ）；インターフェロン−アルファ；インターフェロン−アルファ−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）；イホスファミド；インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）；インターロイキン−２（ＩＬ−２）；メシル酸イマチニブ；イミダゾールカルボキサミド；Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（Ｒ）；Ｉｒｅｓｓａ（Ｒ）；イリノテカン；イソトレチノイン；イキサベピロン；Ｉｘｅｍｐｒａ（ＴＭ）；ＫＡＤＣＹＣＬＡ（Ｒ）；キドロラーゼ（ｔ）Ｌａｎａｃｏｒｔ（Ｒ）；ラパチニブ；Ｌ−アスパラギナーゼ；ＬＣＲ；レナリドミド；レトロゾール；ロイコボリン；リューケラン；Ｌｅｕｋｉｎ（ＴＭ）；ロイプロリド；ロイコクリスチン；Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（ＴＭ）；リポゾーマルＡｒａ−Ｃ；Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｅｄ（Ｒ）；ロムスチン；Ｌ−ＰＡＭ；Ｌ−サルコリジン；Ｌｕｐｒｏｎ（Ｒ）；Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（Ｒ）；Ｍａｔｕｌａｎｅ（Ｒ）；マキシデックス；メクロレタミン；塩酸メクロレタミン；Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ（Ｒ）；Ｍｅｄｒｏｌ（Ｒ）；Ｍｅｇａｃｅ（Ｒ）；メゲストロール；酢酸メゲストロール；メルファラン；メルカプトプリン；メスナ；Ｍｅｓｎｅｘ（ＴＭ）；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メチルプレドニゾロン；Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ（Ｒ）；マイトマイシン；マイトマイシン−Ｃ；ミトキサントロン  Ｍ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（Ｒ）；ＭＴＣ；ＭＴＸ；Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（Ｒ）；ムスチン；Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ｍｙｌｅｒａｎ（Ｒ）；Ｍｙｌｏｃｅｌ（ＴＭ）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（Ｒ）；Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（Ｒ）；ネララビン；Ｎｅｏｓａｒ（Ｒ）；Ｎｅｕｌａｓｔａ（ＴＭ）；Ｎｅｕｍｅｇａ（Ｒ）；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）；Ｎｅｘａｖａｒ（Ｒ）；ニフェジピン；Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（Ｒ）；ニロチニブ；ニルタミド；Ｎｉｐｅｎｔ（Ｒ）；Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｕｓｔａｒｄ  Ｎｏｖａｌｄｅｘ（Ｒ）；Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（Ｒ）；エヌプレート；オクトレオチド；酢酸オクトレオチド；オフタツムマブ；Ｏｎｃｏｓｐａｒ（Ｒ）；Ｏｎｃｏｖｉｎ（Ｒ）；Ｏｎｔａｋ（Ｒ）；Ｏｎｘａｌ（ＴＭ）；オプレルベキン；Ｏｒａｐｒｅｄ（Ｒ）；Ｏｒａｓｏｎｅ（Ｒ）；オキサリプラチン；パクリタキセル；タンパク質に結合したパクリタキセル；パミドロネート；パニツムマブ；Ｐａｎｒｅｔｉｎ（Ｒ）；Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（Ｒ）；パゾパニブ；Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ（Ｒ）；ＰＥＧインターフェロン；ペグアスパラガーゼ；ペグフィルグラスチム；ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（ＴＭ）；ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ；ＰＥＭＥＴＲＥＸＥＤ；ペントスタチン；フェニルアラニンマスタード；Ｐｌａｔｉｎｏｌ（Ｒ）；Ｐｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ（Ｒ）；プレドニゾロン；プレドニゾン；Ｐｒｅｌｏｎｅ（Ｒ）；プロカルバジン；ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ）；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｒ）；カルムスチンインプラントを伴うＰｒｏｌｉｆｅｐｒｏｓｐａｎ  ２０；Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（Ｒ）；ラロキシフェン；Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（Ｒ）；Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（Ｒ）；Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒ）；リツキシマブ；Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（Ｒ）；ロミプロスチム；Ｒｕｂｅｘ（Ｒ）；塩酸ルビドマイシン；Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ（Ｒ）；Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ  ＬＡＲ（Ｒ）；サーグラモスティム；Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ（Ｒ）；Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（Ｒ）；ソラフェニブ；ＳＰＲＹＣＥＬ（ＴＭ）；ＳＴＩ−５７１；ストレプトゾシン；ＳＵ１１２４８；スニチニブ；Ｓｕｔｅｎｔ（Ｒ）；Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  Ｔａｒｃｅｖａ（Ｒ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（Ｒ）；Ｔａｓｉｇｎａ（Ｒ）；Ｔａｘｏｌ（Ｒ）；Ｔａｘｏｔｅｒｅ（Ｒ）；Ｔｅｍｏｄａｒ（Ｒ）；テモゾロミド  テムシロリムス；テニポシド；ＴＥＳＰＡ；サリドマイド；Ｔｈａｌｏｍｉｄ（Ｒ）；ＴｈｅｒａＣｙｓ（Ｒ）；チオグアニン；Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ  Ｔａｂｌｏｉｄ（Ｒ）；チオホスファミド；Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（Ｒ）；チオテパ；ＴＩＣＥ（Ｒ）；Ｔｏｐｏｓａｒ（Ｒ）；トポテカン；トレミフェン；Ｔｏｒｉｓｅｌ（Ｒ）；トシツモマブ；トラスツズマブ；Ｔｒｅａｎｄａ（Ｒ）；トレチノイン；Ｔｒｅｘａｌｌ（ＴＭ）；Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（Ｒ）；ＴＳＰＡ；ＴＹＫＥＲＢ（Ｒ）；ＶＣＲ；Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（ＴＭ）；Ｖｅｌｂａｎ（Ｒ）；Ｖｅｌｃａｄｅ（Ｒ）；ＶｅＰｅｓｉｄ（Ｒ）；Ｖｅｓａｎｏｉｄ（ＴＭ）；Ｖｉａｄｕｒ（ＴＭ）；Ｖｉｄａｚａ（Ｒ）；ビンブラスチン；硫酸ビンブラスチン；Ｖｉｎｃａｓａｒ  Ｐｆｓ（Ｒ）；ビンクリスチン；ビノレルビン；酒石酸ビノレルビン；ＶＬＢ；ＶＭ−２６；ボリノスタット；ヴォトリエント；ＶＰ−１６；Ｖｕｍｏｎ（Ｒ）；Ｘｅｌｏｄａ（Ｒ）；Ｚａｎｏｓａｒ（Ｒ）；Ｚｅｖａｌｉｎ（ＴＭ）；Ｚｉｎｅｃａｒｄ（Ｒ）；Ｚｏｌａｄｅｘ（Ｒ）；ゾレドロン酸；ゾリンザ；Ｚｏｍｅｔａ（Ｒ）；ロイコボリン；５−ＦＵ；テモゾロミド；ゲムシタビン；パクリタキセル；レゴラフェニブ；およびペルツズマブの少なくとも１つを含む、請求項１１３または１１４に記載の医薬組成物。
【請求項１１６】
少なくとも１つの追加の薬剤が、イリノテカン；ロイコボリン；５−ＦＵ；フォルフィリ；エナラプリル；ニフェジピン；クロニジン；テモゾロミド；ゲムシタビン；パクリタキセル；レゴラフェニブ；カペシタビン；およびペルツズマブの少なくとも１つを含む、請求項１１３から１１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１７】
対象における疾患または障害の処置に使用するための、請求項８８から１１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１８】
疾患または障害が、原発性もしくは転移性癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、尿路癌、腎臓癌、膀胱癌、尿路上皮癌、女性生殖管癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛癌、妊娠性絨毛性疾患、男性生殖管癌、前立腺癌、精嚢癌、精巣癌、生殖細胞腫瘍、内分泌腺癌、甲状腺癌、副腎癌、下垂体癌、皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、脳の腫瘍、神経の腫瘍、目の腫瘍、髄膜の腫瘍、星状細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、網膜芽腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経鞘腫、および髄膜腫、造血器悪性腫瘍から生じる固形腫瘍、白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、胃癌、膀胱癌、前立腺癌、直腸癌、造血器悪性腫瘍、無βリポタンパク質血症、先端チアノーゼ、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、結腸直腸癌、ヘアリー細胞白血病、悪性リンパ腫、悪性組織球増殖症、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、膵臓癌腫、腫瘍随伴症候群、悪性の高カルシウム血症、肉腫、固形腫瘍、黄斑変性症、１型糖尿病、糖尿病性網膜症、アテローム性動脈硬化症、または血管過剰増殖、浮腫もしくは異常なＤＬＬ４もしくはＶＥＧＦ活性によって特徴付けられる任意の他の血管新生依存性もしくは非依存性疾患である、請求項１１７に記載の医薬組成物。
【請求項１１９】
医薬組成物が、皮下、筋肉内、静脈内、眼内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、結腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口内、舌下、鼻内または経皮投与用に製剤化される、請求項１１７または１１８に記載の医薬組成物。
【請求項１２０】
請求項８８から１１９のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む処置方法。
【請求項１２１】
医薬組成物が、原発性もしくは転移性癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、尿路癌、腎臓癌、膀胱癌、尿路上皮癌、女性生殖管癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛癌、妊娠性絨毛性疾患、男性生殖管癌、前立腺癌、精嚢癌、精巣癌、生殖細胞腫瘍、内分泌腺癌、甲状腺癌、副腎癌、下垂体癌、皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、脳の腫瘍、神経の腫瘍、目の腫瘍、髄膜の腫瘍、星状細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、網膜芽腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経鞘腫、および髄膜腫、造血器悪性腫瘍から生じる固形腫瘍、白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、胃癌、膀胱癌、前立腺癌、直腸癌、造血器悪性腫瘍、無βリポタンパク質血症、先端チアノーゼ、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、結腸直腸癌、ヘアリー細胞白血病、悪性リンパ腫、悪性組織球増殖症、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、膵臓癌腫、腫瘍随伴症候群、悪性の高カルシウム血症、肉腫、固形腫瘍、黄斑変性症、１型糖尿病、糖尿病性網膜症、アテローム性動脈硬化症、または血管過剰増殖、浮腫もしくは異常なＤＬＬ４もしくはＶＥＧＦ活性によって特徴付けられる任意の他の血管新生依存性または非依存性疾患を処置するために投与される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
医薬組成物が、場合により、イリノテカン、ロイコボリン、テモゾロミド、ゲムシタビン、パクリタキセル、カペシタビンおよび５−ＦＵの１つ以上と組み合わせて、結腸癌を処置するために投与される、請求項１２０または１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
医薬組成物が、場合により、テモゾロミドと組み合わせて、膠芽細胞腫を処置するために投与される、請求項１２０または１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
医薬組成物が、場合により、ゲムシタビンと組み合わせて、膵臓癌を処置するために投与される、請求項１２０または１２１に記載の方法。
【請求項１２５】
医薬組成物が、場合により、パクリタキセルと組み合わせて、乳癌を処置するために投与される、請求項１２０または１２１に記載の方法。
【請求項１２６】
それぞれ独立してＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む第一および第二のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
ＶＤ１は、第一の可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の可変ドメインであり、
Ｃは、定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１であり、
第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインが、第一の機能的標的結合部位を形成し、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインが、第二の機能的標的結合部位を形成し、結合タンパク質が、ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合することができ、
（ｉ）配列番号３９からのＣＤＲ１から３および配列番号４０からのＣＤＲ１から３を含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン；ならびに
（ｉｉ）配列番号４１からのＣＤＲ１から３および配列番号４２からのＣＤＲ１から３、
配列番号４３からのＣＤＲ１から３および配列番号４４からのＣＤＲ１から３、
配列番号４５からのＣＤＲ１から３および配列番号４６からのＣＤＲ１から３、
配列番号４７からのＣＤＲ１から３および配列番号４８からのＣＤＲ１から３、
配列番号４９からのＣＤＲ１から３および配列番号５０からのＣＤＲ１から３、
配列番号５１からのＣＤＲ１から３および配列番号５２からのＣＤＲ１から３、または
配列番号５３からのＣＤＲ１から３および配列番号５４からのＣＤＲ１から３
を含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む結合タンパク質。
【請求項１２７】
（ｉ）配列番号３９および／または配列番号４０を含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号４１−５４からなる群から選択される配列を含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項１２６に記載の結合タンパク質。
【請求項１２８】
結合タンパク質が、第一のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む第一のポリペプチド鎖であって、
ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１である
第一のポリペプチド鎖を含み、
結合タンパク質が、第二のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む第二のポリペプチド鎖であって、
ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、
ｎは、（Ｘ１）ｎについて０または１であり、
ｎは、（Ｘ２）ｎについて０である
第二のポリペプチド鎖を含み、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインが、第一の機能的標的結合部位を形成し、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインが、第二の機能的標的結合部位を形成する、請求項１２６または１２７に記載の結合タンパク質。
【請求項１２９】
（ｉ）配列番号３９と配列番号４０を含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号４１と配列番号４２、
配列番号４３と配列番号４４、
配列番号４５と配列番号４６、
配列番号４７と配列番号４８、
配列番号４９と配列番号５０、
配列番号５１と配列番号５２、または
配列番号５３と配列番号５４
を含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項１２６から１２８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１３０】
２つの第一のポリペプチド鎖と２つの第二のポリペプチド鎖を含み、４つの機能的標的結合部位を形成する、請求項１２６から１２９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１３１】
（ａ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約７．４０×１０−９Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＶＥＧＦ；および／または
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約３．４０×１０−８Ｍまたは５．００×１０−８Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＤＬＬ４
に結合することができる、請求項１２６から１３０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１３２】
（ａ）結合タンパク質におけるリンカーＸ１が、配列番号１−３８のいずれか１つもしくはＧ／Ｓベースの配列を含み、
（ｂ）結合タンパク質におけるリンカーＸ１が、ＣＨ１またはＣＬではなく、
（ｃ）結合タンパク質のＦｃ領域が、可変配列Ｆｃ領域であり、
（ｄ）Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１  ＬＡＬＡ変異体由来のＦｃ領域であり、
（ｅ）結合タンパク質のＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥもしくはＩｇＤまたはこれらのバリアント由来のＦｃ領域であり、および／または
（ｆ）結合タンパク質が、結晶化された結合タンパク質である、
請求項１２６から１３１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１３３】
配列番号５５と配列番号５６、
配列番号５７と配列番号５８、
配列番号５９と配列番号６０、
配列番号６１と配列番号６２、
配列番号６３と配列番号６４、
配列番号６５と配列番号６６、
配列番号６７と配列番号６８、
配列番号６９と配列番号７０、
配列番号７１と配列番号７２、または
配列番号７３と配列番号７４
を含む、請求項１２６から１３２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１３４】
（ｉ）配列番号３９からのＣＤＲ１から３と配列番号４０からのＣＤＲ１から３とを含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン；および
（ｉｉ）配列番号４１からのＣＤＲ１から３と配列番号４２からのＣＤＲ１から３とを含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項１２６から１３３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１３５】
（ｉ）配列番号３９と配列番号４０を含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン；および
（ｉｉ）配列番号４１と配列番号４２を含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項１２６から１３４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１３６】
ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ（配列番号７３と７４を含む。）を含む、請求項１２６から１３５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１３７】
Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１  ＬＡＬＡ変異体由来のＦｃ領域である、請求項１２６から１３６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１３８】
１つ以上のアミノ酸、
１つ以上の多糖および／またはポリソルベート、ならびに
約０．１−１００ｍｇ／ｍｌ濃度の結合タンパク質
を含む医薬製剤であって、
医薬製剤のｐＨが約５．０−７．０であり、
結合タンパク質が、それぞれ独立してＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む第一および第二のポリペプチド鎖を含み、
ＶＤ１は、第一の可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の可変ドメインであり、
Ｃは、定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１であり、
第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインが、第一の機能的標的結合部位を形成し、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインが、第二の機能的標的結合部位を形成し、結合タンパク質がＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合することができる医薬製剤。
【請求項１３９】
少なくとも１つのアミノ酸がヒスチジンであり、約１０−２０ｍＭまたは約１５ｍＭの濃度で存在する、請求項１３８に記載の医薬製剤。
【請求項１４０】
組成物のｐＨが、約５．５−６．０または約５．５または約６．０である、請求項１３８または１３９に記載の医薬製剤。
【請求項１４１】
少なくとも１つの多糖がショ糖であり、約０−８．０重量／体積（ｗ／ｖ）％の濃度で存在する、請求項１３８から１４０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１４２】
ポリソルベートがポリソルベート８０であり、約０−０．０６ｗ／ｖ％の濃度で存在する、請求項１３８から１４１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１４３】
少なくとも１つのアミノ酸がアルギニンであり、約０−１．５ｗ／ｖ％の濃度で存在する、請求項１３８から１４２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１４４】
結合タンパク質が、約１−１００ｍｇ／ｍｌ、または約１−１５ｍｇ／ｍｌ、または約１−  ７．５ｍｇ／ｍｌ、または約２．５−７．５ｍｇ／ｍｌ、または約５−７．５ｍｇ／ｍｌ、または約２５−１００ｍｇ／ｍｌ、または約２０−６０ｍｇ／ｍｌ、または約２５−５０ｍｇ／ｍｌ、または約２５ｍｇ／ｍｌ、または約５０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１−６０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１−２５ｍｇ／ｍｌ、または約１．０−６０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５−６０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１−２．０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５−２．０ｍｇ／ｍｌ、または約１−５ｍｇ／ｍｌ、または約１−７．５ｍｇ／ｍｌ、または約１−１５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌ、または約１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１３８から１４３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１４５】
医薬製剤が、凍結乾燥される、請求項１３８から１４４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１４６】
医薬製剤が、水和されまたは凍結乾燥され再水和されている、請求項１３８から１４４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１４７】
医薬製剤が、デキストロースおよび／または生理食塩水を含む水和溶液中にある、請求項１４６に記載の医薬製剤。
【請求項１４８】
デキストロースが、約５ｗ／ｖ％の濃度であり、および／または生理食塩水が約０．９ｗ／ｖ％の濃度である、請求項１４７に記載の医薬製剤。
【請求項１４９】
医薬製剤が、約１５ｍＭのヒスチジン、約０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、約４％（ｗ／ｖ）のショ糖、および約０．１−２５ｍｇ／ｍｌの結合タンパク質または約１−１５ｍｇ／ｍｌの結合タンパク質を含み、ｐＨが約６であり、結合タンパク質が、
（ｉ）配列番号３９と配列番号４０を含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン；および
（ｉｉ）配列番号４１と配列番号４２を含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項１３８から１４８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１５０】
結合タンパク質が、
（ｉ）配列番号３９からのＣＤＲ１から３と配列番号４０からのＣＤＲ１から３を含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン；および
（ｉｉ）配列番号４１からのＣＤＲ１から３と配列番号４２からのＣＤＲ１から３、
配列番号４３からのＣＤＲ１から３と配列番号４４からのＣＤＲ１から３、
配列番号４５からのＣＤＲ１から３と配列番号４６からのＣＤＲ１から３、
配列番号４７からのＣＤＲ１から３と配列番号４８からのＣＤＲ１から３、
配列番号４９からのＣＤＲ１から３と配列番号５０からのＣＤＲ１から３、
配列番号５１からのＣＤＲ１から３と配列番号５２からのＣＤＲ１から３、または
配列番号５３からのＣＤＲ１から３と配列番号５４からのＣＤＲ１から３
とを含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項１３８から１４９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１５１】
結合タンパク質が、
（ｉ）ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成し、配列番号３９および／または配列番号４０を含む可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成し、配列番号４１−５４からなる群から選択される配列を含む可変ドメイン
を含む、請求項１３８から１５０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１５２】
結合タンパク質が、第一のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む第一のポリペプチド鎖であって、
ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１である
第一のポリペプチド鎖を含み、
結合タンパク質が、第二のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む第二のポリペプチド鎖であって、
ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、
ｎは、（Ｘ１）ｎについて０または１であり、
ｎは、（Ｘ２）ｎについて０である
第二のポリペプチド鎖を含み、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインが、第一の機能的標的結合部位を形成し、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインが、第二の機能的標的結合部位を形成する、請求項１３８から１５１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１５３】
結合タンパク質が、
（ｉ）配列番号３９と配列番号４０を含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号４１と配列番号４２、
配列番号４３と配列番号４４、
配列番号４５と配列番号４６、
配列番号４７と配列番号４８、
配列番号４９と配列番号５０、
配列番号５１と配列番号５２、または
配列番号５３と配列番号５４
を含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項１３８から１５２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１５４】
結合タンパク質が、２つの第一のポリペプチド鎖と２つの第二のポリペプチド鎖を含み、４つの機能的標的結合部位を形成する、請求項１３８から１５３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１５５】
結合タンパク質が、
（ａ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約７．４０×１０−９Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＶＥＧＦ；および／または
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約３．４０×１０−８Ｍまたは５．００×１０−８Ｍの解離定数（ＫＤ）を有するＤＬＬ４
に結合することができる、請求項１３８から１５４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１５６】
（ａ）結合タンパク質におけるリンカーＸ１が、配列番号１−３８のいずれか１つもしくはＧ／Ｓベースの配列を含み、
（ｂ）結合タンパク質におけるリンカーＸ１が、ＣＨ１またはＣＬではなく、
（ｃ）結合タンパク質のＦｃ領域が、可変配列Ｆｃ領域であり、
（ｄ）Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１  ＬＡＬＡ変異体由来のＦｃ領域であり、
（ｅ）結合タンパク質のＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥもしくはＩｇＤまたはこれらのバリアント由来のＦｃ領域であり、および／または
（ｆ）結合タンパク質が、結晶化された結合タンパク質である、
請求項１３８から１５５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１５７】
結合タンパク質が、
配列番号５５と配列番号５６、
配列番号５７と配列番号５８、
配列番号５９と配列番号６０、
配列番号６１と配列番号６２、
配列番号６３と配列番号６４、
配列番号６５と配列番号６６、
配列番号６７と配列番号６８、
配列番号６９と配列番号７０、
配列番号７１と配列番号７２、または
配列番号７３と配列番号７４
を含む、請求項１３８から１５６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１５８】
結合タンパク質が
（ｉ）配列番号３９からのＣＤＲ１から３および配列番号４０からのＣＤＲ１から３を含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号４１からのＣＤＲ１から３および配列番号４２からのＣＤＲ１から３を含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項１３８から１５７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１５９】
結合タンパク質が、
（ｉ）配列番号３９と配列番号４０を含む、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号４１と配列番号４２を含む、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメイン
を含む、請求項１３８から１５８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１６０】
結合タンパク質が、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ（配列番号７３と７４を含む。）を含む、請求項１３８から１５９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１６１】
Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１  ＬＡＬＡ変異体由来のＦｃ領域である、請求項１３８から１６０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１６２】
少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含む、請求項１３８から１６１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１６３】
少なくとも１つの追加の薬剤が、免疫接着分子、造影剤、治療剤、細胞毒性剤、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、ビオチン、代謝抑制剤、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、トキシンまたはアポトーシス剤、化学療法剤；造影剤、血管新生阻害剤、キナーゼ阻害剤（限定されないが、ＫＤＲおよびＴＩＥ−２阻害剤を含む。）、共刺激分子調節剤（限定されないが、抗Ｂ７．１、抗Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ２０を含む。）、接着分子阻害剤（限定されないが、抗ＬＦＡ−１抗体、抗Ｅ／Ｌセレクチン抗体、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ；抗ＤＬＬ４  ｍＡｂ；小分子阻害剤を含む。）、抗サイトカイン抗体またはその機能的断片（限定されないが、抗ＩＬ−１８、抗ＴＮＦまたは抗ＩＬ−６／サイトカイン受容体抗体を含む。）、メトトレキサート、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、検出可能な標識またはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋肉遮断剤、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化剤、イムノグロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン置換薬、放射性医薬、抗うつ剤、抗精神病薬、刺激物質、喘息薬、βアゴニスト、吸入用ステロイド、エピネフリンまたは類似体、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗高血圧薬、利尿薬、アドレナリン受容体アンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬、レニン阻害剤、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、血管拡張剤、アルファ−２アゴニスト、クロニジン、メチルドーパ、ヒドララジン、プラゾシン、レセルピン、モキソニジン、グアンファシン、ペリンドプリル／インダパミド、ロフェキシジン、メチロシン、抗凝固薬、ワーファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ダルテパリン、アルガトロバン、ビバリルジン、レピルジンおよびデキストロースの少なくとも１つを含む、請求項１６２に記載の医薬製剤。
【請求項１６４】
少なくとも１つの追加の薬剤が、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸；２−ＣｄＡ；２−クロロデオキシアデノシン；５−アザシチジン；５−フルオロウラシル；抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ；抗ＤＬＬ４  ｍＡｂ；５−ＦＵ；６−メルカプトプリン；６−ＭＰ；６−ＴＧ；６−チオグアニン；アブラキサン；Ａｃｃｕｔａｎｅ（Ｒ）；アクチノマイシン−Ｄ；Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ａｄｒｕｃｉｌ（Ｒ）；Ａｆｉｎｉｔｏｒ（Ｒ）；Ａｇｒｙｌｉｎ（Ｒ）；Ａｌａ−Ｃｏｒｔ（Ｒ）；アルデスロイキン；アレムツズマブ；ＡＬＩＭＴＡ；アリトレチノイン；Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ（Ｒ）；Ａｌｋｅｒａｎ（Ｒ）；オールトランスレチノイン酸；アルファインターフェロン；アルトレタミン；アメトプテリン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アナグレリド；Ａｎａｎｄｒｏｎ（Ｒ）；アナストロゾール；アラビノシルシトシン；Ａｒａ−Ｃ  Ａｒａｎｅｓｐ（Ｒ）；Ａｒｅｄｉａ（Ｒ）；Ａｒｉｍｉｄｅｘ（Ｒ）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（Ｒ）；Ａｒｒａｎｏｎ（Ｒ）；三酸化ヒ素；Ａｒｚｅｒｒａ（ＴＭ）；アスパラギナーゼ；ＡＴＲＡ；Ａｖａｓｔｉｎ（Ｒ）；アザシチジン；ＢＣＧ；ＢＣＮＵ；ベンダムスチン；ベバシズマブ；ベキサロテン；ＢＥＸＸＡＲ（Ｒ）；ビカルタミド；ＢｉＣＮＵ；Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（Ｒ）；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブスルファン；Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（Ｒ）；Ｃ２２５；カルシウムロイコボリン；Ｃａｍｐａｔｈ（Ｒ）；Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（Ｒ）；カンプトセシン−１１；カペシタビン；Ｃａｒａｃ（ＴＭ）；カルボプラチン；カルムスチン；カルムスチンウエハー；Ｃａｓｏｄｅｘ（Ｒ）；ＣＣ−５０１３；ＣＣＩ−７７９；ＣＣＮＵ；ＣＤＤＰ；ＣｅｅＮＵ；Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（Ｒ）；セツキシマブ；クロラムブシル；シスプラチン；シトロボラム因子；クラドリビン；コルチゾン；Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（Ｒ）；ＣＰＴ−１１；シクロホスファミド；Ｃｙｔａｄｒｅｎ（Ｒ）；シタラビン；シタラビンリポゾーマル；Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（Ｒ）；Ｃｙｔｏｘａｎ（Ｒ）；ダカルバジン；ダコゲン；ダクチノマイシン；ダルベポエチンアルファ；ダサチニブ；ダウノマイシン；ダウノルビシン；塩酸ダウノルビシン；ダウノルビシンリポゾーマル；ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（Ｒ）；デカドロン；デシタビン；Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｆ（Ｒ）；Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（Ｒ）；デニロイキン；ジフチトクス；ＤｅｐｏＣｙｔ（ＴＭ）；デキサメタゾン；酢酸デキサメタゾン；リン酸デキサメタゾンナトリウム；デキサゾン；デクスラゾキサン；ＤＨＡＤ；ＤＩＣ；ジオデックス；ドセタキセル；Ｄｏｘｉｌ（Ｒ）；ドキソルビシン；ドキソルビシンリポゾーマル；Ｄｒｏｘｉａ（ＴＭ）；ＤＴＩＣ；ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（Ｒ）；Ｄｕｒａｌｏｎｅ（Ｒ）；Ｅｆｕｄｅｘ（Ｒ）；Ｅｌｉｇａｒｄ（ＴＭ）；Ｅｌｌｅｎｃｅ（ＴＭ）；Ｅｌｏｘａｔｉｎ（ＴＭ）；Ｅｌｓｐａｒ（Ｒ）；Ｅｍｃｙｔ（Ｒ）；エナラプリル；エピルビシン；エポエチンアルファ；エルビタックス；エルロチニブ；エルウィニア  Ｌ−アスパラギナーゼ；エストラムスチン；エチオール；Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（Ｒ）；エトポシド；リン酸エトポシド；Ｅｕｌｅｘｉｎ（Ｒ）；エベロリムス；Ｅｖｉｓｔａ（Ｒ）；エキセメス���ン；Ｆａｒｅｓｔｏｎ（Ｒ）；Ｆａｓｌｏｄｅｘ（Ｒ）；Ｆｅｍａｒａ（Ｒ）；フィルグラスチム；フロクスウリジン；Ｆｌｕｄａｒａ（Ｒ）；フルダラビン；Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（Ｒ）；フルオロウラシル；フルオロウラシル（クリーム）；フルオキシムエステロン；フルタミド；フォリン酸；ＦＵＤＲ（Ｒ）；フルベストラント；ゲフィチニブ；ゲムシタビン；ゲムツズマブオゾガマイシン；ジェムザール；Ｇｌｅｅｖｅｃ（ＴＭ）；Ｇｌｉａｄｅｌ（Ｒ）ウエハー；ＧＭ−ＣＳＦ；ゴセレリン；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＭＣＳＦ）；Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ（Ｒ）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）；ヘキサドロール；Ｈｅｘａｌｅｎ（Ｒ）；ヘキサメチルメラミン；ＨＭＭ；Ｈｙｃａｍｔｉｎ（Ｒ）；Ｈｙｄｒｅａ（Ｒ）；Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ  Ａｃｅｔａｔｅ（Ｒ）；ヒドロコルチゾン；リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム；コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム；リン酸ハイドロコートン；ヒドロキシウレア；イブリツモマブ；イブリツモマブチウキセタン；Ｉｄａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ  lｆｅｘ（Ｒ）；インターフェロン−アルファ；インターフェロン−アルファ−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）；イホスファミド；インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）；インターロイキン−２（ＩＬ−２）；メシル酸イマチニブ；イミダゾールカルボキサミド；Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（Ｒ）；Ｉｒｅｓｓａ（Ｒ）；イリノテカン；イソトレチノイン；イキサベピロン；Ｉｘｅｍｐｒａ（ＴＭ）；ＫＡＤＣＹＣＬＡ（Ｒ）；キドロラーゼ（ｔ）Ｌａｎａｃｏｒｔ（Ｒ）；ラパチニブ；Ｌ−アスパラギナーゼ；ＬＣＲ；レナリドミド；レトロゾール；ロイコボリン；リューケラン；Ｌｅｕｋｉｎ（ＴＭ）；ロイプロリド；ロイコクリスチン；Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（ＴＭ）；リポゾーマルＡｒａ−Ｃ；Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｅｄ（Ｒ）；ロムスチン；Ｌ−ＰＡＭ；Ｌ−サルコリジン；Ｌｕｐｒｏｎ（Ｒ）；Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（Ｒ）；Ｍａｔｕｌａｎｅ（Ｒ）；マキシデックス；メクロレタミン；塩酸メクロレタミン；Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ（Ｒ）；Ｍｅｄｒｏｌ（Ｒ）；Ｍｅｇａｃｅ（Ｒ）；メゲストロール；酢酸メゲストロール；メルファラン；メルカプトプリン；メスナ；Ｍｅｓｎｅｘ（ＴＭ）；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メチルプレドニゾロン；Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ（Ｒ）；マイトマイシン；マイトマイシン−Ｃ；ミトキサントロン  Ｍ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（Ｒ）；ＭＴＣ；ＭＴＸ；Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（Ｒ）；ムスチン；Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ｍｙｌｅｒａｎ（Ｒ）；Ｍｙｌｏｃｅｌ（ＴＭ）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（Ｒ）；Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（Ｒ）；ネララビン；Ｎｅｏｓａｒ（Ｒ）；Ｎｅｕｌａｓｔａ（ＴＭ）；Ｎｅｕｍｅｇａ（Ｒ）；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）；Ｎｅｘａｖａｒ（Ｒ）；ニフェジピン；Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（Ｒ）；ニロチニブ；ニルタミド；Ｎｉｐｅｎｔ（Ｒ）；Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｕｓｔａｒｄ  Ｎｏｖａｌｄｅｘ（Ｒ）；Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（Ｒ）；エヌプレート；オクトレオチド；酢酸オクトレオチド；オフタツムマブ；Ｏｎｃｏｓｐａｒ（Ｒ）；Ｏｎｃｏｖｉｎ（Ｒ）；Ｏｎｔａｋ（��）；Ｏｎｘａｌ（ＴＭ）；オプレルベキン；Ｏｒａｐｒｅｄ（Ｒ）；Ｏｒａｓｏｎｅ（Ｒ）；オキサリプラチン；パクリタキセル；タンパク質に結合したパクリタキセル；パミドロネート；パニツムマブ；Ｐａｎｒｅｔｉｎ（Ｒ）；Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（Ｒ）；パゾパニブ；Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ（Ｒ）；ＰＥＧインターフェロン；ペグアスパラガーゼ；ペグフィルグラスチム；ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（ＴＭ）；ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ；ＰＥＭＥＴＲＥＸＥＤ；ペントスタチン；フェニルアラニンマスタード；Ｐｌａｔｉｎｏｌ（Ｒ）；Ｐｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ（Ｒ）；プレドニゾロン；プレドニゾン；Ｐｒｅｌｏｎｅ（Ｒ）；プロカルバジン；ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ）；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｒ）；カルムスチンインプラントを伴うＰｒｏｌｉｆｅｐｒｏｓｐａｎ  ２０；Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（Ｒ）；ラロキシフェン；Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（Ｒ）；Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（Ｒ）；Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒ）；リツキシマブ；Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（Ｒ）；ロミプロスチム；Ｒｕｂｅｘ（Ｒ）；塩酸ルビドマイシン；Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ（Ｒ）；Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ  ＬＡＲ（Ｒ）；サーグラモスティム；Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ（Ｒ）；Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（Ｒ）；ソラフェニブ；ＳＰＲＹＣＥＬ（ＴＭ）；ＳＴＩ−５７１；ストレプトゾシン；ＳＵ１１２４８；スニチニブ；Ｓｕｔｅｎｔ（Ｒ）；Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  Ｔａｒｃｅｖａ（Ｒ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（Ｒ）；Ｔａｓｉｇｎａ（Ｒ）；Ｔａｘｏｌ（Ｒ）；Ｔａｘｏｔｅｒｅ（Ｒ）；Ｔｅｍｏｄａｒ（Ｒ）；テモゾロミド  テムシロリムス；テニポシド；ＴＥＳＰＡ；サリドマイド；Ｔｈａｌｏｍｉｄ（Ｒ）；ＴｈｅｒａＣｙｓ（Ｒ）；チオグアニン；Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ  Ｔａｂｌｏｉｄ（Ｒ）；チオホスファミド；Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（Ｒ）；チオテパ；ＴＩＣＥ（Ｒ）；Ｔｏｐｏｓａｒ（Ｒ）；トポテカン；トレミフェン；Ｔｏｒｉｓｅｌ（Ｒ）；トシツモマブ；トラスツズマブ；Ｔｒｅａｎｄａ（Ｒ）；トレチノイン；Ｔｒｅｘａｌｌ（ＴＭ）；Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（Ｒ）；ＴＳＰＡ；ＴＹＫＥＲＢ（Ｒ）；ＶＣＲ；Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（ＴＭ）；Ｖｅｌｂａｎ（Ｒ）；Ｖｅｌｃａｄｅ（Ｒ）；ＶｅＰｅｓｉｄ（Ｒ）；Ｖｅｓａｎｏｉｄ（ＴＭ）；Ｖｉａｄｕｒ（ＴＭ）；Ｖｉｄａｚａ（Ｒ）；ビンブラスチン；硫酸ビンブラスチン；Ｖｉｎｃａｓａｒ  Ｐｆｓ（Ｒ）；ビンクリスチン；ビノレルビン；酒石酸ビノレルビン；ＶＬＢ；ＶＭ−２６；ボリノスタット；ヴォトリエント；ＶＰ−１６；Ｖｕｍｏｎ（Ｒ）；Ｘｅｌｏｄａ（Ｒ）；Ｚａｎｏｓａｒ（Ｒ）；Ｚｅｖａｌｉｎ（ＴＭ）；Ｚｉｎｅｃａｒｄ（Ｒ）；Ｚｏｌａｄｅｘ（Ｒ）；ゾレドロン酸；ゾリンザ；Ｚｏｍｅｔａ（Ｒ）；ロイコボリン；５−ＦＵ；テモゾロミド；ゲムシタビン；パクリタキセル；レゴラフェニブ；およびペルツズマブの少なくとも１つを含む、請求項１６２または１６３に記載の医薬製剤。
【請求項１６５】
少なくとも１つの追加の薬剤が、イリノテカン；ロイコボリン；フォルフィリ；５−ＦＵ；エナラプリル；ニフェジピン；クロニジン；テモゾロミド；ゲムシタビン；パクリタキセル；レゴラフェニブ；およびペルツズマブの少なくとも１つを含む、請求項１６２から１６４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１６６】
結合タンパク質が、
（ａ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、解離定数（ＫＤ）が最大約７．４０×１０−１０Ｍで、ＶＥＧＦに結合することができ、および／もしくはＶＥＧＦＲ１競合ＥＬＩＳＡにおいて測定された場合に、ＩＣ５０が最大約３．８ｎＭで、ＶＥＧＦ活性を遮断することができ、ならびに／または
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、解離定数（ＫＤ）が最大約１．０×１０−８Ｍで、ＤＬＬ４に結合することができ、および／もしくはＮｏｔｃｈ競合ＥＬＩＳＡにおいて測定された場合に、ＩＣ５０が最大約１．０９ｎＭで、ＤＬＬ４活性を遮断することができる、請求項１３６に記載の結合タンパク質または請求項１６０に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年１１月１日に出願した米国仮特許出願第６１／７２１，０７２号と２０１３年３月１５日に出願した米国仮出願第６１／７８７，９２７号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の優先権の利益を主張するものであり、これらはどちらもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書において、多価および多重特異的結合タンパク質、結合タンパク質を作製する方法、ならびに癌、腫瘍および／または他の血管新生依存性疾患の診断、阻害、予防および／または処置におけるこれらの使用が開示される。
【背景技術】
【０００３】
２つまたはそれ以上の抗原に結合することができる多重特異的結合タンパク質などの工学的に作製されたタンパク質が、本分野において公知である。このような多重特異的結合タンパク質は、細胞融合、化学的連結または組換えＤＮＡ技術を用いて作製することが可能である。当該技術分野において公知の多重特異的結合タンパク質の構造は様々に存在する。しかしながら、多数のこのような構造および方法には明らかな不利益がある。
【０００４】
二特異的抗体は、クアドローマ技術を用いて作製されてきた。しかしながら、この技術における誤対合された副産物の存在および大幅に減少した産生率は、複雑な精製操作が必要とされることを意味している。二特異的抗体は、２つの異なるｍＡｂの化学的連結によっても生産することが可能である。しかしながら、このアプローチは、均一な調製を与えない。
【０００５】
以前に使用された他のアプローチは、ヘテロ−二官能性クロスリンカーを有する２つの親抗体のカップリング、タンデムな一本鎖Ｆｖ分子、ダイアボディ、二特異的ダイアボディ、一本鎖ダイアボディおよびジ−ダイアボディの製造を含む。しかしながら、これらのアプローチのそれぞれは不利益を有する。さらに、ＩｇＧの重鎖中に２つのＦａｂリピートを含み、４つの抗原分子に結合することができる多価の抗体構築物が記載されている（ＰＣＴ公開ＷＯ０１７７３４２およびＭｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（９）：４８５４−６１参照）。
【０００６】
リガンド−受容体系は、特異性を維持するために同時に進化してきた。それらの相互作用は、特定の生物活性に関して特定のシグナル伝達を活性化する。しかしながら、非リガンド−受容体結合タンパク質、例えば、単一特異性抗体、二重もしくは多重特異性結合タンパク質、非競合性抗体の組合せまたは受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する他の受容体結合タンパク質は、受容体リガンド−結合部位と異なるエピトープを認識し得る。受容体のＥＣＤに対するこのような異なるエピトープへの結合は、新たな予期しないシグナル伝達カスケードを生じ得る細胞内ドメインに立体構造変化を形質導入することがある。
【０００７】
米国特許第７，６１２，１８１号（この全体が参照により本明細書に組み込まれる。）は、二重可変ドメイン結合タンパク質（ＤＶＤ結合タンパク質）または二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（ＴＭ））と呼ばれる、高親和性を有する２つ以上の抗原に結合することが可能な結合タンパク質の新規なファミリーを提供する。ＤＶＤ分子は、同じ分子または同時に２つの異なる分子上の２つの異なるエピトープに結合することができる四価の二重特異的Ｉｇ様タンパク質である。ＤＶＤは、二価抗体のＮ末端に融合した２つの可変ドメインから構成される固有の結合タンパク質である。可変ドメインは、互いに直接融合されてもよく、または各種の長さおよびアミノ酸組成を有する合成ペプチドリンカーを介して直接接続されてもよい。ＤＶＤは、完全であり、機能的なＦｃドメインを用いて遺伝子操作され得て、次に適切なエフェクター機能を媒介することができる。ＤＶＤフォーマットは、抗体対の最適な柔軟性、２つの抗原結合ドメインの配向およびこれらを連結するリンカーの長さに起因して、新たな治療法を提供することができる。
【０００８】
種々の構造が当該技術分野において提供され、いくつかは利点と欠点を有するが、特定の構築物は、特定の標的に結合する特定の特性を有する多価結合タンパク質を調製するために必要とされる。さらに、新しい可変ドメイン配列は、結合タンパク質の特性をさらに改善することができる。具体的には、ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合する改良されたＤＶＤは有益であることを明らかにすることができた。したがって、本明細書には、米国特許第７，６１２，１８１号（この全体が参照により本明細書に組み込まれる。）において開示された結合タンパク質フレームワークを用いる二重可変ドメイン免疫グロブリンであって、ＶＥＧＦとＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成し、各々が第一および第二の可変ドメイン配列（例えば、表２に列挙されている配列）を含む、特定の第一および第二のポリペプチド鎖を含有する二重可変ドメイン免疫グロブリンが開示されている。いくつかの実施形態において、第一および第二のポリペプチド鎖は、各々が表２に列挙されている配列の１つからの３つのＣＤＲを含有し、ＶＥＧＦとＤＬＬ４について機能的結合部位を形成する、第一および第二の可変ドメイン配列を含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００１／７７３４２号
【特許文献２】米国特許第７，６１２，１８１号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（９）：４８５４−６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＤＬＬ４は、Ｎｏｔｃｈ受容体経路を介する細胞−細胞間シグナル伝達に関与するリガンドである。このような細胞−細胞間コミュニケーションは、分化、増殖およびホメオスタシスなどの多数の生物学的プロセスに必要である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、広範な真核生物によって利用される１つの系である。また、この経路、特にＮｏｔｃｈ受容体は、機能的な腫瘍血管新生に不可欠である。このようにして、Ｎｏｔｃｈ受容体機能の阻害、Ｎｏｔｃｈ受容体の遮断および／またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の遮断は、抗癌組成物および治療のための潜在的な戦略である。Ｎｏｔｃｈ受容体の小分子阻害剤は、多くの場合、身体中のＮｏｔｃｈ受容体の野生型（正常）組織発現を抑制するため、毒性があることが分かっている。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の異なるメンバーが、治療のための潜在的な標的と考えられるべきである。Ｎｏｔｃｈ受容体の脈管構造リガンドは、デルタ４またはデルタ様４（ＤＬＬ４）である。脈管構造において広く発現されるＤＬＬ４は、血管発生にとって重要である（Ｙａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１３（２４）：７２４３−７２４６（２００７年）；Ｓｈｕｔｔｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１４（１１）：１３１３−１３１８（２０００年）；Ｇａｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（４５）：１５９４９−１５９５４（２００４年）；Ｋｒｅｂｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１４（１１）：１３４３−１３５２（２０００年））。ＤＬＬ４についてヘテロ接合性のマウスは、血管発生の大きな欠陥のために、胚性に致死である（Ｇａｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１（４５）：１５９４９−１５９５４（２００４年）；Ｄｕａｒｔｅら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１８（２０）：２４７４−２４７８（２００４年）；Ｋｒｅｂｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１８（２０）：２４６９−２４７３（２００４年））。
【００１２】
ＤＬＬ４の発現は、ＶＥＧＦによって導入され得る（Ｌｉｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２３（１）：１４−２５（２００３年）；Ｌｏｂｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４（９）：３２１９−３２２４（２００７年））。ＶＥＧＦは、血管新生に関与する細胞によって生成されるシグナル伝達タンパク質である。さらに、ＤＬＬ４は、部分的にＶＥＧＦＲ２を抑制し、ＶＥＧＲ１を誘導することにより、ＶＥＧＦシグナル伝達を負に制御し得る（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、７５（２）：１４４−１５４（２００８年）；Ｓｕｃｈｔｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４（９）：３２２５−３２３０（２００７年））。機能的血管新生のためには、ＤＬＬ４およびＶＥＧＦ間の絶妙な協調が不可欠であり、ＤＬＬ４とＶＥＧＦの両方を治療的介入のための潜在的な標的とさせる。
【００１３】
また、ＤＬＬ４およびＶＥＧＦは、これらの生理学的役割に加えて、腫瘍血管において上方制御される（Ｇａｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１（４５）：１５９４９−１５９５４（２００４）；Ｍａｉｌｈｏｓら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、６９（２−３）：１３５−１４４（２００１）；Ｐａｔｅｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６５（１９）：８６９０−８６９７（２００５）；Ｐａｔｅｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１２（１６）：４８３６−４８４４（２００６）；Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４４４（７１２２）：１０３２−１０３７（２００６））。ＤＬＬ４の遮断は、複数のモデルにおいて原発腫瘍増殖を阻害することが示されている（Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４４４（７１２２）：１０３２−１０３７（２００６）；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｎａｔｕｒｅ、４４４（７１２２）：１０８３−１０８７（２００６）；Ｓｃｅｈｎｅｔら、Ｂｌｏｏｄ、１０９（１１）：４７５３−４７６０（２００７））。ＤＬＬ４の阻害は、抗ＶＥＧＦ治療に対して耐性である腫瘍に対してでさえ有効である。したがって、ＤＬＬ４とＶＥＧＦの両方のコンビナトリアル阻害は、抗腫瘍療法の増大を提供し得た。興味深いことに、腫瘍血管形成を低減するＶＥＧＦ阻害とは異なり、ＤＬＬ４遮断は、腫瘍脈管構造密度の増大につながり、この場合、血管は異常であり、効率的な血液輸送を支持できず、効率的に非機能的である。したがって、ＶＥＧＦとＤＬＬ４の両方の崩壊は、潜在的な抗癌処置に作用する異なる方法を提供する。
【００１４】
抗体および様々な結合構築物は当該技術分野に知られているが、例えば、癌および腫瘍形成（ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）を処置するために、ＶＥＧＦおよびＤＬＬ４へのより良好な標的と結合効率に対する必要性が残されている。このように、当該技術分野において、ＤＬＬ４およびＶＥＧＦに結合することができる、改良された多価の結合タンパク質に対する必要性がある。したがって、新規な結合タンパク質が提供され、ここで、結合タンパク質は、ＤＬＬ４およびＶＥＧＦに結合することができる。いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、例えば、ＤＬＬ４およびＶＥＧＦに結合することができ、改良された結合親和性および／または中和能力を有する。
【００１５】
２つのエピトープを標的とすることができる結合タンパク質が提供され、ここで、結合タンパク質は、ＤＬＬ４およびＶＥＧＦに結合することができる。一実施形態において、高親和性を有する、ＤＬＬ４とＶＥＧＦのエピトープに結合することができる結合タンパク質が提供される。一実施形態において、結合タンパク質は、表２に列挙されているＣＤＲおよび可変ドメイン配列を含有する二重可変ドメイン結合タンパク質フレームワークを含む。一実施形態において、二重可変ドメイン結合タンパク質フレームワークは、米国特許第７，６１２，１８１号（この全体が参照により本明細書に組み込まれる。）に開示されているフレームワークを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一実施形態において、２つの異なるタンパク質（ＶＥＧＦおよびＤＬＬ４）の２つのエピトープに結合し得るポリペプチド鎖を含む結合タンパク質が提供され、ここで、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は、第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の可変ドメインであり、Ｃは、定常ドメインであり、Ｘ１は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、Ｘ２は、Ｆｃ領域を表し、ｎは、０または１である。いくつかの実施形態において、結合タンパク質におけるＶＤ１およびＶＤ２は、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２は、ＤＬＬ４のエピトープとＶＥＧＦのエピトープに結合することができる。いくつかの実施形態において、Ｃは、重鎖定常ドメイン、例えばＣＨ１である。特定の実施形態において、Ｘ１は、リンカーであり、ただし、Ｘ１はＣＨ１ではない。
【００１７】
様々な実施形態において、本明細書に開示されている結合タンパク質は、ＤＬＬ４のエピトープとＶＥＧＦのエピトープに結合するポリペプチド鎖を含み、ここで、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインを含み、ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインを含み、Ｃは、重鎖定常ドメインを含み、Ｘ１は、リンカーを含み、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含む。一実施形態において、Ｘ１は、リンカーであり、ただし、それはＣＨ１ではない。一実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２重鎖可変ドメインは、それぞれ、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３におけるＣＤＲから選択される３つのＣＤＲ（すなわち、これらの配列番号のうちの１つからのＣＤＲ１から３）を含み、ここで、ＶＤ１および／またはＶＤ２重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号３９における３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、結合タンパク質は、ＤＬＬ４とＶＥＧＦを結合させることができる。一実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２重鎖可変ドメインは、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３を含み、ここで、ＶＤ１および／またはＶＤ２重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号３９を含む。
【００１８】
様々な実施形態において、本明細書に開示されている結合タンパク質は、ＤＬＬ４のエピトープとＶＥＧＦのエピトープに結合するポリペプチド鎖を含み、ここで、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーを含み、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まない。一実施形態において、Ｘ１は、リンカーであり、ただし、それはＣＨ１およびＣＬではない。一実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２軽鎖可変ドメインは、それぞれ、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２または５４におけるＣＤＲから選択される３つのＣＤＲ（すなわち、これらの配列番号のうちの１つからのＣＤＲ１から３）を含み、ここで、ＶＤ１および／またはＶＤ２軽鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号４０における３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、結合タンパク質は、ＤＬＬ４およびＶＥＧＦに結合することができる。一実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２軽鎖可変ドメインは、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２または５４を含み、ここで、ＶＤ１および／またはＶＤ２軽鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号４０を含む。
【００１９】
別の実施形態において、ＤＬＬ４のエピトープとＶＥＧＦのエピトープに結合する結合タンパク質が開示されている。いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、第一および第二のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一および第二のポリペプチド鎖のそれぞれは、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを独立して含み、ＶＤ１は、第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の可変ドメインであり、Ｃは、定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第一の機能的標的結合部位を形成し、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第二の機能的標的結合部位を形成する。一実施形態において、Ｘ２は、ｎ＝１の場合、Ｆｃ領域を含み、Ｘ２は、ｎ＝０の場合、Ｆｃ領域を含まない。いくつかの実施形態において、第一および第二のポリペプチド鎖上のＸ１配列は同じである。他の実施形態において、第一および第二のポリペプチド鎖上のＸ１配列は異なっている。いくつかの実施形態において、ポリペプチド鎖の少なくとも１つにあるＸ１は、ＣＨ１ドメインではなく、および／またはＣＬドメインではない。一実施形態において、Ｘ１配列は、短い（例えば、６、５、４、３または２個のアミノ酸）リンカーである。別の実施形態において、Ｘ１配列は、長い（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０個またはそれを超えるアミノ酸）リンカーである。別の実施形態において、２つのポリペプチド鎖のうちの１つにあるＸ１配列は短いリンカーであり、他のポリペプチド鎖上のＸ１配列は長いリンカーである。一実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２重鎖可変ドメインはそれぞれ、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３からの３つのＣＤＲ（すなわち、これらの配列番号のうちの１つからのＣＤＲ１から３）を含み、ここで、ＶＤ１および／またはＶＤ２重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号３９における３つのＣＤＲを含み、ＶＤ１およびＶＤ２軽鎖可変ドメインは、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２または５４からの３つのＣＤＲ（すなわち、これらの配列番号のうちの１つからのＣＤＲ１から３）を含み、ここで、ＶＤ１および／またはＶＤ２軽鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号４０における３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、結合タンパク質は、ＤＬＬ４およびＶＥＧＦに結合することができる。一実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２重鎖可変ドメインは、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３を含み、ここで、ＶＤ１および／またはＶＤ２重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号３９を含み、ＶＤ１およびＶＤ２軽鎖可変ドメインは、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２または５４を含み、ここで、ＶＤ１および／またはＶＤ２軽鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号４０を含む。
【００２０】
様々な実施形態において、ＶＥＧＦとＤＬＬ４に結合することができる結合タンパク質が開示されている。いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、第一および第二のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一および第二のポリペプチド鎖のそれぞれは、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを独立して含み、ＶＤ１は、第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の可変ドメインであり、Ｃは、定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、ここで、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第一の機能的標的結合部位を形成し、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第二の機能的標的結合部位を形成する。一実施形態において、ＶＥＧＦについて機能的標的結合部位を形成する可変ドメインは、配列番号４１からの３つのＣＤＲと配列番号４２からの３つのＣＤＲ（例えば、別々の鎖に存在する配列番号４１からのＣＤＲ１から３と配列番号４２からのＣＤＲ１から３、それぞれの鎖のＣＤＲは、特定の順番で配置され、適切なフレームワーク配列によって分離され、機能的結合部位を形成する。）を含む。一実施形態において、ＤＬＬ４について機能的標的結合部位を形成する可変ドメインは、配列番号３９からの３つのＣＤＲ１からと配列番号４０からの３つのＣＤＲ（例えば、別々の鎖に存在する配列番号３９からのＣＤＲ１から３と配列番号４０からのＣＤＲ１から３、それぞれの鎖のＣＤＲは、特定の順番で配置され、適切なフレームワーク配列によって分離され、機能的結合部位を形成する。）を含む。一実施形態において、結合タンパク質は、配列番号４１からの３つのＣＤＲと配列番号４２からの３つのＣＤＲ（例えば、配列番号４１からのＣＤＲ１から３と配列番号４２からのＣＤＲ１から３）を含む、ＶＥＧＦについての機能的標的結合部位、および配列番号３９からの３つのＣＤＲと配列番号４０からの３つのＣＤＲ（例えば、配列番号３９からのＣＤＲ１から３と配列番号４０からのＣＤＲ１から３）を含む、ＤＬＬ４についての機能的標的結合部位を含む。一実施形態において、結合タンパク質は、配列番号４１と配列番号４２を含む、ＶＥＧＦについての機能的標的結合部位、および配列番号３９と配列番号４０を含む、ＤＬＬ４についての機能的標的結合部位を含む。一実施形態において、結合タンパク質は、配列番号５６を含む第一のポリペプチド鎖、および配列番号６４を含む第二のポリペプチド鎖を含む。一実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７３を含む第一のポリペプチド鎖、および配列番号７４を含む第二のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４について結合部位を形成する可変ドメインは、米国出願公開第２０１１０２１７２３７号の可変ドメインを含み、および／またはＶＥＧＦについて結合部位を形成する可変ドメインは、米国出願公開第２０１０００７６１７８号の可変ドメインを含み、これらの文献は、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、結合タンパク質は、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖを含む。一実施形態において、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１  ＬＡＬ���変異体由来のＦｃ領域を含む。
【００２１】
ヒト治療薬、例えば、抗癌剤／抗腫瘍剤としての使用に適した結合タンパク質の開発および生産は、所望の標的に結合することができる結合タンパク質の同定よりも多くのことを必要とし得る。例えば、候補物は、この標的に結合するが、この所望の標的を阻害しまたは中和する能力の低下を示してもよく、安定に製剤化することが困難であることが明らかになってもよく、または適した発現系（例えば、ＣＨＯなどの宿主細胞における発現）において生成することが困難であることが明らかになってもよい。したがって、適した治療薬の開発において考慮すべき因子としては、限定されないが、（ａ）内部と外部の抗原結合ドメインの両方についての結合動態（結合速度、解離速度および親和性）、（ｂ）種々の生化学的アッセイおよび細胞バイオアッセイにおける効力、（ｃ）関連する腫瘍モデルにおけるインビボでの有効性、（ｄ）薬物動態学的および薬力学的特性、（ｅ）選択された細胞株におけるタンパク質発現レベル、拡張性、翻訳後修飾、物理化学的特性、例えば、モノマーの割合、溶解性および安定性（固有の安定性、凍結／解凍安定性、保存安定性など）を含む製造安定性、（ｆ）製剤特性、（ｇ）潜在的な免疫原性リスク、および（ｈ）分子の毒性が挙げられる。また、結合様式および結合価は評価され得て、それは、これらが分子の結合特性および細胞効力に影響を及ぼし得るためである。いくつかの結合タンパク質について、可変ドメイン、定常ドメインおよび／またはリンカーのアミノ酸配列のごく小さな変化は、これらの因子の１つ以上に潜在的に（正または負に）影響を与える可能性があり、そのため、因子の組み合わせは、リード候補物を選択するために評価され得る。リード候補物が同定されると、治療特性のさらなるインビボ評価が行われ、動物およびヒト対象における安全性、有効性および効力の評価が含まれる。
【００２２】
予想外に、配列番号５６と配列番号６４とを含む結合タンパク質または配列番号７３と配列番号７４とを含む結合タンパク質が、異なる可変ドメインおよび／またはリンカー配列を含む他の評価された結合タンパク質と比較して、この点において特性の優れた組み合わせ、例えば、治療的に有用な閾値を超える結合動態（すなわち、解離定数）、改善された中和能力、増大したインビボ有効性、優れた製剤化性、所望のグリコシル化パターン、好ましい薬物動態プロファイル、および宿主細胞における効率的な発現を示したことが見出された。比較された結合タンパク質には、同じ可変ドメイン配列と配向を有するが、異なるリンカーを有するタンパク質、ならびに変更された結合ドメイン配向および／または他の可変ドメイン配列（例えば、親和性成熟配列、十分なヒト配列など）を有するタンパク質が含まれ得る。いくつかの実施形態において、これらの優れた特性は、特定の可変ドメイン配列（例えば、配列番号３９−４２）の選択、内部および外部の位置におけるＶＥＧＦおよびＤＬＬ４結合ドメインの特定の配向（例えば、配列番号５６と配列番号６４において提供される配向）、特定のリンカー配列（例えば、配列番号５６において使用される重鎖可変ドメインと短いリンカー配列、ならびに配列番号６４において使用される軽鎖可変ドメインと長いリンカー配列）、および／または特定の定常ドメイン配列（例えば、配列番号７３と７４において使用される定常ドメイン配列）に依存する。いくつかの実施形態において、単にリンカー配列を変更することにより、機能的特性に大きな影響を与える場合がある。例えば、配列番号７３と７４において使用されるリンカー配列（これらの配列番号に含まれる可変ドメインおよび定常ドメインとともに）を選択することは、結合タンパク質のヒト治療特性に予想外の改善を提供し得る。例えば、表９は、結腸直腸腺癌および神経膠芽腫異種移植モデルにおいて測定した場合、インビボでの抗腫瘍効果において異なるリンカー配列の効果を示す。したがって、例えば、配列番号５６と６４または配列番号７３と７４における配列（そこに含まれるリンカー配列を含む。）を用いることは、インビボでの抗腫瘍効果における予想外の利益を生み出すことができる。
【００２３】
様々な実施形態において、本明細書に開示されている結合タンパク質は、例えば、ＶＥＧＦに対する抗体（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（Ｒ））またはＤＬＬ４に対する抗体（例えば、抗体ｈ１Ａ１１．１）について観察されたものとおよそ比較し得るレベルで、ＶＥＦＧおよび／またはＤＬＬ４について所望の結合親和性、遮断能力および／または中和効力を示す。いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、他の可変ドメイン配列とリンカーを含むＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質と比較して、ＶＥＦＧおよび／またはＤＬＬ４について、親和性、遮断能力および／または中和効力の増加を示す。いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、配列番号４１からの３つのＣＤＲと配列番号４２からの３つのＣＤＲを含むＶＥＧＦについての機能的標的結合部位、ならびに配列番号３９からの３つのＣＤＲと配列番号４０からの３つのＣＤＲを含むＤＬＬ４についての機能的標的結合部位を含み、または配列番号４１と配列番号４２を含むＶＥＧＦについての機能的標的結合部位、ならびに配列番号３９と配列番号４０を含むＤＬＬ４についての機能的標的結合部位を含み、または配列番号５６と配列番号６４を含み、または配列番号７３と配列番号７４とを含む。例えば、結合タンパク質（例えば、配列番号５６と配列番号６４とを含む結合タンパク質または配列番号７３と配列番号７４とを含む結合タンパク質）は、ＶＥＧＦに結合することができ、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、解離定数（ＫＤ）は最大約７．０×１０−１０Ｍであり、および／またはＶＥＧＦ活性を遮断することができ、ＶＥＧＦＲ１競合ＥＬＩＳＡにおいて測定された場合、ＩＣ５０は最大約３．８ｎＭであり、および／またはＤＬＬ４に結合することができ、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、解離定数（ＫＤ）は最大約１．０×１０−８Ｍであり、および／またはＤＬＬ４活性を遮断することができ、Ｎｏｔｃｈ競合ＥＬＩＳＡにおいて測定された場合、ＩＣ５０は最大約１．０９ｎＭである。
【００２４】
いくつかの実施形態において、結合タンパク質（例えば、配列番号５６と配列番号６４を含む結合タンパク質、または配列番号７３と配列番号７４を含む結合タンパク質）は、ＶＥＧＦ抗体とＤＬＬ４抗体（例えば、結合タンパク質についての可変ドメインを提供するために使用される親抗体）の混合物と比較して、ＶＥＧＦの存在下である場合も、ＤＬＬ４についての中和効力の増加を示し得る。いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、ＶＥＧＦ抗体とＤＬＬ４抗体（例えば、結合タンパク質について可変ドメインを提供するために使用される親抗体）の混合物と比較して、ＶＥＧＦの存在下である場合も、ＤＬＬ４についての中和効力の一桁大きい増加を示し得る。例えば、表２４は、配列番号７３と配列番号７４を含む結合タンパク質が、ＶＥＧＦ抗体とＤＬＬ４抗体（結合タンパク質についての可変ドメインを提供するために使用される親抗体）の混合物と比較して、少なくとも約１．２ｎＭ  ＶＥＧＦ（例えば、少なくとも約１．２、１．５、２、２．５、５、１０、５０、１５０またはそれらを超える。）の存在下である場合も、ＤＬＬ４についての中和効力の一桁大きい増加を示し得る。このＤＬＬ４中和効力は有益であり得て、これは、腫瘍に対する治療のインビボ状況において、ＶＥＧＦレベルは、通常、血液循環におけるよりも腫瘍の近辺において高く、一般的に、腫瘍部位での改善された標的化と増大した機能的ＤＬＬ４中和活性の両方を可能にする。
【００２５】
様々な実施形態において、結合タンパク質（例えば、配列番号５６と配列番号６４とを含む結合タンパク質または配列番号７３と配列番号７４とを含む結合タンパク質）は、癌および／または血管新生した腫瘍に対する他の治療と比較して、改善された特性、例えば、改善された安全性、増加した安定性、より大きな効力、減少した炎症もしくは免疫応答、またはインビボでのヒト治療特性に有益な他のものを示す。比較に適した治療には、小分子抗癌剤、ＶＥＧＥに対する抗体（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（Ｒ））および／またはＤＬＬ４（例えば、抗体ｈ１Ａ１１．１）、または他の可変ドメイン配列および／またはリンカーを含むＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質の投与が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、癌および／または血管新生した腫瘍に対する療法の現在の標準と比較して、改善された特性を示す。例えば、結合タンパク質は、改善された結合動態、優れたインビボでの治療効果、増大した製剤化性（凝集減少および改善された保存安定性を含む。）、改善された薬物動態、減少した炎症または免疫応答、および／または増大した宿主細胞発現レベルを示すことができる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、結合タンパク質（例えば、配列番号５６と配列番号６４とを含む結合タンパク質または配列番号７３と配列番号７４とを含む結合タンパク質）は、１つ以上の抗癌剤と組み合わせた抗ＶＥＧＦ抗体もしくは抗ＤＬＬ４抗体と比較して、または１つ以上の抗癌剤と組み合わせた他の可変ドメイン配列および／もしくはリンカーを含むＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質と比較して、１つ以上の抗癌剤と組み合わせた優れた（例えば、相加的および／または超相加的）効果を示す。例えば、優れた結合特性は、表２７−３０および３４において同定されたものであってもよい。例えば、結合タンパク質は、処置されていない腫瘍と比較して、単独でまたは１つ以上の抗癌剤と組み合わせた投与後に、腫瘍増殖の少なくとも約５０％もしくはそれより大きい（例えば、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０％またはそれらを超える。）阻害または腫瘍増殖の遅延を示すことができる。抗癌剤は、例えば、１つ以上のイリノテカン、ＦＯＬＦＩＲＩ、テモゾロミド、ゲムシタビン、パクリタキセル、５−ＦＵおよびカペシタビン、または特定の癌の処置に使用される任意の他の小分子または生物剤であってもよい。単独または１つ以上の抗癌剤と組み合わせた結合タンパク質は、例えば、結腸癌、膠芽腫、膵臓癌または乳癌を処置するための医薬として用いることができる。
【００２７】
一実施形態において、二重改変ドメイン（ＤＶＤ−Ｉｇ）結合タンパク質は、先の段落に記載されている２つの第一のポリペプチド鎖と２つの第二のポリペプチド鎖（すなわち、４つのポリペプチド鎖を含む。）を含み、ここで、ポリペプチド鎖のそれぞれは、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は、第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の可変ドメインであり、Ｃは、定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１である。いくつかの実施形態において、第一鎖は、重鎖であり、軽鎖である第二鎖と対を形成する。このようなＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は、４つの機能的標的結合部位を含む。いくつかの実施形態において、第一および第二のポリペプチド鎖上のＸ１リンカーは、同一または異なっている。いくつかの実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は、いずれかの配向で、同一または異なるタンパク質の２つ以上のエピトープ（例えば、２つ、３つまたは４つ）に結合することができる少なくとも２つの可変ドメイン配列（例えば、ＶＤ１およびＶＤ２）を含む。いくつかの実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２は、独立して選択される。一実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２重鎖可変ドメインはそれぞれ、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３からの３つのＣＤＲを含み、ここで、ＶＤ１および／またはＶＤ２重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号３９における３つのＣＤＲを含み、ＶＤ１およびＶＤ２軽鎖可変ドメインは、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２または５４からの３つのＣＤＲを含み、ここで、ＶＤ１および／またはＶＤ２軽鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号４０における３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、結合タンパク質は、ＤＬＬ４およびＶＥＧＦに結合することができる。一実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２重鎖可変ドメインはそれぞれ、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３を含み、ここで、ＶＤ１および／またはＶＤ２重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号３９を含み、ＶＤ１およびＶＤ２軽鎖可変ドメインはそれぞれ、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２または５４を含み、ここで、ＶＤ１および／またはＶＤ２軽鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号４０を含む。
【００２８】
別の実施形態において、二重改変ドメイン結合タンパク質は、表２に示されている重鎖および軽鎖配列を含み、ここで、ＶＤ１および／もしくはＶＤ２重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号３９を含み、ならびに／またはＶＤ１および／もしくはＶＤ２軽鎖可変ドメインの少なくとも１つは、配列番号４０を含む。
【００２９】
さらなる実施形態において、重鎖、軽鎖、２本鎖または４本鎖の実施形態のいずれかは、配列番号１−３８から選択されるリンカーを含む少なくとも１つのＸ１リンカーを含む。一実施形態において、Ｘ２はＦｃ領域である。別の実施形態において、Ｘ２は可変Ｆｃ領域である。
【００３０】
さらに別の実施形態において、Ｆｃ領域は、第一のポリペプチド中に存在する場合、天然配列Ｆｃ領域またはバリアント配列Ｆｃ領域である。さらに別の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１のＦｃ領域、ＩｇＧ２のＦｃ領域、ＩｇＧ３のＦｃ領域、ＩｇＧ４のＦｃ領域、ＩｇＡのＦｃ領域、ＩｇＭのＦｃ領域、ＩｇＥのＦｃ領域またはＩｇＤのＦｃ領域である。特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＨＩＶウイルスに対して保護を付与するｂ１２抗体の変異体であるヒトＩｇＧ１  ＬＡＬＡ変異体由来のＦｃ領域である。
【００３１】
２つの異なる標的タンパク質に結合する結合タンパク質を作製する方法が提供される。一実施形態において、結合タンパク質を作製する方法は、第一のエピトープに結合する第一の親抗体またはその抗原結合部分を得る工程；ｂ）第二のエピトープに結合する第二の親抗体またはその抗原結合部分を得る工程；ｃ）本明細書に記載されている結合タンパク質のいずれかをコードする構築物を調製する工程；およびｄ）ポリペプチド鎖を発現させ、第一および第二のエピトープに結合する結合タンパク質を生じさせる工程を含む。
【００３２】
本明細書における実施形態のいずれかにおいて、存在する場合、ＶＤ１重鎖可変ドメイン、および存在する場合、軽鎖可変ドメインは、第一の親抗体またはその抗原結合部分由来であってもよく；存在する場合、ＶＤ２重鎖可変ドメイン、および存在する場合、軽鎖可変ドメインは、第二の親抗体またはその抗原結合部分由来であってもよい。第一および第二の親抗体は同じであってもよくまたは異なってもよい。
【００３３】
一実施形態において、第一の親抗体またはその抗原結合部分は第一の抗原に結合し、第二の親抗体またはその抗原結合部分は第二の抗原に結合する。一実施形態において、第一および第二の抗原は異なる抗原である。別の実施形態において、第一の親抗体またはその抗原結合部分は、第二の親抗体またはその抗原結合部分が第二の抗原に結合する効力と異なる効力で第一の抗原に結合する。さらに別の実施形態において、第一の親抗体またはその抗原結合部分は、第二の親抗体またはその抗原結合部分が第二の抗原に結合する親和性と異なる親和性で第一の抗原に結合する。
【００３４】
別の実施形態において、第一の親抗体またはその抗原結合部分および第二の親抗体またはその抗原結合部分は、ヒト抗体、ＣＤＲ移植された抗体、ヒト化抗体および／または親和性成熟された抗体である。
【００３５】
別の実施形態において、結合タンパク質は、第一の親抗体もしくはその抗原結合部分によってまたは第二の親抗体もしくはその抗原結合部分によって示される少なくとも１つの所望の特性を有する。あるいは、第一の親抗体もしくはその抗原結合部分または第二の親抗体もしくはその抗原結合部分は、結合タンパク質によって示される少なくとも１つの所望の特性を有する。一実施形態において、所望の特性は、１つ以上の抗体パラメーターである。別の実施形態において、抗体パラメーターは、抗原特異性、抗原に対する親和性、効力、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、可溶性、生産効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用率、組織交差反応性またはオルソロガス抗原結合性である。一実施形態において、結合タンパク質は多価である。別の実施形態において、結合タンパク質は多重特異的である。本明細書に記載されている多価および／または多重特異的結合タンパク質は、特に治療的見地から望ましい特性を有する。例えば、多価および／または多重特異的結合タンパク質は、（１）抗体が結合する抗原を発現している細胞によって、二価抗体より速く内部に取り込まれる（および／または異化される）；（２）タンパク質に結合するアゴニストであり；および／または（３）多価結合タンパク質が結合することができる抗原を発現している細胞の細胞死および／またはアポトーシスを誘導し得る。多価および／または多重特異的結合タンパク質の少なくとも１つの抗原結合特異性を提供する「親抗体」は、抗体が結合する抗原を発現している細胞によって内部に取り込まれ（および／または異化される）抗体であり得、および／またはアゴニスト、細胞死誘導および／またはアポトーシス誘導抗体であり得、本明細書に記載されている多価および／または多重特異的結合タンパク質は、これらの特性の１つ以上の改善を示し得る。さらに、親抗体は、これらの特性の任意の１つ以上を欠損してもよいが、本明細書に記載されるように、多価結合タンパク質として構築された場合、これらの１つ以上を取得してもよい。
【００３６】
別の実施形態において、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１；または少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１のうちの１つ以上の標的への結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。一実施形態において、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、約１０２Ｍ−１ｓ−１から約１０３Ｍ−１ｓ−１、約１０３Ｍ−１ｓ−１から約１０４Ｍ−１ｓ−１、約１０４Ｍ−１ｓ−１から約１０５Ｍ−１ｓ−１、または約１０５Ｍ−１ｓ−１から約１０６Ｍ−１ｓ−１の、１つ以上の標的に対する結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。
【００３７】
別の実施形態において、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約１０−２ｓ−１；最大約１０−３ｓ−１；最大約１０−４ｓ−１；最大約１０−５ｓ−１；または最大約１０−６ｓ−１のうちの１つ以上の標的への解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。一実施形態において、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、約１０−２ｓ−１から約１０−３ｓ−１の、約１０−３ｓ−１から約１０−４ｓ−１の、約１０−４ｓ−１から約１０−５ｓ−１の、または約１０−５ｓ−１から約１０−６ｓ−１の間の、１つ以上の標的に対する解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。
【００３８】
別の実施形態において、結合タンパク質は、１つ以上の標的に対する平衡解離定数（ＫＤ）が、最大約１０−７Ｍ；最大約１０−８Ｍ；最大約１０−９Ｍ；最大約１０−１０Ｍ；最大約１０−１１Ｍ；または最大約１０−１２Ｍである。一実施形態において、結合タンパク質は、この標的に対する平衡解離定数（ＫＤ）が、約１０−７Ｍから約１０−８Ｍ；約１０−８Ｍから約１０−９Ｍ；約１０−９Ｍから約１０−１０Ｍ；約１０−１０Ｍから約１０−１１Ｍ；または約１０−１１Ｍから約１０−１２Ｍである。
【００３９】
いくつかの実施形態において、抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ結合タンパク質は、抗ＤＬＬ４抗体または抗ＶＥＧＦ抗体と比較して、効力の増加（例えば、ＤＬＬ４および／またはＶＥＧＦ活性に干渉し、阻害および／または中和する能力の増加）を示す。いくつかの実施形態において、結合タンパク質の効力は、ＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４活性を評価するための任意のアッセイ、例えば、ＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４結合ＥＬＩＳＡアッセイ、ＢＩＡＣＯＲＥ（ＴＭ）アッセイ、ＤＬＬ４−Ｎｏｔｃｈ受容体アッセイ、ＶＥＧＦ刺激された内因性細胞増殖／生存アッセイ、または当業者に公知の任意の他のアッセイにおいて評価され得る。いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、ＶＥＧＦの存在下で、ＤＬＬ４効力の増加を示す。
【００４０】
別の実施形態において、本明細書に記載されている結合タンパク質のいずれかを含み、さらにある薬剤を含むコンジュゲートが提供される。一実施形態において、抗原は、免疫接着分子、造影剤、治療剤または細胞毒性剤である。一実施形態において、造影剤は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識またはビオチンである。別の実施形態において、放射性標識は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍである。さらに別の実施形態において、治療剤または細胞毒性剤は、代謝抑制剤、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、トキシンまたはアポトーシス剤である。いくつかの実施形態において、薬剤は、イリノテカン、ロイコボリン、５−ＦＵ、テモゾロミド、ゲムシタビンおよびパクリタキセルの１つ以上である。一実施形態において、薬剤はイリノテカンである、一実施形態において、薬剤はロイコボリンである。一実施形態において、薬剤は５−ＦＵである。一実施形態において、薬剤は、イリノテカン、ロイコボリンおよび５−ＦＵである。一実施形態において、薬剤はテモゾロミドである。一実施形態において、薬剤はゲムシタビンである。一実施形態において、薬剤はパクリタキセルである。
【００４１】
別の実施形態において、コンジュゲートは、結合タンパク質および薬剤を含む。一実施形態において、コンジュゲートにおける結合タンパク質は、第一および第二のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一および第二のポリペプチド鎖のそれぞれは、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを独立して含み、ＶＤ１は、第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の可変ドメインであり、Ｃは、定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第一の機能的標的結合部位を形成し、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第二の機能的標的結合部位を形成し、結合タンパク質は、ＶＥＧＦとＤＬＬ４に結合することができる。いくつかの実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２は、表２に開示されている配列のいずれかからのＣＤＲまたは可変ドメイン配列を含み、対を形成し、ＶＥＧＦとＤＬＬ４について機能的結合部位を形成するために配置される。一実施形態において、コンジュゲートにおける薬物は、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、免疫調節剤、遺伝子治療用ベクター、アルキル化剤、抗血管新生剤、代謝拮抗剤、ホウ素含有剤、化学保護剤、ホルモン、抗ホルモン剤、副腎皮質ステロイド、光活性治療剤、オリゴヌクレオチド、放射性核種剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤および放射線増感剤からなる群から選択される。別の実施形態において、薬剤は、イクセンプラ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＰＥ、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤまたはアウリスタチンＤ誘導体）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥまたはアウリスタチンＥ誘導体）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦまたはアウリスタチンＦ誘導体）、アウリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、５−ベンゾイル吉草酸−ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、メトトレキサート、ダウノルビシン、ビンクリスチン、メイタンシン、メイタンシノール、メイタンシノールのＣ−３エステル、アンサマイトシンＰ１、アンサマイトシンＰ２、アンサマイトシンＰ３、アンサマイトシンＰ４、ドセタキセル、パクリタキセル、ナノ粒子パクリタキセル、硫酸ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、アクチノマイシン、アクチノマイシンＤ、アントラマイシン、キカマイシンＡ、ＤＣ−１８、マゼトラマイシン、ネオトラマイシンＡ、ネオトラマイシンＢ、プロトラカルシンＢ、ＳＧ２２８５、シバノマイシン、シビロマイシン、アントラサイクリン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、カリケアマイシン、γ１’、α２’、α３’、Ｎ−アセチルγ１’、ＰＳＡＧ、θ’１、デュオカルマイシン、アドゼレシン、ビゼレシン、およびカルゼレシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、バチルスカルメット−ゲラン（ＢＣＧ）、レバミゾール、癌ワクチン、組換え二価ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチン１６および１８型ワクチン、組換え四価ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）６、１１、１６および１８型ワクチン、シ��リューセル−Ｔ、サイトカイン、副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン、肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子、ミュラー管阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＮＧＦなどの神経成長因子、血小板増殖因子、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様増殖因子−ＩおよびＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロンα、βおよびγなどのインターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−Ｃ−ＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子および他のポリペプチド因子、例えば、ＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）、コロニー刺激因子、エリスロポエチン（エポエチン）、フィルグラスチム、サルグラモスチム、プロメガポイエチン、オプレルベキン、免疫調節遺伝子治療剤、癌と関連した、変異したまたは他には機能不全（例えば、切断された）遺伝子を置換するために使用される機能的な治療的遺伝子をコードする核酸、癌を処置するための治療的タンパク質をコードするまたは他にはこの生成のために提供する核酸、スルホン酸アルキル、ブスルファン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、およびメルファラン、ニトロソウレア、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ストレプトゾシン、トリアジンおよびヒドラジン、ダカルバジン、プロカルバジン、テモゾロミド、エチレンイミン、チオペタ（ｔｈｉｏｐｅｔａ）、ジアジコン、マイトマイシンＣ、メチルアミン誘導体、エポキシド、アルトレタミン、ジアンヒドロガラクチトール、ジブロモズルシトール、アンジオスタチン、ＡＢＸ  ＥＦＧ、Ｃ１−１０３３、ＰＫＩ−１６６、ＥＧＦワクチン、ＥＫＢ−５６９、ＧＷ２０１６、ＩＣＲ−６２、ＥＭＤ５５９００、ＣＰ３５８、ＰＤ１５３０３５、ＡＧ１４７８、ＩＭＣ−Ｃ２２５、ＯＳＩ−７７４、エルロチニブ、アンジオスタチン、アレスチン、エンドスタチン、ＢＡＹ１２−９５６６、ｗ／フルオロウラシルまたはドキソルビシン、カンスタチン、カルボキシアミドトリオゾールおよびパクリタキセルともに、ＥＭＤ１２１９７４、Ｓ−２４、ビタキシン、ジメチルキサンテノン酢酸、ＩＭ８６２、インターロイキン−１２、インターロイキン−２、ＮＭ−３、ＨｕＭＶ８３３、ＰＴＫ７８７、ＲｈｕＭＡｂ、アンジオザイム、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ネオバスタット、マリムスタット、プリノマスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、ＣＯＬ−３、ＭＭ１２７０、ＳＵ１０１、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、ＳＵ５４１６、パクリタキセルとともに、ゲムシタビンとシスプラチンとともに、イリノテカンと���スプラチンとともにおよび放射線とともに、テコガラン、テモゾロミドおよびＰＥＧインターフェロンα２ｂ、テトラチオモリブデン酸、ＴＮＰ−４７０、サリドマイド、ＣＣ−５０１３およびタキソテレとともに、タムスタチン、２−メトキシエストラジオール、ＶＥＧＦトラップ、ｍＴＯＲ阻害剤（デフォロリムス、エベロリムスおよびテムシロリムス）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、ゲフィチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、ニロチニブ、ラパチニブ、ソラフェニブ、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、葉酸アンタゴニスト、メトトレキサート、４−アミノ葉酸、ロメトレキソール、ペメトレキセド、トリメトレキサート、ピリミジンアンタゴニスト、アザシチジン、カペシタビン、シタラビン、デシタビン、５−フルオロウラシル、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン−５’−リン酸、５−フルオロウリジントリホスフェート、ゲムシタビン、フロクスウリジン（ｆｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、プリンアンタゴニストアザチオプリン、クラドリビン、メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、６−チオグアニン、アデノシンデアミナーゼ阻害剤、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、ペントスタチン、ボロフィシン、ボルテゾミブ、化学保護剤、アミフォスチン、デクスラゾキサン、メスナ、アンドロゲン、エストロゲン、酢酸メドロキシプロゲステロン、プロゲスチン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、ビカルタミド、クロロトリアニセス（ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｎｉｓｅｓ）、酢酸シプロテロン、デガレリクス、エキセメスタン、フルタミド、フルベストラント、ゴセレリン、レトロゾール、ロイプロリド、ルプロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、タモキシフェン、トリプトレリン、アスパラギナーゼ、ダカルバジン、ヒドロキシ尿素、レバミゾール、ミトタン、プロカルバジン、トレチノイン、グルココルチコイド、プレドニゾン、クロマゲン、染料、天然に存在するまたは標準的なおよび／もしくは非標準的なヌクレオチドを用いて合成されるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含む。）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマー、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、リボザイム、アンジオザイム、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、Ｉ２５Ｉ、Ｉ３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、Ｉ０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１’Ｐｂ、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１  １、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、Ｉｒ−１９２、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１  １、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａ���−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｆｍ−２５５、１１Ｃ、１３Ｎ、１５０、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、Ｉ０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、，１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、Ｉ６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、！６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、Ｉ６９Ｙｂ、タキサン、シスプラチン、メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、Ｅ０９、ＲＢ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）、ヒドロキシウレア、ヘマトポルフィリン誘導体、フォトフリン（ｒ）、ベンゾポルフィリン誘導体、ＮＰｅ６、スズエチオポルフィリン（ＳｎＥＴ２）、フェオホルビドａ、バクテリオクロロフィルａ、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、カンプトテシン、イリノテカン、
トポテカン、アムサクリン、ダウノルビシン、ドキソトルビシン（ｄｏｘｏｔｒｕｂｉｃｉｎ）、エピポドフィロトキシン、エリプチシン、エピルビシン、エトポシド、ラゾキサン、テニポシド、アキシチニブ、ボスチニブ、セジラニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、ニロチニブ、セマキサニブ、スニチニブ、バンデタニブ、アブリン、アブリンＡ鎖、アルファトキシン、シナアブラギリタンパク質、アマトキシン、クロチン、クルシン、ジアンチンタンパク質、ジフテリア毒素、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）、ゲロニン、マイトゲリン、モデシンＡ鎖、ゴーヤー阻害剤、ネオマイシン、オンコナーゼ、フェノマイシン、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、シュードモナス内毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａ鎖、レストリクトシン、リシン、リシンＡ鎖、リボヌクレアーゼ（Ｒｎａｓｅ）、サポナリア・オフィキナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、サポリン、アルファ−サルシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、破傷風毒素、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチン（エロキサチン、Ｓａｎｏｆｉ  Ａｖｅｎｔｉｓ）、プロテアソーム阻害剤、ＰＳ−３４１、ＨＤＡＣ阻害剤、ボリノスタット、ベリノスタット、エチノスタット、モセチノスタット、パノビノスタット、ＣＯＸ−２阻害剤、置換尿素、熱ショックタンパク質阻害剤、ゲルダナマイシン、副腎皮質抑制剤、トリコテセン、Ａ１２、１９Ｄ１２、Ｃｐ７５１−８７１、Ｈ７Ｃ１０、アルファＩＲ３、ＳｃＦｖ／ＦＣ、ＥＭ／１６４、マツズマブ、エルビタックス、ベクチビックス、ｍＡｂ８０６、ニモツクマブ（Ｎｉｍｏｔｕｘｕｍａｂ）、ＡＶＥＯ、ＡＭＧ１０２、５Ｄ５（ＯＡ−５ｄ５）、Ｈ２４４Ｇ１１、Ａｂ＃１４（ＭＭ１２１−１４）、ハーセプチン、１Ｂ４Ｃ３；２Ｄ１Ｄ１２、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１−Ａ、ＢＭＳ−５３６，９２４（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−１Ｈ−ピリジン−２−オン）、ＢＭＳ−５５４，４１７、シクロリガン、ＴＡＥ２２６、ＰＱ４０１、イレッサ、ＣＩ−１０３３（ＰＤ１８３８０５）、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６）、タイケルブ、タルセバ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ−１５８７８０、ＥＫＢ−５６９、チルホスチンＡＧ１４７８（４−（３−クロロアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン）、ＰＨＡ６６５７５２、ＡＲＱ１９７、カペシタビン、５−トリフルオロメチル−２’−デオキシウリジン、メトトレキサートナトリウム、ラルチトレキシド、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラビノシド（シタラビン）、５−アザシチジン、６−メルカプトプリン（メルカプトプリン、６−ＭＰ）、アザチオプリン、６−チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン（２−ＣｄＡ、２−クロロデオキシアデノシン）、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、シクロホスファミド、ネオザール、イホスファミド、チオテパ、ＢＣＮＵ→１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトソウレア、ＣＣＮＵ→１−（２−クロロエチル）−３−シクロヘキシル−１−ニトロソウレア（メチルＣＣＮＵ）、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、プロカルバジンＨＣＬ、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、クロラムブシル、メルファラン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ドキソルビシンＨＣＬ、クエン酸ダウノルビシン、ミトキサントロンＨＣＬ、アクチノマイシンＤ、エトポシド、トポテカンＨＣｌ、テニポシド、イリノテカンＨＣＬ（ＣＰＴ−ＩＩ）、ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、酒石酸ビノレルビン、ビンデシン硫酸、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、イクサベピロン、メシル酸イマチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ソラフェニブトスラート（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ  ｔｏｓｌａｔｅ）、ニロチニブ塩酸塩一水和物、Ｌ−アスパラギナーゼ、アルファインターフェロン、アバスチン、ＩＬ−２、アルデスロイキン、プロロイキン、ＩＬ−１２、クエン酸トレミフェン、フルベストラント、ラロキシフェンＨＣＬ、アナストロゾール、レトロゾール、ファドロゾール（ＣＧＳ１６９４９Ａ）、エキセメスタン、酢酸ロイプロリド、ルプロン、酢酸ゴセレリン、パモ酸トリプトレリン、ブセレリン、ナファレリン、セトロレリクス、ビカルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ソマトスタチン類似体、プレンジンソロン（ｐｒｅｎｄｉｎｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン、ケトコナゾール、シロリムス、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、デフォロリムス（ＡＰ２３５７３）、イリノテカン；ロイコボリン；フォルフィリ；５−ＦＵ；エナラプリル；ニフェジピン；クロニジン；テモゾロミド；ゲムシタビン；カペシタビン；パクリタキセル；レゴラフェニブ；ペルツズマブおよびエベロリムス（ＲＡＤ００Ｉ）からなる群から選択される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている１つ以上の結合タンパク質および１つ以上の追加の薬剤、例えば、化学療法剤を含む組成物が開示されている。例えば、組成物は、１つ以上の追加の薬剤を含む溶液中の１つ以上の結合タンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態において、薬剤は、イリノテカン、ロイコボリン、５−ＦＵ、テモゾロミド、ゲムシタビンおよびパクリタキセルのうちの１つ以上である。一実施形態において、薬剤はイリノテカンである。一実施形態において、薬剤はロイコボリンである。一実施形態において、薬剤は５−ＦＵである。一実施形態において、薬剤は、イリノテカン、ロイコボリンおよび５−ＦＵである。一実施形態において、薬剤はテモゾロミドである。一実施形態において、薬剤はゲムシタビンである。一実施形態において、薬剤はパクリタキセルである。
【００４３】
別の実施形態において、結合タンパク質は結晶化された結合タンパク質であり、結晶として存在する。一実施形態において、この結晶は、無担体医薬徐放結晶である。別の実施形態において、結晶化された結合タンパク質は、この結合タンパク質の可溶性対応物より大きなインビボ半減期を有する。さらに別の実施形態において、結晶化された結合タンパク質は生物学的活性を保持する。
【００４４】
別の実施形態において、本明細書に記載されている結合タンパク質はグリコシル化される。例えば、グリコシル化パターンは、ヒトグリコシル化パターンである。
【００４５】
本明細書に開示されている結合タンパク質のいずれか１つをコードする単離された核酸も提供される。さらなる実施形態は、本明細書に開示されている単離された核酸を含むベクターを提供し、ベクターは、ｐｃＤＮＡ；ｐＴＴ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２）；ｐＴＴ３（追加の多重クローニング部位を有するｐＴＴ）；ｐＥＦＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ、（１９９０年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：（１７）；ｐＢＶ；ｐＪＶ；ｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯ；ｐＥＦ６  ＴＯＰＯ；ｐＢＯＳ；ｐＨｙｂＥ；またはｐＢＪである。一実施形態において、ベクターは、米国特許公開第２００９０２３９２５９号に開示されているベクターである。
【００４６】
別の態様において、宿主細胞は、本明細書に開示されたベクターで形質転換される。一実施形態において、宿主細胞は原核細胞、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。別の実施形態において、宿主細胞は真核細胞、例えば、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞または真菌細胞である。一実施形態において、宿主細胞は、これらに限定されないが、ＣＨＯ、ＣＯＳ；ＮＳ０、ＳＰ２、ＰＥＲ．Ｃ６を含む哺乳動物細胞；またはサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの真菌細胞；またはＳｆ９などの昆虫細胞である。一実施形態において、異なる特異性を有する２つまたはそれ以上の結合タンパク質は、単一の組換え宿主細胞中で生産される。例えば、抗体の混合物の発現は、Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（ＴＭ）（Ｍｅｒｕｓ  Ｂ．Ｖ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）米国特許第７，２６２，０２８号および第７，４２９，４８６号と呼ばれている。
【００４７】
結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、本明細書に開示されている宿主細胞のいずれか１つを培地中において培養することを含む、本明細書に開示されている結合タンパク質を生産する方法が提供される。一実施形態において、この方法によって生産された結合タンパク質の５０％から７５％が、二重特異的四価結合タンパク質である。別の実施形態において、この方法によって生産された結合タンパク質の７５％から９０％が、二重特異的四価結合タンパク質である。別の実施形態において、生産された結合タンパク質の９０％から９５％が、二重特異的四価結合タンパク質である。
【００４８】
一実施形態は、結合タンパク質の放出のための組成物を提供し、この組成物は、結晶化された結合タンパク質、成分、および少なくとも１つのポリマー性担体を含む。一実施形態において、ポリマー担体は、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリラート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）またはＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブチラート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテル共重合体、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギナート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸化多糖またはこれらの混和物および共重合体である。一実施形態において、成分は、アルブミン、ショ糖、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールである。
【００４９】
別の実施形態は、本明細書に開示された組成物の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む哺乳動物を治療する方法を提供する。
【００５０】
本明細書に開示された結合タンパク質および医薬として許容される担体を含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、この医薬組成物は、疾患を治療するための少なくとも１つの追加の治療剤を含む。例えば、追加の薬剤は、治療剤、化学治療剤、造影剤、細胞毒性剤、血管新生阻害剤、キナーゼ阻害剤（ＫＤＲおよびＴＩＥ−２阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。）、共刺激分子調節剤（抗Ｂ７．１、抗Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ２０が含まれるが、これらに限定されない。）、接着分子遮断剤（抗ＬＦＡ−１抗体、抗Ｅ／Ｌセレクチン抗体、小分子阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。）、抗サイトカイン抗体またはその機能的断片（抗ＩＬ−１８、抗ＴＮＦまたは抗ＩＬ−６／サイトカイン受容体抗体が含まれるが、これらに限定されない。）、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ；抗ＤＬＬ４  ｍＡｂ；メトトレキサート、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６；検出可能な標識またはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔、鎮静剤、局所麻酔、神経筋肉遮断剤、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化、イムノグロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン置換薬、放射性薬剤、抗うつ剤、抗精神病薬、刺激物質、喘息薬、βアゴニスト、吸引用ステロイド、エピネフリンまたは類似体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストであり得る。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は化学療法剤である。いくつかの実施形態において、追加の薬剤は、イリノテカン、ロイコボリン、５−ＦＵ、テモゾロミド、ゲムシタビンおよびパクリタキセルの１つ以上である。一実施形態において、薬剤はイリノテカンである。一実施形態において、薬剤はロイコボリンである。一実施形態において、薬剤は５−ＦＵである。一実施形態において、薬剤はイリノテカン、ロイコボリンおよび５−ＦＵである。一実施形態において、薬剤はテモゾロミドである。一実施形態において、薬剤はゲムシタビンである。一実施形態において、薬剤はパクリタキセルである。
【００５１】
様々な実施形態において、ＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４を標的とすることによって診断および／または処置され得る障害（例えば、任意の血管新生障害またはＶＥＧＦおよび／もしくはＤＬＬ４の異常発現と関連した任意の他の障害）を患っているヒト対象を診断および／または処置するための方法が提供され、ヒト対象に本明細書に開示されている結合タンパク質を投与することを含み、それにより、ヒト対象における標的の活性が阻害され、１つ以上の症状が軽減されまたは処置が達成される。本明細書において提供されている結合タンパク質は、原発性または転移性癌、例えば、乳房、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢および胆管、小腸、尿路（腎臓、膀胱および尿路上皮を含む。）、女性生殖管（子宮頸部、子宮、卵巣、ならびに絨毛癌および妊娠性絨毛性疾患を含む。）、男性生殖管（前立腺、精嚢、精巣および胚細胞腫瘍を含む。）、内分泌腺（甲状腺、副腎および下垂体を含む。）、および皮膚の癌腫、ならびに血管腫、黒色腫、肉腫（骨および軟組織から生じるものならびにカポジ肉腫を含む。）、脳、神経、眼および髄膜（星細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン腫および髄膜腫を含む。）の腫瘍、造血器悪性腫瘍から生じる腫瘍、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、造血器悪性腫瘍、カポジ肉腫、悪性リンパ腫、悪性組織球症、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、腫瘍随伴症候群／悪性の高カルシウム血症、または固形腫瘍を患っているヒト対象を診断および／または処置するために用いることができる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、患者における癌を処置する方法は、本明細書に開示されている結合タンパク質の１つ以上またはこれらの医薬組成物を投与することを含む。一実施形態において、癌は結腸癌である。一実施形態において、癌は膠芽細胞腫である。一実施形態において、癌は膵臓癌である。一実施形態において、癌は乳癌である。いくつかの実施形態において、癌を処置する方法であり、本明細書に開示されている結合タンパク質の１つ以上またはこれらの医薬組成物を投与することを含み、該方法は、抗ＶＥＧＦ抗体と抗ＤＬＬ４抗体の組み合わせの期待される付加的な効果に少なくともほぼ同等である、腫瘍増殖の低減または腫瘍増殖の遅延をもたらす。いくつかの実施形態において、該方法は、付加を超える腫瘍増殖の低減または腫瘍増殖の遅延（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体および抗ＤＬＬ４抗体の予期される効果を付加することから期待されるものよりも大きな低減）をもたらす。
【００５３】
いくつかの実施形態において、癌を処置する方法は、１つ以上の追加の薬剤、例えば、化学療法剤または生物剤と組み合わせて、本明細書に開示されている結合タンパク質の１つ以上またはこれらの医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、レゴラフェニブ（ＳＴＩＶＡＧＲＡ（ＴＭ））、ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＣＴＡ（ＴＭ））、イリノテカン、ロイコボリン、５−ＦＵ、テモゾロミド、ゲムシタビンおよびパクリタキセルの１つ以上である。一実施形態において、薬剤はイリノテカンである。一実施形態において、薬剤はロイコボリンである。一実施形態において、薬剤は５−ＦＵである。一実施形態において、薬剤はイリノテカン、ロイコボリンおよび５−ＦＵである。一実施形態において、薬剤はテモゾロミドである。一実施形態において、薬剤はゲムシタビンである。一実施形態において、薬剤はパクリタキセルである。いくつかの実施形態において、癌を処置する方法は、１つ以上の追加の薬剤を組み合わせて、本明細書に開示されている１つ以上の結合タンパク質またはこれらの医薬組成物を投与することを含み、該方法は、結合タンパク質と追加の薬剤の組み合わせにより期待される付加的な効果に少なくとも同等である腫瘍増殖の低減または腫瘍増殖の遅延をもたらす。いくつかの実施形態において、該方法は、付加を超える腫瘍増殖の低減または腫瘍増殖の遅延（例えば、結合タンパク質および追加の薬剤の予期される効果を付加することから期待されるものよりも大きな低減）をもたらす。
【００５４】
いくつかの実施形態において、結腸癌を処置する方法は、場合により、１つ以上のイリノテカン、ロイコボリンおよび５−ＦＵと組み合わせて、本明細書に開示されている結合タンパク質の１つ以上またはこれらの医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、膠芽細胞腫を処置する方法は、場合により、テモゾロミドと組み合わせて、本明細書に開示されている結合タンパク質の１つ以上またはこれらの医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、膵臓癌を処置する方法は、場合により、ゲムシタビンと組み合わせて、本明細書に開示されている結合タンパク質の１つ以上またはこれらの医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、乳癌を処置する方法は、場合により、パクリタキセルと組み合わせて、本明細書に開示されている結合タンパク質の１つ以上またはこれらの医薬組成物を投与することを含む。
【００５５】
様々な実施形態において、本明細書において提供されている結合タンパク質は、１つ以上の抗高血圧剤と組み合わせて投与することができる。１つ以上の抗高血圧剤は、利尿薬、アドレナリン受容体アンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬、レニン阻害剤、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、血管拡張剤およびアルファ−２アゴニストからなる群から選択され得る。例えば、薬剤は、１つ以上のクロニジン、エナラプリル；ニフェジピン；メチルドーパ、ヒドララジン、プラゾシン、レセルピン、モキソニジン、グアンファシン、ペリンドプリル／インダパミド、ロフェキシジンおよびメチロシンであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されている結合タンパク質は、１つ以上の抗凝固剤と組み合わせて投与することができる。例えば、抗凝固剤は、１つ以上のワーファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ダルテパリンナトリウム、アルガトロバン、ビバリルジン、レピルジンおよびデキストロースであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される結合タンパク質は、１つ以上の抗高血圧剤と１つ以上の抗凝固剤を組み合わせて投与することができる。
【００５６】
様々な実施形態において、本明細書において提供されている結合タンパク質は、黄斑変性症（湿潤形態を含む。）、糖尿病性網膜症、および／または血管の異常増殖もしくは浮腫によって特徴付けられる任意の他の疾患もしくは障害を患っているヒトを診断および／または処置するために使用することができる。
【００５７】
一実施形態において、結合タンパク質またはその抗原結合部分は、単独でまたは放射線療剤および／または化学療法剤と組み合わせて用いる場合、癌を治療するために使用されまたは本明細書に記載されている腫瘍からの転移の予防もしくは阻害において使用される。
【００５８】
一実施形態において、本明細書において提供されている結合タンパク質と組み合わせることができる化学療法剤または生物剤には、以下の１３−ｃｉｓ−レチノイン酸；２−ＣｄＡ；２−クロロデオキシアデノシン；５−アザシチジン；５−フルオロウラシル；５−ＦＵ；６−メルカプトプリン；６−ＭＰ；６−ＴＧ；６−チオグアニン；アブラキサン；Ａｃｃｕｔａｎｅ（Ｒ）；アクチノマイシン−Ｄ；Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ａｄｒｕｃｉｌ（Ｒ）；Ａｆｉｎｉｔｏｒ（Ｒ）；Ａｇｒｙｌｉｎ（Ｒ）；Ａｌａ−Ｃｏｒｔ（Ｒ）；アルデスロイキン；アレムツズマブ；ＡＬＩＭＴＡ；アリトレチノイン；Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ（Ｒ）；Ａｌｋｅｒａｎ（Ｒ）；オールトランスレチノイン酸；アルファインターフェロン；アルトレタミン；アメトプテリン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アナグレリド；Ａｎａｎｄｒｏｎ（Ｒ）；アナストロゾール；アラビノシルシトシン；Ａｒａ−Ｃ  Ａｒａｎｅｓｐ（Ｒ）；Ａｒｅｄｉａ（Ｒ）；Ａｒｉｍｉｄｅｘ（Ｒ）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（Ｒ）；Ａｒｒａｎｏｎ（Ｒ）；三酸化ヒ素；Ａｒｚｅｒｒａ（ＴＭ）；アスパラギナーゼ；ＡＴＲＡ；Ａｖａｓｔｉｎ（Ｒ）；アザシチジン；ＢＣＧ；ＢＣＮＵ；ベンダムスチン；ベバシズマブ：ベキサロテン；ＢＥＸＸＡＲ（Ｒ）；ビカルタミド；ＢｉＣＮＵ；Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（Ｒ）；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブスルファン；Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（Ｒ）；Ｃ２２５；カルシウムロイコボリン；Ｃａｍｐａｔｈ（Ｒ）；Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（Ｒ）；カンプトセシン−１１；カペシタビン；Ｃａｒａｃ（ＴＭ）；カルボプラチン；カルムスチン；カルムスチンウエハー；Ｃａｓｏｄｅｘ（Ｒ）；ＣＣ−５０１３；ＣＣＩ−７７９；ＣＣＮＵ；ＣＤＤＰ；ＣｅｅＮＵ；セルビジン；セツキシマブ；クロラムブシル；シスプラチン；シトロボラム因子；クラドリビン；コルチゾン；Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（Ｒ）；ＣＰＴ−１１；シクロフォスファミド；Ｃｙｔａｄｒｅｎ（Ｒ）；シタラビン；シタラビンリポゾーマル；Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（Ｒ）；Ｃｙｔｏｘａｎ（Ｒ）；ダカルバジン；ダコゲン；ダクチノマイシン；ダルベポエチンアルファ；ダサチニブ；ダウノマイシン；ダウノルビシン；塩酸ダウノルビシン；ダウノルビシンリポゾーマル；ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（Ｒ）；デカドロン；デシタビン；Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｆ（Ｒ）；Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（Ｒ）；デニロイキン；ジフチトクス；ＤｅｐｏＣｙｔ（ＴＭ）；デキサメタゾン；酢酸デキサメタゾン；リン酸デキサメタゾンナトリウム；デキサゾン；デクスラゾキサン；ＤＨＡＤ；ＤＩＣ；ジオデックス；ドセタキセル；Ｄｏｘｉｌ（Ｒ）；ドキソルビシン；ドキソルビシンリポゾーマル；Ｄｒｏｘｉａ（ＴＭ）；ＤＴＩＣ；ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（Ｒ）；Ｄｕｒａｌｏｎｅ（Ｒ）；Ｅｆｕｄｅｘ（Ｒ）；Ｅｌｉｇａｒｄ（ＴＭ）；Ｅｌｌｅｎｃｅ（ＴＭ）；Ｅｌｏｘａｔｉｎ（ＴＭ）；Ｅｌｓｐａｒ（Ｒ）；Ｅｍｃｙｔ（Ｒ）；エピルビシン；エポエチンアルファ；エルビタックス；エルロチニブ；エルウィニア  Ｌ−アスパラギナーゼ；エストラムスチン；エチオールＥｔｏｐｏｐｈｏｓ（Ｒ）；エトポシド；リン酸エトポシド；Ｅｕｌｅｘｉｎ（Ｒ）；エベロリムス；Ｅｖ��ｓｔａ（Ｒ）；エキセメスタン；Ｆａｒｅｓｔｏｎ（Ｒ）；Ｆａｓｌｏｄｅｘ（Ｒ）；Ｆｅｍａｒａ（Ｒ）；フィルグラスチム；フロクスウリジン；Ｆｌｕｄａｒａ（Ｒ）；フルダラビン；Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（Ｒ）；フルオロウラシル；フルオロウラシル（クリーム）；フルオキシムエステロン；フルタミド；フォリン酸；ＦＵＤＲ（Ｒ）；フルベストラント；ゲフィチニブ；ゲムシタビン；ゲムツズマブオゾガマイシン；ジェムザール；Ｇｌｅｅｖｅｃ（ＴＭ）；Ｇｌｉａｄｅｌ（Ｒ）ウエハー；ＧＭ−ＣＳＦ；ゴセレリン；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＭＣＳＦ）；Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ（Ｒ）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）；ヘキサドロール；Ｈｅｘａｌｅｎ（Ｒ）；ヘキサメチルメラミン；ＨＭＭ；Ｈｙｃａｍｔｉｎ（Ｒ）；Ｈｙｄｒｅａ（Ｒ）；Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ  Ａｃｅｔａｔｅ（Ｒ）；ヒドロコルチゾン；リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム；コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム；リン酸ハイドロコートン；ヒドロキシ尿素；イブリツモマブ；イブリツモマブチウキセタン；Ｉｄａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ  lｆｅｘ（Ｒ）；インターフェロン−アルファ；インターフェロン−アルファ−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）；イホスファミド；インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）；インターロイキン−２（ＩＬ−２）；メシル酸イマチニブ；イミダゾールカルボキサミド；Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（Ｒ）；Ｉｒｅｓｓａ（Ｒ）；イリノテカン；イソトレチノイン；イキサベピロン；Ｉｘｅｍｐｒａ（ＴＭ）；ＫＡＤＣＹＣＬＡ（Ｒ）；キドロラーゼ（ｔ）；Ｌａｎａｃｏｒｔ（Ｒ）；ラパチニブ；Ｌ−アスパラギナーゼ；ＬＣＲ；レナリドミド；レトロゾール；ロイコボリン；リューケラン；Ｌｅｕｋｉｎ（ＴＭ）；ロイプロリド；ロイコクリスチン；Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（ＴＭ）；リポゾーマルＡｒａ−Ｃ；Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｅｄ（Ｒ）；ロムスチン；Ｌ−ＰＡＭ；Ｌ−サルコリジン；Ｌｕｐｒｏｎ（Ｒ）；Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（Ｒ）；Ｍａｔｕｌａｎｅ（Ｒ）；マキシデックス；メクロレタミン；塩酸メクロレタミン；Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ（Ｒ）；Ｍｅｄｒｏｌ（Ｒ）；Ｍｅｇａｃｅ（Ｒ）；メゲストロール；酢酸メゲストロール；メルファラン；メルカプトプリン；メスナ；Ｍｅｓｎｅｘ（ＴＭ）；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メチルプレドニゾロン；Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ（Ｒ）；マイトマイシン；マイトマイシン−Ｃ；ミトキサントロン；Ｍ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（Ｒ）；ＭＴＣ；ＭＴＸ；Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（Ｒ）；ムスチン；Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ｍｙｌｅｒａｎ（Ｒ）；Ｍｙｌｏｃｅｌ（ＴＭ）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（Ｒ）；Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（Ｒ）；ネララビン；Ｎｅｏｓａｒ（Ｒ）；Ｎｅｕｌａｓｔａ（ＴＭ）；Ｎｅｕｍｅｇａ（Ｒ）；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）；Ｎｅｘａｖａｒ（Ｒ）；Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（Ｒ）；ニルタミド；Ｎｉｐｅｎｔ（Ｒ）；Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｕｓｔａｒｄ  Ｎｏｖａｌｄｅｘ（Ｒ）；Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（Ｒ）；エヌプレート；オクトレオチド；酢酸オクトレオチド；オフタツムマブ；Ｏｎｃｏｓｐａｒ（Ｒ）；Ｏｎｃｏｖｉｎ（Ｒ）；Ｏｎｔａｋ（��）；Ｏｎｘａｌ（ＴＭ）；オプレルベキン；Ｏｒａｐｒｅｄ（Ｒ）；Ｏｒａｓｏｎｅ（Ｒ）；オキサリプラチン；パクリタキセル；タンパク質に結合したパクリタキセル；パミドロネート；パニツムマブ；Ｐａｎｒｅｔｉｎ（Ｒ）；Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（Ｒ）；パゾパニブ；Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ（Ｒ）；ＰＥＧインターフェロン；ペグアスパラガーゼ；ペグフィルグラスチム；ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（ＴＭ）；ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ；ＰＥＭＥＴＲＥＸＥＤ；ペントスタチン；フェニルアラニンマスタード；Ｐｌａｔｉｎｏｌ（Ｒ）；Ｐｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ（Ｒ）；プレドニゾロン；プレドニゾン；Ｐｒｅｌｏｎｅ（Ｒ）；プロカルバジン；ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ）；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｒ）；カルムスチンインプラントを伴うＰｒｏｌｉｆｅｐｒｏｓｐａｎ  ２０；Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（Ｒ）；ラロキシフェン；Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（Ｒ）；Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（Ｒ）；Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒ）；リツキシマブ；Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（Ｒ）；ロミプロスチム；Ｒｕｂｅｘ（Ｒ）；塩酸ルビドマイシン；Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ（Ｒ）；Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ  ＬＡＲ（Ｒ）；サーグラモスティム；Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ（Ｒ）；Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（Ｒ）；ソラフェニブ；ＳＰＲＹＣＥＬ（ＴＭ）；ＳＴＩ−５７１；ストレプトゾシン；ＳＵ１１２４８；スニチニブ；Ｓｕｔｅｎｔ（Ｒ）；Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  Ｔａｒｃｅｖａ（Ｒ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（Ｒ）；Ｔａｓｉｇｎａ（Ｒ）；Ｔａｘｏｌ（Ｒ）；Ｔａｘｏｔｅｒｅ（Ｒ）；Ｔｅｍｏｄａｒ（Ｒ）；テモゾロマイド；テムシロリムス；テニポシド；ＴＥＳＰＡ；サリドマイド；Ｔｈａｌｏｍｉｄ（Ｒ）；ＴｈｅｒａＣｙｓ（Ｒ）；チオグアニン；Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ  Ｔａｂｌｏｉｄ（Ｒ）；チオホスファミド；Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（Ｒ）；チオテパ；ＴＩＣＥ（Ｒ）；Ｔｏｐｏｓａｒ（Ｒ）；トポテカン；トレミフェン；Ｔｏｒｉｓｅｌ（Ｒ）；トシツモマブ；トラスツズマブ；Ｔｒｅａｎｄａ（Ｒ）；トレチノイン；Ｔｒｅｘａｌｌ（ＴＭ）；Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（Ｒ）；ＴＳＰＡ；ＶＣＲ；Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（ＴＭ）；Ｖｅｌｂａｎ（Ｒ）；Ｖｅｌｃａｄｅ（Ｒ）；Ｖｅｐｅｓｉｄ（Ｒ）；Ｖｅｓａｎｏｉｄ（ＴＭ）；Ｖｉａｄｕｒ（Ｒ）；Ｖｉｄａｚａ（Ｒ）；ビンブラスチン；硫酸ビンブラスチン；Ｖｉｎｃａｓａｒ  Ｐｆｓ（Ｒ）；ビンクリスチン；ビノレルビン；酒石酸ビノレルビン；ＶＬＢ；ＶＭ−２６；ボリノスタット；ヴォトリエント；ＶＰ−１６；Ｖｕｍｏｎ（Ｒ）；Ｘｅｌｏｄａ（Ｒ）；Ｚａｎｏｓａｒ（Ｒ）；Ｚｅｖａｌｉｎ（ＴＭ）；Ｚｉｎｅｃａｒｄ（Ｒ）；Ｚｏｌａｄｅｘ（Ｒ）；ゾレドロン酸；ゾリンザ；またはＺｏｍｅｔａ（Ｒ）、および／または類似した経路を標的とする、ここに具体的に列挙されていない任意の他の薬剤が挙げられる。
【００５９】
別の実施形態において、障害を患っている患者を処置する方法は、本明細書に開示されている結合タンパク質の１つ以上を単独で投与する工程、または第二の薬剤の投与前、第二の薬剤の投与と同時または第二の薬剤の投与後に、結合タンパク質（単独または複数）を投与する工程を含む。特定の実施形態において、本明細書に開示されている医薬組成物は、経口、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、結腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口内、舌下、鼻内または経皮投与によって、患者に投与される。
【００６０】
様々な実施形態において、試験試料における１つ以上の抗原もしくはその断片の存在、量または濃度を決定する方法が提供され、ここで、１つ以上の抗原またはその断片は、ＤＬＬ４および／またはＶＥＧＦである。この方法は、イムノアッセイによって、抗原またはその断片について試験試料をアッセイすることを含む。イムノアッセイは、（ｉ）少なくとも１つの結合タンパク質および少なくとも１つの検出可能な標識を使用し、（ｉｉ）試験試料中の抗原またはその断片の存在、量または濃度の直接的または間接的指標としての検出可能な標識によって生じるシグナルと、対照または較正因子における抗原またはその断片の存在、量または濃度の直接的または間接的指標として生じるシグナルとを比較することを含む。較正因子は、場合によって、一連の較正因子の一部であり、この場合、較正因子のそれぞれは、抗原またはその断片の濃度によって、その一連の較正因子中の他の較正因子と異なっている。本方法は、（ｉ）捕捉薬剤と抗原またはその断片を含む複合体を形成するために、試料を、抗原またはその断片上のエピトープに結合する少なくとも１つの捕捉剤と接触させること、（ｉｉ）検出複合体を形成するために、捕捉薬剤と抗原またはその断片を含む複合体を、検出可能な標識を含み、抗原またはその断片上のエピトープに結合し、捕捉剤に結合しない少なくとも１つの検出剤と接触させることおよび（ｉｉｉ）（ｉｉ）において形成された検出複合体における検出可能な標識によって発生するシグナルに基づいて、試験試料中の抗原またはその断片の存在、量または濃度を決定することを含むことができ、少なくとも１つの捕捉剤および／または少なくとも１つの検出剤は少なくとも１つの結合タンパク質である。
【００６１】
代わりに、いくつかの実施形態において、試験試料において１つ以上の抗原もしくはその断片の存在、量または濃度を決定する方法は、（ｉ）捕捉薬剤と抗原またはその断片を含む複合体を形成するために、試験試料を、抗原上のエピトープまたはその断片に結合する少なくとも１つの捕捉薬剤に接触させ、同時にまたは連続して、いずれかの順番で、少なくとも１つの捕捉薬剤に結合させるために、試験試料を、試験試料において任意の抗原またはその断片と競合し得る、検出可能に標識された抗原またはその断片に接触させることであって、ここで、試験試料に存在する任意の抗原またはその断片、および検出可能に標識された抗原は互いに競合し、検出複合体を形成すること、および（ｉｉ）（ｉ）において形成された検出複合体における検出可能な標識によって生じたシグナルに基づいて、試験試料における抗原もしくはその断片の存在、量または濃度を決定することを含むことができ、ここで、少なくとも１つ捕捉薬剤は、少なくとも１つの結合タンパク質であり、捕捉検出複合体における検出可能な標識によって生じたシグナルは、試験試料における抗原またはその断片の量または濃度に反比例する。
【００６２】
様々な実施形態において、試験試料は、患者由来であってもよく、この場合、該方法は、さらに、患者を診断し、予測しまたは治療的／予防的処置の有効性を評価することを含むことができる。本方法が、患者の治療的／予防的処置の効力を評価することをさらに含む場合、この方法は、場合によって、効力を改善するために必要な、患者の治療的／予防的処置の改変を加えることをさらに含む。本方法は、自動化システムまたは半自動化システムにおける使用に適合させることができる。したがって、本明細書に記載されている方法はまた、対象が、所与の疾患、障害または状態を有するまたはそれを発症する危険性があるか否かを判定するために使用することができる。具体的には、このような方法は、以下：
（ａ）対象由来の試験試料における１つ以上の分析物もしくはその断片の濃度または量を（例えば、本明細書に記載されている方法または当該技術分野において公知の方法を用いて）決定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）で決定された分析物またはその断片の濃度または量と、所定のレベルを比較する工程
を含むことができ、ここで、工程（ａ）で決定された分析物  の濃度または量が所定レベルと比較して好ましい場合は、対象は、所定の疾患、障害または状態でないまたはこの危険性がないものと決定される。しかしながら、工程（ａ）において決定された分析物の濃度または量が予め決定されたレベルと比較して好ましくない場合、対象は、所定の疾患、障害または状態を有するまたはその危険性があると決定される。
【００６３】
さらに、本明細書において、対象における疾患の進行を監視する方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法は、
（ａ）対象由来の試験試料中の１つ以上の分析物の濃度または量を決定する工程；
（ｂ）同対象由来の後の試験試料における分析物の濃度または量を決定する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において決定された分析物の濃度または量と、工程（ａ）において決定された分析物の濃度または量を比較する工程
を含み、ここで、工程（ｂ）において決定された濃度または量が、工程（ａ）において決定された濃度または量と比較して、変化していないまたは好ましくない場合、対象における減少は、継続し、進行しまたは悪化しているものと決定される。比較して、工程（ｂ）において決定された濃度または量が、工程（ａ）において決定された濃度または量と比較して好ましい場合、対象における疾患は中断し、軽減しまたは改善されたと判断される。
【００６４】
場合により、疾患の進行を監視する方法は、工程（ｂ）において決定される分析物の濃度または量と、例えば、所定のレベルを比較することをさらに含む。さらに、場合によって、例えば、工程（ｂ）において決定された分析物の濃度または量が、予め決定されたレベルと比較して、不利に変更されたことを比較が示す場合、本方法は、ある期間、１以上の医薬組成物を用いて対象を治療することを含む。
【００６５】
また、１つ以上の抗原もしくはその断片の存在または濃度について試験試料をアッセイするためのキットが提供され、ここで、１つ以上の抗原は、ＤＬＬ４および／またはＶＥＧＦである。キットは、抗原またはその断片について試験試料をアッセイするために、本明細書に開示されている少なくとも１つの結合タンパク質と、抗原またはその断片について試験試料をアッセイするための使用説明書を含む。一実施形態において、少なくとも１つの結合タンパク質は、場合により、検出可能に標識されている。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質構築物の模式図であり、２つの親抗体からＤＶＤ結合タンパク質を作製するための戦略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
２つの異なるタンパク質上のエピトープに結合することができる多価および／または多重特異的結合タンパク質が提供される。また、二重可変ドメイン結合タンパク質（ＤＶＤ、ＤＶＤ結合タンパク質または二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（ＴＭ））とも呼ばれる。）およびこの医薬組成物、ならびにこのようなＤＶＤ結合タンパク質を作製するための核酸、組換え発現ベクターおよび宿主細胞が提供される。インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、特定の抗原を検出するＤＶＤ結合タンパク質を使用する方法もまた提供される。
【００６８】
本明細書に別段の定義がなければ、本明細書で使用される科学および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。何らかの曖昧さが伏在している場合には、本明細書中に付与されている定義は、すべての辞書または本明細書外の定義に優越する。文脈上別段の必要がなければ、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。「または」の使用は、別段の記載がなければ、「および／または」を意味する。「含んでいる」という用語ならびに「含む」および「含まれた」などのその他の形式の使用は、限定的なものではない。本明細書に記載されている任意の範囲は、端点および端点間の全ての値を含むものと理解される。
【００６９】
本明細書で使用される項の見出しは、構成を目的とするに過ぎず、記載する主題を限定するものと解釈されるべきではない。この出願において引用されている全ての文献または文献の一部は、限定されないが、特許、特許出願、論説、書籍および論文を含むが、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に明示的に組み込まれる。参照により組み込まれる文献が本明細書に含まれる開示と矛盾する場合において、本明細書は、いずれもの矛盾する材料に優先する。
【００７０】
一般的に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリッド形成に関連して使用される命名法は、周知のものであり、本分野において一般的に使用されている。一般に、本明細書において提供される方法および技術は、別段の記載がなければ、本分野において周知の慣用方法に従い、ならびに本明細書を通じて引用および論述されている様々な一般的参考文献およびより具体的な参考文献中に記載されているように、実施することができる。酵素反応および精製技術は、製造業者の説明書に従って、当該技術分野において一般的に遂行されているように、または他に指示がなければ、本明細書に記載されているように実施される。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関して使用される命名法、ならびに本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学および医薬品化学および薬化学の実験室操作および技術は、周知のものであり、他に指示がなければ、当該技術分野において一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬の調製、調合、および送達、および患者の治療に対しては、標準的な技術を使用し得る。
【００７１】
本開示がより容易に理解し得るように、特定の用語を以下に定義する。
【００７２】
「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖）から一般に構成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子またはＩｇ分子のエピトープ結合特性を保持した機能的断片、変異体、バリアントまたはこれらの誘導体を表すものとする。このような断片、変異体、バリアントまたは誘導体抗体のフォーマットは、本分野において公知である。完全長の抗体の一実施形態において、各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。ＣＨは、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＣＬは単一のＣＬドメインから構成される。ＶＨおよびＶＬは、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。）が散在された超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。）へ、さらに細分割することが可能である。一般に、各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で、アミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。免疫グロブリン分子は、あらゆる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
【００７３】
「二特異的抗体」という用語は、その２つの結合アーム（ＨＣ／ＬＣの一対）の１つの上に１つの抗原（またはエピトープ）を結合し、その第二の結合アーム（ＨＣ／ＬＣの異なる対）の上の異なる抗原（またはエピトープ）に結合する抗体を指す。二特異的抗体は、２つの異なる抗原結合アーム（特異性とＣＤＲ配列の両方における）を有し、それが結合するそれぞれの抗原について一価である。二特異的抗体には、クアドローマ技術（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ（１９８３年）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５（５９３４）：５３７−４０）によって、２つの異なるモノクローナル抗体の化学的コンジュゲーション（Ｓｔａｅｒｚｅｔ  ａｌ．（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（６０１２）：６２８−３１）によってまたはノブ・イントゥ・ホールもしくはＦｃ領域中に突然変異を導入する同様のアプローチ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１４）：６４４４−６４４８）によって生成されるものが含まれる。
【００７４】
「親和性成熟された」抗体とは、変化を有しない親抗体と比べて、抗体の１つ以上のＣＤＲ中に、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす１つ以上の変化を有する抗体である。典型的な親和性成熟された抗体は、標的抗原に対してｎＭの親和性を有し、またはｐＭの親和性さえ有する。親和性成熟された抗体は、本分野において公知の操作によって産生される。「Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３」は、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基の無作為な突然変異導入は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＰｒｏｃＮａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６によって記載されており、活性増強アミノ酸残基による選択的突然変異導入位置、接触または過剰変異位置での突然変異は、米国特許第６，９１４，１２８号に記載されている。
【００７５】
「ＣＤＲ移植された抗体」という用語は、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の１つ以上の配列が別の抗体のＣＤＲ配列で置換されている重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体を指す。例えば、２つの抗体は、マウスＣＤＲの１つ以上がヒトＣＤＲ配列で置換されているマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体などの異なる種由来であり得る。
【００７６】
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト以外の種由来の、より「ヒト類似に」、すなわち、ヒト生殖系列配列により類似するように改変された抗体を表す。ヒト化抗体の１つの種類は、非ヒトＣＤＲ配列がヒトのＶＨおよびＶＬ配列中に導入されて、対応するヒトＣＤＲ配列が置換されているＣＤＲ移植された抗体である。「ヒト化抗体」はまた、ヒト抗体ＦＲ配列のアミノ酸と実質的な同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）を有するフレームワーク領域（ＦＲ）と、非ヒトＣＤＲのアミノ酸配列と実質的な同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む、抗体またはそのバリアント、誘導体、類似体もしくは断片である。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべての配列が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）の配列に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべての配列がヒト免疫グロブリンの配列である、少なくとも１つの、典型的には２つ可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的にすべてを含んでもよい。また、ヒト化抗体は、ヒト抗体由来の重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域を含むことができる。一実施形態において、ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含有する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含有する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメインおよび／または重鎖のヒト化可変ドメインのみを含有する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖、ならびに重鎖の少なくとも可変ドメインを含有する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、重鎖、ならびに軽鎖の少なくとも可変ドメインを含有する。
【００７７】
「二重可変ドメイン結合タンパク質」および「二重可変ドメイン免疫グロブリン」という用語は、その２つの結合アーム（例えば、ＨＣ／ＬＣの一対）のそれぞれにおいて２つの可変ドメインを有する結合タンパク質を指し（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ０２／０２７７３号参照）、それぞれが抗原に結合することができる。一実施形態において、それぞれの可変ドメインは、異なる抗原またはエピトープに結合する。別の実施形態において、それぞれの可変ドメインは、同じ抗原またはエピトープに結合する。別の実施形態において、二重可変ドメイン結合タンパク質は、同一の特異性と同一のＣＤＲ配列を有する２つの同一の抗原結合アームを有し、それが結合するそれぞれの抗原に対して二価である。一実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、単一特異的であってもよく、すなわち、１つの抗原に結合することができまたは多重特異的であってもよく、すなわち、２つ以上の抗原に結合することができる。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤ−Ｉｇ（ＴＭ）と呼ばれる。一実施形態において、４本鎖ＤＶＤ結合タンパク質の各半分は、重鎖ＤＶＤポリペプチド、軽鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの抗原結合部位を含む。一実施形態において、それぞれの結合部位は、抗原結合部位あたりの抗原結合に関与する全６つのＣＤＲを有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【００７８】
「抗イディオタイプ抗体」という用語は、別の抗体の抗原結合部位のアミノ酸配列に対して惹起された抗体を指す。抗イディオタイプ抗体は、抗原に対する免疫応答を増強するために投与され得る。
【００７９】
「生物学的活性」という用語は、分子の１つ以上の固有の生物学的特性（インビボで見られるように天然に存在するものであっても、組換え手段によって提供される、または可能にされるものであっても）を表す。生物学的特性には、受容体に結合すること；細胞増殖の誘導、細胞増殖を阻害すること、他のサイトカインの誘導、アポトーシスの誘導および酵素活性が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
「中和」という用語は、結合タンパク質が抗原に特異的に結合した場合、抗原の生物学的活性を相殺することを指す。一実施形態において、中和結合タンパク質は、抗原（例えば、サイトカイン）に結合し、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％またはそれ以上にその生物学的活性を低下させる。
【００８１】
「特異性」とは、抗原に選択的に結合する結合タンパク質の能力を指す。
【００８２】
「親和性」は、結合タンパク質と抗原との間の相互作用の強さであり、結合タンパク質のＣＤＲの配列によって、ならびに抗原の性質、例えばそのサイズ、形状および／または電荷によって決定される。結合タンパク質は、負の副作用を最小限にしながら、所望の治療の評価項目を提供する親和性について選択することができる。親和性は、当業者に公知の方法（ＵＳ２００９０３１１２５３）を用いて測定することができる。
【００８３】
「効力」という用語は、所望の効果を達成するための結合タンパク質の能力を意味し、その治療有効性の測定である。効力は、当業者に公知の方法（ＵＳ２００９０３１１２５３）を用いて評価することができる。
【００８４】
「交差反応性」という用語は、惹起された標的以外の標的に結合する結合タンパク質の能力を指す。一般に、結合タンパク質は、適切に高い親和性でこの標的組織）／抗原に結合するが、非標的の正常組織に対しては適切に低い親和性を示す。個々の結合タンパク質は、一般に、２つの基準を満たすように選択される：（１）当該技術分野において公知である染色法を用いて視覚化される、抗体標的の既知の発現に適切な組織への抗体結合、および（２）同じ臓器由来のヒトとｔｏｘ属種（マウスおよびカニクイザル）間の類似した染色パターン。交差反応性を評価するためのこれらの方法および他の方法は、当業者に公知である（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
【００８５】
「生物学的機能」という用語は、結合タンパク質の特異的なインビトロまたはインビボにおける作用を意味する。結合タンパク質は、抗原のいくつかのクラスを対象とし、複数の作用機序を介して所望の治療結果を達成することができる。結合タンパク質は、可溶性タンパク質、細胞表面抗原および／または細胞外タンパク質沈着物を対象にすることができる。結合タンパク質は、それらの標的の活性を作働させ、拮抗しまたは中和することができる。結合タンパク質は、それらが結合する標的のクリアランスを助けることができまたは細胞に結合したときに細胞毒性をもたらすことがある。２つ以上の抗体の部分は、単一の結合タンパク質分子において１つを超える異なる機能を達成するために、多価フォーマットに組み込むことができる。生物学的機能を評価するために使用されるインビトロアッセイおよびインビボモデルは、当業者に知られている（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
【００８６】
「安定な」結合タンパク質は、結合タンパク質が、保存時にその物理的安定性、化学的安定性および／または生物学的活性を本質的に保持しているものである。長期間にわたって、種々の温度にてインビトロで安定である多価結合タンパク質が望ましい。結合タンパク質を安定化し、種々の温度でそれらの安定性を評価する方法は、当業者に知られている（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
【００８７】
「溶解性」という用語は、水性溶液中に分散させたままにするタンパク質の能力を意味する。水性製剤中のタンパク質の溶解性は、疎水性および親水性アミノ酸残基の適切な分布に依存し、したがって、溶解性は、正確に折り畳まれたタンパク質の生成と相関し得る。当業者は、日常的なＨＰＬＣ技術および当業者に公知の方法（ＵＳ２００９０３１１２５３）を用いて、結合タンパク質の可溶性の増加または減少を検出することができる。
【００８８】
結合タンパク質は、様々な宿主細胞を用いて生成されてもよく、またはインビトロで生成されてもよく、労力あたりの相対収率は「生成効率」を決定する。生成効率に影響を及ぼす因子には、限定されないが、宿主細胞型（原核生物または真核生物）、発現ベクターの選択、ヌクレオチド配列の選択および使用される方法が挙げられる。結合タンパク質生成に使用される材料および方法、ならびに生成効率の測定は、当業者に公知である（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
【００８９】
「免疫原性」という用語は、免疫応答を誘導する物質の能力を意味する。治療的結合タンパク質の投与は、免疫応答の特定の発生率をもたらし得る。多価形式の免疫原性を誘導し得る潜在的な要素は、親抗体の選択中に分析することができ、このような危険性を低下させるための工程は、多価結合タンパク質形式にそれらの配列を組み込む前に、親抗体を最適化するために採用することができる。抗体と結合タンパク質の免疫原性を減少させる方法は、当業者に公知である（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
【００９０】
「標識」および「検出可能な標識」という用語は、特異的結合対のメンバー間の反応（例えば、結合）を検出可能なものにするために、抗体またはその分析物などの特異的結合対のメンバーに結合させた部分を意味する。特異的結合対の標識された部分は、「検出可能に標識されている」と呼ばれる。したがって、「標識された結合タンパク質」という用語は、結合タンパク質の同定を与える標識が取り込まれたタンパク質を表す。一実施形態において、標識は、視覚または計測手段によって検出可能な信号を生成することができる、検出可能なマーカーであり、例えば、放射性標識されたアミノ酸の取り込み、または印を付けたアビジン（例えば、光学的方法または比色分析法によって検出することができる、蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出することができるビオチン部分のポリペプチドへの付着である。ポリペプチド用の標識の例には、以下の放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍ）；色原体、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）；酵素的標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；およびガドリニウムキレートなどの磁気作用物質が含まれるが、これらに限定されない。イムノアッセイに一般に使用される標識の代表例には、光を生じる部分、例えばアクリジニウム化合物および蛍光を生じる部分、例えばフルオレセインが含まれる。この関連で、部分自体が検出可能に標識され得るが、さらに別の部分との反応後に検出可能にされ得る。
【００９１】
「連結体」という用語は、第二の化学部分（治療剤または細胞毒性剤など）に化学的に連結された抗体またはＤＶＤ−Ｉｇなどの結合タンパク質を表す。「作用物質」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子または生物由来物質から作製された抽出物を含む。治療剤または細胞毒性剤の例としては、限定されないが、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロノールおよびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同体が含まれる。イムノアッセイとの関連において使用される場合、連結体は、検出薬剤として使用される検出可能に標識された抗体またはＤＶＤ−Ｉｇであってよい。
【００９２】
「結晶」および「結晶化された」という用語は、結晶の形態で存在する結合タンパク質（例えば、抗体）またはその抗原結合部分を表す。結晶は、物質の固体状態の一形態であり、これは、非晶質の固体状態または液体の結晶状態などの他の形態とは異なる。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体などのタンパク質）または分子集合体（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的な反復する三次元配列から構成される。これらの三次元配列は、本分野においてよく理解されている特異的な数学的関係に従って整列されている。結晶中で反復されている基礎的単位または構築ブロックは、非対称単位と呼ばれる。所定の十分に整えられた結晶的対称性に合致する配置での非対称単位の反復は、結晶の「単位格子」を与える。すべての三次元中での規則的な転換による単位格子の反復は、結晶を与える。Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．  ａｎｄ  Ｄｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ  ｅａ．，ｐｐ．２０  １−１６，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９９）を参照されたい。
【００９３】
「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸を輸送することができる該核酸分子を表す。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを表す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、ここで、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム中に連結され得る。他のベクターにはＲＮＡベクターが含まれる。ある種のベクターは、当該ベクターがその中に導入された宿主細胞中で自律的複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中へ導入されて、宿主細胞のゲノム中に組み込まれることが可能であり、これにより、宿主ゲノムとともに複製される。ある種のベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。プラスミドは、最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用され得る。しかしながら、発現ベクターの他の形態もまた含まれ、例えば、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）なども含まれる。一群のｐＨｙｂＥベクター（米国特許出願第６１／０２１，２８２号）は、親抗体およびＤＶＤ結合タンパク質のクローニングに使用され得る。ｐＪＰ１８３由来のＶ１；ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，非Ｖ２は、抗体および野生型定常領域を有するＤＶＤ重鎖をクローニングするために使用され得る。ｐＪＰ１９１由来のＶ２；ｐＨｙｂＥ−ｈＣＫ  Ｖ３は、抗体およびカッパ定常領域を有するＤＶＤ軽鎖をクローニングするために使用され得る。ｐＪＰ１９２由来のＶ３；ｐＨｙｂＥ−ｈＣＩ  Ｖ２は、抗体およびランダ定常領域を有するＤＶＤ軽鎖をクローニングするために使用され得る。Ｖ４は、ラムダシグナルペプチドおよびカッパ定常領域を用いて構築され、ラムダ−カッパハイブリッドＶドメインを有するＤＶＤ軽鎖をクローニングするために使用され得る。Ｖ５は、カッパシグナルペプチドおよびラムダ定常領域を用いて構築され、カッパ−ラムダハイブリッドＶドメインを有するＤＶＤ軽鎖をクローニングするために使用され得る。ｐＪＰ１８３由来のＶ７；ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，非Ｖ２は、抗体および（２３４、２３５ＡＡ）突然変異定常領域を有するＤＶＤ重鎖をクローニングするために使用され得る。
【００９４】
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」という用語は、外来ＤＮＡがその中に導入されている細胞を表す。このような用語は、当該細胞を表すのみならず、このような細胞の子孫も表す。突然変異または環境的な影響のために、後続の世代中にある種の修飾が生じ得るので、このような子孫は、実際には親細胞と同一でないことがあり得るが、本明細書において使用される「宿主細胞」という用語の範囲になお含まれる。一実施形態において、宿主細胞には、原核および真核細胞が含まれる。一実施形態において、真核細胞には、原生生物、真菌、植物および動物細胞が含まれる。別の実施形態において、宿主細胞には、原核細胞株Ｅ．コリ；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２およびＰＥＲ．Ｃ６；昆虫細胞株Ｓｆ９および真菌細胞サッカロミセス・セレビシアエが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
「トランスフェクション」という用語は、宿主細胞への外因性核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するために一般的に用いられる様々な技術を包含し、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどが挙げられる。
【００９６】
「サイトカイン」という用語は、細胞間媒介物質として別の細胞集団に作用する１つの細胞集団から放出されるタンパク質を指す。「サイトカイン」という用語には、天然源由来または組換え細胞培養物由来のタンパク質および天然配列のサイトカインの生物学的に活性な同等物が含まれる。
【００９７】
「生物学的試料」という用語は、生物または生物であったものから得られた物質の量を意味する。このような物質には、血液（例えば、全血）、血漿、血清、尿、羊水、滑液、内皮細胞、白血球、単球、他の細胞、臓器、組織、骨髄、リンパ節および脾臓が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
「成分」という用語は、組成物の要素を指す。診断キットに関連して、例えば、成分は、試験試料のアッセイ用のキットに含めることができる、捕捉抗体、検出またはコンジュゲート抗体、対照、較正因子、一連の較正因子、感受性パネル、容器、緩衝液、希釈剤、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液として）、停止液などであってもよい。したがって、「成分」は、いくつかの実施形態において、例えば、抗分析物（例えば、抗ポリペプチド）抗体に結合させることによって、固体支持体上に固定されている、上記のポリペプチドまたは他の分析物を含むことができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の成分は、溶液中にあってもよくまたは凍結乾燥されていてもよい。
【００９９】
「対照」とは、分析物を含まない（「陰性対照」）または分析物を含む（「陽性対照」）組成物を意味する。陽性対照は、既知の濃度の分析物を含み得る。「対照」、「陽性対照」および「較正物質」は、既知の濃度の分析物を含む組成物を表すために本明細書において互換的に使用され得る。「陽性対照」は、アッセイ性能特性を確立するために使用することが可能であり、試薬（例えば、分析物）の完全性の有用な指標である。
【０１００】
「所定のカットオフ」および「所定のレベル」は、所定のカットオフ／レベルに対してアッセイの結果を比較することにより診断／予後診断／治療的効力の結果を評価するために使用されるアッセイのカットオフ値を一般に表し、所定のカットオフ／レベルは様々な臨床的パラメーター（例えば、疾患の重症度、進行／非進行／改善など）にすでにつながっておりまたは関連している。本開示は例示的な所定のレベルを提供し得るが、カットオフ値はイムノアッセイの性質（例えば、使用される抗体など）に応じて様々となり得ることが周知である。さらに、本明細書における開示を他のイムノアッセイに適合させて、本開示を基礎とする他のイムノアッセイについてのイムノアッセイ特異的なカットオフ値を得ることは、当業者の通常の技術の範囲内に十分にある。所定のカットオフ／レベルの正確な値はアッセイ間で様々となり得るが、（もしあれば）本明細書に記載されている相関は一般に適用可能であるはずである。
【０１０１】
本明細書に記載されている診断アッセイにおいて使用される「前処理試薬」、例えば、溶解、沈殿および／または可溶化試薬は、あらゆる細胞を溶解するものおよび／または試験試料中に存在するあらゆる分析物を可溶化するものである。前処理は、本明細書でさらに記載されるように、すべての試料に必要というわけでない。とりわけ、分析物（例えば、目的のポリペプチド）の可溶化は、試料中に存在する内在性結合タンパク質からの分析物の放出を伴い得る。前処理試薬は均一（分離工程を必要としない）または不均一（分離工程を必要とする）であり得る。いくつかの実施形態において、不均一前処理試薬を使用すると、アッセイの次の工程に進行する前に、沈殿した分析物−結合タンパク質は試験試料から除去される。
【０１０２】
本明細書に記載されているイムノアッセイおよびキットとの関連で「品質管理試薬」には、較正物質、対照および感受性パネルが含まれるが、これらに限定されない。１つ以上の「較正物質」または「標準物質」は、抗体または分析物などの標的分子の濃度を内挿するための較正（標準）曲線を確立するために典型的に使用される。いくつかの実施形態において、所定の陽性／陰性カットオフ近くにある単一の較正物質を使用することができる。代わりに、他の実施形態において、複数の較正物質（すなわち、１つを超える較正物質または様々な量の較正物質が、「感受性パネル」または「感受性勾配」を確立するように使用され得る。
【０１０３】
用語「特異的結合パートナー」とは、特異的結合対のメンバーを意味する。特異的結合対は、化学的または物理的な手段を介して互いに特異的に結合する２つの異なる分子を含む。様々な実施形態において、抗原および抗体の特異的結合に加えて、他の特異的結合対は、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）、炭水化物およびレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクターおよび受容体分子、補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素などを含み得る。さらに、特異的結合対は、いくつかの実施形態において、元の特異的結合メンバーの類似体、例えば、分析物類似体であるメンバーを含み得る。免疫反応性特異的結合メンバーには、単離または組換えで産生された抗原、抗原断片およびモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む抗体ならびにその複合体、断片およびバリアント（バリアントの断片を含む）が含まれる。
【０１０４】
「Ｆｃ領域」という用語は、無傷の抗体のパパイン消化によって生成され得る、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義する。Ｆｃ領域は、固有配列のＦｃ領域またはバリアントＦｃ領域であり得る。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含み、場合によって、ＣＨ４ドメインを含む。抗体エフェクター機能を変化させるために、Ｆｃ部分中のアミノ酸残基を置換することが、本分野において周知である（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号および第５，６２４，８２１号）。Ｆｃ領域は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体と抗原−抗体複合体の半減期／クリアランス速度を媒介する。いくつかの場合において、これらのエフェクター機能は、治療用の免疫グロブリンに対して望ましいが、他の場合において、治療目的に応じて、不要であるまたは有害でさえあり得る。
【０１０５】
結合タンパク質の「抗原結合部分」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する結合タンパク質（例えば、抗体）の１つ以上の断片を意味する。結合タンパク質の抗原結合機能は、全長抗体の断片、ならびに二特異的、二重特異的または多重特異的フォーマットで行うことができる。結合タンパク質の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域において、ジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によってコードされているが、これらは、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成している単一のタンパク質鎖として、これらの作製を可能とする合成リンカーによって、組換え法を用いて連結することが可能である（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。）。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものとする。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も包含される。さらに、一本鎖抗体も、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に、抗原結合領域の対を形成する直列Ｆｖセグメントの対を含む「直鎖抗体」（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。
【０１０６】
「多価結合タンパク質」という用語は、２つまたはそれ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を意味する。一実施形態において、多価結合タンパク質は、３つまたはそれ以上の抗原結合部位を有するように工学的に作製され、天然に存在しない抗体である。「多重特異的結合タンパク質」という用語は、２つ以上の関連標的または非関連標的に結合することができる結合タンパク質を指す。一実施形態において、本明細書に提供される二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質は、２つ以上の抗原結合部位を含み、四価または多価の結合タンパク質である。
【０１０７】
「リンカー」という用語は、アミノ酸残基または２つのポリペプチド（例えば、２つのＶＨまたは２つのＶＬドメイン）に連結させて用いられるペプチド結合によって接続された２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを意味する。このようなリンカーポリペプチドの例は、本分野において周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。
【０１０８】
「Ｋａｂａｔ番号」、「Ｋａｂａｔ定義」および「Ｋａｂａｔ標識」という用語は、本明細書において、互換的に使用される。本分野において認められているこれらの用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基に比べて、より可変的な（すなわち、超可変的な）アミノ酸残基に付番するシステムを表す（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＮＯ．９１−３２４２）。重鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から６５およびＣＤＲ３に対するアミノ酸位置９５から１０２にわたる。軽鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から５６およびＣＤＲ３に対するアミノ酸位置８９から９７にわたる。
【０１０９】
「ＣＤＲ」という用語は、免疫グロブリン可変領域配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖および軽鎖可変領域のそれぞれについて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と命名されている、重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれにおいて３つのＣＤＲが存在する。「ＣＤＲセット」という用語は、抗原に結合することができる単一の可変領域中に生じる３つのＣＤＲ群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる系に従って、異なって定義されてきた。Ｋａｂａｔによって記載された系（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ａｎｄ（１９９１））は、抗体のいずれの可変領域に対しても適用可能な明瞭な残基付番系を提供するのみならず、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界を提供する。これらのＣＤＲは、ＫａｂａｔＣＤＲと称され得る。Ｃｈｏｔｈｉａおよび同僚（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３）は、ＫａｂａｔＣＤＲ内のある種の亜部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにも関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造を採ることを見出した。これらの亜部分は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３（「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖および重鎖領域を表記する。）と表記される。これらの領域は、ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲと称される場合があり、これは、ＫａｂａｔＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界が、Ｐａｄｌａｎ（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５によって記載されている。さらに別のＣＤＲ境界定義が、上記系の１つに厳格に従わない場合があり得るが、それにも関わらず、ＫａｂａｔＣＤＲと重複するが、これらは、特定の残基または残基の群またはさらにはＣＤＲ全体が、抗原結合に著しい影響を与えないという予測または実験的な発見に照らして、短縮または延長され得る。本明細書に使用されている方法は、これらの系のいずれかに従って定義されたＣＤＲを使用し得るが、ある種の実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによって定義されたＣＤＲを使用する。
【０１１０】
用語「エピトープ」とは、結合タンパク質、例えば、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる抗原の領域を意味する。ある種の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホリルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、ある種の実施形態において、特異的な三次元構造的特徴および／または特異的な電荷特徴を有し得る。一実施形態において、エピトープは、特異的結合パートナー上の相補的部位に結合することが知られている抗原（またはその断片）の領域のアミノ酸残基を含む。抗原断片は１を超えるエピトープを含むことができる。ある種の実施形態において、結合タンパク質が、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物中で、その標的抗原を認識する場合に、抗体は抗原を特異的に結合する。抗体が交差競合する（例えば、一方が、結合タンパク質への他方の結合を妨げまたは結合タンパク質への他方の結合における調節作用を阻害する。）場合、結合タンパク質は「同じエピトープに結合する」。エピトープ認識を可視化し、モデル化する方法は、当業者に知られている（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
【０１１１】
「薬物動態」とは、薬物が、生物によって、吸収され、分散され、代謝されおよび排泄されるプロセスを指す。いくつかの実施形態において、所望の薬物動態プロファイルを有する多価結合タンパク質分子を生成するために、同様の所望の薬物動態プロファイルを有する親モノクローナル抗体が選択される。選択された親モノクローナル抗体のＰＫプロファイルは、例えば、当業者に公知の方法（ＵＳ２００９０３１１２５３）においてげっ歯類を用いて、容易に決定することができる。
【０１１２】
「生物学的利用能」とは、投与後にその標的に到達する活性薬剤の量を指す。生物学的利用能は、安定性、溶解性、免疫原性および薬物動態を含む前述の特性のいくつかの関数であり、当業者に知られている方法（ＵＳ２００９０３１１２５３）を用いて評価することができる。
【０１１３】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムな生物特異的相互作用の分析を可能とする光学現象を意味する。さらなる記載については、Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６を参照されたい。用語「Ｋｏｎ」とは、結合複合体（例えば、ＤＶＤ／抗原複合体）を形成するために、抗原への結合タンパク質（例えば、抗体またはＤＶＤ）の結合についての結合速度（ｏｎ  ｒａｔｅ）定数を意味する。「Ｋｏｎ」という用語はまた、本明細書において互換的に用いられ、「会合速度定数」または「ｋａ」を意味する。その標的抗原への結合タンパク質の結合速度または結合タンパク質（例えば抗体）と抗原との間の複合体形成の速度を示す。この値はまた、以下の式によって示される。
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）’→Ａｂ−Ａｇ
【０１１４】
用語「Ｋｏｆｆ」は、当該技術分野において公知である結合複合体（例えば、ＤＶＤ／抗原複合体）からの結合タンパク質（例えば、抗体またはＤＶＤ）の解離についての解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）定数または「解離速度定数」を意味する。この値は、以下の式によって示されるように、結合タンパク質（例えば抗体）のその標的抗原からの解離速度または遊離抗体と抗原への経時的なＡｂ−Ａｇ複合体の分離を示す。
Ａｂ＋Ａｇ←Ａｂ−Ａｇ
【０１１５】
「ＫＤ」および「平衡解離定数」という用語は、平衡状態での滴定測定においてまたは解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を結合速度定数（Ｋｏｎ）で割ることによって得られた値を意味する。会合速度定数、解離速度定数および平衡解離定数は、抗原への結合タンパク質（例えば、抗体またはＤＶＤ）の結合親和性を表すために使用される。結合および解離速度定数を決定する方法は本分野において周知である。蛍光を基礎とする技術の使用は、高い感度を提供し、平衡状態で生理的緩衝液中の試料を調べることができる。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）（生体分子相互作用分析）アッセイなどの他の実験的アプローチおよび機器を使用することが可能である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能な機器）。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）（動態排除アッセイ）アッセイも使用することが可能である。
【０１１６】
「バリアント」という用語は、アミノ酸の付加（例えば、挿入）、欠失または保存的置換によってアミノ酸配列中の所与のポリペプチドとは異なるが、所与のポリペプチドの生物活性を保持するポリペプチドを意味する（例えば、バリアントＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦとの結合について抗ＶＥＧＦ抗体と競合することができる。）。アミノ酸の保存的置換、すなわち特性が類似する（例えば、親水性および／または荷電領域の程度もしくは分布）異なるアミノ酸とのアミノ酸の置き換えは、微小変化が典型的に関与すると本分野で認識されている。これらの微小変化は、本分野で理解されているように、アミノ酸のヒドロパシーインデックスを考慮することにより部分的に特定することが可能である（例えば、Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２参照）。一態様において、±２のヒドロパシーインデックスを有するアミノ酸が置換される。また、アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにするために使用することができる。ペプチドとの関連でアミノ酸の親水性を考慮すると、抗原性および免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である、そのペプチドの最大の局所平均親水性の計算が可能となる（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号参照）。本分野で理解されているように、類似した親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらし得る。一態様において、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて置換が行われる。アミノ酸のヒドロパシーインデックスと疎水性値はどちらもそのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この観察に一致して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、アミノ酸、特に、疎水性、親水性、荷電、サイズおよび他の特性によって明らかにされるこれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解されている。「バリアント」という用語は、タンパク質分解、リン酸化または他の翻訳後修飾などによって異なる形でプロセシングされているが、生物活性および／または抗原反応性、例えばＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４に結合する能力を保持するポリペプチドまたはその断片を含む。「バリアント」という用語は、他に定義がなければ、バリアントの断片を包含する。バリアントは、野生型配列に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％同一であってもよい。
【０１１７】
Ｉ．結合タンパク質の生成
２つの異なる抗原に結合することができる結合タンパク質およびこれを作製する方法が提供される。結合タンパク質は、様々な技術を用いて生成することができる。発現ベクター、宿主細胞および結合タンパク質を生成する方法も提供される。
【０１１８】
Ａ．親モノクローナル抗体の作製
ＤＶＤ結合タンパク質の可変ドメインは、目的とする抗原に結合することができるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む親抗体（Ａｂ）から得ることができる。これらの抗体は、天然に存在し得、または組換え技術によって作製され得る。当業者は、例えば、限定されないが、ハイブリドーマ技術の使用、選択されたリンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）、ファージ、酵母もしくはＲＮＡ−タンパク質融合ディスプレイまたは他のライブラリーの使用、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含む非ヒト動物の免疫化、ならびにキメラ抗体、ＣＤＲ移植された抗体およびヒト化された抗体の調製を含む、抗体を生成するための多数の方法に精通している。例えば、米国特許公開第２００９０３１１２５３  Ａ１参照。可変ドメインは、親和性成熟技術を用いて調製することができる。
【０１１９】
Ｂ．親モノクローナル抗体を選択するための基準
ＤＶＤ結合タンパク質分子において望まれる少なくとも１つ以上の特性を有する親抗体を選択することを含む実施形態が提供される。一実施形態において、所望の特性は、例えば、抗原特異性、抗原に対する親和性、効力、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、可溶性、生産効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性またはオルソロガス抗原結合などの１つ以上の抗体パラメーターである。例えば、米国特許出願公報第２００９０３１１２５３号を参照されたい。
【０１２０】
Ｃ．結合タンパク質分子
様々な実施形態において、結合タンパク質は、２つの異なる親モノクローナル抗体由来の２つの異なる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、組換えＤＮＡ技術によって、直接または短いリンカーを介して直列に連結され、その後に軽鎖定常ドメインＣＬが続くように設計され得る。同様に、重鎖は、直接的にまたはリンカーを介して、タンデムに連結された２つの異なる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、その後に定常ドメインＣＨ１およびＦｃ領域を含む（図１）。
【０１２１】
様々な実施形態において、可変ドメインは、本明細書に記載されている方法のいずれか１つによって作製された親抗体から得られた組換えＤＮＡ技術を用いて取得することが可能である。一実施形態において、可変ドメインは、マウス重鎖または軽鎖可変ドメインである。別の実施形態において、可変ドメインは、ＣＤＲ移植されたまたはヒト化された可変重鎖または軽鎖ドメインである。一実施形態において、可変ドメインは、ヒト重鎖または軽鎖可変ドメインである。
【０１２２】
様々な実施形態において、リンカー配列は、単一のアミノ酸またはポリペプチド配列であり得る。一実施形態において、リンカー配列の選択は、いくつかのＦａｂ分子の結晶構造分析に基づいている。Ｆａｂまたは抗体分子構造中の可変ドメインとＣＨ１／ＣＬ定常ドメインの間には、天然の柔軟な連結が存在する。この天然の連結は、一般に、ＶドメインのＣ末端由来の４−６残基およびＣＬ／ＣＨ１ドメインのＮ末端由来の４−６残基によって構成される約１０から１２個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、それぞれ、軽鎖および重鎖中のリンカーとしてＣＬまたはＣＨ１のＮ末端の５から６アミノ酸残基、または１１から１２アミノ酸残基を用いて作製される。ＣＬまたはＣＨ１ドメインのＮ末端残基、特に最初の５から６個のアミノ酸残基は、強い二次構造なしにループ立体構造を採ることが可能であり、したがって、２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーとして作用することが可能である。ＣＬまたはＣＨ１ドメインのＮ末端残基は、それらがＩｇ配列の一部であるため、可変ドメインの天然の伸長である。したがって、それらの使用は、リンカーおよび接合分析物から潜在的に生じる任意の免疫原性を大幅に最小化する。
【０１２３】
種々の実施形態において、本明細書に開示されている結合タンパク質は、配列番号１−３８（表１）の１つ以上を含む少なくとも１つのリンカーを含む。一実施形態において、Ｘ２は、Ｆｃ領域である。別の実施形態において、Ｘ２は、可変Ｆｃ領域である。
【０１２４】
【表１】
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【０１２５】
他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基ではなく、ＣＬ／ＣＨ１ドメイン由来の任意の長さの任意の配列；例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５−１２個のアミノ酸残基を含んでもよい。別の実施形態において、軽鎖リンカーは、ＣκまたはＣλから選択され得て；重鎖リンカーは、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、ＣεおよびＣμを含む、任意のアイソタイプのＣＨ１に由来してもよい。リンカー配列は、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、Ｇ／Ｓを基礎とする配列（例えば、Ｇ４Ｓリピート）；ヒンジ領域に由来する配列および他のタンパク質から得られる他の天然配列などの他のタンパク質からも由来し得る。他のリンカー配列は、Ｇ／Ｓリピートを含む任意の長さの任意の配列（例えば、ＧＧＧＳモチーフのリピートを含む配列）、または任意の他のペプチドリンカーを含んでもよい。
【０１２６】
一実施形態において、定常ドメインは、組換えＤＮＡ技術を用いて、２つの連結された可変ドメインに連結されている。一実施形態において、連結された重鎖可変ドメインを含む配列は、重鎖定常ドメインに連結され、連結された軽鎖可変ドメインを含む配列は、軽鎖定常ドメインに連結される。一実施形態において、定常ドメインは、それぞれ、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインである。一実施形態において、ＤＶＤ重鎖は、Ｆｃ領域にさらに連結されている。Ｆｃ領域は、固有配列のＦｃ領域またはバリアントＦｃ領域であり得る。別の実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。別の実施形態において、Ｆｃ領域には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤから得られるＦｃ領域が含まれる。
【０１２７】
一実施形態において、抗体またはこの機能的抗原結合断片が開示され、これは、表２に列挙されている標的抗原の１つについて機能的結合部位を有する抗体を含み、表２に列挙されている対から選択される、対を形成したＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、またはこれらのＶＨ領域およびＶＬ領域のＣＤＲ領域を含む。例えば、抗体は、ＤＬＬ４について機能的結合部位を形成する、表２のＶＨ領域およびＶＬ領域を含むことができる。一実施形態において、機能的抗原結合断片は、標的抗原に結合するには十分な可変ドメイン領域（例えば、表２における、対を形成したＶＨ配列およびＶＬ配列から取り出されるＣＤＲ領域）を保持する。機能的抗原結合断片は、ヒト化抗体、十分にヒトの抗体、ラクダ化された抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、復帰変異抗体もしくはＣＤＲ移植抗体、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＶＨＨ（ナノボディとも呼ばれる。）、または二特異的もしくは二重特異的抗体を含む、抗原−結合機能を保持する他の抗体断片を含み得る。
【０１２８】
一実施形態において、表２におけるドメインから選択される可変ドメインを含む結合タンパク質が開示されている。一実施形態において、結合タンパク質は、上記されるように第一鎖と第二鎖、および２つの機能的結合部位を含み、ここで、結合タンパク質の第一鎖と第二鎖は、表２において列挙されている標的抗原の１つ以上について２つの機能的結合部位を形成する。一実施形態において、各々の機能的結合部位は、表２に列挙されている対から選択される、対を形成したＶＨ配列とＶＬ配列（例えば、ＤＬＬ４について結合部位を形成する、対を形成したＶＨ配列とＶＬ配列）を含み、またはこれらのＶＨ領域とＶＬ領域のＣＤＲ領域を含む。いくつかの実施形態において、第一鎖は、表２から選択される第一のＶＨ配列と第二のＶＨ配列を含み、またはこれらのＶＨ配列からＣＤＲ配列を含有し、第二鎖は、表２から選択される第一のＶＬ配列と第二のＶＬ配列を含み、またはこれらのＶＬ配列からＣＤＲ配列を含有する。他の実施形態において、第一または第二の結合部位のＶＨ−ＶＬ配置は、２つの鎖を交差して反転され、それにより、各々の鎖は、２つの機能的結合部位を保持しながら、１つの結合部位からのＶＨドメインと他の結合部位からのＶＬドメインを含む。
【０１２９】
一実施形態において、２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドは組み合わされて、ＤＶＤ結合タンパク質を形成する。表２は、疾患の治療に有用な例示的な抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列を列挙している。一実施形態において、いずれかの配向で、表２に列挙されているＶＨ領域および／またはＶＬ領域のうちの少なくとも２つを含むＤＶＤが提供され、ここで、ＶＨ配列および／またはＶＬ配列の少なくとも１つは、配列番号３９または配列番号４０である。いくつかの実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２は、独立して選択される。以下に与えられるＶＨおよびＶＬドメイン配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク配列を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のこれらのＣＤＲおよび／またはフレームワーク配列は、同じ抗原に結合する、当該技術分野において知られている結合タンパク質由来の他のＣＤＲおよび／またはフレームワーク配列によって、機能を損なうことなく置換される。
【０１３０】
【表２】
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【０１３１】
いくつかの実施形態において、配列番号５５−６３から選択されるＶＨ領域を含むＤＶＤ結合タンパク質が提供される。特定の実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、配列番号６４−７３から選択されるＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、配列番号５５−６３および７４から選択されるＶＨ領域と、配列番号６４−７３から選択されるＶＬ領域を含む。これらのＶＨドメインとＶＬドメインのアミノ酸配列を以下の表３に示す。
【０１３２】
【表３】
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【０１３３】
【表４】
2019202994.tif 000010
【０１３４】
表３ａは、ＶＥＧＦとＤＬＬ４に指向された結合タンパク質に関する全長重鎖および軽鎖配列を与える。リンカー配列に下線を付し、一方、ＣＤＲおよび定常領域配列は太字である。
【０１３５】
特異的な標的に結合することができる特異的ＤＶＤ結合タンパク質およびこれを作製する方法の詳細な説明は、以下の実施例の部において提供される。
【０１３６】
Ｄ．結合タンパク質の作製
本明細書において提供される結合タンパク質は、本分野で公知の多数のいずれかによって作製され得る。例えば、結合タンパク質は、宿主細胞において発現され得て、ここで、ＤＶＤ重鎖およびＤＶＤ軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって、宿主細胞中に形質移入される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されているＤＶＤ結合タンパク質は、原核宿主細胞において発現される。他の実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、真核細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞において発現される。
【０１３７】
ＤＶＤタンパク質の組換え発現用の典型的なシステムにおいて、リン酸カルシウムによって媒介された形質移入によって、ＤＶＤ重鎖およびＤＶＤ軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内で、重鎖および軽鎖遺伝子は、遺伝子の転写の高いレベルを誘導するために、各々、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＰＬプロモーター制御要素へ作用可能に連結されている。組換え発現ベクターは、メトトレキサート選択／増幅を用いて、ベクターで形質移入されたＣＨＯ細胞の選択を可能とするＤＨＦＲ遺伝子も担持する。選択された宿主細胞は、ＤＶＤ重鎖およびＤＶＤ軽鎖の発現を可能とするために培養され、完全な状態のＤＶＤ結合タンパク質が培地から回収される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞を形質移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培地からＤＶＤタンパク質を回収するために、標準的な分子生物学的技術が使用される。様々な実施形態において、ＤＶＤタンパク質が合成されるまで、適切な培地中で、宿主細胞を培養することによって、ＤＶＤタンパク質を合成する方法も本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、培地からＤＶＤタンパク質を単離することをさらに含むことが可能である。
【０１３８】
ＤＶＤ結合タンパク質の特徴は、ＤＶＤ結合タンパク質が、慣用の抗体と類似の様式で産生および精製され得ることである。いくつかの実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質の産生は、定常領域の配列修飾、または化学的修飾を必要とせずに、所望される二重特異的活性を有する均一な単一の主産物をもたらす。「二特異的」、「多重特異的」および「多重特異的多価」完全長結合タンパク質を作製するための他の以前に記載された方法は、集合した不活性な単一特異的、多重特異的、多価の完全長結合タンパク質と、異なる結合部位の組合せを有する多価完全長結合タンパク質との混合物の細胞内産生または分泌された産生をもたらし得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されているＤＶＤタンパク質の設計は、主として、宿主細胞における発現後、所望される「二重特異的多価全長結合タンパク質」へ集合する二重可変ドメイン軽鎖および二重可変ドメイン重鎖をもたらす。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、発現され、集合された二重可変ドメイン免疫グロブリン分子の少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％が、所望の二重特異的四価タンパク質であり、したがって、増大した商用的有用性を有する。このようにして、特定の実施形態において、単一の細胞中で二重可変ドメイン軽鎖および二重可変ドメイン重鎖を発現し、「二重特異的四価全長結合タンパク質」の単一の主要生成物をもたらす方法が提供される。
【０１４１】
様々な実施形態において、「二重特異的四価全長結合タンパク質」の「主要生成物」をもたらす単一細胞において、二重可変ドメイン軽鎖および二重可変ドメイン重鎖を発現させる方法が提供され、ここで、「主要生成物」は、二重可変ドメイン軽鎖および二重可変ドメイン重鎖を含むすべての集合されたタンパク質の５０％超であり、例えば、７５％超および９０％超（またはこれらの間の任意のパーセンテージ）である。
【０１４２】
ＩＩ．結合タンパク質の使用
１つ、２つまたはそれを超える抗原に結合する能力が付与されているため、本明細書において提供されている結合タンパク質は、特定の実施形態において、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学など慣用のイムノアッセイを用いて、試料（例えば、血清または血漿などの生物学的試料）中の抗原を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、結合したまたは結合していない抗体の検出を促進するために、検出可能な物質で直接または間接的に標識される。適切な検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例は、ルミノールであり、適切な放射性材料の例には、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍが含まれる。
【０１４３】
様々な実施形態において、本明細書に提供される結合タンパク質はインビトロおよび／またはインビボにおいてそれらの抗原標的の活性を中和することができる。したがって、特定の実施形態において、結合タンパク質は、例えば、抗原を含有する細胞培養物において、ヒト対象において、または結合タンパク質が交差反応する抗原を有する他の哺乳動物対象において、抗原活性を阻害するために使用し得る。別の実施形態において、抗原が有害な疾患または障害を患っているヒトまたは非ヒト動物対象において抗原活性を低減する方法が提供される。様々な実施形態において、本明細書に提供されている結合タンパク質は、診断目的または治療目的で（例えば、疾患、例えば異常なＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４発現によって特徴付けられる疾患を検出または処置するために）、ヒトまたは非ヒト動物対象に投与され得る。
【０１４４】
本明細書において使用される「抗原活性が有害である障害」という用語は、障害に罹患している対象における抗原の存在が、障害の病態生理に関与しているおよび／または障害の悪化に寄与する因子であるまたはそれが疑われることが示されている疾患および／または他の障害を含むことを意図する。したがって、抗原活性が有害である疾患は、抗原活性の低下が疾患の症候および／または進行を緩和することが予測される疾患である。このような疾患は、例えば、本疾患に罹患している患者の生物学的液体中の抗原濃度の増加（例えば、対象の血清、血漿、滑液中などの抗原の濃度の増加）によって明らかとされ得る。本明細書において提供される結合タンパク質で治療することが可能な疾患の非限定的な例には、以下に、および結合タンパク質の医薬組成物に関するセクションに論述されている疾患が含まれる。
【０１４５】
様々な実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、有害な抗原への結合を増加させ、および／または２つの異なる抗原標的（ＤＬＬ４および／またはＶＥＧＦ）を同時に遮断し、有効性／安全性を増大させ、および／または患者の対象範囲を増加させるための治療剤として有用である。
【０１４６】
さらに、いくつかの実施形態において、本明細書において提供されているＤＶＤ結合タンパク質は、細胞内送達（例えば、ＤＶＤを細胞内分子に標的化すること。）を含む、組織特異的な送達（例えば、増大された局所ＰＫについて、より高い有効性および／またはより低い毒性を得るために、組織マーカーおよび／または疾患媒介物質を標的とすること。）のために使用することが可能である。いくつかの実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質はまた、その抗原の非中和エピトープへの結合を介して特異的な位置へ抗原を送達するための担体タンパク質としての役割も果たすことができ、さらに、抗原の半減期を増加させることもできる。さらに、ＤＶＤ結合タンパク質は、特定の実施形態において、患者に植え込まれた医療デバイスに物理的に連結されまたはこれらの医療デバイスを標的とするように設計され得る（Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、（２００６）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８（３）：４３７−４４６；Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、（２００６）Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００（２２−２３）：６３１８−６３２４；Ｄｒｕｇ／ｄｅｖｉｃｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｌｏｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ、Ｗｕ（２００６）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７（１１）：２４５０−２４６７；Ｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ．、Ｍａｒｑｕｅｓ（２００５）Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．３７７−３９７参照）。
【０１４７】
Ａ．様々な疾病における結合タンパク質の使用
様々な実施形態において、本明細書において提供されている結合タンパク質は、様々な疾患または障害、例えば、ＤＬＬ４および／またはＶＥＧＦの有害発現レベルまたは発現レベルを伴う疾患または障害を処置するための治療分子として有用である。いくつかの実施形態において、１つ以上の結合タンパク質は、診断し、処置しもしくは抗腫瘍治療を増大させるために投与され得て、および／または原発性癌および／もしくは転移性癌の処置に有益であってもよい。様々な実施形態において、１つ以上の結合タンパク質は、腫瘍状態を診断し、処置しまたは処置を増大させるために投与することができる。他の実施形態において、１つ以上の結合タンパク質は、異常な血管新生によって特徴付けられる任意の他の疾患または障害（例えば、一般的な自己免疫障害および炎症性障害、創傷治癒）を診断し、処置しまたは処置を増大するために投与することができる。様々な実施形態において、１つ以上の結合タンパク質の投与がＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４への結合をもたらし、これは、過度のＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４レベルによって特徴付けられる状態を患っている患者におけるＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４のレベルを中和しまたは他には低減させ得る。
【０１４８】
開示を制限することなく、特定の疾患状態に関する追加情報が提供される。
【０１４９】
１．腫瘍疾患
モノクローナル抗体療法が、癌に対する重要な治療法として登場している（ｖｏｎ  Ｍｅｈｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５４：３４３−６９）。本明細書に開示され、２つの別個の腫瘍媒介物質を標的とする二重特異的抗体の使用は、単一特異的療法と比較して、さらなる利益を与えるものと考えられる。
【０１５０】
様々な実施形態において、本明細書において提供されている組成物および方法を用いて診断および／または処置され得る腫瘍疾患には、限定されないが、原発性もしくは転移性癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、尿路癌（腎臓、膀胱および尿路上皮を含む。）、女性生殖管癌（子宮頸部、子宮、卵巣、ならびに絨毛癌および妊娠性絨毛性疾患を含む。）、男性生殖管癌（前立腺、精嚢、精巣および胚細胞腫瘍を含む。）、内分泌腺癌（甲状腺、副腎および下垂体を含む。）、皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫（骨および軟組織から生じるものならびにカポジ肉腫を含む。）、脳、神経、眼および髄膜（星細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン腫および髄膜腫を含む。）の腫瘍、造血器悪性腫瘍から生じる固形腫瘍、例えば、白血病、およびリンパ腫（ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫の両方）、胃癌、膀胱癌、前立腺癌、直腸癌、造血器悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、無βリポタンパク血症、先端チアノーゼ、急性および慢性寄生もしくは感染プロセス、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、結腸直腸癌腫、ヘアリー細胞白血病、ホジキン病、カポジ肉腫、悪性リンパ腫、悪性組織球増殖症、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌腫、腫瘍随伴症候群／悪性の高カルシウム血症、肉腫、固形腫瘍、または異常なＤＬＬ４もしくはＶＥＧＦ活性によって特徴付けられる任意の他の血管新生非依存性または依存性疾患が挙げられる。
【０１５１】
様々な実施形態において、ＤＬＬ４および／もしくはＶＥＧＦまたはその抗原結合部分に結合するＤＶＤ結合タンパク質は、単独で使用する場合または放射線治療剤および／もしくは他の化学療法剤と併用して使用する場合のいずれかにおいて、癌を診断および／または処置し、および／または転移を予防するために使用される。
【０１５２】
２．黄斑変性症
様々な実施形態において、本明細書において提供されている組成物および方法は、血管新生（湿潤）黄斑変性症などの黄斑変性症を処置するために使用することができる。黄斑変性症は、網膜損傷に起因する視野の中心に失明をもたらす医学的状態である。血管新生（湿潤）黄斑変性症は、異常な血管成長をもたらし、最終的には、光受容体に不可逆的な損傷を引き起こす可能性がある、黄斑下の血液およびタンパク質の漏れに至る。
【０１５３】
様々な実施形態において、ＤＬＬ４および／またはＶＥＧＦに結合するＤＶＤまたはその抗原結合部分は、単独で使用する場合または他の治療剤と併用して使用する場合、黄斑変性症を診断および／または処置するために使用される。
【０１５４】
３．糖尿病および糖尿病性網膜症
１型糖尿病は、膵臓におけるインスリン産生β細胞の自己免疫破壊に起因する糖尿病の一形態である。インスリンのその後の欠如により、血糖および尿糖の増加をもたらす。糖尿病性網膜症は、糖尿病の合併症として、網膜への損傷を伴う。
【０１５５】
糖尿病性網膜症は、高血糖により誘発される周皮細胞死と血管壁の弱体化に起因する網膜の血管系における小さな変化の結果である。疾患が進行するにつれて、重度の非増殖性糖尿病性網膜症は、血管が増殖する進行段階に入る。処置しない場合、新しい血管が出血し、視界が曇り、さらに網膜が損傷する可能性がある。線維血管性の増殖はまた、網膜剥離を引き起こす場合がある。増殖している血管はまた、眼の前房へと成長し、血管新生緑内障を引き起こす可能性があり得る。
【０１５６】
ＶＥＧＦおよびＤＬＬ４シグナル伝達は、糖尿病性腎症と網膜症の両方の病因における関与を含む、糖尿病性内皮機能障害および血管障害の媒介に重要な役割を果たしていると考えられている。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０９（５）：１０１１−２８（２０１２）；Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１８（８）：１４２７−１４３０（２００３年）；ＰＮＡＳ  １０９（２７）：Ｅ１８６８−７７（２０１２）；米国特許出願第２０１１０１８９１７６（Ｓｋｏｋｏｓら）。したがって、ＶＥＧＦおよびＤＬＬ４は、（例えば、患者において、ＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４の血清レベルを同定しおよび／またはそのレベルを変更するために）本開示のＤＶＤを用いて、糖尿病および／または糖尿病性網膜症の診断および／または治療のために潜在的標的を表してもよい。様々な実施形態において、ＤＬＬ４および／もしくはＶＥＧＦまたはその抗原結合部分に結合するＤＶＤは、単独で使用する場合または他の治療剤と併用して使用する場合のいずれかにおいて、１型糖尿病および／もしくは糖尿病性網膜症を診断および／または処置するために使用される。
【０１５７】
４．アテローム性動脈硬化症
ＶＥＧＦおよびＤＬＬ４は、アテローム性動脈硬化症の進行に関与していると考えられる。Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８（２０）：２１０８−１６（１９９８）；ＰＮＡＳ  １０９（２７）：Ｅ１８６８−７７（２０１２）。具体的には、ＶＥＧＦ発現は、ヒト冠状動脈におけるアテローム性動脈硬化性病変に示されており、これは、ヒト冠状動脈アテローム性硬化症の進行、および閉塞性冠動脈疾患における再開通プロセスにおいてＶＥＧＦの役割を示唆している。同様に、中和抗ＤＬＬ４抗体を用いたＤＬＬ４シグナル伝達の阻害により、アテローム性動脈硬化症の発症を弱め、プラーク石灰化を減少させることが示されている。したがって、ＶＥＧＦレベルおよびＤＬＬ４レベルは、（例えば、患者におけるＶＥＧＦおよび／もしくはＤＬＬ４の血清レベルを同定しならびに／またはそのレベルを変更するために）本開示のＤＶＤを用いて、アテローム性動脈硬化症の診断および／または治療のための潜在的な標的を示す場合がある。様々な実施形態において、ＤＬＬ４および／もしくはＶＥＧＦまたはその抗原結合部分に結合するＤＶＤは、単独で使用する場合または他の治療剤と併用して使用する場合、アテローム性動脈硬化症を診断および／または処置するために使用される。
【０１５８】
ＩＩＩ．医薬組成物
様々な実施形態において、１つ以上の結合タンパク質を単独でまたは予防剤、治療剤および／もしくは医薬として許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物が本明細書において提供される。様々な実施形態において、本明細書に開示されている医薬組成物の使用の非制限的な例としては、障害を診断し、検出および／もしくは監視し、障害もしくは１つ以上のその症候を予防、処置、管理および／もしくは軽減すること、ならびに／または研究における使用が挙げられる。単独または予防薬、治療薬および／または医薬として許容される担体と組み合わせた医薬組成物の製剤は、当業者に公知である（米国特許出願公開第２００９０３１１２５３Ａ１）。
【０１５９】
様々な実施形態において、医薬製剤は、１つ以上のアミノ酸、１つ以上の多糖および／またはポリソルベート、ならびに端点を含む約０．１−１００ｍｇ／ｍｌの間（例えば、０．１−１０、１−１０、０．０１−５０、１−５０、１−１００、１０−１００、２５−１００、２５−５０または５０−１００ｍｇ／ｍｌ）の濃度で存在する結合タンパク質を含み、ここで、製剤は、端点を含む約５．０−７．０の間のｐＨ（例えば、約５．０−６．０、５．５−６．０、５．０−６．５、５．５−６．５または６．０−７．０のｐＨ）である。いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、第一および第二のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一および第二のポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを独立して含み、ＶＤ１は、第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の可変ドメインであり、Ｃは、定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第一の機能的標的結合部位を形成し、第一および第二のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第二の機能的標的結合部位を形成する。一実施形態において、結合タンパク質は、配列番号５６を含む第一のポリペプチド鎖と配列番号６４を含む第二のポリペプチド鎖を含む。一実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７３を含む第一のポリペプチド鎖と配列番号７４を含む第二のポリペプチド鎖を含む。一実施形態において、製剤における少なくとも１つのアミノ酸はヒスチジンであり、約１０−２０ｍＭ、１０−１５ｍＭ、１５−２０ｍＭ、または約１５ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、製剤における少なくとも１つの多糖はショ糖であり、約０−８．０重量／体積（ｗ／ｖ）％の濃度で存在する。一実施形態において、製剤におけるポリソルベートはポリソルベート８０であり、約０−０．０６ｗ／ｖ％の濃度である。一実施形態において、製剤における少なくとも１つのアミノ酸はアルギニンであり、約０−１．５ｗ／ｖ％（例えば、０．５−１．５、１．０−１．５または０．５−１．０ｗ／ｖ％）の濃度で存在する。一実施形態において、結合タンパク質は、約０．１−１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１−１００ｍｇ／ｍｌ、または約１−１５ｍｇ／ｍｌ、または約１−７．５ｍｇ／ｍｌ、または約２．５−７．５ｍｇ／ｍｌ、または約５−７．５ｍｇ／ｍｌ、または約２５−１００ｍｇ／ｍｌ、または約２０−６０ｍｇ／ｍｌ、または約２５−５０ｍｇ／ｍｌ、または約２５ｍｇ／ｍｌ、または約５０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１−６０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１−２５ｍｇ／ｍｌ、または約１．０−６０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５−６０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１−２．０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５−２．０ｍｇ／ｍｌ、または約１−５ｍｇ／ｍｌ、または約１−７．５ｍｇ／ｍｌ、または約１−１５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌ、または約１．０ｍｇ／ｍｌ）の濃度で製剤中に存在する。
【０１６０】
様々な実施形態において、医薬製剤は、水性製剤、凍結乾燥された製剤、または凍結乾燥され、再水和された製剤である。一実施形態において、水和溶液は、デキストロースおよび／または生理食塩水（例えば、約５ｗ／ｖ％濃度のデキストロースおよび／または約０．９ｗ／ｖ％濃度の生理食塩水）である。一実施形態において、医薬製剤は、約１５ｍＭヒスチジン、約０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、約４％（ｗ／ｖ）のショ糖、および約０．１−２５ｍｇ／ｍｌの結合タンパク質または約１−１５ｍｇ／ｍｌの結合タンパク質を含み、ｐＨは約６であり、ここで、結合タンパク質は、配列番号５６と配列番号６４または配列番号７３と配列番号７４を含む。一実施形態において、結合タンパク質は、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖである。一実施形態において、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１  ＬＡＬＡ変異体由来のＦｃ領域を含む。一実施形態において、製剤は、少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含む。
【０１６１】
様々な実施形態において、約２５ｍｇ／ｍｌの結合タンパク質（例えば、配列番号５６と配列番号６４、または配列番号７３と配列番号７４を含む結合タンパク質）、約１５ｍＭのヒスチジン、０．０３％のポリソルベート８０（重量／体積、ｗ／ｖ）、４．０％のショ糖（ｗ／ｖ）を含有し、ｐＨが約６．０である製剤が使用される。いくつかの実施形態において、製剤はアルギニンを含まない。いくつかの実施形態において、製剤は、他の成分または濃度を含む他の製剤と比較して、予想外に改善された凍結−融解安定性、液体製剤安定性および／または凍結乾燥製剤安定性を示す。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、上記で検討され、配列番号５６と配列番号６４を含み、配列番号７３と配列番号７４を含む結合タンパク質を含有する製剤は、製剤化可能性における予想外の改善を示す。例えば、製剤は、５℃で保存した場合の望ましくないゲル化または高レベルの凝集体の形成を避ける。いくつかの実施形態において、製剤は、保存条件（５℃）と促進条件（４０℃）の両方で安定である。
【０１６３】
本明細書において提供されている予防剤または治療剤を投与する方法には、限定されないが、経口投与、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与、粘膜投与（例えば、鼻腔内および経口経路）および肺投与（例えば、吸入器または噴霧器を用いて投与されるエアロゾル化された化合物）が挙げられる。特定の投与経路のための医薬組成物の製剤ならびに投与の様々な方法に必要とされる材料および技術が利用可能であり、当業者に公知である（米国特許出願公開第２００９０３１１２５３Ａ１）。
【０１６４】
様々な実施形態において、投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療的または予防的反応）を提供するように調整されてもよい。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、いくつかに分割した用量は経時的に投与さてもよく、または用量は比例的に減少されてもよくもしくは治療状況の緊急性によって示されるように増加されてもよい。いくつかの実施形態において、投与の容易性および投与量の均一性のために投薬単位形態において非経口組成物が処方される。「投薬単位形態」という用語は、処置されるべき哺乳動物対象のための単位用量として適した物理的に別個の単位を指し；それぞれの単位は、必要とされる医薬的担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
【０１６５】
本明細書において提供されている結合タンパク質の治療的または予防的に有効量の例示的であり、非制限的な範囲は、約０．１−１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１−０．５、０．１−１、０．１−１０、０．１−２０、０．１−５０、０．１−７５、１−１０、１−１５、１−７．５、１．２５−１５、１．２５−７．５、２．５−７．５、２．５−１５、５−１５、５−７．５、１−２０、１−５０、７−７５、１−１００、５−１０、５−１５、５−２０、５−２５、５−５０、５−７５、１０−２０、１０−５０、１０−７５もしくは１０−１００ｍｇ／ｋｇまたはその間の任意の濃度）である。いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、医薬組成物に、治療的に有効な濃度、例えば、約０．１−１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約０．１−０．５、０．１−１、０．１−１０、０．１−２０、０．１−５０、０．１−７５、１−１０、１−２０、１−５０、１−７５、１−１００、５−１０、５−１５、５−２０、５−２５、５−５０、５−７５、１０−２０、１０−５０、１０−７５もしくは１０−１００ｍｇ／ｍｌまたはその間の任意の濃度）で存在する。用量値は、緩和されるべき状態の種類および／または重症度によって変化し得ることに留意すべきである。いずれかの特定の対象について、特定の投薬処方は、個々の必要性および／または組成物を投与しもしくは投与を管理している者の専門的な判断に従って、経時的に調整されてもよく、本明細書において記載されている用量範囲は、単に例示的であり、請求される組成物の範囲または実施を制限することを意図していないことはさらに理解されるべきである。
【０１６６】
ＩＶ．併用療法
様々な実施形態において、本明細書において提供されている結合タンパク質はまた、単独で、または疾患もしくは障害、例えば、ＤＬＬ４および／もしくはＶＥＧＦの有害発現もしくは発現レベルを伴う疾患もしくは障害を処置するために使用される１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与され得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の結合タンパク質は、診断し、処置しもしくは抗腫瘍治療を増大し、ならびに／または原発性および／もしくは転移性癌を処置するために、１つ以上の治療剤と組み合わせて投与することができる。様々な実施形態において、１つ以上の結合タンパク質は、腫瘍状態を診断し、処置しまたは処置を増大するために、１つ以上の治療剤と組み合わせて投与することができる。他の実施形態において、１つ以上の結合タンパク質は、異常な血管新生によって特徴付けられる任意の疾患または障害（例えば、一般的な自己免疫障害および炎症性疾患、創傷治癒）を診断し、処置しまたは処置を増大するために、１つ以上の治療剤と組み合わせて投与することができる。様々な実施形態において、１つ以上の治療剤と組み合わせた１つ以上の結合タンパク質の投与は、過度のＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４レベルによって特徴付けられる状態を患っている患者におけるＶＥＧＦおよび／またはＤＬＬ４のレベルにおいて中和または他の低減をもたらし、ならびに他の治療的変化が、結合タンパク質および／または１つ以上の治療剤の投与に起因する他の治療的変化をもたらす。
【０１６７】
様々な実施形態において、１つ以上の追加の薬剤は、その意図された目的で当業者によって選択される。例えば、追加の薬剤は、癌の処置に有用であるものと当該技術分野において認識されている治療剤であってもよい。併用療法はまた、１つを超える追加の薬剤、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはこれらを超える追加の薬剤を含むことができる。
【０１６８】
様々な実施形態において、併用療法剤には、限定されないが、血管新生阻害剤、抗腫瘍剤、放射線療法剤、化学療法剤、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、シスプラチン、カルボプラチン、抗チューブリン剤、パクリタキセル、ドセタキセル、タキソール、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ジェムザール、アントラサイクリン、アドリアマイシン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン、受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ）およびｓｉＲＮＡが挙げられる。
【０１６９】
本明細書において提供される結合タンパク質と組み合わせることができる化学療法剤の非制限的な例には、以下：１３−ｃｉｓ−レチノイン酸；２−ＣｄＡ；２−クロロデオキシアデノシン；５−アザシチジン；５−フルオロウラシル；５−ＦＵ；６−メルカプトプリン；６−ＭＰ；６−ＴＧ；６−チオグアニン；アブラキサン；Ａｃｃｕｔａｎｅ（Ｒ）；アクチノマイシン−Ｄ；Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ａｄｒｕｃｉｌ（Ｒ）；Ａｆｉｎｉｔｏｒ（Ｒ）；Ａｇｒｙｌｉｎ（Ｒ）；Ａｌａ−Ｃｏｒｔ（Ｒ）；アルデスロイキン；アレムツズマブ；ＡＬＩＭＴＡ；アリトレチノイン；Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ（Ｒ）；Ａｌｋｅｒａｎ（Ｒ）；オールトランスレチノイン酸；アルファインターフェロン；アルトレタミン；アメトプテリン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アナグレリド；Ａｎａｎｄｒｏｎ（Ｒ）；アナストロゾール；アラビノシルシトシン；Ａｒａ−Ｃ  Ａｒａｎｅｓｐ（Ｒ）；Ａｒｅｄｉａ（Ｒ）；Ａｒｉｍｉｄｅｘ（Ｒ）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（Ｒ）；Ａｒｒａｎｏｎ（Ｒ）；三酸化ヒ素；Ａｒｚｅｒｒａ（ＴＭ）；アスパラギナーゼ；ＡＴＲＡ；Ａｖａｓｔｉｎ（Ｒ）；アザシチジン；ＢＣＧ；ＢＣＮＵ；ベンダムスチン；ベバシズマブ：ベキサロテン；ＢＥＸＸＡＲ（Ｒ）；ビカルタミド；ＢｉＣＮＵ；Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（Ｒ）；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブスルファン；Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（Ｒ）；Ｃ２２５；カルシウムロイコボリン；Ｃａｍｐａｔｈ（Ｒ）；Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（Ｒ）；Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ−１１；カペシタビン；Ｃａｒａｃ（ＴＭ）；カルボプラチン；カルムスチン；カルムスチンウエハー；Ｃａｓｏｄｅｘ（Ｒ）；ＣＣ−５０１３；ＣＣＩ−７７９；ＣＣＮＵ；ＣＤＤＰ；ＣｅｅＮＵ；セルビジン；セツキシマブ；クロラムブシル；シスプラチン；シトロボラム因子；クラドリビン；コルチゾン；Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（Ｒ）；ＣＰＴ−１１；シクロフォスファミド；Ｃｙｔａｄｒｅｎ（Ｒ）；シタラビン；シタラビンリポゾーマル；Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（Ｒ）；Ｃｙｔｏｘａｎ（Ｒ）；ダカルバジン；ダコゲン；ダクチノマイシン；ダルベポエチンアルファ；ダサチニブ；ダウノマイシン；ダウノルビシン；塩酸ダウノルビシン；ダウノルビシンリポゾーマル；ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（Ｒ）；デカドロン；デシタビン；Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｆ（Ｒ）；Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（Ｒ）；デニロイキン；ジフチトクス；ＤｅｐｏＣｙｔ（ＴＭ）；デキサメタゾン；酢酸デキサメタゾン；リン酸デキサメタゾンナトリウム；デキサゾン；デクスラゾキサン；ＤＨＡＤ；ＤＩＣ；ジオデックス；ドセタキセル；Ｄｏｘｉｌ（Ｒ）；ドキソルビシン；ドキソルビシンリポゾーマル；Ｄｒｏｘｉａ（ＴＭ）；ＤＴＩＣ；ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（Ｒ）；Ｄｕｒａｌｏｎｅ（Ｒ）；Ｅｆｕｄｅｘ（Ｒ）；Ｅｌｉｇａｒｄ（ＴＭ）；Ｅｌｌｅｎｃｅ（ＴＭ）；Ｅｌｏｘａｔｉｎ（ＴＭ）；Ｅｌｓｐａｒ（Ｒ）；Ｅｍｃｙｔ（Ｒ）；エピルビシン；エポエチンアルファ；エルビタックス；エルロチニブ；エルウィニア  Ｌ−アスパラギナーゼ；エストラムスチン；エチオール；Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（Ｒ）；エトポシド；リン酸エトポシド；Ｅｕｌｅｘｉｎ（Ｒ）；エベロリムス；Ｅｖｉｓｔａ（��）；エキセメスタン；Ｆａｒｅｓｔｏｎ（Ｒ）；Ｆａｓｌｏｄｅｘ（Ｒ）；Ｆｅｍａｒａ（Ｒ）；フィルグラスチム；フロクスウリジン；Ｆｌｕｄａｒａ（Ｒ）；フルダラビン；Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（Ｒ）；フルオロウラシル；フルオロウラシル（クリーム）；フルオキシムエステロン；フルタミド；フォリン酸；ＦＵＤＲ（Ｒ）；フルベストラント；ゲフィチニブ；ゲムシタビン；ゲムツズマブオゾガマイシン；ジェムザール；Ｇｌｅｅｖｅｃ（ＴＭ）；Ｇｌｉａｄｅｌ（Ｒ）ウエハー；ＧＭ−ＣＳＦ；ゴセレリン；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＭＣＳＦ）；Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ（Ｒ）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）；ヘキサドロール；Ｈｅｘａｌｅｎ（Ｒ）；ヘキサメチルメラミン；ＨＭＭ；Ｈｙｃａｍｔｉｎ（Ｒ）；Ｈｙｄｒｅａ（Ｒ）；Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ  Ａｃｅｔａｔｅ（Ｒ）；ヒドロコルチゾン；リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム；コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム；リン酸ハイドロコートン；ヒドロキシ尿素；イブリツモマブ；イブリツモマブチウキセタン；Ｉｄａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ  Ｉｆｅｘ（Ｒ）；インターフェロン−アルファ；インターフェロン−アルファ−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）；イホスファミド；インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）；インターロイキン−２（ＩＬ−２）；メシル酸イマチニブ；イミダゾールカルボキサミド；Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（Ｒ）；Ｉｒｅｓｓａ（Ｒ）；イリノテカン；イソトレチノイン；イキサベピロン；Ｉｘｅｍｐｒａ（ＴＭ）；ＫＡＤＣＹＣＬＡ（Ｒ）；キドロラーゼ（ｔ）；Ｌａｎａｃｏｒｔ（Ｒ）；ラパチニブ；Ｌ−アスパラギナーゼ；ＬＣＲ；レナリドミド；レトロゾール；ロイコボリン；リューケラン；Ｌｅｕｋｉｎｅ（ＴＭ）；ロイプロリド；ロイコクリスチン；Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（ＴＭ）；リポゾーマルＡｒａ−Ｃ；Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｅｄ（Ｒ）；ロムスチン；Ｌ−ＰＡＭ；Ｌ−サルコリジン；Ｌｕｐｒｏｎ（Ｒ）；Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（Ｒ）；Ｍａｔｕｌａｎｅ（Ｒ）；マキシデックス；メクロレタミン；塩酸メクロレタミン；Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ（Ｒ）；Ｍｅｄｒｏｌ（Ｒ）；Ｍｅｇａｃｅ（Ｒ）；メゲストロール；酢酸メゲストロール；メルファラン；メルカプトプリン；メスナ；メスネックス（ＴＭ）；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メチルプレドニゾロン；Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ（Ｒ）；マイトマイシン；マイトマイシン−Ｃ；ミトキサントロン；Ｍ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（Ｒ）；ＭＴＣ；ＭＴＸ；Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（Ｒ）；ムスチン；Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（Ｒ）；Ｍｙｌｅｒａｎ（Ｒ）；Ｍｙｌｏｃｅｌ（ＴＭ）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（Ｒ）；Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（Ｒ）；ネララビン；Ｎｅｏｓａｒ（Ｒ）；Ｎｅｕｌａｓｔａ（ＴＭ）；Ｎｅｕｍｅｇａ（Ｒ）；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）；Ｎｅｘａｖａｒ（Ｒ）；Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（Ｒ）；ニロチニブ；ニルタミド；Ｎｉｐｅｎｔ（Ｒ）；Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｕｓｔａｒｄ  Ｎｏｖａｌｄｅｘ（Ｒ）；Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（Ｒ）；エヌプレート；オクトレオチド；酢酸オクトレオチド；オフタツムマブ；Ｏｎｃｏｓｐａｒ（Ｒ）；Ｏｎｃｏｖｉｎ（Ｒ）；Ｏｎｔａｋ（Ｒ）；Ｏｎｘａｌ（ＴＭ）；オプレルベキン；Ｏｒａｐｒｅｄ（Ｒ）；Ｏｒａｓｏｎｅ（Ｒ）；オキサリプラチン；パクリタキセル；タンパク質に結合したパクリタキセル；パミドロネート；パニツムマブ；Ｐａｎｒｅｔｉｎ（Ｒ）；Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（Ｒ）；パゾパニブ；Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ（Ｒ）；ＰＥＧインターフェロン；ペグアスパラガーゼ；ペグフィルグラスチム；ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（ＴＭ）；ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ；ペメトレキセド；ペントスタチン；フェニルアラニンマスタード；Ｐｌａｔｉｎｏｌ（Ｒ）；Ｐｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ（Ｒ）；プレドニゾロン；プレドニゾン；Ｐｒｅｌｏｎｅ（Ｒ）；プロカルバジン；ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ）；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｒ）；カルムスチンインプラントを伴うプロリフェプロスパン２０；Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（Ｒ）；ラロキシフェン；Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（Ｒ）；Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（Ｒ）；Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒ）；リツキシマブ；Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（Ｒ）；ロミプロスチム；Ｒｕｂｅｘ（Ｒ）；塩酸ルビドマイシン；Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ（Ｒ）；Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ  ＬＡＲ（Ｒ）；サーグラモスティム；Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ（Ｒ）；Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（Ｒ）；ソラフェニブ；ＳＰＲＩＣＥＬ（ＴＭ）；ＳＴＩ−５７１；ストレプトゾシン；ＳＵ１１２４８；スニチニブ；Ｓｕｔｅｎｔ（Ｒ）；Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  Ｔａｒｃｅｖａ（Ｒ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（Ｒ）；Ｔａｓｉｇｎａ（Ｒ）；Ｔａｘｏｌ（Ｒ）；Ｔａｘｏｔｅｒｅ（Ｒ）；Ｔｅｍｏｄａｒ（Ｒ）；テモゾロマイド；テムシロリムス；テニポシド；ＴＥＳＰＡ；サリドマイド；Ｔｈａｌｏｍｉｄ（Ｒ）；ＴｈｅｒａＣｙｓ（Ｒ）；チオグアニン；Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ  Ｔａｂｌｏｉｄ（Ｒ）；チオホスファミド；Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（Ｒ）；チオテパ；ＴＩＣＥ（Ｒ）；Ｔｏｐｏｓａｒ（Ｒ）；トポテカン；トレミフェン；Ｔｏｒｉｓｅｌ（Ｒ）；トシツモマブ；トラスツズマブ；Ｔｒｅａｎｄａ（Ｒ）；トレチノイン；Ｔｒｅｘａｌｌ（ＴＭ）；Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（Ｒ）；ＴＳＰＡ；ＴＹＫＥＲＢ（ＴＭ）；ＶＣＲ；Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（ＴＭ）；Ｖｅｌｂａｎ（Ｒ）；Ｖｅｌｃａｄｅ（Ｒ）；Ｖｅｐｅｓｉｄ（Ｒ）；Ｖｅｓａｎｏｉｄ（Ｒ）；Ｖｉａｄｕｒ（ＴＭ）；Ｖｉｄａｚａ（Ｒ）；ビンブラスチン；硫酸ビンブラスチン；ＶｉｎｃａｓａｒーＰｆｓ（Ｒ）；ビンクリスチン；ビノレルビン；酒石酸ビノレルビン；ＶＬＢ；ＶＭ−２６；ボリノスタット；ヴォトリエント；ＶＰ−１６；Ｖｕｍｏｎ（Ｒ）；Ｘｅｌｏｄａ（Ｒ）；Ｚａｎｏｓａｒ（Ｒ）；Ｚｅｖａｌｉｎ（ＴＭ）；Ｚｉｎｅｃａｒｄ（Ｒ）；Ｚｏｌａｄｅｘ（Ｒ）；ゾレドロン酸；ゾリンザ；またはＺｏｍｅｔａ（Ｒ）が含まれる。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される結合タンパク質は、１つ以上のＴｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ（Ｒ）、イリノテカン、ロイコボリン、５−ＦＵ、ゲムシタビンおよびパクリタキセルと組み合わせて使用される。一実施形態において、結合タンパク質ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖは、１つ以上のＴｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ（Ｒ）、イリノテカン、ロイコボリン、５−ＦＵ、ゲムシタビンおよびパクリタキセルと組み合わせて使用される。
【０１７１】
様々な実施形態において、本明細書において提供される結合タンパク質はまた、薬剤と併用されてもよく、例えば、メトトレキサート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジン、クロロキニン／ヒドロキシクロロキン、ペニシラミン（ｐｅｎｃｉｌｌａｍｉｎｅ）、金チオリンゴ酸塩（筋内および経口）、アザチオプリン、コルヒチン（ｃｏｃｈｉｃｉｎｅ）、コルチコステロイド（経口、吸入および局所注射）、β−２アドレナリン作動性受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテラール）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリカート、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウムおよびオキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノラートモフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンなどのコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作用薬、ＴＮＦαまたはＩＬ−１などの炎症促進性サイトカインによるシグナル伝達を妨害する薬剤（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびそれらの誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体または誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（ＴＭ）およびｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ））、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ）、炎症抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）、セレコキシブ、葉酸、硫酸ヒドロキシクロロキン、ロフェコキシブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、ナプロキセン、バルデコキシブ、スルファサラジン、メチルプレドニゾロン、メロキシカム、酢酸メチルプレドニゾロン、金チオリンゴ酸ナトリウム、アスピリン、トリムシノロン・アセトニド、プロポキシフェンナプシラート／ａｐａｐ、フォラート、ナブメトン、ジクロフェナク、ピロキシカム、エトドラク、ジクロフェナクナトリウム、オキサプロジン、塩酸オキシコドン、ヒドロコドン二酒石酸塩／ａｐａｐ、ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール、フェンタニル、アナキンラ、ヒト組み換え、塩酸トラマドール、サルサラート、スリンダク、シアノコバラミン／ｆａ／ピリドキシン、アセトアミノフェン、アレンドロナートナトリウム、プレドニゾロン、硫酸モルヒネ、塩酸リドカイン、インドメタシン、硫酸グルコサミン／コンドロイチン、塩酸アミトリプチリン、スルファジアジン、塩酸オキシコドン／アセトアミノフェン、塩酸オロパタジン、ミソプロストール、ナプロキセンナトリウム、オメプラゾール、シクロホスファミド、リツキシマブ、ＩＬ−１ＴＲＡＰ、ＭＲＡ、ＣＴＬＡ４−ＩＧ、ＩＬ−１８ＢＰ、抗ＩＬ−１８、抗ＩＬ１５、ＢＩＲＢ−７９６、ＳＣＩＯ−４６９、ＶＸ−７０２、ＡＭＧ−５４８、ＶＸ７４０、ロフル��ラスト、ＩＣ−４８５、ＣＤＣ−８０１およびメソプラムなどの作用物質とも組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、組合せには、メトトレキサートまたはレフルノミドとシクロスポリンが含まれ得る。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、本明細書において提供される結合タンパク質の「治療的有効量」または「予防的有効量」を含み得る。「治療的有効量」は、所望の治療的結果を達成するための投薬量で、および所望の治療的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を表す。結合タンパク質の治療的有効量は、当業者によって決定され得、病状、年齢、性別および個体の体重ならびに結合タンパク質が個体内で所望の応答を惹起する能力などの因子に従って変動し得る。治療的有効量は、抗体または抗体部分のあらゆる毒性効果または有害効果が、治療的に有益な効果によって凌駕される量でもある。「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために必要な投薬量で、および所望の予防的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を表す。典型的には、疾病のより初期段階の前にまたは疾病のより初期段階において、予防的投薬が患者に使用されるので、予防的有効量は、治療的有効量より少ない。
【０１７３】
Ｖ．診断
本明細書における開示はまた、診断の適用例を提供し、限定されないが、１つ以上の結合タンパク質を用いる診断アッセイ法、１つ以上の結合タンパク質を含有する診断用キット、ならびに自動化および／または半自動化システムにおける使用のための方法およびキットを提供する。いくつかの実施形態において、方法およびキットは、個体における疾患または障害の検出、監視および／または処置に用いることができる。
【０１７４】
Ａ．アッセイ法
様々な実施形態において、少なくとも１つの結合タンパク質を用いて、試験試料中の少なくとも１つの分析物もしくはその断片の存在、量および／または濃度を決定する方法が提供される。例示的なアッセイには、限定されないが、イムノアッセイおよび／または質量分析法を用いる方法が挙げられる。
【０１７５】
例えば、本開示によって提供されるイムノアッセイは、とりわけ、サンドイッチイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、競合阻害イムノアッセイ、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、酵素増幅イムノアッセイ技術（ＥＭＩＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）および均一系化学発光アッセイを含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、試験試料中の１つ以上の抗原もしくはその断片の存在、量または濃度を決定する方法が提供され、ここで、１つ以上の抗原もしくはその断片はＤＬＬ４および／またはＶＥＧＦである。本方法は、イムノアッセイによって抗原またはその断片について試験試料をアッセイすることを含む。イムノアッセイは、（ｉ）少なくとも１つの結合タンパク質と少なくとも１つの検出可能な標識を用い、（ｉｉ）試験試料における抗原もしくはその断片の存在、量または濃度の直接的または間接的な指標として、検出可能な標識によって生じたシグナルと、対照または較正物質における、抗原もしくはその断片の存在、量または濃度の直接的または間接的な指標として生じるシグナルとを比較することを含む。較正物質は、場合により、一連の較正物質の一部であり、較正物質の各々は、抗原またはその断片の濃度による一連の他の較正物質と異なる。本方法は、（ｉ）捕捉薬剤と抗原またはその断片を含む複合体を形成するために、試験試料を、抗原上のエピトープまたはその断片に結合する少なくとも１つの捕捉薬剤に接触させること、（ｉｉ）捕捉薬剤と抗原またはその断片を含む複合体と、検出可能な標識を含み、捕捉薬剤に結合しない抗原上のエピトープまたはその断片に結合する少なくとも１つの検出薬剤に接触させ、検出複合体を形成すること、（ｉｉｉ）（ｉｉ）で形成された検出複合体における検出可能な標識によって生じたシグナルに基づいて、試験試料における抗原またはその断片の存在、量または濃度を決定することを含み、ここで、少なくとも１つの捕捉薬剤および／または少なくとも１つの検出薬剤は少なくとも１つの結合タンパク質である。
【０１７７】
代わりに、いくつかの実施形態において、試験試料中の１つ以上の抗原もしくはその断片の存在、量または濃度を決定する方法は、（ｉ）捕捉薬剤と抗原またはその断片を含む複合体を形成するために、試験試料を、抗原またはその断片のエピトープに結合する少なくとも１つの捕捉薬剤に接触させ、同時にまたは連続して、いずれかの順番で、試験試料を、少なくとも１つの捕捉薬剤に結合させるために、任意の抗原またはその断片と競合し得る検出可能に標識された抗原またはその断片に接触させることであって、ここで、試験試料中に存在する任意の抗原またはその断片と、検出可能に標識された抗原は互いに競合し、検出複合体を形成すること、および（ｉｉ）（ｉ）において形成した検出複合体における検出可能な標識によって生じたシグナルに基づいて、試験試料中の抗原もしくはその断片の存在、量または濃度を決定することを含むことができる。
【０１７８】
様々な実施形態において、試験試料は、患者由来であってもよく、この場合、方法は、患者を診断し、予測しまたは治療的／予防的処置の有効性を評価することをさらに含むことができる。本方法が、患者の治療的／予防的処置の有効性を評価することをさらに含む場合、方法は、場合により、有効性を改善する必要がある場合、患者の治療的／予防的処置を改変することをさらに含む。本方法は、自動化システムまたは半自動化システムにおける使用に適合され得る。したがって、本明細書において記載されている方法はまた、対象が、所定の疾患、障害もしくは状態であるまたはそれらを発症する危険性があるかどうかを決定するために使用され得る。具体的には、このような方法は、
（ａ）対象からの試験試料中の１つ以上の分析物またはその断片を（例えば、本明細書において記載されている方法または当該技術分野において公知である方法を用いて）決定する工程；および（ｂ）工程（ａ）において決定された分析物またはその断片の濃度または量と所定レベルを比較する工程を含むことができ、ここで、工程（ａ）において決定された分析物の濃度または量が所定レベルと比較して好ましい場合は、対象は、所定の疾患、障害または状態でないおよびこの危険性がないものと決定される。しかしながら、工程（ａ）において決定された分析物の濃度または量が所定レベルと比較して好ましくない場合は、対象は、所定の疾患、障害または状態でありまたはこの危険性があるものと決定される。
【０１７９】
さらに、本明細書において、対象における疾患の進行を監視する方法が提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、
（ａ）対象由来の試験試料中の１つ以上の分析物の濃度または量を決定する工程；
（ｂ）同対象由来の後の試験試料における分析物の濃度または量を決定する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において決定された分析物の濃度または量と、工程（ａ）において決定された分析物の濃度または量を比較する工程
を含み、ここで、工程（ｂ）において決定された濃度または量が、工程（ａ）において決定された濃度または量と比較して、変化していないまたは好ましくない場合、対象における疾患は、継続し、進行しまたは悪化しているものと決定される。比較によって、工程（ｂ）において決定された濃度または量が、工程（ａ）において決定された濃度または量と比較した場合に好ましい場合には、対象における疾患は、終わり、後退されまたは改善されたものと決定される。
【０１８０】
場合により、疾患の進行を監視する方法は、工程（ｂ）において決定された分析物の濃度または量と、例えば、所定レベルとを比較することをさらに含む。さらに、場合により、本方法は、比較が、例えば、工程（ｂ）において決定された分析物の濃度または量が、所定レベルと比較して好ましくなく変更されたことを示す場合、所定期間、１つ以上の医薬組成物を用いて対象を処置することを含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、分析物もしくはその断片の存在、量または濃度は、化学発光標識（アクリジニウム化合物）などの検出可能な標識を用いて、試料中において検出される。いくつかの実施形態において、生じる化学発光シグナルは、当業者に公知の日常的な技術を用いて検出され得る。生じたシグナルの強度に基づいて、試料の分析物の量または濃度が定量され得る。具体的には、いくつかの実施形態において、試料中の分析物の量は、生じたシグナルの強度に比例してもよい。特定の実施形態において、存在する分析物の量は、生じた光の量を分析物についての標準曲線と比較することによって、または参照標準もしくは較正物質との比較によって定量されてもよい。標準曲線は、既知の濃度の分析物の連続希釈物または溶液を用いて、質量分析、重量法および当該技術分野において公知の他の技術を用いることによって、生じさせてもよい。
【０１８２】
分析物イムノアッセイは、一般的に、当該技術分野において公知の任意のフォーマット、例えば、限定されないが、サンドイッチフォーマットを用いて行うことができる。例えば、イムノアッセイにおいて、１つ以上の結合タンパク質は、試験試料中の分析物（またはその断片）を捕捉するために使用され得て（これらの結合タンパク質は、多くの場合、「捕捉」結合タンパク質と呼ばれる。）、１つ以上の結合タンパク質は、サンドイッチへの検出可能な（すなわち、定量できる）標識を結合させるために使用され得る（これらの結合タンパク質は、多くの場合、「検出」結合タンパク質、または「コンジュゲート」と呼ばれる。したがって、例示的なサンドイッチイムノアッセイフォーマットに照らして、本明細書に記載されているＤＶＤ（またはその断片、バリアントもしくはバリアントの断片）は、捕捉結合タンパク質、検出結合タンパク質またはこれらの両方として用いることができる。例えば、第一の分析物（またはその断片）上のエピトープに結合し得る第一のドメインと第二の分析物（またはその断片）上のエピトープに結合し得る第二のドメインとを有するＤＶＤは、１つ以上の分析物（例えば、ＤＬＬ４および／またはＶＥＧＦ）を検出し、場合により定量するために、捕捉結合タンパク質および／または検出結合タンパク質として用いることができる。さらなる例において、サンドイッチアッセイ内で異なる親和性を有するＤＶＤを用いることは、結合力優位性を提供し得る。本明細書において記載されているイムノアッセイに照らして、一般的には、ＤＶＤの構造内に１つ以上のリンカーを組み込むことが有益でありまたは望まれてもよい。存在する場合、場合により、リンカーは、内部ドメインによってエピトープに結合することがき、および外部ドメインによって別のエピトープに結合することができるように十分な長さと構造柔軟性を有する必要がある。この点において、ＤＶＤは、２つの異なる分析物に結合することができ、一方の分析物は他方よりも大きい場合、望ましくは、大きな分析物は外部ドメインに結合される。
【０１８３】
様々な実施形態において、試験される試料（例えば、分析物またはその断片を含有することが疑われる試料）は、少なくとも１つの捕捉結合タンパク質および少なくとも１つの検出結合タンパク質と、同時にまたは連続して、およびいずれかの順番で接触させることができる。例えば、試験試料は、最初に少なくとも１つの捕捉結合タンパク質と接触され、次に（連続して）少なくとも１つの検出結合タンパク質と接触され得る。代わりに、試験試料は、最初に少なくとも１つの検出結合タンパク質に接触され、次に（連続して）少なくとも１つの捕捉結合タンパク質に接触され得る。なお別の代替において、試験試料は、同時に捕捉結合タンパク質と検出結合タンパク質に接触され得る。様々な実施形態において、本明細書に開示されている１つ以上のＤＶＤを含む競合阻害イムノアッセイは、１つ以上の分析物もしくはその断片（例えば、ＤＬＬ４および／またはＶＥＧＦ）の存在、量または濃度を検出するために使用することができる。
【０１８４】
様々な実施形態において、検出可能なレベルは、直接的にまたはカップリング剤を介して、結合タンパク質に結合し得る。用いることができるカップリング剤の例としては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）である。用いることができる他のカップリング剤は当該技術分野において公知である。結合タンパク質に検出可能な標識を結合させる方法は、当該技術分野において公知である。
【０１８５】
様々な実施形態において、検出アッセイにおける分析物およびＤＶＤを含む複合体に結合した標識の存在または量は、当該技術分野において公知である技術を用いて定量することができる。例えば、酵素標識を用いる場合、標識された複合体は、発色などの定量可能な反応を与える標識について、基質と反応させ得る。標識が放射線標識である場合、標識は、シンチレーションカウンターなどの適切な手段を用いて定量され得る。標識が蛍光標識である場合、標識は、標識を刺激し、蛍光シグナルを検出することによって定量され得る。標識が化学発光標識である場合、標識は、視覚的にまたは照度計、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどによって、発光を検出することによって定量され得る。いくつかの実施形態において、複合体における標識の量が定量されると、試験試料中の分析物またはその断片の濃度は、適切な手段、例えば、既知濃度の分析物もしくはその断片の連続希釈を用いて生じさせた標準曲線の使用または任意の他の較正物質によって決定することができる。
【０１８６】
一実施形態において、化学発光微粒子イムノアッセイ、特にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）自動分析器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用するものが、用いられる。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、質量分析法を用いる方法は、本開示によって提供され、限定されないが、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）およびＳＥＬＤＩ（表面増強レーザー脱離／イオン化）が含まれる。
【０１８８】
イムノアッセイおよび質量分析法を用いて生物学的試験試料を回収し、操作し、処理しおよび分析するための方法は当業者に周知であり、本開示の実施において提供される（ＵＳ２００９−０３１１２５３Ａ１）。
【０１８９】
Ｂ．キット
様々な実施形態において、試験試料中の少なくとも１つ分析物もしくはその断片の存在、量および／または濃度について試験試料をアッセイするためのキットがまた提供される。いくつかの実施形態において、キットは、分析物またはその断片について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分および分析物またはその断片について試験試料をアッセイするための説明書を含む。分析物またはその断片について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分は、本明細書に開示されている結合タンパク質および／またはその断片、バリアントまたはそのバリアントの断片を含む組成物を含むことができる。いくつかの実施形態において、成分は、場合により、固相に固定化されている。
【０１９０】
場合によって、いくつかの実施形態において、キットは、単離されたまたは精製された分析物を含み得る、較正因子または対照を含むことができる。特定の実施形態において、キットは、イムノアッセイおよび／または質量分析法によって、分析物について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分を含むことができる。キット成分は、分析物、結合タンパク質および／または抗分析物結合タンパク質またはその断片を含み、場合によって、当該分野で公知の任意の検出可能な標識を用いて標識されてもよい。（米国２００９−０３１１２５３Ａ１）。
【０１９１】
Ｃ．自動化
様々な実施形態において、試験試料中の少なくとも１つの分析物の存在、量および／または濃度を決定するためのキット（またはこの成分）および方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号および第５，００６，３０９号に記載され、例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）としてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）によって市販されている、多数の自動化システムおよび半自動化システムにおいて使用するために適合され得る。
【０１９２】
結合タンパク質を用いて使用され得る他の自動化プラットフォームまたは半自動化プラットフォームには、限定されないが、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＩＭｘ（Ｒ）（例えば、米国特許第５，２９４，４０４号参照）、ＰＲＩＳＭ（Ｒ）、ＥＩＡ（ビーズ）およびＱｕａｎｔｕｍ（ＴＭ）ＩＩ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから全てを入手される。）ならびに当該技術分野で公知の他のプラットフォームが挙げられる。さらに、アッセイ、キットおよびキットの成分は、他のフォーマットにおいて、例えば、電気化学的および／または他の携帯もしくはポイントオブケアアッセイシステムで使用することが可能である。本開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを行う商業的Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的イムノアッセイシステムに適用可能である。免疫センサーならびに単回使用試験装置におけるこれらの製造および操作方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、第７，４１９，８２１号、および第７，６８２，８３３号；ならびに米国特許公開第２００４００１８５７７号、第２００６０１６０１６４号、およびＵＳ２００９０３１１２５３に記載されている。
【０１９３】
本明細書に記載されている本方法の他の適切な改変および適合が明白であり、本明細書に開示されている範囲または実施形態から逸脱することなく、適切な均等物を用いてこれらを行い得ることは、当業者に容易に明確になる。ここに、ある種の実施形態を詳細に記載してきたが、例示のみを目的とし、限定することを意図したものではない、下記の実施例を参照することによって、本発明がより明確に理解される。
【実施例】
【０１９４】
［実施例１］
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ分子の構築
ヒト化抗ＤＬＬ４  ｍＡｂ（ｈ１Ａ１１．１）および抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ（Ａｖ）からの可変ドメイン配列は、抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ分子のＶＨドメインおよびＶＬドメインを設計するために使用された。可変領域は、二段階ＰＣＲを用いて合成された。プライマーは、クローニングベクターに対して相同な隣接領域と、それぞれのＤＶＤ可変対間のリンカー領域を用いて設計された。細菌の形質転換は、陽性クローンを同定するために行われ、構築物は、当該技術分野において公知の標準的なプロトコールを用いて、哺乳動物の形質転換において使用するために回収され、精製された。
【０１９５】
重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、変異ヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４、２３５Ａ）重鎖およびカッパ軽鎖定常領域にインフレームでクローニングされ、抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ分子を生じさせた（表４）。
【０１９６】
【表５】
2019202994.tif 000011
【０１９７】
［実施例２］
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ構築物の親和性決定
ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｉｎｃ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）は、２５℃にてＢｉａｃｏｒｅ  ２０００、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００またはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上で行われる表面プラズモン共鳴に基づく測定によって決定される、精製された組換えＤＬＬ４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＶＥＧＦ１６５へのＤＶＤの結合を評価するために使用された。ＤＬＬ４結合動態測定について、アッセイ緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰＢ：１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ７９０６）であった。ＶＥＧＦ結合動態測定について、アッセイ緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（３Ｎ０１Ｂ）：１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ７９０６）であった。例えば、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中に希釈されたヤギ抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の約９０００ＲＵは、製造業者の取扱説明書と手法に従って、２５μｇ／ｍｌにて、標準的なアミンカップリングキットを用いてＣＭ５リサーチグレードのバイオセンサーチップ全体に直接固定された。バイオセンサー表面上の未反応部分をエタノールアミンでブロックされる。動態分析について、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｂｉｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．０．１ソフトウェアまたはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアを用いて、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルから誘導された速度方程式は、複数の抗原注入に対して同時にフィッティングさせた（グローバルフィット解析の使用）。精製された抗体は、ヤギ抗ヒトＦｃ反応表面全体で捕捉させるために、稼働緩衝液に希釈される。リガンド（１μｇ／ｍｌ）として補足されるべき抗体は、流速１０μｌ／分で反応マトリックス上に注入される。アッセイ中、全ての測定は、捕捉表面単独（すなわち、捕捉された抗体を含まない。）に対して参照される。結合および解離速度定数のＫｏｎ（Ｍ−１ｓ−１）およびＫｏｆｆ（ｓ−１）は、８０μＬ／分の連続的流速下で決定される。速度定数は、３倍の希釈シリーズとして、１．２３から９００ｎＭの範囲の異なる抗原濃度で動態的結合測定値を生じさせることによって導入され、緩衝液のみの注入を含んだ（二重参照に用いられるべきである。）。次に、抗体と標的抗原間の反応の平衡解離定数ＫＤ（Ｍ）は、以下の式：ＫＤ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎによって、動態速度定数から計算される。結合は、時間の関数として記録され、動態速度定数が計算される。このアッセイにおいて、１０６Ｍ−１ｓ−１程度に速い結合速度と１０−６ｓ−１程度に遅い解離速度が測定され得る。抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤの抗原結合親和性を表５および６に概要する。
【０１９８】
【表６】
2019202994.tif 000012
【０１９９】
【表７】
2019202994.tif 000013
【０２００】
［実施例３］
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ分子のインビトロでの特徴付け
［実施例３．１］
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって決定されるＤＬＬ４結合活性
全長ＤＬＬ４を過剰発現する安定なＨＥＫ２９３Ｇ細胞株は、組織培養フラスコから回収され、４回洗浄され、１％のウシ血清アルブミンおよび１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）に再懸濁された。１．５×１０５個の細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液中で様々な濃度のＤＶＤ結合タンパク質とともに、６０分間、氷上でインキュベートされた。細胞は２回洗浄され、５０μＬのＲ−フィコエリトリンをコンジュゲートさせた抗ラットＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（ＦＡＣＳ緩衝液中で１：２００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、Ｃａｔ、＃１１２−１１６−０７２）が添加された。氷上でのインキュベーション（４℃、６０分）後、細胞は３回洗浄され、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁された。蛍光は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ−ＨＴＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて測定された。データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて解析され、ＥＣ５０値は、ＤＬＬ４を発現する細胞に結合する抗体の最大の５０％を達成する抗体濃度として記録された。
【０２０１】
［実施例３．２］
可溶性ＤＬＬ４細胞外ドメインを用いたＮｏｔｃｈ−１相互作用の阻害によって決定される抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤタンパク質のＤＬＬ４遮断活性
９６ウェルＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏプレート（＃４３９４５４、ｈｕＤＬＬ４  ＥＬＩＳＡ用）および９６ウェルＣｏｓｔａｒプレート（＃９０１８  ｍｕＤＬＬ４  ＥＬＩＳＡ用）は、１６ｎＭヒトＮｏｔｃｈ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃３６４７−ＴＫ、Ｄ−ＰＢＳ中１００μｌ／ウェル）を用いて被覆され、一晩４℃にてインキュベートされた。次に、プレートは、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄され、２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）を用いて１時間、２５℃にてブロッキングされた。ブロッキング中、ビオチン標識されたＤＬＬ４細胞外ドメイン（１４ｎＭ）は、１時間、２５℃にて振とうさせながら、抗体（３０ｐＭ−６６ｎＭ、ブロッキング緩衝液中で３倍連続希釈）と混合された。アッセイプレートは、ブロッキング後に洗浄され、ＤＬＬ４／抗体混合物（１００μｌ／ウェル、振とうしながら１時間２５℃にて）とともにインキュベートされた。プレートは再度洗浄され、１００μｌ／ウェルの、ＨＲＰをコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ＃６５Ｒ−Ｓ１０４ＰＨＲＰｘ、ブロッキング緩衝液中１：５，０００希釈）が１時間、２５℃にて振とうしながら添加された。最終洗浄後、プレートは、１００μｌ／ウェルの基質（ＴＭＢ  Ｓｉｇｍａ  ＃Ｔ８６６５）を用いて発色され、１００μｇ／ウェルの１Ｎ  ＨＣｌを用いて反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析され、ＩＣ５０値は、Ｎｏｔｃｈ１へのＤＬＬ４結合の５０％の減少を達成するのに必要される抗体の濃度として記録された。
【０２０２】
［実施例３．３］
Ｎｏｔｃｈレポーターアッセイを用いたＤＬＬ４依存性Ｎｏｔｃｈ活性化の阻害によって決定される抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤタンパク質のＤＬＬ４ブロッキング活性
９６ウェル黒色透明底組織培養プレートは、Ｎｏｔｃｈ応答性プロモーターによって駆動するルシフェラーゼを発現する遺伝子操作されたＥＡ．ｈｙ９２６細胞とともに一晩播種された（７，０００細胞／ウェル）。２００ｎＭから連続希釈された抗体は、全長ＤＬＬ４を発現するＨＥＫ２９３Ｇ細胞を含有する等体積の溶液とともに１５分間混合された（５，０００細胞／ウェル）。２９３Ｇ／ＤＬＬ４細胞は、試験抗体の存在下で２４時間、ＥＡ．ｈｙ９２６  Ｎｏｔｃｈレポーター細胞と共培養された。ルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａの基質（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｅ２９４０）を用いて分析された。データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析され、ＩＣ５０値は、ＤＬＬ４誘導によるＮｏｔｃｈ活性化の５０％減少を達成するのに必要とされる抗体濃度として記録された。
【０２０３】
［実施例３．４］
捕捉ＥＬＩＳＡによって決定される抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤタンパク質のＶＥＧＦ結合活性
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）は、抗ヒトＦｃ抗体（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）とともに一晩４℃にてインキュベートされた。プレートは、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ）中で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ）中で１時間２５℃にてブロッキングされた。ウェルは３回洗浄され、それぞれの抗体またはＤＶＤは、２５℃にて１時間インキュベートする前に、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で連続して希釈された。ウェルは３回洗浄され、ビオチン化されたＶＥＧＦ（２ｎＭ）はプレートに添加され、１時間２５℃にてインキュベートされた。ウェルは３回洗浄され、次に、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＫＰＬ  ＃４７４−３０００、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｒｕｇ、ＭＤ）とともに１時間２５℃にてインキュベートされた。ウェルは３回洗浄され、１００μｌのＵＬＴＲＡ−ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）はウェルあたりに添加された。発色後、反応は、１Ｍ  ＨＣｌを用いて停止され、４５０ｎｍの吸光度が測定された。
【０２０４】
［実施例３．５］
ＶＥＧＦＲ１を用いたＶＥＧＦ相互作用の阻害によって決定される抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤタンパク質のＶＥＧＦブロッキング活性
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）は、組換えＶＥＧＦＲ１細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含有する１００μｌ  ＰＢＳとともに一晩４℃にてインキュベートされた。プレートは、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ）中で３回洗浄され、ブロッキング緩衝液（１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ）中で１時間２５℃にてブロックされた。それぞれの抗体およびＤＶＤは、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で連続希釈され、５０μｌの２ｎＭビオチン化ＶＥＧＦとともに１時間２５℃にてインキュベートされた。次に、抗体およびビオチン化されたＶＥＧＦの混合物またはＤＶＤおよびビオチン化されたＶＥＧＦ（１００μｌ）の混合物は、ＶＥＧＦＲ１−Ｆｃで被覆されたウェルに添加され、２５℃にて１０分間インキュベートされた。ウェルは３回洗浄され、次に、１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＫＰＬ  ＃４７４−３０００、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｒｕｇ、ＭＤ）とともに１時間２５℃にてインキュベートされた。ウェルは３回洗浄され、１００μｌのＵＬＴＲＡ−ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）はウェルあたり添加された。発色後、反応は、１Ｍ  ＨＣｌを用いて停止され、４５０ｎｍの吸光度が測定された。
【０２０５】
［実施例３．６］
ＶＥＧＦ刺激された内皮細胞の増殖／生存の阻害によって決定される抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤタンパク質のＶＥＧＦブロッキング活性
アッセイ用に播種する前に、ＴＩＭＥ（ＡＴＣＣ）またはＨＵＶＥＣ（２から６継代）の内皮細胞は、ＥＧＭ−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（Ｌｏｎｚａ−Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、＃ＣＣ−４１７６）が補足されたＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ−Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で維持された。細胞は、増殖因子の不存在下で、０．１％のＦＢＳを含む１００μｌのＥＭＢ−２中、コラーゲン被覆された黒色９６ウェルプレート上に１０，０００細胞／ウェルで播種された。翌日、培地は、増殖因子の不存在で、０．１％のＦＢＳを用いて置き換えられた。翌日、培地は、１００μｌのＥＭＢ−２（増殖因子または血清を含まない）で置き換えられ、ＶＥＧＦおよび抗体またはＤＶＤの添加前に４時間インキュベートされた。抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体またはＤＶＤは、０．１％のＢＳＡを含むＥＭＢ−２中で連続希釈され、５０μｌ中、組換えヒトＶＥＧＦ１６５（５０ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間２５℃にてプレインキュベートされた。次に、抗体とＶＥＧＦの混合物またはＤＶＤとＶＥＧＦの混合物が、細胞に添加され（５０μｌ）、プレートは、加湿された、５％のＣＯ２雰囲気下で７２時間、３７℃にてインキュベートされた。細胞の生存／増殖は、製造業者の使用説明書に従って、ＡＴＰｌｉｔｅキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈｍａｎ、ＭＡ）を用いてＡＴＰレベルを評価することによって間接的に測定された。
【０２０６】
上記したアッセイによって特徴付けられる、抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤのインビトロ活性を表７に概要する。
【０２０７】
【表８】
2019202994.tif 000014
【０２０８】
［実施例４］
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤのインビボにおける薬物動態結果
ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−ＡＶ  ＤＶＤの薬物動態特性は、ボーラス静脈内投与後に、カニクイザル（それぞれの投薬群についてｎ＝２）およびＣＤ１マウス（それぞれの投薬群についてはｎ＝６）において評価された。ＣＤ１マウスとカニクイザルの両方でｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤ薬物動態プロファイルは、従来のモノクローナル抗体の特徴を示している（表８）。
【０２０９】
【表９】
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【０２１０】
［実施例５］
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤのインビボでの抗腫瘍有効性
腫瘍増殖における抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤの効果は、最初に、雌性裸ヌードマウスにおけるＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌異種移植腫瘍において評価された。簡単には、２×１０６個の細胞は、右の後ろ脇腹に皮下接種された。腫瘍は２５日間定着され、その時点で、式：Ｌ×Ｗ２／２を用いて、点腫瘍体積は、電子キャリパー測定により決定された。マウスは、処置群（群あたりｎ＝１０）に配分され、そのため、それぞれのコホートは、治療開始前に２１４ｍｍ３の同等の平均腫瘍体積を有した。動物は、４週間、毎週、腹腔内に投薬され、腫瘍体積は、実験期間中に週２回測定された。結果を表９に示す。
【０２１１】
その後、腫瘍増殖における抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤの効果は、雌性ＳＣＩＤマウスにおけるＵ８７−ＭＧヒト膠芽細胞腫異種移植腫瘍において評価された。簡単には、３×１０６細胞は、右の後ろ脇腹に皮下接種された。腫瘍は１７日間定着され、その時点で、式：Ｌ×Ｗ２／２を用いて、点腫瘍体積は、電子キャリパー測定により決定された。マウスは、処置群（群あたりｎ＝１０）に配分され、そのため、それぞれのコホートは、治療開始前に２２１ｍｍ３の同等の平均腫瘍体積を有した。動物は、４週間、毎週、腹腔内に投薬され、腫瘍体積は、実験期間中に週２回測定された。結果を表９に示す。
【０２１２】
【表１０】
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【０２１３】
［実施例６］
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤのインビボでの組み合わせ有効性
腫瘍増殖における化学療法と組み合わせた抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤの効果は、雌性ＳＣＩＤマウスにおけるＵ８７−ＭＧヒト膠芽細胞腫異種移植腫瘍において評価された。簡単には、３×１０６個の細胞は、右の後ろ脇腹に皮下接種された。腫瘍は２２日間定着され、その時点で、式：Ｌ×Ｗ２／２を用いて、点腫瘍体積は、電子キャリパー測定により決定された。マウスは、処置群（群あたりｎ＝１０）に配分され、そのため、それぞれのコホートは、治療開始前に２０７ｍｍ３の同等の平均腫瘍体積を有した。動物は、単回投薬のｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ（Ｒ）および／または４週間毎の投薬の抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤで腹腔内に投薬され、腫瘍体積は、実験期間中に週２回測定された。結果を表１０に示す。
【０２１４】
【表１１】
2019202994.tif 000017
【０２１５】
［実施例７］
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤの予備製剤化の特徴付け
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ（ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−ＡＶ）の保存安定性（５℃）および安定性の促進（４０℃）は、以下に列挙されている製剤およびタンパク質濃度において評価された。安定性は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって評価され、凝集体％、モノマー％、断片％および回収された種全体が定量された。全体的に、製剤は、５−７のｐＨ範囲をカバーし、１．０−１１８ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度範囲をカバーする。
【０２１６】
５℃と４０℃の温度で、５０、３０および１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にて、製剤は、１５ｍＭ酢酸塩  ｐＨ５；１５ｍＭリン酸塩  ｐＨ７；３０ｍＭ酢酸塩、８０ｍｇ／ｍｌショ糖、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ８０  ｐＨ５；３０ｍＭヒスチジン、８０ｍｇ／ｍｌショ糖、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ８０  ｐＨ６；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）であった。全ての製剤は、保存中に微生物の増殖を防止するために０．０２％のアジ化ナトリウムを含有した。５℃と４０℃の温度で、６０、５０、３０および１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にて、製剤は、１５ｍＭヒスチジン  ｐＨ６であった（同様に、保存中に微生物の増殖を防止するために０．０２％のアジ化ナトリウムを含有した。）。５℃で、１１８ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にて、製剤は、１５ｍＭヒスチジン  ｐＨ６であった（同様に、保存中に微生物の増殖を防止するために０．０２％のアジ化ナトリウムを含有した。）。４０℃で、１．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にて、製剤は、ｐＨ５、６、７で１０ｍＭクエン酸塩＋１０ｍＭリン酸塩であった。タンパク質を含む製剤は、可能な微生物を除去するために濾過された。
【０２１７】
凍結−融解安定性は、製剤中のタンパク質を、−８０℃にて少なくとも２０時間凍結させ、３０℃の水浴中での融解する４サイクルに供することによって行われた。凍結−融解安定性について試験された製剤は、以下に列挙される。安定性は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって評価され、凝集体％、モノマー％、断片％および回収された種全体が定量された。製剤は、６０ｍｇ／ｍｌタンパク質で１５ｍＭヒスチジン  ｐＨ６（同様に、微生物の増殖を防止するために０．０２％のアジ化ナトリウムを含有した。）であり、ｐＨ５、６、７および１．０ｍｇ／ｍｌタンパク質で１０ｍＭクエン酸塩＋１０ｍＭリン酸塩（可能な微生物を除去するために濾過された。）であった。
【０２１８】
最後に、熱安定性を測定するための示差走査熱量測定が、ｐＨは５、６、７および１．０ｍｇ／ｍｌタンパク質で、１０ｍＭクエン酸＋１０ｍＭリン酸緩衝液中のタンパク質について行われた。それぞれのタンパク質ドメインのアンフォールディングの開始温度とアンフォールディングの中点温度（Ｔｍ）が定量された。
【０２１９】
表１１と１２におけるデータに基づいて、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖは、ＤＶＤ−Ｉｇ安定性についての予備製剤化基準を満たした。
【０２２０】
【表１２】
2019202994.tif 000018
2019202994.tif 000019
【０２２１】
【表１３】
2019202994.tif 000020
2019202994.tif 000021
【０２２２】
【表１４】
2019202994.tif 000022
【０２２３】
【表１５】
2019202994.tif 000023
【０２２４】
［実施例８］
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤについての製剤選択
材料および方法。抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇ  ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−ＡＶタンパク質の安定性は、表１５に列挙された６個の製剤において評価された。全ての製剤は、１５ｍＭのヒスチジン緩衝液中で調製された。製剤Ｆ１からＦ４は、５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で調製された。これらの製剤において、ｐＨは、５．５−６．０の範囲であり、ポリソルベート８０の濃度は、０−０．０５ｗ／ｖ％の範囲であり、ショ糖濃度は、０−７．５ｗ／ｖ％の範囲であり、アルギニン濃度は、０−１ｗ／ｖ％の範囲であった。製剤Ｆ４は、いずれもの安定剤を含むことなく、１５ｍＭヒスチジン緩衝液  ｐＨ６．０中に調製され、５０ｍｇ／ｍＬ液体製剤安定性評価用の研究対照として機能を果たした。さらに、２つの製剤は、ｐＨ６．０で２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で調製された（製剤Ｆ５およびＦ６）。ポリソルベート８０とショ糖との組成は、これらの２つの製剤においてわずかに異なっていた；ポリソルベート８０の濃度は、０．０２５ｗ／ｖ％−０．０３ｗ／ｖ％の範囲であり、ショ糖の濃度は、３．８ｗ／ｖ％−４ｗ／ｖ％の範囲であった。Ｆ１からＦ５の製剤は、初期の調製プロセスからの材料を使用し、一方、Ｆ６製剤は、より最適化されたプロセスからの材料を用いて製剤化された。製剤Ｆ５およびＦ６の組成は、非常に類似していたが、安定性の差異が、これらの２つの間に観察された。組成物は、異なるプロセスから調製されたため、これは、観察された安定性の差異の原因となり得る。
【０２２５】
【表１６】
2019202994.tif 000024
【０２２６】
上記の製剤において、１５ｍＭのヒスチジン緩衝液は、標的とする製剤ｐＨを維持するのに十分な緩衝能を提供するため、選択された。ショ糖は、凍結−融解ストレス（凍結防止剤）および凍結乾燥プロセスによって誘導されるストレス（凍結乾燥防止剤）に対する安定剤として評価された。ポリソルベート８０（界面活性剤）およびアルギニンは、凝集体および粒子形成に対して、製剤を潜在的に安定化させるために添加された。
【０２２７】
液体製剤の安定性は、凍結／融解中に、−８０、５、２５および４０℃にて、視覚的外観、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）による凝集体％、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）による電荷不均一性、還元型ＳＤＳ−キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）による断片化、およびマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）または光遮蔽（ＨＩＡＣ）によるサブ可視粒子を含む広範な分析的アッセイによって評価された。これらの結果を表１６から１９に与える。
【０２２８】
【表１７】
2019202994.tif 000025
2019202994.tif 000026
【０２２９】
【表１８】
2019202994.tif 000027
【０２３０】
【表１９】
2019202994.tif 000028
【０２３１】
【表２０】
2019202994.tif 000029
【０２３２】
凍結乾燥された製剤の安定性試験。製剤を凍結乾燥した後、結合タンパク質ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖを含有する選択製剤の安定性もまた評価された。凍結乾燥された薬品の安定性は、ショ糖を含有する全ての製剤（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５およびＦ６）について評価された。安定性は、５５℃で２週間保存した後に評価された。安定性は、視覚的外観（再構成の前後）、再構成時間、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）による凝集体％、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）による電荷不均一性、還元型ＳＤＳ−キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）による断片化、マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）または光遮蔽（ＨＩＡＣ）によるサブ可視粒子、およびカールフィッシャー滴定による水分量などを含む広範な分析的アッセイによって試験された。
【０２３３】
凍結乾燥された製剤の安定性試験結果を表２０に与える。評価された全ての製剤について、再構成時間は約１から２分であった。ＳＥＣによる凝集体の僅かな増加とＣＥＸによる塩基性領域％は、５５℃のストレスが与えられた保存状態下で全ての製剤について観察された。最小限の変更は、他の全ての測定された生成物の安定特性において観察された。
【０２３４】
【表２１】
2019202994.tif 000030
【０２３５】
製剤Ｆ６の安定性（凍結乾燥されている、１バイアルあたり２００個の結合タンパク質ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ）もまた、１２カ月の期間にわたって評価された。製剤は、試験期間にわたって安定していた。
【０２３６】
投薬溶液の安定性試験。抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ結合タンパク質は、静脈内投与（ＩＶ）について試験される。投与前に、凍結乾燥された薬品は、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）で再構成される。その後、再構成された生成物は、ＩＶ注入に適している溶液中に希釈される。投薬溶液が希釈される最終濃度は、投与される臨床投薬量に基づいて決定される。
【０２３７】
研究は、２つの通常使用されるＩＶ希釈剤である０．９％の生理食塩水と５％のデキストロース（Ｄ５Ｗ）のうちの１つを含有する投薬溶液における場合、希釈された抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ結合タンパク質ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖの安定性を評価するために行われた。評価されたタンパク質濃度は、０．５および１ｍｇ／ｍＬであった。投薬溶液の安定性および注入成分との適合性を評価するために、試験条件あたり投薬溶液が調製され、ＩＶバッグ（ｎ＝２）に６時間、ＲＴ／ＲＬで保存され、その後、模擬注入試験は、インラインフィルターを含む、通常使用される注入投与成分を用いて行われた。試験試料は、ＩＶバッグ（Ｔ０）において投薬溶液を調製した後、バッグから直接引き出された。さらに、３０分間の注入プロセスの終了時に回収された試料が試験された。試料は、視覚的外観、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）による凝集体％および光遮蔽（ＨＩＡＣ）による不可視粒子を含む一団の分析的アッセイによって試験された。
【０２３８】
投薬溶液の安定性研究は、表２１に与えられる。出発物質中の凝集体レベルは０．７％であった。投薬溶液が生理食塩水中に調製された後、生理食塩水中での希釈時（Ｔ０）および注入の終了時には凝集体レベルの増加を示す明確な傾向が観察された。さらに、これらの試料における不可視粒子カウントは高かった。比較では、５％のデキストロース（Ｄ５Ｗ）中に調製された投薬溶液は、微粒子に対する許容可能な安定性傾向とともに、一貫して低い凝集体％レベルを示した。
【０２３９】
【表２２】
2019202994.tif 000031
【０２４０】
［実施例９］
拡張された予備製剤化の特徴付け
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤにおける拡張された予備製剤化の特性付けは、異なる製剤化条件がＤＶＤの安定性にどのように影響を与えるのかを調査するために行われた。ｈ１Ａ１１．１−ＬＳ−Ａｖのデータは表２２と２３に提供される。ＤＶＤの保存安定性（５℃）および安定性の促進（４０℃）は、以下に列挙された製剤とタンパク質濃度において評価された。安定性は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）および凝集体％、モノマー％、断片％によって評価され、回収された種全体が定量された。全体的に、製剤は、５−７のｐＨ範囲および１０−５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度範囲をカバーする。
【０２４１】
５℃と４０℃の温度で、５０、３０および１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、以下の製剤が評価された：１５ｍＭ酢酸塩  ｐＨ５、１５ｍＭヒスチジン  ｐＨ６、１５ｍＭリン酸塩  ｐＨ７、３０ｍＭ酢酸塩、８０ｍｇ／ｍｌショ糖、０．０２％のＴｗｅｅｎ  ８０  ｐＨ５、３０ｍＭヒスチジン、８０ｍｇ／ｍｌショ糖、０．０２％のＴｗｅｅｎ  ８０  ｐＨ６およびＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）。全ての製剤は、保存中の微生物の増殖を防止するために０．０２％のアジ化ナトリウムを含有した。
【０２４２】
表２２と２３におけるデータに基づいて、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖは、ＤＶＤ−Ｉｇ安定性についての予備製剤化基準を満たした。
【０２４３】
【表２３】
2019202994.tif 000032
2019202994.tif 000033
【０２４４】
【表２４】
2019202994.tif 000034
【０２４５】
［実施例１０］
ＤＬＬ４細胞アッセイにおける抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤの中和活性におけるＶＥＧＦの効果
ＶＥＧＦ結合が抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤのＤＬＬ４中和効力に影響を及ぼすかどうかを評価するために、ＶＥＧＦが、実施例３．３に記載されるＤＬＬ４−Ｎｏｔｃｈレポーターアッセイに含まれた。簡単には、ヒトＤＬＬ４を発現するＨＥＫ２９３Ｇ細胞は、３００ｎＭから連続希釈されたｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤまたは抗ＤＬＬ４  ｍＡｂ（ｈ１Ａ１１．１）と抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ（Ａｖ）の混合物の存在下で２４時間、ＥＡ．ｈｙ９２６  Ｎｏｔｃｈレポーター細胞と共培養された。組換えヒトＶＥＧＦ１６５（ＶＥＧＦの生理学的に関連するヒトスプライスアイソフォーム）または陰性対照タンパク質（ＢＳＧ２）もまた含まれた。ＤＬＬ４中和効力は、ＩＣ５０値、ＤＬＬ４誘導性のＮｏｔｃｈ活性化の５０％減少を達成するのに必要とされる抗体の濃度を評価することによって決定された。表２４に示されるように、６または１５０ｎＭ  ＶＥＧＦの存在が、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤのＤＬＬ４中和効力を大いに増加させた。この増加した効力は、親ｍＡｂ混合物が、含まれたＶＥＧＦの有無に関わらずに同様の効力を示したため、抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤに固有である。
【０２４６】
【表２５】
2019202994.tif 000035
【０２４７】
別の実験において、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤの一価Ｆａｂ断片はまた、ＤＬＬ４中和細胞アッセイにおいて評価された。ＤＶＤ  Ｉｇとは対照的に、一価ＤＶＤ  Ｆａｂは弱いＤＬＬ４中和効力を有する。ＶＥＧＦの存在は、ＤＶＤ−Ｆａｂの効力を改善したが、ＤＶＤ−Ｉｇを用いて観察された程度ではなかった（表２５）。
【０２４８】
【表２６】
2019202994.tif 000036
【０２４９】
別の実験において、ＶＥＧＦ濃度は、連続して徐々に減少され、上述のＤＬＬ４−Ｎｏｔｃｈレポーターアッセイに適用された。表２６に示されるように、ＶＥＧＦは、１．２ｎＭ程度に低い濃度で、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤのＤＬＬ４の中和活性を増大させることができる。
【０２５０】
【表２７】
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【０２５１】
［実施例１１］
ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇのインビボでの組み合わせ有効性
腫瘍増殖における化学療法剤と組み合わせた抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇの効果は、雌性ＳＣＩＤマウスにおけるＳＷ−４８ヒト結腸異種移植腫瘍において評価された。簡単には、５×１０６個の細胞は、右の後ろ脇腹に皮下接種された。腫瘍は１３日間定着され、その時点で、式：Ｌ×Ｗ２／２を用いて、点腫瘍体積は、電子キャリパー測定により決定された。マウスは、処置群（群あたりｎ＝１０）に配分され、そのため、それぞれのコホートは、処置開始前に２１１ｍｍ３の同等の平均腫瘍体積を有した。動物は、表２７における投薬量とスケジュールで、イリノテカン、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂおよび／または抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇで投薬された。腫瘍体積は、実験期間中、週２回測定された。結果を表２７に示す。
【０２５２】
【表２８】
2019202994.tif 000038
【０２５３】
また、腫瘍増殖における化学療法剤と組み合わせた抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇの効果は、雌性ＳＣＩＤマウスにおけるＨＣＴ−１１６ヒト結腸異種移植腫瘍において評価された。簡単には、５×１０６細胞は、右の後ろ脇腹に皮下接種された。腫瘍は１４日間定着され、式：Ｌ×Ｗ２／２を用いて、点腫瘍体積は、電子キャリパー測定により決定された。マウスは、処置群（群あたりｎ＝９）に配分され、そのため、それぞれのコホートは、処置開始前に１９２ｍｍ３の同等の平均腫瘍体積を有した。動物は、表２８における投薬量とスケジュールで、５−ＦＵ、ロイコボリン、イリノテカン、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂおよび／または抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇで投薬された。腫瘍体積は、実験期間中、週２回測定された。結果を表２８に示す。
【０２５４】
【表２９】
2019202994.tif 000039
【０２５５】
腫瘍増殖における化学療法剤と組み合わせた抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇの効果は、雌性ＳＣＩＤマウスにおけるＨＴ−２９ヒト結腸異種移植腫瘍において評価された。簡単には、５×１０６細胞は、右の後ろ脇腹に皮下接種された。腫瘍は２５日間定着され、その時点で、式：Ｌ×Ｗ２／２を用いて、点腫瘍体積は、電子キャリパー測定により決定された。マウスは、処置群（群あたりｎ＝１０）に配分され、そのため、それぞれのコホートは、処置開始前に２０９ｍｍ３の同等の平均腫瘍体積を有した。動物は、表２９における投薬量とスケジュールで、イリノテカンおよび／または抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇで投薬された。腫瘍体積は、実験期間中、週２回測定された。結果を表２９に示す。
【０２５６】
【表３０】
2019202994.tif 000040
【０２５７】
腫瘍増殖における化学療法剤と組み合わせた抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇの効果は、雌性ＳＣＩＤマウスにおけるＵ８７−ＭＧヒト膠芽細胞腫異種移植腫瘍において評価された。簡単には、３×１０６細胞は、右の後ろ脇腹に皮下接種された。腫瘍は１３日間定着され、その時点で、式：Ｌ×Ｗ２／２を用いて、点腫瘍体積は、電子キャリパー測定により決定された。マウスは、処置群（群あたりｎ＝１０）に配分され、そのため、それぞれのコホートは、処置開始前に２０７ｍｍ３の同等の平均腫瘍体積を有した。動物は、表３０における投薬量とスケジュールで、テモゾロミド、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂおよび／または抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇで投薬された。腫瘍体積は、実験期間中、週２回測定された。結果を表３０に示す。
【０２５８】
【表３１】
2019202994.tif 000041
【０２５９】
腫瘍増殖における化学療法剤と組み合わせた抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇの効果は、雌性ＮＳＧマウスにおけるＰＡ０１２３患者由来のヒト膵臓異種移植腫瘍において評価された。簡単には、凍結された腫瘍断片は、右の後ろ脇腹に皮下接種された。腫瘍は２８日間定着され、その時点で、式：Ｌ×Ｗ２／２を用いて、点腫瘍体積は、電子キャリパー測定により決定された。マウスは、処置群（群あたりｎ＝７）に配分され、そのため、それぞれのコホートは、処置開始前に１９３ｍｍ３の同等の平均腫瘍体積を有した。動物は、表３１における投薬量とスケジュールで、ゲムシタビンおよび／または抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇで投薬された。腫瘍体積は、実験期間中、週２回測定された。結果を表３１に示す。
【０２６０】
【表３２】
2019202994.tif 000042
【０２６１】
腫瘍増殖における化学療法剤と組み合わせた抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇの効果は、雌性ＳＣＩＤマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃヒト乳房異種移植腫瘍において評価された。簡単には、２×１０６細胞は、乳腺脂肪体に移植された。腫瘍は１３日間定着され、式：Ｌ×Ｗ２／２を用いて、点腫瘍体積は、電子キャリパー測定により決定された。マウスは、処置群（群あたりｎ＝１０）に配分され、そのため、それぞれのコホートは、処置開始前に１５０ｍｍ３の同等の平均腫瘍体積を有した。動物は、表３２における投薬量とスケジュールで、パクリタキセルおよび／または抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇで投薬された。腫瘍体積は、実験期間中、週２回測定された。さらに、生物発光画像は、肺および／またはリンパ節への癌細胞の自然転移を監視および追跡するために取得された。結果を表３２に示す。
【０２６２】
【表３３】
2019202994.tif 000043
【０２６３】
腫瘍増殖における化学療法剤と組み合わせた抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇの効果は、雌性ＳＣＩＤマウスにおけるＳＵＭ１４９ＰＴヒト乳房異種移植腫瘍において評価された。簡単には、１×１０６細胞は、右の後ろ脇腹に皮下接種された。腫瘍は２８日間定着され、式：Ｌ×Ｗ２／２を用いて、点腫瘍体積は、電子キャリパー測定により決定された。マウスは、処置群（群あたりｎ＝９）に配分され、そのため、それぞれのコホートは、処置開始前に１８３ｍｍ３の同等の平均腫瘍体積を有した。動物は、表３３における投薬量とスケジュールで、パクリタキセルおよび／または抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇで投薬された。腫瘍体積は、実験期間中、週２回測定された。結果を表３３に示す。
【０２６４】
【表３４】
2019202994.tif 000044
【０２６５】
腫瘍増殖における化学療法剤と組み合わせた抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇの効果は、雌性ＳＣＩＤマウスにおけるＳＵＭ１４９ＰＴヒト乳房異種移植腫瘍において評価された。簡単には、１×１０６細胞は、右の後ろ脇腹に皮下接種された。腫瘍は２５日間定着され、式：Ｌ×Ｗ２／２を用いて、点腫瘍体積は、電子キャリパー測定により決定された。マウスは、処置群（群あたりｎ＝１０）に配分され、そのため、それぞれのコホートは、処置開始前に２２８ｍｍ３の同等の平均腫瘍体積を有した。動物は、表３４における投薬量とスケジュールで、パクリタキセル、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂおよび／または抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇで投薬された。腫瘍体積は、実験期間中、週２回測定された。結果を表３４に示す。
【０２６６】
【表３５】
2019202994.tif 000045
【０２６７】
腫瘍増殖における化学療法剤と組み合わせた抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇの効果は、雌性ＳＣＩＤマウスにおけるＨＣＴ−１１６ヒト結腸異種移植腫瘍において評価された。簡単には、５×１０６細胞は、右の後ろ脇腹に皮下接種された。腫瘍は２５日間定着され、式：Ｌ×Ｗ２／２を用いて、点腫瘍体積は、電子キャリパー測定により決定された。マウスは、処置群（群あたりｎ＝９）に配分され、そのため、それぞれのコホートは、処置開始前に１９８ｍｍ３の同等の平均腫瘍体積を有した。動物は、表３５における投薬量とスケジュールで、５−ＦＵ、カペシタビンおよび／または抗ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇで投薬された。腫瘍体積は、実験期間中、週２回測定された。結果を表３５に示す。
【０２６８】
【表３６】
2019202994.tif 000046
【０２６９】
［実施例１２］
ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤの異種間の細胞効力
ＤＬＬ４に対するｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤの異種間の中和効力は、種を超えて、固定された組換えＤＬＬ４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を用いて細胞ベースアッセイにおいて比較された。このアッセイは、ヒト、ラット、マウスおよびカニクイザルの種に由来するＤＬＬ４の同濃度に対して、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤの活性を比較するために利用された。
【０２７０】
透明底ウェルを有する黒色９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、＃３９０４）は、ＰＢＳ中に希釈された１００μＬ／ウェルのＤＬＬ４−ＥＣＤ（１１ｎＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１４１９０）または対照としての１００μＬ／ウェルの１１ｎＭ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ９５７６）のいずれかで予め被覆された。アッセイプレートは密封され、４℃にて１８時間インキュベートされた。翌日、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤは、１０％のＦＢＳを含有するアッセイ培地ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１９９５）中に連続希釈された。予め被覆されたアッセイプレートは、５０μＬ／ウェルの連続希釈されたｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤ溶液を添加する前に、アッセイ培地で１回濯がれた。次に、アッセイプレートは、２５℃にて３０分間インキュベートされた。インキュベーション中に、対照ウミシイタケルシフェラーゼおよびＮｏｔｃｈ応答性プロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼを発現するＥＡ．ｈｙ９２６細胞は、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃２５２００）を用いて培養フラスコから脱着され、アッセイ培地中に３×１０５細胞／ｍＬに再懸濁され、その後、２５μＬ細胞／ウェルでアッセイプレートに直接添加された。次に、アッセイプレートは、３７℃、５％のＣＯ２にて２４時間インキュベートされた。ホタルルシフェラーゼアッセイおよびウミシイタケルシフェラーゼアッセイは、販売業者のプロトコール（Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２９４０）に従って行われた。発光は、プレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、＃１４２０−０５１）で読み取り、生じたデータはウミシイタケルシフェラーゼの発光シグナルに対して標準化された。
【０２７１】
表３６に示されるように、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤは、同等な効力を有するヒトおよびカニクイザルのＤＬＬ４活性を阻害する。ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤはまた、マウスＤＬＬ４を阻害し、ヒトＤＬＬ４と比較して約３倍低い活性を有する。ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤは、細胞アッセイにおいて、ラットＤＬＬ４活性を阻害しない。
【０２７２】
ＶＥＧＦに対するｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤの異種間の中和効力は、ＶＥＧＦで刺激されたＮＩＨ３Ｔ３／ＶＥＧＦＲ−２細胞増殖および生存率アッセイにおいて評価された。
【０２７３】
全長ヒトＶＥＧＦＲ−２のｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ＶＥＧＦで刺激された増殖および生存アッセイに使用された。ＮＩＨ３Ｔ３／ＶＥＧＦＲ−２の安定な細胞株のコンフルエント培養物は、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃２５２００）を用いて培養フラスコから脱着され、アッセイ培地：０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ９５７６）を含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１９９５）を用いて１．３３×１０５細胞／ｍＬに再懸濁された。細胞は、透明底を有する黒色９６ウェル組織培養アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ、＃３９０４）中に７５μＬの全体積において１０，０００細胞／ウェルにて播種され、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートされた。翌日、組換えＶＥＧＦタンパク質およびｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−ＡＶ  ＤＶＤは、アッセイ培地で希釈され、９６ウェルのポリプロピレン製プレート中で混合され、２５℃にて３０分間インキュベートされた。次に、ＶＥＧＦおよびｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−ＡＶ  ＤＶＤカクテル（４×）は、２５μＬ／ウェルにてアッセイプレート上の細胞に添加された。その後、処理された細胞を含有するアッセイプレートは、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートされた。７２時間後、生存率アッセイは、販売業者のプロトコール（ＡＴＰｌｉｔｅ  １ＳＴＥＰ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、＃６０１６７３９）に従って行われた。発光は、プレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、＃１４２０−０５１）で読み取られた。
【０２７４】
表３６に示されるように、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−ＡＶ  ＤＶＤは、カニクイザルＶＥＧＦ活性を中和し、ヒトＶＥＧＦと比較して同様の効力であった。ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−ＡＶ  ＤＶＤは、細胞アッセイにおいてマウスおよびラットＶＥＧＦを阻害しない。
【０２７５】
【表３７】
2019202994.tif 000047
【０２７６】
［実施例１３］
スクリーニングファンネル（ｆｕｎｎｅｌ）およびリード候補物の選択
リードＤＶＤ−Ｉｇ候補物の選択は、複数回サイクルの分子工学、数百の潜在的な候補分子の作製、続く、治療剤に必要とされる特性を有するＤＶＤ−Ｉｇ分子を同定するための一連のアッセイを含むことができるスクリーニングファンネルにおける試験を必要とし得て、これらの全ては、最適な機能特性を提供する可変ドメイン配列または他の構造に関するガイダンスがない。典型的には、これらの特性は、限定されないが、以下の評価を含む：（ａ）内部と外部の抗原結合ドメインの両方についての結合動態（結合速度、解離速度および親和性）、（ｂ）種々の生化学的アッセイおよび細胞バイオアッセイにおける効力、（ｃ）関連する腫瘍モデルにおけるインビボでの有効性、（ｄ）薬物動態学的および薬力学的特性、（ｅ）選択された細胞株におけるタンパク質発現レベル、拡張性、翻訳後修飾、物理化学的特性、例えば、モノマーの割合、溶解性および安定性（固有の安定性、凍結／解凍安定性、保存安定性など）を含む製造安定性、（ｆ）製剤特性、（ｇ）潜在的な免疫原性リスク、および（ｈ）分子の毒性が挙げられる。また、結合様式および結合価は評価され得て、それは、これらが分子の結合特性および細胞効力に影響を及ぼし得るためである。閾値レベルは、それぞれの評価パラメータについて設定され、各パラメータの優れたレベルを示す結合タンパク質が記述される。数百個の分子の初期スクリーニングから、多くの場合、さらなる評価のためにリード候補物を同定する場合、考慮される他の因子のうち、列挙されたパラメータの全てを満たす特性を有するただ１つの分子が出現するまたは全く出現しない。リード候補物が同定されると、治療特性のさらなるインビボでの評価が調べられ、この評価には、動物およびヒト対象における安全性、有効性および効力が含まれる。
【０２７７】
［実施例１４］
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇリード候補物の選択
本発明者らは、表２に列挙されたＶＥＧＦとＤＬＬ４配列を用いて、構築物、ならびにこれらの可変ドメインのＣＤＲ移植され、親和性成熟されたバージョンと追加のヒト化され、完全なヒト可変ドメイン配列を含む、約１００個の抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇ分子を構築し、評価した。完全なヒト親抗ＤＬＬ４  ｍＡｂは、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ｍＲＮＡディスプレイ技術、続く、酵母ディスプレイ技術を用いた親和性成熟によって誘導された。ＣＤＲ−再移植された親抗体は、抗ＤＬＬ４  ｍＡｂ  Ｅ９．７１に基づき、いくつかのヒト化抗ＤＬＬ４  ｍＡｂは、ｈ１Ａ１１．１とｈ３８Ｈ１２．１１に基づいて調製され、さらに、いくつかの親和性成熟されたｈ１Ａ１１抗体が生成された。また、本発明者らは、ＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質において、多数の異なるリンカー配列を評価した。異なるリンカーの使用は、同じ可変ドメイン配列を有する結合タンパク質間でさえ、広く異なる特性をもたらした。
【０２７８】
生成された約１００個のＤＶＤ−Ｉｇ分子のうち、これらのうちの１０個は、一過性トランスフェクションによりＨＥＫ２９３細胞において所望レベルの発現を達成しなかったために除外され、２２個は、ＤＬＬ４への結合の所望の閾値レベルを示さず、１９個は、ＶＥＧＦへの結合の所望の閾値レベルを示さず、いくつかは、Ｏ結合型グリコシル化を含む準最適な翻訳後修飾を示した。いくつかのＤＶＤ−Ｉｇは、所定の閾値を下回る結合親和性を示したために除外された。ＤＶＤ−Ｉｇの内部位置での抗原結合ドメインは、抗原結合親和性および効力のレベル低下を示す場合がある。例えば、ＶＥＧＦ結合ドメインが外部位置に配置され、ＤＬＬ４結合ドメインが内部位置に配置されているｈ１Ａ１１／ＡｖシリーズのＤＶＤ−Ｉｇ分子の全ては、ＤＬＬ４結合親和性の減少を示した。したがって、これらのＤＶＤ−Ｉｇは、さらなる研究のために選択されなかった。反対の配向（すなわち、内部位置のＶＥＧＦ結合ドメインと外部位置のＤＬＬ４結合ドメイン）において、同じ可変ドメインと配向を用いるが、他のリンカー配列、例えば、ｈ１Ａ１１．１−ＳＳ−Ａｖ（重鎖と軽鎖の両方にあるＶＤ１とＶＤ２ドメイン間の短いリンカー）を有する結合タンパク質にさえ、予想外に優れていることが見出された。
【０２７９】
さらに、親和性成熟は、モノクローナル抗体の形態おける場合、非常に高い親和性と安定性を有する抗ＤＬＬ４親抗体を生成するためにｈ１Ａ１１について行われたが、ＤＶＤ−Ｉｇの形態においては、これらの構築物は、使用されたリンカーまたは結合ドメインの配向にもかかわらず、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖについて観察された安定性のレベルを示さなかった。同様に、Ａｖ（抗ＶＥＧＦ）可変ドメインの親和性成熟は、再び、リンカーと配向操作にもかかわらず、安定性レベルの低下を示す安定した親モノクローナル抗体を生成した。さらに、親和性成熟は、モノクローナル抗体のための優れた結合動態を生じさせる場合でさえ、その後のＤＶＤ−Ｉｇの活性を予測できない場合がある。例えば、ｈ１Ａ１１．１が、その親和性成熟されたバリアントで置換されたとき、これらの新規なＤＶＤ−Ｉｇ分子は、腫瘍モデルにおいて、安定性、より短い生体内での半減期、および抗腫瘍活性の減少を示した。さらに、親和性成熟されたｈ１Ａ１１および／またはＡｖ可変ドメインを含有するＤＶＤ−Ｉｇ分子はまた、５℃での保存中に、ゲル化し、高レベルの凝集体を形成する傾向の増加を示した。この望ましくないゲル化および凝集は、特に、ＤＶＤ−Ｉｇ  ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖに関して、同様の条件下で保存した場合、元の親抗体可変ドメイン（すなわち、親和性成熟されていない抗体由来の可変ドメイン）を含むＤＶＤ−Ｉｇ分子について観察されなかった。
【０２８０】
これは、抗原結合親和性単独が、臨床的候補物を選択した場合に考慮される唯一の因子ではないことを示し、実際の結合親和性は、他の結合タンパク質特性、例えば、安定性、製剤化性、物理化学的特性、インビボでの抗腫瘍効力および／または薬物動態学的特性を予測できない場合があり、これらは、ほんの僅かな構造的修飾に感受性である。例えば、ｈ１Ａ１１．１−ＬＳ−Ａｖ、ｈ１Ａ１１．１−ＬＬ−ＡＶおよびｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ  ＤＶＤ−Ｉｇ分子のＶＥＧＦおよびＤＬＬ４中和効力は、概して同等であったが（表７）、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖは、腫瘍増殖の阻害効力の最大レベルを示した（表９）。さらに、結合親和性および細胞効力を保持するＤＶＤ−Ｉｇ分子について、これらのうちのいくつかは、あまり良好でない物理化学的特性を示した。例えば、ｈ１Ａ１１．１−ＬＬ−ＡＶは、治療的リードｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖに非常に類似しているが、２つの構築物における２つの可変ドメインを連結するリンカー間の相違は、ｈ１Ａ１１．１−ＬＬ−Ａｖについてあまり良好でない物理化学的特性をもたらした。これは、例えば、ＤＶＤ−Ｉｇにおける２つの可変ドメイン間のリンカーに対するごく小さな変化が、評価された治療的特性において大きな影響を有し得ることを示す。
【０２８１】
特定の所望の特徴の存在に基づいて、上記されたアッセイにおいて測定したとき、約１００個以上のＤＶＤ−Ｉｇ分子のうち１７個は、抗腫瘍活性および薬物動態学的特性についてマウスモデルにおいてさらに試験された。ＤＶＤ−Ｉｇ  ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖは、試験された他の結合タンパク質と比較して、予想外に優れた腫瘍抑制効力および薬物動態学的特性を示した。このようにして、スクリーニングファンネルにおいて使用される除外基準を評価すると、ＤＶＤ−Ｉｇ  ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖは、最終的に、測定されたパラメータのそれぞれにおいて、良好な（すなわち、閾値値を上回る）特性を示す結合タンパク質として出現した。したがって、結合タンパク質は、さらなる評価および研究のために選択された。
【０２８２】
［実施例１５］
初期のＶＥＧＦ／ＤＬＬ４  ＤＶＤ−Ｉｇとの比較
ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖは、米国特許出願公開第２０１０００７６１７８号（その出願の表５を参照されたい）において公開された９６個の従来のＶＥＧＦ／ＤＬＬ４  ＤＶＤ−Ｉｇ分子と直接比較されなかったが、間接的な比較を行うことができる。例えば、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−ａｖは、参照抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂＡＶに匹敵するＶＥＧＦ結合活性を示した（表５を参照されたい）。対照的に、米国特許出願公開第２０１０００７６１７８号において試験された９６個のＶＥＧＦ／ＤＬＬ４  ＤＶＤ−Ｉｇ分子のうち少なくとも３分の２が、参照抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ  ＡＢ０１４よりも弱いＶＥＧＦ結合活性を有した。（ＡＢ０１４は、抗体ＡＶと同様の可変ドメイン配列を含む。）。したがって、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖは、先の出願において試験された大部分のＤＶＤ−Ｉｇ構築物と比較して、改善された結合動態を示すように見える。
【０２８３】
前述の実施例は、本開示を例証することが意図され、決して本発明を限定することを意図していない。開示されているデバイスおよび方法の他の実施形態は、本明細書に開示されているデバイスおよび方法の仕様および実施を考慮すれば当業者には明らかとなる。
【０２８４】
参照による援用
本出願を通して引用されてもよい、すべての引用される参考資料（参考文献、特許、特許出願およびウェブサイトを含む）の内容は、これによって、これらの参考資料がそこに記載されているかのように、いずれかの目的で参考資料の全体を参照することにより明確に援用される。本開示は、別段の記載がない限り、当該技術分野において周知である免疫学、分子生物学および細胞生物学の従来技術を使用する。
【０２８５】
本開示は、分子生物学および薬物送達の分野で周知の技術全体も、参照により組み込む。これらの技術には、以下の公報に記載されている技術が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０２８６】
【表３８】
2019202994.tif 000048
2019202994.tif 000049
【０２８７】
均等
本開示は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに他の具体的な形態で実施することができる。したがって、前述の実施形態は、本開示を限定するというよりはむしろ、すべての点において例示していると考えるべきである。よって、本開示の範囲は、前述の記載によるというよりはむしろ、添付される特許請求の範囲によって示され、したがって、特許請求の範囲の意味および均等の範囲内にあるすべての変更は本明細書に包含されることが意図される。
【図１】
2019202994.tif 000050
【配列表】
2019202994000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月5日(2019.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含むポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、リンカーであり、但し、ＣＨ１ではなく、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０または１であり、
結合タンパク質が、ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合し、ＶＤ１およびＶＤ２が、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または５３からの３つのＣＤＲを独立して含み、ＶＤ１および／またはＶＤ２の少なくとも１つが、配列番号３９からの３つのＣＤＲを含む結合タンパク質。