(57)【要約】      （修正有）【課題】PHAをリード化合物とした各種誘導体で、より強い活性を有するCK1阻害剤及び／又は概日リズム制御剤の提供。【解決手段】式Iで表される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物。2019210254.tif 000054（R1は、H又はC1-5の直鎖状、分枝状若しくは環状のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基、R2は、H、ハロゲン（F、Cl、Br若しくはI）、又はC1-4のアルキル基、環Aは、5〜8員のラクタム環を表す；但し、R1及びR2が共にHを除く。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Iで表されることを特徴とする化合物、その塩又はそれらの溶媒和物；
【化１】
2019210254.tif 000044
R1は、H又はC1-5の直鎖状、分枝状若しくは環状の置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、
R2は、H、ハロゲン（F、Cl、Br若しくはI）、又はC1-4の置換されていてもよいアルキル基であり、
環Aは、5〜8員のラクタム環を表す；
ただし、R1及びR2が共にHを除く。
【請求項２】
前記式(1)で表される化合物が、下記式(II)で表されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物；
【化２】
2019210254.tif 000045
R1は、H又はC1-5の直鎖状、分枝状若しくは環状の置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、
R2は、H、ハロゲン（F、Cl、Br若しくはI）、又は置換されていてもよいC1-3のアルキル基である；
ただし、R1及びR2が共にHを除く。
【請求項３】
前記式(II)で表される化合物が、下記式(III)〜(X)で表されることを特徴とする請求項２に記載の化合物；
【化３】
2019210254.tif 000046
【化４】
2019210254.tif 000047
【化５】
2019210254.tif 000048
【化６】
2019210254.tif 000049
【化７】
2019210254.tif 000050
【化８】
2019210254.tif 000051
【化９】
2019210254.tif 000052
【化１０】
2019210254.tif 000053
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物を含むことを特徴とする、カゼインキナーゼ１（Casein Kinase 1：CK1）阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物を含むことを特徴とする、植物の概日リズムの制御剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物を含むことを特徴とする、植物の概日リズムの長周期化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物のカゼインキナーゼ1（Casein Kinase 1、以下「CK1」と記載）に対する阻害及び／又は植物の概日リズムを制御する化合物、その塩又はそれらの溶媒和物、並びに、これらの化合物を含むCK1阻害剤、及び、該化合物を含む植物の概日リズムの制御剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物概日リズムは、植物の多様な活動、例えば花形成（非特許文献１〜３）、生長（非特許文献４）、一次代謝物（デンプン、糖等）の蓄積（非特許文献５）、二次代謝物（アントシアニン等）の蓄積（非特許文献６）、低温ストレス応答（非特許文献７）、乾燥ストレス応答（非特許文献７）、病原性細菌への抵抗性の発現（非特許文献８）、窒素代謝（非特許文献９）、鉄代謝（非特許文献１０）、気孔の開閉（非特許文献１１）、葉の緑化（非特許文献１２）、水の吸収（非特許文献１３）、種子の休眠（非特許文献１４）、茎の旋回運動（非特許文献１５）等に影響することが知られている。したがって、概日リズムを制御することによりこれらの活動を制御できることが期待される。
【０００３】
本発明者らは、この植物概日リズムを制御することが可能な化合物を合成し同定した（特許文献１）。さらに、これらの化合物よりも強い植物概日リズム制御活性を有する化合物PHA (2-(pyridin-4-yl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-pyrrolo[3,2-c]pyridine)を同定した。そして、このPHAが、植物のCK1を阻害することにより、植物の概日リズムを制御することを見出した（中道範人ら、Transformative bio-molecules for controlling biological time、第59回日本植物生理学会年会）。
【０００４】
しかし、植物のCK1阻害活性や概日リズム制御活性に対して、そのメカニズムは解明されておらず、また、PHAの構造に各種置換基を結合したPHAをリード化合物とする化合物に関しての構造活性相関も明らかにされておらず、さらに、より活性の強い化合物を取得できる可能性が考えられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2016-40231号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Current Opinion in Plant Biology 2010, 13:594-603.
【非特許文献２】TRENDS in Plant Science 2006, Vol.11 No.11 550-558.
【非特許文献３】Mol Plant, May 2013; 6: 635-649.
【非特許文献４】Nature, Vol 448| 19 July 2007 358-363.
【非特許文献５】The Plant Cell, Vol. 17, 3257-3281, December 2005.
【非特許文献６】Science 290, 2110-2113 (2000).
【非特許文献７】Plant Cell Physiol. 50(3): 447-462 (2009).
【非特許文献８】Nature Vol 470 3 February 2011 110-115.
【非特許文献９】Current Opinion in Genetics & Development 2010, 20:588-598.
【非特許文献１０】Plant Physiology, February 2013, Vol. 161, pp. 893-903.
【非特許文献１１】Development 125, 485-494 (1998).
【非特許文献１２】Biosci. Biotechnol. Biochem, 71(3), 834-839, 2007.
【非特許文献１３】Plant Cell Physiol. 52(2): 373-383 (2011).
【非特許文献１４】The Plant Cell, Vol. 21: 1722-1732, June 2009.
【非特許文献１５】Plant Cell Physiol. 46(8): 1423-1427 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
PHAをリード化合物とした各種誘導体を合成し、植物のCK1阻害活性と植物の概日リズム制御活性とを評価し、構造活性相関を明らかにするとともに、より強い活性を有するCK1阻害剤及び／又は概日リズム制御剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記式Iで表されることを特徴とする化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を提供する；
【化１】
2019210254.tif 000002
ただし、
R1は、Ｈ又はC1-5の直鎖状、分枝状若しくは環状の置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、
R2は、H、ハロゲン（F、Cl、Br若しくはI）、又はC1-4の置換されていてもよいアルキル基であり、
環Aは、5〜8員のラクタム環を表す；
ただし、R1及びR2が共にHを除く。
【０００９】
本発明の化合物において、前記式(I)で表される化合物が、下記式(II)で表される化合物であってもよい；
【化２】
2019210254.tif 000003
R1は、H又はC1-5の直鎖状、分枝状若しくは環状のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、
R2は、H、ハロゲン（F、Cl、Br若しくはI）、又はC1-3のアルキル基である。
ただし、R1及びR2が共にHを除く。
【００１０】
本発明の化合物において、前記式(II)で表される化合物が、下記式(III)〜(X)で表される化合物であってもよい；
【化３】
2019210254.tif 000004
【化４】
2019210254.tif 000005
【化５】
2019210254.tif 000006
【化６】
2019210254.tif 000007
【化７】
2019210254.tif 000008
【化８】
2019210254.tif 000009
【化９】
2019210254.tif 000010
【化１０】
2019210254.tif 000011
【００１１】
また、本発明は、前記化合物を含むカゼインキナーゼ１（Casein Kinase 1：CK1）阻害剤を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、前記化合物を含む植物の概日リズムの制御剤を提供する。
【００１３】
本発明の植物の概日リズムの制御剤において、前記植物の概日リズムの制御剤が、植物の概日リズムの長周期化剤である場合がある。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、PHAと比較して、より強い活性を有するCK1阻害剤及び／又は概日リズム制御剤とを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の化合物（PHA誘導体）存在又は非存在下のカゼイン及びCKL4のリン酸化反応後のポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。
【図２】ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果から算出した本発明の化合物（PHA誘導体）濃度に対するリン酸化活性を表すグラフである。図２A〜Hは、PHA誘導体として、それぞれPHA(図２A)、式(V)で表される化合物AMI212（図２B）、式(III)で表される化合物AMI23（図２C）、式(XIV)で表される化合物AMI331（図２D）、化合物AMI117（図２E）、化合物AMI133（図２F）、化合物AMI214（図２G）及び化合物AMI138（図２H）を用いた結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．PHA誘導体
本発明の実施形態の１つは、PHAをリード化合物として、各種置換基を結合した化合物、その塩又はそれらの溶媒和物であり、リード化合物であるPHAよりも強い植物のCK1阻害活性及び／又は概日リズム制御活性（以下、「生物活性」と記載する）を有し、その構造式は下記式(I)で表される；
【化１１】
2019210254.tif 000012
ただし、
R1は、H又はC1-5の直鎖状、分枝状若しくは環状の置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、
R2は、H、ハロゲン（F、Cl、Br若しくはI）、又はC1-4の置換されていてもよいアルキル基であり、
環Aは、5〜8員のラクタム環を表す；
ただし、R1及びR2が共にHを除く。
【００１７】
本明細書において、上記構造式の記載で、R1及びR2を規定する「アルキル基」とは、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝状の炭化水素基を含む。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基及びネオペンチル基等が挙げられる。
【００１８】
本明細書において、上記構造式の記載で、R1を規定する「アルケニル基」とは、任意の位置に１以上の二重結合を有する、炭素数２〜５の直鎖又は分枝状の炭化水素基を含む。例えば、ビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基、プレニル基、ブタジエニル基、ペンテニル基、イソペンテニル基及びペンタジエニル基等が挙げられる。
【００１９】
本明細書において、上記構造式の記載で、R1を規定する「アルキニル基」とは、任意の位置に１以上の三重結合を有する、炭素数２〜５の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基及びペンチニル基等が挙げられる。
【００２０】
本明細書において、R1を規定する「環状のアルキル基」の例としては、シクロプロピル基又はシクロブチル基等が挙げられる。
【００２１】
上記構造式の記載の「置換されていてもよいアルキル基」及び「置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基」は、アルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基の少なくとも１つの水素原子が、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、ホルミル基、カルバモイル基、スルファモイル基、スルファニル基、スルフィノ基、スルホ基、チオホルミル基、チオカルボキシ基、ジチオカルボキシ基、チオカルバモイル基、トリアルキルシリル基で置換されているアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基を含む。
【００２２】
本発明において、農学的又は薬学的に許容される塩としては、特に制限されるものではなく、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム、及びカリウムなどのアルカリ金属塩、並びにカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
【００２３】
溶媒和物としては、一般式(I)で表される化合物又はその塩と、農学的又は薬学的に許容可能な溶媒との溶媒和物である限り特に限定されない。農学的又は薬学的に許容可能な溶媒としては、例えばエタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
【００２４】
本発明のPHA誘導体において、前記式(I)で表される化合物の好ましい例として、下記式(II)で表される化合物が挙げられる；
【化１２】
2019210254.tif 000013
R1は、H又はC1-5の直鎖状、分枝状若しくは環状のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、
R2は、H、ハロゲン（F、Cl、Br若しくはI）、又はC1-3のアルキル基である。
ただし、R1及びR2が共にHを除く。
【００２５】
本発明のPHA誘導体のより好ましい例として、下記式(III)〜(X)で表される化合物が挙げられる；
【化１３】
2019210254.tif 000014
【化１４】
2019210254.tif 000015
【化１５】
2019210254.tif 000016
【化１６】
2019210254.tif 000017
【化１７】
2019210254.tif 000018
【化１８】
2019210254.tif 000019
【化１９】
2019210254.tif 000020
【化２０】
2019210254.tif 000021
【００２６】
すなわち、本発明のPHA誘導体において、生物活性に対する構造活性相関は、4-ピリジル基が活性部位であり、ラクタム及びピロール部位は誘導化可能である。
【００２７】
前記R1のアルキル鎖が短いものほど活性が高くなり、炭素数としてC1〜5、好ましくはC2〜4、より好ましくはC2〜3である。また、嵩が低い官能基を有するPHA誘導体程、生物活性が高くなる。なお、R1が短い置換基であってもヘテロ原子を有する誘導体（例えば、下記実施例に記載のAMI-124、AMI-125、AMI-130、AMI-210）では、生物活性を示さない。
【００２８】
前記R2が短鎖アルキル鎖又はハロゲンの場合、リード化合物であるPHAと比較して生物活性は増強される（下記実施例参照）。
【００２９】
また、ピリジン環の2位にハロゲン又はメチル基等の置換基を結合させると生物活性は低下又は消失する（下記実施例参照）。さらに、ラクタム環に、置換基を結合すると生物活性が低下する（データ非表示）。
【００３０】
なお、本発明のPHA誘導体の製造方法は、下記実施例で詳細に説明する。
【００３１】
本発明のPHA誘導体は、下記で説明する植物のCK1阻害剤や植物の概日リズム制御剤の農学的な実施形態として利用できる。また、動物においても、CK1によって概日リズムが制御されるところから（国際公開パンフレットWO2012/020726)、農学的な実施のみならず、医薬組成物として薬学的にも利用可能である。
【００３２】
２．植物のCK1阻害剤
本発明のもう1つの実施形態は、前記PHA誘導体を含む植物のCK1阻害剤である。PHAは、植物の概日リズムに対して、CK1を阻害することによって制御、特に概日リズムが長周期化される（中道範人ら、Transformative bio-molecules for controlling biological time、第59回日本植物生理学会年会）。そこで、CK1に対して直接CK1阻害活性を認めたPHA誘導体に限らず、植物の概日リズムを制御する、特に、植物の概日リズムの長周期化活性を有する化合物は、CK1阻害活性を有するものと理解される。
【００３３】
概日リズムは、植物の種々の活動に影響することが知られているので（非特許文献１〜１５）、一般式(I)で示される化合物によれば、これらの活動の制御、例えば花成時期制御、生長制御、一次代謝物（デンプン、糖等）蓄積制御、二次代謝物（アントシアニン等）蓄積制御、低温ストレス応答の制御、乾燥ストレス応答の制御、病原性細菌への抵抗性の発現制御、窒素代謝制御、鉄代謝制御、気孔の開閉の制御、葉の緑化の制御、水の吸収の制御、種子の休眠の制御、茎の旋回運動の制御等が可能である。
【００３４】
より具体的には、例えば花形成時期の制御については、長日植物の場合は、例えば、CK1阻害作用によって、概日リズムが長周期化することによって遅咲きになる一方で、概日リズムが短周期化することによって早咲きになることが知られている。短日植物の場合は、この逆になると考えられている。このため、例えば花以外の組織（例えば葉、茎、根等）が収穫対象器官である長日植物に対しては、CK1の阻害作用に基づいて概日リズムを長周期化することによって遅咲きとし、収穫対象器官の収量の増大を図ることができる。また、別の利用例としては、花又は花形成に伴ってできる器官（果実、種子等）が収穫対象である場合は、CK1亢進活性に基づいて、概日リズムを制御して花形成時期を早める（或いは遅らせる）ことにより、花形成に好ましくない気候（雨季（期）、乾季（期）等）を避けることができる。
【００３５】
本発明の植物概日リズム制御剤の対象植物は、特に限定されない。例えば、被子植物（双子葉植物、単子葉植物等）、裸子植物、コケ植物、シダ植物等の植物に対して広く適用できる。具体例としては、トマト、ピーマン、トウガラシ、ナス等のナス類、キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ等のウリ類、キャベツ、ブロッコリー、ハクサイ等の菜類、セルリー、パセリー、レタス等の生菜・香辛菜類、ネギ、タマネギ、ニンニク等のネギ類、ダイズ、ラッカセイ、インゲン、エンドウ、アズキ等の豆類、イチゴ等のその他果菜類、ダイコン、カブ、ニンジン、ゴボウ等の直根類、サトイモ、キャッサバ、バレイショ、サツマイモ、ナガイモ等のイモ類、アスパラガス、ホウレンソウ、ミツバ等の柔菜類、トルコギキョウ、ストック、カーネーション、キク等の花卉類、イネ、トウモロコシ等の穀物類、ベントグラス、コウライシバ等の芝類、ナタネ、ラッカセイ等の油料作物類、サトウキビ、テンサイ等の糖料作物類、ワタ、イグサ等の繊維料作物類、クローバー、ソルガム、デントコーン等の飼料作物類、リンゴ、ナシ、ブドウ、モモ等の落葉性果樹類、ウンシュウミカン、レモン、グレープフルーツといった柑橘類、サツキ、ツツジ、スギ等の木本類等が挙げられる。これらの中でも、特に、双子葉植物が好ましい。
【００３６】
本発明の植物のCK1阻害剤の対象器官は、植物体を構成する器官である限り特に限定されない。対象器官としては、例えば茎、芽、根、子房、及び果実が挙げられる。
【００３７】
本発明の植物のCK1阻害剤は、本発明の化合物そのものでもよいが、本発明の化合物に加えて、剤形、実施態様等に応じて種々の添加剤を含んでいてもよい。植物のCK1阻害剤中の本発明の化合物の含有割合は、特に限定されない。具体的には、0.0001〜100重量%、好ましくは0.01〜50重量%程度が例示される。
【００３８】
本発明の植物のCK1阻害剤の剤形は、農学的又は薬学的に許容される剤形である限り特に限定されない。例えば、液剤、固形剤、粉剤、顆粒剤、粒剤、水和剤、フロアブル剤、乳剤、ペースト剤、分散剤等が挙げられる。
【００３９】
添加剤は、農学的又は薬学的に許容可能な添加剤である限り特に限定されない。例えば、担体、界面活性剤、増粘剤、増量剤、結合剤、ビタミン類、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、揮散抑制剤、色素等が挙げられる。
【００４０】
本発明の植物のCK1阻害剤の実施態様は、農薬の使用態様として公知の態様（或いは将来開発される態様）である限り特に限定されない。例えば、散布、滴下、塗布、植物生育環境中（土壌中、水中、固形培地中、液体培地中等）への混合や溶解等が挙げられる。
【００４１】
また、植物の概日リズムの機序は、各種の調節機構が複雑に相互作用することが知られているものの、未解明である。本発明の植物のCK1阻害剤は、植物の概日リズムのメカニズムを解明するための研究用の薬剤としても利用できる。
【００４２】
３．植物の概日リズム制御剤
本発明のもう1つの実施形態は、前記PHA誘導体、その塩又はそれらの溶媒和物を含む植物の概日リズム制御剤である。すなわち、リード化合物であるPHAと比較して、より増強された植物CK1阻害活性及び／又は植物の概日リズム制御活性を有するPHA誘導体を活性成分として含有する組成物である。
【００４３】
概日リズムは、植物の種々の活動に影響することが知られているので（非特許文献１〜１５）、一般式(I)で示される化合物によれば、これらの活動の制御、例えば花成時期制御、生長制御、一次代謝物（デンプン、糖等）蓄積制御、二次代謝物（アントシアニン等）蓄積制御、低温ストレス応答の制御、乾燥ストレス応答の制御、病原性細菌への抵抗性の発現制御、窒素代謝制御、鉄代謝制御、気孔の開閉の制御、葉の緑化の制御、水の吸収の制御、種子の休眠の制御、茎の旋回運動の制御等が可能である。
【００４４】
より具体的には、例えば花形成時期の制御については、長日植物の場合は、概日リズムが長周期化することによって遅咲きになる一方で、概日リズムが短周期化することによって早咲きになることが知られている。短日植物の場合は、この逆になると考えられている。このため、例えば花以外の組織（例えば葉、茎、根等）が収穫対象器官である長日植物に対しては、概日リズムを長周期化することによって遅咲きとし、収穫対象器官の収量の増大を図ることができる。また、別の利用例としては、花又は花形成に伴ってできる器官（果実、種子等）が収穫対象である場合は、概日リズムを制御して花形成時期を早める（或いは遅らせる）ことにより、花形成に好ましくない気候（雨季（期）、乾季（期）等）を避けることができる。
【００４５】
本発明の植物概日リズム制御剤の対象植物は、特に限定されない。例えば、被子植物（双子葉植物、単子葉植物等）、裸子植物、コケ植物、シダ植物等の植物に対して広く適用できる。具体例としては、トマト、ピーマン、トウガラシ、ナス等のナス類、キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ等のウリ類、キャベツ、ブロッコリー、ハクサイ等の菜類、セルリー、パセリー、レタス等の生菜・香辛菜類、ネギ、タマネギ、ニンニク等のネギ類、ダイズ、ラッカセイ、インゲン、エンドウ、アズキ等の豆類、イチゴ等のその他果菜類、ダイコン、カブ、ニンジン、ゴボウ等の直根類、サトイモ、キャッサバ、バレイショ、サツマイモ、ナガイモ等のイモ類、アスパラガス、ホウレンソウ、ミツバ等の柔菜類、トルコギキョウ、ストック、カーネーション、キク等の花卉類、イネ、トウモロコシ等の穀物類、ベントグラス、コウライシバ等の芝類、ナタネ、ラッカセイ等の油料作物類、サトウキビ、テンサイ等の糖料作物類、ワタ、イグサ等の繊維料作物類、クローバー、ソルガム、デントコーン等の飼料作物類、リンゴ、ナシ、ブドウ、モモ等の落葉性果樹類、ウンシュウミカン、レモン、グレープフルーツといった柑橘類、サツキ、ツツジ、スギ等の木本類等が挙げられる。これらの中でも、特に、双子葉植物が好ましい。
【００４６】
本発明の植物概日リズム制御剤の対象器官は、植物体を構成する器官である限り特に限定されない。対象器官としては、例えば茎、芽、根、子房、及び果実が挙げられる。
【００４７】
本発明の植物概日リズム制御剤は、本発明の化合物そのものでもよいが、本発明の化合物に加えて、剤形、施用態様等に応じて種々の添加剤を含んでいてもよい。植物概日リズム制御剤中の本発明の化合物の含有割合は、特に限定されない。具体的には、0.0001〜100重量%、好ましくは0.01〜50重量%程度が例示される。
【００４８】
本発明の植物概日リズム制御剤の剤形は、農学的に許容される剤形である限り特に限定されない。例えば、液剤、固形剤、粉剤、顆粒剤、粒剤、水和剤、フロアブル剤、乳剤、ペースト剤、分散剤等が挙げられる。
【００４９】
添加剤は、農学的に許容される添加剤である限り特に限定されない。例えば、担体、界面活性剤、増粘剤、増量剤、結合剤、ビタミン類、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、揮散抑制剤、色素等が挙げられる。
【００５０】
本発明の植物概日リズム制御剤の施用態様は、農薬の使用態様として公知の態様（或いは将来開発される態様）である限り特に限定されない。例えば、散布、滴下、塗布、植物生育環境中（土壌中、水中、固形培地中、液体培地中等）への混合や溶解等が挙げられる。
【００５１】
また、植物の概日リズムの機序は、各種の調節機構が複雑に相互作用することが知られているものの、未解明である。本発明の植物の概日リズム制御剤は、植物の概日リズムのメカニズムを解明するための研究用の薬剤としても利用できる。
【００５２】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。ここに記述される実施例は本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５３】
実施例１．PHA誘導体の合成
特に明記しない限り、乾燥溶媒を含むすべての反応物又は試薬は、商業的供給業者から入手し、受け取ったまま使用した。全ての後処理及び精製は、試薬グレードの溶媒を用いて空気中で行った。
【００５４】
分析用薄層クロマトグラフィー（TLC）は、シリカゲル70 TLCプレート-ワコー（0.25 mm）を用いて行った。展開したクロマトグラムをUVランプ（254 nm）で分析した。
フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Biotage SNAP カートリッジ KP-Silカラムを備えたBiotage Isolera（登録商標）を用いてクロロホルム / メタノールを溶離液として行った。
分取薄層クロマトグラフィー（PTLC）は、本発明者らの実験室で調製したWakogel B5-Fシリカ被覆プレート（0.75 mm）を用いて行った。
高分解能マススペクトルはThermo Fisher Scientific Exactive（ESI）で測定した。
核磁気共鳴（NMR）スペクトルはJEOL JNM-ECZR-600（1H 600 MHz）で測定した。1H NMRの化学シフトは、CD3OD（δ3.31 ppm）に対する百万分率（ppm）で表し、データは以下のように報告される：化学シフト、多重度（s = 一重線、d = 二重線、dd =二重の二重線、ddd =二重の二重の二重線、t = 三重線、dt = 二重の三重線、td = 三重の二重線、q =四重線、dq = 二重の四重線、 m = 多重線、br s =幅広な一重線）、カップリング定数（Hz）、及び積分値である。
【００５５】
［PHA前駆体Boc-PHA(1)の合成］
PHA誘導体を合成するため、はじめに、文献既知の手法（Vanotti, E. ら、J. Med. Chem. 2008, 51, 487-501）にて、PHA前駆体Boc-PHA(1)を合成した。
EDC・HClによるN-β-Boc-アラニン(2)とメルドラム酸の縮合後、酢酸エチル中で加熱還流すると分子内環化反応が進行し、β-ケトアミド(4)が収率86%で得られた。続いて、ハンチュピロール合成法によるピロール環の形成を行った。反応スキームと合成法を以下に記載する。
【００５６】
【化２１】
2019210254.tif 000022
【００５７】
tert-ブチル2,4-ジオキソピペリジン-1-カルボキシレート（4：1.0 g、4.69 mmol、1.0当量）及び2-ブロモ-1-（ピリジン-4-イル）エタン-1-オン臭化水素酸塩（5：1.33 g、4.69 mmol、1.0当量）のエタノール（18.8 mL）溶液に、酢酸アンモニウム（1.45 g、18.9 mmol、4.0当量）を室温で加えた。24時間撹拌した後、反応混合物を飽和NaHCO3水溶液でクエンチし、水層と有機層とに分離した。水層を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗残渣をジエチルエーテルで洗浄して、PHA前駆体Boc-PHA(1)を黄色固体として得た（806 mg、収率55％）。
PHA前駆体Boc-PHA(1)の物性データを以下に記載する。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.49 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 7.08 (s, 1H), 4.11 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.97 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.54 (s, 9H), １つの水素原子 (NH)は検出されなかった。
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.46 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.13 (s, 1H), 4.11 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.00 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.55 (s, 9H), １つの水素原子 (NH)は検出されなかった。
13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 165.3, 154.5, 150.5, 143.2, 141.4, 131.6, 119.5, 117.0, 108.8, 83.9, 46.9, 28.3, 23.4
HRMS (DART) m/z = 314.1505 calcd for C17H20N3O3 [M+H]+, found: 314.1498.
【００５８】
［PHA誘導体の合成］
１．PHAピロール窒素原子への置換基導入
Boc-PHA(1)のピロール窒素原子への置換基導入は、以下に示すスキームで行い、各種PHA誘導体(8)を得た。
【００５９】
【化２２】
2019210254.tif 000023
【００６０】
Boc-PHA（1：120 mg、383 μmol、1.0当量）及びK2CO3（105.9 mg、766 μmol、2.0当量）のDMF（1.5 mL）溶液に、ハロゲン化物（6：1.0当量）を室温で加えた。100℃で24時間撹拌した後、反応混合物を水でクエンチし、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗混合物をPTLC（CHCl3 / メタノール = 9：1）で精製して、化合物7を得た。
化合物7（1.0 mg、1.0当量）のメタノール（0.2 mL）溶液に、塩化アセチル（20 μL、92.3当量）を室温で加えた。2時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮してPHA誘導体8を得た。
【００６１】
得られたPHA誘導体(8)の構造及び収率をハロゲン化物(6)におけるXと共に以下に示す。なお、以下のPHA誘導体(8)の構造において、化合物の略号右上に記載された「a」は化合物7を得る反応を70℃で行ったことを示し、同様に「b」は50℃で行ったことを示す。
【００６２】
【化２３】
2019210254.tif 000024
【００６３】
【化２４】
2019210254.tif 000025
【００６４】
Boc-PHA(1)と種々のハロゲン化物(6)とのSN2反応によって、Boc-PHA(1)の誘導体7a-7ahを低収率ながら得た。その後、tert-ブトキシカルボニル(Boc)基の除去により、PHA誘導体8a-8ahを合成した。なお、合成した8a-8ahはそれらの質量分析により生成を確認しているが、純度に関しては化合物の有機溶媒に対する溶解性が低く、確認していない。
【００６５】
一方、ナフタレン環(6ai)、アミド(6aj)、ニトリル(6ak)、ニトロベンゼン環(6al)、アセチルナフタレン(6am)、ピリジン環(6an)、アクリジン(6ao)、アセト酢酸エチル(6ap)、ベンゾトリアゾール(6aq)、酢酸メチル(6ar)、シクロプロパン(6as)、イソプロピル(6at)、ブタン(6au)、ジメチルプロパン(6av)、アセタール(6aw)部位を有するハロゲン化物を用いると反応は進行しなかった。
【００６６】
PHA誘導体8a-8ahの外観及び物性データを以下に記載する。
1-(2-(1,3-dioxan-2-yl)ethyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8b)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.71 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 8.15 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.27 (s, 1H), 4.49 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 4.41 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.99 (dd, J = 11.8, 4.8 Hz, 2H), 3.69 (td, J = 11.8, 1.2 Hz, 2H), 3.63 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.06 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.90-1.96 (m, 2H), 1.32-1.35 (m, 2H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００６７】
methyl 4-(4-oxo-2-(pyridin-4-yl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-1-yl)butanoate (8c)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.72 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 8.17 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.25 (s, 1H), 4.31 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 3.62 (s, 3H), 3.07 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.95-2.02 (m, 4H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００６８】
1-(3-phenylpropyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one
(8d)
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.55-8.61 (m, 2H), 7.89-7.95 (m, 2H), 7.14-7.23 (m, 5H), 7.08 (s, 1H), 4.22 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.60-3.68 (m, 2H), 2.96-3.03 (m, 2H), 2.57 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.97 (t, J = 7.2 Hz, 2H)
【００６９】
1-hexadecyl-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8e)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.73 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 8.11 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.26 (s, 1H), 4.28 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.64 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.05-3.07 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 1.24-1.29 (m, 28H), 0.90 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００７０】
1-(2-(1H-pyrrol-1-yl)ethyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8f)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.64 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.15 (s, 1H), 6.23 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 5.88 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.58 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 4.09 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.48 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.61 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００７１】
1-(3,3-diphenylpropyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8g)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.62 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 7.96 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 7.23 (t, J = 7.6 Hz, 5H), 7.16 (q, J = 7.3 Hz, 6H), 4.30 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.79 (t, J = 7.8 Hz, 1H) 3.65 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.89-2.93 (m, 2H), 2.40 (q, J = 7.8 Hz, 2H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００７２】
1-(3-methylbenzyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8h)：褐色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.70 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.41 (s, 1H), 7.23 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.79 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.54 (s, 2H), 3.71 (m, 2H), 2.99-3.01 (m, 2H), 2.29 (s, 3H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００７３】
1-(2-methylbenzyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8i)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.60 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.41 (s, 1H), 7.29 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.23 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.16 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 5.46 (s, 2H), 3.59 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.86 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.37 (s, 3H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００７４】
1-ethyl-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8l)
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.76 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 8.12 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 7.27 (s, 1H), 4.29 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.13 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.35 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
【００７５】
1-butyl-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8m)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.79-8.80 (m, 2H), 8.15-8.17 (m, 2H), 7.29 (s, 1H), 4.30 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.73 (td, J = 7.2, 1.8 Hz, 2H), 3.13 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.63-1.70 (m, 2H), 1.25-1.31 (m, 2H), 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００７６】
(4-oxo-2-(pyridin-4-yl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-1-yl)methyl pivalate (8o)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.75-8.82 (m, 2H), 8.22-8.23 (m, 2H), 7.33 (s, 1H), 6.17 (s, 2H), 3.64-3.67 (m, 2H), 3.15-3.19 (m, 2H), 1.15 (s, 9H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００７７】
1-(2-(dimethylamino)ethyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8p)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.80 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 8.18 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.25 (s, 1H), 4.75 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.68 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.43 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.17 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.91 (d, J = 15.8 Hz, 6H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００７８】
methyl 2-((4-oxo-2-(pyridin-4-yl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-1-yl)methyl)benzoate (8r)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.61 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 8.10 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.55 (td, J = 7.2, 1.4 Hz, 1H), 7.46 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 6.73 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.91 (s, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.58-3.62 (m, 2H), 2.84-2.88 (m, 2H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００７９】
methyl 3-((4-oxo-2-(pyridin-4-yl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-1-yl)methyl)benzoate (8t)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.65 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 8.00 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.94 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.49 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.28 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.63 (s, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.62-3.65 (m, 2H), 2.94-2.96 (m, 2H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００８０】
1-(2,3,4,5,6-pentamethylbenzyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8u)
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.63-8.68 (m, 2H), 8.00 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 7.06 (s, 1H), 5.57 (s, 2H), 3.41-3.49 (m, 2H), 2.41-2.51 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 2.22-2.24 (m, 3H), 2.08-2.10 (m, 6H), 1.97-1.99 (m, 6H)
【００８１】
1-(3,3-dimethyl-2-oxobutyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8v)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.72 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.21 (s, 1H), 5.39 (s, 2H), 3.59 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.80 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.26 (s, 9H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００８２】
1-(but-3-en-1-yl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8w)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.72-8.75 (m, 2H), 8.13-8.14 (m, 2H), 7.25 (s, 1H), 5.63-5.70 (m, 1H), 4.95-5.00 (m, 2H), 4.38 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.63-3.65 (m, 2H), 3.06-3.09 (m, 2H), 2.40 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００８３】
1-(pent-4-yn-1-yl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one(8x)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.75-8.71 (m, 2H), 8.15-8.16 (m, 2H), 7.26 (s, 1H), 4.43 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.65-3.66 (m, 2H), 3.10-3.12 (m, 2H), 2.35 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.16 (td, J = 7.2, 2.4 Hz, 2H), 1.85-1.90 (m, 2H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００８４】
1-isobutyl-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8y)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.76-8.80 (m, 2H), 8.18-8.22 (m, 2H), 7.28 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 4.17 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 3.68-3.73 (m, 2H), 3.10-3.12 (m, 2H), 1.73-1.80 (m, 1H), 0.77 (d, J = 6.0 Hz, 6H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００８５】
1-(cyclobutylmethyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8z)：褐色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.77-8.83 (m, 2H), 8.16-8.20 (m, 2H), 7.26 (s, 1H), 4.37 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.70-3.74 (m, 2H), 3.13-3.16 (m, 2H), 2.47-2.55 (m, 1H), 1.85-1.92 (m, 2H), 1.75-1.83 (m, 2H), 1.59-1.65 (m, 2H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００８６】
1-propyl-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8aa)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.71 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 8.11 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.26 (s, 1H), 4.25 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.63 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.06 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.67-1.74 (m, 2H), 0.86 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００８７】
1-(cyclopropylmethyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8ab)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.75-8.80 (m, 2H), 8.18-8.22 (m, 2H), 7.28 (s, 1H), 4.22 (dd, J = 7.2, 3.0 Hz, 2H), 3.67-3.72 (m, 2H), 3.08-3.15 (m, 2H), 1.01-1.08 (m, 1H), 0.54 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 0.24 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００８８】
1-(2-methoxyethyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8ac)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.80 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 8.29 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.25 (s, 1H), 4.47 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.73-3.76 (m, 2H), 3.65 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.24 (s, 3H), 3.12-3.19 (m, 2H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００８９】
1-allyl-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8ad)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.69 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 8.06 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.33 (s, 1H), 6.13-6.18 (m, 1H), 5.36 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 3.62 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.97 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００９０】
1-(prop-2-yn-1-yl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8ae)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.83 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 8.23 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 5.08 (s, 2H), 3.75 (td, J = 7.2, 3.0 Hz, 2H), 3.17-3.21 (m, 3H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００９１】
1-(2-methylallyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8af)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.74 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 8.05 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.35 (s, 1H), 5.06 (s, 1H), 4.76 (s, 2H), 4.46 (s, 1H), 3.65-3.69 (m, 2H), 2.98-3.01 (m, 2H), 1.85 (s, 3H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００９２】
1-(cyclohexylmethyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (8ag)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.76-8.82 (m, 2H), 8.19-8.22 (m, 2H), 7.28 (s, 1H), 4.20 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.67-3.75 (m, 2H), 3.10-3.15 (m, 2H), 1.81-0.82 (11H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【００９３】
２．PHAピロールC3位への置換基導入
２−１．PHAピロールC3位のハロゲン化
Boc-PHA(1)のピロールC3位のハロゲン化は、以下に示すスキームで行い、PHA誘導体(10a, 10b)を得た。
【００９４】
【化２５】
2019210254.tif 000026
【００９５】
Boc-PHA（1：20 mg、63.8 μmol、1.0当量）のDMF（0.3 mL）溶液に、N-ブロモスクシンイミド（NBS：12.5 mg、70.2 μmol、1.1当量）を室温で加えた。反応混合物をヒューニッヒ塩基でクエンチし、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗混合物をPTLC（CHCl3 / メタノール = 9：1）で精製して、化合物9aを黄色油状物として得た（13.9 mg、収率54％）。
化合物9a（1.0 mg、1.0当量）のメタノール（0.3 mL）溶液に、塩化アセチル（23.4 μL、10当量）を室温で加えた。2時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮して、PHA誘導体10aを黄色固体として得た。
PHA誘導体10aの物性データを以下に記載する。
PHA誘導体10a
1H NMR (600 MHz, D2O) δ 8.52 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 8.18 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 3.46 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.88 (t, J = 6.6 Hz, 2H)
13C NMR (150 MHz, D2O) δ 165.61, 146.26, 143.57, 140.36, 123.01, 120.43, 113.48, 101.65, 39.32, 21.26
【００９６】
Boc-PHA（1：20 mg、63.8 μmol、1.0 当量）のDMF（0.3 mL）溶液に、N-クロロスクシンイミド（NCS：9.4 mg、70.2 μmol、1.1当量）を50℃で加えた。反応混合物をヒューニッヒ塩基でクエンチし、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗混合物をPTLC（CHCl3 / メタノール = 9：1）で精製して、化合物9bを黄色油状物として得た（11 mg、収率50％）。
化合物9b（1.0 mg、1.0当量）のメタノール（0.3 mL）溶液に、塩化アセチル（22.4 μL、10当量）を室温で加えた。2時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮して、PHA誘導体10bを黄色固体として得た。
PHA誘導体10bの物性データを以下に記載する。
PHA誘導体10b
1H NMR (600 MHz, D2O) δ 8.53 (dd, J = 7.2, 2.4 Hz, 2H), 8.14 (dd, J = 7.2, 2.4 Hz, 2H), 3.50 (td, J = 7.2, 2.4 Hz, 2H), 2.89 (td, J = 7.2, 2.4 Hz, 2H)
13C NMR (150 MHz, D2O) δ 165.64, 145.90, 143.10, 140.40, 121.69, 120.10, 116.87, 111.96, 39.51, 21.26
【００９７】
２−２．PHAピロールC3位のアルキル化
Boc-PHA(1)のピロールC3位のアルキル化は、以下に示すスキームで行い、PHA誘導体(10c)を得た。
【００９８】
【化２６】
2019210254.tif 000027
【００９９】
4-ピリジンカルボン酸（11a：500 mg、4.06 mmol、1.0当量）を含む丸底フラスコに、EDC・HCl（934 mg、4.87 mmol、1.2当量）、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン（DMAP：496 mg、4.06 mmol、1.0当量）、Me（MeO）NH・HCl（416 mg、4.26 mmol、1.05当量）、Et3N（1.15 g、11.4 mmol、2.8当量）及びCH2Cl2（20 mL）を加えた。TLCで反応の進行を確認しながら混合物を室温で数時間撹拌した後、反応混合物を飽和NaHCO3水溶液でクエンチし、CH2Cl2で3回抽出し、飽和食塩水で洗浄した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、アミド12aを得た。
【０１００】
アミド12a（600 mg、3.61 mmol、1.0当量）の乾燥THF（12 mL）撹拌溶液に、EtMgBr（1 M、5.42 mL、5.42 mmol、1.5当量）のTHF溶液を0℃でゆっくり加え、混合物を0℃で撹拌した。反応混合物を飽和NH4Cl水溶液でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製してケトン13を得た。
【０１０１】
ケトン13（364 mg、2.96 mmol、1.0当量）の5.1 M HBr / HOAc（1.56 mL）撹拌溶液に、Br2（473 mg、2.96 mmol、1.1当量）を室温で滴下した。反応混合物を飽和Na2CO3水溶液でクエンチし、CH2Cl2で3回抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、TFAを添加し、濾過し、減圧下で濃縮して化合物14をTFA塩として得た。
【０１０２】
化合物4（575 mg、2.69 mmol、1.0当量）及び化合物14（884 mg、2.69 mmol、1.0当量）のエタノール（10.8 mL）溶液に、酢酸アンモニウム（831 g、10.8 mmol、4.0当量）を室温で加えた。撹拌後、反応混合物を飽和NaHCO3でクエンチし、水層と有機層とに分離した。水層を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製してPHA前駆体15を得た。
【０１０３】
PHA前駆体15（1.0 mg、1.0当量）のメタノール（0.3 mL）溶液に、塩化アセチル（22.4 μL、10当量）を室温で加えた。2時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮してPHA誘導体10cを黄色固体として得た。
PHA誘導体10cの物性データを以下に記載する。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.61 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 3.59 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.00 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.66 (s, 3H)
【０１０４】
３．PHAピリジン部位の変換
PHAの4-ピリジル基の窒素原子が活性発現に重要であるという知見から、ピリジル基の構造を保ちつつ、その2位と5位に置換基を導入した誘導体の合成を行った。
まず、ワインレブアミド12を以下に示すスキームで合成した。
【０１０５】
【化２７】
2019210254.tif 000028
【０１０６】
ピリジンカルボン酸11に対しEDC・HClを用いて、N-メトキシ-N-メチルアミドを縮合することにより、化合物12を得た。ピリジンカルボン酸11における置換基R3及びR4、並びに、ピリジンカルボン酸11の量X mmol及びDMAPの当量Yを種々変えて反応を行った(Entry 1〜Entry 9)。Entry 1〜Entry 9の反応条件を化合物12の収率と共に表１に記載する。
【０１０７】
【表１】
2019210254.tif 000029
【０１０８】
収率は低収率であったため(Entry 2)、DMAPを添加したところ収率は向上した(Entry 3 及びEntry 4)。合成法の詳細の一例は次の通りである。
4-ピリジンカルボン酸（11：200 mg、1.0当量）を含む丸底フラスコに、EDC・HCl（1.2当量）、DMAP（1.0当量）、Me（MeO）NH・HCl（1.05当量）、Et3N（2.8当量）及びCH2Cl2（0.2 M）を添加した。TLCで反応の進行を確認しながら混合物を室温で数時間撹拌した後、反応物を飽和NaHCO3水溶液でクエンチし、CH2Cl2で3回抽出し、飽和食塩水で洗浄した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、アミド12を得た。
【０１０９】
次に、化合物12からアセチルピリジン16を以下に示すスキームで合成した。
【０１１０】
【化２８】
2019210254.tif 000030
【０１１１】
THF中、化合物12に対しメチルリチウムを0℃にて滴下することで化合物16の合成を試みた。しかし、目的の化合物16は得られず、ピリジンに対し反応が進行した(Entry 1 及びEntry 2)。これは、メチルリチウムの高い求核性が要因であると考えた。そこで、求核剤をメチルリチウムから求核性の低いGrignard試薬に変更したところ、良好な収率で化合物16が得られた(Entry 3〜Entry 6)。化合物12における置換基R3及びR4、化合物12の量X mmol及びTHF溶液中の化合物12の濃度Y M(mol/L)、並びに、求核剤の種類を種々変えて反応を行った(Entry 1〜Entry 8)。Entry 1〜Entry 8の反応条件を化合物16の収率と共に表２に記載する。
【０１１２】
【表２】
2019210254.tif 000031
【０１１３】
ハロゲンを有するワインレブアミド(12c, 12d, 12e)、メチル基を有するワインレブアミド(12f)、及びシアノ基を有するワインレブアミド(12h)を用いるとそれぞれ対応するアセチルピリジン(16c, 16d, 16e, 16f, 16h)が得られた。
一方、トリフルオロメチル基を有するワインレブアミド(12g)を用いた場合、Grignard 試薬を小過剰(1.5 equiv)加えていることから、メチル基が2つ導入された化合物17のみが収率5％で得られ、対応するアセチルピリジン(16g)は得られなかった(Entry 7)。
【０１１４】
【化２９】
2019210254.tif 000032
【０１１５】
また、シアノ基を有するワインレブアミド(12h)を用いた場合、望みのアセチルピリジン(16h)に加えて、Grignard 試薬がシアノ基とも反応した化合物18が収率20％で得られた(Entry 8)。
【０１１６】
【化３０】
2019210254.tif 000033
【０１１７】
合成法の詳細の一例は次の通りである。
アミド12（1.0当量）の乾燥THF（0.3 M）撹拌溶液に、MeMgBr（1 M、1.5当量）のTHF溶液を0℃でゆっくり加え、混合物を0℃で撹拌した。反応混合物を飽和NH4Clでクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製してケトン16を得た。
【０１１８】
得られたアセチルピリジン(16c-16f)を用いて、PHA誘導体21の合成を試みた。反応はPHAの合成と同様であるが、小スケールであったため、臭化水素酸塩として単離することができず、反応停止後の操作に工夫を要した。アセチルピリジン16に対し臭素と臭化水素酸を作用させ、炭酸ナトリウム水溶液で反応を停止した。
その後、酢酸エチルで抽出、溶媒を留去する前にTFAを加え、TFA塩19を得た。得られたTFA塩19と化合物4とを用いたハンチュピロール合成法により、PHA前駆体20を合成した。その後、Boc基の除去により、PHA誘導体21を得た。反応スキームを以下に示す。また、アセチルピリジンにおける置換基R3及びR4、アセチルピリジン16の量X mmolをPHA前駆体20の収率と共に表３に記載する。
【０１１９】
【化３１】
2019210254.tif 000034
【０１２０】
【表３】
2019210254.tif 000035
【０１２１】
合成法の詳細の一例は次の通りである。
ケトン16（1.0当量）の5.1 M HBr / HOAc（2.8当量）撹拌溶液に、Br2（1.1当量）を室温で滴下した。反応混合物を飽和Na2CO3水溶液でクエンチし、CH2Cl2で3回抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、TFAを添加し、濾過し、減圧下で濃縮して、化合物19をTFA塩として得た。
【０１２２】
化合物4（1.0当量）及び化合物19（1.0当量）のエタノール（0.25 M）溶液に、酢酸アンモニウム（4.0当量）を室温で加えた。撹拌後、反応混合物を飽和NaHCO3水溶液でクエンチし、水層と有機層とに分離した。水層を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製してPHA前駆体20を得た。
【０１２３】
PHA前駆体20（1.0 mg、1.0当量）のメタノール（0.3 mL）溶液に、塩化アセチル（22.4 μL、10当量）を室温で加えた。2時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して、PHA誘導体21を黄色固体として得た。
【０１２４】
PHA誘導体21dの物性データは次の通りである。
2-(2,5-dichloropyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one(21d)：黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.44 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 3.72-3.74 (m, 2H), 3.06-3.11 (m, 2H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【０１２５】
４．PHAピロール窒素原子及びPHAピロールC3位への置換基導入
PHAピロールC3位をハロゲン化したPHA誘導体10aを用いて、PHAピロール窒素原子への置換基導入を以下に示すスキームで行った。
【０１２６】
【化３２】
2019210254.tif 000036
【０１２７】
PHA誘導体10a（1：100 mg、255 μmol、1.0当量）及びK2CO3（70.5 mg、510 μmol、2.0当量）のDMF（1.0 mL）溶液に、ハロゲン化物（6：1.0当量）を室温で加えた。50℃で24時間撹拌した後、反応混合物を水でクエンチし、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗混合物をPTLC（CHCl3 / メタノール = 9：1）で精製して、化合物22を得た。
化合物22（1.0 mg、1.0当量）のメタノール（0.2 mL）溶液に、塩化アセチル（20 μL、92.3当量）を室温で加えた。2時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮してPHA誘導体AMI-330〜AMI-332を得た。
PHA誘導体AMI-330〜AMI-332の構造、外観及び物性データを以下に記載する。
【０１２８】
【化３３】
2019210254.tif 000037
【０１２９】
3-bromo-1-ethyl-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one(330):黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ8.81 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 8.11 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.06 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 3.50 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.96 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.11 (t, J = 7.2 Hz, 3H) 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【０１３０】
【化３４】
2019210254.tif 000038
【０１３１】
3-bromo-1-(prop-2-yn-1-yl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one (331):黄色固体
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ8.89 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 8.23 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 3.06-3.09 (m, 3H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【０１３２】
【化３５】
2019210254.tif 000039
【０１３３】
3-bromo-1-(cyclopropylmethyl)-2-(pyridin-4-yl)-1,5,6,7-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2-c]pyridin-4-one(332)
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ8.87 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 8.19 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.01 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 3.56 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 3.04 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 0.81-0.89 (m, 1H), 0.42 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 0.04 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 1つの水素原子(NH)は検出されなかった。
【０１３４】
また、同様にPHA誘導体10aを用いて、PHAピロール窒素原子への置換基導入を以下に示すスキームで行った。
【化３６】
2019210254.tif 000040
PHA誘導体10a（1：695 mg、1.77 mmol、1.0当量）及びK2CO3（490 mg、3.54 mmol、2.0当量）のDMF（7.0 mL）溶液に、トシラート（23：1.0当量）を室温で加えた。70℃で24時間撹拌した後、反応混合物を水でクエンチし、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗混合物をカラムクロマトグラフィー（CHCl3 / メタノール =100：0 to 9：1）で精製して、化合物24を得た。
化合物24（112 mg、1.0当量）のメタノール（20 mL）溶液に、クロロトリメチルシラン（1.2 mL、50当量）を室温で加えた。2時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮してPHA誘導体AMI-327を得た。
PHA誘導体AMI-327の物性データを以下に記載する。
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.63 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 6.0, 1.2 Hz, 2H), 3.95 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.52 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.23 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.93 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.54 (quin, J = 6.6 Hz, 2H), 1.40 (quin, J = 6.6 Hz, 2H), 1.03-1.43 (m, 14H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 166.99, 150.44, 141.22, 140.91, 130.85, 127.02, 112.73, 96.96, 52.44, 46.32, 41.08, 31.36, 30.49, 30.39, 30.29, 30.21, 29.90, 29.81, 27.78, 27.14, 22.79
【０１３５】
さらに、PHA誘導体AMI-327を用いて以下のスキームでPHA誘導体AMI-329を得た。
【０１３６】
【化３７】
2019210254.tif 000041
【０１３７】
PHA誘導体AMI-327（1：695 mg、1.77 mmol、1.0当量）及びトリエチルアミン（490 mg、3.54  mmol、2.0当量）のメタノール（7.0 mL）溶液に、1,3-プロパンジチオール（23：1.0当量）を室温で加えた。室温で39時間撹拌した後、メタノールで希釈し、減圧下で濃縮した。粗混合物をPTLC（CHCl3 / メタノール = 3：1, トリエチルアミン 1%）で精製して、PHA誘導体AMI-329を得た。
PHA誘導体AMI-329の物性データを以下に記載する。
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.62 (dd, J = 6.0, 1.2 Hz, 2H), 7.46 (dd, J = 6.0, 1.2 Hz, 2H), 3.95 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.52 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.92 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.72 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.51 (quin, J = 7.2 Hz, 2H), 1.40 (quin, J = 7.2 Hz, 2H), 1.03-1.32 (m, 14H)
【０１３８】
実施例２．PHA誘導体の生物活性評価１
実施例１で合成したPHA誘導体の植物に対する概日リズムへの活性評価を行った。CCA1プロモーターを導入した遺伝子細胞シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に各PHA誘導体を添加し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を生物発光レポーターに用いたリアルタイム測定によって概日リズムを分析した。化合物の活性は、ブランク実験との概日期間の差を計算することによって決定し、２時間長周期化する化合物濃度を算出した。この概日リズムを２時間長周期化する濃度を化合物の活性の指標とした。
【０１３９】
具体的には、時計関連遺伝子であるCCA1遺伝子のプロモーター(シロイヌナズナ由来、翻訳開始点を0とすると-506から+891までの配列、Nakamichi et al., Plant Cell Physiol. 45(1): 57-67 (2004)のFigure 1-A-cの配列)の下流にルシフェラーゼタンパク質のコード配列が配置されたDNAを、公知の方法にしたがってシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のゲノム中に導入した。Arabidopsis thaliana Col-0バックグラウンドで生成されたCCA1:LUC遺伝子導入株（Nakamichi, N. ら, Plant Cell 98）から採取した種子を滅菌し、スクロースを含まないMS培地（製品番号392-00591、Wako）に播種し、4℃で2日間保った。その後、CCA1:LUC苗を、12時間の明条件（白色光70〜100 μmol s-1 m-2）/12時間の暗条件（LD）に4日間保持し、96ウェルプレート（製品番号136101、Nunc MicroWell Whiteプレート、Thermo Fisher Scientific）に直径6 mmのスポイトで移した。2 ％(w / v)のスクロース、500 μMのルシフェリン、及び最終濃度5％(v / v)のDMSOに溶解した化合物を含有する20μLのMS培地で処理した。5％(v / v)のDMSOを含有するMS培地を添加しても、DMSOを含まないMSに比べて概日周期は有意に変化しなかった。
【０１４０】
化合物処理の翌日から、CCA1:LUCの生物発光を恒明条件（LL）にて、CL96自動バイオルミノメーター（Churitsu、Toyoake、Japan）を用いて分析した。概日リズムのパラメータ（周期及び振幅）は、CL96自動バイオルミノメーターによって自動的に計算された。
【０１４１】
PHA誘導体は実施例１で合成した各種PHA誘導体のうち表４に示すものを用いた。なお、PHA誘導体8n及び8qは収率が低かったため本評価を行わなかった。PHA誘導体を用いた場合の概日リズムを２時間長周期化する濃度を、PHAを用いた場合の該濃度と共に表４に示す。なお、表４において濃度「-」の表記は、活性を示さなかったことを表す。
【０１４２】
【表４】
2019210254.tif 000042
【０１４３】
ピロールの窒素原子にエーテル(AMI-113)、ジオキサン環(AMI-114)、エステル(AMI-115)、ベンゼン環(AMI-116,121)、ピロール環(AMI-118)、キシレン環(AMI-122)、アセタール(AMI-123,124)、アミン(AMI-129)、安息香酸メチル(AMI-130-132)、メチルベンジル(AMI-133)、アシル基(AMI-134)を導入した誘導体は活性を示さなかった。ピロールの窒素原子にエチル基(AMI-126)やメチルアセチレン基(AMI-212)を導入した誘導体はPHAよりも活性が高いのに対し、C16直鎖アルキル基(AMI-117)やプロピルアセチレン基(AMI-205)を導入した誘導体は活性が低いことから、ピロールの窒素原子に導入するアルキル鎖が短いものほど誘導体の活性が高くなり、炭素数C2-C3の置換基が適していることがわかった。また、短いアルキル鎖において、シクロヘキサン環(AMI-214)をもつ誘導体に比べ、シクロブタン環(AMI-207)やシクロプロパン環(AMI-209)をもつ誘導体は活性が向上したことから、ピロールの窒素原子に嵩が低い官能基をもつ誘導体ほど活性が高くなると推測される。
また、ピロールの窒素原子に導入される置換基が炭素数が短いものであってもヘテロ原子を有する誘導体AMI-124, AMI-125, AMI-130, AMI-210及びAMI-119は生物活性を示さず、ヘテロ原子や官能基の導入は効果的でないことがわかった。
さらに、ピロールC3位に置換基（特にハロゲン）を導入した誘導体(AMI-23, 24)は、はるかに高い活性(<1 μM)を示した。このことから、ピロールC3位の置換基によるヘテロビアリール構造のねじれが活性に影響すると考えられる。
【０１４４】
実施例３．PHA誘導体の生物活性評価２
実施例１で合成したPHA誘導体の試験管内でのシロイヌナズナCKL4（CK1ファミリーの１つ）の活性評価を行った。
【０１４５】
100 ng リコンビナントGST-CKL4、500 ng カゼイン(C8032, Sigma)、及びPHA誘導体(4% (v/v) DMSO溶媒)を50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 5 μCi [(-32P] ATP (NN-NEG502A, PerkinElmer)の反応液中で37℃、2時間で反応させた。その後、SDSサンプルバッファーを加えて5分間煮沸して反応を止めた。サンプルは10% ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ゲルを乾燥させたのちに、イメージングプレート(BAS IP-MS 2040) に 32P シグナルを露光させ、イメージングプレートをTyphoon FLA 7000 Laser Scanner/Imager (GE Healthcare)で検出した。カゼインの32Pリン酸化シグナルをCKL4キナーゼ活性として、IC50 （50％阻害濃度）を求めた。
【０１４６】
PHA誘導体は実施例１で合成した各種PHA誘導体のうち表５に示すものを用いた。また、比較としてPHA誘導体の代わりにPHAを用いて同様の評価を行った。
ゲル電気泳動の結果を図１に示す。この結果から、図２に示すPHA誘導体濃度に対するリン酸化活性のグラフを得、IC50を算出した。結果を表５に示す。
【０１４７】
【表５】
2019210254.tif 000043
【図１】
2019210254.tif 000055
【図２】
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