(57)【要約】【課題】抗原とアジュバントとを同時に免疫細胞へ送達でき、免疫賦活作用に優れた免疫組成物を提供する。【解決手段】免疫組成物は、親水性抗原が第１の界面活性剤によって被覆された固体状の親水性抗原−第１の界面活性剤複合体と、疎水性アジュバントと、油相と、第２の界面活性剤と、水相と、を含み、前記親水性抗原−第１の界面活性剤複合体及び前記疎水性アジュバントが前記油相に溶解又は分散しており、前記油相が前記第２の界面活性剤によって被覆されて水相に分散している。【選択図】図１Ｂ
2019202957.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性抗原が第１の界面活性剤によって被覆された固体状の親水性抗原−第１の界面活性剤複合体と、
疎水性アジュバントと、
油相と、
第２の界面活性剤と、
水相と、
を含み、
前記親水性抗原−第１の界面活性剤複合体及び前記疎水性アジュバントが前記油相に溶解又は分散しており、
前記油相が前記第２の界面活性剤によって被覆されて水相に分散している免疫組成物。
【請求項２】
前記疎水性アジュバントが自然免疫受容体に対するリガンドである請求項１に記載の免疫組成物。
【請求項３】
前記疎水性アジュバントがトール様受容体に対するリガンドである請求項１又は２に記載の免疫組成物。
【請求項４】
前記第１の界面活性剤がショ糖脂肪酸エステル、コレステロール、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ＤＬ−α−トコフェロール及び卵ホスファチジルコリンからなる群より選択される１種以上である請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫組成物。
【請求項５】
前記第２の界面活性剤がホスファチジルコリン、ショ糖脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセリン脂肪酸エステル及びジアンヒドロ−Ｄ−マンニトール（Ｚ）−９−オクタデセノアートからなる群より選択される１種以上である請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫組成物。
【請求項６】
第３の界面活性剤を更に含み、
前記第３の界面活性剤が前記油相に分散している請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫組成物。
【請求項７】
前記第３の界面活性剤がソルビタン脂肪酸エステル又はＤＬ−α−トコフェロールである請求項６に記載の免疫組成物。
【請求項８】
前記油相が植物油、動物油、中性脂質、長鎖脂肪酸エステル及び炭化水素類からなる群より選択される１種以上である請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫組成物。
【請求項９】
前記第２の界面活性剤によって被覆された前記油相の平均粒子径が３５０ｎｍ以下である請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品分野において、癌や自己免疫疾患等の難病治療薬におけるバイオ医薬品の位置づけは一層高まっており、現在主流である抗体医薬に続く次世代バイオ医薬品として、ワクチンが注目されている。ワクチンとは、病原体を弱毒化又は不活化した抗原からなる製剤で、体内の抗原特異的な免疫を誘導及び活性化する医薬品である。他の方法と比較して、効果が長期間持続し、また副作用の報告が少ないことが特徴である。ワクチンは最も有効かつ経済的な『予防』策であると認識されているが、近年では癌ワクチンをはじめ『治療』を目的としたワクチンの開発も行われており、ライフサイエンスにおける重要な研究領域である。
【０００３】
多くの場合、ワクチンには、抗原の他に、アジュバントと呼ばれる免疫を活性化する効果をもった添加剤が含まれている。２０世紀後半にかけての分子生物学の発展により、アジュバント成分を特異的に認識するトール様受容体（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）等の受容体が、ワクチンに必須な抗原提示細胞の活性を厳密に制御しており、その後の獲得免疫反応に深く関係することが判明した。具体例として、エンドトキシン由来のリポ多糖であるｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ（ＭＰＬ）や細菌の持つＤＮＡの非メチル化シトシン−グアニン配列であるオリゴ核酸（ＣｐＧ）等、分子レベルでもアジュバント機能を持ったものが多く報告されている（例えば、非特許文献１等参照）。
【０００４】
エマルションアジュバントは、臨床でも用いられている実用的なアジュバントの１つである。既往のＷａｔｅｒ−ｉｎ−Ｏｉｌ（Ｗ／Ｏ）型エマルションアジュバントであるフロイント不完全アジュバントは、用いられているシリコンオイルの皮膚滞留性により免疫が不活性化するという欠点を持つため、実用化が困難であった。また、ＭＦ５９（平均粒子径：約１６０ｎｍ）等のＯｉｌ−ｉｎ−Ｗａｔｅｒ（Ｏ／Ｗ）型エマルションアジュバントは、現在インフルエンザワクチンとして日本国内でも利用されている。
【０００５】
一方、発明者らは、これまで、Ｗ／Ｏ型エマルションから内水相を除去したＳｏｌｉｄ−ｉｎ−Ｏｉｌ（Ｓ／Ｏ）型の経皮免疫剤（例えば、特許文献１等参照）や、このＳ／Ｏ型製剤を水相に分散させたＳｏｌｉｄ−ｉｎ−Ｏｉｌ−ｉｎ−Ｗａｔｅｒ（Ｓ／Ｏ／Ｗ）型の薬物輸送キャリアを開発してきた（例えば、特許文献２等参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５７５２３４３号公報
【特許文献２】特許第５６１８３０７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Coffman RL., et al., “Vaccine adjuvants: putting innate immunity to work.”, Immunity, Vol. 33, Issue 4, p492-503, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のＯｉｌ−ｉｎ−Ｗａｔｅｒ（Ｏ／Ｗ）型エマルションアジュバントでは、親水性である抗原は外水相に存在し、キャリアに封入されていないため、抗原とアジュバントとが別々に投与されていた。そのため、免疫賦活作用が十分に生かされておらず、その効果は限定的であった。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、抗原とアジュバントとを同時に免疫細胞へ送達でき、免疫賦活作用に優れた免疫組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、親水性抗原が第１の界面活性剤によって被覆された固体状の親水性抗原−第１の界面活性剤複合体と疎水性アジュバントとを油相に溶解又は分散させ、さらに該油相を第２の界面活性剤によって被覆させて、水相に分散させたＳ／Ｏ／Ｗ型の免疫組成物が、抗原とアジュバントとを同時に免疫細胞へ送達でき、優れた免疫賦活作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る免疫組成物は、親水性抗原が第１の界面活性剤によって被覆された固体状の親水性抗原−第１の界面活性剤複合体と、疎水性アジュバントと、油相と、第２の界面活性剤と、水相と、を含み、前記親水性抗原−第１の界面活性剤複合体及び前記疎水性アジュバントが前記油相に溶解又は分散しており、前記油相が前記第２の界面活性剤によって被覆されて水相に分散している。
前記疎水性アジュバントが自然免疫受容体に対するリガンドであってもよい。
前記疎水性アジュバントがトール様受容体に対するリガンドであってもよい。
前記第１の界面活性剤がショ糖脂肪酸エステル、コレステロール、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ＤＬ−α−トコフェロール及び卵ホスファチジルコリンからなる群より選択される１種以上であってもよい。
前記第２の界面活性剤がホスファチジルコリン、ショ糖脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセリン脂肪酸エステル及びジアンヒドロ−Ｄ−マンニトール（Ｚ）−９−オクタデセノアートからなる群より選択される１種以上であってもよい。
上記第１態様に係る免疫組成物は、第３の界面活性剤を更に含み、前記第３の界面活性剤が前記油相に溶解又は分散していてもよい。
前記第３の界面活性剤がソルビタン脂肪酸エステル又はＤＬ−α−トコフェロールであってもよい。
前記油相が植物油、動物油、中性脂質、長鎖脂肪酸エステル及び炭化水素類からなる群より選択される１種以上であってもよい。
前記第２の界面活性剤によって被覆された前記油相の平均粒子径が３５０ｎｍ以下であってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
上記態様の免疫組成物によれば、抗原とアジュバントとを同時に免疫細胞へ送達でき、免疫賦活作用に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】本実施形態の免疫組成物の一例を示す概略構成図である。
【図１Ｂ】図１Ａの拡大図である。
【図２】参考例１におけるＦＩＴＣ標識されたオボアルブミン（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ）封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造方法を示す概略工程図である。
【図３Ａ】試験例１における２種類のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの遠心分離法により算出された間接的な封入率を示すグラフである。
【図３Ｂ】試験例１におけるＥＲ−２９０−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの経時的な封入率の変化を示すグラフである。
【図４Ａ】試験例２におけるＥＰＣ−Ｓｐａｎ８５−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの粒子径を示すグラフである。
【図４Ｂ】試験例２におけるＥＰＣ−Ｓｐａｎ８５−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの０．２μｍフィルターによるろ過後の粒子径を示すグラフである。
【図５Ａ】試験例３における各群での全ＲＡＷ細胞中のＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込み割合（％）を示すグラフである。
【図５Ｂ】試験例３における各群でのＣＤ４０及びＣＤ８０陽性細胞中のＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込み割合（％）を示すグラフである。
【図６】試験例３におけるＲＡＷ細胞での抗原（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ）の取り込みと、ＣＤ４０及びＣＤ８０の発現の関係と、を示す概念図である。
【図７】試験例４における各サンプルで免疫したマウスから得られ、ＯＶＡのＭＨＣクラスＩ分子のエピトープペプチド存在下又は非存在下で培養したＣＤ８陽性Ｔ細胞中のＩＦＮ−γを発現した細胞（ＯＶＡ特異的ＣＴＬ）の割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
≪免疫組成物≫
本実施形態の免疫組成物は、親水性抗原が第１の界面活性剤によって被覆された固体状の親水性抗原−第１の界面活性剤複合体と、疎水性アジュバントと、油相と、第２の界面活性剤と、水相と、を含む。
図１Ａ及び図１Ｂは、本実施形態の免疫組成物の一例を示す概略構成図である。なお、図１Ｂは、図１Ａの拡大図であり、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０の内部構造を模式的に表した図である。図１Ａ及び図１Ｂを参照しながら、本実施形態の免疫組成物の構造について、以下に詳細を説明する。
図１Ａ及び図１Ｂに示す免疫組成物１００は、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０と、水相２１とを含む。第２の界面活性剤によって被覆された油相２０は、油相１１が第２の界面活性剤１３によって被覆されたものであり、水相２１中に分散している。具体的には、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０は、油相１１と水相２１との界面に第２の界面活性剤１３が会合し、油相１１を被覆するという構成を有している。
また、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０は、油相１１の他に、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体１０及び疎水性アジュバント１２を含み、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体１０及び疎水性アジュバント１２が油相１１に溶解又は分散している。
また、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０は、図１Ｂに示すように、第３の界面活性剤１４を更に含んでもよい。第３の界面活性剤１４は、油相１１に溶解又は分散している。
また、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体１０は、親水性抗原１と第１の界面活性剤２を主な構成成分として含んでいる。また、親水性抗原１に第１の界面活性剤２の親水性部分が会合し、親水性抗原１の周りを被覆するという構成を有している。
親水性抗原−第１の界面活性剤複合体１０は、粒子が大きくなり過ぎるのを防ぐために、親水性抗原１及び第１の界面活性剤２のみからなるものであってもよく、医薬用製剤において許容される製剤成分（例えば、添加成分等）を含んでもよい。
【００１５】
免疫組成物１００において、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０の形状は、球状又は略球状である。また、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０の平均粒子径の上限値は、ナノサイズであればよく、免疫細胞へ効率的に送達する観点から、３５０ｎｍであることが好ましく、３００ｎｍであることがより好ましく、２００ｎｍであることがさらに好ましい。
一方、平均粒子径の下限値は、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体１０及び疎水性アジュバント１２を封入可能な大きさであればよく、例えば１０ｎｍとすることができる。
【００１６】
本実施形態の免疫組成物は、上記構成を有することで、抗原とアジュバントとを同時に免疫細胞へ送達でき、免疫賦活作用に優れる。
次いで、本実施形態の免疫組成物の各構成成分について、以下に詳細を説明する。
【００１７】
＜構成成分＞
［親水性抗原］
親水性抗原としては、水相に溶解又は分散可能であって、免疫応答を惹起する物質であり、且つ、免疫原性を誘導するものであれば特に限定されず、従来の免疫等に用いられる抗原やワクチン、免疫原性物質、ガン抗原等が用いられる。具体的には、例えば、生理活性物質等のタンパク質やペプチド（例えば、鶏卵白由来リゾチーム、スギ花粉症の抗原領域ペプチド等）、タンパク質やペプチドを結合したハプテン化物質、生又は不活性化（死滅）された細菌やウイルス（全部）又はこれらの部分分解物、不活性化（死滅）させた癌細胞（全部）又はその部分分解物、核酸等が挙げられる。また、抗原性に欠けるもの（例えば、糖質や脂質、無機物等）にハプテン化等の手段によって抗原性を付与させたものも親水性抗原として用いられる。親水性抗原は、動物由来又は植物由来のいずれものであってもよい。例えば、親水性抗原は、家禽及び家畜用抗原又は愛玩動物用抗原であってもよく、牛用抗原、鶏用抗原又は豚用抗原であってもよく、ダニ等の節足動物や昆虫由来であってもよい。また、親水性抗原は、食物由来のものであってもよい。
また、これら親水性抗原は、単一の分子であってもよく、又は、疎水性抗原等を封入したナノゲル（コレステロール修飾プルラン）等の親水性水溶性ナノキャリアであってもよい。また、これら親水性抗原に、後述するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド等の水にも可溶な親水性アジュバントを混合して用いてもよい。
【００１８】
本実施形態の免疫組成物中の親水性抗原の含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば０．０１質量％以上０．１質量%以下とすることができ、例えば０．０２質量%以上０．０５質量％以下とすることができる。
【００１９】
［界面活性剤］
界面活性剤は、医薬用製剤において許容されるものであれば特に制限なく用いることができる。界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、胆汁酸塩等が挙げられる。
これらの中でも、上記第１の界面活性剤、上記第２の界面活性剤及び上記第３の界面活性剤としてそれぞれ好適に用いられるものについて、以下に詳細を説明する。
【００２０】
（第１の界面活性剤）
第１の界面活性剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、コレステロール、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ＤＬ−α−トコフェロール、卵ホスファチジルコリン（ｅｇｇ  ｙｏｌｋ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＥＰＣ）等が挙げられる。
ショ糖脂肪酸エステルとしては、例えば、ショ糖ラウリン酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：１２）、ショ糖ミリスチン酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：１４）、ショ糖パルミチン酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：１６）、ショ糖ステアリン酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：１８）、ショ糖オレイン酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：１８、二重結合の数：１）、ショ糖ベヘニン酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：２２）、ショ糖エルカ酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：２２、二重結合の数：１）、ショ糖混合脂肪酸エステル等が挙げられる。
グリセリン脂肪酸エステルとしては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、モノベヘン酸グリセリン、モノラウリン酸グリセリン等が挙げられる。
ソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、モノオレイン酸ソルビタン（スパン８０）、トリオレイン酸ソルビタン（スパン８５）、トリステアリン酸ソルビタン（スパン６５）、セスキオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン（スパン２０）等が挙げられる。
これら界面活性剤を１種単独でも用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
中でも、第１の界面活性剤としては、親水性抗原を被覆して、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体を形成させて、この親水性抗原−第１の界面活性剤複合体を油相に溶解又は分散するために、疎水性（親油性）の高いものを用いることが好ましい。
なお、本明細書において、親水性（疎油性）及び疎水性（親油性）の指標としては、ＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｌａｎｃｅ）値を用いることができる。一般に、「ＨＬＢ値」とは、界面活性剤の水及び油(水に不溶性の有機化合物)への親和性の程度を表す値である。ＨＬＢ値は０から２０までの値を取り、０に近いほど親油性が高くなり、２０に近いほど親水性が高くなる。第１の界面活性剤におけるＨＬＢ値の上限値は１０が好ましく、８がより好ましい。一方、第１の界面活性剤におけるＨＬＢ値の下限値は、特別な限定はなく、例えば１である。第１の界面活性剤において、当該界面活性剤を構成する炭化水素基の炭素数を増加させること、又は、エステル化度等の親水性官能基の数を減少させること等により疎水性を高めることができ、ＨＬＢ値を低くすることができる。
【００２２】
上記特性を有する界面活性剤として具体的には、例えば、三菱ケミカルフーズ社製のショ糖エルカ酸エステルであるリョートーシュガーエステルＥＲ−１９０（ＨＬＢ値:１、脂肪酸純度：９０％）、同ＥＲ−２９０（ＨＬＢ値:２、脂肪酸純度：９０％）、ショ糖オレイン酸エステルであるリョートーシュガーエステルＯ−１７０（ＨＬＢ値:１、脂肪酸純度：７０％）、ショ糖混合脂肪酸エステルであるリョートーシュガーエステルＰＯＳ−１３５（ＨＬＢ値:１、パルミチン酸、オレイン酸及びステアリン酸の混合脂肪酸、脂肪酸純度：３５％）、ソルビタン脂肪酸エステルであるスパン８５（ＨＬＢ値：１．８）、コレステロール（ＨＬＢ値:４）、ＥＰＣ（ＨＬＢ値:７）等が挙げられ、中でも、細胞毒性が低いことから、コレステロール又はＥＰＣが好ましい。
【００２３】
本実施形態の免疫組成物中の第１の界面活性剤の含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば０．１質量％以上１質量%以下とすることができ、例えば０．３質量%以上０．７質量％以下とすることができる。
【００２４】
（第２の界面活性剤）
第２の界面活性剤としては、ホスファチジルコリン、ショ糖脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセリン脂肪酸エステル、ジアンヒドロ−Ｄ−マンニトール（Ｚ）−９−オクタデセノアート等が挙げられ、これらに限定されない。
ホスファチジルコリンとしては、例えば、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ダイズホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）等が挙げられる。
モノステアリン酸ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）としては、ポリエチレングリコールの分子量が異なるものが存在し、例えば、モノステアリン酸ＰＥＧ−２、モノステアリン酸ＰＥＧ−１０、モノステアリン酸ＰＥＧ−１５、モノステアリン酸ＰＥＧ−２０、モノステアリン酸ＰＥＧ−４０、モノステアリン酸ＰＥＧ−５０、モノステアリン酸ＰＥＧ−１００、モノステアリン酸ＰＥＧ−１５０、モノステアリン酸ＰＥＧ−１０００、モノステアリン酸ＰＥＧ−２０００等が挙げられる。なお、ＰＥＧの後ろの数値は、分子量を示している。
ポリエチレングリコールジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）としては、ポリエチレングリコールの分子量が異なるものが存在し、例えば、ＰＥＧ−１０００−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ−３０００−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ−５０００−ＤＳＰＥ等が挙げられる。なお、ＰＥＧの後ろの数値は、分子量を示している。また、ＰＥＧ−ＤＳＰＥとしては、ポリエチレングリコール鎖に加えて、酸無水物基を有するものを用いてもよく、当該官能基を有するものとしては、例えば、日油社製のＰＥＧ−ｃｏｍｂ−ｓｈａｐｅｄ−ＤＳＰＥであるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＤＳＰＥ−ＡＭ０５３０Ｋ等が挙げられる。
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））等が挙げられる。
ショ糖脂肪酸エステル及びグリセリン脂肪酸エステルとしては、上記「第１の界面活性剤」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、これら界面活性剤を１種単独で含んでもよく、２種以上組み合わせて含んでもよい。
【００２５】
中でも、第２の界面活性剤としては、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体及び疎水性アジュバントが溶解又は分散している油相を被覆して、第２の界面活性剤によって被覆された油相を形成させて、この第２の界面活性剤によって被覆された油相を水相に分散するために、親水性の高いものを用いることが好ましい。第２の界面活性剤におけるＨＬＢ値の下限値は１１が好ましく、１２がより好ましく、１３がさらに好ましい。一方、第２の界面活性剤におけるＨＬＢ値の上限値は、特別な限定はなく、例えば２０である。第２の界面活性剤において、当該界面活性剤を構成する炭化水素基の炭素数を減少させること、又は、エステル化度等の親水性官能基の数を増加させること等により親水性を高めることができ、ＨＬＢ値を高くすることができる。
【００２６】
上記特性を有する界面活性剤として具体的には、例えば、三菱ケミカルフーズ社製のショ糖ラウリン酸エステルであるリョートーシュガーエステルＬ−１６９５（ＨＬＢ値:１６、脂肪酸純度：９５％）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標））（ＨＬＢ値：１５）等が挙げられ、中でも、ヒトでの安全性が担保されていることから、Ｔｗｅｅｎ  ８０が好ましい。
【００２７】
本実施形態の免疫組成物中の第２の界面活性剤の含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば０．１質量％以上１質量％以下とすることができ、例えば０．３質量％以上０．７質量％以下とすることができる。
【００２８】
（第３の界面活性剤）
また、本実施形態の免疫組成物は、図１Ｂに示すように、第３の界面活性剤を更に含んでもよい。第３の界面活性剤としては、油相に溶解又は分散可能なものであればよく、ＨＬＢ値が１０以下のものが好ましい。上記特性を有する界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、ＤＬ−α−トコフェロール等が挙げられる。
ソルビタン脂肪酸エステルとしては、上記「第１の界面活性剤」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、これら界面活性剤を１種単独で含んでもよく、２種以上組み合わせて含んでもよい。中でも、第３の界面活性剤としては、トリオレイン酸ソルビタン（スパン８５）が好ましい。
【００２９】
本実施形態の免疫組成物中の第３の界面活性剤の含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば０．１質量％以上１質量％以下とすることができ、例えば０．３質量％以上０．７質量％以下とすることができる。
【００３０】
［疎水性アジュバント］
疎水性アジュバントとしては、ワクチンに通常用いられるものであれば特に限定されないが、例えば、自然免疫受容体に対するリガンド等が挙げられる。ここでいう「リガンド」とは、受容体に特異的に結合するものを意味し、特に、受容体に特異的に結合して、種々の生理作用を示す物質を用いることができる。このような物質を「アゴニスト」ともいう。
自然免疫受容体としては、例えば、トール様受容体（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＩＧ−Ｉ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＲＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＯＤ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＮＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＬＲ）等が挙げられる。
中でも、ＴＬＲに対するリガンド（以下、「ＴＬＲリガンド」と称する場合がある）又はＣＬＲに対するリガンド（以下、「ＣＬＲリガンド」と称する場合がある）が好ましく、抗原提示細胞の活性化に大きく寄与することが知られていることから、抗原提示細胞の細胞膜上に存在しているＴＬＲに対するリガンドがより好ましい。
【００３１】
（ＴＬＲリガンド）
ＴＬＲリガンドとしては、例えば、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８及びＴＬＲ−９からなる群より選択される少なくとも１種のＴＬＲと相互作用するものを適宜選択すればよい。
ＴＬＲ−２リガンドとしては、例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４等が挙げられる。
ＴＬＲ−３リガンドとしては、例えば、ポリＩＣＬＣ、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）等が挙げられる。
ＴＬＲ−４リガンドとしては、例えば、Ｒ型リポ多糖、Ｓ型リポ多糖、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ等が挙げられる。
ＴＬＲ−５リガンドとしては、例えば、フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）等が挙げられる。
ＴＬＲ−２及びＴＬＲ−６リガンドとしては、例えば、ＭＡＬＰ−２等が挙げられる。
ＴＬＲ−７及びＴＬＲ−８リガンドとしては、例えば、レシキモド（Ｒ８４８）、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、Ｒ８３７）、ガルジキモド（ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、ロキソリビン（ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）等が挙げられる。
ＴＬＲ−９リガンドとしては、例えば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド等が挙げられる。
中でも、ヒト及びマウスにおける安全性及び免疫を活性化する効果が確認されていることから、疎水性アジュバントとしては、レシキモド（Ｒ８４８）が好ましい。
【００３２】
（ＣＬＲリガンド）
ＣＬＲリガンドとしては、例えば、マクロファージ誘導性Ｃ型レクチン（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ；Ｍｉｎｃｌｅ）受容体、マクロファージＣ型レクチン（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ；ＭＣＬ）受容体、樹状細胞関連Ｃ型レクチン−２（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ−２；Ｄｅｃｔｉｎ−２）受容体及び樹状細胞免疫活性化受容体（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＤＣＡＲ）からなる群より選択される少なくとも１種のＣＬＲと相互作用するものを適宜選択すればよい。
Ｍｉｎｃｌｅ受容体リガンド及びＭＣＬ受容体リガンドとしては、例えば、トレハロースジミコール酸等が挙げられる。
Ｄｅｃｔｉｎ−２受容体リガンドとしては、例えば、リポアラビノマンナン等が挙げられる。
ＤＣＡＲリガンドとしては、例えば、ホスファチジルイノシトールマンノシド等が挙げられる。
【００３３】
本実施形態の免疫組成物中の疎水性アジュバントの含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば０．００１質量％以上０．１質量％以下とすることができ、例えば０．００２質量％以上０．００５質量％以下とすることができる。
【００３４】
［油相］
油相としては、医薬用製剤において許容されるものであれば特に制限はなく、例えば、植物油、動物油、中性脂質（モノ置換、ジ置換又はトリ置換のグリセライド）、合成油脂、ステロール誘導体、長鎖脂肪酸エステル、乳酸エステル、多価カルボン酸エステル、その他のカルボン酸のエステル、炭化水素類、シリコーン類等が挙げられる。
植物油としては、例えば、大豆油、綿実油、菜種油、ゴマ油、コーン油、落花生油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ナタネ油、シソ油、ウイキョウ油、カカオ油、ケイヒ油、ハッカ油、ベルガモット油等が挙げられる。
動物油としては、例えば、牛脂、豚油、魚油等が挙げられる。
中性脂質としては、例えば、中鎖脂肪酸トリグリセリド、トリオレイン、トリリノレイン、トリパルミチン、トリステアリン、トリミリスチン、トリアラキドニン等が挙げられる。
合成脂質としては、例えば、アゾン等が挙げられる。
ステロール誘導体としては、例えば、コレステリルオレエート、コレステリルリノレート、コレステリルミリステート、コレステリルパルミデート、コレスレリルアラキデート等が挙げられる。
長鎖脂肪酸エステルとしては、例えば、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸セチル、オレイン酸エチル、リノール酸エチル、リノール酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル等が挙げられる。
乳酸エステルとしては、例えば、乳酸エチル、乳酸セチル等が挙げられる。
多価カルボン酸エステルとしては、例えば、クエン酸トリエチル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジエチル、セバシン酸ジイソプロピル等が挙げられる。
その他のカルボン酸のエステルとしては、例えば、２−エチルヘキサン酸セチル等が挙げられる。
炭化水素類としては、例えば、ワセリン、パラフィン、スクワラン、スクワレン等が挙げられる。
これら油相を１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
中でも、油相としては、スクワレンが好ましい。
【００３５】
本実施形態の免疫組成物中の油相の含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば１質量％以上５０質量％以下とすることができ、例えば２質量％以上３０質量％以下とすることができる。
【００３６】
［水相］
水相としては、医薬用製剤において許容されるものであれば特に制限はなく、例えば、純水、精製水、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が挙げられる。
【００３７】
本実施形態の免疫組成物中の水相の含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば５０質量％以上９９．５質量％以下とすることができ、例えば７０質量％以上９５質量％以下とすることができる。
【００３８】
［その他添加成分］
本実施形態の免疫組成物は、上記構成成分に加えて、更に、その他添加成分を含んでもよい。
その他添加成分としては、例えば、賦形剤、着色剤、結合剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、安定剤、保存剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤（例えば、カルメロースナトリウム等）、緩衝剤、ｐＨ調整剤、基剤、炭化水素類、エステル類、トリグリセリド類、吸収促進剤、等張化剤、有機溶媒、界面活性剤等が挙げられる。
賦形剤としては、例えば、白糖等の糖類、デキストリン等のデンプン誘導体、カルメロースナトリウム等のセルロース誘導体、キサンタンガム等の水溶性高分子等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、上記賦形剤、マクロゴール等が挙げられる。
湿潤剤としては、例えば、グリセリン等が挙げられる。
安定剤としては、例えば、パラヒドロキシ安息香酸エステル類、アルコール類、塩化ベンザルコニウム、フェノール類、チメロサール、無水酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。パラヒドロキシ安息香酸エステル類としては、例えば、パラヒドロキシ安息香酸エステル類メチルパラベン、プロピルパラベン等が挙げられる。アルコール類としては、例えば、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等が挙げられる。フェノール類としては、例えば、フェノール、クレゾール等が挙げられる。
溶剤としては、例えば、水、グリセリン、エタノール、高級アルコール類等が挙げられる。高級アルコール類としては、例えば、オレイルアルコール等が挙げられる。
基剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、クロタミトン、セバシン酸ジエチル、ワセリン等が挙げられる。
炭化水素類としては、例えば、ワセリン、マイクロクリスタンワックス等が挙げられる。
エステル類としては、例えば、ホホバアブアラ、ゲイロウ等が挙げられる。
トリグリセリド類としては、例えば、牛脂、オリーブ油等が挙げられる。
吸収促進剤としては、例えば、メントール等が挙げられる。
本実施形態の免疫組成物において、上記添加成分は、通常の配合量で配合できる。
【００３９】
＜免疫組成物の製造方法＞
本実施形態の免疫組成物は、例えば、以下の工程（１）〜（３）を含む方法を用いて、製造できる。
（１）親水性抗原を含む水相と、第１の界面活性剤を含む有機溶媒とを攪拌混合して、前記水相を前記有機溶媒中に分散させたＷ／Ｏ型エマルションを形成させる工程；
（２）前記Ｗ／Ｏ型エマルションから内側の前記水相と外側の前記有機溶媒とを除いて、前記親水性抗原が前記第１の界面活性剤によって被覆された前記親水性抗原−前記第１の界面活性剤を形成させた後、前記親水性抗原−前記第１の界面活性剤複合体を疎水性アジュバントを含む油相中に分散させたＳ／Ｏ型エマルションを形成させる工程；
（３）前記Ｓ／Ｏ型エマルションと、第２の界面活性剤を含む新たな水相とを攪拌混合して、前記Ｓ／Ｏ型エマルションを前記水相に分散させたＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションを形成させる工程。
【００４０】
上記各工程について、以下に詳細を説明する。
【００４１】
［工程（１）］
まず、親水性抗原の水溶液を調製する。このとき、必要に応じて、上記その他添加成分のうち、親水性のものを併せて添加してもよい。また、ここで使用する水としては、例えば、純水、精製水、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が挙げられる。必要に応じて、エタノール等水混和性の有機溶媒を少量添加してもよいが、アルコール等を加え過ぎるとエマルションが形成されにくくなる場合があるため、水のみを用いることが好ましい。
上記水溶液における親水性抗原の濃度（上記その他添加成分を更に添加する場合は、これらの合計濃度）は、これらを実質的に完全に溶解できれば特に制限されないが、例えば、０．１ｍｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることができる。
【００４２】
別途、第１の界面活性剤の有機溶媒溶液を調製する。ここで使用する有機溶媒は、第１の界面活性剤を溶解することができ、且つ、次工程で除去できるものであれば特に制限されないが、例えば、アルコール、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、エステル系溶剤、ハロゲン系脂肪族炭化水素等が挙げられる。アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール等が挙げられる。脂肪族炭化水素としては、例えば、ヘキサン等が挙げられる。芳香族炭化水素としては、例えば、トルエン等が挙げられる。エステル系溶剤としては、例えば、酢酸エチルエステル等が挙げられる。ハロゲン系脂肪族炭化水素としては、例えば、塩化メチレン等が挙げられる。
また、上記有機溶媒溶液における第１の界面活性剤の濃度も特に制限されないが、例えば、１質量％以上１０質量％以下程度とすることができる。
【００４３】
次に、上記親水性抗原の水溶液、及び、第１の界面活性剤の有機溶剤溶液を、常法に従って攪拌混合して、Ｗ／Ｏ型エマルションを調製する。具体的な攪拌方法としては、例えば、ホモジェナイザーにより高速撹拌する方法、プロペラミキサーやディスパー等の撹拌機により撹拌する方法、これらに加えて超音波を照射することにより攪拌する方法等が挙げられる。或いは、多孔質膜を用いた膜乳化によってＷ／Ｏ型エマルションを調製してもよい。多孔質膜として、例えば、市販の疎水性のシラス多孔質ガラス膜（ＳＰＧ、ＳＰＧテクノ社製）を用いることができる。この多孔膜を用いることで、多孔質ガラス膜の細孔径に対応する粒径の分散相粒子（親水性抗原−第１の界面活性剤複合体）が得られる。
【００４４】
［工程（２）］
次に、上記工程（１）で得られたＷ／Ｏ型エマルションを乾燥し、水分及び有機溶媒を除去して、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体を形成させる。乾燥方法は特に制限されず、例えば、凍結乾燥、減圧乾燥等が挙げられるが、凍結乾燥が好ましい。具体的な条件は、常法に従えばよい。また、残存する水分は親水性抗原の加水分解を生む原因となる可能性があり、また、残存する有機溶媒は、生体に悪影響を及ぼす可能性があるため、当該工程では、水分と有機溶媒とを実質的に完全に除去することが好ましい。具体的には、例えば、カールフィッシャー法による測定で、含水率が１％以下になる程度に乾燥することができる。
【００４５】
次に、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体を、疎水性アジュバントを含む油相に分散することによって、Ｓ／Ｏ化を行なう。このとき、油相は、疎水性アジュバントに加えて、更に、第３の界面活性剤を含んでもよい。具体的な攪拌方法としては、例えば、ボルテックス又はホモジェナイザーにより高速撹拌する方法、プロペラミキサーやディスパー等の撹拌機により撹拌する方法、これらに加えて超音波を照射することにより攪拌する方法等が挙げられる。
また、ここで使用する油相、疎水性アジュバント及び第３の界面活性剤としては、上記「免疫組成物」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
上記工程で使用する油相の量は、第１の界面活性剤と油相の種類との相性等にもよるが、例えば、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体１ｇ当たり、１ｍＬ以上１０ｍＬ以下程度とすることができる。
【００４６】
［工程（３）］
次に、上記工程（２）で得られたＳ／Ｏ型エマルション、及び、第２の界面活性剤を含む新たな水相を、常法に従って攪拌混合して、Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製する。具体的な攪拌方法としては、例えば、ホモジェナイザーにより高速撹拌する方法、プロペラミキサーやディスパー等の撹拌機により撹拌する方法、これらに加えて超音波を照射することにより攪拌する方法等が挙げられる。或いは、多孔質膜を用いた膜乳化によってＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製してもよい。多孔質膜として、例えば、後述の実施例にて用いられた、市販の０．２μｍフィルター（例えば、ミリポア社製等）を用いることができる。この多孔膜を用いることで、多孔質膜の細孔径に対応する粒径の分散相粒子（第２の界面活性剤によって被覆された油相）が得られる。
また、ここで使用する水としては、上記「免疫組成物」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００４７】
［その他工程］
上記Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションは、そのまま、経皮的、皮下注射、静脈注射又は筋肉注射により、被検体に投与してもよいが、医薬として通常添加される上記その他添加成分を添加して製剤化することが好ましい。
【００４８】
各剤形に応じた常套手段によって、上記Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションと上記その他添加成分とを混合して、例えば、軟膏剤、ローション剤、エアゾール剤、硬膏剤、水性パップ剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、プラスター剤、リザーバー型貼付剤、マトリックス型貼付剤、テープ剤、注射剤等とすることができるが、これらに限定されない。
【００４９】
＜投与方法＞
本実施形態の免疫組成物の投与量は、配合する抗原の種類や量、また、患者の年齢や症状等に応じて適宜調整すればよい。例えば、通常、成人１人あたり、１回の投与につき、概ね５０μｇ以上５００μｇ以下とすることができ、概ね５０μｇ以上２００μｇ以下とすることができ、数週間から数ヶ月にわたって、少なくとも２回以上投与することが好ましい。
【００５０】
＜使用用途＞
本実施形態の免疫組成物は、経皮的に投与することができ、極めて安全性の高い非侵襲性の免疫原性製剤又はワクチンとして非常に有用である。
また、本実施形態の免疫組成物は、親水性抗原としてがん抗原を封入し、皮下注射、静脈注射又は筋肉注射により投与することができ、さらに抗ＰＤ−１抗体（オプジーボ（登録商標））等の免疫チェックポイント阻害剤と併用することで、極めて安全性及び治療効果の高い抗がん剤として非常に有用である。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
［参考例１］ＦＩＴＣ標識されたオボアルブミン封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造
図２は、ＦＩＴＣ標識されたオボアルブミン封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造方法を示す概略工程図である。図２を参照しながら、ＦＩＴＣ標識されたオボアルブミン封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造方法について、以下に詳細を説明する。
【００５３】
（１）ＥＰＣ−Ｓｐａｎ８５−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体又はＥＲ−２９０−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体の調製
１ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識されたオボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）（以下、「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ」と略記する場合がある）を蒸留水に溶解して調製した溶液と、卵黄由来ホスファチジルコリン（Ｅｇｇ  ｙｏｌｋ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＥＰＣ）（日油コートソーム社製、ＮＣ−５０）及びＳｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）（Ｓｉｇｍａ社製）を含むシクロヘキサン溶液、又は、ＥＲ−２９０（ショ糖エルカ酸エステル）（三菱ケミカルフーズ社製）を含むシクロヘキサン溶液とを、１：２の容量比となるように混合した。次いで、混合液を、ポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いて、２６０００ｒｐｍで２分間攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルションを調製した。調製後、得られたＷ／Ｏ型エマルションを凍結乾燥することで、ＥＰＣ−Ｓｐａｎ８５−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体又はＥＲ−２９０−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体の固体を得た。
【００５４】
（２）Ｓ／Ｏ型製剤の製造
次いで、（１）で得られたＥＰＣ−Ｓｐａｎ８５−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体又はＥＲ−２９０−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体に、スクワレン（Ｓｉｇｍａ社製）を加えて、２種類のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ型製剤を得た。
【００５５】
（３）ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造
次いで、（２）で得られた２種類のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ型製剤と、０．５質量％のＴｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）とを混合した。次いで、混合液を、１２ｍＬのバイアル瓶中でポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いて、２６０００ｒｐｍで２分間攪拌し、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製した。得られたＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの組成及び各成分の含有量（質量％、ＰＢＳ中）は、以下の表１に示すとおりである。
【００５６】
【表１】
2019202957.tif 000003
【００５７】
［比較例１］従来のＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションの製造
ＥＰＣ及びＳｐａｎ８５、又は、ＥＲ−２９０を含むスクワレン（Ｓｉｇｍａ社製）と、０．５質量％のＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳとを混合した。次いで、混合液を、１２ｍＬのバイアル瓶中でポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いて、２６０００ｒｐｍで２分間攪拌し、Ｏ／Ｗ型エマルションを調製した。次いで、このＯ／Ｗ型エマルションに、終濃度が０．０２質量％となるように１ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−ＯＶＡを添加して、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションを得た。得られたＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションの組成及び各成分の含有量（質量％、ＰＢＳ中）は、上記表１と同様である。
【００５８】
［試験例１］ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションにおけるＦＩＴＣ−ＯＶＡの封入率評価試験
（１）遠心分離法による間接的な封入率評価
参考例１で得られた２種類のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション及び比較例１で得られたＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションについて、それぞれ遠心分離（２０℃、２００００ｇ、１５分間）を行い、外水相のみを得た。次いで、マイクロプレートリーダーを用いて、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションに対するＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの相対蛍光強度を以下の式を用いて算出し、間接的な封入率を評価した。なお、以下の式において、「Ｆ０」は遠心分離後のＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションの外水相の蛍光強度を示し、「ＦＳ／Ｏ／Ｗ−１」は、遠心分離後のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの外水相の蛍光強度を示す。結果を図３Ａに示す。
封入率Ｅ０（％）＝（Ｆ０−ＦＳ／Ｏ／Ｗ−１）／Ｆ０×１００
【００５９】
（２）キャリア崩壊法による直接的な封入率評価
また、上記遠心分離後に外水相を取り除いて残存した固形分に、外水相と等重量のＰＢＳ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えた。このときのＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度は１０質量％とした。その後、ホモジナイザーを用いて２６０００ｒｐｍ、２分間高速攪拌して３７℃で静置した。２日後、このサンプルに対して、遠心分離（２０℃、２００００ｇ、１５分間）を行った。次いで、得られた溶液について、マイクロプレートリーダーを用いて、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションに対するＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの相対蛍光強度を以下の式を用いて算出し、直接的な封入率を評価した。「Ｆ０」は上記と同様であり、「ＦＳ／Ｏ／Ｗ−２」は、遠心分離後のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの固形分の蛍光強度を示す。
封入率Ｅ１（％）＝ＦＳ／Ｏ／Ｗ−２／Ｆ０×１００
【００６０】
図３Ａから、Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションにおけるＦＩＴＣ−ＯＶＡの封入率は、ＥＲ−２９０を用いた場合では５５％、ＥＰＣを用いた場合では３５％であった。また、上記（１）及び上記（２）の結果から、遠心分離法を用いた場合でも、キャリア崩壊法を用いた場合でも、得られる封入率は同程度であった（図示せず）。
【００６１】
（３）経時的な封入率の変化の評価
次いで、ＥＲ−２９０を用いたＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションについて、製造から２４時間後、３６時間後及び１６８時間（１週間）後に、上記（１）と同様の方法を用いて、遠心分離法による間接的な封入率を評価した。結果を図３Ｂに示す。
【００６２】
図３Ｂから、ゆるやかにＦＩＴＣ−ＯＶＡが放出されることが明らかとなった。また、製造から１週間後においても、封入率は４０％程度あり、ＦＩＴＣ−ＯＶＡがＳ／Ｏ／Ｗ型エマルション中に残っていた。
【００６３】
［試験例２］ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの粒子径及び毒性の評価
（１）ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの粒子径評価
参考例１で得られたＥＰＣを用いたＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションについて、動的光散乱測定装置（マルバーン社製）を用いて、粒子径を測定した。結果を図４Ａに示す。なお、図４Ａにおける平均粒子径は２９７ｎｍであった。
さらに、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを、市販の０．２μｍフィルター（ミリポア社製）でろ過した後に、再度同様の方法を用いて、粒子径を測定した。結果を図４Ｂに示す。なお、図４Ｂにおける平均粒子径は１７４ｎｍであった。
【００６４】
図４Ａ及び図４Ｂから、ナノサイズのＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションが得られていることが確かめられた。また、０．２μｍフィルターによるろ過を施すことで、従来のＯ／Ｗ型エマルションであるＭＦ５９と同程度の粒子径のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションが得られることが確かめられた。
【００６５】
（２）ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの毒性評価
参考例１で得られた２種類のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションをそれぞれＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。その結果、ＥＲ−２９０を用いたＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションでは、マウスの皮下注射した部分に炎症が見られたが、ＥＰＣを用いたＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションでは、マウスの皮下注射した部分に特段変化は見られなかった（図示せず）。
よって、ＥＰＣを用いたＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションは、毒性が低いことが確かめられた。
【００６６】
［実施例１］ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造
Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを投与した場合の抗原デリバリーと細胞の活性化との関係を調べるために、ＴＬＲ７／８を刺激することが知られているＴＬＲアジュバントであるＲ８４８を油相に封入したＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製した。Ｒ８４８はイミダゾキノリン骨格を持つ親油性の低分子化合物アジュバントである。具体的な製造方法は、以下に示すとおりである。
【００６７】
（１）ＥＰＣ−Ｓｐａｎ８５−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体の調製
参考例１の（１）と同様の方法を用いて、ＥＰＣ−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体を調製した。
【００６８】
（２）Ｓ／Ｏ型製剤の製造
次いで、（１）で得られたＥＰＣ−Ｓｐａｎ８５−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体に、スクワレン（Ｓｉｇｍａ社製）及びＲ８４８（Ｅｎｚｏ社製）を加えて、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ型製剤を得た。
【００６９】
（３）ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造
次いで、参考例１の（３）と同様の方法を用いて、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製した。得られたＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの組成及び各成分の含有量（質量％、ＰＢＳ中）は、以下の表２に示すとおりである。また、試験例２の（１）と同様の方法を用いて、粒子径を測定した結果、平均粒子径は３０９．９±６．７ｎｍであった。
【００７０】
【表２】
2019202957.tif 000004
【００７１】
［試験例３］抗原提示細胞の活性化及び抗原デリバリー評価
培養したマクロファージ細胞（ＲＡＷ細胞）に実施例１で得られたＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを投与して、ＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込みと細胞表面のＣＤ４０及びＣＤ８０の発現との関係をＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）で分析した。具体的な操作は以下に示すとおりである。
【００７２】
（１）マクロファージ細胞へのＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの投与
実施例１で得られたＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションをＰＢＳで１０倍に希釈した後、遠心分離（２０℃、２００００ｇ、１５分間）を行った。次いで、エマルション相を避けて、シリンジで７割の水相を吸い取り分取し、同量の培地を加えた。これをさらに５倍希釈してＲＡＷ細胞に投与した（以下、この群を「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション」群と称する場合がある）。なお、エマルションを遠心精製した後のＦＩＴＣ−ＯＶＡの封入率は３０％であり、その内７割の水層を除去したため、系には初期の４９％のＦＩＴＣ−ＯＶＡが存在していると推察された。
また、対照群として、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションと同様の濃度のＦＩＴＣ−ＯＶＡを含む培地（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ濃度：０．１ｍｇ／ｇ）を調製し、ＲＡＷ細胞に加えた（以下、この群を「Ｆｒｅｅ  ＯＶＡ」群と称する場合がある）。
また、対照群として、比較例１で得られたＯ／Ｗ型エマルションの水相をＦＩＴＣ−ＯＶＡを含む培地（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ濃度：０．１ｍｇ／ｇ）に置換し、油相にＲ８４８（Ｒ８４８濃度：１０μｇ／ｇ）を添加したものを調製し、ＲＡＷ細胞に加えた（以下、この群を「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８混合Ｏ／Ｗ型エマルション」群と称する場合がある）。
【００７３】
（２）ＦＡＣＳ分析
次いで、（１）における各群の培養開始から１日後に、細胞を回収し、ＦＡＣＳ分析を行った。分析装置としては、日本ＢＤ社製のＢＤ  ＦＡＣＳ（登録商標）フローサイトメトリーシステムを用いた。また、ＣＤ４０及びＣＤ８０の標識抗体として、ＰＥ−Ｃｙ７−抗ＣＤ４０抗体及びＡＰＣ−抗ＣＤ８０抗体（共に、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。全ＲＡＷ細胞中のＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込み割合（％）を図５Ａに、ＣＤ４０及びＣＤ８０陽性細胞中のＯＶＡの取り込み割合（％）を図５Ｂに示す。なお、図５Ａ及び図５Ｂにおいて、「Ｆｒｅｅ  ＯＶＡ」は「Ｆｒｅｅ  ＯＶＡ」群の結果であり、「Ｏ／Ｗ」は「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８混合Ｏ／Ｗ型エマルション」群の結果であり、「Ｓ／Ｏ／Ｗ」は「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション」群の結果である。
【００７４】
図５Ａから、「Ｆｒｅｅ  ＯＶＡ」群（８％）、「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８混合Ｏ／Ｗ型エマルション」群（２９％）、「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション」群（４５％）の順で、ＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込み割合が上昇することが明らかとなった。このことから、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションはＲＡＷ細胞への抗原デリバリー能力に優れることが確かめられた。
また、図５Ｂから、「Ｆｒｅｅ  ＯＶＡ」群（１７％）、「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８混合Ｏ／Ｗ型エマルション」群（２９％）、「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション」群（５３％）の順でＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込み割合が上昇しており、全ＲＡＷ細胞中のＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込み割合よりも、「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８混合Ｏ／Ｗ型エマルション」群と「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション」群との差がより顕著であった。すなわち、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションは、抗原とＴＬＲアジュバントとを同時に封入したキャリアであり、抗原を外水相に封入したＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８混合Ｏ／Ｗ型エマルション（既存のキャリアの類似物）と比較して、ＴＬＲアジュバントによって活性化された細胞における抗原のデリバリーが顕著に向上することが確認された。
【００７５】
図６は、ＲＡＷ細胞での抗原（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ）の取り込みと、ＣＤ４０及びＣＤ８０の発現の関係と、を示す概念図である。図６に示すように、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ４８４封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションは、ＴＬＲアジュバントのデリバリーキャリアとして機能し、抗原提示細胞を活性化することが示唆された。さらに、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ４８４封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションは、ＴＬＲアジュバントと同時に抗原を封入しているため、活性化した抗原提示細胞に効率よく抗原をデリバリーできるキャリアであることが示唆された。
【００７６】
［参考試験例１］動物実験による抗原特異的ＣＴＬの活性化
Ｃ５７ＢＬ/６マウス（日本クレアより購入）にＦｒｅｅ  ＯＶＡ、ＯＶＡ混合Ｏ/Ｗ型エマルション、又は、ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション（全てＲ８４８は含まない）の皮下投与を行い、脾臓の細胞の細胞表面染色及び細胞内サイトカイン染色による抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）の免疫活性化評価を行った。
【００７７】
（１）サンプルの調製
ＦＩＴＣ−ＯＶＡの代わりに、蛍光標識されていないＯＶＡを用いた以外は、参考例１及び比較例１と同様の方法を用いて、ＯＶＡ混合Ｏ/Ｗ型エマルション、及び、ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを作製した。次いで、試験例３の（１）と同様の方法を用いて、各サンプルを調製した。各サンプルの組成及び各成分の含有量（質量％、ＰＢＳ中）を以下の表３に示す。なお、表３において、「Ｏ／Ｗ」はＯＶＡ混合Ｏ/Ｗ型エマルションである。また、「Ｓ／Ｏ／Ｗ」はＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションである。
【００７８】
【表３】
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【００７９】
（２）マウスへの免疫及び細胞の培養
各サンプルに対して６匹ずつのマウス（計１８匹）に、２００μＬ／匹の投与量で投与した。剃毛後、背部に一週間おきに２回皮下投与した。最終免疫から７日後に、マウスの脾細胞を取り出した。次いで、２４穴プレートで各脾細胞を２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種して、培養した。ＯＶＡのＭＨＣクラスＩ分子のエピトープペプチド（配列番号１：ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（ＭＢＬ社製）を１μｇ／ｍＬとなるように添加し、１時間培養した。対照として、上記エピトープペプチドを添加しない群も準備して、同様に培養した。その後、タンパク質輸送阻害剤（Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ、ＢＤ社製）を添加し、さらに一晩培養を行った。
【００８０】
（３）細胞の染色及びフローサイトメトリーによる評価
得られた細胞をＡＰＣ−ＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で染色し、ホルマリン固定及び界面活性剤による膜透過処理を行った。その後、ＰＥ−ＩＦＮ−γ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で染色した。洗浄後フローサイトメトリーで評価した。結果を図７に示す。図７では、各サンプルで免疫したマウスから得られ、ＯＶＡのＭＨＣクラスＩ分子のエピトープペプチド存在下又は非存在下で培養したＣＤ８陽性Ｔ細胞中のＩＦＮ−γを発現した細胞（ＯＶＡ特異的ＣＴＬ）の割合を示している。なお、図７において、「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（−）」とはＯＶＡのＭＨＣクラスＩ分子のエピトープペプチド非存在下で培養した細胞であり、「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（＋）」とは、ＯＶＡのＭＨＣクラスＩ分子のエピトープペプチド存在下で培養した細胞である。
【００８１】
図７から、Ｆｒｅｅ  ＯＶＡ＜Ｏ／Ｗ型エマルション＜Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの順で、ＣＴＬの割合が上昇することが明らかとなった。これにより、従来の抗原が油中に封入されていないＯ／Ｗ型エマルションと比較して、抗原が油中に封入されているＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションのほうが、高い免疫誘導が可能であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本実施形態の免疫組成物によれば、抗原とアジュバントとを同時に免疫細胞へ送達でき、免疫賦活作用に優れる。
【符号の説明】
【００８３】
１…親水性抗原、２…第１の界面活性剤、１０…親水性抗原−第１の界面活性剤複合体、１１…油相、１２…疎水性アジュバント、１３…第２の界面活性剤、１４…第３の界面活性剤、２０…第２の界面活性剤によって被覆された油相、２１…水相、１００…免疫組成物。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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