(57)【要約】【課題】  太陽光、特に紫外線に皮膚が暴露されることにより真皮組織中にカルシウムが蓄積される（石灰化）ことを有効に抑制・改善することができる、紫外線被曝による皮膚老化に対する新規な抑制又は改善剤及び皮膚老化に対する抑制又は改善方法を提供する。【解決手段】  紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤は、紫外線被曝による真皮中の石灰化を抑制又は改善する抑制又は改善剤であって、ビタミンＫ類、ビスホスホネート、オカダ酸、アセタゾラミド、フロセミド、フェニルアラニン、ロイシン、ホモアルギニン、レバミゾール、ミード酸及びオリゴガラクツロン酸から成る群より選ばれる少なくとも１種の成分と海洋深層水とを有効成分として含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
紫外線被曝による真皮中の石灰化を抑制又は改善する剤であって、ビタミンＫ類、ビスホスホネート、オカダ酸、アセタゾラミド、フロセミド、フェニルアラニン、ロイシン、ホモアルギニン、レバミゾール、ミード酸及びオリゴガラクツロン酸から成る群より選ばれる少なくとも１種の成分と海洋深層水とを有効成分として含有することを特徴とする、紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤。
【請求項２】
請求項１記載の紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤において、有効成分をビタミンＫ類、ビスホスホネート及びホモアルギニンから成る群より選ばれる少なくとも１種の成分と海洋深層水することを特徴とする、紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤。
【請求項３】
紫外線被曝による真皮中の石灰化を抑制又は改善するにあたり、請求項１又は２記載の皮膚老化抑制又は改善剤を、石灰化した真皮組織及びそこに存在する皮膚線維芽細胞と接触させて、皮膚線維芽細胞中の石灰化を減少させることを特徴とする、紫外線被曝による皮膚老化抑制又は改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線被曝による皮膚老化に対する新規な抑制又は改善剤及び皮膚老化に対する抑制又は改善方法に関し、特に、皮膚が紫外線に暴露されることにより、皮膚の線維芽細胞（ＮＨＤＦ）中に蓄積する石灰化を減少させる、皮膚老化に対する新規な抑制又は改善剤及び皮膚老化に対する抑制又は改善方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの骨格形成における石灰化以外にも、他の生態組織にも石灰化が生じる場合があり、これを異所性石灰化と称しており、例えば、血管中膜における石灰化現象が知られている。
また、血管の石灰化には、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、リン輸送体（Ｐｉｔ−１）、炎症性酵素ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、オステオカルシン（ＯＣＮ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）などが関連していることが知られている。
【０００３】
一方、紫外線が皮膚の老化において大きな影響を及ぼすことも知られており、特に長波長の紫外線により、ＮＨＤＦ中に石灰化が生じることが知られており（非特許文献１）、かかる皮膚の石灰化は、皮膚の物理的特性を変化させ、老化を招くものである。
【０００４】
皮膚の老化を防止する抗老化剤として、ＮＨＤＦの増殖促進作用を有し、皮膚の老化現象の予防又は改善に有用であるとして、特開２０１５−０１７０８１号公報（特許文献１）には、コエンザイムＱ１０とザクロ加工物とを含有する老化抑制剤が開示されている。
【０００５】
また、特表２０１６−５２３９８２号公報（特許文献２）には、皮膚老化防止化合物として、ａ）ｉ）約０．５％を超える、好ましくは約１．２％を超える、更により好ましくは約１．５％を超える中和された酸の塩形態であって、前記酸は、サリチル酸、グリコール酸及びこれらの組み合わせからなる群から好ましく選択され、更により好ましくは中和されたサリチル酸の塩形態である、中和された酸の塩形態と、ｉｉ）約２重量％〜約０．００１重量％、好ましくは約１．５重量％〜約０．１重量％、更により好ましくは約１．０重量％〜約０．５重量％のガムと、を含む水相と、ｂ）油相と、を含む水中油型エマルションであって、前記水中油型エマルションが実質的に、１４日間、温度約５０℃への曝露によって、化学状態及び物理的均一性が変化しない、水中油型エマルションが開示されている。
【０００６】
更に、特開平９−１３６８２４号公報（特許文献３）には、皮膚の老化を防止する抗老化皮膚剤、主に真皮におけるコラーゲン架橋阻害皮膚外用剤として、シソ科ラウァンドゥラ属により抽出された抽出物を有効成分として含み、更に紫外線防御剤を含む抗老化皮膚外用剤が開示されている。
【０００７】
しかし、従来の皮膚外用剤は、皮膚の真皮中のＮＨＤＦ内に蓄積された、紫外線による石灰化を抑制、低減するものではなく、皮膚の老化を真皮中のＮＨＤＦ内のカルシウム蓄積を抑制・低減させて皮膚の老化を抑制・改善するものではなく、皮膚の老化を十分に抑制・改善させることは、困難であった。
【０００８】
そこで、紫外線に皮膚が暴露されて、真皮中に蓄積されたカルシウム蓄積（石灰化）を抑制・改善することにより、皮膚の老化を防止・改善することができる、皮膚老化に対する抑制又は改善剤が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１５−０１７０８１号公報
【特許文献２】特表２０１６−５２３９８２号公報
【特許文献３】特開平９−１３６８２４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】「ＵＶＡ照射による誘導される正常ヒト線維芽細胞の石灰化に対する海洋深層水の抑制効果」、Ｄｅｅｐ  Ｏｃｅａｎ  Ｗａｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８（１），１−７，２０１７（海洋深層水利用学会、２０１７年１０月３０日）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、太陽光、特に紫外線に皮膚が暴露されることにより真皮組織及びそこに存在するＮＨＤＦ中にカルシウムが蓄積されること（石灰化）を有効に抑制・改善することができる、紫外線被曝による皮膚老化に対する新規な抑制又は改善剤及び皮膚老化に対する抑制又は改善方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、皮膚が紫外線に暴露されることで真皮組織及びそこに存在するＮＨＤＦ中に蓄積されたカルシウム（石灰）を、海洋深層水と特定の成分とを組み合わせて適用することにより、真皮組織及びそこに存在するＮＨＤＦ中にカルシウムが蓄積されること（石灰化）を抑制又は改善することを見出したものである。
【００１３】
請求項１記載の紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤は、真皮中の石灰化を抑制又は改善する剤であって、ビタミンＫ類、ビスホスホネート、オカダ酸、アセタゾラミド、フロセミド、フェニルアラニン、ロイシン、ホモアルギニン、レバミゾール、ミード酸及びオリゴガラクツロン酸から成る群より選ばれる少なくとも１種の成分と海洋深層水とを有効成分として含有することを特徴とする、紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤である。
請求項２記載の紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤は、請求項１記載の紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤において、有効成分をビタミンＫ類、ビスホスホネート及びホモアルギニンから成る群より選ばれる少なくとも１種の成分と海洋深層水とすることを特徴とする、紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤である。
【００１４】
請求項３記載の紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善方法は、紫外線被曝による真皮中の石灰化を抑制又は改善するにあたり、請求項１又は２記載の皮膚老化に対する抑制又は改善剤を、石灰化した真皮組織と接触させて、真皮組織中の石灰化を減少させることを特徴とする、紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤は、太陽光、特に紫外線に皮膚が暴露されることにより真皮組織、特に存在するＮＨＤＦ中にカルシウムが蓄積されること（石灰化）を有効に抑制・改善することができるため、皮膚の硬化、皮膚の弾力性低下を防止することができ、皮膚の老化を抑制・改善することができる。
【００１６】
また、本発明の紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善方法は、前記本発明の皮膚老化に対する抑制又は改善剤を石灰化した真皮組織と接触させることにより、ＮＨＤＦ中の石灰化を有効に抑制又は減少させることが可能である。
【００１７】
従って、海洋深層水と、特定の成分を有効成分としていることにより、皮膚に直接塗布する化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、パック、ファンデーションやボディーローション等の化粧料に適用することが可能であり、更にはヒトに対して毒性を有していない成分を用いることで健康食品等に適用することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】紫外線の照射量と培養ＮＨＤＦの石灰化との関係を示す図である。
【図２】紫外線照射による培養ＮＨＤＦの石灰化による蓄積の状況を示す写真図である。
【図３】培養ＮＨＤＦへの海洋深層水と表層海水の添加量［濃度］と、石灰化抑制程度の関係を示す図である。
【図４】紫外線照射とＰｉＴ−１遺伝子の発現量との関係を示す図である。
【図５】紫外線照射とＰＬＡ２遺伝子の発現量との関係を示す図である。
【図６】紫外線照射とＯＣＮ遺伝子の発現量の関係を示す図である。
【図７】紫外線照射とＯＰＮ遺伝子の発現量の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明を以下の実施形態に基づき詳細に説明する。
本発明の紫外線被曝による皮膚老化を抑制又は改善する抑制又は改善剤は、真皮中の石灰化を抑制又は改善する剤であって、ビタミンＫ類、ビスホスホネート、オカダ酸、アセタゾラミド、フロセミド、フェニルアラニン、ロイシン、ホモアルギニン、レバミゾール、ミード酸及びオリゴガラクツロン酸から成る群より選ばれる少なくとも１種の成分と海洋深層水とを有効成分として含有する、紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤である。
好適には、有効成分としては、ビタミンＫ類、ビスホスホネート及びホモアルギニンから成る群より選ばれる少なくとも１種の成分と海洋深層水とを組み合わせることが望ましい。
【００２０】
本発明の紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤には、有効成分として海洋深層水が含まれる。
海洋深層水は、２００ｍ以深の海水であり、有光層（真光層）以深に位置し、光合成による有機物生産がほとんど行われず分解が卓越している。その資源性は現在知られているだけでも、低温・清浄等があり、この他、ミネラル類・塩類なども着目されている。
海洋深層水を採水するための取水地としては、静岡県伊東市（伊豆赤沢）を始め、現在９都道県で、１５の取水施設が有り（海洋深層水利用学会ＨＰ調べ、２０１７年２月現在）、これらの取水地から採水される海洋深層水のいずれも本発明の適用の対象とすることができ、また前記取水地以外で採水した海洋深層水を用いることも可能である。
特に好ましくは、伊豆赤沢海洋深層水であり、かかる海洋深層水は、伊豆赤沢沖の水深約８００ｍから汲み上げられるもので、表層水に比べて、微生物の存在比が数千分の一程度のものである。また、伊豆赤沢海洋深層水は、伊豆半島付近の海洋表層で北東方向に向けて流れている黒潮や、伊豆半島南東沖海底の高い海底火山群からなる伊豆・小笠原弧が形成されていることから、伊豆赤沢沖は、首都圏・大都市圏に最も近いにもかかわらず、汚染されていない清浄な海洋深層水を取水することができる場所であり、本発明において、有効に適用することができるものである。
【００２１】
本発明における「海洋深層水」には、前記２００ｍ以深の海水自体、さらには、海洋深層水を電気透析処理した水（ＥＤ塩水、ＥＤミネラル水）や逆浸透膜濾過（ＲＯ膜）処理した水、イオン交換膜処理した水や、海洋深層水に含まれるミネラル分に相当するミネラルを含む液体であれば任意の処理水も、本発明における「海洋深層水」の概念に含まれて好適に用いることができる。
本発明において好適に用いられる海洋深層水としては、採水した海洋深層水に含まれるイオンを特定の比率にイオン選択処理した海洋深層水が特に好適であり、これは例えば、塩分等の皮膚への刺激を考慮することが望ましいからである。海洋深層水原水中に含まれるイオンを特定の比率に処理する方法としては、特に限定されず、例えば、公知の逆浸透膜ろ過法、電気透析法やイオン交換膜法等を用いてイオン選択処理することができる。また、海洋深層水原水をイオン選択処理する公知の方法であれば他の任意の方法も適用することができる。
例えば、イオン選択処理する方法としては、電気透析装置「アストム株式会社製、アシライザー２５型  １００対×３段連続式（海水脱塩仕様）」を用いて、電気透析法（イオン交換膜法）によりイオン交換膜と直流電流の作用で、海洋深層水原水中にあるイオン性物質の脱塩・濃縮を行なって、脱塩処理をする方法等を用いることもできる。更に、特開２０００−１５９６５５号公報に開示されているように、海洋深層水を逆浸透膜装置（東洋紡株式会社製、ＨＲ５１５５）で脱塩処理した後、電気透析装置（旭ガラス株式会社製、セレミオンＣＭＶ、セレミオンＡＳＶ）によって脱塩処理する方法を適用してもよく、また、特開２０１０−２７４２１４号公報に記載されているような逆浸透膜法で脱塩処理する方法を適用してもよい。イオン選択処理としては、海洋深層水を、例えば、含有されるカリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、塩素イオンの比率が、Ｋ：Ｎａ：Ｃａ：Ｍｇ：Ｃｌ＝１：３０〜７０：１０〜４０：４０〜１５０：２００〜５００程度となるようにイオン選択処理することが望ましい。具体的には、例えば海洋深層水１００ｇ中、Ｋが０〜０．１ｇ程度、Ｎａが０．０１〜０．５０ｇ程度、Ｃａが０．０１〜０．０４ｇ程度、Ｍｇが０．０５〜０．５ｇ程度、Ｃｌが０．１〜１．０ｇ程度となるように処理された海洋深層水とすることが特に望ましい。
【００２２】
また、本発明の紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善剤は、前記海洋深層水に加えて、ビタミンＫ類、ビスホスホネート、オカダ酸、アセタゾラミド、フロセミド、フェニルアラニン、ロイシン、ホモアルギニン、レバミゾール、ミード酸及びオリゴガラクツロン酸から成る群より選ばれる少なくとも１種の成分を有効成分として含むものである。
【００２３】
ビタミンＫは、脂溶性ビタミンの１種であり、ビタミンＫ依存性タンパク質の活性化に必須の成分であり、動物体内での血液の凝固や組織の石灰化に関連しており、ビタミンＫが欠乏すると出血傾向となることが知られている。
ビタミンＫは、化学構造上は、２−メチル−１，４−ナフトキノンの３誘導体で、天然にはＫ１とＫ２（メナキノン）が含まれ、メナキノン（ＭＫ）には、イソプレノイド側鎖の長さや修飾が異なる多数の化合物が含まれるが、これらの全てのビタミンＫ類を用いることが可能である。
【００２４】
また、ビスホスホネートとしては、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、バミドロネート、ネリドロネート、オルバドロネート、アレンドロネート、チルドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ミノドロネート、ゾレドロネート等を例示することができ、塩としてはナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等を例示することができ、好適にはエチドロン酸・二ナトリウムが用いられ、これらの１種又は２種以上を組みあわせて用いることができる。
【００２５】
オカダ酸は、有毒渦鞭毛藻による産生される毒素であるが、本発明において有効に用いることができる。
またミード酸は、ω−９脂肪酸の一つであり、本発明において有効に用いることができる。
またオリゴガラクツロン酸は、ガラクトースが酸化されたウロン酸のオリゴマーであり、本発明において有効に用いることができる。
【００２６】
上記ビタミンＫ類、ビスホスホネート、オカダ酸、ミード酸、オリゴガラクツロン酸以外に、海洋深層水と組み合わせて用いることができる有効成分としては、アセタゾラミド、フロセミド等のいわゆる利尿成分や、フェニルアラニン、ロイシン、ホモアルギン等の特異なアミノ酸、及びレバミゾール及びオリゴガラクツロン酸等を例示することができる。
レバミゾールは、線虫駆虫剤の１種であり、アルカリホスファターゼ活性に対する抑制剤として知られているものである。
【００２７】
また、海洋深層水と、これらのビタミンＫ類、ビスホスホネート、オカダ酸、アセタゾラミド、フロセミド、フェニルアラニン、ロイシン、ホモアルギニン、レバミゾール、ミード酸及びオリゴガラクツロン酸から成る群より選ばれる少なくとも１種の成分との組み合わせの割合は、質量比で、海洋深層水：前記成分＝１：１×１０−９〜２０、好ましくは１：１×１０−８〜１×１０、さらに好ましくは１：１×１０−７〜５であることが、上記本件発明の効果を有効に発現させるために望ましい。
【００２８】
上記のように、海洋深層水と、ビタミンＫ類、ビスホスホネート、オカダ酸、アセタゾラミド、フロセミド、フェニルアラニン、ロイシン、ホモアルギニン、レバミゾール、ミード酸及びオリゴガラクツロン酸から成る群より選ばれる少なくとも１種の成分とを有効成分として組み合わせて含むことにより、太陽光、特に紫外線に皮膚が暴露されることにより真皮組織、特に存在するＮＨＤＦ中に蓄積されたカルシウム（石灰化）を有効に抑制・改善することができる。従って、皮膚の硬化、皮膚の弾力性低下を防止することができ、しわやたるみができること及び皮膚のゴワゴワ、ガサガサ感を防止することが可能となる。
【００２９】
また、上記本発明の効果を阻害しない限り他の成分を含んでもよく、かかる他の成分としては、公知の紫外線吸収剤や紫外線遮断剤、美白剤、消炎剤、動植物油、ロウ類、多価アルコール、フッ素系の油、高級アルコール、高級脂肪酸、他のノニオン界面活性剤やアニオン界面活性剤や両性界面活性剤等の界面活性剤、酸化防止剤、香料、防腐剤、ｐＨ調製剤等を配合することができる。
【００３０】
本発明の紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善方法は、紫外線被曝による真皮中の石灰化を抑制又は改善するにあたり、ビタミンＫ類、ビスホスホネート、オカダ酸、アセタゾラミド、フロセミド、フェニルアラニン、ロイシン、ホモアルギニン、レバミゾール、ミード酸及びオリゴガラクツロン酸から成る群より選ばれる少なくとも１種の組成物と海洋深層水とを有効成分として含む、本発明の皮膚老化に対する抑制又は改善剤を、石灰化した真皮組織、特に存在するＮＨＤＦと接触させて、ＮＨＤＦ中の石灰化を減少させる、紫外線被曝による皮膚老化に対する抑制又は改善方法である。
【００３１】
本発明の皮膚老化に対する抑制又は改善剤を、石灰化した真皮組織、そこに存在するＮＨＤＦと接触させる方法としては、特に限定されず、例えば、本発明の皮膚老化に対する抑制又は改善剤を直接当該皮膚に塗布したり、希釈して適用すること等によって実施できる。
【００３２】
例えば、本発明の皮膚老化に対する抑制又は改善剤は、皮膚に直接塗布する化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、パック、ファンデーションやボディーローション等の化粧料の形態として適用することが可能である。
更にはヒトに対して毒性を有していない成分を用いることで健康食品等に適用することも期待される。
【実施例】
【００３３】
以下に好適例をあげて説明するが、これらに限定されるものではない。
（試薬・機器等）
・ＮａＣｌ（特級、和光純薬）
・ＫＣｌ（特級、関東化学）
・ＣａＣｌ２（特級、和光純薬）
・ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（特級、国産化学）
・メタノール（特級、和光純薬）
・ＰＢＳ（−）（Ｃａ，Ｍｇを含有しない等張リン酸緩衝液、細胞培養用、日水製薬）
・イーグルＭＥＭ（細胞培養用、日水製薬）
・Ｌ（＋）グルタミン（特級、和光純薬）
・炭酸水素ナトリウム（特級、和光純薬）
・３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（生化学用、同仁化学）
・トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ  （０．２５％）、ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ、Ｇｉｂｃｏ）
・牛胎仔血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，以後ＦＢＳ）
・海洋深層水（ＤＳＷ：伊豆赤沢、北緯３４°５０’１９”、東経１３９°０８’１１”、深度８００ｍ、取水後４℃で保存）
・表層海水（ＳＳＷ：伊豆赤沢、深度０ｍ、取水後４℃で保存）
・石灰化染色キット（コスモ・バイオ株式会社製、Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  ｎｏｄｕｌｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ，Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＡＫ２１）
・ヘキサデシルピリジニウムクロリド−水和物（特級、和光純薬）
・Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）
・ＵＶＡランプ（ＦＬ１５ＢＬＢ、東芝）
・マイクロプレートリーダー（ＭＯＤＥＬ  ５５０、ＢＩＯ−ＲＡＤ）
・ビタミンＫ２（Ｖｉｔ−Ｋ２、製品名：Ｋ２オイルＭ−１５００、製造会社：（株）Ｊ−オイルミルズ）
・エチドロン酸・２ナトリウム（ＥＴＡ．２Ｎａ、製品名：エチドロン酸二ナトリウム水和物、製造会社：東京化成工業（株）
・ホモアルギニン（製品名：Ｌ−ホモアルギニン塩酸塩、製造会社：東京化成工業（株）
【００３４】
（１）培養ＮＨＤＦと培養
地上に達する紫外線Ａ波（長波長）とＢ波（短波長）のうち、真皮にまで透過するＡ波（ＵＶＡ）を、培養ＮＨＤＦに照射するにあたり、培養ＮＨＤＦを以下のようにして準備した。
ヒト皮膚由来培養繊維芽細胞ＮＨＤＦ（ＲＧＢ  ＲＣＢ０２２２、理化学研究所バイオリソースセンター）を１枚の培養シャーレ（φ９０、日本ジェネティック）に播種し、コンフルエント状態まで培養後、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて培養ＮＨＤＦを剥離させて新しい培養シャーレ２枚に継代し、９６穴マイクロプレート（培養細胞用、イワキ）に播種して石灰化試験に供した。
なお、培養ＮＨＤＦの培養は全て３７℃、５％ＣＯ２の条件で行い、培養ＮＨＤＦの増殖及び前培養には１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有イーグルＭＥＭ培地を用いて実施した。
【００３５】
（２）ＵＶＡ照射による培養ＮＨＤＦの石灰化
培養ＮＨＤＦを１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有イーグルＭＥＭに懸濁し、９６穴マイクロプレート（培養細胞用、イワキ）に２×１０４個／２００μＬ／穴になるように播種して２日間前培養した。
前培養後、培地を除去して５０μＬ／穴のＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、新しいＰＢＳ（−）５０μＬ／穴にすべて置換した。
これにＵＶＡランプを並列に設置したスタンドから照射エネルギーが０．５ｍＷ／ｃｍ２（ＵＶ  ＭＥＴＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ＵＶ−３４０、カスタム）となるように光源から培養ＮＨＤＦへの距離を調整して０．４から１．２Ｊ／ｃｍ２の範囲で、０．２Ｊ／ｃｍ２ずつＵＶＡ量を変化させて照射した。
【００３６】
照射後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有イーグルＭＥＭを１００μＬ／穴、２０ｍＭＣａＣｌ２水溶液を２０μＬ／穴、２０ｍＭＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ水溶液を１０μＬ／穴、ＰＢＳ（−）を２５μＬ／穴ずつ各々添加し、これに全量２００μＬ／穴となるように精製水を添加して２４時間培養した。
【００３７】
培養後、上記石灰化染色キットを用いて、培養ＮＨＤＦの石灰化度を測定した。
すなわちＵＶＡ照射後２４時間培養した培養ＮＨＤＦから培地を除去して、新たに５０μＬ／穴のＰＢＳ（−）を加えて培養ＮＨＤＦを２回洗浄した後、５０μＬ／穴の冷メタノールを添加し、氷冷下、３０分間静置して培養ＮＨＤＦを固定した。
【００３８】
固定後メタノールを除去して、５０μＬ／穴の精製水で２回、培養ＮＨＤＦを洗浄した後風乾した。
風乾後、石灰化染色キットを用いて、調製した染色液を５０μＬ／穴ずつ添加し、室温条件下で３０分間静置して染色した。
染色後、染色液を除去してキットに付属している洗浄液を調製後、５０μＬ／穴ずつ添加して非特異的に染色された色素を洗浄して除去した。
【００３９】
これらの操作でＣａ沈着部が特異的に染色された９６穴プレートを室温で十分乾燥させた後、１０％（ｖ／ｖ）塩化セチルピリジニウム溶液を１００μＬ／穴ずつ添加し、３７℃で１時間色素を抽出した後、５７０ｎｍにおける吸光度（以後、ＯＤ５７０）を測定して石灰化度とした。
前記操作で測定したＵＶＡ未照射における培養ＮＨＤＦの石灰化度を１．０として、ＵＶＡ照射により誘導された石灰化度を相対値で示した（ｎ＝６）。
その結果を図１に示す。
【００４０】
（３）ＵＶＡ照射による石灰化
ＵＶＡ未照射条件においては培養ＮＨＤＦはほとんど石灰化しなかったが、図１より、０．４〜０．８Ｊ／ｃｍ２の照射量の範囲において照射量依存的に石灰化度の上昇が認められた。
【００４１】
また、未照射および０．８Ｊ／ｃｍ２照射後の培養ＮＨＤＦ内のカルシウムの蓄積状態の顕微鏡写真図をそれぞれ図２（１）及び図２（２）として図２に示す。
なお、図２の顕微鏡写真図は、以下の機器を用いて撮影した写真図である。
・正立顕微鏡（ＢＸ−５１、オリンパス）
・落射蛍光投光管（ＢＸ−ＲＦＡ、オリンパス）
・顕微鏡デジタルカメラ（ＤＰ７１、オリンパス）
【００４２】
（４）石灰化培養ＮＨＤＦへの海洋深層水（ＤＳＷ）の適用
上記（ＵＶＡ照射による培養ＮＨＤＦの石灰化）において、予め０．８Ｊ／ｃｍ２照射して石灰化を誘導した培養ＮＨＤＦにＤＳＷの終濃度が０〜２．５％（ｖ／ｖ）となるように添加し（ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃））、２４時間培養後に発現する培養ＮＨＤＦの石灰化度に及ぼす影響を試験した。
なお、ＤＳＷの比較対照には、ＤＳＷのかわりにＳＳＷを添加した点以外は同様の培養・処理を行った培養ＮＨＤＦを用いた（ｎ＝５）。
その結果を図３に示す。
【００４３】
図３より、ＵＶＡ照射後の石灰化を誘導した培養ＮＨＤＦにＤＳＷを添加すると、ＳＳＷもＤＳＷも添加濃度依存的に培養ＮＨＤＦの石灰化が抑制されるが、ＤＳＷはＳＳＷよりも高い石灰化抑制効果を示した。しかし、ＤＳＷによっても十分に皮膚の石灰化を抑制・改善できるものではないことがわかる。
【００４４】
（５）ＵＶＡ照射とＡＬＰ活性、ＯＣＮ遺伝子、ＯＰＮ遺伝子、ＰｉＴ−１遺伝子、ＰＬＡ２遺伝子の関係
ＡＬＰ活性、ＯＣＮ遺伝子、ＯＰＮ遺伝子、ＰｉＴ−１遺伝子、ＰＬＡ２遺伝子等の動向と、紫外線照射により皮膚中に蓄積された石灰化との関係について、以下の試験を実施し、評価をおこなった。
紫外線による石灰化誘導におけるリン酸カルシウム形成に関係する酵素ＡＬＰ活性指数とＵＶＡ照射後の培養時間との関係を調べた。その結果、培養ＮＨＤＦに対するＵＶＡ照射２時間後には組織石灰化に関連するＡＬＰ活性の上昇が観察され（未照射の状態のＡＬＰ活性に対する相対値は約３．２）、照射４時間から６時間後程度までさらに高い活性指数（同様に約５．５）を保持した。
また、図４〜７は、紫外線による石灰化誘導における各骨形成関連遺伝子の発現量の変化を示す図である。
【００４５】
具体的な試験方法の概要について以下に説明する。
上記（培養ＮＨＤＦと培養）で準備した培養ＮＨＤＦを、細胞培養ディッシュ（φ３０、日本ジェネティック）に、６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈとなるように播種して２日間前培養した。
前培養後、培地を除去して１ｍＬ／ｄｉｓｈのＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、新しいＰＢＳ（−）１ｍＬ／ｄｉｓｈに全て置換した。
上記（ＵＶＡ照射による培養ＮＨＤＦの石灰化）に従って、照射量が０．５Ｊ／ｃｍ２となるようにＵＶＡを照射した。
照射後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有イーグルＭＥＭを１ｍＬ／ｄｉｓｈ、２０ｍＭＣａＣｌ２水溶液を２００μＬ／ｄｉｓｈ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ水溶液を１００μＬ／ｄｉｓｈ、ＰＢＳ（−）を２５０μＬ／ｄｉｓｈずつ各々添加し、これに全量２ｍＬ／ｄｉｓｈとなるように精製水を添加して評価培養を行い、培養０．５時間後の培養ＮＨＤＦをＰＬＡ２遺伝子発現解析に、培養２４時間後の培養ＮＨＤＦをＯＰＮ、ＯＣＮおよびＰｉＴ−１発現解析に供した。
【００４６】
培養ＮＨＤＦのシャーレから培地成分を取り除き、マイクロピペットでリシスバッファー１．０ｍＬを添加し、数回ピペッティングして培養ＮＨＤＦを溶解した。
培養ＮＨＤＦ溶解液全量を１．５ｍＬチューブに移し、クロロホルム０．２ｍＬを添加して１０秒間ボルテックスミキサーにより攪拌した。１２，０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心後、上層（水相）５００μＬを回収し、新しい１．５ｍＬチューブに移した。等量（５００μＬ）の２−プロパノールを加えて転倒混和した後、１０分間、４℃で静置した。１２，０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心後、上清を捨て、ゲル状のＲＮＡ沈殿物をＮｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒで２００μＬに溶解した。
２０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と２００μＬの２−プロパノールを加えて混和した後、１０分間、４℃で静置した。
１２，０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心後、ＲＮＡの沈殿物に２５０μＬの７５％エタノールを添加し、持ち込みのグアニジン塩の洗浄を行った。
上清を完全に取り除いた後風乾して、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒを５０μＬ加えてＲＮＡの沈殿物を完全に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
【００４７】
ＲＮＡ溶液の濃度と純度を測定するために、ＴＥバッファーにて希釈したＲＮＡ溶液を分光光度計（Ｕ−２８００、ＨＩＴＡＣＨＩ）により波長２６０ｎｍ（Ａ２６０）および２８０ｎｍ（Ａ２８０）における吸光度を測定した。
ＲＮＡの濃度（μｇ／ｍＬ）はＡ２６０×４０で算出し、純度はＡ２６０／Ａ２８０で求め、Ａ２６０／Ａ２８０≧１．８によりタンパク質混入が少なく純度の高いＲＮＡ溶液であることを確認した。
【００４８】
ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔ（東洋紡績）を使用し、本キットの手順書に従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ溶液を調製した。
具体的には、１反応あたり５×ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．０μＬ、ＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ０．５μＬおよびＰｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ  ０．５μＬを必要量調製して０．２ｍＬチューブに３．０μＬずつ分注した後、ＲＮＡ溶液を１反応あたり１μｇかつＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒと合わせて７．０μＬとなるように各０．２ｍＬチューブに分注した。
０．２ｍＬチューブをサーマルサイクラー（ＭｙＣｙｃｌｅｒ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）にセットし、３７℃で１５分間、９８℃で５分間の後、４℃まで冷却し、ｃＤＮＡ溶液を調製した。
【００４９】
ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（東洋紡績）を使用し、当該キットの手順書に従って定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を行い、各遺伝子のｃＤＮＡ定量を行った。
具体的には、１反応あたりＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ  ５．０μＬ、Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．３μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．３μＬ、５０×ＲＯＸ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｙｅ  ０．２μＬおよび滅菌水２．２μＬを必要量調製した後に０．１ｍＬチューブに８．０μＬずつ分注し、１０倍希釈したｃＤＮＡ溶液を２．０μＬずつ添加した。
ＰＣＲ条件は、リアルタイムＰＣＲ装置（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９５℃で１分間加温の後、９５℃で３０秒間と６０℃で３０秒間のサイクルを４０サイクル行った。さらに、ＰＣＲ後に融解曲線解析を実施し、非特異的増幅がないことを確認した。
【００５０】
なお、解析した遺伝子および連鎖反応に用いたプライマーの塩基配列は、以下の通りである。
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）；
５’−ＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＡＣＴＴ−３’
３’−ＧＧＴＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＴＡＧＧＣＡＡＣ−５’
ＯＣＮ；
５’−ＧＧＣＡＧＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＡＧＡＧ−３’
３’−ＧＧＴＣＡＡＧＡＣＧＡＧＧＡＧＡＧＧＴＣ−５’
ＯＰＮ；
５’−ＡＣＡＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＴＴＡ−３’
３’−ＧＴＡＡＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＣ−５’
ＰｉＴ−１；
５’−ＧＣＣＡＡＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣ−３’
３’−ＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＣＧＡＣＡＣＡＣＣ−５’
ＰＬＡ２；
５’−ＡＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＴＧＴＴＧＧ−３’
３’−ＴＣＡＡＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＣＧ−５’
定量解析は、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）値を用い、ＧＡＰＤＨのＣｔ値を内部標準として相対的に評価した。
【００５１】
図４はＰｉＴ−１遺伝子、図５はＰＬＡ２遺伝子、図６はＯＣＮ遺伝子、図７はＯＰＮ遺伝子の発現量の結果を示す。
図４、図６、図７においては、未照射の各遺伝子発現量を１として照射２４時間後の発現量を相対的に表した。図５においては、未照射のＰＬＡ２遺伝子発現量を１として照射０．５時間後の発現量を相対的に表した。
【００５２】
図４〜図７の結果より、紫外線照射した後の皮膚中の石灰化誘導遺伝子であり、石灰化の初期段階で活動するリン酸輸送体遺伝子ＰｉＴ−１遺伝子の発現量とＰＬＡ２遺伝子は、ＵＶＡ照射によりともに、培養ＮＨＤＦ内で約３倍以上に増加していることがわかる。
更に、骨形成の終盤の段階で発現量が増加するＯＣＮ遺伝子の発現量も、未照射の場合に比べて、培養ＮＨＤＦ内で約１．６倍に増加しており、ＯＰＮ遺伝子も増加していることがわかる。
【００５３】
これは、培養ＮＨＤＦのＵＶＡ照射によるカルシウム蓄積により、ＡＬＰ活性の上昇に伴うモノリン酸の細胞内生成が促進されたことに加えて、ＰＬＡ２による炎症反応の発動による細胞質へのカルシウム動員が連鎖的に生じることでリン酸カルシウムが培養ＮＨＤＦ内に蓄積されたものと推測される。従って、これらの培養ＮＨＤＦ中のＰｉＴ−１遺伝子、ＰＬＡ２遺伝子、ＯＣＮ遺伝子、ＯＰＮ遺伝子等の発現量を測定することで、培養ＮＨＤＦ中の石灰化を評価することが可能である。
【００５４】
（６）本発明の皮膚老化を抑制又は改善する抑制又は改善剤の適用
本発明の皮膚老化を抑制又は改善する抑制又は改善剤を、上記紫外線照射（１．２Ｊ／ｃｍ２）して石灰化した上記培養ＮＨＤＦと、ビタミンＫ類、ビスホスホネート、オカダ酸、アセタゾラミド、フロセミド、フェニルアラニン、ロイシン、ホモアルギニン、レバミゾール、ミード酸及びオリゴガラクツロン酸から成る群より選ばれる少なくとも１種の成分とＥＤミネラル水とを種々の割合で配合した液状物とを接触させた。
具体的には、代表例として、ビタミンＫ類（ビタミンＫ２）、ビスホスホネート（エチドロン酸二ナトリウム）及びホモアルギニンから成る群より選ばれる少なくとも１種の成分とＥＤミネラル水とを配合した液状物を用いた。
その結果、本発明の皮膚老化に対する抑制又は改善剤及び皮膚の老化を抑制又は改善する方法によれば、紫外線照射により石灰化した培養ＮＨＤＦ中の石灰化度合いを著しく低減することができることがわかった。
【００５５】
海洋深層水として、伊豆赤沢沖の水深８００ｍ程度からくみ上げられた海洋深層水（伊豆赤沢産）を、以下の方法でイオン選択処理した海洋深層水の電気透析水（海洋深層水（ＥＤミネラル水））を用いた（電気伝導度は１２．５ｍＳ／ｃｍ）。
具体的には、電気透析装置「アストム株式会社製、アシライザー２５型  １００対×３段連続式（海水脱塩仕様）」を用いて、伊豆赤沢産の海洋深層水を電気透析法（イオン交換膜法）によりイオン交換膜を用いて直流電流を負荷することにより、海洋深層水原水中にあるイオン性物質の脱塩・濃縮を行なって、脱塩処理をして、イオン処理した海洋深層水（ＥＤミネラル水）を得た。
かかる海洋深層水（ＥＤミネラル水）は、下記表２に示す成分組成を有する。
海洋深層水中のＫ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇのイオン含有量はマルチタイプＩＣＰ発光分光分析装置（株式会社島津製作所製）を用いて測定し、Ｃｌ含有量は高速液体クロマトグラフ（株式会社島津製作所製）を用いて測定した。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
具体的には以下のように実施した。
上記「（２）ＵＶＡ照射による培養ＮＨＤＦの石灰化」の手順中の、ＵＶＡを１．２Ｊ／ｃｍ２を照射して石灰化した培養ＮＨＤＦを用いて、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有イーグルＭＥＭを１００μＬ／穴、２０ｍＭＣａＣｌ２水溶液を２０μＬ／穴、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ水溶液を１０μＬ／穴、ＰＢＳ（−）を２５−４０μＬ／穴、及び、下記ビタミンＫ２含有評価試料又はエチドロン酸二ナトリウム含有評価試料又はホモアルギニン含有評価試料を各々添加し、これに全量２００μＬ／穴となるように精製水を添加して３７℃、５％ＣＯ２の条件、２４時間培養して、評価培地を調製した。
１）ビタミンＫ２含有評価試料：
・ビタミンＫ２０．０１μＭ＋ＥＤミネラル水の評価培地中の最終濃度が０．５質量％となるように添加配合（ＥＤミネラル水：ビタミンＫ２＝１：１．３×１０-６（質量比））
・ビタミンＫ２０．０１μＭ＋ＥＤミネラル水の評価培地中の最終濃度が２．５質量％となるように添加配合（ＥＤミネラル水：ビタミンＫ２＝１：２．６×１０-７（質量比））
・ビタミンＫ２１０．００μＭ＋ＥＤミネラル水の評価培地中の最終濃度が０．５質量％となるように添加配合（ＥＤミネラル水：ビタミンＫ２＝１：１．３×１０-３（質量比））
・ビタミンＫ２１０．００μＭ＋ＥＤミネラル水の評価培地中の最終濃度が２．５質量％となるように添加配合（ＥＤミネラル水：ビタミンＫ２＝１：２．６×１０-４（質量比））
２）エチドロン酸二ナトリウム含有評価試料：
・エチドロン酸二ナトリウム０．０１μＭ＋ＥＤミネラル水の評価培地中の最終濃度が０．５質量％となるように添加配合（ＥＤミネラル水：エチドロン酸二ナトリウム＝１：５．０×１０-５（質量比））
・エチドロン酸二ナトリウム０．０１μＭ＋ＥＤミネラル水の評価培地中の最終濃度が２．５質量％となるように添加配合（ＥＤミネラル水：エチドロン酸二ナトリウム＝１：１．０×１０-５（質量比））
・エチドロン酸二ナトリウム０．１μＭ＋ＥＤミネラル水の評価培地中の最終濃度が２．５質量％となるように添加配合（ＥＤミネラル水：エチドロン酸二ナトリウム＝１：１．０×１０-４（質量比））
３）ホモアルギニン含有評価試料：
・ホモアルギニン０．１ｍＭ＋ＥＤミネラル水の評価培地中の最終濃度が０．５質量％となるように添加配合（ＥＤミネラル水：ホモアルギニン＝１：４．４×１０-１（質量比））
・ホモアルギニン０．１ｍＭ＋ＥＤミネラル水の評価培地中の最終濃度が２．５質量％となるように添加配合（ＥＤミネラル水：ホモアルギニン＝１：８．８×１０-２（質量比））
・ホモアルギニン１．００ｍＭ＋ＥＤミネラル水の評価培地中の最終濃度が０．５質量％となるように添加配合（ＥＤミネラル水：ホモアルギニン＝１：４．４（質量比））
・ホモアルギニン１．００ｍＭ＋ＥＤミネラル水の評価培地中の最終濃度が２．５質量％となるように添加配合（ＥＤミネラル水：ホモアルギニン＝１：８．８×１０-１（質量比））
【００５８】
なお、比較のために、下記表１に示すように、評価培地中に、上記ビタミンＫ２含有評価試料やエチドロン酸二ナトリウム含有評価試料やホモアルギニン含有評価試料等を添加配合しないもの、ＥＤミネラル水を添加配合したもの、また各ビタミンＫ２、エチドロン酸二ナトリウム、ホモアルギニンをそれぞれ添加配合したものを用いた評価した。
【００５９】
培養後、上記石灰化染色キットを用いてアリザリンレッド−Ｓ染色法で、培養ＮＨＤＦの石灰化度を測定した。
すなわちＵＶＡ照射後２４時間培養した培養ＮＨＤＦから培地を除去して、新たに５０μＬ／穴のＰＢＳ（−）を加えて培養ＮＨＤＦを２回洗浄した後、５０μＬ／穴の冷メタノールを添加し、氷冷下、３０分間静置して培養ＮＨＤＦを固定した。
【００６０】
固定後メタノールを除去して、５０μＬ／穴の精製水で２回、培養ＮＨＤＦを洗浄した後風乾した。
風乾後、前記石灰化染色キット（コスモ・バイオ株式会社製、Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  ｎｏｄｕｌｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ，Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＡＫ２１）に付属しているアリザリンレッド−Ｓ染色液を用いて、当該染色キットの操作要領に準じて、調製した染色液を５０μＬ／穴ずつ添加し、室温条件下で３０分間静置して染色した。
染色後、当該染色キットに付属しているＡＫ２１緩衝液を用いて５０μｌ／穴で添加して、非特異的に染色された色素を洗浄して除去して、染色ＮＨＤＦ細胞を２回洗浄した。
【００６１】
これらの操作でＣａ沈着部が特異的に染色された９６穴プレートを室温で十分風乾乾燥させた後、１０％塩化セチルピリジニウム溶液１００μｌ／穴で添加し、３７℃で１０分間色素を抽出した後、５７０ｎｍにおける吸光度（以後、ＯＤ５７０）を測定して石灰化度とした（ｎ＝６）。
その結果を下記表２に示す。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
（ＵＶＡ照射による石灰化）
図１よりＵＶＡ未照射条件において培養ＮＨＤＦはほとんど石灰化しなかったが、１．２Ｊ／ｃｍ２の仕事量での照射により石灰化度の上昇が認められた。
１）ビタミンＫ２及びＥＤミネラル水の併用による石灰化抑制
ＵＶＡを１．２Ｊ／ｃｍ２を照射して石灰化した培養ＮＨＤＦを、ビタミンＫ２およびＥＤミネラル水無添加の場合の評価培地中の石灰化程度を１として（コントロール）、各評価試料の抑制効果を相対値で示した。
上記表１より、０．５％ＥＤミネラル水は石灰化を抑制しなかった。
また、０．０１μＭビタミンＫ２または１０．００μＭのビタミンＫ２を添加した場合には、培養ＮＨＤＦ細胞の石灰化を若干抑制したが十分ではないことがわかった。
一方、０．０１μＭビタミンＫ２と０．５％または２．５％ＥＤミネラル水の併用や、０．００μＭビタミンＫ２と０．５％または２．５％ＥＤミネラル水を併用することで、ＮＨＤＦ細胞の石灰化抑制効果が顕著となることが認められた。
【００６４】
２）エチドロン酸二ナトリウム及びＥＤミネラル水の併用による石灰化抑制
上記表１より、０．０１μＭまたは０．１０μＭのエチドロン酸二ナトリウムを添加した場合には、培養ＮＨＤＦ細胞の石灰化を若干抑制したが十分はないことがわかった。
一方、０．０１μＭエチドロン酸二ナトリウムと０．５％または２．５％ＥＤミネラル水の併用や、０．１μＭエチドロン酸二ナトリウムと２．５％ＥＤミネラル水を併用することで、ＮＨＤＦ細胞の石灰化抑制効果が顕著となることが認められた。
【００６５】
３）ホモアルギニン及びＥＤミネラル水の併用による石灰化抑制
上記表１より、０．１ｍＭまたは１．００ｍＭのホモアルギニンを添加した場合には、培養ＮＨＤＦ細胞の石灰化を抑制することは難しいことがわかった。
一方、０．１ｍＭホモアルギニンと０．５％または２．５％ＥＤミネラル水を併用や、１．００ｍＭホモアルギニンと０．５％または２．５％ＥＤミネラル水を併用することで、ＮＨＤＦ細胞の石灰化抑制効果が顕著となることが認められた。
【００６６】
以上のことより、紫外線に皮膚が暴露されることによりカルシウムが蓄積された（石灰化）真皮組織及びそこに存在するＮＨＤＦ中の石灰化を、海洋深層水と、代表例としてビタミンＫ類やビスホスホネートやホモアルギニンとを組み合わせて用いることにより、真皮組織中の石灰化が顕著に改善されて、皮膚の老化抑制・改善を極めて有効に実現することができることがわかる。
なお、ビタミンＫ類やビスホスホネートやホモアルギニンについて代表例として例示したが、これらの成分に替えてまたは加えて、オカダ酸、アセタゾラミド、フロセミド、フェニルアラニン、ロイシンレバミゾール、ミード酸やオリゴガラクツロン酸を用いても、同様に真皮組織中の石灰化が顕著に改善されるものである。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、太陽光、特に紫外線に皮膚が暴露されることによりカルシウムが蓄積された（石灰化）真皮組織、特にそこに存在するＮＨＤＦによる、皮膚の老化を抑制・改善することができ、化粧料や健康食品に配合して適用することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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