(57)【要約】【課題】紫外線散乱剤や紫外線吸収剤等を塗布して皮膚表面で紫外線を直接散乱させたり吸収したりするだけではなく、皮膚の内部で皮膚細胞の防御機能が正常に作用するようにして、紫外線による皮膚の光老化を本質的に予防することのできる皮膚の光老化予防剤を提供する。【解決手段】光老化予防剤は、エゴマ油、亜麻仁油、シソの実油、チアシード油、サチャインチ油、又は、グリーンナッツ油に含有されるα−リノレン酸誘導体を有効成分として含有する。この光老化予防剤は、ヒト真皮繊維芽細胞のコラーゲン産生量の低下を抑制し、機能性化粧品として利用できる。【選択図】図１４
2019202990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
紫外線照射によって誘発される皮膚の光老化を予防するための予防剤であって、α−リノレン酸誘導体を有効成分として含有することを特徴とする皮膚の光老化予防剤。
【請求項２】
前記α−リノレン酸誘導体は、少なくとも１分子のα−リノレン酸がエステル結合したトリグリセリドであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚の光老化予防剤。
【請求項３】
前記α−リノレン酸誘導体は、エゴマ油、亜麻仁油、シソの実油、チアシード油、サチャインチ油、又は、グリーンナッツ油に含有されるものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の皮膚の光老化予防剤。
【請求項４】
ヒト真皮繊維芽細胞のコラーゲン産生量の低下を抑制することにより前記光老化を予防することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤。
【請求項５】
紫外線照射によるヒト真皮角化細胞の細胞障害性の緩和作用の発現を１つの要因とすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤。
【請求項６】
紫外線照射による細胞内活性酸素レベルの増加の抑制作用の発現を１つの要因とすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤。
【請求項７】
紫外線照射によるヒト真皮角化細胞の細胞障害性を要因とするヒト繊維芽細胞のコラーゲン合成量低減の抑制作用の発現を１つの要因とすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤。
【請求項８】
紫外線照射によるインターロイキン−８合成量増加の抑制作用の発現を１つの要因とすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤。
【請求項９】
紫外線照射によるヒト繊維芽細胞のコラーゲン合成量の増加作用の発現を１つの要因とすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤を含有することを特徴とする機能性化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の形態的な変化であるシワや、皮膚の色調的な変化であるシミなどを予防する光老化予防剤に関するものであり、特にα−リノレン酸誘導体を含有する皮膚の光老化予防剤及び色素班予防剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人の皮膚は、外側（肌側）から「表皮」、「真皮」及び「皮下組織」の三層に分かれている。表皮の厚さは０．２ｍｍ〜０．０７ｍｍで、外側から角質層、顆粒層、有棘層および基底層から成っている。表皮の最上層にあたる角質層は、皮膚の最も外側にあって、厚さ約０．０２ｍｍで、複数枚の薄い角質細胞が層状に重なり合って形成されている。正常な角質層は異物の侵入を防ぐ等のバリア機能を有しており、肌の健康を維持するうえで大変重要な層である。
【０００３】
表皮の下の真皮は、水分を保持して皮膚の機能を支えている。この真皮に存在する線維芽細胞で生成されたコラーゲンやエラスチンといった線維成分とヒアルロン酸など保湿成分により、皮膚の弾力性を保持している。このようにヒトの皮膚は、それぞれの層において、肌を保護し健やかに保ち、免疫情報を介して生体を防御する機能を有している。
【０００４】
一方、紫外線は、波長が１０〜４００ｎｍの範囲にある電磁波であり、人の健康や環境への影響の観点から、さらに 紫外線Ａ波（ＵＶＡ：４００〜３１５ｎｍ）、紫外線Ｂ波（ＵＶＢ：３１５〜２８０ｎｍ）、紫外線Ｃ波（ＵＶＣ：２８０ｎｍ未満）に分けられる。
【０００５】
ＵＶＡは、地表に届く全紫外線のうち約９５％を占める。それ自体のエネルギーは弱いが照射量が多く、浸透力が高いので人の肌に与える影響が大きい。皮膚の真皮層に作用し、蛋白質を変性させる。皮膚の弾性を失わせ老化を促進する。
【０００６】
ＵＶＢは、全紫外線の約５％を占める。ＵＶＢの多くはオゾン層によって吸収されるが、近年のオゾン層破壊により、地表にも以前より多く届くようになった。このＵＶＢは、主に肌の表面で吸収されるため、皮膚の真皮層まで達することは殆どない。しかし、ＵＶＡより強いエネルギーを持ち、ＵＶＡの１００〜１０００倍といわれている。シミ、シワ、肌の乾燥などの美容に悪影響を及ぼすだけでなく、メラニンの生成を過剰にしてシミを増進させて色素班を形成するほか、免疫力の低下、皮膚がん、白内障などの病気とも深く関わるとされている。
【０００７】
ＵＶＣは、強い殺菌作用があり生体に対する破壊性が最も強いが、オゾン層で守られている地表には通常は到達しない。
【０００８】
したがって、紫外線（ＵＶＡやＵＶＢ）により生じる皮膚の障害を防止することは、シミ、シワ、たるみ、乾燥等を防ぎ、色素班の形成を押え肌の老化を予防することに繋がると共に、免疫力の維持、皮膚がんの予防等にも繋がる。
【０００９】
一般に、紫外線により生じる皮膚の障害を防止するために、紫外線散乱剤や紫外線吸収剤等が含まれる塗布剤（所謂、日焼け止め剤）が使用されている。紫外線散乱剤は、肌を覆うことで紫外線を反射して皮膚への浸透を防ぐものである。これには、酸化チタンや酸化亜鉛等の白色無機粉体が使用されている。
【００１０】
一方、紫外線吸収剤は、皮膚表面で紫外線を吸収し熱エネルギーに変えて放出することで、皮膚への浸透を防止するものである。これには、ベンゾフェノン誘導体、ベンゾトリアゾール誘導体等の合成化合物が使用されている。また、近年は肌に優しい紫外線吸収剤として、天然系素材が使用されている。例えば、下記特許文献１には、金銀花、杜仲葉、パセリ葉、グァバ葉及びマテ茶などの抽出物を天然系の紫外線吸収剤として使用することが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平８−１２０２５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ところで、紫外線散乱剤や紫外線吸収剤には、効果の持続性に限界があること及び肌への負担が大きいこと等の問題があった。また、上記特許文献１に提案されている天然系の紫外線吸収剤にしても、肌に優しいものであっても効果の持続性に問題があり、皮膚の光老化を予防するという効果を期待できるものではない。
【００１３】
そこで、本発明は、上記の諸問題に対処して、紫外線散乱剤や紫外線吸収剤等を塗布して皮膚表面で紫外線を直接散乱させたり吸収したりするだけではなく、皮膚の内部で皮膚細胞の防御機能が正常に作用するようにして、紫外線による皮膚の光老化を本質的に予防することのできる皮膚の光老化予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題の解決にあたり、本発明者らは、人の皮膚の表皮細胞と真皮繊維芽細胞とのクロストーク（細胞間でシグナルを受け渡ししながら他の経路とも影響しあうこと）に着目することにより、エゴマ油による皮膚の光老化の予防効果を確認して本発明の完成に至った。
【００１５】
即ち、本発明に係る皮膚の光老化予防剤は、請求項１の記載によれば、
紫外線照射によって誘発される皮膚の光老化を予防するための予防剤であって、α−リノレン酸誘導体を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１６】
また、本発明は、請求項２の記載によれば、請求項１に記載の皮膚の光老化予防剤であって、
前記α−リノレン酸誘導体は、少なくとも１分子のα−リノレン酸がエステル結合したトリグリセリドであることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明は、請求項３の記載によれば、請求項１又は２に記載の皮膚の光老化予防剤であって、
前記α−リノレン酸誘導体は、エゴマ油、亜麻仁油、シソの実油、チアシード油、サチャインチ油、又は、グリーンナッツ油に含有されるものであることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明は、請求項４の記載によれば、請求項１〜３のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤であって、
ヒト真皮繊維芽細胞のコラーゲン産生量の低下を抑制することにより前記光老化を予防することを特徴とする。
【００１９】
また、本発明は、請求項５の記載によれば、請求項１〜４のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤であって、
紫外線照射によるヒト真皮角化細胞の細胞障害性の緩和作用の発現を１つの要因とすることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明は、請求項６の記載によれば、請求項１〜４のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤であって、
紫外線照射による細胞内活性酸素レベルの増加の抑制作用の発現を１つの要因とすることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明は、請求項７の記載によれば、請求項１〜４のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤であって、
紫外線照射によるヒト真皮角化細胞の細胞障害性を要因とするヒト繊維芽細胞のコラーゲン合成量低減の抑制作用の発現を１つの要因とすることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明は、請求項８の記載によれば、請求項１〜４のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤であって、
紫外線照射によるインターロイキン−８合成量増加の抑制作用の発現を１つの要因とすることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明は、請求項９の記載によれば、請求項１〜４のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤であって、
紫外線照射によるヒト繊維芽細胞のコラーゲン合成量の増加作用の発現を１つの要因とすることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る機能性化粧品は、請求項１０の記載によれば、
請求項１〜９のいずれか１つに記載の皮膚の光老化予防剤を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
上記構成によれば、本発明に係る皮膚の光老化予防剤は、α−リノレン酸誘導体を有効成分として含有する。また、このα−リノレン酸誘導体は、少なくとも１分子のα−リノレン酸がエステル結合したトリグリセリドであってもよい。また、これらの有効成分は、エゴマ油、亜麻仁油、シソの実油、チアシード油、サチャインチ油、又は、グリーンナッツ油に含有されるものであってもよい。この皮膚の光老化予防剤は、ヒト真皮繊維芽細胞のコラーゲン産生量の低下を抑制することにより光老化を予防する（詳細は後述する）。
【００２６】
また、上記構成によれば、本発明に係る皮膚の光老化予防剤は、紫外線照射によるヒト真皮角化細胞の細胞障害性の緩和作用の発現、細胞内活性酸素レベルの増加の抑制作用の発現、ヒト真皮角化細胞の細胞障害性を要因とするヒト繊維芽細胞のコラーゲン合成量低減の抑制作用の発現、インターロイキン−８合成量増加の抑制作用の発現、及び、ヒト繊維芽細胞のコラーゲン合成量の増加作用の発現などのうち、少なくとも１つの作用を要因として、ヒト真皮繊維芽細胞のコラーゲン産生量の低下を抑制することにより光老化を予防する。
【００２７】
よって、上記構成によれば、紫外線散乱剤や紫外線吸収剤等を塗布して皮膚表面で紫外線を直接散乱させたり吸収したりするだけではなく、皮膚の内部で皮膚細胞の防御機能が正常に作用するようにして、紫外線による皮膚の光老化を本質的に予防することのできる皮膚の光老化予防剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】形態的な光老化皮膚の進行における表皮細胞と真皮繊維芽細胞のクロストークを示す概念図である。
【図２】エゴマ油のＨａＣａＴ細胞に対する毒性を示すグラフである。
【図３】α−リノレン酸のＨａＣａＴ細胞に対する毒性を示すグラフである。
【図４】ＵＶＢ照射したＨａＣａＴ細胞の細胞障害性試験に対するエゴマ油の作用を示すグラフ（１）である。
【図５】ＵＶＢ照射したＨａＣａＴ細胞の細胞障害性試験に対するα−リノレン酸の作用を示すグラフ（１）である。
【図６】ＵＶＢ照射したＨａＣａＴ細胞の細胞障害性試験に対するエゴマ油の作用を示すグラフ（２）である。
【図７】ＵＶＢ照射したＨａＣａＴ細胞の細胞障害性試験に対するα−リノレン酸の作用を示すグラフ（２）である。
【図８】ＵＶＢ照射後の細胞内ＲＯＳ増加に対するエゴマ油の作用を示すグラフである。
【図９】ＵＶＢ照射後の細胞内ＲＯＳ増加に対するα−リノレン酸の作用を示すグラフである。
【図１０】ＵＶＢ照射したＨａＣａＴ細胞の培養上清処理によるＮＨＤＦのコラーゲン産生量に対するエゴマ油の作用を示すグラフである。
【図１１】ＵＶＢ照射したＨａＣａＴ細胞の培養上清処理によるＮＨＤＦのコラーゲン産生量に対するα−リノレン酸の作用を示すグラフである。
【図１２】ＵＶＢ照射によるＩＬ−８産生亢進に対するエゴマ油の作用を示すグラフである。
【図１３】ＮＨＤＦのコラーゲン産生量に対するエゴマ油の作用を示すグラフである。
【図１４】表皮細胞と真皮繊維芽細胞のクロストークにおいて形態的な光老化皮膚の進行を抑制するエゴマ油の作用を示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。まず、皮膚老化について説明する。皮膚老化には、生理老化と光老化とがある。太陽光線の慢性的な暴露により進行する光老化は、真皮マトリックスの質的量的な変化によって、その表面に皮膚の形態的な変化であるシワやたるみが生じる。また、本発明においは、皮膚の色調的な変化であるシミやメラニンの過剰な生成に起因する色素班も皮膚の光老化に含めるものとする。
【００３０】
まず、皮膚の形態的な変化について説明する。図１は、形態的な光老化皮膚の進行における表皮細胞と真皮繊維芽細胞のクロストークを示す概念図である。図１において、紫外線（以下「ＵＶ」ともいう）に暴露された皮膚の内部では、活性酸素（以下「ＲＯＳ」ともいう）が生成する。ＲＯＳは繊維芽細胞に作用し、コラーゲン分解酵素であるＭａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１（以下「ＭＭＰ１」ともいう）の合成を促進させる。また、表皮細胞に作用した場合は、炎症性サイトカインであるインターロイキン−１α（以下「ＩＬ−１α」ともいう）、インターロイキン−６（以下「ＩＬ−６」ともいう）及びインターロイキン−８（以下「ＩＬ−８」ともいう）を産生する。
【００３１】
これらの炎症性サイトカインは、炎症を惹起するのみならず、オートクライン、パラクライン的にコラーゲン合成抑制因子（以下「ＣＣＮ１」ともいう）に作用して、真皮マトリックス代謝系に大きく影響する。このマトリックス成分の合成と分解のバランスの変調によって形態的な光老化皮膚が形成されると考えられている。
【００３２】
一方、α−リノレン酸は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などと同じくオメガ３脂肪酸の一種であり、人間の体内では合成することのできない必須脂肪酸である。また、α−リノレン酸などの、ｎ−３系脂肪酸（分子中の二重結合が３つ）は、血中中性脂肪値の低下、不整脈の発生防止、血管内皮細胞の機能改善、血栓生成防止作用等の生理作用を介して生活習慣病の予防効果などに有効に作用することが知られている。更に、最近ではα−リノレン酸を多く含むエゴマ油（α−リノレン酸をトリグリセリドとして含有）などの美肌効果も着目されている。
【００３３】
本発明においては、上記の各生理作用を介する効果や美肌効果に加え、紫外線に対する皮膚細胞の防御機能を正常に作用させる機能があることを確認した。特に、本発明においては、α−リノレン酸誘導体を使用する。α−リノレン酸誘導体としては、例えば、少なくとも１分子のα−リノレン酸がエステル結合したトリグリセリドが挙げられる。
【００３４】
α−リノレン酸がエステル結合したトリグリセリドとしては、α−リノレン酸トリグリセリド、α−リノレン酸ジグリセリド、及び、α−リノレン酸モノグリセリドがあり、これらの混合物であってもよい。また、グリセロールの３つのヒドロキシル基のうち、α−リノレン酸とエステル結合する以外のヒドロキシル基は、他の有機酸、例えば、リノール酸などとエステル結合していてもよい。
【００３５】
α−リノレン酸とエステル結合したトリグリセリドを多く含む植物油（主に種子から搾取）としては、エゴマ油、亜麻仁油、シソの実油、チアシード油、サチャインチ油、及び、グリーンナッツ油などが挙げられる。これらの中でも、エゴマ油は、α−リノレン酸を総脂肪中５０〜６５％と多く含んでいるといわれている。
【００３６】
次に、本発明が皮膚細胞の防御機能を正常に作用させることについて説明する。本実施形態においては、α−リノレン酸とエステル結合したトリグリセリドを多く含むエゴマ油を用いて説明する。なお、本発明に係るα−リノレン酸誘導体の作用効果は、エゴマ油に限るものではなく、α−リノレン酸誘導体を含む他の植物油などであってもよい。  
【００３７】
本発明者らは、形態的な光老化皮膚の進行に対する予防効果を確認するにあたり、
第１段階：ＵＶＢを照射したヒト真皮角化細胞株（以下「ＨａＣａＴ細胞」ともいう）の細胞障害性の緩和作用、
第２段階：細胞内活性酸素（以下「細胞内ＲＯＳ」ともいう）レベルの増加に対する抑制作用、
第３段階：ＵＶＢ照射によるコラーゲン合成量の低下に対する抑制作用、
第４段階：ＵＶＢ照射によるＩＬ−８合成量の増加に対するエゴマ油の抑制作用、
第５段階：ヒト繊維芽細胞（以下「ＨＮＤＦ」ともいう）のコラーゲン合成量に対するエゴマ油の促進作用、
の５段階で確認した。
【００３８】
以下、各段階について説明する。なお、上記５段階のうち第１段階〜第３段階においては、α−リノレン酸誘導体としてエゴマ油（α−リノレン酸含有量５５％）を使用し、その比較対象としてα−リノレン酸（遊離酸の１００％試薬）を使用した。
【００３９】
＜第１段階＞
本第１段階では、ＵＶＢを照射したヒト真皮角化細胞株（ＨａＣａＴ細胞）の細胞障害性の緩和作用について確認した。まず、予備的確認としてエゴマ油とα−リノレン酸のＨａＣａＴ細胞に対する毒性を確認した。培地にＨａＣａＴ細胞を播種（３．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）して３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。次に、エゴマ油又はα−リノレン酸を所定濃度添加した培地に交換して、更に３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。その後、細胞生存率をＭＴＴ法で比色定量して評価した。
【００４０】
図２は、エゴマ油のＨａＣａＴ細胞に対する毒性を示すグラフである。図３は、α−リノレン酸のＨａＣａＴ細胞に対する毒性を示すグラフである。いずれのグラフにおいても、縦軸は細胞生存率（％）、横軸はエゴマ油又はα−リノレン酸の細胞処理濃度（μｇ／ｍｌ）を示している。図２の結果から、エゴマ油の細胞処理可能濃度を３００μｇ／ｍｌとした。また、図３の結果から、α−リノレン酸の細胞処理可能濃度を７５μｇ／ｍｌとした。
【００４１】
次に、エゴマ油又はα−リノレン酸のＵＶＢ耐性試験を行った。まず、培地にＨａＣａＴ細胞を播種（３．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）して３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。次に、この細胞に照射強度０〜８０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ照射を行い、エゴマ油又はα−リノレン酸を所定濃度添加した培地に交換して、更に３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。その後、細胞生存率をＭＴＴ法で比色定量して評価した。
【００４２】
図４は、ＵＶＢ照射（２０ｍＪ／ｃｍ２）したＨａＣａＴ細胞の細胞障害性試験に対するエゴマ油の作用を示すグラフ（１）である。図５は、ＵＶＢ照射（２０ｍＪ／ｃｍ２）したＨａＣａＴ細胞の細胞障害性試験に対するα−リノレン酸の作用を示すグラフ（１）である。いずれのグラフにおいても、縦軸は細胞生存率（％）、横軸はエゴマ油又はα−リノレン酸の細胞処理濃度（μｇ／ｍｌ）を示している。図４の結果から、エゴマ油を１５０μｇ／ｍｌ以上処理した細胞では、ＵＶＢ照射の有無にかかわらず生存率が増加した。一方、図５の結果から、α−リノレン酸を３７．５μｇ／ｍｌ以上処理した細胞では、ＵＶＢ照射の有無により細胞死が誘導された。
【００４３】
一方、図６は、ＵＶＢ照射（０〜８０ｍＪ／ｃｍ２）したＨａＣａＴ細胞の細胞障害性試験に対するエゴマ油の作用を示すグラフ（２）である。図７は、ＵＶＢ照射（０〜８０ｍＪ／ｃｍ２）したＨａＣａＴ細胞の細胞障害性試験に対するα−リノレン酸の作用を示すグラフ（２）である。いずれのグラフにおいても、縦軸は細胞生存率（％）、横軸はＵＶＢ照射強度（ｍＪ／ｃｍ２）を示している。図６の結果から、ＵＶＢ照射強度依存的に細胞死が誘導されるが、エゴマ油の処理は細胞死を抑制した。一方、図７の結果から、ＵＶＢ照射強度依存的に細胞死が誘導され、α−リノレン酸処理は細胞死を促進した。
【００４４】
これらの結果から、エゴマ油は、ＵＶＢ照射によるＨａＣａＴ細胞の細胞障害を有意に抑制することが分かる。これに比べて、α−リノレン酸は、細胞障害を抑制せず、逆に細胞障害を促進する。このことから、エゴマ油（α−リノレン酸とエステル結合したトリグリセリド）が、何らかの作用により皮膚老化に対して有効であるものと考えられる。
【００４５】
＜第２段階＞
本第２段階では、細胞内活性酸素（細胞内ＲＯＳ）レベルの増加に対する抑制作用について確認した。まず、培地にＨａＣａＴ細胞を播種（３．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）して３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。次に、この細胞に照射強度２０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ照射を行い、エゴマ油又はα−リノレン酸を所定濃度添加した培地（０．５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）に交換して、更に３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。
【００４６】
その後、細胞内ＲＯＳ反応性蛍光プローブ（Ｈ２ＤＣＦＤＡ）による細胞内ＲＯＳレベルの測定を行った。測定は、ＢＣＡキットにより細胞タンパク質を定量し、細胞タンパク質当たりの蛍光強度（Ｆ．Ｉ．／μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）にて評価した。
【００４７】
図８は、ＵＶＢ照射後（２０ｍＪ／ｃｍ２）の細胞内ＲＯＳ増加に対するエゴマ油の作用を示すグラフである。図９は、ＵＶＢ照射後（２０ｍＪ／ｃｍ２）の細胞内ＲＯＳ増加に対するα−リノレン酸の作用を示すグラフである。いずれのグラフにおいても、縦軸は細胞内ＲＯＳレベル（Ｆ．Ｉ．／μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、横軸はエゴマ油又はα−リノレン酸の細胞処理濃度（μｇ／ｍｌ）を示している。図８の結果から、エゴマ油を１８．８μｇ／ｍｌ以上処理した細胞においては、ＵＶＢ照射により誘導された細胞内ＲＯＳレベルの増加が抑制された。一方、図９の結果から、α−リノレン酸は、ＵＶＢ照射により誘導された細胞内ＲＯＳレベルを抑制せず、７５μｇ／ｍｌの濃度においては、細胞内ＲＯＳレベルをむしろ増加させる作用が認められた。
【００４８】
これらの結果から、エゴマ油は、ＵＶＢ照射による細胞内ＲＯＳレベルの上昇を抑制した。これに比べて、α−リノレン酸は、ＵＶＢ照射による細胞内ＲＯＳレベルの上昇を抑制せず、濃度によってはむしろ増加させた。これらのことから、エゴマ油（α−リノレン酸とエステル結合したトリグリセリド）は、表皮細胞へのＵＶＢ照射による細胞内ＲＯＳの増加を抑制することにより、細胞障害を緩和する作用を有するものと考えられる。
【００４９】
＜第３段階＞
本第３段階では、ＵＶＢ照射によるコラーゲン合成量の低下に対する抑制作用について確認した。まず、培地にＨａＣａＴ細胞を播種（３．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）して３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。次に、この細胞に照射強度２０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ照射を行い、エゴマ油又はα−リノレン酸を所定濃度添加した培地（０．５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）に交換して、更に３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。また、回収した培養上清からＢＡＣキットにより細胞タンパク質を定量した。
【００５０】
一方、正常ヒト真皮繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を播種（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）した培地に回収した培養上清を添加して３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。その後、Ｉ型コラーゲン（ＣＯＬＩ）合成量をＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ-Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により定量した。次に、定量したＩ型コラーゲン合成量と培養上清のタンパク質量から細胞タンパク質当たりのコラーゲン量を算出した。
【００５１】
図１０は、ＵＶＢ照射（２０ｍＪ／ｃｍ２）したＨａＣａＴ細胞の培養上清処理によるＮＨＤＦのコラーゲン産生量に対するエゴマ油の作用を示すグラフである。図１１は、ＵＶＢ照射（２０ｍＪ／ｃｍ２）したＨａＣａＴ細胞の培養上清処理によるＮＨＤＦのコラーゲン産生量に対するα−リノレン酸の作用を示すグラフである。いずれのグラフにおいても、縦軸はＵＶＢ照射なしを基準にした相対的Ｉ型コラーゲン合成量（％）、横軸はエゴマ油又はα−リノレン酸の細胞処理濃度（μｇ／ｍｌ）を示している。図１０の結果から、ＵＶＢ照射によりＩ型コラーゲン合成量が有意に減少し、エゴマ油はその減少を濃度依存的に抑制した。一方、図１１の結果から、α−リノレン酸は、ＵＶＢ照射によるＩ型コラーゲン合成量の低下を抑制できなかった。
【００５２】
＜第４段階＞
本第４段階では、ＵＶＢ照射によるＩＬ−８合成量の増加に対するエゴマ油の抑制作用について確認した。まず、培地にＨａＣａＴ細胞を播種（４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）して３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。次に、この細胞に照射強度３０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ照射を行い、エゴマ油を０〜３００μｇ／ｍｌ添加した培地（０．５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）に交換して、更に３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養してその培養上清を回収した。次に、回収した培養上清からＥＬＩＳＡ法によりＩＬ−８合成量を定量した。
【００５３】
図１２は、ＵＶＢ照射によるＩＬ−８産生亢進に対するエゴマ油の作用を示すグラフである。図１２において、縦軸はタンパク質中のＩＬ−８の合成量（ｐｇ／μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、横軸はエゴマ油の細胞処理濃度（μｇ／ｍｌ）を示している。図１２の結果から、ＵＶＢ照射によりＩＬ−８の分泌が有意に増加し、エゴマ油はその増加を濃度依存的に抑制した。
【００５４】
＜第５段階＞
本第５段階では、ヒト繊維芽細胞（ＨＮＤＦ）のコラーゲン合成量に対するエゴマ油の促進作用について確認した。まず、培地に正常ヒト真皮繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を播種（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）して３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。次に、エゴマ油を所定濃度添加した培地（０．５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）に交換して、更に３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養してその培養上清を回収した。
【００５５】
次に、ＥＬＩＳＡ法によりＩ型コラーゲン（ＣＯＬＩ）合成量を定量すると共に、培養上清からＢＡＣキットにより細胞タンパク質を定量した。次に、定量したＩ型コラーゲン合成量と培養上清のタンパク質量から細胞タンパク質当たりのコラーゲン量を算出した。
【００５６】
図１３は、ＮＨＤＦのコラーゲン産生量に対するエゴマ油の作用を示すグラフである。図１３において、縦軸は細胞タンパク質当たりのＩ型コラーゲン合成量（ｎｇ／μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、横軸はエゴマ油の細胞処理濃度（μｇ／ｍｌ）を示している。図１３の結果から、エゴマ油は繊維芽細胞の細胞タンパク質当たりのＩ型コラーゲン合成量を濃度依存的に上昇させた。
【００５７】
このように、第４段階及び第５段階の結果から、エゴマ油（α−リノレン酸とエステル結合したトリグリセリド）は、表皮細胞へのＵＶＢ照射により誘導されるＩＬ−８の分泌増加を抑制し、真皮繊維芽細胞のコラーゲン合成量の低下を抑制するものと考えられる。
【００５８】
以上の結果をまとめ、図１４に示す。図１４は、表皮細胞と真皮繊維芽細胞のクロストークにおいて形態的な光老化皮膚の進行を抑制するエゴマ油の作用を示す概念図である。図１４において、エゴマ油（α−リノレン酸とエステル結合したトリグリセリド）は、ＵＶＢ照射により上昇する細胞内ＲＯＳを低下させることにより、ＨａＣａＴ細胞の細胞障害を緩和させる作用を有する。
【００５９】
更に、エゴマ油（α−リノレン酸とエステル結合したトリグリセリド）は、ＵＶＢ照射により皮膚細胞より分泌亢進されるコラーゲン合成能の低下に関わる何らかの液性因子の分泌を抑制することで、ＵＶＢ照射によるコラーゲン合成能の低下を抑制する作用を有する。
【００６０】
これらのことから、エゴマ油（α−リノレン酸とエステル結合したトリグリセリド）は、ＵＶＢによる皮膚細胞の細胞障害を緩和することにより、形態的な光老化皮膚の進行を抑制する作用を有するものと考えられる。
【００６１】
次に、皮膚の色調的な変化について説明する。特に、メラニンの過剰な生成に起因する色素班の抑制について説明する。色素班は、紫外線暴露を刺激として進行するメラニン産生促進メカニズムにより増殖したメラノサイト（メラニンを形成する細胞）がメラニンを過剰に生成することに起因する。
【００６２】
色素班形成メカニズムについて解説した文献（ＦＲＥＧＲＡＮＣＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ２０１４−１１，Ｐ．１４−２１）によれば、メラノサイトの活性化メカニズムとして、ＵＶＢに暴露されたケラチノサイト（表皮角化細胞）内で産生された活性酸素（ＲＯＳ）は、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の発現とタンパク合成を促進し、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）により細胞膜より切り出されたアラキドン酸を基質としてプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生を促進する。ＰＧＥ２はＥＰレセプターを介して、メラノサイトの増殖と樹状突起の伸長を促進させる。
【００６３】
そこで、上述の形態的な光老化皮膚の進行を抑制した第２段階において、エゴマ油がＵＶＢ照射による細胞内ＲＯＳレベルの上昇を抑制したことを確認した。すなわち、ＵＶＢ→ＲＯＳ→ＰＧＥ２→メラノサイト増殖という一連の流れの中で、エゴマ油がＲＯＳの増加を抑制し色素班の生成を抑えることが示されている。その結果、シミや色素班を押え肌の美白効果を促進することものと考えられる。
【００６４】
次に、皮膚の光老化予防剤としてのα−リノレン酸誘導体（主としてα−リノレン酸とエステル結合したトリグリセリド）を皮膚に取り込む方法について説明する。最も直接的な方法としては、肌から皮膚の内部に取り込むことができる。具体的には、各種化粧品として皮膚に取り込むことが考えられる。以下、実施例により機能性化粧品について説明する。なお、本発明に係る機能性化粧品は、以下の実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００６５】
本実施例では、α−リノレン酸とエステル結合したトリグリセリドを多く含むエゴマ油を皮膚の光老化予防剤として含有する機能性化粧品の配合例を挙げる。
【００６６】
＜配合例１：化粧クリーム＞
エゴマ油                          ５．０重量％
スクワラン                      ２０．０重量％
ミツロウ                          ５．０重量％
グリセリン                        ５．０重量％
グリセリンモノステアレート        ２．０重量％
防腐剤                            適量
香料                              適量
精製水                            残余
＜配合例２：化粧水＞
エゴマ油                          ５．０重量％
エタノール                        ５．０重量％
グリセリン                        ２．０重量％
１，３−ブチレングリコール        ２．０重量％
ポリエチレンオレイルエーテル      ０．５重量％
クエン酸ナトリウム                ０．１重量％
クエン酸                          ０．１重量％
精製水                            残余
＜配合例３：乳液＞
エゴマ油                          ５．０重量％
スクワラン                        ４．０重量％
ワセリン                          ２．５重量％
セタノール                        ２．０重量％
グリセリン                        ２．０重量％
親油型モノステアリン酸グリセリン  １．０重量％
ステアリン酸                      １．０重量％
Ｌ−アルギニン                    １．０重量％
水酸化カリウム                    ０．１重量％
香料                              微量
精製水                            残余
以上説明したように、本発明によれば、紫外線散乱剤や紫外線吸収剤等を塗布して皮膚表面で紫外線を直接散乱させたり吸収したりするだけではなく、皮膚の内部で皮膚細胞の防御機能が正常に作用するようにして、紫外線による皮膚の光老化を本質的に予防することのできる皮膚の光老化予防剤を提供することができる。なお、本発明に係る光老化予防剤は、上述の機能性化粧品に利用されるが、その他の用途として機能性食品として利用することも考えられる。
【図１】
2019202990.tif 000003
【図２】
2019202990.tif 000004
【図３】
2019202990.tif 000005
【図４】
2019202990.tif 000006
【図５】
2019202990.tif 000007
【図６】
2019202990.tif 000008
【図７】
2019202990.tif 000009
【図８】
2019202990.tif 000010
【図９】
2019202990.tif 000011
【図１０】
2019202990.tif 000012
【図１１】
2019202990.tif 000013
【図１２】
2019202990.tif 000014
【図１３】
2019202990.tif 000015
【図１４】
2019202990.tif 000016