(57)【要約】【課題】ヒト皮膚のシミュレーションを使用して、皮膚電気穿孔を試験するためのシステムおよび方法を提供すること。【解決手段】システムは、シミュレーションプロトコルを使用して、分子的レベルにおける皮膚の上側層角質層(SC)のin-silico設計を行っている。次いで、このモデルは、皮膚電気穿孔戦略を設計するためにさらに使用される。外部電場が、脂質二重層にわたって印加されて、脂質二重層に孔を形成した。孔サイズおよび孔成長速度は、印加された外部電場に応じて計算された。次いで、生成された孔は、外部電場を変化させることによって安定化した。さらには、外部電場を除去すると、脂質二重層の再形成およびヒト皮膚の自己治癒も達成された。別の実施形態では、システムはまた、外部電場の存在下で皮膚を介した薬物透過の仮想試験を行うように構成されている。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト皮膚のシミュレーションを使用して、皮膚電気穿孔を試験するための方法であって、プロセッサにより実施されるステップを含み、前記ステップが、
前記ヒト皮膚の角質層の層の分子モデルを提供するステップであって、前記角質層の層が、脂質二重層を含む、ステップと、
前記シミュレーションのための平衡環境を創出するために複数のパラメータを設定するステップと、
前記脂質二重層にわたって外部電場を印加するステップであって、前記外部電場の前記印加の結果、前記角質層の層の前記脂質二重層の内側に孔が生成される、ステップと、
前記印加された外部電場に基づいて、前記脂質二重層にわたる前記孔の半径を測定するステップと、
前記印加された外部電場を変化させることによって、前記孔の半径を安定化させるステップと、
前記外部電場を除去するステップであって、外部電場の前記除去の結果、前記脂質二重層が再形成され、ヒト皮膚が自己治癒する、ステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記外部電場の存在下で、前記孔を介して薬物透過を試験するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記印加された外部電場に基づいて、孔成長速度を測定するステップをさらに含み、前記孔成長速度が、所定の時間間隔での前記孔の半径における変化を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記孔の半径が、x方向およびy方向の孔の半径の幾何平均を使用して計算される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のパラメータが、皮膚温度、圧力、皮膚脂質相互作用の力場パラメータ、印加電場、もしくは温度結合のうちの1つまたは複数を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記外部電場が、前記ヒト皮膚の前記脂質二重層にわたって印加される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
皮膚膜の角質層の層の前記分子モデルが、セラミド、コレステロール、および遊離脂肪酸から成る、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記孔の形成は、前記外部電場が閾値電場値を超えた後、開始し、前記閾値電場値が、前記ヒト皮膚の組成に依存している、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記外部電場が、30ボルトから1500ボルトの間である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記印加された外部電場に基づいて、穿孔時間を測定するステップをさらに含み、前記穿孔時間が、前記印加された外部電場の孔の形成に必要な時間を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト皮膚の安全性を確保するために、前記印加された外部電場と穿孔時間との最適値を決定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
ヒト皮膚のシミュレーションを使用して、皮膚電気穿孔を試験するためのシステムであって、
前記ヒト皮膚の角質層の層の分子モデルを提供する第1の入力モジュールであって、前記角質層の層が、脂質二重層を含む、第1の入力モジュールと、
前記シミュレーションのための平衡環境を創出するために複数のパラメータを設定する第2の入力モジュールと、
メモリと、
前記メモリと通信しているプロセッサと
を備え、前記プロセッサが、
前記脂質二重層にわたって外部電場を印加するステップであって、前記外部電場の前記印加の結果、前記角質層の層の前記脂質二重層の内側に孔が生成される、ステップと、
前記印加された外部電場に基づいて、前記脂質二重層をわたる前記孔の半径を測定するステップと、
前記印加された外部電場を変化させることによって、前記孔の半径を安定化させるステップと、
前記外部電場を除去するステップであって、外部電場の前記除去の結果、前記脂質二重層が再形成され、ヒト皮膚が自己治癒する、ステップと
を行うようにさらに構成されている、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書における諸実施形態は、一般に、ヒト皮膚のモデル化およびシミュレーションの分野に関し、より詳細には、皮膚電気穿孔のin-silico設計および試験のための方法ならびにシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の最も大きい器官である皮膚は、体外病原菌の攻撃から保護し、多数の有害分子の透過に対するバリアをもたらし、組織の水和レベルを維持する。角質層(SC:Stratum Corneum)としても知られている皮膚の外層は、主に、これらのバリア性を担っている。
【０００３】
皮膚を介する薬物の送達は、皮膚の高表面積により、好都合な投与経路をもたらし、通常、自己投与可能である。経皮的薬物送達により、胃の不快感さがないこと、不安定な吸収が回避されること、性質が非侵襲的であること、皮膚の表面積が大きいこと、ならびに患者コンプライアンスが改善されることなど、従来の薬物送達システムに対する多くの利点が提供される。
【０００４】
角質層は、性質が高度に選択的であり、通常、相対的に脂溶性の化合物だけを皮膚の内側層内に拡散させることができる。角質層は、性質が高度に疎水性であり、皮膚における分子の輸送は、主には受動拡散によって、大抵はラメラ脂質マトリックスを通して行われる。性質が親水性である薬物およびタンパク質の多くは、このバリアを破壊することができない。
【０００５】
バリア機能を破壊することによって薬物透過を増進させるために、長年にわたって広く開発され、使用されてきた技法がいくつか存在する。これらの技法は、それらの作業原理に基づいた2つのカテゴリ、(a)化学的浸透促進剤リポソームによる受動的輸送と、(b)電気穿孔、イオン泳動、超音波泳動、および熱泳動などの能動的方法とに大きくは分類される。電気穿孔、イオン泳動、超音波泳動、および熱泳動などの能動的方法では、外部エネルギー源(電流、イオン流束など)が使用され、一時的ナノメートルサイズの孔がSC内に生成され、この孔により、さらに分子が透過されやすくなる。
【０００６】
大抵、電気穿孔は、短い時間期間(μsからmsまで)の間、パルスの形態の高電圧の印加を使用することによる皮膚の一時的な摂動を示す。元来、電気穿孔は、(DNAなどの)高分子を含む細胞を、それらの細胞脂質膜を可逆的な形で改変することによって破壊するために使用された。後にこの技法は、ペプチドおよびタンパク質などの高分子を送達するための経皮的薬剤送達に利用するために使用された。皮膚の電気穿孔には、細胞膜の電気穿孔と比較して、より高い電圧(>50〜100V)が必要である。電気穿孔パルスは、2つの相、すなわち、短パルスおよび長パルスに大きくは分類される。
【０００７】
この20年来、研究者は、皮膚を介する小さくて高分子の送達に向けて電気穿孔実験を数多く行ってきた。その取組みには、低から高に変化する電場を使用して、皮膚(ラット、マウス、およびヒト)を介するイオン性、非イオン性、中性、および帯電した様々な薬物分子の送達が含まれる。電気穿孔はまた、皮膚内への、および皮膚を介した遺伝子導入に向けての実験環境にも広く使用されてきた。それほど多くの実験研究があるにもかかわらず、電気穿孔中に、皮膚に構造上の変化を引き起こす下層の分子的メカニズムは、未だによく理解されていない。しかしながら、高電圧パルスが印加されると、水孔が皮膚に形成されるという仮説が立てられている。また、皮膚SC層にわたる電圧降下が30Vを超えると、皮膚透過性は著しく(最大で4桁の大きさまで)増加し、皮膚脂質構造の修正が、水双極子と電場との間の相互作用により生じるという仮説が立てられたことも報告されている。電気穿孔の巨視的メカニズムを理解するために、受動輸送モデルを電気穿孔モデルと組み合わせることによって展開されてきた皮膚電気穿孔の数学輸送モデルがいくつかある。その上、皮膚SC脂質マトリックスの電気穿孔の分子的メカニズムの研究は1つも報告されていない。分子的シミュレーションでは、皮膚の透過および動力学の過程を理解するための便利なやり方が提供され、実験からは、関連の時間および長さのスケールにより得られない可能性がある重要な物理的洞察が分子的レベルにおいて生まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
次は、本開示のいくつかの実施形態の簡略化された概要を提示して、実施形態の基本的な理解を提供する。この概要は、実施形態の広範な概説ではない。それは、実施形態の重要な/重大な要素を特定するようにも、または実施形態の範囲を線引きするようにも意図していない。その唯一の目的は、下記に提示されるより詳細な説明に対する導入部として、簡略化された形態でいくつかの実施形態を提示することである。
【０００９】
前述を考慮して、本明細書における一実施形態は、外部電場の非存在下および存在下で、ヒト皮膚のシミュレーションを使用して、皮膚電気穿孔を試験するためのシステムを提供する。システムは、第1の入力モジュールと、第2の入力モジュールと、メモリと、プロセッサとを備える。第1の入力モジュールは、ヒト皮膚の角質層の層の分子モデルを提供し、この角質層の層は、脂質二重層を含む。第2の入力モジュールは、シミュレーションのための平衡環境を創出するために複数のパラメータを設定する。プロセッサは、次のステップ、すなわち、外部電場を印加するステップであって、外部電場の印加の結果、角質層の層の脂質二重層の内側に孔が生成される、ステップと、印加された外部電場に基づいて、二重層をわたる孔の半径を測定するステップと、印加された外部電場を変化させることによって、孔の半径を安定化させるステップと、外部電場を除去するステップであって、外部電場の除去の結果、脂質二重層が再形成され、ヒト皮膚が自己治癒する、ステップとを行うようにさらに構成されている。
【００１０】
別の態様では、ここでの実施形態は、ヒト皮膚のシミュレーションを使用して、皮膚電気穿孔を試験するための方法を提供する。最初に、ヒト皮膚の角質層の層の分子モデルが提供され、この角質層の層は、脂質二重層を含む。次のステップでは、シミュレーションのための平衡環境を創出するために複数のパラメータが設定される。次のステップでは、外部電場が脂質二重層にわたって印加され、外部電場の印加の結果、角質層の層の脂質二重層の内側に孔が生成される。次いで、二重層にわたる孔の半径が、印加された外部電場に基づいて測定される。次いで、孔の半径は、印加された外部電場を変化させることによって安定化する。最終的には、外部電場は除去され、外部電場の除去の結果、脂質二重層が再形成され、ヒト皮膚が自己治癒する。
【００１１】
本明細書におけるブロック図はいずれも、本主題の原理を実装する例示的なシステムの概念的な図を表していることを当業者は認識すべきである。同様に、フローチャート、フロー図、状態遷移図、および疑似コードなどはいずれも、コンピュータ可読媒体において実質的に表示され得る、したがって、コンピューティングデバイスまたはプロセッサによって、そのようなコンピューティングデバイスまたはプロセッサが明示的に示されているか否かにかかわらず、実行され得る様々な方法を表していることが認識されよう。
【００１２】
本明細書における実施形態は、図面を参照して次の詳細な説明からより良く理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本開示の一実施形態による、ヒト皮膚のシミュレーションを使用して皮膚電気穿孔を試験するためのブロック図である。
【図２】本開示の一実施形態による、時系列で孔の生成を示す脂質二重層の側面図である。
【図３ａ】本開示の一実施形態による、ヒト皮膚のシミュレーションを使用して皮膚電気穿孔の試験に関わるステップを示すフローチャートである。
【図３ｂ】本開示の一実施形態による、ヒト皮膚のシミュレーションを使用して皮膚電気穿孔の試験に関わるステップを示すフローチャートである。
【図４】本開示の一実施形態による、二重層法線に沿う二重層の孔サイズの計算を表すグラフである。
【図５】本開示の一実施形態による、安定した孔の維持電圧を決定するためのグラフである。
【図６】本開示の一実施形態による、穿孔(poration)時間に対する電場の効果を表すグラフである。
【図７】本開示の一実施形態による、穿孔電場の印加に対する二重層の孔成長速度を表すグラフである。
【図８】本開示の一実施形態による、時系列で脂質二重層の再形成を表す脂質二重層の側面図である。
【図９】本開示の一実施形態による、時系列で脂質二重層にわたる薬物の送達を示す側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書における実施形態ならびにそれらの様々な特徴および有利な詳細について、添付の図面に示され次の説明に詳述される非限定的な実施形態を参照してより完全に説明する。本明細書において使用される例は、単に、本明細書における実施形態が実施され得るやり方を理解しやすくするように、および本明細書における実施形態を当業者がさらに実施できるように意図されているにすぎない。したがって、諸例は、本明細書における実施形態の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００１５】
次に、図面、より具体的には、同様の参照文字が図全体を通じて一貫して対応する特徴を表している図1〜図9を参照すると、好ましい実施形態が示されており、これらの実施形態について、次の例示的なシステムおよび/または方法の文脈で説明する。
【００１６】
本開示の一実施形態によれば、ヒト皮膚のシミュレーションを使用して、皮膚電気穿孔を試験するためのシステム100が、図1のブロック図に示されている。システム100は、分子的レベル分解能、および現実的皮膚脂質マトリックスモデルを用いる。システム100は、シミュレーションプロトコルを使用して、分子的および巨視的なレベルにおける皮膚の上側層角質層(SC)のin-silico設計を提供する。次いで、このモデルをさらに使用して、皮膚電気穿孔戦略を設計する。別の実施形態では、システム100はまた、外部電場の存在下で皮膚を介した薬物透過の仮想試験を行うようにも構成されている。
【００１７】
本開示の一実施形態によれば、システム100は、図1のブロック図に示されているように、第1のユーザインターフェース102と、第2のユーザインターフェース104と、メモリ106と、プロセッサ108とで構成されている。プロセッサ108は、メモリ106と通信している。プロセッサ108は、メモリ106に記憶されている複数のアルゴリズムを実行するように構成されている。プロセッサ108は、様々な機能を行うためのシミュレーションモジュール110などの複数のモジュールをさらに含む。
【００１８】
本開示の一実施形態によれば、第1の入力モジュール102は、ヒト皮膚の角質層の層の分子モデルを入力としてプロセッサ108に提供するように構成されている。また第2の入力モジュール104は、シミュレーションのための平衡環境を創出するために複数のパラメータを設定するように構成されている。第1の入力モジュール102および第2の入力モジュール104は、ユーザによって操作される。第1の入力モジュール102および第2の入力モジュール104は、ある種のユーザインターフェースである。別の実施形態では、システム100は、両方の機能を果たす一方の入力モジュールのみを含むこともある。ユーザインターフェース/入力モジュールは、多様なソフトウェアおよびハードウェアのインターフェース、たとえば、ウェブインターフェース、およびグラフィカルユーザインターフェースなどを含むことができ、たとえばLAN、ケーブルなどのワイヤードのネットワーク、およびWLAN、セルラー、または衛星などのワイヤレスのネットワークを含む、幅広い多様なネットワークN/Wならびにプロトコルタイプ内で多通信を容易にすることができる。
【００１９】
皮膚の最上層は、角質層(SC)として知られている。角質層は、結晶性ゲル相の脂質ラメラ二重層構造によって相互結合された、角質細胞として知られている15〜20層の扁平な死細胞殻から成る。角質細胞および脂質マトリックスは、それぞれレンガとモルタルの形で構成されている。皮膚バリア機能は、角質細胞が性質上ほぼ不透過性であるので、大抵、脂質マトリックスの閉塞によって決定される。脂質マトリックスは、長鎖セラミド(CER:Ceramide)と、コレステロール(CHOL:cholesterol)と、遊離脂肪酸(FFA:free fatty acid)との特定の比率の異種混合物である。皮膚脂質マトリックスは、性質上、非常に複雑であり、300近い異なるタイプのセラミドが占める。SCの現実的な脂質二重層をシミュレーションするには、最も豊富なセラミドCER-NS、および遊離脂肪酸(鎖長24)が使用される。
【００２０】
本開示の一実施形態によれば、第2の入力モジュール104は、シミュレーションを行うための平衡環境を達成するために複数のパラメータを設定するように構成されている。複数のパラメータには、皮膚温度、圧力、皮膚脂質相互作用の力場パラメータ、印加電場、もしくは温度結合のうちの1つまたは複数が含まれる。複数のパラメータは、上述のパラメータに限定するものではなく、他の様々なパラメータもまた、平衡を達成するために調整され得る。
【００２１】
本開示の一実施形態では、温度は、時定数が2psのBerendsenサーモスタット(平衡工程)およびNose-Hoverサーモスタット(生産工程)を使用して、皮膚温度約310Kにおいて調整された。圧力は、半等方結合による平衡工程ならびに生産工程それぞれにおいて、時定数がそれぞれ6psおよび12psと圧縮率が4.0×10-5bar-1のBerendsenおよびParrinello-Rahmanの圧調節器によって調整された。圧力は、張力のない二重層を得るために、X、YおよびZ方向に独立に調整された。脂質分子と溶質分子との接合はすべて、LINCSアルゴリズムを使用して制約され、水については、SETTLEアルゴリズムが使用された。2fsの時間段階が、すべてのシミュレーションについて使用された。1.2nmのカットオフが、Vander Waal相互作用および静電相互作用について使用された。長距離静電相互作用は、粒子メッシュEwald(PME:particle mesh Ewald)法を使用してコンピュータ計算された。二重層系は、3方向すべてにおいて周期的であった。構成は、生産工程では、10psおきにサンプル化された。隣接リストは、10段階おきに更新された。したがって、これらのパラメータは、様々な要件に応じて変更可能であり、これらのパラメータにのみ固執すべきではない。異なるパラメータの使用は、十分に本開示の範囲内である。
【００２２】
本開示の一実施形態によれば、システム100は、シミュレーションモジュール110をさらに含む。シミュレーションモジュールは、ヒト皮膚の二重層にわたって外部電場を印加するように構成されている。一例では、シミュレーションモジュール110は、GROMACS分子動力学パッケージを使用して、NVTアンサンブルおよびNPTアンサンブルにおいてすべてのシミュレーションを行う。しかしながら、他の任意のシミュレーションツールの使用は、十分に本開示の範囲内である。外部電場の印加の結果、図2に示されているように、角質層の層の脂質二重層の内側に孔が生成される。外部電場は、(二重層のXY平面に垂直な)Z方向に印加された。孔の形成は、閾値場としても知られている特定の臨界電場を超えた後、行われる。閾値場を上回る場はすべて、二重層に孔を形成し、穿孔場として知られている。
【００２３】
本開示の一実施形態によれば、システム100は、孔のサイズを計算するように構成されている。サイズは、印加された外部電場に基づいて、二重層にわたる孔の半径に関して測定される。孔半径は、二重層の法線Zに沿って変わる。孔サイズは、XとYの両方向で等しくない。二重層の孔サイズを計算するために、二重層は、XとYの平面において別個に投影された。計算の目的で、分子が図9に示されている孔に送達された。XおよびYの各方向における分子の最大ならびに最小の座標が計算された。XおよびYの各方向における最大ならびに最小の座標の差により、X方向およびY方向それぞれにおける孔サイズRxおよびRyが与えられる。孔半径(R=√RxRy)は、RxおよびRyの幾何平均を使用して計算される。一実施形態では、孔サイズは、3ナノメートルから4ナノメートルの間である。しかしながら、孔サイズが、印加された外部電場と電場の印加時間をともに変更することによって、4ナノメートルを超えて作製され得ることを認識すべきである。
【００２４】
本開示の一実施形態によれば、システム100は、印加された外部電場を変化させることによって、孔の半径を安定化させるようにさらに構成されている。外部電場は、100Voltから1500Voltまでの範囲の電圧によって印加される。印加電圧は、二重層が裂傷しないようにして選択されるべきである。非常に高い電圧はまた、皮膚の炎症につながる可能性もある。角質層は、約100の一連の二重層膜から成り、角質層の透過性の一時的な上昇は、角質層にわたる電圧降下が30〜100V(印加電圧100〜1500V)に到達すると、通常、生じる。このことによりひいては、各皮膚二重層では、電気穿孔電圧スペクトル0.3〜1.0Vは、細胞電気穿孔において使用される電圧とほぼ同じになる。平面脂質膜の電気穿孔の分子動力学シミュレーションは、2つの技法、a)二重層法線にわたる電場直接印加法と、b)電荷不均衡法とを使用して行うことができる。本実施形態は、皮膚SC脂質二重層の電気穿孔を獲得するために、脂質二重層に沿う電場直接印加法を使用している。強さEの電場は、脂質二重層平面(ここでは、XY平面である)と垂直に印加される。これは、帯電した原子「i」すべてに追加の力(F=E.qi)を加えることによって実施される。
【００２５】
本開示の一実施形態によれば、システム100はまた、孔成長速度および穿孔時間を計算するように構成されている。孔成長速度は、所定の時間間隔で孔半径の変化に基づいて決定された。各二重層のスナップショットは、2つの異なるシミュレーション時間において撮影された。二重層法線zに沿う孔サイズの変遷は、上述の手順を使用して計算された。この場合、最後のフレームにx方向のRxE孔半径、最後のフレームにy方向のRyE孔半径、最後のフレームにRE孔半径、最初のフレームにx方向のRxS孔半径、最初のフレームにy方向のRyS孔半径、最初のフレームにRS孔半径である。成長速度は、次の式を使用して計算されている:
【００２６】
【数１】
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【００２７】
ただし、Gは、二重層孔の成長速度であり、Δtは、時間フレームにおける差である。
【００２８】
印加された外部電場と穿孔時間との組合せの最適値もまた、計算され得、それにより、孔形成中に皮膚の炎症または裂傷なしに安全に与えられ得る。最適値は、薬剤分子のサイズおよび皮膚のタイプに応じて、変更されることになる。実験結果に基づいて、孔が出現し始めることになるのはどれくらい後か、同様に、孔が特定のサイズに成長するためにかかることになる時間はどれくらいかが決定され得る。
【００２９】
本開示の一実施形態によれば、システム100はまた、図9に示されているように脂質二重層を再形成するように構成されている。再形成は、外部電場が除去されると、生じる。脂質二重層が再形成されると、ヒト皮膚も自己治癒することになる。本実施形態の一例では、孔は、工程の最初の約10〜20nsまでに消滅した。水孔は、図9における白色ケラレによってマーク付けされている。
【００３０】
操作に際して、ヒト皮膚のシミュレーションを使用して、皮膚電気穿孔の試験に関わるステップを示すフローチャート200が、本開示の一実施形態による図3aおよび図3bに示されている。最初に、ステップ202において、ヒト皮膚の角質層の層の分子モデルが、プロセッサに対して提供される。角質層の層は、脂質二重層を含む。次のステップ204では、シミュレーションのための平衡環境を創出するために複数のパラメータが設定される。複数のパラメータには、皮膚温度、圧力、皮膚脂質相互作用の力場パラメータ、印加電場、もしくは温度結合などのうちの1つまたは複数が含まれる。
【００３１】
次のステップ206では、外部電場が、脂質二重層にわたって印加される。外部電場の印加の結果、角質層の層の脂質二重層の内側に孔が生成される。ステップ208において、二重層にわたる孔の半径が、印加された外部電場に基づいて測定される。次のステップ210では、孔の半径は、印加された外部電場を変化させることによって安定化する。最終的には、ステップ212において、外部電場は、除去される。外部電場の除去の結果、脂質二重層が再形成され、ヒト皮膚が自己治癒する。
【００３２】
本開示の一実施形態によれば、システム100はまた、電気穿孔を使用して薬剤を送達するように構成されている。図9は、0〜20nsの時系列に沿って孔を介して薬剤を送達する過程の側面図を示している。脂質分子の鎖は、明瞭にする目的で示されていない。CER、CHOL、FFA、および薬剤分子(白色)が示されている。薬剤分子は、白色ケラレによってマーク付けされている。各スナップショットにおいて与えられている時間は、二重層の親水性孔を介した薬剤分子の透過動態を表している。透過過程は、性質上、確率論的であり、ここで表されている正確な時間値は、必ずしも再現可能というわけではない。
【００３３】
シミュレーションはすべて、GROMACS分子動力学パッケージを使用して、NVTアンサンブルおよびNPTアンサンブルにおいて行われた。本例では、温度は、時定数が2psのBerendsenサーモスタット(平衡工程)およびNose-Hoverサーモスタット(生産工程)を使用して、皮膚温度約310Kにおいて調整された。圧力は、半等方結合による平衡工程ならびに生産工程それぞれにおいて、時定数がそれぞれ6psおよび12psと圧縮率が4.0×10-5bar-1のBerendsenおよびParrinello-Rahmanの圧調節器によって調整された。圧力は、張力のない二重層を得るために、X、YおよびZ方向に独立に調整された。脂質分子と溶質分子との接合はすべて、LINCSアルゴリズムを使用して制約され、水については、SETTLEアルゴリズムが使用された。2fsの時間段階が、すべてのシミュレーションについて使用された。1.2nmのカットオフが、Vander Waal相互作用および静電相互作用について使用された。長距離静電相互作用は、粒子メッシュEwald(PME)法を使用してコンピュータ計算された。二重層系は、3方向すべてにおいて周期的であった。構成は、生産工程では、10psおきにサンプル化された。隣接リストは、10段階おきに更新された。したがって、これらのパラメータは、変更可能であり、これらのパラメータにのみ固執すべきではない。異なるパラメータの使用は、十分に本開示の範囲内である。
【００３４】
電気穿孔によりナノサイズからミクロサイズの孔が脂質二重層に生じることが仮定される。効果を適切に獲得するために、より大きい二重層パッチが使用された。より初期のシミュレーションから取った皮膚脂質二重層のより小さいパッチ(154の脂質(S0)、CER/52、CHOL/50、およびFFA/52、1脂質分子当たり40の水分子)は、616の脂質(S1)および2464の脂質(S2)のより大きい二重層パッチを得るために、XおよびY方向において複製された。各二重層の初期サイズ、ならびに各二重層系における脂質分子および水分子の数は、下のTable 1(表1)に示されている。より大きいパッチはともに、20nsの間、NVT工程にさらされ、その後に200nsのNPT工程が続いた。最終的な平衡化構造は、さらなる電気穿孔シミュレーションに使用された。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
皮膚脂質二重層における孔形成
電気穿孔シミュレーションが行われた二重層系は、Table 1(表1)に示されている。外部電場が、(二重層のXY平面に垂直な)Z方向に印加された。孔形成は、閾値場としても知られている特定の臨界電場後に行われる。閾値場を上回る場はすべて、二重層に孔を形成し、穿孔場として知られている。一旦、トランス角質層電圧(trans stratum corneum voltage)が臨界値30〜100Vに到達すると、皮膚透過性が数桁減少することが、実験上、より早期に示された。角質層は、約100の一連のラメラ二重層で構成されているので、各二重層の効果的なトランス膜電圧は、大抵、0.3〜1.0Vに対応する。この背景に基づいて、実験は、0.3V/nmの電場から開始し、1.0V/nmに到達した。電場の閾値を決定するために、最も小さい二重層系S0(154の脂質)が使用された。電気穿孔過程は、分子スケールにおいて、性質上、確率論的であるので、4つの別個の電気穿孔シミュレーションが各電場において行われた。最初に、0.3V/nmの電場が、二重層法線に沿って印加され、シミュレーションは、200nsの間、行われた。続いて、電場は、各段階において0.1V/nm上昇し、シミュレーションは、各電場において200nsの間、行われた。
【００３７】
水孔安定化
水孔サイズは、穿孔電場の印加後、各二重層系においてさらに大きくなった。水孔を安定化させるために、一旦、孔半径が約3〜4nmにほとんど到達すると、電場は、著しく低減した。水孔安定化シミュレーションは、系S1についてのみ行われた。理由は、系S0は、非常にサイズが小さく(約5nm×5nm)、約3nmの孔サイズでは、二重層が完全に分断されたこと、一方、系S2は、非常にサイズが大きく、コンピュータ計算上、非常に困難であったことである。(孔サイズが約3〜4nmである)二重層の初期構造は、1.0V/nmにおけるS1系の電気穿孔シミュレーションから取った。電気穿孔過程は、性質上、非常に確率論的であるので、複数のシミュレーションが、穿孔場よりも低い各印加電場において実行された。二重層(独立した5つのS1系)は、(0.1V/nmから開始する)より低い電場にさらされ、少なくとも50nsの間、孔が耐えられる持続可能な電場が選択された。印加電場は、段階的に上昇し(1段階当たり0.025V/nm)、シミュレーションは、各段階において50nsの間、実行された。
【００３８】
二重層再形成
穿孔電場の印加後、孔は、印加電場および二重層組成に基づいて、約2ns〜100ns内で二重層系に形成された。穿孔電場が完全に除去されたときに起きることを確認するために、追加のシミュレーションが行われた。これらのシミュレーションは、系S1についてのみ行われた。初期構造(孔がほぼ>3nmの二重層)は、0.8、0.85、0.9、および1.0V/nmの穿孔電場における電気穿孔シミュレーションから取った。3つの独立したシミュレーション(それぞれ20ns)は、電場の印加なしの各構造(3×4=12のシミュレーション)について実行された。
【００３９】
結果
-  S0系における皮膚電気穿孔は、図2に示されているように、1.0V/nmの印加時に5.8nsにおいて行われた。図2は、1.0V/nmの印加電場における電気穿孔シミュレーションのうちの1つの電気穿孔シミュレーションの間の154の脂質の小さい脂質二重層(S0)の前面図を示している。CER、CHOL、およびFFAはそれぞれ、オレンジ色、緑色、および青色で示されている。孔形成は、約5500psにおいて開始する。水孔は、白色の円によってマーク付けされている。電位は、二重層の底部リーフレットに対して上部リーフレットにおいて正である。各スナップショットにおいて与えられている時間は、電場の印加後、二重層において発現した欠陥の動態のみを表している。
-  孔半径は、二重層法線に沿って変化し、これは、図4に示されている本開示の一実施形態による新規に開発された方法を使用して計算された。図4は、二重層法線に沿う二重層の孔サイズの計算を示している。二重層は、XおよびY平面に投影され、それぞれ、0.2nmの小さい瓶に分類された。孔のサイズは、二重層系(S1)における二重層法線zに沿ってエボリュートした。
-  孔は、0.2〜0.25V/nmの電場において安定化した。孔サイズは、図5に示されているように、持続電場が増加するにつれて増大した。図5は、0.2、0.225、および0.25V/nmのより低い持続電場における電気穿孔シミュレーションのうちの1つの電気穿孔シミュレーションの間の616の脂質の大きい脂質二重層(S1)の前面図を示している。電位は、二重層の底部リーフレットに対して上部リーフレットにおいて正である。5つの独立したシミュレーションは、各印加電場(0.2、0.225、および0.25V/nm)について実行され、孔が安定したままである系のスナップショットがここに示されている。これらのシミュレーションについての初期孔形成二重層構成は、電気穿孔シミュレーション(電場1.0V/nmにおける系S1)から取った。
-  系S0の穿孔時間は、図6に示されているように、0.8、0.85、0.9、および1.0V/nmの印加された外部電場について84.24±2.11、75.10±2.32、27.67±2.99、および10.71±1.64nsであった。穿孔時間は、水ファイルがスナップショットに示されている二重層の両リーフレットにリンクする前の時間を示している。各印加穿孔電場においては、4つの独立したシミュレーションが実行された。これらの4つの実行の平均は、ここでは図6に示されている。シミュレーションは、S0、S1、S4、S5、およびS6の系について行われた。
-  穿孔時間は、所与の穿孔電場の系サイズの増加につれて減少した。10.71±1.64ns、3.41±0.45ns、および1.28±0.21nsの穿孔時間は、図6に示されているように1.0V/nmの印加電場の系S0、S1、およびS2についてそれぞれ得られた。
-  所与の穿孔場の穿孔時間は、図6に示されているように、CER(S4)二重層においてより高く、CERとFFAの(S6)二重層においてより低かった。
-  閾値電場は、系S6(CERとFFA)について最小であり、S4(CERのみ)について最大であり、次いで、所与の印加電場の場合、穿孔時間は、図6に示されているようにS6系に比較すると、S5系においてより長かった。
-  孔成長は、二重層のサイズだけでなく、組成によっても左右される。孔成長速度は、図7に示されているようにS0系に比較すると、より大きいS1系においてより高かった。
-  所与の穿孔電場の場合、孔成長速度は、図7に示されているように、CERとCHOL、およびCERとFFAの二重層に比較すると、混合のCER、CHOLとFFA(S0とS1)の二重層においてより高かった。二重層に孔を形成する、閾値場を上回るすべての場は、穿孔場と称される。孔成長速度は、所与のシミュレーション時間内に孔半径の変化に基づいて計算された。孔成長は、系S0、S1、S5、およびS6について計算された。各印加穿孔電場において、4つの独立したシミュレーションが実行された。これらの4つの実行の平均は、ここでは図7に示されている。
-  水孔は、シミュレーション実行の最初の約15〜20nsまでに完全に消滅した。孔消滅時間は、12すべてのシミュレーションにおいて同じではなかったが、孔消滅は、図8に示されているように各シミュレーションにおいて観察された。
-  図9は、0.25V/nmの維持電場において、薬剤分子とともにシミュレートされた系のうちの1つの系のスナップショットを示している。4つの分子中3つの分子が、脂質二重層のヘッドグループに残った。1つの分子だけは、水孔に入った。
-  水孔を介した薬剤分子の透過は、瞬間的であり、約20nsでほとんど行われた。小さい二重層系(S0)のさらなる200nsのMDシミュレーションは、4つの安息香酸分子の存在下で行われた。シミュレーション中、図9に示されているように、薬剤分子は1つも脂質二重層内に浸透しなかった。
-  安息香酸薬剤分子の受動的透過が、可能でないか、または非常に遅いかのいずれかであることがわかった。しかしながら、維持電場が印加されると、図9に示されているように、透過は、20ns内に起きた。
【００４０】
記載の説明は、当業者が諸実施形態を作成し使用できるようにするために、本明細書における主題について述べている。主題の実施形態の範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者には想到される他の修正形態を含み得る。そのような他の修正形態は、それらが特許請求の範囲の文字通りの文言とは異なっていない同様の要素を有する場合、またはそれらが特許請求の範囲の文字通りの文言とは実質的にほとんど異なっていない等価な要素を含んでいる場合、特許請求の範囲内にあるように意図されている。
【００４１】
本明細書における本開示の実施形態は、皮膚電気穿孔のin-silico設計のためのシステムおよび方法を提供する。さらには、この方法はまた、薬剤送達に使用され得る。
【００４２】
しかしながら、保護の範囲が、そのようなプログラム、さらにはメッセージを中に有するコンピュータ可読手段まで拡張されることを理解すべきであり、そのようなコンピュータ可読ストレージ手段は、プログラムが、サーバもしくはモバイルデバイス、または任意の適切なプログラマブルデバイスにおいて動作するとき、方法の1つまたは複数のステップを実施するためのプログラムコード手段を含んでいる。ハードウェアデバイスは、たとえば、サーバもしくはパーソナルコンピュータなどのような任意の種類のコンピュータ、あるいはそれらの任意の組合せを含む、プログラムされ得る任意の種類のデバイスとすることができる。デバイスはまた、たとえば特定用途向け集積回路(ASIC)のようなハードウェア手段、フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)、またはハードウェア手段とソフトウェア手段、たとえばASICとFPGA、あるいは少なくとも1つのマイクロプロセッサと中にソフトウェアモジュールが置かれている少なくとも1つのメモリとの組合せとすることもでき得る手段を含む。したがって、手段は、ハードウェア手段とソフトウェア手段をともに含むことができる。本明細書において説明する方法実施形態は、ハードウェアおよびソフトウェアにおいて実施可能になる。デバイスはまた、ソフトウェア手段を含むことができる。代替として、実施形態は、たとえば複数のCPUを使用して、異なるハードウェアデバイスにおいて実施され得る。
【００４３】
本明細書における実施形態は、ハードウェア要素およびソフトウェア要素を含むことができる。ソフトウェアにおいて実施される実施形態は、ファームウェア、常駐ソフトウェア、マイクロコードなどを含むが、それらに限定されない。本明細書において説明する様々なモジュールによって行われる機能は、他のモジュール、または他のモジュールの組合せにおいて実施され得る。これを説明する目的として、コンピュータ使用可能またはコンピュータ可読媒体が、命令実行システム、装置、もしくはデバイスによって、またはそれらとの関連で使用される、プログラムを含む、記憶する、伝達する、伝搬する、あるいは輸送することができる任意の装置とすることができる。
【００４４】
媒体は、電子、磁気、光学、電磁、赤外線、または半導体のシステム(または装置もしくはデバイス)、あるいは伝搬媒体とすることができる。コンピュータ可読媒体の例には、半導体または固体メモリ、磁気テープ、リムーバブルコンピュータディスケット、ランダムアクセスメモリ(RAM)、読取り専用メモリ(ROM)、剛性磁気ディスク、および光ディスクが含まれる。光ディスクの現在の例には、コンパクトディスク読取り専用メモリ(CD-ROM)、コンパクトディスク読取り/書込み(CD-R/W)、およびDVDが含まれる。
【００４５】
プログラムコードを記憶し、かつ/または実行するのに適しているデータ処理システムは、システムバスを経由してメモリ要素に直接的、または間接的に結合されている少なくとも1つのプロセッサを含むことになる。メモリ要素は、プログラムコードの実際の実行中に利用されるローカルメモリ、バルクストレージ、および実行中、コードが、バルクストレージから読み出されなくてはならない回数を低減させるために少なくとも何らかのプログラムコードの一時的な記憶を可能にするキャッシュメモリを含むことができる。
【００４６】
入力/出力(I/O)デバイス(キーボード、ディスプレイ、ポインティングデバイスなどを含むが、それらに限定されない)は、直接的に、または介在するI/Oコントローラを経由してのいずれかで、システムに結合され得る。ネットワークアダプタもまた、システムに結合されて、データ処理システムが他のデータ処理システム、またはリモートプリンタ、またはストレージデバイスに、介在する個人または公共のネットワークを経由して結合されるようにすることを可能にすることができる。モデム、ケーブルモデム、およびEthernet(登録商標)カードは、現在利用可能なタイプのネットワークアダプタのうちのほんのいくつかにすぎない。
【００４７】
実施形態を実施するための代表的なハードウェア環境は、本明細書における実施形態による情報処理/コンピュータシステムのハードウェア構成を含み得る。本明細書におけるシステムは、少なくとも1つのプロセッサまたは中央処理装置(CPU)を含む。CPUは、システムバスを介して、ランダムアクセスメモリ(RAM)、読取り専用メモリ(ROM)、および入力/出力(I/O)アダプタなどの様々なデバイスに相互接続されている。I/Oアダプタは、ディスク装置、およびテープドライブ、またはシステムによって読取り可能な他のプログラムストレージデバイスなど、周辺デバイスに接続することができる。システムは、プログラムストレージデバイス上の本発明の命令を読み取り、これらの命令に従って、本明細書における実施形態の方法論を実行することができる。
【００４８】
システムは、キーボード、マウス、スピーカ、マイクロフォン、および/またはタッチスクリーンデバイス(図示せず)などの他のユーザインターフェースデバイスをバスに接続してユーザ入力を収集するユーザインターフェースアダプタをさらに含む。加えて、通信アダプタは、バスをデータ処理ネットワークに接続し、ディスプレイアダプタは、バスを、たとえばモニタ、プリンタ、または送信機などの出力デバイスとして実装され得るディスプレイデバイスに接続する。
【００４９】
前述の説明を、様々な実施形態を参照して提示してきた。本願が関係する分野および技術の当業者であれば、原理、趣旨、および範囲から意味上、逸脱することなく、説明の構造および操作方法の代替形態ならびに変更形態が実施され得ることを認識するであろう。
【符号の説明】
【００５０】
100  システム
102  第1のユーザインターフェース、第1の入力モジュール
104  第2のユーザインターフェース、第2の入力モジュール
106  メモリ
108  プロセッサ
110  シミュレーションモジュール
200  フローチャート
【図１】
2019025334.tif 000005
【図２】
2019025334.tif 000006
【図３ａ】
2019025334.tif 000007
【図３ｂ】
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【図４】
2019025334.tif 000009
【図５】
2019025334.tif 000010
【図６】
2019025334.tif 000011
【図７】
2019025334.tif 000012
【図８】
2019025334.tif 000013
【図９】
2019025334.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月9日(2018.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト皮膚のシミュレーションを使用して、皮膚電気穿孔を試験するための方法であって、プロセッサにより実施されるステップを含み、前記ステップが、
前記ヒト皮膚の角質層の層の分子モデルを提供するステップであって、前記角質層の層が、脂質二重層を含む、ステップと、
前記シミュレーションのための平衡環境を創出するために複数のパラメータを設定するステップと、
前記脂質二重層にわたって外部電場を印加するステップであって、前記外部電場の前記印加の結果、前記角質層の層の前記脂質二重層の内側に孔が生成される、ステップと、
前記印加された外部電場に基づいて、前記脂質二重層にわたる前記孔の半径を測定するステップと、
前記印加された外部電場を変化させることによって、前記孔の半径を安定化させるステップと、
前記外部電場を除去するステップであって、外部電場の前記除去の結果、前記脂質二重層が再形成され、ヒト皮膚が自己治癒する、ステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記外部電場の存在下で、前記孔を介して薬物透過を試験するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記印加された外部電場に基づいて、孔成長速度を測定するステップをさらに含み、前記孔成長速度が、所定の時間間隔での前記孔の半径における変化を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記孔の半径が、x方向およびy方向の孔の半径の幾何平均を使用して計算される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のパラメータが、皮膚温度、圧力、皮膚脂質相互作用の力場パラメータ、印加電場、もしくは温度結合のうちの1つまたは複数を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記外部電場が、前記ヒト皮膚の前記脂質二重層にわたって印加される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
皮膚膜の角質層の層の前記分子モデルが、セラミド、コレステロール、および遊離脂肪酸から成る、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記孔の形成は、前記外部電場が閾値電場値を超えた後、開始し、前記閾値電場値が、前記ヒト皮膚の組成に依存している、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記外部電場が、30ボルトから1500ボルトの間である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記印加された外部電場に基づいて、穿孔時間を測定するステップをさらに含み、前記穿孔時間が、前記印加された外部電場の孔の形成に必要な時間を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト皮膚の安全性を確保するために、前記印加された外部電場と穿孔時間との最適値を決定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
ヒト皮膚のシミュレーションを使用して、皮膚電気穿孔を試験するためのシステムであって、
前記ヒト皮膚の角質層の層の分子モデルを提供する第1の入力モジュールであって、前記角質層の層が、脂質二重層を含む、第1の入力モジュールと、
前記シミュレーションのための平衡環境を創出するために複数のパラメータを設定する第2の入力モジュールと、
メモリと、
前記メモリと通信しているプロセッサと
を備え、前記プロセッサが、
前記脂質二重層にわたって外部電場を印加するステップであって、前記外部電場の前記印加の結果、前記角質層の層の前記脂質二重層の内側に孔が生成される、ステップと、
前記印加された外部電場に基づいて、前記脂質二重層をわたる前記孔の半径を測定するステップと、
前記印加された外部電場を変化させることによって、前記孔の半径を安定化させるステップと、
前記外部電場を除去するステップであって、外部電場の前記除去の結果、前記脂質二重層が再形成され、ヒト皮膚が自己治癒する、ステップと
を行うようにさらに構成されている、システム。
【請求項１３】
ヒト皮膚のシミュレーションを使用して、皮膚電気穿孔を試験するための方法を実行するためのコンピュータプログラムを実装した1つまたは複数の非一時的コンピュータ可読情報媒体であって、前記方法は、
前記ヒト皮膚の角質層の層の分子モデルを提供するステップであって、前記角質層の層が、脂質二重層を含む、ステップと、
前記シミュレーションのための平衡環境を創出するために複数のパラメータを設定するステップと、
前記脂質二重層にわたって外部電場を印加するステップであって、前記外部電場の前記印加の結果、前記角質層の層の前記脂質二重層の内側に孔が生成される、ステップと、
前記印加された外部電場に基づいて、前記脂質二重層にわたる前記孔の半径を測定するステップと、
前記印加された外部電場を変化させることによって、前記孔の半径を安定化させるステップと、
前記外部電場を除去するステップであって、外部電場の前記除去の結果、前記脂質二重層が再形成され、ヒト皮膚が自己治癒する、ステップと
を含む、1つまたは複数の非一時的コンピュータ可読情報媒体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
関連出願の相互参照および優先権
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、2017年7月27日に出願された印国特許出願第201721026791号の優先権を主張するものである。
本明細書における諸実施形態は、一般に、ヒト皮膚のモデル化およびシミュレーションの分野に関し、より詳細には、皮膚電気穿孔のin-silico設計および試験のための方法ならびにシステムに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
別の態様では、ここでの実施形態は、ヒト皮膚のシミュレーションを使用して、皮膚電気穿孔を試験するための方法を提供する。最初に、ヒト皮膚の角質層の層の分子モデルが提供され、この角質層の層は、脂質二重層を含む。次のステップでは、シミュレーションのための平衡環境を創出するために複数のパラメータが設定される。次のステップでは、外部電場が脂質二重層にわたって印加され、外部電場の印加の結果、角質層の層の脂質二重層の内側に孔が生成される。次いで、二重層にわたる孔の半径が、印加された外部電場に基づいて測定される。次いで、孔の半径は、印加された外部電場を変化させることによって安定化する。最終的には、外部電場は除去され、外部電場の除去の結果、脂質二重層が再形成され、ヒト皮膚が自己治癒する。
さらなる別の態様では、ここでの実施形態は、ヒト皮膚のシミュレーションを使用して、皮膚電気穿孔を試験するための方法を実行するためのコンピュータプログラムを実装した非一時的コンピュータ可読媒体をさらに提供する。最初に、ヒト皮膚の角質層の層の分子モデルが提供され、この角質層の層は、脂質二重層を含む。次のステップでは、シミュレーションのための平衡環境を創出するために複数のパラメータが設定される。次のステップでは、外部電場が脂質二重層にわたって印加され、外部電場の印加の結果、角質層の層の脂質二重層の内側に孔が生成される。次いで、二重層にわたる孔の半径が、印加された外部電場に基づいて測定される。次いで、孔の半径は、印加された外部電場を変化させることによって安定化する。最終的には、外部電場は除去され、外部電場の除去の結果、脂質二重層が再形成され、ヒト皮膚が自己治癒する。
【外国語明細書】
2019025334000001.pdf