(57)【要約】      （修正有）【課題】エマラウイルス属ウイルスを網羅的且つ迅速に検出する遺伝子診断法の提供。【解決手段】以下の（Ａ）〜（Ｃ）のプライマーのいずれか2つを含む、エマラウイルス属ウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。（Ａ）エマラウイルス属ウイルスのRNA1におけるｍｏｔｉｆ２の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー；（Ｂ）エマラウイルス属ウイルスのRNA1におけるｍｏｔｉｆＡの塩基配列から成る保存領域に対するプライマー；（Ｃ）エマラウイルス属ウイルスのRNA1におけるｍｏｔｉｆ３の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(A)〜(C)のプライマーのいずれか2つを含む、エマラウイルス属ウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(A) エマラウイルス属ウイルスのRNA1における配列番号１記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー；
(B) エマラウイルス属ウイルスのRNA1における配列番号２記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー；
(C) エマラウイルス属ウイルスのRNA1における配列番号３記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー
【請求項２】
以下の(a)〜(e)のいずれか1つのプライマーセットである、請求項１記載のプライマーセット。
(a) 配列番号４記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号５記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット；
(b) 配列番号６記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号７記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット；
(c) 配列番号８記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号９記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット；
(d) 配列番号１０記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号９記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット；
(e) 配列番号１１記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号１２記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット
【請求項３】
請求項１又は２記載のプライマーセットを含む、エマラウイルス属ウイルス検出又はエマラウイルス属ウイルス感染診断用キット。
【請求項４】
請求項１若しくは２記載のプライマーセット又は請求項３記載のキットを用いて、エマラウイルス属ウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行う工程を含む、エマラウイルス属ウイルス検出又はエマラウイルス属ウイルス感染診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば植物ウイルスのエマラウイルス属ウイルスを検出するウイルス診断法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物の病害発生に効果的に対処するためには、迅速な病原体の特定が不可欠である。病原体の中でも植物ウイルスは、培養や光学顕微鏡では診断ができないため、迅速な検出診断には遺伝子診断法が重要となる。
【０００３】
ところで、国際ウイルス分類委員会において植物ウイルスの分類群として近年確立されたエマラウイルス属のウイルスは、世界各地の果樹、花き、穀類等で甚大な被害をもたらしていることが明らかとなってきた。
【０００４】
現在までに、エマラウイルス属ウイルスとして6種が設定されているが、近年発見されたエマラウイルスと考えられる暫定種を含めると12種が存在し、今後も発見が相次ぐものと思われる。国内においては、イチジクモザイクウイルス(Fig mosaic virus(FMV))の他、本発明者等は、オオバ(青しそ)の生産に障害となっているモザイク病の病原体が、新種のエマラウイルスであるシソモザイクウイルス(Perilla mosaic virus(PMoV))であることを解明した。
【０００５】
エマラウイルスは、インドでは年300億円を超える甚大な被害が発生しているが(非特許文献１)、未発生国においても一度発生すれば農業被害や貿易の阻害をもたらすと考えられることから、植物検疫等において厳重な規制がかけられている(非特許文献２〜６)。
【０００６】
また、国内へのエマラウイルスの侵入を防ぐとともに、政府が推進する「攻めの農林水産業」のためには、農産物がエマラウイルスに感染していないことを証明する手段の必要性が高まっている。
【０００７】
一方、非特許文献７では、5種類のエマラウイルス(European mountain ash ringspot-associated virus(EMARaV)、FMV、Rose rosette virus(RRV)、Raspberry leaf blotch virus(RLBV)、Redbud yellow ringspot virus(RYRV))の塩基配列に基づいて設計した2種類のプライマーセットを用い、供試した4種類のウイルス(EMARaV、FMV、Pigeonpea sterility mosaic virus(PPSMV)、High Plains wheat mosaic virus (HPWMoV)[Maize red stripe virus(MRSV)])の全てを検出することに成功した。
【０００８】
非特許文献８では、6種類のエマラウイルス(EMARaV、FMV、PPSMV、PPSMV2、RRV、HPWMoV)の検出を試み、4種の検出に成功したが、PPSMV及びPPSMV2は検出できなかった。
【０００９】
しかしながら、これらの従来の検出方法は、エマラウイルス属ウイルスを網羅的且つ迅速に検出するには十分ではなく、またエマラウイルスの存在を見落とす虞がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Patil and Kumar, 2015. Pigeonpea sterility mosaic virus: a legume-infecting Emaravirus from South Asia. Mol. Plant Pathol. 16:775-786.
【非特許文献２】Irwin et al. 1999. Pathogen risks associated with bulk maize imports to Australia from the United States of America.
【非特許文献３】Coutts et al. 2014. First report of Wheat mosaic virus infecting wheat in Western Australia. Plant Dis. 98:285.
【非特許文献４】Lebas et al. 2005. Development of an RT-PCR for High Plains virus indexing scheme in New Zealand post-entry quarantine. Plant Dis. 89:1103-1108.
【非特許文献５】Ochoa-Corona et al. 2015. New Zealand stresses that it is High Plains virus free, and the virus struggles with an identity crisis. J. Virol. 89:7439-7440.
【非特許文献６】Botelho et al. 2016. Interception of Wheat mosaic virus (WMoV) in Brazil in maize seeds from the United States. Pesq. agropec. bras., Brasilia. 51:688-691.
【非特許文献７】Elbeaino et al. (2013). Emaravirus-specific degenerate RT-PCR primers allowed the identification of partial RNA-dependent RNA polymerase sequences of Maize red stripe virus and Pigeonpea sterility mosaic virus. J. Virol. Methods. 188:37-40.
【非特許文献８】Olmedo-Velarde et al. (2016) Towards a broad detection of emaraviruses: Endpoint RT-PCR reaction. American Phytopathological Society Meeting, August, 2016, Tampa, Florida, USA.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上述の実情に鑑み、エマラウイルス属ウイルスを網羅的且つ迅速に検出する遺伝子診断法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、エマラウイルス属ウイルスの配列情報に基づいて新たに設計したプライマーセットを用いたRT-PCRによれば、エマラウイルス属ウイルスを網羅的且つ迅速に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）以下の(A)〜(C)のプライマーのいずれか2つを含む、エマラウイルス属ウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(A) エマラウイルス属ウイルスのRNA1における配列番号１記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー；
(B) エマラウイルス属ウイルスのRNA1における配列番号２記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー；
(C) エマラウイルス属ウイルスのRNA1における配列番号３記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー
（２）以下の(a)〜(e)のいずれか1つのプライマーセットである、（１）記載のプライマーセット。
(a) 配列番号４記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号５記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット；
(b) 配列番号６記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号７記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット；
(c) 配列番号８記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号９記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット；
(d) 配列番号１０記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号９記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット；
(e) 配列番号１１記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号１２記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット
（３）（１）又は（２）記載のプライマーセットを含む、エマラウイルス属ウイルス検出又はエマラウイルス属ウイルス感染診断用キット。
（４）（１）若しくは（２）記載のプライマーセット又は（３）記載のキットを用いて、エマラウイルス属ウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行う工程を含む、エマラウイルス属ウイルス検出又はエマラウイルス属ウイルス感染診断方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、農業分野において、果樹、花き、穀類、野菜等に感染する既知又は未知のエマラウイルス属ウイルスを迅速且つ網羅的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】エマラウイルスRNA1の塩基配列の各モチーフにおけるアラインメントを示す。塩基配列はDNAで表す。全ての配列で保存された塩基は背景色なしで表示した。各縮重プライマーがアニールする領域及び伸長方向を、新規プライマーは実線矢印、既報プライマー(非特許文献７)は破線矢印で示した。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図２】エマラウイルスRNA1における縮重プライマーの標的位置を示す。上のバーはエマラウイルスのRNA1(全長約7.2 kbのうちnt 3000〜4000の領域)を示し、破線と実線の長方形はそれぞれ既報及び今回新たに見出した保存モチーフを示す。表３、４に示した各縮重プライマーがアニールする位置を矢印で示した。
【図３】各種プライマーセットを用いて行ったRT-PCRのゲル電気泳動像である。#1〜#6は新たに設計したエマラウイルス検出用縮重プライマーであり、#7と#8は既報のユニバーサルプライマー(非特許文献７)である。各プライマーによる増幅産物の想定サイズを下に記す。各レーンの上に記したサンプル名は、H：健全シソ葉、P：PMoV感染シソ葉、F：FMV感染イチジク葉である。
【図４】新規プライマーセットを用いたワンステップRT-PCRのゲル電気泳動像である。#1又は#3の新規プライマーセットを用いてワンステップRT-PCR反応を行った。各レーンの上に記したサンプルは、H：健全シソ葉、P：PMoV感染シソ葉、F：FMV感染イチジク葉である。各プライマーによる増幅産物の想定サイズを下に記す。
【図５】人工合成DNAを用いた新規プライマーセットの絞り込みに関するPCRのゲル電気泳動像である。#2を除く新規プライマーセットを用いてPCR反応を行った。サンプルは健全シソ葉(レーン1)、PMoV感染シソ葉(レーン2)、FMV感染イチジク葉(レーン3)、EMARaV(レーン4)、RLBV(レーン5)、HPWMoV(レーン6)、PPSMV(レーン7)、RYRV(レーン8)、PPSMV2(レーン9)である。レーン1〜3は植物RNA由来のcDNA、レーン4〜9は人工合成DNA(プラスミド)を鋳型とした。プライマーセット#1と#3を選定した。
【図６】縮重プライマーセットによる10種のエマラウイルス種の検出感度の比較を示すRT-PCRのゲル電気泳動像である。#1と#3は本願における新規のプライマーセットであり、#7と#8は既報のプライマーセットである。レーンMは100 bpラダー、以下は順に、AcCRaV、EMARaV、FMV、PMoV、PPSMV、PPSMV2、RLBV、RRV、RYRV、HPWMoVである。各レーンの-は健全宿主植物RNAのみ、+は人工合成ウイルスRNAを加えたサンプル(ただしFMVとPMoVは実際の感染葉のRNA)からの増幅産物である。
【図７】縮重プライマーセットによるエマラウイルス様の新規ウイルスの検出を示すRT-PCRのゲル電気泳動像である。#1と#3は本願における新規のプライマーセットであり、#7と#8は既報のプライマーセットである。上段はシキミ、下段はナシ葉から抽出したトータルRNAでのRT-PCRの結果である。各レーンのHは無病徴のシキミ又はナシの葉、Mは、輪紋症状(シキミ)及びモザイク症状(ナシ)を示す葉である。矢頭で示した増幅産物は、エマラウイルスのRNA1に配列類似性を示し、新種のエマラウイルスが検出された可能性が示唆された。#7、#8では、想定サイズの増幅産物は得られなかった。Specific primersは、シキミ及びナシから見出されたエマラウイルス様配列を元に後から設計した特異的プライマーであり、症状のあるサンプルからは増幅産物が得られた。ナシでは無病徴葉にも薄いバンドがあるため、低濃度で感染している可能性がある。
【図８】ナシ及びシキミから検出されたエマラウイルス様配列の系統樹解析の結果を示す。既知のエマラウイルス及びナシ、シキミから得られた塩基配列から、Motif 2からMotif 3にかけての約500塩基の配列を、MEGA7.0(Kumar et al. (2016) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for bigger datasets. Mol. Biol. Evol. 33:1870-1874.)を用いてアラインメントし、近隣結合法を用いて系統樹を作製した。各枝の数値は1000回試行したブートストラップ値を示す。ナシから得られた配列(Nashivirus)及びシキミから得られた配列(Shikimi)は、既知のエマラウイルスの配列と高い類似性を示し、新種のエマラウイルスを検出した可能性が示唆された。
【図９−１】PreMotif A、Motif 2、Motif A、Motif 3及びMotif Cにおける各縮重プライマーとウイルスの塩基配列の比較を示す。塩基配列はDNAで表す。既知エマラウイルス及び新規エマラ様ウイルスの配列計14種類(PreMotif A及びMotif C領域は12種類)をアラインメントし、プライマーセット#1、#3、#7、#8の縮重プライマーと配列を比較した。プライマー塩基配列のうち、全てのウイルス配列に対してミスマッチが生じない塩基を下線なし、いずれかのウイルス配列に対してミスマッチが生じうる塩基を下線ありで記した。#1、#3では、#3のアンチセンスプライマーにシキミのウイルスで1塩基のみミスマッチが見られたが、その他は完全にカバーしていた。#7、#8では、PreMotif A-senseにおいて、FMVの2株(AB697826、AB697827)、PPSMV、PPSMV2でそれぞれ1塩基、PMoVに5塩基、Motif A-sense及びMotif A-antisenseにおいて、PPSMV及びNashivirusでそれぞれ5塩基、HPWMoV(図中ではWMoVと表記)及びShikimiでそれぞれ2塩基、PPSMV2で1塩基、Motif C-antisenseにおいて、FMV(AB697826)及びRYRVでそれぞれ1塩基、PMoV及びWMoVでそれぞれ2塩基、のミスマッチが発生していた。
【図９−２】図９−１の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るプライマーセットは、エマラウイルス属ウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズする以下の(A)〜(C)のプライマーのいずれか2つを含む、エマラウイルス属ウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットである。
(A) エマラウイルス属ウイルスのRNA1における配列番号１記載の塩基配列から成る保存領域(GAYMGDGARAUHUAYACWGGHAAY：Motif 2)に対するプライマー；
(B) エマラウイルス属ウイルスのRNA1における配列番号２記載の塩基配列から成る保存領域(GAUGCHWSNAARUGGUCWGCWMGRGAU：Motif A)に対するプライマー；
(C) エマラウイルス属ウイルスのRNA1における配列番号３記載の塩基配列から成る保存領域(AAYUGGYUDCARGGNAAYYUNAAY：Motif 3)に対するプライマー。
【００１７】
本発明では、シソモザイクウイルス及びデータベース上にあるエマラウイルス属ウイルスのRNA dependent RNA polymerase(RdRP)をコードするRNA1の塩基配列を比較及び分析し、ウイルス種間で配列共通性が高い領域(保存領域)を探索したところ、これまでに報告された領域と異なる、より共通性が高い保存領域として配列番号１記載の塩基配列から成る保存領域(Motif 2)と配列番号３記載の塩基配列から成る保存領域(Motif 3)を新たに見出した(図１及び２)。新たに見出した当該保存領域及び公知の配列番号２記載の塩基配列から成る保存領域(Motif A)の配列に基づき作製したディジェネレート(縮重)プライマーを用いたRT-PCRによれば、既知及び未知のエマラウイルス属ウイルスを網羅的に検出でき、また非特許文献７及び８等に記載の従来のプライマーでは検出されなかったエマラウイルス種についても検出できる。
【００１８】
本発明において検出対象となるエマラウイルス属ウイルスとは、一般にフシダニ類によって媒介され、多分節（4〜8分節）の1本鎖（-）RNAをゲノムとする植物ウイルスを意味する。具体的なエマラウイルス属ウイルスとしては、例えばEuropean mountain ash ringspot-associated virus(EMARaV)、イチジクモザイクウイルス(FMV)、Pigeonpea sterility mosaic virus(PPSMV)、Raspberry leaf blotch virus(RLBV)、Rose rosette virus(RRV)、High Plains wheat mosaic virus(HPWMoV)(別名：Maize red stripe virus(MRSV)、High Plains virus(HPV)又はWheat mosaic virus(WMoV))、Actinidia chlorotic ringspot-associated virus(AcCRaV)、シソモザイクウイルス(PMoV)、Pigeonpea sterility mosaic virus 2(PPSMV2)、Redbud yellow ringspot virus(RYRV)等が挙げられる。また、本発明においては、未知のエマラウイルス属ウイルスを検出することもできる。
【００１９】
上記(A)〜(C)の「保存領域に対するプライマー」とは、保存領域全体若しくはその一部(センス配列)又はそれらの相補的配列(アンチセンス配列)に特異的にアニーリングできるように、保存領域全体若しくはその一部又はそれらの相補的配列と同一の又は実質的に同一の塩基配列を有するプライマーを意味する。ここで、「実質的に同一の塩基配列」とは、1又は数塩基(例えば、1〜3塩基、好ましくは1又は2塩基)が保存領域全体若しくはその一部又はそれらの相補的配列と異なっても、保存領域全体若しくはその一部又はそれらの相補的配列に特異的にアニーリングできる塩基配列を意味する。
【００２０】
(A)のプライマーは、(B)又は(C)のプライマー(リバースプライマー)との組合せでは、フォワードプライマーとして保存領域全体若しくはその一部と同一の又は実質的に同一の塩基配列を有するプライマーである。(B)のプライマーは、(A)のプライマー(フォワードプライマー)との組合せでは、リバースプライマーとして保存領域全体又はその一部の相補的配列と同一の又は実質的に同一の塩基配列を有するプライマーである。あるいは、(B)のプライマーは、(C)のプライマー(リバースプライマー)との組合せでは、フォワードプライマーとして保存領域全体若しくはその一部と同一の又は実質的に同一の塩基配列を有するプライマーである。(C)のプライマーは、(A)又は(B)のプライマー(フォワードプライマー)との組合せでは、リバースプライマーとして保存領域全体又はその一部の相補的配列と同一の又は実質的に同一の塩基配列を有するプライマーである。
【００２１】
(A)〜(C)のプライマーは、例えばRT-PCRによる検出に適する縮重度(1,000以下、好ましくは200以下)やTm値(35〜65℃、好ましくは45〜55℃)を考慮して設計することができる。また、プライマーの縮重度が高くなりすぎないように、標的配列に対して結合しないが、2本鎖形成を阻害することもないイノシン残基(I)を、(A)〜(C)のプライマーの塩基として、例えば1〜3塩基(好ましくは1又は2塩基)含んでもよい。さらに、(A)〜(C)のプライマーの長さは、標的配列に特異的にアニーリングできる長さであれば特に限定されないが、例えば18塩基〜保存領域全体の長さ、好ましくは20塩基〜保存領域全体の長さが挙げられる。
【００２２】
本発明に係る具体的なプライマーセットとしては、以下の(a)〜(e)のいずれかのプライマーセットが挙げられる。
(a) 配列番号４記載の塩基配列(GDGARATHTAYACWGGHAAY)を含むか又はそれから成るプライマー(Ema-Motif 2-s-20mer：フォワードプライマーとしての(A)のプライマーに相当)と配列番号５記載の塩基配列(GCWGACCAYTTNSWDGCATC)を含むか又はそれから成るプライマー(Ema-Motif A-as-20mer：リバースプライマーとしての(B)のプライマーに相当)とから成るプライマーセット(実施例における#1のプライマーセット)；
(b) 配列番号６記載の塩基配列(GATGCHWSNAARTGGTCWGC)を含むか又はそれから成るプライマー(Ema-Motif A-s-20mer：フォワードプライマーとしての(B)のプライマーに相当)と配列番号７記載の塩基配列(ARRTTNCCYTGHARCCARTT)を含むか又はそれから成るプライマー(Ema-Motif 3-as-20mer：リバースプライマーとしての(C)のプライマーに相当)とから成るプライマーセット(実施例における#3のプライマーセット)；
(c) 配列番号８記載の塩基配列(GAYMGIGARATITAYACWGGHAAY)を含むか又はそれから成るプライマー(Ema-Motif 2-s-2I-24mer：フォワードプライマーとしての(A)のプライマーに相当)と配列番号９記載の塩基配列(GCWGACCAYTTISWDGCATC)を含むか又はそれから成るプライマー(Ema-Motif A-as-I-20mer：リバースプライマーとしての(B)のプライマーに相当)とから成るプライマーセット(実施例における#4のプライマーセット)；
(d) 配列番号１０記載の塩基配列(GAYMGDGARATHTAYACWGG)を含むか又はそれから成るプライマー(Ema-Motif 2-s-I-20mer：フォワードプライマーとしての(A)のプライマーに相当)と配列番号９記載の塩基配列(GCWGACCAYTTISWDGCATC)を含むか又はそれから成るプライマー(Ema-Motif A-as-I-20mer：リバースプライマーとしての(B)のプライマーに相当)とから成るプライマーセット(実施例における#5のプライマーセット)；
(e) 配列番号１１記載の塩基配列(GATGCHWSIAARTGGTCWGC)を含むか又はそれから成るプライマー(Ema-Motif A-s-I-20mer：フォワードプライマーとしての(B)のプライマーに相当)と配列番号１２記載の塩基配列(RTTIARRTTICCYTGHARCC)を含むか又はそれから成るプライマー(Ema-Motif 3-as-2I-20mer：リバースプライマーとしての(C)のプライマーに相当)とから成るプライマーセット(実施例における#6のプライマーセット)。
【００２３】
また、本発明は、本発明に係るプライマーセットを含む、エマラウイルス属ウイルス検出又はエマラウイルス属ウイルス感染診断用キットに関する。当該キットは、例えばRT-PCRに使用する逆転写酵素、DNAポリメラーゼ；RT-PCRに使用する核酸合成基質(dNTP)、緩衝液、塩類、容器等；RT-PCR増幅産物の検出に必要な試薬類(例えば、アガロースゲル、エチジウムブロマイド等)；使用説明書等を更に含むことができる。
【００２４】
さらに、本発明は、以上に説明する本発明に係るプライマーセット又はキットを使用して、エマラウイルス属ウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行う工程を含む、エマラウイルス属ウイルス検出又はエマラウイルス属ウイルス感染診断方法(以下、「本方法」と称する)に関する。本方法は、本発明に係るプライマーセットを用いた核酸増幅反応を行う工程を含み、例えばRT-PCR法、定量的RT-PCR法、RT-nested PCR法、ワンステップRT-PCR法等を利用することができる。
【００２５】
例えば、本方法においてRT-PCR法を使用する場合には、先ず、従来公知の方法に従い、エマラウイルス属ウイルス感染の有無の検出対象の植物由来のサンプルからRNAを抽出及び精製し、精製したRNAを鋳型とし、逆転写酵素及びランダムヘキサマー等のプライマーを用いて、cDNAを作製する。ここで、植物由来のサンプルとしては、例えば植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)、植物培養細胞等が挙げられる。
【００２６】
次いで、作製したcDNAを鋳型として、本発明に係るプライマーセットを用いたPCRに供する。PCR反応液は、例えば反応液25μL当たり、本発明に係るプライマーセットに含まれる各プライマーを終濃度0.1〜10μM(好ましくは1.0〜3.0μM)、cDNA 0.1〜2μL(好ましくは0.2〜1μL)、DNAポリメラーゼ0.1〜2U(好ましくは0.5〜1U)、及びdNTPを終濃度0.1〜1mM(好ましくは0.1〜0.3mM)で含まれるように調製する。また、PCRのサーマルサイクリング条件としては、使用するプライマーセットに応じて適宜決定することができるが、例えば変性：90〜99℃(好ましくは94〜98℃) 1〜60秒(好ましくは5〜10秒)、アニーリング：35〜65℃(好ましくは42〜48℃) 10〜60秒(好ましくは15〜30秒)、伸長：65〜75℃(好ましくは68〜72℃) 10〜60秒(好ましくは15〜30秒)の25〜50サイクル(例えば35〜45サイクル)が挙げられる。
【００２７】
次いで、PCR反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色により、使用したプライマーセットから想定されるサイズの増幅産物の有無を確認する。増幅産物の有無により、エマラウイルス属ウイルス感染を診断(又は検査若しくは評価)することができる。
【００２８】
また、本方法において定量的RT-PCR法を使用する場合には、例えば上記RT-PCR法で使用する試薬以外に、増幅領域内に相補的に結合する蛍光プローブ(5'末端にレポーターを標識し、且つ3'末端にクエンチェーを標識した蛍光プローブ等)を使用してPCRを行い、蛍光シグナルを指標として増幅産物を定量することができる。
【００２９】
本方法においてRT-nested PCR法を使用する場合には、本発明に係るプライマーセットで増幅する標的領域の外側の位置にアニーリングするプライマーセットを使用し、植物由来のサンプルからのRNAを鋳型として、cDNAをPCR増幅する。次いで、上記RT-PCR法と同様に、当該cDNAを鋳型として本発明に係るプライマーセットを用いたPCRに供する(Nested PCR)。
【００３０】
本方法においてワンステップRT-PCR法を使用する場合には、本発明に係るプライマーセットそのものを使用し、植物由来のサンプルからのRNAを鋳型としてcDNAを作製すると共に、作製したcDNAを鋳型としたPCRを行う。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３２】
エマラウイルス属はフシダニ類媒介性の植物ウイルスとして、農業生産上の大きな障害である。また、未同定の新種のウイルス種が多数いると推測されている(Mielke-Ehret and Muehlbach (2012) Emaravirus: A Novel Genus of Multipartite, Negative Strand RNA Plant Viruses. Viruses 4:1515-1536.)。エマラウイルスの検出診断法として、非特許文献７は、5種のエマラウイルス(EMARaV、FMV、RLBV、RRV、RYRV)の塩基配列に基づいた縮重プライマーとRT-PCR法による手法を報告している。
【００３３】
本実施例では、この5種に加え、その後データベースに登録されたPPSMV、PPSMV2、HPWMoV及び、本発明者等が発見した新種のシソモザイクウイルス(PMoV)の配列情報に基づき、さらに広範なエマラウイルス種を検出できる縮重プライマーを設計した。
【００３４】
1. エマラウイルス検出用縮重プライマーの設計
エマラウイルスのRNA1がコードするRNA dependent RNA polymerase(RdRP)のアミノ酸配列を取得するため、NCBIのデータベースから、表１に示すエマラウイルス9種(計12株)の配列を得た。これらに、本発明者等が発見したシソモザイクウイルス(Perilla mosaic virus)のRdRP全長配列も加え、ClustalX(Thompson et al. (1997) The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 25:4876-4882.)によりアミノ酸配列をアラインメントし、保存性の高い領域を探索した。その結果、非特許文献７がプライマーの標的として用いている保存領域(PreMotif A、Motif A、Motif C)の他に、2つの保存性の高い領域を見出し、Motif 2とMotif 3と名付けた(図１）。これらMotifの位置関係を図２に示す。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
各Motifについて、RdRP遺伝子上の塩基配列を比較するため、各エマラウイルス種の塩基配列を同様に取得した(表２）。塩基配列のアラインメントをとり、Motif 2からMotif Aまで、及びMotif AからMotif 3までをRT-PCR法により増幅するための縮重プライマーを各3セット(計6セット)設計した(図１）。うち3セットには、プライマーの縮重度が高くなりすぎないよう、イノシン残基を用いた(表３）。各プライマーセットに用いるプライマーの組み合わせを表４に、ウイルスRNA上の標的位置を図２に示す。
【００３７】
【表２】
2019013169.tif 000004
【００３８】
【表３】
2019013169.tif 000005
【００３９】
【表４】
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【００４０】
2. 国内発生エマラウイルス種(PMoV及びFMV)の検出可能性の検討
エマラウイルスのうち国内発生種であるPMoV及びイチジクモザイクウイルス(FMV)に対して、設計したプライマーによる検出を試みた。検出感度等について非特許文献７のプライマーと比較した。
【００４１】
先ず、健全シソ葉、PMoV感染シソ葉、FMV感染イチジク葉から、TRIzol Reagent(Thermo Scientific)を用いてトータルRNAを精製した。このRNAを鋳型に、PrimeScript Reverse Transcriptase(タカラバイオ社）を用いてcDNAを作製した。プライマーにはランダムヘキサマーを用い、手順は製品説明書に準じた。
【００４２】
このcDNAを鋳型に、縮重プライマーセット(表４：#1〜#8)とTaq DNA Polymerase(タカラバイオ社)を用いてPCR反応を行った。反応は25μLの系で行い、cDNAは0.5μLを加え、プライマーの終濃度は各2μMとした。サーマルサイクリング条件は、98℃ 10秒、45℃ 30秒、72℃ 30秒を40サイクルとした。反応産物5μLを2％アガロースゲル電気泳動に供試し、エチジウムブロマイド染色により、反応産物の増幅を確認した。結果を図３に示す。
【００４３】
図３に示すように、新規に設計した#1〜#6のうち#2以外のプライマーセットでは、PMoV、FMV感染葉に特異的に、想定サイズの増幅産物が得られた。一方、既報プライマー#7、#8では、PMoVは検出できず、FMVも#7では検出されず、#8のみ検出された。#7で検出されない結果は再現的であり(図６）、その理由としては図９に示すように、日本国内のFMV株(AB697826及びAB697827)がPre-motif A-senseプライマーと1塩基のミスマッチが認められるため、アニーリングが不十分であったのかもしれない。
【００４４】
3. ワンステップRT-PCRによる検出可能性の検討
健全シソ葉、PMoV感染シソ葉、FMV感染イチジク葉から、TRIzol Reagent(Thermo Scientific)を用いてトータルRNAを精製した。このRNAを鋳型に、縮重プライマーセット#1又は#3及びPrimeScript One-Step RT-PCR Kit Ver. 2(タカラバイオ社)を用いて、逆転写とPCR反応を同一チューブで行うワンステップRT-PCRを実施した。反応は20μLの系で行い、RNAは0.5μLを加え、プライマーの終濃度は各1μMとした。逆転写反応を50℃ 30分間行い、逆転写酵素を94℃、2分間で失活させた後、引き続きPCR反応を行った。サーマルサイクリング条件は、94℃ 30秒、48℃ 30秒、72℃ 15秒を40サイクルとした。反応産物5μLを2％アガロースゲル電気泳動に供試し、エチジウムブロマイド染色により、反応産物の増幅を確認した。結果を図４に示す。
【００４５】
図４に示すように、新規に設計した#1及び#3のプライマーセットでは、PMoV、FMV感染葉に特異的に、想定サイズの増幅産物が得られた。
【００４６】
4. 国内未発生エマラウイルス種の検出可能性の検討
FMV、PMoVに加えて、国内未発生のエマラウイルス8種を含む計10種の検出可能性を検討した。ウイルス種を表５に示す。なお、そのうちAcCRaVは、プライマー設計の段階で配列が知られていなかったウイルスである。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
国内未発生種はウイルスサンプルの入手が困難なため、Seo et al. (2014) A novel set of polyvalent primers that detect members of the genera Bromovirus and Cucumovirus. J. Virol. Methods 203:112-115.の方法に従い、以下のようにして感染葉RNAの疑似サンプルを作製した。
【００４９】
先ず、国内未発生種のRNA1の塩基配列をデータベースから取得し(表５)、全長約7.2 kbのうち、Pre Motif A、Motif 2、Motif A、Motif 2及びMotif Cをコードする領域とその前後の配列(nt 2500〜4000)の約1.5 kbを有するDNAを、人工遺伝子合成により作製し、プラスミドにクローニングした。また、本配列の上流にはT7 RNA プロモーターを配置し、T7 RNA ポリメラーゼ(タカラバイオ社)により試験管内転写してRNAを作製し、鋳型DNAをDNaseI(タカラバイオ社)により分解して、ウイルスの部分配列を有するRNAを作製した。この各エマラウイルスの人工合成RNAを1 ngと、表５に示すそれぞれの宿主である植物の健全葉から精製したトータルRNAを100 ngとを混合したものを、疑似感染葉RNAサンプルとして使用した。
【００５０】
#1〜#6から、実用性の高いプライマーセットの絞り込みを行った。FMV、PMoV感染葉からのcDNA及び、PPSMV、PPSMV2、RYRV、EMARaV、RLBV、HPWMoVの人工合成DNA(プラスミド)を鋳型として、#1、#3〜#6のプライマーセットにより上記と同様のPCRを行ったところ、いずれも特異的産物が得られたが(図５)、#1及び#3の増幅効率が高いと判断し、以降の実験はこの2セットのみを用いた。なお、ここで選定したプライマーセット#1、#3及び既報プライマー#7、#8はいずれもイノシン残基を含まないため、以下の実験には、イノシンを含むプライマーには適しているが正確性の低いTaq DNA polymeraseの代わりに、正確性がより高いEx Taq DNA Polymerase(タカラバイオ社)を使用した。
【００５１】
次に、上記で作製した疑似感染葉RNAサンプルから、ランダムヘキサマーを用いた逆転写によりcDNAを合成し、PCR反応を行った。ただしプライマーセット#7、#8によるPCR反応は、酵素にプロメガ社ではなくタカラバイオ社のTaq DNA polymeraseを用いたことを除き、非特許文献７のプロトコールに従った。結果を図６に示す。
【００５２】
図６に示すように、既報プライマーの#7では全体的にバンドが薄く、またFMV、PMoVは検出されなかった。#8ではHPWMoVが検出できなかった。
【００５３】
一方、#1、#3では、#3プライマーでHPWMoVのバンドが薄いものの検出はされており、それ以外はいずれもはっきりしたバンドが認められ、供試した10種全てのウイルス種を検出することが可能であった。
【００５４】
5. 未知のエマラウイルスの検出可能性の検討
新規縮重プライマーの設計時点で配列が未知であり、設計の考慮にいれていなかったAcCRaVも検出可能であったことから、配列が未知の新規エマラウイルス種についても検出できる可能性が考えられた。そこで、国内においてフシダニ類の寄生に伴い症状が発生し、ウイルスとの関連が疑われていたシキミの輪紋症状及びナシのモザイク症状について、本プライマーセットを用いてウイルスの検出を試みた。
【００５５】
先ず、Fruit mate(タカラバイオ社)とTRIzol Reagentを用いて、それぞれの植物の葉(症状有り及び症状無しのサンプル)から全RNAを抽出した。このRNAを500 ng用いて、PrimeScript Reverse Transcriptaseにより逆転写反応を行った。プライマーにはランダムヘキサマーを用い、手順は製品説明書に準じた。このcDNA 2μlを鋳型として、Ex Taq DNA PolymeraseでPCR反応を行った。検出用プライマーには#1、#3、#7、#8セットを用い、PCRの温度条件は項目2と同様とした。結果を図７に示す。
【００５６】
図７に示すように、シキミをサンプルとして行ったPCRの結果、#1及び#3からは、症状有りのサンプルで、想定されるサイズの増幅産物が得られた(図７上段)。一方、#7及び#8からは特異的増幅産物は認められなかった。また、ナシをサンプルとして行ったPCRでは、#3のみで、モザイクを呈していた2サンプル中1サンプルで、想定される位置にバンドが確認できた(図７下段)。(#1でも想定サイズのバンドがあるが、症状と相関していないため除外した。ただし、特異的プライマーでナシ無症状葉にも薄いバンドがあるため、低濃度で感染している可能性がある)。
【００５７】
これらのバンドを切り出して精製したDNAの塩基配列を決定した。これらの配列は終止コドンのないオープンリーディングフレームをコードし、そのアミノ酸配列でBlastp検索を行うと、両者ともFMV等エマラウイルスのRdRPが多数ヒットした。さらに、これらDNAの塩基配列と、既知のエマラウイルス属ウイルス10種のRNA1の塩基配列をMEGA7.0(Kumar et al. (2016) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for bigger datasets. Mol. Biol. Evol. 33:1870-1874.)を用いてアライメントを行い、近隣結合法により系統樹を作成した(図８)。シキミ及びナシから得られた配列はそれぞれFMV等及びPMoVと同じクレードに属した。ただし、それぞれの枝の長さから、既知のエマラウイルス種とは別種である可能性が高いと考えられた。
【００５８】
以上の結果から、新規プライマーにより、2種の新種エマラウイルスを検出できた可能性が示された。
【００５９】
6. 考察
ナシ及びシキミのウイルスが、既報のプライマーセット(#7及び#8)で検出できなかった原因として、プライマー配列とウイルスRNA配列のミスマッチの多さが考えられる(図９)。本実施例で構築したプライマーセット(#1及び#3)では、#3のantisenseプライマー(Ema-motif3-as-20mer)においてシキミウイルスと1塩基のみミスマッチが認められたが、それ以外のプライマーは全てのウイルス配列をミスマッチなくカバーできていた。一方、既報のプライマーセットでは、#7のantisenseプライマー(Motif A-antisense)及び#8のsenseプライマー(Motif A-sense)において、ナシで5塩基、シキミで2塩基のミスマッチが確認された。シキミ及びナシのエマラウイルス様配列のPreMotif A及びMotif Cに相当する領域の配列はまだ明らかではないが、Motif Aと同様に、#7、#8のプライマーではミスマッチがあることが予想される。
【００６０】
また、既知ウイルスに対しても、Motif A-sense及びMotif A-antisenseは、PPSMV、HPWMoV、PPSMV2に対してそれぞれ5、2、2塩基のミスマッチが生じるとともに、Pre-motif A-sense、Motif C-antisenseプライマーにおいてもウイルス種により1〜5塩基のミスマッチが生じうる(図９)。
【００６１】
以上の結果より、本実施例で構築したプライマーセット及び実験手法は、既知及び未知のエマラウイルス種の検出手法として、非特許文献７の方法よりも優れていると判断した。
【００６２】
なお、#1、#3の縮重プライマーは、縮重度(degeneracy)が192〜432であり、#7、#8の6〜32と比べてかなり多いが(表３)、実際の検出実験において縮重度の高さが障害にはなっていないと思われた。また、試験の後半では、イノシンを含むプライマー#4、#5、#6は使用しなかったが、検出対象の植物種及びウイルス種、用いるPCR酵素の条件等によっては、これらのプライマーを使用することがより適切な場面もあると考えられ、利用の可能性を排除するものではない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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