(57)【要約】【課題】従来の免疫療法や遺伝子治療法では完解できなかった巨大腫瘍を一気に崩壊させると同時に、免疫賦活効果を導き、がん患者を完治させる方法。【解決手段】がん細胞に特定の遺伝子を導入すると膨張する性質があることを発見した。そこで、がん細胞が形成する腫瘍の栄養動脈あるいはその上流の動脈から腫瘍内部へ遺伝子を集中的に導入することで、一気に膨張したがん細胞が、栄養を運ぶ腫瘍内の栄養動脈と新生血管を圧迫し栄養補給を断つことで、腫瘍全体を一気に崩壊させることが可能となった。また崩壊した腫瘍の大量の断片が免疫系を強力に刺激することで、免疫賦活が起こりやすくなり、従来、単独ではあまり賦活しなかった免疫療法も併用することで、末期を含む進行がんの患者を完治に導く道のりができた。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の遺伝子（下記注１）に列記した遺伝子）の１つまたは複数の組み合わせを、ベクター（ウイルスベクター、プラスミド、リポソーム、脂質などを含む）を用いて、注射器あるいはカテーテルにより腫瘍組織の栄養動脈あるいはその上流に位置する動脈から直接腫瘍組織に注入することにより、栄養動脈あるいは腫瘍内の新生血管周辺のがん細胞に遺伝子を効率よく導入し、この時、がん細胞の膨張する性質を利用し、腫瘍組織中の血流を阻害、遮断することにより、腫瘍組織を崩壊へ導く方法。
【請求項２】
〔請求項１〕の方法を施す前、同時、あるいは後で、免疫療法あるいは免疫賦活剤（インターロイキン、ＣＤ２８およびＣＤ１刺激剤を含む樹状細胞賦活剤、キラーＴ細胞、ＮＫ及びＮＫＴ細胞賦活剤、免疫チェックポイント阻害剤を含む）の投与、あるいはその両方を併用することにより、〔請求項１〕の方法で生き残ったがん細胞を完全に駆逐する免疫療法。
特に、〔請求項１〕の方法による腫瘍崩壊で、崩壊した大量の腫瘍組織片が生体内の免疫をより強力に賦活するため、免疫賦活剤や免疫療法の併用が効果的になる。
注１）導入する特定の遺伝子
ＡＰＥ２、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、Ｃｈｋ１、Ｃｄｃ５、Ｃｄｃ６、Ｃｄｃ７、Ｃｄｃ４５、Ｃｄｔ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、Ｃｔｆ１８、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＤＮＡ２、ＤＵＴ、Ｅｌｇ１、ＥｎｄｏＶ、Ｅｓｐ１、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ１、ＦＢＨ１、ＦＥＮ１、Ｇｅｍｉｎｉｎ、Ｈｕｓ１、ＫＮＴＣ２（ＮＤＣ８０）、Ｋｕ８０、Ｌｉｇａｓｅ１、Ｍａｄ２、ＭＢＤ４、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、Ｍｃｍ８、Ｍｃｍ１０、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ３、Ｍｍｓ４、ＭＰＧ、ＭＳＨ２、Ｍｕｓ８１、ＮＢＳ１、ＮＥＩＬ２、ＮＥＩＬ３、ＮＴＨ１、Ｏｒｃ１、Ｏｒｃ３、Ｐ１６、ｐ５３、ＰＡＲＰ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｆ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＮＫ、Ｐｏｌａ  ｐ１８０、Ｐｏｌａ  ｐ７０、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ１（Ｐｒｉｍ２ａ）、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ  ｐ１２５、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ３、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ４、Ｐｏｌｅ  Ｐｏｌ２、Ｐｏｌｉ、Ｐｏｌｌ、Ｐｏｌｍ、Ｐｓｆ１、Ｐｓｆ２、Ｐｓｆ３、ＰＴＥＮ、Ｒａｄ１、Ｒａｄ１８、Ｒａｄ２３Ａ、Ｒａｄ２３Ｂ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ６Ａ、ＲＰＡ３４、ＲＰＡ７０、Ｓｃｃ１、Ｓｃｃ３、Ｓｉｒ２、ＳＩＲＴ１（Ｓｉｒｔｕｉｎ）、ＴＤＧ、ＴＤＰ１、ＴＩＭＥＬＥＳＳ、Ｔｉｎ２、Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉ、Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩａ、Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩｂ、ＴＲＡＩＬ、Ｕｂｃ１３、ＵＮＧ、ＸＡＢ２、ＸＰＣ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、Ｘｒｃｃ２、ＸＲＣＣ４、３２０ｄ、５２０ｄ、またはこれらの遺伝子をノックアウトする遺伝子配列を持つもの
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、がんの遺伝子治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】  がんの治療法は数多く開発されてきたが、「手術」「抗がん剤」「放射線治療」の三大治療法に代わる決定的なものはない。特にがんが進行し、腫瘍が巨大化した場合には未だに治療法がない。【０００３】  特許文献１には、樹状細胞に、投与したがん抗原のペプチドを提示させ、キラーＴ細胞によるがん細胞を攻撃する、いわゆる「がんの樹状細胞免疫療法」が提案されているが、樹状細胞を用いたがん治療法はあまり効果がないことが判明している。【０００４】  特許文献２には、がん細胞を殺すための免疫細胞の邪魔をする制御性Ｔ細胞を抑えることによりがんに対する免疫力を向上させるもので、一定の効果が認められているが、副作用が深刻なうえに、効果も限定的である。まして、巨大腫瘍の場合、完解には程遠い。【０００５】  特許文献３には、がん細胞をアポトーシスに追い込む遺伝子治療法が提案されているが、効果が極めて限定的であることが知られている。【０００６】  特許文献４には、特許文献３の欠点である遺伝子の導入率の改善を目的とした提案がなされているが、そもそも「１個１個のがん細胞をアポトーシスさせるための遺伝子治療」では、機構的に、がんを根治できない。この類の遺伝子治療の欠点は、がん細胞１個に対し、必ずベクター１個以上を接着させ、遺伝子を導入する必要があるが、腫瘍の塊の中にある全てのがん細胞一つ一つを識別してベクターを接着させることは物理的に不可能であり、遺伝子を未導入のがん細胞がかなり残ってしまう。そのため腫瘍は部分的には縮小することはあっても、必ず再発し、進行してしまう。そのため、延命効果は認められても根治はありえない。加えて、静脈に注射あるいは点滴でベクターを導入しても肝臓などの組織でベクターがトラップされ、目的とする腫瘍に届くベクターの数はかなり減少してしまうため効果も激減してしまう。また、腫瘍に直接注射しても、注射された周辺のみ腫瘍が小さくなるだけで全体の腫瘍は小さくならないことも数多くのケースで確認されている。
また、近年、がん幹細胞の存在が明らかになり、これが存在している限り、必ずと言ってよいほど再発することが判明した。しかるに、かようなランダムなベクターの投与という方法で、がん幹細胞に確実に遺伝子を導入し、アポトーシスを誘導し完治できる確率は極めて低いと言わざるを得ない。一方で、がん幹細胞を識別できる免疫細胞療法は、上記の通り、進行がんにおいてはあまり役に立たず、新しい治療法は八方塞がりなのが現状である。
【先行技術文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−２５６４５４号
【特許文献２】ＷＯ２０１７−０３８９９７号
【特許文献３】特表平８−５０８１６６号
【特許文献４】特表２０１７−５０２９９７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  免疫療法では、免疫細胞が１個１個のがん細胞を認識して殺せるが、免疫細胞自体のがん細胞殺傷能力に限界があるため、殺せるがん細胞数に限界があり、巨大腫瘍化したがん組織は全く手に負えない。一方で、大量に自殺遺伝子を導入できる遺伝子治療法は、通常行われる静脈点滴もしくは局所注射の治療法では、かなり多くの未導入のがん細胞が残ってしまうために根治は不可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】上記の課題を解決するため本発明においては、特定の遺伝子を導入する遺伝子治療の形態をとるが、すべてのがん細胞１つ１つにベクターを接着させ、遺伝子を導入するという発想自体を捨て、がん細胞や腫瘍組織特有の性質を利用することにより巨大化した腫瘍を一気に崩壊させ、短期間で完解に持ち込む治療法を考案した。【００１０】  がん細胞が多数集合し、形成されている巨大な腫瘍組織を観察すると、必ず存在するのが、腫瘍の塊に接続し、がん細胞に栄養を運び込む「栄養動脈（Ｆｅｅｄｉｎｇ  Ａｒｔｅｒｙ）」である。（図―１）
さらに、腫瘍組織に入った栄養動脈から分岐して栄養を運んでいる腫瘍組織内に形成された新生血管は、非常に脆いうえに、直径が１２０ｎｍ程度の大きな穴が、無数に開いている構造をしている。即ち、腫瘍組織の栄養動脈に直径１２０ｎｍ以下のベクターを直接投与すれば、かなり高い確率で、腫瘍組織内にベクターを確実に入れることが可能となる。（図―２）【００１１】  一方で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、がん細胞にベクターを用いて遺伝子導入し、がん細胞に特有に発現している細胞周期や遺伝子複製調節に関与している特定の遺伝子をノックアウトして観察してみるといくつかの特徴がみられる。アポトーシス誘導遺伝子が有効ながん細胞は、一定の時間が経過した後にアポトーシス死を起こしアポトーシス小胞を形成するが、アポトーシス関連遺伝子が不活性と思われる場合、アポトーシス死を起こさず、がん細胞自体が巨大化したままの状態を維持したり、あるいは分裂途中で巨大化したまま長期間留まっていることが判明した。また、導入する遺伝子によっては、アポトーシスが誘導されるまで、何日間も膨張したままのがん細胞も数多く見受けられた。【００１２】  そこで、がん細胞の〔００１１〕に記述の性質を、あえて逆手に取った治療法を提案する。
直径が１２０ｎｍ以下、願わくば１００ｎｍ程度のベクター（多くのレンチウイルスやポリマー、脂質分子などが該当する）を選択し、特定の遺伝子を内包あるいは接着させ、栄養動脈あるいはそのすぐ上流に位置する動脈から腫瘍組織に直接注入すると、腫瘍組織内の新生血管の穴から次々とベクターが入り、新生血管周辺の多くのがん細胞にほぼ同時に遺伝子を導入することができる。（図―３）
この時、局所的にほぼ同時に大量の遺伝子導入できると、遺伝子導入されたがん細胞の中で、アポトーシスを引き起こさないがん細胞が膨張することで、腫瘍組織や新生血管を圧迫し、腫瘍全体に栄養が行きわたらないようにする「膨張圧迫法」が可能になると考えた。（図―４）
もし、栄養動脈の入り口付近の新生血管の血流を阻害、あるいは完全に遮断し、栄養補給を断つことができれば、どんなに巨大化した腫瘍であっても、がん幹細胞を含め、すべてを一気に死滅させることが可能になる。また、この方法なら、血管壁に大きな穴のない一般の健康的な動脈から体内組織へベクターが漏れ出ることはなく、投与したベクターのほぼ１００％が腫瘍に到達し、新生血管の穴から腫瘍組織に入り、がん細胞に接着あるいは感染し、非常に高い確率で遺伝子を導入することが可能となる。非常に高い導入率により、がん細胞が膨張する現象をほぼ同時に利用できることで、新生血管は一気に圧迫され、栄養補給路が遮断できる。また、静脈点滴に比べ、ベクター数もはるかに少なくて済み、遺伝子治療による副作用のリスクも大幅に軽減できる。また薬剤のコストも大幅に下げることができる。【００１３】  腫瘍組織内に栄養動脈、あるいはその上流の動脈からベクターを用いて高効率で遺伝子を導入出来た結果、腫瘍組織内の血管は極めて短時間で圧迫され、血流は途絶えてくるが、この遺伝子導入を継続して行うことにより、腫瘍組織内で血流の残っているところには順次ベクターが入り込み膨張させていき、一定間隔で投与し続けると腫瘍内の血流を完全に止めることが可能となる。一定の期間、本発明の方法で継続的に遺伝子導入を行うと、腫瘍内の新生血管周辺はすべて閉塞され、巨大な腫瘍内の栄養補給路を効率よく完全に断つことが可能となる。やがて、腫瘍全体に栄養が行き渡らなくなり、一定期間が経過すると腫瘍組織が一気に死滅し腫瘍崩壊症候群（Ｔｕｍｏｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を引き起こすしことになる。（図―５）
【発明の効果】
【００１４】  直径が１ｃｍの腫瘍組織にはがん細胞が約１０億個存在する。１回の遺伝子治療で投与するベクターの数は１０００万から多くても１０億個程度である。そこで、我々の発明が正しいことを証明するために、あえて、投与するベクター数よりも、はるかに多くのがん細胞が存在すると思われるがん患者を選び、使用する薬剤の一例として、細胞周期や合成に関与していると思われる遺伝子であり、がん細胞に頻繁に発現しているＣＤＣ６遺伝子をノックアウトする遺伝子を包含させたレンチウイルスを、必要に応じて１〜５０億個の間で栄養動脈、あるいはその上流の動脈に投与してみた。様々な研究では、遺伝子を導入してから３日目が一番遺伝子が発現していることが多いことがわかっているので、３日ごとに投与するのが望ましい。
因みに、この薬剤を、通常の静脈点滴のみ、あるいは静脈点滴に加え局所注射で投与した数多くのケースでは、小さな腫瘍には効果があることもあるが、巨大な腫瘍塊には、部分的には効果があるが、大半の場合、結果的には進行が防げず、腫瘍はさらに巨大化していることが判明している。【００１５】ケース１）４０代女性
直径４ｃｍの乳がん（がん細胞が４３×１０億個≒６４０億個）を持つ患者の栄養動脈の上流と思われる個所にベクターを継続的に注入した。投与２週目で腫瘍が膨張し、非常に硬くなった。これは我々が想定したように、遺伝子導入されたがん細胞が膨張し、腫瘍組織を圧迫しているものと推察された。さらに週１回のペースで薬剤を継続して同様に投与してみたところ、さらに腫瘍全体が膨張し、硬化した。しそして５週目で膨張し硬化した腫瘍が一気に崩壊し、脱落剥離した。
投与した薬剤に含まれるベクター数の何倍もの数のがん細胞が一気に死滅したことになり、これは、我々が想定した通りの結果であった。
ケース２）７０代男性
右肩に直径７ｃｍの原発不明の腫瘍（がん細胞が７３×１０億個≒３４３０億個）が存在している患者の場合、薬剤投与２週目で、骨に張り付いていた腫瘍組織が浮き上がり、腫瘍全体が腫脹、硬化してきた。さらに投与を続けると、５週目で突然、腫瘍が崩れるように崩壊し、腫瘍崩壊症候群（Ｔｕｍｏｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を起こし、腫瘍の塊は、奇跡的にほぼ完全に姿を消した。投与したベクター数の何十倍ものがん細胞が一気に死滅したことになり、我々が想定した通りの現象が起こったものと思われる。
この結果を考察すると、一定間隔で投与したベクターによる遺伝子導入により、腫瘍の大きさが異なっていても、ほぼ同じような時間経過で膨張、硬化、崩壊現象が起こるため、新生血管の圧迫と栄養補給路の遮断は４週間程度経過後には達成できているものと思われる。そして、栄養補給路が完全に遮断されてから一定期間が経過した通算４、５週目あたりで、一気に腫瘍全体が崩壊することからも、従来の治療法とは異なり、我々の想定していた方法が非常に有効であることがわかる。しかも、栄養補給路が確保されている血管からは、必ずベクターが入ってくることから、腫瘍内部の血流はすべて閉塞されてしまうことになる。
それゆえ、この「腫瘍内部膨張圧迫法」は、がん治療としては画期的な方法といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】腫瘍に栄養を補給している栄養動脈に薬剤を直接投与すると効果的である。
【図２】ベクターは穴だらけの新生血管から次々と腫瘍組織に入り込む。
【図３】腫瘍組織に入り込んだベクターは次々とがん細胞に接着し、遺伝子導入する。
【図４】遺伝子導入されたがん細胞の多くは、膨張して、栄養動脈あるいは新生血管を圧迫し、腫瘍全体は膨張し、硬化する。特に、新生血管周辺のがん細胞は、血流が止まらない限り次々と遺伝子導入され膨張し続ける。
【図５】次々と膨張していくがん細胞の圧迫により、新生血管が閉塞し、栄養を遮断された腫瘍組織は一気に崩壊し、腫瘍崩壊症候群（Ｔｕｍｏｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を引き起こす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】  がん患者の体内には、ＣＴＣ（Ｃｙｃｌｉｃ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ）と呼ばれる腫瘍組織から離れたがん細胞が、全身の血流に乗って回っており、このＣＴＣの一部が血管から侵入し、再発や転移を起こすといわれている。  そのため、手術や重粒子線、放射線などの局所的ながんの処置がうまくいっても、ＣＴＣによる再発、転移のリスクが残っている。【００１８】そこで、上記〔００１２〕〔００１３〕の治療を行う際に、栄養動脈にベクターを投与するのと同時に、ベクターを静脈注射あるいは静脈点滴することで全身にベクターを配置し、血流中のＣＴＣの分裂増殖を止めたり、アポトーシス誘導に持ち込むことにより、再発、転移のリスクを無くし、治療効果をより良くする。【００１９】  導入する特定の遺伝子とは上記ＣＤＣ６ノックアウトに限らず、がんの種類によってさまざまな選択、および複数の組み合わせができる。（別表１）【００２０】  また、ベクターはレンチウイルスに限らず、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス，センダイウイルス、ＨＳＶ１、ポックスウイルスの各ウイルス、あるいはこれらを改変したウイルス由来のベクターも可能である。
また、非ウイルスベクターとして、プラスミド、プラスミド・リポソームトランスフェクションも可能である。また、遺伝子をリポソーム、ポリマーに内包させたり複合体を形成したものでも可能である。またバクテリアベクターも可能である。リポソーム、ポリマーには従来の素材のほかに、リン脂質、トレハロースなども含むものとする。
【産業上の利用可能性】
【００２１】  従来の「抗がん剤」「放射線」「免疫療法」などの、がんの治療法では克服できなかった「難治性」あるいは巨大化した「進行がん」を、がん細胞の性質を逆手に取った本発明の「膨張圧迫法」によるがんの遺伝子治療により、進行したがん患者の命を救う、あるいは大幅に延命することが可能になり、「がんは不治の病」ではなくなり、医学の大きな進歩となる。【００２２】また、この治療法により、がんが「不治の病」ではなくなることで、世の中のすべての薬の最大の規制条件である「発がん性」を大幅に緩和、あるいは撤廃することも可能になり、結果的にすべての病気に対する新薬の開発が容易になる。また、過去において、優れた性能を持ちながら、その発がん性ゆえに発売が許可されなかった薬剤も、発売可能となることで、がん以外の多くの病気が解決できるようになる。
【符号の説明】
【００２３】  １…栄養動脈、２…腫瘍、３…新生血管、４…ベクター、５…がん細胞、６…巨大化したがん細胞
ａ…膨張、ｂ…圧迫
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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