(57)【要約】      （修正有）【課題】寒天性紅藻類からの防御エリシター／刺激物質を有する多糖抽出物の抽出方法の提供及び農業用途への適用方法の提供。【解決手段】寒天性紅藻類を熱いうちにアルカリ水抽出または含水アルコールまたはアルコールで抽出することにより糖抽出画分を得る。該画分を限外ろ過またはサイズ排除クロマトグラフィー処理することにより、互いに共有結合する２〜５０糖単位を有する少なくとも１つのオリゴ糖、および互いに共有結合する５０を超える糖単位を有する多糖を得る。これらのオリゴ糖／多糖は植物に処理することにより、ペルオキシダーゼやフェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を増強し、植物の抵抗性を増加させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
陸生植物における防御エリシター／刺激物質としての、少なくとも１つの寒天紅藻類の抽出物または抽出物画分の使用であって、該抽出物または該抽出物画分は、互いに共有結合する２〜５０糖単位を有する少なくとも１つのオリゴ糖、および互いに共有結合する５０を超える糖単位を有する多糖を含有し、これらは全オリゴ糖／多糖に対して０．０１重量％を超えることなく含有され得る、使用。
【請求項２】
寒天性紅藻類が、テングサ（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ）属およびオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）属のものから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
寒天性紅藻類が、Ｇｅｌｉｄｉｕｍ  ｓｅｓｑｕｉｐｅｄａｌｅであることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
抽出物または抽出物画分が、オリゴ糖として、以下から選択される少なくとも１つの天然のオリゴ糖または置換オリゴ糖を含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用：
−Ｇａｌ＝ガラクトース単位であり、２≦ｎ≦４である、（Ｇａｌ）ｎ−グリセロール;
−２つの六炭糖単位からなる二糖;
−２つのガラクツロン酸単位からなる二糖。
【請求項５】
抽出物または抽出物画分がまた、少なくとも１つの、天然の単糖、またはグリセロールもくしはメチルで置換された単糖を含有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
１つ以上の単糖が、フロリドシド／イソフロリドシド（Ｇａｌ−グリセロール）、３，６−アンヒドロガラクトース、ガラクツロン酸、六炭糖または五炭糖から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
抽出物が、：
−塩基性ｐＨのアルカリ水溶液、特に０．１〜１０重量％、好ましくは２〜５重量％の水酸化ナトリウムによる抽出物であり、次いで酸により中和され、互いに共有結合する５０を超える糖単位を有する多糖が少なくとも部分的に除去された抽出物；または
−含水アルコール溶液による抽出物であり、アルコールがその後除去された抽出物；または
−エタノールなどのアルコールによる抽出物であり、アルコールがその後除去された抽出物であって、
抽出物はまた、寒天性紅藻類から寒天を抽出する方法の間に行われたろ過によって、それぞれ、藻類のアルカリ処理後、こうして得られた残渣を水で洗浄後、洗浄中に得られた残渣の酸による中和後、この中和中に得られた残渣を水で洗浄後に得られた水相の１つであってよく；または、最後の水による洗浄後に得られた残渣の熱抽出／ろ過中に、寒天ゲルと同時に得られた残渣の熱抽出により得られた抽出物であってよく；および、この寒天ゲルの凍結融解および／または機械プレス後に得られた離水液であってよく、
抽出物画分が、限外ろ過またはサイズ排除クロマトグラフィーによる、抽出物の分画から得られ、
抽出物または抽出物画分が、その後濃縮、脱水または凍結乾燥され得る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
抽出物または抽出物画分が、１つ以上の寒天性紅藻類を、熱いうちに、水性抽出、アルコール抽出または含水アルコール抽出し、アルコール抽出または含水アルコール抽出の場合は、その後アルコールを除去する方法によって、調製されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用であって、
抽出は、水性アルカリ抽出であることができ、特に以下による水性アルカリ抽出であることができ、該水性アルカリ抽出では、アルカリ処理後にろ過によって、一方では水相（Ａ１）を得て、他方では残渣（Ｒ１）を得て；
その後、該残渣（Ｒ１）を蒸留水により洗浄して、ろ過後に、一方では水相（Ａ２）を得て、他方では残渣（Ｒ２）を得て；
その後、該残渣（Ｒ２）の酸による中和を行い、ろ過後に、一方では水相（Ａ３）を得て、他方では残渣（Ｒ３）を得てもよく；
その後、該残渣（Ｒ３）を蒸留水で洗浄して、ろ過後に、一方では水相（Ａ４）を得て、他方では残渣（Ｒ４）を得ることが可能であり；
その後、該残渣（Ｒ４）の熱抽出およびろ過を行い、一方では残渣（Ｒ５）を得て、他方では寒天ゲルを得てもよく；
その後、該残渣（Ｒ５）の熱水による抽出を行い、水相（Ａ５）を得てもよく；
その後、寒天ゲルの凍結融解および／または機械プレスを行い、一方では離水液（ＪＳ）および純粋な寒天ゲルを得てもよく；
該水相（Ａ１）〜（Ａ５）および離水液（ＪＳ）はまた、それぞれ所望の抽出物を表し、
該抽出物を、エタノールによる処理に供し、一方ではエタノール抽出物（ＥＥ）を得て、他方では沈殿物を得てもよく、
該エタノール抽出物を、限外ろ過またはサイズ排除による分画に供し、互いに共有結合する２〜５０の糖単位を有する少なくとも１つのオリゴ糖と、互いに共有結合する５０を超える糖単位を有する多糖を含有する抽出物画分の単離を可能にし、これらは全オリゴ糖／多糖に対して０．０１重量％を超えないで含有されてよく、
該抽出物または抽出物画分が、その後濃縮、脱水または凍結乾燥され得る、使用。
【請求項９】
抽出物または抽出物画分が、水性媒体中にあるか、粉末形態であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
植物の栄養組織、根系、果実、子実および種子を含む、植物の全体またはその一部に、または、植物を栽培するための土壌または基質に、請求項１〜９のいずれか一項で規定される抽出物または抽出分画分の、植物の自然防御を刺激するのに十分有効な量を、液体状態で、または粉末もしくは顆粒の形態で、適用することからなることを特徴とする、陸生植物の自然防御を刺激する方法。
【請求項１１】
農学的に有用な植物、ヒマワリまたはダイズなどの油糧種子を含む畑作物、ヒヨコ豆などのタンパク質作物、トウモロコシや小麦などの穀物、洋ナシの木、リンゴの木、ネクタリンの木などの果樹、バラの木などの園芸植物、草原植物、およびトマト、メロン、レタスまたはホウレンソウなどの市販の栽培植物を処理することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
液体抽出物または液体抽出物画分が、植物もしくは植物の一部もしくは子実もしくは種子に、または土壌もしくは基質に、０．０００１〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／Ｌのオリゴ糖濃度で、適用されることを特徴とする、請求項１０および１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
抽出物または抽出物画分が、１ヘクタール当たり１〜１０００ｇのオリゴ糖の割合で、液体状態で、または粉末もしくは顆粒の形態で、適用されることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
適用を、１年の栽培中に１〜２０回、好ましくは３〜５回、実施することを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法を実行するための組成物であって、組成物は、液体状態の、または粉末もしくは顆粒の形態の、請求項１〜９のいずれか一項に規定される抽出物または抽出物画分からなることを特徴とし、必要に応じて、植物衛生製品または肥料製品に組み込まれるか、または界面活性剤、分散剤、保存剤、固結防止剤、微量元素、土壌改良剤、欠乏矯正剤、殺菌剤、殺虫剤、除草剤、成長ホルモンから選択される少なくとも１つのアジュバントと組み合わせられる、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陸生植物における自然防御刺激物質としての、寒天性紅藻類（ａｇａｒｏｐｈｙｔｅ  ｒｅｄ  ａｌｇａｅ）の抽出物、特に天然抽出物、または画分抽出物の使用に関するものである。本発明はまた、これらの抽出物または抽出物画分を得る方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、寒天性紅藻類の抽出物の回収、および植物に生物的ストレスに対する抵抗性を発現させる能力を有する自然防御のエリシターまたは刺激物質としての、それらの使用からなる。
【０００３】
農場での農薬などの化学物質の使用は、フランスではＥｃｏｐｈｙｔｏ２プランによって課された制限を受ける。その目的は、農業生産高を維持しながら、農薬などの植物用薬品化学物質の使用を２０２５年までに半減することであり、これは、Ｅｃｏｐｈｙｔｏプランの大志を達成して、農業における農薬の使用に伴うリスクおよび影響を減らすのに役立つであろうエリシターの使用などの、代替方法の開発と応用を提案するものである。
【０００４】
エリシターは、植物の病原性微生物の認識を開始させるシグナル伝達分子である。エリシターは、膜受容体に特異的に結合することができる。エリシターと特異的受容体との間の相互作用の結果として、シグナル伝達事象のカスケードが細胞レベルで観察される。それぞれが、明確に規定されたエリシターに適合することができる、多種多様な膜受容体が存在する（Benhamou, N., and Rey, P. (2012). Elicitors of natural plant defense mechanisms: a new management strategy in the context of sustainable production.：I. Principles of induced resistance. Phytoprotection 92, 1）。
【０００５】
この意味において、相互作用に応じて、以下が存在する：
−膜脱分極、Ｇタンパク質の活性化、プロテインキナーゼ、カルシウムイオンの細胞内放出；
−植物ホルモン、酵素、ストレスタンパク質、プロテアーゼ阻害剤、フィトアレキシンを含む抗菌性のある二次代謝産物の、生合成経路に関与する防御遺伝子の発現；
−直接的な抗菌活性を有する非常に活性の高い分子であり、過敏感反応および細胞壁の補強にも関与している、活性型の酸素すなわちＡＦＯの蓄積。
【０００６】
ＡＦＯの蓄積は、植物に通常少量存在するフリーラジカルの生産を誘発する事象である。攻撃の間、このバランスが崩れ、フリーラジカルの過剰生産が、ＤＮＡ、タンパク質、ある種の酵素、および膜脂質などの分子を損傷し得るために、病原菌だけでなく、植物にとっても有毒である。従って、病原菌の攻撃ゾーンは、死亡し得る（過敏感反応）。ＡＦＯの負の効果を最小限にするために、植物は、ペルオキシダーゼを含む、ＡＦＯの作用範囲を絞る酵素を有している。それゆえ、オキシダティブバースト（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｂｕｒｓｔ）は一般に、ペルオキシダーゼ、すなわちＨ２Ｏ２などのＡＦＯを不活性化する酵素の生産を伴い、それゆえにペルオキシダーゼは潜在的に植物の防御マーカーである。
【０００７】
シグナル伝達事象は、強度および出現順序に関して植物ごとに異なり、また、ストレスシグナルの伝達において主要な役割を果たす。エリシターの性質に応じて、病原菌に抵抗するために様々な反応が起こる。これらの反応の中で、細胞壁の補強が観察され得る。病原菌が侵入する場所には、パピラ（ｐａｐｉｌｌａ）が合成される。
【０００８】
フェノール化合物、シリカ、カロース、タンパク質、糖タンパク質（ＨＲＧＰ）、スベリン、またはリグニンの、迅速かつ局所的な並置により、細胞壁を厚くすることができる（Garcia-Brugger, A., Lamotte, O., Vandelle, E., Bourque, S., Lecourieux, D., Poinssot, B., Wendehenne, D., and Pugin, A. (2006) Early Signaling Events Induced by Elicitors of Plant Defenses. Microbe Interactions 19, 711-724, Senthil-Kumar, M., and Mysore, KS (2013), Nonhost Resistance Against Bacterial Pathogens: Retrospective and Prospects, Annual Review of Phytopathology 51,407-427）。
【０００９】
攻撃ゾーンでのリグニンの生産は、フェニルプロパノイドの生合成に必須であるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）などの、触媒酵素を用いて行われる。
【００１０】
植物は自分自身を守り、自身が受けているストレスの種類への適応を可能にする多様な武器を持っている。エリシターによって誘導される抵抗性の一種は、獲得全身抵抗性（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）である。これは、植物全体に一般化されている抵抗性である。これは、病原菌に対する、および、新たな潜在的攻撃に対する、最適化された防御を可能にする。特に、ＳＤＮの効果が有効である限り、植物は常にスタンバイ状態になる。これは、植物において抵抗性を誘導し、病原菌の攻撃に対する反応時間を顕著に減らす予防方法である。採用されている戦略は、攻撃への反応時間を大幅に減少させるために、低濃度のエリシターを植物に提供することである(Levine, A., Tenhaken, R., Dixon, R., and Lamb, C. (1994), H202 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response, Cell 79, 583-593, Bolwell, GP (1999). Current Opinion in Plant Biology 2, 287-294)。 
【００１１】
生物起源のエリシターと、重金属、ある種の界面活性剤、ある種の抗生物質、ＵＶ照射などの非生物的ストレスとは、区別することができる。生物起源エリシターは、藻類で見られることが一般的である。実際、紅藻類、緑藻類および褐藻類は、それ自体でまたは脱重合形態で、生物起源エリシターとして作用することができる、多様かつ特異的な細胞壁多糖を有する（Vera, 2011）。特に、カラギーナンに富む紅藻類（すなわち、ｃａｒｒａｇｅｅｎｏｐｈｙｔｅ）は、そのオリゴ糖誘導体がエリシター特性を有する、カラギーナンを有する（ＵＳ２０１００１７３７７９Ａ１およびＵＳ２０１１００９９８９８Ａ１）。寒天特有のＬ−ガラクトースと３，６アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースがない点で、カラギーナンは寒天とは異なることに注意すべきである。いくつかの緑藻類は、脱重合するとエリシターとして働く、ウルバン（ｕｌｖａｎ）を有する（Ｗ０２００５０９４５８８Ａ１）。褐藻類に関しては、後者は、エリシターとして働く予備的グルカンである、ラミナリンに富む（ＷＯ１９９４０００９９３Ａ１）。酵素的脱重合によって得られ、紅藻類オゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）を誘発することができる、重合度（ＤＰ）４のアガーオリゴ糖（ｏｌｉｇｏａｇａｒ）がある(Weinberger, F., Friedlander, M., and Hoppe, B.-G. (1999). Oligoagars elicit a physiological response in Gracilaria conferta (Rhodophyta) Journal of Phycology 35, 747-755)。
【発明の概要】
【００１２】
本出願人は、今回、誘発活性（ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す、テングサ（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ）属およびオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）属などの寒天性紅藻類の炭水化物および炭水化物フラグメントを発見した。天然起源のこれらの物質の回収は、環境に配慮した生物学的適用という観点から行われている。これらの天然物質は、そのエリシター特性を活性化するための事前の脱重合を必要としない；それらは、それ自体で活性である。また、これらのエリシター物質は水溶性であり、このことはそれらの天然の特性を強化する。
【００１３】
したがって、本発明は、特に、Ｇｅｌｉｄｉｕｍ  ｓｅｓｑｕｉｐｅｄａｌｅに天然に存在し、ある種の誘発マーカー、例えばカロース、フェノール化合物、ペルオキシダーゼおよびフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）の酵素活性の増加を引き起こし得る分子の抽出物に関する。本発明は、その確立を加速し、植物における一般化された防御を確実にすることにより、獲得全身抵抗性および／または誘導全身抵抗性を改善することを可能にする
【００１４】
日本の特許出願ＪＰ２０１４０９１７０９は、寒天の製造方法において、紅藻類をアルカリ処理して、得られた処理水を洗浄後に得られる、アルカリ処理水からなる植物成長促進剤を開示している。これは、本発明によるものとは異なる適用であり、これらの薬剤は海水からのミネラルを、植物の成長に関与するようにバランスのとれた方法で含むものとして提示されている。
【００１５】
Antonio Ramkissoon, Adesh Ramsubhag and Jayaray Jayaraman, J. Appl. Phycol (2017) 29: 3235-3244 は、トマト植物における病原菌感染症の症状を減少させる、３種類のカリブ海の藻類の抽出物の植物誘発活性について記載している。得られた抽出物は、分子の複雑な混合物である。これとは対照的に、本発明は、本引用文献には一切記載されていない、明確に規定されたオリゴ糖を含有する抽出物または抽出物画分に関する。さらに、この文献によると、抽出物は０．５％の濃度、すなわち５ｇ／Ｌで噴霧される。本発明によると、抽出物／抽出物画分は、１〜１０ｍｇ／Ｌの間、すなわち約１０００倍低い、植物にとってはるかに好ましい濃度で適用されている。これは、本発明による抽出物／抽出物画分の、新規性および利益を裏付けるものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、第一に、陸生植物における防御エリシター／刺激物質としての、少なくとも１つの寒天紅藻類の抽出物または抽出物画分の使用に関するものであり、該抽出物または該抽出物画分は、互いに共有結合する２〜５０の糖単位（ｏｓｅ  ｕｎｉｔ）を有する少なくとも１つのオリゴ糖、および互いに共有結合する５０を超える糖単位を有する多糖を含有し、これらは全オリゴ糖／多糖に対して０．０１重量％を超えることなく含有され得る。
【００１７】
本明細書において、オリゴ糖は、２〜５０の糖単位を含有する化合物として規定され、多糖は、５０を超える糖単位を含有する化合物として規定される。
【００１８】
「重合度」という用語はまた、以下で、この糖単位の数を表すために、用いられる。
【００１９】
寒天性紅藻類は、テングサ（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ）属およびオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）属のものから選択され得、また、特にＧｅｌｉｄｉｕｍ  ｓｅｓｑｕｉｐｅｄａｌｅであり得る。
【００２０】
特に、抽出物または抽出物画分は、オリゴ糖として、以下から選択される少なくとも１つの天然のオリゴ糖または置換オリゴ糖を含んでよい：
−Ｇａｌ＝ガラクトース単位であり、２≦ｎ≦４である、（Ｇａｌ）ｎ−グリセロール；
−２つの六炭糖単位からなる二糖；
−２つのガラクツロン酸単位からなる二糖。
【００２１】
抽出物または抽出物画分はまた、天然の、またはグリセロールもしくはメチルで置換された、少なくとも１つの単糖を含有してよく、１つ以上の単糖はロリドシド／イソフロリドシド（Ｇａｌ−グリセロール）、３，６−アンヒドロガラクトース、ガラクツロン酸、六炭糖または五炭糖から選択されてよい。
【００２２】
抽出物は、以下の抽出物からなってよい：
−塩基性ｐＨのアルカリ水溶液、特に０．１〜１０重量％、好ましくは２〜５重量％の水酸化ナトリウムによる抽出物であり、次いで酸により中和され、互いに共有結合する５０を超える糖単位を有する多糖が、例えば、ろ液をエタノールで沈殿させることによって、少なくとも部分的に除去された抽出物；または
−含水アルコール溶液による抽出物であり、アルコールがその後除去された抽出物；または
−エタノールなどのアルコールによる抽出物であり、アルコールがその後除去された抽出物であって、
抽出物はまた、寒天性紅藻類から寒天を抽出する方法の間に行われたろ過によって、それぞれ、藻類のアルカリ処理後、こうして得られた残渣を水で洗浄後、洗浄中に得られた残渣の酸による中和後、この中和中に得られた残渣を水で洗浄後に得られた水相の１つであってよく；または、最後の水による洗浄後に得られた残渣の熱抽出／ろ過中に、寒天ゲルと同時に得られた残渣の熱抽出により得られた抽出物であってよく；および、この寒天ゲルの凍結融解および／または機械プレス後に得られた離水液であってよく、
抽出物画分は、限外ろ過またはサイズ排除クロマトグラフィーによる、抽出物の分画から得られ、
抽出物または抽出物画分は、その後濃縮、脱水または凍結乾燥され得る。
【００２３】
抽出物または抽出物画分は、１つ以上の寒天性紅藻類を、熱いうちに、水性抽出、アルコール抽出または含水アルコール抽出し、アルコール抽出または含水アルコール抽出の場合は、その後アルコールを除去する方法によって、調製されてよく、
抽出は、水性アルカリ抽出であることができ、特に以下による水性アルカリ抽出であることができ、該水性アルカリ抽出では、アルカリ処理後にろ過によって、一方では水相（Ａ１）を得て、他方では残渣（Ｒ１）を得て；
その後、該残渣（Ｒ１）を蒸留水により洗浄して、ろ過後に、一方では水相（Ａ２）を得て、他方では残渣（Ｒ２）を得て；
その後、該残渣（Ｒ２）の酸による中和を行い、ろ過後に、一方では水相（Ａ３）を得て、他方では残渣（Ｒ３）を得てもよく；
その後、該残渣（Ｒ３）を蒸留水で洗浄して、ろ過後に、一方では水相（Ａ４）を得て、他方では残渣（Ｒ４）を得ることが可能であり；
その後、該残渣（Ｒ４）の熱抽出およびろ過を行い、一方では残渣（Ｒ５）を得て、他方では寒天ゲルを得てもよく；
その後、該残渣（Ｒ５）の熱水による抽出を行い、水相（Ａ５）を得てもよく；
その後、寒天ゲルの凍結融解および／または機械プレスを行い、一方では離水液（ＪＳ）および純粋な寒天ゲルを得てもよく；
該水相（Ａ１）〜（Ａ５）および離水液（ＪＳ）はまた、それぞれ所望の抽出物を表し、
該抽出物を、エタノールによる処理に供し、一方ではエタノール抽出物（ＥＥ）を得て、他方では沈殿物を得てもよく、
該エタノール抽出物を、限外ろ過またはサイズ排除による分画に供し互いに共有結合する２〜５０の糖単位を有する少なくとも１つのオリゴ糖と、互いに共有結合する５０を超える糖単位を有する多糖を含有する抽出物画分の単離を可能にし、これらは全オリゴ糖／多糖に対して０．０１重量％を超えないで含有されてよく、
該抽出物または抽出物画分は、その後濃縮、脱水または凍結乾燥され得る。
【００２４】
抽出物または抽出物画分は、水性媒体中にあってよく、または、粉末形態であってよい。
【００２５】
本発明はまた、植物の栄養組織（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）、根系、果実、子実（ｇｒａｉｎ）および種子（ｓｅｅｄ）を含む、植物の全体またはその一部に、または、植物を栽培するための土壌または基質に、本発明で規定される抽出物または抽出分画分の、植物の自然防御を刺激するのに十分有効な量を、液体状態で、または粉末もしくは顆粒の形態で、適用することからなることを特徴とする、陸生植物の自然防御を刺激する方法に関する。
【００２６】
農学的に有用な植物、ヒマワリまたはダイズなどの油糧種子を含む畑作物、ヒヨコ豆などのタンパク質作物、トウモロコシや小麦などの穀物、洋ナシの木、リンゴの木、ネクタリンの木などの果樹、バラの木などの園芸植物、草原植物、およびトマト、メロン、レタス、またはホウレンソウなどの市販の栽培植物を処理することができる。
【００２７】
液体抽出物または液体抽出物画分は、植物もしくは植物の一部もしくは子実もしくは種子に、または土壌もしくは基質に、０．０００１〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／Ｌのオリゴ糖濃度で、適用することができる。抽出物または抽出物画分はまた、１ヘクタール当たり、１〜１０００ｇの割合で、液体状態で、または粉末もしくは顆粒の形態で、適用することができる。
【００２８】
適用は、１年の栽培中に１〜２０回、好ましくは３〜５回、実施することができる。
【００２９】
本発明はまた、本発明による方法を実行するための組成物に関し、組成物は、液体としての、または粉末もしくは顆粒の形態の、上記に規定される抽出物または抽出物画分からなることを特徴とし、必要に応じて、植物衛生製品または肥料製品に組み込まれるか、または界面活性剤、分散剤、保存剤、固結防止剤、微量元素、土壌改良剤（ａｍｅｎｄｍｅｎｔ）、欠乏矯正剤（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、殺菌剤（ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ）、殺虫剤、除草剤、成長ホルモンから選択される少なくとも１つのアジュバントと組み合わせられる。
【実施例】
【００３０】
実施例１  アルカリ抽出物の取得および分画
１００ｇの乾燥藻類Ｇｅｌｉｄｉｕｍ  ｓｅｓｑｕｉｐｅｄａｌｅを、１５００ｍＬの２ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム水溶液と混合し、７０〜８０℃で１時間攪拌する。それを、１容量％の硫酸で中和する。
【００３１】
次いで、混合物を、ポアサイズ（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）５３μＭのナイロン布で濾過する。不溶性粒子はフィルター上に保持され、除去される。
【００３２】
約５０を超える重合度を有する多糖画分を、３容量のエタノールによる沈殿によって除去する。
【００３３】
エタノール画分は、特に、オリゴ糖および単糖を含有している。その後、エタノールをロータリーエバポレーターで除去して抽出物の水溶液を得る。
【００３４】
実施例２  限外ろ過による、実施例１の抽出物の分画
得られたろ液（すなわち、水性抽出物水溶液）を、５０００Ｄａ以上の質量を有する化合物（多糖を含む）を除去して、保持液中に含有させるために、まず５ｋＤａのメンブレン上で限外ろ過により分画する。
【００３５】
透過液を回収し、１０００Ｄａのメンブレン上で限外ろ過し、これにより１０００Ｄａの保持液中にオリゴ糖濃縮画分を作製することができる。
【００３６】
画分を、糖については、Dubois et al. (DuBois, M., Gilles, KA., Hamilton, JK, Rebers, PA, and Smith, F. (1956), Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances, Analytical Chemistry 28, 350-356)の方法に従い、ウロン酸についてはBlumenkrantz, N., and Asboe-Hansen, G. (1973), New methods for quantitative Determination of uronic acids, Analytical Biochemistry 54, 484-489、フェノール化合物についてはSingleton Method, Singleton VL & Rossi, JA Jr., Colorimetry of Total, phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents, Amer J. J. Enol, Viticult 16: 144-58, 1965、タンパク質についてはBradford, MM (1976)：A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical Biochemistry 72, 248-254に従い、比色定量アッセイを用いて特徴付けを行った。次に、Stevenson, T.T., and Furneaux, R.B. (1991) Chemical methods for the analysis of sulphated galactans from red algae. Carbohydrate Research 210, 277-298.に従って、アルジトールアセテート誘導体を得た後に、単糖組成をＧＰＣによって確立する。抽出物の固形分含有量は、凍結乾燥後に秤量することにより測定する。
【００３７】
【表１】
2019202993.tif 000002
【００３８】
比色定量アッセイは、炭水化物の優位性を示している。画分には、タンパク質、フェノール化合物、ウロン酸も含まれているが、中性糖よりも比率が低い。存在する炭水化物は硫酸塩官能基を有し、その比率は画分によって異なる。
【００３９】
【表２】
2019202993.tif 000003
【００４０】
ＧＰＣ分析から推定される単糖組成では、特に３，６アンヒドロガラクトース型で、ガラクトースが優位であることが観察される。
【００４１】
【表３】
2019202993.tif 000004
【００４２】
質量収率は、５ｋＤａでの限外ろ過による保持液と透過液の質量分布が異なることを反映しているため、サイズが５ｋＤａより大きい化合物は、藻類の初発乾燥重量の５％を示すこと、および、初発乾燥現存量の３３重量％が透過液中に回収され、したがって５ｋＤａより小さい化合物を含有することを、観察することができる。
【００４３】
５ｋＤａでの限界ろ過で回収された透過液に対して行った１ｋＤａの限外ろ過により、５ｋＤａでの限外ろ過で得られたものに近い分布を有する新たな透過液および保持液を得ることができる。
【００４４】
１ｋＤａの限外ろ過はまた、透過液中の無機化合物、および単糖および二糖を除去することができる。
【００４５】
水性抽出物、またはアルコール抽出物、または含水アルコール抽出物の取得
１００ｇの乾燥藻類を、１Ｌの水またはエタノールまたは水−エタノール混合物（２０／８０ｖ／ｖ）と混合して、５０〜６０℃で１時間攪拌する。その後、混合物をポアサイズ５３μｍのナイロン布でろ過する。不溶性粒子はフィルター上に保持され、除去される。
【００４６】
【表４】
2019202993.tif 000005
【００４７】
【表５】
2019202993.tif 000006
【００４８】
水またはエタノールによる抽出により、画分の１〜１５重量％の範囲の炭水化物を含有する画分を、回収することができる。
【００４９】
水とエタノールの混合物で実施した抽出により、５２〜５４％の糖を含有する画分を、回収することができる。水、エタノール、または水−エタノール溶媒で実施した抽出の質量収率は、乾燥藻類の質量に対して２％を超えない。
【００５０】
実施例４  サイズ排除クロマトグラフィーによる、実施例１の抽出物の分画
実施例１で得られた水性抽出物水溶液を、固定相として、１００〜１８００Ｄａのカットオフを有するポリアクリルアミドゲルを用いて、サイズ排除カラムクロマトグラフィーにより分画する。移動相は脱気した超純水であり、流速は０．１８ｍｌ／ｍｉｎである。回収した画分は１．８ｍｌである。それらをＴＬＣにより解析し、炭水化物を含み、かつ同じプロファイルを有するものを組み合わせる：３つの画分、Ｆ１、Ｆ２およびＦ３が得られる。
【００５１】
これらの画分を、比色定量アッセイを用いて、ＧＰＣおよびＥＳＩ−ＭＳにより特徴付けを行った。
【００５２】
【表６】
2019202993.tif 000007
【００５３】
画分Ｆ１およびＦ２はそれぞれ、出発藻類質量の３〜４重量％を表し、一方で画分Ｆ３は１．８重量％を表す。
【００５４】
【表７】
2019202993.tif 000008
【００５５】
比色定量アッセイは、炭水化物が最も多い（ｐｒｅｐｏｎｄｅｒａｎｃｅ）ことを示している。画分はまた、タンパク質、フェノール化合物、およびウロン酸を有し、回収した単糖は、特に画分Ｆ１およびＦ３において、硫酸化されている。
【００５６】
下記の表８は、画分Ｆ１、Ｆ２およびＦ３の単糖組成（ｍｏｌ％）を示す。
【表８】
2019202993.tif 000009
【００５７】
ＧＰＣ分析から推定された糖類組成において、特に３，６−アンヒドロガラクトース型で、ガラクトースが優位であることが観察される。キシロース、グルコース、マンノース、フコース、およびガラクツロン酸も存在する。
エレクトロスプレーイオン化分光法（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＥＳＩ）による画分Ｆ１、Ｆ２およびＦ３の組成：
2019202993.tif 000010
【００５８】
ネガティブモードスペクトルにおいて、３，６−アンヒドロガラクトースおよびＤＰ１の六炭糖（ガラクトース、マンノースまたはグルコース）の存在が、観察される。
【００５９】
ポジティブモードスペクトルにおいて、ＤＰ１の六炭糖、イセチオン酸、フロリドシド／イソフロリドシド、ＤＰ２の六炭糖、およびＤＰ２のガラクツロン酸の存在が、観察される。
【００６０】
2019202993.tif 000011
【００６１】
ネガティブモードスペクトルにおいて、３，６−アンヒドロガラクトースおよびＤＰ１の六炭糖が、観察される。ポジティブモードスペクトルにおいて、ＤＰ１〜４の六炭糖、イセチオン酸、フロリドシド／イソフロリドシド、ＤＰ２のフロリドシド誘導体（すなわち、２つの六炭糖と１つのグリセロール官能基）、ＤＰ３のフロリドシド誘導体（すなわち、３つの六炭糖と１つのグリセロール官能基）、およびＤＰ４のフロリドシド誘導体（すなわち、４つの六炭糖と１つのグリセロール官能基）が存在する。
【００６２】
2019202993.tif 000012
【００６３】
ポジティブモードスペクトルにおいて、イセチオン酸、フロリドシド/イソフロリドシド、並びに、ＤＰ２およびＤＰ３のフロリドシド誘導体が観察される。
【００６４】
2019202993.tif 000013
【００６５】
Juanjuan Chen, Dandan Song, Qijun Luo, Tong Mou, Rui Yang, Chen Haimin, Shan He, and Xiaoj a Yan (2014). Determination of Floridoside and Isofloridoside in Red Algae by High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analytical Letters Volume 47, Pages 2307-2316。
【００６６】
フロリドシド／イソフロリドシドの理論的フラグメンテーションスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）のピークは、実測で得られたものに対応することが知られている。これは、画分Ｆ１〜Ｆ３におけるフロリドシド／イソフロリドシドの存在を証明する。
【００６７】
ＤＰ２のフロリドシド誘導体に帰属する４１６Ｄａの質量に対応するピークのＭＳ／ＭＳスペクトル（Ｍ−Ｈ）：
【００６８】
ＤＰ２のフロリドシド誘導体に対応する４１６ｍ／ｚピークが存在し、また、フラグメンテーション（六炭糖の喪失）の後に、実測値２５３ｍ／ｚピークのフラグメンテーションスペクトルのピークが現れる。これは、画分Ｆ２およびＦ３における、ＤＰ２のフロリドシド誘導体（４１６Ｄａの質量に対応するピーク）の存在を示す。六炭糖のフラグメンテーション後に、フロリドシド／イソフロリドシドのフラグメンテーションスペクトルが見られる。
【００６９】
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【００７０】
６０１のピークのフラグメンテーションは、Ｆ２およびＦ３画分における、フロリドシド誘導体の存在を証明する。
【００７１】
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【００７２】
実施例５  生物的ストレスの結果としての、植物における防御メカニズムの活性化に対する、実施例４の画分の効果
【００７３】
トマト植物のバッチ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｍａｒｍａｎｄｅ変種）を栽培する。均質な（色、葉の数）、６週齢の植物のバッチを構成する。実施例４に従って得られた画分を、０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ中の１、２および１０ｍｇ／Ｌの水溶液として、調製する。それらを、Ｔ０、Ｔ２ＤおよびＴ５Ｄにおいて、トマトの実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇ）の上に流れ出るまで、葉のスプレーとして適用し、１実験あたり４本の実生を使用する。
【００７４】
０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ中の、１０５〜１０６個の胞子／ｍｌの、菌類ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）の胞子懸濁液１００μｌを、Ｔ７Ｄにおいて、葉に付着させる。葉をＴ１４Ｄに収穫し、液体窒素中で凍結し、分析まで−２０℃で保管する。
【００７５】
分析は、カロース含有量、フェノール化合物の含有量、ペルオキシダーゼおよびフェニルアラニンアンモニアリアーゼの酵素活性などの、誘発マーカーをアッセイすることからなる。
【００７６】
結果は、３つの異なる独立した収穫物（モダリティごと、および収穫ごとに４つの植物）の平均を表している。
【００７７】
カロース含有量およびフェノール化合物の含有量は、それぞれ、Hirano, Y., Pannatier, E.G., Zimmermann, S., and Brunner, I. (2004). Induction of callose in roots of Norway spruce seedings after short-term exposure to aluminum. Tree Physiology 24, 1279-1283、および、Singleton V L & Rossi J, Jr. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Amer. J. Enol. Viticult. 16: 144-58, 1965.に従い決定する。
【００７８】
ペルオキシダーゼの酵素活性は、Shindler JS, Childs RE, Bradsley WG. (1976) Peroxidase from human cervical mucus, the isolation and characterization. Eur J Biochem .; 65 (2): 325-331. により記載される方法; Francini, A, Nali, c., Pellegrini, E, and Lorenzini, G. (2008). Characterization and isolation of some genes of the shikimate pathway in sensitive and resistant Centaurea jacea plants after ozone exposure. Environmental Pollution 151, 272-279に記載されるＰＡＬの方法に従い、決定する。
【００７９】
結果を、コントロールである０．０５容量％のＴｗｅｅｎに対する百分率として表す。
【００８０】
１ｍｇ／Ｌの濃度で、トマト植物に適用された画分Ｆ３は、コントロールの２倍のカロース含有量の増加を引き起こし、２ｍｇ／Ｌの濃度では、カロース含有量は３倍になる。１ｍｇ／ＬでのＦ１画分は、フェノール化合物の含有量の増加を引き起こし、コントロールと比較して約５０％の増加が起こる。
【００８１】
【表９】
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【００８２】
【表１０】
2019202993.tif 000017
【００８３】
１ｍｇ／ＬのＦ１画分の濃度は、ペルオキシダーゼ活性を７０％刺激する。２ｍｇ／ＬのＦ１画分の濃度は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼの酵素活性を８２％増強する。
【００８４】
【表１１】
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【００８５】
【表１２】
2019202993.tif 000019
【００８６】
得られた結果により、抽出された画分が実際に誘発活性を有することを確認することができる。
【００８７】
実施例２に従って得られた画分は、誘発マーカーがコントロール植物よりも処理植物において高いため、誘発活性を有することが証明される。また、植物の反応は、適用した画分に応じて異なる。３つの画分は、植物に適用される濃度に応じて様々な形で、ペルオキシダーゼの活性を増加させる。
【００８８】
ペルオキシダーゼ酵素は、植物が酸化ストレスを抑えるためにＡＦＯを生産する際に合成される。さらに、抗菌性フェニルプロパノイドの生合成経路に関与するだけでなく、リグニンの合成、従って細胞壁の強化にも関与する、酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼでは、活性の刺激がみられる。
【００８９】
細胞壁の補強にはまた、カロースおよびフェノール化合物の形成も含まれ、その含有量は、テングサ（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ）の単離した画分の適用によって増加する。これらの自然防御の刺激は、病原菌を抑制することができ、また、植物の抵抗性の最初の兆候の一つである。植物は、本発明に記載される抽出物および画分の存在下で、自身をよりよく防御することができる。
【００９０】
エリシター画分は、誘発マーカーを活性化および増強することにより、植物の抵抗性を増加させる。
【外国語明細書】
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