(57)【要約】【課題】本発明は、多発性骨髄腫の治療に用いられる医薬用組成物及び多発性骨髄腫細胞の増殖抑制方法を提供することを課題とする。【解決手段】ＡＭＰＤ１（adenosine monophosphate deaminase 1）阻害剤を有効成分とし、多発性骨髄腫の治療に用いられることを特徴とする、医薬用組成物、又は、多発性骨髄腫細胞をＡＭＰＤ１阻害剤で処理することにより、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する、多発性骨髄腫細胞の増殖抑制方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＰＤ１（adenosine monophosphate deaminase 1）阻害剤を有効成分とし、多発性骨髄腫の治療に用いられることを特徴とする、医薬用組成物。
【請求項２】
多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する作用を備える、請求項１に記載の医薬用組成物。
【請求項３】
前記ＡＭＰＤ１阻害剤が、抗ＡＭＰＤ１抗体、ＡＭＰＤ１と結合する低分子化合物、ＡＭＰＤ１と結合するアプタマー、又はＡＭＰＤ１遺伝子の転写産物と結合するＲＮＡ若しくは当該ＲＮＡをコードするＤＮＡである、請求項１又は２に記載の医薬用組成物。
【請求項４】
前記ＡＭＰＤ１阻害剤が、下記一般式（１）で表される化合物である、請求項３に記載の医薬用組成物。
【化１】
2019202941.tif 000005
［式中、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して炭素原子又は窒素原子を表し、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。］
【請求項５】
多発性骨髄腫細胞をＡＭＰＤ１阻害剤で処理することにより、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する、多発性骨髄腫細胞の増殖抑制方法。
【請求項６】
低酸素環境下で、多発性骨髄腫細胞をＡＭＰＤ１阻害剤で処理する、請求項５に記載の多発性骨髄腫細胞の増殖抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多発性骨髄腫の治療に用いられる医薬用組成物、及び当該組成物を用いて多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫は、抗体（免疫グロブリン）産生細胞である形質細胞の悪性腫瘍であり、主に高齢者に発症する。多発性骨髄腫の主な症状は、血清中のＭタンパク質濃度の上昇、及びこれに伴う臓器障害である。臓器障害としては、貧血、腎障害、高カルシウム血症、及び骨病変が挙げられる。多発性骨髄腫の治療法としては、プロテアソーム阻害剤や免疫調整薬などを用いた化学療法が中心であり、若年者には大量メルファラン療法併用の自家末梢血幹細胞移植も行われる。
【０００３】
多発性骨髄腫の治療剤としては、これまで多くの薬剤が開発されており、その生存期間は延長している。しかし、治療抵抗性の症例も多く、また、副作用による治療継続が困難な場合も多い。このように、化学療法による多発性骨髄腫の根治は困難であり、長期的な予後は悪いままである。そこで、骨髄腫細胞に対する特異性が高く、既存の治療標的とは異なる新しい多発性骨髄腫治療剤の開発が強く望まれている。
【０００４】
骨髄腫細胞における遺伝子発現が解析されており、骨髄腫細胞において特異的に発現している遺伝子群の１つにＡＭＰＤ１（adenosine monophosphate deaminase 1）が報告されている（非特許文献１参照。）。また、骨髄腫細胞に由来する培養細胞株においても、ＡＭＰＤ１が高発現している（非特許文献２参照。）。ＡＭＰＤは、プリン分解経路の鍵酵素であり、アデニル酸（ＡＭＰ）をイノシシ酸（ＩＭＰ）に変換し、アンモニアを産生する経路を触媒する酵素である。ＡＭＰＤのうち、ＡＭＰＤ１は、骨格筋のみに発現するとされている。骨格筋は嫌気性代謝に依存する速筋と好気性代謝に依存する遅筋に分類され、速筋でＡＭＰＤ活性が強い。運動等により骨格筋でのＡＴＰ消費が合成を上回ると、ＡＭＰの蓄積とともにＡＭＰＤ１の活性化が起こり、ＡＭＰをＩＭＰへ分解する。この結果、増加したヒポキサンチンをはじめとする尿酸前駆物質が血中に放出され、肝臓にて尿酸に代わる。例えば、ＡＭＰＤ１遺伝子変異による筋ＡＭＰＤ欠損症は、常染色体性劣性遺伝の酵素異常症であり、労作後の易疲労感、痙攣、筋痛を示す疾患である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hruz et al.，Advances in Bioinformatics，2008，Article ID 420747.
【非特許文献２】Barretina et al.，Nature，2012，vol.483，p.603-607.
【非特許文献３】Admyre et al.，Chemistry & Biology，2014，vol.21，p.1486-1496.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、多発性骨髄腫の治療に用いられる医薬用組成物及び多発性骨髄腫細胞の増殖抑制方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、多発性骨髄腫細胞においてＡＭＰＤ１の発現を抑制することにより細胞死が誘導されること、また、ＡＭＰＤ１阻害剤により多発性骨髄腫細胞の増殖が有意に抑制されることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
［１］  本発明の第一の態様に係る医薬用組成物は、ＡＭＰＤ１（adenosine monophosphate deaminase 1）阻害剤を有効成分とし、多発性骨髄腫の治療に用いられることを特徴とする。
［２］  前記［１］の医薬用組成物は、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する作用を備えることが好ましい。
［３］  前記［１］又は［２］の医薬用組成物としては、前記ＡＭＰＤ１阻害剤が、抗ＡＭＰＤ１抗体、ＡＭＰＤ１と結合する低分子化合物、ＡＭＰＤ１と結合するアプタマー、又はＡＭＰＤ１遺伝子の転写産物と結合するＲＮＡ若しくは当該ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましい。
［４］  前記［１］〜［３］のいずれかの医薬用組成物としては、前記ＡＭＰＤ１阻害剤が、下記一般式（１）で表される化合物であることが好ましい。
【０００９】
【化１】
2019202941.tif 000002
【００１０】
［式中、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して炭素原子又は窒素原子を表し、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。］
［５］  本発明の第二の態様に係る多発性骨髄腫細胞の増殖抑制方法は、多発性骨髄腫細胞をＡＭＰＤ１阻害剤で処理することにより、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制することを特徴とする。
［６］  前記［５］の多発性骨髄腫細胞の増殖抑制方法としては、低酸素環境下で、多発性骨髄腫細胞をＡＭＰＤ１阻害剤で処理することが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る医薬用組成物は、多発性骨髄腫細胞で特異的に発現しているＡＭＰＤ１に対する阻害剤を有効成分とし、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する。このため、当該医薬用組成物は、多発性骨髄腫の治療用として好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において、多発性骨髄腫細胞株におけるＡＭＰＤ１遺伝子の転写産物のバンドの染色像を示した図である。
【図２】実施例１において、正常な造血細胞におけるＡＭＰＤ１遺伝子の転写産物のバンドの染色像を示した図である。
【図３】実施例１において、多発性骨髄腫細胞株と多発性骨髄腫患者のＣＤ１３８陽性細胞におけるＡＭＰＤ１遺伝子の転写産物のバンドの染色像を示した図である。
【図４】実施例１において、多発性骨髄腫患者のＣＤ１３８陽性細胞及びＣＤ１３８陰性細胞におけるＡＭＰＤ１遺伝子の転写産物のバンドの染色像を示した図である。
【図５Ａ】実施例１において、Ｂ細胞性腫瘍におけるＡＭＰＤ１遺伝子の転写産物のバンドの染色像を示した図である。
【図５Ｂ】実施例１において、Ｂ細胞性腫瘍におけるＡＭＰＤ１遺伝子の転写産物のバンドの染色像を示した図である。
【図６】実施例１において、白血病細胞株及びＴ細胞株におけるＡＭＰＤ１遺伝子の転写産物のバンドの染色像を示した図である。
【図７】実施例１において、多発性骨髄腫患者の各細胞におけるＡＭＰＤ１遺伝子の転写産物のバンドの染色像を示した図である。
【図８】実施例１において、多発性骨髄腫患者の骨髄穿刺検体の抗ＡＭＰＤ１抗体を用いた酵素免疫染色の染色像である。
【図９】実施例１において、多発性骨髄腫患者の骨髄穿刺検体の抗ＡＭＰＤ１抗体を用いた酵素免疫染色の染色像である。
【図１０】実施例１において、形質細胞腫患者の生検の抗ＡＭＰＤ１抗体を用いた酵素免疫染色の染色像である。
【図１１】実施例１において、形質細胞腫患者の生検の抗ＡＭＰＤ１抗体を用いた酵素免疫染色の染色像である。
【図１２】実施例１において、ホジキンリンパ腫患者の生検の抗ＡＭＰＤ１抗体を用いた酵素免疫染色の染色像である。
【図１３】実施例１において、濾胞性リンパ腫患者の生検の抗ＡＭＰＤ１抗体を用いた酵素免疫染色の染色像である。
【図１４Ａ】実施例２において、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞にＡＭＰＤ１  ｓｈＲＮＡを導入した細胞のＡＭＰＤ１遺伝子の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図１４Ｂ】実施例２において、ＭＭ.１ｓ細胞にＡＭＰＤ１  ｓｈＲＮＡを導入した細胞のＡＭＰＤ１遺伝子の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図１４Ｃ】実施例２において、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞にＡＭＰＤ１  ｓｈＲＮＡを導入した細胞の細胞溶解液の抗ＡＭＰＤ１抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示した図である。
【図１５Ａ】実施例２において、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞にＡＭＰＤ１  ｓｈＲＮＡを導入したＡＭＰＤ１遺伝子ノックダウン細胞株の生細胞数（×１０４／ｍＬ）の測定結果を示した図である。
【図１５Ｂ】実施例２において、ＭＭ.１ｓ細胞にＡＭＰＤ１  ｓｈＲＮＡを導入したＡＭＰＤ１遺伝子ノックダウン細胞株の生細胞数（×１０４／ｍＬ）の測定結果を示した図である。
【図１６Ａ】実施例３において、通常の酸素濃度環境下（Normoxia）と低酸素濃度環境下（Hypoxia）で培養したＮＣＩ−Ｈ９２９細胞のＡＭＰＤ１遺伝子の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図１６Ｂ】実施例３において、通常の酸素濃度環境下と低酸素濃度環境下で培養したＭＭ.１ｓ細胞のＡＭＰＤ１遺伝子の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図１６Ｃ】実施例３において、通常の酸素濃度環境下と低酸素濃度環境下で培養したＫＭＳ−１２ＰＥ細胞のＡＭＰＤ１遺伝子の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図１６Ｄ】実施例３において、通常の酸素濃度環境下と低酸素濃度環境下で培養したＮＣＩ−Ｈ９２９細胞、ＭＭ.１ｓ細胞、及びＫＭＳ−１２ＰＥ細胞の細胞溶解液の抗ＡＭＰＤ１抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示した図である。
【図１７Ａ】実施例４において、式（１−１）化合物濃度が０〜５００μＭの培養液中で通常の酸素濃度環境下と低酸素濃度環境下で培養したＫＭＳ−１２ＰＥ細胞の細胞生存率（％）の測定結果を示した図である。
【図１７Ｂ】実施例４において、式（１−１）化合物濃度が０〜５００μＭの培養液中で通常の酸素濃度環境下と低酸素濃度環境下で培養したＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の細胞生存率（％）の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る医薬用組成物は、ＡＭＰＤ１阻害剤を有効成分とし、多発性骨髄腫の治療に用いられることを特徴とする。ＡＭＰＤ１は多発性骨髄腫細胞に特異的に発現しており、ＡＭＰＤ１の酵素活性が阻害されると、多発性骨髄腫細胞の増殖が抑制される。この多発性骨髄腫細胞に対する増殖抑制作用により、本発明に係る医薬用組成物は多発性骨髄腫の治療薬となる。
【００１４】
ＡＭＰＤ１阻害剤としては、細胞内のＡＭＰＤ１の酵素活性を低減させられるものであれば特に限定されるものではない。例えば、ＡＭＰＤ１に結合してその酵素活性を抑制又は失活させるものであってもよく、ＡＭＰＤ１の不活性変異体や酵素活性に必要な部分領域を欠損している部分タンパク質であってもよく、これらを細胞内で発現させ得るものであってもよい。また、ＡＭＰＤ１遺伝子の発現を抑制するものであってもよい。
【００１５】
ＡＭＰＤ１に結合してその酵素活性を抑制又は失活させるものとしては、例えば、抗ＡＭＰＤ１抗体、ＡＭＰＤ１と結合する低分子化合物、ＡＭＰＤ１と結合するアプタマーが挙げられる。ＡＭＰＤ１と結合するアプタマーとしては、核酸アプタマーであってもよく、ペプチドアプタマーであってもよい。核酸アプタマーからなるＡＭＰＤ１阻害剤は、例えば、ＳＥＬＥＸ法のような、ランダムな核酸ライブラリーを用いてＡＭＰＤ１全長タンパク質又はその部分タンパク質と特異的に結合し、その酵素活性を抑制するアプタマーをスクリーニングする方法により取得できる。ランダムなペプチドライブラリーや低分子化合物ライブラリーをスクリーニングすることにより、ペプチドアプタマーや低分子化合物からなるＡＭＰＤ１阻害剤も同様にして取得できる。スクリーニングを行う核酸、ペプチド、低分子化合物等のライブラリーは、公知の様々なライブラリーを用いることができる。ＡＭＰＤ１に結合するタンパク質としては、例えば、ＡＭＰＤ１を特異的に認識する抗体が挙げられる。抗ＡＭＰＤ１抗体は常法により製造できる。
【００１６】
ＡＭＰＤ１の不活性変異体や酵素活性に必要な部分領域を欠損している部分タンパク質も、ＡＭＰＤ１阻害剤として機能し得る。ＡＭＰＤ１の不活性変異体等は、細胞内において内在性のＡＭＰＤ１タンパク質と競合し、ＡＭＰＤ１の酵素活性が抑制又は阻害される。このため、これらの競合阻害性タンパク質を多発性骨髄腫細胞に十分量導入することにより、ＡＭＰＤ１タンパク質の発現を抑制した場合と同様に、多発性骨髄腫細胞の細胞増殖を抑制し得る。ＡＭＰＤ１阻害剤としては、これらの競合阻害性タンパク質そのものであってもよく、これらの発現カセットが搭載されたベクターであってもよい。競合阻害性タンパク質又はその発現カセットが搭載されたベクターは、常法により、製造することができる。
【００１７】
ＡＭＰＤ１阻害剤が、抗ＡＭＰＤ１抗体、ＡＭＰＤ１と結合する低分子化合物、ＡＭＰＤ１の核酸アプタマー、又はＡＭＰＤ１のペプチドアプタマーの場合、ＡＭＰＤ１との結合能を有する部位に加えて、又はそれ以外に、その他の機能性部位を有していてもよい。当該その他の機能性部位としては、ＡＭＰＤ１の酵素活性阻害機能を損なわないものであれば特に限定されるものではない。当該他の機能性部位としては、例えば、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等のタンパク質等の精製に汎用されているタグペプチド等が挙げられる。
【００１８】
ＡＭＰＤ１阻害剤がＡＭＰＤ１遺伝子の発現を抑制するものである場合、特に限定されるものではなく、ＡＭＰＤ１阻害剤は、ゲノムＤＮＡからＡＭＰＤ１遺伝子を削除する方法に使用される化合物であってもよく、ＲＮＡ干渉によるＡＭＰＤ１遺伝子の発現抑制に使用される化合物であってもよい。ＲＮＡ干渉は、ＡＭＰＤ１遺伝子の転写産物と結合するＲＮＡ若しくは当該ＲＮＡをコードするＤＮＡを用いて常法により行うことができる。具体的には、ＡＭＰＤ１遺伝子のｃＤＮＡの部分領域（ＲＮＡｉ標的領域）のセンス鎖とアンチセンス鎖からなる二本鎖構造を有するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）等のＲＮＡが、ＡＭＰＤ１阻害剤となる。また、これらのＲＮＡを細胞内で転写させるためのＤＮＡが組み込まれており、細胞内においてｓｉＲＮＡ等を生産させることができるＲＮＡｉ誘導ベクターも、ＡＭＰＤ１阻害剤となる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ誘導ベクターの作製、細胞への導入等は、常法により行うことができる。また、ＲＮＡｉ誘導ベクターは、市販の各種ＲＮＡｉベクターの塩基配列に、ＲＮＡｉ標的領域の塩基配列を挿入することによって作製することもできる。
【００１９】
本発明において用いられるＡＭＰＤ１阻害剤としては、公知のＡＭＰＤ１阻害剤をそのまま用いることもできる。ＡＭＰＤ１阻害剤としては、例えば、下記一般式（１）で表される低分子化合物が挙げられる（非特許文献３参照。）。一般式（１）中、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して炭素原子又は窒素原子を表し、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。下記一般式（１）で表される化合物はキラル中心があり、当該式で表される化合物には、各立体異性体も含まれる。本発明において用いられるＡＭＰＤ１阻害剤としては、ＡＭＰＤ活性が高いことから、式（１−１）で表される化合物が好ましい。
【００２０】
【化２】
2019202941.tif 000003
【００２１】
【化３】
2019202941.tif 000004
【００２２】
多発性骨髄腫細胞をＡＭＰＤ１阻害剤で処理することにより、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制することができる。ここで、「多発性骨髄腫細胞をＡＭＰＤ１阻害剤で処理する」とは、多発性骨髄腫細胞の細胞内にＡＭＰＤ１阻害剤を導入して、当該細胞内のＡＭＰＤ１の機能を阻害する又はＡＭＰＤ１遺伝子の発現を抑制することを意味する。
【００２３】
骨髄腫細胞内において、ＡＭＰＤ１発現は低酸素環境で上昇する。このため、多発性骨髄腫細胞のＡＭＰＤ１阻害剤による処理は、低酸素環境下で行うことが好ましい。低酸素環境下とは、酸素濃度が大気の酸素濃度（２０容量％）よりも低い環境下を意味し、好ましくは酸素濃度が５容量％以下の環境であり、より好ましくは酸素濃度が０．１〜５容量％の環境であり、さらに好ましくは、０．５〜２．５容量％の環境である。
【００２４】
ＡＭＰＤ１阻害剤により処理する多発性骨髄腫細胞は、生体内の骨髄等に存在する細胞であってもよく、培養細胞株のように培養容器内で培養される細胞であってもよい。例えば、処理対象である多発性骨髄腫細胞が培養細胞株のように培養容器内で培養されている細胞の場合には、当該細胞をＡＭＰＤ１阻害剤を含む培地で培養し、エンドサイトーシスを利用して細胞内に取り込ませることができる。その他、リポフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法等の公知の導入方法でＡＭＰＤ１阻害剤を細胞内に導入させてもよい。
【００２５】
ＡＭＰＤ１阻害剤により処理する多発性骨髄腫細胞が動物の生体内の細胞の場合、本発明に係る医薬用組成物を動物に投与する投与経路は、特に限定されるものではない。例えば、本発明に係る医薬用組成物の投与経路としては、経口投与、経静脈投与、腹腔内投与、注腸投与等が挙げられる。
【００２６】
本発明に係る医薬用組成物が投与される動物は、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物等が挙げられる。
【００２７】
本発明に係る医薬用組成物は、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤、徐放剤などの経口用固形剤、溶液剤、シロップ剤などの経口用液剤、注射剤、注腸剤、スプレー剤、貼付剤、軟膏剤などに製剤化することができる。製剤化は、製剤上の必要に応じて、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、流動化剤、溶剤、溶解補助剤、緩衝剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等を配合して常法により行うことができる。
【００２８】
本発明に係る医薬用組成物の投与量は、多発性骨髄腫細胞のＡＭＰＤ１活性を低減させるために十分な量のＡＭＰＤ１阻害剤を当該多発性骨髄腫細胞に導入することが可能な量であればよく、処理対象の多発性骨髄腫細胞のＡＭＰＤ１活性の強さ、処理対象の多発性骨髄腫細胞を含む動物の生物種、性別、年齢、体重、用法（投与経路、剤型、１日当たりの投与回数など）、有効成分としたＡＭＰＤ１阻害剤の種類等を考慮して適宜決定される。
【００２９】
例えば、ＡＭＰＤ１阻害剤処理により多発性骨髄腫細胞内のＡＭＰＤ１の機能を阻害する場合、ＡＭＰＤ１阻害剤処理（本発明に係る医薬用組成物による処理）がなされた多発性骨髄腫細胞の増殖能が、処理前の細胞の増殖能を１００％とした場合に、９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、よりさらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは０％（完全に死滅した状態）になるように、本発明に係る医薬用組成物の投与量を決定することが好ましい。また、ＡＭＰＤ１阻害剤処理により多発性骨髄腫細胞内のＡＭＰＤ１の発現を抑制させる場合、ＡＭＰＤ１阻害剤処理がなされた多発性骨髄腫細胞のＡＭＰＤ１の発現量を１００％とした場合に、９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、よりさらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは０％（完全に発現していない状態）になるように、本発明に係る医薬用組成物の投与量を決定することが好ましい。
【００３０】
本発明に係る医薬用組成物が含むＡＭＰＤ１阻害剤は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。また、当該医薬用組成物は、ＡＭＰＤ１阻害剤以外の他の有効成分を含有していてもよい。当該他の有効成分としては、例えば、ＡＭＰＤ１阻害作用を有さない多発性骨髄腫への治療剤等が挙げられる。
【実施例】
【００３１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３２】
＜細胞株及び検体＞
以降の実施例等において、多発性骨髄腫細胞株として、ＫＭＳ−１２ＢＭ、ＫＭＳ−１２ＰＥ、ＫＭＭ１、ＫＭＳ１１、Ｕ２６６、ＲＰＭＩ−８２２６、ＮＣＩ−Ｈ９２９、及びＭＭ１．Ｓを使用した。白血病細胞株としてＨＬ−６０、Ｋ５６２を、Ｔ細胞株としてＣＥＭ、ＭＯＬＴ−４、ＭＴ２を使用した。各細胞株は、１０％ ＦＢＳ（fatal bovine serum）含有ＲＰＭＩ１６４０培養液（Sigma-Ardrich社製）を用いて、酸素濃度２０容量％、二酸化炭素濃度５容量％、及び温度３７℃の培養条件下で培養した。低酸素条件での実験の際には、パーソナルマルチガスインキュベーター（ASTEC社製）内で各細胞株を酸素濃度１容量％、二酸化炭素濃度５容量％、及び温度３７℃の培養条件下で培養した。
【００３３】
骨髄腫患者由来の骨髄検体は、まず、Ficoll-Paque（商標）PLUS（GE Healthcare社製）に重層し、遠心後、単核球層のみを採取し、CD138 microbeads（Miltenyi Biotech社製）を用いて骨髄腫細胞を純化した。Ｂ細胞性腫瘍（原発性マクログロブリン血症（ＷＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ））の患者のリンパ節と末梢血の検体は、単核球層採取後にCD19 microbeads（Ｍiltenyi Biotech社製）を用いて腫瘍細胞を純化した。患者検体は、インフォームドコンセントの後に患者の同意を得られたものを使用した。
【００３４】
＜ＡＭＰＤ１の発現量の測定１＞
以降の実施例等において、ＡＭＰＤ１遺伝子の発現量は、ＲＴ−ＰＣＲ法又はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。
ＡＭＰＤ１遺伝子の発現量を測定する対象の細胞のＲＮＡを、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて抽出し、得られたＲＮＡからｃＤＮＡをReverTra Ace qPCR RT Master Mix（TOYOBO社製）を用いて合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ法又はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ＡＭＰＤ１の遺伝子の発現量を測定した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法では、THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (TOYOBO社製）とEco（商標）Real-Time PCR System（Illumina社製）を用いた。内在性コントロールとしてＡＣＴＢ遺伝子を用い、ΔΔＣｔ法により各検体のＡＭＰＤ１遺伝子発現量を比較した。
【００３５】
＜ＡＭＰＤ１の発現量の測定２＞
以降の実施例等において、ＡＭＰＤ１の発現量は、ウェスタンブロット法によっても測定した。
ＡＭＰＤ１遺伝子の発現量を測定する対象の細胞から、M-PER（登録商標）Mammalian Protein Extraction Reagent（Thermo Fisher Scientific社製）、Phosphatase Inhibitor Cocktail（Nacalai Tesque社製）、Protease Inhibitor Cocktail（Nacalai Tesque社製）を用いて細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液は、NuPAGE Bis-Tris precast gel（Thermo Fisher Scientific社製）で電気泳動した後、iBlot（登録商標）Gel Transfer Device（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて当該ゲルのタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。この転写膜は、１時間のブロッキング処理した後に、一次抗体を含む溶液中で１６時間インキュベートし、その後洗浄した。洗浄後の転写膜を、horseradish peroxidase結合二次抗体（GE Healthcare社製）を含む溶液中で３０分間インキュベートした。その後、当該転写膜中の目的のタンパク質を、ECL prime western blotting detection reagent （GE Healthcare社製）を用いて発色させて検出した。なお、一次抗体として、抗ＡＭＰＤ１抗体（Sigma-Aldrich社製）、抗Ａｃｔｉｎ抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）を使用した。
【００３６】
＜免疫染色＞
以降の実施例等において、抗ＡＭＰＤ１抗体を用いた酵素免疫染色は、以下の通りにして測定した。
まず、造血器腫瘍病変部のパラフィン包埋組織を２〜３μｍに薄切した組織切片を準備した。この組織切片に対して、抗ＡＭＰＤ１抗体 （Sigma-Aldrich社製）を用いて酵素免疫染色を行った。抗原賦活化処理では、組織切片を０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム緩衝液に浸透させた後、１２１℃で２０分間オートクレーブした。内因性ペルオキシダーゼ除去には、３％過酸化水素水（Wako Pure Chemical Industries社製）を用いた。発色には、diamino benzidine（Wako Pure Chemical Industries社製）を用いた。
まず、造血器腫瘍病変部のパラフィン包埋組織を２〜３μｍに薄切した組織切片を準備した。この組織切片に対して、抗ＡＭＰＤ１抗体 （Sigma-Aldrich社製）を用いて酵素免疫染色を行った。抗原賦活化処理では、組織切片を０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム緩衝液に浸透させた後、１２１℃で２０分間オートクレーブした。内因性ペルオキシダーゼ除去には、３％過酸化水素水（Wako Pure Chemical Industries社製）を用いた。発色には、diamino benzidine（Wako Pure Chemical Industries社製）を用いた。
【００３７】
＜細胞生存率の検出＞
以降の実施例等において、細胞生存率（％）は、生死判定試薬法７−ＡＡＤ（7-Amino-actinomycinD）を用いて測定した。
細胞生存率を測定する対象の細胞を７−ＡＡＤ（BioLegend社製）染色し、BD FACSVerse（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences社製）にて解析し、７−ＡＡＤ陰性細胞を生細胞として測定した。測定された生細胞数と死細胞数から、細胞生存率（［生細胞数］／（［生細胞数］＋［死細胞数］）×１００（％））を算出した。
【００３８】
［実施例１］
各血球系細胞におけるＡＭＰＤ１の発現を調べた。
【００３９】
（１）多発性骨髄腫細胞株におけるＡＭＰＤ１の発現
多発性骨髄腫細胞株であるＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ１．Ｓ及びＫＭＳ−１２ＰＥにおけるＡＭＰＤ１遺伝子の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。比較対象として、骨格筋とＰＢＭＣ（末梢血単核球細胞）についても同様にして測定した。
ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅された各遺伝子の転写産物のバンドの染色像を図１に示す。ＡＭＰＤ１遺伝子の発現は、骨格筋と多発性骨髄腫細胞株で確認できたが、ＰＢＭＣでは確認されなかった。
【００４０】
（２）正常な造血細胞におけるＡＭＰＤ１の発現
健常人から採取された造血組織から分離した、骨髄形質細胞検体４つ（ＢＭ ＰＣ−１〜ＢＭ ＰＣ−４）、リンパ節細胞検体２つ（ＬＮ−１及びＬＮ−２）、ＰＢＭＣ検体２つ（ＰＢＭＣ−１及びＰＢＭＣ−２）におけるＡＭＰＤ１遺伝子の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。
ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅された各遺伝子の転写産物のバンドの染色像を図２に示す。ＡＭＰＤ１遺伝子の発現は、ＰＢＭＣとリンパ節では確認されず、骨髄形質細胞では確認された。
【００４１】
（３）多発性骨髄腫細胞株と多発性骨髄腫患者のＣＤ１３８陽性細胞におけるＡＭＰＤ１の発現
多発性骨髄腫細胞株（ＫＭＭ１、ＫＭＳ１１、ＫＭＳ−１２ＰＥ、ＲＰＭＩ−８２２６、及びＫＭＳ−１２ＢＭ）と多発性骨髄腫患者のＣＤ１３８陽性細胞検体４つ（ＭＭ ｐｔ−１〜ＭＭ ｐｔ−４）におけるＡＭＰＤ１遺伝子の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。
ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅された各遺伝子の転写産物のバンドの染色像を図３に示す。ＡＭＰＤ１遺伝子の発現は、発現量の多寡はあるものの、ＫＭＳ−１２ＢＭ以外の全ての多発性骨髄腫細胞株と多発性骨髄腫患者のＣＤ１３８陽性細胞検体で確認された。
【００４２】
（４）多発性骨髄腫患者のＣＤ１３８陽性細胞及びＣＤ１３８陰性細胞におけるＡＭＰＤ１の発現
多発性骨髄腫患者の骨髄のＣＤ１３８陽性細胞検体２つ（ＭＭ Ｐｔ−１ ＣＤ１３８＋〜ＭＭ Ｐｔ−２ ＣＤ１３８＋）と、同じ多発性骨髄腫患者の骨髄のＣＤ１３８陰性細胞検体２つ（ＭＭ Ｐｔ−１ ＣＤ１３８−〜ＭＭ Ｐｔ−２ ＣＤ１３８−）におけるＡＭＰＤ１遺伝子の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。
ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅された各遺伝子の転写産物のバンドの染色像を図４に示す。ＡＭＰＤ１遺伝子は、多発性骨髄腫患者の骨髄の細胞のうち、ＣＤ１３８陽性細胞では発現していたが、ＣＤ１３８陰性細胞では発現していなかった。
【００４３】
（５）Ｂ細胞性腫瘍におけるＡＭＰＤ１の発現
Ｂ細胞性腫瘍のうち、ＣＬＬ患者由来の骨髄検体３つ（ＣＬＬ−１〜ＣＬＬ−３）とＷＭ患者由来の骨髄検体３つ（ＷＭ−１〜ＷＭ−３）とＤＬＢＣＬ患者由来の骨髄検体３つ（ＤＬＢＣＬ−１〜ＤＬＢＣＬ−３）とＦＬ患者由来の骨髄検体３つ（ＦＬ−１〜ＦＬ−３）におけるＡＭＰＤ１遺伝子の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。比較対象として、多発性骨髄腫細胞株（ＫＭＳ−１２ＰＥ）についても同様にして測定した。
ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅された各遺伝子の転写産物のバンドの染色像を図５Ａ及び図５Ｂに示す。ＡＭＰＤ１遺伝子は、ＣＬＬ患者、ＷＭ患者、ＤＬＢＣＬ患者、及びＦＬ患者の骨髄細胞では発現していなかった。
【００４４】
（６）白血病細胞株及びＴ細胞株におけるＡＭＰＤ１の発現
白血病細胞株２つ（ＨＬ−６０、Ｋ５６２）とＴ細胞株３つ（ＣＥＭ、ＭＯＬＴ−４、ＭＴ２）におけるＡＭＰＤ１遺伝子の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。比較対象として、多発性骨髄腫細胞株（ＫＭＳ−１２ＰＥ）についても同様にして測定した。
ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅された各遺伝子の転写産物のバンドの染色像を図６に示す。ＡＭＰＤ１遺伝子は、白血病細胞株とＴ細胞株のいずれでも発現していなかった。
【００４５】
（７）多発性骨髄腫患者の各細胞におけるＡＭＰＤ１の発現
多発性骨髄腫患者から採取された骨髄のＣＤ１３８陽性細胞検体（Ｐｔ−１ ＣＤ１３８＋）、ＣＤ１３８陰性細胞検体（Ｐｔ−１ ＣＤ１３８−）、リンパ節（ＬＮ）、ＰＢＭＣ、及び顆粒球におけるＡＭＰＤ１遺伝子の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。比較対象として、多発性骨髄腫細胞株（ＫＭＳ−１２ＰＥ）についても同様にして測定した。
ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅された各遺伝子の転写産物のバンドの染色像を図７に示す。ＡＭＰＤ１遺伝子は、骨髄のＣＤ１３８陽性細胞に特異的に発現していた。
【００４６】
（８）多発性骨髄腫患者の骨髄穿刺検体におけるＡＭＰＤ１の発現局在
多発性骨髄腫患者の骨髄穿刺検体２つ（ＭＭ ＢＭ Ａｓ−１及びＭＭ ＢＭ Ａｓ−２）、形質細胞腫（plasmacytoma）患者の生検２つ（Ｐ Ｂｓ−１及びＰ Ｂｓ−２）、ホジキンリンパ腫患者の生検１つ（ＨＬ Ｂｓ−１）、及びＦＬ患者の生検１つ（ＦＬ Ｂｓ−１）に対して、抗ＡＭＰＤ１抗体を用いて酵素免疫染色を行い、ＡＭＰＤ１の発現とその局在を調べた。
酵素免疫染色の染色像を図８〜１３に示す。多発性骨髄腫患者の骨髄穿刺検体２つでは、ＡＭＰＤ１の染色が確認されたが（図８及び９）、その他の細胞種患者の生検では、ＡＭＰＤ１の染色が確認されなかった（図１０〜１３）。これらの結果からも、ＡＭＰＤ１が多発性骨髄腫細胞に特異的に発現していることが確認できた。
【００４７】
［実施例２］
ＲＮＡ干渉により多発性骨髄腫細胞におけるＡＭＰＤ１遺伝子の発現を抑制し、その影響を調べた。
【００４８】
＜ＡＭＰＤ１遺伝子ノックダウン細胞株の樹立＞
ＡＭＰＤ１遺伝子のｃＤＮＡの部分領域と同じ塩基配列を含むＡＭＰＤ１  ｓｈＲＮＡ２種類（ｓｈＲＮＡ＃２及びｓｈＲＮＡ＃３）とコントロール ｓｈＲＮＡのベクタープラスミドをそれぞれ、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にレンチウイルスとコトランスフェクションし、レンチウイルスベクターを作製した。作製されたレンチウイルスベクターを回収し、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞とＭＭ.１ｓ細胞にポリブレンを用いて導入した後、０．５μｇ／ｍＬ  ピューロマイシン二塩酸塩（Wako Pure Chemical Industries社製）含有培養液を用いてセレクションを行った。ノックダウン効率は、ピューロマイシンを添加して３日後の細胞からＲＮＡを抽出し、ＡＭＰＤ１遺伝子発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定して判定した。また、ＲＮＡ干渉後の細胞におけるＡＭＰＤ１の発現の有無を、ウェスタンブロット法によっても測定した。
【００４９】
ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞に各ｓｈＲＮＡを導入した細胞のＡＭＰＤ１遺伝子の相対発現量（コントロール ｓｈＲＮＡを導入した細胞のＡＭＰＤ１遺伝子発現量を１とする）を図１４Ａに、ＭＭ.１ｓ細胞に各ｓｈＲＮＡを導入した細胞のＡＭＰＤ１遺伝子の相対発現量を図１４Ｂに、それぞれ示す。また、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞に各ｓｈＲＮＡを導入した細胞におけるＡＭＰＤ１の発現を確認したウェスタンブロットの結果を図１４Ｃに示す。この結果、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞とＭＭ.１ｓ細胞のいずれにおいても、ｓｈＲＮＡ＃２又はｓｈＲＮＡ＃３を導入することにより、ＡＭＰＤ１の発現が抑制されていた。
【００５０】
ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞又はＭＭ.１ｓ細胞にＡＭＰＤ１  ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ＃３）又はコントロール ｓｈＲＮＡを導入した細胞をｓｈＲＮＡの導入から１、３、５、又は８日目まで培養した細胞について、細胞生存率（％）を調べた。
ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞にｓｈＲＮＡを導入した細胞の生細胞数（×１０４／ｍＬ）の測定結果を図１５Ａに、ＭＭ.１ｓ細胞にｓｈＲＮＡを導入した細胞の生細胞数（×１０４／ｍＬ）の測定結果を図１５Ｂに、それぞれ示す。この結果、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞とＭＭ.１ｓ細胞のいずれにおいても、ｓｈＲＮＡ＃３を導入してＡＭＰＤ１の発現を抑制したＡＭＰＤ１遺伝子ノックダウン細胞株は、細胞の増殖が顕著に抑制されていた。
【００５１】
［実施例３］
骨格筋は嫌気性代謝に依存する速筋と好気性代謝に依存する遅筋に分類され、速筋でＡＭＰＤ活性が強い。そこで、骨髄腫細胞におけるＡＭＰＤ１の発現に対する酸素濃度の影響を調べた。
【００５２】
多発性骨髄腫細胞株のうち、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞、ＭＭ.１ｓ細胞、及びＫＭＳ−１２ＰＥ細胞を、通常の酸素濃度環境下（２０容量％：Normoxia）と低酸素濃度環境下（１容量％：Hypoxia）で培養し、培養開始から２４時間後及び７２時間後のＡＭＰＤ１遺伝子の相対発現量（通常の酸素濃度環境下で２４時間培養した細胞の発現量を１とする。）を調べた。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の結果を図１６Ａに、ＭＭ.１ｓ細胞の結果を図１６Ｂに、ＫＭＳ−１２ＰＥ細胞の結果を図１６Ｃに、それぞれ示す。また、培養から７２時間後の細胞の細胞溶解液を調製し、ＡＭＰＤ１の発現をウェスタンブロットで確認した。結果を図１６Ｄに示す。
【００５３】
いずれの多発性骨髄腫細胞株においても、低酸素濃度環境下で培養した細胞のほうが、通常の酸素濃度環境下で培養した細胞よりも、ＡＭＰＤ１遺伝子の発現量が有意に多く、ＡＭＰＤ１発現は低酸素環境で上昇することがわかった。
【００５４】
［実施例４］
式（１−１）化合物は、細胞内ＡＭＰ濃度を増加させてＡＭＰＫの活性化を誘導することを利用して糖尿病の治療薬の候補物質として開発されたＡＭＰＤ１阻害剤である（非特許文献３）。式（１−１）化合物による処理により、ＲＮＡ干渉により得られたＡＭＰＤ１遺伝子ノックダウン細胞株と同様に多発性骨髄腫細胞における増殖抑制効果が得らえるか調べた。式（１−１）化合物は、Sundia MediTech Company Ltd.（Shanghai, China)にて合成されたものを用いた。
【００５５】
具体的には、多発性骨髄腫細胞株のうち、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞及びＫＭＳ−１２ＰＥ細胞をそれぞれ、式（１−１）化合物濃度が０〜５００μＭの培養液で７２時間、通常の酸素濃度環境下（２０容量％：Normoxia）又は低酸素濃度環境下（１容量％：Hypoxia）で培養し、細胞生存率（％）を測定した。
【００５６】
ＫＭＳ−１２ＰＥ細胞の測定結果を図１７Ａに、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の測定結果を図１７Ｂに、それぞれ示す。この結果、ＫＭＳ−１２ＰＥ細胞における式（１−１）化合物のＩＣ５０は、通常の酸素濃度環境下では７１．８μＭ、低酸素濃度環境下では２１．３μＭであった。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞における式（１−１）化合物のＩＣ５０は、通常の酸素濃度環境下では６４．８μＭ、低酸素濃度環境下では４４．５μＭであった。このように、いずれの多発性骨髄腫細胞株でも、式（１−１）化合物により細胞内のＡＭＰＤ１の活性が阻害されて細胞増殖が有意に抑制されることが確認できた。さらにこの式（１−１）化合物による多発性骨髄腫細胞に対する細胞増殖抑制効果は、低酸素濃度環境下でより高い効果が得られることが確認された。
【００５７】
なお、多発性骨髄腫患者由来のＰＢＭＣを通常の酸素濃度環境下、式（１−１）化合物濃度が０〜５００μＭの培養液で７２時間培養したところ、その細胞生存率に対する式（１−１）化合物の影響は観察されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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