(57)【要約】【課題】  簡便な工業的手法で効率よくトマチジン又はエスクレオゲニンを製造することができるトマチジン又はエスクレオゲニンの製造方法、並びに得られるトマチジン又はエスクレオゲニンの特性を活かしたトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品を提供することを目的とする。【解決手段】  トマチジンの製造方法は、トマチンを酸処理してトマチジンを含む酸処理物を得る、酸処理工程と、前記酸処理物を精製して酸処理抽出物を得る、精製工程とを含むこととし、エスクレオゲニンの製造方法は、エスクレオサイドを酸処理して、エスクレオゲニンＡ及び／又はＢを含む酸処理物を得る、酸処理工程と、  前記酸処理物を精製して酸処理抽出物を得る、精製工程とを含むこととした。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トマチンを酸処理してトマチジンを含む酸処理物を得る、酸処理工程と、
前記酸処理物を精製して酸処理抽出物を得る、精製工程と
を含む、トマチジンの製造方法。
【請求項２】
前記酸処理工程が、中和工程を含む、請求項１に記載のトマチジンの製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の製造方法で得られるトマチジンを含有することを特徴とする、トマチジンの利用物品。
【請求項４】
エスクレオサイドを酸処理して、エスクレオゲニンＡ及び／又はＢを含む酸処理物を得る、酸処理工程と、
前記酸処理物を精製して酸処理抽出物を得る、精製工程と
を含む、エスクレオゲニンの製造方法。
【請求項５】
前記酸処理工程が、中和工程を含む、請求項４に記載のエスクレオゲニンの製造方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の製造方法で得られるエスクレオゲニンを含有することを特徴とする、エスクレオゲニンの利用物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トマチジン又はエスクレオゲニンの製造方法、並びにトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイド配糖体構造を有するトマチンは未成熟トマトに含まれることが知られており、根や果実のほか、花、葉、茎に特に多く存在する。トマチンは虫に食べられないようにするため防御的な役割を担う成分と考えられており、毒性を持つことから大量摂取は推奨されていない。
一方、トマチンのアグリコンであるトマチジンは通常トマトには含まれておらず、土壌病原菌等に感染した際に、それらの菌が有するトマチナーゼによってトマチンが毒性の無いトマチジンへと変換することが知られている。このトマチジンには、血中コレステロールの低下、動脈硬化の抑制等に効果があることが知られている（特許文献１）。
【０００３】
一方、成熟したトマトにはトマチンはほとんど含まれておらず、エスクレオサイドＡ（３−Ｏ−β−リコテトラオシル（５Ｓ、２２Ｓ、２３Ｓ、２５Ｓ）−２３−アセトキシ−３β、２７−ジヒドロキシスピロソラン２７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノサイド）やその類縁体であるエスクレオサイドＢ（３−Ｏ−β−リコテトラオシル（５Ｓ、２２Ｓ、２３Ｒ、２５Ｓ）−２２、２６−エピミノ−１６β、２３−エポキシ−３β、２３、２７−トリヒドロキシコレスタン２２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノサイド）というステロイド配糖体が含まれていることが明らかとされている。これらのエスクレオサイドは抗がん作用等の生理活性を有することが明らかとされている（非特許文献１）。また、可食性乾燥トマト粉末には、トマトステロイド配糖体として、エスクレオサイドＡとＢのいずれか一方、又は両方が含まれていることも報告されている（特許文献２）。
また、エスクレオサイドのアグリコンであるエスクレオゲニンは通常トマトには含まれていないが、エスクレオサイドと同様に抗がん作用等を有することが明らかになっている。
【０００４】
トマチジンは通常トマトに含まれないため、トマチンから有機化学的に得る等の方法が取り得るが、その際に毒性のあるトマチンを十分に除去するために、多くの工程、時間を要することから、未だ実用に至っていない。
【０００５】
また、エスクレオゲニンを得る方法についても未だ実用に至っていない。
したがって、エスクレオゲニンやトマチジンに係る効果を検証することや、これらを化粧品等に利用し、評価することも非常に困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２０９０９９号公報
【特許文献２】特開２０１０−２７３５９３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ６０（２００４）４９１５―４９２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記事情に対し、簡便な工業的手法で効率よくトマチジン又はエスクレオゲニンを製造することができるトマチジン又はエスクレオゲニンの製造方法、並びに得られるトマチジン又はエスクレオゲニンの特性を活かしたトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討した結果、トマチンとエスクレオサイドから、それぞれトマチジンとエスクレオゲニンを工業的に簡便に効率よく製造する方法を見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち、前記目的を達成するため、本発明に係るトマチジンの製造方法は、トマチンを酸処理してトマチジンを含む酸処理物を得る、酸処理工程と、前記酸処理物を精製して酸処理抽出物を得る、精製工程とを含む。これにより、少ない工程、時間により、簡便に効率よくトマチジンを得ることができる。
【００１１】
本発明に係るトマチジンの製造方法は、その一態様で、前記酸処理工程に、中和工程を含む。
【００１２】
本発明は、別の側面でトマチジンの利用物品であり、本発明に係るトマチジンの製造方法で得られるトマチジンを含む。利用物品が化粧品、食品、医薬品である場合、ビタミンＤ様活性を得られる他、高い保湿効果を得ることができ、肌荒れを抑制することができる。
【００１３】
また、前記目的を達成するため、本発明に係るエスクレオゲニンの製造方法は、エスクレオサイドを酸処理して、エスクレオゲニンＡ及び／又はＢを含む酸処理物を得る、酸処理工程と、前記酸処理物を精製して酸処理抽出物を得る、精製工程とを含む。毒性のあるトマチンをほとんど含まない成熟したトマトから得られるエスクレオサイドを用いることで、より簡便に効率よくエスクレオゲニンを得ることができる。
【００１４】
本発明に係るエスクレオゲニンの製造方法は、その一態様で、前記酸処理工程に、中和工程を含む。
【００１５】
本発明は、別の側面でエスクレオゲニンの利用物品であり、本発明に係るエスクレオゲニンの製造方法で得られるエスクレオゲニンを含む。利用物品が化粧品、食品、医薬品である場合、ビタミンＤ様活性を得られ、高い保湿効果を得ることができ、肌荒れを抑制することができる。
【００１６】
なお、本明細書及び特許請求の範囲において、トマチン由来又はエスクレオサイド由来とは、トマチン又はエスクレオサイドに所定の処理を行うことにより得られた脱配糖体（トマチンの脱配糖体はトマチジン、エスクレオサイドの脱配糖体はエスクレオゲニン）に由来することを意味する。所定の処理とは、酸処理、抽出等の、脱配糖体を得るための任意の処理のことをいう。また、本発明に係るトマチジン又はエスクレオサイドの製造方法で得られる酸処理抽出物は、トマチジン又はエスクレオサイドのみを含む態様とすることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、簡便な工業的手法で効率よくトマチジン又はエスクレオゲニンを製造することができるトマチジン又はエスクレオゲニンの製造方法、並びに得られるトマチジン又はエスクレオゲニンの特性を活かしたトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】トマチジンとトマチンのビタミンＤ様活性の比較を示すグラフである。
【図２】エスクレオゲニンのビタミンＤ様活性を示すグラフである。
【図３】エスクレオゲニンによるフィラグリン遺伝子発現量の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に、本発明に係るトマチジン又はエスクレオゲニンの製造方法、並びにトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品の実施形態を説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施の形態によって限定されるものではない。
【００２０】
［トマチジンの製造方法］
本発明に係るトマチジンの製造方法は、トマチンを酸処理して、トマチジンを含む酸処理物を得る、酸処理工程と、前記酸処理物を精製して酸処理抽出物を得る、精製工程とを含む。
【００２１】
原料となるトマチンは、未成熟のトマトの花、葉、茎、根や未熟果実に含まれている公知の化合物であり、トマトから抽出して得てもよいし、有機化学的に合成して得てもよい。
【００２２】
酸処理工程においては、エタノール等の低級アルコール等の有機溶剤を含む希酸水溶液を穏やかに加熱することにより行う。用いる酸としては、塩酸、酢酸などを例示することができる。
より具体的には、原料となるトマチンを、エタノールを含む０．１〜２Ｎ塩酸中で室温（２４℃）〜６０℃の温度で加温し、０．５〜３時間程度反応させる。反応停止は希アルカリを加えて中和することで行う。これにより、トマチンを脱配糖し、トマチジンを含む酸処理物を得ることができる。なお、本発明者らは、鋭意検討することにより、このような手順で脱配糖することが最も効率的であり、工業的手法に適することに想到した。
【００２３】
精製工程においては、析出物、不溶性残渣等を取り除く。
精製工程では、メッシュサイズの異なる複数のフィルターを用いて段階的にろ過をすることで行う。なお、フィルターを用いる他、カラムを用いることによって行うこともできる。
このようにして、本発明に係るトマチジンの製造方法によれば、酸処理により簡便な工業的手法で効率よくトマチンを十分に脱配糖し、トマチンが含まれないようにトマチジンを抽出して、好適なトマチン由来の酸処理抽出物を製造することができる。
【００２４】
本発明のトマチン由来の酸処理抽出物には、残留トマチンの含有量が、酸処理抽出物全量に対して、１０質量％以下であることが好ましく、５質量％以下であることがより好ましく、１質量％以下であることがさらに好ましい。
【００２５】
［エスクレオゲニンの製造方法］
本発明に係るエスクレオゲニンの製造方法は、エスクレオサイドを酸処理して、エスクレオゲニンＡ及び／又はＢを含む酸処理物を得る、酸処理工程と、前記酸処理物を精製して酸処理抽出物を得る、精製工程とを含む。
【００２６】
原料となるエスクレオサイドは公知の化合物であり、成熟したトマトから抽出して得てもよく、有機化学的に合成して得てもよい。エスクレオサイドには、エスクレオサイドＡ及びＢがありこれらは互いに類縁体であり、トマトの産地や種類によって、含まれるエスクレオサイドＡ及びＢの含有量比は異なる。
【００２７】
酸処理工程においては、エタノール等の低級アルコール等の有機溶剤を含む希酸水溶液を穏やかに加熱することにより行う。用いる酸としては、塩酸、酢酸などを例示することができる。
より具体的には、原料となるエスクレオサイドを、エタノールを含む０．１〜２Ｎ塩酸中で室温（２４℃）〜６０℃の温度で加温し、０．５〜３時間反応させる。反応停止は希アルカリを加えて中和することで行う。これにより、エスクレオサイドＡ及び／又はＢを脱配糖し、エスクレオゲニンＡ及び／又はＢを含む酸処理物を得ることができる。なお、本発明者らは、鋭意検討することにより、このような手順で脱配糖することが最も効率的であり、工業的手法に適することに想到した。
【００２８】
精製工程においては、析出物、不溶性残渣等を取り除く。
精製工程では、メッシュサイズの異なる複数のフィルターを用いて段階的にろ過をすることで行う。なお、フィルターを用いる他、カラムを用いることによって行うこともできる。
【００２９】
前述した通り、原料となるエスクレオサイドには、エスクレオサイドＡ及びＢがありこれらは互いに類縁体であり、トマトの産地や種類によって、含まれるエスクレオサイドＡ及びＢの含有量比は異なる。よって、エスクレオサイドＡ及びＢから脱配糖したエスクレオゲニンＡ及びＢも互いに類縁体であり、トマトの産地や種類によって、酸処理抽出物に含まれるエスクレオゲニンＡとＢの含有量比は異なる。したがって、エスクレオゲニンＡ及びＢの構造は特定されているものの、本発明で得られるエスクレオサイド由来の酸処理抽出物は、エスクレオゲニンＡとＢを含み、その含有量比は特に限定されるものではない。
【００３０】
［トマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品］
本発明者らは、鋭意検討した結果、トマチジン及びエスクレオゲニンにビタミンＤ様の効果、特に、保湿効果や肌荒れ抑制効果があることを見出した。
本発明に係るトマチジンの製造方法で得られる、トマチン由来の酸処理抽出物は、このような特性を備えるトマチジンを含む。また、本発明に係るエスクレオゲニンの製造方法で得られる、エスクレオサイド由来の酸処理抽出物は、このような特性を備えるエスクレオゲニンを含む。
これらの酸処理抽出物は、本発明に係るトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品に採用することができる。
本発明に係るトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品は、化粧品、食品、医薬品（経口投与用又は皮膚外用剤などの非経口投与用を含む）等としての用途がある。
【００３１】
本発明に係るトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品は、化粧品として採用される場合、乳液、クリーム、ローションのようなスキンケア製品等として使用できる。化粧品として使用することで、肌の乾燥を抑えること、肌荒れを抑えること等の効果が得られる。
すなわち、本発明に係る利用物品は、以下のような化粧品を包含する。
トマチジンを含む化粧品組成物。
トマチジンを有効成分として含むビタミンＤ様活性の発現用化粧品。
トマチジンを有効成分として含む肌の保湿用化粧品。
トマチジンを有効成分として含む肌荒れ防止用化粧品。
エスクレオゲニンを含む化粧品組成物。
エスクレオゲニンを有効成分として含むビタミンＤ様活性の発現用化粧品。  
エスクレオゲニンを有効成分として含む肌の保湿用化粧品。
エスクレオゲニンを有効成分として含む肌荒れ防止用化粧品。
【００３２】
本発明に係るトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品は、食品として採用される場合、通常の食品の他、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等、清涼飲料、ドリンク剤、サプリメント、飼料等として使用でき、保湿効果や肌荒れ抑制効果などの美肌効果等の効果を得ることができる。
すなわち、本発明に係る利用物品は、以下のような食品を包含する。
トマチジンを有効成分として含むビタミンＤ様活性の発現用食品。
トマチジンを有効成分として含む肌の保湿用食品。
トマチジンを有効成分として含む肌荒れ防止用食品。
エスクレオゲニンを有効成分として含むビタミンＤ様活性の発現用食品。  
エスクレオゲニンを有効成分として含む肌の保湿用食品。
エスクレオゲニンを有効成分として含む肌荒れ防止用食品。
【００３３】
本発明に係るトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品に含まれるエスクレオゲニン又はトマチジンは、含有量が、利用物品の全量に対して、１〜５０質量％であることが好ましく、５〜５０質量％であることがより好ましく、１０〜５０質量％であることがさらに好ましい。
【００３４】
本発明に係るトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品は、トマチジン又はエスクレオゲニンの他に、本発明の目的を損なわない範囲で他の成分を配合することができる。化粧品として用いる場合は、他の成分としては、防腐剤、酸化防止剤、生理活性成分、動物・海藻・微生物・植物由来エキス成分、香料、紛体、アミノ酸、色素、天然ビタミン類等が挙げられる。また、食品として使用する場合は、他の成分としては、各種油脂、生薬、アミノ酸、多価アルコール、天然高分子、ビタミン、食物繊維、界面活性剤、精製水、賦形剤、安定剤、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、甘味料、呈味成分、有機酸等の酸味料、安定剤、フレーバー、着色料、香料等を挙げることができる。
【００３５】
本発明に係るトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品は、本発明の目的を損なわない範囲で、様々な形態をとりうる。例えば、化粧品として用いる場合は、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水―油２層系、水―油―粉末３層系等、幅広い形態を取り得る。また、食品として用いる場合は、摂取しやすい形態であれば特に限定されず、固体、粉末、液体、ゲル状、スラリー状等を挙げることができる。
【実施例】
【００３６】
以下に、実施例を挙げて本発明に係るトマチジン又はエスクレオゲニンの製造方法、並びにトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品をさらに具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実施例、比較例によって限定されるものではない。
【００３７】
実施例１：
［赤色トマト由来のエスクレオゲニン含有の酸処理抽出物の製造］
赤色トマトを水中でホモゲナイズし、粗ろ過した後、ＨＰ−２０カラムにて精製を行った。ＨＰ−２０カラムは最初に精製水にて洗浄後、エタノールにて成分の溶出を行った。溶出した成分は１Ｎ塩酸を含む５０％エタノール中で６０℃にて１時間の酸処理を行った。水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、ろ過精製した後にエバポレーターにて乾固させた。得られた固形物はオリーブオイルに再溶させることでエスクレオゲニンを含有する酸処理抽出物を得ることができた。こうして得られた酸処理抽出物にエスクレオゲニンが存在すること及びその含有量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて確認した。
【００３８】
実施例２：  
［赤色トマト由来のエスクレオゲニンの製造］
赤色トマトを水中でホモゲナイズし、粗ろ過した後、ＨＰ−２０カラムにて精製を行った。ＨＰ−２０カラムは最初に精製水にて洗浄後、メタノールにて成分の溶出を行った。溶出した成分は１Ｎ塩酸を含む５０％メタノール中で６０℃にて１時間の酸処理を行った。水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、酢酸エチルを用いて分離精製を行った。得られた成分を順相カラムを用いて、クロロホルム／メタノール／水をそれぞれ９／１／０．１の割合で含む溶液で精製することでエスクレオゲニンを得ることができた。エスクレオゲニンが得られたことは、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて確認した。
【００３９】
実施例３：  
［未成熟トマト由来のトマチジン含有の酸処理抽出物の製造］
実施例１と同様の手順で未成熟トマトを処理することによって、トマチジンを含有する酸処理抽出物を得ることができた。得られた酸処理抽出物にトマチジンが存在すること及びその含有量はＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて確認した。
【００４０】
実施例４：  
［未成熟トマト由来のトマチジンの製造］
実施例２と同様の手順で未成熟トマトを処理することによって、トマチジンを得ることができた。トマチジンが得られたことは、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて確認した。
【００４１】
実施例５：
［トマチジン又はエスクレオゲニンの活性の確認試験（ビタミンＤ様の効果について）］
トマチジン及びエスクレオゲニンのビタミンＤ様の効果を確認した。具体的には、トマチジン及びエスクレオゲニンのビタミンＤレセプターに対するアゴニスト活性を、ルシフェラーゼアッセイを用いた下記方法により確認した。
まず、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）―ルシフェラーゼ発現ベクターを、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株、ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＪＣＲＢ細胞バンク）に遺伝子導入した。また、遺伝子導入は市販のＣｉｇｎａｌ  ＶＤＲＥ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＣＣＳ−２０２９Ｌ、ＱＩＡＧＥＮ製）及び、Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１００５、ＱＩＡＧＥＮ製）を用い、メーカー推奨の手順に従って行った。ＨｅｐＧ２細胞は４×１０４個／ｗｅｌｌとなるよう９６ｗｅｌｌプレートに播種し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（３１０８５−０６２、Ｇｉｂｃｏ製）／５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）培地を用いて３７℃、５％のＣＯ２の条件下で培養した。
続いて、遺伝子導入１６時間経過後にＯｐｔｉ−ＭＥＭ／０．５％ＦＢＳ培地  １００μｌ／ｗｅｌｌに培地交換した後、さらに４時間培養した。
遺伝子導入から計２０時間経過後、実施例２又は４で調製した被験物質（トマチジン又はエスクレオゲニン）を添加し、１８時間培養し回収した。
その後、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅ１９１０、Ｐｒｏｍｅｇａ製）を使用し、メーカー推奨の手順に従って細胞内ルシフェラーゼ活性を測定した。なお、細胞溶解液及びルシフェラーゼ基質はともに９６ｗｅｌｌの発光測定用白色プレート（ＭＳ−８０９６Ｗ、住友ベークライト製）に添加し、ルシフェラーゼの測定はマイクロプレートリーダー（ＡＲＶＯ  ＭＸ  １４２０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を使用した。
トマチジンのルシフェラーゼ活性の測定結果は図１に示し、エスクレオゲニンのルシフェラーゼ活性の測定結果は図２に示した。図１では、トマチジン及びトマチンを添加していない試料をコントロールとし、各試料について、当該コントロールに対する相対値を示した。また、図２では、エスクレオゲニンを添加しない試料をコントロールとし、各試料について、当該コントロールに対する相対値を示した（ｎ＝３）。
【００４２】
図１の結果から、トマチジンはビタミンＤレセプターに対するアゴニスト活性を濃度依存的に示し、ビタミンＤ様の効果があることを確認した。特に、１０ｎＭでは１．２８、１００ｎＭでは１．５７、５００ｎＭでは１．９８、１０００ｎＭでは２．２０という高いアゴニスト活性を示した。これに対し、トマチンのビタミンＤレセプターに対するアゴニスト活性はコントロールと同程度であり、ビタミンＤ様の効果はみられなかった。
また、図２の結果から、エスクレオゲニンもまた、ビタミンＤレセプターに対するアゴニスト活性を濃度依存的に示し、ビタミンＤ様の効果があることを確認した。特に、０．０１ｎＭという低濃度でも２．８９という高い効果を示し、０．１ｎＭでは４．４０、１ｎＭでは４．４３、１０ｎＭでは６．９４、１００ｎＭでは９．１８、１０００ｎＭでは９．１２という非常に高いアゴニスト活性を示した。
【００４３】
実施例６：
［フィラグリン遺伝子の発現変動の評価（保湿効果）］
ビタミンＤは、経口摂取や皮膚に塗布することにより、肌荒れの抑制効果や高い保湿効果を得られることが知られている。そこで、アトピー性皮膚炎モデル評価系により、エスクレオゲニンによる皮膚のバリア効果、保湿効果を測定した。具体的には、表皮顆粒層の角化細胞に存在し、皮膚のバリア機能や保湿効果に重要な役割を果たすフィラグリン遺伝子のエスクレオゲニンによる発現変動を評価した。
【００４４】
（サンプルＣ）
ＰＳＶＫ１細胞（ヒト角化細胞株、ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＪＣＲＢ細胞バンク)を６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。培地は、ＭＣＤＢ  １５３(Ｍ７４０３、Ｓｉｇｍａ製)に添加剤（下記※１）を加えたものを使用した。
（※１）
５μｇ/ｍｌのインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、０．１ｍＭのエタノールアミン（細胞培養用培地添加剤ＲＤ−１を使用した。５５１−２０３００−４、極東製薬製）、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、０９３−０６３５１、Ｗａｋｏ製）、０．１ｍＭのホスホエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｐ０５０３、Ｓｉｇｍａ製）、１０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、Ｅ９６４４、Ｓｉｇｍａ製）、及び４０μｇ／ｍｌのウシ脳下垂体抽出物（ｂｏｖｉｎｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ、１３０２８０１４、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
【００４５】
翌日、培地を交換した。培地はＭＣＤＢ  １５３(Ｍ７４０３、Ｓｉｇｍａ製)に添加剤および１．３５ｍＭのＣａＣｌ２（０６７２９−５５、ナカライテスク製）を加えたものを用いた。また、実施例２で調製したエスクレオゲニンを濃度が１μＭ(＝１０００ｎＭ)となるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。その後、ＩＬ−４(ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４、２００−０４、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ製)を終濃度２０ｎｇ／ｍｌとなるよう添加した。
以降、１日おきに前記の培地交換と、前記エスクレオゲニンの添加、及びその２時間後のＩＬ−４の添加を１週間行なった。
その後、１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、細胞を回収した（サンプルＣ）。
【００４６】
（サンプルＢ）
エスクレオゲニンを添加しない点以外は、サンプルＣと同様の方法で処理・培養を行い、サンプルＢを得た。
【００４７】
（サンプルＡ）
エスクレオゲニンとＩＬ−４を添加しない点以外は、サンプルＣと同様の方法で処理・培養を行い、サンプルＡを得た。
【００４８】
前記サンプルＡ〜Ｃの各細胞種から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（７４１０６、ＱＩＡＧＥＮ製)を用いて回収サンプルよりＲＮＡを抽出した。操作はメーカー推奨の方法に従って行った。こうして得られたＲＮＡより、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（６２１０Ａ、タカラバイオ製）を用いてｃＤＮＡを調製した。操作はメーカー推奨の方法に従って行った。
【００４９】
ｃＤＮＡをテンプレートにＴａｑＭａｎ法によるリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、フィラグリン遺伝子の発現変動を評価した。ｑＰＣＲに際し、フィラグリンのＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅはＨｓ００８５６９２７＿ｇ１、内在性コントロールは１８Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）  ７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を測定機器として使用した。全ての操作はメーカー推奨の方法に従って行った（ｎ＝３）。
【００５０】
各サンプルの、フィラグリン遺伝子発現量の測定結果を図３に示す。サンプルＢ、Ｃの測定結果は、サンプルＡに対する相対値によって示す。
この結果から、サンプルＡの１．００に対して、ＩＬ−４を添加することでフィラグリン遺伝子の発現量が０．２９まで減弱することが確認された（サンプルＢ）。
これに対し、エスクレオゲニンを添加することで、ＩＬ−４の添加によるフィラグリン遺伝子の発現量の減弱が０．３５まで抑制されることが分かった（サンプルＣ）。
以上の結果より、エスクレオゲニンが、ＩＬ−４の添加によるフィラグリン遺伝子発現量の減弱を抑制する効果があることが示された。よって、エスクレオゲニンには、皮膚のバリア機能や保湿機能を向上させる効果があることが分かった。また、実施例５で、エスクレオゲニンと同様に高いビタミンＤ様効果があることが示されたトマチジンについても、同様に高い皮膚のバリア機能や保湿機能がある可能性が示された。
【００５１】
実施例７：
［官能試験］
実施例１、３で得られたトマチジン又はエスクレオゲニンの利用物品として、化粧品の使用感に関する評価を以下の評価方法により行った。
トマチジンとエスクレオゲニンのそれぞれについて、利用物品を５名の被験者の肌に塗布し、塗布時の仕上がりを自己評価した。使用感の評価項目として、保湿感、肌荒れの抑制効果を各自が以下の評価基準に従って５段階評価し、５名の平均値ｘを求めた。
評価基準：
５：  非常に良好
４：  良好
３：  ふつう
２：  やや不良
１：  不良
【００５２】
トマチジンの利用物品では、保湿感の平均値ｘが４．２となり、肌荒れの抑制効果については平均値ｘが３．８であった。
また、エスクレオゲニンの利用物品では、保湿感の平均値ｘが４．０となり、肌荒れの抑制効果については平均値ｘが４．２であった。
このように、トマチジン又はエスクレオゲニンを、例えば化粧品として使用すれば、特に高い保湿効果を得られることから、肌の乾燥を抑え、肌荒れを抑える効果があることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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