(57)【要約】      （修正有）【課題】アゾール系薬剤に耐性であるアスペルギルス・フミガーツスの簡易検出法の提供。【解決手段】繰り返し塩基配列内の塩基配列と前記繰り返し塩基配列外の塩基配列との其々にＦＲＥＴ効果を持つ蛍光標識プローブをハイブリダイズさせる第１の工程と、前記繰り返し配列を含む領域をＰＣＲにより増幅させる第２の工程と、前記ＰＣＲ反応中に分解される蛍光標識プローブから発生する蛍光強度を測定する第３の工程と、前記繰り返し塩基配列内にハイブリダイズした前記蛍光標識プローブと前記繰り返し塩基配列外にハイブリダイズした前記蛍光標識プローブの其々から発せられた蛍光強度を比較する第４の工程からなる、前記繰り返し配列の反復数を測定する方法。【選択図】図１
2019013206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繰り返し塩基配列内の塩基配列と繰り返し塩基配列外の塩基配列とのそれぞれに、ＦＲＥＴ効果を持つ蛍光標識プローブをハイブリダイズさせる第１の工程と、繰り返し配列を含む領域をＰＣＲにより増幅させる第２の工程と、ＰＣＲ反応中に分解される蛍光標識プローブから発生する蛍光強度を測定する第３の工程と、繰り返し塩基配列内にハイブリダイズした蛍光標識プローブと繰り返し塩基配列外にハイブリダイズした蛍光標識プローブのそれぞれから発せられた蛍光強度を比較する第４の工程からなる、繰り返し配列の反復数を測定する方法。
【請求項２】
蛍光標識プローブの少なくとも一つの塩基がＲＮＡであり、前記工程にＲＮａｓｅＨを加えることを特徴とする、請求項１に記載の繰り返し配列の反復数を測定する方法。
【請求項３】
繰り返し配列がアスペルギルス・フミガーツスのＣｙｐ５１Ａ遺伝子のプロモーター領域に存在する繰り返し配列である、請求項１または請求項２に記載の繰り返し配列の反復数を測定する方法。
【請求項４】
繰り返し配列が（配列番号１）であり、繰り返し配列内にある蛍光標識プローブの配列が（配列番号２）であり、繰り返し配列外にある蛍光標識プローブの配列が（配列番号３）であり、ＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマーとリバースプライマーの配列がそれぞれ（配列番号６）および（配列番号７）である、請求項３に記載のアスペルギルス・フミガーツスのＣｙｐ５１Ａ遺伝子のプロモーター領域に存在する繰り返し配列の反復数を測定する方法。
【請求項５】
繰り返し配列が（配列番号１）であり、繰り返し配列内にある蛍光標識プローブの配列が（配列番号４）であり、繰り返し配列外にある蛍光標識プローブの配列が（配列番号５）であり、ＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマーとリバースプライマーの配列がそれぞれ（配列番号６）および（配列番号７）である、請求項３に記載のアスペルギルス・フミガーツスのＣｙｐ５１Ａ遺伝子のプロモーター領域に存在する繰り返し配列の反復数を測定する方法。
【請求項６】
配列番号１の反復数が１回である場合をアゾール感受性アスペルギルス・フミガーツスであり、反復数が２回である場合をアゾール耐性アスペルギルス・フミガーツスとする、アゾール耐性アスペルギルス・フミガーツス株の検出方法。
【請求項７】
（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号６）および（配列番号７）、又は  （配列番号４）、（配列番号５）、（配列番号６）および（配列番号７）を含む、請求項６に記載のアゾール耐性アスペルギルス・フミガーツス株の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアゾール耐性アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の簡易検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスペルギルス症はアスペルギルス属真菌を原因とする様々な病態の感染症の総称であり、胞子の吸入とそれに引き続く体内での増殖が原因の日和見感染症である。主要な原因菌はアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ） であり、臨床上最重要視される真菌である。免疫不全者や免疫力が低下している宿主で発症し、速やかに症状が進行し、重篤な場合には全身に感染が広がる。治療しても致死率が高い疾患であり、治療が遅れることは患者にとって極めて危険である。
【０００３】
アジアを含めた世界各地で抗真菌薬であるアゾール系薬剤であるボリコナゾールやイトラコナゾールに耐性のアスペルギルス・フミガーツス（以下、アゾール耐性株という。）の出現が報告されている。このアゾール耐性株はｃｙｐ５１Ａ遺伝子のプロモーター領域に３４ｂｐあるいは４６ｂｐの２ 回繰り返し配列を持つこと、及び一つもしくは複数のアミノ酸置換を伴うことを特徴とする。プロモータ領域の繰り返し配列は単独で野生株に比較して８倍の耐性を誘導し、さらにＣｙｐ５１Ａ の９８番目のアミノ酸変異が加わることにより複数のアゾール系に耐性を示すようになると考えられている。
【０００４】
発明者は日本国内で採取された臨床分離株（非特許文献１）、および土壌細菌（非特許文献２）の中からアゾール耐性アスペルギルス・フミガーツス（ＯＫＨ５０）を初めて見出し、すでにアゾール耐性株が日本国内にも侵入し、蔓延し始めていることを報告した。
【０００５】
従来、遺伝子診断、病原菌の特定などの際に、多検体・多項目を検出するために、ＤＮＡチップ法が頻繁に用いられるようになってきたが、定量性が低く、繰り返し塩基配列の反復数を測定するなどの定量性の高さが求められる検出には適さないという課題がある。
【０００６】
アゾール耐性株の検出法に関しては、特許文献１がＡｚＲＦ１転写因子の５５９〜５６２位における残基ＱＳＱＳの欠失変異を指標とする方法を開示している。また非特許文献３は３４ｂｐ繰り返し配列近傍の領域をＰＣＲで増幅し、その鎖長からアゾール耐性であるか否かを判定する方法を開示している。さらに特許文献２は、繰り返し配列の内部と外部にそれぞれ異なる標識を導入し、標識量を測定することによって繰り返し配列の反復数を測定する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１０−５２５８３７号公報
【特許文献２】特開２００８−１９３９８４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  （ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉａｃ．２０１６．１２．００４）
【非特許文献２】Ｍｅｄ.  Ｍｙｃｏｌ.  Ｊ.  ５８，Ｅ６７〜Ｅ７０，（２０１７）
【非特許文献３】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ.  ５６，３９０５−１０，（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１は特定のアミノ酸変異のみを指標としていることから他のアゾール耐性株を見落とす可能性があり、非特許文献３の方法は２回のＰＣＲと電気泳動による検出を必要とすることから煩雑である。また、特許文献２は遺伝子中に含まれる繰り返し配列の反復数を測定するための方法を開示しているが、本アゾール耐性株の検出法を示唆するものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した課題を解決するために本発明者は鋭意努力した結果、本アゾール耐性株の簡便な検出を可能とする本発明を完成させた。
【００１１】
（１）繰り返し塩基配列内の塩基配列と繰り返し塩基配列外の塩基配列とのそれぞれに、ＦＲＥＴ効果を持つ蛍光標識プローブをハイブリダイズさせる第１の工程と、繰り返し配列を含む領域をＰＣＲにより増幅させる第２の工程と、ＰＣＲ反応中に分解される蛍光標識プローブから発生する蛍光強度を測定する第３の工程と、繰り返し塩基配列内にハイブリダイズした蛍光標識プローブと繰り返し塩基配列外にハイブリダイズした蛍光標識プローブのそれぞれから発せられた蛍光強度を比較する第４の工程からなる、繰り返し配列の反復数を測定する方法。
（２）蛍光標識プローブの少なくとも一つの塩基がＲＮＡであり、前記工程にＲＮａｓｅＨを加えることを特徴とする、（１）に記載の繰り返し配列の反復数を測定する方法。
（３）繰り返し配列がアスペルギルス・フミガーツスのＣｙｐ５１Ａ遺伝子のプロモーター領域に存在する繰り返し配列である、（１）または（２）に記載の繰り返し配列の反復数を測定する方法。
（４）繰り返し配列が（配列番号１）であり、繰り返し配列内にある蛍光標識プローブの配列が（配列番号２）であり、繰り返し配列外にある蛍光標識プローブの配列が（配列番号３）であり、ＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマーとリバースプライマーの配列がそれぞれ（配列番号６）および（配列番号７）である、（３）に記載のアスペルギルス・フミガーツスのＣｙｐ５１Ａ遺伝子のプロモーター領域に存在する繰り返し配列の反復数を測定する方法
（５）繰り返し配列が（配列番号１）であり、繰り返し配列内にある蛍光標識プローブの配列が（配列番号４）であり、繰り返し配列外にある蛍光標識プローブの配列が（配列番号５）であり、ＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマーとリバースプライマーの配列がそれぞれ（配列番号６）および（配列番号７）である、（３）に記載のアスペルギルス・フミガーツスのＣｙｐ５１Ａ遺伝子のプロモーター領域に存在する繰り返し配列の反復数を測定する方法。
（６）配列番号１の反復数が１回である場合をアゾール感受性アスペルギルス・フミガーツスであり、反復数が２回である場合をアゾール耐性アスペルギルス・フミガーツスとする、アゾール耐性アスペルギルス・フミガーツス株の検出方法。
（７）（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号６）および（配列番号７）、又は  （配列番号４）、（配列番号５）、（配列番号６）および（配列番号７）を含む、（６）に記載のアゾール耐性アスペルギルス・フミガーツス株の検出キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来の検出法と比較して、アゾール耐性アスペルギルス・フミガーツスを簡便に検出・判定することがができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】繰り返し配列の反復数を測定する方法を示した模式図である。
【図２】本アゾール耐性株と感受性株でリアルタイムＰＣＲを行った時の増幅曲線を示す。
【図３】ＰＣＲのサイクル数の差から、本アゾール耐性株と感受性株が識別できることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明者が臨床分離株および環境中から検出した、抗真菌剤であるアゾール系薬剤に対して耐性を獲得したアスペルギルス・フミガーツス（ＯＫＨ５０）はＣｙｐ５１Ａ遺伝子のプロモーター領域に３４ｂｐからなる２回繰り返し配列を持つことを特徴としている。ＯＫＨ５０のプロモーター領域近傍の配列を配列番号８に示す。３’末端のＡＴＧがＣｙｐ５１Ａ遺伝子の開始コドンである。本発明はこの繰り返し配列の反復数を簡便に測定する方法を開示するものであり、以下にその方法を説明する。
【００１５】
図１に示す青プローブと赤プローブは蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）効果をもつ蛍光色素で標識されており、それぞれ繰り返し配列の上流側と３４ｂｐの繰り返し単位内にハイブリダイズする。ＦおよびＲプライマーを用いてＴａｑＭａｎプローブ法（タカラバイオ）によりＰＣＲを行い、繰り返し配列を含む領域を増幅させる。この時、ＤＮＡ鎖の延長反応を行うＤＮＡポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性を合わせ持つため、ハイブリダイズしたプローブが分解され、蛍光を発する。本アゾール耐性株は２回繰り返し配列を持つため、青プローブ由来の蛍光量に比べて赤プローブ由来の蛍光量が２倍観測される。一方で、感受性株では繰り返しがないために青プローブと赤プローブは同量の蛍光量となる。
【００１６】
サイクリングプローブ法(タカラバイオ)はＲＮＡ残基を含むプローブとＲＮａｓｅＨを用いるＳＮＰ等の検出法である。ＲＮａｓｅＨは二本鎖を形成するＤＮＡとＲＮＡのうちＲＮＡ側を分解するため、ＴａｑＭａｎプローブ法と同様の効果が得られる。サイクリングプローブ法はＴａｑＭａｎプローブ法に比べてエンドポイントでの計測の可能性があるという点で優位性を持つ。
【００１７】
図２は、ほぼ同量のＤＮＡを用い、本アゾール耐性株と感受性株のリアルタイムＰＣＲを行った時の赤プローブの結果を示す。予想通り感受性株（始点側）よりも本アゾール耐性株（終点側）の方が立ち上がりが早く、同じサイクル数ではより多くの赤プローブが分解されていること、すなわち繰り返し配列の反復数が多いことを示している。
【００１８】
図３は本法による反復数の定量性を示す図である。あらかじめＰＣＲで増幅した精製ＤＮＡ断片を実施例に記載の倍率で希釈し、青プローブと赤プローブを加えて再度ＰＣＲを行った。コントロールとなる青プローブのＣｔ値から繰り返し配列を示す赤プローブのＣｔ値を引き算することにより、タンデムリピート配列を持つアゾール耐性株を明確に判別することができる。本アゾール耐性株は２回繰り返し配列を持つため理論値は１であり、感受性株では０となる（四角で囲んだスポット）。なお、丸で囲んだスポットはゲノムＤＮＡを用いた結果であり、実験系が正常に作動していることを示す。テンプレート量は≧１０７に渡って異なっていても再現良く高い値を示した。さらにＰＣＲ増幅精製ＤＮＡ断片ではなく、ゲノムＤＮＡを用いても同様の結果が得られた。
【００１９】
理論値に比べて実測値は低めにでているが、本発明により簡便に本アゾール耐性株を検出することが可能になった。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
アスペルギルス・フミガーツスのアゾール感受性でタンデムリピート配列がない（繰り返しがない）ＯＫＨ３１株とアゾール耐性でタンデムリピート配列があるＯＫＨ５０株はポテトデキストロース寒天培地（ディフコラボラトリーズ）上で２５℃もしくは３５℃で数日から２週間程度培養した。培養後に胞子を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬）で懸濁した。
【００２２】
懸濁胞子１白金耳（およそ数マイクロリットル）を０．５ｍＬから１ｍＬのポテトデキストロース液体培地（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓもしくはディフコラボラトリーズ）に接種し、３５℃で一晩培養後に菌糸を回収した。回収した菌糸はバイオマッシャーＩＶ（ニッピ）にて破砕し、塩化リチウム（和光純薬）・エチレンジアミン四酢酸（同仁化学）・トリス（和光純薬）・ドデシル硫酸ナトリウム（ナカライテスク）（ＬＥＴＳ）バッファ３５０μＬに懸濁し、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール（ナカライテスク）３５０μＬを加えて、激しく撹拌した。撹拌後１５，０００ｒｐｍで１０分、４℃にて遠心により層分離を行う。上層の水層およそ３００μＬを回収し、１ｍＬのエタノール（ナカライテスク）と混ぜて、１５，０００ｒｐｍで２，３分遠心分離し、上清を除く。７０％エタノールを５００−７００μＬ加えて、再度１５，０００ｒｐｍで２，３分遠心分離し、上清を除く。再度遠心分離後にできるだけ上清を除き、室温での乾燥後に２０μＬの０．３ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ  を含むｐＨ８．０に調整した１０ｍＭ  トリス溶液に懸濁した。
【００２３】
図２および図３に用いた増幅済みＤＮＡ断片は次の通り、ＰＣＲ反応により調整した。ＰＣＲ反応液はＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（タカラバイオ）５μＬ、図１に示すＦ．プライマーおよび（配列番号７）Ｒ．プライマー（配列番号６）（タカラバイオにて委託合成を行った。）の５ｐｍｏｌ／μＬ溶液をそれぞれ０．４μＬ、上記調製ＤＮＡ溶液１μＬ、超純水３．２μＬを混ぜて、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２７２０（アプライドバイオシステム）で９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  １分を３０サイクル繰り返して増幅した。増幅後、ＴＡＥバッファ（コスモバイオ）中１％  アガロースＳ（ニッポンジーン）にて分離後、増幅されたＤＮＡ断片をファストジーンＧｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティクス）で抽出した。抽出したＤＮＡはそのまま、もしくは超純水で希釈（１０２，１０３，１０４，１０６，１０８倍）を行って、リアルタイムＰＣＲに用いた。
【００２４】
リアルタイムＰＣＲは次の通りに行った。なお、青プローブ（配列番号５：サイクリングプローブ、ＨＥＸとクエンチャーがラベルされている、タカラバイオにて委託合成を行った。）の５’側から５つ目の塩基Ａと、赤プローブ（配列番号４：サイクリングプローブ、ＦＡＭとクエンチャーがラベルされている、タカラバイオにて委託合成を行った。）の５’側から４つ目の塩基ＡはともにＲＮＡである。
【００２５】
タカラバイオＣｙｃｌｅａｖｅ  ＰＣＲ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いた。反応溶液はＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  １０μＬ、図１に示すＦ．プライマー（配列番号６）およびＲ．プライマー（配列番号７）それぞれ０．８μＬ、青プローブ（配列番号５）０．８μＬ、赤プローブ（配列番号４）０．８μＬ、調製ゲノムＤＮＡ、もしくは増幅ＤＮＡ断片もしくはその希釈溶液１μＬ、これら容量に対して２０μＬとなるように超純水を加えた。リアルタイムＰＣＲはライトサイクラー４８０インスツルメントＩＩ（ロシュ）を用いて行った。ＰＣＲ反応は最初に９５℃  ３０秒ホールドを行い、９５℃  ５秒、５５℃  １０秒、７２℃  １５秒を４５サイクル行った。蛍光は７２℃のステップで検出した。Ｃｔ値は２ｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ法で算出した。結果を図２および図３に示す。
【図１】
2019013206.tif 000003
【図２】
2019013206.tif 000004
【図３】
2019013206.tif 000005
【配列表】
2019013206000001.app