(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞懸濁液中の少なくとも２つの染色体の領域のコピー数を同時に決定する方法の提供。【解決手段】ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）の方法；チロシンキナーゼ経路を標的とする活性物質に対する患者の応答をテラノースする方法；ＩＳＨまたはＩＨＣの方法を含むテラノーシス方法の改良；ＩＳＨまたはＩＨＣの方法で検出可能に標識されているプローブと接触させた細胞がその表面上にある細胞支持体；及び（ａ）ＩＳＨまたはＩＨＣ用の細胞支持体及び／または少なくとも１つのプローブ及び（ｂ）細胞支持体上でＩＳＨまたはＩＨＣの方法を実施するための使用説明書を含むキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織または細胞の凝塊を含む患者標本からの細胞の調製方法であって、
（ｉ）前記患者標本を、還元剤及びキレート剤を含む予加温した平衡塩類溶液中に浸漬し；
（ｉｉ）前記患者標本を、還元剤、カルシウムイオン源及び極性非プロトン性溶媒を含む新鮮な平衡塩類溶液に移し、混合し；
（ｉｉｉ）前記患者標本を前記の新鮮な平衡塩類溶液から取り出し、（ａ）前記溶液を遠心して脱凝集させた細胞をペレット化するか、または（ｂ）前記溶液を濾過して脱凝集させた細胞を収集し；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）（ａ）後には上清を捨て、前記ペレット化細胞を残留上清中に再懸濁し、再懸濁した細胞を固定液中に入れ、または（ｉｉｉ）（ｂ）後には前記の濾過した細胞を固定液中に入れる；
ことを含み、組織または細胞の凝塊を含む患者標本から細胞を調製する前記方法。
【請求項２】
前記患者標本が、（ａ）新鮮標本、（ｂ）解凍した新鮮冷凍標本、または（ｃ）部分的に固定した標本である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、（ｉ）の前に、前記患者標本を平衡塩類溶液を用いて濯ぐことを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
−前記患者標本を室温でハンクス緩衝液を用いて濯ぎ；
−前記患者標本を２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）及び５ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含有する予加温したハンクス緩衝液中に３７℃で約５分間浸漬し；
−前記した濯ぎ、浸漬した患者標本を２０ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０％  ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含有する新鮮なハンクス緩衝液に移し、約５秒間から約１０秒間混合し；
−前記患者標本を前記の新鮮なハンクス緩衝液から取り出し、（ａ）前記溶液を約１０００×ｇで約１０分間遠心して脱凝集させた細胞をペレット化するか、または前記溶液を濾過して脱凝集させた細胞を収集し；
−遠心後前記上清を捨て、前記ペレット化細胞を残留上清中に再懸濁し、再懸濁した細胞を溶液中に入れるか、または濾過した後前記の濾過した細胞を溶液中に入れることを含み、前記溶液は約３０重量％から約６０重量％のメタノール、約４０重量％から約７０重量％の水、緩衝液及び保存剤を含み、前記溶液を室温で一晩保存する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
更に、（ｖ）前記細胞を細胞支持体に適用することを含む、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞支持体が細胞診スライドであり、前記方法は更に、
（ｖｉ）前記スライドを水−アルコール溶液中に浸漬し、
（ｖｉｉ）前記スライドを固定液中に浸漬し、
（ｖｉｉｉ）前記スライドを乾燥させる
ことを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記水−アルコール溶液は９５％  エタノールであり、前記スライドをエタノール中に室温で約１５分間浸漬し、前記固定液はカルノア液であり、前記スライドをカルノア液中に室温で約３０分間浸漬し、前記スライドを室温で乾燥させる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１、２、３または４に記載の方法に従って調製した細胞を、ハイブリダイジング条件下で検出可能に標識されているプローブと接触させ、患者から標本を取り出してから約１４時間未満で前記検出可能な標識を可視化することを含むｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）の実施方法。
【請求項９】
前記検出可能に標識されているプローブは、蛍光標識されている核酸プローブまたは蛍光標識されている抗体（または、その抗原的に反応性の断片）プローブである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が細胞支持体に適用されている請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞支持体は少なくとも２つの不連続エリアを含み、前記細胞を不連続エリアに適用し、各エリアを少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触させ、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならばこれらの検出可能に標識されているプローブは区別され得る請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
各不連続エリアを検出可能に標識されているプローブの混合物と別々に接触させ、前記混合物は、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＯＳＩに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びｃ−ＭＥＴに対するプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＮＴＲＫ１に対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＫＩＦ５Ｂに対するプローブ、
−ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＡＵＲＫＡに対するプローブ、９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、染色体３に対するＣＥＰ、染色体６に対するＣＥＰ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、ＤＣＣに対するプローブ、１３ｑ１４に対する遺伝子座特異的プローブ及び染色体１８に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＴＥＲＣに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＨＥＲ２に対するプローブ、ＺＮＦ２１７に対するプローブ及び９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、
−ＭＣＬ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、染色体３に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＰＴＥＮに対するプローブ、ＥＲＧに対するプローブ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対する２色ブレイクアウェイプローブ、染色体８に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、または
−ＭＥＴに対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、染色体７に対するＣＥＰ及び染色体３に対するＣＥＰ
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
微細針吸引、コア針生検、摘徐生検及び切除からなる群から選択される標本からの脱凝集させた細胞をハイブリダイジング条件下で検出可能に標識されているプローブと接触させ、患者から前記標本を取り出してから約１４時間未満に前記検出可能な標識を可視化することを含むｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）の実施方法。
【請求項１４】
前記の検出可能に標識されているプローブが蛍光標識されている核酸プローブであるか、または蛍光標識されている抗体（または、その抗原的に反応性の断片）プローブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が細胞支持体に適用されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞支持体は少なくとも２つの不連続エリアを含み、前記細胞を不連続エリアに適用し、各エリアを少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触させ、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならばこれらの検出可能に標識されているプローブは区別され得る請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
各不連続エリアを検出可能に標識されているプローブの混合物と別々に接触させ、前記混合物は、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＯＳＩに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びｃ−ＭＥＴに対するプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＮＴＲＫ１に対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＫＩＦ５Ｂに対するプローブ、
−ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＡＵＲＫＡに対するプローブ、９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、染色体３に対するＣＥＰ、染色体６に対するＣＥＰ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、ＤＣＣに対するプローブ、１３ｑ１４に対する遺伝子座特異的プローブ及び染色体１８に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＴＥＲＣに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＨＥＲ２に対するプローブ、ＺＮＦ２１７に対するプローブ及び９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、
−ＭＣＬ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、染色体３に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＰＴＥＮに対するプローブ、ＥＲＧに対するプローブ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対する２色ブレイクアウェイプローブ、染色体８に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、または
−ＭＥＴに対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、染色体７に対するＣＥＰ及び染色体３に対するＣＥＰ
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＩＳＨまたはＩＨＣを請求項１２に記載の方法に従って実施することを含む、チロシンキナーゼ経路を標的とする活性物質を用いる治療に対する患者の応答のテラノース（ｔｈｅｒａｎｏｓｅ）方法。
【請求項１９】
前記チロシンキナーゼ経路を標的とする活性物質が、クリゾチニブ、ボリチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダサチニブ、トラスツズマブ、またはペルツズマブである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＩＳＨを請求項１７に記載の方法に従って実施することを含む、チロシンキナーゼ経路を標的とする活性物質を用いる治療に対する患者の応答をテラノースする方法。
【請求項２１】
前記したチロシンキナーゼ経路を標的とする活性物質が、クリゾチニブ、ボリチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダサチニブ、トラスツズマブ、またはペルツズマブである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１０、１１または１２に記載の方法の使用を含む、テラノーシス方法における改善。
【請求項２３】
請求項１５、１６または１７に記載の方法の使用を含む、テラノーシス方法における改善。
【請求項２４】
請求項１１または１２に記載の方法に従って検出可能に標識されているプローブと接触させた細胞がその表面上にある細胞支持体。
【請求項２５】
請求項１６または１７に記載の方法に従って検出可能に標識されているプローブと接触させた細胞がその表面上にある細胞支持体。
【請求項２６】
（ａ）ＩＳＨまたはＩＨＣ用の細胞支持体及び／または少なくとも１つのプローブ、及び
（ｂ）請求項１１または１２に記載の方法を実施するための使用説明書
を含むキット。
【請求項２７】
（ａ）ＩＳＨまたはＩＨＣ用の細胞支持体及び／または少なくとも１つのプローブ、及び
（ｂ）請求項１６または１７に記載の方法を実施するための使用説明書
を含むキット。
【請求項２８】
（ａ）ＩＳＨまたはＩＨＣ用の細胞支持体及び／または少なくとも１つのプローブ、及び
（ｂ）請求項１８または１９に記載の方法を実施するための使用説明書
を含むキット。
【請求項２９】
（ａ）ＩＳＨまたはＩＨＣ用の細胞支持体及び／または少なくとも１つのプローブ、及び
（ｂ）請求項２０または２１に記載の方法を実施するための使用説明書
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織または細胞の凝塊から得た細胞の調製方法、前記細胞を含む細胞支持体、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、染色体異常の検出、テラノーシス（ｔｈｅｒａｎｏｓｉｓ）及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌のような癌を治療するための標的療法の選択では、生検標本を、当該癌バイオマーカーを用いて短時間で検査する必要がある。当該バイオマーカーが複数、例えば３つ以上あることはよくあることである。微細針吸引（ＦＮＡ）またはコア針生検では、しばしば疾患の進行期及び付随する病気のために患者から１つの標本しか得られない。その標本は細胞、組織、または肺癌の場合の気管吸引のような生体液を少量しか含んでいないので、標本の使用を最大限とすることが重大となる。
【０００３】
典型的には、ＦＮＡまたはコア針生検は摘除生検または切開生検と同様にプロセッシングされる。固定するために標本をホルムアルデヒド中に２４〜４８時間置く。その後、固定した標本をパラフィン中に包埋する。固定した標本のパラフィンでの包埋には更に２４時間かかる可能性がある。標本を固定／包埋した後、標本を約４〜６ミクロンの厚さに切断する。次いで、乾燥させるために切片をスライド上に載せる。切片の乾燥には別に２４時間かかる可能性がある。蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）前に、乾燥させた切片がその表面上にあるスライドを焼成しなければならない。スライドの焼成には約２時間から約１８時間かかる可能性がある。よって、ＦＩＳＨ用標本を作製するには約５日間かかる。例えば患者が疾患の進行期にあるか、侵襲性の癌に罹っている場合には、時間が患者のアウトカム及び生存における重大な要因となる。
【０００４】
Ｌｉら（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，８６：６１９−６２７（２００６））は、原発性肺癌に関連する遺伝子に対する特定のゲノムプローブを開発し、カバーガラス上にプローブの４つの異なる組成物を配置することを含むマルチプルＦＩＳＨアレイを設計することにより癌診断を向上させることを試みた。各組成物は遺伝子座特異的プローブ及び２つの染色体の各々に対するセントロメアプローブを合計で４つのプローブを含有しており、各プローブは異なる色で標識されていた。スライド上のハイブリダイゼーション緩衝液中に懸濁させた細胞上にカバーガラスを伏せた。Ｌｉらの方法は遺伝子特異的ゲノムプローブの作製を必要とするという欠点がある。加えて、細胞の１つの懸濁液上にゾーン状スライドガラスを伏せると、分析のために全くまたは少数の細胞しか含有していないスライドのエリアにスライドガラスの１つ以上のゾーンが伏される恐れがある。更に、Ｌｉらはこの方法を気管支洗浄と一緒に使用することのみ開示しており、方法で使用するためにどのように他のタイプの標本を作製するかは教示していない。実際、Ｌｉらはこの方法は多分気管支洗浄液のような臨床標本で成功しているが、四分円の一つに偽陰性のリスクがある小さな生検標本または固定組織に対しては適当でないことがある。
【０００５】
Ａｂｒａｍｏｖｉｃｈら（ＲＵ２４１０６６３；Ｒｕｓｓｉａｎ  Ａｐｐ．Ｎｏ．ＲＵ２００９０１３４３６４，２００９年９月１４日公開）は、標準的方法により調製した細胞懸濁液（５μＬ）を顕微鏡スライドの表面に対して有孔パラフィルムストリップを密封接着させることにより形成した孔に適用することを開示しているようである。パラフィルムストリップは２６×５６ｍｍ２であり、直径９ｍｍであり、４ｍｍ離れており、スライドの端部から２ｍｍ離れて８個の孔を含んである。結果は同時ＦＩＳＨのために複数の単離ゾーンとして記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ロシア特許第２４１０６６３号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，８６：６１９−６２７（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＦＩＳＨを標本収集の数時間以内に開始し、２つ以上、例えば複数のバイオマーカーを同時に分析できることが非常に望ましい。従って、本発明の目的は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、例えば蛍光ＩＳＨ（すなわち、ＦＩＳＨ）、特にマルチプレックスＦＩＳＨ、並びに免疫組織化学（ＩＨＣ）のための細胞をＩＳＨ及びＩＨＣ結果が標本収集の約１４時間未満で得ることができるように標本収集の１．５時間以内で調製する方法を提供することである。この目的及び他の目的及び作用効果、並びに発明の要件は本明細書中の詳細説明から明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
組織または細胞の凝塊を含む患者標本からの細胞の調製方法を提供する。この方法は、
（ｉ）患者標本を、還元剤及びキレート剤を含む予加温した平衡塩類溶液中に浸漬し；
（ｉｉ）患者標本を、還元剤、カルシウムイオン源及び極性非プロトン性溶媒を含む新鮮な平衡塩類溶液に移し、混合し；
（ｉｉｉ）患者標本を新鮮な平衡塩類溶液から取り出し、（ａ）溶液を遠心して脱凝集させた細胞をペレット化するか、または（ｂ）溶液を濾過して脱凝集させた細胞を収集し；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）（ａ）後には上清を捨て、ペレット化細胞を残留上清中に再懸濁し、再懸濁した細胞を固定液中に入れ、または（ｉｉｉ）（ｂ）後には濾過した細胞を固定液中に入れる；
ことを含む。患者標本は、（ａ）新鮮標本、（ｂ）解凍した新鮮冷凍標本、または（ｃ）部分的に固定した標本であり得る。方法は更に、（ｉ）の前に、患者標本を、平衡塩類溶液を用いて濯ぐことを含み得る。
【００１０】
方法の実施形態は、患者標本を室温でハンクス緩衝液を用いて濯ぎ；患者標本を、２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）及び５ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含有する予加温したハンクス緩衝液中に３７℃で約５分間浸漬し；濯ぎ、浸漬した患者標本を２０ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０％  ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含有する新鮮なハンクス緩衝液に移し、約５秒間から約１０秒間混合し；患者標本を新鮮なハンクス緩衝液から取り出し、（ａ）溶液を約１０００×ｇで約１０分間遠心して脱凝集させた細胞をペレット化するか、または（ｂ）溶液を濾過して脱凝集させた細胞を収集し；遠心後上清を捨て、ペレット化細胞を残留上清中に再懸濁し、再懸濁した細胞を溶液中に入れるか、または濾過した後濾過した細胞を溶液中に入れることを含み、前記溶液は約３０重量％から約６０重量％のメタノール、約４０重量％から約７０重量％の水、緩衝液及び保存剤を含み、前記溶液を室温で一晩保存する。
【００１１】
方法は更に、（ｖ）細胞を細胞支持体に適用することを含む。細胞支持体が細胞診スライドならば、方法は更に（ｖｉ）スライドを水−アルコール溶液中に浸漬し、（ｖｉｉ）スライドを固定液中に浸漬し、（ｖｉｉｉ）スライドを乾燥させることを含む。水−アルコール溶液は９５％  エタノールであり得、スライドをエタノール中に室温で約１５分間浸漬する。固定液はカルノア液であり得、スライドをカルノア液中に室温で約３０分間浸漬し得る。スライドを室温で乾燥させ得る。
【００１２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施する方法も提供する。１つの実施形態では、方法は、上記方法に従って調製した細胞をハイブリダイジング条件下で検出可能に標識されているプローブと接触させ、患者から標本を取り出してから約１４時間未満で検出可能な標識を可視化することを含む。他の実施形態では、方法は、微細針吸引、コア針生検、摘徐生検及び切除からなる群から選択される標本由来の脱凝集させた細胞をハイブリダイジング条件下で検出可能に標識されているプローブと接触させ、患者から標本を取り出してから約１４時間未満で検出可能な標識を可視化することを含む。検出可能に標識されているプローブは蛍光標識されている核酸プローブ、例えば蛍光ＩＳＨ（ＦＩＳＨ）用プローブ、または蛍光標識されている抗体プローブ、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）用プローブであり得る。好ましくは、細胞を細胞支持体に適用し得る。好ましい実施形態では、細胞支持体は少なくとも２つの不連続エリアを含み、細胞を不連続エリアに適用し、各エリアを少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触させ、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならばこれらの検出可能に標識されているプローブは区別され得る。実施形態では、各不連続エリアを別々に検出可能に標識されているプローブの混合物と接触させ、その混合物は、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＯＳＩに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びｃ−ＭＥＴに対するプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＮＴＲＫ１に対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＫＩＦ５Ｂに対するプローブ、
−ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＡＵＲＫＡに対するプローブ、９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、染色体３に対するＣＥＰ、染色体６に対するＣＥＰ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、ＤＣＣに対するプローブ、１３ｑ１４に対する遺伝子座特異的プローブ及び染色体１８に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＴＥＲＣに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＨＥＲ２に対するプローブ、ＺＮＦ２１７に対するプローブ及び９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、
−ＭＣＬ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、染色体３に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＰＴＥＮに対するプローブ、ＥＲＧに対するプローブ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対する２色ブレイクアウェイプローブ、染色体８に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、または
−ＭＥＴに対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、染色体７に対するＣＥＰ及び染色体３に対するＣＥＰ
からなる。
【００１３】
更に、チロシンキナーゼ経路を標的とする活性物質に対する患者の応答をテラノースする方法を提供する。この方法は、細胞が適用されており、少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブを別々に接触させる少なくとも２つの不連続エリアを含む細胞支持体を用いて上記方法に従ってＩＳＨまたはＩＨＣを実施することを含む。エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならば検出可能に標識されているプローブは区別され得る。チロシンキナーゼ経路を標的とする活性物質はクリゾチニブ、ボリチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダサチニブ、トラスツズマブ、またはペルツズマブであり得る。
【００１４】
もっと更に、テラノーシス方法の改良を提供する。この改良は、例えば細胞が適用されており、少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触させる少なくとも２つの不連続エリアを含む細胞支持体上で上記したＩＳＨまたはＩＨＣを実施する方法を使用することを含み、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならば検出可能に標識されているプローブは区別され得る。
【００１５】
もっと更に、上記したＩＳＨまたはＩＨＣを実施する方法に従って上記したような検出可能に標識されているプローブと接触している細胞がその表面上にある細胞支持体を提供する。この細胞支持体は少なくとも２つの不連続エリアを含み、各エリアを少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触させ、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならばこれらの検出可能に標識されているプローブは区別され得る。各不連続エリアを上記した混合物のような検出可能に標識されているプローブの混合物と別々に接触させてもよい。
【００１６】
よって、キットも提供する。そのキットは、（ａ）ＩＳＨまたはＩＨＣ用の細胞支持体及び／または少なくとも１つのプローブ、及び（ｂ）上記したＩＳＨまたはＩＨＣの実施方法を例えば細胞が適用されており、少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触している少なくとも２つの不連続エリアを含む細胞支持体上で実施するための使用説明書を含み、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならばこれらの検出可能に標識されているプローブは区別され得る。加えてまたは替えて、使用説明書は上記したテラノーシス方法を実施するための使用説明書を含み得る。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、組織サンプルから得た細胞の調製方法、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、特にマルチプレックスＦＩＳＨ、免疫組織化学（ＩＨＣ）の方法、テラノーシスの方法、細胞支持体及びキットを提供する。細胞の調製方法により、組織標本を患者から微細針吸引（ＦＮＡ）、コア針生検、摘徐生検、切除等により得た後できるだけすぐに、例えば約１４時間（例えば、約１３．５時間）未満で核酸ハイブリダイゼーション（例えば、マルチプレックスＦＩＳＨのようなＦＩＳＨ）を実施することができる。組織標本は、（ａ）新鮮であり、（ｂ）解凍した新鮮冷凍であり、または（ｃ）部分的に固定され得る。固定／包埋標本の使用を避けることにより、ハイブリダイゼーション結果はより明瞭に見ることができ、包埋標本の切片作製に関連する打ち切りアーチファクトを避けることができる。本方法により、ＩＳＨ、例えばＦＩＳＨ用に使用しなければならないプローブを含めた試薬の容量を固定／包埋標本に対するＩＳＨ、例えばＦＩＳＨと比較して低減または実質的に低減させることができる。更に、本方法によりＩＳＨ、例えばＦＩＳＨを比較的小さな限定エリアで実施することができ、全体を迅速に画像処理することができる。よって、本方法によりマルチプレックスＩＳＨ、例えばマルチプレックスＦＩＳＨが可能である。
【００１８】
本方法は、例えば別の治療オプションよりも成功する可能性が高い治療オプション、予後判定、考えられる治療応答、予防または治療処置のモニタリング、治療効果の評価等を選択する目的で一般的にコンパニオン診断と称されているテラノーシスにおいて有用である。
【００１９】
より具体的な例は癌の標的療法に対するコンパニオン診断である。すべての迅速に分裂する細胞で干渉される化学療法とは明瞭に対照的に、標的療法（分子標的療法とも称される）は発癌や腫瘍増殖に必要な特別の標的分子で干渉することにより癌細胞の増殖を阻止する。標的治療はより有効であり、正常細胞に対して余り有害でないと予想される。標的治療の主なカテゴリーは小分子、小分子薬物コンジュゲート及びモノクローナル抗体である。現在、乳癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、前立腺癌、メラノーマ及び他の癌に対する標的治療がある。
【００２０】
患者が癌を有していると診断されるか、癌を有していると疑われる場合には、マルチプレックスＩＳＨ（例えば、マルチプレックスＦＩＳＨ）用の細胞のサンプルを複数の（すなわち、２つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の）プローブを用いて作製することが好ましく、望ましくさえあり、この場合各プローブまたはプローブの組合せ（例えば、２つ、３つまたはそれ以上のプローブ）により癌バイオマーカーを検出することができる。この点で、マルチプレックスＦＩＳＨにより、複数の（すなわち、２つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の）癌バイオマーカーを検出することができることが好ましく、望ましくさえある。本発明は多くは癌の関連で、特に癌の診断、癌の予後判定、（併用治療を含めた）癌治療の選択、治療効果の評価、治療のモニタリング、再発のモニタリング等に向けられているが、本発明はマルチプレックスＩＳＨ（例えば、マルチプレックスＦＩＳＨ）による評価を受けることができる他の疾患の関連で有用であると理解されたい。
【００２１】
本方法は、大量生産される予防及び治療薬のテーラード製造及びテーラード投与、並びに前記物質を単独または他の活性物質と一緒のテーラード製造及びテーラード投与において、例えば個別化した用量レベルの２つ以上の活性物質を含有しているピル剤及びポリピル剤の製造及び処方においても有用である。従って、本方法により、医薬コンパウンディング、すなわち特定患者のために有効成分含量及び／または処方に対する患者の具体的要望に応じて医薬品を製造する従来のプラクティスが容易になる。２つ以上の活性物質を含有しているポリピル剤の製造は大量生産される一定容量の配合医薬品の使用に対する代替を提供する。
【００２２】
用語
以下の用語が本発明に関連する：
「約」は、示されている値からほぼ±１０％の変動を指す。特に言及されていてもいなくても、本明細書中に記載されている所与の値には前記変動が常に含まれると理解されたい。
【００２３】
「腺腫」は、腺起源の良性腫瘍である。本明細書中、「腺腫」、「結腸腺腫」、「結腸の腺腫」及び「結腸腺腫」は、腺腫様ポリープとも称されている結腸中の腺腫を指すために使用され得る。腺腫様ポリープは通常結腸内視鏡検査により発見され、悪性になる傾向があるので切除される。
【００２４】
本明細書中、「腺癌」、「結腸腺癌」、「結腸の癌」及び「結腸腺癌」は、結腸での悪性増殖（すなわち、癌）を指すために使用され得る。
【００２５】
本明細書中、「ＡＬＫ」は、染色体２上に位置する未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは２ｐ２３であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは２ｐ２３．１である。別名は未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼ、ＣＤ２４６、ＣＤ２４６抗原、ＥＣ  ２．７．１０．１、ＮＢＬＳＴ３、Ｋｉ−１、ＡＬＫチロシンキナーゼ受容体及び変異未分化リンパ腫キナーゼを含む。本明細書中、「ＡＬＫ」は、ＡＬＫを伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＡＬＫを伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＡＬＫ遺伝子を含む染色体２のｐ２３領域（２ｐ２３）にハイブリダイズさせることが好ましい。参照ＤＮＡ配列には、ＮＣ＿０００００２．１１及びＮＴ＿０２２１８４．１５が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書中、「ＡＵＲＫＡ」は、ヒト染色体２０上のｑ１３に位置するオーロラキナーゼＡ遺伝子を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは２０ｑ１３であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは２０ｑ１３．２である。ＡＵＲＫＡの別名はＡＲＫ１、ＢＴＡＫ、ＳＴＫ１５、ＳＴＫ６、ＡｌＫ、ＰＰＰ１Ｒ４７、ＳＴＫ７、セリン／スレオニンキナーゼ６、オーロラ２、オーロラ関連キナーゼ１、オーロラ／ＩＰＬ１関連キナーゼ１、乳房腫瘍増殖キナーゼ、セリン／スレオニン−タンパク質キナーゼ１５、セリン／スレオニン−タンパク質キナーゼ６、セリン／スレオニン−タンパク質キナーゼオーロラ−Ａ、ＡＲＫ−１、ＡＵＲＡ、ｈＡＲＫ１、ＡＵＲＯＲＡ２、ＡｕｒＡ、セリン／スレオニンキナーゼ１５、オーロラ／ＩＰＬ１様キナーゼ、乳房腫瘍増幅キナーゼ、ＩＰＬ１関連キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ１調節サブユニット４７、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ１５、ＡＩＲＫ１、ＡＹＫ１、ＥＣ２．７．１１．１及びＩＡＫ１を含む。本明細書中、「ＡＵＲＫＡ」は、ＡＵＲＫＡを伴う染色体異常、例えばコピー数の増加を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＡＵＲＫＡを伴うパラメーター、例えばＡＵＲＫＡのコピー数、ＡＵＲＫＡを伴うコピー数比、またはＡＵＲＫＡの増加％を検出するためのプローブを、ＡＵＲＫＡ遺伝子を含む染色体２０のｑ１３領域（２０ｑ１３）にハイブリダイズさせることが好ましい。ＤＮＡ参照配列には、ＮＣ＿００００２０．１０及びＮＴ＿０１１３６２．１０が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
国立衛生研究所が規定している「バイオマーカー」は、正常な生物学的プロセス、病原プロセス、または治療介入に対する医薬応答のインジケーターとして客観的に測定され、評価される特性である。
【００２８】
本明細書中、「ブレイクアパートプローブ」は、転座を検出できる２つの別個に検出可能に標識されているプローブの組合せを指すために使用され得る。例えば、１つのプローブは所与の遺伝子の５’末端またはその近くにハイブリダイズし、１つの波長で蛍光を発し得、他方のプローブは所与の遺伝子の３’末端またはその近くにハイブリダイズし、異なる波長で蛍光を発し得る。染色体が天然状態にあるとき、色は単色、例えば黄色として合わされる。染色体が転移を受けたならば、色は例えば赤色と緑色に分かれる。
【００２９】
「ブラシ細胞診標本」は、上皮表面、例えば胃腸管、肺または頸部をブラッシングすることにより得られる細胞のサンプルである。
【００３０】
「癌診断」は、通常癌のタイプの同定を指す。
【００３１】
「癌予後判定」は、通常癌の起こり得る経過（例えば、疾患の進行）またはアウトカム（例えば、転移または死）の予想または予測を指す。
【００３２】
本明細書中、「ＣＤＫＮ２」は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａを指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは９ｐ２１であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは９ｐ２１．３である。別名はサイクリン依存性キナーゼ４阻害剤Ａ、ＣＤＫ４Ｉ、ＭＬＭ、ＭＴＳ１、ＭＴＳ−１、ＣＭＭ２、Ｐ１６、ＡＲＦ、ＩＮＫ４、ＩＮＫ４Ａ、Ｐ１４、Ｐ１４ＡＲＦ、Ｐ１６−ＩＮＫ４Ａ、Ｐ１６ＩＮＫ４、Ｐ１６ＩＮＫ４Ａ、Ｐ１９、Ｐ１９ＡＲＦ、ＴＰ１６、ＣＤＫ４阻害剤Ｐ１６−ＩＮＫ４、細胞周期ネガティブ調節因子β、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ１６−ＩＮＫ４、Ｐ１６−ＩＮＫ４ａ、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ及びｐ１９ＡＲＦを含む。明細書中、「ＣＤＫＮ２」は、ＣＤＫＮ２を伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＣＤＫＮ２を伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＣＤＫＮ２遺伝子を含む染色体９のｐ２１領域（９ｐ２１）にハイブリダイズさせることが好ましい。「ＣＤＫＮ２」及び「Ｐ１６」は本明細書中で互換可能に使用され得る。ＤＮＡ参照配列には、ＮＣ＿０００００９．１１、ＮＴ＿００８４１３．１８及びＮＣ＿０１８９２０．２が含まれる。
【００３３】
「染色体列挙プローブ（ＣＥＰ）」または「セントロメアプローブ」は、細胞中の１つ以上の特定の染色体を列挙することができるプローブである。染色体列挙プローブは、典型的には特定の染色体のセントロメアまたはその近くの領域（「ペリセントロメア」とも称される）、典型的にはその反復ＤＮＡ配列（例えば、アルファサテライトＤＮＡ）を認識し、結合する。セントロメアは細胞分裂中の忠実な分離のために必要なので、染色体のセントロメアは典型的にはその染色体を表すと見なされている。特定遺伝子座に相当するシグナルの数（コピー数）をセントロメアに相当するシグナルの数と比較することにより、特定の染色体領域の欠失または増幅は通常残留している全染色体（異数染色体）の消失または増加と区別され得る。この比較を行うための１つの方法は、遺伝子座を表すシグナルの数を、セントロメアを表すシグナルの数で割ることである。１未満の比は遺伝子座の相対的消失または欠失を示し、１を超える比は遺伝子座の相対的増加または増幅を示す。また、染色体内のアンバランスな増加または消失を示すために同一の染色体上、例えば染色体の２つの異なるアーム上の２つの異なる遺伝子座間で比較を行うことができる。染色体に対するセントロメアプローブの代わりに、当業者は全染色体消失または増加を概算するために染色体アームプローブを替わりに使用し得ることを認識している。しかしながら、そのようなプローブのシグナルの消失が必ずしも全染色体の消失を示すとは限らないので、前記プローブは染色体を列挙するのに正確ではない。染色体列挙プローブの例には、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（イリノイ州デス・プレーンズ）（旧Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．，イリノイ州ダウナーズ・グローブ）から市販されているＣＥＰ（Ｒ）プローブが含まれる。染色体列挙プローブまたはセントロメアプローブの具体例には、染色体１、染色体２、染色体３、染色体４、染色体５、染色体６、染色体７、染色体８、染色体９、染色体１０、染色体１１、染色体１２、染色体１３、染色体１４、染色体１５、染色体１６、染色体１７、染色体１８、染色体１９、染色体２０、染色体２１、染色体Ｘ及び染色体Ｙに対するプローブが含まれる。ＣＥＰ（Ｒ）プローブの具体例には、ＣＥＰ１、ＣＥＰ２、ＣＥＰ３、ＣＥＰ４、ＣＥＰ５、ＣＥＰ６、ＣＥＰ７、ＣＥＰ８、ＣＥＰ９、ＣＥＰ１０、ＣＥＰ１１、ＣＥＰ１２、ＣＥＰ１３、ＣＥＰ１４、ＣＥＰ１５、ＣＥＰ１６、ＣＥＰ１７、ＣＥＰ１８、ＣＥＰ１９、ＣＥＰ２０、ＣＥＰ２１、ＣＥＰＸ及びＣＥＰＹが含まれる。
【００３４】
「コピー数」は単一遺伝子座、１つ以上の遺伝子座または全ゲノムのＤＮＡの測定値である。２の「コピー数」はヒトにおける「野生型」である（６つの染色体を除いて二倍体であるので）。（６つの染色体を除いて）ヒトにおける２以外の「コピー数」は野生型から逸脱している。そのような逸脱には、増幅、すなわちコピー数の増加、及び欠失、すなわちコピー数の低下、及びコピー数の不在が含まれる。
【００３５】
本明細書中、「コア針生検」「コア生検」または「摘除生検」は、組織の組織学的構築を保存しながら組織のサンプルを取り出すための針または切開の使用を指すために使用されている。
【００３６】
本明細書中、「ＤＣＣ」は、ヒト染色体１８上の領域ｑ２１中に位置する結腸直腸癌欠失遺伝子を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ細胞遺伝学的バンドは１８ｑ２１．３であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは１８ｑ２１．２であり、ＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは１８ｑ２１．１である。別名はＩＧＤＣＣ１、結腸直腸癌抑制因子、免疫グロブリンスーパーファミリーＤＣＣサブクラスメンバー１、腫瘍抑制因子タンパク質ＤＣＣ、ＣＲＣ１８、ＣＲＣＲ１、結腸直腸腫瘍抑制因子、結腸直腸癌欠失タンパク質及びネトリン受容体ＤＣＣを含む。本明細書中、「ＤＣＣ」は、ＤＣＣを伴う染色体異常、例えばＤＣＣコピー数低下を調べるために使用され得るプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用され得る。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＤＣＣを伴うパラメーター、例えばＤＣＣのコピー数、ＤＣＣを伴うコピー数比、またはＤＣＣの増加％を検出するためプローブを、ＤＣＣ遺伝子を含む染色体１８のｑ２１領域（１８ｑ２１）にハイブリダイズさせることが好ましい。ＤＮＡ参照配列には、ＮＣ＿００００１８．９及びＮＴ＿０１０９６６．１４が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書中、「ＥＧＦＲ」は、ヒト染色体７上の領域ｐ１２中に位置する上皮成長因子受容体遺伝子を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ細胞遺伝学的バンド及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは７ｐ１２であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは７ｐ１１．２である。別名は鳥類赤芽球性白血病ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）発癌遺伝子ホモログ、ＥＲＢＢ、ＥＲＢＢ１、癌原遺伝子ｃ−ＥｒｂＢ−１、受容体チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−１、ＨＥＲ１、ＥＣ  ２．７．１０．１、ＰｌＧ６１、細胞増殖抑制タンパク質４０、細胞増殖誘導タンパク質６１、ｍＥＮＡ及びＥＣ  ２．７．１０を含む。本明細書中、「ＥＧＦＲ」は、ＥＧＦＲを伴う染色体異常、例えばＥＧＦＲコピー数増加を調べるために使用され得るプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用され得る。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＥＧＦＲを伴うパラメーター、例えばＥＧＦＲのコピー数、ＥＧＦＲを伴うコピー数比、またはＥＧＦＲの増加％を検出するためのプローブを、ＥＧＦＲ遺伝子を含む染色体７のｐ１２領域（７ｐ１２）にハイブリダイズさせることが好ましい。ＤＮＡ参照配列には、ＮＣ＿０００００７．１３、ＮＴ＿０３３９６８．６及びＮＴ＿０７９５９２．２が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書中、「ＥＲＧ」は、Ｖ−Ｅｔｓ鳥類赤芽球症ウイルスＥ２６発癌遺伝子ホモログを指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは２１ｑ２２．３であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子バンドは２１ｑ２２．２である。別名はＶ−Ｅｔｓ鳥類赤芽球症ウイルスＥ２６発癌遺伝子関連転写調節因子ＥＲＧ（形質転換タンパク質ＥＲＧ）、Ｖ−Ｅｔｓ赤芽球症ウイルスＥ２６発癌遺伝子様、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲ前立腺癌特異的ｅｒｇ−３，ｅｔｓ−関連ｐ５５、ＴＭＰＲＳＳ２／ＥＲＧ融合，転写調節因子ＥＲＧ、Ｖ−Ｅｔｓ赤芽球症ウイルスＥ２６発癌遺伝子ホモログ及び形質転換タンパク質ＥＲＧを含む。本明細書中、「ＥＲＧ」は、ＥＲＧを伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＥＲＧを伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＥＲＧ遺伝子を含む染色体２１のｑ２２領域（２１ｑ２２）にハイブリダイズさせることが好ましい。参照ＤＮＡ配列には、ＮＣ＿００００２１．８、ＮＣ＿０１８９３２．２及びＮＴ＿０１１５１２．１１が含まれる。
【００３９】
本明細書中、「摘徐生検」は、全凝塊または疑わしいエリアの切除を指すために使用されている。
【００４０】
本明細書中、「ＦＧＦＲ１」は、線維芽細胞増殖因子受容体１を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは８ｐ１２であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは８ｐ１１．２２である。別名はＦＬＴ２、ＫＡＬ２、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ２、塩基性線維芽細胞増殖因子受容体１、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ２、癌原遺伝子Ｃ−Ｆｇｒ、ＢＦＧＦＲ、ＣＥＫ、ＦＧＦＢＲ、ＦＧＦＲ−１、ＦＬＧ、ＦＬＴ−２、ＨＢＧＦＲ、ｂＦＧＦ−Ｒ−１、ＥＣ  ２．７．１０、ＥＣ  ２．７．１０．１、ＯＧＤ、プファイファー症候群、ＣＤ３３１、ＣＤ３３１抗原、ＨＨ２、Ｎ−ＳＡＭ，ＦＧＦＲ１／ＰＬＡＧ１融合，ヘパリン結合増殖因子受容体、ヒドロキシアリール−タンパク質キナーゼ、Ｎ−ＳＡＭ，Ｎ−ｓａｍ，ＦＧＦＲ１／ＰＬＡＧ１縮合，ヘパリン結合増殖因子受容体及びヒドロキシアリール−タンパク質キナーゼを含む。本明細書中、「ＦＧＦＲ１」は、ＦＧＦＲ１を伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＦＧＦＲ１を伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＦＧＦＲ１遺伝子を含む染色体８のｐ１１−１２領域（８ｐ１１−１２）にハイブリダイズさせることが好ましい。参照ＤＮＡ配列には、ＮＣ＿０００００８．１０、ＮＴ＿１６７１８７．１及びＮＣ＿０１８９１９．２が含まれる。
【００４１】
本明細書中、「ＦＧＦＲ２」は、線維芽細胞増殖因子受容体２を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ細胞遺伝学的バンドは１０ｑ２６であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは１０ｑ２６．１３であり、ＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは１０ｑ２５．３−ｑ２６である。別名はＦＧＦＲ−２、ＢＥＫ、ケラチノサイト増殖因子受容体、ＫＧＦＲ、ＣＦＤ１、ＪＷＳ、細菌発現キナーゼ、ＥＣ  ２．７．１０．１、頭蓋顔面骨形成不全１、クルゾン症候群、ジャクソン・ワイス症候群、プファイファー症候群、ＢＢＤＳ、ＢＦＲ−１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３２抗原、ＣＥＫ３、ＥＣＴ１、ＴＫ１４、ＴＫ２５、ＢＥＫ線維芽細胞増殖因子受容体、ＦＧＦ受容体、ヒドロキシアリール−タンパク質キナーゼ、タンパク質チロシンキナーゼ受容体様１４、可溶性ＦＧＦＲ４バリアント４、Ｋ−ＳＡＭ、Ｋ−ｓａｍ、ＫＳＡＭ及びＥＣ  ２．７．１０を含む。本明細書中、「ＦＧＦＲ２」は、ＦＧＦＲ２を伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＦＧＦＲ２を伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＦＧＦＲ２遺伝子を含む染色体１０のｑ１４領域（１０ｑ１４）にハイブリダイズさせることが好ましい。参照ＤＮＡ配列には、ＮＣ＿００００１０．１０、ＮＣ＿０１８９２１．２及びＮＴ＿０３００５９．１３が含まれる。
【００４２】
本明細書中、「微細針吸引」または「針吸引生検」は、細胞を取り出す組織の組織学的構築を保存することなく組織から細胞のサンプルを取り出すための針の使用を指すために使用されている。微細針吸引は例えば嚢胞から流体サンプルを取り出すためにも使用され得る。
【００４３】
「固定液」には、アルコール溶液、酸アセトン溶液、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒド）、メタノール／酢酸、及びホルマリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書中、「ＨＥＲ２」は、Ｖ−Ｅｒｂ−Ｂ２鳥類赤芽球性白血病ウイルス発癌遺伝子ホモログ２を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ及びＥｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは１７ｑ１２であり、ＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは１７ｑ１１．２−ｑ１２である。別名はＨＥＲ−２、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＫＲ１、ＮＧＬ、ＮＥＵ、神経／膠芽腫由来発癌遺伝子ホモログ、転移性リンパ節遺伝子１９タンパク質、癌原遺伝子Ｃ−ＥｒｂＢ−２、癌原遺伝子Ｎｅｕ、チロシンキナーゼ−タイプ細胞表面受容体ＨＥＲ２、ＭＬＮ１９、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ＥＣ  ２．７．１０．１、Ｖ−Ｅｒｂ−Ｂ２鳥類赤芽球性白血病ウイルス発癌遺伝子ホモログ２、ＣＤ３４０、Ｃ−Ｅｒｂ  Ｂ２／Ｎｅｕタンパク質、ハースタチン、神経芽細胞腫／膠芽腫由来発癌遺伝子ホモログ、受容体チロシン−タンパク質キナーゼＥｒｂＢ−２、Ｖ−Ｅｒｂ−Ｂ２赤芽球性白血病ウイルス発癌遺伝子ホモログ２、ＭＬＮ１９、ＣＤ３４０抗原及びＥＣ  ２．７．１０を含む。本明細書中、「ＨＥＲ２」は、ＨＥＲ２を伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＨＥＲ２を伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＨＥＲ２遺伝子を含む染色体１７のｑ１１−１２領域（１７ｑ１１−１２）にハイブリダイズさせるのが好ましい。参照ＤＮＡ配列には、ＮＣ＿００００１７．１０、ＮＴ＿０１０７８３．１５及びＮＣ＿０１８９２８．２が含まれる。
【００４５】
本明細書中、「標識されている」、「検出可能な標識で標識されている」及び「検出可能に標識されている」は、実在物（例えば、プローブ）が検出できることを示すために本明細書中で互換可能に使用されている。「標識」及び「検出可能な標識」は、実在物を検出可能にするように該実在物に結合している部分、例えば標的配列に結合したときにプローブを検出可能にするように該プローブに結合している部分を意味する。部分それ自体は検出可能でなくてもよいが、別の部分と反応すると検出可能になり得る。用語「検出可能に標識されている」はこのような標識を包含すると意図される。検出可能な標識は、該標識がシグナルを発生するように選択され、そのシグナルは測定され得、結合した実在物の量に比例する強度を有し得る。分子、例えばプローブのような核酸を標識及び／または検出するための多種多様なシステムが公知である。標識されている核酸は分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的または他の手段により直接または間接的に検出され得る標識を取り込むか、コンジュゲートすることにより作成され得る。適当な検出可能な標識には、放射性同位体、発蛍光団、発色団、化学発光剤、ミクロ粒子、酵素、磁気粒子、電子密度粒子、質量標識、スピン標識、ハプテン等が含まれる。本発明では、発蛍光団及び化学発光剤が好ましい。
【００４６】
本明細書中、「洗浄」は、流体を体腔、例えば肺に導入し、試験のためにその流体を収集することを指すために使用されている。
【００４７】
本明細書中、「遺伝子座特異的プローブ」及び「遺伝子座特異的識別子（ＬＳＩ）」は、染色体上の領域中の特定の遺伝子座、例えば転移の増加／消失を受けたことが判明している遺伝子座に対して選択的に結合するプローブを指すために本明細書中で互換可能に使用され得る。プローブは、エクソン、イントロン、及び／またはプロモーター配列のような調節配列等を含むコーディングまたは非コーディング配列を標的とし得る。
【００４８】
本明細書中、「ＭＥＴ」は、ｍｅｔ癌原遺伝子を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは７ｑ３１であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは７ｑ３１．２である。別名は肝細胞増殖因子受容体、癌原遺伝子Ｃ−Ｍｅｔ、分散因子受容体、チロシン−タンパク質キナーゼＭｅｔ、ＨＧＦ受容体、ＨＧＦ／ＳＦ受容体、ＳＦ受容体、ＥＣ  ２．７．１０．１、ＡＵＴＳ９、ＨＧＦＲ、ＲＣＣＰ２、ｃ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ癌原遺伝子チロシンキナーゼ及びＥＣ  ２．７．１０を含む。本明細書中、「ＭＥＴ」は、ＭＥＴを伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＭＥＴを伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＭＥＴ遺伝子を含む染色体７のｑ３１領域（７ｑ３１）にハイブリダイズさせることが好ましい。参照ＤＮＡ配列には、ＮＣ＿０００００７．１３、ＮＴ＿００７９３３．１５、ＮＣ＿０１８９１８．２、及びＮＴ＿０７９５９６．２が含まれる。
【００４９】
本明細書中、「ＭＣＬ１」は骨髄細胞白血病配列１（ＢＣＬ２関連）を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは１ｑ２１であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは１ｑ２１．３である。別名はＢｃｌ−２様タンパク質３、Ｂｃｌ−２関連タンパク質ＥＡＴ／Ｍｃｌ１、ＢＣＬ２Ｌ３、ｍｃｌ１／ＥＡＴ、ＥＡＴ、ＭＣＬ１−ＥＳ、ＭＣＬ１Ｌ、ＭＣＬ１Ｓ、Ｍｃｌ−１、ＴＭ、ｂｃｌ２−Ｌ−３、誘導骨髄性白血病細胞分化タンパク質Ｍｃｌ−１、骨髄細胞白血病ＥＳ及びＢｃｌ２−Ｌ−３を含む。本明細書中、「ＭＣＬ１」は、ＭＣＬ１を伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＭＣＬ１を伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＭＣＬ１遺伝子を含む染色体１のｑ２１領域（１ｑ２１）にハイブリダイズさせることが好ましい。参照ＤＮＡ配列には、ＮＣ＿０００００１．１０、ＮＣ＿０１８９１２．２及びＮＴ＿００４４８７．１９が含まれる。
【００５０】
本明細書中、「ＭＹＣ」は、染色体８上のｑ２４の領域中に位置するｃ−ｍｙｃ発癌遺伝子を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ及びＥｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは８ｑ２４．２１であり、ＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは８ｑ２４である。別名はｖＨＬＨｅ３９、ｃ−Ｍｙｃ、ｖ−ｍｙｃ鳥類骨髄細胞腫症ウイルス発癌遺伝子ホモログ、クラスＥ塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質３９、癌原遺伝子ｃ−Ｍｙｃ、転写因子ｐ６４、ＭＲＴＬ、鳥類骨髄細胞腫症ウイルス発癌遺伝子ホモログ、ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質、ｍｙｃ関連翻訳／局在化調節因子及びＢＨＬＨＥ３９を含む。本明細書中、ＭＹＣは、ＭＹＣを伴う染色体異常、例えばＭＹＣコピー数増加を調べるために使用され得るプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用され得る。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＭＹＣを伴うパラメーター、例えばＭＹＣのコピー数、ＭＹＣを伴うコピー数比、またはＭＹＣの増加％を検出するためのプローブを、ＭＹＣ遺伝子を含む染色体８のｑ２４領域（８ｑ２４）にハイブリダイズさせることが好ましい。ＤＮＡ参照配列には、ＮＣ＿０００００８．１０及びＮＴ＿００８０４６．１６が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
本明細書中、「ＮＴＲＫ１」は、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体タイプ１を指すために使用され得る。Ｅｎｓｅｍｂｌｅ細胞遺伝学的バンドは１ｑ２３．１であり、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは１ｑ２１−ｑ２２である。別名はＭＴＣ、ＴＲＫＡ、高アフィニティー神経成長因子受容体、トロポミオシン関連キナーゼＡ、チロシンキナーゼ受容体Ａ、ＴＲＫ、Ｔｒｋ−Ａ、ｇｐ１４０ｔｒｋ、ｐ１４０−ＴｒｋＡ、ＴＲＫ１−形質転換チロシンキナーゼタンパク質、ＥＣ  ２．７．１０．１、ＴＲＫ１、発癌遺伝子ＴＲＫ、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体タイプ１、チロシンキナーゼ受容体及びＥＣ  ２．７．１０を含む。本明細書中、「ＮＴＲＫ１」は、ＮＴＲＫ１を伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＮＴＲＫ１を伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＮＴＲＫ１遺伝子を含む染色体１のｑ２１−２３領域（１ｑ２１−２３）にハイブリダイズさせることが好ましい。参照ＤＮＡ配列には、ＮＣ＿０００００１．１０、ＮＴ＿００４４８７．１９及びＮＣ＿０１８９１２．２が含まれる。
【００５２】
「核酸サンプル」は、プローブとのハイブリダイゼーションに適した形態の核酸を含むサンプル、例えば核またはその核から単離または精製した核酸を含むサンプルを指す。核酸サンプルは全または部分的（例えば、特定の染色体）ゲノムＤＮＡ、全または部分的ｍＲＮＡ（例えば、特定染色体または遺伝子）、または選択した配列を含み得る。（間期または中期に存在するような）凝縮した染色体はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ及びマルチプレックスＦＩＳＨ）において標的として使用するのに適している。
【００５３】
本明細書中、「ＰＩＫ３ＣＡ」は、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ触媒サブユニットαを指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ細胞遺伝学的バンドは３ｑ２６．３であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは３ｑ２６．３２であり、ＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは３ｑ２６．３である。別名はホスホイノシチド−３−キナーゼ触媒αポリペプチド、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ触媒サブユニットαイソ型、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ１１０ｋＤａ触媒サブユニットα、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ触媒サブユニットαイソ型、ＰＩ３−キナーゼＰ１１０サブユニットα、ＰＩ３−キナーゼサブユニットα、Ｐｔｄｌｎｓ−３−キナーゼサブユニットＰ１１０−α、Ｐｔｄｌｎｓ−３−キナーゼサブユニットα、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩ３Ｋ−α、ＣＬＯＶＥ、ＥＣ  ２．７．１．１５３、ＥＣ  ２．７．１１．１、ＣＷＳ５、ＰＩ３Ｋアルファ、ＭＣＡＰ、ｐ１１０α、ｐ１１０−α、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ触媒１１０−ＫＤ  α、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ触媒αポリペプチド、ＭＣＭ、ＭＣＭＴＣ、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ１１０ｋＤａ触媒サブユニットα、ホスホイノシチド−３−キナーゼ触媒αポリペプチド及びＥＣ  ２．７．１を含む。本明細書中、「ＰＩＫ３ＣＡ」は、ＰＩＫ３ＣＡを伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すために使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＰＩＫ３ＣＡを伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子を含む染色体３のｑ２６領域（３ｑ２６）にハイブリダイズさせることが好ましい。参照ＤＮＡ配列には、ＮＣ＿０００００３．１１、ＮＣ＿０１８９１４．２及びＮＴ＿００５６１２．１６が含まれる。
【００５４】
「所定カットオフ」及び「所定レベル」は、通常アッセイ結果を所定カットオフ／レベルに対して比較することにより診断／予後／治療有効性結果を評価するために使用されるカットオフ値を指し、前記した所定カットオフ／レベルは既に各種臨床パラメーター（例えば、疾患の重篤度、進行／非進行／改善等）にリンクまたは関連している。
【００５５】
本発明との関連で、「プローブ」は、選択的ハイブリダイゼーションを可能にするかまたは促進させる条件下で標的配列の少なくとも一部に選択的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。通常、プローブはＤＮＡのコーディングまたはセンス（＋）鎖に相補的であり、またはＤＮＡの非コーディングまたはアンチセンス（−）鎖に相補的（時に、「逆相補的」と称される）であり得る。プローブの長さは大きく異なり得る。幾つかの用途では約１０から約１００ヌクレオチド、例えば約１５から約５０ヌクレオチドのような約１５から約７５ヌクレオチドの長さが好ましいことがあり、染色体プローブの場合約５０〜１×１０５ヌクレオチドの長さが好ましいことがあり、遺伝子座特異的プローブの場合約２５，０００から約８００，０００ヌクレオチドの長さが好ましいことがある。本明細書中、プローブは、例えばＩＨＣ及び細胞の上皮細胞としての確認の関連で検出可能に標識されている抗体またはその抗原結合断片を指すためにも使用され得る。
【００５６】
「予後判定」は、疾患の起こりそうなプロセス及び／またはアウトカム、例えば回復の可能性の予想である。よって、予後判定は病態の改善、病態の悪化、及び病態に変化なしを含む。
【００５７】
本明細書中、「ＰＴＥＮ」は、ホスファターゼ及びテンシンホモログを指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ細胞遺伝学的バンドは１０ｑ２３．３であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは１０ｑ２３．３１であり、ＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは１０ｑ２３である。別名はホスファターゼ及びテンシン様タンパク質、ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリスホスフェート３−ホスファターゼ及び二重特異性タンパク質ホスファターゼ、ＰＴＥＮ１、多重進行癌１における変異、ＭＭＡＣ１、染色体１０で欠失しているＭＭＡＣホスファターゼ及びテンシンホモログ、ＢＺＳ、ＭＨＡＭ、ＴＥＰ１、ＧＬＭ２、１０ｑ２３ｄｅｌ、ＣＷＳ１、ＤＥＣ、ＥＣ  ３．１．３．１６、ＥＣ  ３．１．３．４８及びＥＣ  ３．１．３．６７を含む。本明細書中、「ＰＴＥＮ」は、ＰＴＥＮを伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＰＴＥＮを伴うバラメーターを検出するためのプローブを、ＰＴＥＮ遺伝子を含む染色体１０のｑ２３領域（１０ｑ２３）にハイブリダイズさせることが好ましい。参照ＤＮＡ配列には、ＮＣ＿００００１０．１０、ＮＣ＿０１８９２１．２及びＮＴ＿０３００５９．１３が含まれる。
【００５８】
本明細書中、「ＲＢ１」は、ヒト染色体１３上のｑ１４の領域中に位置する網膜芽細胞腫遺伝子を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ、Ｅｎｓｅｍｂｌ及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは１３ｑ１４．２である。別名はＯＳＲＣ、ＲＢ、ｐ１０５−Ｒｂ、ｐＲｂ、ｐｐ１１０、骨肉腫、網膜芽細胞腫感受性タンパク質、網膜芽細胞腫関連タンパク質及びＲｂを含む。「ＲＢ１」は「１３ｑ１４」と本明細書中で互換可能に使用され得る。本明細書中、「ＲＢ１」または「１３ｑ１４」は、ＲＢ１または１３ｑ１４を伴う染色体異常、例えばＲＢ１または１３ｑ１４コピー数増加を調べるために使用され得るプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用され得る。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＲＢ１または１３ｑ１４を伴うパラメーター、例えばＲＢ１または１３ｑ１４のコピー数、ＲＢ１または１３ｑ１４を伴うコピー数比、またはＲＢ１または１３ｑ１４の増加％を検出するためのプローブを、ＲＢ１遺伝子を含む染色体１３のｑ１４領域（１３ｑ１４）にハイブリダイズさせることが好ましい。ＤＮＡ参照配列にはＮＣ＿００００１３．１０及びＮＴ＿０２４５２４．１４が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書中、「ＲＥＴ」は、染色体１０上に位置するｒｅｔ癌原遺伝子を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは１０ｑ１１．２であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは１０ｑ１１．２１である。別名はＣＤＨＦ１２、ＣＤＨＲ１６、ＰＴＣ、ＲＥＴ５１、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ａ、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＥＣ  ２．７．１０．１、ＥＣ  ２．７．１０、カドヘリンファミリーメンバー１２、癌原遺伝子ｃ−Ｒｅｔ、ヒルシュスプルング病１、多発性内分泌腺腫症及び甲状腺髄様癌１、ＲＥＴ−ＥＬＥ１、カドヘリン関連ファミリーメンバー１６、ヒドロキシアリール−タンパク質キナーゼ、癌原遺伝子チロシン−タンパク質キナーゼ受容体Ｒｅｔ、受容体チロシンキナーゼ及ＲＥＴ形質転換配列を含む。本明細書中、「ＲＥＴ」は、ＲＥＴを伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＲＥＴを伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＲＥＴ遺伝子を含む染色体１０のｑ１１領域（１０ｑ１１）にハイブリダイズさせることが好ましい。参照ＤＮＡ配列にはＮＣ＿００００１０．１０及びＮＴ＿０３３９８５．７が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書中、「進行のリスク」は病態の悪化を指すために使用されている。
【００６１】
本明細書中、「ＲＯＳ」は、Ｃ−Ｒｏｓ発癌遺伝子１受容体チロシンキナーゼを指すために使用されている。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ細胞遺伝学的バンドは６ｑ２２であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは６ｑ２２．１であり、ＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは６ｑ２１−ｑ２２である。別名はＭＣＦ３、Ｖ−Ｒｏｓ  ＵＲ２肉腫ウイルス発癌遺伝子ホモログ１、Ｖ−Ｒｏｓ鳥類ＵＲ２肉腫ウイルス発癌遺伝子ホモログ１、Ｖ−Ｒｏｓ  ＵＲ２肉腫ウイルス発癌遺伝子ホモログ１（鳥類）、ｃ−ｒｏｓ−１、癌原遺伝子チロシン−タンパク質キナーゼ、膜貫通チロシン特異的タンパク質キナーゼ、癌原遺伝子Ｃ−Ｒｏｓ、癌原遺伝子Ｃ−Ｒｏｓ−１、受容体チロシンキナーゼＣ−Ｒｏｓ発癌遺伝子、Ｃ−Ｒｏｓ受容体チロシンキナーゼ及びＥＣ  ２．７．１０．１を含む。本明細書中、「ＲＯＳ」はＲＯＳを伴う染色体異常を調べるためのプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＲＯＳを伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＲＯＳ遺伝子を含む染色体６のｑ２２領域（６ｑ２２）にハイブリダイズさせることが好ましい。参照配列には、ＮＣ＿０００００６．１１、ＮＣ＿０１８９１７．２及びＮＴ＿０２５７４１．１５が含まれる。
【００６２】
組織サンプルの「切片」は組織サンプルの１つのパーツまたはピース、例えば組織サンプルから切った組織または細胞の薄片である。組織サンプルの２つ以上の切片を取り、分析してもよい。所望ならば、１つの切片を各種レベルで、例えば形態学的及び分子（例えば、核酸及びタンパク質）レベルで分析し得る。
【００６３】
本発明に関連して、「に対して選択的にハイブリダイズする」（及び「選択的ハイブリダイゼーション」、「に対して特異的にハイブリダイズする」及び「特異的ハイブリダイゼーション」）は、核酸分子をストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列に対して優先的に結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズさせることを指す。用語「ストリンジェントな条件」は、プローブがその標的配列に対して優先的にハイブリダイズし、他の非標識配列に対してはより少ない程度しかまたは全くハイブリダイズしない条件を指す。（例えば、アレイ、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーションまたはＦＩＳＨの場合のように）核酸ハイブリダイゼーションの関連での「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種条件下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する詳細なガイドは、例えばＴｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈ．  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ（１９９３）中に見つけられる。通常、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定のイオン強度及びｐＨで特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは（規定のイオン強度及びｐＨで）標的配列の５０％が完全に整合するプローブに対してハイブリダイズする温度である。特定プローブに対する非常にストリンジェントな条件はＴｍに等しいように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおいてアレイまたはフィルター上で１００個以上の相補性残基を有する相補的核酸をハイブリダイズするためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は標準のハイブリダイゼーション溶液を用いて４２℃である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（２００１）を参照されたい）。
【００６４】
本明細書中、「ＳＴＡＴ１」は、ヒト染色体２上のｑ３２に位置する転写１遺伝子のシグナルトランスデューサー及びアクティベーターを指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ及びＥｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは２ｑ３２．３であり、ＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは２ｑ３２．２−ｑ３２．３である。ＳＴＡＴ１の別名はＳＴＡＴ−１、ＩＳＧＦ−３、ＳＴＡＴ９１、転写因子ＩＳＧＦ−３コンポーネントｐ９１／ｐ８４、ＣＡＮＤＦ７、及び転写１−α／βのシグナルトランスデューサー及びアクティベーターを含む。本明細書中、「ＳＴＡＴ１」は、ＳＴＡＴ１を伴う染色体異常、例えばコピー数の増加を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＳＴＡＴ１を伴うパラメーター、例えばＳＴＡＴ１のコピー数、ＳＴＡＴ１を伴うコピー数比、またはＳＴＡＴ１の増加％を検出するためのプローブを、ＳＴＡＴ１遺伝子を含む染色体２のｑ３２領域（２ｑ３２）にハイブリダイズさせることが好ましい。ＤＮＡ参照配列には、ＮＣ＿０００００２．１１及びＮＴ＿００５４０３．１７が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
「標的配列」、「標的領域」及び「核酸標的」は、例えばその消失及び／または増加を調べようとする特定の染色体位置にあるヌクレオチド配列を指す。
【００６６】
本明細書中、「ＴＥＲＣ」は、テロメラーゼＲＮＡコンポーネントを指すために使用され得る。Ｅｎｓｅｍｂｌ及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは３ｑ２６．２であり、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅバンドは３ｑ２６である。別名はＴＲ、ＴＲＣ３、小カハール体特異的ＲＮＡ１９、ＤＫＣＡ１、ＰＦＢＭＦＴ２、ＳＣＡＲＮＡ１９及びｈＴＲを含む。本明細書中、「ＴＥＲＣ」は、ＴＥＲＣを伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＴＥＲＣを伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＴＥＲＣ遺伝子を含む染色体３のｑ２６領域（３ｑ２６）に対してハイブリダイズさせることが好ましい。参照ＤＮＡ配列には、ＮＣ＿０００００３．１１、ＮＣ＿０１８９１４．２及びＮＴ＿００５６１２．１６が含まれる。
【００６７】
本明細書中、「テラノーシス」は、患者に対して治療を適合させるために使用されるプロセス、例えば診断テスト、特にＩＳＨ（例えば、ＦＩＳＨ）を用いる診断テストを指すために使用されている。テラノーシスにより、具体的患者の治療に対する薬物の適合性を評価し得る。加えて、薬物を用いる患者の治療の有効性を評価し得る。
【００６８】
本明細書中、「ＺＮＦ２１７」は、ジンクフィンガータンパク質２１７を指すために使用され得る。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ、Ｅｎｓｅｍｂｌ及びＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは２０ｑ１３．２である。別名はＺＡＢＣ１である。本明細書中、「ＺＮＦ２１７」はＺＮＦ２１７を伴う染色体異常を調べるために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すためにも使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）によりＺＮＦ２１７を伴うパラメーターを検出するためのプローブを、ＺＮＦ２１７遺伝子を含む染色体２０のｑ１３領域（２０ｑ１３）にハイブリダイズさせることが好ましい。参照ＤＮＡ配列には、ＮＣ＿００００２０．１０、ＮＴ＿０１１３６２．１０及びＮＣ＿０１８９３１．２が含まれる。
【００６９】
本明細書中で使用されている用語は具体的実施形態を記載する目的ためだけであり、別な方法で限定すると意図されない。
【００７０】
細胞の調製方法
細胞のサンプルの調製方法を提供する。細胞のサンプルは組織または細胞の凝塊を含む適当な患者標本から調製され得る。典型的には、患者標本を微細針吸引（ＦＮＡ）、コア針生検、摘徐生検、切除、洗浄（例えば、気管支洗浄）、ブラッシング等のような方法により得る。また、典型的には、患者標本は固定／包埋されていても、固定されているが包埋されていなくても、（例えば、Ｈｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州マルボロ）が製造しているメタノール−水緩衝保存液であるＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｒ）のような保存剤中に）部分的に固定されていても、冷凍（例えば、新鮮冷凍）されていても、または新鮮でもよい。好ましくは、患者標本をＦＮＡ、コア針生検、摘徐生検または切除により得る。幾つかの場合には、組織標本、または細胞の凝塊（すなわち、凝集物または凝集）を含む標本を洗浄及びブラッシングにより得ることができる。本発明の目的は標本を患者から得た後できるだけすぐに、例えば約１４時間未満にＩＳＨ（例えば、ＦＩＳＨ）、特にマルチプレックスＩＳＨ（例えば、マルチプレックスＦＩＳＨ）、または抗体との結合（ＩＨＣの場合のように）のようにプローブとのハイブリダイゼーションの結果を得ることなので、患者標本を包埋せず、（ａ）新鮮であり、（ｂ）解凍した新鮮冷凍され、または（ｃ）部分的に固定されていることが好ましくい。上記にてらして、標本を患者から得た後できるだけ迅速に（例えば、直後に）患者標本から細胞のサンプルを調製することが好ましく、望ましくさえある。上述したように、包埋標本の使用を避けることにより、包埋標本の切片作製に伴う打ち切りアーチファクトを避けることができる。
【００７１】
方法は組織または細胞の凝塊を含む患者標本を脱凝集させることを含む。組織または細胞の凝塊を適当な方法により脱凝集させ得る。好ましくは、方法は遠心または細胞ストレーナーの使用を含む。
【００７２】
実施形態では、方法は、新鮮標本、解凍した新鮮冷凍標本、または部分的に固定した標本であり得る患者標本を濯ぐことを含む。好ましくは、標本を周囲温度（例えば、室温）で平衡塩類溶液を用いて濯ぐ。前記溶液の組成はｐＨ及び浸透圧平衡を維持し、周囲温度で水及び必須無機イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム及び塩素）を与える。平衡塩類溶液の例には、ハンクス平衡塩類溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＴＭ）（カリフォルニア州カールスバッド）から入手可能）、アルセバー液、アール平衡塩類溶液、ゲイ平衡塩類溶液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液、パック平衡塩類溶液、リンガー平衡塩類溶液、シムス平衡塩類溶液、トリス緩衝生理食塩液及びタイロード平衡塩類溶液が含まれるが、これらに限定されない。好ましい平衡塩類溶液はハンクス平衡塩類溶液である。濯いだ後、標本をジチオトレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤及びエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート剤を含む平衡塩類溶液、例えばハンクス平衡塩類溶液中に浸漬する。好ましくは、還元剤及びキレート剤を含み、その中に標本を浸漬する平衡塩類溶液を予加温する。濯ぎ、浸漬した後、標本をＤＴＴのような還元剤、塩化カルシウムのようなカルシウムイオン源、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような極性非プロトン性溶媒を含む新鮮な平衡塩類溶液、例えばハンクス平衡塩類溶液に移し、短時間、例えば約５秒間から約１０秒間混合する。
【００７３】
この時点で、標本を脱凝集させる、例えば遠心または濾過する。遠心する場合、標本を低速（例えば、１０００×ｇ）で回転して、脱凝集させた細胞をペレット化する。脱凝集させた細胞は数分程度で、例えば約１５分未満、例えば約１０分でペレット化する。遠心後、上清を捨て、ペレット化した細胞を残留上清中に再懸濁する。再懸濁した細胞を固定液、例えば緩衝液、保存剤及びアルコール（例えば、メタノールまたはエタノール）、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｒ）等を含む水溶液中に入れる。濾過する場合、標本を細胞ストレーナー、例えばＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ニュージャージ−州フランクリン・レイクス）から入手可能な細胞ストレーナーを介して濾過し、濾過した細胞を固定液、例えば緩衝液、保存剤及びアルコール（例えば、メタノールまたはエタノール）、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｒ）等を含む水溶液中に入れる。再懸濁した細胞を固定液中に数分程度（例えば、約１５分間、約３０分間、または約４５分間）から最長約１時間放置する。
【００７４】
この時点で、再懸濁した細胞を細胞支持体の表面に適用する。適当な細胞支持体が使用され得る。適当な細胞支持体の例には、細胞診スライド、サイトスピン、テティススライド及びマイクロ流体カメラが含まれるが、これらに限定されない。細胞支持体は、核酸ハイブリダイゼーション及び可視化を受けることができる２つ以上、例えば複数の（例えば、３つ４つ、５つ、６つまたはそれ以上の）不連続エリアを含み得る。不連続エリアの例には、凹部、例えば窪み、ウェル、チャンバ等が含まれる。再懸濁した細胞を２つ以上、例えは複数の不連続エリアに分配すると、プローブとのマルチプレックスハイブリダイゼーション、例えばＩＳＨ（例えば、マルチプレックスＦＩＳＨ）及び／または抗体との結合（ＩＨＣの場合のように）を細胞支持体上で実施することができる。ハイブリダイゼーション結果は手動で（標識の際に使用した発蛍光団がヒトの眼に見えない遠赤外発蛍光団でないならば）、または適当なイメージングシステムを用いて可視化され得る。市販されているイメージングシステムには、Ｂｉｏｖｉｅｗ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ビレリカ）及びＡＳＩから入手可能なものが含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
よって、上記にてらして、組織または細胞の凝塊を含む患者標本からの細胞の調製方法を提供する。この方法は、
（ｉ）患者標本を、還元剤及びキレート剤を含む予加温した平衡塩類溶液中に浸漬し；
（ｉｉ）患者標本を還元剤、カルシウムイオン源及び極性非プロトン性溶媒を含む新鮮な平衡塩類溶液に移し、混合し；
（ｉｉｉ）患者標本を新鮮な平衡塩類溶液から取り出し、（ａ）溶液を遠心して脱凝集させた細胞をペレット化するか、または（ｂ）溶液を濾過して脱凝集させた細胞を収集し；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）（ａ）後、上清を捨て、ペレット化した細胞を残留上清中に再懸濁し、再懸濁した細胞を固定液中に入れるか、または（ｉｉｉ）（ｂ）後、濾過した細胞を固定液中に入れることを含む。患者標本は（ａ）新鮮標本、（ｂ）解凍した新鮮冷凍標本、または（ｃ）部分的に固定した標本であり得る。方法は更に、（ｉ）の前に、患者標本を、平衡塩類溶液を用いて濯ぐことを含み得る。
【００７６】
好ましい実施形態では、方法は、患者標本、例えば腺腫のサンプルを室温でハンクス緩衝液を用いて濯ぎ、患者標本を２０ｍＭ  ＤＴＴ及び５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する予加温したハンクス緩衝液中に３７℃で約５分間浸漬し、濯ぎ、浸漬した患者標本を２０ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０％  ＤＭＳＯを含有する新鮮なハンクス緩衝液に移し、約５秒間から約１０秒間混合し、患者標本を新鮮なハンクス緩衝液から取り出し、（ａ）溶液を約１０００×ｇで約１０分間遠心して脱凝集させた細胞をペレット化するか、または（ｂ）溶液を濾過して脱凝集させた細胞を収集し、遠心後は上清を捨て、ペレット化した細胞を残留上清中に再懸濁し、再懸濁した細胞を溶液中に入れるか、または濾過後は濾過した細胞を溶液中に入れる。前記溶液は約３０重量％から約６０重量％のメタノール、約４０重量％から約７０重量％の水、緩衝液及び保存剤を含み、前記溶液は室温で一晩保持されている。
【００７７】
方法は更に、（ｖ）細胞を細胞支持体に適用することを含み得る。細胞支持体が細胞診スライドの場合、方法は更に（ｖｉ）スライドを水−アルコール溶液中に浸漬し、（ｖｉｉ）スライドを固定液中に浸漬し、（ｖｉｉｉ）スライドを乾燥させることを含む。水−アルコール溶液は９５％  エタノールであり得、スライドをエタノール中に室温で約１５分間浸漬する。固定液はカルノア液であり得、スライドをカルノア液中に室温で約３０分間浸漬する。スライドを室温で乾燥させ得る。
【００７８】
細胞支持体
上記方法に従って患者標本から調製した細胞、例えば腺腫のサンプルから単離した細胞を含む細胞支持体、例えば細胞診スライド、サイトスピン、テティススライド（Ｔｅｔｈｉｓ  ｓｌｉｄｅ）及びマイクロ流体カメラも提供する。細胞を細胞支持体に手動で、或いは器具、例えばＴｈｉｎＰｒｅｐ  Ｔ−２０００プロセッサー（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州マルボロ）または別の市販されている器具を用いて適用し得る。細胞支持体は、上記した方法に従って患者標本から調製した細胞を適用するためにＩＳＨ（または、ＩＨＣ）及び可視化を受けることができる２つ以上、例えば複数の（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の）不連続エリアを含み得る。不連続エリアの例には、凹部、例えば窪み、ウェル、チャンバ等が含まれる。好ましい実施形態では、細胞支持体は少なくとも６つの不連続エリアを含む。各不連続エリア中の細胞を少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触させることが好ましく、望ましくさえあり、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならば検出可能に標識されているプローブは異なるプローブとして区別され得る。好ましくは、不連続エリアは、各不連続エリアが全体としてイメージングシステムで見ることできるような大きさである。また、好ましくは、不連続エリア間に距離があり、その距離は１つの不連続エリアにおいて検出可能な標識、例えば蛍光標識により生ずるシグナルが１つ以上の隣接する不連続エリアにおいて検出可能な標識、例えば蛍光標識により生ずるシグナルの可視化を妨害しないような距離である。この点で、検出可能な標識は、隣接エリア中の検出可能な標識が異なる波長で、その可視化が相互に妨害しないシグナルまたは蛍光を発するように選択され得る。不連続エリア間の距離は、細胞支持体を使用しにくくする及び／またはイメージングシステムを使用するならばそのイメージングシステムと適合しなくなるほど大きくてはならない。
【００７９】
細胞を細胞支持体、例えば細胞診スライドの表面に適用し得、細胞支持体を周囲温度（すなわち、室温）でアルコール−水溶液、例えば９５％  エタノール中に数分間、例えば約１５分間浸漬し得る、その後、細胞支持体を周囲温度（すなわち、室温）で上記した固定液、例えば３：１  メタノール：酢酸であるカルノア液中に約３０分間浸漬し、例えば室温で乾燥させ得る。
【００８０】
所望により、細胞支持体、例えばスライドを使用するまで−２０℃で保存し得る。しかしながら、本発明の目的は標本を患者から得た後できるだけ迅速に、例えば約１４時間未満でＩＳＨ（例えば、ＦＩＳＨ）、特にマルチプレックスＩＳＨ（例えば、マルチプレックスＦＩＳＨ）の結果を得ることなので、細胞支持体を直ちに使用することが好ましく、望ましくさえある。
【００８１】
よって、上記にてらして、本明細書中に記載されている方法に従って検出可能に標識されているプローブと接触させた細胞がその表面上にある細胞支持体を提供する。細胞支持体は少なくとも２つの不連続エリアを含み、その不連続エリアに細胞を適用する。各エリアを少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触させ、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならば検出可能に標識されているプローブは区別され得る。例えば、各不連続エリアを検出可能に標識されているプローブの混合物と別々に接触させ得、前記混合物は、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＯＳＩに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びｃ−ＭＥＴに対するプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＮＴＲＫ１に対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＫＩＦ５Ｂに対するプローブ、
−ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＡＵＲＫＡに対するプローブ、９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、染色体３に対するＣＥＰ、染色体６に対するＣＥＰ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、ＤＣＣに対するプローブ、１３ｑ１４に対する遺伝子座特異的プローブ及び染色体１８に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＴＥＲＣに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＨＥＲ２に対するプローブ、ＺＮＦ２１７に対するプローブ及び９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、
−ＭＣＬ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、染色体３に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＰＴＥＮに対するプローブ、ＥＲＧに対するプローブ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対する２色ブレイクアウェイプローブ、染色体８に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、または
−ＭＥＴに対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、染色体７に対するＣＥＰ及び染色体３に対するＣＥＰ
をからなる。
【００８２】
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び免疫組織化学
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）の実施方法を提供する。この方法は、上記方法に従って調製した細胞をハイブリダイジング条件下で検出可能に標識されているプローブと接触させ、患者から標本を取り出してから約１４時間未満、例えば１３．５時間で検出可能な標識を可視化することを含む。実施形態では、方法は、微細針吸引、コア針生検、摘徐生検及び切除からなる群から選択される標本から脱凝集させた細胞をハイブリダイジング条件下で検出可能に標識されているプローブと接触させ、患者から標本を取り出してから約１４時間未満、例えば１３．５時間で検出可能な標識を可視化することを含む。検出可能に標識されているプローブは検出可能に標識されている核酸プローブ、例えば蛍光標識されている核酸プローブ、または検出可能に標識されている抗体、例えば蛍光標識されている抗体（または、その抗原的に反応性の断片）プローブである。上記方法に関して、例えばオリゴベースのプローブを使用するときには、ハイブリダイゼーション及び可視化は実質的に約１４時間未満、例えば約６．５時間で起こり得る。
【００８３】
好ましくは、細胞は細胞支持体に適用されている。好ましくは、細胞支持体は少なくとも２つの不連続エリアを含み、細胞は不連続エリアに適用されており、各エリアを少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触させ、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならば検出可能に標識されているプローブは区別され得る。不連続エリアを適当な検出可能に標識されているプローブと別々に接触させ得る。各不連続エリアを検出可能に標識されているプローブの混合物と別々に接触させ得、前記混合物は、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＯＳＩに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びｃ−ＭＥＴに対するプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＮＴＲＫ１に対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＫＩＦ５Ｂに対するプローブ、
−ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＡＵＲＫＡに対するプローブ、９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、染色体３に対するＣＥＰ、染色体６に対するＣＥＰ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、ＤＣＣに対するプローブ、１３ｑ１４に対する遺伝子座特異的プローブ及び染色体１８に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＴＥＲＣに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＨＥＲ２に対するプローブ、ＺＮＦ２１７に対するプローブ及び９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、
−ＭＣＬ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、染色体３に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＰＴＥＮに対するプローブ、ＥＲＧに対するプローブ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対する２色ブレイクアウェイプローブ、染色体８に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、または
−ＭＥＴに対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、染色体７に対するＣＥＰ及び染色体３に対するＣＥＰ
からなる。
【００８４】
上記方法は当業界で公知の適当な検出方法を用いて実施され得る。同一サンプルに対して２つ以上のプローブを同時にまたは逐次使用する場合、各プローブを別個の標識、例えば別個の発蛍光団で検出可能に標識することが好ましい。
【００８５】
各プローブが、例えばＦＩＳＨにより検出可能に標識されており（同一サンプルに対して２つ以上のプローブを同時にまたは逐次使用する場合には、別個に標識されている）、各プローブが発蛍光団で標識されている（同一サンプルに対して２つ以上のプローブを同時にまたは逐次使用する場合には、別個に標識されている）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより上記方法を実施する場合、方法は患者標本（例えば、腺腫）から本明細書中に記載されている方法に従って調製した細胞（例えば、上皮細胞）を用いて実施し得る。患者標本は、（ａ）新鮮であり得（新鮮な細胞は１〜３日間培養し、染色体が高度に凝縮されている中期中細胞をブロックするためにコルセミドのようなブロッカーを培養物に添加し得、可視化し得る）、（ｂ）解凍・新鮮冷凍され得、または（ｃ）（例えば、メタノール、エタノールまたはＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｒ）中に）部分的に固定され得、（例えば、ＲＮアーゼ及びペプシンで）処理して、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の接触性を高め、非特異的結合を低下させた後に、１つ以上のプローブとハイブリダイズし、洗浄して未結合プローブを除去し、ハイブリダイズしたプローブを検出し得る。
【００８６】
細胞診スライドのような細胞支持体は、ＴｈｉｎＰｒｅｐ  Ｔ−２０００プロセッサー（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州ベッドフォード）を製造業者の使用説明書に従って用いて作製され得る。スライドを２×ＳＳＣ中に７３℃で２分間置き、ペプシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で１０分間インキュベートし、１×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液）中に室温で５分間、１％  ＮＢＦ（中性緩衝ホルマリン）中に室温で５分間、１×ＰＢＳ中に室温で５分間置く。７０％  エタノール、８５％  エタノール及び１００％  エタノール中にそれぞれ１分間置くことによりスライドを脱水した後、風乾する。プローブ及びカバーガラスを適用し、カバーガラスを密封し、スライドをサーモブライトにおいて７２℃で２分間共変性し、３７℃で最長８時間ハイブリダイズし得る。ハイブリダイゼーションが完了したら、スライドを０．４×ＳＳＣ／０．３％  ＮＰ−４０を用いて７３℃で２分間、２×ＳＳＣ／０．１％  ＮＰ−４０を用いて室温で１分間処理した後、風乾し、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩水和物（ＤＡＰＩ）Ｉ褪色防止剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デス・プレーンズ）を載せ、カバーガラスを被せ得る。
【００８７】
上記した細胞支持体を用いる上記した１つ以上のプローブとのハイブリダイゼーションは、自動化共変性機器（ＨＹＢｒｉｔｅまたはＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ変性／ハイブリダイゼーションシステム，Ａｂｂｏｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デス・プレーンズ）を製造業者の使用説明書に従って用いて３７℃で最長８時間実施し得る（この方法は典型的にはプローブ及び標的核酸の変性を含む）。ハイブリダイゼーション後、細胞支持体、例えば細胞診スライドを洗浄緩衝液（２×クエン酸緩衝液／０．３％  ＮＰ４０；Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能）中に室温で２〜１０分間置いてカバーガラスを外した後、７３℃の洗浄緩衝液中に２分間浸漬し、乾燥し、ＤＡＰＩ  Ｉ褪色防止剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を載せ得る。好ましくは、細胞支持体、例えば細胞診スライドをシングルバンドパスフィルター（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を備えている落射蛍光顕微鏡を用いて分析する。
【００８８】
検出前に、細胞サンプルを場合により見かけ上の細胞学的異常に基づいて前選択してもよい。前選択は疑わしい細胞を同定し、これによりこれらの細胞にスクリーニングを集中させることができる。前選択によりより速くスクリーニングすることができ、陽性結果を見落とさない可能性が高くなる。生物学的サンプルからの細胞を顕微鏡スライド上に載せ、通常異形成胞及び新生細胞に関連する細胞学的異常を目視でスキャンすることができる。異常には、通常プローブをその標的ＤＮＡに対してハイブリダイズした後核を核酸ステインまたは染料、例えばヨウ化プロピジウムまたはＤＡＰＩ  Ｉを用いて対比染色することにより評価される核のサイズ、核の形状及び核染色の異常が含まれる。典型的には、新生細胞は広がったり、形状が不規則であったり、及び／またはまだらな染色パターンを示す核を有している。典型的には約０．４μｇ／ｍｌから約５μｇ／ｍｌの濃度で使用されるヨウ化プロピジウムは、６１４ｎｍの発光ピーク波長で観察され得る赤色蛍光ＤＮＡ特異的染料である。典型的には約１２５ｎｇ／ｍｌから約１，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用されるＤＡＰＩは、４５２ｎｍの発光ピーク波長でＤＡＰＩフィルターを用いて低倍率で観察され得る青色蛍光ＤＮＡ特異的ステインである。この場合、検出のために前選択した細胞のみを染色体消失及び／または増加についてカウントする。ＤＡＰＩフィルターを用いて異常な核を有する多くの細胞があると見られるときには、少なくとも１００、好ましくはより多くのオーダーの前選択細胞を染色体消失及び／または増加を評価するために選択することが好ましい。
【００８９】
或いは、あるレベルの異形成または疑わしい病巣を示す組織中のエリアを、ＤＡＰＩフィルターを用いて低倍率で局在化し、プローブの異常なコピー数を有している核の存在について十分に検査し得る。正常細胞では、所与のプローブの２コピーが検出される。異常細胞では、所与のプローブのより多いまたはより少ないコピーが検出される。好ましくは、列挙のために最も有意なコピー数変化を有するエリアを選択する。可能な限り、多数の異常エリアを選択し、少なくとも約１００個の核が分析されるように各異常エリア内で少なくとも約１０個のランダム核を高倍率（６４倍または１００倍の対物レンズ）で選択する。好ましくは、核は重複しておらず、十分に明るいシグナルを有している。
【００９０】
或いは、検出のための細胞は細胞学的または組織学的特徴と無関係に選択され得る。例えば、顕微鏡スライド上の所与の１つ以上のエリア中の非重複細胞のすべてを染色体消失及び／または増加について評価し得る。更なる例として、顕微鏡スライド上に番号順に現れる少なくとも約５０、より好ましくは少なくとも約１００のオーダーのスライド上の細胞、例えば変化した形態を示す細胞が染色体消失及び／または増加を評価するために選択され得る。
【００９１】
遺伝子／遺伝子座／染色体のコピーをカウントする。所望ならば、コピー数をコピーの予想されるまたは「正常な」数（すなわち、２コピー）と比較し得、２を超えるコピー数（すなわち、増加）及び２未満のコピー数（すなわち、低下）、及び／または必要に応じてＬＳＩプローブのコピー数及びセントロメアプローブ（本明細書中では染色体列挙プローブ（ＣＥＰ）とも称される）のコピー数の比較に基づいて比較した相対的低下は、細胞がＦＩＳＨにより異常であることを示す。２つ以上の遺伝子座の３以上のコピーの存在は多染色体性を示す。単一遺伝子座のコピー数の増加、例えば単一遺伝子座の３以上のコピーは単一遺伝子座増加を示す。脱パラフィン、前処理、染色及びルーチンのスライド洗浄も当業界で公知の方法に従って実施し得るが、ＶＰ  ２０００プロセッサー（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デス・プレーンズ）のような自動化システムを使用すると評価用スライドを作成するのに必要な時間が短くなる。スライドは、ハイブリダイゼーション後洗浄のために標準のコプリンジャーを使用するときの小バッチ（例えば、４スライド）と対照的に、大バッチ（例えば、５０スライド）で作成し得る。加えて、スライドの採点法は自動化イメージングを用いて完全自動化され得、これにより標本分析のために必要な実地時間が短くなる。完全自動化により、より多くの異常細胞をより頻繁に、常に捕捉するイメージングアルゴリズムを使用することができる。また、当業界で公知のスライド作成の適当な方法を使用し得るが、スライドを細胞のより均一且つ一定の単層を生成するＴｈｉｎＰｒｅｐ  ２０００（Ｈｏｌｏｇｉｃ、Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いて作成することが好ましい。
【００９２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び類似方法による分析のための核酸標的の変性は典型的には細胞形態を保存するように行われる。例えば、染色体ＤＮＡは高ｐＨ、高熱（例えば、約７０〜９５℃の温度）、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）及びその組合せにより変性され得る。一方、プローブは数分程度加熱することにより変性され得る。
【００９３】
変性後、ハイブリダイゼーションを実施する。プローブをその核酸標的に対して特異的にハイブリダイズするための条件は通常特定のハイブリッドを作製するための所与のハイブリダイゼーション手順で使用され得る条件の組合せを含み、その条件は当業者により容易に決定され得る。その条件は典型的には管理された温度、液相、及びプローブと標的の接触を含む。ハイブリダイゼーション条件は、プローブ濃度、標的長さ、標的及びプローブＧ−Ｃ含量、溶媒組成、温度及びインキュベーション期間を含めた多くの要因に応じて異なる。少なくとも１つの変性ステップをプローブの標的との接触に先行させてもよい。或いは、プローブ及び標的を相互に接触させながら、またはその後プローブを生物学的サンプルと接触させて一緒に変性条件にかけてもよい。ハイブリダイゼーションの後、プローブ／サンプルを例えば約２〜４×ＳＳＣ及び約１０〜５０％  ホルムアミドを含有している液相中、約２５から約５５℃の温度で、例えば約０．５から約９６時間の範囲の時間インキュベートし得る。特異性を高めるために、米国特許Ｎｏ．５，７５６，６９６（その内容は全体として、特にブロッキング核酸の使用の記載について、参照により本明細書に組み入れる）に記載されている非標識ブロッキング核酸のようなブロッキング剤を使用し得る。当業者には自明のように、サンプル中に存在する核酸に対してプローブを特異的にハイブリダイズするために他の条件を容易に使用し得る。ハイブリダイゼーションプロトコルは、例えばＰｉｎｋｅｌら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５：９１３８−９１４２（１９８８）；Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３３，Ｃｈｏｏ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９４）；及びＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８９：５３２１−５３２５（１９９２）に記載されている。
【００９４】
適当なインキュベーション期間が終了したら、サンプルＤＮＡに対する染色体プローブの非特異的結合を一連の洗浄により除去し得る。所望のストリンジェンシーのために温度及び塩濃度を適当に選択する。必要なストリンジェンシーのレベルはゲノム配列に対する特定のプローブ配列の複雑さに依存し、公知の遺伝組成を有するサンプルに対してプローブを系統的にハイブリダイズすることにより決定され得る。通常、高ストリンジェンシー洗浄は約６５から約８０℃の範囲の温度で、約０．２×から約２×ＳＳＣ及び約０．１％から約１％の非イオン性洗浄剤、例えばノニデットＰ−４０（ＮＰ４０）を用いて実施され得る。より低いストリンジェンシー洗浄が必要ならば、洗浄はより低温で、高濃度の塩を用いて実施され得る。
【００９５】
発蛍光団標識されているプローブまたはプローブ組成物を使用する場合、検出方法は蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、またはプローブハイブリダイゼーションを調べるための他の手段を含み得る。複数の発蛍光団を観察するために適当な顕微鏡イメージング方法を本明細書中に記載されている方法と一緒に使用し得る。蛍光顕微鏡法を使用する場合、ハイブリダイズしたサンプルを各発蛍光団の励起に適した光の下で適当な１つ以上のフィルターを使用して観察することができる。自動化デジタルイメージングシステム、例えばＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ、ＢｉｏＶｉｅｗまたはＡｐｐｌｉｅｄイメージングシステムをシグナル列挙及びデータ獲得アルゴリズムと一緒に使用し得る。
【００９６】
使用する方法に応じて、結果の表示を容易にし、蛍光強度の小さな違いを検出する感度を改善するためにデジタル画像分析システムを使用し得る。例示的システムは、自動化ステージ、焦点コントロール及びフィルターホイールを備えた標準蛍光顕微鏡をベースとする自動化画像分析システムであるＱＵＩＰＳ（定量的画像処理システムの頭辞語）（Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌｔｄ．，ニューヨーク州ホウソーン）である。励起波長を選択するために、フィルターホイールを顕微鏡の蛍光励起路中に載置する。二色ブロック中の特殊フィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，バーモンド州ブラトルボロ）により、画像表示をシフトすることなく複数の染料を励起させることができる。顕微鏡は２つのカメラポートを有しており、その１つはスライド上の興味深いエリアを見つけ、焦点を合わせるために使用される高感度高速ビデオ画像表示のための増感ＣＣＤカメラ（Ｑｕａｎｔｅｘ  Ｃｏｒｐ．，カリフォルニア州サニーベール）である。他のカメラポートは、高解像度及び感度で実際の画像を獲得するために使用される冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｌｔｄ．のモデル２００，アリゾナ州ツーソン）を有している。冷却ＣＣＤカメラを、ＶＭＥバスを介してＳＵＮ  ４／３３０ワークステーション（ＳＵＮ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州マウンテンビュー）にインターフェースで接続する。多色画像の全獲得は画像処理ソフトウェアパッケージＳＣＩＬ−Ｉｍａｇｅ（Ｄｅｌｆｔ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，オランダ国デルフト）を用いてコントロールされる。
【００９７】
テラノーシス
テラノーシスのための方法も提供する。この方法は、患者に対して治療を適合させるために使用される上記した細胞支持体を用いる診断テスト、特にＦＩＳＨ、例えばマルチプレックスＦＩＳＨを用いる診断テストのようなプロセスを含む。テラノーシスにより、特定患者の治療のための薬物の適合性を評価し得る。加えて、特に、患者の薬物を用いる治療の有効性を評価し得る。例えば、患者標本から調製した細胞中の調べた遺伝子座が異常（例えば、コピー数の増加または低下、または転座等）ならば、腫瘍は多分活性物質、例えば小分子、標的化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、標的化ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）または他の活性物質に対して感受性であり、この場合この活性物質を患者に投与し得、おそらく投与すべきである。活性物質に対する感受性を示す染色体異常が検出されないならば、患者はその活性物質での治療に応答しないか、うまく応答しない恐れがある。患者を活性物質で治療した後に染色体異常の消失が検出されたならば、その活性物質を用いる患者の治療が有効であると見なされ得る。患者を活性物質で治療した後に染色体異常の増加が検出されたならば、その活性物質を用いる患者の治療が無効であると見なされ得る。患者を活性物質で治療した後に染色体異常の変化が検出されないならば、その活性物質を用いる患者の治療は有効であると見なされるか、あるいは見なされないことがある。
【００９８】
１つの実施形態では、少なくとも２つの不連続エリアを含む細胞支持体を使用し得る。上記方法に従って調製した細胞を連続エリアに適用した後、各エリアを少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触させ、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならば検出可能に標識されているプローブは区別され得る。例えば、各不連続エリアを検出可能に標識されているプローブの混合物と別々に接触させ得、前記混合物は、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＯＳＩに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びｃ−ＭＥＴに対するプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＮＴＲＫ１に対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＫＩＦ５Ｂに対するプローブ、
−ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＡＵＲＫＡに対するプローブ、９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、染色体３に対するＣＥＰ、染色体６に対するＣＥＰ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、ＤＣＣに対するプローブ、１３ｑ１４に対する遺伝子座特異的プローブ及び染色体１８に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＴＥＲＣに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＨＥＲ２に対するプローブ、ＺＮＦ２１７に対するプローブ及び９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、
−ＭＣＬ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、染色体３に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＰＴＥＮに対するプローブ、ＥＲＧに対するプローブ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対する２色ブレイクアウェイプローブ、染色体８に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、または
−ＭＥＴに対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、染色体７に対するＣＥＰ及び染色体３に対するＣＥＰ
からなる。
【００９９】
細胞支持体の上記した実施形態のすべてがチロシンキナーゼ経路を標的とする活性物質に対する患者の応答を本明細書中に記載されている方法に従ってテラノーシスするために使用され得る。例えば、患者標本から調製した細胞中の調べた遺伝子座が異常（例えば、コピー数の増加または低下、または転座等）ならば、腫瘍は多分チロシンキナーゼ経路を標的とする活性物質、例えば小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、標的化ｍＡｂ、標的化ｐＡｂまたは他の活性物質に対して感受性であり、この場合その活性物質を患者に投与し得、おそらく投与すべきである。活性物質に対する感受性を示す染色体異常が検出されないならば、患者はその活性物質での治療に応答しないか、うまく応答しない恐れがある。患者を活性物質で治療した後に染色体異常の減少が検出されたならば、その活性物質を用いる患者の治療が有効であると見なされ得る。患者を活性物質で治療した後に染色体異常の増加が検出されたならば、その活性物質を用いる患者の治療が無効であると見なされ得る。患者を活性物質で治療した後に染色体異常の変化が検出されないならば、その活性物質を用いる患者の治療が有効であると見なされるか、あるいは見なされないことがある。上記方法に従って患者の応答を評価し得る活性物質の例にはクリゾチニブ、ボリチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダサチニブ、トラスツズマブ、またはペルツズマブが含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
患者が結腸直腸腺腫を有しているならば、少なくとも５つの不連続エリアを含む細胞支持体を使用し得る。上記方法に従って調製した細胞を不連続エリアに適用した後、各エリアを少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触させ、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならば検出可能に標識されているプローブは区別され得る。例えば、第１エリアをＥＧＦＲに対する遺伝子座特異的プローブと接触させ、第２エリアをＤＣＣに対する遺伝子座特異的プローブと接触させ、第３エリアを染色体１８に対するＣＥＰと接触させ、第４エリアを１３ｑ１４（染色体１３のｑアーム上のバンド１４）に対する遺伝子座特異的プローブと接触させ、第５エリアをＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブと接触させる。所望ならば、第６不連続エリアをＳＴＡＴ１に対する遺伝子座特異的プローブまたはＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブと接触させてもよい。或いは、第６不連続エリアをＳＴＡＴ１に対する遺伝子座特異的プローブと接触させ、第７不連続エリアをＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブと接触させてもよい。上記した細胞支持体は結腸直腸腺腫の再発のリスク及び結腸直腸腺腫の結腸直腸腺癌への進行のリスクを予知するために使用され得る。染色体異常がないことは結腸直腸腺腫の再発のリスクが低いこと及び／または結腸直腸腺腫の結腸直腸腺癌への進行のリスクが低いことを示し、一方ＥＧＦＲのコピー数の増加は結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いこと及び／または結腸直腸腺腫の結腸直腸腺癌への進行のリスクの高いことを示し、ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数の低下は結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いこと及び／または結腸直腸腺腫の結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示し、ＥＧＦＲのコピー数の増加に加えてＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数の低下、１３ｑ１４のコピー数の増加及びＭＹＣのコピー数の増加は結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いこと及び／または結腸直腸腺腫の結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示す。ＳＴＡＴ１のコピー数の増加及び／またはＡＵＲＫＡのコピー数の増加は結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いこと及び／または結腸直腸腺腫の結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示す。
【０１０１】
その表面上の不連続エリアに上記方法に従って調製した細胞が適用されている細胞支持体は以下の状況でも使用され得る：
−患者が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有しており、患者がＡＬＫに対して陽性の結果を示すならば、クリゾチニブ（ザーコリ（Ｒ））を患者に対して投与し得る。患者がＮＳＣＬＣを有しており、患者がＲＯＳ１に対して陽性の結果を示すならば、患者はクリゾチニブを用いる治療に対して耐性であるか、耐性を有するようになり得る。
−ＡＳＣＬ１及びＲＥＴの高い発現は喫煙関係肺癌を同定するための好結果の予後判定バイオマーカーであり得る。
−多分ＡＵＲＫＡコピー数及び／または染色体２０異数染色体の増加に起因するＡＵＲＫＡの過剰発現が後期上皮性卵巣癌の大部分で見られ、タキサン及び非タキサンをベースとする補助治療応答に差別的に影響を与え得る（Ｌａｓｓｍａｎｎら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３（１４）：４０８３−４０９１（Ｊｕｌｙ  １５、２００７））。ＡＵＲＫＡ過剰発現はタキソール／カルボプラチン治療を受けた患者の向上した全生存期間に関連しており、非タキサンベースの治療を受けた患者では全生存期間を悪化させる（上掲のＬａｓｓｍａｎｎら）。尿路上皮細胞中のＡＵＲＫＡのコピー数の増加は膀胱癌を検出するための将来有望なバイオマーカーであると示唆されている（Ｐａｒｋら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，１００（１９）：１４０１−１４１１（Ｏｃｔ．１，２００８））。
−患者が慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を有しているならば、患者が染色体９と染色体２２間の相互転座から生ずるＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子融合に対して陽性の結果（症例の＞９５％）を示すであろう。タンパク質シグナル化において過度に活発なＡＢＬタンパク質を阻害するためにチロシンキナーゼ阻害剤であるイマチニブメシレート（グリベックとして販売されている；ＳＴＩ−５７１としても公知）を患者に対して投与する。ＣＭＬを有しており、他の治療薬で治療できないかまたは体調が良くならなかった患者に対してはボスチニブ（ボシュリフとして販売されている）を投与する。ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子融合物（フィラデルフィア染色体）に対して陽性である慢性ＣＭＬを有しており、前治療に耐性／寛容であったり、なかったりする患者に対してはダサチニブ（スプリセル（Ｒ）として販売されている）を投与する。フィラデルフィア染色体に対して陽性である急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有しており、前治療に耐性／寛容である患者に対してもダサチニブを投与する。フィラデルフィア染色体に対して陽性であり、慢性ＣＭＬと新たに診断されたか、または以前慢性ＣＭＬに対する治療を受けた患者に対してはニロチニブ（タシグナ（ＴＭ）として販売されている）を投与する。
−患者がＮＳＣＬＣを有しており、癌がＦＧＦＲ２のＦＧＦＲ１を過剰発現しているならば、ＡＺＤ４５４７として公知であり、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３を標的とする新規の選択的ＦＧＦＲインヒビターを投与する（Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，３０７（１）：４７−５２（Ａｕｇｕｓｔ  ２０１１）を参照されたい）。
−患者が乳癌を有しており、癌がＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を過剰発現しているならば、トラスツズマブ（商標にはハークロン及びハーセプチンが含まれる）と名付けられているＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を妨害するモノクローナル抗体薬物を投与する。癌がＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を過剰発現していないならば、トラスツズマブを投与しない。患者がＨＥＲ２陽性の転移性乳癌を有しており、以前トラスツズマブ及びタキサンを別々にまたは一緒に投与されており、補助治療中または補助治療が完了してから６ヶ月以内の転移または疾患再発のために以前治療を受けているならば、アド−トラスツズマブエムタンシン（カドサイラ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を投与する。
−ＮＴＲＫ１の通常遠隔の遺伝子（例えば、ＭＰＲＩＰまたはＣＤ７４）への融合は肺腺癌を有している非喫煙者において見られた（Ｖａｉｓｈｎａｖｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９：１４６９−１４７２（２０１３）を参照されたい）。
−患者が癌を有しており、ＲＥＴを過剰発現しているならば、クリゾチニブ（ザーコリ（Ｒ））またはバンデタニブ（ＺＤ６４７４）を投与する。カボザンチニブ（ＸＬ  １８４）は現在臨床試験中である（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，１０４（１１）：１３９６−１４００（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１３））。
−患者が癌を有しており、ＲＯＳを過剰発現しているならば、クリゾチニブ（ザーコリ（Ｒ））を投与する。
【０１０２】
上皮細胞の存在は、不連続エリア中の細胞を標識されている抗ＣＡＭ５．２抗体と接触させることにより確認され得る（すなわち、ＩＨＣ）。
【０１０３】
よって、他のテラノース方法の中で、チロシンキナーゼ経路を標的とする活性物質に対する患者の応答をテラノースする方法を提供する。この方法は、本明細書中に記載されているように調製した細胞が適用されている少なくとも２つの不連続エリアを含む細胞支持体上でＩＳＨを実施することを含む。各エリアを少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触させ、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならば検出可能に標識されているプローブは区別され得る。各不連続エリアを検出可能に標識されているプローブの混合物と別々に接触させ得、前記混合物は、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＯＳＩに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びｃ−ＭＥＴに対するプローブ、
−ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ及びＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＮＴＲＫ１に対する２色ブレイクアパートプローブ、
−ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ及びＫＩＦ５Ｂに対するプローブ、
−ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＡＵＲＫＡに対するプローブ、９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、染色体３に対するＣＥＰ、染色体６に対するＣＥＰ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、ＤＣＣに対するプローブ、１３ｑ１４に対する遺伝子座特異的プローブ及び染色体１８に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＴＥＲＣに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＭＹＣに対するプローブ、ＨＥＲ２に対するプローブ、ＺＮＦ２１７に対するプローブ及び９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、
−ＭＣＬ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ及び染色体７に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、染色体３に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＰＴＥＮに対するプローブ、ＥＲＧに対するプローブ及び染色体１０に対するＣＥＰ、
−ＦＧＦＲ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対する２色ブレイクアウェイプローブ、染色体８に対するＣＥＰ及び染色体１０に対するＣＥＰ、または
−ＭＥＴに対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、染色体７に対するＣＥＰ及び染色体３に対するＣＥＰ
からなる。
【０１０４】
この点で、本明細書中に記載されているＩＳＨ及びＩＨＣの実施方法はテラノーシスの方法との関連で使用され得る。本明細書中に記載されている方法に伴う作用効果を考慮すると、テラノーシスの関連でのその使用は現在利用されている方法に勝る改善を与える。
【０１０５】
上記方法は、治療薬を用いる治療に対する可能性ある応答の評価、再発のモニタリング、及び予防または治療処置の有効性の評価のために使用され得る。よって、方法は治療決断、例えば治療または予防用治療薬の選択、手術に勝る積極的サーベイランスまたは治療の選択、その選択を含めた補助治療を使用する決断を助け得る。所望ならば、本明細書中に記載されている方法は他の検査、例えばルーチンの細胞学、組織学、抗原アッセイ、ノモグラム、メチル化、変異等と一緒に使用され得る。方法は他の予後判定方法で前もってまたは同時に得た結果を確認するためにも使用され得る。
【０１０６】
例えば、患者において上記した結腸直腸腺腫の予後判定方法を実施する過程でＥＧＦＲの増加したコピー数が存在すると判明したならば、抗ＥＧＦＲ剤を用いて患者を治療する決定がなされ得る。例えば、ヒトＥＧＦＲに結合し、表皮増殖因子（ＥＧＦ）のＥＧＦＲへの結合を阻止して受容体シグナル化を阻止し、細胞活性化及び増殖を阻害することを示すと報告されている（例えば、国際公開Ｎｏ．ＷＯ  ９８／５０４３３及び米国特許Ｎｏ．６，２３５，８８３を参照されたい）ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、またはＫＲＡＳ変異ネガティブのＥＧＦＲ発現転移性大腸癌の治療のために認可されているキメラｍＡｂであるセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）を、腺腫の腺癌への進行を抑制する及び／または腺腫の再発を抑制するために患者に対して投与し得る。加えてまたは替えて、患者に対してフォローアップ結腸内視鏡検査を約１年たったら実施する決定がなされ得る。
【０１０７】
また、患者において上記した結腸直腸腺腫の予後判定方法を実施する過程でＤＣＣの低下したコピー数が存在すると判明したならば、患者を代替治療、例えば抗ＥＧＦＲ剤を含まない抗癌治療を用いて治療する決定がなされ得る。そのような代替治療の例にはフルオロウラシル、シスプラチン、ドキソルビシン及びシクロホスファミドが含まれるが、これらに限定されない。加えてまたは替えて、患者に対してフォローアップ結腸内視鏡検査を約１年たったら実施する決定がなされ得る。
【０１０８】
また、患者に対して結腸内視鏡検査を実施する過程で腺腫が発見され、腺腫様ポリープを切除したならば、上記方法は腺腫の再発について患者をモニターするために使用され得る。同様に、患者において上記した結腸直腸腺腫の予後判定方法を実施する過程で染色体異常がないと判明したときのように患者において腺腫の再発のリスクが低いと判断されるならば、患者に対してフォローアップ結腸内視鏡検査を約５年たったら実施する決定がなされ得る。
【０１０９】
患者における上記した結腸直腸腺腫の予後判定方法を実施する過程でＥＧＦＲ、ＭＹＣ及び１３ｑ１４の増加したコピー数及びＣＥＰ１８に対してＤＣＣの低下したコピー数が存在することが判明したならば、患者をパニツムマブ及び／またはセツキシマブのような抗ＥＧＦＲ剤を単独で、またはフルオロウラシル、シスプラチン、ドキソルビシン及び／またはシクメホスファミドのような代替または補助治療剤と一緒に用いて患者を治療する決定がなされ得る。加えて、患者に対してフォローアップ結腸内視鏡検査を約６ヶ月たったら実施する決定がなされ得る。加えてまたは替えて、上記方法は、方法を経時的に、例えばちょうどよい１時点からその後のちょうどよい時点まで定期的に実施し、結果を経時的に比較することにより治療の有効性を評価するために使用され得る。
【０１１０】
上記方法を、検査サンプルを得た患者の治療の有効性を評価するために使用するならば、方法は場合により更に、有効性を改善するために必要に応じて患者の治療／予防処置を修飾することを含む。自動システムまたは半自動システムにおいて使用するために方法を改変してもよい。
【０１１１】
概して、疾患の進行及び／または治療をモニターするとき、染色体異常（存在またはレベル）は「変化なし」、「有利（または、「有利に変化している」）」、または「不利」（または、「不利に変化している」）であり得る。「高い」または「増加した」は、患者標本（例えば、腺腫）から得た細胞（例えば、上皮細胞）のサンプル中の染色体異常のレベルが正常または典型的なレベルまたは範囲よりも高いこと、または別の参照レベルまたは範囲（例えば、早期または基準サンプル）よりも高いことを指す。用語「低い」または「低下した」は、患者標本（例えば、腺腫）から得た細胞（例えば、上皮細胞）のサンプル中の染色体異常のレベルが正常または典型的なレベルまたは範囲よりも低い、または別の参照レベルまたは範囲（例えば、早期または基準サンプル）よりも低いことを指す。用語「変化した」は、患者標本（例えば、腺腫）からの細胞（例えば、上皮細胞）のサンプル中の染色体異常のレベルが正常または典型的なレベルまたは範囲、または別の参照レベルまたは範囲（例えば、早期または基準サンプル）に比して変化（増加または低下）していることを指す。
【０１１２】
所与の染色体異常についての正常または典型的なレベルまたは範囲は標準プラクティスに従って規定される。幾つかの場合染色体異常のレベルは非常に低いので、典型的なまたは正常レベルまたは範囲、または参照レベルまたは範囲と比較して実験誤差またはサンプルの違いにより説明できない正味の変化があるときに所謂変化したレベルまたは変化が起こったと見なされ得る。よって、特定サンプル中で測定されたレベルを所謂正常被験者からの類似サンプル中で測定されたレベルまたはレベルの範囲と比較する。これに関連して、「正常被験者」は検出可能な疾患を持たない個人であり、「正常」または「対照」患者または集団は例えばそれぞれ検出可能な疾患を示さないものである。更に、ヒト集団の大部分で染色体異常が高レベルで日常的に見つからないならば、「正常被験者」は所与の染色体異常の高いレベルが実質的に検出され得ない個人と見なされ得、「正常」（場合により、「対照」と称する）患者または集団は所与の染色体異常の高いレベルの実質的不検出を示すものである。「見かけ正常な被験者」は染色体異常を評価したことがないかまたは評価のものである。所与の染色体異常のレベルは、染色体異常が通常検出不能であるが検査サンプル中で検出されるとき、またアナライトが試験サンプ中に正常レベルよりも高いレベルで存在しているとき「高い」と言われる。
【０１１３】
方法は他のマーカー等の検出をも含み得る。
【０１１４】
よって、患者における癌（例えば、腺癌）のような状態の治療の有効性をモニターする場合、方法は、
（ａ）治療薬を用いて治療する前の被験者由来の患者標本（例えば、腺癌）からの細胞（例えば、上皮細胞）のサンプル中の染色体異常を測定するステップ；
（ｂ）治療薬を用いて治療した後の被験者由来の患者標本（例えば、腺癌）からの細胞（例えば、上皮細胞）のより後のサンプル中の染色体異常のレベルを測定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された染色体異常のレベルをステップ（ａ）で測定された染色体異常のレベルと比較するステップ；
を含み得、ステップ（ｂ）におけるレベルがステップ（ａ）で測定されたレベルと比較して変化なしかまたは不利ならば、被験者における癌（例えば、腺癌）のような状態は継続、進行または悪化していると判断される。対照的に、ステップ（ｂ）で測定されたレベルがステップ（ａ）で測定されたレベルと比較して有利ならば、被験者における癌（例えば、腺癌）のような状態は休止、退行または改善していそうである。場合により、方法は更に、比較により例えばステップ（ｂ）で測定されたレベルがステップ（ａ）で測定されたレベルに対して不利に変化していると判断されたならば、被験者を例えば１つ以上の他の治療薬、放射線及び／またはホルモン療法を用いて一定期間治療することを含む。被験者が治療を受ける期間は当業者により決められ得る（例えば、期間は約７日間から約２年間、好ましくは約１４日間から約１年間であり得る）。
【０１１５】
治療中、腺癌細胞の第２及びその後のサンプルを被験者から得る。サンプルの数及びサンプルを被験者から得る時期は重要でない。例えは、第２サンプルは被験者が最初に治療を受けてから７日後に得られ得、第３サンプルは被験者が最初に治療を受けてから２週間後に得られ得、第４サンプルは被験者が最初の治療を受けてから３週間後に得られ得、第５サンプルは被験者が最初の治療を受けてから４週間後に得られ得る、等々。
【０１１６】
第２またはその後のサンプルの各々を被験者から得た後、第２またはその後のサンプル中の染色体異常のレベルを（例えば、本明細書中に記載されている方法または当業界で公知の方法を用いて）測定する。次いで、第２またはその後のサンプルの各々において測定されたレベルを第１サンプル（例えば、元々場合により所定レベルと比較したサンプル）において測定されたレベルと比較する。ステップ（ｃ）で測定されたレベルがステップ（ａ）で測定されたレベルと比較して有利ならば、癌（例えば、腺癌）のような状態は休止、退行または改善していそうであり、被験者は治療され続けなければならない。しかしながら、ステップ（ｃ）で測定されたレベルがステップ（ａ）で測定されたレベルと比較して変化なしまたは不利ならば、癌（例えば、腺癌）のような状態は継続、進行または悪化していると判断され、被験者はより高用量の医薬組成物、放射線またはホルモンで治療されなければならず、または被験者は別の方法で治療されなければならない。
【０１１７】
一般的に、繰り返し検査を実施するアッセイ（例えば、疾患の進行及び／または治療に対する応答をモニターする）の場合、第１検査サンプルを被験者から得た後ちょうどよい時に第２またはその後の検査サンプルを得る。具体的には、第１検査サンプルを被験者から得てから数分後、数時間後、数日後、数週間後または数年後に被験者からの第２検査サンプルを得ることができる。例えば、被験者から第１試験サンブルを得てから約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約２５週間、約２６週間、約２７週間、約２８週間、約２９週間、約３０週間、約３１週間、約３２週間、約３３週間、約３４週間、約３５週間、約３６週間、約３７週間、約３８週間、約３９週間、約４０週間、約４１週間、約４２週間、約４３週間、約４４週間、約４５週間、約４６週間、約４７週間、約４８週間、約４９週間、約５０週間、約５１週間、約５２週間、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５．年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年または約１０．０年後に第２検査サンプルを被験者から得ることができる。
【０１１８】
更に、本発明は、癌（例えば、腺癌）または腺腫のような状態に罹りやすいかまたは罹っている被験者が治療の恩恵を受けるかどうかを調べる方法にも関する。特に、本発明はコンパニオン診断方法及び製品に関する。よって、本明細書中に記載されている「被験者における疾患の治療をモニターする」方法は、更に最適には治療のための候補者を選択または同定することを包含し得る。一般的に、被験者は疾患の幾つかの症状を経験している、実際疾患のリスクを有しているかそのリスクがあると診断されるかまたはそのリスクを有している、及び／または本明細書中に記載されている染色体異常の不利なレベルを示しているものである。
【０１１９】
方法は、場合により被験者の治療の前後に染色体異常のレベルを評価する本明細書中に記載したアッセイを含む。治療後染色体異常の不利なレベルが観察されると被験者が更なる治療または継続治療を受ける恩恵を受けないであろうと確認され、治療後染色体異常の有利なレベルが観察されると被験者は更なる治療または継続治療を受ける恩恵を受けるであろうと確認される。この確認は臨床研究の管理及び改善された患者ケアの提供を助ける。
【０１２０】
プローブ
ＡＬＫに対するプローブの例はＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（イリノイ州デス・プレーンズ）から入手可能なＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＡＬＫ２色ブレイクアパート再構成プローブである。ＡＬＫ遺伝子に対して３’でハイブリダイズするプローブの１部分は〜３００ｋｂである。ＡＬＫ遺伝子（３’末端）にハイブリダイズするプローブの他の部分は約〜４４２ｋｂである。
【０１２１】
ＣＤＫＮ２に対するプローブの例はＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＤＫＮ２Ａスペクトルオレンジ／ＣＥＰ  ９スペクトルグリーンプローブセットである。ＣＤＫＮ２ａスペクトルオレンジプローブは〜２２２ｋｂである。
【０１２２】
ＥＲＧに対するブレイクアパートプローブはＥｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ニューヨーク州バッファロー）から入手可能である。このプローブのオレンジ部分は〜１８１ｋｂであり、プローブのグリーン部分は〜１８９ｋｂである。テキサスレッド及びＦＩＴＣを用いる別のスプリットプローブはＡｂｎｏｖａ（カリフォルニア州ウォールナット）から入手可能である。
【０１２３】
オレンジであるＦＧＦＲ１  ＦＩＳＨプローブはＥｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓから入手可能である。このプローブは〜１９３ｋｂである。
【０１２４】
オレンジであるＦＧＦＲ２  ＦＩＳＨプローブはＥｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓから入手可能である。このプローブは〜１７４ｋｂである。
【０１２５】
ＨＥＲ２プローブの例はＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能なＬＳＩ  ＨＥＲ−２である。このプローブはオレンジであり、〜１９０ｋｂである。
【０１２６】
ＭＥＴプローブの例はＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能なＬＳＩ  Ｍｅｔスペクトルレッドである。このプローブはレッドであり、〜４５６ｋｂである。
【０１２７】
ＭＣＬ１  ＦＩＳＨプローブはＥｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓから５つの異なる色で入手可能である。
【０１２８】
ＮＴＲＫ１スプリットプローブはＡｂｎｏｖａから入手可能である。１つのプローブはテキサスレッドで標識されており、〜４２０ｋｂであり、他のプローブはＦＩＴＣで標識されており、〜７８０ｋｂである。
【０１２９】
ＰＩＫ３ＣＡプローブの例はＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能なＬＳＩ  ＰＩＫ３ＣＡスペクトルグリーンプローブである。このプローブは〜７６０ｋｂである。
【０１３０】
ＰＴＥＮプローブの例はＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能なＬＳＩ  ＰＴＥＮスペクトルオレンジプローブである。このプローブは〜３６８ｋｂである。
【０１３１】
ＲＥＴブレイクアパートプローブはＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能である。１つのプローブはレッドであり、〜４６９ｋｂである。他のプローブはグリーンであり、〜５４５ｋｂである。
【０１３２】
ＲＯＳプローブの例はＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能なＬＳＩ  ＲＯＳ１（Ｔｅｌ）スペクトルオレンジプローブである。このプローブは〜３１７ｋｂである。
【０１３３】
ＴＥＲＣプローブの例はＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能なＬＳＩ  ＴＥＲＣスペクトルゴールドプローブである。このプローブは〜４９５ｋｂである。
【０１３４】
ＺＮＦ２１７プローブの例はＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能なＬＳＩ  ＺＮＦ２１７スペクトルオレンジプローブである。このプローブは〜４３３ｋｂである。
【０１３５】
ＥＧＦＲに対するプローブの例はＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（イリノイ州デス・プレーンズ）から入手可能であるＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＥＧＦＲである。ＥＧＦＲ遺伝子は〜１８８ｋｂである。このプローブは遺伝子を超えて５’方向に〜１ｋｂ、３’方向に〜１０６ｋｂ延びている。全プローブは約３００ｋｂである。
【０１３６】
ＤＣＣに対するプローブの例はＡｂｎｏｖａ  ＤＣＣである。Ａｂｎｏｖａ  ＤＣＣはＡｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（台湾）より製造されており、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（ペンシルベニア州ピッツバーグ）よりカタログ番号８９−０２８−９６３で流通している。
【０１３７】
１３ｑ１４またはＲＢ１に対するプローブの例はＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（イリノイ州デス・プレーンズ）から入手可能なＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  １３（１３ｑ１４）である。ＬＳＩ  １３（１３ｑ１４）はＲＢ１遺伝子及びフランキング領域を含む重複クローンのセットから構成されている。ＲＢ１遺伝子は１８０ｋｂである。このプローブは遺伝子を超えて５’方向に１１０〜１７０ｋｂ、３’方向に約１２０ｋｂｅ延びている。全プローブは約４４０ｋｂのサイズを有し、７ｐ１１領域にハイブリダイズする。
【０１３８】
ＭＹＣに対するプローブの例はＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（イリノイ州デス・プレーンズ）から入手可能なＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＭＹＣ（８ｑ２４）である。ＭＹＣ遺伝子は４．４ｋｂである。このプローブは遺伝子を超えて５’方向に〜３８２ｋｂ、３’方向に〜４３４ｋｂ延びている。全プローブは約８２１ｋｂであり、８ｑ２４領域にハイブリダイズする。
【０１３９】
ＳＴＡＴ１に対するプローブは当業界で入手可能な配列情報を用いて当業者に公知の方法に従って調製され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）から入手可能である受託番号ＮＧ＿００８２９４．１の参照配列、及び本明細書中に引用されているＨａｄｄａｄら，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．，８３（１−２）：５８−５９（１９９８）を参照されたい。追加の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋから受託番号ＡＣ０６７９４５．４として入手可能であるＢＡＣクローンＲＰ１１−６２９Ｂ４として入手可能である。
【０１４０】
ＡＵＲＫＡに対するプローブの例はＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（イリノイ州デス・プレーンズ）から入手可能なＶｙｓｉｓ  ＡＵＲＫＡ  ＦＩＳＨプローブである。
【０１４１】
染色体プローブとして使用するのに適しているプローブは染色体のセントロメアに関連する反復ＤＮＡとハイブリダイズする。霊長類染色体のセントロメアは、α−サテライトＤＮＡと称される約１７１塩基対（ｂｐ）のモノマー反復長から構成されているＤＮＡのロングタンデムリピートの複合ファミリーを含んでいる。染色体プローブは、典型的には約５０〜１×１０５ヌクレオチドの長さを有する。より長いプローブは、典型的には約１００〜５００ヌクレオチドの長さを有するより小さな断片を含む。
【０１４２】
染色体領域または小領域を標的とする染色体列挙プローブ（ＣＥＰ）及び遺伝子座特異的プローブは商業的に入手可能であり、または当業者により容易に作製され得る。このプローブはＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（イリノイ州デス・プレーンズ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（オレゴン州ユージーン）、またはＣｙｔｏｃｅｌｌ（英国オックスフォードシャー）から商業的に入手可能である。染色体プローブは、例えばタンパク質核酸（ＰＮＡ）、クローン化ヒトＤＮＡ、例えばプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、及びヒトＤＮＡ配列のインサートを含有しているＰｌ人工染色体（ＰＡＣ）から作製され得る。当該領域はＰＣＲ増幅またはクローニングにより得られ得る。別の実施形態では、染色体プローブはオリゴプローブであり得る。或いは、染色体プローブは当業界で公知の方法に従って合成され得る。
【０１４３】
特定の遺伝子座の標的化を所望する場合、標的化遺伝子の全長に沿ってハイブリダイズするプローブが好ましいが、必須ではない。遺伝子座特異的プローブは、その遺伝子異常が転移に関連する発癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子、例えばＭＹＣにハイブリダイズするように設計され得る。
【０１４４】
プローブは当業界で公知の方法により作製され得る。プローブは合成され得、または組換え的に産生され得る。このプローブの長さは約２５，０００塩基対から約８００，０００塩基対の範囲であり得る。
【０１４５】
プローブが検出可能に標識されていることが好ましく、２つ以上のプローブを同一サンプルに対して同時または逐次使用する場合には各プローブが別個に標識されていることが好ましい。好ましくは、プローブは発蛍光団で検出可能に標識されている。好ましい発蛍光団の例には、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソチアシアネート（ＦＩＴＣ）、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−イソチアシアネート、テトラメチルローダミン−６−イソチアシアネート、５−カルボキシルテトラメチルローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、Ｎ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−３−インダセンプロピオン酸、エオシン−５−イソチアシアネート、エリスロシン−５−イソチアシアネート、スペクトルレッド（ＴＭ）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、スペクトルゴールド（ＴＭ）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、スペクトルグリーン（ＴＭ）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、スペクトルアクア（ＴＭ）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、スペクトルオレンジ（ＴＭ）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デス・プレーンズ）、テキサスレッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシファーイエロー及びカスケードブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）が含まれるが、これらに限定されない。使用する特定標識は重要でない。しかしながら、特定標識がプローブのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他のプローブ上の標識の検出を妨害しないことが望ましい。標識はアッセイの感度を最大限とし、バックグラウンドシグナル以上で検出され得るようにできるだけ低いコピー数で検出されることが望ましい。また、標識が非常に局在化したシグナルを与え、よって高度の空間分解能を与えることが望ましい。
【０１４６】
発蛍光団の核酸プローブへの結合は当業界で公知であり、利用可能な手段によりなし得る。発蛍光団は例えば特定ヌクレオチドに共有結合され得。標識されているヌクレオチドはニックトランスレーション、ランダムプライミング（Ｒｉｇｂｙら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３：２３７（１９９７））、ＰＣＲ標識、末端標識、シトシン残基のような特定残基の化学修飾による直線標識（米国特許Ｎｏ．５，４９１，２２４）等のような標準技術を用いてプローブに取り込まれ得る。或いは、発蛍光団は、プローブに取り込まれた活性化リンカーアームを用いて、例えばアミノ基転移されているプローブのデオキシシチジンヌクレオチドに対してリンカーを介して、ヌクレオチドに共有結合され得る。プローブの標識方法は、いずれもプローブの標識の記載について参照により本明細書に組み入れる米国特許Ｎｏ．５，４９１，２２４及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ”，ｐ．２１−４０，Ｆａｎ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）に記載されている。
【０１４７】
当業者は、標識含有部分として発蛍光団の代わりに他の物質または染料を使用し得ることを認識している。発光剤には、例えば放射蛍光、化学発光、生物発光及び燐光性標識含有部分が含まれる。可視光で検出可能な物質にはシアニン染料が含まれる。或いは、間接手段により可視化される検出部分を使用してもよい。例えば、プローブを当業界で公知のルーチンの方法を用いてビオチンまたはジゴキシゲニンで標識した後、検出のために更にプロセッシングしてもよい。ビオチン含有プローブはその後検出可能なマーカーにコンジュゲートしたアビジンの結合により可視化され得る。検出可能なマーカーは発蛍光団であり得、この場合プローブの可視化及び区別は下記するようになされ得る。
【０１４８】
或いは、標的領域にハイブリダイズした染色体プローブは、不溶性の発色生成物を生じさせるために標識部分を適当な基質と酵素反応させることにより可視化され得る。各プローブは別個の標識部分を選択することによりセット内の他のプローブから区別され得る。セット内のビオチン含有プローブは、その後アルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたアビジン及び適当な基質とインキュベートすることにより検出され得る。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）がアルカリホスファターゼに対する基質として働き、ジアミノベンゾエートがＨＲＰに対する基質として働く。
【０１４９】
キット
キットも提供する。このキットは、（ａ）ＩＳＨまたはＩＨＣ用の細胞支持体及び／または少なくとも１つのプローブ、及び（ｂ）本明細書中に記載されているように作製した細胞が適用される少なくとも２つの不連続エリアを含む細胞支持体上で上記方法を実施するための使用説明書を含み、前記した各エリアを少なくとも１つの検出可能に標識されているプローブと接触させ、エリアを２つ以上の検出可能に標識されているプローブと接触させるならばこれらの検出可能に標識されているプローブは区別され得る。
【０１５０】
実施形態では、キットは、（ａ）患者における結腸直腸腺腫の予後判定を可能にするプローブのセット、及び（ｂ）患者において結腸直腸腺腫を予後判定するための使用説明書を含む。よって、キットは、（ａ）ＥＧＦＲに対する遺伝子座特異的プローブ、ＤＣＣに対する遺伝子座特異的プローブ、染色体１８に対する染色体列挙プローブ（ＣＥＰ１８）、１３ｑ１４に対する遺伝子座特異的プローブ及びＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブを含むまたはこれらから構成される患者における結腸直腸腺腫の予後判定を可能にするプローブのセット、及び（ｂ）患者から得た結腸直腸腺腫のサンプル（例えば、上皮細胞のような細胞のサンプル）中の染色体異常の存在または不在を調べることを含む患者における結腸直腸腺腫の予後判定するための使用説明書を含み得る。プローブのセットは更に、１つ以上の他の遺伝子座特異的プローブ及び／またはセントロメアプローブ（ＣＥＰ）、例えばＳＴＡＴ１に対する遺伝子座特異的プローブ及び／またはＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブを含み得る。染色体異常がないことは、結腸直腸腺腫の再発リスクが低いこと及び／または結腸直腸腺腫の結腸直腸腺癌への進行のリスクが低いことを示す。一方、ＥＧＦＲのコピー数の増加は結腸直腸腺腫の再発リスクが高いこと及び／または結腸直腸腺腫の結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示し、ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数の低下は結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いこと及び／または結腸直腸腺腫の結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示し、ＥＧＦＲのコピー数の増加に加えてＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数の低下、１３ｑ１４のコピー数の増加及びＭＹＣのコピー数の増加は結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いこと及び／または結腸直腸腺腫の結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示す。ＳＴＡＴ１のコピー数の増加及び／またはＡＵＲＫＡのコピー数の増加は結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いこと及び／または結腸直腸腺腫の結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示す。
【０１５１】
キットは、更にブロッキング剤または他のプローブ、プローブの検出を容易にする各種標識または標識剤、ハイブリダイゼーションのための試薬（例えば、緩衝液）、中期スプレッド等を含み得る。
【実施例】
【０１５２】
下記実施例は本発明を説明するのに役立つ。これらの実施例は特許請求されている発明の範囲を限定すると決して意図されない。
【０１５３】
［実施例１］
本実施例は、新鮮冷凍結腸組織サンプルからの上皮細胞の単離及びこれらの細胞の起源の確認を記載する。
【０１５４】
冷凍した結腸組織サンプルを室温で解凍した。組織を室温でハンクス緩衝液を用いて濯いだ。次いで、組織を２０ｍＭ  ＤＴＴ及び５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する予加温したハンクス緩衝液中に３７℃で５分間浸漬した。組織を２ｍＬの振とう溶液（４℃の２０ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１０％  ＤＭＳＯを含有するハンクス緩衝液）を収容している１０ｍＬのファルコンチューブに移し、チューブを５〜１０秒間渦状混合した。組織をファルコンチューブから取り出した。上清を（ｉ）細胞ストレーナー（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手可能な１００μＭ  ナイロン細胞ストレーナー）を介して濾過するか、または（ｉｉ）細胞を沈降させるために１，０００×ｇで１０分間遠心し、その後上清を捨て、残留上清を用いて細胞を再懸濁した。細胞懸濁液を２０ｍＬのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｒ）溶液を収容しているＴｈｉｎＰｒｅｐバイアルに移した。細胞をＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｒ）溶液中、室温で一晩固定した。スライド作成までバイアルを周囲温度で保存した。バイアルを長期間保存しなければならないならば、バイアルを２〜８℃で保存した。
【０１５５】
スライドをＴｈｉｎＰｒｅｐ  Ｔ−２０００プロセッサーを製造業者の使用説明書に従って用いて作成した。スライドを９５％  エタノール中に室温で１５分間浸漬した直後に、カルノア液（３：１  メタノール：酢酸固定液）に室温で３０分間移した。その後、スライドを縦向きで、室温で乾燥した。スライドを長期間保存しなければならないならば、使用するまでスライドを−２０℃で保存した。
【０１５６】
組織、例えば新鮮な組織、新鮮冷凍した組織、またはホルマリン固定／パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）した組織からの上皮細胞の単離を、免疫蛍光抗ＣＡＭ５．２抗体を以下の手順に従って用いて確認した：
１．スライドを１×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で濯ぐ；
２．スライドにＰＢＳ中で調製した１％  新鮮なブロッキング試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州カールスバッド）（１００μＬ）を添加し、パラフィルムを被せる；
３．スライドを加湿ボックスにおいて３７℃で２５分間インキュベートする；
４．パラフィルムを外し、軽くたたいてスライドから試薬を捨てる；
５．スライドにＣＡＭ５．２−ＦＩＴＣ抗体（１００μＬ）を適用し、パラフィルムを被せる；
６．スライドを加湿ボックスにおいて３７℃で１時間インキュベートする；
７．スライドを１×ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳ）を用いて３７℃で５分間洗浄する。２回繰り返す；
８．ＤＡＰＩを適用し、カバーガラスを被せる；
９．スライドを適切なフィルターを有するレギュラー蛍光顕微鏡の下で観察する。
【０１５７】
顕微鏡評価から、単離した細胞の≧９５％が上皮起源を有していたことが判明した。上皮細胞は標的内に均一に分布しており、主に良好な細胞及び核形態を有する個別の細胞とてして存在していた。
【０１５８】
［実施例２］
本実施例は、実施例１からのスライド上で使用した蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）手順を記載する。
【０１５９】
スライドを２×ＳＳＣ中に７３℃で２分間入れ、その後スライドをペプシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で１０分間インキュベートした。その後、スライドを１×ＰＢＳ中に室温で５分間、１％  ＮＢＦ中に室温で５分間、１×ＰＢＳ中に室温で５分間入れた。スライドを７０％  エタノール、８５％  エタノール及び１００％  エタノール中にそれぞれ１分間入れることにより脱水した後、風乾した。スライドにプローブ（１０μｌ）、次いでカバーガラスを適用した。カバーガラスをゴム糊で密封した。スライドをサーモブライトにおいて７２℃で２分間、３７℃で１２〜１８時間（一晩）共変性させた。翌日、スライドを０．４×ＳＳＣ／０．３％  ＮＰ−４０を用いて７３℃で２分間、２×ＳＳＣ／０．１％  ＮＰ−４０を用いて室温で１分間処理した。次いで、スライドを風乾し、ＤＡＰＩ  Ｉ褪色防止剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デス・プレーンズ）を載せ、カバーガラスを被せた。
【０１６０】
ハイブリダイゼーション後、スライドをスペクトルゴールド（ＴＭ）、スペクトルオレンジ（ＴＭ）、スペクトルレッド（ＴＭ）、スペクトルグリーン（ＴＭ）、スペクトルアクア（ＴＭ）及びＤＡＰＩフィルターを有する蛍光顕微鏡を用いて評価した。下記パラメーターを有していたならば、細胞は染色体異常であると見なされた：
ｉ）１細胞あたり３以上で表される遺伝子コピー数増加、及び／または
ｉｉ）１または０シグナルで表される遺伝子コピー数低下、及び／または
ｉｉｉ）１．０未満の、ＣＥＰに対するＬＳＩプローブの比で表される相対低下。
【０１６１】
各スライド上の指定標的エリア中の５０個の細胞を列挙し、各プローブのコピー数を記録した。
【０１６２】
最高頻度の染色体異常を有していたＦＩＳＨプローブを選択するために、結腸直腸癌（ＣＲＣ）に関連する１３個のゲノム領域を６個のＣＲＣ標本及びその正常な隣接組織（ＮＡＴ）で評価した。この評価に基づいて、結腸直腸腺腫と診断された２７個の冷凍組織標本及び３個の正常隣接組織のセットに対して追加の試験をするために５つの候補プローブ（ＥＧＦＲ  ７ｐ１２、ＭＹＣ  ８ｑ２４、１３ｑ１４、ＤＣＣ  １８ｑ２１及びＣＥＰ１８）を選択した。検討した２７人の症例のうち、１１人の患者は結腸癌を合併していると診断されたが、腺腫を有している１６人の患者は結腸癌を合併していなかった。標本毎に５０個の細胞／核についてのＦＩＳＨパターンを１人の観察者が記録し、染色体異常細胞の数を調べた。少なくとも１０個のＦＩＳＨ異常細胞のカットオフポイントを用いて、ＦＩＳＨ正値性を分類した。ＥＧＦＲ、ＭＹＣ及び１３ｑ１４プローブの場合コピー数増加を有していたとき、ＣＥＰ１８に対するＤＣＣの場合コピー数低下を有していたとき、細胞は異常と見なされた。結果から、結腸直腸腺腫症例で同定された４つの異なるＦＩＳＨパターンがあること、すなわち４つ全てのプローブは異常なし（二染色体）；ＤＣＣ遺伝子低下のみ；ＥＧＦＲ遺伝子増加のみ；及び４つ全てのプローブが異常、すなわちＭＹＣ、１３ｑ１４及びＥＧＦＲ増幅及びＤＣＣ欠失（表１を参照されたい）を示した。
【０１６３】
【表１】
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この限定されたセットのサンプルにおいて、結腸直腸癌を合併している患者から得た腺腫標本の９１％がＦＩＳＨ陽性であると判明したのに対して、大腸癌を合併していなかった患者から得た標本の３８％のみがＦＩＳＨ陽性であった。
【０１６４】
所見から、腺腫標本の異なる遺伝子プロフィールが個別化された医療のために臨床価値を有し得ることが示唆される。ＦＩＳＨ異常を有していない（ＦＩＳＨパターン１）患者はポリープ再発及び／または進行の最低リスクを有し、最良の予後判定を有し得、従って治療を必要としない。これらの患者に対しては、例えば５年後のフォローアップ結腸内視鏡検査が推奨され得る。対照的に、全てのプローブについて結腸直腸腺腫ポリープ異常（ＦＩＳＨパターン４）を有している患者はポリープ再発及び／または進行の最高リスクにある恐れがあり、従って治療（例えば、抗ＥＧＦＲ剤）を必要とする。これらの患者に対しては、例えば６ヶ月後のフォローアップ結腸内視鏡検査が推奨され得る。ＥＧＦＲ増幅（ＦＩＳＨパターン２）はポリープ再発及び／または進行の高いリスクを有しているおそれがあり、従って標的薬物治療（例えば、抗ＥＧＦＲ剤）の恩恵を受けることができる。これらの患者に対しては、例えば１年後のフォローアップ結腸内視鏡検査が推奨され得る。ＤＣＣ遺伝子消失の異常のみを有している（ＦＩＳＨパターン３）患者の独自グループはポリープ再発及び／または進行の高いリスクを有しているおそれがあり、従って別の治療の恩恵を受けることができ、予後不良を有することがあり得る。これらの患者に対して、例えば１年後のフォローアップ結腸内視鏡検査が推奨され得る。
【０１６５】
本明細書中に挙げられている全ての特許明細書、特許出願公開明細書、学術論文、教科書及び他の刊行物は本発明が関わる当業者の技術レベルを示している。これらの刊行物はすべて、各刊行物が具体的且つ個別に参照により組み入れると記載されているのと同程度に参照により本明細書に組み入れる。
【０１６６】
本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書中に具体的に開示されていないエレメントまたは限定の非存在下で適当に実施され得る。よって、例えば用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」の各々は他の２つの用語のいずれかで置換され得る。また、単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は文脈上明白に別の意味と分かる以外は、複数形を含む。よって、例えば、「方法」の言及は、本明細書中に記載されている及び／または本明細書を読めば当業者に自明となるであろう、１つ以上のタイプの方法及び／またはステップを含む。
【０１６７】
使用されている用語及び表現は記述として、非限定的に使用されている。これに関して、ある用語が「用語」の欄に記載されており、「発明を実施するための形態」の他のところで別の方法で規定、記載、説明または検討されている場合、これらの規定、記載、説明及び検討はすべてこの用語に帰すると意図される。その部分に示されており、記載されている要件の均等を除外する用語及び表現の使用も意図しない。更に、小見出し、例えば「用語」が「発明を実施するための形態」中に使用されているが、その使用は単に容易に言及するためであり、１つのセクションでなされている開示内容をそのセンションのみに限定すると意図されない。むしろ、１つの小見出しでなされている開示内容は他の小見出しの各々の開示内容を構成すると意図される。
【０１６８】
各種修飾が特許請求されている発明の範囲内で可能であると認められる。よって、本発明は好ましい実施形態及び任意の要件に関連して具体的に開示されているが、当業者は本明細書中に開示されている概念の修飾及び変更をなし得ると理解すべきである。これらの修飾及び変更は特許請求されている発明の範囲内であると見なされる。
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月27日(2018.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液中の少なくとも２つの染色体の領域のコピー数を同時に決定するための方法であって、
（ａ）患者標本由来の細胞を脱凝集して、細胞懸濁液を作製するステップと、
（ｂ）前記細胞懸濁液を、細胞支持体の２又はそれ以上の不連続エリアに適用するステップと、
（ｃ）前記細胞支持体に適用された前記細胞懸濁液を含む前記細胞支持体の前記２又はそれ以上の不連続エリアのそれぞれを、ハイブリダイゼーションする条件下で、検出可能に標識されたプローブの混合物に接触させるステップと、ここで、各混合物は、検出可能に標識されたプローブの異なるセットを含む、
（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、前記細胞支持体の前記２又はそれ以上の不連続エリアに適用された細胞懸濁液上で、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を行い、前記患者標本を得てから１４時間未満に、各混合物からの前記検出可能に標識されたプローブのそれぞれからのシグナルを可視化するステップと、
（ｅ）細胞懸濁液中の前記少なくとも２つの染色体の領域のコピー数を計測し、細胞懸濁液中の前記少なくとも２つの染色体の領域のコピー数を同時決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
患者標本由来の細胞を脱凝集し、細胞懸濁液を作製するステップが、
（ｉ）患者標本を、還元剤及びキレート剤を含む予加温した平衡塩類溶液中に浸漬すること、
（ｉｉ）前記患者標本を、還元剤、カルシウムイオン源、及び極性非プロトン性溶媒を含む新鮮な平衡塩類溶液に移して混合すること、
（ｉｉｉ）前記患者標本を前記平衡塩類溶液から取り出し、（ａ）前記溶液を濾過して脱凝集させた細胞を収集し、溶液を遠心して脱凝集させた細胞をペレット化する、又は、（ｂ）溶液を遠心のみ行って脱凝集させた細胞をペレット化すること
（ｉｖ）上清を捨て、前記ペレット化した細胞を残留上清中に再懸濁し、再懸濁した細胞を固定液中に入れること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者標本を予加温した平衡塩類溶液中に浸漬する前に、前記患者標本を平衡塩類溶液により濯ぐことをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
平衡塩類溶液が、ハンクス緩衝液である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）患者標本を室温でハンクス緩衝液により濯ぎ、前記患者標本を２０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）及び５ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含有する予加温したハンクス緩衝液中に３７℃で５分間浸漬すること、
（ｉｉ）濯いで浸漬した前記患者標本を２０ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＣａＣｌ２及び１０％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含有する４℃の新鮮なハンクス緩衝液に移し、約５秒間から約１０秒間混合すること
（ｉｉｉ）前記患者標本を前記ハンクス緩衝液から取り出し、（ａ）前記溶液を濾過して脱凝集させた細胞を収集し、溶液を約１０００×ｇで約１０分間遠心して脱凝集させた細胞をペレット化するか、又は、（ｂ）約１０００×ｇで約１０分間溶液を遠心のみ行って脱凝集させた細胞をペレット化すること、
（ｉｖ）遠心後前記上清を捨て、前記ペレット化細胞を残留上清中に再懸濁し、再懸濁した細胞を溶液中に入れること、ここで、前記溶液は約３０重量％〜約６０重量％のメタノール、約４０重量％〜約７０重量％の水、及び緩衝液を含み、前記溶液は、室温で一晩保たれる、
ことを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞支持体を水−アルコール溶液中に浸漬し、細胞支持体を固定液中に浸漬し、及び／又は、細胞支持体を乾燥させることをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
患者標本が、（ａ）新鮮な標本、（ｂ）解凍した新鮮冷凍標本、又は（ｃ）部分的に固定した標本である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
患者標本が、腺腫又は腺癌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞支持体が、細胞診スライド、サイトスピン、又はマイクロ流体カメラである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞支持体の２つ又はそれ以上の不連続エリアは、窪み、ウェル、又はチャンバを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
２つ又はそれ以上の検出可能に標識されたプローブの各混合物は、
（ａ）ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、及びＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ、
（ｂ）ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ、及びｃ−ＭＥＴに対するプローブ、
（ｃ）ＡＬＫに対する２色ブレイクアパートプローブ、ＲＯＳ１に対する２色ブレイクアパートプローブ、及びＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ、
（ｄ）ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ、及びＮＴＲＫ１に対する２色ブレイクアパートプローブ、
（ｅ）ＲＥＴに対する２色ブレイクアパートプローブ、及びＫＩＦ５Ｂに対するプローブ、
（ｆ）ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、及び染色体７に対するＣＥＰ、
（ｇ）ＡＵＲＫＡに対するプローブ、９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、染色体３に対するＣＥＰ、染色体６に対するＣＥＰ、及び染色体７に対するＣＥＰ、
（ｈ）ＭＹＣに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、ＤＣＣに対するプローブ、１３ｑ１４に対する遺伝子座特異的プローブ、及び染色体１８に対するＣＥＰ、
（ｉ）ＭＹＣに対するプローブ、ＴＥＲＣに対するプローブ、及び染色体７に対するＣＥＰ、
（ｊ）ＭＹＣに対するプローブ、ＨＥＲ２に対するプローブ、ＺＮＦ２１７に対するプローブ、及び９ｐ２１に対する遺伝子座特異的プローブ、
（ｋ）ＭＣＬ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＭＥＴに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、及び染色体７に対するＣＥＰ、
（ｌ）ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、染色体３に対するＣＥＰ、及び染色体１０に対するＣＥＰ、
（ｍ）ＰＴＥＮに対するプローブ、ＥＲＧに対するプローブ、及び染色体１０に対するＣＥＰ、
（ｎ）ＦＧＦＲ１に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対するプローブ、ＦＧＦＲ２に対する２色ブレイクアウェイプローブ、染色体８に対するＣＥＰ、及び染色体１０に対するＣＥＰ、又は
（ｏ）ＭＥＴに対するプローブ、ＰＩＫ３ＣＡに対するプローブ、ＥＧＦＲに対するプローブ、染色体７に対するＣＥＰ、及び染色体３に対するＣＥＰ
を含む、請求項１０に記載の方法。
【外国語明細書】
2019013228000001.pdf