(57)【要約】【課題】  天然物由来である新規の骨格筋強化剤を提供する。【解決手段】  次の化学式１で示される脂肪酸アミド、又はそれらを含む天然物や天然物の抽出物を骨格筋強化剤として用いる。    【化１】2019202969.tif 000010  ただし、化学式１中、Ｒ１は炭素数が１０〜１８である直鎖の飽和カルボン酸残基又は炭素数が１０〜１８である直鎖のモノ不飽和カルボン酸残基、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立して水素、メチル基、エチル基の何れかである。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式１に示される脂肪酸アミドからなる骨格筋強化剤。
【化１】
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ただし、化学式１中、Ｒ１は炭素数が１０〜１８である直鎖の飽和カルボン酸残基又は炭素数が１０〜１８である直鎖のモノ不飽和カルボン酸残基、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立して水素、メチル基、エチル基の何れかである。
【請求項２】
前記骨格筋強化剤は、筋分化促進、骨格筋の筋量増加、骨格筋の筋量低下抑制、骨格筋の筋肥大の少なくとも何れか一つの作用を有する請求項１に記載の骨格筋強化剤。
【請求項３】
化学式１に示される脂肪酸アミドを含む骨格筋強化のための組成物。
【化１】
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ただし、化学式１中、Ｒ１は炭素数が１０〜１８である直鎖の飽和カルボン酸残基又は炭素数が１０〜１８である直鎖のモノ不飽和カルボン酸残基、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立して水素、メチル基、エチル基の何れかである。
【請求項４】
化学式１に示される脂肪酸アミドを含む天然物及び／又は化学式１に示される脂肪酸アミドを含む天然物の抽出物を含む骨格筋強化のための組成物。
【化１】
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ただし、化学式１中、Ｒ１は炭素数が１０〜１８である直鎖の飽和カルボン酸残基又は炭素数が１０〜１８である直鎖のモノ不飽和カルボン酸残基、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立して水素、メチル基、エチル基の何れかである。
【請求項５】
前記天然物は、セリ科植物、ミル科植物、クロウメモドキ科植物、スベリヒユ科植物、キク科植物の少なくとも何れか１種以上の植物である請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記天然物は、セリ科オランダミツバ属の植物、セリ科ミツバ属の植物、ミル科ミル属の植物、クロウメモドキ科ナツメ属、スベリヒユ科スベリヒユ属の植物、キク科ゴボウ属の少なくとも何れか１種以上の植物である請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、医薬組成物、食品組成物、化粧用組成物又は動物用飼料の何れかである請求項３〜６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、筋分化促進、骨格筋の筋量増加、骨格筋の筋量低下抑制、骨格筋の筋肥大の少なくとも何れか一つの作用を有する請求項３〜７の何れか１項に記載の骨格筋強化剤。
【請求項９】
骨格筋強化剤として化学式１に示される脂肪酸アミドを含む医薬組成物、食品組成物、飲料、化粧用組成物又は動物用飼料。
【化１】
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ただし、化学式１中、Ｒ１は炭素数が１０〜１８である直鎖の飽和カルボン酸残基又は炭素数が１０〜１８である直鎖のモノ不飽和カルボン酸残基、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立して水素、メチル基、エチル基の何れかである。
【請求項１０】
化学式１に示される脂肪酸アミド、化学式１に示される脂肪酸アミドを含む天然物、当該天然物の抽出物の、骨格筋強化用組成物を製造するための使用。
【化１】
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ただし、化学式１中、Ｒ１は炭素数が１０〜１８である直鎖の飽和カルボン酸残基又は炭素数が１０〜１８である直鎖のモノ不飽和カルボン酸残基、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立して水素、メチル基、エチル基の何れかである。
【請求項１１】
前記骨格筋強化剤は、筋分化促進、骨格筋の筋量増加、骨格筋の筋量低下抑制、骨格筋の筋肥大の少なくとも何れか一つの作用を有する請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
セリ科オランダミツバ属の植物、セリ科ミツバ属の植物、ミル科ミル属の植物、クロウメモドキ科ナツメ属の植物、スベリヒユ科スベリヒユ属の植物、キク科ゴボウ属の植物の何れか１種以上の植物体及び／又はそれら植物体の抽出物を有効成分とする骨格筋強化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨格筋強化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋は姿勢の保持や運動の他に糖や脂質の代謝も担うので、負傷あるいはデスクワークを主体とする生活スタイルによる運動不足は筋量を減少させる。筋量の減少は、運動機能を低下させたり、寝たきりや要介護のリスクが高まるロコモティブシンドロームを発症させたりする。それだけでなく、肥満や２型糖尿病のようなメタボリックシンドロームを発症するリスクを増大させる。加齢とともに骨格筋は量的に減少するだけでなく、損傷を受けて回復するまでの期間が長期化する。したがって年齢にかかわらず、骨格筋を量的に維持・増加する必要がある。
【０００３】
このような背景のもと、各種の植物抽出物やそれから単離精製された化合物を骨格筋の強化、例えば筋肉量の増加や筋量低下の抑制を図ろうとする試みが行われている。
【０００４】
例えば、黒ショウガ（Kaempferia parviflora）から抽出されたフラボン化合物が筋肉量の増加を促進すること（特許文献１、２）や、紅茶の抽出物や甘草の抽出物がそれぞれ筋肉量を増加させることが知られている（特許文献３、４）。
【０００５】
また、これら以外にも、ビオチンが骨格筋の筋肉量増加、筋力増強、筋萎縮抑制及び筋線維肥大化促進作用を有すること（特許文献５）や、乳中に含まれる脂肪級皮膜成分が同様に骨格筋の筋肉量増加、筋宿抑制作用を有すること（特許文献６）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１５−５２２５３８号公報
【特許文献２】特開２０１５−０１００７８号公報
【特許文献３】特開２０１３−０９１６０８号公報
【特許文献４】特開２０１２−１９３１５７号公報
【特許文献５】特開２０１６−１６４１３８号公報
【特許文献６】特開２０１３−１００２７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明者等は、機能性表示食品等に利用し得る天然物由来の新たな素材を探究したところ、天然物に含まれるある種の脂肪酸アミドが筋肉量を増加させることを見いだした。  すなわち、本願発明が解決しようとする課題は、いわゆる機能性表示食品などにも利用し得る新たな骨格筋強化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明は、次の化学式１で示される脂肪酸アミドを骨格筋の強化用として利用することにある。ただし、化学式１中、Ｒ１は炭素数が１０〜１８である直鎖の飽和カルボン酸残基又は炭素数が１０〜１８である直鎖のモノ不飽和カルボン酸残基、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立して水素、メチル基、エチル基の何れかである。
【化１】
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【発明の効果】
【０００９】
本願発明によると、天然物に由来する新たな骨格筋強化用の組成物が提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は植物抽出物ＯＤＳカラム分画画分の筋管細胞への分化誘導能を示すクロマトグラムである。
【図２】図２は活性画分のＬＣ−ＭＳにおけるクロマトグラムであって、ＡはＬＣ−ＭＳ標準品のクロマトグラム、Ｂは植物の酢酸エチル抽出画分のクロマトグラムである。
【図３】図３はステアラミド及びオレアミドの筋管細胞への分化誘導能を示す代表的なウエスタンブロット像である。
【図４】図４はオレアミドの筋肥大作用を示す図である。
【図５】図５は行動範囲制限マウスにおけるオレアミドの影響を示す図である。
【図６】図６はセロリシード抽出物の筋管細胞への分化誘導能を示す図であって、Ａはウエスタンブロット像、ＢはＭｙＨＣの発現量を示すグラフである。
【図７】図７はセロリシード抽出物のＬＣ−ＭＳにおけるクロマトグラムであって、ＡはＬＣ−ＭＳ標準品のクロマトグラム、Ｂは植物のエタノール抽出画分のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本願発明に係る骨格筋強化剤は、次の化学式１で示される脂肪酸アミドであって、化学式１中、Ｒ１は炭素数が１０〜１８である直鎖の飽和カルボン酸残基又は炭素数が１０〜１８である直鎖のモノ不飽和カルボン酸残基、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立して水素、メチル基、エチル基の何れかである脂肪酸アミドを含む。ここにおいて、モノ不飽和カルボン酸残基における不飽和の位置は問われず、シス体トランス体の何れであってもよい。飽和カルボン酸残基は、例えば、カプリン酸残基であり、ラウリン酸残基であり、ミリスチン酸残基であり、パルミチン酸残基であり、ステアリン酸残基であり得る。また、不飽和カルボン酸残基は、例えば、ミリストレイン酸残基であり、パルミトレイン酸残基であり、サピエン酸残基であり、オレイン酸残基であり、エライジン酸残基であり、バクセン酸残基であり、ガドレイン酸残基であり、エイコセン酸残基であり得る。
【化１】
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【００１２】
本願発明で用いられる脂肪酸アミドは天然物中に見いだされる脂肪酸アミドであるかどうかは問われないが、好ましくは天然物中に見いだされるものが好ましい。例えば、オレイン酸アミド（オレアミド）であり、ラウリル酸アミド（ラウラミド）であり、ミリステアリン酸アミド（ミリスチラミド）であり、パルミチン酸アミド（パルミタミド）であり、ステアリン酸アミド（ステアラミド）であり得る。
【００１３】
骨格筋は筋線維という多核の筋管細胞から構成され、複数の筋管細胞が互いに融合することで筋線維が形成される。筋管細胞は、幹細胞であるサテライト細胞が増殖・分化することで筋芽細胞となり、筋芽細胞が筋芽細胞同士あるいは既存の筋管細胞と融合することで形成される。骨格筋の再生は、このようなサテライト細胞の増殖・分化による筋芽細胞の形成、筋芽細胞の分化による筋細胞の形成、筋細胞の融合による筋管細胞の形成を経て行われることになる。
【００１４】
本願発明において、骨格筋強化は骨格筋を強化させることを意味し、骨格筋の強化には、骨格筋の再生過程に関わる筋管細胞への分化誘導能を促進する効果だけでなく、成熟した筋線維及び／又は筋管細胞の増量効果、筋線維の萎縮抑制効果、筋力の低下抑制効果の少なくとも何れかの効果が認められることが含まれる。
【００１５】
本願発明に係る骨格筋強化剤は、上記化学式１で示される脂肪酸アミドを含む。骨格筋強化剤は脂肪酸アミド単独からなる場合だけでなく、他の成分を含んだ組成物でもあり得る。組成物は、例えば医薬組成物であり、食品組成物であり、飲料であり、化粧用組成物であり、動物用飼料でもあり得る。
【００１６】
これら組成物の形態も特に限定されるものではなく、医薬組成物は、例えば、錠剤や散剤、シロップ剤などの内服用組成物であり、注射剤や点滴用剤であり、軟膏やパッチ剤、ローション剤、点眼剤のような外用組成物でもあり得る。食品組成物は、例えば、アメや米菓、ケーキ、アイスクリーム、ゼリーのような嗜好品であり、シリアルやとうふ、チーズ、ヨーグルト、麺類、各種冷凍食品などの加工食品であり、錠剤などに加工されたいわゆる健康食品でもあり得る。また、飲料は、例えば、清涼飲料水やアルコールが入ったハードドリンク、牛乳であり得る。化粧用組成物は、日本薬事法における医薬部外品を含むものであって、例えば、整肌用化粧品や保護用化粧品などのスキンケア化粧品であり、ファンデーションやおしろい、口紅などのメークアップ化粧品であり、洗髪料や整髪料などのヘアケア化粧品であり、歯磨き類であり、香水などのフレグランス化粧品でもあり得る。また、動物用の飼料組成物でもあり得る。
【００１７】
これらの組成物は脂肪酸アミドの他に組成物を構成する上で必要な助剤を含み得る。助剤は、例えば乳糖やデキストリンのような賦形剤であり、軟膏や硬膏などの基剤であり、水やエタノールなどの溶剤であり、乳化剤であり、保存剤であり、コーティング剤であり、乳化剤であり、着色剤であり得る。また、本願発明における組成物は、骨格筋強化用として化学式１で示される脂肪酸アミドを含んでいればよく、その他１種又は２種以上の主薬や佐薬成分も含み得る。その他の主薬や佐薬成分としては、各種ビタミン類やカルシウム、ポリフェノールなど身体に対して何らかの作用が期待される機能性成分、疾病の治療を目的として投与される医薬成分であり得る。
【００１８】
また、本願発明においては、化学物質としての脂肪酸アミドだけでなく、脂肪酸アミドを含む天然物そのものやその抽出物も骨格筋強化剤として使用し得る。本願発明においては、抽出物には溶媒を用いて抽出されたものだけでなく、植物の種子などの各種部位から絞り出して得られた精油成分なども含まれる。抽出方法も特に制限されるものではなく、天然物又はその粉砕物を、水や、メタノール、エタノール、ブタノール、酢酸エチルなどの有機溶媒、水と有機溶媒との混液などを用いて抽出する方法、二酸化炭素等による超臨界流体を用いた超臨界抽出法などが例示される。また、抽出溶媒は、ベンゼンやヘキサンのような親油性溶媒も用いられ得るが、酢酸エチルやメタノールなどの親水性溶媒を用いるのが好ましい。本願発明では、単離されあるいは合成された脂肪酸アミドの他に、溶媒や超臨界流体を用いて得られた抽出液や、抽出液に濃縮や乾燥を施したエキスはもちろんのこと、それらに分画操作を行うことで得られた粗精製物を骨格筋強化剤として用いることもできる。また、抽出時における泡立ちなどを防ぐために、抽出の前処理として、植物に対して酸やアルカリを用いた加水分解処理を行うこともできる。
【００１９】
当該脂肪酸アミドを含む天然物としては、植物や動物の如何を問わず、例えばセリ科オランダミツバ属の植物であるセロリ（Apium graveolens）やセリ科ミツバ属の植物でマウンテンセロリ（Cryptotaenia japonica Hassk：MING-CHING CHENGJ. Et al.、Agric. Food Chem. 2008、56、3997-4003）、海藻の一種であるミル科ミル属のミル（Codium fragile：Moon SM. et al.、Int Immunopharmacol.、2018、Mar.、56、179-185）、クロウメモドキ科ナツメ属の植物であるナツメ（Ziziphus jujuba：Periasamy S. et al.、Asian Pac J Cancer Prev.、2015、16(17)、7561-6）、スベリヒユ科スベリヒユ属の植物であるスベリヒユ（Portulaca oleracea、別名馬歯ケン、バシケン：Jilan A. Nazeam, et al.、Natural Product Research,、Volume 32、2018、issue 12）、キク科ゴボウ属の植物であるゴボウ（J Agric Food Chem.、2016 May、64(18)、3564-73）などが例示される。使用部位も特に限定されず、植物の場合であれば、例えば葉であり、根であり、茎であり、種子であり、花であり、全草であり得る。動物の場合であれば、例えば内臓であり、筋肉であり、皮であり得る。
【００２０】
本願発明に係る骨格筋強化剤は、ヒトやヒト以外の種々の動物に対して投与又は摂取される。投与経路も問われず、例えば吸入投与などの局所投与、経口投与や経管栄養投与などの経腸投与、静脈内投与や筋肉内投与、皮下投与などの非経口投与の方法で投与又は摂取される。
【００２１】
骨格筋強化剤の投与量や投与回数などは、種差や性別、体重、症状やその程度、骨格筋の増量や低減防止などの投与目的によって当業者が適宜決定し得るものであるが、概ね体重１ｋｇ当たり０.００１μｇ〜１００ｍｇ程度であり得る。また、組成物中の含有量も組成物の態様（形態）によって当業者が適宜決定し得るものであって、組成物中０.０００１％〜９９.９９９９％である。
【００２２】
次に本発明について以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されることのないのは言うまでもない。
【実施例１】
【００２３】
〔植物抽出物の骨格筋強化作用〕
（植物抽出物の調整）
乾燥植物を市販のミキサーによって均一に細かくしたもの1gを焙煎後、10mlのヘキサンを加え、2日間静置して抽出後、濾紙（ADVANTEC No.2）を用いて濾過した。ヘキサン抽出残渣に1gにつき10mlのメタノールを加え、3日間静置して抽出後、濾紙（ADVANTEC No.2）を用いて濾過し、メタノール抽出画分を取得した。得られたメタノール抽出画分をロータリーエバポレーターにより蒸発乾固させたものを300mlの酢酸エチル、及び300mlの超純水にて分配濾過し、それぞれ酢酸エチル抽出画分（上層）、水抽出画分（下層）とした。酢酸エチル画分をロータリーエバポレーターにより蒸発乾固後、10mgあたり1mlのメタノールに溶解し、植物抽出物とした。
【００２４】
（分化誘導能の測定）
DMEM培地（10％FBS，（+P/S））を用いて、飽和状態の９〜１０割に達したC2C12細胞を上記の植物抽出物（終濃度10μg/ml）を含むDMEM培地（2％HS,（P/S））（1g/L DMEM，2％HS，100units/ml penicillin G sodium，100μg/ml streptomycin，1g/l NaHCO3）で培養し、48時間毎に新鮮な培地に培地交換することにより分化誘導を行った。分化誘導４日目に細胞を回収し、ウエスタンブロット法によってMyHC発現レベルを評価した。この結果を図１に示した。図１から分かるように、当該植物抽出物は骨格筋分化誘導作用を有することが確認された。
【実施例２】
【００２５】
〔活性成分の同定〕
次に、実施例１で得られた植物抽出物の酢酸エチル画分についてＧＣ-ＭＳ分析を行ったところ、ステアラミド、パルミトアミド、オレアミド、ミリスチラミドが同定された（図２参照）。そして、同定されたステアラミド及びオレアラミドについて、市販品を用いて骨格筋の強化作用について調べた。
【００２６】
〔筋管細胞への分化誘導〕
ステアラミド及びオレアラミドの分化誘導能を前記方法に従って調べた。その結果を図３に示した。ステアラミド及びオレアラミドのいずれも終濃度0.1μMで対照に比べて有意な差で分化誘導能を示した。
【００２７】
〔筋管線維の肥大化作用〕
飽和状態の９０〜１００％に達したC2C12細胞を前記ＤＭＥＭ培地で分化誘導し、分化６日目の筋管細胞にオレアミドを２日間曝露した。曝露は、DMEM培地中に終濃度が0.1μMとなるようにオレアミドを添加し、３７℃、５％ＣＯ2濃度下で培養した。その後、筋管細胞を蛍光免疫染色によりMyHCと核を染色した。核が２個以上存在する筋管細胞の短径を測定し、対照（vehicle）との相対比を求めた。その結果を図４に示した。
【００２８】
〔筋量・筋力低下抑制作用〕
行動範囲を制限したマウスに（不活動マウス）対するオレアミドの影響を調べた。飼育ゲージの飼育面積を１／６に区画することでマウスの行動範囲を制限した。この環境下で飼育したマウスでは、種々の筋量及び筋力が低下することが事前に分かっている。そこで、オレアミドが不活動マウスの筋量や筋力に与える影響を調べた。
【００２９】
オスのddY系マウス27匹を１群６又は７匹として４群に分けた。試験群である不活動マウスの１群及び通常マウスの１群にはそれぞれ毎日オレアミド（50 mg/kg 体重）を４週間強制経口投与した。その間、餌及び水を自由摂取させた。また、対照群である残る不活動マウスの１群及び通常マウスの１群も４週間飼育し、その間餌及び水を自由摂取させた。飼育後に、前脛骨筋及びハムストリングの重量、体重及びグリップ力測定器を用いたグリップ力を測定した。その結果を図５に示した。
【００３０】
以上の各試験によると、不飽和脂肪酸アミドであるオレアミドには、筋管細胞への分化誘導能だけでなく、筋量増加や筋力低下抑制作用が認められた。
【実施例３】
【００３１】
セロリの種子（セロリシード）50gに500mLの30％エタノールを加え、２時間加熱還流した。室温まで放冷後、濾紙を用いて抽出液をろ過し、得られた濾液を減圧下で濃縮、その後凍結乾燥して粉末状の抽出物を得た。これを試料としてマウス筋芽細胞株C2C12を用いて、実施例１と同様に筋管細胞への分化誘導を試みたところ、分化誘導能の促進が観察された（図６参照）。また、当該抽出物についてＧＣ−ＭＳ分析を行ったところ、当該抽出物には図７に示すようにミリスチラミド、パルミタミド、オレアミド、ステアラミドの脂肪酸アミドが含まれていることも確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本願発明によると、新たな天然物由来の骨格筋強化作用剤が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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