(57)【要約】      （修正有）【課題】生物システムで観察される自己組織化機能を基盤とした、低エネルギー下でシリカ系材料を創製する方法やかかるシリカ系複合材料の提供。【解決手段】液性媒体中で、塩基性アミノ酸残基を２以上含むペプチドと、シロキサン結合生成基を有するシリコン原料と、を相互作用させて、前記ペプチドと前記シリコン原料に由来するシリコン含有材料とを含むシリコン／ペプチド複合材料を生成させる工程を備える、シリコンを含む材料の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリコンを含む材料の製造方法であって、
液性媒体中で、塩基性アミノ酸残基を２以上含むペプチドと、シロキサン結合生成基を有するシリコン原料と、を相互作用させて、前記ペプチドと前記シリコン原料に由来するシリコン含有材料とを含むシリコン／ペプチド複合材料を生成させる工程、
を備える、方法。
【請求項２】
前記ペプチドは、前記塩基性アミノ酸残基を４以上含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドは、前記塩基性アミノ酸残基に富む塩基性アミノ酸残基リッチ領域を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記塩基性アミノ酸残基リッチ領域は、前記ペプチド含まれる最もＮ末端よりの前記塩基性アミノ酸残基から最もＣ末端よりの前記塩基アミノ酸残基までの前記アミノ酸残基の総数に対する前記塩基性アミノ酸残基の数の割合が４０％以上である領域である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記塩基性アミノ酸残基リッチ領域は、２以上の前記塩基性アミノ酸を連続して含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記塩基性アミノ酸残基リッチ領域は、酸性アミノ酸残基を含まない、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記塩基性アミノ酸は、少なくともアルギニンを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドは環状化されている、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記複合材料は、粒子状又はシート状である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
さらに、前記複合材料から前記ペプチドを分離する工程を備える、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
塩基性アミノ酸残基を２以上含むペプチドと、シロキサン結合を有するシリコン含有材料とを、含む、シリコン／ペプチド複合材料。
【請求項１２】
ケイ素原子で構成された六員環が複数連なった構造を基本骨格とするシートと結合性を有するペプチドを含む、シリコン／ペプチド複合材料を製造するための剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、シリコン／ペプチド複合材料の製造方法及び複合材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケイ素（シリコン）は、地球上に酸素に次いで豊富に存在し、ほぼ無限に利用可能な資源である。半導体や樹脂など様々な用途に使用されている。自然界においてもその利用例は多く、例えば、植物は、ケイ素をケイ素酸（Ｓｉ（ＯＨ）4）の形態で取り込んで、ＳｉＯ2層を形成して、生物（植物病原菌や害虫）耐性や非生物（水不足、過剰塩、有害金属）耐性を高めている。珪藻もシリカ被殻を細胞壁として有し、その構造は、美しい微細パターンを構成している。このバイオナノシリカ粒子構造を直接利用したドラッグ包摂材料も近年報告された。
【０００３】
このようにケイ素は、様々な材料・用途への応用が期待されている。現在、ケイ素由来のシート状あるいは球状等の材料の製造には、概して８０℃〜５００℃程度での処理や、先端機器を用いる必要があった（特許文献１〜３）。
【０００４】
また、本出願人は、シリコン原子層の単層又は複数層を有する構造体であるシリコンナノシート結合性を有するペプチドを既に報告しており、シリコンナノシートと当該ペプチドとの複合材料を形成できることを開示している（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００６／００９０７３号
【特許文献２】特開２０１０−１３２６４０号公報
【特許文献３】特開２００８−２７３７９０号公報
【特許文献４】特開２０１７−１０５７３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生物システムで観察される自己組織化機能を基盤とした、低エネルギー下でシリカ系材料を創製する技術やかかるシリカ系複合材料が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
生物が有する様々な金属イオンを利用した材料創製機能は、生物鉱物化と称されている。生物鉱物化においては、タンパク質やペプチドといった生体分子が主要な役割を担っている。そこで、我々は、ファージライブラリ技術とバイオパンニングの技術によって、ケイ素原子で構成された六員環が複数連なった構造を基本骨格とする、「シリコンナノシート」等に選択的に結合するペプチドの選抜を試みた。洗浄条件や材料を換えた選抜試験の結果、シリコンナノシートに結合するペプチドをいくつか取得した。このうち、いくつかのペプチドが、シロキサン結合生成基を有するケイ素化合物である原料を基質として球状粒子やシートを合成する能力を有していることがわかった。これらの知見に基づき本明細書は以下の手段を提供する。
【０００８】
（１）シリコンを含む材料の製造方法であって、
水性媒体中で、塩基性アミノ酸残基を２以上含むペプチドと、シロキサン結合生成基を有するシリコン原料と、を相互作用させて、前記ペプチドと前記シリコン原料に由来するシロキサン結合を有するシリコン含有材料とを含むシリコン／ペプチド複合材料を生成させる工程、
を備える、方法。
（２）前記ペプチドは、前記塩基性アミノ酸残基を４以上含む、（１）に記載の方法。
（３）前記ペプチドは、前記塩基性アミノ酸残基に富む塩基性アミノ酸残基リッチ領域を有する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記塩基性アミノ酸残基リッチ領域は、前記ペプチドに含まれる最もＮ末端よりの前記塩基性アミノ酸残基から最もＣ末端よりの前記塩基アミノ酸残基までの前記アミノ酸残基の総数に対する前記塩基性アミノ酸残基の数の割合が４０％以上である領域である、（３）に記載の方法。
（５）前記塩基性アミノ酸残基リッチ領域は、２以上の前記塩基性アミノ酸を連続して含む、（３）又は（４）に記載の方法。
（６）前記塩基性アミノ酸残基リッチ領域は、酸性アミノ酸残基を含まない、（３）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記塩基性アミノ酸は、少なくともアルギニンを含む、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記ペプチドは環状化されている、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記複合材料は、粒子状又はシート状である、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）さらに、前記複合材料から前記ペプチドを分離する工程を備える、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）塩基性アミノ酸残基を２以上含むペプチドと、シロキサン結合を有するシリコン含有材料とを含む、シリコン／ペプチド複合材料。
（１２）ケイ素原子で構成された六員環が複数連なった構造を基本骨格とするシートと結合性を有するペプチドを含む、シリコン／ペプチド複合材料を製造するための剤。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】シリコンナノシートに対するバイオパンニングの一連の工程を示す図である。
【図２】ペプチドライブラリより単離されたペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
【図３】シリコンナノシート（Ｓｉシート）に対する単クローンファージの結合性を示す図である。
【図４】単クローンファージの公知のタンパク質に対する結合性を示す図である。
【図５】合成したペプチド、コントロールとなるペプチドの試料番号、アミノ酸配列及び対応するファージＮｏ．を示す図である。
【図６】各種材料（シリコンナノシート；ＳｉＮ、ＳｉＯ2及びＳｉ）に対する合成ペプチドの結合性を示す図である。
【図７】合成ペプチドとＴＭＯＳとの反応を示す図である。
【図８】合成ペプチドとＴＭＯＳとから生成したナノ粒子のＴＥＭ像を示す図である。ＳｉＮＰ−２（（ａ）、（ｂ））、ＳｉＮＰ−４（（ｃ）、(ｄ））及びＳｉＮＰ−５（（ｅ）、（ｆ））をそれぞれ示す。（ｂ）、（ｄ）及び（ｆ）の右上には、デイフラクション像を示す。スケールバーは１００ｎｍである。
【図９】合成ペプチドとＴＭＯＳとから生成したナノ粒子のＳＥＭ／ＥＤＸ分析結果を示す図である。ＳｉＮＰ−２（（ａ）、（ｂ））、ＳｉＮＰ−４（（ｃ）、(ｄ））及びＳｉＮＰ−５（（ｅ）、（ｆ））をそれぞれ示す。スケールバーは１０μｍである。
【図１０】逆相ＨＰＬＣによる生成粒子中のペプチドの確認結果を示す図である。上段は、粒子を溶解させることによって得られた試料のクロマトグラムを示し、下段に、ペプチドのみのクロマトグラムを示す。
【図１１】ＳｉＮＰ−２及び同５についての、ペプチドとＳｉとの反応量論比の確認結果を示す図である。濃色印は、ＳｉＮＰ−２を示し、淡色印は、ＳｉＮＰ−５を示す。
【図１２】合成ペプチドとＴＭＯＳとから生成したシートのＳＥＭ／ＥＤＸを示す図である。ＳｉＮＰ−２（（ａ）、（ｂ））、ＳｉＮＰ−４（（ｃ）、(ｄ））及びＳｉＮＰ−５（（ｅ）、（ｆ））をそれぞれ示す。
【図１３】合成ペプチドとＴＭＯＳとから生成したシートのＡＦＭ分析結果を示す図である。ＳｉＮＰ−２（（ａ）、（ｂ））、ＳｉＮＰ−４（（ｃ）、(ｄ））及びＳｉＮＰ−５（（ｅ）、（ｆ））をそれぞれ示す。グラフは高低差を示し、線は、図中の測定部位に対応している。
【図１４】塩基性アミノ酸とＴＭＯＳとの反応により生じた生成物のＡＦＭ分析結果を示す図である。リジン（ａ、ｂ）、アルギニン（ｃ、ｄ）及びアミノ酸なし（ｅ、ｆ）をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書の開示は、シリコン／ペプチド複合材料の製造方法及び複合材料、複合材料を製造するための剤などに関する。
【００１１】
本明細書に開示されるシリコン含有材料の製造方法によれば、ペプチドとシロキサン結合生成基を有するシリコン原料とを水性媒体中で相互作用させることで、水性媒体中にペプチドと前記シリコン原料に由来しシロキサン結合を有するシリコン含有材料とを生成させることができる。シロキサン結合を有するシリコン含有材料を、高温や、強い酸又はアルカリなどを供給することなく、例えば、生物学的条件下で生成されるため、製造工程を簡易にかつ低コストで実施することができる。
【００１２】
本発明者らは、既に、特許文献４に示すように、シリコンナノシート結合剤としてのペプチドを見出しているが、当該ペプチドがシロキサン結合生成基を有する原料と相互作用するかどうかや、さらには粒状やシート状のシリコン含有材料を形成することは全く想定されなかった。
【００１３】
本開示の前記製造方法によれば、用いるペプチドに対して種々の修飾も可能であるため、こうしたペプチドを用いて複合材料を製造することで、シリコン含有材料に所望の機能や特性を付与することもできる。
【００１４】
本明細書に開示される複合材料によれば、ペプチドを伴っているため、シリコンとペプチドとの双方の特性や機能を備えた新たな材料を提供することができる。
【００１５】
本明細書に開示される複合材料を製造するための剤によれば、シリコンとペプチドとの新たな複合材料を容易に提供することができる。
【００１６】
なお、本明細書において、シリコンナノシートとは、２次元方向に周期的に配列したシリコン原子がＳｉ−Ｓｉ結合により互いに結合しているシリコン単原子層を含むシリコンナノシート及びその積層体をいう。単位ユニット当たりの組成式はＳｉ6Ｈn(ＯＨ)6-n（0＜n≦6）で表される。各種態様のシリコンナノシート及びその製造方法等については、特願２００６−２５０６４３、特願２００６−５２９１４８、特願２００７−７６８４２、特願２００９−１８４５３４、特願２００９−２３２３９２及び特願２０１０−３７９０に開示されている。当業者であれば、これらにおける開示を参照してシリコンナノシートを製造することができる。
【００１７】
また、本明細書においてシリコンナノシートの厚さは、特に限定するものではないが、０．５ｎｍ〜１０ｎｍであることが好ましい。また、なかでも、単層シリコンナノシートは、０．６ｎｍ〜０．８ｎｍとすることができる。また、複数層のシリコン原子層の積層体からなるシリコンナノシートは、その厚さは、シリコン原子層の積層数に比例して厚くなる。例えば、その厚さが１０〜１２０ｎｍ程度とすることもできる。また例えば、１０〜１００ｎｍ、また例えば、２０〜１００ｎｍ、また例えば、４０〜１００ｎｍ、また例えば、４０〜８０ｎｍであってもよい。また、シリコンナノシートの大きさは、特に限定するものではないが、縦×横が、それぞれ１０ｎｍ〜１０μｍであってもよい。一般に、シリコンナノシートの縦又は横が１０ｎｍ未満であると、ナノシートが液体中において再凝集しやすくなる。一方、シリコンナノシートの縦又は横が１μｍを超えると、ナノシートが沈殿しやすくなる。ナノシートの再凝集や沈殿を抑制するには、ナノシートの縦及び横は、０．１〜１０μｍが好ましく、５０ｎｍ〜１０００ｎｍがより好ましい。
【００１８】
シリコンナノシートは、Ｓｉ6Ｈn(ＯＨ)6-n（0＜n≦6）の組成式で表される領域を有していればよく、ダイヤモンドタイプであってもグラファイトタイプであってもよい。また、例えば、一部に有機基等が導入されて修飾されたシリコンナノシートを排除するものではないが、こうした有機基導入が特にほどこされてないシリコンナノシートとすることができる。
【００１９】
以下、本明細書の開示の種々の実施形態について詳細に説明する。
【００２０】
（複合材料の製造方法）
本明細書に開示される複合材料の製造方法は、水性媒体中で、塩基性アミノ酸残基を２以上含むペプチドと、シロキサン結合生成基を有するシリコン原料と、を相互作用させて、前記水性媒体中に前記ペプチドと前記シリコン原料に由来するシロキサン結合を有するシリコン含有材料とを含むシリコン／ペプチド複合材料を生成させる工程（以下、相互作用工程ともいう。）と、を備えることができる。
【００２１】
〔ペプチド〕
相互作用工程で用いるペプチドは、塩基性アミノ酸残基を２以上含むペプチド（以下、単に、本ペプチドともいう。）である。塩基性アミノ酸残基を２以上含むことで、加水分解性基を有するシリコン材料、シリコンナノシート等と相互作用しやすくなる。本ペプチドは、特許文献４などにおいて既に報告されているシリコンナノシートに結合するペプチドから適宜選択することができる。以下、シリコンナノシートと結合性を有するペプチドを以下に説明する。
【００２２】
（第１のアミノ酸配列）
本ペプチドは、１又は２以上の塩基性アミノ酸残基を有する１又は２以上の第１のアミノ酸配列を有する。第１のアミノ酸配列は、本ペプチドのシリコンナノシートに対する結合能を特徴付けることができるアミノ酸配列である。第１のアミノ酸配列は、以下で説明する塩基性アミノ酸残基を含む配列上の特徴を有する配列として、アミノ酸残基数が少なくとも２個、好ましくは３個、より好ましくは４個、さらに好ましくは５個、なお好ましくは６個、さらにまた好ましくは７個、より好ましくは８個以上の配列である。
【００２３】
第１のアミノ酸配列のアミノ酸残基数の上限は、特に限定しないが、以下に説明する各種態様の配列上の特徴を備えるものであればよい。例えば、本ペプチドが環状構造を有する場合には、環状化に寄与するペプチド部位を含まない配列であって、そのアミノ酸残基数が７個以上１２個以下程度とすることができる。また、例えば、第１のアミノ酸配列のアミノ酸残基数は、Ｎ末端及びＣ末端がそれぞれ塩基性アミノ酸残基とする一続きのアミノ酸配列とすることもできる。
【００２４】
第１のアミノ酸配列に含まれる塩基性アミノ酸残基のアミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）及びリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）に基づくアミノ酸のほか、これらの天然アミノ酸に基づく誘導体で塩基性を備えるアミノ酸が挙げられる。
【００２５】
塩基性アミノ酸残基は、アルギニン、ヒスチジン及びリシンの天然アミノ酸残基が好ましいが、等電点（ｐＨ）の観点（アルギニン：10.76、リシン：9.74、ヒスチジン：7.59）から、より好ましくはアルギニン及びリシンであり、さらに好ましくはアルギニンである。
【００２６】
なお、本明細書において疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリンを含むことができる。また、本明細書において、酸性アミノ酸は、グリシン、セリン、トリオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンを含むことができる。また、本明細書において、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含むことができる。
【００２７】
本ペプチドにおける塩基性アミノ酸残基は、１又は２以上を組み合わせて用いることができる。なお、アミノ酸には、Ｌ体及びＤ体があるが、本ペプチド全体においてＬ体又はＤ体で統一されることが好ましい。本ペプチドにおけるアミノ酸残基はＬ体であることが好ましい。
【００２８】
第１のアミノ酸配列は、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有するが、好ましくは、２つ以上の塩基性アミノ酸残基を有する。より好ましくは、３つ以上であり、さらに好ましくは４つ以上であり、なお好ましくは５つ以上である。また、６つ以上であってもよい。
【００２９】
第１のアミノ酸配列は、２以上の塩基性アミノ酸残基を一定の態様で備えていることが好ましい場合がある。例えば、第１のアミノ酸配列は、２以上の塩基性アミノ酸残基が連続する第１の部分配列を有することができる。本明細書における開示を拘束するものではないが、かかる第１の部分配列は、シリコンナノシートに対する結合能に優れるペプチドが有することが多い。
【００３０】
第１の部分配列は、２つの塩基性アミノ酸残基が連続するものであればよく、３つ又は
４つ以上の塩基性アミノ酸残基が連続するものであってもよい。また、２つ以上の塩基性アミノ酸残基は、同一であってもよいし異なっていてもよい。
【００３１】
例示としてＳＣＲＲＩＲＨＷＲＰＷＲＧＣＳ（配列番号１）を参照用アミノ酸配列として説明すると、上記参照用アミノ酸配列においては、第３位及び第４位の部分配列（ＲＲ）と第６位〜７位の部分配列（ＲＨ）が第１の部分配列となる。
【００３２】
第１のアミノ酸配列は、２つの塩基性アミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基以外の他の１つのアミノ酸残基を介して配列する第２の部分配列を有することができる。本明細書の開示を拘束するものではないが、かかる第２の部分配列は、シリコンナノシートに対する結合能に優れるペプチドが有することが多い。
【００３３】
第２の部分配列における他のアミノ酸残基は、好ましくは塩基性アミノ酸残基及び酸性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基である。すなわち、疎水性アミノ酸残基又は極性アミノ酸残基である。疎水性アミノ酸残基の疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン等が好ましい。より好ましくはフェニルアラニン、バリン、ロイシン、プロリンであり、さらに好ましくはフェニルアラニン、バリン、ロイシンである。また、極性アミノ酸残基の極性アミノ酸としては、グリシン、チロシン、グルタミン、セリン、トレオニン等が好ましい。より好ましくはグリシン、チロシンである。
【００３４】
第２の部分配列を構成する２つの塩基性アミノ酸残基は、同一であってもよいし異なっていてもよい。
【００３５】
上記参照用アミノ酸配列においては、第４位〜６位の部分配列（ＲＩＲ）、第７位〜９位の部分配列（ＨＷＲ）が第２の部分配列となる。
【００３６】
第１のアミノ酸配列は、２つの塩基性アミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基以外の他の２つのアミノ酸残基を介して配列する第３の部分配列を有することができる。本明細書の開示を拘束するものではないが、かかる第３の部分配列は、シリコンナノシートに対する結合能に優れるペプチドが有することが多い。
【００３７】
第３の部分配列における他のアミノ酸残基は、第２の部分配列と同様のアミノ酸残基が挙げられる。２つの他のアミノ酸残基は、酸性アミノ酸残基及び／又は疎水性アミノ酸残基であればよく、同一であっても異なっていてもよい。
【００３８】
上記参照用アミノ酸配列においては、第９位〜１２位の部分配列（ＲＰＷＲ）が第３の部分配列となる。
【００３９】
第１のアミノ酸配列は、２つの塩基性アミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基以外の他の３つ又４つのアミノ酸残基を介して配列する第４の部分配列を有していてもよい。一方、第１のアミノ酸配列は、２つの塩基性アミノ酸残基が５つを超える他のアミノ酸残基を介して配列するような部分配列を有していないことが好ましい。これらの部分配列における他のアミノ酸残基は、第２の部分配列と同様のアミノ酸残基が挙げられる。これらの他のアミノ酸残基は、酸性アミノ酸残基及び／又は疎水性アミノ酸残基であればよく、同一であっても異なっていてもよい。
【００４０】
第１のアミノ酸配列は、第１の部分配列、第２の部分配列及び第３の部分配列のいずれかの部分配列を有していることが好ましい。さらに、第４の部分配列を有することもできる。第１のアミノ酸配列は、こうした塩基性アミノ酸残基についての特徴的部分配列を、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上備えている。
【００４１】
第１のアミノ酸配列は、また、好ましくは、少なくとも第１の部分配列を有している。さらに、第１のアミノ酸配列は、好ましくは、第１の部分配列及び第２の部分配列を有している。また、好ましくは第１の部分配列と第３の部分配列とを有している。第１のアミノ酸配列は、また、好ましくは第２の部分配列と第３の部分配列とを有している。また、好ましくは第１、第２及び第３の部分配列を有している。
【００４２】
上記参照用アミノ酸配列においては、上述のとおり、第１の部分配列、第２の部分配列及び第３の部分配列を有している。
【００４３】
第１のアミノ酸配列は、例えば、Ｎ末端及びＣ末端を塩基性アミノ酸残基とし、第１の部分配列、第２の部分配列、第３の部分配列及び第４の部分配列から選択される少なくとも１個、好ましくは２個以上又は３個以上の前記部分配列によって規定される。こうして規定した第１のアミノ酸配列は、好ましくはその全アミノ酸残基数に対して塩基性アミノ酸残基を４０％以上、より好ましくは４５％以上、さらに好ましくは５０％以上、なお好ましくは５５％以上、一層好ましくは６０％以上、より一層好ましくは６５％以上、さらに一層好ましくは７０％以上、なお一層好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上備えることができる。
【００４４】
第１のアミノ酸配列は、塩基性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基とのみからなることができる。また、第１のアミノ酸配列は、塩基性アミノ酸残基と、疎水性アミノ酸残基と、３個以下の極性アミノ酸とのみからなることができる。本明細書の開示を拘束するものではないが、酸性アミノ酸残基は、シリコンナノシートに対する親和性を低減させるものと推認される。極性アミノ酸残基が４個を超えると、第１のアミノ酸配列の極性が高まりすぎて、塩基性アミノ酸残基を有していても、シリコンナノシートとの相互作用が低下すると考えられる。好ましくは、極性アミノ酸残基は、２個以下又は１個である。また、好ましくは、極性アミノ酸残基を含まない。
【００４５】
第１のアミノ酸配列は、環状構造を有することができる。本明細書の開示を拘束するものではないが、第１のアミノ酸配列が環状構造を有することにより、塩基性アミノ酸残基とシリコンナノシートとの相互作用の発現が促進されると推認される。
【００４６】
第１のアミノ酸配列が環状構造を有するとは、例えば、本ペプチドが、第１のアミノ酸配列に加えて、さらに、そのＮ末端とＣ末端とに、ジスルフィド結合を形成するＳＨ基などを有する化合物を導入して、酸化条件下に本ペプチドを置くことによりジスルフィド結合を形成させることにより得ることができる。典型的には、第１のアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側に、それぞれシステインなどのＳＨ基を含む第２のアミノ酸配列を備えるようにすることで、環状化可能な又は環状化された第１のアミノ酸配列を有するペプチドを取得できる。
【００４７】
環状構造の大きさ、すなわち、環状構造を構成するアミノ酸残基の数（環状構造に寄与するシステインなどの２つの導入基の間のアミノ酸残基の数である（ただし、当該２つの導入基は含まないものとする。））は、特に限定しないが、例えば、４個以上とすることができ、好ましくは６個以上であり、より好ましくは７個以上である、より好ましくは８個以上である。また、９個以上であってもよく、１０個以上であってもよく、１１個程度であってもよい。
【００４８】
第１のアミノ酸配列は、例えば、以下のアミノ酸配列又はその一部であってもよい。すなわち、第１のアミノ酸配列は、以下に示すアミノ酸配列において塩基性アミノ酸残基を両末端に備えるアミノ酸配列とすることができるほか、第１の部分配列、第２の部分配列及び第３の部分配列など、上記した各種の特徴を１又は２以上備えるアミノ酸配列とすることができる。なお、以下のアミノ酸配列において、Ｂは共通して塩基性アミノ酸残基を示す。
【００４９】
（１）Z1Z2Z3Z4BBZ5Z6（Z1〜Z3、Z5及びZ6は疎水性アミノ酸残基を示し、Z4は極性アミノ酸残基を示す。）（配列番号２、第１のアミノ酸配列としては、全体配列のほか、BB等の部分配列が挙げられる。）
（２）BBZ7Z8Z9Z10BZ11B（Z7〜Z9、Z11は疎水性アミノ酸残基を示し、Z10は極性アミノ酸残基を示す。）（配列番号３、第１のアミノ酸配列としては、全体配列のほか、BB、BZ11B、BZ7Z8Z9Z10B又はBBZ7Z8Z9Z10B又はBBZ7Z8Z9Z10BZ11Bの部分配列が挙げられる。）
（３）Z12BZ13Z14Z15BBBB(Z12、Z13は極性アミノ酸残基を示し、Z14及びZ15は疎水性アミノ酸残基を示す。)（配列番号４、第１のアミノ酸配列としては、全体配列のほか、BZ13Z14Z15B、BZ13Z14Z15BBBB、BB等の部分配列が挙げられる。）
（４）BBZ16Z17Z18Z19BZ20Z21（Z16、Z18、Z19は、疎水性アミノ酸残基を示し、Z17、Z20、Z21は極性アミノ酸残基を示す。）（配列番号５、第１のアミノ酸配列としては、全体配列のほか、BB、BZ16Z17Z18Z19B、BBZ16Z17Z18Z19B等の部分配列が挙げられる。）
（５）Z22Z23BBZ24BZ25BB(Z22、Z23は酸性アミノ酸残基を示し、Z24、Z25は疎水性アミノ酸残基を示す。)（配列番号６、第１のアミノ酸配列としては、全体配列のほか、BB、BBZ24B、BZ25B、BZ25BB等の部分配列が挙げられる。）
（６）BBZ26BZ27Z28Z29BB（Z26、Z29は酸性アミノ酸残基を示し、Z27、Z28は疎水性アミノ酸残基を示す。）（配列番号７、第１のアミノ酸配列としては、全体配列のほか、BB、BBZ26B、BZ27Z28Z29B又はBZ27Z28Z29BB等の部分配列が挙げられる。）
（７）BBBZ30Z31BZ32BZ33Z34B(Z30、Z31、Z32は疎水性アミノ酸残基を示し、Z33、Z34は酸性アミノ酸残基を示す。)（配列番号８、第１のアミノ酸配列としては、全体配列のほか、BB、BBB、BZ30Z31B、BZ32B、BZ33Z34B、BZ30Z31BZ32BZ33Z34B等の部分配列が挙げられる。）
（８）BBZ35BBZ36BZ37Z38BZ39（Z35、Z36、Z37、Z38は疎水性アミノ酸残基を示し、Z39は酸性アミノ酸残基を示す。）（配列番号９、第１のアミノ酸配列としては、全体配列のほか、BB、BZ35B、BBZ36B、BZ37Z38B、BZ35BBZ36BZ37Z38B等の部分配列が挙げられる。）
（９）BZ40BZ41Z42Z43BBZ44BZ45（Z40、Z43、Z45は疎水性アミノ酸残基を示し、Z41、Z42、Z44は酸性アミノ酸残基を示す。）（配列番号１０、第１のアミノ酸配列としては、全体配列のほか、BZ40B、BZ41Z42Z43B、BBZ44B等の部分配列が挙げられる。）
【００５０】
上記（１）〜（９）に示す第１のアミノ酸配列において、塩基性アミノ酸残基Ｂ及び疎水性アミノ酸残基及び極性アミノ酸残基については既に説明したようなアミノ酸残基の態様を適用できる。第１のアミノ酸配列としては、例えば、以下のアミノ酸配列を好ましく例示できる。
（ａ）Arg-Arg-X15-Arg-X16-Arg-Arg（X15〜X16は、それぞれ疎水性アミノ残基を示す。）（配列番号１９）（実施例におけるＳｉＮＰ−２に対応する。）
（ｂ）Arg-Arg-Arg-X1-X2-Arg-X3-X4-Arg（X1及びX2は、それぞれ疎水性アミノ残基を示し、X3及びX4は、それぞれ極性アミノ酸残基を示す。）（配列番号２０）（実施例におけるＳｉＮＰ−４に対応する。）（実施例におけるＳｉＮＰ−４に対応する。）
（ｃ）Arg-Arg-X11-Arg-His-X12-Arg-X13-X14-Arg（X11〜X14は、それぞれ疎水性アミノ残基を示す。）（配列番号２１）（実施例におけるＳｉＮＰ−５に対応する。）
【００５１】
第１のアミノ酸配列は、好ましくは以下のアミノ酸配列又は上記（１）〜（９）で説明したのと同様にその一部であってもよい。以下の表において、塩基性アミノ酸残基は太字イタリックで示し、疎水性アミノ酸残基は下線を付与して表し、極性アミノ酸残基は太字イタリックでなく下線なしで示す。また、併せて、塩基性アミノ酸残基数（ａ）、全残基数、塩基性アミノ酸残基間の残基数（ｂ）、ａ／ｂ％を示す。なお、以下の表に示すアミノ酸配列において、塩基性アミノ残基は、以下に示すもののほか、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）及びヒスチジン（Ｈ）のいずれかでありうる。同様に、疎水性アミノ酸残基も、以下に示すもののほか、他の疎水性アミノ酸残基でありうる。また、「アミノ酸残基間」というとき、末端の塩基性アミノ残基を含めるものとする。
【００５２】
【表１】
2019210431.tif 000002
【００５３】
本ペプチドは、こうした第１のアミノ酸配列を１又は２以上備えることができる。すなわち、本ペプチドは、こうした第１のアミノ酸配列を１又は２以上を含むアミノ酸配列からなる一続きのペプチド領域を有している。本ペプチドが有する２以上の第１のアミノ酸配列は、同一であっても異なっていてもよい。また、それぞれ環状化されていてもよいし、環状化されていなくてもよい。
【００５４】
本ペプチドは、上記のごとく、第１のアミノ酸配列における第１〜第４のアミノ酸配列で特徴付けできるほか、上記の特徴とともに又は上記特徴とは独立して、例えば、以下の特徴を備えることもできる。
【００５５】
本ペプチドが備える塩基性アミノ酸残基は、例えば、少なくとも１又は２以上のアルギニンを含むことが好ましい。本開示を拘束するものではないが、アルギニンが側鎖にアミノ基を３個含み、塩基性が高いことなどから、シリコンナノシート、シロキサン結合生成基を有するシリコン原料やシロキサン結合を有するシリコン含有材料などの標的材料と相互作用しやすいものと考えられる。２以上の塩基性アミノ酸残基は、同一種類の塩基性アミノ酸残基からなっていてもよいし、２種以上の塩基性アミノ酸残基から構成されていてもよい。例えば、２以上のアミノ酸残基は全てアルギニンであってもよいし、一部がアルギニンであり、他がリシン及び／又はヒスチジンであってもよい。
【００５６】
本ペプチドは、例えば、３以上の塩基性アミノ酸残基、また例えば、４以上の同残基、また例えば、５以上の同残基を、また例えば、６以上の同残基を有することができる。塩基性アミノ酸残基が多いと、シリコン原料と反応してシリコン含有材料を形成しやすくなる傾向がある。かかる観点から、好ましくは４以上の塩基性アミノ酸残基を有し、より好ましくは５以上の塩基性アミノ酸残基、さらに好ましくは６以上の塩基性アミノ酸残基を有することができる。
【００５７】
本ペプチドにおける塩基性アミノ酸残基の割合は、特に限定するものではないが、本ペプチドの全アミノ酸残基数に対して、例えば、２５％以上であり、また例えば、３０％以上であり、また例えば、３５％以上であり、また例えば、４０％以上であり、また例えば４５％以上であり、また例えば、５０％以上である。全アミノ酸残基数に対する塩基性アミノ酸残基数の割合が高いと、本ペプチドにおいて塩基性アミノ酸残基が連続してあるいは近接して配置されることから、シリコン原料やシリコン含有材料などとの相互作用性が高まると考えられる。
【００５８】
本ペプチドにおける全アミノ酸残基数は、例えば、７個以上であり、また例えば、８個以上であり、また例えば９個以上であり、また例えば、１０個以上であり、また例えば１１個以上である。また、前記全アミノ酸残基数は、例えば、２０個以下であり、また例えば、１９個以下であり、また例えば１８個以下であり、また例えば、１７個以下であり、また例えば１６個以下である。本ペプチドの全アミノ酸残基数の範囲は、これらの上限及び下限を適宜組み合わせることで設定するおことができるが、例えば、７個以上２０個以下であり、また例えば、８個以上１８個以下であり、また例えば１０個以上１６個以下である。
【００５９】
本ペプチドにおける全アミノ酸残基数は、例えば、７個以上であり、また例えば、８個以上であり、また例えば９個以上であり、また例えば、１０個以上であり、また例えば１１個以上である。また、前記全アミノ酸残基数は、例えば、２０個以下であり、また例えば、１９個以下であり、また例えば１８個以下であり、また例えば、１７個以下であり、また例えば１６個以下である。本ペプチドの全アミノ酸残基数の範囲は、これらの上限及び下限を適宜組み合わせることで設定するおことができるが、例えば、７個以上２０個以下であり、また例えば、８個以上１８個以下であり、また例えば１０個以上１６個以下である。
【００６０】
全アミノ酸残基数に関する当該態様は、上記した塩基性アミノ酸残基の割合によって本ペプチドを規定する場合に用いることができるほか、かかる規定が適用されない場合の本ペプチドにおいても許容される一態様である。なお、後述するように、本ペプチドは、さらに長くてもよい。
【００６１】
また、本ペプチドにおける塩基性アミノ酸残基の存在形態は、特に限定するものではないが、例えば、本ペプチドにおける塩基性アミノ酸残基の少なくとも一部を、２以上連続して含むことができる。以下、塩基性アミノ酸残基が連続する部分を、連続単位という。連続単位は、また例えば、３以上の塩基性アミノ酸残基、また例えば、４以上の塩基性アミノ酸残基をそれぞれ連続して含むこともできる。本ペプチドにおいて、連続単位は複数含むことができる。１又は２以上の連続単位を含むことで、シリコンを含む標的材料との相互作用性が高まるものと考えられる。
【００６２】
（塩基性アミノ酸残基リッチ領域）
また、本ペプチドにおける塩基性アミノ酸残基は、特に限定するものではないが、例えば、塩基性アミノ酸残基に富む塩基性アミノ酸残基リッチ領域（以下、単にリッチ領域ともいう。）を備えることができる。ここで、リッチ領域とは、本ペプチドにおいてＮ末端側とＣ末端側との２つの塩基性アミノ酸残基で規定される一続きの配列であって、全ての隣接する塩基性アミノ酸残基が、３個以下の非塩基性アミノ酸残基で離間されている関係を充足する一続きの領域である。換言すれば、最も近い塩基性アミノ酸残基が連続しているか、１個の非塩基性アミノ酸残基で離間されているか、２個の非塩基性アミノ酸残基で離間されているか、又は３個の塩基性アミノ酸残基で離間されている、という条件を充足する、最もＮ末側の塩基性アミノ酸残基から最もＣ末側の塩基性アミノ酸残基で規定される領域である。このようなリッチ領域を有することで、シリコン原料やシリコン含有材料との相互作用性が高まる傾向にある。リッチ領域は、隣接する塩基性アミノ酸残基が、３個以下の非塩基性アミノ酸残基で離間されている関係を充足する一続きの領域である。
【００６３】
かかるリッチ領域において２つの塩基性アミノ酸残基を離間する非塩基性アミノ残基は、好ましくは、既述の疎水性アミノ残基である。また、非塩基性アミノ酸残基は、例えば、グルタミン酸及びアスパラギン酸などの酸性アミノ酸残基でないことが好ましい。
【００６４】
リッチ領域を構成する全アミノ酸残基数は特に限定するものではないが、例えば、６個以上であり、また例えば、７個以上であり、また例えば、８個以上である。また例えば、１２個以下であり、また例えば、１１個以下であり、また例えば１０個以下である。リッチ領域の全アミノ酸残基数の範囲は、これらの上限及び下限を適宜組み合わせることで設定するおことができるが、例えば７個以上１２個以下であり、また例えば、８個以上１１個以下である。
【００６５】
リッチ領域においては、２又は３以上の塩基性アミノ酸残基を連続して備えることが好ましい。また、リッチ領域においては、１個又は２個以上の連続単位を備えることができるほか、連続単位に加えて、非連続で含まれる塩基性アミノ酸残基を含むことができる。
【００６６】
リッチ領域の全アミノ酸残基数に対する塩基性アミノ酸残基数の割合は、特に限定するものではないが、例えば、４０％以上、また例えば、４５％以上であり、また例えば、５０％以上であり、また例えば、５５％以上であり、また例えば、６０％以上であり、また例えば６５％以上であり、また例えば、７０％以上である。塩基性アミノ酸残基数の割合が高い場合には、リッチ領域での標的材料との相互作用性が高まるからである。また例えば、８０％以下であり、また例えば、７５％以下であり、また例えば、６０％以下である。リッチ領域における塩基性アミノ酸残基数の割合は、これらの上限及び下限を適宜組み合わせることで設定することができるが、例えば、４０％以上８０％以下であり、また例えば５０％以上７５％以下である。
【００６７】
本ペプチドは、リッチ領域を１又は２以上備えることができる。本ペプチドが２以上のリッチ領域を備える場合、２以上のリッチ領域は、例えば、適当な公知のペプチドリンカーで連結することができる。
【００６８】
本ペプチドは、ペプチドに許容される任意の構造を採ることができる。例えば、本ペプチドは、直線状であってもよいし、システイン残基中のＳＨ基を利用して環状化されて環状領域を備えることもできる。本明細書の開示を拘束するものではないが、第１のアミノ酸配列が環状構造を有することにより、塩基性アミノ酸残基と標的材料との相互作用の発現が促進されると推認される。
【００６９】
特に限定するものではないが、本ペプチド中、例えば、リッチ領域など、周囲より塩基性アミノ酸残基が高頻度で存在している領域が環状領域となることが好ましい。例えば、リッチ領域を挟むようにそのＮ末側及びＣ末側にシステインを備えるようにすることができる。なお、環状化のためのシステイン残基は、リッチ領域の最もＮ末の塩基性アミノ酸残基に直接、あるいは１個又は２個以上のアミノ酸残基を介して備えることができる。かかるアミノ酸残基は、例えば、既述の疎水性アミノ酸残基などを用いることができる。
【００７０】
環状構造の大きさ、すなわち、環状構造を構成するアミノ酸残基の数（環状構造に寄与するシステインなどの２つの導入基の間のアミノ酸残基の数である（ただし、当該２つの導入基は含まないものとする。））は、特に限定しないが、例えば、８個以上とすることができ、また例えば、９個以上であり、また例えば、１０個以上であってもよく、１０個以上であってもよく、１１個程度であってもよい。
【００７１】
こうしたペプチドとしては、例えば、以下に示すペプチド（配列番号１１〜１８）が挙げられる。また、以下に示すように、ペプチドは、そのＮ末側とＣ末側に環状化のためにシステイン（Ｃ）を含む領域（Ｃ又はＣＳ）をそれぞれ備えることもできる。さらに、リッチ領域としては、以下の表に示すリッチ領域を備えることができる。
【００７２】
【表２】
2019210431.tif 000003
【００７３】
また、本ペプチドは、さらに別の所望の機能を発揮できるアミノ酸配列を含めることもできる。例えば、抗体又はその一部、酵素又はその一部、膜タンパク質又はその一部、抗原又はその一部などの各種生化学的な機能を発揮するタンパク質のアミノ酸配列、公知の金属原子や炭酸塩や水酸化物などの各種形態の金属塩を捕捉可能なペプチドのアミノ酸配列、標識物質又は標識物質と結合可能な物質などの標識要素等が挙げられる。本ペプチドにこうした所望のペプチドのアミノ酸配列や標識要素などを複合化合物することで、当該所望のペプチドに基づく機能とシリコン材料機能との複合化が可能となる。
【００７４】
本ペプチドは、公知の化学合成法で合成することができるほか、微生物等を用いて遺伝子工学的に取得することができる。このようなペプチドを取得する技術は、当業者において周知である。
【００７５】
なお、本ペプチドは、シリコンナノシートに結合性を有するペプチドが適宜選択することができる。かかるペプチドについては、本出願人による特願２０１５−２４１２７８号（特許文献４、特開２０１７−１０５７３１号公報）に開示されている。この文献においては、本ペプチドは、シリコンナノシートに結合性を有するものとして開示されている。なお、この文献に開示されているのはあくまでシリコンナノシートに結合性を有するペプチドであって、シロキサン結合生成基を有する原料から複合材料を形成することまでは想定されていない。
【００７６】
以上のことから、本ペプチドは、シロキサン結合生成基を含むケイ素化合物であるシリコン原料からシリコン含有材料含む複合材料を製造するための剤として用いることができることが理解される。本ペプチドは、上記のとおり、ケイ素原子で構成された六員環が複数連なった構造を基本骨格とするシート（シリコンナノシート）と結合性を有するペプチドである。本ペプチドは、シリコンナノシート結合能に基づくスクリーニングにより得られ、そして、シロキサン結合生成基含有シリコン原料から、シロキサン結合の生成に伴って、シリコン／ペプチド複合材料を提供できる。
【００７７】
〔シロキサン結合生成基を有するシリコン原料〕
相互作用工程で用いるシリコン原料（以下、単に、原料ともいう。）は、シロキサン結合生成基を１個以上４個以下有するケイ素化合物を用いることができる。原料としては、少なくともシロキサン結合生成基を４個有する原料を用いることが好ましく、より好ましくは、シロキサン結合生成基を４個有する原料を主成分として用いることが好ましい。ここで、シロキサン結合生成基を４個有する原料を主成分として用いるとは、原料のうち、全原料のモル数に対してシロキサン結合生成基を４個有する原料を５０モル％以上であり、好ましくは６０モル％以上であり、より好ましくは７０モル％以上であり、さらに好ましくは８０モル％以上であり、なお好ましくは９０モル％以上であり、一層好ましくは９５モル％以上であり、より一層好ましくは９８モル％以上であり、さらに一層好ましくは９９モル％以上であり、なお一層好ましくは１００モル％である。
【００７８】
原料が有するシロキサン結合生成基は、水酸基又は加水分解性基である。このうち、加水分解性基としては、ハロゲノ基、アルコキシ基等が挙げられる。加水分解性が良好であり、酸を副生しないことから、加水分解性基としては、アルコキシ基が好ましく、炭素原子数１〜４のアルコキシ基がより好ましい。より好ましくは、メトキシ基、エトキシ基である。本方法においては、こうした原料を１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００７９】
このような原料としては、特に限定するものではないが、例えば、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトラブトキシシラン等のシロキサン結合生成基を４個備える原料、トリメトキシシラン、トリエトキシシラン、トリプロポキシシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、メチルトリプロポキシシラン、メチルトリイソプロポキシシラン、エチルトリメトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、プロピルトリメトキシシラン、プロピルトリエトキシシラン、ブチルトリメトキシシラン、シクロヘキシルトリメトキシシラン、シクロヘキシルトリエトキシシラン、トリクロロシラン等のシロキサン生成基を３個備える原料、ヘキサメチルジシロキサン、ヘキサエチルジシロキサン、ヘキサプロピルジシロキサン、１，１，３，３−テトラメチルジシロキサン、１，３−ジビニル−１，１，３，３−テトラメチルジシロキサン等のシロキサン生成基を２個備える原料、メトキシジメチルシラン、エトキシジメチルシラン、メトキシトリメチルシラン、エトキシトリメチルシラン、メトキシジメチルフェニルシラン、エトキシジメチルフェニルシラン、クロロジメチルシラン、クロロトリメチルシラン、ジメチルシラノール、トリメチルシラノール、トリエチルシラノール、トリプロピルシラノール、トリブチルシラノール等のシロキサン結合生成基を１個備える原料が挙げられる。
【００８０】
〔水性媒体〕
相互作用工程は、水性媒体中で行う。水性媒体は、水を含み、相互作用工程で用いるペプチドが溶解して、シリコン原料と相互作用可能な媒体であればよい。典型的には、水のほか、水と水と相溶する１種又は２種以上の有機溶媒との混液、弱酸性から弱アルカリ性の公知緩衝液等が挙げられる。水と相溶する有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等が挙げられる。また、水性媒体の液性（ｐＨ）は、例えば、４以上９以下であり、また例えば、５以上８以下であり、また例えば、６以上７以下などである。
【００８１】
水性媒体には、必要に応じて、相互作用工程で用いるペプチド同士の凝集化や生成した複合材料の凝集の防止などに寄与することができるＳＤＳやtweenなどの公知の界面活性剤を含めることができる。
【００８２】
相互作用工程は、水性媒体中で、本ペプチドと原料とを、相互作用させる工程である。ここで、相互作用工程は、本ペプチドが変性しない条件であって、かつ原料中のシロキサン結合生成基が縮合する条件を形成すればよい。本ペプチドは、塩基性アミノ酸残基に富む等のことから、原料及びシリコン含有材料中のシリコン又はシロキサン結合に親和性を有し、複合体を形成し維持する傾向を備えている。このため、シロキサン結合生成基が縮合する条件下で本ペプチドが存在することにより、シロキサン結合の生成を促進し、シロキサン結合の生成に伴って三次元構造を付与することがきる。
【００８３】
相互作用工程は、特に限定するものではないが、水性媒体中で、例えば、本ペプチドが変性しない温度条件、例えば、１℃以上４０℃以下、好ましくは１５℃以上、また好ましくは３０℃以下の温度条件下で、本ペプチドと原料とを適当な時間、例えば５分以上、また例えば１０分以上、また例えば３０分以上、また例えば１時間以上、また例えば数時間以上、より好ましくは１０時間以上、さらに好ましくは２０時間以上維持すればよい。
【００８４】
相互作用工程は、本ペプチドと原料とを含む水性媒体をそのまま静置するだけでもよいが、工程当初において撹拌してもよい。なお、相互作用工程において、本ペプチドの機能を損なわない限りにおいて、シロキサン結合生成基の加水分解及び縮合を促進する公知の触媒を添加したり、ｐＨを適宜調整したりすることもできる。
【００８５】
本工程によれば、本ペプチドの存在によって、原料に由来するシロキサン結合を備えるシリコン含有材料と本ペプチドとが複合化した複合材料を得ることができる。シリコン含有材料ないし複合材料の生成は、水性媒体が白濁するなどの現象から確認することができる。シリコン複合材料は、相互作用工程時間などの条件によって、粒子状、シート状などの三次元構造を採ることができる。相互作用時間が長いと、シート状の構造を採る傾向がある。
【００８６】
複合材料は、水性媒体中において生成するが、複合材料がシート状などの形態を採るときには、水性媒体の表面に観察されるようになることが多い。
【００８７】
こうした複合材料を、ろ過や遠心分離などの適当な固液分離方法により分離し、必要に応じて洗浄などすることにより、複合材料を分離することができる。
【００８８】
本方法によれば、本ペプチドの存在下、緩和な条件でシロキサン結合の生成を促進して複合材料を形成できる。複合材料によれば、シリコン含有材料の表面特性を本ペプチド及び本ペプチドの有機基を介して導入されたペプチド、有機官能基によって変化させることができる。
【００８９】
本方法によれば、新たな機能を備えたシリコン含有材料を製造できる。例えば、本ペプチドとして、ペプチド結合のほか、アミノ酸残基が有することがあるアミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基、ＯＨ基を介して、各種の有機官能基や有機化合物を導入したペプチドを用いることで、シリコン含有材料に他の材料に由来する特性を合せ有するシリコン含有材料との複合材料を得ることができる。
【００９０】
本方法によれば、本ペプチドとして、他の金属原子や無機化合物を捕捉したり、ミネラリゼーションできる機能を有するペプチドを連結したものを用いることで、シリコン含有材料にこうした機能を付与した複合材料を得ることができる。
【００９１】
また、本方法によれば、シリコン含有材料とペプチドとの複合材料をボトムアップ的に製造することができる。また、本方法によれば、複合材料からペプチド部分を分離してシリコン含有材料を得ることもできる。複合材料からペプチド部分を分離するには、例えば、焼成によりペプチド部分を焼失させるほか、界面活性剤、次亜塩素酸塩などの酸化剤、水酸化ナトリウムなどのアルカリ剤などの１種又は２種以上のタンパク質分解成分を用いてペプチド部分を分解することで、シリコン含有材料を取得できる。
【００９２】
〔シリコン／ペプチド複合材料〕
本明細書に開示されるシリコン／ペプチド複合材料は、本ペプチドと、シロキサン結合を有する骨格を有するシリコン含有材料とを、含むことができる。複合材料は、本明細書に開示される方法によって得ることができる。複合材料の組成や構造は必ずしも明らかではないが、以下の事象から、複合材料の構成が理解される。
【００９３】
複合材料は、原料として、シロキサン結合生成基を有するシリコン化合物である原料を本ペプチド存在下で、水性媒体中で保持し、水性媒体を白濁させて固相として回収される材料である。また、複合材料は、その形態を、ＳＥＭ／ＥＤＸ等で確認することができ、粒子状やシート状などの三次元形態を採ることができる。以上のことから、複合材料は、シロキサン結合生成基の加水分解・重縮合による、ポリシロキサン骨格を有すると考えられる。
【００９４】
また、複合材料におけるシリコンの存在をＳＥＭ／ＥＤＸ、ＡＦＭ等により確認することができ、同材料における本ペプチドの存在を、ＨＰＬＣ等のクロマトグラフィーによって同定し検出することができる。
【００９５】
以上のことから、複合材料は、本ペプチドと、シロキサン結合を有する骨格を有するシリコン含有材料とを、含むと考えられる。さらに、本複合材料から本ペプチドが容易に分離されることから、本ペプチドは非共有結合的に複合化されていると考えられる。
【実施例】
【００９６】
以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００９７】
〔ランダムペプチド提示型Ｔ７ファージライブラリの構築〕
Ｔ７ファージディスプレイシステム（Novagen）を用いて、ランダムペプチドライブラリの構築を試みた。
【００９８】
２種類のオリゴムクレオチドプライマーＴ７−Ｌｉｂ ｕｐ（ＡＴＧ ＡＡＴ ＡＣＣ ＡＧＧ ＡＴＣ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＴＴ ＣＧ）（配列番号２２）、Ｔ７−Ｌｉｂ ｄｏｗｎ（ＡＣＴ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＧＣＴ）（配列番号２３）を用いてＰＣＲ反応を行い、テンプレートＤＮＡ（ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＴＴ ＣＧＴ ＧＴ（配列番号２４）（ＮＮＫ）9-12 ＴＧＴ ＡＧＣ ＴＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＡ）（配列番号２５）を増幅した（Ｎ＝Ａ２５％、Ｔ２５％、Ｇ２５％、Ｃ２５％の混合塩基（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃの等量混合塩基、Ｋ＝Ａ０％、Ｔ５０％、Ｇ５０％、Ｃ０％の混合塩基）。
【００９９】
増幅したＤＮＡ断片は、一般的なプロトコールに従ってフェーノール処理、ブタノール濃縮を行った後、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。精製したＤＮＡは、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ）で処理した後、T7select 10-3 vector arm（Novagen）にライゲーションし、Ｔ７ファージゲノムを構築した。
【０１００】
構築したファージゲノムを、T7 select packaging溶液（Novagen）と混合することで、ランダムペプチド遺伝子導入型のＴ７ゲノムＤＮＡを有するＴ７ファージを構築した。この際、一部を用いて、構築されたファージ集団の数を計測したところ、１．０×１０6〜４．０×１０7の配列多様性を有するファージライブラリが構築されていることを確認した。
【０１０１】
構築したファージ集団は、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６〜１．０まで培養した大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＴ ５４０３ 株に感染させ増幅後、８％ポリエチレングリコール、０．２２ｍｍフィルター処理を行うことで濃縮・精製した。精製後にファージ数を計測した結果、各ライブラリーは約１．０×１０12ｐｆｕ／ｍｌのファージを有しており、ペプチドファージ１種あたり１００，０００〜１，０００，０００倍に増幅していることを確認した。
【実施例２】
【０１０２】
ランダムペプチド提示型Ｔ７ファージライブラリを用いたシリコンナノシートに対するバイオパンニングの実施
【０１０３】
実施例１にて作製したランダムペプチド提示型Ｔ７ファージライブラリより、シリコンナノシートに結合するペプチドを提示するＴ７ファージの単離を試みた。バイオパンニングの一連の流れを図１に示す。
【０１０４】
特願２００６−５２９１４８の実施例に開示される方法に従って合成したシリコンナノシートをメタノール：アセトン＝１：１溶媒で洗浄し、次いでイソプロパノールにて洗浄後、０．１％ＳＤＳを含むＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に分散させた。
【０１０５】
シリコンナノシート０．２ｍｇを分散させた溶液とＴ７ファージライブラリを混合し、１時間２５℃にて反応後、遠心（６，０００ｒｐｍ，３ｍｉｎ）により粒子を沈殿させ上清を除去することで、非結合ファージを除去した。
【０１０６】
上清除去後、０．１％ＳＤＳを含むＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，Ｔｗｅｅｎ０．１％）溶液を加えてシリコンナノシートを分散させ、再度遠心操作し、本材料に非特異的に結合したファージの除去を試みた。本操作（洗浄操作）を３−１０回繰り返すことで、シリコンナノシートに非特異的に結合するペプチドファージの除去を行った。
【０１０７】
非結合ファージ、非特異的に結合しているファージを洗浄により除去した後、ＯＤ  ６００ｎｍ＝０．６〜１．０まで培養した大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＴ５４０３溶液１０ｍｌと混合し、大腸菌が完全に溶菌するまで３７℃で培養を行った。
【０１０８】
大腸菌が完全に溶菌した後、培養溶液に対して１／１０量の５Ｍ ＮａＣｌを加え遠心（３，５００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）し、大腸菌の細胞壁などの不溶性画分を沈殿させ、上清を回収した。
【０１０９】
回収した上清に対して１／６量の５０％ポリエチレングリコール６，０００溶液を加え、攪拌後３，５００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心しＴ７ファージを沈殿させた。沈殿したＴ７ファージ集団はＨＥＰＥＳ溶液で溶解後、０．２２μｍフィルター処理を行い、使用まで４℃で保存した。
【実施例３】
【０１１０】
〔単クローンファージの提示ペプチド配列解析〕
５ラウンドのパンニングを行った後のファージプールについて単クローン化を行い、ランダムに選択した９６種のファージについて提示ペプチド配列解析を行った結果、１１種について配列の重複が確認された。配列の重複が確認された１１種のペプチド配列を図２に示す。
【実施例４】
【０１１１】
〔シリコンナノシートに結合するペプチドを提示する単クローンファージのスクリーニング〕
実施例３にて同定されたペプチドファージの内、特徴的な配列を提示するファージについて、シリコンナノシートに対する結合性の評価を行った、
【０１１２】
洗浄し０．１％ＳＤＳを含むＨＥＰＥＳに分散させたシリコンナノシート５００μｇと各ファージをそれぞれ混合し１時間２５℃下にて反応後、遠心分離（６，０００ｒｐｍ，３ｍｉｎ）し上清を除去した。次いで、０．１％ＳＤＳを含むＨＥＰＥＳにて１０回洗浄操作を行った。
【０１１３】
洗浄後、シリコンナノシートに結合したファージ数をプラークアッセイ法により測定した。結果、配列の重複が確認されたＮｏ．３−２、３−８、３−９、３−１０、３−１８、３−８５の６種のペプチドについて、野生型と比較して１００倍以上のファージ結合数が確認された。シリコンナノシートに対する結合評価の結果を図３に示す。
【０１１４】
また、コントロールとして、４種類の公知タンパク質に対する結合評価を図４に示す。図４に示すように、ファージＮｏ．３−２、３−８、３−９、３−１０、３−１８及び３−８５は、いずれも、公知のタンパク質には結合性を示さないことがわかった。
【実施例５】
【０１１５】
〔合成ペプチドの調製〕
シリコンナノシートへの結合が確認されたファージＮｏ．２−９、３−８、３−９、３−１０及び３−４１がそれぞれ提示するペプチド配列についてＦｍｏｃ固相合成法により、合成ペプチドを調整した。なお合成ペプチドのＮ末端には、ｇ１０配列由来のＧＧＧを介してＢｉｏｔｉｎ化を行った。また、コントロールとして、ＡＰ−１、ＲＥ−１（Nature Materials, 2012, 11, p817）及び特願２０１４−２５６９３８にて取得したランタノイド認識ペプチドＬａｍｐ１を用いた。用いたペプチドの試料番号、アミノ酸配列及び対応するファージＮＯ．とを図５に示す。
【０１１６】
樹脂より切り出し脱保護したペプチドは、分子内ジスルフィド結合を形成させた後、逆送ＨＰＬＣにて精製し、凍結乾燥した。
【実施例６】
【０１１７】
〔合成ペプチドとシリコンナノシートの結合評価〕
実施例５にて調製した合成ペプチドとシリコンナノシートの結合評価を行った。洗浄しＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ＳＤＳ０．１％，Ｔｗｅｅｎ０．１％）に分散させた特願２００６−５２９１４８の実施例に開示される方法に従って合成したシリコンナノシート２００μｇと各ペプチド（１０μＭ）をそれぞれ混合し１時間２５℃下にて反応後、遠心分離（６，０００ｒｐｍ，３ｍｉｎ）し上清を除去した。次いで、ＨＥＰＥＳｂｕｆｆｅｒにて５回洗浄操作を行った。
【０１１８】
１／５０００に希釈したＳＡ−ＨＲＰの溶液を加え、１時間２５℃下にて反応させた後ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒにて５回洗浄した。ＴＭＢ溶液を加え、ある程度の発色が確認された後、５Ｎ ＨＣｌを添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーSpectra MaxPlus 384にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。シリコンナノシートに対する合成ペプチドの結合評価を図６に示す。
【０１１９】
図６に示すように、ＳｉＮＰ−２、同４及び同５がシリコンナノシートに対して高い結合性を示した。一方、ＳｉＮＰ−１はやや低い結合性を示し、同３は、コントロールと同様のかなり低い結合性を示した。以上のことから、シリコンナノシートとの結合性を発揮するには、塩基性アミノ酸残基が集約される、塩基性アミノ酸残基が連続することなどが好適であることがわかった。また、同様にして、ＳｉＯ2及びＳｉ（粉末）についての結合性の評価を行ったところ、Ｓｉについては、シリコンナノシートと同様に結合性傾向が観察された。またＳｉＯ2については、塩基性アミノ残基を有していないＳｉＮＰ−１が結合性を示した。ＳｉＮＰ−１は、その疎水性部位にてシリコンナノシート、Ｓｉ及びＳｉＯ2に結合しているものと推定される。一般的に、シリコンナノシート等には、水中でＯＨが表層に付加されるものと考えられますが、付加されない部位も存在しており、当該部位にＳｉＮＰ−１が結合しているものと考えられる。
【実施例７】
【０１２０】
〔ナノ粒子の調製と分析〕
実施例５にて調製したペプチドとテトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）を混合し、ナノ粒子を調製した。すなわち、ＴＭＯＳと合成ペプチドをそれぞれＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ｐＨ７．５）に希釈し、ＴＭＯＳは終濃度５０ｍＭ、ペプチドは終濃度１００〜３００μＭとなるよう混合した。
【０１２１】
ＴＭＯＳとペプチドとを混合し、１０分経過後の状態を図７に示す。１０分経過時点では、図７に示すように、塩基性アミノ酸残基を４つ以上含み、また、連続して塩基性アミノ酸残基を含むペプチドの場合にのみ、溶液の白濁化が確認され、粒子が生成していることがわかった。
【実施例８】
【０１２２】
〔ナノ粒子のＴＥＭ分析〕
ＳｉＮＰ−２、同４及び同５について、実施例７にて生成したナノ粒子を透過電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope：ＴＥＭ、日本電子）にて観察した。分析試料は、ＴＭＯＳとペプチド反応後の溶液を銅グリッド（日本電子）に滴下し、真空乾燥させることで調製した。結果を図８に示す。各スケールバーは１００ｎｍを示す。図８に示すように、直径数百ｎｍ、典型的には３００〜６００ｎｍ程度のアモルファス粒子が生成していることが示された。
【実施例９】
【０１２３】
〔ナノ粒子のＳＥＭ／ＥＤＸ分析〕
ＳｉＮＰ−２、同４及び同５について、実施例７にて作製したナノ粒子を走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope：ＳＥＭ）及びエネルギー分散型Ｘ線分析（Energy Dispersive X-ray spectrometry：ＥＤＸ）（TM3000、日立ハイテクノロジー）にて観察した。なお、観察試料は、ＴＭＯＳとペプチド反応後の溶液をナノパーコレータにて処理し、水で洗浄した後乾燥させることで調製した。
【０１２４】
結果を図９に示す。図９に示すように、生成したナノ粒子のＳＥＭ像とＥＤＸ像（Ｓｉ）とは、重複しており、ナノ粒子は、全体的にＳｉを含んでいることが示された。
【実施例１０】
【０１２５】
〔逆相ＨＰＬＣによるナノ粒子中ペプチドの分析〕
ＳｉＮＰ−２、同４及び同５について、実施例７にて作製したナノ粒子を回収し、酸性溶液中に分散させ、得られた溶液を逆相ＨＰＬＣにて分析した。Inertsil ODS-3カラム（GL Science）をProminenceシステム（島津製作所）に接続し、以下の条件で測定した。
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル
０〜１０分：Ａ９９％、Ｂ１％
〜２０分：Ａ９０％、Ｂ１０％
〜３５分：Ａ５０％、Ｂ５０％
〜４０分：Ａ３０％、Ｂ７０％
〜４５分：Ａ９９％、Ｂ１％
【０１２６】
結果を図１０に示す。図１０に示すように、ナノ粒子を溶解させて得られた試料とペプチドのみの試料とにおいて見出されたピーク溶出時間は同一であった。以上のことから、生成粒子中にはペプチドが含まれていることがわかった。
【実施例１１】
【０１２７】
〔ナノ粒子中のＳｉ、ペプチド含有量の検討〕
ＳｉＮＰ−２及び同５について実施例７にて作製したナノ粒子中のＳｉ、ペプチド含有量を測定した。ペプチドとＴＭＯＳの反応により生成した粒子を遠心により沈殿させ、上清を除去し１ｍｌの超純水を加え洗浄した。超純水による洗浄を２回行った後、０．１ｍＭのＮａＯＨを１ｍｌ加え、８０℃で１時間以上加熱することで粒子を完全に溶解させた。本溶液を２０ｍｌの超純水と混合し、１Ｎ−ＨＣｌを１２００μｌ加え中和した。
【０１２８】
超純水を用いて２５ｍｌまでメスアップした後、モリブデン青色法を用いてＳｉＯ32-濃度を定量した。試薬は水質測定用試薬セット：LR-SiO2D No.20D（共立理化学研究所）を用いた。ペプチドの含有量は、ペプチドとＴＭＯＳ反応後の反応上清中ペプチド濃度を分光光度計により定量し、ペプチド添加量から差し引くことで求めた。結果を図１１に示す。
【０１２９】
図１１に示すように、ＳｉＮＰ−５については、試験した全ての濃度範囲で、ペプチド：Ｓｉ＝１：６０の比で反応していることがわかった。ＳｉＮＰ−２については、ペプチド濃度２００μＭ、３００μＭにおいては、ペプチド：Ｓｉ＝１：８０程度であり、ペプチド１００μＭにおいては、ペプチド：Ｓｉ＝１：３５０程度であった。
【０１３０】
以上の実施例から、本ペプチドとシロキサン結合生成基を有する原料との相互作用によって得られるナノ粒子は、シロキサン結合生成基の加水分解及び縮合に基づくポリシロキサン骨格を有するシリコン含有材料と、本ペプチドとが複合化していることがわかった。
【実施例１２】
【０１３１】
〔シリコン含有シートの調製とＳＥＭ／ＥＤＸ分析〕
実施例５にて調製したＳｉＮＰ−２、同４及び同５について、ペプチドとテトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）とを混合し、シリコンを含有するシートを調製した。１日以上反応させた点以外は、実施例８と同様にして、ペプチドとＴＭＯＳとを相互作用させることで、緩衝液表面にシート状体が生成した。
【０１３２】
反応上清をナノパーコレータにて処理し、水で洗浄後、乾燥させ、分析試料とした。これらについて、ＳＥＭ／ＥＤＸで分析した結果を図１２に示す。図１２に示すように、シートは大きいもので数１００μｍの大きさを持ち、Ｓｉはシート全体に分布していることが示された。
【実施例１３】
【０１３３】
〔シリコン含有シートのＡＦＭ分析〕
実施例１２にて調製したＳｉＮＰ−２、同４及び同５を用いたシリコンシートを原子間力顕微鏡（atomic force microscope：ＡＦＭ）にて分析した。シートを含む溶液をマイカ基盤上に滴下し、洗浄・乾燥させ、分析試料とした。結果を図１３に示す。図１３に示すように、シートは厚さがいずれも１００ｎｍ以下であった。
【実施例１４】
【０１３４】
〔単体アミノ酸とＴＭＯＳとの反応〕
単体アミノ酸（アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン）とＴＭＯＳ（５０ｍＭ〜１ｍＭ）を混合した。溶媒には、Ｔｒｉｓ５０ｍＭ（ｐＨ７．５）を用いた。十分な時間、これらの溶液を放置後、ナノ粒子、シートができているか目視にて観察した。結果の一例として、図１４に、塩基性アミノ酸とＴＭＯＳを混合した場合の反応上清ＳＥＭ像を示す。
【０１３５】
図１４に示すように、塩基性アミノ酸を含めどのアミノ酸についても、ＴＭＯＳのみの場合と変化はなく、ゲルが乾燥した塊が確認できたのみで、球状粒子、シートは存在していなかった。
【０１３６】
以上の結果は、単純に塩基性アミノ酸が存在すればよいということでなく、ペプチドの中に塩基性アミノ酸残基がいくつか存在すること、つまりは、塩基性アミノ酸が局所的に高い密度で存在していることが三次元形態を有するポリシロキサン構造体の生成に重要であることを示唆している。すなわち、塩基性アミノ酸残基を有する本ペプチドが、シロキサン結合生成基を有するシリコン原料の加水分解・縮合によるポリシロキサン材料の生成に際して、球状やシート状などの三次元形態の付与に貢献していることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１３７】
配列番号１〜２１：人工ペプチド
配列番号２２〜２３：プライマー
配列番号２４〜２５：テンプレートＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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