(57)【要約】      （修正有）【課題】ベクターとして使用される組換えVSVの生体内モニタリングを精度良く行うためのリアルタイムRT-PCRを用いた定量核酸検査法に使用される検出及び／又は定量用プライマー対の提供。【解決手段】特定の塩基配列を有するフォワードプライマー及び特定の塩基配列を有するリバースプライマーからなる、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株の検出及び／又は定量用プライマー対、並びに特定の塩基配列を有する水疱性口内炎ウイルスインディアナ株の検出及び／又は定量用プローブ。【選択図】図４
2019013167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォワードプライマー及びリバースプライマーの各塩基配列が、
（ａ）配列番号１及び２、
（ｂ）配列番号４及び５、
（ｃ）配列番号７及び８、
（ｄ）配列番号１０及び１１、又は
（ｅ）配列番号１３及び１４、に示される、
水疱性口内炎ウイルスインディアナ株の検出及び／又は定量用プライマー対。
【請求項２】
前記水疱性口内炎ウイルスインディアナ株は、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株のG遺伝子を置換した（又は置換していない）組換えウイルスである請求項１記載の検出及び／又は定量用プライマー対。
【請求項３】
前記水疱性口内炎ウイルスインディアナ株は、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株のG遺伝子をエボラウイルスの糖蛋白質遺伝子と置き換えた組換えウイルスワクチンのワクチンベクターとしての水疱性口内炎ウイルスインディアナ株である請求項２記載の検出及び／又は定量用プライマー対。
【請求項４】
塩基配列が、
配列番号３、６、９、１２又は１５に示される、
水疱性口内炎ウイルスインディアナ株の検出及び／又は定量用プローブ。
【請求項５】
前記水疱性口内炎ウイルスインディアナ株は、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株のG遺伝子を置換した（又は置換していない）組換えウイルスである請求項４記載の検出及び／又は定量用プローブ。
【請求項６】
前記水疱性口内炎ウイルスインディアナ株は、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株のG遺伝子をエボラウイルスの糖蛋白質遺伝子と置き換えた組換えウイルスワクチンのワクチンベクターとしての水疱性口内炎ウイルスインディアナ株である請求項５記載の検出及び／又は定量用プローブ。
【請求項７】
塩基配列が配列番号１に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号２に示されるリバースプライマーからなる第１のプライマー対と、塩基配列が配列番号３に示される第１のプローブと、からなる第１の検出及び／又は定量用キット、
塩基配列が配列番号４に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号５に示されるリバースプライマーからなる第２のプライマー対と、塩基配列が配列番号６に示される第２のプローブと、からなる第２の検出及び／又は定量用キット、
塩基配列が配列番号７に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号８に示されるリバースプライマーからなる第３のプライマー対と、塩基配列が配列番号９に示される第３のプローブと、からなる第３の検出及び／又は定量用キット、
塩基配列が配列番号１０に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号１１に示されるリバースプライマーからなる第４のプライマー対と、塩基配列が配列番号１２に示される第４のプローブと、からなる第４の検出及び／又は定量用キット、又は、
塩基配列が配列番号１３に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号１４に示されるリバースプライマーからなる第５のプライマー対と、塩基配列が配列番号１５に示される第５のプローブと、からなる第５の検出及び／又は定量用キット、を備える水疱性口内炎ウイルスインディアナ株の検出及び／又は定量用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株の検出及び／又は定量用プライマー対、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株の検出及び／又は定量用プローブ、及び、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株の検出及び／又は定量用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
水疱性口内炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus、以下「VSV」と略することがある。)はラブドウイルス科のプロトタイプで、インディアナ株等のいくつかの血清型が存在する。組換えVSVはプラスミドDNAから産生でき、ウイルスゲノムに挿入された外来遺伝子を高発現することができるという特長を持つ。現在最も頻繁に研究に使用されている組換えVSVインディアナ野生株は広範囲な宿主域を持ち、超遠心により容易に濃縮することが可能である。
【０００３】
組換えVSVはワクチンベクターとして長年研究され、最近の開発の中で特筆すべきは、近年アフリカで猛威を振るったエボラウイルス感染に対して、組換えVSVを用いたワクチンが開発され、臨床的にも有効性・安全性が示されたことである。このベクターワクチンはVSVのG遺伝子を、エボラウイルスのスーダン株（SEBOV）、ザイール株(ZEBOV)又はコートジボアール株(CIEBOV)の糖蛋白質遺伝子(GP遺伝子)と置き換えて作製された組換えウイルスワクチン等で、マウスにおける防御効果は既に10年以上前に報告されている。西アフリカでのエボラウイルス病大流行で、サルでの感染防御実験及びヒトを対象とした臨床試験が急速に進められており、実用化が期待される(非特許文献１,２)。
【０００４】
また、特許文献１には、VSV G遺伝子をコードしているプラスミドベクターを細胞内に導入し、VSV G遺伝子からVSV Gタンパク質を発現させ、VSV Gタンパク質を発現する細胞に弱毒化したVSVを感染させ、感染した細胞を培養する、弱毒化したVSVを培養物から回収する方法が記載されている。
【０００５】
また、特許文献２には、１つの抗原型の組換え水疱性口内炎ウイルス(rVSV)を含む１つのワクチン又は免疫抗原性組成物と、他の抗原型のrVSVを含む１つのワクチン又は免疫抗原性組成物と、を有する免疫プラットホームが記載されている。
【０００６】
ところで、VSVは主にウシ・ウマ・ブタ等の家畜に感染し、水疱性口内炎等を引き起こす。ヒトへの病原性は比較的マイルドであり多くは無症状であるものの、稀に発熱、悪寒、筋肉痛等、インフルエンザのような症状が出る。そのため、生体内の組換えVSVの増殖や残存のレベルをモニタリングするための手段が要求される。
【０００７】
これまで、生体内のVSVのモニタリングは、感染価をプラークアッセイ法により測定することで行われてきたが、正確性・再現性や感度の点で精度が高い手法とは言い難い。また、一般的により高感度な核酸検査法（定性法）もいくつか開発されているが、まだ十分な方法が確立されたとは言い切れず、より精度の高いリアルタイムRT-PCRを用いた定量核酸検査法の確立が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１１−５０７５１５号公報
【特許文献２】特表２０１２−５２９４２７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Mire, et al., Nature 520: 688-691, 2015
【非特許文献２】Henao-Restrepo, et al., Lancet 389(10068):505-518, 2017
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、ベクターとして使用される組換えVSVの生体内モニタリングを精度良く行うためのリアルタイムRT-PCRを用いた定量核酸検査法に使用される検出及び／又は定量用プライマー対、検出及び／又は定量用プローブ、及び、検出及び／又は定量用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明にかかる水疱性口内炎ウイルスインディアナ株の検出及び／又は定量用プライマー対は、フォワードプライマー及びリバースプライマーの各塩基配列が、
（ａ）配列番号１及び２、
（ｂ）配列番号４及び５、
（ｃ）配列番号７及び８、
（ｄ）配列番号１０及び１１、又は
（ｅ）配列番号１３及び１４、に示される。
【００１２】
本発明にかかる水疱性口内炎ウイルスインディアナ株の検出及び／又は定量用プローブは、塩基配列が、配列番号３、６、９、１２又は１５に示される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、組換えVSVの生体内モニタリングを精度良く行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】水疱性口内炎ウイルス野生型の概要を示す図である。
【図２】水疱性口内炎ウイルスに特異的な高感度プライマーの一次スクリーニングの結果を示す図である。
【図３】Ct値が20以下のプライマーセットにおいてTaqMan法を採用する二次スクリーニング条件の説明図である。
【図４】野生株とG遺伝子欠損株とを用いて検討した二次スクリーニングの結果を示す図である。
【図５】オリゴセットVSV-77について、合成RNAを用いた検量線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
本発明者らは、生体内等の水疱性口内炎ウイルスインディアナ株を高感度且つ特異的に検出及び／又は定量可能なプライマー対及びプローブを見出し、これによりワクチンベクター等として使用された生体内等の水疱性口内炎ウイルスインディアナ株を検出及び／又は定量可能とした。
【００１７】
VSVは、ラブドウイルス科のベシクロウイルス属に属する(−)単鎖RNA型のウイルスで、膜表面にエンベロープ蛋白質であるG蛋白質を有している。VSVの感染は、G蛋白質が細胞膜表面上にあるホスファチジルセリンに結合した後、エンドサイトーシス経路によって細胞内にVSVが取り込まれることで成立する。
【００１８】
VSVの粒子形態は特徴的な砲弾型を呈する。図１はVSV野生型の模式図であるが、この図に示されるように水疱性口内炎ウイルスのゲノムには３’端より順番に５つの構造蛋白質をコードする遺伝子（Ｎ，Ｐ，Ｍ，Ｇ及びＬ遺伝子）が含まれている。Ｎ遺伝子は、ゲノムのカプシド形成を司っているヌクレオカプシドタンパク質をコードしている一方で、Ｐ（リンタンパク質）及びＬ（大タンパク質）コード配列は、RNA依存性RNAポリメラーゼのサブユニットを構成する。マトリックスタンパク質（Ｍ）は、ビリオン成熟を促進し、ウイルス粒子の内部表面を裏打ちしている。
【００１９】
VSVは、数々の特性によりヒトで使用するための免疫原性組成物におけるベクターとして魅力的な候補となるが、VSVをベクターとして使用するワクチンや治療薬の開発を促進するためにも、ヒトの生体内等での組換えVSVの増殖や残存レベルを正確にモニタリングする手段が切望される。
【００２０】
本発明者は、VSVインディアナ株のL遺伝子領域について全48セットのプライマーを作製し、同株の全長DNAを用いてスクリーニングを実施し、極めて高効率に増幅するプライマーセット５組を選定し、これらに対してプローブを作製した。
【００２１】
PCRでは、DNAポリメラーゼがフォワードプライマー及びリバースプライマーを伸長することによって、鋳型の二本鎖DNAの所定の領域が増幅される。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、増幅対象の２本鎖DNAの両鎖それぞれの３’側と相補的な塩基配列からなる。
【００２２】
PCRでは、DNAポリメラーゼによって、鋳型となるDNAに相補的なデオキシヌクレオチド三リン酸がフォワードプライマーの３’末端に付加されることによって、フォワードプライマーが、５’末端から３’末端の方向に伸長される。PCRでは、反応温度の変化により、２本鎖の鋳型のDNAが１本鎖にほどかれ、フォワードプライマーが鋳型のDNAにアニーリングされ、DNAポリメラーゼによる伸長反応が行われ、伸長されたフォワードプライマーと鋳型のDNAとがほどかれる。リバースプライマーについても同様である。PCRは上記一連の反応を繰り返すことにより、目的の核酸を増幅することができる。
【００２３】
具体的には、フォワードプライマー及びリバースプライマーの各塩基配列が下記に示されるプライマーセットである。
(a)VSV-77
フォワードプライマー  5’- CTGCCCTTCATAGGTTTTCG -3’ (配列番号１)
リバースプライマー    5’- CATCAACCTGGTCAATGCTG -3’ (配列番号２)
(b)VSV-126
フォワードプライマー  5’- CCCGAATTTCAGACTCCTTG -3’ (配列番号４)
リバースプライマー    5’- GTTTCGGACCAATTCCAGAG -3’ (配列番号５)
(c)VSV-31
フォワードプライマー  5’- ATGAGGCAATTTGCATAGCC -3’ (配列番号７)
リバースプライマー    5’- CACTGGGCCGTTTGATAACT -3’ (配列番号８)
(d)VSV-54
フォワードプライマー  5’- AAACCCCGAGATAGCCAAGT -3’ (配列番号１０)
リバースプライマー    5’- GCTGGACTCATTCCCATAGC -3’ (配列番号１１)
(e)VSV-68
フォワードプライマー  5’- GAGACTCCTTGTGCACCATGT -3’ (配列番号１３)
リバースプライマー    5’- TCCCCGTGAACTAAAGACGT -3’ (配列番号１４)
上述の中でも(a)VSV-77が特に好ましい。上述の各プライマー対は、既知の方法で合成することができる。プライマー対は、例えば、固相ホスホルアミダイト法等を含む任意の核酸合成法により化学的に合成される。プライマー対は、トリエステル法でも合成できる。また、種々の自動オリゴヌクレオチド合成装置が市販されており、プライマー対は、当該自動オリゴヌクレオチド合成装置で合成することもできる。また、マルチヌクレオチド合成法も適宜使用することができる。
【００２４】
上述の各プライマー対の使用方法について説明する。上記プライマー対は、VSV由来の核酸を鋳型とするPCRで使用する。VSV由来の核酸は、例えば、血清又は血漿試料から公知の方法でVSVの全RNAを抽出し、逆転写反応によって合成したcDNAである。PCRは、市販のPCR装置で行うことができる。増幅反応の条件は、例えば、５０℃で２０分、９５℃で１５分、続いて次の９４℃で４５秒、６０℃で４５秒を、４５サイクル繰り返せばよい。
【００２５】
PCRによる増幅産物を定量することで、試料に含まれるVSVを検出及び／又は定量できる。増幅産物の定量方法は、インターカレーション法及びハイブリダイゼーション法等、特に限定されない。インターカレーション法では、二本鎖DNAに特異的に挿入されて蛍光を発する色素として、例えばSYBR Greenを用いればよい。ハイブリダイゼーション法では、増幅産物の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いればよい。当該プローブとしてはTaqMan（登録商標）が特に好ましい。増幅産物を定量するために、好ましくは、PCRによる増幅産物を経時的に測定するリアルタイム定量PCR法が用いられる。また、アガロースゲル電気泳動法等で増幅産物を定量してもよい。ハイブリダイゼーション法におけるハイブリダイゼーションの条件は、プローブが、増幅産物とはハイブリダイズするが、他の塩基配列からなる核酸とはハイブリダイズしない、ストリンジェントな条件である。
【００２６】
本実施の形態にかかるプローブは、上記プライマー対で増幅した増幅産物を定量するのに好適である。各プローブの塩基配列は下記に示される。プローブは、プライマー対と同様に、既知の方法で合成することができる。
(a)VSV-77
プローブ  5’- CCATGGTGGGTTCG -3’ (配列番号３)
(b)VSV-126
プローブ  5’- CCCAATCGGGAACTG -3’(配列番号６)
(c)VSV-31
プローブ  5’- CGAAAAATGGAATAACC -3’(配列番号９)
(d)VSV-54
プローブ  5’- CTCACATAGACAAGCTAG -3’(配列番号１２)
(e)VSV-68
プローブ  5’- CAGGGTTCAATTATG -3’(配列番号１５)
上述の中でも(a)VSV-77が特に好ましい。プローブは、好ましくは蛍光色素や放射性物質等によって標識される。蛍光色素としては、フルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体のＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、並びにシアニン色素等があげられる。
【００２７】
蛍光色素で標識したプローブとして、５’末端に蛍光色素が結合しており、蛍光共鳴エネルギー転移の原理によって当該蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが３’末端に結合したプローブが特に好ましい。クエンチャーとしては、テトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素等があげられる。
【００２８】
なお、本実施の形態にかかるプライマー対及びプローブの塩基配列は、上記で特定した塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であってもよい。また、当該プライマー対及びプローブの塩基配列は、上記で特定した塩基配列と配列同一性が９０％以上である塩基配列であってもよい。さらに、当該プライマー対及びプローブの塩基配列は、上記で特定した塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であってもよい。
【００２９】
次に、本実施の形態にかかる水疱性口内炎ウイルスインディアナ株の検出及び／又は定量用キットは、上記したプライマー対とプローブとを備える。
【００３０】
具体的には、第１の検出及び／又は定量用キットは、下記表１に示されるように、下記フォワードプライマー及びリバースプライマーと、下記プローブとを備える。
(a)VSV-77
フォワードプライマー  5’- CTGCCCTTCATAGGTTTTCG -3’ (配列番号１)
リバースプライマー    5’- CATCAACCTGGTCAATGCTG -3’ (配列番号２)
プローブ              5’- CCATGGTGGGTTCG -3’      (配列番号３)
第２の検出及び／又は定量用キットは、下記表１に示されるように、下記フォワードプライマー及びリバースプライマーと、下記プローブとを備える。
(b)VSV-126
フォワードプライマー  5’- CCCGAATTTCAGACTCCTTG -3’ (配列番号４)
リバースプライマー    5’- GTTTCGGACCAATTCCAGAG -3’ (配列番号５)
プローブ               5’- CCCAATCGGGAACTG -3’      (配列番号６)
第３の検出及び／又は定量用キットは、下記表１に示されるように、下記フォワードプライマー及びリバースプライマーと、下記プローブとを備える。
(c)VSV-31
フォワードプライマー  5’- ATGAGGCAATTTGCATAGCC -3’ (配列番号７)
リバースプライマー    5’- CACTGGGCCGTTTGATAACT -3’ (配列番号８)
プローブ              5’- CGAAAAATGGAATAACC -3’   (配列番号９)
第４の検出及び／又は定量用キットは、下記表１に示されるように、下記フォワードプライマー及びリバースプライマーと、下記プローブとを備える。
(d)VSV-54
フォワードプライマー  5’- AAACCCCGAGATAGCCAAGT -3’ (配列番号１０)
リバースプライマー    5’- GCTGGACTCATTCCCATAGC -3’ (配列番号１１)
プローブ              5’- CTCACATAGACAAGCTAG -3’   (配列番号１２)
第５の検出及び／又は定量用キットは、下記表１に示されるように、下記フォワードプライマー及びリバースプライマーと、下記プローブとを備える。
(e)VSV-68
フォワードプライマー  5’- GAGACTCCTTGTGCACCATGT -3’ (配列番号１３)
リバースプライマー    5’- TCCCCGTGAACTAAAGACGT -3’ (配列番号１４)
プローブ              5’- CAGGGTTCAATTATG -3’       (配列番号１５)
【００３１】
【表１】
2019013167.tif 000003
【００３２】
本発明によれば、生体内等で増殖する、又は生体内等に残存する、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株のG遺伝子を置換した（又は置換していない）組換えウイルスを高感度に検出・定量可能である。具体的には、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株のG遺伝子をエボラウイルスの糖蛋白質遺伝子と置き換えた組換えウイルスワクチンのワクチンベクターとしての水疱性口内炎ウイルスインディアナ株を高感度に検出・定量可能である。
【実施例】
【００３３】
インディアナ野生株のL遺伝子領域について全48セットのプライマーを作製し、同株の全長DNAを用いてSYBR Green法によるスクリーニングを実施した。SYBR GreenはDNAに結合するインターカレーターの一種であり、PCRによって合成された二本鎖DNAに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することによりPCR増幅産物の生産量をモニターできる。PCRは、Applied Biosystems 7500 fast(Applied  Biosystems社製)を用いた。データの解析には、付属の解析ソフト(7500 software v2.3)を用いた。SYBR Green法による一次スクリーニングではPower SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit(ThermoFisher社製)を用いた。PCRの条件はキットの推奨条件とした。一次スクリーニングの結果を図２に示す。「Ct」は、蛍光強度が検出閾値を超えた際のサイクル数を示す。
【００３４】
二次スクリーニングでは、図２に示されたプライマーセットにおいてCt値が20以下の優れた増幅効率を示すプライマーセットについてハイブリダイゼーション法(TaqMan(登録商標)法)を採用した。スクリーニングでは、TaqMan（登録商標）RNA-to-CT 1-Step Kit(ThermoFisher社製)を用いた。PCRの条件は、キットの推奨条件とした。プライマー濃度はフォーワード及びリバースともに最終400nMであり、プローブ濃度は最終200nMであった。Tmは5つのセット全て60°C程度であった。結果を図４に示す。なお５’末端の蛍光色素はFAMであり、３’末端のクエンチャーはBHQであった。
【００３５】
TaqMan法により、上記オリゴセットについて野生株とG遺伝子欠損株を用いて検討した。ここでVSVΔG RNAは、BHK-G細胞にVSVΔGを感染させ(MOI: 1.0)、24時間後の培養上清を回収し、回収したウイルス溶液からQIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen)を用いてキットのプロトコールに従いRNAを精製し、精製したRNAをPCRの鋳型として用いた。結果を下記表２及び図４に示す。最も感度・特異性の優れた組み合わせとしてVSV-77を決定した。図４に示されるようにpVSV-XN2（組換えVSV野生株）のプラスミドDNAだけでなく、ウイルス粒子（組換えVSVΔG）そのものから精製したRNAでも実際増幅可能であった。VSVΔGは野生株と同様にL遺伝子をゲノムに保有しているためである。また他のウイルスのDNA/RNAにおいては非特異的な増幅もなく、組換えVSV（野生株及びΔGウイルス）のDNA/RNAだけが特異的に増幅可能であった。
【００３６】
【表２】
2019013167.tif 000004
【００３７】
このオリゴセットVSV-77について、合成RNAを用いて検量線を作成した。結果を図５に示す。検量線の直線性は相関係数R2で評価されるところ、R2は0.999であった。また検量線の傾きも適性範囲であった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
水疱性口内炎ウイルスの検出・定量に使用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００３９】
配列番号１，２，４，５，７，８，１０，１１，１３，１４：プライマー
配列番号３，６，９，１２，１５：プローブ
【図１】
2019013167.tif 000005
【図２】
2019013167.tif 000006
【図３】
2019013167.tif 000007
【図４】
2019013167.tif 000008
【図５】
2019013167.tif 000009
【配列表】
2019013167000001.app