(57)【要約】【課題】生物学的試料の安定化の提供。【解決手段】本発明は、細胞含有生物学的試料中の細胞外核酸集団を安定化させるための、および含有される細胞のトランスクリプトームを安定化させるための方法、組成物、およびデバイスを提供する。本明細書で記載される安定化技術はまた、所望の場合、細胞外核酸集団および細胞内核酸集団の個別の解析も可能とする。さらに、本明細書で記載される安定化は、安定化試料中に含有される細胞、例えば、細胞形態および／または細胞表面特徴を解析することを可能とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明を導く研究は、助成金ｎ°２２２９１６の下で、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ’ｓ  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（ＦＰ７／２００７−２０１３）からの出資を受けた。
【０００２】
本明細書で開示される技術はとりわけ、細胞含有試料、特に、血液試料を安定化させるのに適する方法および組成物、ならびにそれぞれを安定化させた生物学的試料から核酸を単離するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸は、診断分野で重要なバイオマーカーである。例えば、ゲノムの転写物のプロファイル（特に、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分子的診断法においてバイオマーカーとして広く使用されており、疾患の転帰を予測し、個別化された治療コースを指し示す希望と共に、正常な生物学的過程および病理学的過程への洞察をもたらしている。したがって、核酸、特に、ＲＮＡのプロファイリングは、疾患の診断、予後診断、およびバイオマーカーを発見するための臨床試験において重要である。定量的情報を転写プロファイルから得る能力は、基礎生物学を探索し、疾患を診断し、薬物の創成を容易とし、治療剤を特異的な病態および遺伝子プロファイルに合せるのに強力なツールであり、また、生物学的過程および生物学的経路または治療的過程および治療的経路に関与性のデータベースを作成するのにも強力なツールである。近年では、下流のアッセイおよびデータ解析（解析工程）の著明な改善がなされている。しかし、特に、新たな生体分子標的についての試料の操作および試料の安定化などの解析前のステップは、発現プロファイルに対して重大な影響を及ぼし、後続の解析を損ないうる（例えば、Hartelら、２００１年、PahlおよびBrune、２００２年を参照されたい）ことが判明した。解析される試料
の安定化に注意を払わなければ、試料は、ターゲティングされる分子の発現プロファイルを大きく変化させうる輸送時および保存時において変化を受ける（例えば、Rainenら、２００２年；Baechlerら、２００４年を参照されたい）。したがって、遺伝子発現、特に、血液細胞遺伝子の発現は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける試料の操作に対して感受性である。発現プロファイルが試料の操作に起因して変化した場合、後続の解析は、元の試料の状況を反映せず、よって、患者の状況を反映せず、試料の操作時、輸送時、および保存時において発生した人為的プロファイルを測定する。したがって、発現プロファイルを安定化させ、これにより、信頼できる解析を可能とする安定化工程の最適化が必要とされている。特に、血液細胞遺伝子発現プロファイルの解析を可能とするためには、血液試料を安定化させることが必要とされている。
【０００４】
特に、血液試料などの試料の長時間にわたる安定化はかつて、フェノールおよび／またはクロロホルムなどの有機溶媒を添加することにより、または液体窒素中の直接的な凍結により、またはドライアイスを使用することにより実施した。これらの方法は、病院、医師による手術、または日常的な診断検査室では全く実施不可能な技法である。これらの問題を克服するために、ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸは、試料回収の時点におけるＲＮＡ遺伝子発現プロファイルを即時的に安定化させるための試薬を含有する血液回収真空チューブを伴う、ヒト血液を回収するための最初の研究用品（ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ
Ｔｕｂｅ）を開発した。それぞれの安定化組成物は、遺伝子の誘導および転写物の分解によるＲＮＡプロファイルの変化の危険性を伴わずに室温での輸送および保存を可能とする（例えば、ＵＳ６，６１７，１７０、ＵＳ７，２７０，９５３、Kruhofferら、２００
７年を参照されたい）。ここでは、血液試料の即時的な溶解を達成する他の安定化剤も、Ｔｅｍｐｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブという製品商標名の下に、ＡＢＩ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより市販されている。別の生成物は、Ｂｉｏｍａｔｒｉｃａ  Ｖａｃｕｅｔｔｅ  ＲＮＡｇａｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｕｂｅである。このチューブでもまた、溶解は回収時において即時的になされるが、血液のインキュベーション時におけるインタクトなＲＮＡにより示される通り、ＲＮアーゼは不活化されている。それぞれの方法の欠点は、安定化の結果として、細胞の完全な溶解がもたらされることである。細胞を破壊する結果として、細胞内核酸が、細胞外核酸と混合され、これにより、これらの２つの核酸集団の個別の解析が妨げられる。さらに、単離核酸の質および量ならびにそれらの発現プロファイルのそれぞれが解析の対象であるだけでなく、また、例えば、血液試料など、試料中に含有される特異的な細胞の存在、非存在、または数も解析の対象である。細胞の破壊は、細胞分取、または細胞濃縮、または細胞解析のそれぞれが不可能となるため、大きな欠点である。
【０００５】
したがって、とりわけ、細胞を安定化させるために意図される特異的な安定化試薬および血液回収チューブのそれぞれが提供されることも極めて多い。それぞれの製品は、保存の後で、試料の細胞含量を精査する、例えば、例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）解析、またはフローサイトメトリー（ＦＣ）もしくはＦＡＣＳ解析を介する異なる白血球の互いに対する比の変化により、腫瘍細胞の存在を検出することを可能とする。例えば、多くの作業流れでは、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳ解析のための、標準的なＥＤＴＡ血液回収チューブを使用するが、血液細胞は、保存時間にわたりわずかな溶解を示す。Ｓｔｒｅｃｋ  Ｉｎｃ．製のさらなる製品は、フローサイトメトリーによる免疫表現型解析のために全血液試料を保存するための、直接採取型真空血液回収チューブである。この製品は、白血球のサブセットを、フローサイトメトリー解析により識別することを可能とする、白血球抗原を保存する。白血球表面抗原分類（ＣＤ）マーカーの完全性を維持するための技術は、例えば、ＵＳ５，４６０，７９７およびＵＳ５，４５９，０７３によりカバーされている。
【０００６】
しかし、核酸解析および細胞解析のための試料を回収するのに、異なる安定化試薬、したがって、安定化チューブを使用することは煩瑣である。患者の部位における採取ごとに異なる試料回収用チューブ、例えば、異なる下流のアッセイ（例えば、細胞の検出およびＲＮＡの解析）に専用の血液回収チューブの数を低減することが必要とされている。したがって、試料の回収および安定化のためのシステムであって、細胞の形態を保存しながら、同時に、核酸を安定化させるためのシステムが必要とされている。
【０００７】
細胞の安定化と核酸の安定化との同時的な必要に取り組むために、ホルムアルデヒド放出剤の使用に基づく安定化システムを開発した。それぞれの安定化剤は、無細胞ＲＮＡ  ＢＣＴ（血液回収チューブ）という商標名の下に、Ｓｔｒｅｃｋ  Ｉｎｃ．から市販されている。１０ｍｌの血液回収チューブは、血漿中の無細胞ＲＮＡの、室温で最長３日間にわたる保存および安定化を意図する。保存剤は、血漿中の無細胞ＲＮＡを安定化させ、試料の処理時および保存時における、標的以外のバックグラウンドＲＮＡの血液細胞からの放出を防止する。ＵＳ２０１１／０１１１４１０は、同じ血液試料中の細胞およびＲＮＡの安定化を達成するための、ホルムアルデヒド放出性成分の使用について記載している。したがって、この文献は、安定化剤により、採取される血液中の血液細胞を安定化させ、これにより、細胞内ＲＮＡの、無細胞ＲＮＡまたはグロビンＲＮＡとの夾雑を防止し、ＲＮＡの合成を少なくとも２時間にわたり阻害し、血液細胞のタンパク質発現パターンを、血液採取時に照らして実質的に変化させずに保つように、血液細胞内の細胞内ＲＮＡを保存する技法について記載している。白血球は、それぞれの安定化させた試料から単離することができ、次いで、細胞内ＲＮＡを白血球から抽出する。しかし、使用されるホルムアルデヒド放出剤が、後続の核酸の単離工程に干渉するため、それぞれの安定化させた試料からの核酸の単離は極めて困難である。したがって、核酸の収率および／または純度は、とりわけ、ＲＮＡなどの核酸の安定化および単離を目的とする安定化法（例えば、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅ）を使用して安定化させた核酸の単離と比較して大きく低減される。
【０００８】
さらに、先行技術では、血液試料または組織試料などの細胞含有試料を安定化させるための方法であって、細胞、トランスクリプトーム、ゲノム、およびプロテオームを安定化させる方法も公知である。このような方法は、例えば、ＷＯ２００８／１４５７１０において開示されている。前記方法は、特異的な安定化化合物の使用に基づく。ホルムアルデヒド放出剤を伴う安定化法とは対照的に、核酸の単離は、安定化剤により損なわれない。
【０００９】
臨床的対象の細胞含有生物学的試料中に存在するさらなる核酸分子種は、細胞外核酸である。細胞外核酸は、血液中、血漿中、血清中、および他の体液中で同定されている。それぞれの試料中で見出される細胞外核酸は、ヌクレアーゼから保護されている（例えば、プロテオリピド複合体の形態で分泌されるため、タンパク質と会合するか、または小胞内に含有されている）という事実に起因して、分解に対してある程度耐性である。多くの医学的状態、悪性腫瘍、および感染性過程における、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡなどの細胞外核酸のレベルの上昇の存在は、とりわけ、疾患の進行についてスクリーニングし、診断し、予後診断し、監視し、潜在的な治療標的を同定し、処置の応答をモニタリングするための対象である。加えて、母体血液中の胎児ＤＮＡ／ＲＮＡの上昇も、例えば、性別の識別を決定し、染色体異常を評価し、妊娠と関連する合併症をモニタリングするのに使用されている。したがって、細胞外核酸は、特に、非侵襲的診断および予後診断において有用であり、例えば、出産前における非侵襲的な遺伝子検査、腫瘍学、移植医学、または他の多くの疾患など、多くの適用分野において診断マーカーとして使用することができ、よって、診断的関連性を有する（例えば、胎児または腫瘍に由来する核酸）。しかし、細胞外核酸はまた、健常なヒトにおいても見出される。細胞外核酸の一般的な適用法および解析法については、例えば、ＷＯ９７／０３５５８９、ＷＯ９７／３４０１５、Ｓｗａｒｕｐら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８１巻（２００７年）、７９５〜７９９頁；  Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．１０７５巻：４０〜４９頁（２００６年）；  ＦｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ、Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１７７５巻（２００７年）、１９１〜２３２頁；  Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａら（２００６年）、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、２５巻、１１号、６３５〜６４０頁；  Ｆａｎら（２０１０年）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５６巻：８頁において記載されている。
【００１０】
従来、細胞外核酸を血液などの細胞含有生物学的試料から単離する第１のステップは、前記試料、例えば、血液の場合なら、血清または血漿の、本質的に無細胞の画分を得ることである。次いで、血液試料を処理するときに、細胞外核酸を、前記無細胞画分、一般に、血漿から単離する。しかし、注意深く制御された条件を使用して、遠心分離時における細胞の破壊であって、細胞外核酸を、破壊時において放出される細胞内核酸と夾雑させうる破壊を防止することが重要であるので、試料の、本質的に無細胞の画分を得ることは、問題的である可能性があり、分離はしばしば、煩瑣で時間を要するマルチステップ工程となる。さらに、全ての細胞を除去することは、困難であることが多い。したがって、多くの処理された試料であって、一般に「無細胞」血漿または「無細胞」血清などと分類されることが多い試料は、実のところ、分離工程において除去されなかった残留量の細胞を依然として含有する。別の重要な検討事項は、ｅｘ  ｖｉｖｏのインキュベーションでは、典型的には、血液採取イベントから比較的短い時間内に、細胞の破壊に起因して、細胞内核酸が、試料中に含有される細胞から放出されることである。細胞の溶解が始まると、溶解した細胞は、さらなる核酸を放出し、これが、細胞外核酸と混合され、細胞外核酸を調べるために回収することがますます困難となる。先行技術では、これらの問題について論じられている（例えば、Ｃｈｉｕら（２００１年）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７巻：９号、１６０７〜１６１３頁；Ｆａｎら（２０１０年）およびＵＳ２０１０／０１８４０６９を参照されたい）。さらに、利用可能な細胞外核酸の量および回収可能性は、時間経過に応じて、分解に起因して減少しうる。
【００１１】
先行技術では、とりわけ、全血液中に含有される循環核酸を安定化させることを目的とする方法が公知である。一方法では、ホルムアルデヒドの使用を援用して、細胞膜を安定化させ、これにより、細胞の溶解を低減し、さらに、ホルムアルデヒドにより、ヌクレアーゼを阻害する。それぞれの方法については、例えば、ＵＳ７，３３２，２７７およびＵＳ７，４４２，５０６において記載されている。しかし、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出性物質の使用は、核酸分子間の架橋またはタンパク質と核酸との間の架橋を誘導することにより、細胞外核酸単離の有効性を損ないうるので、欠点を有する。血液試料を安定化させる代替的な方法は、例えば、ＵＳ２０１０／０１８４０６９およびＵＳ２０１０／０２０９９３０において記載されている。これにより、細胞含有生物学的試料を安定化させる手段をもたらして、例えば、このような試料中に含有される細胞外核酸の効率的な回収を可能とすることに対する大きな必要が裏付けられる。
【００１２】
全血液試料などの細胞含有生物学的試料中に含まれる遺伝子発現プロファイルおよび細胞外核酸集団の安定化を結果としてもたらし、これにより、このような安定化させた試料の操作、処理のそれぞれを容易とする、試料の処理技法を開発することが依然として持続的に必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第６，６１７，１７０号明細書
【特許文献２】米国特許第７，２７０，９５３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４６０，７９７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４５９，０７３号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１１／０１１１４１０号明細書
【特許文献６】国際公開２００８／１４５７１０号
【特許文献７】国際公開９７／０３５５８９号
【特許文献８】国際公開９７／３４０１５号
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１０／０１８４０６９号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１０／０２０９９３０号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｓｗａｒｕｐら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８１巻（２００７年）、７９５〜７９９頁
【非特許文献２】Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．１０７５巻：４０〜４９頁（２００６年）
【非特許文献３】ＦｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ、Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１７７５巻（２００７年）、１９１〜２３２頁
【非特許文献４】Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａら（２００６年）、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、２５巻、１１号、６３５〜６４０頁
【非特許文献５】Ｆａｎら（２０１０年）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５６巻：８頁
【非特許文献６】Ｃｈｉｕら（２００１年）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７巻：９号、１６０７〜１６１３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
先行技術による試料の安定化法の欠点のうちの少なくとも１つを克服することが本発明の目的である。特に、細胞含有試料、特に、全血液試料を安定化させることが可能な方法をもたらすことが目的である。特に、細胞含有試料中に含有される核酸を安定化させることを可能とする、試料の安定化法をもたらすことが目的である。さらに、細胞の溶解に基づかず、細胞含有試料中に含有される細胞外核酸集団のほか、含有される細胞の遺伝子発現プロファイルも安定化させる、試料の安定化法をもたらすことも目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ある種の添加剤が、細胞外核酸を含む細胞含有生物学的試料、特に、全血液試料または、例えば、血漿など、全血液に由来する試料を安定化させるのに驚くほどに有効であるという知見に基づく。これらの添加剤は、細胞外核酸集団を安定化させるのに高度に効率的であり、特に、ゲノムＤＮＡ、特に、断片化されたゲノムＤＮＡとの夾雑を回避するかまたは少なくとも著明に低減することが可能であることが判明した。さらに、これらの添加剤はまた、含有される細胞の遺伝子発現プロファイルも安定化させることが可能であり、これにより、遺伝子発現の信頼できるプロファイリングを可能とすることも判明した。先行技術の方法とは対照的に、安定化効果は、細胞の溶解に基づかない。したがって、本明細書で記載される安定化技術はまた、所望の場合、細胞外核酸集団および細胞内核酸集団の個別の解析も可能とする。さらに、本明細書で記載される安定化は、安定化試料中に含有される細胞、例えば、細胞形態および／または細胞表面特徴を解析することを可能とする。
【００１７】
本発明の第１の態様によれば、細胞含有試料を安定化させるための方法であって、試料を、式１
【化１】
2019013250.tif 000002
による少なくとも１つの化合物と接触させ、式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖状または分枝状に配置された炭素鎖の長さが原子１〜２０個である同一のまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄、またはセレニウム残基であり、式１による前記化合物がＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである方法が提供される。
【００１８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドなどのＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドは、細胞含有試料、特に、血液試料に極めて有効な安定化剤である。それぞれの化合物を添加することにより、細胞外核酸集団に対して有利な安定化効果がもたらされることが判明した。例により示される通り、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである、式１による化合物は、細胞含有試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させるのに適する。さらに、例により示される通り、これらの化合物は、含有される細胞の遺伝子転写プロファイルを安定化させ、したがって、これを保存するのに適する。例により示される通り、安定化後の安定化時間において、遺伝子発現プロファイルの変化は、低減されるか、なおまたは防止される。したがって、遺伝子発現プロファイルは、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドにより安定化させると、基本的に「凍結」され、したがって、試料の回収および試料の安定化のそれぞれの状態で保存される。細胞含有試料は、全血液、血漿、または血清から選択されることが好ましい。さらに、達成される細胞安定化特性は、例えば、血液試料中に含有される血液細胞または循環腫瘍細胞など、安定化試料中に含有される特異的な細胞を解析することを可能とし、また、これらを分離することも可能とする。
【００１９】
安定化効果を増強するためには、例えば、細胞含有試料中に含まれる細胞外核酸集団および／または含有される細胞の遺伝子転写プロファイルを安定化させるためにはまた、安定化剤の組合せを提供することも本発明の目的である。それぞれの組合せは、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである、上記で規定した、式１による少なくとも１つの化合物と、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤とを含みうる。驚くべきことに、特に、カスパーゼ阻害剤などのアポトーシス阻害剤は、細胞外核酸集団の、細胞内核酸、特に、試料中に含有される細胞、例えば、損傷細胞または死滅細胞に由来する、断片化されたゲノムＤＮＡとの夾雑を低減することが判明した。したがって、アポトーシス阻害剤を含む安定化のための組合せは、試料中に含有される細胞外核酸集団を、生物学的試料が得られ、それぞれが回収された時点においてそれが示した状態で実質的に保存するのに極めて有効である。
【００２０】
それぞれの組合せはまた、例えば、キレート剤など、安定化効果を増強するさらなる添加剤も含みうる。試料が、血液または血液に由来する試料である場合は通常、抗凝血剤もまた添加する。例えば、ＥＤＴＡなどのキレート剤は、この目的に適する。それぞれの安定化のための組合せは、第１の態様による、細胞含有試料を安定化させるための方法において使用すると有利でありうる。
【００２１】
第２の態様によれば、核酸を生物学的試料から単離するための方法であって、
ａ）本発明の第１の態様において規定される方法に従って細胞含有試料を安定化させるステップと、
ｂ）核酸を安定化試料から単離するステップと
を含む方法が提供される。
【００２２】
ステップａ）における安定化は、上記で記載した、本発明による第１の態様に従って達成する。上記で論じた通り、本発明による安定化はとりわけ、試料中に含有される細胞外核酸集団が、生物学的試料が得られた時点および回収された時点のそれぞれにおいてそれが示した状態で、実質的に保存されるという効果をもたらす。したがって、安定化させた試料のそれぞれから得られる細胞外核酸は、例えば、試料中に含まれる崩壊しつつある細胞から生じる細胞内核酸、特に、断片化されたゲノムＤＮＡとの夾雑を含む程度が、安定化させなかった試料から得られる細胞外核酸と比較して低い。この安定化／保存は、任意の後続の試験の精度を増強するため、細胞外核酸集団の実質的な保存は、重要な利点である。細胞外核酸集団の実質的な保存は、細胞外核酸集団の単離および後続の解析の標準化を可能とし、これにより、細胞外核酸画分に基づく診断適用または予後診断適用をより信頼でき、かつ、使用される保存／操作状態に依存しないものとする。これにより、単離された細胞外核酸のそれぞれについての診断適用可能性および予後診断適用可能性を改善する。特に、本発明の教示は、ある種の細胞外核酸分子の比を、試料が回収された時点における比と比較して実質的に一定に保ちうるという利点を有する。安定化は、細胞内核酸を細胞内に実質的に保ち、細胞外核酸を実質的に安定化させることを達成する。さらに、本明細書で記載される安定化法はまた、細胞内核酸を安定化させるのにも適する。試料を安定化させた後では、細胞内ＲＮＡは分解から保護され、さらに、含有される細胞の遺伝子転写プロファイルの変化も阻害される。したがって、本明細書で記載される安定化は特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分解を低減し、遺伝子の誘導を最小化する。したがって、安定化させた試料のそれぞれから単離される細胞内核酸は、例えば、遺伝子発現プロファイリング、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定化試料中の転写レベルの正確な表示を要求する他の解析法に十分に適する。さらに、本明細書で記載される安定化法は、所望の場合、安定化させた細胞外核酸を、同じ安定化試料由来の安定化させた細胞内核酸から個別に単離することを可能として有利である。
【００２３】
第３の態様によれば、細胞含有生物学的試料を安定化させるのに適する組成物であって、
ａ）上記で規定した、式１による少なくとも１つの化合物と、
ｂ）少なくとも１つの抗凝血剤、好ましくは、キレート剤と
を含む組成物が提供される。
【００２４】
それぞれの安定化組成物は、細胞および前記試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させることにより、細胞含有生物学的試料、特に、全血液、血漿、および／または血清を安定化させるのに特に有効である。さらに、それぞれの安定化組成物は、含有される細胞の遺伝子転写プロファイルを安定化させるのに有効である。さらに、例により示される通り、例えば、含有される細胞の細胞形態および／または細胞表面特徴などの重要な細胞特徴も保存することができる。それぞれの安定化組成物は、試料、その中にそれぞれ含有される細胞外核酸集団の品質を実質的に損なうことなく、試料、例えば、全血液の、室温で、少なくとも２日間、または、好ましくは、少なくとも３日間にわたる保存および／または操作、例えば、搬送を可能とする。したがって、本発明による安定化組成物を使用する場合は、試料中に含有される細胞外核酸集団または含有される細胞の遺伝子発現プロファイルに対する実質的な効果を伴わずに、試料の回収、例えば、血液の回収の時点と、核酸の抽出の時点とをずらすことができる。これは、異なる操作手順に帰せられる、細胞外核酸集団および細胞内核酸集団、特に、転写レベルの変動可能性を低減するので、重要な利点である。一実施形態によれば、組成物は、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤、好ましくは、カスパーゼ阻害剤をさらに含む。
【００２５】
第４の態様によれば、細胞含有生物学的試料、好ましくは、血液試料を回収するための容器が提供される。容器は、本発明の第３の態様による組成物を含む。安定化組成物を含むそれぞれの容器、例えば、試料回収用チューブを提供することは、試料をそれぞれの容器内に回収したらすぐ、試料を即時的に安定化させるという利点を有する。さらに、それぞれの試料の回収容器、特に、血液回収チューブは、血液細胞およびそれらの遺伝子転写プロファイルを安定化させることが可能であり、細胞外核酸を安定化させることが可能であり、任意選択で、血液試料中または血液に由来する試料中に含有されるウイルスおよびウイルス性核酸のそれぞれを安定化させることが可能である。これにより、さらなる問題も克服された。
【００２６】
第５の態様によれば、生物学的試料、好ましくは、血液を、患者から、本発明の第４の態様による容器のチャンバーへと直接回収するステップ、好ましくは、引き出すステップを含む方法が提供される。
【００２７】
第６の態様によれば、本発明の第３の態様による組成物を作製する方法であって、組成物の成分を混合する方法、好ましくは、溶液中で混合する方法が提供される。本明細書で使用される「溶液」という用語は特に、液体組成物、好ましくは、水性組成物を指す。溶液は、唯一の相の均一の混合物でありうるが、また、溶液が、例えば、沈殿物などの固体成分を含むことも本発明の範囲内にある。
【００２８】
当業者には、以下の記載および付属の特許請求の範囲から、本適用の他の目的、特色、利点、および態様が明らかとなろう。しかし、以下の記載、付属の特許請求の範囲、および具体的な実施例は、適用の好ましい実施形態を指し示すが、例示だけを目的として与えられることを理解されたい。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞含有生物学的試料を、式１
【化６】
2019013250.tif 000003
による少なくとも１つの化合物と接触させることにより該試料を安定化させるための方法であって、式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖状または分枝状に配置された炭素鎖の長さが原子１〜２０個である同一のまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄またはセレニウム残基であり、式１による該化合物がＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである、方法。
（項目２）
式１による前記化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである、項目１に記載の方法。
（項目３）
以下の特徴：
ａ）前記試料中に存在する核酸の分解を、前記安定化により低減すること、
ｂ）含有される細胞のトランスクリプトームおよび／または転写レベルを安定化させること、
ｃ）ｃ−ｆｏｓ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−８、およびｐ５３から選択される１または複数のマーカー遺伝子の前記転写レベルを、安定化の際少なくとも４８時間にわたり安定化させること、
ｄ）前記細胞含有試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させるのに適すること、
ｅ）前記試料中に含有される細胞から前記試料のうちの無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出を低減すること、および／または
ｆ）前記細胞含有生物学的試料中に含まれる細胞を安定化させること
のうちの１または複数を有する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
血液試料を、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドおよび抗凝血剤と接触させるステップを含み、含有される細胞内の転写レベルを安定化させる、前記血液試料を安定化させるための、項目１から３の一項または複数項に記載の方法。
（項目５）
以下の特徴：
ａ）前記安定化が、前記細胞含有試料中に含有される有核細胞の溶解を促進しないこと、
ｂ）前記安定化法が、前記試料の架橋を伴わずに実施されること、ならびに／または
ｃ）前記安定化が、核酸−核酸間、タンパク質−核酸間、および／もしくはタンパク質−タンパク質間の架橋を誘導する架橋剤の使用を伴わないこと
のうちの１または複数を有する、項目１から４の一項または複数項に記載の方法。
（項目６）
前記細胞含有試料を、カスパーゼ阻害剤、好ましくは、汎カスパーゼ阻害剤とさらに接触させる、項目１から５の一項または複数項に記載の方法。
（項目７）
以下の特徴：
ａ）安定化組成物中にＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、および必要に応じてさらなる添加剤が含まれ、前記細胞含有試料の特定の容量に対する該安定化組成物の容量比が、１０：１〜１：２０、５：１〜１：１５、１：１〜１：１０、および１：２〜１：５から選択されること、
ｂ）前記安定化細胞含有試料を、核酸解析法および／もしくは核酸検出法に供すること、
ｃ）細胞内核酸および／もしくは細胞外核酸を、前記安定化試料から単離し、該単離核酸を解析および／もしくは検出すること、
ｄ）前記安定化試料中に含まれる細胞を、除去すること、ならびに／または
ｅ）（ｉ）前記安定化細胞含有生物学的試料、（ｉｉ）細胞を除去した安定化試料、および／もしくは（ｉｉｉ）前記試料から除去した細胞を保存すること、
ｆ）核酸を、前記安定化試料から単離すること
のうちの１または複数を有する、項目１から６の一項または複数項に記載の方法。
（項目８）
前記除去された細胞を解析し、そして／または核酸またはタンパク質などの生体分子を、前記除去された細胞から単離する、項目７に記載の方法。
（項目９）
核酸を生物学的試料から単離するための方法であって、
ａ）項目１から８の一項または複数項に記載の方法に従って細胞含有試料を安定化させるステップと、
ｂ）核酸を前記安定化試料から単離するステップと
を含む方法。
（項目１０）
ステップｂ）が、細胞内核酸、好ましくは、細胞内ＲＮＡを単離するステップを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
ステップｂ）が、細胞外核酸を単離するステップを含む、項目９または１０に記載の方法。
（項目１２）
前記試料が血液であり、細胞を残りの試料から分離し、細胞外核酸を前記残りの試料から単離する、項目９から１１の一項または複数項に記載の方法。
（項目１３）
前記単離核酸を、さらなるステップｃ）において、処理および／または解析し、好ましくは、
ｉ）修飾し、
ｉｉ）少なくとも１つの酵素と接触させ、
ｉｉｉ）増幅し、
ｉｖ）逆転写させ、
ｖ）クローニングし、
ｖｉ）配列決定し、
ｖｉｉ）プローブと接触させ、
ｖｉｉｉ）検出し、
ｉｘ）定量化し、
ｉｘ）同定し、そして／または
ｘ）遺伝子発現プロファイリングについて解析する、項目９から１２の一項または複数項に記載の方法。
（項目１４）
細胞含有生物学的試料を安定化させるのに適する組成物であって、
ａ）式１
【化７】
2019013250.tif 000004
による少なくとも１つの化合物であって、式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖状または分枝状に配置された炭素鎖の長さが原子１〜２０個である同一のまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄、またはセレニウム残基であり、式１による該化合物がＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである化合物と、
ｂ）少なくとも１つの抗凝血剤と
を含む組成物。
（項目１５）
前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドが、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドであり、前記抗凝血剤が、キレート剤である、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
前記組成物が、アポトーシス阻害剤を含む、項目１４または１５に記載の組成物。
（項目１７）
以下の特徴：
ａ）細胞を安定化させ、前記細胞含有生物学的試料中に含有される細胞から前記試料のうちの無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出を低減することが可能であること、
ｂ）前記生物学的試料中に含まれる前記細胞外ＤＮＡ集団の、前記安定化試料中に含有される細胞に由来するゲノムＤＮＡによる希釈を低減することが可能であること、
ｃ）前記生物学的試料中に含まれる前記細胞外核酸集団の、前記安定化試料中に含有される細胞に由来する細胞内核酸による希釈を低減することが可能であること、
ｄ）前記安定化組成物が、細胞の溶解を誘導または促進する濃度で添加剤を含まないこと、
ｅ）前記安定化組成物が、タンパク質−ＤＮＡ間および／もしくはタンパク質−タンパク質間の架橋を誘導する架橋剤を含まないこと、
ｆ）前記安定化組成物が、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、もしくはホルムアルデヒド放出剤を含まないこと、
ｇ）前記安定化組成物が、毒性作用物質を含まないこと、ならびに／または
ｈ）前記安定化組成物が、前記細胞含有生物学的試料中に含まれる細胞外核酸集団を、冷蔵せずに、好ましくは室温で、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも２日間〜３日間、少なくとも２日間〜６日間、および／もしくは少なくとも２日間〜７日間から選択される期間、安定化させることが可能であること、
ｉ）前記組成物が、含有される細胞の遺伝子転写プロファイルを安定化させることが可能であり、かつ／もしくは細胞含有試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させることが可能であること、ならびに／または
ｊ）前記安定化組成物が、血液試料との混合物として提供されること
のうちの１または複数を有する、項目１４から１６の一項または複数項に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１〜４は、実施例１の試料由来のＦＯＳ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ８、およびＴＰ５３の相対転写レベルを示す図である。転写物は、リアルタイムモノプレックスＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して解析した。個別の試料のサイクル閾値（ＣＴ）として与えられる転写レベルを、白色バーとして示し、平均を、黒色に塗りつぶしたバーとして、標準偏差と共に示し、遺伝子発現変化および各ＰＣＲラン内のＲＴ−ＰＣＲ陽性対照として用いられる、異なる実験のさらなるドナーによる対照試料（プレート対照）を、影を付したバーとして示す。
【図２】図１〜４は、実施例１の試料由来のＦＯＳ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ８、およびＴＰ５３の相対転写レベルを示す図である。転写物は、リアルタイムモノプレックスＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して解析した。個別の試料のサイクル閾値（ＣＴ）として与えられる転写レベルを、白色バーとして示し、平均を、黒色に塗りつぶしたバーとして、標準偏差と共に示し、遺伝子発現変化および各ＰＣＲラン内のＲＴ−ＰＣＲ陽性対照として用いられる、異なる実験のさらなるドナーによる対照試料（プレート対照）を、影を付したバーとして示す。
【図３】図１〜４は、実施例１の試料由来のＦＯＳ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ８、およびＴＰ５３の相対転写レベルを示す図である。転写物は、リアルタイムモノプレックスＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して解析した。個別の試料のサイクル閾値（ＣＴ）として与えられる転写レベルを、白色バーとして示し、平均を、黒色に塗りつぶしたバーとして、標準偏差と共に示し、遺伝子発現変化および各ＰＣＲラン内のＲＴ−ＰＣＲ陽性対照として用いられる、異なる実験のさらなるドナーによる対照試料（プレート対照）を、影を付したバーとして示す。
【図４】図１〜４は、実施例１の試料由来のＦＯＳ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ８、およびＴＰ５３の相対転写レベルを示す図である。転写物は、リアルタイムモノプレックスＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して解析した。個別の試料のサイクル閾値（ＣＴ）として与えられる転写レベルを、白色バーとして示し、平均を、黒色に塗りつぶしたバーとして、標準偏差と共に示し、遺伝子発現変化および各ＰＣＲラン内のＲＴ−ＰＣＲ陽性対照として用いられる、異なる実験のさらなるドナーによる対照試料（プレート対照）を、影を付したバーとして示す。
【図５】図５は、１つのドナーからＥＤＴＡチューブへと回収された血液由来の試料アリコートについての蛍光活性化細胞分取（αＣＤ３  ＦＡＣＳ）解析を示す図である。ＰＥをコンジュゲートさせた抗ＣＤ３抗体を使用して、血液の回収後（０時間）にインキュベートされていない試料、ならびに１日間にわたるＲＴでのインキュベーション後における試料、および３日間にわたるＲＴでのインキュベーション（２４時間、７２時間）後における試料由来の血液アリコートをＦＡＣＳにかけた。蛍光標識された細胞の数をカウントし、イベント１回当たりの蛍光シグナルの強度を定量化した。蛍光シグナルの強度（ｘ軸）および数（ｙ軸）を、ヒストグラムとして示す。非特異的な弱い蛍光シグナル（−）を、細胞に特異的に結合した抗ＣＤ３抗体によりもたらされる、強い特異的な蛍光シグナル（＋）から差別化するために、閾値を規定した。閾値を、各図内の垂直破線として示す。  ＦＡＣＳ（−）対照（ＥＤＴＡ）＝、ＦＡＣＳ解析の陰性対照として用いられるように、スタビライザーにより処置せずに置かれ、そして、抗体と共にインキュベートされなかった、ＥＤＴＡチューブへと回収された血液のアリコート（非染色試料）。検出される弱いシグナルは、自己蛍光および非特異的に結合した抗体（バックグラウンド染色）によりもたらされる。  ＦＡＣＳ（＋）対照（ＥＤＴＡ）＝、ＦＡＣＳ解析の陽性対照として用いられるように、スタビライザーにより処置せずに置かれ、そして、抗体と共にインキュベートされた、ＥＤＴＡチューブへと回収された血液のアリコート（染色試料）。ＦＡＣＳ（−）対照においてもまた現れる弱いシグナル以外に、もっぱら細胞に特異的に結合した抗体によりもたらされる強いシグナルも検出された。  ＤＭＰＡに対する容量比５％の試験溶液＝ＥＤＴＡチューブへと回収された血液のアリコートであり、スタビライザーと混合された（最終濃度を、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、ｐＨ５．５で５倍濃度のＭＯＰＳ緩衝液に対する容量比５％として）後で、抗体を伴うインキュベーションを施されたアリコート（染色試料）。  ＦＡＣＳ（＋）対照／試験溶液＝ＦＡＣＳ（＋）対照（ＥＤＴＡ）［グレーの領域］と被験試料［黒色の直線］とを組み合わせたヒストグラム。
【図６】図６〜７は、カスパーゼ阻害剤を伴わないＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大に対する影響（実施例２）を示す図である。
【図７】図６〜７は、カスパーゼ阻害剤を伴わないＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大に対する影響（実施例２）を示す図である。
【図８】図８〜１６は、カスパーゼ阻害剤と組み合わせた、異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大に対する影響（実施例３〜５）を示す図である。
【図９】図８〜１６は、カスパーゼ阻害剤と組み合わせた、異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大に対する影響（実施例３〜５）を示す図である。
【図１０】図８〜１６は、カスパーゼ阻害剤と組み合わせた、異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大に対する影響（実施例３〜５）を示す図である。
【図１１】図８〜１６は、カスパーゼ阻害剤と組み合わせた、異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大に対する影響（実施例３〜５）を示す図である。
【図１２】図８〜１６は、カスパーゼ阻害剤と組み合わせた、異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大に対する影響（実施例３〜５）を示す図である。
【図１３】図８〜１６は、カスパーゼ阻害剤と組み合わせた、異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大に対する影響（実施例３〜５）を示す図である。
【図１４】図８〜１６は、カスパーゼ阻害剤と組み合わせた、異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大に対する影響（実施例３〜５）を示す図である。
【図１５】図８〜１６は、カスパーゼ阻害剤と組み合わせた、異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大に対する影響（実施例３〜５）を示す図である。
【図１６】図８〜１６は、カスパーゼ阻害剤と組み合わせた、異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大に対する影響（実施例３〜５）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、方法、組成物、およびデバイスを対象とし、したがって、細胞含有生物学的試料中に含まれる細胞外核酸集団および／または含有される細胞の遺伝子転写プロファイルを安定化させるのに適する技術を対象とする。本明細書で開示される安定化技術は、例えば、細胞外核酸集団が、細胞内核酸、特に、断片化されたゲノムＤＮＡであって、試料中に含有される損傷した細胞および／または死滅しつつある細胞に由来する細胞内核酸、例えば、これらから放出される細胞内核酸と夾雑する危険性を低減する。さらに、本明細書で開示される安定化技術は、含有される細胞の遺伝子転写プロファイルを実質的に保存し、これにより、遺伝子発現プロファイルの信頼できる解析を可能とする。さらに、本明細書で記載される安定化は、細胞外核酸の細胞内核酸との夾雑およびこの逆を防止し、同じ安定化細胞含有試料由来の細胞外核酸集団および細胞内核酸の個別の解析を可能とする。したがって、本発明は、含有される細胞の溶解を伴わずに、試料の安定化を達成し、これにより、その中に含まれる細胞外核酸集団の安定化を達成する。どちらかといえば、試料中に含有される細胞を安定化させ、これにより、細胞内核酸の放出を実質的に防止または低減する。さらに、例により示される通り、変化を阻害し、したがって、転写レベルの変化を阻害することにより、含有される細胞の遺伝子転写プロファイルを実質的に保存する。さらに、細胞は、安定化試料から回収することもでき、これらは、異なる解析に適する。例えば、所望の場合、含有される細胞の細胞形態および／または細胞表面特徴を解析することができる。さらに、安定化試料は、例えば、腫瘍細胞、例えば、全血液試料中に存在する循環腫瘍細胞など特異的細胞の存在または非存在について解析することができる。本発明の方法および組成物により達成される、核酸の目覚ましい安定化は、試料の品質およびその中に含有される細胞外核酸のそれぞれを危険にさらすことなく、室温で長時間にわたる安定化試料の保存および／または操作を可能とする。本発明の教示を使用することにより、細胞外核酸集団の組成および細胞内トランスクリプトームを安定化させ、したがって、試料が得られた時点において実質的に保存するので、試料の回収と核酸の抽出との間で時間が経過しても、細胞外核酸集団の組成に対する著明な影響を及ぼすことはない。これは、試料の操作／保存における変動がその品質および細胞外核酸集団の組成のそれぞれに及ぼす影響が小さいため、例えば、診断的または予後診断的な細胞外核酸解析の標準化を可能とし、これにより、先行技術の方法を凌ぐ重要な利点をもたらす。したがって、試料および安定化させた試料のそれぞれから得られる細胞外核酸のそれぞれは、より比較可能となる。さらに、含有される細胞の遺伝子転写プロファイルの安定化の達成は、安定化試料の長期にわたる保存の後でなお、信頼できる遺伝子発現解析を可能とする。さらに、本発明の教示は、細胞外核酸の細胞内核酸との夾雑、特に、本発明の教示がなければ、崩壊しつつある細胞から放出される、断片化されたゲノムＤＮＡとの夾雑を回避および低減することのそれぞれのために、試料中に含有される細胞を、試料の無細胞部分から直接分離する必要性を排して有利である。この利点は、試料の操作、特に、全血液試料の操作を大幅に簡略化する。例えば、診療所において得られ、本発明の教示に従って安定化させた全血液試料は、室温で搬送することができ、細胞外核酸を含有する血漿は、受領する臨床検査室において、含有される細胞から簡便に分離することができる。しかし、本発明の教示はまた、細胞を枯渇させた生物学的試料、または一般に、「無細胞」と称する試料、例えば、血漿または血清などの血液を処理する場合にも有利である。それぞれの細胞枯渇生物学的試料または「無細胞」生物学的試料は、依然として（また、使用される分離工程にも応じて）残留細胞、特に、ゲノムＤＮＡを含み、したがって、（潜在的な）残留細胞が、搬送または保存工程において損傷されるかまたは死滅する場合、細胞外核酸集団が細胞内核酸、特に、断片化されたゲノムＤＮＡと一層夾雑する危険性を提起する白血球を含む。本発明により教示される安定化法を使用する場合、この危険性は、大幅に低減される。本発明の技術は、試料の細胞外核酸集団および含有される細胞の遺伝子発現プロファイルを、試料を回収し、安定化剤と接触させた時点において効率的に保存することを可能とするため、細胞外核酸を前記試料から単離する目的で、前記試料を、細胞外核酸集団の細胞内核酸との夾雑を実質的に回避および低減することのそれぞれを行いながら、受領施設において適切に精査することができる。細胞内核酸は、安定化させた細胞から単離することができ、例えば、遺伝子発現プロファイリングのために使用することができる。また、例えば、検査室など、試料を受領する施設は通常、例えば、高速遠心分離機など、例えば、血漿中など、細胞枯渇試料中に存在しうる残留細胞を含む試料中に含まれる細胞を効率的に除去するのに必要な装置（または他の手段；下記もまた参照されたい）も有する。このような装置は、試料が得られる施設内には存在しないことが多い。したがって、本発明は、例えば、全血液試料など、大量の細胞を含む生物学的試料を安定化させる場合に多くの利点を有し、また、少量の細胞だけを含む生物学的試料、または例えば、血漿、血清、尿、唾液、滑液、羊水、涙液、膿漿、リンパ液、体液、脳脊髄液などの細胞を含有することだけが疑われる生物学的試料を安定化させる場合にも重要な利点を有する。
【００３１】
第１の態様によれば、試料を、式１
【化２】
2019013250.tif 000005
による少なくとも１つの化合物と接触させることにより、細胞含有試料、好ましくは、血液試料を安定化させるための方法であって、式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖状または分枝状に配置された炭素鎖の長さが原子１〜２０個である同一のまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄、またはセレニウム残基であり、式１による前記化合物がＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである方法が提供される。
【００３２】
したがって、第１の態様では、試料を少なくとも１つのＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドと接触させることにより、細胞含有生物学的試料を安定化させるための方法が提供される。Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド（N,N-dialklpropanamide）とは、式１［式中
、Ｒ１は、Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一のアルキル残基または異なるアルキル残基であり、Ｒ４は、酸素である］による化合物である。
【００３３】
提示される例により示される通り、このような化合物はとりわけ、細胞含有試料に対する目覚ましい安定化効果を達成するのに有効であり、例えば、安定化試料中の細胞外核酸集団の組成を実質的に保存するのに有効である。これにより、細胞外核酸集団が、細胞内核酸、特に、含有される細胞、例えば、損傷細胞または死滅細胞に由来する断片化されたゲノムＤＮＡと夾雑する危険性を低減し、そして／または試料中に存在する核酸の分解を低減および阻害することのそれぞれを行う。これにより、前記試料中に含まれる細胞外核酸集団の組成を実質的に保存することおよび安定化させることのそれぞれの効果がもたらされる。また、式１による１または複数の化合物の混合物も安定化のために使用することができる。
【００３４】
本明細書で使用される「細胞外核酸」または「細胞外核酸」という用語は特に、細胞内に含有されない核酸を指す。それぞれの細胞外核酸はまた、無細胞核酸と称することも多い。本明細書では、これらの用語を、同義語として使用する。したがって、細胞外核酸は通常、試料中の細胞の外側または複数の細胞の外側に存在する。「細胞外核酸」という用語は、例えば、細胞外ＲＮＡのほか、細胞外ＤＮＡも指す。例えば、血漿などの体液などの生物学的試料の無細胞画分（それぞれの一部）内で見出される典型的な細胞外核酸の例は、例えば、細胞外腫瘍関連ＤＮＡおよび／もしくは細胞外腫瘍関連ＲＮＡまたは腫瘍に由来するＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡなどの哺乳動物細胞外核酸、他の細胞外疾患関連ＤＮＡおよび／または細胞外疾患関連ＲＮＡ、後成的に修飾されたＤＮＡ、胎児性ＤＮＡおよび／または胎児性ＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなどの低分子干渉ＲＮＡ、ならびに哺乳動物以外の細胞外核酸、例えば、ウイルス核酸、細胞外核酸集団へと放出される病原体核酸であって、例えば、原核生物（例えば、細菌）、ウイルス、真核生物寄生虫、または真菌から放出される病原体核酸などを含むがこれらに限定されない。細胞外核酸集団は通常、損傷細胞または死滅細胞から放出されたある量の細胞内核酸を含む。例えば、血液中に存在する細胞外核酸集団は通常、損傷細胞または死滅細胞から放出された細胞内グロビンｍＲＮＡを含む。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じる天然の過程である。細胞外核酸集団内に存在するこのような細胞内核酸はなお、後続の核酸検出法における対照の目的にもかないうる。本明細書で記載される安定化法は特に、細胞外核酸集団内に含まれるゲノムＤＮＡなどの細胞内核酸の量が、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける試料の操作に起因して、細胞含有試料を回収した後で著明に増大する危険性を低減する。したがって、ｅｘ  ｖｉｖｏ操作のための細胞外核酸集団の変化を低減し、なお防止することもできる。一実施形態によれば、細胞外核酸は、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、体液、脳脊髄液、痰、涙液、汗、羊水、またはリンパ液などの細胞含有生物学的試料としての体液から得られる細胞外核酸、および細胞含有生物学的試料としての体液中に含まれる細胞外核酸のそれぞれである。本明細書では、本発明者らは、循環体液から得られる細胞外核酸を、循環細胞外核酸または循環無細胞核酸と称する。一実施形態によれば、「細胞外核酸」という用語は特に、哺乳動物細胞外核酸を指す。例は、腫瘍と関連する細胞外核酸もしくは腫瘍に由来する細胞外核酸、炎症もしくは傷害、特に、外傷に起因して放出される細胞外核酸、他の疾患と関連して放出される細胞外核酸および／もしくは他の疾患に起因して放出される細胞外核酸、または胎児に由来する細胞外核酸など、疾患と関連する細胞外核酸または疾患に由来する細胞外核酸を含むがこれらに限定されない。本明細書で記載される、１または複数の「細胞外核酸」という用語はまた、他の試料、特に、体液以外の生物学的試料から得られる細胞外核酸も指す。通常、複数の細胞外核酸が試料中に含まれている。通常、試料は、複数の種類または型の細胞外核酸を含む。本明細書で使用される「細胞外核酸集団」という用語は特に、細胞含有試料中に含まれる、異なる細胞外核酸の集合を指す。細胞含有試料は通常、特徴的な細胞外核酸集団を含み、したがって、固有の細胞外核酸集団を含む。したがって、具体的な試料の細胞外核酸集団内に含まれる１または複数の細胞外核酸の型、種類および／または量は、重要な試料特徴である。したがって、上記で論じた通り、試料の細胞外核酸集団内に含まれる１もしくは複数の細胞外核酸の組成および／または量は、治療分野、予後診断分野、または診断分野において貴重な情報をもたらしうるので、前記細胞外核酸集団を安定化させ、したがって、これを実質的に保存することは重要である。したがって、細胞外核酸集団のプロファイルを効率的に安定化させれば有利である。特に、試料を回収した後における夾雑を低減し、よって、細胞外核酸集団の細胞内核酸による希釈、特に、ゲノムＤＮＡの希釈を低減することは重要である。本発明に従う安定化技術により達成しうる細胞外核酸集団の実質的な保存は、試料中の細胞外核酸の集団を、安定化時間にわたり、試料を安定化させたときの細胞外核酸の集団と比較して、実質的に不変化のまま維持することを可能とする。少なくとも、含まれる細胞外核酸の量、品質、および／または組成に照らした細胞外核酸集団の変化、特に、放出されるゲノムＤＮＡの増大に帰せられる変化は、安定化時間にわたり、安定化させなかった試料または対応する試料、例えば、血液試料または血液に由来する試料の場合なら、ＥＤＴＡにより安定化させたと比較して大幅に（好ましくは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）低減される。
【００３５】
さらに、上記で記載した通り、本発明の方法はまた、細胞内核酸、特に、細胞内ＲＮＡを安定化させるのにも適する。細胞含有試料を、式１によるＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドと接触させる結果として、含有される細胞の遺伝子転写レベルが安定化する。したがって、安定化試料中の新たな転写物の産生および既存の転写物の分解は、安定化させなかった試料と比較して阻害され、これにより、含有される細胞の遺伝子転写プロファイルは、安定化の際、実質的に「凍結」される。したがって、安定化はまた、転写レベルを、試料の回収時および安定化時においてそれらが示した状態で維持することにより、トランスクリプトームを安定化させるのに適する。「トランスクリプトーム」という用語は特に、１つの細胞内または細胞の集団内で産生された、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡなど、他の非コードＲＮＡを含む、全てのＲＮＡ分子のセットを指す。例により裏付けられる通り、血液試料などの細胞含有生物学的試料は、実質的な転写レベルの変化を伴わずに、少なくとも３日間にわたり安定化させることができ、なお長期にわたり安定化させることもできた。遺伝子転写プロファイルは特に、ＲＮＡの分解を低減し、特に、遺伝子の誘導または下方調節など、遺伝子発現の変化を最小化することにより安定化させる。理論に束縛されることなく述べると、安定化のために本明細書で使用される、式１による化合物は、細胞過程を阻害し、これにより、転写物の新たな合成のほか、既存の転写物の分解を阻害すると考えられる。式１による化合物は、細胞内に入り、したがって、これらの効果を達成するように細胞透過性であると考えられる。したがって、細胞含有試料の回収および安定化の後で、回収時および安定化時のそれぞれにおいて存在する、ｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子発現プロファイルが保存される。さらに、ＲＮＡの品質および完全性も維持され、これにより、試料の回収および安定化のそれぞれの時点における、ｉｎ  ｖｉｖｏの転写レベルの正確な表示がもたらされ、真正で正確な転写レベルを得ることが可能となる。安定化の際のｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子転写プロファイルの保存は、例えば、安定化させた試料のそれぞれを使用して、遺伝子発現プロファイリング、または転写レベルの正確な表示を要求する他の解析法を実施することを可能とする。しかし、所望されるとはいえなお、全ての転写レベルを安定化させることも、それらを同等に十分に安定化させることも必要でないことが多い。これもまた遺伝子転写プロファイルを安定化させる先行技術について通常なことである通り、特異的な標的転写物または新たな標的転写物の安定化特徴を検証すべきであり、したがって、特異的な標的転写物または新たな標的転写物に対する効能特徴を検証すべきである。遺伝子転写プロファイルまたは特異的な転写レベルの安定化の達成は、例えば、遺伝子転写プロファイルの安定化を解析するために確立されたマーカー遺伝子に基づき決定することができる。一実施形態によれば、方法により達成される、含有される細胞の遺伝子転写プロファイルまたは転写レベルを安定化させる結果として、ｃ−ｆｏｓ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−８、およびｐ５３から選択される１または複数、好ましくは、２つ以上のマーカー遺伝子が、安定化の際少なくとも４８時間にわたり安定化する。これらのマーカー遺伝子は、保存時において極めて不安定的な転写物をもたらすものとして同定されており、したがって、試料を回収した後の、適切な安定化の非存在下において、上方調節または下方調節される。したがって、これらの遺伝子の転写レベルは、遺伝子転写レベルの安定化が達成されたのかどうかを解析するマーカーとして適する。安定化効果は、実施例で記載されるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して解析することができる。一実施形態によれば、これらのマーカー遺伝子のうちの１または複数の転写レベルは、Ｔ０（安定化点）と安定化時間の終点との間で、１．５ＣＴ値、好ましくは、１．２５ＣＴ値、より好ましくは１ＣＴ値を超えて変化しない。それぞれの安定化効果は、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、または少なくとも９６時間にわたり達成することが好ましい。それぞれの安定化の特徴は少なくとも、マーカー遺伝子であるｃ−ｆｏｓ、ＩＬ８、およびＩＬ−１ベータにより達成することが好ましく、前述のマーカー遺伝子の全てにより達成することが好ましい。例により示される通り、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドは、それぞれの安定化効能を達成し、したがって、好ましいスタビライザーである。
【００３６】
さらに、本発明による方法は、細胞の溶解に基づかないので、細胞は、安定化後の時間において、安定化試料から分離することができ、安定化試料から単離された細胞は解析に適する。例えば、上記で記載した通り、ＲＮＡなどの細胞内核酸は、含まれる細胞から単離することができ、解析することができる。さらに、安定化試料中の細胞の保存は、細胞を分取または捕捉し、例えば、腫瘍細胞などの特異的細胞をなお濃縮し、次いで、特異的に解析する可能性も開く。例えば、循環腫瘍細胞を単離することができ、それらの遺伝子発現プロファイルを解析することができる。さらに、得られた細胞を特徴付けるために、細胞形態および／または細胞マーカー、特に、細胞表面マーカーを解析することができる。さらに、細胞内核酸は、前記濃縮された特異的細胞からも単離することができる。例えば、ＲＮＡは、前記細胞から単離することができる。本明細書で記載される安定化法の転写レベル安定化特性は、単離されるＲＮＡを、遺伝子発現プロファイリングおよび他の重要な解析に使用することを可能として有利である。したがって、本明細書で記載される安定化法は、核酸を濃縮された細胞から抽出する前における細胞の濃縮を可能とし、これにより、例えば、細胞含有試料中、例えば、血液試料中の循環腫瘍細胞の希少なイベントを検出する可能性を増大させるため、例えば、がんまたは他の疾患の分子的診断において有利である。これはまた、特異的なバイオマーカー、特に、希少なバイオマーカーを試料中で同定する可能性も増大させる。
【００３７】
一実施形態によれば、細胞含有試料は、血液試料であり、この場合、白血球を安定化させる。これは、白血球を安定化試料から分離することを可能とする。含有される血液細胞のうちの少なくとも１つの型を、少なくとも４８時間であることが好ましい安定化時間において安定化させれば、白血球は安定化する。一実施形態によれば、血液試料内に含有されるリンパ球および／または単球を安定化させる。本明細書で記載される安定化は、細胞含有試料中に含有される有核細胞の溶解を誘導または促進しない。したがって、安定化は、細胞の溶解に基づかない。細胞含有試料が血液であり、対象の核酸が細胞外核酸、特に、細胞外ＲＮＡである場合、本明細書で使用される安定化は、溶血を防止することが好ましい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける溶血の原因の大半は、検体の回収と関連する。しかしまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける溶血は通常、適正な安定化法を使用しなければ、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける保存時の血液試料中で生じる。対象の細胞外核酸に応じて、溶血は、無視できない問題でありうる。対象の細胞外核酸がＤＮＡである場合、赤血球は核を含有せず、結果として、ゲノムＤＮＡを含有しないため、溶血は大きな問題ではない。したがって、溶血時において、細胞内ＤＮＡが赤血球から放出されることはない。対象の細胞外核酸がＤＮＡである場合、この場合には、細胞内ＲＮＡに加えて、ゲノムＤＮＡも放出されるため、特に、白血球の溶解または崩壊が問題である。したがって、対象の細胞外核酸が細胞外ＤＮＡである場合、特に、白血球の溶解を防止しなければならない。白血球は、それらの安定性特徴において互いに異なりうる。したがって、いくつかの白血球の型は、他の型より安定的である。しかし、白血球は一般に、赤血球より著明に安定的である。したがって、赤血球の溶解は、白血球が溶解したことを必ずしも指し示さない。当技術分野ではまた、白血球および赤血球の、溶解に対する異なる感受性が、例えば、白血球の回収を可能とするために、例えば、赤血球を特異的に溶解させながら、白血球を保存するのにも使用されている。しかし、対象の細胞外核酸がＲＮＡである場合、溶血は問題を構成し、したがって、赤血球の溶解も問題を構成する。成熟赤血球は、ＲＮＡもまた含有しないが、それらの前駆体（網状赤血球）は、ＲＮＡを含有する。網状赤血球は、赤血球のうちの約０．５％〜１％を占め、大量のグロビンＲＮＡを含有する。したがって、特に、対象の細胞外核酸がＲＮＡである場合、細胞外核酸集団、特に、細胞外ＲＮＡ集団の、グロビンｍＲＮＡによる希釈を低減するためには、保存時における赤血球の溶解を防止／低減するべきであり、したがって、網状赤血球の溶解を防止／低減するべきである。さらに、上記で記載した通り、細胞外核酸集団の組成を維持することは重要であり、したがって、それは多くの診断適用にとって重要であるので、細胞外核酸集団のプロファイルの維持であって、本明細書で記載される安定化法を使用して達成される維持は重要である。本発明による安定化法を使用する場合、溶血は、効率的に防止／低減することができる。これにより、細胞外核酸集団は実質的に保存され、さらに、安定化血液試料、特に、安定化血液試料から得られる血漿または血清は、溶血の防止によるものであり、また他の標準的な検査室解析に一般に適する細胞の溶解によるものでもある。
【００３８】
一実施形態によれば、少なくとも４８時間であることが好ましい安定化時間において、細胞の形態を保存する。これは、含有される細胞を、それらの形態に基づき解析し、任意選択で、特徴付けることを可能とする。一実施形態によれば、有核細胞の形態を保存する。一実施形態によれば、血液試料中に含有されるリンパ球の形態を、安定化時において保存する。
【００３９】
一実施形態によれば、細胞表面エピトープを保存する。一実施形態によれば、ＣＤタンパク質などの細胞表面タンパク質を保存する。例により示される通り、式１によるＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドを使用する安定化により、細胞表面エピトープおよび細胞表面タンパク質を保存する。これは、含有される細胞を、これらの細胞表面特徴に基づき特徴付け、かつ／または含有される細胞を単離することを可能とするので、利点である。特に、これは、細胞表面上に存在する腫瘍マーカーの解析を可能とする。
【００４０】
一実施形態によれば、安定化法は、血液試料を、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドおよび抗凝血剤と接触させるステップを含み、含有される細胞内の転写レベルを安定化させる。さらに、実施例で示される通り、細胞外核酸集団もさらに安定化させる。これは、細胞外核酸集団を、同じ安定化試料由来の細胞内核酸集団と別個に解析することを可能とするので、有利である。
【００４１】
炭化水素残基であるＲ２および／またはＲ３は、互いに独立に、短鎖アルキルおよび長鎖アルキルを含むアルキルを含む基から選択することができる。以下の基：
【００４２】
アルキル：好ましくは、短鎖アルキル、特に、直鎖状のＣ１〜Ｃ５アルキルおよび分枝状のＣ１〜Ｃ５アルキル、または長鎖アルキル：直鎖状のＣ５〜Ｃ２０アルキルおよび分枝状のＣ５〜Ｃ２０アルキルは、本発明の範囲内の一般に記載される基内で使用することが好ましい。
【００４３】
Ｒ２および／またはＲ３の鎖長ｎの値は特に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０でありうる。Ｒ２およびＲ３の炭素鎖の長さは、１〜１０でありうる。この場合、鎖長ｎの値は特に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０でありうる。Ｒ２およびＲ３の炭素鎖の長さは、１〜５であることが好ましく、この場合、鎖長の値は特に、１、２、３、４、および５でありうる。Ｒ２およびＲ３では、１または２の鎖長が特に好ましい。上記で記載した通り、本発明で使用される、式１による化合物は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである。
【００４４】
実施例で示される通り、血液試料などの細胞含有試料を安定化させるために、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドなどのＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドを使用することができる。
【００４５】
細胞含有生物学的試料を、式１による化合物、したがって、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、またはそれぞれの化合物の混合物と接触させるときに得られる混合物は、前記化合物または化合物の混合物を、最終濃度の少なくとも０．１％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．５％、少なくとも０．７５％、少なくとも１％、少なくとも１．２５％または少なくとも１．５％で含みうる。適切な濃度範囲は、０．１％〜５０％までを含むがこれらに限定されない。好ましい濃度範囲は、０．１％〜３０％、０．１％〜２０％、０．１％〜１５％、０．１％〜１０％、０．１％〜７．５％、０．１％〜５％、１％〜３０％、０．７５％〜１０％；１％〜２０％、１％〜１５％、１％〜１０％、１％〜７．５％、１％〜５％；１．２５％〜３０％、１．２５％〜２０％、１．２５％〜１５％、１．２５％〜１０％、１．２５％〜７．５％、１．２５％〜５％；１．５％〜３０％、１．５％〜２０％、１．５％〜１５％、１．５％〜１０％、１．５％〜７．５％、および１．５％〜５％からなる群から選択することができる。それぞれの濃度は、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドを安定化剤として使用する場合に特に適する。転写レベルを安定化させるためには、混合物中の濃度であって、２．５％〜１０％、好ましくは、３％〜８％、より好ましくは４％〜７．５％の範囲内にある濃度を使用することが好ましい。また、例により示される通り、細胞外核酸集団を安定化させるためには、低濃度も使用することができる。上述の濃度は、例えば、全血液または血漿など血液生成物を安定化させるのに極めて適する。当業者はまた、日常的な実験を使用することにより、例えば、実施例で記載される試験アッセイにおいて、化合物およびその異なる濃度のそれぞれを調べることにより、式１による他の化合物および／または他の細胞含有生物学的試料に適する濃度範囲も決定することができる。安定化のためのさらなる添加剤を使用することにより、例えば、低濃度を使用することが可能となる。
【００４６】
細胞含有試料を安定化させるためには、式１による化合物、したがって、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドを、キレート剤と組み合わせて使用することが好ましい。血液試料、または、例えば、血漿または血清などの血液に由来する試料を安定化させる場合は特に、キレート剤を抗凝血剤として使用することができる。適切なキレート剤および濃度範囲を、下記に提示する。
【００４７】
一実施形態によれば、上記で規定した、式１による少なくとも１つの化合物、すなわち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドと、アポトーシス阻害剤とを含む安定化剤の組合せを使用する。既に、アポトーシス阻害剤単独は、細胞含有試料を安定化させ、細胞外核酸集団を、特に、断片化されたゲノムＤＮＡとの夾雑から生じるその組成の変化から実質的に保存するのに有効である。したがって、アポトーシス阻害剤をさらに使用すると、得られる安定化効果は増強される。試料は、例えば、アポトーシス阻害剤を試料へと添加することにより、アポトーシス阻害剤と接触させることもでき、この逆も可能である。安定化組成物は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド（Ｎ，Ｎ  ｄｉｅｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）を含み、アポトーシス阻害剤を使用することが好ましい。結果として得られる混合物中に存在する少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、試料中に含有される細胞の安定化を支援し、試料中に含まれる核酸の分解を阻害し、これにより、細胞外核酸集団を実質的に保存することに寄与する。
【００４８】
本明細書で使用される「アポトーシス阻害剤」という用語は特に、細胞含有生物学的試料中のその存在により、細胞内のアポトーシスの低減過程、防止過程、および／もしくは阻害過程がもたらされ、そして／または細胞のアポトーシス性刺激に対する耐性が大きくなる化合物を指す。アポトーシス阻害剤は、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質様分子、もしくはペプチド様分子、有機分子、および無機分子を含むがこれらに限定されない。アポトーシス阻害剤は、代謝阻害剤、核酸分解および核酸経路のそれぞれの阻害剤、酵素阻害剤、特に、カスパーゼ阻害剤、カルパイン阻害剤、ならびにアポトーシス過程に関与する他の酵素の阻害剤として作用する化合物を含む。それぞれのアポトーシス阻害剤を、表１に列挙する。細胞含有生物学的試料を安定化させるために使用する少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、代謝阻害剤、カスパーゼ阻害剤、およびカルパイン阻害剤からなる群から選択されることが好ましい。各クラスに適する例を、表１のそれぞれの範疇に列挙する。アポトーシス阻害剤は、細胞透過性であることが好ましい。
【００４９】
また、同じクラスのアポトーシス阻害剤または異なるクラスのアポトーシス阻害剤由来の、異なるアポトーシス阻害剤の組合せを使用すること、および同じ作用機構または異なる作用機構によりアポトーシスを阻害する、異なるアポトーシス阻害剤の組合せを使用することのそれぞれも、本発明の範囲内にある。
【００５０】
有利な実施形態では、アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。カスパーゼ遺伝子ファミリーのメンバーは、アポトーシスにおいて著明な役割を果たす。カスパーゼへの結合の競合に成功するペプチドを開発するために、個別のカスパーゼの基質優先性または特異性が利用されている。カスパーゼ特異的ペプチドを、例えば、アルデヒド化合物、ニトリル化合物、またはケトン化合物へとカップリングすることにより、カスパーゼ活性化の可逆性阻害剤または不可逆性阻害剤を作り出すことが可能である。例えば、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫなどのフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）誘導体化ペプチドは、細胞傷害性効果を添加することなく、有効な不可逆性阻害剤として作用する。Ｎ末端におけるベンジルオキシカルボニル基（ＢＯＣ）およびＯ−メチル側鎖により合成される阻害剤は、細胞透過性の増強を呈示する。さらなる適切なカスパーゼ阻害剤は、Ｃ末端におけるフェノキシ基により合成する。例は、細胞透過性で、不可逆性で、広域スペクトルのカスパーゼ阻害剤であって、アポトーシスを防止するのに、カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫなおより有効なカスパーゼ阻害剤である、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈである。
【００５１】
一実施形態によれば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドであることが好ましいＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドに加えて使用されるカスパーゼ阻害剤は、汎カスパーゼ（ｐａｎｃａｓｐａｓｅ）阻害剤であり、したがって、広域スペクトルカスパーゼ阻害剤である。一実施形態によれば、カスパーゼ阻害剤は、修飾カスパーゼ特異的ペプチドを含む。前記カスパーゼ特異的ペプチドは、アルデヒド化合物、ニトリル化合物、またはケトン化合物で修飾することが好ましい。好ましい実施形態によれば、カスパーゼ特異的ペプチドを、好ましくは、カルボキシル末端において、Ｏ−フェノキシ基またはフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）基で修飾する。一実施形態によれば、カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫからなる群から選択される。一実施形態では、競合的で不可逆性のペプチド阻害剤であり、カスパーゼ１ファミリーおよびカスパーゼ３ファミリーの酵素を遮断する汎カスパーゼ阻害剤である、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫを使用する。好ましい実施形態では、カスパーゼに対する広域スペクトルの阻害剤である、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈを使用する。Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈは、細胞透過性であり、アポトーシスによる細胞死を阻害する。Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈは、極めて高い濃度でもなお、細胞に対して毒性ではなく、アミノ酸であるバリンおよびアスパラギン酸へとコンジュゲートさせたカルボキシ末端のフェノキシ基からなる。Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈは、３つの主要なアポトーシス経路である、カスパーゼ９およびカスパーゼ３経路、カスパーゼ８およびカスパーゼ１０経路、およびカスパーゼ１２経路により媒介されるアポトーシスを防止するのにも同様に有効である（Casertaら、２００３年）。さらなるカスパーゼ阻害剤を、表１に列挙する。
一実施形態によれば、細胞含有試料を安定化させるためのアポトーシス阻害剤として使用されるカスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ３など、細胞の細胞内細胞死経路の下流に位置する、１または複数のカスパーゼに対して作用するカスパーゼ阻害剤である。一実施形態では、カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ３、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、およびカスパーゼ１２からなる群から選択される、１または複数のカスパーゼに対する阻害剤である。また、カスパーゼ阻害剤の組合せを使用することも、本発明の範囲内にある。
【００５２】
Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドに加えてカスパーゼ阻害剤を使用する場合、生物学的試料を少なくとも１つのアポトーシス阻害剤と接触させた後で得られる混合物は、アポトーシス阻害剤（またはアポトーシス阻害剤の組合せ）を、少なくとも０．０１μＭ、少なくとも０．０５μＭ、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２．５μＭまたは少なくとも３．５μＭの群から選択される濃度で含みうる。当然ながらまた、高濃度も使用することができる。細胞含有生物学的試料と混合した場合のアポトーシス阻害剤（複数可）に適する濃度範囲は、０．０１μＭ〜１００μＭ、０．０５μＭ〜１００μＭ、０．１μＭ〜５０μＭ、０．５μＭ〜５０μＭ、１μＭ〜４０μＭ、より好ましくは、１μＭ〜３０μＭ、または２．５μＭ〜２５μＭを含むがこれらに限定されない。高濃度は、より有効であることが判明したが、良好な安定化結果はまた、低濃度でも達成された。したがって、効率的な安定化はまた、特に、アポトーシス阻害剤を組合せで使用する場合、例えば、０．１μＭ〜１０μＭ、０．５μＭ〜７．５μＭ、または１μＭ〜５μＭから選択される範囲の低濃度でも達成される。上述の濃度は、単一のアポトーシス阻害剤の使用のほか、カスパーゼ阻害剤の組合せの使用にも適用される。また、カスパーゼ阻害剤の組合せを使用する場合も、アポトーシス阻害剤の組合せの全濃度が、上述の特色を満たす場合、アポトーシス阻害剤の前記混合物中で使用される個別のアポトーシス阻害剤の濃度は、上述の濃度を下回りうる。細胞をやはり効率的に安定化させ、そして／または試料中に存在する核酸の分解をやはり低減する低濃度を使用することは、安定化のための費用を低減しうる利点を有する。アポトーシス阻害剤を、本明細書で記載される１または複数のスタビライザーと組み合わせて使用するため、低濃度を使用することができる。前述の濃度は、特に、カスパーゼ阻害剤、特に、アポトーシス阻害剤としてのＱ−ＶＤ−ＯＰｈおよび／またはＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫなどの修飾カスパーゼ特異的ペプチドを使用する場合に適する。上述の濃度は、例えば、全血液、特に、１０ｍｌの血液を安定化させるのに極めて適する。当業者は、日常的な実験を使用することにより、例えば、実施例で記載される試験アッセイにおいて、それぞれ異なる濃度でアポトーシス阻害剤を調べることにより、他のアポトーシス阻害剤および／または他の細胞含有生物学的試料に適する濃度範囲を決定することができる。
【００５３】
一実施形態によれば、アポトーシス阻害剤は、有効量で、細胞含有生物学的試料中のアポトーシスを、それぞれのアポトーシス阻害剤を含有しない対照試料と比較して、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも５０パーセント、好ましくは、少なくとも７５パーセント、より好ましくは、少なくとも８５パーセント減殺または低減するであろう。
【００５４】
したがって、一実施形態によれば、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤と、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである、上記で規定した、式１による少なくとも１つの化合物とを含む安定化剤の組合せを使用する。それぞれの組合せはまた、例えば、抗凝血剤およびキレート剤など、安定化効果を増強するさらなる添加剤も含みうる。一実施形態によれば、安定化剤の組合せは、カスパーゼ阻害剤と、抗凝血剤、好ましくは、ＥＤＴＡなどのキレート剤とを含む。それぞれの組合せは、第１の態様による、細胞含有試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させるのに適する方法において使用すると有利でありうる。安定化剤の組合せについて観察される安定化効果は、単独で使用される場合の個別の安定化剤のうちのいずれかについて観察される効果より強く、かつ／または低濃度を使用することを可能とし、これにより、安定化剤の組合せ使用を魅力的な選択肢とする。アポトーシス阻害剤および上記で規定した、式１による化合物、特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドのほか、効率的な試料の安定化を達成するのに適する、適切で好ましい濃度のそれぞれの薬剤の適切で好ましい実施形態は、上記に併せて詳細に記載されている。
【００５５】
背景技術で論じた通り、細胞外核酸は通常、試料中に「ネイキッド」では存在せず、例えば、複合体内で保護されることにより、または小胞内に含有されることなどにより、ある程度安定化している。これにより、細胞外核酸は、既に天然である程度安定化しており、したがって、通常、全血液、血漿、または血清などの細胞含有試料中のヌクレアーゼにより迅速に分解することはないという効果がもたらされる。したがって、生物学的試料中に含まれる細胞外核酸を安定化させようと意図する場合、主要な問題のうちの１つは、細胞外核酸集団の細胞内核酸、特に、試料中に含有される損傷細胞または死滅細胞に由来する断片化されたゲノムＤＮＡによる希釈および夾雑のそれぞれである。これはまた、血漿または血清などの細胞枯渇試料（わずかな量の細胞を含みうるが、これもまた、場合によって、「無細胞」であると記載される）を処理する場合の問題も提起する。本発明による安定化技術は、試料中に存在する細胞外核酸を実質的に保存し、例えば、含まれる細胞外核酸の分解を阻害する（安定化時間にわたり、安定化させなかった試料またはＥＤＴＡで安定化させた試料と比較して、好ましくは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または最も好ましくは、少なくとも９５％）だけでなく、さらに、ゲノム試料中に含有される細胞からのＤＮＡの放出を効率的に低減し、かつ／またはそれぞれのゲノムＤＮＡの断片化を低減するため、この点で特に有利である。一実施形態によれば、本発明の教示に従って細胞含有試料を安定化させるための、上記で規定した、式１による化合物と、任意選択で、アポトーシス阻害剤とを使用することにより、試料中に含有される細胞からのＤＮＡの放出から生じるＤＮＡの増大を、安定化させなかった試料と比較して低減するという効果がもたらされる。一実施形態によれば、前記ゲノムＤＮＡの放出を、安定化時間にわたり、安定化させなかった試料またはＥＤＴＡで安定化させた対応する試料と比較して、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも１２分の１、少なくとも１５分の１、少なくとも１７分の１、または少なくとも２０分の１に低減する（特に、血液試料または血漿もしくは血清などの血液に由来する試料の場合）。一実施形態によれば、前記ゲノムＤＮＡの放出を、安定化時間にわたり、安定化させなかった試料またはＥＤＴＡで安定化させた対応する試料と比較して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％低減する（特に、血液試料または血漿もしくは血清などの血液に由来する試料の場合）。ＤＮＡの放出は、例えば、本明細書の実施例節で記載されるリボソーム１８Ｓ  ＤＮＡを定量化することにより決定することができる。したがって、試料中に含有される細胞外核酸集団は、標準的なＥＤＴＡチューブ内で安定化させた試料と比較して、大幅に安定化する。したがって、一実施形態によれば、例えば、実施例で記載される１８Ｓ  ＤＮＡアッセイにおいて決定可��である通り、アポトーシス阻害剤と組み合わせて使用しうる、本発明により教示される式１による化合物により達成される安定化効果の結果として、試料中に含有される細胞からのＤＮＡの放出を、少なくとも１０分の１、好ましくは、７分の１、より好ましくは、５分の１に低減し、最も好ましくは、少なくとも４分の１に低減する。例により示される通り、細胞外核酸集団の有効な安定化は、少なくとも最長６日間にわたり達成可能である。試料のより短時間、例えば、最長３日間にわたる保存では、例えば、実施例で記載される１８Ｓ  ＤＮＡアッセイにおいて決定可能である通り、ＤＮＡの放出を、少なくとも２分の１に低減することができる。したがって、本発明による安定化法を使用する場合、ＤＮＡの放出を、最長３日間の保存について、２分の１以下に低減することができる。これは、細胞外核酸集団の安定化の、先行技術の方法と比較して目覚ましい改善である。これは、任意の後続の試験の精度を著明に増強する。ある種の場合には、例えば、試料材料を、例えば、室温で、長距離にわたり輸送するか、または長時間にわたり保存しなければならない場合（例えば、ある種の諸国における場合の通り）、本発明による工程は、このような時間の後で、これらの試験を実行することを初めて可能とする。しかし、当然ながらまた、所望の場合、試料を早期にさらに処理することもできる。達成可能な安定化時間を全て使用する必要もない。本発明により達成される安定化は、それらが回収された後において試料の異なる操作／処理（例えば、保存状態および保存時間）から生じうる、細胞外核酸集団の変動を低減する。これは、操作および分子的解析の標準化を大きく改善する。
【００５６】
細胞含有試料をさらに安定化させるためには、さらなる添加剤を、上記で規定した、式１による化合物に加えて使用することができる。それらを、アポトーシス阻害剤に加えて使用することもでき、アポトーシス阻害剤の代替物として使用することもできる。これもまた安定化効果に寄与する適切な添加剤の選択もまた、安定化させる細胞含有試料の型に依存しうる。例えば、全血液を細胞含有生物学的試料として処理する場合、例えば、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸、クエン酸、シュウ酸、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される抗凝血剤を含むことが有利であり、また、一般的でもある。有利な実施形態では、抗凝血剤は、キレート剤である。キレート剤とは、有機化合物の２つ以上の原子を介して金属との配位結合を形成することが可能な有機化合物である。本発明によるキレート剤は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジニトリロ四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）およびＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）を含むがこれらに限定されない。好ましい実施形態によれば、ＥＤＴＡを使用する。本明細書で使用される「ＥＤＴＡ」という用語は、とりわけ、例えば、Ｋ２ＥＤＴＡ、Ｋ３ＥＤＴＡ、またはＮａ２ＥＤＴＡなどのＥＤＴＡ化合物のＥＤＴＡ部分を指し示す。ＥＤＴＡなどのキレート剤を使用することによってもまた、ＤＮアーゼなどのヌクレアーゼが阻害され、これにより、例えば、ＤＮアーゼによる細胞外ＤＮＡの分解が防止されるという有利な効果が及ぼされる。さらに、高濃度で使用／添加されるＥＤＴＡは、細胞内核酸、特に、ゲノムＤＮＡの、細胞からの放出を低減し、これにより、式１に従う少なくとも１つの化合物により達成される安定化効果を支援することが可能であることも判明した。しかし、ＥＤＴＡ単独では、例えば、試料中に含有される細胞から放出されるゲノムＤＮＡの断片化を効率的に阻害することが可能ではない。したがって、ＥＤＴＡは、十分な安定化効果を達成しない。しかし、本発明の教示と組み合わせて、特に、アポトーシス阻害剤、特に、カスパーゼ阻害剤と組み合わせて使用すると、ＥＤＴＡは、上記で論じた理由により、安定化をさらに改善しうる。さらにＥＤＴＡはまた、ＲＮＡの化学的安定性を増大させるとも考えられる。一実施形態によれば、キレート剤、好ましくは、上記で記載した安定化化合物のうちの１または複数と混合された生物学的試料中のＥＤＴＡの濃度は、接触ステップの後で、０．０５ｍＭ〜１００ｍＭ、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭ、０．１ｍＭ〜３０ｍＭ、１ｍＭ〜２０ｍＭ、および２ｍＭ〜１５ｍＭからなる群から選択される範囲内にある。それぞれの濃度は、血液試料、血漿試料、および／または血清試料、特に、１０ｍｌの血液試料を安定化させる場合に特に有効である。
【００５７】
細胞含有試料の安定化をさらに支援すること、および細胞外核酸集団の保存を支援することのそれぞれためには、さらなる添加剤もまた使用することができる。それぞれの添加剤の例は、ヌクレアーゼ阻害剤、特に、ＲＮアーゼ阻害性化合物およびＤＮアーゼ阻害性化合物を含むがこれらに限定されない。ＲＮアーゼ阻害剤の例は、抗ヌクレアーゼ抗体またはリボヌクレオシド−バナジル複合体を含むがこれらに限定されない。それぞれのさらなる添加剤を選択する場合は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである、式１による化合物の安定化効果を損ない、かつ／またはこれに対抗しないように注意を払うべきである。したがって、添加剤は、生物学的試料中に含有される細胞の溶解および／もしくは分解を結果としてもたらすかまたは支援し、かつ／または生物学的試料の無細胞画分内に含有される核酸の分解を支援する濃度で使用すべきではない。さらにまた、添加剤は、安定化のために使用されるＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドのトランスクリプトーム安定化効果に対抗し、かつ、圧倒する濃度でも使用すべきではない。
【００５８】
本発明の有利な実施形態では、血液試料または血漿もしくは血清などの血液に由来する試料であることが好ましい細胞含有生物学的試料を、
ａ）Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである、上記で規定した、式１による少なくとも１つの化合物（好ましい濃度は、上記で記載されている）、および
ｂ）好ましくは、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈを、好ましくは、１μＭ〜３０μＭの濃度範囲で伴うアポトーシス阻害剤としての、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および
ｃ）さらなる添加剤、好ましくは、４ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは、４ｍＭ〜２０ｍＭの濃度範囲の、好ましくは、キレート剤、最も好ましくは、ＥＤＴＡ
と接触させる。
【００５９】
安定化組成物の成分は、緩衝液、例えば、ＭＯＰＳ、ＴＲＩＳ、ＰＢＳなどの生物学的緩衝液中に含まれることおよび溶存することのそれぞれが可能である。さらに、安定化組成物の成分は、水中に溶存させることもでき、他の任意の適切な溶媒中に溶存させることもできる。一実施形態によれば、安定化組成物は、ＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒を含む。
【００６０】
上記で規定した、式１による化合物、すなわち、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドであることが好ましいＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドのほか、任意選択で存在するさらなる添加剤は、例えば、試料を回収するためのデバイス、好ましくは、容器内に存在させることもでき、生物学的試料を回収する前に、それぞれの回収デバイスに即時的に添加することもでき、試料をその中に回収した直後に、回収デバイスへと添加することもできる。また、安定化剤（複数可）、および、任意選択で、さらなる添加剤（複数可）を、細胞含有生物学的試料へと個別に添加することも本発明の範囲内にある。しかし、操作を容易にするためには、１または複数の安定化剤、および、任意選択で、さらなる添加剤を、１つの組成物により供給することが好ましい。さらに、有利な実施形態では、上記で記載した、式１による化合物、および、任意選択で、さらなる添加剤（複数可）を、試料を添加する前に、回収デバイス内に存在させる。これにより、安定化剤（複数可）と接触させると、細胞含有生物学的試料は、即時的に安定化することが確認される。安定化剤（複数可）は、前記容器内に回収される量の細胞含有試料および前記容器内に含まれる量の細胞含有試料のそれぞれの安定化をもたらすのに有効な量で、容器内に存在する。記載される通り、試料は、試料を回収した後で、および／または試料を回収するときに、安定化剤（複数可）と直接混合し、これにより、試料を安定化させることができる。
【００６１】
試料は、試料を回収した後で、および／または試料を回収するときに、安定化剤（複数可）と直接混合することが好ましい。したがって、上記で記載した安定化剤（複数可）および添加剤は、安定化組成物の形態で提供することが好ましい。前記安定化組成物は、液体形態で提供することが好ましい。前記安定化組成物は、例えば、回収時において、試料を即時的に安定化させるように、試料回収デバイス内にあらかじめ充填することができる。一実施形態によれば、安定化組成物を、細胞含有試料と、１０：１〜１：２０、５：１〜１：１５、１：１〜１：１０、および１：２〜１：５から選択される容量比で接触させる。大試料容量による安定化を、小容量の安定化組成物により達成しうることは、本発明の教示の特有の利点である。したがって、好ましくは、安定化組成物の試料に対する比は、１：２〜１：７、より好ましくは１：３〜１：５の範囲内にある。
【００６２】
本明細書で使用される「細胞含有試料」という用語は特に、少なくとも１個の細胞を含む試料を指す。細胞含有試料は、少なくとも２個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２５０個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、少なくとも２０００個、または少なくとも５０００個の細胞を含みうる。さらに、前記用語には、はるかに多くの細胞を含む細胞含有試料もまた包含され、本発明に従う教示により安定化させることができる。しかし、それぞれの試料は、残留細胞を含むことが多いので、「細胞含有試料」という用語はまた、例えば、血漿など、一般に「無細胞」と称する細胞枯渇試料を含む細胞枯渇試料も指し、したがって、これらも包含する。少なくとも、血漿などのいわゆる「無細胞」試料がなお、残留量の細胞を含み、したがって、これにより、細胞外核酸集団が、前記残留細胞から放出される細胞内核酸と夾雑する危険性が提起される場合も完全には除外しないことが多い。したがって、一実施形態ではまた、「細胞含有試料」という用語により、細胞枯渇試料および「無細胞」試料のそれぞれも包含される。したがって、「細胞含有試料」は、例えば、全血液の場合と同様、大量の細胞を含む場合もあるが、ごくわずかな量の細胞だけを含む場合もある。したがって、「細胞含有試料」という用語はまた、細胞を含有することの危険性が疑われるかまたはこれを提起するに過ぎない試料も包含する。上記で論じた通り、例えば、血漿（一般に無細胞と称する場合でもなお、通常は、少残留量の細胞を含有する（調製法に応じて）血漿）など、わずかな量の細胞だけおよび残留量の細胞だけのそれぞれを含む生物学的試料に関してもまた、これらの残留細胞もまた、含まれる細胞外核酸への所望されない夾雑結果としてもたらしうるので、本発明による方法は、無視できない利点を有する。また、本発明の安定化技術を使用することにより、残留量の細胞だけを含むか、または残留量の細胞の危険性が疑われるかもしくはこれを提起するだけであるそれぞれの試料も、これもまた上記で詳細に記載した通りに、効率的に安定化させることが確認される。一実施形態によれば、細胞部分は、細胞含有生物学的試料のうちの、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも５％、好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％を占める。また、細胞画分が４０％超を占める細胞含有試料も、本明細書で記載される教示を使用して安定化させることができる。本発明による安定化法を使用することは、試料の組成およびその中に含有される細胞の数に関わらず、その中に含有される細胞外核酸集団の実質的な保存および安定化のそれぞれを行い、これにより、含有される細胞外核酸の後続の単離および／または解析の標準化を可能とするという利点を有する。
【００６３】
一実施形態によれば、細胞含有生物学的試料は、全血液、血液に由来する試料、血漿、血清、痰、涙液、リンパ液、尿、汗、体液、脳脊髄液、腹水、母乳、糞便、気管支洗浄液、唾液、羊水、鼻腔内分泌物、膣内分泌物、精子／精液、創傷分泌物、ならびに細胞培養物上清、および他のスワブ試料から得られる上清からなる群から選択される。一実施形態によれば、細胞含有生物学的試料は、体液、体内分泌物、または体外排出物、好ましくは、体液、最も好ましくは、全血液、血漿、または血清である。細胞含有生物学的試料は、細胞外核酸を含む。別の実施形態によれば、細胞含有生物学的試料は、例えば、糞便試料、組織試料、または生検試料など、ヒトまたは動物に由来する非流体試料である。本発明に従う方法により安定化させうる細胞含有生物学的試料の他の例は、細胞懸濁液、細胞培養物、細胞培養物の上清など、細胞外核酸を含む生物学的試料を含むがこれらに限定されない。
【００６４】
上記で記載され、例により裏付けられる通り、本発明の方法を使用することにより、冷蔵または凍結させずに、細胞含有試料を、長時間にわたり安定化させることが可能となる。したがって、試料を、室温で、なおまたは高温で、例えば、最高３０℃、または最高４０℃で保存することができる。一実施形態によれば、安定化効果を、室温で少なくとも２日間、好ましくは、少なくとも３日間；より好ましくは少なくとも１日間〜６日間、最も好ましくは少なくとも１日間〜少なくとも７日間にわたり達成する。例で示される通り、本発明の方法に従って安定化させた試料は、室温で３日間にわたり保存しても、実質的に損なわれなかった。室温で最長６日間、なおまたは７日間にわたる長期の保存においてもなお、細胞外核酸集団の安定化は、安定化させなかった試料と比較して、または、例えば、ＥＤＴＡ処置などの標準的な方法を使用して安定化させた試料と比較して実質的に大きかった。安定化効果は、時間経過に応じて減殺されうるが、細胞外核酸集団の組成を保存して、解析および／またはさらなる処理を可能とするのに依然として十分である。したがって、本発明の方法に従って安定化させた試料は、室温で長期にわたる保存の後でなお、その中に含有される細胞外核酸を単離し、任意選択で、これを解析するのに依然として適した。さらに、トランスクリプトームも効率的に安定化させた。したがって、特に、好ましい安定化剤の組合せを使用する場合は、試料が損なわれなかったので、長期の保存／搬送時間もなお検討可能である。しかし、通常の保存時間、ならびに、例えば、核酸の単離、および、任意選択で、解析を実施する検査室への搬送時間は通常、６または７日間を超えず、通常、２または３日後であってもなお終了するので、通常、長時間は必要でない。例で示される通り、安定化効率は、この時間において特に良好である。しかし、本発明に従う方法により達成可能な、並外れて長期の安定化時間および安定化効率は、重要な安全性因子をもたらす。
【００６５】
本発明の教示に従って使用される添加剤は高度に活性であるため、本発明による方法、およびまた、後出で記載される、本発明による組成物は、小容量の添加物質を伴う大容量の生物学的試料の安定化もまた可能とする。試料のサイズ／容量は、特に、試料中に含有される細胞外核酸を単離するために自動式工程を使用しようと意図する場合、後続の単離手順に対して無視できない制約を課するため、これは、重要な利点である。さらに、細胞外核酸は、含有される試料中に少量だけで含まれることが多いことも考慮しなければならない。したがって、例えば、血液試料など、大容量の細胞含有試料を処理することは、循環核酸を、試料から単離することができ、したがって、後続の解析に利用可能であるという利点を有する。
【００６６】
生物学的試料の安定化の直後に、核酸を解析するための技法を施すこともでき、核酸を試料から精製することもできる。したがって、本発明の方法に従って安定化させた試料は、核酸解析法および／もしくは検出法により解析することもでき、そして／またはさらに処理することもできる。例えば、細胞外核酸を、安定化試料から単離し、次いで、核酸解析法および／または検出法により解析することもでき、さらに処理することもできる。さらに、細胞を、安定化試料から除去し、解析することもでき、そして／または核酸を、得られた細胞から単離することもできる。さらに、細胞は、それらの形態または細胞表面特徴について解析することができる。これは、例えば、腫瘍細胞を同定することを可能とする。一実施形態によれば、細胞内ＲＮＡを単離し、解析する。一実施形態によれば、方法は、１または複数の遺伝子転写物の定性的解析または定量的解析を実施するステップを含む。
【００６７】
さらに、第２の態様によれば、核酸を生物学的試料から単離するための方法であって、
ａ）第１の態様による方法に従って細胞含有試料を安定化させるステップと、
ｂ）核酸を安定化試料から単離するステップと
を含む方法が提供される。
【００６８】
一実施形態によれば、前記方法は、
ａ）第１の態様による方法に従って細胞含有試料を安定化させるステップと、
ｂ）細胞内核酸を安定化試料から単離するステップと
を含む。
【００６９】
一実施形態によれば、前記方法は、細胞外核酸を、細胞含有生物学的試料から単離するための方法であって、
ａ）本発明の第１の態様で規定した方法に従って細胞含有試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させるステップと、
ｂ）細胞外核酸を単離するステップと
を含む方法である。
【００７０】
上記で論じた通り、本発明に従う安定化により、試料中に含有される細胞外核酸集団を、生物学的試料が得られた時点においてそれが示した状態で実質的に保存する効果および採取する効果のそれぞれがもたらされる。特に、通常観察される核酸の大きな増大であって、細胞内核酸、特に、ゲノムＤＮＡ、より具体的には、損傷細胞または死滅細胞から放出される断片化されたゲノムＤＮＡから生じる増大は、実施例で裏付けられる通り、効率的に低減される。したがって、安定化させた試料のそれぞれから得られる細胞外核酸は、安定化させなかった試料と比較して、試料中に含まれる分解または死滅しつつある細胞に由来する細胞内核酸との少量の夾雑を含み、特に、安定化させなかった試料と比較して少量の、断片化されたゲノムＤＮＡを含む。さらに、固有の安定化ステップは、細胞外核酸の回収可能量を増大させうる。本発明による安定化法は、試料の架橋形成を伴わずに実施することができる。それらの試薬は、架橋形成に起因して、細胞外核酸の回収可能量を低減しうるので、これは、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤などの架橋剤の使用を凌ぐ重要な利点である。したがって、本発明による方法は、細胞外核酸の診断能力および予後診断能力を改善する。さらに、前記安定化は、ステップｂ）で、試料中に含有される細胞を分離する前に、および／またはその中に含まれる細胞外核酸を単離する前に、長時間にわたる（室温でなお）試料の保存および／または操作、例えば、輸送を可能とする。安定化の詳細については、本節にもまた適用される上記の開示が参照される。
【００７１】
一実施形態によれば、例えば、全血液試料などの細胞含有生物学的試料は、上記で詳細に記載したステップa）において、上記で記載した、式１による少なくとも１つの化合物
、すなわち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドと、任意選択で、さらなる添加剤とを使用して、安定化させる。適切で好ましい実施形態については、上記で記載した。全血液試料を安定化させるための、上記で記載した、カスパーゼ阻害剤の、抗凝血剤、好ましくは、キレート剤と組み合わせたさらなる使用が特に好ましい。
【００７２】
例えば、全血液の場合のように、試料が大量の細胞を含む場合は、細胞外核酸を含む試料の無細胞、細胞低減または細胞枯渇画分のそれぞれを得るために、細胞は、残りの試料から分離する。したがって、一実施形態によれば、ステップa）とステップｂ）との間で
、細胞を細胞含有試料から除去する。この中間ステップは、任意選択であるに過ぎず、例えば、血漿または血清など、わずかな量の残留細胞だけを含む試料を処理する場合、例えば、これを排することができる。しかし、単離時における細胞外核酸集団を夾雑させうるので、結果を改善するにはまた、それぞれの残留細胞（または潜在的な残留細胞）も除去することが好ましい。試料の型に応じて、残留細胞を含む細胞は、例えば、遠心分離、好ましくは、高速遠心分離により分離および除去することもでき、遠心分離ステップを回避する場合、例えば、濾過、沈降、または（任意選択で、磁気）粒子表面への結合など、遠心分離以外の手段を使用することにより分離および除去することもできる。それぞれの細胞除去ステップはまた、自動式試料調製プロトコールへと容易に組み入れることもできる。除去されるそれぞれの細胞はまた、さらに処理することもできる。細胞は、例えば、保存することができ、かつ／または、例えば、核酸またはタンパク質などの生体分子は、除去された細胞から単離することができる。
【００７３】
さらに、試料を精査する、さらなる中間ステップを含むこともまた、本発明の範囲内にある。
【００７４】
次いで、ステップｂ）において、細胞外核酸を、例えば、無細胞および細胞枯渇画分のそれぞれ、例えば、上清、血漿、および／または血清から単離する。細胞外核酸を単離するには、核酸をそれぞれの試料および細胞枯渇試料のそれぞれから単離するのに適する、任意の公知の核酸単離法を使用することができる。それぞれの精製法の例は、抽出、固相抽出、シリカベースの精製、磁気粒子ベースの精製、フェノール−クロロホルム抽出、クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（アニオン交換表面を使用する）、電気泳動、濾過、沈殿、クロマチン免疫沈殿、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。また、例えば、配列特異的結合を可能とする適切なプローブを使用することにより、特異的な標的細胞外核酸を特異的に単離し、固体支持体へとカップリングすることも、本発明の範囲内にある。また、当業者が公知の他の任意の核酸単離技法も使用することができる。一実施形態によれば、核酸は、カオトロピック薬剤および／またはアルコールを使用して単離する。核酸は、それらを、固相、好ましくは、シリカまたはアニオン交換官能基を含む固相へと結合させることにより単離することが好ましい。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、Ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍａｇｅｎ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍａ  ＸＳ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）、Ｐｌａｓｍａ／Ｓｅｒｕｍ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ）、Ｐｌａｓｍａ／Ｓｅｒｕｍ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ）、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）、および循環核酸を抽出および精製するのに適する他の市販のキットなどの、適切な方法およびキットもまた市販されている。
【００７５】
一実施形態によれば、ステップａ）の後で得られる、または、任意選択で、細胞を中間ステップで除去した後に得られる試料中に含まれる全ての核酸を単離する、例えば、無細胞および細胞枯渇画分のそれぞれから単離する。例えば、全核酸は、血漿または血清から単離することができ、細胞外核酸は、これらの抽出された核酸内の部分として含まれる。細胞を効率的に除去した場合、単離された全核酸は、細胞外核酸を主に含み、なおまたはこれらからなるであろう。また、少なくとも主に、特異的な標的核酸を単離することも、本発明の範囲内にある。標的核酸は、例えば、ある型の核酸、例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、他の非コード核酸、後成的に修飾された核酸、および他の核酸を含むＲＮＡまたはＤＮＡでありうる。また、例えば、単離の後でヌクレアーゼを使用して、非標的核酸を消化することも、本発明の範囲内にある。標的核酸という用語はまた、特殊な種類の核酸、例えば、ある種の疾患マーカーであることが公知である特異的細胞外核酸も指す。
【００７６】
上記で論じた通り、細胞外核酸の単離はまた、例えば、適切な捕捉プローブを使用することを介する、それぞれの標的核酸の特異的な単離も含みうる。「標的核酸」という用語はまた、ある長さを有する核酸、例えば、長さが２０００ｎｔ以下、１０００ｎｔ以下、または５００ｎｔ以下である核酸も指す。細胞外核酸は通常、２０００ｎｔ未満、通常は１０００ｎｔ未満であり、なおしばしば５００ｎｔ未満という小さなサイズであることが公知であるため、それぞれの低分子の標的核酸を単離することが有利でありうる。本明細書で指し示されるサイズおよびサイズ範囲のそれぞれは、鎖長を指す。すなわち、ＤＮＡの場合、サイズとは、ｂｐを指す。単離および精製のそれぞれの焦点を、それぞれの低分子核酸に当てることにより、単離核酸中で得られる細胞外核酸部分を増大させることができる。本発明による安定化法は、特に、細胞内のゲノムＤＮＡの断片化の阻害に起因して、例えば、核酸の抽出手順における、このような高分子量のゲノムＤＮＡの、断片化された細胞外核酸集団からのより効率的な分離を可能とする。本発明による安定化技術を使用すると、ゲノム核酸と循環核酸との間の実質的なサイズ差が本質的に保存されるので、例えば、ＤＮＡのサイズ選択的回収により、ゲノムＤＮＡを、それぞれの安定化を伴わない場合より効率的に除去することができる。先行技術では、例えば、高分子量のゲノムＤＮＡを枯渇させることにより、細胞外核酸集団のそれぞれの選択的な単離を達成するのに適する方法が周知であり、したがって、本明細書におけるさらなる記載を必要としない。例えば、試料から、１，０００〜１０，０００ヌクレオチドまたは１，０００〜１０，０００塩基対より大きな任意の核酸を枯渇させるサイズ選択法を使用すれば十分であろう。本発明に従って安定化させた試料中のゲノム核酸（通常、＞１０，０００ｂｐより大きな）と細胞外核酸（通常、＜１０００ｂｐ）とのサイズ差は通常、効率的な安定化に起因して比較的大きい（差違は、例えば、１０００〜１０，０００ｂｐの範囲でありうる）ので、細胞外核酸を生物学的試料から選択的に単離するための公知の方法を適用しうるであろう。これはまた、単離された細胞外核酸集団内の細胞内核酸の量を低減するための機会もさらにもたらす。例えば、核酸抽出プロトコールにおけるゲノムＤＮＡの除去はまた、残留細胞を除去するための、核酸の抽出を開始する前における、血漿試料のｇ力の大きな個別の遠心分離を補充し、なおまたはこれを置きかえうるであろう。前記残留細胞から放出されるゲノムＤＮＡは、本発明による安定化に起因して、大量に分解することを防止され、したがって、サイズ選択的単離プロトコールにより除去することができる。多くの臨床検査室は、このようなｇ力の大きな遠心分離を実施することが可能な遠心分離機、または、特に、微量の残留細胞を除去するための他の手段を有さないので、この選択肢は、特に有利である。
【００７７】
さらに、細胞内核酸は、例えば、細胞を残りの試料から分離した後で、含有される細胞から単離することもできる。例えば、ＲＮＡは、単離し、遺伝子発現解析のために使用することができる。
【００７８】
次いで、ステップｃ）では、適切なアッセイ法および／または解析法を使用して、単離核酸を、解析し、そして／またはさらに処理することができる。例えば、単離核酸を同定し、修飾し、少なくとも１つの酵素と接触させ、増幅し、逆転写させ、クローニングし、配列決定し、プローブと接触させ、検出し（それらの存在または非存在を）、そして／または定量化することができる。先行技術では、それぞれの方法が周知であり、細胞外核酸（また、背景技術における詳細な記載も参照されたい）を解析するために、治療分野、診断分野、および／または予後診断分野において一般に適用されている。したがって、細胞外核酸を、単離し、任意選択で、全核酸、全ＲＮＡ、および／または全ＤＮＡ（上記を参照されたい）の一部として解析した後で、これらにより、多数の新生物疾患、特に、がんの異なる形態など、前悪性腫瘍および悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない、疾患状態の存在、非存在、または重症度を同定することができる。例えば、単離された細胞外核酸を、多くの適用分野における診断マーカーおよび／または予後診断マーカー（例えば、胎児または腫瘍に由来する細胞外核酸）であって、非侵襲的出産前遺伝子検査および非侵襲的出産前遺伝子スクリーニングのそれぞれ、疾患スクリーニング、病原体スクリーニング、腫瘍学、がんスクリーニング、早期がんスクリーニング、がん治療モニタリング、遺伝子検査（遺伝子型決定）、感染性疾患検査、損傷診断法、外傷診断法、移植医学、または他の多くの疾患を含むがこれらに限定されないマーカーを検出するために解析することができ、よって、診断および／または予後診断に関与性である。一実施形態によれば、単離された細胞外核酸を、解析して、疾患または胎児特徴を同定し、そして／または特徴付ける。したがって、上記で論じた通り、本明細書で記載される単離法は、核酸を解析および／または処理するステップｃ）をさらに含みうる。したがって、一実施形態によれば、単離された細胞外核酸を、ステップｃ）において解析して、疾患および／または少なくとも１つの胎児特徴を同定、検出、スクリーニング、モニタリング、または除外する。
【００７９】
増幅技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、ディジタルＰＣＲ、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量分析、蛍光検出、紫外線分光分析、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＤＮＡ配列決定またはＲＮＡ配列決定、制限解析、逆転写、ＮＡＳＢＡ、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼサイクリングアセンブリー（ＰＣＡ）、非対称ポリメラーゼ連鎖反応、指数関数後線形ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）、ヘリカーゼ依存型増幅（ＨＤＡ）、ホットスタートポリメラーゼ連鎖反応、配列間特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＳＳＲ）、インバースポリメラーゼ連鎖反応、ライゲーション介在型ポリメラーゼ連鎖反応、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、固相ポリメラーゼ連鎖反応、またはこれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない、任意の核酸解析法／核酸処理法を使用して、核酸の解析／さらなる処理を実施することができる。当業者には、それぞれの技術が周知であり、したがって、本明細書では、さらなる記載を必要としない。
【００８０】
一実施形態によれば、単離ステップまたは解析ステップｂ）およびｃ）の一方または両方を、本発明の教示に従ってそれぞれを安定化させた試料を回収して、少なくとも１日〜最大７日後に施す。本発明による方法を使用して、試料、特に、血液試料、その中にそれぞれ含有される細胞外核酸集団を安定化させうるのに適する時間もまた、上記で記載されており、ここでもまた適用される。一実施形態によれば、単離ステップは、試料を回収し、本発明による方法に従って安定化させた少なくとも１日後、少なくとも２日後、少なくとも３日後、少なくとも４日後、少なくとも５日後、または少なくとも６日後に実施する。一実施形態によれば、細胞含有生物学的試料を保存するために、試料の凍結を伴わずに、かつ／またはホルムアルデヒドの使用を伴わずに、単離ステップまたは解析ステップの一方または両方を施す。生物学的試料は、上記で規定した、式１による化合物であって、好ましくは、ＥＤＴＡなどの抗凝血剤などのさらなる添加剤と組み合わせた化合物と接触させた後で安定化させる。抗凝血剤は、血液または血液に由来する試料を安定化させる場合に使用することが好ましい。安定化させた試料のそれぞれは、操作する、例えば、保存し、そして／または室温で搬送することができる。上記で記載した通り、一実施形態によれば、アポトーシス阻害剤、好ましくは、カスパーゼ阻害剤を、安定化のためにさらに使用する。
【００８１】
さらに、本発明の第３の態様によれば、生物学的試料中の細胞外核酸集団を安定化させるのに適する組成物であって、
ａ）上記で規定した、式１による少なくとも１つの化合物と、
ｂ）少なくとも１つの抗凝血剤、好ましくは、キレート剤と
を含む組成物が提供される。
【００８２】
上記で論じた通り、それぞれの安定化組成物は、含まれる細胞、転写レベル、および含まれる細胞外核酸を安定化させ、これにより、細胞外核酸集団を実質的に保存することおよび安定化させることのそれぞれにより、細胞含有生物学的試料、特に、全血液、血漿、および／または血清を安定化させるのに特に有効である。それぞれの安定化組成物は、試料およびその中に含有される細胞外核酸集団のそれぞれの品質を実質的に損なうことなく、全血液であることが好ましい試料の、室温で少なくとも２日間、好ましくは、少なくとも３日間にわたる保存および／または操作、例えば、搬送を可能とする。さらに、含有される細胞のトランスクリプトームについての遺伝子発現プロファイルも、これにより保存される。当然ながら、可能な全安定化時間を使用することは必須ではなく、所望の場合、試料はまた早期に処理することもできる。生物学的試料を、安定化組成物と接触させることにより、含有される核酸を単離し、任意選択で、解析および／または処理する前に、試料を、室温でなお、保存および／または操作、例えば、搬送することが可能となる。したがって、試料の回収または安定化と核酸の抽出との間の時間を、その中に含有される集団およびその中に含有される細胞外核酸集団の組成のそれぞれに実質的に影響を及ぼすことなくずらすことができる。特に、細胞内核酸、特に、断片化されたゲノムＤＮＡによる希釈および夾雑のそれぞれが低減される。さらに、含有される細胞の遺伝子転写プロファイルを安定化させるので、細胞内ＲＮＡを単離し、例えば、遺伝子発現を解析する方法において使用することができ、遺伝子発現プロファイリングのために使用することができる。試料の回収の直後または回収時において、安定化組成物を試料と接触させることが好ましい。安定化組成物はまた、本明細書で記載される安定化剤、例えば、カスパーゼ阻害剤であることが好ましいアポトーシス阻害剤もさらに含みうる。
【００８３】
上記では、安定化法と共に、式１による化合物およびアポトーシス阻害剤の適切で好ましい実施形態のほか、それぞれの化合物の適切で好ましい濃度についても詳細に記載している。安定化組成物に関してもまた適用される、上記の開示が参照される。一実施形態によれば、式１による化合物は、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである。前記化合物はまた、アポトーシス阻害剤、好ましくは、カスパーゼ阻害剤と組み合わせて使用することもできる（好ましい実施形態は、上記で記載されており、上記の開示が参照される）。
【００８４】
さらに、特に、全血液、血漿、または血清を安定化させるために組成物を使用する場合、安定化組成物は、さらなる添加剤、例えば、キレート剤などの抗凝血剤を含むことが好ましい。
【００８５】
一実施形態によれば、安定化組成物は、上述のスタビライザーおよび任意選択の添加剤と、任意選択で、緩衝剤とから本質的になる。安定化組成物は、試料を安定化させ、したがって、試料中に含有される細胞の溶解および／または破壊を促進しない。例えば、実施例節で記載されるアッセイ法により決定しうる通り、安定化組成物は、試料中に含まれる細胞の損傷を低減する可能性がある。
【００８６】
組成物は、固体形態で提供することができる。安定化させる生物学的試料が、固体を溶存させる液体を含有する（例えば、細胞含有流体、培地中の細胞、尿中の細胞など）か、または安定化させる生物学的試料に、液体、例えば、水を添加して固体を溶存させる場合、固体形態は、例えば、適切な選択肢である。固体の安定化組成物を使用する利点は、固体は通常、化学的により安定的であることである。しかし、また、液体組成物も使用することができる。液体組成物は、安定化させる試料との混合を迅速に達成することができ、これにより、基本的に、試料を液体の安定化組成物と接触させるとすぐに、即時的な安定化効果がもたらされるという利点を有することが多い。液体の安定化組成物中に存在する安定化剤（複数可）は、溶液中で安定性を維持し、使用者による前処置（例えば、可溶性が限定された沈殿物を溶存させることなど）は、安定化効率を変動させる危険性を提起するため、この種の前処置を要求しないことが好ましい。
【００８７】
また、生物学的試料と混合された、本発明による安定化組成物を含む混合物も提供される。生物学的試料の適切で好ましい例のほか、生物学的試料と混合した場合の適切な濃度の安定化剤（複数可）も、安定化法と共に上記で記載されている。本節でもまた適用される上記の開示が参照される。安定化組成物は、回収時において、試料を即時的に安定化させるように、試料回収デバイス内にあらかじめ充填することが好ましい。一実施形態によれば、安定化組成物を、１０：１〜１：２０、５：１〜１：１５、１：１〜１：１０、および１：２〜１：５から選択される容量比で、生物学的試料と接触させる。大試料容量による安定化を、小容量の安定化組成物により達成しうることは、本発明の安定化組成物の特有の利点である。したがって、好ましくは、安定化組成物の試料に対する比は、１：２〜１：７、より好ましくは１：３〜１：５の範囲内にある。
【００８８】
本発明による安定化組成物の第３の態様を使用して、細胞含有試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させることができる。さらに、本発明による安定化組成物の第３の態様はまた、試料中に含有される細胞を安定化させるためにも使用することができる。上記で記載した通り、安定化組成物はとりわけ、崩壊しつつある細胞から生じる、ゲノムＤＮＡの細胞からの放出を低減する。したがって、それぞれの使用もまた有利であり、本発明に従う教示により提示される。さらに、本発明による安定化組成物の第３の態様はまた、含有される細胞内の転写レベルを安定化させるためにも使用することができる。
【００８９】
また、本発明の第３の態様による組成物を製造する方法であって、組成物の成分を、好ましくは、水溶液中で混合する方法も提供される。
【００９０】
本発明の組成物はまた、試料回収デバイス、特に、血液回収アセンブリーへと組み込み、これにより、このようなデバイスの新たで有用な変化形をもたらすこともできる。このようなデバイスは典型的に、開放端および閉止端を有する容器を含む。容器は、血液回収チューブであることが好ましい。容器の型はまた、回収される試料にも依存し、他の適するフォーマットは、下記で記載される。
【００９１】
さらに、本発明は、細胞含有生物学的試料、好ましくは、血液試料を回収するための容器であって、本発明による安定化組成物を含む容器を提供する。それぞれの容器、例えば、本発明による安定化組成物を含む試料回収用チューブを提供することは、試料をそれぞれの容器内に回収したときに、試料を迅速に安定化させる利点を有する。安定化組成物に関する詳細については、上記で記載されており、本節でもまた適用される上記の開示が参照される。
【００９２】
一実施形態によれば、生物学的試料を受容および回収するための回収容器であって、
ａ）試料を回収したときに、式１による化合物が、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも０．７５％、少なくとも１％、少なくとも１．２５％、もしくは少なくとも１．５％の濃度で含まれるような、上記で規定した、式１による少なくとも１つの化合物、または０．１％〜５０％、０．１〜３０％、１％〜２０％、１％〜１０％、１％〜７．５％、および１％〜５％から選択される濃度範囲で含まれる、上記で規定した、式１による少なくとも１つの化合物；ならびに／あるいは
ｂ）任意選択で、少なくとも１つのさらなる添加剤、好ましくは、容器が、血液または血液生成物を回収するための容器である場合、キレート剤などの抗凝血剤、好ましくは、ＥＤＴＡ
を含む容器が提供される。適切な濃度は、上記で記載されており、好ましくは、４ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは４ｍＭ〜２０ｍＭの範囲内にある。
【００９３】
適切な濃度はまた、方法と共に上記でも記載されており、上記の開示が参照される。一実施形態によれば、試料を回収したときに、結果として得られる混合物中のアポトーシス阻害剤または２つ以上のアポトーシス阻害剤の組合せの濃度が、少なくとも０．０１μＭ、少なくとも０．０５μＭ、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２．５μＭまたは少なくとも３．５μＭから選択され、好ましくは、０．０１μＭ〜１００μＭ、０．０５μＭ〜１００μＭ、０．１μＭ〜５０μＭ、１μＭ〜４０μＭ、１．０μＭ〜３０μＭ、または２．５μＭ〜２５μＭから選択される濃度範囲内に存在するように、容器は、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤をさらに含む。
【００９４】
あらかじめ充填した成分は、液体形態で提供することもでき、乾燥形態で提供することもできる。安定化成分は、安定化組成物として提供することが好ましい。安定化させる生物学的試料が、固体を溶存させる液体を含有する（例えば、細胞含有流体、培地中の細胞、尿中の細胞など）か、または安定化させる生物学的試料に、液体、例えば、水を添加して固体を溶存させる場合、乾燥形態は、例えば、適切な選択肢である。固体の安定化組成物を使用する利点は、固体は通常、液体より化学的に安定的であることである。一実施形態によれば、容器の内壁を、本発明による安定化組成物で処置する／覆う。前記組成物は、例えば、スプレー乾燥法を使用して、内壁へと適用することができる。実質的に固体状態の保護性組成物を得るため、安定化組成物に、液体除去技法を実施することができる。液体除去の条件は、それらが、分散させた液体の安定化組成物の元の量のうちの、重量で少なくとも約５０％、重量で少なくとも約７５％、または重量で少なくとも約８５％の除去を結果としてもたらすような条件でありうる。液体除去の条件は、結果として得られる組成物が、薄膜、ゲル、または他の実質的に固体であるかもしくは粘性の高い層の形態にある程度に十分な液体の除去を、それらが結果としてもたらすような条件でありうる。例えば、液体除去は、実質的に不動のコーティング（好ましくは、血液生成物試料であることが好ましい細胞含有試料と接触させると、再溶存するか、または他の形で分散するコーティング）を結果としてもたらしうる。保護剤の実質的な固体形態（例えば、１または複数のペレットの形態にある）を実現するためには、凍結乾燥化、または他の技法も援用しうる可能性がある。したがって、液体除去の条件は、それらが、検討下の試料（例えば、全血液試料）保護剤と接触させると、試料中に分散し、試料中の成分（例えば、細胞外核酸）を実質的に保存する材料を結果としてもたらすような条件でありうる。液体除去の条件は、その結果、残りの組成物が結晶性を実質的に含まず、周囲温度で実質的に不動である程度に十分に高い粘性を有し、またはその両方となるような条件でありうる。
【００９５】
しかし、また、液体組成物も使用することができる。液体組成物は、安定化させる試料との混合を迅速に達成することができ、これにより、基本的に、試料を液体の安定化組成物と接触させるとすぐに、即時的な安定化効果がもたらされるという利点を有することが多い。液体の安定化組成物中に存在する安定化剤（複数可）は、溶液中で安定性を維持し、使用者による前処置（例えば、可溶性が限定された沈殿物を溶存させることなど）は、安定化効率を変動させる危険性を提起するため、この種の前処置を要求しないことが好ましい。
【００９６】
安定化組成物は、前記容器内に回収される量の試料の安定化をもたらすのに有効な量で容器内に含まれる。一実施形態によれば、液体の安定化組成物を、１０：１〜１：２０、５：１〜１：１５、１：１〜１：１０、および１：２〜１：５から選択される容量比で、生物学的試料と接触させる。大試料容量による安定化を、小容量の安定化組成物により達成しうることは、本発明の安定化組成物の特有の利点である。したがって、好ましくは、安定化組成物の試料に対する比は、１：２〜１：７、より好ましくは１：３〜１：５の範囲内にある。
【００９７】
一実施形態によれば、容器は、真空である。真空化は、特殊な容量の流体試料を内部へと採取するのに有効であることが好ましい。これにより、適正量の試料が、容器中に含まれる、あらかじめ充填した量の安定化組成物と接触し、したがって、安定化が効率的であることが確認される。一実施形態によれば、容器は、中隔により密閉された開口端を有するチューブを含む。例えば、容器には、固体形態または液体形態にある規定量の安定化組成物をあらかじめ充填し、規定された真空を供給し、中隔で密閉する。中隔は、標準的なサンプリング用の付属品（例えば、カニューレなど）と適合可能であるように構築する。例えば、カニューレと接触させると、真空によりあらかじめ決定された試料量が容器内に回収される。それぞれの実施形態は特に、血液を回収するのに有利である。適する容器は、例えば、ＵＳ６，７７６，９５９において開示されている。
【００９８】
本発明による容器は、ガラス、プラスチック、または他の適切な材料から作製することができる。プラスチック材料は、酸素不透過性材料の場合もあり、酸素不透過性層を含有する場合もある。代替的に、容器は、水透過性プラスチック材料および空気透過性プラスチック材料から作製することができる。本発明による容器は、透明な材料から作製されることが好ましい。適切な透明耐熱プラスチック材料の例は、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリエチレンテレフタレートを含む。容器は、回収される生物学的試料の要求される容量に従って選択される適切な大きさでありうる。上記で記載した通り、容器は、大気圧を下回る内圧へと真空化することが好ましい。このような実施形態は、全血液などの体液を回収するのに特に適する。圧力は、所定容量の生物学的試料を、容器へと採取するように選択することが好ましい。このような真空チューブに加えてまた、非真空チューブ、機械分別型チューブ、またはゲルバリア型チューブも、特に、血液試料を回収するための試料容器として使用することができる。適切な容器および止栓デバイスの例は、ＵＳ５，８６０，３９７およびＵＳ２００４／００４３５０５において開示されている。細胞含有試料を回収するための容器としてはまた、回収デバイス、例えば、シリンジ、尿回収デバイス、または他の回収デバイスもさらに使用することができる。容器の型はまた、回収される試料の型にも依存する場合があり、適切な容器は当業者にもまた利用可能である。
【００９９】
有益な結果は、容器、デバイスのそれぞれに、上記で規定した、式１による少なくとも１つの化合物を安定化剤として充填するかまたはあらかじめ充填する場合に得られる。抗凝血剤を、式１による化合物に加えて包含することが好ましい。抗凝血剤は、ＥＤＴＡなどのキレート剤であることが好ましい。さらに、容器中に含まれる安定化組成物はまた、アポトーシス阻害剤、好ましくは、カスパーゼ阻害剤も含むことが可能であり、任意選択で、さらなる添加剤も含むことが可能である。一実施形態によれば、容器中に含まれる安定化組成物は、カスパーゼ阻害剤および抗凝血剤を含む。
【０１００】
一実施形態によれば、容器は、チャンバーを規定する、開放された上部、底部、およびこれらの間に広がる側壁を有し、本発明による安定化組成物は、チャンバー内に含まれる。本発明による安定化組成物は、その中に液体形態で含まれる場合もあり、固体形態で含まれる場合もある。一実施形態によれば、容器はチューブであり、底部は、閉止された底部であり、容器は、開放された上部における密栓をさらに含み、チャンバーの圧力は低減されている。チャンバー内の圧力の低減の利点については、上記で記載した。密栓は、注射針またはカニューレによる穿刺が可能であり、圧力の低減は、特定の容量の液体試料を、チャンバーへと採取するように選択することが好ましい。一実施形態によれば、チャンバーは、特定の容量の液体試料を、チャンバーへと採取するように選択された圧力に低減されており、安定化組成物は、液体であり、細胞含有試料の特定の容量に対する安定化組成物の容量比が、１０：１〜１：２０、５：１〜１：１５、１：１〜１：１０、および１：２〜１：５から選択されるようにチャンバー内に入れる。関連する利点については、上記で記載した。
【０１０１】
容器は、患者由来の血液を採取するための容器であることが好ましい。
【０１０２】
第５の態様によれば、試料を、患者から、本発明の第４の態様による容器のチャンバーへと直接回収するステップを含む方法が提供される。容器および試料に関する詳細については、上記で記載した。容器および試料に関する詳細については、それぞれの開示を参照されたい。一実施形態によれば、血液試料は、回収され、好ましくは、患者から引き出される。
【０１０３】
本明細書で開示される方法および組成物は、生物学的試料中に含まれる細胞に由来し、細胞の損傷および細胞の溶解のそれぞれに起因して生物学的試料中に入る可能性がある核酸、特に、断片化されたゲノムＤＮＡとの混合可能性を低減しながら、細胞外核酸の効率的な保存および単離を可能とする。本発明による方法のほか、組成物および開示されるデバイス（例えば、回収容器）は、試料中に含有される細胞外核酸が、細胞内核酸のそれぞれと夾雑せず、それぞれの夾雑が、本発明に従う教示により低減されるように、細胞外核酸の分解を低減し、また、細胞の溶解および／またはゲノム核酸の放出、特に、断片化されたゲノムＤＮＡも低減する。上記で論じた通り、細胞外核酸と細胞核酸、特に、断片化されたゲノムＤＮＡとの相互混合は、生物学的試料中の細胞外核酸の量のいかなる測定の精度も低減する可能性がある。上記で論じた通り、本発明の重要な利点は、試料中に含有される細胞（全血液、血漿、または血清の場合は、特に、白血球または白血球の型）および細胞外核酸の両方を、本質的に同時に安定化させる可能性である。これは、ゲノムＤＮＡなどの細胞内核酸が、細胞外核酸の構造的な完全性もまた維持しながら、試料の無細胞部分へと放出され、含まれる対象の細胞外核酸（および関連するバイオマーカー）をさらに希釈することを防止する一助となる。本明細書で論じられる通り、全血液または血漿などの細胞含有生物学的試料を、安定化剤（複数可）と接触させることにより、細胞外核酸を単離する前の時間にわたり、試料を保存することが可能となる。細胞含有生物学的試料、例えば、血液または血漿は、１カ所（例えば、医療施設）で採取し、安定化剤（複数可）と接触させ、核酸の単離工程および検査工程のために、異なる遠隔地（例えば、検査室）へと後日輸送しうることがより好ましい。
【０１０４】
さらに、上記で詳細に記載した通り、本明細書で記載される安定化技術は、細胞内核酸を安定化させ、特に、転写レベルを安定化させることを可能とする。さらに、細胞は、試料から単離し、これにより、例えば、腫瘍細胞、例えば、血液試料中の循環腫瘍細胞などの特異的な細胞集団の解析を可能とすることができる。利点および技術的効果については、上記で詳細に記載したものであり、上記の開示が参照される。
【０１０５】
さらに、本発明による試料の安定化は、このような架橋形成試薬の使用を伴わないので、本明細書で開示される安定化試薬は、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド放出剤などの架橋形成試薬の使用を伴う、公知の最新技術の安定化試薬を凌ぐ利点を提供する。架橋形成試薬は、核酸間の分子間共有結合もしくは分子内共有結合、または核酸とタンパク質との間の分子間共有結合もしくは分子内共有結合を引き起こす。この効果は、複合生物学的試料からの精製または抽出の後における、このような安定化させ、かつ、部分的に架橋した核酸の回収を低減させうる。例えば、全血液試料中の循環核酸の濃度は、既に比較的低濃度であるので、このような核酸の収率をさらに低減するいかなる措置も回避すべきである。これは、悪性腫瘍または妊娠の第１周産期において発生しつつある胎児に由来する、極めて希少な核酸分子を検出し、解析する場合に特に重要でありうる。したがって、一実施形態によれば、ホルムアルデヒド放出剤は、安定化組成物中に含まれることも、それぞれ安定化のためにさらに使用されることもない。
【０１０６】
したがって、一実施形態によれば、ホルムアルデヒドなどの架橋剤またはホルムアルデヒド放出剤は、安定化組成物中に含まることも、それぞれ安定化のためにさらに使用されることもない。したがって、本明細書では、安定化組成物は、核酸−核酸間、核酸−タンパク質間、特に、タンパク質−ＤＮＡ間、および／またはタンパク質−タンパク質間の架橋を誘導する架橋剤を含まない。特に、安定化組成物は、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、またはホルムアルデヒド放出剤を含まない。さらに、記載される通り、安定化組成物は、例えば、カオトロピック塩など、細胞の溶解を誘導するいかなる添加剤も含まないことが好ましい。
【０１０７】
以下では、特に好ましい実施形態について再度記載する。
【０１０８】
第１の態様では、本発明は特に、試料を、式１
【化３】
2019013250.tif 000006
による少なくとも１つの化合物と接触させることにより、細胞含有生物学的試料を安定化させるための方法であって、式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖状または分枝状に配置された炭素鎖の長さが原子１〜２０個である同一のまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄、またはセレニウム残基であり、式１による前記化合物がＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである方法を対象とする。
【０１０９】
一実施形態によれば、式１による化合物は、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである。一実施形態によれば、式１による少なくとも１つの化合物は、任意選択で、さらなる添加剤を含み、試料と接触させる安定化組成物中に含まれる。一実施形態によれば、細胞含有試料は、体液、血液、軟膜、白血球、血漿、血清、および尿から選択され、好ましくは、試料は、血液試料である。一実施形態によれば、細胞含有試料は、血液試料であり、抗凝血剤とさらに接触させる。一実施形態によれば、試料中に存在する核酸の分解は、安定化により低減される。
【０１１０】
一実施形態によれば、細胞内ＲＮＡを安定化させる。一実施形態によれば、含有される細胞のトランスクリプトーム、特に、ｍＲＮＡの発現プロファイル、および／または含有される細胞内の転写レベルを安定化させる。特に、ｃ−ｆｏｓ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−８、およびｐ５３から選択される１または複数のマーカー遺伝子の転写レベルを、安定化の際少なくとも４８時間にわたり安定化させる。
【０１１１】
一実施形態によれば、方法は、細胞含有試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させるのに適する。試料中に含有される細胞から試料のうちの無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出を低減することが好ましい。
【０１１２】
一実施形態によれば、細胞含有生物学的試料中に含まれる細胞を安定化させる。安定化は、安定化試料からの細胞の単離を可能とすることが好ましい。細胞含有試料は、血液試料であり、白血球を安定化させることが好ましい。特に、方法は、以下の特徴：
ａ）細胞の形態を保存すること、
ｂ）有核細胞の形態を保存すること、
ｃ）試料は、血液試料であり、含有されるリンパ球および／もしくは単球を安定化させること、
ｄ）細胞表面エピトープを保存すること、ならびに／または
ｅ）細胞表面タンパク質を保存すること
のうちの１または複数を有する。
【０１１３】
一実施形態によれば、方法は、血液試料を安定化させるための方法であり、血液試料を、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドおよび抗凝血剤と接触させるステップを含み、含有される細胞内の転写レベルを安定化させる。
一実施形態によれば、方法は、以下の特徴：
ａ）安定化が、細胞含有試料中に含有される有核細胞の溶解を促進しないこと、
ｂ）安定化法が、試料の架橋を伴わずに実施されること、ならびに／または
ｃ）安定化が、核酸−核酸間、タンパク質−核酸間、および／もしくはタンパク質−タンパク質間の架橋を誘導する架橋剤の使用を伴わないこと
のうちの１または複数を有する。
【０１１４】
一実施形態によれば、細胞含有試料を、アポトーシス阻害剤とさらに接触させる。アポトーシス阻害剤は、好ましくは、カスパーゼ阻害剤であり、より好ましくは、汎カスパーゼ阻害剤である。
一実施形態によれば、核酸を、安定化試料から単離する。特に、方法は、以下の特徴：
ａ）安定化組成物中にＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドおよび任意選択でさらなる添加剤が含まれ、細胞含有試料の指定容量に対する安定化組成物の容量比が、１０：１〜１：２０、５：１〜１：１５、１：１〜１：１０、および１：２〜１：５から選択されること、
ｂ）安定化細胞含有試料を、核酸解析法および／もしくは核酸検出法に供すること、
ｃ）細胞内および／もしくは細胞外核酸を安定化試料から単離し、単離核酸を解析および／もしくは検出すること、
ｄ）安定化試料中に含まれる細胞を除去すること、ならびに／または
ｅ）（ｉ）細胞含有生物学的試料、（ｉｉ）細胞を除去した安定化試料、および／もしくは（ｉｉｉ）試料から除去した細胞を保存すること
のうちの１または複数を有する。
【０１１５】
一実施形態によれば、細胞を、安定化試料から除去する。特に、除去された細胞を解析し、そして／または核酸またはタンパク質などの生体分子を、除去された細胞から単離する。一実施形態によれば、ＲＮＡを、安定化試料中に含有される細胞から単離する。
【０１１６】
第２の態様では、本発明は特に、核酸を生物学的試料から単離するための方法であって、
ａ）本発明の第１の態様による方法に従って細胞含有試料を安定化させるステップと、
ｂ）核酸を安定化試料から単離するステップと
を含む方法に関する。
【０１１７】
一実施形態によれば、ステップｂ）は、細胞内核酸、好ましくは、細胞内ＲＮＡを単離するステップを含む。特に、方法は、細胞を安定化試料から除去するステップと、核酸を除去された細胞から単離するステップとを含む。一実施形態によれば、ステップｂ）は、細胞外核酸を単離するステップを含む。
【０１１８】
一実施形態によれば、細胞を残りの試料から分離し、細胞外核酸を残りの試料から単離する。
【０１１９】
一実施形態によれば、試料は、血液である。
【０１２０】
一実施形態によれば、単離核酸を、さらなるステップｃ）において、処理および／または解析し、好ましくは、
ｉ）修飾し、
ｉｉ）少なくとも１つの酵素と接触させ、
ｉｉｉ）増幅し、
ｉｖ）逆転写させ、
ｖ）クローニングし、
ｖｉ）配列決定し、
ｖｉｉ）プローブと接触させ、
ｖｉｉｉ）検出し、
ｉｘ）定量化し、
ｉｘ）同定し、そして／または
ｘ）遺伝子発現プロファイリングについて解析する。
【０１２１】
第３の態様では、本発明は特に、細胞含有生物学的試料を安定化させるのに適する組成物であって、
ａ）式１
【化４】
2019013250.tif 000007
による少なくとも１つの化合物であって、式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖状または分枝状に配置された炭素鎖の長さが原子１〜２０個である同一のまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄、またはセレニウム残基であり、式１による前記化合物がＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである化合物と、
ｂ）少なくとも１つの抗凝血剤と
を含む組成物に関する。
【０１２２】
一実施形態によれば、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドは、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである。
【０１２３】
一実施形態によれば、抗凝血剤は、キレート剤である。一実施形態によれば、細胞含有試料は、血液試料である。一実施形態によれば、組成物は、アポトーシス阻害剤を含む。一実施形態によれば、組成物は、含有される細胞の遺伝子転写プロファイルを安定化させることが可能であり、かつ／または細胞含有試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させることが可能である。
【０１２４】
一実施形態によれば、組成物は、以下の特徴：
ａ）細胞を安定化させ、細胞含有生物学的試料中に含有される細胞から試料のうちの無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出を低減することが可能であること、
ｂ）生物学的試料中に含まれる細胞外ＤＮＡ集団の、安定化試料中に含有される細胞に由来するゲノムＤＮＡによる希釈を低減することが可能であること、
ｃ）生物学的試料中に含まれる細胞外核酸集団の、安定化試料中に含有される細胞に由来する細胞内核酸による希釈を低減することが可能であること、
ｄ）安定化組成物が、細胞の溶解を誘導または促進する濃度で添加剤を含まないこと、
ｅ）安定化組成物が、タンパク質−ＤＮＡ間および／もしくはタンパク質−タンパク質間の架橋を誘導する架橋剤を含まないこと、
ｆ）安定化組成物が、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、もしくはホルムアルデヒド放出剤を含まないこと、
ｇ）安定化組成物が、毒性作用物質を含まないこと、ならびに／または
ｈ）安定化組成物が、細胞含有生物学的試料中に含まれる細胞外核酸集団を、冷蔵せずに、好ましくは室温で、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも２日間〜３日間、少なくとも２日間〜６日間、および／もしくは少なくとも２日間〜７日間から選択される期間、安定化させることが可能であること
のうちの１または複数を有する。
【０１２５】
一実施形態によれば、安定化組成物を血液試料と接触させて、ｃ−ｆｏｓ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−８、およびｐ５３から選択される１または複数のマーカー遺伝子の転写レベルを、安定化の際少なくとも４８時間にわたり安定化させ、安定化組成物の細胞含有試料に対する容量比を、１０：１〜１：２０、５：１〜１：１５、１：１〜１：１０、および１：２〜１：５から選択することが好ましい。
【０１２６】
一実施形態によれば、試料は、血液試料であり、白血球、好ましくは、リンパ球、または試料中に含有される他の細胞の形態および／またはこれらの上の細胞表面エピトープを保存する。安定化組成物を、生物学的試料との混合物として提供することが好ましい。
【０１２７】
一実施形態によれば、安定化組成物は、生物学的試料との混合物として提供され、前記試料は、以下の特徴：
ａ）細胞外核酸を含むこと、
ｂ）全血液であること
のうちの１または複数を有する。
【０１２８】
本発明は、本発明の第１の態様による安定化法における、本発明の第３の態様による組成物の使用をさらに対象とする。
【０１２９】
第４の態様では、本発明は特に、細胞含有生物学的試料、好ましくは、血液、血漿または血清試料を回収するのに適する容器であって、細胞含有生物学的試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させるのに適する安定化組成物を含み、前記安定化組成物が、式１
【化５】
2019013250.tif 000008
による少なくとも１つの化合物を含み、式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖状または分枝状に配置された炭素鎖の長さが原子１〜２０個である同一のまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄、またはセレニウム残基であり、式１による前記化合物がＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである容器を対象とする。
【０１３０】
一実施形態によれば、式１による化合物は、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである。一実施形態によれば、安定化組成物は、抗凝血剤、好ましくは、キレート剤をさらに含む。一実施形態によれば、安定化組成物は、アポトーシス阻害剤、好ましくは、カスパーゼ阻害剤、より好ましくは、汎カスパーゼ阻害剤をさらに含む。一実施形態によれば、安定化組成物は、核酸／核酸間、タンパク質−核酸間、および／またはタンパク質−タンパク質間の架橋を誘導する架橋剤を含まない。
【０１３１】
一実施形態によれば、安定化組成物は、本発明の第３の態様による組成物である。
【０１３２】
一実施形態によれば、容器は、本発明の他の態様について本明細書で規定された特色のうちの１または複数を有する。
【０１３３】
第５の態様では、本発明は、試料を、患者から、本発明の第４の態様による容器のチャンバーへと回収するステップを含む方法を対象とする。
【０１３４】
本発明は、本明細書で開示される例示的な方法および材料により限定されず、本明細書で記載される方法および材料と同様または同等の任意の方法および材料も、本発明の実施形態の実施または試行において使用することができる。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。本明細書で提示される表題は、全体としての明細書を参照することにより読み取られうる、本発明の多様な態様または実施形態の限定ではない。
【０１３５】
本明細書で使用される「溶液」という用語は特に、液体組成物、好ましくは、水性組成物を指す。溶液は、唯一の相の均一の混合物でありうるが、また、溶液が、例えば、含まれる化学的薬剤の、例えば、沈殿物などの固体添加剤を含むことも本発明の範囲内にある。
【０１３６】
ヌクレオチド数（ｎｔ）に照らして本明細書で指し示されるサイズおよびサイズ範囲のそれぞれは、鎖長を指し、したがって、一本鎖分子のほか、二本鎖分子の長さについて記載するためにも使用される。二本鎖分子では、前記ヌクレオチドは、対合している。
【０１３７】
一実施形態によれば、方法の場合ならある種のステップを含むものとして、または組成物の場合ならある種の成分、溶液、および／もしくは緩衝液を含むものとして本明細書で記載される対象物は、それぞれのステップまたは成分からなる対象物を指す。本明細書で記載される好ましい実施形態を選択し、組み合わせることが好ましい。好ましい実施形態のそれぞれの組合せから得られる特殊な対象物もまた、本開示に属する。
【表１−１】
2019013250.tif 000009
【表１−２】
2019013250.tif 000010
【表１−３】
2019013250.tif 000011
【表１−４】
2019013250.tif 000012
【表１−５】
2019013250.tif 000013
【表１−６】
2019013250.tif 000014
【表１−７】
2019013250.tif 000015
【表１−８】
2019013250.tif 000016
【表１−９】
2019013250.tif 000017
【表１−１０】
2019013250.tif 000018
【表１−１１】
2019013250.tif 000019
【表１−１２】
2019013250.tif 000020
【表１−１３】
2019013250.tif 000021
【表１−１４】
2019013250.tif 000022
【表１−１５】
2019013250.tif 000023
【実施例】
【０１３８】
以下の実施例では、本発明の材料および方法が提示される。これらの例は、例示的な目的だけのものであり、いかなる形であれ、本発明を限定するものとみなされるべきではないことを理解されたい。
【０１３９】
Ｉ．Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドの細胞安定化特性および転写レベル安定化特性
（実施例１）
血液試料を安定化させるためのＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの使用
選択される遺伝子（ｃ−ｆｏｓ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−８、ｐ５３）からの一定の転写レベルにより指し示される、遺伝子転写物の安定化能を有する試薬組成物の同定を可能とする試験系および研究設定を確立した。先行研究では、これらの転写物は、保存時の、血液回収後数分間以内に、誘導または下方制御（転写物の増大および喪失）される、極めて不安定的な転写物として同定され、したがって、スクリーニングの目的では「ワーストケース」マーカーとして選択された。
【０１４０】
さらに、ＲＮＡ調製プロトコールの、転写レベルの解析に対する任意の可能な影響を除外するために、試料安定化の［＋］対照のために使用される同じＲＮＡ調製技術を、試料安定化の［−］対照および被験試料を安定化させるためにも使用した。
【０１４１】
血液を、複数のドナーから、複数連のＥＤＴＡ血液チューブ（ＢＤ；試料安定化の［−］対照）および試料安定化の［＋］対照として用いられるＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）へと回収した。ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅ（また、背景技術も参照されたい）は、細胞を溶解させ、これにより、遺伝子転写プロファイルを「凍結」させる組成物を含有する。ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅは、遺伝子発現解析のために血液を安定化させるためのものである。１つの目的は、細胞の溶解に基づかず、転写レベルの安定化において、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅと同じであるかまたは同様の効能を達成する安定化法を見出すことであった。したがって、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ内で回収され、したがって、その中に含有される安定化組成物で処置された試料を、実験の設定では、陽性対照として使用した。血液回収の直後において、ＥＤＴＡ血液試料の半分を、細胞および転写物の安定化試験溶液で処置し、血液被験試料を結果としてもたらした。１ｍｌの安定化添加剤を、９ｍｌのＥＤＴＡ血液へと添加した。血液およびスタビライザー溶液は、８〜１０回にわたるチューブの反転により混合した。全ての血液チューブは、ＲＴで０、２４、および７２時間にわたりインキュベートした。インキュベーションを伴わない（０時間後の試験時点）として規定されたＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅは、ＲＮＡを、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅから単離するのに要求される最小限の細胞溶解時間およびＲＮＡ沈殿時間であるので、２時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅ試料を、−２０℃で凍結させる一方、２．５ｍｌずつのＥＤＴＡ血液およびスタビライザーと混合されたＥＤＴＡ血液試料のアリコートを、０時間後の試験時点または安定化後の時間において、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅへと移し、記載したチューブの反転により混合し、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅ内で６時間にわたり、溶解させるためにインキュベートした後、−２０℃で保存した。
【０１４２】
融解およびチューブの室温への平衡化の後で、ハンドブックに記載されているプロトコールに従って、ＰＡＸｇｅｎｅ  ９６  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により、最終的にＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅ内に入れた全ての血液試料からのＲＮＡの調製を実施した。
【０１４３】
ＲＮＡの量（ＲＮＡの収率）および質（ＲＮＡの純度、ＲＮＡの完全性）は、ＵＶ分光法およびＲＩＮの計算を伴う小型キャピラリーゲル電気泳動（Ｎａｎｏｃｈｉｐｓ  ｏｎ
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）により測定した。
【０１４４】
全てのＲＮＡ試料の転写レベルは、ＦＯＳ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ８、およびＴＰ５３のモノプレックスアッセイを使用して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより解析し、反応へと投入された鋳型の量に照らして標準化した。転写物の量を反映する、結果として得られるＣＴ値を直接比較した。血液試料のＲＴでのインキュベーションから影響を受けなかった相対転写レベルが、一定のＣＴ値により指し示される一方で、転写物の増大（例えば、遺伝子の誘導による）は、ＣＴの低下により指し示され、転写物の喪失（例えば、遺伝子の抑制による）は、高ＣＴ値の上昇により指し示された。
【０１４５】
細胞および細胞表面エピトープの完全性は、蛍光コンジュゲートした抗ＣＤ３抗体を使用して、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）により解析した。
【０１４６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド（ＤＭＰＡ）を、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである、式１による化合物の例として、材料および方法において記載した、転写物および白血球を安定化させるその潜在的可能性について調べた。血液は、８例のドナーから、異なるチューブへと回収し、処置せずに対照として保持するか、または１ｍｌの安定化添加剤（Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドに対する容量比５０％であり、ｐＨ５．５で５倍濃度のＭＯＰＳ緩衝液）を、９ｍｌのＥＤＴＡ血液へと添加することにより処置した。血液の混合、インキュベーション、血液試料アリコートのＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅへの移動、凍結、保存およびＲＮＡの調製は、上記で記載した通りに行った。ＲＮＡは、上記で記載した転写レベル解析にかけた。
【０１４７】
加えて、安定化試料中の細胞および細胞表面エピトープの完全性を、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）により解析した。詳細を述べると、リンパ球に特異的な細胞エピトープであるＣＤ３を指向する蛍光コンジュゲート抗体（ＰＥ標識された抗ＣＤ３）の結合により、細胞表面タンパク質の存在および接近可能性を解析したが、他の白血球亜型（単球、好中球）は、ＣＤ３陰性である。本実施例において得られた全ての結果を、図１〜図５に示す。
【０１４８】
予測される通り、４つの選択された遺伝子由来の転写物の相対レベルは、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅ内では安定性を維持し、スタビライザーを施されないＥＤＴＡチューブ内では変化した（ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＦＯＳ、ＩＬ８の遺伝子の誘導／転写物の増大、およびＩＬ１Ｂ、ＴＰ５３の遺伝子の抑制／転写物の喪失）。スタビライザーであるＤＭＰＡと混合されたＥＤＴＡ血液試料は、血液試料を保存する時間経過にわたる、ＣＴ値の不変化またはわずかな最小限だけの変化により指し示される発現レベルの安定化を示した（図１〜４を参照されたい）。したがって、ＤＭＰＡにより安定化させると、遺伝子発現プロファイルは、ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅについて見られる効果と同様に「凍結」された。しかし、ＤＭＰＡで処置された試料中では、細胞が保存され、これにより、細胞の個別の解析が可能となった。
【０１４９】
未処置のＥＤＴＡ血液（ＦＡＣＳ［＋］対照［ＥＤＴＡ］）では、室温で３日間にわたる血液のインキュベーションであるこの試験シリーズの最後のインキュベーション試験時点まで、リンパ球が検出された。また、安定化添加剤（ＤＭＰＡに対する容量比５％の試験溶液）で処置されたＥＤＴＡ血液中のリンパ球も、最長で３日間にわたり検出可能であった（図５を参照されたい）。ＦＡＣＳ（−）対照（ＥＤＴＡ）試料中では、特異的な蛍光シグナルが検出されなかったのに対し、ＥＤＴＡチューブへと回収された他の全ての試料であって、処置せずに保持された試料、およびスタビライザーであるＤＭＰＡで処置された試料である、新鮮な血液およびインキュベートされた血液による試料は、特異的なリンパ球の存在を示した。したがって、ＤＭＰＡによる安定化は、安定化試料中に含有される細胞の解析を可能とする。
【０１５０】
したがって、実施例１は、ＲＮＡを、スタビライザーとしてのＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド（ＤＭＰＡ）で処置された血液試料から、効率的に単離しうることを示す。抽出されたＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ解析に適し、転写レベルは、ＤＭＰＡと混合された血液中、室温で長時間にわたり効率的に安定化された。さらに、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド（ＤＭＰＡ）で処置された血液中では、リンパ球はインタクトであり、細胞表面エピトープ（細胞膜タンパク質）も検出可能であった。したがって、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドなどの、式１によるＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドは、転写レベルを安定化させる有効な安定化剤であり、したがって、転写レベルの変化を阻害することにより、遺伝子転写プロファイルを安定化させ、解析のために、細胞を、安定化試料から単離しうるように、細胞を安定化させることもさらに可能である、有効な安定化剤である。
【０１５１】
ＩＩ．Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドを、単独またはカスパーゼ阻害剤と組み合わせて使用する、血液試料中の細胞外核酸集団の安定化
材料および方法
単独であるかまたはカスパーゼ阻害剤と組み合わせた、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド（ＤＭＰＡ）を、細胞含有生物学的試料、本明細書では、全血液試料を安定化させるその能力について調べた。下記の実施例から見ることができる通り、ＤＭＰＡは、血液試料を効率的に安定化させ、特に、安定化血液試料中に含まれる細胞からのゲノムＤＮＡの放出を阻害することが見出された。したがって、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドは、細胞外核酸集団を安定化させることが可能である。さらに、カスパーゼ阻害剤と組み合わせたＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドが、安定化効果の達成を改善するのに有利であることも判明した。それぞれの組合せは、安定化効果の延長を結果としてもたらし、さらに、異なるドナーから得られる血液試料について達成される安定化効果の変動の減少も示した。これは、細胞外核酸集団を保存する血液試料について均一で信頼できる安定化法をもたらすので、重要な利点である。
【０１５２】
血液の回収および安定化
ドナーから得られた血液を、１０ｍｌのＫ２  ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ）へと回収した。回収された４．５ｍｌずつの血液を、０．９ｍｌの異なる安定化溶液（被験安定化溶液の詳細についての下記の実施例を参照されたい）と混合した。
【０１５３】
全ての安定化血液試料を、１つの条件および１つの試験時点につき３連で準備した。時点０（基準時点）では、安定化溶液と血液とを混合した直後に、血漿を生成させ、循環細胞外ＤＮＡを抽出した。残りの安定化血液試料は、室温で３日間および６日間にわたり保存した。
【０１５４】
また、基準対照として、ＥＤＴＡ安定化血液試料（さらなる添加剤を伴わずに、Ｋ２  ＥＤＴＡチューブ内で回収された）も、３日間および６日間にわたり保存した。さらに、実施例で指し示されている通り、カスパーゼ阻害剤およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＡ）を含む安定化溶液も、比較に組み入れた（前記安定化溶液を血液試料へと添加する場合に得られる混合物中の最終濃度：１ｍｌ当たり７．２ｍｇのＫ２  ＥＤＴＡ、１μＭのＱｕｉｎｏｌｉｎｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）および５％のＤＭＡＡ）（未公開のＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７０２１１およびＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６８８５０を参照されたい）。本明細書における被験ＤＭＡＡ安定化試料は、さらなるカスパーゼ阻害剤を常に含んだ。後続の例では、カスパーゼ阻害剤を伴わないＤＭＡＡ含有安定化溶液については調べなかった。
【０１５５】
細胞外核酸の単離および解析
血漿は、血液を含有するチューブを４回にわたり反転させることにより、安定化血液試料および非安定化（ＥＤＴＡ）血液試料から作り出した。次いで、チューブを、４℃、１９００×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。２．５ｍｌの血漿画分を、未使用の１５ｍｌのｆａｌｃｏｎチューブへと移し、４℃、１６，０００×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。製造元の指示書に従って、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、細胞外核酸を単離するために清澄化した２ｍｌずつの血漿を使用した。
【０１５６】
異なる断片長の１８ＳリボソームＤＮＡ：
１８ＳリボソームＤＮＡ：６６ｂｐの単位複製配列
１８ＳリボソームＤＮＡ：５００ｂｐの単位複製配列
をターゲティングする２つの異なるｑＰＣＲアッセイを使用して、単離細胞外ＤＮＡを解析した。
【表２】
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【０１５７】
ｇＤＮＡの検量線に従って、個別の試料のサイクル閾値を、溶出物中のｇＤＮＡ量へと変換した。保存時点のｇＤＮＡ量を、同じドナー由来の時点ゼロのｇＤＮＡレベルと比較し、倍数の増大として図に示す。とりわけ、保存後における、血液試料の血漿画分中の５００ｂｐの断片の増大は、白血球の溶解／破壊の指標である。したがって、５００ｂｐのＤＮＡの放出量が少ないほど、安定化法の効能は大きい。
【０１５８】
結果
後出で記載される例に対応する結果を示す図は、異なる単位複製配列長の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を使用する、異なる安定化溶液による、時点０に照らしたＤＮＡの増大（倍数変化）を示す。バーは、条件および試験時点についての３連試料の平均を指し示す。
【０１５９】
（実施例２）
カスパーゼ阻害剤を伴わずにＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドを使用する安定化
実施例２では、異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド（ＤＭＰＡ）を、異なるドナーから得られる血液試料を安定化させるために使用した。解析の焦点は、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大を解析することにより決定される、細胞外核酸集団の安定化であった。試料の安定化および処理は、ＩＩの下の「材料および方法」において記載した通りに実施した。
【０１６０】
カスパーゼ阻害剤を伴わない安定化溶液は、異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドおよびＥＤＴＡを含んだ。これらの安定化溶液を血液試料へと添加して、血液／安定化溶液混合物中の以下：７．２ｍｇのＫ２  ＥＤＴＡ／ｍｌおよび異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド（１．５％、２％、または２．５％）の最終濃度を得た。ＤＭＡＡ安定化試料（５％）はまた、基準としても組み入れた。
【０１６１】
図６および７は、血液を異なる濃度のＤＭＰＡにより安定化させた場合に得られる安定化結果を示す。Ｎ−メチルホルムアミドで安定化させた試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大の著明な低減から見ることができる通り、ＤＭＰＡをスタビライザーとして異なる濃度で含む被験安定化組成物は、細胞外核酸集団を安定化させるのに有効であった。安定化剤はＤＭＰＡだけであり、低濃度を使用した場合であっても、被験の全安定化時間（最長６日間）にわたり、安定化効果を見ることができた。
【０１６２】
（実施例３）
Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドおよびカスパーゼ阻害剤による安定化
２例の異なるドナー由来の血液を、１０ｍｌのＫ２  ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ）へと回収した。それぞれ回収された４．５ｍｌずつの血液を、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド、ＥＤＴＡ、およびカスパーゼ阻害剤を含む０．９ｍｌの安定化溶液と混合した。これにより、血液／安定化混合物中に以下の最終濃度：
７．２ｍｇのＫ２  ＥＤＴＡ、１μＭのＱｕｉｎｏｌｉｎｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）、および２．５％、５％、または７．５％（ｖ／ｖ）のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド、または５％（ｖ／ｖ）のＤＭＡＡのそれぞれが得られた。
【０１６３】
全ての安定化血液試料を、１つの条件および１つの試験時点につき３連で準備した。時点０（基準時点）では、安定化溶液と血液とを混合した直後に、血漿を生成させ、ｃｃｆＤＮＡを抽出した。残りの血液試料は、室温で３日間および６日間にわたり保存した。また、対照として、ＥＤＴＡ安定化血液試料も３日間および６日間にわたり保存した。血液を含有するチューブを４回にわたり反転させることにより、安定化血液試料および非安定化（ＥＤＴＡ）血液試料から血漿を生成させた。次いで、チューブを、３，０００ｒｐｍ／１９１２×ｇで１５分間にわたり遠心分離した。２．５ｍｌの血漿画分を、未使用の１５ｍｌのｆａｌｃｏｎチューブへと移し、１６，０００×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。ＱＩＡａｍｐ循環核酸キットを使用して、細胞外核酸を単離するために、清澄化した２ｍｌずつの血漿を使用した。
【０１６４】
結果を、図８および９に示す。時点０に照らした、単位複製配列の長さが異なる１８Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子を使用する、２．５％、５％、および７．５％のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドまたは５％のＤＭＡＡによる、ＤＮＡの増大（倍数変化）を示す。バーは、条件および試験時点についての３連試料の平均を指し示す。本発明による全ての溶液は、室温で３および６日間にわたる保存後において、非安定化ＥＤＴＡ血液と比較して、著明に低量のＤＮＡの放出を示し、ＤＭＡＡと同等の結果を示す。
【０１６５】
（実施例４）
Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドおよびカスパーゼ阻害剤による安定化
２例の異なるドナー由来の血液を、１０ｍｌのＫ２  ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ）へと回収した。それぞれ回収された４．５ｍｌずつの血液を、Ｋ２  ＥＤＴＡ、Ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤：ＤＭＳＯ中に溶存させた）、および異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド（ＤＭＰＡ）またはＤＭＡＡを含有する、０．９ｍｌの安定化溶液と混合した。試料の安定化および処理は、ＩＩの下の「材料および方法」において記載した通りに実施した。
【０１６６】
血液／安定化混合物中に以下の最終濃度：
１ｍｌ当たり７．２ｍｇのＫ２  ＥＤＴＡ、１μＭのＱｕｉｎｏｌｉｎｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）、および異なる濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド（Ｎ，Ｎ  ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｏｒｐａｎａｍｉｄｅ）（２．５％、５％、または７．５％）、または５％のＤＭＡＡ
を得た。
【０１６７】
結果を、図１０および１１に示す。解析の焦点は、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大を解析することにより決定される、細胞外核酸集団の安定化であった。時点０に照らした、単位複製配列の長さが異なる１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を使用する、２．５％、５％、および７．５％のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド（ＤＭＰＡ）またはカスパーゼ阻害剤を伴う５％のＤＭＡＡによる、ＤＮＡの増大（倍数変化）を示す。バーは、条件および試験時点についての３連試料の平均を指し示す。見られる通り、本発明による溶液は、室温で３および６日間にわたる保存後において、非安定化ＥＤＴＡ血液と比較して、著明に低量のＤＮＡの放出を示し、安定化ＤＭＡＡ＋カスパーゼ阻害剤と同等の結果を示した。したがって、細胞外核酸集団の安定化が達成された。さらに、溶血が生じたのかどうかを解析するために、得られた血漿を精査した。特に、２．５％および５％のＤＭＰＡで安定化させた血液試料から得られる血漿試料は、溶血の徴候を示さなかった。
【０１６８】
（実施例５）
Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドおよびカスパーゼ阻害剤による安定化
実施例５では、血液試料を安定化させるために、異なる濃度のＤＭＰＡを、カスパーゼ阻害剤と組み合わせて使用した。解析の焦点は、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大を解析することにより決定される、細胞外核酸集団の安定化であった。試料の安定化および処理は、ＩＩの下の「材料および方法」において記載した通りに実施した。
【０１６９】
安定化溶液は、異なる濃度のＤＭＰＡ、カスパーゼ阻害剤、およびＥＤＴＡを含んだ。これらの安定化溶液を血液試料へと添加して、血液／安定化溶液混合物中の以下の最終濃度：
１ｍｌ当たり７．２ｍｇのＫ２  ＥＤＴＡ、１μＭのＱｕｉｎｏｌｉｎｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）、および異なる濃度のＤＭＰＡ（詳細については、図を参照されたい）
を得た。
【０１７０】
図１２〜１６は、異なるドナー由来の血液について得られる安定化結果を示し、血液試料は異なる濃度のＤＭＰＡ（詳細については、図を参照されたい）およびカスパーゼ阻害剤で安定化させた。ＤＭＰＡ安定化試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡの増大の著明な低減から見ることができる通り、ＤＭＰＡを異なる濃度で含む被験安定化組成物は、細胞外核酸集団を安定化させるのに有効であった。したがって、異なる濃度でカスパーゼ阻害剤と組み合わせたＤＭＰＡは、血液試料を安定化させるのに高度に有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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