(57)【要約】      （修正有）【課題】イネ起源の遺伝子を導入することにより、カロテノイドを高蓄積するイネの提供。【解決手段】（ｉ）特定の配列からなるアミノ酸配列を含むタンパク質、（ｉｉ）特定の配列からなるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは、（ｉｉｉ）特定の配列からなるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現量が野生型と比較して増加するように改変され、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した形質転換イネ。【選択図】図５
2019013154.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列、
をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列
と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、ならびに、
（ｂ）（ａ）に記載の遺伝子をイネにおいて過剰発現させるプロモーターとして機能するＤＮＡ、
を含有する、組換えベクター。
【請求項２】
（ｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列、
を含むタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列
と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
の発現量が野生型と比較して増加するように改変され、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した形質転換イネ。
【請求項３】
請求項１に記載の組換えベクターで形質転換され、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した請求項２に記載の形質転換イネ。
【請求項４】
以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した形質転換イネの作製方法。
（ａ）請求項１に記載の組換えベクターでイネ細胞を形質転換する工程、
（ｂ）該組換えベクターで形質転換されたイネ細胞からイネ植物体を再生する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カロテノイドを高蓄積するイネ及びその作製方法に関する。詳細には、本発明は、GIC（GLK-Induced CCT domain-containing proteins）をコードする遺伝子を過剰
に発現させることによってカロテノイドを高濃度に蓄積するイネおよびその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイドはビタミンＡ（レチノール）の前駆体として重要な脂溶性色素である。ビタミンＡの欠乏はヒトや家畜に夜盲症や失明、抗酸化力の低下、粘膜の乾燥、免疫力の低下等を引き起こす。特に米を主食とする地域で夜盲症や失明のリスクが高い。世界保健機関（WHO、2009）は、年間で約50万人の未就学児童と約100万人の妊婦が夜盲症を患ったと報告している（非特許文献１）。ビタミンA前駆体のβ-カロテン（カロテノイドの一種）高蓄積米の実用化により、上述のリスクを低減すると期待されている。また、家畜にも飼料にビタミン剤を添加して与えることがしばしばあるが、カロテノイド高蓄積米を飼料に混合すれば、ビタミン剤の投与量の軽減が可能で、経費の節減につながると期待されている。
カロテノイドを高度に蓄積するイネとして「ゴールデンライス」の実用化が進行中である。ゴールデンライスは、植物起源のphytoene synthase（PSY）の他に植物病原細菌（Erwinia uredovora）起源のcarotene desaturase（crtI）のカロテノイド生合成系の酵素をコードする遺伝子が導入された遺伝子組換えイネであり、これら2遺伝子を恒常的過剰発
現あるいは胚乳特異的に高発現させることで穀粒のカロテノイド含量を高めている（非特許文献２，３）。
実用化途上の改良型ゴールデンライス（ゴールデンライス2）にはイネ起源ではない遺
伝子、すなわちトウモロコシPSY遺伝子とErwinia crtI遺伝子が共導入されており（非特
許文献２）、目下、フィリピン、バングラデシュ、インドネシアで実用化に向けた試験栽培が進行中である。しかし、遺伝子組換え作物（Genetically Modified Organism; GMO）栽培に対する厳しい規制やGMOに対する農民や消費者のネガティブなイメージ等のため、
ゴールデンライス2の実用化への道は平坦ではない状況である。従って、社会により広く
受け入れやすい方策の一つとして、出来る限り植物起源、より望ましくはイネ起源の遺伝子をイネに導入することにより、カロテノイドを高蓄積することが求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】World Health Organization (WHO) 著,「Global prevalence of vitamin A deficiency in populations at risk 1995-2005: WHO global database on vitamin A deficiency.」, (2009), p.1-55.
【非特許文献２】Paine, J.ら著,「Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content.」, Nat Biotechnol, (2005) 23: 482-487.
【非特許文献３】Ye, X.ら著,「Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm.」, Science, (2000) 287: 303-305.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、イネ起源の遺伝子を導入することにより、カロテノイドを高蓄積するイネを作製することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、葉緑体分化の正の制御因子Golden2-Like（GLK：イネではOsGLK1とOsGLK2の2種）のcDNAを過剰発現するイネ（OsGLK1/2-OX）のカルスが、野生型カルスの乳白色
に対し、緑色を呈し、かつその細胞内に発達した葉緑体を有することを見出した。次に、OsGLK1-OXイネならびにOsGLK2-OXイネの緑色カルスを、農業生物資源研究所（現 農業・
食品産業技術総合研究機構）にてイネ44k発現マイクロアレイ解析に供試した。その結果
、野生型カルスに比して、上記の形質転換イネの緑色カルスで共通して3倍以上の発現上
昇を見せた遺伝子群の中に、タンパク質間相互作用やDNA結合に働くと考えられるCCTドメインをC末端側に含むCONSTANS-like（COL）ファミリー転写因子と推定されるタンパク質
をコードする遺伝子を5種類見出した（GLK-Induced CCT domain-containing proteins：GIC1、GIC2、GIC3、GIC4、GIC5）。本発明者らは、GIC1〜GIC5遺伝子の各cDNAをイネに個
別導入し、過剰発現させたところ、OsGIC4-OXおよびOsGIC5-OXイネ系統のカルスは乳白色で、濃黄色カルスは出現しなかった。一方、GIC1、GIC2、GIC3を過剰発現する形質転換イネ（OsGIC1/2/3-OX）系統は、特定の種類のカロテノイドの高蓄積に起因して、カルスや
種子が濃黄色を呈することを見出した。本発明者らはこのような知見に基づいて発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）（ａ）（ｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列、
をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列
と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、ならびに、
（ｂ）（ａ）に記載の遺伝子をイネにおいて過剰発現させるプロモーターとして機能するＤＮＡ、
を含有する、組換えベクター。
（２）（ｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列、
を含むタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列
と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
の発現量が野生型と比較して増加するように改変され、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した形質転換イネ。
（３）（１）に記載の組換えベクターで形質転換され、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した前記形質転換イネ。
（４）以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した形質転換イネの作製方法。
（ａ）（１）に記載の組換えベクターでイネ細胞を形質転換する工程、
（ｂ）該組換えベクターで形質転換されたイネ細胞からイネ植物体を再生する工程。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のイネ及びその作製法は、イネ起源の遺伝子をイネに導入する点でゴールデンライスに比べて少ない外来遺伝子数で、ゴールデンライスとは全く異なるメカニズム（すなわち、カロテノイド生合成酵素遺伝子を導入しない）により、カロテノイドを高蓄積させることができる。カロテノイド生合成酵素遺伝子ではなく、GIC遺伝子をイネに導入する
ことによりカロテノイドを高蓄積できるのは、当該分野の技術常識から予測し得なかった顕著な効果である。
本発明の組換えベクターを用いてイネを形質転換することにより、カロテノイドをイネに高蓄積できるため、本発明のイネは、稲作地帯でビタミンＡ欠乏にさいなまれている人々の救済に活用可能であり、また、家畜のビタミンＡ補給や欠乏対策にも活用可能である。
本発明の組換えベクターにおいて、例えば、胚乳特異的発現遺伝子のプロモーターを使用することにより、カロテノイドを胚乳限定的に高蓄積するイネを作製することができる。
本発明の組換えベクターにおいて、例えば、葉身に比べて葉緑体の発達が十分でない葉鞘やシュート（地上部）維管束で特異的に発現する遺伝子のプロモーターを使用することにより、カロテノイドを葉鞘や維管束に高蓄積するイネを作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、CO-like（COL）転写因子群の系統樹である。GIC1-5はイネ由来、GIC1-5以外はシロイヌナズナ由来である。
【図２】図２は、GIC1-3のアミノ酸配列のアライメントである。GIC1-3は、Ｎ末端側にB-Box ジンクフィンガー（zinc finger: ZF）ドメインを有し、Ｃ末端側にEAR様モチーフおよびCCTドメインを有する。
【図３】図３は、GIC1L 転写産物（mRNA 前駆体）の選択的スプライシングによってGIC1S mRNA の出現する分子機構を示している。
【図４】図４は、GIC1-3を過剰発現するためのバイナリーベクターpSMAHdN638GWの構造を示す。SpR：Tn7由来スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性遺伝子、staA：シュードモナスプラスミドpVS1由来のプラスミド安定性に関与する領域、repA-LC：アグロバクテリウム内のプラスミド維持のための複製タンパク質Ａ遺伝子（低コピータイプ）およびpVS1由来複製開始領域、ColE1 ori：pBR322由来ColE1型複製開始領域、Pnos：アグロバクテリウムnopaline synthase遺伝子プロモーター、hpt：大腸菌ハイグロマイシン耐性遺伝子、TiaaM：アグロバクテリウムtryptophan 2-monooxygenase（iaaM）遺伝子ポリアデニル化シグナル（ターミネーター）、OsAct-1 prom：イネActin-1遺伝子プロモーター、Gateway Reading Frame Cassette A（RfA）：attR1からattR2までの配列でGateway部位特異的DNA組換え用カセット（CmR：クロラムフェニコール耐性遺伝子、ccdB：ネガティブ選抜用致死遺伝子）。部位特異的Gateway LR反応により、Gatewayカセットが対象GIC cDNAに置換される。Tnos：アグロバクテリウムnopaline synthase遺伝子ポリアデニル化シグナル（ターミネーター）、LBとRB：アグロバクテリウムT-DNA left border配列と同right border配列。
【図５】図５は、GIC過剰発現（OX）イネのカルス（上図：野生型（日本晴）、GIC1-OX及びGIC2-OXイネ系統、下図：野生型とGIC1-OXイネ系統）の写真を示す。GIC過剰発現により、各形質転換イネ系統のカルスは濃黄色を呈した。
【図６】図６は、GIC1S過剰発現（GIC1S-OX）イネ系統（T1世代）の種子胚が黄色を呈したことを示す写真である。 MS寒天培地に置床して一晩経過した状態を比較した。左半分：野生型（日本晴）、右半分：GIC1S-OXイネ系統（T1世代）本明細書では再分化した植物の世代をT0と定義し、その自殖後代をT1世代と称する。
【図７】図７Aは、GIC1L-OXイネ系統（T2世代）の種子由来のカルスが黄色を呈したことを示す写真である。Aでは、種子をN6D寒天培地に置床して17日後のカルスの呈色状況を写真撮影した。Bでは、T2 種子由来のカルスをN6D寒天培地にて継代し、135日後の呈色状況を写真撮影した。図７Bは、GIC1L-OXイネ系統（T2世代）の種子由来のカルスが黄色を呈し、かつその呈色が少なくとも135日間安定に維持されていることを示す写真である。左側：野生型（日本晴）、右側：GIC1L-OXイネ系統（T2世代）
【図８】図８は、分光学的測定から導き出されたGIC2-OX及びGIC1S-OXイネカルスのカロテノイド含量を示す。GIC2-OX及びGIC1S-OXイネは３系統ずつ供試した。
【図９】図９は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析から算出した各標品のカロテノイド含有量を示す。カロテノイド含有量は、各検体（カルス）をケン化処理した後の抽出液を、450nmの光波長で検出したHPLCクロマトグラムにおけるピーク面積の合計から、1 g新鮮重のカルスあたりのルテイン当量として算出した。本分析は農業・食品産業技術総合研究機構 野菜花き研究部門の山溝千尋博士と大宮あけみ博士に実施頂いた。
【図１０】図１０は、HPLCによるGIC1S-OX及びGIC2-OXイネカルスのカロテノイド組成を示す。本分析は農業・食品産業技術総合研究機構 野菜花き研究部門の山溝千尋博士と大宮あけみ博士に実施頂いた。mAU: milliabsorbance unit（ミリ吸光単位）
【図１１】図１１は、各種欠失型または変異型GIC1 cDNAを過剰発現するカルスの写真及びカロテノイド色素の分光学的定量の結果をまとめて示したものである。
【図１２】図１２は、GIC1タンパク質の334番目のロイシン（L）残基をアラニン（A）残基に置換した変異型GIC1(L334A)をコードするcDNAであるGIC1(L334A)を過剰発現するGIC1(L334A)-OXカルスが黄化しなかったことを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．本発明の組換えベクター
本発明の組換えベクターは、GIC1、GIC2またはGIC3をコードする遺伝子の各cDNA配列、および、これらの遺伝子をイネにおいて過剰発現させるプロモーターとして機能するＤＮＡを含有する。GIC1、GIC2、GIC3は単独または２〜３の組み合わせで過剰発現されてもよい。本発明の組換えベクターにおいて、GIC1、GIC2またはGIC3をコードする遺伝子の各cDNAは、上記の過剰発現型プロモーター配列の3’下流に連結され、同プロモーターの制御
下に置かれている。
GIC1［遺伝子座 (RAP Locus): Os02g0731700］、GIC2（Os03g0711100）、及びGIC3（Os06g0264200）遺伝子の塩基配列、並びに同遺伝子産物のアミノ酸配列は当該分野で公知である。本明細書中において、GIC1の塩基配列（cDNA配列）は、配列番号１で示され、そのアミノ酸配列は、配列番号２で示されている。GIC2の塩基配列（cDNA配列）は、配列番号３で示され、そのアミノ酸配列は、配列番号４で示されている。GIC3の塩基配列（cDNA配列）は、配列番号５で示され、そのアミノ酸配列は、配列番号６で示されている。
なお、実施例で示すように、GIC1はＮ末部分を欠損させた配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列を有するＮ末欠損体でもカロテノイド高蓄積効果を発揮するのでこのＮ末欠損体を過剰発現させてもよい。また、配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列に対応するGIC2およびGIC3の部分は、図２のアラインメントから、それぞれ配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１、配列番号６のアミノ酸番号１９６〜
４４８に該当するので、これらのアミノ酸配列を有するGIC2およびGIC3のＮ末欠損体を過剰発現させてもよい。
【００１０】
本発明の組換えベクターにおいて、「過剰発現」とは、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子などの目的の遺伝子の発現量が、野生型イネと比較して、mRNAの量が、例えば、３倍以上、好ましくは１０倍以上に上昇していることを意味する。発現量は、例えば、定量的RT-PCRで測定できる。GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子の発現の上昇には、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子の転写の促進、転写物のスプライシングの促進、およびタンパク質への翻訳の促進が含まれる。
【００１１】
GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子は、好ましくは、それぞれ、配列番号１もしくは配列番号１の塩基番号６０７〜１３５６、配列番号３もしくは配列番号３の塩基番号６０７〜１２６３、配列番号５もしくは配列番号５の塩基番号５８６〜１３４４で示される配列を有するＤＮＡであり、イネで過剰発現させることにより野生型イネと比較してカロテノイドの蓄積量が増加する限り、配列番号１もしくは配列番号１の塩基番号６０７〜１３５６、配列番号３もしくは配列番号３の塩基番号６０７〜１２６３、配列番号５もしくは配列番号５の塩基番号５８６〜１３４４の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有するＤＮＡであってもよい。本発明でＤＮＡに関し「ストリンジェントな条件下」というときは、高程度にストリンジェントな条件をいう。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、第6〜7章、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示されている。本発明において、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、5XSSC、7%(W/V)SDS、100マイクログラム/ml変性サケ精子DNA、5Xデンハルト液を含む溶液にて60℃でハイブリダイゼーションを行い、その後0.1XSSC溶液にて65℃でしんとうしながら２時間洗浄する条件が挙げられ
る。GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子は、さらに、イネで過剰発現させることにより野生型イネと比較してカロテノイドの蓄積量が増加する限り、配列番号１もしくは配列番号１の塩基番号６０７〜１３５６、配列番号３もしくは配列番号３の塩基番号６０７〜１２６３、配列番号５もしくは配列番号５の塩基番号５８６〜１３４４の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。ここで、「１または数個の塩基」とは、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜９個の塩基である。
【００１２】
GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子は、好ましくは、配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列をコードする。また、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子は、これらの遺伝子の機能に実質的に影響しない保存的変異を有していてもよい。すなわち、配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１又は数個のアミノ酸残基」とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個のアミノ酸残基である。なお、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子は、イネで過剰発現させることにより野生型イネと比較してカロテノイドの蓄積量が増加する限り、配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。
【００１３】
GIC（GLK-Induced CCT domain-containing proteins：GIC1-5）との名称は、GIC遺伝子が、葉緑体分化の正の制御因子Golden2-Like（GLK）のcDNAを過剰発現するイネにおいて
見出され、タンパク質間相互作用やDNA結合に働くと考えられるCCTドメインをC末端側に
含むCONSTANS-like（COL）ファミリー転写因子をコードしており、5種類存在していたこ
とに由来する（図1、2）。GIC1-5のうちGIC1-3の3種は互いにアミノ酸配列同一性が高く
、GIC1とGIC2の同一性は３７％であり、GIC1とGIC3の同一性は５９％であり、GIC2とGIC3の同一性は４１％であり、タンパク質間相互作用への関与が推測されるB-box zinc finger（ZF）ドメインをN末端側に、タンパク質間相互作用やDNA結合に働くと考えられるCCTドメインをC末端側にそれぞれ1つずつ有するのが特徴である（図1、2）。B-boxドメインの
同一性は、GIC1とGIC2間で８１％、GIC1とGIC3間で９８％、GIC2とGIC3間で８４％を示した。また、CCTドメインの同一性は、GIC1とGIC2間で９５％、GIC1とGIC3間で９８％、GIC2とGIC3間で９８％を示した（表１）。以上より、両ドメインはGIC1-3で高度に保存され
ていることが判明した。この知見は、これら３種類のGICタンパク質の機能に類似性（重
複性）があることを示唆するものである。
【００１４】
【表１】
2019013154.tif 000003
【００１５】
GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、またはGIC3遺伝子が挿入されるベクターは、イネ植物細胞内で遺伝子を過剰発現させるためのプロモーターを含み、イネ植物細胞内で挿入物の機能を発揮させることが可能なものであれば特に制限はない。イネ植物細胞内で遺伝子を過剰発現させるためのプロモーターとしてはGIC1遺伝子、GIC2遺伝子、またはGIC3遺伝子が本来有するプロモーターより強力なプロモーターであることが好ましく、恒常的プロモーターでも誘導型プロモーターでもよいが、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロ
モーター、イネ由来アクチンプロモーター（例えば、Actin-1遺伝子のプロモーター）、
トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター（例えば、Ubiquitin-1（ZmUbi-1）遺伝子のプロモーター）、イネ由来翻訳伸長因子プロモーター（例えば、Elongation factor 1 beta（EF-1β）遺伝子のプロモーター）などを用いることができる。ここでいう「イネ植物細胞」には、種々の形態のイネ植物細胞、例えば、種子、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００１６】
また、本発明の組換えベクターにおいて、例えば、Plant Mol. Biol. 30: 1207-1221 (1996)およびPlant J. 4: 357-366 (1993)に記載されるような胚乳特異的発現遺伝子のプ
ロモーター（GluB-1、GluA-2）を使用することにより、カロテノイドを胚乳限定的に高蓄積するイネを作製することができるし、例えば、葉鞘特異的発現遺伝子のプロモーターや、特許第4474540号公報に記載されるようなシュート（地上部）維管束特異的発現遺伝子
のプロモーターを使用することにより、カロテノイドを葉鞘や維管束に高蓄積するイネを作製することができる。
【００１７】
本発明の組換えベクターを用いることにより、イネにおいてカロテノイドを高濃度で蓄積させることができる。カロテノイドのうち、植物性の食品由来の主要なカロテノイドとしては、β−カロテン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−カロテン、β−クリプトキサンチンの６種が知られている。この６種のカロテノイドについては、食品や植物により含まれるカロテノイドの組成に特徴がある。例えば、β−カロテンは、ニンジン、カボチャなどの緑黄色野菜に多く含まれ、マンゴーなどの果実にも含まれている。また、リコペンはトマトに特異的に多く含まれている。また、ルテインは、卵黄や緑黄色野菜に含まれ、抽出原料としてはマリーゴールドの花が用いられる。また、ゼアキサンチンは、トウモロコシ種子や卵黄に含まれている。また、α−カロテンは、緑黄色野菜に含まれている。
本発明においては、ビタミンＡの前駆体であるβ−カロテン等のカロテノイド色素をイネに高蓄積させることにより、東南アジアなどの米を主食とする地域で多いビタミンＡの不足を補うことができる。本発明のイネにおいては、野生型と比較して、例えば、２倍以上、３倍以上、４倍以上の量のカロテノイドを蓄積させることができる。カロテノイドの蓄積量はそれぞれ公知の方法で測定することができる。
本発明においては、β−カロテン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−カロテン、β−クリプトキサンチンなどを総称してカロテノイドというが、β−カロテン、α−カロテン、β−クリプトキサンチンなど分解されてビタミンＡに変換されるものが、カロテノイドとして好ましい。ただし、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン等のカロテノイドも生体構成物質に障害を与えると言われる活性酸素やラジカルの消去能力が高いこと、またルテインやゼアキサンチンは視物質としての機能も重要であることから、これら色素の高蓄積も健康機能上有用と期待される。
本発明においては、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、またはGIC3遺伝子の過剰発現により、通常、ゼアキサンチンおよびβ−カロテンを多く含むカロテノイドが、野生型と比較して高度に蓄積され、これらの種類のカロテノイドは濃黄色を呈するため、濃黄色の着色によってもカロテノイドの蓄積が確認できる。
【００１８】
２．本発明の形質転換イネの作製
本発明のイネは、形質転換によって、上記GIC1、GIC2、またはGIC3タンパク質の発現量が野生型と比較して増加するように改変され、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加したイネであればよい。本発明のイネの製造方法は、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、またはGIC3遺伝子の発現が野生型と比較して上昇したイネを作製できれば特に制限されず、これらの遺伝子のプロモーター置換によって得られるものでもよいが、好ましくは、本発明の組換えベクターをイネに導入することによって、本発明の形質転換イネを得ることができる。
【００１９】
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。アグロバクテリウム（例えば、EHA101株やEHA105株）を介する方法においては、例えば、超迅速単子葉形質転換法（特許第3141084
号公報、Toki S, et al. Plant J. 47: 969-976, 2006）を用いることが可能である。ま
た、パーティクルガン法においては、例えば、パーティクルデリバリーシステム（PDS-10
00/Heシステム等、バイオラッド社）を用いることが可能である。
【００２０】
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型やインド型のイネ品種に適用可能）を再生させる方法（Hayashimoto A, et al. Plant Physiol. 93: 857-863, 1990; Datta SK: In Gene Transfer To Plants（Potrykus I and Spangenberg G, Eds）pp.66-74, 1995）、電気パルス（エレクトロポレーション）によりプ
ロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型やインド型のイネ品種に適用可能）を再生させる方法（Shimamoto K, et al. Nature 338: 274-276, 1989; Datta SK, et al. Bio/Technology 8: 736-740, 1990; Toki S, et al. Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992
）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou P, et al. Bio/Technology. 9: 957-962, 1991）、およびアグロバクテリウムを
介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei Y, et al. Plant J. 6: 271-282, 1994; Toki S, et al. Plant J. 47: 969-976, 2006）など、いくつかの技術が既に確
立し、本発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
適当な抗生物質による選抜を経由して得られた各種GIC形質転換植物体を、カロテノイ
ド色素の分析に供試し、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した形質転換イネ植物体を本発明の形質転換イネとして得ることができる。
【００２１】
本発明のイネは、上述の形質転換イネを、該形質転換イネ系統内で交配させること又は他のイネ系統、例えば、コシヒカリなどの優良イネ品種と交配させることによって得られた後代であって、野生型イネと比較してカロテノイドの蓄積量が増加した形質転換イネであってもよい。
本発明において使用されるイネとしては、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、またはGIC3遺伝子を有するものであれば限定されないが、例えば、コシヒカリ、あきたこまち、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、ななつぼし、にこまる等が挙げられる。
【００２２】
以下に実施例を挙げて本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がこれら実施例にのみ限定を受けないことは言うまでもない。
【実施例】
【００２３】
実施例１（GIC遺伝子の過剰発現の発見）
葉緑体分化の正の制御因子Golden2-Like（GLK：イネではOsGLK1とOsGLK2の2種）のcDNAを過剰発現するイネ（OsGLK1/2-OX）は緑色を呈する。OsGLK1-OXイネならびにOsGLK2-OX
イネの緑色カルスをイネ44k発現マイクロアレイ解析に供試した（Nakamura et al. Plant
Cell Physiol. 50(11): 1933-1949, 2009）。これら形質転換イネカルスで共通して発現が3倍以上の上昇を見せた遺伝子群の中に、タンパク質間相互作用やDNA結合に働くと考えられるCCTドメインをC末端側に含むCONSTANS-like（COL）ファミリー転写因子をコードする遺伝子を5種類見出し、GLK-Induced CCT domain-containing proteins（GIC1-5）と名
付けた（表２）。
【００２４】
【表２】
2019013154.tif 000004
【００２５】
GIC1-5のうちGIC1-3の3種は互いに相同性が高く、タンパク質間相互作用への関与が推
測されるB-Box zinc finger（ZF）ドメインをN末端側に、タンパク質間相互作用やDNA結
合に働くと考えられるCCTドメインをC末端側にそれぞれ1つずつ有する（図1、2）。
野生型イネ（日本晴）におけるGIC1-5遺伝子の組織別発現をRT-PCRにて調べたところ、いずれも葉や茎で発現が高く、根、カルスではほとんど発現が見られなかった。GIC1-5遺伝子のうち、GIC1転写産物は選択的スプライシングを受け、2種類のmRNAを生成すること
が判明した。 ここでは、より長い転写産物をGIC1L（完全長cDNA（fl-cDNA）のアクセッ
ション番号: AK120314）、短いものをGIC1S（AK072346）と呼称する。ただし、単にGIC1
と記載する場合はGIC1Lを指すものとする。GIC1L mRNAはGIC1 mRNA前駆体からイントロン1が切り出されることで生成する(配列番号1)。GIC1S mRNAはN末端側のB-box zinc fingerドメインを欠くタンパク質をコードする。GIC1S mRNAはGIC1L mRNAの推定開始コドンから5’上流に12塩基の位置、および130番目のATGコドンから5’上流に14塩基の位置から始まる8塩基の重複配列5’-TCGTCGTG-3’にて分子内相同組換えを介したスプライシングによ
ってB-boxを含む配列がイントロンとして切り出された後に生じる産物と推定された（図3）。
なお、GIC1L fl-cDNAクローン（AK120314）の塩基配列には1塩基の欠失（配列番号1の509番目の塩基C）が見つかり、それ以降の配列にフレームシフトが生じ、中途から本来のGIC1Lとは全く別物のアミノ酸配列を持つタンパク質が作られることになる。そこで、GIC1L塩基配列の509番目にCを挿入することで、GIC1L cDNAのコドンの読み枠を正常なものに
戻した後、イネ形質転換用ベクターの構築に供した。
【００２６】
実施例２（GIC遺伝子の過剰発現ベクターの構築）
GIC1-5のコード領域（Coding sequence: CDS）を含むfl-cDNAクローンの配列情報は、
農業生物資源研究所（現 農業・食品産業技術総合研究機構  遺伝資源センター）の菊池
尚志博士らから、またGIC 1-5のfl-cDNA試料（プラスミドDNA）は同研究所（現 農業・食品産業技術総合研究機構  次世代作物開発研究センター）のイネゲノムリソースセンター（RGRC、http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/jp/）の長村吉晃博士らから提供された。
GIC1-5のストップコドンを除去したCDSの5’上流に、各20塩基のGIC1-5非コード配列とGateway attB1配列を付加し、3’下流にはattB2配列を付加した各cDNAのPCR産物を、att
配列を介したGateway BP部位特異的組換え反応により、エントリーベクターpDONR207（Invitrogen/サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）に組込んだ。
得られた各cDNAのGatewayエントリークローンを、Gateway LR反応を介して、農業生物
資源研究所（現 農業・食品産業技術総合研究機構 生物機能研究部門）が構築したGIC過
剰発現（GIC-OX）用Gatewayデスティネーション・バイナリーベクターpSMAHdN638GW（図4）に部位特異的に組み込み、各GIC-OX発現ベクターを取得した。
バイナリーベクターpSMAHdN638GWには、T-DNA上に植物用選抜マーカー遺伝子として、
アグロバクテリウムTiプラスミド由来nos（ノパリン合成酵素）遺伝子のプロモーター::
大腸菌由来hpt〔ハイグロマイシン耐性〕遺伝子のコード領域::Tiプラスミド由来TiaaM（トリプトファンモノオキシゲナーゼ）遺伝子のターミネーターを配置し、形質転換された植物細胞が抗生物質ハイグロマイシンB（Hyg）に耐性を示すようにした。また、その隣接部位にイネ由来Actin-1遺伝子のプロモーター::部位特異的組換え用Gatewayカセット配列::Tiプラスミド由来nosターミネーターから構成されるキメラ遺伝子を配置し、対象遺伝
子（GIC1-5）断片をGateway LR反応によってActin-1プロモーターとnosターミネーターの間に挿入した。また、T-DNAのleft border（LB）配列とright border（RB）の配列の外側のベクター骨格には、微生物で機能し得るスペクチノマイシン耐性（SpR）遺伝子、大腸
菌で機能するpBR322由来（ColE1型）複製開始領域、またPseudomonas pVS1プラスミド起
源の遺伝子（断片）として3種類、すなわちアグロバクテリウムでプラスミドが安定に保
持されるために必要なstaAをコードする遺伝子、プラスミドDNAの複製タンパク質repAを
コードする遺伝子、さらに高宿主域（大腸菌では機能しないが、アグロバクテリウムで機能）複製開始点oriV（origin of vegetative replication）を設けた。各GIC-OX発現ベクターは、エレクトロポレーション法により、アグロバクテリウムEHA105株に導入した。
上記バイナリーベクターpSMAHdN638GWは、特許第4505627号公報に記載されるバイナリー
ベクターpSMAHdN627-M2GUSに由来する発現ベクターである。pSMAHdN638GWとpSMAHdN627-M2GUS とのT-DNA領域の差異は、マルチクローニング部位のHidIII認識配列からnosターミ
ネーター（Tnos）の開始部位にあるSacI認識部位までの一連の塩基配列で、これ以外は共通の配列である。
【００２７】
実施例３（GIC-OX形質転換イネの作出）
イネへの遺伝子導入は迅速形質転換法（WO 2005/092082、Toki, S., Hara, N., Ono, K., Onodera, H., Tagiri, A., Oka, S. and Tanaka, H. (2006) Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice. The Plant Journal 47: 969-976）に準じて実施した。イネ（品種：日本晴）種子は、籾殻を除去して玄米とした後、70%エタノールで30秒間、続いて界面活性剤（10% (v/v) Tween 20
またはTriton X-100を約10 μl /10 mL）を添加した次亜塩素酸ナトリウム溶液（最終有
効塩素濃度：2.5%）で30分間殺菌し、滅菌蒸留水で数回すすいで水を切った後、胚が上向きになるようN6D寒天培地〔N6塩類及びビタミン〔Chu, C.C., Wang, C.S., Sun, C.C., Hsu, C, Yin, K.C., and Chu, C.Y. (1975) Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources. Scientia Sinica 18: 659-668〕、30 g/L ショ糖、0.3 g/L カザミノ酸、2.8 g/L プロリン、2 mg/L 2,4-D、2 g/L ゲルライト、pH 5.7〕に置床後、30〜32℃かつ明条件下で約7
日間培養することで胚盤周辺部の細胞を脱分化させ、カルス（不定形の細胞塊）を誘導した。
実施例２で調製した5種類のGIC-OX発現ベクターをそれぞれ保持するEHA105アグロバク
テリウム系統を、25 mg/Lクロラムフェニコール、12.5 mg/Lリファンピシン、及び100 mg/Lスペクチノマイシンを含むLB液体培地にて28℃、180 rpmで約24時間培養した。
約1週間経過したイネの培養初期カルス（各処理区あたり約5 g）を20 mg/Lのアセトシ
リンゴンを含むN6D液体培地（40 mL）に入れ、さらに上述の各5種類（合計10種類）のGIC-OXアグロバクテリウムの各培養菌液を最終菌密度がO.D. 600 nm = 0.001になるよう添加した。イネ培養細胞が入った各菌懸濁液は数分間、軽く転倒混和した後、ステンレス製の茶こしにあけた。茶こしに残ったカルスの水分を滅菌ろ紙上で除去後、N6D寒天培地に再
度置床し、25℃の暗条件下で3日間の共存培養を行った。その後、共存培養後のイネカル
スを滅菌水で7〜8回、続いて12.5 mg/Lメロペネム（アグロバクテリウム除菌用抗生物質
、商品名：メロペン、大日本住友製薬）を含む滅菌水で１〜数回洗浄し、滅菌ろ紙上で余分な水分を切った後、12.5 mg/L メロペネム及び30 mg/L Hygを含むN6D（N6D + Hyg）寒
天培地に置床し、30〜32℃の明条件下で約2週間培養した。その後、増殖中のカルスを新
たなN6D + Hyg寒天培地に移し、Hyg耐性カルスを得た。
各処理区で出現したHyg耐性カルスは、12.5 mg/Lメロペネムと30 mg/L Hygを添加した
植物体再分化培地〔MS塩類及びビタミン（Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-497）、30 g/L ショ糖、30 g/L ソルビトール、2 g/L カザミノ酸、0.02 mg/L ナフタレン酢酸、2 mg/L カイネチン、2 g/L ゲルライト（pH 5.8）〕に移
し、30℃かつ明条件下で14日間培養し、カルスの緑化とシュート（地上部）形成を促した。さらにこの操作をもう一度繰り返すことで、Hyg耐性を有する緑色シュート（地上部）
を再分化させた。これらの独立した複数の再分化個体（イネ科では通常、再分化当代をT0世代と称する）を植物ホルモン無添加のMS寒天培地［MS塩類及びビタミン〔MurashigeとSkoog (1962)：前掲〕、30 g/L ショ糖、4 g/L ゲルライト（pH 5.8）］に移植し、30℃かつ明条件下で1〜2週間生育させ、シュート（地上部）の伸長、及び発根とその伸長を促した。
【００２８】
実施例４（GIC-OX形質転換イネの栽培、表現型観察）
N6D + Hyg寒天培地上で形成された各種GIC-OX形質転換カルスの形状や色を、野生型（
コントロール）のカルスと比較した。GIC1-5-OX形質転換カルスと野生型カルスの間で、
カルスの形状や増殖速度に顕著な差異は見られなかった。カルスの色調を比較したところ、野生型カルスの乳白色（クリーム色）に対し、GIC1/2/3-OXを導入したHyg耐性カルスの多くは濃黄色を呈した（図５：上段と下段の写真）。なお、GIC1には実施例１及び図３に記載の通り、2種類の転写産物GIC1LとGIC1Sが存在し、両者のcDNAを過剰発現するイネの
カルスは共に濃黄色を示した。実施例１（GIC遺伝子の過剰発現の発見）で述べた通り、GIC1Sタンパク質にはB-box ZFドメインが欠落しているが、上述の結果はB-boxがカルスの
黄化に必須ではないことを示すものである。
一方、GIC4/5-OXを導入したHyg耐性カルスは野生型と同じく乳白色を呈した。以上の結果から、GIC1/2/3は各cDNAの過剰発現により、黄色の色素をイネの培養細胞に蓄積する性質があることが判明した。
シャーレ（直径9 cm）内で再分化した各種GIC形質転換イネのシュート及び根の長さが
約10 cm、あるいはそれ以上の長さに到達した時点で、同一起源のカルス集団から得られ
た再分化個体の中から1本の分げつのみを選んで合成粒状培土（ボンソル2号、住友化学工業）に移植し、形質転換イネ育成用グロースチャンバーにて明期14時間（28〜30℃）および暗期10時間（24〜25℃）のサイクルでさらに生育させた。各系統（T0世代）の生育特性を観察しながら栽培を継続し、最終的に自殖後代（T1世代）種子を収穫した。
各種GIC形質転換イネ系統のT1種子及び野生型（日本晴）種子を、実施例３の記載に準
じて滅菌し、それぞれ12.5 mg/L メロペネムを含むMS + Hyg及びMS（Hyg無し）寒天培地
に置床し、28〜30℃の明条件下で発芽を誘導した。MS + Hyg寒天培地にて発芽・生育したT1形質転換植物（Hyg耐性幼苗）は、上述のT0植物の栽培時と同様、形質転換イネ育成用
グロースチャンバー、あるいは形質転換イネ育成用閉鎖系ガラス温室にて栽培し、T2種子を得た。各種GIC形質転換イネ系統種子（T1、T2世代等）及び野生型種子をカルス化する
際は、上述の通り玄米を滅菌処理した後、それぞれ12.5 mg/L メロペネムを含むN6D + Hyg及びN6D（Hyg無し）寒天培地に置床し、30〜32℃の明条件下で培養し、2〜3週間毎に継
代培養した。
MS寒天培地に置床した直後の野生型（日本晴）の種子は、種子胚が乳白色を示した。一方、MS + Hyg寒天培地に置床した直後の各種GIC形質転換イネ系統（T1世代）の形質転換
種子は、通常、種子胚が黄色を呈した（図６）。これはGIC cDNAの過剰発現に用いたOsAct-1プロモーターの活性が胚で比較的高く、胚乳ではその形成の中・後期に低下すること
から、種子における黄色の色素蓄積は同プロモーター活性に応じて起こっている考えられる。各種GIC形質転換イネ系統（T1及びT2世代）の種子をカルス化したところ、多くの系
統のカルスが濃黄色を呈し、その色合いは少なくとも4か月以上に渡り、安定に保持され
た（図７A、７B）。以上の結果から、各種GIC形質転換イネ系統に見られる濃黄色の色素
の蓄積という表現型は、長期間かつ世代を超えて安定した形質であることが明らかになった。
【００２９】
実施例５（GIC-OX形質転換イネのカロテノイド色素の分析）
1）分光学的定量
GIC1/2/3-OXイネ系統のカルス（培養細胞塊）が（濃）黄色を示したことから、この色
素はフラボノイド（カルコンやオーロン）、あるいはカロテノイド（β−カロテン、ゼアキサンチン他）に由来すると推察した。他にベタキサンチンと称されるベタレインに属する黄色の色素があるが、ベタレインは、ビート（アカザ科）、オシロイバナとブーゲンビレア（共にオシロイバナ科）、ケイトウ（ヒユ科）、マツバボタン（スベリヒユ科）等のナデシコ目植物に限定して含まれ、イネ（科）には見られないため、候補から除外した。
上記の形質転換イネ系統の黄色カルスの小塊をアルカリ性溶液（0.1N KOH等）に浸漬しても呈色に変化が見られなかったことから、この色素はフラボノイド系のカルコンやオーロン）に由来するものではないと推察した。次に、カロテノイドとクロロフィルの分光学的定量を、「光合成の森  光合成関連実験プロトコール  クロロフィル定量法」（http://www.photosynthesis.jp/proto/chlorophyll.html）に記載の手法を参考に、両色素含量
を同時に導き出すことが可能なLichtenthalerとWelburn（1983）の計算式に従って実施した（Lichtenthaler HK and Wellburn AR, Biochem. Soc. Trans. 11: 591-592, 1983）。すなわち、約100 mgのカルスを1.5 mL ミクロチューブに入れてすりつぶした後、800 μLのアセトンを加え、4℃にて一晩、色素を抽出した。これに200 μLの水を加えて終濃度80%（v/v）のアセトン溶液とし、遠心分離（15,000 rpm、5分間）により上清を得た。各上
清は小型ろ過フィルター（0.45 μm、非水系）を通して精製後、470 nm、663 nm、646 nmの吸光度を、分光光度計を用いて測定し、以下に示すLichtenthaler and Welburn（1983
）の計算式に従って各カルスのカロテノイド含量を算出した。
[Chl a] = 12.21×A663 - 2.81×A646
[Chl b] = 20.13×A646 - 5.03×A663
[Carotenoids] = (1000×A470 - 3.27×[Chl a] - 104×[Chl b]) ÷ 229
カロテノイド色素の測定結果を図８に示す。各3検体のGIC1S-OX及びGIC2-OX黄色カルスは野生型（日本晴）カルスに比べ、グラム新鮮重あたり6〜7倍のカロテノイドを含むことがわかった。
2）高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いたカロテノイドの分析
本分析は、農業・食品産業技術総合研究機構 花き研究所（現：野菜花き研究部門）の
山溝 千尋博士と大宮 あけみ博士に実施して頂いた。
各0.5 gのカルス標品を細胞破砕装置（シェイクマスター、株式会社バイオメディカル
サイエンス）で粉砕した後、0.5 mLのアセトンを加えて色素を抽出した。さらに1.5 mLのジエチルエーテルを加えてよく撹拌し、エーテル層（上層）を回収した。アセトン、ジエチルエーテルによる抽出をカルスの黄色の着色が視認出来なくなるまで繰り返した。これによって得られたアセトン／エーテル抽出液に等量の水を加え、3回の洗浄を行った。カ
ロテノイドを含むエーテル層（上層）を採取し、その液量の半量のアルカリ溶液（5% KOH-NaOH）を加えて暗所で2時間静置することでけん化処理をした。カロテノイドの中でも、キサントフィル類はしばしば脂肪酸が結合した状態、すなわち脂肪酸エステルの状態で存在する。けん化（saponification）による加水分解の結果、脂肪酸エステル型キサントフィルから脂肪酸が遊離され、フリーのキサントフィル類が得られる。けん化処理無しの試料をHPLC分析に供試すると、脂肪酸の種類、位置、数によって複数のピークに別れてしまうので、各キサントフィル分子種の正確な同定や定量が困難になる。けん化後の溶液に蒸留水を加え、よく攪拌した後、上層のエーテル層を回収し、中性になるまで水で洗浄した後、濃縮乾固した（ケン化サンプル）。これをメタノールで溶解し、フォトダイオードアレイ検出器（PDA） 付きHPLC分析に供した。
・高速液体クロマトグラフ  X-LC（日本分光株式会社、東京）
・PDA検出器  X-LC 3110MD（同上）
・カラム  YMC Carotenoid シリカ系逆相カラム
（内径 4.6 mm, 長さ 100 mm, 粒子径 3 μm；株式会社ワイエムシィ、京都）
・展開溶媒A  Methanol:t-butyl methyl ether:H20 = 95:1:4
・展開溶媒B  Methanol:t-butyl methyl ether:H20 = 25:71:4
溶出
以下の条件にて行い、200〜750 nmの範囲の吸収スペクトルを検出した。
1） 0〜 5分：溶媒Aを5分間流す（溶媒A 100% / 溶媒B 0%）
2） 5〜38分：溶媒Aに対し、溶媒Bが0〜100%になるよう直線的に濃度勾配をかける
3）38〜40分：溶媒Bを2分間流す（溶媒A 0% / 溶媒B 100%）
・流速  1.0 mL/min
・カラム温度  35℃
各カロテノイド成分は、検出されたピークの保持時間と吸収スペクトルを、標準物質と比較することで同定した。また、各標品のカロテノイド含有量は、ケン化処理後の抽出液を450nmの光波長で検出したHPLCクロマトグラムにおけるピーク面積の合計から、1 g新鮮重のカルスあたりのルテイン当量として算出した。
HPLC分析の結果、供試系統の総カロテノイド含有量（ルテイン当量）は、野生型に比べて6〜14倍も増加していた（図９）。この結果は、前述の1）分光学的定量の結果（図８）を裏付けるもので、GIC cDNAの過剰発現はイネにカロテノイドの蓄積を亢進することが明らかになった。また、HPLCクロマトグラムを比較した結果、GIC1S-OXおよびGIC2-OXイネ
系統の黄色カルスは、野生型に比して、ゼアキサンチンやβ-カロテンを含むカロテノイ
ド含有量が顕著に増大していていることが判明した（図１０）。
【００３０】
実施例６（カルスの黄化に必要なGIC1タンパク質の領域の同定）
カルスの黄化に必要なGIC1タンパク質の領域を明らかにすべく、様々な領域を欠失させたGIC1誘導体（図１１）のcDNAコンストラクト（内部欠失型または変異型GIC1過剰発現ベクター）を作製し、それらを個別に導入した形質転換イネ系統のカルスのカロテノイド含量を調べた。
＊材料と方法
1）ドメイン欠失やアミノ酸置換を施したGIC1のcDNA過剰発現コンストラクトの構築
GIC1の各領域の欠失型または変異型のコンストラクト作製のため、まず適当なプライマーペアを用いて各断片をPCR増幅し、pENTR/D-TOPOベクター（Invitrogen／サーモフィッ
シャーサイエンティフィック株式会社）にクローン化することで、Gatewayエントリーク
ローンを得た。
コンストラクト#4の欠失型GIC1 cDNA断片は、同#2のGIC1 cDNA断片を鋳型として外向きのプライマーペア、すなわち280番目のアミノ酸を指定するトリプレット（3個のヌクレオチド配列）から5’側方向、及び371番目のアミノ酸を指定するトリプレットから3’側方
向にPCRを行うための2つのプライマーを用いて増幅し、得られたPCR産物をセルフライゲ
ーションした。ライゲーション反応後の試料を大腸菌に導入することで、コンストラクト#4のGatewayエントリークローンを得た。
GIC1の334番目のアミノ酸であるロイシン残基（L）をアラニン残基（A）に置換したGIC1(L334A)をコードするcDNAを有するコンストラクト#9は、334番目のロイシンを指定する
トリプレットCTCに変異を導入してアラニンを指定するGCCに置換することにより作製した。この変異導入では、始めに上記の2塩基の変異を中央付近に持つプライマーを両向きに
デザインした。このプライマーペアでGIC1 cDNAクローン（プラスミドDNA）を鋳型にしたPCRを実施した。変異導入を行う前のプラスミドDNAはメチル化されているため、5’-gatc-3’（ただし、a（アデニン）はメチル化）を認識する制限酵素DpnIで消化される。一方
、変異導入したPCR産物はメチル化されていないため、DpnIによる消化を受けない。次に
、このDNA断片をセルフライゲーションさせた後に大腸菌に導入し、コンストラクト#9のGatewayエントリークローンを得た。複数のクローンからプラスミドDNAを単離し、DNA塩基配列解析により標的とするか所への変異導入を確認した。
以上の各GatewayエントリーベクターにcDNA過剰発現用ベクターpSMAHdN638GW（図４）
を加えてGateway LR反応を行うことで、イネActin-1プロモーター（OsAct-1）制御下で各種GIC1誘導体を過剰発現するコンストラクト（バイナリーベクター）を作製した。
2）形質転換イネの作出とカルス化
実施例３（GIC-OX形質転換イネの作出）に記載の方法に準じて、上記の各種過剰発現ベクターをアグロバクテリウム経由でイネに導入した。得られた過剰発現イネ再分化植物体（T0世代）を栽培し、T1種子を収穫した。イネ種子（玄米、T1世代）をN6D寒天培地に無
菌播種した後、約32℃にて培養することでカルスを誘導した。1週間後、胚乳やシュート
部分を除去した初期カルスを新しいN6D培地に移し、培養を2〜3週間ごとに継代した。
3）カロテノイド色素の分光学的定量
実施例５（GIC-OX形質転換イネのカロテノイド色素の分析）の1）分光学的定量に準じ
て実施した。
＊結果
各種欠失型または変異型GIC1過剰発現カルスの写真及びカロテノイド定量の結果を図１１にまとめて示した。GIC1は選択的スプライシングにより2種類のmRNA（GIC1LとGIC1S）
が生じ、それらが翻訳されることで2種のタンパク質GIC1LとGIC1Sが生合成されると考え
られる。B-box ZFドメインを含むN末端202番目までのアミノ酸配列（領域I）を欠くGIC1
をコードするコンストラクト#2の過剰発現は、GIC1Lをコードするコンストラクト#1過剰
発現と同様、イネカルスを黄色に変え、カロテノイドの高蓄積を誘発した。この結果は、実施例４（GIC-OX形質転換イネの栽培、表現型観察）に記載のGIC1L及びB-box ZFドメイ
ンのコード領域を欠いたGIC1S cDNAの過剰発現が共にイネのカルスを黄化したことと一致する。従って、B-box ZFドメインを含む領域Iは、イネカルスのカロテノイド蓄積に必須
でないことが明らかになった。一方、N末端から280アミノ酸（領域IとII）を欠くコンス
トラクト#3の過剰発現イネカルスは黄色に呈色することはなかった。これらの結果から、GIC1の202〜279番目のアミノ酸配列（領域II）がカルスの黄化に必須であると判断した。次に、コンストラクト#2から280〜370番目のアミノ酸配列（領域III）、あるいは371番目〜C末端までの配列（領域IV）をそれぞれ欠失させたペプチドのcDNAコンストラクト#4及
び#5の過剰発現カルスは黄色く変化しなかった。
同様に、コンストラクト#2から領域IIIとIVを欠いた配列をコードするコンストラクト#6、領域IIとIVを欠いた配列をコードするコンストラクト#7、及び領域IIIとIVを欠いた配列をコードするコンストラクト#8を過剰発現するイネ系統のカルスも、黄変することはなかった。これらの結果から、GIC1の過剰発現によるイネ細胞のカロテノイドの高蓄積には、N末端配列（領域I）を除く領域II、IIIおよびIVが必須であることが導き出された。ま
た、EAR-likeモチーフ（*注）内のロイシン残基（L）をアラニン残基（A）に置換したGIC1(L334A)をコードするcDNAコンストラクト#9の過剰発現カルスも黄化しなかったことから（図１１、１２）、この334番目のロイシン残基も細胞の黄化に重要であることが明らか
になった。以上の結果を総合し、GIC1の領域II、III、IVに存在する酸性領域、PEST配列
、EAR-likeモチーフ、およびCCTドメインが、カルスの黄化に必要であると推論した。
【００３１】
*注：EAR-likeモチーフ
当初、植物特有のAP2/ERFファミリーに属す転写因子の配列中に、転写抑制に関わる比
較的短い機能ドメインとして見出された。その後、SUPERMANをはじめとするZFファミリーや、IAAファミリーの転写因子等にもこのモチーフが見つかり、その一部が実際に転写抑
制活性を持つことが実験的に示されている。その一つであるリプレッションドメインSRDX（Superman Repression Domain modified ver. X）は、シロイヌナズナの強力な転写抑制化因子SUPERMANのC末端配列を部分改変した12個のアミノ酸配列（Leu Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Phe Ala）（配列番号７）で、このSRDX配列をC末端あるいはN末端に付加した転写活性化因子（キメラリプレッサー、あるいはドミナントネガティブ体）は転写抑制化因子に変換される。一方、転写抑制化因子にSRDXを付加したキメラリプレッサーは通常、活性化因子に変換されること無く、抑制化因子のままである。このキメラリプレッサーを用いる転写因子機能のサイレンシング法は、Chimeric REpressor gene-Silencing Technology（CRES-T）法と命名され、従来のアンチセンス法やRNAi法とは全く異なる機構で転写因子の機能解明を可能にする。また、CRES-T法はアンチセンス法やRNAi法でノックダウンできなかった転写因子に対してもしばしば有効に機能するだけでなく、機能の重複する一群の転写因子に対しても優性に働くことが示されており、高次倍数体などでは難しいとされてきた遺伝子のノックダウンを可能にする技法として注目されている（Hiratsuら、Plant J. 34: 733-739 (2003) および 光田と高木、化学と生物 52: 438-446 (2014)）。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、イネを含むイネ科穀類の分子育種の分野で有用である。
【図１】
2019013154.tif 000005
【図２】
2019013154.tif 000006
【図３】
2019013154.tif 000007
【図４】
2019013154.tif 000008
【図５】
2019013154.tif 000009
【図６】
2019013154.tif 000010
【図７】
2019013154.tif 000011
【図８】
2019013154.tif 000012
【図９】
2019013154.tif 000013
【図１０】
2019013154.tif 000014
【図１１】
2019013154.tif 000015
【図１２】
2019013154.tif 000016
【配列表】
2019013154000001.app