(57)【要約】【課題】微生物産生マンガン酸化物の高速な製造方法を提供する。【解決手段】マンガン酸化細菌を担持した担体に、二価マンガンイオンを供給する微生物産生マンガン酸化物の製造方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンガン酸化細菌を担持した担体に、二価マンガンイオンを供給することを特徴とする微生物産生マンガン酸化物の製造方法。
【請求項２】
前記担体が、砕石、または砂利であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
二価マンガンイオン濃度が１０ｍｇ／Ｌ以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記マンガン酸化細菌が、Ｕ９−１ｉクラスターに属する菌、または、レプトスリックス（Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ）属であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記マンガン酸化細菌が、Ｕ９−１ｉ株、または、ＳＰ−６株であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。 
【請求項６】
マンガン酸化細菌を担持した担体を、重金属吸着剤とすることを特徴とする重金属吸着方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法で生成した微生物産生マンガン酸化物を、担体表面に付着したままの状態で、重金属吸着剤とすることを特徴とする重金属吸着方法。
【請求項８】
前記担体が、砕石または砂利であることを特徴とする請求項６または７に記載の重金属吸着方法。
【請求項９】
担体と、該担体表面上に蓄積した微生物産生マンガン酸化物とを有することを特徴とする重金属吸着剤。
【請求項１０】
前記担体が、砕石または砂利であることを特徴とする請求項９に記載の重金属吸着剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンガン酸化細菌が産生する微結晶性のマンガン酸化物（以下、微生物産生マンガン酸化物という）の製造方法と、微生物産生マンガン酸化物を利用した重金属吸着方法と重金属吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
廃棄物や自然土壌中には、鉛や水銀、カドミウムといった有害な重金属などが含まれている場合がある。これらの有害な重金属は、雨水の浸透等による洗い出しに伴って浸出水中に溶出して環境を汚染する。このような環境汚染対策、すなわち重金属対策には、キレート剤、カルシウム化合物、硫化物、鉄粉等の薬剤を用いた不溶化、セメント固化による土壌からの溶出抑制など様々な方法が知られている。
【０００３】
重金属対策のなかでも、重金属吸着剤を利用する方法が知られている。ここで、微生物が産生する微生物産生マンガン酸化物は、カドミウム、亜鉛等の金属陽イオンの吸着能力が大きく、重金属吸着剤として機能する。一方で、微生物産生マンガン酸化物は、ヒ酸や亜ヒ酸のように陰イオンとして存在する金属に対する吸着能力は一般的に高くないが、酸化剤として機能するため、毒性の高い亜ヒ酸を毒性が低いヒ酸に速やかに酸化することができる。
【０００４】
本発明者らは、非特許文献１において、Ｕ９−１ｉ株が、α−プロテオバクテリア綱に属する新規のマンガン酸化細菌であり、液体培地や寒天培地を用いた単独での培養時には増殖は遅く難培養性であるが、種々の真菌や細菌類等を共存させると容易に増殖できることを報告している。また、本発明者らは、特許文献１、２において、Ｕ９−１ｉ株等の微生物産生酸化マンガンを利用した重金属吸着剤を提案している。
【０００５】
マンガン酸化細菌が産生する微生物産生マンガン酸化物を重金属吸着剤として利用するためには、マンガン酸化細菌を大量に培養し、安定的に大量の微生物産生マンガン酸化物を得る必要がある。しかし、マンガン酸化細菌は、通常マンガンが５５ｍｇＭｎ／Ｌ（１ｍＭ）程度以上となるとマンガン酸化を行わなくなるか、マンガン酸化速度が非常に遅くなるため、微生物産生マンガン酸化物を大量に作成することは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−１８７７９５号公報
【特許文献２】特開２０１６−１８７８０１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】宮田直幸、齊藤和之、山口天聡、岡野邦宏、尾▲崎▼保夫：難培養性マンガン酸化細菌の分離とその増殖特性、日本水処理生物学会誌別巻第２９号、ｐ１４（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、微生物産生マンガン酸化物の高速な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１．マンガン酸化細菌を担持した担体に、二価マンガンイオンを供給することを特徴とする微生物産生マンガン酸化物の製造方法。
２．前記担体が、砕石、または砂利であることを特徴とする１．に記載の製造方法。
３．二価マンガンイオン濃度が１０ｍｇ／Ｌ以上であることを特徴とする１．または２．に記載の製造方法。
４．前記マンガン酸化細菌が、Ｕ９−１ｉクラスターに属する菌、または、レプトスリックス（Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ）属であることを特徴とする１．〜３．のいずれかに記載の製造方法。
５．前記マンガン酸化細菌が、Ｕ９−１ｉ株、または、ＳＰ−６株であることを特徴とする１．〜４．のいずれかに記載の製造方法。
６．マンガン酸化細菌を担持した担体を、重金属吸着剤とすることを特徴とする重金属吸着方法。
７．１．〜５．のいずれかに記載の製造方法で生成した微生物産生マンガン酸化物を、担体表面に付着したままの状態で、重金属吸着剤とすることを特徴とする重金属吸着方法。
８．前記担体が、砕石または砂利であることを特徴とする６．または７．に記載の重金属吸着方法。
９．担体と、該担体表面上に蓄積した微生物産生マンガン酸化物とを有することを特徴とする重金属吸着剤。
１０．前記担体が、砕石または砂利であることを特徴とする９．に記載の重金属吸着剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の微生物産生マンガン酸化物の製造方法により、高速でマンガン酸化を行うことができる。また、本発明の製造方法は、二価マンガンイオン濃度が１０ｍｇ／Ｌ以上の高濃度条件下であっても、マンガン酸化を行うことができる。本発明の製造方法は、原料であるマンガンイオン濃度を高濃度とすることができるため、担体に担持していない状態でのマンガン酸化と比較して、微生物産生マンガン酸化物を短期間で大量に製造することができる。
微生物産生マンガン酸化物は、重金属吸着剤として用いることができる。本発明の製造方法により、重金属吸着剤（微生物産生マンガン酸化物）を短い時間で大量に製造することができるため、土壌汚染現場等で要求される大量の重金属吸着剤を迅速に供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｕ９−１ｉ株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列。
【図２】Ｕ９−１ｉ株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列に基づいて近隣結合法で作成した系統樹。
【図３】Ｕ９−１ｉ株、および図２に示す細菌の一部について、Ｕ９−１ｉ株の配列１２７０Ｆに相当する領域の塩基配列を示す図。
【図４】実験１の回分試験におけるマンガンイオン濃度の経時変化を示す図。
【図５】実験２の回分試験におけるマンガンイオン濃度の経時変化を示す図。
【図６】実験３におけるマンガンイオン濃度の経時変化を示す図。
【図７】実験４におけるマンガン濃度（流入）とマンガン負荷量を示す図。
【図８】実験４におけるマンガン濃度（流出）を示す図。
【図９】実験４における砕石バイオフィルム中のＵ９−１ｉ株と全細菌の、ＰＣＲ法による定量結果を示す図。
【図１０】実験４における砕石バイオフィルム中の真正細菌叢解析結果を示す図。
【図１１】実験５におけるマンガン濃度（流入）とマンガン負荷量を示す図。
【図１２】実験５におけるマンガン濃度（流出）を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の微生物産生マンガン酸化物の製造方法は、マンガン酸化細菌を担体に担持した状態で、二価マンガンイオンを供給することを特徴とする。
【００１３】
「マンガン酸化細菌」
マンガン酸化細菌としては、特に制限されず、例えば、下記のような従来公知の細菌を使用することができる。
環境中（河川、湖沼、土壌、海洋など）に普遍的に棲息する細菌（Ｂ．Ｍ．Ｔｅｂｏ，Ｈ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ａ．Ｓ．Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ（２００５）．Ｇｅｏｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ（ＩＩ）  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３，４２１−４２８；Ｈ．Ｌ．Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｄ．Ｋ．Ｎｅｗｍａｎ（２００９）．Ｇｅｏｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．）。
【００１４】
湿地から分離されたＬｅｐｔｏｔｈｒｉｘ  ｄｉｓｃｏｐｈｏｒａ  ＳＰ−６（Ｌ．Ｆ．Ａｄａｍｓ，Ｗ．Ｃ．Ｇｈｉｏｒｓｅ（１９８７）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｎ２＋−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｍｎ２＋−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ  ｄｉｓｃｏｐｈｏｒａ  ＳＳ−１．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６９，１２７９−１２８５．）。
【００１５】
淡水から分離されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（Ｍ．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔ．Ｓｕｇｉｔａ，Ｍ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙ．Ｏｈｏｄｅ，Ｋ．Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｅ．Ｗ．ｄｅ  Ｖｒｉｎｄ−ｄｅ  Ｊｏｎｇ，Ｊ．Ｐ．Ｍ．ｄｅ  Ｖｒｉｎｄ，Ｐ．Ｌ．Ａ．Ｍ．  Ｃｏｒｓｔｊｅｎｓ（１９９７）．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６３，４７９３−４７９９．）。
【００１６】
淡水及び土壌から分離されたＰｅｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．（Ｅ．Ｉ．Ｌａｒｓｅｎ，Ｌ．Ｉ．Ｓｌｙ，Ａ．Ｇ．ＭｃＥｗａｎ（１９９９）．Ｍａｎｇａｎｅｓｅ（ＩＩ）  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＡＣＭ  ３０６７．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７１，２５７−２６４．）。
【００１７】
土壌から分離されたＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．（Ｈ．Ｌ．Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｄ．Ｋ．Ｎｅｗｍａｎ（２００９）．Ｇｅｏｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．）。
【００１８】
「Ｕ９−１ｉ株」
マンガン酸化細菌として、本発明者らが、河川床生物膜から調製したマンガン酸化汚泥（集積培養系）から単離したＵ９−１ｉ株（非特許文献１）を好適に利用することができる。Ｕ９−１ｉ株は、微結晶性であるマンガン酸化物を産生し、この微生物産生マンガン酸化物は、Ｕ９−１ｉ株の細胞表層を覆うように蓄積される。微生物産生マンガン酸化物の生成と蓄積は、他のマンガン酸化細菌でも共通である。
【００１９】
Ｕ９−１ｉ株は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４５９として、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８））に、２０１７年４月２１日付で寄託されている。
Ｕ９−１ｉ株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（部分配列：配列番号１）を図１に示す。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に基づく分子系統解析の結果、Ｕ９−１ｉ株は、α−プロテオバクテリア綱に属する新規な細菌である。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて近隣結合法で作成した系統樹を図２に示す。
【００２０】
「Ｕ９−１ｉクラスターに属する菌」
マンガン酸化細菌として、Ｕ９−１ｉ株と遺伝子的に近縁種であるＵ９−１ｉクラスターに属する菌を好適に利用することができる。ここで、本明細書において、Ｕ９−１ｉクラスターに属する菌とは、Ｕ９−１ｉ株と、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子全長１４０６ｂｐとクエリーカバー率（Ｑｕｅｒｙ  ｃｏｖｅｒ）９９％以上（１４０６ｂｐのうち１３９２ｂｐ以上）において相同性９７％以上を示し、かつ近隣結合法で作成した分子系統樹においてＵ９−１ｉ株、ＯＴＳｚ  Ａ  ２７２株とともに１つのクレードを形成する細菌群を意味する。
【００２１】
Ｕ９−１ｉ株は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に特異的な領域を有し、配列番号１に示される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１１８７〜１２０４位の領域（図１で下線を引いた部分の配列）である配列番号２に示す塩基配列１２７０Ｆ（５’−ＣＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧＡＴＡＡＴ−３’）、またはその相補配列を含むプライマーにより、容易に検出、同定することができる。
【００２２】
ここで、Ｕ９−１ｉ株、および、図２に示す系統樹に記載されている細菌の一部について、Ｕ９−１ｉ株の配列１２７０Ｆに相当する領域の塩基配列を図３に示す。
図３に示すように、Ｕ９−１ｉクラスターに属する菌は、Ｕ９−１ｉ株の配列１２７０Ｆに相当する領域において配列番号３〜５に示す塩基配列１２７０Ｆ  ｆａｍｉｌｙを有する。配列１２７０Ｆ  ｆａｍｉｌｙは、配列１２７０Ｆの１８ｂｐの塩基配列に対して１７ｂｐ以上が一致しており、９４．４％以上（＝１７ｂｐ／１８ｂｐ）の非常に高い相同性を有する。それに対し、Ｕ９−１ｉクラスターに属さない菌の当該領域における配列１２７０Ｆとの相同性は低く、遺伝子データベースに登録されている全真正細菌の約３５０万の配列のうち、配列１２７０Ｆと一致するものは僅か２００配列程度である。同様に、配列１２７０Ｆ  ｆａｍｉｌｙと一致するものも同程度と僅かである。さらに図３に示すように、Ｕ９−１ｉクラスターに属さない比較的近縁の菌では８３．４％以下（１８ｂｐに対して１５ｂｐ以下）の一致度であることがほとんどである。したがって、配列番号３〜５に示される配列である１２７０Ｆ  ｆａｍｉｌｙ、またはその相補配列からなるプライマーにより、Ｕ９−１ｉクラスターに属する菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、特異的に増幅することができる。
【００２３】
「担体」
本発明の製造方法は、マンガン酸化細菌を担体に担持した状態で二価マンガンイオンを供給し、微生物産生マンガン酸化物を産生することを特徴とする。マンガン酸化細菌は、微結晶性であるマンガン酸化物を産生し、この微生物産生マンガン酸化物は、マンガン酸化細菌の細胞表層を覆うように蓄積される。すなわち、本発明の製造方法により、担体に担持されたマンガン酸化細菌の細胞表層に微生物産生マンガン酸化物が蓄積され、マンガン酸化細菌等のバイオフィルムと、このマンガン酸化細菌の細胞表層に蓄積した微生物産生マンガン酸化物を備えたマンガン酸化物担持担体が得られる。得られるマンガン酸化物担持担体は、表面に蓄積した微生物産生マンガン酸化物により褐色または黒褐色となる。
【００２４】
担体にマンガン酸化細菌を担持させる方法は特に制限されず、担体を充填したろ床へのマンガン酸化細菌の植種、マンガン酸化細菌含有培地への担体の浸漬等により行うことができる。マンガン酸化細菌は、菌体のみ、または、担体に担持された状態で、植種することができる。マンガン酸化細菌を担持する担体としては特に制限されず、砕石、砂利、ゼオライト、セラミック、木炭、ポリビニルアルコール、ポリオレフィン、ポリスチレン、等を用いることができる。これらの中で、砕石または砂利が、土壌汚染現場等で要求される大量の微生物産生マンガン酸化物を利用した重金属吸着剤を低コストで供給することができるため好ましい。
【００２５】
担体存在下でマンガン酸化細菌を培養する条件は、有機物、酸素、微量元素等を含み、温度等が適切な条件であれば特に制限されないが、マンガン酸化細菌が利用可能な形態の二価マンガンイオンを含むことが好ましい。マンガンイオンの存在下では、マンガン酸化細菌を優先的に増殖させることができる。好ましい条件としては、例えば、二価マンガンイオン濃度が０．５ｍｇ／Ｌ以上５００ｍｇ／Ｌ以下、有機物がＴＯＣ濃度で０．５ｍｇ／Ｌ以上１，０００ｍｇ／Ｌ以下である。酸素は、好気条件が維持されるよう供給する。より好ましくは、二価マンガンイオン濃度が５ｍｇ／Ｌ以上５００ｍｇ／Ｌ以下、ＴＯＣ濃度が０．５ｍｇ／Ｌ以上２５０ｍｇ／Ｌ以下である。
【００２６】
原因は不明であるが、マンガン酸化細菌は、担体で担持した状態では、担体で担持されていない状態と比較して、二価マンガンイオンから微生物産生マンガン酸化物を高速で産生することができる。また、二価マンガンイオンが高濃度であっても微生物産生マンガン酸化物を産生することができる。すなわち、微生物産生マンガン酸化物の産生を、マンガン酸化細菌を担体に担持させた状態で行うことにより、同一時間でより大量の微生物産生マンガン酸化物を製造することができ、さらに、原料であるマンガンイオンを高濃度とした場合には、より大量の微生物産生マンガン酸化物を短期間で製造することができる。微生物産生マンガン酸化物の製造中における二価マンガンイオン濃度は特に制限されないが、１０ｍｇ／Ｌ以上５００ｍｇ／Ｌ以下が好ましい。
【００２７】
「重金属吸着方法および重金属吸着剤」
マンガン酸化細菌により産生した微生物産生マンガン酸化物は、重金属吸着剤として使用することができる。微生物産生マンガン酸化物を重金属吸着剤として使用する形態は特に制限されず、例えば、微生物産生マンガン酸化物を備えるマンガン酸化物担持担体を、焼成、消毒等せず、マンガン酸化細菌が生息している状態で、重金属吸着剤として使用することができる。
【００２８】
本発明の重金属吸着剤により、重金属で汚染された環境から重金属を除去することができる。重金属で汚染された環境とは、地下水、土壌（岩石含む）、廃棄物、排水、河川、湖沼、海あるいは汚染された環境を通過した水等を挙げることができる。
本発明の重金属吸着剤は、微生物産生マンガン酸化物が吸着可能な重金属の１種または２種以上を対象とする吸着処理に特に制限することなく使用することができる。また、本発明の重金属吸着剤は、マンガン酸化細菌によりマンガンイオンを固定化することができるため、マンガンの処理に用いることもできる。
【００２９】
本発明の重金属吸着剤の使用方法は特に制限されないが、一般的には、吸着層として地中や掘削ずりの下方に設置する。吸着層が、重金属を吸着、除去することにより、下流への重金属の流出を防ぐことができる。この際、担体として砕石または砂利を用いることが、大量の重金属吸着剤を供給することができるため好ましい。
【実施例】
【００３０】
・マンガン酸化細菌
Ｕ９−１ｉ株、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ  ｄｉｓｃｏｐｈｏｒａ  ＳＰ−６（ＡＴＣＣ  ５１１６８。以下、ＳＰ−６株という。）は、下記表１に示すＬｅｐｔｏｔｈｒｉｘ培地を用いて室温で約１週間振とう培養し、フルグロースさせた。
【表１】
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【００３１】
「実験１：Ｕ９−１ｉ株とＰＶＡゲル担体」
「実施例１」
担体（株式会社クラレ製、製品名：クラゲール、直径約４ｍｍの球形であるポリビニルアルコールゲル）を表２に示す培地１００ｍＬに１０ｇ添加しオートクレーブ滅菌した。この培地に塩化マンガンを二価マンガンイオン濃度が６ｍｇ／Ｌとなるように添加した後、上記でフルグロースさせたＵ９−１ｉ株の培養液を体積比１０％となるように植種し、２５℃、９０ｒｐｍの条件で振とう培養を１４４時間（６日間）行った（２連）。
培養後、担体をデカンテーションにより回収して新鮮な培地に移し替え、二価マンガンイオン濃度を２０ｍｇ／Ｌに上昇させて９６時間（４日間）培養した後、さらに同様にして新鮮な培地を移し替え、二価マンガンイオン濃度を３０ｍｇ／Ｌに上昇させて９６時間（４日間）の培養を行うことにより、回分試験を行った。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
「比較例１」
担体を添加しない以外は、実施例１と同様にして、Ｕ９−１ｉ株浮遊性菌体による回分試験を行った。なお、比較例１において、１回目および２回目の回分培養終了後は、体積比１０％の培養液を新鮮な培地に植種して培養を繰り返した。
【００３４】
「結果」
培養液上清中の二価マンガンイオン濃度をＩＣＰ質量分析法（ＩＣＰ―ＭＳ）で測定した。図４に、二価マンガンイオン濃度の経時変化を示す。
二価マンガンイオン濃度が６ｍｇ／Ｌである１回目の回分試験は、担体の有無に関わらず、試験開始直後から二価マンガンイオン濃度が減少し、４８時間までにマンガンイオン濃度はほぼ０となり、微生物産生マンガン酸化物が産生した。
【００３５】
担体を添加した実施例１は、二価マンガンイオン濃度を２０ｍｇ／Ｌに上昇させた２回目の回分試験において、４８時間までに二価マンガンイオン濃度がほぼ０となった。また、培養前に白色であった担体は、ゲル上のバイオフィルムにマンガン酸化物が蓄積することにより、黒褐色に変化した。さらに３回目の回分試験において、３０ｍｇ／Ｌという高濃度である二価マンガンイオンの速やかな減少が観察され、微生物産生マンガン酸化物が高速で製造できた。
【００３６】
それに対し、担体を添加していない比較例１では、二価マンガンイオン濃度を２０ｍｇ／Ｌに上昇させた２回目の回分試験以降は二価マンガン濃度の減少は認められず、マンガン濃度が高いと、マンガン酸化が進行しないことが確かめられた。
すなわち、マンガン酸化細菌は、担体に担持させることにより、二価マンガンイオンが高濃度であってもマンガン酸化物を産生できることが確かめられた。
【００３７】
「実験２：ＳＰ−６株とＰＶＡゲル担体１」
「実施例２」
ＳＰ−６株を使用し、培養中の二価マンガンイオン濃度７ｍｇ／Ｌ（９６時間）、３０ｍｇ／Ｌ（８４時間）、６０ｍｇ／Ｌ（８４時間）１２０ｍｇ／Ｌ（９６時間）、１２０ｍｇ／Ｌ（９６時間）とした以外は、上記実施例１と同様にして、回分試験を行った。
【００３８】
「比較例２」
担体を添加しない以外は、実施例２と同様にして、ＳＰ−６株浮遊性菌体による回分試験を行った。なお、培地交換時には、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分）により菌体を沈殿させ、沈殿した菌体の全量を新鮮な培地に移植した。
【００３９】
培養液上清中の二価マンガンイオン濃度をＩＣＰ質量分析法（ＩＣＰ―ＭＳ）で測定した。図５に、二価マンガンイオン濃度の経時変化を示す。
ＳＰ−６株においても、二価マンガンイオンが低濃度（７ｍｇ／Ｌ）の場合は、担体の有無による差異はほとんど無くマンガン酸化が行われれた。
【００４０】
担体に担持した実施例２は、３０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、１２０ｍｇ／Ｌの二価マンガンイオンのほぼ全量を、それぞれ２４時間、４８時間、９６時間で酸化できた。
それに対し、担体無しの比較例２は、９６時間程度（４日）をかければ３０および６０ｍｇ／Ｌの二価マンガンイオン濃度を全量酸化できたが、さらに高濃度（１２０ｍｇ／Ｌ）では、９６時間経過しても全量を酸化することはできなかった。
このことから、担体に担持した実施例２が、担体に担持されていない比較例２と比較して、マンガンイオンの消費が速くなり、担体添加により微生物産生マンガン酸化物を高速で製造できることが確かめられた。
【００４１】
「実験３：ＳＰ−６株とＰＶＡゲル担体２」
「実施例３」
培養中の二価マンガンイオン濃度を約６０ｍｇ／Ｌ（１０８時間）とした以外は、上記実施例２と同様にして、培養を行った。
【００４２】
「比較例３」
担体を添加しない以外は、実施例３と同様にして、ＳＰ−６株浮遊性菌体による培養実験を行った。
【００４３】
培養液上清中の二価マンガンイオン濃度をＩＣＰ質量分析法（ＩＣＰ―ＭＳ）で測定した。図６に、二価マンガンイオン濃度の経時変化を示す。
ＳＰ−６株は、培養初期における二価マンガンイオンが６０ｍｇ／Ｌと高濃度であっても、マンガン酸化を行うことができた。しかし、担体に担持させた実施例３は、担体に担持させていない比較例３と比較して、より高速でマンガンが消費されており、担体に担持させることにより、微生物産生マンガン酸化物を高速で製造できることが確かめられた。
【００４４】
「実施例４：Ｕ９−１ｉ株と砕石担体１」
プラスチック製コンテナに、容積が計６０Ｌとなるように砕石（７号砕石）を投入し、循環液２０Ｌ、循環速度０．２５Ｌ／分にて、培地をコンテナ上部から散水し、下部から回収して循環させた。培地は、下記表３で示した組成の培地を適宜濃縮、希釈し、さらに硫酸マンガン（５〜４５０ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ）を添加したものを用いた。培地は、２４時間循環させる毎に新たな培地に交換した。これに、上記で培養しておいたＵ９−１ｉ株の培養液を、培養０日目に２５０ｍＬ、培養２１日目に２００ｍＬ植菌した。なお、コンテナ、及び、砕石は滅菌処理を行っていない。
【表３】
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【００４５】
実験初期より徐々にマンガン濃度（ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ）およびマンガン負荷量（ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ／日）（＝培養液中のＭｎ濃度（ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ）×１日あたりの培養液量（Ｌ／日）／培養槽容積（Ｌ））を上昇させた。新たに循環させる培地のマンガン濃度（流入）と、この培地によるマンガン負荷量を図７に、２４時間循環後の培地のマンガン濃度（流出）を図８に示す。
【００４６】
実験開始から５０日目までマンガン濃度及びマンガン負荷量を上昇させたところ、マンガン濃度（流入）７５ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ、マンガン負荷２５ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ／日まではマンガン濃度（流出）はほぼ０であった。しかし、マンガン濃度（流入）１３５ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ、マンガン負荷量４５ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ／日では、マンガン濃度（流出）が増加し、マンガンの酸化が十分に行われなかった。
【００４７】
マンガン濃度（流入）７５ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ、マンガン負荷量２５ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ／日に戻して培養を続けたところ、培養１０２日目までは、時折、マンガン濃度（流出）の増加が見受けられたが、その後、マンガン濃度（流出）はほぼ０となり、マンガン酸化は安定した。
培養２１４日目以降、マンガン濃度（流入）およびマンガン負荷量を上昇させたところ、最大でマンガン濃度（流入）３００ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ、マンガン負荷量１００ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ／日まで２４時間後のマンガン濃度（流出）が０．５ｍｇ／Ｌ以下を示し、マンガン濃度（流入）４５０ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ、マンガン負荷量１５０ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ／日まで２４時間後のマンガン酸化率９９％以上を示した。
以上の結果から、担体として砕石を用いた場合でも、非常に高いマンガン濃度でのマンガン酸化が可能であり、高速での酸化マンガン生成が可能であることが確かめられた。
【００４８】
「リアルタイムＰＣＲ」
Ｕ９−１ｉ株について、配列番号２に示す配列１２７０Ｆからなるオリゴヌクレオチドプローブと、真正細菌特異的なユニバーサルプライマー（１４９２Ｒ）とのプライマーセットを用いて、下記表４に示す条件でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法によるリアルタイムＰＣＲを行った。また、全細菌について、真正細菌特異的なユニバーサルプライマー（１０４８Ｆ、１１９４Ｒ）を用いて、下記表４に示す条件でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法によるリアルタイムＰＣＲを行った。
【表４】
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【００４９】
・Ｕ９−１ｉ株の定量
上記実施例４における砕石表面からバイオフィルムを約０．５ｇ測り採った後、１００ｍＭアスコルビン酸溶液を２００μＬ添加し、ボルテックスで５分間撹拌してＭｎ酸化物を溶解した。Ｍｎ酸化物溶解後の試料全量を土壌ＤＮＡ抽出キット（株式会社ニッポン・ジーン製、商品名：ＩＳＯＩＬ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  Ｂｅａｔｉｎｇ）を用いてＤＮＡを抽出した。なお、ＤＮＡ抽出は付属のマニュアルに従った。
抽出したＤＮＡを分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、装置名：ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００）により定量後、１０〜１００倍に希釈して定量ＰＣＲに用いた。
【００５０】
定量ＰＣＲは、上記表４に示す「１２７０Ｆ」を用いたプライマーセットを用いてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法で行った。反応にはＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ＤＮＡ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、マニュアルで推奨された反応液組成およびプライマー濃度で反応させた。なお、ＤＮＡの定量はリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ社製、装置名：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏシステム）により、上記表４のサーマルサイクル反応で解析した。また、Ｕ９−１ｉ株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を用いてスタンダードを作成し、絶対検量線法で定量した。
鋳型ＤＮＡを段階希釈して実験を行い、最も増幅効率の高かった結果をＤＮＡのコピー数とした。その結果を図９に示す。
【００５１】
４０日までは配列１２７０Ｆは検出されたがコピー数の増加は確認できなかった。しかし、全細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コピー数がほぼ一定（１０８／ｇ担体）に達した５０日以後に配列１２７０Ｆのコピー数が増加し、その後培養１００日目からは１０６〜１０７コピー／ｇ担体の範囲で、安定的に維持されていることが確認できた。Ｕ９−１ｉ株のゲノム中には、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が１コピー存在するため、１００日目以後は、担体１ｇ当たり１０６〜１０７細胞のＵ９−１ｉ株が保持されていることになる。
一方、それぞれプライマーが異なるため、単純な割り算で存在比を求めることは難しいが、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子数を目安として全細菌に占めるＵ９−１ｉ株の存在比（Ｕ９−１ｉ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コピー数／全細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コピー数×１００）を見積もった。その結果、培養開始直後から４０日後までの存在比は１％から０．１％程度と低かったが、その後増加し、配列１２７０Ｆのコピー数がほぼ一定に維持された１００日以後は数％〜１０％程度で推移していた。
【００５２】
・砕石バイオフィルムの真正細菌叢解析
次世代シーケンサーＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）用のアダプター配列を連結した真正細菌に特異的なプライマーセット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅａｒｔｈｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ｏｒｇ）（５１５Ｆ：５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ−３’、８０６Ｒ：５’−ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ−３’）によりＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製、商品名：Ｅｘ  Ｔａｑ）を用いてサーマルサイクラー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、装置名：ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ）により行った。反応液の総量は４０μＬとし、組成はＥｘ  Ｔａｑ付属のマニュアルに従った。
ＰＣＲ産物をＤＮＡ精製試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、商品名：ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ）で精製後、フルオロメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、装置名：Ｑｕｂｉｔ）で定量後に各サンプルを同濃度で混合した。混合したＰＣＲ産物は、自動ＤＮＡ断片ゲル抽出装置（Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、装置名：ＢｌｕｅＰｉｐｐｉｎ）で再度精製してアンプリコン解析用のライブラリーとした。
調製したライブラリーはシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製、装置名：ＭｉＳｅｑ）により配列を決定した。得られた配列は、Ｃｌａｉｄｅｎｔ  ｖ０．２（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｌａｉｄｅｎｔ．ｏｒｇ）を用いて分子系統学的に分類した。結果を図１０に示す。
【００５３】
運転開始直後にＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門および未同定細菌群の急激な増加が確認された。運転約６０日目、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の増加とともにＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門は減少し、その後細菌叢は安定した。加えて、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門は運転期間中増減を繰り返しながら常に優占した。
Ｕ９−１ｉ株は、培養直後は１％以下に減少したが、培養６０日目以降でＵ９−１ｉ株の増加が確認され、定量ＰＣＲの結果と一致した。Ｕ９−１ｉ株の増加は試験終了時まで持続しており、他の細菌の存在下でもＵ９−１ｉ株を安定的に培養できることが確かめられた。
【００５４】
「実験５：Ｕ９−１ｉ株と砕石担体２」
ガラスカラム（φ２．２ｃｍ、長さ１５ｃｍ、容積５７ｃｍ３）に、実験４における培養１０３日目の砕石と新品の７号砕石とを等量混合したものを充填した（空隙：２５．５ｍＬ）。なお、ガラスカラムと新品の砕石とは、滅菌処理を行っていない。
実施例４と同様の培地をカラム下部からチューブポンプで送液した。
６２日目までは、上部から流出した培地は、マンガン濃度（流出）を測定後、廃棄した。
６３日目以降は、カラム上部から流出した培地は、プラスチック瓶に戻し、このプラスチック瓶からカラム下部に送液することにより循環した。培地は、１日毎に交換し、交換時にマンガン濃度（流出）を測定した。
【００５５】
実験初期より徐々にマンガン濃度（流入）およびマンガン負荷量を上昇させた。培地のマンガン濃度（流入）と、この培地によるマンガン負荷量を図１１に、マンガン濃度（流出）を図１２に示す。なお、６２日目までは流量、６３日目以降は循環させる培地の総量がが異なるため、マンガン濃度（流入）とマンガン負荷量とは、別々に変化している。
【００５６】
５０日程度でマンガン酸化は安定した。最大でマンガン濃度（流入）２００ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ、マンガン負荷量３００ｍｇ−Ｍｎ／Ｌ／日まで安定したマンガン酸化が可能であり、砕石を用いたマンガン酸化は、高いマンガン酸化速度を持つことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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