(57)【要約】【課題】前立腺癌の予後を定量化するための遺伝子発現プロフィールアルゴリズムおよび試験を提供すること。【解決手段】本発明は、前立腺癌患者から採取した生物学的サンプルからの、遺伝子、またはその共発現遺伝子の発現量の測定を含む、アルゴリズムに基づく分子アッセイを提供するものである。前立腺癌患者の臨床転帰の尤度を予測する上で有用な定量スコアを計算するために、上記遺伝子を、機能遺伝子サブセットに分類することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルにおける、遺伝子の群からのＲＮＡ転写物レベルを、前立腺癌患者についての臨床転帰の尤度の指標とする方法であって、
以下の遺伝子群：
ａ）遺伝子ＦＬＮＣ、ＧＳＮおよびＴＰＭ２を含む細胞構成遺伝子群
ｂ）遺伝子ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１およびＳＲＤ５Ａ２を含むアンドロゲン遺伝子群
ｃ）遺伝子ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１およびＳＦＲＰ４を含む間質反応遺伝子群
のうちの１つ、２つまたは３つ全てにおける各遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルを決定するステップ；ならびに
１）少なくとも１つのリファレンス遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルに対して、前記ＲＮＡ転写物のレベルを正規化すること、２）臨床転帰に対するその寄与により、各遺伝子の正規化された前記ＲＮＡ転写物レベルを重み付けすること、および／または臨床転帰に対するそれらの寄与により遺伝子群中の遺伝子の正規化された前記ＲＮＡ転写物レベルを重み付けすること、ならびに３）アルゴリズムを適用して、重み付けされ、正規化された前記ＲＮＡ転写物のレベルから定量スコアを算出することによって、前記患者についての少なくとも１つの定量スコアを算出するステップ
を含み、ここで、
前記患者についての臨床転帰の尤度が、前記少なくとも１つの定量スコアに基づいて予測される、方法。
【請求項２】
前記細胞構成遺伝子群からのＲＮＡ転写物のレベルが決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＦＬＮＣ、ＧＳＮおよびＴＰＭ２のそれぞれ、およびＧＳＴＭ２、ＩＧＦＢＰ６、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＢＩＮ１、ＶＣＬ、ＩＧＦ１、Ｃ７およびＧＳＴＭ１から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子のレベルを決定することを含み、ここで、前記少なくとも１つの定量スコアが、ＦＬＮＣ、ＧＳＮおよびＴＰＭ２ならびに前記少なくとも１つのさらなる遺伝子の重み付けされ、正規化されたＲＮＡ転写物レベルから算出される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの定量スコアが細胞構成群スコアを含み、前記細胞構成群スコアは、０．１６３×ＦＬＮＣ＋０．５０４×ＧＳＮ＋０．４２１×ＴＰＭ２＋０．３９４×ＧＳＴＭ２に等しく、ここで、遺伝子名は、各遺伝子についての正規化されたＲＮＡ転写物レベルを示す、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記アンドロゲン遺伝子群からのＲＮＡ転写物のレベルが決定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの定量スコアがアンドロゲン遺伝子群スコアを含み、前記アンドロゲン遺伝子群スコアは、０．６３４×ＦＡＭ１３Ｃ＋１．０７９×ＫＬＫ２＋０．６４２×ＡＺＧＰ１＋０．９９７×ＳＲＤ５Ａ２閾値スコアに等しく、ここで、遺伝子名は、各遺伝子についての正規化されたＲＮＡ転写物レベルを示し、前記ＳＲＤ５Ａ２閾値スコアは、ＳＲＤ５Ａ２が５．５未満の場合５．５に等しく、ＳＲＤ５Ａ２が５．５以上の時、ＳＲＤ５Ａ２に等しい、請求項１または５に記載の方法。
【請求項７】
前記間質反応遺伝子群からのＲＮＡ転写物のレベルが決定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１およびＳＦＲＰ４のそれぞれ、およびＡＳＰＮ、ＳＰＡＲＣ、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＩＮＨＢＡおよびＴＨＢＳ２から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子のレベルを決定することを含み、ここで、前記定量スコアが、ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１およびＳＦＲＰ４ならびに前記少なくとも１つのさらなる遺伝子の重み付けされ、正規化されたＲＮＡ転写物レベルから算出される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの定量スコアが間質反応群スコアを含み、前記間質反応群スコアは、０．５２７×ＢＧＮ＋０．４５７×ＣＯＬ１Ａ１＋０．１５６×ＳＦＲＰ４に等しく、ここで、遺伝子名は、各遺伝子についての正規化されたＲＮＡ転写物レベルを示す、請求項１または８に記載の方法。
【請求項１０】
以下のさらなる遺伝子群：
ｄ）遺伝子ＣＹＰ３Ａ５、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５、ＬＡＭＢ３およびＳＤＣ１を含む基底上皮遺伝子群；
ｅ）遺伝子ＤＵＳＰ１、ＥＧＦＲ１、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＥＧＲ３、ＧＡＤＤ４５ＢおよびＺＦＰ３６を含むストレス応答遺伝子群；および
ｆ）遺伝子ＣＤＣ２０、ＴＰＸ２、ＵＢＥ２Ｔ、ＭＹＢＬ２およびＣＤＫＮ２Ｃを含む増殖遺伝子群
のうちの少なくとも１つにおける少なくとも１つの遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルを決定するステップをさらに含み、
ただし、前記細胞構成遺伝子群（ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２、ＴＰＭ２）、前記間質反応遺伝子群（ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４）および前記アンドロゲン遺伝子群（ＡＺＧＰ１、ＫＬＫ２、ＦＡＭ１３Ｃ１、ＳＲＤ５Ａ２）の３つ全てのＲＮＡ転写物レベルが決定されない場合、前記増殖遺伝子群のＴＰＸ２のＲＮＡ転写物レベルは決定されない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記基底上皮遺伝子群における少なくとも１つの遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルが決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ストレス応答遺伝子群における少なくとも１つの遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルが決定される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増殖遺伝子群における少なくとも１つの遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルが決定される、請求項１０、１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記増殖遺伝子群からのＴＰＸ２、ＣＤＣ２０およびＭＹＢＬ２から選択される少なくとも１つの遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルを決定するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記臨床転帰が、前立腺癌の悪性度進行である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記臨床転帰が、前立腺癌の病期進行である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記臨床転帰が、前立腺癌の再発である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記臨床転帰の尤度が、悪性病理の尤度であるか、非器官限局性疾患の尤度であるか、高グレード疾患の尤度であるか、あるいは高グレードまたは非器官限局性疾患の尤度である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的サンプルが、固定され、パラフィン包埋されている組織サンプルである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
１つ以上の前記ＲＮＡ転写物のレベルが定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記臨床転帰の尤度および／または前記定量スコアをまとめたレポートを作成するステップをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第６１／５９３，１０６号明細書（２０１２年１月３１日出願）、米国特許仮出願第６１／６７２，６７９号明細書（２０１２年７月１７日出願）、および米国特許仮出願第６１／７１３，７３４号明細書（２０１２年１０月１５日出願）に対する優先権を主張するものであり、それらの仮出願はいずれも本明細書に参照として援用されている。
【０００２】
本開示は、癌患者の予後情報を特定するための遺伝子発現プロフィールに関する情報を提供する、分子診断検査法に関する。詳細には、本開示は、遺伝子または同時発現遺伝子を含むアルゴリズムを提供し、これら遺伝子の発現を用いて、前立腺癌患者が肯定的または否定的臨床転帰を経験する尤度を定量化し得る。
【背景技術】
【０００３】
１９８７年に前立腺特異抗原（ＰＳＡ）スクリーニングが導入されたことにより、決して臨床的に有意となることのない、または死亡を引き起こすことのない低悪性前立腺癌の多くの症例の診断および積極的治療が行われるようになった。その理由は、前立腺癌の自然史は、その症例の大部分が、低悪性であり、たとえ治療しないままであっても、男性の生涯にわたって苦痛または死亡を引き起こすまで進行しないという点で、悪性腫瘍の中でも稀有である。男性の約半数がその生涯の間に浸潤性前立腺癌を発現する（部検調査により検出）（Ｂ．Ｈａｌｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  １６：７３７−７４２（１９６３）；Ｂ．Ｈｏｌｕｎｄ，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １４：２９−３５（１９８０）；Ｓ．Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ
Ｎｅｐｈｒｏｌ  ４：９３−９７（１９７０）；Ｍ．Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １７９：８９２−８９５（２００８））が、１７％しか、前立腺癌と診断されず、前立腺癌のために死亡するのはわずか３％に過ぎない。Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ．Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （２０１０）；ＪＥ  Ｄａｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３７１：１７１０−１７２１（２００８）。
【０００４】
しかし、現在、前立腺癌と診断される男性の９０％超が、低リスク前立腺癌であっても、根治的前立腺摘除もしくは根治的放射線療法のいずれかを受けている。ＭＲ  Ｃｏｏｐｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８：１１１７−１１２３（２０１０）；ＭＲ  Ｃｏｏｐｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：８１４６−８１５１（２００５）。手術および放射線療法は、前立腺癌の再発および癌による死亡のリスクを低減する（ＡＶ  Ｄ’Ａｍｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊａｍａ  ２８０：９６９−９７４（１９９８）；Ｍ  Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｏｌ  Ｃｌｉｎ
Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２８：５５５−５６５（２００１）；ＷＵ  Ｓｈｉｐｌｅｙ  ｅｔ
ａｌ．，Ｊａｍａ  ２８１：１５９８−１６０４（１９９９）；ＡＪ  Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：４３００−４３０５（２００９））が、前立腺癌による死亡を阻止するために治療を受けなければならない男性の推定数は、１２〜１００の範囲である。Ａ  Ｂｉｌｌ−Ａｘｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １００：１１４４−１１５４（２００８）；Ｊ  Ｈｕｇｏｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １１：７２５−７３２（２０１０）；ＬＨ  Ｋｌｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １３  Ｓｕｐｐｌ
１：４８−５５（２００６）；Ｓ  Ｌｏｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２９：４６４−４６７（２０１１）；ＦＨ  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６０：１３２０−１３２８（２００９）。前立腺癌のこうした過度な治療は、高額な費用と毒性を招く。例えば、根治的前立腺摘除を受ける男性の大部分が、手術の結果、失禁および陰萎を患い（ＭＳ  Ｌｉｔｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １０９：２２３９−２２４７（２００７）；ＭＧ  Ｓａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５８：１２５０−１２６１（２００８）、２５％もの男性が前立腺癌の治療の選択について後悔している。ＦＲ  Ｓｃｈｒｏｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ５４：７８５−７９３（２００８）。
【０００５】
前立腺癌の過度な治療の理由の１つは、即時根治療法を必要とする男性と、即時療法を延期し、積極的サーベイランス療法を受けるのが適した候補を識別する適切な予後予測ツールがないことである。例えば、臨床病期、治療前ＰＳＡ、および生検グリソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）スコアの結果に基づき低リスク疾患を有すると思われ、プロトコルに基づく積極的サーベイランス療法で管理されていた男性のうち、３０〜４０％が、経過観察の最初の数年にわたり疾患の進行（ＰＳＡの上昇、反復生検でのグリソンスコアの増加、または臨床的進行）を経験し、その一部は、治癒療法の機会を失ってしまった可能性がある。ＨＢ  Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １７８：２３５９−２３６４およびｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２３６４−２３５５（２００７）；ＭＡ  Ｄａｌｌ’Ｅｒａ  ｅｔ
ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １１２：２６６４−２６７０（２００８）；Ｌ  Ｋｌｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８：１２６−１３１（２０１０）。また、積極的サーベイランス療法の候補者であると思われるが、いずれにせよ即時前立腺摘除を受ける男性のうち、３０〜４０％が、手術の時点で、予想より高いリスクの疾患を有することが判明しており、これは、高グレード（３＋４以上のグリソンスコア）または非器官限局性癌（嚢外進展（ＥＣＥ）または精嚢併発（ＳＶＩ））を有することにより定義される。ＳＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １８１：１６２８−１６３３およびｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １６３３−１６２４（２００９）；ＣＲ  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １７８：８６０−８６３（２００７）；ＰＷ  Ｍｕｆａｒｒｉｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １８１：６０７−６０８（２００９）。
前立腺癌の再発危険率および治療決定に関する評価は、現在、主にＰＳＡレベルおよび／または臨床上の腫瘍病期に基づいて行われている。腫瘍病期と転帰との関連性は、病理学的レポートに記載するのに十分有意なものであることが実証されているが、米国病理学者協会（Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ）コンセンサスステートメントは、この情報の入手、解釈、リポーティングおよび解析の手法にはバリエーションが存在することに注目している。Ｃ．Ｃｏｍｐｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １２４：９７９−９９２（２０００）。その結果、既存の病理学的病期分類方法は、再現性に欠くとして批判されてきており、それ故、個々の患者について不正確なリスク評価がなされ得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂ．Ｈａｌｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  １６：７３７−７４２（１９６３）
【非特許文献２】Ｂ．Ｈｏｌｕｎｄ，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １４：２９−３５（１９８０）
【非特許文献３】Ｓ．Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ４：９３−９７（１９７０）
【非特許文献４】Ｍ．Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １７９：８９２−８９５（２００８）
【非特許文献５】Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ．Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （２０１０）
【非特許文献６】ＪＥ  Ｄａｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３７１：１７１０−１７２１（２００８）
【非特許文献７】ＭＲ  Ｃｏｏｐｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８：１１１７−１１２３（２０１０）
【非特許文献８】ＭＲ  Ｃｏｏｐｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：８１４６−８１５１（２００５）
【非特許文献９】ＡＶ  Ｄ’Ａｍｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊａｍａ  ２８０：９６９−９７４（１９９８）
【非特許文献１０】Ｍ  Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２８：５５５−５６５（２００１）
【非特許文献１１】ＷＵ  Ｓｈｉｐｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊａｍａ  ２８１：１５９８−１６０４（１９９９）
【非特許文献１２】ＡＪ  Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：４３００−４３０５（２００９）
【非特許文献１３】Ａ  Ｂｉｌｌ−Ａｘｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １００：１１４４−１１５４（２００８）
【非特許文献１４】Ｊ  Ｈｕｇｏｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １１：７２５−７３２（２０１０）
【非特許文献１５】ＬＨ  Ｋｌｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １３  Ｓｕｐｐｌ  １：４８−５５（２００６）
【非特許文献１６】Ｓ  Ｌｏｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２９：４６４−４６７（２０１１）
【非特許文献１７】ＦＨ  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６０：１３２０−１３２８（２００９）
【非特許文献１８】ＭＳ  Ｌｉｔｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １０９：２２３９−２２４７（２００７）
【非特許文献１９】ＭＧ  Ｓａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５８：１２５０−１２６１（２００８）
【非特許文献２０】ＦＲ  Ｓｃｈｒｏｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ５４：７８５−７９３（２００８）
【非特許文献２１】ＨＢ  Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １７８：２３５９−２３６４およびｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２３６４−２３５５（２００７）
【非特許文献２２】；ＭＡ  Ｄａｌｌ’Ｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １１２：２６６４−２６７０（２００８）
【非特許文献２３】Ｌ  Ｋｌｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８：１２６−１３１（２０１０）
【非特許文献２４】ＳＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １８１：１６２８−１６３３およびｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １６３３−１６２４（２００９）
【非特許文献２５】ＣＲ  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １７８：８６０−８６３（２００７）
【非特許文献２６】ＰＷ  Ｍｕｆａｒｒｉｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １８１：６０７−６０８（２００９）
【非特許文献２７】Ｃ．Ｃｏｍｐｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １２４：９７９−９９２（２０００）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願は、前立腺癌患者から採取された生物学的サンプルからの１つ以上の遺伝子または遺伝子サブセットの発現量の測定、および測定された発現量の解析を含み、これらによって、臨床転帰の尤度に関する情報を提供する、分子アッセイを開示するものである。例えば、臨床転帰の尤度は、臨床的または生化学的無再発期間、全体的生存率、前立腺癌特異的生存、生検から放射線による前立腺切除までの病期／悪性度進行、または前立腺切除時点での高グレードまたは非器官限局性疾患の存在に基づく定量スコアに変換して表すことができる。
【０００８】
また、本出願は、ある前立腺癌患者のリスク等級を決定するために、採取した生物学的サンプルからの１つ以上の遺伝子または遺伝子サブセットの発現量の測定を含む、分子アッセイを開示している。例えば、前立腺癌の肯定的臨床転帰、または予後因子に対して正または負の関連性を示す１種以上の遺伝子の発現量を用いて、患者を層別化することができる。例示的な実施例において、予後因子はグリソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）スコアである。
【０００９】
本発明は、前立腺癌患者についての臨床転帰の尤度を予測する方法を提供し、患者から採取した腫瘍細胞を含む生物学的サンプルにおいて、１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルの決定を含み、ここで、ＲＮＡ転写物またはその発現生成物は、図１に示し、かつ表１Ａおよび１Ｂに記載する８１の遺伝子から選択される。本方法は、１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物を、細胞構成遺伝子群、基底上皮遺伝子群、ストレス応答遺伝子群、アンドロゲン遺伝子群、間質反応遺伝子群、および増殖遺伝子群から選択される１つ以上の遺伝子群に割り当てるステップを含む。本方法はさらに、臨床転帰に対するそれらの寄与により、１つ以上のＲＮＡ転写物またはその発現生成物のレベルを計量することによって、患者の定量スコアを算出するステップ、ならびにこの定量スコアに基づいて患者の臨床転帰の尤度を予測するステップを含む。本発明の一実施形態において、定量スコアの増加は、否定的臨床転帰の尤度増加と相関する。
【００１０】
具体的実施形態において、１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物は、以下から選択する：ＢＩＮ１、ＩＧＦ１、Ｃ７、ＧＳＮ、ＤＥＳ、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＰＭ２、ＶＣＬ、ＦＬＮＣ、ＩＴＧＡ７、ＣＯＬ６Ａ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ２、ＰＡＧＥ４、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＳＲＤ５Ａ２、ＰＲＫＣＡ、ＩＧＦＢＰ６、ＧＰＭ６Ｂ、ＯＬＦＭＬ３、ＨＬＦ、ＣＹＰ３Ａ５、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５、ＬＡＭＢ３、ＳＤＣ１、ＤＵＳＰ１、ＥＧＦＲ１、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＥＧＲ３、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＺＦＰ３６、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＳＰＮ、ＳＦＲＰ４、ＢＧＮ、ＴＨＢＳ２、ＩＮＨＢＡ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＦＮ１、ＦＡＰ、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＤＣ２０、ＴＰＸ２、ＵＢＥ２Ｔ、ＭＹＢＬ２およびＣＤＫＮ２Ｃ。ＢＩＮ１、ＩＧＦ１、Ｃ７、ＧＳＮ、ＤＥＳ、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＰＭ２、ＶＣＬ、ＦＬＮＣ、ＩＴＧＡ７、ＣＯＬ６Ａ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ２、ＰＡＧＥ４、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＳＲＤ５Ａ２、ＰＲＫＣＡ、ＩＧＦＢＰ６、ＧＰＭ６Ｂ、ＯＬＦＭＬ３およびＨＬＦは、細胞構成遺伝子群に割り当てる。ＣＹＰ３Ａ５、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５、ＬＡＭＢ３、およびＳＤＣ１は、基底上皮遺伝子群に割り当てる。ＤＵＳＰ１、ＥＧＦＲ１、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＥＧＲ３、ＧＡＤＤ４５Ｂ、およびＺＦＰ３６は、ストレス応答遺伝子群に割り当てる。ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１、およびＳＲＤ５Ａ２は、アンドロゲン遺伝子群に割り当てる。ＡＳＰＮ、ＳＦＲＰ４、ＢＧＮ、ＴＨＢＳ２、ＩＮＨＢＡ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＦＮ１、ＦＡＰ及びＣＯＬ５Ａ２は、間質反応遺伝子群に割り当てる。ＣＤＣ２０、ＴＰＸ２、ＵＢＥ２Ｔ、ＭＹＢＬ２およびＣＤＫＮ２Ｃは、増殖遺伝子群に割り当てる。本方法はさらに、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＮＦＡＴ５、ＡＺＧＰ１、ＡＮＰＥＰ、ＩＧＦＢＰ２、ＳＬＣ２２Ａ３、ＥＲＧ、ＡＲ、ＳＲＤ５Ａ２、ＧＳＴＭ１、およびＧＳＴＭ２から選択される少なくとも１つのＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定するステップも含み得る。
【００１１】
本発明の一実施形態では、間質反応遺伝子群および細胞構成遺伝子群の各々から、１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定する。別の実施形態では、間質反応遺伝子群およびＰＳＡ遺伝子群の各々から、１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定する。さらに、細胞構成遺伝子群および／または増殖遺伝子群から、１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定する。この実施形態において、間質反応遺伝子群から検定しようとする遺伝子は、ＡＳＰＮ、ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、およびＳＦＲＰ４から選択することができ；アンドロゲン遺伝子群から検定しようとする遺伝子は、ＦＡＭ１３ＣおよびＫＬＫ２から選択することができ；細胞構成遺伝子群から検定しようとする遺伝子は、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２、ＩＧＦＢＰ６、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＢＩＮ１、ＶＣＬ、ＩＧＦ１、ＴＰＭ２、Ｃ７、およびＧＳＴＭ１から選択することができ；増殖遺伝子群から検定しようとする遺伝子は、ＴＰＸ２、ＣＤＣ２０、およびＭＹＢＬ２から選択することができる。
【００１２】
特定の実施形態において、ＲＮＡ転写物、またはその発現生成物は、ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＴＰＭ２、ＴＰＸ２、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１、ＧＳＴＭ２、およびＳＲＤ５Ａ２から選択する。ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、およびＳＦＲＰ４を間質反応遺伝子群に割り当て；ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、およびＴＰＭ２を細胞構成遺伝子群に割り当て；ＦＡＭ１３ＣおよびＫＬＫ２をアンドロゲン遺伝子群に割り当てる。間質反応遺伝子群、細胞構成遺伝子群、およびアンドロゲン遺伝子群から選択される遺伝子群の少なくとも１つを含む、ＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを、本発明の方法のために決定することができる。実施形態のいずれにおいても、アンドロゲン遺伝子群はさらに、ＡＺＧＰ１およびＳＲＤ５Ａ２を含み得る。
【００１３】
加えて、表４に示す遺伝子組み合わせのいずれか１つのレベルを決定してもよい。例えば、表４のＲＳ０モデルは、ＡＳＰＮ、ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２、ＩＧＦＢＰ６、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＴＰＸ２、ＣＤＣ２０、ＭＹＢＬ２、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＳＴＡＴ５Ｂ、およびＮＦＡＴ５のＲＮＡ転写物、その遺伝子発現生成物のレベルを決定するステップを含む。さらに、表４に示すアルゴリズムのいずれか１つを用いて、患者の定量スコアを算出することも可能である。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
前立腺癌患者についての臨床転帰の尤度を予測する方法であって、
前記患者から採取した癌細胞を含む生物学的サンプルにおいて、１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定するステップであって、ここで、前記１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物が、ＢＩＮ１、ＩＧＦ１、Ｃ７、ＧＳＮ、ＤＥＳ、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＰＭ２、ＶＣＬ、ＦＬＮＣ、ＩＴＧＡ７、ＣＯＬ６Ａ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ２、ＰＡＧＥ４、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＳＲＤ５Ａ２、ＰＲＫＣＡ、ＩＧＦＢＰ６、ＧＰＭ６Ｂ、ＯＬＦＭＬ３、ＨＬＦ、ＣＹＰ３Ａ５、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５、ＬＡＭＢ３、ＳＤＣ１、ＤＵＳＰ１、ＥＧＦＲ１、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＥＧＲ３、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＺＦＰ３６、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＳＰＮ、ＳＦＲＰ４、ＢＧＮ、ＴＨＢＳ２、ＩＮＨＢＡ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＦＮ１、ＦＡＰ、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＤＣ２０、ＴＰＸ２、ＵＢＥ２Ｔ、ＭＹＢＬ２、およびＣＤＫＮ２Ｃから選択されるステップ；
１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物を、細胞構成遺伝子群、基底上皮遺伝子群、ストレス応答遺伝子群、アンドロゲン遺伝子群、間質反応遺伝子群、および増殖遺伝子群から選択される１つ以上の遺伝子群に割り当てるステップ；
臨床転帰に対するそれらの寄与により、１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを計量することによって、前記患者の定量スコアを算出するステップ；ならびに
前記定量スコアに基づいて前記患者の臨床転帰の尤度を予測するステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記生物学的サンプルにおいて、少なくとも１つのＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定するステップであって、ここで、少なくとも１つのＲＮＡ転写物、またはその発現生成物が、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＮＦＡＴ５、ＡＺＧＰ１、ＡＮＰＥＰ、ＩＧＦＢＰ２、ＳＬＣ２２Ａ３、ＥＲＧ、ＡＲ、ＳＲＤ５Ａ２、ＧＳＴＭ１、およびＧＳＴＭ２から選択されるステップ；および
前記臨床転帰に対するその寄与により、前記少なくとも１つのＲＮＡ転写物またはその発現生成物のレベルを計量して、前記定量スコアを算出するステップ
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記定量スコアの増加が、否定的臨床転帰の尤度増加と相関する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記臨床転帰が、前立腺癌の悪性度進行である、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記臨床転帰が、前立腺癌の病期進行である、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記臨床転帰が、前立腺癌の再発である、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記間質反応遺伝子群から、少なくとも３つのＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定し、前記間質反応遺伝子群が、ＡＳＰＮ、ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、およびＳＦＲＰ４を含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記アンドロゲン遺伝子群から、少なくとも１つのＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定し、前記アンドロゲン遺伝子群が、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１、およびＳＲＤ５Ａ２を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記細胞構成遺伝子群から、少なくとも３つのＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定するステップをさらに含み、前記細胞構成遺伝子群が、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２、ＩＧＦＢＰ６、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＢＩＮ１、ＶＣＬ、ＩＧＦ１、ＴＰＭ２、Ｃ７、およびＧＳＴＭ１を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記増殖遺伝子群から、少なくとも１つのＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定するステップをさらに含み、前記増殖遺伝子群が、ＴＰＸ２、ＣＤＣ２０、およびＭＹＢＬ２を含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
表４に示す前記遺伝子の組み合わせのいずれか１つのレベルを決定する、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記定量スコアを、表４に示す前記アルゴリズムのいずれか１つに基づいて算出する、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＴＰＭ２、ＦＡＭ１３ＣおよびＫＬＫ２のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物を以下の遺伝子群：
ａ）間質反応遺伝子群：ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、およびＳＦＲＰ４
ｂ）細胞構成遺伝子群：ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、およびＴＰＭ２；ならびに
ｃ）アンドロゲン遺伝子群：ＦＡＭ１３ＣおよびＫＬＫ２
に割り当て、ａ）〜ｃ）の少なくとも１つのＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定する、項目１または２に記載の方法。
（項目１４）
前記１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを１つ以上のリファランス遺伝子の発現量に対して正規化する、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記臨床転帰が、悪性病理、非器官限局性疾患、高グレード疾患、及び高グレードまたは非器官限局性疾患から選択される、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前立腺癌患者の臨床転帰の尤度を予測する方法であって、
前記患者から採取した癌細胞を含む生物学的サンプルにおいて、１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定するステップであって、ここで、前記１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物が、ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２、ＴＰＭ２、ＡＺＧＰ１、ＫＬＫ２、ＦＡＭ１３Ｃ１、ＳＲＤ５Ａ２、およびＴＰＸ２から選択されるステップ、
前記１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを正規化することにより、前記１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物の正規化発現量を取得するステップ、
前記正規化発現量をリファランス前立腺癌サンプルの遺伝子発現データと比較するステップ、ならびに
前記１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物の正規化発現量に基づいて、前記患者における悪性病理、非器官限局性疾患、高グレード疾患、または高グレードもしくは非器官限局性疾患の１つ以上の尤度を予測するステップ
を含み、ここで、
ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、およびＴＰＸ２の正規化発現量の増加は、悪性病理、非器官限局性疾患、高グレード疾患、または高グレードもしくは非器官限局性疾患の尤度増加と相関しており、
ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２、ＴＰＭ２、ＡＺＧＰ１、ＫＬＫ２、ＦＡＭ１３Ｃ１、およびＳＲＤ５Ａ２の正規化発現量の増加は、悪性病理、非器官限局性疾患、高グレード疾患、または高グレードもしくは非器官限局性疾患の尤度減少と相関している、方法。
（項目１７）
前記１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物を、細胞構成遺伝子群、アンドロゲン遺伝子群、間質反応遺伝子群、および増殖遺伝子群から選択される１つ以上の遺伝子群に割り当てるステップ；
臨床転帰に対するそれらの寄与により、１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを計量することによって、患者についての１つ以上の定量スコアを算出するステップ；ならびに
前記定量スコアに基づいて、前記患者についての、悪性病理、非器官限局性疾患、高グレード疾患、または高グレードもしくは非器官限局性疾患の１つ以上の尤度を予測するステップ
をさらに含み、ここで、
前記定量スコアが、間質反応群スコア、細胞構成群スコア、アンドロゲン群スコア、増殖群スコア、および再発スコアから選択され、
前記間質反応群スコアが、ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、およびＳＦＲＰ４の正規化発現量を含み；前記細胞構成群スコアが、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＴＰＭ２、およびＧＳＴＭ２の正規化発現量を含み；アンドロゲン群スコアが、ＦＡＭ１３Ｃ、ＬＫ２、ＡＺＧＰ１、およびＳＲＤ５Ａ２を含み；増殖群スコアが、ＴＰＸ２の正規化発現量を含み；再発スコアが、間質反応群スコア、細胞構成群スコア、アンドロゲン群スコア、および増殖群スコアを含んでおり；
間質反応群スコア、増殖群スコア、および再発スコアの増加が、悪性病理、非器官限局性疾患、高グレード疾患、または高グレードもしくは非器官限局性疾患の尤度増加と相関し、細胞構成群スコアおよびアンドロゲン群スコアの増加が、悪性病理、非器官限局性疾患、高グレード疾患、または高グレードもしくは非器官限局性疾患の尤度減少と相関している、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記生物学的サンプルが、組織サンプルである、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記組織サンプルが、固定され、パラフィン包埋されているか、または新鮮であるか、または凍結されている、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルを、定量ＲＴ−ＰＣＲにより決定する、項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記発現生成物のレベルを、免疫組織化学またはプロテオミクス技術により決定する、項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
予測をまとめたレポートを作成するステップをさらに含む、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記１つ以上のＲＮＡ転写物、またはその発現生成物の代わりに、表８〜１１に挙げる共発現遺伝子が用いられ得る、項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２、ＴＰＭ２、ＡＺＧＰ１、ＫＬＫ２、ＦＡＭ１３Ｃ１、ＳＲＤ５Ａ２、およびＴＰＸ２の前記ＲＮＡ転写物、またはその発現生成物のレベルを決定する、項目１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】遺伝子同定試験から選択した８１の遺伝子の関連を描いた樹状図である。
【図２Ａ】各患者からの適合サンプルについて正規化した遺伝子発現（Ｃｐ）の比較を示す散乱図であり、ｘ軸は、一次グリソンパターンＲＰサンプル（ＰＧＰ）からの遺伝子発現であり、ｙ軸は、生検（ＢＸ）サンプルからの遺伝子発現である。図２Ａ：全ＥＣＭ（間質反応）遺伝子；図２Ｂ：全流動（細胞構成）遺伝子；図２Ｃ：全増殖遺伝子；図２Ｄ：ＰＳＡ（アンドロゲン）遺伝子；図２Ｅ：これら４つの遺伝子群のいずれにも属さない８１遺伝子リストからの他の遺伝子。
【図２Ｂ】各患者からの適合サンプルについて正規化した遺伝子発現（Ｃｐ）の比較を示す散乱図であり、ｘ軸は、一次グリソンパターンＲＰサンプル（ＰＧＰ）からの遺伝子発現であり、ｙ軸は、生検（ＢＸ）サンプルからの遺伝子発現である。図２Ａ：全ＥＣＭ（間質反応）遺伝子；図２Ｂ：全流動（細胞構成）遺伝子；図２Ｃ：全増殖遺伝子；図２Ｄ：ＰＳＡ（アンドロゲン）遺伝子；図２Ｅ：これら４つの遺伝子群のいずれにも属さない８１遺伝子リストからの他の遺伝子。
【図２Ｃ】各患者からの適合サンプルについて正規化した遺伝子発現（Ｃｐ）の比較を示す散乱図であり、ｘ軸は、一次グリソンパターンＲＰサンプル（ＰＧＰ）からの遺伝子発現であり、ｙ軸は、生検（ＢＸ）サンプルからの遺伝子発現である。図２Ａ：全ＥＣＭ（間質反応）遺伝子；図２Ｂ：全流動（細胞構成）遺伝子；図２Ｃ：全増殖遺伝子；図２Ｄ：ＰＳＡ（アンドロゲン）遺伝子；図２Ｅ：これら４つの遺伝子群のいずれにも属さない８１遺伝子リストからの他の遺伝子。
【図２Ｄ】各患者からの適合サンプルについて正規化した遺伝子発現（Ｃｐ）の比較を示す散乱図であり、ｘ軸は、一次グリソンパターンＲＰサンプル（ＰＧＰ）からの遺伝子発現であり、ｙ軸は、生検（ＢＸ）サンプルからの遺伝子発現である。図２Ａ：全ＥＣＭ（間質反応）遺伝子；図２Ｂ：全流動（細胞構成）遺伝子；図２Ｃ：全増殖遺伝子；図２Ｄ：ＰＳＡ（アンドロゲン）遺伝子；図２Ｅ：これら４つの遺伝子群のいずれにも属さない８１遺伝子リストからの他の遺伝子。
【図２Ｅ】各患者からの適合サンプルについて正規化した遺伝子発現（Ｃｐ）の比較を示す散乱図であり、ｘ軸は、一次グリソンパターンＲＰサンプル（ＰＧＰ）からの遺伝子発現であり、ｙ軸は、生検（ＢＸ）サンプルからの遺伝子発現である。図２Ａ：全ＥＣＭ（間質反応）遺伝子；図２Ｂ：全流動（細胞構成）遺伝子；図２Ｃ：全増殖遺伝子；図２Ｄ：ＰＳＡ（アンドロゲン）遺伝子；図２Ｅ：これら４つの遺伝子群のいずれにも属さない８１遺伝子リストからの他の遺伝子。
【図３Ａ】生検（ＢＸ）およびＰＧＰ  ＲＰサンプルにおける、各遺伝子群内の個々の遺伝子の遺伝子発現の範囲プロットである。図３Ａ：全ＥＣＭ（間質反応）遺伝子；図３Ｂ：全流動（細胞構成）遺伝子；図３Ｃ：全増殖遺伝子；図３Ｄ：遺伝子群のいずれにも属さない８１遺伝子リストからの他の遺伝子。
【図３Ｂ】生検（ＢＸ）およびＰＧＰ  ＲＰサンプルにおける、各遺伝子群内の個々の遺伝子の遺伝子発現の範囲プロットである。図３Ａ：全ＥＣＭ（間質反応）遺伝子；図３Ｂ：全流動（細胞構成）遺伝子；図３Ｃ：全増殖遺伝子；図３Ｄ：遺伝子群のいずれにも属さない８１遺伝子リストからの他の遺伝子。
【図３Ｃ】生検（ＢＸ）およびＰＧＰ  ＲＰサンプルにおける、各遺伝子群内の個々の遺伝子の遺伝子発現の範囲プロットである。図３Ａ：全ＥＣＭ（間質反応）遺伝子；図３Ｂ：全流動（細胞構成）遺伝子；図３Ｃ：全増殖遺伝子；図３Ｄ：遺伝子群のいずれにも属さない８１遺伝子リストからの他の遺伝子。
【図３Ｄ】生検（ＢＸ）およびＰＧＰ  ＲＰサンプルにおける、各遺伝子群内の個々の遺伝子の遺伝子発現の範囲プロットである。図３Ａ：全ＥＣＭ（間質反応）遺伝子；図３Ｂ：全流動（細胞構成）遺伝子；図３Ｃ：全増殖遺伝子；図３Ｄ：遺伝子群のいずれにも属さない８１遺伝子リストからの他の遺伝子。
【図４】共発現遺伝子を同定するのに用いられるクリーク−スタック法の概略図である。
【図５】クリークおよびスタックの例を示す。図５（ａ）は、クリークではないグラフの１例であり；図５（ｂ）は、クリークの１例であり；図５（ｃ）は、クリークの１例であるが、極大クリークではない。
【図６】２つの極大クリーク：１−２−３−４−５および１−２−３−４−６を示すグラフである。
【図７】２つの極大クリークのスタッキングを概略的に示す図である。
【図８】Ｒ２７およびＣＡＰＲＡリスク群が、高グレードまたは非器官限局性疾患からの自由度（ｆｒｅｅｄｏｍ）を予測することを示すグラフである。
【図９】Ｒ２７およびＡＵＡリスク群が、高グレードまたは非器官限局性疾患からの自由度（ｆｒｅｅｄｏｍ）を予測することを示すグラフである。
【図１０】遺伝子同定試験からのＰＴＥＮ低およびＰＴＥＮ正常患者の臨床的再発までの時間を示すグラフである。
【図１１】ＰＴＥＮ低／正常およびＴＭＰＲＳＳ−ＥＲＧ低／正常に層別化した遺伝子同定試験からの患者の臨床的再発までの時間を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
別途定義がない限り、本願明細書に用いられている技術用語および科学用語は、本発明の帰する当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４），ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９２）は、当業者にとって、本出願に用いられている多くの用語に対する一般的指針となる。
【００１６】
当業者であれば、本明細書に記述されている方法および材料と類似もしくは等価で、かつ本発明の実施に使用し得る多くの方法および材料を識別するであろう。事実上、本発明はいかなる場合も、本明細書に記述されている方法および材料に限定されない。以下、本発明の目的に合わせて、以下の用語を定義する。
【００１７】
本明細書で用いられている「腫瘍」および「病変」という用語は、悪性であるか良性であるかに関係なく、全ての腫瘍細胞の成長および増殖、ならびに全ての前癌性／癌性の細胞および組織を意味する。当業者であれば、１種以上の癌細胞、部分的または断片化した細胞、様々な病期の腫瘍、組織学的に正常な外観の周囲組織、および／またはマクロもしくはミクロ解剖された組織等の複数の生物学的要素を、腫瘍組織標本に含み得ることを理解するであろう。
【００１８】
「癌」および「癌性」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖によって特徴づけられる、哺乳類の生理的条件を指し、これを説明するものである。本開示における癌の実施例は、前立腺癌等の尿生殖路癌を包含している。
【００１９】
本明細書において「前立腺癌」という用語は、最も広義に用いられ、前立腺の組織から生じる全ての病期の癌および全ての形態の癌を指す。
【００２０】
癌の病期分類は、疾患がどれくらい進行しているかを評価し、患者の治療を計画する上で医師の助けとなる。病期分類は、身体的検査、血液検査、または放射線療法に対する応答により臨床的に（臨床的病期分類）、および／または根治的前立腺摘除術などの手術に基づき病理学的に（病理学的病期分類）に実施され得る。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ
Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）のＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ（７ｔｈ  Ｅｄ．，２０１０）の腫瘍（ｔｕｍｏｒ）、リンパ節（ｎｏｄｅ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）（ＴＮＭ）病期分類システムによれば、前立腺癌の様々な病期は、腫瘍（Ｔ１：臨床的に不顕性な腫瘍であり、かつ画像診断を介しても触知できないかまたは不可視である。Ｔ１ａ：組織学的に偶然検出された腫瘍で切除組織の５％以下、Ｔ１ｂ：組織学的に偶然検出された腫瘍で切除組織の５％を超える、Ｔ１ｃ：針生検で腫瘍が同定される；Ｔ２：腫瘍が前立腺内に限局している、Ｔ２ａ：腫瘍が１葉の半分以下に及んでいる、Ｔ２ｂ：腫瘍が１葉の半分を越えた域にまで及んでいるが、両葉には及んでいない、Ｔ２ｃ：腫瘍が両葉に及んでいる；Ｔ３：腫瘍が前立腺被膜を通過して進展している、Ｔ３ａ：被膜の外へ拡大（片側であるか両側であるかを問わない）、Ｔ３ｂ：腫瘍が精嚢に浸潤する；Ｔ４：腫瘍が定着しているか、または精嚢以外の隣接する構造（膀胱頚部、外括約筋、直腸、挙筋、もしくは骨盤壁）に侵入する）。一般に、臨床的Ｔ（ｃＴ）期は、Ｔ１またはＴ２であり、病理学的Ｔ（ｐＴ）期はＴ２以上である。リンパ節：Ｎ０：局部リンパ節の転移が存在しない；Ｎｌ：局部リンパ節における転移。転移：Ｍ０：遠隔転移が存在しない；Ｍｌ：遠隔転移が存在する。
【００２１】
グリソン悪性度分類システム（Ｇｌｅａｓｏｎ  Ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用することで、前立腺癌を有する男性の予後の評価に役立つ。他のパラメーターと共に、前立腺癌の病期分類ストラテジーに組み込まれ、予後を予測し、療法を指導する助けになる。前立腺癌は、その顕微鏡的な外観に基づいてグリソン「スコア」または「グレード」が与えられる。グリソンスコアが低い腫瘍は典型的には、その生涯にわたって患者に有意な脅威を引き起こし得ないほど充分に緩徐に生育する。これらの患者は、経時的な監視（「注意深い経過観察（ｗａｔｃｈｆｕｌ  ｗａｉｔｉｎｇ）」もしくは「積極的サーベイランス（Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）」を受ける。グリソンスコアが高い癌は、攻撃性が強く予後が悪化する。これらの患者は一般に手術（例えば、根治的前立腺切除）、および場合によっては療法（例えば、放射線、ホルモン、超音波、化学療法）で治療される。グリソンスコア（もしくは総計）は、２つの最も一般的な腫瘍パターンのグレードを含む。これらのパターンはグリソンパターン１〜５と呼ばれる。パターン１は最も高分化型である。大部分はパターンが混在されている。グリソンスコアまたはグレードを得るには、優性パターンをその次に優性なパターンに加算する。これにより、２〜１０の数値が得られる。グリソングレードとしては、以下が挙げられる。Ｇ１：高分化（軽度異型性）（グリソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）２〜４）
Ｇ２：中分化（中等度異型性）（グリソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）５〜６）
Ｇ３〜４：低分化または未分化（高度異型性）（グリソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）７〜１０）
【００２２】
病期分類：Ｉ期：Ｔｌａ  Ｎ０  Ｍ０  Ｇ１。ＩＩ期：（Ｔ１ａ、Ｎ０、Ｍ０、Ｇ２〜４）または（Ｔ１ｂ、ｃ、Ｔ１、Ｔ２、Ｎ０、Ｍ０、全てのＧ）；ＩＩＩ期：Ｔ３、Ｎ０、Ｍ０、全てのＧ；ＩＶ期：（Ｔ４、Ｎ０、Ｍ０、全てのＧ）または（全てのＴ、Ｎ１、Ｍ０、全てのＧ）または（全てのＴ、全てのＮ、Ｍ１、全てのＧ）。
【００２３】
本明細書において「悪性度進行」という用語は、根治的前立腺摘除術（ｒａｄｉｃａｌ
ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ）（ＲＰ）から決定されたグリソングレードの増加を指す。例えば、悪性度進行は、生検の時点での３＋３または３＋４から、ＲＰの時点での３＋４以上までのグリソングレードの変化を意味する。本明細書で用いる「有意な悪性度進行」または「悪性度進行２」は、生検で決定された３＋３もしくは３＋４から、ＲＰの時点での４＋３以上までのグリソングレードの変化、またはＲＰの時点での精嚢浸潤（ＳＶＩ）もしくは被膜外浸潤（ＥＣＥ）を指す。
【００２４】
本明細書において「高グレード」という用語は、ＲＰの時点での≧３＋４または≧４＋３のグリソンスコアを指す。本明細書において「低悪性度」という用語は、ＲＰの時点での３＋３のグリソンスコアを指す。特定の実施形態では、「高グレード」疾患は、少なくともメジャーパターン４、マイナーパターン５、または第３パターン５のグリソンスコアを指す。
【００２５】
本明細書において「病期進行」という用語は、生検からＲＰ時点での腫瘍病期までの腫瘍病期の増加を指す。例えば、病期進行は、生検時点での臨床Ｔ１またはＴ２病期から、ＰＲ時点での病理Ｔ３病期への変化である。
【００２６】
本明細書において「非器官限局性疾患」という用語は、ＲＰ時点での病理的病期Ｔ３疾患を有する場合を指す。本明細書において「器官限局性」という用語は、ＲＰ時点での病理的病期ｐＴ２を指す。
【００２７】
本明細書において「悪性病理」という用語は、上に定義した通りの高グレード疾患、または上に定義した通りの非器官限局性疾患を指す。特定の実施形態では、「悪性病理」は、≧３＋４または≧４＋３のグリソンスコアまたは病期Ｔ３を有す前立腺癌を指す。
【００２８】
別の実施形態において、「高グレードまたは非器官限局性疾患」という用語は、少なくともメジャーパターン４、マイナーパターン５、もしくは第３パターン５、または病期Ｔ３のグリソンスコアを有する前立腺癌を指す。
【００２９】
本明細書において、「積極的サーベイランス（ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）」および「注意深い経過観察（ｗａｔｃｈｆｕｌ  ｗａｉｔｉｎｇ）」という用語は、症候が現れるかまたは変化するまで一切の治療なしに患者の症状を綿密に監視することを意味する。例えば、前立腺癌の場合、注意深い経過観察（ｗａｔｃｈｆｕｌ  ｗａｉｔｉｎｇ）は通常、他の医療問題および早期疾患を有する高齢の男性に用いられる。
【００３０】
本明細書において、「手術」という用語は、癌組織を除去するために行われる外科的方法（例えば、骨盤のリンパ節切除、根治的前立腺摘除術、経尿道的前立腺切除術（ＴＵＲＰ）、摘出、切開、および腫瘍生検／除去など）に適用される。遺伝子発現解析に使用される腫瘍組織または切片は、これらの方法のいずれかによって採取し得る。
【００３１】
本明細書において、「癌細胞を含む生物学的サンプル」という用語は、癌患者から採取した腫瘍材料を含むサンプルを指す。この用語は、腫瘍組織サンプル、例えば、根治的前立腺摘除術により得られる組織、および例えば、コア生検または微細針生検などの生検により得られる組織を包含する。生物学的サンプルは、新鮮なサンプル、凍結、または固定した、ワックス包埋組織サンプル、例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織サンプルであってよい。生物学的サンプルはまた、癌細胞を含む体液、例えば、血液、血漿、血清、尿なども包含する。これ以外にも、「癌細胞を含む生物学的サンプル」という用語は、原発腫瘍以外の部位から得られる腫瘍細胞、例えば、循環腫瘍細胞を含むサンプルも包含する。この用語は、患者の腫瘍細胞の子孫である細胞、例えば、原発腫瘍細胞または循環腫瘍細胞に由来する細胞培養物サンプルも包含する。この用語は、さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞から放出されるタンパク質または核酸材料、例えば、骨髄、血液、血漿、血清などを含み得るサンプルも包含する。この用語はまた、腫瘍細胞が濃縮されたサンプル、あるいは、その入手後操作されたサンプル、ならびに患者の腫瘍細胞から得られるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含むサンプルも包含する。
【００３２】
予後因子は、癌の自然な経過に関連した変数であり、癌をいったん発症した後の患者の再発速度および転帰に影響を及ぼす。予後の悪化と関連する臨床パラメーターとしては、例えば、腫瘍病期の増分、提示される高ＰＳＡレベル、および高グリソングレードまたはグリソンパターンが挙げられる。予後因子は多くの場合、様々なベースライン再発リスクを基準に患者をサブグループに分類する場合に使用される。
【００３３】
本明細書中で使用されている「予後」という用語は、癌患者が癌に起因し得る死または進行（前立腺癌等の腫瘍性疾患の再発、転移進展、および薬剤抵抗を含む）を有する尤度を指す。例えば、「予後良好」とは再発を伴わない長期生存を包含し、「予後不良」とは癌の再発を包含する。
【００３４】
「肯定的臨床転帰」は、患者に対する利益を示す任意のエンドポイントを用いて評価することができ、このようなエンドポイントとして、限定されないが、以下のものが挙げられる：（１）増殖の減速および完全な停止などの腫瘍細胞のある程度の阻害；（２）腫瘍細胞の数の減少；（３）腫瘍サイズの縮小；（４）隣接する周辺器官および／または組織への腫瘍細胞の浸潤の阻害（すなわち、低減、減速、もしくは完全な停止）；（５）転移の阻害；（６）腫瘍の後退または拒絶などを引き起こし得る抗腫瘍免疫応答の増大；（７）腫瘍に関連する１つ以上の症状のある程度の軽減；（８）治療後の生存期間の増加；および／または（９）治療後の所与の時点での死亡率の減少。肯定的臨床転帰はまた、同等の臨床診断を有する患者の集団の転帰に対する、個体の転帰に関して考慮することもでき、様々なエンドポイント、例えば、無再発期間（ＲＦＩ）の増加、集団の生存期間（全体的な生存率（ＯＳ））または前立腺癌特異的生存期間（前立腺癌特異的生存率（ＰＣＳＳ））の増加、生検から根治的前立腺摘除術までの腫瘍病期もしくはグリソングレードに病期進行または悪性度進行がないこと、根治的前立腺摘除術時点での３＋３グレードおよび器官限局性疾患の存在などを用いて評価することができる。
【００３５】
「リスク分類」という用語は、被験者が特定の否定的臨床転帰を経験するリスクのレベル（あるいは尤度）を基準に、被験者をグループ化することを意味する。本開示の方法（例えば、高、中間、低リスク）に基づいて、被験者をリスクグループに分類するかリスクのレベルで分類し得る。「リスクグループ」は、特定の臨床転帰に関して同程度のリスクレベルを有する被験者、または個々のグループである。
【００３６】
「長期」生存という用語は、特定期間（例えば、少なくとも５年、または少なくとも１０年）の生存を指すために本明細書中に使用されている。
【００３７】
「再発」という用語は、癌の局所再発もしくは遠隔再発（即ち、転移）を指すために、本明細書中に使用されている。例えば、前立腺癌は、前立腺の隣の組織内でまたは精嚢内で局所的に再発する可能性がある。癌はまた、骨盤内の周囲リンパ節またはこの領域の外側のリンパ節に影響を及ぼし得る。前立腺癌は、前立腺の隣の組織（例えば、骨盤筋、骨、もしくは他の器官）に広がり得る。再発は、例えば画像診断検査もしくは生検で検出される臨床的再発を基準に判別するか、あるいは、例えば持続的な経過観察による前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベル≧０．４ｎｇ／ｍＬ、またはＰＳＡレベル上昇の結果としてサルベージ療法の初発変化で検出される生化学的再発を基準に判別することができる。
【００３８】
「臨床的無再発期間（ｃＲＦＩ）」という用語は、本明細書において、手術から最初の臨床的再発まで、または前立腺癌の臨床的再発による死亡までの期間として用いられる。経過観察が、臨床的再発、あるいは他の原発性癌、または臨床的再発に先立つ死亡の発生なしに終了した場合、ｃＲＦＩまでの時間は打ち切られたとみなされるため、これが起きた場合に唯一わかることは、打ち切り時間に達するまで、この被験者に臨床的再発が起こらなかったという情報だけである。ｃＲＦＩの計算を目的とする場合、生化学的再発は無視される。
【００３９】
「生化学的無再発期間（ｂＲＦＩ）」という用語は、本明細書において、手術から前立腺癌の最初の生化学的再発までの期間として用いられる。臨床的再発が、生化学的再発の前に起こったり、経過観察がｂＲＦＩ、あるいは他の原発性癌、または生化学的再発に先立つ死亡の発生なしに終了したりした場合、生化学的再発までの期間は、これらの最初の時点で打ち切られたとみなされる。
【００４０】
「全体的な生存率（ＯＳ）」という用語は、本明細書において、手術から何らかの原因による死亡までの期間を指すために用いられる。被験者が最後の経過観察の時点でまだ生存している場合、生存期間は、最後の経過観察の時点で打ち切られたとみなされる。ＯＳの計算を目的とする場合、生化学的再発および臨床的再発は無視される。
【００４１】
「前立腺癌特異的生存率（ＰＣＳＳ）」という用語は、本発明において、手術から前立腺癌による死亡までの期間を指すために用いられる。経過観察の終了前に患者が前立腺癌で死亡しなかったり、あるいは、他の原因で死亡したりした場合、ＰＣＳＳは、この時点で打ち切られたとみなされる。ＰＣＳＳの計算を目的とする場合、臨床的再発および生化学的再発は無視される。
【００４２】
実際には、上に挙げた事象までの期間の計算は、打ち切られたとみなされる事象の定義に応じて、調査ごとに異なる可能性がある。
【００４３】
本明細書において、「発現量」という用語は、遺伝子に適用された場合、遺伝子産物の正規化レベル（例えば、遺伝子のＲＮＡレベル、または遺伝子のポリペプチドレベルに対して決定された正規化値）を指す。
【００４４】
「遺伝子産物」または「発現生成物」という用語は、本明細書において、ｍＲＮＡを含む遺伝子のＲＮＡ（リボ核酸）転写産物（転写物）、およびそのようなＲＮＡ転写物のポリペプチド翻訳産物を指すために用いられる。遺伝子産物は、例えば、非スプライスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライスバリアントｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、断片化ＲＮＡ、ポリペチド、翻訳後修飾ポリペチド、スプライスバリアントポリペチドなどであり得る。
【００４５】
本明細書において「ＲＮＡ転写物」という用語は、遺伝子のＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、非スプライスＲＮＡ、スプライスバリアントｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、および断片化ＲＮＡを含む）を指す。
【００４６】
特に明記しない限り、本明細書中に使用されている各遺伝子名は、遺伝子に割り当てられた公式シンボルと一致し、これらのシンボルは本出願の出願日時点でＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ）によって提供されている。
【００４７】
「マイクロアレイ」という用語は、ハイブリダイゼーション可能なアレイ要素（例えば、基質上のオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドプローブ）の秩序立った配列を指す。
【００４８】
「ポリヌクレオチド」という用語は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを一般に指し、それらは無修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。したがって、例えば、本明細書中に定義されているポリヌクレオチドは、限定はされないが、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域とを含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖領域と二本鎖領域とを含むＲＮＡ、ならびにＤＮＡとＲＮＡ（一本鎖であり得るかより典型的には二本鎖であり得、かつ一本鎖領域と二本鎖領域とを含む）とを含んでなるハイブリッド分子を包含する。加えて、本明細書において「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。そのような領域内の鎖は、同じ分子からの鎖であるか、異なる分子からの鎖であり得る。領域は１つ以上の分子を全て含んだ領域を包含し得るが、より典型的には分子をいくつか含んだ領域のみを包含する。三重螺旋領域の分子の１つは、多くの場合オリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」という用語は、特異的にｃＤＮＡを包含する。この用語は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、および１つ以上の修飾塩基を含有するＲＮＡを包含する。したがって、安定化または他の理由で主鎖が修正されたＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書中で意図された「ポリヌクレオチド」である。本明細書で定義されている用語「ポリヌクレオチド」内には更に、イノシン等の異例の塩基を有するＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはトリチウム化された塩基等の修飾塩基が含有されている。一般に、「ポリヌクレオチド」という用語は、化学的に、酵素によって、かつ／または代謝的に修飾された無修飾ポリヌクレオチドの全ての形態と、ウイルスおよび細胞（単純型および複雑型細胞を含む）に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態とを包含する。
【００４９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、比較的短いポリヌクレオチドを指し、限定はされないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡｒＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡを包含する。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドは多くの場合、例えば市販のオートメーション化されたオリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用して化学法で合成される。ただし、オリゴヌクレオチドは、細胞および有機体内でのＤＮＡの発現によるインビトロ組み換えＤＮＡ媒介技術を含む他の様々な方法で作製し得る。
【００５０】
本明細書において「ＣＴ」という用語は閾値サイクル（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）を指す。つまり、或る反応中に発生した蛍光が、定義済みの閾値を優に超える時点（例えば、反応中に充分な数の単位複製配列が累積して定義済み閾値と一致した時点）での定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）のサイクル数である。
【００５１】
本明細書において「Ｃｐ」という用語は、「クロッシングポイント（ｃｒｏｓｓｉｎｇ
ｐｏｉｎｔ）」を指す。Ｃｐ値は、ｑＰＣＲ増幅曲線全体の二次導関数およびその最大値を定量化することによって計算される。Ｃｐ値は、蛍光の増加が最高に達し、ＰＣＲの対数期が開始する時点でのサイクルを表す。
【００５２】
「閾値」または「閾値処理（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）」という用語は、遺伝子発現測定値と臨床反応の非線形関係を説明すると共に、レポートされた患者スコアの変動を更に低減するために使用される手順を指す。閾値処理（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）を適用した場合、閾値に満たないか、または閾値を超える測定値はいずれも、その閾値に設定される。遺伝子発現と転帰の非線形関係は、スムーザーまたは三次スプラインを使用し、無再発期間についてはＣｏｘ  ＰＨ回帰を、または悪性病理状態についてはロジスティック回帰を用いて遺伝子発現をモデリングして、調べることができる。Ｄ．Ｃｏｘ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  ３４：１８７−２２０（１９７２）。レポートされた患者スコアの変動は、特定の遺伝子の定量化および／または検出の限界点における遺伝子発現の変動性の関数として調べることができる。
【００５３】
本明細書において「単位複製配列」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応等の増幅技術を使用して合成されたＤＮＡの断片を指す。
【００５４】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」は当業者であれば容易に判別でき、一般的にプローブ長さ、洗浄温度、および塩濃度に応じて経験則に基づき算定される。一般に、プローブが長いほど適切なアニーリングを得るための所要温度は高く、一方、プローブが短いほど所要温度は低い。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖がその融解温度未満の環境に存在する場合に、変性ＤＮＡが相補鎖をリアニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用可能な相対温度が高い。結果として、相対温度が高いほど反応条件のストリンジェンシーが強まる傾向があり、一方、温度が低いほどその傾向が弱まる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）を参照されたい。
【００５５】
本明細書中に定義されている「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェントな条件」は典型的に（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば、５０℃にて０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用し；（２）ハイブリダイゼーション時に４２℃にて７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含有する０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液と共に、ホルムアミド、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドなどの変性剤を使用するか、または（３）４２℃にて５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを使用し、４２℃にて０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド中で洗浄した後、５５℃にてＥＤＴＡ含有の０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェントな洗浄を行う。
【００５６】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９の説明に従って確認でき、上記のハイブリダイゼーション条件に比べて低ストリンジェントな洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の一例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で３７℃にて一晩インキュベートした後、約３７〜５０℃にて１×ＳＳＣ中でフィルタを洗浄する。プローブ長およびこれに類するもの等の因子に適合させるための所要温度、イオン強度等の調整方法は、当業者によって認識されるであろう。
【００５７】
「スプライシング」および「ＲＮＡスプライシング」という用語は、交換可能に用いられており、真核細胞の細胞質内に移動する連続したコード配列を有する成熟ｍＲＮＡを生成するため、イントロンを除去してエクソン同士を連結するＲＮＡプロセッシングを指す。
【００５８】
本明細書において「ＴＭＰＲＳＳ融合」および「ＴＭＰＲＳＳ２融合」は交換可能に使用される用語であり、アンドロゲン駆動ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子と、前立腺癌と有意な関連性があることが実証されたＥＲＧオンコジーンとの融合を指す。Ｓ．Ｐｅｒｎｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｅ  Ａ．４６（７）：７５４−７６０（２００７）；Ｓ．Ａ．Ｎａｒｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９９（６）：８４７−８５１（２００８）。本明細書において、陽性ＴＭＰＲＳＳ融合状態はＴＭＰＲＳＳ融合が組織標本内に存在することを示し、一方、陰性ＴＭＰＲＳＳ融合状態はＴＭＰＲＳＳ融合が組織標本内に存在しないことを示す。当業者であれば、ＴＭＰＲＳＳ融合状態の判定方法には、リアルタイム、定量的ＰＣＲ、または高スループットシークエンシング等、多くの方法があることを認識するであろう。例えば、Ｋ．Ｍｅｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉｓ  ９（３）：２００−２０６（２００７）；Ｃ．Ｍａｈｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ４５８（７２３４）：９７−１０１（２００９）を参照のこと。
【００５９】
「相関」および「関連」という用語は、本明細書中で交換可能に用いられており、２つの測定値の関連（または測定されたエンティティ）を指す。本開示は、遺伝子または遺伝子サブセットを提供するが、それらの発現量は臨床転帰と関連している。例えば、遺伝子の発現量の増加は、良好または肯定的な転帰と正の相関（正の関連性）を示し得る。そのような正の相関は、様々な方法、例えば、１未満の癌の再発ハザード比または１未満の悪性度進行もしくは病期進行オッズ比により、統計学的に実証し得る。別の例では、遺伝子の発現量の増加は、良好または肯定的な臨床転帰と負の相関（負の関連性）を示し得る。その場合、例えば、患者は、癌の再発または癌の悪性度進行／病期進行を経験する可能性があり、これは、様々な方法、例えば、１を超えるハザード比または１を超えるオッズ比により、統計学的に実証し得る。本明細書において「相関」はまた、２つの異なる遺伝子の発現量の関連の強さも指し、このような場合、両者の発現量が高度に相関していれば、所与のアルゴリズムにおいて第１遺伝子の発現量を第２遺伝子の発現量で置換することができる。アルゴリズムにおいて置換が可能な２つの遺伝子のこのような「相関した発現」は、例えば、第１遺伝子の発現増大が、転帰と正の相関を示し（例えば、良好な臨床転帰の尤度増加）、次に、共発現して、第１遺伝子との相関発現を呈示する第２遺伝子も同じ転帰と正の相関を示す場合、通常、互いに正の相関を示す遺伝子発現量である。
【００６０】
本明細書において「共発現する」および「共発現した」という用語は、様々な患者からなる集団全体におけるそれぞれの転写物配列の量の統計的な相関を指す。ペアワイズ共発現（Ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、当該技術分野で公知の様々な方法で、例えば、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関係数またはスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）相関係数を算出することによって計算できる。共発現遺伝子クリークは、本明細書の実施例４に記載する極大クリーク列挙（ＭＣＥ）をシードおよびスタックすることにより同定することもできる。共発現の解析は、正規化された発現データを使用して算定することができる。同じ遺伝サブセット子内の遺伝子も、共発現したとみなされる。
【００６１】
「コンピュータベースのシステム」は、情報解析に使用されるハードウェア、ソフトウェアおよびデータ記憶媒体のシステムを指す。患者のコンピュータベースシステムの最小ハードウェアは、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、データ入力／データ出力用ハードウェア（例えば、ディスプレイ装置）、およびデータ記憶装置を備える。現在利用可能な任意のコンピュータベースのシステムおよび／またはそのコンポーネントが、本開示の方法に関連した使用に好適であることは、当業者であれば容易に認めることができる。データ記憶媒体は、上に記載した本情報を記録する装置を備える製造品、またはそのような製造品にアクセスできる記憶アクセス装置を備える任意の製造品を含み得る。
【００６２】
データ、プログラミング、または他の情報をコンピュータ可読媒体に「記録する」とは、当該技術分野で公知られている任意の方法を使用して情報を保存する工程を指す。保存された情報へのアクセスに用いる手段に応じて、何らかの便利なデータ記憶構造を選択できる。保存に使用できるデータプロセッサプログラムおよびフォーマットには、例えば、文書処理テキストファイル、データベースフォーマット等、様々なものがある。
【００６３】
「プロセッサ」あるいは「コンピューティング手段」とは、それに必要とされる機能を実行する任意のハードウェアおよび／またはソフトウェアの組み合わせを指す。例えば、好適なプロセッサは、電子コントローラ、メインフレーム、サーバ、またはパーソナルコンピュータ（デスクトップ型または携帯型）等の型式で利用可能なプログラム可能なデジタルマイクロプロセッサであり得る。プロセッサがプログラム可能である限り、好適なプログラミングが遠隔位置からプロセッサに伝達できるか、またはコンピュータプログラム製品（携帯型または固定型コンピュータ読み取り可能記憶媒体等、基盤のデバイスが磁気、光学、または固体かを問わない）に予め保存される。磁気媒体または光ディスクは、プログラミングを実行でき、対応する端末で各プロセッサとやり取りする好適な読み取り装置を介して読み取ることが可能である。
【００６４】
アルゴリズムに基づく方法および遺伝子サブセット
本発明は、前立腺癌患者の臨床転帰を予測するためのアルゴリズムに基づく分子診断アッセイを提供する。１つ以上の遺伝子の発現量を単独で用いて、または機能遺伝子サブセットに導入して、定量スコアを算出することができ、このスコアは、臨床転帰の尤度を予測するのに使用することができる。アルゴリズムに基づくアッセイ、および本発明の方法の実施により提供される関連情報は、前立腺癌の最適な治療の意思決定を容易にする。例えば、このような臨床ツールにより、医師は、侵襲性癌を有する尤度が低い、従って、ＲＰの必要がない患者、または侵襲性癌を有する尤度が高い、従って、ＲＰが必要な患者を識別することが可能になる。
【００６５】
本明細書で用いる「定量スコア」は、計算により、または数学的に算出される数値であり、これは、開示される遺伝子または遺伝子サブセットの或る発現量と前立腺癌患者の臨床転帰の尤度との相関などの、より複雑な量的情報の解析を単純化または開示または知る上で役立てることを目的とする。定量スコアは、特定のアルゴリズムの適用によって決定することができる。本明細書に開示する方法で定量スコアを算出するのに用いるアルゴリズムは、遺伝子の発現量の値を分類し得る。遺伝子の分類は、少なくとも部分的に、本明細書で述べる群のように、生理学的機能または構成細胞の特徴に応じた遺伝子の相対的寄与の知識に基づいて実施され得る。定量スコアは、１遺伝子群について決定することもできる（「遺伝子群スコア」）。加えて、群の形成により、定量スコアに対する遺伝子または遺伝子サブセットの様々な発現量の寄与の数学的重み付けも容易にすることができる。生理学的プロセスまたは構成細胞の特徴を表す遺伝子もしくは遺伝子群の重み付けは、癌の病理および臨床転帰（例えば、癌の再発または悪性度進行／病期進行）に対する上記プロセスまたは特徴の寄与を示している。本発明は、例えば、表４に記載するように、定量スコアを算出するためのいくつかのアルゴリズムを提供する。本発明の一実施形態において、定量スコアの増加は、否定的な臨床転帰の尤度増加を示す。
【００６６】
一実施形態において、定量スコアは、「再発スコア」であり、これは、癌再発、癌の悪性度進行もしくは病期進行、悪性病理、非器官限局性疾患、高グレード疾患、および／または高グレードもしくは非器官限局性疾患の尤度を示す。再発スコアの増加は、癌再発、癌の悪性度進行もしくは病期進行、悪性病理、非器官限局性疾患、高グレード疾患、および／または高グレードもしくは非器官限局性疾患の尤度増加と相関している可能性がある。
【００６７】
本発明の遺伝子サブセットは、ＥＣＭ遺伝子群、流動遺伝子群、アンドロゲン遺伝子群、増殖遺伝子群、上皮遺伝子群、およびストレス遺伝子群を含む。
【００６８】
本明細書において「ＥＣＭ遺伝子群」、「間質遺伝子群」および「間質反応遺伝子群」と称する遺伝子サブセットは、交換可能に用いられ、主に間質細胞により合成され、間質反応に関与する遺伝子、およびＥＣＭ遺伝子群の遺伝子と共発現する遺伝子を包含する。「間質細胞」は、本明細書において、結合組織細胞と呼ばれ、こうした細胞は、生物学的組織の支持構造を構成する。間質細胞は、繊維芽細胞、免疫細胞、血管周囲細胞、上皮細胞、および炎症細胞を含む。「間質反応」は、原発性腫瘍または浸潤の部位での宿主組織の間質線維化反応を指す。例えば、Ｅ．Ｒｕｂｉｎ，Ｊ．Ｆａｒｂｅｒ，Ｐａｔｈｌｏｇｙ，９８５−９８６（ｅｎｄ  Ｅｄ．１９９４）を参照。ＥＣＭ遺伝子群は、例えば、ＡＳＰＮ、ＳＦＲＰ４、ＢＧＮ、ＴＨＢＳ２、ＩＮＨＢＡ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＦＮ１、ＦＡＰ、およびＣＯＬ５Ａ２、ならびにその共発現遺伝子を含む。例示的共発現遺伝子としては、表８に示す遺伝子および／または遺伝子クリークがある。
【００６９】
本明細書において「流動遺伝子群」または「流動調節遺伝子群」または「細胞骨格遺伝子群」または「細胞構成遺伝子群」と称する遺伝子サブセットは、交換可能に使用され、アクチンおよび補助タンパク質の動的ミクロフィラメントネットワークの一部であって、細胞に細胞内支持を提供し、細胞運動および細胞分裂のための物理的力を生成すると共に、小胞および細胞小器官の細胞内輸送を促進する遺伝子および共発現遺伝子を含む。流動遺伝子群は、例えば、ＢＩＮ１、ＩＧＦ１、Ｃ７、ＧＳＮ、ＤＥＳ、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＰＭ２、ＶＣＬ、ＦＬＮＣ、ＩＴＧＡ７、ＣＯＬ６Ａ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ２、ＰＡＧＥ４、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＳＲＤ５Ａ２、ＰＲＫＣＡ、ＩＧＦＢＰ６、ＧＰＭ６Ｂ、ＯＬＦＭＬ３、およびＨＬＦ、ならびにその共発現遺伝子を含む。例示的共発現遺伝子および／または遺伝子クリークを表９に示す。
【００７０】
本明細書において「アンドロゲン遺伝子群」、「ＰＳＡ遺伝子群」、および「ＰＳＡ調節遺伝子群」と称する遺伝子サブセットは、交換可能に使用され、セリンプロテアーゼのカリクレインファミリーのメンバー（例えば、カリクレイン３［ＰＳＡ］）、およびアンドロゲン遺伝子群の遺伝子と共発現する遺伝子を含む。アンドロゲン遺伝子群は、例えば、ＦＡＭ１３ＣおよびＫＬＫ２、ならびにその共発現遺伝子を含む。アンドロゲン遺伝子群は、さらにＡＺＧＰ１およびＳＲＤ５Ａ２、ならびにその共発現遺伝子も含み得る。
【００７１】
本明細書において「増殖遺伝子群」および「細胞周期遺伝子群」と称する遺伝子サブセットは、交換可能に使用され、細胞周期機能と関連する遺伝子、および増殖遺伝子群の遺伝子と共発現する遺伝子を含む。本明細書で用いる「細胞周期機能」は、細胞増殖および細胞周期制御、例えば、チェックポイント／Ｇ１〜Ｓ期移行を指す。増殖遺伝子群は、従って、例えば、ＣＤＣ２０、ＴＰＸ２、ＵＢＥ２Ｔ、ＭＹＢＬ２、およびＣＤＫＮ２Ｃ、ならびにその共発現遺伝子を含む。例示的共発現遺伝子および／または遺伝子クリークを表１０に示す。
【００７２】
本明細書において「上皮遺伝子群」および「基底上皮遺伝子群」と称する遺伝子サブセットは、交換可能に使用され、極性上皮の分化の過程で発現され、細胞内構造統合性をもたらすことにより、隣接する上皮細胞との物理的相互作用を促進する遺伝子、および上皮遺伝子群の遺伝子と共発現する遺伝子を含む。上皮遺伝子群は、例えば、ＣＹＰ３Ａ５、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５、ＬＡＭＢ３、およびＳＤＣ１、ならびにその共発現遺伝子を含む。
【００７３】
本明細書において「ストレス遺伝子群」、「ストレス応答遺伝子群」、および「早期応答遺伝子群」と称する遺伝子サブセットは、交換可能に使用され、転写因子であり、細胞ストレスおよびその他の細胞外シグナルに応答して迅速かつ一時的に活性化されるＤＮＡ−結合タンパク質である、遺伝子および共発現遺伝子を含む。これらの因子もまた、多様な遺伝子の転写を調節する。ストレス遺伝子群は、例えば、ＤＵＳＰ１、ＥＧＲ１、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＥＧＲ３、ＧＡＤＤ４５Ｂ、およびＺＦＰ３６、ならびにその共発現遺伝子を含む。例示的共発現遺伝子および／または遺伝子クリークを表１１に示す。
【００７４】
上記遺伝子サブセットの１つ以上と一緒に、他の遺伝子およびその共発現遺伝子の発現量を用いて、前立腺癌患者の臨床転帰の尤度を予測することができる。例えば、開示した遺伝子サブセットのいずれにも属さない図１または表１Ａもしくは表１Ｂに示す８１の遺伝子から選択した１つ以上の遺伝子の発現量を、開示した遺伝子サブセットの１つ以上と一緒に用いてよい。本発明の一実施形態において、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＮＦＡＴ５、ＡＺＧＰ１、ＡＮＰＥＰ、ＩＧＦＢＰ２、ＳＬＣ２２Ａ３、ＥＲＧ、ＡＲ、ＳＲＤ５Ａ２、ＧＳＴＭ１、およびＧＳＴＭ２を、前述した１つ以上の遺伝子サブセットで用いて、臨床転帰の尤度を予測することができる。
【００７５】
本発明はまた、特定の遺伝子についての閾値発現量を決定する方法も提供する。閾値発現量は、特定の遺伝子について計算することができる。或る遺伝子の閾値発現量は、正規化した発現量に基づくものであってよい。一例において、Ｃｐ閾値発現量は、ロジスティック回帰またはＣｏｘ比例ハザード回帰を用いて機能形態を評価することにより、算出することができる。
【００７６】
本発明はさらに、特定のタイプの癌に関連する検証済みバイオマーカーとして、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により同定される特定の遺伝子と共発現する遺伝子を決定する方法も提供する。共発現する遺伝子はそれ自体で有用なバイオマーカーである。共発現遺伝子は、これらが一緒に共発現する遺伝子の代わりに用いられ得る。本方法は、マイクロアレイデータから遺伝子クリークを同定するステップ、マイクロアレイデータを正規化するステップ、アレイプローブについてのペアワイズスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）相関行列を計算するステップ、様々な試験から有意な共発現プローブをフィルタリングにより取得するステップ、グラフを作成するステップ、遺伝子に対しプローブをマッピングするステップ、および遺伝子クリークレポートを作成するステップを含み得る。共発現遺伝子を同定する例示的方法を以下の実施例３に記載し、この方法を用いて同定した共発現遺伝子を表８〜１１に表示する。１つ以上の遺伝子クリークの発現量を用いて、前立腺癌患者が、癌再発の尤度減少などの肯定的な臨床転帰を経験する尤度を算出することができる。
【００７７】
遺伝子群のいずれか１つ以上の組み合わせを本発明の方法で検定することができる。例えば、間質応答遺伝子群を単独で、あるいは、細胞構成遺伝子群、増殖遺伝子群、および／またはアンドロゲン遺伝子群と組み合わせて検定してよい。さらに、各遺伝子群のいくつの遺伝子を検定してもよい。
【００７８】
本発明の特定の実施形態において、前立腺癌患者の臨床転帰を予測する方法は、間質反応遺伝子群、またはその共発現遺伝子からの少なくとも１つの遺伝子と、細胞構成遺伝子群、またはその共発現遺伝子からの少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定するステップを含む。別の実施形態では、間質反応遺伝子群、またはその共発現遺伝子からの少なくとも２つの遺伝子と、細胞構成遺伝子群、またはその共発現遺伝子からの少なくとも２つの遺伝子の発現量を測定する。また別の実施形態では、間質反応遺伝子群および細胞構成遺伝子群の各々から、少なくとも３つの遺伝子の発現量を測定する。さらに別の実施形態では、間質反応遺伝子群および細胞構成遺伝子群の各々から、少なくとも４つの遺伝子の発現量を測定する。別の実施形態では、間質反応遺伝子群および細胞構成遺伝子群の各々から、少なくとも５つの遺伝子の発現量を測定する。さらにまた別の実施形態では、間質反応遺伝子群および細胞構成遺伝子群の各々から、少なくとも６つの遺伝子の発現量を測定する。
【００７９】
別の具体的実施形態では、アンドロゲン遺伝子群、またはその共発現遺伝子からの少なくとも１つの遺伝子の発現量に加えて、間質反応遺伝子群、またはその共発現遺伝子からの少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定してよい。特定の実施形態では、間質反応遺伝子群、またはその共発現遺伝子からの少なくとも３つの遺伝子の発現量と、アンドロゲン遺伝子群からの少なくとも１つの遺伝子、またはその共発現遺伝子の発現量を測定してよい。
【００８０】
さらに別の具体的実施形態では、間質反応遺伝子群、アンドロゲン遺伝子群、および細胞構成遺伝子群、またはそれらの共発現遺伝子の各々から少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定してよい。特定の実施形態では、間質反応遺伝子群からの少なくとも３つの遺伝子、アンドロゲン遺伝子群からの少なくとも１つの遺伝子、および細胞構成遺伝子群からの少なくとも３つの遺伝子の発現量を測定してよい。別の実施形態では、間質反応遺伝子群、アンドロゲン遺伝子群、および増殖遺伝子群の各々、またはそれらの共発現遺伝子から少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定してよい。特定の実施形態では、間質反応遺伝子群からの少なくとも３つの遺伝子、アンドロゲン遺伝子群からの少なくとも１つの遺伝子、および増殖遺伝子群からの少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定してもよい。また、これらの組み合わせのいずれかにおいて、アンドロゲン遺伝子群からの少なくとも２つの遺伝子を測定してもよい。また、これら組み合わせのいずれかにおいて、アンドロゲン遺伝子群からの少なくとも４つの遺伝子を測定してもよい。
【００８１】
さらに別の具体的実施形態では、間質反応遺伝子群、アンドロゲン遺伝子群、細胞構成遺伝子群、および増殖遺伝子群の各々、またはそれらの共発現遺伝子から少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定してよい。特定の実施形態では、間質反応遺伝子群からの少なくとも３つの遺伝子、細胞構成遺伝子群からの少なくとも３つの遺伝子、増殖遺伝子群からの少なくとも１つの遺伝子、およびアンドロゲン遺伝子群からの少なくとも２つの遺伝子の発現量を測定してよい。これら実施形態のいずれかにおいて、アンドロゲン遺伝子群からの少なくとも４つの遺伝子を測定してもよい。
【００８２】
さらに、本明細書に記載の遺伝子サブセットに属さない１つ以上の遺伝子の発現量を本明細書に記載の遺伝子サブセットの組み合わせのいずれかと一緒に測定してもよい。あるいは、遺伝子サブセットに属するいずれかの遺伝子をその遺伝子サブセットから個別に、または別の遺伝子サブセットにおいて解析してもよい。例えば、本明細書に記載した遺伝子サブセットに加えて、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの遺伝子の発現量を測定してもよい。本発明の一実施形態において、追加の遺伝子は、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＮＦＡＴ５、ＡＺＧＰ１、ＡＮＰＥＰ、ＩＧＦＢＰ２、ＳＬＣ２２Ａ３、ＥＲＧ、ＡＲ、ＳＲＤ５Ａ２、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ２から選択する。
【００８３】
特定の実施形態において、本発明の方法は、表４に示す遺伝子および遺伝子サブセットの特定の組み合わせの発現量を測定するステップを含む。さらに別の実施形態では、遺伝子群スコアおよび定量スコアを表４に示すアルゴリズムに従って計算する。
【００８４】
開示した遺伝子の発現量の決定のための様々な技術的手法を本明細書に記載するが、そのような手法として、限定するものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイスループット配列決定、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）およびデジタル遺伝子発現（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＤＧＥ）が挙げられるが、これらについては以下に詳述する。特定の態様では、各遺伝子の発現量を、エクソン、イントロン、タンパク質エピトープおよびタンパク質活性などの遺伝子の発現生成物の様々な特徴に関して決定することができる。
【００８５】
アッセイする発現生成物は、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドであってよい。発現生成物を断片化してもよい。例えば、アッセイでは、発現生成物の標的配列と相補的なプライマーを用いることができるため、完全転写物、さらには標的配列を含む断片化発現生成物も測定することができる。更なる情報を表Ａに記載する。
【００８６】
ＲＮＡ発現生成物は、直接、またはＰＣＲに基づく増幅方法、例えば、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）から得られるｃＤＮＡの検出により、検定することができる（例えば、米国特許第７，５８７，２７９号明細書を参照）。ポリペプチド発現生成物は、プロテオミクス技術により、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて検定してもよい。さらに、マイクロアレイを用いて、ＲＮＡおよびポリペプチド発現生成物の両方をアッセイしてもよい。
【００８７】
遺伝子産物の発現量アッセイ方法
遺伝子発現プロファイリングの方法としては、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション解析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、およびプロテオミクスに基づく方法が挙げられる。サンプル中のＲＮＡの発現を定量化するための例示的方法としては、当該技術分野で公知のノーザンブロット法およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ  ＆  Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７−２８３（１９９９））、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）プロテクションアッセイ（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８５２−８５４（１９９２））、およびＰＣＲに基づく方法、例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３−２６４（１９９２））が挙げられる。配列特異的な二重鎖を認識できる抗体（例えば、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡ−蛋白質二重鎖など）を用いてもよい。配列決定に基づく遺伝子発現解析方法の代表例としては、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）、および大量並行シグネチャー配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析が挙げられる。当該技術分野で公知の方法も使用され得る。
【００８８】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
典型的には、ｍＲＮＡは、試験サンプルから単離される。出発原料は、典型的には、ヒト腫瘍（通常、原発性腫瘍）から単離される総ＲＮＡである。任意選択的に、同じ患者からの正常な組織を内部対照として使用できる。そのような正常な組織は、腫瘍に隣接した組織学的に正常な外観の組織であり得る。ｍＲＮＡは、組織標本から（例えば、新鮮で冷凍された（例えば新鮮凍結）、またはパラフィン包埋（例えばホルマリン固定）サンプルから）抽出されたものであってよい。
【００８９】
ｍＲＮＡ抽出の一般的な方法は当該技術で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）等の分子生物学の標準教科書で開示されている。パラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出する方法は、例えば、Ｒｕｐｐ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｅｒ，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７（１９８７）、およびＤｅ  Ａｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４（１９９５）で開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、精製キット、緩衝液セット、およびＱｉａｇｅｎ等の商業的な製造業者からのプロテアーゼを使用して、そのメーカーの指示に従い実施できる。例えば、培養物内の細胞からの総ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用して単離し得る。他の市販ＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）が挙げられる。組織標本からの総ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離し得る。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離し得る。
【００９０】
次いで、ＲＮＡ含有のサンプルを逆転写にかけ、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成した後、ＰＣＲ反応において指数関数的増幅を行う。最も一般的に使用されている逆転写酵素としては、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）の２つがある。逆転写工程は、典型的には、状況および発現プロファイリングの目標に応じて特定のプライマー、ランダムヘキサマー（ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ）、またはオリゴｄＴプライマーを使用してプライムされる。例えば、抽出されたＲＮＡは、メーカーの指示に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して逆転写できる。続いて、誘導されたｃＤＮＡは以降のＰＣＲ反応で鋳型として使用できる。
【００９１】
ＰＣＲベースの方法では、耐熱ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）を使用する。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは典型的には、ＴａｑポリメラーゼまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用し、そのアンプリコンに結合されているハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、等価な５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素であれば、どのような酵素でも使用できる。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ反応生成物に典型的なアンプリコンを生成する。第３のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、２つのＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーション部位間に位置するアンプリコンのヌクレオチド配列の検出を容易にするように設計し得る。プローブは、レポーター色素等で検出可能に標識でき、更に蛍光染料および失活剤蛍光染料の両方で標識してＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ構成として提供できる。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）を使用した場合、増幅反応中にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型に依存した方法でプローブを開裂する。結果として得られたプローブ断片は溶液中で分離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第２の蛍光体の消光効果を免れる。新しい分子が合成されるたびに、レポーター色素の１分子が遊離される。消光されていないレポーター色素の検出は、データの定量的解釈の基礎となる。
【００９２】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、市販の機器（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ
７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等の高スループットのプラットフォーム）を使用して実施できる。好適な実施形態では、手順をマイクロウェルプレートベースのサイクラープラットフォームであるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）リアルタイムＰＣＲシステム上で実行する。
【００９３】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは一般的に、初めに閾値サイクル（「Ｃｔ」）として表される。蛍光値は全てのサイクルで記録され、増幅反応においてその位置に増幅される生成物の分量を表す。閾値サイクル（Ｃｔ）は、蛍光シグナルが統計的に有意として初めて記録される時点である、と一般的に説明される。代わりに、データをクロッシングポイント（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（「Ｃｐ」）として表すこともできる。Ｃｐ値は、ｑＰＣＲ増幅曲線全体の二次導関数、およびその最大値を定量化することによって計算される。Ｃｐ値は、蛍光の増加が最高に達してＰＣＲの対数期が開始するサイクルを表す。
【００９４】
誤差およびサンプル間の変動の効果を最小限に抑えるため、ＲＴ−ＰＣＲは通常、内部標準を使用して実施される。理想的な内部標準遺伝子（リファレンス遺伝子も呼ばれる）は、同じ起源（即ち、正常組織および癌組織間で有意な相異のないレベル）の癌組織および非癌組織の間で極めて一定のレベルにて表され、実験的処置による有意な影響を受けず（即ち、化学療法に露出された結果として、関連する組織内での発現量における有意差を呈さず）、別々の患者から採取された同じ組織同士の間で極めて一定のレベルで表される。例えば、本明細書中に開示されている方法において有用なリファレンス遺伝子は、癌性前立腺内で、正常前立腺組織と比較して有意に相異する発現量を呈してはならない。正規化に使用される例示的なリファレンス遺伝子は、遺伝子ＡＡＭＰ、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１、およびＰＧＫ１のうちの１つ以上を含んで構成される。遺伝子発現の測定値は、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上）のリファレンス遺伝子の平均を基準に正規化できる。基準により正規化された（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）発現測定値は２から１５までの範囲に及ぶ可能性があり、ここで、１単位の増加は一般に、ＲＮＡ量における２倍の増加を反映する。
【００９５】
リアルタイムＰＣＲは、標的配列ごとの内部競合核酸（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）を正規化に使用する定量的比較ＰＣＲと、サンプル中に含有する正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲ用ハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較ＰＣＲの両方と互換性を持つ。詳細については、例えば、Ｈｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４（１９９６）を参照のこと。
【００９６】
本開示の方法に用いられる代表的なプロトコールのステップでは、固定パラフィン包埋組織をＲＮＡ供給源として使用する。例えば、ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸張および増幅は当該技術分野で利用可能な方法を用いて実施できる（例えば、Ｇｏｄｆｒｅｙ
ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：８４−９１（２０００）；Ｓｐｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９（２００１））を参照のこと。簡潔に言うと、典型的なプロセスでは、初めに、パラフィン包埋腫瘍組織標本の約１０μｍ厚の切片を切断する。その後、ＲＮＡを抽出し、蛋白質およびＤＮＡをＲＮＡ含有のサンプルから除去する。ＲＮＡ濃度を解析した後、遺伝子特異的プライマーを使用してＲＮＡを逆転写し、続いてｃＤＮＡ増幅産物に対してＲＴ−ＰＣＲを行う。
【００９７】
イントロンベースのＰＣＲプライマーおよびプローブの設計
ＰＣＲプライマーおよびプローブは、対象遺伝子のｍＲＮＡ転写物中に存在するエクソンまたはイントロン配列に基づいて設計できる。プライマー／プローブの設計を行う際は、ＤＮＡ  ＢＬＡＴソフトウェア（開発元：Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（４）：６５６−６４（２００２））等の一般公開されているソフトウェア、またはＢＬＡＳＴソフトウェア（そのバリエーションを含む）を使用できる。
【００９８】
必要であるか望ましい場合、標的配列の反復塩基配列は、非特異的シグナルが緩和されるようにマスクし得る。これを遂行するための例示的なツールとしては、反復因子のライブラリに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、内部で反復因子がマスクされる問い合わせ配列を返すためのＲｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラム（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅを介してオンラインで利用可能な）が挙げられる。その後、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＧＢ  ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ  Ｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎ  Ｊ．Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００）Ｐｒｉｍｅｒ３  ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ）等の市販またはそれ以外の一般公開されているプライマー／プローブ設計パッケージいずれかを使用して、マスクしたイントロン配列を使用してプライマーおよびプローブ配列を設計することができる。Ｓ．Ｒｒａｗｅｔｚ，Ｓ．Ｍｉｓｅｎｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３６５−３８６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。
【００９９】
ＰＣＲプライマー設計に影響する可能性のある他の因子としては、プライマーの長さ、融解温度（Ｔｍ）およびＧ／Ｃ含量、特異性、相補プライマー配列、ならびに３’末端配列が挙げられる。一般に、ＰＣＲプライマーは概ね１７〜３０塩基の長さで、約２０〜８０％の含有率（例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基）であり、５０〜８０℃の間（例えば、約５０〜７０℃）の融解温度を呈するものが、最適である。
【０１００】
ＰＣＲプライマーおよびプローブの設計に関するガイドラインの詳細については、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，ＣＷ．ｅｔ  ａｌ，“Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ
ｆｏｒ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ”ｉｎ：ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．１３３−１５５、Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲｓ”ｉｎ：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４，ｐｐ．５−１１、およびＰｌａｓｔｅｒｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．７０：５２０−５２７（１９９７）を参照のこと。それらの開示全体は、本明細書中で引用により明示的に援用されている。
【０１０１】
本明細書に開示されている実施例と関連するプライマー、プローブ、およびアンプリコン配列に関する詳細は、表Ａに記載のとおりである。
【０１０２】
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）システム
ＭａｓｓＡＲＲＡＹベースの方法、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が策定した例示的な方法では、ＲＮＡの単離および逆転写の後、採取されたｃＤＮＡを競合核酸（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）である合成ＤＮＡ分子でスパイクし、単一塩基を除く全ての位置にある標的ｃＤＮＡ領域と照合して、内部標準として作用する。ｃＤＮＡ／競合核酸（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）の混合物は、増幅されたＰＣＲであり、ＰＣＲ後のシュリンプ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素処理を施すことによって、残存ヌクレオチドが脱リン酸化される。アルカリホスファターゼの失活後、競合核酸（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）およびｃＤＮＡからのＰＣＲ産物にプライマー伸張法を行い、それによって、競合核酸（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）およびｃＤＮＡで誘導されたＰＣＲ産物に対して明白なマスシグナルを生成する。精製後、これらの生成物をチップアレイ上に分取し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型質量解析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）解析での解析に必要とされる成分を予め装填する。その後、反応において存在するｃＤＮＡは、生成されたマススペクトルにおけるピーク領域の比率を解析することによって定量化される。詳細については、例えば、Ｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｎｔｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：３０５９−３０６４（２００３）を参照のこと。
【０１０３】
他のＰＣＲベースの方法
本明細書中に開示されている方法に使用できるＰＣＲベースの技術としては、上述のもの以外に、例えば、ＢｅａｄＡｒｒａｙ（登録商標）技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），Ｊｕｎｅ  ２００２、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７２：５６１８（２０００））、遺伝子発現の迅速アッセイ法において市販のＬｕｍｉｎｅｘ１００  ＬａｂＭＡＰ（登録商標）システムおよび複数カラーコードミクロスフィア（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いた遺伝子発現検出用ビーズアレイ法（ＢｅａｄｓＡｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＢＡＤＧＥ））（登録商標））（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：１８８８−１８９８（２００１））、ならびに高カバー率遺伝子発現プロフィール（ｈｉｇｈ  ｃｏｖｅｒａｇｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＨｉＣＥＰ））解析法（Ｆｕｋｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３１（１６）ｅ９４（２００３））が挙げられる。
【０１０４】
マイクロアレイ
関心のある遺伝子またはマイクロアレイの発現量の評価には、マイクロアレイ技術を利用することもできる。この方法では、関心のあるポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）は、基質上に配列される。その後、アレイ配列（ａｒｒａｙｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、特定のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、試験サンプルのＲＮＡから生成された検出可能に標識されたｃＤＮＡと接触される。ＲＴ−ＰＣＲ方法の場合と同様にＲＮＡ供給源は、典型的には、腫瘍サンプルから単離された総ＲＮＡであり、任意選択的には、同じ患者の正常組織から内部標準または細胞系として単離された総ＲＮＡである。ＲＮＡは、例えば、凍結またはアーカイブされたパラフィン包埋、および固定（例えばホルマリン固定）組織標本から抽出できる。
【０１０５】
例えば、アッセイ対象となる遺伝子のｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅済みインサートは、高密度の配列内の基質に適用される。通常、少なくとも１万のヌクレオチド配列が基質に適用される。例えば、マイクロチップ上に１万要素ごとに不動化されたマイクロアレイ遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに好適である。蛍光標識ｃＤＮＡプローブは、関心のある組織から抽出されたＲＮＡの逆転写によって蛍光ヌクレオチドを組み込むことで生成し得る。チップに適用された標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットと特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントな条件下で洗浄して、非特異的に結合しているプローブを取り除いた後、共焦レーザー顕微鏡、または別の検出方法（ＣＣＤカメラ等）でチップをスキャンする。各アレイ済み要素のハイブリダイゼーションを定量化することにより、対応するＲＮＡの存在量の評価が可能になる。
【０１０６】
二色蛍光により、２つのＲＮＡ供給源から生成された別個の標識ｃＤＮＡプローブを、ペアでアレイにハイブリダイズさせる。したがって、各特異的遺伝子に対応する２つの供給源からの転写物の相対存在量が、同時に定量される。ハイブリダイゼーションを小規模化すると、大量の遺伝子の発現パターンを簡便かつ迅速に評価できる。そのような方法は、１細胞あたり２〜３のコピー数で発現される稀少な転写物を検出するだけでなく、発現量において少なくとも約２倍の差を再現的に検出するのにも必要な感度を有することが証明されてきた（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ９３（２）：１０６−１４９（１９９６））。マイクロアレイ解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ（登録商標）技術またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術等の製造業者のプロトコールに従い、市販の機器で実施できる。
【０１０７】
遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）
遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）は、転写産物ごとに個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なしに多数の遺伝子転写物を同時かつ定量的に解析するための方法である。最初に、転写物を一意に同定するのに充分な情報を含む短配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）を生成する。ただし、そのタグは、各転写物内の一意の位置から採取されることを条件とする。その後、配列できる多数の転写物を一括に連結し、長い連続分子を形成して、同時に複数のタグの同一性を暴露する。転写物の任意の母集団の発現パターンは、個々のタグの存在量を定量化し、各タグに対応する遺伝子を同定することによって、定量的に評価し得る。詳細については、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４−４８７（１９９５）、およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８８：２４３−５１（１９９７）を参照のこと。
【０１０８】
核酸配列決定による遺伝子発現解析
核酸配列決定技術は、遺伝子発現解析に好適な方法である。これらの方法の基礎をなすのは、サンプル中にｃＤＮＡ配列が検出される回数が、その配列に対応するＲＮＡの相対的な発現に直接に関連するという原理である。これらの方法は時折、結果として得られたデータの離散的な数値特性を反映する、デジタル遺伝子発現（ＤＧＥ）という用語で呼ばれることもある。この原理が適用されている初期の方法は、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）および大量並行シグネチャー配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）であった。例えば、Ｓ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８（６）：６３０−６３４（２０００）を参照のこと。最近では、「次世代の」配列決定技術の出現によって、ＤＧＥが単純化され、スループットが向上し、しかも入手しやすくなった。その結果、ＤＧＥを利用することによって、これまでよりも多くの個々の患者サンプルにおいて従来可能であったよりも多くの遺伝子の発現をスクリーニングできるようになったラボが増加つつある。例えば、Ｊ．Ｍａｒｉｏｎｉ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８（９）：１５０９−１５１７（２００８）；Ｒ．Ｍｏｒｉｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８（４）：６１０−６２１（２００８）；Ａ．Ｍｏｒｔａｚａｖｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５（７）：６２１−６２８（２００８）；Ｎ．Ｃｌｏｏｎａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５（７）：６１３−６１９（２００８）を参照のこと。
【０１０９】
体液からのＲＮＡの単離
発現解析用にＲＮＡを血液、血漿および血清から（例えば、Ｋ．Ｅｎｄｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４８，１６４７−５３（２００２）および同書中の引用文献を参照）、更には尿から（例えば、Ｒ．Ｂｏｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，４９５−５０３（１９９０）および同書中の引用文献を参照）単離する方法が記載されている。
【０１１０】
免疫組織化学
免疫組織化学方法はまた、遺伝子の発現量の検出に好適であり、本明細書中に開示されている方法に対する適用されている。そのような方法においては、関心のある遺伝子の遺伝子産物と特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を使用できる。例えば、放射性ラベル、蛍光ラベル、ビオチン等のハプテンのラベル、またはワサビ由来ペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ等の酵素で抗体自体を直接標識することによって、抗体を検出し得る。あるいは、未標識の一次抗体を、一次抗体に特異的な標識二次抗体と共に使用することもできる。免疫組織化学プロトコールおよびキットは当該技術分野において周知であり、市販されている。
【０１１１】
プロテオミクス
「プロテオーム」という用語は、或る時点でサンプル（例えば組織、有機体または細胞培養液）中に存在する蛋白質の総量として定義される。プロテオミクスは、とりわけ、サンプルの蛋白質発現の全体的な変更の研究を包含する（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）。プロテオミクスは典型的には、（１）二次元ゲル電気泳動（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）でサンプル中の個々の蛋白質を分離する工程と、（２）ゲルから回収された個々の蛋白質を同定する工程（例えばマイマススペクトロメトリーまたはＮ末端配列決定）と、（３）バイオインフォマティクスを使用してデータを解析する工程を含む。
【０１１２】
ｍＲＮＡの単離、精製および増幅の概説
固定パラフィン包埋組織をＲＮＡ供給源として使用した遺伝子発現プロファイリングの代表的プロトコールの工程（ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長および増幅を含む）は、様々な発行ジャーナル記事に提供されている（例えば、Ｔ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：８４−９１（２０００）；Ｋ．Ｓｐｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９（２００１），Ｍ．Ｃｒｏｎｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６４：３５−４２（２００４）を参照）。代表的な方法では、まず組織標本部（例えば、パラフィン包埋腫瘍組織標本の約１０μｍ厚の断片）を切断する。次いで、ＲＮＡを抽出し、蛋白質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の解析の後、必要に応じてＲＮＡ修復を実行する。続いて、例えば、遺伝子特異的プロモーターを使用した逆転写によってサンプルを解析にかけた後、ＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。
【０１１３】
遺伝子の同定における発現量の統計解析
当業者であれば、本明細書中に記述されているように、関心のある臨床転帰（例えば、再発）とマーカー遺伝子の発現量との間に有意な関係があるかどうかの判定に用いることができる統計的方法が数多くあることは認識されよう。例示的な実施例において、本発明は３つの試験を含む。第１の試験は、前立腺癌患者からの組織およびデータを用いた、層化コホートサンプリングデザイン（ケースコントロールサンプリングの形態）である。標本の選択は、病期Ｔ期（Ｔ１、Ｔ２）、手術年度（＜１９９３、≧１９９３）、および前立腺切除グリソンスコア（低／中、高）によって層化した。臨床的再発を有する全ての患者を選択し、臨床的再発を経験しなかった患者の層化ランダムサンプルを選択した。患者ごとに、２つまでの濃縮された腫瘍標本、および１つの正常な外観の組織サンプルを検定した。第２の試験では、第１試験から、適合前立腺生検腫瘍組織が検定された７０人の患者のサブセットを用いた。第３の試験は、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ（ＣＣ）で１９９９〜２０１０年にその前立腺癌の手術を受けた者で、低または中間リスク（ＡＵＡによる）の臨床的な限局性前立腺癌を有する全ての患者（評価可能な１７０人）を含むが、これらの患者は、積極的サーベイランスの妥当な候補であったかもしれないが、生検による前立腺癌の診断から６ヵ月以内にＣＣでＲＰを受けた者である。これらの患者からの生検腫瘍組織を検定した。
【０１１４】
全ての仮説試験が、両側ｐ値を使用してレポートされた。転帰（例えば、臨床的無再発期間（ｃＲＦＩ）、生化学無再発期間（ｂＲＦＩ）、前立腺癌特異的生存率（ＰＣＳＳ）、全体的生存率（ＯＳ））と、個々の遺伝子との間に有意な関係があるかどうか、ならびに人口統計的または臨床的共変量を調査する目的で、重み付き擬似最偏尤推定量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏ  ｐａｒｔｉａｌ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｅｓｔｉｍａｔｏｒ）を用いたＣｏｘ比例ハザード（ＰＨ）モデルを使用し、危険率（ＨＲ）が１であるという帰無仮説のウォールド試験から得られるｐ値を記録する。個々の遺伝子と特定のサンプルのグリソンパターンとの間に有意な関係があるかどうかを調査する目的で、重み付き擬似最尤法（ｍａｘｉｍｕｍ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いた序数ロジスティック回帰（ｏｒｄｉｎａｌ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）モデルを使用し、オッズ比（ＯＲ）が１であるという帰無仮説のウォールド試験から得られるｐ値を記録する。個々の遺伝子と、ＲＰ時の悪性度進行および／もしくは病期進行または悪性病理との間に有意な関係があるかどうかを調査する目的で、重み付き擬似最尤法（ｍａｘｉｍｕｍ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いたロジスティック回帰（ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）モデルを使用し、オッズ比（ＯＲ）が１であるという帰無仮説のウォールド試験から得られるｐ値を記録する。
【０１１５】
同時発現解析
例示的な実施例において、調査対象となった前立腺癌標本の間での遺伝子発現量の共同相関を評価することもできる。この目的のために、遺伝子および標本の間の相関構造を、階層的クラスター方法を介して調査することもできる。この情報を用いることによって、前立腺癌標本内で高度な相関を示すことが公知である遺伝子同士が、予期したように群生することを確認し得る。一変量Ｃｏｘ  ＰＨ回帰分析におけるｃＲＦＩと名目上有意な（未調整のｐ＜０．０５）関係を示す遺伝子だけが、これらの解析の対象として含まれる。
【０１１６】
現在公知であるかまたは以後に策定される共発現解析方法の多くは、本発明の範囲および趣旨の範囲内に入るであろう。これらの方法は、例えば、相関係数、共発現ネットワーク分析、クリーク分析等を含むものであってもよいし、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、塩基配列決定、および他の類似技術から得られる発現データに基づくものであってもよい。例えば、遺伝子発現クラスターは、相関のペアワイズ解析を使用し、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関係数またはスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）相関係数に基づいて同定し得る（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｋ．ａｎｄ  Ｌｅｅ  Ａ．，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ  ２，３５７（１９０２）；Ｃ．Ｓｐｅａｒｍａｎ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｌ  １５：７２−１０１（１９０４）；Ｊ．Ｍｙｅｒｓ，Ａ．Ｗｅｌｌ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｐ．５０８（２ｎｄ  Ｅｄ．，２００３）を参照）。共発現遺伝子を同定する例示的方法を以下の実施例３に記載する。
【０１１７】
発現量の正規化
本明細書中に開示されている方法に用いられる発現データは、正規化することが可能である。正規化とは、例えば、アッセイされたＲＮＡの量の差、および使用されるＲＮＡの質の変動性を修正（変動性を排除して正規化）して、ＣＴまたはＣｐ測定値、およびこれらに類するものにおける系統的バリエーションの不要ソースを除去する工程を指す。アーカイブされた固定パラフィン包埋組織標本を含むＲＴ−ＰＣＲ実験に関して、系統的バリエーションのソースは、患者サンプルの時間経過、およびサンプルの貯蔵に使用される定着剤の種類を基準としたＲＮＡ分解の程度を包含したものであることは公知である。系統的バリエーションの他のソースは、ラボの処理条件に起因する。
【０１１８】
アッセイは、関連する条件の下で発現量に有意な差がない特定の正規化遺伝子の発現を組み込むことにより、正規化を達成することができる。本明細書に開示する例示的な正規化遺伝子としては、ハウスキーピング遺伝子が挙げられる（例えば、Ｅ．Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９（７）：３６２−３６５（２００３）を参照）。正規化は、アッセイされた全ての遺伝子の平均値もしくはメジアンシグナル（ＣｔまたはＣｐ）、またはその大規模サブセット（全体的な正規化手法）に基づいて行うことができる。一般に、リファレンス遺伝子とも呼ばれる正規化遺伝子は、典型的に、前立腺癌において、非癌性前立腺組織と比較して有意に異なる発現量を呈示せず、しかも様々なサンプルおよび処理条件で再現性のあることがわかっている遺伝子であるため、外的影響を受けずに正規化を達成することができる。
【０１１９】
例示的な実施態様において、ｍＲＮＡ発現データを正規化するための基準として、次の遺伝子の１つ以上を用いる：ＡＡＭＰ、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１。予後遺伝子および予測的遺伝子の各々についての較正済み加重平均ＣＴまたはＣｐ測定値は、５つ以上のリファレンス遺伝子の平均値を基準にして正規化することができる。
【０１２０】
当業者であれば、正規化が多数の方法で達成されることは認識されよう。従って、上述の技術は網羅的なものではなく、単なる例示を意図したものである。
【０１２１】
発現量の標準化
本明細書に開示する方法に用いられる発現データは、標準化することが可能である。標準化は、全ての遺伝子を同等のスケールに有効に変換する方法を指す。この標準化を行う理由は、一部の遺伝子が他に比べて多くの変動を示す（発現がより広範である）ためである。標準化は、その遺伝子の全てのサンプルにおける各発現値をその標準偏差で除算することによって行う。その場合、ハザード比は、発現における１標準偏差増分当たりの臨床エンドポイント（臨床的再発、生物学的再発、前立腺癌による死亡、または何らかの原因による死亡）についてのハザードの比例変動として解釈される。
【０１２２】
本発明のキット
本発明の方法に使用される材料は、周知の手順に従って製作されたキットの調製に好適である。したがって、本開示は、開示されている遺伝子の発現を定量化し、予後の転帰または治療に対する反応を予測するために、遺伝子特異的プローブ、遺伝子選択プローブおよび／またはプライマーを含有し得る薬剤を含むキットを提供する。そのようなキットは、任意選択的に、腫瘍サンプルからＲＮＡを抽出するための試薬（特に、固定パラフィン包埋組織標本および／またはＲＮＡ増幅用試薬）を含んでもよい。加えて、本キットは、任意選択的に、識別用の記載もしくはラベル付きの試薬、または本発明の方法における使用に関する指示を含んでもよい。キットは容器（本方法の自動化実装での使用に好適なマイクロリットルプレートを含む）を備えてもよく、本方法で利用される各種材料または試薬（典型的には、濃縮形態）のうちの１種以上、例えば、クロマトグラフィーカラム、事前作製済み（ｐｒｅ−ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）マイクロアレイ、緩衝液、適当なヌクレオチド三リン酸塩（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに本発明のプローブおよびプライマー（例えば、適当な長さのポリ（Ｔ）、またはＲＮＡポリメラーゼと反応するプロモーターに連結されているランダムプライマー）のうちの１つ以上が、各容器に付属する。予後情報または予測的情報の推定または定量化に使用される数学的アルゴリズムもまた、適切にキットの構成要素となり得る。
【０１２３】
レポート
商業的な診断目的に実施された場合は通常、レポート、即ち、本明細書に記載されている方法で得られる情報のサマリーを生成する。例えば、レポートは、１つ以上の遺伝子の発現量に関する情報、腫瘍もしくは患者の再発リスクの分類、患者に起こり得る予後またはリスク分類、臨床因子および病理学的因子、および／または他の情報を含み得る。本発明の方法およびレポートは、レポートをデータベースに保管する工程を更に含み得る。本方法は、被験者のデータベースに記録を作成し、その記録にデータを取り込むことができる。レポートは、紙レポート、聴覚レポート、または電子記録であり得る。レポートは表示および／またはコンピュータ（例えば、ハンドヘルドデバイス、デスクトップコンピュータ、スマートデバイス、ウェブサイトなど）への保存が可能である。レポートを医師および／または患者に提供するように企図されている。レポートの受信は、データおよびレポートを含むサーバコンピュータへのネットワーク接続を確立する工程と、サーバコンピュータからデータおよびレポートを要求する工程と、を更に含み得る。
【０１２４】
コンピュータプログラム
上述の分析で得られた値（例えば、発現データ）は計算して手動で保存することができる。代わりに上記のステップは、コンピュータプログラム製品で完全にまたは部分的に実行できる。したがって、本発明は、コンピュータプログラムを保管した記憶媒体（コンピュータによる読み取りが可能）を備えるコンピュータプログラム製品を提供する。プログラムは、コンピュータでの読み取り時に、個体から採取された１つ以上の生体サンプルの分析により得られた値に基づいて、関連する計算を実行できる（例えば、遺伝子の発現量、正規化、標準化、閾値処理（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）および分析で得られた値からスコアへの変換、および／または腫瘍病期および関連情報のテキストもしくはグラフィック描写への変換）。コンピュータプログラム製品の内部には、計算を実行するためのコンピュータプログラムが保存されている。
【０１２５】
本開示は、上述のプログラムを実行するためのシステムを提供する。本システムは通常、ａ）中央コンピューティング環境と、ｂ）患者データを受信するコンピューティング環境に作動可能に接続されている入力装置（ここで、患者データが、例えば、発現量、もしくは患者から採取された生物学的サンプルを使用した分析から得られた他の値、または上に詳述されているマイクロアレイデータを含み得る）と、ｃ）情報をユーザー（例えば、医療関係者）に提供するコンピューティング環境に作動可能に接続されている出力装置と、ｄ）中央コンピューティング環境（例えば、プロセッサ）を介して実行されるアルゴリズム（ここで、アルゴリズムは入力装置で受信されるデータに基づいて実行され、かつアルゴリズムは発現スコア、閾値処理（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）または本明細書に記載されている他の関数の計算を行う）と、を備える。本発明により提供される方法は、全面的または部分的に自動化し得る。
【０１２６】
本発明について説明してきたが、本発明は、下記の実施例を参照することによってさらに容易に理解されるであろう。下記の実施例は、いかなる形であれ発明を限定することを意図するものでなく、例示として提供されている。
【実施例】
【０１２７】
実施例１：アルゴリズム開発のための８１の遺伝子の選択
臨床的再発、生物学的再発および／または前立腺癌による死亡に関連する遺伝子を同定するための遺伝子同定試験については、２０１０年７月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，２１７号明細書；２０１０年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第第６１／４１４，３１０号明細書；および２０１１年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／４８５，５３６号明細書；ならびに２０１１年７月２５日に出願され、２０１２年２月２日に公開された米国特許第２０１２００２８２６４号明細書に記載されている（これらは全て、参照として本明細書に組み込む）。ＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて、根治的前立腺切除の治療を受けた早期前立腺癌の患者における前立腺癌組織およびその周囲の正常に見える組織（ＮＡＴ）での７３２個の遺伝子およびリファレンス遺伝子のＲＮＡ発現量を定量した。臨床的無再発期間（ｃＲＦＩ）、生物的無再発期間（ｂＲＦＩ）、前立腺癌特異的生存（ＰＣＳＳ）、および悪性度進行／病期進行に有意に関連する遺伝子（ｐ＜０．０５）を決定した。
【０１２８】
転帰に関連するものとして同定された遺伝子から、続くアルゴリズムの開発のために８１の遺伝子を選択した。８１の遺伝子（および５つのリファレンス遺伝子）のプライマー、プローブ、およびアンプリコン配列を表Ａに記載する。選択した遺伝子は、中でもｃＲＦＩおよびその他の特性に関して最も予後徴候を示したものであり、表１Ａ〜１Ｂに示す。考慮したその他の特性は、以下のものであった：１）一次グリソンパターン腫瘍での遺伝子発現およびｃＲＦＩの関連についての平均補正標準化ハザード比への回帰に関して最も強い遺伝子；２）最も高いグリソンパターン腫瘍を用いたｃＲＦＩと関連する一致性（ハザード比）；３）前立腺癌特異的生存（ＰＣＳＳ）との関連性；４）Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｒｉｓｋ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＣＡＰＲＡ）（Ｃｏｏｐｅｒｂｅｒｇ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１７３：１９８３−１９４２、２００５）の調整後の高いハザード比；５）腫瘍の遺伝子発現および手術によるグリソンパターンの関連について統計的に有意なオッズ比；６）大きな全体的変動性（患者内変動性より、患者間変動性が大きい方が好ましい）；および７）高い発現度。
【０１２９】
真の発見率関連度（ＴＤＲＤＡ）方法（Ｃｒａｇｅｒ，Ｓｔａｔ  Ｍｅｄｉ．２０１０年１月１５日；２９（１）：３３−４５）を遺伝子発現およびｃＲＦＩの解析に用い、結果を表１Ａに示す。真の発見率関連度は、偽発見率の相対物である。Ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ  Ｃｏｘ  ＰＨ回帰モデルをあてはめ、ＴＤＲＤＡを用いて、平均への回帰（ＲＭ）についての標準化ハザード比の推定値を修正し、少なくとも指定レベルの絶対標準化ハザード比を有する遺伝子を同定するための偽発見率を評価した。偽発見率を１０％に制御した。ＴＤＲＤＡ法によって、指定した比率が、指定レベル以上の絶対関連（ここでは、絶対標準化ハザード比）を有すると予想される遺伝子の集合を同定する。これにより、遺伝子等級付け方法がもたらされるが、この方法は、各遺伝子がＴＤＲＤＡ集合に属する、最大下限（ＭＬＢ）度の関連を用いる。平均への回帰による「選択偏向」についての近似修正を含む各遺伝子の実際の関連度の推定値は、単純な２変量正規理論とＥｆｒｏｎおよびＴｉｂｓｈｉｒａｎｉの経験ベイズ法を用いて導き出すことができる。Ｅｆｒｏｎ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２：１９７−２２３（２００８）；Ｅｆｒｏｎ  ａｎｄ  Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ２３：７０−８６。表１Ａは、一次グリソンパターン（ＰＧＰ）または最高グリソンパターン（ＨＧＰ）サンプル遺伝子発現のいずれかを用いた各遺伝子についての標準化ハザード比のＲＭ修正推定値およびＭＬＢを示す。−１の関連方向の付いた遺伝子は、臨床的再発の尤度低減に関連し、１の関連方向の付いた遺伝子は、臨床的再発の尤度増加に関連する。
【０１３０】
患者への影響をランダムとして扱う混合モデルを用いて、患者内および患者間変量成分を推定した。正規化遺伝子発現の全体的平均および標準偏差ならびに患者内および患者間変量成分を表１Ａに示す。
【０１３１】
重み付き擬似最偏尤推定量を用いた１変量Ｃｏｘ  ＰＨ回帰を使用して、遺伝子発現と前立腺癌特異的生存（ＰＣＳＳ）との関連を推定した。ＳｔｏｒｅｙのＦＤＲ方法を用いた標準化ハザード比（ＨＲ）、ｐ値およびｑ値を表１Ｂに記載する。Ｓｔｏｒｅｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  ６４：４７９−４９８（２００２）。ｑ値は、同定された遺伝子が偽発見であるというデータが与えられれば、経験的ベイズ事後確率、すなわち、臨床的再発との関連が一切ない確率として解釈することができる。
【０１３２】
１変量順序ロジスティック回帰モデルを用いて、遺伝子発現と、一次グリソンパターン腫瘍のグリソンパターンとの関連を推定した（３、４、５）。ＳｔｏｒｅｙのＦＤＲ方法を用いた標準化オッズ比（ＯＲ）、ｐ値およびｑ値を表１Ｂに記載する。
【０１３３】
図１は、８１の遺伝子の関連を表す樹状図の一例を示す。ｙ軸は、１−ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）ｒとして測定したクラスター間の平均距離に一致する。数（距離測定値）が小さければ小さいほど、遺伝子同士が高度に相関している。合併方法は、重み付きペア群平均法である。共発現した遺伝子を樹状図から同定したが、これらを遺伝子群に分類する。図１に基づき、遺伝子同定試験からの遺伝子を下記の遺伝子群またはサブセットに形成した。
【０１３４】
細胞構成遺伝子群（ＢＩＮ１；ＩＧＦ１；Ｃ７；ＧＳＮ；ＤＥＳ；ＴＧＦＢ１Ｉ１；ＴＰＭ２；ＶＣＬ；ＦＬＮＣ；ＩＴＧＡ７；ＣＯＬ６Ａ１；ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ；ＧＳＴＭ１；ＧＳＴＭ２；ＰＡＧＥ４；ＰＰＡＰ２Ｂ；ＳＲＤ５Ａ２；ＰＲＫＣＡ；ＩＧＦＢＰ６；ＧＰＭ６Ｂ；ＯＬＦＭＬ３；ＨＬＦ）
【０１３５】
基底上皮遺伝子群（ＣＹＰ３Ａ５；ＫＲＴ１５；ＫＲＴ５；ＬＡＭＢ３；ＳＤＣ１）
【０１３６】
ストレス応答遺伝子群（ＤＵＳＰ１；ＥＧＲ１；ＦＯＳ；ＪＵＮ；ＥＧＲ３；ＧＡＤＤ４５Ｂ；ＺＦＰ３６）
【０１３７】
アンドロゲン遺伝子群（ＦＡＭ１３Ｃ；ＫＬＫ２；ＡＺＧＰ１；ＳＲＤ５Ａ２）
【０１３８】
間質遺伝子群（ＡＳＰＮ；ＳＦＲＰ４；ＢＧＮ；ＴＨＢＳ２；ＩＮＨＢＡ；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＬ３Ａ１；ＣＯＬ１Ａ２；ＳＰＡＲＣ；ＣＯＬ８Ａ１；ＣＯＬ４Ａ１；ＦＮ１；ＦＡＰ；ＣＯＬ５Ａ２）
【０１３９】
増殖遺伝子群（ＣＤＣ２０；ＴＰＸ２；ＵＢＥ２Ｔ；ＭＹＢＬ２；ＣＤＫＮ２Ｃ）
【０１４０】
【表１】
2019013255.tif 000002
【０１４１】
【表２】
2019013255.tif 000003
【０１４２】
【表３】
2019013255.tif 000004
【０１４３】
【表４】
2019013255.tif 000005
【０１４４】
【表５】
2019013255.tif 000006
【０１４５】
【表６】
2019013255.tif 000007
【０１４６】
【表７】
2019013255.tif 000008
【０１４７】
【表８】
2019013255.tif 000009
【０１４８】
実施例２：コンパニオン試験からのデータに基づくアルゴリズムの開発
Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ（「ＣＣ」）コンパニオン試験は、表２に記載するように、３つの患者コホートおよび各コホートについての個別の解析からなる。第１コホート（表２）は、１９８７年〜２００４年の間にＣＣでＲＰを受け、かつ診断生検組織がＣＣで入手可能であった、遺伝子ＩＤ試験０９−００２からの低〜高リスク（ＡＵＡ基準に基づく）を有する男性を含む。コホート２および３は、それぞれ、臨床的に決定された低および中間リスク（ＡＵＡ基準に基づく）前立腺癌を有する男性を含み、彼らは、積極的サーベイランスの妥当な候補であり得たが、生検による前立腺癌の診断から６ヵ月以内に根治的前立腺摘除（ＲＰ）を受けた者である。コホート１の主な目的は、生検組織からの分子プロフィールを根治的前立腺摘除組織からのものと比較することであった。コホート２および３の主な目的は、診断時点の低〜中間リスク患者における生検組織を用いて、ＲＰ時点の悪性度進行／病期進行の複数遺伝子予測法を開発することであった。
【０１４９】
遺伝子同定試験からの患者のサブセット（患者７０人）について、適合生検サンプルを採取した。８１の選択した遺伝子と５つのリファレンス遺伝子（ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１、ＰＧＫ１）の遺伝子発現をＲＰ標本と、これら７０人の患者から採取した生検組織において比較した。
【０１５０】
悪性度進行および病期進行との関連について、８１の遺伝子をコホート２および３で評価した。コホート２および３におけるこれら８１の遺伝子と悪性度進行および病期進行との関連を表３に示す。Ｐ値および標準化オッズ比を記載する。
【０１５１】
これに関して、「悪性度進行」は、グリソングレードが生検時点での３＋３または３＋４から、ＲＰの時点での３＋４以上になるまでの増加を指す。「悪性度進行２」は、グリソングレードが生検の時点での３＋３または３＋４から、ＲＰの時点での４＋３以上になるまでの増加を指す。
【０１５２】
【表９】
2019013255.tif 000010
【０１５３】
複数の異なるモデルを調査して、ＲＰと生検標本の発現を比較した。ＲＰと生検標本の発現の一致性に基づいて、遺伝子を選択した。図２Ａ〜２Ｅは、各患者からの適合サンプルについての正規化遺伝子発現（Ｃｐ）の比較を示す散布図であり、ｘ軸はＰＧＰ  ＲＰサンプル（ＰＧＰ）からの正規化遺伝子発現であり、また、ｙ軸は、生検サンプル（ＢＸ）からの正規化遺伝子発現である。図３Ａ〜３Ｄは、生検（ＢＸ）およびＰＧＰ  ＲＰサンプルにおける各遺伝子群内の個々の遺伝子の遺伝子発現の範囲プロットを示す。
【０１５４】
生検およびＲＰサンプルにおける遺伝子発現の一致を評価した後、表４に示す以下のアルゴリズム（ＲＳモデル）を開発したが、ここで、重みは、標準化ではなく、正規化データを用いて決定する。細胞構成遺伝子群に属するＳＲＤ５Ａ２およびＧＳＴＭ２などのいくつかの遺伝子も個別に評価し、独立の係数を割り当てた（表４の「その他の」カテゴリーを参照）。別の例において、ＧＳＴＭ１およびＧＳＴＭ２を酸化「ストレス」群として分類し、係数をこの「ストレス」群に割り当てた（ＲＳ２０およびＲＳ２２モデルを参照）。遺伝子群のいずれにも属さないＡＺＧＰ１およびＳＬＣ２２Ａ３などのその他の遺伝子も特定のアルゴリズムに含ませた（例えば、表４の「その他の」カテゴリーを参照）。さらに、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１、およびＳＲＤ５Ａ２を含むように、アンドロゲン遺伝子群を確立した。ＢＧＮ、ＳＰＡＲＣ、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＴＰＸ２およびＳＲＤ５Ａ２などのいくつかの遺伝子は、モデルにおいて評価する前に閾値処理した。例えば、ＴＰＸ２の場合、４．５に満たない正規化発現値は、４．５に設定し、ＳＲＤ５Ａ２の場合、５．５に満たない正規化発現値は、５．５に設定した。
【０１５５】
【表１０】
2019013255.tif 000011
【０１５６】
【表１１】
2019013255.tif 000012
【０１５７】
【表１２】
2019013255.tif 000013
【０１５８】
【表１３】
2019013255.tif 000014
【０１５９】
【表１４】
2019013255.tif 000015
【０１６０】
【表１５】
2019013255.tif 000016
【０１６１】
【表１６】
2019013255.tif 000017
【０１６２】
【表１７】
2019013255.tif 000018
【０１６３】
表５Ａは、ｃＲまでの時間について、悪性度進行および病期進行ならびに有意な悪性度進行および病期進行の組み合わせについて、実施例１に記載する最初の遺伝子ＩＤからのデータを用いたＲＳモデルの各々の標準化オッズ比を示す。表５Ｂは、悪性度進行および病期進行ならびに有意な悪性度進行および病期進行の組み合わせについて、ＣＣコンパニオン（コホート２および３）試験からのデータを用いたＲＳモデルの各々の性能を示す。これに関して、「悪性度進行」は、グリソングレードが生検時点での３＋３または３＋４から、根治的前立腺切除の時点で３＋４以上になるまでの増加を指す。これに関連して「有意な悪性度進行」は、グリソングレードが生検の時点での３＋３または３＋４から、根治的前立腺切除の時点で４＋３以上になるまでの上昇を指す。
【０１６４】
さらに、ＲＳ２５モデルで用いる遺伝子群を単独および様々な組み合わせで評価した。表６Ａは、遺伝子同定試験からのデータを用いた解析の結果を示し、図６Ｂは、ＣＣコンパニオン試験のコホート２および３からのデータを用いた解析の結果を示す。
【０１６５】
ある遺伝子について遺伝子発現を閾値処理してもよく、例えば、ＳＲＤ５Ａ２＜５．５であれば、ＳＲＤ５Ａ２閾値＝５．５であるか、またはＳＲＤ５Ａ２≧５．５であれば、ＳＲＤ５Ａ２であり、ＴＰＸ２＜５．０であれば、ＴＰＸ２閾値＝５．０であるか、またはＴＰＸ２≧５．０であれば、ＴＰＸ２である。ここで、遺伝子シンボルは、正規化遺伝子発現値を表す。
【０１６６】
表４から得られた等級化されていないＲＳスコアも、０〜１００に等級化することができる。例えば、ＲＳ２７は、以下のように、０〜１００に等級化することができる。
【０１６７】
１３．４×（ＲＳｕ＋１０．５）＜０であれば、ＲＳ（等級化）＝０であり；０≦１３．４×（ＲＳｕ＋１０．５）≦１００であれば、１３．４ｘ（ＲＳｕ＋１０．５）であり；または１３．４×（ＲＳｕ＋１０．５）＞１００であれば、１００である。
【０１６８】
等級化ＲＳを用いて、以下の表Ｂに定義する予め規定したカットポイントにより、患者を低、中間、および高ＲＳ群に分類することができる。これらのカットポイントは、低ＲＳ群と中間ＲＳ群との境界、および中間ＲＳ群と高ＲＳ群との境界を定める。平均して臨床的に有意な低または高リスクを有した患者の実質的割合を同定することを意図する発見調査から、カットポイントを取得した。等級化ＲＳは、小数点以下を四捨五入した後に、ＲＳ群の境界を定めるカットポイントを適用する。
【０１６９】
【表１８】
2019013255.tif 000019
【０１７０】
【表１９】
2019013255.tif 000020
【０１７１】
【表２０】
2019013255.tif 000021
【０１７２】
【表２１】
2019013255.tif 000022
【０１７３】
【表２２】
2019013255.tif 000023
【０１７４】
実施例３：共発現した遺伝子を同定するためのクリークスタック解析
この実施例に記載する遺伝子クリークスタック方法の目的は、上に開示した遺伝子と同様か、またはそれより良好な転帰を、信頼性をもって予測するのに用いることができる１セットの共発現（または代替）バイオマーカーをみいだすことであった。共発現マーカーを同定するのに用いた方法を図４に示す。この共発現バイオマーカーのセットは、科学文献から引用したキュレーティッド（ｃｕｒａｔｅｄ）バイオマーカーと一緒に極大クリーク列挙（ＭＣＥ）をシードすることにより取得した。極大クリーク列挙（ＭＣＥ）法［Ｂｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９７３］は、遺伝子を密に共発現した群に集合させて、同じ群の遺伝子全てが類似した発現プロフィールを有するようにする。１群の遺伝子全てが最低限の類似性条件を満たすとき、その群はクリークと呼ばれる。クリークが、「非類似」遺伝子をそのクリークに一切入らせることなく、可能な限り大きくなったとき、そのクリークは、極大であるという。ＭＣＥ法を用いて、全ての極大クリークをデータセット内で検索する。この方法を用いて、最大クリーク同士のほぼあらゆる程度の重なりを、この重なりがデータによって支持されている限り見出すことができる。極大クリーク列挙［Ｂｏｒａｔｅ  ｅｔ  ａｌ，２００９］は、共発現遺伝子モジュール（ＣＧＭ）を同定する有効な方法であることがわかっている。
【０１７５】
１．定義
以下の表は、遺伝子クリークスタック解析で一般に用いられるいくつかの用語である。
【０１７６】
【表２３】
2019013255.tif 000024
【０１７７】
２．クリークおよびスタックの例
図５は、３つの異なるグラフのファミリーを示す。グラフは、ノード（番号付）と、連結エッジ（線分）から構成される。図５（ａ）は、ノード３および４をつなぐエッジがないため、クリークではない。図５（ｂ）は、グラフ中のノードの全てのペア毎の組み合わせをつなぐエッジがあるので、クリークである。図５（ｃ）はクリークであるが、クリーク（ｂ）に含まれているので、極大クリークではない。連結エッジを含むグラフが与えられれば、ＭＣＥアルゴリズムは、３つ以上のノードを含む極大クリークの全てを体系的に列挙する。例えば、図６のグラフは、２つの極大クリーク：１−２−３−４−５および１−２−３−４−６を有する。
【０１７８】
遺伝子発現データに基づく場合、典型的に、互いに非常に類似した極大クリークが多数存在する。これらの極大クリークは、最大クリークのスタックにマージすることができる。スタックは、目的とする最大遺伝子モジュールであり、一般に、極大クリークよりはるかに数が少ない。図７は、２つの極大クリークのスタッキングを概略的に示す。
【０１７９】
３．シーディング
代替共発現マーカーを見出す目的で、文献からのバイオマーカーを同定し、これを用いて、ＭＣＥおよびスタッキングアルゴリズムをシードすることができる。基本的構想は次の通りである：各シードについて、１セットの極大クリークを計算する（平行ＭＣＥアルゴリズムを用いて）。次に、各シードについて得られた極大クリークをスタックし、１セットのシード済スタックを取得する。最後に、シード済スタックをスタックすることにより、「シード済スタックのスタック」を取得する。シード済スタックのスタックは、従来の（すなわち、シードされていない）ＭＣＥ／スタッキングアルゴリズムを用いて得られるであろうスタックと近似のものである。上に開示した遺伝子と共発現する遺伝子を同定する方法は図４に示すが、以下に、より詳しく説明する。
【０１８０】
３．１  シード済ＭＣＥアルゴリズム（ステップ１〜４）
１．このプロセスは、シーディング遺伝子の適切な１セット、Ｓｓを同定することにより開始する。この場合、シーディング遺伝子は、上に開示した遺伝子サブセットから選択した。
【０１８１】
２．指定したシーディング遺伝子を用いて、いずれか２つの遺伝子ｇ１、ｇ２の遺伝子発現プロフィール同士の相関の尺度、Ｒ（ｇ１，ｇ２）を、相関閾値（これを下回ると、ｇ１、ｇ２は非相関とみなされ得る）に従って選択する。シーディングセットＳｓ中の各シーディング遺伝子ｓについて、Ｒ（ｓ、ｇ）が相関閾値より大きいか、またはこれと等しくなるように、データセットにおいて全ての遺伝子ペア（ｓ、ｇ）を見出す。Ｇｓは、ｓ、およびｓと相関する全遺伝子のセットの和集合とする。本試験の場合、スピアマン係数を相関の尺度として用い、相関閾値として０．７を用いた。
【０１８２】
３．Ｇｓにおける遺伝子（ｇｉ，ｇｊ）のペア毎の組み合わせの各々について相関係数を計算する。Ｘｓは、Ｒ（ｇｉ，ｇｊ）が、相関閾値より大きいか、またはこれと等しい全遺伝子ペアの集合であるとする。遺伝子を図５に示すようにプロットすれば、Ｘｓの遺伝子の各ペアの間にエッジ（線分）が存在するであろう。
【０１８３】
４．各シーディング遺伝子の遺伝子ペアＸｓについて、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂ．Ｃｏｍｐｕｔ．６９（２００９）４１７−４２８）に記載されているように、ＭＣＥアルゴリズムを実行する。
【０１８４】
３．２  シード済スタッキングアルゴリズム（ステップ５〜６）
スタッキングの目的は、クリークの数を処理しやすい数の遺伝子モジュール（スタック）に減らすことである。続いて図４のステップ５および６を実施する。
【０１８５】
５．各シーディング遺伝子について、最大から最小まで、すなわち最大数のノードから最小数のノードまでクリークを選別する。残ったクリークから、最大の重なりを有するクリークを見出す。重なりがユーザ指定の閾値Ｔを超えたら、２つのクリークを一緒にマージして、第１スタックを形成する。クリークおよびスタックを最大から最小まで選択し、重なり試験およびマージを繰り返す。このプロセスを新たなマージが起こらなくなるまで繰り返す。
【０１８６】
６．現時点で、各シーディング遺伝子について１セットのスタックがある。最終ステップにおいて、シードしたスタックの全てを合わせて、１セットのスタック、σにする。最後の計算として、σにおけるスタックの全てをステップ５と全く同様にスタックする。このスタックのスタックは、本試験に用いる遺伝子モジュールのセットである。
【０１８７】
この方法により同定された遺伝子と共発現することが判明した遺伝子を表８〜１１に示す。これらの表にある「スタックＩＤ」は、単純に、スタックを列挙するためのインデックスであり、「プローブＷｔ」は、プローブ重み、すなわちプローブ（遺伝子）がスタックに出現した回数を指す。
【０１８８】
【表２４】
2019013255.tif 000025
【０１８９】
【表２５】
2019013255.tif 000026
【０１９０】
【表２６】
2019013255.tif 000027
【０１９１】
【表２７】
2019013255.tif 000028
【０１９２】
【表２８】
2019013255.tif 000029
【０１９３】
【表２９】
2019013255.tif 000030
【０１９４】
【表３０】
2019013255.tif 000031
【０１９５】
【表３１】
2019013255.tif 000032
【０１９６】
【表３２】
2019013255.tif 000033
【０１９７】
【表３３】
2019013255.tif 000034
【０１９８】
【表３４】
2019013255.tif 000035
【０１９９】
【表３５】
2019013255.tif 000036
【０２００】
【表３６】
2019013255.tif 000037
【０２０１】
【表３７】
2019013255.tif 000038
【０２０２】
【表３８】
2019013255.tif 000039
【０２０３】
【表３９】
2019013255.tif 000040
【０２０４】
【表４０】
2019013255.tif 000041
【０２０５】
【表４１】
2019013255.tif 000042
【０２０６】
【表４２】
2019013255.tif 000043
【０２０７】
【表４３】
2019013255.tif 000044
【０２０８】
【表４４】
2019013255.tif 000045
【０２０９】
【表４５】
2019013255.tif 000046
【０２１０】
【表４６】
2019013255.tif 000047
【０２１１】
【表４７】
2019013255.tif 000048
【０２１２】
【表４８】
2019013255.tif 000049
【０２１３】
【表４９】
2019013255.tif 000050
【０２１４】
【表５０】
2019013255.tif 000051
【０２１５】
【表５１】
2019013255.tif 000052
【０２１６】
実施例４：ＲＳ２７の予測的バリデーション
試験設計および統計方法
表４のアルゴリズムＲＳ２７を予測的臨床バリデーション試験において試験した。この試験は、サンフランシスコ、カリフォルニア大学（ＵＣＳＦ）で１９９７年〜２０１０年の間に前立腺癌の手術を受けた評価可能な患者３９５人を含んだ。患者は、臨床的に決定された前立腺癌の低または中間リスク（ＣＡＰＲＡによる）を有し、積極的サーベイランスの妥当な候補となり得たが、生検による前立腺癌の診断から６ヵ月以内に、ＵＣＳＦでＲＰを受けた。患者選択のためのランダム化は実施しなかった。各患者について、１つ以上の腫瘍含有針コアを含む１つの固定パラフィン包埋組織（ＦＰＥＴ）ブロックからの前立腺生検サンプルを評価した。
【０２１７】
ＲＳ２７またはＲＳ２７の任意の成分と、ＲＰ時点での悪性病理との間に有意な関係があるかどうかを調べるために、多変量および１変量多項ロジスティック回帰モデルを用いて、オッズ比（ＯＲ）が１であるという帰無仮説の尤度比（ＬＲ）試験からｐ値を記録した。また、多項ロジスティック回帰モデルを用いて、高グレードまたは非器官限局性疾患の確率の、９５％信頼区間を用いた推定値も計算した。ＲＳ２７、ベースライン共変量、およびこれら要因の組み合わせと、高グレードまたは非器官限局性疾患との関係を評価するために、多変量および１変量２値ロジスティック回帰モデルを用い、オッズ比（ＯＲ）が１であるという帰無仮説の尤度比試験からｐ値を記録した。
【０２１８】
主要エンドポイントを以下のように計画した。
【０２１９】
【表５２】
2019013255.tif 000053
【０２２０】
ここで、グリソンスコア≦３＋３およびｐＴ２（「１」を示す）は、リファランスカテゴリーであり、他の全てのカテゴリー（２〜６）をリファランスカテゴリーと比較する。
【０２２１】
２値ロジスティック回帰モデルで評価した表１２の細胞の組み合わせは以下のものを含む。
細胞２、４、６対１、３、５：非器官限局性疾患
細胞５、６対１、２、３、４：高グレード疾患
細胞２、４、５、６対１および３：高グレードまたは非器官限局性疾患
【０２２２】
ＲＳ２７アルゴリズム
０〜１００の等級のＲＳ２７を以下のように、リファランス−正規化遺伝子発現測定値から得た。
【０２２３】
非等級化ＲＳ２７（ＲＳ２７ｕ）を表４に示すように定義した。
【０２２４】
ＲＳ２７ｕ＝０．７３５＊ＥＣＭ（間質反応）群−０．３６８＊流動（細胞構成）群−０．３５２＊ＰＳＡ（アンドロゲン）群＋０．０９５＊増殖（ＴＰＸ２）
ここで、
ＥＣＭ（間質反応）群スコア＝０．５２７＊ＢＧＮ＋０．４５７＊ＣＯＬ１Ａ１＋０．１５６＊ＳＦＲＰ４
遊走遊走（細胞構成）群スコア＝０．１６３＊ＦＬＮＣ＋０．５０４＊ＧＳＮ＋０．４２１＊ＴＰＭ２＋０．３９４＊ＧＳＴＭ２
ＰＳＡ（アンドロゲン）群スコア＝０．６３４＊ＦＡＭ１３Ｃ＋１．０７９＊ＫＬＫ２＋０．６４２＊ＡＺＧＰ１＋０．９９７＊ＳＲＤ５Ａ２閾値
増殖（ＴＰＸ２）スコア＝ＴＰＸ２閾値
【０２２５】
上記式中、ＳＲＤ５Ａ２およびＴＰＸ２についての閾値処理遺伝子スコアは、以下のように計算する。
【数１】
2019013255.tif 000054
【数２】
2019013255.tif 000055
【０２２６】
次に、ＲＳ２７ｕを以下のように０〜１００の間で再等級化する。
【数３】
2019013255.tif 000056
【０２２７】
以下の表１３に定義する予め指定したカットポイントを用いて、低、中間および高ＲＳ２７群に患者を分類した。これらのカットポイントは、低および中間ＲＳ２７群の間の境界と、中間および高ＲＳ２７群の間の境界を定めた。カットポイントは、平均して、悪性病理の臨床的に有意な低または高リスクを有した患者の実質的割合を決定することを目的とする発見調査から導き出した。ＲＳ２７を整数に四捨五入してから、ＲＳ２７群の境界を定めるカットポイントを適用した。
【０２２８】
【表５３】
2019013255.tif 000057
【０２２９】
アッセイ方法
Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｘｙｌｅｎｅ代替品（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）を用いて、サンプルからパラフィンを除去した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＦｏｒｍａＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、核酸を単離した。
【０２３０】
Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡ  Ａｓｓａｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ＲＮＡの量を決定した。定量したＲＮＡを、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、相補的ＤＮＡに変換した後、表Ａに示すように、ＲＳ２７の１２の遺伝子と５つの正規化遺伝子（ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１、ＰＧＫ１）の逆プライマーと結合させた。反応物を３７℃で６０分インキュベートした後、９３℃で５分不活性化した。
【０２３１】
Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．の要請で、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により製造された特注ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ならびに表Ａに示す全ての標的についてのフォワードおよびリバースプライマーを用いて、ｃＤＮＡを予め増幅した。反応物をサーモサイクラー（ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（登録商標）ＰＴＣ２００Ｇ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）内に配置し、下記の条件下でインキュベートした：Ａ）９５℃で１５秒；Ｂ）６０℃で４分；Ｃ）９５℃で１５秒の後、Ｄ）ステップＢおよびＣを８回繰り返した。増幅した産物を、表Ａに示す標的の各々についてのフォワードおよびリバースプライマーならびにＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）と混合した後、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中で４５サイクルにわたり増幅した。クロッシングポイント（Ｃｐ）法を用いて発現量を計算した。
【０２３２】
結果
ＲＳ２７は、悪性病理、非器官限局性疾患、高グレード疾患、および高グレードまたは非器官限局性疾患を有意に予測したため、表１４、１５、１６および１７にそれぞれ示す生検グリソンスコアを超える値を付加する。
【０２３３】
【表５４】
2019013255.tif 000058
【０２３４】
【表５５】
2019013255.tif 000059
【０２３５】
【表５６】
2019013255.tif 000060
【０２３６】
【表５７】
2019013255.tif 000061
【０２３７】
さらに、ＲＳ２７は、表１８に示すように、従来の臨床／病理治療指数を超える悪性病理を予測した。
【０２３８】
【表５８】
2019013255.tif 000062
【０２３９】
ＣＡＰＲＡなどの従来の臨床／病理治療ツールに追加すると、ＲＳ２７は、高グレードまたは非器官限局性疾患のリスクをさらに精密化した。ＣＡＰＲＡを単独で用いた場合、患者の５％が、高グレードまたは非器官限局性疾患から自由である８５％超の確率を有するとして同定されたのに対し、ＣＡＰＲＡにＲＳ２７を併用すると、患者の２２％が、高グレードまたは非器官限局性疾患から自由であるとものとして同定された（図８）。
【０２４０】
ＡＵＡ（Ｄ’Ａｍｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  ２８０：９６９−９７４，１９９８）などの従来の臨床／病理治療ツールに追加すると、ＲＳ２７は、高グレードまたは非器官限局性疾患のリスクをさらに精密化した。図９に示すように、ＡＵＡを単独で用いた場合、患者の０％が、高グレードまたは非器官限局性疾患から自由である８０％超の確率を有するものとして同定されるのに対し、ＡＵＡにＧＰＳを併用すると、患者の２７％が、高グレードまたは非器官限局性疾患を含まないものとして同定される。
【０２４１】
また、表１９、２０、２１および２２にそれぞれ示すように、１変量解析において、ＲＳ２７の個々の遺伝子および遺伝子群を悪性病理、高グレード疾患、非器官限局性疾患、および高グレードまたは非器官限局性疾患とも関連させた。
【０２４２】
【表５９】
2019013255.tif 000063
【０２４３】
【表６０】
2019013255.tif 000064
【０２４４】
【表６１】
2019013255.tif 000065
【０２４５】
【表６２】
2019013255.tif 000066
【０２４６】
実施例５：ＲＳ２７は、臨床的再発の予測において、ＰＴＥＮ／ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ状態以外の価値を付加する
ＰＴＥＮ突然変異およびＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合遺伝子は、一般に、前立腺癌の予後不良に関連している。ここで、ＲＳ２７を解析することにより、ＲＳ２７が、臨床的再発の予測において、ＰＴＥＮ／ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ状態以外の価値を付与することができるかどうかを決定した。
【０２４７】
上記実施例１および米国特許公開第２０１２００２８２６４号明細書に記載されている遺伝子同定試験で得られたＰＴＥＮおよびＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合物発現レベルを用いて、患者をＰＴＥＮ低およびＰＴＥＮ正常グループに層化した。患者のＰＴＥＮおよびＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ（「Ｔ２−ＥＲＧ」）状態は、下記のように判明した。
【０２４８】
【表６３】
2019013255.tif 000067
【０２４９】
「ＰＴＥＮ低」のカットポイントを≦８．５に設定したが、これは、約１３％のＴ２−ＥＲＧ陰性患者と２８％のＴ２−ＥＲＧ陽性患者を含んだ。ＰＴＥＮ正常は、＞８．５として定めた。
【０２５０】
１変量Ｃｏｘ比例ハザードを適用して、ＰＴＥＮ状態および時間と臨床的再発（ｃＲ）の関連を評価した。図１０および表２４は、ＰＴＥＮ低の患者が、ＰＴＥＮ正常の患者と比較して、より高い再発のリスクを有することを示している。
【０２５１】
【表６４】
2019013255.tif 000068
【０２５２】
患者をＰＴＥＮ低／Ｔ２−ＥＲＧ陰性（「カテゴリー０」）、ＰＴＥＮ低／Ｔ２−ＥＲＧ陽性（「カテゴリー１」）、ＰＴＥＮ正常／Ｔ２−ＥＲＧ陰性（「カテゴリー２」）、およびＰＴＥＮ正常／Ｔ２−ＥＲＧ陽性（「カテゴリー３」）にさらに層化したところ、両方のＰＴＥＮ低カテゴリーが、図１１および表２５に示すように、ＰＴＥＮ正常の患者と比較して、最も低い再発率を有した。
【０２５３】
【表６５】
2019013255.tif 000069
【０２５４】
以下の表は、ＰＴＥＮ／Ｔ２−ＥＲＧ状態（表２６）またはＰＴＥＮ状態（表２７）、ＲＳ２７、ならびに生検グリソンスコア（Ｂｘ  ＧＳ）を用いた多変量モデルの結果をまとめるが、これらにより、ＲＳ２７が、臨床的再発の予測において、ＰＴＥＮおよびＴ２−ＥＲＧマーカーならびに生検ＧＳ以外の価値を付加することが明らかである。
【０２５５】
【表６６】
2019013255.tif 000070
【０２５６】
【表６７】
2019013255.tif 000071
【０２５７】
【表６８】
2019013255.tif 000072
【０２５８】
【表６９】
2019013255.tif 000073
【０２５９】
【表７０】
2019013255.tif 000074
【０２６０】
【表７１】
2019013255.tif 000075
【０２６１】
【表７２】
2019013255.tif 000076
【０２６２】
【表７３】
2019013255.tif 000077
【図１】
2019013255.tif 000078
【図２Ａ】
2019013255.tif 000079
【図２Ｂ】
2019013255.tif 000080
【図２Ｃ】
2019013255.tif 000081
【図２Ｄ】
2019013255.tif 000082
【図２Ｅ】
2019013255.tif 000083
【図３Ａ】
2019013255.tif 000084
【図３Ｂ】
2019013255.tif 000085
【図３Ｃ】
2019013255.tif 000086
【図３Ｄ】
2019013255.tif 000087
【図４】
2019013255.tif 000088
【図５】
2019013255.tif 000089
【図６】
2019013255.tif 000090
【図７】
2019013255.tif 000091
【図８】
2019013255.tif 000092
【図９】
2019013255.tif 000093
【図１０】
2019013255.tif 000094
【図１１】
2019013255.tif 000095
【配列表】
2019013255000001.app
【外国語明細書】
2019013255000001.pdf