(57)【要約】【課題】Ｃ１基質（メタンまたはメタノールなど）をバイオマスに変換し、次いで、バイオ燃料またはバイオプラスチックなどに変換するためのＣ１代謝微生物反応装置系の使用を提供すること。【解決手段】１つの態様では、本開示は、（例えば、精製ユニット中で）Ｃ１代謝非光合成微生物由来の油組成物を精製して燃料を生産することによって燃料を作製する方法を提供する。さらに、本開示は、Ｃ１代謝非光合成微生物を主に含む培養物由来のバイオマスを油組成物に変換し、油組成物を燃料に精製することによる燃料を作製するための方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表を、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供し、本配列表は、本明細書中に参考として援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、２００２０６＿４０４＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。本テキストファイルは１４６ＫＢであり、２０１３年７月１２日に作成し、ＥＦＳ−Ｗｅｂによって電子的に提出している。
【０００２】
背景
技術分野
本開示は、バイオ燃料生産のための生物工学アプローチに関し、特に、Ｃ１基質（メタンまたはメタノールなど）をバイオマスに変換し、次いで、バイオ燃料またはバイオプラスチックなどに変換するためのＣ１代謝微生物反応装置系の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
化石燃料の枯渇、温室効果ガス生成量の増加、および気候変動に関する懸念の高まりに伴い、化石燃料の代替物としてのバイオ燃料（例えば、エタノール、バイオディーゼル）が産業的に注目されるようになった。しかし、今日までに生成されたバイオ燃料には、困難と懸念がある。第１世代のバイオ燃料は植物（例えば、デンプン；ショ糖；ならびにトウモロコシ油、ナタネ油、ダイズ油、ヤシ油、および他の植物油）に由来するが、これらの燃料用作物はヒトおよび動物が消費するために育てられる作物と競合する。利用可能な耕作地は、世界的規模の食物および燃料のニーズを満たすのに十分でない。したがって、第２の世代のバイオ燃料は、例えば、セルロースまたは藻類から生産されている。しかし、生産コスト高と共に技術的に生産が困難であることにより、第２世代のバイオ燃料を、これ以上費用効果を高くしたり利用しやすくしたりできていない。
【０００４】
代替供給材料（すなわち、糖、トウモロコシ、藻類でない）でできている第３または次世代のバイオ燃料が必要である。これに関して、メタンは最も豊富な国内炭素供給材料の１つであり、これは主に天然ガスから供給されている。近年のメタンの国内生産の増加（２００６年の４８ｂｆｔ３／日から２０１２年の６５ｂｆｔ３／日まで）により、天然ガスのコストが最安値になっている（２００６年の約＄１４．００／ＭＭＢＴＵから２０１２年の約＄２．５０／ＭＭＢＴＵまで）。国内天然ガスは主に水圧破砕（「フラッキング」）によって生産されるが、埋め立てゴミおよび下水などの他の供給源からメタンを得ることもできる。さらに、メタンはＣＯ２と比較して２３倍の温室効果をもたらすので、メタン供給源の捕捉は環境に有意な利益をもたらすであろう。
【０００５】
しかし、メタンの揮発性は、輸送および燃料としての直接的な利用において問題となる。このため、使用拠点まで容易に輸送するために気体を液体に変換することが強く望まれている。以下の主に２つのアプローチが現在探究されている：液化天然ガス（ＬＮＧ）への液化およびガスから液体へ変換するための化学的変換（ＧＴＬ）（Ｐａｔｅｌ，７ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ，２００５）。フィッシャー・トロプシュ（Ｆ−Ｔ）プロセスは、現在、天然ガスから高次炭化水素へのメタン変換のための最も一般的なＧＴＬアプローチである（Ｐａｔｅｌ、２００５）。Ｆ−Ｔプロセスが水蒸気改質によって天然ガスから生産される材料としてシンガスを使用することに留意のこと（シンガスを、水および酸素を使用した高温反応による石炭ガス化から供給することもできる）。Ｆ−Ｔプロセスによって今日の燃料供給に一致する石油製品が得られるが、多数の欠点（低収量、低選択性（下流部門の利用を複雑にしている）が含まれる）を抱えており、経済的生産を達成するために有意な設備投資および規模が必要である（Ｓｐａｔｈ  ａｎｄ  Ｄａｙｔｏｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００３  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３４９２９）。Ｆ−Ｔプラントの継続的な操作には大量のメタン供給材料が必要であるので、Ｆ−Ｔプラントに必要とされる規模の大きさ（典型的なプラントの資本コストは２０億ドル超であること［Ｐａｔｅｌ、２００５］）にも大きな制限を受ける。大抵の場合にメタン輸送が法外に高額であるので、かかるプラントを巨大なガス供給所またはパイプラインのいずれかと共同設置しなければならない。Ｆ−Ｔ触媒がシンガス変換プロセスにおいて残存する天然ガス中の一般的な夾雑物質に対する反応性が高いので、さらなるコストおよびスケーリングファクターはガス洗浄テクノロジーの経済的問題である（Ｓｐａｔｈ  ａｎｄ  Ｄａｙｔｏｎ，２００３）。
【０００６】
Ｆ−Ｔプラントは、１９３８以来半継続的に操業中である。上記で考察したメタンの現在の利用可能性および価格が得られる新規のプラントの導入を現在調査中の企業もある。しかし、過去７０年以上にわたる懸命な研究開発にもかかわらず、Ｆ−Ｔテクノロジーの制約が商業的ＧＴＬプロセスの広範な採用を妨げている。大量の処理ガスを迅速に利用する必要があるので、莫大な資本投資と組み合わせて、現在、天然ガスベースのＦ−Ｔプラントは世界中でほんの数カ所での操業が成功しているにすぎない（Ｓｐａｔｈ  ａｎｄ  Ｄａｙｔｏｎ，２００３）。高い輸送コストと併せてＧＴＬまたはＬＮＧプラントの必要最小処理量が高いことにより、より少量のメタン供給源を「ストランデッド」ガス（例えば、海洋油井で生産された天然ガスまたは埋め立てゴミ由来のメタンオフガス）という。現在の効率的な小規模変換テクノロジーの非存在下で、メタン蓄積が安全上の重大なリスクであるので、かかるストランデッドガス供給源は典型的には大気に放出されるか燃やされる。
【０００７】
第１世代、第２世代、および次世代のバイオ燃料の生産に関連する限界を考慮して、環境に負担をかけることや食糧生産と競合することのない代替燃料の新規の効率的且つ費用効果の高い生産方法が当該分野で必要であることは明らかである。本発明は、生物工学を使用したバイオ燃料および他の生成物の効率的且つ費用効果の高い生産方法を提供することによってこの問題を解決する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｐａｔｈ  ａｎｄ  Ｄａｙｔｏｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００３  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３４９２９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
概要
１つの態様では、本開示は、（例えば、精製ユニット中で）Ｃ１代謝非光合成微生物由来の油組成物を精製して燃料を生産することによって燃料を作製する方法を提供する。さらに、本開示は、Ｃ１代謝非光合成微生物を主に含む培養物由来のバイオマスを油組成物に変換し、油組成物を燃料に精製することによる燃料を作製するための方法を開示する。さらに別の態様では、本開示は、油組成物がＣ１代謝非光合成微生物に由来する処理ユニットおよび油組成物を精製して燃料を生産するための精製ユニットを含むバイオリファイナリーを提供する。さらに別の態様では、本開示は、水素原子および炭素原子を含む分子を有し、水素原子および炭素原子が組成物の重量の少なくとも約５０％〜約９９％であり、組成物のδ１３Ｃが約−３５‰〜約−５０‰、−４５‰〜約−３５‰、または約−５０‰〜約−４０‰、または約−４５‰〜約−６５‰、または約−６０‰〜約−７０‰、または約−３０‰〜約−７０‰の範囲である、油組成物またはバイオ燃料組成物を提供する。
【００１０】
一定の実施形態では、本開示は、原核生物または細菌であるＣ１代謝微生物（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなど）を提供する。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝細菌は、メタン資化性菌（ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈ）またはメチロトローフ菌（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈ）である。例示的なメタン資化性菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、またはその組み合わせが含まれる。
【００１１】
例示的なメタン資化性菌種には、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｙ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、またはその高成長バリアントが含まれる。
【００１２】
例示的なメチロトローフ菌種には、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその組み合わせが含まれる。
【００１３】
なおさらなる実施形態では、本開示は、シンガス代謝細菌であるＣ１代謝微生物（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、またはその任意の組み合わせなど）を提供する。例示的なシンガス代謝細菌には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその任意の組み合わせが含まれる。
【００１４】
一定の他の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、酵母（Ｃａｎｄｉｄａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、またはＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａが含まれる）などの真核生物である。
【００１５】
さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、脂肪酸産生酵素、ホルムアルデヒド同化酵素、またはその組み合わせをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え微生物である。一定の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、チオエステラーゼ、マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、またはその任意の組み合わせをコードする。例えば、チオエステラーゼは、周辺質ターゲティング配列を欠くコドン最適化した大腸菌ｔｅｓＡであり得、マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼはコドン最適化した大腸菌ｆａｂＤであり得、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼはコドン最適化した大腸菌ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ａｃｃＤ、またはその任意の組み合わせであり得る。一定のさらなる実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を最小にするか排除する変異をさらに含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
バイオ燃料を作製するための方法であって、Ｃ１代謝非光合成微生物のバイオマスまたは油組成物を精製して燃料を生産する工程を含む、方法。
（項目２）
Ｃ１代謝非光合成微生物の前記油組成物を前記Ｃ１代謝非光合成微生物から抽出する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記方法が、
（ａ）制御培養ユニット中にてＣ１基質を含む供給材料の存在下でＣ１代謝細菌を培養する工程であって、ここで培養された前記細菌が油組成物を産生する、工程；
（ｂ）培養された前記細菌から前記油組成物を抽出する工程；および
（ｃ）抽出された前記油組成物を精製して燃料を生産する工程
を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記Ｃ１基質が、天然ガス、非従来型天然ガス、シンガス、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、一酸化炭素、二酸化炭素、シアン化物、メチルアミン、メチルチオール、メチルハロゲン、またはその任意の組み合わせである、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記Ｃ１代謝非光合成微生物がＣ１代謝細菌またはＣ１代謝酵母である、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記Ｃ１代謝細菌がメタン資化性菌またはメチロトローフ菌である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記細菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｙ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその任意の組み合わせである、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記Ｃ１代謝細菌がシンガス代謝細菌である、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記シンガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその組み合わせである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記Ｃ１代謝細菌が、脂肪酸産生酵素、ホルムアルデヒド同化酵素、またはその任意の組み合わせをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換えＣ１代謝細菌である、項目５に記載の方法。
（項目１１）
前記異種ポリヌクレオチドが、チオエステラーゼ、マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、またはその任意の組み合わせをコードする、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記チオエステラーゼが、周辺質ターゲティング配列を欠くコドン最適化した大腸菌ｔｅｓＡである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼがコドン最適化した大腸菌ｆａｂＤである、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが、コドン最適化した大腸菌ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ａｃｃＤ、またはその任意の組み合わせである、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記Ｃ１代謝微生物が、脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を最小にするか排除する変異をさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記プロセスをバイオリファイナリーまたは統合バイオリファイナリーで実施する、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
バイオリファイナリーであって、
（ａ）油組成物がＣ１代謝非光合成微生物に由来する処理ユニット；および
（ｂ）前記油組成物を精製して燃料を生産するための精製ユニット
を含む、バイオリファイナリー。
（項目１８）
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が細菌または酵母である、項目１７に記載のバイオリファイナリー。
（項目１９）
前記Ｃ１代謝細菌がメタン資化性菌またはメチロトローフ菌である、項目１８に記載のバイオリファイナリー。
（項目２０）
前記細菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｙ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその任意の組み合わせである、項目１８に記載のバイオリファイナリー。
（項目２１）
前記Ｃ１代謝細菌がシンガス代謝細菌である、項目１８に記載のバイオリファイナリー。
（項目２２）
前記シンガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその組み合わせである、項目２１に記載のバイオリファイナリー。
（項目２３）
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、脂肪酸産生酵素、ホルムアルデヒド同化酵素、またはその組み合わせをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換えＣ１代謝非光合成微生物である、項目１７〜２２のいずれか１項に記載のバイオリファイナリー。
（項目２４）
前記異種ポリヌクレオチドが、チオエステラーゼ、マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、またはその任意の組み合わせをコードする、項目２３に記載のバイオリファイナリー。
（項目２５）
前記チオエステラーゼが、周辺質ターゲティング配列を欠くコドン最適化した大腸菌ｔｅｓＡである、項目２４に記載のバイオリファイナリー。
（項目２６）
前記マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼがコドン最適化した大腸菌ｆａｂＤである、項目２４に記載のバイオリファイナリー。
（項目２７）
前記アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが、コドン最適化した大腸菌ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ａｃｃＤ、またはその任意の組み合わせである、項目２４に記載のバイオリファイナリー。
（項目２８）
前記Ｃ１代謝微生物が、脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を最小にするか排除する変異をさらに含む、項目２３に記載のバイオリファイナリー。
（項目２９）
Ｃ１基質を含む供給材料の存在下でＣ１代謝非光合成微生物を培養するための制御培養ユニットをさらに含み、培養された前記細菌が前記油組成物を産生する、項目１７〜２８のいずれか１項に記載のバイオリファイナリー。
（項目３０）
前記Ｃ１基質が、天然ガス、非従来型天然ガス、シンガス、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、一酸化炭素、二酸化炭素、シアン化物、メチルアミン、メチルチオール、メチルハロゲン、またはその任意の組み合わせである、項目２９に記載のバイオリファイナリー。
（項目３１）
前記制御培養ユニットが発酵槽またはバイオリアクターである、項目２９に記載のバイオリファイナリー。
（項目３２）
前記処理ユニットが制御培養ユニットをさらに含む、項目１７〜３１のいずれか１項に記載のバイオリファイナリー。
（項目３３）
前記処理ユニットが、抽出によって前記油組成物を誘導することができる、項目１７〜３２のいずれか１項に記載のバイオリファイナリー。
（項目３４）
前記油組成物を、前記精製ユニットにおいてクラッキング、エステル交換反応、改質、蒸留、水素化処理、異性化、またはその組み合わせのプロセスによって精製する、項目１７〜３３のいずれか１項に記載のバイオリファイナリー。
（項目３５）
前記水素化処理が、水素化、水素処理、水素添加分解、水素化異性化（ｈｙｄｒｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、またはその組み合わせである、項目３４に記載のバイオリファイナリー。
（項目３６）
前記クラッキングが、接触分解、流動接触分解、水蒸気分解、水素添加分解、熱分解、接触熱分解、またはその組み合わせである、項目３４に記載のバイオリファイナリー。
（項目３７）
第２の処理ユニットをさらに含み、前記第２の処理ユニットが精製された前記油組成物由来の残留物質の処理のための排出物処理ユニットである、項目１７〜３６のいずれか１項に記載のバイオリファイナリー。
（項目３８）
前記排出物処理ユニットが嫌気性消化装置、好気性消化装置、またはその両方を含む、項目３７に記載のバイオリファイナリー。
（項目３９）
前記バイオリファイナリーが、前記Ｃ１代謝非光合成微生物の培養または維持に用いるための前記排出物処理ユニットから少なくとも１つの生成物を送達するための導管をさらに含む、項目３７に記載のバイオリファイナリー。
（項目４０）
前記燃料が、ジェット燃料、ディーゼル燃料、パラフィン系ケロシン、ガソリン、またはその組み合わせを含む、項目１７〜３９のいずれか１項に記載のバイオリファイナリー。
（項目４１）
前記バイオリファイナリーが統合されている、項目１７〜４０のいずれか１項に記載のバイオリファイナリー。
（項目４２）
燃料を作製するための方法であって、Ｃ１代謝非光合成微生物を主に含む培養物由来のバイオマスを油組成物に変換する工程、および前記油組成物を燃料に精製する工程を含む、方法。
（項目４３）
前記バイオマスを抽出によって油組成物に変換する、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記油組成物を、クラッキング、エステル交換反応、改質、蒸留、水素化処理、異性化、またはその組み合わせのプロセスによって精製する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４５）
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が細菌または酵母である、項目４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４６）
前記Ｃ１代謝細菌がメタン資化性菌またはメチロトローフ菌である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記細菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｙ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ
ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその任意の組み合わせである、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記Ｃ１代謝細菌がシンガス代謝細菌である、項目４５に記載の方法。
（項目４９）
前記シンガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその組み合わせである、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、脂肪酸産生酵素、ホルムアルデヒド同化酵素、またはその任意の組み合わせをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換えＣ１代謝非光合成微生物である、項目４２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記異種ポリヌクレオチドが、チオエステラーゼ、マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、またはその任意の組み合わせをコードする、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記チオエステラーゼが周辺質ターゲティング配列を欠くコドン最適化した大腸菌ｔｅｓＡである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼがコドン最適化した大腸菌ｆａｂＤである、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが、コドン最適化した大腸菌ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ａｃｃＤ、またはその任意の組み合わせである、項目５１に記載の方法。
（項目５５）
前記Ｃ１代謝微生物が、脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を最小にするか排除する変異をさらに含む、項目５０に記載の方法。
（項目５６）
前記Ｃ１代謝非光合成微生物を、天然ガス、非従来型天然ガス、シンガス、メタン、メ
タノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、一酸化炭素、二酸化炭素、シアン化物、メチルアミン、メチルチオール、メチルハロゲン、またはその任意の組み合わせから選択されるＣ１基質の存在下で培養した、項目４２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記燃料が、ジェット燃料、ディーゼル燃料、パラフィン系ケロシン、ガソリン、またはその任意の組み合わせを含む、項目４２〜５６のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
Ｃ１代謝非光合成微生物の油組成物であって、水素原子および炭素原子を含む分子を含み、前記水素原子および前記炭素原子が前記組成物の重量の少なくとも約５０％であり、前記組成物のδ１３Ｃが約−７０‰〜約−３０‰の範囲である、Ｃ１代謝非光合成微生物の油組成物。
（項目５９）
前記水素原子および前記炭素原子が、前記組成物の重量の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％である、項目５８に記載の油組成物。
（項目６０）
前記組成物を燃料成分とさらにブレンドして燃料生成物を生産する、項目５８または５９に記載の油組成物。
（項目６１）
前記組成物が少なくとも５０％ｗ／ｗの脂肪酸を含む、項目５８〜６０のいずれか１項に記載の油組成物。
（項目６２）
前記脂肪酸が遊離脂肪酸である、項目６１に記載の油組成物。
（項目６３）
前記脂肪酸がジアシルグリセリドとトリアシルグリセリドとの混合物を含む、項目６１に記載の油組成物。
（項目６４）
前記脂肪酸の大部分がＣ１４〜Ｃ１８の炭素鎖長から構成される、項目６１に記載の油組成物。
（項目６５）
前記脂肪酸の大部分がＣ１６〜Ｃ１８の炭素鎖長から構成される、項目６１に記載の油組成物。
（項目６６）
前記脂肪酸の大部分がＣ１６未満の炭素鎖長から構成される、項目６１に記載の油組成物。
（項目６７）
前記組成物が少なくとも５０％ｗ／ｗのテルペノイド化合物、イソプレノイド化合物、またはその組み合わせを含む、項目５８〜６０のいずれか１項に記載の油組成物。
（項目６８）
前記テルペノイドがファルネセンである、項目６７に記載の油組成物。
（項目６９）
前記テルペノイドがリモネンである、項目６７に記載の油組成物。
（項目７０）
水素原子および炭素原子を含むＣ１代謝非光合成微生物由来の油組成物を含むバイオ燃料組成物であって、前記水素原子および前記炭素原子が前記組成物の重量の少なくとも約９０％であり、前記組成物のδ１３Ｃが約−４０‰〜約−６０‰の範囲である、バイオ燃料組成物。
（項目７１）
前記バイオ燃料が少なくとも５０％ｗ／ｗの脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を含む、項目７０に記載のバイオ燃料組成物。
（項目７２）
前記ＦＡＭＥの大部分がＣ１４〜Ｃ１８の炭素鎖長を有する、項目７１に記載のバイオ燃料組成物。
（項目７３）
前記ＦＡＭＥの大部分がＣ１６〜Ｃ１８の炭素鎖長を有する、項目７１に記載のバイオ燃料組成物。
（項目７４）
前記ＦＡＭＥの大部分がＣ１６未満の炭素鎖長を有する、項目７１に記載のバイオ燃料組成物。
（項目７５）
前記バイオ燃料が少なくとも５０％ｗ／ｗの脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）を含む、項目７０に記載のバイオ燃料組成物。
（項目７６）
前記ＦＡＥＥの大部分がＣ１６〜Ｃ１８の炭素鎖長を有する、項目７５に記載のバイオ燃料組成物。
（項目７７）
前記ＦＡＥＥの大部分がＣ１４〜Ｃ１８の炭素鎖長を有する、項目７５に記載のバイオ燃料組成物。
（項目７８）
前記ＦＡＥＥの大部分がＣ１６未満の炭素鎖長を有する、項目７５に記載のバイオ燃料組成物。
（項目７９）
前記バイオ燃料が主に水素化テルペノイドから構成される、項目７０に記載のバイオ燃料組成物。
（項目８０）
前記水素化テルペノイドの大部分がファルネサン（ｆａｒｎｅｓａｎｅ）、リモナン（ｌｉｍｏｎａｎｅ）、またはその両方から構成される、項目７９に記載のバイオ燃料組成物。
（項目８１）
前記バイオ燃料が水素化バイオマスである、項目７０に記載のバイオ燃料組成物。
（項目８２）
前記水素化バイオマスの大部分が直鎖アルカンおよび分枝状アルカンの混合物を含む、項目８１に記載のバイオ燃料組成物。
（項目８３）
組換えＣ１代謝非光合成微生物であって、前記微生物が、親または基準のＣ１代謝非光合成微生物と比較して増大したレベルの脂肪酸を蓄積するか、または脂肪酸を過剰発現する、組換えＣ１代謝非光合成微生物。
（項目８４）
前記組換えＣ１代謝非光合成微生物が細菌または酵母である、項目８３に記載の組換えＣ１代謝非光合成微生物。
（項目８５）
前記組換えＣ１代謝細菌がメタン資化性菌またはメチロトローフ菌である、項目８４に記載の組換えＣ１代謝非光合成微生物。
（項目８６）
前記親または基準の細菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｙ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１
）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその任意の組み合わせである、項目８４に記載の組換えＣ１代謝非光合成微生物。
（項目８７）
前記組換えＣ１代謝細菌がシンガス代謝細菌である、項目８４に記載の組換えＣ１代謝非光合成微生物。
（項目８８）
前記親または基準のシンガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその組み合わせである、項目８７に記載の組換えＣ１代謝非光合成微生物。
（項目８９）
前記組換えＣ１代謝非光合成微生物が、脂肪酸産生酵素、ホルムアルデヒド同化酵素、またはその任意の組み合わせをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、項目８３〜８８のいずれか１項に記載の組換えＣ１代謝非光合成微生物。
（項目９０）
前記異種ポリヌクレオチドが、チオエステラーゼ、マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、またはその任意の組み合わせをコードする、項目８９に記載の組換えＣ１代謝非光合成微生物。
（項目９１）
前記チオエステラーゼが、前記Ｃ１代謝非光合成微生物にコドン最適化されている、項目９０に記載の組換えＣ１代謝非光合成微生物。
（項目９２）
前記マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼがコドン最適化した大腸菌ｆａｂＤである、項目９０に記載の組換えＣ１代謝非光合成微生物。
（項目９３）
前記アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼがコドン最適化した大腸菌ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ａｃｃＤ、またはその任意の組み合わせである、項目９０に記載の組換えＣ１代謝非光合成微生物。
（項目９４）
前記組換えＣ１代謝微生物が、脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を最小にするか排除する変異をさらに含む、項目９０に記載の組換えＣ１代謝非光合成微生物。
（項目９５）
Ｃ１代謝非光合成微生物バイオマスであって、前記バイオマスのδ１３Ｃが約−３０‰未満である、Ｃ１代謝非光合成微生物バイオマス。
（項目９６）
前記バイオマスのδ１３Ｃが約−４０‰〜約−６０‰の範囲である、項目９５に記載のバイオマス。
（項目９７）
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が細菌または酵母である、項目９５または９６に記載の
バイオマス。
（項目９８）
前記Ｃ１代謝細菌がメタン資化性菌またはメチロトローフ菌である、項目９７に記載のバイオマス。
（項目９９）
前記細菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｙ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ
ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその任意の組み合わせである、項目９８に記載のバイオマス。
（項目１００）
前記Ｃ１代謝細菌がシンガス代謝細菌である、項目９７に記載のバイオマス。
（項目１０１）
前記シンガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその組み合わせである、項目１００に記載のバイオマス。
（項目１０２）
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、脂肪酸産生酵素、ホルムアルデヒド同化酵素、またはその任意の組み合わせをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換えＣ１代謝非光合成微生物である、項目９５〜１０１のいずれか１項に記載のバイオマス。
（項目１０３）
前記異種ポリヌクレオチドが、チオエステラーゼ、マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、またはその任意の組み合わせをコードする、項目１０２に記載のバイオマス。
（項目１０４）
前記チオエステラーゼが、前記Ｃ１代謝非光合成微生物にコドン最適化されている、項目１０３に記載のバイオマス。
（項目１０５）
前記マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼがコドン最適化した大腸菌ｆａｂＤである、項目１０３に記載のバイオマス。
（項目１０６）
前記アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが、コドン最適化した大腸菌ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ａｃｃＤ、またはその任意の組み合わせである、項目１０３に記載のバイオマス。
（項目１０７）
前記Ｃ１代謝微生物が、脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を最小にするか排除する変異をさらに含む、項目１０３に記載のバイオマス。
（項目１０８）
前記バイオマスが組換えＣ１代謝非光合成微生物の培養物由来の使用済み培地上清組成物を含み、前記使用済み培地組成物のδ１３Ｃが約−３０‰未満である、項目９５〜１０７のいずれか１項に記載のバイオマス。
（項目１０９）
油組成物を前記使用済み培地組成物から抽出するか濃縮する、項目９５〜１０８のいずれか１項に記載のバイオマス。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本開示の一定の実施形態によるメタン捕捉およびアルカン燃料への変換のためのＣ１代謝微生物反応装置系の例示的な概念モデルを示す。
【図２】図２は、本開示の一定の実施形態によるメタン捕捉およびバイオディーゼルへの変換のためのＣ１代謝微生物反応装置系の例示的な概念モデルを示す。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、ＴｅｓＡ’（周辺質ターゲティング配列を除去した大腸菌由来のＴｅｓＡ遺伝子）を発現する組換えＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓにより、（Ａ）遊離脂肪酸産生が増加し、（Ｂ）この増加が主にＣ１６：０脂質レベルおよびＣ１８：０脂質レベルの増加に起因することを示す。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、トルエン：メタノール中でのＫＯＨを使用した加水分解およびエステル交換反応の前（Ａ）および後（Ｂ）のＭ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍから抽出した油組成物のＧＣ／ＭＳクロマトグラムを示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、トルエン：メタノール中でのＫＯＨを使用した加水分解およびエステル交換反応の前（Ａ）および後（Ｂ）のＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓから抽出した油組成物のＧＣ／ＭＳクロマトグラムを示す。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、トルエン：メタノール中でのＫＯＨを使用した加水分解およびエステル交換反応の前（Ａ）および後（Ｂ）のＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａから抽出した油組成物のＧＣ／ＭＳクロマトグラムを示す。
【図７】図７は、種々の炭素供給源のδ１３Ｃ分布の略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本開示は、Ｃ１代謝微生物をバイオオイルの蓄積を最大にしたバイオマスを生成するように培養する、バイオ燃料およびバイオプラスチックを生成するための組成物、方法、およびシステムを提供する。例えば、規模を変更可能な商業的プロセスであるメタンからバイオ燃料への発酵プロセスを提供する。この新規のアプローチは、例えば、メチロトローフ細菌またはメタン資化細菌を、例えば、水素処理のためのエステル化したバイオディーゼルまたはアルカン燃料の形態またはバイオプラスチックのためのポリヒドロアルカノアート（ＰＨＡ）の形態でバイオ燃料のためのバイオマスを生成するための新規の宿主系として使用することができる。さらに、目的の油組成物を、メチロトローフ細菌またはメタン資化細菌から得ることができる。何故なら、これらの生物は本明細書中に記載の条件下でかなりの量の膜脂質を蓄積することができ、さらに、これらの微生物は膜成分を大量に産生するからである。
【００１８】
種々の供給源（天然ガスが含まれる）由来のメタンが豊富な国内資源であるという背景がある。燃料としてのメタンの使用を改良するためのガス・トゥー・リキッド（ＧＴＬ）テクノロジーの化学的開発アプローチは、現在、懸命な調査にもかかわらずその成功は一部のみに制限されている。対照的に、ＧＴＬプロセスの開発に対して現代の生物工学的アプローチを適用する努力はほとんどなされていない。いくつかの制限（最も注目すべきは糖供給材料のコスト）により、微生物系を使用したバイオ燃料の経済的生産が阻止されている。安価で国内に豊富な炭素供給材料（メタンなど）の活用により、経済的に持続可能なバイオ燃料生産の代替法が得られる。新規の生物工学ツールおよび技術を使用して本明細書中に記載の工業規模のＧＴＬバイオプロセスを得るための新規の生産微生物を開発した。さらに、抽出した脂質の精製および品位向上後の燃料特性により、ディーゼル、ガソリン、ジェット燃料、またはオレフィンなどにドロップイン型として適用される可能性がある。
【００１９】
１つの態様では、本開示は、精製ユニット中でＣ１代謝非光合成微生物由来の油組成物を精製して燃料を生産することによって燃料を作製する方法を提供する。さらに、本開示は、Ｃ１代謝非光合成微生物を主に含む培養物由来のバイオマスを油組成物に変換し、油組成物を燃料に精製することによる燃料を作製するための方法を提供する。別の態様では、本開示は、油組成物がＣ１代謝非光合成微生物に由来する処理ユニットおよび油組成物を精製して燃料を生産するための精製ユニットを含むバイオリファイナリーを提供する。
【００２０】
さらに別の態様では、本開示は、水素原子および炭素原子を含む分子を有し、水素原子および炭素原子が組成物の重量の少なくとも約５０％〜約９９％であり、組成物のδ１３Ｃが−３０‰未満であるか約−７０‰〜約−３５‰の範囲であるか、燃料成分とブレンドして燃料生成物を生産する場合、約−３７‰〜約−１０‰の範囲である油組成物または油組成物に由来するバイオ燃料組成物を提供する。１つの関連する態様では、本開示は、δ１３Ｃが−３０‰未満であるか、約−３５‰〜約−５０‰、−４５‰〜約−３５‰、または約−５０‰〜約−４０‰、または約−４５‰〜約−６５‰、または約−６０‰〜約−７０‰、または約−３０‰〜約−７０‰の範囲であるバイオマスを提供する。
【００２１】
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書中で使用すべき一定の用語を定義することがその理解の一助となるかもしれない。本開示を通して、さらなる定義を説明する。
【００２２】
本説明において、任意の濃度範囲、百分率の範囲、比の範囲、または整数範囲は、他で示さない限り、引用した範囲内の任意の整数値および、適切な場合、その分数（整数の１／１０および１／１００など）が含まれると理解すべきである。また、任意の物理的特徴（ポリマーサブユニット、サイズ、または厚さなど）に関する本明細書中に引用した任意の数字は、他で示さない限り、引用した範囲内の任意の整数が含まれると理解すべきである。本明細書中で使用する場合、用語「約」は、他で示さない限り、表示の範囲、値、または構造の±２０％を意味する。用語「本質的に〜からなる」は、特定の材料もしくは工程、または特許請求の範囲に記載の発明の基本的特徴および新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料もしくは工程に特許請求の範囲の範囲を制限する。用語「ａ」および「ａｎ」は、本明細書中で使用する場合、列挙した成分の「１つ以上」をいうと理解すべきである。選択肢（例えば、「または（ｏｒ）」）の使用は、選択肢の一方、両方、またはその任意の組み合わせを意味すると理解すべきである。本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」を、同意語として使用し、これらの用語およびその異形が本発明を制限しないと解釈することを意図する。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、「Ｃ１基質」または「Ｃ１化合物」は、炭素−炭素結合を欠く分子または組成物を含む任意の炭素をいう。例示的なＣ１基質には、天然ガス、非従来型天然ガス、シンガス、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸またはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチル化アミン（例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミンなど）、メチル化チオール、メチルハロゲン（例えば、ブロモメタン、クロロメタン、ヨードメタン、ジクロロメタンなど）、シアン化物、またはその任意の組み合わせが含まれる。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、「Ｃ１代謝微生物」または「Ｃ１代謝非光合成微生物」は、Ｃ１基質をエネルギー源としてか、エネルギーおよびバイオマスのその主要な供給源として使用する能力を有する任意の微生物をいい、この微生物は他の炭素基質（糖および複合糖質など）をエネルギーおよびバイオマスのために使用してもしなくても良い。例えば、Ｃ１代謝微生物は、Ｃ１基質（メタンまたはメタノールなど）を酸化することができる。Ｃ１代謝微生物には、細菌（メタン資化性菌およびメチロトローフ菌など）および酵母が含まれる。一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物には光合成微生物（藻類など）が含まれない。一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、その唯一のエネルギー源がＣ１基質であることを意味する「偏性Ｃ１代謝微生物」であろう。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）を、Ｃ１基質供給材料の存在下で（すなわち、エネルギー源としてＣ１基質を使用して）培養するであろう。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、用語「メチロトローフ性細菌」は、少なくとも１つの炭素を含み、且つ炭素−炭素結合を含まない任意の形態（例えば、固体、液体、気体）の任意の化合物を酸化することができる任意の細菌をいう。一定の実施形態では、メチロトローフ性細菌は、メタン資化性菌であり得る。例えば、「メタン資化性細菌」は、炭素およびエネルギーの供給源としてメタンを酸化する能力を有し、メタンが炭素およびエネルギーの主な供給源であり得る任意のメチロトローフ性細菌をいう。例示的なメタン資化性細菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、またはＭｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓが含まれる。一定の実施形態では、メチロトローフ性細菌は「偏性メチロトローフ性細菌」であり、これは、エネルギーの生成がＣ１基質の使用に制限される細菌をいう。一定の実施形態では、メチロトローフ性細菌は、Ｃ１基質に加えてその炭素源およびエネルギー源として多炭素基質（酢酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、またはエタノールなど）を天然に使用することができる「通性メタン資化性細菌」である。通性メタン資化性菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａのいくつかの種（例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｄａｌｔｏｎａ  ＳＢ２、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｂｒｙｏｐｈｉｌａ、およびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ  ａｕｒｅａ  ＫＹＧ）、およびＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）が含まれる。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、用語「ＣＯ利用細菌」は、炭素およびエネルギーの供給源として一酸化炭素（ＣＯ）を酸化する能力を天然に保有する細菌をいう。一酸化炭素を、「合成ガス」または「シンガス」（任意の有機供給材料（石炭、石油、天然ガス、バイオマス、または廃棄有機物など）の気化によって生産される一酸化炭素と水素との混合物）から利用することができる。ＣＯ利用細菌には、その炭素源としてＣＯで成長するように遺伝子改変されなければならない細菌は含まれない。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、「シンガス」は、一酸化炭素（ＣＯ）および水素（Ｈ２）を含む混合物をいう。シンガスは、ＣＯ２、メタン、ならびにＣＯおよびＨ２より少量の他のガスも含むことができる。
【００２８】
「成長」を、細胞集団の増加と定義する。これは、特定の化合物またはポリマー（一定の脂質など）の蓄積に起因して細胞集団が増加する場合、「均衡的成長」中または「不均衡的成長」中に細胞分裂（複製）および新規細胞の形成によって起こり得る。後者の場合、細胞内のバイオポリマーの蓄積に起因する細胞サイズの増加として成長を示し得る。
【００２９】
「均衡的細胞成長」中、全ての供給材料（電子供与体および電子受容体）および全ての栄養素は、細胞の全高分子成分を作製するのに必要な比で存在する。すなわち、供給材料または栄養素は、タンパク質、複合糖質ポリマー、脂肪、または核酸の合成を制限しない。対照的に、「不均衡的細胞成長」中、１つ以上の細胞の高分子を作製するのに必要な供給材料または栄養素が均衡的成長に必要な量または比で存在しない。したがって、この供給材料または栄養素が律速となり、「制限的栄養素」という。
【００３０】
いくつかの細胞は不均衡的条件下で依然として正味の成長を達成することができるが、その成長は不均衡的であり、制限的な供給材料または栄養素の非存在下で合成することができるポリマーが蓄積するであろう。これらのポリマーには、脂質または細胞内貯蔵生成物（ポリヒドロキシアルカノアート（ｐｏｌｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）（ＰＨＡ）（ポリヒドロキシブチラート（ＰＨＢ）、ポリヒドロキシバレラート（ＰＨＶ）、およびポリヒドロキシヘキサノアート（ＰＨＨｘ）−グリコーゲンが含まれる）、または分泌物（細胞外ポリサッカリドなど）など）が含まれる。かかる油組成物は、バイオプラスチックの生産で有用である。
【００３１】
例示的な均衡的成長条件および不均衡的成長条件は、培地中の窒素含有量が異なり得る。例えば、窒素は乾燥細胞重量の約１２％を構成し、これは、１００ｍｇ／Ｌの乾燥細胞重量を成長させるために１２ｍｇ／Ｌの窒素（例えば、必要な化学量論比の供給材料および他の栄養素と共に硝酸塩またはアンモニウム塩の形態で）を供給しなければならないことを意味する。理論に拘束されることを望まないが、これは、大気窒素のアンモニアへの固定（すなわち、窒素固定による）が生合成中間体または細胞成分のための有意な窒素源ではないと考えられる。他の供給材料および栄養素が１００ｍｇ／Ｌの乾燥細胞重量を産生するのに必要な量で利用可能であるが１２ｍｇ／Ｌ未満の窒素しか供給されない場合、不均衡的細胞成長が起こり得、窒素を含まないポリマーが蓄積される。その後に窒素が供給される場合、貯蔵されたポリマーが細胞のための供給材料としての機能を果たして均衡的成長が起こり得、新規の細胞が複製および産生される。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、用語「成長サイクル」は、細胞または微生物に適用する場合、細胞または微生物が培養条件下で移動する代謝サイクルをいう。例えば、サイクルは、種々の段階（遅滞期、指数期、指数期末期、および静止期など）を含み得る。
【００３３】
用語「指数増殖」、「指数期増殖」、「対数期」、または「対数期増殖」は、微生物が成長および分裂する速度をいう。例えば、対数期中、微生物は、その遺伝的潜在能力、培地の性質、および微生物が成長する条件を前提としてその最大の速度で成長している。微生物の成長速度は指数期に一定であり、微生物は一定間隔で分裂してその数が倍増する。「活発に成長する」細胞は、対数期に成長している細胞である。対照的に、「静止期」は、培養物の細胞成長が遅延してさらに停止する成長サイクルの時点をいう。用語「成長変更環境」は、細胞成長を阻害するか細胞を死滅させる能力を有するエネルギー、化学物質、または生物をいう。阻害剤には、変異誘発物質、薬物、抗生物質、ＵＶ光、極端な温度、ｐＨ、代謝副産物、有機化合物、無機化合物、細菌、またはウイルスなどが含まれ得る。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、「高成長バリアント」は、唯一または主な炭素源およびエネルギー源としてＣ１基質（メタンまたはメタノールなど）を使用して成長することができ、親、基準、または野生型の生物、微生物、細菌、酵母、または細胞よりも速い指数期増殖速度を有する生物、微生物、細菌、酵母、または細胞をいう。すなわち、高成長バリアントは、親細胞と比較してより速い倍加時間を有し、結果的に、成長速度および代謝されたＣ１基質１グラムあたりの細胞集団の収率が高い（例えば、米国特許第６，６８９，６０１号を参照のこと）。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「バイオ燃料」は、少なくとも部分的に「バイオマス」に由来する燃料をいう。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「バイオマス」または「生物材料」は、１つ以上のホールセル、溶解細胞、または細胞外物質などを含み得る生物起源の有機材料をいう。例えば、培養微生物（例えば、細菌または酵母の培養物）から回収した材料はバイオマスとみなされ、これは、細胞、細胞膜、細胞質、封入体、培養培地内に分泌または排出された生成物、またはその任意の組み合わせを含み得る。一定の実施形態では、バイオマスは、本開示のＣ１代謝微生物が成長した培養培地と共に本開示のＣ１代謝微生物を含む。他の実施形態では、バイオマスは、Ｃ１基質（例えば、天然ガス、メタン）上で成長した培養物から回収した本開示のＣ１代謝微生物（ホールセルまたは溶解細胞またはその両方）を含む。さらなる他の実施形態では、バイオマスは、Ｃ１基質上で培養したＣ１代謝微生物の培養物由来の使用済み培地上清を含む。かかる培養物を再生可能資源と見なすことができる。
【００３７】
本明細書中で使用する場合、「油組成物」は、バイオマス（例えば、細菌培養物）の脂質成分（脂肪酸、脂肪酸エステル、トリグリセリド、リン脂質、ポリヒドロキシアルカノアート（ｐｏｌｙｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）、イソプレン、またはテルペンなどが含まれる）をいう。バイオマスの油組成物を、本明細書中に記載の方法（ヘキサン抽出またはクロロホルム抽出など）によってバイオマス材料の残存物から抽出することができる。さらに、「油組成物」を、培養物の任意の１つ以上の領域（細胞膜、細胞質、封入体、培養培地内の分泌物または排出物、またはその任意の組み合わせが含まれる）で見出すことができる。油組成物は、天然ガスでも原油でもない。
【００３８】
本明細書中で使用する場合、用語「宿主」は、目的のポリペプチド（例えば、チオエステラーゼ［ｔｅｓＡ］、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ［ａｃｃＡＢＣＤ］、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ［ｆａｂＤ］）を産生するために外因性核酸分子を使用して遺伝子改変することができる細胞または微生物（例えば、メタン資化性菌）をいう。一定の実施形態では、宿主細胞は、脂質生合成に関連するか関連しない所望の性質を付与する他の遺伝子改変を任意選択的に既に保有し得るか含むように改変することができる（例えば、欠失、変更、または短縮された長鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ［ｆａｄＤ］）。例えば、宿主細胞は、脂肪酸の分解を最小にするか減少させ、宿主細胞の成長抑制物質の産生を最小にするか減少させ、高成長、夾雑物質または特定の培養条件に対する耐性（例えば、酸耐性、殺生物剤耐性）、さらなる炭素基質を代謝する能力、またはさらなる所望の生成物または中間体を合成する能力を付与する遺伝子改変を有し得る。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、「組換え」また「非天然」は、少なくとも１つの遺伝子変化を有するか、異種核酸分子の導入によって改変されている生物、微生物、細胞、核酸分子、またはベクターをいうか、内因性の核酸分子または遺伝子の発現を調節することができるように変化した細胞をいう。組換えはまた、１つ以上のかかる改変を有する細胞または細胞の子孫由来の細胞をいう。遺伝子変化には、例えば、タンパク質もしくは酵素をコードする発現可能な核酸分子を導入する改変、または他の核酸分子の付加、欠失、置換、または細胞の遺伝子材料の他の機能的変化が含まれる。例えば、組換え細胞は、未変性細胞（すなわち、非改変細胞または野生型細胞）内に同一形態で見出されない遺伝子もしくは他の核酸分子または内因性遺伝子の発現パターンを変化させ得る遺伝子もしくは他の核酸分子（過剰発現、過小発現、最小発現するか、全く発現しない可能性がある遺伝子）を発現することができる。
【００４０】
微生物内での外因性核酸または異種核酸の組換え発現方法は当該分野で周知である。かかる方法を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）中に見出すことができる。例示的な発現すべき外因性のタンパク質または酵素には、チオエステラーゼ、１つ以上のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ、またはその任意の組み合わせが含まれる。酵素をコードする核酸分子またはその機能的フラグメントの遺伝子改変により、その天然に存在する状態から変化した組換え細胞に生化学的能力または代謝能力を付与することができる。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、用語「内因性」または「未変性」は、宿主細胞内に通常存在する遺伝子、タンパク質、化合物、または活性をいう。用語「同種」または「ホモログ」は、宿主細胞、種、または株で見いだされるか由来する分子または活性と同一または類似する分子または活性である外因性（外来）供給源由来の分子または活性をいう。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「異種」核酸分子、構築物、または配列は、類似の条件下における未変性発現レベルと比較して発現される細胞を起源としない核酸分子もしくは核酸分子配列の一部、変化または変異した宿主細胞を起源とする核酸分子もしくは核酸分子の一部、または発現が変化した核酸分子をいう。例えば、異種調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）を使用して、天然または培養において通常発現する遺伝子または核酸分子と異なる方法で遺伝子または核酸分子の発現を調節することができる。一定の実施形態では、異種核酸分子は未変性の宿主細胞遺伝子と同種であり得るが、異なる発現レベルまたは異なる配列またはその両方を有し得る。他の実施形態では、異種または外因性の核酸分子は、宿主細胞または宿主ゲノムに対して内因性でない可能性があるが、その代わりに接合、形質転換、トランスフェクション、またはエレクトロポレーションなどによって宿主細胞に付加されたかもしれず、付加した分子が宿主ゲノムに取り込まれ得るか、染色体外遺伝子材料（例えば、プラスミドまたは他の自己複製ベクター）として存在することができる。
【００４３】
一定の実施形態では、１つを超える異種または外因性の核酸分子を、個別の核酸分子としてか、ポリシストロニック核酸分子としてか、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子としてか、またはその任意の組み合わせとして宿主細胞に導入することができ、これを依然として１つを超える異種または外因性の核酸と見なすことができる。例えば、Ｃ１代謝微生物を、１つ以上の本明細書中に開示のチオエステラーゼをコードする同一または異なり得る２つ以上の異種または外因性の核酸分子を発現するように改変することができる。一定の実施形態では、ポリヌクレオチド分子をコードするチオエステラーゼ（ＴＥ）の複数のコピー（ポリヌクレオチドをコードする同一のＴＥまたは異なるＴＥの２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるコピーであり得る）を宿主細胞に導入する。
【００４４】
２つ以上の外因性核酸分子を宿主Ｃ１代謝微生物に導入する場合、２つ以上の（ｔｗｏ
ｍｏｒｅ）外因性核酸分子を、（例えば、単一のベクター上の）単一の核酸分子として導入し、個別のベクター上で、宿主染色体内の単一の部位または複数の部位に取り込むことができ、これらの各実施形態は依然として２つ以上の外因性核酸分子と見なすべきであると理解される。したがって、基準となる異種核酸分子数またはタンパク質活性数はコード核酸分子数またはタンパク質活性数をいい、宿主細胞に導入される個別の核酸分子数をいわない。
【００４５】
２つ以上の核酸配列間の「同一率（％）」は、２つ以上の配列のアラインメントを最適にするために導入する必要があるギャップ数および各ギャップの長さを考慮した配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一率（％）＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２つ以上の配列の間の配列の比較および同一率（％）の決定を、数学アルゴリズム（デフォルトパラメーターでのＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムなど）を使用して行うことができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴでのＢＬＡＳＴＮも参照のこと）。
【００４６】
「保存的置換」は、当該分野で、あるアミノ酸の類似の性質を有する別のアミノ酸への置換と認識されている。例示的な保存的置換は、当該分野で周知である（例えば、ＷＯ９７／０９４３３号，ｐ．１０；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ（１９９０），ｐ．８を参照のこと）。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、「過剰発現」は、遺伝子またはタンパク質に関して言及する場合、遺伝子またはタンパク質の発現または活性の増加を意味する。発現または活性の増加には、野生型（遺伝子操作されていない）コントロール微生物または基準微生物のレベルを超えた遺伝子またはタンパク質の発現または活性の増加が含まれる。遺伝子またはタンパク質は、通常は発現することも活性であることもない微生物で発現または活性が生じる場合に過剰発現される。遺伝子またはタンパク質は、発現または活性が野生型コントロール微生物または基準微生物内よりも組換え微生物内で広範または長期間存在する場合に過剰発現される。
【００４８】
「阻害する」または「阻害された」は、本明細書中で使用する場合、コントロール、内因性、または基準の分子と比較した標的遺伝子の発現または標的分子（例えば、長鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ）の活性の直接的または間接的な変更、減少、下方制御、抑止、または欠失をいい、ここで、変更、減少、下方制御、または抑止は、統計的、生物学的、産業的、または臨床的に有意である。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、「バイオリファイナリー」は、バイオマス変換プロセスとバイオマスから燃料を生産するための装置とを統合した施設をいう。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、「精製所」は、油組成物（例えば、バイオマス、バイオ燃料、または粗製油、石炭、もしくは天然ガスなどの化石燃料）を処理することができる精油所またはその態様をいう。かかる精製所で行われる例示的なプロセスには、クラッキング、エステル交換反応、改質、蒸留、水素化処理（ｈｙｄｒｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、異性化、またはその任意の組み合わせが含まれる。
【００５１】
バイオ燃料生産システム
本開示のバイオ燃料の生成システムは、個別のユニット（例えば、相互に近接または隣接しているか、そのどちらでもない）、統合されたユニットを含むことができるか、システム自体を相互に接続して部分的または完全に統合することができる。本開示のシステムは、燃料組成物および燃料生成物、特にバイオ燃料を生成するために統合バイオリファイナリーで成長させた微生物由来のバイオマスを使用することができる。一定の実施形態では、バイオリファイナリーは、燃料（例えば、ディーゼル燃料、ジェット燃料、ガソリン）を生成するために単一のバイオマスまたは混合バイオマス（バイオマスとしてのＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、またはその高成長バリアントなど））など）を使用する。
【００５２】
例示的なバイオリファイナリーシステムを、図１に図示する。かかるシステムは、１つ以上の以下の工程を実施することができる：１つ以上の改良された性質（例えば、組換え、より高い成長率、高ｐＨでの成長能力、栄養素利用の改善、温度安定性、バイオマス収量の増加）を有し得る目的の微生物株（例えば、メタン資化性菌、メチロトローフ菌、または酵母）の培養、微生物からの油組成物（例えば、脂肪酸、トリグリセリド、リン脂質、イソプレン、テルペン、ＰＨＡ、またはその任意の組み合わせ）などの生成物の回収、およびプラスチック前駆体または１つ以上の燃料（ジェット燃料、ディーゼル燃料、ガソリン、またはその組み合わせなど）を生産するための油組成物の精製。異なるバイオ燃料組成物および生成物を、前記システムによって同時または連続的に生産することができる。例えば、本システムは、油組成物をジェット燃料およびディーゼルに変換することができる水素処理のプラントまたはユニットを含むことができる。本システムはまた、水素処理プラント由来の粗製油および生成物をガソリンに変換することができる石油精製所を含むことができる。例えば、ジェット燃料およびディーゼル燃料の生産により、ナフサおよび軽質炭化水素（プロパンが含まれる）などのさらなる生成物を得ることができ、次いで、これらをガソリン生成のために使用する。例示的な軽質炭化水素には、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ブタノール、およびイソブタノールが含まれる。別の例では、ガソリンの生産により、ディーゼルなどのさらなる生成物を得ることができ、これをジェット燃料生産のために使用することができる。
【００５３】
例示的な代替バイオリファイナリーシステムを図２に図示する。かかるシステムは、１つ以上の以下の工程を実施することができる：１つ以上の改良された性質（例えば、組換え、より高い成長率、高ｐＨでの成長能力、栄養素利用の改善、温度安定性、バイオマス収量の増加）を有し得る目的の微生物株（例えば、メタン資化性菌、メチロトローフ菌、または酵母）の培養、微生物からの油組成物（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、トリグリセリド、リン脂質、イソプレン、テルペン、ＰＨＡ、またはその任意の組み合わせ）などの生成物の回収、およびバイオディーゼル組成物を生産するための油組成物の精製。例えば、本システムは、アルコールとの反応によって油組成物をバイオディーゼルに変換することができるエステル化のプラントまたはユニットを含むことができる。例示的なアルコールには、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、またはより長い鎖の脂肪アルコールが含まれる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示のシステムは、微生物として細菌（メチロトローフ菌またはメタン資化性菌など）または酵母を使用する。細菌または酵母を、培養培地から収集して分離し（そうでない場合、例えば、バイオフィルムとして成長させる）、それにより、細菌または酵母のペーストを得ることができる。細菌または酵母のバイオマスを、任意選択的に、バイオマスから油組成物を得る前に乾燥させることができる。一定の実施形態では、細菌または酵母のバイオマスはいくらか湿ったままであり、油組成物を誘導、分離、または抽出する前に完全に乾燥している必要はない。細菌または酵母の油組成物をバイオマスから抽出し、細菌または酵母の固体またはスラッジから分離することができる。
【００５５】
油組成物を、種々の異なる方法または溶媒（例えば、極性溶媒、非極性溶媒、中性溶媒、酸性溶媒、塩基性溶媒、ヘキサン、またはその組み合わせ（ヘキサンまたは酸性メタノールまたはクロロホルム／メタノール混合物など））を本明細書中により詳細に記載のプロセスまたは当該分野で公知の他の抽出方法などのプロセスで使用して抽出することができる。
【００５６】
一定の実施形態では、収集したバイオマス内に含まれるＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）油組成物を、有機溶媒（例えば、ヘキサン）との高剪断接触および調整剤を使用してバイオマスから分離する。背景として、油はヘキサンまたは他の類似の溶媒に溶解してミセラ溶液を形成するのに対して、水および細胞固体は溶解せず、ミセラから分離することができる。水およびヘキサンの不混和性を使用して、望ましい分離を行う。一定の実施形態では、高剪断混合後、油組成物／ヘキサン／水混合物を、デカンターに移して２つの異なる液体（上層のヘキサンおよび油組成物相（ミセラ）および下層の水および使用済み固体の相）に分離する。なおさらなる実施形態では、デカンター由来のミセラを蒸留プロセスに流し込み、このプロセスで油組成物を溶媒から分離し、それによって溶媒が回収および再利用され、油を下流処理される段階まで精製する。蒸留は、例えば、２成分を分離するために溶媒と油の沸点の違いを活用する。
【００５７】
一定の実施形態では、本開示の油組成物を精製する。精製には、クラッキング、エステル交換反応、改質、蒸留、水素化処理、異性化、またはその組み合わせが含まれ得る。任意選択的に、精製は、夾雑物質の除去を含み得る。例えば、ヘテロ原子および金属を、水素処理（例えば、水素化脱窒素（ＨＤＮ）、水素化脱酸素（ＨＤＯ）、水素化脱硫（ＨＤＳ）、水素化脱金属（ＨＤＭ））によって除去することができる。水素処理はまた、オレフィンの飽和、留出油水素処理、真空ガスオイル水素処理、固定床残渣水素処理、またはその組み合わせであり得る。油組成物の水素処理は、ジェット燃料またはディーゼルを生産することができる。油組成物を、クラッキング（接触分解など）によって精製してガソリンを生産することもできる。代表的なクラッキングプロセスには、接触分解、流動接触分解、水蒸気分解、水素添加分解、熱分解、接触熱分解、またはその組み合わせが含まれ得る。水素処理およびクラッキングによる精製を、同時に（両方のプロセスを行う）または交互に（いずれか一方を行う）行うことができる。精製プロセスは、互いの後に行うこともでき、例えば、次いで、水素処理によって生産された生成物をクラッキングによって処理することができる。一方の精製プロセス由来の生成物（例えば、Ｈ２）を、他方の精製プロセスでさらに使用することもできる。精製プロセスは、システムの個別のユニットであり得るか、同一ユニット内に存在し得る。さらに、細菌または酵母の固体またはスラッジを使用して、燃料、動物用飼料、またはエネルギー（固体またはスラッジの消化から放出されたメタンなど）を生産することができる。
【００５８】
一定の実施形態では、本開示は、（ａ）油組成物がＣ１代謝非光合成微生物に由来する処理ユニット；および（ｂ）油組成物を精製して燃料を生産するための精製ユニットを含むバイオリファイナリーを提供する。さらなる実施形態では、バイオリファイナリーは、Ｃ１基質を含む供給材料の存在下でＣ１代謝非光合成微生物を培養するための制御培養ユニットをさらに含むことができ、前記培養細菌が油組成物を産生する。
【００５９】
例示的な制御培養ユニットには、発酵槽、バイオリアクター、中空繊維セル、または充填ベッドバイオリアクターなどが含まれる。さらなる実施形態では、培養物を液相発酵または固相発酵の形態で成長させることができる。例えば、細菌（メチロトローフ菌またはメタン資化性菌など）を、一定の脂質または目的の他のポリマー（例えば、ＰＨＡ）が細胞内に蓄積するようにリン、窒素、微量元素、酸素、またはその任意の組み合わせの量が制限された平衡培地または非平衡培地を含むバイオリアクター中で培養することができる。
【００６０】
一定の実施形態では、培養物は、高レベルの目的の油組成物（すなわち、高ｗ／ｗ比の脂質：バイオマス）を生産する細菌集団（種々のメチロトローフ菌またはメタン資化性菌が含まれる）を含む。一定範囲のバイオリアクター配置（シーケンシングメンブレンバイオリアクターおよび連続多段階分散成長配置が含まれる）を使用することができる。一定の実施形態では、バイオリアクターを、メタンから目的の油組成物を効率的に生産する細菌を選択するように操作する。例えば、バイオリアクター条件を、メタンから目的の油組成物を生産することも、かかる組成物を非効率的に生産することもない細菌について選択することができる。
【００６１】
さらなる実施形態では、本開示は、Ｃ１基質（例えば、メタンまたはシンガス）を気相で固相発酵中の微生物バイオフィルムに送達させる制御培養ユニットを提供する。他の実施形態では、均衡的または不均衡的成長条件を固相発酵で確立する。さらなる他の実施形態では、メチロトローフ菌またはメタン資化性菌を、均衡的成長条件下で成長させ、液相から収集して分離し、Ｃ１基質が不均衡的条件（例えば、窒素が含まれない条件）下で送達される固相発酵チャンバーに移し、細菌が基質を消費して目的の油組成物を生成する。
【００６２】
一定の実施形態では、本開示は、（ａ）Ｃ１基質を含む供給材料の存在下でＣ１代謝非光合成微生物を培養するための制御培養ユニットであって、培養細菌が油組成物を産生する、制御培養ユニット；（ｂ）油組成物がＣ１代謝非光合成微生物に由来するかこの微生物から抽出される処理ユニット；および（ｃ）油組成物を精製して燃料を生産するための精製ユニットを含むバイオリファイナリーを提供する。さらなる実施形態では、バイオリファイナリーで使用される供給材料のＣ１基質は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸またはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、シンガス、メチルアミン、メチルチオール、またはメチルハロゲンである。
【００６３】
さらなるバイオリファイナリー実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物はメチロトローフ菌またはメタン資化性菌であり、供給材料であるＣ１基質は天然ガスまたはメタンであり、細菌を好気性条件下で培養する。さらなる実施形態では、メタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、その任意の組み合わせ、またはその高成長バリアントであり、メチロトローフ菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ、その任意の組み合わせ、またはその高成長バリアントである。一定の他の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、偏性Ｃ１代謝非光合成微生物（偏性メタン資化性菌またはメチロトローフ菌など）である。
【００６４】
さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、脂肪酸産生酵素、ホルムアルデヒド同化酵素、またはその組み合わせをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え微生物である。例えば、燃料または他の価値の高い化学物質の生産のための前駆体として使用することができる遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の生合成を、本開示のＣ１代謝非光合成微生物（例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ）へのチオエステラーゼ（ＴＥ）遺伝子の導入によって増強することができる。ＦＦＡの生合成を、１つを超えるＴＥ遺伝子、マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ（ＦａｂＤ、ＭＣＴとも呼ばれる）遺伝子、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼオペロン（ＡｃｃＡＢＣＤ）由来の１つ以上の遺伝子、またはその任意の組み合わせを任意選択的に導入することによって増強することもできる。一定の実施形態では、脂肪酸生合成の第１の関与段階がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）依存性アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼによるアセチル−ＣｏＡからマロニル−ＣｏＡへの変換およびその後のＦａｂＤ酵素によるマロニル−ＣｏＡのマロニル−ＡＣＰへの変換であるので、ＦＦＡの生産を、マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ（ＦａｂＤ、ＭＣＴとも呼ばれる）の過剰発現によって改良することができる。
【００６５】
さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、脂肪酸の分解を最小にするか減少させる遺伝子改変を含む組換え微生物である。例えば、Ｃ１代謝非光合成微生物は、１つ以上の内因性ｆａｄＤ遺伝子によってコードされる長鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を短縮またはノックアウトする１つ以上の変異を含む組換え微生物である。
【００６６】
野生型ＦａｄＤタンパク質をコードする核酸配列は、変異ｆａｄＤ遺伝子のデザインのための参照標準出発点である。例えば、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａ、Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、およびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉによってコードされる野生型ＦａｄＤタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦＨ００９３１．１、ＹＰ＿１１４０２１．１、ＹＰ＿００４５１２１４８．１、ＹＰ＿００２９６４８７１．１、およびＹＰ＿００３７８２０６５．１，にそれぞれ示されている。一定の実施形態では、上記タンパク質のいずれか１つをコードするｆａｄＤ遺伝子の核酸分子を、ｆａｄＤを変異するように個別に改変する。本明細書中の実施例２では、種々のＣ１代謝微生物由来のｆａｄＤ遺伝子を、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（配列番号１）、Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａ（配列番号３５）、Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（配列番号５２）、およびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（配列番号８５）由来の遺伝子の５’領域にいくつかの停止変異およびフレームシフトを組み込むように合成した。Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ｆａｄＤ遺伝子について、遺伝子の残存する５’末端および３’末端を元の読み枠（配列番号１８）を維持するように連結することができるように内部欠失を含む核酸分子を合成した。
【００６７】
ｆａｄＤ遺伝子配列が知られていない一定のＣ１代謝微生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）について、ゲノムを配列決定することができ、大腸菌のｆａｄＤホモログを、ｔｂｌａｓｔｎ検索（大腸菌ＦａｄＤのタンパク質配列を使用した翻訳されたヌクレオチド遺伝子配列の検索）によって同定する。例えば、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ｆａｄＤ遺伝子の核酸分子を、遺伝子の５’領域にいくつかの停止変異およびフレームシフトを組み込むように合成する。
【００６８】
一定の実施形態では、本明細書中に記載の方法を使用したＣ１代謝微生物への接合、エレクトロポレーション、または形質転換のために、変異ｆａｄＤ核酸分子をプラスミド発現ベクター（任意選択的にＣ１代謝微生物の複製起点を欠き、抗生物質耐性をコードする）にクローン化する。一定の実施形態では、相同組換えによってｆａｄＤ変異体を宿主細胞ゲノムに組み込み、それにより、長鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を欠くか最小量を有する組換え細胞が得られる。
【００６９】
一定の実施形態では、本開示のＣ１代謝微生物に導入されたＴＥ遺伝子、ＭＣＴ遺伝子、およびＡｃｃ遺伝子のいずれか１つまたは全てを過剰発現することができ、Ｃ１代謝微生物は、脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を最小にするか排除する変異（例えば、ｆａｄＤノックアウト）を任意選択的に有することができる。
【００７０】
一定の実施形態では、バイオリファイナリー処理ユニットは、湿式抽出、超臨界流体抽出、乾式抽出、熱抽出（例えば、水蒸気ストリッピング、水熱液化、高圧蒸解）、酵素加水分解（例えば、細胞壁の）、パルス電界抽出、微小気泡、または中空繊維抽出などによって油組成物を駆動することができる。さらなる実施形態では、湿式抽出は、極性溶媒、非極性溶媒、中性溶媒、酸性溶媒、塩基性溶媒、ヘキサン、またはその組み合わせの使用を含む。一定の実施形態では、油組成物は、Ｃ１代謝非光合成微生物の細胞膜に由来するかこれから抽出されるか、分泌または排出される場合、培養上清から回収するか、その組み合わせが可能である。さらなる実施形態では、バイオリファイナリーは、第２の処理ユニットをさらに含み、第２の処理ユニットは精製された油組成物由来の残留物質の処理のための排出物処理ユニットであり、排出物処理ユニットは嫌気性消化装置、好気性消化装置、またはその両方を含む。なおさらなる実施形態では、バイオリファイナリーは、Ｃ１代謝非光合成微生物の培養または維持で用いる排出物処理ユニットから少なくとも１つの生成物を送達するための導管をさらに含む。
【００７１】
なおさらなる実施形態では、バイオリファイナリー処理ユニットは制御培養ユニットをさらに含み、この制御培養ユニットは、培養および処理（例えば、抽出）を同一ユニットまたは同一チャンバーでさえも行うことができる固相発酵ユニットである。一定の実施形態では、培養／処理ユニットを組み合わせたバイオリファイナリーは、ＣＯ２、メタノール、またはＨ２Ｏを含む超臨界流体などによる超臨界流体抽出を含む。
【００７２】
一定の態様では、任意の上記バイオリファイナリーを統合している。
【００７３】
Ｃ１代謝微生物
本開示のＣ１代謝微生物は、天然であるか、適応させた株であるか（例えば、親株と比較して成長速度が改善され、総バイオマス収量が増加した株を選択するための発酵を実施する）、目的の脂質を産生するように（例えば、脂肪酸産生酵素、ホルムアルデヒド同化酵素、またはその組み合わせを発現するように遺伝子操作する）、成長速度を増加させるように、またはその両方のために組み換えによって改変することができる。一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、Ｃ１代謝非光合成微生物（藻類または植物など）ではない。
【００７４】
一定の実施形態では、本開示は、原核生物または細菌であるＣ１代謝微生物（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなど）を提供する。
【００７５】
さらなる実施形態では、Ｃ１代謝細菌はメタン資化性菌またはメチロトローフ菌である。例示的なメタン資化性菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、またはその組み合わせが含まれる。例示的なメチロトローフ菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその組み合わせが含まれる。
【００７６】
一定の実施形態では、Ｃ１基質供給材料を油組成物に変換する能力を有するメタン資化性細菌を遺伝子操作する。メタン資化性細菌は、炭素源およびエネルギー源としてメタンを酸化する能力を有する。メタン資化性細菌は、その炭素同化経路および内部膜構造に基づいて以下の３群に分類される：タイプＩ（γプロテオバクテリア綱）、タイプＩＩ（αプロテオバクテリア綱、およびタイプＸ（γプロテオバクテリア綱）。タイプＩメタン資化性菌は炭素同化のためにリブロース一リン酸（ＲｕＭＰ）経路を使用するのに対して、タイプＩＩメタン資化性菌はセリン経路を使用する。タイプＸメタン資化性菌はＲｕＭＰ経路を使用するが、セリン経路の酵素も低レベルで発現する。メタン資化性細菌には、炭素源およびエネルギー源のためにＣ１基質のみを利用することができる偏性メタン資化性菌ならびに炭素源およびエネルギー源としていくつかの多炭素基質を利用する能力を天然に有する通性メタン資化性菌が含まれる。
【００７７】
例示的な通性メタン資化性菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、およびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａのいくつかの種（例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｄａｌｔｏｎａ  ｓｔｒａｉｎ  ＳＢ２、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｂｒｙｏｐｈｉｌａ、およびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ  ａｕｒｅａ  ＫＹＧ）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、またはその高成長バリアントが含まれる。例示的な偏性メタン資化性細菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｙ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔａ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、およびＭｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、またはその高成長バリアントが含まれる。
【００７８】
なおさらなる実施形態では、本開示は、シンガス代謝細菌であるＣ１代謝微生物（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、またはその任意の組み合わせなど）を提供する。例示的なシンガス代謝細菌には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその任意の組み合わせが含まれる。
【００７９】
一定の他の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、酵母（Ｃａｎｄｉｄａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、またはＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａが含まれる）などの真核生物である。
【００８０】
一定の他の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、偏性Ｃ１代謝非光合成微生物（偏性メタン資化性菌またはメチロトローフ菌など）である。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、脂肪酸産生酵素、ホルムアルデヒド同化酵素、またはその組み合わせをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え微生物である。一定の実施形態では、本開示のＣ１代謝微生物に導入されたＴＥ遺伝子、ＭＣＴ遺伝子、およびＡｃｃ遺伝子のいずれか１つまたは全てを過剰発現することができ、Ｃ１代謝微生物は、脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を最小にするか排除する変異（例えば、ｆａｄＤノックアウト）を任意選択的に有することができる。
【００８１】
本開示の各微生物を、成長を助けることができる異種生物を有する単離培養物として成長させることができるか、１つ以上のこれらの細菌を混合培養物が生成されるように組み合わせることができる。なおさらなる実施形態では、本開示のＣ１代謝非光合成微生物は、偏性Ｃ１代謝非光合成微生物である。
【００８２】
任意の１つの上記Ｃ１代謝微生物を親または基準の宿主細胞として使用して、本開示の組換えＣ１代謝微生物を作製することができる。
【００８３】
コドン最適化
組換えタンパク質の発現は、その元の宿主の外部で困難であり得る。例えば、異なる細菌種間でコドン使用頻度の偏りの変動が認められている（Ｓｈａｒｐら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３３：１１４１，２００５）。組換えタンパク質の過剰発現は、その未変性の宿主内でさえも困難であり得る。一定の実施形態では、本明細書中に記載の宿主に導入すべき核酸分子（例えば、チオエステラーゼ、ｆａｂＤ、ａｃｃＡＢＣＤをコードする核酸）を、宿主への導入前に確実にタンパク質発現を効率的にするか増強するためにコドン最適化に供することができる。コドン最適化は、非天然ＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドを変更することなく宿主の典型的なコドン使用頻度を反映するための形質転換前の遺伝子または核酸のコード領域中のコドンの変更をいう。異種宿主中の最適な遺伝子発現のためのコドン最適化法は、以前に記載されている（例えば、Ｗｅｌｃｈら，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ７００２，２００９；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３４６，２００４；Ｗｕら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：Ｄ７６，２００７；Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓら，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７：２８５，２００６；米国特許出願公開第２０１１／０１１１４１３号および同第２００８／０２９２９１８号（その方法の開示全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００８４】
同様に、ポリペプチドバリアントをコードする本開示の外因性核酸分子を、上述の文献（米国特許第８，００５，６２０号；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら；Ｗｅｌｃｈら；Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓら；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら）に記載の生理遺伝学ベースの方法を使用してデザインすることができる。これらの方法によって生成された各変異ポリペプチドは、少なくとも５０％の活性（好ましくは１００％以上の活性）を保持し、基準または親野生型ポリペプチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一のポリペプチド配列を有するであろう。一定の実施形態では、変異ポリペプチドは、バリアントが目的を活性（例えば、チオエステラーゼ活性または脂肪酸産生）を保持することを条件として、基準または親野生型酵素と比較して所定の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、または１０またはそれを超えるか、２０、２５、または３０までの置換）を含むであろう。
【００８５】
一定の実施形態では、大腸菌、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｒｉｃｉｎｉｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、またはＪａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃｕｓのチオエステラーゼを、本開示のＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌、メチロトローフ菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）内での発現についてコドン最適化する。さらなる実施形態では、任意の１つ以上のコドン最適化されたチオエステラーゼ配列を、本開示のＣ１代謝微生物に導入する（例えば、形質転換する、接合する、エレクトロポレートする）。例示的なコドン最適化されたチオエステラーゼ配列を、（１）Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂについては配列番号３〜１３；（２）Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈについては配列番号２０〜３０；（３）Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａについては配列番号３７〜４７；（４）Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓについては配列番号５４〜６４；（５）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍについては配列番号７０〜８０；および（６）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉについては配列番号８７〜９７に記載している。
【００８６】
一定の実施形態では、大腸菌マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ（ｆａｂＤ）配列を、本開示のＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌、メチロトローフ菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）内での発現についてコドン最適化する。さらなる実施形態では、任意の１つ以上のコドン最適化されたｆａｂＤ配列を、本開示のＣ１代謝微生物に導入する（例えば、形質転換する、接合する、エレクトロポレートする）。例示的なコドン最適化されたｆａｂＤ配列を、（１）Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂについては配列番号２；（２）Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈについては配列番号１９；（３）Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａについては配列番号３６；（４）Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓについては配列番号５３；（５）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍについては配列番号６９；および（６）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉについては配列番号８６に記載している。
【００８７】
一定の実施形態では、１つ以上のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ配列（例えば、大腸菌由来のａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、およびａｃｃＤ）を、本開示のＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌、メチロトローフ菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）内での発現についてコドン最適化する。さらなる実施形態では、任意の１つ以上のコドン最適化されたＡｃｃ配列を、本開示のＣ１代謝微生物に導入する（例えば、形質転換する、接合する、エレクトロポレートする）。他の実施形態では、コドン最適化したａｃｃＡを導入するか、コドン最適化したａｃｃＡＢＣＤを導入する。例示的なコドン最適化されたａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、およびａｃｃＤ配列を、それぞれ、（１）Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂについては配列番号１４〜１７；（２）Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ
Ｂａｔｈについては配列番号３１〜３４；（３）Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａについては配列番号４８〜５１；（４）Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓについては配列番号６５〜６８；（５）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍについては配列番号８１〜８４；および（６）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉについては配列番号９８〜１０１に記載している。
【００８８】
形質転換法
本明細書中に記載の任意の組換えＣ１代謝微生物またはメタン資化性細菌を、新規または増強された活性（例えば、酵素活性）を有する宿主を得るために少なくとも１つの外因性核酸を含むように形質転換することができるか、当該分野で公知の任意の種々の方法を使用して内因性遺伝子機能を除去または実質的に低下させるように遺伝子改変することができる。
【００８９】
形質転換は、核酸分子（例えば、外因性または異種の核酸分子）の宿主細胞への導入をいう。形質転換された宿主細胞は、外因性または異種の核酸分子を染色体外に保有することができるか、染色体内に取り込むことができる。宿主細胞ゲノムへの取り込みおよびベクターの自己複製により、一般に、形質転換された核酸分子が遺伝的に安定に遺伝する。形質転換された核酸分子を含む宿主細胞を、「天然に存在しない」、「遺伝子操作された」、「組換え」、「形質転換された」、または「トランスジェニック」細胞（例えば、細菌）という。
【００９０】
Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性細菌）内での異種核酸の発現に有用な発現系および発現ベクターは公知である。
【００９１】
Ｃ１代謝細菌のエレクトロポレーションは本明細書中に記載されており、例えば、Ｔｏｙａｍａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６６：１，１９９８；Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：１０５，１９９７；Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２３：７８７，２００１，および米国特許出願公開第２００８／００２６００５号に以前に記載されている。
【００９２】
ドナー細胞とレシピエント細胞との直接的接触を含む特定の形質転換型をいう細胞接合は、Ｃ１代謝細菌への核酸分子の移入のためにより頻繁に使用されている。細菌接合は、相互に密接して接触させた「ドナー」細胞および「レシピエント」細胞の混合を含む。接合は、新規に合成されたドナー核酸分子がレシピエント細胞に一方向性に導入されるドナー細菌とレシピエント細菌との間の細胞質連結の形成によって生じる。接合反応におけるレシピエントは、ドナー細菌からの水平伝播によって核酸を受容することができる任意の細胞である。接合反応におけるドナーは、接合性プラスミド、接合性トランスポゾン、または可動性プラスミドを含む細菌である。ドナープラスミドの物理的移入は、自己伝染性プラスミドによるか、「ヘルパー」プラスミドの補助によって行うことができる。Ｃ１代謝細菌に関する接合は本明細書中に記載されており、Ｓｔｏｌｙａｒら，Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ  ６４：６８６，１９９５；Ｍｏｔｏｙａｍａら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４２：６７，１９９４；Ｌｌｏｙｄら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７１：３６４，１９９９；国際公開第０２／１８６１７号；およびＡｌｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：２９３１，２００６に以前に記載されている。
【００９３】
Ｃ１代謝細菌中での異種核酸の発現は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第６，８１８，４２４号、米国特許出願公開第２００３／０００３５２８号を参照のこと）。メチロトローフ性細菌のＭｕトランスポゾンベースの形質転換が記載されている（Ａｋｈｖｅｒｄｙａｎら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９１：８５７，２０１１）。Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ内の宿主遺伝子を挿入不活化しない異種遺伝子の単一コピーまたは多コピーの発現のためのｍｉｎｉ−Ｔｎ７トランスポゾン系が記載されている（米国特許出願公開第２００８／００２６００５号）。
【００９４】
Ｃ１代謝細菌において内因性遺伝子機能を不活化、ノックアウト、または欠失するための種々の方法を使用することができる。低成長Ｃ１代謝細菌中に欠失／挿入変異体を構築するための自殺ベクターを使用した対立遺伝子交換はまた、本明細書中および、例えば、Ｔｏｙａｍａ  ａｎｄ  Ｌｉｄｓｔｒｏｍ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：１８３，１９９８；Ｓｔｏｌｙａｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４５：１２３５，１９９９；Ａｌｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：２９３１，２００６；Ｖａｎ  Ｄｉｅｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４９：６０１，２００３に記載されている。
【００９５】
外因性核酸分子の高発現のための適切な同種または異種プロモーターを利用することができる。例えば、米国特許第７，０９８，００５号は、Ｃ１代謝細菌における異種遺伝子発現のためのメタンまたはメタノールの存在下で高度に発現するプロモーターの使用を記載している。使用することができるさらなるプロモーターには、デオキシ−キシルロースリン酸シンターゼメタノールデヒドロゲナーゼオペロンプロモーター（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６０：１１９，１９９８）；ＰＨＡ合成用プロモーター（Ｆｏｅｌｌｎｅｒら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：２８４，１９９３）；ピルビン酸デカルボキシラーゼプロモーター（Ｔｏｋｕｈｉｒｏら，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１：７９５，２００６）；またはメチロトローフ菌（ＥＰ  ２９６４８４）における未変性プラスミドから同定したプロモーターが含まれる。外来プロモーターには、ｌａｃオペロンＰｌａｃプロモーター（Ｔｏｙａｍａら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：５９５，１９９７）またはハイブリッドプロモーター（Ｐｔｒｃなど）（Ｂｒｏｓｉｕｓら，Ｇｅｎｅ  ２７：１６１，１９８４）が含まれる。
【００９６】
一定の実施形態では、プロモーターまたはコドン最適化を、宿主メタン資化性細菌において１つ以上の乳酸産生酵素をコードする外因性ポリヌクレオチドを構成性に高発現させるために使用する。宿主メタン資化性細菌における外因性核酸の発現制御も利用することができる。一定の実施形態では、１つ以上のチオエステラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、またはマロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ酵素をコードする外因性核酸の発現制御は、天然に存在しないメタン資化性細菌による脂質産生を至適化するのに望ましいかもしれない。例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２２１８１３号などに記載のメチロトローフ性細菌およびメタン資化性細菌における組換えタンパク質発現の誘導性／調節系を使用することができる。
【００９７】
組換えＣ１代謝微生物
本明細書中に記載のように、本明細書中に記載の任意の組換えＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性細菌）を、組換えＣ１代謝微生物を作製するための親または基準の宿主細胞として使用することができる。一定の実施形態では、本開示は組換えＣ１代謝非光合成微生物を提供し、ここで、この微生物は脂肪酸生合成に関連する異種核酸配列を含み、発現異種核酸配列により、親または基準のＣ１代謝非光合成微生物と比較して組換えＣ１代謝微生物中で高レベルの脂肪酸を蓄積し、脂肪酸を過剰発現する。
【００９８】
一定の実施形態では、組換えＣ１代謝非光合成微生物は、脂肪酸産生酵素、ホルムアルデヒド同化酵素、またはその任意の組み合わせをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、チオエステラーゼ、マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、またはその任意の組み合わせをコードする。例えば、チオエステラーゼは、大腸菌、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｒｉｃｉｎｉｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、またはＪａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃｕｓのチオエステラーゼであり得る。例示的なｆａｂＤ遺伝子、ａｃｃＡ遺伝子、ａｃｃＢ遺伝子、ａｃｃＣ遺伝子、およびａｃｃＤ遺伝子は、大腸菌または最適な任意の他の生物に由来し得る。
【００９９】
さらなる実施形態では、組換えＣ１代謝非光合成微生物は、Ｃ１代謝非光合成微生物における効率的な発現のためにコドン最適化された異種核酸配列を含む。一定の実施形態では、任意の１つ以上のチオエステラーゼ、ｆａｂＤ、ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、およびａｃｃＤを、Ｃ１代謝非光合成微生物についてコドン最適化する。１つの実施形態では、コドン最適化されたチオエステラーゼは、周辺質ターゲティング配列を欠く大腸菌ｔｅｓＡである。
【０１００】
さらに他の実施形態では、任意の上述の組換えＣ１代謝非光合成微生物は、脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を最小にするか排除する変異をさらに含む。
【０１０１】
本開示の組換えＣ１代謝非光合成微生物の作製で用いる例示的な生物には、細菌または酵母が含まれる。一定の実施形態では、本開示の組換えＣ１代謝細菌を作製するために使用される親または基準のＣ１代謝細菌は、メチロトローフ菌またはメタン資化性菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｙ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその任意の組み合わせなど）である。
【０１０２】
さらなる実施形態では、本開示の組換えＣ１代謝細菌を作製するために使用される親または基準のＣ１代謝細菌は、シンガス代謝細菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその組み合わせなど）である。
【０１０３】
培養方法および油組成物の作製方法
種々の培養方法を、本明細書中に記載の微生物、細菌、および酵母のために使用することができる。例えば、Ｃ１代謝微生物（メタン資化細菌またはメチロトローフ細菌など）を、バッチ培養または連続培養法によって成長させることができる。一定の実施形態では、培養物を、制御培養ユニット（発酵槽、バイオリアクター、または中空繊維セルなど）で成長させる。一般に、対数期の細胞は、しばしば、いくつかのシステムにおいて目的の生成物または中間体の大量生産を担うのに対して、他のシステムでは静止期または指数期後に生産することができる。
【０１０４】
古典的なバッチ培養法は、培養開始時に培養液の組成を設定し、培養プロセス中に変更しない閉鎖系である。すなわち、培養プロセス開始時に１つ以上の最適な微生物を使用して培養液をインキュベートし、次いで、いかなる物質も系に添加することなく成長させる。本明細書中で使用する場合、「バッチ」培養は、最初に添加した特定の炭素源量が不変であることに関するのに対して、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の制御を培養中にモニタリングおよび変更することができる。バッチ系では、系の代謝産物およびバイオマス組成物は、培養終了時まで絶えず変化する。バッチ培養物内で、細胞（例えば、メチロトローフ菌などの細菌）は、一般に、静的な遅滞期から高成長の対数増殖期に移行し、成長速度が低下または停止する静止期に移行するであろう（条件が変化しない場合、最終的に細胞は死滅するであろう）。
【０１０５】
フェドバッチ系は、培養が進行するにつれて目的の炭素基質を漸増的に添加する標準的なバッチ系の異形である。フェドバッチ系は、細胞代謝が異化代謝産物抑制によって阻害されている可能性が高い場合、および培養物中の基質量が制限されることが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系内の実際の基質濃度を測定することが困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、および排ガスの部分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定する。バッチ培養法およびフェドバッチ培養法は、当該分野で一般的であり、且つ公知である（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：２２７，１９９２を参照のこと）。
【０１０６】
連続培養は、特定の培養培地をバイオリアクターに連続的に添加する一方で、処理のために同量の使用済み（「馴化」）培地を同時に除去するという意味で「開放」系である。連続培養は、一般的に、細胞が主に対数増殖期にあるように細胞の液相密度を高度に一定に維持する。あるいは、連続培養を、固定化細胞（例えば、バイオフィルム）を使用して実施することができ、この培養は、炭素および栄養素を連続的に添加し、価値のある生成物、副生成物、および廃棄物を細胞集団から連続的に取り出す。細胞固定化を、天然材料、合成材料、またはその組み合わせから構成される広範な固体支持体を使用して行うことができる。
【０１０７】
連続培養または半連続培養により、細胞成長または最終生成物の濃度に影響を及ぼす１つ以上の因子を調整可能である。例えば、１つの方法は、限定された栄養素を固定された比率で維持することができ（例えば、炭素源、窒素）、経時的に他の全てのパラメーターを変化させることが可能である。他の実施形態では、成長に影響を及ぼすいくつかの因子を連続的に変化させることができる一方で、培地混濁度によって測定される細胞濃度を一定に保つ。連続培養系の目的は、培養条件を定常状態に維持する一方で、培養液除去に起因する細胞喪失と細胞成長速度との平衡を保つことである。生成物の形成速度を最大にするための連続培養プロセスおよび技術のための栄養素および成長因子の調整方法は、当該分野で周知である（Ｂｒｏｃｋ，１９９２を参照のこと）。
【０１０８】
一定の実施形態では、培養培地は、Ｃ１代謝微生物のエネルギー源としての炭素基質を含む。適切な基質には、Ｃ１基質（メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸（ギ酸塩）、一酸化炭素、二酸化炭素、メチル化アミン（メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミンなど）、メチル化チオール、またはメチルハロゲン（ブロモメタン、クロロメタン、ヨードメタン、ジクロロメタンなど）など）が含まれる。一定の実施形態では、培養培地は、Ｃ１代謝微生物の唯一の炭素源として単一のＣ１基質を含むことができるか、Ｃ１代謝微生物の複数の炭素源として２つ以上のＣ１基質の混合物（混合Ｃ１基質組成物）を含むことができる。
【０１０９】
さらに、いくつかのＣ１代謝生物は、代謝活動のために非Ｃ１基質（糖、グルコサミン、または種々のアミノ酸など）を利用することが公知である。例えば、いくつかのＣａｎｄｉｄａ種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝することができる（Ｓｕｌｔｅｒら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５，１９９０）。Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ  ＡＭ１は、限定数のＣ２、Ｃ３、およびＣ４基質上で成長することができる（Ｖａｎ  Ｄｉｅｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４９：６０１，２００３）。あるいは、Ｃ１代謝微生物は、別の炭素基質を利用する能力を有する組換えバリアントであり得る。それ故、選択されるＣ１代謝微生物に依存して、培養培地中の炭素源が炭素基質と単一炭素化合物および多炭素化合物との混合物を含むことができると予想される。
【０１１０】
一定の実施形態では、本開示は、Ｃ１代謝非光合成微生物を主に含む培養物由来のバイオマスを油組成物に変換し、油組成物を燃料に精製する工程を含む、燃料を作製するための方法を提供する。一定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、偏性Ｃ１代謝非光合成微生物（偏性メタン資化性菌またはメチロトローフ菌など）である。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、脂肪酸産生酵素、ホルムアルデヒド同化酵素、またはその組み合わせをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え微生物である。一定の実施形態では、本開示のＣ１代謝微生物に導入されたＴＥ遺伝子、ＭＣＴ遺伝子、およびＡｃｃ遺伝子のいずれか１つまたは全てを過剰発現することができ、Ｃ１代謝微生物は、脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を最小にするか排除する変異（例えば、ｆａｄＤノックアウト）を任意選択的に有することができる。さらなる実施形態では、油組成物は、Ｃ１代謝非光合成微生物（例えば、メチロトローフ菌、メタン資化性菌、酵母）の細胞膜に由来するかこの細胞膜から抽出されるか、分泌または排出される場合、培養上清から回収するか、その組み合わせが可能である。
【０１１１】
さらなる実施形態では、バイオマスの油組成物への変換工程は、湿式抽出、超臨界流体抽出、乾式抽出、熱抽出（例えば、水蒸気ストリッピング、水熱液化、高圧蒸解）、酵素加水分解（例えば、細胞壁の）、パルス電界抽出、微小気泡、または中空繊維抽出などによる油組成物の抽出を含む。例示的な抽出方法は当該分野で公知である（Ｆｏｌｃｈクロロホルム：メタノール（２：１  ｖ／ｖ）（ＣＭ溶液）法（Ｆｏｌｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：４９７，１９５７を参照のこと）、またはその修正法（実施例３を参照のこと）；Ｈａｒａ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｎヘキサン：イソプロパノール（ＨＩＰ）抽出法（Ｈａｒａ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９０：４２０，１９７８を参照のこと）；またはＢｌｉｇｈ  ａｎｄ  Ｄｙｅｒクロロホルム：メタノール：水法（Ｂｌｉｇｈ  ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１，１９５９を参照のこと）など）。他の例示的な抽出方法には、固相抽出カラム（Ｐｉｎｋａｒｔら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．３４：９，１９９８）、一段階反応抽出（Ｎｅｌｓｏｎ，Ａｌｌ  Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｔｈｅｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｓ．Ｐａｐｅｒ  ６４２，ｄｉｇｉｔａｌｃｏｍｍｏｎｓ．ｕｓｕ．ｅｄｕ／ｅｔｄ／６４２）、α−ヒドロキシスルホン酸抽出（米国特許出願公開第２０１３／０１４４０７８号）、高温高圧抽出（米国特許出願公開第２０１２／０１１０８９８号）、または加速溶媒抽出（ＡＳＥ）、ソックスレー，超音波抽出、および発振器抽出法（Ｌｉｕら，Ｊ．Ｅａｒｔｈ  Ｓｃｉ．２１：３００，２０１０を参照のこと）が含まれる。これらの各抽出法は、その全体が本明細書中で参考として援用され、任意の上記の方法または本明細書中に記載のバイオリファイナリーシステムで使用することができる。
【０１１２】
一定の実施形態では、本開示は、（例えば、精製ユニット中で）油組成物を精製して燃料を生産することによって燃料を作製する方法を提供し、ここで、油組成物は、Ｃ１代謝非光合成微生物（メチロトローフ菌またはメタン資化性菌など）に由来する。さらなる実施形態では、本方法は、油組成物を抽出する工程またはＣ１代謝非光合成微生物から油組成物を抽出するための処理ユニットの使用をさらに含む。なおさらなる実施形態では、本方法は、（ａ）制御培養ユニット中にてＣ１基質を含む供給材料の存在下でＣ１代謝細菌を培養する工程であって、培養細菌が油組成物を産生する、培養する工程；（ｂ）培養細菌から油組成物を抽出するか、処理ユニット内の油組成物を抽出する工程；および（ｃ）抽出油組成物を精製するか、精製ユニット内の油組成物を精製して燃料を生産する工程を含む。一定の実施形態では、供給材料のＣ１基質は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオール、またはメチルハロゲンである。
【０１１３】
任意の上記の燃料またはバイオ燃料を作製するための方法では、Ｃ１代謝非光合成微生物はメタン資化性菌、メチロトローフ菌、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍであり、供給材料のＣ１基質は天然ガス、シンガス、またはメタンであり、細菌を好気性または嫌気性の条件下で培養する。さらなる実施形態では、メタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、その任意の組み合わせ、またはその高成長バリアントであり、メチロトローフ菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ、その任意の組み合わせ、またはその高成長バリアントであり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその任意の組み合わせ、またはその高成長バリアントである。一定の他の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、偏性Ｃ１代謝非光合成微生物（偏性のメタン資化性菌、メチロトローフ菌、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍなど）である。
【０１１４】
任意の上記の燃料またはバイオ燃料を作製するための方法では、Ｃ１代謝非光合成微生物はメタン資化性菌であり、供給材料のＣ１基質は天然ガスまたはメタンであり、細菌を好気性条件下で培養する。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物はメタン資化性菌であり、Ｃ１基質は天然ガスまたはメタンであり、細菌を、制限された量のリン、窒素、微量元素、酸素、またはその任意の組み合わせと共に培養する。
【０１１５】
燃料組成物および燃料生成物
背景として、安定同位体測定および物質収支アプローチは、メタンの総供給源および吸収源を評価するために広く使用されている（Ｗｈｉｔｉｃａｒ  ａｎｄ  Ｆａｂｅｒ，Ｏｒｇ．Ｇｅｏｃｈｅｍ．１０：７５９，１９８６；Ｗｈｉｔｉｃａｒ，Ｏｒｇ．Ｇｅｏｃｈｅｍ．１６：５３１，１９９０を参照のこと）。酸化量を決定するために残留メタンのδ１３Ｃ値を使用するために、メタンの微生物酸化に原因する同位体分留度を知ることが必要である。例えば、好気性メタン資化性菌は、特異的酵素であるメタンモノオキシゲナーゼ（ｍｅｔｈａｎｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＭＭＯ））によってメタンを代謝することができる。メタン資化性菌は、メタンをメタノールに変換し、その後にホルムアルデヒドに変換する。ホルムアルデヒドを、ＣＯ２にさらに酸化して還元等価物（ＮＡＤＨ）の形態で細胞にエネルギーを供給することができるか、光合成生物における炭素同化経路と直接的に類似するＲｕＭＰサイクルまたはセリンサイクル（Ｈａｎｓｏｎ  ａｎｄ
Ｈａｎｓｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：４３９，１９９６）のいずれかによってバイオマスに組み込むことができる。より詳細には、タイプＩメタン資化性菌は、バイオマス合成のためにＲｕＭＰ経路を使用して完全にＣＨ４に由来するバイオマスを生成するのに対して、タイプＩＩメタン資化性菌は、５０〜７０％のＣＨ４由来の細胞炭素および３０〜５０％のＣＯ２由来の細胞炭素を同化するセリン経路を使用する（Ｈａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，１９９６）。炭素同位体組成の測定方法は、例えば、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら（Ｇｅｏｃｈｉｍ．Ｃｏｓｍｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７０：１７３９，２００６）（その方法全体が本明細書中で参考として援用される）に示されている。バイオマス由来の油組成物の１３Ｃ／１２Ｃ安定炭素同位体比（「δ」値‰（δ１３Ｃ）として示す）は、使用されるＣ１基質の供給源および純度に応じて変化し得る（例えば、図７を参照のこと）。
【０１１６】
本明細書中に記載のＣ１代謝非光合成微生物および方法を使用して産生した油組成物ならびに油組成物に由来するバイオ燃料組成物を、炭素フィンガープリント法によって石油化学製品または光合成微生物もしくは光合成植物から産生した油および燃料を区別することができる。一定の実施形態では、バイオマス、油組成物、またはバイオマスもしくは油組成物由来のバイオ燃料のδ１３Ｃは、−３０‰未満、−３１‰未満、−３２‰未満、−３３‰未満、−３４‰未満、−３５‰未満、−３６‰未満、−３７‰未満、−３８‰未満、−３９‰未満、−４０‰未満、−４１‰未満、−４２‰未満、−４３‰未満、−４４‰未満、−４５‰未満、−４６‰未満、−４７‰未満、−４８‰未満、−４９‰未満、−５０‰未満、−５１‰未満、−５２‰未満、−５３‰未満、−５４‰未満、−５５‰未満、−５６‰未満、−５７‰未満、−５８‰未満、−５９‰未満、−６０‰未満、−６１‰未満、−６２‰未満、−６３‰未満、−６４‰未満、−６５‰未満、−６６‰未満、−６７‰未満、−６８‰未満、−６９‰未満、または−７０‰未満である。
【０１１７】
一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物バイオマスは油組成物を含み、ここで、バイオマスのδ１３Ｃは、約−３５‰〜約−５０‰、−４５‰〜約−３５‰、または約−５０‰〜約−４０‰、または約−４５‰〜約−６５‰、または約−６０‰〜約−７０‰、または約−３０‰〜約−７０‰である。さらなる実施形態では、バイオマス油組成物は、少なくとも５０％の脂肪酸を含むか、少なくとも５０％の遊離脂肪酸を含む。なおさらなる実施形態では、バイオマス油組成物は、ジアシルグリセリドとトリアシルグリセリドとの混合物を含む。なおさらなる実施形態では、バイオマス油組成物は、脂肪酸の大部分（５０％ｗ／ｗ超）がＣ１４〜Ｃ１８またはＣ１６〜Ｃ１８の範囲の炭素鎖長を有するか、または脂肪酸の大部分がＣ１６未満の炭素鎖長を有する。さらなる実施形態では、バイオマス油組成物は、５０％ｗ／ｗ超のテルペノイド化合物またはイソプレノイド化合物を含み、ここで、テルペノイドはファルネセンまたはリモネンであり得る。
【０１１８】
さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物バイオマスのδ１３Ｃは、約−３０‰未満であるか、約−４０‰〜約−６０‰の範囲である。一定の実施形態では、バイオマスは使用済み培地と共に組換えＣ１代謝非光合成微生物を含むか、バイオマスは組換えＣ１代謝非光合成微生物の培養物由来の使用済み培地上清組成物を含み、ここで、バイオマスのδ１３Ｃは約−３０‰未満である。一定の他の実施形態では、油組成物をバイオマスから抽出または濃縮し、このバイオマスは、培養物由来の使用済み培地（すなわち、組換えＣ１代謝非光合成微生物の培養物由来の使用済み培地上清組成物）と共に組換えＣ１代謝非光合成微生物を含み得る。
【０１１９】
一定の実施形態では、組換えＣ１代謝非光合成微生物のバイオマスは、脂肪酸産生酵素、ホルムアルデヒド同化酵素、またはその任意の組み合わせをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、チオエステラーゼ、マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、またはその任意の組み合わせをコードする。例えば、チオエステラーゼは、大腸菌、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｒｉｃｉｎｉｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、またはＪａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃｕｓのチオエステラーゼであり得る。例示的なｆａｂＤ遺伝子、ａｃｃＡ遺伝子、ａｃｃＢ遺伝子、ａｃｃＣ遺伝子、およびａｃｃＤ遺伝子は、大腸菌または最適な任意の他の生物に由来し得る。
【０１２０】
さらなる実施形態では、組換えＣ１代謝非光合成微生物のバイオマスは、Ｃ１代謝非光合成微生物における効率的な発現のためにコドン最適化された異種核酸配列を含む。一定の実施形態では、任意の１つ以上のチオエステラーゼ、ｆａｂＤ、ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、およびａｃｃＤを、Ｃ１代謝非光合成微生物についてコドン最適化する。１つの実施形態では、コドン最適化されたチオエステラーゼは、周辺質ターゲティング配列を欠く大腸菌ｔｅｓＡである。
【０１２１】
さらに他の実施形態では、組換えＣ１代謝非光合成微生物の任意の上述のバイオマスは、脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を最小にするか排除する変異をさらに含む。
【０１２２】
本開示の組換えＣ１代謝非光合成微生物のバイオマスの生成で用いる例示的な生物には、細菌または酵母が含まれる。一定の実施形態では、Ｃ１代謝細菌のバイオマスは、メチロトローフ菌またはメタン資化性菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｙ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその任意の組み合わせなど）に由来する。
【０１２３】
さらなる実施形態では、本開示の組換えＣ１代謝細菌由来のＣ１代謝細菌のバイオマスは、シンガス代謝細菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその組み合わせなど）である。
【０１２４】
一定の実施形態では、油組成物のδ１３Ｃは、約−３５‰〜約−５０‰、−４５‰〜約−３５‰、または約−５０‰〜約−４０‰、または約−４５‰〜約−６５‰、または約−６０‰〜約−７０‰、または約−３０‰〜約−７０‰である。さらなる実施形態では、油組成物は、少なくとも５０％ｗ／ｗの脂肪酸を含むか、少なくとも５０％ｗ／ｗの遊離脂肪酸を含む。なおさらなる実施形態では、油組成物は、ジアシルグリセリドとトリアシルグリセリドとの混合物を含む。なおさらなる実施形態では、油組成物は、脂肪酸の大部分がＣ１４〜Ｃ１８またはＣ１６〜Ｃ１８の範囲の炭素鎖長を有するか、脂肪酸の大部分がＣ１６未満の炭素鎖長を有する。さらなる実施形態では、油組成物は、５０％ｗ／ｗ超のテルペノイド化合物またはイソプレノイド化合物を含み、ここで、テルペノイド化合物は、ファルネセン、リモネン、またはその両方であり得る。
【０１２５】
一定の実施形態では、バイオマスまたは油組成物由来のバイオ燃料のδ１３Ｃは、約−３５‰〜約−５０‰、−４５‰〜約−３５‰、または約−５０‰〜約−４０‰、または約−４５‰〜約−６５‰、または約−６０‰〜約−７０‰、または約−３０‰〜約−７０‰である。一定の他の実施形態では、油組成物由来のバイオ燃料のδ１３Ｃは、約−３５‰〜約−５０‰、−４５‰〜約−３５‰、または約−５０‰〜約−４０‰、または約−４５‰〜約−６５‰、または約−６０‰〜約−７０‰、または約−３０‰〜約−７０‰である。
【０１２６】
さらなる実施形態では、バイオ燃料は、少なくとも５０％ｗ／ｗの脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を含む。関連する実施形態では、バイオ燃料は少なくとも５０％のＦＡＭＥを含み、ここで、ＦＡＭＥの大部分はＣ１４〜Ｃ１８、Ｃ１６〜Ｃ１８、またはＣ１６未満の炭素鎖長を有する。なおさらなる実施形態では、バイオ燃料は、少なくとも５０％ｗ／ｗの脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）を含む。関連する実施形態では、バイオ燃料は少なくとも５０％のＦＡＥＥを含み、ここで、ＦＡＥＥの大部分はＣ１４〜Ｃ１８、Ｃ１６〜Ｃ１８、またはＣ１６未満の炭素鎖長を有する。なおさらなる実施形態では、バイオ燃料は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水素化テルペノイド（ファルネサン（ｆａｒｎｅｓａｎｅ）またはリモナン（ｌｉｍｏｎａｎｅ）など）を含む。一定の実施形態では、水素化テルペノイドの大部分は、ファルネサン（ｆａｒｎｅｓａｎｅ）、リモナン（ｌｉｍｏｎａｎｅ）、またはその両方から構成される。一定の実施形態では、バイオ燃料は水素化バイオマスを含む。一定の実施形態では、水素化バイオマスの大部分は、直鎖アルカンおよび分枝状アルカンの混合物を含む。一定の実施形態では、バイオ燃料は、脂肪酸の大部分がＣ１４〜Ｃ１８またはＣ１６〜Ｃ１８の範囲の炭素鎖長を有するか、脂肪酸の大部分がＣ１６未満の炭素鎖長を有する。さらなる実施形態では、バイオ燃料は、５０％ｗ／ｗを超えるテルペノイド化合物またはイソプレノイド化合物を含み、ここで、テルペノイドは、ファルネセンまたはリモネンであり得る。
【０１２７】
一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物の油組成物（任意選択的にＣ１代謝微生物バイオマス由来の抽出物または単離物であり得る）は、組成物の重量の少なくとも約５０％〜約８０％の水素原子および炭素原子を含み、ここで、組成物のδ１３Ｃは、約−３５‰未満または約−３６‰未満または約−３７‰未満または約−３８‰未満または約−３９‰未満または約−４０‰未満である。一定の実施形態では、油組成物または油組成物に由来するバイオ燃料組成物は、水素原子および炭素原子を有する分子を含み、ここで、水素原子および炭素原子は、組成物の重量の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％であり、組成物のδ１３Ｃは約−３０‰〜約−７０‰の範囲であるか、細胞密度が約−５‰〜約−２０‰まで増加するにつれてバイオマス中のδ１３Ｃは減少するか、バイオマスのδ１３Ｃは、銅の存在下または非存在下で培養した場合に、同時に産生されたＣＯ２より平均で５‰〜１５‰高かった。
【０１２８】
さらなる実施形態では、本開示のＣ１代謝微生物の油組成物（任意選択的にＣ１代謝微生物バイオマスから抽出または単離することができる）は、組成物重量の少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の水素原子および炭素原子を含む。一定の実施形態では、油組成物または油組成物に由来するバイオ燃料組成物は水素原子および炭素原子を有する分子を含み、ここで、水素原子および炭素原子は、組成物の重量の少なくとも約９０％であり、組成物のδ１３Ｃは約−４０‰〜約−５５‰の範囲である。
【０１２９】
本明細書中に記載され、且つ当該分野で公知の燃料成分は、燃料生成物を生成するための化石燃料または混合ブレンドであり得る。例えば、燃料またはバイオ燃料ブレンドのための混合物は、別の炭化水素混合物とブレンドして燃料生成物またはバイオ燃料生成物を生成するのに適切な炭化水素混合物であり得る。例えば、軽質アルカンの混合物は、ある燃料型に適切な一定のオクタン価を持たなくてもよいが、高オクタン混合物とブレンドして燃料生成物を生成することができる。一定の実施形態では、本開示のバイオマス、油組成物、またはこれらに由来するバイオ燃料は、精製後の燃料成分またはバイオ燃料成分である。
【０１３０】
一定の実施形態では、バイオ燃料組成物は、水素原子および炭素原子を有する分子を含み、ここで、水素原子および炭素原子は組成物の重量の少なくとも８０％であり、且つ組成物のδ１３Ｃ分布は約−３７％〜約−１０％の範囲であるか、ここで、細胞密度が−２２％から−９％に増加するにつれてバイオマス中のδ１３Ｃ分布が増加するか、ここで、バイオマスのδ１３Ｃ組成は、銅の存在下または非存在下で培養した場合に、同時に産生されたＣＯ２より平均で５％〜１５％高かった。
【０１３１】
本明細書中に記載のバイオ燃料生成物は、本開示の油組成物または油組成物に由来するバイオ燃料組成物の燃料成分またはバイオ燃料成分とのブレンドによって生成される生成物である。いくつかの例では、バイオ燃料生成物のδ１３Ｃ分布は−６０‰超または−５０‰超または−４０‰超または−３０‰超であるが、但し、ブレンドの油組成物部分または油組成物に由来するバイオ燃料組成物部分が光合成微生物または光合成植物に由来しないことを条件とする。一定の実施形態では、ブレンドのために使用される燃料成分は、石油ベースの組成物または燃料添加剤（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールのような酸素化物；エーテル（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、第三アミルメチルエーテルなど）；抗酸化剤（ブチル化ヒドロキシトルエン、エチレンジアミンなど）；アンチノック剤（テトラエチル鉛、フェロセン、トルエンなど）；掃鉛剤（リン酸トリクレジルなど）；または色素など）である。例えば、Ｃ１代謝微生物の油組成物を、本明細書中に記載の燃料生成物を生成するために精製（例えば、エステル交換反応；クラッキング）前に燃料成分とブレンドすることができる。さらなる他の実施形態では、油組成物は液体または固体であり、油組成物をバイオ燃料生成物の生産で用いる燃料添加剤中で精製する。一定の実施形態では、油組成物は、テルペン、テルペノイド、イソプレン、またはイソプレノイド（ｉｓｏｐｒｅｎｉｏｄ）を含む。さらなる他の実施形態では、バイオ燃料生成物は、８５〜１２０のオクタン価または９０超のオクタン価を有する。
【実施例】
【０１３２】
実施例１
Ｃ１代謝微生物による脂質産生のための培養条件およびバイオリアクター条件
例示的な本開示のＣ１代謝微生物（メタン資化性菌、メチロトローフ菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）を、試験管、バイアル、ボトル、プレート、またはバイオリアクター（発酵）内で培養した。種々の微生物についての成長条件、培地、および炭素源を、本実施例中に記載する。
【０１３３】
Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ＯＢ３ｂ（ＮＣＩＭＢ  １１１３１）；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  １６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２４０２）；またはＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ
血清瓶のために、細菌を、ヒギンス最少硝酸塩培地（ＮＳＭ；Ｃｏｒｎｉｓｈら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２５６５，１９８４；Ｐａｒｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３８：４２３，１９９１）またはＭＭ−Ｗ１培地中にて３０℃で培養した。上部空間の組成を、メタン：空気の体積比を１：１に調整した。ボトルを２００〜２５０ｒｐｍの速度で震盪した。あるいは、培養物を、１：１（ｖ／ｖ）メタン：空気ガス混合物を含む気密チャンバー中またはメタノール蒸気の存在下（パラフィルム密封プレートの蓋内の０．５ｍＬメタノールによる）で成長させた１．５％ｗ／ｖ寒天を含むＮＳＭ−培地プレート上または０．５％メタノールを補足したＮＳＭ−培地プレート上に維持した。プレートを逆さにして３０℃の加湿チャンバー中でインキュベートした。
【０１３４】
ＮＳＭ培地の組成は以下であった：１．０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２０ｇのＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２．０ｍｌのキレート鉄溶液（０．１ｇのクエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、または０．５ｇの塩化鉄（ＩＩＩ）；０．２ｇのＥＤＴＡ、ナトリウム塩；０．３ｍｌの濃ＨＣｌ；１００．０ｍｌの蒸留脱イオンＨ２Ｏ）、１．０ｇのＫＮＯ３、０．５ｍｌの微量元素溶液（５００．０ｍｇのＥＤＴＡ、２００．０ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．０ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、３０．０ｍｇのＨ３ＢＯ３、２０．０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．０ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．０Ｌの蒸留水）、０．２７２ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．７１７ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、任意選択的に１２．５ｇの精製寒天（例えば、Ｏｘｏｉｄ  Ｌ２８またはＢａｃｔｏ（商標）寒天；プレート作製時に使用）、１．０Ｌの蒸留脱イオン水（ｐＨ６．８に調整し、１２１℃で１５分間オートクレーブする）。
【０１３５】
発酵について、１Ｌの滅菌特定培地ＭＭ−Ｗ１を含む２リットルのバイオリアクターに、メタンおよび空気の１：１（ｖ／ｖ）混合物を供給したＭＭ−Ｗ１で成長させた血清瓶バッチ培養物（１０〜２０％ｖ／ｖ）由来の細胞を播種した。使用したＭＭ−Ｗ１の培地組成は以下であった：０．８ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのＮａＮＯ３、０．１４ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．３５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、３．４ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２０．７μＭのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１μＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０μＭのＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡ、および１ｍＬ／リットルの微量元素溶液（１リットルあたり５００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１５ｍｇのＨ３ＢＯ３、２５０ｍｇのＥＤＴＡを含む）。培地をオートクレーブし、冷却した後に、リン酸塩、重炭酸塩、およびＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡを添加した。一定の発酵において、重炭酸塩を０．１％（ｗ／ｖ）まで添加した。反応器の内容物を、オーバーヘッドインペラーを使用して７５０ｒｐｍの一定速度で撹拌した。培地に約６０ｍＬ／分〜約１２０ｍＬ／分で噴霧する一定量のメタンを供給し、その一方で、約４０％〜約８０％の溶存酸素レベル（培地の飽和空気と比較して）を維持するために約１０〜１００ｍＬ／分の可変速度で濃縮酸素（少なくとも８５％）を供給した。
【０１３６】
バイオリアクター内の温度を３０℃に維持し、約４時間毎〜約２４時間毎に（およそ５ＯＤ単位のＯＤ６００増加に相当する）他の添加物と共に培地への０．５ＭのＮａＯＨおよび０．５ＭのＨＣｌの自動添加を使用してｐＨ７．１±０．１に維持した。他の添加を、金属添加（最終濃度が１０μＭのＣｕＳＯ４、５μＭのＦｅＳＯ４、５μＭのＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡ）と栄養素添加（５．７５ｍＭのＫｘＨｙＰＯ４、１０ｍＭのＮａＮＯ３）との間で変化させた。これらの条件下で、２０超のＯＤ６００に対して約２．７〜約３．３グラム乾燥細胞重量／リットル／日の有効なバイオマス生成速度で本質的に線形の成長が認められた。培養バイオマスを遠心分離によって収集し、ＭＭ−Ｗ１培地で１回洗浄し、回収したバイオマスを−８０℃で冷凍するか、細胞成分の分画（例えば、脂質抽出）のために直ちに使用した。
【０１３７】
バイオマス生産性を維持し、発酵のシャットダウンおよびスタートアップに関連する時間（すなわち、ターンアラウンドタイムまたはリードタイム）を短縮させるために、半連続発酵アプローチも適用することができる。
【０１３８】
培養密度が静止期に近づいた時（しかし、静止期に入る前）、細菌バイオマスの収集をおよそ１２〜２４時間間隔で行った。バイオリアクター体積の約半分を、遠心ポンプによって個別の容器に移すことによって除去した。次いで、反応器の最適密度がその初期値のおよそ半分であるように、等体積の滅菌または再利用した培地をバイオリアクターに戻した。単一の発酵運転中に複数回の成長およびバイオマス回収サイクルを行うことができるように、バイオリアクター発酵を上記プロトコールにしたがって継続した。
【０１３９】
Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）
細菌を、ヒギンス最少硝酸塩培地（ＮＳＭ）またはＭＭ−Ｗ１培地を含む血清瓶中にて４２℃で培養した。上部空間の組成を、メタン：空気の体積比を１：１に調整した。ボトルを２００〜２５０ｒｐｍの速度で震盪した。あるいは、培養物を、１：１（ｖ／ｖ）メタン：空気ガス混合物を含む気密チャンバー中で成長させた１．５％ｗ／ｖ寒天で固化させたＮＳＭ−培地プレート上に維持した。プレートを逆さにして４２℃のチャンバー中でインキュベートした。
【０１４０】
発酵について、１．２５Ｌの滅菌培地ＭＭＦ１．１を含む３リットルのバイオリアクターに、メタンおよび空気の１：１（ｖ／ｖ）混合物を補足した同一の培地中で成長させた血清瓶バッチ培養物（１０〜２０％ｖ／ｖ）由来の細胞を播種した。培地ＭＭＦ１．１の組成は以下であった：０．８ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４０ｍＭのＮａＮＯ３、０．１４ｍＭのＣａＣｌ２、６ｍＭのＮａＨＣＯ３、４．７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、６．８ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２０．７μＭのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、６μＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０μＭのＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡ、および１ｍＬ／リットルの微量元素溶液（１リットルあたり５００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１５ｍｇのＨ３ＢＯ３、２５０ｍｇのＥＤＴＡを含む）。培地をオートクレーブし、冷却した後に、リン酸塩、重炭酸塩、およびＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡを添加した。反応器の内容物を、オーバーヘッドインペラーを使用して７５０ｒｐｍの一定速度で撹拌した。培地に約６０〜約２００ｍＬ／分で噴霧する一定量のメタンを供給し、その一方で、濃縮酸素（８５％超）を１５〜９０ｍＬ／分の可変速度で供給し、１０％未満の溶存酸素レベル（培地の飽和空気と比較して）を維持した。
【０１４１】
バイオリアクター内の温度を４４℃に維持し、３〜６時間毎に（ＯＤ５到達後のおよそ３〜５ＯＤ単位のＯＤ６００の増加に相当する）銅および鉄（５μＭのＣｕＳＯ４、５μＭのＦｅＳＯ４、１０μＭのＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡ最終濃度）の培地への添加と共に０．５ＭのＮａＯＨおよび０．５ＭのＨＣｌの自動添加を使用してｐＨ７．１±０．１に維持した。これらの条件下で、１０超のＯＤ６００に対して５グラム乾燥細胞重量／リットル／日超の有効なバイオマス生成速度で本質的に線形の成長が認められた。培養バイオマスを遠心分離によって収集し、細胞をＭＭ−Ｗ１培地で１回洗浄し、細胞ペレットを−８０℃で冷凍するか、細胞成分の分画のために直ちに使用した。
【０１４２】
栄養の枯渇を、発酵中の増殖収率を制限し得る問題と認識した。栄養素（主に窒素およびリン酸塩）の制限を回避するために、培地のＯＤ６００が５を超えた後に２倍濃縮のＭＭＦ１．１から構成される栄養素の供給を開始した。培養体積を拡大しながら洗い流しを回避し、且つＯＤ増加を維持するために、培養物の成長速度のおよそ半分に対応する希釈率で栄養供給を開始した。単一の発酵運転中に複数回の成長およびバイオマス回収サイクルを行うことができるように、バイオリアクター発酵を上記プロトコールにしたがって継続した。
【０１４３】
Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓまたはＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ＯＢ３ｂ（ＮＣＩＭＢ  １１１３１）
細菌を、０．５％メタノールを補足したヒギンス最少硝酸塩培地（ＮＳＭ）を含む試験管中にて３０℃で培養する。試験管を２００〜２５０ｒｐｍの速度で震盪する。あるいは、培養物を、メタノール蒸気の存在下（パラフィルム密封プレートの蓋内の０．５ｍＬメタノールによる）で成長させた１．５％ｗ／ｖ寒天を含むか、０．５％メタノールを補足したＮＳＭ−培地プレート上に維持する。プレートを逆さにして通常大気下にて３０℃の加湿チャンバー中でインキュベートする。
【０１４４】
発酵について、１Ｌの限定培地ＭＭ−Ｗ１を含む２リットルのバイオリアクターに、培養チューブバッチ培養物由来の細胞（１０〜２０％ｖ／ｖ）を播種する。ＭＭ−Ｗ１の培地組成は上記の通りであった。反応器の内容物を、オーバーヘッドインペラーを使用して８００ｒｐｍの一定速度で撹拌する。培養物に、最終濃度０．５％までの初期ボーラスのメタノールおよび可変量のメタノールを供給し、一方で、６０〜９０％の溶存酸素レベル（培地の飽和空気と比較して）を維持するために３０〜１００ｍＬ／分の可変速度で純酸素を供給した。
【０１４５】
バイオリアクター内の温度を３０℃に維持し、上記の金属および栄養素の添加と共に０．５ＭのＮａＯＨおよび１ＭのＨＣｌの自動添加を使用してｐＨ７．１±０．１に維持した。これらの条件下で、２０超のＯＤ６００に対して２．７〜３．３グラム乾燥細胞重量／リットル／日の有効なバイオマス生成速度で本質的に線形の成長が認められた。培養バイオマスを遠心分離によって収集し、細胞をＭＭ−Ｗ１培地で１回洗浄し、細胞ペレットを−８０℃で冷凍するか、細胞成分の分画のために直ちに使用した。
【０１４６】
バイオマス生産性を維持し、発酵のシャットダウンおよびスタートアップに関連する時間（すなわち、ターンアラウンドタイムまたはリードタイム）を短縮させるために、半連続発酵アプローチも適用することができる。
【０１４７】
培養密度が静止期に近づいた時（しかし、静止期に入る前）、蓄積した細菌バイオマスの収集をおよそ１２〜２４時間間隔で行った。バイオリアクター体積の約半分を、遠心ポンプによって個別の容器に移すことによって除去した。次いで、反応器の最適密度がその初期値のおよそ半分であるように、等体積の新鮮なまたは再利用した培地をバイオリアクターに戻した。単一の発酵運転中に複数回の成長およびバイオマス回収サイクルが行われるように、バイオリアクター発酵を上記プロトコールにしたがって継続した。
【０１４８】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細菌を、ブチルゴム栓および２００ｋＰａの鉄鋼所排ガスを有するプラスチックコーティングした５００ｍｌ−Ｓｃｈｏｔｔ  Ｄｕｒａｎ（登録商標）ＧＬ４５ボトル内の１００ｍＬの改変ＰＥＴＣ培地（ＡＴＣＣ培地１７５４）中にて３７℃で嫌気的に培養する。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）の測定によって成長をモニタリングする。
【０１４９】
改変ＰＥＴＣ培地は、（１リットルあたり）１ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．４ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＮａＣｌ、０．１ｇのＫＨ２ＰＯ４、２０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｍｌの微量元素溶液（以下を参照のこと）、１０ｍｌのウォルフスビタミン溶液（以下を参照のこと）、２ｇのＮａＨＣＯ３、および１ｍｇのレサズリンを含む。ｐＨ５．６に調整後、培養物をボイルし、嫌気的に分注し、１２１℃で１５分間オートクレーブする。鉄鋼所排ガス（組成：４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２）または等価な合成混合物を炭素源として使用する。培地の最終ｐＨは５．９であり、濃度０．００８％（ｗ／ｖ）のシステイン−ＨＣｌおよびＮａ２Ｓで還元する。
【０１５０】
微量元素溶液は、１リットルあたり２ｇのニトリロ三酢酸（残存成分の添加前にＫＯＨでｐＨ６に調整済み）、１ｇのＭｎＳＯ４、０．８ｇのＦｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＮａ２ＳｅＯ４、および２０ｍｇのＮａ２ＷＯ４を含む。
【０１５１】
ウォルフスビタミン溶液（Ｗｏｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３８：２８８２、１９６３）は、（１リットルあたり）２ｍｇのビオチン、２ｍｇの葉酸、１０ｍｇの塩酸ピリドキシン、５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、５ｍｇのリボフラビン、５ｍｇのニコチン酸、５ｍｇのＤ−（＋）−パントテン酸カルシウム、０．１ｍｇのビタミンＢ１２、５ｍｇのｐ−アミノ安息香酸、および５ｍｇのチオクト酸を含む。
【０１５２】
ａ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの発酵
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの発酵を、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３００５９３号に記載の方法に類似の方法を使用して行う。簡潔に述べれば、１．３Ｌの溶液Ａ（３．０８３ｇのＮＨ４Ａｃ；０．６１ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．２９４ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．１５ｇのＫＣｌ；０．１２ｇのＮａＣｌ（任意）；これらを蒸留水で１Ｌにする）を含む２リットルのバイオリアクターに、Ｎ２ガスを噴霧する。Ｈ３ＰＯ４の８５％溶液（２．０２５ｍＬ、３０ｍＭ）を添加し、濃ＮＨ４ＯＨ水溶液を使用してｐＨ５．３に調整する。次いで、１３．５ｍＬの溶液Ｂ（２０．０ｍｇのビオチン；２０．０ｍｇの葉酸；１０．０ｍｇのピリドキシンＨＣｌ；５０．０ｍｇのチアミンＨＣｌ；５０．０ｍｇのリボフラビン；５０．０ｍｇのニコチン酸；５０．０ｍｇのＤ−（＊）−パントテン酸カルシウム；５０．０ｍｇのビタミンＢ１２；５０．０ｍｇのｐ−アミノ安息香酸；５０．０ｍｇのチオクト酸；これらを蒸留水で１Ｌにする）を添加し、溶液にＮ２ガスを噴霧する。溶液の酸化還元電位（ＯＲＰ）がおよそ−２００ｍＶに低下するまで塩化クロム（ＩＩ）を添加し、ここで、レサズリン（１．３５ｍＬの２ｇ／Ｌ溶液）を添加する。多硫化ナトリウム（５．４ｍＬの３Ｍ溶液、以下を参照のこと）を添加し、溶液にＮ２を噴霧し、次いでＣＯ含有ガス（１％Ｈ２；１３％Ｎ２；７１％ＣＯ；１５％ＣＯ２）を噴霧する。金属硫化物溶液（１５０ｍＬ、以下を参照のこと）を添加し、およそ５％（ｖ／ｖ）のレベルの活発に成長しているＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ培養物の播種前にこの溶液をさらに３０分間噴霧する。
【０１５３】
多硫化ナトリウム溶液を、Ｎａ２Ｓ（９３．７ｇ、０．３９ｍｏｌ）および２００ｍｌのＨ２Ｏを充填した５００ｍｌフラスコ中に調製する。塩が溶解するまで溶液を撹拌し、硫黄（２５ｇ、０．１ｍｏｌ）を一定のＮ２流下で添加する。室温で２時間の撹拌後、多硫化ナトリウム溶液（Ｎａに関して約４Ｍおよび硫黄に関して約５Ｍ）（現時点で透明な赤褐色の液体）をＮ２パージした血清瓶に移し、アルミニウム箔で包む。
【０１５４】
クロム（ＩＩ）溶液を、不活性ガス下で作業し、その後に所望の生成物を適切な貯蔵フラスコに移すための気密性の入口および出口を取り付けた１Ｌ三つ口フラスコ中で調製する。フラスコに、ＣｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（４０ｇ、０．１５ｍｏｌ）、亜鉛顆粒［２０メッシュ］（１８．３ｇ、０．２８ｍｏｌ）、水銀（１３．５５ｇ、１ｍＬ、０．０６７６ｍｏｌ）、および５００ｍＬの蒸留水を充填する。Ｎ２で１時間のフラッシング後、混合物を約８０℃に加温して反応を開始させる。一定のＮ２流下で２時間の撹拌後、混合物を室温に冷却し、反応混合物が濃青色溶液に変化する時点までさらに４８時間連続的に撹拌する。溶液をＮ２パージした血清瓶に移し、さらなる使用のために４℃で保存する。
【０１５５】
金属硫化物溶液を、約９５０ｍＬの溶液Ａを１Ｌ発酵槽に添加し、Ｎ２ガスを噴霧することによって調製する。８５％Ｈ３ＰＯ４溶液（１．５ｍＬ、３０ｍＭ）を添加し、濃ＮＨ４ＯＨ水溶液を使用してｐＨ５．３に調整する。溶液Ｂ（１０ｍＬ）を添加し、溶液にＮ２を噴霧する。溶液の酸化還元電位（ＯＲＰ）がおよそ−２００ｍＶに低下するまで塩化クロム（ＩＩ）を添加し、ここで、レサズリン（１ｍＬの２ｇ／Ｌ溶液）を添加する。溶液Ｃ（１／１０；１０ｍｌのＦｅＣｌ３；５ｍｌのＣｏＣｌ２；５ｍｌのＮｉＣｌ２；１ｍｌのＨ３ＢＯ３；１ｍｌのＮａ２ＭｏＯ４；１ｍｌのＭｎＣｌ２；１ｍｌのＮａ２ＷＯ４；１ｍｌのＺｎＣｌ２；１ｍｌのＮａ２ＳｅＯ３；１Ｌの培地中）を添加し、次いで、多硫化ナトリウム（２ｍＬの３Ｍ溶液）を添加し、次いで、この溶液にＮ２ガスを噴霧する。
【０１５６】
ポリスルフィドの存在下でのバッチ条件下におけるＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍによるＣＯを含む基質の発酵により、蓄積速度が実質的に増加し、２〜３日間にわたっておよそ４ｇ／Ｌのバイオマスが最終的に蓄積される。例えば、約１日間の短期の遅滞期後、バイオマスは、およそ３６時間の発酵にわたって約０．５ｇ／Ｌから少なくとも３．５ｇ／Ｌまで増加し得る。さらに、酢酸塩はポリスルフィドの存在下で成長期に生成されず（バッチ発酵で典型的に見出される）、一定の環境下でいくつかの酢酸塩が消費される。したがって、発酵槽内の酢酸塩の正味の量が減少する。培養バイオマスを遠心分離によって収集し、細胞を培地中で１回洗浄し、細胞ペレットを−８０℃で凍結するか、細胞成分の分画のために直ちに使用した。
【０１５７】
バイオマス生産性を維持し、発酵のシャットダウンおよびスタートアップに関連する時間（すなわち、ターンアラウンドタイムまたはリードタイム）を短縮させるために、半連続発酵アプローチも適用することができる。
【０１５８】
培養密度が静止期に近づいた時（しかし、静止期に入る前）、蓄積した細菌バイオマスの収集をおよそ１２〜２４時間間隔で行った。バイオリアクター体積の約半分を、遠心ポンプによって個別の容器に移すことによって除去した。次いで、反応器の最適密度がその初期値のおよそ半分であるように、等体積の新鮮なまたは再利用した培地をバイオリアクターに戻した。単一の発酵運転中に複数回の成長およびバイオマス回収サイクルが行われるように、バイオリアクター発酵を上記プロトコールにしたがって継続した。
【０１５９】
ｂ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの発酵
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの発酵を、例えば、米国特許第５，１７３，４２９号および同第５，５９３，８８６号に記載の方法に類似の方法を使用して行う。簡潔に述べれば、バッチ発酵を、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの生物学的に純粋な培養物を使用して行う。培地（（１）８０．０ｍＬのＫＨ２ＰＯ４  ３．００ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ３．００ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ６．００ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ６．００ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・２Ｈ２Ｏ  １．２５ｇ／Ｌを含む塩；（２）１．０ｇの酵母エキス；（３）１．０ｇのトリプチケース；（４）３．０ｍｌのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １５００ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ３０ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  ３００ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇ、ＣｕＣｌ２・Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ２０ｍｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ３０ｍｇ、Ｎａ２ＳｅＯ３  １０ｍｇを含み、蒸留水で１ＬにしたＰＦＮ（Ｐｆｅｎｎｉｎｇ）微量金属溶液；（５）１０．０ｍｌの塩酸ピリドキサール１０ｍｇ、リボフラビン５０ｍｇ、塩酸チアミン５０ｍｇ、ニコチン酸（Ｎｉｃｔｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）５０ｍｇ、Ｃａ−Ｄ−パントテイナート５０ｍｇ、リポ酸６０ｍｇ、ｐ−アミノ安息香酸５０ｍｇ、葉酸２０ｍｇ、ビオチン２０ｍｇ、シアノコバラミン５０ｍｇを含み、蒸留水で１ＬにしたビタミンＢ群；（６）０．５ｇのシステインＨＣｌ；（７）０．０６ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；（８）２．０ｇのＮａＨＣＯ３；（９）１．０ｍＬのレサズリン（０．０１％）；および（１０）９２０．０ｍＬの蒸留水）の調製を、８０％窒素および２０％ＣＯ２の雰囲気下で嫌気的に行う。発酵中の培地のｐＨを制御し、ＨＣｌで５．０に維持する。必要な場合、滅菌１０％ＮａＯＨ溶液または１．０％酢酸溶液を使用してｐＨを調整する。培地を１５７．５ｍＬ血清瓶に移し、ブチルゴム栓およびアルミニウムシールで密封する。次いで、ボトルを１２１℃で２０分間オートクレーブする。
【０１６０】
実験開始のおよそ４８時間前に、種培養物を、上記と類似のボトル中でＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの保存培養物から調製する。種培養物を振盪恒温器中にて３７℃で成長させ、１００ｒｐｍで震盪した。還元溶液（２．０ｍｌのＮａ２Ｓ、２．５％溶液）および２．０ｍｌのシステイン−ＨＣｌ（３．５％溶液））を培養物に添加し、これを振盪恒温器中に約１５分間入れて完全に酸素を除去し、温度純化させる。生物の生物学的に純粋な培養物の単離に使用される手順と異なり、メタンインヒビターの添加はバッチ発酵で必要ない。
【０１６１】
Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉを使用した発酵を、栄養培地を含むＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｂｉｏｆｌｏｗ  ＩＩｃ  ２．５リットル発酵槽中にて３７℃で行い、１．５リットルの流体レベルを一定に維持する一方で、およそ５００ｃｍ３／分の速度でガスを導入しながら流体を１，０００回転／分の可変速度で振盪する。最適なガス保持時間は、３分間の範囲である。ガス供給は、細菌によるその取り込みによって異なり、これは細胞密度の関数でもある。
【０１６２】
培養密度が静止期に近づいた時（しかし、静止期に入る前）、蓄積した細菌バイオマスの収集をおよそ１２〜２４時間間隔で行った。バイオリアクター体積の約半分を、遠心ポンプによって個別の容器に移すことによって除去した。次いで、反応器の最適密度がその初期値のおよそ半分であるように、等体積の新鮮なまたは再利用した培地をバイオリアクターに戻した。単一の発酵運転中に複数回の成長およびバイオマス回収サイクルが行われるように、バイオリアクター発酵を上記プロトコールにしたがって継続した。
【０１６３】
実施例２
脂質産生の増強のために操作されたＣ１代謝微生物
宿主細胞を、内因性ｆａｄＤ遺伝子によってコードされる長鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性のノックアウトによって脂肪酸分解を最小にするか減少させるための遺伝子改変を有するように操作した。さらに、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の生合成を、チオエステラーゼ（ＴＥ）遺伝子の本開示のメタン資化性菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）への導入によって増強した。かかる組換え変化を、本実施例にさらに記載する。
【０１６４】
組換え核酸分子
野生型ＦａｄＤタンパク質をコードする核酸配列は、変異ｆａｄＤ遺伝子のデザインのための基準標準出発点であった。例えば、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａ、Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、およびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉによってコードされる野生型ＦａｄＤタンパク質配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦＨ００９３１．１、ＹＰ＿１１４０２１．１、ＹＰ＿００４５１２１４８．１、ＹＰ＿００２９６４８７１．１、およびＹＰ＿００３７８２０６５．１中に提供されている。それ故、上述のタンパク質をコードするｆａｄＤ遺伝子の核酸分子を、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（配列番号１）、Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａ（配列番号３５）、Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（配列番号５２）、およびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（配列番号８５）由来の遺伝子の５’領域にいくつかの停止変異およびフレームシフトを組み込むように個別に合成した。Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ｆａｄＤ遺伝子について、遺伝子の残存する５’末端および３’末端を元の読み枠（配列番号１８）を維持するように連結することができるように内部欠失を含む核酸分子を合成した。
【０１６５】
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍについて、ゲノムを配列決定し、大腸菌のｆａｄＤホモログを、ｔｂｌａｓｔｎ検索（大腸菌ＦａｄＤのタンパク質配列を使用した翻訳されたヌクレオチド遺伝子配列の検索）によって同定する。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのｆａｄＤ遺伝子の核酸分子を、遺伝子の５’領域にいくつかの停止変異およびフレームシフトを組み込むように合成する。
【０１６６】
本明細書中に記載の方法を使用したＣ１代謝微生物への接合、エレクトロポレーション、または形質転換のために、変異ｆａｄＤ核酸分子をプラスミドベクター（メタン資化性菌またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの複製起点を欠き、且つカナマイシン耐性をコードする）に個別にクローン化する。かかるベクター（Ｃ１代謝微生物中で複製されない）により、（組換え細胞が長鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を欠くか最小で有するように）任意のカナマイシン耐性Ｃ１代謝微生物が相同組換えおよび内因性ｆａｄＤ遺伝子の上記ｆａｄＤ変異体との置換によって宿主細胞ゲノムに組み込まれた耐性遺伝子を有することが確実であろう。
【０１６７】
さらに、１つ以上の選択されたチオエステラーゼ配列、マロニルＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ（ｆａｂＤ）配列、およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ配列（例えば、大腸菌由来のａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、およびａｃｃＤ）をコドン最適化し、適切なプロモーターを使用して合成した。次いで、１つ以上のチオエステラーゼ遺伝子およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子（例えば、ａｃｃＡまたはａｃｃＡＢＣＤ）を適切な発現ベクターにクローン化し、本明細書中に記載の野生型またはｆａｄＤ−ノックアウトＣ１代謝微生物に接合、エレクトロポレーション、または形質転換する。
【０１６８】
コドン最適化されたチオエステラーゼ配列を、（１）Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ
ＯＢ３ｂについては配列番号３〜１３；（２）Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈについては配列番号２０〜３０；（３）Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａについては配列番号３７〜４７；（４）Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓについては配列番号５４〜６４；（５）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍについては配列番号７０〜８０；および（６）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉについては配列番号８７〜９７に記載している。コドン最適化されたｆａｂＤ配列を、（１）Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂについては配列番号２；（２）Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈについては配列番号１９；（３）Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａについては配列番号３６；（４）Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓについては配列番号５３；（５）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍについては配列番号６９；および（６）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉについては配列番号８６に記載している。コドン最適化されたａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、およびａｃｃＤ配列を、それぞれ、（１）Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂについては配列番号１４〜１７；（２）Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈについては配列番号３１〜３４；（３）Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａについては配列番号４８〜５１；（４）Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓについては配列番号６５〜６８；（５）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍについては配列番号８１〜８４；および（６）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉについては配列番号９８〜１０１に記載している。
【０１６９】
接合
大腸菌由来のプラスミドのＭ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂまたはＭ．ｍｅｔｈａｎｉｃａへの接合手順は、Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｒｅｌｌによって開発された方法（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２７：２４３，１９９５）に基づく一方で、大腸菌由来のプラスミドのＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓへの接合手順は、Ａｌｉ  ａｎｄ  Ｍｕｒｒｅｌｌによって報告された方法（Ｍｉｃｏｌｏｇｉｏｌｏｇｙ  １５５：７６１，２００９）に基づいた。
【０１７０】
簡潔に述べれば、１つ以上の目的の遺伝子（例えば、変異ｆａｄＤ、ＭＣＴ、１つ以上のＴＥ、１つ以上のＡｃｃ）を含み、且つカナマイシン耐性をコードする可動性プラスミドを、最初に標準的なエレクトロポレーション法を使用して大腸菌Ｓ１７−１に形質転換した。形質転換を、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ−寒天上でのカナマイシン耐性コロニーの選択によって確認した。形質転換したコロニーを、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地に播種し、３７℃で一晩震盪した。次いで、１０ｍＬアリコートの一晩培養物を、滅菌４７ｍｍニトロセルロースフィルター（ポアサイズ０．２ｍｍ）上に回収した。大腸菌ドナー細胞を、５０ｍＬ滅菌ＮＳＭ培地を使用してフィルター上で洗浄して、残存する培地および抗生物質を除去した。
【０１７１】
並行して、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａ、またはＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈレシピエント株のサンプルを、２０〜５０ｍＬのＮＳＭ培地を含む１００ｍＬ血清瓶に個別に播種した。次いで、ボトルの上部空間に、酸素およびメタンの１：１混合物をフラッシングし、ボトルをブチルゴム隔膜で密封し、圧着した。ボトルを、ＯＤ６００がおよそ０．３に到達するまで３０℃（Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａ）または４５℃（Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ）の恒温器中で連続的に震盪した。次いで、細胞を、大腸菌ドナー株と同一のフィルター上に回収した。フィルターを、５０ｍＬの滅菌ＮＳＭ培地を使用して再度洗浄した。フィルターを、０．２％酵母エキスを含むＮＳＭ寒天プレート上に置き（細胞側を上に）、メタンおよび空気の１：１混合物の存在下にて３０℃（Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａ）または３７℃（Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ）で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を１０ｍＬ滅菌（ＮＳＭ）培地に再懸濁後、遠心分離によって濃縮した。収集した細胞を１ｍＬ滅菌ＮＳＭ培地に再懸濁し、アリコート（１００μＬ）を、１０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＮＳＭ寒天プレート上に広げた。
【０１７２】
プレートを、メタンおよび空気の１：１混合物を含む密封チャンバー中でインキュベートし、３０℃（Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａ）または４５℃（Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ）で維持した。ガス混合物を、コロニーが形成されるまで（典型的には、７〜１４日後）２日毎に補充した。カナマイシンを含むＮＳＭプレート上にコロニーを画線してカナマイシン耐性を確認し、残存大腸菌ドナー細胞から形質転換されたメタン資化性菌細胞をさらに単離した。
【０１７３】
エレクトロポレーション−Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
プラスミドのＭ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓへの導入手順は、Ｕｅｄａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：９２４、１９９１に記載の手順に基づく。簡潔に述べれば、野生型（ｗｔ）Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓを、０．５％メタノールを補足したＮＳＭ培地中にて３０℃で培養する。対数中期（１．４×１０９／ｍｌ）まで成長させたＭ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ  ＮＲ−２の細胞を６，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、エレクトロポレーション緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（Ｈ２０）、１０％［ｗｔ／ｖｏｌ］スクロース［ｐＨ７．５］）で洗浄した。細胞を、７．０×１０１０／ｍｌの細胞濃度で同一緩衝液中に再懸濁する。細胞懸濁液およびベクター（７０μｇ／ｍＬ）をチューブ内で９：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比で混合し、次いで、１０μＬを、３分間平衡化したチャンバーの電極間の空間に移す。１０パルスの１０ｋＶ／ｃｍ電界に３００μｓｅｃ／パルス供した後、５μＬのアリコートの混合物を清潔なチューブに移し、０．２ｍＬのＮＳＭ培地を添加する。次いで、細胞懸濁液を３０℃で２時間インキュベートして抗生物質耐性遺伝子を発現後、０．５μｇ／ｍＬメタノールおよび２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＮＳＭプレート上にプレートする。
【０１７４】
コロニーが形成されるまでプレートを３０℃でインキュベートした。コロニーを二連のプレートに画線してカナマイシン耐性を確認し、残存する大腸菌ドナー細胞から形質転換されたメチロトローフ菌細胞をさらに単離した。
【０１７５】
エレクトロポレーション−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの形質転換法を米国特許出願公開第２０１１／０２３６９４１号に記載のように行うかＣ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍについては修正プロトコール（Ｚｈｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９０：１５４、２００５）を使用して行う。簡潔に述べれば、コンピテント細胞を作製するために、本明細書中に記載の培養条件にしたがって５０ｍＬのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ培養物を新鮮な培地に３日間連続して継代培養する。これらの細胞を使用して、４０ｍＭのＤＬ−トレオニンを含む５０ｍＬのＰＥＴＣ培地にＯＤ６００値０．０５で播種する。培養物がＯＤ６００値０．４に到達した時に細胞を嫌気性チャンバーに移し、４，７００×ｇおよび４℃で収集する。培養物を氷冷エレクトロポレーション緩衝液（２７０ｍＭのスクロース、１ｍＭのＭｇＣｌ２、７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、最終的に６００μｌの新鮮なエレクトロポレーション緩衝液に懸濁する。この混合物を、１μｇのベクター（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ複製起点を欠き、目的の核酸分子を含み、クラリスロマイシン耐性をコードする）を含む０．４ｃｍ電極ギャップを備えた予冷エレクトロポレーションキュベットに移し、Ｇｅｎｅ  ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を以下の設定で使用して直ちにパルスを発生させる：２．５ｋＶ、６００μｌ、および２５μＦ。時定数３．７〜４．０ｍｓが達成される。培養物を５ｍｌの新鮮な培地に移す。細胞の再生を、チューブホルダを備えたＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｈｅｌｉｏｓ  Ｅｐｓｉｌｏｎ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して波長６００ｎｍでモニタリングする。バイオマスの初期の減少後、細胞は再度成長し始める。一旦バイオマスがその時点から倍加すると、細胞を収集し、２００μｌの新鮮な培地に懸濁し、４μｇ／μｌクラリスロマイシンを有する選択ＰＥＴＣプレート（１．２％Ｂａｃｔｏ（商標）寒天（ＢＤ）を含有）上にプレートする。３０ｐｓｉ鉄鋼所ガスとの３７℃で４〜５日間のインキュベーション後、コロニーが明らかに認められる。
【０１７６】
あるいは、エレクトロポレーションパルス後、細胞をＨｕｎｇａｔｅ管内の５ｍＬの予熱培地に移し、成長が認められるまで（光度計内でＨｕｎｇａｔｅ管を測定する）３７℃でインキュベートする。形質転換体のアリコートを５ｍＬ液体培地に播種し、クラリスロマイシン含有プレート上に広げて変異コロニーを作製する。
【０１７７】
選択した組換えコロニーを使用して、４μｇ／μｌクラリスロマイシンを含む２ｍｌのＰＥＴＣ培地を播種する。成長が認められた場合、培養物を、４μｇ／μｌのクラリスロマイシンおよび炭素源としての３０ｐｓｉの製鋼所ガスを含む５ｍｌのＰＥＴＣ培地にスケールアップし、その後に５０ｍｌのＰＥＴＣ培地にスケールアップする。
【０１７８】
組換えＣ１代謝細菌
抗生物質選択に対する細胞の耐性によって形質転換を確認し、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法、またはＥＬＩＳＡ法によって遺伝子発現を確認する。例えば、移入を検証するために、プラスミドＤＮＡを単離し、標準的条件（９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で１分間を３２サイクル；７２℃で１０分間）を使用したｉｌｌｕｓｔｒａ  ＰｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（商標）ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＰＣＲに供することができる。さらなるコントロールとして、１μｌの各単離プラスミドを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’Ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に再形質転換し、これからプラスミドを清潔に単離し、制限消化によって検証することができる。
【０１７９】
相同組換え事象の同定方法は当該分野で十分に確立されている（ゲノム内の固有のプライマーおよび適切な挿入を確認するためのベクターを使用したＰＣＲおよび配列決定など）。次いで、適切な挿入を有すると同定された組換え細菌を、選択圧の非存在下で（例えば、カナマイシンまたはクラリスロマイシンを使用しないで）数世代成長させ、カナマイシン選択性クローンを、レプリカ平板法（または等価な技術）によって同定する。およそ５０％のカナマイシン感受性復帰変異体は、野生型の代わりに標的遺伝子の変異形態を有するはずであり、この形態は、ＰＣＲおよび配列決定によって確認される。ｆａｄＤの発現または機能の喪失を、１つ以上の（１）ＰＣＲおよび配列決定、（２）ノーザンブロット分析、および（３）アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性のアッセイによって検証することができる。
【０１８０】
アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性について、例えば、Ｋａｍｅｄａらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５７０２，１９８１）を、必要に応じて抗生物質を有するＮＳＭ中での対数中期までの細胞の成長、遠心分離による細胞の収集、ＮＳＭでの２回の洗浄、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣ１）（ｐＨ７．５）での密度１．２×１０９細胞／ｍＬへの細胞の懸濁、および氷上の３サイクルの超音波処理による溶解によって使用することができる。反応混合物を、総体積０．５ｍｌに２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣ１）（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭのＡＴＰ、８ｍＭのＭｇＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＮａＦ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１０ｐＭの［３Ｈ］オレイン酸、０．５ｍＭの補酵素Ａ、および細胞抽出物を含めるように調製する。酵素反応を補酵素Ａの添加によって開始し、３５℃で１０分間インキュベートし、２．５ｍｌのイソプロピルアルコール：ｎ−ヘプタン：１ＭのＨ２ＳＯ４（４０：１０：１）の添加によって反応停止させる。放射性オレイン酸をｎ−ヘプタンを使用した有機抽出によって除去する一方で、反応中に形成されたオレオイル−ＣｏＡは、シンチレーション測定によって水性画分中に依然として定量される。酵素抽出物中のタンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを使用したＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して決定する。
【０１８１】
Ｃ１基質（ＣＨ４およびＣＯ）からの脂肪酸の産生
メタン資化性菌について、１つ以上のチオエステラーゼ遺伝子をコードする遺伝子を含むかアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現するベクターで形質転換した野生型またはｆａｄＤ−ノックアウトのＭ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａ、Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、またはＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈを使用して、２０〜５０ｍＬのＮＳＭ培地および１０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む１００ｍＬの血清瓶または培養管に播種する。Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓについて、培地に炭素源として０．５％メタノールを補足するのに対して、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａ、およびＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈについてはボトルの上部空間に炭素源として酸素およびメタンの１：１混合物をフラッシングする。ボトルをブチルゴム隔膜で密封し、圧着する。次いで、ボトルまたはチューブを、３０℃（Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍ．ｍｅｔｈａｎｉｃａ、Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）または４２〜４５℃（Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ）でのインキュベーション中に２００〜２５０ｒｐｍの速度で連続して振盪する。
【０１８２】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａについて、１つ以上のチオエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を含み、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を有するか有さないベクターで形質転換した野生型またはｆａｄＤ−ノックアウトのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉを使用して、４μｇ／μｌクラリスロマイシンを含む２ｍｌのＰＥＴＣ培地に播種する。成長が認められた場合、培養物を、４μｇ／μｌクラリスロマイシンおよび炭素源としての３０ｐｓｉの製鋼所ガスを含む５ｍｌのＰＥＴＣ培地にスケールアップし、その後に５０ｍｌのＰＥＴＣ培地にスケールアップする。次いで、ボトルを、３７℃でのインキュベーション中に２００〜２５０ｒｐｍの速度で連続して振盪する。
【０１８３】
組換えＣ１代謝細菌によって産生された脂肪酸を、ガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）を使用して定量する。細胞培養物中の脂肪酸を、抽出物のＧＣ／ＭＳ分析の内部標準としてウンデカン酸を含む酢酸ブチルと共に激しくボルテックスすることによって抽出する。混合物の短期間の遠心分離後、有機層の一部を個別のバイアルに移し、その後に等体積のＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドを添加した。サンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−５ＭＳ  ＧＣ／ＭＳカラム（３０．０ｍ×２５０μＭ×０．２５μＭフィルム厚）を使用したマススペクトロメータ検出器（ＨＰ  ５７９２）を備えたＧＣによって分析した。インジェクタについて２５０℃での分割比２０：１を使用し、ヘリウムは流速１．２ｍＬ／分のキャリアガスであった。オーブン温度を６０℃に１分間保持し、その後に２５０℃に到達するまで１９℃／分の温度勾配で温度上昇させた。細胞培養物中の脂肪酸濃度を、脂肪酸標準の検量線に基づいて選択イオンモードを使用して計算した。メタンが細胞に供給された唯一の炭素源であったので、産生された全脂肪酸は、メタンに由来しているに違いなかった。
【０１８４】
結果
Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの脂肪酸プロフィールは、ｆａｄＤのノックアウトならびに大腸菌チオエステラーゼ遺伝子の導入および発現によって変化した。第１に、周辺質ターゲティング配列が除去された大腸菌チオエステラーゼ遺伝子（ＴｅｓＡ’）を、異なる発現レベルを有するバリアントを生成するためにデザインされた３つの異なるコドン組成（ＴｅｓＡ’−３、配列番号１０２；ＴｅｓＡ’−３７、配列番号１０３；およびＴｅｓＡ’−２０、配列番号１０４）を使用して合成した。ＴｅｓＡ’バリアントを、ＩｎｃＰベースのプラスミド（Ｉｎｃ−Ｐ  ｏｒｉＶおよびｏｒｉＴを含む）にクローン化し、メタン資化性菌で機能するプロモーターに作動可能に連結した。ＴｅｓＡ’を含む組換え発現ベクターを、本明細書中に記載のようにＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓに形質転換した。１５０ｍＬの密封血清瓶中にて５ｍＬのＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ培養物を、４０ｍＬメタンおよび８０ｍＬ酸素と共に５日間成長させた。成長段階後、１ｍＬの各培養物を、本明細書中に記載のように、ＧＣ／ＭＳを使用して脂肪酸の濃度および組成についてアッセイした。遊離脂肪酸の測定値を、培養によるＯＤ６００に正規化した。Ｃ１６：１という表記は少なくとも３つの異なる異性体から構成され、Δ９−シスパルミトレイン酸が最も豊富である（データ示さず）ことに留意のこと。
【０１８５】
並行して、大腸菌アシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）シンセターゼのホモログ（ｆａｄＤ）を、本明細書中に記載のようにＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓゲノム中の配列番号１８を使用して組換え的にノックアウトし、ＰＣＲ分析によって確認した。ＦａｄＤノックアウトは、いくつかの他の微生物株において遊離脂肪酸レベルの増加が示されている（例えば、Ｌｅｎｎｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６５９、２０１２を参照のこと）。Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ｆａｄＤノックアウト変異体は、遊離脂肪酸レベルの有意な増加を示さなかった。これは、１つ以上のさらなるＦａｄＤホモログがＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓゲノム内に存在し得るが、Ｃ１８：０脂質が増加したので脂質プロフィールがシフトしたことを示す。
【０１８６】
形質転換細胞中の遊離脂肪酸プールは劇的に増加し（図３Ａを参照のこと）、この増加は主にＣ１６：０脂質およびＣ１８：０脂質のレベルの増加に起因していた（図３Ｂを参照のこと）。
【０１８７】
実施例３
Ｃ１代謝微生物からの脂質抽出
収集した細菌バイオマス内に含まれる油組成物を、２０℃（すなわち、室温）で１体積のメタノールを含む２体積のクロロホルムから作製された抽出溶液（ＣＭ溶液）中にて実施したＦｏｌｃｈ抽出プロトコール（Ｆｏｌｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：４９７，１９５７）の修正バージョンを使用して抽出した。約５ｇの湿細胞重量（ＷＣＷ）のいずれかの新鮮な細菌バイオマス（または−８０℃で保存し、その後に解凍した細菌バイオマス）を抽出のために使用した。１００ｍＬのＣＭ溶液を細胞材料に添加し、混合物を分液漏斗中で強く抽出した。少なくとも１０分後、３相に分離された。抽出脂質を含む有機相が分液漏斗の底部に沈殿し、これを清潔なガラスボトルに排出させた。中間層は主に溶解した細胞材料を含み、塩および他の可溶性細胞成分を含む軽質の水相から分離することができた。
【０１８８】
任意選択的に、水相中の固体を、遠心機または他の機械的濃縮装置を使用して濃縮することができる。固体から除去した水を再利用することができる一方で、いくらか水が残存する固体を固体処理ユニットに供給することができる。
【０１８９】
脂質抽出効率を向上させるために、残存溶解細胞集団および残留水を含む分液漏斗にさらなる１００ｍＬの新鮮なＣＭ溶液を直接添加することによって第２の抽出工程を行った。混合物を再度完全に混合し、相を分離させ、２種の抽出物由来の底部の有機相をプールした。次いで、プールした有機相を、分液漏斗中で１００ｍＬ脱イオン水を使用して洗浄して任意の残存する水溶性材料を除去した。分離された有機画分を分液漏斗の底部から再度単離し、酸素の非存在下が好ましい加熱回転蒸発によるか窒素流下での５５℃の蒸発によって溶媒を除去した。
【０１９０】
【表１】
2019013258.tif 000002
【０１９１】
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、およびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａの収集培養物から抽出した固化油組成物をそれぞれ秤量し、元の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）の重量画分として表１に示す。これらのデータは、これらのＣ１代謝微生物由来のＤＣＷの有意な画分を脂質が占めることを示す。
【０１９２】
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６バイオマス由来の油組成物も、Ｈａｒａ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｎのヘキサン：イソプロパノール（ＨＩＰ）抽出法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９０：４２０，１９７８）を使用して抽出した。ＨＩＰ法を使用して抽出した油組成物の分析は、これらの油組成物が修正Ｆｏｌｃｈ法を使用して抽出した油組成物と本質的に同一である（データ示さず）ことを示していた。
【０１９３】
実施例４
Ｃ１代謝微生物由来の脂質の脂肪酸メチルエステル変換
乾燥固体の形態のＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、およびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ培養バイオマスから抽出した脂質画分を個別に水酸化カリウム（ＫＯＨ）を使用して加水分解し、単一工程でのメタノールとの反応によって脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に変換した。１０ｍＬガラスボトル中の約５ｇの抽出固体脂質を、５ｍＬのトルエン：メタノール（１：１  ｖ／ｖ）の０．２Ｍ  ＫＯＨ溶液を使用して溶解した。ボトルを強く振盪し、次いで、２５０ｒｐｍにて４２℃で６０分間混合後、溶液を周囲温度に冷却し、分液漏斗に移した。およそ５ｍＬの蒸留水および５ｍＬのＣＭ溶液を分液漏斗に添加し、混合し、次いで、相を重力または５分間の遠心分離（３，０００ｒｐｍ、２５℃）によって分離させた。溶解したグリセロールリン酸エステルを含む上部の水層を除去し、重い油相（底部）を回収し、回転蒸発または一定の窒素流によって濃縮乾固した。
【０１９４】
各メタン資化性菌培養物由来の脂質中に見出されたＦＦＡおよびＦＡＭＥを、ガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）を使用して分析した。加水分解／エステル交換反応工程の前後に回収した固体を、ＧＣ／ＭＳ分析の内部標準としてウンデカン酸を含む３００μＬ酢酸ブチルに溶解した。得られた溶液を、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して不溶性残渣を除去した。同体積のＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド等価物を遠心分離工程由来の上清に添加し、短時間ボルテックスした。サンプルを、質量分析計検出器（ＨＰ  ５７９２）を備えたＧＣにロードし、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−５ＭＳ  ＧＣ／ＭＳカラム（３０．０ｍ×２５０μｍ×０．２５μｍフィルム厚）を使用してＦＦＡおよびＦＡＭＥを分離した。ＦＦＡおよびＦＡＭＥの同一性を、その標準の保持時間および質量スペクトルの電子衝撃イオン化を使用して確認した。ＧＣ／ＭＳ法は、キャリアガスとして流速１．２ｍＬ／分のヘリウムを利用した。注入ポートを２０：１のスプリット比で２５０℃に保持した。オーブン温度を６０℃に１分間保持し、その後に３００℃まで８℃増加／分を含む温度勾配上昇させた。ＦＦＡおよびＦＡＭＥのそれぞれの面積率を、質量検出器の応答由来の総イオンに基づいて計算した。
【０１９５】
加水分解／エステル交換反応の前後に回収された固体残渣を、ＧＣ／ＭＳによってＦＦＡおよびＦＡＭＥについて分析した（表２を参照のこと）。また、ＧＣ／ＭＳ分析由来のクロマトグラムを、図４〜６に示す。
【０１９６】
【表２】
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【０１９７】
表２および図４〜６から明らかなように、加水分解／エステル交換反応前の抽出油組成物は、遊離脂肪酸および（ほぼ間違いなく）ジアシルグリセリドおよびトリアシルグリセリドとして存在するさらなる脂肪酸（ＧＣ／ＭＳ軌跡上で検出されない）が豊富であるが、ＦＦＡは加水分解／エステル交換反応後に種々の長さの脂肪酸メチルエステルに変換される。これらのデータは、本開示のＣ１代謝微生物由来の油組成物を精製し、これを使用して価値の高い分子を作製することができることを示す。
【０１９８】
実施例５
Ｃ１代謝微生物由来の油組成物を使用したバイオ燃料産生
Ｃ１代謝微生物由来の抽出油組成物を、共同設置された精製所で処理するか、離れた精製所に輸送することができる。精製所を使用して、生体再生可能飼料由来のトリグリセリド（脂肪、グリース、およびメタン資化性菌油など）を脂質炭化水素燃料の混合物（主にバイオディーゼルおよびバイオジェット燃料、高品質の合成パラフィン系ケロシン（ＳＰＫ））に変換する。この過程には、メタン改質を使用して施設内で生産することができるか、既存の精製所での発酵施設の共同設置によって供給される水素を必要とする。
【０１９９】
精製所を、生産物がバイオディーゼル燃料およびバイオジェット燃料の混合物である混合モード、または生産物が主にバイオディーゼルであるディーゼルモードで運転することができる。
【０２００】
精製中、脂肪酸およびグリセリドを、３工程でＳＰＫに変換する。第１に、供給材料を必要に応じて処理して、触媒夾雑物および水を除去する。第２の工程では、脂肪酸鎖を、水素処理装置内でｎ−パラフィンに変換する。一例は、水素化処理装置中での水素化反応および脱酸素反応によるｎ−オクタデカンへのオレイン酸変換である。ほとんどのバイオオイル、脂肪、およびグリースについて、水素化処理装置の液体生成物は、主にＣ１５〜Ｃ１８のｎ−パラフィン組成物である。プロセスの第３工程では、これらの長い直鎖パラフィンをより短い分岐鎖パラフィンに水素添加分解する。水素添加分解生成物は、主にケロシン沸点範囲内に含まれる。
【０２０１】
生産されたＳＰＫは、好ましくは、密度以外は全ジェット燃料の目的にかなった規格を満たすかそれを超える。その優れた熱安定性および低微粒子排出特性が与えられるＳＰＫの高Ｈ対Ｃ比は、より低密度の炭化水素組成物を意味する：最小ＡＳＴＭ規格値７７５ｋｇ／ｍ３と比較して７６０〜７７０ｋｇ／ｍ３。しかし、これは、石油ジェット燃料：ＳＰＫブレンド（例えば、５０／５０）に関する問題ではない。
【０２０２】
実施例６
Ｃ１代謝微生物由来の脂質中の安定炭素同位体分布
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍのバイオマスおよび脂質画分の乾燥サンプルを、ＩｓｏＰｒｉｍｅ１００  ＩＲＭＳ（Ｉｓｏｐｒｉｍｅ，Ｃｈｅａｄｌｅ，ＵＫ）を取り付けたＣＨＮＯＳ元素分析器（ｖａｒｉｏ  ＩＳＯＴＯＰＥ  ｃｕｂｅ，Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ，Ｈａｎａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した元素分析器／連続フロー型同位体比質量分析によって、炭素および窒素含有量（％乾燥重量）、ならびに炭素（１３Ｃ）および窒素（１５Ｎ）安定同位体比について分析した。発酵槽または血清瓶で培養したメタン資化性バイオマスのサンプルを遠心分離し、脱イオン水に再懸濁し、０．２〜２ｍｇの炭素（約０．５〜５ｍｇ乾燥細胞重量）に対応する体積を５×９ｍｍスズカプセル（Ｃｏｓｔｅｃｈ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に移し、８０℃で２４時間乾燥させた。同様に、事前に抽出した脂質画分をクロロホルムに懸濁し、０．１〜１．５ｍｇの炭素を含む体積をスズカプセルに移し、８０℃で２４時間蒸発乾固させた。０．１ｍｇの炭素を含む標準によって信頼性の有るδ１３Ｃ値を得た。
【０２０３】
同位体比を「δ」表記（‰）で示し、これは、千分率偏差に基づいた標準の同位体組成に対する材料の同位体組成がδ１３Ｃ（またはδ１５Ｎ）＝（Ｒサンプル／Ｒ標準−１）×１，０００（式中、Ｒは重い同位体の軽い同位体に対する分子比である）で与えられる。炭素標準はウィーンピーディーベレムナイト（Ｖ−ＰＤＢ）であり、窒素については大気である。ＮＩＳＴ（国立標準技術研究所）は、ＳＲＭ（標準参照物質）番号１５４７（モモの葉）を較正標準として使用することを推奨していた。全同位体分析を、カリフォルニア大学バークレー校の安定同位体生物地質化学センターで行った。Ｃ同位体およびＮ同位体分析の長期外部精度は、それぞれ０．１０‰および０．１５‰である。
【０２０４】
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ＯＢ３ｂを３つの異なる発酵バッチ内でメタンに対して成長させ、Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈを２つの異なる発酵バッチ内でメタンに対して成長させ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａを単一の発酵バッチ内でメタンに対して成長させた。３つの各培養物由来のバイオマスを、安定炭素同位体分布（δ１３Ｃ値；表３を参照のこと）について分析した。
【０２０５】
【表３】
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【０２０６】
さらに、安定炭素同位体分析を、実施例１に記載のようにバイオリアクター中でメタンに対して成長させたＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株（Ｍｔ  ＯＢ３ｂ）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株（Ｍｃ  Ｂａｔｈ）、およびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ株（Ｍｍｓ  １６ａ）由来のバイオマスおよび対応する脂質画分（表４を参照のこと）について行った。
【０２０７】
【表４】
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【０２０８】
Ｍｔ  ＯＢ３ｂ株、Ｍｃ  Ｂａｔｈ株、およびＭｍｓ  １６ａ株由来のバイオマスを、それぞれ９４時間（３．１４ｇのＤＣＷ／Ｌ）、２６時間（２．２ｇのＤＣＷ／Ｌ）、および３９時間（１．１４ｇのＤＣＷ／Ｌ）で収集した。表４中の脂質についてのδ１３Ｃ値は、２連の測定値の平均を示す。
【０２０９】
実施例７
脂質における安定炭素同位体分布に及ぼすメタン供給源および純度の影響
天然ガス成分を含むメタンに対して成長させたメタン資化性菌を試験するために、１００ｍＬ特定培地ＭＭＳ１．０を含む一連の０．５リットル血清瓶に、メタンおよび空気の１：１（ｖ／ｖ）混合物を供給した同一培地中で成長させた血清瓶バッチ培養（５％ｖ／ｖ）由来のＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂまたはＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈを播種した。ＭＭＳ１．０培地の組成は以下であった：０．８ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭのＮａＮＯ３、０．１４ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．３５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、３．４ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２０．７μＭのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、６μＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０μＭのＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡ、および１ｍＬ／リットルの微量元素溶液（Ｌあたり以下を含む：５００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１５ｍｇのＨ３ＢＯ３、２５０ｍｇのＥＤＴＡ）。培地をオートクレーブし、冷却した後に、リン酸塩、重炭酸塩、およびＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡを添加した。培地の最終ｐＨは７．０±０．１であった。
【０２１０】
播種したボトルをゴムスリーブストッパーで密封し、滅菌０．４５μｍフィルターおよび滅菌２７Ｇ針によってシリンジを介して６０ｍＬメタンガスを注入した。二連の培養物に６０ｍＬの（Ａ）純度９９％のメタン（グレード２．０，Ｐｒａｘａｉｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｇａｓ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）、（Ｂ）天然ガス標準を示す純度７０％のメタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；９％エタン、６％プロパン、３％メチルプロパン、３％ブタン、および他の微量炭化水素成分も含む）、（Ｃ）メタン供給源ＡおよびＢの１：１混合物として送達させた純度８５％のメタン；および（Ｄ）９３％超のメタン（グレード１．３，Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ；インハウス分析ではメタン組成９９％超を示した）をそれぞれ注入した。培養物を、２５０ｒｐｍでの回転振盪を使用して３０℃（Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ＯＢ３ｂ）または４２℃（Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ）でインキュベートし、１ｍＬのサンプルを取り出すことによっておよそ１２時間間隔で成長を測定してＯＤ６００を決定した。この時ボトルを通気し、上部空間を６０ｍＬの各メタン供給源（Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ）および６０ｍＬの濃縮酸素（少なくとも純度８５％）と置換した。約２４時間間隔で、５ｍＬのサンプルを取り出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）によって細胞を回収し、次いで、分析するまで−８０℃で保存した。
【０２１１】
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ＯＢ３ｂおよびＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ由来のメタン資化性バイオマスについての炭素含有量および窒素含有量（％乾燥重量）ならびに炭素（１３Ｃ）および窒素（１５Ｎ）安定同位体比の分析を実施例６に記載のように行った。表５は、異なるレベルの純度を有するメタンに対してボトル培養の種々のバッチで成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ由来のバイオマスサンプルについての安定炭素同位体分析の結果を示す。
【０２１２】
【表５】
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【０２１３】
１つのメタン供給源（Ａ、９９％）に対して成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの平均δ１３Ｃは−４１．２±１．２であった一方で、異なるメタン供給源（Ｂ、７０％）に対して成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの平均δ１３Ｃは−４４．２±１．２であった。メタン供給源ＡおよびＢを混合した場合、中間のδ１３Ｃの平均−４３．８±２．４が認められた。これらのデータは、メタン供給源ＡおよびＢに対して成長させた細胞材料のδ１３Ｃが投入メタンのδ１３Ｃの相違に起因して相互に有意に異なることを示す。しかし、２つのガスの混合物に対して成長させた細胞は１２Ｃを優先的に利用し、したがって、より負のδ１３Ｃ値となる傾向を示す。
【０２１４】
異なるメタン供給源およびボトル培養の種々のバッチにおいて成長させた２つの異なるメタン資化性菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＢａｔｈおよびＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ）がδ１３Ｃ分布の相違を示すかどうかを試験するために、類似の実験を行った（表６を参照のこと）。
【０２１５】
【表６】
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【０２１６】
第１のメタン供給源（Ａ）に対して成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの平均δ１３Ｃは−４４．５±８．８であった一方で、同一メタン供給源に対して成長させたＭ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍの平均δ１３Ｃは−４７．８±２．０であった。第２のメタン供給源（Ｂ）に対して成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの平均δ１３Ｃが−３７．９±０．４であった一方で、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍの平均δ１３Ｃは−３９．８±４．５であった。これらのデータは、メタン供給源に対して成長させた細胞材料のδ１３Ｃが同一のメタン供給源に対して成長させた異なる株由来の細胞材料のδ１３Ｃと高度に類似することを示す。したがって、細胞材料のδ１３Ｃの実測値は、研究された特定の細菌株の性質よりもむしろ投入ガスの組成に主に依存するようである。
【０２１７】
上記の種々の実施形態を組み合わせてさらなる実施形態を得ることができる。本明細書中で言及されており、そして／または出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物（米国特許出願第６１／６７１，５２号が含まれるが、これに限定されない）の全ては、その全体が本明細書中で参考として援用される。必要に応じて種々の特許、出願、および刊行物の概念を使用するために実施形態の態様を修正して、さらなる実施形態を得ることができる。
【０２１８】
上記の詳細な説明を考慮して実施形態のこれらおよび他の変更形態を得ることができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用した用語は、明細書中に開示した特定の実施形態に特許請求の範囲を制限すると解釈すべきでないが、特許請求の範囲は、かかる特許請求の範囲が権利を付与される均等物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示により制限されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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