(57)【要約】    【課題】骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導できる骨髄幹細胞の分化誘導剤を提供すること、骨髄幹細胞を表皮に誘引して表皮細胞に分化させることによって表皮機能を改善できる表皮改善剤や皮膚外用剤を提供すること、などを課題とする。    【解決手段】ニーム葉抽出物と紅茶抽出物とを含む、骨髄幹細胞の分化誘導剤を提供する。また、骨髄幹細胞の誘引剤をさらに含む、表皮改善剤や皮膚外用剤を提供する。上記の分化誘導剤、表皮改善剤、皮膚外用剤は、ナス果実抽出物をさらに含んでもよい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニーム葉抽出物と紅茶抽出物とを含む、骨髄幹細胞の分化誘導剤。
【請求項２】
ナス果実抽出物をさらに含む、請求項１に記載の分化誘導剤。
【請求項３】
骨髄幹細胞の誘引剤と、ニーム葉抽出物と、紅茶抽出物とを含む、表皮改善剤。
【請求項４】
ナス果実抽出物をさらに含む、請求項３に記載の表皮改善剤。
【請求項５】
骨髄幹細胞の誘引剤と、ニーム葉抽出物と、紅茶抽出物とを含む、皮膚外用剤。
【請求項６】
ナス果実抽出物をさらに含む、請求項５に記載の皮膚外用剤。
【請求項７】
請求項３若しくは４に記載の表皮改善剤、又は、請求項５若しくは６に記載の皮膚外用剤を表皮に塗布することによって、骨髄幹細胞を表皮に誘引し、誘引した前記骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化させることを備える、表皮改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄幹細胞の分化誘導剤、表皮改善剤、皮膚外用剤、及び、表皮改善方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
未だ分化しておらず様々な組織細胞へと分化しうる幹細胞としては、受精卵が分化していない状態の細胞である胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、分化した組織に含まれ未だ分化していない状態の細胞である体性幹細胞などが知られている。
体性幹細胞は、体内の各種組織に存在するものであり、体性幹細胞としては、例えば、骨髄に存在する骨髄幹細胞が知られている。
【０００３】
骨髄幹細胞は、機能が失われた組織においてその組織細胞に分化することによって組織の機能を回復させ得るものとして注目されている。具体的には、骨髄幹細胞は、炎症のある組織又は損傷を受けた組織へ血流にのって誘引されて集積し、分化を誘導する分化誘導剤の影響を受けてその組織細胞へ分化し得るものとして注目されている。
【０００４】
ところで、従来、骨髄幹細胞を特定の組織細胞に分化させ得る分化誘導剤としては、例えば、血小板由来成長因子（Platelet-Derived Growth Factor）としてのＰＤＧＦ−ＢＢを含み骨髄幹細胞を筋肉組織細胞に分化させ得る分化誘導剤が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００５／０６３９６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の分化誘導剤は、骨髄幹細胞を筋肉組織細胞へ分化誘導できるものの、例えば、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導する性能を有しないという問題がある。
【０００７】
本発明は、上記の問題点等に鑑み、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導できる骨髄幹細胞の分化誘導剤を提供することを課題とする。
また、本発明は、骨髄幹細胞を表皮に誘引して表皮細胞に分化させることによって表皮機能を改善できる表皮改善剤、皮膚外用剤、及び、表皮改善方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る骨髄幹細胞の分化誘導剤は、ニーム葉抽出物と紅茶抽出物とを含むことを特徴とする。上記の分化誘導剤は、ナス果実抽出物をさらに含むことが好ましい。
【０００９】
本発明に係る表皮改善剤及び皮膚外用剤は、骨髄幹細胞の誘引剤と、ニーム葉抽出物と、紅茶抽出物とを含むことを特徴とする。上記の表皮改善剤及び皮膚外用剤は、ナス果実抽出物をさらに含むことが好ましい。
【００１０】
本発明に係る表皮改善方法は、上記の表皮改善剤、又は、上記の皮膚外用剤を表皮に塗布することによって、骨髄幹細胞を表皮に誘引し、誘引した骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化させることを備える。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の骨髄幹細胞の分化誘導剤は、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導できるという効果を奏する。
本発明の表皮改善剤、皮膚外用剤、及び、表皮改善方法は、骨髄幹細胞を表皮に誘引して表皮細胞に分化させることによって表皮機能を改善できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】分化誘導に関わる評価試験結果を表すグラフ。
【図２Ａ】分化誘導に関わる評価試験結果を表すグラフ。
【図２Ｂ】分化誘導に関わる評価試験結果を表すグラフ。
【図３Ａ】分化誘導に関わる評価試験結果を表すグラフ。
【図３Ｂ】分化誘導に関わる評価試験結果を表すグラフ。
【図４Ａ】分化誘導に関わる評価試験結果を表すグラフ。
【図４Ｂ】分化誘導に関わる評価試験結果を表すグラフ。
【図５】分化誘導に関わる評価試験結果を表すグラフ。
【図６】ヒトにおける表皮改善作用の評価試験結果を表すグラフ。
【図７】細胞誘引試験方法の様子を模式的に示した図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明の骨髄幹細胞の分化誘導剤の実施形態について説明する。
【００１４】
本実施形態の骨髄幹細胞の分化誘導剤は、ニーム葉抽出物と紅茶抽出物とを含むものである。本実施形態の骨髄幹細胞の分化誘導剤によれば、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導できる。
【００１５】
骨髄幹細胞は、間葉系幹細胞の１種である。骨髄幹細胞は、骨髄で作り出される幹細胞である。骨髄幹細胞は、血液中にも含まれ、血流にのって体内の各組織へ運ばれ得るものである。
【００１６】
上記ニーム葉抽出物は、センダン科アザディラクタ属に属するインドセンダンの葉を抽出溶媒で抽出処理することによって得られるものである。換言すると、ニーム葉抽出物は、抽出溶媒によってインドセンダンの葉から抽出された成分を含む。インドセンダンの学名は、Melia azadirachta L. (Meliceae)である。インドセンダンは、英語でNeem（ニーム）と称される。
【００１７】
上記ニーム葉抽出物は、例えば、加熱処理したインドセンダンの葉に対して、抽出溶媒で抽出処理を施すことによって得られる。
【００１８】
上記紅茶抽出物は、ツバキ科ツバキ属に属する基準変種のチャノキ（変種のアッサムチャを含む）の葉に対して抽出溶媒で抽出処理を施すことによって得られるものである。換言すると、紅茶抽出物は、抽出溶媒によってチャノキの葉から抽出された成分を含む。基準変種のチャノキの学名は、Thea sinensis Linne である。チャノキには、トウチャやベニバナチャが含まれる。また、アッサムチャの学名は、Thea sinensis Linne var. assamica Pierre (Theaceae)である。本実施形態では、紅茶抽出物は、アッサムチャの葉の抽出物である。
【００１９】
上記紅茶抽出物は、完全に発酵処理（酸化発酵処理）されたチャノキの葉（紅茶）に対して、抽出溶媒によって抽出処理を施すことによって得られる。完全発酵されてなる紅茶としては、例えばアッサム紅茶、ダージリン紅茶、セイロン紅茶などが挙げられる。
【００２０】
本実施形態の骨髄幹細胞の分化誘導剤は、ナス果実抽出物をさらに含むことが好ましい。上記の分化誘導剤がナス果実抽出物をさらに含むことによって、より十分に骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導できるという利点がある。
【００２１】
上記ナス果実抽出物は、ナス科ナス属に属するナス（Solanum melongena）の果実に対して抽出溶媒で抽出処理を施すことによって得られるものである。ナスとしては、ミズナスが好ましい。ミズナスの学名は、Solanum melongena (Mizunasu)である。
【００２２】
上記ナス果実抽出物は、ナスの果実に対して、抽出溶媒によって抽出処理を施すことによって得られる。
【００２３】
上述した各抽出物は、抽出溶媒又は希釈用溶媒を含む抽出液の状態、又は、抽出後の抽出溶媒を除去した乾燥物の状態になり得る。具体的には、各抽出物は、例えば、溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状などの状態になり得る。
【００２４】
上記抽出溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの脂肪族１価アルコール（炭素数１〜４であり且つＯＨ基を１つ有する有機化合物（構造異性体含む））；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの脂肪族多価アルコール（炭素数１〜５であり且つＯＨ基を複数有する有機化合物）；アセトンなどのケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステルなどのエステル類；キシレン、ベンゼン、トルエンなどの芳香族類；クロロホルムなどハロゲン化アルキル類などの有機溶媒が挙げられる。
これらの抽出溶媒は、１種が単独で、又は２種以上が混合されて用いられ得る。混合抽出溶媒の混合比は、特に限定されるものではなく、適宜調整される。
【００２５】
上記ニーム葉抽出物の抽出溶媒としては、脂肪族多価アルコールを含む溶媒が好ましく、脂肪族多価アルコール（１，３−ブチレングリコール）を５０質量％以上含む抽出溶媒がより好ましく、１，３−ブチレングリコールを９０質量％以上含む溶媒がさらに好ましい。
上記紅茶抽出物の抽出溶媒としては、脂肪族１価アルコールを含む溶媒が好ましく、脂肪族１価アルコール（エタノール）を５０質量％以上含む抽出溶媒がより好ましく、エタノールを９０質量％以上含む溶媒がさらに好ましい。脂肪族１価アルコールで抽出された抽出物は、１，３−ブチレングリコールなどの脂肪族多価アルコールによって溶解されてもよい。
上記ナス果実抽出物の抽出溶媒としては、水と脂肪族多価アルコール（例えば１，３−ブチレングリコール）とを含む混合溶媒が好ましい。混合溶媒において、水と脂肪族多価アルコール（１，３−ブチレングリコール）との混合比は、７：３（水：脂肪族多価アルコール）が好ましい。
【００２６】
上記抽出処理の方法としては、特に制限されず、従来公知の一般的な抽出方法を採用することができる。抽出処理においては、抽出原料として各植物の抽出部位（葉や果実）をそのまま若しくは乾燥させて用いることができる。また、通常、抽出溶媒量が抽出原料の５〜１５倍量（質量比）であり、抽出温度が２０℃〜８０℃であり、抽出時間が２時間〜３日間である。抽出処理した後においては、必要に応じて、ろ過、脱臭、脱色などの精製処理を行うことができる。
【００２７】
上記骨髄幹細胞の分化誘導剤において、紅茶抽出物に対するニーム葉抽出物の質量比（ニーム葉抽出物／紅茶抽出物）は、乾燥物換算で、１／１以上２３／１以下であることが好ましく、２／１以上５／１以下であることがより好ましく、３／１以上５／１以下であることがさらに好ましい。
ナス果実抽出物の質量に対する、ニーム葉抽出物と紅茶抽出物との合計量の質量比（ニーム葉抽出物及び紅茶抽出物／ナス果実抽出物）は、１／１以上７／１以下であることが好ましく、１／１以上５／１以下であることがさらに好ましい。
なお、乾燥物換算とは、抽出物に含まれる溶媒を抽出物から取り除いた乾燥物の質量に換算することである。
【００２８】
上記骨髄幹細胞の分化誘導剤に含まれる上記各抽出物の濃度は、特に限定されないが、例えば、ニーム葉抽出物の濃度が乾燥物換算で０．０００５質量％以上０．０７５質量％以下であり、紅茶抽出物の濃度が乾燥物換算で０．０００１５質量％以上０．０３質量％以下である。また、ナス果実抽出物の濃度が乾燥物換算で０．０００１質量％以上０．０１５質量％以下である。
【００２９】
上記各抽出物としては、例えば、化粧料用原料、食品添加物として市販されているものを用いることができる。
【００３０】
本実施形態の骨髄幹細胞の分化誘導剤は、上記の各抽出物の他に、水、エタノール、多価アルコール、油分、界面活性剤、増粘剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、などを含んでもよい。本実施形態の骨髄幹細胞の分化誘導剤は、例えば、液状、ゲル状、クリーム状、固形状などの状態であってもよい。
【００３１】
本実施形態の骨髄幹細胞の分化誘導剤は、例えば、皮膚塗布用又は皮膚貼付用の皮膚外用剤であってもよい。本実施形態の骨髄幹細胞の分化誘導剤は、例えば、化粧料、医薬品、医薬部外品などの用途で用いられてもよい。
【００３２】
次に、本発明の表皮改善剤及び皮膚外用剤の実施形態について説明する。本実施形態の表皮改善剤及び皮膚外用剤は、いずれも、骨髄幹細胞の誘引剤と、上記のニーム葉抽出物と、上記の紅茶抽出物とを含むものである。本実施形態の表皮改善剤及び皮膚外用剤は、上記のナス果実抽出物をさらに含むことが好ましい。
【００３３】
上記の骨髄幹細胞の誘引剤は、表皮に塗布されることによって、血流中の骨髄幹細胞を表皮に誘引するものであれば、特に限定されない。表皮改善剤又は皮膚外用剤に含まれる上記誘引剤（化合物量及び乾燥物換算量の総量）の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．００００１質量％以上１０質量％以下である。また、表皮改善剤又は皮膚外用剤に含まれるニーム葉抽出物の濃度は、例えば、乾燥物換算で０．０００５質量％以上０．０７５質量％以下であり、紅茶抽出物の濃度は、例えば、乾燥物換算で０．０００１５質量％以上０．０３質量％以下である。
【００３４】
上記の誘引剤は、ボダイジュ抽出物、ボタンピ抽出物、クスノハガシワ抽出物、アセンヤク抽出物、パシャンベ抽出物、シンナムタンニンＢ１、ペンタガロイルグルコース、ボルケンシフラボン、モレロフラボン、ケンフェリトリン、ケルセチン−３，７−ジラムノシド、プロシアニジンＡ２、プロシアニジンＢ１、デアセチルサイトカラシンＣ、エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）の培養物、及び、タラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）の培養物からなる群より選択された少なくとも１種であることが好ましい。
【００３５】
上記ボダイジュ抽出物は、シナノキ科（Tiliaceae）の植物に対して抽出溶媒によって抽出処理を施すことによって得られるものである。シナノキ科（Tiliaceae）の植物としては、ナツボダイジュ（Tilia platyphyllos Scop.）、フユボダイジュ（Tilia.cordata Mill.）、セイヨウシナノキ（Tilia.europaea L.）、又はその他の近縁植物が挙げられる。なかでも、シナノキ科（Tiliaceae）の植物としては、骨髄幹細胞をより確実に誘引できるという点で、フユボダイジュ（Tilia.cordata Mill.）が好ましい。即ち、ボダイジュ抽出物としては、フユボダイジュ抽出物が好ましい。シナノキ科の植物の抽出部位としては、特に限定されず、例えば、花、果実、樹皮などが挙げられる。なかでも、抽出される部位としては、骨髄幹細胞をより確実に誘引できるという点で、花（花部）が好ましい。
上記ボダイジュ抽出物の抽出溶媒としては、エタノールと水とを含む抽出溶媒が好ましく、水と５０容量％以上のエタノールとを含む抽出溶媒がより好ましい。
【００３６】
上記ボタンピ抽出物は、ボタン科ボタン属ボタン（Paeonia suffruticosa Andrews）の根皮に対して抽出溶媒によって抽出処理を施すことによって得られるものである。
上記ボタンピ抽出物の抽出溶媒としては、エタノールと水とを含む抽出溶媒が好ましく、水と５０容量％以上のエタノールとを含む抽出溶媒がより好ましい。
【００３７】
上記クスノハガシワ抽出物は、トウダイグサ科に属するクスノハガシワ（Mallotus philippinensis）に対して抽出溶媒によって抽出処理を施すことによって得られるものである。クスノハガシワの抽出部位としては、特に限定されず、例えば、葉、枝、材部、樹皮、根などが挙げられる。なかでも、骨髄幹細胞をより確実に誘引できるという点で、樹皮が好ましい。
上記クスノハガシワ抽出物の抽出溶媒としては、エタノールと水とを含む抽出溶媒が好ましく、水と５０容量％以上のエタノールとを含む抽出溶媒がより好ましい。
【００３８】
上記アセンヤク抽出物は、アセンヤク（Uncaria gambir）に対して抽出溶媒によって抽出処理を施すことによって得られるものである。アセンヤクの抽出部位としては、特に限定されず、例えば、葉、枝などが挙げられる。アセンヤク抽出物としては、骨髄幹細胞をより確実に誘引できるという点で、葉及び枝の両方に対して抽出溶媒によって抽出処理を施すことによって得られるものが好ましい。
上記アセンヤク抽出物の抽出溶媒としては、エタノールと水とを含む抽出溶媒が好ましく、水と５０容量％以上のエタノールとを含む抽出溶媒がより好ましい。
【００３９】
上記パシャンベ抽出物は、ユキノシタ科ヒマラヤユキノシタ属に属するパシャンベ（Pashanbheda）の１種又は２種以上に対して抽出溶媒によって抽出処理を施すことによって得られるものである。パシャンベとしては、Bergenia ligulata（Wall.）Engl.、Bergenia stracheyi（Hook．f．＆Thoms．）Engl．、又は、Bergenia ciliata（Haw．）Sternb．などが挙げられる。骨髄幹細胞をより確実に誘引できるという点で、Bergenia ligulata（Wall.）Engl. に対して抽出処理を施すことによって得られるパシャンベ抽出物が好ましい。パシャンベの抽出部位としては、特に限定されないが、骨髄幹細胞をより確実に誘引できるという点で、根茎が好ましい。
上記パシャンベ抽出物の抽出溶媒としては、エタノールと水とを含む抽出溶媒が好ましく、水と５０容量％以上のエタノールとを含む抽出溶媒がより好ましい。
【００４０】
上記シンナムタンニンＢ１は、下記式（１）の分子構造を有する化合物である。上記表皮改善剤又は皮膚外用剤において、シンナムタンニンＢ１の濃度は、特に限定されず、例えば、０．００１〜１０質量％である。
【００４１】
【化１】
2019202966.tif 000002
【００４２】
上記ペンタガロイルグルコースは、下記式（２）の分子構造を有する化合物である。上記表皮改善剤又は皮膚外用剤において、ペンタガロイルグルコースの濃度は、特に限定されず、例えば、０．００１〜１０質量％である。
【００４３】
【化２】
2019202966.tif 000003
【００４４】
上記ボルケンシフラボン（タルボタフラボン）［Volkensiflavone（Talbotaflavone）］は、下記式（３）の分子構造を有する化合物である。上記表皮改善剤又は皮膚外用剤において、ボルケンシフラボンの濃度は、特に限定されず、例えば、０．００１〜１０質量％である。
【００４５】
【化３】
2019202966.tif 000004
【００４６】
上記モレロフラボン「Morelloflavone」は、下記式（４）の分子構造を有する化合物である。上記表皮改善剤又は皮膚外用剤において、モレロフラボンの濃度は、特に限定されず、例えば、０．００１〜１０質量％である。
【００４７】
【化４】
2019202966.tif 000005
【００４８】
上記ケンフェリトリン［Kaempferitrin］（又は、ケンフェロール−３，７−ジラムノシドともいう）は、下記式（５）の分子構造を有する化合物である。上記表皮改善剤又は皮膚外用剤において、ケンフェリトリンの濃度は、特に限定されず、例えば、０．００１〜１０質量％である。
【００４９】
【化５】
2019202966.tif 000006
【００５０】
上記ケルセチン−３，７−ジラムノシド［Quercetin-3,7,-di-O-α-L-rhamnoside］は、下記式（６）の分子構造を有する化合物である。上記表皮改善剤又は皮膚外用剤において、ケルセチン−３，７−ジラムノシドの濃度は、特に限定されず、例えば、０．００１〜１０質量％である。
【００５１】
【化６】
2019202966.tif 000007
【００５２】
上記プロシアニジンＡ２は、下記式（７）の分子構造を有する化合物である。上記表皮改善剤又は皮膚外用剤において、プロシアニジンＡ２の濃度は、特に限定されず、例えば、０．００１〜１０質量％である。
【００５３】
【化７】
2019202966.tif 000008
【００５４】
上記プロシアニジンＢ１は、下記式（８）の分子構造を有する化合物である。上記表皮改善剤又は皮膚外用剤において、プロシアニジンＢ１の濃度は、特に限定されず、例えば、０．００１〜１０質量％である。
【００５５】
【化８】
2019202966.tif 000009
【００５６】
上記デアセチルサイトカラシンＣは、下記式（９）の分子構造を有する化合物である。上記表皮改善剤又は皮膚外用剤において、デアセチルサイトカラシンＣの濃度は、特に限定されず、例えば、０．００１〜１０質量％である。
【００５７】
【化９】
2019202966.tif 000010
【００５８】
上記デアセチルサイトカラシンＣは、例えば、子のう菌類微生物に分類される黒彊病菌（メタリジウム  アニソプリエ  Metarhizium anisopliae）を培養することによって生成された生成物に含まれる。
【００５９】
上記エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）の培養物は、例えば、子のう菌類微生物に分類されるエウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）を培養することによって生成された生成物に含まれる。
【００６０】
上記タラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）の培養物は、例えば、不整子のう菌類微生物に分類されるタラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）を培養することによって生成された生成物に含まれる。
【００６１】
本実施形態の表皮改善剤又は皮膚外用剤を、例えば表皮に塗布することによって、骨髄幹細胞を表皮に誘引して表皮細胞に分化させることができ、表皮機能を改善できる。
表皮は、最も外側から順に、角質層、顆粒層、有棘層、基底層を有しており、基底層に存在する表皮細胞が代謝によって外側に押し上げられ、各層の細胞を形成する。誘引された骨髄幹細胞は、基底層の表皮細胞に分化し得るものである。
【００６２】
本実施形態の表皮改善剤又は皮膚外用剤は、上述した分化誘導剤と同様に、水、エタノール、多価アルコール、油分、界面活性剤、増粘剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、などをさらに含んでもよい。本実施形態の表皮改善剤は、例えば、液状、ゲル状、クリーム状、固形状などの状態であってもよい。
【００６３】
本実施形態の表皮改善剤、皮膚外用剤は、例えば、皮膚塗布用又は皮膚貼付用の用途で用いられてもよい。本実施形態の表皮改善剤、皮膚外用剤は、例えば、化粧料、医薬品、医薬部外品などの用途で用いられてもよい。本実施形態の表皮改善剤及び皮膚外用剤は、例えば、後述する表皮改善方法のごとく使用される。
【００６４】
続いて、本発明に係る表皮改善方法の実施形態について説明する。
【００６５】
本実施形態の表皮改善方法は、上記の表皮改善剤又は上記の皮膚外用剤を表皮に塗布することによって骨髄幹細胞を表皮に誘引し、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化させることを備える。
表皮機能は、加齢に伴って表皮細胞を生み出す基となる表皮幹細胞が減少し、表皮を構成する細胞の数が少なくなったり、細胞の配列が乱れたりすることで悪化する。表皮において表皮幹細胞を増やすことによって、いったん悪化した表皮機能が回復できる。従って、上記の表皮改善剤又は上記の皮膚外用剤によって、骨髄幹細胞を表皮に誘引し、表皮において骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化させることで、表皮機能を回復させることができる。
【００６６】
上記の表皮改善剤や皮膚外用剤が塗布される表皮の部位は、特に限定されず、例えば角質層、顆粒層、有棘層、又は基底層である。斯かる表皮の部位は、健常部であっても、創傷部であってもよい。
【００６７】
上記の表皮改善方法においては、上記の表皮改善剤や皮膚外用剤の誘引剤によって、骨髄幹細胞を表皮に誘引できる。
【００６８】
例えば、表皮組織に上記の表皮改善剤（皮膚外用剤）を塗布することによって、その表皮組織に、血液中の骨髄幹細胞を誘引できる。
【００６９】
上記表皮改善方法は、in situにおいてヒト以外の動物で実施できる。また、ヒトにおいて、表皮機能を改善させる美容上の目的で、非治療的に実施できる。美容上の目的としては、例えば、肌のハリを向上させる目的、肌のシワを抑制する目的、肌の乾燥を抑制する目的、肌のくすみを抑制する目的、肌のシミを除去する目的、又は、肌を明るくする目的などが挙げられる。
【００７０】
本実施形態の分化誘導剤、表皮改善剤、皮膚外用剤の組成物、及び、表皮改善方法は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示の実施形態に限定されるものではない。また、本発明では、一般の分化誘導剤、表皮改善剤、皮膚外用剤、及び、表皮改善方法において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。
【００７１】
［ニーム葉抽出物］
製品名「ニームリーフリキッドＢ」（一丸ファルコス社製）をニーム葉抽出物として用いた。斯かるニーム葉抽出物の製造法は、下記の通りである。
ニーム（インドセンダン）（Melia azadirachta L. (Meliceae)）の葉を加熱処理した後、１，３−ブチレングリコールを抽出溶媒として用いて抽出処理を施し、さらにろ過処理を行ったものをニーム葉抽出物とした。水浴上で５ｍＬのニーム葉抽出物を１０５℃、６時間で蒸発乾固させた後の蒸発残量から計算すると、ニーム葉抽出物は、乾燥物を１．１質量％含むものであった（固形分濃度換算）。
【００７２】
［紅茶抽出物］
製品名「紅茶リキッド」（一丸ファルコス社製）を紅茶抽出物として用いた。斯かる紅茶抽出物の製造法は、下記の通りである。
アッサムチャ（Thea sinensis L. var. assamica Pierre (Theaceae)）の葉を、エタノールを抽出溶媒として用いて抽出処理し、冷凍処理した後、ろ過処理してろ液を得た。このろ液に１，３−ブチレングリコールを加え、ろ過処理したものを紅茶抽出物（アッサム紅茶抽出物）とした。水浴上で１０ｍＬの紅茶抽出物を１０５℃、６時間で蒸発乾固させた後の蒸発残量から計算すると、紅茶抽出物は、乾燥物を２．４質量％含むものであった（固形分濃度換算）。
【００７３】
［ナス果実抽出物］
市販されているナス果実抽出物を用いた。斯かるナス果実抽出物の製造法は、下記の通りである。
ミズナス（Solanum melongena (Mizunasu)）の果実の乾燥物１００ｇに、精製水と１，３−ブチレングリコールとの混合液（質量比  水：１，３−ＢＧ＝７：３）を１２００ｇ混合し、８０℃で２時間抽出を行った後、ろ過処理を施して、ミズナス果実抽出物を得た。得られたミズナス果実抽出物は、乾燥物を１．０１質量％含むものであった（固形分濃度換算）。
【００７４】
（試験例１）
上記のニーム葉抽出物と、上記の紅茶抽出物とを混合し、抽出物の乾燥物換算の合計量が０．０１質量％（四捨五入後の数値）となるように希釈して、試験例１のサンプルを調製した。希釈溶媒として、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導させる分化誘導培地（表皮細胞を長期間培養した培養上清液）を用いた。乾燥物換算で、ニーム葉抽出物と紅茶抽出物との質量比（ニーム葉抽出物／紅茶抽出物）は、四捨五入後の数値で１／１であった。
【００７５】
（試験例２）
上記のニーム葉抽出物と、上記の紅茶抽出物とを混合し、抽出物の乾燥物換算の合計量が０．０１質量％（四捨五入後の数値）となるように希釈して、試験例２のサンプルを調製した。希釈溶媒として、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導させる分化誘導培地（表皮細胞を長期間培養した培養上清液）を用いた。乾燥物換算で、ニーム葉抽出物と紅茶抽出物との質量比（ニーム葉抽出物／紅茶抽出物）は、四捨五入後の数値で２／１であった。
【００７６】
（試験例３）
上記のニーム葉抽出物と、上記の紅茶抽出物とを混合し、抽出物の乾燥物換算の合計量が０．０１質量％（四捨五入後の数値）となるように希釈して、試験例３のサンプルを調製した。希釈溶媒として、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導させる分化誘導培地（表皮細胞を長期間培養した培養上清液）を用いた。乾燥物換算で、ニーム葉抽出物と紅茶抽出物との質量比（ニーム葉抽出物／紅茶抽出物）は、四捨五入後の数値で３／１であった。
【００７７】
（試験例４）
上記のニーム葉抽出物と、上記の紅茶抽出物とを混合し、抽出物の乾燥物換算の合計量が０．０１質量％（四捨五入後の数値）となるように希釈して、試験例４のサンプルを調製した。希釈溶媒として、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導させる分化誘導培地（表皮細胞を長期間培養した培養上清液）を用いた。乾燥物換算で、ニーム葉抽出物と紅茶抽出物との質量比（ニーム葉抽出物／紅茶抽出物）は、四捨五入後の数値で５／１であった。
【００７８】
（試験例５）
上記のニーム葉抽出物と、上記の紅茶抽出物とを混合し、抽出物の乾燥物換算の合計量が０．０１質量％（四捨五入後の数値）となるように希釈して、試験例５のサンプルを調製した。希釈溶媒として、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導させる分化誘導培地（表皮細胞を長期間培養した培養上清液）を用いた。乾燥物換算で、ニーム葉抽出物と紅茶抽出物との質量比（ニーム葉抽出物／紅茶抽出物）は、四捨五入後の数値で２３／１であった。
【００７９】
（試験例６）
上記のナス果実抽出物を表皮細胞に添加し、２４時間培養後に上清を回収することによって、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化させる分化誘導培地（ナス果実抽出物入り）を調製した。この分化誘導培地（ナス果実抽出物入り）を用いて、上記のニーム葉抽出物および紅茶抽出物を、抽出物の乾燥物換算の合計量が０．０２質量％となるように希釈し、試験例６のサンプルを調製した。乾燥物換算で、ナス果実抽出物の質量に対する、ニーム葉抽出物及び紅茶抽出物の合計質量の比（（ニーム葉抽出物およびアッサム紅茶抽出物）／ミズナス果実抽出物）は、四捨五入後の数値で７／１であった。
【００８０】
（試験例７）
上記のナス果実抽出物を表皮細胞に添加し、２４時間培養後に上清を回収することによって、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化させる分化誘導培地（ナス果実抽出物入り）を調製した。この分化誘導培地（ナス果実抽出物入り）を用いて、上記のニーム葉抽出物および紅茶抽出物を、抽出物の乾燥物換算の合計量が０．０２質量％となるように希釈し、試験例７のサンプルを調製した。乾燥物換算で、ナス果実抽出物の質量に対する、ニーム葉抽出物及び紅茶抽出物の合計質量の比（（ニーム葉抽出物およびアッサム紅茶抽出物）／ミズナス果実抽出物）は、四捨五入後の数値で４／１であった。
【００８１】
（試験例８）
上記のナス果実抽出物を表皮細胞に添加し、２４時間培養後に上清を回収することによって、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化させる分化誘導培地（ナス果実抽出物入り）を調製した。この分化誘導培地（ナス果実抽出物入り）を用いて、上記のニーム葉抽出物および紅茶抽出物を、抽出物の乾燥物換算の合計量が０．０２質量％となるように希釈し、試験例８のサンプルを調製した。乾燥物換算で、ナス果実抽出物の質量に対する、ニーム葉抽出物及び紅茶抽出物の合計質量の比（（ニーム葉抽出物およびアッサム紅茶抽出物）／ミズナス果実抽出物）は、四捨五入後の数値で１／１であった。
【００８２】
（参考例１、参考例２）
上記のニーム葉抽出物の乾燥物換算の量が、それぞれ０．００６質量％、０．０１１質量％となるように、上記のニーム葉抽出物を希釈して、参考例１及び参考例２のサンプルを調製した。希釈溶媒として、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導させる分化誘導培地（表皮細胞を長期間培養した培養上清液）を用いた。
【００８３】
（参考例３〜５）
上記の紅茶抽出物の乾燥物換算の量が、それぞれ０．０００２質量％、０．００２４質量％、０．００３６質量％となるように、上記の紅茶抽出物を希釈して、参考例３〜５のサンプルを調製した。希釈溶媒として、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導させる分化誘導培地（表皮細胞を長期間培養した培養上清液）を用いた。
【００８４】
＜分化誘導に関わる評価試験＞
９６ウェルプレートに骨髄幹細胞を６，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、３日間培養した。別途、表皮細胞を直径１０ｃｍシャーレに播種し、９割コンフルエントに達したときに新しい培地に交換し、２４時間培養後に上清培養液を回収した。回収した上清培養液を遠心分離し、ろ過することによって得られた溶液を、分化誘導培地（骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化誘導させる分化誘導培地）とした。また、ナス果実抽出物を用いた試験においては、ナス果実抽出物を表皮細胞に添加し、培養２４時間後に上清を回収し、遠心分離、ろ過によって得られた溶液を分化誘導培地とした。各試験に応じて、調製した分化誘導培地を用いてニーム葉抽出物、紅茶抽出物を希釈し、培養した骨髄幹細胞に添加した後、９〜１０日間分化誘導培養を行った。培養後、免疫細胞染色によって、分化度合いを評価した。分化誘導させた骨髄幹細胞（ＭＳＣ）を４％パラホルムアルデヒド（ＷＡＫＯ社製）で固定後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。その後、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ溶液で処理し、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。さらに、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）（ＳＩＧＭＡ社製）溶液による反応を室温で１時間行い、引き続き一次抗体による反応を４℃で終夜行った。反応後に一次抗体溶液を除去し、ＴＢＳ−Ｔで５回洗浄後、二次抗体反応およびＨｏｅｃｈｓｔ溶液による反応を室温で３０分間行った。二次抗体溶液を除去後、ＴＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳ（−）に置換した後に、分化度合いを観察した。免疫細胞染色の一次抗体においては、表皮細胞のみに発現するケラチン１４（Ｋ１４）抗体と、ケラチン５（Ｋ５）抗体とを使用した。染色度合いは、Ｉｎ ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｚｅｒ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて染色画像の数値化（Ｄｅｎｓ  ｌｅｖｅｌ  ｓｕｍ  ×  Ａｒｅａ）  ／  Ｈｏｃｈｅｓｔ）を施し、その値で評価した。
【００８５】
試験例１〜５を用いた分化誘導に関わる評価試験結果を図１に示す。参考例１、２における評価試験結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。参考例３〜５における評価試験結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。ナス果実抽出物を単独で用いた評価試験結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。試験例３、６〜８の評価試験結果を図５に示す。各図における結果から把握されるように、ニーム葉抽出物と紅茶抽出物とを含む骨髄幹細胞の分化誘導剤によって、骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化させることができた。ニーム葉抽出物と紅茶抽出物とが特定の質量比（例えば、乾燥物換算で、ニーム葉抽出物／紅茶抽出物＝２：１〜５：１の範囲、より好ましくは３：１〜５：１の範囲）のときに、分化誘導性能が顕著に発揮された。この効果は、ニーム葉抽出物と紅茶抽出物との相乗的な効果である。
また、図５に示されるように、ニーム葉抽出物及び紅茶抽出物に、さらにナス果実抽出物を組み合わせることによって、分化誘導性能をさらに向上させることができた。ナス果実抽出物は、表皮細胞に対して分化誘導因子の分泌を増やす作用を有すると考えられる。
【００８６】
下記のようにして骨髄幹細胞の誘引剤を調製した。調製した誘引剤を使用して、生体外における細胞誘引試験を行った。
【００８７】
「誘引剤１」
誘引剤１のボダイジュ抽出物（フユボダイジュ抽出物）を調製した。詳しくは、フユボダイジュ（Tilia.cordata Mill）の花を乾燥して細かく砕いたもの１００ｇに５０容量％エタノール水溶液１Ｌを加え、室温（２０℃）にて３日間抽出操作をおこない、さらにろ過処理を行った。そして、ろ過した液から減圧乾燥により乾燥物を得て、この乾燥物を１，３−ブチレングリコールで希釈してフユボダイジュ抽出物を調製した。このボダイジュ抽出物は、減圧乾燥によって抽出溶媒を除去したあとの乾燥物質量から計算すると、乾燥物を０．４５質量％含むものであった。
【００８８】
「誘引剤２」
誘引剤２のボタンピ抽出物を調製した。詳しくは、ボタン（Paeonia suffruticosa Andrews）の根皮を乾燥して細かく砕いたもの１００ｇに５０容量％エタノール水溶液１Ｌを加え、室温（２０℃）にて３日間抽出操作をおこない、さらにろ過処理を行った。そして、ろ過した液から減圧乾燥により乾燥物を得て、この乾燥物を１，３−ブチレングリコールで希釈してボタンピ抽出物を調製した。このボタンピ抽出物は、減圧乾燥によって抽出溶媒を除去したあとの乾燥物質量から計算すると、乾燥物を０．９０質量％含むものであった。
【００８９】
「誘引剤３」
誘引剤３のクスノハガシワ抽出物を調製した。詳しくは、クスノハガシワ（Mallotus philippinensis Mueller-Argoviensis）の樹皮を乾燥して細かく砕いたもの２００ｇに５０容量％エタノール水溶液２Ｌを加え、６０〜８０℃を保ちつつ２日間抽出操作をおこない、さらにろ過処理を行った。そして、ろ過した液から減圧乾燥により乾燥物を得て、この乾燥物を１，３−ブチレングリコールで希釈してクスノハガシワ抽出物を調製した。このクスノハガシワ抽出物は、減圧乾燥によって抽出溶媒を除去したあとの乾燥物質量から計算すると、乾燥物を０．２０質量％含むものであった。
【００９０】
「誘引剤４」
誘引剤４のアセンヤク抽出物を調製した。詳しくは、アセンヤク（Uncaria gambir Roxburgh）の葉及び若枝を乾燥して細かく砕いたもの１００ｇに５０容量％エタノール水溶液２Ｌを加え、撹拌しながら５０〜７０℃を保ちつつ３時間抽出操作をおこない、さらにろ過処理を行った。そして、ろ過した液から減圧乾燥により乾燥物を得て、この乾燥物を１，３−ブチレングリコールで希釈してアセンヤク抽出物を調製した。このアセンヤク抽出物は、減圧乾燥によって抽出溶媒を除去したあとの乾燥物質量から計算すると、乾燥物を４．１０質量％含むものであった。
【００９１】
「誘引剤５」
誘引剤５のパシャンベ抽出物を調製した。詳しくは、パシャンベ（Bergenia ligulata（Wall.）Engl.）の根茎を乾燥して細かく砕いたもの２００ｇに５０容量％エタノール水溶液３ｋｇを加え、撹拌しながら５０℃にて８時間抽出操作を行った。粗抽出物を冷却、ろ過操作した後、濃縮し、合成吸着体（商品名「ダイヤイオンＨＰ−２０」  三菱化学社製）を充填したカラムに通液した。そして、水洗を行い、３０容量％エタノール水溶液にて溶出させた溶出液を減圧乾燥後、１，３−ブチレングリコールに再溶解してパシャンベ抽出物を調製した。このパシャンベ抽出物は、減圧乾燥によって抽出溶媒を除去したあとの乾燥物質量から計算すると、乾燥物を０．５０質量％含むものであった。
【００９２】
「誘引剤６」
誘引剤６として、市販のシンナムタンニンＢ１を使用した。
「誘引剤７」
誘引剤７として、市販のペンタガロイルグルコースを使用した。
「誘引剤８」
誘引剤８として、市販のボルケンシフラボンを使用した。
「誘引剤９」
誘引剤９として、市販のモレロフラボンを使用した。
「誘引剤１０」
誘引剤１０として、市販のケンフェリトリンを使用した。
「誘引剤１１」
誘引剤１１として、市販のケルセチン−３，７−ジラムノシドを使用した。
「誘引剤１２」
誘引剤１２として、市販のプロシアニジンＡ２を使用した。
「誘引剤１３」
誘引剤１３として、市販のプロシアニジンＢ１を使用した。
【００９３】
「誘引剤１４」
下記に示すように、デアセチルサイトカラシンＣを含む誘引剤を製造した。
即ち、黒彊病菌（メタリジウム  アニソプリエ（Metarhizium anisopliae））を培養し、培養後の培地及び菌体を含む粗培養物を得た。この粗培養物に対して抽出処理を施すことにより培養抽出物を調製した。詳細について、以下に説明する。
まず、メタリジウム  アニソプリエ（Metarhizium anisopliae）の前培養を行うために、グリセロールストックから取り出した種菌を下記の培養条件に従って培養した。
・前培養条件：温度２８℃、４０日間
・前培養培地組成：下記に示すＬＣＡ寒天培地
グルコース                  １ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                １ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ０．２ｇ
ＫＣｌ                      ０．２ｇ
ＮａＮＯ３                  ２ｇ
バクト-酵母エキス          ０．２ｇ
（Becton, Dickinson and Company社製）
寒天（和光純薬社製）      ２０ｇ
水道水                    １Ｌ
ＮａＯＨ                  ６４．８ｍｇ
前培養後、菌糸体を含む寒天培地をストローで打ち抜いた。一方、３．５ｍＬの滅菌水道水を１５ｍＬ容量の遠心管に分注した。打ち抜いた寒天培地の５片を遠心管に入れ、綿棒で寒天培地を押し潰して懸濁液を調製した。
続いて、本培養のための培地として、５０ｍＬ容量の遠心管中に下記組成の本培養培地を作製し、本培養用の遠心管に１ｍＬの上記懸濁液を添加し、下記の培養条件で本培養した。
・本培養条件：温度２８℃、２週間
・本培養培地組成：下記に示す固形状培地
野菜ジュース                        １０ｍＬ
（キャンベル・スープ・カンパニー社製  商品名「Ｖ８ジュース」）
オートミール                          ３ｇ
（雪印乳業（クエーカー）社製）
本培養後の遠心管に抽出溶媒としての８０容量％アセトン水溶液を加え、粗培養物に対して抽出溶媒による抽出処理を行った。
詳しくは、遠心管に抽出溶媒を加えた後、遠心管を激しく上下に振って内容物を撹拌し、室温で３０分間静置した。その後、遠心管に対して回転数３５００ｒｐｍ、２３℃で５分間の遠心分離操作を行い、遠心分離後の上清約１５ｍＬをデカンテーションにより回収した。
続いて、上清をドラフトで約１５時間静置することにより抽出溶媒を揮発させて濃縮した後、濃縮された上清が約１０ｍＬになるまで−２０℃で保存した。
保存した後の上清をマイクロチューブに入れ、１３，０００ｒｐｍの遠心分離により、沈殿物と沈殿物以外のサンプル液とを得た。
サンプル液の２２５．６μＬ（本培養ブロス２００μＬに相当）を遠心エバポレーターで乾固させ、−２０℃で保存した。乾固させたサンプルを８０容量％メタノール水溶液１００μＬに溶解し、ボルテックスミキサーを用いて３０分間懸濁させた後、１３，５００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離により上清を得て、培養抽出物を調製し、誘引剤を製造した。
該誘引剤は、溶媒を除去したあとの乾燥物質量から計算すると、乾燥物を１５質量％含むものであった。
上記のごとく製造した誘引剤１４がデアセチルサイトカラシンＣを含むことは、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、質量分析（ＭＳ）法によって確認した。
【００９４】
「誘引剤１５」（Eupenicillium ludwigiiの培養物）
エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）を培養することにより、培養後の培地及び菌体を含む粗培養物を得た。粗培養物に対して抽出処理を施して培養抽出物を得て、誘引剤１５を製造した。その詳細について以下に説明する。
まず、グリセロールストックから取り出した菌体を傾斜培地（麦芽エキス寒天培地（ＭＡ培地））に植え付け、１週間の前培養を行った。次に、前培養後の菌体を白金耳で取り出し、５ｍＬの滅菌生理食塩水に懸濁させた後、下記組成の培地が入った１５０ｍＬ容量のポリプロピレン製フラスコ内に懸濁液の全部を入れて植菌し、静置培養（２５℃、１２日間）した。
・培地組成
そば粉            １０ｇ
ＳＢ溶液          １０ｍＬ  （計２０ｇ／フラスコ）
・ＳＢ溶液の組成
酒石酸ナトリウム                        0.005%
ＫＨ２ＰＯ４                            0.005%
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    0.005%
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    0.0005%
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    0.0005%
酵母エキス（オリエンタル酵母社製）      0.01%
水                                      残部
続いて、培養後の培地及び菌体の混合液（粗培養物）２４０μＬに対して、抽出溶媒としての１００％ブタノール（１００μＬ）を用いて抽出処理を施し、遠心分離により分離した上清を凍結乾燥して溶媒を除去した。
さらに、ブタノールで抽出した後の凍結乾燥物に５０μＬのメタノールを加え、ボルテックスミキサーによって３０分間撹拌して懸濁させた後、１３，５００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離によって上清を得た。
このようにして、エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）の培養抽出物を含む誘引剤を製造した。
該誘引剤は、溶媒を除去したあとの乾燥物質量から計算すると、乾燥物を２質量％含むものであった。
【００９５】
「誘引剤１６」（Talaromyces trachyspermusの培養物）
エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）に代えて、タラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）を用いた点以外は、誘引剤１５と同様にして誘引剤１６を製造した。該誘引剤は、乾燥物を２質量％含むものであった。
【００９６】
＜生体外における細胞誘引試験＞
図７は、該試験方法の様子を模式的に示したものである。以下、図７を参照しつつ試験方法の詳細を説明する。
上記の各誘引剤を試験用サンプルとして用意した。誘引剤の濃度が所定の各濃度（１％や０．１％など）となるように希釈したものを、試験用サンプルとして用意した。
一方、陰性対照サンプルとして、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）「ＦＢＳ（−）、Ｐ／Ｓ（−）」を用意した。
また、陽性対照サンプルとして、２０ｎｇ／ｍＬ  ＰＤＧＦ−ＢＢ（血小板由来成長因子  ＰＥＰＲＯ  ＴＥＣＨ社製）濃度のＤＭＥＭ溶液を用意した。
まず、マウス骨髄幹細胞（以下、ｍＭＳＣともいう）をコンフルエントまで培養して回収し、１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ「Ｐ／Ｓ（−）」で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁し、細胞懸濁液を用意した。なお、ＦＢＳは、１０％ウシ胎児血清を示し、Ｐ／Ｓは、１００ユニットペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを示している。また（−）の記号は、配合していないことを示している。
次に、複数の独立したウェルを備え、図７（ａ）に示すようにメンブレンＭによってウェルが上部ウェルＰと下部ウェルＱとに仕切られているボイデンチャンバーＢ（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ社製）を用意した。各試験用サンプルのいずれか１種と陰性対照サンプル及び陽性対照サンプルとが同一のボイデンチャンバーＢにおいて試験できるように設定し、該チャンバーＢの各下部ウェルに各サンプルをそれぞれ２８μＬずつアプライした。ボイデンチャンバーＢのメンブレンＭとしては、商品名「Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ社製  細孔サイズ８μｍ）を用いた。
続いて、上部ウェルＰに上記細胞懸濁液を５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した（図７（ｂ）を参照）。
４時間培養後、図７（ｃ）に示すように、移動していないｍＭＳＣを付属のフィルターワイパーＲではぎ取り、メンブレンＭの下側へ移動したｍＭＳＣのみをディフ・クイック染色（Ｓｙｓｍｅｘ社製キットを使用）によって染色した。
そして、染色像をデジタル化してコンピュータに取り込み、画像を黒と白に２値化すべく青色に染色された部分が白色になるように変換したうえで、各ウェル範囲内の輝度の平均値を画像編集ソフトウェア（商品名「フォトショップ」）の機能を用いて測定した。陰性対照サンプルおよび陽性対照サンプルにおける輝度を各試験用サンプルにおける輝度と比較することによって、各誘引剤のｍＭＳＣ誘引活性を評価した。
【００９７】
細胞誘引試験の結果（輝度）を表１に示す。１％濃度、０．１％濃度などの所定濃度となるように誘引剤を希釈したサンプルを用いた結果のうち、輝度が最も高くなった結果を示す。また、同時に試験を行ったときの陽性対照及び陰性対照の結果も示す。表１から把握できるように、上記の各誘引剤は、骨髄幹細胞を誘引することができる。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
＜ヒトでの表皮改善作用の評価試験＞
７名の被験者で評価試験を行った。あらかじめ予備試験において、ＵＶ−Ｂ領域の紫外線を前腕内側部に照射して被験者ごとに最小紅斑量（ＭＥＤ）を決定した。上腕内側部の６箇所（１×１ｃｍ）に、１日１回、３日間、最小紅斑量（ＭＥＤ）の紫外線を照射して、人工的に色素斑を発生させた。
この色素斑に１日２回、２ヶ月間、下記のいずれかを連続塗布し、色素斑消退度合いを評価した。
・骨髄幹細胞（ＭＳＣ）誘引剤であるクスノハガシワ抽出物３質量％のみ
・クスノハガシワ抽出物３質量％（乾燥物換算０．００６質量％）
＋分化誘導剤（ニーム葉抽出物  乾燥物換算０．０１１質量％、
アッサム紅茶抽出物  乾燥物換算０．０１２質量％、
ナス果実抽出物  乾燥物換算０．００５０５質量％）
乾燥物換算でニーム葉抽出物：アッサム紅茶抽出物：ナス果実抽出物＝
２．２：２．４：１．０
評価は、色差計により測定を行い、得られたマンセル値から、試料塗布部のΔＬ*（経時変化）を算出して行った。数値が大きいほど、色の消退量が大きい。結果を図６に示す。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明の分化誘導剤は、例えば、血流にのって体内を循環している骨髄幹細胞を表皮組織に誘引し、表皮組織において、誘引した骨髄幹細胞を表皮細胞へ分化させる目的で、好適に使用される。本発明の表皮改善剤、皮膚外用剤、及び、表皮改善方法は、上記のごとく表皮組織に骨髄幹細胞を誘引し、さらに、誘引された骨髄幹細胞を表皮細胞に分化させて、表皮機能を改善させる目的で、好適に使用される。例えば、本発明の表皮改善剤、皮膚外用剤は、表皮に塗布されることによって表皮に骨髄幹細胞を誘引して、誘引された骨髄幹細胞を表皮細胞に分化させて、肌の外観を改善させる目的で、好適に使用される。
【符号の説明】
【０１０１】
Ｂ：ボイデンチャンバー、  Ｐ：上部ウェル、  Ｑ：下部ウェル、  Ｍ：メンブレン、  Ｒ：フィルターワイパー。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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