(57)【要約】【課題】顆粒球、及び赤血球を除去しつつ、良好な回収効率で単核球を回収できる細胞分離装置と、当該細胞分離装置を用いて単核球を含む細胞含有液を取得する方法とを提供すること。【解決手段】単核球、顆粒球、及び赤血球を含む粗細胞含有液から、顆粒球、及び赤血球を除去しつつ、単核球を含む細胞含有液を取得する際に、直列につながれた第１フィルターと第２フィルターとを備え、第１フィルター内、及び第２フィルター内に、それぞれ所定の通気度を示す不織布からなるフィルター部材が、それぞれ所定の状態で充填された細胞分離装置を用いる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１フィルターと、第２フィルターと、を備える細胞分離装置であって、
前記第１フィルターと、前記第２フィルターとが、それぞれ、液体導入口と、液体導出口と、フィルター部材収容部とを備え、
前記第１フィルターの液体導出口と、前記第２フィルターの液体導入口とが、流路で接続されており、
前記第１フィルターが備える前記フィルター部材収容部に、通気度が１０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である不織布からなる第１フィルター部材が、収容前の前記第１フィルター部材の厚さＴ１０が、収容後の前記第１フィルター部材の厚さＴ１１の１．０倍以上１．２倍以下であるように収容され、
前記第２フィルターが備える前記フィルター部材収容部に、通気度が３ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上５０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である不織布からなる第２フィルター部材が、収容前の前記第２フィルター部材の厚さＴ２０が、収容後の前記第２フィルター部材の厚さＴ２１の１．０倍以上３．０倍以下であるように収容されている、細胞分離装置。
【請求項２】
前記第２フィルター部材を構成する不織布に含まれる繊維の平均繊維径が１μｍ以上５μｍ以下である、請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
前記フィルター部材収容部に収容後の前記第１フィルター部材の厚さＴ１１が、前記第１フィルター部材が収容された前記フィルター部材収容部の、前記第１フィルター部材の厚さ方向と同方向の高さＨ１の、０．８倍以上１．２倍以下である、請求項１又は２に記載の細胞分離装置。
【請求項４】
前記第１フィルター部材と、前記第２フィルター部材の、前記フィルター部材収容部に収容された状態での厚さが、それぞれ、３ｍｍ以上２０ｍｍ以下の範囲内である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞分離装置。
【請求項５】
前記第１フィルター、及び前記第２フィルターにおけるフィルター部材収容部の断面積が、それぞれ１６０ｍｍ２以上１４００ｍｍ２以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞分離装置。
【請求項６】
前記不織布を構成する繊維が、ポリエステル、ナイロン、及びポリオレフィンからなる群より選択される少なくとも１種の樹脂を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞分離装置。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞分離装置を用いて、単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む粗細胞含有液から、前記顆粒球の少なくとも一部と、前記赤血球の少なくとも一部とを除去しつつ、前記単核球を含む細胞含有液を取得する方法であって、
前記液体導入口から前記第１フィルター内に前記粗細胞含有液を導入し、前記第１フィルターが備える前記液体導出口から第１ろ液を導出させることと、
前記液体導入口から前記第２フィルター内に前記第１ろ液を導入し、前記第２フィルターが備える前記液体導出口から第２ろ液を導出させて、前記第１ろ液内の前記単核球を、前記第２フィルター部材に捕捉させることと、
前記第２フィルターが備える前記液体導出口から、前記第２フィルター内に回収液を導入して、前記第２フィルター部材に捕捉された前記単核球を前記回収液に遊離させて、前記細胞含有液を生じさせることと、
前記細胞含有液を、前記第２フィルターが備える前記液体導入口から回収することと、
を含む、前記細胞含有液の取得方法。
【請求項８】
前記細胞含有液に含まれる赤血球数が、前記粗細胞含有液に含まれる赤血球数の１０％以下である、請求項７に記載の前記細胞含有液を取得する方法。
【請求項９】
前記細胞含有液に含まれる顆粒球数が、前記粗細胞含有液に含まれる顆粒球数の４０％以下である、請求項７又は８に記載の前記細胞含有液を取得する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の細胞を含む粗細胞含有液からの単核球の回収に好適に用いられる細胞分離装置と、当該細胞分離装置を用いて単核球を含む細胞含有液を取得する方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液学や科学テクノロジーの急速な進歩に伴い、全血・骨髄・臍帯血・組織抽出物をはじめとする体液から必要な血液分画のみを分離して患者に投与することで治療効果を高め、さらに、治療に必要のない分画は投与しないことで副作用を抑制する、という治療スタイルが広く普及している。
【０００３】
例えば、血液輸血もその１つである。赤血球製剤は、出血又は赤血球が不足する場合、又は赤血球の機能低下により酸素が欠乏している場合に使用される血液製剤である。赤血球製剤には、異常な免疫反応や移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の副作用を誘導する白血球は不要であり、フィルターで白血球を除去する必要がある。場合によっては白血球に加えて血小板も除去することもある。
【０００４】
一方、血小板製剤は、血液凝固因子の欠乏による出血ないし出血傾向にある患者に使用される血液製剤である。血小板製剤の製造のためには、遠心分離により、血小板以外の不要な細胞や成分は除去され、必要とされる血小板成分のみが採取されている。
【０００５】
加えて近年、白血病に向けた造血幹細胞移植が盛んに行われるようになり、治療に必要な、造血幹細胞を含む白血球群を分離し投与する方法がとられている。この造血幹細胞のソースとして、ドナーの負担が少ない、増殖能力が優れている、等の利点から、骨髄や末梢血に加えて臍帯血も注目を浴びている。また近年、月経血中にも幹細胞が豊富に存在することが示唆され、これまで廃棄されていた月経血も貴重な幹細胞ソースとして利用される可能性がある。
また固形癌の治療に対しては樹状細胞療法が盛んに行われており、患者の血液や細胞培養液から治療のもととなる単球を含む細胞群を分離するケースがある。
【０００６】
細胞分離方法として、最近では、赤血球と血小板は捕捉されず白血球のみを捕捉するフィルター材料を用いて白血球を回収する方法も報告されている（特許文献１、特許文献２、及び特許文献３を参照）。従来は遠心分離又は比重液を使用した密度勾配遠心法によって分離操作を行っていたが、フィルターを用いることで操作の簡略化や大型のセルプロセッシング施設が必要ない等の利点がある。
しかしながら、特許文献１〜３等に記載の白血球の回収方法を、単核球の回収に適用してみても、例えば顆粒球や赤血球等の単核球以外の不要な細胞も高い割合で混入してしまい、また必ずしも十分に高い回収率で単核球を回収しにくい問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００１−５１８７９２号公報
【特許文献２】国際公開第９８／３２８４０号
【特許文献３】特開平１０−３１３８５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のような事情に鑑み、本発明は、顆粒球、及び赤血球を除去しつつ、良好な回収効率で単核球を回収できる細胞分離装置と、当該細胞分離装置を用いて単核球を含む細胞含有液を取得する方法とを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、単核球、顆粒球、及び赤血球を含む粗細胞含有液から、顆粒球、及び赤血球を除去しつつ、単核球を含む細胞含有液を取得する際に、直列につながれた第１フィルターと第２フィルターとを備え、第１フィルター内、及び第２フィルター内に、それぞれ所定の通気度を示す不織布からなるフィルター部材が、それぞれ所定の状態で充填された細胞分離装置を用いることによって、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
【００１１】
〔１〕第１フィルターと、第２フィルターと、を備える細胞分離装置であって、
第１フィルターと、第２フィルターとが、それぞれ、液体導入口と、液体導出口と、フィルター部材収容部とを備え、
第１フィルターの液体導出口と、第２フィルターの液体導入口とが、流路で接続されており、
第１フィルターが備えるフィルター部材収容部に、通気度が１０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である不織布からなる第１フィルター部材が、収容前の第１フィルター部材の厚さＴ１０が、収容後の第１フィルター部材の厚さＴ１１の１．０倍以上１．２倍以下であるように収容され、
第２フィルターが備えるフィルター部材収容部に、通気度が３ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上５０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である不織布からなる第２フィルター部材が、収容前の第２フィルター部材の厚さＴ２０が、収容後の第２フィルター部材の厚さＴ２１の１．０倍以上３．０倍以下であるように収容されている、細胞分離装置。
【００１２】
〔２〕第２フィルター部材を構成する不織布に含まれる繊維の平均繊維径が１μｍ以上５μｍ以下である、〔１〕に記載の細胞分離装置。
【００１３】
〔３〕フィルター部材収容部に収容後の第１フィルター部材の厚さＴ１１が、第１フィルター部材が収容されたフィルター部材収容部の、第１フィルター部材の厚さ方向と同方向の高さＨ１の、０．８倍以上１．２倍以下である、〔１〕又は〔２〕に記載の細胞分離装置。
【００１４】
〔４〕第１フィルター部材と、第２フィルター部材の、フィルター部材収容部に収容された状態での厚さが、それぞれ、３ｍｍ以上２０ｍｍ以下の範囲内である、〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の細胞分離装置。
【００１５】
〔５〕第１フィルター、及び第２フィルターにおけるフィルター部材収容部の断面積が、それぞれ１６０ｍｍ２以上１４００ｍｍ２以下である、〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の細胞分離装置。
【００１６】
〔６〕不織布を構成する繊維が、ポリエステル、ナイロン、及びポリオレフィンからなる群より選択される少なくとも１種の樹脂を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の細胞分離装置。
【００１７】
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の細胞分離装置を用いて、単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む粗細胞含有液から、顆粒球の少なくとも一部と、赤血球の少なくとも一部とを除去しつつ、単核球を含む細胞含有液を取得する方法であって、
液体導入口から第１フィルター内に粗細胞含有液を導入し、第１フィルターが備える液体導出口から第１ろ液を導出させることと、
液体導入口から第２フィルター内に第１ろ液を導入し、第２フィルターが備える液体導出口から第２ろ液を導出させて、第１ろ液内の単核球を、第２フィルター部材に捕捉させることと、
第２フィルターが備える液体導出口から、第２フィルター内に回収液を導入して、第２フィルター部材に捕捉された単核球を回収液に遊離させて、細胞含有液を生じさせることと、
細胞含有液を、第２フィルターが備える液体導入口から回収することと、
を含む、細胞含有液を取得する方法。
【００１８】
〔８〕細胞含有液に含まれる赤血球数が、粗細胞含有液に含まれる赤血球数の１０％以下である、〔７〕に記載の細胞含有液を取得する方法。
【００１９】
〔９〕細胞含有液に含まれる顆粒球数が、粗細胞含有液に含まれる顆粒球数の４０％以下である、〔７〕又は〔８〕に記載の細胞含有液を取得する方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、顆粒球、及び赤血球を効率的に除去しつつ、良好な回収効率で単核球を回収できる細胞分離装置と、当該細胞分離装置を用いて単核球を含む細胞含有液を取得する方法とを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】細胞分離用フィルターの１例の概略を示す図である。
【図２】フィルター部材を収容した状態の細胞分離用フィルターの１例についての断面を示す図である。
【図３】細胞分離装置の回路の概略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
【００２３】
≪細胞分離装置≫
細胞分離装置は、第１フィルターと、第２フィルターとを備える。
なお、細胞分離フィルターは、本発明の目的を阻害しない範囲で、第１フィルターの上流側、第１フィルターと第２フィルターとの間、又は第２フィルターの下流側等に、第１フィルター、及び第２フィルター以外の他のフィルターを備えていてもよい。細胞分離装置が他のフィルターを備える場合、他のフィルターの数は、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されず、１つであっても２以上の任意の数であってもよい。
以下、第１フィルター、第２フィルター、又は他のフィルターとして使用し得る、細胞分離用フィルター装置について説明する。
【００２４】
〔細胞分離用フィルター〕
以下、細胞分離用フィルターの好ましい一例について、図１、図２（ａ）、及び図２（ｂ）を用いて説明する。
細胞分離用フィルター１は、細胞分離用フィルター容器２と、フィルター部材１１とを備える。
細胞分離用フィルター容器２は、液体導入口９と、液体導出口１０と、フィルター部材収容部３とを有する。
以下、細胞分離用フィルター容器について、単に「容器」とも記す。
かかる細胞分離用フィルター容器２内に、不織布からなるフィルター部材１１を収容することにより、細胞分離用フィルター１が構成される。細胞分離用フィルター容器２内に収容されたフィルター部材１１において、液体導入口９側の面が第１面であり、液体導出口１０側の面が第２面である。
以下、細胞分離用フィルターについて単に「フィルター」とも記す。
【００２５】
上記の細胞分離用フィルター容器２の構成について以下説明する。
【００２６】
（細胞分離用フィルター容器）
例えば、図１、２（ａ）、２（ｂ）に示される、容器２の好ましい態様では、円筒形状の容器２が、円筒状の収容部３と、その上部及び下部にある開口部に蓋をすることができるノズル付内蓋４、５と、収容部３とノズル付内蓋４、５とを固定するための環状外蓋６、７とで構成される。
【００２７】
フィルター部材収容部３は、両端に開口を有する筒状の部材である。フィルター部材収容部３は、後述するフィルター部材１１を収容する。
以下、フィルター部材収容部３について、収容部３とも記す。
【００２８】
収容部３の形状は、両端に開口を有する筒状である。筒状について、径方向の断面の形状は円形であっても、多角形のような円形以外の形状であってもよい。
収容部３の形状の好ましい具体例としては、例えば、容量約０．１ｍＬ以上４００ｍＬ以下程度、内径０．１ｃｍ以上１５ｃｍ以下程度、厚さ０．１ｃｍ以上５ｃｍ以下程度の円筒状や、一片の長さ０．１ｃｍ以上２０ｃｍ以下程度の正方形又は長方形で、厚さが０．１ｃｍ以上５ｃｍ以下程度の四角柱状等が挙げられる。
【００２９】
良好な回収率で単核球を回収しやすい点からは、細胞分離用フィルター１の容量は４ｍＬ以上５０ｍＬ以下が好ましく、１０ｍＬ以上２５ｍＬ以下がより好ましい。
なお、細胞分離用フィルター１の容量は、筒状の収容部３と、筒状の収容部の両端を封鎖する二つの面とで囲まれる空間の容量である。図１、図２（ａ）、及び図２（ｂ）に示される細胞分離用フィルター１では、細胞分離用フィルター１の容量は、液体導入口９を含むノズル付き内蓋４と、液体導出口１０を含むノズル付き内蓋５と、収容部３とで囲まれる内部空間の容量である。
また、同じく、良好な回収率で単球を回収しやすい点からは、収容部３に収容されたフィルター部材１１のろ過面の面積が、１６０ｍｍ２以上１４００ｍｍ２以下であるのが好ましく、３００ｍｍ２以上７２０ｍｍ２以下であるのがより好ましい。
【００３０】
ノズル付内蓋４、５には、容器２内部に液体を導入するための液体導入口９と、容器２から液体を排出するための液体導出口１０とがそれぞれ設けられている。
液体導入口９及び液体導出口１０は液体を送液するためのチューブを接続しやすくするために、ノズルで構成されている。前記ノズルの形状や大きさについては特に限定はない。
なお、便宜上、液体導入口９、液体導出口１０と称するが、フィルター１の使用時には、液体導入口９から液体が排出されてもよく、液体導出口１０から液体が導入されてもよい。
【００３１】
ノズル付内蓋４、５は栓型になっており、収容部３の内腔に押し込むことで、収容部３の内面と接して固定される。
ノズル付内蓋４、５と収容部３との接触面にはシール８が設けられるのが好ましい。このシール８により、ノズル付内蓋４、５と収容部３との気密性を確実にして外部からの微生物等の侵入を防ぐことができる。シール８としては、例えば、図２（ｂ）に示すように、ノズル付内蓋４、５の表面に設けた溝の周囲に樹脂製のパッキン（Ｏリング）を設けることが挙げられるが、シール８の配置や構成については特に限定はない。
【００３２】
ノズル付き内蓋４、５は、収容部３に直接固定できるようにしてもよい（図示せず）。ノズル付き内蓋４、５と収容部３とが接触する面に、例えば、ネジを設けることでノズル付き内蓋４、５と収容部３とを固定することができる。この場合、図２（ｂ）に示す環状外蓋６、７は不要となる。
また、ノズル付き内蓋４は、フィルター１に取り付けた場合にフィルター部材１１と対向する面に、１つ又は複数の第１突起１２ａを備えていてもよい。第１突起１２ａは、ノズル付き内蓋４において、収容部３の内壁面近傍に設けられた第１環状支持体１２ｂにより支持されるのが好ましい。
ノズル付き内蓋５も、ノズル付き内蓋４と同様に、第２突起１３ａと、第２環状支持体１３ｂとを備えていてもよい。
ノズル付き内蓋４，５が、それぞれ、第１突起１２ａ、第１環状支持体１２ｂ、及び第２突起１３ａ、及び第２環状支持体１３ｂを備える場合、収容部３内で、フィルター部材１１が、第１突起１２ａ、第１環状支持体１２ｂと第２突起１３ａ、第２環状支持体１３ｂとで挟み込まれてしっかりと支持される。
これによって、収容部３内で、フィルター部材１１が弛んだ箇所を、粗細胞含有液、回収液、細胞含有液等がショートパスすることを防ぎつつ、細胞含有液を取得する操作を行うことができる。
【００３３】
容器２内では、フィルター部材１１として不織布からなる細胞分離材が積層されて充填される。例えば、繊維径の異なる細胞分離材を２層以上積層したフィルターとすることにより、細胞を捕捉する箇所が分散され、目詰まりの発生が抑制されるとともに、フィルターからの細胞の分離・回収も効率的に行うことができる。なお、繊維径が同じ細胞分離材が連続して積層された部分は、積層された細胞分離材の枚数によらず１層として扱う。
【００３４】
また、容器２には、液体導入口９側に独立して細胞分離材内に留まっている非付着細胞を洗浄するための洗浄液導入口を設けたり（図示せず）、液体導出口１０側に独立して細胞分離材に捕捉された細胞を回収するための細胞回収液導入口（細胞含有液及び洗浄液の流れとは逆方向から細胞回収液を流すため）を設けてもよい（図示せず）。
【００３５】
容器２は、任意の構造材料を使用して作製することができる。構造材料としては、具体的には非反応性ポリマー、生体親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー（ＡＢＳ）等のアクリルニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。容器の材料として有用な金属材料（生体親和性金属、合金）としては、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、及びそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。特に好ましくは、耐滅菌製を有する素材であるが、具体的には、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。
【００３６】
（フィルター部材）
フィルター部材１１としては繊維で構成される不織布が好ましく用いられる。
【００３７】
フィルター部材１１である不織布を構成する繊維の材質としては、例えば、ポリオレフィン（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、及び低密度ポリエチレン等）、ポリエステル、塩化ビニル、ポリビニルアルコール、塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル系樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクロニトリル、ポリアクリル酸、ポリアクリレート等）、ナイロン（例えば、脂肪族ポリアミド、芳香族ポリアミド（アラミド））、ポリウレタン、ポリイミド、キュプラ、ケブラー、カーボン、フェノール樹脂、テトロン、パルプ、麻、セルロース、ケナフ、キチン、キトサン、ガラス、綿等を挙げることができる。中でも、ポリエステル、ポリプロピレン、アクリル、レーヨン、ナイロン、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート等の高分子を好適に用いることができる。これらの材質の中では、ふるい効果、細胞との接着性の面から、ポリエステル、ナイロン、及びポリオレフィンからなる群より選択される少なくとも１種の樹脂が好ましい。フィルター部材１１は、これらの材質のうち、単一の材質からなってもよいし、複数の材質を組み合わせた複合材からなってもよい。
【００３８】
フィルター部材１１の平均繊維径としては、目的の細胞の種類に合わせて適宜選択すればよく特に限定はない。
【００３９】
フィルター部材１１の性能をより向上させるために、フィルター部材１１に親水化処理を行ってもよい。
親水化処理により、目的とする必要細胞以外の細胞における非特異的な捕捉の抑制、細胞含有液を偏り無くフィルター部材１１中に通過させる性能の向上、必要細胞の回収効率向上等の効果が付与され得る。
【００４０】
親水化処理方法としては、
水溶性多価アルコール、又は水酸基やカチオン基、アニオン基を有するポリマー、あるいはその共重合体（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、あるいはその共重合体等）を吸着させる方法；
水溶性高分子（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等）を吸着させる方法；
疎水性膜に親水性高分子を固定する方法（例えば、表面に親水性モノマーを化学的に結合させる方法等）；
電子線照射する方法；
含水状態で細胞分離フィルターに放射線を照射することで親水性高分子を架橋不溶化する方法；
乾燥状態で熱処理することにより親水性高分子を不溶化し固定する方法；
疎水性膜の表面をスルホン化する方法；
親水性高分子と疎水性ポリマードープとの混合物から膜をつくる方法；
アルカリ（ＮａＯＨ、ＫＯＨ等）の水溶液による処理により膜表面に親水基を付与する方法；
疎水性多孔質膜をアルコールに浸漬した後、水溶性ポリマー水溶液で処理乾燥後、熱処理や放射線等で不溶化処理する方法；又は、
界面活性作用を有する物質を吸着させる方法等が挙げられる。
【００４１】
親水性高分子としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、多糖類（セルロース、キチン、キトサン等）、水溶性多価アルコール等が挙げられる。
【００４２】
疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン（ポリエチレン、ポリプロピレン等）、アクリル、ウレタン、ビニロン、ナイロン、ポリエステル等が挙げられる。
【００４３】
さらに除去、又は回収目的とする細胞のフィルター部材１１への付着性を向上させるために、細胞付着性のタンパク質や、目的とする幹細胞上に発現されている特異的抗原に対する抗体を、フィルター部材上に固定化してもよい。なお、第１フィルター内のフィルター部材１１には、粗細胞含有液内の除去されるべき細胞が捕捉され、第２フィルター内のフィルター部材１１には、後述する第１ろ液内の回収されるべき細胞（単核球）が捕捉される。細胞付着性のタンパク質としては、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン等が挙げられる。抗体としては、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ１４０ａ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、固定化方法としては、例えば、一般的なタンパク質の固定化方法である、臭化シアン活性化法、酸アジド誘導体法、縮合試薬法、ジアゾ法、アルキル化法、架橋法等の方法を任意に用いることができる。
【００４４】
〔細胞分離装置の具体的構成〕
以下、細胞分離装置の具体的構成について、図３を参照しつつ説明する。
前述の通り、細胞分離装置１００は、第１フィルター１０１と、第２フィルター１０２と、を備える。
第１フィルター１０１、及び第２フィルター１０２として用いられるフィルターについて、後述する所定の条件を満たす限りにおいて特に限定されない。第１フィルター１０１、及び第２フィルター１０２としては、それぞれ、前述の細胞分離用フィルターが好適に使用される。
なお、細胞分離装置１００における、第１フィルター１０１の数と、第２フィルター１０２の数とは、それぞれ特に限定されず、１であっても、２以上の複数であってもよい。
第１フィルター１０１の数、及び／又は第２フィルター１０２の数が複数である場合、第１フィルター１０１、及び／又は第２フィルター１０２は、直列に配置されても、並列に配置されてもよい。
細胞分離装置１００の組み立てや、細胞分離装置１００を使用する際の通液操作が容易であることから、細胞分離装置１００は、第１フィルター１０１と、第２フィルター１０２とをそれぞれ１つずつ備えるのが好ましい。
【００４５】
第１フィルター１０１と、第２フィルター１０２とは、それぞれ、液体導入口９と、液体導出口１０と、フィルター部材収容部３とを備える。
第１フィルター１０１の液体導出口１０と、第２フィルター１０２の液体導入口９とは、流路１０３で接続されている。
【００４６】
細胞分離装置１００には、単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む後述する粗細胞含有液が、第１フィルター１０１から第２フィルター１０２に向けて流れるように供給される。
より具体的には、第１フィルター１０１の液体導入口９に供給された粗細胞含有液が、第１フィルター１０１の液体導出口１０から第１ろ液として導出され、第１ろ液が第２フィルター１０２の液体導入口９に供給された後、第２フィルター１０２の液体導出口１０から第２ろ液が導出される。
そして、第２ろ液の第２フィルター１０２からの導出後、第２フィルター１０２が備える液体導出口１０から、第２フィルター１０２内に回収液が導入される。これにより、第２フィルター部材１１ｂに捕捉された単核球が回収液に遊離され、単核球を含む細胞含有液が生じる。
第２フィルター１０２内に生成した単核球を含む細胞含有液は、第２フィルター１０２が備える液体導入口９を経由して、所望の細胞含有液回収容器１０６に回収される。細胞含有液回収容器１０６の具体的な形態としては、シリンジやバッグ等が挙げられる。
【００４７】
流路１０３は、例えば、第１フィルター１０１の液体導出口１０、及び第２フィルターの液体導入口９に対してそれぞれ着脱自在な管であってよい。かかる管は、外力により容易に変形しない硬質の管であってもよく、フレキシブルな管であってもよい。流路１０３の内径や長さは、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。
この場合、第１フィルター１０１から第１ろ液を供給する際には、第１フィルター１０１と第２フィルター１０２とが流路１０３により連結された状態で細胞分離装置１００が使用される。
そして、第２フィルター１０２の液体導出口１０から回収液を第２フィルター内に導入した後に、単核球を含む細胞含有液を、第２フィルター１０２が備える液体導入口９を経由して回収する場合、流路１０３を、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０、及び第２フィルター１０２が備える液体導入口９の少なくとも一方から取り外す。
流路１０３が、第２フィルター１０２が備える液体導入口９から取り外される場合、第２フィルター１０２が備える液体導入口９から単核球を含む細胞含有液を回収することができる。
流路１０３が、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０から取り外され、第２フィルター１０２が備える液体導入口９には接続されている場合、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０から取り外された流路１０３の端部から単核球を含む細胞含有液を回収することができる。
【００４８】
流路１０３の途中には、クッション槽（不図示）が設けられてもよい。かかるクッション槽が設けられる場合、クッション槽に一旦第１ろ液を貯留した後に、所望する給液速度に調整して第１ろ液を第２フィルター１０２に給液することが容易である。
クッション槽の流路１０３との接続部分付近には、第１フィルター１０１側と、第２フィルター１０２側とにそれぞれ弁（不図示）が設けられるのが好ましい。
クッション槽の第１フィルター１０１側に弁があると、第１ろ液のクッション槽への流入量を必要に応じて調製したり、第１ろ液のクッション槽への流入を遮断したりすることができる。
また、クッション槽の第２フィルター１０２側に弁があると、第１ろ液の第２フィルター１０２への供給速度を必要に応じて調整したり、第１ろ液の第２フィルター１０２への供給を停止したりすることができる。
クッション槽の第２フィルター１０２側には、さらにポンプ（不図示）を設けてもよい。ポンプを設ける場合、さらに第２フィルター１０２への第１ろ液の供給量の制御が容易である。
【００４９】
流路１０３の途中には、図３に図示されるように三方以上の多方弁１０４が設けられるのが好ましい。図３中では、多方弁１０４として三方弁を図示する。
流路１０３の途中に多方弁１０４を設ける場合、多方弁１０４の動作によって、液の流通方向を容易に切り替えることができる。このため、流路１０３を、第１フィルター１０１、及び／又は第２フィルター１０２から取り外すことなく、単核球を含む細胞含有液を、第２フィルター１０２から容易に回収することができる。
【００５０】
上記の単核球を含む細胞含有液を取得する過程において、第１フィルター１０１では第１フィルター部材１１ａに顆粒球等を捕捉させることによって、主に顆粒球が除去される。一方で、単核球と赤血球とは、第１フィルター１０１を通過しやすい。そして、第２フィルター１０２では、赤血球等が第２フィルター１０２内の第２フィルター部材１１ｂを通過しやすい一方で、単核球が第２フィルター部材１１ｂに効率よく捕捉される。
以上の通り、第１フィルター１０１において主に顆粒球を除去し、第１フィルター１０１と第２フィルター１０２の双方とについて赤血球を除去し、単核球を選択性良く回収することができる。
【００５１】
第１フィルター１０１が備えるフィルター部材収容部３には、通気度が１０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である不織布からなる第１フィルター部材１１ａが収容される。
第１フィルター部材１１ａは、収容前の第１フィルター部材１１ａの厚さＴ１０が、収容後の第１フィルター部材１１ａの厚さＴ１１の１．０倍以上１．２倍以下、好ましくは１．０倍超１．０５倍以下であるように第１フィルター１０１が備えるフィルター部材収容部３に収容される。
つまり、第１フィルター部材１１ａは、第１フィルター１０１内において圧縮されないか、ほとんど圧縮されない。
【００５２】
単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む後述する粗細胞含有液を、上記の通気度を有する第１フィルター部材１１ａが、圧縮されないか、ほとんど圧縮されない状態で内部に収容された第１フィルター１０１を通過させることによって、単核球を過度に捕捉することなく、顆粒球の少なくとも一部が第１フィルター部材１１ａに捕捉される。
【００５３】
第１フィルター部材１１ａの通気度は、１２ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４３ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下が好ましく、１５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下がより好ましく、２０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上３５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下が特に好ましい。
なお、第１フィルター部材１１ａの通気度は、ＪＩＳ  Ｌ  １９１３に準拠した方法（フラジール形法）によって測定された値である。
【００５４】
第１フィルター部材１１ａは、１枚の不織布からなっても、積層された２枚以上の不織布からなってもよい。入手が容易であることや、積層される枚数を調整することによって、第１フィルター部材１１ａを所望する厚さ又は所望する圧縮状態に調整しやすいことから、第１フィルター部材１１ａは、積層された２枚以上の不織布からなるのが好ましい。
【００５５】
第１フィルター部材１１ａのフィルター部材収容部３に収容された状態での厚さは、３ｍｍ以上２０ｍｍ以下の範囲内であるのが好ましく、５ｍｍ以上１５ｍｍ以下の範囲内であるのがより好ましく、７ｍｍ以上１０ｍｍ以下の範囲内であるのが特に好ましい。
第１フィルター部材１１ａのフィルター部材収容部３に収容された状態での厚さが、上記の範囲内であると、顆粒球等を所望する程度に除去しつつ、最終的に回収すべき単核球を過度に第１フィルター部材１１ａに捕捉させることなく第１ろ液を生成させることができる。
なお、フィルター部材収容部３に収容された第１フィルター部材１１ａの主面に凹凸がある場合、第１フィルター部材１１ａの一方の面の、フィルター部材収容部３の中央に最も近い位置と、第１フィルター部材１１ａの他方の面の、フィルター部材収容部３の中央に最も近い位置との間の距離を、第１フィルター部材１１ａのフィルター部材収容部３に収容された状態での厚さとする。
【００５６】
フィルター部材収容部３に収容後の第１フィルター部材１１ａの厚さＴ１１は、第１フィルター部材１１ａが収容されたフィルター部材収容部３の、第１フィルター部材１１ａの厚さ方向と同方向の高さＨ１の、０．８倍以上１．２倍以下が好ましく、０．９５倍以上１．０５倍以下がより好ましい。
Ｔ１１とＨ１とが上記の関係を満たす場合、第１フィルター部材１１ａに顆粒球を良好に捕捉させ、粗細胞含有液から顆粒球を良好に除去しやすい。
【００５７】
第２フィルター１０２が備えるフィルター部材収容部３には、通気度が３ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上５０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下、好ましくは２０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上５０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下、より好ましくは２５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である不織布からなる第２フィルター部材１１ｂが収容される。
第２フィルター部材１１ｂは、収容前の第２フィルター部材１１ｂの厚さＴ２０が、収容後の第２フィルター部材１１ｂの厚さＴ２１の１．０倍以上３．０倍以下、好ましくは１．３倍以上３．０倍以下、より好ましくは１．５倍以上３．０倍以下、さらにより好ましくは１．５倍以上２．７倍以下、特に好ましくは１．７倍以上２．７倍以下であるように、第２フィルター１０２が備えるフィルター部材収容部３に収容される。
第２フィルター１０２において、第２フィルター部材１１ｂに所望する程度に単核球を捕捉させるためには、第２フィルター部材１１ｂは、第２フィルター１０２内において、ある程度の倍率（例えば１．３倍以上）で厚さ方向に圧縮されてフィルター部材収容部３に収容差されるのが好ましい。
【００５８】
顆粒球の少なくとも一部が粗細胞含有液から除去された、単核球と赤血球とを含む第１ろ液を、上記の通気度を有する第２フィルター部材１１ｂが、所定の状態で内部に収容された第２フィルター１０２を通過させることによって、赤血球の大部分を液体導出口から排出させつつ、単核球を第２フィルター部材１１ｂに良好に捕捉させることができる。
【００５９】
第２フィルター部材１１ｂの通気度は、２２ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４８ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下が好ましく、２５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下がより好ましく、３０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下が特に好ましい。
なお、第２フィルター部材１１ｂの通気度は、第１フィルター部材１１ａと同様、ＪＩＳ  Ｌ  １９１３に準拠した方法（フラジール形法）によって測定された値である。
【００６０】
第２フィルター部材１１ｂは、第１フィルター部材１１ａと同様に、１枚の不織布からなっても、積層された２枚以上の不織布からなってもよい。入手が容易であることや、積層される枚数を調整することによって、第２フィルター部材１１ｂを所望する厚さ又は所望する圧縮状態に調整しやすいことから、第２フィルター部材１１ｂは、積層された２枚以上の不織布からなるのが好ましい。
【００６１】
第２フィルター部材１１ｂのフィルター部材収容部３に収容された状態での厚さは、３ｍｍ以上２０ｍｍ以下の範囲内であるのが好ましく、５ｍｍ以上１５ｍｍ以下の範囲内であるのがより好ましく、５ｍｍ以上１０ｍｍ以下の範囲内であるのが特に好ましい。
第２フィルター部材１１ｂのフィルター部材収容部３に収容された状態での厚さが、上記の範囲内であると、第２フィルター１０２において、良好に赤血球を通過させつつ、単核球を良好に第２フィルター部材１１ｂに捕捉させやすい。
なお、フィルター部材収容部３に収容された第２フィルター部材１１ｂの主面に凹凸がある場合、第２フィルター部材１１ｂの一方の面の、フィルター部材収容部３の中央に最も近い位置と、第２フィルター部材１１ｂの他方の面の、フィルター部材収容部３の中央に最も近い位置との間の距離を、第２フィルター部材１１ｂのフィルター部材収容部３に収容された状態での厚さとする。
【００６２】
第２フィルター部材１１ｂを構成する不織布に含まれる繊維の平均繊維径は１μｍ以上５μｍ以下であるのが好ましい。不織布の繊維径がかかる範囲内であると、単核球をより高い回収率で回収しやすい。
【００６３】
以上説明した細胞分離装置１００を用いることにより、顆粒球、及び赤血球を除去しつつ、良好な回収効率で単核球を回収できる。
【００６４】
≪単核球を含む細胞含有液の取得方法≫
単核球を含む細胞含有液の取得方法は、前述の細胞分離装置を用いて、単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む粗細胞含有液から、顆粒球の少なくとも一部と、赤血球の少なくとも一部とを除去しつつ、単核球を含む細胞含有液を取得する方法である。
かかる方法は、
液体導入口から第１フィルター内に粗細胞含有液を導入し、第１フィルターが備える液体導出口から第１ろ液を導出させることと、
液体導入口から第２フィルター内に第１ろ液を導入し、第２フィルターが備える液体導出口から第２ろ液を導出させて、第１ろ液内の単核球を、第２フィルター部材に捕捉させることと、
第２フィルターが備える液体導出口から、第２フィルター内に回収液を導入して、第２フィルター部材に捕捉された単核球を回収液に遊離させて、細胞含有液を生じさせることと、
細胞含有液を、第２フィルターが備える液体導入口から回収することと、
を含む。
【００６５】
以下、液体導入口から第１フィルター内に粗細胞含有液を導入し、第１フィルターが備える液体導出口から第１ろ液を導出させることを、「第１ろ液導出」とも記す。
液体導入口から第２フィルター内に第１ろ液を導入し、第２フィルターが備える液体導出口から第２ろ液を導出させて、第１ろ液内の単核球を、第２フィルター部材に捕捉させることを、「単核球捕捉」とも記す。
第２フィルターが備える液体導出口から、第２フィルター内に回収液を導入して、第２フィルター部材に捕捉された単核球を回収液に遊離させて、細胞含有液を生じさせることを、「細胞含有液生成」とも記す。
細胞含有液を、第２フィルターが備える液体導入口から回収することを、「細胞含有液回収」とも記す。
【００６６】
以下、単核球を含む細胞含有液の取得方法が備える各工程について説明する。
【００６７】
＜第１ろ液導出＞
第１ろ液導出では、単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む粗細胞含有液を、前述の第１フィルター１０１内に液体導入口９から導入する。これにより、顆粒球の少なくとも一部が、第１フィルター１０１内の第１フィルター部材１１ａに捕捉される一方で、単核球と、赤血球の大部分は、第１ろ液として第１フィルター１０１が備える液体導出口１０から導出される。
【００６８】
粗細胞含有液としては、少なくとも単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む懸濁液であれば特に限定されず用いることができる。例えば、臍帯等の生体組織を酵素処理や破砕処理や抽出処理や分解処理や超音波処理等をした後の懸濁液、血液や骨髄液、臍帯血、末梢血等の体液、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理やろ過処理や酵素処理や分解処理や超音波処理等の前処理をして調製された細胞懸濁液等が粗細胞含有液として例示される。これらの中でも、粗細胞含有液としては、血液及び／又は骨髄液が好ましい。
また、粗細胞含有液は、所望する種類の細胞を生体外で培養液や刺激因子等を用いて培養や増殖等をした後の懸濁液であってもよい。
【００６９】
第１フィルター１０１の液体導入口９から粗細胞含有液を導入する方法は特に限定されない。粗細胞含有液を導入する際には、典型的には、液体導入口９と液体導出口１０との間に差圧を生じさせる。差圧を生じさせる方法は、特に限定されず、粗細胞含有液を加圧させたり、重力を利用することで第１フィルター１０１内へ粗細胞含有液の導入させる方法や、液体導出口１０側を減圧して、第１フィルター１０１内へ粗細胞含有液を吸入する方法等が挙げられる。
このようにして、第１フィルター１０１内に粗細胞含有液を供給し、粗細胞含有液を第１フィルター部材１１ａと接触させて、顆粒球等を第１フィルター部材１１ａに捕捉させつつ、単核球や赤血球等を液体導出口１０側へ通過させる。その結果、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０から、顆粒球の少なくとも一部が除去され、単核球と赤血球とを含む第１ろ液が導出される。
【００７０】
差圧の程度としては、第１フィルター１０１に破損が生じたり、粗細胞含有液に含まれる細胞の過度の破砕が生じたりしない程度であれば、特に限定されない。好ましい差圧の範囲としては、２００ｋＰａ以下が好ましい。差圧は、液体導入口９及び液体導出口１０に三方活栓を介して圧力センサーを付けることによって測定することができる。
【００７１】
粗細胞含有液を、第１フィルター１０１内に供給する際の流速は、例えば、８．０×１０−３ｍＬ／秒以上６．７×１０−１ｍＬ／秒以下が好ましく、１．７×１０−２ｍＬ／秒以上３．３×１０−１ｍＬ／秒以下がより好ましく、２．８×１０−２ｍＬ／秒以上１．７×１０−１ｍＬ／秒以下が特に好ましい。
【００７２】
以上説明した操作は、室温下で行ってもよいし、冷蔵温度下で行ってもよい。冷蔵温度下で行う場合、冷蔵された粗細胞含有液を処理することが挙げられる。粗細胞含有液の保管としては、冷蔵温度に設定した冷蔵庫による保管、ウォーターバスによる保管、及びドライアイスによる保管等が挙げられる。汎用性から冷蔵庫で保存することが好ましい。冷蔵温度としては、１℃以上６℃以下が好ましく、より好ましくは３℃以上５℃以下が好ましい。冷蔵温度が１℃未満では細胞は死滅し、６℃を超えて保存すると細菌が繁殖しコンタミネーションを起こす可能性がある。
【００７３】
また、第１フィルター部材１１ａの状態を整えて、顆粒球を捕捉しやすくする観点から、第１フィルター１０１内に粗細胞含有液を供給する前に、液体導入口９又は液体導出口１０から生理食塩水又は緩衝液を第１フィルター１０１内に導入し、第１フィルター部材１１ａと生理食塩水又は緩衝液とを接触させてもよい。
【００７４】
＜単核球捕捉＞
単核球の捕捉は、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０から導出された第１ろ液を、第２フィルター１０２が備える液体導入口９から第２フィルター１０２内に導入することにより行われる。
第２フィルター１０２内の第２フィルター部材１１ｂによる単核球の捕捉は、第１フィルター１０１内の第１フィルター部材１１ａによる顆粒球の捕捉と同様にして行われる。
【００７５】
＜細胞含有液生成＞
細胞含有液生成では、第２フィルター１０２内に液体導出口１０から回収液を供給することで、第２フィルター部材１１ｂに捕捉された単核球を回収液中に遊離させて細胞含有液を生じさせる。
なお、第２フィルター１０２で生成した単核球を含む細胞含有液は、通常、生成後すぐに、液体導入口９を経由して回収される。
【００７６】
回収液を、第２フィルター１０２内に供給する際の流速は、５ｍＬ／秒以上５０ｍＬ／秒以下が好ましく、８ｍＬ／秒以上３０ｍＬ／秒以下がより好ましく、１０ｍＬ／秒以上２５ｍＬ／秒以下が特に好ましい。このような流速で回収液を供給することにより、フィルター部材１１ｂから回収液に単核球を遊離させやすく、より高い単核球の回収率を実現しやすい。
【００７７】
回収液は、細胞と等張である溶液であれば特に限定はないが、生理食塩液やリンゲル液等の注射溶剤として使用実績のあるものや、緩衝液、細胞培養用の培地等が挙げられる。特に、培養工程を経る際はそのまま培養が行える培地が好ましく、培養工程を経ずそのまま治療に用いる際は、生理食塩液等の点滴等に使用実績のある等張液等、安全性が保証されている回収液を使用することが好ましい。
【００７８】
細胞含有液生成の操作は、単核球捕捉の操作と同様、室温下で行ってもよいし、冷蔵温度下で行ってもよい。
【００７９】
回収液を用いて単核球を含む細胞含有液を生じさせる前に、生理食塩水又は緩衝液を第２フィルター１０２が備える液体導入口９から導入して液体導出口１０から導出させることにより、フィルター部材１１ｂ内の夾雑成分を除去でき、これにより回収される細胞（単核球）内の不要成分を低減することができる。
【００８０】
＜細胞含有液回収＞
細胞含有液回収では、細胞含有液生成で生成させた単核球を含む細胞含有液を、第２フィルター１０２内から回収する。
回収方法は特に限定されず、細胞分離装置について前述した方法により細胞含有液を回収することができる。
例えば、図３に示される細胞分離装置１００を用いる場合、流路１０３中の多方弁（三方弁）１０４を、第２フィルター１０２が備える液体導入口９と、流路１０３から分岐した枝流路１０５とが連通されるように切り替えた後、枝流路１０５の端部から単核球を含む細胞含有液を回収することができる。
この時、枝流路１０５の端部に回収専用の所定の細胞含有液回収容器１０６を接続して、単核球を含む細胞含有液を、当該細胞含有液回収容器１０６内に回収すればよい。
【００８１】
上記の方法により取得された細胞含有液に含まれる赤血球数は、粗細胞含有液に含まれる赤血球数の１０％以下であるのが好ましく、７％以下であるのがより好ましく、５％以下であるのが特に好ましい。
つまり、細胞含有液を取得する際の、粗細胞含有液に対する赤血球除去率は、９０％以上が好ましく、９３％以上が好ましく、９５％以上が特に好ましい。
【００８２】
上記の方法により取得された細胞含有液に含まれる顆粒球数は、粗細胞含有液に含まれる顆粒球数の４０％以下であるのが好ましく、３０％以下であるのがより好ましく、２０％以下であるのが特に好ましい。
つまり、細胞含有液を取得する際の、粗細胞含有液に対する顆粒球除去率は、６０％以上が好ましく、７０％以上が好ましく、８０％以上が特に好ましい。
【００８３】
上記の方法により取得された細胞含有液に含まれる単核球数の、粗細胞含有液に含まれる単核球数に対する比率である単核球回収率は、１５％以上が好ましく、２０％以上がより好ましく、３０％以上がさらに好ましく、５０％以上が特に好ましい。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例において本発明に関して詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００８５】
（実施例１〜４、及び比較例１）
第１フィルター１０１として、フィルター容量が４．９２ｍＬであり、ろ過面積５３１ｍｍ２であり、前述の高さＨ１が９ｍｍである細胞分離用フィルターを用いた。
第２フィルター１０２として、フィルター容量が３．８２ｍＬであり、ろ過面積５３１ｍｍ２であり、第１フィルター１０１における高さＨ１に相当する高さＨ２が７ｍｍである、細胞分離用フィルターを用いた。
なお、フィルター容量は、液体導入口９の開口端と、液体導出口１０の開口端との間の容積である。
第１フィルター１０１、及び第２フィルター１０２として、円筒状の収容部３に、丸型にカットされた、表２に記載の種類及び枚数の不織布を、表２に記載の圧縮比で充填し、収容部３の上下の開口部に、第１突起１２ａを備えるノズル付内蓋４と、第２突起１３ａを備えるノズル付き内蓋５とを差し込み、その上から環状外蓋６、７でネジ止めし、図１、２（ａ）、２（ｂ）に示すような構造を有する細胞分離用フィルター１を作製した。
各不織布の詳細については、表１に記す。
なお、表２に記載の第１フィルター部材１１ａの圧縮比は、収容部３に収容される前の第１フィルター部材１１ａの厚さ（複数の不織布の厚さの合計）をＴ１０とし、収容部３に収容された後のフィルター部材の厚さ（複数の不織布の厚さの合計）をＴ１１とした場合の、Ｔ１０／Ｔ１１の値である。
第２フィルター部材１１ｂの圧縮比は、収容部３に収容される前の第２フィルター部材１１ｂの厚さ（複数の不織布の厚さの合計）をＴ２０とし、収容部３に収容された後のフィルター部材の厚さ（複数の不織布の厚さの合計）をＴ２１とした場合の、Ｔ２０／Ｔ２１の値である。
【００８６】
次に、細胞分離装置１００として、第１フィルター１０１と、第２フィルター１０２とを含む図３に示される回路を作製した。
【００８７】
具体的には、図３に示される回路において、第１フィルター１０１が備える液体導入口９に、三方弁１０９ａと三方弁１０９ｂとを含む分岐した流路を介して、粗細胞含有液を供給するための粗細胞含有液容器１０７と、生理食塩水等のプライミング液を供給するためのプライミング液容器１０８と、廃液容器１１０ａとを接続した。
【００８８】
次いで、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０と、第２フィルター１０２が備える液体導入口９とを、流路１０３により接続した。流路１０３の途中には、多方弁（三方弁）１０４を設け、多方弁１０４に接続される枝流路１０５に細胞含有液回収容器１０６を接続した。
【００８９】
第２フィルター１０２が備える液体導出口１０には、三方弁１０９ｃを含む分岐した流路を介して、回収液を供給するための回収液容器１１１と、廃液容器１１０ｂとを接続した。
【００９０】
上記の細胞分離装置１００を用いて、単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む粗細胞含有液からの、単核球を含む細胞含有液の取得操作を実施した。なお、細胞分離装置１００に通液する液体の種類、送液する目的の手段に応じて、三方弁１０９ａ、三方弁１０９ｂ、三方弁１０９ｃ、及び多方弁１０４によって、各流路の切り替えを適宜行った。
【００９１】
まず、プライミング液容器１０８に収容された生理食塩水を５０ｍＬ以上１５０ｍＬ以下程度の量用いて第１フィルター１０１、及び第２フィルター１０２のプライミング操作を行い、廃液容器１１０ｂに第１フィルター１０１、及び第２フィルター１０２を通過した生理食塩液を回収した。
次に、粗細胞含有液容器１０７から白血球濃厚液（ヘパリンで抗凝固したブタ血液）２０ｍＬを、第１フィルター１０１に重力を利用して通液し、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０から第１ろ液を導出させた。その後、第１ろ液を、流路１０３を通じて、第２フィルター１０２が備える液体導入口９に供給し、第２フィルター部材１１ｂに単核球を捕捉させる一方で、赤血球等を含む第２ろ液を第２フィルター１０２が備える液体導出口１０から導出させた。第２ろ液は廃液容器１１０ｂに回収した。
【００９２】
上記操作で使用した白血球濃厚液は、ヘパリンで抗凝固したブタ血液を３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離して得たバッフィーコートより、処理する白血球数が１．０×１０９ｃｅｌｌｓ〜４．０×１０９ｃｅｌｌｓになるように調製した。
【００９３】
その後、プライミング液容器１０８から、第１フィルター１０１、及び流路１０３を経由して生理食塩水１００ｍＬを第２フィルター１０２に重力を利用して通液し、通過液は廃液容器１１０ｂに回収した。
最後に、回収液容器１１１としてシリンジを用いて、シリンジから回収液として生理食塩水を導入した。具体的には、生理食塩水５０ｍＬをシリンジに収容し、手押しすることで第２フィルター１０２が備える液体導出口１０より第２フィルター１０２内に生理食塩水を導入した。これにより、第２フィルター１０２内で、第２フィルター部材１１ｂに捕捉された単核球を回収液に遊離させ、単核球を含む細胞含有液を生成させた。生成した細胞含有液は、液体導入口９に、流路１０３、多方弁１０４、及び枝流路１０５を介して接続された細胞含有液回収容器１０６に回収した。
【００９４】
なお、比較例１では、第１フィルター１０１内に第１フィルター部材１１ａを充填することなく試験を行った。また、比較例２では、第１フィルター１０１の液体導出口１０から導出される第１ろ液を、第２フィルター１０２に供給することなく細胞含有液として回収した。
比較例３では、通液中に、第１フィルター１０１内で目詰まりが発生したため、細胞含有液を回収できなかった。
【００９５】
細胞含有液、及び、粗細胞含有液に含まれる各細胞の濃度を、血球カウンター（Ｋ−４５００、シスメックス社）及びフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  ｃａｎｔｏ、ＢＤ社）により測定した。その後、粗細胞懸濁液と細胞含有液の体積より各細胞数を算出して、下記式：
回収率（％）＝細胞含有液中の細胞数／粗細胞含有液中の細胞数×１００
に従って、単核球回収率、顆粒球回収率、赤血球回収率をそれぞれ求めた。
そして、顆粒球回収率と、赤血球回収率とから、下記式：
顆粒球除去率（％）＝１００−顆粒球回収率
赤血球除去率（％）＝１００−赤血球回収率
に従って、顆粒球除去率と、赤血球除去率とを算出した。
なお、実施例５については、リンパ球に特異的な細胞表面マーカー（ＣＤ３）に対して蛍光標識し、上記フローサイトメーターによる解析を行うことでリンパ球回収率も求めた。
それぞれの結果を表２に示す。
【００９６】
【表１】
2019024426.tif 000003
【００９７】
【表２】
2019024426.tif 000004
【００９８】
実施例１〜５によれば、それぞれ、所定の通気度を有する不織布が、所定の状態で第１フィルター１０１及び第２フィルター１０２に充填されている細胞分離装置１００を用いる場合、良好に顆粒球と、赤血球とを除去しつつ、単核球を回収できることが分かる。
【００９９】
比較例１によれば、所定の条件を満たす第１フィルター１０１を用いることなく、第２フィルター１０２のみを用いて細胞含有液を回収する場合、顆粒球の除去が困難であることが分かる。
【０１００】
比較例２によれば、所定の条件を満たす第２フィルター１０２を用いることなく、第１フィルター１０１を通過した液を細胞含有液として回収する場合、赤血球の除去が困難であることが分かる。
【０１０１】
比較例３によれば、第１フィルター１０１内に充填される第１フィルター部材１１ａの圧縮比が過度に高い場合、目詰まりにより、そもそも細胞含有液の回収が困難であることが分かる。
【０１０２】
比較例４によれば、第２フィルター１０２内に充填される第２フィルター部材１１ｂの通気度が過度に高い場合、単核球を所望する程度に回収することが困難であることが分かる。
【符号の説明】
【０１０３】
１  細胞分離用フィルター装置
２  細胞分離用フィルター容器
３  フィルター部材収容部
４、５  ノズル付き内蓋
６、７  環状外蓋
８  シール
９  液体導入口
１０  液体導出口
１１  フィルター部材
１１ａ  第１フィルター部材
１１ｂ  第２フィルター部材
１２ａ  第１突起
１２ｂ  第１環状支持体
１３ａ  第２突起
１３ｂ  第２環状支持体
１００  細胞分離装置
１０１  第１フィルター
１０２  第２フィルター
１０３  流路
１０４  他方弁
１０５  枝流路
１０６  細胞含有液回収容器
１０７  粗細胞含有液容器
１０８  プライミング液容器
１０９ａ、１０９ｂ、１０９ｃ  三方弁
１１０ａ、１１０ｂ  廃液容器
１１１  回収液容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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