(57)【要約】      （修正有）【課題】転写因子を利用した根に於ける地上部様器官を形成する手段・方法の提供。【解決手段】植物体の根に於ける地上部様器官形成の誘導に必須であると同定された（１）転写因子ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX PROTEIN 25（ATHB25、At5g65410）をコードする塩基配列からなるＤＮＡ又はそのホモログ等；及び、（２）B3ファミリー転写因子REPRODUCTIVE MERISTEM 7（REM7、At3g18960）をコードする塩基配列からなるＤＮＡ又はそのホモログ等；によってコードされる２つの転写因子から成る群から選択される転写因子を、植物体の根における地上部様器官の形成因子、並びに、根において該転写因子を特異的に発現誘導して根に地上部様器官を形成させる工程を含む、植物体の根に地上部様器官を形成させる方法。【選択図】図５
2019050760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
夫々、以下のＤＮＡ（Ａ）及びＤＮＡ（Ｂ）にコードされる２つの転写因子（TF）から成る群から選択される、植物体の根における地上部様器官の形成因子：
ＤＮＡ（Ａ）：
（１）転写因子ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX PROTEIN 25（ATHB25、At5g65410）をコードする配列番号：１で表される塩基配列からなるＤＮＡ又はそのホモログ；
（２）上記（１）のＤＮＡ又はそのホモログと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は
（３）上記（１）のＤＮＡ又はそのホモログと８０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、前記転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び
ＤＮＡ（Ｂ）：
（４）B3ファミリー転写因子REPRODUCTIVE MERISTEM 7（REM7、At3g18960）をコードする配列番号：２で表される塩基配列からなるＤＮＡ又はそのホモログ；
（５）上記（４）のＤＮＡ又はそのホモログと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は
（６）上記（４）のＤＮＡ又はそのホモログと８０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、前記転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
地上部様器官が以下に挙げる特性の少なくとも一つによって特徴づけられる、請求項１記載の形成因子：
（１）各側根の付け根の領域および主根の新生誘導部分に緑化地上部様器官が形成される；
（２）重力屈性異常；
（３）クロロフィル含有量の増加；及び
（４）維管束構造における、維管束細胞の数の増加、大きさの増大、又は葉緑体の生成。
【請求項３】
地上部様器官に於いて、WUSCHEL (WUS), SHOOT MERISTEMLESS (STM), および AGAMOUS-LIKE 15 (AGL15)から選択される一つ又はそれ以上のSAM特異的遺伝子の発現が１０倍以上の上方制御されている、請求項１又は２記載の形成因子。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）を含む、植物体の根における地上部様器官の形成用ベクター。
【請求項５】
アグロバクテリウム法に用いるバイナリーベクターである、請求項４記載のベクター。
【請求項６】
ＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）の発現が化学的誘導系で制御される、請求項４又は５記載のベクター。
【請求項７】
大腸菌SOS レギュロンのLexAオペレーター、並びに、そのリプレッサーLexAのDNA結合ドメイン（X）、単純ヘルペスウィルスHSV由来のVP16の酸性トランス活性化ドメイン（V）およびヒトエストロゲン受容体の調節領域（Ｅ）からなるキメラ転写活性化因子（XVE）を含む、請求項６記載のベクター。
【請求項８】
ＤＮＡ（Ａ）及びＤＮＡ（Ｂ）を含み、且つ、XVEのオペレーターが夫々のＤＮＡの上流に連結されている、請求項７記載のベクター。
【請求項９】
植物体の根に地上部様器官を形成させる方法であって、請求項４〜８のいずれか一項に記載のベクターを該植物体に導入する工程、得られた形質転換植物体を選択する工程、並びに、形質転換植物体の根においてＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）の発現を特異的に誘導して該形質転換植物体の根に地上部様器官を形成させる工程、を含む前記方法。
【請求項１０】
ベクターをアグロバクテリウム法により植物体を形質転換する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）の発現がエストラジオール誘導系で化学的誘導される、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
植物体の根においてＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）の発現を特異的に誘導する際に、更に、サイトカイニンで処理することを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
根に地上部様器官が形成されていることを特徴とする、形質転換植物体。
【請求項１４】
地上部様器官が以下に挙げる特性の少なくとも一つによって特徴づけられる、請求項１３記載の形質転換植物体：
（１）各側根の付け根の領域および主根の新生誘導部分に緑化地上部様器官が形成される；
（２）重力屈性異常；
（３）クロロフィル含有量の増加；及び
（４）維管束構造における、維管束細胞の数の増加及び大きさの増大、又は葉緑体の生成。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、茎頂分裂組織に特異的に発現する転写因子群の根に於ける異所的発現誘導による地上部様器官の形成（又は、「発生」）、根に該地上部様器官が形成されていることを特徴とする形質転換植物体（トランスジェニック植物体）、及び、かかる地上部様器官の形成を誘導する該転写因子群等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の個体に於ける各器官形成は特定の転写制御因子セットの協調作業を通して行われる。植物体の形成および維持は、複雑なシグナル経路によって高度に調節される。一方で、植物細胞は一般に表現型に於ける可塑性を有することが知られている1。例えば、葉と茎の体細胞は、不定（異所性）根を生み出す再生能力を保持している2-4。最近の研究では、根に於ける異常な胚形成が報告されている5〜7。植物体細胞における高い再生能力は、ヒストン修飾によって強く制御されるため、ヒストン修飾の欠如は、増殖細胞の生成を促進する5,6。しかしながら、これまでに遺伝子導入によって茎を再生した報告は行われていない。
【０００３】
最近の研究により、根、花および葉の形成を制御する複雑な遺伝子ネットワークが明らかにされている。例えば、転写因子（TFs）の特定の組み合わせによる共同作用によって植物形成の様々な局面が制御されることが明らかにされている8,9。ただし、茎の形成を制御する遺伝子群については未同定のままであった。
【０００４】
植物体では、胚形成の過程で茎頂分裂組織（shoot apical meristem: SAM）と根端分裂組織（root meristem: RM）が形成され、地上部と地下部はそれぞれの分裂組織から形成される。しかし、植物の胚からどのようにしてSAMとRMが誘導されるのか、どのような転写因子群がそれらを決定しているのか等の分子機構は不明なままである。
【０００５】
本発明者等は、これまでに、複数の遺伝子群をひとつのベクターにつなぐために固相DNA連続連結（PRESSO）法を開発した（非特許文献１）。この方法を用いて、我々はエストラジオール誘導型ベクターにSAM に特異的に発現する９つの転写因子遺伝子（At1g14440、At1g75240、At2g45190、At3g18960、At3g50890、At3g60390、At3g61310、At4g31805およびAt5g65410）を連結し、誘導条件下でこれらの遺伝子群を発現するシロイヌナズナ形質転換植物体を作製した（非特許文献２）。興味深いことに、この遺伝子群導入植物体は根で茎様の緑色器官を形成した。この遺伝子群導入植物体は重力屈性の異常も示した。光学顕微鏡による形態観察の結果、実際に根の組織及び維管束器官内部に葉緑体が形成されていた。根で葉緑体が形成されるだけではなく、根の構造自体が変化していることが示唆された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Takita, E. et al. Precise sequential DNA ligation on a solid substrate: solid-based rapid sequential ligation of multiple DNA molecules. DNA Res 20, 583-592, doi:10.1093/dnares/dst032 (2013)
【非特許文献２】第54回日本植物生理学会年会2013年3月21日〜3月23日  岡山  岡山大学津島キャンパス （講演） 要旨集:p138 (1pC01)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、植物体の根に於ける地上部様器官形成の誘導に必須の転写因子を同定することによって、該転写因子を利用して根に於ける地上部様器官を形成する手段・方法等を提供し、更には、茎の発生機構を解明することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana：Arabidopsis）を用いたSAM特異的転写因子の異所的誘導の実験により、SAM特異的転写因子である、「ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX PROTEIN 25（ATHB25、At5g65410）」及び／又は「B3ファミリー転写因子REPRODUCTIVE MERISTEM 7（REM7、At3g18960）」（夫々、Induction of Shoot 1（ISH1）およびInduction of Shoot 2（ISH2）と命名）等を根に於いて発現させることによって、人工植物器官である誘導性茎様器官（inducible stem-like organs ：ISO）（又は「誘導性地上部様器官」とも称する）が形成されることを初めて見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、これらSAM特異的転写因子を根に於いて発現誘導することによって、シロイヌナズナの根に、茎状の木質部構造を呈し異常な重力応答を示す緑色のISOが形成された。さらに、遺伝子発現解析により、ISH1およびISH2（並びに、それらのホモログ）は、光合成および葉緑体の形成を含む地上部の発生・形成の様々な局面に関与する多くの遺伝子の発現を誘導し、元々、根で発現されている遺伝子を抑制することが示された。
【００１０】
即ち、本発明は以下の態様を有する。
［態様１］夫々、以下のＤＮＡ（Ａ）及びＤＮＡ（Ｂ）にコードされる２つの転写因子（TF）から成る群から選択される、植物体の根における地上部様器官の形成因子：
ＤＮＡ（Ａ）：
（１）転写因子ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX PROTEIN 25（ATHB25、At5g65410）をコードする配列番号：１で表される塩基配列からなるＤＮＡ又はそのホモログ；
（２）上記（１）のＤＮＡ又はそのホモログと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は
（３）上記（１）のＤＮＡ又はそのホモログと８０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、前記転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び
ＤＮＡ（Ｂ）：
（４）B3ファミリー転写因子REPRODUCTIVE MERISTEM 7（REM7、At3g18960）をコードする配列番号：２で表される塩基配列からなるＤＮＡ又はそのホモログ；
（５）上記（４）のＤＮＡ又はそのホモログと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は
（６）上記（４）のＤＮＡ又はそのホモログと８０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、前記転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［態様２］地上部様器官が以下に挙げる特性の少なくとも一つによって特徴づけられる、態様１記載の形成因子：
（１）各側根の付け根の領域および主根の新生誘導部分に緑化地上部様器官が形成される；
（２）重力屈性異常；
（３）クロロフィル含有量の増加；及び
（４）維管束構造における、維管束細胞の数の増加、大きさの増大、又は葉緑体の生成。
［態様３］地上部様器官に於いて、WUSCHEL (WUS), SHOOT MERISTEMLESS (STM), および AGAMOUS-LIKE 15 (AGL15)から選択される一つ又はそれ以上のSAM特異的遺伝子の発現が１０倍以上の上方制御されている、態様１又は２記載の形成因子。
［態様４］
態様１に記載のＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）を含む、植物体の根における地上部様器官の形成用ベクター。
［態様５］
アグロバクテリウム法に用いるバイナリーベクターである、態様４記載のベクター。
［態様６］
ＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）の発現が化学的誘導系で制御される、態様４又は５記載のベクター。
［態様７］
大腸菌SOS レギュロンのLexAオペレーター、並びに、そのリプレッサーLexAのDNA結合ドメイン（X）、単純ヘルペスウィルスHSV由来のVP16の酸性トランス活性化ドメイン（V）およびヒトエストロゲン受容体の調節領域（Ｅ）からなるキメラ転写活性化因子（XVE）を含む、態様６記載のベクター。
［態様８］
ＤＮＡ（Ａ）及びＤＮＡ（Ｂ）を含み、且つ、XVEのオペレーターが夫々のＤＮＡの上流に連結されている、態様７記載のベクター。
［態様９］
植物体の根に地上部様器官を形成させる方法であって、態様４〜８のいずれか一項に記載のベクターを該植物体に導入する工程、得られた形質転換植物体を選択する工程、並びに、形質転換植物体の根においてＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）の発現を特異的に誘導して該形質転換植物体の根に地上部様器官を形成させる工程、を含む前記方法。
［態様１０］
ベクターをアグロバクテリウム法により植物体を形質転換する、態様９記載の方法。
［態様１１］
ＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）の発現がエストラジオール誘導系で化学的誘導される、態様９又は１０記載の方法。
［態様１２］
植物体の根においてＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）の発現を特異的に誘導する際に、更に、サイトカイニンで処理することを特徴とする、態様９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
［態様１３］
根に地上部様器官が形成されていることを特徴とする、形質転換植物体。
［態様１４］
地上部様器官が以下に挙げる特性の少なくとも一つによって特徴づけられる、態様１３記載の形質転換植物体：
（１）各側根の付け根の領域および主根の新生誘導部分に緑化地上部様器官が形成される；
（２）重力屈性異常；
（３）クロロフィル含有量の増加；及び
（４）維管束構造における、維管束細胞の数の増加及び大きさの増大、又は葉緑体の生成。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、シロイヌナズナの根に於いてSAM特異的転写因子であるISH1及び／又はISH2（並びに、それらのホモログ）を発現誘導させることによって、誘導性茎様器官（ISOs）又は誘導性地上部様器官と呼ばれる茎様器官を生じさせることが可能となった。 SAMはRMから形成され、根が茎になる能力を有することを示している。従って、ISH1及びISH2（並びに、それらのホモログ）の転写因子が、植物器官の運命を再プログラミングするISOの形成に重要な役割を果たし、これらの転写因子が地上部幹細胞発生の引き金となることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ISH1およびISH2の共誘導は、地上部（幹）様器官（ISO）を生成することを示す。 a、ISH1（AHB25、At5g65410）およびISH2（REM7、At3g18960）の遺伝子構造。 ZF：C2H2型ジンクフィンガードメイン、HD：ホメオドメイン、およびAP2 / B3：AP2 / B3様DNA結合ドメイン。 b、ISH1およびISH2（ISH1および2）の共誘導のための構築物。緑色の三角形、黄色のボックスおよび茶色のボックスは、それぞれXVEオペレーター、コーディング領域およびターミネーターを表す。ピンク色のボックスは、ゲートウェイクローニングのattB1およびattB2配列を示す。 c、ISH1＆2植物の根。 d-f、ISH1（d）またはISH2（e）を発現する植物の根、およびpGWB501ベクターを保有する植物（対照）（f）。 g、h、ISH1＆2植物の主根（g）および側根（h）に形成されるISO。 i、ISH1-oxとISH2-oxを交配したF1植物の子葉。 j、根のクロロフィル含量（左側：Ch1a、右側：Ch1b）。 k、l、サイトカイニンは、ISH1（k）およびISH1＆2植物（l）の根の緑化を促進する。
【図２】ISOは地上部様の維管構造を発達させることを示す。 エスタジオール処理で誘導をかけたISH1&2-ind植物の根の横断面画像（右上）とエスタジオール処理なしの対照（左上）。下図は、典型的な横断切断面のパターン図。
【図３】ISH1およびISH2によって制御される下流の遺伝子を示す。 a、ISH1-ind、ISH2-indおよびISH1＆2-ind植物における10倍の上方制御または下方制御された遺伝子の数。 b、ISH1-ind、ISH2-indおよびISH1＆2-ind植物における１０倍の上方制御または下方制御された遺伝子の発現パターンc、ISOで制御される遺伝子の組織特異的発現。
【図４】ConfeitoおよびATTED-II分析によるSAM特異的な９つのTFの選択及びクローニング。a、SAM特異的TFの選択の流れ。b、SAM特異的9遺伝子の誘導のためのプラスミドの図。 c、コンストラクトに用いた9遺伝子の組織特異的発現のヒートマップ。
【図５】９つのTF遺伝子の異所性の共誘導が、根の一部に緑化したISOが形成されたことを示す。a、SAM特異的TFをコードする9個のcDNAを共発現している植物の表現型。トランスジェニック植物を5μM 17-β-エストラジオールで3週間処理した。 b、XVE-オペレーター制御下で9個のcDNAを発現するトランスジェニック植物の重力屈性; コントロール（左）およびトランスジェニック植物（右：9遺伝子-ind）。これらの植物は1μM 17-β-エストラジオールで4日間処理した。エラーバー= 1cm。 c、野生型植物における地上部および根の発生の模式図。 d、ISOs形成時として提案されたモデル図。
【図６】ISH1及びISH2Iの化学的誘導性ベクター構築及び化学的誘導を示す。a、エストラジオール処理のための新しい誘導性ベクターpGWB501_TOPX。 attL配列を有するDNA断片と、ベクターのattR1およびattR2とでLR反応を行うことによって、attB1とattB2との間に遺伝子をクローニングした。 b、pGWB501_TOPXベクターによるエストラジオール誘導。pGWB501_TOPXベクターでのエストラジオールによる誘導を確認するために、GUSをコードするDNA断片をベクターにクローニングし、アグロバクテリウムを介した花序浸漬法でpGWB501_TOPX-GUSをシロイヌナズナ植物に導入した結果、エストラジオール処理により、GUS染色が検出された。 c、ISH1およびISH2誘導のためのコンストラクト。各cDNA（ISH1, ISH2）および両方を連結したcDNA (2 gene A) をpGWB501_TOPXベクターにクローニングし、遺伝子（ISH1＆2-ind）および単一のISH1（ISH1-ind）およびISH2（ISH2-ind）の誘導性クローンを作製した。 d、ISH1およびISH2遺伝子の発現が誘導性トランスジェニック植物において確認された。e、f、ISH1（e）およびISH2（f）の系統樹。
【図７】サイトカイニンによるISH1及びISH2Iの化学的誘導を示す。a、ISH1-ind、ISH2-indまたはISH1＆2-indを有する7日目の植物を、1μMのBAありまたはなしでビタミンおよび5μMのエストラジオールを含有する1 / 2MS−1％ショ糖プレート上に移植し、さらに10日間育てた結果を示す。 b、サイトカイニンの有無における、ISH1-ind、ISH2-indおよびISH1＆2-ind植物の根におけるクロロフィル含量。
【図８】ISH1とISH2の発現を示す。a-g、 ISH1遺伝子発現および細胞内局在。 h-m、ISH2遺伝子の発現および細胞内局在。胚（a、b、h、j）および苗のSAM（c、k）およびSAM（d、l）、胚軸と根（e）の境界および側根の境界領域（f）の成熟植物でのプロモーター活性。 g、m、根におけるISH1（g）およびISH2（m）の過剰産生mRFP融合タンパク質の核局在化。スケールバーは100μm（a、h）、 200μm（b、d、e、f、i、j、l、m）、及び 2mm（c、k）である。酵母ツーハイブリッドアッセイの結果によれば、ISH1とISH2の相互作用が認められなかった（n, o）。
【図９】ISH1とISH2により制御される標的遺伝子を示す。a、マイクロアレイ実験の主成分分析。赤色、ISH1＆2-ind：青色、ISH1-ind：緑色、ISH2-ind：黒、コントロール植物。淡色はエストラジオール誘導のない試料のデータを示す。 b、胚形成および分裂組織発生に関与する遺伝子の発現：PR21、LBD29、WUS、STM、およびAGL15。 c、ISH1およびISH2の個々の誘導による植物発生中のアップレギュレートされた遺伝子の発現マップ。 d、ISH1およびISH2の個々の誘導による植物発生中のダウンレギュレートされた遺伝子の発現マップ。
【図１０】ISH1ホモログAt2g02540を単独で誘導したAt2g02540-indの表現型。根の一部でISH1&2-indと同様に地上部様器官が誘導されていることが確認できる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、夫々、以下のＤＮＡ（Ａ）及びＤＮＡ（Ｂ）にコードされる２つの転写因子（TF）から成る群から選択される、植物体の根における地上部様器官の形成因子に係る：
ＤＮＡ（Ａ）：
（１）転写因子ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX PROTEIN 25（ATHB25、At5g65410）をコードする配列番号：１で表される塩基配列からなるＤＮＡ又はそのホモログ；
（２）上記（１）のＤＮＡ又はそのホモログと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は
（３）上記（１）のＤＮＡ又はそのホモログと８０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、前記転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
ＤＮＡ（Ｂ）：
（４）B3ファミリー転写因子REPRODUCTIVE MERISTEM 7（REM7、At3g18960）をコードする配列番号：２で表される塩基配列からなるＤＮＡ又はそのホモログ；
（５）上記（４）のＤＮＡ又はそのホモログと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は
（６）上記（４）のＤＮＡ又はそのホモログと８０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、前記転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１４】
ここで、「ホモログ」とは、共通の祖先をもち、実質的に同じアミノ酸配列及び機能を有するタンパク質又はそれをコードするＤＮＡを意味し、特に、オーソロジー（種分岐相同性）を意味する。該形成因子は、上記２つの転写因子の双方、又は、その一方、例えば、ＤＮＡ（Ａ）にコードされる転写因子のみでも良い。
【００１５】
本明細書に於いて、「地上部様器官」とは「茎様器官」とも呼ばれ、根に於いて人工的及び異所的に形成された、茎等の本来は地上に現れる植物体の器官を意味する。また、植物体の種類及び用途等になどに特に制限はなく、単子葉植物及び双子葉植物等が含まれる。
【００１６】
該器官は以下に挙げる特性の少なくとも一つによって特徴づけられる：
（１）各側根の付け根の領域および主根の新生誘導部分に緑化地上部様器官が形成される；
（２）重力屈性異常；
（３）クロロフィル含有量の増加；及び
（４）維管束構造における、維管束細胞の数の増加、大きさの増大、又は葉緑体の生成。
【００１７】
本明細書の実施例で示されるように、地上部様器官に於いては、WUSCHEL (WUS), SHOOT MERISTEMLESS (STM), およびAGAMOUS-LIKE 15 (AGL15)等の約７００個以上のSAM特異的遺伝子の発現が１０倍以上の上方制御（促進）され、一方で、元々、根で発現されている約４０個以上の遺伝子が１０倍以上の下方制御（抑制）されていることを特徴とする。
【００１８】
配列番号：１〜３等に記載されたＤＮＡ又はそれらのホモログは当業者に公知の任意の方法、例えば、本明細書の実施例に示すような、公的機関の遺伝子ライブラリーから入手可能なｃＤＮＡクローンに基づき、適当なプライマーを用いるＰＣＲにより容易に調製することが出来る。
【００１９】
ハイブリダイゼーションは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、又は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｎｇ  ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００２０】
本明細書において、ハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」の具体的な条件とは、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  塩
化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．２）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’s）溶
液、０．１％  ＳＤＳ、１０％  デキストラン硫酸及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子
ＤＮＡで４２℃インキュベーションした後、フィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄
することを例示することができる。
【００２１】
従って、配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列を含むＤＮＡ又はそれらのホモログと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との同一性の程度が、全体の平均で、約８０％以上、好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることができる。
【００２２】
２つの塩基配列における配列同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位における塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じ塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列同一性は、配列間での同一である部位数の全部位数に対する百分率で示される。
【００２３】
上記の原理に従い、２つの塩基配列における配列同一性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７、１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムやＦＡＳＴＡプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００２４】
本発明に於ける、転写因子（TF）をコードするＤＮＡ（Ａ）及びＤＮＡ（Ｂ）には、該転写因子のアミノ酸配列をコードする領域のみから成る塩基配列（即ち、エクソン部分のみが結合された塩基配列）からなるｃＤＮＡの他に、染色体由来のＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、及び、当業者に公知の任意の方法によって化学合成されたＤＮＡも含まれる。
【００２５】
本発明はまた、上記のＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）を含む、植物体の根における地上部様器官の形成用のベクターに係る。
【００２６】
本発明のベクターは、植物体に導入され、得られた形質転換植物体の根に於いて、ＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）の発現が誘導され、該形質転換植物体の根に地上部様器官を形成することが出来る機能を有している限り、その構造・形態及び種類等に、特に、制限はない。例えば、プラスミド及び上記ＤＮＡ分子自体等の形態を用いることかできる。
【００２７】
上記ベクターには、その作製方法及び導入方法、ＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）の発現方法、及び形質転換体の選択方法などに応じて、上記遺伝子以外に当業者に公知の任意の要素が含まれている。
【００２８】
例えば、ベクターに含まれる得る選択マーカー遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン及びスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子、並びに、植物の利用できない炭素源を資化したり解毒できる遺伝子を挙げることが出来る。また、ベクターは、導入された植物体機能する各種のプロモーター及びその他の制御配列（例えば、オペレーター配列、レプレッサー配列、トランスドメイン配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）、さらに、目的とするＤＮＡを挿入するためのマルチクローニングを含むことが望ましい。
【００２９】
更に、該ベクターにおいては、適当な程度（発現量）でＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）が発現誘導されるように、これらＤＮＡの発現が当業者に公知の適当な誘導系で制御されていることが好ましい。例えば、後述するエストラジオール誘導系で制御されるような構造を有している場合には、大腸菌SOS レギュロンのLexAオペレーター、並びに、そのリプレッサーLexAのDNA結合ドメイン（X）、単純ヘルペスウィルスHSV由来のVP16の酸性トランス活性化ドメイン（V）およびヒトエストロゲン受容体の調節領域（Ｅ）からなるキメラ転写活性化因子（XVE）が含まれる。特に、一つのベクターにＤＮＡ（Ａ）及びＤＮＡ（Ｂ）が共に含まれている場合には、XVEのオペレーターが夫々のＤＮＡの上流に連結されていることが好ましい。
【００３０】
更に、好適例として、例えば、本明細の実施例にされているように、ゲートウェイクローニングによりベクターを構築した場合には、それに必要な「ゲートウェイカセット」等の各要素、ベクターをアグロバクテリウム法を使用して導入法する場合には、そのバイナリーベクターに必要な境界配列であるRB及びLB等が含まれる。
【００３１】
本発明のベクターは、本明細書の実施例に詳細に記載されているように、当業者に公知の適当な遺伝子工学的な手段を用いて、上記のＤＮＡ及びその他の植物体の根における地上部様器官の形成に必要な各要素をベクター内に連結することにより構築することができる。
【００３２】
例えば、ベクターの構築法の好適例として、当業者に公知のゲートウェイクローニング技術及び既に述べた固相DNA連続連結（PRESSO）法を挙げることが出来る。PRESSO法は、（１）ビオチン化標識したリンカーDNAをビーズに固定する、（２）リンカーDNAにDNAを連続して連結させる、（３）ベクターを結合させてセルフライゲーションする、の３つの過程からなる方法である。
【００３３】
本発明は更に、植物体の根に地上部様器官を形成させる方法であって、本発明のベクターを該植物体に導入する工程、得られた形質転換体を選択する工程、並びに、形質転換植物体の根においてＤＮＡ（Ａ）及びＤＮＡ（Ｂ）の発現を特異的に誘導して該形質転換植物体の根に地上部様器官を形成させる工程、を含む前記方法に係る。
【００３４】
ベクターの該植物体への導入及び形質転換法としては、植物体の種類等に応じて、アグロバクテリウム法、パーティクル・ガン法、ウィスカー法等の当業者に公知の任意の方法を挙げることが出来る。
【００３５】
アグロバクテリウム法はAgrobacterium tumefaciens（正式名称 Rhizobium radiobacter）に含まれるTiプラスミドを利用する方法であり、特に、その経済性及び簡便さの点で他の方法に比べて優れている。目的遺伝子（T-DNA）は植物の核ゲノムに１〜２コピー程度の低コピー数で導入されることが多い。アグロバクテリウム法には中間ベクター法とバイナリーベクター法(binary vector)があり、現在はバイナリー・ベクター法が主流である。
【００３６】
バイナリー・ベクター法では、本来のT-DNAを欠損したが、vir領域という、T-DNAを植物ゲノムに導入するために必要な遺伝子群を保持したままのvir helper Ti plasmidとそれを保持するA. tumefaciensの菌株が開発された。A. tumefaciensの染色体上にも植物への遺伝子導入に必要とされる遺伝子群(chv genes: chromosomal virulence genes)が存在するために、更にTi plasmidの宿主としてもA. tumefaciensはアグロバクテリウム法において必要とされる。T-DNAの両末端にはRB(right border:右境界配列)とLB(left border:左境界配列)という短い配列が存在している。RBとLBに挟まれた配列が植物に導入され、その間の配列には特異性がない。そこで、植物に導入したい遺伝子や形質転換植物を選択するための選択マーカー遺伝子をRBとLBに挟みこめば、任意の人工のT-DNAを構築できる。vir領域とT-DNAとの作用関係はトランスであり、両者が同一のプラスミド上に存在している必要が無い。そこで、操作しやすい小型のシャトル・ベクターに人工のT-DNAを付与したT-DNAプラスミド（バイナリー・ベクター）を大腸菌等の内で増幅させ、その後、vir helper Ti plasmidとそれを保持するA. tumefaciensの菌株へ導入し、こうして得られたA. tumefaciensを植物に感染させる。
【００３７】
本発明方法に於いて該ベクターによって形質転換された植物体は、該ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の種類に応じた方法で適宜選択することが出来る。例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む場合には、ハイグロマイシンを含む培地を用いて、適当な条件下で植物を栽培することによって形質転換植物体を容易に選択することが出来る。
【００３８】
その後、該形質転換植物体の根においてＤＮＡ（Ａ）及び／又はＤＮＡ（Ｂ）の発現を特異的に誘導して地上部様器官を形成させる。このような導入されたＤＮＡ（遺伝子）の発現の誘導系としては、当業者に公知の任意の方法、例えば、トランス転写因子とシスエレメントが関与し、外部から作用させる化合物によって化合物によって遺伝子発現を制御する系（化学的誘導系）が知られている。その一例として、エストラジオール誘導系、テトラサイクリン誘導系及びデキサメタゾン系などを挙げることが出来る。これらの誘導系を使用する場合には、夫々、適当な条件下で、適当量のエストラジオール、テトラサイクリン、又はデキサメタゾンを添加した培地上で該形質転換植物体を生育させることによって、その根においてＤＮＡ（Ａ）及びＤＮＡ（Ｂ）の発現を適当な程度で（即ち、「過剰発現にはならない程度」）特異的に誘導させることが出来る。
【００３９】
更に、植物体の根においてＤＮＡ（Ａ）及び／又ＤＮＡ（Ｂ）の発現を特異的に誘導する際に、6-ベンジルアミノプリン（BA）等のサイトカイニンで処理することによって、ISH1＆2-indの根緑化表現型が増強することが出来る。サイトカイニン処理を行うことによって、ＤＮＡ（Ａ）のみを誘導させた植物、すなわちISH1-indの根緑化表現型をもたらすこともできる。サイトカイニンによる処理は、当業者に公知の任意の方法、例えば、培地に該サイトカイニンを含有させること等の手段で行うことが出来る。
【００４０】
本発明は更に、根に地上部様器官が形成されていることを特徴とする、形質転換植物体に係る。このような形質転換植物体は、例えば、上記の本発明方法によって作製することが出来る。該形質転換植物体は、その地上部様器官が以下に挙げる特性の少なくとも一つを有しており、それらによって特徴づけられる：
（１）各側根の付け根の領域および主根の新生誘導部分に緑化地上部様器官が形成される；
（２）重力屈性異常；
（３）クロロフィル含有量の増加；及び
（４）維管束構造における、維管束細胞の数の増加及び大きさの増大、又は葉緑体の生成。
【００４１】
以下、実施例に則して本発明を詳述する。尚、該実施例は本発明の一態様にすぎず、本発明の技術的範囲はこれら実施例の記載によって制限されるものではなく、本明細書全体の記載、本明細書に引用された参考文献等の記載内容、及び、当該技術分野における技術常識等によって判断される。
【００４２】
尚、本明細書に特に記載がない場合には、実施例等に於ける各種条件・手段・手法等は当該技術分野における技術常識に従って当業者が適宜設定し実施することが出来る。
【実施例】
【００４３】
［実験の概要と結果］
まず、これまでにバイオインフォマティクス分析を用いて選択されたSAM特異的TFをコードする９つのシロイヌナズナ遺伝子に焦点を当て、これらの９つの遺伝子をシロイヌナズナに導入した（図４）。 
【００４４】
具体的には、PRESSO法およびMultiSite Gateway Cloning（ThermoFisher Scientific、http：//www.thermofisher.com）法を用いて選択した、SAM特異的転写因子をコードする９つのcDNAを、ターミネーター/ LexAオペレーター/ミニプロモーター（TOP）と共に連結した（図４a）。これらのクローニングされたcDNAは、以下のアルファベットA〜Iを有する黄色のボックスで示されている。 A: HOMEOBOX LEUCINE ZIPPER PROTEIN3 (HAT3, At3g60390), B: UBIQUITIN CARRIER PROTEIN 1 (UBC1, At1g14400), C: HOMEOBOX PROTEIN 28, ZINC-FINGER HOMEODOMAIN 7 (AtHB28, ZHD7, At3g50890), D: ABNORMAL FLORAL ORGANS, FILAMENTOUS FLOWER, YABBY1 (AFO, FIL, YAB1, At2g45190), E: HOMEOBOX PROTEIN 33, ZINC-FINGER HOMOEDOMAIN 5 (HB33, ZHD5, At1g75240), F: AT-HOOK MOTIF NUCLEAR LOCALIZED PROTEIN 11 (AHL11, At3g61310), G: POLAR LOCALIZATION DURING ASYMMETRIC DIVISION AND REDISTRIBUTION (POLAR, At4g31805), H: HOMEOBOX PROTEIN 25, ZINC-FINGER HOMOEDOMAIN 1, ZINC-FINGER HOMOEDOMAIN 2 (ATHB25, HB25, ZHD1, ZFHD2, At5g65410) and I: AP2/B3-like transcription factor family protein, REPRODUCTIVE MERISTEM 7 (REM7, At3g18960)。 3組の連結カセットA〜E、F-G、およびH-1遺伝子をattB部位（ピンクボックス）にクローニングした。各cDNAをLexAオペレーター（緑三角）の下流につなぎ、エストラジオール処理で誘導可能とした（図４b）。細菌クローンおよび植物形質転換体を抗生物質、スペクチノマイシン（暗緑色）およびハイグロマイシン（青色）でそれぞれ選択した。植物形質転換用の配列、右ボーダー（RB）と左ボーダー（LB）は黒い四角で示している。コンストラクトに用いた9遺伝子の組織特異的発現をヒートマップとして示した（図４ｃ）。尚、このヒートマップは、公的データベースで公開されているシロイヌナズナの発生過程における発現データ（受託番号E-TABM-17）に基づいて描かれた。
【００４５】
この実験により、９つのTF遺伝子の異所性の共誘導が、根の一部に緑化したISOが形成されたことを示された（図５）。興味深いことに、誘導中に根端分裂組織（RM）でISOが形成し、RMがSAM様細胞を産生したことを示唆している。即ち、ISOの形成が根分裂組織（RM）で起こったことは注目に値する（図５b）。 SAM特異的TFは、RMをSAM様分裂組織に転換した。通常、SAM（S）またはRM（R）細胞は娘細胞（S 'およびR'）を産生し、娘S 'およびR'細胞はそれぞれシュートと根になる細胞に分裂する（図５ c）。 S細胞とR細胞がそれぞれ上下に押し上げられ、子孫細胞は、細胞特性に基づいて上方または下方に伸長する。対照的に、ISH1およびISH2の共誘導によって、R細胞はR '細胞の代わりにS'娘細胞を作り出す（図５d）。 S '細胞はS細胞として挙動し、R細胞を押し上げる。誘導が終了すると、R細胞は再びR '細胞を再生し、その後、新しい子孫細胞はR細胞を押し下げ、再び下方に伸長する。この仮想モデルによって、根でのISO形成中に何が起こっているかを説明することができる。
【００４６】
ISO形成に不可欠な遺伝子を同定するために、各遺伝子を組み合わせた一連の構築物が導入され、シロイヌナズナの根で誘導された（図６cおよびd）。その結果、２つの転写因子、ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX PROTEIN 25（ATHB25、At5g65410）10およびB3ファミリー転写因子REPRODUCTIVE MERISTEM 7（REM7、At3g18960）11の共発現する20系統の80％に於いて、上記の９つの転写因子の遺伝子の共発現と同様に、シロイヌナズナの根に於いてISOs形成が誘導されることを見出した（図１および図６eおよびf）。我々は、これらの転写因子をそれぞれ、Induction of Shoot 1（ISH1）（ISH1：ATHB25、At5g65410）およびInduction of Shoot 2（ISH2：REM7、At3g18960）と名付けた。 以下、本明細書中では、夫々、単に「ISH1」及び「ISH2」と表記された場合でも、これら転写因子のホモログも含まれている。
【００４７】
これらの転写因子をコードするヌクレオチド（塩基）及びそのホモログの具体例（配列番号１〜配列番号３）を表１〜３に示す。
【００４８】
【表１】
2019050760.tif 000003
【００４９】
【表２】
2019050760.tif 000004
【００５０】
【表３】
2019050760.tif 000005
【００５１】
尚、従来技術に於いては、ISH1およびISH2は双方とも植物発生において機能的に特徴付けられていなかった。
【００５２】
夫々、ISH1又はISH2を単独誘導発現された植物体（ISH1-ind、ISH2-ind）、及び、ISH1とISH2が共誘導発現された植物体（ISH1＆2-ind）を有する7日目の植物を、1μMのBAありまたはなしでビタミンおよび5μMのエストラジオールを含有する1 / 2MS−1％ショ糖プレート上に移植し、さらに10日間育てた。その結果を図７aに示す。赤い矢印はISOを示している。サイトカイニンなし（左パネル）では、ISOはISH1＆2-ind植物の根でのみ観察された。一方、サイトカイニン処理区（右パネル）では、ISH1-indは、ISH1＆2-ind植物のそれに見られるように根でISOを形成した。また、サイトカイニン処理は、ISH1＆2-ind植物におけるISOの形成を増強した。
【００５３】
（ISH1＆2-ind）では、各側根（lateral root）の付け根の領域および主根（main root）の新生誘導部分(nascent-induced part)（図1および図７）に緑化ISOが形成された。 ISOでは、細胞分裂の高い活性および組織の肥大が観察された（図１c、g）。 ISOは表皮に根毛がないが、ISOの隣接する新生誘導部分には根毛を増加していた。 ISH1＆2-ind植物は根が短く、重力屈性異常の表現型も示した（図１h、及び図５）。 ISH1＆2-ind植物は、茎頂中にアントシアニンの蓄積を伴うわずかな矮小化を示した。 対照的に、ISH1又はISH2の単一遺伝子が誘導発現された植物体（それぞれ、「ISH1-ind」または「ISH2-ind」）によっては、ISH1＆2-indに見られるような可視表現型の明白な変化を引き起こさなかった（図1dおよびe、および図７）。 以上のことから、少なくともサイトカイニン処理をしない場合には、ISH1とISH2の両方がISOの形成に必要であると判断した。
【００５４】
更に、同様の方法で、ISH1ホモログAt2g02540を単独で誘導したAt2g02540-indに於いては、サイトカイニン処理をしなくとも、根の一部でISH1&2-indと同様に地上部様器官が誘導されていることが確認できた（図１０）。
【００５５】
ISOは緑色器官である。色素の状態を特徴付けるために、ISOのクロロフィル含有量を測定し結果、ISH1＆2によって誘導されたISOではクロロフィル含有量が増加することが示された（図１j）。以前の研究では、植物ホルモンであるサイトカイニンが根の緑化を誘導することが報告されている12ので、サイトカイニンがISO形成を増強する可能性があると考えられた。 上記のように、サイトカイニン処理では、ISH1＆2-indの根緑化表現型が増強された（図１1）。さらに、サイトカイニンが単一のISH1-ind植物の根の緑化も誘導することを見出した（図１kおよび図７）。 即ち、ISH1自体には、特定の条件下でISOを独自に作成する能力があることが判明した。サイトカイニンを適用することによって、ISH2の作用を補償し得る。しかしながら、サイトカイニンは、単一のISH1-indよりもむしろISH1＆2-ind植物の緑化を強く促進するので、サイトカイニンシグナルは、ISH1およびISH2活性からの独立した更なる経路であると考えられる。
【００５６】
尚、「重力屈性」とは、植物が示す屈性のうち、重力方向に対して示す屈性であり、植物ホルモンのオーキシンが重力に従って下方に移動するので、発芽した植物体を横に置くと、芽では茎の下側が伸長促進されて起き上がり、根では下側が伸長阻害を受けて地中方向へ伸長する。
【００５７】
根にISH1とISH2が共発現誘導されてISOが形成されたことは、RMがSAMに変化されたことを示唆する。これは、ISH1およびISH2が植物の初期発生において重要な役割を果たし、ISH1およびISH2の過剰発現がSAMの共起発生（ordinal development）を阻害するのではないか、という仮説が立てられた。初期の発達段階でのISH1とISH2の機能を解析するために、ISH1またはISH2を過剰生産する植物（それぞれISH1-oxおよびISH2-ox）も作製した。いずれの ISHを過剰発現する植物も異常な表現型を示さなかった。しかし、ISH1-oxとISH2-oxを交配すると、カップ型子葉（cuc）突然変異体14（図1i）に見られるように、F1系統（ISH1＆2-ox）では子葉の分離に於ける欠陥が観察された。 ISH1＆2-oxは、葉や根の発達などの次の段階が上手く行かなかったために致死的であった。 ISH1およびISH2の両者の異所的過剰発現は、SAM形成における異常な表現型を引き起こした。このようなcuc様表現型は、ISH1およびISH2機能の微調整がSAM形成において重要な役割を果たすことを示している。
【００５８】
次に、ISOの維管束表現型を調べ、その構造の詳細をさらに特徴づけた。 ISH1＆2共誘導により、根に肥大した器官（thickened organ）のISOが生成された。組織学的アッセイでは、維管束の肥大および構造変化がISOで観察された（図２）。ISOでは、維管束細胞、特に木部導管細胞の数は増加し、維管束細胞の大きさが増大した。 ISOの肥大と構造の変化は、細胞分裂と細胞拡張の両方によって引き起こされた。 ISH1＆2共誘導はまた、維管束内に葉緑体を生成した（図２）。このように、ISH1＆2の共誘導発現は、ISOにおいて地上部様維束管構造を生じた。対照的に、各単一遺伝子ISH1またはISH2の誘導発現では、維管束構造を変化させなかった。 ISH1-indまたはISH2-ind植物のいずれも、正常な木部構造を示し、維管束には葉緑体は生じなかった。
【００５９】
以上のことから、ISH1及びISH2の共誘導発現によって、根がＩＳＯに変化し、それは、負の重力屈性を示し、地上部様維管束組織を有する光合成器官を生成することが示された。 いくつかの証拠は、これら２つのTFのみを操作することによって根を茎に変え得ることを実証した。 
【００６０】
このように、ISH1及びISH2はISO形成に必要な転写因子であることが判明した。そこで、これらのISH1とISH2が植物発生段階で直接的にまたは間接的に協力するかどうかを検証した。まず、両方の遺伝子の発現パターンを明らかにするために、ISH1およびISH2プロモーター：GUSレポーターを有する植物を作製し、GUSレポーターアッセイを行った。その結果、ISH1とISH2はもともと異なる組織で発現していることが確認された。即ち、 ISH1は、胚の地上部と根の境界および、幼苗と成熟植物のSAM周辺で検出された（図８ a-f）。 ISH1はまた、地上部と根の境界領域、葉原基、および側根など、異なる組織間の境界における維管束で発現していた。対照的に、ISH2の発現は胚では観察できなかった（図８ h-j）。  ISH2は、幼苗および成熟植物のSAM周辺の葉脈で検出された（図８ kおよびl）。
【００６１】
次に、ISH1およびISH2相互作用を調べるために、酵母ツーハイブリッドアッセイを行った。即ち、U、W、Lアミノ酸を含まないSC（Synthetic Complete）液体培地中で、ISH1-またはISH2-ベイトおよびプレイプラスミドを含むクローン化形質転換酵母細胞（L40）を30℃で3日間培養した（図８ n）。 次いで、細胞を、U、W、LおよびHを含まないが1.5mMの3-アミノトリアゾール（3-AT）を含むSC培地プレートに移し、22℃で1週間増殖させた（図８ o）。しかし、ISH1とISH2タンパク質との間の相互作用は、酵母による実験では観察されなかった（図８ nおよびo）。
【００６２】
ISH1とISH2の両方の細胞内局在を調べるために、35SΩ：mRFP：ISH1またはISH2を野生型植物に導入した。 ISH1：mRFPおよびISH2：mRFPタンパク質の両方が核内で検出され、転写因子としてのアノテーションと矛盾がないことが確認された（図８ gおよびm）。
【００６３】
以上の結果から、両方の遺伝子は共に維管束の発達において重要な役割を果たすが、植物発生過程の異なる組織および段階で機能することを示唆された。即ち、ISH1およびISH2は核内で独立的に機能しており、植物発生過程において互いに相互作用してはいないものと思われる。
【００６４】
次に、ISH1およびISH2の標的遺伝子を発見するために、我々はDNAマイクロアレイ実験を行い、エストラジオール誘発の有無に於いて、コントロール、ISH1-ind、ISH2-indおよびISH1＆2-ind植物から遺伝子発現データを得た。ISH1-ind、ISH2-indおよびISH1＆2-ind植物に於いて、夫々、合計776個、159個および886個の遺伝子が10倍上方制御（アップレギュレート）され、45個,47個および167個の遺伝子がそれぞれ10倍下方制御（ダウンレギュレート）された。ISH1＆2-ind植物に於いて10倍制御された遺伝子の多くは、ISH1-ind植物またはISH2-ind植物のいずれにおいても制御されなかった（図３a、bおよび図９）。 ISH1＆2-ind植物は、上方制御された886個の遺伝子のうち531個、および下方制御された167個の遺伝子のうち156個を特異的に制御した。以上の結果は、ISH1＆2-ind植物で制御される遺伝子は、単一のISH1-indおよびISH2-ind植物で制御される遺伝子を単にオーバーラップさせることによっては説明されないことを示している。
【００６５】
サンプル間の類似性および相違点を視覚的に評価し、サンプルをグループ化できるかどうかを判断する数学的アルゴリズムである主成分分析（PCA）は、ISH1&2-indの遺伝子発現パターンがISH1-indまたはISH2-indとは異なることを示した（図９ a）。 PCAでは、コントロールおよびエストラジオール処理をしていない植物からのデータを同じクラスターグループとして視覚化した。しかし、ISH1-ind、ISH2-ind、およびISH1＆2-indデータの成分は、異なるグループとして分類された。PCAによっても、ISH1＆2-ind植物で制御される遺伝子が、単一のISH1-indおよびISH2-ind植物のものと部分的に重複しているが、単一のISH1-indおよびISH2-ind植物で制御される遺伝子を重ね合わせることによって単純に説明されていないことが確認された。
【００６６】
更に、ISH1-indまたはISH2-ind植物におけて10倍以上変動のあった遺伝子群の元来の発現パターンをヒートマップとして示した（図９ cおよびd）。アップレギュレートされた遺伝子のいくつかはもともと地上部で発現しており、ダウンレギュレートされた遺伝子のいくつかは根で発現していた。特に、ISH2によってダウンレギュレートされた遺伝子群の多くは、根特異的遺伝子として知られていた。しかし、ISH1＆2-ind植物（図３c）のデータと比較して、単一のISH1およびISH2誘導の効果は限定的であった。
【００６７】
以上の結果から、ISH1とISH2との２つの転写因子の共誘導発現による効果は、夫々の転写因子が個別に発現した際の効果（遺伝子の制御）の単なる相加作用ではなく、それら個別の効果からは予見しがたい顕著な相乗効果であることが確認された。
【００６８】
ISH1＆2-ind植物で制御されている標的遺伝子が本来発現している器官を探索するために、植物発生中の標的遺伝子の発現パターンを、公開データベース15からダウンロードしたデータを用いてバイオインフォマティックに分析した。 ISH1＆2-ind植物の上方制御された遺伝子は、主に芽で発現され、下方制御された遺伝子の発現は本来は根で観察されるものであった（図３c）。 特に、ISH1と2の共誘導は、SAMの形成に重要な役割を果たすSAM特異的遺伝子WUS、STM、およびAGL15の発現を促進した（図９ b）。 この事実は、ISH1とISH2の共誘導がSAMを生成し、根を茎に変えることができることを示している。 このように、ISOに於ける遺伝子発現プロファイルが根のパターンから芽のパターンに変化したことが確認された。
【００６９】
更に、ISH1およびISH2によって制御されている生物学的過程を探索するために、遺伝子オントロジー（GO）分析を行った（表４〜表６）。尚、GO解析は、10倍以上変動が見られた遺伝子群についてGene Ontology ConsortiumウェブサイトのAmiGo2（http://amigo.geneontology.org/amigo）を使用して行った。ISH1-ind、ISH2-ind、ISH1&2-ind植物について１０倍の閾値で表を作成した。
【００７０】
【表４】
2019050760.tif 000006
【００７１】
【表５】
2019050760.tif 000007
【００７２】
【表６】
2019050760.tif 000008
【００７３】
上記の表から明らかなように、「ビタミン代謝プロセス（GO：0030656）の制御」、「花弁表皮パターニング（GO：0080172）」、「L-アスコルビン酸生合成プロセス（GO：2000082）」の制御は、 ISH1＆2の誘導によってアップレギュレートされていた。これらのカテゴリーは、化学反応の調節およびビタミンの生合成プロセス、または細胞の協調的成長および空間配置に関連している。光合成で一般的に合成されるオルニチン酸、リンゴ酸、クチン、tRNA、カーボーンなどの様々な二次代謝産物の応答、輸送、生合成の制御もISH1＆2-indで誘導されていた。 ISH1＆2-ind植物でダウンレギュレートされた遺伝子は、「脂肪酸に対する応答（GO：0071398およびGO：0070542）」、「ADP-リボシル化（GO：0006471）」、「発生プログラム細胞死（GO：0010623） 「DNA代謝（GO：0051103、GO：0006273およびGO：0006266）」に関与している群であった。これらのカテゴリーは、組織の細胞分裂および肥大に高い活性を示したISH1＆2-ind植物の表現型と関連している可能性がある。ISH1およびISH2の共誘導は、光合成および細胞増殖の調節に関わる多様な生物学的プロセスを広く制御しているものと考えられる。
【００７４】
一方、「低酸素応答（GO：0071456およびGO：0001666）」または「酸素レベルに対する応答（GO：0071453、GO：0036294、GO：0070482およびGO：0036293）」のような低酸素に対する応答は、各単一遺伝子ISH1またはISH2の誘導によってアップレギュレートされていた。これらカテゴリーは、ISH1＆2-indのものと互いに重なり合い、共通していた。そのほかのISH1およびISH2（ISH1および2-ind）の共誘導において検出されたカテゴリーの多くは、個々のISHを誘導した際には検出されなかった。 
【００７５】
［ISH1遺伝子及びそのパラログの予想される機能］
ISH1遺伝子は、ジンクフィンガーホメオドメインタンパク質 [HOMEOBOX PROTEIN 25（ATHB25）、ジンクフィンガーホメオドメイン1（ZHD1）、ジンクフィンガーホメオドメイン2（ZFHD2）]（図１、図６e）をコードしている。以前の研究では、ISH1の過剰発現が、ジベレリン（GA）生合成酵素をコードするジベレリン酸3-オキシダーゼ2の発現を誘導し、GA1およびGA4のレベルを増加させることが報告され、ISH1は、種子の寿命に関するジベレリン合成において役割を果たしていると考えられていた。シロイヌナズナには、推定ジンクフィンガーおよびホメオドメインを示すZHDファミリーに属するジンクフィンガーホメオボックスタンパク質が14個存在する。パラログの一つATHB22 [At4g24660、MATERNAL EFFECT EMBRYO ARREST 68（MEE68）、ZINC FINGER HOMEODOMAIN2（ZHD2）]は、種子休眠終了の胚発生を制御し、ジベレリン合成においてISH1と協調的に働くことが知られている。二重変異体athb25およびathb22は、ジベレリン含量を減少させると報告されている。 ATHB21 [At2g02540、ジンクフィンガーホメオドメイン3（ZHD3）、ジンクフィンガーホメオドメイン4（ZFHD4）]およびATHB31 [At1g14440、ジンクフィンガーホメオドメイン4（ZHD4）、メリステムでの花成形成2（FTM2）]もISH1と類似した構造を持っている。 ATHB21は維管束細胞で発現しているが、分子機能は不明である。 ATHB31は、光周性花成を制御して、栄養成長から生殖成長への移行中に茎頂分裂組織を制御すると考えられている。他のパラログ、ATHB33 [At1g75240、HOMEOBOX PROTON 33（ATHB33）、ZINC-フィンガーホメオドメイン5（ZHD5）]およびATHB29 [At1g69600、ジンクフィンガーホメオドメイン11（ZHD11）、ジンクフィンガーホメオドメイン1（ZFHD1）は、アブシジン酸活性化シグナル伝達経路や感想ストレス応答に関与していると考えられている。しかしながら、ZHDファミリーの機能についてはほとんど知られていない。シロイヌナズナには約100個のホメオボックス遺伝子があり、その多くは様々な発生過程において重要な役割を果たすことが示されている。ジンクフィンガーを含まない他のクラスのホメオボックスタンパク質、SHOOT MERISTEMLESSおよびKNOTTED-LIKE HOMEOBOXなどのクラスIノックス遺伝子、STIMPY / WOX9およびWUSCHELなどのHD含有遺伝子のWOXクラス、およびPHAVOLUTAなどのクラスIII HD-Leuジッパータンパク質、PHABULOSA、REVOLUTA、ATHB8およびATHB15 / CNAは、胚、維管束、SAM、葉または花の発生分化を制御している。このように多くのホメオボックスタンパク質が植物発生の様々な局面に大きく寄与しているので、ZHDファミリーもまた、植物発生の局面での調節因子である可能性が推察される。
【００７６】
［ISH2遺伝子及びそのパラログの予想される機能］
ISH2（At3g18960）は、AP2 / B3転写因子のサブグループであるREM（Reproductive Meristem）遺伝子ファミリーに属するREM7遺伝子である（図１および拡張データ図６f）。 ISH2とREM8（At4g01580）はおよそ90％の高い類似性を示す（209アミノ酸のうち187個）。 REMファミリーは、分裂組織において発現し、クロマチン構造の制御に関与していると考えられているが、REMファミリーの分子機能は明らかではない。おそらく、これらのパラログのいくつかは、植物の発生および分化に影響を及ぼすと考えられる。例えば、B3ドメインタンパク質のVAL1 / HSI2（At2g30470）およびVAL2 / HSI1（At4g32010）は、幹細胞の維持または細胞分化において重要な役割を果たす。
【００７７】
［実験の方法及び材料］
バイオインフォマティクス
ConfeitoとATTED IIの分析は、Cop：Co-expressed biological processes（http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/）17とATTED II（http://atted.jp ）である18。
【００７８】
材料
RIKENシロイヌナズナ完全長cDNAクローンを理化学研究所バイオリソースセンター（www.brc.riken.jp）19から入手した。 At1g14440、At1g75240、At2g45190、At3g18960、At3g50890、At3g60390、At3g61310、At4g31805およびAt5g65410についてのcDNAは、夫々、ID番号（寄託番号）：RAFL09-75-E05、RAFL16-33-K14、RAFL16-22-D15、RAFL21-04-N20、RAFL22-13-N07、RAFL09-45-G03、RAFL07-16-A05、RAFL14-02-E14およびRAFL09-18-O11が付され、寄託されている。 ゲートウェイベクターと化学的誘導ベクターpER8は、中川剛教授（島根大学）20、光田のぶたか博士（AIST、日本）21、およびChua Nam-Hai教授（米国ロックフェラー大学）22から、 それぞれ、提供された。
【００７９】
植物材料と成長
シロイヌナズナ生物資源センター（ABRC、オハイオ州立大学、https://abrc.osu.edu）23から入手可能なシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）種生態型コロンビア（Columbia）を使用した。バイナリーベクター上の構築物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（更新された学名： Rhizobium radiobacter）ＥＨＡ１０５24を用いてシロイヌナズナに導入した。適切な抗生物質（25μg/ Lカナマイシンまたは20μg/ Lハイグロマイシン）を含む1％スクロース（pH5.7）を含有する1/2 Murashige-Skoog（MS）-1％フィトアガー培地上でＴ１形質転換体を選択した。 ISH1＆2-ox植物は、人工的な交配から作った。種子を70％エタノールすすぎで表面滅菌し、直ちに33％漂白剤で5分間すすぎ、次いで滅菌水で2回洗浄した。その後、種子を無菌的に抗生物質を含有する1 / 2MSプレートに播種し、続いて4℃で3〜4日間暗所で吸水（浸出）させた。幼植物（苗）を22℃で一定の光条件下、または40μmol/ m-2/秒-1の冷白色蛍光灯の16時間明/ 10時間暗サイクル下で7日間生育させ、次いで抗生物質耐性幼植物を化学的誘導のための1〜10μMエストラジオールおよびサイトカイニン処置のための1μM 6-ベンジルアデニン（BA）を有するが、抗生物質を含まない1/2 MS-1.2％フィタゲルまたは1％フィトアガープレートに移した。
【００８０】
因みに、シロイヌナズナは、ユーラシア大陸から北アフリカ大陸原産の越年草である。日本においては帰化植物で、北海道から九州の海岸や低地の草地に分布する。2000年12月に植物としては初めて全ゲノム解読が終了した。ゲノムサイズは1.3億塩基対、遺伝子数は約2万6000個と顕花植物では最小の部類に入る。染色体は5対である。
【００８１】
シロイヌナズナはゲノムサイズが小さいこと、一世代が約2ヶ月と短いこと、室内で容易に栽培できること、多数の種子がとれること、自家不和合性を持たないこと、形質転換が容易であることなど、モデル生物としての利点を多く備えているため、研究材料として利用しやすい。多くの変異系統が維持されている。
【００８２】
プラスミド構築
複数のＴＦ遺伝子を保持するプラスミドは、固相ＤＮＡ連続連結（PRESSO ）技術25 および マルチラウンドゲートウェイクローニング（MultiRound Gateway Cloning） 26を用いて構築した。特に記載のない限り、サブクローニングのためのポリメラーゼ連鎖反応は、PrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（TaKaRa Bio Inc.、Shiga、Japan、http：// http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）を用いて実施した。 www.takara-bio.co.jp/）。 ISH1-ind、ISH1-ox、ISH1-ox、ISH2-ox、ISH1-プロモーター：GUS、ISH2-プロモーター：GUS、35SΩ：mRFP：ISH1および35SΩ：mRFP：ISH2植物のためのプラスミドを得た Gateway Cloning反応（Thermo Fisher Scientific、Wilmington、USA、https://www.thermofisher.com/）によって作製した。
【００８３】
ＴＯＰ - カセットの調製
まず、pHSG299CSPSベクター27に、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2（hsp）ターミネーター/ LexAオペレーター/リフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーターの-46〜+12断片（TOP）- カセットを調製した。このカセットは、上流遺伝子の転写を終結し、それ以降の遺伝子を化学的に誘導した。具体的には、（i）hspターミネーター、（ii）LexAオペレーターおよびCaMV 35Sプロモーターの-46〜+12および（iii）SfiI部位のDNA断片並びに（iv）マルチクローニング部位のないpHSG299CSPSベクター骨格の全体をpER8 およびpHSG299CSPSから増幅した。 PCR増幅は、以下のプライマーセットを用いて行った：
【００８４】
hspターミネーター 用：
hsp-ter_FW_SfiI （配列番号：４）
(5'-GAGTGGACGATTGGCAGAAGGCCATAAAGGCCATATGAAGATGAAGATGAAATATTTGGTG-3') 及び
hsp-ter_RV_XhoI（配列番号：５）
(5'-GAGTGGACGATTGGCAGAAGCTCGAGCTTATCTTTAATCATATTCCATAGTCCAT-3'); 
LexA オペレーター用：
LexA_ FW_XhoI （配列番号：６）
(5'-GAGTGGACGATTGGCAGAAGCTCGAGCCCCTCGACAGCTTGCAT-3' ) 及び
LexA_RV_SfiI（配列番号：７） 
(5'-GAGTGGACGATTGGCAGAAGGCCAATTAGGCCAGGATCCGACTAGCTTCA-3' ) ; 
SfiI and I-SceI部位用：
CSPS_FW_SfiI（配列番号：８）
(5'-GAGTGGACGATTGGCAGAAGGCCAAATAGGCCTGGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGG-3') 及び
CSPS_RV_I-SceI （配列番号：９）
(5'-GAGTGGACGATTGGCAGAAGTAGGGATAACAGGGTAATTCTTCTTCG-3');
pHSG299CSPS ベクターバックボーン用：
pUC_FW_ （配列番号：１０）
(5'-GAGTGGACGATTGGCAGAAGCAGCTGGCACGACAGGTTT-3') 及び
pUC_ RV_ SfiI_I-SceI（配列番号：１１）
(5'-AAGGAAAAAAGGCCATTAAGGCCTAGGGATAACAGGGTAATTCTTCTTCG-3')。 
【００８５】
次に、PCR産物のそれぞれを適切な制限酵素で消化し、以下の順序でPRESSO法25で順次連結した：hspターミネーター、LexAオペレーター、およびCaMV 35Sプロモーターの-46〜+ 12、およびマルチクローニングサイトを含まないpHSG299CSPSベクター骨格。その結果、2つのSfiI部位（GGCCTTAAAGGCCおよびGGCCTAATAGGCC）の間にTOPカセットを提供する、プラスミドが得られた。
【００８６】
35Sプロモーター：Ω：XVEカセットの調製
2ｘCaMV 35Sプロモーター：Ω転写エンハンサー（35Sプロモーター：Ω）下に、細菌リプレッサーLexAのDNA結合ドメイン（X）、VP16の酸性トランス活性化ドメイン（V）およびヒトエストロゲン受容体の調節領域（Ｅ）からなるキメラ転写活性化因子（XVE）をコードするDNA断片をクローニングした。 XVEおよび35Sプロモーター：ΩのDNA断片は、夫々、pER8 22およびpGWB502Ω20から増幅し、PRESSO法を用いてpDONRに基づくベクターであるpDONR Zeo Thsp R3 NPTII R4 L2 ccdB L1 CDPS（受託番号：LC217877）ベクター上に以下の順でクローニングした： I-CeuI、I-SceI、PI-PspI、PI-SceI、SfiI制限酵素認識部位、35Sプロモーター：Ω、XVE。 以下のプライマーセットをPCR増幅に使用した：前述したように、I-CeuI、I-SceI、PI-PspI、PI-SceI、SfiI制限酵素認識部位用のCSPS_FW_SfiIおよびCSPS_RV_I-SceI：
【００８７】
35Sプロモーター: Ω用：
35S_ FV_ SfiI（配列番号：１２） 
(5'-GAGTGGACGATTGGCAGAAGGCCTgcaTGGCCgttttcccagtcacgacgtt-3') 及び 
35S_RV_SfiI （配列番号：１３）
(5'-GAGTGGACGATTGGCAGAAGGCCAattAGGCCaaacttgttgataactctagaaattg-3'); 
XVE用：
XVE_ FW_ SfiI（配列番号：１４） 
(5'-GAGTGGACGATTGGCAGAAGGCCAAATCGGCCatgaaagcgttaacggccag-3') 及び
XVE_RV_SfiI （配列番号：１５）
(5'-GAGTGGACGATTGGCAGAAGGCCCTTATGGCCaagcttgtttgggatgtt-3'); 
ベクターバックボーン用： 
hsp-ter_FW2_SfiI（配列番号：１６）
(5'-TCCCTAGGCCTTAAAGGCCATATGAAGATGAAGATGAAATATTTGGTG-3') 及び
I-SceI RV （配列番号：１７）
(5'-GAGTGGACGATTGGCAGAAGTAGGGATAACAGGGTAATTCTTCTTCG-3'). 
【００８８】
その結果、35Sプロモーター：Ω：XVEカセットを提供するプラスミドが得られた。
【００８９】
複数の転写因子の遺伝子を含むセットのpGWB501_TOPXへのクローニング
SAM特異的転写因子の化学的誘導を達成するために、SAM特異的TFをコードする9つの全長cDNAフラグメントおよびTOPカセットDNAフラグメントを調製した。 使用したRAFL cDNAクローンは上記の通りでる。 2つのSfiI部位（GGCCAAATCGGCCおよびGGCCATAAGGGCC）の間にクローニングされる各RAFL cDNAをSfiIで消化し、電気泳動して完全長cDNA断片を分離し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN GmbH、Hilden、Germany、http： qiagen.com）を用いて精製した。 TOPカセットをSfiIで消化し、精製した。
【００９０】
次いで、PRESSO法およびMultiSite Gateway技術25,26において、9つのRAFL cDNAおよびTOPカセットを連続的に連結した。 PRESSO法では、エントリーベクターに於いて、複数ｃＤＮＡのセットを３つ（５つの遺伝子）：At3g60390、At1g14400、At3g50890、At2g45190およびAt1g75240；（２つの遺伝子B）：At3g61310およびAt4g31805、ならびに（２つの遺伝子A）：ISH1（At5g65410）およびISH2 （At3g18960）作製した。最初に、先に記載したようにストレプトアビジン− ビーズ上のスペーサーDNAにTOPカセットをライゲートし、次いでビーズ上のTOPカセットに完全長cDNA断片を連結した。 
【００９１】
即ち、上記の５つの遺伝子を含む: TOP, At3g60390, TOP, At1g14400, TOP, At3g50890, TOP, At2g45190, TOP およびAt1g75240；上記の２つの遺伝子 Bを含む: TOP, At3g61310, TOP およびAt4g31805； 並びに 、上記の２つの遺伝子 Aを含む: TOP, ISH1, TOP, およびISH2の順序で、反復的にビーズ上のDNA断片に複数のcDNA断片およびTOPカセットを連結した。 PRESSOの最後のステップでは、PrimeSTAR GXL DNAポリメラーゼ（TaKaRa Bio Inc.）で増幅されたI-SceI制限酵素認識部位を含むpDONRに基づくベクターDNA断片を連結した。ビーズ結合DNA断片を制限酵素I-SceIで消化した。回収したDNAを精製し、TaKaRa DNA Ligation Kit LONG（TaKaRa Bio Inc.）を用いてI-SceI部位を介して自己連結した。
【００９２】
このようにして、PRESSOに於けるGateway Cloning用pDONRベースのベクター上に、LexAオペレーター下に複数のcDNAを有する3つのセット（5遺伝子、2遺伝子Aおよび2遺伝子B）をクローニングし、これらの挿入物をMultiRound Gateway Cloningキット（Thermo Fisher Scientific ）26で結合した。更に、以下に示すように、遺伝子Aカセットとそれに含まれる２つの個々の遺伝子とを化学的誘導ベクターpGWB501_TOPXにクローニングした（図６c）。
【００９３】
エストラジオール誘導性ゲートウェイベクター（pGWB501_TOPX）の調製
エストラジオール誘導性ゲートウェイベクター（pGWB501_TOPX）を調製するために、「LexAオペレーター、35Sプロモーターの-46〜+12」、「Hsp18.2ターミネーター」および「35Sプロモーター - オメガ翻訳エンハンサー：XVE融合タンパク質、ラットグルココルチコイド 受容体3 'UTR pea rbcS E9ターミネーター」のDNA断片を上記のプラスミドＤＮＡからクローニングし、これらの断片をpGWB501上のHindIII、SacIおよびAscI部位にそれぞれクローニングした（図６a）。 以下のプライマーセットをPCR増幅に使用した：
【００９４】
LexA オペレーターおよび最小プロモーター用：
OP1_FW_HindIII（配列番号：１８）
(5'-CCCCAAGCTTAGCTTGGGCTGCAGGTCGAG-3') 及び 
OP1_RV_ HindIII （配列番号：１９）
(5'-CCCCAAGCTTGACTAGCTTCAGCGTGTCCT-3'); 
Hspターミネーター用：
hsp-ter_FW_SacI （配列番号：２０）
(5'-CCCCGAGCTCATATGAAGATGAAGATGAAA-3') 及び
hsp-ter_RV_SacI （配列番号：２１）
(5'-CCCCGAGCTCCTTATCTTTAATCATATTCC-3'); 
35S:Ω:XVE:E9ターミネーター用：
35S-XVE_FW_AscI  （配列番号：２２）
(5'-AAAAGGCGCGCCCAACATGGTGGAGCACGACA-3') 及び
35S-XVE_ RV_AscI （配列番号：２３）
(5'-AAAAGGCGCGCCGTTTGGGATGTTTTACTCCT-3')。
【００９５】
得られたプラスミドベクターを「pGWB501_TOPX」（アクセッション番号：LC217876）と命名した（図６a）。 pGWB501_TOPXベクターは、オペレーター：最小35Sプロモーター - ゲートウェイカセット-hspターミネーター、35Sプロモーター-XVEエンハンサー遺伝子-rbcS E9ターミネーターおよび植物用ハイグロマイシン耐性遺伝子および細菌用スペクチノマイシン耐性遺伝子を含有する。 XVEエンハンサータンパク質は、17-β-エストラジオール処理により活性化され、次いで、ゲノムクローニング部位上にクローン化された遺伝子を転写する。
【００９６】
エストラジオール誘導系が外来遺伝子の発現を促進するかどうかを調べるために、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子をpGWB501_TOPXのGatewayクローニング部位にクローニングし、LexAオペレーターを有するGUS遺伝子をシロイヌナズナ生態型コロンビア植物に導入した。 GUS遺伝子は、pENTR-Gus（Thermo Fisher Scientific）から提供された。 pGWB501_TOPX-GUSを有するT1植物を、25μg/ Lのハイグロマイシンプレートを含む1 / 2MSプレート上で選択した。 ハイグロマイシンプレート上で1週間増殖させたT2植物を、5μMエストラジオールを含むプレートに移した。 エストラジオールプレート上で10日間生育させた植物にGUS染色を施した。 その結果、GUS遺伝子カセットを導入することにより、pGWB501_TOPXベクターにクローン化された遺伝子発現の化学的誘導を確認した（図６b）。
【００９７】
ISH1およびISH2をコードする個々のコード配列（CDS）ならびに両方のcDNAの組み合わせセット（２つの遺伝子A）に化学的に誘導可能なプロモーターを、ゲートウェイベクターpGWB501_TOPX（図６c）にクローニングした。前述のように、「２つの遺伝子A」はエントリーベクター上に構築された。各CDS DNAフラグメントを、attB1またはattB2配列にオーバーハングする以下のプライマーセットを用いてPCRで増幅した：
【００９８】
ISH1用：
ISH1_CDS_FW （配列番号：２４）
（5'-AAAAAGCAGGCTTCATGGAGTTTGAAGACAACAACAACA-3 '）および
ISH1の場合はISH1_CDS_RV（配列番号：２５）
（5'-AGAAAGCTGGGTGTCATGGTTGGTCTTGTTCATGATG-3 '）;
ISH2用：
ISH2_CDS_FW（配列番号：２６）
（5'-AAAAAGCAGGCTTCATGGTTACAACCCAAAACACGAAG-3 '）および
ISH2_CDS_RV（配列番号：２７）
（5'-AGAAAGCTGGGTGTTATCCCCTGAAGACTCTCTTGT-3 '）;
Gateway Cloningのオーバーハング配列伸長用：
attB1（配列番号：２８）
（5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3 '）および
attB2（配列番号：２９）
（5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTG-3 '）。 
【００９９】
Gateway Cloning BPおよびLR反応は、製造元のマニュアル（Thermo Fisher Scientific）に従って行った。単一のISH1、ISH2および2つの遺伝子A誘導性クローンとして、それぞれ、ISH1-ind、ISH2-indおよびISH1＆2-indと名付けた。これらの構築物をシロイヌナズナに導入し、これらの遺伝子をエストラジオール処理で誘導する（図６d）ことにより、ISH1およびISH2をコードする２つの遺伝子がISO形成に必要であることがわかった。
【０１００】
各ISHを過剰発現するISH1-oxおよびISH2-ox植物を作製するために、Gateway Cloning 20のpGWB502）にISH1およびISH2のコード領域をクローン化した。我々はISH1-oxおよびISH2-ox植物を10系統以上生産し、RT-PCRにより過剰産生を確認した。ISH1とISH2の2つのライン（図１iのF1プラントの例）を交配させた。
尚、pGWB502には、構成発現プロモーターであるCaMV35Sプロモーターが含まれている。
【０１０１】
ISH1とISH2の細胞内局在とタンパク質相互作用
また、ISH1とISH2の細胞内局在とタンパク質相互作用を分析するために、35S：RFP：CDS、pDEST-BTM116：CDSおよびpDEST-GAD424：CDS構築物を作製した。 CDSもまた、RFP融合タンパク質の過剰発現用にpGWB555 20へ、および酵母ツーハイブリッドアッセイにおけるタンパク質相互作用のためにベイトおよびプレイベクター、pDEST-BTM116およびpDEST-GAD424 21へ、増幅およびクローニングされた。
【０１０２】
ISH1およびISH2のプロモーター活性を調べるために、プロモーター：GUS構築物を作製した14。プロモーターのためのISH1およびISH2コード配列（CDS）のATGから上流のDNA断片およびシロイヌナズナのゲノムDNAの5 '非翻訳領域（5'-UTR）を増幅した。プロモーター配列を以下のプライマーセットで増幅した：
ISH1プロモーター用:
ISH1_promoter_FW（配列番号：３０）
（5'-aaaaaagcaggctcaCTTGCAATTTTATAAAATTGTGAGA-3 '）および
ISH1_promoter_RV（配列番号：３１）
（5'-acaagaaagctgggtcCATTCAAGAAGTCGAGAAATG-3 '）;
ISH2プロモーター用：
ISH2_promoter_FW（配列番号：３２）
（5'-aaaaaagcaggctcaCCATACAATCTTACTCTCAATTCC-3 '）および
ISH2_promoter_RV（配列番号：３３）
（5'-acaagaaagctgggtcCATTTTTGTTTGCCTTGTTCAG-3 '）;
Gateway Cloningのためのオーバーハング配列用のattB1およびattB2。
【０１０３】
ISH1およびISH2のプロモーター領域および5'-UTRの長さはそれぞれ3077bpおよび1250bpであった。各DNA断片をpDONR221ベクターにサブクローニングし、Gateway Cloning Kits（Invitrogen、USA）を用いてpGWB533に導入して、プロモーター：GUS構築物を作製した20。
【０１０４】
葉緑素測定
液体窒素中で粉砕した根（50〜100mgの新鮮重量）を500mlの80％（v / v）アセトン中でホモジナイズした。 ホモジネートを15,000rpmで5分間遠心分離して上清を回収した後、沈殿したデブリを80％（v / v）アセトン500mlで2回抽出した。 1回目および2回目の抽出からの上清を混合して、80％（v / v）アセトン抽出物1mlを得た後、Ultrospec 3100 pro分光光度計（GEヘルスケアライフサイエンス（GE Healthcare Life Sciences、ピッツバーグ、米国、https://www.gelifesciences.com）を用いて、720、663、および647 nmにおける吸光度を測定した。 試料のクロロフィル濃度は、以前に記載された方法で測定した28。
【０１０５】
顕微鏡分析
胚発生観察のために、胚珠を水に砕き、小さな孵化バスケット（φ100μm）（INTAVIS Bioanalytical Instruments AG、Cologne、Germany、www.intavis.com）で胚を回収した。胚を抱水クロラール、水およびグリセロール（8：3：1、vol / vol）の透明化溶液で処理した。発生中の胚を微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡下で観察した。組織学のために、切片化を以前に記載されたように実施した29。ISOおよび対応する領域の試料をFAA溶液（エタノール：水：酢酸：ホルマリン= 50：40：5：5）中に固定し、段階的な一連のエタノール脱水和化し、製造者の指示に従ってTechnovit 7100樹脂（Heraeus Kulzer GmbH、Wehrheim、Germany、www.heraeus-kulzer.com）に包埋した。ミクロトームRM2165（Leica Biosystems、Wetzler、Germany、www.leicabiosystems.com）で切片（1〜2μm）を切断し、0.02％トルイジンブルーO溶液で染色した。木部および師部細胞を視覚化するために、切片を0.02％サフラニン-Oおよび0.005％アニリンブルー溶液（Thermo Fisher Scientific）で染色し、U-MWU2ミラーユニット（Olympus、Tokyo、Japan、 http://www.olympus-lifescience.com）を用いた光学顕微鏡で観察した。
【０１０６】
グルクロニダーゼ分析
前の段落で説明したインキュベーションバスケットを用いて胚を単離した。 無傷の植物、トリミングされた器官および胚を80％冷アセトンと共に15分間インキュベートし、次いで50mMリン酸緩衝液pH7.2, 0.5mM K3 [Fe（CN）6]および0.5mM K4 [Fe（CN）6]を含むＧＵＳ緩衝液でリンスした。 サンプルを、1mM の5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニドシクロヘキシルアンモニウム塩（X-Gluc）を含有するGUS緩衝液と共に37℃で1時間インキュベートし、次いで70％EtOHでリンスした。
【０１０７】
写真
植物およびISOの写真は、オリンパスDP20（オリンパス）を使用したZEISS Stemi 2000-C顕微鏡（ZEISS、Oberkochen、Germany、http：// www。 zeiss.com/）およびGR Digital III（RICOH、Tokyo、Japan、http://www.ricoh.com/）で撮影された。組織化学画像は、Nikon PlanFlour ELWDレンズ（Nikon、Tokyo、Japan、http://www.nikon.com）を用いたKeyence Biozero BZ-8000顕微鏡（Keyence、Osaka、Japan、http://www.keyence.com）とオリンパスIX83（オリンパス）で撮影した。
【０１０８】
RNA単離
エストラジオールを含まないプレート上で1週間発芽させた苗をエストラジオール含有プレート上でさらに1週間培養した。 苗の根を収穫した。 全RNAをRNeasy Plant Mini Kitで単離し、次いで製造者のマニュアル（QIAGEN）に従ってRNase-Free DNase Setで処理した。
【０１０９】
マイクロアレイ解析
根から抽出した全RNAを低入力高速アンプラベリングキット（Low Input Quick Amp Labeling Kit：1色、Cyanine3-CTP）（Agilent Technologies、Santa Clare、CA、USA、www.agilent.com）で標識し、製造元のマニュアルに従って、遺伝子発現ハイブリダイゼーションキット（Agilent Technologies）によりAgilent Arabidopsis Oligo DNA Microarray Ver.4（Agilent Technologies）をとハイブリダイズさせた。標識反応は、RNA Spike In Kit（Agilent Technologies）を用いて確認した。 cDNA濃度および品質は、NanoDrop ND-1000分光光度計（Thermo Fisher Scientific）およびAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies）を用いて確認した。ハイブリダイズした画像をAgilent Technology Scanner G2505Cでスキャンし、Feature Extractionバージョン10.7.3.1ソフトウェア（Agilent）で処理した。マイクロアレイデータの正規化と解析は、GeneSpring GX ver12ソフトウェア（Tomy Digital Biology、Tokyo、Japan、www.digital-biology.co.jp）およびRバージョン3.2.1（www.r-project.org）およびBioconductorバージョン3.1（https：//www.bioconductor。 org）を用いて行った。データはチップ当たり75パーセンタイルシフトで中央値に正規化された。。ヒートマップを描くために、処理間で10倍以上の変化値を有する遺伝子を選択し、zスコアを付けた。 Bioconductorを使ったRのgplotsパッケージとGenefilterでヒートマップを作製した。発生段階におけるISH1およびISH2制御遺伝子の発現を調べるために、シロイヌナズナ発生の発現マップ（受託番号E-TABM-17）のアレイデータを、公式データベースArrayExpress（http：// www。 .ebi.ac.uk / arrayexpress / experiments / E-TABM-17 /）30 15からダウンロードした。
【０１１０】
リアルタイム定量的PCR (RT-qPCR)
SuperScript III First-Strand Symthesis System（Thermo Fisher Scientific）を用いて、1.0μgの全RNAに対して逆転写を行った。 DNA Engine Opticon 2システム（MJ Research、Waltham、USA、http：//mj-research.com）上で、DyNAmo HS SYBR Green qPCRキット（Thermo Fisher Scientific）を用いて定量的PCRを行った。測定値をユビキチン10（UBQ10）のレベルに正規化した。 ISH1、ISH2およびUBQ10のために以下の遺伝子特異的プライマーセットを使用した：
ISH1_RT-FW（5'-CAACAACAACAACAACGACGAA-3 '）（配列番号：３４）および
ISH1_RT-RV（5'-AGAACACGAGAGAGAGGAGGAGAG-3 '）（配列番号：３５）;
ISH2_RT-FW（5'-GCTTGCGAGACCAAATATCCA-3 '）（配列番号：３６）および
ISH2_RT-RV（5'-CCCTGAAGACTCTCTTGTCTTCTTC-3 '）（配列番号：３７）;
UBQ10_FW（5'-GAAGTTCAATGTTTCGTTTCATGT-3 '）（配列番号：３８）および
UBQ10_RV（5'-GGATTATACAAGGCCCCAAAA-3 '）（配列番号：３９）。
【０１１１】
マイクロアレイデータのデータマイニング
主成分分析（PCA）にはRを用いた。正規化した値に擬似数「16」を加えて対数変化（LogFC）を計算し、z-スコア化したLogFCを用いてPCA解析を行った。 又、Gene Ontology ConsortiumウェブサイトのAmiGo2（http://amigo.geneontology.org/amigo）を使用して、１０倍以上変動のあった遺伝子群でGO濃縮分析を行った。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明に於いて初めて見出された、植物の根における地上部様器官の形成に関与する転写因子であるISH1およびISH2は、植物組織培養または増殖細胞からの芽を再生し、葉、花および果実などの他の器官を生じる成分の一部であり得る。又、現在、形質転換体の作製時に地上部の誘導がネックとなっているが、ISH1およびISH2は、その主な問題点を改善し形質転換体作製の効率化に寄与する可能性がある。
【０１１３】
従って、本発明で形成されたISOは、哺乳動物において誘導された多能性幹細胞（iPSCs）16のような、植物における物質生産および再生メカニズムの理解のための大きな可能性を有している。 
【０１１４】
更に、本発明は、今後、自由自在に植物器官を作出する技術、及び、植物工場で廃棄される根の有効活用のための技術開発に寄与することが期待される。
【０１１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019050760.tif 000015
【図８】
2019050760.tif 000016
【図９】
2019050760.tif 000017
【図１０】
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【配列表】
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