(57)【要約】      （修正有）【課題】ｉＰＳ細胞誘導因子をコードする一本鎖ｍＲＮＡを含む精製されたＲＮＡ調製物を用いて、体細胞を再プログラム化するための組成物および方法の提供。【解決手段】精製されたＲＮＡ調製物は好ましくは、ｉ）体細胞における免疫応答を活性化するであろう、ｉｉ）体細胞における一本鎖ｍＲＮＡの発現を低下させるであろう、および／またはｉｉｉ）体細胞におけるＲＮＡセンサーを活性化させるＲＮＡ夾雑物分子が実質的にない。ある実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、部分的ｍＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、キャッピングされていないＲＮＡ分子、および／または一本鎖続走ｍＲＮＡが実質的にない。【選択図】図１
2019162125.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは他の哺乳類の体細胞を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）へと、再プログラム化するためのインビトロの方法であって、以下のＡ）並びにＢ）：
Ａ）ＨＰＬＣまたは重力フロー液体クロマトグラフィーを含む精製工程、および／または、ＲＮａｓｅＩＩＩによる処理およびＲＮａｓｅＩＩＩ消化産物の除去、を用いて、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣをコードするインビトロで合成されたｍＲＮＡ分子の溶液を精製および／または処理して、精製されたｍＲＮＡ溶液を生成し、そして、前記精製されたｍＲＮＡ溶液を合わせて、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣを集合的にコードするｍＲＮＡ分子を含む精製されたＲＮＡ調製物を生成する工程であって、
前記精製により、生得的免疫応答を誘導することによって細胞に対して毒性のある、ｄｓＲＮＡ分子を含むＲＮＡ夾雑物分子が除去され、前記精製されたＲＮＡ調製物は：
ｉ）メンブレンドットブロット免疫アッセイの定義された時間のデジタル画像化の後で検出されないｄｓＲＮＡに基づいて、ｄｓＲＮＡを含まず、前記ｄｓＲＮＡに特異的なＪ２モノクローナル抗体が、前記精製されたＲＮＡ調製物におけるｄｓＲＮＡの量に結合し、そしてこれを、既知量のｄｓＲＮＡを含む対照ＲＮＡにおいて検出されるｄｓＲＮＡの量と比較して定量化するために使用され、そして、
ｉｉ）インビトロヒト単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）免疫原性アッセイを用いて、以下のａ）およびｂ）：
ａ）前記精製されたＲＮＡ調製物を用いた形質移入の後の２４時間の間に、ＭＤＤＣにより、前記精製に付されていないｍＲＮＡを含む調製物を用いた形質移入の後に分泌される場合よりも、ＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−αのそれぞれ少なくとも５倍少ない分泌、および／または、
ｂ）ＲＮＡを含まない対照を用いて形質移入されたＭＤＤＣにより分泌されたＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−αのそれぞれの量と比較して、前記精製されたＲＮＡ調製物を用いた形質移入の後の２４時間の間に、ＭＤＤＣにより分泌されたＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−αの量の増加がない、
を測定することにより検出可能な免疫原性ではない；並びに、
Ｂ）前記精製されたＲＮＡ調製物を、形質移入試薬と共に複数日においてヒトまたは他の哺乳類の体細胞に導入し、当該細胞を培養状態および培地において維持する工程であって、前記細胞は生存可能であり、かつ、前記細胞に導入される前記ｍＲＮＡ分子は、前記導入後に、ｉＰＳＣに特有のマーカーを発現し、かつ培地中で生存するｉＰＳＣが生成されるように発現する；
の工程を含み、前記インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子は、
１）グアノシン、アデノシン、シチジン、および、ウリジンの代わりにプソイドウリジン（Ψ）；５’−キャップ；および、３’ポリ（Ａ）末端を含んでおり、かつ、
２）修飾されていないシチジンヌクレオシドの代わりに、５−メチルシチジンを含まない、方法。
【請求項２】
ヒトまたは他の哺乳類の体細胞を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）へと、再プログラム化するためのインビトロの方法であって、以下のＡ）、Ｂ）並びにＣ）：
Ａ）ＵＴＰの代わりに修飾されたＮＴＰを含む反応混合物中で、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＤＮＡテンプレートのインビトロの転写（ＩＶＴ）により、複数のｉＰＳＣ誘導因子のそれぞれをコードするｍＲＮＡ分子をインビトロで合成し、次いで、キャッピング酵素系によるキャッピング、および、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いたＩＶＴ−ＲＮＡのポリアデニル化を行う工程であって、前記インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子は：
１）以下のｉＰＳＣ誘導因子をコードし：
ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣ、
ｂ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣおよびＬＩＮ２８、
ｃ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣおよびＮＡＮＯＧ、または、
ｄ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧ、
前記ａ）〜ｄ）における前記ＭＹＣが、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、およびＮ−ＭＹＣから選択され、かつ、
２）（ｉ）１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）、プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、および修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）からなる群から選択される、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド；（ｉｉ）５’キャップ；および（ｉｉｉ）３’ポリ（Ａ）末端、を含み、かつ、
３）修飾されていないシチジンヌクレオシドの代わりに、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含まない；
Ｂ）ＨＰＬＣまたは重力フロー液体クロマトグラフィーを含む精製工程、および／または、ＲＮａｓｅＩＩＩによる処理およびＲＮａｓｅＩＩＩ消化産物の除去、を用いて、前記再プログラミングのための各ｉＰＳＣ誘導因子をコードする前記ｍＲＮＡ分子の溶液を精製および／または処理して、前記再プログラミングのための前記ｉＰＳＣ誘導因子のすべてをコードする前記精製されたＲＮＡ分子を合わせて、精製されたＲＮＡ調製物を生成する工程であって、
前記ｍＲＮＡ分子の前記精製により、生得的免疫応答を誘導することによって細胞に対して毒性のある、ｄｓＲＮＡ分子を含むＲＮＡ夾雑物分子が除去され、前記精製されたＲＮＡ調製物は：
ｉ）メンブレンドットブロット免疫アッセイの定義された時間のデジタル画像化の後で検出されないｄｓＲＮＡに基づいて、ｄｓＲＮＡを含まず、前記ｄｓＲＮＡに特異的なＪ２モノクローナル抗体が、前記精製されたＲＮＡ調製物におけるｄｓＲＮＡの量に結合し、そしてこれを、既知量のｄｓＲＮＡを含む対照ＲＮＡにおいて検出されるｄｓＲＮＡの量と比較して定量化するために使用され、そして、
ｉｉ）インビトロヒト単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）免疫原性アッセイを用いて、以下のａ）およびｂ）：
ａ）前記精製されたＲＮＡ調製物を用いた形質移入の後の２４時間の間に、ＭＤＤＣにより、前記精製に付されていないｍＲＮＡを含む調製物を用いた形質移入の後に分泌される場合よりも、ＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−αのそれぞれ少なくとも５倍少ない分泌、および／または、
ｂ）ＲＮＡを含まない対照を用いて形質移入されたＭＤＤＣにより分泌されたＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−αのそれぞれの量と比較して、前記精製されたＲＮＡ調製物を用いた形質移入の後の２４時間の間に、ＭＤＤＣにより分泌されたＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−αの量の増加がない、
を測定することにより検出可能な免疫原性ではない；並びに、
Ｃ）前記精製されたＲＮＡ調製物を、形質移入試薬と共に複数日において炎症性サイトカインの発生なしに、ヒトまたは他の哺乳類の体細胞に導入し、当該細胞を培養状態および培地において維持する工程であって、前記細胞は生存可能であり、かつ、前記細胞に導入される前記ｍＲＮＡ分子は、前記導入後に、ｉＰＳＣに特有のマーカーを発現し、かつ培地中で生存するｉＰＳＣが生成されるように発現する；
の工程を含む、方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ夾雑物分子は、ｄｓＲＮＡ分子およびキャッピングされていないｍＲＮＡ分子からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記精製されたＲＮＡ調製物は、インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子を含んでおり、
（ｉ）９８％を超える前記ｍＲＮＡ分子は、キャッピングされている；
（ｉｉ）前記ｍＲＮＡ分子は、キャップ１構造を備えたキャップを示している；
（ｉｉｉ）前記ｍＲＮＡ分子は、５０〜２００ヌクレオチドの、または、１５０ヌクレオチドを超える、ポリＡ末端を含んでいる；
（ｉｖ）前記ｍＲＮＡ分子は、異種の５’ＵＴＲ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ＩＲＥＳ配列および３’ＵＴＲ配列からなる群から選択される少なくとも１つの特定の配列を示し、前記特定の配列は、前記特定の配列を示さない同一のｍＲＮＡ分子と比較して、ｍＲＮＡ分子のより高い翻訳をもたらし、前記５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列は、アフリカツメガエルまたはヒトのアルファグロブリンまたはベータグロブリンのｍＲＮＡ由来であるか、前記５’ＵＴＲ配列はタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）のＲＮＡ由来の配列である；および／または、
（ｖ）前記ｍＲＮＡ分子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧおよびｃ−ＭＹＣまたはｌ−ＭＹＣをコードしている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記複数日において前記導入することは、少なくとも１０〜１６日間毎日、前記導入することを包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
ｉＰＳＣに特有の発現マーカーが、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４、ＣＲＩＰＴＯ、ＲＥＸ１およびＴＲＡ−１−６０から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記再プログラム化したｉＰＳＣは、培養物において少なくとも４０日間生存し、複製する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記導入することの後、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−ｌαもしくはβ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β、ＩＬ−８、α−メラニン形成細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、エリスロポエチン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦＩＩ）、および骨誘導因子４（ＢＭＰ−４）からなる群から選択される、少なくとも１つの増殖因子および／またはサイトカインに、前記細胞を接触させることをさらに包含している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＴＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、エリスロポエチン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦＩＩ）、骨誘導因子４（ＢＭＰ−４）、熱ショックタンパク質、ＨＳＰ７０、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、および、増殖因子シグナリングを下方制御するかまたは拮抗するタンパク質、からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインまたは増殖因子をコードしているｍＲＮＡを、前記細胞に導入することをさらに包含している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記修飾されたヌクレオシドは、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）または５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）であり、前記対応する修飾されていないヌクレオシドの代わりの前記修飾されたヌクレオシドの割合は、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％および５０％から選択される分率、または５０％未満の分率である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記修飾されたヌクレオシドは、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）またはさらに修飾されていないプソイドウリジン（Ψ）であり、実質的にすべての前記対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの代わりに存在している、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子を包含している哺乳類の体細胞を含んでいる、組成物であって、
前記インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子は、
（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣ、
（ｉｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣおよびＬＩＮ２８、
（ｉｉｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣおよびＮＡＮＯＧ、または
（ｉｖ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧ
であるｉＰＳＣ誘導因子であって、前記ＭＹＣが、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、およびＮ−ＭＹＣから選択されるｉＰＳＣ誘導因子をコードしており、
前記インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子は：
ａ）（ｉ）グアノシン、（ｉｉ）アデノシン、（ｉｉｉ）シチジン、および（ｉｖ）ウリジンの代わりに、プソイドウリジン、を含んでおり；かつ、
ｂ）５−メチルシチジンを含まない、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、そのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれる、２００９年１２月７日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／２６７，３１２号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、２００５年８月２３日に出願された米国仮出願第６０／７１０，１６４号に対する優先権を主張する２００６年８月２１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０６／３２３７２の米国国内登録である２００９年３月２７日に出願された米国出願シリアル番号第１１／９９０，６４６号に対する優先権も主張し、これらのすべては全体として引用により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
（本発明の分野）
本発明は、ヒトまたは他の動物細胞を含む真核細胞の分化の状態を、該真核細胞と再プログラム化因子（例えば、ｉＰＳ細胞誘導因子）を各々コードする１つ以上の異なる一本鎖ｍＲＮＡ分子を含むかまたは該分子からなる精製されたＲＮＡ調製物を接触させることによって変化または再プログラム化するための組成物および方法に関する。精製された一本鎖ｍＲＮＡ分子は好ましくは、対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの少なくとも一部の替わりに（例えば、対応する修飾されていないＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴの通常のヌクレオシドの実質的にすべての替わりに）、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド（例えば、プソイドウリジン（ギリシャ文字「プサイ」または「Ψ」によって略記）、５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２’−ＯＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、およびＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される）を含む。加えて、一本鎖ｍＲＮＡ分子は好ましくは、意図されていない応答を活性化させ、一本鎖ｍＲＮＡの発現を低下させ、および／または細胞におけるＲＮＡセンサーを活性化させるであろうＲＮＡ夾雑物分子が実質的にないように精製される。ある実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、完全長の一本鎖ｍＲＮＡ分子よりも短いかもしくは長い、二本鎖の、および／またはキャッピングされていないＲＮＡである、ＲＮＡ夾雑物分子が実質的にない。
【背景技術】
【０００４】
２００６年において、４つのタンパク質因子（ＯＣＴ４（オクタマー−４；ＰＯＵクラス５ホメオボックス１）、ＳＯＸ２（ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２）、ＫＬＦ４（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ様因子４）、およびｃ−ＭＹＣ）をコードする遺伝子の、分化したマウス体細胞への導入は、多能性幹細胞（本明細書では「人工多能性幹細胞」、「ｉＰＳ細胞」、または「ｉＰＳＣ」と呼ぶ）になるよう該細胞を誘導することが報告された（Takahashi and Yamanaka 2006）。この元の報告に続いて、多能性幹細胞は、ヒト体細胞を、類似のヒトタンパク質因子（ＯＣＴ４，  ＳＯＸ２，  ＫＬＦ４，  ａｎｄ  ｃ−ＭＹＣ）をコードする遺伝子で形質転換することによっても（Takahashi et al. 2007）、またはヒトＯＣＴ４およびＳＯＸ２をコードする遺伝子ならびに２つの他のヒト因子であるＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８（Ｌｉｎ−２８ホモログＡ）をコードする遺伝子で形質転換することによっても（Yu et al. 2007）誘導された。これらの方法はすべて、レトロウイルスまたはレンチウイルスを用い、再プログラム化因子をコードする遺伝子を、形質転換された細胞のゲノムへと組み込み、体細胞は、長時間にわたってのみｉＰＳ細胞へと再プログラム化された（例えば、１週間超）。
【０００５】
分化した体細胞からのｉＰＳ細胞の作製は、細胞移植を通じて疾患を治療するための可能な手段として大いに期待される。個々の患者由来の体細胞からｉＰＳ細胞を作製する可能性は、免疫拒絶によるリスクを低下させた患者特異的療法の開発も可能にし得る。なおもさらに、疾患特異的体細胞からのｉＰＳ細胞の作製は、特異的疾患状態を治療するための薬剤を研究および開発するための手段として期待される（Ebert et al. 2009, Lee et al. 2009, Maehr et al. 2009）。
【０００６】
タンパク質再プログラム化因子（または「ｉＰＳＣ因子」）をコードする遺伝子のウイルス送達は、体細胞からｉＰＳ細胞を作製するための非常に効率的な方法を提供するが、外来性ＤＮＡのゲノムへの組み込みは、ランダムであろうと非ランダムであろうと、予測不可能な結果を生じ、究極的には癌をもたらし得る（Nakagawa et al. 2008）。新たな報告は、ｉＰＳ細胞がゲノム組み込みを必要としない他の方法を用いることによって、（より低い効率で）作製されることができることを示す。例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣについての遺伝子を含む発現プラスミドのマウス胚性線維芽細胞への反復した形質移入によりｉＰＳ細胞を作製することが示された（Okita et al. 2008）。人工多能性幹細胞は、ヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８をコードする遺伝子を発現したプラスミドの導入によって、ヒト体細胞からも作製された（Yu et al. 2009）。ｉＰＳ細胞を作製するための他の成功したアプローチには、体細胞を、組換えタンパク質再プログラム化因子（Zhou et al. 2009）、非組み込みアデノウイルス（Stadtfeld etal. 2008）、またはピギーバック式トランスポゾン（Woltjen et al. 2009）で処理して、再プログラム化因子を送達することが含まれる。現在のところ、これらの非ウイルス送達技術を用いて、再プログラム化因子を送達するｉＰＳ細胞の作製は、極度に非効率的である。可能性のある臨床用途のためにｉＰＳ細胞を作製するための方法は、ゲノム完全性を維持しながらｉＰＳ細胞の形成の速度および効率性を高める必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ヒトまたは他の動物細胞を含めた真核細胞の分化の状態を、該細胞を、再プログラム化因子（例えば、ｉＰＳ細胞誘導因子）を各々コードする１つ以上の異なる一本鎖ｍＲＮＡ分子を含むかまたは該分子からなる精製されたＲＮＡ調製物と接触させることによって再プログラム化するための組成物および方法を提供する。精製された一本鎖ｍＲＮＡ分子は好ましくは、（例えば、プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２’−ＯＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、およびＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択された）少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを、対応する修飾されていないＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴの通常のヌクレオシドの対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの替わりに含む。加えて、一本鎖ｍＲＮＡ分子は好ましくは、細胞において、意図されていない応答を活性化し、一本鎖ｍＲＮＡの発現を低下させ、および／またはＲＮＡセンサー（例えば、二本鎖ＲＮＡ依存性酵素）を活性化するであろうＲＮＡ夾雑物分子が実質的にないように精製される。ある実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、完全長の一本鎖ｍＲＮＡ分子よりも短いかまたは長いＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、および／またはキャッピングされていないＲＮＡである、ＲＮＡ夾雑物分子が実質的にない。いくつかの好ましい実施態様において、本発明は、ヒトまたは他の動物体細胞を含めた分化した真核細胞を、ｉＰＳ細胞誘導因子を各々コードする１つ以上の異なる一本鎖ｍＲＮＡ分子を含むかまたは該分子からなる精製されたＲＮＡ調製物と接触させることによってプログラム化するための組成物および方法を提供する。
【０００８】
いくつかの実施態様において、本発明は、体細胞の分化の状態を変化させるための方法であって、ｉＰＳ細胞誘導因子をコードするｍＲＮＡを体細胞へ導入して、再プログラム化された脱分化した細胞を作製し、この中で、該ｍＲＮＡは、少なくとも１つの５−メチルシチジン（または本明細書に説明される他の修飾された塩基）を含むことを含む、該方法を提供する。
【０００９】
ある実施態様において、本発明は、第一の分化した状態または表現型を呈する細胞を、第二の分化した状態または表現型を呈する細胞に再プログラム化するための方法であって、第一の分化した状態を呈する細胞に少なくとも１つの再プログラム化因子をコードする修飾されたｍＲＮＡ分子を含む精製されたＲＮＡ調製物を導入することと、細胞が第二の分化した状態を呈する条件下で該細胞を培養することとを含む、該方法を提供する。ある実施態様において、修飾されたｍＲＮＡ分子は、プソイドウリジンまたは５−メチルシチジンからなる群から選択される少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含む。ある実施態様において、該細胞は、ヒトまたは動物由来である。さらなる実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、ｉ）第一のｉＰＳ細胞誘導因子をコードする第一の一本鎖ｍＲＮＡを含み、この中で、第一の一本鎖完全ｍＲＮＡの実質的にすべては、少なくとも１つのプソイドウリジン残基および／または少なくとも１つの５−メチルシチジン残基を含み、かつｉｉ）該体細胞においてＲＮＡセンサーを活性化することのできるＲＮＡ夾雑物分子が実質的にない。ある実施態様において、ＲＮＡ夾雑物分子は、該ｉＰＳ細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的なｍＲＮＡ、完全長のｍＲＮＡよりも小さなＲＮＡ分子、完全長のｍＲＮＡよりも大きなＲＮＡ分子、二本鎖ｍＲＮＡ分子、およびキャッピングされていないｍＲＮＡ分子からなる群から選択される。
【００１０】
いくつかの実施態様において、本発明は、体細胞を再プログラム化する（例えば、脱分化するかまたは分化転換する）ための方法であって、体細胞を精製されたＲＮＡ調製物と接触させて、再プログラム化された細胞を作製し、この中で、精製されたＲＮＡ調製物は、ｉ）第一のｉＰＳ細胞誘導因子をコードする第一の一本鎖ｍＲＮＡを含み、この中で、第一の一本鎖完全ｍＲＮＡの実質的にすべては、少なくとも１つのプソイドウリジン残基および／または少なくとも１つの５−メチルシチジン残基を含み、かつｉｉ）該体細胞においてＲＮＡセンサーを活性化することのできる夾雑物分子（例えば、ＲＮＡ夾雑物分子）が実質的にない。特定の実施態様において、ＲＮＡ夾雑物分子は、該ｉＰＳ細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的なｍＲＮＡ、ｉＰＳ細胞誘導因子をコードしかつｉＰＳ細胞誘導因子の少なくとも１つの追加的な部分をコードする一本鎖続走（ｒｕｎ−ｏｎ）ｍＲＮＡ、二本鎖ｍＲＮＡ分子、およびキャッピングされていないｍＲＮＡ分子を含む。ある実施態様において、また、第一の一本鎖ｍＲＮＡは、第一のｉＰＳ細胞誘導因子の追加的な部分をコードしない。
【００１１】
いくつかの実施態様において、再プログラムされた細胞は、脱分化した細胞（例えば、幹細胞または幹細胞様細胞）である。他の実施態様において、再プログラム化された細胞は、分化転換した細胞である（例えば、皮膚細胞は、ニューロン細胞、または他の種類の変化へと再プログラム化される）。さらなる実施態様において、第一の一本鎖ｍＲＮＡは、完全な第一のｉＰＳ誘導因子をコードする（例えば、ｍＲＮＡは、特定のｉＰＳ誘導因子についての完全なコード配列をコードする）。他の実施態様において、該接触することはさらに、（例えばある時間後に）体細胞を増殖因子および／またはサイトカインと接触させることを含む。さらなる実施態様において、該接触はさらに、体細胞を免疫応答阻害因子と接触させることを含む。
【００１２】
ある実施態様において、第一の一本鎖ｍＲＮＡにおけるウリジンヌクレオシドのすべてまたはほぼすべては、プソイドウリジンヌクレオシドによって置き換えられる。他の実施態様において、第一の一本鎖ｍＲＮＡにおけるシチジンヌクレオシドのすべてまたはほぼすべては、５−メチルシチジンヌクレオシドまたは本明細書に列挙された他の塩基によって置き換えられる。
【００１３】
特定の実施態様において、本発明は、再プログラム化された細胞を作製するための方法であって、体細胞を精製されたＲＮＡ調製物と接触させて、培養物において少なくとも１０日間（例えば、少なくとも１０日間…少なくとも１３日間…少なくとも１６日間…少なくとも２０日間…少なくとも４０日間…または細胞株を形成することのできる日数）生存することのできる再プログラム化された細胞を作製し、この中で、精製されたＲＮＡ調製物は、ｉＰＳ細胞誘導因子をコードする第一の一本鎖ｍＲＮＡを含み、かつこの中で、大部分の第一の一本鎖ｍＲＮＡは、少なくとも１つのプソイドウリジン残基および／または少なくとも１つの５−メチルシチジン残基を含むことを含む、該方法を提供する。
【００１４】
ある実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、再プログラム化された細胞が培養物において少なくとも１０日間（例えば、少なくとも１０日間…少なくとも１５日間…少なくとも２０日間…少なくとも４０日間、またはそれより長く）生存することを妨げるのに十分な体細胞における免疫応答を活性化するであろう量のＲＮＡ夾雑物分子がない。他の実施態様において、ＲＮＡ夾雑物分子には、ｉＰＳ細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的ｍＲＮＡ、ｉＰＳ細胞誘導因子を完全にコードしかつｉＰＳ細胞誘導因子の少なくとも１つの追加的な部分をコードする一本鎖続走ｍＲＮＡ、二本鎖ｍＲＮＡ分子、キャッピングされていないｍＲＮＡ分子、およびこれらの混合物が含まれる。ある実施態様において、作製された再プログラム化された細胞は、再プログラム化された細胞株を形成することができる。他の実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、再プログラム化された細胞株の作製を妨げるるのに十分な体細胞における免疫応答を活性化するであろう量のＲＮＡ夾雑物分子がない。
【００１５】
特定の実施態様において、ＲＮＡ夾雑物分子は、ｉＰＳ細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的ｍＲＮＡ、ｉＰＳ細胞誘導因子をコードしかつｉＰＳ細胞誘導因子の少なくとも１つの追加的な部分をコードする一本鎖続走ｍＲＮＡ、二本鎖ｍＲＮＡ分子、キャッピングされていないｍＲＮＡ分子、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施態様において、本発明は、ａ）体細胞を精製されたＲＮＡ調製物と接触させて、再プログラム化された細胞を作製し、この中で、精製されたＲＮＡ調製物は、ｉＰＳ細胞誘導因子をコードするｍＲＮＡを含み、かつこの中で、大部分のｍＲＮＡは、少なくとも１つのプソイドウリジン残基および／または少なくとも１つの５−メチルシチジン残基を含むこと、ならびにｂ）脱分化した細胞を培養して、再プログラム化された細胞株を作製すること、を含む、再プログラム化された細胞株を作製するための方法を提供する。他の実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、再プログラム化された細胞株の作製を妨げるのに十分な体細胞の免疫応答を活性化するであろう量の夾雑物分子がない。ある実施態様において、免疫応答は、体細胞におけるＲＮＡセンサーの活性化を包含する。
【００１７】
いくつかの実施態様において、本発明は、体細胞を再プログラム化するための方法であって、体細胞を精製されたＲＮＡ調製物と接触させて、再プログラム化された細胞を作製し、この中で、精製されたＲＮＡ調製物は、ｉ）第一のｉＰＳ細胞誘導因子をコードする第一の一本鎖ｍＲＮＡを含み、この中で、第一の一本鎖ｍＲＮＡの実質的にすべては、少なくとも１つのプソイドウリジン残基および／または少なくとも１つの５−メチルシチジン残基を含み、かつｉｉ）ａ）第一のｉＰＳ細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的ｍＲＮＡ、およびｂ）二本鎖ｍＲＮＡ分子が実質的にないことを含む、該方法を提供する。さらなる実施態様において、また、第一の一本鎖ｍＲＮＡは、第一のｉＰＳ細胞誘導因子の追加的な部分をコードしない。特定の実施態様において、第一の一本鎖ｍＲＮＡは、第一のｉＰＳ細胞誘導因子を完全にコードする。他の実施態様において、また、精製されたＲＮＡ調製物は、第一のｉＰＳ細胞誘導因子をコードしかつ第一のｉＰＳ細胞誘導因子の少なくとも１つの追加的な部分をコードする一本鎖続走ｍＲＮＡが実質的にない（かまたは本質的にないかまたは事実上ないかまたはない）。他の実施態様において、第一の一本鎖完全ｍＲＮＡの実質的にすべては５’キャッピングされている。他の実施態様において、また、精製されたＲＮＡ調製物は、キャッピングされていないｍＲＮＡ分子が実質的にない。いくつかの実施態様において、第一の一本鎖ｍＲＮＡの実質的にすべては、少なくとも１つのプソイドウリジン残基を含む。追加的な実施態様において、実質的にすべての第一の一本鎖ｍＲＮＡは、少なくとも１つの５‐メチルシチジン残基を含む。他の実施態様において、実質的にすべての第一の一本鎖ｍＲＮＡは、少なくとも１つのプソイドウリジン残基および少なくとも１つの５−メチルシチジン残基を含む。
【００１８】
ある実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、形質移入試薬を含む。他の実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、かなりの量の部分的ｍＲＮＡおよび二本鎖ｍＲＮＡを含有するＲＮＡ試料のＨＰＬＣ精製によって得られる。さらなる実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、部分的ｍＲＮＡおよび一本鎖続走ｍＲＮＡが本質的にない。いくつかの実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、二本鎖ｍＲＮＡ分子が本質的にないかまたは事実上ないかまたはない。他の実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、キャッピングされていないｍＲＮＡ分子が本質的にないかまたは事実上ないかまたはない。いくつかの実施態様において、実質的にすべての第一の一本鎖ｍＲＮＡはポリアデニル化されている。他の実施態様において、第一の一本鎖完全ｍＲＮＡは、７−メチルグアノシンでキャッピングされている。
【００１９】
いくつかの実施態様において、第一のｉＰＳ細胞誘導因子は、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２からなる群から選択される。他の実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、ｉ）第二のｉＰＳ細胞誘導因子をコードする第二の一本鎖ｍＲＮＡをさらに含み、この中で、第二の一本鎖ｍＲＮＡは、少なくとも１つのプソイドウリジン残基および／または少なくとも１つの５−メチルシチジン残基を含み、かつｉｉ）ａ）第二のｉＰＳ細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的ｍＲＮＡ、およびｂ）二本鎖ｍＲＮＡがさらに実質的にない。他の実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物はさらに、第二のｉＰＳ細胞誘導因子をコードしかつ第二のｉＰＳ細胞誘導因子の少なくとも１つの追加的な部分をコードする一本鎖続走ｍＲＮＡが実質的にない。いくつかの実施態様において、第二のｉＰＳ細胞誘導因子は、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２からなる群から選択される。ある実施態様において、体細胞は線維芽細胞である。他の実施態様において、再プログラム化された細胞は、多能性幹細胞である。他の実施態様において、脱分化した細胞は、ＮＡＮＯＧおよびＴＲＡ−１−６０を発現する。いくつかの実施態様において、細胞はインビトロである。さらなる実施態様において、細胞は培養物中に存する。特定の実施態様において、細胞は、マウス胎仔由来線維芽細胞（ＭＥＦ）馴化培地中に存する。
【００２０】
いくつかの実施態様において、本発明は、精製されたＲＮＡ調製物を含む組成物を提供し、この中で、精製されたＲＮＡ調製物は、ｉ）第一のｉＰＳ細胞誘導因子をコードする第一の一本鎖ｍＲＮＡを含み、この中で、第一の一本鎖ｍＲＮＡは、少なくとも１つのプソイドウリジン残基および／または少なくとも１つの５‐メチルシチジン残基を含み、かつｉｉ）体細胞におけるＲＮＡセンサーを活性化することのできるＲＮＡ夾雑物分子が実質的にない。ある実施態様において、本発明は、精製されたＲＮＡ調製物を含む組成物を提供し、この中で、精製されたＲＮＡ調製物は、ｉ）第一のｉＰＳ細胞誘導因子をコードする第一の一本鎖ｍＲＮＡを含み、この中で、第一の一本鎖完全ｍＲＮＡは、少なくとも１つのプソイドウリジン残基および／または少なくとも１つの５−メチルシチジン残基を含み、かつｉｉ）ａ）第一のｉＰＳ細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的ｍＲＮＡ、およびｂ）二本鎖ＲＮＡが実質的にない、組成物を提供する。
【００２１】
ある実施態様において、また、精製されたＲＮＡ調製物は、第一のｉＰＳ細胞誘導因子をコードしかつ第一のｉＰＳ細胞誘導因子の少なくとも１つの追加的な部分をコードする一本鎖続走ｍＲＮＡが実質的にない。いくつかの実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、ｉ）第二のｉＰＳ細胞誘導因子をコードする第二の一本鎖ｍＲＮＡをさらに含み、この中で、第二の一本鎖完全ｍＲＮＡは、少なくとも１つのプソイドウリジン残基および／または少なくとも１つの５−メチルシチジン残基、およびｉｉ）ａ）第二の第一のｉＰＳ細胞誘導因子をコードしかつ第二のｉＰＳ細胞誘導因子の少なくとも１つの追加的な部分をコードする一本鎖続走ｍＲＮＡが実質的にない。
【００２２】
いくつかの実施態様において、本発明は、ＭＹＣ遺伝子をコードするインビトロで合成されたｍＲＮＡを含む組成物を提供し、この中で、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、少なくとも１つのプソイドウリジン残基および／または少なくとも１つの５−メチルシチジン残基を含む。ある実施態様において、組成物は、体細胞におけるＲＮＡセンサーを活性化することのできるＲＮＡ夾雑物分子が実質的にない。
【００２３】
特定の実施態様において、本発明は、ＭＹＣタンパク質を産生するよう哺乳類細胞を誘導するための方法であって、哺乳類細胞を、ＭＹＣ遺伝子をコードするインビトロで合成されたｍＲＮＡと接触させ、この中で、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、少なくとも１つのプソイドウリジン残基および／または少なくとも１つの５−メチルシチジン残基を含み、それによりＭＹＣタンパク質を産生するよう哺乳類細胞を誘導することを含む、該方法を提供する。他の実施態様において、哺乳類細胞は樹状細胞である。他の実施態様において、哺乳類細胞は、肺胞細胞、星状細胞、小膠細胞、またはニューロンである。
【００２４】
いくつかの実施態様において、本発明は、対象を、先におよび本明細書に説明されたＭＹＣタンパク質産生哺乳類細胞と接触させることを含む、対象を治療する方法を提供する。
【００２５】
さらなる実施態様において、本発明は、ＭＹＣ遺伝子をコードするインビトロで転写されるＲＮＡ分子を合成する方法であって、単離されたＲＮＡポリメラーゼ、ＭＹＣ遺伝子をコードするテンプレート核酸配列、修飾されていないヌクレオチド、および少なくとも１つのプソイドウリジンまたは５−メチルシチジン残基を含む、ＭＹＣ遺伝子をコードするインビトロで転写されるＲＮＡ分子が生成されるような条件下で、プソイドウリジンまたは５−メチルシチジンにより修飾されたヌクレオチドを組み合わせることを含む、ＭＹＣ遺伝子をコードするインビトロで転写されるＲＮＡ分子を合成する方法を提供する。
【００２６】
本発明の実施態様の開発中に実施された実験は、ｍＲＮＡ分子が、細胞に投与されて脱分化過程を誘導して、多能性幹細胞を含めた脱分化した細胞を作製することができることを示した。したがって、本発明は、ｉＰＳ細胞を作製するための組成物および方法を提供する。驚くべきことに、ｍＲＮＡの投与は、ｉＰＳ細胞の非常に効率的な作製を提供することができる。
【００２７】
本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子、それらを含む遺伝子療法ベクター、それらの合成方法、ならびに遺伝子置換、遺伝子療法、遺伝子転写サイレンシング、および治療用タンパク質の該分子を含む組織へのインビボでの送達のための方法も提供する。本発明は、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子の免疫原性を低下させる方法も提供する。
【００２８】
いくつかの実施態様において、本発明は、１つ以上のｉＰＳＣ誘導因子をコードするｍＲＮＡを体細胞に導入して脱分化した細胞を作製することを含む、体細胞を脱分化させるための方法を提供する。
【００２９】
いくつかの実施態様において、本発明は、１つ以上のｉＰＳＣ誘導因子をコードするｍＲＮＡを体細胞に導入すること、および、細胞が生存可能でありかつ細胞に導入されるｍＲＮＡが、脱分化した細胞を作製するのに十分な量かつ十分な時間で翻訳される条件下で、細胞を維持することを含む、体細胞を脱分化させるための方法を提供する。いくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞は、人工多能性幹細胞である。
【００３０】
いくつかの実施態様において、本発明は、１つ以上の再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを細胞に導入すること、および、細胞が生存可能でありかつ、細胞に導入されるｍＲＮＡが、該ｍＲＮＡが導入された細胞と比較して、分化の変化した状態を呈する細胞を作製するのに十分な量かつ十分な時間で翻訳される条件下で細胞を維持することを含む、真核細胞の分化の状態（または分化した状態）を変化させるための方法を提供する。
【００３１】
いくつかの実施態様において、本発明は、１つ以上の再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを細胞に導入すること、および、細胞が生存可能でありかつ細胞に導入されるｍＲＮＡが、該ｍＲＮＡが導入された細胞と比較して分化の変化した状態を呈する細胞を作製するのに十分な量および十分な時間で翻訳される条件下で細胞を維持することを含む、真核細胞の分化の状態を変化させるための方法を提供する。いくつかの実施態様において、分化の変化した状態は、該ｍＲＮＡが導入された細胞と比較して、分化の脱分化した状態である。例えば、いくつかの実施態様において、分化の変化した状態を呈する細胞は、該ｍＲＮＡが導入された体細胞（例えば、線維芽細胞、心筋細胞、または別の分化した細胞種類へと分化する細胞）と比較して脱分化する多能性幹細胞である。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡが導入される細胞は、１つの細胞系列、表現型、または機能の体細胞であり、分化の変化した状態を呈する細胞は、ｍＲＮＡが導入された細胞のものとは異なる細胞系列、表現型、または機能を呈する体細胞であり、したがって、これらの実施態様において、該方法は、分化転換を結果として生じる（Graf and Enver 2009）。
【００３２】
本発明は、ｍＲＮＡが導入される特定の細胞に関して限定されない。先の方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、ｍＲＮＡが導入される細胞は、任意の多細胞性真核生物に由来する。先の方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、ｍＲＮＡが導入される細胞は、ヒト細胞および別の動物細胞のうちから選択される。本明細書に呈される作業は、ヒトまたは他の動物の細胞を用いて実施されたが、本出願者はさらに、人および動物の細胞を、１つ以上の精製された一本鎖ｍＲＮＡ分子（該分子の各々は、タンパク質再プログラム化因子（例えば、転写因子）をコードする）からなる精製されたＲＮＡ調製物と接触させることよって、該細胞を再プログラム化することを含む、本発明の方法が、他の真核細胞（例えば、植物細胞および真菌細胞）の再プログラム化にも関することをさらに主張する。先の方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、ｍＲＮＡが導入される細胞は、公知の疾患のない生物体に由来する正常細胞である。先の方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、ｍＲＮＡが導入される細胞は、公知の疾患を有する生物体に由来する細胞である。先の方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、ｍＲＮＡが導入される細胞は、公知の病態のない細胞である。先の方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、ｍＲＮＡが導入される細胞は、疾患状態または公知の病態を呈する細胞（癌細胞、または糖尿病細胞に特徴的な代謝特性を呈する膵ベータ細胞）である。
【００３３】
本発明は、脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）を作製するために、１つ以上のｉＰＳＣ細胞誘導因子をコードするｍＲＮＡを導入することを含む本方法の実施態様における特異的な細胞種類の使用に（例えば、特異的な体細胞種類に）限定されない。ｉＰＳ細胞誘導因子を用いて脱分化できるる任意の細胞が熟慮される。このような細胞には、線維芽細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核臍帯血における細胞、頬粘膜細胞、肝細胞、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７、または他の癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、細胞は、インビトロ（例えば、培養液中）またはインビボに存在する。いくつかの実施態様において、培養物中で発生させる場合、無細胞馴化培地（例えば、ＭＥＦ馴化培地）が用いられる。下に示されるように、このような培地は、亢進したｉＰＳ細胞発生を提供した。本発明はしかしながら、用いられる培養条件に限定されない。（例えば、体細胞からｉＰＳを作製して該細胞を維持するための）現在公知のまたは本発明の方法に有用であるとして後に特定される任意の培養条件または培地が、本発明を用いた使用のために企図される。例えば、好ましくはないが、本方法のいくつかの実施態様において、本方法を用いて処理される細胞を培養するために、フィーダー細胞層が馴化培地の替わりに用いられる。
【００３４】
これらの方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、ｍＲＮＡを導入する工程は、該ｍＲＮＡを細胞（例えば、ヒトまたは他の動物の体細胞）に形質移入試薬（例えば、ＴＲＡＮＳＩＴ（商標）ｍＲＮＡ形質移入試薬、ＭｉｒｕｓＢｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて送達することを含む。
【００３５】
しかしながら、本発明は、利用される形質移入方法の性質によって限定されない。実際、ｍＲＮＡ分子を細胞にインビトロまたはインビボで送達することのできる公知のまたは将来特定される任意の形質移入プロセスが熟慮され、これには、培養物中のまたは生命支持培地中の細胞が、単離された細胞または真核生物の組織もしくは臓器を含む細胞を含むのであろうと、該細胞に該ｍＲＮＡを送達する方法、あるいは、ヒト、動物、植物、または真菌などの生物体における細胞に該ｍＲＮＡをインビボで送達する方法が含まれる。いくつかの実施態様において、形質移入試薬は、脂質（例えば、リポソーム、ミセルなど）を含む。いくつかの実施態様において、形質移入試薬は、ナノ粒子またはナノチューブを含む。いくつかの実施態様において、形質移入試薬は、陽イオン性化合物（例えば、ポリエチレンイミン、またはＰＥＩ）を含む。いくつかの実施態様において、形質移入方法は、該ｍＲＮＡを細胞に（例えば、電気穿孔法によって）送達するために電流を用いる。いくつかの実施態様において、形質移入方法は、微粒子銃法を用いて、該ｍＲＮＡを細胞に送達する（例えば、「遺伝子銃」または「微粒子銃粒子送達システム」）。
【００３６】
本明細書に呈されるデータは、細胞に導入されるｍＲＮＡに関して、本明細書で説明される実施例において用いられるある量のｍＲＮＡが結果的に、他の量のｍＲＮＡよりも用いられる特定の体細胞からの多能性幹細胞のより高い効率およびより迅速な誘導を生じたことを示す。しかしながら、本発明の方法は、細胞に導入する特定量のｍＲＮＡの使用に限定されない。例えば、いくつかの実施態様において、各用量が、各々異なるヒト再プログラム化因子をコードする各６の異なるｍＲＮＡを１８マイクログラム含む合計３回用量を用いて、ｍＲＮＡを１０ｃｍプレートにおけるおよそ３×１０５のヒト線維芽細胞に導入したが、あの実施態様において、より多量のまたはより少量のｍＲＮＡを用いて、細胞に導入した。
【００３７】
本発明は、用いられるｍＲＮＡの特定の化学的形態に限定されないが、ある形態のｍＲＮＡは、より効率的な結果を生じ得る。しかしながら、いくつかの好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、（例えば、プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２’−ＯＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、およびＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される）少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを、対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの少なくとも一部の替わりに含む（いくつかの好ましい実施態様において、実質的にすべての対応する修飾されていないＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴの通常のヌクレオシドの替わりに少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド）。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡは、ポリアデニル化されている。いくつかの好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、インビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡのポリアデニル化によって調製され、該方法は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（例えば、酵母ＲＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を用いてＩＶＴ  ＲＮＡを接触させることを含む。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）末端をコードするＤＮＡテンプレートを用いることによって、ＩＶＴの間にポリアデニル化される。ＲＮＡがポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて、またはＤＮＡテンプレートのＩＶＴの間にポリアデニル化されるかどうかにかかわらず、いくつかの好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、ポリＡ末端（例えば、５０〜２００ヌクレオチド、例えば、好ましくは１００〜２００、１５０〜２００ヌクレオチド、または１５０ヌクレオチド超を有するポリＡ末端）を含むが、いくつかの実施態様において、より長いまたはより短いポリＡ末端が用いられる。いくつかの実施態様において、本方法において用いられるｍＲＮＡがキャッピングされる。細胞における発現の効率性を最大化するために、大部分のｍＲＮＡ分子がキャップを含有することが好ましい。いくつかの好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、本方法において用いられるｍＲＮＡ分子は、キャッピング酵素系の存在下で、キャッピングされていない一次ＲＮＡをインキュベートすることによって、インビトロで合成される。いくつかの好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、キャッピング酵素反応において用いられる一次ＲＮＡは、合成されるべきＲＮＡをコードするＤＮＡ分子のインビトロでの転写（ＩＶＴ）によって合成される。合成されるべきＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有し、これに、ＲＮＡポリメラーゼが結合して、そこから転写を開始する。また、ｍＲＮＡ分子がしばしば、翻訳開始コドンの前および翻訳されていない翻訳終止コドンの後に配置される異なる配列の領域を有することは、当該技術分野において公知である。それぞれ、５プライム非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３プライム非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と呼ばれるこれらの領域は、ｍＲＮＡの安定性、ｍＲＮＡの局在、およびそれらの結合したｍＲＮＡの翻訳効率に影響を及ぼし得る。アルファグロビンおよびベータグロビンについてのものなど、あ��５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡの安定性およびｍＲＮＡの発現を改良することが公知である。したがって、いくつかの好ましい実施態様において、再プログラム化因子（例えば、ｉＰＳＣ誘導因子）をコードするｍＲＮＡは、該細胞においてより大きなｍＲＮＡ安定性およびより高いｍＲＮＡ発現を結果として生じる５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ（例えば、アルファグロビンまたはベータグロブンの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ、例えば、アフリカツメガエルまたはヒトのアルファグロブリンまたはベータグロブリンの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ、あるいは、例えば、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）の５’ＵＴＲ）を呈する。
【００３８】
ＩＶＴは、ＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡの合成が、個々の同族のＲＮＡポリメラーゼプロモーターから特異的かつ十分に開始され、かつ完全長のｍＲＮＡが得られる限り、任意のＲＮＡポリメラーゼを用いて実施されることができる。いくつかの好ましい実施態様において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、およびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼのうちから選択される。いくつかの他の実施態様において、キャッピングされたＲＮＡは、ＩＶＴ反応におけるジヌクレオチドキャップアナログを用いること（例えば、ＡＭＰＬＩＣＡＰ（商標）Ｔ７キットまたはＭＥＳＳＡＧＥＭＡＸ（商標）Ｔ７  ＡＲＣＡ−ＣＡＰＰＥＤ  ＭＥＳＳＡＧＥ転写キット、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥまたはＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡを用いること）によって、同時転写的に合成される。キャッピングが同時転写的に実施される場合、好ましくは、ジヌクレオチドキャップアナログは、抗逆キャップアナログ（ＡＲＣＡ）である。しかしながら、個別のＩＶＴ反応の使用に続く、およそ１００％のＲＮＡがキャッピングされる結果を生じるキャッピング酵素系を用いたキャッピングは、典型的には、約８０％のＲＮＡしかキャッピングされないことを結果として生じる同時転写キャッピングよりも好ましい。したがって、いくつかの好ましい実施態様において、本発明の方法において用いられるｍＲＮＡ分子のより高い割合がキャッピングされる（ｍＲＮＡ分子の集団の８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超、９９．５％超、または９９．９％超がキャッピングされる）。いくつかの好ましい実施態様において、本発明の方法において用いられるｍＲＮＡは、キャップ１構造を備えたキャップを有しており、キャップヌクレオチドに関して最後から２番目のヌクレオチドにおけるリボースの２’ヒドロキシルがメチル化されることを意味する。しかしながら、いくつかの実施態様において、本方法において用いられるｍＲＮＡは、キャップ０を備えたキャップを有しており、キャップヌクレオチドに関して最後から２番目のヌクレオチドにおけるリボースの２’ヒドロキシルがメチル化されていないことを意味する。いくつかの、しかしすべてではない転写産物を用いて、キャップ１構造を備えたキャップを有するｍＲＮＡを用いた真核細胞の形質移入は、同じ細胞の同じｍＲＮＡを用いるが、キャップ０構造を有するキャップを用いた形質移入と比較して、形質移入された細胞におけるより高レベルのまたはより長い持続時間のタンパク質の発現を結果的に生じる。いくつかの実施態様において、本発明の方法において用いられるｍＲＮＡは、修飾されたキャップヌクレオチドを有する。本明細書の実施例において呈される実験の前に実施されたいくつかの実験において、本出願者は、１０７９またはＩＭＲ９０ヒト線維芽細胞に、ウリジンまたはウリジンの替わりのプソイドウリジンのいずれかを含有するＯＣＴ４ｍＲＮＡを形質移入した場合、ウリジンを含有するｍＲＮＡよりもプソイドウリジン含有ｍＲＮＡを高レベルで、または長い持続時間で翻訳することを発見した。それゆえ、いくつかの好ましい実施態様において、本発明の方��において用いられるｍＲＮＡ（複数可）において含有されるウリジンのうちの１つ以上またはすべては、プソイドウリジンによって置換される（例えば、ウリジン−５’−三リン酸の替わりに該ＲＮＡを合成するために、ＩＶＴ反応におけるプソイドウリジン−５’−三リン酸を置換することによる）。しかしながら、いくつかの実施態様において、本発明の方法において用いられるｍＲＮＡは、ウリジンを含有し、かつプソイドウリジンを含有しない。いくつかの好ましい実施態様において、該ｍＲＮＡは、（プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２’−ＯＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、およびＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される）少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを、対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの少なくとも一部の替わりに（例えば、対応する修飾されていないＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴの通常のヌクレオシドの実質的にすべての替わりに）含む。いくつかの好ましい実施態様において、該ｍＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）および５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの好ましい実施態様において、該ｍＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）および５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）の両方を含む。加えて、特定の目標を達成するために、本発明の方法のいずれにおいても真核細胞に導入されるｍＲＮＡのヌクレオチドの１つ以上における核酸塩基、糖部分、またはヌクレオチド間結合は、修飾された核酸塩基、糖部分、またはヌクレオチド間結合を含んでもよい。
【００３９】
本発明は、本発明の方法のいずれかにおける真核細胞に送達されるｍＲＮＡの源に関しても限定されない。実施例において説明されるものなど、いくつかの実施態様において、該ｍＲＮＡは、線形化したプラスミドベクターにおいてクローン化された遺伝子を含むＤＮＡテンプレートのインビトロでの転写によって、またはＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲによって（すなわち、ＰＣＲ像副産物のＩＶＴによって）合成されるＤＮＡテンプレートのインビトロでの転写によって、キャッピング酵素系を用いたキャッピングによって、またはＩＶＴ、およびポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いるポリアデニル化の間のジヌクレオチドキャップアナログ（例えば、ＡＲＣＡ）の組み込みによる同時転写キャッピングによって合成される。いくつかの好ましい実施態様において、該ｍＲＮＡは、線形化されたプラスミドベクターにおいてクローン化された遺伝子またはＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲの増幅産物を含むＤＮＡテンプレートのＩＶＴによって合成され、この中で、ＤＮＡテンプレートは、３’ポリ（Ａ）末端をコードする。いくつかの他の実施態様において、本発明の方法のいずれかにおいて真核細胞に送達されるｍＲＮＡは、細胞または生物試料に直接由来する。例えば、いくつかの実施態様において、細胞または生物試料に由来するｍＲＮＡは、ＲＮＡ増幅反応を用いてｍＲＮＡを細胞または生物試料から増幅すること、および増幅されたｍＲＮＡを、キャッピング酵素系を用いてキャッピングすることまたはＩＶＴ中のジヌクレオチドキャップアナログ（例えば、ＡＲＣＡ）の組み込みによる同時転写キャッピングによって得られ、増幅されたｍＲＮＡが、ＲＮＡ増幅反応由来のテンプレートでコードされたポリ（Ａ）末端をすでに含有していない場合、増幅されたｍＲＮＡを、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリアデニル化する。
【００４０】
脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）を作製するために、１つ以上のｉＰＳ細胞誘導因子をコードするｍＲＮＡを導入することを含む方法に関して、本発明は、用いられるｉＰＳ細胞誘導因子の性質によって限定されない。脱分化における使用が見出される今や公知の、または後に発見される１つ以上のタンパク質誘導因子をコードする任意のｍＲＮＡが、本発明における使用について企図される。いくつかの実施態様において、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、またはＳＯＸ２をコードする１つ以上のｍＲＮＡが採用される。Ｏｃｔ−３／４および、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーのうちのあるメンバー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）は、誘導プロセスに包含される転写調節因子として同定されている。しかしながら、Ｋｌｆファミリーのうちのあるメンバー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、およびＮ−ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８を含む追加的な遺伝子は、誘導効率を高めることが確認されている。任意の１つ以上のこのような因子を所望の通り用いてもよい。
【００４１】
本発明の組成物および方法は、ｉＰＳ細胞を作製するために用いられ得るが、本発明は、このような細胞の作製に限定されない。例えば、いくつかの実施態様において、１つ以上の再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入された細胞と比較して分化の変化した状態を有する細胞を作製するために、細胞に導入される。例えば、いくつかの実施態様において、１つ以上のｉＰＳ細胞誘導因子をコードするｍＲＮＡを用いて、ｉＰＳ細胞ではない脱分化した細胞を作製する。このような細胞は、研究、薬剤スクリーニング、および他の用途における使用が見出される。
【００４２】
いくつかの実施態様において、本発明はさらに、先の方法によって作製された脱分化した細胞を採用する方法を提供する。例えば、このような細胞は、ヒトまたは他の動物における研究、薬剤スクリーニング、および治療用途における使用が見出される。例えば、いくつかの実施態様において、作製された細胞は、ｉＰＳ細胞誘導因子および分化または脱分化と関連した他の因子の特定および特徴づけにおける使用が見出される。いくつかの実施態様において、作製された脱分化した細胞を生物体に、またはインビトロもしくはインビボで存在する組織に移植する。いくつかの実施態様において、作製された細胞の寄主となる生物体、組織、または培養系は、試験化合物に曝露され、細胞に及ぼすまたは生物体、組織、もしくは培養系に及ぼす試験化合物の効果が観察または測定される。
【００４３】
いくつかの実施態様において、上記の方法を用いて作製された脱分化細胞（例えばｉＰＳ細胞）は、該作製された脱分化細胞が由来する体細胞と比較して同じ分化状態または細胞種類を有する分化細胞を作製するためにさらに処理される。他のいくつかの実施態様では、上記の方法を用いて作製された脱分化細胞（例えばｉＰＳ細胞）は、該作製された脱分化細胞が由来する体細胞と比較して異なる分化状態または細胞種類を有する分化細胞を作製するためにさらに処理される。いくつかの実施態様において、分化細胞は、１つまたは複数の処理の間に、１つ以上の再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを、作製されたｉＰＳ細胞に導入し、ｍＲＮＡが導入された細胞を、その細胞が生存可能であり、１つ以上の再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡが導入された、作製された脱分化細胞（例えば作製されたｉＰＳ細胞）と比較して変更した分化状態または細胞種類を有する細胞に分化させる条件下で維持することにより、作製された脱分化細胞（例えば作製されたｉＰＳ細胞）から作製される。これらの実施態様のいくつかにおいて、変更された分化状態を有する作製された分化細胞は、（例えば、ヒトまたは他の動物における）研究、薬剤スクリーニング、および治療用途に使用される。例えば、作製された分化細胞は、分化に関連する再プログラム化因子の特定および特性決定において用途が見出される。いくつかの実施態様において、作製された分化細胞は生物体に移植されるか、インビトロあるいはインビボで存在する組織に移植される。いくつかの実施態様では、作製された分化細胞の寄主となる生物体、組織、または培養系が試験化合物に曝露され、該生物体、組織、または培養系に及ぼす試験化合物の効果が観察または測定される。
【００４４】
１つ以上のｉＰＳＣ誘導因子をコードするｍＲＮＡを体細胞に導入することと、該細胞が生存可能であり、かつ細胞に導入されるｍＲＮＡが脱分化した細胞を作製するのに十分な量かつ十分な時間発現する条件下で細胞を維持することとを含む（例えば、この中で、脱分化した細胞は、人工多能性幹細胞である）方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するのに十分な時間は、１週間未満である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、ｍＲＮＡが導入される３×１０５の移入された細胞あたり５０以上の脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣ）である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、ｍＲＮＡが導入される３×１０５の移入された細胞あたり１００以上の脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣ）である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、ｍＲＮＡが導入される３×１０５の移入された細胞あたり１５０以上の脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣ）である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、ｍＲＮＡが導入される３×１０５の移入された細胞あたり２００以上の脱分化した細胞である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣ）を作製するための再プログラム化効率は、ｍＲＮＡが導入される３×１０５の移入された細胞あたり３００以上の脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣ）である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、ｍＲＮＡが導入される３×１０５の投入された細胞あたり４００以上の脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣ）である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、ｍＲＮＡが導入される３×１０５の移入された細胞あたり５００以上の脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣ）である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、ｍＲＮＡが導入される３×１０５の移入された細胞あたり６００以上の脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣ）である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、ｍＲＮＡが導入される３×１０５の移入された細胞あたり７００以上の脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣ）である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、ｍＲＮＡが導入される３×１０５の移入された細胞あたり８００以上の脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣ）である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、ｍＲＮＡが導入される３×１０５の移入された細胞あたり９００以上の脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣ）である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、ｍＲＮＡが導入��れる３×１０５の移入された細胞あたり１０００以上の脱分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣ）である。したがって、いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも２倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも５倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも１０倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも２０倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも２５倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも３０倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールより３５倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも４０倍超効率的であった。
【００４５】
本発明は、本方法において用いられるか有用な、および／または本明細書に記載される方法により作製される組成物（系、キット、反応混合物、細胞、ｍＲＮＡ）をさらに提供する。例えば、いくつかの実施態様において、本発明は、ｉＰＳ細胞誘導因子をコードするｍＲＮＡを提供し、該ｍＲＮＡは、ウリジンに替えてプソイドウリジンを有する。
【００４６】
本発明は、形質移入試薬およびｉＰＳ細胞誘導因子をコードするｍＲＮＡ（例えば、形質移入試薬およびｍＲＮＡの混合物）を含む組成物をさらに提供する。いくつかの好ましい実施態様において、この組成物は、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２を含むがこれらに限定されない複数（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ）のｉＰＳ細胞誘導因子をコードするｍＲＮＡを含む。
【００４７】
前記組成物はさらに、本明細書に説明される方法のいずれかを実施するのに十分な、必要な、または有用な任意の他の試薬または成分を含んでもよい。このような試薬または成分には、形質移入試薬、培地（例えば、ＭＥＦ馴化培地）、細胞（例えば、体細胞、ｉＰＳ細胞）、容器、箱、緩衝液、阻害剤（例えば、ＲＮａｓｅ阻害剤）標識（例えば、蛍光、発光、放射性等）、陽性および／または陰性対照分子、キャッピングされたｍＲＮＡを作製するための試薬、ドライアイスまたは他の保冷材、使用のための説明書、細胞培養用具、検出／分析用具、ならびにこれらに類するものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４８】
本発明は、プソイドウリジンもしくは修飾されたヌクレオシドを含むＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子、それらを含む遺伝子療法ベクター、それらを含む遺伝子療法および遺伝子転写サイレンシング方法、それらの免疫原性を低下させる方法、およびそれらを合成する方法を提供する。
【００４９】
一実施態様において、本発明は、プソイドウリジン残基を含むメッセンジャーＲＮＡを提供する。別の実施態様において、本発明は、関心対象のタンパク質をコードするＲＮＡ分子を提供し、該ＲＮＡ分子は、プソイドウリジン残基を含む。別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むインビトロで転写されるＲＮＡ分子を提供する。別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むインビトロで合成されたオリゴリボヌクレオチドを提供し、この中で、修飾されたヌクレオシドは、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ψ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕである。別の実施態様において、本発明は、インビトロで合成されたポリリボヌクレオチド分子を含む遺伝子療法ベクターを提供し、この中で、ポリリボヌクレオチド分子は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む。
【００５０】
別の実施態様において、本発明は、その配列の一部としてプソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含有する、およびｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをさらに含む、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を提供する。別の実施態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、長さ５０ヌクレオチド超である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【００５１】
別の実施態様において、本発明は、哺乳類細胞を、組換えタンパク質をコードするインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ（該インビトロで合成されたＲＮＡ分子は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む）、それにより哺乳類細胞を誘導して、組換えタンパク質を産生することを含む、哺乳類細胞を誘導して、組換えタンパク質を産生するための方法を提供する。
【００５２】
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞をインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ（該インビトロで合成されたＲＮＡ分子は、エリスロポエチンをコードする）、それにより対象における貧血を治療することを含む、対象における貧血を治療する方法を提供する。
【００５３】
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞をインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ（インビトロで合成されたＲＮＡ分子は、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）をコードする）、それにより対象における血管攣縮を治療することを含む、対象における血管攣縮を治療するための方法を提供する。
【００５４】
別の実施態様において、本発明は、対象における細胞を、インビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ（該インビトロで合成されたＲＮＡ分子は、熱ショックタンパク質をコードする）、それにより対象における細胞の生存率を改良することを含む、該細胞の生存率を改良するための方法を提供する。
【００５５】
別の実施態様において、本発明は、血管の細胞をインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ（該インビトロで合成されたＲＮＡ分子は、熱ショックタンパク質をコードする）、それにより対象における再狭窄の発生率を低下させることを含む、血管を拡張させる手順後の血管の再狭窄の発生率を低下させる方法を提供する。
【００５６】
別の実施態様において、本発明は、頭皮の細胞をインビトロで合成された分子と接触させ（インビトロで合成されたＲＮＡ分子は、テロメラーゼまたは免疫抑制タンパク質をコードする）、それにより毛髪濾胞からの発毛を高めることを含む、対象の頭皮における濾胞からの発毛を高めるための方法を提供する。
【００５７】
別の実施態様において、本発明は、細胞をインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ（該インビトロで合成されたＲＮＡ分子は、抗酸化活性を有する酵素をコードする）、それにより細胞における該酵素の発現を誘導することを含む、該細胞における抗酸化活性を有する酵素の発現を誘導する方法を提供する。
【００５８】
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞をインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ（該インビトロで合成されたＲＮＡ分子は、嚢胞性線維症幕貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードする）、それにより対象における嚢胞性線維症を治療することを含む、対象における嚢胞性線維症を治療するための方法を提供する。
【００５９】
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞をインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ（該インビトロで合成されたＲＮＡ分子は、ブルトン型チロシンキナーゼをコードする）、それによりＸ連鎖無ガンマグロブリン血症を治療することを含む、対象におけるＸ連鎖無ガンマグロブリン血症を治療するための方法を提供する。
【００６０】
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞をインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ（該インビトロで合成されたＲＮＡ分子は、ＡＤＡをコードする）、それによりＡＤＡ  ＳＣＩＤを治療することを含む、対象におけるアデノシンデアミナーゼ重症複合免疫不全（ＡＤＡ  ＳＣＩＤ）を治療するための方法を提供する。
【００６１】
別の実施態様において、本発明は、インビトロ翻訳装置￥をインビトロで合成されたポリリボヌクレオチドと接触させ（該インビトロで合成されたポリリボヌクレオチドは、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む）、それにより組換えタンパク質を産生することを含む、組換えタンパク質を産生するための方法を提供する。
【００６２】
別の実施態様において、本発明は、単離されたポリメラーゼを、修飾されていないヌクレオチドと修飾されたヌクレオチドとの混合物と接触させることを含む、プソイドウリジンにより修飾されたヌクレオシドを有する修飾されたヌクレオチドを含むインビトロで転写されるＲＮＡ分子を合成する方法を提供する。
【００６３】
別の実施態様において、本発明は、修飾されていないヌクレオチド、プソイドウリジンもしくは修飾されたヌクレオシドを含有するヌクレオチド、およびポリメラーゼを含む、インビトロでの転写装置を提供する。別の実施態様において、本発明は、修飾されていないヌクレオチド、プソイドウリジンもしくは修飾されたヌクレオシドを含有するヌクレオチド、およびポリメラーゼを含むインビトロ転写キットを提供する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
以下の図は、本明細書の部分を形成し、本発明のある態様をさらに示すよう含まれる。本発明は、本明細書に呈される具体的な実施態様に関する詳細な説明との組み合わせで、これらの図の１つ以上に対する引用によりより良好に理解され得る。
【図１】図１は、実施例において説明されるように調製された６のヒト再プログラム化因子の各々をコードするｍＲＮＡが、ヒト新生児１０７９線維芽細胞への形質移入後に翻訳され、および推定細胞下位置に局在することを示す。未処理のヒト１０７９線維芽細胞：写真Ａ、Ｅ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、およびＵは、再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡで形質転換されていない未処理のヒト１０７９線維芽細胞の位相差画像を示し、写真Ｂ、Ｆ、Ｊ、Ｎ、Ｒ、およびＶは、細胞が各再プログラム化因子に特異的な抗体を用いて染色した後の同じ場の蛍光画像を示し、これらの結果は、未処理のヒト１０７９線維芽細胞において、これらの内在性再プログラム化因子タンパク質がほとんどまたは全くなかったことを示す。処理したヒト１０７９線維芽細胞：写真Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｏ、Ｓ、およびＷは、示された再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを形質移入したヒト１０７９線維芽細胞の位相差画像を示し、写真Ｄ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、およびＸは、細胞が形質移入２４時間後に各再プログラム化因子に特異的な抗体を用いて染色した後の同じ場の蛍光画像を示す。これらの結果は、再プログラム化因子タンパク質の各々が、個々の再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを用いた形質移入の２４時間後にヒトの１０７９の線維芽細胞において発現したこと、および再プログラム化因子タンパク質が、推定細胞下位置に局在したことを示す。Ａ〜Ｔは、２０倍の倍率である。Ｕ〜Ｘは、１０倍の倍率である。
【図２】図２は、ヒト再プログラム化因子（ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）をコードするｍＲＮＡが、ヒト体細胞におけるｉＰＳ細胞を作製することを示す。図２は、再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを用いた最終的な形質移入の１２日後のｉＰＳの明視野（Ａ、Ｃ）画像および免疫蛍光（Ｂ、Ｄ）画像を示す。ＮＡＮＯＧ染色は、コロニー＃１（Ｂ、Ｄ）において観察される。画像ＡおよびＢは１０倍の倍率である。ＣおよびＤは２０倍の倍率である。
【図３】図３は、ヒト１０７９およびＩＭＲ９０体細胞由来のｉＰＳコロニーが、ＮＡＮＯＧおよびＴＲＡ−１−６０に対して陽性であることを示す。図３は、１０７９細胞（Ａ、Ｄ）およびＩＭＲ９０細胞（Ｇ）由来のｉＰＳコロニーの位相差（Ａ、Ｄ、Ｇ）画像および免疫蛍光（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ）画像を示す。（Ａ）に示される同じｉＰＳコロニーは、ＮＡＮＯＧ（Ｂ）およびＴＲＡ−１−６０（Ｃ）の両方について陽性である。（Ｄ）に示されるｉＰＳコロニーは、ＮＡＮＯＧ陽性（Ｅ）およびＴＲＡ−１−６０陽性（Ｆ）である。ＩＭＲ９０線維芽細胞（Ｇ）から作製されたｉＰＳコロニーも、ＮＡＮＯＧ（Ｈ）およびＴＲＡ−１−６０（Ｉ）について陽性である。すべての画像は２０倍の倍率である。
【図４】図４は、迅速な亢進した効率のｉＰＳＣコロニー形成が、細胞に、ＭＥＦ馴化培地において再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを形質移入することによって達成されることを示す。２００超のコロニーを、最終的な形質移入の３日後に検出し、１０ｃｍ皿において、ＩＭＲ９０細胞に３６μｇの（すなわち、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２をコードする）各再プログラム化ｍＲＮＡを３回形質移入した。代表的なｉＰＳＣコロニーを、４倍（Ａ、Ｂ）、１０倍（Ｃ〜Ｅ）、および２０倍の倍率（Ｆ）で示す。６の再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを用いた最終的なｍＲＮＡ形質移入の８日後、１０００超のｉＰＳＣコロニーを、１８μｇ（Ｇ、Ｉ）または３６μｇ（Ｈ）の６のｍＲＮＡの各々を形質移入したＩＭＲ９０細胞において計数した。代表的なコロニーを４倍の倍率（Ｇ〜Ｈ）および１０倍の倍率（Ｉ）で示す。
【図５】図５は、１０７９由来およびＩＭＲ９０由来のｉＰＳＣコロニーが、ＮＡＮＯＧおよびＴＲＡ−１−６０について陽性であることを示す。６つの再プログラム化因子の各々について３６μｇのｍＲＮＡを用いた最終的なｍＲＮＡ形質移入の８日後、１０７９由来のｉＰＳＣコロニー（Ａ、Ｄ、およびＧに示す）は、ＮＡＮＯＧ（Ｂ、Ｅ、およびＨ）およびＴＲＡ−１−６０（Ｃ、Ｆ、およびＩ）について陽性である。６つの再プログラム化因子の各々について１８μｇ（Ｊ〜Ｌ）または３６μｇ（Ｍ〜Ｏ）のｍＲＮＡを用いた最終的なｍＲＮＡ形質移入の８日後、ＩＭＲ９０由来のｉＰＳコロニーも、ＮＡＮＯＧ（Ｋ、Ｎ）およびＴＲＡ−１−６０（Ｌ、Ｏ）について陽性である。
【図６】天然ＲＮＡを用いて形質移入したＭＤＤＣによるＴＮＦ−αの産生であり、修飾されていないインビトロで合成されたＲＮＡおよび細菌ＲＮＡおよび哺乳類ミトコンドリアＲＮＡが非常に免疫原性であるのに対し、他の哺乳類ＲＮＡが弱い免疫原性であることを示す。ヒトＭＤＤＣを単独のあるいはＲ−８４８（１μｇ／ｍＬ）または２９３細胞（全ＲＮＡ、核ＲＮＡ、および細胞質ＲＮＡ）、マウス心臓（ポリＡ＋ｍＲＮＡ）、ヒト血小板ミトコンドリアＲＮＡ、ウシｔＲＮＡ、細菌ｔＲＮＡ、およびＲＮａｓｅ消化を有するもしくは有さない全ＲＮＡ（大腸菌）と複合体形成したＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）とともにインキュベートした。８時間後、ＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにより上清中で測定した。平均値±標準誤差を示す。結果は、３つの独立した実験の代表値である。
【図７】ＲＮＡによるＴＬＲ依存性活性化は、ｍ６Ａ修飾およびｓ２Ｕ修飾がＴＬＲ３シグナル伝達を遮断するのに対し、すべての修飾がＴＬＲ７およびＴＬＲ８のシグナル伝達を遮断すること、ならびに、より少なく修飾されている細菌ＲＮＡおよび修飾されていないインビトロで転写されるＲＮＡが３つのＴＬＲすべてを活性化することを示す。（Ａ）ｍ５Ｃ、ｍ６Ａ、Ψ、ｍ５Ｕ、またはＳ２Ｕヌクレオシド修飾を有さない（なし）または有するインビトロで転写されるＲＮＡ−１５７１の一定分量（１μｇ）を、変性アガロースゲルに続いて臭化エチジウム染色およびＵＶ照明において分析した。（Ｂ）ヒトＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および対照ベクターを発現する２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）単独、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）−Ｒ−８４８（１μｇ／ｍＬ）、またはＲＮＡ（５μｇ／ｍＬ）で処理した。ＲＮＡ−７３０およびＲＮＡ−１５７１において存在する修飾されたヌクレオシドに注意する。（Ｃ）ＣｐＧ  ＯＤＮ−２００６（５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１．０μｇ／ｍＬ）、およびＲＮＡ単離物をラット肝臓、マウス細胞株（ＴＵＢＯ）、およびヒト脾臓（全体）、ヒト血小板ミトコンドリアＲＮＡ、または２つの異なる大腸菌源から得た。２９３−ｈＴＬＲ９細胞は、対照として機能した。８時間後、ＩＬ−８をＥＬＩＳＡによる上清において測定した。平均値±標準誤差を示す。ｈＴＬＲ３を標的にしたｓｉＲＮＡを含有する細胞株を星印で示す。結果は、４つの独立した実験の代表値である。
【図８】ＲＮＡを形質移入した樹状細胞によるサイトカイン産生は、すべての修飾がサイトカイン産生樹状細胞の活性化を遮断するのに対し、ウリジン修飾のみが血液由来の樹状細胞活性化を遮断することを示す。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４（Ａ、Ｃ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮ−α  ＭＤＤＣ（Ｂ）を用いて作製されたＭＤＤＣ、および初代樹状細胞１および樹状細胞２（Ｄ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）単独、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）−Ｒ−８４８（１μｇ／ｍＬ）、またはＲＮＡ（５μｇ／ｍＬ）で８〜１６時間処理した。ＲＮＡ−１５７１に存在する修飾されたヌクレオシドに注意する。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２（ｐ７０）、およびＩＦＮ−αを、ＥＬＩＳＡによって上清中で測定した。平均値±標準誤差を示す。結果は、１０（ＡおよびＣ）、４（Ｂ）、および６（Ｄ）の独立した実験の代表値である。Ｅ．ＲＮＡによる樹状細胞の活性化。ＭＤＤＣを、単独または１μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ）：（Ｃ）ともしくは陽性対照としてのＲ−８４８と複合体形成したＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）で（上部パネル）、あるいは示されるＲＮＡと複合体形成したＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（５μｇ／ｍＬ、下部パネル）で２０時間処理した。ＲＮＡ−１８８６において存在する修飾されたヌクレオシドに注意する。ＣＤ８３、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲの発現をフローサイトメトリーによって決定した。
【図８Ｅ】Ｅ．ＲＮＡによる樹状細胞の活性化。ＭＤＤＣを、単独または１μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ）：（Ｃ）ともしくは陽性対照としてのＲ−８４８と複合体形成したＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）で（上部パネル）、あるいは示されるＲＮＡと複合体形成したＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（５μｇ／ｍＬ、下部パネル）で２０時間処理した。ＲＮＡ−１８８６において存在する修飾されたヌクレオシドに注意する。ＣＤ８３、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲの発現をフローサイトメトリーによって決定した。
【図９】ＲＮＡによる樹状細胞の活性化は、すべてのヌクレオシド修飾がＲＮＡ仲介性の樹状細胞活性化を阻害することを示す。ＭＤＤＣをＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）単独、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）−Ｒ−８４８（１μｇ／ｍＬ）、または示されるように修飾されたＲＮＡ−１５７１（５μｇ／ｍＬ）で２０時間処理した。（Ａ）ＣＤ８３およびＨＬＡ−ＤＲ染色。（Ｂ）ＲＮＡを伴うインキュベーションに対する応答における上清中のＴＮＦ−αレベルならびにＣＤ８０およびＣＤ８６の平均蛍光。培地の容積は、星印によって示されるように、フローサイトメトリーについて３０倍増大した。データは、４の独立した実験の代表値である。
【図１０】異なる量（対応する修飾されていないＮＴＰ  に対する０、１、１０、５０、９０、９９、および１００％の修飾されたヌクレオシド）を含有するキャッピングされたＲＮＡ−１５７１を転写し、数個のヌクレオシドのみの修飾が樹状細胞の活性化の阻害を結果的に生じることを見出した。（Ａ）すべての転写産物を一リン酸に消化し、逆相ＨＰＬＣによって分析して、修飾されたヌクレオシド組み込みの相対量を決定した。示される（Ψ：Ｕ）比で得られた代表的な吸光度特性を示す。プソイドウリジン（Ψ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、７−メチルグアノシン（「ｍ７Ｇ」）、およびアデノシン（「Ａ」）について、溶出時間に注意する。（Ｂ）ＲＮＡ−１５７１の修飾されたヌクレオシド含有量。ＲＮＡ−１５７１におけるｍ６Ａ、Ψ（プソイドウリジン）、またはｍ５Ｃの期待される割合を、ＲＮＡ−１５７１の転写反応およびヌクレオシド組成（Ａ：５０５、Ｕ：４５１、Ｃ：２７３、Ｇ：３４２）における修飾されたＮＴＰの相対量に基づいて算出した。測定された修飾されたヌクレオシド含有量についての値を、ＨＰＬＣクロマトグラムの定量に基づいて決定した。注記：Ａ：ＡＴＰ、ＵＴＰ、およびＣＴＰそれぞれに対するｍ６ＡＴＰ、ΨＴＰ、またはｍ５ＣＴＰについての値（％）。Ｂ：すべてのＮＭＰに対するｍ６Ａ、Ψ、およびｍ５Ｃ一リン酸についての値。（Ｃ）ＭＤＤＣに、示される量のｍ６Ａ、Ψ、またはｍ５Ｃを含有する、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）と複合体形成したキャッピングされたＲＮＡ−１５７１（５μｇ／ｍＬ）を形質移入した。８時間後、ＴＮＦ−αを上清中で測定した。データは、ＴＮＦ−αの相対的な阻害として表す。３の独立した実験において得られた平均値±標準誤差を示す。
【図１１】オリゴリボヌクレオチドを形質移入された樹状細胞によるＴＮＦ−αの発現は、１つという少ない修飾されたヌクレオシドでも樹状細胞の活性化を低下させることを示す。（Ａ）化学的に合成されたオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ１〜４）の配列（配列番号６〜９）またはインビトロで転写されるオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ５〜６）の配列（配列番号１０〜１１）を示す。修飾されたヌクレオシドＵｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ５Ｃ、およびΨの位置を強調している。ヒトＭＤＤＣにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）単独（培地）、Ｒ−８４８（１μｇ／ｍＬ）、またはＲＮＡ（５μｇ／ｍＬ）と複合体形成したＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を形質移入した。記載するところでは、細胞を２．５μｇ／ｍＬのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理した。８時間のインキュベーション後、ＴＮＦ−αを上清中で測定した。（Ｃ）細胞由来のＲＮＡをノザンブロット法によって分析した。３つの独立した実験の代表的な平均値±標準誤差を示す。
【図１２】Ａ．Ψ修飾したｍＲＮＡは、インビボでの炎症誘発性サイトカイン産生を刺激しない。血清試料（注射６時間後）をＥＬＩＳＡによって分析し、３μｇの修飾されていないｍＲＮＡが、３μｇのΨ修飾されたｍＲＮＡよりも高いレベルのＩＦＮ−αを誘導することを明らかにした（Ｐ＜０．００１）。３μｇのΨ修飾されたｍＲＮＡによって誘導されるＩＦＮ−αのレベルは、動物に複合体形成していないリポフェクチンを注射した場合に得られるものと類似していた。値は、平均±標準誤差として表す（ｎ＝３または５個体／群）。Ｂ．類似の結果をＴＮＦ−αについても観察した。
【図１３】プソイドウリジン（Ψ）を含有するｍＲＮＡは、ＰＫＲを活性化しない。Ψ：プソイドウリジン。対照：修飾されていないＲＮＡ。ｍ５Ｃ：ｍ５Ｃ修飾を有するｍＲＮＡ。
【図１４】ウサギ網状赤血球溶解産物におけるプソイドウリジン含有ｍＲＮＡからのルシフェラーゼの増大した発現。Ｌｕｃ−Ｙ：プソイドウリジン修飾を伴うｍＲＮＡ、ｌｕｃ−Ｃ：修飾されていないＲＮＡ。データを、修飾されていないルシフェラーゼＲＮＡに対してルシフェラーゼ活性を標準化することによって表す。
【図１５】培養された細胞におけるプソイドウリジン含有ｍＲＮＡからのウミシイタケの増大した発現。Ａ．２９３細胞。Ｂ．マウス初代ウシ骨髄由来マウス樹状細胞。ｒｅｎｉｌｌａ−Ｙ：プソイドウリジン修飾を有するｍＲＮＡ、ｒｅｎｉｌｌａ−Ｃ：修飾されていないＲＮＡ。記載されるとおり、ＲＮＡをｍ５Ｃ、ｍ６Ａ、およびｍ５Ｕで修飾した。
【図１６】Ａ．Ψ修飾されたｍＲＮＡの翻訳効率に及ぼす３’要素および５’要素の相加効果。２９３細胞に従来のホタルルシフェラーゼおよびΨ修飾された、５’キャップ（ｃａｐＬｕｃ）、５０ヌクレオチド長の３’ポリＡ末端（ＴＥＶｌｕｃＡ５０）を有したｍＲＮＡ（これらの要素は両方であるかまたはいずれでもない（それぞれ、ｃａｐＴＥＶｌｕｃＡ５０およびＬｕｃ））を形質移入した。細胞を４時間後に溶解し、全溶解産物の一定分量（１／２０）においてルシフェラーゼ活性を測定した。Ｂ．Ψ修飾されたｍＲＮＡは、修飾されていないｍＲＮＡよりも安定である。修飾されていないまたはΨ修飾されたヌクレオシドを含有するｃａｐＴＥＶｌｕｃＡｎを形質移入した２９３細胞を、形質移入後の示される時間に溶解した。一定分量（１／２０）の溶解産物をルシフェラーゼについてアッセイした。標準誤差はあまりにも小さすぎるので、誤差棒で可視化できない。Ｃ．β−ガラクトシダーゼの発現を、従来のｍＲＮＡと比較してΨ修飾されたｍＲＮＡを用いて高める。９６ウェルプレートにおいて播種した２９３細胞にリポフェクチンと複合体形成した、細菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードするｍＲＮＡ（０．２５μｇ／ウェル）を形質移入した。転写産物は、３０ヌクレオチド長（ｃａｐｌａｃＺ）または最大２００ヌクレオチド長（ｃａｐｌａｃＺ−Ａｎ）のいずれかであるキャップおよび３’ポリＡ末端を有した。従来のＵまたはΨヌクレオシドを用いて作製されるコンストラクトを試験した。形質移入の２４時間後、細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌを用いて染色した。代表的なウェルから、倒立顕微鏡検査（４０倍および１００倍の倍率）によって画像を撮影した。
【図１７】Ａ．修飾されたまたは修飾されていないコードするｍＲＮＡの脳内注射後のウミシイタケの発現。ラット大脳皮質に８箇所／個体で注射した。１つの半球には、プソイドウリジン修飾を有する、キャッピングされウミシイタケをコードするＲＮＡを注射した（ｃａｐＲｅｎｉｌｌａ−Ｙ）のに対し、対応する半球には、ヌクレオシド修飾を有さないキャッピングされたＲＮＡを注射した（ｃａｐＲｅｎｉｌｌａ−Ｃ）。２個体（６の注射部位）からのデータを示す。ＢＧ；本アッセイのより低レベルの検出。Ｂ．静脈内送達されたΨ修飾されたｍＲＮＡを脾臓において発現させる。リポフェクチンと複合体形成したΨｍＲＮＡ（０．３μｇのｃａｐＴＥＶｌｕｃＡｎ／マウス）を尾静脈注射によって投与した。動物を注射２時間後および４時間後に屠殺し、ルシフェラーゼ活性を溶解緩衝液において均質化した一定分量（１／１０）の臓器において測定した。値は、全臓器におけるルシフェラーゼ活性を表す。Ｃ．Ψ修飾されたｍＲＮＡは、インビボでより大きな安定性および翻訳を示す。Ψ修飾を有するまたは有さない、リポフェクチンと複合体形成したｃａｐＴＥＶｌｕｃＡｎ（０．３μｇ／６０μＬ／個体）をマウスに静脈内送達した。注射１、４、および２４時間後に動物を屠殺し、該動物の脾臓の１／２をルシフェラーゼ酵素測定のために（左パネル）、もう半分をＲＮＡ分析のために加工した（右パネル）。ルシフェラーゼ活性を脾臓の半分から作製された一定分量（１／５）の均質液において測定した。プロットされた値は、全脾臓におけるルシフェラーゼ活性を表し、平均±標準誤差として表す（ｎ＝３または４／地点）。Ｄ．ｍＲＮＡの気管内注射後のホタルルシフェラーゼの発現。ｃａｐＴＥＶｌｕｃ−Ｙ：キャッピングされホタルルシフェラーゼをコードするプソイドウリジン修飾されたＲＮＡ。ＣａｐＴＥＶｌｕｃ−Ｃ：ヌクレオシド修飾を有さないキャッピングされたＲＮＡ。
【図１８】タンパク質産生は、マウスにおいて静脈内に送達されるｍＲＮＡの量に依存する。６０μＬ／個体の容積で、示される量のリポフェクチンと複合体形成した核酸、Ψ成分を有するまたは有さない、ｃａｐＴＥＶｌｕｃＡｎ  ｍＲＮＡ、およびｐＣＭＶｌｕｃプラスミドＤＮＡをマウスに静脈内注射によって送達した。ｍＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡを注射した動物を注射６時間後または２４時間後にそれぞれ屠殺し、ルシフェラーゼ活性を、溶解緩衝液において均質化された一定分量（１／１０）の該動物の脾臓において測定した。各動物由来の値が示されており、短い水平線は平均を、Ｎ．Ｄ．は検出不可能を示す。
【図１９】コードｍＲＮＡの気管内送達後のホタルルシフェラーゼの発現。ｍＲＮＡをリポフェクチン（または注記する場合、ＰＥＩ）と複合体形成し、動物に、ホタルルシフェラーゼをコードする０．３μｇのΨ修飾しまたはしていないｍＲＮＡを注射した後、３時間後に屠殺した。肺を回収および均質化し、ルシフェラーゼ活性を一定分量の溶解した臓器において測定した。
【図２０】Ψ修飾されたｍＲＮＡは、肺送達後の炎症性仲介因子を誘導しない。ルシフェラーゼをコードする修飾されていないｍＲＮＡまたはΨ修飾されたｍＲＮＡの気管内送達後の血清におけるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αの誘導。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αの血清レベルを、ｍＲＮＡ送達の２４時間後にＥＬＩＳＡによって決定した。
【図２１】実施例３５からの結果を示す：示された修飾を有する、ホタルまたはウミシイタケのルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを、リポフェクチンと複合体形成し、マウス樹状細胞（Ａ）およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｂ）に送達した。ヒト樹状細胞に、示された修飾を有するＴｒａｎｓＩＴと複合体形成した、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを形質移入した（Ｃ）。データは、修飾されていないｍＲＮＡと比較した倍数変化として表す。
【図２２】実施例３６からの結果を示す。ｍＲＮＡの作製に用いられたＴ７ポリメラーゼ転写反応は、正確な大きさの多量のＲＮＡを結果として生じるが、夾雑物も含有している。このことは、変性条件下で大きさに基づいてＲＮＡを分離する逆相ＨＰＬＣカラムへのＲＮＡの適用によって可視化される。Ψ修飾されたＴＥＶ−ルシフェラーゼ−Ａ５１  ＲＮＡを３８％緩衝液Ｂにおいて該ＨＰＬＣカラムに適用し、緩衝液Ｂが５５％まで増加する直線勾配に供した。特性は、期待された物よりも小さくおよび期待された夾雑物よりも大きいことの両方を示した。
【図２３】実施例３７からの結果を示す：（Ａ）示された修飾を有しかつＨＰＬＣ精製を伴うまたは伴わない、ＥＰＯをコードするｍＲＮＡをマウス樹状細胞に送達し、上清におけるＥＰＯレベルを２４時間後に測定した。Ｍ５Ｃ／Ψ修飾されたｍＲＮＡは、ＨＰＬＣ精製前に最高レベルの翻訳を有したのに対し、Ψ修飾されたｍＲＮＡは、ＨＰＬＣ精製後に最高の翻訳を有した。（Ｂ）ヒト樹状細胞に、ＨＰＬＣ精製を伴うまたは伴わない、示された修飾を有する、ウミシイタケをコードするｍＲＮＡを形質移入した。
【図２４】実施例３８からの結果を示す。（Ａ）ヒト樹状細胞に、ＨＰＬＣ精製を伴うまたは伴わない、示された修飾を有するＴｒａｎｓＩＴと複合体形成したＲＮＡを形質移入した。ＩＦＮ−αレベルを２４時間後に測定した。ＨＰＬＣ精製は、他の修飾されていないＲＮＡが類似のレベルのＩＦＮ−αを有し、またはＨＰＬＣ精製後にレベルを低下させたので、配列に依存する、修飾されていないＲＮＡの免疫原性を増大させた。Ψ修飾されたＲＮＡは、対照処理された樹状細胞と類似の、測定不可能なレベルのＩＦＮ−αを有した。（Ｂ）ＨＰＬＣ精製前（−）およびＨＰＬＣ精製後（Ｐ１およびＰ２）のΨ修飾されたＲＮＡを、二本鎖ＲＮＡに特異的なモノクローナル抗体を用いるドットブロッティング法を用いて、二本鎖ＲＮＡについて分析した（Ｊ２）。ＲＮＡの精製は、二本鎖ＲＮＡ夾雑物を除去した。（Ｃ）ｉＰＳ因子をコードするΨ修飾されたＲＮＡは免疫原性であり、該ＲＮＡは、該ＲＮＡのＨＰＬＣによって除去される。
【図２５】ＫＬＦ４（配列番号１２）およびＬＩＮ２８（配列番号１３）についての配列をコードするｍＲＮＡを提供する。
【図２６】ｃＭＹＣ（配列番号１４）およびＮＡＮＯＧ（配列番号１５）についての配列をコードするｍＲＮＡを提供する。
【図２７】ＯＣＴ４（配列番号１６）およびＳＯＸ２（配列番号１７）についての配列をコードするｍＲＮＡを提供する。
【図２８】ヒト再プログラム化因子（ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）をコードするｍＲＮＡが、初代ヒトケラチノサイト細胞においてｉＰＳ細胞を作製することを示す。図２８は、４の再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを用いた最終的な形質移入の２日後のＨＥＫｎ細胞（Ａ）ならびに１１日後（Ｂ）および２０日後（Ｃ）のｉＰＳコロニー形成の位相差画像を示す。画像は、１０倍の倍率である。
【図２９】ヒト再プログラム化因子（ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）をコードするｍＲＮＡが、公知のｉＰＳ細胞マーカーに対して陽性であるヒトケラチノサイトにおいてｉＰＳ細胞を作製することを示す。図２９は、ＨＥＫｎ細胞由来のコロニーの位相差画像を示す（Ａ、Ｄ、およびＧ）。（Ａ）において示される同じｉＰＳコロニーは、ＫＬＦ４（Ｂ）およびＬＩＮ２８（Ｃ）に対して陽性である。（Ｄ）において示されるｉＰＳコロニーは、ＳＳＥＡ４陽性（Ｅ）およびＴＲＡ−１−６０陽性（Ｆ）である。（Ｇ）に示されるｉＰＳコロニーは、ＮＡＮＯＧ陽性である（Ｈ）。すべての画像は２０倍の倍率である。
【図３０】図３０は、再プログラム化因子ＮＡＮＯＧを含まない４つの再プログラム化ｍＲＮＡ（ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）を形質移入したＨＥＫｎ細胞における３のｉＰＳ関連メッセージの発現の増加を示す。該メッセージの増加した発現を定量的ＰＣＲによって検出し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化する。各メッセージの発現レベルを、元の細胞株において認められるレベルに関連して図示する。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
（定義）
本発明は、下に定義される用語に基づいて理解および解釈される。
【００６６】
本明細書で使用する場合、プソイドウリジンまたは５−メチルシチジン残基を含む一本鎖完全ｍＲＮＡに対する引用における「実質的にすべて」は、試料中に存在する一本鎖完全ｍＲＮＡのうちの少なくとも９５％が、プソイドウリジンまたは５−メチルシチジン残基のいずれかを有することを意味する。
【００６７】
本明細書で使用する場合、プソイドウリジンもしくは５−メチルシチジン残基を含む一本鎖完全ｍＲＮＡに対する引用における「本質的にすべて」は、試料中に存在する一本鎖完全ｍＲＮＡのすべてのうち少なくとも９９％が、プソイドウリジンまたは５−メチルシチジン残基のいずれかを有することを意味する。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ夾雑物分子」は、ＲＮＡ残基を含みかつ、細胞に形質移入される場合に、（例えば、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびオリゴアデニラートシンテターゼ（ＯＡＳ）等のＲＮＡセンサーを活性化することによって）免疫応答を少なくとも部分的に活性化することのできる分子、または該細胞において、（例えば、大きな二本鎖ＲＮＡ分子に対するもしくは低分子二本鎖ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）に対する応答を含む）ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）応答を少なくとも部分的に活性化することのできるＲＮＡ分子である。例示的なＲＮＡ夾雑物分子には、再プログラム化分子（例えば、非完全長ｉＰＳ細胞誘導因子）の一部のみをコードする部分的なまたは非完全長のｍＲＮＡ、例えば、理論によって結び付けられることなく、「続走ＩＶＴ」もしくは他の機構によって再プログラム化因子（例えば、ｉＰＳ細胞誘導因子）をコードする完全長のｍＲＮＡよりも大きな一本鎖ｍＲＮＡ、二本鎖の大きなまたは小さなｍＲＮＡ分子、およびキャッピングされていないｍＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書で使用する場合、精製されたＲＮＡ調製物は、精製されたＲＮＡ調製物における全ＲＮＡの０．５％未満が、ＲＮＡ夾雑物分子（または特に列挙されたＲＮＡ夾雑物）からなる場合、ＲＮＡ夾雑物分子（または特定の列挙されるＲＮＡ夾雑物）が「実質的にない」。非夾雑物ｍＲＮＡ分子およびＲＮＡ夾雑物分子（または特定のＲＮＡ夾雑物）の量および相対量は、ＲＮＡ分子を分離および定量するために、ＨＰＬＣまたは当該技術分野において用いられる他の方法によって決定され得る。
【００７０】
本明細書で使用する場合、精製されたＲＮＡ調製物は、精製されたＲＮＡ調製物の全ＲＮＡの１．０％未満が、ＲＮＡ夾雑物分子（または特に列挙されたＲＮＡ夾雑物）からなる場合、ＲＮＡ夾雑物分子（または特定の列挙されたＲＮＡ夾雑物）が「本質的にない」。非夾雑物ｍＲＮＡ分子およびＲＮＡ夾雑物分子（または特定のＲＮＡ夾雑物）の量および相対量は、ＲＮＡ分子を分離および定量するために、ＨＰＬＣまたは当該技術分野において用いられる他の方法によって決定され得る。
【００７１】
本明細書で使用する場合、精製されたＲＮＡ調製物は、精製されたＲＮＡ調製物の全ＲＮＡの０．１％未満が、ＲＮＡ夾雑物分子（または特に列挙されたＲＮＡ夾雑物）からなる場合、ＲＮＡ夾雑物分子（または特定の列挙されたＲＮＡ夾雑物）が「事実上ない」。非夾雑物ｍＲＮＡ分子およびＲＮＡ夾雑物分子（または特定のＲＮＡ夾雑物）の量および相対量は、ＲＮＡ分子を分離および定量するために、ＨＰＬＣまたは当該技術分野において用いられる他の方法によって決定され得る。
【００７２】
本明細書で使用する場合、精製されたＲＮＡ調製物は、精製されたＲＮＡ調製物の全ＲＮＡの０．０１％未満が、ＲＮＡ夾雑物分子（または特に列挙されたＲＮＡ夾雑物）からなる場合、ＲＮＡ夾雑物分子（または特定の列挙されたＲＮＡ夾雑物）が「ない」。非夾雑物ｍＲＮＡ分子およびＲＮＡ夾雑物分子（または特定のＲＮＡ夾雑物）の量および相対量は、ＲＮＡ分子を分離および定量するために、ＨＰＬＣまたは当該技術分野において用いられる他の方法によって決定され得る。
【００７３】
用語「を含む」、「を含有する」、「を有する」、「を含む」、および「を含んでいる」は、別段の記載がない限り、「含んでいるが、これに限定されない」として解釈されるべきである。用語「ａ」、「ａｎ」、ならびに「ｔｈｅ」およびに本発明を説明する文脈における、具体的には、添付の特許請求の範囲の文脈における類似の指示語は、別段の記載がない限り、単数形および複数形の両方を網羅するものとして解釈されるべきである。任意のおよびすべての例または例示的な言語（「例えば」、「例えば」、「等の」）の使用は、本発明の態様または実施態様を説明するために単に意図されており、別段の主張がない限り、その範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【００７４】
試料、生物試料、細胞、腫瘍、またはそれらに類するものに「由来する」ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）またはポリペプチドなど、「由来する」という語の使用に関して、ＲＮＡまたはポリペプチドのいずれかが試料、生物試料、細胞、腫瘍、またはこれらに類するものに存在し、あるいは、インビトロでの転写反応またはＲＮＡ増幅反応（この中で、該ＲＮＡまたはポリペプチドは、元の試料、生物試料、細胞、腫瘍、またはこれらに類するものにおける該ＲＮＡまたはポリペプチド分子のすべてまたは一部によってコードされるかあるいは該すべてまたは一部のコピーである。）等のプロセスによって、試料、生物試料、細胞、腫瘍、またはこれらに類するものにおけるＲＮＡを用いて作製されたことを意味する。例として、このようなＲＮＡは、インビトロでの転写またはＲＮＡ増幅反応に用いられる元のＲＮＡが、試料、生物試料、細胞、腫瘍、またはこれらに類するものに由来した限り、試料、生物試料、細胞、腫瘍、またはこれらに類するものから直接得られるのではなく、ｃＤＮＡのクローン化を伴うまたは伴わないインビトロでの転写またはＲＮＡ増幅反応に由来することができる。「試料」および「生物試料」という用語は、それらの最も広範な意味で用いられ、生物源および環境源を含めた真核細胞を含有するまたは含有し得る任意の源から得られる試料または標本を包含する。本明細書で使用する場合、「試料」という用語は、生物体から得られる生物試料を指すために用いられる場合、体液（例えば、血液または唾液）、糞便、生検、スワブ（例えば、頬側スワブ）、単離された細胞、滲出物、およびこれらに類するものを含む。生物体には、真菌、植物、動物、およびヒトが含まれる。しかしながら、これらの例は、本発明での使用が見出される試料または生物体の種類を制限するものとして解釈されるべきではない。加えて、本発明の方法または組成物の使用に関連した研究を実施しまたは該使用に関連した結果を研究するために、いくつかの実施態様において、「試料」または「生物試料」は、固定された細胞、処理された細胞、細胞溶解物、およびこれらに類するものを含む。ｍＲＮＡが、公知の疾患を有する生物体由来の細胞に、または疾患状態もしくは公知の病態を呈する細胞に送達される方法の実施態様等のいくつかの実施態様において、「試料」または「生物試料」は、細菌またはウイルスも含む。
【００７５】
本明細書で使用する場合、用語「インキュベートすること」およびその変形は、反応の１つ以上の成分を別の１つの成分または複数の成分と、所望の反応産物が形成される条件下で、所望の反応産物が形成されるのに十分な時間接触させることを意味する。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基（例えば、通常の核酸塩基：グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、およびシトシン（Ｃ））、または五炭糖（例えば、リボースまたは２’−デオキシリボース）と共有結合した修飾された核酸塩基（例えば、５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ））からなるのに対し、「ヌクレオチド」または「モノヌクレオチド」は、五炭糖のヒドロキシル基のうちの１つにおいてリン酸化されたヌクレオシドからなる。線形核酸分子は、「５’末端」（５’端）および「３’末端」（３’端）を有するといわれ、その理由は、キャッピングまたはアデニル化（例えば、リガーゼによるアデニル化）に関するものを除き、モノヌクレオチドが、ホスホジエステル結合を介して一方向に結合して、１つのモノヌクレオチド糖部分の５’炭素におけるリン酸が、その隣接するモノヌクレオチドの糖部分の３’炭素における酸素に結合するような様式で、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを生成するからである。それゆえ、線形一本鎖のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの末端または線形二本鎖核酸（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）の１つの鎖の末端は、その５’リン酸が、モノヌクレオチド糖部分の３’炭素の酸素に結合または結合していない場合、「５’端」と呼ばれ、その３’酸素が、別のモノヌクレオチドの糖に結合した５’リン酸に結合していない場合、「３’端」と呼ばれる。末端のヌクレオチドは、本明細書で使用する場合、３’末端または５’末端の端位置におけるヌクレオチドである。
【００７７】
特定の目標を達成するために、本発明の方法のいずれかにおける真核細胞に導入されるｍＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つ以上における核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間（もしくはヌクレオチド間）結合は、修飾された塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合を含んでもよい。例えば、本発明の方法を実施するために本明細書の他所で論議されたその他の修飾されたヌクレオチドに加えて、該ｍＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つ以上も、キサンチン、アリアミノ−ウラシル、アリアミノ−チミジン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、４−チオウラシル、６−チオグアニン、アザもしくはデアザウラシル、アザもしくはデアザチミジン、アザもしくはデアザシトシン、アザもしくはデアザアデニン、またはアザもしくはデアザグアニン、あるいは、ビオチン部分、ジゴキシゲニン部分、蛍光もしくは化学発光部分、クエンチング部分もしくは１つ以上の特定の他の目的を達成するためのいくつかの他の部分を含むまたはそれらからなる修飾された核酸塩基を有することができ、および／あるいは該ｍＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つ以上は、いくつかのヌクレアーゼに対して耐性を提供する２’−フルオロ−２’−デオキシリボースまたは２’−Ｏ−メチル−リボース、あるいは可視、蛍光、赤外線蛍光、または他の検出可能な色素または、電解質部分、感光性部分、アルキニル部分、もしくは他の反応性化学物質部分を有する化学物質と反応することによって標識されることのできる２’−アミノ−２’−デオキシリボースまたは２’−アジド−２’−デオキシリボースなどだがそれらに限定されない、糖部分を有することができる。
【００７８】
本発明のいくつかの実施態様において、前記ｍＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つ以上は、ＲＮＡの同時転写キャッピングのためのＩＶＴ反応において用いられるジヌクレオチドキャップアナログ（Grudzien−Nogalska et al. 2007）において、または（ＲＮＡのＩＶＴ中の修飾されたホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレナート、もしくはホスホロジセレナート結合を有するヌクレオチドの組み込みによる、または例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いるポリアデニル化によるＲＮＡにおけるポリ（Ａ）末端への、修飾されたホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレナート、もしくはホスホロジセレナート結合を含有するＡＴＰの組み込みによる）ポリ（Ａ）末端において含むいくつかのヌクレアーゼに対して耐性のあるホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレナート、またはホスホロジセレナート結合等の修飾されたヌクレオシド間結合を含む。本発明は、方法における特定の目的のために用いられ得る例を示すために呈される、列挙された修飾された核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合に限定されない。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、あるヌクレオチドの糖部分の３’位が、ホスホジエステル結合によって、次のヌクレオチドの糖部分の５’位に結合し、かつ該ヌクレオチドが、特定の配列、すなわちヌクレオチドの線形の順序で結合する、ヌクレオチドの共有結合配列である。いくつかの実施態様において、該核酸またはポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）からなるかまたはそれを含む。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）からなるかまたはそれを含む。
【００８０】
用語「単離された」または「精製された」は、「単離されたＲＮＡ」または「精製されたＲＮＡ」におけるように、ポリヌクレオチドまたは核酸との関連において使用する場合、その源において通常伴う少なくとも１つの夾雑物から特定および分離される核酸を指す。したがって、単離されたまたは精製された核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、天然に見出されるものとは異なる形態もしくは設定、または処置もしくは精製の方法に供する前に存在したものとは異なる形態もしくは設定において存在する。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、他の遺伝子ならびに構造タンパク質および機能タンパク質、および特異的ＲＮＡ（例えば、特異的タンパク質をコードする特異的ｍＲＮＡ）とともに、宿主細胞染色体において見出され、数多くの他のＲＮＡおよび他の細胞成分との混合物として細胞中に見出される。単離されたまたは精製されたポリヌクレオチドまたは核酸は、一本鎖または二本鎖の形態で存在し得る。
【００８１】
「キャップ」または「キャップヌクレオチド」は、好適な反応条件下でキャッピング酵素系によって基質として用いられ、かつそれにより一次ＲＮＡ転写産物をもしくは５’−二リン酸を有するＲＮＡを含むキャッピングされていないＲＮＡの５’−端に結合するヌクレオシド−５’−三リン酸を意味する。そのように該ＲＮＡに結合するヌクレオチドは、本明細書で「キャップヌクレオチド」とも呼ばれる。「キャップヌクレオチド」は、その５’端を通じて一次ＲＮＡ転写産物の５’端に結合するグアニンヌクレオチドである。その５’端に結合したキャップヌクレオチドを有するＲＮＡは、「キャッピングされたＲＮＡ」または「キャッピングされたＲＮＡ転写産物」または「キャッピングされた転写産物」と呼ばれる。共通のキャップヌクレオシドは、７−メチルグアノシンまたはＮ７−メチルグアノシン（時々、「標準キャップ」と呼ばれる）であり、「ｍ７Ｇ」として指定された構造を有し、この場合、キャッピングされたＲＮＡまたは「ｍ７ＧキャッピングされたＲＮＡ」は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１（ｐＮ）ｘ−ＯＨ（３’）として、またはより単純にはｍ７ＧｐｐｐＮ１（ｐＮ）ｘもしくはｍ７Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｎとして指定された構造を有し、この中で、ｍ７Ｇは、７−メチルグアノシンキャップヌクレオシドを表し、ｐｐｐはキャップヌクレオシドの５’炭素と一次ＲＮＡ転写産物の第一のヌクレオチドの間の三リン酸架橋を表し、Ｎ１（ｐＮ）ｘ−ＯＨ（３’）は、一次ＲＮＡ転写産物を表し、このうち、Ｎ１は、最も５’のヌクレオチドであり、「ｐ」はリン酸基を表し、「Ｇ」は、グアノシンヌクレオシドを表し、「ｍ７」は、グアニンの７位におけるメチル基を表し、および「［５’］」は、「ｐ」がキャップヌクレオチドのリボースとｍＲＮＡ転写産物の第一のヌクレオシド（「Ｎ」）に結合する位置を示す。この「標準的なキャップ」に加えて、種々の他の天然および合成のキャップ類似体が、当該技術分野において公知である。いかなるキャップヌクレオチドを有するＲＮＡも、「キャッピングされたＲＮＡ」と呼ばれる。キャッピングされたＲＮＡは、生物試料から自然に生じることができ、または５’三リン酸基を有するＲＮＡの、もしくは５’二リン酸基を有するＲＮＡの、キャッピング酵素系（例えば、ワクシニアキャッピング酵素系または出芽酵母キャッピング酵素系）を用いたインビトロでのキャッピングによって得られることができる。あるいは、キャッピングされたＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するＤＮＡテンプレートのインビトロでの転写（ＩＶＴ）によって得られることができ、この中で、ＧＴＰに加えて、ＩＶＴ反応は、当該技術分野において公知の方法を用いて（例えば、ＡＭＰＬＩＣＡＰ（商標）Ｔ７キャッピングキットまたはＭＥＳＳＡＧＥＭＡＸ（商標）Ｔ７  ＡＲＣＡ−ＣＡＰＰＥＤ  ＭＥＳＳＡＧＥ転写キット、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、またはＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔを用いて）、ジヌクレオチドキャップアナログ（例えば、ｍ７ＧｐｐｐＧキャップアナログ、またはＮ７−メチル、２’−Ｏ−メチル−ＧｐｐｐＧ  ＡＲＣＡキャップアナログ、またはＮ７−メチル、３’−Ｏ−メチル−ＧｐｐｐＧ  ＡＲＣＡキャップア���ログ）も含有する。
【００８２】
５’−三リン酸化した一次ｍＲＮＡ転写産物のインビボでのキャッピング（またはインビトロでキャッピング酵素系を用いること）は、いくつかの酵素工程を介して生じる（Higman et al. 1992、Martin et al. 1975、Myette and Niles 1996）。
【００８３】
以下の酵素反応が、真核生物ｍＲＮＡのキャッピングに関与する：
（１）ＲＮＡトリホスファターゼは、ｍＲＮＡの５’−三リン酸を二リン酸に開裂し、
ｐｐｐＮ１（ｐ）Ｎｘ−ＯＨ（３’）    →    ｐｐＮ１（ｐＮ）ｘ−ＯＨ（３’）  ＋  Ｐｉ
、次いで
（２）ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼは、ＧＴＰの、ｍＲＮＡの最も５’のヌクレオチド（Ｎ１）の５’−二リン酸への結合を触媒し、
ｐｐＮ１（ｐＮ）ｘ−ＯＨ（３’）  ＋  ＧＴＰ  →    Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１（ｐＮ）ｘ−ＯＨ（３’）  ＋  ＰＰｉ
、最後に、
（３）Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）を補因子として用いるグアニン−７−メチルトランスフェラーゼは、キャップヌクレオチドにおけるグアニンの７−窒素のメチル化を触媒する。
【００８４】
Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１（ｐＮ）ｘ−ＯＨ（３’）  ＋  ＡｄｏＭｅｔ  →    ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１（ｐＮ）ｘ−ＯＨ（３’）  ＋  ＡｄｏＨｙｃ
ＲＮＡトリホスファターゼおよびＲＮＡグアニルトランスフェラーゼの酵素活性の作用から結果として生じるＲＮＡ、ならびにグアニン−７−メチルトランスフェラーゼ酵素活性によって追加的にメチル化されるＲＮＡは、本明細書で「５’キャッピングされたＲＮＡ」または「キャッピングされたＲＮＡ」と呼ばれ、本明細書での「キャッピング酵素系」または、より単純には、「キャッピング酵素」は、「キャッピングされたＲＮＡ」を結果として生じる酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドの任意の組み合わせを意味する。このような酵素のクローン化した形態を含むキャッピング酵素系が特定され、多くの源から精製され、当該技術分野において周知である（Banerjee 1980, Higman et al. 1992, Higman et al. 1994, Myette andNiles 1996, Shuman 1995, Shuman 2001, Shuman et al. 1980, Wang et al. 1997）。５’ポリリン酸を有するキャッピングされていないＲＮＡをキャッピングされたＲＮＡに変換することのできる任意のキャッピング酵素系を用いて、本発明の実施態様のいずれについてのキャッピングされたＲＮＡをも提供することができる。いくつかの実施態様において、該キャッピング酵素系は、ポックスウイルスキャッピング酵素系である。いくつかの好ましい実施態様において、キャッピング酵素系は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素である。いくつかの実施態様において、キャッピング酵素系は、出芽酵母キャッピング酵素である。また、ＲＮＡトリホスファターゼ、ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼ、およびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼを１つの源からコードする遺伝子が、別の源からこれらの遺伝子のうちの１つまたはすべてにおける欠失を補充することができるという事実の点で、キャッピング酵素系は、１つの源から派生することができ、またはＲＮＡトリホスファターゼ、ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼ、および／もしくはグアニン−７−メチルトランスフェラーゼ活性のうちの１つ以上は、異なる源由来のポリペプチドを含むことができる。
【００８５】
本発明の「修飾されたキャップヌクレオチド」は、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合が、対応する通常の７−メチルグアノシンキャップヌクレオチドと比較して化学的に修飾される、キャップヌクレオチドを意味する。修飾されたキャップヌクレオチドの例には、（ｉ）デオキシリボース糖部分の２’−または３’−デオキシ位置が、アミノ基、アジド基、フッ素基、メトキシ基、チオール（もしくはメルカプト）基、またはメチルチオ（もしくはメチルメルカプト）基を含む基と置換される、修飾された２’−もしくは３’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸（またはグアニン２’−もしくは３’−デオキシリボ核酸−５’−三リン酸）を、あるいは（ｉｉ）グアニン塩基のＯ６酸素がメチル化される修飾されたグアノシン−５’−三リン酸を、あるいは（ｉｉｉ）３’−デオキシグアノシンを含むキャップヌクレオチドが挙げられる。明確にする目的のために、「アルコキシ置換デオキシグアノシン−５’−三リン酸」が、「Ｏ−アルキル置換グアノシン−５’−三リン酸」とも呼ばれることができることは本明細書で理解されるであろうし、例として、しかし制限を有さないが、２’−メトキシ−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸（２’−メトキシ−２’−ｄＧＴＰ）および３’−メトキシ−３’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸（３’−メトキシ−３’−ｄＧＴＰ）は、本明細書においてそれぞれ、２’−Ｏ−メチルグアノシン−５’−三リン酸（２’−ＯＭｅ−ＧＴＰ）および３’−Ｏ−メチルグアノシン−５’−三リン酸（３’−ＯＭｅ−ＧＴＰ）と呼ばれることができる。修飾されたキャップヌクレオチドを、一次ＲＮＡ転写産物を含むキャッピングされていないＲＮＡ（もしくは５’−二リン酸を有するＲＮＡ）の５’端に結合した後、一次ＲＮＡ転写産物を含むキャッピングされていないＲＮＡ（もしくは５’−二リン酸を有するＲＮＡ）に結合した該修飾されたキャップヌクレオチドの部分は本明細書において、「修飾されたキャップヌクレオシド」と呼ばれ得る（すなわち、結合したリン酸基に言及せずに）が、時々、「修飾されたキャップヌクレオチド」と呼ばれる。
【００８６】
「修飾されたヌクレオチドでキャッピングされたＲＮＡ」は、キャッピング酵素系と修飾されたキャップヌクレオチドとを用いて合成された、キャッピングされたＲＮＡ分子であり、この中で、その５’末端におけるキャップヌクレオチドは、修飾されたキャップヌクレオチドを、またはジヌクレオチドキャップアナログがキャップヌクレオチドにおける化学的修飾を含有する修飾されたジヌクレオチドキャップアナログを含有するインビトロでの転写反応において同時転写的に合成されるキャッピングされたＲＮＡを含む。いくつかの実施態様において、修飾されたジヌクレオチドキャップアナログは、反逆方向キャップアナログまたはＡＲＣＡである（Grudzien et al. 2004, Jemielity et al. 2003, Grudzien−Nogalska et al. 2007, Peng et al. 2002, Stepinski et al. 2001）。
【００８７】
「一次ＲＮＡ」または「一次ＲＮＡ転写産物」は、ＲＮＡポリメラーゼによってインビボまたはインビトロで合成されかつＲＮＡ分子がその最も５’のヌクレオチドの５’−炭素において三リン酸を有するＲＮＡ分子を意味する。
【００８８】
「ＲＮＡ増幅反応」または「ＲＮＡ増幅方法」は、試料における１または複数の所望のＲＮＡ配列に対応するＲＮＡの量を増加させるための方法を意味する。例えば、いくつかの実施態様において、ＲＮＡ増幅方法は、（ａ）所望のＲＮＡ分子にアニーリングする１つ以上のプライマーのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ伸長によって１つ以上の所望のＲＮＡ分子と相補的な第一の鎖のｃＤＮＡを合成すること、（ｂ）機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが結合するプロセスを用いて、第一の鎖のｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成すること、および（ｃ）二本鎖ＤＮＡを、１つ以上の所望のＲＮＡ分子に対応するＲＮＡが得られる転写条件下で該プロモーターに結合するＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む。本発明の特定の実施態様と関連した別段の記載がない限り、本発明に従ったＲＮＡ増幅反応は、センスＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡもしくは他の一次ＲＮＡ転写産物の相補体ではなく、該ｍＲＮＡもしくは他の一次ＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＲＮＡ）を合成するＲＮＡ増幅反応を意味するセンスＲＮＡ増幅反応を意味する。本定義内に包含される、当該技術分野で公知のセンスＲＮＡ増幅反応には、Ｏｚａｗａら（Ozawa et al. 2006）において、ならびに米国特許出願第２００９００５３７７５号、第２００５０１５３３３３号、第２００３０１８６２３７号、第２００４０１９７８０２号、および第２００４０１７１０４１号において説明される、センスＲＮＡを合成する方法が含まれるが、これらに限定されない。米国特許出願第２００９００５３７７５号において説明されるＲＮＡ増幅方法は、１つ以上の細胞に由来する増幅されたＲＮＡを得るための好ましい方法であり、該増幅されたＲＮＡを次に、本発明の方法における使用のためのｍＲＮＡを生成するために用いる。
【００８９】
「ポリ−Ａポリメラーゼ」（「ＰＡＰ」）は、ほとんどの真核生物、原核生物、および真核生物性ウイルスにおいて見出される、ＡＴＰを選択的に用いて、ＡＭＰ残基をＲＮＡの３’ヒドロキシル化端に組み込むテンプレート非依存性ＲＮＡポリメラーゼを意味する。植物、動物、細菌、およびウイルスから研究されたＰＡＰ酵素はすべて、同じ全体的な反応を触媒し（Edmonds 1990）、高度に構造的に保存され（Gershon 2000）、ならびに、ＰＡＰが、ＡＡＵＡＡＡポリアデニル化シグナルを認識するタンパク質から分離される場合、ＲＮＡ分子の特定の配列または大きさに対する本質的な特異性を欠失するので（Wilusz and Shenk 1988）、種々の源のうちのいずれかに由来する精製された野生型および組換えＰＡＰ酵素は、本発明のために用いられることができる。いくつかの実施態様において、サッカロミセス由来の（例えば、出芽酵母由来の）ＰＡＰ酵素をポリアデニル化のために用いて、１つ以上の修飾されたｍＲＮＡを含むかまたはそれからなる精製されたＲＮＡ調製物を作製し、該修飾されたｍＲＮＡの各々は、再プログラム化因子（例えば、ｉＰＳ細胞誘導因子）をコードする。いくつかの実施態様において、大腸菌由来のＰＡＰ酵素をポリアデニル化に用いて、１つ以上の修飾されたｍＲＮＡを含むかまたはそれからなる精製されたＲＮＡ調製物を作製し、該修飾されたｍＲＮＡの各々は、再プログラム化因子（例えば、ｉＰＳ細胞誘導因子）をコードする。
【００９０】
「再プログラム化因子」は、単独で、または他の因子もしくは条件との組み合わせで用いる場合、再プログラム化因子が導入されまたは発現する細胞の分化の状態の変化を生じるタンパク質、ポリぺプチド、または他の生体分子を意味する。本発明の方法のいくつかの好ましい実施態様において、再プログラム化因子は、細胞に導入されたｍＲＮＡによってコードされたタンパク質またはポリペプチドであり、それにより該ｍＲＮＡが導入された細胞と比較して分化の変化した状態を呈する細胞を作製する。本発明の方法のいくつかの好ましい実施態様において、再プログラム化因子は転写因子である。本発明の方法において用いられる再プログラム化因子に関する一実施態様は、「ｉＰＳ細胞誘導因子」である。
【００９１】
「ｉＰＳ細胞誘導因子」または「ｉＰＳＣ誘導因子」は、単独で、または他の再プログラム化因子との組み合わせで用いて、体細胞からのｉＰＳ細胞の作製を生じるタンパク質、ポリペプチド、または他の生体分子である。ｉＰＳ細胞誘導因子の例には、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８が挙げられる。ｉＰＳ細胞誘導因子には、完全長のポリペプチド配列またはその生物学的に活性のある断片が含まれる。同様に、ｉＰＳ細胞誘導因子をコードするｍＲＮＡは、完全長のポリペプチドまたはその生物学的に活性のある断片をコードし得る。例示的なｉＰＳ誘導因子についての配列をコードするｍＲＮＡを図２５（ＫＬＦ４およびＬＩＮ２８）、図２６（ｃＭＹＣおよびＮＡＮＯＧ）、および図２７（ＯＣＴ４およびＳＯＸ２）において示す。ある実施態様において、本発明は、これらの図に示される配列または類似の配列を採用し、これには、これらのｍＲＮＡ配列に結合した、５’および３’ＵＴＲ配列、コザック配列、ＩＲＥＳ配列、キャップヌクレオチド、ならびに／または本明細書で説明される実験において用いられるポリ（Ａ）配列のいずれかを呈するオリゴリボヌクレオチド、あるいは当該技術分野で一般的に公知でありかつ細胞における個々のｍＲＮＡ分子の翻訳を最適化して、本明細書に説明される方法を達成するために細胞における該分子の安定性を改良する目的のために、これらのタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に結合することによって、本明細書で用いられる配列の替わりに用いられることのできるオリゴリボヌクレオチドを追加的に含むｍＲＮＡ分子が含まれる。
【００９２】
「分化」または「細胞内分化」は、特殊化の程度が低い状態の分化を呈する細胞または細胞種類（例えば、受精卵細胞、胚における細胞、または真核生物における細胞）が、より特殊化した状態の分化を呈する細胞または細胞種類となる天然の生物過程を意味する。生物学者、細胞生物学者、免疫学者、および発生学者を含む科学者は、種々の方法および基準を用いて、「細胞種類」、「分化した状態」、または「分化の状態」に従って異なる細胞を定義、説明、または分類する。一般に、細胞は、該細胞によって呈される１つ以上の表現型に基づいて、「細胞種類」、「分化した状態」、または「分化の状態」に関して定義、説明、または分類され、該表現型には、形状、生化学的もしくは代謝的な活性もしくは機能、（例えば、具体的な生体分子と反応する染色に基づいた）細胞中のもしくは（例えば、細胞表面上の具体的な生体分子と反応する１つ以上の抗体の結合に基づいた）細胞上のある生体分子の存在が含まれることができる。例えば、いくつかの実施態様において、異なる細胞種類は、細胞選別機または蛍光発色細胞選別機（ＦＡＣＳ）機器を用いて特定および選別される。「分化」または「細胞の分化」は、培養物中の細胞にも生じ得る。
【００９３】
「再プログラム化」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞への１つ以上の再プログラム化因子の直接的な（例えば、細胞へのタンパク質またはポリペプチド再プログラム化因子の送達による）または間接的な（例えば、各々が再プログラム化因子をコードする１つ以上のｍＲＮＡ分子を含む本発明の精製されたＲＮＡ調製物の送達による）送達および、分化の助けとなる条件（例えば、培地、温度、酸素およびＣＯ２レベル、マトリックス、ならびに他の環境条件）の下で細胞を維持することに応答して生じる分化または細胞内分化を意味する。「再プログラム化」という用語は、本明細書で使用する場合、分化の特定の方向または経路を意味するまたは指すよう意図されておらず、自然において通常観察されるものよりも分化の方向または経路において進行するプロセスを排除しない。したがって、本発明の異なる実施態様において、「再プログラム化」は、以下のうちのいずれかおよびすべてを意味し含む：
（１）特殊化の程度がより低い状態の分化を呈する細胞または細胞種類（例えば、ｉＰＳ細胞）に進む、より特殊化した状態の分化を呈する細胞または細胞種類（例えば、哺乳類線維芽細胞、ケラチノサイト、筋細胞、または神経細胞）の過程を意味する「脱分化」、
（２）別のより特殊化した状態の分化または細胞種類（例えば、線維芽細胞もしくはケラチノサイトから筋細胞へ）に進む、より特殊化した状態の分化を呈する細胞または細胞種類（例えば、哺乳類線維芽細胞、ケラチノサイト、または神経細胞）の過程を意味する「分化転換」、および
（３）（例えば１つ以上の再プログラム化因子に応答して）生物または培養物においてインビボで生じようとなかろうと、細胞がその天然の場所および環境に（例えば、胚または臓器に）存在した場合に本来期待されるであろう別の状態の分化または細胞種類に進む、任意の特定の状態の分化または細胞種類を呈する細胞の過程を意味する「再分化」または「期待される分化」または「自然分化」。
【００９４】
（本発明の説明）
本発明は、ヒトまたは他の動物の細胞を含む真核細胞を、再プログラム化因子（例えば、ｉＰＳ細胞誘導因子）を各々コードする１つ以上の異なる一本鎖ｍＲＮＡ分子を含むかそれからなる精製されたＲＮＡ調製物と接触させることによって、該細胞の分化の状態を再プログラム化するための組成物および方法を提供する。精製された一本鎖ｍＲＮＡ分子は好ましくは、プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２’−ＯＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、およびＮ６−メチルアデノシンを、対応する修飾されていないＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴの通常のヌクレオシドの対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの少なくとも一部（例えば、実質的にすべてを含む）の替わりに含む。加えて、一本鎖ｍＲＮＡ分子は好ましくは、意図されていない応答を活性化させ、一本鎖ｍＲＮＡの発現を低下させ、および／または細胞におけるＲＮＡセンサーを活性化させるであろうＲＮＡ夾雑物分子が実質的にないよう精製される。ある実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、完全長の一本鎖ｍＲＮＡ分子よりも短いかまたは長いか、二本鎖ＲＮＡ、および／またはキャッピングされていないＲＮＡであるＲＮＡ夾雑物分子が実質的にない。いくつかの好ましい実施態様において、本発明は、ヒトまたは他の動物の体細胞を含む分化した真核細胞を、ｉＰＳ細胞誘導因子を各々コードする１つ以上の異なる一本鎖ｍＲＮＡ分子を含むかまたはそれからなる精製されたＲＮＡ調製物と接触させることによって、該細胞を再プログラム化するための組成物および方法を提供する。
【００９５】
ある実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物において用いられるｍＲＮＡは精製されて、実質的に、本質的に、または事実上すべてのＲＮＡ夾雑物を含む夾雑物を実質的に、本質的に、または事実上すべて除去する。本発明は、ｍＲＮＡを精製するために用いられる精製方法に関して制限されず、本発明には、当該技術分野で公知の、または、該ｍＲＮＡを精製して、該ｍＲＮＡの意図された使用に干渉するＲＮＡ夾雑物を含む夾雑物を除去するために将来開発される、任意の方法の使用が含まれる。例えば、好ましい実施態様において、ｍＲＮＡの精製は、細胞に対して毒性のある夾雑物を（例えば、細胞における生得的免疫応答を誘導することによって、または二本鎖ＲＮＡを含むＲＮＡ夾雑物の場合、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を、例えばｓｉＲＮＡもしくは長いＲＮＡｉ分子を介して誘導することによって）および細胞におけるｍＲＮＡの翻訳を直接的にまたは間接的に低下させる夾雑物を除去する。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡは、実施例に含む、本明細書に説明される方法を用いるＨＰＬＣによって精製される。ある実施態様において、ｍＲＮＡは、Ｃ１８で誘導体化したスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーを含むポリマー樹脂基質に関して用いて精製され、酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）イオン対形成剤が、ｍＲＮＡを溶出して、それをＲＮＡ夾雑物から大きさ依存的な様式で分離するためにアセトニトリル勾配の使用とともに、カラムにおいて用いられ、いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡ精製は、ＨＰＬＣを用いて実施されるが、いくつかの他の実施態様において、重力フローカラムが精製に用いられる。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡは、引用により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  ２００９によって刊行された、Douglas T. Gjerde, Lee Hoang, and David Hornbyによる「ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」という表題の書籍において説明された方法を用いて精製される。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡ精製は、（例えば、約５０℃未満の温度での、例えば、大気温での）非変性モードで実施される。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡ精製は、（約７２℃を超える温度での）変性モードで実施される。もちろん、当業者は、変性温度が、精製されているｍＲＮＡの融解温度（Ｔｍ）、およびｍＲＮＡに混入するＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの融解温度に依存することを知っている。いくつかの他の実施態様において、ｍＲＮＡは、Mellits KH et al.（そのすべての内容が引用により本明細書に組み込まれるRemovalof double−stranded contaminants from RNA transcripts:  synthesis of adenovirus VA RNA1 from a T7 vector. Nucleic AcidsResearch 18: 5401−5406, 1990）によって説明される通り精製される。これらの著者は、本発明の実施態様において用いられ得る、夾雑物を除去するための３工程精製を用いた。工程１は、７Ｍ尿素（変性条件）における８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法であった。主なＲＮＡバンドをゲル切片から摘出し、非変性条件（無尿素）下での８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、主なバンドをゲル切片から回収した。さらなる精製を、二本鎖ＲＮＡを一本鎖ＲＮＡから分離するエタノール−塩緩衝液移動相を用いて、セルロースＣＦ−１１カラムにおいて実施し（Franklin RM. 1966. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55: 1504−1511; Barber R. 1966. Biochem. Biophys. Acta114:422; and Zelcer A etal. 1982. J. Gen. Virol. 59: 139−148、これらのすべて
は、引用により本明細書に組み込まれる）、最終的な精製工程は、セルロースクロマトグラフィーであった。いくつかの他の実施態様において、ｍＲＮＡは、（例えば、それらのすべてが引用により本明細書に組み込まれる、Pays E. 1977. Biochem. J. 165: 237−245、Lewandowski LJ et al. 1971. J. Virol. 8: 809−812、Clawson GA and Smuckler EA.  1982. Cancer Research 42: 3228−3231、および/またはAndrews−PfannkochC et al. 2010. Applied and Environmental Microbiology 76: 5039−5045によって説明されるように）非変性条件下でまたはより高温でヒドロキシルアパタイト（ＨＡＰ）カラムを用いて精製される。いくつかの他の実施態様において、ｍＲＮＡは、（例えば、引用により本明細書に組み込まれる、インビトロでの転写反応を除去するためのEaston LE et al. 2010. RNA 16: 647−653によって説明されるように）非変性条件下で弱陰イオン交換液体クロマトグラフィーによって精製される。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡは、先の方法または当該技術分野で公知のもしくは将来開発される別の方法のいずれかの組み合わせを用いて精製される。なおも別の実施態様において、本発明の組成物および方法において用いられるｍＲＮＡは、該ｍＲＮＡを、１つ以上の夾雑物ＲＮＡまたは夾雑物核酸（例えば、ＤＮＡを含む）と特異的に作用する（例えば、消化する）が、所望のｍＲＮＡには作用しない（例えば、消化しない）酵素で処理することを含むプロセスを用いて精製される。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の組成物および方法において用いられるｍＲＮＡは、リボヌクレアーゼＩＩＩ（ＲＮａｓｅＩＩＩ）酵素（例えば、大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩ）で処理することを含むプロセスを用いて精製され、次に、該ｍＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩ消化産物とは別に精製される。本明細書のリボヌクレアーゼＩＩＩ（ＲＮａｓｅＩＩＩ）酵素は、約１２塩基対よりも大きな二本鎖ＲＮＡを消化して、二本鎖ＲＮＡ断片を支える酵素を意味する。いくつかの実施態様において、本発明の組成物および方法において用いられるｍＲＮＡは、該ｍＲＮＡを、１つ以上の夾雑物ＲＮＡまたは夾雑物核酸（例えば、ＤＮＡを含む）を特異的に消化する１つ以上の他の酵素で処理することを含むプロセスを用いて精製される。
【００９６】
本発明は、プソイドウリジンもしくは修飾されたヌクレオシドを含むＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子、それらを含む遺伝子療法ベクター、それらを含む遺伝子療法および遺伝子転写サイレンシング法、その免疫原性を低下させる方法、ならびにその合成方法を提供する。これらの修飾された配列は好ましくは、本明細書に説明される精製されたＲＮＡ調製物において存在する。
【００９７】
一実施態様において、本発明は、プソイドウリジン残基を含むメッセンジャーＲＮＡを提供する。別の実施態様において、メッセンジャーＲＮＡは、関心対象のタンパク質をコードする。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。別の実施態様において、本発明は、関心対象のタンパク質をコードするＲＮＡ分子を提供し、該ＲＮＡ分子は、プソイドウリジン残基を含む。別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンを含む、インビトロで転写されるＲＮＡ分子を提供する。別の実施態様において、本発明は、修飾されたヌクレオシドを含む、インビトロで転写されるＲＮＡ分子を提供する。
【００９８】
本明細書で提供されるように、本発明は、プソイドウリジンおよび／または修飾されたヌクレオシドを含む、インビトロで転写されるＲＮＡ分子を合成するための方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジン残基を含むメッセンジャーＲＮＡ分子を提供する。
【００９９】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のインビトロで転写されるＲＮＡ分子は、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼによって合成される。別の実施態様において、該分子は、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼによって合成される。別の実施態様において、該分子は、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼによって合成される。別の実施態様において、該分子は、先のポリメラーゼ類から選択されるポリメラーゼによって合成される。別の実施態様において、インビトロで転写されるＲＮＡ分子は、オリゴリボヌクレオチドである。別の実施態様において、インビトロで転写されるＲＮＡ分子は、ポリリボヌクレオチドである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む、インビトロで合成されたオリゴリボヌクレオチドを提供し、この中で、修飾されたヌクレオシドは、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ψ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕである。別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む、インビトロで合成されたポリリボヌクレオチドを提供し、この中で、修飾されたヌクレオシドは、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ψ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕである。
【０１００】
別の実施態様において、インビトロで合成されたオリゴリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドは、低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡである。別の実施態様において、インビトロで合成されたオリゴリボヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。別の実施態様において、インビトロで合成されたオリゴリボヌクレオチドは、当該技術分野で公知の任意の他の種類のオリゴリボヌクレオチドである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１０１】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子はさらに、機能的タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。別の実施態様において、該ＲＮＡ分子またはオリゴリボヌクレオチド分子は、ＲＮｚｙｍｅ等のように、（例えば、転写サイレンシングにおいて）機能的タンパク質をコードすることなく機能する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１０２】
別の実施態様において、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子はさらに、ポリ−Ａ末端を含む。別の実施態様において、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、ポリ−Ａ末端を含まない。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１０３】
別の実施態様において、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子はさらに、ｍ７ＧｐｐｐＧキャップを含む。別の実施態様において、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、ｍ７ＧｐｐｐＧキャップを含まない。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１０４】
別の実施態様において、ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子はさらに、キャップ非依存性翻訳エンハンサーを含む。別の実施態様において、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子分子は、キャップ非依存性翻訳エンハンサーを含まない。別の実施態様において、キャップ非依存性翻訳エンハンサーは、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）のキャップ非依存性翻訳エンハンサーである。別の実施態様において、キャップ非依存性翻訳エンハンサーは、当該技術分野で公知の任意の他のキャップ非依存性翻訳エンハンサーである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１０５】
別の実施態様において、本発明は、インビトロで合成されたポリリボヌクレオチド分子を含む遺伝子療法ベクターを提供し、この中で、ポリリボヌクレオチド分子は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む。
【０１０６】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、プソイドウリジンを含む。別の実施態様において、ＲＮＡ分子またはオリゴリボヌクレオチド分子は、修飾済みのヌクレオシドを含む。別の実施態様において、ＲＮＡ分子またはオリゴリボヌクレオチド分子は、インビトロで合成されたＲＮＡ分子またはオリゴリボヌクレオチドである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１０７】
「プソイドウリジン」は、別の実施態様において、ｍ１ａｃｐ３Ψ（１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、ｍ１Ψ（１−メチルプソイドウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、Ψｍ（２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、ｍ３Ψ（３−メチルプソイドウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、さらに修飾されていないプソイドウリジン部分を指す。別の実施態様において、該用語は、先のプソイドウリジンのいずれかの一リン酸、二リン酸、または三リン酸を指す。別の実施態様において、該用語は、当該技術分野で公知の任意の他のプソイドウリジンを指す。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１０８】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、治療用オリゴリボヌクレオチドである。
【０１０９】
別の実施態様において、本発明は、組換えタンパク質を対象に送達するための方法を提供し、該方法は、対象を、本発明のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、ポリリボヌクレオチド分子、または遺伝子療法ベクターと接触させ、それにより組換えタンパク質を対象に送達する工程を含む。
【０１１０】
別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含み、かつｓｉＲＮＡまたは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をさらに含む、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。別の実施態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、長さ５０ヌクレオチド超である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１１１】
別の実施態様において、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドは、ｓｉＲＮＡ配列内にある。別の実施態様において、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドは、ｓｉＲＮＡ配列の外側にある。別の実施態様において、１つ以上のプソイドウリジンおよび／または修飾されたヌクレオシド残基は、ｓｉＲＮＡ配列の内部および外側の両方に存在する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１１２】
別の実施態様において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ分子において内部に含有される。別の実施態様において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ分子の片方の末端に含有される。別の実施態様において、１つ以上のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ分子の片方の末端に含有されるのに対し、別の１つ以上は、内部に含有される。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１１３】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子（例えば、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）分子またはｄｓＲＮＡ分子）の長さは、長さ３０ヌクレオチド超である。別の実施態様において、ＲＮＡ分子またはオリゴリボヌクレオチドは、長さ３５ヌクレオチド超である。別の実施態様において、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも４０００ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも５０００ヌクレオチドである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１１４】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のｄｓＲＮＡ分子は、インビトロでの転写によって製造される。別の実施態様において、インビトロでの転写の工程は、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼを利用する。別の実施態様において、インビトロでの転写は、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼを利用する。別の実施態様において、インビトロでの転写は、先のポリメラーゼ類から選択されるＲＮＡポリメラーゼを利用する。別の実施態様において、インビトロでの転写は、当該技術分野で公知の任意の他のＲＮＡポリメラーゼを利用する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１１５】
別の実施態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、細胞酵素によって処理されて、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを生じることができる。別の実施態様において、細胞酵素は、エンドヌクレアーゼである。別の実施態様において、細胞酵素は、Ｄｉｃｅｒである。Ｄｉｃｅｒは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）および、これらの遺伝子サイレンシング経路の特異性を決定する低分子ＲＮＡの生成による関連現象を開始する、ＲＮａｓｅＩＩＩ−ファミリーヌクレアーゼである（Bernstein E, Caudy AA et al, Role for a bidentate ribonuclease inthe initiation step of RNA interference. Nature 2001; 409(6818): 363−6）。別の実施態様において、細胞酵素は、ｄｓＲＮＡ分子を開裂することのできる、当該技術分野で公知の任意の他の細胞酵素である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１１６】
別の実施態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、２のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含有する。別の実施態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、３のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含有する。別の実施態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、４つ以上のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含有する。別の実施態様において、ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡは、細胞酵素によってｄｓＲＮＡ分子から遊離する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１１７】
別の実施態様において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ分子を投与することを含む、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを細胞に投与するための方法を提供し、この中で、細胞は、ｄｓＲＮＡ分子を処理してｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを生じ、それによりｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを細胞に投与する。
【０１１８】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子において修飾されるヌクレオシドは、ウリジン（Ｕ）である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、シチジン（Ｃ）である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、アデノシン（Ａ）である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、グアノシン（Ｇ）である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１１９】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物の修飾されたヌクレオシドは、ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、Ψ（プソイドウリジン）である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）である。
【０１２０】
他の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、ｍｌＡ（ｌ−メチルアデノシン）、ｍ２Ａ（２メチルアデノシン）、Ａｍ（２’−Ｏ−メチルアデノシン）、ｍｓ２ｍＧＡ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）、ｉＧＡ（〜イソペンテニルアデノシン）、ｍｓｚｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）、ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）、ｔ６Ａ（Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−とレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｈｎ６Ａ（Ｎ６ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸））、Ｉ（イノシン）、ｍ１Ｉ（ｌ−メチルイノシン）、ｍｌＩｍ（ｌ，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）、ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）、Ｃｍ（２’−Ｏ−メチルシチジン）、Ｓ２Ｃ（２チオシチジン）、ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）、ｆ５Ｃ（５−ホルミルシチジン）、ｍ５Ｃｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン）、ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン）、ｋ２Ｃ（リシジン）、ｍ１Ｇ（ｌ−メチルグアノシン）、ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）、ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）、Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）、ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）、ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）、ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）、Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸））、ｙＷ（ワイブトシン）、ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ＊（未修飾ヒドロキシワイブトシン）、ｉｍＧ（ワイオシン）、ｍｉｍＧ（メチルワイオシン）、Ｑ（ケウオシン）、ｏＱ（エポキシケウオシン）、ｇａｌＱ（ガラクトシル−ケウオシン）、ｍａｎＱ（マンノシルケウオシン）、ｐｒｅＱ０（７−シアノ−７−デアザグアノシン）、ｐｒｅＱｌ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）、Ｇ＋（アルカエオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ））、Ｄ（ジヒドロウリジン）、ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）、Ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）、ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）、ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）、ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）、ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）、ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）、ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）、ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）、ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））、ｍｃｈｍ５Ｕ（５（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）、ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）、ｍｃｍ５Ｕｍ（５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）、ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）、ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５メチルアミノメチル−２−チオウリジン）、ｍｎｍｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）、ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）、ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−−メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）、ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）、Ｉｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）、ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）、ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン）、ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）、ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）、ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）、ｍ６Ａｍ（Ｎ６，２’−Ｏジメチルアデノシン）、ｍ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン）、ｍ２，７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）、ｍ２，２，７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）、ｍ３Ｕｍ（３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）、ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）、ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）、ｍｌＧｍ（ｌ，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）、ｍ１Ａｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン）、τｍ５Ｕ（５−タウリノメチルウリジン）、τｍ５ｓ２Ｕ（５−タウリノメチル−２−チオウリジン）、ｉｍＧ−１４（４−デメチルワイオシン）、ｉｍＧ２（イソワイオシン）、またはａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１２１】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、２つ以上の先の修飾の組み合わせを含む。別の実施態様において、ＲＮＡ分子またはオリゴリボヌクレオチド分子は、先の修飾のうちの３つ以上の組み合わせを含む。別の実施態様において、ＲＮＡ分子またはオリゴリボヌクレオチド分子は、先の修飾のうちの４つ以上の組み合わせを含む。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１２２】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子における残基の０．１％〜１００％は修飾される（例えば、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシド塩基のいずれかの存在による）。別の実施態様において、残基の０．１％は修飾される。別の実施態様においては、０．２％である。別の実施態様において、分率は０．３％である。別の実施態様において、分率は０．４％である。別の実施態様において、分率は０．５％である。別の実施態様において、分率は０．６％である。別の実施態様において、分率は０．８％である。別の実施態様において、分率は１％である。別の実施態様において、分率は１．５％である。別の実施態様において、分率は２％である。別の実施態様において、分率は２．５％である。別の実施態様において、分率は３％である。別の実施態様において、分率は４％である。別の実施態様において、分率は５％である。別の実施態様において、分率は６％である。別の実施態様において、分率は８％である。別の実施態様において、分率は１０％である。別の実施態様において、分率は１２％である。別の実施態様において、分率は１４％である。別の実施態様において、分率は１６％である。別の実施態様において、分率は１８％である。別の実施態様において、分率は２０％である。別の実施態様において、分率は２５％である。別の実施態様において、分率は３０％である。別の実施態様において、分率は３５％である。別の実施態様において、分率は４０％である。別の実施態様において、分率は４５％である。別の実施態様において、分率は５０％である。別の実施態様において、分率は６０％である。別の実施態様において、分率は７０％である。別の実施態様において、分率は８０％である。別の実施態様において、分率は９０％である。別の実施態様において、分率は１００％である。
【０１２３】
別の実施態様において、分率は５％未満である。別の実施態様において、分率は３％未満である。別の実施態様において、分率は１％未満である。別の実施態様において、分率は２％未満である。別の実施態様において、分率は４％未満である。別の実施態様において、分率は６％未満である。別の実施態様において、分率は８％未満である。別の実施態様において、分率は１０％未満である。別の実施態様において、分率は１２％未満である。別の実施態様において、分率は１５％未満である。別の実施態様において、分率は２０％未満である。別の実施態様において、分率は３０％未満である。別の実施態様において、分率は４０％未満である。別の実施態様において、分率は５０％未満である。別の実施態様において、分率は６０％未満である。別の実施態様において、分率は７０％未満である。
【０１２４】
別の実施態様において、所与のヌクレオチドの残基（ウリジン、シチジン、グアノシン、またはアデニン）の０．１％は修飾される。別の実施態様において、ヌクレオチドの分率は０．２％である。別の実施態様において、分率は０．３％である。別の実施態様において、分率は０．４％である。別の実施態様において、分率は０．５％である。別の実施態様において、分率は０．６％である。別の実施態様において、分率は０．８％である。別の実施態様において、分率は１％である。別の実施態様において、分率は１．５％である。別の実施態様において、分率は２％である。別の実施態様において、分率は２．５％である。別の実施態様において、分率は３％である。別の実施態様において、分率は４％である。別の実施態様において、分率は５％である。別の実施態様において、分率は６％である。別の実施態様において、分率は８％である。別の実施態様において、分率は１０％である。別の実施態様において、分率は１２％である。別の実施態様において、分率は１４％である。別の実施態様において、分率は１６％である。別の実施態様において、分率は１８％である。別の実施態様において、分率は２０％である。別の実施態様において、分率は２５％である。別の実施態様において、分率は３０％である。別の実施態様において、分率は３５％である。別の実施態様において、分率は４０％である。別の実施態様において、分率は４５％である。別の実施態様において、分率は５０％である。別の実施態様において、分率は６０％である。別の実施態様において、分率は７０％である。別の実施態様において、分率は８０％である。別の実施態様において、分率は９０％である。別の実施態様において、分率は１００％である。
【０１２５】
別の実施態様において、所与のヌクレオチドの分率は、８％未満である。別の実施態様において、分率は１０％未満である。別の実施態様において、分率は５％未満である。別の実施態様において、分率は３％未満である。別の実施態様において、分率は１％未満である。別の実施態様において、分率は２％未満である。別の実施態様において、分率は４％未満である。別の実施態様において、分率は６％未満である。別の実施態様において、分率は１２％未満である。別の実施態様において、分率は１５％未満である。別の実施態様において、分率は２０％未満である。別の実施態様において、分率は３０％未満である。別の実施態様において、分率は４０％未満である。別の実施態様において、分率は５０％未満である。別の実施態様において、分率は６０％未満である。別の実施態様において、分率は７０％未満である。
【０１２６】
別の実施態様において、用語「リボヌクレオチド」、「オリゴリボヌクレオチド」、および「ポリリボヌクレオチド」は、少なくとも２の塩基‐糖‐リン酸のひと連なり組み合わせを指す。該用語には、別の実施態様において、糖部分がリボースであるヌクレオチドを含む化合物が含まれる。別の実施態様において、該用語には、骨格が修飾されたＲＮＡおよびＲＮＡ誘導体の両方が含まれる。「ヌクレオチド」は、別の実施態様において、核酸ポリマーのモノマー単位を指す。ＲＮＡは、別の実施態様において、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（低分子核ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（伝令ＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態にあり得る。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用は説明されている（Caudy AA et al, Genes & Devel 16: 2491−96および該文献で引用される参考文献）。加えて、これらの形態のＲＮＡは、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖であり得る。該用語には、別の実施態様において、他の種類の骨格だが同じ塩基を含有し得る人工核酸も含まれる。別の実施態様において、人工核酸は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡは、ペプチド主鎖およびヌクレオチド塩基を含有し、別の実施態様において、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の両方に結合することができる。別の実施態様において、該ヌクレオチドは、オキセタン修飾されている。別の実施態様において、該ヌクレオチドは、１つ以上のホスホジエステル結合のホスホロチオアート結合との置き換えによって修飾される。別の実施態様において、該人工核酸は、当該技術分野で公知の天然核酸のリン酸骨格の任意の他のバリアントを含有する。ホスホチオラート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｒａｔｅ）核酸およびＰＮＡは、当業者に公知であり、例えば、Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353−57〜およびRaz NK et al Biochem Biophys Res Commun. 297:1075−84において説明される。核酸の製造および使用は、当業者に公知であり、例えば、MolecularCloning, (2001), Sambrook and Russell, eds.およびMethodsin Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchioand G. C. Fareedにおいて説明される。各核酸誘導体は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１２７】
別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」という用語は、２５ヌクレオチド（ｎｔ）未満を含むひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、２４ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、２３ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、２２ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、２１ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、２０ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、１９ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、１８ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、１７ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、１６ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１２８】
別の実施態様において、「ポリリボヌクレオチド」という用語は、２５ヌクレオチド（ｎｔ）超を含むひと連なりを指す。別の実施態様において、「ポリリボヌクレオチド」は、２６ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「ポリリボヌクレオチド」は、２８ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、３０ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、３２ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、３５ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、４０ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、５０ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、６０ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、８０ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、１００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、１２０ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、１５０ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、２００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、３００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、４００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、５００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、６００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、８００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、１０００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、１２００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、１４００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、１６００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、１８００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、２０００ヌクレオチド超のひと連なりを指す。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１２９】
別の実施態様において、本発明は、哺乳類細胞を、組換えタンパク質をコードする、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ、それにより哺乳類細胞を誘導して関心対象のタンパク質を産生することを含む、哺乳類細胞を誘導して、関心対象のタンパク質を産生するための方法を提供する。別の実施態様において、関心対象のタンパク質は、組換えタンパク質である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１３０】
「コードすること」は、別の実施態様において、関心対象のタンパク質をコードするＲＮＡ分子を指す。別の実施態様において、該ＲＮＡ分子は、関心対象のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。別の実施態様において、１つ以上の他のタンパク質もコードされる。別の実施態様において、関心対象のタンパク質は、コードされる唯一のタンパク質である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１３１】
別の実施態様において、本発明は、哺乳類細胞を、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドをさらに含む、組換えタンパク質をコードするインビトロで転写されるＲＮＡ分子と接触させ、それにより哺乳類細胞を誘導して、組換えタンパク質を産生することを含む、哺乳類細胞を誘導して、組換えタンパク質を産生する方法を提供する。
【０１３２】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、同じ配列を有する修飾されていないＲＮＡ分子よりも効率的に、細胞において翻訳される。別の実施態様において、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、標的細胞によって翻訳される高まった能力を呈する。別の実施態様において、翻訳は、その修飾されていない対応物に対して２倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、３倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、５倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、７倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、１０倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、１５倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、２０倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、５０倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、１００倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、２００倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、５００倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、１０００倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、２０００倍ほど高まる。別の実施態様において、倍数は１０〜１０００倍である。別の実施態様において、倍数は１０〜１００倍である。別の実施態様において、倍数は１０〜２００倍である。別の実施態様において、倍数は１０〜３００倍である。別の実施態様において、倍数は１０〜５００倍である。別の実施態様において、倍数は２０〜１０００倍である。別の実施態様において、倍数は３０〜１０００倍である。別の実施態様において、倍数は５０〜１０００倍である。別の実施態様において、倍数は１００〜１０００倍である。別の実施態様において、倍数は２００〜１０００倍である。別の実施態様において、翻訳は、任意の他の有意な量または量の範囲ほど高まる。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１３３】
翻訳効率を決定する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、コードされたリポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼもしくはウミシイタケ［本明細書の実施例］または緑色蛍光タンパク質［Wall AA, Phillips AM et al, Effective translation of thesecondcistron in two Drosophila dicistronic transcripts is determined by the absenceof in−frame AUG codons in the first cistron. J BiolChem 2005;280(30): 27670−8］）の活性を測定すること、または翻訳されたタンパク質に組み込まれた放射性
標識を測定すること（Ngosuwan J, Wang NM et al, Rolesof cytosolic Hsp70 and Hsp40 molecular chaperones in post−translational translocation of presecretory proteins into theendoplasmic reticulum. J Biol Chem 2003;278(9): 7034−42）を含む。各方法は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１３４】
本明細書に提供されるいくつかの発現研究において、翻訳を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）と複合体形成したＲＮＡから測定し、マウスの尾静脈に注射した。脾臓溶解産物において、プソイドウリジン修飾したＲＮＡは、修飾されていないＲＮＡよりも優位に効率的に翻訳された（図１７のＢ）。本明細書で利用される条件下で、本発明の形質移入ベースの方法の効率は、形質移入試薬が組織に浸透する能力と相関しており、該効果が脾細胞においてなぜ最も顕著であったかについての説明を提供する。脾臓血流は開放系であり、血液含有量は、リンパ球系細胞を含む赤脾髄要素および白脾髄要素と直接接触する。
【０１３５】
別の実験において、インビトロでのリン酸化アッセイを、組換えヒトＰＫＲおよびその基質であるｅＩＦ２αを用いて、キャッピングされたウミシイタケをコードするｍＲＮＡ（０．５および０．０５ｎｇ／μＬ）の存在下で実施した。プソイドウリジン（Ψ）を含有するｍＲＮＡは、ＰＫＲの自己リン酸化およびｅＩＦ２αのリン酸化の両方の欠失によって検出されるように、ＰＫＲを活性化しなかったのに対し、ヌクレオシド修飾のないＲＮＡおよびｍ５Ｃ修飾のあるｍＲＮＡは、ＰＫＲを活性化した。リン酸化型ｅＩＦ２αは、ｍＲＮＡ翻訳の開始を遮断することが公知であり、それゆえ、リン酸化の欠失は、別の実施態様において、プソイドウリジン（Ψ）を含有するｍＲＮＡの高まった翻訳を可能にする。
【０１３６】
別の実施態様において、高まった翻訳は、細胞においてである（同じ配列を有する修飾されていないＲＮＡの同じ細胞における翻訳との比較、実施例１３〜１４）。別の実施態様において、高まった翻訳は、インビトロである（例えば、インビトロでの翻訳混合物または網状赤血球溶解産物における、実施例１３〜１４）。別の実施態様において、高まった翻訳はインビボである（実施例１３）。各場合において、高まった翻訳は、同じ配列を有する同じ条件下にある修飾されていないＲＮＡに相対的である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１３７】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、同じ配列を有する修飾されていないインビトロで合成されたＲＮＡ分子よりも有意に免疫原性が低い。別の実施態様において、修飾されたＲＮＡ分子は、その修飾されていない対応物よりも免疫原性が２倍低い。別の実施態様において、免疫原性は３倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は５倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は７倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は１０倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は１５倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は２０倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は５０倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は１００倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は２００倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は  ５００倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は１０００倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は２０００倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は別の倍数差ほど低い。
【０１３８】
別の実施態様において、「有意により低い免疫原性」は、免疫原性における検出可能な低下を指す。別の実施態様において、該用語は、免疫原性における倍数低下を指す（例えば、先に列挙された倍数低下のうちの１つ）。別の実施態様において、該用語は、有効量のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子が、検出可能な免疫応答を惹起することなく投与されることができるような低下を指す。別の実施態様において、該用語は、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子が、組換えタンパク質の発現を検出可能に低下させるのに十分な免疫応答を誘発することなく反復して投与されることができるような低下を指す。別の実施態様において、該低下は、組換えタンパク質の検出可能な発現を除去するのに十分な免疫応答を誘発することなく反復して投与されることのできるようなものである。
【０１３９】
「有効量」のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、別の実施態様において、治療効果を発揮するのに十分な量を指す。別の実施態様において、該用語は、検出可能な量の組換えタンパク質の発現を誘発するのに十分な量を指す。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１４０】
本発明のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子の低下した免疫原性は、本明細書に示されている（実施例４〜１１）。
【０１４１】
免疫原性を決定する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−ｌαもしくはβ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β、またはＩＬ−８、本明細書の実施例）の分泌を測定すること、樹状細胞活性化マーカー（例えば、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６、本明細書の実施例）の発現を測定すること、または適応性免疫応答のためのアジュバントとして作用する能力を測定することを含む。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１４２】
別の実施態様において、修飾されたヌクレオチドおよびその修飾されていない対応物の相対的な免疫原性は、修飾されていないヌクレオチドの所与の量と同じ程度まで先の応答のうちの１つを誘発するのに必要な修飾されたヌクレオチドの量を決定することによって決定される。例えば、修飾されたヌクレオチドが、修飾されていないヌクレオチドよりも２倍低い免疫原性である場合、修飾されたヌクレオチドは、修飾されていないヌクレオチドよりも２倍低い免疫原性である。
【０１４３】
別の実施態様において、修飾されたヌクレオチドおよびその修飾されていない対応物の相対的な免疫原性は、修飾されていないヌクレオチドの同じ量に対する、修飾されたヌクレオチドの投与に応答して分泌されたサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、  ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−ｌαもしくはβ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β、またはＩＬ−８）の量を決定することによって決定される。例えば、修飾されていないヌクレオチドと比べて、サイトカインの半分が分泌されると、修飾されたヌクレオチドは、修飾されていないヌクレオチドの２倍低い免疫原性である。別の実施態様において、刺激の背景レベルが、先の方法における免疫原性を算出する前に減算される。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１４４】
別の実施態様において、本発明の方法はさらに、接触の工程の前に、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子を形質移入試薬と混合することを含む。別の実施態様において、本発明の方法はさらに、形質移入試薬とともにＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子を投与することを含む。別の実施態様において、形質移入試薬は、陽イオン性脂質試薬である（実施例６）。
【０１４５】
別の実施態様において、形質移入試薬は、脂質ベースの形質移入試薬である。別の実施態様において、形質移入試薬は、タンパク質ベースの形質移入試薬である。別の実施態様において、形質移入試薬は、ポリエチレンイミンベースの形質移入試薬である。別の実施態様において、形質移入試薬は、リン酸カルシウムである。別の実施態様において、形質移入試薬は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）である。別の実施態様において、形質移入試薬は、当該技術分野で公知の任意の他の形質移入試薬である。
【０１４６】
別の実施態様において、形質移入試薬は、リポソームを形成する。リポソームは、別の実施態様において、細胞内安定性を増大させ、取り込み効率を増大させ、生物活性を改良する。別の実施態様において、リポソームは、細胞膜を形成する脂質と類似した様式で配置された脂質から構成される中空の球状小胞である。リポソームは、別の実施態様において、水溶性化合物を捕捉するための内部水性空間を有し、大きさは直径０．０５〜数ミクロンに及ぶ。別の実施態様において、リポソームは、生物活性のある形態でＲＮＡを細胞に送達することができる。
【０１４７】
各種類の形質移入試薬は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１４８】
別の実施態様において、本発明の方法の標的細胞は、抗原提示細胞である。別の実施態様において、該細胞は動物細胞である。別の実施態様において、該細胞は樹状細胞である（実施例１４）。別の実施態様において、該細胞は神経細胞である。別の実施態様において、該細胞は脳細胞である（実施例１６）。別の実施態様において、該細胞は脾細胞である。別の実施態様において、該細胞はリンパ球系細胞である。別の実施態様において、該細胞は、肺細胞である（実施例１６）。別の実施態様において、該細胞は皮膚細胞である。別の実施態様において、該細胞はケラチノサイトである。別の実施態様において、該細胞は内皮細胞である。別の実施態様において、該細胞は星状細胞、小膠細胞、またはニューロンである（実施例１６）。別の実施態様において、該細胞は肺胞細胞である（実施例１６）。別の実施態様において、該細胞は、表面肺胞細胞である（実施例１６）。別の実施態様において、該細胞は肺胞マクロファージである。別の実施態様において、該細胞は肺胞肺細胞である。別の実施態様において、該細胞は脈管内皮細胞である。別の実施態様において、該細胞は間葉系細胞である。別の実施態様において、該細胞は上皮細胞である。別の実施態様において、該細胞は造血細胞である。別の実施態様において、該細胞は、コロニー上皮細胞である。別の実施態様において、該細胞は、肺上皮細胞である。別の実施態様において、該細胞は骨髄細胞である。
【０１４９】
他の実施態様において、標的細胞は、クラウディウス細胞、ヘンゼン細胞、メルケル細胞、ミューラー細胞、パネート細胞、プルキンエ細胞、シュワン細胞、セルトリ細胞、好酸細胞、腺房細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、褐色もしくは白色α細胞、無軸索細胞、β細胞、莢膜細胞、セメント細胞、主細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、クロム親和性細胞、色素嫌性細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、δ細胞、ランゲルハンス細胞、濾胞樹状細胞、腸管クロム親和性細胞、脳室上衣細胞、上皮細胞、基底細胞、鱗状細胞、内皮細胞、移行細胞、赤芽球、赤血球、線維芽細胞、線維細胞、濾胞細胞、生殖細胞、配偶子、卵子、精子、卵母細胞、第一卵母細胞、第二卵母細胞、不動精子、精母細胞、第一精母細胞、第二精母細胞、生殖上皮、巨細胞、神経膠細胞、星状芽細胞、星状細胞、乏突起神経膠芽細胞、希突起神経膠細胞、神経膠芽細胞、杯状細胞、性腺刺激ホルモン分泌細胞、顆粒膜細胞、血球芽細胞、有毛細胞、肝芽細胞、肝細胞、硝子体細胞、間質細胞、傍糸球体細胞、ケラチノサイト、角膜実質細胞、レンマ細胞（ｌｅｍｍａｌ  ｃｅｌｌ）、白血球、顆粒球、好塩基球、好酸球、好中球、リンパ芽球、Ｂリンパ芽球、Ｔリンパ芽球、リンパ球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパー誘導型Ｔリンパ球（ｈｅｌｐｅｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、Ｔｈ１  Ｔリンパ球、Ｔｈ２  Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、胸腺細胞、マクロファージ、クッパー細胞、肺胞マクロファージ、泡沫細胞、組織球、ルテイン細胞、リンパ球性幹細胞、リンパ系細胞、免疫幹細胞、大グリア細胞、乳腺刺激ホルモン産生細胞、マスト細胞、髄芽細胞、巨核芽球、巨核球、メラニン芽細胞、メラニン形成細胞、メサンギウム細胞、中皮細胞、後骨髄球、単芽球、単球、胃腺頚粘液細胞、筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨髄球、骨髄性細胞、骨髄幹細胞、筋芽細胞、筋上皮細胞、筋線維芽細胞、神経芽細胞、神経上皮細胞、ニューロン、象牙芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、酸分泌細胞、傍濾胞細胞、傍黄体細胞、消化細胞、周細胞、末梢血単核球、クロム親和性細胞、支持細胞、松果体細胞、後葉グリア細胞、形質細胞、血小板、被蓋細胞、前赤芽球、前単球、前骨髄芽球、前骨髄球、前正赤芽球、幹細胞、セルトリ細胞、終末グリア細胞、または酵素原細胞である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１５０】
とりわけ、単一遺伝子障害、感染性疾患、後天性疾患、癌、およびこれらに類するものを含む種々の障害が、本発明の方法を採用することによって治療され得る。例示的な単一遺伝子障害には、アデノシンデアミナーゼ欠損症、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、血友病、慢性肉芽腫症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ファンコニー貧血、鎌状赤血球貧血、ゴーシェ病、ハンター症候群、Ｘ染色体連鎖性重症複合免疫不全症、およびこれらに類するものが含まれる。別の実施態様において、治療される障害は、下記に列挙されるタンパク質のうちの１を包含する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１５１】
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子によってコードされる組換えタンパク質は、エクト−ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼである。
【０１５２】
別の実施態様において、組換えタンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である。他の実施態様において、コードされる組換えタンパク質は、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＤ３、ＡＣＡＤＭ、ＡＧＬ、ＡＧＴ、ＡＬＤＨ４ＡＩ、ＡＬＰＬ、ＡＭＰＤ１、ＡＰＯＡ２、ＡＶＳＤ１、ＢＲＣＤ２、Ｃ１ＱＡ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＧ、Ｃ８Ａ、Ｃ８Ｂ、ＣＡＣＮＡ１Ｓ、ＣＣＶ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＨＭＬ、ＣＨＳ１、ＣＩＡＳ１、ＣＬＣＮＫＢ、ＣＭＤ１Ａ、ＣＭＨ２、ＣＭＭ、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＰＴ２、ＣＲＢ１、ＣＳＥ、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＴＰＡ、ＣＴＳＫ、ＤＢＴ、ＤＩＯ１、ＤＩＳＣ１、ＤＰＹＤ、ＥＫＶ、ＥＮＯ１、ＥＮＯ１Ｐ、ＥＰＢ４１、ＥＰＨＸ１、Ｆ１３Ｂ、Ｆ５、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＨＬ、ＦＨ、ＦＭＯ３、ＦＭＯ４、ＦＵＣＡ１、ＦＹ、ＧＡＬＥ、ＧＢＡ、ＧＦＮＤ、ＧＪＡ８、ＧＪＢ３、ＧＬＣ３Ｂ、ＨＦ１、ＨＭＧＣＬ、ＨＰＣ１、ＨＲＤ、ＨＲＰＴ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＨＳＰＧ２、ＫＣＮＱ４、ＫＣＳ、ＫＩＦ１Ｂ、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、ＬＧＭＤ１Ｂ、ＬＭＮＡ、ＬＯＲ、ＭＣＫＤ１、ＭＣＬ１、ＭＰＺ、ＭＴＨＦＲ、ＭＴＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＯＣ、ＮＢ、ＮＣＦ２、ＮＥＭ１、ＮＰＨＳ２、ＮＰＰＡ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＯＰＴＡ２、ＰＢＸ１、ＰＣＨＣ、ＰＧＤ、ＰＨＡ２Ａ、ＰＨＧＤＨ、ＰＫＬＲ、ＰＫＰ１、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ、ＰＬＯＤ、ＰＰＯＸ、ＰＰＴ１、ＰＲＣＣ、ＰＲＧ４、ＰＳＥＮ２、ＰＴＯＳ１、ＲＥＮ、ＲＦＸ５、ＲＨＤ、ＲＭＤ１、ＲＰＥ６５、ＳＣＣＤ、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＳＪＳ１、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＰＧ２３、ＳＰＴＡ１、ＴＡＬ１、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＮＴ２、ＴＰＭ３、ＴＳＨＢ、ＵＭＰＫ、ＵＯＸ、ＵＲＯＤ、ＵＳＨ２Ａ、ＶＭＧＬＯＭ、ＶＷＳ、ＷＳ２Ｂ、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＣＡＤＬ、ＡＣＰ１、ＡＧＸＴ、ＡＨＨＲ、ＡＬＭＳ１、ＡＬＰＰ、ＡＬＳ２、ＡＰＯＢ、ＢＤＥ、ＢＤＭＲ、ＢＪＳ、ＢＭＰＲ２、ＣＨＲＮＡ１、ＣＭＣＷＴＤ、ＣＮＧＡ３、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＰＳＩ、ＣＲＹＧＡ、ＣＲＹＧＥＰ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＤＢＩ、ＤＥＳ、ＤＹＳＦ、ＥＤＡＲ、ＥＦＥＭＰＩ、ＥＩＦ２ＡＫ３、ＥＲＣＣ３、ＦＳＨＲ、ＧＩＮＧＦ、ＧＬＣ１Ｂ、ＧＰＤ２、ＧＹＰＣ、ＨＡＤＨＡ、ＨＡＤＨＢ、ＨＯＸＤ１３、ＨＰＥ２、ＩＧＫＣ、ＩＨＨ、ＩＲＳＩ、ＩＴＧＡ６、ＫＨＫ、ＫＹＮＵ、ＬＣＴ、ＬＨＣＧＲ、ＬＳＦＣ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＮＥＢ、ＮＭＴＣ、ＮＰＨＰ１、ＰＡＦＡＨ１Ｐ１、ＰＡＸ３、ＰＡＸ８、ＰＭＳ１、ＰＮＫＤ、ＰＰＨ１、ＰＲＯＣ、ＲＥＧ１Ａ、ＳＡＧ、ＳＦＴＰＢ、ＳＬＣ１１Ａ１、ＳＬＣ３Ａ１、ＳＯＳ１、ＳＰＧ４、ＳＲＤ５Ａ２、ＴＣＬ４、ＴＧＦＡ、ＴＭＤ、ＴＰＯ、ＵＧＴ１Ａ＠、ＵＶ２４、ＷＳＳ、ＸＤＨ、ＺＡＰ７０、ＺＦＨＸ１Ｂ、ＡＣＡＡ１、ＡＧＳ１、ＡＧＴＲ１、ＡＨＳＧ、ＡＭＴ、ＡＲＭＥＴ、ＢＢＳ３、ＢＣＨＥ、ＢＣＰＭ、ＢＴＤ、ＣＡＳＲ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤＬ１、ＣＭＴ２Ｂ、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＰ、ＣＰＯ、ＣＲＶ、ＣＴＮＮＢ１、ＤＥＭ、ＥＴＭ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＩＨ、ＦＯＸＬ２、ＧＢＥ１、ＧＬＢ１、ＧＬＣ１Ｃ、ＧＮＡＩ２、ＧＮＡＴＩ、ＧＰ９、ＧＰＸ１、ＨＧＤ、ＨＲＧ、ＩＴＩＨ１、ＫＮＧ、ＬＰＰ、ＬＲＳ１、ＭＣＣＣＩ、ＭＤＳ１、ＭＨＳ４、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＹＬ３、ＭＹＭＹ、ＯＰＡ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＰＢＸＰ１、ＰＣＣＢ、ＰＯＵ１Ｆ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＲＯＳ１、ＰＴＨＲ１、ＲＣＡ１、ＲＨＯ、ＳＣＡ７、ＳＣＬＣ１、ＳＣＮ５Ａ、ＳＩ、ＳＬＣ２５Ａ２０、ＳＬＣ２Ａ２、ＴＦ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＰＯ、ＴＨＲＢ、ＴＫＴ、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＲＨ、ＵＭＰＳ、ＵＱＣＲＣ１、ＵＳＨ３Ａ、ＶＨＬ、ＷＳ２Ａ、ＸＰＣ、ＺＮＦ３５、ＡＤＨ１Ｂ、ＡＤＨ１Ｃ、ＡＦＰ、ＡＧＡ、ＡＩＨ２、ＡＬＢ、ＡＳＭＤ、ＢＦＨＤ、ＣＮＧＡ１、ＣＲＢＭ、ＤＣＫ、ＤＳＰＰ、ＤＴＤＰ２、ＥＬＯＮＧ、ＥＮＡＭ、ＥＴＦＤＨ、ＥＶＣ、Ｆ１１、ＦＡＢＰ２、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＧＦＲ３、ＦＧＧ、ＦＳＨＭＤ１Ａ、ＧＣ、ＧＮＰＴＡ、ＧＮＲＨＲ、ＧＹＰＡ、ＨＣＡ、ＨＣＬ２、ＨＤ、ＨＴＮ３、ＨＶＢＳ６、ＩＤＵＡ、ＩＦ、ＪＰＤ、ＫＩＴ、ＫＬＫＢ１、ＬＱＴ４、ＭＡＮＢＡ、ＭＬＬＴ２、ＭＳＸ１、ＭＴＰ、ＮＲ３Ｃ２、ＰＢＴ、ＰＤＥ６Ｂ、ＰＥＥ１、ＰＩＴＸ２、ＰＫＤ２、ＱＤＰＲ、ＳＧＣＢ、ＳＬＣ２５Ａ４、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ３、ＳＴＡＴＨ、ＴＡＰＶＲ１、ＴＹＳ、ＷＢＳ２、ＷＦＳ１、ＷＨＣＲ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＲＢ２、ＡＭＣＮ、ＡＰ３ＢＩ、ＡＰＣ、ＡＲＳＢ、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＢＨＲ１、Ｃ６、Ｃ７、ＣＣＡＬ２、ＣＫＮ１、ＣＭＤＪ、ＣＲＨＢＰ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＨＦＲ、ＤＩＡＰＨ１、ＤＴＲ、ＥＯＳ、ＥＰＤ、ＥＲＶＲ、Ｆ１２、ＦＢＮ２、ＧＤＮＦ、ＧＨＲ、ＧＬＲＡ１、ＧＭ２Ａ、ＨＥＸＢ、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＴＧＡ２、ＫＦＳ、ＬＧＭＤ１Ａ、ＬＯＸ、ＬＴＣ４Ｓ、ＭＡＮ２Ａ１、ＭＣＣ、ＭＣＣＣ２、ＭＳＨ３、ＭＳＸ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＣＳＫ１、ＰＤＥ６Ａ、ＰＦＢＩ、ＲＡＳＡＩ、ＳＣＺＤＩ、ＳＤＨＡ、ＳＧＣＤ、ＳＬＣ２２Ａ５、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＣ６Ａ３、ＳＭ１、ＳＭＡ＠、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＳＰＩＮＫ５、ＴＣＯＦ１、ＴＥＬＡＢ１、ＴＧＦＢＩ、ＡＬＤＨ５Ａ１、ＡＲＧ１、ＡＳ、ＡＳＳＰ２、ＢＣＫＤＨＢ、ＢＦ、Ｃ２、Ｃ４Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＹＰ２１Ａ２、ＤＹＸ２、ＥＪＭ１、ＥＬＯＶＬ４、ＥＰＭ２Ａ、ＥＳＲ１、ＥＹＡ４、Ｆ１３Ａ１、ＦＡＮＣＥ、ＧＣＬＣ、ＧＪＡ１、ＧＬＹＳ１、ＧＭＰＲ、ＧＳＥ、ＨＣＲ、ＨＦＥ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＰＢＩ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＰＦＨ、ＩＣＳ１、ＩＤＤＭ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＧＡＤ１、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＳＣＷ、ＬＡＭＡ２、ＬＡＰ、ＬＣＡ５、ＬＰＡ、ＭＣＤＲ１、ＭＯＣＳ１、ＭＵＴ、ＭＹＢ、ＮＥＵ１、ＮＫＳ１、ＮＹＳ２、ＯＡ３、ＯＤＤＤ、ＯＦＣ１、ＰＡＲＫ２、ＰＢＣＡ、ＰＢＣＲＡ１、ＰＤＢ１、ＰＥＸ３、ＰＥＸ６、ＰＥＸ７、ＰＫＨＤ１、ＰＬＡ２Ｇ７、ＰＬＧ、ＰＯＬＨ、ＰＰＡＣ、ＰＳＯＲＳ１、ＰＵＪＯ、ＲＣＤ１、ＲＤＳ、ＲＨＡＧ、ＲＰ１４、ＲＵＮＸ２、ＲＷＳ、ＳＣＡ１、ＳＣＺＤ３、ＳＩＡＳＤ、ＳＯＤ２、ＳＴ８、ＴＡＰｌ、ＴＡＰ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＴＮＤＭ、ＴＮＦ、ＴＰＢＧ、ＴＰＭＴ、ＴＵＬＰ１、ＷＩＳＰ３、ＡＡＳＳ、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ４、ＡＣＨＥ、ＡＱＰ１、ＡＳＬ、ＡＳＮＳ、ＡＵＴＳ１、ＢＰＧＭ、ＢＲＡＦ、Ｃ７ｏｒｆ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＣＭ１、ＣＤ３６、ＣＦＴＲ、ＣＨＯＲＤＯＭＡ、ＣＬＣＮ１、ＣＭＨ６、ＣＭＴ２Ｄ、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＲＳ、ＣＹＭＤ、ＤＦＮＡ５、ＤＬＤ、ＤＹＴ１１、ＥＥＣ１、ＥＬＮ、ＥＴＶ１、ＦＫＢＰ６、ＧＣＫ、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＳ、ＧＬＩ３、ＧＰＤＳ１、ＧＵＳＢ、ＨＬＸＢ９、ＨＯＸＡ１３、ＨＰＦＨ２、ＨＲＸ、ＩＡＢ、ＩＭＭＰ２Ｌ、ＫＣＮＨ２、ＬＡＭＢ１、ＬＥＰ、ＭＥＴ、ＮＣＦ１、ＮＭ、ＯＧＤＨ、ＯＰＮ１ＳＷ、ＰＥＸ１、ＰＧＡＭ２、ＰＭＳ２、ＰＯＮ１、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＰＲＳＳ１、ＰＴＣ、ＰＴＰＮ１２、ＲＰ１０、ＲＰ９、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＣＥ、ＳＨＦＭ１、ＳＨＨ、ＳＬＣ２６Ａ３、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＯＳ、ＳＭＡＤ１、ＴＢＸＡＳ１、ＴＷＩＳＴ、ＺＷＳ１、ＡＣＨＭ３、ＡＤＲＢ３、ＡＮＫ１、ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＣＡＬ１、ＣＬＮ８、ＣＭＴ４Ａ、ＣＮＧＢ３、ＣＯＨ１、ＣＰＰ、ＣＲＨ、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＤＥＣＲ１、ＤＰＹＳ、ＤＵＲＳ１、ＥＢＳ１、ＥＣＡ１、ＥＧＩ、ＥＸＴ１、ＥＹＡ１、ＦＧＦＲ１、ＧＮＲＨ１、ＧＳＲ、ＧＵＬＯＰ、ＨＲ、ＫＣＮＱ３、ＫＦＭ、ＫＷＥ、ＬＧＣＲ、ＬＰＬ、ＭＣＰＨ１、ＭＯＳ、ＭＹＣ、ＮＡＴ１、ＮＡＴ２、ＮＢＳ１、ＰＬＡＴ、ＰＬＥＣ１、ＰＲＫＤＣ、ＰＸＭＰ３、ＲＰ１、ＳＣＺＤ６、ＳＦＩＰＣ、ＳＧＭ１、ＳＰＧ５Ａ、ＳＴＡＲ、ＴＧ、ＴＲＰＳ１、ＴＴＰＡ、ＶＭＤ１、ＷＲＮ、ＡＢＣＡ１、ＡＢＬ１、ＡＢＯ、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＫ１、ＡＬＡＤ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＯＢ、ＡＭＢＰ、ＡＭＣＤ１、ＡＳＳ、ＢＤＭＦ、ＢＳＣＬ、Ｃ５、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＡＣ、ＣＬＡ１、ＣＭＤ１Ｂ、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＲＡＴ、ＤＢＨ、ＤＮＡＩ１、ＤＹＳ、ＤＹＴ１、ＥＮＧ、ＦＡＮＣＣ、ＦＢＰ１、ＦＣＭＤ、ＦＲＤＡ、ＧＡＬＴ、ＧＬＤＣ、ＧＮＥ、ＧＳＭ１、ＧＳＮ、ＨＳＤ１７Ｂ３、ＨＳＮ１、ＩＢＭ２、ＩＮＶＳ、ＪＢＴＳ１、ＬＡＬＬ、ＬＣＣＳ１、ＬＣＣＳ、ＬＧＭＤ２Ｈ、ＬＭＸ１Ｂ、ＭＬＬＴ３、ＭＲＯＳ、ＭＳＳＥ、ＮＯＴＣＨ１、ＯＲＭ１、ＰＡＰＰＡ、ＰＩＰ５Ｋ１Ｂ、ＰＴＣＨ、ＰＴＧＳ１、ＲＬＮ１、ＲＬＮ２、ＲＭＲＰ、ＲＯＲ２、ＲＰＤ１、ＳＡＲＤＨ、ＳＰＴＬＣ１、ＳＴＯＭ、ＴＤＦＡ、ＴＥＫ、ＴＭＣ１、ＴＲＩＭ３２、ＴＳＣ１、ＴＹＲＰ１、ＸＰＡ、ＣＡＣＮＢ２、ＣＯＬ１７Ａｌ、ＣＵＢＮ、ＣＸＣＬ１２、ＣＹＰ１７、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ９、ＥＧＲ２、ＥＭＸ２、ＥＲＣＣ６、ＦＧＦＲ２、ＨＫ１、ＨＰＳ１、ＩＬ２ＲＡ、ＬＧＩ１、ＬＩＰＡ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＢＬ２、ＭＫＩ６７、ＭＸＩ１、ＮＯＤＡＬ、ＯＡＴ、ＯＡＴＬ３、ＰＡＸ２、ＰＣＢＤ、ＰＥＯ１、ＰＨＹＨ、ＰＮＬＩＰ、ＰＳＡＰ、ＰＴＥＮ、ＲＢＰ４、ＲＤＰＡ、ＲＥＴ、ＳＦＴＰＡ１、ＳＦＴＰＤ、ＳＨＦＭ３、ＳＩＡＬ、ＴＨＣ２、ＴＬＸ１、ＴＮＦＲＳＦ６、ＵＦＳ、ＵＲＯＳ、ＡＡ、ＡＢＣＣ８、ＡＣＡＴ１、ＡＬＸ４、ＡＭＰＤ３、ＡＮＣ、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＣ３、ＡＴＭ、ＢＳＣＬ２、ＢＷＳ、ＣＡＬＣＡ、ＣＡＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５９、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＬＮ２、ＣＮＴＦ、ＣＰＴ１Ａ、ＣＴＳＣ、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＤＨＣＲ７、ＤＬＡＴ、ＤＲＤ４、ＥＣＢ２、ＥＤ４、ＥＶＲ１、ＥＸＴ２、Ｆ２、ＦＳＨＢ、ＦＴＨ１、Ｇ６ＰＴ１、Ｇ６ＰＴ２、ＧＩＦ、ＨＢＢ、ＨＢＢＰ１、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＭＢＳ、ＨＮＤ、ＨＯＭＧ２、ＨＲＡＳ、ＨＶＢＳ１、ＩＤＤＭ２、ＩＧＥＲ、ＩＮＳ、ＪＢＳ、ＫＣＮＪ１１、ＫＣＮＪ１、ＫＣＮＱ１、ＬＤＨＡ、ＬＲＰ５、ＭＥＮ１、ＭＬＬ、ＭＹＢＰＣ３、ＭＹＯ７Ａ、ＮＮＯ１、ＯＰＰＧ、ＯＰＴＢ１、ＰＡＸ６、ＰＣ、ＰＤＸ１、ＰＧＬ２、ＰＧＲ、ＰＯＲＣ、ＰＴＨ、ＰＴＳ、ＰＶＲＬ１、ＰＹＧＭ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＲＯＭ１、ＲＲＡＳ２、ＳＡＡ１、ＳＣＡ５、ＳＣＺＤ２、ＳＤＨＤ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＳＭＰＤ１、ＴＣＩＲＧ１、ＴＣＬ２、ＴＥＣＴＡ、ＴＨ、ＴＲＥＨ、ＴＳＧ１０１、ＴＹＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＶＭＤ２、ＶＲＮＩ、ＷＴ１、ＷＴ２、ＺＮＦｌ４５、Ａ２Ｍ、ＡＡＡＳ、ＡＣＡＤＳ、ＡＣＬＳ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＬＤＨ２、ＡＭＨＲ２、ＡＯＭ、ＡＱＰ２、ＡＴＤ、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＤＣ、Ｃ１Ｒ、ＣＤ４、ＣＤＫ４、ＣＮＡ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＹＰ２７Ｂ１、ＤＲＰＬＡ、ＥＮＵＲ２、ＦＥＯＭ１、ＦＧＦ２３、ＦＰＦ、ＧＮＢ３、ＧＮＳ、ＨＡＬ、ＨＢＰ１、ＨＭＧＡ２、ＨＭＮ２、ＨＰＤ、ＩＧＦ１、ＫＣＮＡ１、ＫＥＲＡ、ＫＲＡＳ２、ＫＲＴ１、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴ３、ＫＲＴ４、ＫＲＴ５、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ６Ｂ、ＫＲＴＨＢ６、ＬＤＨＢ、ＬＹＺ、ＭＧＣＴ、ＭＰＥ、ＭＶＫ、ＭＹＬ２、ＯＡＰ、ＰＡＨ、ＰＰＫＢ、ＰＲＢ３、ＰＴＰＮ１１、ＰＸＲ１、ＲＬＳ、ＲＳＮ、ＳＡＳ、ＳＡＸ１、ＳＣＡ２、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＭＡＬ、ＳＰＰＭ、ＳＰＳＭＡ、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＣＦ１、ＴＰＩ１、ＴＳＣ３、ＵＬＲ、ＶＤＲ、ＶＷＦ、ＡＴＰ７Ｂ、ＢＲＣＡ２、ＢＲＣＤ１、ＣＬＮ５、ＣＰＢ２、ＥＤ２、ＥＤＮＲＢ、ＥＮＵＲ１、ＥＲＣＣ５、Ｆ１０、Ｆ７、ＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＩＰＦ１、ＭＢＳ１、ＭＣＯＲ、ＮＹＳ４、ＰＣＣＡ、ＲＢ１、ＲＨＯＫ、ＳＣＺＤ７、ＳＧＣＧ、ＳＬＣ１０Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ１５、ＳＴＡＲＰ１、ＺＮＦ１９８、ＡＣＨＭ１、ＡＲＶＤ１、ＢＣＨ、ＣＴＡＡ１、ＤＡＤ１、ＤＦＮＢ５、ＥＭＬ１、ＧＡＬＣ、ＧＣＨ１、ＩＢＧＣ１、ＩＧＨ＠、ＩＧＨＣｇｒｏｕｐ、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＭ、ＩＧＨＲ、ＩＶ、ＬＴＢＰ２、ＭＣＯＰ、ＭＪＤ、ＭＮＧ１、ＭＰＤ１、ＭＰＳ３Ｃ、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＮＰ、
ＮＰＣ２、ＰＡＢＰＮ１、ＰＳＥＮ１、ＰＹＧＬ、ＲＰＧＲＩＰ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＡ６、ＳＬＣ７Ａ７、ＳＰＧ３Ａ、ＳＰＴＢ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＧＭＩ、ＴＩＴＦ１、ＴＭＩＰ、ＴＲＡ＠、ＴＳＨＲ、ＵＳＨ１Ａ、ＶＰ、ＡＣＣＰＮ、ＡＨＯ２、ＡＮＣＲ、Ｂ２Ｍ、ＢＢＳ４、ＢＬＭ、ＣＡＰＮ３、ＣＤＡＮ１、ＣＤＡＮ３、ＣＬＮ６、ＣＭＨ３、ＣＹＰ１９、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＤＹＸ１、ＥＰＢ４２、ＥＴＦＡ、ＥＹＣＬ３、ＦＡＨ、ＦＢＮ１、ＦＥＳ、ＨＣＶＳ、ＨＥＸＡ、ＩＶＤ、ＬＣＳ１、ＬＩＰＣ、ＭＹ０５Ａ、ＯＣＡ２、ＯＴＳＣ１、ＰＷＣＲ、ＲＬＢＰ１、ＳＬＣ１２Ａ１、ＳＰＧ６、ＴＰＭ１、ＵＢＥ３Ａ、ＷＭＳ、ＡＢＣＣ６、ＡＬＤＯＡ、ＡＰＲＴ、ＡＴＰ２Ａ１、ＢＢＳ２、ＣＡＲＤ１５、ＣＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＥＴＰ、ＣＨＳＴ６、ＣＬＮ３、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＴＨ、ＣＴＭ、ＣＹＢＡ、ＣＹＬＤ、ＤＨＳ、ＤＮＡＳＥ１、ＤＰＥＰ１、ＥＲＣＣ４、ＦＡＮＣＡ、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＮ、ＨＡＧＨ、ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＨＲ、ＨＢＱ１、ＨＢＺ、ＨＢＺＰ、ＨＰ、ＨＳＤ１１Ｂ２、ＩＬ４Ｒ、ＬＩＰＢ、ＭＣ１Ｒ、ＭＥＦＶ、ＭＨＣ２ＴＡ、ＭＬＹＣＤ、ＭＭＶＰ１、ＰＨＫＢ、ＰＨＫＧ２、ＰＫＤ１、ＰＫＤＴＳ、ＰＭＭ２、ＰＸＥ、ＳＡＬＬ１、ＳＣＡ４、ＳＣＮＮ１Ｂ、ＳＣＮＮ１Ｇ、ＳＬＣ１２Ａ３、ＴＡＴ、ＴＳＣ２、ＶＤＩ、ＷＴ３、ＡＢＲ、ＡＣＡＣＡ、ＡＣＡＤＶＬ、ＡＣＥ、ＡＬＤＨ３Ａ２、ＡＰＯＨ、ＡＳＰＡ、ＡＸＩＮ２、ＢＣＬ５、ＢＨＤ、ＢＬＭＨ、ＢＲＣＡ１、ＣＡＣＤ、ＣＣＡ１、ＣＣＺＳ、ＣＨＲＮＢ１、ＣＨＲＮＥ、ＣＭＴ１Ａ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＲＤ５、ＣＴＮＳ、ＥＰＸ、ＥＲＢＢ２、Ｇ６ＰＣ、ＧＡＡ、ＧＡＬＫ１、ＧＣＧＲ、ＧＦＡＰ、ＧＨ１、ＧＨ２、ＧＰ１ＢＡ、ＧＰＳＣ、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ１２、ＫＲＴ１３、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１４Ｌ１、ＫＲＴ１４Ｌ２、ＫＲＴ１４Ｌ３、ＫＲＴ１６、ＫＲＴ１６Ｌ１、ＫＲＴ１６Ｌ２、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ９、ＭＡＰＴ、ＭＤＢ、ＭＤＣＲ、ＭＧＩ、ＭＨＳ２、ＭＫＳ１、ＭＰＯ、ＭＹＯ１５Ａ、ＮＡＧＬＵ、ＮＡＰＢ、ＮＦ１、ＮＭＥ１、Ｐ４ＨＢ、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＰＥＣＡＭ１、ＰＥＸ１２、ＰＨＢ、ＰＭＰ２２、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＷＮＫ４、ＰＲＰ８、ＰＲＰＦ８、ＰＴＬＡＨ、ＲＡＲＡ、ＲＣＶ１、ＲＭＳＡ１、ＲＰ１７、ＲＳＳ、ＳＣＮ４Ａ、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＳＧＣＡ、ＳＧＳＨ、ＳＨＢＧ、ＳＬＣ２Ａ４、ＳＬＣ４Ａ１、ＳＬＣ６Ａ４、ＳＭＣＲ、ＳＯＳＴ、ＳＯＸ９、ＳＳＴＲ２、ＳＹＭ１、ＳＹＮＳＩ、ＴＣＦ２、ＴＨＲＡ、ＴＩＭＰ２、ＴＯＣ、ＴＯＰ２Ａ、ＴＰ５３、ＴＲＩＭ３７、ＶＢＣＨ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＢＣＬ２、ＣＮＳＮ、ＣＯＲＤ１Ｉ、ＣＹＢ５、ＤＣＣ、Ｆ５Ｆ８Ｄ、ＦＥＣＨ、ＦＥＯ、ＬＡＭＡ３、ＬＣＦＳ２、ＭＡＤＨ４、ＭＡＦＤ１、ＭＣ２Ｒ、ＭＣＬ、ＭＹＰ２、ＮＰＣ１、ＳＰＰＫ、ＴＧＦＢＲＥ、ＴＧＩＦ、ＴＴＲ、ＡＤ２、ＡＭＨ、ＡＰＯＣ２、ＡＰＯＥ、ＡＴＨＳ、ＢＡＸ、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＬ３、ＢＦＩＣ、Ｃ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＣＣＯ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＯＭＰ、ＣＲＸ、ＤＢＡ、ＤＤＵ、ＤＦＮＡ４、ＤＬＬ３、ＤＭ１、ＤＭＷＤ、Ｅ１１Ｓ、ＥＬＡ２、ＥＰＯＲ、ＥＲＣＣ２、ＥＴＦＢ、ＥＸＴ３、ＥＹＣＬＩ、ＦＴＬ、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ６、ＧＡＭＴ、ＧＣＤＨ、ＧＰＩ、ＧＵＳＭ、ＨＢ１、ＨＣＬ１、ＨＨＣ２、ＨＨＣ３、ＩＣＡＭ３、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ３、ＫＬＫ３、ＬＤＬＲ、ＬＨＢ、ＬＩＧ１、ＬＯＨ１９ＣＲ１、ＬＹＬ１、ＭＡＮ２Ｂ１、ＭＣＯＬＮ１、ＭＤＲＶ、ＭＬＬＴ１、ＮＯＴＣＨ３、ＮＰＨＳ１、ＯＦＣ３、ＯＰＡ３、ＰＥＰＤ、ＰＲＰＦ３１、ＰＲＴＮ３、ＰＲＸ、ＰＳＧ１、ＰＶＲ、ＲＹＲ１、ＳＬＣ５Ａ５、ＳＬＣ７Ａ９、ＳＴＫ１１、ＴＢＸＡ２Ｒ、ＴＧＦＢ１、ＴＮＮＩ３、ＴＹＲＯＢＰ、ＡＤＡ、ＡＨＣＹ、ＡＶＰ、ＣＤＡＮ２、ＣＤＰＤ１、ＣＨＥＤ１、ＣＨＥＤ２、ＣＨＲＮＡ４、ＣＳＴ３、ＥＤＮ３、ＥＥＧＶ１、ＦＴＬＬ１、ＧＤＦ５、ＧＮＡＳ、ＧＳＳ、ＨＮＦ４Ａ、ＪＡＧ１、ＫＣＮＱ２、ＭＫＫＳ、ＮＢＩＡ１、ＰＣＫ１、ＰＩ３、ＰＰＣＤ、ＰＰＧＢ、ＰＲＮＰ、ＴＨＢＤ、ＴＯＰ１、ＡＩＲＥ、ＡＰＰ、ＣＢＳ、ＣＯＬ６Ａｌ、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＳＴＢ、ＤＣＲ、ＤＳＣＲ１、ＦＰＤＭＭ、ＨＬＣＳ、ＨＰＥ１、ＩＴＧＢ２、ＫＣＮＥ１、ＫＮＯ、ＰＲＳＳ７、ＲＵＮＸ１、ＳＯＤ１、ＴＡＭ、ＡＤＳＬ、ＡＲＳＡ、ＢＣＲ、ＣＥＣＲ、ＣＨＥＫ２、ＣＯＭＴ、ＣＲＹＢＢ２、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＴＨＭ、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｄ７Ｐ１、ＤＧＣＲ、ＤＩＡ１、ＥＷＳＲ１、ＧＧＴ１、ＭＧＣＲ、ＭＮ１、ＮＡＧＡ、ＮＥ２、ＯＧＳ２、ＰＤＧＦＢ、ＰＰＡＲＡ、ＰＲＯＤＨ、ＳＣＯ２、ＳＣＺＤ４、ＳＥＲＰＩＮＤ１、ＳＬＣ５ＡＩ、ＳＯＸＩ０、ＴＣＮ２、ＴＩＭＰ３、ＴＳＴ、ＶＣＦ、ＡＢＣＤ１、ＡＣＴＬ１、ＡＤＦＮ、ＡＧＭＸ２、ＡＨＤＳ、ＡＩＣ、ＡＩＥＤ、ＡＩＨ３、ＡＬＡＳ２、ＡＭＣＤ、ＡＭＥＬＸ、ＡＮＯＰ１、ＡＲ、ＡＲＡＦ１、ＡＲＳＣ２、ＡＲＳＥ、ＡＲＴＳ、ＡＲＸ、ＡＳＡＴ、ＡＳＳＰ５、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＲＸ、ＡＶＰＲ２、ＢＦＬＳ、ＢＧＮ、ＢＴＫ、ＢＺＸ、Ｃ１ＨＲ、ＣＡＣＮＡ１Ｆ、ＣＡＬＢ３、ＣＢＢＭ、ＣＣＴ、ＣＤＲ１、ＣＦＮＳ、ＣＧＦ１、ＣＨＭ、ＣＨＲ３９Ｃ、ＣＩＤＸ、ＣＬＡ２、ＣＬＣＮ５、ＣＬＳ、ＣＭＴＸ２、ＣＭＴＸ３、ＣＮＤ、ＣＯＤ１、ＣＯＤ２、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＰＸ、ＣＶＤ１、ＣＹＢＢ、ＤＣＸ、ＤＦＮ２、ＤＦＮ４、ＤＦＮ６、ＤＨＯＦ、ＤＩＡＰＨ２、ＤＫＣ１、ＤＭＤ、ＤＳＳ、ＤＹＴ３、ＥＢＭ、ＥＢＰ、ＥＤ１、ＥＬＫ１、ＥＭＤ、ＥＶＲ２、Ｆ８、Ｆ９、ＦＣＰ１、ＦＤＰＳＬ５、ＦＧＤ１、ＦＧＳ１、ＦＭＲ１、ＦＭＲ２、Ｇ６ＰＤ、ＧＡＢＲＡ３、ＧＡＴＡ１、ＧＤＩ１、ＧＤＸＹ、ＧＪＢ１、ＧＫ、ＧＬＡ、ＧＰＣ３、ＧＲＰＲ、ＧＴＤ、ＧＵＳＴ、ＨＭＳ１、ＨＰＲＴ１、ＨＰＴ、ＨＴＣ２、ＨＴＲ２Ｃ、ＨＹＲ、ＩＤＳ、ＩＨＧ１、ＩＬ２ＲＧ、ＩＮＤＸ、ＩＰ１、ＩＰ２、ＪＭＳ、ＫＡＬ１、ＫＦＳＤ、ＬＩＣＡＭ、ＬＡＭＰ２、ＭＡＡ、ＭＡＦＤ２、ＭＡＯＡ、ＭＡＯＢ、ＭＣＦ２、ＭＣＳ、ＭＥＡＸ、ＭＥＣＰ２、ＭＦ４、ＭＧＣＩ、ＭＩＣ５、ＭＩＤ１、ＭＬＬＴ７、ＭＬＳ、ＭＲＳＤ、ＭＲＸ１４、ＭＲＸ１、ＭＲＸ２０、ＭＲＸ２、ＭＲＸ３、ＭＲＸ４０、ＭＲＸＡ、ＭＳＤ、ＭＴＭＩ、ＭＹＣＬ２、ＭＹＰＩ、ＮＤＰ、ＮＨＳ、ＮＰＨＬＩ、ＮＲＯＢＩ、ＮＳＸ、ＮＹＳＩ、ＮＹＸ、ＯＡＩ、ＯＡＳＤ、ＯＣＲＬ、ＯＤＴＩ、ＯＦＤ１、ＯＰＡ２、ＯＰＤ１、ＯＰＥＭ、ＯＰＮ１ＬＷ、ＯＰＮ１ＭＷ、ＯＴＣ、Ｐ３、ＰＤＨＡ１、ＰＤＲ、ＰＦＣ、ＰＦＫＦＢ１、ＰＧＫ１、ＰＧＫ１Ｐ１、ＰＧＳ、ＰＨＥＸ、ＰＨＫＡ１、ＰＨＫＡ２、ＰＨＰ、ＰＩＧＡ、ＰＬＰ１、ＰＯＦ１、ＰＯＬＡ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＰＭＸ、ＰＲＤ、ＰＲＰＳＩ、ＰＲＰＳ２、ＰＲＳ、ＲＣＣＰ２、ＲＥＮＢＰ、ＲＥＮＳ１、ＲＰ２、ＲＰ６、ＲＰＧＲ、ＲＰＳ４Ｘ、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＲＳ１、Ｓ１１、ＳＤＹＳ、ＳＥＤＬ、ＳＥＲＰＩＮＡ７、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＨＦＭ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＳＭＡＸ２、ＳＲＰＸ、ＳＲＳ、ＳＴＳ、ＳＹＮ１、ＳＹＰ、ＴＡＦ１、ＴＡＺ、ＴＢＸ２２、ＴＤＤ、ＴＦＥ３、ＴＨＡＳ、ＴＨＣ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＩＭＰ１、ＴＫＣＲ、ＴＮＦＳＦ５、ＵＢＥ１、ＵＢＥ２Ａ、ＷＡＳ、ＷＳＮ、ＷＴＳ、ＷＷＳ、ＸＩＣ、ＸＩＳＴ、ＸＫ、ＸＭ、ＸＳ、ＺＦＸ、ＺＩＣ３、ＺＮＦ２６１、ＺＮＦ４１、ＺＮＦ６、ＡＭＥＬＹ、ＡＳＳＰ６、ＡＺＦＩ、ＡＺＦ２、ＤＡＺ、ＧＣＹ、ＲＰＳ４Ｙ、ＳＭＣＹ、ＳＲＹ、ＺＦＹ、ＡＢＡＴ、ＡＥＺ、ＡＦＡ、ＡＦＤ１、ＡＳＡＨ１、ＡＳＤ１、ＡＳＭＴ、ＣＣＡＴ、ＣＥＣＲ９、ＣＥＰＡ、ＣＬＡ３、ＣＬＮ４、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＴＳＩ、ＤＦ、ＤＩＨ１、ＤＷＳ、ＤＹＴ２、ＤＹＴ４、ＥＢＲ３、ＥＣＴ、ＥＥＦ１Ａ１Ｌ１４、ＥＹＣＬ２、ＦＡＮＣＢ、ＧＣＳＨ、ＧＣＳＬ、ＧＩＰ、ＧＴＳ、ＨＨＧ、ＨＭＩ、ＨＯＡＣ、ＨＯＫＰＰ２、ＨＲＰＴ１、ＨＳＤ３Ｂ３、ＨＴＣ１、ＨＶ１Ｓ、ＩＣＨＱ、ＩＣＲ１、ＩＣＲ５、ＩＬ３ＲＡ、ＫＡＬ２、ＫＭＳ、ＫＲＴ１８、ＫＳＳ、ＬＣＡＴ、ＬＨＯＮ、ＬＩＭＭ、ＭＡＮＢＢ、ＭＣＰＨ２、ＭＥＢ、ＭＥＬＡＳ、ＭＩＣ２、ＭＰＦＤ、ＭＳ、ＭＳＳ、ＭＴＡＴＰ６、ＭＴＣＯＩ、ＭＴＣＯ３、ＭＴＣＹＢ、ＭＴＮＤ１、ＭＴＮＤ２、ＭＴＮＤ４、ＭＴＮＤ５、ＭＴＮＤ６、ＭＴＲＮＲ１、ＭＴＲＮＲ２、ＭＴＴＥ、ＭＴＴＧ、ＭＴＴＩ、ＭＴＴＫ、ＭＴＴＬ１、ＭＴＴＬ２、ＭＴＴＮ、ＭＴＴＰ、ＭＴＴＳ１、ＮＡＭＳＤ、ＯＣＤ１、ＯＰＤ２、ＰＣＫ２、ＰＣＬＤ、ＰＣＯＳ１、ＰＦＫＭ、ＰＫＤ３、ＰＲＣＡ１、ＰＲＯ１、ＰＲＯＰ１、ＲＢＳ、ＲＦＸＡＰ、ＲＰ、ＳＨＯＸ、ＳＬＣ２５Ａ６、ＳＰＧ５Ｂ、ＳＴＯ、ＳＵＯＸ、ＴＨＭ、またはＴＴＤである。各組換えタンパク質は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１５３】
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞を、エリスロポエチンをコードするインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ、それにより対象における貧血を治療することを含む、対象における貧血を治療するための方法を提供する。別の実施態様において、インビトロで合成されたＲＮＡ分子はさらに、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。別の実施態様において、細胞は、皮下組織細胞である。別の実施態様において、細胞は肺細胞である。別の実施態様において、細胞は線維芽細胞である。別の実施態様において、細胞はリンパ球系細胞である。別の実施態様において、細胞は平滑筋細胞である。別の実施態様において、細胞は、当該技術分野で公知の任意の他の種類の細胞である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１５４】
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞を、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）をコードするインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ、それにより対象における血管攣縮を治療することを含む、対象における血管攣縮を治療するための方法を提供する。
【０１５５】
別の実施態様において、本発明は、対象における細胞を、熱ショックタンパク質をコードするインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ、それにより対象における細胞の生存率を改良することを含む、該細胞の生存率を改良するための方法を提供する。
【０１５６】
別の実施態様において、生存率の改良された細胞は、虚血性細胞である。別の実施態様において、該細胞は、虚血性ではない。別の実施態様において、該細胞は、虚血性環境に曝露されている。別の実施態様において、該細胞は、環境ストレスに曝露されている。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１５７】
別の実施態様において、本発明は、血管の細胞を、熱ショックタンパク質をコードするインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ、それにより、対象における再狭窄の発生率を低下させることを含む、血管を拡大させる手順後に血管の再狭窄の発生率を低下させるための方法を提供する。
【０１５８】
別の実施態様において、前記手順は、血管形成術である。別の実施態様において、前記手順は、血管を拡大させる当該技術分野で公知の任意の他の手順である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１５９】
別の実施態様において、本発明は、対象の頭皮の細胞を、テロメラーゼまたは免疫抑制性タンパク質をコードするインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ、それにより、毛包からの養毛を増加させることを含む、該頭皮における毛包からの発毛を増加させるための方法を提供する。
【０１６０】
別の実施態様において、免疫抑制性タンパク質は、α−メラニン形成細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）である。別の実施態様において、免疫抑制性タンパク質は、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）である。別の実施態様において、免疫抑制性タンパク質は、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）である。別の実施態様において、免疫抑制性タンパク質は、当該技術分野で公知の任意の他の免疫抑制性タンパク質である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１６１】
別の実施態様において、本発明は、細胞を、抗酸化活性を有する酵素をコード鵜ｓるインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ、それにより細胞における抗酸化活性を有する酵素の発現を誘導することを含む、細胞における抗酸化活性を有する酵素の発現を誘導する方法を提供する。
【０１６２】
一実施態様において、該酵素はカタラーゼである。別の実施態様において、該酵素はグルタチオンペルオキシダーゼである。別の実施態様において、該酵素は、リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼである。別の実施態様において、該酵素は、スーパーオキシドジスムターゼ−１である。別の実施態様において、該酵素は、スーパーオキシドジスムターゼ−２である。別の実施態様において、該酵素は、当該技術分野で公知の抗酸化活性を有する任意の他の酵素である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１６３】
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞を、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードするインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ、それにより、対象における嚢胞性線維症を治療することを含む、対象における嚢胞性線維症を治療するための方法を提供する。
【０１６４】
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞を、ブルトン型チロシンキナーゼをコードするインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ、それにより、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症を治療することを含む、対象におけるＸ連鎖無ガンマグロブリン血症を治療するための方法を提供する。
【０１６５】
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞を、アデノシンデアミナーゼをコードするインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ、それによりアデノシンデアミナーゼ重症複合免疫不全（ＡＤＡ  ＳＣＩＤ）を治療することを含む、対象におけるＡＤＡ  ＳＣＩＤを治療するための方法を提供する。
【０１６６】
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞を、エクト−ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼをコードするインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ、それにより皮膚の免疫応答性を低下させ、および皮膚の病態を改良することを含む、皮膚の免疫応答性を低下させ、および皮膚の病態を改良するための方法を提供する。
【０１６７】
別の実施態様において、本発明のＲＮＡ分子またはリボヌクレオチド分子は、ナノ粒子に封入される。ナノ粒子封入のための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、BoseS, et al (Role of Nucleolin in Human Parainfluenza Virus Type 3Infection of Human Lung Epithelial Cells. J. Virol. 78:8146. 2004)、Dong Y et al. Poly(d,l−lactide−co−glycolide)/montmorillonite nanoparticlesfor oral delivery of anticancer drugs. Biomaterials 26:6068. 2005)、Lobenberg R. et al (Improved body distribution of 14C−labelled AZT bound to nanoparticles in rats determined byradioluminography. J Drug Target 5:171. 1998)、Sakuma SRet al (Mucoadhesion of polystyrene nanoparticles having surface hydrophilicpolymeric chains in the gastrointestinal tract. Int J Pharm 177:161. 1999)、Virovic L et al. Novel delivery methodsfor treatment of viralhepatitis: an update. Expert Opin Drug Deliv 2:707.2005)、およびZimmermann E et al., Electrolyte−and pH−stabilities of aqueous solid lipid nanoparticle (SLN) dispersions inartificial gastrointestinal media. Eur J Pharm Biopharm 52:203.2001）において説明される。各方法は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１６８】
本発明の化合物の薬用量範囲の種々の実施態様を、本発明の方法において用いることができる。一実施態様において、該薬用量は、１〜１０μｇ／日の範囲にある。別の実施態様において、該薬用量は、２〜１０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、３〜１０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、５〜１０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、２〜２０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、３〜２０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、５〜２０μｇ／日である。別の実施態様において、薬用量は、１０〜２０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、３〜４０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、５〜４０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、１０〜４０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、２０〜４０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、５〜５０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、１０〜５０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、２０〜５０μｇ／日である。一実施態様において、該薬用量は、１〜１００μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、２〜１００μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、３〜１００μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、５〜１００μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、１０〜１００μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、２０〜１００μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、４０〜１００μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、６０〜１００μｇ／日である。
【０１６９】
別の実施態様において、該薬用量は、０．１μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、０．２μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、０．３μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、０．５μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、１μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、２  ｍｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、３μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、５μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、１０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、１５μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、２０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、３０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、４０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、６０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、８０μｇ／日である。別の実施態様において、該薬用量は、１００μｇ／日である。
【０１７０】
別の実施態様において、該薬用量は、１０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、３０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、４０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、６０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、８０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１５０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、３００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、４００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、６００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、８００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１０００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１．５ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、３ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、５ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１５ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、３０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、５０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、８０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１００ｍｇ／用量である。
【０１７１】
別の実施態様において、該薬用量は、１０〜２０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２０〜３０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２０〜４０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、３０〜６０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、４０〜８０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、５０〜１００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、５０〜１５０μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１００〜２００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２００〜３００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、３００〜４００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、４００〜６００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、５００〜８００μｇ／／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、８００〜１０００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１０００〜１５００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１５００〜２０００μｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２〜３ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２〜５ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２〜１０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２〜２０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２〜３０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２〜５０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２〜８０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、２〜１００ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、３〜１０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、３〜２０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、３〜３０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、３〜５０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、３〜８０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、３〜１００ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、５〜１０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、５〜２０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、５〜３０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、５〜５０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、５〜８０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、５〜１００ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１０〜２０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１０〜３０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１０〜５０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１０〜８０ｍｇ／用量である。別の実施態様において、該薬用量は、１０〜１００ｍｇ／用量である。
【０１７２】
別の実施態様において、該薬用量は、日用量である。別の実施態様において、該薬用量は、週用量である。別の実施態様において、該薬用量は、月用量である。別の実施態様において、該薬用量は、年用量である。別の実施態様において、該用量は、一連の規定された数の用量における１である。別の実施態様において、該用量は、単回用量である。下記に説明されるように、別の実施態様において、本発明のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子の利点は、より少量の用量の使用を可能にする、該分子のより大きな効能である。
【０１７３】
別の実施態様において、本発明は、インビトロでの翻訳用具をプソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むインビトロで合成されたＲＮＡ分子と接触させ、それにより組換えタンパク質を産生することを含む、組換えタンパク質を産生するための方法を提供する。
【０１７４】
別の実施態様において、本発明は、インビトロでの翻訳用具を、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むインビトロで転写されるＲＮＡ分子と接触させ、それにより組換えタンパク質を産生することを含む、組換えタンパク質を産生するための方法を提供する。
【０１７５】
別の実施態様において、本発明は、修飾されていないヌクレオチド、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含有するヌクレオチド、およびポリメラーゼを含むインビトロでの転写用具を提供する。別の実施態様において、本発明は、修飾されていないヌクレオチド、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含有するヌクレオチド、およびポリメラーゼを含むインビトロでの転写キットを提供する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１７６】
別の実施態様において、インビトロでの翻訳用具は、網状赤血球の溶解産物を含む。別の実施態様において、網状赤血球の溶解産物は、ウサギ網状赤血球溶解産物である。
【０１７７】
別の実施態様において、本発明は、オリゴリボヌクレオチド分子またはＲＮＡ分子のヌクレオチドを、修飾されたヌクレオシドまたはプソイドウリジンを含有する修飾されたヌクレオチドと置き換え、それにより、オリゴリボヌクレオチド分子またはＲＮＡ分子の免疫原性を低下させることを含む、オリゴリボヌクレオチド分子またはＲＮＡ分子の免疫原性を低下させる方法を提供する。
【０１７８】
別の実施態様において、本発明は、ポリリボヌクレオチド分子またはＲＮＡ分子のヌクレオチドを、修飾されたヌクレオシドまたはプソイドウリジンを含有する修飾されたヌクレオチドと置き換え、それにより、遺伝子療法ベクターの免疫原性を低下させる工程を含む、ポリリボヌクレオチド分子またはＲＮＡ分子を含む遺伝子療法ベクターの免疫原性を低下させる方法を提供する。
【０１７９】
別の実施態様において、本発明は、ポリリボヌクレオチド分子またはＲＮＡ分子のヌクレオチドを、修飾されたヌクレオシドまたはプソイドウリジンを含有する修飾されたヌクレオチドと置き換え、それにより、遺伝子療法ベクターからのインビボでの翻訳を亢進する工程を含む、ポリリボヌクレオチド分子またはＲＮＡ分子を含む遺伝子療法ベクターからのインビボでの翻訳を亢進する方法を提供する。
【０１８０】
別の実施態様において、本発明は、ポリリボヌクレオチド分子またはＲＮＡ分子のヌクレオチドを、修飾されたヌクレオシドまたはプソイドウリジンを含有する修飾されたヌクレオチドと置き換え、それにより、遺伝子療法ベクターによる組換えタンパク質の送達の効率性を高める工程を含む、ポリリボヌクレオチド分子またはＲＮＡ分子を含む遺伝子療法ベクターによる組換えタンパク質の送達の効率性を高める方法を提供する。
【０１８１】
別の実施態様において、本発明は、ポリリボヌクレオチド分子またはＲＮＡ分子のヌクレオチドを、修飾されたヌクレオシドまたはプソイドウリジンを含有する修飾されたヌクレオチドと置き換え、それにより、遺伝子療法ベクターのインビボでの安定性を高める工程を含む、遺伝子療法ベクターのインビボでの安定性を高める方法を提供する。
【０１８２】
別の実施態様において、本発明は、単離されたポリメラーゼを、修飾されていないヌクレオチドと修飾されたヌクレオチドとの混合物と接触させることを含む、プソイドウリジンヌクレオシドを含むインビトロで転写されるＲＮＡ分子を合成する方法を提供する（実施例５および１０）。
【０１８３】
別の実施態様において、本発明のインビトロでの転写方法は、動物細胞からの抽出物を利用する。別の実施態様において、該抽出物は、網状赤血球またはインビトロでの転写の類似の効率性を有する細胞に由来する。別の実施態様において、該抽出物は、当該技術分野で公知の任意の他の種類の細胞に由来する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１８４】
本発明のＲＮＡ分子またはオリゴリボヌクレオチド分子のうちのいずれも、別の実施態様において、本発明の方法のうちのいずれにおいても用いられ得る。
【０１８５】
別の実施態様において、本発明は、抗原をミトコンドリア（ｍｔ）ＲＮＡとの組み合わせで投与することを含む、抗原に対する免疫応答を亢進する方法を提供する（実施例４および８）。
【０１８６】
別の実施態様において、本発明は、本発明の方法によってＲＮＡ分子のヌクレオシドを修飾することを含む、樹状細胞（ＤＣ）を刺激するＲＮＡ分子の能力を低下させる方法を提供する（例えば、実施例参照）。
【０１８７】
別の実施態様において、該ＤＣは、ＤＣ１細胞である。別の実施態様において、該ＤＣは、ＤＣ２細胞である。別の実施態様において、該ＤＣは、ＤＣ１細胞またはＤＣ２細胞のサブタイプである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１８８】
別の実施態様において、本発明ｈあ、本発明の方法によってＲＮＡ分子のヌクレオシドを修飾することを含む、ＴＬＲ３によるシグナル伝達を刺激するＲＮＡ分子の能力を低下させる方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、本発明の方法によるＲＮＡ分子のヌクレオシドを修飾することを含む、ＴＬＲ７によるシグナル伝達を刺激するＲＮＡ分子の能力を低下させる方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、本発明の方法によるＲＮＡ分子のヌクレオシドを修飾することを含む、ＴＬＲ８によるシグナル伝達を刺激するＲＮＡ分子の能力を低下させる方法を提供する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１８９】
別の実施態様において、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子におけるヌクレオシド間結合またはヌクレオチド間結合のすべては、ホスホジエステルである。別の実施態様において、ヌクレオチド間結合は、主としてホスホジエステルである。別の実施態様において、ヌクレオチド間結合のほとんどは、ホスホロチオアートである。別の実施態様において、ヌクレオチド間結合のほとんどは、ホスホジエステルである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０１９０】
別の実施態様において、ホスホジエステルである、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子におけるヌクレオチド間結合の割合は、５０％超である。別の実施態様において、該割合は１０％超である。別の実施態様において、該割合は１５％超である。別の実施態様において、該割合は２０％超である。別の実施態様において、該割合は２５％超である。別の実施態様において、該割合は３０％超である。別の実施態様において、該割合は３５％超である。別の実施態様において、該割合は４０％超である。別の実施態様において、該割合は４５％超である。別の実施態様において、該割合は５５％超である。別の実施態様において、該割合は６０％超である。別の実施態様において、該割合は６５％超である。別の実施態様において、該割合は７０％超である。別の実施態様において、該割合は７５％超である。別の実施態様において、該割合は８０％超である。別の実施態様において、該割合は８５％超である。別の実施態様において、該割合は９０％超である。別の実施態様において、該割合は９５％超である。
【０１９１】
別の実施態様において、本発明の方法は、ＲＮＡ分子における修飾されたヌクレオシドの数、割合、または頻度を高めて、免疫原性を低下させまたは翻訳の効率を高めることを含む。本明細書で提供される場合（例えば、実施例参照）、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子における修飾された残基の数は、別の実施態様において、本発明において観察される効果の程度を決定する。
【０１９２】
別の実施態様において、本発明は、対象を、組換えタンパク質をコードする、プソイドウリジンまたは別の修飾されたヌクレオシドをさらに含むインビトロで転写されるＲＮＡ分子と接触させ、それにより、該対象の細胞に該組換えタンパク質を導入することを含む、該対象の細胞に該組換えタンパク質を導入するための方法を提供する。
【０１９３】
別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシド塩基を含有するよう遺伝子療法ベクターを操作し、それにより、対象における遺伝子療法ベクターに応答してＴＮＦ−α産生を低下させる工程を含む、対象における該ベクターに応答してＴＮＦ−α産生を低下させるための方法を提供する。
【０１９４】
別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシド塩基を含有するよう遺伝子療法ベクターを操作し、それにより対象における遺伝子療法ベクターに応答してＩＬ−１２産生を低下させる工程を含む、対象における該ベクターに応答してＩＬ−１２産生を低下させるための方法を提供する。
【０１９５】
別の実施態様において、本発明は、修飾されたヌクレオシドを遺伝子療法ベクターに導入し、それにより遺伝子療法ベクターの免疫原性を低下させることを含む、該遺伝子療法ベクターの免疫原性を低下させる方法を提供する。
【０１９６】
本明細書で提供される場合、本発明の発見は、初代ＤＣが、ｍ５Ｃ修飾されたおよびｍ６Ａ修飾されたＲＮＡを認識する追加的なＲＮＡシグナル伝達実体を有し、そのシグナル伝達が、Ｕ残基の修飾によって阻害されることを示す。
【０１９７】
別の実施態様において、本発明のＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子の利点は、（ＤＮＡベースのベクターとは反対に）ＲＮＡが、ゲノムに組み込まないことである。別の実施態様において、利点は、ＲＮＡ翻訳、それゆえコードされた産物の出現が瞬時であることである。別の実施態様において、利点は、ｍＲＮＡから生じたタンパク質の量が、多かれ少なかれＲＮＡを送達することによって調節されることができることである。別の実施態様において、利点は、精製されたプソイドウリジンまたは他の修飾されたＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、もしくはポリリボヌクレオチド分子の反復された送達が、免疫応答を誘導しないのに対し、修飾されていないＲＮＡの反復された送達が、ＲＮＡセンサーを通じてシグナル伝達経路を誘導し得ることである。
【０１９８】
別の実施態様において、利点は、炎症性サイトカインの発生のない反復した送達を可能にする、免疫原性の欠失である。別の実施態様において、ＲＮＡの安定性は、エキソヌクレアーゼによる分解を低下させる環化によって高まる。
【０１９９】
別の実施態様において、本発明は、自己ＲＮＡ分子に対する免疫応答を含む疾患を有する対象に、ＴＬＲ−３分子のアンタゴニストを投与し、それにより、自己ＲＮＡ分子に対する免疫応答を含む疾患を有する対象を治療することを含む、該対象を治療する方法を提供する。
【０２００】
別の実施態様において、本発明は、自己ＲＮＡ分子に対する免疫応答を含む疾患を有する対象に、ＴＬＲ−７分子のアンタゴニストを投与し、それにより、自己ＲＮＡ分子に対する免疫応答を含む疾患を有する対象を治療することを含む、該対象を治療する方法を提供する。
【０２０１】
別の実施態様において、本発明は、自己ＲＮＡ分子に対する免疫応答を含む疾患を有する対象に、ＴＬＲ−８分子のアンタゴニストを投与し、それにより、自己ＲＮＡ分子に対する免疫応答を含む疾患を有する対象を治療することを含む、該対象を治療する方法を提供する。
【０２０２】
別の実施態様において、本発明は、自己ＲＮＡ分子に対する免疫応答を含む疾患は、自己免疫疾患である。別の実施態様において、該疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。別の実施態様において、該疾患は、自己ＲＮＡ分子に対する免疫応答を含む、当該技術分野で公知の別の疾患である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０２０３】
別の実施態様において、本発明は、本発明の方法を実施する上で利用される試薬を含むキットを提供する。別の実施態様において、本発明は、本発明の組成物、ツール、または器具を含むキットを提供する。
【０２０４】
別の実施態様において、本発明は、実施例７において例証されるように、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、およびＴＬＲ−７受容体によるシグナル伝達を測定または研究するためのキットを提供する。
【０２０５】
別の実施態様において、本発明の処置プロトコールは、治療的である。別の実施態様において、該プロトコールは予防的である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０２０６】
一実施態様において、「細胞を接触させること」または「集団を接触させること」という表現は、直接的または間接的であり得る曝露の方法を指す。一方法において、このような接触は、微量注入法など、当該技術分野で周知の任意の手段を通じた、細胞の直接的な注入を含む。別の実施態様において、細胞への供給は、細胞を取り囲む培地における提供を介して、対象への投与を介して、または当該技術分野で公知の任意の経路を介してなど、間接的である。別の実施態様において、「接触させること」という用語は、本発明の分子が、処置を受けている対象に導入されることを意味し、該分子は、インビボでの細胞と接触させておかれる。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０２０７】
網状赤血球の頻度の定量化のためのおよびＥＰＯ生物活性を測定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ramos, AS et al (Biological evaluation of recombinant humanerythropoietin in pharmaceutical products. Braz J Med Biol Res 36:1561）において説明されている。各方法は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０２０８】
本発明の組成物は、別の実施態様において、非経口的に、側癌性に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、膣内に、または腫瘍内になど、当業者に公知の任意の方法によって対象に投与されることができる。
【０２０９】
本発明の方法および組成物の別の実施態様において、該組成物は経口的に投与され、したがって、経口投与に好適な形態で、すなわち、固形または液体の調製物として製剤化される。好適な固形経口調製物には、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレット剤、およびこれらに類するものが含まれる。好適な液体経口製剤には、液剤、懸濁剤、分散剤、エマルション、油、およびこれらに類するものが挙げられる。本発明の別の実施態様において、活性成分は、カプセル中に製剤化される。本実施態様によると、本発明の組成物は、該活性化合物および不活性担体もしくは不活性希釈剤に加えて、硬質ゼラチン化カプセルを含む。
【０２１０】
他の実施態様において、医薬組成物は、液体調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体製剤には、液剤、懸濁剤、分散剤、エマルション、油、およびこれらに類するものが含まれる。別の実施態様において、医薬組成物は、静脈内に投与され、したがって、静脈内投与に好適な形態で製剤化される。別の実施態様において、医薬組成物は、動脈内に投与され、したがって、動脈内投与に好適な形態で製剤化される。別の実施態様において、医薬組成物は、筋肉内投与され、したがって、筋肉内投与に好適な形態で製剤化される。
【０２１１】
別の実施態様において、医薬組成物は、体表面に局所的に投与され、したがって、局所投与に好適な形態で製剤化される。好適な局所製剤には、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、ドロップ、およびこれらに類するものが含まれる。局所投与のために、該組成物またはその生理学的に耐容性のある誘導体は、医薬担体とともにまたはそれなしで、生理学的に許容し得る希釈剤中の液剤、懸濁剤、またはエマルションとして調製および適用される。
【０２１２】
別の実施態様において、該組成物は、坐剤、例えば、直腸坐剤または尿道坐剤として投与される。別の実施態様において、該医薬組成物は、ペレットの皮下埋没によって投与される。別の実施態様において、ペレットは、薬剤の経時的な徐放のために備える。
【０２１３】
別の実施態様において、活性化合物は、小胞、例えば、リポソームにおいて送達される（Langer,Science 249: 1527−1533 (1990)、Treatet al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez−Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353−365 (1989)、Lopez−Berestein,ibid., pp. 317−327参照、一般的には同書参照）。
【０２１４】
本明細書で使用する場合、「医薬として許容し得る担体または希釈剤」は、当業者に周知である。該担体または希釈剤は、種々の実施態様において、固形製剤のための固形の担体もしくは希釈剤、液体製剤のための液体の担体もしくは希釈剤、またはこれらの混合物であり得る。
【０２１５】
別の実施態様において、固形担体／希釈剤には、ゴム、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、あらかじめゼラチン化したデンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース性材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリラート（例えば、ポリメチルアクリラート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、滑石、またはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１６】
他の実施態様において、液体製剤のための医薬として許容し得る担体は、水性もしくは非水性の溶液、懸濁液、エマルション、または油であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチル等の駐車可能な有機エステルである。水性担体には、塩類溶液および緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルション、または懸濁液が含まれる。油の例は、石油、動物、植物、または合成の起源の油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、オリーブ油、ヒマワリ油、および魚肝油である。
【０２１７】
非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射用）には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、ならびに不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および養分の補液、リンゲルデキストロースをベースにしたものなどの電解質の補液、ならびにこれらに類するものが含まれる。例は、界面活性剤および他の医薬として許容し得るアジュバントの添加を伴うまたは伴わない、水および油等の滅菌済み液体である。一般に、水、塩類溶液、水性デキストロース、および関連糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールは、好ましい液体担体であり、特に注射可能な溶液のためにそうである。油の例は、石油、動物、植物、もしくは合成の起源の油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、オリーブ油、ヒマワリ油、および魚肝油である。
【０２１８】
別の実施態様において、前記組成物はさらに、結合剤（例えば、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化シリコン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーゴム、グリコール酸デンプンナトリウム）、種々のｐＨおよびイオン強度の緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、表面への吸収を防止するためのアルブミンまたはゼラチン等の添加物、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、浸透増強剤、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール）、安定化剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増粘剤（例えば、カルボマー、コロイド状二酸化シリコン、エチルセルロース、グアーゴム）、甘味料（例えば、アスパルターム、クエン酸）、保存料（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ、ベンジルアルコール、パラベン）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、流動酸（ｆｌｏｗ−ａｃｉｄ）（例えば、コロイド状二酸化シリコン）、可塑化剤（例えば、フタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル）、乳化剤（例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、ポリマーコーティング（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）、コーティングおよびフィルム形成剤（例えば、エチルセルロース、アクリラート、ポリメタクリラート）ならびに／あるいはアジュバントを含む。先の賦形剤の各々は、本発明の個別の実施態様を表す。
【０２１９】
別の実施態様において、本明細書で提供される医薬組成物は、徐放性組成物、すなわち、化合物が１５の投与後に経時的に放出される組成物である。徐放性または持効性組成物には、親油性デポー剤（例えば、脂肪酸、ワックス、油）における製剤が含まれる。別の実施態様において、該組成物は、即時放出型組成物、すなわち、化合物全体が投与直後に放出される組成物である。
【０２２０】
別の実施態様において、本発明の分子は、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、またはポリプロリン等の水溶性ポリマーの共有結合によって修飾される。修飾された化合物は、対応する修飾されていない化合物よりも静脈内注射後の実質的に長い血中半減期を呈することが知られている（Abuchowski et al., 1981、Newmark et al., 1982、およびKatre et al., 1987）。また、このような修飾は、別の実施態様において、水溶液中の化合物の溶解度を高め、凝集を排除し、化合物の物理的および化学的安定性を亢進し、化合物の免疫原性および反応性を大きく低下させる。結果として、所望のインビボでの生物活性は、修飾されていない化合物よりもより低い頻度でまたは少量の用量で、このようなポリマー‐化合物アブダクツ（ａｂｄｕｃｔ）の投与によって達成され得る。
【０２２１】
活性成分は、別の実施態様において、中和された医薬として許容し得る塩形態として組成物へと製剤化される。医薬として許容し得る塩には、例えば、塩酸もしくはリン酸等の無機酸と、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸、およびこれらの類似物のような有機酸と形成される酸付加塩（例えば、ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基とともに形成される）が含まれる。また、遊離カルボキシル基から形成された塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化鉄等の無機塩基に、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、およびこれらに類するもののような有機塩基に由来し得る。
【０２２２】
先の添加物、賦形剤、製剤、および投与方法の各々は、本発明の個別の実施態様を表す。
【実施例】
【０２２３】
別段の記載がない限り、以下の実験プロトコールを、下記に提供される実施例において採用した。
【０２２４】
（実施例１〜３についての材料および方法）
細胞培養。
【０２２５】
ヒト新生児包皮線維芽細胞１０７９細胞（カタログ番号ＣＲＬ−２０９７，  ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）およびヒトＩＭＲ９０細胞（カタログ番号ＣＣＬ−１８６，  ＡＴＣＣ）を、１０％熱失活済みウシ胎仔血清（ＦＢＳ，  Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｌｏｇａｎ，  ＵＴ）、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ  ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）において培養した。すべての細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。いくつかの実験において、本明細書に説明された方法を用いて誘導されるヒトｉＰＳ細胞を、２０％ノックアウト血清交換剤、０．１ｍＭのＬ−グルタミン（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、および１００ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地における０．１％ゼラチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，  ＮＪ）であらかじめ被覆した１０cmプレートにおける照射済みのマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）において維持した。いくつかの実験において、本明細書に説明された方法を用いて誘導されるヒトｉＰＳ細胞を、すでに説明されたように（Xu et al. 2001）回収したＭＥＦ馴化培地において維持した。
【０２２６】
ベクターの構築。ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のためのｃＤＮＡを、ｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅し（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，  ＡＬ）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流でプラスミドベクターへとクローン化し（Mackie 1988, Studier and Moffatt 1986）（例えば、種々のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ベクター，  Ａｇｉｌｅｎｔ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡまたはｐＧＥＭ（商標）ベクター，  Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、配列決定した。ＳＯＸ２のＯＲＦをｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｃ−ＭＹＣのＯＲＦをＲＴ−ＰＣＲによって、ＨｅＬａ細胞全ＲＮＡから単離した。ＳＯＸ２およびｃ−ＭＹＣの両ＯＲＦも、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流のプラスミドベクターへとクローン化し、配列決定した。
【０２２７】
（ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）のヒトオープンリーディングフレームを含有する代替的なプラスミドベクターをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩへとクローン化した。これらのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを、先のオープンリーディングフレームをＥｃｏＲＶ（ｃＭｙｃ）またはＥｃｏＲＶ／ＳｐｅＩ（ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）部位へと、説明された５’および３’アフリカツメガエルβ−グロビン非翻訳領域の間で連結することによって構築した（Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ  １９８４）。
【０２２８】
ｍＲＮＡの製造。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有プラスミドコンストラクト（ｐＴ７−ＫＬＦ４，  ｐＴ７−ＬＩＮ２８，  ｐＴ７−ｃ−ＭＹＣ，  ｐＴ７−ＯＣＴ４，  ｐＴ７−ＳＯＸ２，  ｏｒ  ｐＴ７−ＸＢｇ−ＫＬＦ４，  ｐＴ７−ＸＢｇ−ＬＩＮ２８，  ｐＴ７−ＸＢｇ−ｃ−ＭＹＣ，  ｐＴ７−ＸＢｇ−ＯＣＴ４，  ａｎｄ  ｐＴ７−ＸＢｇ−ＳＯＸ２）をＢａｍＨＩで線形化し、ｐＴ７−ＮＡＮＯＧおよびｐＴ７−ＸＢｇ−ＮＡＮＯＧをＸｂａＩで線形化した。ｍＳＣＲＩＰＴ（商標）ｍＲＮＡ製造システム（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥまたはＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）を用いて、５’キャップ１構造および３’ポリ（Ａ）末端を有するｍＲＮＡを製造した（例えば、およそ１５０のＡ残基を有する）が、例外は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼインビトロ転写反応において、ウリジン−５’−三リン酸の替わりにプソイドウリジン−５’−三リン酸（ＴＲＩＬＩＮＫ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いることであった。
【０２２９】
ｍＲＮＡの精製および分析。いくつかの実験的実施態様において、ｍＲＮＡをＨＰＬＣによって精製し、カラム画分を回収し、ｍＲＮＡ画分を、において説明されるように、ならびに／または図２２〜図２４に説明されおよび示されるように、免疫原性の精度について分析した。いくつかの実験的実施態様において、免疫原性をほとんどまたは全く呈さない１つ以上の再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを含むかまたはそれからなる精製されたＲＮＡ調製物を、ヒト体細胞をｉＰＳ細胞に再プログラム化するための実験に用いた。
【０２３０】
ＭＥＦにおけるヒト体細胞の再プログラム化。
【０２３１】
１０７９線維芽細胞を、０．１％ゼラチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であらかじめコーティングされた６ウェル皿の１×１０５個／ウェルで播種し、一晩増殖させた。１０７９線維芽細胞に、ＴｒａｎｓＩＴ  ｍＲＮＡ形質移入試薬（ＭｉｒｕｓＢｉｏ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いて、等量の各再プログラム化因子ｍＲＮＡ（ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）を形質移入した。合計３回の形質移入を実施し、１回の形質移入を１日おきに実施し、培地を第一および第二の形質移入の翌日に交換した。第三の形質移入の翌日、細胞をトリプシン処理し、３．３×１０５個を、前日に７．５×１０５のＭＥＦを播種した、０．１％ゼラチンであらかじめ被覆した１０ｃｍプレートへと１０７９中で播種した。形質移入した１０７９線維芽細胞をＭＥＦ上に播種した翌日、培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。ｉＰＳ細胞培地を毎日交換した。形質移入した細胞をＭＥＦ上に播種した８日後、ＭＥＦ馴化培地を用いた。ＭＥＦ馴化培地をすでに説明された通り回収した（Xu et al. 2001）。プレートを、倒立顕微鏡を用いて、ｉＰＳ形態を有するコロニーの存在について毎日スクリーニングした。
【０２３２】
ＭＥＦ上の１０７９線維芽細胞およびＩＭＲ９０線維芽細胞を再プログラム化するための代替的なプロトコールも用いた。ＭＥＦを、０．１％ゼラチンであらかじめ被覆した６ウェル皿の１．２５×１０５個／ウェルに播種し、完全線維芽細胞培地において一晩インキュベートした。１０７９線維芽細胞またはＩＭＲ９０線維芽細胞を、前日にＭＥＦを播種した６ウェル皿の３×１０４個／ウェルで播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩増殖させた。次に、ｍＳｃｒｉｐｔ  Ｋｉｔを用いて、以下のベクター（ｐＴ７−Ｘβｇ−ＫＬＦ４、ｐＴ７−Ｘβｇ−ＬＩＮ２８、ｐＴ７−Ｘβｇ−ｃ−ＭＹＣ、ｐＴ７−Ｘβｇ−ＮＡＮＯＧ、ｐＴ７−Ｘβｇ−ＯＣＴ４、およびｐＴ７−Ｘβｇ−ＳＯＸ２）からキャップ１／ポリアデニル化ｍＲＮＡを生成し、これらの毎日の形質移入において用いた。６の再プログラム化ｍＲＮＡをすべて、各ｍＲＮＡの１００ｎｇ／μＬに希釈した。等モル濃度の各ｍＲＮＡを、以下の変換因子を用いて互いに添加した（ＯＣＴ４は、１に設定され、他のｍＲＮＡはすべて、各ｍＲＮＡ混合物における等モル濃度を得るために、以下のの変換係数によって乗じた。）。ＫＬＦ＝１．３２、ＬＩＮ２８＝０．５８、ｃ−ＭＹＣ＝１．２６、ＮＡＮＯＧ＝０．８５、ＯＣＴ４＝１、およびＳＯＸ２＝０．８８。等モル量の各因子を得る為に、１３２μＬのＫＬＦ４、５８μＬのＬＩＮ２８、１２６μＬのｃ−ＭＹＣ、８５μＬのＮＡＮＯＧ、１００μＬのＯＣＴ４、および８８μＬのＳＯＸ２のｍＲＮＡ（各１００ｎｇ／μＬ）を互いに添加するであろう。形質移入のための合計６００μｇの用量は、６の再プログラム化ｍＲＮＡの各々の１００ｎｇ（先のモル濃度変換を用いる）を用いたことを意味するであろう。Ｔｒａｎｓ−ＩＴ  ｍＲＮＡ形質移入試薬を用いて、これらのｍＲＮＡ用量を形質移入した。すべての形質移入のために、ｍＲＮＡプールを、添加物のないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、または添加物のないＡｄｖａｎｃｅｄ  ＭＥＭ培地のいずれかの２５０μＬに添加した。５μＬのｍＲＮＡ刺激試薬および５μＬのＴｒａｎｓＩＴ形質移入試薬を各チューブに添加し、室温で２分間インキュベートした後、形質移入混合物を、１０％ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのｈＦＧＦｂを有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＭＥＭ培地または１００ｎｇ／ｍＬのｈＦＧＦｂを含有するｉＰＳ培地のいずれかの２．５ｍＬに添加した。形質移入を１０〜１６日間毎日反復した。培地を各形質移入の４時間後に交換した。いくつかの実施態様において、最初の形質移入の５〜８日間後に、細胞をトリプシン処理し、新鮮なＭＥＦプレートに再度播種した。１０７９細胞を新鮮なＭＥＦプレートに１／６または１／１２で分けたのに対し、ＩＭＲ９０細胞を新鮮なＭＥＦプレートに１／３または１／６で分けた。
【０２３３】
ＭＥＦ馴化培地におけるヒト体細胞の再プログラム化。１０７９繊維芽細胞またはＩＭＲ９０線維芽細胞を、０．１％ゼラチンであらかじめ被覆した１０ｃｍ皿（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）あたり３×１０５個で播種し、一晩増殖させた。１０７９線維芽細胞またはＩＭＲ９０線維芽細胞に等量の再プログラム化因子ｍＲＮＡ（ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）を、ＴｒａｎｓＩＴ  ｍＲＮＡ形質移入試薬（ＭｉｒｕｓＢｉｏ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いて形質移入した。各形質移入のために、６μｇ、１８μｇ、または３６μｇのいずれかの各再プログラム化ｍＲＮＡ（ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）を１０ｃｍ皿につき用いた。合計３回の形質移入を実施し、１回の形質移入を１日ごとに実施し、培地を第一および第二の形質移入の各翌日に交換した。すべての形質移入をＭＥＦ馴化培地において実施した。第三の形質移入の翌日、細胞をトリプシン処理し、０．１％ゼラチンであらかじめ被覆した新鮮な１０ｃｍ皿（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に播種した。細胞を、実験の間ＭＥＦ馴化培地において増殖させた。
【０２３４】
類似の毎日のｍＲＮＡ形質移入も、先の説において説明されたとおり実施したが、唯一の違いは、ＭＥＦをフィーダー層として用いず、ＭＥＦ馴化培地のみを用いることであった。
【０２３５】
免疫蛍光。１０７９細胞または１０７９由来のｉＰＳ細胞プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドにおいて室温で３０分間固定した。次に、ｉＰＳ細胞をＰＢＳで３回、各洗浄に５分間洗浄した後、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において３回洗浄した。次に、ｉＰＳ細胞をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ、２％ＦＢＳ、および１％ＢＳＡ）において室温で１時間ブロッキングした。次に、細胞を、ブロッキング緩衝液中の１：５００希釈における一次抗体（マウス抗ヒトＯＣＴ４カタログ番号ｓｃ−５２７９，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ、ウサギ抗ヒトＮＡＮＯＧカタログ番号３５８０、ウサギ抗ヒトＫＬＦ４カタログ番号４０３８、マウス抗ヒトＬＩＮ２８カタログ番号５９３０、ウサギ抗ヒトｃ−ＭＹＣカタログ番号５６０５、ウサギ抗ヒトＳＯＸ２カタログ番号３５７９、およびマウス抗ＴＲＡ−１−６０、すべてＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ製）とともに室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において５回洗浄した後、ｉＰＳ細胞を、ブロッキング緩衝液中の１：１０００希釈における抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体（カタログ番号４４１２，  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗マウスＦＩＴＣ二次抗体（カタログ番号Ｆ５２６２，  Ｓｉｇｍａ）、または抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５（カタログ番号４４０９，  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに２時間インキュベートした。画像を、ＮＩＳ−ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を用いる２−メガピクセルモノクロデジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ）を備えたＮｉｋｏｎ  ＴＳ１００Ｆ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）において撮影した。
【０２３６】
（実施例１）
本実施例は、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２をコードするｍＲＮＡを用いた形質移入が、新生児包皮１０７９線維芽細胞における各個々のタンパク質産物の発現および適切な細胞レベル下局在を結果として生じたかどうかを決定するための試験を説明する。本実験において用いられたｍＲＮＡを、ウリジン−５’−三リン酸と置き換えるプソイドウリジン−５’−三リン酸を用いて調製した（Kariko et al. 2008）。１０７９の線維芽細胞に、６ウェル皿のウェルあたり４μｇの各ｍＲＮＡを形質移入し、免疫蛍光分析を形質移入２４時間後に実施した。内在性ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２タンパク質レベルは、形質移入されていない１０７９細胞において免疫蛍光によって検出不可能であった（図１：Ｂ、Ｆ、Ｎ、Ｒ、Ｖ）。ｃ−ＭＹＣの内在性レベルは、形質移入されていない１０７９細胞において比較的高かった（Ｆｉｇ．１Ｊ）。転写因子ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２をコードするｍＲＮＡの形質移入はすべて、ｍＲＮＡ形質移入２４時間後に、各タンパク質の主として核の局在を結果として生じた（図１：Ｄ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｘ）。細胞質ｍＲＮＡ結合タンパク質ＬＩＮ２８は、細胞質に局在した（図１：Ｈ）。
【０２３７】
（実施例２）
再プログラム化タンパク質の効率的なｍＲＮＡ形質移入および適切な細胞レベル下局在を示したので、本実施例は、体細胞性線維芽細胞からのｉＰＳ細胞の生成のためのプロトコールの開発を説明する。等量（重量による）のＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２のｍＲＮＡを１０７９線維芽細胞に３回（１日おきに１回）形質移入した。３回目の形質移入の翌日、細胞を、照射済みＭＥＦフィーダー細胞へと播種し、ｉＰＳ細胞培地において増殖させた。１０７９線維芽細胞を照射済みＭＥＦに播種した６日後、２の推定ｉＰＳ細胞コロニーは、３μｇの各再プログラム化因子ｍＲＮＡ（ＫＬＦ４，  ＬＩＮ２８，  ｃ−ＭＹＣ，  ＮＡＮＯＧ，  ＯＣＴ４，  ａｎｄ
ＳＯＸ２）を形質移入した１０ｃｍプレートにおいて明白となった。コロニーを、最後の形質移入の１２日後まで増殖させておいた後、該コロニーを免疫蛍光分析のために固定した。内部細胞塊特異的マーカーＮＡＮＯＧは、ｉＰＳ細胞コロニーが、真にｉＰＳコロニーであるかどうかをアッセイするのにしばしば用いられる（Gonzalez et al. 2009、Huangfu et al. 2008）。１２日間早く形質移入したｍＲＮＡから生じるＮＡＮＯＧ発現は、ｍＲＮＡの安定性および発現の期間に関する先行報告（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）に基づいて無視できるであろう。ＮＡＮＯＧについての染色は、２のｉＰＳ細胞コロニーの両方がＮＡＮＯＧ陽性であることを示した（図２のＢ、Ｄ、および非表示）。ｉＰＳ細胞コロニーの部分ではない周辺の線維芽細胞は、ＮＡＮＯＧ陰性であり、該線維芽細胞がｉＰＳ細胞へと再プログラムされないことを示唆した。
【０２３８】
同じプロトコールを用いるその後の実験において、１０７９線維芽細胞およびヒトＩＭＲ９０線維芽細胞の両方に、同じ再プログラム化ｍＲＮＡを形質移入した。複数のコロニーを、形質移入した細胞を照射済みＭＥＦに播種した４日後と同じだけ早く検出した。６μｇの各ｍＲＮＡ（ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）を６ウェル皿における形質移入において用いると、３の推定ｉＰＳ細胞コロニーを、１０ｃｍプレートにおけるＭＥＦに播種した後に両細胞株において後に検出した（図３）。ＮＡＮＯＧの発現についてこれらのコロニーを分析することに加えて、完全に再プログラムされたｉＰＳ細胞のより厳密なマーカーであるＴＲＡ−１−６０（Chan et al. 2009）も免疫蛍光分析に用いた。１０７９線維芽細胞から（図３のＡ〜Ｆ）およびＩＭＲ９０線維芽細胞から（図３のＧ〜Ｉ）生じたｉＰＳコロニーは、ＮＡＮＯＧおよびＴＲＡ−１−６０の両方について陽性であり、これらのコロニーが完全に再プログラムされたＩＩＩ型ｉＰＳ細胞コロニーであることを示した。６の再プログラム化因子をすべてコードするｍＲＮＡの３の形質移入と、ＭＥＦフィーダー細胞へ播種することとを含む本プロトコールは結果的に、発現プラスミドの形質移入による同じ再プログラム化因子の送達を含むプロトコールによって既に報告されたように（Aoi et al. 2008）、類似の再プログラム化効率（１×１０６の投入細胞あたり３〜６のｉＰＳコロニー）を生じた。
【０２３９】
（実施例３）
本実施例は、分化した細胞を、ｍＲＮＡを用いて再プログラム化する効率を改良するための試行を説明する。１つのアプローチにおいて、線維芽細胞培地ではなくＭＥＦ馴化培地において６つの再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを１０７９線維芽細胞またはＩＭＲ９０線維芽細胞に３回（１日おきに１回）経いつ移入することと、次に、処理された１０７９線維芽細胞を処理後にＭＥＦフィーダー層に播種するのではなくＭＥＦ馴化培地において増殖させることを含むプロトコールを用いた。利用される最高の形質移入用量時に（１０ｃｍ皿あたり３６μｇの各再プログラム化因子）、２０８のｉＰＳ細胞コロニーを最終的な形質移入の３日後に検出した（図Ａ〜Ｆ）。興味深いことに、３日目の時点で６μｇまたは１８μｇのいずれかの再プログラム化因子の各々を形質移入した皿においてｉＰＳ細胞コロニーを検出せず、１８μｇを上回る用量がこれらの条件下で、ＭＥＦ馴化培地において３日間以内にｉＰＳ細胞コロニー形成が生じるために重要であることを示唆した。ＩＭＲ９０細胞は、さらにより多数のｉＰＳ細胞コロニーを示し、６つの再プログラム化因子ｍＲＮＡの各々の３回の６μｇ用量を形質移入したプレートにおいて最後の形質移入の８日後に約２００コロニーを、６つの再プログラム化因子ｍＲＮＡの各々の１８μｇまたは３６μｇ用量を３回形質移入したＩＭＲ９０細胞において１０００超のコロニーを有した（図４のＧ〜Ｉ）。コロニーは、１０７９細胞における最終的な形質移入の３日後に可視であったのに対し、コロニーは、ＩＭＲ９０細胞における最終的な形質移入の６〜７日後に可視となった。それゆえ、１０７９細胞由来のより成熟なコロニーは、より大きくかつより密であり、およびＩＭＲ９０コロニーと比較して明視野画像においてより暗かった（図４）。３６μｇの各再プログラム化ｍＲＮＡを３回形質移入した１０７９プレートにおけるコロニーはすべて、最終的なｍＲＮＡ形質移入の８日後にＮＡＮＯＧおよびＴＲＡ−１−６０の両方について陽性であった（図５のＡ〜Ｉ）。より未熟なＩＭＲ９０  ｉＰＳコロニーもすべて、ＮＡＮＯＧおよびＴＲＡ−１−６０の両方について陽性であった（図５のＪ〜Ｏ）が、より成熟な１０７９コロニーと比較してあまり密ではない該より未熟なＩＭＲ９０  ｉＰＳコロニーの細胞性質により、両マーカーについてあまり頑強ではない染色を示した（図５のＡ〜Ｉ）。ＭＥＦ馴化培地における１０７９細胞またはＩＭＲ９０細胞への該ｍＲＮＡの送達を含む本プロトコールは、３×１０５の投入細胞あたり２００〜１０００超のコロニーの再プログラム化効率を有していた。ｉＰＳ細胞を誘導するための本プロトコールはより迅速であり、線維芽細胞培地におけるこれらの同じ６つの再プログラム化因子をコードするＤＮＡプラスミドを線維芽細胞に形質移入することを含む公開されたプロトコールよりもほぼ２〜３桁、より効率的であった（Aoi et al. 2008）。なおもさらに、本プロトコールは、６×１０５の投入細胞あたりおよそ５７のｉＰＳ細胞コロニーを結果として生じる、１０７９新生児線維芽細胞への再プログラム化因子のレンチウイルス送達の公開されたデータに基づいたレンチウイルスを用いた再プログラム化因子の送達を含む公開されたプロトコール（Aoi et al. 2008）よりも７〜４０倍効率的であった。また、本プロトコールは、公開された方法よりも非常に迅速である。
【０２４０】
（実施例４  天然ＲＮＡ分子は樹状細胞を活性化させる分化能を呈する：材料および実験方法）
（プラスミドおよび試薬）
プラスミドｐＴ７Ｔ３Ｄ−ＭＡＲＴ−１およびｐＵＮＯ−ｈＴＬＲ３をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）およびＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）からそれぞれ得た。ｐＴＥＶｌｕｃをＤａｎｉｅｌ  Ｇａｌｌｉｅ博士（ＵＣ  Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ）から得、ｐＴ７−ＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルスゲノムＲＮＡのリーダー配列）−ルシフェラーゼ−Ａ５０を含有し、Gallie, DR et al, 1995. The tobacco etch viral 5’ leader and poly(A) tail are functionally synergistic regulators oftranslation. Gene 165:233）に説明されている。ｐＳＶｒｅｎを、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ消化、末端充填（ｅｎｄ−ｆｉｌｌｉｎｇ）、および再連結によるホタルルシフェラーゼコード配列の除去によって、ｐ２ｌｕｃ（Grentzmann G, Ingram JA, et al, A dual−luciferasereporter system for studying recoding signals. RNA 1998;4(4): 479−86）から生じた。
【０２４１】
ヒトＴＬＲ３（ｎｔ７０３〜７２２、受入番号：ＮＭ＿００３２６５）に対して２０ｎｔ長相同のｓｈＲＮＡをコードする合成ＯＤＮを、プラスミドｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ４．１−ＣＭＶ−ｎｅｏ（Ａｍｂｉｏｎ，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）へとまずクローニングすること、次に、ＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の相応部位へのサブクローン化によって、ヒトＴＬＲ３特異的ｓｉＲＮＡであるｐＴＬＲ３−ｓｈを得た。ＬＰＳ（大腸菌０５５：Ｂ５）を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯから得た。ＣｐＧ  ＯＤＮ２００６およびＲ−８４８をＩｎｖｉｖｏＧｅｎから得た。
【０２４２】
（細胞および細胞培養）
ヒト胚性腎２９３細胞（ＡＴＣＣ）を、グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，  Ｏｇｄｅｎ，  ＵＴ）（完全培地）を補充したＤＭＥＭにおいて増殖させた。本明細書におけるすべての場合において、「２９３細胞」は、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞を指す。２９３−ｈＴＬＲ３細胞株を、２９３細胞をｐＵＮＯ−ｈＴＬＲ３で形質転換することによって生じた。細胞株２９３−ｈＴＬＲ７、２９３−ｈＴＬＲ８、および２９３−ｈＴＬＲ９（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、ブラスチシジン（１０  μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を補充した完全培地において増殖させた。細胞株２９３−ＥＬＡＭ−ＩｕｃおよびＴＬＲ７−２９３（Ｍ．  Ｌａｍｐｈｉｅｒ，  Ｅｉｓａｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ａｎｄｏｖｅｒ  ＭＡ）、ならびにＴＬＲ３−２９３細胞を、説明された通り培養した（Kariko et al, 2004, mRNA is anendogenous ligand for Toll−like receptor 3. J Biol Chem 279: 12542−12550）。
細胞株２９３、２９３−ｈＴＬＲ７、および２９３−ｈＴＬＲ８にｐＴＬＲ３−ｓｈを安定して形質移入し、Ｇ−４１８（４００  μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて選択した。Ｎｅｏ耐性コロニーをスクリーニングし、ポリ（Ｉ）：（Ｃ）に対するＩＬ−８分泌の欠失として決定されるＴＬＲ３を発現しないもののみを、さらなる研究において用いた。白血球フェレーシス試料を、ＩＲＢ認可プロトコールを通じてＨＩＶ未感染ボランティアから得た。
【０２４３】
（マウスＤＣ作製）
マウスＤＣを、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの脛骨および大腿骨から骨髄細胞を回収し、赤血球細胞を溶解することによって作製した。細胞を２ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＶＳおよび２０ｎｇ／ｍＬのｍｕＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）において１０６個／ウェルで６ウェルプレートに播種した。３日後、ｍｕＧＭ−ＣＳＦを有する２ｍＬの新鮮培地を添加した。６日後、２ｍＬの培地／ウェルを回収し、細胞をペレットにし、ｍｕＧＭ−ＣＳＦを有する新鮮培地に再懸濁した。培養７日後、ｍｕＤＣを収穫、洗浄した。
【０２４４】
（天然ＲＮＡ）
ミトコンドリアを、分画溶解手順（ミトコンドリア単離キット；Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を用いて、ペンシルバニア大学血液バンクから得た血小板から単離した。ＲＮＡをＭａｓｔｅｒ  Ｂｌａｓｔｅｒ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）によって、２９３細胞、未分画２９３細胞、ラット肝臓、マウス細胞株ＴＵＢＯ、および大腸菌のＤＨ５α株の、精製されたミトコンドリア画分、細胞質画分、および核画分から単離した。ウシｔＲＮＡ、コムギｔＲＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、大腸菌ｔＲＮＡ、マウス心臓由来のポリ（Ａ）＋  ｍＲＮＡ、およびポリ（Ｉ）：（Ｃ）を、Ｓｉｇｍａから購入し、ヒト脾臓由来の全ＲＮＡおよび大腸菌ＲＮＡをＡｍｂｉｏｎから購入した。オリゴリボヌクレオチド−５’−一リン酸を化学的に合成した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，  ＣＯ）。
【０２４５】
一定分量のＲＮＡ試料を、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼの存在下でインキュベートした（１マイクロリットルあたり１マイクログラム（μｇ／μＬ）の５μＬのＲＮＡあたり１Ｕで１時間）。一定分量のＲＮＡ−７３０をアルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。質の保証のために、ＲＮＡ試料を、変性アガロース電気泳動法またはポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅゲル塊アッセイを用いたＲＮＡ調製物におけるＬＰＳについてのアッセイは、１ミリリットルあたり３ピコグラム（ｐｇ／ｍＬ）の感度で陰性であった（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）。
【０２４６】
（ＨＰＬＣ分析）
ヌクレオシド一リン酸を、ＨＰＬＣを介して分離および可視化した。遊離ヌクレオシド３’−一リン酸を放出するために、５μｇの一定分量のＲＮＡを、１０μＬの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ４．５）における０．１ＵのＲＮａｓｅ
Ｔ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて一晩消化した後、試料を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ  １８カラム（Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣへと注入した。１ｍＬ／分の流速で、１００％緩衝液Ａ（３０  ｍＭ  ＫＨ２Ｐ０４および１０  ｍＭリン酸テトラエチルアンモニウム［ＰｉｃＡ試薬，  Ｗａｔｅｒｓ］、ｐＨ  ６．０）から３０％緩衝液Ｂ（アセトニトリル）への勾配を６０分間かけて実施した。ヌクレオチドを、光ダイオードアレイを用いて２５４ｎｍにおいて検出した。それがなにであるかを、保持時間及びスペクトルによって認証した。
【０２４７】
（樹状細胞アッセイ）
９６ウェルプレートにおける樹状細胞（およそ１．１×１０５個／ウェル）をＲ−８４８、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、またはＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）−ＲＮＡで１時間処理した後、培地を交換した。（別段の記載がない限り、）８時間の終了時に、細胞をＲＮＡ単離またはフローサイトメトリーのいずれかのために収穫したのに対し、回収された培地を、サイトカインＥＬＩＳＡに供した。ＩＬ−１２（ｐ７０）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）をサンドイッチＥＬＩＳＡによって上清中で測定した。培養を三つ組または四つ組で実施し、二つ組で測定した。
【０２４８】
（ノザンブロット分析）
先に説明された通り、ＲＮＡを処置の後の８時間のインキュベーション後にＭＤＤＣから単離した。該当する場合、細胞を刺激３０分前に、インキュベーションの全体の長さを通じて、２．５μｇ／ｍＬのシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）で処理した。ＲＮＡ試料を処理し、ＡＴＣＣから得られたプラスミド（それぞれｐＥ４およびｐＨｃＧＡＰ）に由来するヒトＴＮＦ−αプローブおよびＧＡＰＤＨプローブを用いて、説明される通り（Kariko et al. 2004、同書）ノザンブロット法において分析した。
【０２４９】
（結果）
異なる細胞のＲＮＡサブタイプの免疫刺激能力を決定するために、ＲＮＡを、異なる細胞レベル下区画、すなわち、細胞質、核、およびミトコンドリアから単離した。これらのＲＮＡ画分、ならびに哺乳類源にすべて由来する全ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびポリＡ末端で選択されたｍＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）と複合体形成し、ＭＤＤＣに添加した。哺乳類の全ＲＮＡ、核ＲＮＡ、および細部質ＲＮＡはすべて、検出可能なＴＮＦ−α分泌によって立証されるように、ＭＤＤＣを刺激したが、ＴＮＦ−αレベルは、インビトロで合成されたｍＲＮＡによって誘導されるものよりも非常に低かった（図６）。その上、哺乳類ｔＲＮＡは、ＴＮＦ−αのいずれの検出可能なレベルも誘導しなかったが、ミトコンドリア（ｍｔ）ＲＮＡは、他の哺乳類ＲＮＡサブタイプよりも非常により多くのＴＮＦ−αを誘導した。細菌全ＲＮＡもＭＤＤＣの強力な活性化因子であり、対照的に、細菌ｔＲＮＡは、低レベルのＴＮＦ−αしか誘導しなかった。他の源（酵母、コムギ胚、ウシ）由来のｔＲＮＡは、非刺激性であった。類似の結果が、他の哺乳類源由来のＲＮＡを試験した時に観察された。ＲＮＡ試料を、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡを開裂するＢｅｎｚｏｎａｓｅで消化すると、ＲＮＡシグナル伝達は、ＭＤＤＣにおいて消滅し、ＴＮＦ−α分泌が、該調製物におけるＲＮＡによることを認証した。試験したＲＮＡ種類の活性化能力は、ヌクレオシド修飾の程度との負の相関を呈した。類似の結果は、サイトカインの生じる両方の種類のＤＣについて本実施例において説明された実験において得られた。
【０２５０】
これらの発見は、ＲＮＡの免疫原性が、ヌクレオシド修飾の程度によって影響され、より大きな程度の修飾は、免疫原性を低下させる傾向にあることを示す。
【０２５１】
（実施例５  修飾されたヌクレオシド用いたＲＮＡ分子のインビトロでの合成：材料および実験方法）
（インビトロで転写されるＲＮＡ）
インビトロでの転写アッセイ（ＭｅｓｓａｇｅＭａｃｈｉｎｅキットおよびＭｅｇａＳｃｒｉｐｔキット；  Ａｍｂｉｏｎ，）を用いて、以下の長いＲＮＡを、説明される通りＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）によって生じた（Kariko et al, 1998, Phosphate−enhancedtransfection of cationic lipid−complexed mRNA andplasmid DNA. Biochim Biophys Acta 1369, 320−334）（注記：テンプレートの名称は、カッコの中に示されており、ＲＮＡの名称中の数は長さを指定する）：ＲＮＡ−１８６６（Ｎｄｅ  Ｉで線形化されたｐＴＥＶｌｕｃ）は、ホタルルシフェラーゼをコードし、５０ｎｔ長のポリＡ末端である。ＲＮＡ−１５７１（Ｓｓｐ  Ｉで線形化されたｐＳＶｒｅｎ）は、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする。ＲＮＡ−７３０（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで線形化されたｐＴ７Ｔ３Ｄ−ＭＡＲＴ−ｌ）は、ヒトメラノーマ抗原ＭＡＲＴ−Ｉをコードする。ＲＮＡ−７１３（ＥｃｏＲ  Ｉで線形化されたｐＴＩＴ３Ｄ−ＭＡＲＴ−ｌ）は、ＭＡＲＴ−１のアンチセンス配列に相応し、ＲＮＡ４９７（Ｂｇｌ  ＩＩで線形化されたｐＣＭＶ−ｈＴＬＲ３）は、ｈＴＬＲ３の部分的５’断片をコードする。ＲＮＡ分子の配列は、以下のとおりである：
ＲＮＡ−Ｉ８６６：
ggaauucucaacacaacauauacaaaacaaacgaaucucaagcaaucaagcauucuacuucuauugcagcaauuuaaaucauuucuuuuaaagcaaaagcaauuuucugaaaauuuucaccauuuacgaacgauagccauggaagacgccaaaaacauaaagaaaggcccggcgccauucuauccucuagaggauggaaccgcuggagagcaacugcauaaggcuaugaagagauacgcccugguuccuggaacaauugcuuuuacagaugcacauaucgaggugaacaucacguacgcggaauacuucgaaauguccguucgguuggcagaagcuaugaaacgauaugggcugaauacaaaucacagaaucgucguaugcagugaaaacucucuucaauucuuuaugccgguguugggcgcguuauuuaucggaguugcaguugcgcccgcgaacgacauuuauaaugaacgugaauugcucaacaguaugaacauuucgcagccuaccguaguguuuguuuccaaaaagggguugcaaaaaauuuugaacgugcaaaaaaaauuaccaauaauccagaaaauuauuaucauggauucuaaaacggauuaccagggauuucagucgauguacacguucgucacaucucaucuaccucccgguuuuaaugaauacgauuuuguaccagaguccuuugaucgugacaaaacaauugcacugauaaugaauuccucuggaucuacuggguuaccuaaggguguggcccuuccgcauagaacugccugcgucagauucucgcaugccagagauccuauuuuuggcaaucaaaucauuccggauacugcgauuuuaaguguuguuccauuccaucacgguuuuggaauguuuacuacacucggauauuugauauguggauuucgagucgucuuaauguauagauuugaagaagagcuguuuuuacgaucccuucaggauuacaaaauucaaagugcguugcuaguaccaacccuauuuucauucuucgccaaaagcacucugauugacaaauacgauuuaucuaauuuacacgaaauugcuucugggggcgcaccucuuucgaaagaagucggggaagcgguugcaaaacgcuuccaucuuccagggauacgacaaggauaugggcucacugagacuacaucagcuauucugauuacacccgagggggaugauaaaccgggcgcggucgguaaaguuguuccauuuuuugaagcgaagguuguggaucuggauaccgggaaaacgcugggcguuaaucagagaggcgaauuaugugucagaggaccuaugauuauguccgguuauguaaacaauccggaagcgaccaacgccuugauugacaaggauggauggcuacauucuggagacauagcuuacugggacgaagacgaacacuucuucauaguugaccgcuugaagucuuuaauuaaauacaaaggauaucagguggcccccgcugaauuggaaucgauauuguuacaacaccccaacaucuucgacgcgggcguggcaggucuucccgacgaugacgccggugaacuucccgccgccguuguuguuuuggagcacggaaagacgaugacggaaaaagagaucguggauuacguggccagucaaguaacaaccgcgaaaaaguugcgcggaggaguuguguuuguggacgaaguaccgaaaggucuuaccggaaaacucgacgcaagaaaaaucagagagauccucauaaaggccaagaagggcggaaaguccaaauuguaaaauguaacucuagaggauccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaca（配列番号１）。
【０２５２】
ＲＮＡ−１５７１：
ggcuagccaccaugacuucgaaaguuuaugauccagaacaaaggaaacggaugauaacugguccgcaguggugggccagauguaaacaaaugaauguucuugauucauuuauuaauuauuaugauucagaaaaacaugcagaaaaugcuguuauuuuuuuacaugguaacgcggccucuucuuauuuauggcgacauguugugccacauauugagccaguagcgcgguguauuauaccagaccuuauugguaugggcaaaucaggcaaaucugguaaugguucuuauagguuacuugaucauuacaaauaucuuacugcaugguuugaacuucuuaauuuaccaaagaagaucauuuuugucggccaugauuggggugcuuguuuggcauuucauuauagcuaugagcaucaagauaagaucaaagcaauaguucacgcugaaaguguaguagaugugauugaaucaugggaugaauggccugauauugaagaagauauugcguugaucaaaucugaagaaggagaaaaaaugguuuuggagaauaacuucuucguggaaaccauguugccaucaaaaaucaugagaaaguuagaaccagaagaauuugcagcauaucuugaaccauucaaagagaaaggugaaguucgucguccaacauuaucauggccucgugaaaucccguuaguaaaaggugguaaaccugacguuguacaaauuguuaggaauuauaaugcuuaucuacgugcaagugaugauuuaccaaaaauguuuauugaaucggacccaggauucuuuuccaaugcuauuguugaaggugccaagaaguuuccuaauacugaauuugucaaaguaaaaggucuucauuuuucgcaagaagaugcaccugaugaaaugggaaaauauaucaaaucguucguugagcgaguucucaaaaaugaacaaaugucgacgggggccccuaggaauuuuuuagggaagaucuggccuuccuacaagggaaggccagggaauuuucuucagagcagaccagagccaacagccccaccagaagagagcuucaggucugggguagagacaacaacucccccucagaagcaggagccgauagacaaggaacuguauccuuuaacuucccucagaucacucuuuggcaacgaccccucgucacaauaaagauaggggggcaacuaaagggaucggccgcuucgagcagacaugauaagauacauugaugaguuuggacaaaccacaacuagaaugcagugaaaaaaaugcuuuauuugugaaauuugugaugcuauugcuuuauuuguaaccauuauaagcugcaauaaacaaguuaacaacaacaauugcauucauuuuauguuucagguucagggggaggugugggagguuuuuuaaagcaaguaaaaccucuacaaaugugguaaaaucgauaaguuuaaacagauccagguggcacuuuucggggaaaugugcgcggaaccccuauuuguuuauuuuucuaaauacauucaaauauguauccgcucaugagacaauaacccugauaaaugcuucaauaau（配列番号２）。
【０２５３】
ＲＮＡ−７３０：
Gggaauuuggcccucgaggccaagaauucggcacgaggcacgcggccagccagcagacagaggacucucauuaaggaagguguccugugcccugacccuacaagaugccaagagaagaugcucacuucaucuaugguuaccccaagaaggggcacggccacucuuacaccacggcugaagaggccgcugggaucggcauccugacagugauccugggagucuuacugcucaucggcuguugguauuguagaagacgaaauggauacagagccuugauggauaaaagucuucauguuggcacucaaugugccuuaacaagaagaugcccacaagaaggguuugaucaucgggacagcaaagugucucuucaagagaaaaacugugaaccugugguucccaaugcuccaccugcuuaugagaaacucucugcagaacagucaccaccaccuuauucaccuuaagagccagcgagacaccugagacaugcugaaauuauuucucucacacuuuugcuugaauuuaauacagacaucuaauguucuccuuuggaaugguguaggaaaaaugcaagccaucucuaauaauaagucaguguuaaaauuuuaguagguccgcuagcaguacuaaucaugugaggaaaugaugagaaauauuaaauugggaaaacuccaucaauaaauguugcaaugcaugauaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacugcggccgca（配列番号３）。
【０２５４】
ＲＮＡ−７１３
Gggaauaagcuugcggccgcaguuuuuuuuuuuuuuuuuuuuaucaugcauugcaacauuuauugauggaguuuucccaauuuaauauuucucaucauuuccucacaugauuaguacugcuagcggaccuacuaaaauuuuaacacugacuuauuauuagagauggcuugcauuuuuccuacaccauuccaaaggagaacauuagaugucuguauaaauucaagcaaaagugugagagaaauaauuucagcaugucucaggugucucgcuggcucuuaaggugaauaaggugguggugacuguucugcagagaguuucucauaagcagguggagcauugggaaccacagguucacaguuuuucucuugaagagacacuuugcugucccgaugaucaaacccuucuugugggcaucuucuuguuaaggcacauugagugccaacaugaagacuuuuauccaucaaggcucuguauccauuucgucuucuacaauaccaacagccgaugagcaguaagacucccaggaucacugucaggaugccgaucccagcggccucuucagccgugguguaagaguggccgugccccuucuugggguaaccauagaugaagugagcaucuucucuuggcaucuuguagggucagggcacaggacaccuuccuuaaugagaguccucugucugcuggcuggccgcgugccucgugccgaauu（配列番号４）。
【０２５５】
ＲＮＡ−４９７：
Gggagacccaagcuggcuagcagucauccaacagaaucaugagacagacuuugccuuguaucuacuuuugggggggccuuuugcccuuugggaugcugugugcauccuccaccaccaagugcacuguuagccaugaaguugcugacugcagccaccugaaguugacucagguacccgaugaucuacccacaaacauaacaguguugaaccuuacccauaaucaacucagaagauuaccagccgccaacuucacaagguauagccagcuaacuagcuuggauguaggauuuaacaccaucucaaaacuggagccagaauugugccagaaacuucccauguuaaaaguuuugaaccuccagcacaaugagcuaucucaacuuucugauaaaaccuuugccuucugcacgaauuugacugaacuccaucucauguccaacucaauccagaaaauuaaaaauaaucccuuugucaagcagaagaauuuaaucacauua（配列番号５）。
【０２５６】
修飾されたＲＮＡを得るために、転写反応を、塩基性ＮＴＰのうちの１（または２）と、修飾されたヌクレオチド５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、２−チオウリジン、Ｎ６−メチルアデノシン、またはプソイドウリジンの対応する三リン酸誘導体（複数可）との置き換えで組み立てた（ＴｒｉＬｉｎｋ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）。各転写反応において、４のヌクレオチドすべてまたはそれらの誘導体は、７．５ミリモル濃度（ｍＭ）の濃度で存在した。選択された実験において、示されるように、６ｍＭのｍ７ＧｐｐｐＧキャップアナログ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）もキャッピングされたＲＮＡを得るために含まれた。ＯＲＮ５およびＯＲＮ６を、ＤＮＡオリゴデオキシヌクレオチドテンプレートおよびＴ７  ＲＮＡＰ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キット，  Ａｍｂｉｏｎ）を用いて生じた。
【０２５７】
（結果）
免疫原性に及ぼすヌクレオシド修飾の効果をさらに試験するために、インビトロでの系を、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを用いたＲＮＡ分子を製造するために開発した。４つのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）のうちの１つまたは２つを、対応するヌクレオシド修飾されたＮＴＰと置換するインビトロでの転写反応を実施した。長さ０．７〜１．９ｋｂに及びかつ修飾されたヌクレオシドのうちの０、１つ、または２つの種類のいずれかを含有する異なる一次配列を有するいくつかのＲＮＡセットを転写した。修飾されたＲＮＡは、変性ゲル電気泳動法における該ＲＮＡの移動度に関して該ＲＮＡの修飾されていない対応物とは区別できず、該ＲＮＡが、無傷であり、それ以外は修飾されていないことを示した（図７のＡ）。この手順は、Ｔ７、ＳＰ６、およびＴ３ファージポリメラーゼのうちのいずれかと効率よく作用し、それゆえ、広範な種々のＲＮＡポリメラーゼに汎化可能である。
【０２５８】
これらの発見は、修飾されたヌクレオシドを用いたＲＮＡ分子の製造のための新規のインビトロでの系を提供する。
【０２５９】
（実施例６  インビトロで転写されるＲＮＡはヒトＴＬＲ３を刺激し、ヌクレオシド修飾は、ＲＮＡの免疫原性を低下させる：材料および実験方法）
すべてがＴＬＲ３特異的ｓｉＲＮＡを発現する親２９３、２９３−ｈＴＬＲ７、および２９３−ｈＴＬＲ８細胞を、９６ウェルプレートに播種し（５×１０４個／ウェル）、抗生物質なしで培養した。翌日、細胞をＲ−８４８または、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合体形成したＲＮＡに、説明されている通り曝露した（Kariko et al, 1998，同書）。ＲＮＡを１時間後に除去し、細胞をさらに完全培地において７時間インキュベートした。上清をＩＬ−８測定のために回収した。
【０２６０】
（結果）
ヌクレオシドの修飾が、ＴＬＲのＲＮＡ仲介性活性化に影響するかどうかを決定するために、ヒトＴＬＲ３を発現するよう、ヒト胚性腎２９３細胞を安定して形質転換した。該細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）と複合体形成したＲＮＡで処理し、ＴＬＲ活性化をインターロイキン（ＩＬ）−８放出によって１０に示されるようにモニターした。いくつかの異なるＲＮＡ分子を試験した。修飾されていないインビトロで転写されるＲＮＡは、高レベルのＩＬ−８分泌を誘発した。しかし、対照的に、ｍ６Ａまたはｓ２Ｕヌクレオシド修飾を含有するＲＮＡは、検出可能なＩＬ−８分泌を誘導しなかった（図７のＢ）。試験した他のヌクレオシド修飾（すなわち、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、Ψ、およびｍ５Ｃ／Ψ）は、ＴＬＲ３刺激に及ぼすより小さな抑制効果を有した（図７のＢ）。「Ψ」はプソイドウリジンを指す。
【０２６１】
したがって、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、Ψ、およびｍ５Ｃ／Ψ等のヌクレオシド修飾は、ＴＬＲ３シグナル伝達によって仲介されるように、ＲＮＡの免疫原性を低下させる。
【０２６２】
（実施例７  インビトロで転写されるＲＮＡはヒトＴＬＲ７およびＴＬＲ８を刺激し、ヌクレオシド修飾は、ＲＮＡの免疫原性を低下させる。）
２９３が、特異的ＴＬＲ受容体に及ぼすＲＮＡの効果を評価することに干渉する内在性ＴＬＲ３を発現する可能性を試験するために、ＴＬＲ３特異的低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとしても公知）を発現するプラスミドを細胞に安定して形質移入することによって、内在性ＴＬＲ３の発現を２９３−ＴＬＲ８細胞株から除去した。この細胞株は、ポリ（Ｉ）：（Ｃ）、ＬＰＳ、およびＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオシド（ＯＤＮ）に応答せず、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ９の不在を示したが、ヒトＴＬＲ８の同族リガンドであるＲ−８４８に応答した（図７のＢ）ので、さらなる試験に用いた。ＴＬＲ３の標的にされたｓｈＲＮＡを発現する２９３−ｈＴＬＲ８細胞（２９３−ｈＴＬＲ８  ｓｈＲＮＡ−ＴＬＲ３細胞）に、インビトロで転写されるＲＮＡを形質移入すると、該細胞は、多量のＩＬ−８を分泌した。対照的に、ヌクレオシド修飾（ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、Ψ、およびｍ５Ｃ／Ψ、Ｓ２Ｕ）のほとんどを含有するＲＮＡは、刺激を除去した（陰性対照、すなわち空ベクター以下のＩＬ−８産生）。ｍ６Ａ修飾は、様々な効果を有し、いくつかの場合、ＩＬ−８放出を除去し、他の場合、ＩＬ−８放出を低下させた（図７のＢ）。
【０２６３】
本実施例および先行実施例の結果は、（ａ）天然ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有するＲＮＡ（すなわち、インビトロで転写されるＲＮＡ）が、ヒトＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８を刺激し、（ｂ）ｍ６Ａ、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｓ２Ｕ、およびΨ等のヌクレオシド修飾は、単独でおよび組み合わせで、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８シグナル伝達によって仲介されるＲＮＡの免疫原性を低下させることを示す。加えて、これらの結果は、特異的ＴＬＲ受容体によるシグナル伝達を研究するための新規の系を提供する。
【０２６４】
（実施例８  ヌクレオシド修飾は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８シグナル伝達によって仲介されるＲＮＡの免疫原性を低下させる。）
次のセットの実験は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８を刺激する天然源から単離されたＲＮＡの能力を試験した。異なる哺乳類種由来のＲＮＡを先行実施例において説明されたＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８を発現する２９３細胞株に形質移入した。哺乳類ＲＮＡ試料のうちのいずれも、陰性対照レベルを上回るＩＬ−８分泌を誘導しなかった。対照的に、２つの異なる大腸菌源から得られた細菌全ＲＮＡは、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８を形質移入した細胞において頑強なＩＬ−８分泌を誘導したが、ＴＬＲ９ではそうではなかった（図７のＣ）。ＬＰＳもメチル化されていないＤＮＡ（ＣｐＧ  ＯＤＮ）（細菌ＲＮＡ単離物における潜在的な夾雑物）も、試験されたＴＬＲ３、ＴＬＲ７、またはＴＬＲ８を活性化しなかった。ヒト血小板から単離されたミトコンドリアＲＮＡは、ヒトＴＬＲ８を刺激したが、ＴＬＲ３もＴＬＲ７も刺激しなかった。
【０２６５】
これらの結果は、修飾されていないインビトロで転写され、細菌性であるＲＮＡが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８の活性化因子であり、かつミトコンドリアＲＮＡがＴＬＲ８を刺激することを示す。加えて、これらの結果は、ＲＮＡのヌクレオシド修飾が、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８を刺激するその能力を低下させるという発見を確認する。
【０２６６】
（実施例９  ヌクレオシド修飾は、サイトカイン分泌およびＤＣによる活性化マーカー発現を誘導するＲＮＡの能力を低下させる。）
（材料および実験方法）
（ＤＣ刺激アッセイ）
ＲＮＡを伴う２０時間のインキュベーションの後、ＤＣをＣＤ８３−フィコエリトリンｍＡｂ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ，  Ｆｌａｎｄｅｒｓ，  ＮＪ）、ＨＬＡ−ＤＲ−Ｃｙ５ＰＥ、およびＣＤ８０もしくはＣＤ８６−フルオレセインイソチオシアナートｍＡｂで染色し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェアを用いるＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において分析した。細胞培養上清を２０時間のインキュベーションの終了時に採集し、サイトカインＥＬＩＳＡに供した。ＩＬ−１２（ｐ７０）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、ＩＦＮ−α、およびＴＮＦ−α（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）のレベルを、ＥＬＩＳＡによって上清中で測定した。培養を三つ組または四つ組で実施し、各試料を二つ組で測定した。
【０２６７】
（結果）
次の実験は、修飾されたまたは修飾されていないヌクレオシドを含有するＲＮＡが、サイトカインを産生するＭＤＤＣを刺激する能力を試験した。ヌクレオシド修飾は、５ＲＮＡが、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４を生じるＭＤＤＣおよび（ＧＭＣＳＦ）／ＩＦＮ−αを生じるＭＤＤＣの両方によるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２分泌を誘導する能力を、たいていの場合、陰性対照以下のレベルに再現可能に低下させる（図８のＡおよびＢ）。結果は、同じ塩基修飾を有するが、異なる一次配列および長さを有する他のセットのＲＮＡが試験される場合、あるいはＲＮＡが５’キャップ構造および／もしくは３’末端ポリＡ末端を添加することによって、または５’三リン酸部分を除去することによってさらに修飾される場合、類似していた。異なる長さおよび配列のＲＮＡは、ＤＣから変動する量のＴＮＦ−αを誘導し、典型的には２倍未満の差であった（図８のＣ）。
【０２６８】
次に、前記アッセイを、一次ＤＣ１およびＤＣ２に関して実施した。一次単球様（ＤＣＩ、ＢＤＣＡ１＋）および形質細胞様（ＤＣ２、ＢＤＣＡ４＋）ＤＣを、末梢血から精製した。両細胞種類は、Ｒ−８４８に曝露するとＴＮＦ−αを産生したが、ＤＣ１のみが、非常に低レベルでポリ（Ｉ）：（Ｃ）に応答し、ＤＣ２におけるＴＬＲ３活性の不在を示した。インビトロでの転写産物の形質移入は、ＤＣ１およびＤＣ２の両方においてＴＮＦ−αの分泌を誘導したのに対し、ｍ５Ｕ、Ψ、またはｓ２Ｕにより修飾された転写産物は、刺激性ではなかった（図８のＤ）。サイトカインを生じるＤＣとは対照的に、ＲＮＡのｍ５Ｃおよびｍ６Ａ修飾は、一次ＤＣ１およびＤＣ２におけるその刺激性能力を低下させなかった。単一の種類の修飾を有するＲＮＡ分子（ｍ６Ａ＋Ψ）は、強力なサイトカイン誘導因子であった。したがって、ウリジン修飾は、初代ＤＣにおけるインシスのＲＮＡ分子に及ぼす優性抑制効果を発揮した。これらの結果は、試験したすべてのドナーの間で一致した。
【０２６９】
これらの発見は、インビトロで転写されるＲＮＡが、ＤＣによるサイトカイン産生を刺激することを示す。加えて、ＤＣ２がＴＬＲ３もＴＬＲ８も発現せず、かつＲＮＡのｍ５Ｃおよびｍ６Ａ修飾がＴＬＲ７に関するその刺激能力を低下させたので、これらの発見は、一次ＤＣが、ｍ５Ｃおよびｍ６Ａにより修飾されたＲＮＡを認識し、かつそのシグナル伝達がＵ残基の修飾によって阻害されるさらなるＲＮＡシグナル伝達実体を有することを示す。
【０２７０】
さらなる免疫原性表示因子として、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現、ならびにＴＮＦ−αの分泌を、ＲＮＡ−１５７１およびその修飾されたバージョンで処理したＭＤＤＣのＦＡＣＳ分析によって測定した。プソイドウリジンおよび修飾されたヌクレオシド（ｍ５Ｃ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、およびｍ６Ａ／Ψ）は、これらのマーカーを低下させ（図９）、先行知見を確認した。
【０２７１】
要約すると、ＤＣを成熟するように誘導して、サイトカインを分泌させるＲＮＡの能力は、ＤＣのサブタイプに、およびＲＮＡ中に存在するヌクレオシド修飾の特徴に依存する。増大する量の修飾は、ＲＮＡの免疫原性を低下させる。
【０２７２】
（実施例１０  ＲＮＡ仲介性免疫刺激の抑制は、ＲＮＡ中に存在する修飾されたヌクレオシドの数に比例する。）
（材料および実験方法）
（ヒトＤＣ）
サイトカインを生じるＤＣのために、単球を不連続Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配遠心法によって末梢血単核球から精製した。低密度画分（単球が豊富）を、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ１９、およびＣＤ５６に特異的な磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ，  Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，  ＮＹ）を用いて、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞から枯渇させ、抗ＣＤ１４（９５％超）または抗ＣＤ１１ｃ（９８％超）モノクローナル抗体を用いるフローサイトメトリーによって決定されるように、高度に精製された単球を生じた。
【０２７３】
未熟なＤＣを生じるために、単球由来のＤＣ（ＭＤＤＣ）の作製のために、説明された通り（Weissman,D et al, 2000. J Immunol 165: 4710−4717）、精製された単球を、ＡＩＭ  Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓｍ
ＭＮ）を補充したＡＩＭ  Ｖ無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養した。また、ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ−α（１，０００Ｖ／ｍＬ）による処置（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって生じさせ、ＩＦＮ−αＭＤＤＣを得た（Santini et al., 2000. Type I interferon as a powerful adjuvant formonocyte−derived dendritic cell development andactivity in vitro and in Hu
−PBL−SCID mice. JExp Med 191: 1777−178）。
【０２７４】
一次骨髄ＤＣおよび形質細胞様ＤＣ（ＤＣ１およびＤＣ２）を、ＢＤＣＡ−ｌおよびＢＤＣＡ−４細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）をそれぞれ用いて、末梢血から得た。
【０２７５】
（結果）
これまで、利用されたヌクレオシドにより修飾されたＲＮＡのほとんどは、ＲＮＡにおける全ヌクレオチドのおよそ２５％を生じる修飾のうちの１種類を含有した（例えば、すべてウリジン塩基）。本明細書で利用される条件下で免疫原性を低下させるのに十分である特定の修飾されたヌクレオシドの最小頻度を規定するために、制限された数の修飾されたヌクレオシドを有するＲＮＡ分子を生じさせた。第一のセットの実験において、ＲＮＡを、ｍ６Ａ、Ψ（プソイドウリジン）、またはｍ５Ｃとそれらの対応する修飾されていないＮＴＰとの変動する比の存在下で、インビトロで転写した。修飾されたヌクレオシドリン酸のＲＮＡへの組み込み量は、転写反応において含有される比と比例することが期待され、なぜなら、Ｔ７  ＲＮＡＰで得られたＲＮＡ収量は、該酵素が、ｍ６Ａ、Ψ、またはｍ５ＣのＮＴＰを、塩基性ＮＴＰとほぼ同程度効率的に利用することを示したからである。この期待を確認するために、５０：５０の比におけるＵＴＰ：Ψの存在下で転写されたＲＮＡを消化し、ほぼ５０：５０の比でＵＭＰおよびΨを含有することを発見した（図１０のＡ）。
【０２７６】
修飾されたヌクレオシド含有量の増加するＲＮＡ分子をＭＤＤＣへと形質移入し、ＴＮＦ−α分泌を評価した。各修飾（ｍ６Ａ、Ψ、およびｍ５Ｃ）は、修飾された塩基の各分に比例してＴＮＦ−α分泌を阻害した。最少量の試験された修飾された塩基（０．２〜０．４％、１５７１ｎｔ分子あたり３〜６の修飾されたヌクレオシドに相応）でさえ、サイトカイン分泌を測定可能に阻害するのに十分であった（図１０のＢ）。１．７〜３．２％の修飾されたヌクレオシドレベルのＲＮＡ（分子あたり１４〜２９修飾）は、ＴＮＦ−α発現の誘導における５０％低下を呈した、ＴＬＲを発現する２９３細胞において、より高い割合（２．５％）の修飾されたヌクレオシド含有量は、ＲＮＡ仲介性シグナル伝達事象を阻害するのに必要であった。
【０２７７】
したがって、プソイドウリジンおよび修飾されたヌクレオシドは、少量の各分の残基として存在する場合でさえ、ＲＮＡ分子の免疫原性を低下させる。
【０２７８】
追加的な実験において、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する２１マーのオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）を合成し、この中で、修飾されたヌクレオシド（ｍ５Ｃ、Ψ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕ［Ｕｍ］）を、特定の位置において置換した（図１１のＡ）。修飾されていないＯＲＮがＴＮＦ−α分泌を誘導したのに対し、この効果は、単一のヌクレオシド修飾の存在によって消滅した（図１１のＢ）。類似の結果は、ＴＬＲ３を標的とするｓｉＲＮＡを発現するＴＬＲ−７およびＴＬＲ−８で形質転換された２９３細胞を用いて得られた。
【０２７９】
先の結果は、先の２１マーのＯＲＮ（ＯＲＮ１）および３１マーのインビトロで合成された転写産物（ＯＲＮ５およびＯＲＮ６）の両方を用いるノザンブロットアッセイによって、ＭＤＤＣにおけるＴＮＦ−αｍＲＮＡレベルを測定することによって確認された。該シグナルを増幅するために、選択されたｍＲＮＡの分解を遮断するシクロヘキシミドをいくつかの試料に、図に示されるように添加した。修飾されていないＯＤＮは、ＴＮＦ−αｍＲＮＡレベルを増大させたのに対し、単一の修飾されたヌクレオシドを含有するＯＲＮは、有意により低い刺激性であり、ＯＲＮ２−Ｕｍは、ＴＮＦ−α産生の最大の低下を呈した（図１１のＣ）。類似の結果は、マウスマクロファージ様ＲＡＷ細胞において、およびヒトＤＣにおいて観察された。
【０２８０】
要約すると、試験された修飾物の各々（ｍ６Ａ、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｓ２Ｕ、Ψ、および２’−Ｏ−メチル）は、残基の小さな割合として存在する場合でさえ、ＲＮＡ仲介性免疫刺激を抑制した。さらなる抑制は、修飾されたヌクレオシドの比が増大する場合に観察された。
【０２８１】
（実施例１１  ＲＮＡのプソイドウリジン修飾は、インビボでのその免疫原性を低下させる。）
ＲＮＡのインビボでの免疫原性に及ぼすプソイドウリジン修飾の効果を決定するために、０．２５μｇのＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）に複合体形成し、マウスに気管内注射し、マウスから２４時間後に採血し、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αの循環レベルを血清試料からアッセイした。キャッピングされたプソイドウリジンにより修飾されたｍＲＮＡは、修飾されていないｍＲＮＡによって誘発されるよりも有意により少ないＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αｍＲＮＡを誘導した（図１２のＡ〜Ｂ）。
【０２８２】
これらの結果は、プソイドウリジンにより修飾されたｍＲＮＡが、修飾されていないＲＮＡよりもインビボで有意により小さな免疫原性であるというさらなる証拠を提供する。
【０２８３】
（実施例１２  プソイドウリジン含有ＲＮＡは、ＰＲＫを活性化させる能力の低下を呈する。）
（材料および実験方法）
（ＰＫＲリン酸化アッセイ）
一定分量の活性化型ＰＫＲアガロース（Ｕｐｓｔａｔｅ）をマグネシウム／ＡＴＰカクテル（Ｕｐｓｔａｔｅ）、キナーゼ緩衝液、および［γ３２Ｐ］ＡＴＰ混合物、およびＲＮＡ分子の存在下で３０℃で３０分間インキュベートした。修飾されていないＲＮＡおよびヌクレオシド修飾を有するＲＮＡ（ｍ５Ｃ、プソイドウリジン、ｍ６Ａ、ｍ５Ｕ）ならびに二本鎖ＲＮＡを試験した。ヒト組換えｅＩＦ２ａ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を添加し、試料をさらに３０℃で５分間インキュベートした。反応を、還元剤を有するＮｕＰａｇｅ
ＬＤＳ試料緩衝液を添加することによって停止し、７０℃で１０分間変性させ、１０％ＰＡＧＥにおいて分析した。ゲルを乾燥させ、フィルムに露光した。ＰＫＲ活性化因子であるヘパリン（１Ｕ／μＬ）を陽性対照として用いた。
【０２８４】
（結果）
プソイドウリジン含有ｍＲＮＡが、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化させるかどうかを決定するために、インビトロでのリン酸化アッセイを、組換えヒトＰＫＲおよびその基質であるｅＩＦ２α（真核生物翻訳開始因子２α）を用いて、ウミシイタケをコードするキャッピングされたｍＲＮＡ（０．５および０．０５ｎｇ／μＬ）の存在下で実施した。プソイドウリジン（Ψ）を含有するｍＲＮＡは、ＰＫＲの自己リン酸化およびｅＩＦ２αのリン酸化の両方の欠失によって検出されるように、ＰＫＲを活性化しなかったのに対し、ヌクレオシド修飾を有さないＲＮＡおよびｍ５Ｃ修飾を有するｍＲＮＡはＰＫＲを活性化した（図１３）。したがって、プソイドウリジン修飾は、ＲＮＡ免疫原性を低下させる。
【０２８５】
（実施例１３  プソイドウリジンおよびｍ５Ｃを含有するＲＮＡからのタンパク質のインビトロでの翻訳の亢進）
（材料および実験方法）
（ウサギ網状赤血球溶解産物におけるｍＲＮＡのインビトロでの翻訳）
インビトロでの翻訳を、ウサギ網状赤血球溶解産物において実施した（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）。９μＬの一定分量の溶解産物に１μＬ（１μｇ）のｍＲＮＡを補充し、３０℃で６０分間インキュベートした。１μＬの一定分量をホタルおよびウミシイタケアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）、ならびにＬＵＭＡＴ  ＬＢ９５０ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ／ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を用いた１０秒間の測定時間の分析のために取り出した。
【０２８６】
（結果）
ＲＮＡ翻訳効率に及ぼすプソイドウリジン修飾のインビトロでの効果を決定するためにホタルルシフェラーゼをコードしプソイドウリジンで修飾されたキャッピングされていないｍＲＮＡ（０．１μｇ／μＬ）をウサギ網状赤血球溶解産物において３０℃で１時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を決定した。プソイドウリジンを含有するｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血球溶解産物におけるプソイドウリジンを有さないＲＮＡよりも２倍超効率的に翻訳したが、コムギ抽出物においても大腸菌溶解産物においてもそうならず（図１４）、プソイドウリジン修飾が、ＲＮＡ翻訳効率を高めることを示した。類似の結果を、ｍ５Ｃにより修飾されたＲＮＡを用いて得た。ポリＡ末端をプソイドウリジン含有ｍＲＮＡに付加すると、翻訳効率のさらに１０倍の増加を観察した（実施例１０）。
【０２８７】
したがって、プソイドウリジンおよびｍ５Ｃによる修飾は、ＲＮＡ翻訳効率を高め、プソイドウリジン含有ｍＲＮＡへのポリＡ末端の付加は、翻訳効率をさらに高める。
【０２８８】
（実施例１４  培養細胞におけるプソイドウリジン含有ＲＮＡからのタンパク質の翻訳の亢進）
（材料および実験方法）
（細胞における翻訳アッセイ）
９６ウェルを有するプレートに、ウェルあたり５×１０４個で形質移入の１日前に播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）−ｍＲＮＡ複合体を構築し、培地を除去した後に細胞単層に直接添加した（ウェルあたり５０μＬにおける０．２μｇのｍＲＮＡ‐０．８μｇのリポフェクチン）。細胞を形質移入混合物とともに３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて１時間インキュベートした後、該混合物を、１０％ＦＣＳを含有する新鮮なあらかじめ加温した培地と交換した後、細胞を先の実施例において説明される通り分析した。
【０２８９】
（結果）
培養された細胞におけるＲＮＡ翻訳に及ぼすプソイドウリジン修飾の効果を決定するために、２９３細胞に、リポータータンパク質ウミシイタケをコードするインビトロで転写されヌクレオシドで修飾され、キャッピングされたｍＲＮＡを形質移入した。細胞を形質移入の開始３時間後に溶解し、ウミシイタケのレベルを酵素アッセイによって測定した。２９３細胞において、プソイドウリジンによりおよびｍ５Ｃにより修飾されたＤＮＡは、修飾されていないｍＲＮＡよりもそれぞれほぼ１０倍および４倍効率的に翻訳された（図１５のＡ）。
【０２９０】
次に、本実験を、一次骨髄由来マウスＤＣを用いて実施し、この場合、細胞を形質移入の３時間後および８時間後に溶解した。プソイドウリジン修飾を含有するＲＮＡは、修飾されていないＲＮＡよりも１５〜３０倍効率的に翻訳された（図１５のＢ）。
【０２９１】
類似の発現結果を、ヒトＤＣおよび他の一次細胞ならびに、ＣＨＯ細胞およびマウスマクロファージ様ＲＡＷ細胞を含む確立された細胞株を用いて得た。すべての細胞種類において、プソイドウリジン修飾は、試験された修飾の最大の亢進を生じた。
【０２９２】
したがって、プソイドウリジン修飾は、異なる種類の専門抗原提示細胞および非専門抗原提示細胞を含む、試験されたすべての細胞種類におけるＲＮＡ翻訳効率を増大させ、プソイドウリジン修飾が、ＲＮＡ翻訳の効率を高めるというさらなる証拠を提供した。
【０２９３】
（実施例１５  ５’要素および３’要素は、哺乳類細胞におけるΨｍＲＮＡの翻訳を亢進する。）
プソイドウリジン修飾による翻訳の亢進に及ぼす追加的なＲＮＡ構造要素の効果を試験するために、以下の修飾、すなわち１）独特な５’非翻訳配列（ＴＥＶ、キャッピング非依存性翻訳エンハンサー）、２）キャッピング、および３）ポリＡ末端の組み合わせを含有する、ホタルルシフェラーゼをコードする１セットのΨｍＲＮＡを合成した。ΨｍＲＮＡまたは従来のｍＲＮＡの翻訳を亢進するこれらの修飾の能力を評価した（図１６のＡ）。これらの構造要素は、従来型およびΨｍＲＮＡの両方の翻訳効率性を追加的に亢進し、ΨｍＲＮＡは、全コンストラクトからのより多量のタンパク質製造を呈した。
【０２９４】
次に、率的なホタルルシフェラーゼΨｍＲＮＡコンストラクトであるｃａｐＴＥＶｌｕｃＡ５０（ＴＥＶ、キャッピング、および伸長したポリ（Ａ）末端を含有）からのタンパク質発現の能力を、２９３細胞において、２４時間にわたって検査した（図１６のＢ）。ΨｍＲＮＡは、試験された時点ごとにより多量のタンパク質を製造し、等価の従来のｍＲＮＡコンストラクトよりも持続的なルシフェラーゼ発現を与え、Ψ修飾がｍＲＮＡを安定化させることを示した。
【０２９５】
ｍＲＮＡのΨ修飾が、哺乳類細胞における翻訳効率性をインサイツで改良したかどうかを試験するために、伸長したポリＡ末端（Ａｎ）を有するかまたは有さない、かつβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードするｃａｐｌａｃＺ−ΨｍＲＮＡコンストラクトを生成し、これを用いて、２９３細胞に形質移入した。ｍＲＮＡ送達の２４時間後、β−ガラクトシダーゼレベルの有意な増大を、Ｘ−ｇａｌ可視化法によって、ｃａｐｌａｃＺおよびｃａｐｌａｃＺ−Ａｎの両方において、対応する対照（従来型）転写産物と比較して検出した（図１６のＣ）。この傾向は、β−ガラクトシダーゼの検出可能なレベルを発現する細胞数かまたは個々の細胞におけるシグナルの程度のいずれかを分析する場合に観察された。
【０２９６】
（実施例１３）
（プソイドウリジン含有ＲＮＡからのインビボでのタンパク質の翻訳の亢進：材料および実験方法）
（脳内ＲＮＡ注射）
すべての動物手順は、実験動物の取り扱いおよび使用についてのＮＩＨの指針に準拠し、機関の動物の取り扱いおよび使用委員会によって認可された。雄のウィスター系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，
ＭＡ）をペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射（６０ｍｇ／体重ｋｇ）によって麻酔した。頭部を定位フレームに置き、８つの等間隔に空いた直径１．５ｍｍのばり孔を両側に作製し（ブレグマに対する座標：前部／後部＋３、０、−３、−６ｍｍ、側部±２．５ｍｍ）、硬膜を無処置のままにした。脳内注射を、大きなプローブホルダーおよび定位アームに固定された３０ゲージ、１インチの滅菌針（Ｂｅｃｋｔｏｎ  ２５  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）を有する２５μＬの注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｒｅｎｏ，  ＮＶ）を用いて実施した。注射器中の空気の空間を回避するために、針ハブに５５μＬ複合体を充填した後、針を装着し、試料の残りを、針を通じて引き抜いた。注射深度（２ｍｍ）を、硬膜の表面に対して決定し、４μＬの複合体（３２ｎｇのｍＲＮＡ）を単回の急速投与注入において投与した。３時間後、ラットをハロタンで安楽死させ、脳を、冷蔵しておいたリン酸緩衝塩類溶液へと取り出した。
【０２９７】
（マウス尾静脈へのＲＮＡの注射）
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の尾静脈に、６０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）と複合体形成したＲＮＡ（０．２６μｇ）を注射した（急速投与）。臓器を摘出し、微量遠心チューブにおいてルシフェラーゼまたはウミシイタケ溶解緩衝液において練和棒を用いて均質化した。均質液を遠心分離し、上清を活性について分析した。
【０２９８】
（ＲＮＡの肺への送達）
ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを麻酔した。小さな切開を気管近くの皮膚に作製した。気管を露出させると、５０１−１１のＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）と複合体形成したＲＮＡ（０．２μｇ）を肺に向かう気管の中へと点滴した。切開を閉鎖し、動物を回復させておいた。ＲＮＡ送達の３時間後、マウスを頸椎脱離により屠殺し、肺を摘出し、ルシフェラーゼまたはウミシイタケ溶解緩衝液（２５０μＬ）において均質化し、活性についてアッセイした。異なるセットの動物において、血液試料（１００μＬ／個体）を尾静脈から回収し、凝血させ、遠心分離した。血清画分を用いて、先の実施れにおいて説明したとおり、マウス特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡによって、ＴＮＦおよびＩＦＮαのレベルを決定した。
【０２９９】
（結果）
インビボでのＲＮＡ翻訳に及ぼすプソイドウリジン修飾の効果を決定するために、ラット脳の各半球に、ウミシイタケをコードするキャッピングされたプソイドウリジンにより修飾されたＲＮＡかまたは修飾されていないＲＮＡのいずれかを注射し、ＲＮＡ翻訳を測定した。プソイドウリジンにより修飾されたＲＮＡは、修飾されていないＲＮＡよりも有意に効率的に翻訳された（図１７のＡ）。
【０３００】
次に、発現試験をマウスにおいて実施した。内在性哺乳類酵素がホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの検出に干渉しないので、該ｍＲＮＡを用いた。転写産物（修飾されていないｍＲＮＡおよびΨｍＲＮＡ）をキャッピング、ＴＥＶ（ｃａｐＴＥＶＡ５０）および伸長した（−２００ｎｔ）ポリ（Ａ）末端とともに構築した。０．２５μｇのＲＮＡ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）と複合体形成したものをマウスに注射した（静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈）。ある範囲の臓器をルシフェラーゼ活性について調査し、最適な測定部位を決定した。０．３μｇのｃａｐＴＥＶｌｕｃＡｎΨｍＲＮＡの投与は、脾臓において高いルシフェラーゼ発現を、骨髄において中程度の発現を誘導したが、肺、肝臓、心臓、腎臓、または脳において発現をほとんど誘導しなかった（図１７のＢ）。その後の試験において、脾臓を試験した。
【０３０１】
従来型およびΨｍＲＮＡ（０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．３μｇ／個体を静脈内付与）の翻訳効率を次に、経時的な実験において比較した。ルシフェラーゼ活性は、従来型またはΨｍＲＮＡのいずれかの投与の１時間後で容易に検出可能であり、４時間後でピークになり、２４時間後まで低下したが、すべての時刻において、ΨｍＲＮＡを与えられた動物において実質的により大きかった（図１７のＣ、左のパネル）。２４時間まで、ΨｍＲＮＡを注射された同ｂつのみが、検出可能な脾臓ルシフェラーゼ活性を示した（背景を４倍上回る）。ウミシイタケルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（Ψ修飾を有するまたは有さないｃａｐＲｅｎ）を、ホタルルシフェラーゼの替わりに動物に注射すると、または単離されたマウス脾細胞を培養物中のｍＲＮＡに曝露すると、発現の類似の相対的なパターン（修飾されたｍＲＮＡと修飾されていないｍＲＮＡの間）を得た。
【０３０２】
次の実験において、０．２５μｇのｍＲＮＡ‐Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）をマウス肺に気管内注射によって送達した。プソイドウリジンにより修飾されたキャッピングされたＲＮＡは、プソイドウリジン修飾を有さないキャッピングされたＲＮＡよりも効率的に翻訳された（図１７のＤ）。
【０３０３】
したがって、プソイドウリジン修飾は、培養された細胞においてインビトロでのＲＮＡ翻訳効率を、およびインビボでの複数の動物モデルにおいて、および複数の投与経路によって高め、ＲＮＡ翻訳の効率を高める手段としてのその広範な適用を示す。
【０３０４】
（実施例１７  プソイドウリジン修飾は、インビボでの安定性を亢進する。）
先の実施例由来の動物における注射１時間後および４時間後の脾臓ＲＮＡのノザン分析は、投与されたｍＲＮＡが、その無処置かつ部分的に分解された形態で、容易に検出可能であることを明らかにした（図１７のＣ、右のパネル）。対照的に、２４時間で、修飾されていないｃａｐＴＥＶｌｕｃＡｎ  ｍＲＮＡは、検出レベルを下回ったのに対し、ｃａｐＴＥＶｌｕｃＡｎΨｍＲＮＡは、部分的に分解されたが、なおも明らかに検出可能であった。したがって、ΨｍＲＮＡは、対照のｍＲＮＡよりもインビボにおいてより安定して保存されている。
【０３０５】
インビボでのタンパク質産生が、静脈内送達されたｍＲＮＡの濃度に定量的に依存するかどうかを試験するために、ｍＲＮＡをマウスに０．０１５〜０．１５０ｍｇ／ｋｇ（個体あたり０．３〜３．０μｇのｃａｐＴＥＶｌｕｃＡｎ）で投与し、脾臓を先に説明した通り６時間後に分析した。ルシフェラーゼ
発現は、注射されたＲＮＡの量と（図１８）各濃度において定量的に相関した。
【０３０６】
これらの発見は、実施例１５の結果を確認し、ΨｍＲＮＡが、修飾されていないＲＮＡよりも安定であることを示す。Ψ−ｍＲＮＡのさらなる免疫原性は、先に本明細書に説明されたように、修飾されていないＲＮＡよりも低かった（図１２および図１７のＣ、右のパネル）。
【０３０７】
実施例１６〜１７を要約すると、インビトロで観察された、従来のｍＲＮＡと比較したΨ−ｍＲＮＡの３の利点（翻訳の亢進、安定性の増大、および免疫原性の低下）は、インビボでも観察される。
【０３０８】
（実施例１８  気道を介して送達されたΨｍＲＮＡは、静脈内投与されたｍＲＮＡと同様に挙動する。）
吸入によって送達されるΨｍＲＮＡの能力を試験するために、ホタルルシフェラーゼをコードするＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）とまたはＰＥＩと複合体形成されたｍＲＮＡをマウスに気管内経路によって送達し、この中で、針を気管に配置し、ｍＲＮＡ溶液を肺へと噴霧した。静脈内送達と同様に、有意により大きなルシフェラーゼ発現は、修飾されていないｍＲＮＡと比較してΨｍＲＮＡを用いて観察された（図１９）が、静脈内経路と比較して気管内経路を用いて有意により少量のタンパク質が産生された。気管内経路によって投与された修飾されていないｍＲＮＡは、ビヒクル対照と比較して有意により高濃度の炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−α）を伴った。
【０３０９】
したがって、ΨｍＲＮＡは、生得的免疫応答を活性化させることなく吸入によって送達されることができる。
【０３１０】
（実施例１９  ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡの２９３細胞への送達）
ΨｍＲＮＡを、ヒトＥＰＯｃＤＮＡを含有するプラスミドから作製した。０．２５μｇのＥＰＯ−ΨｍＲＮＡを１０６の培養された２９３細胞へと形質移入し、６００ｍＵ／ｍＬ超のＥＰＯタンパク質を産生した。したがって、本発明の修飾されたＲＮＡ分子は、組換えタンパク質を細胞に送達する上で効果的である。
【０３１１】
（実施例２０  ＥＰＯをコードする改良されたΨｍＲＮＡコンストラクトの調製）
（材料および実験方法）
ＥＰＯコード配列を、制限酵素技術を用いてクローン化し、２の新たなプラスミド、すなわち、ｐＴＥＶ−ＥＰＯおよびｐＴ７ＴＳ−ＥＰＯを作製し、これらをＥＰＯ−ΨｍＲＮＡ産生のためのテンプレートとして用いる。ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡをこれらのテンプレートから、インビトロでの転写（ＭｅｓｓａｇｅＭａｃｈｉｎｅ（登録商標）およびＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）キット；Ａｍｂｉｏｎ，）によって、ヌクレオシドを等モル濃度（７．５ｍＭ）の濃度で組み込むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）を用いて製造した。ヌクレオシド修飾を組み込むために、Ψ三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）は、転写反応においてＵＴＰと置き換わる。ΨｍＲＮＡのキャッピングを確認するために、不可逆的キャッピングアナログである６ｍＭの３’−Ｏ−Ｍｅｍ７ＧｐｐｐＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）も含む。ΨｍＲＮＡは、３０℃で３〜２４時間混合した〜１．５μｇ／μＬのＲＮＡ、５ｍＭのＡＴＰ、および６０Ｕ／μＬの酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＵＳＢ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）の反応物においてポリ（Ａ）末端化されている。ΨｍＲＮＡの質を、変性アガロースゲル電気泳動法によって評価する。３ｐｇ／ｍＬの感度を有するＬｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅゲル塊アッセイを用いるｍＲＮＡ調製物におけるＬＰＳについてのアッセイも実施する。
【０３１２】
（結果）
ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡの近位の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、遍在性タンパク質であるエリスロポエチンｍＲＮＡ結合タンパク質（ＥＲＢＰ）との特異的な会合によってＥＰＯｍＲＮＡを安定化させる新生ＥＰＯｍＲＮＡ由来の約９０ｎｔ長のピリミジンの多い安定化要素を保存する。ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡの安定性を最大化するために、２の変更をＥＰＯプラスミドに組み込み、転写されたｍＲＮＡの安定性および翻訳効率を改良する：１）タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）の５’ＵＴＲ配列をＥＰＯコード配列の上流に組み込み、ｐＴＥＶ−ＥＰＯを生じる。２）プラスミドｐＴ７ＴＳ−ＥＰＯを生じ、この中で、ＥＰＯｃＤＮＡは、アフリカツメガエルβグロビンｍＲＮＡの５’および３’ＵＴＲに対応する配列によって隣接される。
【０３１３】
加えて、これらのプラスミドテンプレートからのΨｍＲＮＡの製造中のポリ（Ａ）末端の長さは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応のインキュベーション時間を延長することによって伸長する。より長いポリ（Ａ）末端は、ΨｍＲＮＡが翻訳中に分解する速度を低下させる。
【０３１４】
これらの改良は結果的に、インビボでの翻訳効率の亢進を生じ、最終産物の治療的用量を最小化する。
【０３１５】
（実施例２１  ＥＰＯｍＲＮＡコンストラクトからのタンパク質製造のインビトロでの分析）
（材料および実験方法）
（哺乳類細胞の調製）
ヒト胚性腎２９３細胞（ＡＴＣＣ）を、グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，  Ｏｄｇｅｎ，  ＵＴ）を補充したＤＭＥＭ（完全培地）において増殖させる。白血球フェレーシス試料を、ＩＲＢの認可したプロトコールを通じてＨＩＶ非感染ボランティアから得る。ＤＣを先に説明される通り製造し、ＡＩＭ  Ｖ培地（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに培養した。
【０３１６】
マウス脾細胞およびＤＣを、公開された手順によって得る。簡潔には、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓を無菌的に摘出し、完全培地中でピンセットで細かくする。組織断片を重力によって沈降させ、単一の細胞懸濁液を洗浄し、ＡＫＣ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で溶解する。マウスＤＣは、６〜９週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿骨および脛骨から回収された骨髄細胞に由来する。細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および５０ｎｇ／ｍＬのｍｕＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）を含有するＤＭＥＭにおいて培養し、７日後に使用する。
【０３１７】
（細胞の形質移入ならびにＥＰＯおよび炎症誘発性サイトカインの検出）
形質移入を、脾臓およびインビトロでの細胞発現のための有効な送達方法である、リン酸緩衝液の存在下でのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎを用いた形質移入を実施する。ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡ（０．２５μｇ／ウェル；１００，０００個）を各細胞種類に三つ組で１時間添加し、上清を新鮮培地と交換する。２４時間後、上清をＥＰＯ、ＩＦＮ−αもしくはβ、およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡ測定のために回収する。
【０３１８】
（結果）
ΨｍＲＮＡ翻訳効率の亢進に及ぼす独特なＵＴＲの影響を評価するために、長いポリ（Ａ）末端を有する各改良物（５’  ＴＥＶ要素、β−グロビン５’および３’ＵＴＲ）を含有するまたは含有しないＥＰＯ−ΨｍＲＮＡを、インビトロでのタンパク質製造および対照としての従来のヌクレオシドを含有するＥＰＯｍＲＮＡを用いるインビトロでの免疫活性化について試験する。各ｍＲＮＡからのタンパク質製造の効率を、哺乳類細胞株（ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ）、ヒトおよびマウス一次ＤＣ、並びに脾細胞において、各ｍＲＮＡについて評価する。すべての細胞種類において製造された全ＥＰＯおよび一次細胞における免疫原性（上清と会合した炎症誘発性サイトカイン）の測定を評価する。（１つ以上の細胞種類における）高いＥＰＯ製造と低いサイトカイン誘発との最適な組み合わせを示すｍＲＮＡコンストラクトをその後の研究に用いる。ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡの５’および３’ＵＴＲならびにより長いポリ（Ａ）末端の改良は結果的に、翻訳効率におけるおよそ２〜１０倍の亢進を生じる。
【０３１９】
（実施例２２  ＥＰＯ製造の特徴づけおよびＥＰＯ−ΨｍＲＮＡに対するインビボでの生物学的応答）
（材料および実験方法）
（ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡのマウスへの投与）
本明細書に説明される動物研究はすべて、実験動物のトリ圧秋および使用についてのＮＩＨの指針、ならびにペンシルバニア大学の機関動物の取り扱いおよび使用委員会によって認可される。雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（実験条件に付きｎ＝５、６週齢、１８〜２３ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、Ｎ２ＯおよびＯ２（７０：３０）の混合物における３．５％ハロタンを用いて麻酔した後、ハロタンを１％に低あｋさせ、麻酔を、鼻用マスクを用いて維持する。該手順を通じて、動物の体温を、３７℃に加温した加温パッドを用いて維持する。ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡ−リポフェクチン複合体（６０μＬの最終的な容積における変動する量の核酸と１μＬのリポフェクチンとを混合することによって構築）を側部尾静脈に注射する。血液試料を、経時試験間、ｍＲＮＡ注射後３日間、１日３回、用量反応試験において１つの最適な時点で、および網状赤血球増加症についての試験において２〜６日後に毎日回収する。
【０３２０】
（フローサイトメトリーによる網状赤血球の決定）
血液試料を、Ｒｅｔｉｃ−ＣＯＵＮＴ試薬（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて染色し、データ事象を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターにおいて獲得する。赤血球（ＲＢＣ）を、順方向および側方の散乱特性によって選択し、チアゾールオレンジの取り込みについて分析する。Ｒｅｔｉｃ−ＣＯＵＮＴ試薬で染色した細胞を蛍光により検出し、網状赤血球を全ＲＢＣの割合として表す。少なくとも５０，０００の事象を試料あたり計数する。
【０３２１】
（結果）
ＥＰＯをコードするｍＲＮＡに応答して生物学的に機能のあるヒトＥＰＯタンパク質（ｈＥＰＯ）の製造を最適化するために、以下の試験を実施する：
（ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡの単回注射後のＥＰＯ製造の時間経過）
１μｇのＥＰＯ−ΨｍＲＮＡの静脈内投与後、ＥＬＩＳＡによるＥＰＯ−ΨｍＲＮＡ投与１〜９６時間後にｈＥＰＯを連続的に測定し、血清中のＥＰＯタンパク質の半減期を決定する。この半減期は、ＥＰＯタンパク質の半減期およびＥＰＯ−ΨｍＲＮＡの機能的半減期の両方の結果である。ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡ投与後のＥＰＯタンパク質を測定するための結果として生じる最適な時点をその後の試験に利用する。
【０３２２】
（ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡの単回注射後のＥＰＯ製造の用量反応）製造されるＥＰＯタンパク質の量と投与されるＥＰＯ−ΨｍＲＮＡの量の間の相関を決定するために、増大する濃度のＥＰＯ−ΨｍＲＮＡ（０．０１〜１μｇ／個体）を投与し、最適な時点でＥＰＯを測定する。
【０３２３】
（ｈＥＰＯ製造と網状赤血球増加症の間の関連性）ＥＰＯ活性の生物学的な相関に及ぼすＥＰＯ−ΨｍＲＮＡの効果を測定するために、フローサイトメトリーを用いて、血液中の網状赤血球頻度を決定する。フローサイトメトリーは、３％未満の変動の係数を有する。マウスは、単回用量のＥＰＯ−ΨｍＲＮＡを受容し、血液をマウスから２〜６日後に回収する。ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡ用量と網状赤血球頻度の間の関連性を次に、最大網状赤血球増加症の時点で評価する。網状赤血球計数における少なくとも５％の増加をもたらすＥＰＯ−ΨｍＲＮＡの用量をその後の研究に用いる。概算された５０ｍＵ／ｍＬのマウスにおける血清ｈＥＰＯ濃度および／または概算された５％の網状赤血球頻度の増加を得る。
【０３２４】
（実施例２３  ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡに対する免疫応答のインビボでの測定）
（材料および実験方法）
（血漿中のサイトカインの検出）
リポフェクチンと複合体形成したｍＲＮＡの７回の毎日の投与の間および後の異なる時点で回収された血液から得られた血清試料を、ＥＬＩＳＡキットを用いてマウスＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２について分析する。
【０３２５】
（ノザンブロット分析）
脾臓から単離された一定分量の（２．０μｇ）のＲＮＡ試料を、１．４％のアガロースゲル電気泳動法によって分離し、帯電したメンブレンに転移させ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）、ＭｉｒａｃｌｅＨｙｂ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）においてハイブリッド形成する。メンブレンをＴＮＦ−α、下流のＩＦＮシグナル伝達分子（例えば、ＩＲＦ７、ＩＬ−１２  ｐ３５およびｐ４０、ならびにＧＡＰＤＨ）、ならびに免疫活性化に関する他のマーカーについて調べる。すべてのプローブの特異性を配列決定によって確認する。メンブレンを調べるために、ランダムプライム標識キット（Ｒｏｃｈｅ）をとともにＲｅｄｉｖｕｅ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、５０ｎｇのＤＮＡを標識する。ハイブリッド形成したメンブレンを、−７０℃でＭＳ増感剤スクリーンを用いて、Ｋｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘ  ＭＳフィルムに露光する。
【０３２６】
（組織病理）
ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡで処理したマウスならびに陽性対照および陰性対照で処理したマウス由来の脾臓を収集し、固定し、切片作製し、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色し、免疫活性化の徴候について獣医病理学者によって検討した。
【０３２７】
（結果）
本発明のＲＮＡ分子の免疫原性の低下を確認するために、マウス（ｎ＝５）は、日用量のＥＰＯ−ΨｍＲＮＡを７日間受容した後、血清サイトカイン濃度、炎症性タンパク質をコードするｍＲＮＡの脾臓発現、および病理検査によって示されるような、免疫仲介性有害事象について評価する。投与される最大用量は、先に決定されるように、３μｇまたは、単回有効量の５倍である。修飾されていないｍＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）単独をそれぞれ、陽性対照および陰性対照として用いる。
【０３２８】
これらの試験は、本発明のＲＮＡ分子の免疫原性の低下を確認する。
【０３２９】
（実施例２４）
（ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡ送達方法のさらなる改良）
（ナノ粒子複合体形成）
ポリマーおよびΨｍＲＮＡ溶液を混合して、複合体を形成する。種々の製剤条件を試験し最適化する：（１）２２ｎｍ未満のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／ｍＲＮＡ複合体を、２５容積のｍＲＮＡを水中の１容積のＰＥＩに、１５分間混合せずに添加することによって作製する。（２）１２×１５０ｎｍの平均寸法を有する桿状ポリ−Ｌ−リシン−ポリエチレングリコール（ＰＬＬ−ＰＥＧ）を、９容積のｍＲＮＡを、酢酸対イオン緩衝液における１容積のＣＫ３０−ＰＥＧ１０ｋにボルテックスをかけながらの緩徐な添加によって合成する。（３）生分解性遺伝子担体ポリマーの合成のために、無水ポリアスパラギン酸コエチレングリコール（ＰＡＥ）を、無水Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）無水Ｌ−アスパラギン酸およびエチレングリコールの開環重縮合によって合成する。次に、アスパラギン酸の枝分かれしたアミンを脱保護し、塩化水素による酸性化によってプロトン化し、ｍＲＮＡと縮合する。（４）ナノ粒子の最後の発生のために、酢酸アンモニウムとしての一定分量のストックのＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ（１．２５ｍＬ；６．４ｍｇ／ｍＬ）をシリコン処理したエッペンドルフチューブに加える。次に、ｍＲＮＡをＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ（１１．２５ｍＬの無ＲＮａｓｅＨ２Ｏにおける２．５ｍｇ）に１〜２分間かけて緩徐に添加する。１５分後、無ＲＮａｓｅＨ２Ｏにおいて１：２に希釈する。
【０３３０】
（気管内送達）
マウスを麻酔チャンバーにおける３％ハロタン（７０％Ｎ２Ｏ＋３０％Ｏ２）で麻酔し、鼻用円錐体を用いて操作の間、１％ハロタン（７０％Ｎ２Ｏ＋３０％Ｏ２）で維持する。気管を露出させ、５０μＬのｍＲＮＡ複合体を１５０μの気体とともに肺へと気管を通じて、２７Ｇ１／２’’針を有する２５０μＬのハミルトン注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，
Ｒｅｎｏ，  ＮＶ）を用いて注入する。
【０３３１】
（結果）
気管内（ｉ．ｔ．）経路を介して投与されるΨｍＲＮＡの送達および発現の効率性を改良するために、ΨｍＲＮＡをナノ粒子に封入する。ナノ粒子包装は、ポリ−Ｌ−リシンおよびポリエチレングリコールを含む化学物質を用いて、（例えば）ＤＮＡを濃縮し、核膜孔よりも小さな粒子へと該ＤＮＡを封入することを包含する。ＲＮＡを４の異なるナノ粒子製剤（ＰＥＩ、ＰＬＬ、ＰＡＥ、およびＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ）へと包装し、ΨｍＲＮＡ送達の効率性を、ルシフェラーゼをコードするΨｍＲＮＡと比較し、（Ｌｕｃ−ΨｍＲＮＡ）と比較する。送達動態および用量反応を次に、ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡを用いて特徴づける。
【０３３２】
（実施例２５  組換え熱ショックタンパク質をコードする修飾されたｍＲＮＡの頸動脈への送達による再狭窄の予防）
（材料および実験方法）
（実験設計）
バルーン血管形成術とほぼ同時に動脈内注射によってラットの頸動脈にＲＮＡを投与し、その後、血流を回復させる。ラットを注射３時間後に屠殺し、頸動脈切片を摘出し、脈管内皮細胞を収集および均質化し、ルシフェラーゼ活性を先の実施例において説明される通り決定する。
【０３３３】
（結果）
ルシフェラーゼをコードする、プソイドウリジンにより修飾されたＲＮＡを、ラット頸動脈に投与する。３時間後、ＲＮＡを送達部位で検出することができるが、隣接部位では検出できない。
【０３３４】
次に、本プロトコールを用いて、熱ショックタンパク質、例えばＨＳＰ７０、増殖因子（例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ））、血管内皮増殖因子（Ｖ−ＥＧＦ）、もしくはインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、または増殖因子のシグナル伝達を下方制御もしくは拮抗するタンパク質、をコードする修飾されたＲＮＡの送達による、動物再狭窄モデルにおけるバルーン血管形成術後の血管の再狭窄を予防する。修飾されたＲＮＡの投与は、再狭窄の発生率を低下させる。
【０３３５】
（実施例２６  ＣＦＴＲをコードする修飾されたｍＲＮＡ分子の呼吸上皮への送達による嚢胞性線維症の治療）
ＣＦＴＲをコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたＲＮＡを、実施例１６において説明される通り、嚢胞性線維症動物モデルの肺に送達し、該疾患に及ぼすその効果を、Scholte BJ, et al(Animal models of cystic fibrosis. J Cyst Fibros2004; 3 Suppl2: 183−90)またはCopreniE, et al(Lentivirus−mediated gene transfer to the respiratoryepithelium: a promising approach to gene therapy of cystic fibrosis. GeneTher2004; 11 Suppl 1: S67−75）において説明される通り評価した。ＲＮＡの投与は、嚢胞性線維症を寛解させる。
【０３３６】
追加的な実験において、本発明の修飾されたｍＲＮＡ分子を用いて、肺に、治療価値のある他の組換えタンパク質を、例えば、ＲＮＡを送達する吸入器を介して送達する。
【０３３７】
（実施例２７  ＡＤＡをコードする修飾されたｍＲＮＡ分子の造血細胞への送達によるＸＬＡの治療）
ＡＤＡをコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたＲＮＡをＸ連鎖無ガンマグロブリン血症の造血細胞に送達し、該疾患に及ぼすその効果をTanaka M, Gunawan F, et al, Inhibition of heart transplant injuryand graft coronaryartery disease after prolonged organ ischemia by selectiveprotein kinase C regulators. J Thorac Cardiovasc Surg 2005;129(5): 1160−7またはZonta S, Lovisetto F, et al, Uretero−neocystostomy in a swine model of kidney transplantation: a newtechnique. J Surg Res. 2005 Apr;124(2):250−5において説明される通り評価する。
ＲＮＡの投与は、ＸＬＡを改良することが見いだされている。
【０３３８】
（実施例２８  免疫調節性タンパク質をコードする修飾されたｍＲＮＡ分子の移植片部位への送達による臓器拒絶の予防）
サイトカイン、ケモカイン、またはインターフェロンＩＳ（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−Ｉ０、またはＴＧＦ−β）をコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたＲＮＡを、臓器移植片拒絶動物モデルの移植片部位に送達し、拒絶の発生率に及ぼすその効果をYu PW, Tabuchi R S et al, Sustained correction of B−cell development and function in a murine model of X−linked agammaglobulinemia (XLA) using retroviral−mediated gene transfer. Blood. 2004 104(5): 1281−90またはSatoh M, Mizutani A et al, X−linked immunodeficient mice spontaneously produce lupus−related anti20 RNA helicase A autoantibodies, but are resistant topristane−induced lupus. Int Immunol 2003, 15(9):1117−24において説明される通り評価する。ＲＮＡの投与は、移植片拒絶の発生率を低下させる。
【０３３９】
（実施例２９  修飾されたｍＲＮＡの身体組織への送達によるニーマン・ピック病、ムコ多糖症、および他の先天性代謝障害の治療）
スフィンゴミエリナーゼをコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたＲＮＡをニーマン・ピック病Ａ型およびＢ型動物モデルの肺、脳、または他の組織に送達し、該疾患に及ぼすその効果をPassini MA, Macauley SL, et al, AAV vector−mediatedcorrection of brain pathology in a mouse model of Niemann−Pick A disease. Mol Ther 2005;11(5): 754−62またはBuccoliero R, Ginzburg L, et al, Elevation of lung surfactantphosphatidylcholine in mouse models of Sandhoff and of Niemann−Pick A disease. J Inherit Metab Dis 2004;27(5): 641−8において説明される通り評価する。ＲＮＡの投与は、該疾患を改良することが見いだされている。
【０３４０】
α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロナート−２−スルファターゼ、または関連酵素をコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたＲＮＡを、ムコ多糖症動物モデルの身体組織に送達し、該疾患に及ぼすその効果をSimonaro CM, D’Angelo M, et al, Joint andbone disease in mucopolysaccharidoses VI and VII: identification of newtherapeutic targets and biomarkers using animal models. Pediatr Res 2005;57(5Pt 1): 701−7またはMcGlynn R,Dobrenis K, et al, Differential subcellular localization of cholesterol,gangliosides, and glycosaminoglycans in murine models of mucopolysaccharidestorage disorders. J Comp Neurol 2004 20;480(4): 415−26において説明される通り評価する。ＲＮＡの投与は、該疾患を寛解させる。
【０３４１】
追加的な実験において、本発明の修飾されたｍＲＮＡ分子を用いて、凝固因子を提供する（例えば、血友病者用）。追加的な実験において、本発明の修飾されたｍＲＮＡ分子を用いて、ゴーシェを治療するための酸−ｂ−グルコシダーゼを提供する。追加的な実験において、本発明の修飾されたｍＲＮＡ分子を用いて、ファブリ病（Ｆａｂｒｙ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）を治療するためにα−ガラクトシダーゼを提供する。追加的な実験において、本発明の修飾されたｍＲＮＡ分子を用いて、感染性疾患の治療のためにサイトカインを提供する。
【０３４２】
追加的な実験において、本発明の修飾されたｍＲＮＡ分子を用いて、例えば、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＤ３、ＡＣＡＤＭ、ＡＧＬ、ＡＧＴ、ＡＬＤＨ４Ａｌ、ＡＬＰＬ、ＡＭＰＤ１、ＡＰＯＡ２、ＡＶＳＤ１、ＢＲＣＤ２、Ｃ１ＱＡ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＧ、Ｃ８Ａ、Ｃ８Ｂ、ＣＡＣＮＡ１Ｓ、ＣＣＶ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＨＭＬ、ＣＨＳ１、ＣＩＡＳ１、ＣＬＣＮＫＢ、ＣＭＤ１Ａ、ＣＭＨ２、ＣＭＭ、ＣＯＬ１１ＡＩ、ＣＯＬ８Ａ２、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＰＴ２、ＣＲＢ１、ＣＳＥ、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＴＰＡ、ＣＴＳＫ、ＤＢＴ、ＤＩＯ１、ＤＩＳＣ１、ＤＰＹＤ、ＥＫＶ、ＥＮＯ１、ＥＮＯ１Ｐ、ＥＰＢ４１、ＥＰＨＸ１、Ｆ１３Ｂ、Ｆ５、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＨＬ、ＦＨ、ＦＭＯ３、ＦＭＯ４、ＦＵＣＡ１、ＦＹ、ＧＡＬＥ、ＧＢＡ、ＧＦＮＤ、ＧＪＡ８、ＧＪＢ３、ＧＬＣ３Ｂ、ＨＦ１、ＨＭＧＣＬ、ＨＰＣ１、ＨＲＤ、ＨＲＰＴ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＨＳＰＧ２、ＫＣＮＱ４、ＫＣＳ、ＫＩＦ１Ｂ、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、ＬＧＭＤ１Ｂ、ＬＭＮＡ、ＬＯＲ、ＭＣＫＤ１、ＭＣＬ１、ＭＰＺ、ＭＴＨＦＲ、ＭＴＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＯＣ、ＮＢ、ＮＣＦ２、ＮＥＭ１、ＮＰＨＳ２、ＮＰＰＡ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＯＰＴＡ２、ＰＢＸ１、ＰＣＨＣ、ＰＧＤ、ＰＨＡ２Ａ、ＰＨＧＤＨ、ＰＫＬＲ、ＰＫＰ１、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ、ＰＬＯＤ、ＰＰＯＸ、ＰＰＴ１、ＰＲＣＣ、ＰＲＧ４、ＰＳＥＮ２、ＰＴＯＳ１、ＲＥＮ、ＲＦＸ５、ＲＨＤ、ＲＭＤ１、ＲＰＥ６５、ＳＣＣＤ、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＳＪＳ１、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＰＧ２３、ＳＰＴＡ１、ＴＡＬ１、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＮＴ２、ＴＰＭ３、ＴＳＨＢ、ＵＭＰＫ、ＵＯＸ、ＵＲＯＤ、ＵＳＨ２Ａ、ＶＭＧＬＯＭ、ＶＷＳ、ＷＳ２Ｂ、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＣＡＤＬ、ＡＣＰ１、ＡＧＸＴ、ＡＨＨＲ、ＡＬＭＳ１、ＡＬＰＰ、ＡＬＳ２、ＡＰＯＢ、ＢＤＥ、ＢＤＭＲ、ＢＪＳ、ＢＭＰＲ２、ＣＨＲＮＡ１、ＣＭＣＷＴＤ、ＣＮＧＡ３、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＰＳ１、ＣＲＹＧＡ、ＣＲＹＧＥＰ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＤＢＩ、ＤＥＳ、ＤＹＳＦ、ＥＤＡＲ、ＥＦＥＭＰ１、ＥＩＦ２ＡＫ３、ＥＲＣＣ３、ＦＳＨＲ、ＧＩＮＧＦ、ＧＬＣ１Ｂ、ＧＰＤ２、ＧＹＰＣ、ＨＡＤＨＡ、ＨＡＤＨＢ、ＨＯＸＤ１３、ＨＰＥ２、ＩＧＫＣ、ＩＨＨ、ＩＲＳ１、ＩＴＧＡ６、ＫＨＫ、ＫＹＮＵ、ＬＣＴ、ＬＨＣＧＲ、ＬＳＦＣ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＮＥＢ、ＮＭＴＣ、ＮＰＨＰ１、ＰＡＦＡＨ１Ｐ１、ＰＡＸ３、ＰＡＸ８、ＰＭＳ１、ＰＮＫＤ、ＰＰＨ１、ＰＲＯＣ、ＲＥＧＩＡ、ＳＡＧ、ＳＦＴＰＢ、ＳＬＣ１１Ａ１、ＳＬＣ３Ａｌ、ＳＯＳ１、ＳＰＧ４、ＳＲＤ５Ａ２、ＴＣＬ４、ＴＧＦＡ、ＴＭＤ、ＴＰＯ、ＵＧＴ１Ａ＠、ＵＶ２４、ＷＳＳ、ＸＤＨ、ＺＡＰ７０、ＺＦＨＸ１Ｂ、ＡＣＡＡ１、ＡＧＳ１、ＡＧＴＲ１、ＡＨＳＧ、ＡＭＴ、ＡＲＭＥＴ、ＢＢＳ３、ＢＣＨＥ、ＢＣＰＭ、ＢＴＤ、ＣＡＳＲ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤＬ１、ＣＭＴ２Ｂ、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＰ、ＣＰＯ、ＣＲＹ、ＣＴＮＮＢ１、ＤＥＭ、ＥＴＭ１、ＦＡＮＣＤ２、Ｆ１Ｈ、ＦＯＸＬ２、ＧＢＥ１、ＧＬＢ１、ＧＬＣ１Ｃ、ＧＮＡＩ２、ＧＮＡＴ１、ＧＰ９、ＧＰＸ１、ＨＧＤ、ＨＲＧ、ＩＴＩＨ１、ＫＮＧ、ＬＰＰ、ＬＲＳ１、ＭＣＣＣ１、ＭＤＳ１、ＭＨＳ４、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＹＬ３、ＭＹＭＹ、ＯＰＡ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＰＢＸＰＩ、ＰＣＣＢ、ＰＯＵ１ＦＩ、ＰＰＡＲＧ、ＰＲＯＳ１、ＰＴＨＲ１、ＲＣＡ１、ＲＨＯ、ＳＣＡ７、ＳＣＬＣ１、ＳＣＮ５Ａ、ＳＩ、ＳＬＣ２５Ａ２０、ＳＬＣ２Ａ２、ＴＦ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＰＯ、ＴＨＲＢ、ＴＫＴ、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＲＨ、ＵＭＰＳ、ＵＱＣＲＣ１、ＵＳＨ３Ａ、ＶＨＬ、ＷＳ２Ａ、ＸＰＣ、ＺＮＦ３５、ＡＤＨ１Ｂ、ＡＤＨ１Ｃ、ＡＦＰ、ＡＧＡ、ＡＩＨ２、ＡＬＢ、ＡＳＭＤ、ＢＦＨＤ、ＣＮＧＡ１、ＣＲＢＭ、ＤＣＫ、ＤＳＰＰ、ＤＴＤＰ２、ＥＬＯＮＧ、ＥＮＡＭ、ＥＴＦＤＨ、ＥＶＣ、Ｆ１１、ＦＡＢＰ２、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＧＦＲ３、ＦＧＧ、ＦＳＨＭＤ１Ａ、ＧＣ、ＧＮＰＴＡ、ＧＮＲＨＲ、ＧＹＰＡ、ＨＣＡ、ＨＣＬ２、ＨＤ、ＨＴＮ３、ＨＶＢＳ６、ＩＤＵＡ、ＩＦ、ＪＰＤ、ＫＩＴ、ＫＬＫＢ１、ＬＱＴ４、ＭＡＮＢＡ、ＭＬＬＴ２、ＭＳＸ１、ＭＴＰ、ＮＲ３Ｃ２、ＰＢＴ、ＰＤＥ６Ｂ、ＰＥＥ１、ＰＩＴＸ２、ＰＫＤ２、ＱＤＰＲ、ＳＧＣＢ、ＳＬＣ２５Ａ４、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ３、ＳＴＡＴＨ、ＴＡＰＶＲ１、ＴＹＳ、ＷＢＳ２、ＷＦＳ１、ＷＨＣＲ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＲＢ２、ＡＭＣＮ、ＡＰ３ＢＩ、ＡＰＣ、ＡＲＳＢ、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＢＨＲ１、Ｃ６、Ｃ７、ＣＣＡＬ２、ＣＫＮ１、ＣＭＤＪ、ＣＲＨＢＰ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＨＦＲ、ＤＩＡＰＨ１、ＤＴＲ、ＥＯＳ、ＥＰＤ、ＥＲＶＲ、Ｆ１２、ＦＢＮ２、ＧＤＮＦ、ＧＨＲ、ＧＬＲＡ１、ＧＭ２Ａ、ＨＥＸＢ、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＴＧＡ２、ＫＦＳ、ＬＧＭＤ１Ａ、ＬＯＸ、ＬＴＣ４Ｓ、ＭＡＮ２Ａ１、ＭＣＣ、ＭＣＣＣ２、ＭＳＨ３、ＭＳＸ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＣＳＫ１、ＰＤＥ６Ａ、ＰＦＢＩ、ＲＡＳＡ１、ＳＣＺＤ１、ＳＤＨＡ、ＳＧＣＤ、ＳＬＣ２２Ａ５、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＣ６Ａ３、ＳＭ１、ＳＭＡ＠、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＳＰＩＮＫ５、ＴＣＯＦ１、ＴＥＬＡＢ１、ＴＧＦＢＩ、ＡＬＤＨ５Ａｌ、ＡＲＧ１、ＡＳ、ＡＳＳＰ２、ＢＣＫＤＨＢ、ＢＦ、Ｃ２、Ｃ４Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＹＰ２１Ａ２、ＤＹＸ２、ＥＪＭ１、ＥＬＯＶＬ４、ＥＰＭ２Ａ、ＥＳＲ１、ＥＹＡ４、Ｆ１３Ａ１、ＦＡＮＣＥ、ＧＣＬＣ、ＧＪＡ１、ＧＬＹＳ１、ＧＭＰＲ、ＧＳＥ、ＨＣＲ、ＨＦＥ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＰＦＨ、ＩＣＳ１、ＩＤＤＭ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＧＡＤ１、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＳＣＷ、ＬＡＭＡ２、ＬＡＰ、ＬＣＡ５、ＬＰＡ、ＭＣＤＲ１、ＭＯＣＳ１、ＭＵＴ、ＭＹＢ、ＮＥＵ１、ＮＫＳ１、ＮＹＳ２、ＯＡ３、ＯＯＤＤ、ＯＦＣ１、ＰＡＲＫ２、ＰＢＣＡ、ＰＢＣＲＡ１、ＰＤＢ１、ＰＥＸ３、ＰＥＸ６、ＰＥＸ７、ＰＫＨＤ１、ＰＬＡ２Ｇ７、ＰＬＧ、ＰＯＬＨ、ＰＰＡＣ、ＰＳＯＲＳ１、ＰＵＪＯ、ＲＣＤ１、ＲＤＳ、ＲＨＡＧ、ＲＰ１４、ＲＵＮＸ２、ＲＷＳ、ＳＣＡ１、ＳＣＺＤ３、ＳＩＡＳＤ、ＳＯＤ２、ＳＴ８、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＴＮＤＭ、ＴＮＦ、ＴＰＢＧ、ＴＰＭＴ、ＴＵＬＰ１、ＷＩＳＰ３、ＡＡＳＳ、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ４、ＡＣＨＥ、ＡＱＰ１、ＡＳＬ、ＡＳＮＳ、ＡＵＴＳ１、ＢＰＧＭ、ＢＲＡＦ、Ｃ７ｏｒｆ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＣＭ１、ＣＤ３６、ＣＦＴＲ、ＣＨＯＲＤＯＭＡ、ＣＬＣＮ１、ＣＭＨ６、ＣＭＴ２Ｄ、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＲＳ、ＣＹＭＤ、ＤＦＮＡ５、ＤＬＤ、ＤＹＴ１１、ＥＥＣ１、ＥＬＮ、ＥＴＶ１、ＦＫＢＰ６、ＧＣＫ、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＳ、ＧＬＩ３、ＧＰＤＳ１、ＧＵＳＢ、ＨＬＸＢ９、ＨＯＸＡ１３、ＨＰＦＨ２、ＨＲＸ、ＩＡＢ、ＩＭＭＰ２Ｌ、ＫＣＮＨ２、ＬＡＭＢ１、ＬＥＰ、ＭＥＴ、ＮＣＦ１、ＮＭ、ＯＧＤＨ、ＯＰＮ１ＳＷ、ＰＥＸ１、ＰＧＡＭ２、ＰＭＳ２、ＰＯＮ１、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＰＲＳＳ１、ＰＴＣ、ＰＴＰＮ１２、ＲＰ１０、ＲＰ９、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＣＥ、ＳＨＦＭ１、ＳＨＨ、ＳＬＣ２６Ａ３、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＯＳ、ＳＭＡＤ１、ＴＢＸＡＳ１、ＴＷＩＳＴ、ＺＷＳ１、ＡＣＨＭ３、ＡＤＲＢ３、ＡＮＫＩ、ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＣＡＬ１、ＣＬＮ８、ＣＭＴ４Ａ、ＣＮＧＢ３、ＣＯＨ１、ＣＰＰ、ＣＲＨ、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＤＥＣＲ１、ＤＰＹＳ、ＤＵＲＳ１、ＥＢＳ１、ＥＣＡ１、ＥＧＩ、ＥＸＴ１、ＥＹＡ１、ＦＧＦＲ１、ＧＮＲＨ１、ＧＳＲ、ＧＵＬＯＰ、ＨＲ、ＫＣＮＱ３、ＫＦＭ、ＫＷＥ、ＬＧＣＲ、ＬＰＬ、ＭＣＰＨ１、ＭＯＳ、ＭＹＣ、ＮＡＴ１、ＮＡＴ２、ＮＢＳ１、ＰＬＡＴ、ＰＬＥＣ１、ＰＲＫＤＣ、ＰＸＭＰ３、ＲＰ１、ＳＣＺＤ６、ＳＦＴＰＣ、ＳＧＭ１、ＳＰＧ５Ａ、ＳＴＡＲ、ＴＧ、ＴＲＰＳ１、ＴＴＰＡ、ＶＭＤ１、ＷＲＮ、ＡＢＣＡ１、ＡＢＬ１、ＡＢＯ、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＫ１、ＡＬＡＤ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＯＢ、ＡＭＢＰ、ＡＭＣＤ１、ＡＳＳ、ＢＤＭＦ、ＢＳＣＬ、Ｃ５、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＡＣ、ＣＬＡ１、ＣＭＤ１Ｂ、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＲＡＴ、ＤＢＨ、ＤＮＡＩ１、ＤＹＳ、ＤＹＴ１、ＥＮＧ、ＦＡＮＣＣ、ＦＢＰ１、ＦＣＭＤ、ＦＲＤＡ、ＧＡＬＴ、ＧＬＤＣ、ＧＮＥ、ＧＳＭ１、ＧＳＮ、ＨＳＤ１７Ｂ３、ＨＳＮ１、ＩＢＭ２、ＩＮＶＳ、ＪＢＴＳ１、ＬＡＬＬ、ＬＣＣＳ１、ＬＣＣＳ、ＬＧＭＤ２Ｈ、ＬＭＸ１Ｂ、ＭＬＬＴ３、ＭＲＯＳ、ＭＳＳＥ、ＮＯＴＣＨ１、ＯＲＭ１、ＰＡＰＰＡ、ＰＩＰ５Ｋ１Ｂ、ＰＴＣＨ、ＰＴＧＳ１、ＲＬＮ１、ＲＬＮ２、ＲＭＲＰ、ＲＯＲ２、ＲＰＤ１、ＳＡＲＤＨ、ＳＰＴＬＣ１、ＳＴＯＭ、ＴＤＦＡ、ＴＥＫ、ＴＭＣ１、ＴＲＩＭ３２、ＴＳＣ１、ＴＹＲＰ１、ＸＰＡ、ＣＡＣＮＢ２、ＣＯＬｌ７Ａ１、ＣＵＢＮ、ＣＸＣＬ１２、ＣＹＰ１７、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ９、ＥＧＲ２、ＥＭＸ２、ＥＲＣＣ６、ＦＧＦＲ２、ＨＫ１、ＨＰＳＩ、ＩＬ２ＲＡ、ＬＧＩ１、ＬＩＰＡ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＢＬ２、ＭＫＩ６７、ＭＸＩ１、ＮＯＤＡＬ、ＯＡＴ、ＯＡＴＬ３、ＰＡＸ２、ＰＣＢＤ、ＰＥＯ１、ＰＨＹＨ、ＰＮＬ１Ｐ、ＰＳＡＰ、ＰＴＥＮ、ＲＢＰ４、ＲＤＰＡ、ＲＥＴ、ＳＦＴＰＡ１、ＳＦＴＰＤ、ＳＨＦＭ３、ＳＩＡＬ、ＴＨＣ２、ＴＬＸ１、ＴＮＦＲＳＦ６、ＵＦＳ、ＵＲＯＳ、ＡＡ、ＡＢＣＣ８、ＡＣＡＴ１、ＡＬＸ４、ＡＭＰＤ３、ＡＮＣ、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＣ３、ＡＴＭ、ＢＳＣＬ２、ＢＷＳ、ＣＡＬＣＡ、ＣＡＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５９、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＬＮ２、ＣＮＴＦ、ＣＰＴ１Ａ、ＣＴＳＣ、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＤＨＣＲ７、ＤＬＡＴ、ＤＲＤ４、ＥＣＢ２、ＥＤ４、ＥＶＲ１、ＥＸＴ２、Ｆ２、ＦＳＨＢ、ＦＴＨ１、Ｇ６ＰＴ１、Ｇ６ＰＴ２、ＧＩＦ、ＨＢＢ、ＨＢＢＰ１、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＭＢＳ、ＨＮＤ、ＨＯＭＧ２、ＨＲＡＳ、ＨＶＢＳ１、ＩＤＤＭ２、ＩＧＥＲ、ＩＮＳ、ＪＢＳ、ＫＣＮＪ１１、ＫＣＮＪ１、ＫＣＮＱ１、ＬＤＨＡ、ＬＲＰ５、ＭＥＮ１、ＭＬＬ、ＭＹＢＰＣ３、ＭＹＯ７Ａ、ＮＮＯ１、ＯＰＰＧ、ＯＰＴＢ１、ＰＡＸ６、ＰＣ、ＰＤＸ１、ＰＧＬ２、ＰＧＲ、ＰＯＲＣ、ＰＴＨ、ＰＴＳ、ＰＶＲＬ１、ＰＹＧＭ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＲＯＭ１、ＲＲＡＳ２、ＳＡＡ１、ＳＣＡ５、ＳＣＺＤ２、ＳＤＨＤ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＳＭＰＤ１、ＴＣＩＲＧ１、ＴＣＬ２、ＴＥＣＴＡ、ＴＨ、ＴＲＥＨ、ＴＳＧ１０１、ＴＹＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＶＭＤ２、ＶＲＮ１、ＷＴ１、ＷＴ２、ＺＮＦ１４５、Ａ２Ｍ、ＡＡＡＳ、ＡＣＡＤＳ、ＡＣＬＳ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＬＤＨ２、ＡＭＨＲ２、ＡＯＭ、ＡＱＰ２、ＡＴＤ、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＤＣ、Ｃ１Ｒ、ＣＤ４、ＣＤＫ４、ＣＮＡ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＹＰ２７Ｂ１、ＤＲＰＬＡ、ＥＮＵＲ２、ＦＥＯＭ１、ＦＧＦ２３、ＦＰＦ、ＧＮＢ３、ＧＮＳ、ＨＡＬ、ＨＢＰ１、ＨＭＧＡ２、ＨＭＮ２、ＨＰＤ、ＩＧＦ１、ＫＣＮＡ１、ＫＥＲＡ、ＫＲＡＳ２、ＫＲＴ１、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴ３、ＫＲＴ４、ＫＲＴ５、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ６Ｂ、ＫＲＴＨＢ６、ＬＤＨＢ、ＬＹＺ、ＭＧＣＴ、ＭＰＥ、ＭＶＫ、ＭＹＬ２、ＯＡＰ、ＰＡＨ、ＰＰＫＢ、ＰＲＢ３、ＰＴＰＮ１１、ＰＸＲ１、ＲＬＳ、ＲＳＮ、ＳＡＳ、ＳＡＸ１、ＳＣＡ２、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＭＡＬ、ＳＰＰＭ、ＳＰＳＭＡ、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＣＦ１、ＴＰＩ１、ＴＳＣ３、ＵＬＲ、ＶＤＲ、ＶＷＦ、ＡＴＰ７Ｂ、ＢＲＣＡ２、ＢＲＣＤ１、ＣＬＮ５、ＣＰＢ２、ＥＤ２、ＥＤＮＲＢ、ＥＮＵＲ１、ＥＲＣＣ５、Ｆ１０、Ｆ７、ＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＩＰＦ１、ＭＢＳ１、ＭＣＯＲ、ＮＹＳ４、ＰＣＣＡ、ＲＢ１、ＲＨＯＫ、ＳＣＺＤ７、ＳＧＣＧ、ＳＬＣ１０Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ１５、ＳＴＡＲＰ１、ＺＮＦｌ９８、ＡＣＨＭ１、ＡＲＶＤＩ、ＢＣＨ、ＣＴＡＡ１、ＤＡＤ１、ＤＦＮＢ５、ＥＭＬ１、ＧＡＬＣ、ＧＣＨ１、ＩＢＧＣ１、ＩＧＨ＠、ＩＧＨＣｇｒｏｕｐ、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＭ、ＩＧＨＲ、ＩＶ、ＬＴＢＰ２、ＭＣＯＰ、ＭＪＤ、ＭＮＧ１ＭＰＤ１、ＭＰＳ３Ｃ、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＮＰ、ＮＰＣ２、ＰＡＢＮ１、ＰＳＥＮ１ＰＹＧＬ、ＲＰＧＲＩＰ１、
ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＡ６、ＳＬＣ７Ａ７、ＳＰＧ３Ａ、ＳＰＴＢ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＧＭＩ、ＴＩＴＦ１、ＴＭＩＰ、ＴＲＡ＠、ＴＳＨＲ、ＵＳＨ１Ａ、ＶＰ、ＡＣＣＰＮ、ＡＨＯ２、ＡＮＣＲ、Ｂ２Ｍ、ＢＢＳ４、ＢＬＭ、ＣＡＰＮ３、ＣＤＡＮ１、ＣＤＡＮ３、ＣＬＮ６、ＣＭＨ３、ＣＹＰ１９、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＤＹＸ１、ＥＰＢ４２、ＥＴＦＡ、ＥＹＣＬ３、ＦＡＨ、ＦＢＮ１、ＦＥＳ、ＨＣＶＳ、ＨＥＸＡ、ＩＶＤ、ＬＣＳ１、ＬＩＰＣ、ＭＹＯ５Ａ、ＯＣＡ２、ＯＴＳＣ１、ＰＷＣＲ、ＲＬＢＰ１、ＳＬＣ１２Ａ１、ＳＰＧ６、ＴＰＭ１、ＵＢＥ３Ａ、ＷＭＳ、ＡＢＣＣ６、ＡＬＤＯＡ、ＡＰＲＴ、ＡＴＰ２Ａ１、ＢＢＳ２、ＣＡＲＤ１５、ＣＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＥＴＰ、ＣＨＳＴ６、ＣＬＮ３、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＴＨ、ＣＴＭ、ＣＹＢＡ、ＣＹＬＤ、ＤＨＳ、ＤＮＡＳＥ１、ＤＰＥＰ１、ＥＲＣＣ４、ＦＡＮＣＡ、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＮ、ＨＡＧＨ、ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＨＲ、ＨＢＱ１、ＨＢＺ、ＨＢＺＰ、ＨＰ、ＨＳＤ１１Ｂ２、ＩＬ４Ｒ、ＬＩＰＢ、ＭＣ２Ｒ、ＭＥＦＶ、ＭＨＣ２ＴＡ、ＭＬＹＣＤ、ＭＭＶＰ１、ＰＨＫＢ、ＰＨＫＧ２、ＰＫＤ１、ＰＫＤＴＳ、ＰＭＭ２、ＰＸＥ、ＳＡＬＬ１、ＳＣＡ４、ＳＣＮＮ１Ｂ、ＳＣＮＮ１Ｇ、ＳＬＣ１２Ａ３、ＴＡＴ、ＴＳＣ２、ＶＤＩ、ＷＴ３、ＡＢＲ、ＡＣＡＣＡ、ＡＣＡＤＶＬ、ＡＣＥ、ＡＬＤＨ３Ａ２、ＡＰＯＨ、ＡＳＰＡ、ＡＸＩＮ２、ＢＣＬ５、ＢＨＤ、ＢＬＭＨ、ＢＲＣＡ１、ＣＡＣＤ、ＣＣＡ１、ＣＣＺＳ、ＣＨＲＮＢ１、ＣＨＲＮＥ、ＣＭＴ１Ａ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＲＤ５、ＣＴＮＳ、ＥＰＸ、ＥＲＢＢ２、Ｇ６ＰＣ、ＧＡＡ、ＧＡＬＫ１、ＧＣＧＲ、ＧＦＡＰ、ＧＨ１、ＧＨ２、ＧＰ１ＢＡ、ＧＰＳＣ、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ１２、ＫＲＴ１３、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１４Ｌ１、ＫＲＴ１４Ｌ２、ＫＲＴ１４Ｌ３、ＫＲＴ１６、ＫＲＴ１６Ｌ１、ＫＲＴ１６Ｌ２、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ９、ＭＡＰＴ、ＭＤＢ、ＭＤＣＲ、ＭＧＩ、ＭＨＳ２、ＭＫＳ１、ＭＰＯ、ＭＹＯ１５Ａ、ＮＡＧＬＵ、ＮＡＰＢ、ＮＦ１、ＮＭＥ１、Ｐ４ＨＢ、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＰＥＣＡＭ１、ＰＥＸ１２、ＰＨＢ、ＰＭＰ２２、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＷＮＫ４、ＰＲＰ８、ＰＲＰＦ８、ＰＴＬＡＨ、ＲＡＲＡ、ＲＣＶ１、ＲＭＳＡ１、ＲＰ１７、ＲＳＳ、ＳＣＮ４Ａ、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＳＧＣＡ、ＳＧＳＨ、ＳＨＢＧ、ＳＬＣ２Ａ４、ＳＬＣ４Ａ１、ＳＬＣ６Ａ４、ＳＭＣＲ、ＳＯＳＴ、ＳＯＸ９、ＳＳＴＲ２、ＳＹＭ１、ＳＹＮＳ１、ＴＣＦ２、ＴＨＲＡ、ＴＩＭＰ２、ＴＯＣ、ＴＯＰ２Ａ、ＴＰ５３、ＴＲＩＭ３７、ＶＢＣＨ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＢＣＬ２、ＣＮＳＮ、ＣＯＲＤ１、ＣＹＢ５、ＤＣＣ、Ｆ５Ｆ８Ｄ、ＦＥＣＨ、ＰＥＯ、ＬＡＭＡ３、ＬＣＦＳ２、ＭＡＤＨ４、ＭＡＦＤ１、ＭＣ２Ｒ、ＭＣＬ、ＭＹＰ２、ＮＰＣ１、ＳＰＰＫ、ＴＧＦＢＲＥ、ＴＧＩＦ、ＴＴＲ、ＡＤ２、ＡＭＨ、ＡＰＯＣ２、ＡＰＯＥ、ＡＴＨＳ、ＢＡＸ、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＬ３、ＢＦＩＣ、Ｃ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＣＣＯ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＯＭＰ、ＣＲＸ、ＤＢＡ、ＤＤＵ、ＤＦＮＡ４、ＤＬＬ３、ＤＭ１、ＤＭＷＤ、Ｅ１１Ｓ、ＥＬＡ２、ＥＰＯＲ、ＥＲＣＣ２、ＥＴＦＢ、ＥＸＴ３、ＥＹＣＬ１、ＦＴＬ、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ６、ＧＡＭＴ、ＧＣＤＨ、ＧＰＩ、ＧＵＳＭ、ＨＢ１、ＨＣＬ１、ＨＨＣ２、ＨＨＣ３、ＩＣＡＭ３、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ３、ＫＬＫ３、ＬＤＬＲ、ＬＨＢ、ＬＩＧ１、ＬＯＨ１９ＣＲ１、ＬＹＬ１、ＭＡＮ２Ｂ１、ＭＣＯＬＮ１、ＭＤＲＶ、ＭＬＬＴ１、ＮＯＴＣＨ３、ＮＰＨＳ１、ＯＦＣ３、ＯＰＡ３、ＰＥＰＤ、ＰＲＰＦ３１、ＰＲＴＮ３、ＰＲＸ、ＰＳＧ１、ＰＶＲ、ＲＹＲ１、ＳＬＣ５Ａ５、ＳＬＣ７Ａ９、ＳＴＫ１１、ＴＢＸＡ２Ｒ、ＴＧＦＢ１、ＴＮＮＩ３、ＴＹＲＯＢＰ、ＡＤＡ、ＡＨＣＹ、ＡＶＰ、ＣＤＡＮ２、ＣＤＰＤ１、ＣＨＥＤ１、ＣＨＥＤ２、ＣＨＲＮＡ４、ＣＳＴ３、ＥＤＮ３、ＥＥＧＶ１、ＦＴＬＬ１、ＧＤＦ５、ＧＮＡＳ、ＧＳＳ、ＨＮＦ４Ａ、ＪＡＧ１、ＫＣＮＱ２、ＭＫＫＳ、ＮＢＩＡ１、ＰＣＫ１、ＰＩ３、ＰＰＣＤ、ＰＰＧＢ、ＰＲＮＰ、ＴＨＢＤ、ＴＯＰ１、ＡＩＲＥ、ＡＰＰ、ＣＢＳ、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＳＴＢ、ＤＣＲ、ＤＳＣＲ１、ＦＰＤＭＭ、ＨＬＣＳ、ＨＰＥ１、ＩＴＧＢ２、ＫＣＮＥ１、ＫＮＯ、ＰＲＳＳ７、ＲＵＮＸ１、ＳＯＤ１、ＴＡＭ、ＡＤＳＬ、ＡＲＳＡ、ＢＣＲ、ＣＥＣＲ、ＣＨＥＫ２、ＣＯＭＴ、ＣＲＹＢＢ２、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＴＨＭ、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｄ７Ｐ１、ＤＧＣＲ、ＤＩＡ１、ＥＷＳＲ１、ＧＧＴ１、ＭＧＣＲ、ＭＮ１、ＮＡＧＡ、ＮＦ２、ＯＧＳ２、ＰＤＧＦＢ、ＰＰＡＲＡ、ＰＲＯＤＨ、ＳＣＯ２、ＳＣＺＤ４、ＳＥＲＰＩＮＤ１、ＳＬＣ５Ａ１、ＳＯＸ１０、ＴＣＮ２、ＴＩＭＰ３、ＴＳＴ、ＶＣＦ、ＡＢＣＤ１、ＡＣＴＬ１、ＡＤＦＮ、ＡＧＭＸ２、ＡＨＤＳ、ＡＩＣ、ＡＩＥＤ、ＡＩＨ３、ＡＬＡＳ２、ＡＭＣＤ、ＡＭＥＬＸ、ＡＮＯＰ１、ＡＲ、ＡＲＡＦ１、ＡＲＳＣ２、ＡＲＳＥ、ＡＲＴＳ、ＡＲＸ、ＡＳＡＴ、ＡＳＳＰ５、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＲＸ、ＡＶＰＲ２、ＢＦＬＳ、ＢＧＮ、ＢＴＫ、ＢＺＸ、Ｃ１ＨＲ、ＣＡＣＮＡ１Ｆ、ＣＡＬＢ３、ＣＢＢＭ、ＣＣＴ、ＣＤＲ１、ＣＦＮＳ、ＣＧＦ１、ＣＨＭ、ＣＨＲ３９Ｃ、ＣＩＤＸ、ＣＬＡ２、ＣＬＣＮ５、ＣＬＳ、ＣＭＴＸ２、ＣＭＴＸ３、ＣＮＤ、ＣＯＤ１、ＣＯＤ２、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＰＸ、ＣＶＤ１、ＣＹＢＢ、ＤＣＸ、ＤＦＮ２、ＤＦＮ４、ＤＦＮ６、ＤＨＯＦ、ＤＩＡＰＨ２、ＤＫＣ１、ＤＭＤ、ＤＳＳ、ＤＹＴ３、ＥＢＭ、ＥＢＰ、ＥＤ１、ＥＬＫ１、ＥＭＤ、ＥＶＲ２、Ｆ８、Ｆ９、ＦＣＰ１、ＦＤＰＳＬ５、ＦＧＤ１、ＦＧＳ１、ＦＭＲ１、ＦＭＲ２、Ｇ６ＰＤ、ＧＡＢＲＡ３、ＧＡＴＡ１、ＧＤＩ１、ＧＤＸＹ、ＧＪＢ１、ＧＫ、ＧＬＡ、ＧＰＣ３、ＧＲＰＲ、ＧＴＤ、ＧＵＳＴ、ＨＭＳ１、ＨＰＲＴ１、ＨＰＴ、ＨＴＣ２、ＨＴＲ２Ｃ、ＨＹＲ、ＩＤＳ、ＩＨＧ１、ＩＬ２ＲＧ、ＩＮＤＸ、ＩＰ１、ＩＰ２、ＪＭＳ、ＫＡＬ１、ＫＦＳＤ、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＰ２、ＭＡＡ、ＭＡＦＤ２、ＭＡＯＡ、ＭＡＯＢ、ＭＣＦ２、ＭＣＳ、ＭＥＡＸ、ＭＥＣＰ２、ＭＦ４、ＭＧＣ１、ＭＩＣ５、ＭＩＤ１、ＭＬＬＴ７、ＭＬＳ、ＭＲＳＤ、ＭＲＸ１４、ＭＲＸ１、ＭＲＸ２０、ＭＲＸ２、ＭＲＸ３、ＭＲＸ４０、ＭＲＸＡ、ＭＳＤ、ＭＴＭ１、ＭＹＣＬ２、ＭＹＰ１、ＮＤＰ、ＮＨＳ、ＮＰＨＬ１、ＮＲ０Ｂ１、ＮＳＸ、ＮＹＳ１、ＮＹＸ、ＯＡ１、ＯＡＳＤ、ＯＣＲＬ、ＯＤＴ１、ＯＦＤ１、ＯＰＡ２、ＯＰＤ１、ＯＰＥＭ、ＯＰＮ１ＬＷ、ＯＰＮ１ＭＷ、ＯＴＣ、Ｐ３、ＰＤＨＡ１、ＰＤＲ、ＰＦＣ、ＰＦＫＦＢ１、ＰＧＫ１、ＰＧＫ１Ｐ１、ＰＧＳ、ＰＨＥＸ、ＰＨＫＡ１、ＰＨＫＡ２、ＰＨＰ、ＰＩＧＡ、ＰＬＰ１、ＰＯＦ１、ＰＯＬＡ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＰＭＸ、ＰＲＤ、ＰＲＰＳ１、ＰＲＰＳ２、ＰＲＳ、ＲＣＣＰ２、ＲＥＮＢＰ、ＲＥＮＳ１、ＲＰ２、ＲＰ６、ＲＰＧＲ、ＲＰＳ４Ｘ、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＲＳ１、Ｓ１１、ＳＤＹＳ、ＳＥＤＬ、ＳＥＲＰＩＮＡ７、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＨＦＭ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＳＭＡＸ２、ＳＲＰＸ、ＳＲＳ、ＳＴＳ、ＳＹＮ１、ＳＹＰ、ＴＡＦ１、ＴＡＺ、ＴＢＸ２２、ＴＤＤ、ＴＦＥ３、ＴＨＡＳ、ＴＨＣ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＩＭＰ１、ＴＫＣＲ、ＴＮＦＳＦ５、ＵＢＥ１、ＵＢＥ２Ａ、ＷＡＳ、ＷＳＮ、ＷＴＳ、ＷＷＳ、ＸＩＣ、ＸＩＳＴ、ＸＫ、ＸＭ、ＸＳ、ＺＦＸ、ＺＩＣ３、ＺＮＦ２６１、ＺＮＦ４１、ＺＮＦ６、ＡＭＥＬＹ、ＡＳＳＰ６、ＡＺＦ１、ＡＺＦ２、ＤＡＺ、ＧＣＹ、ＲＰＳ４Ｙ、ＳＭＣＹ、ＳＲＹ、ＺＦＹ、ＡＢＡＴ、ＡＥＺ、ＡＦＡ、ＡＦＤ１、ＡＳＡＨ１、ＡＳＤ１、ＡＳＭＴ、ＣＣＡＴ、ＣＥＣＲ９、ＣＥＰＡ、ＣＬＡ３、ＣＬＮ４、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＴＳ１、ＤＦ、ＤＩＨ１、ＤＷＳ、ＤＹＴ２、ＤＹＴ４、ＥＢＲ３、ＥＣＴ、ＥＥＦ１Ａ１Ｌ１４、ＥＹＣＬ２、ＦＡＮＣＢ、ＧＣＳＨ、ＧＣＳＬ、ＧＩＰ、ＧＴＳ、ＨＨＧ、ＨＭＩ、ＨＯＡＣ、ＨＯＫＰＰ２、ＨＲＰＴ１、ＨＳＤ３Ｂ３、ＨＴＣ１、ＨＶ１Ｓ、ＩＣＨＱ、ＩＣＲ１、ＩＣＲ５、ＩＬ３ＲＡ、ＫＡＬ２、ＫＭＳ、ＫＲＴ１８、ＫＳＳ、ＬＣＡＴ、ＬＨＯＮ、ＬＩＭＭ、ＭＡＮＢＢ、ＭＣＰＨ２、ＭＥＢ、ＭＥＬＡＳ、ＭＩＣ２、ＭＰＦＤ、ＭＳ、ＭＳＳ、ＭＴＡＴＰ６、ＭＴＣＯ１、ＭＴＣＯ３、ＭＴＣＹＢ、ＭＴＮＤ１、ＭＴＮＤ２、ＭＴＮＤ４、ＭＴＮＤ５、ＭＴＮＤ６、ＭＴＲＮＲ１、ＭＴＲＮＲ２、ＭＴＴＥ、ＭＴＴＧ、ＭＴＴＩ、ＭＴＴＫ、ＭＴＴＬ１、ＭＴＴＬ２、ＭＴＴＮ、ＭＴＴＰ、ＭＴＴＳ１、ＮＡＭＳＤ、ＯＣＤ１、ＯＰＤ２、ＰＣＫ２、ＰＣＬＤ、ＰＣＯＳ１、ＰＦＫＭ、ＰＫＤ３、ＰＲＣＡ１、ＰＲＯ１、ＰＲＯＰ１、ＲＢＳ、ＲＦＸＡＰ、ＲＰ、ＳＨＯＸ、ＳＬＣ２５Ａ６、ＳＰＧ５Ｂ、ＳＴＯ、ＳＵＯＸ、ＴＨＭ、またはＴＴＤをコードするｍＲＮＡ分子の投与によって、代謝に関する他の先天的な障害を修正する。
【０３４３】
（実施例３０  ｉＮＯＳをコードする修飾されたｍＲＮＡ分子の身体組織への送達による血管攣縮の治療）
誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）をコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたＲＮＡを、血管攣縮動物モデル（例えば、くも膜下出血）の血管内皮に送達し、該疾患に及ぼすその効果を、Pradilla G, Wang PP, et al, Prevention of vasospasm by anti−CD11/CD18 monoclonal antibody therapy following subarachnoidhemorrhage in rabbits. J Neurosurg 2004;101(1): 88−92またはPark S, Yamaguchi M, et al, Neurovascular protection reduces earlybrain injury after subarachnoid hemorrhage. Stroke 2004;35(10): 2412−7において説明される通り評価する。ＲＮＡの投与は、該疾患を寛解させる。
【０３４４】
（実施例３１  免疫抑制性タンパク質をコードする修飾されたｍＲＮＡの送達による発毛の修復）
テロメラーゼまたは免疫抑制性タンパク質（例えば、α−ＭＳＨ、ＴＧＦ−β１、またはＩＧＦ−Ｉ）をコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたｍＲＮＡを、Jiang J, Tsuboi R, et al, Topical application of ketoconazolestimulates hair growth in C3H/HeN mice. J Dermatol 2005;32(4): 243−7またはMcElwee KJ, Freyschmidt−Paul P, et al, Transfer of CD8(+) cells induces localized hair losswhereas CD4(+)/CD25(−) cells promote systemic alopeciaareata and CD4(+)/CD25(+) cells blockade disease onset in the C3H/HeJ mousemodel. J Invest Dermatol2005;124(5): 947−57において説明される通り評価する。ＲＮＡ投与は、発毛を修復さ
せる。
【０３４５】
（実施例３２  ｓｉＲＮＡを含有する変化したヌクレオシドを有するインビトロで転写されるＲＮＡ分子の合成）
プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含みかつ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をさらに含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を、以下の手順によって合成する：ウリジンまたは１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含有する所望の配列と相補的なＲＮＡ鎖を、実施例５において説明される通り、インビトロでの転写によって（例えば、Ｔ７、ＳＰ６、またはＴ３ファージＲＮＡポリメラーゼによって）合成する。二本鎖ＲＮＡ分子は、免疫原性の低下を呈する。他の実験において、二本鎖ＲＮＡ分子を細胞酵素によって加工されるよう設計し、所望のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを生じる。数百のヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ分子は容易に合成されるので、また、各二本鎖ＲＮＡは、いくつかのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含有して、複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの単一の標的細胞への送達を容易にするように設計され得る。
【０３４６】
（実施例３３  ｓｉＲＮＡを送達するための変化したヌクレオシドを有するインビトロで転写されるＲＮＡ分子の使用）
先行実施例の二本鎖ＲＮＡ分子を、形質移入試薬（例えば、陽イオン性形質移入試薬、脂質系形質移入試薬、タンパク質系形質移入試薬、ポリエチレンイミン系形質移入試薬、またはリン酸カルシウム）と複合体形成させ、関心対象の標的細胞に送達する。標的細胞の表面中のまたは表面上の酵素は、二本鎖ＲＮＡを所望のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子（いずれも複数可）に分解する。本方法は、ｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列（いずれも複数可）に対応する１つ以上の細胞遺伝子の転写を効果的に停止させる。
【０３４７】
（実施例３４  ＲＮＡ免疫原性および翻訳効率に及ぼす追加的なヌクレオシド修飾の効果の試験）
追加のヌクレオシド修飾を、実施例５および１０において先に説明された方法を用いて、インビトロで転写されるＲＮＡへと導入し、免疫原性翻訳効率に及ぼすその効果を、実施例４〜１１および１２〜１８においてそれぞれ説明される通り試験する。ある追加的な修飾は、免疫原性を低下させ、翻訳を亢進することが見いだされている。これらの修飾は、本発明の方法および組成物の追加的な実施態様である。
【０３４８】
試験される修飾には、例えば、ｍｌＡ、ｍ２Ａ、Ａｍ、ｍｓ２ｍ６Ａ、ｉ６Ａ、ｍｓ２ｉ６Ａ、ｉｏ６Ａ、ｍｓ２ｉ０６Ａ、ｇ６Ａ、ｔ６Ａ、ｍｓ２ｔ６Ａ、ｍ６ｔ６Ａ、ｈｎ６Ａ、ｍｓ２ｈｎ６Ａ、Ａｒ（ｐ）、Ｉ、ｍ１Ｉ、ｍｌＩｍ、ｍ３Ｃ、Ｃｍ、Ｓ２Ｃ、ａｃ４Ｃ、ｆ５ｃ、ｍ５Ｃｍ、ａｃ４Ｃｍ、ｋ２ｃ、ｍ１Ｇ、ｍ２Ｇ、ｍ７Ｇ、Ｇｍ、ｍ２２Ｇ、ｍ２Ｇｍ、ｍ２２Ｇｍ、Ｇｒ（ｐ）、ｙＷ、ｏ２ｙＷ、ＯＨｙＷ、ＯＨｙＷ＊、ｉｍＧ、ｍｉｍＧ、Ｑ、ｏＱ、ｇａｌＱ、ｍａｎＱ、ｐｒｅＱ０、ｐｒｅＱ１、Ｇ＋、Ｄ、ｍ５Ｕｍ’，ｍ１Ψ、Ψｍ、Ｓ４Ｕ、・ｍ５ｓ２Ｕ’、Ｓ２Ｕｍ、’ａｃｐ３Ｕ・、ｈｏ５ｕ．、ｍｏ５Ｕ・、ｃｍｏ５Ｕ・、ｍｃｍｏ５Ｕ、ｃｈｍ５Ｕ、ｍｃｈｍ５Ｕ・、ｍｃｍ５Ｕ、ｍｃｍ５Ｕｍ、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ、ｎｍ５ｓ２Ｕ、ｍｎｍ５Ｕ、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ、ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ、ｎｃｍ５Ｕ、ｎｃｍ５Ｕｍ、ｃｍｎｍ５Ｕ、ｃｍｎｍ５Ｕｍ、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ、ｍ６２Ａ、Ｉｍ、ｍ４Ｃ、ｍ４Ｃｍ、ｈｍ５Ｃ、ｍ３Ｕ、ｍ１ａｃｐ３Ψ、ｃｍ５Ｕ、ｍ６Ａｍ、ｍ６２Ａｍ、ｍ２，７Ｇ、ｍ２，２，７Ｇ、ｍ３Ｕｍ、ｍ５Ｄ、ｍ３Ψ、ｆ５Ｃｍ、ｍｌＧｍ、ｍｌＡｍ、τｍ５Ｕ、τｍ５ｓ２Ｕ、ｉｍＧ−１４、ｉｍＧ２、およびａｃ６Ａが含まれる。
【０３４９】
（実施例３５〜３８についての材料および方法）
（ＲＮＡのＨＰＬＣ精製）：Ｔ７ポリメラーゼ転写によって製造されるｍＲＮＡを、アルキル化非多孔性ポリスチレン−ジビニルベンゼン（ＰＳ−ＤＶＢ）コポリマーミクロスフェア（２．１μｍ）（２１ｍｍ×１００ｍｍカラム）のカラムマトリックス、およびアセトニトリル勾配を有する酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）の緩衝液系を用いるＨＰＬＣによって精製した。緩衝液Ａは、０．１ＭのＴＥＡＡを含有し、緩衝液Ｂは、０．１ＭのＴＥＡＡおよび２５％アセトニトリルを含有した。カラムを緩衝液Ａ中の３８％緩衝液Ｂで平衡化し、ＲＮＡを負荷し、次に５５％緩衝液Ｂまでの線形勾配を用いて５ｍＬ／分で３０分間にわたって流した。所望のピークに対応する画分を回収した。ＲＮＡ分析を同じカラムマトリックスおよび緩衝液系を用いて実施したが、１．０ｍＬ／分における７．８ｍｍ×５０ｍｍのカラムおよび２５分間の勾配時間を用いた。
【０３５０】
（カラム画分からのＲＮＡ単離）：回収された画分を組み合わせ、第一のこれらのＲＮＡ含有量を、３０Ｋメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルターユニットを用いて濃縮した。フィルター装置に１５ｍＬ試料を充填し、スウィングバケット回転機を用いるＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ１６Ｒ遠心分離機において、４，０００×ｇで１０分間（４℃）回転させた。これらの条件下で、約９８％の溶媒容積を除去することができる。回収された画分は１５ｍＬ超の容積を有すると、フィルターユニットを、追加的なカラム画分で充填し、ＲＮＡがすべて１本のチューブに収まるまで、再度遠心分離することによって再利用した。濃縮されたＲＮＡから塩および溶媒を除去するために、ヌクレアーゼ非含有水を添加し（最大１５ｍＬ）、フィルター装置を再度回転させた。「洗浄する」過程を、アセトニトリルの濃度が０．００１％未満になるまで反復した。脱塩した無溶媒試料をフィルター装置から取り出し、ＲＮＡをＮａＯＡｃ（０．３Ｍ、ｐＨ５．５）、イソプロパノール（１容積）、およびグリコーゲン（３μＬ）において−２０℃で一晩沈殿させることによって回収した。沈殿したＲＮＡを回収し、氷冷７５％エタノールで２回洗浄し、水中で再構成した。
【０３５１】
（二本鎖ＲＮＡドットブロット）：ＲＮＡ（２５〜１００ｎｇ）をニトロセルロースメンブレンにブロットし、乾燥させておき、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）を補充したＴＢＳ緩衝液における５％無脂肪乾燥乳でブロッキングし、二本鎖ＲＮＡ特異的ｍＡｂ  Ｊ２またはＫ１（Ｅｎｇｌｉｓｈ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ）とともに６０分間インキュベートした。メンブレンをＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、ＨＲＰ抱合型ロバ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）と反応させた。６回洗浄した後、二本鎖ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ
Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加により検出し、画像をＦｕｊｉｆｉｌｍ  ＬＡＳ１０００デジタル画像化システムにおいて３０秒間〜２分間捕捉した。
【０３５２】
（樹状細胞の作製）：単球フェレーシス試料を、ＩＲＢ認可のプロトコールを通じて正常なボランティアから得た。ＡＩＭ  Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において単球をＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍＬ）で７日間処置することによって、ヒトＤＣを製造した。３日後および６日後に、サイトカインを有する５０％容積の新鮮培地を添加した。
【０３５３】
マウスＤＣを、Ｂａｌｂ／ｃマウスから骨髄単核細胞を単離し、マウスＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ培地において培養することによって作製した。３日後および６日後に、ＧＭ−ＣＳＦを有する５０％容積の新鮮培地を添加した。非接着性細胞を培養７日後に用いた。
【０３５４】
（ＲＮＡのリポフェクチン複合体形成）：ストックリン酸緩衝液を無血清ＤＭＥＭに添加し、２０ｍＭリン酸カリウムおよび１００ｎｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ６．４の終濃度を与えた。９６ウェルプレートのうちの３ウェルについては、リポフェクチンと複合体形成したＲＮＡを以下の比で調製した：２．４μＬのリポフェクチンを、リン酸緩衝液を有する２１．３μＬの無血清ＤＭＥＭ培地に添加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、９．９μＬの無血清ＤＭＥＭにおける０．７５μｇのＲＮＡを添加し、混合物を室温でさらに１０分間インキュベートした。最後に、１１６．４ｍＬの無血清ＤＭＥＭを添加して、最終容積を１５０ｍＬにした。混合物をボルテックスにかけた。
【０３５５】
（ＲＮＡのＴｒａｎｓＩＴ複合体形成）：９６ウェルプレートの各ウェルについて、０．２５μｇのＲＮＡを１７．３μＬの無血清ＤＭＥＭに氷上で添加した。ＴｒａｎｓＩＴ
ｍＲＮＡ試薬（０．３μＬ）をボルテックスにかけながら添加した後、０．２μＬのｍＲＮＡ押し上げ（ｂｏｏｓｔ）試薬を添加し、ボルテックスにかけた。複合体形成したＲＮＡを形成の５分以内に添加した。
【０３５６】
（細胞の形質移入）：リポフェクチンと複合体形成したＲＮＡのために、５０μＬ（０．２５μｇＲＮＡ／ウェル）をウェルあたり５×１０５個の細胞に直接添加した。形質移入した細胞を５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で１時間インキュベートした。リポフェクチン−ＲＮＡ混合物を取り出し、２００μＬのあらかじめ加温しておいた血清含有培地と交換した。ＴｒａｎｓＩＴと複合体形成したＲＮＡについて、１７μＬの複合体を、２００μＬの血清含有培地におけるウェルあたり５×１０５個の細胞に添加した。形質移入の３〜２４時間後、細胞を特異的溶解培地において溶解し、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼ活性をルミノメーターにおいて特異的な基質を用いて測定した。
【０３５７】
（ＲＮＡ免疫原性分析）：９６ウェルプレートにおけるＤＣ（マウスまたはヒト）（５×１０５個／ウェル）を培地、またはリポフェクチンもしくはＴｒａｎｓＩＴと複合体形成したＲＮＡで処理した。上清を２４時間後に収集し、分析に供した。ＩＦＮ−α（ＴｒａｎｓＩＴにより送達されるＲＮＡ）またはＴＮＦ−α（リポフェクチンにより送達されるＲＮＡ）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）のレベルを、ＥＬＩＳＡによって上清中で測定した。培養を三つ組ないし四つ組で実施し、二つ組で測定した。
【０３５８】
（実施例３５）
本実施例は、Ψ、ｍ５Ｃ、およびΨ／ｍ５Ｃにより修飾されたｍＲＮＡの配列および翻訳の細胞種類依存性を、修飾されていない（Ｕ）ＲＮＡに対して検討する。示された修飾を有する、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを、リポフェクチンと複合体形成させ、マウス樹状細胞（Ａ）およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｂ）に送達した。ヒトＤＣに、ＴｒａｎｓＩＴと複合体形成した示された修飾を有する、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを形質移入した（Ｃ）。データは、ＲＮＡの配列および該ＲＮＡを翻訳する細胞の種類に応じて、最適な修飾が変動することを示す。該データは、修飾されたヌクレオシドの組み込みによって生じた亢進が、形質移入された細胞株と比較して一次細胞について実質的に大きいことも示す。溶解した細胞における酵素活性を、特異的な基質および生じた光の測定をルミノメーターにおいて用いて測定し、修飾されていない（Ｕ）ＲＮＡと比較した倍数増加として表した。
【０３５９】
（実施例３６）
ｍＲＮＡの作製に用いられるファージポリメラーゼ転写反応は、正確な大きさの多量のＲＮＡを結果的に生じるが、夾雑物も含有する。このことは、ＲＮＡを変性条件下で大きさに基づいて分離する逆相ＨＰＬＣカラムにＲＮＡを適用することによって可視化される。Ｙ修飾されたＴＥＶ−ルシフェラーゼ−Ａ５１  ＲＮＡをＨＰＬＣカラムに、３８％緩衝液Ｂにおいて適用し、緩衝液Ｂを５５％まで増大させる線形勾配に供した。特性は、期待されるよりも小さく、かつ予期される夾雑物よりも大きいことを示した。これらの結果を図２２に示す。
【０３６０】
（実施例３７）
ＨＰＬＣ精製は、すべての種類の修飾されたまたは修飾されていないＲＮＡの翻訳を増加させるが、Ψ修飾されたｍＲＮＡは最良に翻訳される。本結果を図２３に示す：（Ａ）示された修飾を有しかつＨＰＬＣ精製を伴うまたは伴わない、ＥＰＯをコードするｍＲＮＡを、マウスＤＣに送達し、上清中のＥＰＯレベルを２４時間後に測定した。ｍ５Ｃ／Ｙ修飾されたｍＲＮＡは、ＨＰＬＣ精製の前に最高レベルの翻訳を有していたが、Ψ修飾されたｍＲＮＡは、ＨＰＬＣ精製後に最高の翻訳レベルを有していた。（Ｂ）ヒトＤＣに、ＨＰＬＣ精製を伴うまたは伴わない、示された修飾を有する、ウミシイタケをコードするｍＲＮＡを形質移入した。マウスＤＣおよびＥＰＯｍＲＮＡと同様に、ＨＰＬＣ精製後に、Ｙ修飾されたｍＲＮＡは、最高レベルの翻訳を有していた。
【０３６１】
（実施例３８）
Ψ、ｍ５Ｃ、およびΨ／ｍ５Ｃ修飾されたｍＲＮＡは、ＨＰＬＣ精製を伴う対照レベルまで低下する低レベルの免疫原性を有する。本結果を図２４に示す：（Ａ）ヒトＤＣに、ＨＰＬＣ精製を伴うまたは伴わない、示された修飾を有するＴｒａｎｓＩＴと複合体形成したＲＮＡを形質移入した。ＩＦＮ−αレベルを２４時間後に測定した。ＨＰＬＣ精製は、修飾されていないＲＮＡの免疫原性を高め、このことは、他の修飾されていないＲＮＡが、類似のレベルのＩＦＮ−αまたは低下したレベルを有していたので、該配列に依存している。Ψ修飾されたＲＮＡは、対照処置されたＤＣと類似の、測定不可能なレベルのＩＦＮ−αを有していた。（Ｂ）ＨＰＬＣ精製前（−）および後のΨ修飾されたＲＮＡ（Ｐ１およびＰ２）を、二本鎖ＲＮＡに特異的なモノクローナル抗体によるドットブロット法を用いて、二本鎖ＲＮＡについて分析した（Ｊ２）。ＲＮＡの精製は、二本鎖ＲＮＡの夾雑物を除去した。（Ｃ）ｉＰＳ因子をコードするΨ修飾されたＲＮＡは、免疫原性であり、ＲＮＡのＨＰＬＣ精製によって除去される。
【０３６２】
（実施例３９〜４１についての材料および方法）
（細胞培養）新生児ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ケラチノサイト増殖栄養補助剤およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＥｐｉＬｉｆｅ培地において培養した。すべての細胞を３７℃および５％ＣＯ２において増殖させた。本明細書に説明される方法を用いて誘導されるヒトｉＰＳ細胞を、ｈＥＳＣ限定マトリゲルマトリックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で被覆した６ウェルプレートに、形質移入後に転移させた。
【０３６３】
（ベクターの構築）一般的に実施例１〜３と同じ。
【０３６４】
（ｍＲＮＡの製造）一般的に実施例１〜３と同じ。
【０３６５】
（ｍＲＮＡ精製および分析）いくつかの実験的実施態様において、ｍＲＮＡをＨＰＬＣによって精製し、カラム画分を回収し、ｍＲＮＡ画分を「実施例３５〜３８についての材料および方法」において説明されるように、ならびに／または図２２〜図２４について説明されおよび示されるように、免疫原性の純度について分析した。いくつかの好ましい実験的実施態様において、免疫原性をほとんどまたは全く呈さない１つ以上の再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを含むかまたはそれからなる精製されたＲＮＡ調製物を、ヒト体細胞をｉＰＳ細胞に再プログラム化するための実験に用いた。
【０３６６】
（一次ケラチノサイトの再プログラム化）ＨＥＫｎ細胞を、ＥｐｉＬｉｆｅ培地において６ウェル皿の１×１０５個／ウェルで播種し、一晩増殖させた。細胞に等量の各プログラム化因子ｍＲＮＡ（ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）、または該因子のサブセットを、ＴｒａｎｓＩＴ（商標）ｍＲＮＡ形質移入試薬（ＭｉｒｕｓＢｉｏ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いて形質移入した。３回の形質移入を１日おきに、培地交換を毎日実施した。第三の形質移入の翌日、細胞をトリプシン処理し、マトリゲルで被覆した６ウェルプレートへと、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において播種した。ｍＴｅＳＲ細胞培地を毎日交換した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で維持した。プレートを、倒立顕微鏡を用いて形態変化についてスクリーニングした。
【０３６７】
ＨＥＮｎ細胞を、等量の各再プログラム化因子ｍＲＮＡを用いた電気穿孔法による単回の形質移入によっても再プログラム化した。細胞を、マトリゲルを被覆したプレートに、６ウェル皿あたり１×１０５個または１０ｃｍ皿あたり７．５×１０５個の密度で、毎日交換するｍＴｅＳＲ１培地において直接播種した。
【０３６８】
（免疫蛍光）一般的に実施例１〜３と同じ。
【０３６９】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ））細胞ＲＮＡを、標準的な方法および等量の細胞ＲＮＡ由来のオリゴｄ（Ｔ）２１プライマーを用いて逆転写した。３つのメッセージを遺伝子特異的プライマーならびに、ＳＹＢＲグリーン検出およびＧＡＰＤＨ標準化を用いるリアルタイムＰＣＲを用いて増幅した。発現レベルを、元のＨＥＫｎ細胞株における発現レベルに関して決定し、周期閾値（ＣＴ）レベルの変化として表した。
【０３７０】
（実施例３９）
本実施例は、体細胞ケラチノサイトからのｉＰＳ細胞の作製のためのプロトコールの開発を説明する。等量（重量による）のＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２のｍＲＮＡをＨＥＫｎ細胞に３回（１日おきに１回）、ＴｒａｎｓＩＴ（商標）ｍＲＮＡ試薬を用いて形質移入した。培地を毎日交換した。第三の形質移入の翌日、細胞をマトリゲルで被覆した皿に播種し、ＴｅＳＲ１細胞培地において増殖させた。第一の形質移入の１１日後までに、再プログラム化した細胞の形態が現れ始めた（図２８）。
【０３７１】
（実施例４０）
本実施例は、等量のＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２のｍＲＮＡを用いた一次ケラチノサイトの形質移入から結果として生じる細胞の特徴づけを説明する。１００万個のＨＥＫｎ細胞に５マイクログラムの各ｍＲＮＡを用いて１回電気穿孔し、ｍＴｅＳＲ１細胞培地においてマトリゲルで被覆した１０ｃｍ皿へ播種した。形質移入の１５日後、細胞を免疫蛍光分析のために固定した。結果として生じるコロニーは、ｉＰＳマーカーＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、およびＮＡＮＯＧについて陽性であった（図２９）。
【０３７２】
（実施例４１）
本実施例は、一次ケラチノサイトと等量のＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２のｍＲＮＡを用いて再プログラム化されたケラチノサイトの間の発現の差を説明する。７．５×１０５のＨＥＫｎ細胞に３または５マイクログラムの各ｍＲＮＡを１回電気穿孔し、マトリゲルで被覆した１０ｃｍ皿にｍＴｅＳＲ１培地中で播種した。培地を毎日交換した。形質移入の１３日後、細胞を新鮮に被覆したマトリゲルプレートに転移させた。形質移入の２１日後、全細胞ＲＮＡを、形質移入していないＨＥＫｎ細胞および２のウェルの再プログラム化された細胞から精製した。等量の各細胞ｒＮＡをｃＤＮＡに変換し、ｑＰＣＲによって分析した。増加したレベルのＮＡＮＯＧ、ＣＲＩＰＴＯ、およびＲＥＸ１を、メッセージ特異的プライマーを用いるｑＰＣＲによって検出した（図３０）。これら３つのメッセージは、ｉＰＳ細胞において上昇することが示されている（Aasen T etal. 2008. Nature Biotech 26: 1276）。これらの因子のいずれも、形質移入によって細胞に導入されず、それゆえ、発現の変化は、導入された再プログラム化因子の影響による。
【０３７３】
（実施例４２  ｍＲＮＡを用いた細胞の分化転換）
細胞は、本明細書に説明された精製されたｍＲＮＡ調製物、または本明細書に説明された修飾されたｍＲＮＡ、または本明細書に説明された修飾されたｍＲＮＡを含有する精製されたｍＲＮＡ調製物を用いて分化転換することができる。本実施例において、少なくとも１つのプソイドウリジンまたは１つの５−メチルシチジンを有するＯＣＴ４ｍＲＮＡを含有する精製されたＲＮＡ調製物を採用する。このような精製されたかつ修飾されたＯＣＴ４ｍＲＮＡを、Szabo et al.(Nature 468: 521−528, 2010,  本明細書で完全に示されたかのようにそのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれる）およびRacila et al.(Gene Therapy, 1−10, 2010,  本明細書で完全に示されたかのようにそのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれる）によって説明されるプロトコールにおけるＯＣＴ４をコードするベクターと置き換える。これらの方法の各々の一実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、ＯＣＴ４ｍＲＮＡを含むかまたはそれからなり、この中で、ウリジンヌクレオシドはすべて、プソイドウリジンヌクレオシドによって置き換えられる。これらの方法の各々の一実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、ＯＣＴ４ｍＲＮＡを含むかまたはそれからなり、この中で、シチジンヌクレオシドはすべて、５−メチルシチジンヌクレオシドによって置き換えられる。これらの方法の各々の一実施態様において、精製されたＲＮＡ調製物は、ＯＣＴ４ｍＲＮＡを含むかまたはそれからなり、この中で、ウリジンヌクレオシドはすべてプソイドウリジンヌクレオシドによって置き換えられ、シチジンヌクレオシドはすべて、５−メチルシチジンヌクレオシドによって置き換えられる。好ましい実施態様において、夾雑しているＲＮＡがないようＯＣＴ４ｍＲＮＡを精製する。Ｒａｃｉｌｌａらの参考文献は、ヒトケラチノサイトが、代替的な分化経路に再度向けられることによって分化転換したシステムを説明する。特に、ヒト皮膚ケラチノサイトの転写因子ＯＣＴ４による一過性の形質移入を採用した。２日後、これらの形質移入した細胞は、内在性胚性遺伝子の発現を示し、ゲノムメチル化の低下を示した。このような細胞をニューロン細胞種類および収縮性間葉系細胞種類へと変換することができることが示された。
【０３７４】
Ｓｚａｂｏらの参考文献は、多能性を確立することなくヒト皮膚線維芽細胞から直接、造血の運命にある前駆細胞および成熟細胞を作製する能力を示した。特に、ＯＣＴ４により活性化される造血転写因子の異所性発現は、特異的サイトカイン処理とともに、全白血球マーカーＣＤ４５を発現する細胞の発生を可能にした。これらの独特な線維芽細胞由来の細胞は、顆粒球性、単球性、巨核球性、および赤血球系の系列を生じ、インビボでの生着能力を示した。
【０３７５】
ＯＣＴ４の使用のほかに、また、これらのプロトコールは両方とも、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）など、サイトカインまたは増殖因子を採用した。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、エリスロポエチン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦＩＩ）、および骨誘導因子４（ＢＭＰ−４）など、他の増殖因子およびサイトカインを用いることができた。そういうものとして、ある実施態様において、ＲａｃｉｌｌａらまたはＳｚａｂｏらのプロトコールは、先に列挙された増殖因子またはサイトカインの使用とともに、修飾されたＯＣＴ４ｍＲＮＡ（例えば、プソイドウリジンにより修飾されたおよび／または５−メチルシチジンにより修飾された）の置換を用いて反復される。いくつかの実施態様において、該細胞を、使用されるサイトカインおよび／または増殖因子タンパク質と接触させる。いくつかの他の実施態様において、細胞を、分化転換プロトコールにおいて用いられるサイトカインおよび／または増殖因子のうちの１つ以上をコードする修飾されたｍＲＮＡ（例えば、本出願において説明されるような修飾されたｍＲＮＡ、例えば、プソイドウリジンにより修飾されたおよび／または５−メチルシチジンにより修飾されたもの）と接触させる。本明細書から、本発明には、第一の状態の分化または表現型から第二の状態の分化または表現型を有する細胞へと分化転換するために、ヒトまたは動物の細胞を、再プログラム化因子をコードするｍＲＮＡを含むかまたはそれからなる精製されたＲＮＡ調製物と接触させることが含まれることは明確である。
【０３７６】
（付記事項）
なお、以下の（１）および（２）の発明も、本願発明の範疇である。
【０３７７】
（１）ヒトまたは他の哺乳類の体細胞を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣ）へと、再プログラム化するためのインビトロの方法であって、
ヒトまたは他の哺乳類の体細胞に、精製されたＲＮＡ調製物を導入することを包含し、
前記ＲＮＡ調製物は、Ａ）インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子と、Ｂ）形質移入試薬とを含み、
Ａ）前記インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子は、
１）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣ、
２）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ及びＬＩＮ２８、
３）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ及びＮＡＮＯＧ、又は
４）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ
であるｉＰＳＣ誘導因子であって、前記Ａ）〜Ｄ）における前記ＭＹＣが、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、およびＮ−ＭＹＣから選択されるｉＰＳＣ誘導因子をコードしており、
前記ＲＮＡ調製物を複数日において前記体細胞に反復して導入し、当該体細胞を培養状態及び培地において維持し、前記体細胞は生存可能であり、かつ、前記体細胞に導入される前記ｍＲＮＡ分子は、前記導入後に、ｉＰＳ細胞の形態特性及びマーカーの特性の発現を有し、かつ培地中で生存するｉＰＳ細胞群が生成されるように発現し、
前記インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子は、
（ａ）以下を含んでおり、
（ｉ）グアノシン；
（ｉｉ）アデノシン；
（ｉｉｉ）シチジン；
（ｉｖ）対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、さらに修飾されていないプソイドウリジン（Ψ）、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、および対応する修飾されていないヌクレオシドウリジンの少なくとも一部分の代わりに、２−チオウリジン（Ｓ２Ｕ）、および対応する修飾されていないヌクレオシドシチジンの少なくとも一部分の代わりに、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）からなる群から選択される、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド；
（ｖ）５’キャップ；及び
（ｖｉ）３’ポリ（Ａ）末端、かつ、
（ｂ）生得的免疫応答を誘導することによる前記体細胞に対する免疫原性および毒性のＲＮＡ夾雑物分子を取り除く少なくとも１つの精製工程を用いて精製されており、
前記精製されたＲＮＡ調製物が、前記体細胞に対する生得的免疫応答を誘導することによる前記体細胞に対する免疫原性および毒性ではないことは、前記精製されたＲＮＡ調製物で形質移入されたヒトまたはネズミ単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）によるＩＮＦ−αサイトカインまたはＴＮＦ−αサイトカインの分泌量が増加しないこと、すなわち、前記インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子を含まないネガティブコントロールで形質移入されたＭＤＤＣによるＩＮＦ−αサイトカインまたはＴＮＦ−αサイトカイン分泌量の平均＋標準誤差（ＳＥＭ）よりもＩＮＦ−αサイトカインまたはＴＮＦ−αサイトカインの分泌量が増加しない点で優れていることを測定する、インビトロＭＤＤＣ免疫原性分析を用いて決定することが可能である、方法であって、
前記精製工程は、
以下のａ）ならびにｂ）
ａ）ＨＰＬＣまたは重力フローカラム精製を用いた前記ｍＲＮＡ分子の精製：ならびに
ｂ）短鎖のＲＮａｓｅＩＩＩ消化産物が生成されるように、リボヌクレアーゼＩＩＩ（ＲＮａｓｅＩＩＩ）酵素を用いて前記ｍＲＮＡ分子を処理すること、および前記ｍＲＮＡ分子から、前記短鎖のＲＮａｓｅＩＩＩ消化産物を除去すること
からなる群から選択される少なくとも一つの方法を包含している、方法。
【０３７８】
（２）ヒトまたは他の哺乳類の体細胞を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣ）へと、再プログラム化するためのインビトロの方法であって、
ヒトまたは他の哺乳類の体細胞に、精製されたＲＮＡ調製物を導入することを包含し、
前記ＲＮＡ調製物は、Ａ）インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子と、Ｂ）形質移入試薬とを含み、
Ａ）前記インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子は、
１）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣ、
２）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ及びＬＩＮ２８、
３）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ及びＮＡＮＯＧ、又は
４）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ
であるｉＰＳＣ誘導因子であって、前記Ａ）〜Ｄ）における前記ＭＹＣが、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、およびＮ−ＭＹＣから選択されるｉＰＳＣ誘導因子をコードしており、
前記ＲＮＡ調製物を複数日において前記体細胞に反復して導入し、当該体細胞を培養状態及び培地において維持し、前記体細胞は生存可能であり、かつ、前記体細胞に導入される前記ｍＲＮＡ分子は、前記導入後に、ｉＰＳ細胞の形態特性及びマーカーの特性の発現を有し、かつ培地中で生存するｉＰＳ細胞群が生成されるように発現し、
前記インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子は、
（ａ）以下を含んでおり、
（ｉ）グアノシン；
（ｉｉ）アデノシン；
（ｉｉｉ）シチジン；
（ｉｖ）対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、さらに修飾されていないプソイドウリジン（Ψ）、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、および対応する修飾されていないヌクレオシドウリジンの少なくとも一部分の代わりに、２−チオウリジン（Ｓ２Ｕ）、および対応する修飾されていないヌクレオシドシチジンの少なくとも一部分の代わりに、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）からなる群から選択される、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド；
（ｖ）５’キャップ；及び
（ｖｉ）３’ポリ（Ａ）末端、かつ、
（ｂ）生得的免疫応答を誘導することによる前記体細胞に対する免疫原性および毒性のＲＮＡ夾雑物分子を取り除く少なくとも１つの精製工程を用いて精製されており、
前記精製されたＲＮＡ調製物が、前記体細胞に対する生得的免疫応答を誘導することによる前記体細胞に対する免疫原性および毒性ではないことは、前記精製されたＲＮＡ調製物で形質移入されたヒトまたはネズミ単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）によるＩＮＦ−αサイトカインまたはＴＮＦ−αサイトカインの分泌量が増加しないこと、すなわち、前記インビトロで合成されたｍＲＮＡ分子を含まないネガティブコントロールで形質移入されたＭＤＤＣによるＩＮＦ−αサイトカインまたはＴＮＦ−αサイトカイン分泌量の平均＋標準誤差（ＳＥＭ）よりもＩＮＦ−αサイトカインまたはＴＮＦ−αサイトカインの分泌量が増加しない点で優れていることを測定する、インビトロＭＤＤＣ免疫原性分析を用いて決定することが可能である、方法であって、
前記インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子は、実質的にすべての、対応する修飾されていないシチジンヌクレオシドの代わりに、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）修飾されたヌクレオシドを含んでいる、方法。
【０３７９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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