(57)【要約】【課題】ポリペプチドの製造に適している核酸構築物、およびその利用を提供すること【解決手段】ヒトサイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルスからなる群から選択されるウイルスのプロモータ領域に由来する発現制御配列と、牛白血病ウイルスのロングターミナルリピートに由来する配列と、を含む、動物細胞内での遺伝子発現用の核酸構築物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からなる群から選択されるウイルスのプロモータ領域に由来する発現制御配列と、
上記発現制御配列の下流側に正方向に配置される、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）に由来する配列と、を含む、
動物細胞内での遺伝子発現用の核酸構築物。
【請求項２】
ＬＴＲに由来する上記配列は、Ｕ３領域の少なくとも一部を欠損している、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
上記発現制御配列が、ＣＭＶのプロモータ領域に由来する、請求項１又は２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
上記発現制御配列は、プロモータおよび／またはエンハンサを含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の核酸構築物。
【請求項５】
上記発現制御配列は、プロモータおよびエンハンサを含む、請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項６】
ＬＴＲに由来する上記配列の下流側に、ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の核酸構築物。
【請求項７】
ＬＴＲに由来する上記配列と、ポリペプチドをコードする上記核酸配列とで、ＢＬＶの５’ＬＴＲから３’ＬＴＲまでの核酸配列の全長またはその部分に相当する配列を構成している、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
ＢＬＶの５’ＬＴＲから３’ＬＴＲまでの核酸配列の上記部分は、少なくともＧａｇポリペプチドをコードする、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一項に記載の核酸構築物を含む、動物細胞。
【請求項１０】
請求項６〜８の何れか一項に記載の核酸構築物を発現させる工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
上記ポリペプチドとして、ウイルス粒子またはウイルス様粒子を構成するポリペプチドを製造することで、ウイルス粒子またはウイルス様粒子を製造する、請求項１０に記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現用の核酸構築物、およびその利用に関し、本発明の一態様では、特にポリペプチドの製造に適している核酸構築物、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子を発現させることによって目的ポリペプチドを製造する技術は、学術研究の分野のみならず、産業界においても広く普及している。特に産業界においては、ペプチドワクチンを含むペプチド医薬品の製造に際して、目的ポリペプチドをより効率的かつ大量に得る様々な手法が検討されている。
【０００３】
目的ポリペプチドの中には、遺伝子を発現させることによって比較的容易に大量製造できるものと、大量製造が困難なものとが存在する。大量製造が困難な目的ポリペプチドの一例としては、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）が挙げられる。
【０００４】
ＢＬＶは、悪性Ｂリンパ腫である地方病性牛白血病（ＥＢＬ）を引き起こすレトロウイルスである。ＢＬＶ感染牛は、長い潜伏期間（５〜１０年）の後に、その約５％が白血病を発症して死に至る。有効な予防法および根治療法はなく、国内外で感染率および発症率が増加しており、畜産界への打撃が懸念されている。現在の対処法は、隔離または淘汰であるが、拡大を防ぐに至っていない。そのため、ペプチドワクチン等の医薬品による予防法および治療法の確立が急がれている。
【０００５】
ＢＬＶは、そのプロウイルスの５’末端側および３’末端側にロングターミナルリピート（ＬＴＲ）を有しており、各ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域から構成される。ＢＬＶプロウイルスのｍＲＮＡへの転写は５’ＬＴＲのＵ３とＲ領域の境界から開始される。これらのＬＴＲは、ＢＬＶによる増殖感染している細胞においてのみ、効率的な転写プロモータ活性を発揮する（非特許文献１）。ＢＬＶは、宿主ゲノムの様々な部位に組み込まれ得るが、腫瘍化細胞においてはＢＬＶ遺伝子の転写は必須ではないと思われる（非特許文献２）。実際に、感染個体からの新しい腫瘍細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＢＬＶゲノムの転写は、従来技術によってほとんど検出不可能である（非特許文献２、３）。
【０００６】
以上に一端を示すように、ＢＬＶゲノムの転写制御には複雑な機構が働いているため、細胞においてＢＬＶゲノムの転写を活性化して、ＢＬＶウイルス粒子を効率的に製造することは容易ではない。
【０００７】
そのため、例えば、特許文献１等に記載のように、Ｔ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープとなり得るＢＬＶ由来の部分ペプチドを特定し、この部分ペプチドを用いてペプチド医薬品を製造する試みもなされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１４／１５７５９５（２０１４年１０月２日公開）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Gillet N, Florins A, Boxus M, Burteau C, Nigro A, Vandermeers F, Balon H, Bouzar AB, Defoiche J, Burny A, et al: Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human. Retrovirology 2007, 4:18.
【非特許文献２】Kettmann R, Deschamps J, Cleuter Y, Couez D, Burny A, Marbaix G: Leukemogenesis by bovine leukemia virus: proviral DNA integration and lack of RNA expression of viral long terminal repeat and 3' proximate cellular sequences. Proc Natl Acad Sci U S A 1982, 79:2465-2469.
【非特許文献３】Kettmann R, Cleuter Y, Mammerickx M, Meunier-Rotival M, Bernardi G, Burny A, Chantrenne H: Genomic integration of bovine leukemia provirus: comparison of persistent lymphocytosis with lymph node tumor form of enzootic. Proc Natl Acad Sci U S A 1980, 77:2577-2581.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１等に記載の従来技術は、ＢＬＶを構成するポリペプチドのごく一部のみを利用する技術である。動物の免疫機構は極めて複雑であるから、例えばペプチドワクチンを製造する際に、ＢＬＶを構成するポリペプチドの実質的に全部を利用する場合と、ごく一部のみを利用する場合とで、動物に対して同様の免疫応答を惹起し得るかは不明である。従って、利用可能なポリペプチドに関して様々な選択肢を提示するためには、発現等が比較的困難な遺伝子を対象とする場合でも、目的ポリペプチドをより効率的かつ大量に得ることが出来る手法の確立が求められている。
【００１１】
すなわち、本発明の一態様は、ポリペプチドの製造に適している核酸構築物、およびその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決するために、本発明は、以下の一態様を含む。
１）  ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からなる群から選択されるウイルスのプロモータ領域に由来する発現制御配列と、上記発現制御配列の下流側に正方向に配置される、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）に由来する配列と、を含む、動物細胞内での遺伝子発現用の核酸構築物。
２）  ＬＴＲに由来する上記配列は、Ｕ３領域の少なくとも一部を欠損している、１）に記載の核酸構築物。
３）  上記発現制御配列が、ＣＭＶのプロモータ領域に由来する、１）又は２）に記載の核酸構築物。
４）  上記発現制御配列は、プロモータおよび／またはエンハンサを含む、１）〜３）の何れか一項に記載の核酸構築物。
５）  上記発現制御配列は、プロモータおよびエンハンサを含む、４）に記載の核酸構築物。
６）  ＬＴＲに由来する上記配列の下流側に、ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、１）〜５）の何れか一項に記載の核酸構築物。
７）  ＬＴＲに由来する上記配列と、ポリペプチドをコードする上記核酸配列とで、ＢＬＶの５’ＬＴＲから３’ＬＴＲまでの核酸配列の全長またはその部分に相当する配列を構成している、６）に記載の核酸構築物。
８）  ＢＬＶの５’ＬＴＲから３’ＬＴＲまでの核酸配列の上記部分は、少なくともＧａｇポリペプチドをコードする、７）に記載の核酸構築物。
９）  １）〜８）の何れか一項に記載の核酸構築物を含む、動物細胞。
１０）  ６）〜８）の何れか一項に記載の核酸構築物を発現させる工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
１１）  上記ポリペプチドとして、ウイルス粒子またはウイルス様粒子を構成するポリペプチドを製造することで、ウイルス粒子またはウイルス様粒子を製造する、１０）に記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の一態様によれば、ポリペプチドの製造に適している核酸構築物、およびその利用を提供することが出来るという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施例１に係る各変異体のウイルス産生量を比較した図である。
【図２】本発明の実施例１に係る各変異体の細胞内および培養上清中のウイルス抗原発現を比較した図である。
【図３】本発明の実施例１に係る各変異体のウイルス産生量を比較した図である。
【図４】本発明の実施例１に係る各変異体の細胞内および培養上清中のウイルス抗原発現を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。
【００１６】
〔核酸構築物〕
本実施形態に係る核酸構築物は、動物細胞内での遺伝子発現に用いられる新規の核酸構築物であり、一例においては、ポリペプチドの製造に適している。具体的には、核酸構築物は、ウイルスのプロモータ領域に由来する発現制御配列と、発現制御配列の下流側に正方向に配置される、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）に由来する配列とを含む。
【００１７】
なお、本明細書中において、「遺伝子発現」は、遺伝子の転写、および転写されたＲＮＡのポリペプチドへの翻訳の両方または一方を指すものとする。また、「遺伝子発現制御」とは、遺伝子の転写からポリペプチドへの翻訳までのいずれかの時点で行なわれる制御を指し、制御が行われるタイミングおよびその機構は、特に限定されるものではない。
【００１８】
また、本明細書において、遺伝子の「発現制御配列」は、遺伝子の発現を制御している「ポリヌクレオチド」を指す。「発現制御配列」の一例としては、プロモータ領域の配列などが挙げられる。但し、後述するように、本実施形態においては「発現制御配列」以外の配列も、遺伝子発現の制御に寄与する可能性を排除はしていない。
【００１９】
また、本明細書中「核酸」とは、ポリヌクレオチドを意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００２０】
（発現制御配列）
発現制御配列は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からなる群から選択されるウイルスのプロモータ領域に由来する。上記いずれかのウイルスに由来する発現制御配列を用いる。
【００２１】
なお、本明細書中で、あるウイルスに由来する「プロモータ領域」とは、対象とするウイルスにおいてプロモータおよびエンハンサを含む領域であり、プロモータ／エンハンサ又はホールプロモータとも称される。ウイルスのプロモータ領域に由来する配列は、ウイルスのプロモータ領域の全長に限定されず、例えば、プロモータのみ、またはエンハンサのみ等、プロモータ領域の一部であり得る。
【００２２】
好ましくは、発現制御配列は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からなる群から選択されるウイルスのプロモータ領域に由来する、以下の１）〜３）のいずれかを含む。
１）プロモータ
２）エンハンサ
３）プロモータおよびエンハンサ
各ウイルスのプロモータ、またはエンハンサとしては、例えば下記のものを利用することができる。
・ＣＭＶのプロモータ／エンハンサ：ＣＭＶ  ＩＥプロモータ／ＩＥエンハンサ
・ＳＶ４０のプロモータ／エンハンサ：ＳＶ４０ early promoter/enhancer
・ＲＳＶのプロモータ／エンハンサ：ＲＳＶ  ＬＴＲ
発現制御配列が、上記１）〜３）のいずれかを含むことにより、動物細胞内で遺伝子を好適に高発現させることが可能である。
【００２３】
より好ましくは、発現制御配列は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からなる群から選択されるウイルスのプロモータ領域に由来する、プロモータおよびエンハンサを含む（例えば、上述のプロモータ領域の全長を含む場合が、この好ましいケースに相当する）。発現制御配列が、上記から選ばれるウイルスに由来するプロモータおよびエンハンサを含むことで、動物細胞内で遺伝子をより好適に高発現させることが可能である。
【００２４】
ウイルスのプロモータ領域に由来する配列は、野生型ウイルスのプロモータ領域中の配列と同一の配列を有していなくてもよく、野生型ウイルスのプロモータ領域の配列から改変された配列であり得る。例えば、市販の遺伝子発現用ベクターであるｐＩＲＥＳベクターを構成しているＣＭＶ  ＩＥプロモータは、本実施形態に係る「ウイルスのプロモータ領域に由来する、プロモータ」に包含される。
【００２５】
発現制御配列は、ＣＭＶのプロモータ領域に由来することが好ましい。発現制御配列が、ＣＭＶのプロモータ領域に由来することで、動物細胞内で特に好適に遺伝子発現を誘導することが可能である。
【００２６】
より好ましくは、発現制御配列は、ＣＭＶのプロモータ領域に由来する、以下の１）〜３）のいずれかを含む。
１）プロモータ
２）エンハンサ
３）プロモータおよびエンハンサ
さらに好ましくは、発現制御配列は、ＣＭＶのプロモータ領域に由来する、プロモータおよびエンハンサを含む。
【００２７】
特に好ましくは、発現制御配列は、ｐＩＲＥＳベクターを構成しているＣＭＶ  ＩＥプロモータの全長である。実施例においても示す通り、発現制御配列としてＣＭＶ  ＩＥプロモータの全長を用いることで、動物細胞内で特に好適に遺伝子発現を誘導することが可能である。
【００２８】
以下では、ＣＭＶ  ＩＥプロモータの全長およびＣＭＶ  ＩＥエンハンサを含む配列を一例として示す。なお、下記配列中のＣＭＶ  ＩＥプロモータの全長およびＣＭＶ  ＩＥエンハンサは、公知のデータベース等に登録されているＣＭＶ  ＩＥプロモータの全長およびＣＭＶ  ＩＥエンハンサの配列とは一部異なる可能性がある。
１）ＣＭＶ  ＩＥプロモータの全長を含む配列（配列番号１）
CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGA
２）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサを含む配列（配列番号２）
GTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGA
好ましい態様では、ＣＭＶのプロモータまたはエンハンサは、上記の１）に含まれるＣＭＶ  ＩＥプロモータの全長、または２）に含まれるＣＭＶ  ＩＥエンハンサの配列と、９０％以上の配列同一性のものであり、より好ましい態様では９５％以上、さらに好ましい態様では９６％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％、または９９％以上の配列同一性の配列を有する。
【００２９】
（ＢＬＶのＬＴＲに由来する配列）
ＢＬＶのＬＴＲに由来する配列（以下、ＬＴＲ由来配列とも称する）は、ＢＬＶのＬＴＲの全長に限定されず、ＢＬＶのＬＴＲの一部のみであってもよい。ＢＬＶのＬＴＲに由来する配列は、例えば、ＬＴＲのＵ３領域、Ｒ領域およびＵ５領域のうち、いずれかの領域の一部を欠いたものであってもよい。
【００３０】
好ましくは、ＬＴＲ由来配列は、Ｕ３領域の少なくとも一部を欠損している。好ましい一例では、ＬＴＲ由来配列は、Ｕ３領域のうち、以下１）または２）のいずれか一つ（より好ましくは両方）を欠いている。
１）ＢＬＶのプロモータ領域（Ｕ３領域における、Ｒ領域の近傍に存在する）
２）複数のＴａｘ response element（ＴｘＲＥ）のうち、少なくとも一つ。好ましくはＴｘＲＥの全て。
【００３１】
上記の１）または２）を欠くことが好ましい理由は必ずしも定かではないが、上述の「発現制御配列」との機能的な干渉が防がれていることがその理由の一つと推定される。なお、ＢＬＶプロウイルス（ＤＮＡ）におけるＵ３領域はｍＲＮＡに転写されない領域であり、仮にＵ３領域が欠けている場合でも、転写後のＬＴＲの機能には影響を与えないと考えられる。
【００３２】
より好ましくは、ＬＴＲ由来配列は、Ｕ３領域の全長を欠いている。ＬＴＲ由来配列がＵ３領域の全長を欠いていることにより、より好適に動物細胞内での遺伝子発現を行うことが可能である。
【００３３】
ＬＴＲ由来配列は、野生型ＢＬＶのＬＴＲと同一の配列を有していなくてもよく、野生型ＢＬＶのＬＴＲの配列から改変された配列であり得る。
【００３４】
発現制御配列の下流側に機能的に連結される上記のＬＴＲ由来配列は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲのどちらに由来するものであってもよいが、好ましくは、５’ＬＴＲに由来する配列である。
【００３５】
以下では、ＢＬＶの５’ＬＴＲの配列、およびＢＬＶの５’ＬＴＲからＵ３領域の全長を欠いた配列（以下ではΔＵ３配列とも称する）を含む配列を、一例として示す。なお、下記配列中に含まれているＬＶの５’ＬＴＲの配列、およびＢＬＶのΔＵ３配列は、公知のデータベース等に登録されているＢＬＶの５’ＬＴＲおよびＢＬＶのΔＵ３配列とは一部異なる可能性がある。
１）ＢＬＶの５’ＬＴＲ（配列番号３）
ACTAGTTGTATGAAAGATCATGCCGACCTAGGCGCCGCCACCGCCCCGTAAACCAGACAGAGACGTCAGCTGCCAGAAAAGCTGGTGACGGCAGCTGGTGGCTAGAATCCCCGTACCTCCCCAACTTCCCCTTTCCCGAAAAATCCACACCCTGAGCTGCTGACCTCACCTGCTGAGAAATTAATAAAATGCCGGCCCTGTCGAGTTAGCGGCACCAGAAGCGTTCTTCTCCTGAGACCCTCGTGCTCAGCTCTCGGTCCTGAGCTCTCTTGCTCCCGAGACCTTCTGGTCGGCTATCCGGCAGCGGTCAGGTAAGGCAAACCACGGTTTGGAGGGTGGTTCTCGGCTGAGACCACCGCGAGCTCTATCTCCGGTCCTCTGACCGTCTCCACGTGGACTCTCTCCTTTGCCTCCTGACCCCGCGCTCCAAGGGCGTCTGGCTTGCACCCGCGTTTGTTTCCTGTCTTACTTTCTGTTTCTCGCGGCCCGCGCTCTCTCCTTCGGCGCCCTCTAGCGGCCAGGAGAGACCGGCAAACA
２）ＢＬＶのΔＵ３配列（配列番号４）
GTTCTTCTCCTGAGACCCTCGTGCTCAGCTCTCGGTCCTGAGCTCTCTTGCTCCCGAGACCTTCTGGTCGGCTATCCGGCAGCGGTCAGGTAAGGCAAACCACGGTTTGGAGGGTGGTTCTCGGCTGAGACCACCGCGAGCTCTATCTCCGGTCCTCTGACCGTCTCCACGTGGACTCTCTCCTTTGCCTCCTGACCCCGCGCTCCAAGGGCGTCTGGCTTGCACCCGCGTTTGTTTCCTGTCTTACTTTCTGTTTCTCGCGGCCCGCGCTCTCTCCTTCGGCGCCCTCTAGCGGCCAGGAGAGACCGGCAAACA
好ましい態様では、ＢＬＶの５’ＬＴＲ、およびのＢＬＶのΔＵ３配列は、上記の１）に含まれるＢＬＶの５’ＬＴＲ、または２）に含まれるＢＬＶのΔＵ３配列と、９０％以上の配列同一性のものであり、より好ましい態様では９５％以上、さらに好ましい態様では９６％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％、または９９％以上の配列同一性の配列を有する。
【００３６】
（核酸構築物の構造）
核酸構築物では、上述のＬＴＲ由来配列は、上述の発現制御配列の下流側に正方向に配置されている。換言すれば、核酸構築物では、ＬＴＲ由来配列は、上記発現制御配列よりも３’側に配置されている。
【００３７】
なお、ＬＴＲ由来配列が「正方向に配置」されているとは、ＬＴＲ由来配列が、野生型のＢＬＶの転写における転写方向と同じ方向に配置されていることを意味する。つまり、発現制御配列の下流側に、Ｕ３領域、Ｒ配列、およびＵ５配列が、Ｕ３領域−Ｒ配列−Ｕ５配列の順番で配置されている。なお、上述した通り、ＬＴＲ由来配列は、Ｕ３領域、Ｒ配列、およびＵ５配列の一部が欠損したものであってもよい。
【００３８】
核酸構築物において、発現制御配列は、少なくとも、その下流側に位置するＬＴＲ由来配列に対して機能的に配置されている。ここで、「機能的に配置される」とは、発現制御配列が、ＬＴＲ由来配列の転写制御に少なくとも関与することを指す。
【００３９】
核酸構築物がＤＮＡである場合の一態様において、発現制御配列は、それ単独で、またはＬＴＲ由来配列と協働して、当該ＬＴＲ由来配列、およびＬＴＲ由来配列の下流側に位置する配列（タンパク質をコードするコーディング配列であっても、タンパク質をコードしていないノンコーディング配列であってもよい：「目的配列」とも称する）の転写をアップレギュレートすると推定される。核酸構築物がＤＮＡである場合の好ましい一態様において、ＬＴＲ由来配列と、当該ＬＴＲ由来配列の下流側に位置する配列とは、同一のｍＲＮＡを構成する構成要素として転写される。また、ｍＲＮＡに転写された後のＬＴＲ由来配列は、当該ＬＴＲ由来配列の下流側に位置する配列がコーディング配列である場合、その翻訳をアップレギュレートすると推定される。
【００４０】
核酸構築物がＤＮＡである場合のより好ましい一態様では、ＬＴＲ由来配列と目的配列との間に、プロモータおよび／またはエンハンサが挿入されない。
【００４１】
〔核酸構築物の好ましい態様〕
核酸構築物は、好ましい態様では、例えば遺伝子発現ベクターとすることができる。遺伝子発現ベクターは、一般的によく利用されているものは二本鎖ＤＮＡ構築物であるが、一本鎖ＤＮＡ構築物等である態様も、本実施形態の範疇である。より好ましくは、遺伝子発現ベクターは、プラスミドベクターである。
【００４２】
遺伝子発現ベクターは、ＬＴＲ由来配列の下流側に位置する配列として、タンパク質をコードするコーディング配列が挿入されたタンパク質発現ベクターに限定されない。タンパク質をコードしないノンコーディング配列が挿入されたＲＮＡ発現ベクターも、本発明の遺伝子発現ベクターの範疇に含まれる。さらに、ＬＴＲ由来配列の下流側に上述の目的配列を挿入する前の形態（ＬＴＲ由来配列の下流側に設けられた核酸断片挿入部位に目的配列を挿入する前の形態）も、本発明の遺伝子発現ベクターの範疇に含まれる。
【００４３】
なお、本実施形態に係る遺伝子発現ベクターは、例えば、公知の遺伝子発現ベクターのプロモータを、上述の発現制御配列とＬＴＲ由来配列との組合せで置換することによって作製することも出来る。
【００４４】
〔核酸構築物を含む、動物細胞〕
上述の核酸構築物（ただし、上述の目的配列として、ポリペプチドをコードする核酸配列を含むもの）を適当な宿主細胞に導入することによって形質転換細胞を作製することができる。作製された形質転換細胞、その培養後代、または形質転換細胞から誘導した組織等（個体であってもよいがヒト個体は除く）は、本発明の一態様に係る核酸構築物の全長を含んでいるか、少なくとも当該核酸構築物の一部を含んでいて、当該核酸構築物がコードするポリペプチドを発現可能である。なお、上述の核酸構築物の全長またはその一部は、宿主のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【００４５】
宿主細胞としては、上述の核酸構築物の転写および翻訳が可能な限り特に限定されないが、動物細胞が好ましい。動物細胞としては、昆虫細胞、両生類細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、哺乳動物細胞などが挙げられ、哺乳動物細胞であることが好ましい。昆虫細胞の例としては、例えば、カイコの細胞などが挙げられる。哺乳動物細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞などが挙げられる。なお、本発明の一態様では、上述の核酸構築物としてＳＶ４０のプロモータ領域に由来する発現制御配列が組み込まれたものを用い、ＳＶ４０のＴ抗原を利用して、宿主細胞の不死化等を行ってもよい。ＳＶ４０のＴ抗原は、宿主細胞に発現させてもよく（例えば、ＨＥＫ２９３ＴやＣＯＳ細胞を宿主細胞として利用する）、あるいは、宿主細胞の培養系に添加してもよい。
【００４６】
宿主細胞の形質転換は、宿主細胞の種類等に応じて適宜選択すればよく、例えば、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、およびパーティクルガン法などにより行うことができる。
【００４７】
本発明の一態様において、上記の形質転換細胞は、導入された上述の核酸構築物の発現が可能な条件下で、培養等を行う。
【００４８】
〔ポリペプチドの製造方法〕
上述の核酸構築物がコードしているポリペプチドは、この核酸構築物の翻訳を、無細胞タンパク質合成系内で、または宿主細胞内で行うことによって、製造することが出来る。宿主細胞の種類は、この核酸構築物の転写および翻訳が可能な限り特に限定されないが、上述した動物細胞であることが好ましい。
【００４９】
製造されたポリペプチドは、必要に応じて精製を行ってもよい。精製の方法は、製造されるポリペプチドに応じた公知の方法を適宜選択すればよいが、宿主細胞内に蓄積されるポリペプチドの場合は、宿主細胞を破砕した後に精製をすればよく、宿主細胞外に放出されるポリペプチド（後述するウイルス粒子またはウイルス様粒子はこの一例である）の場合は、例えば、宿主細胞の培養上清からポリペプチドを精製し、回収すればよい。
【００５０】
（ウイルス粒子またはウイルス様粒子の製造方法）
上述のポリペプチドの製造方法において、ウイルス粒子（Virus Particle；VP）またはウイルス様粒子（Virus-Like Particle；VLP）を構成する上で必要なポリペプチドをコードする核酸配列を発現させることによって、ウイルス粒子またはウイルス様粒子を製造することができる。
【００５１】
なお、ウイルス様粒子を構成する上で必要なポリペプチド（すなわち、粒子構造をとるために必要最小限のポリペプチド）は、ウイルスの種類ごとに異なり得るが、ＢＬＶの場合はＧａｇポリペプチドである。但し、ポリペプチドをコードする上記核酸配列は、機能的なパッケージングシグナル（Ψ）を含まないように構築される。
【００５２】
同様に、ＢＬＶのウイルス粒子を構成する上で必要なポリペプチドも、ウイルスの種類ごとに異なり得るが、ＢＬＶの場合はＧａｇポリペプチドである。但し、ポリペプチドをコードする上記核酸配列は、機能的なパッケージングシグナル（Ψ）を含むように構築され、これによって核酸構築物のＲＮＡがウイルス粒子中に取り込まれる。
【００５３】
なお、ＢＬＶのウイルス粒子またはウイルス様粒子を製造する場合、ポリペプチドをコードする上記核酸配列は、Ｇａｇポリペプチドに加えて、ＥｎｖポリペプチドやＰｏｌポリペプチド等をさらにコードしていてもよい。但し、これら複数種のポリペプチドは、異なる核酸配列上にコードされていてもよい。
【００５４】
〔ＢＬＶワクチン〕
本発明の一態様にかかる医薬品組成物は、以下の有効成分１）および／または２）を含んでなる、抗ＢＬＶ用のワクチン組成物である。有効成分１）を含む場合は核酸ワクチン組成物であり、有効成分２）を含む場合はペプチドワクチン組成物である。なお、医薬品組成物における有効成分の含有量は特に限定されず、適宜、設定すればよい。
１）上述の核酸構築物（但し、ポリペプチドをコードする核酸配列として、ＢＬＶの５’ＬＴＲから３’ＬＴＲまでの間のポリペプチドコード核酸配列の全長またはその部分に相当する配列を含むもの。当該ポリペプチドコード核酸配列の全長の８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列を含むものがより好ましい）。核酸構築物はＲＮＡからなるものであってもよいが、安定性等の観点では、好ましくはＤＮＡからなるものである。
２）上述のポリペプチド（但し、ＢＬＶの５’ＬＴＲから３’ＬＴＲまでの間のポリペプチドコード核酸配列によってコードされるポリペプチドの全長またはその部分に相当する配列を含むもの。当該ポリペプチドコード核酸配列によってコードされるポリペプチドの全長の８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列を含むものがより好ましい）。
【００５５】
抗原性に優れ、大きな免疫惹起効が期待できるという観点では、上述のポリペプチドは、ＢＬＶのウイルス粒子（ＶＰ）、または、ＢＬＶのウイルスゲノムを含まないＢＬＶのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形態であることが好ましく、ＢＬＶのウイルス粒子であることがより好ましい。同様の観点から、上述の核酸構築物は、ＢＬＶのウイルス粒子、またはＢＬＶのウイルス様粒子をコードしているものであることが好ましい。
【００５６】
ＢＬＶのウイルス粒子は、天然のウイルス粒子そのものであってもよいし、加熱もしくは薬剤等による不活化処理、または、細胞継代もしくは動物継代等の馴化操作または遺伝子操作等による弱毒化処理が施されたウイルス粒子であってもよい。ＢＬＶのウイルス様粒子は、上述の通り、ポリペプチドコード核酸配列としてＢＬＶのｇａｇ遺伝子を発現させることによって得られるが、このＶＬＰはその他の抗原ペプチド（例えば、ＢＬＶのＰｏｌまたはＥｎｖの部分配列等）をさらに含んでいてもよい。
【００５７】
医薬品組成物は、これらの他に、薬学的に許容される担体、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塩類、緩衝剤、着色剤、抗酸化剤、粘度調整剤、賦活剤（免疫賦活剤としての炭酸アパタイト、水酸化ナトリウム、アラム、不完全／完全フロイントアジュバント等も含む概念）、またはナノ粒子等を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、水、各種塩溶液、アルコール、植物油、およびミネラルオイル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
医薬品組成物の形態も特に限定されず、例えば、注射剤、液剤、懸濁剤、乳剤、散剤、顆粒剤、およびカプセル剤等が挙げられる。医薬品組成物の投与形態も特に限定されず、経口投与であってもよいし、非経口投与（皮下投与、経鼻投与、腹腔内投与、皮膜投与、筋肉内投与、または静脈内投与等）であってもよい。
【００５９】
医薬品組成物は、牛白血病の予防または治療に好適に使用され得る。そのため、本発明はまた、本発明の一態様に係る医薬品組成物を対象動物に接種または投与する工程を含む、牛白血病の予防または治療方法、好ましくは予防方法を提供する。
【００６０】
医薬品組成物が投与される対象動物としては、ＢＬＶに感染し得るヒトおよび非ヒト動物が挙げられる。非ヒト動物は、特に限定されないが、例えば、ウシ（Bos taurus）、コブウシ（Bos indicus）、スイギュウ（Bubalus bubalis）、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、およびサル等の哺乳動物が挙げられる。ウシとしては、乳用種、肉用種、乳肉兼用種、役用種、および役肉兼用種等が挙げられる。具体的には、例えば、黒毛和種、日本短角種等の和牛、ホルスタイン、ジャージー、および各国の在来種等の品種が挙げられるが、これらに限定されない。対象動物は、好ましくはウシ、コブウシおよびスイギュウであり、より好ましくはウシおよびスイギュウであり、さらに好ましくはウシである。
【実施例１】
【００６１】
本発明の一実施例について以下に説明する。
【００６２】
＜材料および方法＞
〔プラスミドの作製〕
BLVの感染性分子クローンpBLV-IF（Inabeら、1998、Virology 245:53-64）を制限酵素SpeIおよびHindIIIで切断し、pBLV-IF中のプロウイルス配列の5’側をpBluescriptII KS(-)にクローニングした。クローニングにより得られたプラスミドをテンプレートとして、プライマー5’pBLV-del-F (TCTAGAACTAGTTTGTATGAAAGATCATGCC（配列番号５）)および5’pBLV-del-R (TTCATACAACTAGTTCTAGAGCGGCC（配列番号６）)を用いて、PrimeSTAR MAXを使用してPCRを行った。得られたPCR産物を用いて、大腸菌XL1-blue MRF’を形質転換し、BLVプロウイルスの5’側の配列からさらに5’LTRよりも上流の配列を欠損した配列が挿入されたプラスミドを構築した(5’pBLV-IF2/pKS)。
【００６３】
また、pBLV-IFをHindIIIおよびKpnIで切断して、pBLV-IF中のプロウイルス配列の3’側をpBluescriptII KS(-)にクローニングした。プライマー3’pBLV-del-F (GGGCAAACAGGTACCCAGCTTTTGTTC（配列番号７）)および3’pBLV-del-R (GGCAAACACCGGTACCCAATTCGCCCTA（配列番号８）)を用いて、PCRを行った。得られたPCR産物を用いて大腸菌XL1-blue MRF’を形質転換し、BLVプロウイルスの3’側の配列からさらに3’LTRよりも下流の配列を欠損した配列が挿入されたプラスミドを構築した（3’pBLV-IF2/pKS）。
【００６４】
ここで、上記3’pBLV-IF2/pKSを制限酵素HindIIIおよびKpnIで切断し、得られたBLV 3’末端側を含むDNA断片を、5’pBLV-IF2/pKSの対応領域に挿入することで、pBLV-IF2を構築した。
【００６５】
次に、pIRES ベクターをテンプレートとして、プライマーSpeI-CMV-En-R(aaaaaaACTAGTCATGGTAATAGCGATGAC（配列番号９）)およびSpeI-CMVp-R(aaaaaaACTAGTTCACTAAACGAGCTCTG（配列番号１０）)を用いて、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター領域中のエンハンサー領域（CMVen）をPCR増幅した。得られたPCR産物を、制限酵素SpeIで切断し、上記の5’pBLV-IF2/pKSのSpeIサイトにライゲーションし、5’CMVen-pBLV-IF2/pKSを得た。
【００６６】
また、pIRES ベクターをテンプレートとして、プライマーNotI-CMV-F (aaaaaaGCGGCCGCGTTACATAACTTACGG（配列番号１１）)およびSpeI-CMVp-Rを用いて、CMVのプロモーター領域の全長（CMVp）をPCR増幅し、制限酵素SpeIおよびNotIで切断し、5’pBLV-IF2/pKSの対応箇所にライゲーションし、5’CMVp-pBLV-IF2/pKSを得た。
【００６７】
また、5’pBLV-IF2/pKSをテンプレートとして、プライマーSpeI-LTR-R-F(ggcaccACTAGTgttcttctcctgagac（配列番号１２）)およびSpeI-LTR-R-R（aagaacACTAGTggtgccgctaactcgac（配列番号１３））を用いたsite-direct mutagenesisにより、BLV-IFの5' LTRのＵ３領域とR領域との間に、SpeIサイトを導入した。得られた核酸構築物に対し、NotIおよびSpeIサイトを利用して、上記CMVpをライゲーションした。これにより、CMVのプロモーター領域からＵ３領域の全長が取り除かれた発現制御配列（CMVΔU3）を含む、5’CMVΔU3-pBLV-IF2/pKSを得た。
【００６８】
3’pBLV-IF2/pKSを制限酵素HindIIIおよびKpnIで切断し、5’CMVp-pBLV-IF2/pKS、5’CMVen-pBLV-IF2/pKS、および5’CMVΔU3-pBLV-IF2/pKSの対応領域にそれぞれ導入することで、（１）CMVp-pBLV-IF2、（２）CMVen-pBLV-IF2、および（３）CMVΔU3-pBLV-IF2の計３種類のプラスミドを得た。
【００６９】
（１）CMVp-pBLV-IF2は、CMVpの下流側に、BLVのプロウイルス配列の全長が正方向に配置されたプラスミドである。
【００７０】
（２）CMVen-pBLV-IF2は、CMVenの下流側に、BLVのプロウイルス配列の全長が、正方向に配置された構造を有するプラスミドである。
【００７１】
（３）CMVΔU3-pBLV-IF2は、CMVpの下流側に、BLVのプロウイルス配列の全長から5’LTRのU3を欠損した配列を、正方向に配置された構造を有するプラスミドである。
【００７２】
以下に示した配列１）は、（１）CMVp-pBLV-IF2のCMVpからBLVの5’ＬＴＲまでの配列を含む。
１）CMVp-pBLV-IF2のCMVpからBLVの5’ＬＴＲまでを含む配列（配列番号１４）
CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACTAGTTGTATGAAAGATCATGCCGACCTAGGCGCCGCCACCGCCCCGTAAACCAGACAGAGACGTCAGCTGCCAGAAAAGCTGGTGACGGCAGCTGGTGGCTAGAATCCCCGTACCTCCCCAACTTCCCCTTTCCCGAAAAATCCACACCCTGAGCTGCTGACCTCACCTGCTGAGAAATTAATAAAATGCCGGCCCTGTCGAGTTAGCGGCACCAGAAGCGTTCTTCTCCTGAGACCCTCGTGCTCAGCTCTCGGTCCTGAGCTCTCTTGCTCCCGAGACCTTCTGGTCGGCTATCCGGCAGCGGTCAGGTAAGGCAAACCACGGTTTGGAGGGTGGTTCTCGGCTGAGACCACCGCGAGCTCTATCTCCGGTCCTCTGACCGTCTCCACGTGGACTCTCTCCTTTGCCTCCTGACCCCGCGCTCCAAGGGCGTCTGGCTTGCACCCGCGTTTGTTTCCTGTCTTACTTTCTGTTTCTCGCGGCCCGCGCTCTCTCCTTCGGCGCCCTCTAGCGGCCAGGAGAGACCGGCAAACA
以下に示した配列２）は、（２）CMVen-pBLV-IF2のCMVenからBLVの5’ＬＴＲまでの配列を含む。
２）CMVen-pBLV-IF2のCMVenからBLVの5’ＬＴＲまでを含む配列（配列番号１５）
CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGACTAGTTGTATGAAAGATCATGCCGACCTAGGCGCCGCCACCGCCCCGTAAACCAGACAGAGACGTCAGCTGCCAGAAAAGCTGGTGACGGCAGCTGGTGGCTAGAATCCCCGTACCTCCCCAACTTCCCCTTTCCCGAAAAATCCACACCCTGAGCTGCTGACCTCACCTGCTGAGAAATTAATAAAATGCCGGCCCTGTCGAGTTAGCGGCACCAGAAGCGTTCTTCTCCTGAGACCCTCGTGCTCAGCTCTCGGTCCTGAGCTCTCTTGCTCCCGAGACCTTCTGGTCGGCTATCCGGCAGCGGTCAGGTAAGGCAAACCACGGTTTGGAGGGTGGTTCTCGGCTGAGACCACCGCGAGCTCTATCTCCGGTCCTCTGACCGTCTCCACGTGGACTCTCTCCTTTGCCTCCTGACCCCGCGCTCCAAGGGCGTCTGGCTTGCACCCGCGTTTGTTTCCTGTCTTACTTTCTGTTTCTCGCGGCCCGCGCTCTCTCCTTCGGCGCCCTCTAGCGGCCAGGAGAGACCGGCAAACA
以下に示した配列３）は、（３）CMVΔU3-pBLV-IF2のCMVΔU3からBLVの5’ＬＴＲまでの配列を含む。
３）CMVΔU3-pBLV-IF2のCMVΔU3からBLVの5’ＬＴＲまでを含む配列（配列番号１６）
CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACTAGTGTTCTTCTCCTGAGACCCTCGTGCTCAGCTCTCGGTCCTGAGCTCTCTTGCTCCCGAGACCTTCTGGTCGGCTATCCGGCAGCGGTCAGGTAAGGCAAACCACGGTTTGGAGGGTGGTTCTCGGCTGAGACCACCGCGAGCTCTATCTCCGGTCCTCTGACCGTCTCCACGTGGACTCTCTCCTTTGCCTCCTGACCCCGCGCTCCAAGGGCGTCTGGCTTGCACCCGCGTTTGTTTCCTGTCTTACTTTCTGTTTCTCGCGGCCCGCGCTCTCTCCTTCGGCGCCCTCTAGCGGCCAGGAGAGACCGGCAAACA
〔細胞〕
アフリカミドリザル腎由来細胞（COS-1）細胞は、10%牛胎児血清(FBS)および1xPenicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG)を添加したDMEM培地上で、CO2インキュベーター内で37℃で維持した。
【００７３】
〔トランスフェクション〕
COS-1細胞5x105 cells/60mm-dishに、以下の３種類のプラスミドを混和し、FugeneHD 16uLを用いて、トランスフェクションを行った。
・pBLV-IF2 野生株（WT）、pBluescriptII KS(-)、または上記３種類のLTR改変プラスミドのいずれか１つ2.8ug
・pME18neoまたはTax-D247G/pME18neo（Tajimaら、2000、Journal of Virology、10939-49.） 1.4ug
・pEGFP-N1 0.4ug
トランスフェクションの48時間後に、細胞および培養上清を回収した。以下では、トランスフェクションを行った細胞を、「変異体」とも称する。
【００７４】
〔ウエスタンブロット〕
回収した細胞とRIPA bufferとを用いてセルライセートを作製し、BCA法により、セルライセートのタンパク質量を測定した。また、培養上清5mLを回収し、40,000 xg、40minの超遠心分離を行い、得られた沈殿をPBS(-)に懸濁した。セルライセートおよび超遠心後濃縮した培養上清に対してLaemmli buffer を加えて、100℃で5分間インキュベートし、サンプルとした。次に12.5%のSDS-ポリアクリルアミドゲルを作製して、サンプルをアプライし、電気泳動を行なった（SDS-PAGE）。泳動後のタンパク質をPVDFメンブレンに転写し、5%スキムミルクで30分間ブロッキングを行った。メンブレンをPBS-Tで洗浄後、一次抗体として抗BLV-gp51抗体（BLV-2、VMRD社）および抗BLV-p24抗体（BLV-3、VMRD社）を用いて染色した。メンブレンをPBS-Tで洗浄後、HRP標識抗マウスIgG1抗体で染色し、PBS-Tで洗浄後、Super Signal west pico (Thermo Fisher Scientific)で化学発光を行い、シグナルを検出した。
【００７５】
〔逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)アッセイ〕
上清中のウイルスRNA量をRT-PCRアッセイで測定した。培養上清140uLから、QIAamp viral RNA mini kit (QIAGEN)を使用してウイルスRNAを抽出し、TURBO DNase-free kit (Thermo Fisher Scientific) により処理した。処理後のウイルスRNAをテンプレートとして、High Capacity RNA-to-cDNA Kit (ThermoFisher Scientific) を用いて逆転写反応を行い、CoCoMo-BLV-PCR kit (理研ジェネシス)によりウイルス量を定量した。
【００７６】
〔サンドイッチELISA〕
96-Well Microplate (Beckman coulter社) に炭酸バッファー（pH9.5）で懸濁したBLV陽性牛血清を100uL加えて、4℃で一晩培養した。PBS-Tで洗浄後、3%スキムミルク 200uLで室温で1時間ブロッキングした。PBS-Tで洗浄後、回収した培養上清90uLに対して、5% NP-40を10uL加え、プレートに加えて室温で2時間インキュベートした。PBS-Tで洗浄後、一次抗体として抗BLV-gp51抗体（BLV-2、VMRD社）または抗BLV-p24抗体（BLV-3、VMRD社）を3%スキムミルクで5000倍稀釈して各ウェルに加えて、室温で90分インキュベートし、PBS-Tで洗浄後、HRP標識抗マウスIgG1抗体を3%スキムミルクで2000倍稀釈して各ウェルに加えて、1時間インキュベートした。PBS-Tでwash後、1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (Thermo Fisher Scientific) を加えて発色反応後、2M-H2SO4で反応を停止し、プレートリーダーで吸光度OD450を測定した。
〔フローサイトメトリー解析〕
回収した細胞に2%パラホルムアルデヒドを加えて4℃で15 分間固定を行い、0.5%ＦＢＳを含むPBS(-)で3回洗浄を行った。-20℃の70%エタノール中で膜透過処理を行い、解析時まで-20℃で保存した。エタノールを除き、0.5%ＦＢＳを含むPBS(-)で3回洗浄後、一次抗体として0.5%ＦＢＳを含むPBS(-)に100倍稀釈した抗BLV-gp51抗体（BLV-2、VMRD社）または抗BLV-p24抗体（BLV-3、VMRD社）を加えて4℃で60分インキュベートした。3回洗浄後、二次抗体として0.5%ＦＢＳを含むPBS(-)に300倍稀釈したＡＰＣ標識抗マウスIgG1抗体を加えて4℃で30分インキュベートした。3回洗浄後、各サンプルの平均蛍光強度(MFI)をFACSCalibur（BD Biosciences）を用いて解析した。
【００７７】
＜結果＞
〔ウイルス産生量の比較〕
図１は、各プラスミドを導入した変異体の、ウイルス産生量の比較を示す図である。なお、以下の図中の略号は、それぞれpEGFP-N1以外に以下のプラスミドを導入した変異体の結果を指す。
・ＷＴ：pBLV-IF2野生株およびpME18neo
・ＣＭＶｐ：CMVp-pBLV-IF2およびpME18neo
・ＣＭＶ−ｅｎ：CMVen-pBLV-IF2およびpME18neo
・ＣＭＶ−ΔＵ３：CMVΔU3-pBLV-IF2およびpME18neo
・ｐＫＳ：pBluescriptII KS(-)およびpME18neo
図１（ａ）は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す図である。図１（ｂ）は、サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。図１（ｃ）は、抗Ｇａｇ抗体を用いたフローサイトメトリーの結果を示す図である。図１（ｄ）は、抗Ｅｎｖ抗体を用いたフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【００７８】
〔細胞内および培養上清中のウイルス抗原発現〕
図２は、ウエスタンブロットの結果を示す図である。図２（ａ）および図２（ｂ）は、それぞれ独立して行った実験の結果を示す。図中では、矢印を用いて、ｇｐ５１およびｐ２４のバンドの位置を示している。
【００７９】
〔Ｔａｘ発現による各変異体のウイルス産生の増強効果〕
図３は、Ｔａｘ発現の有無による、各変異体のウイルス産生の増強効果を比較した図である。本図中で新たに使用する略号は、それぞれpEGFP-N1以外に以下のプラスミドを導入した変異体の結果を指す。
・ＷＴ＋Ｔａｘ−Ｄ２４７Ｇ：pBLV-IF2 野生株（WT）およびTax-D247G/pME18neo
・ＣＭＶｐ＋Ｔａｘ−Ｄ２４７Ｇ：CMVp-pBLV-IF2およびTax-D247G/pME18neo
・ＣＭＶｅｎ＋Ｔａｘ−Ｄ２４７Ｇ：CMVen-pBLV-IF2およびTax-D247G/pME18neo
・ＣＭＶ−ΔＵ３＋Ｔａｘ−Ｄ２４７Ｇ：CMVΔU3-pBLV-IF2およびTax-D247G/pME18neo
図３（ａ）は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す図である。図３（ｂ）は、サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。図３（ｃ）は、抗Ｇａｇ抗体を用いたフローサイトメトリーの結果を示す図である。図３（ｄ）は、抗Ｅｎｖ抗体を用いたフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【００８０】
〔細胞内および培養上清中のウイルス抗原発現〕
図４は、ウエスタンブロットの結果を示す図である。図４（ａ）および図４（ｂ）は、それぞれ独立して行った実験の結果を示す。図中では、矢印を用いて、ｇｐ５１およびｐ２４のバンドの位置を示している。
【００８１】
図４の各結果において、＋Ｔａｘ−Ｄ２４７Ｇと付記されている４列は、Tax-D247G/pME18neoを導入した変異体を示す。
（文献１）Inabe K, Ikuta K, Aida Y: Transmission and propagation in cell culture of virus produced by cells transfected with an infectious molecular clone of bovine leukemia virus. Virology 1998, 245:53-64.
（文献２）Tajima, S and Aida, Y: The region between amino acids 245 and 265 of the bovine leukemia virus (BLV) tax protein restricts transactivation not only via the BLV enhancer but also via other retrovirus enhancers. Journal of Virology 2000, 10939-49.
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は、例えばＢＬＶワクチンの製造に利用することができる。
【図１】
2019024351.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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