(57)【要約】【課題】ユーイング肉腫ファミリー腫瘍に対する効果的な新規抗がん物質のスクリーニングに使用できる、キメラ遺伝子に直接反応して腫瘍を形成するユーイング肉腫ファミリー腫瘍のモデル細胞を樹立すること。【解決手段】骨髄間質細胞由来のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞であって、誘導型転写制御配列を含むプロモーターの制御下に置かれたEWSキメラ遺伝子が染色体上に導入され、EWSキメラタンパク質の発現時に、生育可能であり、無限増殖能を有する、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞。【選択図】図７
2019050732.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄間質細胞由来のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞であって、
誘導型転写制御配列を含むプロモーターの制御下に置かれたEWSキメラ遺伝子が染色体上に導入され、
EWSキメラタンパク質の発現時に、生育可能であり、無限増殖能を有する、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞。
【請求項２】
EWSキメラ遺伝子がEWS-FLI1遺伝子である、請求項１に記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞。
【請求項３】
EWSキメラ遺伝子が薬剤耐性遺伝子とともに誘導型転写制御配列を含むプロモーターの制御下に置かれた、請求項１または２に記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞。
【請求項４】
誘導型転写制御配列がTetオペレーターであり、前記細胞はリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子を発現する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞。
【請求項５】
前記EWSキメラ遺伝子はレンチウイルスベクターを用いて染色体上に導入された、請求項１〜４のいずれか一項に記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞を初期化することによって得られる人工多能性幹細胞。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞が移植され、EWSキメラタンパク質の発現依存的にユーイング肉腫ファミリー腫瘍を発症する、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
EWSキメラ遺伝子の発現誘導下で培養された請求項１〜５のいずれか一項に記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞に試験化合物を添加する工程、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞の増殖能または腫瘍表現型を調べる工程、及び、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞の増殖能を低下させること、または腫瘍表現型を減少させることを指標として、試験化合物をユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療薬候補化合物として選択する工程を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項６に記載の人工多能性幹細胞を骨細胞に分化させる工程、EWSキメラタンパク質の発現を誘導する工程、得られたEWSキメラタンパク質を発現するユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞に試験化合物を添加する工程、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞の増殖能または腫瘍表現型を決定する工程、及び、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞の増殖能を低下させること、または腫瘍表現型を減少させることを指標として、試験化合物をユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療薬候補化合物として選択する工程を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の人工多能性幹細胞をEWSキメラタンパク質が発現しない状態で試験化合物を添加した骨分化誘導培地で培養して骨細胞に分化させる工程、骨細胞への分化度を決定する工程、及び、該骨細胞への分化度を増加させることを指標として、試験化合物を骨分化促進物質として選択する工程を含む、骨分化促進物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞および細胞を用いた医薬のスクリーニング方法に関し、具体的には、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍モデル細胞とそれを用いた抗腫瘍剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユーイング肉腫ファミリー腫瘍（Ewing's sarcoma of family tumors：ESFT）は、小児期から青年期の骨や軟部組織に発症する肉腫である。発症部位は様々であり、転移部位は肺、骨髄、骨が多く、転移した部位により予後は異なるが、一般に予後は不良である。
【０００３】
ユーイング肉腫ファミリー腫瘍患者のほとんどにキメラ遺伝子が検出され、キメラ遺伝子が発がんの原因遺伝子と考えられている。遺伝子検査にてEWS-FLI、EWS-ERG、EWS-ETV1、EWS-FEVなどのキメラ遺伝子が検出されれば、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍の確定診断となる。
【０００４】
ユーイング肉腫ファミリー腫瘍に対して有効性が高い化学療法として、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、イホスファミド、エトポシド、アクチノマイシンが挙げられ、これらを組み合わせた多剤併用化学療法が行われる。化学療法の進歩とともに治療成績の改善を認めているが、決定的なものは無く、化学療法、外科治療、放射線治療を組み合わせた集学的治療が必要である。特に頭頸部、脊椎、骨盤部などの手術、放射線照射を行い難い部位に発生した場合の予後は不良である。また治療後の長期生存者には、抗がん剤や放射線照射による二次がんが増加しており、二次がんを含めた晩期合併症の長期にわたるフォローアップが重要となる。
【０００５】
以上のような背景から、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍に対する効果的な新規抗がん物質の開発が望まれている。特にユーイング肉腫ファミリー腫瘍に特徴的で、かつ肉腫発生の根本的な原因であるキメラ遺伝子に対する分子標的特異的阻害物質の開発が期待されている。
【０００６】
現在までキメラ遺伝子によるユーイング肉腫ファミリー腫瘍の動物モデル、細胞モデル作製の取り組みがなされてきたが、キメラ遺伝子導入による肉腫形成および細胞株作製の報告はあるものの、キメラ遺伝子に直接反応する腫瘍モデル作製の報告はない。例えば、非特許文献１および２ではキメラ遺伝子EWS-FLI1をレトロウイルスベクターで初代培養の骨由来細胞または骨髄由来間葉前駆細胞に導入し、腫瘍を作製しているが、EWS-FLI1を恒常的に発現させており、腫瘍細胞がEWS-FLI1に依存して細胞増殖および腫瘍形成能を獲得しているかどうかは不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cancer Res. 2005 Dec 15;65(24):11459-68
【非特許文献２】Cancer Res. 2005 Oct 1;65(19):8698-705
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞株はキメラ遺伝子に直接反応するものではなく、それらを用いて薬剤スクリーニングを行っても化合物の作用点がキメラ遺伝子であるか
は不明であり、単に細胞増殖を抑制する化合物が得られる可能性が高いという問題があった。
【０００９】
したがって、本発明は、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍に対する効果的な新規抗がん物質のスクリーニングに使用できる、キメラ遺伝子に直接反応して腫瘍を形成するユーイング肉腫ファミリー腫瘍のモデル細胞を樹立することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ドキシサイクリン誘導性ＥＷＳ−ＦＬＩ１系を使用してマウス骨髄間質細胞よりＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的骨肉腫モデルを構築することに成功した。さらに、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞技術を利用して、癌関連性遺伝子異常を有するＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的骨肉腫由来ｉＰＳ細胞を得ることにも成功した。そして、これらの細胞が、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍に対する医薬のスクリーニングに好適に使用できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］骨髄間質細胞由来のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞であって、
誘導型転写制御配列を含むプロモーターの制御下に置かれたEWSキメラ遺伝子が染色体上に導入され、EWSキメラタンパク質の発現時に生育可能であり、無限増殖能を獲得した、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞。
［２］EWSキメラ遺伝子がEWS-FLI1遺伝子である、［１］に記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞。
［３］EWSキメラ遺伝子が薬剤耐性遺伝子とともに誘導型転写制御配列を含むプロモーターの制御下に置かれた、［１］または［２］に記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞。
［４］誘導型転写制御配列がTetオペレーターであり、前記細胞はリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子を発現する、［１］〜［３］のいずれかに記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞。
［５］前記EWSキメラ遺伝子はレンチウイルスベクターを用いて染色体上に導入された、［１］〜［４］のいずれかに記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞。
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞を初期化することによって得られる人工多能性幹細胞。
［７］［１］〜［５］のいずれかに記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞が移植され、EWSキメラタンパク質の発現依存的にユーイング肉腫ファミリー腫瘍を発症する、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍モデル非ヒト哺乳動物。
［８］EWSキメラ遺伝子の発現誘導下で培養された［１］〜［５］のいずれかに記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞に試験化合物を添加する工程、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞の増殖能または腫瘍表現型を調べる工程、及び、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞の増殖能を低下させること、または腫瘍表現型を減少させることを指標として、試験化合物をユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療薬候補化合物として選択する工程を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療薬のスクリーニング方法。
［９］［６］に記載の人工多能性幹細胞を骨細胞に分化させる工程、EWSキメラタンパク質の発現を誘導する工程、得られたEWSキメラタンパク質を発現するユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞に試験化合物を添加する工程、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞の増殖能または腫瘍表現型を決定する工程、及び、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞の増殖能を低下させること、または腫瘍表現型を減少させることを指標として、試験化合物をユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療薬候補化合物として選択する工程を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療薬のスクリーニング方法。
［１０］［６］に記載の人工多能性幹細胞をEWSキメラタンパク質が発現しない状態で試験化合物を添加した骨分化誘導培地で培養して骨細胞に分化させる工程、骨細胞への分化
度を決定する工程、及び、該骨細胞への分化度を増加させることを指標として、試験化合物を骨分化促進物質として選択する工程を含む、骨分化促進物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、薬剤等の刺激によりユーイング肉腫ファミリー腫瘍に検出されるキメラ遺伝子(EWS-FLI1など)の発現コントロールが可能な肉腫細胞、および肉腫細胞由来のiPS細胞が得られた。この肉腫細胞ではキメラ遺伝子の発現に依存して細胞増殖活性が誘導される点で従来の細胞株とは異なる。また、肉腫細胞由来iPS細胞は、骨分化誘導後にキメラ遺伝子を発現させることで、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍を形成することが可能である。これらは、キメラ遺伝子による影響を直接的にモニター可能な細胞系と考えられる。
ユーイング肉腫ファミリー腫瘍関連キメラ遺伝子に応答する細胞系は、キメラ遺伝子に対する直接的な分子標的特異的阻害物質の開発のスクリーニングに有用である。また、キメラ遺伝子の発現のON OFFを調節でき、腫瘍の表現型を可逆的に制御できるので、骨肉腫発生のメカニズム解析などにも好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】レンチウイルスを用いたＥＷＳ−ＦＬＩ１発現系の模式図。Ｒｏｓａ２６−Ｍ２ｒｔＴＡマウスから採取された骨髄間質細胞にレンチウイルスベクターを導入し、ＥＷＳ−ＦＬＩ１発現ネオマイシン耐性細胞を選択する。
【図２】各細胞における不死化細胞（ＥＦＮ＃２）のＤｏｘ含有培地またはＤｏｘ不含有培地での生育を示す顕微鏡写真。ＥＦＮ＃２はＤｏｘ含有培地中で急速に増殖した。Ｄｏｘの除去によりＥＷＳ−ＦＬＩ１発現性細胞の増殖の遅延化及び形態の変化が引き起こされた（除去から４日後）。
【図３】Ｄｏｘ処理試料におけるＤｏｘ有り無しでのＥＷＳ−ＦＬＩ１のｍＲＮＡ発現を示すｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフ。データは平均値±ＳＤとして提示されている。Ｄｏｘ非処理細胞の発現レベルを１に設定した。
【図４】抗ＨＡ抗体を使用するウエスタンブロッティングの結果を示す図（写真）。Ｄｏｘの存在下でＥＷＳ−ＦＬＩ１タンパク質が検出された。
【図５】ＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的不死化細胞（ＥＦＮ＃２）を移植したマウスの、Ｄｏｘ有り無しでの腫瘍形成を示す写真。ＥＦＮ＃２はＤｏｘの存在下でのみ免疫低下状態のマウスにおいて腫瘍を発生した（移植から１０週間後）。
【図６】Ｄｏｘ有り無しでのＥＦＮ＃２の移植から１０週間後の腫瘍重量を示す図。腫瘍発生はＤｏｘ投与に依存した。
【図７】構築されたＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的肉腫細胞株（ＳＣＯＳ＃２及びＳＣＯＳ＃１２）の細胞増殖アッセイの結果を示す図。肉腫細胞の増殖はＥＷＳ−ＦＬＩ１発現に依存し、Ｄｏｘ曝露を受けていない肉腫細胞はＤｏｘの除去から３日後に増殖を失い始めた。
【図８】細胞外領域関連遺伝子及びマトリックス関連遺伝子がＳＣＯＳ＃２細胞においてＤｏｘの除去から７２時間後に発現上昇することが遺伝子オントロジー濃縮分析により示された。それらの発現上昇した遺伝子は１．５を超えるホールド変化及び１．０Ｅ−４未満のｐ値のカットオフポイントにより選択された。上位５つの濃縮クラスターが明らかにされている。
【図９】骨形成関連遺伝子及び軟骨形成関連遺伝子のスキャッタープロット分析。骨形成関連遺伝子及び軟骨形成関連遺伝子がＳＣＯＳ＃２細胞においてＤｏｘの除去から７２時間後に発現上昇することが明らかになった。
【図１０】アルカリホスファターゼ染色の結果を示す図（写真）。上は顕微鏡写真。Ｄｏｘの除去から５日後に肉腫細胞はアルカリホスファターゼ活性を示した。スケールバー、１００μｍ。
【図１１】Ｄｏｘの除去から３８日後の細胞の顕微鏡写真（下はＤｏｘ有）。Ｄｏｘの除去から３８日後にゆっくりと増殖する不均一な細胞が観察された。
【図１２】Ｄｏｘの除去から３８日後にｑＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡ発現レベルを測定した結果を示す図（左はＤｏｘ有）。Ｄｏｘの除去から３８日後に細胞はより高い骨分化関連遺伝子の発現を示した。データは平均値±ＳＤとして提示されている。Ｄｏｘ処理細胞の発現レベルを１に設定した。ｑＲＴ−ＰＣＲではＳｏｓｔ、Ｆｇｆ２３及びＭｅｐｅはＤｏｘ処理試料中に検出不可能であった。そのため、代わりにＤｏｘ非処理細胞の発現レベルを１に設定した。
【図１３】ＨＥ染色、Ｋｉ６７免疫組織化学およびAlizarin red染色の結果を示す図（写真）。Ｄｏｘの除去により小青色細胞集団の顕著な減少及び骨形成の増加が引き起こされたことがＨＥ染色により示されている。Ｋｉ６７免疫組織化学によりＤｏｘによる肉腫における活発細胞増殖が示される。スケールバー、５０μｍ（Ｄｏｘ処理）、２００μｍ（Ｄｏｘ非処理、上）、５０μｍ（Ｄｏｘ非処理、下）。
【図１４】肉腫細胞株ＳＣＯＳ＃２を使用するインビボ腫瘍形成アッセイの結果を示す図。３週目にＤｏｘ処理を中止し、７週目にマウスを殺処理した。
【図１５】得られたｉＰＳ細胞様細胞の顕微鏡写真。再プログラム化転写因子を導入することにより肉腫細胞からｉＰＳ細胞様細胞を構築した。
【図１６】肉腫由来ｉＰＳ細胞様細胞における多能性関連遺伝子の発現レベルを示すｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフ。多能性関連遺伝子の発現レベルがＥＳ細胞のものと同等であることが明らかにされた。データは平均値±ＳＤとして提示されている。ＥＳ細胞の発現レベルを１に設定した。
【図１７】バイサルファイトシーケンシング分析の結果を示す図。肉腫由来ｉＰＳ細胞様細胞においてＮａｎｏｇプロモーターとＯｃｔ３／４遠位エンハンサー領域が脱メチル化されていることが明らかにされた。白丸と黒丸はそれぞれＣｐＧ部位における非メチル化シトシンとメチル化シトシンを表す。
【図１８】神経組織、軟骨組織、円柱上皮の切片の染色結果を示す写真。肉腫ｉＰＳ細胞は免疫低下状態のマウスの皮下組織中に外胚葉組織、中胚葉組織及び内胚葉組織から構成されるテラトーマを生じた。スケールバー、５０μｍ。
【図１９】インビトロ骨分化の模式図。
【図２０】骨分化関連遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図。骨分化実験において野生型ＥＳ細胞（Ｖ６．５）又はＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導性ＥＳ細胞（Ｒｏｓａ−ｒｔＴＡ／Ｒｏｓａ：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１−ｉｒｅｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ）を対照として使用した。骨分化関連遺伝子の発現について骨分化中の０日目と１７日目の肉腫由来ｉＰＳ細胞と対照ＥＳ細胞を調査した。３回の独立した実験の平均値±ＳＤが示されている。１７日目のＥＳ細胞の平均発現レベルを１に設定した。
【図２１】ｉＰＳ細胞様細胞におけるアリザリンレッド染色の結果を示す写真。比較にＥＳ細胞を示した。明るい赤みがかったオレンジ色に染色された細胞外カルシウム沈着物が明らかになった（骨分化誘導から２８日後）。スケールバー、２０μｍ。
【図２２】テラトーマ中の類骨産生を有する骨形成領域の組織学的分析の結果を示す写真。肉腫ｉＰＳ細胞に由来する類骨産生細胞は対照ＥＳ細胞に由来するものよりも高い細胞増殖活性を有することがＫｉ６７免疫組織化学により明らかにされた。スケールバー、５０μｍ。
【図２３】肉腫ｉＰＳ細胞又は対照ＥＳ細胞に由来するテラトーマ中の骨形成領域のＫｉ６７陽性率を示す図。ＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導性ＥＳ細胞（Ｒｏｓａ−Ｍ２ｒｔＴＡ／Ｃｏｌ１ａ１：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１−ｉｒｅｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ）を対照として使用した。２つの独立した肉腫由来ｉＰＳ細胞テラトーマ中の６つの独立した骨形成領域又は２つの独立したＥＳ細胞テラトーマ中の９つの独立した骨形成領域の平均値±ＳＤが示されている。統計学的分析にはマン・ホイットニーのＵ検定を使用した。
【図２４】Ｄｏｘ有り無しでのｉＰＳ細胞又は対照ＥＳ細胞の増殖を示すグラフ。ＥＷＳ−ＦＬＩ１発現は未分化多能性幹細胞の増殖を促進しない。
【図２５】インビトロ骨分化及びＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導の模式図。誘導された骨形成細胞（骨分化誘導から１７日後）を後にＤｏｘで２週間処理した、又は処理しなかった。
【図２６】Ｄｏｘ有り無しでの各細胞の増殖を示す写真。肉腫ｉＰＳ細胞由来骨形成細胞はＤｏｘ処理によって顕著に細胞増殖するが、Ｒｏｓａ−Ｍ２ｒｔＴＡ／Ｒｏｓａ：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１  ＥＳ細胞由来骨形成細胞はそのようにならなかった。
【図２７】ＥＷＳ−ＦＬＩ１発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示すグラフ。誘導された骨形成細胞におけるＥＷＳ−ＦＬＩ１発現はＤｏｘ曝露によって検出可能であった。
【図２８】肉腫ｉＰＳ細胞由来骨形成細胞を移植されたマウスの、Ｄｏｘ有り無しでの腫瘍形成を示す写真。ＥＷＳ−ＦＬＩ１を有するｉＰＳ細胞から誘導された骨形成細胞はＤｏｘの存在下でのみ免疫低下状態のマウスにおいて腫瘍を発生した（処理から３〜７週間後）。
【図２９】腫瘍組織のＨＥ染色の結果を示す写真（左はＤｏｘなし）。組織学的に見ると、発生した腫瘍は小細胞性骨肉腫に類似した小円形青色細胞から構成される肉腫であった。スケールバー、２００μｍ（左）及び５０μｍ（右）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞＞
本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞は、骨髄間質細胞に由来し、誘導型転写制御配列を含むプロモーターの制御下に置かれたEWSキメラ遺伝子が染色体上に導入され、EWSキメラタンパク質の発現時に、生育可能であり、無限増殖能を有する細胞である。
【００１５】
本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞は、哺乳動物由来の骨髄間質細胞に、誘導型転写制御配列を含むプロモーターの制御下に置かれたEWSキメラ遺伝子を、染色体に組み込む形で導入し、EWSキメラタンパク質を発現させた状態で生育でき、不死化した細胞を選別することで得ることができる。
【００１６】
骨髄間質細胞は、様々な供給源から得ることができる。骨髄間質細胞の供給源およびそれらの供給源から骨髄間質細胞を得る方法及びその培養方法は、従来技術に記載されている（例えば、Friedenstein et al.、1987, Cell Tissue Kinetics 20 : 263-272 ; Castro-Malaspina et al.、1980, Blood 56 : 289-301 ; Mets et al.、1981, Mech. Ageing Develop. 16 : 81-89 ; Piersma et al.、1985, Exp. Hematol. 13 : 237-243 ; Caplan, 1991, J.Orthoped.Res. 9:641-650; Prockop,1997, Science 276:71-74 ; Beresford et al.、1992, J.Cell Sci. 102:341-351; Cheng et al.、1994, Endocrinology 134:277-286 ; Rickard et al.、1994, Develop. Biol. 161: 218-228 ; Clark et al.、1995, Ann. N. Y. Acad. Sci. 770 : 70-78)。
【００１７】
骨髄間質細胞は、任意の骨髄から得ることができ、例えば、ヒトのドナーの腸骨稜の吸引によって得られる骨髄からの細胞を含む。ドナーから骨髄を得る方法は周知技術である。さらに、骨髄間質細胞は商業的に得ることもでき、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ及びウマから単離された骨髄間質細胞は、Cognate Bioservices社（Baltimore, MD）から入手可能である。
【００１８】
EWSキメラ遺伝子としては、Cancer Res. 2000 Mar 15;60(6):1536-40 等に記載されるようにEWS-FLI 、EWS-ERG、EWS-ETV1、EWS-FEVなどが例示されるが、好ましくはEWS-FLI1である。
EWS-FLI1としてはヒト由来のEWS-FLI1が好ましく、例えば、配列番号１の塩基番号１〜１４９４の塩基配列によってコードされる、EWS（配列番号２）とFLI1（配列番号３）の融合タンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。ただし、細胞を癌化させてユーイング肉腫ファミリー腫瘍を誘導する機能を維持する限り、上記アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
【００１９】
誘導型転写制御配列としては、薬剤等の刺激に応答してプロモーターからの転写を開始させる配列が挙げられ、例えば、Tetオペレーター配列、Cumateオペレーター配列（System Biosciences社：SparQ Cumate Switch Inducible System）、γオペレーター配列（特表２００６−５２６９９１）などが挙げられる。
【００２０】
Tetオペレーター配列はリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子が結合する配列（テトラサイクリン応答因子：TRE）であり、細胞に添加されたドキシサイクリン（Dox）などのリバーステトラサイクリンに依存して宿主細胞から発現したリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子が結合し、その下流に連結された遺伝子の発現が誘導される。
【００２１】
リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子としては、Clonetech社のTet-On Systemに含まれる、変異型Tetリプレッサータンパク質（tTetR）とVP16活性化ドメイン（AD）より構成される融合タンパク質が例示され、Tetオペレーター配列を用いる際には遺伝子が導入される宿主細胞として、当該タンパク質を発現した細胞を用いる。
【００２２】
誘導型転写制御配列の下流には哺乳動物細胞で機能し得るプロモーターに連結されたEWSキメラ遺伝子が配置される。哺乳動物細胞で機能し得るプロモーターとしては、β-アクチンプロモーター、CMVプロモーター、CAG（CAGGS）プロモーター等が例示されるが、プロモーターの種類は多く知られており、特にこれらに限定されない。
【００２３】
なお、遺伝子導入のための発現コンストラクトには、上記の誘導型転写制御配列、プロモーター、EWSキメラ遺伝子の他に、タグ配列（例えば、Flagタグ：配列番号４、HAタグ：配列番号５）、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー配列、リボソーム結合配列、発光タンパク質コード配列などが含まれてよい。
【００２４】
なお、EWSキメラ遺伝子と薬剤耐性遺伝子をTetオペロン制御下におくことで、ドキシサイクリン（Dox）投与によってEWSキメラ遺伝子と薬剤耐性遺伝子を同時に誘導可能になる。EWSキメラ遺伝子はがん遺伝子であるものの、特定の細胞種でのみ発がんに寄与し、多くの細胞腫において毒性をもたらすところ、腫瘍細胞をDox＋薬剤（ネオマイシンなど）存在下で培養することで、確実にEWSキメラ遺伝子で正に制御される細胞を選別できる。これにより、より確実にEWSキメラ遺伝子に依存した腫瘍細胞を得ることが可能になる。
【００２５】
染色体上への遺伝子導入の方法は特に制限されず、ウイルスベクターを用いる方法、プラスミドベクターを用いる方法、人工染色体を用いる方法などが挙げられるが、ウイルスベクターを用いる方法が好ましく、レンチウイルスベクターを用いる方法がより好ましい。
【００２６】
レンチウイルスベクターとしては、サル免疫不全ウイルスベクター、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）ベクター、ヒト免疫不全ウイルス（HIV、例えばHIV1またはHIV2）ベクター、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）ベクターなどを用いることができ、市販のレンチウイルスベクターを使用することもできる。
【００２７】
誘導型転写制御配列を含むプロモーターの制御下に置かれたEWSキメラ遺伝子を、哺乳動物由来の骨髄間質細胞に、染色体に組み込む形で導入し、その後、遺伝子発現誘導のための刺激物質を添加してEWSキメラタンパク質を発現させ、その状態で細胞を培養し、生育でき、不死化した細胞を選別することで本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞を得ることができる。ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞は、その増殖能に加え、染色体異常や腫瘍特異的遺伝子や細胞周期マーカー（例えばＫｉ６７）の発現などでも特徴づけられる。なお、本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞は株化されたものでもよい。
【００２８】
本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞をマウスやラットなどの非ヒト哺乳動物に移植することで、EWSキメラタンパク質の発現依存的にユーイング肉腫ファミリー腫瘍を生じるユーイング肉腫ファミリー腫瘍モデル動物を得ることができる。なお、移植部位や移植に用いる細胞の量は動物の体重や目的の表現型などに応じ適宜決定すればよい。
【００２９】
＜人工多能性幹（iPS）細胞＞
本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞を初期化することで、EWSキメラタンパク質の発現依存的にユーイング肉腫ファミリー腫瘍の表現型を呈する細胞に分化し得るiPS細胞を得ることができる。
【００３０】
iPS細胞は、ある特定の核初期化物質を、DNAまたはタンパク質の形態で本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞に導入することまたは薬剤によって当該核初期化物質の内在性のmRNAおよびタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676、K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872、J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920、M. Nakagawa et al.
(2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106、国際公開WO 2007/069666および国際公開WO 2010/068955）。核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b,Nanog, EsrrbまたはEsrrgが例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも1つ、2つもしくは3つ含む組み合わせであり、好ましくは4つを含む組み合わせである。
【００３１】
上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトcDNAのヌクレオチド配列並びに当該cDNAにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得できる。当業者は、当該cDNA配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
【００３２】
これらの核初期化物質は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって初期化対象の腫瘍細胞に導入してもよいし、あるいは、DNAの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって腫瘍細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell,
131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-62, 2009）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが挙
げられる。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など)、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、腫瘍細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる（Kaji, K. et al., (2009), Nature, 458: 771-775、Woltjen et al., (2009), Nature, 458: 766-770 、WO 2010/012077）。さらに、ベクターには、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルス（lymphotrophic herpes virus）、BKウイルスおよび牛乳頭腫（Bovine papillomavirus）の起点とその複製に係る配列を含んでいてもよい。例えば、EBNA-1およびoriPもしくはLarge TおよびSV40ori配列を含むことが挙げられる（WO 2009/115295、WO 2009/157201およびWO 2009/149233）。また、複数の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列の間は、IRESまたは口蹄病ウイルス（FMDV）2Aコード領域により結合されていてもよい（Science, 322:949-953, 2008およびWO 2009/0920422009/152529）。
【００３３】
核初期化に際して、iPS細胞の誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤[例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標) (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling activator（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell,
3, 132-135 (2008)）、LIFまたはbFGFなどの増殖因子、ALK5阻害剤（例えば、SB431542）（Nat. Methods, 6: 805-8 (2009)）、mitogen-activated protein kinase signaling阻害剤、glycogen synthase kinase-3阻害剤（PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、miR-291-3p、miR-294、miR-295などのmiRNA (R.L. Judson et al., Nat. Biotech., 27:459-461 (2009))、等を使用することができる。
【００３４】
薬剤によって核初期化物質の内在性のタンパク質の発現を上昇させる方法における薬剤としては、6-bromoindirubin-3'-oxime、indirubin-5-nitro-3'-oxime、valproic acid、2-(3-(6-methylpyridin-2-yl)-lH-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine、1-(4-methylphenyl)-2-(4,5,6,7-tetrahydro-2-imino-3(2H)-benzothiazolyl)ethanone HBr(pifithrin-alpha)、prostaglandin J2および prostaglandin E2等が例示される（WO 2010/068955）。
【００３５】
iPS細胞誘導のための培養培地としては、例えば(1) 10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12またはDME培地（これらの培地にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、(2) bFGFまたはSCFを含有するES細胞培養用培地、例えばマウスES細胞培養用
培地(例えばTX-WES培地、トロンボＸ社)または霊長類ES細胞培養用培地（例えば霊長類（ヒト＆サル）ES細胞用培地（リプロセル、京都、日本）、mTeSR-1）、などが含まれる。
【００３６】
培養法の例としては、たとえば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEMまたはDMEM/F12培地中で腫瘍細胞と核初期化物質 (DNAまたはタンパク質) を接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞 (たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等) 上にまきなおし、腫瘍細胞と核初期化物質の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培地で培養し、該接触から約30〜約45日またはそれ以上ののちにES細胞様コロニーを生じさせることができる。また、iPS細胞の誘導効率を高めるために、5-10％と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。
【００３７】
あるいは、その代替培養法として、フィーダー細胞 (たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等) 上で10％FBS含有DMEM培地（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日またはそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する腫瘍細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
【００３８】
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。
【００３９】
iPS細胞が得られたことはＮａｎｏｇ及びＯｃｔ３／４などの多能性関連遺伝子の発現やＮａｎｏｇプロモーター及びＯｃｔ３／４遠位エンハンサーなどの脱メチル化、またはテラトーマ形成などによって確認できる。
【００４０】
iPS細胞の骨細胞への分化誘導方法
前述のように得られたiPS細胞を培養し、骨細胞に分化させることでEWSキメラタンパク質の発現依存的にユーイング肉腫ファミリー腫瘍の表現型を呈する細胞を得ることができる。
【００４１】
iPS細胞の培養は公知の方法を用いることができる。接着培養でもよいし、浮遊培養でもよいし、フィーダー細胞を用いる培養でもよい。
【００４２】
iPS細胞を培養するための培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle’s
Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Doulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM)培地、Ham’s F12培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、αMEM培地である。さらに、培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、およびサイトカインを1つ以上含有しうる。
これにトリヨードサイロニンに例示される骨分化に必要な成分を加えればよい。骨分化の方法は、例えば、Nature 467, 285-290. 2010に記載されている。
【００４３】
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2〜5％である。
【００４４】
骨分化は、Ｒｕｎｘ２、Ｓｐ７、Ｐｔｈ１ｒ、Ｃｏｌ１ａ１及びＤｍｐ１などの骨分化関連遺伝子などの骨分化マーカーの発現や細胞の形態などで確認することができる。
【００４５】
＜スクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法の一つの態様は、EWSキメラタンパク質の発現誘導下で培養された、上記本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞に試験化合物を添加する工程、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞の増殖能または腫瘍表現型を調べる工程、及び、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞の増殖能を低下させること、または腫瘍表現型を減少させることを指標として、試験化合物をユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療薬候補化合物として選択する工程を含む。化合物無添加時または対照化合物添加時と比較して腫瘍細胞株の増殖能または腫瘍表現型が低下または減少すればその試験化合物を腫瘍治療薬候補化合物として選択できる。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、上記本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞由来iPS細胞を骨細胞に分化させる工程、EWSキメラタンパク質の発現を誘導する工程、得られたEWSキメラタンパク質を発現するユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞に試験化合物を添加する工程、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞の増殖能または腫瘍表現型を決定する工程、及び、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞の増殖能を低下させること、または腫瘍表現型を減少させることを指標として、試験化合物をユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療薬候補化合物として選択する工程を含む。なお、EWSキメラタンパク質の発現誘導と同時に化合物を加えてもよい。
【００４７】
腫瘍細胞の増殖能は公知の方法で調べることができる。また、腫瘍細胞の表現型としては、細胞形態、腫瘍マーカー遺伝子やＫｉ６７などの細胞周期関連遺伝子の発現、腫瘍タンパク質の発現等で調べることができ、遺伝子やタンパク質の発現レベルは公知の方法で決定することができる。
【００４８】
また、本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞を移植した非ヒト哺乳動物を用いてユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療薬のスクリーニングを行うこともできる。
例えば、本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞が移植された非ヒト哺乳動物においてEWSキメラタンパク質の発現を誘導し、得られたEWSキメラタンパク質を発現し、腫瘍を生じたユーイング肉腫ファミリー腫瘍モデル動物に試験化合物を投与し、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞のサイズや腫瘍表現型を決定し、該ユーイング肉腫ファミリー腫瘍のサイズを低下させること、または腫瘍表現型を減少させることを指標として、試験化合物をユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療薬候補化合物として選択する、という態様が例示される。
【００４９】
さらに、本発明のスクリーニング方法の他の態様は、上記本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞由来iPS細胞を、EWSキメラタンパク質が発現しない状態で試験化合物を添加した骨分化誘導培地で培養して骨細胞に分化させる工程、骨細胞への分化度を決定する工程、及び、該骨細胞への分化度を増加させることを指標として、試験化合物を骨分化促進物質として選択する工程を含む。本発明のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞由来iPS細胞はコントロール細胞に比べて骨分化が抑制されているので、これを用いて骨分化を指標として骨分化促進物質のスクリーニングを行うことができる。化合物無添加時または対照
化合物添加時と比較して骨分化を促進すればその試験化合物を骨分化促進物質として選択できる。骨分化促進物質は骨粗鬆症などの骨関連疾患の治療薬になりうるし、骨分化不全が肉腫形成に関わることが示されたため、骨分化促進物質は肉腫抑制物質の候補にもなりうる。なお、骨細胞への分化度は、Ｒｕｎｘ２、Ｓｐ７、Ｐｔｈ１ｒ、Ｃｏｌ１ａ１及びＤｍｐ１などの骨分化関連遺伝子などの骨分化マーカーの発現や細胞の形態などで確認することができる。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法においては、任意の被検物質を用いることができ、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、及び天然化合物が例示される。本発明において、被検物質はまた、（1）生物学的ライブラリ法、（2）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリ法、（3）「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリ法、及び（4）アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する合成ライブラリ法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、その他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の低分子化合物ライブラリに適用できる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67）。分子ライブラリの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993)Science 261: 1303-5; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059;Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994)J. Med. Chem. 37: 1233-51）。化合物ライブラリは、溶液（Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21を参照のこと）又はビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82-4）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、及び同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al.(1992)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9）若しくはファージ（Scott and Smith(1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; 米国特許出願第2002103360号）として作製され得る。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の態様には限定されない。
【００５２】
＜実験材料と方法＞
Ｒｏｓａ２６ターゲティング・ベクター、ＥＳ細胞ターゲティング、及びキメラマウスの作製
ユーイング肉腫細胞株ＴＣ１３５(Int J Cancer 128, 216-226. 2011)からＥＷＳ−ＦＬＩ１融合遺伝子をクローニングした。Ｒｏｓａ−Ｍ２ｒｔＴＡ／Ｒｏｓａ：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１系についてはＲｅｄ／ＥＴ  ＢＡＣ組換えシステムを使用してＴｅｔＯＰ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１−ＦＬＡＧ−ＨＡ−ｉｒｅｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｐＡ及び選択カセット（ＳＡ−ｒｏｘ−ＰＧＫ−ＥＭ７−ＢｓｄＲ−ｐＡ−ｒｏｘ−２ｐＡ）をＲｏｓａ２６  ＢＡＣのイントロン１に導入した。得られたベクターをＲｏｓａ２６−Ｍ２ｒｔＴＡアレルを有するＫＨ２  ＥＳ細胞(Genesis 44, 23-28. 2006)に電気穿孔法で導入した。１５μｇ／ｍｌのブラスチシジンＳ（Ｂｓｄ、フナコシ株式会社）を含有するＥＳ培地でＥＳ細胞を培養した。Ｂｓｄ耐性コロニーを回収し、増殖させた。ＥＳクローンが正確にターゲットされたことをサザンブロッティングにより確認した。Ｒｏｓａ−Ｍ２ｒｔＴＡ／Ｃｏｌ１ａ１：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１系についてはＥＷＳ−ＦＬＩ１−ＦＬＡ
Ｇ−ＨＡ−ｉｒｅｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｐＡ配列をｐＢＳ３１に挿入し、それを上述のようにＫＨ２  ＥＳ細胞に電気穿孔法で導入した。両方の系で胚盤胞注入によりキメラマウスを得た。
【００５３】
レンチウイルスベクターの構築、レンチウイルスの感染及び細胞培養
ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性レンチウイルスベクターを構築するため、Ａｄｄｇｅｎｅから入手したｐＥＮ−ＴｍｉＲＣ３及びｐＳＬＩＫ−Ｎｅｏレンチウイルスベクタープラスミドを改変した。まず、ｐＥＮ−ＴｍｉＲＣ３をＳｐｅＩとＸｈｏＩで消化してＥＷＳ−ＦＬＩ１−ＦＬＡＧ−ＨＡをｔｅｔＯＰ−ｍＣＭＶプロモーターの下流にライゲーションした。その後、ｉｒｅｓ−ＮｅｏＲカセットをＨＡタグの３’側にライゲーションし、続いてｐＳＬＩＫ−ＮｅｏからＵｂｉＣ−ｒｔＴＡ３−ｉｒｅｓ−ＮｅｏＲ配列を切り出した。ｐＥＮ−ＴｍｉＲＣ３（ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１−ｉｒｅｓ−Ｎｅｏ）とｐＳＬＩＫ（ＵｂｉＣ−ｒｔＴＡ３−ｉｒｅｓ−Ｎｅｏ無し）との間のＬＲ組換えの後に、ｐＳＬＩＫ−ＴｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１−ｉｒｅｓ−Ｎｅｏベクターを得た。
【００５４】
Nat Protoc 4, 102-106. 2009に報告されたようにして、 ３〜４週齢のＲｏｓａ２６−Ｍ２ｒｔＴＡマウス(Genesis 44, 23-28. 2006)から骨髄間質細胞を得た。骨髄細胞の採取から３〜４日後に培地を交換することにより非付着細胞（造血細胞）を除去し、付着細胞にレンチウイルスを感染させた。その後、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ナカライテスク株式会社）及び２μｇ／ｍｌのＤｏｘ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社）で細胞を２か月間培養し、ＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的不死化細胞を選択した。同じ培地を用いて骨肉腫細胞株、ＳＣＯＳ＃２及びＳＣＯＳ＃１２を維持した。
【００５５】
インビボ実験
Ｒｏｓａ−Ｍ２ｒｔＴＡ／Ｒｏｓａ：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１マウス及び肉腫細胞を接種された免疫低下状態のマウスを２ｍｇ／ｍｌのＤｏｘ含有水と１０ｍｇ／ｍｌのショ糖で処理した。早期の致死性のため、より低い濃度のＤｏｘ（１００μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ）でＲｏｓａ−Ｍ２ｒｔＴＡ／Ｃｏｌ１ａ１：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１マウスを処理した。
【００５６】
ｉＰＳ細胞の誘導及び維持
初期化因子を含むレトロウイルスベクター（ｐＭＸ−ｈＯＣＴ３／４、ｐＭＸ−ｈＳＯＸ２、ｐＭＸ−ｈＫＬＦ４及びｐＭＸ−ｈ−ｃＭＹＣ；Ａｄｄｇｅｎｅ）を利用することによりｉＰＳ細胞誘導を行った。ヒト組換えＬＩＦ（和光純薬工業株式会社）、２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び５０μｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）を添加したＥＳ細胞培地の中で初期化因子誘導性肉腫細胞を培養し、ＬＩＦ、１μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）を添加したＥＳ細胞培地でそれらの構築されたｉＰＳ細胞を維持した。
【００５７】
ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙプラスミニキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用してＲＮＡを抽出した。最大で１μｇまでのＲＮＡをｃＤＮＡへの逆転写反応に使用した。Ｇｏ−ＴａｑグリーンマスターミックスとＧｏ−Ｔａｑ  ｑＰＣＲマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をそれぞれ使用してＲＴ−ＰＣＲと定量的リアルタイムＰＣＲを行った。β−アクチンにより転写物レベルを標準化した。
【００５８】
ウエスタンブロット分析
５００μｌのＲＩＰＡ溶解緩衝液の中に培養細胞を採取し、タンパク質濃度を測定した。
２×ＳＤＳを使用してタンパク質を９５℃で５分間変性処理した。総計で２０μｇの変性タンパク質を１０％のＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルに負荷し、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ  ＰＶＤＦメンブレン、ＧＥヘルスケア社）に転写した。次の抗体を使用するイムノブロッティングによりタンパク質を検出した：抗ＨＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社；希釈度１：６００）、抗βアクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社；希釈度１：１０００）。視覚化のためにＰｉｅｒｃｅ  ＥＣＬプラス・ウエスタンブロッティング基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用し、検出にＬＡＳ４０００（ＧＥヘルスケア社）を使用した。
【００５９】
組織学的分析及び免疫組織化学
全ての組織試料及び腫瘍試料を４％パラフォルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋した。標準的プロトコルを用いてヘマトキシリンとエオシンにより切片を染色した。免疫組織化学について、使用した抗体は抗ＨＡ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；希釈度１：２００）と抗Ｋｉ６７（ＳＰ６）（Ａｂｃａｍ社；希釈度１：１５０）であった。
【００６０】
免疫細胞化学
ＰＢＳで培養細胞を洗浄し、２％パラフォルムアルデヒドにより室温で１０分間固定した。免疫細胞化学について、使用した抗体は抗ｐ５３（Ａｂｃａｍ社；希釈度１：２００）と抗ｐ２１（ＨＵＧＯ２９１）（Ａｂｃａｍ社；希釈度１：５００）であった。
【００６１】
細胞増殖アッセイ
肉腫細胞及びＥＳ／ｉＰＳ細胞をそれぞれ５×１０4細胞／ウェルと１×１０5細胞／ウェルの密度で１２ウェル培養プレートに播種した。実験を三回行い、各試料を２回測定した。自動細胞計測器（ＴＣ１０（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により細胞数を測定した。
【００６２】
異種移植アッセイ
ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ及びＪａｐａｎ  ＳＬＣよりそれぞれ購入したＮＯＤ／ＳｈｉＪｉｃ−ｓｃｉｄ  Ｊｃｌマウス又はＢＡＬＢ／ｃＳＬＣ−ｎｕ／ｎｕマウスに総計で３×１０6個のＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的不死化細胞、ＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的肉腫細胞、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を移植した。
ＮＯＤ／ＳｈｉＪｉｃ−ｓｃｉｄ  ＪｃｌマウスにＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的不死化細胞を接種し、それらのマウスを移植から１０週間後に殺処理した。ＢＡＬＢ／ｃＳＬＣ−ｎｕ／ｎｕマウスの皮下組織にＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的骨肉腫細胞を接種した。毎週デジタル式ノギスにより腫瘍サイズを測定し、次のように腫瘍体積を計算した：体積＝幅２×長さ÷２。ＢＡＬＢ／ｃＳＬＣ−ｎｕ／ｎｕマウスにＥＳ細胞／ｉＰＳ細胞を移植し、３〜４週間後にテラトーマを得た。
【００６３】
ＥＳ細胞／ｉＰＳ細胞の骨形成系列へのインビトロ分化
Nature 467, 285-290. 2010に記載されるインビトロ骨分化プロトコルをわずかに改変して用いた。具体的には、ＥＳ分化培地（ＩＭＤＭ、１５％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスコルビン酸、トランスフェリン、チオグリセロール）を含む９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｓｐｈｅｒｅ、Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中に５０００個のＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を２日間培養した。２日目にレチノイン酸を添加した（終濃度、１０-6Ｍ）。５日目に胚様体を収集し、６ウェル組織培養ディッシュに移し、骨分化培地（αＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、２ｎＭのトリヨードサイロニン、ＩＴＳ）中で培養した。一日おきに培地を交換した。１７日目にＲＮＡを抽出し、誘導した骨形成細胞の骨形成遺伝子の発現を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより確認した。２８日目にアリザリンレッド染色を行った。
【００６４】
ＡＬＰ染色
ＰＢＳで培養細胞を洗浄し、固定し、そして製造業者のプロトコルに従ってＡＬＰ染色キット（Ｓｉｇｍａ）で染色した。
【００６５】
老化関連β−ｇａｌ染色
ＰＢＳで培養細胞を洗浄し、固定し、そして製造業者のプロトコルに従って老化β−ガラクトシダーゼ染色キット（９８６０Ｓ番、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）で染色した。
【００６６】
アリザリンレッド染色
ＰＢＳで培養細胞を洗浄し、４％パラフォルムアルデヒドにより室温で５分間固定した。固定した細胞を脱イオン水で数回洗浄し、アリザリンレッド染色溶液（アリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ、Ａ５５３３）２％、ＮＨ4ＯＨによりｐＨ４．２に調節）中で５分間染色した。同様に、脱パラフィン化切片をアリザリンレッド染色溶液中で５分間染色した。
【００６７】
レンチウイルス組込み部位の検出
Stem Cells 27, 300-306.に記載される方法をわずかに改変した方法でレンチウイルス組込み部位を調べた。ＳＣＯＳ＃２から抽出したゲノムＤＮＡをウルトラソニケーター（Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｅ２１０）により５００〜８００ｂｐの断片に消化した。ＬＣ１とＬＣ２をアニーリングして得たリンカーカセットをそれらの消化されたゲノムＤＮＡ断片に結合した。その後、ＡＰ１＿ＦとｐＳＬＩＫ１＿Ｒのプライマーセットを用いて最初のＰＣＲを行い、ＡＰ２＿ＦとｐＳＬＩＫ２＿Ｒのプライマーセットを用いてネステッドＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＴＡクローニング法によりｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、ｓｅｑ＿ＬＴＲ＿Ｒプライマーを用いて３５００ｘＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により挿入断片のＤＮＡ配列を分析した。得られた配列をＢＬＡＳＴで調査した。
【００６８】
アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション
ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ゲノムＤＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３マウスゲノムＣＧＨマイクロアレイキット（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用してアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション分析を行い、Ａｇｉｌｅｎｔゲノミック・ワークベンチ７．０により解析を行った。
【００６９】
マイクロアレイ分析
ＲＮｅａｓｙミニキットを使用して調製された２００ｎｇの全ＲＮＡをＷＴ発現キット（Ａｍｂｉｏｎ社）によるｃＤＮＡ合成の対象とし、それにより生じたｃＤＮＡを断片化し、マウス・ジーン１．０ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後に製造業者の標準的プロトコルに従ってＧｅｎｅＣｈｉｐアレイを洗浄し、ＧｅｎｅＣｈｉｐフルイディクス・ステーション４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）によって染色し、そしてスキャナー３０００ＴＧシステム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）により検出した。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸソフトウェア（バージョン１３．０、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用することにより得られたデータを分析した。
【００７０】
バイサルファイトゲノムシーケンシング
製造業者のプロトコルに従ってＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ  Ｋｉｔ（商標）（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を使用してバイサルファイト処理を行った。使用したＰＣＲプライマーは追加情報に示されている。増幅産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、ＤＨ５αに形質転換した。コロニーを無作為に選択し、各遺伝子についてＭ１３フォワードプライマーとリバースプライマー
を用いてシーケンシングした。
【００７１】
＜参考例＞
ＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導性ＥＳ細胞及びマウスの構築
まず、遺伝子座ターゲティング法によるＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導性マウスモデルの構築を試みた。tet-inducibleカセットが組み込まれたＫＨ２系マウスとＲｏｓａ２６ターゲティング・ベクター（Cell 156, 663-677. 2014; J Clin Invest 123, 600-610. 2013；Genesis 44, 23-28. 2006)を利用することでＤｏｘ誘導性ＥＷＳ−ＦＬＩ１アレルを含有するＥＳ細胞２種類を構築した。それらのＥＳ細胞では、Ｒｏｓａ２６遺伝子座からリバーステトラサイクリン制御性トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）が発現し、一方ではＴｅｔオペレーター−ＥＷＳ−ＦＬＩ１−ｉｒｅｓ−ｍＣｈｅｒｒｙコンストラクトがＣｏｌ１ａ１遺伝子座の３’ＵＴＲに組み込まれており（Ｒｏｓａ−Ｍ２ｒｔＴＡ／Ｃｏｌ１ａ１：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１）、もう一方ではＲｏｓａ２６遺伝子座のイントロン１に組み込まれている（Ｒｏｓａ−Ｍ２ｒｔＴＡ／Ｒｏｓａ：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１）。インビトロでＤｏｘにより処理されると両方のＥＳ細胞がｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を発現した。また、ＥＳ細胞におけるその誘導性ＥＷＳ−ＦＬＩ１発現はｑＲＴ−ＰＣＲとウエスタンブロッティングによっても確認された。
【００７２】
次に上記ＥＳ細胞の胚盤胞注入を行い、キメラマウスを得た。Ｄｏｘ処理するとＥＷＳ−ＦＬＩ１はユーイング肉腫が多くの場合に生じる骨髄と骨皮質をはじめとするそのマウスの多種多様な器官と組織において発現した。幾匹かのマウス（Ｒｏｓａ−Ｍ２ｒｔＴＡ／Ｃｏｌ１ａ１：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１）はＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導直後に死亡し、それには分化異常に起因する腸細胞の異形性変化が伴った（１４匹のマウスのうちの８匹）。しかしながら、長期のＥＷＳ−ＦＬＩ１の誘導（最大で１３か月）にもかかわらず、どちらの系でもＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的腫瘍形成を全く観察しなかった（Ｒｏｓａ−Ｍ２ｒｔＴＡ／Ｃｏｌ１ａ１：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１マウス：ｎ＝１４、Ｒｏｓａ−Ｍ２ｒｔＴＡ／Ｒｏｓａ：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１マウス：ｎ＝９）。
【００７３】
＜実施例＞
Ｄｏｘ誘導性ＥＷＳ−ＦＬＩ１レンチウイルスシステムによるＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的不死化細胞の構築
成熟マウスにおけるＥＷＳ−ＦＬＩ１の誘導は肉腫発生に充分ではないことが我々の結果から示唆された。
そこで、Ｄｏｘ誘導性発現系を有するレンチウイルス性ＥＷＳ−ＦＬＩ１発現ベクターを作製した。Ｒｏｓａ２６−Ｍ２ｒｔＴＡ（３〜４週齢）の骨髄間質細胞にＴｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１−ｉｒｅｓ−Ｎｅｏカセット（図１）をレンチウイルスにより形質導入した。形質導入された骨髄細胞をＤｏｘ及びＧ４１８と共に培養した。その後、Ｄｏｘ及びＧ４１８を含有する培地の中で生存細胞を２か月間培養した。ＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導性アレルを有する大半の細胞は生き残らなかったが、我々はそれでも３つの不死化細胞株（ＥＦＮ＃２、ＥＦＮ＃１２及びＥＦＶ＃４；図２）を得た。それらの３株はＤｏｘに応答してＥＷＳ−ＦＬＩ１のｍＲＮＡとタンパク質を発現し（図３及び４）、Ｄｏｘ含有培養条件下で絶えず細胞増殖した（図２）。Ｄｏｘが除去されると２つの細胞株（ＥＦＮ＃２及びＥＦＮ＃１２）の形態が徐々に平坦な形にまで変化し、且つ、細胞増殖が阻害された。これらの観察は、我々がインビトロでマウス成熟骨髄間質細胞から２つのＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的不死化細胞株を得たことを示している。
【００７４】
ＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的不死化細胞はインビボで骨肉腫を形成した
ＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的不死化細胞株がインビボで腫瘍形成能を有するか確認するため、我々はＥＦＮ＃２及びＥＦＮ＃１２を免疫低下状態のマウスの皮下に移植した。接種から１０週間後に移植を受けたマウスはＤｏｘを投与されると両方の細胞株から腫瘍を発生し
たが（ＥＦＮ＃２については１６／１６、ＥＦＮ＃１２については２／４；図５及び６）、一方でＤｏｘ投与が無いと腫瘍形成はマウスにおいて観察されなかった（ＥＦＮ＃２について０／１６、ＥＦＮ＃１２について０／４；図５及び６）。それらの腫瘍はユーイング肉腫に類似した小円形青色細胞から構成されることが組織学的分析により明らかになった。腫瘍細胞は多くが類骨形成を示し、小細胞性骨肉腫であると考えられた。さらに、腫瘍細胞がＥＷＳ−ＦＬＩ１を発現し、増殖性細胞のマーカーであるＫｉ６７について陽性であることが免疫組織化学により示された（データを示さず）。
【００７５】
ＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的骨肉腫細胞株の構築
ＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導性骨肉腫の特性をさらに詳細に調べるため、我々はＥＦＮ＃２細胞及びＥＦＮ＃１２細胞を接種された免疫低下状態のマウスの皮下骨肉腫からＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的骨肉腫細胞株を構築した（それぞれＳＣＯＳ＃２及びＳＣＯＳ＃１２）。上記ＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的不死化細胞において観察されたように、それらの構築された骨肉腫細胞株はＤｏｘ濃度依存的にＥＷＳ−ＦＬＩ１を発現し、Ｄｏｘの存在下で活発に細胞増殖した（図７）。Ｄｏｘの除去後にＳＣＯＳ＃２及びＳＣＯＳ＃１２はそれらの形態を変化させ、細胞増殖を停止した。我々は同時にｐ５３及びｐ２１の発現の上昇を観察したが、老化関連β−ｇａｌ（ＳＡβｇａｌ）活性の上昇は観察されなかった。Ｄｏｘを再投与すると増殖を停止していた細胞が細胞増殖能を再獲得した。ＥＷＳ−ＦＬＩ１の消失によりそれらの骨肉腫細胞の細胞周期が停止することがこの可逆的な表現型から示唆された。
【００７６】
レンチウイルスのゲノム挿入が骨肉腫発生において役割を果たす可能性があることを考慮して、我々はＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導性骨肉腫細胞株（ＳＣＯＳ＃２）のウイルス組込み部位を決定した。我々は、肉腫発生の遺伝的駆動因子として作用する可能性が無い位置であるＣｄ１４の１３ｋｂ下流の遺伝子間領域に単一の組込みを特定した。
【００７７】
ＥＷＳ−ＦＬＩ１発現の消失により骨肉腫細胞の骨分化が促進された
ＥＷＳ−ＦＬＩ１の標的を調査するため、我々は次にＳＣＯＳ＃２及びＳＣＯＳ＃１２を使用してＥＷＳ−ＦＬＩ１発現性肉腫細胞とＥＷＳ−ＦＬＩ１非発現性肉腫細胞の間で遺伝子発現プロファイルを比較した。興味深いことに両方の細胞株においてＧＯ濃縮分析によりＤｏｘ処理ＥＷＳ−ＦＬＩ１発現性肉腫細胞と比較すると多くの場合に骨発生関連遺伝子及び軟骨発生関連遺伝子を含む細胞外マトリックス関連遺伝子及び細胞外領域関連遺伝子がＤｏｘ非処理肉腫細胞（７２時間）において著しく濃縮された（図８、９）。ユーイング肉腫細胞におけるｓｈＲＮＡによるＥＷＳ−ＦＬＩ１の長期ノックダウンにより骨形成系列、脂肪生成系列及び軟骨形成系列への細胞分化が引き起こされ、Cancer Cell 11, 421-429 2007などで示唆されるユーイング肉腫の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）起源と合致した。同様に、本研究ではＳＣＯＳ＃２及びＳＣＯＳ＃１２におけるＥＷＳ−ＦＬＩ１の短期の消失によりアルカリホスファターゼ活性の増加と共に骨分化の促進が引き起こされた（図１０）。ＥＷＳ−ＦＬＩ１の長期の消失の後にある分画の肉腫細胞はゆっくりと細胞増殖し、且つ、不均一な形態を示した（図１１）。ＥＷＳ−ＦＬＩ１の発現が中止された肉腫細胞はより高いレベルの骨分化マーカー遺伝子（図１２）、並びに軟骨形成遺伝子と脂肪生成遺伝子を発現した。
【００７８】
ＳＣＯＳ＃２及びＳＣＯＳ＃１２はＤｏｘを投与された免疫低下状態のマウスにおいて前述の小細胞性骨肉腫を形成した（図１３）。これらの肉腫細胞はＫｉ６７免疫組織化学によると高い細胞増殖活性を有した（図１３）。ＳＣＯＳ＃２及びＳＣＯＳ＃１２の両方の増殖がＥＷＳ−ＦＬＩ１発現に依存するというインビトロでの知見と一致して、前記皮下腫瘍はインビボでＤｏｘの除去後に増殖を停止又は遅延化した（図１３及び１４）。Ｄｏｘが除去された腫瘍は類骨組織及び成熟骨組織と少数の青色細胞から構成されることが組織学的分析により明らかになった（図１３）。これらの結果はＥＷＳ−ＦＬＩ１の消失に
よりインビボで骨肉腫細胞の骨分化が促進されることを表した。以上より、我々の結果は骨肉腫細胞の末期分化の抑制に対するＥＷＳ−ＦＬＩ１発現の役割を明らかにした。
【００７９】
ＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導性骨肉腫細胞からのｉＰＳ細胞の構築
ＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導性肉腫発生に追加的遺伝子異常が必要とされる可能性があることを考慮すると、ＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導性肉腫細胞から多能性幹細胞を構築することにより、肉腫発生に対するＥＷＳ−ＦＬＩ１発現以外の遺伝子異常の影響を研究するためのユニークなツールが提供されるはずである。我々はＳＣＯＳ＃２及びＳＣＯＳ＃１２からのｉＰＳ細胞の構築を試みた。それらの肉腫細胞からの単一細胞クローニングの後にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃＭＹＣをそれらの肉腫細胞に導入し、ＥＷＳ−ＦＬＩ１の発現が無い状態でｉＰＳ細胞様コロニーを得た（コロニー形成効率は０．０００９％であった。図１５）。これらのｉＰＳ細胞様細胞はＥＳ細胞と同等のレベルでＮａｎｏｇ及びＯｃｔ３／４などの多能性関連遺伝子を発現した（図１６）。同様に、ｉＰＳ細胞様細胞の全体的遺伝子発現パターンは通常のＥＳ細胞及び対照ｉＰＳ細胞のパターンと同様であった。
【００８０】
前記肉腫由来ｉＰＳ細胞様細胞はＮａｎｏｇプロモーターとＯｃｔ３／４遠位エンハンサーの両方の脱メチル化を示した（図１７）。これはこれらの細胞がエピジェネティック再構成を経て多能性を獲得したことを表している。細胞再プログラム化の後期ステージに生じる前記外来性４因子の発現のサイレンシングが幾つかのｉＰＳ細胞様クローンにおいて観察された。これはこれらの細胞が充分に再プログラム化されたことを示唆している。次に我々はアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイＣＧＨ）を行い、前記単一細胞由来肉腫細胞が広範な染色体異常を有していることを発見した。複数の肉腫由来ｉＰＳ細胞様細胞が幾つかの同一の染色体異常を有しており、これはこれらのｉＰＳ細胞様クローンが前記親肉腫細胞から得られたことを確認するものである。これらの肉腫由来ｉＰＳ細胞様細胞は胚盤胞注入により成熟キメラマウスになる能力を喪失しており、おそらくはこれはＣＧＨ分析において観察された広範な遺伝子異常のためである。しかしながら、肉腫由来ｉＰＳ細胞様細胞は免疫低下状態のマウスの皮下組織に接種されると３種類の異なる胚葉へ分化する細胞から構成されるテラトーマを形成した（図１８）。これはそれらの細胞が多能性を有することを示している。これらの結果はＥＷＳ−ＦＬＩ１誘導性骨肉腫細胞からのｉＰＳ細胞の作製に成功したことを示している。
【００８１】
肉腫由来ｉＰＳ細胞はＥＷＳ−ＦＬＩ１発現と無関係に骨分化異常を示す
ＥＷＳ−ＦＬＩ１が消失したときの肉腫細胞の骨分化の増加からＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的骨肉腫が骨形成細胞から生じる可能性が提起された。したがって、ＥＷＳ−ＦＬＩ１の発現が無い状態で多能性幹細胞からインビトロで前記肉腫の想定起始細胞である骨形成細胞の誘導を試みた（図１９） (Nature 467, 285-290. 2010の方法参照)。対照ＥＳ細胞では骨分化刺激はＲｕｎｘ２、Ｓｐ７、Ｐｔｈ１ｒ、Ｃｏｌ１ａ１及びＤｍｐ１などの骨分化関連遺伝子を誘導した（１７日目）（図２０）。骨分化刺激は肉腫由来ｉＰＳ細胞においても骨分化の重要な転写因子であるＲｕｎｘ２の発現を誘導したが、Ｒｕｎｘ２の下流にある骨形成遺伝子の誘導はＥＷＳ−ＦＬＩ１の発現が無くても減少した（１７日目）（図２０）。骨分化誘導を延長したとき（２８日目）、アリザリンレッド染色により評価すると石灰化領域が全ての試料で検出された（図２１）。しかしながら、石灰化された面積は肉腫由来ｉＰＳ細胞よりも対照ＥＳ細胞で大きかった（図２１）。我々は免疫低下状態のマウスにおいてテラトーマを作製するために肉腫由来ｉＰＳ細胞のインビボ分化方法を用いた。肉腫由来ｉＰＳ細胞と対照ＥＳ細胞の両方がテラトーマを形成し、それらのテラトーマにはＥＷＳ−ＦＬＩ１の発現が無い状態で骨形成領域が含まれた（図２２）。肉腫ｉＰＳ細胞由来骨形成細胞のＫｉ６７陽性率は対照ＥＳ細胞由来骨形成細胞のものよりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１）（図２３）。まとめると、肉腫由来ｉＰＳ細胞はＥＷＳ−ＦＬＩ１発現と無関係に骨分化異常を示し、これはＥＷＳ−ＦＬＩ１融合以外の遺伝的変
化によっても骨分化が阻害され、増殖性始原細胞状態が維持されることを示唆している。
【００８２】
ＥＷＳ−ＦＬＩ１発現は肉腫−ｉＰＳ細胞由来骨形成細胞からの急速な肉腫発生を誘導した
肉腫発生に対するＥＷＳ−ＦＬＩ１発現と遺伝子異常に関連する分化異常との間の協同作用の分析を試みた。肉腫由来ｉＰＳ細胞と対照ＥＳ細胞（Ｒｏｓａ−Ｍ２ｒｔＴＡ／Ｒｏｓａ：：ｔｅｔＯ−ＥＷＳ−ＦＬＩ１）の両方においてＥＷＳ−ＦＬＩ１発現は未分化培養条件下で細胞増殖に何の促進効果も無い（図２４）。次に、肉腫由来ｉＰＳ細胞と対照ＥＳ細胞の骨分化をインビトロで誘導し、その後でＥＷＳ−ＦＬＩ１発現を誘導した（図２５）。骨分化プロトコルの１７日目に肉腫由来ｉＰＳ細胞と対照ＥＳ細胞に由来する骨形成前駆細胞をＤｏｘで処理した（図２５）。その結果、肉腫由来骨形成細胞のみが３１日目にＤｏｘに応答して顕著な細胞増殖をインビトロで示した（図２６及び２７）。これらの細胞の異種移植によりＤｏｘを投与されたマウスにおいてのみ腫瘍発生が生じた（図２８）。これらの異種移植腫瘍は小円形青色細胞から構成される肉腫であることが組織学的分析により明らかになった（図２９）。対照ＥＳ細胞に由来する骨形成細胞はインビボで明確なＥＷＳ−ＦＬＩ１依存的増殖を示さなかった（データを示さず）。これは肉腫発生が追加の異常を必要とすることを確認している。まとめると、これらの結果は肉腫ゲノムと関連する分化能異常がＥＷＳ−ＦＬＩ１発現時の骨形成細胞の急速な悪性形質転換に寄与することを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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