(57)【要約】      （修正有）【課題】ウイルスベクター、ウイルス粒子、並びにウイルス抗体、又はサンプルの中和抗体活性をスクリーニング、検出、分析、及び定量する方法及び使用の提供。【解決手段】ウイルスベクター、ベクター粒子、並びに方法及び使用は、多種多様なウイルスタイプ（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）血清型など）に適用可能である。具体的には、ベクター配列がリポータトランスジーンを含む組換えＡＡＶベクター配列において、前記リポータトランスジーンが、（ａ）一本鎖又は自己相補的ゲノムを含み、（ｂ）１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ（ｃ）１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている、組換えＡＡＶベクター配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクター配列がリポータトランスジーンを含む組換えＡＡＶベクター配列において、前記リポータトランスジーンが、（ａ）一本鎖又は自己相補的ゲノムを含み、（ｂ）１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ（ｃ）１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている、組換えＡＡＶベクター配列。
【請求項２】
ベクターがリポータトランスジーンを含む組換えＡＡＶベクターにおいて、前記リポータトランスジーンが、（ａ）一本鎖又は自己相補的ゲノムを含み、（ｂ）１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ（ｃ）１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされており、ここで、前記組換えＡＡＶベクターは、感染性組換えＡＡＶ粒子を含む、組換えＡＡＶベクター。
【請求項３】
ＡＡＶに結合する抗体を、分析又は検出若しくは測定するための方法において、以下：（ａ）組換えベクターを包膜する感染性組換えＡＡＶ粒子を用意するステップであって、（ｉ）前記ベクターが、リポータトランスジーンを含み、（ｉｉ）前記リポータトランスジーンが、一本鎖若しくは自己相補的ゲノムを含むと共に、（ｉｉｉ）前記リポータトランスジーンが、１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている、ステップ；
（ｂ）ＡＡＶに結合する抗体を分析又は検出するために、被験者からの生体サンプルを用意するステップ；
（ｃ）前記感染性組換えＡＡＶ粒子に感染し得る細胞を用意するステップ；
（ｄ）（ａ）の感染性組換えＡＡＶ粒子を（ｂ）の生体サンプルと接触させるか、又はインキュベートし、これによって得られる混合物（Ｍ）を生成するステップ；
（ｅ）得られた混合物（Ｍ）と（ｃ）の細胞を、（ａ）の前記感染性組換えＡＡＶ粒子が、前記細胞中の前記リポータトランスジーンに感染して、これを発現させることを可能にする条件下で、接触させるステップ；
（ｆ）前記リポータトランスジーンの発現を測定するステップ；並びに
（ｇ）（ｆ）の前記リポータトランスジーン発現を対照のリポータトランスジーンと比較するステップであって、前記対照が、（ｉ）ＡＡＶに結合する抗体が欠失した陰性（−）対照であるか、又は（ｉｉ）ＡＡＶに結合する既定量の抗体を有する陰性（−）対照であるかのいずれかであり、これによって、ＡＡＶに結合する抗体の存在を分析、又は検出若しくは測定するステップ
を含む方法。
【請求項４】
前記細胞が、哺乳動物細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、ＡＡＶ複製及び／又はゲノム組込みのためのヘルパー機能をコード化する核酸配列をもたらす、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又はこれらＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラのＶＰ１、ＶＰ２若しくはＶＰ３配列と９０％以上同一のＶＰ１、ＶＰ２若しくはＶＰ３配列を含むＡＡＶ粒子に感染し得る、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又は前記ＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラに感染し得る、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、哺乳動物細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、ＨＥＫ−２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、１０Ｔ１／２、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ、ＢＳＣ  １、ＢＳＣ  ４０、ＢＭＴ  １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、２９３、Ｂ−５０、３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ−２、Ｈｕｈ７、ＨＥＲ、ＨＥＫ、ＨＥＬ、又はＨｅＬａ細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、ＡＡＶ  Ｅ４遺伝子を発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、２Ｖ６．１１細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記リポータトランスジーンが、酵素、比色、蛍光、発光、化学発光、又は電気化学シグナルを賦与するタンパク質をコード化する、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記リポータトランスジーンが、ルシフェラーゼ遺伝子を含む、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ルシフェラーゼ遺伝子が、ウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ又はホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ遺伝子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記リポータトランスジーンが、βガラクトシダーゼ遺伝子、βグルコロニダーゼ遺伝子、又はクロラムフェニコールトランスフェラーゼ遺伝子を含む、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記リポータトランスジーンが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）又はアルカリホスファターゼをコード化する、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記組換えベクターが、ＡＡＶベクターを含む、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０ベクター、又はこれらＡＡＶベクターのいずれかのハイブリッド若しくはキメラを含む、請求項１７に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１９】
前記発現調節エレメントが、哺乳動物細胞において作動可能なプロモータ及び／又はエンハンサー核酸配列を含む、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記発現調節エレメントが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモータ／エンハンサー、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ／エンハンサー、ＳＶ４０プロモータ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモータ、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモータ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、又は伸長因子−１α（ＥＦ１−α）プロモータを含む、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記リポータトランスジーンが、一本鎖ゲノムである、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記リポータトランスジーンが、自己相補的ゲノムである、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記フランキングエレメントが、１つ又は複数のＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リポータトランスジーンが、１つ又は複数の５’及び／又は３’ＡＡＶ  ＩＴＲの間に位置する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記自己相補的リポータトランスジーンゲノムが、二本鎖逆方向反復配列構造を含む、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記フランキングエレメントが、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質によりプロセシングされていない突然変異又は変異型ＡＡＶ  ＩＴＲを含む、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記フランキングエレメントが、感染性組換えＡＡＶ粒子において、自己相補的リポータトランスジーンゲノムの二本鎖逆方向配列構造への形成を可能にするか、又はそれを促進する突然変異若しくは変異型ＡＡＶ  ＩＴＲを含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
前記突然変異、改変若しくは変異型ＡＡＶ  ＩＴＲが、欠失Ｄ配列、及び／又は突然変異、改変若しくは変異型末端分離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）部位（ＴＲＳ）配列を有する、請求項２７又は２８に記載のＡＡＶベクター又は方法。
【請求項２９】
前記突然変異、改変若しくは変異型末端分離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）部位（ＴＲＳ）配列が、ＣＧＧＴＴＧを含む、請求項２８に記載のＡＡＶベクター又は方法。
【請求項３０】
前記突然変異又は変異型ＡＡＶ  ＩＴＲが、前記リポータトランスジーンの自己相補的配列同士の間に位置する、請求項２７又は２８に記載のＡＡＶベクター又は方法。
【請求項３１】
前記突然変異又は変異型ＡＡＶ  ＩＴＲが、ＡＡＶ２ゲノム配列のヌクレオチド１２２〜１４４に対応するヌクレオチドが欠失したＡＡＶ２  ＩＴＲを含む、請求項２７又は２８に記載のＡＡＶベクター又は方法。
【請求項３２】
前記組換えベクターが、ＡＡＶの第１の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）；哺乳動物細胞において作動可能なプロモータ；リポータトランスジーン；ポリアデニル化シグナル；及び任意選択でＡＡＶの第２のＩＴＲを含む、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項３３】
前記組換えベクターが、哺乳動物細胞において、作動可能なプロモータの下流にリポータトランスジーンの挿入を可能にする制限部位を、また、該制限部位の下流に転写後調節エレメントを含み、ここで、前記プロモータ、前記制限部位及び前記転写後調節エレメントは、５’ＡＡＶ  ＩＴＲの下流に、また任意選択の３’ＡＡＶ  ＩＴＲの上流に位置する、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項３４】
前記感染性組換えＡＡＶ粒子が、霊長類に感染するＡＡＶ血清型を含む、請求項１若し
くは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項３５】
前記感染性組換えＡＡＶ粒子が、ヒト又はアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）に感染するＡＡＶ血清型を含む、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項３６】
前記感染性組換えＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又はこれらＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラのＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列と９０％以上同一であるＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列を含む、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項３７】
前記感染性組換えＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又は前記ＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラを含む、請求項１若しくは２に記載のＡＡＶベクター、又は請求項２に記載の方法。
【請求項３８】
前記生体サンプルが、霊長類サンプルを含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体サンプルが、血清を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項４０】
前記生体サンプルが、血漿を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項４１】
前記生体サンプルが、ヒト血清又はヒト血漿を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項４２】
前記被験者が、哺乳動物である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項４３】
前記被験者が、ヒトである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験者が、タンパク質の不十分な発現又は活性に起因する障害に罹患している、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項４５】
前記被験者が、異常、欠陥若しくは望ましくないタンパク質の発現又は活性に起因する障害に罹患している、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項４６】
前記被験者が、遺伝性疾患に罹患している、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項４７】
前記被験者が、遺伝子置換又は補充療法の候補である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項４８】
前記被験者が、遺伝子ノックダウン又はノックアウト療法の候補である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験者が、以下：肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、出血性疾患（例えば、抑制因子を伴う、若しくは伴わないＡ型血友病又はＢ型血友病）、サラセミア、血液疾患（例えば、貧血）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、リソソーム蓄積症、銅若しくは鉄蓄積障害（例えば、ウィルソン若しくはメンケス病）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、神経若しくは神経変性疾患、癌、１型若しくは２型糖尿病、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、
代謝異常（例えば、グリコーゲン蓄積症）、網膜変性疾患（例えば、ＲＰＥ６５欠損症、コロイデレミア、及びその他の眼病）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患、又は感染性ウイルス性（例えば、Ｂ型及びＣ型肝炎、ＨＩＶなど）、細菌性若しくは真菌性疾患に罹患している、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５０】
陰性（−）対照と比較した（ｆ）の前記リポータトランスジーン発現に基づいて、前記生体サンプル中のＡＡＶに結合する抗体の量を計算するステップをさらに含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５１】
前記生体サンプル中のＡＡＶに結合する抗体の前記量を、前記被験者に関連する報告書に入力又は算入するステップをさらに含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５２】
前記生体サンプル中のＡＡＶに結合する抗体の前記量をデータベースに入力し、これによって、データベースエントリー、すなわち前記被験者に関連するデータベースエントリーを作成するステップをさらに含む、請求項２又は２に記載の方法。
【請求項５３】
分析又は検出される前記抗体が、ＡＡＶキャプシドタンパク質に結合する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５４】
分析又は検出される前記抗体が、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又は前記ＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラに結合する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５５】
前記既定量の抗体が、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又は前記ＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラに結合する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５６】
前記生体サンプルを、（ａ）の感染性組換えＡＡＶ粒子との接触又はインキュベートの前に希釈する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５７】
前記生体サンプルの複数の希釈物を分析する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５８】
複数の異なる希釈率の前記生体サンプルを分析する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５９】
前記生体サンプルを、（ａ）の感染性組換えＡＡＶ粒子との接触又はインキュベートの前に、１：１〜１：５００に希釈する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６０】
前記生体サンプルを、（ａ）の感染性組換えＡＡＶ粒子との接触又はインキュベートの前に、１：５００〜１：５０００に希釈する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つの異なる希釈率の生体サンプルを分析する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞を、前記得られた混合物（ｄ）と６〜４８時間接触させる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞を、前記得られた混合物（ｄ）と１２〜３６時間接触させる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞を、前記得られた混合物（ｄ）と２０〜３０時間接触させる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞を、前記得られた混合物（ｄ）と約２４時間接触させる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６６】
前記リポータトランスジーンの発現を測定する前に、前記細胞を溶解させる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６７】
前記生体サンプルが、熱失活させてある、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６８】
前記生体サンプルが、約５０〜７０℃で約１５分〜１時間熱失活させてある、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６９】
前記生体サンプルが、約５６℃で約３０分間熱失活させてある、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項７０】
前記方法がｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される、請求項２又は３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年７月１２日に提出された“ＡＡＶ  ＶＥＣＴＯＲ  ＡＮＤ  ＡＳＳＡＹ  ＦＯＲ  ＡＮＴＩ−ＡＡＶ（ＡＤＥＮＯ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＶＩＲＵＳ）ＮＥＵＴＲＡＬＩＺＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ“と題する米国仮特許出願第６１／８４５，８４１号明細書に対する優先権を主張するものであり、この出願は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに対する体液性免疫は、血管内遺伝子移入に対する重要なバリアを賦与するため、ベクターが標的細胞に侵入する前に、ベクターのクリアランスが起こる。ＡＡＶキャプシドに対する抗体は、該ウイルスの天然の宿主であるヒトにおいて極めて優勢であり、キャプシドタンパク質配列の相同性の程度によって、多様な血清型と交差反応する。その結果、比較的低い力価の中和抗体（ＮＡｂ）であっても、ベクターが血流に導入された場合、ＡＡＶ導入を阻止することができる。反対に、眼への遺伝子移入、ＡＡＶベクターの脳又は直接的筋肉内送達は、ＮＡｂによる中和を受けにくいと考えられる。
【０００３】
ＡＡＶに対するＮＡｂは、滑液（ＳＦ）においてみいだされ、血清依存的様式でベクター媒介性形質導入を阻害する潜在力を有する。しかし、ＳＦ中の様々な血清型に対するＮａｂレベル、並びに血清中の抗ＡＡＶ  ＮＡｂ力価とＳＦとの関係については、ほとんどわかっていない。最後に、ＮＡｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＡＶ媒介性形質導入を効率的に阻止することができるため、ウイルスキャプシドに対する体液性免疫を克服する戦略は、遺伝子移入を成功させる上で極めて重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書には、ウイルスベクター、ウイルス粒子、並びにウイルス抗体、又はサンプルの中和抗体活性をスクリーニング、検出、分析、及び定量する方法及び使用を開示する。このようなウイルスベクター、ベクター粒子、並びに方法及び使用は、多種多様なウイルスタイプ（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）血清型など）に適用可能である。様々なウイルスベクター、ウイルス粒子、並びに抗体スクリーニング方法及び使用を用いて、抗ウイルス免疫グロブリン（ｇ）（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）をスクリーニング、検出、分析及び定量することができる。
【０００５】
こうしたスクリーニング、検出、分析及び定量から得られる結果を用いて、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）血清型を用いた（欠陥若しくは欠損遺伝子を置換若しくは補充するか、又は欠陥若しくは望ましくない遺伝子の発現をノックダウン若しくはノックアウトするための）遺伝子療法に関する被験者の適合性、又はベクタータイプ若しくは用量を決定することができる。例えば、被験者が、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）などの特定のウイルス血清型に対して抗体をほとんど、又は全く発現しなければ、被験者は、ＡＡ２媒介性遺伝子療法の好適な候補となり得る。被験者が、ＡＡＶ２などの特定のウイルス血清型に対して中程度若しくは実質的な量の抗体を発現する場合には、被験者は、ＡＡＶ２媒介性遺伝子療法、又はＢ細胞応答の薬理学的調節の薬剤若しくは方法と併用した該療法のためのＡＡＶ２ベクターの用量をより多く又はより多数回
必要とし得る。このように、そうでなければウイルスベクター遺伝子移入療法の理想的な候補ではなかった被験者における遺伝子移入を達成することができる。あるいは、入手可能であれば、非ＡＡＶ２ベクター（例えば、別のＡＡＶ血清型）をそのような被験者の遺伝子療法に使用することもできる。従って、ウイルスベクター投与は、存在するウイルス抗体（もしあれば）の存在若しくは非存在、タイプ及び／又は量（例えば、力価）に基づいてパーソナライズすることができると共に、ベクターは、所与の被験者ついて、該被験者におけるウイルス抗体の存在、タイプ及び量に基づいて選択することができる。
【０００６】
本発明によれば、組換えＡＡＶベクター配列、すなわちリポータトランスジーンを含むベクター配列が提供される。一実施形態では、組換えＡＡＶベクター配列は、リポータトランスジーンを含み、このリポータトランスジーンは、（ａ）一本鎖又は自己相補的ゲノムを含み、（ｂ）１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ（ｃ）１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている。
【０００７】
本発明によれば、ベクターが、リポータトランスジーンを含む、組換えＡＡＶベクターも提供される。一実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、リポータトランスジーンを含み、該リポータトランスジーンは、（ａ）一本鎖又は自己相補的ゲノムを含み、（ｂ）１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ（ｃ）１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている。特定の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、感染性組換えＡＡＶ粒子を含む。
【０００８】
本発明によれば、ＡＡＶに結合する抗体を、分析又は検出若しくは測定するための方法及び使用がさらに提供される。一実施形態では、方法又は使用は、以下を含む：Ａ）組換えベクターをキャプシドで包膜する感染性組換えＡＡＶ粒子を用意するステップであって、（ｉ）ベクターが、リポータトランスジーンを含み、（ｉｉ）リポータトランスジーンが、一本鎖若しくは自己相補的ゲノムを含むと共に、（ｉｉｉ）リポータトランスジーンが、１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている、ステップ；Ｂ）ＡＡＶに結合する抗体を分析又は検出するために、被験者からの生体サンプルを用意するステップ；Ｃ）前記感染性組換えＡＡＶ粒子に感染し得る細胞を用意するステップ；Ｄ）（Ａ）の感染性組換えＡＡＶ粒子を（Ｂ）の生体サンプルと接触させるか、又はインキュベートし、これによって得られる混合物（Ｍ）を生成するステップ；得られた混合物（Ｍ）と（Ｃ）の細胞を、（Ａ）の感染性組換えＡＡＶ粒子が、前記細胞中のリポータトランスジーンに感染して、これを発現させることを可能にする条件下で、接触させるステップ；リポータトランスジーンの発現を測定するステップ；並びに（ｆ）の前記リポータトランスジーン発現を対照のリポータトランスジーン発現と比較するステップであって、前記対照が、（ｉ）ＡＡＶに結合する抗体が欠失した陰性（−）対照であるか、又は（ｉｉ）ＡＡＶに結合する既定量の抗体を有するいずれかである、ステップ。前記（−）対照のリポータトランスジーン発現より大きい（ｆ）のリポータトランスジーン発現によって、生体サンプル中のＡＡＶに結合する抗体の存在を分析、又は検出若しくは測定する。ＡＡＶに結合する既定量の抗体のリポータトランスジーン発現と比較した（ｆ）のリポータトランスジーン発現によって、対照より多い、又は少ない生体サンプル中の抗体を分析、又は検出若しくは測定する。
【０００９】
本発明の特定の態様において、組換えベクターは、ＡＡＶベクターを含む。より具体的態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０ベクター、又はこれらＡＡＶベクターのいずれかのハイブリッド若しくはキメラを含む。
【００１０】
本発明の特定の態様では、本方法又は使用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。例えば、細胞は、感染性組換えＡＡＶ粒子とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触又はインキュベートしてもよい。
【００１１】
本発明の様々な実施形態において、分析、検出又は測定される抗体は、ウイルスエンベロープ又はキャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質に結合する。本発明の特定の態様では、分析、検出又は測定される抗体は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又はこれらＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラに結合する。
【００１２】
本発明の様々な実施形態では、ＡＡＶに結合する既定量の抗体は、任意のＡＡＶ血清型であってよい。本発明の具体的態様では、既定量の抗体は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又はこれらＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラに結合する。
【００１３】
本発明の様々な実施形態において、細胞は、霊長類（例えば、ヒト）細胞などの哺乳動物細胞を含む。本発明のより具体的態様では、細胞は、ＨＥＫ−２９３（例えば、２Ｖ６．１１）細胞、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、１０Ｔ１／２、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ、ＢＳＣ  １、ＢＳＣ  ４０、ＢＭＴ  １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、２９３、Ｂ−５０、３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ−２、Ｈｕｈ７、ＨＥＲ、ＨＥＫ、ＨＥＬ、又はＨｅＬａ細胞を含む。
【００１４】
別の態様では、細胞は、ＡＡＶ複製及び／又はゲノム組込みのためのヘルパー機能をコード化する核酸配列をもたらす。より具体的な態様では、細胞は、ＡＡＶ  Ｅ４遺伝子、及び／又はＡＡＶｒｅｐ若しくはｃａｐを発現する。
【００１５】
さらに別の態様では、細胞は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又はこれらＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラのＶＰ１、ＶＰ２若しくはＶＰ３配列と９０％以上同一のＶＰ１、ＶＰ２若しくはＶＰ３配列を含むＡＡＶ粒子に感染し得るか、又は前記細胞は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又は前記ＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラに感染し得る。
【００１６】
さらに別の態様では、細胞は、得られた混合物（Ｍ）と、６〜４８時間、１２〜３６時間、２０〜３０時間、又は約２４時間の期間にわたって接触させる。また別の態様では、リポータトランスジーンの発現を測定する前に、細胞を溶解させる。
【００１７】
本発明の様々な実施形態において、リポータトランスジーンは、酵素、比色、蛍光、発光、化学発光、又は電気化学シグナルを付与するタンパク質をコード化する。特定の態様では、リポータトランスジーンは、ウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ又はホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ遺伝子などのルシフェラーゼ遺伝子を含む。別の具体的態様では、リポータトランスジーンは、βガラクトシダーゼ遺伝子、βグルコロニダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ遺伝子を含む。別の具体的態様では、リポータトランスジーンは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）又はアルカリホスファターゼをコード化する。
【００１８】
本発明のさらに別の様々な実施形態では、リポータトランスジーンは、一本鎖ゲノムであるか、又はリポータトランスジーンは、自己相同的ゲノムである。本発明の別の態様では、自己相補的リポータトランスジーンゲノムは、二本鎖（又は二重螺旋）逆方向反復配列構造を含む。本発明のさらに別の態様では、自己相補的リポータトランスジーンゲノムは、ヘアピンループ構造を含む。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、ベクター又はベクター配列は、１つ（又は複数の）発現調節エレメント、例えば、哺乳動物細胞において作動可能なプロモータ及び／又はエンハンサー核酸配列を含む。本発明のまた別の実施形態では、ベクター又はベクター配列は、１つ又は複数のフランキングエレメント、例えば、１つ又は複数のＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。本発明のさらに別の態様では、リポータトランスジーンは、１つ又は複数の５’及び／又は３’ＡＡＶ  ＩＴＲなどの１つ又は複数のフランキングエレメントの間に位置する。
【００２０】
本発明のより具体的な実施形態では、ベクター又はベクター配列は、ＡＡＶの第１の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）；哺乳動物細胞において作動可能なプロモータ；リポータトランスジーン；ポリアデニル化シグナル；及び任意選択で、ＡＡＶの第２のＩＴＲを含む。本発明の特定の態様では、組換えベクター又はベクター配列は、哺乳動物細胞において、作動可能なプロモータの下流にリポータトランスジーンの挿入を可能にする制限部位を、また、該制限部位の下流に転写後調節エレメントを含む。本発明の別の特定の態様では、組換えベクター又はベクター配列は、哺乳動物細胞において、作動可能なプロモータの下流にリポータトランスジーンの挿入を可能にする制限部位を、また、該制限部位の下流に転写後調節エレメントを含む。特定の態様では、プロモータ、制限部位及び転写後調節エレメントは、５’ＡＡＶ  ＩＴＲの下流に、また任意選択の３’ＡＡＶ  ＩＴＲの上流に位置する。
【００２１】
本発明のより具体的態様では、フランキングエレメントは、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質によりプロセシングされていない突然変異又は変異型ＡＡＶ  ＩＴＲである。本発明の別の具体的態様では、フランキングエレメントは、感染性組換えＡＡＶ粒子において、自己相補的リポータトランスジーンゲノムの二本鎖逆方向配列構造への形成を可能にするか、又はそれを促進する突然変異若しくは変異型ＡＡＶ  ＩＴＲである。本発明のさらに別の具体的態様では、フランキングエレメントは、Ｄ配列が欠失した、及び／又は末端分離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）部位（ＴＲＳ）配列が欠失した、突然変異若しくは変異型ＡＡＶ
ＩＴＲである（例えば、突然変異若しくは変異型ＡＡＶ  ＩＴＲは、リポータトランスジーンの自己相補的配列同士の間に位置する）。本発明のまた別の具体的態様では、突然変異若しくは変異型ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２ゲノム配列のヌクレオチド１２２〜１４４に対応する１つ又は複数のヌクレオチドが突然変異、改変、変異若しくは欠失したＡＡＶ２  ＩＴＲを含む。
【００２２】
本発明の別の具体的態様では、感染性組換えＡＡＶ粒子は、霊長類に感染するＡＡＶ血清型を含む。特定の態様では、感染性組換えＡＡＶ粒子は、ヒト又はアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）に感染するＡＡＶ血清型を含む。様々な具体的態様では、感染性組換えＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又はこれらＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラのＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列と９０％以上同一であるＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列を含む。別の様々な具体的態様では、感染性組換えＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又は前記ＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラを含む。
【００２３】
本発明の様々な実施形態において、生体サンプルは、霊長類サンプルを含む。こうしたサンプルとして、限定はしないが、血清、血漿、又は血液、例えば、ヒト血清、ヒト血漿若しくはヒト血液が挙げられる。
【００２４】
本発明の別の実施形態において、生体サンプルを熱失活させるか、又は熱失活させてある。特定の態様では、生体サンプルは、約５０〜７０℃で約１５分〜１時間熱失活させるか、若しくは熱失活させてあり、又は、約５６℃で約３０分間熱失活させるか、若しくは熱失活させてある。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、生体サンプルは、感染性組換えＡＡＶ粒子との接触又はインキュベートの前に希釈する。特定の態様では、生体サンプルの複数の希釈物を分析、測定若しくは検出する。別の特定の態様では、複数の異なる希釈率の生体サンプルを分析、測定若しくは検出する。より具体的態様では、生物学的サンプルは、感染性組換えＡＡＶ粒子との接触又はインキュベートの前に、１：１〜１：５００に希釈するか；又は生体サンプルは、感染性組換えＡＡＶ粒子との接触又はインキュベートの前に、１：５００〜１：５０００に希釈する。別の具体的態様では、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つの異なる希釈率の生体サンプルを分析、測定若しくは検出する。
【００２６】
本発明の様々な実施形態において、被験者（例えば、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクター媒介性遺伝子療法の候補）被験者は、哺乳動物（例えば、霊長類）である。特定の態様では、被験者は、ヒトである。
【００２７】
本発明の様々な実施形態において、被験者は、タンパク質の不十分な発現又は活性に起因する障害に罹患しているか、又は異常、欠陥若しくは望ましくないタンパク質の発現又は活性に起因する障害に罹患している。
【００２８】
本発明の別の様々な実施形態において、被験者は、遺伝性疾患に罹患している。本発明のさらに別の様々な実施形態において、被験者は、遺伝子ノックダウン又はノックアウト療法などの遺伝子置換又は補充療法の候補である。本発明のより具体的態様では、被験者は、以下：肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、出血性疾患（例えば、抑制因子を伴う、若しくは伴わないＡ型血友病又はＢ型血友病）、サラセミア、血液疾患（例えば、貧血）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、リソソーム蓄積症、銅若しくは鉄蓄積障害（例えば、ウィルソン若しくはメンケス病）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、神経若しくは神経変性疾患、癌、１型若しくは２型糖尿病、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝異常（例えば、グリコーゲン蓄積症）、網膜変性疾患（例えば、ＲＰＥ６５欠損症、コロイデレミア、及びその他の眼病）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患、又は感染性ウイルス性（例えば、Ｂ型及びＣ型肝炎、ＨＩＶなど）、細菌性若しくは真菌性疾患に罹患している。
【００２９】
本発明の様々な別の実施形態では、生体サンプル中のＡＡＶに結合する抗体の量を決定／計算する。一実施形態では、陰性（−）対照と比較した（ｆ）のリポータトランスジーン発現に基づいて計算する。別の態様では、ＡＡＶ抗体対照の既定量と比較した（ｆ）のリポータトランスジーン発現に基づいて計算する。
【００３０】
本発明のさらに別の実施形態では、抗体の量を、生体サンプルを取得した被験者に関連するデータベース又は報告書に入力する。この入力により、被験者に関連するデータベースエントリー又は報告書を作成する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】細胞継代数の関数としてのルシフェラーゼリポータ遺伝子Ｍａｘシグナルを示す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０ｂを用いて実施する統計分析。線形回帰：Ｒ２曲線０．１５０９、ｐ＜０．０００１、曲線の傾きは、有意に非ゼロである。継代１〜１２の細胞を用いて得られたＭａｘシグナル（ＲＬＵ）の平均値を継代１３〜２５の平均値と比較することにより、さらなる統計分析を実施した。この目的のために、両側独立ｔ検定を用いた。平均値＋／−平均値の標準誤差：継代１〜１２、１７９２１＋／−１１８１、ｎ＝５３；継代１３〜２５、１１４２７＋／−９０３、ｎ＝４５、ｐ＜０．０００１。
【００３２】
【図１Ｂ】細胞継代数の関数としてのルシフェラーゼリポータ遺伝子バックグラウンドシグナルを示す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０ｂを用いて実施する統計分析。線形回帰：Ｒ２曲線０．０４７２０、ｐ＝０．０３０８、曲線の傾きは、有意に非ゼロである。継代１〜１２の細胞を用いて得られたバックグラウンドシグナル（ＲＬＵ）の平均値を継代１３〜２５の平均値と比較することにより、さらなる統計分析を実施した。この目的のために、両側独立ｔ検定を用いた。平均値＋／−平均値の標準誤差：継代１〜１２、３２０＋／−２４、ｎ＝５４；継代１３〜２５、２５２＋／−２７、ｎ＝４５、ｐ＝０．０６５１。
【００３３】
【図２】オペレータ１及び２に関するヒト血清サンプルの平均ＮＡｂ力価を示す。エラーバーは、±標準偏差を示す。
【００３４】
【図３】表示するように、突然変異ＴＲＳ配列「ＣＧＧＴＴＧ」を有するＡＡＶ２  ＩＴＲの構造を示す。ＲＢＳ：Ｒｅｐ結合配列；Ｆｌｏｐ／Ｆｌｉｐ：ＩＴＲ（＋／−系統に類似）。
【００３５】
【図４】ルシフェラーゼリポータトランスジーンを有する一般的プラスミド構築物構造を示す。ＣＢＡ：ニワトリβアクチンプロモータ；ｐＡ：ポリアデニル化。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、少なくとも一部が、ウイルス抗体、又は中和抗体をスクリーニング、検出、分析、及び定量するための高感度アッセイに基づく。従って、本発明は、ベクター、ウイルスベクター及び粒子、並びにウイルス抗体、又は例えば、サンプル中の中和抗体をスクリーニング、検出、分析、及び定量する方法及び使用を提供する。
【００３７】
本明細書に記載するように、ベクター配列、ベクター（例えば、ウイルスベクター）及び粒子は、ウイルス抗体、又は中和抗体をスクリーニング、検出、分析、及び定量する手段を提供する。本発明のベクター配列、ベクター（例えば、ウイルスベクター）及び粒子、並びにウイルス抗体をスクリーニング、検出、分析、及び定量する方法及び使用では、リポータトランスジーン（トランスジーンは、検出可能なシグナルをもたらす）を用いるが、該トランスジーンは、一本鎖又は自己相補的ゲノムを含む。自己相補的トランスジーンゲノムは、ウイルス粒子（ウイルスベクター）にパッケージングされたとき、又はウイルスベクターの細胞形質導入及び形質導入細胞内でのウイルス脱殻時に、二本鎖になるか、又は二本鎖の二量体である。
【００３８】
「相補性」又は「相補体」という用語は、トランスジーンなどのポリヌクレオチド又は核酸分子に関して用いられる場合、塩基対合により、１つの一本鎖配列が、別の一本鎖配列と「特異的にハイブリダイズ」若しくは結合（アニーリング）して、二本鎖若しくは二重螺旋分子を形成するか、形成することができるような、複数の化学塩基を指す。２つの一本鎖配列が、互いに特異的にハイブリダイズ若しくは結合（アニーリング）して、二本
鎖（若しくは二重螺旋）分子を形成する能力は、一方の鎖（例えば、センス）上の塩基の官能基によるものであり、該塩基は、逆方向の核酸鎖（アンチセンス）上の別の塩基と水素結合する。典型的に、各々他方に結合することができる相補的塩基は、ＤＮＡの場合、ＡとＴ、及びＣとＧであり、ＲＮＡの場合、ＣとＧ、及びＵとＡである。従って、自己相補的配列は、ＡＴＣＧＸＸＸＣＧＡＴであり、Ｘは、非相補的塩基を表し、ハイブリダイズしないＸ塩基を有するこのような二本鎖若しくは二重螺旋分子の構造は、以下：
【化１】
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のように、出現する。
【００３９】
従って、「相補性」及び「相補体」という用語は、トランスジーンなどのポリヌクレオチド又は核酸分子に関して用いられる場合、二本鎖若しくは二重螺旋ポリヌクレオチド又は核酸分子が形成する物理的状態を示すか、あるいは、単に、各一本鎖分子が、他方と二本鎖を形成することができるような、２つのポリヌクレオチド又は核酸分子同士の配列関係を表す。従って、「相補性」及び「相補体」は、各ポリヌクレオチド又は核酸分子鎖の塩基の関係を指すのであって、２本の鎖が、二本鎖（若しくは二重螺旋）立体配置、又は二重螺旋における相互の物理的状態として存在しなければならない関係ではない。
【００４０】
典型的には、ＡＡＶなどの一本鎖核酸をパッケージングするウイルスベクターの場合、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）配列は、複製に参加して、ヘアピンループを形成し、これが、第２のＤＮＡ鎖の開始及び合成を可能にするような自己プライミング（ｓｅｌｆ−ｐｒｉｍｉｎｇ）に寄与する。第２ＤＮＡ鎖の合成後、ＡＡＶ  ＩＴＲは、いわゆる末端分離部位（ＴＲＳ）を有し、これによって、ヘアピンループが、各々ウイルスパッケージングのための５’及び３’末端反復配列を有する２つの一本鎖に切断される。
【００４１】
少なくとも１つのＩＴＲにおける、欠失、突然変異、修飾、又は非機能性ＴＲＳの使用によって、ＴＲＳで切断されていない二本鎖二重螺旋が形成される。自己相補的リポータトランスジーン二本鎖二重螺旋構造の実施形態では、典型的に、２つの相補鎖の間に位置する欠失、突然変異、又は変異型ＴＲＳを有するＩＴＲが存在する。非切断性又は非分離性ＴＲＳは、二本鎖形態が切断されないことから、自己相補的リポータトランスジーン二本鎖二重螺旋構造の形成を可能にする。欠失、突然変異、若しくは変異型ＴＲＳを有する非分離性ＩＴＲ、又は非分離性ＩＴＲのいずれかは、ウイルスパッケージングに好適となり得る。分離性ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＩＴＲが要望される機能、例えば、ウイルスパッケージング又は組み込みを媒介する限り、野生型ＩＴＲ配列である必要はない。
【００４２】
欠失、突然変異、修飾、又は変異し得る様々なＡＡＶ血清型のＩＴＲ及びＴＲＳ配列には、本明細書に記載する、又は当業者には公知のあらゆるＡＡＶ血清型が含まれる。例えば、様々なＡＡＶ血清型のＩＴＲ及びＴＲＳ配列としては、例えば、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０又はＡＡＶ−２ｉ８が挙げられる。ＡＡＶ２の場合、代表的な突然変異ＴＲＳ配列は、「
ＣＧＧＴＴＧ」である。
【００４３】
トランスジーン以外に考慮される自己相補的リポータトランスジーン配列を含むベクター又はベクター又は配列、例えば、１つ又は複数のＩＴＲ、発現若しくは調節制御配列、下流配列などについては、リポータトランスジーン以外のベクター配列のこうした配列は、自己相補性であってもよいが、自己相補性である必要はない。ゆえに、自己相補性は、例えば、リポータトランスジーンなどのトランスジーンだけが自己相補的であるような、リポータトランスジーンなどのトランスジーンに関する具体的な文脈で用いることができるが、他の非トランスジーン配列は、自己相補性であっても、なくてもよい。
【００４４】
自己相補性トランスジーンの場合、一本鎖における全ての塩基が、逆方向相補鎖の全ての塩基と相補的である必要はない。ただ、２つのポリヌクレオチド又は核酸分子が、特異的にハイブリダイズするか、又は互いに結合（アニーリング）することを可能にするのに十分な数の相補的ヌクレオチド若しくはヌクレオシド塩基があればよい。従って、自己相補的ポリヌクレオチド又は核酸分子の間に、非相補的塩基の短い配列セグメント若しくは領域が存在し得る。例えば、１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜７５、７５〜１００、若しくは１００〜１５０、又はそれ以上の連続した、若しくは非連続の非相補的塩基が存在し得るが、２つのポリヌクレオチド又は核酸分子が、特異的にハイブリダイズするか、又は互いに結合（アニーリング）して、二本鎖（若しくは二重螺旋）配列の形成を可能にするように、十分な相補的塩基が両配列の長さにわたって存在し得る。従って、２つの一本鎖領域の配列は、互いに対して１００％未満相補的であってもよく、それでもなお二本鎖二重螺旋分子を形成することができる。特定の実施形態では、２つの一本鎖配列は、互いに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上の相補性を有する。
【００４５】
自己相補的ポリヌクレオチド又は核酸分子同士の非相補的塩基のこのようなセグメント又は領域は、内部配列であってよく、これにより、２つの一本鎖分子の相補的部分が、二本鎖又は二重螺旋を形成すると、非相補的塩基は、ループ又はバルジ（ｂｕｌｇｅ）立体配置を形成し、全体的構造はヘアピンに類似する。自己相補的ポリヌクレオチド又は核酸分子の間の非相補的塩基のこうしたセグメント若しくは領域は、相補的領域をフランキングすることもでき、その場合、５’又は３フランキング領域のいずれか若しくは両方が、二本鎖二重螺旋を形成しないこともある。
【００４６】
二本鎖又は二重螺旋配列を形成する自己相補性トランスジーンは、一本鎖トランスジーンの対応物より速く発現される（より迅速な開始）。従って、このような発現は、指定の時点（例えば、１、２、３４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２〜１６、１６〜２０、２０〜２４時間）などで、経時的に発現を測定することにより検出することができる。さらに、二本鎖自己相補性トランスジーンの発現量は、一般に、一本鎖リポータトランスジーン対応物より大きい。従って、このような発現は、発現が最大値に近いとみなされるか、又は最大時点で測定することにより検出することができる。従って、二本鎖自己相補性トランスジーン立体配置は、検出感度を高めると共に、とりわけ、特定の細胞型への感染が効率的でないウイルス、すなわち細胞感染性又は親和性が比較的低いウイルスのウイルス抗体定量の正確度を改善する。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「ベクター」は、細胞に核酸（例えば、リポータトランスジーン）を送達するのに用いることができるパルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）などのウイルス粒子を意味し得るが、このようなベクターとして、ビリオンにパッケージングされるか、又はウイルスタンパク質（ＡＡＶキャプシドなどのエンベロープタンパク質若しくはキャプシドタンパク質）により包膜される核酸（例えば、リポータトランスジーン）がある
。あるいは、「ベクター」という用語は、より限定的な文脈で、ベクター配列又は核酸を指すのにも用いられる場合もある。従って、本明細書で用いられるベクターは、核酸（例えば、リポータトランスジーン）を含むウイルス粒子、又は核酸若しくは配列のみ（このような配列は、「ベクター配列」などと呼ぶことができる）を指すのに用いられ得る。
【００４８】
ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む１つ又は複数の核酸エレメントに由来するか、又はこれらに基づく。具体的ウイルスベクターとしては、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのパルボウイルスベクターが挙げられる。
【００４９】
特定の実施形態では、組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）は、パルボウイルスベクターである。パルボウイルスは、一本鎖ＤＮＡゲノムを有する小型ウイルスである。「アデノ関連ウイルス」（ＡＡＶ）は、パルボウイルスファミリーに属する。
【００５０】
本明細書で用いる場合、ウイルスベクターなどのベクターの修飾語、並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの配列の修飾語としての「組換え」という用語は、組成物（例えば、ＡＡＶ若しくは配列）が、一般に天然では起こらない様式で操作（例えば、改変）されていることを意味する。組換えベクターの具体例、例えば、ＡＡＶベクターの場合、野生型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノムに通常存在しないポリヌクレオチドがウイルスゲノム内に挿入されている。例えば、組換えベクターの１例においては、当該遺伝子が、通常、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターゲノムなどのベクター内で結合されている５’、３’及び／又はイントロン領域と一緒に、又はそれなしで、異種ポリヌクレオチド（例えば、トランスジーン）がベクター配列にクローン化されている。「組換え」という用語は、常にＡＡＶベクターなどのウイルスベクター、並びにベクター配列及びポリヌクレオチド及びポリペプチドに関して用いられるとは限らないが、省略されていたとしても、ＡＡＶなどのウイルスベクター、ベクター配列及びポリヌクレオチド及びポリペプチドの組換え形態は明白に包含される。
【００５１】
組換え「ベクター」又は「ＡＡＶベクター」は、分子法を用いて、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）配列から野生型ゲノムを除去し、リポータトランスジーンなどの非ネイティブ核酸で置換することにより、ＡＡＶなどのウイルスの野生型ゲノムから取得することができる。典型的には、ＡＡＶの場合、野生型ＡＡＶゲノムの１つ又は両方の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がＡＡＶベクター中に保持される。組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）は、ウイルスゲノム配列の全部又は一部が、リポータトランスジーンなどのウイルス（例えば、ＡＡＶ）核酸に関して、非ネイティブ配列で置換されていることから、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノムから識別される。従って、リポータトランスジーンなどの非ネイティブ配列の取り込みは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を「組換え」ベクターとして定義し、これは、ＡＡＶの場合、「ｒＡＡＶベクター」と呼ぶことができる。
【００５２】
組換えベクター「ゲノム」（例えば、ウイルス若しくはＡＡＶベクターゲノム）は、後に行うｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の感染（形質導入若しくは形質転換）のために、ウイルス（本明細書では、「粒子」又は「ビリオン」とも呼ばれる）に包膜又はパッケージングすることができる。組換えＡＡＶベクターゲノムをＡＡＶに包膜又はパッケージングする場合、該粒子は、「ｒＡＡＶ」と呼ぶことができる。このような粒子又はビリオンは、典型的に、ベクターゲノムを包膜又はパッケージングするタンパク質を含む。具体例として、ウイルスキャプシド及びエンベロープタンパク質、並びにＡＡＶの場合には、ＡＡＶキャプシドタンパク質が挙げられる。
【００５３】
組換えプラスミドの場合、ベクター「ゲノム」は、最終的にパッケージング又は包膜されて、ウイルス粒子を形成する組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えプラスミドを用いて、組換えベクターを構築又は製造する場合、ベクターゲノムは、組換えプラスミド
のベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」と呼ばれ、これは、プラスミドのクローン化及び増幅、すなわち、増殖及び組み換えウイルス生産に必要なプロセスにとって重要であるが、これ自体はウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子にパッケージング又は包膜されない。
【００５４】
従って、ベクター「ゲノム」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によりパッケージング又は包膜され、異種（トランスジーン）ポリヌクレオチド配列を含むベクタープラスミドの部分を指す。組換えプラスミドの非ベクターゲノム部分は、骨格を含み、これは、プラスミドのクローン化及び増幅に重要であるが、これ自体はウイルス（例えば、ＡＡＶ）によってパッケージング又は包膜されない。
【００５５】
組換えベクター配列は、ポリヌクレオチドの挿入又は取り込みによって操作される。本明細書に開示するように、ベクター配列又はプラスミドは、一般に、細胞中での増殖のための少なくとも１つの複製起点と１つ又は複数の制御エレメントとを含む。
【００５６】
組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）、ベクター配列若しくはプラスミド、並びにその方法及び使用は、あらゆるウイルス株又は血清型を含む。非制限的例として、組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）プラスミドは、例えば、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０又はＡＡＶ−２ｉ８などの任意のＡＡＶゲノムに基づくものでよい。このようなベクターは、同じ株若しくは血清型（又は亜群若しくは変異体）に基づくものであっても、あるいは、互いに異なっていてもよい。非制限的例として、１つの血清型ゲノムに基づく組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）プラスミドは、ベクターをパッケージングするキャプシドタンパク質の１つ又は複数と同一であってもよい。さらに、組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）プラスミドは、ベクターをパッケージングするキャプシドタンパク質の１つ又は複数とは異なる。従って、あくまで例示として、ｒＡＡＶ−２ベクタープラスミドは、例えば、ＡＡＶ−１、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０又はＡＡＶ−２ｉ８キャプシドからの３つのキャプシドタンパク質の少なくとも１つ（又は複数）を有し得る。
【００５７】
本明細書に開示するように、ベクターを用いて、リポータトランスジーンで標的細胞に形質導入し、続いて、このトランスジーンを転写及び任意選択で翻訳させることにより、トランスジーン発現を検出又は測定するための検出可能なシグナルを提供する。シグナルの量は、細胞形質導入及び続く発現の効率と比例する。リポータトランスジーンをパッケージング又は包膜するベクタータンパク質に結合する抗体は、トランスジーン導入及び後の発現を阻害する。従って、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクタータンパク質などのベクタータンパク質に結合する抗体の存在についての検出、測定及び分析を確認することができる。
【００５８】
本明細書に記載するアッセイでは、抗体の検出、測定及び分析は、リポータトランスジーンをパッケージング又は包膜するエンベロープ若しくはキャプシドタンパク質の同一性によって決定される。従って、ＡＡＶ−２抗体を検出しようとする場合、リポータトランスジーンをＡＡＶ−２キャプシドタンパク質によって包膜すべきである。ＡＡＶ−７抗体を検出しようとする場合には、リポータトランスジーンをＡＡＶ−７キャプシドタンパク質によって包膜すべきである。ＡＡＶ−８抗体を検出しようとする場合には、リポータトランスジーンをＡＡＶ−８キャプシドタンパク質によって包膜すべきである。抗体が存在する場合、抗体は、リポータトランスジーンを包膜するエンベロープ又はキャプシドタンパク質に結合して、細胞の形質導入、並びにその結果として起こるリポータトランスジーン発現を低減させる。エンベロープ又はキャプシドタンパク質に結合する抗体の量が多い
ほど、細胞のベクター形質導入、並びにその結果として起こるリポータトランスジーン発現は低減する。
【００５９】
伝統的な定義に従い、血清型は、目的のウイルスが、中和活性について既存の特性決定された全ての血清型に特異的な血清に対して試験され、その結果、目的のウイルスを中和する抗体が全くみいだされていないことを意味する。天然に存在するウイルス単離物が多くみいだされ、及び／又はキャプシド突然変異体が生成されているため、現在存在する血清型のいずれかと血清学的差異がある場合もあれば、ない場合もある。従って、新規ウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、血清学的差異がない場合、この新規ウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、対応する血清型の血清亜群又は変異体となり得る。多くの場合、キャプシド配列修飾を有する突然変異型ウイルスに関して、これらが、血清型の伝統的な定義に応じて別の血清型であるか否かを決定するための中和活性についての血清学試験は、いまだに実施されていない。従って、便宜上、そして繰り返しを避けるため、「血清型」という用語は、血清学的に異なるウイルス（例えば、ＡＡＶ）、並びに血清学的に異なっておらず、所与の血清型の血清亜群又は変異型に属すると思われるウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を指す。
【００６０】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ−２ｉ８を含む、組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）及びベクター配列は、１つ又は複数の機能性ＡＡＶ  ＩＴＲ配列とフランキングする１つ又は複数の異種ポリヌクレオチド配列（トランスジーン）を包含するように、当業者には公知の組換え技術を用いて、構築することができる。こうしたベクターは、１つ又は複数の野生型ＡＡＶ遺伝子、例えば、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が全部又は一部欠失しているが、ＡＡＶベクター粒子への組換えベクターのレスキュー、複製、及びパッケージングの必要に応じて、少なくとも１つの機能性フランキングＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ２又はいずれか他のＡＡＶ血清型ＩＴＲ）を保持する。従って、ＡＡＶベクターゲノムは、複製及びパッケージングのために必要なｃｉｓ配列（例えば、機能性ＩＴＲ配列）を含む。
【００６１】
「トランスジーン」、「配列」、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書では、置き換え可能に用いられ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、あらゆる形態の核酸、オリゴヌクレオチドを指す。トランスジーンとしては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ（スプライシング若しくは非スプライシング）が挙げられる。トランスジーンには、天然に存在する、合成、及び意図的に改変若しくは修飾されたポリヌクレオチド、並びに類似体及び誘導体が含まれる。トランスジーンは、典型的に、一本鎖若しくは二本鎖、線状若しくは環状であり、任意の長さであってよい。トランスジーンについて述べる際、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’方向の配列を提供する慣習に従って記載する場合がある。
【００６２】
「異種」トランスジーン、配列、又はポリヌクレオチドは、細胞へのポリヌクレオチドのベクター媒介性移入／送達の目的で、ベクター（例えば、ＡＡＶ）に挿入されるポリヌクレオチドを指す。異種トランスジーン、配列、又はポリヌクレオチドは、典型的に、ベクター（例えば、ＡＡＶ）核酸とは異なる、すなわち、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）核酸配列に関して、非ネイティブである。いったん細胞に移入／送達されると、ビリオン内に含まれる異種トランスジーン、配列、又はポリヌクレオチドは発現（例えば、転写、適切であれば、翻訳）され得る。あるいはビリオン内に含まれ、細胞中に移入／送達された異種トランスジーン、配列、又はポリヌクレオチドが発現される必要はない。「異種」という用語は、本明細書において、常にトランスジーン、配列、又はポリヌクレオチドに関して用いられるわけではないが、修飾語「異種」がない場合でも、トランスジーン、配列、又はポリヌクレオチドと言うとき、省略にかかわらず、異種トランスジーン、配列、又は
ポリヌクレオチドを含むことが意図される。
【００６３】
「トランスジーン」という用語は、本明細書では、便宜上、細胞又は生物に導入された異種ポリヌクレオチドを指すために用いられる。トランスジーンは、ポリヌクレオチドに転写される遺伝子、又は典型的には、中間転写物としてポリペプチド若しくはタンパク質をコード化する遺伝子など、あらゆるポリヌクレオチドを指す。
【００６４】
本明細書で用いる場合、「リポータ」トランスジーンは、検出可能なシグナルを賦与する遺伝子である。シグナルは、トランスジーン自体、トランスジーンの転写物、又はトランスジーンによりコード化されるタンパク質によって賦与され得る。リポータトランスジーンの特定の非制限的例として、ルシフェラーゼタンパク質をコード化するルシフェラーゼ遺伝子などがある。
【００６５】
「トランスジーン」又は「ポリヌクレオチド配列」によりコード化される「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、天然に存在するタンパク質と同様に、完全長ネイティブ配列、さらには、サブ配列、修飾形態又は変異体がネイティブ完全長タンパク質のある程度の機能性を保持している限り、機能性サブ配列、修飾形態又は配列変異体を包含する。本発明の方法及び使用において、トランスジーン又はポリヌクレオチド配列によりコード化されるこうしたポリペプチド、タンパク質及びペプチドは、野生型タンパク質と同一であってよいが、同一である必要はない。
【００６６】
本明細書に開示する非制限的リポータトランスジーン及びコード化タンパク質を含む、トランスジーン、配列及びポリヌクレオチドのあらゆる哺乳動物及び非哺乳動物形態が、既知又は未知のいずれも明白に包含される。従って、本発明は、非哺乳動物、ヒト以外の哺乳動物、及びヒト由来のリポータトランスジーン及びタンパク質を含み、これらのリポータトランスジーン及びタンパク質は、本明細書で記載するように、形質導入又は移入後に、細胞中に検出可能である。
【００６７】
トランスジーンを有する細胞において、トランスジーンは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）などのベクターによって、導入／移入されている。このプロセスは、細胞の「形質導入」又は「形質転換」又は「トランスフェクション」と呼ばれる。「形質導入する」、「形質転換する」及び「トランスフェクトする」という用語は、トランスジーンなどの分子の細胞への導入を指す。
【００６８】
トランスジーンが導入された細胞は、「形質転換細胞」又は「形質転換体」と呼ばれる。従って、「形質導入」、「形質転換」又は「トランスフェクト」された細胞（例えば、哺乳動物では、細胞又は組織若しくは臓器細胞）は、該細胞への外性分子、例えば、ポリヌクレオチド若しくはタンパク質（例えば、トランスジーン）の取り込み後の該細胞の遺伝子変化を意味する。このように、「形質導入」、「形質転換」又は「トランスフェクト」された細胞は、例えば、外性分子が導入された細胞、又はその子孫である。上記細胞は増殖させることができ、また導入されたトランスジーンを転写させる、及び／又はタンパク質を発現させることもできる。
【００６９】
導入されたトランスジーンは、レシピエント細胞の核酸に組み込んでもよいし、組み込まなくてもよい。導入されたトランスジーンが、レシピエント細胞又は生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）に組み込まれたら、これを該細胞又は生物中に安定に維持し、さらに、レシピエント細胞若しくは生物の子孫細胞若しくは生物に継代させるか、又は遺伝させることができる。最後に、導入されたトランスジーンは、レシピエント細胞又は宿主生物中に一時的に存在してもよい。
【００７０】
トランスジーンを担持するベクター（例えば、ウイルスベクター）による形質導入の標的となり得る細胞は、ベクターによる感染に対し感受性の任意の細胞であってよい。このような細胞は、感染に対する低度、中度若しくは高度の感受性を有し得る。従って、標的細胞は、あらゆる起原（例えば、中胚葉、外胚葉若しくは内胚葉）のあらゆる組織又は臓器タイプの細胞を含む。細胞の特定の非制限的例として、肝臓（例えば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば、β膵島細胞）、肺、中枢若しくは末梢神経系、例えば、脳（例えば、神経、グリア若しくは上衣細胞）又は脊柱、腎臓（ＨＥＫ−２９３細胞）、眼（例えば、網膜、細胞成分）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、隔膜、心臓（心臓系）、筋肉若しくは腰筋、又は消化管（例えば、内分泌）、脂肪組織（白色、褐色若しくはベージュ）、筋肉（例えば、線維芽細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞又は造血系（例えば、血液若しくはリンパ系）細胞が挙げられる。別の例としては、幹細胞、例えば、肝臓（例えば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば、β膵島細胞）、肺、中枢若しくは末梢神経系、例えば、脳（例えば、神経、グリア若しくは上衣細胞）又は脊柱、腎臓、眼（網膜、細胞成分）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、隔膜、心臓（心臓系）、筋肉若しくは腰筋、又は消化管（例えば、内分泌）、脂肪組織（白色、褐色若しくはベージュ）、筋肉（例えば、線維芽細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞又は造血系（例えば、血液若しくはリンパ系）細胞へと発生又は分化する万能性又は多能性前駆細胞が挙げられる。
【００７１】
ＡＡＶベクター及びベクター配列などのウイルスベクターは、１つ又は複数の「発現制御エレメント」又は「調節エレメント」を含んでもよい。典型的に、発現制御エレメント又は調節エレメントは、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす核酸配列である。ベクター内に存在する、プロモータ及びエンハンサーなどの、本明細書に記載の発現制御エレメント及び調節エレメントを含む制御エレメントは、適正な異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）転写、並びにもし適切であれば、翻訳を促進するために含まれる（例えば、プロモータ、エンハンサー、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのフレーム内翻訳を可能にするための遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、終止コドンなど）。このようなエレメントは、ｃｉｓで作用するが、ｔｒａｎｓでも作用し得る。
【００７２】
発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルで実施することができる。典型的に、転写を調節する発現制御エレメントは、転写ポリヌクレオチドの５’末端付近（すなわち「上流」）に並置される。発現制御エレメントはまた、転写された配列の３’末端（すなわち「下流」）又は転写物内（例えば、イントロン中）にも配置することができる。発現制御エレメントは、転写配列から特定の距離（例えば、ポリヌクレオチドから１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００、５０００〜１０，０００又はそれ以上のヌクレオチド）離れた地点（相当の距離離れていても）に配置してもよい。それでも、ポリヌクレオチド長さの制約のために、ＡＡＶベクターの場合、このような発現制御エレメントは、典型的に、ポリヌクレオチドから１〜１０００ヌクレオチドの範囲内にある。
【００７３】
機能的に、作動可能に連結された異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）の発現は、エレメントが、ポリヌクレオチドの転写、また、もし適切であれば、転写物の翻訳を調節するように、エレメント（例えば、プロモータ）によって、少なくともその一部が制御可能である。発現制御エレメントの具体例として、プロモータがあり、これは、通常、転写された配列の５’側に配置することができる。発現制御エレメントの別の具体例は、エンハンサーであり、これは、転写された配列の５’、３’側、又は転写された配列内に配置することができる。
【００７４】
本明細書で用いる場合、「プロモータ」は、トランスジーンに隣接して位置するＤＮＡ配列を指す。プロモータは、典型的に、隣接する配列、例えば、異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）に作動可能に連結される。プロモータは、典型的に、プロモータが存在しない場合に発現される量と比較して、異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）から発現される量を増加させる。
【００７５】
本明細書で用いる場合、「エンハンサー」は、異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）に隣接して位置する配列を指すことができる。エンハンサーエレメントは、典型的に、プロモータの上流に位置するが、やはり機能し、また、ＤＮＡ配列（例えば、トランスジーン）の下流又は該配列内に配置することができる。従って、エンハンサーエレメントは、異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）の１００塩基対、２００塩基対、若しくは３００以上の塩基対上流又は下流に配置することができる。エンハンサーエレメントは、典型的に、プロモータエレメントによって付与される増大した発現よりも多く、異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）の発現を増大させる。
【００７６】
発現制御エレメント（例えば、プロモータ）は、特定の組織又は細胞型で活性のものを含み、これらは、本明細書において「組織特異的発現制御エレメント／プロモータ」と呼ばれる。組織特異的発現制御エレメントは、典型的に、特定の細胞又は組織（例えば、肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、眼、網膜、骨、筋肉、肺、膵臓、心臓、腎細胞など）において活性である。発現制御エレメントは、典型的に、特定の細胞、組織若しくは臓器タイプに特有の転写活性化タンパク質、又はその他の転写調節因子によって認識されるため、これらの細胞、組織若しくは臓器において活性である。
【００７７】
発現制御エレメントはまた、遍在性又は乱交雑プロモータ／エンハンサーも含み、これらは、多くの異なる細胞型におけるポリヌクレオチドの発現を駆動することができる。こうしたエレメントとして、限定はしないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモータ／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ／エンハンサー配列並びに様々な哺乳動物細胞型において活性の他のウイルスプロモータ／エンハンサー、又は天然に存在しない合成エレメント（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照）、ＳＶ４０プロモータ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモータ、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモータ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、並びに伸長因子−１α（ＥＦ１−α）プロモータが挙げられる。
【００７８】
発現制御エレメントは、調節可能な様式で、発現を付与することもできる。すなわち、シグナル又は刺激が、作動可能に連結された異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）の発現を増大若しくは低減する。シグナル又は刺激に応答して、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を増大する調節可能なエレメントは、「誘導性エレメント」（すなわち、シグナルにより誘導される）とも呼ばれる。特定の例として、限定はしないが、ホルモン（例えば、ステロイド）誘導性プロモータがある。シグナル又は刺激に応答して、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を低減する調節可能なエレメントは、「抑制エレメント」（すなわち、シグナルが除去されるか、存在しないとき、発現が増大されるように、シグナルは発現を低減する）とも呼ばれる。典型的に、こうしたエレメントにより付与される増大又は低減の量は、存在するシグナル又は刺激の量に比例し；シグナル又は刺激の量が多いほど、発現の増大又は低減の程度も大きくなる。特定の非制限的例として、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモータ、ステロイドホルモン誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ；Ｔ７ポリメラーゼプロモータ系（国際公開第９８／１００８８号パンフレット）；テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２））；テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅ
ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６８：１７６６−１７６９（１９９５）；また、Ｈａｒｖｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２−５１８（１９９８）も参照）；ＲＵ４８６−誘導系（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９−２４３（１９９７）及びＷａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１（１９９７）］；並びにラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５−２８７２（１９９７）；Ｒｉｖｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：１０２８−１０３２（１９９６））が挙げられる。本発明に関して有用となり得る、その他の調節可能な制御エレメントに、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期によって調節されるものがある。
【００７９】
さらに、発現制御エレメントは、異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）のネイティブエレメントも含む。ネイティブ制御エレメント（例えば、プロモータ）は、異種ポリヌクレオチドの発現が、ネイティブ発現を模倣することが要望される場合に用いることができる。ネイティブエレメントは、異種ポリヌクレオチドの発現を一時的若しくは発生過程で、又は組織特異的に、又は特定の転写刺激因子に応答して、調節しようとする場合に用いてもよい。さらに、イントロン、ポリアデニル化部位若しくはＫｏｚａｋ共通配列などの他のネイティブ発現制御エレメントを用いてもよい。
【００８０】
本明細書で用いる場合、「作動可能な連結」又は「作動可能に連結された」という用語は、そのように表現された成分が意図される様式で機能することを可能にするような、該成分の物理的又は機能的並置を指す。トランスジーンとの作動可能な連結状態にある発現制御エレメントの例において、この関係は、制御エレメントがトランスジーンの発現を調節するような関係である。より具体的には、例えば、作動可能に連結された２つのＤＮＡ配列とは、２つのＤＮＡが、これらＤＮＡ配列の少なくとも一方が他方の配列に生理学的作用を及ぼすことができるような関係で、配置（ｃｉｓ又はｔｒａｎｓ）されていることを意味する。
【００８１】
本明細書に開示するように、ＡＡＶ及びベクター配列などのウイルスベクターを含むベクターは、さらに別の核酸エレメントを含んでもよい。これらのエレメントとして、限定はしないが、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列、プロモータ／エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、トランスジーンをフランキングする５’若しくは３’非翻訳領域（例えば、ポリアデニル化配列）、又はイントロンＩの全部若しくは一部が挙げられる。このようなエレメントはまた、任意選択で転写終結シグナルも含む。転写終結シグナルの具体的な非制限的例として、ＳＶ４０転写終結シグナルがある。
【００８２】
「フランキングする」という用語は、トランスジーンなどのベクター若しくはベクター配列のエレメントに関して本明細書で用いられる場合、該当するエレメントが、５’又は３’側に位置することを意味する。従って、発現制御エレメントがトランスジーンをフランキングする場合、この制御エレメントは、トランスジーンの５’又は３’側に位置する。用語「フランキングする」は、それらの間の中間配列を除外するものではない。例えば、トランスジーンと制御エレメント、例えば、制限部位との間に介在配列が存在し得る。制限部位は、トランスジーンと制御エレメントとの間の介在配列であってもよい。従って、あるエレメントを「フランキングする」配列とは、１つのエレメントが、該配列の５’又は３’側に位置するが、フランキング配列は、それがフランキングする配列に直接隣接しないように、介在配列が存在し得ることを示す。
【００８３】
本明細書に開示するように、ＡＡＶベクターは、一般にサイズが約４ｋｂ〜約５．２ｋｂの規定範囲であるか、又はこれを若干超えるＤＮＡの挿入片を受容する。従って、リポータトランスジーンが一本鎖ゲノムであるか、又は自己相補的である場合、トランスジー
ンのサイズは、約４ｋｂ〜約５．２ｋｂより小さくなる。
【００８４】
より短いベクター配列の場合、ウイルス粒子へのＡＡＶベクターのパッケージングに許容されるウイルスゲノム配列の通常サイズ若しくはその前後に長さを調整するための、挿入断片へのスタッファー又は充填材の導入。様々な実施形態では、充填材／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（非タンパク質コード化）セグメントである。ＡＡＶベクターの特定の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、４．７ｋｂ未満の長さを有し、充填材又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、トランスジーン配列と組み合わせた（例えば、ベクターに挿入された）場合、全長が約３．０〜５．５Ｋｂ、又は約４．０〜５．０Ｋｂ、又は約４．３〜４．８Ｋｂとなる長さを有する。
【００８５】
修飾形態を含むポリヌクレオチド及びポリペプチドは、種々の標準的クローン化、組換えＤＮＡ技術を用いて、細胞発現又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳及び化学合成技術により、作製することもできる。ポリヌクレオチドの純度は、配列決定、ゲル電気泳動などにより決定することができる。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーション又はコンピューターによるデータベーススクリーニング法を用いて単離することができる。このような方法として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：（１）相同性ヌクレオチド配列を検出するための、ゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリーとプローブのハイブリダイゼーション；（２）例えば、発現ライブラリーを用いた、共通の構造的特徴を有するポリペプチドを検出するための、抗体スクリーニング；（３）目的の核酸配列にアニーリングすることができるプライマーを用いた、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ上でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；（４）関連配列についての配列データベースのコンピューター検索；並びに（５）減じられた核酸ライブラリーの示差スクリーニング。
【００８６】
修飾形態を含むポリヌクレオチド及びポリペプチドはまた、当業者には周知の方法、例えば、自動化合成装置を用いて、化学合成により生成することもできる（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡを参照）。ペプチドは、全部又は一部を、化学的方法（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８０）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５；Ｈｏｒｎ（１９８０）；並びにＢａｎｇａ，Ａ．Ｋ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ
Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９５）Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡを参照）を用いて合成することができる。ペプチド合成は、様々な固相技術（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２（１９９５）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３（１９９７）を参照）を用いて実施することができ、自動化合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、製造者の指示に従い、達成することができる。
【００８７】
組成物（例えば、ベクター）の修飾語として用いられる場合、「単離された」という用語は、組成物が、人の手により作製されているか、又はその天然に存在するｉｎ  ｖｉｖｏ環境から完全に、又は少なくとも一部が分離されていることを意味する。一般に、単離された組成物は、それらが天然では通常結合する１つ又は複数の物質、例えば、１つ又は複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。用語「単離された」は、人の手により生み出された組合せ、例えば、ベクターゲノムと医薬製剤をパッケージング又は包膜する組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）、ベクター配列、又はウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ）を除外しない。さらに、用語「単離された」は、組成物の別の物理的形態、例えば、ハイブリッド／キメラ、多量体／オリゴマー、修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化）若しくは誘導された形態、又は人の手により生成された宿主細胞に発現された形態も除外しない。
【００８８】
組換えベクター、ベクター配列、粒子などを担持するリポータトランスジーンによって、ウイルス抗原、例えば、ＡＡＶキャプシドを含むエンベロープ又はキャプシドタンパク質に結合する抗体を分析又は検出（測定／定量）することができる。本発明によれば、ウイルス抗原に結合する抗体を分析又は検出（測定／定量）するための方法が提供される。一実施形態では、一方法は、以下を含む：組換えベクターを包膜する感染性組み換えウイルス粒子を用意するステップであって、（ｉ）ベクターが、リポータトランスジーンを含み、（ｉｉ）リポータトランスジーンが、一本鎖若しくは自己相補的ゲノムを含み、（ｉｉｉ）リポータトランスジーンが、１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている、ステップ；ウイルスに結合する抗体を分析又は検出するために、被験者からの生体サンプルを用意するステップ；前記感染性組換えウイルス粒子に感染し得る細胞を用意するステップ；感染性組換えウイルス粒子を生体サンプルと接触させるか、又はインキュベートし、これによって得られる混合物を生成するステップ；得られた混合物と細胞を、感染性組み換えウイルス粒子が、細胞に感染して、該細胞中にリポータトランスジーンを発現させることができる条件下で、接触させるステップ；リポータトランスジーンの発現を測定するステップ。混合物のリポータトランスジーン発現を陰性（−）対照のリポータトランスジーン発現と比較するステップであって、ここで、（−）対照は、（ｉ）感染性ウイルスに結合する抗体が欠失しているか、又は（ｉｉ）感染性ウイルスに結合する既定量の抗体を有するかのいずれかである、ステップ。混合物のリポータトランスジーン発現が、（−）対照より高ければ、これによって、生体サンプル中のウイルスに結合する抗体の存在が決定又は検出される。
【００８９】
特定の態様では、分析若しくは検出対象の抗体が、ＡＡＶ粒子に結合し、及び／又は感染性組み換えウイルス粒子は、１つ又は複数のＡＡＶキャプシドタンパク質を含み、及び／又は組換えベクターは、任意選択で１つ又は複数のＡＡＶ  ＩＴＲと共に、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターを含む。
【００９０】
「被験者」という用語は、動物、典型的に、哺乳動物、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類（類人猿、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、飼育動物（イヌ及びネコ）、家畜（ニワトリ及びアヒルなどの家禽、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、並びに実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）などを指す。ヒト被験者は、胎児、新生児、幼児、小児及び成人被験者を含む。
【００９１】
本発明は、パッケージング材及び１つ又は複数の構成要素を含むキットを提供する。キットは、典型的に、ラベル又はパッケージング挿入片を含み、これらは、構成要素の説明、又はキット内の要素のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、若しくはｅｘ  ｖｉｖｏでの使用についての指示を含む。キットは、このような要素、例えば、ベクター（例えば、ＡＡＶ）、ベクター配列、ゲノム若しくはウイルス粒子又は組成物の収集物を含んでよい。
【００９２】
キットは、キットの１つ又は複数の成分を収容する物理的構造を指す。パッケージング材は、成分を滅菌状態に維持することができ、こうした目的に一般に使用される材料（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブなど）から製造することができる。
【００９３】
ラベル又は挿入片は、キット内の１つ又は複数の要素、用量、活性成分の臨床薬理学（作用機構、薬物動態及び薬力学）の明示情報を含んでよい。ラベル又は挿入片は、製造者、ロット番号、製造場所及び製造日、使用期限を明示する情報を含んでもよい。ラベル又は挿入片は、製造者情報、ロット番号、製造者の場所及び日付を明示する情報を含んでも
よい。ラベル又は挿入片は、一方法、又は使用におけるキット構成要素の１つ又は複数を使用する上での臨床医又は被験者に対する指示を含んでもよい。指示は、本明細書に記載する方法及び使用のいずれかを実施する上での指示を含んでよい。
【００９４】
ラベル又は挿入片は、「印刷物」、例えば、紙若しくはボール紙を含んでもよく、あるいは個別の、又は要素、キット若しくはパッキング材（例えば、箱）に添付した、又はキット構成要素を含有するアンプル、チューブ若しくはバイアルに貼り付けた印刷物を含んでもよい。ラベル又は挿入片は、さらに、コンピューターで読み取り可能な媒体、例えば、バーコード化した印刷ラベル、ディスク、ＣＤ−若しくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなどの光ディスク、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、又はＲＡＭ及びＲＯＭなどの電気記憶媒体、あるいはこれらのハイブリッド、例えば、磁気／光学媒体、ＦＬＡＳＨ媒体若しくはメモリータイプカードを含んでもよい。
【００９５】
別に定義されていない限り、本明細書で用いる技術及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料は、本明細書に記載されるものである。
【００９６】
本明細書に引用される全ての出願、刊行物、特許及びその他の参照文献、ＧｅｎＢａｎｋ引用事項及びＡＴＣＣ引用事項は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。不一致が生じた場合、定義を含め、本明細書が優先されるものとする。
【００９７】
本明細書に開示される特徴の全てをあらゆる組合せで組み合わせてもよい。本明細書に開示される各々の特徴の代わりに、同じ、同等、若しくは類似の目的を果たす別の特徴を用いてもよい。従って、別のことが明示されていない限り、開示される特徴（例えば、組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）、ベクター配列、プラスミド、ゲノム、若しくはトランスジーン、又は組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ）は、同等の、若しくは類似する特徴の類の例である。
【００９８】
本明細書で用いる場合、単数形「１つの」、「及び」及び「その」は、文脈が明らかに別のことを示すのでない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「１つのポリヌクレオチド」というとき、複数のポリヌクレオチドを含み、「１つのベクター」というとき、複数のベクターを含み、「１つのベクター配列、プラスミドまたはゲノム」というとき、複数のベクター配列を含み、「１つのウイルス」又は「粒子」というとき、複数のビリオン／粒子を含む。
【００９９】
本明細書で用いる場合、全ての数値又は数値範囲は、文脈が明らかに別のことを示すのでない限り、そのような範囲内の整数、並びに範囲内の値又は整数の分数を含む。従って、例示のために、少なくとも８０％の相同性又は同一性というとき、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％など、並びに８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％、など、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％などを含む。
【０１００】
「より多い（大きい）又は少ない」を伴うある整数というとき、指示対象の数より大きい又は小さい任意の数をそれぞれ含む。従って、例えば、１より大きいというとき、２、３、４、５、６、及びそれ以上を含む。
【０１０１】
本明細書で用いる場合、全ての数値又は範囲は、文脈が明らかに別のことを示すのでない限り、そのような範囲内の値及び整数の分数、並びにそのような範囲内の整数の分数を含む。従って、例示のために、例えば、１〜１０のような数パーセンテージの範囲などの
値範囲をいうとき、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５などを含む。従って、１〜５０の範囲というとき、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０など、以後５０まで、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５などを含む。
【０１０２】
範囲のシリーズを指すとき、シリーズ内の様々な範囲の境界の値を組み合わせた範囲を含む。従って、例示のために、以下：１１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００、５，５００〜６，０００、６，０００〜７，０００、７，０００〜８，０００、又は８，０００〜９，０００の範囲のシリーズというとき、１０〜５０、５０〜１００、１００〜１，０００、１，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００などの範囲を含む。
【０１０３】
本発明は、一般に、様々な実施形態及び態様を説明するために肯定的な表現を用いて開示されている。本発明はさらに、物質又は材料、方法ステップ及び条件、プロトコル、若しくは手順などの特定の対象の内容が、全部又は一部排除される実施形態も具体的に含む。例えば、本発明の特定の実施形態又は態様では、材料及び／又は方法ステップが排除される。従って、本発明が何を含まないかについて、本発明が概して本明細書に表現されていなかったとしても、本発明において明白には排除されない態様がやはり本明細書に開示される。
【０１０４】
いくつかの本発明の実施形態について説明してきた。しかし、当業者であれば、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、多様な用途及び条件に合わせて、これを改変するために、本発明の様々な変更及び修正を行うことができる。従って、以下に示す実施例は、例示を意図するのであって、特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１０５】
実施例１
この実施例は、抗ＡＡＶ中和抗体（ＮＡｂ）アッセイの性能を評価する様々な試験を概説する。このようなアッセイを用いて、ＡＡＶベクター媒介性遺伝子移入試験への登録前に被験者を選択すると共に、ＡＡＶベクター媒介性遺伝子移入療法の過程で、及びＡＡＶベクター媒介性遺伝子移入療法後の抗ＡＡＶ中和抗体の存在又は量をモニターすることができる。
【０１０６】
成人集団の実質的な部分は、典型的には、幼児期における気道の感染により、野生型ＡＡＶに曝露されている（Ｃａｌｃｅｄｏ，２０１１）。従って、多くの人は、ベクターと交差反応するＡＡＶに対するＮＡｂを保有している。初期の臨床試験（Ｍａｎｎｏ  ｅｔ
ａｌ．２００６）により、あまり高くない力価のＮＡｂであっても、ベクターが循環を介して送達されると、形質導入を阻止するようであることが明らかにされた。ヒト以外の霊長類での他の研究から、ベクターが循環を介して送達されると、１：５という低いＮＡｂ力価が、肝臓の形質導入を完全に阻止することが立証された（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６；Ｓｃａｌｌａｎ，Ｂｌｏｏｄ  ２００６）。このアッセイの目的は、この治験への参加のために来診する被験者におけるＮＡｂ力価を決定することであり；既存の力価が＞１：５の者は、この治験に参加する候補ではない。
【０１０７】
本治験は、リポータ遺伝子を発現するＡＡＶベクターを用いた細胞アッセイを使用する。試験血清をベクターと混合して、ルシフェラーゼ発現のレベルを、血清に曝露していない対照サンプル中のレベルと比較する。中和力価は、細胞及びベクターを含むが、血清は含まないウェルと比較して、リポータ遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）発現の５０％以上の阻害をもたらす血清の最大希釈度として定義するが、本明細書には範囲として報告する；例えば、サンプルの１：３．１希釈度で５０％以上の阻害が認められたら、力価は、１：３．１〜１：１０の範囲として報告する。
【０１０８】
３つの変数が、アッセイの精度及び正確度に影響を与え得る。これらは、アッセイ結果への細胞継代数の影響、オペレータ変動性、並びに試験血清の凍結−解凍サイクル及びＦＡＣＴによる結果の安定性である。試験のための血清サンプルは、通常ドライアイスで凍結した状態で受け取り、−８０℃で保存し、最初の解凍時に試験する。さらにもう１回の凍結−解凍サイクルの後、反復アッセイを実施してもよい。
【０１０９】
実施例２
この実施例は、本明細書に記載する試験で用いられる特定の材料及び装置についての説明を含む。
【０１１０】
材料：試験サンプル、すなわち被検体供給源は、以下の通りである：血清又は血漿（血漿は、抗凝固因子としてのヘパリンを含有してはならない）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、滅菌、Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋非含有の、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １４１９０−１３６若しくは同等物；ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ））、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１９６５−０８４、若しくは同等物；ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＨ３００７０．０３ＩＲ、若しくは同等物；ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５１４０−１２２、若しくは同等物；Ｌ−グルタミン、２００  ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２５０３０−１５６、若しくは同等物；ｃＤＭＥＭ：完全ＤＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×Ｌ−グルタミン）；Ａｄ−Ｅ４を安定に発現するヒト胎児由来腎臓細胞（２Ｖ６．１１細胞、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２７８４、継代＃２６以下）；トリプシン−ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ  ４Ｎａを含む０．２５％トリプシン）１×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２５２００−０５６、若しくは同等物；ルシフェラーゼプラスミドを標準として用いて、ドット−ブロットハイブリダイゼーションにより滴定した、キャプシド：ベクターゲノム（ｖｇ）比が１の密度勾配精製ＡＡＶ−ルシフェラーゼ；対照ＦＡＣＴ血漿、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｔ＃  ００２０−１、ロット番号Ｄ９ｄ１、５０ｕｌアリコート中に冷凍保存；ポナステロン（Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｈ１０１−０１、濃度１μｇ／ｍＬで１００％エタノール中に再構成；５００ｍＬ濾過システム、０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＣＧＰＵ０５ＲＥ；９６−ウェル平底組織培養プレートＣｏｒｎｉｎｇ  ３５９５；セロロジカルピペット（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｉｐｅｔｔｅｓ）、５、１０、２５ｍＬ；５０ｍＬ遠心分離／コニカルチューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ４３０２９０；試薬リザーバ、Ｃｏｓｔａｒ  ４８７０；１２−チャンネルのマルチチャンネルピペタ（Ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｎｎｅｌ  Ｐｉｐｅｔｔｏｒ）１〜１０μｌ；１２−チャンネルのマルチチャンネルピペタ２０〜２００μｌ；ｐ−２０、ｐ−２００及びｐ−１０００レイニン・ピペットマン（Ｒａｉｎｉｎ  Ｐｉｐｅｔｍａｎ）；ピペットチップ（Ｐｉｐｅｔ  Ｔｉｐｓ）；エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブ；１２−チャンネルレザーバ、Ｃｏｓｔａｒ  ４８７７；ピペット・エイド（Ｐｉｐｅｔｔｅ  Ａｉｄ）、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ４−０００−１００若しくは同等物；ボルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）ミキサー；生存細胞計数用のトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ）（Ｓｉｇｍａ  Ｔ８１５４若しくは同等物）；ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼアッセイキット、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃Ｅ２８２０；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェア。
【０１１１】
装置：３７℃及び５％ＣＯ2のインキュベータ；安全キャビネット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃａｂｉｎｅｔ）；血球計数器（Ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｂｒｉｇｈｔ−Ｌｉｎｅ、Ｆｉｓｈｅｒ＃０２−６７１−５、又は同等物；倒立顕微鏡；冷凍庫、−８０℃；冷蔵庫、２〜８℃；インキュベータ、３７℃；化学天秤；Ｖｅｒｉｔａｓマイクロプレートルミノメータ、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；及び攪拌器。
【０１１２】
実施例３
この実施例は、抗ＡＡＶ抗体を検出及び／又は定量する例示的方法の説明を含む。
【０１１３】
２Ｖ６．１１細胞（アデノウイルス由来のＥ４遺伝子を発現するように遺伝子改変されたＨＥＫ−２９３細胞）を、ＡＡＶ−ルシフェラーゼベクター単独、又は様々な希釈度の血清と混合したベクターで形質導入する。２４時間後、ルミノメータを用いて、ルシフェラーゼ発現を検出する。細胞は、これらの治験及び常用的アッセイについて同一に扱った。
【０１１４】
３回反復した結果ラン（ｒｕｎ）をベクター単独（対照）からの読取り値と比較して、ルシフェラーゼ発現が、ベクター単独の場合の５０％以下と等しくなる血清希釈度を決定する。このアッセイでは、低いレベルの阻害で感度がより高いという理由で、リポータ遺伝子としてｌａｃＺではなく、ルシフェラーゼリポータ遺伝子を用いる。
【０１１５】
ラン（ｒｕｎ）の成功を評価する基準は、以下を含む：
１．対照血漿（プールしたヒト血漿、ＦＡＣＴ）が、ＡＡＶ８ベクターについては１：１００〜１：３１６、及びＡＡＶ２ベクターについては１：１０００〜１：３１６０の読取り値をもたらす。
２．細胞を含むが、ベクター及び血清は含まないウェルが、許容される程度の低い読取り値をもたらす。
３．細胞及びベクターを含むが、血清は含まないウェルが、許容される読取り値をもたらす。
【０１１６】
循環を通して、ベクターを送達するプロトコルの場合、典型的に、低い（＜１：５）又は検出不能な力価が、治験への参加には好ましい。そのため、この範囲にある全ての結果を反復ラン（ｒｅｐｅａｔ  ｒｕｎ）で確認する。
【０１１７】
アッセイのアッセイ間変動性を、米国に居住し、重篤な血友病を有する成人（抗ＡＡＶ８ＮＡｂ力価が、低−陰性から高まで）から得た９つのヒト血清サンプルからなる１群において推定した。これらの治験には、陽性対照ＦＡＣＴ血漿（ロット＃Ｄ９ｄ１）が含まれた。ＦＡＣＴは、少なくとも３０人のヒトドナー由来の正常なヒト血漿サンプルの市販されているプールである。プールされた集団には、より高い力価のＡＡＶ抗体を有する個体があり、これが、このアッセイにおいて陽性として現れることになる。陽性対照としての血漿の使用は、血清と血漿が類似レベルの抗体を有するため、許容される。単一ロットのＦＡＣＴ血漿を治験に使用した。
【０１１８】
より詳細には、試薬及びサンプル：濃度≧２×１０11ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ−ＣＢＳ−ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ベクターを調製し、アリコートを−８０℃で保存する。対照血漿ＦＡＣＴについては、サンプルを５６℃で３０分熱失活させてから、アリコートを−８０℃で保存する。試験サンプルについては、サンプル（血清又は血漿）を５６℃で３０分熱失活させてから、アリコートを−８０℃で保存する。ルシフェラーゼ溶解及びアッセイバッファーについては、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ系中の試薬
を調製し、製造者に従って使用する。希釈血清については、ウシ胎仔血清を５６℃で３０分熱失活させてから、室温まで冷却した後、０．２２μＭフィルターを通してろ過する。アリコートを−８０℃で保存する。
【０１１９】
より詳細には、本手順のために、ＡＴＣＣ（ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−２７８４）から取得した低継代（＃２）２Ｖ６．１１細胞を３７℃の水浴中で約２分かけて解凍した後、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び１％グルタミンを含むＤＭＥＭで２回洗浄する。次に、細胞をＴ−７５細胞培養フラスコに播種し、２日間培養し、トリプシン処理した後、Ｔ−７５フラスコにおいてさらに２継代にわたって再播種する。続いて、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、計数してから、ｃＤＭＥＭ及びポナステロン（Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ（最終濃度１ｕｇ／ｍＬまで添加）中で１×１０5細胞／ｍＬに希釈した後
、９６ウェルプレート上に、ウェル当たり２０，０００個の密度で播種する。細胞を３７℃／５％ＣＯ2インキュベータにおいて一晩インキュベートすると、約７０〜８０％密集
度になるはずである。
【０１２０】
希釈プレート（９６ウェルＵ底組織培養プレート）において試験サンプル及び対照血漿サンプルの希釈系列を調製する。希釈剤としてＦＢＳを用いて、ＦＡＣＴ対照血漿の３．１倍（ｈａｌｆ−ｌｏｇ）階段希釈を調製する。希釈範囲は、ＦＡＣＴ血漿に応じて変動する。少なくとも６つの連続的希釈、典型的に、１：１０〜１：３１６０が推奨される。
【０１２１】
希釈剤としてＦＢＳを用いて、試験サンプルの３．１倍階段希釈を調製する。希釈範囲は、サンプルに応じて変動する：推奨される希釈度は、ベースライン（投与前）サンプルの場合、１：１〜１：３１６、ＡＡＶ投与後のサンプルについては、１：１０以上である。
【０１２２】
希釈プレートから前記希釈物の１８μＬを第２の９６ウェルプレアッセイプレートに移す。ＡＡＶルシフェラーゼベクターをＤＭＥＭ中で８×１０7〜２×１０9ｖｇ／ｍＬに希釈することにより、作業濃度のＡＡＶルシフェラーゼベクターを調製するが、その際、ｃＤＭＥＭ又はウシ血清を含有する希釈剤は一切使用しない。０．５ｍＬ希釈ベクターの量が１つの全アッセイプレートに十分である。
【０１２３】
希釈した試験及び対照サンプルとベクターの混合物を調製することにより、「中和」サンプルを取得する。希釈ベクターを１２チャンネルレザーバに移す。レザーバから１８μＬの希釈ベクターを、プレアッセイプレート中の試験及び対照サンプルの希釈物の各々１８μＬに移す。１８μＬの希釈ベクターを１８μＬのＦＢＳと混合して、ベクター単独対照（「Ｖ＋ＦＢＳ」）を得る。１８μＬのＦＢＳを「ブランク（Ｂｌａｎｋ）」としてプレアッセイプレートの１ウェルに添加する。プレアッセイプレートを３７℃で１時間インキュベートする。
【０１２４】
インキュベーション後、７．５μＬの「中和」試験希釈物、「中和」対照血漿希釈物、Ｖ＋ＦＢＳ対照及びブランクＦＢＳをアッセイプレートに３回反復して移す。アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ2インキュベータにおいて一晩インキュベートする。
【０１２５】
細胞溶解及びルシフェラーゼ活性の測定のために、記載のように、１５又は５０ｍＬ円錐チューブ中に十分な溶解バッファー（１プレートにつき５ｍＬで十分である）、及び１５又は５０ｍＬ円錐チューブ中に十分なアッセイバッファー（１プレートにつき７ｍＬで十分である）を調製する。形質導入から２０〜２４時間後、ＰＢＳで細胞を１回洗浄する。マルチチャンネルピペットを用いて、細胞培養物上清を吸引する。細胞単層をかき乱さないように注意しながら、２００μＬのＰＢＳを細胞に添加する。洗浄液を吸引し、ウェル当たり４０μＬの溶解バッファーを添加してから、室温で１５分間インキュベートする
。
【０１２６】
ルミノメータを作動させ、アッセイバッファーを指定箇所にロードし、インジェクターを充填し、細胞板をロードする（Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼプロトコル）。ルシフェラーゼ活性を測定し、読取り値を全てＥｘｃｅｌに保存する。ルミノメータのパラメータ：組込み時間、２秒、最後の操作とこの注入との間隔：０秒、注入量：５０ｕｌ、注入速度：３３３ｕｌ／秒、注入と測定との間隔：１秒。
【０１２７】
抗ＡＡＶ中和抗体力価の計算のために、Ｅｘｃｅｌシートの３回反復ウェルからの平均生ルシフェラーゼ−ＢＬＡＮＫ値を計算し、ルシフェラーゼ発現率（％）を決定する：
ルシフェラーゼ発現率（％）＝［（試験サンプルルシフェラーゼ読取り値−ブランク）／（Ｖ−ＦＢＳルシフェラーゼ読取り値−ブランク）］×１００。
ルシフェラーゼ阻害率（％）＝１００−ルシフェラーゼ発現率（％）
【０１２８】
サンプルの中和力価は、ルシフェラーゼ発現の５０％以上の阻害率をもたらす、最も高い希釈度として決定する。ＮＡｂ力価は、希釈度範囲として報告する。例えば、５０％以上の阻害率がサンプルの１：１０希釈度で認められた場合、力価は、１：１０〜１：３１の範囲として報告する。
【０１２９】
オペレータ変動：オペレータ変動性は、異なる日に同じ群のヒト血清サンプルについて、オペレータ１及び２により実施された複数のＡＡＶ  ＮＡｂの結果に基づいて評価した。オペレータに対して、サンプル番号はマスクしなかった。
【０１３０】
オペレータ１は、異なる日に６回、９つの血清サンプルについてＮＡｂアッセイを実施した。ＦＡＣＴ血漿は、６つの異なる日に計１８回試験した。
【０１３１】
オペレータ２は、異なる日に５回、９つの血清サンプルについてＮＡｂアッセイを実施した。ＦＡＣＴ血漿は、５つの異なる日に計１５回試験した。
【０１３２】
細胞継代数を記録し、結果分析に用いた。最後に、複数の凍結−解凍サイクル後にＦＡＣＴ血漿の抗ＡＡＶ８  ＮＡｂ力価を決定して、サンプル取り扱いに関連する抗ＡＡＶ８
ＮＡｂの変化を評価した。
【表１】
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【０１３３】
サンプル希釈物を括弧内に示す。Ｍａｘシグナル（Ｓｉｇｎａｌ）ウェルは、サンプル希釈剤のみとインキュベートしたウイルスを含む。バックグラウンドウェルは、希釈剤のみを含む。最大３つの未知のサンプルを９６ウェルプレートで試験した。ここに示すアッセイプレートのレイアウトは、アッセイの実施中に用いたものと同一である。
【０１３４】
実施例４
この実施例は、抗ＡＡＶ抗体を検出及び／又は定量するためのアッセイ結果の説明を含む。
【０１３５】
細胞継代数の関数としてのシグナル強度：合計３３のプレートに播種した後、この治験におけるＡＡＶ  ＮＡｂ試験に使用した。最大及び最小リポータシグナル強度を細胞継代数の関数として測定した。
【０１３６】
細胞継代数が増加すると、最大リポータ遺伝子シグナル（Ｍａｘシグナル）の低下が認められた（図１Ａ）が、これは、アッセイの結果に影響しないようであった。すなわち、ＮＡｂ力価は、最大２５継代まで、細胞継代数には関係なく、アッセイしたサンプルについて同じであり、全てのアッセイが、アッセイ成功の要件を満たした。本アッセイで用いた細胞は、決して２５回超継代培養しなかったことに留意されたい。ＮＡｂアッセイの目的のために、細胞は、２５継代以下であるべきである。
【０１３７】
バックグラウンドシグナルもまた、細胞継代数と共に低下した（図１Ｂ）。しかし、細胞継代１〜１２と１３〜２５についての平均シグナルは、統計的に差はなかった。
【０１３８】
オペレータ変動性：これらの分析に用いられ、数ヵ月の期間にわたって実験室で常用的に評価されたＦＡＣＴ血漿の特定のロットのＡＡＶ  ＮＡｂ力価は、ＡＡＶ８ベクターの場合、１：１００〜１：３１６である。平均値からのＮＡｂ力価≧又は≦１／２ログを排除した。排除したラン（ｒｕｎ）の研究への標準的アプローチは、試薬はいずれも期限切れではなく、ルミノメータを含む重要な装置の維持が最新であることを確認することである。経験から、許容範囲外アッセイについて、具体的原因がみいだされるのは稀であり；恐
らく、これは細胞アッセイに固有の変動性を表すことがわかっている。
【０１３９】
オペレータ１：オペレータ１により実施された決定の群において、ＦＡＣＴ対照血漿の抗ＡＡＶ８  ＮＡｂ力価を、６つの個別の治験で１８回測定した。
・１６／１８回で、ＦＡＣＴ血漿は、１：１００〜１：３１６の力価を示した；
・１／１８回（プレート２、４日目）で、測定された力価は、１／２ｌｏｇ低く、１：３１〜１：１００であり、これによってこのアッセイランは排除された；
・１／１８回（プレート３、６日目）で、測定された力価は、１／２ｌｏｇ高く、１：３１６〜１：１０００であり、これによってこのアッセイランは排除された。
【表２】
2019162109.tif 000004
【０１４０】
合計９つのヒト血清サンプルを、６つの異なる日に、抗ＡＡＶ８  ＮＡｂについて試験した。結果を表２Ｂにまとめる。グレーの陰影を付けた箇所は、ＦＡＣＴ血漿対照ＮＡｂ力価が、過去の範囲とは違っていたため、分析から除外したアッセイランを示す。
【０１４１】
全ての日で陰性（＜１：１）と評点されたサンプル１、２、３、５及び７について、力価の間に変動性は全く認められなかった。サンプル４及び９の場合、５つの試験日に関して約１ｌｏｇの変動が認められ、力価は、それぞれ＜１：１から１：３．１〜１：１０まで、及び１：３．１〜１：１０から１：３１．６〜１：１００までと変動した。サンプル６の場合、ｈａｌｆ  ｌｏｇの変動が認められ；このサンプルは、第５日を除く全ての日で陰性と評点された。サンプル８では、力価のｈａｌｆ  ｌｏｇ変動が認められ、力価は、１：３１６〜１：１０００から１：１０００〜１：３１６０まで変動した。
【０１４２】
各サンプルは、１〜４日目で閾値を超え（不適格）、５日目に閾値未満（適格）と評点されたサンプル９を除き、一貫して、治験適格基準の閾値を超えるか、又は満たないかのいずれかの評価であった。
【表３】
2019162109.tif 000005
【０１４３】
オペレータ２：オペレータ２により実施された治験の部分（表３Ａ）では、ＦＡＣＴ対照血漿の抗ＡＡＶ８  ＮＡｂ力価を、５つの個別の実験で１５回測定した。
・１３／１５回で、ＦＡＣＴ血漿は、１：１００〜１：３１６の力価を示した；
・１／１５回（プレート３、３日目）で、測定された力価は、１／２ｌｏｇ高く、１：３１６〜１：１０００であり、これによってこのアッセイランは排除された；
・１／１５回（プレート３、５日目）で、測定された力価は、１／２ｌｏｇ低く、１：３１．６〜１：１００であり、これによってこのアッセイランは排除された。
【表４】
2019162109.tif 000006
【０１４４】
合計９つのヒト血清サンプルを、５つの異なる日に、抗ＡＡＶ８  ＮＡｂについて試験した。結果を表３Ｂにまとめる。陰影を付けた箇所は、ＦＡＣＴ血漿対照ＮＡｂ力価が、過去の範囲とは違っていたため、分析から除外したアッセイランを示す。
【０１４５】
サンプル１、２、３、５、６は、陰性抗ＡＡＶ８  ＮＡｂ力価（＜１：１）で、サンプル４は、力価が１：１〜１：３．１であり、一貫して、５つの全ての試験日を通じて同じ力価を示した。サンプル８及び９も、試験日を通じて一貫しており；サンプル８は、１：１００〜１：３１６、サンプル９は、１：１０〜１：３１．６と評点された。サンプル７は、１：１〜１：３．１、すなわちｈａｌｆ  ｌｏｇ変動と評点された２日目を除いて、全ての試験日で陰性（＜１：１）と評点された。
【０１４６】
各サンプルは、一貫して、治験適格性の閾値を超えるか、又は満たないかのいずれかと評点された。
【表５】
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【０１４７】
オペレータ間変動性：オペレータ１及び２により測定された各サンプルについての平均ＡＡＶ  ＮＡｂ力価を表４及び図２に示す。平均値は、報告された力価範囲の低値の逆数を用いて計算した。例えば、所与のランにおけるサンプルの力価が、１：３．１〜１：１０として報告された場合、平均値を計算するのに３．１を用いた。力価が、＜１．１として記録された場合には、０の値を用いた。
【０１４８】
サンプル１、２、３、４又は５については、オペレータ間変動性が認められなかった。サンプル６、７、８及び９の場合、いくらかのオペレータ間変動性が認められたが、オペレータ平均値同士の差は、いずれのサンプルについても、１ｌｏｇ以下であった。平均ＦＡＣＴ力価は、オペレータ間でほぼ同じであり、０．０１ｌｏｇしか違わなかった（平均ＦＡＣＴ力価の計算は、ＦＡＣＴ力価が過去の変異とは異なる、除外されたランも含んだ）。
【表６】
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【０１４９】
凍結−解凍サイクルの影響：ＡＡＶ  ＮＡｂ力価に対する反復凍結−解凍サイクルの影響をＦＡＣＴ血漿陽性対照について評価した。サンプルを最大６つの凍結−解凍サイクルに付した（３７℃で解凍し、エタノール／ドライアイス浴中で凍結し、その間−８０℃で保存する）後、抗ＡＡＶ８  ＮＡｂ力価を測定した。試験を２回反復した。試験サンプルも−８０℃で保存するが、氷上（０℃）で解凍したことに留意されたい。凍結−解凍試験の結果を表５にまとめる。最大６回の凍結−解凍サイクル後に、ＡＡＶ  ＮＡｂ力価に変動は測定されなかった。
【表７】
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【０１５０】
実施例５
この実施例は、ＡＡＶ抗体アッセイに基づく結論の説明を含む。
【０１５１】
ＮＡｂアッセイで用いた細胞の最初の解凍から２５継代以内に、ルシフェラーゼシグナルの最大シグナルに有意な低下が観測された。しかし、この低下は、この試験結果に影響を及ぼさなかったと考えられる。すなわち、ＡＡＶ  ＮＡｂ力価は、２５継代まで、細胞継代数とは関係なく、アッセイしたサンプルについて同一であり、全てのアッセイがアッセイの成功の要件を満たした。
【０１５２】
６回の凍結−解凍サイクルは、本アッセイで測定した対照血漿サンプルのＮＡｂ力価に影響しない。このアッセイで用いた対照血漿は、受け取り時に、アリコートに等分及び凍結されており、解凍したアリコートは再凍結しない。
【０１５３】
同じサンプル群の複数の測定値間で、ＮＡｂ力価に限定的な変動性が認められた（アッセイ間変動性）。中間から高いＮＡｂ力価を有するサンプルについては、より高い変動性が測定され、低力価ＮＡｂサンプルでは、より低い変動性が観測された。
【０１５４】
同様に、中間から高いＮＡｂ力価を有するサンプルについては、オペレータ間で、ＮＡｂ力価のより高い変動性が観測され（オペレータ間変動性）、低力価ＮＡｂサンプルでは、より低い変動性が観測された。
【０１５５】
本ＡＡＶ媒介性遺伝子移入試験への参加のための閾値が、＜１：５であるとすれば，７／８試験ランで＞１：５（治験への参加に不適格）と評点され、１／８試験ランで＜１：５（治験への参加に適格）と評点されたサンプル９だけに曖昧な結果が認められた。これが、実際の被験者サンプルであった場合、＜１：５の力価については、直ちに反復試験が実施されたであろう。
【０１５６】
これらの結果は、ＮＡｂアッセイが、ヒト血清（又は血漿）サンプル中の抗ＡＡＶ  ＮＡｂ力価を測定するための信頼できる試験であることを示している。このようなアッセイは、ＡＡＶ遺伝子移入試験への登録前に、低い抗ＡＡＶ力価を有する被験者を識別するため、及び／又はＡＡＶ媒介性遺伝子移入の過程で、又は移入後にＡＡＶ力価をモニターするために使用することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
2019162109.tif 000012
【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月16日(2019.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクター配列がリポータトランスジーンを含む組換えＡＡＶベクター配列において、前記リポータトランスジーンが、（ａ）一本鎖又は自己相補的ゲノムを含み、（ｂ）１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ（ｃ）１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている、組換えＡＡＶベクター配列。
【外国語明細書】
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