(57)【要約】【課題】癌細胞に対する選択度の高いメリチン含有組成物を提供すること。【解決手段】本発明は、癌に対する標的性が高くて、血中半減期が長いメリチンナノ粒子を含む癌の予防、治療及び改善用組成物に関する。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メリチンを含むコア；及び、
前記コアを被覆する被覆層を含む粒子を含む癌の予防及び治療用組成物。
【請求項２】
前記被覆層は、ポリエチレングリコールを含むことを特徴とする、請求項１に記載の癌の予防及び治療用組成物。
【請求項３】
前記粒子は、１８０〜３５０ｎｍの大きさを有することを特徴とする、請求項１に記載の癌の予防及び治療用組成物。
【請求項４】
前記粒子は、被覆層のないメリチンより、下記＜式４＞によって計算した選択度がさらに高いことを特徴とする、請求項１に記載の癌の予防及び治療用組成物。
【数１】
2019108318.tif 000009
【請求項５】
前記粒子は、被覆層のないメリチンより血液内安全性が高いことを特徴とする、請求項１に記載の癌の予防及び治療用組成物。
【請求項６】
前記粒子は、被覆層のないメリチンより生体内半減期が長いことを特徴とする、請求項１に記載の癌の予防及び治療用組成物。
【請求項７】
前記メリチンは、蜂毒来由メリチンであることを特徴とする、請求項１に記載の癌の予防及び治療用組成物。
【請求項８】
前記被覆層は、ポリラクチド−コ−グリコリド又はキトサンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の癌の予防及び治療用組成物。
【請求項９】
前記癌の予防及び治療用組成物は、注射剤用の懸濁液の形態であることを特徴とする、請求項１に記載の癌の予防及び治療用組成物。
【請求項１０】
メリチンを含むコア；及び、
前記コアを被覆する被覆層を含む粒子を含む癌の予防及び改善用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メリチンナノ粒子を含む癌の予防、治療及び改善用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
蜂毒は、民間療法の１つであって、人体の免疫機能を活性化して、各種痛み疾患及び炎症疾患の治療剤として活用されてきた。メリチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）は、乾燥した蜂毒において、４０〜５０％に該当する主要成分であり、２６個のアミノ酸から構成されている。メリチンは、抗癌活性を始め、細菌の成長抑制及び殺菌、抗炎症、鎮痛及び免疫増強作用など、様々な効能が報告されたことがある（韓国公開特許１０−２０１２−００７４３６２号、韓国公開特許１０−２０１０−００５５０２５号、韓国公開特許１０−１９９２−７００３０８０号など）。
【０００３】
しかし、メリチンは、非特異的に細胞に作用して、正常細胞のりん脂質層を全部分解する問題点があり、低濃度でも赤血球細胞に早く作用して、強い溶血作用を引き起こすなど、強い毒性を有し、産業に利用されるには問題がある。
【０００４】
このため、本発明者たちは、メリチンの癌細胞に対する選択度を高める方法を研究するうち、メリチンを特定の成分で被覆してナノ化する場合、癌細胞に対する選択度が高くて、血中半減期が増加することを確認したうえで本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、癌細胞に対する選択度の高いメリチン含有組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために本発明は、メリチンを含むコア；及び、前記コアを被覆する被覆層を含む粒子を含む癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【０００７】
また本発明は、メリチンを含むコア；及び、前記コアを被覆する被覆層を含む粒子を含む癌の予防及び改善用食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の組成物は、癌細胞に対する選択度が高くて、血中半減期が増加する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】被覆素材による粒子の模式図を示す。
【図２】ナノエマルジョンを製造する方法を示す模式図である。
【図３】エクスビボで赤血球に対する細胞毒性を評価する方法を示す模式図である。
【図４】フリー（ｆｒｅｅ）メリチンの濃度によるＨＥＫ２９３細胞の生存率を示す。
【図５】フリー（ｆｒｅｅ）メリチンの濃度による赤血球細胞の溶血（ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）度合を示す。
【図６】フリー（ｆｒｅｅ）メリチンの濃度によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞増殖抑制率を示す。
【図７】キトサン含量によるナノ粒子の粒径（Ａ）、ＰＤＩ（Ｂ）、散乱強度（Ｃ）及びゼータ電位（Ｄ）の差を示す。異なる文字を有する平均は、かなり異なる（ｐ＜０．０５）。
【図８】被覆成分によるナノ粒子の粒径（Ａ）、ＰＤＩ（Ｂ）、散乱強度（Ｃ）及びゼータ電位（Ｄ）の差を示す。異なる文字を有する平均は、かなり異なる（ｐ＜０．０５）。
【図９】被覆に用いたＰＬＧＡ、ＰＥＧ  ２０００及びＤＳＰＥ ＰＥＧによるナノ粒子の粒径（Ａ）、ＰＤＩ（Ｂ）、散乱強度（Ｃ）及びゼータ電位（Ｄ）の差を示す。異なる文字を有する平均は、かなり異なる（ｐ＜０．０５）。
【図１０】被覆に用いたＰＥＧ ２０００及びＤＳＰＥ ＰＥＧによるナノ粒子の捕集効率（Ａ）及び含有効率（Ｂ）の差を示す。
【図１１】被覆に用いたＰＬＧＡ、ＰＥＧ ２０００及びＤＳＰＥ ＰＥＧによるＨＥＫ２９３細胞の生存率を示す。
【図１２】被覆に用いたＰＬＧＡ、ＰＥＧ ２０００及びＤＳＰＥ ＰＥＧによる赤血球細胞の溶血（ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）度合を示す。
【図１３】被覆に用いたＰＬＧＡ、ＰＥＧ ２０００及びＤＳＰＥ ＰＥＧによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する細胞増殖抑制率を示す。大文字で示された平均は、同一試料であり、同一濃度における小文字は、かなり異なる（ｐ＜０．０５）。
【図１４】被覆に用いたＰＬＧＡ、ＰＥＧ ２０００及びＤＳＰＥ ＰＥＧによる正常細胞毒性に対する癌細胞の生育抑制活性の割合を示す。
【図１５】被覆に用いたＰＬＧＡ、ＰＥＧ ２０００及びＤＳＰＥ ＰＥＧによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の共焦点（ｃｏｎｆｏｃａｌ）顕微鏡写真である。
【図１６】被覆に用いたＰＬＧＡ、ＰＥＧ ２０００及びＤＳＰＥ ＰＥＧによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）領域を示す。（Ａ−１、Ｂ−１、Ｃ−１、Ｄ−１：３０分培養、Ａ−２、Ｂ−２、Ｃ−２、Ｄ−２：６０分培養）
【図１７】被覆に用いたＰＥＧ ２０００及びＤＳＰＥ ＰＥＧによるＨＰＨナノカプセルの粒径（Ａ）、ＰＤＩ（Ｂ）、散乱強度（Ｃ）及びゼータ電位（Ｄ）の差を示す。異なる文字を有する平均は、かなり異なる（ｐ＜０．０５）。
【図１８】被覆に用いたＰＥＧ ２０００及びＤＳＰＥ ＰＥＧによるＨＰＨナノカプセルの捕集効率の差を示す。異なる文字を有する平均は、かなり異なる（ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、メリチンを含むコア；及び、前記コアを被覆する被覆層を含む粒子を含む癌の予防及び治療用組成物に関する。
【００１１】
また本発明は、メリチンを含むコア；及び、前記コアを被覆する被覆層を含む粒子を含む癌の予防及び改善用食品組成物に関する。
【００１２】
また本発明は、対象にメリチンを含むコア；及び、前記コアを被覆する被覆層を含む粒子を含む癌の予防及び治療用組成物を投与する段階を含む癌の予防及び治療方法に関する。
【００１３】
また本発明は、対象にメリチンを含むコア；及び、前記コアを被覆する被覆層を含む粒子を含む癌の予防及び改善用食品組成物を投与する段階を含む癌の予防及び改善方法に関する。
【００１４】
また本発明は、メリチンを含むコア；及び、前記コアを被覆する被覆層を含む癌の予防及び治療用粒子に関する。
【００１５】
また本発明は、メリチンを含むコア；及び、前記コアを被覆する被覆層を含む癌の予防及び改善用粒子に関する。
【００１６】
また本発明は、メリチンを含むコア；及び、前記コアを被覆する被覆層を含む粒子の癌の予防、治療及び改善用途に関する。
【００１７】
以下に、本発明を詳説する。
【００１８】
メリチン
本発明のメリチンは、自然来由メリチン又は合成メリチンであってもよい。好ましくは、本発明のメリチンは、自然来由メリチンであり、さらに好ましくは、蜂毒来由メリチンである。
【００１９】
コア
本発明の粒子は、メリチンを含むコアを含む。前記コアは、メリチンのほか、粒子の安全性、被覆層との親和性、薬物伝達性などを増加するために、当業界に知られた他の成分を追加して含んでいてもよい。
【００２０】
被覆層
本発明の被覆層は、メリチンを含むコアを被覆（ｃｏａｔｉｎｇ）した層である。前記被覆層は、被覆物質であって、ポリエチレングリコール、キトサン又はポリラクチド−コ−グリコリドを含んでいてもよく、好ましくは、ポリエチレングリコールを含み、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール、キトサン及びポリラクチド−コ−グリコリドを含む。前記ポリエチレングリコールは、分子量が１８００〜２５００、好ましくは、２０００である非イオン性であり、親水性ポリマーを用いることが好ましい。また、前記ポリラクチド−コ−グリコリド（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）は、分子量が２７００〜３０００、好ましくは、２８０６であるアニオン性であり、両親媒性ポリマーを用いることが好ましい。被覆層内のメリチンと被覆物質は、１：３００〜４６０の重量比で混合することが好ましい。
【００２１】
粒子
本発明は、メリチンを含むコア；及び、前記コアを被覆する被覆層を含む粒子に関する。前記粒子は、１８０〜３５０ｎｍの大きさを有することが好ましくて、さらに好ましくは、２００〜３２０ｎｍの大きさを有する。
【００２２】
前記粒子は、被覆層のないメリチンより下記＜式４＞によって計算した選択度がさらに高い。前記＜式４＞における「癌細胞に対する抑制活性」は、「癌細胞に対する細胞毒性」を意味し、「正常細胞の細胞毒性」が「正常細胞に対する細胞毒性」を意味する。従って、本発明の粒子は、被覆層のないメリチンの短所である正常細胞に対する毒性の問題を乗り越えたものである。
【００２３】
【数１】
2019108318.tif 000003
【００２４】
また、本発明の粒子は、被覆層のないメリチンより血液内安全性が高くて、生体内半減期が長い。
【００２５】
癌
本発明は、本発明の粒子を含む癌の予防及び治療用組成物、癌の予防及び改善用食品組成物などに関する。前記癌は、医界において悪性腫瘍、癌に分類する癌を指すものである。例えば、前記癌は、大腸直腸癌、胃癌、肺癌、食道癌、甲状腺癌、喉頭癌、膵臓癌、肝臓癌、皮膚癌、乳癌などになり、特に制限されるものではないが、好ましくは、乳癌である。
【００２６】
癌の予防及び治療用組成物
本発明は、本発明の粒子を含む癌の予防及び治療用組成物に関する。前記癌の予防及び治療用組成物は、薬学的組成物である。
【００２７】
本発明の薬学的組成物は、前記粒子を０．０１〜８０重量％含んでいてもよく、好ましくは、０．０２〜６５重量％含んでいてもよい。しかしこれは、投薬者の必要によって増減することができ、食生活、栄養状態、病気の進行度合、肥満度合など、状況によって適切に増減することができる。
【００２８】
本発明の薬学的組成物は、経口又は非経口で投与可能であり、一般医薬品製剤の形態に用いられてよい。好ましい薬剤学的製剤は、錠剤、硬質又は軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤などのような経口投与用製剤及び注射剤、静脈注射剤のような非経口投与用の製剤があり、これら薬剤学的製剤は、薬剤学的に許容可能な通常の担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩解剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、保存剤、又は増量剤などを用いて調剤することができる。好ましくは、前記薬学的製剤は、注射剤用の懸濁液であり、静脈注射で投与されてもよい。
【００２９】
本発明の粒子を含む薬学的組成物の投与用量は、患者の状態、年齢、性別及び合併病など、様々な要因によって専門家により決定されるが、通常、大人１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは、１０ｍｇ〜５ｇの用量で投与されてもよい。また、単位剤形当たり前記薬学的組成物の１日用量又はこれの１／２、１／３又は１／４の用量が含有されるようにして、一日に１〜６回投与されてもよい。しかし、健康及び衛生を目的とするか、又は健康調節を目的とする長期間摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下であってもよいし、有効成分は、安全性面で何ら問題がないため、前記範囲以上の量で用いられてもよい。このとき、前記粒子は、分離して粉末状に用いても、ナノエマルジョン状に用いてもよい。
【００３０】
癌の予防及び改善用食品組成物
本発明は、本発明の粒子を含む癌の予防及び改善用食品組成物に関する。
【００３１】
本発明の食品は、健康補助食品、健康機能食品、機能性食品などになるが、これに制限されるものではなく、天然食品、加工食品、一般食材などに本発明の粒子を添加することも含まれる。
【００３２】
本発明の食品組成物は、前記粒子をそのまま添加するか、他の食品又は食品組成物と共に用いられるし、通常の方法によって適切に使用されてもよい。有効成分の混合量は、それの使用目的（予防、改善又は治療的処置）によって好適に決定される。通常、本発明の粒子は、食品又は飲料を製造する時に食品又は飲料の原料１００重量％に対し、０．１〜７０重量％、好ましくは、２〜５０重量％添加されてもよい。前記粒子の有効用量は、薬学的組成物の有効用量に基づいて使用できるが、健康及び衛生を目的とするか、又は健康調節を目的とする長期間摂取の場合には、前記範囲以下であってもよいし、有効成分は、安全性面で何ら問題がないため、前記範囲以上の量で用いられてもよい。このとき、前記粒子は、分離して粉末状に用いられても、ナノエマルジョン状に用いられてもよい。
【００３３】
前記食品の種類には特に制限がない。前記食品組成物は、錠剤、硬質又は軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤などのような経口投与用製剤の形態に使用されてもよいし、これら製剤は、許容可能な通常の担体、例えば、経口投与用製剤の場合には、賦形剤、結合剤、崩解剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、保存剤、又は増量剤などを用いて調剤してもよい。
【００３４】
前記粒子を添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤、その他営養剤等があげられるが、これら種類の食品に制限されるものではない。
【００３５】
対象
本発明は、本発明の組成物又は粒子を対象に投与する段階を含む癌の予防及び治療方法を含む。また本発明は、本発明の組成物又は粒子を対象に投与する段階を含む癌の予防及び改善方法を含む。
【００３６】
前記対象は、癌の発生リスクが高いか、癌と診断された人を含む哺乳動物である。好ましくは、前記対象は、癌の発生リスクが高いか、癌と診断された人であり、さらに好ましくは、癌と診断された患者であり、なおさらに好ましくは、乳癌患者である。
【００３７】
＜用語＞
本発明における「フリー（ｆｒｅｅ）メリチン」は、ナノ粒子化されていないメリチン、すなわち、被覆されていないメリチンを意味する。
【００３８】
本発明におけるメリチンナノ粒子は、メリチンが被覆層によって被覆された、ナノ単位の大きさを有するカプセルを意味する。
【００３９】
本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下に開示される実施例に限定されるものではなく、異なる多様な形態に具現されるものである。但し、本実施例は、本発明の開示を完全にして、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。
【００４０】
＜材料及び方法＞
材料
メリチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）は、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入して用いた。ＰＬＧＡ（ｐoｌｙ Ｄ，L−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入したＲｅｓｏｍｅｒ（登録商標） ＲＧ７５２  Ｈを用いた。不溶性の低分子量キトサン（ＣＳ，５０，０００−１９０，０００Ｄａ）とＰＥＧ ２０００は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。ＤＳＰＥ ＰＥＧ（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｌｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−２０００]）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｖａｎｔ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）から購入して用いた。
【００４１】
統計分析
全実験は、３回以上繰り返し行っており、実験結果は、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＳＰＳＳ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２１．０，ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）で比較分析しており、ｐ＜０．０５水準でダンカンの多重比較検定で平均に対する有意性を検証した。
【００４２】
＜実施例１＞ナノカプセルの製造
＜１−１＞粒子タイプ別のナノカプセル製造
メリチンを複数の種類の被覆材で被覆して、下表１のように、ナノカプセルを製造した（図１）。
【００４３】
溶液の製造
先ず、メリチンを２０重量％アセトニトリルに溶かして、メリチン母液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（５ｍｇ／ｍＬ）を製造した。ＰＬＧＡ１００ｍｇをクロロホルム３ｍＬに溶解させた後、前記メリチン母液１０ｍｇに添加して油相溶液を製造した。
【００４４】
水相溶液の製造
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を１２％（ｗ／ｗ）となるように、蒸溜水に添加した後、６０℃で撹拌（５００ｒｐｍ）させてＰＶＡ溶液を製造した。そして、キトサンを１重量％氷酢酸に完全に溶かしてキトサン溶液を製造した。前記ＰＶＡ溶液８ｍＬと前記キトサン溶液４ｍＬを混合してＰＶＡ／キトサン溶液を製造した。
【００４５】
一方、ＰＥＧ  ２０００が前記ＰＶＡの１０％（ｗ／ｗ）となるように、前記ＰＶＡ／キトサン溶液に添加してＰＶＡ／キトサン／ＰＥＧ  ２０００溶液を製造した。
【００４６】
また、ＤＳＰＥ ＰＥＧが前記ＰＶＡの１０％（ｗ／ｗ）となるように、前記 ＰＶＡ／キトサン溶液に添加してＰＶＡ／キトサン／ＤＳＰＥ ＰＥＧ溶液を製造した。
【００４７】
【表１】
2019108318.tif 000004
【００４８】
ナノエマルジョンの製造
前記油相溶液３ｍＬと前記水相溶液１２ｍＬを混合した後、低温水槽で超音波処理（７０％、１５秒）した（ＶＣ  ５０５，Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ Ｓｏｎｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＵＳＡ）。そして、２４時間撹拌（５００ｒｐｍ）して有機溶媒を除去し、エマルジョン溶液を製造した。前記エマルジョン溶液からＰＶＡを除去してナノ粒子を選別するために、アミコンウルトラ−１５（５０Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、前記エマルジョン溶液を分離した（１４，０００ｇ ｆｏｒｃｅ，１５分、２５℃）。そして、蒸溜水を用いて分離したエマルジョン溶液を３回繰り返して洗滌した後、蒸溜水を添加して最終嵩が１２ｍＬとなるようにして、メリチンの被覆されたナノ粒子が分散された分散額状態であるナノエマルジョンを製造した（図２）。以下の実験では、前記ナノエマルジョン状態でナノ粒子を用いた。前記ナノカプセル１〜４の４種類の粒子タイプは、共通して油相部分にＰＬＧＡが、水相部分にはＰＶＡが添加されることを基本ベースとして、ここに追加して水相部分にキトサン、ＰＥＧ ２０００、ＤＳＰＥ ＰＥＧが選択的に加えられる形態である。ナノカプセル２の場合、油相はＰＬＧＡが添加されて、水相はＰＶＡとキトサンが含有された、すなわち、ＰＶＡ／キトサン溶液であり、このように油相と水相を乳化したナノエマルジョン形態で用いられた。
【００４９】
＜実施例２＞ナノ粒子の物理的特性測定
ナノ粒度分析器（Ｚａｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕ．Ｋ）を用いてナノカプセルの粒径（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ）、粒子の分散度（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ，ＰＤＩ）、散乱強度（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｏｕｎｔ  ｒａｔｅ，  ＤＣＲ）及びゼータ電位（ｚｅｔａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）などの粒子特性を測定した。
【００５０】
＜実施例３＞メリチンの捕集効率及び含有効率測定
メリチンの捕集効率測定
ナノカプセル化されていないフリー（ｆｒｅｅ）メリチン量を測定するために、ナノエマルジョンを製造する時にナノ粒子を選別する遠心分離過程において、フィルターを通した溶液を分離した。遠心分離によって分離された溶液は、ナノカプセル化されていないフリー（ｆｒｅｅ）メリチンと看做して、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）方法を用いて分析した。捕集効率（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ＥＥ）は、下記式１を用いて計算した。
【００５１】
【数２】
2019108318.tif 000005
【００５２】
メリチンの含有効率測定
ナノ粒子内に含有されたメリチンの含有効率を測定するために、凍結乾燥したナノ粒子からメリチンを抽出した。ナノ粒子をアセトニトリルに分散させた後、４８時間撹拌（３７℃、１００ｒｐｍ）した後に遠心分離した。遠心分離によって分離された上層額内のメリチン含量をＢＣＡ方法を用いて分析した。メリチンの含有効率（ｌｏａｄｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ＬＥ）は、下記式２を用いて計算した。
【００５３】
【数３】
2019108318.tif 000006
【００５４】
＜実施例４＞乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及び腎臓由来正常細胞（ＨＥＫ２９３）培養
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１％ペニシリン−ストレプトマイシンと１０％不活性ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が添加されたＲＰＭＩ Ｍｅｄｉｕｍ １６４０（＋Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）培地を用いた。ＨＥＫ２９３細胞は、１％ペニシリン−ストレプトマイシンと１０％不活性ＦＢＳが添加されたＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）培地を用いた。前記２つの細胞ともＣＯ2インキュベーターの一定条件（３７℃、５％ＣＯ2９５％湿度）で培養した。密集度が７５〜８０％に至ると、培地を除去して、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で濯いだ。付着した細胞は、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を収去した後、１，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞ペレットを集めた。上層額を除去した後、沈殿した細胞ペレットに培地３〜４ｍＬで再び分散させて７５ｃｍ2Ｔ−フラスコで培養した。４８時間後、新しい培地に入れ替えて、フラスコ表面に付着していない浮遊細胞を除去した。細胞の継代培養は、通常、６〜８日間隔で行い、継代培養時に収去した細胞は、３〜５ｍＬの培地に分散させた後、トリパンブルー染色試薬と１:１で混合した後、セルカウンターによって細胞数を測定して細胞数を調整しながら培養した。
【００５５】
＜実施例５＞メリチンナノ粒子の安全性評価
＜５−１＞Ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞毒性評価
ナノ粒子及びフリー（ｆｒｅｅ）メリチンの細胞毒性に対する安全性は、ＨＥＫ２９３細胞を用いてＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｅｔｒａｚｏｌｙｌｙ）−２，３−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）分析によって分析した。ＭＴＴ分析は、細胞のミトコンドリア内酵素であるコハク酸デヒドロゲナーゼによってＭＴＴから青磁色ホルマザンが形成される原理を利用したものである。
【００５６】
前記実施例４において培養したＨＥＫ２９３細胞を細胞濃度が５．５×１０4細胞／ｍＬとなるように希釈して、９６ウェルプレートに各ウェルに１８０μＬずつ分注して２４時間培養した。２４時間培養の後、最終メリチンの濃度区間に合わせたナノ分散額を細胞に注入した後、２４時間培養を行っており、その後、前処理した細胞にＭＴＴ試薬を処理して４時間培養した。１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上層額を除去した後、ＤＭＳＯでダーク・ブルーホルマザンを溶解させて５４０ｎｍで発色度合を測定した。対照群（メリチンナノ分散額無処理群）との細胞生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）比較を行い、メリチンナノ分散額の正常細胞に対する毒性有無を分析した。
【００５７】
＜５−２＞Ｅｘ  ｖｉｖｏで赤血球細胞毒性評価
ナノ粒子の赤血球細胞毒性に係るエクスビボ実験に用いる血液を兎の耳介中心動脈に注射針を使って採血した。本実験では、体重が２〜３ｋｇである雄兎を用いており、動物実験室で飼育して２週に１回ずつ循環血液量の１０％である勧奨最大採血量（ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｍａｘｉｍｕｍ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｂｌｏｏｄ  ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ）を基準として、それ以下の血液量を採血して実験に用いた。採血の際に用いた抗凝固剤は、抗凝血性クエン酸デキストロース（Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｘｔｏｒｓｅ，ＡＣＤ）であった。血液は、２４０×ｇ、１０分間遠心分離して赤血球を分離した。１次に分離された赤血球は、３７℃  ＰＢＳを用いて遠心分離して、２次に洗滌し、これと同じ方法で３次に洗滌しており、３７℃  ＰＢＳに希釈して、以後の実験に用いた（図３）。
【００５８】
赤血球細胞毒性は、赤血球細胞の溶血（ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）を利用して赤血球細胞が溶血された時に発生するヘモグロビンの発色度合によって測定した。赤血球細胞分散額を血球計数器を用いて１〜２×１０６細胞／ｍＬに調整して実験に用いた。赤血球細胞分散額とナノ分散額を１:１の重量比で混合して、３７℃に３０分間培養しており、１０分間遠心分離（９８０×ｇ）して上層額を除去して、５４０ｎｍで発色度合を測定した。１％トリトンｘ−１００を対照群と設定して、相対的な溶血（ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）度合を計算して、下記式３に従い赤血球細胞に対する毒性評価を分析した。
【００５９】
【数４】
2019108318.tif 000007
【００６０】
＊ブランク（Ｂｌａｎｋ）（陰性対照群）：ＲＢＣ＋ＰＢＳ
＊トリトン（陽性対照群）：ＲＢＣ＋１％トリトン×−１００
【００６１】
＜５−３＞Ｅｘ  ｖｉｖｏで抗癌活性評価
最適な粒子製造条件から製造したナノ粒子の抗癌活性測定は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳癌細胞）を用いてＭＴＴ分析によって分析した。培養したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、細胞濃度が５．５×１０4細胞／ｍＬとなるように希釈して、９６ウェルプレートに各ウェルに１８０μＬずつ分注して２４時間培養した。２４時間培養した後、最終メリチンの濃度区間に合わせたナノ分散額を細胞に注入した後、２４時間培養を行っており、その後、前処理した細胞にＭＴＴ試薬を処理して４時間培養した。１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上層額を除去した後、ＤＭＳＯでダーク・ブルーホルマザンを溶解させて５４０ｎｍで発色度合を測定した。この吸光度値をもって、対照群との細胞抑制率（ｃｅｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）比較によって、ナノ分散額の乳癌細胞に対する抗癌活性を分析した。また、標的癌細胞に対する生育抑制活性の割合を示す選択度（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）を算出して、下記式４のように標的化度合を分析した。前記前記＜式４＞における「癌細胞に対する抑制活性」が「癌細胞に対する細胞毒性」を意味し、「癌細胞に対する抑制活性」は「癌細胞に対する細胞毒性」を意味する。
【００６２】
【数５】
2019108318.tif 000008
【００６３】
＜実施例６＞細胞透過観測
＜６−１＞共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いた細胞透過度分析
共焦点蛍光顕微鏡を用いてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のナノ粒子透過能に対する定性的評価を行った。カバーグラスを入れた６−ウェルプレートに４×１０５細胞／ｍＬの密度で接種を行った。接種した細胞は、ＣＯ2インキュベーター、３７℃、５％ＣＯ2条件で培養して、４８時間間隔で培地を入れ替えた。５０〜７０％の密集度に至り、適正な細胞単層形成が完了すると、培地を除去して、細胞をＰＢＳで洗滌した。
【００６４】
蛍光物質であるクマリン（ｃｏｕｒｍａｒｉｎ）−６に表した標準ナノ粒子分散額と培地をあらゆるウェルにそれぞれ０．５ｍＬ、２ｍＬずつ処理して、２時間培養した。培養が完了した後、サンプルを除去して、ＰＢＳで細胞を２回洗滌した後、７０％エタノール（ｐＨ７．１  ｉｎ  ＰＢＳ）で１５分間細胞を固定させた。
【００６５】
その後、７０％エタノールを除去してＰＢＳで洗滌した後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞核をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した後、３０分間培養した。
【００６６】
染色が完了した後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が付着しているカバーグラスを ６−ウェルプレートから取り出して、マウンティング溶液を落としたスライドグラス上に載せた後、１〜２時間ぐらい乾燥した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するナノ粒子の透過度合を測定するために共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ５，Ｌｅｉｃａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて蛍光５０５ｎｍと励起光４２０ｎｍで撮影した。ナノ粒子に対する蛍光の強さは、イメージソフトウェアシステム（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）で分析した。
【００６７】
＜６−２＞ＦＡＣＳ分析によるアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）測定
メリチン含有ナノ粒子のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する細胞死滅の全過程を測定するために、流細胞分析器（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＡＣＳ）を用いて全アポトーシス細胞／フィールド（％）を測定した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を２５ｃｍ2Ｔ−フラスコに１×１０６細胞／ｍＬの密度で接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。
【００６８】
接種した細胞は、７０〜９０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に至るまでＣＯ2培養基で３７℃、５％ＣＯ2で１〜４日間培養した。適正な細胞濃度に至ったとき、培地を除去してＰＢＳを細胞で洗滌した。
【００６９】
その後、培地と同一嵩で混合したナノ分散額６ｍＬを細胞に処理した後、３０分、６０分間隔で培養した。培養を完了した後、サンプルを除去してＰＢＳで洗滌した後、０．２５％トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）０．５ｍＬを処理して、細胞を脱着させて収去した後、１，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離した後に上層額を除去した。
【００７０】
その後、細胞ペレット（ｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔ）に結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）バッファー０．５ｍＬを処理して細胞を分散させた後、５μＬアネキシンＶ−ＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅと１０μＬヨウ化プロピジウム溶液を入れて１０分間遮光して染色した。染色が完了した細胞分散額をセルストレーナーキャップが装着した５ｍＬ Ｐｏｌｙｓｔｒｅｎｅ  Ｒｏｕｎｄ−Ｂｏｔｔｏｍ Ｔｕｂｅに注入して、流細胞分析器（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ Ｉ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて全アポトーシス細胞／フィールド（％）を測定しており、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって試料当たり１０，０００個のｅｖｅｎｔを分析した。
【００７１】
＜結果＞
＜実験例１＞メリチンの安全性
＜実験例１−１＞Ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞毒性（ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）
ナノカプセル化されていないフリー（ｆｒｅｅ）メリチン自体の細胞毒性を観測するために、メリチンを濃度別に処理したＨＥＫ２９３細胞をＭＴＴ分析によって細胞生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定した。
【００７２】
その結果、試料を処理しない対照群の細胞生存率と比較したとき、１００μｇ／ｍＬ区間で６６％の生存率が測定されており、濃度依存的にＨＥＫ２９３細胞に対して毒性が増加することが確認された（図４）。
【００７３】
＜実験例１−２＞Ｅｘ  ｖｉｖｏで赤血球に対する細胞毒性（ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）
ナノカプセル化されていないフリー（ｆｒｅｅ）メリチンを濃度別に処理したとき、赤血球細胞が溶血されて発生するヘモグロビンの発色度合を５４０ｎｍで測定して、赤血球細胞に対する毒性を評価した。赤血球細胞分散額と１％トリトンｘ−１００を処理した対照群と比較して、ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ（赤血球溶血、％）を分析した。
【００７４】
その結果、１０μｇ／ｍＬから１０％の溶血が観測しはじめ、濃度依存的に赤血球に対する細胞毒性を有することが確認された（図５）。
【００７５】
＜実験例２＞メリチンの抗癌活性（ｅｘ  ｖｉｖｏ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にフリー（ｆｒｅｅ）メリチンを濃度別に処理した後、ＭＴＴ分析によって細胞抑制率（ｃｅｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）を測定して、メリチン自体の乳癌細胞に対する抗癌活性を評価した。
【００７６】
その結果、メリチン自体の乳癌細胞増殖抑制率は、最小２０％から最大８０％に濃度依存的に増加することが確認された（図６）。ナノ粒子化されていない（ｆｒｅｅ）メリチンの固有抗癌活性を濃度別に測定することで、相対的に細胞毒性と赤血球細胞毒性が少ないながら、抗癌活性が発現される５μｇ／ｍＬ以下の低濃度区間をカプセルの最終メリチン濃度に設定してナノ粒子を製造した。
【００７７】
＜実験例３＞被覆素材が空ナノカプセルの粒子特性に及ぶ影響
＜実験例３−１＞キトサン含量による粒子特性
キトサン（ＣＳ）、ＰＥＧ、ＤＳＰＥ ＰＥＧを用いたナノ粒子を製造するとき、添加されるキトサン含量を決定するために、キトサンの含量によるＰＥＧナノ粒子の粒子特性を観測した。これは、メリチンが含有されていないＰＬＧＡ／キトサン／ＰＥＧ  ２０００ナノ粒子を用いて、キトサン含量による粒子特性を観測して行った。前記ナノ粒子は、ＰＬＧＡ１００ｍｇ、キトサン：７．２〜２８．８ｍｇ及びＰＥＧ  ２０００ ２４ｍｇを含む。
【００７８】
キトサン含量別に粒子特性を確認した結果、粒径は、Ｕ字状の傾向を示しており、キトサン含量が１４．４ｍｇ／ｍＬである時に最も小さい粒径が観測された。キトサン含量が最も低い７．２ｍｇでは、粒子生成時の結合力も低くなり、粒径が増加したように見えた。逆に、２８．８ｍｇでは、キトサン含量が高くて、相対的に厚い層を形成したと判断された（図７Ａ）。
【００７９】
ＰＤＩは、０．３を基準として低いほど安定的であると判断しているが、実験群いずれも０．３以下の安定した値を示しており、結果の間に有意差は表れなかった（図７Ｂ）。
【００８０】
散乱強度（ＤＣＲ）は、粒子から散乱された光の強度量であり、これは、製造された粒子の数と大きさによって影響される。本発明では、キトサン２８．８ｍｇで散乱強度が明らかに増加したため、この条件で、他の条件より相対的に大きいナノ粒子が多く形成されたと推定された（図７Ｃ）。
【００８１】
一方、通常、ゼータ電位は、３０ｍＶを基準として絶対値が大きいほど安定すると判断している。ゼータ電位は、キトサン含量が増加するほど増加する傾向を示した。特に、キトサン含量７．２ｍｇと１４．４ｍｇでは、ほぼ０に近い値を示しが、２１．６ｍｇと２８．８ｍｇでは、３０ｍＶ以上の高い絶対値で安定したゼータ電位を示した（図７Ｄ）。
【００８２】
従って、最終的に、粒径が２６１ｎｍであり、比較的に小さいながらゼータ電位の側面で安全性を示したキトサン含量２１．６ｍｇを最適なキトサン含量と決定した。
【００８３】
＜実験例３−２＞被覆物質による粒子特性
被覆物質であるＰＬＧＡ、キトサン、ＰＥＧ、ＤＳＰＥ ＰＥＧによるナノカプセルの粒子特性に及ぶ影響を分析するために、メリチンを添加しないブランク（ｂｌａｎｋ）ナノ粒子を製造して粒子特性を観測した。ブランクナノ粒子は、メリチンが添加されていないことを除いて、ナノカプセル１〜４と同じ方式で４種類タイプに製造された。また、細胞吸収能を測定するためのクマリン−６含有ナノ粒子は、メリチンの代わりに蛍光物質であるクマリン−６を用いたことを除いて、いずれも実施例６と同じ方式で製造された。
【００８４】
その結果、ＰＬＧＡに追加してキトサン、ＰＥＧ、ＤＳＰＥ ＰＥＧがカプセル化されるにつれて粒径が増加する傾向を示した（図８Ａ）。
【００８５】
ＰＤＩは、４種類タイプのナノ粒子とも０．３以下の安定した値に測定されており、特に、ＰＬＧＡを被覆したナノ粒子が最も均一な粒子分布が形成されたと判断された（図８Ｂ）。
【００８６】
散乱強度もＰＬＧＡを被覆した試験群で有意に最も高いと確認された（図８Ｃ）。
【００８７】
ゼータ電位は、ナノ粒子表面の電気二重層における電位を意味し、コロイドシステムの安全性を示す指標である。ゼータ電位は、ＰＬＧＡナノ粒子と比較したとき、キトサン（ＣＳ）、ＰＥＧ、ＤＳＰＥ ＰＥＧ（本発明では、簡単に「ＤＳＰＥ」とも記載する）を被覆したナノ粒子で絶対値が大きく増加したことが確認されたが、これはキトサンの影響と判断された（図８Ｄ）。
【００８８】
＜実験例４＞
＜４−１＞メリチン含有ナノカプセル
メリチン含有ナノ粒子の物理的特性を観測するために、メリチン含有ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＤＳＰＥ ＰＥＧ粒子を実施例１と同じ方法で製造した後、粒径及びＰＤＩ、散乱強度、ゼータ電位の物理的特性を測定した。
【００８９】
＜４−２＞メリチン含有ナノカプセルの粒子特性
粒径を測定した結果、ＰＬＧＡナノ粒子は２０３ｎｍと測定されており、キトサン（ＣＳ）とＰＥＧが加えられながら、粒径が多少増加して、ＰＥＧとＤＳＰＥ ＰＥＧナノ粒子は、それぞれ３１９ｎｍと２７９ｎｍを示した。ＰＥＧ２種類タイプを比較したとき、ＰＥＧナノ粒子よりＤＳＰＥ ＰＥＧナノ粒径が約４０ｎｍさらに小さく測定された（図８Ａ）。
【００９０】
ＰＤＩは、あらゆる粒子タイプにおいて、０．３以下と測定されて、均一な粒子分布を示した（図９Ｂ）。
【００９１】
メリチンが含有されていないブランクナノ粒子のように、ＰＬＧＡナノ粒子が最も高い散乱強度を示した（図９Ｃ）。
【００９２】
ゼータ電位は、ＰＬＧＡナノ粒子が−１３ｍＶの値を示した反面、ＰＥＧとＤＳＰＥナノ粒子は、それぞれ＋３３．３ｍＶ、＋３０．２ｍＶであり、絶対値３０ｍＶ以上の安定したゼータ電位を示した（図９Ｄ）。
【００９３】
＜４−３＞物理的特性
捕集効率
メリチンをＰＬＧＡのみで捕集したときよりＰＬＧＡにキトサンとＰＥＧが追加するにつれて捕集効率が有意に増加しており、ＰＥＧとＤＳＰＥ ＰＥＧナノ粒子は、相互有意差がなく、それぞれ９５％、９４％と測定された（図１０Ａ）。
【００９４】
含有効率
含有効率は、ＰＥＧ及びＤＳＰＥ ＰＥＧナノ粒子の間に有意差がなく、それぞれ１７．２％と１７．８％に測定された（図１０Ｂ）。  
【００９５】
＜実験例５＞ナノ粒子の安全性検査
＜実験例５−１＞Ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞毒性
実施例１のように、メリチン含有ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＤＳＰＥ ＰＥＧナノ粒子の細胞毒性を観察した。３種類タイプのナノ分散額を用いて多様なメリチン濃度区間でＨＥＫ２９３細胞に処理した後、細胞の生存率を比較した。
【００９６】
その結果、ナノカプセル化されていないメリチン（フリー（ｆｒｅｅ）メリチン）を始め、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＤＳＰＥ ＰＥＧでナノカプセル化されたメリチンを処理したＨＥＫ２９３細胞の生存率は、試料（ｓａｍｐｌｅ）処理をしていない対照群の生存率の平均７５％以上と測定された。この結果によって、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ及びＤＳＰＥ ＰＥＧの３種類のナノ粒子は、ナノ粒子化していないフリー（ｆｒｅｅ）メリチンと比較したとき、細胞毒性は、多少増加はしたが、いずれも平均７５％以上の生存率を示しており、正常細胞に対する毒性はないと判断された（図１１）。
【００９７】
＜実験例５−２＞Ｅｘ  ｖｉｖｏで赤血球に対する細胞毒性評価
赤血球細胞溶血検査
最終メリチン濃度区間に合わせて希釈したＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＤＳＰＥ ＰＥＧナノ分散額を赤血球細胞に処理したとき、赤血球細胞の溶血量を分析して赤血球細胞に対する毒性を観察した。
【００９８】
その結果、最終ナノ粒子の含有メリチン濃度区間である０〜２μｇ／ｍＬでは、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＤＳＰＥ ＰＥＧ被覆されたナノ粒子いずれも溶血（ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）（％）が１％未満であったし、粒子間に有意差は存在しなかった。しかし、メリチン３μｇ／ｍＬの濃度では、ＰＥＧとＤＳＰＥ ＰＥＧの溶血（％）が平均それぞれ１０％と３９％と測定されて、ＤＳＰＥの赤血球溶血量がさらに高く測定されたことを確認することができた。これは、りん脂質が重合されたＤＳＰＥ ＰＥＧの構造的要因によって、細胞に対する親和度が高くて、メリチンの毒性が早く発現されたためであると判断された（図１２）。
【００９９】
＜実験例５−３＞Ｅｘ  ｖｉｖｏ抗癌活性評価
最終メリチン濃度区間に合わせて希釈したＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＤＳＰＥ ＰＥＧナノ分散額をＭＤＡ−ＭＢ−２３細胞に処理したとき、２４時間後の細胞増殖抑制率を分析してＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する抗癌活性を観察した。
【０１００】
その結果、全般的にフリー（ｆｒｅｅ）メリチン及び３種類のナノ粒子とも濃度が増加するにつれて抗癌活性が有意に増加した。メリチン濃度０．２５μｇ／ｍＬでは、３種類のナノ粒子間の有意差は表れなかったが、これを除いた濃度区間では、３種類のナノ粒子ともフリー（ｆｒｅｅ）メリチンより抗癌活性が有意に高かった。また、濃度が増加するにつれて、ナノ粒子間の差は明らかであった。ナノ粒子間の抗癌活性を比較すると、ＰＬＧＡよりＰＥＧとＤＳＰＥ ＰＥＧナノ粒子が有意に高い抗癌活性を示しており、特に、ＰＥＧの抗癌活性が有意に最も高かった（図１３）。従って、抗癌活性の側面では、メリチン含有ＰＥＧナノ粒子が最も効果的であると判断された。
【０１０１】
一方、メリチンの特性上、非特異的に細胞に作用して、一般正常細胞膜のりん脂質二重層を分解する問題点があり、ＨＥＫ２９３細胞に対する毒性とＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生育抑制活性の割合を測定した。
【０１０２】
その結果、フリー（ｆｒｅｅ）メリチンに比べて、ＰＬＧＡナノ粒子は、相対的に低い選択度を示したが、ＰＥＧとＤＳＰＥ ＰＥＧナノ粒子は、相対的に高い選択度を示した。特に、ＰＥＧ被覆されたナノ粒子の選択度が最も高かったし、ＰＥＧ１．０μｇ／ｍＬに処理された時に最も高い選択度割合（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｒａｔｉｏ）を示したところ、それが抗癌効果を発現するための最も効率的な濃度と判断された。一方、ＤＳＰＥ ＰＥＧの選択度は、ＰＥＧに比べて相対的に低かったが、これは、前述と同様、りん脂質が重合されたＤＳＰＥ ＰＥＧの構造的要因によって、癌細胞だけでなく、正常細胞に対する親和度が共に高くて、メリチンの毒性がＨＥＫ２９３細胞に発現されたためであると判断された（図１４）。
【０１０３】
＜実験例６＞細胞透過観測
＜実験例６−１＞共焦点レーザー走検型顕微鏡 （ＣＬＳＭ）を用いた細胞透過度分析
メリチンナノ粒子と同じ粒子製造条件で、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）−６を捕集したＰＬＧＡ及びＰＥＧ、ＤＳＰＥ ＰＥＧナノ粒子を製造した後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に処理した。すなわち、クマリン−６捕集ナノ粒子は、メリチンの代わりにクマリン−６を用いたことを除くと、上記＜実験例５＞のナノ粒子と同じ方法で製造された。その後、細胞内の標準物質吸収度合を視覚的に確認するために細胞核をＰＩで染色して、細胞質で吸収された形態を観測した。
【０１０４】
その結果、赤く染色された細胞核の周りで緑蛍光を帯びており、細胞内に吸収されたことを観察することができた。フリークマリン−６とＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＤＳＰＥ ＰＥＧに対して、それぞれイメージソフトウェアでｍｅａｎ ｐｉｘｅｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙを計算した。その結果、あらゆるナノ粒子における細胞内吸収能がフリークマリンにおける細胞内吸収能より高いことが確認された。一方、ナノ粒子同士に比較すると、ＰＬＧＡよりＰＥＧとＤＳＰＥ ＰＥＧで被覆した場合、細胞透過能が高いことが確認された（図１５）。これは、ＰＥＧとＤＰＳＥ ＰＥＧ粒子の共通構成成分のうち、陽電荷を帯びており、高い細胞透過能を示すキトサンの影響と判断された。
【０１０５】
＜実験例６−２＞ＦＡＣＳ分析によるアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）測定
フリー（ｆｒｅｅ）メリチンとメリチン含有ナノ粒子を処理した後、３０分経過後、そして、６０分経過後の間隔で流細胞分析器（ＦＡＣＳ、（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｍｅｔｒｙ）を用いて全アポトーシス細胞／フィールド（ｆｉｅｌｄ）（％）を測定した。
【０１０６】
その結果、ＰＬＧＡを処理したアポトーシス領域は、３０、６０分の培養時間ともフリー（ｆｒｅｅ）メリチンに類似する活性を示した。一方、ＰＥＧとＤＳＰＥ ＰＥＧの場合、両粒子間のアポトーシス領域は、類似しており、３０分経過した時にそれぞれ１７．５、２７．８％、６０分経過した時にそれぞれ３０．８、３５．９％と測定されて、フリー（ｆｒｅｅ）メリチンよりＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のアポトーシスを促進させると確認された（図１８）。これは、先にＣＬＳＭによって測定した細胞透過能に類似する結果と判断される。すなわち、ＰＬＧＡに比べて、高い細胞透過能を有するＰＥＧとＤＰＳＥ ＰＥＧ粒子が抗癌活性を増進させると確認された。
【０１０７】
結論
本発明では、メリチンのナノカプセル化による乳癌細胞に及ぶ影響を分析するために、メリチンを含有した３種類のナノ粒子の粒子特性及び細胞毒性と乳癌細胞に対する抗癌活性、細胞透過を観測した。
【０１０８】
粒径は、粒子の種類によって２００〜３２０ｎｍに形成されており、各粒子は、均一な粒子分布を示した。
【０１０９】
抗癌効果の場合、あらゆるナノ粒子がナノ粒子化していないフリー（ｆｒｅｅ）メリチンに比べて高い活性を示しており、そのうち、ＰＥＧとＤＳＰＥ ＰＥＧナノ粒子の抗癌効果が最も高いと確認された。しかし、毒性の場合、ＤＳＰＥ ＰＥＧは、３μｇ／ｍＬから溶血現象が観測されて、ＰＥＧ  ２０００に比べて相対的に高い毒性を示した。
【０１１０】
また、ＰＥＧがＤＳＰＥ ＰＥＧに比べて、選択度割合（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｉｏ）が高く、乳癌細胞に対する標的性が高いと確認された。従って、３種類のナノ粒子のうち、毒性が少ないながら、乳癌に対する抗癌効果が高い粒子タイプは、ＰＥＧであり、最適なメリチン濃度は、選択度割合が高い１μｇ／ｍＬと判断された。
【０１１１】
＜実験例７＞
＜実験例７−１＞高圧均質機を用いしたナノ粒子の製造
上記実験において、３種類粒子タイプのうち、最も活性が高かったＰＥＧとＤＳＰＥ ＰＥＧを用いて粒径の減少可能性を把握するために、高圧均質機（Ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＨＰＨ））を用いてナノ粒子を製造した。前記ナノ粒子は、消音波処理後に高圧均質機（Ｎａｎｏ ＤｅＢＥＥ，ＢＥＥ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｓｏｕｔｈ  Ｅａｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて均質化させる工程が加えられたことを除くと、前記＜実験例５＞のナノ粒子と同じ方法で製造された。このとき、均質化条件は、３サイクルで固定して、圧力は１０，０００と２０，０００ｐｓｉでそれぞれ測定された。
【０１１２】
＜実験例７−２＞ＨＰＨ粒子の粒子特性
ＨＰＨ粒子の粒子特性を測定した結果は、図１７のとおりである。粒径を測定した結果、圧力による大きい差なしに、ＨＰＨで均質化過程を加えることで、１５７〜１７４ｎｍの小さい粒径を達成することができた。これは、均質化する前の粒径から約１００〜１５０ｎｍぐらい減少したものである（図１７Ａ）。
【０１１３】
ＰＤＩは、あらゆる粒子タイプにおいて、０．３以下と測定されて、有意差がなく、均一な粒子分布に測定されており、均質化する前のナノ粒子より低いＰＤＩ 値でさらに安定した分散度を示した（図１７Ｂ）。
【０１１４】
散乱強度では、相対的に１０，０００ｐｓｉでは、均質化過程前の散乱強度に類似する値と測定されており、２０，０００ｐｓｉでは、１０，０００ｐｓｉより低く測定されたことからみて、１０，０００ｐｓｉでさらに多いナノ粒子が形成されたと推定された（図１７Ｃ）。
【０１１５】
ゼータ電位は、均質化の前より全般的に減少しており、１０，０００ｐｓｉで製造されたＨＰＨ−ＤＳＰＥナノ粒子だけ以前に類似する高いゼータ電位を示した。粒子類型によって差はあるが、高い圧力と温度でＨＰＨ過程を経りながら、粒子の製剤に影響を与えたと推定された（図１７Ｄ）。
【０１１６】
＜実験例７−３＞捕集効率
ＨＰＨナノ粒子の捕集効率を測定した結果、全般的に均質化する前のナノ粒子（９４−９５％）より捕集効率が確然と減少した。また、２０，０００ｐｓｉより１０，０００ｐｓｉで製造されたとき、メリチン捕集効率が有意に高いと確認された（図１８）。これは、ＨＰＨで処理する時に圧力が高くなりながら、捕集されたメリチンが損失されて、捕集効率が減少したと判断された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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