(57)【要約】【課題】キラル体のカルボン酸を不斉合成する新規の方法を提供すること。【解決手段】下記一般式（Ｉ）で表されるα位に不斉炭素を有するチオエステル化合物のラセミ体から、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３からなる群より選択される少なくとも一種のアシルＣｏＡエステラーゼによる酵素加水分解反応により、キラル体のカルボン酸を不斉合成する方法：2019024494.tif 000029［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、水素又は置換基を示す。Ｒ2及びＲ3はこれらが結合する炭素原子と共に置換又は無置換の環構造を形成してもよい。ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＣＯ−Ｓ−Ｒ4は互いに異なる。]【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるα位に不斉炭素を有するチオエステル化合物の光学異性体の混合物から、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３からなる群より選択される少なくとも一種のアシルＣｏＡエステラーゼによる酵素加水分解反応により、キラル体のカルボン酸を不斉合成する方法：
【化１】
2019024494.tif 000023
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、水素又は置換基を示す。
Ｒ2及びＲ3はこれらが結合する炭素原子と共に置換又は無置換の環構造を形成してもよい。
ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＣＯ−Ｓ−Ｒ4は互いに異なる。]。
【請求項２】
Ｒ1が水素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ4が、下記一般式
【化２】
2019024494.tif 000024
［式中、Ｒ10及びＲ11は、同一又は異なって、水素又はアルキル基を示す。−Ｏ−Ｒ12は、水酸基、リン酸基含有官能基又はスルホン酸基を示す。ｐは１〜６の自然数を示す。ｑは０〜５の整数を示す。ｒは１〜６の自然数を示す。］
で表される基である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ1が水素であり、−Ｓ−Ｒ4が−Ｓ−ＣｏＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ2が下記一般式
【化３】
2019024494.tif 000025
［式中、Ｒ5は、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−を示す。Ｒ6は置換基を示す。ｍは０〜５の整数を示す。ｍが２以上の場合、Ｒ6は同一でも異なってもよい。］
で表される基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ2が下記一般式
【化４】
2019024494.tif 000026
［式中、Ｒ5及びＲ7は、同一又は異なって、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−を示す。Ｒ6及びＲ8は、同一又は異なって、置換基を示す。ｍ'は１〜５の自然数を示す。ｎは０〜４の整数を示す。ｍ'−１が２以上の場合、Ｒ6は同一でも異なってもよい。ｎが２以上の場合、Ｒ8は同一でも異なってもよい。］
で表される基である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ2及びＲ3がこれらが結合する炭素原子と共に下記一般式
【化５】
2019024494.tif 000027
［式中、Ｒ9は水素又は置換基を示す。］
で示される環構造を形成している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ9が
【化６】
2019024494.tif 000028
で示される基である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ3が炭素数１〜６のアルキル基である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボン酸化合物の不斉合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性な生体物質などは、片方のエナンチオマーのみが有用あるいは有害であることがあり、光学異性体を含まないキラルな物質として合成する必要がある。その方法のひとつとして不斉合成があり、立体選択的な化学反応により、光学異性体を作り分ける方法として実用化されている（例えば非特許文献１）。
一方、化学合成産業では、反応選択性が高い反応、あるいは水溶液中（有機溶剤を使わない）で高い活性を有する化学反応系が求められており、水溶液中で高い選択性、活性を有する、酵素反応が開発され、実用化されている（例えば非特許文献2）。
また、キラルな化合物を合成する不斉合成反応のひとつとして、触媒となる酵素の立体選択性を利用した酵素不斉合成反応がある。その一つとして、α位に不斉炭素を有するカルボン酸化合物（以下カルボン酸）およびその誘導体の不斉合成法として、ATP依存性アシルコエンザイムAリガーゼ（アシルCoAリガーゼ）を用いた方法がある（例えば特許文献１）。この方法では、ラセミ体のカルボン酸をアシルCoAリガーゼにより補酵素A（CoA）と脱水縮合したCoAチオエステル化合物に変換する際、カルボン酸の片方の光学異性体が選択的に反応することにより、キラルなCoAチオエステル化合物を合成する。この方法は水溶液中で進行するため、有機溶剤が不要であるなどのメリットがある。
【０００３】
しかしこの酵素反応は補因子として高価なATPが必要である。また反応生成物であるキラルなCoAチオエステル化合物がエノール化によりラセミ化しやすく、光学純度を高い状態で維持できない場合がある。このような場合は、未反応で残ったカルボン酸のみがキラルであり利用可能であるが、必然的に回収率は50%以下となる。反応生成物であるCoAチオエステル化合物がラセミ化しにくく、キラルな化合物として利用できる場合でも、CoAチオエステル化合物が水溶性であるため、その分離精製が煩雑になり多くの時間と費用が必要になるという問題もある。
【０００４】
アシルCoAリガーゼによる酵素反応に、チオエステル加水分解酵素（チオエステラーゼ）を組合せ、ラセミ化を伴いながらの光学分割、いわゆるDynamic Kinetic Resolution(DKR)反応系を構築することにより、理論上100%の収率にて光学活性なカルボン酸を合成する方法もある（非特許文献３および非特許文献４）。しかしこれらの方法では、立体選択性を有さないあるいは極めて低いチオエステラーゼを用いているため、アシルCoAリガーゼによる立体選択的酵素反応を繰り返す必要があり、多量のアシルCoAリガーゼの添加が必要である。更に中間体となるCoAチオエステル化合物のラセミ化が進行しにくい場合、エピメラーゼを加える必要があり、この場合３種類の酵素を共存下での反応となり、反応条件の最適化および制御が必要で、多くの時間と費用が必要となるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】加藤太一郎, 太田博道, 宮本憲二, 場家幹雄 「ルシフェラーゼを用いる光学活性なカルボン酸の製造方法」特開2007-29017.
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"酵素を用いて鏡像異性体を分ける，創る，速度論的分割の力", 古田未有ら, 生物工学会誌, 2014, 92(6), 298-302.
【非特許文献２】小宮山眞監修：酵素利用技術体系〜基礎・解析から改変・高機能化・産業利用まで〜，p.434-438，エヌ・ティー・エス出版 (2010).
【非特許文献３】Juri Maeda, Dai-ichiro Kato, Masatoshi Okuda, Masahiro Takeo, Seiji Negoro, Kazunari Arima, Yuji Ito, Kazuki Niwa, "Biosynthesis-inspired deracemizative production of D-luciferin by combining luciferase and thioesterase" BBA - General Subjects 1861, 2112-2118 (2017)
【非特許文献４】Xiao Qu, Amanda Allan, Grace Chui, Thomas J. Hutchings, Ping Jiao, Lawrence Johnson, Wai Y. Leung, Portia K. Li, Georgina R. Steel, Andrew S. Thompson, Michael D. Threadgill, Timothy J. Woodman, Matthew D. Lloyd, "Hydrolysis of ibuprofenoyl-CoA and other 2-APP-CoA esters by human acyl-CoA thioesterase-1 and -2 and their possible role in the chiral inversion of profens" Biochemical Pharmacology 86, 1621-1625 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、キラル体のカルボン酸を不斉合成する新規の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる状況の下、本発明者らは、不斉炭素を含む特定の構造を有するチオエステル化合物の光学異性体の混合物を反応基質とし、これを特定のアシルＣｏＡエステラーゼを用いた酵素加水分解反応に供することにより、キラル体のカルボン酸を不斉合成することができることを見出した。本発明はかかる新規の知見に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明は、典型的には、以下の項に規定する発明を提供する：
項１．下記一般式（Ｉ）で表されるα位に不斉炭素を有するチオエステル化合物の光学異性体の混合物から、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３からなる群より選択される少なくとも一種のアシルＣｏＡエステラーゼによる酵素加水分解反応により、キラル体のカルボン酸を不斉合成する方法：
【化１】
2019024494.tif 000002
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、水素又は置換基を示す。
Ｒ2及びＲ3はこれらが結合する炭素原子と共に置換又は無置換の環構造を形成してもよい。
ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＣＯ−Ｓ−Ｒ4は互いに異なる。]。
【００１０】
項２．Ｒ1が水素である、項１に記載の方法。
【００１１】
項３．Ｒ4が、下記一般式
【化２】
2019024494.tif 000003
［式中、Ｒ10及びＲ11は、同一又は異なって、水素又はアルキル基を示す。−Ｏ−Ｒ12は、水酸基、リン酸基含有官能基又はスルホン酸基を示す。ｐは１〜６の自然数を示す。ｑは０〜５の整数を示す。ｒは１〜６の自然数を示す。］
で表される基である、項１又は２に記載の方法。
【００１２】
項４．Ｒ1が水素であり、−Ｓ−Ｒ4が−Ｓ−ＣｏＡである、項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【００１３】
項５．Ｒ2が下記一般式
【化３】
2019024494.tif 000004
［式中、Ｒ5は、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−を示す。Ｒ6は置換基を示す。ｍは０〜５の整数を示す。ｍが２以上の場合、Ｒ6は同一でも異なってもよい。］
で表される基である、項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【００１４】
項６．Ｒ2が下記一般式
【化４】
2019024494.tif 000005
［式中、Ｒ5及びＲ7は、同一又は異なって、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−を示す。Ｒ6及びＲ8は、同一又は異なって、置換基を示す。ｍ'は１〜５の自然数を示す。ｎは０〜４の整数を示す。ｍ'−１が２以上の場合、Ｒ6は同一でも異なってもよい。ｎが２以上の場合、Ｒ8は同一でも異なってもよい。］
で表される基である、項５に記載の方法。
【００１５】
項７．Ｒ2及びＲ3がこれらが結合する炭素原子と共に下記一般式
【化５】
2019024494.tif 000006
［式中、Ｒ9は水素又は置換基を示す。］
で示される環構造を形成している、項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【００１６】
項８．Ｒ9が
【化６】
2019024494.tif 000007
で示される基である、項７に記載の方法。
【００１７】
項９．Ｒ3が炭素数１〜６のアルキル基である、項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、α位に不斉炭素を有するカルボン酸のチオエステル体の光学異性体の混合物を酵素加水分解反応に供することにより、キラル体のカルボン酸を不斉合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本願実施例３の試験結果を示す。
【図２】本願実施例４の試験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、下記一般式（Ｉ）で表されるα位に不斉炭素を有するチオエステル化合物の光学異性体の混合物から、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３からなる群より選択される少なくとも一種のアシルＣｏＡエステラーゼによる酵素加水分解反応により、キラル体のカルボン酸を不斉合成する方法：
【化７】
2019024494.tif 000008
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、水素又は置換基を示す。
Ｒ2及びＲ3はこれらが結合する炭素原子と共に置換又は無置換の環構造を形成してもよい。ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＣＯ−Ｓ−Ｒ4は互いに異なる。]
を提供する。
【００２１】
チオエステル化合物
本発明において、「置換基」としては、本明細書中でそうでないことが明記されない限り、特に限定されず、例えば、水酸基、アミノ基、アルキル、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、アリールオキシ、チオアリール、置換又は無置換の１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基等が挙げられる。
【００２２】
また、Ｒ2で示される「置換基」には、本明細書中でそうでないことが明記されない限り、前述した一般式（Ａ１）で表される基、前述した一般式（Ａ２）で表される基等も包含される。また、Ｒ4で示される「置換基」には、前述した一般式（Ｂ１）で表される基等も包含される。
【００２３】
本発明において、アルキルとしては、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状アルキル基等が挙げられ、より具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル基等を挙げることができる。
【００２４】
ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。
【００２５】
アリールとしては、炭素数６〜１４のアリール基等が挙げられ、より具体的には、例えば、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アントリル、ビフェニリル、テトラヒドロナフチル等が挙げられる。
【００２６】
アリールカルボニルとしては、例えば、炭素数６〜１４のアリール基がカルボニル基に結合した構造を有する炭素数７〜１７のアリールカルボニル基等が挙げられる。より具体的には、アリールカルボニルとしては、前記に列挙したアリールがカルボニル基に結合した構造の基等を挙げることができる。
【００２７】
アリールオキシとしては、例えば、アリール部分が炭素数６〜１４のアリール基であるアリールオキシ等が挙げられる。より具体的には、アリールオキシとしては、アリール部分が前記に列挙したアリール基であるアリールオキシ等を挙げることができる。
【００２８】
１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基としては、例えば、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択される少なくとも１種のヘテロ原子（好ましくは窒素及び／又は硫黄）を１〜３個（好ましくは１〜２個、より好ましくは２個）有する５〜１０員環の不飽和複素環基等が挙げられる。より具体的には、１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基としては、チエニル、ピロリル、フリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピラジル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、トリアゾロピリジル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾチアゾリル（例えば、ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル等）キノリル、イソキノリル等が挙げられる。
【００２９】
１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基は、置換基を有していても、無置換であってもよい。１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基が置換基を有する場合、置換基としては、特に限定されず、前述のものが挙げられるが、例えば、水酸基、アミノ基、アルキル、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、アリールオキシ、チオアリール、置換又は無置換の１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基等が挙げられる。１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基が置換基としてさらに「置換基を有する１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基」を有する場合、当該不飽和複素環基に置換基として結合した不飽和複素環基がさらに有する置換基としては、前述の置換基のうち、「置換又は無置換の１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基」以外のものを挙げることができる。
【００３０】
本発明において、Ｒ1としては、特に限定されないが、例えば、水素、炭素数１〜６（好ましくは１〜３）のアルキル基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、アリールオキシ、チオアリール、置換又は無置換の１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基等が挙げられ、水素、アリール、アリールオキシ、チオアリール等が好ましく、水素、アリール、アリールオキシ等がより好ましく、水素が特に好ましい。
【００３１】
本発明において、Ｒ2としては、例えば、下記一般式（Ａ１）
【化８】
2019024494.tif 000009
［式中、Ｒ5は、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−を示す。Ｒ6は置換基を示す。ｍは０〜５の自然数を示す。ｍが２以上の場合、Ｒ6は同一でも異なってもよい。］で表される基であることが好ましい。
【００３２】
Ｒ2が上記一般式（Ａ１）で表される基である場合、Ｒ5は、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−であり、好ましくは、結合、−Ｏ−又は−Ｓ−であり、より好ましくは結合又は−Ｏ−であり、さらに好ましくは結合である。
【００３３】
Ｒ2が上記一般式（Ａ１）で表される基である場合、Ｒ6で示される置換基としては、特に限定されないが、例えば、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、チオアリール等が挙げられ、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、チオアリール等が好ましく、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル等がより好ましい。一般式（Ａ１）においてｍが２以上の場合、Ｒ6は、少なくともパラ位に１個及びメタ位に１又は２個、存在していることが好ましい。また、一般式（Ａ１）においてｍが２でありＲ6がパラ位及びメタ位に１個ずつ存在していることがより好ましく、一般式（Ａ１）においてｍが２でありＲ6がパラ位及びメタ位に１個ずつ存在しておりかつＲ5が結合であることがさらに好ましい。
【００３４】
本発明の上記実施形態において、好ましくは、Ｒ2は、下記一般式（Ａ−１）
【化９】
2019024494.tif 000010
［式中、Ｒ5は、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−を示す。Ｒ6は置換基を示す。］
で表される基を示す。
【００３５】
Ｒ2が一般式（Ａ１−１）で表される基である場合、Ｒ5としては、前述のものが挙げられるが、当該実施形態においては、Ｒ5は−Ｏ−であることが好ましい。
【００３６】
また、Ｒ2が一般式（Ａ１−１）で表される基である場合、Ｒ6で示される置換基としては、前述のものが挙げられるが、当該実施形態においては、Ｒ6はハロゲンであることが好ましい。
【００３７】
また、Ｒ2が一般式（Ａ１）で表される基である場合における別の好ましい実施形態としては、Ｒ2は下記一般式（Ａ２）
【化１０】
2019024494.tif 000011
［式中、Ｒ5及びＲ7は、同一又は異なって、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−を示す。Ｒ6及びＲ8は、同一又は異なって、置換基を示す。ｍ'は１〜５の自然数を示す。ｎは０〜４の整数を示す。ｍ'−１が２以上の場合、Ｒ6は同一でも異なってもよい。ｎが２以上の場合、Ｒ8は同一でも異なってもよい。］
で表される基であってもよい。
【００３８】
Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、Ｒ5としては、前述のＲ2が一般式（Ａ１）で表される基である場合について挙げたもの等が挙げられるが、当該実施形態においては、Ｒ5は結合であることが好ましい。
【００３９】
Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、Ｒ6で示される置換基としては、ハロゲン等が挙げられるが、当該実施形態においては、Ｒ6はハロゲン（例えば、フッ素等）等であることが好ましい。
【００４０】
Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、Ｒ7は、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−を示し、結合又は−Ｃ（＝Ｏ）−が好ましい。
【００４１】
Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、Ｒ8としては、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、チオアリール等が挙げられ、水酸基等が好ましい。
【００４２】
Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、ｍは、１〜５の自然数を示し、１〜３が好ましく、１〜２がより好ましい。
【００４３】
Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、ｎは、０〜４の整数を示し、０〜１が好ましく、０がより好ましい。
【００４４】
Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、ｍ'、Ｒ6及びＲ7の好ましい組み合わせとしては、ｍ'が１であり（従ってＲ6が存在しない）かつＲ7が−Ｃ（＝Ｏ）−である組み合わせ；ｍ'が２〜３（好ましくは２）であり、Ｒ6が前記ハロゲンでありかつＲ7が結合である組み合わせ等が挙げられる。
【００４５】
本発明において、Ｒ3で示される置換基としては、特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６（好ましくは１〜３、より好ましくは１）のアルキル基、アミノ基等が挙げられ、炭素数１〜６（好ましくは１〜３、より好ましくは１）のアルキル基、アミノ基等が好ましく、炭素数１〜６（好ましくは１〜３、より好ましくは１）のアルキル基等がより好ましい。
【００４６】
本発明のうち、Ｒ2が前記一般式（Ａ１）で表される基である実施形態において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の組み合わせとしては、
Ｒ1が水素、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、又はチオアリールであり、
Ｒ2が前記一般式（Ａ２）で表される基であり、
Ｒ3が炭素数１〜６（好ましくは１〜３、より好ましくは１）のアルキル基、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、又はチオアリールである組み合わせが好ましく；
Ｒ1が水素であり、
Ｒ2が前記一般式（Ａ２）で表される基であり、
Ｒ3が炭素数１〜６（好ましくは１〜３、より好ましくは１）のアルキル基である組み合わせがより好ましい。
【００４７】
また、本発明の別の実施形態においては、Ｒ2及びＲ3は、これらが結合する炭素原子と共に環構造を形成してもよい。かかる環構造は、α炭素に対応する炭素原子を１個有している限り特に限定されず、炭化水素環でも炭素原子を少なくとも１個有する複素環でもよい。より具体的には、例えば、かかる環構造としては、シクロペンタン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、ジヒドロキノリン等の３〜６員環の炭化水素環において、当該炭化水素環が有する１個の炭素に結合する２個の水素が外れてなる二価の基；ピロリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、チアゾリン、ピロリジン等の１〜３個のヘテロ原子を有し、（α炭素に対応する）−ＣＨ2−構造を含む５〜１０員環の不飽和複素環等が挙げられる。好ましい実施形態においては、Ｒ2及びＲ3がこれらが結合する炭素原子と共に下記一般式（Ａ３）
【化１１】
2019024494.tif 000012
［式中、Ｒ9は水素又は置換基を示す。］
で示される環構造を形成してもよい。
【００４８】
当該実施形態において、Ｒ9で示される置換基としては、置換又は無置換の１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基、炭素数１〜６（好ましくは１〜３）のアルキル基、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、チオアリール等が挙げられ、置換又は無置換の１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基等が好ましい。
【００４９】
Ｒ9が、置換基を有する１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基の場合、１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基としては、ベンゾチアゾール等が挙げられる。１〜３個のヘテロ原子を有する５〜１０員環の不飽和複素環基がさらに置換基を有する場合、当該置換基としては、特に限定されないが、例えば、アリール、水酸基等が挙げられ、水酸基等が好ましい。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態において、Ｒ9としては、
【化１２】
2019024494.tif 000013
で示される基が挙げられる。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態において、Ｒ4としては、下記一般式
【化１３】
2019024494.tif 000014
［式中、Ｒ10及びＲ11は、同一又は異なって、水素又はアルキル基を示す。−Ｏ−Ｒ12は、水酸基、リン酸基含有官能基又はスルホン酸基を示す。ｐは１〜６の自然数を示す。ｑは０〜５の整数を示す。ｒは１〜６の自然数を示す。］
で表される基等が挙げられる。
【００５２】
ｐは１〜６の自然数を示し、好ましくは１〜３を示し、より好ましくは２を示す。ｑは０〜５の整数を示し、好ましくは１〜３を示し、より好ましくは２を示す。ｒは１〜６の自然数を示し、好ましくは１〜３を示し、より好ましくは２を示す。ｒが２以上の場合、複数のｐは同一でも異なっても良い。またｒが２以上の場合、複数のｑは同一でも異なっても良い。
【００５３】
式（Ｂ１）中、Ｒ10及びＲ11は、同一又は異なって、水素又はアルキル基（好ましくは炭素数１〜６、より好ましくは炭素数１〜３、さらに好ましくは炭素数１のアルキル基）を示す。
【００５４】
リン酸基含有官能基としては、リン酸基
【化１４】
2019024494.tif 000015
下記一般式（Ｃ１）
【化１５】
2019024494.tif 000016
［式中、ｓは、１〜３の自然数を示す。Ｘは、リン酸基で置換されていてもよいヌクレオシド基を示す。］
で表される基等が挙げられる。
【００５５】
本発明において、ヌクレオシド基とは、ヌクレオシドの５位の水酸基に含まれる水素が外れてなる一価の基を意味する。従って、一般式（Ｃ１）で表される基において、Ｘがヌクレオシド基の場合、
【化１６】
2019024494.tif 000017
の部分は、当該ヌクレオシド基の５位に結合する。
ヌクレオシド基としては、アデノシル基、グアノシル基、ウリジル基、シチジル基等が挙げられる。
【００５６】
ｓは、１〜３の自然数を示し、好ましくは１〜２であり、より好ましくは２である。
【００５７】
また、これらのヌクレオシド基は、リン酸基で置換されていてもよい。典型的には、これらのヌクレオシド基の２位の水酸基がリン酸基で置換されていてもよい。
【００５８】
本発明において、−Ｓ−Ｒ4が、−Ｓ−ＣｏＡであること、従って、−Ｓ−Ｒ4が、下記式で示される基であることが好ましい：
【化１７】
2019024494.tif 000018
【００５９】
酵素加水分解反応
本発明の方法においては、一般式（Ｉ）で表されるα位に不斉炭素を有するチオエステル化合物をＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３からなる群より選択される少なくとも一種のアシルＣｏＡエステラーゼによる酵素加水分解反応に供することにより、上記チオエステル化合物の光学異性体の混合物からキラル体のカルボン酸を不斉合成することができる。
【００６０】
本発明において、光学異性体の混合物とは、所定のキラル体とその光学異性体との混合物であって、典型的には、所定のキラル体の過剰率が20%ee以下、例えば、10%ee以下、より典型的にはラセミ体を示す。また、別の実施形態において本発明において光学異性体の混合物中の所定のキラル体が、所定のキラル体の過剰率が0%ee以下、-10%ee以下、-20%ee以下等であってもよい。本発明において、不斉合成とは、光学異性体を含む光学異性体の混合物から、そのうちの１種類のキラル体の割合を、その他の異性体より有意に高くすることを意味し、典型的には、所定のキラル体の過剰率を50%ee以上、好ましくは75%ee以上、より好ましくは90%ee以上、さらに好ましくは99%ee以上とすることを意味する。ここでキラル体の過剰率は、以下の式から算出することができる：
【数１】
2019024494.tif 000019
。
【００６１】
本発明において用いるアシルＣｏＡエステラーゼとしては、例えば、acyl-coenzyme A thioesterase 7（ＡＣＯＴ７）が挙げられる。ＡＣＯＴ７はヒトのアシルＣｏＡチオエステラーゼの一種で、大腸菌や酵母、動物細胞によるタンパク質発現系、あるいは無細胞タンパク質発現系により調製できる。ＡＣＯＴ７としては、Genbank Accession No. NP_009205で示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。より具体的には、ＡＣＯＴ７としては、下記に示すアミノ酸配列を有するものが挙げられる：
【表１】
2019024494.tif 000020
ここで、ＡＣＯＴ７は、下記アミノ酸配列（ｉ）の部分に特徴的なモチーフを有することが知られている：
（ｉ）RPDDANVAGN VHGGTILKMI EEAGAIISTR HCNSQNGERC VAALARVERTDFLSPMCIGE VAHVSAEITY TSKHSVEVQV NVMSENI及び（配列番号２）LHGFVHGGVT MKLMDEVAGI VAARHCKTNI VTASVDAINF HDKIRKGCVI TISGRMTFTS NKSMEIEVLV DA（配列番号３）
従って、本発明においては、アシルＣｏＡエステラーゼＡＣＯＴ７として、上記（ｉ）で示されるアミノ酸配列を有するもの等を用いることもできる。また、本発明において、ＡＣＯＴ７には、Genbank Accession No. NP_009205で示されるアミノ酸配列；配列番号１で示されるアミノ酸配列；または配列番号２及び３で示されるアミノ酸配列を有するもの等だけでなく、本発明の効果が得られる範囲において、これらのいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、１〜５個、１〜３個、１個等）のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むものも包含される。
【００６２】
また、本発明において用いるアシルＣｏＡエステラーゼとしては、例えば、acyl-coenzyme A thioesterase 13（ＡＣＯＴ１３）も挙げられる。ＡＣＯＴ１３はヒトのアシルＣｏＡチオエステラーゼの一種で、大腸菌を用いたタンパク質発現系により調製できる。ＡＣＯＴ１３としては、Genbank Accession No. NP_060943で示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。より具体的には、ＡＣＯＴ１３としては、下記に示すアミノ酸配列を有するものが挙げられる：
【表２】
2019024494.tif 000021
また、本発明において、ＡＣＯＴ１３には、Genbank Accession No. NP_060943で示されるアミノ酸配列；又は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するもの等だけでなく、本発明の効果が得られる範囲において、これらのいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、１〜５個、１〜３個、１個等）のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むものも包含される。これらのチオエステラーゼとしては、ヒト、マウス、ラット等の哺乳動物由来；ゼブラフィッシュ、メダカ等の魚類由来；カイコ、ショウジョウバエ、コクゾウムシ等  昆虫由来等、様々なものを用いることができる。
【００６３】
ここで、ＡＣＯＴシリーズのタンパク質としてはＡＣＯＴ１〜１３の１３種類が知られている。下記表３にＡＣＯＴシリーズのタンパク質の相同性計算の結果を示す。
【表３】
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本発明者らは、多種多様な酵素を用いた反応を鋭意検討した結果、ＡＣＯＴシリーズのうち、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３を用い、反応基質として前述の化合物を用いた場合に、立体選択性が非常に高い反応を実現できることを見出した。
上記表１に示すように、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３は、いずれも他のＡＣＯＴシリーズに対し相同性が低く、構造的に大きく異なっている。また、本願実施例に示すように、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３は、いずれも他のＡＣＯＴシリーズと比較して、機能（反応性、立体選択性）の点でも大きく異なる。
【００６４】
本発明の方法は、下記一般式（Ｉ）で表されるα位に不斉炭素を有するチオエステル化合物を、酵素加水分解反応に供する工程を含む。
【００６５】
当該反応は、通常、水等の溶媒に上記チオエステル化合物を溶解又は分散した液で行われる。上記チオエステル化合物の濃度は特に限定されないが、例えば、0.1 〜1000 ｍＭ、好ましくは、10 〜100 ｍＭの範囲で適宜設定できる。また、反応系中の酵素の配合量も特に限定されないが、例えば、1 ng/mL〜1 mg/mL、好ましくは、10 ng/mL〜1 μg/mLの範囲で適宜設定できる。反応時間も特に限定されないが、例えば、5〜60分、好ましくは、10〜30分の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、20〜40℃、好ましくは、30〜37℃の範囲で適宜設定できる。反応時の圧力も特に限定されず、常圧、加圧下、減圧下のいずれで行ってもよい。
【００６６】
当該反応により、一般式（Ｉ）で表されるチオエステル化合物のチオエステル部分がカルボキシル基になる。ここで、本発明においては、チオエステル反応は、一般式（Ｉ）で表されるチオエステル化合物の光学異性体の混合物に含まれる光学異性体のうち一方に対し優先的に進行するため、キラル体のカルボン酸を不斉合成することができる。また、本発明において、前記チオエステル化合物の光学異性体の混合物に含まれる光学異性体のうち一方に対し優先的に進行するため、反応が進むと、残存するもう一方のチオエステル化合物の割合が相対的に高くなり得る。
【００６７】
従って、本発明によれば、α位に不斉炭素を有するカルボン酸のチオエステル体を、立体選択的に片方の光学異性体のみを加水分解することで、キラルなカルボン酸を合成することができる。このように得られるキラルなカルボン酸は、各種医薬品・生理活性物質やキラル液晶材料などのファインケミカル、又はそれらを製造するための中間体として用いられ得る。従って、本発明の不斉合成方法は、それらの化合物を製造するのに、有用である。
【００６８】
本発明において、例えば、ＣｏＡ又はこれに類似する構造を有するチオエステル化合物（本明細書においてＣｏＡチオエステル化合物と示すこともある）等は、一般的に、カルボン酸に比べて容易にラセミ化が可能であるため好ましい。一般式（Ｉ）で表されるチオエステル化合物がラセミ化し易い化合物である場合、光学異性体のうちチオエステル加水分解が進行しにくい方の化合物がラセミ化により、もう一方の光学異性体となる。従って、かかる実施形態においては、光学分割がラセミ化を伴いながら進むため、より高い分離能で光学分割を行うことができ、好ましい。また、本発明の好ましい実施形態において、更にエピメラーゼにより一般式（Ｉ）で表されるチオエステル化合物のラセミ化を促進させることもできる。
【００６９】
ラセミなCoAチオエステル化合物は元となるラセミなカルボン酸とCoAから有機合成することが可能であり、このものを立体選択的に加水分解できれば、ATPを用いることなくキラルなカルボン酸を合成することができる。生成するカルボン酸が非水溶性であれば、このものを液相分離により酵素、CoA等を含む反応水溶液から分離することが可能であり、より安価な不斉合成反応系を提供することが可能になる。
【００７０】
これまで、チオエステル加水分解酵素（チオエステラーゼ）が立体選択性を有するとの報告はされていなかった。またCoAチオエステル化合物はカルボン酸に比べて容易にラセミ化が可能であり、更にエピメラーゼによりラセミ化を促進させることも可能である。このような特性を利用すれば、立体選択性を有するチオエステラーゼにより、ラセミ化を伴いながらの光学分割、いわゆるDynamic Kinetic Resolution(DKR)反応系を、立体選択的なCoAリガーゼを使用することなく構築することも可能となり、理論上100%の収率にて光学活性なカルボン酸を合成することも可能であり、従って、本発明はかかる点からも非常に有用である。
【実施例】
【００７１】
実施例１
２  ｍＭフルルビプロフェニル−ＣｏＡ水溶液１０μＬと、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８］バッファー１００Ｌを１．５ｍＬのプラスチックチューブに入れて混合し、そこに１０μｇ／ｍＬのＡＣＯＴ７水溶液を１０μＬ  加え、室温に２時間置いた。ＡＣＯＴ７はＯＲＦ配列がクローン化されたエントリークローン（ＦＬＪ３２６０６ＡＡＡＮ）と、Ｎ末端側ＧＳＴ−ｔａｇ，  ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合用デスティネーションベクターとを用い、非特許文献１記載の方法に従って、コムギ胚芽抽出液（ＷＥＰＲＯ７２４０Ｇ、セルフリーサイエンス社）を用いてタンパク質合成を行った。
この反応液に10倍量の2 Nの塩酸を加え、反応を停止させ、ジエチルエーテルによる溶媒抽出、乾燥を行った。このものを、ダイセル社製キラルカラムCHIRALCEL OD-Hを用いた高速液体カラムクロマトグラフィー（HPLC）により、生成したフルルビプロフェンの光学純度を分析した(hexane/i-PrOH/TFA = 95/5/0.1%, 1 mL/min, 210 nm)。対照実験として、酵素非添加の溶液も同様の操作で分析を行った。結果を図１に示す。
【００７２】
その結果、酵素ACOT７の添加によりＲ-フルルビプロフェンが選択的に生成し、その鏡像体過剰率は100%eeであった。酵素ACOT７に代えてACOT2、ACOT4、ACOT8、ACOT9、ACOT11 、ACOT12を用いる以外、上記と同様にしてフルルビプロフェンを生成し、光学純度を分析した。その結果、ACOT9の鏡像体過剰率は46%eeに止まった。また、ACOT2、ACOT4、ACOT8、ACOT11、及びACOT12については、反応自体が進まなかった。
【００７３】
実施例２
０．０５ｍＭのルシフェリル−ＣｏＡ（ラセミ体）に、１０μｇ／ｍＬの酵素ＡＣＯＴ１３を添加し、生成したルシフェリンの光学純度をダイセル社製キラルカラムCHIRALCEL OD-RHを用いてHPLC分析した(H2O/acetonitrile/TFA = 73/27/0.1%, 1 mL/min, ex330 nm, em510 nm)。その結果、L-ルシフェリンの鏡像体過剰率が100%eeとなった。酵素ルシフェラーゼは、ゲンジボタル由来の遺伝子を導入した発現ベクターを大腸菌に導入して調製し、酵素ACOT13は実施例1のACOT7と同じ方法で調整した。対照実験として、酵素ACOT13非添加の溶液も同様の操作で分析を行った。図２に結果を示す。さらに、酵素ACOT１３に代えてTESB、ACOT2、ACOT4、ACOT7、ACOT8、ACOT9、ACOT11又はACOT12を用いる以外、上記と同様にしてルシフェリンを生成し、光学純度を分析した。その結果、ACOT7については鏡像体過剰率は77%eeに達した。これに対し、ACOT9の鏡像体過剰率は31%eeに止まった。また、ACOT2、ACOT4、ACOT8、ACOT11及びACOT12については、反応自体が進まなかった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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