(57)【要約】      （修正有）【課題】(S)-3'-メチル-アブシシン酸、およびそのエステル、ならびにこれらの化合物の使用、その製造方法の提供。【解決手段】下式；2019108344.tif 000015[式中、Rは、水素、置換もしくは非置換アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルである]で示される化合物およびその塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)：
2019108344.tif 000014
(I)
[式中、Rは、水素、置換もしくは非置換アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルである]
で示される化合物およびその塩。
【請求項２】
Rが水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Rがアルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Rが低級アルキルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Rが、-OH、-NH2、-SH、ハロゲン、-CN、-NR1R2、-OR1、-SR1、-S(O)R1、-SO2R1、-C(O)R1、-C(O)NR1R2、-NHC(O)R1、-NHSO2R1、-NHC(O)OR3、-SO2NR1R2または-NHC(O)NR1R2の少なくとも1つで独立して置換され；ここで、R1およびR2はそれぞれ独立して、水素または低級アルキルであり、R3は低級アルキルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
塩が、アルカリまたはアルカリ土類金属カチオン、プロトン化アミン(+NHR4R5R6)(ここで、R4、R5およびR6はそれぞれ独立して、水素、低級アルキル、アラルキルである)または第四級アンモニウムイオン(+NR7R8R9R10)(ここで、R7、R8、R9およびR10はそれぞれ独立して、アラルキルまたは低級アルキルである)を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
塩が、塩素(Cl-)、臭素(Br-)、ヨウ素(I-)、硫酸塩(SO42-)および重硫酸塩(HSO4-)から選ばれる無機アニオン、あるいはギ酸塩(HCO2-)、酢酸塩(CH3CO2-)、酒石酸塩(-CO2CH(OH)CH(OH)CO2-)、メタンスルホン酸塩(CH3SO3-)およびトルイルスルホン酸塩(CH3C6H4SO3-)から選ばれる有機アニオンを含み、Rが、塩基性窒素原子を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
成長の調節を必要とする植物に、有効量の請求項１に記載の化合物を適用することを含む、植物の成長を調節する方法。
【請求項９】
a．(S)-アブシシン酸をアルキル化剤と反応させて、エステルを形成させること；
b．溶媒中、ステップaで得られる化合物を塩基およびメチル化剤で処理すること；
c．任意に、ステップbで得られる化合物を加水分解すること；を含む、請求項１に記載の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年1月10日出願の米国仮出願第61/925,764号に対する優先権を主張する。上記出願の開示の全体を参照することにより本出願に含める。
技術分野
本発明は、(S)-3'-メチル-アブシシン酸((S)-3'-メチル-ABA)、およびそのエステル、ならびにこれらの化合物の使用および製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アブシシン酸(ABA)は、種子の発芽、苗の伸び、非生物的ストレス応答、開花、および果実の発育などの広範な植物の生理的過程を調節する天然由来の植物成長調節剤である。天然に由来し、生物活性のあるABAの形態は、Sエナンチオマーである(S)-アブシシン酸((S)-ABA)である。それゆえに、(S)-ABAに対し、園芸と農学において、さまざまな商業上の有用性が、特定されている。(S)-ABAは、(S)-ABA受容体に結合し、細胞シグナル伝達カスケードを活性化させることによって、その生物活性を発揮する。さらに、(S)-ABAは、医薬的および栄養補助的有用性を有することが実証されている(米国特許第8,536,224号を参照)。
【０００３】
ABAの合成類縁体は、(S)-ABAに類似するが、変更(増強)された効力を有する(ABAアゴニスト)か、または複数のABA受容体に対して(S)-ABA自体が有するものとは異なるスペクトルの親和性を有する生物活性を示すことができる。合成類縁体は、植物組織による改善された取り込みならびに増強された代謝安定性を有することもできる。さらに、合成類縁体は、(S)-ABAと比較して、よりよい化学的および環境的安定性を有することができる。このように、合成ABA類縁体は、独特の生物活性を有し、新規な植物成長調節剤を同定するためのアプローチとして追求されている。
【０００４】
ABAのさまざまな合成類縁体が、公で明らかにされている。いくつかの日本の研究グループが、デノボ合成を介して、側鎖の変更および／またはシクロヘキセノン環置換基を有するABA類縁体を合成している(Y. Todoroki、at al. Phytochem. 1995、38、561-568；Y. Todoroki、et al. Phytochem. 1995、40、633-641；S. Nakano、et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1995、59、1699-176；Y. Todoroki、et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994、58、707-715；Y. Todoroki、et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1997、61、2043-2045；Y. Todoroki、et al. Tetrahedron、1996、52、8081-8098)。(S)-ABAからの(S)-3'-ハロゲン-ABA、(S)-3'-アジド-ABAおよび(S)-3'-アルキルチオ-ABAの合成が報告されている(Y. Todoroki、et al. Tetrahedron、1995、51、6911-6926；S. Arai、et al. Phytochem. 1999、52、1185-1193；J. J. Balsevich、et al. Phytochem. 1977、44、215-220；Y. Todoroki、et al. Tetrahedron、2000、56、1649-1653；Y. Todoroki、et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001、11、2381-2384)。カナダ国家研究会議の植物バイオテクノロジー研究所にて、S. R. Abramsおよび共同研究者らによって行なわれた研究は、注目に値する。デノボ合成アプローチを用いて、変更された側鎖またはC6'-置換を有するABA類縁体が、ラセミ混合物として、場合によって、純粋な立体異性体として製造されている(米国特許第5,518,995号；D. M. Priest、et al. FEBS Letters、2005、579、4454-4458を参照)。(S)-ABAのシクロヘキセノン環が二環式テトラロン環で置換されるテトラロンシリーズの類縁体もまた報告されている(J. M. Nyangulu、et al. Org. Biomol. Chem. 2006、4、1400-1412；J. M. Nyangulu、et al. J. Am. Chem. Soc. 2005、127、1662-1664；WO2005/108345)。
【０００５】
文献に報告されている合成ABA類縁体は、範囲が限定されており、多段階デノボ合成を介して製造されることが多い。一般に、合成は、特に、光学的に純粋なシングルエナンチオマーが望まれる場合に、全収量が低いという問題に苦しんでいる。したがって、これらの化合物は、一般に、大規模で合成するか、または市販規模で製造する場合に高価であり、それらの市販適用が制限される。本発明の(S)-ABA類縁体は、前述の生物活性を有し、さらに重要なことには、最近までは大量に利用することができなかった(S)-ABAから効率的に製造されうる。
【０００６】
ラセミ(±)-3'-メチル-ABAの生物活性は、刊行物にまとめられている(K. Ueno、et al. Bioorg. Med. Chem. 2005、13、3359-3370)が、この化合物の合成については報告されていない。Ueno、et al.によれば、(±)-3'-メチル-ABAは、米苗の伸長アッセイにおいて(S)-ABAと等しい活性を示し、(S)-ABA 8'-ヒドロキシラーゼ阻害アッセイにおいて(S)-ABAよりも弱い活性を示した。さらに、S)-3'-メチル-ABAを表すと解釈されうる構造は、刊行物に記載された(Y. Todoroki、et al. Bioorg. Med. Chem. Lett、2001、11、2381-2384)が、その化合物のための合成も生物学的データも公には報告されていない。したがって、公には、(S)-3'-メチル-ABAおよびそのエステルの合成を可能にするか、または(S)-3'-メチル-ABAおよびそのエステルの生物活性を教示する先行技術は存在しない。最も重要なことは、すべての公に利用可能な情報(上記参照)に基づいたとしても、(S)-3'-メチル-ABAが(S)-ABAまたは(±)-3'-メチル-ABAを凌ぐ何らかの利点を提供することが本発明時において当業者にとって自明ではないということである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、(S)-ABAのアゴニストであってもよく、改善された生物活性を有する鏡像異性的に純粋な(S)-3'-メチル-ABA類縁体が必要である。(S)-3'-メチル-ABAおよびそのエステルの製造方法も必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概略
出願人は、鏡像異性的に純粋な(S)-3'-メチル-アブシシン酸およびそのエステルならびにこれらの化合物の合成方法を発見している。
【０００９】
1つの態様において、本発明は、式(I)：
2019108344.tif 000002
(I)
[式中、Rは、水素、置換もしくは非置換アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルである]
で示される化合物およびその塩に関する。
【００１０】
もう1つの態様において、本発明は、有効量の任意の本発明化合物を、成長調節を必要とする植物に適用することを含む、植物の成長を調節する方法に関する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、化学合成による本発明化合物の効率的な製造方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】後記実施例５に記載の種子発芽アッセイからのデータから作成された、0.3ppmの(S)-ABAおよび類縁体の存在下におけるシロイヌナズナの種子の発芽を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な記載
本発明化合物は、鏡像異性的に純粋であり、比較的合成が容易である(S)-ABA類縁体である。また、本発明の合成工程式は、良好な収率も提供する。
【００１４】
1つの実施態様において、本発明は、式(I)：
2019108344.tif 000003
(I)
[式中、Rは、水素、置換もしくは非置換アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルである]
で示される化合物およびその塩に関する。
【００１５】
好ましい実施態様において、Rは水素である。
【００１６】
もう1つの好ましい実施態様において、Rはアルキルである。さらに好ましい実施態様において、Rは低級アルキルである。
【００１７】
本明細書において用いる「置換された化合物」は、コア構造の1つ以上の水素原子が、アルキル、ヒドロキシまたはハロゲンなどの官能基で置換されている化合物である。置換ベンゼンの例はトルエン(C6H5-CH3)である。
【００１８】
本明細書において用いる「アルキル」は、直鎖または分枝鎖アルカンラジカル(すなわち、安定な構造のために必要な水素原子の1つを失っている基)、(-CnH2n+1)を意味する。アルキルの例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルおよびドデシルが挙げられる。「低級アルキル」は、1〜6個の炭素を含むアルキルを意味する。シクロアルキルは、脂環式炭化水素を意味する。シクロアルキルの例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルが挙げられる。本明細書において用いる「ヘテロシクロアルキル」は、環中に炭素以外の元素を有する環式アルキルを意味する。好ましいアルキルは、低級アルキルである。
【００１９】
本明細書において用いる「アルケニル」は、ビニルプロトンを除去することによってアルケンから誘導され、好ましくは2〜40個、より好ましくは2〜20個、なおさらに好ましくは2〜6個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素ラジカルを意味する。本明細書において用いる「シクロアルケニル」は、脂環式アルケニルを意味する。「ヘテロシクロアルケニル」は、環中に炭素以外の元素を有する環式アルケニルを意味する。代表的なアルケニル基として、ビニル(-CH=CH2)およびZ-またはE-1-ブテン-1-イル(-CH=CHCH2CH3)が挙げられる。
【００２０】
本明細書において用いる「アルキニル」は、アルキニルプロトンの1つを除去することによってアルキンから誘導され、好ましくは2〜40個、より好ましくは2〜20個、なおさらに好ましくは2〜6個の炭素原子を有するモノラジカルを意味する。好ましいアルキニル基として、エチニル(-C≡CH)、1-プロピン-1-イル(-C≡CCH3)などが挙げられる。
【００２１】
本明細書で用いる用語「アルケニルアルキル」は、結合点から離れた位置に、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含むアルキル基を意味する。アルケニルアルキルキの例は、2-プロペン-1-イル(-CH2CH=CH2、別名アリル)である。
【００２２】
本明細書で用いる用語「アルキニルアルキル」は、結合点から離れた位置に、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含むアルキル基を意味する。アルキニルアルキルキの例は、2-プロピン-1-イル(-CH2C≡CH、別名プロパルギル)である。
【００２３】
本明細書で用いる語「アリール」は、単環(たとえば、フェニル)または複数の縮合(融合)環を有する6〜20個の炭素原子からなる置換または非置換芳香族炭素環式基を意味し、ここで、少なくとも1つの環は、芳香族(たとえば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニルまたはアントリル)である。好ましいアリールとして、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。
【００２４】
本明細書において用いる「ヘテロアリール」は、5員または6員環中に、あるいは数個の縮合5員または6員環のうちの少なくとも1つの環中に、炭素以外の元素を有する芳香族環式基を意味する。代表的なヘテロアリール基として、ピリジル、オキサゾリルおよびチアゾリルが挙げられる。
【００２５】
本明細書において用いる「シアノ」は、式：-C≡Nを有するラジカルを意味する。
【００２６】
本明細書で用いる用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を意味する。本発明の実施態様は、ジまたはトリハロゲンを含んでもよい。
【００２７】
本明細書で用いる用語「塩」は、親化合物の生物学的有効性および特性を保持し、投与される用量において生物学的もしくはその他の点において有害ではない塩を意味する。本発明化合物の塩は、無機もしくは有機酸または塩基から製造されてもよい。
【００２８】
1つの実施態様において、本発明は、式(I)：
2019108344.tif 000004
(I)
[式中、Rは、-OH、-NH2、-SH、ハロゲン、-CN、-NR1R2、-OR1、-SR1、-S(O)R1、-SO2R1、-C(O)R1、-C(O)NR1R2、-NHC(O)R1、-NHSO2R1、-NHC(O)OR3、-SO2NR1R2または-NHC(O)NR1R2の少なくとも1つで独立して置換される；ここで、R1およびR2はそれぞれ独立して、水素または低級アルキルであり、R3は低級アルキルである]
で示される化合物に関する。
【００２９】
さらなる実施態様において、本発明の塩は、アルカリまたはアルカリ土類金属カチオン、たとえば、Na+、K+、Li+、Mg2+、Ca2+などの無機カチオン(これらに限定されるものではない)、またはプロトン化アミン(+NHR4R5R6)(ここで、R4、R5およびR6はそれぞれ独立して、水素、低級アルキル、アラルキルである)もしくは第四級アンモニウムイオン(+NR7R8R9R10)(ここで、R7、R8、R9およびR10はそれぞれ独立して、アラルキルまたは低級アルキルである)であるなどの有機カチオンを含む。
【００３０】
さらにもう1つの実施態様において、本発明の塩は、塩素(Cl-)、臭素(Br-)、ヨウ素(I-)、硫酸塩(SO42-)および重硫酸塩(HSO4-)などから選ばれる無機アニオン、あるいはギ酸塩(HCO2-)、酢酸塩(CH3CO2-)、酒石酸塩(-CO2CH(OH)CH(OH)CO2-)、メタンスルホン酸塩(CH3SO3-)およびトルイルスルホン酸塩(CH3C6H4SO3-)から選ばれる有機アニオンを含み、ここで、Rは、塩基性窒素原子を含まなければならない。
【００３１】
さらにもう1つの実施態様において、本発明は、有効量の本発明化合物を、成長調節を必要とする植物または植物部位に適用することを含む、植物の成長を調節する方法に関する。
【００３２】
もう1つの実施態様において、本発明は、(S)-ABAをアルキル化剤と反応させて、エステルを形成させること(ステップa)；溶媒中、ステップaで得られる(S)-ABAエステルを塩基およびメチル化剤で処理すること(ステップb)；および任意に、エステル加水分解手順を用いて、ステップbで得られる化合物を加水分解すること；を含む、本発明化合物の製造方法に関する。当技術分野で公知の任意のエステル加水分解手順を用いることができる。これらの手順は、水性メタノール中のLiOH、NaOHまたはKOHを用いる、任意に混和性の有機溶媒と組合せた水中でのヒドロラーゼによる酵素加水分解を包含する。この合成を下記工程式Iに示す。
【００３３】
工程式I：
2019108344.tif 000005
【００３４】
本発明化合物は、果物(たとえば、ブドウ）着色、間伐、つぼみの破壊、種子処理および作物のストレス管理などの広範な商業上の有用性を有する。さらに、これらの化合物は、栄養補助食品および医薬品の分野で有用性を有する可能性がある。
【００３５】
開示された実施態様は、単に本明細書に開示された発明概念の例示的実施態様であり、請求の範囲が他に言及しない限り、限定とみなされるべきではない。
【００３６】
本明細書において用いる量、重量パーセントなどに関するすべての数値は、各特定の値の「約」または「およそ」として、すなわち、プラスマイナス10%(±10%)として定義される。たとえば、語句「少なくとも5重量%」は、「少なくとも4.5重量%〜5.5重量%」として理解されるべきである。したがって、主張された値の10%以内の量は、本発明の範囲に含まれる。
【００３７】
冠詞「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に他を示さない限り、
複数ならびに単数を包含することを意図される。
【００３８】
以下の実施例は、本発明を説明し、本発明の製剤をどのように使用するかを当業者に教示することを意図するものである。それらは、いかなる方法においても限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００３９】
実施例1a
2019108344.tif 000006
(2Z,4E)-メチル 5-((S)-1-ヒドロキシ-2,6,6-トリメチル-4-オキソシクロへキス-2-エン-1-イル)-3-メチルペンタ-2,4-ジエノエート
アセトニトリル(800 ml)中の(S)-ABA(53 g、0.2モル)の溶液を氷浴で冷却した。炭酸セシウム(98 g、0.3モル)を加えた。混合物を10分間攪拌し、次いで、ヨウ化メチル(24.8 ml、56.5 g、0.4モル)を加えた。周囲温度にて一夜攪拌した後、混合物を〜300 mlに濃縮し、水(500 ml)を加えた。得られる混合物を酢酸エチル(3x200 ml)で抽出した。得られる有機溶液を、飽和水性亜硫酸ナトリウムを加え、乾燥(無水MgSO4)し、ろ過した。ろ液を蒸発させて、標記化合物をオフホワイトの固体(56 g)で得た。1HNMR(CDCl3)：δ7.90(d、1H)、6.15(d、1H)、5.95(s、1H)、5.76(s、1H)、3.71(s、3H)、2.48(d、1H)、2.29(d、1H)、2.01(s、3H)、1.93(s、3H)、1.11(s、3H)、1.02(s、3H)。
【００４０】
実施例1
2019108344.tif 000007
(2Z,4E)-メチル 5-((S)-1-ヒドロキシ-2,3,6,6-テトラメチル-4-オキソシクロへキス-2-エン-1-イル)-3-メチルペンタ-2,4-ジエノエート
無水テトラヒドロフラン(THF、600 ml)中の実施例1a(27.8 g、0.1モル)の溶液を、窒素雰囲気下、氷浴で0℃に冷却した。リチウムヘキサメチルジシラザン(1.0 M THF溶液、150 ml)を、シリンジを介して約30分かけて滴下した。得られる溶液を0℃にて30分間攪拌し、氷浴を除去した。無水THF(20 ml)中のヨウ化メチル(8.09 ml、18.4 g、0.13モルの溶液を、シリンジを介して20分間にわたって加えた。得られる溶液を周囲温度で一夜攪拌した。反応物に飽和水性塩化アンモニウム溶液(200 ml)および水(200 ml)を加えて反応を停止し、酢酸エチル(3x150 ml)で抽出した。合わせた有機溶液を乾燥(MgSO4)し、ろ過し、濃縮した。残渣を、酢酸エチルおよびヘキサンで溶離するシリカゲルカラムにて精製した。標記化合物を白色固体(17.1 g)で得た。1HNMR(CDCl3)：δ7.84(d、1H)、6.16(d、1H)、5.75(s、1H)、3.70(s、3H)、2.44(d、1H)、2.34(d、1H)、2.00(s、3H)、1.88(s、3H)、1.83(s、3H)、1.07(s、3H)、1.00(s、3H)。MS(ESI-)：m/e=291。
【００４１】
実施例2
2019108344.tif 000008
(2Z,4E)-5-((S)-1-ヒドロキシ-2,3,6,6-テトラメチル-4-オキソシクロへキス-2-エン-1-イル)-3-メチルペンタ-2,4-ジエン酸(3'-メチル-(S)-アブシシン酸)
メタノール(270 ml)および水(30 ml)中の実施例1(17.1 g、58.5ミリモル)の溶液に、水酸化リチウム一水和物(9.81 g、234ミリモル)を加えた。混合物を室温にて48時間攪拌し、次いで、蒸発させて大部分のメタノールを除去した。水(200 ml)を加えた。得られる混合物を氷浴で冷却し、6N水性HClでpH 2-3に酸性化し、白色沈殿を得た。混合物を酢酸エチル(3x150 ml)で抽出した。合わせた有機溶液を乾燥(MgSO4)し、ろ過し、蒸発させて、標記化合物を白色固体(16.4 g)で得た。別法として、酸性化した水性溶液からろ過によって白色沈殿を直接採取し、少量の水で洗浄し、真空乾燥して、標記化合物を得ることができる。1HNMR(CDCl3)：δ7.89(d、1H)、6.17(d、1H)、5.76(s、1H)、2.47(d、1H)、2.34(d、1H)、2.15(s、1H)、2.10(s、3H)、1.87(s、3H)、1.83(s、3H)、1.07(s、3H)、1.01(s、3H)。MS(ESI-):m/e=277。2D-NMR実験(COSY、NOESY、HSQC、HMBC)は、メチル化が3'-位で起きることを実証した。Pirkle Covalent(R,R)-Whelk-01カラムにおけるキラルHPLC分析は、この物質が＞99%(S)-異性体であることを示す。(R)-異性体は、262 nmで設定されたUV検出器の検出限界以下である。
【００４２】
実施例3a
2019108344.tif 000009
(2E,4E)-メチル 5-((S)-1-ヒドロキシ-2,3,6,6-テトラメチル-4-オキソシクロへキス-2-エン-1-イル)-3-メチルペンタ-2,4-ジエノエート
この化合物は、実施例1の製造中の副産物として単離された。
【００４３】
実施例3
2019108344.tif 000010
(2E,4E)-5-((S)-1-ヒドロキシ-2,3,6,6-テトラメチル-4-オキソシクロへキス-2-エン-1-イル)-3-メチルペンタ-2,4-ジエン酸
実施例1の代わりに実施例3aを用い、実施例2の手順にしたがって、標記化合物を製造した。1HNMR(CDCl3)：δ6.43(d、1H)、6.17(d、1H)、5.87(s、1H)、2.46(d、1H)、2.35(d、1H)、2.29(s、3H)、2.11(s、1H)、1.85(s、3H)、1.82(s、3H)、1.06(s、3H)、100(s、3H)。MS(ESI-)：m/e=277。2D-NMR実験(COSY、NOESY、HSQC、HMBC)は、アルキル化が3'-位で起きることを実証した。
【００４４】
実施例4:比較用の(±)-3'-メチルABA
実施例4a
2019108344.tif 000011
(±)-(2Z,4E)-メチル 5-(1-ヒドロキシ-2,6,6-トリメチル-4-オキソシクロへキス-2-エン-1-イル)-3-メチルペンタ-2,4-ジエノエート
(S)-ABAの代わりに(±)-ABAを用い、実施例1aの手順にしたがって標記化合物を製造した。
【００４５】
実施例4b
2019108344.tif 000012
(±)-(2Z,4E)-メチル 5-(1-ヒドロキシ-2,3,6,6-テトラメチル-4-オキソシクロへキス-2-エン-1-イル)-3-メチルペンタ-2,4-ジエノエート
実施例1aの代わりに実施例4aを用い、実施例1の手順にしたがって標記化合物を製造した。
【００４６】
実施例4
2019108344.tif 000013
(±)-(2Z,4E)-5-(1-ヒドロキシ-2,3,6,6-テトラメチル-4-オキソシクロへキス-2-エン-1-イル)-3-メチルペンタ-2,4-ジエン酸
実施例1の代わりに実施例4bを用い、実施例2の手順にしたがって標記化合物を製造した。1HNMR(CDCl3)：δ7.89(d、1H)、6.17(d、1H)、5.76(s、1H)、2.47(d、1H)、2.34(d、1H)、2.15(s、1H)、2.04(s、3H)、1.88(s、3H)、1.83(s、3H)、1.06(s、3H)、1.01(s、3H)。MS(ESI-)：m/e=277。2D-NMR実験(COSY、NOESY、HSQC、HMBC)は、メチル化が3'-位で起きることを実証した。263 nmで設定されたUV検出器によるPirkle Covalent(R,R)-Whelk-01カラムにおけるキラルHPLC分析は、この物質が49%の(S)-異性体および51%の(R)-異性体から構成されることを示す。
【００４７】
実施例5
種子発芽アッセイ
類縁体の発芽阻害効力を決定するために、モデル植物であるシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を用いて発芽アッセイを行なった。シロイヌナズナの種子を200プルーフのエタノール中で5分間振とうし、次いで、10%漂白溶液中で5分間振とうすることによって滅菌した。次いで、滅菌、蒸留、脱イオン水で5回種子を洗浄し、0.1%フィトアガーに懸濁した。種子を含むチューブをアルミホイルで覆い、4℃にて少なくとも2日間湿層処理(stratified)した。
【００４８】
4ウェルプレートにおいて類縁体を試験した。各プレートは、1つのウェルに、それぞれ、0.5% DMSOコントロール、(S)-ABA、(S)-3'-メチル-ABA(実施例2)および(±)-3'-メチル-ABA(実施例4)を所望の濃度で含んだ。典型的実験において、10% DMSO中の各化合物の100 ppmストック溶液18マイクロリットルを、所望のウェルにピペットで置いた。追加のDMSO(28.2マイクロリットル)および水(3.8マイクロリットル)を各ウェルに加え、次いで、1.2%バクトアガーを含んでいる5.95 mLの1/2 x Murashige and Skoog培地をすべてのウェルに加えた。この処理により各ウェルの総体積は、6.0 mLになり、試験化合物は0.3 ppmになり、最終DMSO濃度は0.5%となった。培地が固化したとき、100個の滅菌湿層処置したシロイヌナズナの種子を各ウェルに分配した。プレートを外科テープで密閉し、24℃にて12時間の明期および19℃で12時間の暗期の概日周期を提供する成長チャンバーに置いた。すべての種子が発芽するまで、プレートを毎日高解像度(600 dpi)で走査した。幼根が現れたら、種子を発芽したと採点した。発芽した種子のパーセンテージを、毎日、図１のグラフに記録する。各濃度における試験を少なくとも２回繰り返し、結果は再現可能であった。
【００４９】
図１から明らかなように、(S)-3'-メチル-ABA(実施例2)は、(S)-ABAまたはラセミ類縁体(±)-3'-メチル-ABA(実施例4)と比較して、シロイヌナズナの種子の発芽の阻害効力が強かった。100%発芽に要する時間は、(S)-ABA処理で６日間、(±)-3'-メチル-AB処理で８日間、(S)-3'-メチル-ABA処理で１５日間であった。この生物アッセイは、(S)-ABAと比較した場合の(S)-3'-メチル-ABAの全体的なアゴニスト性質を示す。
【００５０】
このように、予期せぬことに、出願人は、このアッセイを用いて、(S)-3'-メチル-アブシシン酸が、(S)-ABAまたは(±)-3'-メチル-ABAのいずれかよりも効力が強いことを見い出した。Ueno、et al、(前述)の教示に基づくと、これらの結果は予期せぬものであった。さらに、植物生理学における(S)-ABAの公知の機能に基づくと、これらの結果は、気孔閉鎖を仲介し、アントシアニンの生合成を促進することにおいて、(S)-3'-メチル-アブシシン酸およびそのエステルが、(S)-ABAまたは(±)-3'-メチル-ABAと比較して、より有効であることを暗示する。したがって、この化合物は、果物(たとえば、ブドウ）着色、間伐、間伐ストレスからの植物の保護またはその他の(S)-ABAの生物学的効果にとってより有効であることが期待される。
【図１】
2019108344.tif 000016