(57)【要約】      （修正有）【課題】治療及び診断目的のための、改善されたフィブロネクチンドメインスカフォールドタンパク質及びその作製方法の提供。【解決手段】選択的結合表面設計を有するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）反復ベースのタンパク質スカフォールド及びスカフォールドライブラリを特定の配列を持つ標的分子と接触させるか、又はパニングする工程及び、所定の親和性を有する標的分子に特異的に結合するタンパク質スカフォールドを単離する工程とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ βストランド、ＣＤループ、Ｆ βストランド、及びＦＧループによって形成される
多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有する、フィブロネクチンＩＩＩ型モジュー
ル（ＦＮ３）ドメインのライブラリを作製する方法であって、
ａ．配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、基
準ＦＮ３ドメインポリペプチドを提供する工程と、
ｂ．前記多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有する前記ＦＮ３ドメインライブ
ラリを形成するために、少なくとも１つのＣ βストランド残基及び少なくとも１つのＦ 
βストランド残基を変異させることによって、前記基準ＦＮ３ドメインポリペプチドに多
様性を導入する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記Ｃ βストランドの１、２、３、又は４つの残基が変異されているが、配列番号２
７の中の対応する残基Ｓ３０が変異されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号２７の中の対応する前記Ｃ βストランド残基Ｌ３２、Ｑ３４、及びＱ３６が
変異されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｆ βストランド中の１、２、３、又は４つの残基が変異されているが、配列番号
２７の中の対応する残基Ｅ６６が変異されていない、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
配列番号２７の中の対応する前記Ｆ−βストランド残基Ｔ６８、Ｓ７０、及びＹ７２が
変異されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤループ中の１、２、３、又は４つの残基が変異されているが、配列番号２７の
中の対応する残基Ｇ４２及びＥ４３が変異されていない、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
配列番号２７の中の対応する残基Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、及びＶ４１が変異されてい
る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＦＧループ中の１、２、３、又は４つの残基が変異されているが、配列番号２７の
中の対応する残基Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、及びＳ８０が変異されていない、請求項４に
記載の方法。
【請求項９】
配列番号２７の中の対応する残基Ｈ７８、Ｒ７９、及びＮ８１が変異されている、請求
項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基準ＦＮ３ドメインが、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方
法。
【請求項１１】
アミノ酸位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６において少なくとも１つ
の置換を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法によって生成されたライブラリ。
【請求項１３】
前記ライブラリが、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のライブラ
リ。
【請求項１４】
標的分子に特異的に結合することが可能な多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を
有するフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメインを含む、タンパク質スカ
フォールドを得る方法であって、請求項１２に記載のライブラリを前記標的分子と接触さ
せるか、又はパニングする工程と、所定の親和性を有する標的分子と特異的に結合するタ
ンパク質スカフォールドを単離する工程と、を含む、方法。
【請求項１５】
本明細書に記載されたいずれかの発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的結合表面設計を有するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）反復に基
づく、タンパク質スカフォールド及びスカフォールドライブラリに関する。より具体的に
は、本発明は、選択的βストランド及びループによって形成される凹状結合部位を有する
ＦＮ３スカフォールド及びライブラリに関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクロール抗体は、標的分子に対する高親和性及び特異性が望ましい時に最も広く使
用されるクラスの治療用タンパク質である。しかしながら、一般的にタンパク質スカフォ
ールドと称される、所望の標的分子に結合するように改変され得る、比較的画定された三
次元構造を有する非抗体タンパク質は、それらの小さいサイズ、ジスルフィド結合の欠如
、高安定性、及び原核宿主において発現される能力により、従来の抗体に優る利点を有す
る。これらのスカフォールドは典型的に、特異的又はランダム配列変化に適している１つ
以上の領域を含有し、かかる配列ランダム化はしばしば、そのものから所望の生成物が選
択され得るタンパク質のライブラリを生成するために実施される。新規精製法が容易に適
用され、スカフォールドは、容易に薬剤／毒素と抱合され、組織内に効率よく侵入し、か
つ多特異的なバインダーに整形される（Ｂｉｎｚ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｃｕｒ
ｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６，４５９〜４６９，２００５，Ｓｋｅｒｒａ
，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，１３，１６７〜１８７，２０００）。
【０００３】
１つのそのようなタンパク質スカフォールドは、７つのβストランドによって接続され
る６つのループを有する特有の三次構造を有する多数のタンパク質中で同定される、フィ
ブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである。３つのループ、具体的にＦＧ、ＢＣ、
及びＤＥループは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と構造的に類似する。これらのルー
プは、多くの異なる標的に対する特異的なバインダーをうまく選択する一方で、重要な生
物物理学的特性を保持するように、ＦＮ３ドメインスカフォールドのライブラリを生成す
るためにランダム化されている（Ｇｅｔｍａｎｏｖａら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，１３，５
４９〜５５６，２００６，Ｈａｃｋｅｌら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３８１，１２３８〜
１２５２，２００８，Ｋａｒａｔａｎら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，１１，８３５〜８４４，
２００４；Ｋｏｉｄｅら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２８４，１１４１〜１１５１，１９９
８；Ｋｏｉｄｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０４，６６
３２〜６６３７，２００７；Ｐａｒｋｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ
，１８，４３５〜４４４，２００５；Ｘｕら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ
，９，９３３〜９４２，２００２）。ＦＮ３ドメインのライブラリは、ＡＢ、ＥＦ、及び
ＣＤループもランダム化することによって生成されている（米国公開特許第２０１１／０
０３８８６６号；国際特許公開第ＷＯ２０１１／０５１３３号；米国公開特許第２０１１
／０１２４５２７号）。ＦＮ３ライブラリに関する他の参考文献としては、国際特許公開
第ＷＯ２００２／３２９２５号、同第ＷＯ２００３／１０４４１８号、同第ＷＯ２００９
／０２３１８４号、及び同第ＷＯ２０１０／０６００９５号が挙げられる。国際特許公開
第ＷＯ２０１２／０１６２４５号は、ＣＤ及びＦＧループと共に、βシートの表面露出残
基を使用した、ＦＮ３ドメインライブラリを記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
治療及び診断目的の両方で、改善されたフィブロネクチンドメインスカフォールドタン
パク質を得ることは有利であり得る。本開示は、かかる改善されたタンパク質を提供する
。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施形態は、Ｃ  βストランド、ＣＤループ、Ｆ  βストランド、及びＦＧ
ループによって形成される多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有するフィブロネ
クチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメインのライブラリを作製する方法であり、配列
番号２７の中のものと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する基準ＦＮ３ドメイン
ポリペプチドを提供する工程と、多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有するＦＮ
３ドメインライブラリを形成するために、少なくとも１つのＣ  βストランド残基及び少
なくとも１つのＦ  βストランド残基を変異させることによって、基準ＦＮ３ドメインポ
リペプチドに多様性を導入する工程とを含む。
【０００６】
本発明の別の態様は、本発明に記載される本発明の方法によって生成されるライブラリ
である。
【０００７】
本発明の更に別の態様は、標的分子に特異的に結合させる多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−Ｆ
Ｇ選択を有するフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメインを含む、タンパ
ク質スカフォールドを得る方法であって、請求項１１に記載のライブラリを標的分子と接
触させるか、又はパニングする工程と、所定の親和性を有する標的分子に特異的に結合す
るタンパク質スカフォールドを単離する工程とを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＦＮ３ドメイン及び抗体ＶＨドメイン構造のリボンダイアグラムを示す。ＣＤＲと構造的に類似したＦＮ３ドメインのループが表示される。
【図２】Ａ）ランダム化ループを有する従来のＦＮ３ライブラリ（図２Ａ）；Ｂ）ランダム化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有するＦＮ３ライブラリ（ＴＣＬ１４ライブラリ）（図２Ｂ）；Ｃ）ランダム化Ａ−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ−Ｅ表面を有するＦＮ３ライブラリ（ＴＣＬ１５ライブラリ）（図２Ｃ）の間の比較を可能にする構造図を示す。これらのライブラリ設計中でランダム化された位置は、リボンダイアグラムに黒一色で示される。
【図３】ランダム化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有するＴｅｎｃｏｎ２７スカフォールド（配列番号２７）及びＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号２８）の配列アラインメントを示す。ループ残基は、四角内に表示される。特定のループ及びβストランド領域は配列の上に示される。
【図４】ランダム化Ａ−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ−Ｅ選択的表面を有するＴｅｎｃｏｎ２７スカフォールド（配列番号２７）及びＴＣＬ１５ライブラリ（配列番号６１）の配列アラインメントを示す。ループ残基は、四角内に表示される。特定のループ及びβストランド領域は配列の上に示される。
【図５】ランダム化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面（ＴＣＮ１４ライブラリ）を有する、Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列番号２７）に対するライブラリ設計のトポロジーダイアグラムを示す。βストランドは、プロット中で隣接して配置されるＴｅｎｃｏｎ２７構造中で、互いに水素結合したストランドの残基を有する矢印で示される。ランダム化された残基の位置は、灰色の網掛けの楕円で示される。
【図６】ランダム化Ａ−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ−Ｅ選択的表面（ＴＣＬ１５ライブラリ）を有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号２７）に対するライブラリ設計のトポロジーダイアグラムを示す。βストランドは、プロット中で隣接して配置されるＴｅｎｃｏｎ構造中で、互いに水素結合したストランドの残基を有する矢印で示される。ランダム化された残基の位置は、灰色の網掛けの楕円で示される。
【図７】ＴＣＬ１４ライブラリ中のランダム化位置における予測及び観察されたアミノ酸分布を示す。
【図８】ランダム化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有する、Ｔｅｎｃｏｎ２７、ＴＣＬ１４、並びにＦＮ１０，ＴＮ３及びＦｉｂｃｏｎに対して設計されたライブラリの配列アラインメントを示す。残基番号は、Ｔｅｎｃｏｎ２７配列に基づく。ライブラリのアミノ酸配列は、配列番号２８、９８、９９、及び６２の中でそれぞれに示される。ループ残基は、四角内に表示される。特定のループ及びβストランド領域は配列の上に示される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書で用いられる用語「フィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメイン
」又は「ＦＮ３ドメイン」は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク
質、サイトカイン受容体、及び原核酵素を含む、タンパク質中で頻繁に発生するドメイン
を指す（Ｂｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
ＵＳＡ  ８９，８９９０〜８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ  １７５，１９１０〜１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃ
ｈｅｍ  ２６５，１５６５９〜１５６６５，１９９０）。例示的なＦＮ３ドメイン（又は
モジュール）は、ヒトテネイシンＣ中に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、及びヒ
トフィブロネクチン（ＦＮ）中に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメインである。個々の
ＦＮ３ドメインは、ドメイン番号及びタンパク質名によって、例えば、テネイシンの第３
ＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、又はフィブロネクチンの第１０  ＦＮ３ドメイン（ＦＮ１
０）と称される。
【００１０】
本明細書で用いられる用語「基準ＦＮ３ドメイン」は、標的分子に特異的に結合するタ
ンパク質スカフォールドを生成するために置換が行われるテンプレートとして使用される
、野生型又は非自然発生ＦＮ３ドメインを指す。
【００１１】
本明細書で用いられる用語「選択的表面」は、２つ以上のβストランド、及び少なくと
も１つのループを含むＦＮ３ドメインの片側の表面を指す。例示的な選択的表面は、Ｃ及
びＦ  βストランド並びにＣＤ及びＦＧループ中のアミノ酸によって形成されるＣ−ＣＤ
−Ｆ−ＦＧ表面、並びにＡ、Ｂ、及びＥ  βストランド並びにＢＣループ中のアミノ酸に
よって形成されるＡ−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ−Ｅ表面である。
【００１２】
本明細書で用いられる用語「置換する」若しくは「置換される」、又は「変異する」若
しくは「変異させられる」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列における１つ以
上のアミノ酸又はヌクレオチドを変更、削除、挿入し、その配列の変異体を生成すること
を指す。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「ランダム化する」若しくは「ランダム化される」、又は「
多様化される」若しくは「多様化する」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列にお
いて少なくとも１つの置換、挿入、又は欠失を行うことを指す。
【００１４】
本明細書で用いられる「変異体」は、例えば、置換、挿入、又は欠失等の１つ以上の修
飾によって、基準ポリペプチド又は基準ポリヌクレオチドとは異なっている、ポリペプチ
ド又はポリヌクレオチドを指す。
【００１５】
本明細書で用いられる用語「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、少なくとも１
×１０−６Ｍの親和性（Ｋｄ）で標的分子に結合する、及び／又は表面プラズモン共鳴に
よって測定されるような非特異性抗原（例えばＢＳＡ若しくはカゼイン）に対するその親
和性よりも少なくとも１０倍大きい親和性で、標的分子に結合する、本発明のＦＮ３ドメ
インの能力を指す。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「標的分子」は、本発明のＦＮ３ドメインによって認識され
る抗原又はエピトープを有する、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質等を指す。標的
分子は、自然又は非自然発生的であってもよい。
【００１７】
用語「ライブラリ」は、変異体の集合を指す。ライブラリは、ポリペプチド又はポリヌ
クレオチド変異体からなってもよい。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「テネイシンＣ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２
１５１及び配列番号５７の中に示される配列を有する、ヒトテネイシンＣを指す。テネイ
シンＣは、配列番号１〜１５の中にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有する、１５個のタ
ンデムＦＮ３ドメインを有する。テネイシンＣの第３  ＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）のアミ
ノ酸配列は、配列番号３の中に示される。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「安定性」は、その正常な機能活性（例えば、標的分子への
結合）のうちの少なくとも１つを維持するように、生理学的条件下で折りたたみ状態を維
持する分子の能力を指す。
【００２０】
本発明は、標的分子に特異的に結合するＦＮ３ドメインを提供し、したがって、治療及
び診断用途に幅広く使用され得る。本発明は、２つ以上のβストランド及び少なくとも１
つのループを含むＦＮ３ドメインの片側の選択的表面が、高親和性で標的分子に特異的に
結合するタンパク質スカフォールドに対して生成及び選択するために、ランダム化され得
るという発見に基づく。公開されたＦＮ３ベースのドメインライブラリは、抗体可変鎖中
のＣＤＲと構造的に類似する領域である、頂部又は底部ループのいずれかを多様化し、湾
曲した結合表面を提供することによって生成されてきた。本発明において、高親和性結合
分子は、選択的表面をランダム化することによって生成される凹状相互作用表面を示す、
したがって、高親和性結合タンパク質スカフォールドが選択され得るエピトープ及び標的
の数を増加させる可能性が高い、ＦＮ３ドメインライブラリから選択される。本発明は、
タンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチド又はその相補的核酸、ベクター、宿主
細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。本発明は、ＦＮ３ドメインのラ
イブラリを作製する方法、及び本発明の方法によって作成されるライブラリを提供する。
【００２１】
フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン
フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン（又はモジュール）は、最初にフィブロ
ネクチン中で同定され、現在は細胞表面受容体、細胞外マトリックスタンパク質、酵素、
及び筋タンパク質を含む、様々な動物タンパク質ファミリー中に存在することが既知であ
る、原型反復ドメインである。構造的に、ＦＮ３ドメインは、ジスルフィド結合の欠如を
除いて、免疫グロブリン様ドメインのものと非常に似ているトポロジーを有する。当該技
術分野において既知である通り、自然発生するＦＮ３ドメインは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、Ｄ
Ｅ、ＥＦ、及びＦＧループと称される６つのループによって結合される、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ
、Ｅ、Ｆ、及びＧと称される７つのβストランドを有するβサンドイッチ構造を有する（
Ｂｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ
Ａ  ８９，８９９０〜８９９２，１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。３つの
ループ、ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループは、ＦＮ３ドメインの頂部にあり、３つのＡＢ、Ｃ
Ｄ、及びＥＦループは、ドメインの底部にある（図１）。表１は、タンパク質を含有する
いくつかのＦＮ３ドメインを示し、異なるＦＮ３ドメインの数は、各タンパク質と関連す
る。ＦＮ３ドメイン立体配座が高度に保存されている一方で、アミノ酸レベルにおける異
なるドメイン間の類似性はかなり低い。
【００２２】
ＦＮ３ドメインは、自然又は非自然発生的であってもよい。例示的な非自然発生ＦＮ３
ドメインは、ある特定のタンパク質中に存在する選択的ＦＮ３ドメインのアラインメント
に基づいて設計され、非自然発生ＦＮ３ドメインを生成するために、各位置で最も保存さ
れた（頻繁な）アミノ酸を組み込む、共通ＦＮ３ドメインである。例えば、非自然発生Ｆ
Ｎ３ドメインは、ヒトテネイシンＣからの１５個のＦＮ３ドメインの共通配列に基づいて
、又はヒトフィブロネクチンからの１５個のＦＮ３ドメインの共通配列に基づいて設計さ
れる。これらの非自然発生ＦＮ３ドメインは、ＦＮ３ドメインの典型的なトポロジーを保
持し、野生型ＦＮ３ドメインと比較して改善された安定性などの改善された特性を示し得
る。例示的な非自然発生的ＦＮ３ドメインは、配列番号１６及び５８の中にそれぞれ示さ
れるＴｅｎｃｏｎ及びＦｉｂｃｏｎドメインであり、米国公開特許第２０１０／０２１６
７０８号及び米国公開特許第２０１０／０２５５０５６号に記載されている。
【００２３】
【表１】
2019081760.tif 000002
【００２４】
各ループ及び各βストランドを画定するアミノ酸残基は、表２においてＦＮ３スカフォ
ールドＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号２７）に関して示される。テネイシンＣ第３  ＦＮ３
ドメイン（ＴＮ３）（配列番号３）及びＦｉｂｃｏｎ（配列番号５８）の中の各ループ及
びβストランドの位置は、Ｔｅｎｃｏｎ２７のそれと同一である。βストランド残基は、
よく知られている方法を使用して、例えば、Ｘ線回折、核磁気共鳴、又は分子モデリング
によって生成される三次元構造の分析によって同定され得る。モデルが利用可能ではない
場合、ストランド及びループ領域の境界を予測するために、他の既知のＦＮ３分子を有す
る配列アラインメントの分析が使用され得る。最後に、タンパク質一次配列からのβスト
ランドの存在を予測するために、コンピュータアルゴリズムが使用され得る。
【００２５】
【表２】
2019081760.tif 000003
【００２６】
ＦＮ３ドメイン上の選択的表面
頂部（ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧ）及び底部（ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ）ループ、例えば、Ｆ
Ｎ３ドメイン中の報告された結合表面は、ＦＮ３構造の中心を形成するβストランドによ
って分離される（図１、２Ａ）。ループのみによって形成される表面とは異なる形状を有
する、ＦＮ３ドメインの２つの「側」に存在する選択的表面は、ＦＮ３ドメイン構造を９
０度回転させることによって視覚化され得る（図２Ｂ、２Ｃ）。わずかに凹状の表面が、
２つの逆平行βストランド、Ｃ及びＦ  βストランド、並びにＣＤ及びＦＧループによっ
てＦＮ３ドメインの片側に形成され、本明細書においてＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面と呼ばれ
る。選択的表面はまた、Ａ、Ｂ、及びＥ  βストランド並びにＡＢ及びＢＣループによっ
てＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面の反対側に形成され、本明細書においてＡ−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ−
Ｅ表面と呼ばれる。
【００２７】
ＦＮ３ドメイン中の選択的表面は、各ＦＮ３ドメイン中のアミノ酸の不連続な広がり部
によってコードされる。例えば、表２に示されるように、Ｔｅｎｃｏｎ２７  Ｃ−ＣＤ−
Ｆ−ＦＧ表面は、配列番号２７のアミノ酸残基２９〜４３及び６５〜８１によって形成さ
れ、Ｔｅｎｃｏｎ２７  Ａ−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ−Ｅ表面は、配列番号２７のアミノ酸残基１
〜２８及び５５〜５９によって形成される。
【００２８】
選択的表面のランダム化に基づくタンパク質スカフォールド
本発明の一実施形態は、選択的表面を含むＦＮ３ドメインを含む、単離されたタンパク
質スカフォールドであり、その選択的表面は、基準ＦＮ３ドメインと比較して、選択的表
面を形成する各βストランド及び各ループにおいて、少なくとも１つのアミノ酸置換を有
する。
【００２９】
別の実施形態において、本発明のタンパク質スカフォールドは、基準ＦＮ３ドメインに
よって特異的に結合されない標的分子に特異的に結合する。
【００３０】
別の実施形態において、基準ＦＮ３ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
別の実施形態において、本発明のタンパク質スカフォールドは、Ｃ  βストランド、Ｃ
Ｄループ、Ｆ  βストランド、及びＦＧループによって形成されるＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選
択的表面を含む。
【００３２】
別の実施形態において、Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を形成するＣ  βストランド、
ＣＤループ、Ｆ  βストランド、又はＦＧループは、表４及び５、並びに配列番号４５〜
４８の中に示されるように、特定のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
別の実施形態において、Ｃ  βストランドは、１、２、３、若しくは４つの残基におけ
る置換を有するアミノ酸配列ＤＳＦＬＩＱＹＱＥ（配列番号３３）を含み、Ｆ  βストラ
ンドは、１、２、３、４、若しくは５つの残基における置換を有するアミノ酸配列ＴＥＹ
ＴＶＳＩＹＧＶ（配列番号３９）を含み、Ｃ  βストランド及びＣＤループは、１、２、
３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の残基における置換を有するアミノ酸配列
ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥ（配列番号４２）を含み、又はＦ  βストランド及びＦ
Ｇループは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは１１個の残基におけ
る置換を有するアミノ酸配列ＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号４３）を含
む。
【００３４】
別の実施形態において、Ｃ  βストランド及びＦ  βストランドは、配列番号３３と少
なくとも６７％同一、及び配列番号３９と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をそれぞ
れ含み、Ｃ  βストランド及びＣＤループは、配列番号４２と少なくとも５３％同一のア
ミノ酸配列を含み、又はＦ  βストランド及びＦＧループは、配列番号４３と少なくとも
６５％同一のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
別の実施形態において、本発明のタンパク質スカフォールドは、配列番号２８の中に示
されるアミノ酸配列を含む、ＦＮ３ドメインを含む。
【００３６】
別の実施形態において、本発明のタンパク質スカフォールドは、
残基１〜１２、１３〜１６、１７〜２１、２２〜２８、４４〜５０、５１〜５４、５５
〜５９、６０〜６４、及び８２〜８９のそれぞれにおいて、配列番号２７と同一のアミノ
酸配列を有する、Ａ  βストランド、ＡＢループ、Ｂ  βストランド、ＢＣループ、Ｄ  
βストランド、ＤＥループ、Ｅ  βストランド、ＥＦループ、及びＧ  βストランドと、
配列番号４２と少なくとも５３％同一のアミノ酸配列を有する、Ｃ  βストランド及び
ＣＤループと、
配列番号２７の中のアミノ酸残基１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６の中
の対応するアミノ酸位置において、少なくとも１つの置換を任意に有し、配列番号４３と
少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有する、Ｆ  βストランド及びＦＧループと、を
含む、ＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのフィブロネクチンモジュールを含み、そのタンパク
質スカフォールドは、基準ＦＮ３ドメインによって特異的に結合されない標的分子に特異
的に結合する。
【００３７】
別の実施形態において、本発明のタンパク質スカフォールドは、配列番号２７に示され
るアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、
ＦＮ３ドメインを含む。
【００３８】
別の実施形態において、本発明のタンパク質スカフォールドは、Ａ  βストランド、Ａ
Ｂループ、Ｂ  βストランド、ＢＣループ、及びＥ  βストランドによって形成されるＡ
−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ−Ｅ選択的表面を含む。
【００３９】
別の実施形態において、Ａ−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ−Ｅ選択的表面を形成するＡ  βストラン
ド、ＡＢループ、Ｂ  βストランド、及びＢＣループは、表４及び５並びに配列番号４９
及び５０の中に示されるように、ある特定のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
別の実施形態において、Ａ  βストランド、ＡＢループ、Ｂ  βストランド、及びＢＣ
ループは、配列番号４４と少なくとも５９％同一であるアミノ酸配列を含み、Ｅ  βスト
ランドは、配列番号３７と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４１】
別の実施形態において、本発明のタンパク質スカフォールドは、配列番号６１の中に示
されるアミノ酸配列を含む、ＦＮ３ドメインを含む。
【００４２】
別の実施形態において、本発明の単離タンパク質スカフォールドは、
残基２９〜３７、３８〜４３、４４〜５０、５１〜５４、６０〜６４、６５〜７４、７
５〜８１、及び８２〜８９のそれぞれにおいて、配列番号２７と同一のアミノ酸配列を有
する、Ｃ  βストランド、ＣＤループ、Ｄ  βストランド、ＤＥループ、ＥＦループ、Ｆ
βストランド、ＦＧループ、及びＧ  βストランドと、
配列番号４４と少なくとも５９％同一であるアミノ酸配列を有する、Ａ  βストランド
、ＡＢループ、Ｂ  βストランド、及びＢＣループと、
配列番号２７のアミノ酸残基１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６の中の対
応するアミノ酸位置において、少なくとも１つの置換を任意に有する、配列番号３７と少
なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を有する、Ｅ  βストランドと、
を含む、ＦＮ３ドメインを含み、そのタンパク質スカフォールドは、基準ＦＮ３ドメイ
ンによって特異的に結合されない標的分子に特異的に結合する。
【００４３】
標的分子に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、選択的表面を形成する残基のサブセッ
トをランダム化することによって生成され得る。例えば、少なくとも１、２、３、４、５
、６、７、８、９、又は１０個の残基が、選択的表面に寄与する各βストランド及び各ル
ープ中でランダム化され得る。ライブラリの多様性を増加させるために、追加の残基がラ
ンダム化され得る。例えば、選択的表面を形成する各βストランド及び各ループ中の残基
の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％
、又は９５％が、ランダム化できる。あるいは、標的分子に特異的に結合するＦＮ３ドメ
インは、ループのいずれもランダム化することなく、選択的表面に寄与するβストランド
中で残基のサブセットをランダム化することによって生成され得る。例えば、選択的表面
に寄与する各ストランド中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０
個の残基が、ランダム化され得る。ライブラリ多様性は、βストランド中に存在する追加
の残基をランダム化することによって増加され得る。例えば、選択的表面を形成する各β
ストランド中の残基の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０
％、８５％、９０％、又は９５％が、ランダム化できる。
【００４４】
βストランドは、全ての他の残基の側鎖がタンパク質の表面に露出される反復構造を有
する。表面露出側鎖は、三次元構造の検査によって、又は多配列アラインメントによる既
知の構造を有するＦＮ３ドメインの配列との比較によって決定される。選択的表面に寄与
するβストランド中の表面露出残基の全て又はサブセットは、ランダム化されるように選
択できる。例えば、Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列番号２７）Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面は
、Ｃ  βストランド中の４つの表面露出残基（Ｓ３０、Ｌ３２、Ｑ３４、及びＱ３６）、
並びにＦ  βストランド中の５つの表面露出残基（Ｅ６６、Ｔ６８、Ｓ７０、Ｙ７２、及
びＶ７４）を有し、残基の番号は、配列番号２７に基づく。これらの残基のうちの１つ以
上は、ライブラリを生成するようにランダム化できる。Ｓ３０、Ｅ６６、及びＶ７４など
の、選択的表面の接合部における残基は、ランダム化されても、又はされなくてもよい。
βストランドの埋もれた残基のランダム化は、構造のコア中の疎水性接点の損失によって
、スカフォールドの不安定化をもたらし得る。埋もれた残基は、アミノ酸のサブセットの
み、例えば、疎水性アミノ酸のみが使用されるように、ランダム化できる。
【００４５】
選択的表面に寄与するループ領域中のサブセット又は全部の残基がランダム化できる。
例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個の位
置が、選択的表面に寄与するＣＤ及び／又はＦＧループ中で置換できる。Ｔｅｎｃｏｎ２
７中のＧ４２、Ｇ７６、及び／又はＧ７７など、ループ中のグリシン残基は、柔軟性を提
供することができ、ランダム化されても、又はされなくてもよい。Ｔｅｎｃｏｎ２７中の
Ｅ４３など、βストランド／ループ境界における残基は、ランダム化されても、又はされ
なくてもよい。βストランド又はループ領域中の追加の残基は、ランダム化に含まれても
よく、又は除外されてもよい。例えば、ＦＮ３ドメインの結晶構造の分析に基づいて同定
される安定化に必要とされると思われる残基は、例えば、ランダム化されても、又はされ
なくてもよい。例えば、Ｔｅｎｃｏｎ２７中のＳ８０は、ＦＧループを潜在的に安定化す
るためにＦＮ３ドメインコアに接触し、Ｋ７５は部分的に選択的表面から外方を向く。し
たがって、これらの残基の両方は、初期のライブラリ設計から除外されてもよい。ランダ
ム化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面を有する例示的なＦＮ３ドメインライブラリにおいて、ラン
ダム化され得る残基は、配列番号２７の位置３０、３２、３４、３６、３８、３９、４０
、４１、４２、４３、６６、６８、７０、７２、７４、７５、７６、７７、７８、７９、
８０、又は８１において残基を含む。ランダム化Ａ−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ−Ｅ表面を有する例
示的なＦＮ３ドメインライブラリにおいて、ランダム化され得る残基は、位置６、８、１
０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、５５、及び５７において残基を含む。
【００４６】
選択的表面に寄与するループにおける多様性は、ループにおける残基の挿入及び／又は
欠失によって達成され得る。例えば、ＦＧ及び／又はＣＤループは、１〜２２個のアミノ
酸によって延長でき、又は１〜３個のアミノ酸によって減少できる。Ｔｅｎｃｏｎ２７中
のＦＧループは、７個アミノ酸の長さであるが、一方で、抗体重鎖中の対応するループは
、４〜２８個の残基に及ぶ。最大多様性を提供するために、選択的表面に寄与するループ
、例えば、ＦＧループは、４〜２８個の残基の抗体ＣＤＲ３長さ範囲に対応するように、
配列並びに長さが多様化できる。
【００４７】
標的分子に特異的に結合する得られたＦＮ３ドメインは更に、例えば、安定性の改善、
免疫原性の低減、結合親和性、オン速度、オフ速度、半減期、溶解度、又は任意の他の好
適な特徴の強化の目的で、選択的表面の外又は内に存在する残基において修飾され得る。
この目的を達成する一方法において、スカフォールドタンパク質は、任意に親配列及び改
変配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的改変産物の分析プロセスによ
って調製され得る。三次元モデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている
。選択された候補配列の考えられる三次元立体配座構造を図示し表示するコンピュータプ
ログラムが使用可能であり、潜在的な免疫原性を計測することができる（例えば、Ｘｅｎ
ｃｏｒ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｒｏｖｉａ，ＣＡ）のＩｍｍｕｎｏｆｉｌｔｅｒプログラム）
。これらの表示の検査は、候補配列の機能における残基の考えられる役割、例えば、スカ
フォールドタンパク質の安定性に影響を及ぼす残基、又はその標的分子に結合する候補ス
カフォールドタンパク質の能力の分析を可能にする。このように、残基は、改善されたス
カフォールド安定性などの所望の特徴が達成されるように、親配列及び基準配列から選択
及び組み合わされ得る。あるいは、又は上記の手順に加えて、他の好適な改変方法が当該
技術分野において既知であるように使用され得る。
【００４８】
本発明のＦＮ３ドメインの望ましい物理特性は、高熱安定性並びに熱フォールディング
及びアンフォールディングの可逆性を含む。タンパク質及び酵素の見かけの熱安定性を高
めるため、極めて類似性の高い熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジスルフィド
架橋の安定化設計、α−ヘリックス傾向を増加させる変異、塩橋の改変、タンパク質の表
面電荷の変化、定方向進化、及び共通配列の組成物を含む、いくつかの方法が適用されて
いる（Ｌｅｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｙｓｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
，１２，３７１〜３７５，２００１）。高熱安定性は、発現したタンパク質の収率を増加
させ、溶解度又は活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコールドチェーンの
必要性を最小化することができる。
【００４９】
本発明のＦＮ３ドメインの任意の特徴を改善するように置換され得る残基は、置換を行
い、スカフォールドの所望の特徴をアッセイすることによって決定され得る。改善された
特徴を有する例示的なＦＮ３ドメインベースのスカフォールドは、１つ以上のアミノ酸残
基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６で修飾される、Ｔｅｎｃｏｎスカ
フォールド（配列番号１６）又はＴｅｎｃｏｎ２７スカフォールド（配列番号２７）であ
る。
【００５０】
安定性の消失に関しては、即ち、タンパク質が「変性する」又はタンパク質の「変性」
とは、タンパク質の機能特性を付与する三次元立体配座のうちのいくつか又は全てが、活
性及び／又は溶解度の付随損失と共に消失するプロセスを意味する。変性中に破壊される
力としては、分子内結合、例えば、静電力、疎水性力、ファン・デル・ワールス力、水素
結合、及びジスルフィドが挙げられる。タンパク質の変性は、タンパク質又はタンパク質
を含む溶液に加えられる力、例えば、機械力（例えば、圧縮力又は剪断力）、熱応力、浸
透ストレス、ｐＨ、電界、又は磁界の変化、電離放射線照射、紫外線放射及び脱水など、
並びに化学的変性剤によって引き起こされ得る。
【００５１】
タンパク質安定性及びタンパク質不安定性の測定は、タンパク質完全性と同じ又は異な
る態様として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線又は電離放射線、溶液中の場
合には周囲の浸透圧モル濃度及びｐＨの変化、小さな孔寸法での濾過によって与えられる
機械的せん断力、紫外線放射、γ線照射によるなどの電離放射線照射、化学的又は熱脱水
、あるいはタンパク質構造の破壊を引き起こす可能性のあるその他の任意の作用又は力に
よって引き起こされる変性に対して感受性がある、つまり「不安定」である。分子の安定
性は、標準方法を用いて決定することができる。例えば、分子の安定性は、標準方法を用
いて、分子の半分がアンフォールディングされるセ氏（℃）での温度である、熱融解（「
ＴＭ」）温度を測定することによって決定され得る。典型的には、ＴＭが高いほど、分子
はより安定している。熱に加えて、化学環境もまた、タンパク質が特有の三次元構造を維
持する能力を変化させる。
【００５２】
一実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、ＴＭの増加によって測定される改変
前の同一ドメインと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０
％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０
％、８５％、９０％、若しくは９５％、又はそれ以上の増加した安定性を示す。
【００５３】
化学変性も同様に、様々な方法によって測定することができる。化学的変性剤としては
、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ
、ベンゼン、アセトニトリル）、塩類（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム
、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイ
トール、βメルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン（dinitrothiobenzene）、及び
水素化物、例えば水素化ホウ素ナトリウム）、非イオン性及びイオン性洗剤、酸類（例え
ば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば
、リン脂質）、及び標的変性剤が挙げられる。変性の範囲の定量化は、標的分子に結合す
る能力などの機能特性の消失、あるいは凝集する、これまで溶媒が到達しにくかった残基
が露出する、又はジスルフィド結合が破壊若しくは形成する傾向などの物理化学的性質に
よる消失に依存し得る。
【００５４】
一実施形態において、本発明のスカフォールドは、化学的変性剤としてグアニジン塩酸
塩を使用することによって、測定される改変前の同一スカフォールドと比較して、少なく
とも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％
、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％
、又はそれ以上の増加した安定性を示す。増加した安定性は、よく知られている方法を使
用して塩酸グアニジンの濃度を増加させる処理による、減少したトリプトファン蛍光の関
数として測定され得る。
【００５５】
本発明の標的分子に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、その中に提供される方法に従
って、置換のためのテンプレートとして任意のＦＮ３ドメインを使用して生成され得る。
ランダム化された選択的表面を有する例示的なＦＮ３ドメインは、テネイシンＣの第３  
ＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）（配列番号３）、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１６）、Ｔｅｎｃｏ
ｎ２７（配列番号２７）、Ｆｉｂｃｏｎ（配列番号５８）、及びフィブロネクチンの第１
０  ＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）（配列番号９７）である。Ｔｅｎｃｏｎ２７中で選択的
表面を描くアミノ酸位置は、表２及び図８に示され、Ｔｅｎｃｏｎ、ＴＮ３、及びＦｉｂ
ｃｏｎの直鎖状配列において同一である。ＦＮ１０中で選択的表面を描くアミノ酸位置は
、図８に示される。他のＦＮ３ドメイン中で選択的表面を形成する残基は、利用可能な場
合、三次元構造の検査によって、又はよく知られている方法によるＦＮ３ドメインの配列
アラインメントの分析によって同定され得る。
【００５６】
本発明のＦＮ３ドメインは、単量体、二量体、若しくは多量体として、例えば、標的分
子結合の原子価及びしたがって結合活性を増加させるための、又は２つ以上の異なる標的
分子に同時に結合する二重若しくは多特異性スカフォールドを生成するための手段として
、生成できる。二量体及び多量体は、例えば、アミノ酸リンカー、例えば、ポリグリシン
、グリシン及びセリン、又はアラニン及びプロリンを含有するリンカーの含有によって、
単一特異性、二重又は多特異性タンパク質スカフォールドを結合することによって生成で
きる。ポリペプチドを新規の結合融合ポリペプチドと結合するための自然発生的並びに人
工ペプチドリンカーの使用は、文献においてよく知られている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、
Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４，５２６０〜５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎら、
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８，７２５〜７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｓａ
ｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，１０９〜１１６，１９９６；米国特許第５，
８５６，４５６号）。
【００５７】
本発明のＦＮ３ドメインは、二重特異性分子として使用されてもよく、ドメイン中の第
１の選択的表面は第１の標的分子に対する特異性を有し、かつ同一ドメイン中の第２の選
択的表面は第２の標的分子に対する特異性を有する。例示的な二重特異性タンパク質ドメ
インは、Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面において第１の標的分子に結合し、かつＡ−ＡＢ−Ｂ−
ＢＣ−Ｅ表面において第２の標的分子に結合する、Ｔｅｎｃｏｎ２７の変異体である。
【００５８】
本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、共有結合相互作用を介して、他のサブユニットを
組み込んでもよい。抗体定常領域の全部又は一部分は、抗体様特性、特に、Ｆｃ領域と関
連した特性、例えば、補体活性、半減期などを付与するために、ＦＮ３ドメインに付着で
きる。例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存
性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体の下方制御（例えば、Ｂ細
胞受容体；ＢＣＲ）などのＦｃエフェクター機能は、これらの活性に関与するＦｃ中の残
基を修飾することによって提供及び／又は制御され得る（概観のために、Ｓｔｒｏｈｌ，
Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，６８５〜６９１，２００９を参照さ
れたい）。
【００５９】
毒素複合体、アルブミン又はアルブミンバインダー、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，
０００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エ
ステル、例えば、ラウレート、ミリステート、ステアレート、アラキダート、ベヘネート
、オレエート、アラキドナート、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、
ドコサン二酸等、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ
又はポリサッカライド）など、追加の部分が、所望の特性のために本発明のＦＮ３ドメイ
ンに組み込みできる。これらの部分は、タンパク質スカフォールドコード配列との直接融
合であってもよく、標準的なクローニング及び発現技術によって生成できる。あるいは、
組み換え技術によって産生された本発明のＦＮ３ドメインにその部分を付着させるために
、よく知られている化学的結合方法が使用できる。
【００６０】
追加の部分を組み込むＦＮ３ドメインは、いくつかのよく知られている分析評価によっ
て官能性に関して比較できる。例えば、Ｆｃドメイン及び／又はＦｃドメイン変異体の組
み込みによる変化したＦＮ３ドメイン特性は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩ
Ｉ、若しくはＦｃＲｎ受容体などの受容体の可溶型を使用して、あるいは例えば、ＡＤＣ
Ｃ若しくはＣＤＣを測定するか、又はインビボモデル中のタンパク質スカフォールドの薬
物動態学的特性を評価する、よく知られている細胞ベースの分析評価を使用して、Ｆｃ受
容体結合アッセイで分析できる。
【００６１】
ＦＮ３ドメインタンパク質の生成及び産生
本発明の一実施形態は、選択的表面を含むＦＮ３ドメインのライブラリを作製する方法
であって、その選択的表面は基準ＦＮ３ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置
換を有し、その方法は、基準ＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチドを提供する工
程と、選択的表面をランダム化することによって基準ＦＮ３ドメインのポリヌクレオチド
配列のライブラリを生成する工程と、インビトロでライブラリを翻訳する工程、又は宿主
中でライブラリを発現させる工程とを含む。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、Ｃ  βストランド、ＣＤループ、Ｆ  βストランド、及びＦ
Ｇループによって形成される多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有するＦＮ３ド
メインのライブラリを作製する方法であり、配列番号２７と少なくとも８０％同一のアミ
ノ酸配列を有する基準ＦＮ３ドメインポリペプチドを提供する工程と、多様化したＣ−Ｃ
Ｄ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有するＦＮ３ドメインライブラリを形成するために、少なくと
も１つのＣ  βストランド残基及び少なくとも１つのＦ  βストランド残基を変異させる
ことによって、基準ＦＮ３ドメインポリペプチドに多様性を導入する工程とを含む。
【００６３】
本発明のライブラリを作製する方法において、Ｃ  βストランド中の１、２、３、又は
４つの残基は、Ｓ３０が変異されないという条件で変異され得る（残基番号は、配列番号
２７による）。
【００６４】
本発明のライブラリを作製する方法において、Ｃ  βストランド残基Ｌ３２、Ｑ３４、
及びＱ３６は、変異され得る（残基番号は、配列番号２７による）。
【００６５】
本発明のライブラリを作製する方法において、Ｆ  βストランド中の１、２、３、又は
４つの残基は、Ｅ６６が変異されないという条件で変異され得る（残基番号は、配列番号
２７による）。
【００６６】
本発明のライブラリを作製する方法において、Ｆ−βストランド残基Ｔ６８、Ｓ７０、
及びＹ７２は、変異され得る（残基番号は、配列番号２７による）。
【００６７】
本発明のライブラリを作製する方法において、ＣＤループ残基中の１、２、３、又は４
つの残基は、Ｇ４２及びＥ４３が変異されないという条件で変異され得る（残基番号は、
配列番号２７による）。
【００６８】
本発明のライブラリを作製する方法において、ＣＤループ中の残基Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ
４０、及びＶ４１は、変異され得る。
【００６９】
本発明のライブラリを作製する方法において、ＦＧループ中の１、２、３、又は４つの
残基は、残基Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、及びＳ８０が変異されないという条件で変異され
得る（残基番号は、配列番号２７による）。
【００７０】
本発明のライブラリを作製する方法において、ＦＧループ中の残基Ｈ７８、Ｒ７９、及
びＮ８１は、変異され得る（残基番号は、配列番号２７による）。
【００７１】
本発明のライブラリを作製する方法において、基準ＦＮ３ドメインは、アミノ酸位置１
１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６において少なくとも１つの置換を任意に含
む、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
【００７２】
配列番号１７〜２６の中に及び表３に示されるように、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１６）
又はその変異体など、他の基準ＦＮ３ドメインが本発明の方法で使用できる。
【００７３】
本発明の他の実施形態は、本発明の方法によって生成されたライブラリである。
【００７４】
本発明のスカフォールドタンパク質、ＦＮ３ドメイン（又はモジュール）の生成は典型
的に、核酸レベルで達成される。１つ以上の特異残基において置換コドンを有する本発明
のライブラリのＦＮ３ドメインは、例えば、米国特許第６，５２１，４２７号及び米国特
許第６，６７０，１２７号に記載される方法に従って、標準ＰＣＲクローニング方法又は
化学的遺伝子合成を使用して、合成できる。コドンは、よく知られている方法、例えば、
設計された多様性に一致する縮重オリゴヌクレオチドを使用して、又はＫｕｎｋｅｌ突然
変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７〜３８
２，１９８７）を使用して、ランダム化できる。
【００７５】
ライブラリは、アミノ酸のランダム又は定義されたセットを使用して、選択されたコド
ンにおいてランダム化できる。例えば、ランダム置換を有するライブラリ中の変異体は、
２０の自然発生するアミノ酸全てをコードするＮＮＫコドンを用いて生成できる。他の多
様化スキームにおいて、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌ
ｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードするために、ＤＶ
Ｋコドンが使用できる。あるいは、２０全てのアミノ酸残基を生じさせ、同時に停止コド
ンの頻度を低減するために、ＮＮＳコドンが使用できる。コドン指定は、よく知られてい
るＩＵＢコードによる。
【００７６】
任意のその他のタンパク質としての本発明のＦＮ３ドメインは、様々な物理的及び／又
は化学的不安定性になりやすく、下流処理に悪影響をもたらす結果となる。例えば、物理
的及び化学的不安定性は、凝集、分解、生成物の収率の減少、効力の喪失、免疫原性の可
能性の増加、分子不均一性、及び活性の喪失を引き起こす可能性がある。したがって、残
基及び認識配列を誘発する可能性がある不安定性の存在は、ライブラリの設計中に最小化
できる。例えば、表面露出メチオニン及びトリプトファンは、保存条件で酸化され得、タ
ンパク質スカフォールド効力の損失をもたらす可能性がある。よく知られているＮ−グリ
コシル化認識部位（ＮＸＳ／Ｔ）への寄与に加えて、アスパラギンの存在は、グリシンが
続くとき、脱アミド化され得、異型遺伝子性を引き起こす可能性がある（Ｒｏｂｉｎｓｏ
ｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９９，５２８３〜５２８８，
２００２）。したがって、これらのアミノ酸のうちの一部又は全部は、選択された位置を
ランダム化するために使用される混合物から除外されても、又はされなくてもよい。更に
、システイン及びプロリンは、βシートのジスルフィド架橋形成及び破壊を最小化するた
めに除外できる。
【００７７】
多様化される位置に偏ったアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリは、例え
ば、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）テクノロジー（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎ
ｉｎｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成できる。このテクノロジーは、何千もの遺伝子合成プロセ
スに十分な普遍的な構築ブロックとして機能する、あらかじめ作られた二本鎖トリプレッ
トのライブラリを使用する。トリプレットのライブラリは、あらゆる所望のＤＮＡ分子を
構築するのに必要な、全ての考えられる配列組合せを示す。
【００７８】
特定の位置において選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合
成は当該分野でよく知られており、例えば、ＴＲＩＭ手法が知られている（Ｋｎａｐｐｅ
ｋら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６，５７〜８６，１９９９；Ｇａｒｒａｒｄ  ＆  Ｈ
ｅｎｎｅｒ，Ｇｅｎｅ  １２８，１０３〜１０９，１９９３）。特定のコドンセットを有
しているヌクレオチドのそのようなセットは、市販されているヌクレオチド又はヌクレオ
シド試薬、及び装置を使用して合成することができる。
【００７９】
例示的な多様化スキームにおいて、Ｔｅｎｃｏｎ２７  ＦＮ３ドメイン（配列番号２７
）残基、Ｃ  βストランド中のＬ３２、Ｑ３４、及びＱ３６、ＣＤループ中のＳ３８、Ｅ
３９、Ｋ４０、及びＶ４１、Ｆ  βストランド中のＴ６８、Ｓ７０、及びＹ７２、並びに
ＦＧループ中のＨ７８、Ｒ７９、及びＮ８１は、ＮＮＳコドンでランダム化される。
【００８０】
インビトロでライブラリを発現又は翻訳するために、ライブラリをベクターにクローニ
ングするか、又はライブラリの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成するために、標準的なクロ
ーニング及び発現技術が使用される。例えば、インビトロ翻訳の後に形成されるタンパク
質−ＤＮＡ複合体のプールを生成するために、スカフォールドタンパク質をコードするＤ
ＮＡフラグメントを、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡフラグメントに結紮するために、ｃｉ
ｓディスプレイが使用され得、各タンパク質は、それをコードするＤＮＡと安定的に結合
する（米国特許第７，８４２，４７６号；Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃ
ａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，２８０６〜２８１０，２００４）。例えば、リボソ
ームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａ
ｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４，４９３７〜４９４２，１９９７）、ｍＲＮＡディスプレ
イ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
ＵＳＡ，９４，１２２９７〜１２３０２，１９９７）、又は他の無細胞系（米国特許第
５，６４３，７６８号）など、他の方法が使用され得る。タンパク質スカフォールドのラ
イブラリは、例えば、任意の好適なバクテリオファージの表面上に提示される融合タンパ
ク質として発現できる。バクテリオファージの表面上の融合ポリペプチドを提示するため
の方法は、よく知られている（米国公開特許第２０１１／０１１８１４４号；国際公開特
許第ＷＯ２００９／０８５４６２号；特許第６，９６９，１０８号；米国特許第６，１７
２，１９７号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第６，５８２，９１５号；米
国特許第６，４７２，１４７号）。
【００８１】
スクリーニング
標的分子への特異的結合に対する改変タンパク質ＦＮ３ドメイン又はＦＮ３ドメイン変
異体のライブラリのスクリーニングは、例えば、実施例及びＯｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，２８０６〜２８１０，２００４に
記載されるように、ｃｉｓディスプレイを使用して、ライブラリを産生し、当該技術分野
において既知の任意の方法によって、標的分子への特異的結合に対してライブラリを分析
することによって、達成され得る。使用され得る例示的なよく知られている方法は、ＥＬ
ＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、並びに競合及び非競合アッセイである（例えば、Ａｕ
ｓｕｂｅｌら編、１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．
，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【００８２】
本発明のＦＮ３ドメインは、ヒト又はその他哺乳類のタンパク質に、広範な親和性（Ｋ
Ｄ）で結合することができる。典型的に、本発明のＦＮ３ドメインは、当業者によって実
施されるように、表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって決定されるように、約
１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１
０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、又は１０−１５以下のＫＤで、標的タンパク質に結合するこ
とができる。抗原に対するＦＮ３ドメインの親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的
に決定され得る。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅ
ｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８
４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本発明に記載される方法
を参照されたい）。特定のＦＮ３ドメイン抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条
件（例えば、浸透圧モル濃度、ｐＨ）下で測定される場合に異なる可能性がある。したが
って、親和性及びその他抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定
は、好ましくは、タンパク質スカフォールド及び抗原の標準化溶液、及び本明細書で記載
される緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。
【００８３】
核酸分子及びベクター
本発明は、インビトロ転写／翻訳に使用される線状ＤＮＡ配列、原核、真核、若しくは
糸状ファージ発現、組成物若しくはその定方向突然変異原の分泌及び／若しくは提示に適
合するベクターを含む、単離ポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの部分として、
又は線状ＤＮＡ配列の部分として、本発明のＦＮ３ドメインをコードする核酸を提供する
。ある特定の例示的なポリヌクレオチドが本明細書に開示されるが、遺伝暗号の縮重及び
所与の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明のタンパク質スカフォールド
及びタンパク質スカフォールドのライブラリをコードする他のポリヌクレオチドも本発明
の範囲内である。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドは、自動式ポリヌクレオチド合成装置での固相ポリヌクレオ
チド合成などの化学合成により製造され、完全一本鎖又は二本鎖分子に構築され得る。別
の方法としては、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに続いて慣用的なクローニングを
行うなどの他の手法により製造され得る。所与の既知の配列のポリヌクレオチドを製造す
る又は得るための手法は、当該技術分野において周知である。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチドは、プロモータ又はエンハンサー配列、イントロン、ポリア
デニル化シグナル、ＲｅｐＡ結合を促進するｃｉｓ配列等、少なくとも１つの非コード配
列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列はまた、タンパク質、シグナル配列、ＲｅｐＡ
などの融合タンパク質パートナー、Ｆｃ、又はｐＩＸ若しくはｐＩＩＩなどのバクテリオ
ファージコートタンパク質の精製又は検出を促進するために、例えば、マーカー又はヒス
チジンタグ若しくはＨＡタグなどのタグ配列をコードする追加のアミノ酸をコードする追
加の配列を含んでもよい。
【００８６】
例示的なポリヌクレオチドは、Ｔａｃプロモータに対する配列、ＦＮ３ドメインライブ
ラリ及びｒｅｐＡをコードする配列、ｃｉｓ要素、並びに細菌の複製起源（ｏｒｉ）を含
む。別の例示的なポリヌクレオチドは、ｐｅｌＢ又はｏｍｐＡシグナル配列、ｐＩＩＩ又
はｐＩＸバクテリオファージコートタンパク質、ＦＮ３ドメイン、及びｐｏｌｙＡ部位を
含む。ＴＣＬ１４ライブラリ及びＴｅｎｃｏｎ２７をコードする例示的なポリヌクレオチ
ドは、配列番号１００及び１０１の中にそれぞれ示される。
【００８７】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクター
である。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイル
ス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生
物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の
任意のベクターであってよい。かかるベクターは、かかるベクターによってコードされる
ポリペプチドの発現を制御、調整、誘発、又は許容することができる核酸配列因子を含む
発現ベクターであってもよい。このような因子は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポ
リメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現システムにおけるコードされ
たポリペプチドの発現を促進する他の部位を含んでよい。このような発現系は、当該技術
分野において周知の、細胞ベースの、又は無細胞の系であってよい。
【００８８】
宿主細胞選択又は宿主細胞工学
本発明のＦＮ３ドメインは、任意に、当該技術分野においてよく知られている細胞株、
混合細胞株、不死化細胞、又は不死化細胞のクローン集団によって産生され得る。例えば
、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１
９８７〜２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａ第１、２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
，ＮＹ（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９
）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２００１
）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７〜２
００１）を参照のこと。
【００８９】
発現のために選択される宿主細胞は、哺乳類起源であり得るか、又はＣＯＳ−１、ＣＯ
Ｓ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、６５３、ＳＰ
２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はその
任意の誘導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択できる。あるいは、宿主細胞は、ポ
リペプチドをグリコシル化することが不可能な種又は生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１
（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１
７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、及び天然又は改変大腸菌種、クレブシエラ種、又はシュ
ードモナス種の菌株などの原核細胞又は生物、から選択できる。
【００９０】
本発明のＦＮ３ドメインの使用
本発明に記載され、上述の方法のいずれかによって生成されるＦＮ３ドメイン（モジュ
ール）ベースの分子の組成物は、ヒトの疾病の症状、又は細胞、組織、臓器、体液、若し
くは一般には宿主の特定の病変を、診断、監視、調節、治療、緩和、発生の防止を補助、
又は軽減するために使用され得る。免疫介在疾患又は免疫不全症、代謝性疾患、心臓血管
傷害又は疾患；悪性疾患；神経障害又は疾患；細菌性、ウイルス性又は寄生虫感染症など
の感染症；あるいは、腫脹、疼痛、及び組織壊死又は線維症などのその他既知の又は特定
の関連疾患を治療するために、特定の目的のために改変されたＦＮ３ドメインが使用され
得る。
【００９１】
かかる方法は、かかる症状の調節、治療、軽減、予防、若しくは低減、効果、又は機序
を必要としている細胞、組織、器官、動物、又は患者に、標的分子に特異的に結合する少
なくとも１つのＦＮ３ドメインを含む組成物又は医薬組成物を有効量投与することを含み
得る。有効量は、本明細書に記載のように、又は関連分野で既知のように、既知の方法を
用いて行い決定するとき、単回（例えば、ボーラス投与）、複数回、若しくは持続投与あ
たり約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇの量、又は単回、複数回、若しくは持続投与あたり
０．０１〜５０００μｇ／ｍＬの血清濃度を達成する量、又はこの中の任意の有効範囲若
しくは値を含んでよい。
【００９２】
ＦＮ３ドメインベースのタンパク質を含む医薬組成物
単一、二重、又は多特異性の修飾又は非修飾単量体、二量体、又は多量体である標的分
子に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、捕捉、固定化、分配、又は沈殿のために当該技
術分野でよく知られている分離手順を使用して単離され、商業的な適用可能性に必要な程
度まで精製され得る。
【００９３】
治療的使用のために、標的分子に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、薬理学的に許容
可能なキャリア中の活性成分として有効量のＦＮ３ドメインを含有する医薬組成物として
調製できる。用語「キャリア」は、活性化合物と共に投与される希釈剤、助剤、賦形剤、
又は溶媒のことを指す。かかる溶媒は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等の、石油、
動物、植物、又は合成物由来のものを含む、水及び油等の液体であってよい。例えば、０
．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することができる。これらの溶液は滅菌性
であり、粒子状物質を含まない。これらの溶液は、従来の公知の滅菌法（例えば濾過）に
よって滅菌することができる。組成物には、生理学的条件に近づけるために必要とされる
ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などの薬理学的に許容され得
る補助物質を含有させることができる。こうした医薬製剤に含まれる本発明の薬剤濃度は
、重量にして約０．５％未満、通常は約１％又は少なくとも約１％から、最大で１５又は
２０％までと大きく異なってよく、選択される特定の投与方法に従って、主として必要と
される用量、液体の体積、粘度などに基づいて選択される。好適な媒体及び製剤（他のヒ
トタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：
Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１
版、Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．編、Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋ
ｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ  ６９１〜１０９２に記載され、特に
ｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。
【００９４】
標的分子に特異的に結合するＦＮ３ドメインの治療的使用のための投与方法は、非経口
投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、若しくは皮下、肺；経粘膜的（経口、鼻
腔内、膣内、直腸）；タブレット、カプセル、溶液、粉末、ゲル、粒子の製剤を使用する
；及びシリンジ、埋め込みデバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプに収
容される；又は当該技術分野でよく知られているような、当業者によって理解される他の
手段など、宿主に薬剤を送達する、任意の好適な投与法であってもよい。部位特異的投与
は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内
、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立
腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀
胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る
。
【００９５】
本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を
限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
【実施例】
【００９６】
実施例１．Ｔｅｎｃｏｎスカフォールド
Ｔｅｎｃｏｎの設計
ヒトテネイシンＣ（配列番号３）からのＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインの第３フィブロネ
クチンモジュールは、特異的標的分子に結合するように改変され得るタンパク質スカフォ
ールドとして使用できる。天然型のこのドメインの融解温度はＰＢＳ中で５４℃である。
【００９７】
類似構造及び改善された物理学的特性、例えば改善された熱安定性を有するタンパク質
スカフォールドを産生するために、ヒトテネイシンＣからの１５個のＦＮ３ドメイン（配
列番号１〜１５の中に示される）のアラインメントに基づいて、共通配列を設計した。１
５個の選択されたＦＮ３ドメインは、１３〜８０％の範囲の互いとの配列同一性を有し、
対間の平均配列同一性は、２９％である。各位置において最も保存された（頻繁な）アミ
ノ酸を組み込むことによって、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１６）に指定される共通配列を設
計した（米国公開特許第２０１０／０２１６７０８号を参照されたい）。対アラインメン
トにおいて、Ｔｅｎｃｏｎは、３４〜５９％の位置において、テネイシンＣからのＦＮ３
ドメインと同一であり、平均配列同一性は、４３％である。
【００９８】
Ｔｅｎｃｏｎ発現及び精製
Ｔｅｎｃｏｎのアミノ酸配列を逆翻訳し、配列番号５９の中に示されるｃＤＮＡ配列を
得た。常法を使用して、ｃＤＮＡを増幅し、修飾ｐＥＴ１５ベクターにクローニングした
。タンパク質を、大腸菌中の可溶型のＣ末端Ｈｉｓ６融合タンパク質として発現させ５０
０ｍＭのイミダゾール中の溶出を用いた標準的なＮｉ−ＮＴＡアガロースを使用して精製
した。所望の画分をプールし、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に透析した。精製の第２工程とし
て、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０カラム（Ｇ
Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にタンパク質をのせた。Ｔｅｎｃｏｎを含む画分をプールし
、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＵｌｔｒａＣｅｌ  ＹＭ−３濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて
濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Ｔｅｎｃｏｎが、単量体タンパク質についての予測
質量である１０．７ｋＤａに一致して、６〜１４ｋＤａの間で泳動することを示した。培
養液１Ｌにつき収率＞５０ｍｇの精製Ｔｅｎｃｏｎタンパク質が得られた。
【００９９】
Ｔｅｎｃｏｎ生物物理学的特徴付け
Ｔｅｎｃｏｎの構造及び安定性を、円偏光二色性分光法（ＣＤ）及び示差走査熱量測定
法（ＤＳＣ）によって特徴づけた。ＰＢＳ中濃度０．２ｍｇ／ｍＬで、２０℃において、
ＡＶＩＶ分光計でＣＤ測定を実施した。スペクトルは、２１８ｎｍで最小を示し、ＦＮ３
ファミリーに属するタンパク質に対して予測されるβシート構造を示唆する。ＰＢＳ中テ
ネイシンＣからの第３  ＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）又はＴｅｎｃｏｎの溶液０．５ｍｇ／
ｍＬを、Ｎ−ＤＳＣＩＩ熱量計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ）にお
いて、３５℃〜９５℃まで、１℃／分の速度で加熱することによってＤＳＣデータを得た
。このデータから、ＣｐＣａｌｃ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ）ソ
フトウェアを用いて、ＴＮ３及びＴｅｎｃｏｎそれぞれについて、５４℃及び７８℃の融
解温度を計算した。両ドメインのフォールディング及びアンフォールディングは、これら
の温度で可逆的である。したがって、生成されたＴｅｎｃｏｎスカフォールドは、ＴＮ３
の熱安定性と比較して改善された熱安定性を示す。この安定性向上に基づき、Ｔｅｎｃｏ
ｎスカフォールドは、アミノ酸置換により適しており、製造がより容易である可能性が高
い。タンパク質の安定性を低下させる変異は、より安定なスカフォールドという意味にお
いて、より耐性が高いと考えられ、したがって向上した安定性を有するスカフォールドは
、スカフォールド変異体ライブラリから、より機能的で、よく折り畳まれたバインダーを
もたらすと考えられる。
【０１００】
Ｍ１３ファージ上のＴｅｎｃｏｎ提示
Ｔｅｎｃｏｎアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号５９）を、標準的なＰＣＲ
及び制限消化クローニングによって、ファージミド発現ベクターｐＰｅｐ９（国際国際特
許公開第ＷＯ２００８／０７９９７３号）にサブクローニングし、ベクターｐＴｅｎｃｏ
ｎ−ｐＩＸを得た。このベクターは、ＯｍｐＡシグナル配列を利用して、Ｌａｃプロモー
タ（ＩＰＴＧなしでのより低い発現レベル及びＩＰＴＧの添加後の発現の増加を可能にす
る）下で、バクテリオファージＭ１３  ｐＩＸタンパク質のＮ末端へのＣ末端融合として
、Ｎ末端がＭｙｃタグ付けされたＴｅｎｃｏｎを発現させる。短いＴＳＧＧＧＧＳリンカ
ー（配列番号６０）をＴｅｎｃｏｎとｐＩＸとの間に挿入し、これらのタンパク質間の立
体相互作用を防止した。
【０１０１】
Ｍ１３ファージ粒子の表面上の提示の確認のために、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌中のｐＴ
ｅｎｃｏｎ−ｐＩＸの単一コロニー形質転換体を、対数期中期に達するまで３７℃で成長
させ、６１０ｐｆｕのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを用いてレスキューした。アンピシ
リンが補充され、続いて、２ＹＴ培地中の１６時間の膨張及び１ｍＭのＩＰＴＧの誘導後
、上清をレスキューした培養物から採取し、４０００×ｇで２０分間遠心分離し、分析の
ために４℃で保存した。
【０１０２】
ファージ粒子の抗Ｍｙｃ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａ
ｄ，ＣＡ）への結合を利用して、Ｍ１３ファージ表面のＭｙｃ−Ｔｅｎｃｏｎ構築物の提
示を確認した。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、抗Ｍｙｃ又は抗αｖ抗体（陰性対照）を用
いて、２．５μｇ／ｍＬの濃度で一晩コーティングし、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｔ２０（
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）を用いてブロッキング
した。上述のファージミド培養液の上清を、ＰＢＳで２倍ずつ連続希釈し、コーティング
したプレートのウェルに加えた。１時間後、プレートをＴＢＳＴで洗浄し、抗−Ｍ１３  
ＨＲＰ抗体をそれぞれのウェルに添加し、１時間のインキュベーション後ＴＢＳＴで洗浄
した。Ｒｏｃｈｅ  ＢＤ  ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質を加え、Ｔｅｃａｎプレートリーダー
で発光を検出した。
【０１０３】
実施例２：Ｔｅｎｃｏｎ中の変異の安定化
ＦＧ並びにＦＧ及びＢＣループに多様性を同時に導入するように設計されるＴｅｎｃｏ
ｎライブラリ、ＦＧ７及びＢＣ６／ＦＧ７は、記載されている（米国公開特許第２０１０
／０２５５０５６号；米国公開特許第２０１０／０２１６７０８号）。
【０１０４】
変異体の設計
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１６）の折たたみ安定性を改善するために突然変異体を設計し
た。いくつかの点突然変異を生じさせて、配列番号１６の個々の残基、例えば、Ｎ４６Ｖ
（Ｔｅｎｃｏｎ１７；配列番号１７）、Ｅ１４Ｐ（Ｔｅｎｃｏｎ１８；配列番号１８）、
Ｅ１１Ｎ（Ｔｅｎｃｏｎ１９；配列番号１９）、Ｅ３７Ｐ（Ｔｅｎｃｏｎ２０；配列番号
２０）、及びＧ７３Ｙ（Ｔｅｎｃｏｎ２１；配列番号２１）の置換を生じさせ、これらは
、プログラムＰｏＰＭｕＳｉＣ  ｖ２．０（Ｄｅｈｏｕｃｋら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ
ｉｃｓ，２５，２５３７〜２５４３，２００９）によってスカフォールド安定性を改善す
ると予想された。突然変異体Ｅ８６Ｉ（Ｔｅｎｃｏｎ２２；配列番号２２）は、相同タン
パク質、ヒトテネイシンＣからの第３  ＦＮ３ドメインを安定させることが以前に見出さ
れている（国際公開第ＷＯ２００９／０８６１１６号）。Ｔｅｎｃｏｎの全てのループ残
基が独立してアラニンで置換されるアラニン走査実験中に、Ｌ１７Ａ変異体（Ｔｅｎｃｏ
ｎ２６；配列番号２６）がＴｅｎｃｏｎを有意に安定させることが見出された（データは
示されず）。安定性アッセイの初回の後（下記参照）、安定性を更に増加させるために、
組み合わせ突然変異体Ｎ４６Ｖ／Ｅ８６Ｉ（Ｔｅｎｃｏｎ２３；配列番号２３）、Ｅ１４
Ｐ／Ｎ４６Ｖ／Ｅ８６Ｉ（Ｔｅｎｃｏｎ２４；配列番号２４）、及びＬ１７Ａ／Ｎ４６Ｖ
／Ｅ８６Ｉ（Ｔｅｎｃｏｎ２５；配列番号２５）を産生した。
【０１０５】
発現及び精製
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、Ｔｅ
ｎｃｏｎコード配列中の変異を行い、ＨＩＳ６融合タンパク質として、標準プロトコルを
使用して、変異タンパク質を発現及び精製した。５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７
．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、及び２５０ｍＭのイミダゾールで、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ）カラムからタンパク質を溶出した。溶出後、タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ  ７
．４）に透析した。
【０１０６】
熱安定性の特性評価
ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）（２〜３ｍｇ／ｍＬ）中のＴｅｎｃｏｎ及び各変異タンパク質
の熱安定性を、キャピラリー示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって測定した。オートサ
ンプラー（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ）を備えたＶＰ−ＤＳＣ機器を使用して、これらサ
ンプルの融解温度を測定した。サンプルを１０℃〜９５℃又は１００℃まで毎分１℃の速
度で加熱した。積分のためのベースラインを計算するために、各サンプルの走査の間に緩
衝液のみの走査を行った。データは、緩衝液のみのシグナルを差し引いた後の二状態変性
モデルに合致していた。各サンプルをセルから取り出すことなく走査を繰り返すことによ
って、熱変性の可逆性を決定した。可逆性は、１回目の走査曲線の下の面積を２回目の走
査曲線の下の面積と比較することによって計算された。ＤＳＣ実験の結果は、完全な融解
曲線から導かれた値として表３に示されている（Ｔｍ（Ｋｃａｌ））。単一の突然変異体
Ｔｅｎｃｏｎ１７、Ｔｅｎｃｏｎ１８、Ｔｅｎｃｏｎ１９、及びＴｅｎｃｏｎ２２は、親
Ｔｅｎｃｏｎ配列と比べて熱安定性を改善していた。Ｔｅｎｃｏｎ２１だけが有意に不安
定化した。コンビナトリアル突然変異体Ｔｅｎｃｏｎ２３、Ｔｅｎｃｏｎ２４、及びＴｅ
ｎｃｏｎ２５は全て、安定性の向上が有意に大きく、設計された変異は熱安定性の改善に
対して相加的に作用することを示す。
【０１０７】
塩酸グアニジンによる変性
トリプトファン蛍光で測定した場合の、高濃度の塩酸グアニジン（ＧｄｍＣｌ）で処理
された際にＴｅｎｃｏｎ及び各突然変異体が折りたたみを維持する能力を用いて、安定性
を評価した。Ｔｅｎｃｏｎはトリプトファン残基を１個だけ含有している。トリプトファ
ン残基は疎水性コアの中に埋め込まれ、したがって、３６０ｎｍの蛍光放射は、このタン
パク質の折りたたみ状態の感度の高い測定となる。１７点の滴定を産出するために、５０
ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．４８〜６．
６３Ｍの可変濃度のＧｄｍＣｌを含有する２００μＬの溶液を、黒色で非結合の９６個の
ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）にピペットで入れた。Ｔｅｎｃｏｎ突然変異体を含有
する１０μＬの溶液を、最終タンパク質濃度が２３μＭになるようにプレートにわたり各
ウェルに加え、ピペットをゆっくりと上下に操作することによって混合した。室温で２４
時間インキュベーションした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、２８０ｎｍでの
励起及び３６０ｎｍでの発光により蛍光を読み取った。次の式（Ｐａｃｅ，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １３１：２６６〜２８０，１９８６）を用いて、蛍光シグナルを折
りたたみが壊れた割合に変換した。
【０１０８】
【数１】
2019081760.tif 000004
式中、ｙＦは、折りたたみサンプルの蛍光シグナルであり、ｙｕは非折りたたみサンプ
ルの蛍光シグナルである。
【０１０９】
非折りたたみへの移行の中間点、及び転移の勾配を、以下の式（Ｃｌａｒｋｅら、１９
９７）にフィッティングさせて決定した。
【０１１０】
【数２】
2019081760.tif 000005
式中、Ｆは所与の変性剤濃度における蛍光であり、及びαＮ及びαＤは、元の状態と変
性状態のｙ切片であり、及びβＮ及びβＤは、元の状態と変性状態のベースラインの傾斜
であり、［Ｄ］はＧｄｍＣｌの濃度であり、［Ｄ］５０％は、サンプルの５０％が変性し
ている時点のＧｄｍＣｌ濃度であり、ｍは転移の勾配であり、Ｒは気体定数であり、Ｔは
温度である。各サンプルの折りたたみの自由エネルギーを次の式を用いて推定した（Ｐａ
ｃｅ  １９８６（上記を参照）；Ｃｌａｒｋｅら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７０，７７
１〜７７８，１９９７）。ΔＧ＝ｍ［Ｄ］５０％
【０１１１】
このような曲線の転移の勾配ｍを正確に測定するのは困難な場合が多い。加えて、本明
細書に記載の突然変異は、Ｔｅｎｃｏｎの折りたたみ機構を変更させるものとは期待され
ない。したがって、各突然変異体のｍ値を測定し、この値を平均して（上記Ｐａｃｅ  １
９８６参照）、全ての自由エネルギー計算で使用されるｍ＝３５４４ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｍ
を生成した。これらの計算の結果が表３に示されている。ＧｄｍＣｌ変性実験の結果は、
熱安定性に関してＴｅｎｃｏｎを安定させる同じ突然変異体が、ＧｄｍＣｌ誘発変性に対
してもタンパク質を安定させることを示している。
【０１１２】
【表３】
2019081760.tif 000006
【０１１３】
サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、Ｔｅｎｃｏｎ及び各Ｔｅｎｃｏｎ
変異体の凝集状態を評価した。５μＬの各サンプルを、ＰＢＳ移動相を用いる０．３ｍＬ
／分の流量でのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ５／１５０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ）上に注入した。カラムからの溶出を２８０ｎｍの吸光度でモニターした。凝集状態を
評価するために、球状分子量標準品（globular molecular weight standards）（Ｓｉｇ
ｍａ）でカラムを予め較正した。Ｔｅｎｃｏｎ２１を除く試験した全てのサンプルは、モ
ノマーサンプルの溶出体積と一致する溶出体積で単一ピークに溶出された。Ｔｅｎｃｏｎ
２１は２つのピークに溶出され、凝集の存在を示していた。
【０１１４】
実施例３：選択的結合表面を有するＴｅｎｃｏｎライブラリの生成
ＴＣＬ１４ライブラリの設計
特定のライブラリ設計においてランダム化される残基の選択は、作成される相互作用表
面の全体の形状に影響を与える。ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループがランダム化されたライブ
ラリからのマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に結合するように選択されたスカフォー
ルドタンパク質を含有するＦＮ３ドメインのＸ線結晶学的分析は、ＭＢＰの活性部位に適
合する、大きく湾曲した接合面を有することが示された（Ｋｏｉｄｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａ
ｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０４，６６３２〜６６３７，２００７）。対照
的に、ＭＢＰに結合するように選択されたアンキリン反復スカフォールドタンパク質は、
はるかに平面的な相互作用表面を有すること、及び活性部位から離れたＭＢＰの外面に結
合することがわかった（Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，５７５〜５
８，２００４）。これらの結果は、スカフォールド分子の結合表面の形状（曲面対平面）
は、何の標的タンパク質又はそれらの標的タンパク質上の特異的エピトープが、スカフォ
ールドによって効果的に結合されることが可能であるかを決定し得ることを示唆する。タ
ンパク質結合のためにＦＮ３ドメインを含有する改変されたタンパク質スカフォールドを
取り囲む公開された試みは、標的結合のために隣接ループを改変すること（図１）に依存
し、したがって、湾曲した結合表面をもたらした。このアプローチは、かかるスカフォー
ルドによって到達可能な標的及びエピトープの数を制限し得る。
【０１１５】
Ｔｅｎｃｏｎ及び他のＦＮ３ドメインは、分子の反対側の面上にあるＣＤＲ様ループの
２つのセットを含有し、第１のセットは、ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループによって形成され
、第２のセットは、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループによって形成される。ループの２つのセ
ットは、ＦＮ３構造の中心を形成するβストランドによって分離される（図１、２Ａ）。
図１に示されるＴｅｎｃｏｎ構造の画像が９０度回転させられる場合、選択的表面は視覚
化され得る（図２Ｂ）。このわずかに凹状の表面は、ＣＤ及びＦＧループ、並びに２つの
逆平行βストランド、Ｃ及びβストランドによって形成され、本明細書ではＣ−ＣＤ−Ｆ
−ＦＧ表面と呼ばれる（図２Ｂ）。Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面は、表面を形成する残基のサ
ブセットをランダム化することによって、タンパク質スカフォールド相互作用表面のライ
ブラリを設計するためのテンプレートとして使用され得る。βストランドは、全ての他の
残基の側鎖がタンパク質の表面に露出される反復構造を有する。したがって、ライブラリ
は、βストランド中の一部又は全部の表面露出残基をランダム化することによって作製さ
れ得る。βストランド中の適切な残基を選択することによって、Ｔｅｎｃｏｎスカフォー
ルドの固有安定性が最小限に損なわれる一方で、他のタンパク質との相互作用のための特
有のスカフォールド表面を提供するはずである。
【０１１６】
本明細書ではＴＣＬ１４（配列番号２８）と呼ばれる新しいライブラリを、追加のＥ１
１Ｒ置換（Ｔｅｎｃｏｎ２７、配列番号２７）を有するＴｅｎｃｏｎ２５スカフォールド
（配列番号２５）に設計した（図２Ｂ、３）。ループ及びストランドの位置並びにそれら
の配列は、Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列番号２７）及びＴＣＬ１４（配列番号２８）のそれぞ
れに対して、表４及び表５に示される。表５において、「Ｘ」は、任意のアミノ酸を示す
。
【０１１７】
Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列番号２７）：
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓＲｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｋｇｇｈｒ
ｓｎｐｌｓａｉｆｔｔ
【０１１８】
ＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号２８）：
【０１１９】
[配列表１]
2019081760.tif 000007
ここで、「Ｘ」は、任意のアミノ酸である。
【０１２０】
Ｔｅｎｃｏｎ２７中でＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面を形成する２つのβストランドは、ラン
ダム化され得る合計で９つの表面露出残基、Ｃ−ストランド：Ｓ３０、Ｌ３２、Ｑ３４、
Ｑ３６；Ｆ−ストランド：Ｅ６６、Ｔ６８、Ｓ７０、Ｙ７２、及びＶ７４を有し、一方で
、ＣＤループは、６つの可能な残基：Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、Ｖ４１、Ｇ４２、及びＥ
４３を有し、ＦＧループは、７つの可能な残基：Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、Ｈ７８、Ｒ７
９、Ｓ８０、及びＮ８１を有する（図５）。２２個全ての残基がランダム化された場合の
ライブラリのより大きい理論的サイズのため、ＴＣＬ１４設計に含める選択残基を選択し
た。
【０１２１】
ランダム化のために、Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列番号２７）中の１３個の位置を選択した
：Ｃ−ストランド中のＬ３２、Ｑ３４、及びＱ３６、ＣＤ−ループ中のＳ３８、Ｅ３９、
Ｋ４０、及びＶ４１、Ｆ−ストランド中のＴ６８、Ｓ７０、及びＹ７２、ＦＧ−ループ中
のＨ７８、Ｒ７９、及びＮ８１。Ｃ及びＦストランド中、Ｓ３０及びＥ６６は、ＣＤ及び
ＦＧループのすぐ向こう側にあり、明らかにＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面の一部のように見え
ないため、それらをランダム化しなかった。ＣＤループに対して、Ｇ４２及びＥ４３は、
柔軟性を提供するグリシンがループ領域中で有益であり得、Ｅ４３が表面の接合部にある
ため、ランダム化しなかった。ＦＧループは、Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、及びＳ８０を除
外した。上記の理由でグリシンを除外し、一方で、結晶構造の注意深い検査により、安定
したＦＧループの形成を助けるために、コアと主要な接触を行うＳ８０を明らかになった
。Ｋ７５は、Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面の表面から外方を向き、ランダム化の候補としては
あまり魅力的ではなかった。上記の残基は、元のＴＣＬ１４設計においてランダム化され
なかったが、それらは、新しい選択のために、又は例えば、選択ＴＣＬ１４標的特異的ヒ
ット上の親和性成熟ライブラリに向けて追加の多様性を提供するために、後続のライブラ
リ設計に含まれ得る。
【０１２２】
【表４】
2019081760.tif 000008
【０１２３】
既存のＦＮ３−スカフォールドベースのライブラリ設計（Ｋｏｉｄｅら、Ｊ  Ｍｏｌ  
Ｂｉｏｌ，２８４，１１４１〜１１５１，１９９８）；Ｋｏｉｄｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ
ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，６６３２〜６６３７，２００７；（Ｄｉｎｅｅ
ｎら、ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ，８，３５２〜３６１，２００８；Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒ
ｏｂｅｒｔｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ，１６，４７６〜４８４，２００７；Ｘｕら、Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，９３３〜９４２，２００２；Ｋａｒａｔａ
ｎら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，１１，８３５〜８４４，２００４；Ｈａｃｋｅｌら、Ｊ  Ｍ
ｏｌ  Ｂｉｏｌ，４０１，８４〜９６，２０１０；Ｈａｃｋｅｌら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ
ｌ  ３８１，１２３８〜１２５２，２００８；Ｋｏｉｄｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃ
ａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０４，６６３２〜６６３７，２００７；Ｌｉｐｏｖｓｅｋ
ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３６８，１０２４〜１０４１，２００７；国際特許公開第Ｗ
Ｏ２００９／１３３２０８号；国際特許公開第ＷＯ２００９／０５８３７９号；米国特許
第７，１１５，３９６号）とは反対に、設計されたＴＣＬ１４ライブラリ表面は、抗体可
変ドメイン若しくはＣＤＲ、又はすでに記載されたＦＮ３ライブラリとの構造の類似性を
有しなかった。この設計によって生成された大きい相互作用表面のため、高親和性分子は
、場合によっては親和性成熟工程の必要なく、迅速に単離され得る。この設計は、
【０１２４】
【表５】
2019081760.tif 000009
【０１２５】
連続したアミノ酸の長い広がりをランダム化しないため、それは、すでに記載されたラ
イブラリよりも可溶性の、かつ安定したＦＮ３結合分子を産生し得る。記載されたＴＣＬ
１４ライブラリは、前のライブラリの湾曲表面と比較して、平坦又は凹状相互作用表面を
もたらす。したがって、ＴＣＬ１４から選択されたＦＮ３分子は、前のＦＮ３ライブラリ
設計から見つけられたもののように異なる抗原及びエピトープに結合する可能性が高い。
ＴＣＬ１４ライブラリ設計はまた、二重特異性を達成するために、同一分子上の２つの異
なる結合表面の産生を可能にし得る。
【０１２６】
ＴＣＬ１４ライブラリの生成
ｃｉｓディスプレイ系（Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  
ＵＳＡ  １０１：２８０６〜２８１０，２００４）を使用して、上記のＴＣＬ１４ライブ
ラリを発現させた。この系において、ライブラリは、ＲｅｐＡコード配列をコードするＤ
ＮＡフラグメント、ｃｉｓ及びｏｒｉ要素、並びにＴａｃプロモータに結紮され、得られ
た結紮生成物は、インビトロで転写／翻訳される。産生されたＴＣＬ１４−ＲｅｐＡ融合
タンパク質は、融合タンパク質がコードされるＤＮＡに、ｃｉｓで結合される。ライブラ
リは、所望のタンパク質に特異的に結合するスカフォールド分子に対してスクリーニング
され、分子は単離され、結合したＤＮＡは増幅され、結合したスカフォールド分子のコー
ド配列を同定する。
【０１２７】
縮重プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、Ｔｅｎｃｏｎ２
７（配列番号２７）中の位置Ｌ３２、Ｑ３４、Ｑ３６（Ｃ−ストランド）、Ｓ３８、Ｅ３
９、Ｋ４０、Ｖ４１（ＣＤ−ループ）、Ｔ６８、Ｓ７０、Ｙ７２（Ｆ−ストランド）、Ｈ
７８、Ｒ７９、及びＮ８１（ＦＧ−ループ）をランダム化することによって、ＴＣＬ１４
ライブラリを生成し、標準プロトコルを使用して、ｃｉｓディスプレイのために、５’か
らＲｅｐＡ遺伝子にクローニングした。Ｃストランド及びＣ：Ｄループをランダム化する
ためにプライマーＣ−ＣＤ  Ｎ４６Ｖ（配列番号５１）を使用し、Ｆストランド及びＦ：
Ｇループをランダム化するためにプライマーＦ−ＦＧ−Ｓｆ  Ｅ８６Ｉ−Ｒ（配列番号５
２）を使用した。インビトロ転写／翻訳のためのＴＣＬ１４ライブラリを生成するために
、プライマーＲ１ＲｅｃＦｏｒ（配列番号５３）及びＤｉｇＬｉｇＲｅｖ（配列番号５４
）を用いて、最終結紮を増幅した。表６は、利用されるプライマーの配列を示す。多様化
のためにコドンＮＮＳを使用した（ＩＵＢコード；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを示す；Ｓは
Ｃ又はＧを示す）。
【０１２８】
【表６】
2019081760.tif 000010
【０１２９】
ＴＣＬ１４ライブラリの特徴付け
ＴＣＯＮ６（配列番号５５）及びＴＣＯＮ５  Ｅ８６Ｉ短（配列番号５６）プライマー
を使用して、リガーゼ非依存性クローニング部位（ｐＥＴ１５４−ＬＩＣ）を含有する修
飾ｐＥＴ１５ベクター（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、生成されたＴＣＬ１４ラ
イブラリをＰＣＲクローニングし、標準プロトコルを使用した形質転換及びＩＰＴＧ誘導
（１ｍＭ最終、３０℃）１６時間後に、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ付けされたタンパク質として
タンパク質を発現させた。遠心分離によって細胞を採取し、続いて、０．２ｍｇ／ｍＬの
Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｅｇｇ  Ｗｈｉｔｅ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が補充されたＢｕｇｂｕｓｔｅｒ  ＨＴ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）で溶解した。遠心分離によって細菌溶解物を浄
化し、上清を新しい９６ディープウェルプレートに移した。９６ウェルＮｉ−ＮＴＡ  Ｍ
ｕｌｔｉｔｒａｐ  Ｐｌａｔｅ（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａ
ｙ，ＮＪ）を使用して、タンパク質を精製した。
【０１３０】
クローンの無作為選択を採取し、評価するための配列がライブラリ中の分布に得られた
。ライブラリ中の観察された多様性は、予測と十分に一致した（図７）。完全長ライブラ
リクローン中の観察された多様性を計算するために、所与のアミノ酸が多様化したライブ
ラリ領域中に現れた合計回数を全てのクローンにおいて合計し、ランダム位置の合計数で
除算し（１３個のランダムライブラリ位置＊  ６９個の完全長クローン）、１００を乗じ
、％頻度を得た。予測された多様性は、以下のアミノ酸分布：Ｐｈｅ＝１、Ｌｅｕ＝３、
Ｉｌｅ＝１、Ｍｅｔ＝１、Ｖａｌ＝２、Ｓｅｒ＝３、Ｐｒｏ＝２、Ｔｈｒ＝２、Ａｌａ＝
２、Ｃｙｓ＝１、Ａｒｇ＝３、Ｇｌｙ＝２、Ｔｙｒ＝１、Ｈｉｓ＝１、Ｇｌｎ＝１、Ａｓ
ｎ＝１、Ｌｙｓ＝１、Ａｓｐ＝１、Ｇｌｕ＝１、Ｔｒｐ＝１を有するＮＮＳ縮重コドンに
基づく、コドンを、コドンの総数（３２）で除算し、１００が乗じて、％頻度を得る。
【０１３１】
精製タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーに供し、個々のライブラリメンバーの
凝集傾向を決定した。吸光度が２８０ｎｍで読み取られるＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｈ
ＰＬＣを使用して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ５／１５０カラム上に１０μＬの精製タン
パク質を注入することによって、選択クローンの溶出プロファイルを決定した。クローン
を含有する約８０％の非システインを単一の単量体ピークとして溶出し、したがって、大
部分の個々のライブラリメンバーが、親分子の固有溶解度及び構造を保持したことを示す
。遊離システインを含有するいくつかの分子は、精製後に酸化し、したがって、二量体分
子として溶出することがわかった。
【０１３２】
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を使用し、ＳＥＣ分析によって決定されるような単分散
プロファイルを有したクローンを更に特徴付けした。ＶＰ−ＤＳＣキャピラリーセルマイ
クロ熱量計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ，ＬＬＣ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）において、１℃
／分の速度で、３５℃から９５℃に、ＰＢＳ中の各クローンに対する０．５ｍｇ／ｍＬの
溶液を加熱することによって、ＤＳＣデータを得た。表７に示されるデータの要約を用い
て、ＣｐＣａｌｃ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ，ＬＬＣ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）ソフトウ
ェアを使用して、各クローンに対する融解温度を計算した。試験分子の平均融解温度は、
７０±９℃であった。得られたデータは、ＴＣＬ１４ライブラリ設計が、親分子Ｔｅｎｃ
ｏｎ２５の有意な量の熱安定性を保持し（９３℃）、それら自体が本質的に熱的に安定し
、十分にフォールディングされるスカフォールド分子を産生することを示す。
【０１３３】
【表７】
2019081760.tif 000011
【０１３４】
所望の標的分子に特異的に結合するＴＣＬ１４ライブラリ分子の選択
細胞表面受容体細胞外ドメイン、サイトカイン、キナーゼ、ホスファターゼ、熱ショッ
クタンパク質、及び免疫グロブリン、並びにそれらのフラグメントからなる異なるタンパ
ク質の種類の様々な標的タンパク質に対して、ＴＣＬ１４ライブラリをスクリーニングし
、これらのタンパク質及び／又はタンパク質ドメインに特異的に結合するスカフォールド
分子を同定した。ＨＥＫ２９３又は大腸菌細胞中で発現した、精製された可溶性タンパク
質を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ  
Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用
してビオチン化し、続いて、ＰＢＳ中に大量透析した。選択のために、３μｇのＴＣＬ１
４ライブラリを大腸菌Ｓ３０  Ｌｉｎｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＷＩ）中でインビトロで転写及び翻訳し（ＩＶＴＴ）、発現したライブラリを
、Ｃｉｓ  Ｂｌｏｃｋ（２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
，ＭＯ）、１００μｇ／ｍＬ  Ｈｅｒｒｉｎｇ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１ｍｇ／ｍＬへパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でブロッキングした。選択のために、各ビオチン化標的タンパク質を
４００ｎＭ（１回目）、２００ｎＭ（２及び３回目）、並びに１００ｎＭ（４及び５回目
）の濃度で添加した。ニュートラアビジン磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）（１、３、及び５回目）又はストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）（２及び４回目）を使用して、結合ライブラリメ
ンバーを回収し、ビーズを５００μＬのＰＢＳＴで５〜１４回、続いて、５００μＬのＰ
ＢＳで２回洗浄することによって、非結合ライブラリメンバーを除去した。
【０１３５】
５回の選択の後、ＤＮＡ産出をＰＣＲによって増幅し、標準プロトコルを使用してｐＥ
Ｔ１５４−ＬＩＣにサブクローニングした。
【０１３６】
２つの標的タンパク質に対する改善された親和性を有するスカフォールド分子を同定す
るために、追加の選択巡回を実施した。簡潔に、５回目からの産出を上記のように調製し
、以下の変化を伴う追加の反復巡回の選択に供した：ビオチン化標的タンパク質によるイ
ンキュベーションを１時間から１５分に減少させ、ビーズ捕捉を２０分から１５分に減少
させ、ビオチン化標的タンパク質を２５ｎＭ（６及び７回目）又は２．５ｎＭ（８及び９
回目）に減少させ、過剰な非ビオチン化標的タンパク質の存在下で追加の１時間の洗浄を
実施した。これらの変化の目的は、実質的により低いＫＤをもたらす、潜在的により速い
結合速度及びより遅い解離速度を有するバインダーを同時に選択することであった。第９
回の産出を上記のようにＰＣＲ増幅、クローニング、及び発現させた。
【０１３７】
所望のタンパク質及び／又はタンパク質ドメインに結合するスカフォールド分子のイン
ビトロ特徴付け
結合
５回目のパニングの産出からの１８８個の個々のクローンに対して、酵素免疫測定法（
ＥＬＩＳＡ）を実施した。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，
ＮＹ）を０．１μｇの抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で一晩コ
ーティングし、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を有するトリス緩衝食塩水（ｐＨ  ７．４
）（ＴＢＳＴ）で洗浄し、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉ
ｓｈｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してブロッキングした。１μｇ／ｍＬのＨｉ
ｓ６タグ付けされたＴＣＬ１４−ＲｅｐＡ融合又は対照タンパク質（ヒト血清アルブミン
）を含有する浄化した細菌溶解物を、コーティングされたプレートのウェルに添加した。
プレートを１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉ
ｃｅｓ  Ｍ５プレートリーダーを使用して、ビオチン化タンパク質をストレプトアビジン
ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ
）及びＰＯＤ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で検出した
。ライブラリの性能をヒット率によって評価した。ヒット率を、スクリーニングされたク
ローンの合計数（１８８個）で除算した、対照シグナルよりも１０倍の発光シグナルを有
するスカフォールド分子のパーセント（％）として定義した。表８に示されるように、Ｔ
ＬＣ１４ライブラリは、８つの異なるタンパク質に対して８％〜４５％の間の範囲のヒッ
ト率を有するスカフォールド分子を得た。サイトカイン２は、マウスＩＬ−１７Ａである
。
【０１３８】
【表８】
2019081760.tif 000012
【０１３９】
マウスＩＬ−１７Ａバインダーの特徴付け
ＩＬ−１７Ａ受容体阻害
マウスＩＬ−１７Ａ（ｍＩＬ−１７Ａ）に対する５及び９回目のパニングの産出が、ｍ
ＩＬ−１７Ａ受容体へのｍＩＬ−１７Ａの結合を阻害したかを決定するために、阻害アッ
セイを実施した。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを０．２μｇ／ｍＬのｍＩＬ−１７Ａ受容体
Ｆｃ融合（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で一晩コーティン
グし、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ  
７．４）（ＴＢＳＴ）で洗浄し、ＰＢＳ中２％  ＢＳＡ、５％スクロースでブロッキング
した。１０ｎｇ／ｍＬのビオチン化ｍＩＬ１７Ａ（ｂ−ｍＩＬ−１７Ａ）を、ＰＢＳ中１
％  ＢＳＡで１：５０に希釈した浄化細菌溶解物に添加し、混合物を２０分間インキュベ
ートした。ブロッキングされたプレートを洗浄し、細菌溶解物／ｂ−ｍＩＬ−１７Ａイン
キュベーションをプレート上に移した。プレートを更に１時間インキュベートし、ＰＢＳ
Ｔで洗浄し、ビオチン化タンパク質を、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉ
ｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）及びＯＰＤ比色分析基質（
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で検出した。Ｍ５プレートリー
ダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、
４９０ｎｍでの吸光度を読み取り、データを％阻害に変換した。ｍＩＬ−１７Ａ：ｍＩＬ
−１７受容体結合に対する％阻害を、１００−（試料／陰性対照×１００）として定義し
た。
【０１４０】
１０μＭ〜５６ｐＭの間の濃度の１００μＬの精製ＴＣＬ１４−Ｈｉｓ（Ｎｉ−ＮＴＡ
）融合タンパク質をアッセイで使用したことを除いて、上記のプロトコルを使用した用量
応答阻害アッセイで、ｍＩＬ−１７Ａ：ｍＩＬ−１７受容体相互作用を阻害するスカフォ
ールド分子を含有する選択細菌溶解物を更に特徴付けした。Ｓ字形用量応答フィッティン
グを使用して、用量応答曲線からＩＣ５０値を計算した。表９に要約されるように、ｍＩ
Ｌ−１７Ａ特異的阻害剤は、約９〜約４２８ｐＭのＩＣ５０の範囲を有する。
【０１４１】
【表９】
2019081760.tif 000013
【０１４２】
親和性測定
ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ−３６器具（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した表面プラズモン共鳴
を用いて、ｍＩＬ−１７Ａに結合する選択分子の親和性を測定した。ｐＨ  ５．０及び３
０μＬ／分の流量で５分間、異なる密度（１００〜３００Ｒｕｓ）のアミン結合を介して
、精製された分子をチップ上に直接固定化した。３倍濃度系列で希釈した１００ｎＭでの
ｍＩＬ−１７Ａを、チップ表面上での異なる分子へのそれらの結合に対して試験した。全
試料の全濃度に対する解離相を、それらの解離速度に応じて、１００μＬ／分の流量で、
１〜２時間、監視した。緩衝液試料を注入し、ベースライン安定性を監視し、更なる使用
のために表面を再生しなかった。ＴＬＣ１４ライブラリから選択されるスカフォールド分
子の異なる表面のそれぞれに対する全濃度系列に対する応答データを、１：１単純ラング
ミュア結合モデルに全体的にフィッティングさせ、運動（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ）及び親和性
（ＫＤ）定数の推定値を抽出した。表９に要約されるように、ｍＩＬ−１７Ａに特異的に
結合するスカフォールド分子の親和性は、サブナノモル範囲であった。
【０１４３】
選択ｍＩＬ−１７Ａバインダーの配列は、配列番号８５〜９６の中に示され、Ｃ及びＦ
βストランド並びにＣＤ及びＦＧループは、表１０に示される。
【０１４４】
【表１０】
2019081760.tif 000014
【０１４５】
実施例４：第２の選択的表面でランダム化されるＴｅｎｃｏｎ２７ライブラリ
Ｔｅｎｃｏｎ２７上の第２の選択的表面は、図２Ｃで視覚化されるように、Ｃ−ＣＤ−
Ｆ−ＦＧ表面の反対側に存在し、本明細書ではＡ−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ−Ｅ表面と呼ばれ、Ａ
βストランド、ＡＢループ、Ｂ  βストランド、ＢＣループ、及びＥ  βストランドに
よって形成される。Ａ−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ−Ｅ表面はまた、わずかに凹状であり、表面を形
成する残基のサブセットをランダム化することによって、タンパク質スカフォールド相互
作用表面のライブラリを設計するためのテンプレートとして使用され得る。βストランド
は、全ての他の残基の側鎖がタンパク質の表面に露出される反復構造を有する。したがっ
て、ライブラリは、βストランド中の一部又は全部の表面露出残基をランダム化すること
によって作製され得る。βストランド中の適切な残基を選択することによって、Ｔｅｎｃ
ｏｎ２７スカフォールドの固有安定性が最小限に損なわれる一方で、他のタンパク質との
相互作用のための特有のスカフォールド表面を提供するはずである。Ａ−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ
−Ｅ表面のランダム化は、ＴＣＬ１４ライブラリ設計と比較して、Ｔｅｎｃｏｎ２７構造
の反対側に結合表面を生成する。ランダム化Ａ−ＡＢ−Ｂ−ＢＣ−Ｅ表面を有するＴｅｎ
ｃｏｎ２７のライブラリ設計は、配列番号６１（ＴＣＬ１５ライブラリ）の中に及び図６
に示される。
【０１４６】
ＴＣＬ１５ライブラリ（配列番号６１）：
ｌｐａｐｋＸｌＸｖＸＸｖＸＸＸＸａＸｌＸｗＸａｐｄａａｆｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒＸｙＸｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｋｇｇｈｒ
ｓｎｐｌｓａｉｆｔｔ；
ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。
【０１４７】
ＴＣＬ１４ライブラリに関する上記のように、標的分子に特異的に結合するスカフォー
ルドに対して、ＴＣＬ１５ライブラリが生成及び選択される。
【０１４８】
実施例５：他のＦＮ３ドメイン：選択的表面のランダム化によるライブラリの生成
Ｔｅｎｃｏｎ２７スカフォールドに関する実施例に記載される選択的表面を利用したラ
イブラリ設計は、ＦＮ３ドメイン間の構造的類似性により、様々なタンパク質の他のＦＮ
３ドメインに適用され得る。かかるＦＮ３ドメインは、自然発生的又は合成であってもよ
く、例えば、フィブロネクチンドメインの共通配列に基づくＦｉｂｃｏｎ共通スカフォー
ルド（配列番号５８）（米国公開特許第２０１０／０２５５０５６号）、ヒトフィブロネ
クチンの第１０  ＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）（配列番号９７）、又はヒトテネイシンか
らの第３  ＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）（配列番号３）、又は表１に列挙されるタンパク質
中に存在する任意のＦＮ３ドメインである。
【０１４９】
ランダム化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有するＦｉｂｃｏｎ、ＦＮ１０、及びＴＮ
３ライブラリに対するライブラリ設計は、図８、並びに配列番号６２、９８、及び９９の
それぞれの中に示される。設計されたライブラリは、本明細書に記載されるプロトコルを
使用して、特異的バインダーに対して合成、発現、及び選択される。
【０１５０】
ランダム化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面を有するＦｉｂｃｏｎベースのタンパク質スカフォ
ールドライブラリ（配列番号６２）：
ｌｄａｐｔｄｌｑｖｔｎｖｔｄｔｓｉｔｖｓｗｔｐｐｓａｔｉｔｇｙＸｉＸｙＸｐＸＸ
ＸＸｇｅｐｋｅｌｔｖｐｐｓｓｔｓｖｔｉｔｇｌｔｐｇｖｅｙＸｖＸｌＸａｌｋｄｎＸＸ
ｓＸＰｌｖｇｔｑｔｔ；
ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。
【０１５１】
ランダム化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面を有するＦＮ１０ベースのタンパク質スカフォール
ドライブラリ（配列番号９８）：
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＸＩＸＹＸＥＸ
ＸＸＸＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＸＩＸＶＸＡＶＴＧＲＧ
ＤＳＰＸＸＳＸＰＩＳＩＮＹＲＴ；
ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。
【０１５２】
ランダム化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面を有するＴＮ３ベースのタンパク質スカフォールド
ライブラリ（配列番号９９）：
ｄａｐｓｑｉｅｖｋｄｖｔｄｔｔａｌｉｔｗｆｋｐｌａｅｉｄｇｉＸｌＸｙＸｉＸＸＸ
ＸｇｄｒｔｔｉｄｌｔｅｄｅｎｑｙｓｉｇｎｌｋｐｄｔｅｙＸｖＸｌＸｓｒｒｇｄＸＸｓ
ＸｐａｋＥｔｆｔｔ；
ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。
【０１５３】
Ｔｅｎｃｏｎ２７スカフォールドに関して記載されるものと同様に、他のＦＮ３ドメイ
ンのＣＤ及び／又はＦＧループを含む残基の一部又は全部は、異なる長さのライブラリを
生成するために、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個
のランダム化位置で置換され得る。
【０１５４】
以上の記述及び実施例中で特に記されたものとは別な形で本発明を実施できることは明
白であろう。以上の教示に照らして、本発明の数多くの修正及び変形が可能であり、した
がってこれらは、添付の特許請求の範囲内に入るものである。
【図１】
2019081760.tif 000015
【図２】
2019081760.tif 000016
【図３】
2019081760.tif 000017
【図４】
2019081760.tif 000018
【図５】
2019081760.tif 000019
【図６】
2019081760.tif 000020
【図７】
2019081760.tif 000021
【図８】
2019081760.tif 000022
【配列表】
2019081760000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月28日(2018.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃβストランド、ＣＤループ、Ｆβストランド、及びＦＧループによって形成される多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有する、フィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメインに基づくタンパク質スカフォールドであって、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインポリペプチドを含み、
前記ＦＮ３ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列において、少なくとも１つのＣβストランドの残基、少なくとも１つのＣＤループの残基、少なくとも１つのＦβストランドの残基及び少なくとも１つのＦＧループの残基からなる群から選択される残基において変異を含み、多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を形成し、
(i) 前記Ｃβストランドの残基Ｌ３２、Ｑ３４及びＱ３６のそれぞれは変異されているが残基Ｓ３０は変異されていないか（残基番号は配列番号２７による）、または、
(ii) 前記Ｆβストランドの残基Ｔ６８、Ｓ７０及びＹ７２のそれぞれは変異されているが残基Ｅ６６は変異されていない（残基番号は配列番号２７による）、
スカフォールド。
【請求項２】
前記ＣＤループ中の１、２、３、又は４つの残基が、残基Ｇ４２及びＥ４３（残基番号は配列番号２７による）が変異されないという条件で、変異されている、請求項１に記載のスカフォールド。
【請求項３】
残基Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、及びＶ４１（残基番号は配列番号２７による）が変異されている、請求項２に記載のスカフォールド。
【請求項４】
前記ＦＧループ中の１、２、３、又は４つの残基が、残基Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、及びＳ８０（残基番号は配列番号２７による）が変異されないという条件で、変異されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスカフォールド。
【請求項５】
残基Ｈ７８、Ｒ７９、及びＮ８１（残基番号は配列番号２７による）が変異されている、請求項４に記載のスカフォールド。
【請求項６】
前記スカフォールドが、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、場合により、アミノ酸位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６において少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のスカフォールド。
【請求項７】
前記スカフォールドが配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のスカフォールド。
【請求項８】
Ｃβストランド、ＣＤループ、Ｆβストランド、及びＦＧループによって形成される多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有する、フィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメインに基づくタンパク質スカフォールドであって、(i) 配列番号２７のアミノ酸配列を含み、場合により、アミノ酸位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６において少なくとも１つの置換を含むか、(ii) 配列番号２８のアミノ酸配列を含む、スカフォールド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
以上の記述及び実施例中で特に記されたものとは別な形で本発明を実施できることは明白であろう。以上の教示に照らして、本発明の数多くの修正及び変形が可能であり、したがってこれらは、添付の特許請求の範囲内に入るものである。
本発明は次の実施態様を含む。
（１）Ｃ βストランド、ＣＤループ、Ｆ βストランド、及びＦＧループによって形成される多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有する、フィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメインのライブラリを作製する方法であって、
ａ．配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、基準ＦＮ３ドメインポリペプチドを提供する工程と、
ｂ．前記多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有する前記ＦＮ３ドメインライブラリを形成するために、少なくとも１つのＣ βストランド残基及び少なくとも１つのＦ βストランド残基を変異させることによって、前記基準ＦＮ３ドメインポリペプチドに多様性を導入する工程と、を含む、方法。
（２）前記Ｃ βストランドの１、２、３、又は４つの残基が変異されているが、配列番号２７の中の対応する残基Ｓ３０が変異されていない、上記（１）に記載の方法。
（３）配列番号２７の中の対応する前記Ｃ βストランド残基Ｌ３２、Ｑ３４、及びＱ３６が変異されている、上記（２）に記載の方法。
（４）前記Ｆ βストランド中の１、２、３、又は４つの残基が変異されているが、配列番号２７の中の対応する残基Ｅ６６が変異されていない、上記（２）に記載の方法。
（５）配列番号２７の中の対応する前記Ｆ−βストランド残基Ｔ６８、Ｓ７０、及びＹ７２が変異されている、上記（４）に記載の方法。
（６）前記ＣＤループ中の１、２、３、又は４つの残基が変異されているが、配列番号２７の中の対応する残基Ｇ４２及びＥ４３が変異されていない、上記（４）に記載の方法。
（７）配列番号２７の中の対応する残基Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、及びＶ４１が変異されている、上記（６）に記載の方法。
（８）前記ＦＧループ中の１、２、３、又は４つの残基が変異されているが、配列番号２７の中の対応する残基Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、及びＳ８０が変異されていない、上記（４）に記載の方法。
（９）配列番号２７の中の対応する残基Ｈ７８、Ｒ７９、及びＮ８１が変異されている、上記（８）に記載の方法。
（１０）前記基準ＦＮ３ドメインが、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、上記（９）に記載の方法。
（１１）アミノ酸位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６において少なくとも１つの置換を含む、上記（１０）に記載の方法。
（１２）上記（１）に記載の方法によって生成されたライブラリ。
（１３）  前記ライブラリが、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、上記（１２）に記載のライブラリ。
（１４）標的分子に特異的に結合することが可能な多様化したＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ選択的表面を有するフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメインを含む、タンパク質スカフォールドを得る方法であって、上記（１２）に記載のライブラリを前記標的分子と接触させるか、又はパニングする工程と、所定の親和性を有する標的分子と特異的に結合するタンパク質スカフォールドを単離する工程と、を含む、方法。
（１５）本明細書に記載されたいずれかの発明。