(57)【要約】      （修正有）【課題】組織マトリックスの機械的特性及び／又は生物学的特性を制御する方法の提供。【解決手段】組織マトリックスの処理方法において、組織マトリックスを選択するステップと、前記組織マトリックスをアルカラーゼに接触させるステップと、前記組織マトリックスを放射線で治療するステップと、を含み、前記アルカラーゼは、放射線による治療後に柔軟性の増加を生じさせるように選択された、アルカラーゼ活性を有する溶液中でのインキュベーション時間だけ提供されることを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織マトリックスの処理方法において、
組織マトリックスを選択するステップと、
前記組織マトリックスをアルカラーゼに接触させるステップと、
前記組織マトリックスを放射線で治療するステップと、
を含み、
前記アルカラーゼは、放射線による治療後に柔軟性の増加を生じさせるように選択された、アルカラーゼ活性を有する溶液中でのインキュベーション時間だけ提供されることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、引張強さ、引裂強さ、縫合部強さ、耐クリープ性、破裂強さ、熱転移温度、コラゲナーゼ感受性又はこれらの組合せのうち少なくとも１つの望ましくない変化が、前記組織マトリックスに発生しないように、前記組織マトリックスをアルカラーゼに接触させることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法において、アルカラーゼとの接触が、組織の柔軟性をほぼ最大に増加させることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスが非霊長類の組織マトリックスであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスがブタ組織マトリックスであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、弾性に望ましくない変化が前記組織マトリックスに発生しないように、前記組織マトリックスを前記アルカラーゼに接触させることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスを処理して、前記組織マトリックスから少なくとも一部の細胞及び細胞成分を除去するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記組織マトリックスから全ての細胞及び細胞成分を除去するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスが無細胞組織マトリックスであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスが真皮組織マトリックスを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスをアルカラーゼに接触させるステップが、前記組織マトリックスを、１×１０−６アンソンユニット／ｍＬ〜０．０１５アンソンユニット／ｍＬの活性を伴うアルカラーゼを有する溶液に接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスをアルカラーゼに接触させるステップが、前記組織マトリックスを、１×１０−６アンソンユニット／ｍＬ〜１．５×１０−３アンソンユニット／ｍＬの活性を伴うアルカラーゼを有する溶液に接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスをアルカラーゼに接触させるステップが、前記組織マトリックスを、約２×１０−５アンソンユニット／ｍＬ〜約４×１０−５アンソンユニット／ｍＬの活性を伴うアルカラーゼを有する溶液に接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３の何れか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスを包装するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１４の何れか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスを滅菌するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１乃至１５の何れか１項に記載の方法において、ドレープ値の少なくとも３０％の低減を前記組織マトリックスに生じさせるように、前記組織マトリックスをアルカラーゼに接触させることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１乃至１５の何れか１項に記載の方法において、ドレープ値の少なくとも４０％の低減を前記組織マトリックスに生じさせるように、前記組織マトリックスをアルカラーゼに接触させることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１乃至１５の何れか１項に記載の方法において、ドレープ値の少なくとも５０％の低減を前記組織マトリックスに生じさせるように、前記組織マトリックスをアルカラーゼに接触させることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１５の何れか１項に記載の方法において、ドレープ値の少なくとも６０％の低減を前記組織マトリックスに生じさせるように、前記組織マトリックスをアルカラーゼに接触させることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１９の何れか１項に記載の方法において、前記放射線が、電子ビーム放射を具えることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１乃至１９の何れか１項に記載の方法において、前記放射線が、ガンマ線を具えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年９月５日に出願され、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第１４／０１９，２７４号明細書の、米国特許法第１２０条に基づく一部継続出願である。
【０００２】
本開示は、組織マトリックスに関し、特に、組織マトリックスをタンパク質分解酵素で処理することによって、当該マトリックスの機械的特性及び／又は生物学的特性を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
罹患した又は損傷した組織及び器官の再生、修復、又は別の治療のために、様々な組織由来製品が使用される。このような製品としては、無傷組織移植片及び／又は無細胞組織若しくは再構成無細胞組織（例えば、細胞播種を行った又は行っていない、皮膚、腸又は他の組織に由来する無細胞組織マトリックス）を挙げることができる。このような製品の機械的特性は、一般に、組織源（即ち、それが由来する組織の種類及び動物）及び組織製品の製造に使用される処理パラメーターによって決定される。組織製品は、外科用途及び／又は組織の置換若しくは増大に使用されることが多いため、組織製品の機械的特性は重要である。例えば、外科医は、一般に、天然組織のような感触の、及び／又は外科処置中に取り扱いが容易な組織を好む。しかし、組織製品の中には、望ましくないほど硬い、及び／又は不自然な感触を有するものがある。したがって、より望ましい機械的特性を生じさせる、組織製品の処理方法を提供する。
【０００４】
そのほかに、外来材料由来の組織製品（例えば、他の動物又は患者由来の組織、及び任意の種類の加工組織）は、体内に移植された場合に、レシピエントにおいて炎症反応又は免疫応答を誘発する場合がある。場合により、過剰な免疫応答は有害となり得、移植組織に望ましくない瘢痕組織を形成させたり、移植部位における組織の適切な再生を妨げたりする場合がある。したがって、移植された場合に組織製品の免疫応答を低減又は制御する、組織製品の処理方法を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
ある実施形態によれば、組織マトリックスの処理方法が提供される。本方法は、コラーゲン含有組織マトリックスを選択するステップと、組織マトリックスに所望のレベルの柔軟性を生じさせるのに十分な条件下で、組織マトリックスをタンパク質分解酵素に接触させるステップとを含むことができる。
【０００６】
別の実施形態では、組織マトリックスの処理方法が提供される。本方法は、コラーゲン含有無細胞組織マトリックスを選択するステップと、組織マトリックスに所望のレベルの柔軟性を生じさせ、且つ組織マトリックスの空隙率を増加させるのに十分な条件下で、組織マトリックスをタンパク質分解酵素に接触させるステップとを含むことができる。
【０００７】
幾つかの実施形態では、無細胞組織マトリックスが提供される。マトリックスは、無細胞組織マトリックスを選択するステップと、組織マトリックスに所望のレベルの柔軟性を生じさせるのに十分な条件下で、組織マトリックスをタンパク質分解酵素に接触させるステップとを含む方法によって調製することができる。
【０００８】
ある実施形態によれば、組織マトリックスの処理方法が提供される。本方法は、少なくとも１種のコラーゲン含有組織マトリックスを選択するステップと；少なくとも１種のコラーゲン含有組織マトリックスをタンパク質分解酵素に接触させるステップと；アッセイを行って、少なくとも１種のコラーゲン含有組織マトリックスを少なくとも１種のタンパク質分解酵素に接触させるステップによって、少なくとも１種のコラーゲン含有組織マトリックスが人体に移植された場合に、組織マトリックスに対するヒト免疫応答を低減するように、当該組織マトリックスが変わったかどうかを判定するステップとを含むことができる。
【０００９】
ある実施形態によれば、組織マトリックスの処理方法が提供される。本方法は、真皮組織マトリックスを選択するステップと；顕著なコラーゲン分解を生じることなく、ドレープ性試験により測定した場合に組織マトリックスの柔軟性に所望の増加を生じさせるように選択された、アルカラーゼ活性を有する溶液中でのインキュベーション時間を含む条件下で、真皮組織マトリックスをアルカラーゼに接触させるステップとを含むことができる。
【００１０】
ある実施形態によれば、組織マトリックスの処理方法が提供される。本方法は、真皮組織マトリックスを選択するステップと；真皮組織マトリックスをアルカラーゼに接触させるステップと；組織マトリックスを照射によって処理するステップにおいて、照射による処理をすると組織マトリックスに所望の柔軟性を生じさせるように選択される条件下でアルカラーゼが用意されるステップとを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、実施例１に記載の方法を使用して酵素で処理した後の無細胞組織マトリックス、及び無処理の対照を示す。
【図２】図２は、実施例１の方法による処理サンプルと対照サンプルの引張強さ試験データの箱ひげ図である。
【図３】図３は、実施例１の方法による処理サンプルと対照サンプルの縫合部強さ試験データの箱ひげ図である。
【図４】図４は、実施例１の方法による処理サンプルと対照サンプルの引裂強さ試験データの箱ひげ図である。
【図５】図５は、実施例１の方法による処理サンプルと対照サンプルの弾性試験データの箱ひげ図である。
【図６】図６は、実施例１の方法による処理サンプルと対照サンプルの耐クリープ性試験データの箱ひげ図である。
【図７】図７は、無処理の組織、及び実施例２．２に従ってブロメライン及びアルカラーゼを使用して処理した組織のＤＳＣサーモグラムを示す。
【図８】図８Ａ−８Ｂは、実施例２．４に記載の単球活性化アッセイを使用して様々な組織と共培養した単球における、活性化マーカーＣＤ１４の発現パターンを示す。
【図９】図９Ａ−Ｆは、実施例２．５に記載の、無処理のｐＡＤＭの外植後のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）切片である。
【図１０】図１０Ａ−Ｄは、実施例２．５に記載の無処理のｐＡＤＭ外植片のＨ＆Ｅ切片である。
【図１１】図１１は、実施例３に記載の方法を使用してアルカラーゼで処理した後の組織マトリックス、及び無処理の対照の、ドレープ性試験の結果を示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、実施例３に記載の方法を使用してアルカラーゼで処理した後の組織マトリックス、及び無処理の対照の、コラゲナーゼ消化アッセイの結果を示す折れ線グラフである。
【図１３】図１３は、無処理の組織、及び実施例３に従ってアルカラーゼを使用して処理した組織の変性発現温度を含む、ＤＳＣの結果を示す。
【図１４】図１４は、実施例３に記載の方法を使用してアルカラーゼで処理した後の組織マトリックス、及び無処理の対照の、最大荷重／単位幅の区間プロットである。
【図１５】図１５は、実施例３に記載の方法を使用してアルカラーゼで処理した後の組織マトリックス、及び無処理の対照の、弾性の区間プロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示による特定の例示的な実施形態についてここで詳述することにし、その特定の実施例を添付の図面に示す。同じ又は類似の部分を指すのに、可能な限り、図面全体を通して同じ参照番号を使用することにする。
【００１３】
本願では、別段の指定のない限り、単数形を使用すると複数形が含まれる。本願では、特記しない限り、「又は」を使用すると「及び／又は」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態を使用しても、限定するものではない。本明細書に記載する任意の範囲は両端点及び端点間の全ての値を含むものと理解されることになる。
【００１４】
本明細書で使用する項目見出しは構成を目的とするに過ぎず、記載する対象を限定するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、論説、書籍及び論文を含むがこれらに限定されるものではない、本願に引用する全ての文献又は文献の一部は、その内容全体が、あらゆる目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「組織製品」とは、細胞外マトリックスタンパク質を含有する任意のヒト又は動物の組織を指すものとする。「組織製品」としては、無細胞の又は部分的に脱細胞化された組織マトリックス、外来細胞を再増殖させた脱細胞化組織マトリックス、及び／又は細胞組織を挙げることができる。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「組織マトリックス」とは、一定の組織のコラーゲンを含む細胞外マトリックスを指し、ここで、当該マトリックスは、それが由来する組織の元来の細胞外マトリックスがもつ相互に結合した構造のコラーゲンマトリックスの特質を保持しているものである。「無細胞組織マトリックス」とは、元来の組織細胞が除去された「組織マトリックス」を指す。
【００１７】
様々なヒト及び動物の組織を使用して、患者を治療するための製品を製造することができる。例えば、様々な疾患及び／又は構造的損傷（例えば、外傷、手術、萎縮及び／又は長期摩耗並びに変性による）により損傷した、又は失われたヒト組織の再生、修復、増大、補強、及び／又は治療のための様々な組織製品が製造されてきた。このような製品としては、例えば、無細胞組織マトリックス、組織同種移植片若しくは異種移植片、及び／又は再構成組織（即ち、少なくとも部分的に脱細胞化された組織に細胞を播種して生存可能な材料に製造したもの）を挙げることができる。
【００１８】
外科用途では、一定の機械的特性を有する組織製品を製造することが望ましい場合が多い。例えば、シート状の材料を含み得る組織製品は、使用目的の要求に耐えるのに十分な強度を有しているべきである。ある組織製品は、欠損（例えばヘルニア）を修復、周囲組織又は移植組織（例えば、豊胸及び／又は乳房再建用）を支持、又は損傷した若しくは失われた組織（例えば、外傷又は外科的切除後）を置換するために使用され得る。特定の用途が何であれ、組織製品は、組織再生及び／又は修復が生じるまで機能するのに十分な強度、弾性、及び／又は他の機械的特性を有しているべきである。
【００１９】
さらに、組織製品は、望ましい感触を有しているべきである。例えば、外科医は、一般に、天然組織のような感触（例えば、十分に柔らかく、柔軟で、且つ／又は弾性のある）を有する材料を好む。さらに、移植後、組織製品が自然な感触であることが望ましい。例えば、豊胸に使用される組織は、移植すると自然な感触の乳房を作り出すために、過度に硬いものであってはならない。
【００２０】
しかし、組織製品の中には、一部の用途には過度に硬いものがあり得る。例えば、ＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）などのブタ由来の真皮材料は、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）などのヒト真皮製品より柔軟性が低いことを指摘する外科医がいる。しかしながら、このような製品の感触を改善する方法は、製品の生物学的特性及び／又は機械的特性に悪影響を及ぼしてはならない。特に、製品を処理して製品の感触を改善することで、引張強さなどの他の機械的特性に望ましくない低下が生じてはならず、材料が組織再生及び／又は修復を支持しないようにタンパク質マトリックスを変化させてはならない。
【００２１】
本開示は、組織から製造される組織製品の感触を制御するための組織の処理方法を提供する。本開示はまた、本処理方法を使用して製造される組織製品も提供する。さらに、本開示は、組織から製造される組織製品の空隙率を制御するための、組織の処理方法を提供する。空隙率を制御すると、細胞浸潤並びに組織再生及び／又は修復を改善することができる場合がある。
【００２２】
さらに、本開示は、身体に移植された場合に、組織マトリックスに対する免疫応答を制御又は低減する方法を提供する。免疫応答は、単球活性化アッセイ、食作用アッセイ、及び／又は酸化バーストアッセイを含む幾つかの免疫測定法を使用して測定することができる。組織を処理して、組織の感触を改善、組織の機械的特性（本明細書に挙げた任意の機械的特性を含む）を制御、及び／又は組織の空隙率を制御するのと同時に、免疫原性も制御することができる。組織マトリックスを処理してから、マトリックスにアッセイを行って、組織の免疫原性が望ましく変化したかどうかを判定することができる。
【００２３】
ある実施形態によれば、組織マトリックスの処理方法が提供される。本方法は、真皮組織マトリックスを選択するステップと；顕著なコラーゲン分解を生じることなく、ドレープ性試験により測定した場合に組織マトリックスの柔軟性に所望の増加を生じさせるように選択された、アルカラーゼ活性を有する溶液中でのインキュベーション時間を含む条件下で、真皮組織マトリックスをアルカラーゼに接触させるステップとを含むことができる。
【００２４】
ある実施形態では、酵素処理条件は、ドレープ値を目標まで低くするように選択される。本明細書で使用する場合、「ドレープ性試験」とは、既知の円形面積を有する組織マトリックスのサンプルを既知の直径を有する円形の台の頂部に配置する（垂らしかける）というものである。真皮マトリックスを台に垂らしかけてから、その投影面積を組織マトリックス円の原面積で除算してドレープ値を求める。この円板の原面積と、ドレープ面積とから台の面積を減算し、その後、これら２つの面積を除算してドレープを求めることに留意されたい。ドレープ値が低いほど、より柔らかい（よりドレープ性がある）材料であることを意味する。
【００２５】
ある実施形態では、酵素はアルカラーゼであり、処理条件は、直径６０ｍｍの組織マトリックスサンプル及び１９ｍｍの台を使用した際のドレープ値に、１０〜９０％の間、２０〜８０％の間、３０〜７０％の間、４０〜６０％の間、若しくは約５０％（例えば、４５〜５５％）、又は少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％若しくは少なくとも７０％の低減が生じるように選択される。さらに、幾つかの実施形態では、条件は、真皮無細胞組織のドレープ値が、０．２〜０．４の間、若しくは０．２５〜０．３５の間、又は０．４未満、０．３５未満、０．３未満、若しくは０．２未満になるように選択される。
【００２６】
様々な要因が最終ドレープ値に影響し得る。例えば、組織の柔軟性に対する効果を制御するために変化させることができる要因としては、例えば、温度、ｐＨ、使用する溶液又は緩衝液、酵素の濃度、使用する特定の種類のアルカラーゼ、組織の量と比較した際の溶液の量、及び／又は溶液中の酵素阻害剤の存在を挙げることができる。
【００２７】
以下でより詳細に述べるように、アルカラーゼは真皮組織マトリックスの処理において幾つかの有益性を有することがわかった。例えば、インキュベーション時間が比較的短く、酵素活性が比較的低い場合、アルカラーゼは、組織の柔軟性を相当に増加させ、組織マトリックスのドレープ性試験に改善をもたらし（即ち、より高いドレープ能をもたらし）、コラーゲン構造に容認できない変化も、組織の他の特性（引張強さ、弾性、引裂強さ、縫合部強さ、耐クリープ性、破裂強さ、熱転移温度、コラゲナーゼ感受性又はこれらの組合せなど）における悪化も引き起こさないことがわかった。
【００２８】
実施例３に詳述するように、アルカラーゼで処理してから照射（例えば、最終滅菌ステップとして）すると、酵素処理条件の変化に基づいて、組織の機械的特性に対する様々な効果を有することがわかった。例えば、酵素濃度が比較的低く、処理時間が比較的短い場合、その後照射をすると、組織の柔軟性における初期増加における得られた組織、その増加は例えば図１１に示すように、ある点でピークになる。さらなるアルカラーゼ処理（例えば、処理時間がより長く、酵素活性がより高い）を行い、その後照射すると、柔軟性が失われる。したがって、幾つかの実施形態では、本方法は、真皮組織マトリックスを選択するステップと；真皮組織マトリックスをアルカラーゼに接触させるステップと；組織マトリックスを照射によって処理するステップにおいて、照射による処理をすると組織マトリックスに所望の柔軟性を生じさせるように選択される条件下でアルカラーゼが用意されるステップとを含むことができる。
【００２９】
ｉｎ  ｖｉｖｏに移植された細胞外マトリックスの安定性を維持するために、処理中にコラーゲンの安定性を維持することが望ましい。ＤＳＣによるコラーゲンの変性発現温度及びコラゲナーゼ酵素での処理中の重量損失は、コラーゲンの安定性の指標である。本明細書で使用する場合、「コラーゲン組織構造における容認できない劣化」とは、ＤＳＣによるコラーゲンの変性発現温度の変化が、１℃より大きい、２℃より大きい、３℃より大きい、若しくは４℃より大きい、又は５℃より大きいことを意味する。
【００３０】
様々なアラカーゼ（ａｌａｃａｓｅ）活性及び処理時間を使用することができる。例えば、アルカラーゼは、ｍＬ当たり１×１０−６アンソンユニット〜ｍＬ当たり０．０１５アンソンユニットの活性、ｍＬ当たり１×１０−６ユニット〜１．５×１０−３アンソンユニットの活性、又はｍＬ当たり約２×１０−５アンソンユニット〜ｍＬ当たり約４×１０−５アンソンユニットの活性で溶液中に用意してもよい。さらに、処理時間は約４時間〜５日の間で変化させてもよい。
【００３１】
一実施形態では、組織マトリックスの処理方法が提供される。本方法は、コラーゲン含有組織マトリックスを選択するステップと、組織マトリックスに所望のレベルの柔軟性を生じさせるのに十分な条件下で、組織マトリックスをタンパク質分解酵素に接触させるステップとを含むことができる。別の実施形態では、組織マトリックスの処理方法が提供される。本方法は、コラーゲン含有無細胞組織マトリックスを選択するステップと、組織マトリックスに所望のレベルの柔軟性を生じさせ、且つ組織マトリックスの空隙率を増加させるのに十分な条件下で、組織マトリックスをタンパク質分解酵素に接触させるステップとを含むことができる。図１Ａ〜図１Ｄは、本開示の方法を使用して酵素で処理した後の無細胞組織マトリックス（ＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標））及び無処理の対照を示す。図のように、処理したサンプルは無処理のサンプルより有意に柔軟性がある。
【００３２】
ある実施形態によれば、組織マトリックスの処理方法が提供される。本方法は、少なくとも１種のコラーゲン含有組織マトリックスを選択するステップと；少なくとも１種のコラーゲン含有組織マトリックスをタンパク質分解酵素に接触させるステップと；アッセイを行って、少なくとも１種のコラーゲン含有組織マトリックスを少なくとも１種のタンパク質分解酵素に接触させるステップによって、少なくとも１種のコラーゲン含有組織マトリックスが人体に移植された場合に、組織マトリックスに対するヒト免疫応答を低減するように、当該組織マトリックスが変わったかどうかを判定するステップとを含むことができる。
【００３３】
様々な実施形態では、組織マトリックスをタンパク質分解酵素で処理することにより、１種以上の生物学的特性を劣化させることなく、改善された機械的特性が得られる。例えば、組織マトリックスの処理により、炎症の増加も瘢痕形成も引き起こすことなく、並びに／又は細胞の内方成長及び再生を促進する組織マトリックスの能力を低下させることなく、所望の硬さ、感触、触質性、及び／又は所望の空隙率を生じさせることができる。
【００３４】
組織マトリックスは、多種多様な生物学的特性及び機械的特性を付与するように選択することができる。例えば、無細胞組織マトリックス又は他の組織製品は、組織の内方成長及び再構築が、マトリックスを移植する部位で通常に見られる組織の再生を補助するのを可能にするように選択することができる。例えば、無細胞組織マトリックスは、筋膜上又は筋膜中に移植される場合、過剰な線維形成も瘢痕形成も起こすことなく、筋膜の再生を可能にするように選択することができる。ある実施形態では、組織製品は、それぞれヒト及びブタの無細胞真皮マトリックスであるＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）又はＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）から形成することができる。或いは、以下に記載するように、他の適切な無細胞組織マトリックスを使用することができる。組織は、皮膚（真皮又は皮膚全層）、筋膜、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靱帯組織、脂肪組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織及び腸組織を含む様々な組織源から選択することができる。本明細書に記載する方法は、任意の種類のコラーゲン性組織を処理し、任意の組織マトリックス製品を得るために使用することができる。例えば、幾つかの生物学的足場材料をＢａｄｙｌａｋらが記述しており、それら又は当技術分野において公知の他の組織製品を処理するために本開示の方法を使用することができる。Ｂａｄｙｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  ａｓ  ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ（２００８），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｃｔｂｉｏ．２００８．０９．０１３。
【００３５】
場合により、組織製品は、脱細胞化組織マトリックスとして提供することができる。適切な無細胞組織マトリックスを以下に記載する。別の場合には、本方法は、無傷組織を処理して細胞又は他の材料を除去するステップをさらに含むことができる。組織を完全に又は部分的に脱細胞化して、患者に使用するための無細胞組織マトリックス又は細胞外組織材料を得ることができる。例えば、皮膚、腸、骨、軟骨、脂肪組織、神経組織（例えば、神経線維又は硬膜）、腱、靱帯又は他の組織などの様々な組織を完全に又は部分的に脱細胞化して、患者に有用な組織製品を製造することができる。場合により、これらの脱細胞化製品は、外来の細胞材料（例えば幹細胞）を加えることなく使用することができる。特定の場合、これらの脱細胞化製品に、自家供給源又は他の供給源の細胞を播種して治療を促進することができる。無細胞組織マトリックスを製造するのに好適な処理を以下に記載する。
【００３６】
幾つかの異なる酵素を使用して、組織マトリックスを処理することができる。例えば、適切な酵素としては、ブロメラインなどのスルフヒドリルプロテアーゼを挙げることができる。さらには、ブロメライン、パパイン、フィシン、アクチニジン、アルカラーゼ、トリプシン又はこれらの組合せを挙げることができる。これらの酵素は、市販品を購入することも、果実源から抽出することもできる。例えば、ブロメラインの一供給源はＭＣＣＯＲＭＩＣＫ  ＭＥＡＴ  ＴＥＮＤＥＲＩＺＥＲ（登録商標）であるが、この酵素は、パイナップルから抽出することもでき、及び／又は医療用製剤として購入することもできる。
【００３７】
酵素を組織に接触させて、他の機械的及び／又は生物学的特性における望ましくない劣化を引き起こすことなく、組織の柔軟性を増加させることができる。例えば、本明細書に記載の酵素処理をして、又はしないで材料のバッチを製造すると、酵素処理をした方は、引張強さ、引裂強さ、縫合部強さ、耐クリープ性、弾性、コラゲナーゼ感受性、破裂強さ、熱転移温度又はこれらの組合せのうち少なくとも１つにおける望ましくない変化を生じさせないであろう。ある場合には、望ましくない変化は、引張強さ、引裂強さ、縫合部強さ、耐クリープ性、グリコサミノグリカン含有量、レクチン含有量、破裂強さのうち、任意の１つにおける統計学的に有意な低下、コラゲナーゼ感受性の増加、又は熱転移温度（示差走査熱量測定を使用して測定した場合）の変化（上方又は下方）である。
【００３８】
前述のように、幾つかの実施形態では、組織を酵素で処理して組織の空隙率を増加させる。様々な実施形態では、組織の空隙率の増加は、チャネルの数及び／又はサイズを増加させるように行われ、これにより細胞浸潤及び組織再生の速度を改善することができる。
【００３９】
場合により、酵素は、組織内のタンパク質の部位特異的な切断を引き起こすように選択される。例えば、ブタの真皮材料をブロメラインで処理しても、一定量の処理をした後、マトリックス構造にさらなる変化は起こらないことがわかっている。したがって、真皮をブロメラインで処理しても、長時間の曝露で、又は長時間経過した後に、マトリックスにさらなる変化は起こらない。
【００４０】
さらに、酵素は、種々の適切な溶液として組織に適用することができる。例えば、ブロメラインは、生理食塩溶液で組織に適用すると有効であることがわかっているが、他の適切な緩衝液（例えばＰＢＳ）も使用することができる。
【００４１】
前述のように、酵素で処理した後、アッセイを行って、少なくとも１種のコラーゲン含有組織マトリックスを少なくとも１種のタンパク質分解酵素に接触させることによって、少なくとも１種のコラーゲン含有組織マトリックスが人体に移植された場合に、組織マトリックスに対するヒト免疫応答を低減するように、当該組織マトリックスが変わったかどうかを判定することができる。複数の適切なアッセイを行ってもよい。例えば、適切なアッセイとしては、単球活性化アッセイ、食作用アッセイ及び酸化バーストアッセイを挙げることができる。
【００４２】
幾つかの実施形態では、処理した組織の切片又は部分にアッセイを行い、組織の他の部分をその後の医療処置又は外科処置に使用してもよい。他の実施形態では、多数のサンプルのバッチから１つ以上のサンプルにアッセイを行い、次いで、アッセイを行わないサンプルを患者の治療に使用するために選択してもよい。
【００４３】
ある実施形態では、酵素処理は、体温で変性を可能にする熱転移温度を有する、材料中のコラーゲン又は他のタンパク質を除去するように選択される。例えば、幾つかの実施形態では、真皮無細胞組織が選択され、酵素処理は、ＤＳＣを使用して測定した場合の熱ピークがセ氏約３０度〜４０度の間になるのを除外するように選択される。この小さなＥＣＭピークにより、ヒト体温で自然に変性が起こると予測され、移植後に起こる様々な炎症反応の一因となり得る。
【００４４】
無細胞組織マトリックス
「無細胞組織マトリックス」という用語は、本明細書で使用する場合、一般に、細胞及び／又は細胞成分を実質的に含まない任意の組織マトリックスを指す。皮膚、皮膚の一部（例えば真皮）、並びに他の組織、例えば、血管、心臓弁、筋膜、軟骨、脂肪組織、骨及び神経結合組織などを使用して、本開示の範囲に入る無細胞マトリックスを作り出すことができる。無細胞組織マトリックスが細胞及び／又は細胞成分を実質的に含まないかどうかを判定するために、複数の方法で無細胞組織マトリックスを試験又は評価することができる。例えば、処理した組織を光学顕微鏡で検査して、細胞（生細胞又は死細胞）及び／又は細胞成分が残存しているかどうかを判定することができる。さらに、一定のアッセイを使用して、細胞又は細胞成分の存在を確認することができる。例えば、ＤＮＡ又は他の核酸のアッセイを使用して、組織マトリックス内に残存している核物質を定量することができる。一般に、残存するＤＮＡも他の核酸もなければ、完全に脱細胞化されている（即ち、細胞及び／又は細胞成分が除去されている）ことを示すことになる。最後に、細胞に特異的な成分（例えば表面抗原）を同定する他のアッセイを使用して、組織マトリックスが無細胞であるかどうかを判定することができる。皮膚、皮膚の一部（例えば真皮）、並びに他の組織、例えば、血管、心臓弁、筋膜、軟骨、骨及び神経結合組織などを使用して、本開示の範囲に入る無細胞マトリックスを作り出すことができる。
【００４５】
一般に、無細胞組織マトリックスの製造に必要なステップには、ドナー（例えば、ヒト死体又は動物供給源）から組織を採取するステップと、生物学的機能及び構造的機能を維持する条件下で細胞を除去するステップとが含まれる。ある実施形態では、本方法は、細胞除去と同時又はその前に、化学処理を含めることで組織を安定化させ、生化学的分解及び構造的分解を回避する。様々な実施形態では、安定化溶液は、浸透圧性、低酸素性、自己分解性及びタンパク質分解性の分解を阻止及び防止し、微生物汚染から保護し、例えば平滑筋成分（例えば血管）を含有する組織に起こる可能性のある機械的損傷を低減する。安定化溶液は、適切な緩衝液、１種以上の酸化防止剤、１種以上の膨張剤、１種以上の抗生物質、１種以上のプロテアーゼ阻害剤及び／又は１種以上の平滑筋弛緩剤を含有してもよい。
【００４６】
次いで、組織を脱細胞化溶液に入れて、コラーゲンマトリックスの生物学的及び構造的統合性を損傷することなく、構造的マトリックスから生細胞（例えば、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞）を除去する。脱細胞化溶液は、適切な緩衝液、塩、抗生物質、１種以上の界面活性剤、１種以上の架橋結合防止剤、１種以上のプロテアーゼ阻害剤及び／又は１種以上の酵素を含有してもよい。幾つかの実施形態では、組織を脱細胞化溶液に入れて、９０ｒｐｍで穏やかに振盪させながら３７℃で終夜インキュベートする。ある実施形態では、追加の界面活性剤を使用して、組織サンプルから脂肪を除去してもよい。
【００４７】
脱細胞化処理の後、組織サンプルを徹底的に洗浄する。幾つかの例示的な実施形態では、例えば異種間の材料を使用する場合、次に、脱細胞化された組織をデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）溶液で処理する。緩衝液が適切なＤＮａｓｅ活性を付与する限り、任意の適切な緩衝液を使用することができる。
【００４８】
無細胞組織マトリックスは、無細胞組織マトリックス移植片のレシピエントと同種の１体以上の個体から作製することができるが、必ずしもそうであるとは限らない。したがって、例えば、無細胞組織マトリックスがブタ組織から作製され、ヒト患者に移植されてもよい。無細胞組織マトリックスのレシピエント及び無細胞組織マトリックスを製造するための組織又は器官のドナーの役目をすることができる種としては、以下に限定されるものではないが、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ又はチンパンジー）、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ラット又はマウスが挙げられる。
【００４９】
コラーゲン含有材料からα−ｇａｌエピトープを除去すると、コラーゲン含有材料に対する免疫応答を低減させることができる。α−ｇａｌエピトープは、非霊長類哺乳動物及び新世界ザル（南米のサル）に、並びに細胞外成分のプロテオグリカンなどの高分子に発現する。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７７５５（１９８８）。しかし、このエピトープは、旧世界霊長類（アジア及びアフリカのサル、及び類人猿）及びヒトには存在しない。同書。抗ｇａｌ抗体は、ヒト及び霊長類で、胃腸細菌のα−ｇａｌエピトープの糖鎖構造に対する免疫応答の結果として産生される。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１７３０（１９８８）；Ｒ．Ｍ．Ｈａｍａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１２２３（１９９２）。
【００５０】
非霊長類哺乳動物（例えばブタ）はα−ｇａｌエピトープを産生するため、これらの哺乳動物から霊長類にコラーゲン含有材料を異種移植すると、コラーゲン含有材料のこれらのエピトープに霊長類の抗Ｇａｌ抗体が結合するため、拒絶反応が起こることが多い。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １４：４８０（１９９３）；Ｍ．Ｓａｎｄｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１３９１（１９９３）；Ｈ．Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２４：５５９（１９９２）；Ｂ．Ｈ．Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５００（１９９５）。さらに、異種移植により免疫系が顕著に活性化して、多量の高親和性抗ｇａｌ抗体が産生される。したがって、幾つかの実施形態では、α−ｇａｌエピトープを産生する動物を組織源として使用する場合、細胞から、及びコラーゲン含有材料の細胞外成分からα−ｇａｌエピトープを実質的に除去し、細胞のα−ｇａｌエピトープの再発現を防止すると、抗ｇａｌ抗体のα−ｇａｌエピトープへの結合に伴うコラーゲン含有材料に対する免疫応答を低減することができる。
【００５１】
α−ｇａｌエピトープを除去するために、一定の免疫原性の抗原が組織サンプル中に存在する場合、そのサンプルに１種以上の酵素処理を行ってそれを除去してもよい。幾つかの実施形態では、α−ｇａｌエピトープが組織中に存在する場合、その組織サンプルをα−ガラクトシダーゼ酵素で処理してそれを除去することができる。幾つかの実施形態では、１００ｍＭリン酸緩衝液中にｐＨ６．０で調製した濃度３００Ｕ／Ｌのα−ガラクトシダーゼで組織サンプルを処理する。他の実施形態では、採取した組織からα−ｇａｌエピトープを十分に除去するために、α−ガラクトシダーゼの濃度を４００Ｕ／Ｌまで高める。抗原の除去を実現するのに十分である限り、任意の適切な酵素濃度及び緩衝液を使用することができる。
【００５２】
或いは、組織を酵素で処理するのではなく、遺伝子組み換えをして１種以上の抗原エピトープを欠損させた動物を組織源として選択してもよい。例えば、遺伝子改変して末端のα−ガラクトース部分を欠損させた動物（例えばブタ）を組織源として選択することができる。適切な動物の説明については、同時係属中の米国特許出願第１０／８９６，５９４号明細書及び米国特許第６，１６６，２８８号明細書を参照されたく、これらの開示は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。さらに、α−１，３−ガラクトース部分の量を低減した若しくは欠損した、又はしていない無細胞マトリックスを製造するための、特定の例示的な組織の処理方法が、Ｘｕ，Ｈｕｉ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｐｏｒｃｉｎｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｔｈａｔ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ  Ｓｏｆｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓｅ−α−（１，３）−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，”Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１５，１−１３（２００９）に記載されており、この文献は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５３】
無細胞組織マトリックスを形成した後に、任意選択により、組織適合性生細胞を無細胞組織マトリックスに播種して移植片を製造してもよく、これは宿主によってさらに再構築され得る。幾つかの実施形態では、組織適合性生細胞は、移植前に標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞共培養技術によって、又は移植後にｉｎ  ｖｉｖｏ再増殖によって、マトリックスに加えることができる。Ｉｎ  ｖｉｖｏ再増殖は、レシピエント自身の細胞が無細胞組織マトリックス中に遊走することによる、又はレシピエントから得られた細胞若しくは別のドナー由来の組織適合性細胞を無細胞組織マトリックス中にｉｎ  ｓｉｔｕで導入若しくは注入することによるものとすることができる。胚性幹細胞、成人幹細胞（例えば間葉系幹細胞）及び／又は神経細胞を含む様々な細胞型を使用することができる。様々な実施形態では、移植の直前又は直後に、無細胞組織マトリックスの内部に細胞を直接適用することができる。ある実施形態では、移植予定の無細胞組織マトリックス内に細胞を配置し、移植前に培養することができる。
【実施例】
【００５４】
実施例１：柔軟性を増加させるための組織マトリックスの処理
以下の実施例は、ブタ真皮無細胞組織マトリックスを含む材料の柔軟性を増加させるために、材料をブロメラインで処理する方法を説明する。以下に述べるように、処理をしても様々な機械的特性に望ましくない変化は起こらなかった。さらに、処理によって材料の空隙率が増加し、これにより細胞浸潤及び組織再生の速度を改善し得る。
【００５５】
この実験では、ＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）無細胞組織マトリックスを、ＬＩＦＥＣＥＬＬ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）から入手して使用した。ＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）は、柔軟な形態として、及びより堅い種類として入手可能である。この実験には両タイプを使用した。試験に使用するサンプルを４等分にカットし、４分の３を処理した。無処理のサンプル（４分の１）を対照として使用した。処理中は対照を冷蔵した。ＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）は溶液に入れて包装されており、したがって、再水和の必要がない。処理サンプルを、ＭＣＣＯＲＭＩＣＫ  ＭＥＡＴ  ＴＥＮＤＥＲＩＺＥＲ  ５５ｇを含有する冷水道水０．５リットルに入れた。
【００５６】
図１Ａ〜図１Ｄは、本開示の方法を使用して酵素で処理した後の無細胞組織マトリックス、及び無処理の対照を示す。図２〜図６は、各処理サンプルと対照サンプルについての、引張強さ、縫合部強さ、引裂強さ、弾性及び耐クリープ性の箱ひげ図である。処理サンプルの柔軟性は対照と比較して顕著に増加したが、他の機械的特性については有意な低減がなかった。さらに、熱転移温度にもコラゲナーゼ感受性にも有意な変化は見られなかった。全般的に、対応のあるｔ検定により、対照群と処理群との間に統計的差違は見られなかった。
【００５７】
実施例２：移植の際に免疫応答を調節するための組織マトリックスの処理
１．ブタ無細胞真皮マトリックス（ｐＡＤＭ）の調製
ブタ皮膚を食肉処理場から採取した。表皮及び皮下脂肪を物理的に除去した。残存している真皮組織を、抗生物質を含有するＰＢＳに入れて３７℃で２４時間除染した。
【００５８】
除染後、組織を無菌条件で処理した。真皮組織を、界面活性剤で２４時間脱細胞化して生細胞を除去し、生理食塩水で洗浄し、ＤＮＡｓｅ／α−ガラクトシダーゼで又はさらに２４時間処理した。細胞片及び残留化学物質を、ＰＢＳ中で洗浄して除去した。得られたブタ無細胞真皮マトリックス（ｐＡＤＭ）を、使用するまで周囲温度で保管した。
【００５９】
２．酵素処理ｐＡＤＭの調製
１種又は２種のプロテアーゼ酵素（アルカラーゼ又はブロメライン）を用いて、ｐＡＤＭを３７℃で終夜処理した。脱細胞化ステップの前又はＤＮＡｓｅ／α−ガラクトシダーゼステップの後に、濃度１００ユニット／リットルのブロメラインを使用して、ｐＡＤＭを処理した。脱細胞化ステップの前に、アルカラーゼを濃度０．００３アンソンユニット／ｍＬで使用して、ｐＡＤＭを処理した。
【００６０】
３．処理サンプルの示差走査熱量測定
ブタ組織ＥＣＭに対するブロメライン酵素処理の効果を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を使用して評価した。組織サンプルを気密に封止し、３℃／分で２℃から１２０℃まで走査した。無処理の組織、及び実施例２．２に従って酵素（ブロメライン及びアルカラーゼ）を使用して処理した組織のＤＳＣサーモグラムを図７に示す。サーモグラムは、酵素処理後の組織ＥＣＭにおいてわずかな変化を示した。第１に、無処理の対照脱細胞化組織とは対照的に、酵素処理ＥＣＭは３０℃〜４０℃の間で小さなピーク（約２％）を示さなかった。この小さなＥＣＭピークにより、ヒト体温で自然に変性が起こると予測され、これが、無処理の及び酵素処理ｐＡＤＭによって誘発される様々な炎症反応の一因となり得る。第２に、５５℃を超えたところでの２つの重要なＥＣＭピークは平均でわずかに０．９℃下がった。第３に、全体的なＥＣＭ変性エンタルピーは、酵素処理後、平均で約７．５％増加した。
【００６１】
４．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単球活性化
単球は、自然免疫系の一部を形成する白血球細胞である。単球は、炎症性物質に応答して急速に活性化し、炎症反応を惹起する。酵素処理組織及び無処理の組織に対するヒト炎症反応を予測するために、単球をヒト末梢血から単離し、組織とともに終夜インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、活性化をモニターするために使用される２種の表面マーカーであるＣＤ１４及びＣＤ１６３に対する抗体で染色した。
【００６２】
単球は、活性化すると、ＣＤ１４とＣＤ１６３の両方の発現をその表面から減少させる。この発現パターンは、単球の既知の活性化物質であるリポ多糖（ＬＰＳ）を使用して確認した。図８Ａ〜図８Ｂは、様々な組織と共培養した単球における活性化マーカーＣＤ１４（Ａ）及びＣＤ１６３（Ｂ）の発現パターンを示す。非誘導性の単球におけるＣＤ１４及びＣＤ１６３の発現レベル（黒）がベースライン陰性対照としての役目をする。比較の際には、非誘導性の単球におけるこれらのマーカーの発現パターンが陰性対照としての役目をする。両マーカーの発現パターンが証明する通り、酵素処理ｐＡＤＭが誘導した活性化は、無処理のｐＡＤＭより大幅に低いレベルであった。事実、酵素処理ｐＡＤＭに曝露した単球におけるＣＤ１４の発現パターン及びレベルは、非誘導性の単球の同パターン及びレベルに極めて類似している。酵素処理ｐＡＤＭに曝露した単球のＣＤ１６３の発現はわずかに減少したが、その程度は無処理のｐＡＤＭ又はＬＰＳに曝露した単球より大幅に少なかった。
【００６３】
この結果は、酵素処理ｐＡＤＭはヒト単球において最小限の炎症反応しか誘導しないことを示す。単球が活性化すると、ＣＤ１４とＣＤ１６３の両方の発現が減少する。このパターンは、既知の単球活性化物質であるリポ多糖（ＬＰＳ）と共培養した細胞によって確認される。無処理のｐＡＤＭ（赤）のＣＤ１４及びＣＤ１６３の発現は、酵素処理ｐＡＤＭ（緑）と比較して低く、酵素処理が単球の活性化を低減することを示している。したがって、酵素処理ｐＡＤＭが誘発するヒト単球における炎症反応は少ない。
【００６４】
５．ｐＡＤＭ及び酵素処理ｐＡＤＭのｉｎ  ｖｉｖｏ性能
ｐＡＤＭ及び酵素処理ｐＡＤＭのｉｎ  ｖｉｖｏ性能を評価するため、ｐＡＤＭ及び酵素処理ｐＡＤＭの１ｃｍ×１ｃｍ片を免疫適格ラットの皮下組織に移植した。移植から２週間後及び４週間後に、組織を外植し、処理して、炎症、細胞の再増殖及び血管再生の組織学的評価を行った。
【００６５】
図９Ａ〜図９Ｆは、前述の通り、無処理のｐＡＤＭ（９Ａ〜９Ｃ）及び酵素処理ｐＡＤＭ（９Ｄ〜９Ｆ）の、外植後のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）切片である。図１０Ａ〜図１０Ｄは、前述の通り、無処理のｐＡＤＭ（９Ａ〜９Ｂ）外植片及び酵素処理ｐＡＤＭ（Ｃ〜Ｄ）外植片のＨ＆Ｅ切片である。酵素処理ｐＡＤＭが誘導した炎症は最小限から皆無であったが、無処理のｐＡＤＭは、多量の免疫細胞の存在を特徴とする、中等度から重度の炎症反応を誘導した。さらに、酵素処理ｐＡＤＭ外植片には、無処理のｐＡＤＭと比較して、細胞の再増殖及び血管再生の増強が見られた。無処理のｐＡＤＭには、線維芽細胞様細胞及び血管構造が主に組織の末梢に存在していた。対照的に、これらの同様の細胞及び血管構造は、酵素処理ｐＡＤＭでは組織の中央を含む全体に観察された。
【００６６】
６．コラゲナーゼ消化アッセイ
凍結乾燥ｐＡＤＭ及び酵素処理（ブロメライン、トリプシン及びアルカラーゼを使用）ｐＡＤＭの様々なアリコートを秤量し、時間の長さを変化させて、コラゲナーゼタイプＩで消化した。各時点で、消化されたサンプルの一部のアリコートを遠心分離によってコラゲナーゼＩ溶液から分離し、水で洗浄して、残留するコラゲナーゼＩ溶液を除去した。全てのアリコートを再度凍結乾燥し、秤量した。各時点で残存しているマトリックスの百分率を、消化されたサンプルの乾燥重量対初期サンプルの乾燥重量の比を得ることによって計算した。
【００６７】
酵素処理は、コラゲナーゼ消化に対するｐＡＤＭの感受性に悪影響を及ぼさなかった。ｐＡＤＭと酵素処理ｐＡＤＭの両方が、コラゲナーゼタイプＩによって、同程度まで、同速度で消化された。したがって、本開示の方法により、移植すると、コラゲナーゼ感受性の劣化を引き起こすことなく、改善された免疫学的特性が得られることが判明した。
【００６８】
実施例３：アルカラーゼ活性の制御を伴う組織の処理
３×１０−５〜０．０１５アンソンユニット／ｍＬの様々な活性を有するアルカラーゼのほぼ中性のｐＨ水溶液で、ブタ真皮を１６時間処理した。次いで、ブタ真皮を脱細胞化し、消毒し、電子線で滅菌して、滅菌無細胞真皮マトリックスを調製した。様々な試験を行って、種々の機械的特性、構造的特性及び生物学的特性に対するアルカラーゼの効果を調査した。
【００６９】
図１１は、実施例３に記載の方法を使用してアルカラーゼで処理した後の組織マトリックス、及び無処理の対照のドレープ性試験の結果を示す棒グラフである。ドレープ性試験は、直径６０ｍｍの円の真皮マトリックスを直径１９ｍｍの台の頂部に配置するというものとした。真皮マトリックスを台に垂らしかけてから、その投影面積を直径６０ｍｍの円の原面積で除算してドレープ値を求めた。この円板の原面積と、ドレープ面積とから台の面積を減算し、その後、これら２つの面積を除算してドレープを求めることに留意されたい。ドレープ値が低いほど、より柔らかい（よりドレープ性がある）材料であることを意味する。データは、酵素濃度が最低の３×１０−５アンソンユニット／ｍＬの場合に、ドレープ値が有意に低減する（材料が柔らかくなる）ことを示している。選択した処理時間、温度及びｐＨでは、３×１０−５アンソンユニット／ｍＬを超えるとドレープ値が増加し、１．５×１０−３アンソンユニット／ｍＬを超えるとプラトーに達するようである。
【００７０】
図１３は、実施例３に記載の方法を使用してアルカラーゼで処理した後の組織マトリックス、及び無処理の対照のコラゲナーゼ消化アッセイの結果を示す折れ線グラフである。データは、濃度がより低いアルカラーゼについては対照（酵素処理していないマトリックス）と同様の消化プロファイルを示し、濃度がより高いアルカラーゼに曝露したマトリックスについては分解速度が増していることを示している。
【００７１】
図１４は、ＤＳＣの結果、即ち、無処理の組織、及び実施例３に従ってアルカラーゼを使用して処理した組織の変性発現を示す。コラゲナーゼ感受性試験を使用して測定したコラーゲン安定性（図１３）と同様に、アルカラーゼ濃度が増すと変性発現が低下することは、アルカラーゼ処理濃度に応じてコラーゲン安定性が低下することを示している。
【００７２】
図１５は、実施例３に記載の方法を使用してアルカラーゼで処理した後の組織マトリックス、及び無処理の対照の最大荷重／単位幅の区間プロットである。このデータは、荷重を測定しながら、およそ１ｃｍ幅の材料片を、破損するまで引張試験を行うことによって作成した。ＩＮＳＴＲＯＮ機械的試験システムを使用して試験を行った。データは、全ての処理について強さが同様であることを示している。
【００７３】
図１６は、実施例３に記載の方法を使用してアルカラーゼで処理した後の組織マトリックス、及び無処理の対照の弾性の区間プロットである。弾性とは、変位−荷重曲線の直線部におけるより高い荷重での材料の硬さの尺度である。弾性は、極めて低い荷重（組織に対する重力）での硬さを反映するドレープ測定値と対照をなす。処理群間で弾性における有意な変化は見られなかった。
【００７４】
試験は、アルカラーゼ処理により、初期処理でｐＡＤＭの柔軟性が有効に増加し、継続処理で柔軟性が引き続き増加することを示している。さらに、低レベルのアルカラーゼ曝露では、最大荷重、コラゲナーゼ感受性及び弾性に悪影響を及ぼすことがない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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