(57)【要約】      （修正有）【課題】抗老化抗微生物創傷治癒性ポリマーベースのヒドロゲルの提供。【解決手段】抗老化性、創傷治癒性および抗微生物性であって、担体として調製したゲルに、ホウ素誘導体およびポロキサマーを加えることにより得られるヒドロゲル。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗老化性、創傷治癒性および抗微生物性であって、担体として調製したゲルに、ホウ素誘導体およびポロキサマーを加えることにより得られるヒドロゲル。
【請求項２】
１％カルボポールが調製したゲルに用いられる請求項１記載のヒドロゲル。
【請求項３】
五ホウ酸ナトリウム五水和物がホウ素誘導体として用いられる請求項１または２記載のヒドロゲル。
【請求項４】
３％五ホウ酸ナトリウム五水和物が、ホウ素誘導体として用いられる請求項１〜３のいずれか１記載のヒドロゲル。
【請求項５】
４％ポロキサマーが、調製したゲルに用いられる請求項１〜４のいずれか１記載のヒドロゲル。
【請求項６】
ゲル、ホウ素誘導体およびポロキサマーの混合物が４℃にて１６〜２４時間貯蔵される  請求項１〜５のいずれか１記載のヒドロゲル。
【請求項７】
ホウ酸がホウ素誘導体として用いられる請求項１または２記載のヒドロゲル。
【請求項８】
アルカリ金属ホウ酸塩がホウ素誘導体として用いられる請求項１または２記載のヒドロゲル。
【請求項９】
アルカリ土類金属ホウ酸塩がホウ素誘導体として用いられる請求項１または２記載のヒドロゲル。
【請求項１０】
ローション、クリーム、エマルジョン、スプレー、フォーム、ゼラチン、ペースト、パウダー、プラスター、スキンプレートまたは創傷包帯織物品になる請求項１〜９いずれか１記載のヒドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗老化抗微生物創傷治癒性ポリマーベースのヒドロゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の基本的機能は、環境損傷および影響から身体を保護できる障壁を創製し、ホメオスタシスを確保することである。かくして、皮膚完全性（skin integrity）に生じ得るいずれの変形も、感染、極度の脱水、電解質平衡異常等のごとき多数の病理学的状況に対して、人体を脆弱にさせ得る（ＢａｕｍおよびＡｒｐｅｙ、２００５年）。この理由のために、疾患または外傷により皮膚に生じ得る大きな損傷は、重篤な機能不全および死亡さえ引き起こす（ＳｉｎｇｅｒおよびＣｌａｒｋ、１９９９年）。皮膚完全性の障害直後に、創傷治癒は体内で始まる。これは、一連の生物学的事象が規則的に相互に続く場合の複雑な事象であり、創傷治癒は、組織の部分的または完全な再生でほとんど終わる。一般的には、創傷治癒は、ホメオスタシス、炎症、増殖および組織修復の４つの相互に接続する期よりなる（ＤｉｅｇｅｌｍａｎｎおよびＥｖａｎｓ、２００４年）。たとえ生物が創傷を閉鎖して修復するように組織されたとしても、その生物から独立した多数の因子が、創傷治癒に影響することによりプロセスを遅延させ、慢性創傷の形成を引き起こし得る。例えば、創傷領域で生じ得る微生物汚染、およびこれらの微生物によって形成される産物（エンドトキシン、メタロプロテイナーゼ等）は、治癒プロセスにネガティブに作用することにより皮膚完全性の修復を妨害し得る（Ｒｏｂｓｏｎ、１９９７年）。創傷面上に形成された微生物コロニー形成が多数の病原体を提供する多微生物環境であるので、創傷の感染リスクは高い（Ｂｏｗｌｅｒら、２００１年）。創傷感染は創傷治癒を遅延させ、外傷を増加させ、治療プロセスを複雑でより高価にさせる。
【０００３】
Ｚｏｕｔｍａｎらは、彼らか行った試験で、創傷感染が、患者の入院期間を平均して１０.２日増加させ、これは、患者当たり３，９３７ドル（１９９８）のさらなる費用をもたらすことを示した。
【０００４】
いずれかの微生物による創傷領域の汚染を防止するために、成長因子およびサイトカインによって刺激された免疫系細胞は、創傷領域へ遊走する。創傷が生じた直後に起こる炎症段階において、好中球およびマクロファージは創傷領域に達する。また、これらに加えて、リンパ球および単球は、創傷領域へ行き、マクロファージに変換し、防御系を助ける。創傷領域に達した好中球およびマクロファージは、多量の活性酸素種（ＲＯＳ）の生成により、創傷領域にて微生物を抑制する（ＧｏｒｄｉｌｌｏおよびＳｅｎ、２００３年）。創傷領域に極度の微生物汚染が存在するならば、好中球およびマクロファージの密度は増加し、過剰量のＲＯＳを生成するこれらの細胞は、組織および細胞の破壊を引き起こす。この破壊は創傷治癒を遅延させる。活性酸素種は、ＤＮＡ、タンパク質および脂質と相互作用し、それらの分解を引き起こす。そのＲＯＳ種はＤＮＡに結合し、二本鎖または一本鎖の分解および突然変異を引き起こす（Ｂａｒｔｏｓｚ、２００８年）。それに加えて、ＲＯＳ種は、ＲＯＳ脂質過酸化を引き起こすことにより細胞の溶解を引き起こす（Ｐａｎｃｈａｔｃｈａｒａｍら、２００６年）。ＲＯＳ種の創傷治癒への悪影響のもう１つの例は、過酸化水素のごときＲＯＳ種が角化細胞のごとき多数の細胞の増殖および遊走を低減するという事実である（Ｏ’Ｔｏｏｌｅら、１９９６年）。しかしながら、ある種の適応が皮膚完全性を維持するためにＲＯＳ種に対して明らかになっている。ＲＯＳ解毒は、細胞内の２つの異なる戦略によって提供される。ＲＯＳは、ポリ不飽和脂肪酸、アスコルビン酸塩または糖（ほとんどマンニトール）のごとき抗酸化低分子によって、またはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼおよび種々のペルオキシダーゼ（例えば、グルタチオンペルオキシダーゼ）で除去される（Ｓｔｅｉｌｉｎｇら、１９９９年）。これらの酵素のうち、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、創傷治癒プロセスにおいて大抵形成されるスーパーオキシドラジカルアニオンの過酸化水素への変換を可能にする（Ｕｌｒｉｃｈら、２００６年）。たとえ過酸化水素がラジカルでないとしても、ヒドロキシルラジカルに変換するその能力のために、それは直ちに分解されるであろう。過酸化水素を水に還元する反応は、カタラーゼおよびグルタチオンの酵素の助けで一般的に行われる。創傷治癒の間に、これらの酵素量がＲＯＳ種のものより少ないならば、それらは創傷領域にて、ＤＮＡ損傷、タンパク質および脂質過酸化を引き起こし、かくして、創傷治癒を遅延させる。
【０００５】
細胞間コミュニケーション、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）形成、成長因子およびサイトカインの放出は、創傷治癒の過程で完全な治癒のために完了するであろう。ＥＣＭ形成は、ほとんど全創傷治癒プロセスに含まれ、重要な位置を有する。一般的には、ＥＣＭを形成する成分は細胞表面外部で合成され、組み合わされ、かくして、結合組織および器官に構造的および機能的な完全性を提供する。ＥＣＭの細胞外での合成および貯蔵は、細胞表面受容体によって提供される、シグナル伝達手段、成長因子およびサイトカイン放出によって可能になる（ＳｃｈｕｌｔｚおよびＷｙｓｏｃｋｉ、２００９年）。繊維芽細胞は、組織内で生じた損傷を回復し、かつ完全性を維持するために、創傷形成直後に種々のコラーゲンタイプを合成する（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎおよびＰｉｅｚ、１９８８年）。１型および３型コラーゲンは、皮膚の抗張力を提供し、それにより、皮膚が機械的ストレスに対して強くかつ抵抗性となることを可能にする。
【０００６】
最初は、コラーゲンは皮膚完全性を維持するためだけに必要であると考えられたが、しかしながら、新しい研究は、コラーゲンも細胞形態ならびに分化、遊走および創傷治癒に必要な多数のタンパク質の合成に重要であることを示した（Ｂｒｅｔｔ、２００８年）。角化細胞の有効な遊走を確保するために、創傷領域にて十分な量の１型コラーゲンが存在しなければならない。
【０００７】
もう１つの重要な細胞間マトリックスタンパク質はフィブロネクチンである。創傷領域にて細胞によって合成された接着性糖タンパク質であるフィブロネクチンは、細胞接着、増殖、細胞の遊走および分化に機能する。フィブロネクチンは、その分子構造により生物学的接着剤として作用し、細胞が他の細胞間マトリックスタンパク質と情報交換するための重要な懸け橋として機能する（Ｃｌａｒｋ、１９９０年）。フィブロネクチンおよびフィブリンは創傷領域にて一過性のマトリックスを生成することにより細胞接着および遊走を可能にする。しかしながら、皮膚上皮性の再生が完了する時、フィブロネクチンは、皮膚の表皮の接続領域の基底膜領域でほとんど制限されたままである（ＳｃｈｕｌｔｚおよびＷｙｓｏｃｋｉ、２００９年）。かくして、フィブロネクチンは、ある段階の創傷治癒により変化する効果を有する。
【０００８】
また、ＥＣＭの組織修復および合成の増加は、皮膚に対する老化を遅延させる。老化している皮膚上のＥＣＭ層がより脆弱になるので、しわが生じる。内部または外部因子により老化した皮膚組成は、真皮層におけるＥＣＭの量または変形の低下によって引き起こされ得る（Ｔａｋａｓａｏら、２０１２年）。かくして、真皮層中のＥＣＭ組成の９０％を構成する１型コラーゲンの誘導および弾性繊維合成は、老化をゆっくり進めることにより皮膚をより若く保つことができる（ＦｅｒｎａｎｄｅｓおよびＳｉｇｎｏｒｉｎｉ、２０１２年）。
【０００９】
ＥＣＭ欠乏だけでなくＲＯＳ余剰も老化に大きな役割を果たす。環境条件により生じるＲＯＳは、皮膚上で炎症を増加させることによりＥＣＭ破壊に特に機能するマトリックスメタロプロテイナーゼの増加（上方制御）を引き起こす（Ｐｉｌｌａｉら、２００５年）。炎症を引き起こすことに加えて、ＲＯＳ誘導体の結果、タンパク質カルボニル化および脂質過酸化を引き起こすことにより肌表面上の損傷を生じる（Ｍａｓａｋｉ、２０１０年）。これらの理由のために、ＲＯＳ除去のために機能する酵素（例えば、ＳＯＤ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびカタラーゼ）の活性増加が、皮膚に生じ得る崩壊を低減するので、それは老化をゆっくり進めるであろう。
【００１０】
ホウ素は植物について重要な微量元素であるが、哺乳類系に対するその活性および機構は完全には理解されていない。今日まで行われたいくつかの研究において、ホウ素を含有するいくつかの化合物が、創傷治癒のプロセスに有効であり得ることが主張されている。創傷に対する３％ホウ酸の局所投与が、集中治療室の滞在日数を３分の１に低下させたことが観察された（Ｎｚｉｅｔｃｈｕｅｎｇら、２００２年）。加えて、ホウ酸が細胞間マトリックスタンパク質を増加させることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験にて示されている（Ｂｅｎｄｅｒｄｏｕｒら、１９９８年）。ホウ酸が細胞内の分子（プロテオグリカン、コラーゲンおよびタンパク質）の合成を低下させ、培地へのこれらの分子の放出を増加させることが主張された（Ｂｅｎｄｅｒｄｏｕｒら、１９９７年）。これとは別に、ホウ素誘導体である４つの異なる化合物（ホウ酸トリエタノールアミン；Ｎ−ジエチル−ホスホロアミダート−プロピルボロン酸；２，２ ジメチルヘキシル−ｌ，３−プロパンジオール−アミノプロピルボロナート，および１，２  プロパンジオールアミノプロピル−ボロナート）が、ホウ酸より多くの細胞間マトリックスタンパク質を提供することが判明したが、これらの化合物がホウ酸より有毒であることも言及されている（Ｂｅｎｄｅｒｄｏｕｒら、２０００年）。
【００１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において、もう１つのホウ素化合物であるホウ酸ナトリウム化合物が、ヒト角化細胞に増殖効果を有さず（Ｃｈｅｂａｓｓｉｅｒら、２００４ａ）、また、創傷治癒プロセスにおける重要な段階である皮膚細胞遊走および肉芽組織モデリングに機能するメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）のレベルを増加させる（Ｃｈｅｂａｓｓｉｅｒら、２００４ｂ）ことも示された。
【００１２】
ポロキサマー（poloxamer）は、疎水性ポリプロピレンオキシドおよび親水性ポリエチレンオキシド単位からなるトリブロック構造を有する合成高分子である。ポロキサマーは、治療薬、薬物および遺伝子を運搬するために用いることができる（ＢａｔｒｏｋｏｖａおよびＫａｂａｎｏｖ、２００８年）。それらの両親媒性構造により、それらは界面活性剤として機能し、膜と相互作用できる。溶液において、それらは薬物を吸収でき、臨界ミセル濃度を超える濃度でミセルを形成することによりその運搬に用いることができる（Ｋａｂａｎｏｖ、１９９５年ら）。ポロキサマーは、細胞生存率を増強し、撹拌ストレスを減少させるためにバイオリアクターに用いることができる（ＲａｍｉｒｅｚおよびＭｕｔｈａｒａｓａｎ、１９９０年）。
【００１３】
当該技術分野における公知の出願の１つであるＵＳ２０１０２８６０１０と番号が付与された米国特許文書は、コンタクトレンズを洗浄し消毒するための水溶液を開示する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の目的は、抗微生物性ポリマーベースのヒドロゲルを提供することである。
【００１５】
本発明のもう１つの目的は、抗老化性ポリマーベースのヒドロゲルを提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、創傷治癒性ポリマーベースのヒドロゲルを提供することである。
【００１７】
本発明のもう１つの目的は、損傷領域で速く作用する、ポリマーベースのヒドロゲルをに提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、瘢痕形成を防止し、適用される領域での迅速な創傷閉鎖を可能にする、ポリマーベースのヒドロゲルを提供することである。
【００１９】
本発明のもう１つの目的は、低コストのポリマーベースのヒドロゲルを提供することである。
【００２０】
本発明の目的を満たすために開発した「ポリマーベースのヒドロゲル」は、以下の添付図面に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、Ｌ９２９細胞生存率に対する１５μｇ／ｍｌのＮＡＢおよびポロキサマーの組合せの効果を示す（ＮＡＢ：五ホウ酸ナトリウム五水和物；ＮＡＢ＋ポロキサマー：ゲル）。
【図２】図２は、Ｌ９２９細胞生存率に対する１５μｇ／ｍｌ  ＮＡＢおよびポロキサマーの組合せの時間依存性効果を示す（ＮＡＢ：五ホウ酸ナトリウム五水和物；ＮＡＢ＋ポロキサマー：ゲル）。
【図３】図３は、Ｌ９２９細胞生存率に対するゲル組合せ、および１〜８ｍｇ／ｍｌの範囲内の８つの異なる高濃度での、有効成分として用いられる五ホウ酸ナトリウム五水和物の効果を示す。
【図４】図４は、ヒト線維芽細胞細胞生存率に対する１０〜２００μｇ／ｍｌの範囲内の９つの異なる高濃度での、ゲルの組合せにおいて有効成分として用いられる五ホウ酸ナトリウム五水和物の効果を示す。
【図５】図５は、Ｌ９２９のｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷閉鎖に対する、ゲル組合せおよびその組合せに用いた分子の異なる組合せの効果図である。
【図６】図６は、ヒト線維芽細胞細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷閉鎖図である。
【図７】図７は、（ａ）Ｌ９２９／ＨＵＶＥＣ共培養、（ｂ）角化細胞および（ｃ）ヒト線維芽細胞創傷閉鎖のｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷閉鎖の結果図である。
【図８】図８は、（ａ）Ａｋｔ、（ｂ）Ｂａｘおよび（ｃ）ｐ５３遺伝子レベルの結果の図である。
【図９】図９は、（ａ）グルタチオンペルオキシダーゼ、（ｂ）スーパーオキシドジスムターゼおよび（ｃ）マロンジアルデヒドのレベルの結果図である。
【図１０】図１０はヒト線維芽細胞の核型分析結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の研究において、創傷治癒ゲル製剤は、カルボポール（carbopol）ベースのゲル中のポロキサマーポリマーおよびホウ素成分を組み合わせることにより開発されている。
【００２３】
実験研究
ゲルの調製
担体として活性分子に用いられるゲルは、１％カルボポールを用いることにより調製する。そのゲルの調製において、１％カルボポールを加えた蒸留水は、室温での水和のために残る。水和プロセスにおいて、カルボポールは、完全に水飽和した１リットル溶液に１．６グラムの１８％ＮａＯＨを加えることによりゲル化される。３％ホウ素化合物および４％ポロキサマーをゲル混合物に加え、水和の完了後に混合により均質化した。その混合物を４℃にて１６〜２４時間貯蔵し、使用に備えた。
【００２４】
本発明のヒドロゲルの調製において、五ホウ酸ナトリウム五水和物が、ホウ素化合物として特に好ましい。この化合物とは別に、ホウ酸、アルカリ金属ホウ酸塩およびアルカリ土類金属ホウ酸塩、ならびにこれらのホウ酸塩のすべての水和物形態、アンモニウムホウ酸塩、ホウ酸エステルも用いることができる。
【００２５】
分析研究
ディスク拡散法
開発したヒドロゲル組成物の抗微生物特性は、文献（ＬａｌｉｔｈａおよびＶｅｌｌｏｒｅ、２００５年）に従前に記載されたディスク拡散法によってテストした。１０８ｃｆｕ／ｍｌの細菌、１０６ｃｆｕ／ｍｌの酵母および１０４胞子／ｍｌの真菌を含有する１００μｌ溶液を新しい培養液で調製し、各々、栄養寒天培地（ＮＡ）、サブローデキストロース寒天培地（ＳＤＡ）およびポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）上の拡散方法で接種した。２０μｌのヒドロゲル組合せを空ディスク上に導入し、次いで、接種媒体上に置いた。その有効成分を含有しないヒドロゲルを陰性対照として用いた。陽性対照については、オフロキサシン（１０μｇ／ディスク）およびナイスタチン（３０μｇ／ディスク）を各々、細菌および真菌に用いた。接種後のペトリ皿を３６±１℃にて、細菌について２４時間、酵母について４８時間、および２５±１℃にて真菌について７２時間培養した。ディスク拡散法においてテストした微生物に対する抗微生物活性を阻止帯の測定により評価した。
【００２６】
細胞毒性の決定
調製したゲル組合せの毒作用は、文献（Ｙａｌｖａｃら、２００９年）に与えられたＭＴＳ（３−（４,５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシ−メトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）法を用いることにより決定した。ゲルに用いた分子は、培地中で単独または組合せて調製し、計数することにより、９６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）に蒔いたＬ９２９（マウス繊維芽細胞）、ＨＦ（ヒト線維芽細胞）およびヒト角化細胞の細胞系に適用した。分子の毒性に対する細胞の応答は、３日間細胞生存率を測定することによって決定した。細胞生存率は、細胞のミトコンドリア脱水素酵素活性を測定するＭＴＳと呼ばれる方法を用いて決定した。培地と一緒に細胞に加えたＭＴＳ物質の結果、細胞生存率の指標として有色のホルマザン結晶形成を生じる。得られた色彩変化は、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いることにより、吸収度測定に基づいて評価した（図１、２、３、４、５）。得られた結果を分析した。
【００２７】
創傷治癒スクラッチモデル
創傷治癒に対するゲルの効果、細胞遊走についてのその能力および創傷閉鎖を決定するために、文献（Ｗａｌｔｅｒら、２０１０）に記載されたスクラッチアッセイを用いることにより分析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの創傷治癒モデルにおいて、Ｌ９２９（マウス繊維芽細胞）、ＨＦ（ヒト線維芽細胞）およびヒト角化細胞の細胞系ならびにＬ９２９−ＨＵＶＥＣ共培養物を用いた。細胞は１００，０００細胞／ウェルの濃度にて１２ウェルプレート上に接種し、次いで、付着し、十分な密度に達することができるように、二酸化炭素インキュベーターにそれらを貯蔵した。スクラッチは、アセテートペンにより、ウェルの中心からウェル外側に描いた水平線に垂直になるように、２００μｌピペットチップを用いて形成した。ゲル組合せを細胞に適用し、スクラッチ閉鎖を観察した。スクラッチ閉鎖（図６〜７）は、スクラッチ領域の撮影に際して、ＮＩＨ画像プログラムを用いることにより分析し、スクラッチ領域はアセテートペンにより描かれた線に対応し、０、１２および２４時間での顕微鏡視野内にある。
【００２８】
リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）分析をＳＹＢＲグリーン法を用いることによる文献（Ｙａｌｖａｃ、２０１０年ら）に従い行った。コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、Ａｋｔ、ＢａｘおよびＰ５３遺伝子に属するプライマーは、プライマーＢＬＡＳＴソフトウェア（米国国立バイオテクノロジーセンター＝ＮＣＢＩ）を用いて設計した。合計ＲＮＡは、ゲル組合せが適用され、ｃＤＮＡが合成された細胞から単離した。合成されたｃＤＮＡは、最終体積が２０μｌになるように、ＳＹＢＲグリーンミックス溶液中でプライマーと混合し、遺伝子（図８）の発現レベルをＢＩＯ−ＲＡＤデバイスを用いて分析した。
【００２９】
酸化ストレスパラメーターの調査
抗酸化パラメーターは、グルタチオンペルオキシダーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ酵素活性アッセイ、およびＭＤＡ（マロンジアルデヒド）のレベルの分析によって決定した。６ウェルプレート中でゲル組合せ、活性剤、および対照目的用培地だけに付した細胞を収集し、タンパク質単離をＲＩＰＡ緩衝液を用いることにより細胞ペレットから行った。単離タンパク質の濃度は、吸収度を測定し、ウシアルブミンタンパク質標準（０．１２５、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０ｍｇ／ｍｌ）を用いることにより、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート中のブラッドフォード溶液で５９５ｎｍの波長にて標準曲線を描くことにより決定した。酵素活性アッセイおよびＭＤＡレベルは、市販キットに与えられたプロトコールに従って決定した（図９）。
【００３０】
染色体分析
ゲル組合せが染色体異常を引き起こすかどうかは、文献（Ｙａｌｖａｃら、２０１１年）に従って細胞遺伝学的分析を用いることにより決定した。細胞は、有効成分群および対照群が存在するようなＴ−７５細胞培養プレート中で５０％濃度まで増殖させた。細胞は、最初に２．４５時間染色体溶解溶液中に、次いで、７５分間分裂中期停止溶液中に貯蔵した。細胞をトリプシンで収集した後、それらをカルノワ固定剤で固定し、スライドガラス上に広げ、６５℃にて一晩培養し、ギムザで染色し、その分裂中期の出現を光学顕微鏡によって分析した（図１０）。
【００３１】
実験結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞生存率分析は、五ホウ酸ナトリウム五水和物およびポロキサマーポリマーの組合せからなるゲル混合物中で、単独または組み合わせて、分子の毒作用を決定する目的でＬ９２９細胞（マウス繊維芽細胞）に対して行った。ゲルの調製に用いた１５μｇ／ｍｌの五ホウ酸ナトリウム五水和物およびポロキサマー混合物が、創傷治癒実験におけるモデル細胞として用いたマウス繊維芽細胞に対して毒作用を有しないことを観察した。３日間行ったＭＴＳ分析の後、ゲル組合せおよびその組成物に用いた物質が、毒作用を有しなかったと決定した（図１）。
【００３２】
細胞生存率分析に用いた濃度および組合せを持つゲルにつき、時間依存性効果および適当な代謝期間を見出すために毒性分析を繰り返した。ＭＴＳ実験は、３、６、９および１２時間にてＬ９２９細胞で行い、最適な活性期間を決定した。分析後、９時間の適用が、最大活性が観察される期間であることを決定した（図２）。
【００３３】
ゲル組合せ内の有効成分として用いた五ホウ酸ナトリウム五水和物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件において高濃度にて細胞生存率に対するネガティブな効果を有するかどうかを見出す目的で、１〜８ｍｇ／ｍｌの範囲にある８つの異なる濃度として用いたカルボポールおよび、担体分子内で調製したゲル混合物につき毒性分析を３日間行った。統計的に分析した場合、有意な量の毒作用は、５ｍｇ／ｍｌより高濃度で決定した（図３）。
【００３４】
マウス繊維芽細胞に対して行った毒性分析に続いて、ヒト線維芽細胞系に対する細胞生存率分析を同様に完了した。細胞生存率分析は、１０〜２００μｇ／ｍｌの範囲にある９つの異なる濃度を用いることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件においてヒト線維芽細胞について行った。毒作用は、適用した濃度で観察されなかった（図４）。
【００３５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件において、創傷治癒アッセイは、単一層として増殖する細胞をスクラッチし、ある期間にて創傷領域を撮影することによる治癒を分析することにより行った。創傷閉鎖実験は、創傷治癒上の調製したゲル製剤の活性を決定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件にてＬ９２９細胞で行った。創傷領域は、０、１２および２４時間にて創傷の撮影によるＮＩＨ画像プログラムによって分析した。最初の１２時間の間、ゲル中の有効成分として用いた五ホウ酸ナトリウム五水和物は、ゲル組合せよりも有効であった；２４時間のモニタリングの終わりには、ゲル組合せが、創傷閉鎖を実質的に増加させたと決定した。１２時間の終わりには、約４９％の閉鎖を対照群で観察したが、７１％および６４％の閉鎖を、各々、五ホウ酸ナトリウム五水和物およびゲル組合せを与えた群で観察した。２４時間の終わりには、対照群の創傷閉鎖率が７５％であったが、五ホウ酸ナトリウム五水和物およびゲル組合せを与えた群において、各々、創傷閉鎖率は８４％および９１％と測定した（図５）。
【００３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷治癒実験をヒト線維芽細胞を用いることにより繰り返した。創傷閉鎖は、１２および２４時間での写真撮影することにより分析した。創傷閉鎖率を分析した場合、ゲルに用いた五ホウ酸ナトリウム五水和物が対照群およびゲル組合せよりも創傷治癒に対してより有効であったと決定した。１２時間の期間の終わりには、対照群の創傷閉鎖率が３９％と決定したが、五ホウ酸ナトリウム五水和物およびゲル組合せを与えた群の創傷閉鎖率は、各々、５８％および５４％であった。２４時間の終わりには、対照群の創傷閉鎖率を６７％と測定したが、五ホウ酸ナトリウム五水和物およびゲル組合せを与えた群の創傷閉鎖率は、各々、９１％および８５％と測定した（図６）。
【００３７】
共培養実験を行って、皮膚における創傷治癒を模倣した。創傷治癒は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件にてＬ９２９マウス繊維芽細胞およびＨＵＶＥＣ内皮細胞の培養により分析した。１２時間の終わりには、対照群の創傷閉鎖率は４１％と決定したが、五ホウ酸ナトリウム五水和物およびゲル組合せを与えた群の創傷閉鎖率は、各々、５９％および５４％と決定した。２４時間の終わりには、対照群の創傷閉鎖率は７６％と測定したが、五ホウ酸ナトリウム五水和物およびゲル組合せを与えた群の創傷閉鎖率は、各々、１００％および９７％と測定した。有効成分の五ホウ酸ナトリウム五水和物およびゲル組合せが、対照群に比較して、創傷治癒に対してより有効であると決定した（図７）。
【００３８】
リアルタイムＰＣＲ分析は、遺伝子発現レベルにおいて創傷治癒に対する、調製したゲル組合せの活性を示すために行った。遺伝子発現レベルで行った分析は、細胞遊走に影響する遺伝子およびアポトーシス遺伝子を分析することにより完了した。Ａｋｔ遺伝子レベルの減少は、細胞における創傷閉鎖に影響する因子であり、その遺伝子レベルの減少は、細胞遊走の増加の指標である（Ｊｏｎｅｓら、２０１０年）。Ｂａｘおよびｐ５３の遺伝子は、アポトーシス機序に役割を果たし、それらの発現レベルの減少は細胞増殖の指標と考えられる。行った分析の結果は、ゲル組合せおよびその組合せに用いた活性分子がアポトーシス遺伝子レベルおよびａｋｔ遺伝子レベルを減少させることを示した（図８）。
【００３９】
酸化ストレスは、創傷治癒プロセスおよび皮膚老化に有効な因子である。種々の抗酸化酵素の活性を用いて、体内に生成された活性酸素種およびそれらの悪影響が除去される。抗酸化酵素活性に対する本発明において開発したゲル組合せの効果は、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）のレベルの測定により決定した。グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼおよびマロンジアルデヒドは、酸化ストレスの効果の観察のための指標として創傷治癒研究における文献に用いられている。ＳＯＤは、スーパーオキサイドイオンを過酸化水素に変換し、得られた過酸化水素は、リゾチーム中のグルタチオンペルオキシダーゼで水に変換される。さらに、ＭＤＡは、脂質過酸化の結果としても生成され、ＤＮＡとの相互作用に際して、突然変異を引き起こす。グルタチオンペルオキシダーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ酵素活性における増加およびＭＤＡレベルの減少は、有効な創傷治癒の指標と考えられる（ＢａｙａｔｉおよびＡｂｄｕｌｌａ、２０１２年）。グルタチオンペルオキシダーゼが創傷治癒の炎症段階において保護効果を有するという事実は、行れた研究において証明されている（Ｍｕｎｚら、１９９７年）。グルタチオンペルオキシダーゼ活性は、吸収度に基づいたＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）酸化の分析により間接的に測定される。対照群に比較して、ゲル組合せおよび五ホウ酸ナトリウム五水和物群において相当量の酵素活性を決定した。スーパーオキシドジスムターゼ酵素活性を間接的に決定した。高レベルの酵素活性は、ゲル組合せおよび五ホウ酸ナトリウム五水和物群において観察した。
【００４０】
脂質過酸化の指標であるマロンジアルデヒドのレベルを分析した場合、対照群に比較した低いＭＤＡレベルをゲル組合せおよび五ホウ酸ナトリウム五水和物群において観察した。酸化ストレスパラメーターが調査される場合、五ホウ酸ナトリウム五水和物群だけが、ゲル組合せより有効であると決定した（図９）。
【００４１】
核型分析は、調製したゲル組合せが細胞上の染色体異常を引き起こしたかどうか決定するために行った。その結果は、五ホウ酸ナトリウム五水和物およびゲル組合せが適用された場合に、細胞がそれらの正常核型を維持したことを示した（図１０）。
【００４２】
本発明の「ポリマーベースのヒドロゲル」を用いると、ローション、クリーム、エマルジョン、スプレー、フォーム、ゼラチン、ペースト、パウダーまたはプラスター、スキンプレート（skin plate）および創傷包帯織物品は、抗微生物性（抗菌性、抗カンジダ性、抗真菌性）で速い創傷治癒性であり、かつしわおよび瘢痕の形成を防止する種々の治療用組成物において開発できる。
【００４３】
製剤において生成物と化学的に相互作用しないすべての種類の芳香剤、保湿剤および界面活性剤は、抗微生物性、創傷治癒性および抗老化性の特性を低減しないような適当な濃度にて前記ヒドロゲルに添加できる。
【００４４】
本特許文書に開示されたヒドロゲル製剤は、最適化の際に、すべての医療品、パーソナルケア製品、化粧用適用、薬物製剤および医学適用において用いることができる。
【００４５】
参考文献
Al-Bayaty, Fouad, and Mahmood Ameen Abdulla. "A Comparison of Wound Healing Rate Following Treatment with Aftamed and Chlorine Dioxide Gels in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats." Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2012 (2012). 
auf dem Keller, Ulrichら, "Reactive oxygen species and their detoxification in healing skin wounds." Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. Vol. 11. No. 1. Nature Publishing Group, 2006. 
Bartosz, Grzegorz. "Reactive oxygen species: destroyers or messengers?."Biochemical pharmacology 77.8 (2009): 1303-1315. 
Batrakova, Elena V., and Alexander V. Kabanov. "Pluronic block copolymers: evolution of drug delivery concept from inert nanocarriers to biological response modifiers." Journal of Controlled Release 130.2 (2008): 98-106. 
Baum, Christian L., and Christopher J. Arpey. "Normal cutaneous wound healing: clinical correlation with cellular and molecular events." Dermatologic surgery 31.6 (2006): 674-686. 
【００４６】
Benderdour, M.ら, "Effects of boron derivatives on extracellular matrix formation." Journal of trace elements in medicine and biology 14.3 (2000): 168- 173. 
Benderdour, M.ら, "Boron modulates extracellular matrix and TNFα synthesis in human fibroblasts." Biochemical and biophysical research communications 246.3 (1998): 746-751. 
Benderdour, Mohamedら, "Effect of boric acid solution on cartilage metabolism." Biochemical and biophysical research communications 234.1 (1997): 263-268. 
Bowler, P. G., B. I. Duerden, and D. G. Armstrong. "Wound microbiology and associated approaches to wound management." Clinical microbiology reviews14.2 (2001): 244-269. 
Brett, David. "A review of collagen and collagen-based wound dressings."Wounds 20.12 (2008): 347-353. 
【００４７】
Chebassier, Nathalieら, "In vitro induction of matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 expression in keratinocytes by boron and manganese." Experimental dermatology 13.8 (2004): 484-490. 
Clark, Richard AF. "Fibronectin matrix deposition and fibronectin receptor expression in healing and normal skin." Journal of Investigative Dermatology 94 (1990): 128s-134s. 
Diegelmann, Robert F., and Melissa C. Evans. "Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing." Front Biosci 9.1 (2004): 283-289. 
Ellis, Ian R.ら, "Migration Stimulating Factor (MSF) promotes fibroblast migration by inhibiting AKT." Cellular signalling 22.11 (2010): 1655-1659. 
Fernandes, Desmond, and Massimo Signorini. "Combating photoaging with percutaneous collagen induction." Clinics in dermatology 26.2 (2008): 192-199. 
【００４８】
Gordillo, Gayle M., and Chandan K. Sen. "Revisiting the essential role of oxygen in wound healing." The American journal of surgery 186.3 (2003): 259-263.  
Hotel-Dieu, Place A. Ricordeau, and FR44035 NANTES. "Stimulatory effect of boron and manganese salts on keratinocyte migration." Acta Derm Venereol 84 (2004): 191-194. 
Kabanov, Alexander V.ら, "Micelle formation and solubilization of fluorescent probes in poly (oxyethylene-b-oxypropylene-b-oxyethylene) solutions." Macromolecules 28.7 (1995): 2303-2314. 
Lalitha, M. K. "Manual on antimicrobial susceptibility testing." URL: http://www. ijmm. org/documents/Antimicrobial. doc (2005). 
Masaki, Hitoshi. "Role of antioxidants in the skin: anti-aging effects." Journal of dermatological science 58.2 (2010): 85-90. 
【００４９】
McPherson JM, Piez KA. Collagen in dermal wound repair.In: Clark RAF, Henson PM, editors. The molecular and cellular biology of wound repair. New York: Plenum Press, 1988: 471-91. 
Munz, B.ら, "A novel type of glutathione peroxidase: expression and regulation during wound repair." Biochemical Journal 326.Pt 2 (1997): 579. 
Nzietchueng, Rosine Mayapら, "Mechanisms implicated in the effects of boron on wound healing." Journal of trace elements in medicine and biology16.4 (2002): 239-244. 
O'Toole, Edel A., Mimi Goel, and David T. Woodley. "Hydrogen peroxide inhibits human keratinocyte migration." Dermatologic surgery: official publication for American Society for Dermatologic Surgery [et al.] 22.6 (1996): 525.  
Panchatcharam, Manikandanら, "Curcumin improves wound healing by modulating collagen and decreasing reactive oxygen species." Molecular and cellular biochemistry 290.1 (2006): 87-96. 
【００５０】
Pillai, S., C. Oresajo, and J. Hayward. "Ultraviolet radiation and skin aging: roles of reactive oxygen species, inflammation and protease activation, and strategies for prevention of inflammation‐induced matrix degradation-a review."International journal of cosmetic science 27.1 (2005): 17-34. 
Ramirez, Octavio T., and R. Mutharasan. "The role of the plasma membrane fluidity on the shear sensitivity of hybridomas grown under hydrodynamic stress." Biotechnology and bioengineering 36.9 (2004): 911-920. 
Robson, Martin C. "Wound infection: a failure of wound healing caused by an imbalance of bacteria." Surgical Clinics of North America 77.3 (1997): 637-650. 
Schultz, Gregory S., and Annette Wysocki. "Interactions between extracellular matrix and growth factors in wound healing." Wound Repair and Regeneration17.2 (2009): 153-162. 
【００５１】
Singer, Adam J., and Richard AF Clark. "Cutaneous wound healing." New England journal of medicine 341.10 (1999): 738-746. 
Steiling, Heikeら, "Different types of ROS-scavenging enzymes are expressed during cutaneous wound repair." Experimental cell research 247.2 (1999): 484- 494. 
Takasao, Naokoら, "Cinnamon extract promotes type I collagen biosynthesis via activation of IGF-I signaling in human dermal fibroblasts."Journal of agricultural and food chemistry 60.5 (2012): 1193-1200.  
Walter, M. N. M.ら, "Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays." Experimental cell research 316.7 (2010): 1271-1281. 
Yalvac, Mehmet E.ら, "Comparison and optimisation of transfection of human dental follicle cells, a novel source of stem cells, with different chemical methods and electro-poration." Neurochemical research 34.7 (2009): 1272-1277. 
【００５２】
Yalvac, Mehmet E.ら, "Human tooth germ stem cells preserve neuroprotective effects after long-term cryo-preservation." Curr Neurovasc Res 7 (2010): 49-58. 
Yalvac, Mehmet E.ら, "Differentiation and Neuro-Protective Properties of Immortalized Human Tooth Germ Stem Cells." Neurochemical research 36.12 (2011): 2227-2235. 
Zoutman, Dick, Shirley McDonald, and Dilini Vethanayagan. "Total and attributable costs of surgical-wound infections at a Canadian tertiary-care center." Infection control and hospital epidemiology (1998): 254-259.  
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月1日(2019.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３％ホウ素化合物、４％ポロキサマーおよび１％ゲルを含む抗老化性、抗微生物性かつ創傷治癒性のヒドロゲルであって、
担体として調製したゲルに、ホウ素化合物およびポロキサマーを加え、
ホウ素化合物が、五ホウ酸ナトリウム五水和物、ホウ酸、アルカリ金属ホウ酸塩、アルカリ土類金属ホウ酸塩、およびこれらのホウ酸塩のすべての水和物、ならびにアンモニウムホウ酸塩およびホウ酸エステルよりなる群から選択される該ヒドロゲル。
【請求項２】
ゲルがカルボポールを含む請求項１記載のヒドロゲル。
【請求項３】
ホウ素化合物が五ホウ酸ナトリウム五水和物である請求項１記載のヒドロゲル。
【請求項４】
ゲル、ホウ素化合物およびポロキサマーの混合物が使用前に４℃にて１６〜２４時間貯蔵されてなる請求項１記載のヒドロゲル。
【請求項５】
ホウ素化合物がホウ酸である請求項１記載のヒドロゲル。
【請求項６】
ホウ素化合物がアルカリ金属ホウ酸塩である請求項１記載のヒドロゲル。
【請求項７】
ホウ素化合物がアルカリ土類金属ホウ酸塩である請求項１記載のヒドロゲル。
【請求項８】
ヒドロゲルの形態が、ローション、クリーム、エマルジョン、スプレー、フォーム、ゼラチン、ペースト、パウダー、プラスター、スキンプレートおよび創傷包帯織物品よりなる群から選択される請求項１記載のヒドロゲル。
【外国語明細書】
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