(57)【要約】      （修正有）【課題】線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの予防および／または処置のための少なくとも１つの分子標的の提供。【解決手段】線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの予防および／または処置に使用される−ＨＩＣ１、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、ＩＲＦ７、ＰＯＵ２Ｆ２、ＳＴＡＴ４およびＴＣＦ４、優先的にＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質；および／または−ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２およびＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質を含む治療用化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの予防および／または処置に使用される
−  ＨＩＣ１、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、ＩＲＦ７、ＰＯＵ２Ｆ２、ＳＴＡＴ４およびＴＣＦ４、優先的にＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質；
および／または
−  ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２およびＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
を含む治療用化合物。
【請求項２】
−  Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＧＬＩ１、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４およびＳＯＸ９、ＳＲＦ、優先的にＥＧＲ２、ＳＯＸ９からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
および／または
−  ＥＴＳ１およびＰＰＡＲＧからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
をさらに含む、請求項１に記載の治療用化合物。
【請求項３】
前記作用物質は、裸のまたはプラスミドもしくはウイルスベクター形態のアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＴＡＬＥＮＳまたはリボザイムからなる群から選択される、請求項１または２に記載の治療用化合物。
【請求項４】
前記作用物質はタンパク質機能の阻害剤またはエンハンサーである、請求項１または２に記載の治療用化合物。
【請求項５】
前記作用物質は、可逆的にまたは不可逆的に結合してタンパク質機能を阻害する結合剤、たとえば抗体または合成アンタゴニスト；または前記タンパク質のシグナル伝達機構の上流または下流で作用してタンパク質機能を阻害する作用物質からなる群から選択される、請求項４に記載の治療用化合物。
【請求項６】
前記治療用化合物は哺乳動物の線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するのに使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療用化合物。
【請求項７】
前記治療用化合物はヒトの線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するのに使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療用化合物。
【請求項８】
前記治療用化合物は局所適用用である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の治療用化合物。
【請求項９】
前記治療用化合物は包帯材または包帯材の含浸に利用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の治療用化合物。
【請求項１０】
薬学的に許容されるキャリアと共に請求項１〜９のいずれか一項に記載の治療用化合物を含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記治療用化合物を薬学的もしくは獣医学的に許容されるキャリアまたはビヒクルと併用するまたは会合させるステップを含む、請求項１０に記載の医薬組成物を調製するための方法。
【請求項１２】
哺乳動物の線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するための方法であって、前記線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織に、
−  ＨＩＣ１、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、ＩＲＦ７、ＰＯＵ２Ｆ２、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、優先的にＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
および／または
−  ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
を含む治療用化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項１３】
線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するためのキットであって、
（ａ）請求項ｌ〜９のいずれかに記載の少なくとも１つの治療用化合物または請求項１０に記載の組成物および
（ｂ）前記線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を施すための少なくとも１つの包帯材
を含むキット。
【請求項１４】
（ａ）  −  ＨＩＣ１、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、ＩＲＦ７、ＰＯＵ２Ｆ２、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、優先的にＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
および／または
−  ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
と
ｂ）少なくとも１つのさらなる療法剤
を含む、線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するための併用療法剤。
【請求項１５】
線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するための
−  ＨＩＣ１、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、ＩＲＦ７、ＰＯＵ２Ｆ２、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、優先的にＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
および／または
−  ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
の使用であって、
前記作用物質は線維芽細胞および筋線維芽細胞の分化および／または活性を調節する
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの予防および／または処置のための少なくとも１つの分子標的に関する。さらに、本発明は、線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドを予防または処置するための新規な療法剤、および前記線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドを予防および／または処置するための前記分子標的を含む新規な遺伝子治療アプローチに関する。加えて、本発明は、前記療法剤または前記遺伝子治療を用いた線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドを予防および／または処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、器官または組織における過剰な線維組織または瘢痕組織の形成である。線維症は、慢性傷害または長期炎症に対する組織の一般的な病態生理学的反応である。この線維症の考えられる起源は、多くある。線維症は、疾患（遺伝性または遺伝性でないもの）、処置の副作用（たとえば放射線または化学療法）、毒性環境（たとえば喫煙）または傷害により誘発され得る。線維症では皮膚または肺など様々な器官が侵される。
【０００３】
線維症は、一般に罹患した器官の組織の不全を誘発する（ｉｎｄｕｃｅｄ）。線維性組織は、瘢痕組織のように抗伸張性、厚みがあり硬い。場合によっては、線維性組織は肥厚することもある。たとえば、肺では、線維症により線維化肺の異常な膨張のため、特に運動中に息切れおよび乾いた空咳が生じる。
【０００４】
線維症の一部の例として、肺線維症（肺）、嚢胞性線維症（肺および消化器系）、クローン病（腸）、強皮症／全身性硬化症（肺または皮膚）、関節線維症（膝、肩、他の関節）、肥厚性またはケロイド瘢痕を伴う皮膚線維症が挙げられる。
【０００５】
この現象に関係する組織が皮膚である場合、影響を受けるのは、主に創傷治癒過程である。
【０００６】
自然創傷治癒は、連続的な３つの段階に分けられる。それぞれの段階：炎症期、増殖期およびリモデリング期は、特定の細胞活動を特徴とする。
【０００７】
炎症期と呼ばれる最初の段階は、傷害の直後から始まる。血管破裂が、主にフィブリンおよびフィブロネクチンからなる血栓形成を誘発する。血餅が外傷の一部を塞ぎ、外傷内の炎症細胞の遊走を可能にする。炎症細胞がリクルートされて創傷を清浄化する。血小板は、創傷治癒に関係している細胞（好中球およびマクロファージなどの炎症細胞、線維芽細胞ならびに内皮細胞）のリクルートメントを誘導する増殖因子またはサイトカインなどの因子を分泌する。
【０００８】
第２の段階は増殖期と呼ばれ、肉芽組織の発生に対応する。線維芽細胞は創傷領域に遊走し、増殖して細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）タンパク質を分泌することにより新たに仮の細胞外マトリックスを形成する。次いで内皮細胞が遊走して外傷の血管新生または血管形成を促進する。肉芽組織の内部では、線維芽細胞が活性化して筋線維芽細胞に分化し、そのα平滑筋アクチンの発現の結果、収縮性を示す（平滑筋細胞の平滑筋アクチンと同様）。筋線維芽細胞は、創傷の収縮を行うため創傷治癒において重要な役割を有する。最後に、ケラチノサイトが創縁から遊走し、増殖し、分化して表皮を再構成する。
【０００９】
創傷治癒過程の最終段階は、創傷閉鎖後に現れる。これは、肉芽組織のリモデリングに相当する。肉芽組織が再構築され、正常真皮は主にＩ型コラーゲンからなるため、ＩＩＩ型コラーゲンがＩ型コラーゲンで置き換えられる。この段階において、過剰な筋線維芽細胞はアポトーシスにより除去される。創傷治癒の最終段階は長時間にわたる。傷害から１年後、瘢痕が再構成され、赤みが引き、薄くなる。
【００１０】
しかしながら、この過程は複雑であるばかりでなく不安定であり、妨害または障害を受けて慢性または非治癒創傷の形成または異常瘢痕の形成を来しやすい。これを助長し得る因子には、疾患（糖尿病、静脈または動脈疾患など）、年齢、感染症または組織局在が挙げられる。
【００１１】
創傷治癒における線維芽細胞の役割
線維芽細胞は創傷治癒の過程に関係しており、これには、静止線維芽細胞から動員線維芽細胞に分化し、これが筋線維芽細胞に形質転換して最終的にアポトーシスに移行するといういくつかのステップが含まれる。
【００１２】
正常な創傷治癒では、線維芽細胞は活性化し、次いで筋線維芽細胞に分化し、そのα−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の発現の結果、収縮性を示す。筋線維芽細胞は、細胞外マトリックスの堆積および創縁に接近することによる創傷閉鎖に関わっている。肥厚性瘢痕、ケロイドまたは繊維性創傷の治癒では、筋線維芽細胞の活性が持続し、組織変形を引き起こし、これは、たとえば、熱傷後に発症する肥厚性瘢痕において特に明らかである。本発明の目的は、この過程において活性化または不活性化する様々な遺伝子を全ゲノム規模でマッピングし、そして異常瘢痕または線維症を起こす異常治癒の分子署名を提供することである。
【００１３】
腱、軟骨、骨、真皮、角膜等の結合組織は、多種多様な物理的構造および様々な機能を示す。器官および組織は特有の機能を有する（たとえば、皮膚機能には保護、感覚および温調節がある）ので、これらの組織および器官を構成する結合組織も、特定の細胞型により与えられる正確な機能を有する。たとえば、乳頭または細網真皮には、コラーゲンＩ、ＩＩＩおよびＶ、ＸＩＶ、弾性線維、パールカンまたはＳＰＡＲＣが見られる一方、腱ではＩＩＩ型、ＩＸ型、Ｘコラーゲン型がアグレガン（ａｇｇｒｅｇａｎ）およびデルマタン硫酸と共に見られる。
【００１４】
線維芽細胞は、結合（または間葉）組織の主要な細胞であり、細胞は細胞外マトリックスで囲まれている（細胞が一緒に結合している上皮と対照的）。これらの線維芽細胞は、損傷を受けた（ｄａｍａｇｅｓ）器官の創傷治癒において活性であり、増殖し、筋線維芽細胞に分化し、コラーゲンおよび他の特定のＥＣＭタンパク質、ならびに器官の結合組織を構成する線維を分泌して、組織の治癒および再構築をもたらす。
【００１５】
筋線維芽細胞は、線維症において起こる過剰なＥＣＭタンパク質の堆積の主な原因と定義される。常在性筋線維芽細胞は、皮膚、肺または腎臓などの多くの器官と同様に、傷害に反応して増殖し活性化する組織特異的線維芽細胞の集団から生じる。
【００１６】
線維症、肥厚性瘢痕およびケロイド
線維症は、慢性傷害に対する組織の一般的な病態生理学的反応である。線維症では、皮膚または肺などの様々な器官が侵される。線維症は、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化、および結合組織の過剰な蓄積を特徴とする。線維症は、器官の機能喪失および器官の不全の可能性を誘発する。
【００１７】
肥厚性、ケロイドまたは繊維性瘢痕は、異常創傷治癒に起因する。これらの瘢痕は、ＥＣＭタンパク質、特にコラーゲンの過剰な堆積を特徴とする。これらの異常創傷では、過剰な筋線維芽細胞により肉芽組織が過剰増殖している（非特許文献１）。
【００１８】
正常な創傷治癒では、線維芽細胞は活性化し、次いで筋線維芽細胞に分化し、そのα−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の発現の結果、収縮性を示す。筋線維芽細胞は、細胞外マトリックスの堆積および創縁に接近することによる創傷閉鎖に関わっている。肥厚性瘢痕、ケロイドまたは繊維性創傷の治癒では、筋線維芽細胞の活性が持続し、組織変形を引き起こし、これは、たとえば、熱傷後に発症する肥厚性瘢痕において特に明らかである。
【００１９】
肥厚性およびケロイド瘢痕は、過剰量のコラーゲンが堆積し、瘢痕が隆起することを特徴とする（肥厚性瘢痕よりケロイドでより激しい）。肥厚性およびケロイド瘢痕は、ほとんどの場合、面皰、身体のピアス穴、切り傷および熱傷の部位で形成される。
【００２０】
一部の肥厚性瘢痕は、瘢痕が発症した皮膚の機能が限定されるため非機能的瘢痕である。非機能的瘢痕では、瘢痕領域および隣接する領域の可動性の喪失が起こり、運動（たとえば、肘および腕の可動性）が完全に限定される可能性がある。非機能的瘢痕は、主に特定の解剖学的領域の熱傷の結果である。
【００２１】
よって、創傷の処置は、創傷が異常瘢痕を発症するか、または正しく治癒できないリスクを示す場合、特にその段階で創傷に適合される。したがって創傷治癒に寄与する因子を増強するまたは操作することによりその過程を修正ことで、想定される線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの発生を抑制することが可能になり得る。組織（たとえば器官の）が線維症を発症しやすい場合、早い段階でのこの組織の処置も考慮の対象になる。
【００２２】
本発明は、新たな創傷が線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドに悪化しないことと、既存の創傷が積極的に治癒を促進する方法、および線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの形成を予防する方法で処置され得ることとを確保することにより、患者の生活の質を改善することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】「ＨＴＳの細胞・分子病理学：治療の基礎（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＨＴＳ：ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」アーマー・エー（Ａｒｍｏｕｒ  Ａ）、スコット・ピージー（Ｓｃｏｔｔ  ＰＧ）、トレッドゲット・イーイー（Ｔｒｅｄｇｅｔ  ＥＥ）著、ウーンドリペアアンドリジェネレーション（Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎ．）、２００７年９月−１０月、１５号  補巻１、ｐ．Ｓ６−１７、レビュー（Ｒｅｖｉｅｗ）、正誤表（Ｅｒｒａｔｕｍ）：ウーンドリペアアンドリジェネレーション（Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎ．）、２００８年７月−８月、１６号（４）、ｐ．５８２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
一態様では、本発明は、
線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの予防および／または処置に使用される
−  ＨＩＣ１、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、ＩＲＦ７、ＰＯＵ２Ｆ２、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、優先的にＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
および／または
−  ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
を含む治療用化合物に関する。
【００２５】
本発明はさらに、薬学的に許容されるキャリアと共に上記で定義した治療用化合物を含む医薬組成物に関する。
【００２６】
本発明はさらに、前記治療用化合物を薬学的もしくは獣医学的に許容されるキャリアまたはビヒクルと併用するまたは会合させることを含む、上記のような医薬組成物を調製するための方法に関する。
【００２７】
一態様では、本発明は、哺乳動物の線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドを処置または予防するための方法であって、前記線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織に：
−  ＨＩＣ１、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、ＩＲＦ７、ＰＯＵ２Ｆ２、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、優先的にＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
および／または
−  ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
を含む治療用化合物を投与するステップを含む
方法に関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するためのキットであって、
（ａ）上記で定義した少なくとも１つの治療用化合物または組成物および
（ｂ）前記創傷に施すための少なくとも１つの包帯材
を含むキットに関する。
【００２９】
本発明はさらに、
（ａ）  −  ＨＩＣ１、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、ＩＲＦ７、ＰＯＵ２Ｆ２、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、優先的にＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
および／または
−  ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
と
ｂ）少なくとも１つのさらなる療法剤
を含む、線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するための併用療法剤に関する。
【００３０】
なお別の態様では、本発明は、
線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するための
−  ＨＩＣ１、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、ＰＯＵ２Ｆ２、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、優先的にＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
および／または
−  ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
の使用であって、
前記作用物質は線維芽細胞および筋線維芽細胞の分化および／または活性を調節する
使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ａ）は、線維芽細胞の筋線維芽細胞分化における主要な転写因子に関するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの遺伝子ネットワーク解析の図解である。ｂ）は、線維芽細胞の筋線維芽細胞分化における主要な転写因子に関するバイオインフォマティクスおよびネットワーク解析により同定された様々な転写因子を示す表である。
【図２】ａ）は、ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価したαＳＭＡのｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。ＮＨＤＦを異なるｍＲＮＡ（ＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＲＦ、ＳＯＸ９、ＨＩＣ１、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＭＹＣ、ＪＵＮ、ＩＲＦ７、Ｅ２Ｆ１、ＧＬＩ１、ＣＲＥＢ５、ＳＴＡＴ１）に対するｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡあるいはｓｉＲＮＡで処理し、同時にＴＧＦβ１処理に付すかまたは付さなかった。ＲＴｑＰＣＲはＴＵＢＢで補正し、ｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡ処理（ＴＧＦ−ｂ）状態を１に設定した。ＳＲＦ、ＨＩＣ１またはＳＴＡＴ４に対するｓｉＲＮＡでＮＨＤＦを処理すると大量の細胞死（＊）が起こるので、解析ができなかった。ＳＴＡＴ１およびＵＳＦ２に対するｓｉＲＮＡによるＮＨＤＦの処理は、これらの因子が線維芽細胞の筋線維芽細胞分化にまったく作用しないため、対照実験である。ｂ）は、ａ）に記載されているようなＮＨＤＦの処理後にαＳＭＡ陽性細胞の割合で評価した分化細胞の割合をグラフ表示する。ＳＲＦ、ＨＩＣ１またはＳＴＡＴ４に対するｓｉＲＮＡでＮＨＤＦを処理すると大量の細胞死（＊）が起こるので、解析ができなかった。ＳＴＡＴ１およびＵＳＦ２に対するｓｉＲＮＡによるＮＨＤＦの処理は、これらの因子が線維芽細胞の筋線維芽細胞分化にまったく作用しないため、対照実験である。ｃ）は、ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価したαＳＭＡのｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。初代ヒト皮膚線維芽細胞を、異なるｍＲＮＡ（ＰＰＡＲＧ、ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２、ＳＴＡＴ１またはＵＳＦ２）に対するｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡあるいはｓｉＲＮＡで処理した。ＲＴｑＰＣＲはＴＵＢＢで補正し、ｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡ処理（ＴＧＦ−ｂ）状態を１に設定した。ＳＴＡＴ１およびＵＳＦ２に対するｓｉＲＮＡによるＮＨＤＦの処理は、これらの因子が線維芽細胞の筋線維芽細胞分化にまったく作用しないため、対照実験である。
【図３−１】ＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＲＦ、ＳＯＸ９、ＨＩＣ１、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＭＹＣ、ＪＵＮ、ＩＲＦ７、Ｅ２Ｆ１、ＧＬＩ１、ＣＲＥＢ５をＴＧＦβ１で処理してからの短時間および長時間を示す。ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価した、ＴＧＦβによるＮＨＤＦ処理から経過時間後のｍＲＮＡレベルを因子ごとにグラフ表示する。
【図３−２】ＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＲＦ、ＳＯＸ９、ＨＩＣ１、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＭＹＣ、ＪＵＮ、ＩＲＦ７、Ｅ２Ｆ１、ＧＬＩ１、ＣＲＥＢ５をＴＧＦβ１で処理してからの短時間および長時間を示す。ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価した、ＴＧＦβによるＮＨＤＦ処理から経過時間後のｍＲＮＡレベルを因子ごとにグラフ表示する。
【図３−３】ＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＲＦ、ＳＯＸ９、ＨＩＣ１、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＭＹＣ、ＪＵＮ、ＩＲＦ７、Ｅ２Ｆ１、ＧＬＩ１、ＣＲＥＢ５をＴＧＦβ１で処理してからの短時間および長時間を示す。ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価した、ＴＧＦβによるＮＨＤＦ処理から経過時間後のｍＲＮＡレベルを因子ごとにグラフ表示する。
【図４】ＰＰＡＲＧ、ＳＩＸ２、ＭＥＯＸ２、ＭＡＦをＴＧＦβ１で処理してからの短時間および長時間を示す。ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価した、ＴＧＦβによるＮＨＤＦ処理から経過時間後のｍＲＮＡレベルを因子ごとにグラフ表示する。
【図５−１】異なるＴＦ  ｍＲＮＡ（ＳＯＸ９、ＥＧＲ２、ＴＣＦ４またはＦＯＸＳ１）に対するｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡあるいはｓｉＲＮＡで４８時間（薄い灰色）または７２時間（濃い灰色）ＮＨＤＦ（ドナーＡ）を処理し、同時にＴＧＦ−βで処理した後のＴＣＦ４（Ａ）、ＥＧＲ２（Ｂ）、ＳＯＸ９（ｃ）、ＳＴＡＴ４（ｄ）、ＦＯＸＳ１（ｅ）、ＰＰＡＲＧ（ｆ）、ＭＡＦ（ｇ）、ＭＥＯＸ２（ｈ）およびＳＩＸ２（ｉ）のｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。すべてのグラフにおいて、ＴＧＦ−βで処理したｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡ（Ｔ＋Ｅ）状態を各処理時間（４８時間および７２時間）の１００％に設定した。
【図５−２】表１：線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドを処置および／または予防するため、増加または減少する遺伝子を示す。
【図５−３】表２：標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡの配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
したがって、本発明の一態様では、
線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの予防および／または処置に使用される
（ａ）ＨＩＣ１、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、ＩＲＦ７、ＰＯＵ２Ｆ２、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、優先的にＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＳＴＡＴ４
からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
を含む治療用化合物を提供する。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、前記治療用化合物は、
線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの予防および／または処置に使用される
Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＧＬＩ１、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＯＸ９、ＳＲＦ、優先的にＥＧＲ２、ＳＯＸ９からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
ＥＴＳ１、ＰＰＡＲＧからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
をさらに含む。
【００３４】
実際に、本発明者らは、これらの遺伝子が線維症過程に関与していること、およびそれらのダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションが線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの処置の有用であると考えられることを見出した。
【００３５】
このため、本発明は、新規な遺伝子治療アプローチおよび／または新規なタンパク質治療アプローチに関する。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「遺伝子の活性を阻害する作用物質」または「阻害剤」という表現は、前記遺伝子をダウンレギュレートできる作用物質をいう。この表現は、ある細胞に存在するタンパク質の量を減少させるあるいはタンパク質の活性を阻害することにより、遺伝子発現のレベルで作用する作用物質のほか、タンパク質のレベルで作用する作用物質を包含する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「遺伝子の活性を増強する作用物質」または「エンハンサー」という表現は、前記遺伝子をアップレギュレートできる作用物質をいう。この表現は、ある細胞に存在するタンパク質の量を増加させるあるいはタンパク質の活性を増加させることにより、遺伝子発現のレベルで作用する作用物質のほか、タンパク質のレベルで作用する作用物質を包含する。この表現はさらに、シグナル伝達経路における前記遺伝子またはタンパク質の上流または下流で作用する作用物質を包含する。
【００３８】
一実施形態では、新規な療法剤は遺伝子発現の阻害剤またはエンハンサーを含み、この阻害剤またはエンハンサーは、裸のまたはプラスミドおよびウイルスベクターもしくは薬剤の形態のアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＴＡＬＥＮＳまたはリボザイムであってもよい。
【００３９】
好ましい実施形態では、前記治療用化合物は、配列番号１１から配列番号７４に記載した配列を有するｓｉＲＮＡおよびそれらの混合物からなる群から選択されるｓｉＲＮＡである。
【００４０】
【表１−１】
2019108347.tif 000002
【００４１】
【表１−２】
2019108347.tif 000003
【００４２】
【表１−３】
2019108347.tif 000004
【００４３】
これらのｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害する。
【００４４】
一実施形態では、遺伝子の活性を増強する作用はｃＤＮＡである。
【００４５】
典型的には、ＣＲＥＢ５遺伝子の発現はＣＲＥＢ５  ｃＤＮＡを投与することにより増強することができる。
【００４６】
同じことが、列挙された他のすべての遺伝子にも準用される。
【００４７】
ｃＤＮＡは、当業者に公知の任意の好適な形態で処置対象の線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドに投与または送達することができる。ｃＤＮＡは、裸のＤＮＡとして送達しても、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたは他の任意の好適な手段を用いて送達してもよい。
【００４８】
別の実施形態では、新規な療法剤は、遺伝子機能によりコードされたタンパク質の阻害剤またはエンハンサーを含み、この阻害剤またはエンハンサーは、可逆的あるいは不可逆的に結合してタンパク質機能を阻害または増強する結合剤、たとえば抗体あるいは公知または合成されたタンパク質アゴニストもしくはアンタゴニストであっても；あるいはタンパク質のシグナル伝達機構の上流または下流で作用してタンパク質のシグナル伝達を阻害または増強し、そして創傷組織におけるタンパク質の発現作用を無効にするまたは増強する作用物質であってもよい。
【００４９】
前記作用物質（阻害剤またはエンハンサー）は、ある分子標的に作用する、当該技術分野において公知のどのような作用物質であってもよい。
【００５０】
典型的には、ＰＰＡＲＧのエンハンサーは、チアゾリジンジオン、たとえばロシグリタゾンおよびピオグリタゾンからなる群において選択することができる（カレントドラッグターゲッツ．カージオバスキュラーアンドヘマトロジカルディスオーダー（Ｃｕｒｒ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  ｈａｅｍａｔｏｌ  ｄｉｓｏｒｄ．）、２００５年１０月、５巻（５）、ｐ．３７７〜８６「前糖尿病患者および糖尿病患者の治療におけるＰＰＡＲガンマアゴニストチアゾリジンジオンの役割：心血管の観点から（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ：ａ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）」デュマシア・アール（Ｄｕｍａｓｉａ  Ｒ）、イーグル・ケーエー（Ｅａｇｌｅ  ＫＡ）、クライン−ロジャース・イー（Ｋｌｉｎｅ−Ｒｏｇｅｒｓ  Ｅ）、メイ・エヌ（Ｍａｙ  Ｎ）、チョー・エル（Ｃｈｏ  Ｌ）、ムクハージー・ディー（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  Ｄ）著）。
【００５１】
典型的には、ＰＰＡＲＧの阻害剤は、Ｇ３３３５（ＣＡＳ  ３６０９９−９５−３）（ケムバイオケム（Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ）、２００６年、７巻（１）、ｐ．７４〜８２。「ジペプチドＨ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−ＯＨはＰＰＡＲガンマに対して高アンタゴニスト活性を示す：分子モデリングシミュレーションを用いたバイオアッセイ（Ｔｈｅ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  Ｈ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−ＯＨ  ｓｈｏｗｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ：ｂｉｏａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）」イェー・エフ（Ｙｅ  Ｆ）、ジャン・ジーエス（Ｚｈａｎｇ  ＺＳ）、ルオ・エイチエル（Ｌｕｏ  ＨＢ）、シェン・ジェーエイチ（Ｓｈｅｎ  ＪＨ）、チェン・ケーエックス（Ｃｈｅｎ  ＫＸ）、シェン・エックス（Ｓｈｅｎ  Ｘ）、ジャン・エイチエル（Ｊｉａｎｇ  ＨＬ）著）であってもよい。
【００５２】
本発明の療法剤は、線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの処置または予防に使用される。これらの線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドは、優先的に哺乳動物の線維症、肥厚性瘢痕またはケロイド、より優先的にヒトの線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドである。
【００５３】
本発明に使用される抗体は、最も理想的にはモノクローナル抗体またはヒト化抗体である。
【００５４】
本発明の上記の態様および実施形態では、療法剤は局所適用のために製剤化されるが、さらに経口適用、皮膚適用、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用、静脈内適用または任意の公知の適用のために製剤化されてもよい。
【００５５】
あるいは、上記の本発明の態様では、療法剤は、包帯材への適用または包帯材の含浸のために製剤化される。
【００５６】
本発明の療法剤は、活性薬剤と一緒に投与してもよい。こうした活性薬剤は、抗生物質もしくは抗菌薬、消毒薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、鎮痛薬、抗炎症薬、創傷治癒剤、角質溶解薬、麻酔薬でもよい。こうした活性薬は、当業者によく知られている。
【００５７】
本発明の別の態様では、薬学的に（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）許容されるキャリアと一緒に本発明の療法剤を含む、線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドを処置するのに使用される医薬組成物を提供する。
【００５８】
医薬組成物には、処置対象の線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織に適切または望ましいと考えられ得る他の活性材料がさらに存在してもよい。
【００５９】
キャリア、または２種以上が存在する場合、各キャリアは、製剤の他の成分との適合性という意味で許容可能であり、レシピエントに有害でないものでなければならない。
【００６０】
製剤は、局所投与、経口投与、直腸投与、経鼻投与または公知の任意の投与に好適なものを含み、薬学の技術分野において周知の任意の方法により調製することができる。
【００６１】
組成物は、本発明の療法剤およびキャリアを会合させることにより調製することができる。一般に、製剤は、活性薬剤を液体キャリアと均一かつ均質に会合させる、または活性薬を液体キャリアもしくは微粉化した固体キャリアまたはそれらの両方と充分に会合させて、次いで必要に応じて生成物を成形することにより調製される。本発明は、本発明の療法剤を薬学的に許容されるキャリアまたはビヒクルとコンジュゲートさせるまたは会合させることを含む医薬組成物を調製するための方法まで及ぶ。
【００６２】
皮膚への局所適用の場合、通常使用の化合物は、クリーム、軟膏、ゲル、ゼリー、溶液または懸濁液等にしてもよい。本組成物に使用してもよいクリームまたは軟膏の製剤は、当該技術分野において周知の通常の製剤である。
【００６３】
本発明の経口投与のための製剤は、各々が所定量の活性薬剤を含むカプセル、サッシェもしくは錠剤として；粉末もしくは顆粒として；活性薬剤を水性液体もしくは非水性液体に溶かした溶液もしくは懸濁液として；または水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンとして；または巨丸剤等として提供してもよい。
【００６４】
経口投与のための組成物（たとえば錠剤およびカプセル）の場合、「許容されるキャリア」という用語は、ビヒクル、たとえば一般的な賦形剤、たとえば結合剤、たとえばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよびデンプン；充填剤およびキャリア、たとえばコーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸；ならびに滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウムおよび他のステアリン酸金属塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコーン油、タルク、ワックス、油およびコロイド状シリカを含む。さらに着香料、たとえばペパーミント、ウィンターグリーン油、サクランボ香料および同種のものを使用してもよい。剤形を特定しやすくするように着色料を加えると望ましい場合がある。錠剤はまた、当該技術分野において周知の方法によりコーティングしてもよい。
【００６５】
これに加えて、あるいはこれとは別に、本発明のさらなる態様はさらにまたは代わりに、線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドを予防および／または処置するための新規な方法であって、
前記線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドに：
ＨＩＣ１、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、ＩＲＦ７、ＰＯＵ２Ｆ２、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、優先的にＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＳＴＡＴ４からなる群において選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
および／または
−  ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２およびＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
を投与すること
を含む方法を含む。
【００６６】
本発明は、線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドを予防および／または処置するための新規な方法であって、前記線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドに：
−  Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＧＬＩ１、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＯＸ９およびＳＲＦ、優先的にＥＧＲ２、ＳＯＸ９から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
および／または
−  ＥＴＳ１、ＰＰＡＲＧから選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
を投与することを含む方法をさらに含む。
【００６７】
本発明のなおさらなる態様によれば、線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドを予防および／または処置するためのキットであって、
（ａ）上記のような少なくとも１つの療法剤；および
（ｂ）前記線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織に施すための少なくとも１つの医療装置
を含むキットを提供する。
【００６８】
「医療装置」という用語は、機器、器具、インプラント、インビトロ試薬、または疾患もしくは他の状態を診断、予防または処置するが、体内または体表の化学作用によりその目的を達成しない（そうなると医療装置は薬剤になる）同様もしくは関連する物品を含む。医薬製品（医薬品ともいう）は薬理学的、代謝的または免疫学的手段によりその主作用を達成するのに対し、医療装置は、物理的、機械的または熱的手段のような他の手段により作用する。
【００６９】
本発明のなおさらなる態様によれば、遺伝子発現の阻害剤またはエンハンサーおよびタンパク質活性の阻害剤またはエンハンサーを含む、線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドを予防および／または処置するための併用療法剤を提供する。
【００７０】
本発明のさらなる態様によれば、タンパク質またはそのホモログの阻害剤またはエンハンサーを含む、線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドを予防および／または処置するための療法剤を提供する。
【００７１】
本発明のさらなる態様によれば、線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するための薬物の製造における、タンパク質またはそのホモログの阻害剤またはエンハンサーの使用を提供する。本発明のさらなる態様によれば、線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するための、タンパク質またはそのホモログの阻害剤またはエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅ）の使用を提供する。「ホモログ」という用語は、本明細書で使用する場合、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＥＴＳ１、ＧＬＩ１、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＭＹＣ、ＰＯＵ２Ｆ２、ＰＰＡＲＧ、ＳＩＸ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＯＸ９、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４のアミノ酸配列と少なくとも５０％相同な配列を有し、かつＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＥＴＳ１、ＧＬＩ１、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＭＹＣ、ＰＯＵ２Ｆ２、ＰＰＡＲＧ、ＳＩＸ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＯＸ９、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４の配列の生物活性を保持するアミノ酸配列をいう。ホモログは、ＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＥＴＳ１、ＧＬＩ１、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＭＹＣ、ＰＯＵ２Ｆ２、ＰＰＡＲＧ、ＳＩＸ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＯＸ９、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４のペプチド配列と少なくとも７５％相同であり、優先順位を高くするとＦＯＸＳ１、ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＥＴＳ１、ＧＬＩ１、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＭＹＣ、ＰＯＵ２Ｆ２、ＰＰＡＲＧ、ＳＩＸ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＯＸ９、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４のペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同であることが好ましい。
【００７２】
本明細書に記載の線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの処置は、ヒトまたは獣医学上の使用に関する言及を含む。
【００７３】
後述される特許請求の範囲および本発明の前述の説明では、言語表現または当然の含意により文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という単語または「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、包括的意味で、すなわち本発明の種々の実施形態において記載された特徴の存在を明記するが、別の特徴の存在または付加を否定しないために、使用される。
【００７４】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかと関連して記載した通りであってもよい。
【００７５】
本発明の他の特徴は、以下の例により明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なものまたは任意の新規な組み合わせまで及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または例に関連して記載された特徴、整数、特性、化合物または化学部分は、相容れない場合を除き、本明細書に記載の他の任意の態様、実施形態または例に適用可能であると理解される。
【００７６】
さらに、他に記載がない限り、本明細書に開示された任意の特徴は、同一または類似の目的を果たす代替の特徴で置き換えてもよい。
【００７７】
本発明による遺伝子の完全に同一なものは、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で入手可能であるか、または当業者によく知られている。
【００７８】
次に、特に図および表を参照しながら以下の例によって本発明を説明する。
【実施例】
【００７９】
線維芽細胞は外傷に反応して創傷部に遊走し、そこで収縮性の筋線維芽細胞に分化し、筋線維芽細胞はリモデリング期において最終的にアポトーシスに至る。この分化過程は、環境制御された組織培養条件においてエキソビボで試験することができ、したがって適時に制御された一連の様々な遺伝子発現パターンに対処することができる。
【００８０】
材料および方法
線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドのエキソビボモデルの樹立
筋線維芽細胞は、傷害後の皮膚の生理的再建、および肥厚性瘢痕などの線維症を特徴づける病理学的組織変形の発生の重要な細胞因子である（デムーリエル・エー（Ｄｅｓｍｏｕｌｉｅｒｅ  Ａ）、シャポニエル・シー（Ｃｈａｐｏｎｎｉｅｒ  Ｃ）、ガッビアーニ・ジー（Ｇａｂｂｉａｎｉ  Ｇ）著、２００５年、「組織修復、収縮、および筋線維芽細胞（Ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｐａｉｒ，ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）」、ウーンドリペアアンドリジェネレーション（Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．）、１３巻、ｐ．７〜１２）。
【００８１】
線維症、肥厚性瘢痕またはケロイド瘢痕の形成に関与する筋線維芽細胞を研究するため、１０％ＦＣＳ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、５Ｎｇ／ｍＬのインスリンおよび１ｎｇ／ｍＬのｂ−ＦＧＦ（プロモキネ（ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ））、および線維芽細胞でαＳＭＡの発現を誘発することが知られている１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−０１（Ｏ１）（プロモセル（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ））を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２（インビトロジェン）中のコラーゲンコート培養プレートでＮＨＤＦを培養した（デムーリエル・エー（Ｄｅｓｍｏｕｌｉｅｒｅ  Ａ）、ゲイノズ・エー（Ｇｅｉｎｏｚ  Ａ）、ガッビアーニ・エフ（Ｇａｂｂｉａｎｉ  Ｆ）、ガッビアーニ・ジー（Ｇａｂｂｉａｎｉ  Ｇ）著、１３（１９９３年）「トランスフォーミング増殖因子ベータ１は肉芽組織筋線維芽細胞ならびに静止および増殖培養された線維芽細胞においてアルファ平滑筋アクチンの発現を誘発する（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  １  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｌｐｈａ−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）」ザジャーナルオブセルバイオロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９３年７月、１２２巻（１）、ｐ．１０３〜１１１）。
【００８２】
線維芽細胞分化の効率は、筋線維芽細胞マーカーα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の発現を解析することにより推定した。
【００８３】
このαＳＭＡの発現は、ＲＴ−ｑＰＣＲ（ｍＲＮＡレベル）およびウエスタンブロット（タンパク質）により評価した。
【００８４】
線維芽細胞分化の効率は、筋線維芽細胞マーカーα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の発現を解析することにより推定した。
【００８５】
ウエスタンブロットアッセイ
溶解緩衝液（トリス、ＮａＣｌ、ＮＰ４０、ＥＤＴＡ、ＩＭＤＴＴ）を用いて細胞をスクラッチして総タンパク質を抽出し、氷中で３０分インキュベートした。細胞残屑を除去するため、サンプルを１３，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、使用時まで−２０℃で保存した（ｓｔｏｒｅ）。タンパク質濃度は、ＢＣＡ法（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に従い判定した。等量の総タンパク質（２０μｇ）を１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン）にロードし、１５０Ｖで泳動して分離し、ニトロセルロース膜（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ））に３０Ｖで１時間転写した。その後、膜をαＳＭＡ（アブカム（Ａｂｃａｍ））およびチューブリン（アブカム）に対して染色した。続いてそれぞれ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（プロメガ）とコンジュゲートされた二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびヤギ抗マウスＩｇＧによりインキュベーションを行った。信号は、ＵｐｔｉＬｉｇｈｔ  ＨＳ  ＷＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（アプティマ、インターキム（Ｕｐｔｉｍａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ））を用いてＥＣＬ化学発光により検出した。バンドをスキャナでデジタル化し、同じブロットのすべてのバンド密度間の比をソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ  １．４３ｕ、６４ビット）により計算した。αＳＭＡの相対発現量は、それぞれのチューブリンの値に対して補正した。
【００８６】
全ＲＮＡサンプルの調製
実験の４日後、処理した線維芽細胞をＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）で溶解し、−８０℃で保存した。次いでＲＮＡをクロロホルムを用いて精製し、イソプロパノールにより沈殿させた。全ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ  分光光度計（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で定量した。５００ｎｇの全ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（インビトロジェン）およびＲＮＡｓｅ  ＯＵＴ（インビトロジェン）を用いてオリゴ（ｏｌｉｇｏｔ）ｄＴ（インビトロジェン）により行った。ｃＤＮＡは−２０℃で保存した。
【００８７】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）は、Ｍａｘｉｍａ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（フェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））で５μＬの１：２０希釈ｃＤＮＡにより行った。フォワードおよびリバースプライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓにより設計され（ＭＷＧ、αＳＭＡフォワード：ＣＴＧＴＴＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＴＴＧＴＧ（配列番号９）、αＳＭＡリバース：ＣＣＡＴＧＴＴＣＴＡＴＣＧＧＧＴＡＣＴＴ（配列番号１０））、１００μＭのストックを−２０℃で保存した。ＲＴ−ｑＰＣＲ反応ごとにフォワードおよびリバースプライマーの対を使用した。サイクル条件は以下の通りであった：最初に９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒、５８℃で３０秒、７２℃で２０秒の４５サイクル。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＳＷ  １．５を使用してＴＭ曲線を評価してＣｐを判定し、各増幅反応の相対濃度を概算した。
【００８８】
ｓｉＲＮＡ処理
ＮＨＤＦに特異的な低分子干渉ＲＮＡを一過性にトランスフェクトして、異なるＴＦの発現をノックダウンした。少なくとも２つの異なるｓｉＲＮＡ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））または高度に特異的なＯＮ  ＴＡＲＧＥＴ  ＰＬＵＳ  ｓｍａｒｔｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ（サーモサイエンティフィック）を各標的に使用した。製造者の指示に従い、１０ｎＭのｓｉＲＮＡおよび４μＬのＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ、オジーム（Ｏｚｙｍｅ））でＮＨＤＦを処理し、同時に（ｃｏｎｃｏｍｉｔｔａｎｔｙ）ＴＧＦ−β１および滲出液で６日間処理した。十分なノックダウンを維持するため、第１のトランスフェクションの４８時間後に第２のトランスフェクションを行った。ノックダウンの効率は、第１のトランスフェクションから４８時間後に評価した。
【００８９】
α−平滑筋アクチン免疫蛍光法
コラーゲンコート培養皿で増殖させ、前述のように処理した細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳで１５分間固定し、２．５％トリトンＸ−１００（ユーロメディックス（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）、２０００−Ｂ）を含むＰＢＳで３分間透過処理した。５％ＢＳＡを含むＰＢＳで飽和後、細胞をα−ＳＭＡ（アブカム、ａｂ５６９４）およびＤＮＡ（ＤＡＰＩ）に対して染色した。二次抗体として、ＣｙＴＭ３コンジュゲート抗ウサギ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰＡ４３００４）を使用した。サンプルは、Ｎｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ（株式会社ニコン）を用いて油浸対物レンズ（Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ  ４０×油浸／１．３０、株式会社ニコン）で観察した。デジタル画像は、デジタルカメラ（Ｃｏｏｌ  ＳＮＡＰ  ＨＱ２、フォトメトリクス（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ））およびソフトウェア（ＭｅｔａＭｏｒｆ  ７．５．４．０）で撮影した。様々な処理による線維芽細胞分化の割合を推定するため、１視野当たりの細胞総数をＤＡＰＩにより判定し、筋線維芽細胞、分化した線維芽細胞をα−ＳＭＡ染色によりカウントした。次いで、スチューデント検定（ｔ検定）およびχ２検定を実施して、未処理線維芽細胞（ＴＧＦβを使用せず）と処理した線維芽細胞との間のαＳＭＡの発現の差を評価した。
【００９０】
ネットワーク解析
それぞれ異なる処理後の線維芽細胞の運命のマスターレギュレーターを明らかにするため、我々は遺伝子ネットワーク解析を行い、ＴＧＦβを使用せずに処理した線維芽細胞の遺伝子プロファイルとＴＧＦβで処理した線維芽細胞の遺伝子プロファイルに関するｍＲＮＡ配列のディープシーケンシング解析後に判定した遺伝子発現リスト（ｌｉｓｔｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）を処理した。これらの解析では、相互に連結した遺伝子の減少または増加がＬｏｇ  ＦＣの有意性より有意性が強いという仮定に基づき、我々は、それらのＰ値のみに基づき、それらのＬｏｇ  ＦＣの値に基づかずに選択した遺伝子のリストを使用した。我々は、２つのタイプの解析、すなわちｉｎｇｅｎｕｉｔｙ「ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ解析」およびＤＩＲＥ（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｒｅ．ｄｃｏｄｅ．ｏｒｇ／）解析を行った。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ「ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ解析」は、２つの条件間の遺伝子発現の特定のプロファイルを踏まえて、上流レギュレーター候補を選択するものである。ＤＩＲＥ解析は、進化における遺伝子間に共通の調節エレメントの保存を基にした、これらのエレメント候補の選択によるものである。これらの同定されたエレメントから、ＤＩＲＥは、同時調節される遺伝子リストのマスターレギュレーターリストを与えることができる。これら２つの解析から、解析されたリストごとに、我々は、対象となるリストにおいて考慮された２つの条件の少なくとも１つで発現した転写因子（ＴＦ）を選択した（すなわち２つの条件の少なくとも１つのシーケンシングの数は２０を上回る（ｈｉｓ））。次いで、我々は、この２組みの解析を徹底的に比較し、両方の解析に属する転写因子を「重要レギュレーターリスト」に保存することとした。これらの２つの解析に偏りの可能性があるため、我々はさらに、一方の解析にのみ属し、他方に属さないが、一方のリストまたは他方で非常に興味深い標的遺伝子パターンを示す転写因子を救出することとした。全体として、これらの遺伝子ネットワーク解析により、一方または他方の線維芽細胞の運命の重要なレギュレーターであるＴＦのリストを提案することができた（図１）。
【００９１】
線維芽細胞の筋線維芽細胞分化時の遺伝子発現経路
正常および病的条件下のヒト初代線維芽細胞の線維芽細胞分化に関係する主要な分子標的の同定
【００９２】
我々は、前に定義された異なる遺伝子発現経路の推定上流レギュレーターを明らかにするためｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの遺伝子ネットワーク解析を行った。我々は、包括的な遺伝子ネットワーク解析を使用して重要なレギュレーター候補を同定し、これらの因子を選択するためにそれらの発現の変化を考慮に入れなかったという意味で、このアプローチは独自のものであった。たとえば、我々は、ＤＩＲＥプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｒｅ．ｄｃｏｄｅ．ｏｒｇ／）を使用して、異なる遺伝子リストにおいて進化的に保存された候補調節エレメントを同定したことで、これらのエレメントに結合する可能性があり、したがってこれらの遺伝子のセットを調節し得る転写因子を明らかにすることができた。この解析から２３の転写因子を選び出した。
【００９３】
様々な転写因子（ＴＦ）に関する広範囲に及ぶ研究に優先順位をつけるため、我々は、様々な線維芽細胞の処理後にＴＦの時間反応研究を行った。我々は、様々な処理後のそれらの発現の変化について短時間（３０分〜８時間）解析および長時間（８時間〜９６時間）解析を行った（図３および４）。
【００９４】
我々は一方で、正常線維芽細胞の筋線維芽細胞分化経路におけるこれらの様々な因子の役割を研究するため網羅的なｓｉＲＮＡを用いたアプローチを行った（図２）。
【００９５】
その中で同定された１４の重要転写因子候補のｓｉＲＮＡノックダウンは、ＴＧＦβおよびｓｉＲＮＡ処理ＮＨＤＦからのαＳＭＡの発現解析により評価したところ、線維芽細胞の筋線維芽細胞分化経路を阻害した。すなわちＧＬＩ１、ＨＩＣ１、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９、ＳＴＡＴ４、ＭＹＣ、ＣＲＥＢ５、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＳＲＦ、ＦＯＸＳ１は、それらのノックダウンが減少させたので、程度の差はあるが、筋線維芽細胞の分化を効率的に阻害する（図２ａ−ｂ−ｃ）。非常に興味深いことに、ＴＧＦβ処理時に発現が強力かつ急速にアップレギュレートされるＳＯＸ９、ＦＯＸＳ１およびＥＧＲ２を除くと、残りの因子のｍＲＮＡレベルは、ＴＧＦβ処理から１日ほどの間一定であり、全体として分化の４日間において変化がなかった。このことから、線維芽細胞の筋線維芽細胞分化に必要なのは、それらの発現の維持であり、それらの過剰発現でないことが示される。
【００９６】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析により同定された他の４つの重要転写因子候補（ＭＡＦ、ＳＩＸ２、ＭＥＯＸ２およびＰＰＡＲＧ）のｓｉＲＮＡノックダウンは、ＴＧＦβで処理したｍｏｃｋトランスフェクト細胞で得られたのと同程度に、ＴＧＦβの非存在下で線維芽細胞の筋線維芽細胞分化を誘発するようであった。全体としてこれらの結果から、我々がノックダウンアプローチを用いて線維芽細胞の筋線維芽細胞分化を抑制または誘発できることが示された（表１）。
【００９７】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子ネットワーク解析により、我々は、分化における線維芽細胞の運命の重要レギュレーター候補を同定することができた。我々は、ノックダウンアプローチによりこれら１９の因子の分化に対する強い作用を見出した。
【００９８】
我々はさらに、ノックダウンするとαＳＭＡ発現が一貫して見られるが、穏やかに減少するので、一定の役割を果たすが、前の段落に記載したものほど強力でないと思われる因子を同定した。これらの因子は、ＭＹＣ、ＪＵＮ、Ｅ２Ｆ１、ＩＲＦ７およびＣＲＥＢ５である。
【００９９】
非常に興味深いことに、我々は、一部の転写因子を不活性化すると、線維芽細胞分化それ自体が増加することを示した。ＰＰＡＲＧ  ｍＲＮＡをノックダウンすると線維芽細胞の筋線維芽細胞分化が増加する。
【０１００】
ＦＯＸＳ１は、形態形成および分化などの発生過程に関与することが多い転写因子のフォークヘッドファミリーに属する。ＦＯＸＳ１は精巣の血管系の発生に最も重要であることが示されている。さらに、ＦＯＸＳ１は、初期感覚神経細胞マーカーとされた。本明細書で我々は、ＦＯＸＳ１を不活性化すると、ＴＧＦβの非存在下で筋線維芽細胞の分化が増加することを示す。
【０１０１】
ＭＥＯＸ２は既に、ＴＧＦβ３ノックアウトマウスの口蓋裂発症の重要な因子として同定されたため、ＴＧＦβ経路に関係するといわれてきた。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の実験から、ＭＥＯＸ２は骨格筋の発生および分化にも重要であることが示された。本明細書で我々は、ＭＥＯＸ２に対するｓｉＲＮＡにより、筋線維芽細胞に分化できる線維芽細胞が滲出液の影響をバイパスすることを示した。
【０１０２】
Ｔ細胞では、ＭＡＦがＴＧＦβの中和によるＩＬ２２発現の阻害に関わっていることが示されている。ＴＧＦβおよびＭＡＦは、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞においてＩＬ２１発現に対してアンタゴニスト／逆作用を有する。同じ関係で本研究において我々は、ｓｉＲＮＡによるＭＡＦの不活性化により筋線維芽細胞の分化が増加するため、ＭＡＦが滲出液の非存在または存在下で線維芽細胞の筋線維芽細胞分化の阻害剤として関係しているとした。一方、軟骨細胞分化において、長い形態のＭＡＦはＳＯＸ９と相互作用および協同して下流標的を活性化する。これは、筋線維芽細胞分化と軟骨細胞分化との間の相違の別の例である。
【０１０３】
ＳＩＸ２は、腎臓の多能性の維持に関与している。腎胚間充織細胞でＳＩＸ２は分化を抑制することができ、腎臓発生においては前駆細胞プールを維持する。本明細書では、皮膚線維芽細胞のＳＩＸ２を無効にすると、ＴＧＦβシグナル伝達に対する支配的な滲出液の影響がバイパスされる。
【０１０４】
線維芽細胞の筋線維芽細胞分化における重要転写因子間の調節相互作用
ＳＯＸ９、ＥＧＲ２またはＦＯＸＳ１のノックダウン後にＴＣＦ４  ｍＲＮＡの発現は改変されなかった（図５）ことから、ＴＣＦ４をこれらの因子間の調節相互作用ネットワークの最上流に置いた。一方、ＥＧＲ２の発現はＴＣＦ４およびＳＯＸ９に対するｓｉＲＮＡ処理時に大きく阻害されたが、ＦＯＸＳ１に対する処理時に変化がなかった（図５）ことから、ＥＧＲ２をネットワークにおいてＴＣＦ４およびＳＯＸ９の後だが、ＦＯＸＳ１の前に置いた。ＳＯＸ９  ｍＲＮＡは、ＴＣＦ４およびＦＯＸＳ１のノックダウン時に大きく変化しなかった。我々は、ＦＯＸＳ１をＳＯＸ９の下流標的とした。一方、ＳＯＸ９は、ＥＧＲ２ノックダウン時にアップレギュレートされる（図５）。ＳＴＡＴ４  ｍＲＮＡは、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９およびＥＧＲ２のノックダウンによりダウンレギュレートされる（図５）ことから、ＳＴＡＴ４（ｉｓ）をこれらのＴＦの下流標的とする一方、ＦＯＸＳ１のｓｉＲＮＡ処理時に変化がなかったことから、ＳＴＡＴ４を前に置いた。ＦＯＸＳ１  ｍＲＮＡは常にＴＣＦ４、ＳＯＸ９およびＥＧＲ２のｓｉＲＮＡ処理時にダウンレギュレートされる（図５）ことから、ＦＯＸＳ１をこのカスケードの最下流に置いた。全体的に、ＰＰＡＲＧ、ＭＡＦおよびＭＥＯＸ２のｍＲＮＡは、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９、ＥＧＲ２およびＦＯＸＳ１に対するｓｉＲＮＡ処理時にアップレギュレートされており（図５）、線維芽細胞分化におけるアンタゴニストとしてのそれらの役割と整合的であった。ＳＩＸ２  ｍＲＮＡレベルは、ＥＧＲ２およびＦＯＸＳ１のノックダウン時に変化がなかったが（図５）、ＴＣＦ４およびＳＯＸ９により同じようにアップレギュレートされ、これらの２つのＴＦ間の密接な相互連結と整合的であり、分化アゴニストＳＯＸ９およびＴＣＦ４とアンタゴニストＳＩＸ２との間にシグナルのバランスが存在することが示唆された。
【０１０５】
分化をバイパスできる転写因子の同定は、線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドにおいて非常に重要である。本研究では、我々は線維芽細胞に焦点を当てることで、皮膚治癒過程における好中球およびマクロファージのような他の細胞の重要性を決して隠そうとしたのではなく（ｍｅａｎ）、我々はあえて、状況をより明確に描写するため生物学的文脈を単純化した。
【０１０６】
癌との関連
筋線維芽細胞は線維症において重要な細胞であるだけでなく、その重要性は癌においても以前から証明されており、間質における「癌関連線維芽細胞」としての筋線維芽細胞の存在は腫瘍発生を促進し、多くの場合、炎症、細胞浸潤、高悪性度腫瘍および予後不良と関連している。筋線維芽細胞は、良性前立腺肥大と比較して前立腺癌由来の間質に豊富に見られ、癌腫の先端にある。筋線維芽細胞は、ＭＭＰ、サイトカイン（ＩＬ８、ＶＥＧＦ）およびケモカイン（ＣＸＣＬ１２）を産生して癌の増殖、腫瘍の浸潤および血管新生を促進する。代替の治療トラックとして、遊走、浸潤および増殖する能力を弱めるため癌の間質細胞（とりわけ筋線維芽細胞）を標的とすることが最重要と思われる。しかしながら癌の場合はそれほど些細なことではない。そこで、炎症は、多くの場合、癌に関連しているため、炎症をバイパスまたは阻害する新しい方法を見出すことも、癌との闘いの一助になり得る。ＴＧＦβ依存性の線維芽細胞の筋線維芽細胞分化に関するこの広範囲に及ぶ研究は、治療標的発見のための多くの新しい道を与える。とはいえ、ＴＧＦβの線維症促進と抗炎症の二重活性のため、ＴＧＦβ作用の阻害または強化（ｒｅ−ｅｎｆｏｒｃｅｍｅｎｔ）により働く療法剤は、ＴＧＦβ経路の阻害による線維症の阻害により癌感受性が高まることもあり得るので、バランスを取るべきである。
【０１０７】
正常線維芽細胞の筋線維芽細胞分化の理解を深めることは、他の重要な病状に使用できる新規な療法のマーカーまたは標的に新たな道を開くので、この分野において最重要である。
【０１０８】
組織線維症（たとえば肺線維症、肝線維症、間質性腎線維症、心血管線維症、肥厚性またはケロイド瘢痕など）は主に、ＴＧＦβ１によるＥＣＭ産生筋線維芽細胞の過剰な活性化に起因する。線維芽細胞から筋線維芽細胞への遺伝子発現経路の理解を深めることは、線維症の理解および治療に非常に重要である。我々は、慢性創傷の滲出液が筋線維芽細胞の分化を防止および逆行できることを示し、肝臓、腎臓またはＨｅｐａｔｏ  Ｓｔｅｌｌａｒ  Ｃｅｌｌ（ＨＳＣ）由来の筋線維芽細胞で既に示されたような分化の可逆性の新たな徴候を与えた。我々はさらに、不活性化するとＴＧＦβ依存性の筋線維芽細胞の分化を阻害する転写因子を同定している。筋線維芽細胞は線維症において重要な細胞であるだけでなく、その重要性は癌においても以前から証明されており、間質における「癌関連線維芽細胞」としての筋線維芽細胞の存在は腫瘍発生を促進し、多くの場合、炎症、細胞浸潤、高悪性度腫瘍および予後不良と関連している。筋線維芽細胞は、良性前立腺肥大と比較して前立腺癌由来の間質に豊富に見られ、癌腫の先端にある。筋線維芽細胞は、ＭＭＰ、サイトカイン（ＩＬ８、ＶＥＧＦ）およびケモカイン（ＣＸＣＬ１２）を産生して癌の増殖、腫瘍の浸潤および血管新生を促進する。代替の治療トラックとして、遊走、浸潤および増殖する能力を弱めるため癌の間質細胞（とりわけ筋線維芽細胞）を標的とすることが最重要と思われる。しかしながら癌の場合はそれほど些細なことではない。そこで、炎症は、多くの場合、癌に関連しているため、炎症をバイパスまたは阻害する新しい方法を見出すことも、癌との闘いの一助になり得る。ＴＧＦβ依存性の線維芽細胞の筋線維芽細胞分化に関する本研究は、治療標的発見のための多くの新しい道を示す。とはいえ、ＴＧＦβの線維症促進と抗炎症の二重活性のため、ＴＧＦβ作用の阻害または強化（ｒｅ−ｅｎｆｏｒｃｅｍｅｎｔ）により働く療法剤は、ＴＧＦβ経路の阻害による線維症の阻害により癌感受性が高まることもあり得るので、バランスを取るべきである。
【図１】
2019108347.tif 000005
【図２】
2019108347.tif 000006
【図３−１】
2019108347.tif 000007
【図３−２】
2019108347.tif 000008
【図３−３】
2019108347.tif 000009
【図４】
2019108347.tif 000010
【図５−１】
2019108347.tif 000011
【図５−２】
2019108347.tif 000012
【図５−３】
2019108347.tif 000013
【配列表】
2019108347000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月25日(2019.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維症、肥厚性瘢痕またはケロイドの予防および／または処置に使用される
ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２およびＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
を含む治療用化合物。
【請求項２】
−  Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＧＬＩ１、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４およびＳＯＸ９、ＳＲＦ、優先的にＥＧＲ２、ＳＯＸ９からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質
および／または
−  ＥＴＳ１およびＰＰＡＲＧからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
をさらに含む、請求項１に記載の治療用化合物。
【請求項３】
前記作用物質は、裸のまたはプラスミドもしくはウイルスベクター形態のアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＴＡＬＥＮＳまたはリボザイムからなる群から選択される、請求項１または２に記載の治療用化合物。
【請求項４】
前記作用物質はタンパク質機能の阻害剤またはエンハンサーである、請求項１または２に記載の治療用化合物。
【請求項５】
前記作用物質は、可逆的にまたは不可逆的に結合してタンパク質機能を阻害する結合剤、たとえば抗体または合成アンタゴニスト；または前記タンパク質のシグナル伝達機構の上流または下流で作用してタンパク質機能を阻害する作用物質からなる群から選択される、請求項４に記載の治療用化合物。
【請求項６】
前記治療用化合物は哺乳動物の線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するのに使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療用化合物。
【請求項７】
前記治療用化合物はヒトの線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するのに使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療用化合物。
【請求項８】
前記治療用化合物は局所適用用である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の治療用化合物。
【請求項９】
前記治療用化合物は包帯材または包帯材の含浸に利用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の治療用化合物。
【請求項１０】
薬学的に許容されるキャリアと共に請求項１〜９のいずれか一項に記載の治療用化合物を含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記治療用化合物を薬学的もしくは獣医学的に許容されるキャリアまたはビヒクルと併用するまたは会合させるステップを含む、請求項１０に記載の医薬組成物を調製するための方法。
【請求項１２】
線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するためのキットであって、
（ａ）請求項ｌ〜９のいずれかに記載の少なくとも１つの治療用化合物または請求項１０に記載の組成物および
（ｂ）前記線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を施すための少なくとも１つの包帯材
を含むキット。
【請求項１３】
ａ）ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質、及び
ｂ）少なくとも１つのさらなる療法剤
を含む、線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するための併用療法剤。
【請求項１４】
線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドまたは線維症、肥厚性瘢痕もしくはケロイドを発症しやすい組織を処置するための
ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する作用物質
の使用であって、前記作用物質は線維芽細胞および筋線維芽細胞の分化および／または活性を調節する使用。
【外国語明細書】
2019108347000001.pdf