(57)【要約】【課題】細胞免疫療法のための方法および組成物の提供。【解決手段】本発明は、腫瘍特異的サブセット特異的遺伝子改変型ＣＤ４＋  Ｔ細胞の存在下で遺伝子改変型腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を養子移入することによるなどの細胞免疫療法によって媒介される免疫応答を与え、および／または強化するための方法および組成物であって、前記ＣＤ４＋  Ｔ細胞が、目的の腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の抗腫瘍反応性を維持し、かつ腫瘍特異的増殖を増加させ、および／もしくは最大にするＣＤ８＋  Ｔ細胞能力を与え、ならびに／または強化する、方法および組成物を提供する。この方法によって製造される薬学的製剤、およびそれを用いる方法もまた記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国を除く全ての国について出願人として米国内企業であるフレッド  ハッチンソン  キャンサー  リサーチ  センターを指定し、国籍カナダ国のスタンリー  アール．  リデルと国籍ドイツ国のミヒャエル  フデツェクを米国のみ出願人として指定した名義で、ＰＣＴ国際特許出願として２０１２年３月２３日に出願され、２０１１年３月２３日に出願された米国特許出願第６１／４６６，５５２号に対する優先権を主張する。米国特許出願第６１／４６６，５５２号の開示は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、生物医学の分野、具体的には、がん治療に有用な方法に関する。特に、本発明の実施形態は、細胞免疫療法を行うための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
連邦政府支援の研究に関する言明
本発明は、米国保健福祉省国立衛生研究所からの助成金Ｒ０１ＣＡ１８０２９の形をとる政府支援、および白血病リンパ腫協会（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）ＳＣＯＲＥ助成金でなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００４】
発明の背景
齧歯類における研究は、抗原特異的Ｔ細胞での養子免疫療法が、がんおよび感染症に有効であることを実証しており、この様式がヒトにおいて治療活性を有するという証拠がある１−８。臨床適用について、所望の抗原特異性のＴ細胞を単離し、または感染細胞もしくは形質転換細胞を標的とする受容体を発現するようにＴ細胞を操作し、その後、これらの細胞を培養で増殖することが必要である９−１４。Ｔ細胞クローンの移入は、それが特異性および機能の制御を可能にし、かつインビボの持続、毒性、および効力の評価を容易にするため、魅力的である。加えて、同種幹細胞移植の場合において、病原体または悪性細胞を標的とするドナー由来のＴ細胞クローンのレシピエントへの投与により、非選択性ドナーＴ細胞の注入で生じる移植片対宿主疾患を回避することができる３、４、１５。しかしながら、培養Ｔ細胞、特にクローン化ＣＤ８＋  Ｔ細胞の効力は、養子移入後に持続できないことにより制限される場合が多いことが、臨床研究から明らかである１６、１７。
【０００５】
養子免疫療法のためのＴ細胞を引き出すことができるリンパ球のプールは、ナイーブＴ細胞、および長命の、抗原を経験したメモリーＴ細胞（ＴＭ）を含有する。ＴＭは、表現型、ホーミング性質、および機能の点で異なる、セントラルメモリー細胞（ＴＣＭ）およびエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）のサブセットへさらに分類することができる１８。ＣＤ８＋  ＴＣＭは、細胞表面にＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７を発現し、それらは、リンパ節への遊走を促進し、抗原に再曝露された場合には、急速に増殖する。ＣＤ８＋  ＴＥＭは、細胞表面ＣＤ６２Ｌを欠き、末梢組織へ優先的に遊走し、即時エフェクター機能を示す１９。抗原刺激に応答して、ＣＤ８＋  ＴＣＭおよびＴＥＭのどちらも、高レベルのグランザイムおよびパーフォリンを発現するが、短命である細胞溶解性エフェクターＴ細胞（ＴＥ）へ分化する２０。したがって、臨床免疫療法治験におけるＴ細胞の低い生存率は、単に、インビトロ培養中の、死ぬように運命づけられているＴＥへのそれらの分化に起因するにすぎない可能性がある１７、２１、２２。インビボでの養子移入されたＴ細胞の生存の増強をもたらす細胞集団および方法を同定する必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
一態様において、本発明は、腫瘍特異的、サブセット特異的な、遺伝子改変されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を養子移入することによるなどの細胞免疫療法により媒介される免疫応答を与え、および／または強化する方法および組成物であって、前記ＣＤ４＋  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の抗腫瘍反応性を維持し、かつ腫瘍特異的増殖を増加させ、および／もしくは最大にする能力を与え、ならびに／または強化する、方法および組成物に関する。
【０００７】
一実施形態において、本発明は、疾患または障害を有する被験体において、細胞免疫応答をもたらす遺伝子改変された細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物、ならびに優勢Ｔｈ１表現型を示し、加えて、他のサイトカインを産生し、直接的腫瘍認識を誘発し、および遺伝子改変された細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物の細胞免疫応答を媒介する能力を強化する遺伝子改変されたヘルパーＴリンパ球細胞調製物を被験体に投与することにより、細胞免疫療法を実施する方法であって、前記細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、および共刺激ドメインなどのＴ細胞受容体または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞を含み、前記ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む、方法を提供する。上記方法の様々な改変が可能である。例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を改変するキメラ抗原受容体は、同じ、または異なり得る。代替の実施形態において、Ｔ細胞は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）で改変することができる。ＴＣＲは、任意の抗原、病原体、または腫瘍に特異的であり得る。メラノーマ（例えば、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００）、白血病（例えば、ＷＴ１、マイナー組織適合抗原）、乳がん（例えば、ｈｅｒ２、ＮＹ−ＢＲ１）における多くの腫瘍抗原についてのＴＣＲがある。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、細胞免疫応答を誘発する遺伝子改変されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物、ならびに優勢Ｔｈ１表現型を示し、加えて、他のサイトカインを産生し、直接的腫瘍認識を誘発し、および遺伝子改変された細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物の細胞免疫応答を媒介する能力を強化する遺伝子改変されたヘルパーＴリンパ球細胞調製物を有する養子細胞免疫療法組成物であって、前記細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外可変ドメイン抗体、および共刺激ドメインなどのＴ細胞受容体または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞を含み、前記ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を有する、養子細胞免疫療法組成物を提供する。
【０００９】
さらに別の実施形態において、本発明は、細胞免疫応答を誘発するキメラ抗原受容体改変型腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物、およびＣＤ４５ＲＯ陰性、ＣＤ６２Ｌ陽性、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に由来する抗原反応性キメラ抗原受容体改変型ナイーブＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞、および薬学的に許容され得る担体を有する養子細胞免疫療法組成物であって、前記細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外単鎖抗体およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む、養子細胞免疫療法組成物を提供する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、患者由来のＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む、細胞免疫応答を誘発する抗原特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物を、Ｔｈ１サイトカイン応答を誘発し、病原体に対するＣＤ８＋免疫応答を強化する抗原反応性キメラ抗原受容体改変型ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞と共に有する養子細胞免疫療法組成物であって、前記ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を有する、養子細胞免疫療法組成物を提供する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、直接的腫瘍認識を誘発し、かつ病原体に対するＣＤ８＋免疫応答を強化する抗原反応性キメラ抗原受容体改変型ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞を含む養子細胞免疫療法組成物であって、前記ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む、養子細胞免疫療法組成物を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、細胞免疫応答を誘発するキメラ抗原受容体改変型腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物、および抗原反応性キメラ抗原受容体を得るステップであって、前記改変型細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達モジュールを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む、ステップ、ならびにＴｈ１サイトカイン応答を誘発する改変型ナイーブＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞を得るステップであって、前記改変型ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋細胞を含む、ステップにより、養子免疫療法組成物を製造する方法を提供する。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、Ｔｈ１サイトカイン応答を誘発する改変型ナイーブＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞を得るステップであって、前記改変型ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む、ステップ、ならびに前記改変型ナイーブＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞を、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有する抗原特異的セントラルメモリーＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物と組み合わせるステップにより、養子免疫療法組成物を製造する方法を提供する。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、疾患または障害を有する被験体において、遺伝子改変されたヘルパーＴリンパ球細胞調製物を被験体に投与することにより、細胞免疫療法を実施する方法であって、前記改変型ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達モジュールを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む、方法を提供する。
【００１５】
本発明のこれらを始めとする実施形態は、添付の明細書、図面、および特許請求の範囲においてさらに記載される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ａ）直接的腫瘍認識を誘発し、かつ病原体に対するＣＤ８＋免疫応答を強化する抗原反応性キメラ抗原受容体改変型ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞であって、ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む、抗原反応性キメラ抗原受容体改変型ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞、ならびに
ｂ）生理学的に許容され得る賦形剤
を含む、養子細胞免疫療法組成物。
（項目２）
ｃ）疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む、遺伝子改変されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物
をさらに含む、項目１に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目３）
ｃ）患者由来のＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む、細胞免疫応答を誘発する抗原特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物
をさらに含む、項目１に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目４）
前記抗原反応性キメラ抗原受容体改変型ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞が、ＣＤ４５ＲＯ陰性、ＣＤ６２Ｌ陽性、ＣＤ４陽性のＴ細胞由来である、項目１〜３のいずれか一項に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目５）
前記ＣＤ４＋  Ｔヘルパーリンパ球細胞が、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、またはバルクＣＤ４＋
Ｔ細胞からなる群から選択される、項目１〜４のいずれか一項に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目６）
前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球細胞がナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞が、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む、項目５に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目７）
前記ＣＤ８＋  Ｔ細胞傷害性リンパ球細胞が、ナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞、またはバルクＣＤ８＋  Ｔ細胞からなる群から選択される、項目１〜６のいずれか一項に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目８）
前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞がセントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む、項目７に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目９）
前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞がセントラルメモリーＴ細胞であり、かつ該ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球細胞がナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞である、項目１〜８のいずれか一項に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目１０）
前記疾患または障害が、固形腫瘍、血液系悪性腫瘍、メラノーマ、またはウイルスによる感染症である、項目１〜９のいずれか一項に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目１１）
前記疾患または障害に関連した抗原が、腫瘍関連細胞表面抗原である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目１２）
前記疾患または障害に関連した抗原が、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、およびＢ型肝炎表面抗原からなる群から選択される、項目１〜１０のいずれか一項に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目１３）
前記キメラ抗原受容体が、単鎖抗体由来キメラ抗原受容体を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目１４）
前記キメラ抗原受容体のＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達モジュールが、膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、またはＴ細胞共刺激分子の他のドメインを含む、項目１〜１３のいずれか一項に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目１５）
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３細胞内ドメインに連結したＣＤ２８膜貫通シグナル伝達ドメインを含む、項目１４に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目１６）
前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインが、前記ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと同じである、項目１〜１５のいずれか一項に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目１７）
前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインが、前記ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと異なる、項目１〜１５のいずれか一項に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目１８）
前記ＣＤ８＋  Ｔ細胞および前記ＣＤ４＋  Ｔ細胞がどちらも、病原体特異的細胞表面抗原を特異的に結合する抗体重鎖ドメインで遺伝子改変されている、項目２〜１７のいずれか一項に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目１９）
前記疾患または障害に関連した病原体特異的細胞表面抗原が、ＨＩＶ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＣＭＶ抗原、および寄生虫抗原からなる群から選択される、項目１８に記載の養子細胞免疫療法組成物。
（項目２０）
がんの処置における項目１〜１９のいずれか一項に記載の養子免疫療法組成物の使用。
（項目２１）
前記がんが、固形腫瘍、血液系悪性腫瘍、またはメラノーマから選択される、項目２０に記載の使用。
（項目２２）
感染疾患の処置における項目１〜１９のいずれか一項に記載の養子免疫療法組成物の使用。
（項目２３）
前記感染疾患がウイルス感染症である、項目２２に記載の養子免疫療法組成物の使用。
（項目２４）
前記ウイルス感染症が、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、およびフラビウイルスによる感染症から選択される、項目２３に記載の養子免疫療法組成物の使用。
（項目２５）
前記ウイルス感染症が肝炎ウイルスによる感染症である、項目２４に記載の養子免疫療法組成物の使用。
（項目２６）
Ｔｈ１サイトカイン応答を誘発する改変型ナイーブＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞を得るステップであって、改変型ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、前記疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４陽性細胞を含む、ステップを含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載の養子免疫療法組成物を製造する方法。
（項目２７）
細胞免疫応答を誘発するキメラ抗原受容体改変型腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物、および抗原反応性キメラ抗原受容体を得るステップであって、前記改変型細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、前記疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達モジュールを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８＋細胞を含む、ステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
項目１〜１９のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、疾患または障害を有する被験体において細胞免疫療法を実施する方法。
（項目２９）
以下のステップを含む、疾患または障害を有する被験体において細胞免疫療法を実施する方法：
該疾患または障害に関連した抗原の存在について該被験体の生体試料を分析するステップ、および項目１〜１９のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップであって、前記キメラ抗原受容体が該抗原に特異的に結合する、ステップ。
（項目３０）
以下のステップを含む、疾患または障害を有する被験体において細胞免疫療法を実施する方法：
遺伝子改変されたヘルパーＴリンパ球細胞調製物を該被験体に投与するステップであって、改変型ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、該疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達モジュールを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む、ステップ。
（項目３１）
遺伝子改変された細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物を前記被験体に投与するステップであって、改変型細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、前記疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達モジュールを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む、ステップをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記疾患または障害に関連した抗原が腫瘍関連細胞表面抗原である、項目２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記疾患または障害に関連した抗原が、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、およびＣＤ２０からなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記疾患または障害に関連した抗原が、ＨＩＶ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＣＭＶ抗原、および寄生虫抗原からなる群からの病原体特異的細胞表面抗原である、項目２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記ＣＤ８＋  Ｔ細胞および前記ＣＤ４＋  Ｔ細胞がどちらも、病原体特異的細胞表面抗原を特異的に結合する抗体重鎖ドメインで遺伝子改変されている、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
Ｔｈ１表現型を有する前記キメラ抗原受容体改変型ＣＤ４＋  Ｔヘルパーリンパ球細胞調製物が、腫瘍細胞の存在下で、増殖応答の増加を誘発し、持続を伝達し、または抗腫瘍反応性応答を増加させる、項目２６〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記ＣＤ４＋  Ｔヘルパーリンパ球細胞が、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、またはバルクＣＤ４＋
Ｔ細胞からなる群から選択される、項目２６〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記ＣＤ４＋  Ｔヘルパーリンパ球細胞がナイーブＣＤ４＋  Ｔである、項目３７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＲＯＲ１−ＣＡＲコード化レンチウイルスでＣＡＲ形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞系、および対照としての形質導入されていないＣＤ８＋  Ｔ細胞系における、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現の表現型および分析を示す。ＲＯＲ１−ＣＡＲカセットは、形質導入マーカーとしての役割を果たす切断型ＥＧＦＲを含有し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体での染色によって検出することができる。切断型Ｆｃ−ＲＯＲ１融合タンパク質は、ＲＯＲ１−ＣＡＲの抗原結合ドメインに直接、結合し、ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞系を選択的に染色するが、形質導入されていない対照Ｔ細胞系を染色しない。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞表面上のＲＯＲ１−ＣＡＲの発現は、ＲＯＲ１−Ｆｃ融合タンパク質への結合によって直接的に測定され、ベクター内で２Ａ配列の下流にコードされている切断型ＥＧＦＲの発現によって間接的に測定される。
【図２】図２は、５１Ｃｒ遊離アッセイにおける、ヒトＲＯＲ１陽性腫瘍細胞系（Ｋ５６２）および初代腫瘍細胞（Ｂ−ＣＬＬ）および自己正常Ｂ細胞のパネルに対するＲＯＲ１特異的キメラ抗原受容体を発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞溶解活性を示す。悪性Ｂ細胞上にＲＯＲ１の均一な発現があるが、成熟した正常Ｂ細胞上には発現がないことに一致して、遺伝子改変されたＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞のみがＲＯＲ１＋腫瘍細胞を溶解したが、成熟した正常Ｂ細胞を溶解しなかった。ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、初代ＣＬＬを含むＲＯＲ１陽性腫瘍細胞に対して特異的な溶解活性を発揮するが、正常Ｂ細胞に対して発揮しない。
【図３】図３は、ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞系、および対照としての形質導入されていないＣＤ４＋  Ｔ細胞系の表現型およびＣＡＲ発現を示す。ＣＤ４＋  Ｔ細胞の細胞表面上のＲＯＲ１−ＣＡＲの発現は、ＲＯＲ１−Ｆｃ融合タンパク質への特異的結合によって測定される。切断型Ｆｃ  ＲＯＲ１融合タンパク質はＲＯＲ１−ＣＡＲに直接、結合するが、Ｆｃタンパク質単独は、結合せず、ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞系を選択的に染色するが、形質導入されていない対照ＣＤ４＋  Ｔ細胞系を染色せず、細胞表面上のＲＯＲ１−ＣＡＲの発現、およびＲＯＲ１タンパク質への結合が確認される。ＣＤ４＋  Ｔ細胞の細胞表面上のＲＯＲ１−ＣＡＲの発現は、ＲＯＲ１−Ｆｃ融合タンパク質へ特異的に結合するが、対照Ｆｃ融合タンパク質に結合しないことによって測定される。
【図４】図４（すなわち、図４Ａ〜４Ｂをまとめて）は、５１Ｃｒ遊離アッセイにおいて、初代ＣＬＬ、マントル細胞リンパ腫系Ｊｅｋｏ−１、ＲＯＲ１を安定的にトランスフェクションされたＫ５６２細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）を含むＲＯＲ１陽性腫瘍細胞のパネルに対して、ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の弱いが、特異的な細胞溶解活性があり、しかし未変性のＲＯＲ１陰性Ｋ５６２細胞に対してはないことを示している。ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞に対して弱いが、特異的な溶解活性を発揮する。
【図５】図５（すなわち、図５Ａ〜５Ｂをまとめて）は、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡ（図５Ａ）およびマルチプレックスサイトカインアッセイ（図５Ｂ）の結果を示す。ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞系およびＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌。ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＲＯＲ１＋腫瘍細胞と共インキュベートし、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）のレベルをＥＬＩＳＡにより測定し（５Ａ）、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１７のレベルをＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定した（５Ｂ）。ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞は、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞およびＲＯＲ１陽性腫瘍細胞系を特異的に認識し、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞より高い量の、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、特にＩＬ−２を含むＴｈ１サイトカインを産生する。これらのデータは、ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＲＯＲ１−ＣＡＲを通しての刺激後、ヘルパーエフェクター機能を発揮し、直接的抗腫瘍反応性を媒介することに加えて、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞の、細胞免疫応答を媒介する能力を強化するために利用することもできることを実証している。
【図６】図６は、ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞系および初代腫瘍細胞での刺激後、増殖するように誘導されること（ＣＦＳＥアッセイ）、ならびに増殖細胞のパーセンテージ、および増殖サブセットが起こした細胞分裂の回数の両方が、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞と比較して、有意に高かったことを示す増殖研究の結果を示している。ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬと比較して、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１、初代ＣＬＬ、およびＪｅｋｏ  ＭＣＬ）での刺激後、より活発に増殖する。
【図７】ポリクローナルの選別されていないＣＤ４＋  ＲＯＲ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬを、それらが腫瘍に応答して増殖するのを促進することによって、援助する。（バルクＣＤ４＋  Ｔ細胞由来の）ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ポリクローナルの選別されていないＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬの増殖を有意に増加させた（個々の培養における１８％→ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞との共培養後の３１．５％）。
【図８Ａ】図８（すなわち、図８Ａ〜８Ｄをまとめて）は、フロー選別精製されたＣＤ４＋ナイーブサブセット、ＣＤ４＋セントラルメモリーサブセット、およびエフェクターメモリーサブセットからのＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系の作製、およびＴ細胞機能の分析を示す。サイトカインプロファイルおよび増殖能力は、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋  ＣＴＬを援助するのに最も良く適している可能性があることを示唆する。同様のデータが、ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系の機能を比較する実験において得られた。図８Ａは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌの発現に基づいた、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞のフロー選別精製を示す。図８Ｂは、選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入により導かれたＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞系の増殖の分析を示す（ＣＦＳＥアッセイ）。図８Ｃは、選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌の分析を示す（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）。図８Ｄは、選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌の分析を示す（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）。マルチプレックスサイトカイン分析により得られたサイトカインプロファイル（図８Ｂ）およびＣＦＳＥ染色による増殖能力（図８Ｃ）は、ナイーブサブセット由来のＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞が、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞での刺激後、最も高いレベルのＴｈ１サイトカインを産生し、かつ最も活発に増殖したことを示しており、それらが、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬを強化するのに最も良く適している可能性があることを示唆している。選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌の分析（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）は、ＣＤ４  Ｔ細胞サブセットの活性が多くのＣＡＲに対して一般化できることを実証している。
【図８Ｂ】図８（すなわち、図８Ａ〜８Ｄをまとめて）は、フロー選別精製されたＣＤ４＋ナイーブサブセット、ＣＤ４＋セントラルメモリーサブセット、およびエフェクターメモリーサブセットからのＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系の作製、およびＴ細胞機能の分析を示す。サイトカインプロファイルおよび増殖能力は、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋  ＣＴＬを援助するのに最も良く適している可能性があることを示唆する。同様のデータが、ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系の機能を比較する実験において得られた。図８Ａは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌの発現に基づいた、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞のフロー選別精製を示す。図８Ｂは、選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入により導かれたＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞系の増殖の分析を示す（ＣＦＳＥアッセイ）。図８Ｃは、選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌の分析を示す（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）。図８Ｄは、選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌の分析を示す（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）。マルチプレックスサイトカイン分析により得られたサイトカインプロファイル（図８Ｂ）およびＣＦＳＥ染色による増殖能力（図８Ｃ）は、ナイーブサブセット由来のＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞が、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞での刺激後、最も高いレベルのＴｈ１サイトカインを産生し、かつ最も活発に増殖したことを示しており、それらが、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬを強化するのに最も良く適している可能性があることを示唆している。選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌の分析（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）は、ＣＤ４  Ｔ細胞サブセットの活性が多くのＣＡＲに対して一般化できることを実証している。
【図８Ｃ】図８（すなわち、図８Ａ〜８Ｄをまとめて）は、フロー選別精製されたＣＤ４＋ナイーブサブセット、ＣＤ４＋セントラルメモリーサブセット、およびエフェクターメモリーサブセットからのＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系の作製、およびＴ細胞機能の分析を示す。サイトカインプロファイルおよび増殖能力は、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋  ＣＴＬを援助するのに最も良く適している可能性があることを示唆する。同様のデータが、ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系の機能を比較する実験において得られた。図８Ａは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌの発現に基づいた、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞のフロー選別精製を示す。図８Ｂは、選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入により導かれたＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞系の増殖の分析を示す（ＣＦＳＥアッセイ）。図８Ｃは、選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌の分析を示す（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）。図８Ｄは、選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌の分析を示す（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）。マルチプレックスサイトカイン分析により得られたサイトカインプロファイル（図８Ｂ）およびＣＦＳＥ染色による増殖能力（図８Ｃ）は、ナイーブサブセット由来のＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞が、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞での刺激後、最も高いレベルのＴｈ１サイトカインを産生し、かつ最も活発に増殖したことを示しており、それらが、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬを強化するのに最も良く適している可能性があることを示唆している。選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌の分析（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）は、ＣＤ４  Ｔ細胞サブセットの活性が多くのＣＡＲに対して一般化できることを実証している。
【図８Ｄ】図８（すなわち、図８Ａ〜８Ｄをまとめて）は、フロー選別精製されたＣＤ４＋ナイーブサブセット、ＣＤ４＋セントラルメモリーサブセット、およびエフェクターメモリーサブセットからのＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系の作製、およびＴ細胞機能の分析を示す。サイトカインプロファイルおよび増殖能力は、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋  ＣＴＬを援助するのに最も良く適している可能性があることを示唆する。同様のデータが、ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系の機能を比較する実験において得られた。図８Ａは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌの発現に基づいた、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞のフロー選別精製を示す。図８Ｂは、選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入により導かれたＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞系の増殖の分析を示す（ＣＦＳＥアッセイ）。図８Ｃは、選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌の分析を示す（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）。図８Ｄは、選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌の分析を示す（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）。マルチプレックスサイトカイン分析により得られたサイトカインプロファイル（図８Ｂ）およびＣＦＳＥ染色による増殖能力（図８Ｃ）は、ナイーブサブセット由来のＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞が、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞での刺激後、最も高いレベルのＴｈ１サイトカインを産生し、かつ最も活発に増殖したことを示しており、それらが、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬを強化するのに最も良く適している可能性があることを示唆している。選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞系のサイトカイン分泌の分析（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）は、ＣＤ４  Ｔ細胞サブセットの活性が多くのＣＡＲに対して一般化できることを実証している。
【図９】図９は、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞との共培養（形質導入されていない対照ＣＤ４＋  Ｔ細胞とは共培養していない）を示す。ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬの最大増殖を可能にするであろうＣＤ８＋  Ｔ細胞とＣＤ４＋  Ｔ細胞の最適な組み合わせを定義するための、ナイーブサブセット、セントラルメモリーサブセット、およびエフェクターメモリーサブセット由来のＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞系とＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬとの共培養。ＣＤ４ナイーブＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ８セントラルメモリーＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬを最もよく増殖させる。共培養は、ＣＤ８＋サブセットの腫瘍特異的増殖の増加をもたらし、ＣＤ８＋サブセットのその最大増殖は、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞との共培養後に観察される。
【図１０】図１０は、ＣＤ１９＋マントル細胞リンパ腫腫瘍系Ｊｅｋｏ−１で刺激された、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  ＣＴＬおよびＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞系に関する共培養実験におけるセントラルメモリー由来ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬの腫瘍特異的増殖を強化する、ナイーブサブセット由来のＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系の優れた能力を示す。セントラルメモリー由来ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬの腫瘍特異的増殖を強化する、ナイーブサブセット由来のＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系の優れた能力は、ＣＤ１９＋マントル細胞リンパ腫腫瘍系Ｊｅｋｏ−１で刺激された、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  ＣＴＬおよびＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞系に関する共培養実験において確認された。
【図１１Ａ】図１１は、免疫不全マウスのリンパ腫モデル（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−Ｒａｊｉ）において、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞が非依存的に、直接的抗腫瘍効力を与えることを示す。マウス群（ｎ＝３）に、ホタルルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ腫瘍細胞を尾静脈注射によって接種し、単一用量の１０×１０６個のＴ細胞で処置した。マウスは、ＣＤ１９−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ８＋セントラルメモリー由来Ｔ細胞もしくは対照の偽形質導入されたＣＤ８＋セントラルメモリー由来Ｔ細胞（Ａ）、またはＣＤ１９−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋ナイーブ由来Ｔ細胞もしくは対照の偽形質導入されたＣＤ４＋ナイーブ由来Ｔ細胞（Ｂ）のいずれかを受けた。腫瘍量および腫瘍分布を、連続的な生物発光画像法を用いて分析した。
【図１１Ｂ】図１１は、免疫不全マウスのリンパ腫モデル（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−Ｒａｊｉ）において、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞が非依存的に、直接的抗腫瘍効力を与えることを示す。マウス群（ｎ＝３）に、ホタルルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ腫瘍細胞を尾静脈注射によって接種し、単一用量の１０×１０６個のＴ細胞で処置した。マウスは、ＣＤ１９−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ８＋セントラルメモリー由来Ｔ細胞もしくは対照の偽形質導入されたＣＤ８＋セントラルメモリー由来Ｔ細胞（Ａ）、またはＣＤ１９−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋ナイーブ由来Ｔ細胞もしくは対照の偽形質導入されたＣＤ４＋ナイーブ由来Ｔ細胞（Ｂ）のいずれかを受けた。腫瘍量および腫瘍分布を、連続的な生物発光画像法を用いて分析した。
【図１２】図１２は、全身性マントル細胞リンパ腫のマウス腫瘍モデル（ＮＳＧ／Ｊｅｋｏ−１−ｆｆＬｕｃ）における、ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞の、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬの抗腫瘍効力への強化および相乗効果を示す。全身性侵襲性マントル細胞リンパ腫のマウス腫瘍モデル（ＮＳＧ／Ｊｅｋｏ−１）におけるＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型ＣＤ４＋  Ｔ細胞の抗腫瘍効力。ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬ、ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞、またはＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせの養子移入後の生物発光画像法を用いた腫瘍量の分析。全てのマウスは、同じ総用量のＣＡＲ  Ｔ細胞を受けた。
【図１３Ａ】図１３は、全身性リンパ腫のマウスモデル（ＮＳＧ／Ｒａｊｉ）におけるＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の相乗作用を示す。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼ形質導入されたＲａｊｉ腫瘍細胞を接種した。腫瘍接種後６日目に、生物発光画像法によりＲａｊｉ腫瘍の生着が確認された（処置前）（処置スキームはＡに示されており、生物発光による腫瘍生着はＢに示されている）。その後、マウス群（ｎ＝５）を、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞か、またはＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方を含有した組み合わせ型Ｔ細胞製造物のいずれかで処置した。全てのマウスは、同じ総用量のＴ細胞を受けた（１０×１０６個）。生物発光画像法を用いた腫瘍量の分析により、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスのコホート、およびＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせ型Ｔ細胞製造物で処置されたマウスにおいてＲａｊｉ腫瘍の完全な根絶が示された（Ｂ、処置後の中央の黒色バーおよび灰色バー）。その後、マウスを、Ｒａｊｉ腫瘍細胞の２回目の接種で曝露させ、末梢血におけるＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の頻度、ならびに腫瘍生着を分析した。ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせ型Ｔ細胞製造物で処置されたマウスにおける、腫瘍曝露後の有意により高いレベルのＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｃの下方のパネル）、およびＲａｊｉ接種物の完全な拒絶（Ｂ、腫瘍曝露後の右の灰色バー）。対照的に、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  ＣＴＬ単独を受けたマウスにおいて、本発明者らは、腫瘍曝露後にＣＡＲ  Ｔ細胞の増加を検出せず（Ｃ）、Ｒａｊｉ腫瘍細胞は生着することができた（パネルＢ、腫瘍曝露後の右の黒色バー）。
【図１３Ｂ】図１３は、全身性リンパ腫のマウスモデル（ＮＳＧ／Ｒａｊｉ）におけるＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の相乗作用を示す。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼ形質導入されたＲａｊｉ腫瘍細胞を接種した。腫瘍接種後６日目に、生物発光画像法によりＲａｊｉ腫瘍の生着が確認された（処置前）（処置スキームはＡに示されており、生物発光による腫瘍生着はＢに示されている）。その後、マウス群（ｎ＝５）を、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞か、またはＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方を含有した組み合わせ型Ｔ細胞製造物のいずれかで処置した。全てのマウスは、同じ総用量のＴ細胞を受けた（１０×１０６個）。生物発光画像法を用いた腫瘍量の分析により、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスのコホート、およびＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせ型Ｔ細胞製造物で処置されたマウスにおいてＲａｊｉ腫瘍の完全な根絶が示された（Ｂ、処置後の中央の黒色バーおよび灰色バー）。その後、マウスを、Ｒａｊｉ腫瘍細胞の２回目の接種で曝露させ、末梢血におけるＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の頻度、ならびに腫瘍生着を分析した。ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせ型Ｔ細胞製造物で処置されたマウスにおける、腫瘍曝露後の有意により高いレベルのＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｃの下方のパネル）、およびＲａｊｉ接種物の完全な拒絶（Ｂ、腫瘍曝露後の右の灰色バー）。対照的に、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  ＣＴＬ単独を受けたマウスにおいて、本発明者らは、腫瘍曝露後にＣＡＲ  Ｔ細胞の増加を検出せず（Ｃ）、Ｒａｊｉ腫瘍細胞は生着することができた（パネルＢ、腫瘍曝露後の右の黒色バー）。
【図１３Ｃ】図１３は、全身性リンパ腫のマウスモデル（ＮＳＧ／Ｒａｊｉ）におけるＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の相乗作用を示す。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼ形質導入されたＲａｊｉ腫瘍細胞を接種した。腫瘍接種後６日目に、生物発光画像法によりＲａｊｉ腫瘍の生着が確認された（処置前）（処置スキームはＡに示されており、生物発光による腫瘍生着はＢに示されている）。その後、マウス群（ｎ＝５）を、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞か、またはＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方を含有した組み合わせ型Ｔ細胞製造物のいずれかで処置した。全てのマウスは、同じ総用量のＴ細胞を受けた（１０×１０６個）。生物発光画像法を用いた腫瘍量の分析により、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスのコホート、およびＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせ型Ｔ細胞製造物で処置されたマウスにおいてＲａｊｉ腫瘍の完全な根絶が示された（Ｂ、処置後の中央の黒色バーおよび灰色バー）。その後、マウスを、Ｒａｊｉ腫瘍細胞の２回目の接種で曝露させ、末梢血におけるＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の頻度、ならびに腫瘍生着を分析した。ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせ型Ｔ細胞製造物で処置されたマウスにおける、腫瘍曝露後の有意により高いレベルのＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｃの下方のパネル）、およびＲａｊｉ接種物の完全な拒絶（Ｂ、腫瘍曝露後の右の灰色バー）。対照的に、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  ＣＴＬ単独を受けたマウスにおいて、本発明者らは、腫瘍曝露後にＣＡＲ  Ｔ細胞の増加を検出せず（Ｃ）、Ｒａｊｉ腫瘍細胞は生着することができた（パネルＢ、腫瘍曝露後の右の黒色バー）。
【図１３Ｄ】図１３は、全身性リンパ腫のマウスモデル（ＮＳＧ／Ｒａｊｉ）におけるＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の相乗作用を示す。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼ形質導入されたＲａｊｉ腫瘍細胞を接種した。腫瘍接種後６日目に、生物発光画像法によりＲａｊｉ腫瘍の生着が確認された（処置前）（処置スキームはＡに示されており、生物発光による腫瘍生着はＢに示されている）。その後、マウス群（ｎ＝５）を、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞か、またはＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方を含有した組み合わせ型Ｔ細胞製造物のいずれかで処置した。全てのマウスは、同じ総用量のＴ細胞を受けた（１０×１０６個）。生物発光画像法を用いた腫瘍量の分析により、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスのコホート、およびＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせ型Ｔ細胞製造物で処置されたマウスにおいてＲａｊｉ腫瘍の完全な根絶が示された（Ｂ、処置後の中央の黒色バーおよび灰色バー）。その後、マウスを、Ｒａｊｉ腫瘍細胞の２回目の接種で曝露させ、末梢血におけるＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の頻度、ならびに腫瘍生着を分析した。ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせ型Ｔ細胞製造物で処置されたマウスにおける、腫瘍曝露後の有意により高いレベルのＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｃの下方のパネル）、およびＲａｊｉ接種物の完全な拒絶（Ｂ、腫瘍曝露後の右の灰色バー）。対照的に、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  ＣＴＬ単独を受けたマウスにおいて、本発明者らは、腫瘍曝露後にＣＡＲ  Ｔ細胞の増加を検出せず（Ｃ）、Ｒａｊｉ腫瘍細胞は生着することができた（パネルＢ、腫瘍曝露後の右の黒色バー）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で用いられる場合、「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、サル、イヌ、およびヒトを含む、任意の哺乳類、好ましくは霊長類の種由来であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、レシピエント被験体と同種異系（同じ種であるが、異なるドナー由来）であり、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、自己性（ドナーとレシピエントが同じである）であり、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は同系（ドナーとレシピエントは異なるが、一卵性双生児である）である。
【００１８】
本明細書で用いられる場合、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、その表面上にＣＤ８を発現するＴリンパ球（すなわち、ＣＤ８＋  Ｔ細胞）を指す。いくつかの実施形態において、そのような細胞は、好ましくは、抗原を経験している「メモリー」Ｔ細胞（ＴＭ細胞）である。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、「セントラルメモリー」Ｔ細胞（または「ＴＣＭ」）は、その表面上にＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯを発現し、かつナイーブ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡを発現せず、またはＣＤ４５ＲＡの発現が少ない、抗原を経験したＣＴＬを指す。実施形態において、セントラルメモリー細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ９５の発現について陽性であり、ＣＤ５４ＲＡの発現がナイーブ細胞と比較して少ない。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（または「ＴＥＭ」）は、その表面上に、セントラルメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌを発現せず、またはＣＤ６２Ｌの発現が少なく、かつナイーブ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡを発現せず、またはＣＤ４５ＲＡの発現が少ない、抗原を経験したＣＴＬを指す。実施形態において、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞またはセントラルメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡの発現について陰性であり、ＣＤ１２７について陽性である。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、「ナイーブ」Ｔ細胞は、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを発現し、かつセントラルメモリー細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＯ−を発現せず、またはＣＤ４５ＲＯの発現が少ない、抗原を経験していないＴリンパ球を指す。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ８＋  Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡを含む、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現により特徴づけられる。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、「エフェクター」「ＴＥ」Ｔ細胞は、セントラルメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８を発現せず、またはそれらの発現が少なく、かつグランザイムＢおよびパーフォリンについて陽性である、抗原を経験した細胞傷害性Ｔリンパ球細胞を指す。
【００２３】
混合物において細胞型の量を記載するために本明細書で用いられる場合、「濃縮された」および「枯渇した」は、結果として、「濃縮された」型の数の増加、および「枯渇した」細胞の数の減少を生じる工程または段階に細胞の混合物を供することを指す。したがって、濃縮工程に供される最初の細胞集団の供給源に依存して、混合物または組成物は、（数またはカウントにおいて）６０、７０、８０、９０、９５、または９９パーセント、またはそれ以上の「濃縮された」細胞、および（数またはカウントにおいて）４０、３０、２０、１０、５、または１パーセント、またはそれ未満の「枯渇した」細胞を含み得る。
【００２４】
インターロイキン−１５は、既知のものであり、例えば、米国特許第６，３４４，１９２号に記載されている。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、「ＣＡＲ」は、疾患または障害に関連した抗原に特異的な抗体の細胞外可変ドメイン、および共刺激ドメインなどのＴ細胞受容体または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を指す。
【００２６】
本開示の形態
インビトロ培養中のＣＤ４＋  Ｔリンパ球は、インビトロおよびインビボで、腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖、持続、および抗腫瘍反応性を有意に増加させる。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞は、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、またはバルクＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＣＤ４＋  Ｔ細胞と比較して、より優れたヘルパー活性をもたらす固有プログラミングを有する。
【００２７】
実施形態において、腫瘍反応性ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１またはＣＤ１９分子に特異的な単鎖抗体由来キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で改変される。ＲＯＲ１は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）およびマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）において一律に発現しており、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来のＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）内に発現する場合、悪性Ｂ細胞の特異的認識を与えるが、成熟した正常Ｂ細胞の認識を与えない。バルクＣＤ４＋  Ｔ細胞ならびにフロー選別精製されたナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞由来のＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、健康なドナーおよびＣＬＬ患者のどちらの末梢血からも得られる。ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、初代ＣＬＬ、ＭＣＬ系Ｊｅｋｏ−１、およびＲＯＲ１をトランスフェクションされたＫ５６２細胞を含むＲＯＲ１＋腫瘍に対して特異的であるが、弱い細胞溶解活性を有していた。マルチプレックスサイトカイン分析は、Ｔｈ１サイトカインの高レベル産生を検出し、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬと比較して、ＩＦＮγ、ＴＮＦａ、および特にＩＬ−２のレベルが有意に高い。ＣＦＳＥ染色は、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞での刺激後、劇的により高い増殖を示し、増殖するように誘導された細胞のパーセンテージ、および増殖サブセットが起こした細胞分裂の回数の両方が、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬと比較して、有意に高い。健康なドナーおよびＣＬＬ患者のどちらから得られたＣＤ４＋  Ｔ細胞も、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲでの遺伝子改変後、抗腫瘍反応性を獲得する。さらに、外因性サイトカインの非存在下で増殖する能力、および高レベルのＴｈ１サイトカインを産生する能力により、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲを通しての刺激後に典型的なヘルパー機能を発揮するということが実証され、直接的抗腫瘍効果を与えることに加えて、腫瘍特異的ＣＤ８＋  ＣＴＬを強化するために利用し得ることが示唆される。
【００２８】
フロー選別精製されたＣＤ４＋ナイーブサブセット、セントラルメモリーサブセット、およびエフェクターメモリーサブセット由来のＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカインプロファイルおよび増殖能力が得られる。ナイーブＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ４５ＲＯ−  ＣＤ６２Ｌ＋サブセット由来のＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＲＯＲ１＋腫瘍細胞に応答して、最も高いレベルのＴｈ１サイトカイン、特にＩＬ−２を産生し、増殖する。実際、共培養実験において、ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞の添加は、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬの腫瘍特異的増殖の有意な増加をもたらすが、形質導入されていないＣＤ４＋  Ｔ細胞はもたらさない。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーサブセットおよびエフェクターメモリーサブセットまたはバルクＣＤ４＋  Ｔ細胞よりむしろナイーブサブセット由来のＣＡＲ改変型ＣＤ４＋  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬの増殖の増強をもたらす。
【００２９】
ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞は、それらが投与後の長期間持続することを可能にする固有のプログラミングを有し、それゆえに免疫療法のためのＣＤ８＋  Ｔ細胞の好ましいサブセットである。実施形態において、選別精製されたＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞由来のＲＯＲ１−ＣＡＲまたはＣＤ１９  ＣＡＲ改変型ＣＴＬおよびＣＤ４＋ナイーブＣＡＲ改変型Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットの増殖の増強をもたらす。実施形態において、腫瘍特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、インビトロおよびインビボで、抗腫瘍反応性を発揮し、かつ腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を援助する。特定の実施形態において、ナイーブサブセット由来の腫瘍特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞が利用される。
【００３０】
別の実施形態において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）で改変することができる。ＴＣＲは、任意の抗原、病原体、または腫瘍（メラノーマ（例えば、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００）、白血病（例えば、ＷＴ１、マイナー組織適合抗原）、乳がん（例えば、ｈｅｒ２、ＮＹ−ＢＲ１）における多くの腫瘍抗原についてのＴＣＲがある）に特異的であり得る。
【００３１】
詳細な説明
組成物
本開示は、遺伝子改変された細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物の細胞免疫応答を媒介する能力を強化する、遺伝子改変されたヘルパーＴリンパ球細胞調製物を含む養子細胞免疫療法組成物であって、前記ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む、養子細胞免疫療法組成物を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、養子細胞免疫療法組成物は、細胞免疫応答を誘発するキメラ抗原受容体改変型腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物をさらに含み、前記細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外単鎖抗体およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、養子細胞免疫療法組成物は、ＣＤ４５ＲＯ陰性、ＣＤ６２Ｌ陽性、ＣＤ４陽性のＴ細胞由来の抗原反応性キメラ抗原受容体改変型ナイーブＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞、および薬学的に許容され得る担体と組み合わせて、細胞免疫応答を誘発するキメラ抗原受容体改変型腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物を含み、前記細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外単鎖抗体およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む。
【００３４】
他の実施形態において、養子細胞免疫療法組成物は、患者由来の細胞免疫応答を誘発する抗原特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物を、ＣＤ８＋免疫応答を強化する抗原反応性キメラ抗原受容体改変型ナイーブＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞と組み合わせて含み、前記ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む。
【００３５】
さらなる実施形態において、養子細胞免疫療法組成物は、ＣＤ８＋免疫応答を強化する抗原反応性キメラ抗原受容体改変型ナイーブＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞を含み、前記ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む。
【００３６】
実施形態において、ＣＤ４＋  Ｔヘルパーリンパ球細胞は、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、またはバルクＣＤ４＋  Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球細胞は、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞であり、前記ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む。実施形態において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞傷害性リンパ球細胞は、ナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞、またはバルクＣＤ８＋  Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞は、セントラルメモリーＴ細胞であり、前記セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む。さらに他の実施形態において、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞は、セントラルメモリーＴ細胞であり、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球細胞は、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞である。
【００３７】
代替の実施形態において、Ｔ細胞は、組換えＴ細胞受容体で改変することができる。ＴＣＲは、任意の抗原、病原体、または腫瘍に特異的であり得る。メラノーマ（例えば、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００）、白血病（例えば、ＷＴ１、マイナー組織適合抗原）、乳がん（例えば、ｈｅｒ２、ＮＹ−ＢＲ１）における多くの腫瘍抗原についてのＴＣＲがある。
【００３８】
Ｔリンパ球集団の選択および選別
本明細書に記載された組成物は、抗原反応性ＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球を提供する。
【００３９】
Ｔリンパ球は、公知の技術に従って収集して、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択などの抗体への親和結合などの公知の技術により濃縮し、または枯渇させることができる。濃縮および／または枯渇ステップ後、所望のＴリンパ球のインビトロ増殖は、公知の技術（Ｒｉｄｄｅｌｌらの米国特許第６，０４０，１７７号に記載されたものが挙げられるが、それらに限定されない）または当業者に明らかであろうそれらのバリエーションに従って実行することができる。
【００４０】
例えば、所望のＴ細胞集団または亜集団を、インビトロで最初のＴリンパ球集団を培地へ加え、その後、その培地へ非分裂末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などのフィーダー細胞を加え（例えば、生じる細胞集団が、増殖されるべき最初の集団における１個のＴリンパ球に対して少なくとも約５個、１０個、２０個、または４０個、またはそれ以上のＰＢＭＣフィーダー細胞を含有するように）、その培養物を（例えば、Ｔ細胞の数を増加させるのに十分な時間）インキュベートすることにより増殖させてもよい。非分裂フィーダー細胞は、γ線照射されたＰＢＭＣフィーダー細胞を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、約３０００〜３６００ラドの範囲でのγ線で照射される。Ｔ細胞およびフィーダー細胞の培地への添加の順番は、必要に応じて逆にすることができる。培養物は、典型的には、Ｔリンパ球の成長に適している温度などの条件下でインキュベートすることができる。ヒトＴリンパ球の成長について、例えば、温度は、一般的には、少なくとも摂氏約２５度、好ましくは少なくとも約３０度、より好ましくは約３７度であろう。
【００４１】
増殖されるＴリンパ球としては、ヒト腫瘍または病原体上に存在する抗原に特異的である細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびヘルパーＴリンパ球が挙げられる。
【００４２】
任意で、増殖方法は、フィーダー細胞として非分裂性のＥＢＶ形質転換されたリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を加えるステップをさらに含んでもよい。ＬＣＬは、約６０００〜１００００ラドの範囲でのγ線で照射することができる。ＬＣＬフィーダー細胞は、少なくとも約１０：１のＬＣＬフィーダー細胞対最初のＴリンパ球の比など任意の適切な量で供給されてもよい。
【００４３】
任意で、増殖方法は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を（例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）培地へ加えるステップをさらに含んでもよい。任意で、増殖方法は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を培地へ加えるステップをさらに含んでもよい（例えば、ＩＬ−２の濃度は少なくとも約１０ユニット／ｍｌである）。
【００４４】
Ｔリンパ球の単離後、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方は、増殖（ｅｘｏａｎｓｉｏｎ）の前または後のいずれかで、ナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団、およびエフェクターＴ細胞亜集団へ選別することができる。
【００４５】
ＣＤ８＋細胞は、標準方法を用いることにより得ることができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋細胞は、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞へ、ＣＤ８＋細胞のそれらの型のそれぞれに関連している細胞表面抗原を同定することにより、さらに選別される。実施形態において、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋サブセットとＣＤ６２Ｌ−サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体での染色後、ＣＤ６２Ｌ−  ＣＤ８＋画分およびＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ８＋画分へ選別される。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴＣＭの表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ１２７を含み、グランザイムＢについて陰性である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクターＴＥは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ１２７について陰性であり、グランザイムＢおよびパーフォリンについて陽性である。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ８＋  Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現により特徴づけられる。
【００４６】
細胞または細胞集団が特定の細胞表面マーカーについて陽性であるかどうかは、その表面マーカーに対する特異的な抗体およびアイソタイプ適合対照抗体での染色を用いるフローサイトメトリーにより決定することができる。マーカーについて陰性の細胞集団は、アイソタイプ対照を上回る特異的抗体での細胞集団の有意な染色の欠如を指し、陽性は、アイソタイプ対照を上回る細胞集団の均一な染色を指す。いくつかの実施形態において、マーカーのうちの１つの発現の減少は、参照細胞集団と比較して、細胞の平均蛍光強度における１  ｌｏｇ１０の消失、および／または少なくとも細胞の２０％、細胞の２５％、細胞の３０％、細胞の３５％、細胞の４０％、細胞の４５％、細胞の５０％、細胞の５５％、細胞の６０％、細胞の６５％、細胞の７０％、細胞の７５％、細胞の８０％、細胞の８５％、細胞の９０％、細胞の９５％、および細胞の１００％、および２０％〜１００％の間の任意の％の、そのマーカーを示す細胞のパーセンテージの減少を指す。いくつかの実施形態において、マーカーのうちの１つについて陽性の細胞集団は、参照細胞集団と比較して、少なくとも細胞の５０％、細胞の５５％、細胞の６０％、細胞の６５％、細胞の７０％、細胞の７５％、細胞の８０％、細胞の８５％、細胞の９０％、細胞の９５％、および細胞の１００％、および５０％〜１００％の間の任意の％の、そのマーカーを示す細胞のパーセンテージを指す。
【００４７】
ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することにより、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞へ選別される。ＣＤ４＋リンパ球は、標準方法によって得ることができる。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ４＋  Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性であり、かつＣＤ４５ＲＯ陽性である。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯが陰性である。
【００４８】
抗原特異的であるＣＤ４＋集団およびＣＤ８＋集団は、ナイーブまたは抗原特異的Ｔリンパ球を抗原で刺激することにより得ることができる。例えば、抗原特異的Ｔ細胞クローンは、サイトメガロウイルス抗原に対して、感染した被験体からＴ細胞を単離し、インビトロでその細胞を同じ抗原で刺激することによって、産生することができる。ナイーブＴ細胞もまた用いられてもよい。腫瘍細胞、がん細胞、または感染病原体由来の抗原のいくつでも利用できる。そのような抗原の例としては、ＨＩＶ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＣＭＶ抗原、寄生虫抗原、ならびにオーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、およびＣＥＡなどの腫瘍抗原が挙げられる。いくつかの実施形態において、養子細胞免疫療法組成物は、固形腫瘍、血液系悪性腫瘍、メラノーマ、またはウイルスによる感染症を含む疾患または障害の処置において有用である。
【００４９】
Ｔリンパ球集団の改変
いくつかの実施形態において、本開示に従って免疫療法に用いられるＴ細胞へ機能性遺伝子を導入することが望ましい場合がある。例えば、導入される遺伝子（複数可）は、移入されたＴ細胞の生存能および／もしくは機能を促進することにより治療の効力を向上させ得る；またはそれらは、インビボ生存または遊走の選択および／もしくは評価を可能にする遺伝子マーカーを提供し得る；またはそれらは、例えば、Ｌｕｐｔｏｎ  Ｓ．Ｄ．ら、Ｍｏｌ．  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１１：６（１９９１）およびＲｉｄｄｅｌｌら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：３１９−３３８（１９９２）に記載されているように、インビボでのネガティブ選択に対する、その細胞の感受性を高くすることにより、免疫療法の安全性を向上させる機能を組込み得る；優性ポジティブ選択マーカーをネガティブ選択マーカーと融合することに由来する二機能性選択可能融合遺伝子の使用について記載する、Ｌｕｐｔｏｎらによる国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８４４２号および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１号の公報もまた参照されたい。これは、公知の技術（例えば、Ｒｉｄｄｅｌｌらの米国特許第６，０４０，１７７号、１４〜１７欄参照）、または本開示に基づいて当業者に明らかであろうそれらのバリエーション従って行うことができる。
【００５０】
実施形態において、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で改変される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、Ｔ細胞活性化および細胞傷害性を媒介するＴＣＲ  ＣＤ３＋鎖に連結した、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖に由来する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。共刺激シグナルもまた、ＣＤ２８または４−１ＢＢの共刺激ドメインをＣＤ３＋鎖に融合することにより、ＣＡＲを通して提供することができる。ＣＡＲは、ＨＬＡとは無関係に細胞表面分子に特異的であり、したがって、腫瘍細胞上でのＨＬＡ拘束性および低レベルのＨＬＡ発現を含む、ＴＣＲ認識の制限を克服するものである。
【００５１】
例えば抗体分子の、抗原結合フラグメントまたは抗体可変ドメインを利用することにより、任意の細胞表面マーカーに対する特異性をもつＣＡＲを構築することができる。抗原結合分子を、１つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結させることができる。実施形態において、細胞シグナル伝達モジュールとしては、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８膜貫通ドメインが挙げられる。実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３細胞内ドメインに連結した、ＣＤ２８膜貫通シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲはまた、ｔＥＧＦＲなどの形質導入マーカーも含むことができる。
【００５２】
実施形態において、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと同じである。他の実施形態において、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと異なる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞はどちらも、病原体特異的細胞表面抗原を特異的に結合する抗体重鎖ドメインで遺伝子改変されている。実施形態において、ＣＡＲは、病原体、腫瘍、またはがん細胞に関連した細胞表面発現抗原に特異的である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＨＩＶ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＣＭＶ抗原、寄生虫抗原、ならびにオーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、およびＣＥＡなどの腫瘍抗原に特異的である。ＣＡＲを作製するための方法は、本明細書に記載されており、またＦｏｒｍａｎによる第６，４１０，３１９号、ならびにＪｅｎｓｅｎらによる国際公開公報ＷＯ２００２／０７７０２９号、７，４４６，１９１号、２０１０／０６５８１８号、２０１０／０２５１７７号、２００７／０５９２９８号、および第７，５１４，５３７号にも見出すことができ、またＢｅｒｇｅｒ  Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１１８：１  ２９４−３０８（２００８）により記載されており、それらは参照により本明細書に組み入れられている。
【００５４】
実施形態において、同じ、または異なるＣＡＲを、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球のそれぞれへ導入することができる。実施形態において、これらの集団のそれぞれにおけるＣＡＲは、同じ抗原に特異的に結合する抗原結合分子を有する。細胞シグナル伝達モジュールは異なり得る。実施形態において、ＣＤ４  Ｔリンパ球またはＣＤ８  Ｔリンパ球のそれぞれは、形質導入前に、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞、またはエフェクター細胞へ選別することができる。代替の実施形態において、ＣＤ４  Ｔリンパ球またはＣＤ８  Ｔリンパ球のそれぞれは、形質導入前に、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞、またはエフェクター細胞へ選別することができる。
【００５５】
代替の実施形態において、Ｔ細胞は、組換えＴ細胞受容体で改変することができる。ＴＣＲは、任意の抗原、病原体、または腫瘍に特異的であり得る。メラノーマ（例えば、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００）、白血病（例えば、ＷＴ１、マイナー組織適合抗原）、乳がん（例えば、ｈｅｒ２、ＮＹ−ＢＲ１）における多くの腫瘍抗原についてのＴＣＲがある。
【００５６】
遺伝子送達のために組換え感染性ウイルス粒子を利用する様々な感染技術が開発されている。これは、現在のところ、本発明のＴリンパ球の形質導入への好ましいアプローチを示す。このように用いられているウイルスベクターとしては、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルス由来のウイルスベクターが挙げられる。したがって、遺伝子移入および発現方法は、多数あるが、本質的に、哺乳類細胞において遺伝子材料を導入し、かつ発現するように機能する。上記技術のいくつかは、造血細胞またはリンパ球系細胞を形質導入するために用いられており、そのような技術としては、リン酸カルシウム法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、および組換えアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターでの感染が挙げられる。初代Ｔリンパ球は、エレクトロポレーションおよびレトロウイルス感染により形質導入することに成功している。
【００５７】
レトロウイルスベクターは、真核細胞への遺伝子移入のための非常に効率的な方法を提供する。さらに、レトロウイルス組込みは、管理された様式で起こり、細胞あたり１個、または数個の、新しい遺伝情報のコピーの安定的な組込みをもたらす。
【００５８】
刺激因子（例えば、リンホカインまたはサイトカイン）の過剰発現は、処置される個体にとって毒性であり得ると考えられる。それゆえに、インビボでのネガティブ選択に対する、本発明のＴ細胞の感受性を高くする、遺伝子断片を含むことは、本発明の範囲内である。「ネガティブ選択」とは、注入された細胞が、個体のインビボ状態における変化の結果として除去され得ることを意味する。ネガティブ選択表現型は、投与される作用物質、例えば、化合物に対する感受性を与える遺伝子の挿入に起因してもよい。ネガティブ選択遺伝子は、当技術分野において知られており、とりわけ、以下が挙げられる：ガンシクロビル感受性を与える、単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３、１９７７）；細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、細菌シトシンデアミナーゼ（Ｍｕｌｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：３３（１９９２））。
【００５９】
いくつかの実施形態において、インビトロでネガティブ選択表現型の細胞の選択を可能にするポジティブマーカーをＴ細胞内に含めることは有用であり得る。ポジティブ選択マーカーは、宿主細胞へ導入されたとき、その遺伝子を有する細胞のポジティブ選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であってもよい。この型の遺伝子は当技術分野において知られており、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を与える、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が挙げられる。
【００６０】
好ましくは、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択エレメントは、ネガティブ選択エレメントの消失がまた必ず、ポジティブ選択マーカーの消失を伴うように連結される。さらにより好ましくは、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーは、一方の消失が、義務的に、他方の消失をもたらすように、融合される。発現産物として、上記の望ましいポジティブ選択特性とネガティブ選択特性の両方を与えるポリペプチドを生じる融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ・チミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでのポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、およびインビボでのネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を与えるポリペプチドを生じる。Ｌｕｐｔｏｎ  Ｓ．Ｄ．ら、Ｍｏｌ．  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：３３７４−３３７８、１９９１参照。加えて、好ましい実施形態において、キメラ受容体をコードする本発明のポリヌクレオチドは、その融合遺伝子、具体的には、インビトロでのポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、およびインビボでのネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を与える融合遺伝子を含有するレトロウイルスベクター、例えば、前記Ｌｕｐｔｏｎ  Ｓ．Ｄ．ら（１９９１）に記載されたＨｙＴＫレトロウイルスベクター内にある。優性ポジティブ選択マーカーをネガティブ選択マーカーと融合することに由来する二機能性選択可能融合遺伝子の使用について記載する、Ｓ．Ｄ．Ｌｕｐｔｏｎによる国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８４４２号および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１号の公報もまた参照されたい。
【００６１】
好ましいポジティブ選択マーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子由来であり、好ましいネガティブ選択マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ、ＶＺＶ  ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子由来である。特に好ましいマーカーは、ポジティブ選択マーカーがｈｐｈまたはｎｅｏ由来であり、かつネガティブ選択マーカーがシトシンデアミナーゼまたはＴＫ遺伝子由来である、二機能性選択可能融合遺伝子である。
【００６２】
当技術分野においてよく知られているように、Ｔリンパ球を形質導入するために様々な方法を用いることができる。例えば、レトロウイルス形質導入は、以下のように実行することができる：本明細書に記載されているようにＲＥＭを用いる刺激後１日目に、細胞に、２０〜３０ユニット／ｍｌのＩＬ−２を供給する；３日目、培地の半分を、標準方法に従って調製されたレトロウイルス上清と交換し、その後、培養液に、５ｕｇ／ｍｌのポリブレンおよび２０〜３０ユニット／ｍｌのＩＬ−２を追加する；４日目、細胞を洗浄し、２０〜３０ユニット／ｍｌのＩＬ−２を追加した新鮮な培地中にそれらを入れる；５日目、レトロウイルスへの曝露を繰り返す；６日目、３０ユニット／ｍｌのＩＬ−２を追加した、（例えば、レトロウイルスベクター内に与えられた抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を含有する）選択培地中に細胞を入れる；１３日目、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配分離を用いて死細胞から生細胞を分離し、その後、生細胞をサブクローニングする。
【００６３】
ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞は、ＣＡＲをコードする発現ベクターで改変することができる。実施形態において、その後、これらの細胞は、上記のようなナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞の亜集団へ、それらの細胞集団のそれぞれに固有の細胞表面抗原について選別することにより、さらに選別される。加えて、ＣＤ４＋細胞集団またはＣＤ８＋細胞集団は、それらのサイトカインプロファイルまたは増殖活性によって選択されてもよい。例えば、抗原で刺激された場合、疑似形質導入された細胞または形質導入されたＣＤ８＋細胞と比較して、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、およびＩＦＮγなどのサイトカインの産生の増強を生じるＣＤ４＋  Ｔリンパ球を選択することができる。他の実施形態において、ＩＬ−２および／またはＴＮＦαの産生の増強を生じるナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞が選択される。同様に、疑似形質導入されたＣＤ８＋細胞と比較して、ＩＦＮγ産生の増強を生じるＣＤ８＋細胞が選択される。
【００６４】
実施形態において、抗原に応答して増殖するＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞が選択される。例えば、抗原で刺激された場合、疑似形質導入された細胞またはＣＤ８＋の形質導入された細胞と比較して、活発に増殖するＣＤ４＋細胞が選択される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、抗原を有する細胞に対して細胞傷害性である、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞が選択される。実施形態において、ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ８＋細胞と比較して、細胞傷害性が弱いことが予想される。
【００６６】
本開示は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞とＣＤ８＋  Ｔ細胞の組み合わせが、組成物に利用されることを企図する。一実施形態において、ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋細胞の組み合わせは、そのＣＡＲと同じ抗原特異性のＣＤ８＋抗原反応性細胞と組み合わせることができる。他の実施形態において、ＣＡＲ形質導入されたＣＤ８＋細胞は、抗原反応性ＣＤ４＋細胞と組み合わされる。さらに別の実施形態において、ＣＡＲ改変型ＣＤ４＋細胞およびＣＡＲ改変型ＣＤ８＋細胞が組み合わされる。
【００６７】
本明細書に記載されているように、本開示は、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を、ナイーブ細胞集団、セントラルメモリー細胞集団、およびエフェクター細胞集団などの亜集団へさらに分離することができることを企図する。本明細書に記載されているように、いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ４＋細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陽性である。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陰性かつＣＤ４５ＲＯ陽性である。これらの集団のそれぞれは、独立して、ＣＡＲで改変されてもよい。
【００６８】
本明細書に記載されているように、実施形態において、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋サブセットとＣＤ６２Ｌ−サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体での染色後、ＣＤ６２Ｌ−  ＣＤ８＋画分およびＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ８＋画分へ選別される。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴＣＭの表現型マーカーの発現は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ１２７を含み、グランザイムＢについて陰性である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクターＴＥは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ１２７について陰性であり、グランザイムＢおよびパーフォリンについて陽性である。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ８＋  Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ１２７＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋により特徴づけられる。これらの集団のそれぞれは、独立して、ＣＡＲで改変されてもよい。
【００６９】
ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の亜集団のそれぞれは、お互いに組み合わせることができる。特定の実施形態において、改変型ナイーブＣＤ４＋細胞は、改変型セントラルメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞と組み合わされて、腫瘍細胞などの抗原を有する細胞への相乗的細胞傷害性効果をもたらす。
【００７０】
方法
本開示は、養子免疫療法組成物を作製する方法、および疾患もしくは障害を有する被験体において細胞免疫療法を実施するためのこれらの組成物の使用またはそれらを用いる方法を提供する。
【００７１】
実施形態において、該組成物を製造する方法は、改変型ナイーブＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞を得るステップであって、前記改変型ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む、ステップを含む。
【００７２】
別の実施形態において、方法は、改変型ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を得るステップであって、前記改変型細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８＋細胞を含む、ステップをさらに含む。
【００７３】
別の実施形態において、方法は、改変型ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を得るステップであって、前記改変型細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む、ステップを含み、かつ前記改変型ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパー細胞リンパ球細胞調製物と組み合わせるステップをさらに含む。
【００７４】
ＣＡＲで改変されているＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の調製については、上記および実施例に記載されている。抗原特異的Ｔリンパ球は、その疾患もしくは障害を有する患者から得ることができ、または抗原の存在下でのＴリンパ球のインビトロ刺激によって調製することができる。ＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球の亜集団はまた、本明細書に記載されているように、単離し、製造方法において組み合わせることができる。
【００７５】
本開示はまた、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、疾患または障害を有する被験体において細胞免疫療法を実施する方法を提供する。他の実施形態において、方法は、細胞免疫応答をもたらす遺伝子改変された細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物、ならびに直接的腫瘍認識を誘発し、かつ前記の遺伝子改変された細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物の細胞免疫応答を媒介する能力を強化する遺伝子改変されたヘルパーＴリンパ球細胞調製物を被験体に投与するステップであって、前記細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞を含み、前記ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む、ステップを含む。
【００７６】
別の実施形態において、疾患または障害を有する被験体において細胞免疫療法を実施する方法は、遺伝子改変されたヘルパーＴリンパ球細胞調製物を被験体に投与するステップであって、前記改変型ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達モジュールを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む、ステップを含む。実施形態において、方法は、遺伝子改変された細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物を被験体に投与するステップであって、前記改変型細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、疾患または障害に関連した抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達モジュールを含むキメラ抗原受容体を有するＣＤ８陽性細胞を含む、ステップをさらに含む。
【００７７】
別の実施形態は、疾患または障害を有する被験体において細胞免疫療法を実施する方法であって、その疾患または障害に関連した抗原の存在について被験体の生体試料を分析するステップ、および本明細書に記載された養子免疫療法組成物を投与するステップを含み、前記キメラ抗原受容体が前記抗原に特異的に結合する、方法を記載する。
【００７８】
固形腫瘍、がん、ウイルス感染、および寄生虫の感染などの疾患または状態に関連した抗原への特異的結合を提供する構成要素を有するＣＡＲが作製される。実施形態において、キメラ抗原受容体のＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達モジュールは、膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、またはＴ細胞共刺激分子の他のドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達分子は、ＣＤ３細胞内ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ３細胞内ドメインに連結したＣＤ２８膜貫通シグナル伝達ドメイン、またはＴ細胞共刺激分子の他のドメインを含む。
【００７９】
代替の実施形態において、Ｔ細胞は、組換えＴ細胞受容体で改変することができる。ＴＣＲは、任意の抗原、病原体、または腫瘍に特異的であり得る。メラノーマ（例えば、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００）、白血病（例えば、ＷＴ１、マイナー組織適合抗原）、乳がん（例えば、ｈｅｒ２、ＮＹ−ＢＲ１）における多くの腫瘍抗原についてのＴＣＲがある。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋  Ｔヘルパーリンパ球細胞は、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、またはバルクＣＤ４＋  Ｔ細胞からなる群から選択される。特定の実施形態において、ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球細胞は、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞であり、前記ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む。さらに他の実施形態において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞傷害性リンパ球細胞は、ナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞、またはバルクＣＤ８＋  Ｔ細胞からなる群から選択される。特定の実施形態において、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞は、セントラルメモリーＴ細胞であり、前記セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む。特定の実施形態において、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞は、セントラルメモリーＴ細胞であり、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球細胞は、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞である。
【００８１】
実施形態において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞はどちらも、病原体または腫瘍特異的細胞表面抗原を特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含むＣＡＲで遺伝子改変される。他の実施形態において、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと同じである。さらに他の実施形態において、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと異なる。
【００８２】
本発明によって処置することができる被験体は、一般的に、ヒト、ならびに獣医学を目的として、サルおよび類人猿などの他の霊長類の被験体である。被験体は男性（雄）または女性（雌）であり得、乳幼児、若年、青年、成人、および老人の被験体を含む、任意の適切な年齢であり得る。
【００８３】
前記方法は、例えば、固形腫瘍、血液系悪性腫瘍、メラノーマ、またはウイルスもしくは他の病原体による感染症の処置において有用である。病原体による感染症としては、ＨＩＶ疾患、ＨＣＶ疾患、ＨＢＶ疾患、ＣＭＶ疾患、および寄生虫症が挙げられる。いくつかの実施形態において、疾患または障害に関連した抗原は、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、およびＢ型肝炎表面抗原からなる群から選択される。
【００８４】
処置することができる被験体としては、限定されないが、結腸がん、肺がん、肝がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん（メラノーマを含む）、骨がん、および脳がんなどを含むがんに苦しめられている被験体が挙げられる。いくつかの実施形態において、メラノーマ、乳がん、扁平上皮癌腫、結腸がん、白血病、骨髄腫、前立腺がんなどの腫瘍関連抗原は知られている（これらの実施形態において、メモリーＴ細胞を、単離することができ、またはＴ細胞受容体遺伝子を導入することにより操作することができる）。他の実施形態において、腫瘍関連タンパク質は、操作された免疫受容体を発現する遺伝子改変されたＴ細胞で標的化することができる。例としては、Ｂ細胞リンパ腫、乳がん、前立腺がん、および白血病が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８５】
処置することができる被験体としてはまた、限定されないが、ウイルス感染症、レトロウイルス感染症、細菌感染症、および原虫感染症などを含む、感染疾患に苦しめられている被験体、またはそれを発症するリスクがある被験体が挙げられる。処置することができる被験体としては、限定されないが、移植患者等における、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染症、アデノウイルス感染症、ＢＫポリオーマウイルス感染症を含む、ウイルス感染症に苦しめられている免疫不全患者が挙げられる。
【００８６】
上記のように調製された細胞は、公知の技術、または本開示に基づいて当業者に明らかであろうそれらのバリエーションに従って、養子免疫療法のための方法および組成物において利用することができる。例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇらの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号を参照；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号も参照。
【００８７】
いくつかの実施形態において、細胞は、まず、細胞を培地から収集し、その後、細胞を洗浄および濃縮することにより、投与に適した媒体およびコンテナシステム（「薬学的に許容され得る」担体）において処置有効量で、製剤化される。適切な注入媒体は、任意の等張性媒体製剤、典型的には、生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ  Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）、またはＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であり得るが、５％ブドウ糖水溶液または乳酸リンゲル液もまた、利用することができる。注入媒体には、ヒト血清アルブミンを追加することができる。
【００８８】
組成物中の処置有効量の細胞は、少なくとも２個の細胞（例えば、１個のＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞サブセットおよび１個のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット）であり、またはより典型的には、１０２個より多い細胞で、かつ１０６個まで、１０８個または１０９個を含む個数までの細胞であり、１０１０個より多い細胞であり得る。細胞の数は、組成物の最終的な用途に依存するであろうし、それに含まれる細胞の型も同様であろう。例えば、特定の抗原に特異的である細胞が望まれる場合には、その集団は、７０％より多い、一般的には、８０％、８５％、および９０〜９５％より多いそのような細胞を含有するであろう。本明細書に提供される使用については、細胞は、一般的に、１リットル以下の体積であり、５００ｍｌ以下、さらに２５０ｍｌ以下または１００ｍｌ以下であり得る。したがって、所望の細胞の密度は、典型的には、１０６個の細胞／ｍｌより高く、一般的には、１０７個の細胞／ｍｌより高く、一般的には１０８個の細胞／ｍｌまたはそれ以上である。累積的に、１０９個、１０１０個、または１０１１個の細胞に等しく、またはそれを超える、臨床的に意義のある数の免疫細胞を、複数回に分わけて注入することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本発明のリンパ球は、個体に免疫を与えるために用いられてもよい。「免疫」とは、病原体または腫瘍へリンパ球応答が向けられて、その病原体の感染または腫瘍に対する応答に関連した１つまたは複数の身体症状が軽減することを意味する。投与される細胞の量は、通常、病原体に対する免疫を有する正常な個体に存在する範囲内である。したがって、細胞は、通常、注入によって投与され、各注入が２個の細胞から、少なくとも１０６個〜１０１０個の細胞／ｍ２までの範囲内、好ましくは少なくとも１０７〜１０９個の細胞／ｍ２の範囲内である。クローンは、単回注入により、またはある時間の範囲にわたっての複数回注入により、投与されてもよい。しかしながら、個体によって、応答性が異なることが予想されるため、注入される細胞の型および量、加えて、注入の回数、および複数回注入が与えられる時間範囲は、担当医によって決定され、定期検査によって決定することができる。十分なレベルの（細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパーＴリンパ球を含む）Ｔリンパ球の産生は、本明細書で例示されているように、本発明の迅速な増殖方法を用いて容易に達成できる。例えば、Ｒｉｄｄｅｌｌらの米国特許第６，０４０，１７７号、１７欄を参照。
【００９０】
本発明につき、下に示された実施例においてさらに例証する。
【実施例】
【００９１】
実験
実施例１  −  Ｔ細胞形質導入およびＣＡＲ発現の分析
ＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞内に発現することができ、ＲＯＲ１＋  Ｂ細胞腫瘍の特異的認識を与えるが、成熟した正常Ｂ細胞の認識を与えない。本発明者らは、健康なドナーまたはＣＬＬ患者由来のＴ細胞内に発現した場合、初代Ｂ−ＣＬＬおよびマントル細胞リンパ腫の特異的認識を与える、ＲＯＲ１特異的キメラ抗原受容体を構築した。
【００９２】
材料および方法
細胞系
エプスタイン・バーウイルスで形質転換されたＢ細胞（ＥＢＶ−ＬＣＬ）を記載されているように作製した（２５）。腫瘍細胞系Ｊｅｋｏ−１およびＢＡＬＬ−１は、Ｏｌｉｖｅｒ  Ｐｒｅｓｓ博士およびＪｅｒａｌｄ  Ｒａｄｉｃｈ博士（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）によって提供された。全ての細胞系を、ＲＰＭＩ、１０％ウシ胎仔血清、０．８ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＬＣＬ培地）中に維持した。Ｋ５６２細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。
【００９３】
Ｋ５６２細胞のＲＯＲ１でのトランスフェクション
ＲＯＲ１遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のために、全ＲＮＡをＢ−ＣＬＬ細胞から取得し（ＲＮｅａｓｙＰｌｕｓＫｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ）、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｃＤＮＡへ逆転写した。ＰＣＲを、特異的プライマー（ＲＯＲ１−Ｆ：５−ＸｈｏＩＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＴＧＣＡＣＣＧＧＣＣ−３およびＲＯＲ１−Ｒ：５−ＸｈｏＩ−ＣＡＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＧＴ−３）で、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ−ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実行した。ＰＣＲ産物をＭＩＧＲ−１レトロウイルスベクターへクローニングし（２３）、配列を検証した。Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ａ細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にＭＩＧＲ−１／ＲＯＲ１をトランスフェクションし、ＲＯＲ１コード化レトロウイルスを作製した。Ｋ５６２細胞を、３２℃において、２５００ｒｐｍで６０分間の遠心分離によりレトロウイルスによって形質導入し、増殖し、ＲＯＲ１陽性サブセットを選別精製した。
【００９４】
リアルタイム定量的ＰＣＲ
Ｂ−ＣＬＬ、正常な休止および活性化Ｂ細胞、ならびにＥＢＶ−ＬＣＬの第１鎖ｃＤＮＡを、前の段落で記載されているように、調製した。正常組織（ヒト組織パネルＩ／ＩＩ、血液画分）由来の第１鎖ｃＤＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈから入手した。ＲＯＲ１  ｍＲＮＡの発現を、二連で分析し、ＧＡＰＤＨに対して標準化した。増幅を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、２５μＬ  Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２．５ｎｇのｃＤＮＡ、ならびに以下の３００ｎＭの遺伝子特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる５０μＬの反応物中で実施した：
ＲＯＲ１−Ｆ  ５−ＡＧＣＧＴＧＣＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＴ−３、
ＲＯＲ１−Ｒ  ５−ＧＡＣＴＧＧＴＧＣＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＴ−３、
ＧＡＰＤＨ−Ｆ  ５−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３、
およびＧＡＰＤＨ−Ｒ  ５−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３。
【００９５】
サイクル閾値（Ｃｔ）を、ＳＤＳソフトウェアｖ２．２．２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定し、遺伝子発現のレベルを、比較Ｃｔ法を用いて計算した（２−（ΔΔＣｔ））。
【００９６】
ベクター構築およびレンチウイルスの生成
ＣＤ２０−ＣＡＲコード化レンチウイルスベクター（ＣＤ２０Ｒ−ｅｐＨＩＶ７）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コード化レンチウイルスベクター（ＧＦＰ−ｅｐＨＩＶ７）は以前に記載された（２４）。ＲＯＲ１−ＣＡＲを同じベクターにコードさせた。以前の研究において、初代Ｂ−ＣＬＬおよびＭＣＬ腫瘍系上に発現するヒトＲＯＲ１への特異的結合を示すマウスｍＡｂ（クローン２Ａ２）を作製し、クローニングし、特徴づけた。ｍＡｂ  ２Ａ２のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含有するｓｃＦｖをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ）、ＮｈｅＩおよびＲｓｒＩＩ制限部位を用いてＣＤ２０Ｒ−ｅｐＨＩＶ７へクローニングし、ＣＤ２０特異的ｓｃＦｖを置換した。Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、レンチウイルスベクターならびにパッケージングベクターｐＣＨＧＰ−２、ｐＣＭＶＲｅｖ２、およびｐＣＭＶ−Ｇを同時トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞において、レンチウイルスを産生した。トランスフェクションから１６時間後、培地を交換し、４８時間後、レンチウイルスを収集した。
【００９７】
レンチウイルス形質導入およびＣＡＲ形質導入Ｔ細胞クローンの単離
健康なドナーおよびＢ−ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣ、および選別精製されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を、抗ＣＤ３  ｍＡｂ（３０ｎｇ／ｍＬ）で活性化し（２５）、活性化後２日目および３日目に、３２℃、２５００ｒｐｍでの６０分間の遠心分離により、１μｇ／ｍＬポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および５０ＩＵ／ｍＬ組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）を追加したレンチウイルス上清において形質導入した。１０％ヒト血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ（ＣＴＬ培地）中、Ｔ細胞を増殖させた（２５）。増殖後、それぞれの形質導入されたＴ細胞系のアリコートを、ビオチンコンジュゲート化抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）ｍＡｂ、ストレプトアビジン−ＰＥ、および抗ＣＤ８  ｍＡｂで染色した。ＥＧＦＲ＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞を選別精製し、限界希釈（０．５細胞／ウェル）によってクローニングした（２５）。ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞を、ビオチン化組換えＦｃ−ＲＯＲ１細胞外ドメイン融合タンパク質およびストレプトアビジン−ＰＥでの染色により同定した。記載されているように（２６）、組換えＲＯＲ１タンパク質を、一過性にトランスフェクションされた２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において産生し、精製し、ＢｉｏｔｉｎＴａｇキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ビオチン化した。類似した様式で、ＧＦＰ形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって同定し、選別精製し、クローニングした。
【００９８】
クロム遊離アッセイおよびサイトカイン分泌アッセイ
標的細胞を、５１Ｃｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で一晩、標識し、洗浄し、１〜２×１０３個の細胞／ウェルで、エフェクターＴ細胞と、様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比において、三連でインキュベートした。４時間のインキュベーション後、γカウントのために上清を回収し、比溶解を、標準式を用いて計算した（２５）。
【００９９】
結果
形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ビオチン化抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂおよびストレプトアビジンコンジュゲート化色素を用いて選別精製した。選別精製されたＴ細胞の表面上のＲＯＲ１−ＣＡＲ発現を、ＲＯＲ１−ＣＡＲのｓｃＦｖに直接結合するビオチン化組換えＦｃ−ＲＯＲ１細胞外ドメイン誘導タンパク質で細胞を染色し、かつストレプトアビジンコンジュゲート体で共染色することにより、評価した。Ｆｃ−ＲＯＲ１タンパク質は、ＲＯＲ１−ＣＡＲレンチウイルスベクターを形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を特異的に染色したが、ＧＦＰをコードする対照レンチウイルスベクターを形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を染色しなかった（図１）。
【０１００】
本発明者らは、ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞クローン（ｎ＝１０）および対照ＧＦＰ形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞クローン（ｎ＝４）を、限界希釈により樹立し、複数のラウンドのインビトロ増殖後、ＣＡＲの安定的な表面発現を確認した。形質導入されていないＴ細胞クローンまたはＧＦＰ形質導入Ｔ細胞クローンと比較して、ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞クローンの成長に明らかな差はなかった（データ未呈示）。
【０１０１】
ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞クローンは、ＲＯＲ１遺伝子を安定的にトランスフェクションされた初代Ｂ−ＣＬＬ細胞およびＫ５６２細胞を効率的に溶解したが、未変性のＲＯＲ１陰性Ｋ５６２細胞は溶解せず、ＲＯＲ１の特異的認識を実証した（図２）。
【０１０２】
考察
ＣＡＲ改変型Ｔ細胞を用いる養子免疫療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍についての臨床治験において検討中である。標的化されることになっている表面分子は、Ｂ細胞系譜特異的であり、ＣＤ１９（プロＢ細胞段階からプラズマ細胞までの正常Ｂ系譜細胞上に発現している）、およびＣＤ２０（プレＢ細胞段階からメモリーＢ細胞までの正常Ｂ細胞上に発現している）が挙げられる。したがって、これらの分子を標的化する効果的な治療の予測される結果は、正常なＢ細胞およびＢ細胞前駆体の枯渇である。遺伝子発現プロファイリング研究により、悪性Ｂ細胞により優先的にまたは独占的に発現するが、正常Ｂ細胞によっては発現しない遺伝子が同定されており、ＲＯＲ１は、２つの独立した分析においてＣＬＬシグネチャー遺伝子として出現した（２７、２８）。ＲＯＲ１に対する特異的抗体は、ＣＤ１５４を発現するように改変された自己腫瘍細胞でのワクチン接種およびレナリドマイドでの処置後のＣＬＬ患者において、正常組織への明らかな毒性なしに、発生し、この腫瘍抗原が、免疫療法の適切な標的であり得ることを示唆した（２９、３０）。
【０１０３】
本発明者らの研究は、ＲＯＲ１−ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞で、ＲＯＲ１陽性悪性細胞を標的化する可能性を例証している。ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、バルクＰＢＭＣか、または動物モデルにおいて、養子移入後長期間、持続する（３１）選別精製されたＴＣＭのいずれかのレンチウイルス形質導入後の正常ドナーおよびＣＬＬ患者のどちらの由来でもあり得る。ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞は、初代Ｂ−ＣＬＬを効率的に溶解したが、正常な休止または活性化Ｂ細胞を溶解しなかった。これらのＴ細胞は、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞に応答して、ＴＮＦ−α、ＩＦＮγ、およびＩＬ−２を含むエフェクターサイトカインを産生し、増殖する能力があった。
【０１０４】
実施例２  −  ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系の作製およびエフェクター機能の分析
ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、健康なドナー／ＣＬＬ患者のＰＢＭＣから作製することができる。ＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞内に発現することができ、ＲＯＲ１＋  Ｂ細胞腫瘍の特異的認識を与えるが、成熟した正常Ｂ細胞の認識を与えない。
【０１０５】
材料および方法
細胞系
エプスタイン・バーウイルスで形質転換されたＢ細胞（ＥＢＶ−ＬＣＬ）を記載されているように作製した（２５）。腫瘍細胞系Ｊｅｋｏ−１およびＢＡＬＬ−１は、Ｏｌｉｖｅｒ  Ｐｒｅｓｓ博士およびＪｅｒａｌｄ  Ｒａｄｉｃｈ博士（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）によって提供された。全ての細胞系を、ＲＰＭＩ、１０％ウシ胎仔血清、０．８ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＬＣＬ培地）中に維持した。Ｋ５６２細胞および２９３Ｔ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、指示されているように培養した。
【０１０６】
Ｋ５６２細胞のＲＯＲ１でのトランスフェクション
ＲＯＲ１遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のために、全ＲＮＡをＢ−ＣＬＬ細胞から取得し（ＲＮｅａｓｙＰｌｕｓＫｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ）、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｃＤＮＡへ逆転写した。ＰＣＲを特異的プライマー（ＲＯＲ１−Ｆ：５−ＸｈｏＩＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＴＧＣＡＣＣＧＧＣＣ−３およびＲＯＲ１−Ｒ：５−ＸｈｏＩ−ＣＡＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＧＴ−３）で、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ−ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実行した。ＰＣＲ産物をＭＩＧＲ−１レトロウイルスベクターへクローニングし（２３）、配列を検証した。Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ａ細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にＭＩＧＲ−１／ＲＯＲ１をトランスフェクションし、ＲＯＲ１コード化レトロウイルスを作製した。Ｋ５６２細胞を、３２℃において、２５００ｒｐｍで６０分間の遠心分離によりレトロウイルスによって形質導入し、増殖し、ＲＯＲ１陽性サブセットを選別精製した。
【０１０７】
ベクター構築およびレンチウイルスの生成
ＣＤ２０−ＣＡＲコード化レンチウイルスベクター（ＣＤ２０Ｒ−ｅｐＨＩＶ７）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コード化レンチウイルスベクター（ＧＦＰ−ｅｐＨＩＶ７）は以前に記載された（２４）。ＲＯＲ１−ＣＡＲを同じベクターにコードさせた。以前の研究において、初代Ｂ−ＣＬＬおよびＭＣＬ腫瘍系上に発現するヒトＲＯＲ１への特異的結合を示すマウスｍＡｂ（クローン２Ａ２）を作製し、クローニングし、特徴づけた。ｍＡｂ  ２Ａ２のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含有するｓｃＦｖをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ）、ＮｈｅＩおよびＲｓｒＩＩ制限部位を用いてＣＤ２０Ｒ−ｅｐＨＩＶ７へクローニングし、ＣＤ２０特異的ｓｃＦｖを置換した。Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、そのレンチウイルスベクターならびにパッケージングベクターｐＣＨＧＰ−２、ｐＣＭＶＲｅｖ２、およびｐＣＭＶ−Ｇを同時トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞において、レンチウイルスを産生した。トランスフェクションから１６時間後、培地を交換し、４８時間後、レンチウイルスを収集した。
【０１０８】
レンチウイルス形質導入およびＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞系の単離
ＣＤ４＋  Ｔ細胞を健康なドナーのＰＢＭＣから単離し、抗ＣＤ３  ｍＡｂ（３０ｎｇ／ｍＬ）で活性化し（２５）、活性化後２日目および３日目に、３２℃、２５００ｒｐｍでの６０分間の遠心分離により、１μｇ／ｍＬポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および５０ＩＵ／ｍＬ組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）を追加したレンチウイルス上清において形質導入した。１０％ヒト血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ（ＣＴＬ培地）中、Ｔ細胞を増殖させた（２５）。増殖後、それぞれの形質導入されたＴ細胞系のアリコートを、ビオチンコンジュゲート化抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）ｍＡｂ、ストレプトアビジン−ＰＥ、および抗ＣＤ４  ｍＡｂで染色した。ＥＧＦＲ＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞を選別精製し、増殖させた。ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞を、ビオチン化組換えＦｃ−ＲＯＲ１細胞外ドメイン融合タンパク質およびストレプトアビジン−ＰＥでの染色により同定した。記載されているように（２６）、組換えＲＯＲ１タンパク質を、一過性にトランスフェクションされた２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において産生し、精製し、ＢｉｏｔｉｎＴａｇキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ビオチン化した。類似した様式で、ＧＦＰ形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって同定し、選別精製し、クローニングした。
【０１０９】
クロム遊離アッセイおよびサイトカイン分泌アッセイ
標的細胞を、５１Ｃｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で一晩、標識し、洗浄し、１〜２×１０３個の細胞／ウェルで、エフェクターＴ細胞と、様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比において、三連でインキュベートした。４時間のインキュベーション後、γカウントのために上清を回収し、比溶解を、標準式を用いて計算した（２５）。サイトカイン分泌の分析のために、標的細胞およびエフェクター細胞を、２：１のＥ／Ｔ比で、三連のウェル中に蒔き、インターフェロン（ＩＮＦγ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−２を、２４時間のインキュベーション後取り出された上清において、マルチプレックスサイトカインイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）により測定した。
【０１１０】
ＣＦＳＥ増殖アッセイ
Ｔ細胞を、０．２μＭカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、洗浄し、１０Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−２を含有するＣＴＬ培地において２：１の比で刺激細胞と共に蒔いた。７２時間のインキュベーション後、細胞を、抗ＣＤ４  ｍＡｂおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で標識して、分析から死細胞を排除した。試料を、フローサイトメトリーによって分析し、生きているＣＤ４＋  Ｔ細胞の細胞分裂をＣＦＳＥ希釈によって評価した。
【０１１１】
共培養アッセイ
ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を、ＣＦＳＥで標識し、２：１、１：１、および１：２の比で共培養した。その後、共培養物を、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞および対照Ｋ５６２細胞で刺激し、細胞増殖を、５日間のインキュベーション後、ＣＦＳＥ色素希釈アッセイによって測定した。フロー分析のために、試料を、コンジュゲート化抗ＣＤ８  ｍＡｂおよびコンジュゲート化抗ＣＤ４  ｍＡｂで染色し、ＣＤ８＋サブセットとＣＤ４＋サブセットを区別した。
【０１１２】
結果
健康なドナーおよびＣＬＬ患者のＰＢＭＣからのＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の作製
本発明者らは、ＲＯＲ１、癌胎児性チロシンキナーゼ受容体が、ＣＬＬおよびＭＣＬ上に一律に発現することを示し、ＣＤ８＋  Ｔ細胞内に発現する場合、悪性Ｂ細胞の特異的認識を与えるが、成熟した正常Ｂ細胞の認識を与えない抗ＲＯＲ１  ｍＡｂ由来のＲＯＲ１−ＣＡＲを開発した（３２）。ここで、本発明者らは、ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製して、直接的な腫瘍認識、およびＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬを強化するそれらの能力を分析した。ＣＡＲ改変型ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、健康なドナー（ｎ＝４）およびＣＬＬ患者（ｎ＝４）のバルク末梢ＣＤ４＋  Ｔ細胞から、ＲＯＲ１−ＣＡＲコード化レンチウイルスベクターを用いて容易に作製することができた。このベクターにおいて、本発明者らは、形質導入マーカーとして、および抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂを用いた導入遺伝子発現Ｔ細胞の濃縮のための両方の役割を果たすように、ＲＯＲ１−ＣＡＲおよび自己切断可能な２Ａエレメントの下流に切断型ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体、ｔＥＧＦＲ）ドメインをコードさせた（図３）。本発明者らは、ｔＥＧＦＲマーカーを用いて、ＲＯＲ１−ＣＡＲコード化レンチウイルスでの単回形質導入（ＭＯＩ＝３）後１２日目においてＣＡＲ改変型Ｔ細胞の頻度を決定し、同じ個体から得られたＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系と比較して、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系において、一貫してより高い形質導入効率を見出した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞の表面上のＲＯＲ１−ＣＡＲの発現を確認するために、本発明者らが、ＲＯＲ１−ＣＡＲのｓｃＦｖに直接結合するビオチン化組換えＦｃ−ＲＯＲ１細胞外ドメイン融合タンパク質を利用したところ、ＲＯＲ１−ＣＡＲレンチウイルスを形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を特異的に染色したが、形質導入されていない対照ＣＤ４＋  Ｔ細胞は染色しなかった（図３）。本発明者らは、ｔＥＧＦＲマーカーを用いて、導入遺伝子を発現するＣＤ４＋  Ｔ細胞を濃縮し、抗ＣＤ３  ｍＡｂでの刺激によりＣＡＲ陽性Ｔ細胞サブセットを増殖した。ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の３−ｌｏｇより多い増殖を、１４日間の刺激サイクルの終わりに達成することができ、それは、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬにおいて観察された増幅と等しい。増殖後、本発明者らは、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞表面上のＲＯＲ１−ＣＡＲの安定的発現を確認し（データ未呈示）、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞の認識について分析した。
【０１１３】
ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞はＲＯＲ１陽性腫瘍を特異的に認識する
本発明者らは、ＲＯＲ１陽性初代腫瘍細胞およびＲＯＲ１陽性腫瘍細胞系に対するＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞のエフェクター機能を分析した。本発明者らは、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の直接的細胞傷害性を与える能力を、クロム遊離アッセイ（ＣＲＡ）により分析し、標準の４時間のインキュベーションの終わりに、ＲＯＲ１陽性標的細胞の弱いが、特異的な溶解を検出した（図４）。本発明者らは、ＣＲＡを１０時間まで延長し、比溶解のさらなる増加を観察したが、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の全体の細胞溶解活性は、まだＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬより低かった（図２、４）。健康なドナーとＣＬＬ患者のどちらの由来のＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞も、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡにより、初代ＣＬＬ細胞、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞系Ｊｅｋｏ−１（ＭＣＬ）およびＢＡＬＬ−１（Ｂ−ＡＬＬ）、ならびにＲＯＲ１遺伝子を安定的にトランスフェクションされたＫ５６２細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）を特異的に認識したが、未変性のＲＯＲ１陰性Ｋ５６２細胞を認識せず、標的細胞の細胞表面上のＲＯＲ１の特異的認識を実証した（図５Ａ）。マルチプレックスサイトカイン分析により、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬと比較して有意に高いレベルでのＴＮＦ−αおよびＩＬ−２などの他のＴｈ１サイトカインの産生、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１７の産生が明らかにされた（図５Ｂ）。
【０１１４】
次に、本発明者らは、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞での刺激後のＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を、ＣＦＳＥ染色によって評価し、いかなる潜在的非特異的刺激も除去するために外因性サイトカインの添加なしのストリンジェントな培養条件を用いた。ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞に応答して、劇的かつ特異的な増殖を示した。増殖するように誘導されたＴ細胞のパーセンテージ、および増殖サブセットが行う細胞分裂の回数のどちらも、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞においての方が有意に高かった（図６）。まとめると、本発明者らのデータは、健康なドナーおよびＣＬＬ患者のどちらから得られたＣＤ４＋  Ｔ細胞も、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲでの遺伝子改変後、抗腫瘍反応性を獲得することを実証している。さらに、外因性サイトカインの非存在下で増殖する能力、および高レベルのＴｈ１サイトカインを産生する能力により、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲを通しての刺激後に典型的なヘルパー機能を発揮し、直接的抗腫瘍効果を与えることに加えて、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬを強化するためにも利用され得ることが示唆される。
【０１１５】
ＣＡＲ改変型ＣＤ４＋  Ｔ細胞はＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬを援助するが、形質導入されていないＣＤ４＋  Ｔ細胞は援助しない  ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬを援助することができるかどうかを分析するために、本発明者らは、健康なドナーおよびＣＬＬ患者から樹立した、ＣＡＲ形質導入されたポリクローナルのＣＤ４＋  Ｔ細胞系およびＣＤ８＋  Ｔ細胞系、ならびに対照の形質導入されていないポリクローナルのＣＤ４＋  Ｔ細胞系およびＣＤ８＋  Ｔ細胞系での共培養実験を行った。援助の提供についての読み出しとして、本発明者らは、単独で培養されたＣＤ８＋  Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の存在下での腫瘍特異的ＣＤ８＋エフェクター機能の向上を定義した。本発明者らは、ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞かまたは形質導入されていない対照ＣＤ４＋  Ｔ細胞のいずれかを、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬと、異なるＣＤ４：ＣＤ８比（２：１、１：１、１：２）で組み合わせ、それらをＲＯＲ１陽性腫瘍細胞で刺激し、ＣＦＳＥ色素希釈により増殖を測定した。本発明者らは、ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞のＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬへの添加が、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬ単独と比較して、ＣＤ８＋サブセットの特異的増殖を有意に増加させるが、形質導入されていないＣＤ４＋  Ｔ細胞は有意には増加させないことを見出した（図７）。増殖の増加は、少なくとも等量のＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞（２：１または１：１のＣＤ４：ＣＤ８比）が共培養に加えられた場合、最も顕著であった。形質導入されていないＣＤ４＋  Ｔ細胞と形質導入されていないＣＤ８＋  Ｔ細胞との組み合わせは、追加的な対照としての役割を果たし、ＣＤ８＋サブセットにおいて非特異的増殖を誘導しなかった（データ未呈示）。
【０１１６】
考察
遺伝子発現プロファイリング研究により、悪性Ｂ細胞により優先的にまたは独占的に発現するが、正常Ｂ細胞によっては発現しない遺伝子が同定されており、ＲＯＲ１は、２つの独立した分析においてＣＬＬシグネチャー遺伝子として出現した（２７、２８）。本発明者らの研究は、ＲＯＲ１陽性悪性細胞を、ＲＯＲ１−ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞で標的化する可能性を例証している。ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、バルクＰＢＭＣかまたは選別精製されたＴ細胞のいずれかのレンチウイルス形質導入後の正常ドナー由来であり得る。ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞は、初代Ｂ−ＣＬＬを効率的に溶解したが、正常な休止または活性化Ｂ細胞を溶解しなかった。ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞は、初代Ｂ−ＣＬＬを弱く溶解したが、正常な休止または活性化Ｂ細胞を溶解しなかった。これらのＴ細胞は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０を含むエフェクターサイトカインを産生した。ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞は、形質導入されたＣＤ８＋細胞より有意に高い量のサイトカインを産生した。どちらの細胞型も、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞に応答して増殖する能力があった。この場合もやはり、ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬより２〜３倍多く増殖した。これらの結果は、形質導入されたＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が、典型的なヘルパー機能を発揮することを示しており、それらが、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬを強化するために利用され得ることを示唆している。
【０１１７】
実施例３  −  ナイーブサブセット、セントラルメモリーサブセット、およびエフェクターメモリーサブセットに由来したＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞のエフェクター機能
ナイーブサブセット、セントラルメモリーサブセット、およびエフェクターメモリーサブセットから引き出され、その後、ＲＯＲ１  ＣＡＲで改変されたＣＤ４  Ｔ細胞のエフェクター機能を比較した。
【０１１８】
材料および方法
ナイーブＣＤ４細胞、セントラルメモリーＣＤ４細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ４細胞の選別精製
健康なドナーのＰＢＭＣから、触れられていないＣＤ４＋  Ｔ細胞を生じるネガティブ磁気ビーズ選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ４単離キット）を用いて、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を単離した。ＣＤ４＋画分を、コンジュゲート化抗ＣＤ４５ＲＡ  ｍＡｂ、抗ＣＤ４５ＲＯ  ｍＡｂ、および抗ＣＤ６２Ｌ  ｍＡｂで標識し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフロー選別機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフロー選別精製し、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ４５ＲＯ−  ＣＤ６２Ｌ＋）、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−  ＣＤ４５ＲＯ＋  ＣＤ６２Ｌ＋）、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−  ＣＤ４５ＲＯ＋  ＣＤ６２Ｌ−）を、これらの定義されたマーカーの発現に基づいて精製した。
【０１１９】
ＣＦＳＥ増殖アッセイ
Ｔ細胞を、０．２μＭカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、洗浄し、１０Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−２を含有するＣＴＬ培地において２：１の比で刺激細胞と共に蒔いた。７２時間のインキュベーション後、細胞を、抗ＣＤ８  ｍＡｂまたは抗ＣＤ４  ｍＡｂ、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で標識して、分析から死細胞を排除した。試料を、フローサイトメトリーによって分析し、生きているＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞の細胞分裂をＣＦＳＥ希釈によって評価した。
【０１２０】
サイトカインアッセイ
サイトカイン分泌の分析のために、標的細胞およびエフェクター細胞を、２：１のＥ／Ｔ比で、三連のウェル中に蒔き、インターフェロン（ＩＮＦγ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−２を、２４時間のインキュベーション後取り出された上清において、マルチプレックスサイトカインイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）により測定した。
【０１２１】
結果
本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ６２Ｌの発現に基づいた３人の健康なドナーの末梢血からＣＤ４＋  Ｎ  Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＣＭ）、およびエフェクターメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＥＭ）をフロー選別精製し（図８Ａ）、ＲＯＲ１−ＣＡＲでの改変後のそれらのエフェクター機能を比較した。本発明者らは、その３つのサブセットのそれぞれに由来するＣＡＲ  Ｔ細胞系において同様に高い形質導入効率を達成した。導入遺伝子を発現するＴ細胞の濃縮後の多パラメータフローサイトメトリーは、レンチウイルス形質導入後の活性化表現型と一致した、ＣＤ４＋  Ｎ  ＣＡＲ  Ｔ細胞系におけるＣＤ４５ＲＯの発現およびＣＤ４５ＲＡの消失を示した。ＣＤ４＋  Ｎ  ＣＡＲ  Ｔ細胞系、ＣＤ４＋  ＣＭ  ＣＡＲ  Ｔ細胞系、およびＣＤ４＋  ＥＭ  ＣＡＲ  Ｔ細胞系は、ＣＤ６２Ｌの発現差異を保持しており、最初のフロー選別精製が高純度で実行されたことが確認された。
【０１２２】
その後、本発明者らは、Ｎサブセット、ＣＭサブセット、およびＥＭサブセット由来のＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍認識、サイトカイン分泌、および増殖を分析し、バルクＣＤ４＋  Ｔ細胞から生じたＣＡＲ  Ｔ細胞系とそれらを比較した。本発明者らは、その細胞系のそれぞれにおいて、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡによりＲＯＲ１陽性腫瘍細胞の特異的認識を観察した。マルチプレックスサイトカイン分析により、Ｎサブセット由来のＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、群を抜いて最も高いレベルのＴｈ１サイトカイン、特にＩＬ−２を産生することが明らかにされ（図８Ｃ）、ＣＦＳＥ色素希釈により、それらが、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞での刺激に応答して最も活発に増殖することが示された（図８Ｂ）。
【０１２３】
考察
本発明者らの研究は、ＲＯＲ１−ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞でＲＯＲ１陽性悪性細胞を標的化する可能性を例証している。ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、どちらも、バルクＰＢＭＣかまたは、定義されたナイーブＴ細胞サブセットもしくはメモリーＴ細胞サブセットから選別精製されたＴ細胞のいずれかのレンチウイルス形質導入後の正常ドナー由来であり得る。ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４＋セントラルメモリーＴ細胞、およびＣＤ４＋エフェクターＴ細胞は、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０を含むエフェクターサイトカインを産生した。ナイーブサブセット由来のＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋細胞は、ＣＡＲを通してのシグナル伝達後、セントラルメモリー由来のＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびエフェクターメモリー由来ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞より有意に高い量のＴＮＦαおよびＩＬ−２を産生した。全てのＣＤ４細胞型は、ＲＯＲ１／Ｋ５６２に応答して増殖する能力があったが、ナイーブサブセット由来のＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋細胞において、増殖するように誘導されたＴ細胞のパーセンテージ、および増殖サブセットが起こした細胞分裂の回数は、有意に高かった。サイトカインプロファイルおよび増殖能力の両方は、ナイーブＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬを強化するのに最も良く適している可能性があることを示している。
【０１２４】
実施例４  −  ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞がメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞より良いヘルパーである  ナイーブの形質導入型ＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリーの形質導入型ＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターの形質導入型ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、形質導入型ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球と共培養し、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞での刺激に応答した、それらの細胞の増殖応答を測定した。
【０１２５】
材料および方法
共培養
ナイーブ由来ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞、セントラルメモリー由来ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびエフェクターメモリー由来ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞、ならびにナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞由来ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびセントラルメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞由来ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を、ＣＦＳＥで標識し、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系およびＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系を、１：１比で共培養した。その後、共培養物を、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞および対照Ｋ５６２細胞で刺激し、細胞増殖を、５日間のインキュベーション後、ＣＦＳＥ色素希釈アッセイによって測定した。フロー分析のために、試料を、コンジュゲート化抗ＣＤ８  ｍＡｂおよびコンジュゲート化抗ＣＤ４  ｍＡｂで染色して、ＣＤ８＋サブセットとＣＤ４＋サブセットを区別した。
【０１２６】
結果
ＣＤ４＋ナイーブＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬのエフェクター機能を強化する優れた能力を有する
本発明者らは、ＣＤ４＋  Ｎ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の有利なサイトカインプロファイルおよび増殖ポテンシャルがまた、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬへの最も強いヘルパー効果へと変換されるかどうかを決定するために、ＣＤ４＋  Ｎ  ＣＡＲ  Ｔ細胞系、ＣＤ４＋  ＣＭ  ＣＡＲ  Ｔ細胞系、およびＣＤ４＋  ＥＭ  ＣＡＲ  Ｔ細胞系のヘルパー機能を比較した。以前の研究により、Ｎ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞とＣＭ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞とＥＭ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の間に、養子免疫療法のためのそれらの潜在的有用性に影響する本質的相違があることが実証されている。本発明者らのグループは、最近、ＣＭ由来ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、養子移入後、長期間持続することができるが、ＥＭ由来ＣＤ８＋  Ｔ細胞はできないことを示しており、それゆえに、ＣＭ由来ＣＤ８＋  Ｔ細胞は免疫療法のためのＣＤ８＋  Ｔ細胞の好ましいサブセットである（３３、３４）。他のグループは、ＣＤ８＋  Ｎ  Ｔ細胞もまたＴ細胞治療に用いられる有利な形質を有する可能性があると示唆した（３５、３６）。したがって、本発明者らは、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞サブセットおよびＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞サブセットの最適な組み合わせを決定するために、選別精製されたＮ  Ｔ細胞およびＣＭ  Ｔ細胞からＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬを作製した。レンチウイルス形質導入、およびｔＥＧＦＲマーカーを用いたＣＡＲ形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の濃縮後、本発明者らは、ＣＤ８＋  Ｎ  ＣＡＲ  ＣＴＬおよびＣＤ８＋  ＣＭ  ＣＡＲ  ＣＴＬの腫瘍反応性を確認し（データ未呈示）、前のように、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞との共培養実験を行った。予測されたように、ＣＤ８＋  Ｎ  ＣＡＲ  ＣＴＬおよびＣＤ８＋  ＣＭ  ＣＡＲ  ＣＴＬのＣＤ４＋  Ｎ  ＣＡＲ  Ｔ細胞との共培養は、ＣＤ４＋  ＣＭ  ＣＡＲ  Ｔ細胞もしくはＣＤ４＋  ＥＭ  ＣＡＲ  Ｔ細胞との共培養、またはＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬ単独と比較して、有意に高いＣＤ８＋サブセットの腫瘍特異的増殖をもたらした（図９）。全ての組み合わせのうち、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞での刺激に応答した、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬの最大増殖は、ＣＤ４＋  Ｎ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ８＋  ＣＭ  ＣＡＲ  ＣＴＬとの共培養後に観察された（図９）。まとめると、本発明者らのデータは、Ｎ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＭ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびＥＭ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の間に、それらのサイトカインプロファイルおよび増殖ポテンシャルにおける本質的相違があり、ＣＤ４＋  Ｎ  Ｔ細胞においてＩＬ−２の産生がより高く、増殖がより優勢であることを実証している。本発明者らのデータは、選別精製されたＣＭ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＥＭ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞、またはバルクＣＤ４＋  Ｔ細胞よりむしろ、選別精製されたＮ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋  ＣＴＬのエフェクター機能を強化するのに最も良く適している可能性があることを示唆し、ＣＭ由来ＣＤ８＋  Ｔ細胞が養子免疫療法に用いられる有利な特徴を有するという、ＣＤ８＋  Ｔ細胞における以前の研究を補完している。
【０１２７】
考察
まとめると、これらのデータは、ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型ＣＤ８＋  Ｔ細胞の養子移入が、侵襲性全身性リンパ腫のインビボモデルにおいて強力な抗腫瘍応答を与えることを実証し、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬの抗腫瘍効力へのＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の有益かつ相乗的な効果についての証拠を提供している。本発明者らのデータは、どのようにして、細胞固有の質の分析が、腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞および腫瘍特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の両方を含有する細胞製造物の理論的な設計に情報を与えて、がん免疫療法の結果を向上させることができるかを例証している。
【０１２８】
実施例５  −  全身性マントル細胞リンパ腫のマウス腫瘍モデル（ＮＳＧ／Ｊｅｋｏ−１−ｆｆＬｕｃ）
本発明者らは、侵襲性全身性マントル細胞リンパ腫のインビボモデルにおいて、ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型ＣＤ８＋  ＣＴＬの抗腫瘍効力への、ＣＤ４のヘルパー効果を調べた。
【０１２９】
材料および方法
致死量以下で照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ガンマ−／−（ＮＳＧ）マウスに、生物発光画像法を用いて腫瘍量および腫瘍分布の評価を可能にするためにホタルルシフェラーゼで安定的にトランスフェクションされている５×１０５個のＪｅｋｏ−１細胞（Ｊｅｋｏ−１／ｆｆＬｕｃ）を尾静脈注射によって生着させた。本発明者らは、これらの条件下で、ＮＳＧマウスにおいて、急速進行性播種性リンパ腫の一貫した生着（生着率＝１００％）および発症を確認した。腫瘍生着後、３匹のマウスの群は、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬ（群１）、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞（群２）、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入型Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入型Ｔ細胞の組み合わせ（群３）、形質導入されていない対照Ｔ細胞（群４、５、６）のいずれかを尾静脈注射によって受け、または処置を受けなかった（群７）。移入されたＴ細胞の総数は、全ての場合において１０×１０６個であった。本発明者らは、養子移入から２日後、マウスから眼の血液を採取し、末梢血におけるＲＯＲ１−ＣＡＲ形質導入型Ｔ細胞または形質導入されていないＴ細胞の存在を確認した。
【０１３０】
結果
Ｔ細胞移入後６日目、本発明者らは、腫瘍量を評価するために生物発光画像法を実施した。ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせを受けたマウスにおいて、最も強い抗腫瘍効果が観察され、対照群と比較して生物発光シグナルの＞２  ｌｏｇの低下があった（図１０）。本発明者らはまた、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞かまたはＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞のいずれかを受けたマウスにおいて強い抗腫瘍効果を観察し、対照と比較して生物発光シグナルの＞１  ｌｏｇの低下があった（図１０）。重要なことには、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞組み合わせの投与後の腫瘍量の低下は、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬ群の腫瘍量の低下とＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞群の腫瘍量の低下を合わせたものより大きく、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬが相乗的に働いていたことを示唆した。
【０１３１】
考察
まとめると、これらのデータは、ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型ＣＤ８＋  Ｔ細胞の養子移入が、侵襲性全身性リンパ腫のインビボモデルにおいて強力な抗腫瘍応答を与えることを実証し、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬの抗腫瘍効力へのＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の有益かつ相乗的な効果についての証拠を提供している。本発明者らのデータは、どのようにして、細胞固有の質の分析が、腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞および腫瘍特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の両方を含有する細胞製造物の理論的な設計に情報を与えて、がん免疫療法の結果を向上させることができるかを例証している。
【０１３２】
実施例６  −  ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は同じ相乗作用を示す
本発明者らは、インビトロでの共培養において、および侵襲性全身性マントル細胞リンパ腫のインビボモデルにおいて、ＣＤ１９改変型ＣＤ８＋  ＣＴＬの抗腫瘍効力への、ＣＤ４のヘルパー効果を調べた。
【０１３３】
材料および方法
ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、米国特許出願公開第２００８／０１３１４１５号（参照により本明細書に組み入れられている）に記載されているように調製することができる。
【０１３４】
共培養アッセイ
ＣＤ１９−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ１９−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を、ＣＦＳＥで標識し、２：１、１：１、および１：２の比で共培養した。その後、共培養物を、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞および対照Ｋ５６２細胞で刺激し、細胞増殖を、５日間のインキュベーション後、ＣＦＳＥ色素希釈アッセイによって測定した。フロー分析のために、試料を、コンジュゲート化抗ＣＤ８  ｍＡｂおよびコンジュゲート化抗ＣＤ４  ｍＡｂで染色し、ＣＤ８＋サブセットとＣＤ４＋サブセットを区別した。
【０１３５】
インビボモデル
致死量以下で照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ガンマ−／−（ＮＳＧ）マウスに、生物発光画像法を用いて腫瘍量および腫瘍分布の評価を可能にするためにホタルルシフェラーゼで安定的にトランスフェクションされている５×１０５個のＪｅｋｏ−１細胞（Ｊｅｋｏ−１／ｆｆＬｕｃ）を尾静脈注射によって生着させた。本発明者らは、これらの条件下で、ＮＳＧマウスにおいて、急速進行性播種性リンパ腫の一貫した生着（生着率＝１００％）および発症を確認した。腫瘍生着後、３匹のマウスの群は、ＣＤ８＋  ＣＤ１９  ＣＡＲ  ＣＴＬ（群１）、ＣＤ４＋  ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（群２）、ＣＤ８＋  ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入型Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入型Ｔ細胞の組み合わせ（群３）、形質導入されていない対照Ｔ細胞（群４、５、６）のいずれかを尾静脈注射によって受け、または処置を受けなかった（群７）。移入されたＴ細胞の総数は、全ての場合において１０×１０６個であった。本発明者らは、養子移入から２日後、マウスから眼の血液を採取した。
【０１３６】
結果
図１０は、ＣＤ１９＋マントル細胞リンパ腫腫瘍系Ｊｅｋｏ−１で刺激された、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  ＣＴＬおよびＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞系に関する共培養実験におけるセントラルメモリー由来ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬの腫瘍特異的増殖を強化する、ナイーブサブセット由来のＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系の優れた能力を示す。しかし、セントラルメモリーサブセットまたはエフェクターメモリーサブセット由来のＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞系は、セントラルメモリー由来のＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬの腫瘍特異的増殖を、はるかに低い程度で強化する。
【０１３７】
図１１は、免疫不全マウスのリンパ腫モデル（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−Ｒａｊｉ）において、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞が非依存的に、直接的抗腫瘍効力を与えることを示す。マウスは、ＣＤ１９−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ８＋セントラルメモリー由来Ｔ細胞もしくは対照の偽形質導入されたＣＤ８＋セントラルメモリー由来Ｔ細胞（Ａ）、またはＣＤ１９−ＣＡＲ形質導入されたＣＤ４＋ナイーブ由来Ｔ細胞もしくは対照の偽形質導入されたＣＤ４＋ナイーブ由来Ｔ細胞（Ｂ）のいずれかを受けた。
【０１３８】
図１２は、全身性マントル細胞リンパ腫のマウス腫瘍モデル（ＮＳＧ／Ｊｅｋｏ−１−ｆｆＬｕｃ）における、ＣＤ４＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型Ｔ細胞の、ＣＤ８＋  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＣＴＬの抗腫瘍効力への強化および相乗効果を示す。全身性侵襲性マントル細胞リンパ腫のマウス腫瘍モデル（ＮＳＧ／Ｊｅｋｏ−１）におけるＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＲＯＲ１−ＣＡＲ改変型ＣＤ４＋  Ｔ細胞の抗腫瘍効力は、いずれかの細胞集団単独と比較した場合、または形質導入されていない細胞と比較した場合、増強されていた。
【０１３９】
図１３は、全身性リンパ腫のマウスモデル（ＮＳＧ／Ｒａｊｉ）におけるＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の相乗作用を示す。腫瘍接種後６日目に、生物発光画像法によりＲａｊｉ腫瘍の生着が確認された（処置前）（処置スキームはＡに示されており、生物発光による腫瘍生着はＢに示されている）。生物発光画像法を用いた腫瘍量の分析により、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスのコホート、およびＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせ型製造物で処置されたマウスにおいてＲａｊｉ腫瘍の完全な根絶が示された（Ｂ、処置後の中央の黒色バーおよび灰色バー）。その後、マウスを、Ｒａｊｉ腫瘍細胞の２回目の接種で曝露させ、末梢血におけるＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の頻度、ならびに腫瘍生着を分析した。ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせ型製造物で処置されたマウスにおける、腫瘍曝露後の有意により高いレベルのＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｃの下方のパネル）、およびＲａｊｉ接種物の完全な拒絶（Ｂ、腫瘍曝露後の右の灰色バー）。対照的に、ＣＤ８＋  ＣＤ１９−ＣＡＲ  ＣＴＬ単独を受けたマウスにおいて、本発明者らは、腫瘍曝露後にＣＡＲ  Ｔ細胞の増加を検出せず（Ｃ）、Ｒａｊｉ腫瘍細胞は生着することができた（パネルＢ、腫瘍曝露後の右の黒色バー）。
【０１４０】
考察
まとめると、これらのデータは、別（ＣＤ１９）のＣＡＲ構築物を細胞に形質導入すること、すなわち、ＣＤ１９−ＣＡＲ改変型ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ１９−ＣＡＲ改変型ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、侵襲性全身性リンパ腫のインビボモデルにおいて強力な抗腫瘍応答を与えることを実証し、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  ＣＴＬの抗腫瘍効力へのＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の有益かつ相乗的な効果についての証拠を提供している。
【０１４１】
前述は、本発明の例証となるものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲、加えて、それに含まれ得る特許請求の範囲の等価物により定義される。本明細書で言及された全ての引例および文献は、参照により本明細書に組み入れられている。
【０１４２】
参考文献
【０１４３】
【表１−１】
2019108403.tif 000002
【０１４４】
【表１−２】
2019108403.tif 000003
【０１４５】
【表１−３】
2019108403.tif 000004
【図１】
2019108403.tif 000005
【図２】
2019108403.tif 000006
【図３】
2019108403.tif 000007
【図４】
2019108403.tif 000008
【図５】
2019108403.tif 000009
【図６】
2019108403.tif 000010
【図７】
2019108403.tif 000011
【図８Ａ】
2019108403.tif 000012
【図８Ｂ】
2019108403.tif 000013
【図８Ｃ】
2019108403.tif 000014
【図８Ｄ】
2019108403.tif 000015
【図９】
2019108403.tif 000016
【図１０】
2019108403.tif 000017
【図１１Ａ】
2019108403.tif 000018
【図１１Ｂ】
2019108403.tif 000019
【図１２】
2019108403.tif 000020
【図１３Ａ】
2019108403.tif 000021
【図１３Ｂ】
2019108403.tif 000022
【図１３Ｃ】
2019108403.tif 000023
【図１３Ｄ】
2019108403.tif 000024
【配列表】
2019108403000001.app
【外国語明細書】
2019108403000001.pdf