(57)【要約】【課題】新たなホスホジエステラーゼ阻害用組成物を提供することを課題とする。【解決手段】アンペロプシン及び／又はカテキンを含有するホスホジエステラーゼ阻害用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンペロプシン及び／又はカテキンを含有するホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
【請求項２】
アンペロプシン１質量部に対しカテキンが１．０〜２．５質量部の比率で含有されている請求項１に記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
【請求項３】
ホスホジエステラーゼがｃＡＭＰホスホジエステラーゼである請求項１又は２に記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
【請求項４】
アンペロプシンが藤茶由来である請求項１〜３のいずれかに記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
【請求項５】
カテキンが緑茶由来である請求項１〜４のいずれかに記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホジエステラーゼの阻害作用を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホジエステラーゼは、広義にはリン酸ジエステル結合の一方の結合を加水分解する酵素をいう。臨床的にはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）やサイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）等の環状リン酸ジエステルを加水分解する酵素（環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ）を特定して、これをホスホジエステラーゼと呼んでいる。本願明細書においては、後者の臨床上の定義を意味する用語として使用している。
ｃＡＭＰやｃＧＭＰはセカンドメッセンジャーであり、ホスホジエステラーゼはその酵素活性のバランスによってその濃度を調節し、シグナル伝達に重要な役割を担っていると考えられている。ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤として公知の医薬品は、テオフィリン、パパベリン、カフェインなどがある。これらの医薬品は、細胞内カルシウム濃度をあげ、心筋収縮力をあげるため、心疾患の治療に処方される。
【０００３】
ホスホジエステラーゼは肥満にも関わっていることが知られている。
肥満の原因たる白色脂肪細胞にあっては、ノルアドレナリンがβ３受容体に結合すると、ＡＴＰ結合タンパク質を介してアデニル酸シクラーゼが活性化され、ＡＴＰがｃＡＭＰへ変換され、脂肪分解につながる。ｃＡＭＰはホスホジエステラーゼによって分解されるため、脂肪分解のためには、ホスホジエステラーゼの働きを抑える必要がある。ホスホジエステラーゼの阻害は、脂肪の分解を促進し、肥満を改善するといわれている。
【０００４】
さらにまた、ホスホジエステラーゼは、男性の性機能不全にも関与している。
いわゆる勃起は、性的刺激によって遊離した一酸化窒素（ＮＯ）により、陰茎海綿体平滑筋内でグアニル酸シクラーゼが活性化され、ＧＭＰがｃＧＭＰに変換されることで陰茎海綿体平滑筋が弛緩して海綿体洞内に血液が貯留することで起こる。しかし、ホスホジエステラーゼによってｃＧＭＰが分解されると勃起機能不全（ＥＤ）となるため、ＥＤを抑制するためにはホスホジエステラーゼの働きを抑える必要がある。
【０００５】
これまでホスホジエステラーゼ阻害作用を有する化合物や抽出物の探索が行なわれている。
天然物由来のホスホジエステラーゼ阻害物質として、マンゴージンジャー抽出物（特許文献１）、テンニンカ抽出物（特許文献２）、ヒマラヤンラズベリー（特許文献３）、キンモクセイ抽出物（特許文献４）、有色素米抽出物（特許文献５）、藤茶抽出物（特許文献６）などが注目されている。
【０００６】
藤茶抽出物にはホスホジエステラーゼ阻害作用があることが知られている（特許文献６）。またアンペロプシンは、藤茶に含有されるフラボノール化合物であり、ジヒドロミリセチンともよばれている。
【０００７】
一方、緑茶に多く含有されるカテキンのなかのエピガロカテキンガレートと、ホスホジエステラーゼ阻害剤を併用した場合、ガン、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症又は筋萎縮の治療に使用できることが特許文献７に記載されている。また非特許文献１には、エピガロカテキンガレートが平滑筋細胞において、ホスホジエステラーゼを阻害することによって平滑筋細胞内のｃＧＭＰやｃＡＭＰ濃度を上昇させることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−１０４８８６号公報
【特許文献２】特開２００６−１９９６７８号公報
【特許文献３】特開２００８−０７４７６７号公報
【特許文献４】特開２００９−０６７７４９号公報
【特許文献５】特開２００１−１６３７９６号公報
【特許文献６】特許第５０６０６９０号公報
【特許文献７】国際公開第２０１１／１６２３２０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ezequiel Alvarez  et.al., British Journal of Pharmacology (2006) 147, 269-280,
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、藤茶アンペロプシンの示すｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用について研究を進めたところ、このアンペロプシンと緑茶由来のカテキンを併用するとホスホジエステラーゼ阻害作用を相乗的に増強することを初めて見いだした。
本発明は、この知見に基づきなされたものであって、新たなホスホジエステラーゼ阻害用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の主な構成は以下の通りである。
（１）アンペロプシン及び／又はカテキンを含有するホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
（２）アンペロプシン１質量部に対しカテキンが１．０〜２．５質量部の比率で含有されている（１）に記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
（３）ホスホジエステラーゼがｃＡＭＰホスホジエステラーゼである（１）又は（２）に記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
（４）アンペロプシンが藤茶由来である（１）〜（３）のいずれかに記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
（５）カテキンが緑茶由来である（１）〜（４）のいずれかに記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、新たなホスホジエステラーゼ阻害用組成物が提供される。
また、アンペロプシンの原料である藤茶エキスとカテキンの原料である緑茶エキスを配合して調製した飲食品やサプリメントは、アンペロプシンとカテキンを含有する飲食品やサプリメントとなる。したがってアンペロプシンとカテキンを含有する飲食品やサプリメントを日常的に飲用することでホスホジエステラーゼ阻害による心疾患改善、肥満改善、ＥＤ改善などの効果を期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、アンペロプシン及び／又はカテキンを含有するホスホジエステラーゼ阻害作用を有する組成物に係る発明である。
【００１４】
アンペロプシンは、下記の式で表される。
【００１５】
【化１】
2019108312.tif 000002
【００１６】
本発明に用いるアンペロプシンは、例えば、藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）、大叶蛇葡萄（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｍｅｇａｌｏｐｈｙｌｌａ）、広東蛇葡萄（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｃａｎｔｏｎｉｅｎｓｉｓ）、ケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）、オノエヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ）、ヨレハマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｌｅｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ及びカツラ（Ｃｅｒｃｉｄｉｐｈｙｌｌｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）から選ばれる植物の抽出物から単離精製することができる。これらの中でも、藤茶が好ましい。
【００１７】
具体的には、Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ属植物である藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）から、下記のようにしてアンペロプシンを得ることができる。
すなわち、乾燥させた藤茶の枝葉部を含水エタノールで抽出した抽出物を濃縮し、例えば多孔性樹脂（ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０）を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ、８０容量％含水メタノールで溶出される分画にアンペロプシンが得られる。これを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶により、更に精製することができる。精製されたアンペロプシンは、試薬としても販売されており、これを用いることもできる。
【００１８】
藤茶からアンペロプシンを得るためには以下のような操作を行う。
乾燥した藤茶の葉又は茎の粉砕物又は粉末を抽出原料とし、水又は親水性有機溶媒若しくはこれらの混合溶媒に投入し、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で任意の装置を用いて抽出することにより得ることができる。
【００１９】
抽出に用いる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられる。
また、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。なお、水と親水性有機溶媒との混合系溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して３０〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１０〜４０質量部、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１０〜９０質量部添加することが好ましい。
抽出溶媒を満たした処理槽に、藤茶の乾燥・粉砕物を投入し、必要に応じて時々撹拌しながら、３０分〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、この抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は、抽出原料の通常５〜１５倍量（質量比）であることが好ましく、抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃で１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いる場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜４時間程度である。
得られた抽出液から抽出溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られる。更に乾燥すれば、固形の抽出物が得られる。本発明においては、アンペロプシンの含有量が１０質量％以上、好ましくは２０質量％以上であれば、上記抽出液又はその濃縮液の状態であっても良い。これらは、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂、液―液向流分配などの方法により精製してから用いても構わない。
したがって、上記の藤茶から抽出しアンペロプシンの濃度を高めた抽出物も本発明の組成物として使用可能である。
【００２０】
組成物中のアンペロプシンの含有量は、ＨＰＬＣなど公知の分析方法で分析することができる。ＨＰＬＣによる定量方法の概略は次のとおりである。
・試料溶液の調整
ＨＰＬＣ法で調整したメンブランフィルターろ過前に試料溶液（２４μｇ／ｍｌ）を３０％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）にて正確に５倍希釈し、０．２μｍのメンブランフィルターろ過したものを標準溶液とする。
【００２１】
・ＨＰＬＣ法試料調整
試料約３０ｍｇを精秤し、３０％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）を加えて超音波にて溶解し、正確に５０ｍＬとする。この溶液１ｍＬを３０％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）にて２５ｍＬに正確に希釈し、０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過したものを試料溶液とする（２４μｇ／ｍｌ）。
【００２２】
・ 標準溶液の調整
ＨＰＬＣ法で調整した８μｇ／ｍｌ標準溶液を３０％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）にて正確に５倍希釈し、１．６μｇ／ｍｌ標準溶液を調整する。これを３０％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）にて正確に５倍希釈し、０．３２μｇ／ｍｌ標準溶液を調整する。８μｇ／ｍｌ標準溶液、１．６μｇ／ｍｌ標準溶液、０．３２μｇ／ｍｌ標準溶液を０．２μｍのフィルターろ過し、標準溶液とする。
【００２３】
・ＨＰＬＣ法標準液の調整
標準品１０．００ｍｇを精秤し、メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）を適量加えて超音波処理して溶解し、メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）を加えて正確に２５ｍＬとする。その溶液を５ｍｌとり１２．５％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）を加えて正確に２５ｍｌとする。その溶液を４ｍｌとり３０％メタノール（０．５％アスコルビン酸含有）を加えて正確に２０ｍｌとし、１６μｇ／ｍＬ標準溶液を調整する。これを正確に２倍希釈し、８μｇ／ｍｌ標準溶液とする。これを正確に２倍希釈し、４μｇ／ｍｌ標準溶液とした。０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過したものを標準溶液とする。
【００２４】
・測定条件
LC装置：ACQUITY UPLC (Waters)
MS装置：TOD(Waters)
カラム：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm, 100x2.1 mm i.d., Waters)
カラム温度：40 ℃
移動相：A) 0.1% formic acid/Ultra Pure Water,
B) 0.1% formic acid/MeCN
10％B溶液で、7分間イソクラティック分析。その後カラム洗浄のため、2分間かけてリニアで90%B溶液まで上げ、0.5分で10%B溶液にリニアで戻し、4分間10%B溶液で再安定化させてから次の分析を実施する。
流速：0.4 mL/min
注入量：2.0 μL
検出器：UV 290 nm, MS(M.w. 319.0434)
MS条件：Polarity ES-(capillary voltage 1.8 kV, sampling cone 40 V, extraction cone 4.0 kV, cone Voltage: 20 V, source temp. 150℃, desolvation temp. 400℃, cone gas flow 50 L/h, desolvation gas flow 1000 L/h, Mass scan range: 100-1000 Da, Scan time: 0.2 sec-1.
MRM condition：precursor ion>production：318.83>192.90
検出感度の点からPolarity ES-を使用した。
オートサンプラー：5℃
【００２５】
・算出方法
標準品成績書に記載の純度（HPLC純度・水分値）で補正し算出する。
【００２６】
本発明に使用されるカテキンは、緑茶から抽出した緑茶カテキンが好ましい。緑茶カテキンは、植物学的にはツバキ科カメリア属（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）に属する茶を原料として、製造方法の違いにより、不発酵茶に分類される煎茶、ほうじ茶、かぶせ茶、玉露等から抽出精製されたものを使用することができる。
【００２７】
一般に緑茶抽出物のカテキンは、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート及びエピガロカテキンガレートの合計８種となっているが、その成分比率は、植物の種類や品種、産地等にも影響される。また、工業的に精製等の工程により特定の成分比率を上げた製品も市販されている。
【００２８】
本発明で用いる緑茶抽出物カテキンは、茶葉または茶葉を粉砕したものを、水または熱水もしくはグリセリンやエタノールなどのアルコールにより抽出した画分、または酢酸エチル可溶画分、アセトン可溶画分より得たものなどが挙げられる。
高濃度の緑茶カテキンを得るためには、まず、茶葉からカテキン類を抽出して得られた茶葉抽出液を乾燥し、カテキン類を３０〜９８質量％含有する粉末を調製する。このような粉末の調製方法は公知の方法によって得ることができ、特開昭５９−２１９３８４号公報、特開昭６０−１３７８０号公報、特開昭６１−１３０２８５号公報等に開示されている。
このような粉末は、例えば、茶葉を熱水で抽出して得られた抽出物を酢酸エチル等の有機溶媒で分画して乾燥することにより、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、カテキンガレート、エピガロカテキン、ガロカテキン、エピカテキン、（＋）カテキン等のカテキン類を３０〜９８質量％含有する粉末を得ることができる。このような粉末として、例えば、商品名「ＰＦ−ＴＰ９０」、商品名「ファーマフーズおいしいカテキンＰＦ−ＴＰ８０」（いずれも株式会社ファーマフーズ製）等の市販のものを用いることもできる。緑茶カテキン中の総カテキン含量は、酒石酸鉄を発色剤として用いた公知の比色定量法により測定することができる。また、各カテキン類の組成を詳細に測定するためには、逆相高速液体クロマトグラフィーで測定し、定量することができる。
【００２９】
本発明の組成物中のカテキン含有量の定量方法は、ＨＰＬＣ法がこのましい。測定の条件としては、特開２００７−１５９５４１号に具体的測定の概略が記載されているが、この記載に基づいて測定可能である。測定条件は次のとおりである。
（ＨＰＬＣ分析条件）
分析装置：島津ＳＣＬ−１０Ａ高速液体クロマト装置（島津製作所製）
カラム：Ｓｈｉｍｐａｃｈ  ＶＰ  ＯＤＳ（１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
移動相：メタノール／０．０５％リン酸水溶液＝２０／８０
カラム温度：４０℃
検出波長：２８０ｎｍ
総カテキン量は、ＨＰＬＣによって分離されるカテキン、ガロカテキン、カテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート及びエピガロカテキンガレートの標準品を用いた検量線法で得られる構成成分の合計値で表すことができる。
【００３０】
本発明のホスホジエステラーゼ阻害作用を有する組成物にあっては、アンペロプシン１質量部に対しカテキンが１．０〜２．５質量部の比率で含有されるのが望ましい。
カテキンとアンペロプシンは、共存することで相乗的に作用して、ホスホジエステラーゼを阻害する作用効果を発揮する。
【００３１】
本発明のホスホジエステラーゼ阻害用組成物は、アンペロプシン及び／又はカテキンを必須の構成成分とする。適宜賦形剤やその他成分を添加して錠剤や液剤、あるいは粉末の製剤とすることができる。
またホスホジエステラーゼ阻害用のサプリメント剤や健康食品、飲料として利用することができる。
【実施例】
【００３２】
以下にアンペロプシンとカテキンによるホスホジエステラーゼ阻害活性を測定した試験例を示し、本発明の作用効果を説明する。
１．試験方法
（１）試験試料
アンペロプシンとして市販の「藤茶エキスパウダー」（丸善製薬株式会社製：アンペロプシン３０％含有）、カテキンとして、市販の「緑茶抽出物ＰＦ−ＴＰ９０Ｆ」（株式会社ファーマフーズ製：カテキン７０％含有）を試験用試料として用いた。
【００３３】
（２）試験溶液の調製方法
試験用試料は、蒸留水を用いて１０００μｇ／ｍｌに希釈後、これをさらに所望の試験濃度に希釈した。
【００３４】
（３）ホスホジエステラーゼ阻害活性の測定
ホスホジエステラーゼの阻害活性は、市販の「ＰＤＥ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）Ａｂｃａｍ社」を使用して測定する。測定はキットのプロトコルに則して、希釈調製した（１）試験試料、（２）ＰＤＥ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ、（３）３’，５’−ｃＡＭＰ（１ｍＭ）をＰＤＥ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて０．５ｍＭに希釈調製した基質溶液、（４）５’−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ（５ｋＵ／μＬ）、（５）ＰＤＥ  ＥｎｚｙｍｅをＰＤＥ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて４ｍＵ／μＬに調整した溶液の５種類を下記表１のようにキット中の９６−ｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（１／２  ｖｏｌｕｍｅ）に分注した。また、コントロールには、試験試料の代わりにＰＤＥ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを分注した。
【００３５】
【表１】
2019108312.tif 000003
【００３６】
３７℃の恒温器で４５分間インキュベート後、キット中の試薬（６）Ｇｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを１００μＬ添加し、室温で３０分間インキュベート後、波長６２０ｎｍで吸光度を測定した。
下記計算式によりホスホジエステラーゼ阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（１−試験試料の吸光度／コントロールの吸光度）×１００
【００３７】
２．試験結果
（１）アンペロプシン、カテキンの濃度とホスホジエステラーゼ阻害活性
下記表２に示す濃度範囲でアンペロプシン及びカテキンは濃度依存的にホスホジエステラーゼ阻害効果を有することが確認できた。
【００３８】
【表２】
2019108312.tif 000004
【００３９】
すなわちアンペロプシン及びカテキンは濃度依存的にホスホジエステラーゼを阻害することが確認できた。
【００４０】
（２）アンペロプシン、カテキン併用によるホスホジエステラーゼ阻害効果
アンペロプシン単独、カテキン単独、アンペロプシンとカテキン併用によるホスホジエステラーゼ阻害効果を測定した結果を下記の表３に示す。
【００４１】
【表３】
2019108312.tif 000005
【００４２】
表３の通り、アンペロプシン及びカテキンの併用試験において相乗効果が確認された。