(57)【要約】  【課題】骨格筋リハビリテーション補助効果を評価するための慢性炎症の非ヒトモデル動物の作製方法、および当該非ヒトモデル動物を用いた被検物質の骨格筋リハビリテーション補助効果の評価方法の提供。  【解決手段】ペプチドグリカンおよび多糖を構成単位として含む化合物を、慢性炎症を惹起するための有効量、非ヒト動物に投与する工程を含む、非ヒトモデル動物の作製方法、ならびに当該非ヒト動物モデルに対して被検物質を投与することを含む、当該被検物質の骨格筋リハビリテーション補助効果の評価方法。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格筋リハビリテーション補助効果を評価するための、慢性炎症の非ヒトモデル動物の作製方法であって、
ペプチドグリカンおよび多糖を構成単位として含む化合物を、前記慢性炎症を惹起するための有効量、非ヒト動物に投与する工程
を含む、非ヒトモデル動物の作製方法。
【請求項２】
前記非ヒトモデル動物が骨格筋の廃用性筋萎縮を呈さない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドグリカンおよび多糖を構成単位として含む化合物が、少なくともラムノースを構成単位として含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物を、前記動物の体重１ｇ当たり、ラムノース当量で２．５〜７．５μｇの量で投与する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、細菌の細胞壁に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、溶連菌の細胞壁に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物を腹腔内または皮下に投与する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記慢性炎症が、継続して１週間以上、以下の所見
（ｉ）血中白血球濃度の増加
（ｉｉ）後肢の踝の厚さの増大
の少なくとも一方を示す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記慢性炎症が、継続して１週間以上、以下の所見
（ｉ）血中白血球濃度が前記化合物の投与前と比べて１０％以上増加すること
（ｉｉ）後肢の踝の厚さが前記化合物の投与前と比べて１０％以上２０％未満増大していること
の少なくとも一方を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記慢性炎症が、継続して１週間以上、以下の所見
（ｉ）血中白血球濃度の増加
（ｉｉ）後肢の踝の厚さの増大
の両方を示す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記慢性炎症が、継続して１週間以上、以下の所見
（ｉ）血中白血球濃度が前記化合物の投与前と比べて１０％以上増加すること
（ｉｉ）後肢の踝の厚さが前記化合物の投与前と比べて１０％以上２０％未満増大していること
の両方を示す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記非ヒト動物が哺乳動物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記非ヒト動物がマウスまたはラットである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により作製される、慢性炎症の非ヒトモデル動物。
【請求項１５】
被検物質の骨格筋リハビリテーション補助効果を評価する方法であって、
請求項１４に記載の慢性炎症の非ヒトモデル動物に対して被検物質を投与する工程、
前記非ヒトモデル動物の筋肉または筋肉を収縮させる神経を刺激する工程、および
前記刺激前後における前記非ヒトモデル動物において、骨格筋量、血中白血球濃度および後肢の踝の厚さからなる群から選択される少なくとも一つを比較する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨格筋リハビリテーション効果を評価するための慢性炎症の非ヒトモデル動物の作製方法に関する。本発明はさらに、当該非ヒトモデル動物を用いて、被検物質の骨格筋リハビリテーション補助効果を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、リウマチおよび慢性心疾患等の慢性疾病の患者や肥満患者、ならびに手術後の患者においては慢性的な炎症の惹起が認められ、二次性サルコペニア（筋量や筋機能の低下）が認められる。二次性サルコペニアは、慢性疾病患者において健康寿命や生命予後の短縮をもたらし、手術後においては日常生活への復帰までの期間の延長につながる。そのため、慢性炎症状態にある患者や手術後の患者においては、骨格筋の量や機能の低下を防止するために骨格筋リハビリテーションが重要となる。
【０００３】
骨格筋リハビリテーションにおいては、骨格筋に負荷をかけるレジスタンス運動（いわゆる、筋力トレーニング）が主に用いられており、健常者においてはその効果は数々の先行知見により証明されている。また、レジスタンス運動による筋量や筋機能の増大を補助する食品や薬品の評価も盛んに行われており、たんぱく質源となる食品を中心に臨床試験や動物実験に基づく前臨床試験によるエビデンスが構築されている。
【０００４】
一方で、慢性炎症状態の患者においては、たんぱく質異化が亢進する傾向があり、健常状態の人とはレジスタンス運動に対する効果や、食品や薬品が筋量や筋機能に及ぼす効果が異なる可能性がある。しかしながら、臨床試験においては同レベルの炎症状態にある被験者を揃えることが難しく、また、前臨床試験においては骨格筋リハビリテーションを模したレジスタンス運動を課すのに適した慢性炎症モデルが無いことから、詳細なエビデンスの構築が不十分であった。
【０００５】
ところで、従来、溶連菌細胞壁精製物であるペプチドグリカン-多糖類（PG-PS、商品名PG-PS 10S; BD bioscience社）を、ラットに投与することで、慢性的な関節炎や炎症性貧血が惹起されることが報告されている（非特許文献１および２）。しかしながら、慢性関節炎や炎症性貧血が惹起されたこれらのラットにおいては、重度の足関節の炎症（浮腫および痛み等）が惹起され、十分なレジスタンス運動を課すことができるものではなかった。また、摂餌量の減少による大幅な体重低下や、痛みにより後肢を接地しないように生活することによる、炎症性ではない廃用性の筋萎縮の発生が認められ、積極的な運動により骨格筋リハビリテーションを行う状態を模しているとは言い難かった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Domnald Kimpel et al., ARTHRITIS & REUMATISM, Vol.48(12), 3357-3567, 2003
【非特許文献２】Igor Theuri et al. Blood 113(21), 5277-5286, 2009
【発明の概要】
【０００７】
このような状況下、本発明者らは、慢性炎症状態における骨格筋リハビリテーションのためのモデル動物の作出という新たな課題を見出した。そして、ラットの足関節に電気刺激によるレジスタンス運動を負荷するモデルを応用して、慢性炎症状態における骨格筋リハビリテーションを模した評価系を構築できるか鋭意検討した。その結果、ペプチドグリカンおよび多糖を構成単位として含む化合物を所定の用量で動物に投与することにより、慢性的な炎症が惹起されるものの、炎症に伴う骨格筋の萎縮が軽度であるため、十分なレジスタンス運動を負荷することができる、慢性炎症状態における骨格筋リハビリテーションを評価するためのモデル動物を作出できることを見出した。そして、本発明者らは、このようなモデル動物を用いることにより、被検物質の慢性炎症状態における骨格筋リハビリテーション補助効果を評価できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【０００８】
したがって、本発明は、骨格筋リハビリテーション効果を評価するための慢性炎症の非ヒトモデル動物の作製方法、および当該非ヒトモデル動物を用いた被検物質の骨格筋リハビリテーション補助効果の評価方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）骨格筋リハビリテーション補助効果を評価するための、慢性炎症の非ヒトモデル動物の作製方法であって、
ペプチドグリカンおよび多糖を構成単位として含む化合物を、前記慢性炎症を惹起するための有効量、非ヒト動物に投与する工程
を含む、非ヒトモデル動物の作製方法。
（２）前記非ヒトモデル動物が骨格筋の廃用性筋萎縮を呈さない、（１）に記載の方法。
（３）前記ペプチドグリカンおよび多糖を構成単位として含む化合物が、少なくともラムノースを構成単位として含む、（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記化合物を、前記動物の体重１ｇ当たり、ラムノース当量で２．５〜７．５μｇの量で投与する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記化合物が、細菌の細胞壁に由来する、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記化合物が、溶連菌の細胞壁に由来する、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記化合物を腹腔内または皮下に投与する、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記慢性炎症が、継続して１週間以上、以下の所見
（ｉ）血中白血球濃度の増加
（ｉｉ）後肢の踝の厚さの増大
の少なくとも一方を示す、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記慢性炎症が、継続して１週間以上、以下の所見
（ｉ）血中白血球濃度が前記化合物の投与前と比べて１０％以上増加すること
（ｉｉ）後肢の踝の厚さが前記化合物の投与前と比べて１０％以上２０％未満増大していること
の少なくとも一方を示す、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記慢性炎症が、継続して１週間以上、以下の所見
（ｉ）血中白血球濃度の増加
（ｉｉ）後肢の踝の厚さの増大
の両方を示す、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記慢性炎症が、継続して１週間以上、以下の所見
（ｉ）血中白血球濃度が前記化合物の投与前と比べて１０％以上増加すること
（ｉｉ）後肢の踝の厚さが前記化合物の投与前と比べて１０％以上２０％未満増大していること
の両方を示す、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記非ヒト動物が哺乳動物である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記非ヒト動物がマウスまたはラットである、（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１４）（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法により作製される、慢性炎症の非ヒトモデル動物。
（１５）被検物質の骨格筋リハビリテーション補助効果を評価する方法であって、
（１４）に記載の慢性炎症の非ヒトモデル動物に対して被検物質を投与する工程、
前記非ヒトモデル動物の筋肉または筋肉を収縮させる神経を刺激する工程、および
前記刺激前後における前記非ヒトモデル動物において、骨格筋量、血中白血球濃度および後肢の踝の厚さからなる群から選択される少なくとも一つを比較する工程
を含む、方法。
（１６）α−ラクトアルブミンまたはα−ラクトアルブミン−ＥＰＡ（α−ラクトアルブミンとＥＰＡとの混合物）の少なくとも一つを有効成分とする、骨格筋リハビリテーション補助剤。
（１７）足関節の炎症の抑制剤である、（１６）に記載の剤。
【００１０】
本発明によれば、ペプチドグリカンおよび多糖を構成単位として含む化合物を所定の用量で動物に投与することにより、慢性炎症状態における骨格筋リハビリテーションのためのモデル動物を新たに提供することができる。また、本発明の方法により得られるモデル動物においては摂餌量が保存されるため、被検物質を混餌投与することにより、被検物質の骨格筋リハビリテーション補助効果を簡便に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ラットの筋力トレーニングを行うための装置を示す模式図である。
【図２】体重１ｇあたり１０μｇまたは１５μｇのラムノース当量のペプチドグリカン−多糖複合体を投与する前後における、各群のラットの（Ａ）後肢の踝の厚さおよび（Ｂ）白血球濃度の経時変化、ならびに筋力トレーニング終了後の後肢骨格筋の重量（（Ｃ）腓腹筋、（Ｄ）足底筋、ヒラメ筋および長趾伸筋）を示すグラフである。
【図３】体重１ｇあたり１０μｇまたは１５μｇのラムノース当量のペプチドグリカン−多糖複合体を投与する前後における、各群のラットの総トレーニング負荷量を示すグラフである。
【図４】体重１ｇあたり２．５μｇ、５μｇまたは７．５μｇのラムノース当量のペプチドグリカン−多糖複合体を投与する前後における、各群のラットの（Ａ）後肢の踝の厚さおよび（Ｂ）白血球濃度の経時変化、ならびに筋力トレーニング終了後の下位群ＡおよびＢそれぞれの後肢骨格筋の重量（下位群Ａ：（Ｃ）腓腹筋、（Ｄ）足底筋、ヒラメ筋および長趾伸筋、下位群Ｂ：（Ｅ）腓腹筋、（Ｆ）足底筋、ヒラメ筋および長趾伸筋）を示すグラフである。
【図５】体重１ｇあたり２．５μｇ、５μｇまたは７．５μｇのラムノース当量のペプチドグリカン−多糖複合体を投与する前後における、下位群ＡおよびＢそれぞれのラットの総トレーニング負荷量を示すグラフである。
【図６】通常食、α−Ｌａ食およびαＬａ−ＥＰＡ（α―ラクトアルブミンとＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）の混合物）食を摂食させた各群のラットの（Ａ）ラットの後肢の踝の厚さおよび（Ｂ）白血球濃度の経時変化、ならびに筋力トレーニング終了後の左右それぞれの後肢骨格筋の重量（（Ｃ）足底筋および（Ｄ）腓腹筋）を示すグラフである。
【図７】通常食、α−Ｌａ食およびαＬａ−ＥＰＡ食を摂食させた各群のラットにおける血液中の白血球濃度と腓腹筋重量との相関関係を示すグラフである。
【発明の具体的説明】
【００１２】
慢性炎症の非ヒトモデル動物の作製方法
本発明は、骨格筋リハビリテーション効果を評価するための慢性炎症の非ヒトモデル動物（以下、「本発明のモデル動物」ともいう）を提供する。
本発明のモデル動物は、ペプチドグリカンおよび多糖を構成単位として含む化合物を、慢性炎症を惹起するための有効量、非ヒト動物に投与することにより作製することができる。
【００１３】
本発明のモデル動物を作製するために用いられる非ヒト動物（以下、「本発明で用いられる非ヒト動物」ともいう）は、実験動物として一般的に使用される非ヒト動物であれば特に制限されないが、好ましくは非ヒト脊椎動物であり、より好ましくは非ヒト哺乳動物であり、さらに好ましくはげっ歯類動物である。本発明で用いられる非ヒト動物としては、具体的には、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ニワトリおよびサル等を例示することができる。本発明で用いられる非ヒト動物は、好ましくはマウス、ラット、モルモットまたはハムスターであり、特に好ましくはマウスまたはラットである。
【００１４】
本発明のモデル動物は、骨格筋のリハビリテーションを行うことが可能であれば特に制限されず、例えば、血中白血球濃度の増加および後肢の踝の厚さの増大の少なくとも一つの所見を示す。血中白血球濃度の増加とは、例えば、血中白血球濃度が正常時と比較して１０％以上増加することを意味する。また、後肢の踝の厚さの増大とは、例えば、正常時と比較して後肢の踝の厚さが１０％以上２０％未満の範囲で増大することを意味する。
【００１５】
本発明のモデル動物は、慢性炎症状態にあるものであれば特に制限されず、例えば、血中白血球濃度の増加および後肢の踝の厚さの増大の少なくとも一つの所見を示す状態のものを意味する。血中白血球濃度の増加とは、例えば、血中白血球濃度が正常時と比較して１０％以上増加することを意味する。また、後肢の踝の厚さの増大とは、例えば、正常時と比較して後肢の踝の厚さが１０％以上２０％未満の範囲で増大することを意味する。さらに、本発明のモデル動物は、血中白血球濃度の増加および後肢の踝の厚の増大の他に、一般的に公知の炎症状態の所見、例えば、炎症性サイトカインの増加、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の増加、発熱、アルブミン濃度低下、βマクログロブリンやフィブリンなどの急性期タンパク質の増加、貧血症状（炎症性貧血）等を示すものであってもよい。
【００１６】
また、本発明のモデル動物は、慢性炎症に伴う骨格筋の量や機能の著しい低下等の理由により、骨格筋が一定期間使用されなかったことにより生じる骨格筋の筋萎縮（いわゆる「廃用性筋萎縮」）を呈さないことが好ましい。
【００１７】
本発明において、骨格筋は、骨格を作動する筋肉であれば特に制限されず、例えば、上肢（前肢）骨格筋および下肢（後肢）骨格筋が挙げられ、より具体的には、腓腹筋、ヒラメ筋、足底筋、長趾伸筋、前脛骨筋等が挙げられる。
【００１８】
本発明において、骨格筋リハビリテーション効果の評価方法は、特に制限されるものではなく、例えば、リハビリテーションによる骨格筋の合成および分解の亢進の程度を評価すること、リハビリテーションの有無による骨格筋量や筋機能の差異を比較すること等によって行うことができる。
【００１９】
リハビリテーションによる骨格筋の合成および分解の亢進の程度に基づく骨格筋のリハビリテーション効果の評価は、例えば、以下の手順に従って行うことができる。
本発明のモデル動物の足関節に単回のトレーニングを負荷することにより、腓腹筋、足底筋、ヒラメ筋等の骨格筋に強制的なレジスタンス運動を課す。単回のトレーニングとは、強縮最大筋力が発揮されるように調節した電気刺激、例えば最大単縮筋力が得られるように調整した電圧（電流）による４ミリ秒間のパルス刺激を１００Ｈｚの頻度で３秒間（３００パルス）課すことを１回として、５秒間隔で５回実施することを１セットとして、２〜３分間の休息をはさんで４セット実施することである。
レジスタンス運動を課した直後〜２４時間後の任意の時間に、剖検によりレジスタンス運動を課した部位である腓腹筋、足底筋、ヒラメ筋を採取する。次いで、採取したそれぞれの筋肉について、骨格筋の合成速度および分解速度、またはそれぞれに関与するシグナル分子の活性化等を測定する。これらの測定結果から、慢性炎症状態におけるリハビリテーション時の骨格筋合成および分解の亢進の程度を評価することができ、その評価結果に基づいて骨格筋リハビリテーション効果を評価することができる。
【００２０】
また、リハビリテーションの有無による骨格筋量の差異の比較は、例えば、以下の手順に従って行うことができる。
本発明のモデル動物の足関節に５回の単回のトレーニングを長期間、定期的に（２日に１回または３日に２回など）負荷することにより、腓腹筋、足底筋、ヒラメ筋等の骨格筋に強制的なレジスタンス運動を課す。レジスタンス運動を課す期間が終了した後、剖検によりレジスタンス運動を課した部位である腓腹筋、足底筋、ヒラメ筋を採取する。次いで、採取したそれぞれの筋肉について重量を測定し、レジスタンス運動を課していない筋肉の重量と比較する。具体的には、左後肢の骨格筋にレジスタンス運動を課さず、右後肢の骨格筋にレジスタンス運動を課した後に、左右の後肢の対応する骨格筋の重量を比較する。その比較結果に基づいて骨格筋リハビリテーション効果を評価することができる。なお、バイオインピーダンス法、二重Ｘ線吸光法、ＣＴ、ｍｉｃｒｏ−ＭＲＩ、超音波法および安定同位体ラベルクレアチン投与法等を用いて、１個体の経日的な骨格筋量を間接的に評価することも可能であり、レジスタンス運動を課した前後における骨格筋量を比較することによっても、骨格筋リハビリテーション効果を評価することができる。
【００２１】
また、リハビリテーションの有無による筋機能の差異の比較は、例えば、以下の手順に従って行うことができる。
本発明のモデル動物の足関節をロードセルに接続したフットプレートに固定し、単回のトレーニングを負荷することにより、腓腹筋、足底筋、ヒラメ筋等の骨格筋に強制的なレジスタンス運動を課す。トレーニングの負荷によりラットが発揮した足関節の底屈の力（足関節底屈筋力）を、足関節筋力測定装置により測定する。レジスタンス運動を課した前後の足関節底屈筋力の最大値や足関節底屈筋力の減衰の程度を比較し、その比較結果に基づいて骨格筋リハビリテーション効果を評価することができる。
【００２２】
本発明において、ペプチドグリカンおよび多糖を構成単位として含む化合物（以下、「本発明で用いられる化合物」という）とは、骨格筋リハビリテーションを行うことができる範囲内の慢性炎症を惹起することができる化合物であれば特に制限されないが、好ましくはペプチドグリカンと多糖とを構成単位として含む化合物である。また、本発明において、ペプチドグリカンおよび多糖を構成単位として含む化合物とは、当該化合物自体だけではなく、当該化合物を含む組成物をも包含する。そのような化合物または組成物としては、例えば、細菌から抽出した細胞壁精製物等が挙げられる。具体的には、レンサ球菌属（Streptococcus属）に属する細菌が挙げられる。レンサ球菌属に属する細菌としては、α、βおよびγのいずれの溶血性のレンサ球菌に属する細菌も使用することができ、具体的には、α溶血性レンサ球菌としては、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、緑色連鎖球菌（Streptococcus viridans）、β溶血性レンサ球菌としては、Ａ群β溶血性レンサ球菌（溶連菌または化膿レンサ球菌ともいう、Streptococcus pyogenes）、Ｂ群β溶血性レンサ球菌（Streptococcus agalactiae）等が挙げられる。特に好適には、Ａ群β溶血性レンサ球菌（溶連菌）から抽出した細胞壁精製物が挙げられる。本発明で用いられる化合物としては、具体的には、溶連菌から精製したPeptidglycan-polysaccharide（ＰＧ−ＰＳ、ペプチドグリカン−多糖複合体）、加熱処理したBurucella abortus菌体等が挙げられる。本発明においては、ＰＧ−ＰＳが好ましく用いられる。ただし、本発明で用いられる化合物は、目的の炎症状態を惹起できれば特に抽出元の菌種を制限するものではなく、加熱処理したBurucella abortus菌体等も用いることができる。
【００２３】
本発明で用いられる化合物の投与量としては、本発明で用いられる非ヒト動物において、骨格筋リハビリテーションを行うことができ、かつ慢性炎症を惹起するために有効な量であれば特に制限されないが、その有効量の下限は、本発明で用いられる非ヒト動物の体重１ｇ当たり、ラムノース当量で２．５μｇであり、より好ましくは３μｇであり、さらに好ましくは３．５μｇであり、その上限は７．５μｇであり、より好ましくは６μｇであり、さらに好ましくは５μｇである。
【００２４】
本発明で用いられる化合物の投与経路としては、本発明で用いられる非ヒト動物において、骨格筋リハビリテーションを行うことができ、かつ慢性炎症を惹起することができる経路であれば特に制限されないが、腹腔内投与または皮下投与が好ましく、より好ましくは腹腔内投与である。
【００２５】
また、本発明で用いられる化合物は、骨格筋リハビリテーションを行うことができる範囲内の慢性炎症を惹起することができる化合物であることから、本発明で用いられる化合物を、骨格筋リハビリテーションを行うことができる範囲内の慢性炎症が惹起されたモデル動物を作製するために使用することも可能である。すなわち、骨格筋リハビリテーションを行うことができる範囲内の慢性炎症が惹起されたモデル動物を作製するための、本発明で用いられる化合物の使用もまた、本発明に包含される。中でも、骨格筋リハビリテーションを行うことができる範囲内の慢性炎症が惹起されたモデル動物を作製するための、ＰＧ−ＰＳの使用が好ましい。
【００２６】
骨格筋リハビリテーション補助効果の評価方法
本発明は、被検物質の骨格筋リハビリテーション補助効果の評価方法（以下、「本発明の評価方法」ともいう）を提供する。
本発明の評価方法は、本発明のモデル動物に被検物質を投与し、投与後に筋肉又は筋肉を収縮させる神経を刺激し、刺激前後の骨格筋量、血中白血球濃度および後肢の踝の厚さの少なくとも一つを比較することにより行うことができる。
【００２７】
本発明の評価方法の対象となる被検物質は、特に制限されず、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質およびペプチド等の単一化合物、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物産物ならびに植物抽出物等を被検物質とすることができる。
【００２８】
本発明の評価方法は、例えば、骨格筋リハビリテーション効果の評価方法において被検物質を投与することにより行うことができる。すなわち、骨格筋リハビリテーション効果の評価方法において、リハビリテーション（電気刺激による骨格筋の強制的なレジスタンス運動）の前に被検物質を投与し、被検物質投与の有無による、リハビリテーション後の骨格筋の合成および分解の亢進の程度の差異を評価すること、またはリハビリテーション後の骨格筋量や筋機能の差異を比較することによって行うことができる。
【００２９】
本発明の評価方法は、本発明のモデル動物に被検物質を投与し、電気刺激のような外部刺激による強制的なレジスタンス運動を課すことにより行うため、慢性的な炎症状態において安定的に被検物質の骨格筋リハビリテーション補助効果を評価することができる。また、本発明の評価方法は、モデル動物の自発的な運動能力に依存する部分が少なく、モデル動物の体調等にも左右されることが少ないことからも安定的な評価方法である。
【００３０】
骨格筋リハビリテーション補助剤
本発明は、骨格筋のリハビリテーションを補助する剤（以下、「本発明の剤」ともいう）を提供する。
本発明の剤は、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）およびα−ラクトアルブミン−ＥＰＡ（α−ラクトアルブミンとＥＰＡの混合物）の少なくとも一つを有効成分として含む。
【００３１】
本発明の剤は、足関節の炎症の抑制、特に後肢の踝の厚さの増大の抑制に特に効果を奏する。
【００３２】
本発明の剤におけるα−Ｌａの含有量は、足関節の炎症抑制効果を奏する限り特に制限されないが、好ましくは剤に対して０．７５質量％〜３０質量％であり、より好ましくは３質量％〜３０質量％であり、さらに好ましくは６質量％〜３０質量％である。
また、本発明の剤におけるＥＰＡの含量は、足関節の炎症抑制効果を奏する限り特に制限されないが、好ましくは剤に対して５質量％〜３０質量％であり、より好ましくは１０質量％〜３０質量％であり、さらに好ましくは１５質量％〜３０質量％である。
本発明の剤において、α−ＬａまたはＥＰＡ単独で使用することもできるが、両者を組み合わせて使用することもできる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により制限されるものではない。
【００３４】
比較例：ペプチドグリカン−多糖複合体の投与量の検討
本実施例においては、筋力トレーニングが実施可能な範囲の慢性炎症を惹起することができるペプチドグリカン−多糖複合体の投与量を、以下の手順に従って検討した。
【００３５】
＜実験手順＞
１４匹の７週齢の雌Ｌｅｗｉｓラット（日本チャールズリバー社より購入）を、ＣＲＦ−１飼料を自由摂食させて１週間飼育することにより馴化した。馴化後、ＡＩＮ−９３Ｇ飼料（粉末）を自由摂食させて５日間飼育することにより更に馴化した。更なる馴化後の１４匹のラットから、体重がより重いまたはより軽い３匹のラットを除外した後、残りの１１匹のラットを、各群の平均体重が同程度になるように、対照群（３匹）、低用量（Ｌ）群（４匹）および高用量（Ｈ）群（４匹）の３群に分けた。全てのラットの後肢の踝の厚さを、後述する測定方法に従って測定した。また、全てのラットにおいて、部分採血を行い、得られた血液にＥＤＴＡを添加して保存し、後の白血球濃度測定に供した。なお、部分採血は、イソフルラン麻酔下で頸静脈から血液を３００μＬ採取することにより行った。血液中の白血球濃度を、後述する測定方法に従って測定した。得られた測定値を、試験前（投与開始０日）の測定値とした。
【００３６】
次いで、Ｌ群およびＨ群のそれぞれのラットに、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓ（ラムノース当量で約５ｍｇ／ｍＬのペプチドグリカン−ポリサッカライドポリマーを含有する生理食塩水、BD bioscience社製）を、各群のラットの平均体重１ｇ当たりのラムノース当量が１０μｇまたは１５μｇとなるように腹腔内投与した。対照群のラットには同量の生理食塩水を腹腔内投与した。
【００３７】
ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与開始１、２、３、６、８、１０、１３、１５、１７および２０日後に、全てのラットの後肢の踝の厚さを測定した。また、投与開始３、６、１３および２０日後には、全てのラットにおいて部分採血を行い、得られた血液にＥＤＴＡを添加して保存し、後の白血球濃度測定に供した。
【００３８】
ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与開始２２日後の夜から全てのラットを絶食させ、投与開始２３日後に、後述する方法に従って筋力トレーニングを行った。筋力トレーニング終了１時間後に、全てのラットにおいて、イソフルレン麻酔下で腹部下行大静脈から全採血を行い、得られた血液にＥＤＴＡを添加し、白血球濃度測定に供した。全採血後、ラットを屠殺し、速やかに後肢骨格筋を採取し、それぞれ重量を測定した。
【００３９】
また、各群のラットの総トレーニング負荷量は以下の手順で算出した。
筋力トレーニングにより発揮された筋力を、フットプレートに接続されたロードセルによって２０００Ｈｚの頻度でリアルタイムに出力し、データ集積装置（Power Lab、バイオリサーチセンター株式会社製）にトルクとして記録した。記録したトルクを時間で積分し、単回のトレーニングあたりの負荷強度（ｍＮ・ｍ・秒、５回×４セット＝２０回の筋力発揮分の合算）を算出した。
【００４０】
＜後肢の踝の厚さの測定方法＞
ラットの後肢の踝の厚さの測定は、以下の手順に従って行った。
各群の全てのラットの左右の後肢の踝の厚さを、デジタルノギス（CD-15CX、株式会社ミツトヨ製）を用いて３回ずつ測定した。各群の全てのラットの測定結果の平均値を、各群の測定値とした。
【００４１】
＜白血球濃度の測定方法＞
ラットの血液中の白血球濃度の測定は、以下の手順に従って行った。
各群のラットから得られた血液中の白血球濃度を、全自動血球分析装置（XT-1800i、シスメックス株式会社製）を用いて測定した。投与開始０、３、６、１３および２０日後に得られた血液については、ＥＤＴＡ添加全血をセルパックＩＩ（シスメックス社製）で５倍希釈し、測定サンプルとして使用した。また、投与開始２３日後に得られた血液（ＥＤＴＡ添加全血）については、ＥＤＴＡ添加全血をそのまま測定サンプルとして使用した。
【００４２】
＜筋力トレーニングの方法＞
ラットの筋力トレーニングは、K. Sumi et al., Appl. Physiol. Nutr. Metab., 2014, 39: 902-910において本発明者らによって報告された装置（図１）を用いて、以下の手順に従って行った。
各ラットを、イソフルラン麻酔下で、図１に示す装置のラット固定台上にうつ伏せに固定した。右下肢の膝を圧迫固定し、足関節（踝）をフットプレートに固定した。ふくらはぎに皮膚電極を貼り、腓腹筋に経皮的に電気刺激を与えて強制的に運動させた。強制的な運動は、パルス幅４ミリ秒、パルス頻度１００Ｈｚ、パルス負荷数３００回の電気刺激を１バウトとして、８秒に１バウトのペースで計５バウト繰り返すことを１セットとし、セット間休憩を３分として４セット（計２０バウト）行った。
【００４３】
図２に、各群のラットの後肢の踝の厚さおよび白血球濃度の経時変化（それぞれ（Ａ）および（Ｂ））、ならびに筋力トレーニング終了後の後肢骨格筋の重量（腓腹筋については（Ｃ）、足底筋、ヒラメ筋および長趾伸筋については（Ｄ））を示す。
また、図３に、各群のラットの総トレーニング負荷量を示す。
【００４４】
図２の結果から、Ｌ群およびＨ群のいずれにおいても、（Ａ）足関節（後肢の踝）の厚さの大幅な増大、および（Ｂ）白血球濃度の慢性的な増加が引き起こされることが示された。さらに、（Ｃ）腓腹筋の大幅な萎縮、ならびに（Ｄ）足底筋、ヒラメ筋および長趾伸筋の大幅な萎縮が引き起こされることが示された。
【００４５】
また、図３の結果から、Ｌ群およびＨ群のいずれにおいても、総トレーニング負荷量が大幅に低下することが示された。この結果から、いずれの群においても、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与により骨格筋萎縮が引き起こされ、十分な筋力トレーニングを行うことができなかったことが示唆された。
【００４６】
図２および３の結果から、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓを、体重１ｇ当たりのラムノース当量が１０μｇ〜１５μｇとなるように投与したラットにおいては、慢性的な炎症が惹起される一方で、それに伴う骨格筋の萎縮が重度であるため、十分な筋力トレーニングを行うことができないことが示唆された。すなわち、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓを、体重１ｇ当たりのラムノース当量が１０μｇ〜１５μｇとなるように投与したラットは、慢性炎症に伴う骨格筋の機能低下が重度であるため、十分な筋力トレーニングを行うことができず、慢性炎症患者における骨格筋の機能回復のためのリハビリテーションのためのモデル動物として用いることはできないと考えられる。
【００４７】
実施例１：ペプチドグリカン−多糖複合体の投与量の検討
本実施例においては、筋力トレーニングが実施可能な範囲の慢性炎症を惹起することができるペプチドグリカン−多糖複合体の投与量を検討した。本実施例において、後肢の踝の厚さ、および血液中の白血球濃度は、比較例と同様の手順に従って測定した。また、筋力トレーニングも、比較例と同様の手順に従って行った。
【００４８】
＜実験手順＞
３４匹の７週齢の雌Ｌｅｗｉｓラット（日本チャールズリバー社より購入）を、ＣＲＦ−１飼料を自由摂食させて１週間飼育することにより馴化した。馴化後、ＡＩＮ−９３Ｇ飼料（粉末）を自由摂食させて４日間飼育することにより更に馴化した。更なる馴化後の３４匹のラットから、体重がより重いまたはより軽い４匹のラットを除外した後、残りの３０匹のラットを、各群の平均体重が同程度になるように、対照群（６匹）、低用量（Ｌ）群（８匹）、中用量（Ｍ）群（８匹）および高用量（Ｈ）群（８匹）の４群に分けた。全てのラットの後肢の踝の厚さを測定した。また、全てのラットにおいて部分採血を行い、血液中の白血球濃度を測定した。得られた測定値を、試験前（投与開始０日）の測定値とした。
【００４９】
次いで、Ｌ群、Ｍ群およびＨ群のそれぞれのラットに、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓ（ラムノース当量で約５ｍｇ／ｍＬのペプチドグリカン−ポリサッカライドポリマーを含有する生理食塩水、BD bioscience社製）を、各群のラットの平均体重１ｇ当たりのラムノース当量が２．５μｇ、５μｇまたは７．５μｇとなるように腹腔内投与した。対照群のラットには同量の生理食塩水を腹腔内投与した。
【００５０】
ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与開始１、２、３、４、７、９、１１および１４日後に、全てのラットの後肢の踝の厚さを測定した。また、投与開始４、７および１４日後には、全てのラットにおいて部分採血を行い、血液中の白血球濃度を測定した。
【００５１】
次いで、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与開始１４日目に、各群内のラットの白血球濃度、後肢の踝の厚さおよび体重が同程度になるように各群を２つの下位群に分け、投与開始１５日後の夜から各群の１つの下位群のラット（下位群Ａ）を絶食させ、投与開始１６日後に筋力トレーニングを行った。筋力トレーニング終了１時間後に、下位群Ａの全てのラットにおいて、イソフルレン麻酔下で腹部下行大静脈から全採血を行い、血液中の白血球濃度を測定した。全採血後、ラットを屠殺し、速やかに後肢骨格筋を採取し、それぞれ重量を測定した。
【００５２】
次いで、各群のもう一つの下位群のラット（下位群Ｂ）について、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与開始１６、１８および２１日後に、ラットの後肢の踝の厚さを測定した。また、投与開始２１日後には、下位群Ｂの全てのラットにおいて部分採血を行い、血液中の白血球濃度を測定した。投与開始２２日後の夜から各群の下位群Ｂのラットを絶食させ、投与開始２３日後に筋力トレーニングを行った。筋力トレーニング終了１時間後に、下位群Ｂの全てのラットにおいて、イソフルレン麻酔下で腹部下行大静脈から全採血を行い、血液中の白血球濃度を測定した。全採血後、ラットを屠殺し、速やかに後肢骨格筋を採取し、それぞれ重量を測定した。
【００５３】
また、各群のラットの総トレーニング負荷量は以下の手順で算出した。
筋力トレーニングにより発揮された筋力を、フットプレートに接続されたロードセルによって２０００Ｈｚの頻度でリアルタイムに出力し、データ集積装置（Power Lab、バイオリサーチセンター株式会社製）にトルクとして記録した。記録したトルクを時間で積分し、単回のトレーニングあたりの負荷強度（ｍＮ・ｍ・秒、５回×４セット＝２０回の筋力発揮分の合算）を算出した。
【００５４】
図４に、各群のラットの後肢の踝の厚さおよび白血球濃度の経時変化（それぞれ（Ａ）および（Ｂ））、ならびに下位群ＡおよびＢの筋力トレーニング終了後の後肢骨格筋の重量（下位群Ａの腓腹筋については（Ｃ）、足底筋、ヒラメ筋および長趾伸筋については（Ｄ）、下位群Ｂの腓腹筋については（Ｅ）、足底筋、ヒラメ筋および長趾伸筋については（Ｆ））を示す。
また、図５に下位群ＡおよびＢのラットの総トレーニング負荷量を示す。
【００５５】
図４の結果から、Ｍ群およびＨ群において、（Ａ）足関節（後肢の踝）の厚さの大幅な増大、および（Ｂ）白血球濃度の慢性的な増加が引き起こされることが示された。また、Ｌ群においても、足関節（後肢の踝）の厚さの大幅な増大、および白血球濃度の慢性的な増加が認められた。
【００５６】
また、図示していないが、Ｌ群、Ｍ群およびＨ群の全ての群において、貧血症状の惹起、およびＩＬ−６等の炎症性サイトカインの増加が認められた。
【００５７】
さらに、図４の結果から、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与量が、Ｍ群およびＨ群において、投与開始１６日後および２３日後のいずれにおいても、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与量に比例して、腓腹筋の大幅な萎縮（（Ｃ）および（Ｅ））、ならびに足底筋、ヒラメ筋および長趾伸筋の大幅な萎縮（（Ｄ）および（Ｆ））が引き起こされることが示された。また、Ｌ群においても、腓腹筋、足底筋、ヒラメ筋および長趾伸筋の萎縮が認められた。
【００５８】
また、図５の結果から、Ｌ群、Ｍ群およびＨ群の全ての群において、総トレーニング負荷量が低下する傾向が見られたが、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与開始１６日後および２３日後のいずれにおいても、対照群と比較して約５０〜９５％の総トレーニング負荷量が維持されていた。この結果から、いずれの群においても、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与により骨格筋萎縮が引き起こされるものの、十分な筋力トレーニングを行うことができたことが示唆された。
【００５９】
図４および５の結果から、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓを、体重１ｇ当たりのラムノース当量が２．５μｇ〜７．５μｇとなるように投与したラットにおいては、慢性的な炎症が惹起される一方で、それに伴う骨格筋の萎縮が軽度であるため、十分な筋力トレーニングを行うことができることが示唆された。すなわち、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓを、体重１ｇ当たりのラムノース当量が２．５μｇ〜７．５μｇとなるように投与したラットは、慢性炎症に伴う骨格筋の機能低下状態を反映しており、かつ、十分な筋力トレーニングを行うことも可能であるため、慢性炎症患者における骨格筋の機能回復のためのリハビリテーションを評価するためのモデル動物として用いられ得ると考えられる。
【００６０】
実施例２：骨格筋の廃用性筋萎縮を呈さない慢性炎症モデルラットを用いた骨格筋リハビリテーション補助効果の検証
本実施例においては、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓにより惹起される慢性炎症に伴い骨格筋が萎縮したラットにおいて、筋力トレーニング（リハビリテーション）を行うことにより萎縮した骨格筋が回復するか検証した。また、抗炎症作用を有する物質が、慢性炎症に伴い萎縮した骨格筋回復のためのリハビリテーションを補助する物質として有用であるか検証した。本実施例において、後肢の踝の厚さおよび血液中の白血球濃度は、比較例と同様の手順に従って測定した。また、筋力トレーニングも、比較例と同様の手順に従って行った。
【００６１】
＜実験手順＞
３６匹の７週齢の雌Ｌｅｗｉｓラット（日本チャールズリバー社より購入）を、ＣＲＦ−１飼料を自由摂食させて１週間飼育することにより馴化した。馴化後、ＡＩＮ−９３Ｇ飼料（粉末）を自由摂食させて４日間飼育することにより更に馴化した。更なる馴化後、各群の平均体重が同程度になるように、対照（Ｐ）群（６匹）および試験群（３０匹）に分けた。全てのラットの後肢の踝の厚さを測定した。また、全てのラットにおいて部分採血を行い、血液中の白血球濃度を測定した。得られた測定値を、試験前（投与開始０日）の測定値とした。
【００６２】
次いで、試験群の全てのラットに、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓ（ラムノース当量で約５ｍｇ／ｍＬのペプチドグリカン−ポリサッカライドポリマーを含有する生理食塩水、BD bioscience社製）を、試験群のラットの平均体重１ｇ当たりのラムノース当量が５μｇとなるように腹腔内投与した。Ｐ群のラットには同量の生理食塩水を腹腔内投与した。
【００６３】
ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与開始２および４日後に、全てのラットの後肢の踝の厚さを測定した。また、投与開始４日後には、全てのラットにおいて部分採血を行い、血液中の白血球濃度を測定した。血中白血球濃度の増加が平均より大幅に小さいまたは大きいラット８匹を除外した後、残りの２２匹のラットを、各群の平均体重が同程度になるように、通常食（Ｎ）群（７匹）、α−ラクトアルブミン食（Ａ）群（８匹）およびα−ラクトアルブミン−ＥＰＡ食（Ｅ）群（７匹）の３群に分けた。
【００６４】
Ａ群を、ＡＩＮ−９３Ｇ飼料中のカゼインの５０％をα−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）に置換した飼料（α−ＬＡ食）を自由摂食させて飼育した。また、Ｅ群を、ＡＩＮ−９３Ｇ飼料中のカゼインの５０％をα−Ｌａで、大豆油の５０％をＥＰＡ高含有魚油（EPA-28、分析値：ＥＰＡ  ２９．９％、ＤＨＡ  １３．８％、日本水産株式会社製）で置換した飼料（α−ＬＡ−ＥＰＡ食）を自由摂食させて飼育した。Ｐ群およびＮ群は引き続きＡＩＮ−９３Ｇ飼料（通常食）を自由摂食させて飼育した。
【００６５】
ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与開始７、９、１１、１４、１６および１８日後に、全てのラットの後肢の踝の厚さを測定した。また、投与開始７および１４日後には、全てのラットにおいて部分採血を行い、血液中の白血球濃度を測定した。この間、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓの投与開始６日後から１７日後まで、全てのラットの右後肢について、２日に１回のペースで、計５回にわたり筋力トレーニングを行った。
【００６６】
最後の筋力トレーニングが終了した翌日に、全てのラットにおいて部分採血を行い、その後、イソフルレン麻酔下で腹部下行大静脈から全採血を行い、それぞれ血液中の白血球濃度を測定した。全採血後、ラットを屠殺し、速やかに後肢骨格筋を採取し、それぞれ重量を測定した。
【００６７】
図６に、各群のラットの後肢の踝の厚さおよび白血球濃度の経時変化（それぞれ（Ａ）および（Ｂ））、ならびに筋力トレーニング終了後の左右それぞれの後肢骨格筋の重量（足底筋（Ｃ）および腓腹筋（Ｄ））を示す。
【００６８】
図７に、各群のラットにおける血液中の白血球濃度と右後肢の腓腹筋重量との相関関係を示す。
【００６９】
図６（Ａ）および（Ｂ）の結果から、Ｐ群と比較して、Ｎ群、Ａ群およびＥ群のいずれにおいても、（Ａ）後肢の踝の厚さの増大、および（Ｂ）血中白血球濃度の慢性的な増加が引き起こされることが示された。また、図６の（Ｃ）および（Ｄ）の結果から、Ｐ群と比較して、Ｎ群、Ａ群およびＥ群において、足底筋および腓腹筋の萎縮が引き起こされることが示された。一方で、図６の（Ｃ）および（Ｄ）の結果から、全ての群において、筋力トレーニングを行った右後肢においては、筋力トレーニングを行わなかった左後肢と比較して足底筋および腓腹筋の重量の増大が認められた。
【００７０】
これらの結果から、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓを、体重１ｇ当たりのラムノース当量が５μｇとなるように投与したラットにおいては、慢性的な炎症が惹起される一方で、それに伴う骨格筋の萎縮が軽度であるため、十分な筋力トレーニングを行うことができることが示唆された。また、筋力トレーニングを行うことにより、骨格筋重量が増大することも確認された。したがって、ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓを、体重１ｇ当たりのラムノース当量が５μｇとなるように投与したラットは、慢性炎症患者における骨格筋の機能回復のためのリハビリテーションのための好適なモデル動物として用いられ得ると考えられる。
【００７１】
また、図６（Ａ）の結果から、Ｎ群と比較して、Ａ群とＥ群では後肢の踝の厚さの増大が抑制されることが示された。また、図６の（Ｃ）および（Ｄ）の結果から、Ｎ群と比較して、Ａ群とＥ群の方が足底筋重量と腓腹筋の重量が増大したことが示された。さらに、図７の結果から、白血球濃度と腓腹筋重量との間に負の相関関係が認められた。これらの結果から、慢性炎症を抑制することによって、筋量の減少が抑制される可能性が示された。これらの結果は、α−ラクトアルブミンやＥＰＡにより炎症が抑制されることにより、筋萎縮が抑制されることを示唆するものであり、α−ラクトアルブミンやＥＰＡ等の抗炎症作用を有する物質が、慢性炎症に伴い萎縮した骨格筋回復のためのリハビリテーションを補助する物質として有用であることを示唆するものであると考えられる。
【００７２】
さらに、図６および７の結果から、体重１ｇ当たりのラムノース量当量が５μｇとなるようにＰＧ−ＰＳ  １０Ｓを投与したラットに被検物質を摂取させて筋力トレーニングを行った場合の骨格筋重量の変化に基づいて、被検物質の骨格筋回復を補助する効果を評価できることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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