(57)【要約】【課題】新規な細胞培養基材、細胞培養容器、及び細胞培養方法を提供すること。【解決手段】平面状メッシュ構造を有し、ポリマーでコーティングされている、細胞培養基材とする。細胞培養器は、この細胞培養基材を備えたものとして、細胞培養を行う。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養を行うための細胞培養基材であって、
平面状メッシュ構造を有し、
ポリマーでコーティングされている、細胞培養基材。
【請求項２】
前記基材が金属を含有する、請求項１に記載の細胞培養基材
【請求項３】
前記金属がニッケルである、請求項２に記載の細胞培養基材
【請求項４】
前記平面状メッシュ構造が細線状基材で構成され、
前記細線状基材の最大線径が１０μm以下であり、
メッシュ開口部の最大幅が３０μm以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の
細胞培養基材
【請求項５】
メッシュ開口部の面積が培養細胞の面積以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養基材
【請求項６】
メッシュ開口部の面積が１００μｍ２以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養基材
【請求項７】
前記細胞が幹細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項８】
前記幹細胞が多能性幹細胞である、請求項７に記載の細胞培養基材。
【請求項９】
前記ポリマーがｐ−キシレン系ポリマーである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項１０】
前記ポリマーでコーティングされた上に、細胞の足場材でコーティングされている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養基材を培養液中に浮かせた状態で保持するための保持部を備えた、細胞培養容器。
【請求項１２】
複数の前記保持部を備えた、請求項１１に記載の細胞培養容器。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養基材に細胞を播種する工程と、
前記細胞培養基材を培養液中に浮遊状態にして、前記細胞を培養する工程と、
を含む、細胞培養方法。
【請求項１４】
１つの細胞培養容器中に複数の前記細胞培養基材が積層されて前記細胞が培養されている、請求項１３に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養基材、細胞培養容器、及び細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞は、容器や細胞培養基材へ接着して培養する接着性細胞であり、一般的には、容器や基材の底面上に細胞を播種し、増殖させる。この時、コンフルエントな状態までに増殖すると細胞の接触障害が生じて細胞は増殖を停止し、細胞死を起こしたり、分化し始めたり、形質転換を起こしたりする。そのため、コンフルエント状態の８０％程度まで細胞が増えたら、細胞を継代する必要がある。
【０００３】
現状の自動細胞培養装置では、継代工程は人の手により行なわれているため、その工程で微生物が混入するリスクがある。しかも、継代操作自体、細胞に悪影響があり、継代操作を繰り返すことによって多分化能が低下し、高品質な細胞を得ることが難しくなる。そこで、マイクロメッシュ上で細胞を培養することによって長期間培養が継続できる方法が開発された（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１-０７８９６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、新規な細胞培養基材、細胞培養容器、及び細胞培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にかかる一実施態様は、細胞培養を行うための細胞培養基材であって、平面メッシュ構造を有し、ポリマーでコーティングされている、細胞培養基材である。前記基材が金属を含有してもよく、前記金属がニッケルであってもよい。また、前記平面状メッシュ構造が線状基材で構成され、前記線状基材の最大線径が１０μｍ以下であり、メッシュ開口部の最大幅が３０μｍ以上であってもよい。メッシュ開口部の面積が培養細胞の面積以上であってもよく、１００μｍ２以上であってもよい。前記細胞が多能性幹細胞などの幹細胞であってもよい。前記ポリマーがｐ−キシレン系ポリマーであってもよい。前記ポリマーでコーティングされた上に、細胞の足場材でコーティングされていてもよい。
【０００７】
本発明にかかる他の実施態様は、上記いずれかの細胞培養基材を培養液中に浮かせた状態で保持するための保持部を備えた細胞培養容器である。複数の前記保持部を備えていてもよい。
【０００８】
本発明にかかる、さらなる実施態様は、上記いずれか１の細胞培養基材に細胞を播種する工程と、前記細胞培養基材を培養液中に浮遊状態にして、前記細胞を培養する工程と、を含む、細胞培養方法である。１つの細胞培養容器中に複数の前記細胞培養基材が積層されて前記細胞が培養されていてもよい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、新規な細胞培養基材、細胞培養容器、及び細胞培養方法を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞培養基材の（Ａ）上面図及び（Ｂ）断面図である。
【図２】本発明の実施形態に係る、細胞培養容器の断面図である。
【図３】本発明の実施形態に係る、細胞培養基材を積層した細胞培養容器の断面図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る、細胞培養装置の断面図である。
【図５】本発明の実施例における、菱形メッシュの顕微鏡画像である。
【図６】本発明の実施例１における、（Ａ）菱形金属メッシュ上および（Ｂ）菱形光硬化性樹脂メッシュ上での細胞培養の経過観察結果を示す明視野顕微鏡画像である。
【図７】本発明の実施例２における、開口部の面積が異なるメッシュ上での細胞培養観察結果を示す明視野顕微鏡画像である。
【図８】本発明の一実施形態に係る、開口部が（Ａ）正三角形及び（Ｂ）円形であるメッシュの顕微鏡画像である。
【図９】本発明の実施例３における、開口部が（Ａ）正三角形及び（Ｂ）円形であるメッシュ上での細胞培養の経過観察結果を示す明視野顕微鏡画像である。
【図１０】本発明の実施例４における、開口部が（Ａ）菱形及び（Ｂ）円形であるパリレンコーティングありのメッシュ上での細胞培養の経過観察結果を示す明視野顕微鏡画像である。
【図１１】本発明の実施例１及び４におけるパリレンコーティングあり・なしの菱形メッシュを用いた培養培地中のhCGホルモン量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、図を参照しながら、本発明の実施の形態を詳細に記載するが、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１２】
１．平面メッシュ
本発明の実施形態にかかる細胞培養基材について説明する。この細胞培養基材は平面状メッシュ構造を有する。従来の細胞培養基材のように細胞より面積の大きな足場、または細胞の面積より空隙面積が小さい足場に細胞が接着して増殖するのではなく、培養液中に設置すると、細胞が細胞培養基材に接着しながら、細胞の面積より大きい面積を有する平面メッシュ１の開口部に、細胞が自発的に伸展する。その後、細胞は細胞培養基材上で増殖し、複数の細胞で開口部２を埋めていく。また、細胞培養基材は、培養容器中では培地中に浮かせた状態で設置してもよい。更に、本発明に係る細胞培養基材は、培養面積拡大のため、強度の強い材料で作製することが好ましい。以下、図を参照しながら、具体的な実施態様を詳細に説明する。
【００１３】
図１に、細胞培養基材によって構成される平面メッシュ１の一例の模式図を示す。
【００１４】
細胞培養基材を製造するための材料は特に限定されないが、細胞毒性を示さず、且つ強度の強い金属、例えば、純ニッケル、チタン、白金、金、タングステン、レニウム、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、合金（ステンレス鋼、チタニウム／ニッケル、ニチノール、コバルトクロム、非鉄合金、白金イリジウム合金）を含むか、これらの金属であることが好ましい。また、強度が十分であれば、例えば、光硬化性樹脂、生体適合性材料、生
体分解性材料なども含んでもよい。光硬化性樹脂としては、例えば、アクリレート化合物、メタクリレート化合物、エポキシ化合物、イソシアネート化合物、チオール化合物、シリコーン系化合物などが挙げられ、具体的には、ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレート、エポキシアクリレート、ポリ（メタ）アクリル酸メチル、エトキシ化ビスフェノールＡアクリレート、脂肪族ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル変性脂環式エポキシド、２官能アルコールエーテル型エポキシド、アクリルシリコーン、アクリルジメチルシロキサン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞培養基材をそのまま生体に移植するなど再生医療に好適に用いることができるという点では、基材の材料は生体適合性材料や生体分解性材料を含むか、それらからなることが好ましい。生体適合性材料としては、シリコーン、ポリエーテルブロックアミド（ＰＥＢＡＸ）、ポリウレタン、シリコーン−ポリウレタン共重合体、セラミックス、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ゴアテックス（商標）などの超高分子量ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、その他生体由来材料などが挙げられるがこれらに限定されない。生体分解性材料としては、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、及びそれらの共重合体、ＰＨＢ−ＰＨＶ系ポリ（アルカン酸）類、ポリエステル類、デンプン、セルロース、キトサンなどの天然高分子やその誘導体などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１５】
細胞培養基材は、上記材料を用いて、その構造や用途などに応じて、当業者が公知の方法やそれに準ずる方法で適宜作製することができるが、細線状基材からなる平面メッシュ１であることが好ましい。例えば、純ニッケルやチタンを用いれば電鋳法等により、光硬化性樹脂を用いれば、フォトリソグラフィ法によって作製することができる。細胞培養基材の材料に細胞毒性があったり、生体適合性材料以外のものであったりする場合、細線状基材の表面を生体適合性材料などで処理すればよい。
【００１６】
細線状基材の線径は、特に限定されず、材料や、培養する細胞の大きさに合わせて、当業者が適宜決定することができる。従来の細胞培養基材は、細胞が定着するよう細胞の最大径と同等か、より大きな幅の構造体が用いられていたところ、本発明に係る細線状基材の線径は、細胞の最大径よりも細くてもよく、例えば細胞の最大径の２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、あるいはそれ以下であってもよい。具体的には、細線状基材の線径は、１〜１０μｍであってもよく、１μm以下であってもよい。平面
メッシュ１に最初に細胞を播種する際、細胞は細胞培養基材に接着するので、細線状基材の線径を調節することにより、接着する細胞数も制御できる。なお、ここで、細胞の最大径とは、細胞の周辺の二点を結ぶ直線のうち最長の直線の長さをいう。
【００１７】
次に、細線状基材を用い、開口部２が規則的または不規則に繰り返し並んだ平面状の構造体である平面メッシュ１を作製する。開口部２の形状は、典型的には正三角形、正方形、正六角形などの正多角形であるが、その他の多角形のほか、円や楕円であってもよい。開口部が正多角形の場合、一辺の長さは特に限定されないが、例えば、３０〜４００μｍ程度とすることができる。また、開口部２は、すべて同じ形状でなくてもよく、複数の開口部を１セットとして、各セットが規則的または非規則的に繰り返し並んだ平面状の構造体でもよく、開口部２の形状がランダムであってもよく、全ての開口部２が異なる形状であってもよい。
【００１８】
開口部２は、培養する細胞１個以上の大きさである、すなわち、細胞が開口部２を通過できる大きさであることが好ましい。この場合、開口部２は、細胞が開口部２に接触しないで、あるいは細線状基材に接触しても変形しないで通過できる大きさであってもよいし、開口部２に接触して変形しながら通過できる大きさであってもよい。
【００１９】
開口部２が培養する細胞以上の大きさである例として、メッシュ構造の開口部２の面積が、播種前の細胞の最大面積より大きい場合が挙げられる。ここで、細胞の最大面積とは、断面積が最大になるように細胞を切断した場合の断面積をいう。播種前の細胞の最大面積とは、細胞が播種される前の状態、すなわち細胞が培養細胞基材に接着して伸展する前の状態での最大面積を意味する。細胞が接着する前は、通常その形状は球状に近いので、メッシュ構造の開口部２の面積が、播種前の細胞１個の最大面積より大きければ、容易にメッシュ構造の開口部２を通り抜けることができる。他の例としては、開口部２の最小径が、培養する細胞の播種前の最大径よりも大きいものであってもよく、例えば、開口部２の最小径が、培養する細胞の最大径の２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍、１００倍、１０００倍等であってもよい。開口部２の最小径は、当業者が適宜測定することができるが、例えば、開口部２の形の重心（例えば、正角形の場合、その中心）を通って辺上の二点を結ぶ直線のうち最短の直線の長さをいう。開口部２の形状が２種以上ある場合、いずれかの開口部２においてのみ、開口部２の最小径が培養する細胞の播種前の最大径より大きくてもよいし、すべての開口部２において、開口部２の最小径が培養する細胞の播種前の最大径より大きくてもよい。
【００２０】
なお、具体的な開口部２の面積は特に限定されないが、５０μｍ２であることが好ましく、１００μｍ２であることがより好ましく、２００μｍ２以上であることがさらに好ましい。
【００２１】
また、細胞培養基材は、周囲を補強してもよく、それによって細胞の培養に加え、その移動や成形などの操作もしやすくなる。細胞培養基材を補強する方法としては、例えばカプトンテープを周囲に貼ったり、またはＰＤＭＳなどで挟んだりする方法が挙げられる。
【００２２】
開口部２の最小径が、細胞の最大径より大きい場合、細胞培養基材を水平に置いてその上方から細胞を播種すると、細胞培養基材に定着する細胞もあり、細胞培養基材に接触せずに下に落ちる細胞もある。細胞培養基材に定着した細胞だけでは、当初は開口部２が埋まらないが、細胞が開口中心に向かって自発的に伸展していく結果、開口部２が細胞で埋められていく。
【００２３】
２．細胞培養基材の前処理
細胞培養基材は、細胞を培養基材に定着させて伸展や増殖をしやすくするために、細胞培養に用いるための前処理として、接着性細胞の足場となる材料をコーティングしてもよい。この足場となる材料は、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの細胞外マトリックスタンパク質、ポリＬリジンなどの陽性電荷物質などが挙げられるが、これらに限定されない。コーティングは、例えばコラーゲンの場合、約０．１％溶液に細胞培養基材を浸漬させてインキュベートすることにより行うことができる。フィブロネクチンの場合は約１０μｇ／ｍｌの溶液、マトリゲルの場合は１％溶液を用いることができるが、これらの濃度、処理温度や処理時間は、当業者が適宜調節することができる。
【００２４】
また、細胞培養基材へ接着性細胞の足場となる材料をコーティングする前に、細胞培養基材へモノマーまたはポリマーまたはそれらの混合物（以下、これら３つを含めてモノマー／ポリマーと記載する。）をコーティングすることにより、培養細胞の性質をコントロールすることが可能となる。例えば多能性幹細胞を培養する場合、モノマー／ポリマーをコーティングすることで、未分化状態の多能性幹細胞の性質を維持したまま培養することが可能となる。ここで用いるモノマー／ポリマーは、細胞毒性がなく、生体適合性のあるものであれば使用できる。例えばアクリル樹脂（アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸２-ヒドロキシエチル、アクリル酸２-ヒドロキシエチル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸グリセリル、グリセリル、メタクリル酸グリセリル、メタクリルアミド、アクリルアミド）、ビニル（ エチレン、プロピレン、クロロエチレン、酢酸ビ
ニル、ビニルピロリドン、フッ化ビニルデン）、ナイロン（ポリカプロラクタム、ポリロウリムラクタム、ポリヘキサメチレンビグアニド、アジポアミド、ポリヘキサメチレンドデカンジアミン）、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリスルフォン、ポリエチレンテレフタラート、ジメチルポリシロキサン、ポリエーテルケトン、ペルフルオロアルコキシフッ素樹脂（テフロン（登録商標）、ネオフロン（登録商標）; ポリクロロトリフルオロエチレン）、ふっ化エチレンプロピレンポリマー（テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロペン）、エキスパンデッドポリテトラフルオロエチレンなどが例示できるが、ｐ−キシレン樹脂が好ましく、ポリｐ−キシレンがより好ましく、パリレンがさらに好ましい。
【００２５】
コーティングの方法は特に限定されないが、蒸着を用いるなど、それぞれのモノマー／ポリマーに最適なコーティング方法を用いればよい。コーティングの厚みは、細線状基材の線径が細胞の最大断面長を超えることがなければ良い。例えば、ポリｐ−キシレンでは１００〜５００nm厚でコーティングできる。
【００２６】
３．細胞培養容器
本発明の一実施形態は、上述した細胞培養基材４を含んだ、細胞７を培養するための細胞培養容器５である。
【００２７】
細胞培養容器５は、細胞培養基材４を培養液中に浮かせた状態で保持する保持部６を備えてもよい。「培養液中に浮かせた状態で」とは、細胞培養基材４の両面が、細胞培養容器５の内壁や底面に接触しておらず、両面とも培養液と十分に接触できる状態をいう。例えば、図２に示すように、細胞培養基材４は、細胞培養容器５内において、水平に設置しても（図２Ａ）垂直に設置しても（図２Ｂ）よい。本明細書において「細胞培養基材を培養液中に浮かせた状態で保持するための保持部」は、細胞培養基材４を培養液中に浮かせた状態で、安定に保持できる限り、どのような手段であってもよい。例えば、この保持部６は、細胞培養容器５の内壁（図２Ａ）に設けられた溝６であってもよい。図２Bに示す
ように、細胞培養基材４を垂直に保持する場合、溝６は細胞培養容器に設けられる。増殖能の高い幹細胞の場合、一般に、培養すると積み重なって細胞塊を形成することが多いが、細胞塊の中心の細胞に培養液からの栄養が回らず、細胞塊の内側から細胞が死んでいくことがある。しかしながら、細胞培養基材を垂直に置いて培養すると、余分な細胞が細胞培養基材４から剥離し、コロニーの形成が抑制される。
【００２８】
細胞培養容器５は、細胞培養基材４を複数装着できるものであってもよい。例えば、図３に示すように、細胞培養容器５の壁または底面に、細胞培養基材を培養液中に浮かせた状態で保持するための保持部６を複数形成して細胞培養基材４を底面または壁面に垂直になるように装着すれば、複数の細胞培養基材４を平行に設置することができる。これらの構成においては、少ないスペースで大量に細胞を培養することが可能となる。
【００２９】
４．細胞培養装置
本発明の一実施形態にかかる細胞培養装置は、上記細胞培養容器を用いて細胞を培養するための装置である。この細胞培養装置を用いて、細胞培養、すなわち、細胞培養基材に細胞を播種する工程と、細胞を培養する工程とを自動、もしくは一部手動で行なうことができる装置である。この細胞培養装置は、目的の培養細胞を付着させた細胞培養基材を保持するための細胞培養容器、細胞培養容器に培地を供給するための細胞培地タンク、細胞培養容器から排出された培地を貯蔵するための廃液タンク、細胞培養装置内の温度および二酸化炭素分圧を調整するための温度調節・二酸化炭素濃度調節機構を備える。
【００３０】
図４に示した細胞培養装置の一実施形態において、細胞を培養する方法を以下に述べる。
【００３１】
まず、細胞培養容器５に細胞培養基材を設置した後、目的の細胞を細胞培養基材播種するか、あるいは、目的の細胞を細胞培養基材に播種した後、その細胞培養基材を細胞培養容器に設置することによって、細胞が付着した細胞培養基材を有する細胞培養容器５を準備する。次に、廃液タンク１０への弁を閉じ、一定量の培地が、細胞培地タンク９から供給され、細胞培地タンク９からの弁を閉じ、一定時間インキュベートされる。その間、温度調節・二酸化炭素濃度調節機構１１によって、細胞培養装置内の温度および二酸化炭素分圧が一定に保たれる。その後、廃液タンク１０への弁を開き、培地が廃液タンク１０に排出される。そして、再度、廃液タンク１０への弁を閉じ、一定量の培地が、細胞培地タンク９から供給され、細胞培地タンク９からの弁を閉じ、一定時間インキュベートされる。細胞培地タンク９の弁及び廃液タンク１０の弁の開閉は、適宜調節することができ、例えば細胞培地タンク９より培地を供給する際に廃液タンク１０の弁を開き、低流速で培地を交換・循環してもよい。この工程が繰り返されることにより、細胞が培養される。なお、細胞培養容器５の準備以降の工程を、全て自動的に行うための制御装置を備えていることが好ましい。
【００３２】
５．細胞培養方法
本発明の一実施形態である細胞培養方法は、上記細胞培養基材に細胞を播種する工程と、その細胞培養基材を培養液中に浮遊状態にして細胞を培養する工程と、を含む。
【００３３】
ここで用いる細胞は特に限定されないが、接着培養可能な細胞であることが好ましく、幹細胞であることがより好ましく、多能性幹細胞であることがさらに好ましい。多能性幹細胞とは、生体外において培養することが可能で、かつ生体を構成するほぼすべての細胞に分化しうる細胞をいう。具体的にはＥＳ細胞、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ］細胞：Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.1998, 95:13726-31）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Nature. 2008, 456:344-9）、体細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ
細胞）、ヒト多能性体性幹細胞（神経幹細胞）が挙げられるが、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞が好ましく、ｉＰＳ細胞がさらに好ましい。
【００３４】
細胞培養基材に細胞を播種する工程に先立ち、細胞培養容器及び細胞培養基材を滅菌しておくことが好ましい。培養液は細胞の種類に合わせて、当業者が適宜調製することができる。
【００３５】
細胞培養基材へ細胞を播種するには、細胞培養基材上に、細胞を懸濁した溶液を添加し、細胞を細胞培養基材へ接着させる。この工程は公知の方法又はそれに準ずる方法で適宜行うことができる。例えば、培養液で細胞を懸濁し、ピペット等で細胞培養基材に滴下すればよい。この工程のために必要な細胞溶液は、それぞれの細胞に推奨されている培地にて、培養面積を考慮し細胞数を適宜調整すればよい。細胞培養基材へ細胞を播種したのち、培養液中に浮かせた状態で細胞培養容器に設置する。培養液中に浮かせた状態で細胞培養基材を設置することにより、すべての細胞が必要な栄養を培養液から取り込み、不要物を排出することができるので、細胞にとって適切な培養条件で維持することができる。その後、細胞培養基材を培養に適した環境下に置き、培地を定期的に交換する。培養に用いる培地や培養環境（温度や二酸化炭素濃度）、培地の交換のタイミングは、用いる細胞に推奨されている公知の条件で行えばよい。
【００３６】
この細胞培養方法を用いることにより、死細胞や劣化した細胞は自然に細胞培養基材から脱落するので、細胞を継代する必要がなく、細胞培養容器中に細胞培養基材を設置したまま、必要に応じて培養液を交換又は循環等することにより、細胞培養装容器内で、細胞を長期間培養することができる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００３８】
［実施例１］
本実施例では、金属または光硬化樹脂を用いて平面状メッシュを作製し、同メッシュ上にてｉＰＳ細胞の培養を行ない、細胞が分化した例を示す。
【００３９】
まず、開口部２となる菱形の短軸長が２００μｍ、メッシュ線２の線径が５μｍの菱形メッシュ１２を作製した。
【００４０】
菱形光硬化性樹脂メッシュは、ＳＵ−８を用い、フォトリソグラフィ法を用いて、以下のように作製した。まず、東京大学ＶＤＥＣの電子線描画装置を用い、電子線描画によりフォトマスクブランクに正方形のメッシュパターンを描いた。その後、４インチのシリコンウェハーの表面上に犠牲層となるゼラチンをスピンコーティングにより塗布した。続いて、ゼラチンの上にＳＵ−８を、厚みが２μｍとなるようにスピンコーティングした。その後、６５℃で１分、９５℃で２分と段階的に加熱しソフトベークを行い、次に露光及び現像を行った。その後、メッシュパターンの周囲に厚み１００μｍのカプトンテープを貼って補強し、次にウェハーを８０℃の熱湯に浸してゼラチンを溶かし、ウェハー上に形成されたＳＵ−８薄膜を回収し、細胞培養基材を得た。
【００４１】
菱形金属メッシュは、純ニッケルを用い、電鋳法により作製した。ニッケルメッシュに対しても、ハンドリングを容易にするために、メッシュ周辺を厚み１００μｍのカプトンテープ１３により補強した。
【００４２】
作製した細胞培養基材１２へＵＶランプを２４時間以上照射し、滅菌を行なった。滅菌済みの細胞培養基材１２は、図２Ａの構成を用いて細胞培養容器５へ設置した。
【００４３】
次に、足場剤として１ｍｇ／ｍＬ濃度に調整したマトリゲル（CORNING社）を、メッシ
ュを覆うように添加し、４℃で１０日間処理した。その後マトリゲルを除去してＤＭＥＭ／Ｆ-１２（GIBCO社）培地にてメッシュ以外に存在するマトリゲルを洗浄した後に、ヒト胎児肺繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞（細胞の直径は約１０μｍ）を５×１０５細胞／μＬになるようEssential８（GIBCO社）培地にて調整し、且つ溶液の１／１０００量のRock Inhibitor（和光純薬社）を添加したｉＰＳ細胞懸濁液をマトリゲルと同様にメッシュ上に添加し、３７℃、  ＣＯ２濃度５％に調整された細胞培養装置でインキュベートした。培養開始後１日目にｉＰＳ細胞調整液を除去し、Essential８培地を細胞培養容器へ添加し、
再度細胞培養装置でインキュベートした。その後、２日ごとに培地を交換して細胞の経過観察を行なった結果を図６に示す。
【００４４】
培養１日目では、ヒトｉＰＳ細胞１４は細胞培養基材のメッシュ線３上に接着していた。細胞は培養４日目より徐々に伸展して単一層を形成し、培養１２日目で、ｉＰＳ細胞が矢印で示すように嚢胞状となり、胚盤胞へ分化していることが観察された。このように、材料として金属及び光硬化性樹脂を用いたメッシュ状の細胞培養基材を用いることで、ｉＰＳ細胞を培養でき、且つ細胞を誘導剤なしで胚盤胞へ分化させることができる。
【００４５】
［実施例２］
本実施例では、開口部の大きさが異なる細胞培養基材を作製し、ｉＰＳ細胞培養を行なった。
【００４６】
図５に示すように、開口部２となる面積が、細胞の最大面積の約１０、３０、１２０、
５００倍であり、且つメッシュ線の線径が５μｍの菱形ニッケルメッシュを細胞培養基材として用いた。細胞培養基材は実施例１と同様に作製し、準備した。
【００４７】
足場剤として１ｍｇ／ｍＬ濃度に調整したラミニン（Sigma Aldrich社、５０μｇ／ｍ
Ｌ）を、メッシュを覆うように添加し、４℃で１０日間処理した。その後足場剤を除去してＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて余分な足場剤を洗浄した後、ヒト胎児肺繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞を５×１０５細胞／μＬにｍＴｅＳＲ（ベリスタ社）培地にて調整し、Rock Inhibitorを添加したヒトｉＰＳ細胞懸濁液をラミニンと同様にメッシュ上に添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％に調整した細胞培養装置でインキュベートした。培養１日目に培地を除去し、ｍＴｅＳＲを添加し、再度細胞培養装置でインキュベートした。その後、２日ごとに培地を交換して細胞の経過観察を行なった。培養１３日目の結果を図７に示す。
【００４８】
培養１日目には、ヒトｉＰＳ細胞１４は、実施例１と同様に、細胞培養基材のメッシュ線上に接着していた。培養１３日目には、ｉＰＳ細胞が図７中矢印で示すように嚢胞状となり、胚盤胞へ分化していることが観察された。このように、開口部が細胞の最大面積に対して１０〜５００倍の間のメッシュ上の細胞培養基材を用いても、ヒトｉＰＳ細胞を培養でき、且つ細胞を誘導剤なしで胚盤胞へ分化させることができる。
【００４９】
［実施例３］
本実施例では、開口部の形が菱形以外（三角形、円形）の平面状メッシュをもちいてｉＰＳ細胞培養を行なった。
【００５０】
図８Ａに示すように、開口部１５が正三角形の（１辺１００μm）ニッケルメッシュ（
メッシュ線１６の線径：５μm）、開口部１７が円形の（直径５０μm）ニッケルメッシュ（メッシュ１８の厚み：７μm）を細胞培養基材として用いた。尚、ニッケルメッシュは
実施例１と同様に電鋳法により作製した。細胞培養基材はハンドリングを容易にするために、作製したメッシュ周辺を、厚み１００μｍのカプトンテープにより補強した。作製した細胞培養基材へＵＶランプを２４時間以上照射し、滅菌を行なった。滅菌済みの細胞培養基材は、図２Ａに記載の構成で細胞培養容器５へ設置した。
【００５１】
足場剤として１ｍｇ／ｍＬ濃度に調整したマトリゲル（ＣＯＲＮＩＮＧ社）を、メッシュを覆うように添加し、４℃で１０日間処理した。その後マトリゲルを除去してＤＭＥＭ／Ｆ−１２（GIBCO社）培地にてメッシュ以外に存在するマトリゲルを洗浄した後に、ヒ
ト胎児肺繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞（細胞の直径は約１０μm）を５×１０５細胞／μLになるようEssential８（GIBCO社）培地にて調整し、且つ溶液の１／１０００量のRock Inhibitor（和光純薬社）を添加したｉＰＳ細胞懸濁液をマトリゲルと同様にメッシュ上に添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の細胞培養装置でインキュベートした。培養１日目に培地を除去し、Essential８培地を、細胞培養基材が満たされるように細胞培養容器へ添加し
、再度細胞培養装置でインキュベートした。その後経過観察を行なった結果を図９に示す。その後、２日ごとに培地を交換して細胞の経過観察を行なった。
【００５２】
培養１日目では、ヒトｉＰＳ細胞１４は細胞培養基材のメッシュ１６及び１８に接着していた。培養５日よりに徐々に伸展して単一層を形成し、培養１２日目で、ｉＰＳ細胞が矢印で示すように嚢胞状となり、胚盤胞へ分化していることが観察された。このように、メッシュの開口部の形状が正三角形及び円形の細胞培養基材を用いることでも、ｉＰＳ細胞を培養でき、且つ細胞を誘導剤なしで胚盤胞へ分化させることができる。
【００５３】
［実施例４］
本実施例では、平面状メッシュへポリマーをコーティングした後に、ｉＰＳ細胞を培養した。図５に示した開口部２の短軸長が２００μｍの菱形メッシュ（メッシュ線３及び厚
が２〜５μｍ）に対し、足場剤をコーティングする前にポリマーをコーティングすることで、ｉＰＳ細胞の未分化状態を維持できることを示す。
【００５４】
菱形メッシュはニッケルまたはＳＵ−８を材料とした。菱形ニッケルメッシュ及び菱形ＳＵ−８メッシュは実施例１と同様に作製し、ハンドリングを容易にするために、作製したメッシュ周辺を、厚み１００μｍのカプトンテープ１２により補強した。
【００５５】
次に、作製した細胞培養基材に対し、下記化学式のパリレンＣ（日本パリレン社）を約０．２〜０．５μｍ厚となるようにメッシュにコーティングした。パリレンＣのコーティングにはラボコーターＰＤＳ２０１０（日本パリレン社）を使用し、試薬及び装置のマニュアルに従った。
【００５６】
【化１】
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【００５７】
次に、パリレンＣをコーティングした細胞培養基材に対し、ＵＶランプを２４時間以上照射し、滅菌を行なった。そして、足場剤として１ｍｇ／ｍＬ濃度に調整したマトリゲルまたはラミニンを、メッシュを覆うように添加し、４℃で１０日間処理した。その後足場剤を除去してＤＭＥＭ／Ｆ−１２またはＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて余分な足場剤を洗浄した後に、ヒト胎児肺繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞（細胞の直径は約１０μｍ）を５×１０５細胞／μLになるようにEssential８にて調整し、Rock Inhibitorを添加したｉＰＳ細胞懸濁液をマトリゲル及びラミニンと同様にメッシュ上に添加し、３７℃、  ＣＯ２濃度５％に調整された細胞培養装置でインキュベートした。静置後１日目にｉＰＳ細胞調整液を除去し、Essential８培地を添加し、再度細胞培養装置でインキュベートした。その後２日
ごとに培地を交換して経過観察を続けた結果を図１０Ａに示す。
【００５８】
培養１日目では、ｉＰＳ細胞１４は細胞培養基材１９に接着していた。そして、培養５〜１２日までに徐々に伸展して単一層を形成した。実施例１に示すように、パリレンＣのコーティングなしのメッシュでは１２日目で嚢胞状の胚盤胞への分化が確認されたが、パリレンＣのコーティングを行なったメッシュではｉＰＳ細胞の胚盤胞への分化は確認されなかった。この結果はニッケルを材料としてメッシュでも確認できた。
【００５９】
また、実施例３で作製した円形メッシュに対しパリレンＣをコーティングして同様の実験を行ったところ、図１０Ｂに示すように、菱形メッシュ同様、嚢胞状の胚盤胞への分化は生じなかった。
【００６０】
さらに、実施例１〜４で用いているiPS細胞は、胚盤胞へ分化すると、ヒト絨毛性ゴナ
ドトロピン（Human chorionic gonadotropin、 hCG）ホルモン（以下hCG）を分泌するの
で、図１０Aにおける培養溶液中のhCG量を、培養日数（１０、１３、１６、２０日目）毎に測定した。対照として、パリレンＣのコーティングを行なわずにマトリゲルをコーティングした実施例１における細胞培養基材で細胞培養して得られた培養溶液を用いた。定量には、ELISA反応を利用したhCG ELISAキット（IMMUNOSPEC社）を用いて、吸光プレートリーダー（TECAN infinite F５０、 TECAN社）にてOD４５０の値を検出した。ELISA反応及
び測定方法の詳細はキットのマニュアルに従った。
【００６１】
その結果、対照の培養溶液からは、培養１３日目以降よりhCG量が増加しているのに対
し、パリレンＣをコーティングした細胞培養基材を用いた場合は培養日数が１３日以降もhCGは検出されず、培養２０日目にわずかに検出されたものの、対照で得られた値の５０
分の１程度であった（図１１）。なお、ニッケルを材料としたメッシュでも同様の結果が得られた。
【００６２】
このように、足場でコーティングする前にパリレンＣをコーティングした細胞培養基材を用いると、ｉＰＳ細胞を長期間培養しても未分化状態が維持される。従って、足場剤をコーティングする前にパリレンＣでコーティングした細胞培養基材を用いることで、ｉＰＳ細胞を培養でき、且つ細胞を未分化な状態で長期間維持することができる。
【符号の説明】
【００６３】
１…平面状メッシュ
２、１５、１７…開口部
３、１６、１８…メッシュ線
４、１２…細胞培養基材
５…細胞培養容器
６…保持部
７、１４…細胞
８…培地
９…細胞培地タンク
１０…細胞培養廃液タンク
１１…温度調節・二酸化炭素濃度調節機構
１３…カプトンテープ
１９、２０…パリレンコーティング平面状メッシュ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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