(57)【要約】      （修正有）【課題】第X因子変異体及び血液凝固障害の治療におけるその使用を提供する。【解決手段】第X因子であって、少なくとも1つの変異A、A'、B、C又はC'を含み、変異Aは、アミノ酸43〜52の置換からなり、変異A'は、アミノ酸47〜52の置換からなり、変異Bは、アミノ酸52と53との間への配列の挿入からなり、変異Cは、アミノ酸52と53との間への配列の挿入、並びにアミノ酸4〜13の欠失からなり、変異C'は、アミノ酸52と53との間への配列の挿入、並びにアミノ酸4〜9の欠失からなる、タンパク質を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1の変異配列を含むタンパク質であって、前記配列番号1の変異配列は少なくとも1つの変異A、A'、B、C又はC'を含み、変異Aは、DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR及びKATXATLSPRから選択される配列による配列番号1の配列のアミノ酸43〜52の置換からなり、
変異A'は、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR及びLSCGQRから選択される配列による配列番号1の配列のアミノ酸47〜52の置換からなり、
変異Bは、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのDFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR及びLSCGQRから選択される配列の挿入からなり、
変異Cは、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのDFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR及びKATXATLSPRから選択される配列の挿入、並びに配列番号1の配列のアミノ酸4〜13の欠失からなり、
変異C'は、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのTSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR及びLSCGQRから選択される配列の挿入、並びに配列番号1の配列のアミノ酸4〜9の欠失からなり、
N*は任意選択にグリコシル化アスパラギンである、タンパク質。
【請求項２】
少なくとも1つの変異A、A'、B、C又はC'を有する配列番号7の配列を含む、好ましくはそれらからなることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号9〜16、18〜25、27〜34、105〜112、114〜121及び123〜130から選択される配列を含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質、及び配列番号2の配列の少なくとも1つのタンパク質を含み、前記タンパク質がジスルフィド結合によって互いに連結されている、タンパク質複合体。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項６】
配列番号77〜84、86〜93、95〜102、133〜140、142〜149及び151〜158の配列から選択されることを特徴とする、請求項5に記載の核酸。
【請求項７】
請求項5又は6に記載の核酸を含む、発現カセット。
【請求項８】
請求項7に記載の発現カセットを含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項９】
請求項5又は6に記載の核酸を含む組換え細胞であって、前記核酸が、好ましくは請求項8に記載のベクター内に含まれる、組換え細胞。
【請求項１０】
医薬として使用するための請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
出血性障害の治療に使用するための請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第X因子変異体及び血液凝固障害の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
第X因子は血中に存在するタンパク質である。このタンパク質は凝固カスケードにおいて重要な役割を果たす。血液凝固は、損傷した血管を通る血液の流れを阻止できるようにする複雑なプロセスである。血管が破壊するとすぐに、凝固の役割を担う要素が互いに相互作用して、血管が破壊した部位に止血栓である栓を形成する。適所に止血栓を保持し、凝固を安定化させるために、凝固因子が必要とされる。
【０００３】
正常な凝固の形成は4つの段階で発生する:
段階1  血管が損傷する。
段階2  損傷した領域への血液供給を制限するように血管が収縮する。
段階3  血小板が、血管損傷の際に露出した内皮細胞下腔に付着し、更に刺激された血管壁にも付着する。血小板は広がり、これは「血小板粘着」と称されるものである。これらの広がった血小板は他の隣接する血小板を活性化する物質を放出し、それによってそれらは止血栓を形成するために損傷の中心で凝集する。これは「血小板凝集」と称されるものである。
段階4  このように活性化した血小板の表面は、血液凝固が起こりうる表面を構成する。血中に循環する凝固タンパク質(第X因子を含む)は、血小板の表面で活性化され、フィブリン塊を形成する。
【０００４】
これらの凝固タンパク質(すなわち、第I因子、第II因子、第V因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、第XII因子及び第XIII因子、加えてヴォン・ヴィレブランド因子)は、連鎖反応、すなわち凝固カスケードにおいて作用する。
【０００５】
活性化形態(Xa)の第X因子は、特に、プロトロンビナーゼ複合体を形成するように、活性化した第V補因子と複合体を形成する場合、より特には、プロトロンビン(第II因子)からトロンビン(第IIa因子)の活性化に関与する。この因子は凝固カスケードにおいて必須要素である。
【０００６】
この因子が欠失している場合、鼻出血(鼻血)、関節血症(関節腔内への血液の浸出)又は消化管出血等の出血が起こる。第X因子欠損は極めて稀である。その遺伝は常染色体劣性であり、その有病率は1/1000000である。
【０００７】
FX活性化は、
-  微量のトロンビンの形成が生じる比較的効果的が低い反応において、第VIIa因子/組織因子複合体による凝固カスケード開始段階の間の極めて早期か、
-  又は第VIII因子及び第IX因子の活性化をもたらす、微量のトロンビンによって生じる正のフィードバックに起因する凝固カスケード増幅段階の間
のいずれかに発生する。
【０００８】
後者の2つの因子は血友病A及び血友病Bを患っている個体では欠損しているので、治療しなければ致命的になりうる出血性障害を引き起こす。これらの因子の不在は、出血を停止させるのに十分な量の活性化した第X因子を生成できないことを意味する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、凝固の開始の間に生成された微量のトロンビンの直接使用により、トロンビンによって活性化でき、第VIII因子及び/又は第IX因子の不在下で効果的に凝固することができる改変された第X因子についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、トロンビンによって効果的に活性化され、それ故、第VIII因子、第IX因子及び更に第X因子の不在下で凝固を修復できる、特定の第X因子変異体(第X因子バリアントとも呼ばれる)を同定した。実際に、実施例において実証されているように、これらの第X因子変異体はトロンビンによって活性化でき、内因性第VIII因子及び/又は第IX因子及び/又は第X因子の不在下でさえも効果的な凝固を可能にする。
【００１１】
これらの第X因子バリアントにおいて生成される活性化ペプチド切断部位もまた、第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、第XIa因子、第XIIa因子又はカリクレイン等の他の凝固プロテアーゼの標的になりうる。
【００１２】
更に、第X因子の活性化ペプチドの改変により、トロンビンによる唯一の認識以外に、その薬理学的特性の更なる改変が生じうる。この改変は第X因子バリアントに特異的活性、安定性若しくはプロテアーゼ耐性の向上又は更に薬物動態の増加を与えうる。加えて、野生型分子と比較して、更なるグリコシル化及びリン酸化の存在又は反対にこれらの改変の不在は、活性化ペプチドに導入される改変によって引き起こされうる。
【００１３】
したがって、本発明は、配列番号1の変異配列を含むタンパク質であって、前記配列番号1の変異配列は少なくとも1つの変異A、A'、B、C又はC'を含み、
変異Aは、DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR及びKATXATLSPRから選択される配列による配列番号1の配列のアミノ酸43〜52の置換からなり、
変異A'は、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR及びLSCGQRから選択される配列による配列番号1の配列のアミノ酸47〜52の置換からなり、
変異Bは、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのDFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR及びLSCGQRから選択される配列の挿入からなり、
変異Cは、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのDFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR及びKATXATLSPRから選択される配列の挿入、並びに配列番号1の配列のアミノ酸4〜13の欠失からなり、
変異C'は、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのTSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR及びLSCGQRから選択される配列の挿入、並びに配列番号1の配列のアミノ酸4〜9の欠失からなり、
N*は任意選択にグリコシル化アスパラギンである、タンパク質に関する。
【００１４】
本発明の別の主題は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１５】
本発明の別の主題は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。
【００１６】
本発明の別の主題は前記発現ベクター又は前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。
【００１７】
本発明の別の主題は医薬としての前記タンパク質の使用である。特に、前記タンパク質は、血液凝固障害、特に血友病A、B及びC(第XI因子欠損)、第X因子欠損等の出血性障害の治療又は更に第VIIa因子を代用するための緊急の凝固の必要性のために使用されてもよい。強力及び迅速な凝血促進反応が必要とされる場合、前記タンパク質は、第VIIa因子及び/若しくはフィブリノーゲン等の他の止血分子と組み合わせて又は更に治療の有効性を増強できる凝血促進化合物(血小板輸血、FEIBA、Kaskadil、Kanokad等の凝血促進混合物)と組み合わせて使用されてもよい。
【００１８】
本明細書に使用される場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、100より多いアミノ酸を有するアミノ酸配列を指す。本明細書に使用される場合、「タンパク質」という用語は、100から1000の間のアミノ酸、好ましくは120から500の間のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本発明は、配列番号1の変異配列を含むタンパク質であって、前記配列番号1の変異配列は少なくとも1つの変異A、A'、B、C又はC'を含み、
変異Aは、DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR及びKATXATLSPRから選択される配列による配列番号1の配列のアミノ酸43〜52の置換からなり、
変異A'は、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR及びLSCGQRから選択される配列による配列番号1の配列のアミノ酸47〜52の置換からなり、
変異Bは、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのDFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR及びLSCGQRから選択される配列の挿入からなり、
変異Cは、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのDFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR及びKATXATLSPRから選択される配列の挿入、並びに配列番号1の配列のアミノ酸4〜13の欠失からなり、
変異C'は、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのTSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR及びLSCGQRから選択される配列の挿入、並びに配列番号1の配列のアミノ酸4〜9の欠失からなり、
N*は任意選択にグリコシル化アスパラギンである、タンパク質に関する。
【００２０】
好ましくは、前記タンパク質は、上記の少なくとも1つの変異A、A'、B、C又はC'を有する配列番号7の配列を含む、好ましくはそれらからなる。
【００２１】
配列番号7の配列(500アミノ酸)は配列番号1の全ての配列(306アミノ酸)を含む。より特には、配列番号7の配列は、N末端からC末端方向において、シグナルペプチド及びプロペプチド(合計40アミノ酸)、配列番号5の配列、配列番号1の配列、次いで(489〜500位置、すなわち12アミノ酸の長さにおいてアミノ酸の)タグ、すなわちHPC4タグを含む。配列番号103の配列はシグナルペプチドを有さず、プロペプチドを有さない配列番号7の配列に対応する。
【００２２】
本発明に係る前記タンパク質は凝固障害の治療に効果的である変異第X因子である。
【００２３】
第X因子は、スチュワート・プロワー因子とも呼ばれており、F10遺伝子によってコードされ、セリンプロテアーゼEC3.4.21.6を指す。第X因子は306アミノ酸の重鎖及び139アミノ酸の軽鎖から構成される。
【００２４】
第X因子は、シグナルペプチド、プロペプチド、並びに軽鎖及び重鎖からなる、488アミノ酸のタンパク質である。
【００２５】
ヒト第X因子はUniProtKBで受託番号P00742として見出されうる。図1に、その天然構造を例示する。
【００２６】
タンパク質はプレプロペプチド形態で翻訳される。シグナルペプチドの切断後、プロペプチドは最終的に切断され、軽鎖及び重鎖(それぞれ142及び306アミノ酸)(チモーゲン)が生じる。凝固の誘発後、重鎖は、254アミノ酸のみ(最初の52アミノ酸は処理の間に切断される)を含有するように活性化ペプチドの切断によって最終的に活性化される:これは第Xa因子の重鎖(配列番号6)である。
【００２７】
ヒト第X因子のプレプロペプチドは配列番号4に対応する。重鎖は配列番号1に対応し、軽鎖は配列番号5に対応する。重鎖の活性化ペプチドは配列番号3に対応し、52アミノ酸を含む。
【００２８】
配列番号2は配列番号4のアミノ酸1〜182と同一である。
【００２９】
配列番号1は配列番号4のアミノ酸183〜488と同一である。
【００３０】
第Xa因子の重鎖(配列番号6)は、配列番号3のペプチドが切断されている配列番号1に対応する。
【００３１】
本発明に係るタンパク質は、構築物に応じて、
-  最大幅で残基42から52の間に含まれる同じ部位における同一の数の残基の置換によって改変されているか、又は
-  残基52と53との間への残基の挿入を受けているか、又は
-  最大幅で残基4から13の間における同一の数の残基の欠失と共に、最大幅で残基52と53との間への残基の挿入を受けている
活性化ペプチドを含む変異第X因子タンパク質を、チモーゲン形態で含む。
【００３２】
本発明に係るタンパク質は配列番号1の変異配列を含むタンパク質であって、前記配列番号1の変異配列は少なくとも1つの変異Aを含み、変異Aは、DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR及びKATXATLSPRから選択される配列による配列番号1の配列のアミノ酸43〜52の置換からなり、N*は任意選択にグリコシル化アスパラギンである、タンパク質であってもよい。好ましくは、タンパク質は少なくとも1つの変異Aを有する配列番号7の配列を含む。
【００３３】
この場合、更に好ましくは、変異タンパク質は配列番号9、配列番号10及び配列番号11から選択される配列を含む。
【００３４】
本発明に係るタンパク質は配列番号1の変異配列を含むタンパク質であって、前記配列番号1の変異配列は少なくとも1つの変異A'を含み、変異A'は、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR及びLSCGQRから選択される配列による配列番号1の配列のアミノ酸47〜52の置換からなる、タンパク質であってもよい。好ましくは、タンパク質は少なくとも1つの変異A'を有する配列番号7の配列を含む。
【００３５】
この場合、更に好ましくは、変異タンパク質は、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15及び配列番号16から選択される配列を含む。
【００３６】
本発明に係るタンパク質は配列番号1の変異配列を含むタンパク質であって、前記配列番号1の変異配列は少なくとも1つの変異Bを含み、変異Bは、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのDFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR及びLSCGQRから選択される配列の挿入からなり、N*は任意選択にグリコシル化アスパラギンである、タンパク質であってもよい。好ましくは、タンパク質は少なくとも1つの変異Bを有する配列番号7の配列を含む。
【００３７】
この場合、更に好ましくは、変異タンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24及び配列番号25から選択される配列を含む。
【００３８】
本発明に係るタンパク質は、配列番号1の変異配列を含むタンパク質であって、前記配列番号1の変異配列は少なくとも1つの変異Cを含み、変異Cは、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのDFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR及びKATXATLSPRから選択される配列の挿入、並びに配列番号1の配列のアミノ酸4〜13の欠失からなり、N*は任意選択にグリコシル化アスパラギンである、タンパク質であってもよい。好ましくは、タンパク質は少なくとも1つの変異Cを有する配列番号7の配列を含む。
【００３９】
この場合、更に好ましくは、変異タンパク質は配列番号27、配列番号28及び配列番号29から選択される配列を含む。
【００４０】
本発明に係るタンパク質は、配列番号1の変異配列を含むタンパク質であって、前記配列番号1の変異配列は少なくとも1つの変異C'を含み、変異C'、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのTSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR及びLSCGQRから選択される配列の挿入、並びに配列番号1の配列のアミノ酸4〜9の欠失からなる、タンパク質であってもよい。好ましくは、タンパク質は少なくとも1つの変異C'を有する配列番号7の配列を含む。
【００４１】
この場合、更に好ましくは、変異タンパク質は、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33及び配列番号34から選択される配列を含む。
【００４２】
好ましくは、本発明に係るタンパク質は、配列番号9〜16、18〜25、27〜34、105〜112、114〜121及び123〜130から選択される配列を含む、好ましくはそれらからなる。
【００４３】
本出願に記載されている配列は以下のようにまとめることができる:
【００４４】
【表１Ａ】
2019050819.tif 000002
【００４５】
【表１Ｂ】
2019050819.tif 000003
【００４６】
【表１Ｃ】
2019050819.tif 000004
【００４７】
本発明の主題はまた、
-  本発明に係る配列番号1の変異配列を含むタンパク質、及び
-  配列番号2の配列の少なくとも1つのタンパク質
を含み、前記タンパク質はジスルフィド結合によって互いに連結されている、タンパク質複合体である。
【００４８】
本発明の別の主題は前記タンパク質をコードする核酸(ポリヌクレオチド)である。好ましくは、核酸は、配列番号77〜84、86〜93、95〜102、133〜140、142〜149及び151〜158の配列から選択される。
【００４９】
本発明の別の主題は、前記タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又は前記ポリヌクレオチドを含む発現カセットである。本発明によれば、本発明に係る使用に適した発現ベクターは、核酸配列に機能的に連結される少なくとも1つの発現制御エレメントを含むことができる。発現制御エレメントはベクター内に挿入され、核酸配列の発現を調節することが可能となる。発現制御エレメントの発現は、特にlac系、ラムダファージプロモーター、酵母プロモーター又はウイルスプロモーターを含む。リーダー配列、停止コドン、ポリアデニル化シグナル並びに宿主系における核酸配列の後の転写及び翻訳に必要な配列等の他の機能的エレメントが組み込まれてもよい。発現制御エレメントの正確な組合せは選択される宿主系に依存することは、当業者であれば理解しているものと予想される。また、発現ベクターは、宿主系内及び宿主系中に核酸配列を含有する発現ベクターの後の転移及び複製に必要な追加のエレメントを含有しなければならないことも理解しているものと予想される。
【００５０】
このようなベクターは従来の方法又は商業的に利用可能な方法を使用して容易に構築される。
【００５１】
本発明の別の主題は、上記の発現ベクター、又は上記のポリヌクレオチドを含む組換え細胞である。本発明によれば、使用されうる宿主細胞の例は、動物、植物、昆虫及び酵母細胞等の真核細胞;並びに大腸菌(E.coli)等の原核細胞である。遺伝子を保持するベクターを細胞内に導入することができる手段は、特に、DEAE-デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウムによるマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、形質導入若しくはトランスフェクション又は当業者に公知の他の手段を含む。1つの好ましい実施形態において、真核細胞において機能する真核生物発現ベクターが使用される。このようなベクターの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス、ポリオウイルス若しくはレンチウイルス等のウイルスベクター、細菌発現ベクター又はpcDNA5等のプラスミドが含まれる。好ましい真核細胞株には、COS細胞、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、PerC6細胞、ヒーラ細胞、NIH/3T3 293細胞(ATCC#CRL1573)、T2細胞、樹状細胞又は単球が含まれる。
【００５２】
本発明に係るタンパク質はトランスジェニック動物の乳中で産生されうる。
【００５３】
この場合、第1の態様によれば、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子を含有するDNA配列の発現は、哺乳動物カゼインプロモーター又は哺乳動物ホエープロモーターによって制御され、前記プロモーターは、生来、前記遺伝子の転写を制御せず、DNA配列はまた、タンパク質を分泌するための配列を含有する。分泌配列は遺伝子とプロモーターとの間に介在する分泌シグナルを含む。
【００５４】
使用されるトランスジェニック動物は、所望のタンパク質を産生できるだけでなく、この能力をその子孫に伝えることもできる。乳内へのタンパク質の分泌は精製を容易にし、血液製剤の使用を回避する。このように動物は、ヤギ、雌ウサギ、雌ヒツジ又は雌ウシから選択されうる。
【００５５】
本発明に係るタンパク質は医薬として使用されうる。したがって、本発明に係るタンパク質は医薬組成物内に導入されうる。特に、本発明に係るタンパク質は、凝固障害、特に出血性障害の治療に使用されうる。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤と、任意選択に、治療組成物を形成するために生分解性ポリマー等の持続放出マトリクスとを組み合わせてもよい。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、髄腔内、眼内、大脳内、経皮、局所又は直腸内に投与されてもよい。次いで、単独で又は別の有効成分と組み合わせて、有効成分は、従来の薬学的担体との混合物として単位投与形態で投与されてもよい。単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル、粉剤、顆粒剤及び経口液剤又は懸濁剤等の経口形態、舌下及び口腔投与形態、エアロゾル、皮下インプラント、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下及びくも膜下投与形態、鼻腔内投与形態及び直腸投与形態を含む。
【００５８】
好ましくは、医薬組成物は、注入されうる製剤のための薬学的に許容可能なビヒクルを含有する。これは、特に、無菌等張製剤、食塩水(リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウム等又はこのような塩の混合物を含む)、又は必要に応じて、滅菌水若しくは生理食塩水が加えられる場合、注射可能な溶質の構成を可能にする、凍結乾燥組成物を含んでもよい。
【００５９】
注射用途に適した薬剤形態は、無菌水溶液又は分散体、ゴマ油及びピーナッツ油を含む油性製剤、並びに無菌注射溶液又は分散体の即時調製のための無菌粉剤を含む。いずれにしても、この形態は注射器を使用して注射されなければならないので、無菌でなければならず、流体でなければならない。それは製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されていなければならない。
【００６０】
本発明に係る分散体は、グリセロール、脂質ポリエチレングリコール若しくはそれらの混合物中、又は油中で調製されうる。貯蔵及び使用の正常な条件下で、これらの製剤は微生物増殖を阻止するための防腐剤を含有する。
【００６１】
薬学的に許容可能なビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)、これらの適切な混合物、及び/又は植物油を含有する、溶媒又は分散媒であってもよい。好適な流動性は、例えば、レシチン等の界面活性剤の使用により維持されうる。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸又はその他にチメロサールによってもたらされうる。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好適である。注射組成物の持続的吸収は、組成物中の吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンの使用によってもたらされうる。
【００６２】
無菌注射溶液は、上に挙げた他の成分のいくつかと共に、適切な溶媒内に必要とされる量で有効物質を組み込むことによって調製され、必要に応じて後で濾過滅菌が行われる。一般に、分散体は、基礎分散媒及び上に挙げたものの中で必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル内に種々の滅菌された有効成分を組み込むことによって調製される。無菌注射溶液を調製するための無菌粉剤の場合、好ましい調製プロセスは真空及び凍結乾燥下での乾燥である。上記溶液は、処方中、投薬レジメン処方と適合するように治療有効量で投与される。製剤は上記の注射溶液等の種々の薬剤形態で容易に投与されるが、薬物放出カプセル等も使用できる。例えば水溶液の非経口投与に関して、上記溶液は、適切に緩衝化されていなければならず、液体希釈剤は、十分な量の食塩水又はグルコースで等張になっていなければならない。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に適している。これに関して、使用されうる滅菌水媒体は当業者周知である。例えば、用量は1mlの等張NaCl溶液中に溶解されてもよく、次いで1000mlの適切な液体に加えられてもよく、又は提案された注入部位に注射されてもよい。治療される対象の状態に応じて、特定の投薬レジメンの変更が必要になると予想される。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、用量当たり約0.0001〜1.0ミリグラム、又は約0.001〜0.1ミリグラム、又は約0.1〜1.0ミリグラム、又は更に約10ミリグラム又はそれ以上を含む治療混合物中で製剤化されうる。複数回用量もまた、投与されてもよい。特定の患者に特有の治療有効用量のレベルは、治療される障害及び疾患の重症度、使用される特定の化合物の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食事、投与時間、投与経路、使用される特定の化合物の排泄率、治療期間、又はその他に並行して使用される医薬を含む、種々の要因に依存する。
【００６４】
以下の例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的のために記載される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】天然ヒト第X因子の構造である。
【図２】変異体の開発戦略である。ファミリー1は変異A又はA'を含む変異体を含む。ファミリー2は変異Bを含む変異体を一緒にグループ化している。ファミリー3は変異C又はC'を含む変異体を一緒にグループ化している。
【図３】CHO中で産生されたバリアント因子の発現のレベルである。3つのFXファミリーがCHO中でのトランスフェクション後に発現した。7日目の上清を、Zymutest FXキット(Hyphen社)を用いて3連で分析した。濃度(μg/ml)をy軸に沿って示す。標準偏差をヒストグラムの上に示す。ファミリー1、灰色のバー;ファミリー2、黒色のバー;ファミリー3、白色のバー。
【図４】HEK中で産生された第X因子及びバリアントの発現のレベルである。3つのFXファミリーがHEK293S中でのトランスフェクション後に発現した。7日目の上清を、Zymutest FXキット(Hyphen社)を用いて3連で分析した。濃度(μg/ml)をy軸に沿って示す。標準偏差をヒストグラムの上に示す。ファミリー1、灰色のバー;ファミリー2、黒色のバー;ファミリー3、白色のバー。
【図５】第X因子欠損血漿中のCHO中で産生された第X因子及びバリアントの時間測定による(chronometric)活性である。3つのFXファミリーがCHO-S中でのトランスフェクションの後に発現した。7日目の上清を、Star自動装置(Stago社)でTP試験によって少なくとも2連で分析した。凝固時間は比活性{s/(μg/ml)}を算出することを可能にし、次いで野生型組換え第X因子活性の百分率に変換した。これらの値をy軸に沿って与える。標準偏差をヒストグラムの上に示す。ファミリー1、灰色のバー;ファミリー2、黒色のバー;ファミリー3、白色のバー。*FX-Kal2ファミリー3は行わず。
【図６】RVV-X画分による活性化後、CHO中で産生したファミリー1の第X因子バリアントの活性である。ファミリー1のFXバリアントがCHO-S中でのトランスフェクション後に発現した。7日目に上清を、ラッセルクサリヘビ蛇毒のRVV-X画分の存在下で2つのFX濃度(少なくとも2連)にてインキュベートした。405nMにてpNAPEP 1025基質の加水分解をモニターすることによってFXaの出現を測定した。初期変換速度(mODU/分/nM)を、100%に固定したFX-WTのものと比較した。2つの濃度における値の平均を確立し、y軸に与える。標準偏差をヒストグラムの上に示す。
【図７】組織因子(1pM)による活性化後、第VIII因子欠損血漿のプールへのファミリー2のFX又はそのバリアントの添加から得たトロンビノグラム(thrombinogram)である。-  x軸に沿って:時間(分)-  y軸に沿って:観察されたトロンビンの最大濃度(nM)正常な血漿プール試料は黒色の曲線(●)で表し、第FVIII因子欠損血漿プール試料は(〇)で表す。1U/ml又は0.1U/mlのFVIIIでオーバーロードした欠損血漿に対応する曲線はそれぞれ、記号■及び□で表す。野生型FX及びバリアントを表す記号は以下の通りである:FX-WT(◆)、FX-対照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(実線における×)、FX-FIXa1(＊)、FX-FIXa2(破線を有する×)、FX-Kal1(
【数１】
2019050819.tif 000005
)、FX-Kal2(
【数２】
2019050819.tif 000006
)及びFX-Kal3(記号を有さない実線)。技術的理由のためにFX-Kal2及び3はそれぞれ3.5及び1.65μg/mlにて使用したことを除いて、第X因子又はそのバリアントは5μg/mlにて使用した。
【図８】セファリンによる活性化後、第VIII因子欠損血漿のプールへのファミリー2のFX又はそのバリアントの添加から得たトロンビノグラムである。-  x軸に沿って:時間(分)-  y軸に沿って:観察されたトロンビンの最大濃度(nM)正常な血漿プール試料は黒色の曲線(●)で表し、第FVIII因子欠損血漿プール試料は(〇)で表す。1U/ml又は0.1U/mlのFVIIIでオーバーロードした欠損血漿に対応する曲線はそれぞれ、記号■及び□で表す。野生型FX及びバリアントを表す記号は以下の通りである:FX-WT(◆)、FX-対照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(実線における×)、FX-FIXa1(＊)、FX-FIXa2(破線を有する×)、FX-Kal1(
【数３】
2019050819.tif 000007
)、FX-Kal2(
【数４】
2019050819.tif 000008
)及びFX-Kal3(記号を有さない実線)。技術的理由のためにFX-Kal2及び3はそれぞれ3.5及び1.65μg/mlにて使用したことを除いて、第X因子又はそのバリアントは5μg/mlにて使用した。
【図９】組織因子又はセファリンによる活性化後、第VIII因子欠損血漿のプールへのファミリー2のFX又はそのバリアントの添加から得たトロンボグラムの速度である。図7及び図8から得られた速度の値(生成したトロンビンのnM/分)を提示する。他のFX及びバリアントについて5μg/mlの代わりに、FX-Kal2及び3(*)はそれぞれ3.5及び1.65μg/mlにて使用したことに留意すべきである。白いバー、組織因子(1pM)による活性化によって得られた値;黒いバー、セファリンによる活性化によって得られた値。
【図１０】組織因子(1pM)による活性化後、第IX因子欠損血漿のプールへのファミリー2のFX又はそのバリアントの添加から得たトロンビノグラムである。-  x軸に沿って:時間(分)-  y軸に沿って:観察されたトロンビンの最大濃度(nM)正常な血漿プール試料は黒色の曲線(●)で表し、第FVIII因子欠損血漿プール試料は(〇)で表す。1U/ml又は0.1U/mlのFVIIIでオーバーロードした欠損血漿に対応する曲線はそれぞれ、記号■及び□で表す。野生型FX及びバリアントを表す記号は以下の通りである:FX-WT(◆)、FX-対照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(実線における×)、FX-FIXa1(＊)、FX-FIXa2(破線を有する×)、FX-Kal1(
【数５】
2019050819.tif 000009
)、FX-Kal2(
【数６】
2019050819.tif 000010
)及びFX-Kal3(記号を有さない実線)。技術的理由のためにFX-Kal2及び3はそれぞれ3.5及び1.65μg/mlにて使用したことを除いて、第X因子又はそのバリアントは5μg/mlにて使用した。
【図１１】セファリンによる活性化後、第IX因子欠損血漿のプールへのファミリー2のFX又はそのバリアントの添加から得たトロンビノグラムである。-  x軸に沿って:時間(分)-  y軸に沿って:観察されたトロンビンの最大濃度(nM)正常な血漿プール試料は黒色の曲線(●)で表し、第FVIII因子欠損血漿プール試料は(〇)で表す。1U/ml又は0.1U/mlのFVIIIでオーバーロードした欠損血漿に対応する曲線はそれぞれ、記号■及び□で表す。野生型FX及びバリアントを表す記号は以下の通りである:FX-WT(◆)、FX-対照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(実線における×)、FX-FIXa1(＊)、FX-FIXa2(破線を有する×)、FX-Kal1(
【数７】
2019050819.tif 000011
)、FX-Kal2(
【数８】
2019050819.tif 000012
)及びFX-Kal3(記号を有さない実線)。技術的理由のためにFX-Kal2及び3はそれぞれ3.5及び1.65μg/mlにて使用したことを除いて、第X因子又はそのバリアントは5μg/mlにて使用した。
【図１２】組織因子(1pM)又はセファリンによる活性化後、第IX因子欠損血漿のプールへのファミリー2のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンボグラムの速度である。図10及び図11から得られた速度の値(生成したトロンビンのnM/分)を提示する。他のFX及びバリアントについて5μg/mlの代わりに、FX-Kal2及び3(*)はそれぞれ3.5及び1.65μg/mlにて使用したことに留意すべきである。結果を対数目盛で提示する。より読みやすくするために、生成したトロンビンの1nM/分未満の値は表さない(+)。白いバー、組織因子(1pM)による活性化によって得られた値;黒いバー、セファリンによる活性化によって得られた値。
【図１３】ファミリー2のFX-WT及びバリアントのトロンビン活性化である。ファミリー2のFX-WT及びその特定のバリアントの活性化を、Pefachrome FXa 8595基質を含有するHepes緩衝液中でトロンビン(10nM)の存在下で実施した。生成したFXaによって放出したパラ-ニトロアニリドの出現を経時的に405nmにてモニターした。種々の濃度にて、活性化した第X因子を陽性対照として使用した。
【図１４】組織因子による活性化後、第VIII因子欠損血漿のプールへのファミリー1のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンビノグラムである。-  x軸に沿って:時間(分)-  y軸に沿って:観察されたトロンビンの最大濃度(nM)正常な血漿プール試料は黒色の曲線(●)で表し、第FVIII因子欠損血漿プール試料は(〇)で表す。1U/ml又は0.1U/mlのFVIIIでオーバーロードした欠損血漿に対応する曲線はそれぞれ、記号■及び□で表す。野生型FX及びバリアントを表す記号は以下の通りである:FX-WT(◆)、FX-対照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(実線における×)、FX-FIXa1(＊)、FX-FIXa2(破線を有する×)、FX-Kal1(
【数９】
2019050819.tif 000013
)、FX-Kal2(
【数１０】
2019050819.tif 000014
)及びFX-Kal3(記号を有さない実線)。技術的理由のためにFX-Kal3は1.65μg/mlにて使用したことを除いて、第X因子又はそのバリアントは7.5μg/mlにて使用した。
【図１５】セファリンによる活性化後、第VIII因子欠損血漿のプールへのファミリー1のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンビノグラムである。-  x軸に沿って:時間(分)-  y軸に沿って:観察されたトロンビンの最大濃度(nM)正常な血漿プール試料は黒色の曲線(●)で表し、第FVIII因子欠損血漿プール試料は(〇)で表す。1U/ml又は0.1U/mlのFVIIIでオーバーロードした欠損血漿に対応する曲線はそれぞれ、記号■及び□で表す。野生型FX及びバリアントを表す記号は以下の通りである:FX-WT(◆)、FX-対照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(実線における×)、FX-FIXa1(＊)、FX-FIXa2(破線を有する×)、FX-Kal1(
【数１１】
2019050819.tif 000015
)、FX-Kal2(
【数１２】
2019050819.tif 000016
)及びFX-Kal3(記号を有さない実線)。技術的理由のためにFX-Kal3は1.65μg/mlにて使用したことを除いて、第X因子又はそのバリアントは7.5μg/mlにて使用した。
【図１６】組織因子(1pM)又はセファリンによる活性化後、第VIII因子欠損血漿のプールへのファミリー1のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンボグラムの速度である。図14及び図15から得られた速度の値(生成したトロンビンのnM/分)を提示する。他のFX及びバリアントについて7.5μg/mlの代わりに、FX-Kal3(*)は1.65μg/mlにて使用したことに留意すべきである。FX-WTの値は2回の実験の平均である。より読みやすくするために、生成したトロンビンの1nM/分未満の値は表さない(+)。白いバー、組織因子(1pM)による活性化によって得られた値;黒いバー、セファリンによる活性化によって得られた値。
【図１７】組織因子による活性化後、第IX因子欠損血漿のプールへのファミリー1のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンビノグラムである。-  x軸に沿って:時間(分)-  y軸に沿って:観察されたトロンビンの最大濃度(nM)正常な血漿プール試料は黒色の曲線(●)で表し、第FIX因子欠損血漿プール試料は(〇)で表す。1U/ml又は0.1U/mlのFIXでオーバーロードした欠損血漿に対応する曲線はそれぞれ、記号■及び□で表す。野生型FX及びバリアントを表す記号は以下の通りである:FX-WT(◆)、FX-対照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(実線における×)、FX-FIXa1(＊)、FX-FIXa2(破線を有する×)、FX-Kal1(
【数１３】
2019050819.tif 000017
)、FX-Kal2(
【数１４】
2019050819.tif 000018
)及びFX-Kal3(記号を有さない実線)。技術的理由のためにFX-Kal3は1.65μg/mlにて使用したことを除いて、第X因子又はそのバリアントは7.5μg/mlにて使用した。
【図１８】セファリンによる活性化後、第IX因子欠損血漿のプールへのファミリー1のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンビノグラムである。-  x軸に沿って:時間(分)-  y軸に沿って:観察されたトロンビンの最大濃度(nM)正常な血漿プール試料は黒色の曲線(●)で表し、第FIX因子欠損血漿プール試料は(〇)で表す。1U/ml又は0.1U/mlのFIXでオーバーロードした欠損血漿に対応する曲線はそれぞれ、記号■及び□で表す。野生型FX及びバリアントを表す記号は以下の通りである:FX-WT(◆)、FX-対照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(実線における×)、FX-FIXa1(＊)、FX-FIXa2(破線を有する×)、FX-Kal1(
【数１５】
2019050819.tif 000019
)、FX-Kal2(
【数１６】
2019050819.tif 000020
)及びFX-Kal3(記号を有さない実線)。技術的理由のためにFX-Kal3は1.65μg/mlにて使用したことを除いて、第X因子又はそのバリアントは7.5μg/mlにて使用した。
【図１９】組織因子(1pM)又はセファリンによる活性化後、第IX因子欠損血漿のプールへのファミリー1のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンボグラムの速度である。図17及び図18から得られた速度の値(生成したトロンビンのnM/分)を提示する。他のFX及びバリアントについて7.5μg/mlの代わりに、FX-Kal3(*)は1.65μg/mlにて使用したことに留意すべきである。FX-WTの値は2回の実験の平均である。より読みやすくするために、生成したトロンビンの1nM/分未満の値は表さない(+)。白いバー、組織因子(1pM)による活性化によって得られた値;黒いバー、セファリンによる活性化によって得られた値。
【図２０】組織因子による活性化後、第VIII因子欠損血漿のプールへのファミリー3のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンビノグラムである。-  x軸に沿って:時間(分)-  y軸に沿って:観察されたトロンビンの最大濃度(nM)正常な血漿プール試料は黒色の曲線(●)で表し、第FVIII因子欠損血漿プール試料は(〇)で表す。1U/ml又は0.1U/mlのFVIIIでオーバーロードした欠損血漿に対応する曲線はそれぞれ、記号■及び□で表す。野生型FX及びバリアントを表す記号は以下の通りである:FX-WT(◆及び---)、FX-対照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(実線における×)、FX-FIXa1(＊)、FX-FIXa2(破線を有する×)、FX-Kal1(
【数１７】
2019050819.tif 000021
)、FX-Kal2(
【数１８】
2019050819.tif 000022
)及びFX-Kal3(記号を有さない実線)。技術的理由のためにFX-Kal3は1.65μg/mlにて使用したことを除いて、第X因子又はそのバリアントは7.5μg/mlにて使用した。
【図２１】セファリンによる活性化後、第VIII因子欠損血漿のプールへのファミリー3のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンビノグラムである。-  x軸に沿って:時間(分)-  y軸に沿って:観察されたトロンビンの最大濃度(nM)正常な血漿プール試料は黒色の曲線(●)で表し、第FVIII因子欠損血漿プール試料は(〇)で表す。1U/ml又は0.1U/mlのFVIIIでオーバーロードした欠損血漿に対応する曲線はそれぞれ、記号■及び□で表す。野生型FX及びバリアントを表す記号は以下の通りである:FX-WT(◆及び---)、FX-対照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(実線における×)、FX-FIXa1(＊)、FX-FIXa2(破線を有する×)、FX-Kal1(
【数１９】
2019050819.tif 000023
)、FX-Kal2(
【数２０】
2019050819.tif 000024
)及びFX-Kal3(記号を有さない実線)。技術的理由のためにFX-Kal3は1.65μg/mlにて使用したことを除いて、第X因子又はそのバリアントは7.5μg/mlにて使用した。
【図２２】組織因子(1pM)又はセファリンによる活性化後、第VIII因子欠損血漿のプールへのファミリー3のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンボグラムの速度である。図20及び図21から得られた速度の値(生成したトロンビンのnM/分)を提示する。他のFX及びバリアントについて7.5μg/mlの代わりに、FX-Kal3(*)は1.65μg/mlにて使用したことに留意すべきである。FX-WTの値は2回の実験の平均である。白いバー、組織因子(1pM)による活性化によって得られた値;黒いバー、セファリンによる活性化によって得られた値。
【図２３】組織因子による活性化後、第IX因子欠損血漿のプールへのファミリー3のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンビノグラムである。-  x軸に沿って:時間(分)-  y軸に沿って:観察されたトロンビンの最大濃度(nM)正常な血漿プール試料は黒色の曲線(●)で表し、第FIX因子欠損血漿プール試料は(〇)で表す。1U/ml又は0.1U/mlのFIXでオーバーロードした欠損血漿に対応する曲線はそれぞれ、記号■及び□で表す。野生型FX及びバリアントを表す記号は以下の通りである:FX-WT(◆)、FX-対照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(実線における×)、FX-FIXa1(＊)、FX-FIXa2(破線を有する×)、FX-Kal1(
【数２１】
2019050819.tif 000025
)、FX-Kal2(
【数２２】
2019050819.tif 000026
)及びFX-Kal3(記号を有さない実線)。技術的理由のためにFX-Kal3は1.65μg/mlにて使用したことを除いて、第X因子又はそのバリアントは7.5μg/mlにて使用した。
【図２４】セファリンによる活性化後、第IX因子欠損血漿のプールへのファミリー3のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンビノグラムである。-  x軸に沿って:時間(分)-  y軸に沿って:観察されたトロンビンの最大濃度(nM)正常な血漿プール試料は黒色の曲線(●)で表し、第FIX因子欠損血漿プール試料は(〇)で表す。1U/ml又は0.1U/mlのFIXでオーバーロードした欠損血漿に対応する曲線はそれぞれ、記号■及び□で表す。野生型FX及びバリアントを表す記号は以下の通りである:FX-WT(◆)、FX-対照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(実線における×)、FX-FIXa1(＊)、FX-FIXa2(破線を有する×)、FX-Kal1(
【数２３】
2019050819.tif 000027
)、FX-Kal2(
【数２４】
2019050819.tif 000028
)及びFX-Kal3(記号を有さない実線)。技術的理由のためにFX-Kal3は1.65μg/mlにて使用したことを除いて、第X因子又はそのバリアントは7.5μg/mlにて使用した。
【図２５】組織因子(1pM)又はセファリンによる活性化後、第IX因子欠損血漿のプールへのファミリー3のFX又はそのバリアントの添加から得られたトロンボグラムの速度である。図23及び図24から得られた速度の値(生成したトロンビンのnM/分)を提示する。他のFX及びバリアントについて7.5μg/mlの代わりに、FX-Kal3(*)は1.65μg/mlにて使用したことに留意すべきである。FX-WTの値は2回の実験の平均である。白いバー、組織因子(1pM)による活性化によって得られた値;黒いバー、セファリンによる活性化によって得られた値。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
実施例
(実施例1)
第X因子バリアントの相補的DNAの生成
1-概説
種々の構築物のヌクレオチド及びタンパク質配列が配列表に記載され、表の説明にまとめられている。野生型FX分子はFX-WT(配列番号7)と呼ばれ、それはヒトFXに対応し、そのヌクレオチド配列は最適化されている。この分子は変異分子の3つのファミリーのための対照として使用される。
【００６７】
変異分子は重鎖の上流に位置する切断部位に従って命名される。FX-対照+はフィブリノーゲン又はフィブリノペプチドA上のトロンビン認識部位に対応する。本発明に係る変異分子は、それぞれ、FX-IIa(トロンビン切断コンセンサス部位)、FX-PAR1(PAR1受容体上の改変トロンビン切断部位)、FX-PAR1M(グリコシル化部位を有さないPAR1受容体上の改変トロンビン切断部位)、FX-FXIa1(FIX上のFXIa切断部位1)、FX-FXIa2(FIX上のFXIa切断部位2)、FX-Kal1(FXII上のカリクレイン切断部位1)、FX-Kal2(FXII上のカリクレイン切断部位2)及びFX-Kal3(FXII上のカリクレイン切断部位3)と命名される。
【００６８】
図2に示されるように、これらの部位の各々は異なる環境(ファミリー)、すなわち:
-  活性化ペプチド切断部位の上流の6又は10アミノ酸の置換からなるファミリー1(変異A又はA');
-  又は活性化ペプチド切断部位の上流の同じ配列の挿入からなるファミリー2(変異B);
-  又は活性化ペプチドの部分の欠失に連結される、活性化ペプチド切断部位の上流のこれらの配列の挿入からなるファミリー3(変異C又はC')
のいずれかに存在する。
【００６９】
このように、配列番号9〜16の配列のタンパク質は、変異A又はA'が挿入されている配列番号7の配列に対応する。したがって、これらのタンパク質はファミリー1に属する。
【００７０】
配列番号18〜25の配列のタンパク質は、変異Bが挿入されている配列番号7の配列に対応する。したがって、これらのタンパク質はファミリー2に属する。
【００７１】
最後に、配列番号27〜34の配列のタンパク質は、変異C又はC'が挿入されている配列番号7の配列に対応する。したがって、これらのタンパク質はファミリー3に属する。
【００７２】
配列番号8、17及び26の配列はFX-対照+に対応し、比較用である。
【００７３】
2-実験プロトコル
ヌクレオチド配列が挿入及び/又は欠失されるように慎重に設計されたプライマーを使用して、各バリアントに特異的な配列を、アセンブリ又はInfusion PCRによって、ホモサピエンス(Homo sapiens)における発現に最適化されたFXをコードする合成ヌクレオチド配列(配列番号35)内に導入する。
【００７４】
2.1.ヒトFXをコードするpCEP4-FXWT4HS-gsベクターの調製
ホモサピエンスにおける発現に最適化し、Genescriptによって調製した合成遺伝子を含有するpUC57クローニングベクターを、BamHI及びHindIII酵素を用いて、pCEP4発現ベクター(Life Technologies社)のように消化する。FX遺伝子(FXWT4HSgs)及び消化したpCEP4ベクターに対応する挿入物を、T4リガーゼを使用して一緒にライゲートする前に、Nucleospin抽出物II(Clonetech Laboratories社)を使用して精製する。ライゲーション産物を使用して、Top10細菌(Life Technologies社)を形質転換する。細菌コロニー内の挿入物の存在は、BamHI及びHindIII酵素を用いてプラスミドを消化し、1519bpのバンドをプラスミド内で検出するために消化産物をアガロースゲルに通すことによって判定される。CMVs1(5'-GGGACTTTCCTACTTGGCAGT-3'配列番号36)及びSV40-3'UTR(5'-TTCACTGCATTCTAGTTGTGGT-3'配列番号37)プライマーを使用して配列決定することによってcDNAを検証する。
【００７５】
2.2-ヒトFXをコードするOptiCHO FXWT4HSベクターの調製
バリアントの最適発現のために、バリアント及びまた、野生型分子をOptiCHOベクター中で調製する。
【００７６】
pCEP4-FXWT4HS-gsベクターを使用して、FXWT4HS配列のcDNAを、5'FXWT及び3'FX-SwaIプライマーを用いたPCR(カッパHifi;Biosystems社)によって増幅する。
【００７７】
OptiCHOデスティネーションベクターと同様に、NheI及びSwaI酵素を用いて消化する前に、Nucleospin抽出物を使用して1551bpのPCR産物を精製する。それらを消化後にNucleospin抽出物で再び精製する。
【００７８】
ライゲーション産物をコンピテントTop10細菌内に組み込む前に、挿入物及びベクターを、T4リガーゼを使用して一緒にライゲートする。アンピシリンの存在下での細菌増幅後、細菌コロニーをペトリ皿からサンプリングし、5'efla及び3FXプライマーを用いて296bpのアンプリコンを探すためにPCRによってスクリーニングし、前記アンプリコンはOptiCHOベクター中のFXをコードする挿入物の存在の証拠である。PCRスクリーニングを、アガロースゲル上で1538bpの断片を探すためにNhe I及びSwaI酵素を用いた酵素消化による精製したベクターのスクリーニングによって補足する。OptiCHO-FXWT4HSベクターをプライマー:
-  5'ef1a:5'-GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG-3'(配列番号38)
-  3FX:5'-CTTCATTTCCTCCAGGAAAGAGTTGGC-3'(配列番号39)
-  2BGHPA: 5'-CAGATGGCTGGCAACTAGAA-3'(配列番号40)
を用いて配列決定する。
【００７９】
2.3.ファミリー1バリアントの調製
ファミリー1バリアントのcDNAをコードする挿入物の調製を、table 2(表3)に記載されているプライマーを使用して、アセンブリPCR及びライゲーションによって、又はInfusion技術によってtable 1(表2)に従って実施する。PCR1及び2に使用される鋳型はOptiCHO-FXWT4HSベクターである。親DNAを消化するためにDpnIを用いてPCR産物を処理する。Nucleospin抽出物を使用して対象のアンプリコンを精製する。
【００８０】
OptiCHO-FX WTF1D、OptiCHO-FX WTF1G及びOptiCHO-FX WTF1I分子について、PCR1及び2から精製したアンプリコンを鋳型として使用し、table 1(表2)に従ってアセンブリPCRによって構築した。精製したPCR3アンプリコン並びにまた、NheI及びSwaIで消化したベクターを、T4リガーゼを用いたライゲーションによって構築する。
【００８１】
【表２】
2019050819.tif 000029
【００８２】
【表３Ａ】
2019050819.tif 000030
【００８３】
【表３Ｂ】
2019050819.tif 000031
【００８４】
OptiCHO-FX WTF1a、OptiCHO-FX WTF1b、OptiCHO-FX WTF1c、OptiCHO-FX WTF1e、OptiCHO-FX WTF1f及びOptiCHO-FX WTF1h分子について、PCR1及び2から精製したアンプリコンをtable 3(表4)の条件に従ってPCRによって生成した。PCR1及び2の精製したアンプリコンを、NheI及びSwaIで前消化したベクターを用いてInfusionによって構築し、Nucleospin抽出物を使用して精製する。
【００８５】
【表４】
2019050819.tif 000032
【００８６】
各バリアントについて、最終ベクターを細菌形質転換によってTop10細菌内に挿入する。アンプリコンの存在下での細菌増幅後、細菌コロニーをペトリ皿からサンプリングし、5'efla及び3FXプライマーを用いて296bpのアンプリコンを探すためにPCRによってスクリーニングし、前記アンプリコンは、OptiCHOベクター中のFXをコードする挿入物の存在の証拠である。OptiCHO-FX WTF1aからOptiCHO-FX WTF1iベクターを、プライマー:
-  5'efla
-  2BGHPA
を用いて配列決定する。
【００８７】
2.4-ファミリー2バリアントの調製
ファミリー2バリアントのcDNAをコードする挿入物の調製を、table 2(表3)に記載されているプライマーを使用して、PCRの技術及びInfusionによるアセンブリによってtable 4(表5)に従って実施する。PCR1及び2のために使用される鋳型はOptiCHO-FXWT4HSベクターである。親DNAを消化するためにDpnIを用いてPCR産物を処理する。Nucleospin抽出物を使用してアンプリコンを精製する。PCR1及び2の精製したアンプリコンを、NheI及びSwaIで前消化したOptiCHOベクターを用いたInfusionによって構築し、Nucleospin抽出物を使用して精製する。
【００８８】
【表５】
2019050819.tif 000033
【００８９】
各バリアントについて、最終ベクターを細菌形質転換によってTop10細菌内に挿入する。アンプリコンの存在下での細菌増幅後、細菌コロニーをペトリ皿からサンプリングし、5'efla及び3FXプライマーを用いて296bpのアンプリコンを探すためにPCRによってスクリーニングし、前記アンプリコンは、OptiCHOベクター中のFXをコードする挿入物の存在の証拠である。OptiCHO-FX WTF2aからOptiCHO-FX WTF2iベクターを、プライマー:
-  5'efla
-  2BGHPA
を用いて配列決定する。
【００９０】
2.5.-ファミリー3バリアントの調製
ファミリー3は、酵素切断部位をその中に挿入しうる前に、調製するのに必要である活性化ペプチド中に欠失を含有する。これに関して、2つの中間ベクター、ファミリー3バリアントF3aからF3dについてOptiCHO FXWT F3AD、及びファミリー3バリアントF3eからF3iについてOptiCHO FXWT F3EIを調製する。
【００９１】
中間ベクターの挿入物を、鋳型としてOptiCHO FXWT4HS-gsベクター、並びにtable 2(表3)に記載されている5'FXWT、3'FX-SwaI、3FXF3、5FXF3、3FXF3bis及び5FXF3bisプライマーを使用してtable 5(表6)に従ってアセンブリPCRによって構築する。
【００９２】
【表６】
2019050819.tif 000034
【００９３】
OptiCHOデスティネーションベクターと同様に、NheI及びSwaI酵素で消化する前に、Nucleospin抽出物を使用してアセンブリPCR産物を精製する。消化後、それらをNucleospin抽出物で再び精製する。
【００９４】
ライゲーション産物をコンピテントTop10細菌内に組み込む前に、挿入物及びベクターを、T4リガーゼを使用して一緒にライゲートする。アンピシリンの存在下での細菌増幅後、細菌コロニーをペトリ皿からサンプリングし、5'efla及び3FXプライマーを用いて296bpのアンプリコンを探すためにPCRによってスクリーニングし、前記アンプリコンはOptiCHOベクター中のFXバリアントをコードする挿入物の存在の証拠である。
【００９５】
OptiCHO FXWT F3AD及びOptiCHO FXWT F3EI中間ベクターを、プライマー:
-  5'efla
-  3FX
-  2BGHPA
を用いて配列決定する。
【００９６】
OptiCHO FXWT F3A分子を除いて、連続した3つのバリアントのcDNAをコードする挿入物の調製を、table 2(表3)に記載されているプライマーを使用してアセンブリPCRによってtable 6(表7)に従って実施する。PCR1及び2のために使用される鋳型は、ファミリー3バリアントF3aからF3dについてOptiCHO FXWT F3ADベクター、及びファミリー3バリアントF3eからF3iについてOptiCHO FXWT F3EIである。Nucleospin抽出物を使用してアンプリコンを精製する。PCR1及び2の精製したアンプリコンを、NheI及びSwaIで前消化したOptiCHOベクターを用いてアセンブリPCRによって構築し、Nucleospin抽出物を使用して精製する。
【００９７】
【表７】
2019050819.tif 000035
【００９８】
OptiCHOデスティネーションベクターと同様に、NheI及びSwaI酵素で消化する前に、Nucleospin抽出物を使用してアセンブリPCR産物を精製する。消化後、それらをNucleospin抽出物で再び精製する。
【００９９】
ライゲーション産物をコンピテントTop10細菌内に挿入する前に、挿入物及びベクターを、T4リガーゼを使用して一緒にライゲートする。アンピシリンの存在下での細菌増幅後、細菌コロニーをペトリ皿からサンプリングし、5'efla及び3FXプライマーを用いて296bpのアンプリコンを探すためにPCRによってスクリーニングし、前記アンプリコンはOptiCHOベクター中のFXバリアントをコードする挿入物の存在の証拠である。
【０１００】
最終的なファミリー3ベクターを、プライマー:
-  5'efla
-  2BGHPA
を用いて配列決定する。
【０１０１】
(実施例2)
組換え第X因子の産生
1-実験プロトコル
1.1-試薬
ProCHO4(Lonza社)及びFreestyle(商標)F17(Gibco社)培養培地。
L-グルタミン(Gibco社)。
CHO-S細胞トランスフェクション培地:Opti-Pro SFM(Gibco社)。
HEK細胞トランスフェクション培地:Opti-MEM(Gibco社)。
ビタミンK1(Sigma社)。
【０１０２】
1.2-プロトコル
野生型第X因子及びそのバリアントを、一過性発現においてCHO-S又はHEK-293-Freestyle真核細胞(Invitrogen社)中で産生する。
【０１０３】
CHO-S細胞をProCHO4培地及びHEK 293F細胞をF17培地中で培養し、それぞれの培地は4mM及び8mMのL-グルタミンを補足した。2つの細胞株を、37℃の制御雰囲気(8%CO2)中で135rpmにて振盪する条件下で培養する。トランスフェクションの前日に、細胞を7×105細胞/mlの密度にて播種する。
【０１０４】
トランスフェクションの日に、DNA(20〜30μg)及び30μgのトランスフェクション剤(TA)を、CHO-SについてOpti-Pro培地及びHEK 293FについてOpti-MEM中で別々に5分間プレインキュベートし、次いで混合し、DNA/TA複合体の形成を可能にするために20分間インキュベートする。全て30mlの体積で1×106細胞/mlの細胞調製物に加える。
【０１０５】
天然ビタミンKエポキシドレダクターゼ(VKOR)とのFXの共トランスフェクションの場合、全量20〜30μgのDNAを得るために2つのベクターを種々の割合で加える。VKOR酵素は、ガンマ-カルボキシル化を最適化しながら、HEK中で活性FXの産生を可能にする。トランスフェクションの直後、ビタミンK1(5μg/ml)を培地に加える。トランスフェクションの次の日に、GFP(緑色蛍光タンパク質)を発現する対照プラスミドを使用してトランスフェクションレベルを評価する。産生は7日間「バッチ」様式で実施する。産生の終わりに、細胞及び上清を遠心分離によって分離する。細胞を除去し、上清を濾過し、次いで凍結する。
【０１０６】
(実施例3)
第X因子濃度の測定
1-実験プロトコル
第X因子濃度を、製造業者の推奨に従って市販のELISA Zymutest第X因子(Hyphen BioMed社)によって測定する。アッセイの検出の線形領域に位置する抗原価を使用して濃度を三連で測定する。導入された変異が濃度の測定を妨害しないことを確実にするために、FXを同一の量で沈殿させ、ELISAを使用したもの{抗ヒトFXポリクローナル抗体(Cryopep社カタログ番号PAHFX-S)}と異なるポリクローナル抗体を用いた免疫ブロッティングによって、又はSDS-PAGE(データは示さず)後の染色によって明らかにする。
【０１０７】
2-結果
2.1-CHO中で一過性発現した第X因子バリアントの発現
ファミリー1〜3をコードするcDNAでトランスフェクトしたCHO-S細胞の上清に存在する第X因子(FX)バリアントの濃度を、市販のELISA Zymutest第X因子を使用することによって測定した(図3)。
【０１０８】
予想される通り、トランスフェクトしていない(対照)CHO細胞の上清はFXを含有しない。種々のFXをコードするベクターでのトランスフェクションにより、0.5〜3.06μg/mlの範囲のレベルを得ることが可能となる。種々のファミリーのFXの発現の大きな相違は存在しない。多くても、ファミリー3のFX-IIaは、ファミリー1のFX-IIa(1.26μg/ml)より2.1X高く発現した(2.64μg/ml)。いくつかの構築物は野生型第X因子より高濃度で第X因子を得ることが可能となり:それらはFX-IIa(ファミリー3)及びFX-PAR1(ファミリー1及び3)構築物である。FX-Kal3はFX産生を減少させるようである。
【０１０９】
2.2-HEK中で一過性発現した第X因子バリアントの発現
ファミリー1〜3をコードするcDNAでトランスフェクトしたHEK293S細胞の上清に存在する第X因子バリアントの濃度を、市販のELISA Zymutest第X因子を使用して測定した(図4)。予想される通り、トランスフェクトしていない(対照)HEK293S細胞の上清はFXを含有しない。ファミリー1分子をFX-WTのレベル(0.14〜1.64μg/ml)に近いレベルで産生した。FX-PAR1分子のみをより高いレベルで産生する。FX-Kal3分子は少なくとも産生した分子のままである。ファミリー2を全ての構築物について同様の方法で産生し、より低いレベルで産生したFX-Kal3構築物(0.66μg/ml)を除いて1.79〜2.54μg/mlの発現値を有する。ファミリー3を0.2〜1.2μg/mlのより低いレベルで産生した。
【０１１０】
結論として、特定の第X因子バリアント構築物はFX-WTより高いレベルでFXを産生することが可能となる:
-  それらは、CHO細胞において、FX-IIa(ファミリー3)及びFX-PAR1(ファミリー1及び3)構築物であり、
-  HEK細胞において、ファミリー1のFX-PAR1である。
【０１１１】
(実施例4)
CHO-S中で産生した第X因子バリアントの凝固活性の測定
1-実験プロトコル
CHO-S細胞により産生したFXバリアントの時間測定による活性を、FX欠損血漿の存在下でStar自動装置(Stago社)を使用して測定した。FX欠損血漿、ネオプラスチン及びOwren-Koller緩衝液はStago社(Asnieres、フランス)から得た。
【０１１２】
濃縮した培養上清を、FX欠損血漿に加える前に、Owren-Koller緩衝液中で1/10に希釈する。混合物を37℃にて240秒の間、インキュベートし、次いでプロトロンビン時間(PT)を、100μlのネオプラスチンを加えることによって開始する。凝固時間(秒)をFXの比活性に変換する。
【０１１３】
2-結果
CHO中の種々のトランスフェクションから得た濃縮した上清を、第X因子欠損を補償するそれらの能力について評価した。上清をFX欠損血漿中でインキュベートし、PT試験を実施した。凝固時間(秒)を比活性(SA;1μgのタンパク質当たりの秒)に変換し、次いで野生型FXと比較した比活性の百分率を算出した(図5)。結果は種々のファミリー間で一貫している。この結果により、挙動の相違は主に切断部位に由来し、それらがクローニングされる方法に由来していないことが示される。
【０１１４】
構築物は3つのカテゴリーに分類できる:そのSAがFX-WTのSAと同様である、第1のカテゴリー(FX-対照+を含有する)、そのSAが対照のSAと比較して減少している、第2のカテゴリー(FX-IIa、FX-PAR1、FX-PAR1M及びFX-Kal3を含有する)、及びFXの不在下でその活性がFX-WTの活性より多い、第3のカテゴリー(FX-FXIa1及び2、FX-Kal1及び2を含有する)。FX-Kal2ファミリー3構築物は技術的理由のために分析できなかったことは留意すべきである(グラフ上の*)。
【０１１５】
これらの結果により、導入されてファミリー3(FX-FXIa1及び2、FX-Kal1及び2)を形成する改変は、第X因子分子に、内因性第X因子の不在下で野生型第X因子より凝固する効果的な能力を与えることが示される。
【０１１６】
(実施例5)
RVV-X毒画分によってCHO-S中で産生した第X因子バリアントの活性化の測定
1-実験プロトコル
CHO-S細胞によって産生したFXバリアントの活性化を、ラッセルクサリヘビ蛇毒抗第X因子画分(RVV-X)の存在下で培養上清のインキュベーション後に測定した。対照の活性化第X因子、毒画分X(RVV-X)及びpNAPEP 1025基質はHaematologic Technologies社(Cryopep社、Montpellier、フランス)から得た。
【０１１７】
活性化を以下の緩衝液中で37℃にて研究した:25mM HEPES、pH7.4、0.175M NaCl、5mM CaCl2及び5mg/ml BSA。0〜100nMの濃度のFXについて、200mU/mlの濃度のRVV-Xを使用した。5分間のインキュベーション後、反応を、50mM Tris緩衝液、pH8.8、0.475M NaCl、9mM EDTA中で停止させる。生成したFXaの量を、405nmにてpNAPEP 1025基質(250μM)の加水分解速度を測定することによってモニターする。
【０１１８】
2-結果
ファミリー1バリアントを発現するCHOの上清をRVV-Xとインキュベートした。FXaの生成を、種々の濃度のFXを使用したこの処理の後に測定した。FXaの存在を溶液中のpNAPEP 1025の産生物の出現速度(mODU/分)によって定量する。この生成は、RVV-XによるFXの認識及び切断、及びまた、FX基質を認識するために生成したFXaの能力を反映する。出現速度の平均をFXの種々の開始濃度について算出し、この値はFX-WTの値の百分率に関連している。
【０１１９】
ファミリー1の分析は、特にFX-対照+、FX-IIa、FX-Kal1、FX-Kal2及びFX-Kal3について、PTによって得た結果と同様である結果を部分的に示す(図6)。FX-XIa1及び2分子は活性を示すが、この時間はFX-WTより長くない。他方で、FX-PAR1及びFX-PAR1M分子はPTによって観察された活性より大きい有意な活性を実証する。
【０１２０】
これらの結果は、ファミリー1のFX-PAR1M及びFX-Kal2が、FX-WTよりRVV-Xによって効果的に活性化することを示す。
【０１２１】
(実施例6)
トロンビン生成時間(TGT)に関して、ファミリー2の第X因子バリアントの凝血促進能力:FVIII欠損血漿中の外因性凝固経路(TF 1pM/PL 4μM)の活性化の測定
1-実験プロトコル
1.1-試薬
トロンビン標準物である、PPP試薬である低反応性のCK-Prest、Fkuca Kit(Fluo-緩衝液+Fluo-基質)、PNP及びFIX欠損血漿はStago社(Asnieres、フランス)から得た。FX欠損血漿はCryopep社(Montpellier、フランス)から得た。FVIII欠損血漿はSiemens Healthcare社(Marburg、ドイツ)から得た。ヒトFX(カタログ番号HCX-0050)及びヒトFXa(カタログ番号HCXA-0060)はHaematologic Technologies Inc.社(Burlington、Vt、USA)から得た。対照の組換えヒト第VIII因子はBaxter社{リコンビネート(Recombinate)}(Maurepas、フランス)から得た。
【０１２２】
1.2-プロトコル
1単位のFX(1U/ml)=血漿中の10μg/mlとみなされ、血漿中の100%FXレベルに対応する。
【０１２３】
トロンビン生成試験は、組織因子及びリン脂質の混合物(外因経路の活性化)によって、又はセファリン(内因経路の活性化)によってのいずれかで、エキソビボで凝固を活性化すること、及び次いで経時的に生成したトロンビンの濃度を測定することからなる。
【０１２４】
トロンビン生成試験を、最終濃度1pMの組織因子(TF)及び4μMのリン脂質(PL)を含有する20μlのPPP試薬(Stago社)の存在下で、任意選択に細胞上清又は対照を含有する、血漿の80μlのプールで実施する。正常、第X因子欠損、第VIII因子欠損又は第IX因子欠損である、種々の血漿を使用できる。
【０１２５】
トロンビンの出現の測定の開始を構成する20μlのFlucaキット(基質+CaCl2)を加えることによって反応を開始する。蛍光の出現を、390nmの励起波長及び460nmの発光波長にてFluoroskan Ascent蛍光光度計(ThermoLabsystems社)で測定する。次いでトロンビノグラム(時間の関数として蛍光強度を表す曲線)を、比較計算によって蛍光値をトロンビンのnMに変換するThrombinoscope(商標)ソフトウェアによって分析する。
【０１２６】
2-結果
上清を、所望の濃度が得られるまで、少なくとも1時間、2500gにてSartorius VivaSpin 20〜30kDaで約20倍に濃縮した。ユニキャリブレータ(Unicalibrator)血漿及びまた、0、0.1又は1U/mlで再構成したFVIII欠損血漿を対照として使用する。
【０１２７】
予想される通り、組織因子による凝固の活性化後、FVIII欠損血漿は実験のバックグラウンドノイズに対応する最も弱い信号を与える。ユニキャリブレータ血漿はFVIII濃度(0.1又は1U/ml)で再構成したFVIII欠損血漿より弱い信号を与える。他方で、FX-WTによるFVIII欠損血漿の再構成は十分な量のトロンビンを生成することを可能にしない。この再構成は欠損血漿単独よりわずかに多い{図7、table 7(表8)}。
【０１２８】
【表８】
2019050819.tif 000036
【０１２９】
全てのFXバリアント分子はFX-WTより大きな信号を与え、FVIIIの不在下でトロンビンを生成するそれらの能力がFX-WTと比較して有意に増加することを示唆している{table 7(表8)}。ファミリー2のFX変異体の速度はFX-WTの速度の2から4.5Xの間で振動する{図9、table 7(表8)}。2Xの速度は30%低いFX-Kal2の量(5μg/mlの代わりに3.5μg/ml)で得られることに留意すべきである。
【０１３０】
FVIIIの不在下で最も多くの量のトロンビンを生成することが可能となる変異体は、順に、FX-PAR1、FX-FXIa1、FX-IIa及びFX-Kal1である。
【０１３１】
(実施例7)
トロンビン生成時間(TGT)に関して、第X因子バリアント:FVIII欠損血漿中の内因性凝固経路(セファリン単独)の凝血促進能力の測定
1-実験プロトコル
試薬、自動装置及び実験プロトコルは実施例6に記載されているものと同一である。
【０１３２】
トロンビン生成試験を、20μlのセファリン(1mlの蒸留したH2Oで再構成したCK-Prest)及び20μlのfluca-キット(基質+CaCl2)の存在下で任意選択に細胞上清及び対照を含有する正常な血漿の80μlのプールで実施する。使用した血漿は正常な血漿及び第VIII因子欠損血漿である。
【０１３３】
2-結果
実施例6で使用した上清を、同じ対照を使用してセファリンによる活性化後にTGTによって分析した。
【０１３４】
対照は予想されるように作用し、FVIII欠損血漿はIIaを全く生成することができず、FVIIIの用量を増加させた場合、有効性の勾配が見出される{table 8(表9)}。
【０１３５】
【表９】
2019050819.tif 000037
【０１３６】
ファミリー2の分析は、予想されるように、野生型FXが、弱い残留活性(3.4nM/s)を示す、少なくとも活性FX分子であることを示す。全ての他の分子は、トロンビンを生成する、より高い能力を示す{table 8(表9)}。FX-Kal-1〜3、FX-FXI-2及びFX-PAR1M分子は、FX-対照+、FX-PAR1及びFX-FXI-1構築物(10.5〜13.3nM/s)未満であるが、少し強い活性(6.6〜8.7nM/s)を示す。他方で、FX-IIa分子は、0.1及び1U/mlのFVIII(78.2nM/s)について得た値の間である信号を得ることが可能となり、FVIII欠損を非常に効果的に修復する。速度のこれらの相違は、変異体について、1.8X高い(3.5μg/mlでのFX-Kal2変異体を除いて)〜22.8X高い(FX-IIa変異体について)、トロンビン生成有効性を示す。
【０１３７】
結論として、いくつかのFX変異体は、組織因子及びセファリンによる血漿の活性化後にFVIIIの不在下で凝固を修復する能力を有する。
【０１３８】
(実施例8)
トロンビン生成時間(TGT)に関して、ファミリー2の第X因子バリアントの凝血促進能力:FIX欠損血漿中の外因性凝固経路(TF 1pM/PL 4μM)の活性化の測定
1-実験プロトコル
試薬、自動装置及び実験プロトコルは実施例6に記載されているものと同一である。
【０１３９】
トロンビン生成試験を、1pMの組織因子(TF)及び4μMのリン脂質(PL)並びに20μlのfluca-キット(基質+CaCl2)の存在下で任意選択に細胞上清及び対照を含有する正常な血漿の80μlのプールで実施する。使用した血漿は正常又は第IX因子欠損のいずれかである。
【０１４０】
2-結果
実施例6で使用した上清を、対照として正常な血漿(ユニキャリブレータ)又は0、0.1若しくは1U/mlの血漿FIXで再構成したFIX欠損血漿を使用して組織因子による活性化後にTGTによって分析した{図10、table 9(表10)}。
【０１４１】
FIX欠損血漿は陰性であり(それはIIaを全く生成できない)、FIXによるその再構成により、多量のトロンビンを生成できる。しかしながら、使用したFIXの2つの濃度の間に量的差異はなく、したがって、それらの両方は、最大量のIIaを形成することが可能となることを示唆している{table 9(表10)}。
【０１４２】
【表１０】
2019050819.tif 000038
【０１４３】
このアッセイにおいて、全ての変異体はFX-WTより多い量のIIaを生成することが可能となる。しかしながら、相違はFVIIIの不在下におけるよりかなり低く:それ故、速度は1.50X(3.5μg/mlでのFX-Kal2について)〜4.60X(FX-PAR1について)の範囲である。この変異体に加えて、FX-IIa、FX-PAR1M、FX-FXIa1及びFX-Kal1分子が最も効果的である{図12、table 9(表10)}。
【０１４４】
(実施例9)
トロンビン生成時間(TGT)に関して、ファミリー2の第X因子バリアントの凝血促進能力:FIX欠損血漿中の内因性凝固経路(セファリン)の活性化の測定
1-実験プロトコル
試薬、自動装置及び実験プロトコルは実施例6に記載されているものと同一である。
【０１４５】
トロンビン生成試験を、セファリン(1mlの蒸留したH2Oで再構成したCK-Prest)及び20μlのfluca-キット(基質+CaCl2)の存在下で任意選択に細胞上清及び対照を含有する正常な血漿の80μlのプールで実施する。使用した血漿は正常又は第IX因子欠損のいずれかである。
【０１４６】
2-結果
実施例6で使用した上清を、対照として正常な血漿(ユニキャリブレータ)及び0、0.1若しくは1U/mlの血漿FIXで再構成したFIX欠損血漿を使用してセファリンによる活性化後にTGTによって分析した{図11、table 10(表11)}。
【０１４７】
FIX欠損血漿は陰性であり(それはIIaを全く生成できない)、FIXによるその再構成により、多量のトロンビンを生成できる。しかしながら、使用したFIXの2つの濃度の間に量的差異はなく、したがって、それらは最大量のIIaを形成することを示唆している{table 10(表11)}。
【０１４８】
【表１１】
2019050819.tif 000039
【０１４９】
セファリンによる凝固の誘導後、3つの分子のみがFX-WTよりトロンビンを有意に生成することが可能となり、それらはFX-IIa、FX-対照+及びFX-PAR1であり、その速度はそれぞれ、FX-WTの速度より61X、8.3X及び3.8X速い{図12、table 10(表11)}。しかしながら、他の変異体はFX-WTの速度より速い速度を有する。
【０１５０】
結論として、研究した全ての変異体は、誘導が使用されたものは全て、FIXの不在下でトロンビンを生成することが可能となる。FX-IIa、FX-対照+及びFX-PAR1が最も効果的である。
【０１５１】
(実施例10)
HEK中で産生したファミリー2の第X因子バリアント及び野生型第X因子のトロンビン活性化
1-実験プロトコル
ビタミンKエポキシドレダクターゼ(VKOR)の存在下でHEK細胞によって産生したFXバリアントの活性化を、トロンビンの存在下で、培養上清のインキュベーション後に測定した。対照の活性化第X因子、トロンビン及びPefachrome FXa8595基質は、Haematologic Technologies社(Cryopep社、Montpellier、フランス)から得た。
【０１５２】
リン脂質はDiagnostica Stago社から得た(Asnieres、フランス)。
【０１５３】
活性化を以下の緩衝液:25mM HEPES、pH7.4、0.175M NaCl、5mM CaCl2及び5mg/ml BSA中で37℃にて研究した。42.5及び85nMのFXの濃度について、10nMの濃度のトロンビン及び4μMの濃度のリン脂質を使用した。37℃にて1時間のインキュベーション後、生成したFXaの量を、405nmにてPefachrome FXa8595基質(250μM)の加水分解速度を測定することによってモニターする。
【０１５４】
2-結果
トロンビンによって切断することを意図する部位が実際にこの酵素によって認識されることを検証するために、FX-WT、FX-対照+及びFX-IIaの濃縮した上清をトロンビンの存在下でインキュベートした。FXaの出現を基質分解産物の出現によって測定した(図13)。血漿FXaを陽性対照として使用した。変異体を有する産物の出現の動態はFXaの動態と直接比較できない。なぜならこれらの分子は、活性を放出する前に、活性化されることを必要とするからである。更に、トロンビンについての切断部位は複合であり、分子の活性化は必ずしも最適ではないからである。実際に、全ての分子は切断部位の下流の元の領域に保存され、上流部分のみが改変される。したがって、組換え分子によるFXa基質分解の動態はFXaによる動態と異なる。
【０１５５】
得られた結果により、予想される通り、血漿及びWT FXを用いてTGTによって得られたデータが陰性であることが確認される。なぜならそれらはトロンビン認識部位を有さないからである。他方で、FX-IIa及びFX-対照+は、トロンビンによって活性化でき、FXaを放出できる。TGT測定のように、FX-IIaはFX-対照+より効果的に活性化する。
【０１５６】
(実施例11)
トロンビン生成時間(TGT)に関して、ファミリー1の第X因子バリアント:FVIII欠損血漿中の外因性凝固経路(TF 1pM/PL 4μM)の凝血促進能力の測定
1-実験プロトコル
トロンビン生成試験を、最終濃度1pMの組織因子(TF)及び4μMのリン脂質(PL)を含有する20μlのPPP試薬(Stago社)の存在下で任意選択に細胞上清及び対照を含有する血漿の80μlのプールで実施する。使用した種々の血漿は正常及び第VIII因子欠損である。
【０１５７】
反応は、トロンビンの出現の測定の開始を構成する20μlのFluca-キット(基質+CaCl2)を加えることによって開始する。蛍光の出現を、390nmの励起波長及び460nmの発光波長にてFluoroskan Ascent蛍光光度計(ThermoLabsystems社)で測定する。次いでトロンビノグラム(時間の関数として蛍光強度を表す曲線)を、比較計算によって蛍光値をトロンビンのnMに変換するThrombinoscope(商標)ソフトウェアによって分析する。
【０１５８】
2-結果
VKORの存在下でHEK293F細胞のトランスフェクションから生じたファミリー1の上清を、既に記載した対照を使用して組織因子による活性化後にTGTにより分析した。対照(正常な血漿、組換えFVIIIで再構成した又は組換えFVIIIで再構成しなかったFVIII欠損血漿)は予想されるように作用する。他方で、FX-WTは中程度であるが、予想されるより大きい信号を与える{図14及び図16;table 11(表12)}。しかしながら、その平均速度(59nM/分)はいくつかの変異体、特にFX-FXIa1/2、FX-Kal1/2及びFX-対照+及びFX-IIaの平均速度を下回り、それらは対照の少なくとも130%の速度を有する。
【０１５９】
【表１２】
2019050819.tif 000040
【０１６０】
(実施例12)
トロンビン生成時間(TGT)に関して、ファミリー1の第X因子バリアント:FVIII欠損血漿中の内因性凝固経路(セファリン単独)の凝血促進能力の測定
1-実験プロトコル
試薬、自動装置及び実験プロトコルは実施例6に記載されているものと同一である。
【０１６１】
トロンビン生成試験を、20μlのセファリン(1mlの蒸留したH2Oで再構成したCK-Prest)及び20μlのfluca-キット(基質+CaCl2)の存在下で任意選択に細胞上清及び対照を含有する血漿の80μlのプールで実施する。使用した血漿は正常な血漿及び第VIII因子欠損血漿である。
【０１６２】
2-結果
VKORの存在下でHEK293F細胞のトランスフェクションから生じたファミリー1の上清を、既に記載した対照を使用してセファリンによる活性化後にTGTにより分析した。
【０１６３】
対照は予想されるように作用し、FVIII欠損血漿は陰性であり(Iiaの生成がまったく起こらない)、FVIIIの用量を増加させた場合、有効性の勾配が見出される{図15;table 12(表13)}。このアッセイにおいて、FXによる補足(2つのアッセイを実施した)はトロンビンの有意な量を生成することができない(6.06及び7.65nM/分の速度)。他方で、ファミリー1のFX-IIa、FX-FXIa1及び2並びにFX-対照+変異体は、対照の少なくとも3.5Xのトロンビンの有意に多い量を生成することが可能となる{図15及び図16;table 12(表13)}。
【０１６４】
【表１３】
2019050819.tif 000041
【０１６５】
(実施例13)
トロンビン生成時間(TGT)に関して、ファミリー1の第X因子バリアント:FIX欠損血漿中の外因性凝固経路(TF 1pM/PL 4μM)の凝血促進能力の測定
1-実験プロトコル
試薬、自動装置及び実験プロトコルは実施例6に記載されているものと同一である。
【０１６６】
トロンビン生成試験を、最終濃度1pMの組織因子(TF)及び4μMのリン脂質(PL)を含有する20μlのPPP試薬(Stago社)並びに20μlのfluca-キット(基質+CaCl2)の存在下で任意選択に細胞上清及び対照を含有する血漿の80μlのプールで実施する。使用した血漿は正常な血漿及び第IX因子欠損血漿である。
【０１６７】
2-結果
VKORの存在下でHEK293F細胞のトランスフェクションから生じたファミリー1の上清を、既に記載した対照を使用して組織因子による活性化後にFIX欠損血漿中でTGTにより分析した。対照{正常な血漿、血漿FIX(10%又は100%にて)で再構成したFIX欠損血漿、血漿FIXで再構成しなかったFIX欠損血漿}は予想されるように作用する。他方で、FX-WTは、中程度であるが、予想されるより大きい信号を与える{図17;table 13(表14)}。しかしながら、その平均速度(23nM/分)はFX-PAR1を除く全ての変異体の平均速度を下回る。前記変異体は、特に、対照の少なくとも150%の速度を有する、FX-FXIa1/2、FX-Kal2/3及びFX-対照+及びFX-IIaである。
【０１６８】
【表１４】
2019050819.tif 000042
【０１６９】
(実施例14)
トロンビン生成時間(TGT)に関して、ファミリー1の第X因子バリアント:FIX欠損血漿中の内因性凝固経路(セファリン)の凝血促進能力の測定
1-実験プロトコル
試薬、自動装置及び実験プロトコルは実施例6に記載されているものと同一である。
【０１７０】
トロンビン生成試験を、20μlのセファリン(1mlの蒸留したH2Oで再構成したCK-Prest)及び20μlのfluca-キット(基質+CaCl2)の存在下で任意選択に細胞上清及び対照を含有する血漿の80μlのプールで実施する。使用した血漿は正常な血漿及び第IX因子欠損血漿である。
【０１７１】
2-結果
VKORの存在下でHEK293F細胞のトランスフェクションから生じたファミリー1の上清を、既に記載した対照を使用してセファリンによる活性化後にTGTにより分析した。
【０１７２】
対照は予想されるように作用し、FIX欠損血漿は陰性であり(それはIIaを全く生成できず)、FIXの用量を増加させた場合、有効性の勾配が見出される{図18;table 14(表15)}。このアッセイにおいて、FXによる補足(2つのアッセイを実施した)はトロンビンの有意な量を生成することができない(1.24及び1.53nM/分の速度)。他方で、ファミリー1のFX-IIa、FX-FXIa1及び2並びにFX-対照+変異体は、対照の少なくとも4.7X〜55Xのトロンビンの有意に多い量を生成することが可能となる{図18及び図19;table 14(表15)}。
【０１７３】
【表１５】
2019050819.tif 000043
【０１７４】
(実施例15)
トロンビン生成時間(TGT)に関して、ファミリー3の第X因子バリアント:FVIII欠損血漿中の外因性凝固経路(TF 1pM/PL 4μM)の凝血促進能力の測定
1-実験プロトコル
トロンビン生成試験を、最終濃度1pMの組織因子(TF)及び4μMのリン脂質(PL)を含有する20μlのPPP試薬(Stago社)の存在下で任意選択に細胞上清又は対照を含有する血漿の80μlのプールで実施する。使用した種々の血漿は正常及び第VIII因子欠損である。
【０１７５】
トロンビンの出現の測定の開始を構成する20μlのFluca-キット(基質+CaCl2)を加えることによって反応を開始する。蛍光の出現を、390nmの励起波長及び460nmの発光波長にてFluoroskan Ascent蛍光光度計(ThermoLabsystems社)で測定する。次いでトロンビノグラム(時間の関数として蛍光強度を表す曲線)を、比較計算によって蛍光値をトロンビンのnMに変換するThrombinoscope(商標)ソフトウェアによって分析する。
【０１７６】
2-結果
VKORの存在下でHEK293F細胞のトランスフェクションから生じたファミリー3の上清を、既に記載した対照を使用して組織因子による活性化後にTGTにより分析した。対照(正常な血漿、組換えFVIIIで再構成した又は組換えFVIIIで再構成しなかったFVIII欠損血漿)は予想されるように作用する。他方で、FX-WTは、中程度であるが、予想されるより大きい信号を与える{図20及び図21;table 15(表16)}。しかしながら、その平均速度(59nM/分)は、いくつかの変異体、特にFX-FXIa1/2、FX-Kal2/3及びFX-対照+並びにFX-IIaの平均速度を下回り、それらの速度は78nM/分超である(すなわち対照の少なくとも130%)。
【０１７７】
【表１６】
2019050819.tif 000044
【０１７８】
(実施例14)
トロンビン生成時間(TGT)に関して、ファミリー3の第X因子バリアント:FVIII欠損血漿中の内因性凝固経路(セファリン単独)の凝血促進能力の測定
1-実験プロトコル
試薬、自動装置及び実験プロトコルは実施例6に記載されているものと同一である。トロンビン生成試験を、20μlのセファリン(1mlの蒸留したH2Oで再構成したCK-Prest)及び20μlのfluca-キット(基質+CaCl2)の存在下で任意選択に細胞上清及び対照を含有する血漿の80μlのプールで実施する。使用した血漿は正常な血漿及び第VIII因子欠損血漿である。
【０１７９】
2-結果
VKORの存在下でHEK293F細胞のトランスフェクションから生じた上清のファミリー3を、既に記載した対照を使用してセファリンによる活性化後にTGTにより分析した。
【０１８０】
対照は予想されるように作用し、FVIII欠損血漿は陰性であり(それはIIaを全く生成できず)、FVIIIの用量を増加させた場合、有効性の勾配が見出される{図21;table 16(表17)}。FXによる補足(2つのアッセイを実施した)はトロンビンの有意な量を生成することができない(6.06及び7.65nM/分の速度)。他方で、ファミリー3のFX-IIa、FX-FXIa1及び2並びにFX-対照+変異体は、26nMより速い、すなわちFX-WTより少なくとも3.8X速い速度で有意な量のトロンビンを生成することが可能となる{図23;table 16(表17)}。
【０１８１】
【表１７】
2019050819.tif 000045
【０１８２】
(実施例15)
トロンビン生成時間(TGT)に関して、ファミリー3の第X因子バリアント:FIX欠損血漿中の外因性凝固経路(TF 1pM/PL 4μM)の凝血促進能力の測定
1-実験プロトコル
試薬、自動装置及び実験プロトコルは実施例6に記載されているものと同一である。
【０１８３】
トロンビン生成試験を、最終濃度1pMの組織因子(TF)及び4μMのリン脂質(PL)を含有する20μlのPPP試薬(Stago社)並びに20μlのfluca-キット(基質+CaCl2)の存在下で任意選択に細胞上清及び対照を含有する血漿の80μlのプールで実施する。使用した血漿は正常な血漿及び第IX因子欠損血漿である。
【０１８４】
2-結果
VKORの存在下でHEK293F細胞のトランスフェクションから生じたファミリー3の上清を、既に記載した対照を使用して組織因子による活性化後にTGTにより分析した。
【０１８５】
対照は予想されるように作用し、FIX欠損血漿は陰性であり(それはIIaを全く生成できず)、FIXの用量を増加させた場合、有効性の勾配が見出される{図23;table 17(表18)}。FXによる補足(2つのアッセイを実施した)はトロンビンの有意な量を生成することができない(23nM/分の平均速度)。他方で、FX-PAR1Mを除いて、ファミリー3の全ての変異体は、33nMより速い、すなわちFX-WTより少なくとも140%速い速度で有意な量のトロンビンを生成することが可能となる{図23;table 17(表18)}。
【０１８６】
【表１８】
2019050819.tif 000046
【０１８７】
(実施例16)
トロンビン生成時間(TGT)に関して、ファミリー3の第X因子バリアント:FIX欠損血漿中の内因性凝固経路(セファリン)の凝血促進能力の測定
1-実験プロトコル
試薬、自動装置及び実験プロトコルは実施例6に記載されているものと同一である。トロンビン生成試験を、20μlのセファリン(1mlの蒸留したH2Oで再構成したCK-Prest)及び20μlのfluca-キット(基質+CaCl2)の存在下で任意選択に細胞上清及び対照を含有する正常な血漿の80μlのプールで実施する。使用した血漿は正常な血漿及び第IX因子欠損血漿である。
【０１８８】
2-結果
VKORの存在下でHEK293F細胞のトランスフェクションから生じたファミリー3の上清を、既に記載した対照を使用してセファリンによる活性化後にTGTにより分析した。
【０１８９】
対照は予想されるように作用し、FIX欠損血漿は陰性であり(それはIIaを全く生成できず)、FXIの用量を増加させた場合、有効性の勾配が見出される{図24;table 18(表19)}。このアッセイにおいて、FXによる補足(2つのアッセイを実施した)はトロンビンの有意な量を生成することができない(1.24及び1.53nM/分の速度)。他方で、ファミリー1のFX-IIa、FX-FXIa1及び2、FX-Kal2及び3、並びにFX-対照+変異体は、対照の少なくとも3.4X〜52X多い有意な量のトロンビンを生成することが可能となる{図24及び図25;table 18(表19)}。更に、FX-PAR1M及びFX-Kal2変異体を除いて、全ての変異体はFX-WTより活性である。
【０１９０】
【表１９】
2019050819.tif 000047
【図１】
2019050819.tif 000048
【図２】
2019050819.tif 000049
【図３】
2019050819.tif 000050
【図４】
2019050819.tif 000051
【図５】
2019050819.tif 000052
【図６】
2019050819.tif 000053
【図７】
2019050819.tif 000054
【図８】
2019050819.tif 000055
【図９】
2019050819.tif 000056
【図１０】
2019050819.tif 000057
【図１１】
2019050819.tif 000058
【図１２】
2019050819.tif 000059
【図１３】
2019050819.tif 000060
【図１４】
2019050819.tif 000061
【図１５】
2019050819.tif 000062
【図１６】
2019050819.tif 000063
【図１７】
2019050819.tif 000064
【図１８】
2019050819.tif 000065
【図１９】
2019050819.tif 000066
【図２０】
2019050819.tif 000067
【図２１】
2019050819.tif 000068
【図２２】
2019050819.tif 000069
【図２３】
2019050819.tif 000070
【図２４】
2019050819.tif 000071
【図２５】
2019050819.tif 000072
【配列表】
2019050819000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月11日(2018.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1の変異配列を含むタンパク質であって、前記配列番号1の変異配列は少なくとも1つの変異A、B、又はCを含み、
変異Aは、DFLAEGLTPRによる配列番号1の配列のアミノ酸43〜52の置換からなり、
変異Bは、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのDFLAEGLTPRの挿入からなり、
変異Cは、配列番号1の配列のアミノ酸52と53との間へのDFLAEGLTPRの挿入、並びに配列番号1の配列のアミノ酸4〜13の欠失からなる、
、タンパク質。
【請求項２】
少なくとも1つの変異A、B、又はCを有する配列番号7の配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項３】
少なくとも1つの変異A、B、又はCを有する配列番号7の配列からなることを特徴とする、請求項2に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号9、18、27、105、114及び123から選択される配列を含むことを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項1に記載のタンパク質、及び配列番号2の配列の少なくとも1つのタンパク質を含み、前記タンパク質がジスルフィド結合によって互いに連結されている、タンパク質複合体。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか一項に規定されるタンパク質をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項７】
配列番号77、86、95、133、142及び151の配列から選択されることを特徴とする、請求項6に記載の核酸。
【請求項８】
請求項6又は7に記載の核酸を含む、発現カセット。
【請求項９】
請求項8に記載の発現カセットを含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項１０】
請求項6又は7に記載の核酸を含む組換え細胞。
【請求項１１】
前記核酸が、請求項9に記載のベクター内に含まれる、請求項10に記載の組換え細胞。
【請求項１２】
医薬として使用するための請求項1〜5のいずれか一項に記載のタンパク質を含む組成物。
【請求項１３】
出血性障害の治療に使用するための請求項1〜5のいずれか一項に記載のタンパク質を含む組成物。
【外国語明細書】
2019050819000001.pdf