(57)【要約】【課題】ＣｔＢＰ２の活性化物質を効率よくスクリーニングする技術を提供する。【解決手段】ＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングする方法であって、被験物質の存在下で第１及び第２の融合タンパク質を接触させる工程であって、第１の融合タンパク質はＣｔＢＰ２とスプリットレポータータンパク質の一方との融合タンパク質であり、第２の融合タンパク質はＣｔＢＰ２結合タンパク質とスプリットレポータータンパク質の他方との融合タンパク質である工程と、ＣｔＢＰ２とＣｔＢＰ２結合タンパク質とが結合すると、スプリットレポータータンパク質の一方及び他方が結合し、活性型のレポータータンパク質が形成される工程と、レポータータンパク質の活性を測定する工程であって、レポータータンパク質の活性が被験物質の非存在下と比較して高いことが、被験物質がＣｔＢＰ２の活性化物質であることを示す、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＣｔＢＰ２）の活性化物質をスクリーニングする方法であって、
被験物質の存在下で第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を接触させる工程であって、前記第１の融合タンパク質はＣｔＢＰ２とスプリットレポータータンパク質の一方との融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質はＣｔＢＰ２結合タンパク質と前記スプリットレポータータンパク質の他方との融合タンパク質である工程と、
前記ＣｔＢＰ２と前記ＣｔＢＰ２結合タンパク質とが結合すると、前記スプリットレポータータンパク質の一方及び前記スプリットレポータータンパク質の他方が結合し、活性型のレポータータンパク質が形成される工程と、
前記レポータータンパク質の活性を測定する工程であって、前記レポータータンパク質の活性が前記被験物質の非存在下と比較して高いことが、前記被験物質がＣｔＢＰ２の活性化物質であることを示す、方法。
【請求項２】
前記レポータータンパク質が酵素又は蛍光タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣｔＢＰ２結合タンパク質が、Ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｏ１（ＦＯＸＯ１）、ＣＲＥＢ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＢＰ）、ＰＲ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １６（ＰＲＤＭ１６）、Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ＦＯＧ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ１（ＺＦＰＭ１）及びＺｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ＦＯＧ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ２（ＺＦＰＭ２）からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＣ末端側に前記スプリットレポータータンパク質の他方が融合した融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングするためのキットであって、第１の融合タンパク質の発現ベクター及び第２の融合タンパク質の発現ベクターを備え、
前記第１の融合タンパク質はＣｔＢＰ２とスプリットレポータータンパク質の一方との融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質はＣｔＢＰ２結合タンパク質と前記スプリットレポータータンパク質の他方との融合タンパク質であり、
ＣｔＢＰ２の活性化物質の存在下で前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質を接触させると、前記ＣｔＢＰ２と前記ＣｔＢＰ２結合タンパク質とが結合し、その結果、前記スプリットレポータータンパク質の一方及び前記スプリットレポータータンパク質の他方が結合し、活性型のレポータータンパク質が形成される、キット。
【請求項６】
前記第１の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＣ末端側に前記スプリットレポータータンパク質の他方が融合した融合タンパク質である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
ＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングするためのキットであって、第１の融合タンパク質の発現ベクター及び第２の融合タンパク質の発現ベクターが導入された細胞を備え、
前記第１の融合タンパク質はＣｔＢＰ２とスプリットレポータータンパク質の一方との融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質はＣｔＢＰ２結合タンパク質と前記スプリットレポータータンパク質の他方との融合タンパク質であり、
ＣｔＢＰ２の活性化物質の存在下で前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質を接触させると、前記ＣｔＢＰ２と前記ＣｔＢＰ２結合タンパク質とが結合し、その結果、前記スプリットレポータータンパク質の一方及び前記スプリットレポータータンパク質の他方が結合し、活性型のレポータータンパク質が形成される、キット。
【請求項８】
前記第１の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＣ末端側に前記スプリットレポータータンパク質の他方が融合した融合タンパク質である、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＣｔＢＰ２）の活性化物質をスクリーニングする方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣｔＢＰ２は転写抑制因子の１種である。ＣｔＢＰ２は腫瘍形成に関与することが知られており、前立腺癌、肝細胞癌、卵巣癌等で過剰発現していることが報告されている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Dai F., et al., CtBP2 overexpression promotes tumor cell proliferation and invasion in gastric cancer and is associated with poor prognosis., Oncotarget, 8 (17), 28736-28749, 2017.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＣｔＢＰ２はＲｏｓｓｍａｎｎ  ｆｏｌｄと呼ばれるポケット構造を有することが知られている。発明者らは、ＣｔＢＰ２のポケット構造に、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）／酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、脂肪酸アシルＣｏＡ等の化合物が収容されることにより、ＣｔＢＰ２の活性が調節されることを見出した。
【０００５】
発明者らはまた、活性化したＣｔＢＰ２が、肝臓における、糖新生、脂質合成、炎症等に関連する遺伝子の発現を転写レベルで制御し、糖尿病や脂肪肝等の代謝異常疾患を改善することを見出した。すなわち、発明者らは、ＣｔＢＰ２の活性化物質が、代謝異常疾患の治療剤になり得ることを見出した。
【０００６】
しかしながら、従来、ＣｔＢＰ２の活性化を評価する手段としては、操作が煩雑な免疫共沈降法等しか存在せず、ＣｔＢＰ２の活性化物質を大規模にスクリーニングすることが困難であった。
【０００７】
このような背景のもと、本発明は、ＣｔＢＰ２の活性化物質を効率よくスクリーニングする技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングする方法であって、被験物質の存在下で第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を接触させる工程であって、前記第１の融合タンパク質はＣｔＢＰ２とスプリットレポータータンパク質の一方との融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質はＣｔＢＰ２結合タンパク質と前記スプリットレポータータンパク質の他方との融合タンパク質である工程と、前記ＣｔＢＰ２と前記ＣｔＢＰ２結合タンパク質とが結合すると、前記スプリットレポータータンパク質の一方及び前記スプリットレポータータンパク質の他方が結合し、活性型のレポータータンパク質が形成される工程と、前記レポータータンパク質の活性を測定する工程であって、前記レポータータンパク質の活性が前記被験物質の非存在下と比較して高いことが、前記被験物質がＣｔＢＰ２の活性化物質であることを示す、方法。
［２］前記レポータータンパク質が酵素又は蛍光タンパク質である、［１］に記載の方法。
［３］前記ＣｔＢＰ２結合タンパク質が、Ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｏ１（ＦＯＸＯ１）、ＣＲＥＢ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＢＰ）、ＰＲ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １６（ＰＲＤＭ１６）、Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ＦＯＧ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ１（ＺＦＰＭ１）及びＺｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ＦＯＧ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ２（ＺＦＰＭ２）からなる群より選択される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記第１の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＣ末端側に前記スプリットレポータータンパク質の他方が融合した融合タンパク質である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングするためのキットであって、第１の融合タンパク質の発現ベクター及び第２の融合タンパク質の発現ベクターを備え、前記第１の融合タンパク質はＣｔＢＰ２とスプリットレポータータンパク質の一方との融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質はＣｔＢＰ２結合タンパク質と前記スプリットレポータータンパク質の他方との融合タンパク質であり、ＣｔＢＰ２の活性化物質の存在下で前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質を接触させると、前記ＣｔＢＰ２と前記ＣｔＢＰ２結合タンパク質とが結合し、その結果、前記スプリットレポータータンパク質の一方及び前記スプリットレポータータンパク質の他方が結合し、活性型のレポータータンパク質が形成される、キット。
［６］前記第１の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＣ末端側に前記スプリットレポータータンパク質の他方が融合した融合タンパク質である、［５］に記載のキット。
［７］ＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングするためのキットであって、第１の融合タンパク質の発現ベクター及び第２の融合タンパク質の発現ベクターが導入された細胞を備え、前記第１の融合タンパク質はＣｔＢＰ２とスプリットレポータータンパク質の一方との融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質はＣｔＢＰ２結合タンパク質と前記スプリットレポータータンパク質の他方との融合タンパク質であり、ＣｔＢＰ２の活性化物質の存在下で前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質を接触させると、前記ＣｔＢＰ２と前記ＣｔＢＰ２結合タンパク質とが結合し、その結果、前記スプリットレポータータンパク質の一方及び前記スプリットレポータータンパク質の他方が結合し、活性型のレポータータンパク質が形成される、キット。
［８］前記第１の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＣ末端側に前記スプリットレポータータンパク質の他方が融合した融合タンパク質である、［７］に記載のキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＣｔＢＰ２の活性化物質を効率よくスクリーニングする技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実験例２において、ルシフェラーゼの発光強度の経時変化を測定した結果を示すグラフである。
【図２】実験例３において、ルシフェラーゼの発光強度の経時変化を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［ＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングする方法］
１実施形態において、本発明は、ＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングする方法であって、（１）被験物質の存在下で第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を接触させる工程であって、前記第１の融合タンパク質はＣｔＢＰ２とスプリットレポータータンパク質の一方との融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質はＣｔＢＰ２結合タンパク質と前記スプリットレポータータンパク質の他方との融合タンパク質である工程と、（２）前記ＣｔＢＰ２と前記ＣｔＢＰ２結合タンパク質とが結合すると、前記スプリットレポータータンパク質の一方及び前記スプリットレポータータンパク質の他方が結合し、活性型のレポータータンパク質が形成される工程と、（３）前記レポータータンパク質の活性を測定する工程であって、前記レポータータンパク質の活性が前記被験物質の非存在下と比較して高いことが、前記被験物質がＣｔＢＰ２の活性化物質であることを示す方法を提供する。
【００１２】
本明細書において、ＣｔＢＰ２の活性化物質とは、ＣｔＢＰ２のＣｔＢＰ２結合タンパク質に対する結合能を上昇させる物質である。活性化したＣｔＢＰ２はＣｔＢＰ２結合タンパク質と結合する。
【００１３】
発明者らは、ＣｔＢＰ２の活性化物質が代謝異常疾患の治療剤となり得ることを見出した。したがって、本実施形態のスクリーニング方法は、代謝異常疾患の治療剤のスクリーニング方法であるということもできる。
【００１４】
本明細書において、スプリットレポータータンパク質とは、２つに分割されたレポータータンパク質を意味する。スプリットレポータータンパク質のそれぞれが離れて存在する状態では、レポータータンパク質としての機能を示さない。しかしながら、スプリットレポータータンパク質の一方及び他方が近接又は結合すると、レポータータンパク質としての機能を示すようになる。これにより、レポータータンパク質の活性を測定することによってＣｔＢＰ２とＣｔＢＰ２結合タンパク質との結合を検出することが可能になる。
【００１５】
すなわち、本実施形態のスクリーニング方法では、レポータータンパク質の活性がＣｔＢＰ２の活性に対応する指標となる。したがって、本実施形態のスクリーニング方法は、ＣｔＢＰ２の活性を測定する方法であるということもできる。あるいは、本実施形態のスクリーニング方法は、被験物質のＣｔＢＰ２の活性化能を測定する方法であるということもできる。
【００１６】
スプリットレポータータンパク質の構造は、スプリットレポータータンパク質の一方及び他方が近接した場合に、近接したことが識別可能であれば特に制限されない。例えば、スプリットレポータータンパク質は、スプリットレポータータンパク質の一方及び他方が近接した場合に、構造的相補性が促進されて活性型のレポータータンパク質が形成されるように構成されていてもよい。
【００１７】
あるいは、スプリットレポータータンパク質は、スプリットレポータータンパク質の一方及び他方が近接した場合に、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（生物発光共鳴エネルギー移動、ＢＲＥＴ）又はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（蛍光共鳴エネルギー移動、ＦＲＥＴ）が生じるように構成されていてもよい。この場合、活性型のレポータータンパク質とは、スプリットレポータータンパク質の一方及び他方が近接し、ＢＲＥＴ又はＦＲＥＴを生じる状態になったものをいう。
【００１８】
レポータータンパク質がＢＲＥＴ又はＦＲＥＴを生じるものである場合、スプリットレポータータンパク質の一方又は他方に更に蛍光物質を結合させる構成としてもよい。
【００１９】
あるいは、スプリットレポータータンパク質は、スプリットレポータータンパク質の一方及び他方が近接した場合に、プロテインスプライシングにより活性型のレポータータンパク質が形成されるように構成されていてもよい。これは、スプリットレポータータンパク質の一方及び他方に、それぞれプロテインスプライシングドメインを融合させておくことにより実現できる。
【００２０】
プロテインスプライシングドメインとしては、例えば、シネコシスティスｓｐ．ＰＣＣ６８０３株のｄｎａＥ遺伝子由来のプロテインスプライシングドメインである、ＤｎａＥｎ及びＤｎａＥｃとの組み合わせ等が挙げられる。
【００２１】
スプリットレポータータンパク質は、活性型のレポータータンパク質を可逆的に形成可能であることが好ましい。これにより、スプリットレポータータンパク質の一方及び他方の近接及び解離を繰り返し検出することができる。すなわち、ＣｔＢＰ２とＣｔＢＰ２結合タンパク質との結合及び解離を繰り返し検出することが可能になる。
【００２２】
より具体的なレポータータンパク質としては、酵素、蛍光タンパク質等が挙げられる。蛍光タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの改変体等が挙げられる。また、酵素としては、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、インベルターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、これらの酵素の改変体等が挙げられる。
【００２３】
本実施形態のスクリーニング方法において、ＣｔＢＰ２としては、スクリーニングする活性化物質の適用対象の種のＣｔＢＰ２を用いることが好ましい。種としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、サル等が挙げられる。
【００２４】
また、ＣｔＢＰ２結合タンパク質としては、ＦＯＸＯ１、ＣＢＰ、ＰＲＤＭ１６、ＺＦＰＭ１、ＺＦＰＭ２等が挙げられる。ＣｔＢＰ２結合タンパク質としては、使用するＣｔＢＰ２と同じ種由来のものを用いることが好ましい。
【００２５】
実施例において後述するように、発明者らは、本実施形態のスクリーニング方法により、ＣｔＢＰ２の活性を数時間にわたってリアルタイムにモニターできることを明らかにした。また、ＣｔＢＰ２の活性化状態において測定されるレポータータンパク質の活性と、ＣｔＢＰ２の非活性化状態において測定されるレポータータンパク質の活性には、約１０倍の差があり、本実施形態のスクリーニング方法が高感度であることが明らかとなった。また、本実施形態のスクリーニング方法では、煩雑な洗浄操作等が不要であり、高いスループットでＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングすることができることが明らかとなった。したがって、本実施形態のスクリーニング方法により、数十万化合物の被験物質をスクリーニングすることができる。
【００２６】
本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
【００２７】
本実施形態のスクリーニング方法は、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を発現した細胞内で実施してもよい。この場合、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の発現は一過性の発現であってもよいし、恒常性の発現であってもよい。すなわち、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の安定発現細胞株を用いて本実施形態のスクリーニング方法を実施してもよい。
【００２８】
ここで、細胞としては、動物細胞が挙げられ、樹立された細胞株が使いやすく好ましい。細胞は、スクリーニングする活性化物質の適用対象の種由来の細胞であることが好ましい。
【００２９】
あるいは、本実施形態のスクリーニング方法は、精製した第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含む試験管内で実施してもよい。
【００３０】
あるいは、本実施形態のスクリーニング方法は、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を発現する細胞の破砕液を用いて実施してもよい。
【００３１】
本実施形態のスクリーニング方法において、第１の融合タンパク質はＣｔＢＰ２とスプリットレポータータンパク質の一方との融合タンパク質である。また、第２の融合タンパク質はＣｔＢＰ２結合タンパク質と前記スプリットレポータータンパク質の他方との融合タンパク質である。
【００３２】
第１の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２のＮ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であってもよく、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であってもよい。
【００３３】
また、第２の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＮ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であってもよく、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であってもよい。
【００３４】
なかでも、第１の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＣ末端側に前記スプリットレポータータンパク質の他方が融合した融合タンパク質であることが好ましい。
【００３５】
実施例において後述するように、このような構造の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を用いて本実施形態のスクリーニング方法を実施した場合に、ＣｔＢＰ２の活性化状態において測定されるレポータータンパク質の活性と、ＣｔＢＰ２の非活性化状態において測定されるレポータータンパク質の活性の差が特に大きく、より高い感度を得ることができる傾向にある。
【００３６】
［ＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングするためのキット］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、ＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングするためのキットであって、第１の融合タンパク質の発現ベクター及び第２の融合タンパク質の発現ベクターを備え、前記第１の融合タンパク質はＣｔＢＰ２とスプリットレポータータンパク質の一方との融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質はＣｔＢＰ２結合タンパク質と前記スプリットレポータータンパク質の他方との融合タンパク質であり、ＣｔＢＰ２の活性化物質の存在下で前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質を接触させると、前記ＣｔＢＰ２と前記ＣｔＢＰ２結合タンパク質とが結合し、その結果、前記スプリットレポータータンパク質の一方及び前記スプリットレポータータンパク質の他方が結合し、活性型のレポータータンパク質が形成される、キットを提供する。
【００３７】
本実施形態のキットは、代謝異常疾患の治療剤のスクリーニング用キットであるということもできる。あるいは、ＣｔＢＰ２の活性測定用キットであるということもできる。
【００３８】
本実施形態のキットにおいて、ＣｔＢＰ２の活性化物質、第１の融合タンパク質、第２の融合タンパク質、スプリットレポータータンパク質は、上述したものと同様である。
【００３９】
第１実施形態のキットは、発現ベクターを備えるものである。本実施形態のキットを用いてＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングする場合には、第１の融合タンパク質の発現ベクター及び第２の融合タンパク質の発現ベクターを細胞に導入し、一過性に発現させるか、あるいは安定発現細胞株を樹立して使用するとよい。
【００４０】
あるいは、大腸菌、酵母、動物細胞、無細胞翻訳系等で第１の融合タンパク質の発現ベクター及び第２の融合タンパク質の発現ベクターを発現させて第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を作製し、試験管内でＣｔＢＰ２の活性化物質のスクリーニングを実施してもよい。
【００４１】
本実施形態のキットにおいて、発現ベクターとしては、細胞中で第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を発現させることができる限り特に制限されず、プラスミドベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは遺伝子の導入効率が高く使いやすい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が挙げられる。
【００４２】
本実施形態のキットにおいて、第１の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２のＮ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であってもよく、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であってもよい。
【００４３】
また、第２の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＮ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であってもよく、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であってもよい。
【００４４】
なかでも、第１の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＣ末端側に前記スプリットレポータータンパク質の他方が融合した融合タンパク質であることが好ましい。
【００４５】
実施例において後述するように、このような構造の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を用いてＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングした場合に、ＣｔＢＰ２の活性化状態において測定されるレポータータンパク質の活性と、ＣｔＢＰ２の非活性化状態において測定されるレポータータンパク質の活性の差が特に大きく、より高い感度を得ることができる傾向にある。
【００４６】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、ＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングするためのキットであって、第１の融合タンパク質の発現ベクター及び第２の融合タンパク質の発現ベクターが導入された細胞を備え、前記第１の融合タンパク質はＣｔＢＰ２とスプリットレポータータンパク質の一方との融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質はＣｔＢＰ２結合タンパク質と前記スプリットレポータータンパク質の他方との融合タンパク質であり、ＣｔＢＰ２の活性化物質の存在下で前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質を接触させると、前記ＣｔＢＰ２と前記ＣｔＢＰ２結合タンパク質とが結合し、その結果、前記スプリットレポータータンパク質の一方及び前記スプリットレポータータンパク質の他方が結合し、活性型のレポータータンパク質が形成される、キットを提供する。
【００４７】
本実施形態のキットは、代謝異常疾患の治療剤のスクリーニング用キットであるということもできる。あるいは、ＣｔＢＰ２の活性測定用キットであるということもできる。
【００４８】
第１実施形態のキットが発現ベクターの形態であるのに対し、第２実施形態のキットは細胞の形態である点が主に異なる。
【００４９】
本実施形態のキットにおいて、ＣｔＢＰ２の活性化物質、第１の融合タンパク質、第２の融合タンパク質、スプリットレポータータンパク質は、上述したものと同様である。
【００５０】
本実施形態のキットにおいて、細胞としては、動物細胞が挙げられ、樹立された細胞株が使いやすく好ましい。細胞は、スクリーニングする活性化物質の適用対象の種由来の細胞であることが好ましい。
【００５１】
本実施形態のキットにおいて、第１の融合タンパク質の発現ベクター及び第２の融合タンパク質の発現ベクターは、細胞内で一過性に発現されていてもよく、恒常的に発現されていてもよい。すなわち、細胞は、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の安定発現細胞株であってもよい。
【００５２】
上述したものと同様に、第１の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であり、前記第２の融合タンパク質は、ＣｔＢＰ２結合タンパク質のＣ末端側に前記スプリットレポータータンパク質の他方が融合した融合タンパク質であることが好ましい。
【００５３】
実施例において後述するように、このような構造の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を用いてＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングした場合に、ＣｔＢＰ２の活性化状態において測定されるレポータータンパク質の活性と、ＣｔＢＰ２の非活性化状態において測定されるレポータータンパク質の活性の差が特に大きく、より高い感度を得ることができる傾向にある。
【実施例】
【００５４】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５５】
［実験例１］
（融合タンパク質発現ベクターの作製）
第１の融合タンパク質の発現ベクター及び第２の融合タンパク質の発現ベクターを作製した。ＣｔＢＰ２としてマウスＣｔＢＰ２を使用した。また、ＣｔＢＰ２結合タンパク質としてマウスＦＯＸＯ１を使用した。また、レポータータンパク質として深海エビ（トゲオキヒオドシエビ）由来のルシフェラーゼ（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）、プロメガ社）を使用した。
【００５６】
使用したルシフェラーゼは、Ｌａｒｇｅ  ＢｉＴ（以下、「ＬｇＢｉＴ」という。）及びＳｍａｌｌ  ＢｉＴ（以下、「ＳｍＢｉＴ」という。）と呼ばれる２つのサブユニットからなり、２つのサブユニットが複合体を形成すると活性型のルシフェラーゼが形成されるものであった。すなわち、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴの組み合わせは、スプリットレポータータンパク質の一方及び他方の組み合わせを構成する。
【００５７】
第１の融合タンパク質としては、ＣｔＢＰ２に上記ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴのいずれを連結させるか、また、Ｎ末端側及びＣ末端側のいずれに連結させるかによって４種類の融合タンパク質があり得る。同様に、第２の融合タンパク質としては、ＦＯＸＯ１に上記ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴのいずれを連結させるか、また、Ｎ末端側及びＣ末端側のいずれに連結させるかによって４種類の融合タンパク質があり得る。
【００５８】
そして、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の組み合わせとしては、下記表１に示す８通りの組み合わせがあり得る。下記表１には、各融合タンパク質をコードする塩基配列の配列番号も示す。
【００５９】
【表１】
2019050765.tif 000002
【００６０】
マウスＣｔＢＰ２をコードする遺伝子断片、及びマウスＦＯＸＯ１をコードする遺伝子断片を、それぞれ市販のベクター（型式「ＮａｎｏＢｉＴ  ＣＭＶ  ＭＣＳ  ＢｉＢｉＴ−Ｒｅａｄｙ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」、プロメガ社）にクローニングし、上記表１に示す４種類の第１の融合タンパク質の発現ベクター及び４種類の第２の融合タンパク質の発現ベクターをそれぞれ作製した。
【００６１】
［実験例２］
（融合タンパク質発現ベクターの一過性の発現）
上記表１に示すＡ〜Ｈの組み合わせで、それぞれ上記表１に示す第１の融合タンパク質の発現ベクター及び上記表１に示す第２の融合タンパク質の発現ベクターをヒト胎児腎細胞株であるＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし一過性に発現させた。
【００６２】
ＨＥＫ２９３細胞は９６ウェルプレートを用いて培養し、第１の融合タンパク質の発現ベクターを７５ｎｇ／ウェル、第２の融合タンパク質の発現ベクターを２５ｎｇ／ウェルでトランスフェクションした。
【００６３】
続いて、３６時間後にルシフェラーゼ（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）、プロメガ社）の基質（型式「Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ」、プロメガ社）を各ウェルにそれぞれ添加した。続いて、まず、ベースラインの発光強度を１５分間測定した。その後、終濃度５０ｍＭの乳酸を各ウェルに添加し、継続してルシフェラーゼの発光強度を測定した。なお、乳酸を添加すると、細胞内の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の存在量が増加し、ＣｔＢＰ２が活性化することが知られている。
【００６４】
図１は、ルシフェラーゼの発光強度の経時変化を測定した結果を示すグラフである。図１中、「対照」は空のベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の結果を示す。
【００６５】
その結果、乳酸の添加直後にルシフェラーゼの発光強度が増加することが明らかとなった。この結果は、本実験系により、ＣｔＢＰ２の活性をリアルタイムに評価することができることを示す。更に、ＣｔＢＰ２の活性は、約２時間にわたって評価可能であった。
【００６６】
また、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の組み合わせとして、特に、上記表１に示すＡ又はＣの組み合わせを用いると、ルシフェラーゼの発光強度の変化量が大きく、乳酸の非存在下の約１０倍の発光強度を得ることができることが明らかとなった。
【００６７】
すなわち、第１の融合タンパク質として、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にＬｇＢｉＴを融合した融合タンパク質を使用し、第２の融合タンパク質としてＦＯＸＯ１のＣ末端側にＳｍＢｉＴを融合した融合タンパク質を使用する組み合わせ（組み合わせＡ）、又は第１の融合タンパク質として、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にＳｍＢｉＴを融合した融合タンパク質を使用し、第２の融合タンパク質としてＦＯＸＯ１のＣ末端側にＬｇＢｉＴを融合した融合タンパク質を使用する組み合わせ（組み合わせＣ）を用いると、ルシフェラーゼの発光強度の変化量が大きかった。
【００６８】
［実験例３］
（融合タンパク質発現ベクターの安定発現細胞株の作製）
続いて、上記表１に示すＡ〜Ｈの組み合わせで第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を発現する安定発現細胞株を作製した。
【００６９】
第１の融合タンパク質の発現ベクター及び第２の融合タンパク質の発現ベクターは、それぞれＮｄｅＩ／ＳａｌＩで制限酵素処理してライゲーションした。これにより、１つのベクター上で両方向性のＣＭＶプロモーターによって第１の融合タンパク質及び第２の合タンパク質を発現するベクターが得られた。
【００７０】
これらの発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクション後、ブラスチシジンで薬剤選択し、それぞれ安定発現細胞株（以下、それぞれ「安定発現細胞株Ａ」〜「安定発現細胞株Ｈ」という。）を得た。
【００７１】
続いて、得られた各安定発現細胞株の培地に乳酸を添加することによりＣｔＢＰ２を活性化し、各安定発現細胞株におけるルシフェラーゼの活性化をそれぞれ検討した。
【００７２】
具体的には、まず、各安定発現細胞株を９６ウェルプレートに播種した。続いて、ルシフェラーゼ（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）、プロメガ社）の基質（型式「Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ」、プロメガ社）を各ウェルにそれぞれ添加した。続いて、まず、ベースラインの発光強度を１５分間測定した。その後、終濃度５０ｍＭの乳酸を各ウェルに添加し、継続してルシフェラーゼの発光強度を測定した。
【００７３】
図２は、安定発現細胞株Ａ〜Ｈにおけるルシフェラーゼの発光強度の経時変化を測定した結果を示すグラフである。図２中、「対照」は空のベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の結果を示す。
【００７４】
その結果、いずれの安定発現細胞株においても、乳酸の添加直後にルシフェラーゼの発光強度が増加することが明らかとなった。この結果は、安定発現細胞株を用いた場合においても、ＣｔＢＰ２の活性をリアルタイムに評価することができることを示す。
【００７５】
安定発現細胞株を使用することができれば、第１の融合タンパク質の発現ベクター及び第２の融合タンパク質の発現ベクターを細胞に導入するステップを省略することができるため、例えばＣｔＢＰ２の活性化物質をスクリーニングする場合の作業効率を高めることができる。
【００７６】
また、安定発現細胞株を用いた場合においても、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の組み合わせとして、特に、上記表１に示すＣの組み合わせを用いると、ルシフェラーゼの発光強度の変化量が大きく、乳酸の非存在下の約１０倍の発光強度を得ることができることが明らかとなった。
【００７７】
すなわち、第１の融合タンパク質として、ＣｔＢＰ２のＣ末端側にＳｍＢｉＴを融合した融合タンパク質を発現し、第２の融合タンパク質としてＦＯＸＯ１のＣ末端側にＬｇＢｉＴを融合した融合タンパク質を発現する安定発現細胞株Ｃを用いると、ルシフェラーゼの発光強度の変化量が大きかった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明によれば、ＣｔＢＰ２の活性化物質を効率よくスクリーニングする技術を提供することができる。
【図１】
2019050765.tif 000003
【図２】
2019050765.tif 000004
【配列表】
2019050765000001.app