(57)【要約】【課題】小分子プロドラッグの所望する特性を模倣する抗体を提供する。【解決手段】マスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）、及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して特異的に結合する抗体（ＡＢ）を含む活性化可能抗体、及び抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の製造方法、及び種々の処置、診断及び予防指標へのそれらの抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の使用方法に関する。【選択図】図１Ａ
2019108331.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を、活性化された状態下で結合する活性化可能抗体であって、以下の：
ＥＧＦＲに対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、ここで、前記ＡＢは、（ｉ）配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列、又は（ｉｉ）配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含み；
ＥＧＦＲに対する切断されていない状態での前記活性化可能抗体の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、ここで、前記マスキング部分はアミノ酸配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）を含み；及び
前記ＡＢと結合した切断可能部分（ＣＭ）、ここで、前記ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり、そしてアミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号１３）を含む、を含み、
ここで、前記活性化可能抗体が、切断されていない状態で、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを有する、活性化可能抗体。
【請求項２】
前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、ｓｃＦｖ及びｓｃＡｂから成る群から選択される、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項３】
前記活性化可能抗体が、以下：
（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖；
（ｄ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖；
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖；及び
（ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖から成る群から選択されるＨ及びＬ鎖の組合せを含む、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項４】
前記活性化可能抗体が、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項５】
前記活性化可能抗体が、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項６】
前記活性化可能抗体が、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項７】
前記ＡＢが、ＥＧＦＲへの結合のために約１００ｎＭ又はそれ以下の平衡解離定数を有する、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項８】
前記ＭＭが、ＥＧＦＲへの前記ＡＢの平衡解離定数よりも高い、前記ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項９】
前記ＭＭが、ＥＧＦＲへの結合のために切断された状態での活性化可能抗体の前記ＡＢを干渉しないか、又は前記ＡＢと競争しない、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項１０】
前記ＭＭが、長さ４０個以下のアミノ酸のポリペプチドである。請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項１１】
前記ＭＭポリペプチド配列が、ＥＧＦＲのその配列とは異なり、そして前記ＭＭポリペプチド配列が、前記ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して５０％以上同一ではない、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項１２】
前記ＭＭがＥＧＦＲに対して２５％以上のアミノ酸配列同一性を有さない、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項１３】
前記ＭＭがＥＧＦＲに対して１０％以上のアミノ酸配列同一性を有さない、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項１４】
前記ＣＭが、１５個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項１５】
前記プロテアーゼが、組織中でＥＧＦＲと共局在し、そして前記プロテアーゼが、活性化可能抗体が前記プロテアーゼに供される場合、活性化可能抗体におけるＣＭを切断する、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項１６】
前記活性化可能抗体が、前記ＭＭと前記ＣＭとの間に連結ペプチドを有する、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項１７】
前記活性化可能抗体が、前記ＣＭと前記ＡＢとの間に連結ペプチドを有する、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項１８】
前記活性化可能抗体が第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして前記活性化可能抗体が、切断されていない状態で次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-LP1-CM-LP2-AB又はAB-LP2-CM-LP1-MMを有する、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項１９】
前記２種の連結ペプチドがお互いに同一である必要はない、請求項１８に記載の活性化可能抗体。
【請求項２０】
前記ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つが、（GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n（配列番号１５）及び(GGGS)n（配列番号１６)（ｎは、少なくとも１の整数である）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の活性化可能抗体。
【請求項２１】
前記ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つがGGSG（配列番号１７）、GGSGG（配列番号１８）、GSGSG（配列番号１９）、GSGGG（配列番号２０）、GGGSG（配列番号２１）及びGSSSG（配列番号２２）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の活性化可能抗体。
【請求項２２】
前記ＬＰ１が、アミノ酸配列GSSGGSGGSGGSG（配列番号２３）を含む、請求項１８に記載の活性化可能抗体。
【請求項２３】
前記ＬＰ２が、アミノ酸配列GSSGT（配列番号２４）又はGSSG（配列番号３７）を含む、請求項１８に記載の活性化可能抗体。
【請求項２４】
前記活性化可能抗体が、切断されていない状態でスペーサーを含み、前記スペーサーが前記ＭＭに対して直接連結され、そしてスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置を有する、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項２５】
前記スペーサーがアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含む、請求項２４に記載の活性化可能抗体。
【請求項２６】
前記スペーサー及びＭＭが、アミノ酸配列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY（配列番号５９）を含む、請求項２４に記載の活性化可能抗体。
【請求項２７】
前記ＡＢが剤に結合される、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項２８】
前記剤がトキシン又はそのフラグメントである、請求項２７に記載の活性化可能抗体。
【請求項２９】
前記剤がドラスタチンである、請求項２７に記載の活性化可能抗体。
【請求項３０】
前記剤がアウリスタチン又はその誘導体である、請求項２７に記載の活性化可能抗体。
【請求項３１】
前記剤がアウリスタチンＥ又はその誘導体である、請求項２７に記載の活性化可能抗体。
【請求項３２】
前記剤がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項２７に記載の活性化可能抗体。
【請求項３３】
前記剤がマイタンシノイド又はその誘導体である、請求項２７に記載の活性化可能抗体。
【請求項３４】
前記剤がＤＭ１又はＤＭ４である、請求項２７に記載の活性化可能抗体。
【請求項３５】
前記剤がデュオカルマイシン又はその誘導体である、請求項２７に記載の活性化可能抗体。
【請求項３６】
前記剤がカリケアマイシン又はその誘導体である、請求項２７に記載の活性化可能抗体。
【請求項３７】
前記剤が、リンカーを介してＡＢに結合される、請求項２７に記載の活性化可能抗体。
【請求項３８】
前記リンカーが切断可能リンカーである、請求項３７に記載の活性化可能抗体。
【請求項３９】
検出可能部分を含む、請求項１に記載の活性化可能抗体。
【請求項４０】
前記検出可能部分が診断剤である、請求項３９に記載の活性化可能抗体。
【請求項４１】
請求項１に記載の活性化可能抗体をコードする単離核酸分子。
【請求項４２】
前記活性化可能抗体をコードする核酸が、シグナルペプチドをコードする核酸を含む、請求項４１に記載の単離核酸分子。
【請求項４３】
前記シグナルペプチドをコードする核酸が、スペーサーをコードする核酸を介して、活性化可能抗体をコードする核酸に作動可能的に連結される、請求項４２に記載の単離核酸分子。
【請求項４４】
前記スペーサーをコードする核酸が、QGQSGQ（配列番号３８）を含むアミノ酸配列をコードする、請求項４３に記載の単離核酸分子。
【請求項４５】
請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項４６】
活性化可能抗体の発現を導く条件下で、細胞を培養することによる活性化可能抗体の生産方法であって、ここで前記細胞が請求項４５に記載のベクターを含む、方法。
【請求項４７】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を、活性化された状態下で結合する活性化可能抗体の製造方法であって、以下の：
（ａ）請求項１に記載の活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を、前記活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養し；そして
（ｂ）活性化可能抗体を回収すること
を含む、方法。
【請求項４８】
治療的有効量の請求項１又は２７に記載の活性化可能抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＥＧＦＲ関連障害を処置するか又はその進行を遅らせる方法。
【請求項４９】
前記ＥＧＦＲ−関連障害が癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、グリア芽腫、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、肉腫、又は皮膚癌である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＥＧＦＲ−関連障害が乾癬である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
治療的有効量の請求項１又は２７に記載の活性化可能抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における血管新生の阻害方法。
【請求項５３】
対象又はサンプルにおける切断剤及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の存在又は不在の検出方法であって、以下の：
（ａ）請求項１に記載の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体又は請求項２４に記載の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体と、対象又はサンプルとを接触し、そして
（ｂ）前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のレベルを測定することを含み、
ここで前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出可能なレベルが、前記切断剤及びＥＧＦＲが対象又はサンプルに存在することを示し、そして前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出可能なレベルの不在が、前記切断剤、ＥＧＦＲ、又は切断剤及びＥＧＦＲの両者が対象又はサンプルに不在であることを示す、方法。
【請求項５４】
前記抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体が検出可能な標識を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記検出可能な標識が、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記方法がインビボ（in vivo）法、インサイチュ（in situ）法、エクスビボ（ex vivo）法又はインビトロ（in vitro）法である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
ＥＧＦＲ−関連障害の処置のために患者集団を同定するか又は細分するための方法であって、（ｉ）請求項１又は２７に記載の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体と、対象由来のサンプルとを接触し；（ｉｉ）サンプル中の活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のレベルを測定し、ここで前記サンプル中の活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出可能なレベルが、前記サンプルが、ＥＧＦＲ、及び請求項１又は２７に記載の活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）における基質を切断する切断剤の存在について陽性であることを示し；（ｉｉｉ）ＥＧＦＲ及び切断剤の存在について陽性と出る１又は２以上の対象を同定し、そして選択し、それにより、患者集団を同定するか又は細分し；そして（ｉｖ）治療的有効量の請求項１又は２７に記載の活性化可能抗体を、ＥＧＦＲ及び切断剤の存在について陽性と出る、患者集団中の１又は２以上の対象に投与することを含む、方法。
【請求項５８】
前記抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体が検出可能な標識を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記検出可能な標識が、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＥＧＦＲ−関連障害が癌である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、グリア芽腫、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、肉腫、又は皮膚癌である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＥＧＦＲ−関連障害が乾癬である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
ＥＧＦＲ−関連障害の処置のために患者集団を同定するか又は細分するためのキットであって、（ｉ）請求項１又は２７に記載の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体；（ｉｉ）対象由来のサンプル中の活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のレベルを測定する手段、ここでサンプル中の活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出可能なレベルが、前記サンプルが、ＥＧＦＲ、及び請求項１又は２７に記載の活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）における基質を切断する切断剤の存在について陽性であることを示し；（ｉｉｉ）ＥＧＦＲ及び切断剤の存在について陽性と出る１又は２以上の対象を同定し、そして選択し、それにより、患者集団を同定するか又は細分する手段；及び（ｉｖ）治療的有効量の請求項１又は２７に記載の活性化可能抗体を、ＥＧＦＲ及び切断剤の存在について陽性と出る、患者集団中の１又は２以上の対象に投与するための説明書を含む、キット。
【請求項６４】
前記抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体が検出可能な標識を含む、請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
前記検出可能な標識が、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
前記ＥＧＦＲ−関連障害が癌である、請求項６３に記載のキット。
【請求項６７】
前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、グリア芽腫、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、肉腫、又は皮膚癌である、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
前記ＥＧＦＲ−関連障害が乾癬である、請求項６３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年４月２７日に提供された米国特許仮出願第６１／６３９，７９６号；２０１２年６月２０日提出された米国特許仮出願第６１／６６２，２０４号；２０１３年１月４日に提出された米国特許仮出願第６１／７４９，２２０号；２０１３年１月７日に提出された米国特許仮出願第６１／７４９，５２９号；及び２０１３年２月１１日に提出された米国特許仮出願第６１／７６３，２３７号の利益を主張し；それらは参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般的に、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して特異的に結合する活性化可能抗体、ＥＧＦＲに対して特異的に結合する複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）活性化可能抗体、及びそれらの抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体及び／又は複合化抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の製造方法及び種々の治療、診断及び予防指標への使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗体に基づく治療は、いくつかの疾患のためには効果的な治療であることがわかっているが、しかしいくつかの場合、広いターゲット式のために、毒性がそれらの治療有効性を制限して来た。さらに、抗体に基づく治療は、他の制限、例えば、投与後の循環からの急速なクリアランスを示して来た。
【０００４】
小分子治療の分野では、活性化学物質のプロドラッグを提供するための戦略が開発されて来た。そのようなプロドラッグは、比較的不活性（又は有意に低い活性）形で投与される。投与されると、プロドラッグはインビボで活性化合物に代謝される。そのようなプロドラッグ戦略は、その意図される標的のために及び有害効果を低めるために、薬剤の高められた選択性を提供することができる。
【０００５】
従って、小分子プロドラッグの所望する特性を模倣する抗体についての継続的な必要性が抗体に基づく治療の分野において存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、マスキング成分（ＭＭ）に結合される上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、結果的に、ＭＭの結合がＥＧＦＲを結合する抗体又はその抗原結合フラグメントの能力を低める、活性化可能抗体を提供する。好ましい実施態様によれば、ＭＭは、プロテアーゼ、例えば対象における治療部位でＥＧＦＲと共に局在するプロテアーゼのための基質を含む配列を介して結合される。本明細書において提供される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、循環中で安定し、治療及び／又は診断の意図される部位で活性化されるが、しかし正常、すなわち健康な組織においてはそうではなく、そして活性化される場合、その対応する修飾されていない抗体に少なくとも匹敵するＥＧＦＲに対する結合を示す。
【０００７】
本発明は、マスキング成分（ＭＭ）に結合される上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、結果的に、ＭＭの結合がＥＧＦＲを結合する抗体又はその抗原結合フラグメントの能力を低める、１又は２以上の追加の剤に結合される、結合された活性化可能抗体を提供する。結合された活性化可能抗体の好ましい実施態様によれば、ＭＭは、プロテアーゼ、例えば対象における治療部位でＥＧＦＲと共に局在するプロテアーゼのための基質を含む配列を介して結合される。本明細書において提供される、結合された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、循環中で安定し、治療及び／又は診断の意図される部位で活性化されるが、しかし正常、すなわち健康な組織においてはそうではなく、そして活性化される場合、その対応する修飾されていない抗体に少なくとも匹敵するＥＧＦＲに対する結合を示す。
【０００８】
本発明は、治療分子、例えば活性化された状態でＥＧＦＲを結合する活性化可能抗体、及び／又は活性化された状態でＥＧＦＲを結合する結合された活性化可能抗体、特に活性化される場合、ＥＧＦＲ及び／又はＥＧＦＲ介在性シグナル伝達の少なくとも１つの生物学的活性を結合し、そして中和するか、又は他方では阻害する活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体を用いて、対象における微候、例えばＥＧＦＲの異常発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害、例えばＥＧＦＲ−関連障害の症状を治療し、予防し、そして／又はその開始又は進行を遅延するか、又は症状を軽減する方法を提供する。
【０００９】
本明細書に記載される活性化可能抗体は、活性化された状態で、ＥＧＦＲを結合し、そして（ｉ）ＥＧＦＲに対して特異的に結合する抗体、又はその抗原結合フラグト（ＡＢ）（ここで前記ＡＢはセツキシマブであるか又はそれに由来する）；（ｉｉ）ＥＧＦＲへの切断されていない状態での活性化可能抗体のＡＢの結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）；及び（ｉｉｉ）ＡＢに結合される切断可能部分（ＣＭ）（ここで、前記ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである）を含む。
【００１０】
いくつかの実施態様によれば、前記ＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの平衡解離定数よりも高い、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。
【００１１】
いくつかの実施態様によれば、前記ＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの平衡解離定数以下である、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。
【００１２】
いくつかの実施態様によれば、前記ＭＭは、ＥＧＦＲへの結合のために切断された状態での活性化可能抗体のＡＢを干渉しないか、又はＡＢと競争しない。
【００１３】
いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは組織においてＥＧＦＲと共局在し、そしてプロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露される場合、活性化可能抗体におけるＣＭを切断する。いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、ＥＧＦＲを有意に発現しない組織においては活性的ではないか又は有意に低い活性である。いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、健康的な、例えば非疾患組織においては、活性的ではないか又は有意に低い活性である。
【００１４】
いくつかの実施態様によれば、切断されていない状態での活性化可能抗体は、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを有する。
【００１５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。
【００１６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、ＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む。
【００１７】
いくつかの実施態様によれば、前記活性化可能抗体は、第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして切断されていない状態での前記活性化可能抗体は次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-LP1-CM-LP2-AB又はAB-LP2-CM-LP1-MMを有する。いくつかの実施態様によれば、前記２種の連結ペプチドはお互いに同一である必要はない。
【００１８】
いくつかの実施態様によれば、前記ＡＢは、ＥＧＦＲへの結合のために約１００ｎＭ又はそれ以下の平衡解離定数を有する。
【００１９】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、約２〜４０個の長さのアミノ酸、例えば４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。
【００２０】
いくつかの実施態様によれば、前記ＭＭポリペプチド配列はＥＧＦＲのその配列とは異なり、そして前記ＭＭポリペプチド配列はＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して５０％以上同一ではない。
【００２１】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体の結合は、ＥＧＦＲへの修飾されていないＡＢ結合の平衡解離定数よりも少なくとも２０倍高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方では、切断された状態での活性化可能抗体のＡＢは、ＥＧＦＲを結合する。
【００２２】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体の結合は、ＥＧＦＲへの修飾されていないＡＢ結合の平衡解離定数よりも少なくとも１００倍高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方では、切断された状態での活性化可能抗体のＡＢは、ＥＧＦＲを結合する。
【００２３】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体の結合は、ＥＧＦＲへの修飾されていないＡＢ結合の平衡解離定数よりも少なくとも２００倍高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方では、切断された状態での活性化可能抗体のＡＢは、ＥＧＦＲを結合する。
【００２４】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低め、結果的に、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合される場合のＡＢの解離定数（Ｋd）は、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合されない場合のＡＢの解離定数（Ｋd）よりも少なくとも２０倍高い。いくつかの実施態様によれば、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低め、結果的に、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合される場合のＡＢのＫdは、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合されない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１００倍高い。いくつかの実施態様によれば、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低め、結果的に、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合される場合のＡＢのＫdは、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合されない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１０００倍高い。いくつかの実施態様によれば、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低め、結果的に、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合される場合のＡＢのＫdは、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合されない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１０、０００倍高い。
【００２５】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは１５個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである。
【００２６】
いくつかの実施態様によれば、標的置換アッセイ、例えば国際公開第２００９／０２５８４６号及び第２０１０／０８１１７３号に記載されるアッセイを用いて、インビトロでアッセイされる場合、ＥＧＦＲの存在下で、ＭＭは、ＣＭが切断される場合に比較して、ＣＭが切断されない場合、少なくとも９０％、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低める。
【００２７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施態様によれば、ＥＧＦＲを結合する抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体及び単一ドメインＬ鎖抗体である。いくつかの実施態様によれば、ＥＧＦＲを結合するそのような抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、マウス、キメラ、ヒト適合された、又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００２８】
いくつかの実施態様によれば、活性化された状態下で、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を結合する活性化可能抗体は、ＥＧＦＲに対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、ここで、前記ＡＢは配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含み；ＥＧＦＲに対する切断されていない状態での前記活性化可能抗体の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、ここで、前記マスキング部分はアミノ酸配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）を含み；及び前記ＡＢに結合された切断可能部分（ＣＭ）、ここで、前記ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり、そしてアミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号１３）を含む、を含み、ここで切断されていない状態での活性化可能抗体は、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを有する。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されたアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を包含するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【００２９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列及び配列番号２８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されたアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号２８を包含するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【００３０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列及び配列番号４を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されたアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４を包含するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【００３１】
いくつかの実施態様によれば、活性化された状態下で、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を結合する活性化可能抗体は、ＥＧＦＲに対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、ここで、前記ＡＢは配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含み；ＥＧＦＲに対する切断されていない状態での前記活性化可能抗体の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、ここで、前記マスキング部分はアミノ酸配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）を含み；及び前記ＡＢに結合された切断可能部分（ＣＭ）、ここで、前記ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり、そしてアミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号１３）を含む、を含み、ここで切断されていない状態での活性化可能抗体は、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを有する。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６８を包含するＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６８を包含するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【００３２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号２８を包含するＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号２８を包含するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【００３３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号４を包含するＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号４を包含するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【００３４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号６７を包含するＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸、及び配列６７を包含する核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【００３５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号２７を包含するＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸配列、及び配列２７を包含する核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【００３６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号３を包含するＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸配列、及び配列３を包含する核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【００３７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されたアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を包含するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【００３８】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列及び配列番号２８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されたアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号２８を包含するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【００３９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列及び配列番号４を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されたアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４を包含するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【００４０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されたアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６８を包含するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列を含む。
【００４１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列及び配列番号２８を含むＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８を含むアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号２８を包含するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列を含む。
【００４２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列及び配列番号４を含むＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８を含むアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号４を包含するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列を含む。
【００４３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号６７を包含するＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸、及び配列６７を包含する核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【００４４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号２７を包含するＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸配列、及び配列２７を包含する核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【００４５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号３を包含するＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸配列、及び配列３を包含する核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【００４６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体ＡＢは、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００４７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００４８】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００４９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体ＡＢは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００５０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００５１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００５２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体ＡＢは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００５３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００５４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００５５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体ＡＢは、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００５６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００５７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００５８】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体ＡＢは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００５９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００６０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００６１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体ＡＢは、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００６２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００６３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００６４】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択される酵素のための基質である。いくつかの実施態様によれば、酵素はｕＰＡである。いくつかの実施態様によれば、酵素はレグマインである。いくつかの実施態様によれば、酵素はＭＴ−ＳＰ１を含む。
【００６５】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは、アミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号１３）を含む。
【００６６】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲに対して２５％以上のアミノ酸配列同一性を含まない。いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲに対して１０％以上のアミノ酸配列同一性を含まない。
【００６７】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、アミノ酸配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）を含む。
【００６８】
いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (配列番号１５) 及び(GGGS)n (配列番号１６)（ｎは、少なくとも１の整数である）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つはGGSG (配列番号１７)、GGSGG (配列番号１８)、GSGSG (配列番号１９)、GSGGG (配列番号２０)、GGGSG (配列番号２１)及びGSSSG (配列番号２２)から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００６９】
いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１は、アミノ酸配列GSSGGSGGSGGSG（配列番号２３）を含む。
【００７０】
いくつかの実施態様によれば、ＬＰ２は、アミノ酸配列GSSGT (配列番号２４) 又は GSSG (配列番号３７)を含む。
【００７１】
いくつかの実施態様によれば、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体がｕＰＡ又はＭＴ−ＳＰ１に暴露され、そしてそれにより切断され、結果的に、活性化された又は切断された状態で、活性化された抗体は、配列番号６９のＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体がレグマインに暴露され、そしてそれにより切断され、結果的に、活性化された又は切断された状態で、活性化された抗体は、配列番号７０のＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【００７２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体はまた、ＡＢに結合される剤を含む。いくつかの実施態様によれば、剤は治療剤である。いくつかの実施態様によれば、剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施態様によれば、剤はトキシン又はそのフラグメントである。いくつかの実施態様によれば、剤は、表１に列挙される群から選択される剤である。いくつかの実施態様によれば、剤はドラスタチンである。いくつかの実施態様によれば、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はアウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施態様によれば、剤はメイタンシノイド又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施態様によれば、剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はカリチアマイシン又はその誘導体である。
【００７３】
いくつかの実施態様によれば、剤はリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施態様によれば、リンカーは切断できるリンカーである。いくつかの実施態様によれば、リンカーは、表２及び３に示されるリンカーから成る群から選択される。
【００７４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体はまた、検出可能部分も含む。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は診断剤である。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は、結合可能検出試験である。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は例えばフルオレセイン誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。
【００７５】
いくつかの実施態様によれば、活性可能抗体はまた、シグナルペプチドも含む。いくつかの実施態様によれば、シグナルペプチドはスペーサーを介して活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーは、シグナルペプチドの不在下で活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーは、活性化可能抗体のＭＭの直接的に連結される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーはアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてＭＭ配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）に対して直接的に連結される配列QGQSGQ（配列番号３８）のスペーサーを含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、ＭＭ配列に対して直接的に連結されるスペーサーを含み、そしてスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてアミノ酸配列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY（配列番号５９）を含む。
【００７６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
【００７７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は単一特異的である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、多重特異的、例えば非制限的例によれば、二重特異的又は三官能性である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、プロ−二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（pro−Biospecific T Cell Engager）（BITE）分子の一部として配合される。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、プロ−キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞又は他の構築受容体の一部として配合される。
【００７８】
活性化された状態で、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を結合する活性化可能抗体は、ＥＧＦＲに対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、ここで、前記ＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含み；ＥＧＦＲに対する切断されていない状態での前記活性化可能抗体の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、ここで、前記マスキング部分はアミノ酸配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）を含み；及び前記ＡＢに結合された切断可能部分（ＣＭ）、ここで、前記ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり、そしてアミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号１３）を含む、を含み、ここで切断されていない状態での前記活性化可能抗体は、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを有する。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【００７９】
活性化された状態で、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を結合する活性化可能抗体は、ＥＧＦＲに対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、ここで、前記ＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含み；ＥＧＦＲに対する切断されていない状態での前記活性化可能抗体の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、ここで、前記マスキング部分はアミノ酸配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）を含み；及び前記ＡＢに結合された切断可能部分（ＣＭ）、ここで、前記ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり、そしてアミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号１３）を含む、を含み、ここで切断されていない状態での前記活性化可能抗体は、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを有する。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【００８０】
いくつかの実施態様によれば、前記その抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、ｓｃＦｖ及びｓｃＡｂから成る群から選択される。
【００８１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号６８ンアミノ酸配列を含むＬ鎖；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号６８ンアミノ酸配列を含むＬ鎖；配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号６８ンアミノ酸配列を含むＬ鎖；配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号６８ンアミノ酸配列を含むＬ鎖；配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号６８ンアミノ酸配列を含むＬ鎖；及び配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号６８ンアミノ酸配列を含むＬ鎖から成る群から選択されるＨ鎖及びＬ鎖の組合せを含む。
【００８２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体ＡＢは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００８３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００８４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００８５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体ＡＢは、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００８６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００８７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００８８】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体ＡＢは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００８９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００９０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００９１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体ＡＢは、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００９２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００９３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００９４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体ＡＢは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００９５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００９６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００９７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体ＡＢは、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００９８】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【００９９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１００】
いくつかの実施態様によれば、ＡＢは、ＥＧＦＲへの結合のために約１００ｎＭ又はそれ以下の平衡解離定数を有する。
【０１０１】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの平衡解離定数よりも高い、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲへの結合のために、切断された状態での活性化可能抗体のＡＢを干渉しないか、又はそのＡＢと競争しない。
【０１０２】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施態様によれば、ＭＭポリペプチド配列は、ＥＧＦＲのその配列とは異なり、そしてＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの何れか天然の結合パオートナーに対して５０％以下同一である。いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲに対して２５％以上のアミノ酸配列同一性を含まない。いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲに対して１０％以上のアミノ酸配列同一性を含まない。
【０１０３】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは、１５個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施態様によれば、ＣＭは、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択される酵素のための基質である。いくつかの実施態様によれば、酵素はｕＰＡを含む。いくつかの実施態様によれば、酵素はレグマインを含む。いくつかの実施態様によれば、酵素はＭＴ−ＳＰ１を含む。いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、組織においてＥＧＦＲと共局在し、そしてプロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露される場合、活性化可能抗体におけるＣＭを切断する。
【０１０４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして切断されていない状態での前記活性化可能抗体が次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-LP1-CM-LP2-AB 又はAB-LP2-CM-LP1-MMを有する。いくつかの実施態様によれば、２つの連結ペプチドは、お互い同一である必要はない。
【０１０５】
いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (配列番号１５) 及び(GGGS)n (配列番号１６)（ｎは、少なくとも１の整数である）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つはGGSG (配列番号１７)、GGSGG (配列番号１８)、GSGSG (配列番号１９)、GSGGG (配列番号２０)、GGGSG (配列番号２１)及びGSSSG (配列番号２２)から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１は、アミノ酸配列GSSGGSGGSGGSG（配列番号２３）を含む。いくつかの実施態様によれば、ＬＰ２は、アミノ酸配列GSSGT (配列番号２４) 又は GSSG (配列番号３７)を含む。
【０１０６】
いくつかの実施態様によれば、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、ｕＰＡ又はＭＴ−ＳＰ１に暴露され、そして切断され、結果的に、活性化された又は切断された状態下で、活性化された抗体は配列番号６９のＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、レグマインに暴露され、そして切断され、結果的に、活性化された又は切断された状態下で、活性化された抗体は配列番号７０のＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【０１０７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体はまた、ＡＢに結合される剤を含む。いくつかの実施態様によれば、剤は治療剤である。いくつかの実施態様によれば、剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施態様によれば、剤はトキシン又はそのフラグメントである。いくつかの実施態様によれば、剤は、表１に列挙される群から選択される剤である。いくつかの実施態様によれば、剤はドラスタチンである。いくつかの実施態様によれば、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はアウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施態様によれば、剤はメイタンシノイド又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施態様によれば、剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はカリチアマイシン又はその誘導体である。
【０１０８】
いくつかの実施態様によれば、剤はリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施態様によれば、リンカーは切断できるリンカーである。いくつかの実施態様によれば、リンカーは、表２及び３に示されるリンカーから成る群から選択される。
【０１０９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体はまた、検出可能部分も含む。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は診断剤である。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は、結合可能検出試験である。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は例えばフルオレセイン誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。
【０１１０】
いくつかの実施態様によれば、活性可能抗体はまた、シグナルペプチドも含む。いくつかの実施態様によれば、シグナルペプチドはスペーサーを介して活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーは、シグナルペプチドの不在下で活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーは、活性化可能抗体のＭＭの直接的に連結される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーはアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてＭＭ配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）に対して直接的に連結される配列QGQSGQ（配列番号３８）のスペーサーを含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、ＭＭ配列に対して直接的に連結されるスペーサーを含み、そしてスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてアミノ酸配列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY（配列番号５９）を含む。
【０１１１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
【０１１２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は単一特異的である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、多重特異的、例えば非制限的例によれば、二重特異的又は三官能性である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、プロ−二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（pro−Biospecific T Cell Engager）（BITE）分子の一部として配合される。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、プロ−キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞又は他の構築受容体の一部として配合される。
【０１１３】
本発明はまた、活性化された状態で上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を結合し、そしてＦＧＦＲに対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）；切断されていない状態下で活性化可能抗体のＡＢのＥＧＦＲへの結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）；ＡＢに結合される切断可能部分（ＣＭ）（プロテアーゼ及び細胞毒性剤のための基質として機能するポリペプチドである）を含む、結合された活性化可能抗体も提供する。
【０１１４】
いくつかの実施態様によれば、ＡＢは、セツキシマブであるか、又はそれから誘導される。
【０１１５】
結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、その抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体、及び単一ドメインＬ鎖抗体から成る群から選択される。
【０１１６】
いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体のＡＢは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体のＡＢは、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体のＡＢは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体のＡＢは、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列、及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に直接結合する、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【０１１７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１１８】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１１９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１２０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１２１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１２２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１２３】
結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＡＢは、ＥＧＦＲへの結合のために約１００ｎＭ又はそれ以下の平衡解離定数を有する。
【０１２４】
結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの平衡解離定数よりも高い、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲへの結合のために、切断された状態での活性化可能抗体のＡＢを干渉しないか、又はそのＡＢと競争しない。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＭＭは、４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＭＭポリペプチド配列は、ＥＧＦＲのその配列とは異なり、そしてＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの何れか天然の結合パオートナーに対して５０％以下同一である。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲに対して２５％以上のアミノ酸配列同一性を含まない。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲに対して１０％以上のアミノ酸配列同一性を含まない。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＭＭは、アミノ酸配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）を含む。
【０１２５】
結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＣＭは、１５個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＣＭは、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択される酵素のための基質である。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、酵素はｕＰＡを含む。いくつかの実施態様によれば、酵素はレグマインを含む。いくつかの実施態様によれば、酵素はＭＴ−ＳＰ１を含む。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＣＭは、アミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号１３）を含む。
【０１２６】
いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体は、第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして切断されていない状態での結合された活性化可能抗体が次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-LP1-CM-LP2-AB 又はAB-LP2-CM-LP1-MMを有する。いくつかの実施態様によれば、２つの連結ペプチドは、お互い同一である必要はない。
【０１２７】
結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (配列番号１５) 及び(GGGS)n (配列番号１６)（ｎは、少なくとも１の整数である）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つはGGSG (配列番号１７)、GGSGG (配列番号１８)、GSGSG (配列番号１９)、GSGGG (配列番号２０)、GGGSG (配列番号２１)及びGSSSG (配列番号２２)から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＬＰ１は、アミノ酸配列GSSGGSGGSGGSG（配列番号２３）を含む。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、ＬＰ２は、アミノ酸配列GSSGT (配列番号２４) 又は GSSG (配列番号３７)を含む。
【０１２８】
いくつかの実施態様によれば、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、ｕＰＡ又はＭＴ−ＳＰ１に暴露され、そして切断され、結果的に、活性化された又は切断された状態下で、活性化された抗体は配列番号６９のＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、レグマインに暴露され、そして切断され、結果的に、活性化された又は切断された状態下で、活性化された抗体は配列番号７０のＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【０１２９】
いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体に含まれる細胞毒性剤は、ＡＢに結合される剤である。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、剤は治療剤である。いくつかの実施態様によれば、剤は抗腫瘍剤である。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、剤はトキシン又はそのフラグメントである。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、剤は、表１に列挙される群から選択される剤である。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、剤はドラスタチンである。いくつかの実施態様によれば、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はアウリスタチンＥ又はその誘導体である。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施態様によれば、剤はメイタンシノイド又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施態様によれば、剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はカリチアマイシン又はその誘導体である。
【０１３０】
結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、剤はリンカーを介してＡＢに結合される。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、リンカーは切断できるリンカーである。結合された活性化可能抗体のいくつかの実施態様によれば、リンカーは、表２及び３に示されるリンカーから成る群から選択される。
【０１３１】
いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体はまた、検出可能部分も含む。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は診断剤である。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は、結合可能検出試験である。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は例えばフルオレセイン誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。
【０１３２】
いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体はまた、シグナルペプチドも含む。いくつかの実施態様によれば、シグナルペプチドはスペーサーを介して活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーは、シグナルペプチドの不在下で結合された活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーは、結合された活性化可能抗体のＭＭの直接的に連結される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーはアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてＭＭ配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）に対して直接的に連結される配列QGQSGQ（配列番号３８）のスペーサーを含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、ＭＭ配列に対して直接的に連結されるスペーサーを含み、そしてスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてアミノ酸配列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY（配列番号５９）を含む。
【０１３３】
いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
【０１３４】
いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は単一特異的である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、多重特異的、例えば非制限的例によれば、二重特異的又は三官能性である。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、プロ−二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（pro−Biospecific T Cell Engager）（BITE）分子の一部として配合される。いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、プロ−キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞又は他の構築受容体の一部として配合される。
【０１３５】
本発明はまた、本明細書に記載される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体をコードする単離核酸分子、及びそれらの単離核酸配列を含むベクターも提供する。本発明は、活性化可能抗体の発現を導く条件下で、そのようなベクターを含む細胞を培養することによる、活性化可能抗体の生成方法を提供する。
【０１３６】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＥＧＦＲへのＡＢの平衡解離定数よりも高い、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有するＭＭをコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＥＧＦＲへのＡＢの平衡解離定数以下である、ＡＢに結合するための平衡解離定数を有するＭＭをコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＥＧＦＲへの結合のために、切断された状態での活性化可能抗体のＡＢを干渉しないか、又はそのＡＢと競争しないＭＭをコードする。
【０１３７】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、組織においてＥＧＦＲと共局在するプロテアーゼにより切断されるＣＭをコードし、そして前記プロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露される場合、活性化可能抗体におけるＣＭを切断する。いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、ＥＧＦＲを実質的に発現しない組織においては活性的ではないか、又は有意に低い活性である。いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、健康な組織、例えば非疾患組織においては、活性的ではないか、又は有意に低い活性である。
【０１３８】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、切断されていない状態で、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを有する活性化可能抗体をコードする。
【０１３９】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む活性化可能抗体をコードする。
【０１４０】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む活性化可能抗体をコードする。
【０１４１】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含む活性化可能抗体をコードし、そして切断されていない状態での前記活性化可能抗体は次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-LP1-CM-LP2-AB 又はAB-LP2-CM-LP1-MMを有する。
【０１４２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢをコードする核酸は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を有する。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１４３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢをコードする核酸は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１４４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢをコードする核酸は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１４５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢをコードする核酸は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１４６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢをコードする核酸は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１４７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢをコードする核酸は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１４８】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号１の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６７の核酸配列を含むＬ鎖を含むＡＢを含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号１の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号３の核酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号１の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２７の核酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１４９】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２５の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６７の核酸配列を含むＬ鎖を含むＡＢを含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２５の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号３の核酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２５の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２７の核酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１５０】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号５の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６７の核酸配列を含むＬ鎖を含むＡＢを含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号５の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号３の核酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号５の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２７の核酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１５１】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２９の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６７の核酸配列を含むＬ鎖を含むＡＢを含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２９の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号３の核酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２９の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２７の核酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１５２】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号９の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６７の核酸配列を含むＬ鎖を含むＡＢを含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号９の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号３の核酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号９の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２７の核酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１５３】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号３３の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６７の核酸配列を含むＬ鎖を含むＡＢを含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号３３の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号３の核酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号３３の核酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２７の核酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０１５４】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＥＧＦＲへの結合のために約１００ｎＭ又はそれ以下の平衡解離定数を有するＡＢをコードする。
【０１５５】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、約２〜４０個の長さのアミノ酸、例えば４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドであるＭＭをコードする。
【０１５６】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＥＧＦＲのその配列とは異なるＭＭポリペプチド配列をコードし、そしてＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの何れか天然の結合パートナーに対して５０％以上同一ではない。
【０１５７】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、活性化可能抗体に位置するＣＭをコードし、結果的に、切断されていない状態下で、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体の結合は、ＥＧＦＲに結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも２０倍高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方では、切断された状態での活性化可能のＡＢはＥＧＦＲを結合する。
【０１５８】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、活性化可能抗体に位置するＣＭをコードし、結果的に、切断されていない状態下で、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体の結合は、ＥＧＦＲに結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも１００倍高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方では、切断された状態での活性化可能のＡＢはＥＧＦＲを結合する。
【０１５９】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、活性化可能抗体に位置するＣＭをコードし、結果的に、切断されていない状態下で、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体の結合は、ＥＧＦＲに結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも２００倍高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方では、切断された状態での活性化可能のＡＢはＥＧＦＲを結合する。
【０１６０】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、１５個までの長さのアミノ酸のポリペプチドであるＣＭをコードする。
【０１６１】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、標的置換アッセイ、例えば国際公開第２００９／０２５８４６号及び第２０１０／０８１１７３号に記載されるアッセイを用いて、インビトロでアッセイされる場合、ＥＧＦＲの存在下で、ＣＭが切断される場合に比較して、ＣＭが切断されない場合、少なくとも９０％、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低める、ＭＭをコードする。
【０１６２】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＥＧＦＲを特異的に結合する抗体又はその抗原−結合フラグメントを含む活性化可能抗体をコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＥＧＦＲを結合し、そしてモノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ａＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体及び単一ドメインＬ鎖抗体である、抗体又は免疫学的活性のそのフラグメントをコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、核酸は、ＥＧＦＲを結合し、そしてマウス、キメラ、ヒト適合された又は完全なヒトモノクローナル抗体である、抗体又は免疫学的活性のそのフラグメントをコードする。
【０１６３】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む活性化可能抗体のＡＢをコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む活性化可能抗体のＡＢをコードする。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０１６４】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号２８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む活性化可能抗体をコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号２８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む活性化可能抗体をコードする。
【０１６５】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む活性化可能抗体をコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む活性化可能抗体をコードする。
【０１６６】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号６７を含むＬ鎖核酸配列を含むＡＢを含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択される核酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列、及び配列番号６７を含む核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸を含むＡＢを含む。
【０１６７】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号２７を含むＬ鎖核酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択される核酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列、及び配列番号２７を含む核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸を含む。
【０１６８】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号３を含むＬ鎖核酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択される核酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列、及び配列番号３を含む核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸を含む。
【０１６９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含むＡＢを含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸配列を含むＡＢを含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０１７０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号２８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【０１７１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体をコードする核酸は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【０１７２】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号６７を含むＬ鎖核酸配列を含むＡＢを含む。いくつかの実施態様によれば、核酸配列は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択され核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列、及び配列番号６７の核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸を含むＡＢを含む。
【０１７３】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号２７を含むＬ鎖核酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、核酸配列は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択され核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列、及び配列番号２７の核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸を含む。
【０１７４】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号４を含むＬ鎖核酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、核酸配列は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択され核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列、及び配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸を含む。
【０１７５】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択される酵素のための基質であるＣＭをコードする。いくつかの実施態様によれば、酵素はｕＰＡを含む。いくつかの実施態様によれば、酵素はレグマインを含む。いくつかの実施態様によれば、酵素はＭＴ−ＳＰ１を含む。
【０１７６】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、アミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号１３）を含むＣＭをコードする。
【０１７７】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＥＧＦＲに対して２５％以上のアミノ酸配列同一性を含まないＭＭをコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＥＧＦＲに対して１０％以上のアミノ酸配列同一性を含まないＭＭをコードする。
【０１７８】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、アミノ酸配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）を含むＭＭをコードする。
【０１７９】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＬＰ１及び／又はＬＰ２をコードし、ここでＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つが(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (配列番号１５) 及び(GGGS)n (配列番号１６)（ｎは、少なくとも１の整数である）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【０１８０】
いくつかの実施態様によれば、核酸はＬＰ１及び／又はＬＰ２をコードし、ここでＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つがGGSG (配列番号１７)、GGSGG (配列番号１８)、GSGSG (配列番号１９)、GSGGG (配列番号２０)、GGGSG (配列番号２１)及びGSSSG (配列番号２２)から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【０１８１】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、アミノ酸配列GSSGGSGGSGGSG（配列番号２３）を含むＬＰ１をコードする。
【０１８２】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、アミノ酸配列GSSGT (配列番号２４) 又は GSSG (配列番号３７)を含むＬＰ２をコードする。
【０１８３】
いくつかの実施態様によれば、核酸は、シグナルペプチドも含む活性化可能抗体をコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、スペーサーを介して活性化可能抗体に結合されるシグナルペプチドをコードする。いくつかの実施態様によれば核酸は、シグナルペプチドの不在下で活性化可能抗体に結合されるスペーサーをコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、活性化可能抗体のＭＭに直接的に連結されるスペーサーをコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、少なくともアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）をコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてＭＭ配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）に対して直接的に連結される配列QGQSGQ（配列番号３８）のスペーサーを含む活性化可能抗体をコードする。いくつかの実施態様によれば、核酸は、ＭＭ配列に対して直接的に連結されるスペーサーを含み、そしてスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてアミノ酸配列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY（配列番号５９）を含む活性化可能抗体をコードする。
【０１８４】
本発明はまた、（ａ）活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を、活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養し、ここで、前記活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）、及びＥＧＦＲを特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで（ｉ）前記ＣＭは、プロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり；そして（ｉｉ）前記ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態で、ＭＭはＥＧＦＲへのＡＢの特異的結合を干渉し、そして活性化可能抗体が切断された状態下にある場合、ＭＭはＥＧＦＲへのＡＢの特異的結合を干渉しないか、又はそれと競争しない；そして（ｂ）活性化可能抗体を回収することにより、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を、活性化された状態下で結合する活性化可能抗体の製造方法も提供する。
【０１８５】
いくつかの実施態様によれば、ＡＢは、セツキシマブであるか、又はそれから誘導される。
【０１８６】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの平衡解離定数よりも高い、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。
【０１８７】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの平衡解離定数以下である、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。
【０１８８】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲへの結合のために、切断された状態で活性化可能抗体のＡＢを干渉しないか、又はそれと競争しない。
【０１８９】
いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、組織においてＥＧＦＲと共局在し、そしてプロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露される場合、活性化可能抗体におけるＣＭを切断する。いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、ＥＧＦＲを実質的に発現しない組織においては活性的ではないか、又は有意に低い活性である。いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、健康な組織、例えば非疾患組織においては、活性的ではないか、又は有意に低い活性である。
【０１９０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、切断されていない状態で、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを有する。
【０１９１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。
【０１９２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、ＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む。
【０１９３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして切断されていない状態での前記活性化可能抗体は次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-LP1-CM-LP2-AB又はAB-LP2-CM-LP1-MMを有する。
【０１９４】
いくつかの実施態様によれば、２種の連結ペプチドは、お互い同一である必要はない。
【０１９５】
いくつかの実施態様によれば、ＡＢは、ＥＧＦＲに結合するために、約１００ｎＭ又はそれ以下の平衡解離定数を有する。
【０１９６】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、約２〜４０個の長さのアミノ酸、例えば４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。
【０１９７】
いくつかの実施態様によれば、前記ＭＭポリペプチド配列はＥＧＦＲのその配列とは異なり、そして前記ＭＭポリペプチド配列はＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して５０％以上同一ではない。
【０１９８】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体の結合は、ＥＧＦＲへの修飾されていないＡＢ結合の平衡解離定数よりも少なくとも２０倍高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方では、切断された状態での活性化可能抗体のＡＢは、ＥＧＦＲを結合する。
【０１９９】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体の結合は、ＥＧＦＲへの修飾されていないＡＢ結合の平衡解離定数よりも少なくとも１００倍高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方では、切断された状態での活性化可能抗体のＡＢは、ＥＧＦＲを結合する。
【０２００】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体の結合は、ＥＧＦＲへの修飾されていないＡＢ結合の平衡解離定数よりも少なくとも２００倍高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方では、切断された状態での活性化可能抗体のＡＢは、ＥＧＦＲを結合する。
【０２０１】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低め、結果的に、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合される場合のＡＢの解離定数（Ｋd）は、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合されない場合のＡＢの解離定数（Ｋd）よりも少なくとも２０倍高い。いくつかの実施態様によれば、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低め、結果的に、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合される場合のＡＢのＫdは、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合されない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１００倍高い。いくつかの実施態様によれば、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低め、結果的に、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合される場合のＡＢのＫdは、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合されない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１０００倍高い。いくつかの実施態様によれば、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低め、結果的に、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合される場合のＡＢのＫdは、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合されない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１０、０００倍高い。
【０２０２】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは１５個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである。
【０２０３】
いくつかの実施態様によれば、標的置換アッセイ、例えば国際公開第２００９／０２５８４６号及び第２０１０／０８１１７３号に記載されるアッセイを用いて、インビトロでアッセイされる場合、ＥＧＦＲの存在下で、ＭＭは、ＣＭが切断される場合に比較して、ＣＭが切断されない場合、少なくとも９０％、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低める。
【０２０４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施態様によれば、ＥＧＦＲを結合する抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体及び単一ドメインＬ鎖抗体である。いくつかの実施態様によれば、ＥＧＦＲを結合するそのような抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、マウス、キメラ、ヒト適合された、又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【０２０５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０２０６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号２８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号２８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０２０７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０２０８】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸を含む核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０２０９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６７を含むＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸を含む核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６７を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【０２１０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列、及び配列番号４を含むＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号４を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【０２１１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列を含む核酸、及び配列番号６７を含むＬ鎖核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択される核酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸配列、及び配列番号６７を含む核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列を含む核酸配列によりコードされる。
【０２１２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号２７を含むＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択される核酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸配列、及び配列番号２７を含む核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列を含む核酸配列によりコードされる。
【０２１３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号４を含むＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択される核酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸配列、及び配列番号２７を含む核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列を含む核酸配列によりコードされる。
【０２１４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０２１５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号２８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号２８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【０２１６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【０２１７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０２１８】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号２８を含むＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸、及び配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【０２１９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号４を含むＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸、及び配列番号４を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【０２２０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号６７を含むＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択される核酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸配列、及び配列番号６７を含む核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【０２２１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号２７を含むＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択される核酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸配列、及び配列番号２７を含む核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【０２２２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号３を含むＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択される核酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸配列、及び配列番号３を含む核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【０２２３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０２２４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０２２５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０２２６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０２２７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０２２８】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０２２９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号６のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０２３０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０２３１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０２３２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号３０のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０２３３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０２３４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０２３５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号１０のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０２３６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０２３７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０２３８】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号３４のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体のＡＢは、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０２３９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０２４０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む。
【０２４１】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択される酵素のための基質である。いくつかの実施態様によれば、酵素はｕＰＡを含む。いくつかの実施態様によれば、酵素はレグマインを含む。いくつかの実施態様によれば、酵素はＭＴ−ＳＰ１を含む。
【０２４２】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは、アミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号１３）を含む。
【０２４３】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲに対して２５％以上のアミノ酸配列同一性を含まない。
【０２４４】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲに対して１０％以上のアミノ酸配列同一性を含まない。
【０２４５】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、アミノ酸配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）を含む。
【０２４６】
いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (配列番号１５) 及び(GGGS)n (配列番号１６)（ｎは、少なくとも１の整数である）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【０２４７】
いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つはGGSG (配列番号１７)、GGSGG (配列番号１８)、GSGSG (配列番号１９)、GSGGG (配列番号２０)、GGGSG (配列番号２１)及びGSSSG (配列番号２２)から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【０２４８】
いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１は、アミノ酸配列GSSGGSGGSGGSG（配列番号２３）を含む。
【０２４９】
いくつかの実施態様によれば、ＬＰ２は、アミノ酸配列GSSGT (配列番号２４) 又は GSSG (配列番号３７)を含む。
【０２５０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体はまた、ＡＢに結合される剤も含む。いくつかの実施態様によれば、剤は治療剤である。いくつかの実施態様によれば、剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施態様によれば、剤は、トキシン又はそのフラグメントである。いくつかの実施態様によれば、剤は、リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施態様によれば、リンカーは切断可能リンカーである。
【０２５１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体はまた、検出可能部分も含む。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は診断剤である。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は、結合可能検出試験である。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は例えばフルオレセイン誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。
【０２５２】
いくつかの実施態様によれば、活性可能抗体はまた、シグナルペプチドも含む。いくつかの実施態様によれば、シグナルペプチドはスペーサーを介して活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーは、シグナルペプチドの不在下で活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーは、活性化可能抗体のＭＭの直接的に連結される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーはアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてＭＭ配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）に対して直接的に連結される配列QGQSGQ（配列番号３８）のスペーサーを含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、ＭＭ配列に対して直接的に連結されるスペーサーを含み、そしてスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてアミノ酸配列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY（配列番号５９）を含む。
【０２５３】
本発明は、治療分子、例えばＥＧＦＲを結合する活性化可能抗体、及び／又はＥＧＦＲを結合する結合された活性化可能抗体、ＥＧＦＲ及び／又はＥＧＦＲ介在性シグナル伝達の少なくとも１つの生物学的活性を結合し、そして中和するか、又は他方では阻害する活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体を用いて、対象における微候、例えばＥＧＦＲの異常発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害、例えばＥＧＦＲ−関連障害又はＥＧＦＲ−関連疾患の症状を治療し、予防し、そして／又はその開始又は進行を遅延するか、又は症状を軽減する方法を提供する。
【０２５４】
いくつかの実施態様によれば、ＥＧＦＲの異常発現及び／又は活性に関連する徴候、例えば疾患又は障害は、癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は、乳癌であり、例えば非限定的な例によれば、乳癌はトリプルネガティブ乳癌である。いくつかの実施態様によれば、癌はトリプルネガティブ乳癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は結腸直腸癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は胃癌である。いくつかの実施態様によれば、癌はグリア芽腫である。いくつかの実施態様によれば、癌は頭頸部癌、例えば非制限的例によれば、食道癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は食道癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は肺癌、例えば非限定的例によれば、非小細胞肺癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は非小細胞肺癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は卵巣／子宮内膜癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は膵臓癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は前立腺癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は腎癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は肉腫、例えば非限定的な例えばよれば、骨肉腫である。いくつかの実施態様によれば、癌は骨肉腫である。いくつかの実施態様によれば、癌は皮膚癌、例えば非限定的な例によれば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、及び/又は黒色腫である。いくつかの実施態様によれば、癌は扁平上皮癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は基底細胞癌である。いくつかの実施態様によれば、癌は黒色腫である。
【０２５５】
いくつかの実施態様によれば、ＥＧＦＲの異常発現及び活性に関連する徴候、例えば疾患又は障害は、炎症性障害及び／又は自己免疫疾患である。いくつかの実施態様によれば、炎症性及び／又は自己免疫疾患は、乾癬である。
【０２５６】
治療分子、例えば活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及び／又は複合化抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、疾患の何れの段階ででも投与され得る。例えば、治療分子は、初期段階から転移性段階のいずれかの段階の癌を患っている患者に投与され得る。例えば治療分子は、初期開始段階から進行した段階の何れかの段階の炎症性障害及び／又は自己免疫疾患を患っている患者に投与され得る。用語、対象及び患者とは本明細書においては交換可能的に使用されることが理解されるべきである。
【０２５７】
治療分子、例えば活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及び／又は結合活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体はまた、他の治療指標及び治療計画においても有用である。例えば、本明細書に提供される実施態様の治療分子は、ネオアジュバント療法を包含する治療計画に使用され得る。
【０２５８】
いくつかの実施態様によれば、治療分子、例えば活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及び／又は結合活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、１又は２以上の追加の剤、例えば非限定的な例によれば、化学療法剤と組合して、治療の間及び／又はその後、投与される。いくつかの実施態様によれば、治療分子及び追加の剤は、同時に投与される。例えば、治療分子及び追加の剤は、単一の組成物に配合されるか、又は２以上の別々の組成物として投与され得る。いくつかの実施態様によれば、治療分子及び追加の剤は、連続して投与される。
【０２５９】
本発明はまた、治療的有効量の本明細書に記載される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体を、その必要な対象に投与することにより、対象におけるＥＧＦＲ−関連障害、例えば癌を予防し、その進行を遅延し、治療し、その症状を軽減するか、又は他方では、改善する方法も提供する。
【０２６０】
本発明はまた、治療的有効量の本明細書に記載される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体を、その必要な対象に投与することにより、対象における血管新生の阻害方法も提供する。
【０２６１】
いくつかの実施態様によれば、対象は哺乳類である。いくつかの実施態様によれば、対象はヒトである。いくつかの実施態様によれば、対象は、非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、作業動物又は動物園の動物である。
【０２６２】
活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及びその治療製剤は、異常ＥＧＦＲ発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を有するか又はかかりやすい対象に投与される。異常ＥＧＦＲ発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を有するか又はかかりやすい対象は、当業界において知られている種々の方法を用いて、同定される。例えば、癌又は他の腫瘍性状態を有する対象は、健康状態を評価するために、種々の臨床学的及び／又は臨床検査、例えば物理的試験、及び血液、尿及び糞便分析を用いて、同定される。
【０２６３】
異常ＥＧＦＲ発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を有する患者への活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の投与は、種々の実験的又は臨床目的が達成される場合、成功したものとして見なされる。例えば、異常ＥＧＦＲ発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を有する患者への活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の投与は、患者又は障害に関連する１又は２以上の症状が緩和され、軽減され、阻害されるか、又はさらなる悪化状態に進行しない場合、成功したものとして見なされる。異常ＥＧＦＲ発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を有する患者への活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の投与は、糖尿病が回復するか、又はさらに悪化状態に進行しない場合、成功したものとして見なされる。
【０２６４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、１又は２以上の追加の剤、例えば化学療法剤と組合して、治療の間及び／又はその後、投与される。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及び追加の剤は、同時に投与される。例えば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及び追加の剤は、単一組成物に配合されるか、又は２以上の別々の組成物として投与され得る。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及び追加の剤は、連続的に投与される。
【０２６５】
本発明はまた、種々の診断及び／又は予防指標において、ＥＧＦＲを結合する活性化可能抗体（すなわち、活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体、また、本明細書においては、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体としても言及される）の使用方法、及びそれらの方法に使用するためのキットも提供する。例えば、本発明は、（i）抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体と、対象又はサンプルとを接触し、そして（ii）前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のレベルを測定することによる、対象又はサンプルにおける切断剤及びＥＧＦＲの存在又は不在の検出方法を提供し、ここで前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出レベルは、前記切断剤及びＥＧＦＲが対象又はサンプルに存在することを示し、そして前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出レベルの不在が、前記切断剤、ＥＧＦＲ、又は切断剤及びＥＧＦＲの両者が対象又はサンプルに不在であることを示す。そのような抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及びＥＧＦＲを特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（ｉ）切断されていない（すなわち、非活性化）状態での抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを含み；（ｉｉ）ＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず；そして（ｉｉｉ）切断されていない状態での活性化可能抗体のＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された（すなわち、活性化された）状態での活性化可能抗体のＭＭは、ＥＧＦＲへの特異的結合を干渉しないか、又はそれと競争しない。
【０２６６】
本発明はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び興味ある（ＥＧＦＲ）の標的物の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここでキットは、対象又はサンプルの接触に使用するための本明細書に記載される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体及び／又は複合化抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体、及び対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体及び／又は複合化抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を含み、ここで前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出レベルが、前記切断剤及びＥＧＦＲが対象又はサンプルに存在することを示し、そして前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出レベルの不在が、前記切断剤、ＥＧＦＲ、又は切断剤及びＥＧＦＲの両者が対象又はサンプルに不在であることを示す。
【０２６７】
本発明はまた、（i）ＥＧＦＲの存在下で、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体と、対象又はサンプルとを接触し、そして（ii）前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のレベルを測定することによる、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在の検出方法も提供し、ここで前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出レベルが、前記切断剤が対象又はサンプルに存在することを示し、そして前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出レベルの不在が、前記切断剤が対象又はサンプルに不在であることを示す。そのような抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及びＥＧＦＲを特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（ｉ）切断されていない（すなわち、非活性化）状態での抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを含み；（ｉｉ）ＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず；そして（ｉｉｉ）切断されていない状態での活性化可能抗体のＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された（すなわち、活性化された）状態での活性化可能抗体のＭＭは、ＥＧＦＲへの特異的結合を干渉しないか、又はそれと競争しない。
【０２６８】
本発明はまた、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここでキットは、少なくとも、対象又はサンプルの接触に使用するための本明細書に記載される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体及び／又は複合化抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体、及び対象又はサンプルにおける複合化抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体及び／又は活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を含み、ここで前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出レベルが、前記切断剤が対象又はサンプルに存在することを示し、そして前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出レベルの不在が、前記切断剤が対象又はサンプルに不在であることを示す。
【０２６９】
本発明はまた、（i）抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体と、対象又はサンプルとを接触し、ここで前記抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、ＣＭの切断に続いて放出される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の一部に位置する検出可能標識を含み、そして（ii）前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のレベルを測定することによる、対象又はサンプルにおける切断剤及びＥＧＦＲの存在又は不在の検出方法も提供し、ここで前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出レベルが、前記切断剤及びＥＧＦＲが対象又はサンプルに存在することを示し、そして前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出レベルの不在が、前記切断剤、ＥＧＦＲ、又は切断剤及びＥＧＦＲの両者が対象又はサンプルに不在であることを示す。そのような抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及びＥＧＦＲを特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（ｉ）切断されていない（すなわち、非活性化）状態での抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを含み；（ｉｉ）ＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず；そして（ｉｉｉ）切断されていない状態での活性化可能抗体のＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された（すなわち、活性化された）状態での活性化可能抗体のＭＭは、ＥＧＦＲへの特異的結合を干渉しないか、又はそれと競争しない。
【０２７０】
本発明はまた、（i）抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体と、対象又はサンプルとを接触し、ここで前記抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、ＣＭの切断に続いて放出される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の一部に位置する検出可能標識を含み；そして（ii）前記対象又はサンプルにおける検出可能標識のレベルを測定することによる、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在の検出方法も提供し、ここで前記対象又はサンプルにおける検出可能標識の検出可能レベルが、前記切断剤が対象又はサンプルに存在することを示し、そして前記対象又はサンプルにおける検出可能標識の検出可能レベルの不在が、前記切断剤が対象又はサンプルに不在であることを示す。そのような抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及びＥＧＦＲを特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（ｉ）切断されていない（すなわち、非活性化）状態での抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを含み；（ｉｉ）ＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず；そして（ｉｉｉ）切断されていない状態での活性化可能抗体のＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された（すなわち、活性化された）状態での活性化可能抗体のＭＭは、ＥＧＦＲへの特異的結合を干渉しないか、又はそれと競争しない。
【０２７１】
本発明はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び興味ある（ＥＧＦＲ）の標的物の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここでキットは、対象又はサンプルの接触に使用するための本明細書に記載される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体及び／又は複合化抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体、及び対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体及び／又は複合化抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を含み、ここで前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出可能レベルが、前記切断剤が対象又はサンプルに存在することを示し、そして前記対象又はサンプルにおける検出可能標識の検出可能レベルの不在が、前記切断剤が対象又はサンプルに不在であることを示す。
【０２７２】
それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施態様によれば、前記抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は検出できる標識を含む。それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施態様によれば、前記検出できる標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む。それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施態様によれば、イメージング剤は、放射性同位体を含む。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、放射性同位体は、ホウ素であるか、又はヨウ素から誘導される。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、放射性同位体は、125Ｉ又は133Ｉである。それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施態様によれば、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を包含する。それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施態様によれば、酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼを含む。それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施態様によれば、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（YFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、変性された赤色蛍光タンパク質（mRFP）、赤色蛍光タンパク質tdimer2（RFP  tdimer2）、HCRED、又はユーロピウム誘導体を含む。それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施態様によれば、発光標識は、Ｎ−メチルアクリジニウム誘導体を含む。それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施態様によれば、標識は、Alexa Fluor（登録商標）標識、例えばAlex Fluor（登録商標） 680又はAlexa Fluor（登録商標）750を包含する。それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施態様によれば、リガンドに基づく標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、又は１又は２以上のハプテンを含む。
【０２７３】
それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施態様によれば、対象は哺乳類である。いくつかの実施態様によれば、対象はヒトである。いくつかの実施態様によれば、対象は、非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、作業動物又は動物園の動物である。
【０２７４】
それらの方法のいくつかの実施態様によれば、前記方法はインビボ法である。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、前記方法はインサイチュ法である。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、前記方法はエクスビボ法である。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、前記方法はインビトロ法である。
【０２７５】
それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施態様によれば、方法及び／又はキットは、開示の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、細分し、例えば層別化するために使用される。例えば、標的物（例えば、ＥＧＦＲ）及びそれらの方法において試験される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）において基質を切断するプロテアーゼの両者について検査陽性である患者は、そのようなＣＭを含むそのような抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、標的物（例えば、ＥＧＦＲ）、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗体中のＣＭにおける基質を切断するプロテアーゼの何れか又は両者について検査陰性である患者は、別の治療形のための適切な候補体として同定される（すなわち、試験される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体による治療のために適切でない）。いくつかの実施態様によれば、そのような患者は、治療のための適切な抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体（例えば、患者の部位で患者により切断されるＣＭを含む抗−ＥＧＦＲ活性可能抗体）が同定されるまで、他の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体により検査され得る。
【０２７６】
本発明はまた、患者集団を同定するか又は他方では、細分する方法に使用するためのキットも提供し、ここで前記キットは、少なくとも、（ｉ）対象又はサンプルの接触に使用するための、本明細書に記載される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体及び/又は複合化抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体；（ｉｉ）対象又はサンプル中の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体及び/又は複合化抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のレベルを測定する手段、ここでサンプル中の活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の検出できるレベルが、サンプルが、ＥＧＦＲ、及び抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体及び/又は複合化抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）における基質を切断する切断剤の存在について陽性であることを示し；（ｉｉｉ）ＥＧＦＲ及び切断剤の存在について陽性と出る１又は２以上の対象を同定し、そして選択し、それにより、患者集団を同定するか又は細分する手段を含む。いくつかの実施態様によれば、キットはまた、治療的有効量の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体及び/又は複合化抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体を、ＥＧＦＲ及び切断剤の存在について陽性と出る、患者集団中の１又は２以上の対象に投与するための説明書を含む。いくつかの実施態様によれば、キットはまた、治療的有効量の本明細書に記載される別の抗−ＥＧＦＲ治療剤を、ＥＧＦＲ及び切断剤の存在について陽性と出る、患者集団中の１又は２以上の対象に投与するための説明書を含む。いくつかの実施態様によれば、前記抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は検出できる標識を含む。いくつかの実施態様によれば、前記検出できる標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む。いくつかの実施態様によれば、前記癌は、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、グリア芽腫、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、肉腫、又は皮膚癌である。いくつかの実施態様によれば、前記ＥＧＦＲ−関連障害は乾癬である。
【０２７７】
それらの方法のいくつかの実施態様によれば、ＭＭは約２〜４０個の長さのアミノ酸のペプチドである。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体はリンカーペプチドを含み、ここで前記リンカーペプチドは、ＭＭとＣＭとの間に位置する。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体はリンカーペプチドを含み、ここで前記リンカーペプチドは、ＡＢとＣＭとの間に位置する。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体は、第１リンカーペプチド（ＬＬ）及び第２リンカーペプチド（Ｌ２）を含み、ここで前記第１リンカーペプチドはＭＭとＣＭとの間に位置し、そして第２リンカーペプチドはＡＢとＣＭとの間に位置する。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、各Ｌ１及びＬ２は、約１〜２０個の長さのアミノ酸のペプチドであり、そして各Ｌ１及びＬ２は同じリンカーである必要はない。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、Ｌ１及びＬ２の１つ又は両者は、グリシン−セリンポリマーを含む。
【０２７８】
それらの方法のいくつかの実施態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (配列番号１５) 及び(GGGS)n (配列番号１６)（ｎは、少なくとも１の整数である）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つはGGSG (配列番号１７)、GGSGG (配列番号１８)、GSGSG (配列番号１９)、GSGGG (配列番号２０)、GGGSG (配列番号２１)及びGSSSG (配列番号２２)から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１は、アミノ酸配列GSSGGSGGSGGSG（配列番号２３）を含む。いくつかの実施態様によれば、ＬＰ２は、アミノ酸配列GSSGT (配列番号２４) 又は GSSG (配列番号３７)を含む。
【０２７９】
それらの方法のいくつかの実施態様によれば、ＡＢは、本明細書に提供される抗−ｋＥＧＦＲ抗体配列から選択される抗体又は抗体フラグメントを含む。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、ＡＢは、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ又は単鎖抗体（ＳＣＡＢ）を含む。
【０２８０】
それらの方法のいくつかの実施態様によれば、切断剤は、ＥＧＦＲと共に対象又はサンプルに共局在するプロテアーゼであり、そしてＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり、ここでプロテアーゼは、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露される場合、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体におけるＣＭを切断する。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、ＣＭは１５個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、ＣＭは、ＡＢのＮ−末端に結合される。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、ＣＭは、ＡＢのＣ−末端に結合される。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、ＣＭは、ＡＢのＶＬ鎖のＮ−末端に結合される。
【０２８１】
それらの方法のいくつかの実施態様によれば、切断剤は酵素であり、そしてＣＭは酵素のための基質である。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、酵素は、本明細書に開示されるプロテアーゼである。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、本明細書に開示されるプロテアーゼの１つである。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ−ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ−１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３及びＭＭＰ−１４から成る群から選択される。いくつかの実施態様によれば、酵素はｕＰＡを含む。いくつかの実施態様によれば、酵素はレグマインを含む。いくつかの実施態様によれば、酵素はＭＴ−ＳＰ１を含む。いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、ＥＧＦＲを実質的に発現しない組織においては、活性的ではないか、又は実質的に低い活性である。いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、健康な、例えば非疾患組織においては、活性的ではないか、又は実質的に低い活性である。
【０２８２】
本発明はまた、種々の診断及び／又は予防指標において、抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体（すなわち、活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体、また、本明細書においては、複合化活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体、及び/又は結合された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体としても言及される）の使用方法も提供する。例えば、本発明は、（i）抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体と、対象又はサンプルとを接触し、そして（ii）前記対象又はサンプルにおける抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体のレベルを測定することによる、対象又はサンプルにおける切断剤及び興味ある標的物（ＥＧＦＲ）の存在又は不在の検出方法を提供し、ここで前記対象又はサンプルにおける抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体の検出可能レベルは、前記切断剤及びＥＧＦＲが対象又はサンプルに存在することを示し、そして前記対象又はサンプルにおける抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体の検出可能レベルの不在が、前記切断剤、ＥＧＦＲ、又は切断剤及びＥＧＦＲの両者が対象又はサンプルに不在であることを示す。
【０２８３】
本発明は、（i）抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体と、対象又はサンプルとを、ＥＧＦＲの存在下で接触し、そして（ii）前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体のレベルを測定することによる、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在の検出方法を提供し、ここで前記対象又はサンプルにおける活性化された抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体の検出可能レベルは、前記切断剤が対象又はサンプルに存在することを示し、そして前記対象又はサンプルにおける抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体の検出可能レベルの不在が、前記切断剤が対象又はサンプルに不在であることを示す。
【０２８４】
本発明は、（i）抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体と、対象又はサンプルとを接触し、そして（ii）前記対象又はサンプルにおける検出可能標識のレベルを測定することによる、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在の検出方法を提供し、ここで前記対象又はサンプルにおける検出可能標識の検出可能レベルは、前記切断剤が対象又はサンプルに存在しないことを示し、そして前記対象又はサンプルにおける検出可能標識の検出可能レベルの不在が、前記切断剤が対象又はサンプルに存在ことを示す。
【０２８５】
それらの方法のいくつかの実施態様によれば、抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンド系標識から成る群から選択される検出可能標識を含む。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、イメージング剤は、放射性同位体を含む。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を包含する。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼを含む。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（YFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、変性された赤色蛍光タンパク質（mRFP）、赤色蛍光タンパク質tdimer2（RFP  tdimer2）、HCRED、又はユーロピウム誘導体を含む。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、発光標識は、Ｎ−メチルアクリジニウム誘導体を含む。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、標識は、Alexa Fluor（登録商標）標識、例えばAlex Fluor（登録商標） 680又はAlexa Fluor（登録商標）750を包含する。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、リガンドに基づく標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、又は１又は２以上のハプテンを含む。
【０２８６】
それらの方法のいくつかの実施態様によれば、対象は哺乳類である。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、対象はヒトである。いくつかの実施態様によれば、対象は、非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、作業動物又は動物園の動物である。
【０２８７】
それらの方法のいくつかの実施態様によれば、前記方法はインビボ法である。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、前記方法はインサイチュ法である。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、前記方法はエクスビボ法である。それらの方法のいくつかの実施態様によれば、前記方法はインビトロ法である。
【０２８８】
それらの方法のいくつかの実施態様によれば、前記方法は、開示の抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、細分するために使用される。例えば、標的物（例えば、ＥＧＦＲ）、及びそれらの方法において試験される抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体の切断可能部分（ＣＭ）において基質を切断するプロテアーゼの両者について検査陽性である患者は、そのようなＣＭを含むそのような抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又はそのような結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、標的物（例えば、ＥＧＦＲ）、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗体中のＣＭにおける基質を切断するプロテアーゼの何れか又は両者について検査陰性である患者は、別の治療形のための適切な候補体として同定される（すなわち、試験される抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体による治療のために適切でない）。いくつかの実施態様によれば、そのような患者は、治療のための適切な抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体（例えば、患者の部位で患者により切断されるＣＭを含む抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体）が同定されるまで、他の抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体により検査され得る。
【０２８９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、活性化された状態で、ＥＧＦＲを結合し、そして（ｉ）ＥＧＦＲに対して特異的に結合する抗体、又はその抗原結合フラグト（ＡＢ）（ここで前記ＡＢはセツキシマブであるか又はそれに由来する）；（ｉｉ）ＥＧＦＲへの切断されていない状態での活性化可能抗体のＡＢの結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）；及び（ｃ）ＡＢに結合される切断可能部分（ＣＭ）（ここで、前記ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである）を含む。
【０２９０】
いくつかの実施態様によれば、前記ＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの平衡解離定数よりも高い、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。いくつかの実施態様によれば、前記ＭＭは、ＥＧＦＲへのＡＢの平衡解離定数以下である、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。いくつかの実施態様によれば、前記ＭＭは、活性化可能抗体が存在する場合、ＥＧＦＲへの結合のために切断された状態での活性化可能抗体のＡＢを干渉しないか、又はＡＢと競争しない。
【０２９１】
いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは組織においてＥＧＦＲと共局在し、そしてプロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露される場合、活性化可能抗体におけるＣＭを切断する。いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、ＥＧＦＲを有意に発現しない組織においては活性的ではないか又は有意に低い活性である。いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼは、健康的な、例えば非疾患組織においては、活性的ではないか又は有意に低い活性である。
【０２９２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体は、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを有する。
【０２９３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体は、ＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。
【０２９４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体ｖは、ＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む。
【０２９５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体は、第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして切断されていない状態での活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体は次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-LP1-CM-LP2-AB 又はAB-LP2-CM-LP1-MMを有する。いくつかの実施態様によれば、前記２種の連結ペプチドはお互いに同一である必要はない。
【０２９６】
いくつかの実施態様によれば、前記ＡＢは、ＥＧＦＲへの結合のために約１００ｎＭ又はそれ以下の平衡解離定数を有する。
【０２９７】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、約２〜４０個の長さのアミノ酸、例えば４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。
【０２９８】
いくつかの実施態様によれば、前記ＭＭポリペプチド配列はＥＧＦＲのその配列とは異なり、そして前記ＭＭポリペプチド配列はＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して５０％以上同一ではない。
【０２９９】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体の結合は、ＥＧＦＲへの修飾されていないＡＢ結合の平衡解離定数よりも少なくとも２０倍高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方では、切断された状態での活性化可能抗体のＡＢは、ＥＧＦＲを結合する。
【０３００】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体の結合は、ＥＧＦＲへの修飾されていないＡＢ結合の平衡解離定数よりも少なくとも１００倍高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方では、切断された状態での活性化可能抗体のＡＢは、ＥＧＦＲを結合する。
【０３０１】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体の結合は、ＥＧＦＲへの修飾されていないＡＢ結合の平衡解離定数よりも少なくとも２００倍高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方では、切断された状態での活性化可能抗体のＡＢは、ＥＧＦＲを結合する。
【０３０２】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低め、結果的に、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合される場合のＡＢの解離定数（Ｋd）は、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合されない場合のＡＢの解離定数（Ｋd）よりも少なくとも２０倍高い。いくつかの実施態様によれば、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低め、結果的に、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合される場合のＡＢのＫdは、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合されない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１００倍高い。いくつかの実施態様によれば、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低め、結果的に、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合される場合のＡＢのＫdは、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合されない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１０００倍高い。いくつかの実施態様によれば、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低め、結果的に、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合される場合のＡＢのＫdは、ＥＧＦＲ近くのＭＭに結合されない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１０、０００倍高い。
【０３０３】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは１５個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである。
【０３０４】
いくつかの実施態様によれば、標的置換アッセイ、例えば国際公開第２００９／０２５８４６号及び第２０１０／０８１１７３号に記載されるアッセイを用いて、インビトロでアッセイされる場合、ＥＧＦＲの存在下で、ＭＭは、ＣＭが切断される場合に比較して、ＣＭが切断されない場合、少なくとも９０％、ＥＧＦＲを結合するＡＢの能力を低める。
【０３０５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施態様によれば、ＥＧＦＲを結合する抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体及び単一ドメインＬ鎖抗体である。いくつかの実施態様によれば、ＥＧＦＲを結合するそのような抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、マウス、キメラ、ヒト適合された、又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【０３０６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０３０７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸を含む核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列含む核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０３０８】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号６７を含むＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号１、配列番号５及び配列番号９から成る群から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸配列、及び配列番号６７を含む核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸を含む核酸配列含む核酸配列によりコードされる。
【０３０９】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０３１０】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸を含む核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸をコードする核酸配列を含む核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０３１１】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択されるＨ鎖核酸配列、及び配列番号６７を含むＬ鎖核酸配列を含む核酸によりコードされる。いくつかの実施態様によれば活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２５、配列番号２９及び配列番号３３から成る群から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＨ鎖核酸配列を含む核酸、及び配列番号６７を含む核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖核酸をコードする核酸配列によりコードされる。
【０３１２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖アを含む。いくつかの実施態様によれば活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０３１３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２６のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖アを含む。いくつかの実施態様によれば活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０３１４】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号６のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖アを含む。いくつかの実施態様によれば活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０３１５】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号３０のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖アを含む。いくつかの実施態様によれば活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０３１６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号１０のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖アを含む。いくつかの実施態様によれば活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０３１７】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号３４のアミノ酸を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ鎖アを含む。いくつかの実施態様によれば活性化可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＡＢは、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸を含むＬ鎖を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列及びスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、配列番号６８のＬ鎖アミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸、及びアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、アミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含むスペーサーアミノ酸配列に対して直接的に連結される配列番号６８のＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＬ鎖アミノ酸を含む。
【０３１８】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択される酵素のための基質である。いくつかの実施態様によれば、酵素はｕＰＡである。いくつかの実施態様によれば、酵素はレグマインである。いくつかの実施態様によれば、酵素はＭＴ−ＳＰ１を含む。
【０３１９】
いくつかの実施態様によれば、ＣＭは、アミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号１３）を含む。
【０３２０】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲに対して２５％以上のアミノ酸配列同一性を含まない。いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、ＥＧＦＲに対して１０％以上のアミノ酸配列同一性を含まない。
【０３２１】
いくつかの実施態様によれば、ＭＭは、アミノ酸配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）を含む。
【０３２２】
いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (配列番号１５) 及び(GGGS)n (配列番号１６)（ｎは、少なくとも１の整数である）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つはGGSG (配列番号１７)、GGSGG (配列番号１８)、GSGSG (配列番号１９)、GSGGG (配列番号２０)、GGGSG (配列番号２１)及びGSSSG (配列番号２２)から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、ＬＰ１は、アミノ酸配列GSSGGSGGSGGSG（配列番号２３）を含む。いくつかの実施態様によれば、ＬＰ２は、アミノ酸配列GSSGT (配列番号２４) 又は GSSG (配列番号３７)を含む。
【０３２３】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体はまた、ＡＢに結合される剤を含む。いくつかの実施態様によれば、剤は治療剤である。いくつかの実施態様によれば、剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施態様によれば、剤はトキシン又はそのフラグメントである。いくつかの実施態様によれば、剤は、表１に列挙される群から選択される剤である。いくつかの実施態様によれば、剤はドラスタチンである。いくつかの実施態様によれば、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はアウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施態様によれば、剤はメイタンシノイド又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施態様によれば、剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施態様によれば、剤はカリチアマイシン又はその誘導体である。
【０３２４】
いくつかの実施態様によれば、剤はリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施態様によれば、リンカーは切断できるリンカーである。いくつかの実施態様によれば、リンカーは、表２及び３に示されるリンカーから成る群から選択される。
【０３２５】
いくつかの実施態様によれば、活性可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体はまた、シグナルペプチドも含む。いくつかの実施態様によれば、シグナルペプチドはスペーサーを介して活性可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体に結合される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーは、シグナルペプチドの不在下で活性可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体に結合される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーは、活性可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体のＭＭの直接的に連結される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーはアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を含む。いくつかの実施態様によれば、活性可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体は、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてＭＭ配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）に対して直接的に連結される配列QGQSGQ（配列番号３８）のスペーサーを含む。いくつかの実施態様によれば、活性可能抗体及び/又は結合された活性可能抗体は、ＭＭ配列に対して直接的に連結されるスペーサーを含み、そしてスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてアミノ酸配列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY（配列番号５９）を含む。
【０３２６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は単一特異的である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、多重特異的、例えば非制限的例によれば、二重特異的又は三官能性である。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、プロ−二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（pro−Biospecific T Cell Engager）（BITE）分子の一部として配合される。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及び/又は結合された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、プロ−キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞又は他の構築受容体の一部として配合される。
【０３２７】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体及び／又は複合化抗体、及び担体を含むことができる。それらの医薬組成物は、キット、例えば診断キットに含まれ得る。
【図面の簡単な説明】
【０３２８】
【図１Ａ】図１Ａは、第１の状態下でマスキングされ、そして疾患関連プロテアーゼの存在下で活性化される、本発明の活性化可能抗体を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、所望する位置で本発明の活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体を選択的に活性化するであろう適切な基質を同定するために使用される基質選択方法を示す図である。
【図２】図２は、活性化可能抗体の略図である（図２Ａ）。図２Ｂ−２Ｄは、「Ｐｂ−１２０４」又は３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体として本明細書において言及される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインビトロ特性化を示す一連のグラフである。図２Ｂは、Ｐｂ−１２０４の切断で、２種のプロテアーゼＭＴ−ＳＰ１及びｕＰＡの酵素効率を示すグラフである。図２Ｃは、プロテアーゼｕＰＡ、ＭＴ−ＳＰ１及びレグマインによる消化の前後、Ｐｂ−１２０４の細管電気泳動分析を示すグラフである。図２Ｄは、Ｈ２９２細胞の増殖に対する、抗−ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ、Ｐｂ−１２０４及びｕＰＡ−活性化されたＰｂ−１２０４の効果を示すグラフである。
【図３ａ】図３は、近赤外線急冷プローブＣｙ５．５−１２０４−Ｑの化学構造の略図である（図３Ａ）。図３Ｂ−３Ｈは、Ｐｂ−１２０４として本明細書において言及される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体が異種移植片腫瘍においていかにして蓄積するかを示す一連の図である。図３Ｂは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０−結合Ｐｂ−ＮＳＵＢ（赤）及び「ＩＱ−ＮＳＵＢ」として本明細書において言及される急冷プローブＣｙ５−ＮＳＵＢ−Ｑ（青；左側パネル）（ここで、ＮＳＵＢはプロテアーゼ切断に対して感受性ではないアミノ酸配列を表す）、又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０−結合Ｐｂ−１２０４（赤）及び「ＩＱ−１２０４」として本明細書において言及される急冷プローブＣｙ５．５−１２０４−Ｑ（青；右側パネル）（ここで１２０４は、少なくともｕＰＡによる切断に対して感受性である基質配列１２０４：LSGRSDNH（配列番号１３）のいずれかにより腹腔内注射されたＨＴ２９異種移植片担持マウスの光学的イメージングを示す図である。高強度の重複蛍光シグナルが、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及びプローブ含有１２０４基質を投与されたマウスの腫瘍においてのみ検出された。図３Ｃ及び３Ｄは、マウスがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０−結合Ｐｂ−１２０４ (図 ３Ｃ) 又は Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０−結合Ｐｂ−ＮＳＵＢ (図３Ｄ)により注射された７日後、ＨＴ２９異種移植片腫瘍における活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の免疫蛍光検出を示す図である。図３Ｅ及び３Ｆは、Ｐｂ−ＮＳＵＢ、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４又はセツキシマブ（すなわち、変性されていないセツキシマブ）により腹腔内注射されたＨ２９２異種移植片腫瘍担持のマウスの光学的イメージングの一連の写真である。３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体は、Ｈ２９２異種移植片マウスモデルにおける腫瘍部位に局在する。図３Ｇは、セツキシマブ、Ｐｂ−ＮＳＵＢ 又は３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４を投与されたＨ２９２異種移植片マウスモデルにおける動物の三次元光学及びコンピューター断層撮影（３Ｄ／ＣＴ断層撮影）を示す一連の写真である。図３Ｈは、インビボイメージング研究からの代表的Ｈ２９２腫瘍に対するヒトＩｇＧ免疫組織化学染色を示す一連の写真である。
【図３ｂ】同上。
【図３ｃ−ｄ】同上。
【図３Ｅ】同上。
【図３Ｆ】同上。
【図３Ｇ】同上。
【図３Ｈ】同上。
【図４】図４は、異種移植片モデルにおける腫瘍増殖を阻害する、Ｐｂ−１２０４として本明細書において言及される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の能力を示す一連のグラフである（図４Ａ−４Ｆ）。図４Ａは、セツキシマブ (２５ ｍｇ/ｋｇ、青ライン)、Ｐｂ−１２０４ (２５ ｍｇ/ｋｇ、赤ライン)、Ｐｂ−ＮＳＵＢ (２５ ｍｇ/ｋｇ、緑ライン)又はビヒクル (黒ライン)を用いて毎週、治療されたＨ２９２異種移植片腫瘍担持マウスに見られる効果を示すグラフであり、ここでＰｂ−ＮＳＵＢは、ＥＧＦＲを結合し、そしてプロテアーゼ切断に対して感受性ではないＮＳＵＢアミノ酸配列も含む抗体部分を有する活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体コンストラクトを表す。データは、平均腫瘍体積±ＳＥＭとして表される。％腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）は、２日目で評価された。図４Ｂ及び４Ｃは、２５ ｍｇ/ｋｇのセツキシマブ、Ｐｂ−ＮＳＵＢ 又はＰｂ−１２０４を注射されたＨ２９２異種移植片腫瘍担持マウスから採取された血漿（投与後、１、８、２４、７２時間）（図４Ｂ）及び腫瘍（投与後、７２時間）（図４Ｃ）のサンプルにおけるＩｇＧ濃度のレベル及びＥＧＦＲ−結合ＩｇＧのレベルを示すグラフである。ＩｇＧ濃度（青）及びＥＧＦＲ結合（赤）はＥＬＩＳＡにより測定された。図４Ｄは、セツキシマブ（２５ｍｇ／ｋｇ、青のライン）、Ｐｂ−１２０４（２５ｍｇ／ｋｇ、赤のライン）、ビヒクル（ブランクライン）により一度、腹腔内注射されたＬＸＦＡ６７７腫瘍マウスにおいて観察される腫瘍体積を示すグラフである。データは、平均腫瘍体積±ＳＥＭとして表される。％腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）は、２５日目で評価された。図４Ｅ及び４Ｆは、２５ ｍｇ/ｋｇのセツキシマブ又は２５ ｍｇ/ｋｇのＰｂ−１２０４を注射されたＬＸＦＡ６７７異種移植片腫瘍担持マウスから採取された血漿（投与後、１、７、１４、２１、２８時間）（図４Ｅ）及び腫瘍（投与後、７２時間）（図４Ｆ）のサンプルにおけるＩｇＧ濃度のレベル及びＥＧＦＲ−結合ＩｇＧのレベルを示すグラフである。ＩｇＧ濃度（青）及びＥＧＦＲ結合（赤）はＥＬＩＳＡにより測定された。
【図５】図５は、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体のさらなるインビトロ特性を示す一連のグラフである（図５Ａ−５Ｃ）。図５Ａは、ＭＴ−ＳＰ１及びｕＰＡによるＰｂ−１２０４切断のタンパク質分解変換のレベルを示すグラフである。図５Ｂは、レグマイン、ＭＴ−ＳＰ１及びｕＰＡによる消化の前後、Ｐｂ−１２０４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。図５Ｃは、固定されたＥＧＦＲ−ＥＣＤへのセツキシマブ、親Ａｂ、Ｐｂ−１２０４又はｕＰＡ−活性化されたＰｂ−１２０４の結合を示すグラフである。
【図６】図６は、Ｐｂ−１２０４が正常肝臓においていかにして活性化されないかを示す図である（図６Ａ及び６Ｂ）。図６Ａ及び６Ｂは、マウスがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０−結合されたＰｂ−１２０４ (図６Ａ) 又は Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０−結合されたＰｂ−ＮＳＵＢ (図６Ｂ)により注射された後７日目、肝臓における活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の免疫蛍光検出を示す。
【図７】図７は、腫瘍担持マウスにおけるセツキシマブ及びＰｂ−１２０４の腫瘍活性化及びＰＫを示す図及びグラフである（図７Ａ及び７Ｂ）。図７Ａにおいては、セツキシマブ、Ｐｂ−ＮＳＵＢ及びＰｂ−１２０４（２４ｍｇ／ｋｇ）により治療されたＨ２９２異種移植片腫瘍の溶解物を、治療後７２時間で生成し、そしてヒトＩｇＧＬ鎖を、免疫ブロット法により分析した。図７Ｂにおいては、２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ又はＰｂ−１２０４により０日目で注射されたＬＸＦＡ６７７異種移植片腫瘍担持マウスからの血漿を、投与後、１、７、１４、２１、２８日目に採取し、そして固定されたＥＧＦＲ−ＥＣＤ（セツキシマブ、青；Ｐｂ−１２０４、赤）への結合を測定した。
【図８】図８は、プロテアーゼが関与するいくつかの相互依存工程に起因する腫瘍の進行、浸潤及び転移を示す一連の図である（図８Ａ及び８Ｂ）。それらの図は、Affara NI, et al. “Delineating protease functions during cancer development.” Methods Mol Biol. 539 (2009): 1-32から適合される。
【図９】図９は、ＩＱプローブにおける１２０４基質配列LSGRSDNH（配列番号１３）に対するプロテアーゼｕＰＡ（ヒト及びマウス）、ＭＴ−ＳＰ１（ヒト及びマウス）、レグマイン（ヒト）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ、ヒト）及びトロンビン（ヒト）の切断速度及び基質選択性を示す表及びグラフである（図９Ａ及び９Ｂ）。１２０４基質配列は、各研究において５００ｎＭの最終濃度で存在した。
【図９Ｃ】図９Ｃ及び９Ｄは、組換えヒトｕＰＡ（図９Ｃ）及び組換えヒトＭＴ−ＳＰ１（図９Ｄ）による１２０４基質配列の切断速度を示す一連のグラフである。１２０４基質配列は、各研究において５００ｎＭの最終濃度で存在した。
【図９Ｄ】図９Ｃ及び９Ｄは、組換えヒトｕＰＡ（図９Ｃ）及び組換えヒトＭＴ−ＳＰ１（図９Ｄ）による１２０４基質配列の切断速度を示す一連のグラフである。１２０４基質配列は、各研究において５００ｎＭの最終濃度で存在した。
【図１０Ａ】図１０Ａは、変性されていないセツキシマブ抗体（「親」）、Ｐｂ−ＮＳＵＢコンストラクト（「ＮＳＵＢ」）及び切断されていない３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体の、プロテアーゼの存在下でＥＧＦＲを結合する相対的能力を示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、変性されていないセツキシマブ抗体（「親」）、Ｐｂ−ＮＳＵＢコンストラクト（「ＮＳＵＢ」）及び活性化された、すなわち切断された３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体の、２種のプロテアーゼ、すなわちヒトｕＰＡ及びヒトＭＴ−ＳＰ１の存在下でＥＧＦＲを結合する相対的能力を示すグラフである。図１０Ｂは、適切なプロテアーゼにより活性化されると、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体が親抗体に対しての匹敵できるレベルで、ＥＧＦＲを結合することを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４が、マウスへの投与後少なくとも４週後、循環においては安定し、そして血漿においては低い活性化を示し、このことは、卓越した毒性プロフィールを示唆することを示す一連のグラフである。図１１に使用される場合、「親Ａｂ」とは、変性されていないセツキシマブ抗体を言及し、Ｐｂ−ＮＳＵＢコンストラクトは、プロテアーゼ切断に対して感受性ではないＮＳＵＢ配列を含む活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体を表し、そして「ＰＢ−ＮＳＥＬＥＣＴ」は、非選択性基質、すなわち循環において酵素により認識されるアミノ酸配列を含む活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４が、マウスへの投与後少なくとも４週後、循環においては安定し、そして血漿においては低い活性化を示し、このことは、卓越した毒性プロフィールを示唆することを示す一連のグラフである。図１１に使用される場合、「親Ａｂ」とは、変性されていないセツキシマブ抗体を言及し、Ｐｂ−ＮＳＵＢコンストラクトは、プロテアーゼ切断に対して感受性ではないＮＳＵＢ配列を含む活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体を表し、そして「ＰＢ−ＮＳＥＬＥＣＴ」は、非選択性基質、すなわち循環において酵素により認識されるアミノ酸配列を含む活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体である。
【図１２】図１２は、セツキシマブ、Ｐｂ−ＮＳＵＢｖ５ (すなわち、３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ５)又は３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５の投与に続いて、皮膚発疹を示す非ヒト霊長類の数を示すグラフである。
【図１３】図１３は、初期の４０ｍｇ／ｋｇの負荷用量の後、カニクイザルの血液に検出されるセツキシマブ及び３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５のレベルを比較する一連のグラフである（図１３Ａ−１３Ｄ）。
【図１４】図１４は、ＭＴ−ＳＰ１（抗体Ａ１１）の活性部位を特異的に認識する抗体によるＨ２９２異種移植片腫瘍における蛍光イメージングの一連のグラフである（図１４Ａ−１４Ｃ）。
【図１５】図１５は、活性化可能抗体のインサイチュイメージングの概略図である：１．組織切片がスライド上に配置される。２．スライドが標識された活性化可能抗体を含む溶液により被覆され、そしてインキュベートされる。３．十分な洗浄の後、活性化された抗体の結合が可視化される。
【図１６】図１６は、インサイチュイメージングを用いて活性化され、そして凍結された癌組織を結合する抗−ＥＧＦＲ活性可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５の能力を示す一連の写真である。図１６、パネルＡにおける赤色蛍光組織画像は、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の組織由来のタンパク質分解性切断により活性化されるＣ２２５ｖ５抗体の結合を示す。組織染色の同一パターンが、図１６、パネルＢに示されるように、組織に、市販の抗−ＥＧＦＲ抗体を暴露することにより検出された。図１６、パネルＣは、パネルＡに示される蛍光シグナルを暴露することにより検出された。図１６、パネルＣは、パネルＡに示される蛍光シグナルが広範囲の阻害剤のカクテル組III 及び５０ｍＭのＥＤＴＡの１：１００希釈溶液による組織の前処理により阻害されたことを示す。青色染色は、ＤＡＰＩ核染色を表す。
【図１７】図１７は、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５が広範囲のヒト腫瘍サンプルにおいて活性化可能であることを示す一連の表である。列２は、種々のヒト癌組織サンプルに関して、市販の抗−ＥＧＦＲ抗体により検出されるように、ＥＧＦＲ受容体の発現レベルを示す。列３は、種々のヒト癌組織サンプルにおいて、抗体Ａ１１により検出されるように、活性マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の量を示す。列４及び５は、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘ）組織染色（列４）に比較して、ＥＧＦＲ活性化可能抗体（列５）のインサイチュ活性化及び結合の評価を表す。組織サンプルに結合するＥＧＦＲ及びＡ１１抗体の量を測定するＩＨＣ染色は、次のように０〜３に得点された：０、染色なし；１＋（すなわち、「＋」）、弱い染色；２＋（すなわち、「＋＋」）、中位の染色；及び３＋（すなわち、「＋＋＋」）、強い染色。インサイチュイメージング染色評点は、セツキシマブ抗体染色との比較に基づき、そして次の通りに定義される；０、染色ない；１＋（すなわち、「＋」）、親抗体に比べて弱い染色；２＋（すなわち、「＋＋」）、親抗体に比べて中位の染色；及び３＋（すなわち、「＋＋＋」）、親抗体に対して類似する染色。
【図１８】図１８は、腫瘍増殖を阻害する抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体−剤複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）３９４５−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥの能力を示すグラフである。
【図１９】図１９は、セツキシマブの半減期に比べて、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５の半減期を示すグラフである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、マスキング及び活性化能力を維持しながら、ＭＭＡＥのリシン結合が３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５能力を高めることを示す一連のグラフである。３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５へのＭＭＡＥの結合は、ＥＧＦＲへのその結合を変更しない。３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５へのＭＭＡＥの結合は、その細胞殺害活性を高める。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、マスキング及び活性化能力を維持しながら、ＭＭＡＥのリシン結合が３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５能力を高めることを示す一連のグラフである。３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５へのＭＭＡＥの結合は、ＥＧＦＲへのその結合を変更しない。３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５へのＭＭＡＥの結合は、その細胞殺害活性を高める。
【図２１】図２１は、ヒト結腸直腸癌肝転移組織サンプルにおけるＥＧＦＲ及びＡ１１の共局在化を示す図である。
【図２２】図２２は、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体を活性化し、そして結合するヒト結腸直腸肝転移組織の能力を示す図である。
【図２３】図２３は、インサイチュイメージング、ＥＧＦＲ  ＩＨＣ及びＡ１１  ＩＨＣの三重染色を示す一連の写真である。画像の上段は、次の通りに示す（左側から右側へ）、単一組織スライス上で行われた染色を示す：インサイチュイメージング条件下でのＥＧＦＲ発現、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の活性及びセツキシマブの結合。画像の下段は、次の通りに示す（左側から右側へ）、単一組織スライス上で行われた染色を示す：ＥＧＦＲ発現、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の活性及び抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５のインサイチュイメージング。図２３における画像の右列は、セツキシマブの結合（上部画像）、及びインサイチュイメージング条件下で組織由来のタンパク質分解性切断により活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の結合（下部画像）を比較する。組織染色の同一パターンが、図２３、画像の左列に示されるように、組織に市販の抗−ＥＧＦＲ抗体を暴露することにより検出された。図２３（画像の中間列）は、ＥＧＦＲ発現とマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）活性との共局在性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０３２９】
発明の詳細な説明
本発明は、またＥＧＦ受容体、ヒトＥＧＦ受容体−１（ＨＥＲ１）、ｅｒｂＢ、ｅｒｂＢ１、及び種抗原７（ＳＡ−７）としても知られているヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を特異的に結合する活性化可能モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を提供する。抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体又はＥＧＦＲ活性可能抗体として本明細書において言及される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、異常ＥＧＦＲ発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を治療し、予防し、その進行を遅延し、その症状を改善し、そして／又は軽減する方法に使用される。例えば活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、癌又は他の腫瘍性状態を治療し、予防し、その進行を遅延し、その症状を改善し、そして／又は軽減する方法に使用される。
【０３３０】
活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、マスキング部分（ＭＭ）に結合される上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、結果的に、ＭＭの結合は、ＥＧＦＲを結合する抗体又はその抗原結合フラグメントの能力を低める。好ましい実施態様によれば、ＭＭは、プロテアーゼ、例えば対象における治療部位でＥＧＦＲと共局在するプロテアーゼのための基質を含む配列を介して結合される。多くの研究が、固形腫瘍における異常プロテアーゼレベル、例えばｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ−ＳＰ１、マトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）レベルの相関性を示して来た（例えば、Murthy RV, et al. “Legumain expression in relation to clinicopathologic and biological variables in colorectal cancer.” Clin Cancer Res. 11 (2005): 2293-2299; Nielsen BS, et al. “Urokinase plasminogen activator is localized in stromal cells in ductal breast cancer.” Lab Invest 81 (2001): 1485-1501; Mook OR, et al. “In situ localization of gelatinolytic activity in the extracellular matrix of metastases of colon cancer in rat liver using quenched fluorogenic DQ-gelatin.” J Histochem Cytochem. 51 (2003): 821-829を参照のこと）。
【０３３１】
本明細書に提供される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、治療及び／又は診断の部位での標的化された抗体活性化のために腫瘍細胞におけるプロテアーゼ活性の活用において有用である、プロテアーゼのための基質を含む。この工程の一般概要は、図１Ａに示されており、そしてプロテアーゼ、例えばｕＰＡ、ＭＴ−ＳＰ１、レグマイン、等のための適切な基質が選択される工程の一般概要は、図１Ｂに示されている。基質選択工程を用いて、多くの所望する特徴を有する基質を同定する。例えば、選択される基質は全身的に安定し（すなわち、対象の全身性循環において安定する）、一般的に、循環プロテアーゼ、例えばプラスミン、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）又はカリクレイン（ＫＬＫ）、例えばＫＬＫ−５及び／又はＫＬＫ−７による切断に対して一般的に感受性ではなく、非毒性であり、毒性の可能性ある部位、例えば皮膚で、プロテアーゼ、例えばＡＤＡＭ ９、ＡＤＡＭ １０、ＡＤＡＭ １７ 及び/又はカリクレイン、例えばＫＬＫ−５及びＫＬＫ−７による切断に対して感受性ではなく、そして治療及び／又は診断の意図される部位で活性である。好ましくは、同定される基質は、治療及び／又は診断の意図される部位で過剰発現されるが、しかし正常な、健康な又は他方では、非疾患性又は損傷された組織では典型的には発現されないプロテアーゼのために選択され、そして次に、選択される基質は続いて、正常な、例えば非疾患性組織において発現されるプロテアーゼに対してカウンタースクリーニングされる。
【０３３２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体における抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗−ＥＧＦＲ抗体セツキシマブから誘導される。Ｅｒｂｉｔｕｘ又はＣ２２５としても知られているセツキシマブは、ＥＧＦＲを特異的に結合するキメラ（マウス／ヒト）モノクローナル抗体である。セツキシマブは現在、転移性結腸直腸癌及び頭頸部癌の治療に使用される。
【０３３３】
好ましくは、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列、配列番号３０のアミノ酸配列、又は配列番号３４のアミノ酸配列であるか、又はそれに由来するＨ鎖を含む。
【０３３４】
いくつかの実施態様によれば、ＥＧＦＲを結合する抗体又はその抗体結合フラグメントの配列は、グリコシル化の可能性ある部位を除くために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。例えば、ＥＧＦＲを結合する抗体又はその抗原結合フラグメントは、グリコシル化の可能性ある部位を除くためにＨ鎖及び／又はＬ鎖にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様によれば、ＥＧＦＲを結合する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＨ鎖の位置８８でアスパラギンに対応するアスパラギン（Ｎ）が、配列番号２６のアミノ酸を有するＨ鎖を生成するために、グルタミン（Ｑ）残基により置換されているＨ鎖を有する。
【０３３５】
アスパラギン、活性化可能抗体においてＥＧＦＲを結合する抗体又はその抗原結合フラグメントは、特に前記抗体又はその抗原結合フラグメントのＦｃ領域に、追加の修飾を含むことができる。例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントのＦｃ領域は、グリコシル化の可能性ある部位を除くために、及び／又はその受容体のＦｃ領域の結合を破壊するために、１又は２以上のアミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施態様によれば、ＥＧＦＲを結合する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＨ鎖の位置２９９でアスパラギンに対応するアスパラギン（Ｎ）が、アラニン（Ａ）残基により置換されているＨ鎖を有する。この突然変異は、Ｆｃ領域におけるグリコシル化部位を除き、そしてＦｃによる低められたＦｃ受容体結合を導く。いくつかの実施態様によれば、ＥＧＦＲを結合する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＨ鎖の位置８８でアスパラギンに対応するアスパラギン（Ｎ）が、グルタミン（Ｑ）残基により置換され、そして配列番号３０のアミノ酸配列を有するＨ鎖の位置２９９でアスパラギンに対応するアスパラギン（Ｎ）が、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＨ鎖を生成するために、アラニン（Ａ）残基により置換されているＨ鎖を有する。
【０３３６】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、スペーサーにより、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体に連結され得る。いくつかの実施態様によれば、スペーサーは、シグナルペプチドの不在下で活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーは、活性化可能抗体のＭＭに直接連結される。いくつかの実施態様によれば、スペーサーはアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号３８）を有する。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてＭＭ配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）に対して直接的に連結される配列QGQSGQ（配列番号３８）のスペーサーを含む。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、ＭＭ配列に対して直接的に連結されるスペーサーを含み、そしてスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ−末端からＣ−末端への構造配置においてアミノ酸配列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY（配列番号５９）を含む。
【０３３７】
本明細書に提供される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、マスキング部分を含む。いくつかの実施態様によれば、マスキング部分は、抗−ＥＧＦＲ抗体に結合されるか、又は他方では、付加され、そして活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体コンストラクト内に位置するアミノ酸配列であり、結果的に、マスキング部分は、ＥＧＦＲを特異的に結合する抗−ＥＧＦＲ抗体の能力を低める。適切なマスキング部分は、種々の既知技法の何れかを用いて同定される。例えば、ペプチドマスキング部分は、Daughertyなどによる米国特許出願公開第２００９／００６２１４２号（その内容は、それらの全体を参照により本明細書に組込まれる）に記載される方法を用いて、同定される。
【０３３８】
本明細書に提供される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、切断可能部分を含む。いくつかの実施態様によれば、切断可能部分は、プロテアーゼ、通常細胞外プロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。適切な基質は、種々の既知技法のいずれかを用いて同定される。例えば、ペプチド基質は、Daughertyなどによる米国特許第7,666,817号に記載される方法を用いて同定され、前記特許の内容は、その全体を参照により本明細書に組込まれる（また、Boulware et al. “Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics.” Biotechnol Bioeng. 106.3 (2010): 339-46も参照のこと）。
【０３３９】
本明細書に記載される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、抗体療法、特にインビボで少なくともある程度、毒性であることが知られている抗体療法の限界を克服する。標的物−媒介性毒性は、治療抗体の開発のための主要制限を構成する。これは、セツキシマブ、すなわち上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を特異的に結合し、そして結腸直腸癌及び頭頚部癌の治療のために認識されている抗体により治療された患者の８８％が苦しむ皮膚発疹により例示されている。本明細書に提供される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、従来の治療抗体による正常組織中の標的物の阻害に関連する毒性に対処するよう企画されている。それらの活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、疾患の部位でタンパク質分解的に活性化されるまで、マスキングされたままである。親治療抗体としてセツキシマブから開始して、本発明の活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、プロテアーゼ基質を組込むリンカーを通して阻害マスクに抗体を結合することにより構築された。インビトロ試験で実施された研究によれば、ＥＧＦＲへの結合性、及び活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の細胞に基づく活性が、セツキシマブに比較して、減じられた。インビボ試験で実施された研究によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は正常組織においてはマスキングされたままであったが、しかし腫瘍環境下で活性化され、そして蓄積された。活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の腫瘍活性化は、セツキシマブの有効性と同等であったインビボ有効性に変換した。
【０３４０】
本明細書に提供される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、有意な臨床学的必要性を満たす。ＥＧＦＲは、腫瘍細胞の増殖、血管新生及び浸潤／転移を促進し、そして腫瘍細胞のアポトーシスを阻害することが示されている臨床学的に有効な標的である。ＥＧＦＲを標的とする抗体及び小分子チロシンキナーゼ阻害剤は、癌治療のために承認されている（Nature Rev Cancer 5 (2005) 341; Curr Opin Cell Biol 21, (2009) 177）。しかしながら、ＥＧＦＲ阻害剤（ＥＧＦＲｉ）としても言及される現在の抗−ＥＧＦＲ療法は、治療後の多くの有害事象、例えば特にヒト対象の顔及び上部体幹での丘疹膿疱性発疹；乾燥肌及び敏感肌、爪の周りの炎症、頭皮上の脱毛；及びまつげ及び顔面の毛の高められた成長を示すことが示されている。ＥＧＦＲｉによる治療に起因する皮膚毒性が、患者の４５〜１００％に影響を与えることが示されている（例えば、Segaert and Van Cutsem. Ann Oncol. 16(9) (2005):1425-33を参照のこと）。
【０３４１】
本発明の典型的な活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、例えば上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を結合する、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性化可能抗体として本明細書に言及される活性化可能抗体を包含する。３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の２種の配列が下記に示されており、ここで配列１は、シグナルペプチドを含む３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体バージョンの配列であり、そして配列２は、シグナルペプチドを含まない３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の配列である：
【０３４２】
3954-1204-C225v5 活性化可能抗体Ｈ鎖ヌクレオチド配列 1:
[シグナルペプチド (配列番号60)][C225v5 (配列番号25)]
【０３４３】
【化１】
2019108331.tif 000003
【０３４４】
イタリック体:  シグナルペプチド
通常テキスト:  抗−EGFR抗体由来の配列
【０３４５】
3954-1204-C225v5 活性化可能抗体Ｈ鎖アミノ酸配列 1:
[シグナルペプチド (配列番号 61)][C225v5 (配列番号 26)]
【０３４６】
【化２】
2019108331.tif 000004
【０３４７】
イタリック体:  シグナルペプチド
通常テキスト:  抗−EGFR抗体由来の配列
【０３４８】
3954-1204-C225v5 活性化可能抗体Ｌ鎖ヌクレオチド配列 1:
[シグナルペプチド (配列番号 60)][スペーサー (配列番号 62)][マスク（Ｍａｓｋ (配列番号 63)][リンカー 1 (配列番号 64)][1204 基質 (配列番号 65)][リンカー 2 (配列番号 66)][C225 (配列番号 67)]
【０３４９】
【化３】
2019108331.tif 000005
【０３５０】
イタリック体:                  シグナルペプチド
太字:                          スペーサー
下線:                          マスク
イタリック体 及び 下線:        リンカー 1
太字及び 下線:                 1204 基質
太字, イタリック体 及び 下線:  リンカー 2
通常テキスト:                  抗-EGFR抗体由来の配列
【０３５１】
3954-1204-C225v5 活性化可能抗体Ｌ鎖アミノ酸配列 1:
[シグナルペプチド (配列番号 61)][スペーサー (配列番号 38)][マスク (配列番号 14)][リンカー 1 (配列番号 23)][1204 基質 (配列番号 13)][リンカー 2 (配列番号 24)][C225 (配列番号 68)]
【０３５２】
【化４】
2019108331.tif 000006
【０３５３】
イタリック体:                    シグナルペプチド
太字:                            スペーサー
下線:                            マスク
イタリック体 及び 下線:          リンカー 1
太字及び 下線:                   1204 基質
太字, イタリック体 及び 下線:    リンカー 2
通常テキスト:                    抗−EGFR抗体由来の配列
【０３５４】
3954-1204-C225v5 活性化可能抗体Ｈ鎖ヌクレオチド配列 2:
[C225v5 (配列番号 25)]
【０３５５】
【化５】
2019108331.tif 000007
【０３５６】
3954-1204-C225v5 活性化可能抗体Ｈ鎖アミノ酸配列 2:
[C225v5 (配列番号 26)]
【０３５７】
【化６】
2019108331.tif 000008
【０３５８】
3954-1204-C225v5 活性化可能抗体Ｌ鎖ヌクレオチド配列 2:
[スペーサー (配列番号 62)][マスク (配列番号 63)][リンカー 1 (配列番号 64)][1204 基質 (配列番号 65)][リンカー 2 (配列番号 66)][C225 (配列番号 67)]
【０３５９】
【化７】
2019108331.tif 000009
【０３６０】
太字:                            スペーサー
下線:                            マスク
イタリック体 及び 下線:          リンカー 1
太字及び 下線:                   1204 基質
太字, イタリック体 及び 下線:    リンカー 2
通常テキスト:                    抗−EGFR抗体由来の配列
【０３６１】
954-1204-C225v5 活性化可能抗体Ｌ鎖アミノ酸配列 2:
[スペーサー (配列番号 38)][マスク (配列番号 14)][リンカー 1 (配列番号 23)][1204 基質 (配列番号 13)][リンカー 2 (配列番号 24)][C225 (配列番号 68)]
【０３６２】
【化８】
2019108331.tif 000010
【０３６３】
太字:                          スペーサー
下線:                          マスク
イタリック体 及び 下線:        リンカー 1
太字及び 下線:                 1204 基質
太字, イタリック体 及び 下線:  リンカー 2
通常テキスト:                  抗−EGFR抗体由来の配列
【０３６４】
本発明の別の典型的な活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、例えば上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を結合する、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体として本明細書に言及される活性化可能抗体である。３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の２種の配列が下記に示されており、ここで配列１は、シグナルペプチドを含む３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体バージョンの配列であり、そして配列２は、シグナルペプチドを含まない３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の配列である：
【０３６５】
3954-1204-C225v4 活性化可能抗体Ｈ鎖ヌクレオチド配列 1:
[シグナルペプチド (配列番号 60)][C225v4 (配列番号 29)]
【０３６６】
【化９】
2019108331.tif 000011
【０３６７】
イタリック体:        シグナルペプチド
通常テキスト:        抗−EGFR抗体由来の配列
【０３６８】
3954-1204-C225v4 活性化可能抗体Ｈ鎖アミノ酸配列 1:
[シグナルペプチド (配列番号 61)][C225v4 (配列番号 30)]
【０３６９】
【化１０】
2019108331.tif 000012
【０３７０】
イタリック体:    シグナルペプチド
通常テキスト:    抗−EGFR抗体由来の配列
【０３７１】
3954-1204-C225v4 活性化可能抗体Ｌ鎖ヌクレオチド配列 1:
[シグナルペプチド (配列番号 60)][スペーサー (配列番号 62)][マスク (配列番号 63)][リンカー 1 (配列番号 64)][1204 基質 (配列番号 65)][リンカー 2 (配列番号 66)][C225 (配列番号 67)]
【０３７２】
【化１１】
2019108331.tif 000013
【０３７３】
イタリック体:                  シグナルペプチド
太字:                          スペーサー
下線:                          マスク
イタリック体 及び 下線:        リンカー 1
太字及び 下線:                 1204 基質
太字, イタリック体 及び 下線:  リンカー 2
通常テキスト:                  抗−EGFR抗体由来の配列
【０３７４】
3954-1204-C225v4 活性化可能抗体Ｌ鎖アミノ酸配列 1:
[シグナルペプチド (配列番号 61)][スペーサー (配列番号 38)][マスク (配列番号 14)][リンカー 1 (配列番号 23)][1204 基質 (配列番号 13)][リンカー 2 (配列番号:24)][C225 (配列番号68)]
【０３７５】
【化１２】
2019108331.tif 000014
【０３７６】
イタリック体:                    シグナルペプチド
太字:                            スペーサー
下線:                            マスク
イタリック体 及び 下線:          リンカー 1
太字及び 下線:                   1204 基質
太字, イタリック体 及び 下線:    リンカー 2
通常テキスト:                    抗−EGFR抗体由来の配列
【０３７７】
3954-1204-C225v4 活性化可能抗体Ｈ鎖ヌクレオチド配列 2:
[C225v4 (配列番号29)]
【０３７８】
【化１３】
2019108331.tif 000015
【０３７９】
3954-1204-C225v4 活性化可能抗体Ｈ鎖アミノ酸配列 2:
[C225v4 (配列番号 30)]
【０３８０】
【化１４】
2019108331.tif 000016
【０３８１】
3954-1204-C225v4 活性化可能抗体Ｌ鎖ヌクレオチド配列 2:
[スペーサー (配列番号 62)][マスク (配列番号 63)][リンカー 1 (配列番号 64)][1204 基質 (配列番号 65)][リンカー 2 (配列番号 66)][C225 (配列番号 67)]
【０３８２】
【化１５】
2019108331.tif 000017
【０３８３】
太字:                            スペーサー
下線:                            マスク
イタリック体 及び 下線:          リンカー 1
太字及び 下線:                   1204 基質
太字, イタリック体 及び 下線:    リンカー 2
通常テキスト:                    抗−EGFR抗体由来の配列
【０３８４】
3954-1204-C225v4 活性化可能抗体Ｌ鎖アミノ酸配列 2:
[スペーサー (配列番号 38)][マスク (配列番号 14)][リンカー 1 (配列番号 23)][1204 基質 (配列番号 13)][リンカー 2 (配列番号 24)][C225 (配列番号 68)]
【０３８５】
【化１６】
2019108331.tif 000018
【０３８６】
太字:                          スペーサー
下線:                          マスク
イタリック体 及び 下線:        リンカー 1
太字及び 下線:                 1204 基質
太字, イタリック体 及び 下線:  リンカー 2
通常テキスト:                  抗−EGFR抗体由来の配列
【０３８７】
本発明の別の典型的な活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、例えば上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を結合する、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ６活性化可能抗体として本明細書に言及される活性化可能抗体である。３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ６活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の２種の配列が下記に示されており、ここで配列１は、シグナルペプチドを含む３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ６活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体バージョンの配列であり、そして配列２は、シグナルペプチドを含まない３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ６活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の配列である：
【０３８８】
3954-1204-C225v6 活性化可能抗体 Ｈ鎖 ヌクレオチド配列 1:
[シグナルペプチド (配列番号60)][C225v6 (配列番号 33)]
【０３８９】
【化１７】
2019108331.tif 000019
【０３９０】
イタリック体:  シグナルペプチド
通常テキスト:  抗-EGFR抗体由来の配列
【０３９１】
954-1204-C225v6 活性化可能抗体 Ｈ鎖 アミノ酸配列 1:
[シグナルペプチド (配列番号 61)][C225v6 (配列番号 34)]
【０３９２】
【化１８】
2019108331.tif 000020
【０３９３】
イタリック体:  シグナルペプチド
通常テキスト:  抗-EGFR抗体由来の配列
【０３９４】
3954-1204-C225v6 活性化可能抗体 Ｌ鎖 ヌクレオチド配列 1:
[シグナルペプチド (配列番号 60)][スペーサー (配列番号62)][マスク (配列番号 63)][リンカー 1 (配列番号 64)][1204 基質 (配列番号 65)][リンカー 2 (配列番号 66)][C225 (配列番号 67)]
【０３９５】
【化１９】
2019108331.tif 000021
【０３９６】
イタリック体:                    シグナルペプチド
太字:                            スペーサー
下線:                            マスク
イタリック体 及び 下線:          リンカー 1
太字 及び 下線:                  1204 基質
太字, イタリック体 及び 下線:    リンカー 2
通常テキスト:                    抗-EGFR抗体由来の配列
【０３９７】
3954-1204-C225v6 活性化可能抗体 Ｌ鎖 アミノ酸配列 1:
[シグナルペプチド (配列番号61)][スペーサー (配列番号 38)][マスク (配列番号 14)][リンカー 1 (配列番号 23)][1204 基質 (配列番号 13)][リンカー 2 (配列番号 24)][C225 (配列番号68)]
【０３９８】
【化２０】
2019108331.tif 000022
【０３９９】
イタリック体:                    シグナルペプチド
太字:                            スペーサー
下線:                            マスク
イタリック体 及び 下線:          リンカー 1
太字 及び 下線:                  1204 基質
太字, イタリック体 及び 下線:    リンカー 2
通常テキスト:                    抗-EGFR抗体由来の配列
【０４００】
3954-1204-C225v6 活性化可能抗体 Ｈ鎖 ヌクレオチド配列 2:
[C225v6 (配列番号 33)]
【０４０１】
【化２１】
2019108331.tif 000023
【０４０２】
3954-1204-C225v6 活性化可能抗体 Ｈ鎖 アミノ酸配列 2:
[C225v6 (配列番号 34)]
【０４０３】
【化２２】
2019108331.tif 000024
【０４０４】
3954-1204-C225v6 活性化可能抗体 Ｌ鎖 ヌクレオチド配列 2:
[スペーサー (配列番号 62)][マスク (配列番号 63)][リンカー 1 (配列番号 64)][1204 基質 (配列番号 65)][リンカー 2 (配列番号66)][C225 (配列番号 67)]
【０４０５】
【化２３】
2019108331.tif 000025
【０４０６】
太字:                            スペーサー
下線:                            マスク
イタリック体 及び 下線:          リンカー 1
太字 及び 下線:                  1204 基質
太字, イタリック体 及び 下線:    リンカー 2
通常テキスト:                    抗-EGFR抗体由来の配列
【０４０７】
3954-1204-C225v6 活性化可能抗体 Ｌ鎖 アミノ酸配列 2:
[スペーサー (配列番号 38)][マスク (配列番号 14)][リンカー 1 (配列番号 23)][1204 基質 (配列番号 13)][リンカー 2 (配列番号24)][C225 (配列番号 68)]
【０４０８】
【化２４】
2019108331.tif 000026
【０４０９】
太字:                            スペーサー
下線:                            マスク
イタリック体 及び 下線:          リンカー 1
太字 及び 下線:                  1204 基質
太字, イタリック体 及び 下線:    リンカー 2
通常テキスト:                    抗-EGFR抗体由来の配列
【０４１０】
本発明の活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体がプロテアーゼにより切断される場合、すなわち活性化可能抗−ＥＧＦＲが活性状態又は切断された状態で存在する場合、活性化された抗−ＥＧＦＲ抗体は、不活性状態又は切断されていない状態で、活性化可能抗体のアミノ酸配列の一部のみを保持するであろう。活性又は切断された状態での活性化可能抗−ＥＧＦＲの配列は、異なったプロテアーゼは異なった認識部位を有するので、プロテアーゼが切断する基質（ＣＭ）に依存して変化するであろう。
【０４１１】
例えば、本発明の典型的な抗−ＥＧＦＲ抗体、すなわち３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性化可能抗体、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体、及び/又は３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ６活性化可能抗体は、それぞれ、同じＬ鎖アミノ酸（Ｌ鎖アミノ酸配列２として本明細書では言及される）を有する。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）又はＭＴ−ＳＰ１の何れかに暴露され、そして活性化される場合、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の活性化形態は、次のアミノ酸配列を有する：
【０４１２】
3954-1204-C225v5、3954-1204-C225v4 及び/又は 3954-1204-C225v6 の活性化形態
uPA又はMT-SP1により活性化される場合の活性化可能抗体 Ｌ鎖 アミノ酸配列 2:
【０４１３】
【化２５】
2019108331.tif 000027
【０４１４】
レグマインに暴露され、そして活性化される場合、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の活性化形態は次のアミノ酸配列を有する：
【０４１５】
3954-1204-C225v5, 3954-1204-C225v4 及び/又は 3954-1204-C225v6 の活性化形態
レグマインにより活性化される場合の活性化可能抗体 Ｌ鎖 アミノ酸配列 2:
【０４１６】
【化２６】
2019108331.tif 000028
【０４１７】
いくつかの実施態様によれば、本明細書に記載される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体はまた、活性化可能抗体に結合される剤も含む。いくつかの実施態様によれば、結合された剤は、治療剤、例えば、抗腫瘍剤である。そのような実施態様によれば、剤は活性化可能抗体の炭水化物部分に結合され、好ましくはここで炭水化物部分は、抗体の抗原結合領域又は活性化可能抗体における抗原結合フラグメントの外側に位置する。いくつかの実施態様によれば、剤は、抗体のスルフヒドリル基、又は活性化可能抗体における抗原結合フラグメントに結合する。いくつかの実施態様によれば、剤は、抗体のアミノ基、又は活性化可能抗体の抗原結合フラグメントに結合される。いくつかの実施態様によれば、剤は、抗体のカルボン酸基、又は活性化可能抗体の抗原結合フラグメントに結合される。
【０４１８】
いくつかの実施態様によれば、剤は、細胞毒性剤、例えばトキシン（例えば、細菌、菌類、植物又は動物起源の酵素的活性トキシン、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体（すなわち、放射性複合体）である。適切な細胞毒性剤は例えば、表１に列挙される細胞毒性剤の何れかである。いくつかの実施態様によれば、細胞毒性剤は、ドラスタチン又はその誘導体（例えば、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＤＭＡＦ、ＤＭＡＥ）である。例えば、細胞毒性剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。
【０４１９】
いくつかの実施態様によれば、結合された活性化可能抗体は、活性化可能抗体配列に挿入されたか又は他方では、含まれる修飾されたアミノ酸配列を通して部位−特異的結合のために修飾され得る。それらの修飾されたアミノ酸配列は、結合された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体内の結合された剤の制御された配置及び／又は投与を可能にするよう企画される。例えば、活性化可能抗体は、反応性チオ基を提供し、そして抗原結合を変更しないで、タンパク質折り畳み及びアッセンブリーに負の影響を及ぼさない、Ｌ及びＨ鎖上の位置でのシステイン置換を含むよう構築され得る。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、結合のための適切な部位を提供するために活性化可能抗体内に１又は２以上の非天然アミノ酸残基を含むか、又は他方では、導入するよう構築され得る。いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、活性化可能抗体配列内に酵素的に活性化可能ペプチド配列を含むか又は他方では、導入するよう構築され得る。
【０４２０】
いくつかの実施態様によれば、剤は、検出可能部分、例えば標識又は他のマーカーである。例えば、剤は、放射性標識されたアミノ酸、マークされたアビジンにより検出され得る１又は２以上のビオチニル部分（例えば、光学的又は熱量測定方法により検出され得る蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプタビジン）、１又は２以上の放射性同位体又は放射性核種、１又は２以上の蛍光標識、１又は２以上の酵素標識、及び／又は１又は２以上の化学発光剤であるか、又は含む。いくつかの実施態様によれば、検出可能部分は、スペーサー分子により結合される。
【０４２１】
使用され得る酵素的活性のトキシン及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosaからの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、アレウリテス・フォルジ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ファイトラカ・アメリカナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰII及びＰＡＰ−Ｓ）、ゴーヤ（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（Sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。種々の放射性核種は、放射性複合化抗体の製造のために利用できる。例としては、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ及び186Ｒｅを挙げることができる。
【０４２２】
抗体及び細胞毒性剤の結合は、種々の二官能性タンパク質−カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド誘導体（例えば、ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて製造される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載のようして調製され得る。炭素−１４−標識された１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種の結合のための典型的なキレート剤である（国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと）。
【０４２３】
当業者は、多くの種類の可能性ある部分が、本発明の得られる抗体に結合され得ることを理解するであろう（例えば、"Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照のこと；それらの全内容は、参照により本明細書に組込まれる）。
【０４２４】
表１は、本明細書に記載される発明に使用され得る典型的な医薬剤のいくつかを列挙するが、但しそれらだけに限定するものではない。
【０４２５】
【表１】
2019108331.tif 000029
【０４２６】
【表２】
2019108331.tif 000030
【０４２７】
【表３】
2019108331.tif 000031
【０４２８】
【表４】
2019108331.tif 000032
【０４２９】
【表５】
2019108331.tif 000033
【０４３０】
カップリングは、抗体及び他の部分がそれらのそれぞれの活性をできるだけ長く保持するよう、それらの２つの分子を結合するであろう何れかの化学反応により達成され得る。この結合は、多くの化学機構、例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、コーディネート結合及び複合体化を包含する。しかしながら、好ましい結合は、共有結合である。共有結合は、存在する側鎖の直接的縮合により、又は外部架橋分子の組込みにより達成され得る。多くの二価又は多価結合剤が、タンパク質分子、例えば本発明の抗体の他の分子へのカップリングにおいて有用である。例えば、代表的なカップリング剤は、有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン及びヘキサメチレンジアミンを包含することができる。この列挙は、当業界において知られている種々の種類のカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、むしろ、より一般的なカップリング剤の例である（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); 及び Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)を参照のこと）。
【０４３１】
好ましいリンカーは、文献に記載されている（例えば、ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載する、Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)を参照のこと）。また、オリゴペプチドリンカーにより抗体に結合されるハロゲン化されたアセチルヒドラジド誘導体の使用を記載する米国特許第５，０３０，７１９号を参照のこと。特に好ましいリンカーは、次のものを包含する：(i) SMPT (４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−(２−ピリジル−ジチオ)−トルエン (Pierce Chem. Co., カタログ番号(21558G); (ii) SPDP (スクシンイミジル−６ ［３−（２−ピリジルジチオ) プロピオンアミド] ヘキサノエート(Pierce Chem. Co., カタログ番号2165Ｇ)及び(iii) スルホ-LC−SPDP (スルホスクシンイミジル６ ［３−（２−ピリジルジチオ)−プロピオンアミド] ヘキサノエート (Pierce Chem. Co. カタログ番号2165-G)。
【０４３２】
上記リンカーは、異なった属性を有し、従って異なった物理化学的特性を有する複合体体を導く成分を含む。例えば、リンカーＳＨＰＴは、立体的ヒンダードジスルフィド結合を含み、そして高められた安定性を有する複合体を形成することができる。ジスルフィド結合はインビトロで切断され、低い利用可能な複合体をもたらすので、そのジスルフィド結合は一般的に、他の結合よりも低い安定性である。
【０４３３】
試薬ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩は、カルボン酸、及び第一又第ニ級アミンから出発して、カルボキサミドを作成するために有用である。従って、ＥＤＣは、リンカー又はトキシンにおけるカルボン酸と抗体におけるリシン残基とを連結するために、又はリンカー又はトキシンにおけるアミンと抗体におけるアスパラギン酸又はグルタミン酸とを連結するために使用され得る。ＥＤＣを用いるそのような結合反応は、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）又はスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−３−オキシスルホニルスクシンイミド）の添加により増強され得る。そのような結合反応へのＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳの添加は、結合反応の速度、完全性、選択性及び／又は再現性を増強することができる。
【０４３４】
いくつかの実施態様によれば、リンカーは切断可能である。いくつかの実施態様によれば、リンカーは非切断可能である。いくつかの実施態様によれば、複数のリンカーが存在する。それらの複数のリンカーは、すべて同じであり、例えば切断可能か又は非切断可能であるか、又はそれらの複数のリンカーは異なっており、例えば少なくとも１つは切断可能であり、そして少なくとも１つは非切断可能である。
【０４３５】
本発明は、ＡＢへの剤の結合、すなわち（ａ）ＡＢの炭水化物部分への結合、又は（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への結合、又は（ｃ）ＡＢのアミノ基への結合、又は（ｄ）ＡＢのカルボキシレート基への結合のためのいくつかの方法を利用する。本発明によれば、ＡＢは、少なくとも２種の反応性基（１つはＡＢと反応し、そして１つは剤と反応する）を有する中間リンカーを通して剤に共有結合され得る。任意の適合性有機化合物を含むことができるリンカーが選択され、結果的に、ＡＢ（又は剤）との反応はＡＢ反応性及び選択性に悪影響を及ぼさない。さらに、剤へのリンカーの結合は、剤の活性を破壊しない。酸化された抗体又は酸化された抗体フラグメントとの反応のための適切なリンカーは、第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びチオセミカルバジド基から成る群から選択されるアミンを含むそれらのリンカーを包含する。そのような反応性官能基は、リンカーの構造の一部として存在することができ、又はそのような基を含まないリンカーの適切な化学変性により導入され得る。
【０４３６】
本発明によれば、還元されたＡＢへの結合のための適切なリンカーは、還元された抗体又はフラグメントのスルフヒドリル基と反応できる一定の反応性基を有するそれらのリンカーを包含する。そのような反応性基は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：反応性ハロアルキル基（例えば、ハロアセチル基を包含する）、ｐ−マーキュリーベンゾエート基、及びマイケル型付加反応できる基（例えば、マレイミド、及びMitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110により記載されるタイプの基を包含する）。
【０４３７】
本発明によれば、酸化も、還元もされていないＡＢへの結合のための適切なリンカーは、ＡＢにおける修飾されていないリシン残基に存在する第一級アミノ基と反応できる一定の官能基を有するそれらのリンカーを包含する。そのような反応性基は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ＮＨＳカルボン酸又は炭酸エステル、スルホ−ＮＨＳカルボン酸又は炭酸エステル、４−ニトロフェニルカルボン酸又は炭酸エステル、ペンタフルオロフェニルカルボン酸又は炭酸エステル、アシルイミダゾール、イソシアネート及びイソチオシアネート。
【０４３８】
本発明によれば、酸化も又は還元もされていないＡＢへの結合のための適切なリンカーは、適切な試薬により活性化された、Ａｂにおけるアスパラギン酸又はグルタミン酸残基に存在するカルボン酸基と反応できる一定の官能基を有するそれらのリンカーを包含する。適切な活性化試薬は、ＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳを添加されているか又は添加されていないＥＤＣ、及びカルボキシアミド形成のために利用される他の脱水剤を含む。それらの場合、適切なリンカーに存在する官能基は、第一及び第ニ級アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、及びヒドラジドを包含する。
【０４３９】
剤は、リンカーがＡＢに結合される前又はその後、リンカーに結合され得る。ある種の用途によれば、リンカーが関連する剤を有さないＡＢ−リンカー中間体を、まず生成することが所望される。特定の用途に依存して、特定の剤がリンカーに共有結合され得る。他の実施態様によれば、ＡＢはまず、ＭＭ、ＣＭ、及び関連リンカーに結合され、そして次に、結合目的のためのリンカーに結合される。
【０４４０】
分枝（ｂｒａｎｃｈｅｄ）リンカー：特定の実施態様によれば、剤の結合のための複数の部位を有する分枝リンカーが使用される。複数部位リンカーに関しては、ＡＢへの単一の共有結合が、多くの部位で剤を結合できるＡＢ−リンカー中間体をもたらす。部位はアデヒド又はスルフヒドリル基、又は剤が結合され得る何れかの化学部位であり得る。
【０４４１】
他方では、より高い比活性（又はＡＢに対する剤のより高い比率）が、ＡＢ上の複数部位での単一部位リンカーの結合により達成され得る。この複数部位は、２種の方法の何れかによりＡＢ中に導入され得る。最初の方法は、同じＡＢに複数のアルデヒド基及び／又はスルフヒドリル基を生成することができる。第２の方法は、リンカーへの続く結合のための複数の官能部位を有する「分枝リンカー」を、ＡＢのアルデヒド又はスルフヒドリル基に結合することができる。分枝リンカー又は複数部位リンカー中の官能部位は、アルデヒド又はスルフヒドリル基であり得、又はリンカーが結合され得る何れかの化学部位であり得る。さらに高い比活性が、それらの２つのアプローチを組合すことにより、すなわちＡＢ上のいくつかの部位で複数部位リンカーを結合することにより得られる。
【０４４２】
切断可能リンカー：補体系の酵素、例えばウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、プラスミン、又はタンパク質分解活性を有する別の酵素（但し、それらだけには限定されない）による分解に対して敏感であるペプチドリンカーは、本発明の１つの実施態様に使用され得る。本発明の１つの方法によれば、剤は、補体による切断に対して感受性のリンカーを介して結合される。抗体は、補体を活性化できる種類から選択される。従って、抗体−剤複合体は、補体カスケードを活性化し、そして標的部位で剤を開放する。本発明の別の方法によれば、剤は、タンパク質分解活性を有する酵素、例えばウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性因子、プラスミン又はトリプシンによる切断に対して感受性のリンカーを介して結合される。それらの切断可能リンカーは、細胞外トキシン、例えば非制限的例によれば、表１に示される細胞外トキシンの何れかを含む結合された活性化可能抗体において有用である。
【０４４３】
切断可能リンカー配列の非制限的例が、表２に提供される。
【０４４４】
【表６】
2019108331.tif 000034
【０４４５】
【表７】
2019108331.tif 000035
【０４４６】
さらに、剤は、ジスルフィド結合（例えば、システイン分子上のジスルフィド結合）を介してＡＢに結合され得る。多くの腫瘍は自然に高レベルのグルタチオン（還元剤）を放出するので、これはジスルフィド結合を還元し、続いて、送達の部位で剤を開放する。一定の特定の実施態様によれば、ＣＭを修飾する還元剤はまた、結合された活性化可能抗体のリンカーも修飾するであろう。
【０４４７】
スペーサー及び切断可能要素：さらに別の実施態様によれば、剤と、活性化可能抗体のＡＢとの間の空間を最適化するような手段でリンカーを構築することが必要である。これは、下記一般構造のリンカーの使用により達成され得る：
Ｗ−（ＣＨ2）n−Ｑ
ここで、Ｗは、−ＮＨ−ＣＨ2−又は−ＣＨ2−のいずれかであり；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり；そして
ｎは、０〜２０の整数である。
【０４４８】
さらなる他の実施態様によれば、リンカーは、スペーサー要素及び切断可能要素を含むことができる。スペーサー要素は、ＡＢのコアーから離れて切断可能要素を配置するのに役立ち、結果的に、切断可能要素は切断を担当できる酵素により接近できる。上記に記載される特定の分枝リンカーがスペーサー要素として役立つことができる。
【０４４９】
この議論を通して、剤へのリンカー（又は切断可能要素へのスペーサー要素の、又は剤への切断可能要素の）の結合は、結合又は反応の特定の様式である必要はない。適切な安定性及び生物学的適合性の生成物を提供する何れかの反応が許容される。
【０４５０】
血清補体及びリンカーの選択：本発明の１つの方法によれば、剤の放出が所望される場合、補体を活性化できる種類の抗体であるＡＢが使用される。得られる複合体は、抗原を結合し、そして補体カスケードを活性化する両能力を保持する。従って、本発明の実施態様によれば、剤は、切断可能リンカー又は切断可能要素の一端に連結され、そしてリンカー基の他端はＡＢ上の特定部位に結合される。例えば、剤がヒドロキシ基又はアミノ基を有する場合、それは、それぞれエステル又はアミド結合を介して、ペプチド、アミノ酸又は他の適切に選択されたリンカーのカルボキシ末端に結合され得る。例えば、そのような剤は、カルボジイミド反応を介してリンカーペプチドに結合され得る。剤がリンカーへの結合を干渉する官能基を含む場合、それらの干渉性官能基は、結合の前、ブロックされ得、そして生成物の複合体又は中間体が製造されると、ブロック解除される。次に、リンカーの反対又はアミノ末端が直接的に、又は補体を活性化できるＡＢへの結合のためにさらなる修飾の後、使用される。
【０４５１】
リンカー（又はリンカーのスペーサー要素）は任意の所望する長さのものであり得、その一端は、活性化可能抗体のＡＢ上の特定部位に共有結合され得る。リンカー又はスペーサー要素の他端は、アミノ酸又はペプチドリンカーに結合され得る。
【０４５２】
従って、それらの複合体が補体の存在下で抗原に結合する場合、リンカーに剤を結合するアミド又はエステル結合が切断され、その活性形での剤の放出がもたらされる。それらの複合体は、対象に投与される場合、標的部位で剤の送達及び放出を達成し、そして表１に提供されるように（但し、それらに限定されない）、医薬剤、抗生物質、代謝拮抗剤、抗増殖剤及び同様のもののインビボ送達のために、特に効果的である。
【０４５３】
補体活性化を伴わないでの放出のためのリンカー：標的化された送達のさらなる別の用途によれば、補体活性化を伴わないでの剤の放出が、補体カスケードの活性化は究極的には標的細胞を溶解するので、所望される。従って、このアプローチは、剤の送達及び放出が標的細胞を殺さないで達成される場合、有用である。細胞メディエーター、例えばホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経達成物質、遺伝子又は酵素の標的細胞への送達が所望される、そのような場合が、目標である。それらの複合体は、血清プロテアーゼによる切断に対して軽度に影響を受けるリンカーを介して、補体を活性化できないＡＢへの剤の結合により調製され得る。この複合体が個人に投与される場合、抗原−抗体複合体はすばやく形成するが、ところが剤の切断はゆっくり生じ、従って標的部位での化合物の放出がもたらされる。
【０４５４】
生化学的クロスリンカー：他の実施態様によれば、活性化可能抗体は、一定の生化学的クロスリンカーを用いて、１又は２以上の治療剤に結合され得る。架橋試薬は、２種の異なった分子の官能基を一緒に結びつける分子架橋を形成する。２種の異なったタンパク質を段階的に連結するためには、所望しないホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性クロスリンカーが使用され得る。
【０４５５】
リソソームプロテアーゼにより切断できるペプチジルリンカー、例えばＶａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ａｌａ、又は他のジペプチドがまた有用である。さらに、リソソームの低−ｐＨ環境下で切断できる酸−不安定性リンカー、例えば、ビス−シアリルエーテルが使用され得る。他の適切なリンカーは、カテプシン−不安定性基質、特に酸性ｐＨで最適な機能を示すそれらのものを包含する。
【０４５６】
典型的なヘテロ−二官能性クロスリンカーが表３に参照される。
【０４５７】
【表８】
2019108331.tif 000036
【０４５８】
【表９】
2019108331.tif 000037
【０４５９】
非切断可能リンカー又は直接的結合：本発明のさらに他の実施態様によれば、複合体は、剤が標的に送達するが、しかし放出されないよう企画され得る。これは、直接的に、又は非切断可能リンカーを介して、ＡＢに剤を結合することにより達成され得る。
【０４６０】
それらの非切断可能リンカーは、続いて、本明細書に記載される方法によりＡＢへの結合において利用され得る官能基を含むよう修飾され得る、アミノ酸、ペプチド、Ｄ−アミノ酸又は他の有機化合物を包含することができる。そのような有機リンカーのための一般式は、下記式であり得る：
Ｗ−（ＣＨ2）n−Ｑ
ここで、Ｗは、−ＮＨ−ＣＨ2−又は−ＣＨ2−のいずれかであり；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり；そして
ｎは、０〜２０の整数である。
【０４６１】
非切断可能複合体：他方では、化合物は、補体を活性化しないＡＢに結合され得る。補体活性化できないＡＢを用いる場合、この結合は、活性化された補体による切断に対して敏感であるリンカー、又は活性化された補体による切断に対して敏感ではないリンカーを用いて、達成され得る。
【０４６２】
定義
特にことわらない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により通常理解される意味を有するであろう。さらに、特に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、そして複数形は単数を含むものとする。一般的に、本明細書に記載される細胞及び組織培養物、分子生物学、及びタンパク質及びオリゴ−又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及びそれらの技法は、当業者に良く知られており、そして当業界において通常使用される。標準技法が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）について使用される。酵素反応及び精製技法は、製造業者の規格に従って、又は当業界において通常達成されるようにして、又は本明細書に記載されるようにして、実施される。前述の技法及び手順は、当業界において良く知られている従来の方法に従って、及び本明細書を通して引用され、そして論じられる種々の一般的及び特定の参照に記載のようにして、一般的に実施される。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照のこと。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、及び医学及び薬化学に関連して使用される命名法、及び実験手順及び技法は、当業者に良く知られており、そして当業界において通常使用される。標準技法が、化学合成、化学分析、医薬調製、配合、及び送達、及び患者の治療のために使用される。
【０４６３】
本開示に従って使用される場合、次の用語が、特にことわらない限り、次の意味を有することが理解されるであろう。
【０４６４】
本明細書において使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原を特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を言及する。「特異的に結合する」又は「免疫反応する」又は「免疫特異的に結合する」とは、抗体が所望する抗原の１又は２以上の抗原決定因子と反応し、そして他のポリペプチドと反応せず、そしてより低い親和性（Ｋd＞１０-6）で結合しないことを意味する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂ，及びＦ（ａｂ’）2フラグメント、ｓｃＦｖｓ、及びＦａｂ発現ライブラリーを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０４６５】
基本的な抗体構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、同一の２対のポリペプチド鎖から構成され、各対は１つの「Ｌ鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「Ｈ鎖」（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担当する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端は、エフェクター機能を主に担当する不変領域を規定する。一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、分子に存在するＨ鎖の性質によりお互い異なる、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤの何れかに関連する。特定クラスは、サブクラス、例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2及び他のものも有する。さらに、ヒトにおいては、Ｌ鎖はカッパ鎖又はラムダ鎖である得る。
【０４６６】
用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）又は「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書において使用される場合、ユニークＬ鎖遺伝子生成物及びユニークＨ鎖遺伝子生成物から成る抗体分子の１つの分子種のみを含む抗体分子集団を言及する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、前記集団のすべての分子において同一である。ＭＡｂは、抗原のエピトープに対してユニーク結合親和性により特徴づけられる抗原の特定エピトープと免疫反応できる抗原結合部位を含む。
【０４６７】
用語「抗原−結合部位」又は「結合部分」とは、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を言及する。抗原結合部位は、重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）のＮ−末端可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基により形成される。「超可変領域」として言及される、Ｈ及びＬ鎖のＶ領域内の３種の高度に分岐するストレッチが、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」として知られているより保存された隣接ストレッチ間に介在される。従って、用語「ＦＲ」とは、免疫グロブリン中の超可変領域間に、及びそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を言及する。抗体分子においては、Ｌ鎖の３種の超可変領域及びＨ鎖の３種の超可変領域が、立体空間においてお互い相対的に配列され、抗原−結合表面が形成される。前記抗原−結合表面は、結合される抗原の立体表面に対して相補的であり、そして各Ｈ及びＬ鎖の３種の超可変領域は、「相補性−決定領域」又は「ＣＤＲ」として言及される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、又は Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)の定義に従う。
【０４６８】
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ又はＴ−細胞受容体に対して特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ−細胞受容体に対して特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。エピトープ決定因子は通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的活性表面基から成り、そして通常、特定の立体構造特性、及び特定の電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端ペプチドに対して産生され得る。抗体は、解離定数が≦１μＭ；好ましくは≦１００ｍＭ及び最も好ましくは≦１０ｎＭである場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
【０４６９】
本明細書において使用される場合、用語「特異的結合」、「免疫学的結合」及び「免疫学的結合性質」とは、免疫グロブリンが特異的である、免疫グロブリン分子と抗原との間に生じるタイプの非共有相互作用を言及する。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋd）により表され、ここでより小さなＫdはより大きな親和性を表す。選択されるポリペプチドの免疫学的結合性質は、当業界において良く知られている方法を用いて定量化され得る。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の速度を測定することを伴い、ここでそれらの速度は、複雑なパートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方の速度の等しい影響を及ぼす幾何学的パラメーターに依存する。従って、「オン速度定数」（Ｋon）及び「オフ速度定数」（Ｋoff）の両者は、濃度、及び会合及び解離の実際の速度の計算により決定され得る（Nature 361:186-87 (1993)を参照のこと）。Ｋoff／Ｋonの比は、親和性に関連しないすべてのパラメーターの取り消しを可能にし、そして解離定数Ｋdに等しい（一般的に、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照のこと）。本発明の抗体は、アッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイ又は当業者に知られている類似するアッセイにより測定されるように、平衡結合定数（Ｋd）が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、及び最も好ましくは、≦１００Ｍ〜約１ｐＭである場合、ＥＧＦＲに対して特異的に結合すると言われる。
【０４７０】
用語「単離されたポリヌクレオチド」とは、本明細書において使用される場合、ゲノム、ｃＤＮＡ又は合成起源、又はそれらのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その起源によれば、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドのすべて又は一部と会合せず、（２）それが天然で連結されないポリヌクレオチドに対して作動可能的に連結されるか、又は（３）大きな配列の一部として、天然に存在しない。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に示されるＨ鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、及び本明細書に記載されるＬ鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。
【０４７１】
本明細書に記載される用語「単離されたタンパク質」とは、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、又は合成起源又はそれらのいくつかの組合せのタンパク質を意味し、その起源、又は誘導の源によれば、「単離されたタンパク質」は、（１）自然界に見出されるタンパク質に関連せず、（２）同じ源からの他のタンパク質を有さず、例えばネズミタンパク質を有さず、（３）異なった種からの細胞により発現され、又は（４）自然界には存在しない。
【０４７２】
用語「ポリペプチド」は、ポリペプチド配列の天然タンパク質、フラグメント、又は類似体を言及するために一般用語として本明細書において使用される。従って、天然タンパク質、フラグメント及び類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明のポリペプチドは、本明細書に示されるＨ鎖免疫グロブリン分子、及び本明細書に示されるＬ鎖免疫グロブリン分子、並びにＬ鎖免疫グロブリン分子、例えばカッパＬ鎖免疫グロブリン分子、及びその逆、並びにそれらのフラグメント及び類似体を含んで成る組合せにより形成される抗体分子を含む。
【０４７３】
本明細書において使用される場合、用語「天然に存在する」とは、目的物に適用される場合、目的物が自然界において見出され得る事実を言及する。例えば、生物（例えば、ウィルス）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチドは、自然源から単離され、そして実験室においてヒトにより意図的に変性されていないか、又は他方では、天然に存在する。
【０４７４】
用語「作動可能的に連結された」とは、本明細書において使用される場合、記載される成分の意図された様式でのそれらの機能を可能にする関係下にあるそのような成分の位置を言及する。コード配列に「作動可能的に連結された」制御配列は、そのコード配列の発現が制御配列と適合できる条件下で達成されるような手段で連結される。
【０４７５】
用語「制御配列」とは、本明細書において使用される場合、それらが連結されるコード配列の発現及びプロセッシングをもたらすのに必要であるポリヌクレオチド配列を言及する。そのような制御配列の性質は、原核生物における宿主生物に依存して異なり、そのような制御配列は一般的に、真核生物におけるプロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み、一般的にそのような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、それらの存在が発現及びプロセッシングのために必須であるすべての成分を、最低でも含むことが意図され、そしてまた、それらの存在がリーダー配列及び融合パートナー配列のために好都合である追加成分も含むことができる。用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書において使用される場合、少なくとも１０個の長さの塩基のヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれか、又は修飾された形のいずれかのタイプのヌクレオチドを意味する。この用語は、単鎖及び二本鎖形のＤＮＡを包含する。
【０４７６】
本明細書に言及される用語オリゴヌクレオチドは、天然に存在し、そして天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合により一緒に連結された、天然に存在し、そして修飾されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、２００個の長さか、又はそれよりも少ない長さの塩基を、一般的に含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０個の長さ、及び最も好ましくは、１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０〜４０個の長さの塩基である。オリゴヌクレオチドは通常、例えばプローブに関しては、単鎖であり、ところがオリゴヌクレオチドは、遺伝子変異体の構成への使用のためには、二本鎖であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０４７７】
本明細書において言及される用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾された又は置換された糖基及び同様のものを有するヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される用語「オリゴヌクレオチド結合」は、オリゴヌクレオチド結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデ−ト（phoshoraniladate）、ホスホロンミデート（phoshoronmidate）及び同様のものを包含する。例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、所望には、検出のための標識を含むことができる。
【０４７８】
本明細書において使用される場合、２０個の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用法に従う。Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))を参照のこと。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα−、α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来型アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例は、次のものを包含する：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、・−Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルリシン、・−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、・−Ｎ−メチルアルギニン、及び他の類似するアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用されるポリペプチド表記法においては、標準用法及び慣例に従って、左側方向はアミノ末端方向であり、そして右側方向はカルボキシ末端方向である。
【０４７９】
同様に、特にことわらない限り、単鎖ポリヌクレオチド配列の左側端は、５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向として言及される。新生ＲＮＡ転写体の５’から３’付加の方向は、転写方向として言及され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の及びＲＮＡ転写体の５’末端に対して５’側に存在する配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の、及びＲＮＡ転写体の３’末端に対して３’側に存在する領域は、「下流配列」と呼ばれる。
【０４８０】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的に同一」とは、２種のペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を用いて、プログラムＧＡＰ又はＧＥＳＴＦＩＴによれば、適切に整列される場合、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、及び最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。
【０４８１】
好ましくは、同一でない残基位置は、保存性アミノ酸置換により異なる。
【０４８２】
本明細書において論じられる場合、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるマイナーな変動は、アミノ酸配列における変動が少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％及び最も好ましくは９９％維持する場合、本発明により包含されるものとして意図される。特に、保存性アミノ酸置換が企画される。保存性置換は、それらの側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で起こるそれらの置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は一般的に、次のファミリーに分けられる：（１）酸性アミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸であり；（２）塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンであり；（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、そして（４）非荷電性極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、及びトレオニンを包含する。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリンを包含する。他のファミリーのアミノ酸は、（ｉ）脂肪族−ヒドロキシファミリーである、セリン及びトレオニン；（ｉｉ）アミド含有ファミリーである、アスパラギン及びグルタミン；（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーである、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン；及び（ｉｖ）芳香族ファミリーである、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを包含する。例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの単離された置換、又は構造的に関連するアミノ酸による１つのアミノ酸の類似する置換は、特にその置換が骨格部位内にアミノ酸を含まない場合、得られる分子の結合又は性質に対して主要効果を有さないであろうことを予測するが妥当である。アミノ酸変化が機能ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより、容易に決定され得る。アッセイは本明細書に詳細に記載される。抗体又は免疫グロブリン分子のフラグメント又は類似体は、当業者により容易に調製され得る。フラグメント又は類似体の好ましいアミノ−及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近くで存在する。構造的及び機能的ドメインは、公的又は独自の配列データベースとのヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データの比較により同定され得る。好ましくは、コンピューター化された比較方法が、既知構造及び／又は機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフ又は予測されるタンパク質コンフォメーションドメインを同定するために使用される。既知立体構造に折り畳むタンパク質配列を同定するための方法は周知である（Bowie et al. Science 253:164 (1991)）。従って、前述の例は、当業者が本発明に従って構造及び機能的ドメインを規定するために使用され得る、配列モチーフ及び構造コンフォメーションを認識することができることを示している。
【０４８３】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低め、（２）酸化に対する感受性を低め、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変更し、（４）そのような類似体の他の物理化学的又は機能的性質を付与するか又は修正するそれらの置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々のムテインを含むことができる。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存性アミノ酸置換）が、分子間接触を形成する天然に存在する配列（好ましくは、ドメイン外のポリペプチドの一部）において行われ得る。保存性アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的変更すべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に生じるヘリックスを分解するか、又は親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を破壊する傾向であってはならない）。当核分野で認識されるポリペプチド二次及び三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H.  Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J.  Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991));及びThornton et at. Nature 354:105 (1991)に記載される。
【０４８４】
用語「ポリペプチドフラグメント」とは、本明細書において使用される場合、アミノ酸末端及び／又はカルボキシ末端欠失及び／又は１又は２以上の内部欠失を有するが、しかし残るアミノ酸配列は例えば完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列においてその対応する位置と同一であるポリペプチドを言及する。フラグメントは、典型的には、少なくとも５，６，８又は１０個の長さのアミノ酸、好ましくは少なくとも１４個の長さのアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０個の長さのアミノ酸、通常少なくとも５０個の長さのアミノ酸、及びさらにより好ましくは少なくとも７０個の長さのアミノ酸である。用語「類似体」とは、本明細書において使用される場合、推定されるアミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性を有し、そして適切な結合条件下でＥＧＦＲに対する特異的結合を有する、少なくとも２５個のアミノ酸のセグメントから構成されるポリペプチドを言及する。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に関して、保存性アミノ酸置換（又は付加又は欠失）を含む。類似体は典型的には、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個又はそれ以上の長さのアミノ酸であり、そしてしばしば、完全な長さの天然に存在するポリペプチドと同じ長さであり得る。
【０４８５】
用語「剤」は、化学物質、化学物質及び生体高分子の混合物、又は生物学的材料から製造される抽出物を示すために、本明細書において使用される。
【０４８６】
本明細書において使用される場合、用語「標識」又は「標識された」とは、例えば放射性標識されたアミノ酸の組込み、又はマークされたアビジン（例えば、光学的又は熱量測定方法により検出され得る蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプタビジン）により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合による、検出可能マーカーの組込みを言及する。一定の状況下で、標識又はマーカーもまた治療性であり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する種々の方法は、周知であり、そして使用され得る。ポリペプチドについての標識の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：放射性同位体又は放射性核種（例えば、3Ｈ、14Ｃ、15Ｎ、35Ｓ、90Ｙ、99Ｔｃ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学ルミネセンス、ゼオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施態様によれば、標識は、可能性ある立体障害を低めるために、種々の長さのスペーサーアームにより結合される。用語「医薬剤又は薬剤」とは、本明細書において使用される場合、患者に適切に投与される場合、所望する治療効果を誘発できる化学物質又は組成物を言及する。
【０４８７】
本明細書における他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))により例示されるように、当核技術分野における従来の使用法に従って使用される。
【０４８８】
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な」とは、目的の種が存在する優性種であり（すなわち、モル基準で、組成物において任意の他の個々の種より豊富である）、そして好ましくは、実質的に純粋な画分が、目的の種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を含む組成物であることを意味する。
【０４８９】
一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在するすべての高分子種の約８０％以上、より好ましくは約８５％、９０％、９５％及び９９％以上を含むであろう。最も好ましくは、目的の種は、本質的な均質性に精製され（汚染種は従来の検出方法によっては、組成物において検出され得ない）、ここで組成物は単一の高分子種から実質的に成る。
【０４９０】
用語、患者とは、ヒト及び動物種を包含する。
【０４９１】
抗体
本発明の活性化可能抗体はヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を特異的に結合する。本明細書に記載される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体と同じエピトープに結合する活性化可能抗体がまた、本発明に包含される。
【０４９２】
当業者は、モノクローナル抗体（例えば、ネズミ又はヒト適合されたモノクローナル抗体）が、前者がＥＧＦＲへの結合から後者を妨げるかどうかを確かめることにより、本明細書に記載される方法に使用されるモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかを、過渡の実験をすることなく、決定することが可能であることを認識するであろう。試験されるモノクローナル抗体が、本発明のモノクローナル抗体による結合の低下により示されるように、本発明のモノクローナル抗体と競争する場合、それらの２種のモノクローナル抗体は、同じか、又は密接に関連するエピトープに結合する。モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定するための他の方法は、ＥＧＦＲと共に本発明のモノクローナル抗体をプレインキュベートし、そして次に、試験されるモノクローナル抗体がＥＧＦＲを結合するその能力を阻害するかどうかを決定するために試験されるモノクローナル抗体を添加することである。試験されるモノクローナル抗体が阻害される場合、十中八九、それは本発明のモノクローナル抗体と同じか、又は機能的に等しいエピトープ特異性を有する。
【０４９３】
活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の使用
本発明の治療剤が、改良された転送、送達、耐性及び同様のものを提供するために製剤中に組込まれる、適切な担体、賦形剤及び他の剤と共に投与されることは理解されるであろう。多数の適切な製剤が、すべての製薬化学者に周知の処方に見出され得る：Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))、特にそこにおける、Blaug、Seymourによるチャプター８７。それらの製剤は、例えば粉末、ペースト、軟膏、ジェリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有小胞（例えば、Lipofection（登録商標））、ＤＮＡ複合体、無水吸水性ペースト、水中油型及び油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体状ゲル、及びカーボワックスを含む半固体状混合物を包含する。前述の混合物のいずれかが、製剤中の活性成分が製剤化により不活性化されず、そして製剤が生理学的に適合でき、そして投与の経路で許容できる場合、本発明による治療及び療法において適切であり得る。また、Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、及び製薬化学者に周知の製剤、賦形剤及び担体に関連する追加の情報についてのそこにおける引用も参照のこと。
【０４９４】
活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体を含む、本発明の治療製剤は、異常ＥＧＦＲ発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を予防し、治療し、又は他方では、改善するために使用される。例えば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体を含む、本発明の治療製剤は、癌又は他の腫瘍性状態を治療し、又は他方では、改善するために使用される。
【０４９５】
高められたタンパク質分解は、癌の特徴であることが知られている（例えば、Affara NI, et al. “Delineating protease functions during cancer development.” Methods Mol Biol. 539 (2009): 1-32を参照のこと）。腫瘍の進行、浸潤及び転移は、プロテアーゼが関与するいくつかの相互依存工程に起因する。この工程は、一般的に図８Ａ及び８Ｂに示されている。
【０４９６】
予防、改善又は治療の有効性は、異常ＥＧＦＲ発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を診断するか、又は治療するための何れかの既知方法に関連して決定される。対象の生存性の延長、又は他方では、対象における異常ＥＧＦＲ発現及び又は活性に関連する疾患又は障害の進行の遅延は、活性化可能抗体が臨床的利益を与えることを示唆する。
【０４９７】
活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、医薬組成物の形で投与され得る。そのような組成物の調製に関連する原則及び考慮点、並びに成分の選択の指針は、例えばRemington : The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994;及びPeptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供される。
【０４９８】
活性化可能抗体フラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに対して特異的に結合する最小フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づけば、標的タンパク質配列を結合する能力を保持するペプチド分子が企画され得る。そのようなペプチドは、化学的に合成され、そして／又は組換えＤＮＡ技法により製造され得る（例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照のこと）。製剤はまた、治療される特定の徴候のために必要な１以上の活性化合物、好ましくはお互い悪影響を与えない相補的活性を有するそれらのものも含むことができる。他方では、又はさらに、組成物は、その機能を増強する剤、例えば細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤を含むことができる。そのような分子は、意図する目的のために効果的である量での組合せで適切に存在する。
【０４９９】
活性成分はまた、それぞれ、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）下で、又はマイクロエマルジョン下で、液滴形成技法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに閉じ込められ得る。
【０５００】
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌であるべきである。これは、無菌濾過膜を通しての濾液により容易に達成される。
【０５０１】
徐放性製剤が調製され得る。除放性製剤の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを包含し、ここでマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形で存在する。除放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ−（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタノートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グルコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−クリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射用微小球）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。ポリマー、例えばエチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸は１００日間にわたって分子を放出できるが、ある種のヒドロゲルは、より短い期間、タンパク質を放出する。
【０５０２】
いくつかの実施態様によれば、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。損なわれていない抗体、又はそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ又はＦ（ａｂ）2）が使用される。プローブ又は抗体に関して、用語「標識された」とは、プローブ又は抗体に検出可能物質を結合する（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブの直接的標識、及び直接的に標識される別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接的標識の包含を意図する。間接的標識の例は、蛍光標識された二次抗体を用いての一次抗体の検出、及び蛍光標識されたストレプタビジンにより検出され得るようビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識を包含する。用語「生物学的サンプル」とは、対象から単離された組織、細胞及び生物学的流体、並びに対象内に存在する組織、細胞及び体液の包含を意図する。従って、用語「生物学的サンプル」の使用範囲内に包含されるものは、血液、及び血清、血漿又はリンパを含む血液の画分又は成分である。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロ及びインビボで、生物学的サンプルにおける分析物ｍＲＮＡ、タンパク質又はゲノムＤＮＡを検出するために使用され得る。例えば、分析物ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技法は、ノーザンハイブリダイゼーション及びインサイチュハイブリダイゼーションを包含する。分析物タンパク質の検出のためのインビトロ技法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスターンブロット、免疫沈澱、免疫化学染色、及び免疫蛍光を包含する。分析物ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技法は、サザンハイブリダイゼーションを包含する。免疫検定を行うための手順は、例えば“ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; and “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載される。さらに、分析物タンパク質の検出のためのインビボ技法は、標識された抗−分析物タンパク質抗体を対象中に導入することを包含する。例えば、抗体は、対象における存在及び位置が標識イメージング技法により検出され得る放射性マーカーにより標識され得る。
【０５０３】
診断及び予防製剤
本発明の抗−ＥＧＦＲ抗体及び／又は活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、診断及び予防製剤に使用される。１つの実施態様によれば、抗−ＥＧＦＲ抗体及び／又は活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、１又は２以上の前述の癌又は他の障害を発症する危険性がある患者に投与される。１又は２以上の前述の障害に対する患者又は器官の素因は、遺伝子型、血清学的又は生化学的マーカーを用いて決定され得る。
【０５０４】
本発明の別の実施態様によれば、抗−ＥＧＦＲ抗体及び／又は活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、１又は２以上の前述の障害に関連する臨床学的徴候を有するものとして診断されたヒト個人に投与される。診断に基づいて、抗−ＥＧＦＲ抗体及び／又は活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、臨床学的徴候の効果を軽減するか又は無効にするために投与される。
【０５０５】
本発明の抗及び／又は活性化可能抗体はまた、患者サンプルにおけるＥＧＦＲの検出においても有用であり、そして従って、診断としても有用である。例えば、本発明の抗−ＥＧＦＲ抗体及び／又は活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、患者サンプルにおけるＥＧＦＲレベルを検出するために、インビトロアッセイ、例えばＥＬＩＳＡに使用される。
【０５０６】
１つの実施態様によれば、本発明の抗−ＥＧＦＲ抗体及び／又は活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定される。固定された抗体及び／又は活性化可能抗体は、試験サンプルに存在できる何れかのＥＧＦＲのための保護抗体として機能する。患者サンプルと固定された抗体との接触の前、固体支持体は、すすがれ、そしてブロッキング剤、例えば乳タンパク質又はアルブミンにより、分析物の非特異的吸着を妨げるために処理される。
【０５０７】
結果的に、ウェルは、抗原を含む疑いのある試験サンプル、又は標準量の抗原と含む溶液により処理される。そのようなサンプルは例えば、病理学の診断であると見なされるレベルの循環抗体を有する疑いのある対象からの血清サンプルである。試験サンプル又は標準をすすいだ後、固体支持体は、検出可能的に標識される二次抗体により処理される。標識された二次抗体は、検出抗体として作用する。検出可能標識のレベルが測定され、そして試験サンプル中のＥＧＦＲ抗原の濃度が、標識サンプルから得られる標準曲線との比較により決定される。
【０５０８】
インビトロ診断アッセイで本発明の抗−ＥＧＦＲ抗体を用いて得られる結果に基づけば、ＥＧＦＲ抗体の発現レベルに基づいて対象における疾患を段階的に分けることが可能であることが理解されるであろう。所定の疾患に関しては、血液サンプルが疾患の進行における種々の段階であるものとして診断された患者から、及び／又は疾患の治療処置における種々の点で採取される。進行又は治療の各段階について統計学的に有意な結果を提供するサンプル集団を用いて、各段階の特性と考えられ得る抗原の濃度範囲が示される。
【０５０９】
抗−ＥＧＦＲ抗体及び／又は活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体はまた、診断及び／又はイメージング方法にも使用され得る。いくつかの実施態様によれば、そのような方法は、インビトロ方法である。いくつかの実施態様によれば、そのような方法は、インビボ方法である。いくつかの実施態様によれば、そのような法方は、インサイチュ方法である。いくつかの実施態様によれば、そのような方法はエクスビボ方法である。例えば、酵素切断できるＣＭを有する活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、ＣＭを切断できる酵素の存在又は不在を検出するために使用され得る。そのような活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、所定の宿主生物の所定の細胞又は組織における活性化された抗−ＥＧＦＲ抗体（すなわち、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の切断に起因する抗体）の測定される蓄積を通して酵素活性（又は、いくつかの実施態様によれば、ジスルフィド結合の還元を提供することができる高められた還元電位の環境）のインビボ検出（例えば、定性的又は定量的）を包含することができる診断に使用され得る。活性化された抗−ＥＧＦＲ抗体のそのような蓄積は、組織が酵素活性（又はＣＭの性質に依存する高められた還元電位）を表すことを示すのみならず、また組織が活性化された抗体が結合する標的物を表すことも示唆する。
【０５１０】
例えば、ＣＭは、腫瘍の部位で、ウィルス又は細菌感染の部位で、生成学的に制限された部位で(例えば、膿瘍において、器官において、及び同様において)、及び同様の部位で見出されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ基質として選択され得る。ＡＢは、標的抗原を結合するものである。当業者になじみの方法を用いて、検出可能標識（例えば、蛍光標識又は放射性標識又は放射性トレーサー）は、ＡＢ、又は抗−ＥＧＦＲ抗体及び／又は活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の他の領域に結合され得る。適切な検出可能標識は、上記スクリーニング方法において論じられ、そして追加の特定の例が下記に提供される。その活性が興味ある疾患組織において高められるプロテアーゼと共に、病状のタンパク質又はペプチドに対して特異的なＡＢを用いて、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、ＣＭ特異的酵素が検出可能レベルで存在しないか、又は疾患組織においてよりも低いレベルで存在するか、又は不活性である（例えば、チモーゲン形で、又は阻害剤との複合体下で）、組織と比較して、疾患組織への結合率の増加を示すであろう。小タンパク質及びペプチドは腎臓濾過システムにより血液から急速にクリアランスされるので、及びＣＭに対して特異的な酵素は検出可能レベルで存在しないので（又は非疾患組織に低レベルで存在するか、又は不活性コンフォメーション下で存在する）、疾患組織における活性化された抗−ＥＧＦＲ抗体の蓄積は、非疾患組織に対して増強される。
【０５１１】
別の例によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、サンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するために使用され得る。例えば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体が酸素による切断に対して敏感なＣＭを含む場合、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、サンプル中の酵素の存在を検出する（定性的に又は定量的に）ために使用され得る。活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体が還元剤による切断に対して敏感なＣＭを含む別の例によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、サンプルにおける還元状態の存在を検出する（定性的に又は定量的に）ために使用され得る。それらの方法での分析を促進するためには、活性化可能抗体は検出可能的に標識され得、そして支持体（例えば、固体支持体、例えばスライド又はビーズ）に結合され得る。検出可能標識は、切断に続いて放出されない活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の一部上に位置し、例えば検出可能標識は、クエンチ蛍光標識、又は切断が生じるまで検出できない他の標識であり得る。アッセイは、例えば固定された、検出可能的に標識された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体と、酵素及び／又は還元剤を含む疑いがあるサンプルとを、切断が生じるのに十分な時間、接触し、次に過剰のサンプル及び汚染物を除去するために洗浄することにより実施され得る。次に、サンプル中に切断剤（例えば、酵素又は還元剤）の存在又は不在が、サンプルとの接触の前、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の検出可能シグナルの変化、例えばサンプル中の切断剤による活性化可能抗体の切断による検出可能シグナルの存在及び／又は上昇により評価され得る。
【０５１２】
そのような検出方法は、切断される場合、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体のＡＢを結合できる標的物の存在又は不在の検出を提供できるよう適合され得る。従って、アッセイは、切断剤の存在又は不在、及び興味ある（ＥＧＦＲ）の標的物の存在又は不在を評価するように適合され得る。切断剤の存在又は不在は、上記のような活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の検出可能レベルでの存在及び／又は上昇により検出され得、そして標的物の存在又は不在は標的物−ＡＢ複合体の検出により、例えば検出可能的に標識された抗−標的物抗体の使用により、検出され得る。
【０５１３】
活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、例えばプロテアーゼ切断及び特定標的物への結合による、活性化可能抗体活性化の検証のためのインサイチュイメージングにおいても有用である。インサイチュイメージングは、生物学的サンプル、例えば細胞培養物又は組織切片におけるタンパク質分解活性及び標的物の局在化を可能にする技法である。この技法を用いて、所定の標的物への結合、及び検出可能標識（たとえば、蛍光標識）の存在に基づいてのタンパク質分解活性の両者を確認することが可能である。
【０５１４】
それらの技法は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）又は健康組織由来の任意の凍結細胞又は組織に関して有用である。それらの技法はまた、新鮮細胞又は組織サンプルに関しても有用である。
【０５１５】
それらの技法によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、検出可能標識により標識される。検出可能標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、近赤外（ＮＩＲ）色素（例えば、Ｑｄｏｔ（登録商標）ナノ結晶）、コロイド状金属、ハプテン、放射性マーカー、ビオチン及び増幅試薬、例えばストレプタビジン、又は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）であり得る。
【０５１６】
標識された、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体と共にインキュベートされたサンプル中の標識の検出は、サンプルが標的物、すなわちＥＧＦＲを含み、そして活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体のＣＭに対して特異的であるプロテアーゼを含むことを示唆する。いくつかの実施態様によれば、プロテアーゼの存在は、広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを用いて、及び／又はプロテアーゼに対して特異的である剤、例えばプロテアーゼマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）に対して特異的であり、そしてＭＴ−ＳＰ１のタンパク質分解活性を阻害する抗体、例えばＡ１１を用いることにより確認され得る；例えば、国際公開番号第ＷＯ  ２０１０／１２９６０９号（２０１０年１１月１１日に公開された）を参照のこと。広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを使用し、及び／又はより選択的な阻害剤を使用する同じアプローチが、プロテアーゼ、又は活性可能抗−ＥＧＦＲ抗体のＣＭに対して特異的な種類のプロテアーゼを同定するために使用され得る。いくつかの実施態様によれば、標的物の存在は、標的物、例えば別の抗−ＥＧＦＲ抗体に対して特異的である剤を用いて確認され得、又は検出可能標識が、標識されていないＥＧＦＲと比較され得る。いくつかの実施態様によれば、標識されていない活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体が、標識された二次抗体又はより複雑な検出システムによる検出を伴って、使用され得る。
【０５１７】
類似する技法がまた、対象、例えば哺乳類、例えばヒトにおける蛍光シグナルの検出が、疾患部位が標的物、すなわちＥＧＦＲを含み、そして活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体のＣＭに対して特異的であるプロテアーゼを含むことを示唆する、インビボイメージングのためにも有用である。
【０５１８】
それらの技法はまた、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体におけるプロテアーゼ−特異的ＣＭに基づいて、種々の細胞、組織及び生物におけるプロテアーゼの検出、同定又は特徴化のために、キットにおいて、及び／又は試薬としても有用である。
【０５１９】
いくつかの実施態様によれば、インサイチュイメージング及び／又はインビボイメージングは、治療する患者を同定する方法において有用である。例えば、インサイチュイメージングによれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、適切な位置で、例えば腫瘍部位で、適切なプロテアーゼ及び標的物を有するそれらの患者を同定するために、患者サンプルをスクリーニングするために使用される。
【０５２０】
いくつかの実施態様によれば、インサイチュイメージングが、本開示の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、細分するために使用される。例えば、標的物（例えば、ＥＧＦＲ）、及び試験される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）（例えば、疾患部位で活性化抗体を蓄積する）における基質を切断するプロテアーゼの両者に対して陽性の患者が、そのようなＣＭを含む抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、標的物（例えば、ＥＧＦＲ）、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗体中のＣＭにおいて基質を切断するプロテアーゼの何れか又は両者に対して陰性の患者が、別の形の療法（すなわち、試験される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体による治療のためには適切でない）のための適切な候補体として同定される。いくつかの実施態様によれば、第１の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体に関して陰性のそのような患者は、治療のための適切な抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭを含む抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体）が同定されるまで、異なったＣＭを含む他の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体により試験され得る。
【０５２１】
いくつかの実施態様によれば、インビボイメージングは、本開示の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか又は細分するために使用される。例えば、標的物（例えば、ＥＧＦＲ）、及び試験される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）（例えば、疾患部位で活性化抗体を蓄積する）における基質を切断するプロテアーゼの両者に対して陽性の患者が、そのようなＣＭを含むそのような抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、陰性の患者が、別の形の療法（すなわち、試験される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体による治療のためには適切でない）のための適切な候補体として同定される。いくつかの実施態様によれば、第１の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体に関して陰性のそのような患者は、治療のための適切な抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭを含む抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体）が同定されるまで、異なったＣＭを含む他の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体により試験され得る。
【０５２２】
医薬組成物
本発明の活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体（また「活性化合物」として、本明細書において言及される）、その誘導体、フラグメント、類似体及び相同体は、投与のために適切な医薬組成物中に組み込まれ得る。そのような組成物は典型的には、活性化可能抗体及び医薬的に許容できる担体を含む。本明細書において使用される場合、用語「医薬的に許容できる担体」とは、医薬投与に適合できる、何れか及びすべての溶媒、分散媒体、コーチング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、及び同様のものを含むよう意図される。適切な担体は、参照により本明細書に組込まれる、分野的標準参考テキストである、Remington’s Pharmaceutical Scienceの最新版に記載される。そのような担体又は希釈剤の好ましい例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース液体、及び５％ヒト血清アルブミンを包含するが、但しそれらだけには限定されない。リボソーム及び非水性ビヒクル、例えば固定油がまた使用され得る。医薬敵活性物質のためのそのような媒体及び剤の使用は、周知である。何れかの従来の媒体又は剤が活性化合物と不適合である限りを除いて、組成物へのそれらの使用が企画される。補助活性化合物もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０５２３】
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合できるよう処方される。投与経路の例は、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、及び直腸投与を包含する。非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は次の成分を含むことができる：無菌希釈剤、例えば注射用蒸留水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又は亜流酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩及び張性の調整のための剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムにより調節され得る。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、又はガラス又はプラスチック製の複数用量バイアル中に封入され得る。
【０５２４】
注射使用に適した医薬組成物は、無菌注射用溶液又は分散液の即時調整のための無菌水溶液（ここで、水溶性）又は分散液、及び無菌粉末を含む。静脈内投与に関しては、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（登録商標）（BASF、Parsippany, N.J.）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。すべての場合、組成物は、無菌であるべきであり、そして容易な注射針通過性が存在する程度に流動する必要がある。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定性でなければならず、そして微生物、例えば細菌及び菌類の汚染作用に対して保存されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、及び同様のもの）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散性媒体であり得る。適切な流動性は、例えばコーチング、例えばレシチンの使用により、分散液の場合、必要とされる粒度の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール及び同様のものにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを、組成物に含むことが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延する剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを、組成物に含むことによりもたらされ得る。
【０５２５】
無菌注射用溶液は、上記に列挙される１つの成分又は成分の組合せと共に、適切な溶媒に、必要とされる量の活性化合物を組込むことにより、必要なら、続いて濾過殺菌により調製され得る。一般的に、分散液は、塩基性分散液媒体及び上記に列挙されるそれらからの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクル中に、活性化合物を組み込むことにより調製される。注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分の粉末、及び前もって無菌濾過された溶液からの任意の追加の所望する成分の粉末を生成する、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０５２６】
経口組成物は一般的に、不活性希釈剤又は食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、又は錠剤に圧縮される。経口治療投与のためには、活性化合物が、賦形剤と共に組込まれ、そして錠剤、トローチ又はカプセルの形で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォシュとしての使用のために流体担体を用いて調製され得、ここで流体担体中、化合物が経口適用され、うがいされ、そして吐き出されるか、又は飲み込まれる。医薬的に適用できる結合剤及び／又はアジュバント材料が、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチ及び同様のものは、次の成分、又は類似する性質の化合物の何れかを含むことができる：結合剤、例えば微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチン；賦形剤、例えば澱粉又はラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル又はコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム又はステローツ（Sterotes）；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化珪素；甘味剤、例えばスクロース又はサッカリン；又は風味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香料。
【０５２７】
吸入による投与に関しては、化合物は、適切な推進剤、例えばガス、例えば二酸化炭素を含む加圧された容器又は分散器、又はネブライザーからエアロゾル噴霧の形で供給される。
【０５２８】
全身性投与はまた、経粘膜又は経皮手段によるものであっても良い。経粘膜又は経皮投与に関しては、浸透されるバリアに適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は一般的に周知であり、そして例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を包含する。経粘膜投与は、鼻用スプレー又は坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与に関しては、活性化合物は、一般的に当業界において知られているように、軟膏、膏剤、ゲル又はクリーム中に処方される。
【０５２９】
化合物はまた、直腸供給のためには、坐剤（例えば、従来の坐剤基材、例えばココナツバター及び他のグリセリドを含む）、又は保持浣腸の形でも調製され得る。
【０５３０】
１つの実施態様によれば、活性化合物は、身体からの急速な排除に対して化合物を保護するであろう担体、例えば制御放出製剤、例えばインプラント及びマイクロカプセル化送達システムにより調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が使用され得る。そのような製剤の調製方法は、当業者に明らかであろう。材料はまた、Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Incから商業的に得られる。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体により、感染された細胞に標的化されるリポソームを含む）はまた、医薬的に許容できる担体としても使用され得る。それらは、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に知られている方法に従って調製され得る。
【０５３１】
容易な投与及び投薬量の均一性のために、投薬単位形で、経口又は非経口組成物を処方することが特に好都合である。投薬単位形とは、本明細書において使用される場合、治療される対象のために単位投与量として適した物理的に別個の単位を言及し；各単位は、必要とされる医薬担体と共に所望する治療効果を生成するために計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物のユニーク特性及び達成される特定の治療効果、及び個人の治療のために活性化合物を配合する技術的に固有の制限により決定され、そしてそれらに直接的に依存する。
【０５３２】
医薬組成物は、投与についての説明書と共に、容器、パック又はディスペンサーに含まれ得る。
【０５３３】
本発明はさらに、次の実施例に記載されるが、それらは請求項に記載される本発明の範囲を限定されるものではない。
【実施例】
【０５３４】
実施例１．材料及び方法
活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の発現及び精製。活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の各Ｈ鎖及びＬ鎖をコードするｃＤＮＡを、修飾されたｐｃＤＮＡ３．１の哺乳類発現ベクター（Life  Technologies）中に、別々にクローン化した。ＣＨＯ−Ｓ細胞（Life  Technologies）を、製造業者の説明書に従って、FｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＭＡＸトランスフェクション試薬（Life  Technologies）を用いて、５−７日間、各活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体についてのプラスミドにより一時的トランスフェクトした。活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体を、ＡＫＴＡ精製機（GE  Healthcare）に連結されたHiTrap Mab Select Sure プロテインA カラム (GE Healthcare)を用いて精製した。精製された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の純度及び均質性を、それぞれ、還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びSuperdex 200, 10/300 GL カラム (GE Healthcare)を用いてのサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。
【０５３５】
活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体分解の速度及びＫcat／Ｋm決定。組換えヒトuPA and MT-SP1 (R & D Systems; 1.6 - 100 nMの最終濃度)を、50 mM のトリス-HCl、pH 7.4、150 mM のNaCl、0.05% Tween-20、 5 mMの 塩化カルシウム、(TBST)下で500 nM の(uPA)及び2 μM の(MT-SP1)と共に、３７℃で２４時間、インキュベートした。反応を、7 μlの HT Protein Express Sample Buffer (Caliper LifeSciences)に５μｌのサンプルを添加し、そして９５℃で１０分間インキュベートすることにより停止した。サンプルを、キャピラリー電気泳動（GXII; Caliper LifeSciences）により分析し、そして切断された及び切断されていないＬ鎖の濃度を、LabChip GXソフトウェア(Caliper LifeSciences)を用いて決定した。Ｋcat／Ｋmを、次の等式を用いて決定した：
【０５３６】
【数１】
2019108331.tif 000038
【０５３７】
Ｃ＝変換される生成物の相対部分（切断されたＬ鎖／切断された＋切断されていないＬ鎖）、ｔ＝時間（秒）及びｐ＝プロテアーゼ濃度（Ｍ）。基質濃度を、Ｋm以下及びプロテアーゼ以上に維持した。
【０５３８】
活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体のプロテアーゼ消化／活性化。Ｐｂ−１２０４（１００μｇ）として本明細書において言及される３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体を、種々のプロテアーゼ：uPA (PBS中、50 nM、pH 7.2)、MT-SP1 (PBS中、10 nM、 pH 7.2), 又はレグマイン(50 mMの MES中、30 ug/ml、250 mM のNaCl、 pH 6.0)と共に、室温で４日間、インキュベートした。細胞増殖及びＥＧＦＲ結合アッセイのために、ｕＰＡ−切断されたＰｂ−１２０４を、プロテインＡアガロース親和性クロマトグラフィーにより精製した。Ｐｂ−１２０４の切断を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びキャピラリー電気泳動（(LabChip GXII; Caliper Life Sciences）により分析した。
【０５３９】
細胞培養及び増殖アッセイ。Ｈ２９２ヒト肺癌細胞（American Type Culture Collection）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）により補充されたＲＰＭＩ培地において、３７℃（５％ＣＯ2）で維持した。増殖アッセイに関しては、細胞を、低血清条件（ＲＰＭＩ＋１％ＦＢＳ）下で、９６ウェルプレートにおいて３０００個の細胞／ウェルで播種した。次の日、抗体及び活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体を、示される濃度で添加し、そして細胞を、さらに４日間、３７℃でインキュベートした。細胞生存率を、Cell-Titer Glo (Promega)を用いて、その製造業者の説明書に従って測定した。
【０５４０】
ＥＧＦＲ結合アッセイ。９６ウェルプレート（Nunc）を、ハンクス液（HBSS  Ｐｈ７．４，１０ｍＭのHepes）中、EGFR−Fc（５０ｎｇ／ウェル；R＆D  Systems）により被覆し、そして１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳによりブロックした。プレートを、ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡ中、示される濃度の抗体又は活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを、ＨＢＳＳ中、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗−ヒトＦ（ａｂ’）2（Jackson ImmunoResearch Laboratories）と共に３０分間インキュベートし、そして検出を、３，３’,  ５，５’−テトラメチルベンジジン基質（１−段階  Ultra−TMB、Pierce）、続いて等体積の１Ｍの塩酸の添加により実施した。次に、４５０ｎｍでの吸光を測定し、そして光学密度（ＯＤ４５０ｎｍ）として報告した。
【０５４１】
ある場合、相対的ＥＧＦＲ結合を、セツキシマブ標準曲線（１ｎＭの出発濃度、１０ポイントの連続希釈）を用いて、ＩｇＧ濃度に変換した。標準曲線を、４パラメーター曲線上に適合し、そして結果を、Ｅｌｘ８００ソフトウェアを用いて補間した。
【０５４２】
光学イメージングによる活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体分布の評価。ＨＴ２９異種移植片腫瘍担持のマウスを、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体結合の１２．５ｍｇ／ｋｇのAlexa Fluor750により腹腔内注射した。イメージングの１時間前、マウスを、クエンチＰＥＧ化Ｃｙ５．５基質プローブ（２ｎモル）により静脈内注射した。マウスを、IVIS Spectrum/CT イメージングシステム (Caliper LifeSciences)を用いて、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体注射の２４時間後、画像化した。手順の間、マウスを、３７℃で、ガス麻酔（５％イソフラン）下で維持した。７５０ｎｍでのイメージングは、この波長での標識された活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の分布が抗体活性化及びＥＧＦＲ受容体結合の指標であるので、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体（例えば、3954-1204-C225v4 又は3954-1204-C225v5、及びそれぞれ、3954-1204-C225v4又は3954-1204-C225v5からのプロテアーゼ基質配列がプロテアーゼ切断に対して敏感ではない配列により置換されたＰｂ−ＮＳＵＢ構造体）の蓄積レベルを評価するために使用される。６８０ｎｍでのイメージングを用いて、腫瘍組織におけるプローブ活性化動態をモニターすることにより、基質切断のレベルを評価する。最終的に、剖検を用いて、生体内分布をエクスビボで評価する。
【０５４３】
免疫蛍光。活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体注射の７日後、マウスを屠殺し、そして組織サンプルを摘出し、そして凍結保存した。ＨＴ２９異種移植片腫瘍及び肝臓のサンプルを、−２０℃で切断した（５μｍ）。切片を、AlexaFluor488結合ロバ抗−ヒトＩｇＧにより染色し、そしてＤＡＰＩ退色防止剤封入剤により対比染色した。染色された切片を、蛍光顕微鏡（Olympus  IX８１）及びLife Science Microscopy Cellのためのイメージングソフトフェアを用いて画像化した。
【０５４４】
ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ。９６ウェルmaxisorpプレート（ＮＵＮＣ）を、ＨＢＳＳ（Invitrogen）中、マウス抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（50 ng/ウェル; Jackson ImmunoResearch）により被覆し、そして１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳによりブロックした。サンプルをウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを、ＨＢＳＳ中、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗−ヒトＦ（ａｂ′）2（Jackson ImmunoResearch Laboratories）と共に３０分間インキュベートし、そして検出を、３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン基質（1-Step Ultra-TMB, Pierce）、続いて等体積の１Ｍの塩酸の添加により実施した。次に、４５０ｎｍでの吸光度を測定し、そして光学密度（ＯＤ４５０ｎｍ）として報告した。標準曲線を、セツキシマブ（１ｎｍの出発濃度、１０ポイント連続）を用いて各プレートについて生成した。標準曲線を、４パラメーター曲線上に適合し、そして結果を、Elx800ソフトウェアを用いて補間した。
【０５４５】
免疫沈澱及びウェスターンブロット。組織サンプルを、溶解緩衝液（HBSS/ 2% Triton X-100、Haltプロテアーゼ阻害剤カクテル; Thermo Fisher Scientific）中で、ステンレス鋼ビーズ含有Bullet Blender均質化管（Next Advance）を用いて、２ｍｌの溶解緩衝液当たり１ｇの腫瘍／組織の比率で均質化した。組織ホモジネートを、３０００ｘｇで遠心分離し、そして上清液を、さらに２０，８００ｘｇで、４℃で４５分間、遠心分離した。組織溶解物を、１０μlのヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的磁気ビーズ（Bangs Laboratories, Inc.）を共に、４℃で一晩インキュベートした。ビーズを洗浄し、そして次に、β−メルカプトエタノール（Sigma, St. Louis, MO）含有ＬＤＳサンプル緩衝液（Invitrogen）による変性（５分間、９５℃）により溶出した。サンプルを電気泳動し、ニトロセルロースに移し、ＨＲＰ−結合マウス抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Jackson ImmunoResearch）を用いてブロットした。バンドを、SuperSignal Pico化学発光基質(Thermo Fisher Scientific)及び ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare)を用いて可視化した。
【０５４６】
インビボ有効性研究。Jackson Laboratoryで行われたインビボ研究が再考され、そしてInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)により承認された。インビボ研究は、Regierungs-prasidium Freiburg, Germanyにより再考され、承認されたOncotest GmbHで行われ、そしてGerman Amimal Welfare Actのガイドラインに従って行われた。
【０５４７】
インビボ異種移植研究。Jackson Laboratoryでの１組の異種移植研究によれば、生後６−８週の雌ＮＵ／Ｊ（ＪＡＸ＃２０１９）マウスを、血清フリー媒体中、Matrigel（登録商標）により１：１で懸濁された5 X 106 NCI-H292細胞(ATCC)により、右後肢脇腹に皮下播種した。臨床学的観察、体重及びデジタルカリパス腫瘍体積測定を、腫瘍が測定可能になるとすぐに、週３回、行った。動物を、約１５０ｍｍ3−２００ｍｍ3の平均腫瘍体積を有するコホート（１２匹のマウス／群）において適合する腫瘍サイズごとにランク付けし、そして治療を開始した。動物を、４週間、毎週、静脈内治療した。腫瘍を、研究の期間、週２度、カリパスにより測定した。血漿を、１，８，２４，７２時間で、群当たり３匹のマウスからＫ2ＥＤＴＡに採取し、血液採取をコホート内のマウス間で変更した。群当たり４匹のマウスを、３日目、安楽死し、そして腫瘍を集め、そして分析のために即座に凍結した。
【０５４８】
ＬＸＦＡ６７７異種移植片モデルを用いての別の組の異種移植研究を、インフォームドコンセント後、主要患者材料から、Oncotest GmbHで確立した。異種移植片を、無胸腺ＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスにおいて皮下増殖し、そして１００−３００ｍｍ3の腫瘍体積に達した後、ランダム化した。マウス（１２匹／群）を、週１度、抗体により腹腔内処理し、そして腫瘍を、週３度、カリパスにより測定した。血液を週１度、群当たり３匹のマウスから集め、そして採血を、コホート内のマウス間で変更した。群当たり４匹のマウスを、３日目、安楽死し、そして腫瘍を集め、そして即座に、分析のために凍結した。
【０５４９】
免疫組織化学。異種移植片腫瘍及び肝臓のサンプルを切断した（５μｍ）。スライドを脱パラフィンし、そして蒸留水に再水和化し、続いてクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（Thermo Scientific）により取得した。内因性ペルオキシダーゼを、０．３％過酸化水素によりクエンチした。切片を、アビジン／ビオチンブロッキングキット（Vector Laboratoried）、続いて３％ＢＳＡによりブロックした。切片を、ビオチン結合ロバ抗−ヒトＩｇＧ（Jackson）抗体により、ABC Elite Detectionキット（Vecter Laboratories）を用いて染色し、そしてDAB（Pierce Scientific）により可視化した。スライドを、ヘマトキシリンにより対比染色し、脱水し、クリアランスし、そしてカバーガラスを取り除いた。染色された切片を、明視野範囲（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ７５０）及びLAS EZソフトウェア(Leica Application Suite)を用いて画像化した。
【０５５０】
薬物動態：血漿薬物動態パラメーターを、各時点で各群についての個々の動物濃度のプーリングを伴って、スパーズサンプリング（Phoenix WinNonlin, v 5.2; Pharsight; Mountain View, CA）による非コンパートメント分析を用いて、セツキシマブ又は活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体濃度から誘導した。値は、推定値の標準誤差を伴って、人口推定値として報告される。
【０５５１】
実施例２．活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の調製
本明細書に記載される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、抗−ＥＧＦＲ抗体セツキシマブから誘導される抗体又は抗原−結合フラグメントを包含する。セツキシマブは、結腸直腸及び頭頸部癌の治療のために承認されている、十分に特徴づけられた治療抗体である。Ｐｂ−１２０４として本明細書において言及される１つのセツキシマブ基材の活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体を、Ｌ鎖のＮ末端に２１個の長さのアミノ酸の結合ペプチド、すなわちマスキング部分を付加することにより構築した（図２Ａ）。マスクを、ｕＰＡ、ＭＴ−ＳＰ１又はレグマイン特異的基質配列である、８個の長さの残基配列を担持する２６個の長さのアミノ酸を通して抗体に結合した。Ｐｂ−１２０４活性化可能抗体（１２０４基質として又は単純には１２０４として本明細書において言及される）内の基質に関する種々のプロテアーゼ（ｕＰＡ、ＭＴ−ＳＰ１、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）及び／又はトロンビン）の効率、切断速度及び選択性が、図９Ａ−９Ｄに示されている。
【０５５２】
異なったプロテアーゼによるＰｂ−１２０４の切断の効率及び特異性を評論した。Ｐｂ−１２０４は、ヒトMT-SP1 (2200 M-1 s-1 ± 470 M-1 s-1)、ヒトuPA (530 M-1 s-1 ± 40 M-1 s-1)、及びレグマインにより効果的に切断された。しかしながら、Ｐｂ−１２０４は、ｔＰＡ又はプラスミン、ＡＤＡＭ９，１０及び１７、カリクレイン５及び７によっては切断されなかった。Ｐｂ−１２０４を、ほぼ完全に消化し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動及びＮ−末端配列決定により分析した（図２Ｃ及び５Ｂ）。切断された生成物のＮ−末端配列は、３種のプロテアーゼについての予測される切断部位を示した。ＭＴ−ＳＰ１及びｕＰＡは同じＰ１部位でＰｂ−１２０４基質配列を切断し、そして同じ分子量のＬ鎖生成物を生成した。レグマインによる切断は、３個のアミノ酸、短かった、遅く移動するＬ鎖を生成した。
【０５５３】
実施例３．活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体のインビトロ活性
セツキシマブ、Ｐｂ−１２０４、及びｕＰＡにより完全に消化されたＰｂ−１２０４の相対的インビトロ活性を、次に評価した。ＥＧＦＲへのＰｂ−１２０４の結合を、セツキシマブに対して２３倍、相対的低め、これは、０．０２ｎＭに比べて０．３６ｎＭの見掛けＫdを示す（５Ｃ）。完全に活性化されたＰｂ−１２０４及びセツキシマブの見掛けＫdは同一であった（０．０２ｎＭ）。Ｈ２９２細胞増殖に対するＰｂ−１２０４の阻害活性は、セツキシマブに対して、９９０倍、低められた（それぞれ、ＩＣ50  ４６．６ｎＭ及び０．０５ｎＭ；図２Ｄ）。活性化されると、Ｐｂ−１２０４は、セツキシマブ（ＩＣ50  ０．０７ｎＭ）に匹敵する阻害性を示した。
【０５５４】
実施例４．活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体のインビボ分布
Ｐｂ−１２０４切断に敏感なタンパク質分解活性のインビボ分布を評価するために、近赤外蛍光自己消光イメージング（ＩＱ）プローブを使用した。Ｐｂ−１２０４の基質配列を担持するＩＱプローブ（ＩＱ−１２０４；図３Ａ）、及び基質配列を伴わないでペプチドリンカーを担持する負の対象ＩＱプローブ（ＩＱ−ＮＳＵＢ）を、ＨＴ２９腫瘍担持のマウスに注射した。本明細書において使用される用語「ＮＳＵＢ」とは、グリシン及びセリン残基を含むが、しかしプロテアーゼ切断に対して敏感ではないアミノ酸基質配列を言及する。ＩＱ−１２０４の注射の１時間後、そのイメージングは、腫瘍部位に限定される蛍光を示した（図３Ｂ）。蛍光標識されたＰｂ−１２０４による注射の４８時間後、それらのマウスの同時イメージングは、ＩＱ−１２０４と同一の蛍光分布を示し、そして腫瘍に制限された。蛍光は、ＩＱ−ＮＳＵＢ及び蛍光標識されたＰｂ−ＮＳＵＢ陰性対照により注射された動物においては検出されなかった。注射の７日後、治療されたマウスからの腫瘍及び肝臓サンプルにおける活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の局在化を、免疫蛍光染色を用いて、評価した。Ｐｂ−１２０４により注射された動物の腫瘍は、上皮細胞上の膜蛍光染色を示したが、ところが染色は、Ｐｂ−ＮＳＵＢにより注射されたマウスからの腫瘍においては検出されなかった（図３Ｃ及び３Ｄ）。染色は、Ｐｂ−１２０４又はＰｂ−ＮＳＵＢにより治療された動物からの肝臓サンプルには検出されなかった（図６Ａ及び６Ｂ）。それらの結果は、腫瘍部位に関連するタンパク質分解活性が１２０４基質配列を特異的に切断することを示唆する。基質配列の切断は、その標的物への抗体の結合及び腫瘍部位での抗体の蓄積を可能にする。
【０５５５】
実施例５．異種移植モデルにおける活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の分析
ＥＧＦＲ−依存性腫瘍増殖に対するＰｂ−１２０４の効果を、ＮＳＣＬＣ異種移植モデルＨ２９２を用いて調べた。腫瘍退縮が、Ｐｂ−１２０４処理された群及びセツキシマブ対照処理された群において見られた（図４Ａ）。それらの処理群間の平均腫瘍体積は、研究終了（２０目）で、統計学的に異ならず、このことは、Ｐｂ−１２０４がセツキシマブと同程度に有効であったことを示唆する。Ｐｂ−ＮＳＵＢ対照により処理されたマウスには、統計学的に有意な腫瘍低下は見られなかった。サブセットのマウス（ｎ＝４）においては、血漿サンプルが、マウスが殺され、そして腫瘍が取り出される時点である、７２時間までの異なった時点で集められた。Ｐｂ−１２０４の循環濃度はセツキシマブ及びＰｂ−ＮＳＵＢ濃度よりも高いにもかかわらず、Pb-1204 (2.2% ± 0.2) 及びPb-NSUB (3.9% ± 0.3)の得られるＥＧＦＲ結合活性は、セツキシマブ（９５．６％±３．５；図４Ｂ）に比べて、限界であった。腫瘍に見出されるＰｂ−１２０４、Ｐｂ−ＮＳＵＢ及びセツキシマブの濃度は、同等であった。それらの腫瘍からの溶解物のウェルターンブロット分析は、Ｐｂ−１２０４の有意な画分が活性化されたが、ところがＰｂ−ＮＳＵＢは損なわれないまま及び活性化されないままであったことを示した。予想通り、腫瘍に見出されるＰｂ−１２０４（５１．６％±０．８）のＥＧＦＲ結合活性は、血漿におけるその活性又はＰｂ−ＮＳＵＢ（１８．２％±０．３；図４Ｃ）の結合活性よりも高かった。
【０５５６】
次に、セツキシマブに対する単一用量のＰｂ−１２０４の活性を、患者由来の非小細胞肺癌腫瘍異種移植片モデル（ＬＸＦＡ６７７）においても決定した。活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体及び抗体は、腫瘍増殖の阻害で、均等に有効であった。２１日目で、セツキシマブは、９６％、腫瘍増殖を阻害し、そしてＰｂ−１２０４は１００％阻害した（図４Ｄ）。セツキシマブ及びＰｂ−１２０４の血漿濃度は、同一の暴露（３３３１μｇ／ｍｌ×日）下で、研究を通して同等であった（図７Ｂ）。血漿におけるＥＧＦＲ結合活性濃度は、セツキシマブについての抗体の濃度と同等であった。しかしながら、Ｐｂ−１２０４に関しては、ＥＧＦＲ結合活性の濃度は、循環する活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の合計濃度に比べて、非常に低められた。Ｐｂ−１２０４（１２１４μｇ／ｍｌ×日）のＥＧＦＲ結合についての暴露（１−２８日）は、循環する活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の合計濃度についての暴露の３６％を表した。処理の７２時間後、サブセットのマウス（ｎ＝４）からの腫瘍を切除し、そして活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体、及び抗体濃度及び活性について評価した。腫瘍におけるＰｂ−１２０４の平均濃度は、セツキシマブの濃度に等しかった。腫瘍に見出される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の相当画分（３５±４％）が、ＥＧＦＲ結合活性を示した。
【０５５７】
要約すると、２種の細菌表示スクリーニングプラットフォームの開発を通して、セツキシマブのための阻害結合ペプチド、すなわちマウス、及びプロテアーゼＭＴ−ＳＰ１、uＰＡ及びレグマインのための新規ペプチド基質を同定した。新規ペプチド基質を担持する柔軟ペプチドリンカーを通してＬ鎖のＮ−末端に阻害ペプチドを連結するよう、親抗体を修飾した。この活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体を、Ｐｂ−１２０４と命名した。Ｐｂ−１２０４のインビトロ特徴化は、マスキングペプチドが、セツキシマブに比べて、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の活性を相当に阻害したことを示す。基質含有リンカーは、ＭＴ−ＳＰ１、ｕＰＡ及びレグマインによる活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の特異的活性化を可能し、そして活性化されると、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブに等しい活性を示した。インビボで、Ｐｄ−１２０４は、循環において、及び正常組織において安定して存続するが、しかし異種移植片腫瘍においては効果的に活性化された。Ｐｂ−１２０４の特異的腫瘍活性化は、セツキシマブと同等である抗−腫瘍効果を導いた。
【０５５８】
従って、本明細書に記載される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体は、標的物介在性毒性を示す大部分の抗体療法の治療窓の改善において有用である。さらに、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の使用は、関連毒性のために従来の抗体を用いて考えられ得ない標的物に向けられる癌治療の開発を可能にする。ことにより、癌標的範囲を拡大する。
【０５５９】
実施例６．非ヒト霊長類モデルにおける活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の分析
セツキシマブ投与されたヒト及び非ヒト霊長類に見られる毒性の中で、皮膚発疹、例えば顔及び上幹の丘疹膿疱性発疹、及び乾燥肌及び敏感肌が存在する。本明細書に記載される研究によれば、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５を、非ヒト霊長類動物モデルを用いて評価した。手短には、３匹の雌カニクイザルの３群を、それぞれセツキシマブ（すなわち、変性されていないセツキシマブ）、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５又はＰｂ−ＮＳＵＢ（すなわち、３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ５、プロテアーゼ切断に対して敏感ではないＮＳＵＢ配列を含む活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体）により静脈内（ＩＶ）投与した。４０ｍｇ／ｋｇの負荷用量を投与し（５日間にわたって、２時間の点滴を３回）、続いて２５ｍｇ／ｋｇの用量を毎週投与した（週当たり２時間の点滴を２回）。動物は、５週間にわたって投与され（最後の投与は３２日目に行われた）、続いて４週間の無治療回復期を伴う。すべての動物は皮膚発疹について毎日、試験された。すべての動物はまた、臨床化学及び血液分析、並びにＴＫ及び免疫原性の対象となった。図１２及び表４に示されるように、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５を投与された動物は、セツキシマブを投与されたそれらの動物に比べて、検出できる発疹を示さなかった。さらに、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５を投与された動物あ、セツキシマブを投与されたそれらの動物に比べて、低められた皮膚科学的毒性を示した。
【０５６０】
【表１０】
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【０５６１】
０＝紅斑なし
１＝わずかな紅斑
２＝明確な紅斑
３＝中程度の重度紅斑
４＝わずかな痂皮形成の重度の紅班
（ａ）＝この動物上に示される「赤み」は、他の２匹の動物において示される「発疹」の典型ではない。
【０５６２】
初期の４０ｍｇ／ｋｇの負荷用量の後、毎週、２５ｍｇ／ｋｇを受けたカニクイザルの血液に検出されるセツキシマブ及び３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５のレベルの比較を、図１３Ａ−１３Ｄに示す。
【０５６３】
カニクイザルの皮膚におけるヒトＩｇＧのＩＨＣ分析は、皮膚においけるセツキシマブの有意な結合を示したが、しかし皮膚における抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５の検出できる結合は示さなかった。
【０５６４】
時間の経路と共に血清濃度を比較する薬物動態試験は、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５の半減期が６．６±０．５日であり、ところがセツキシマブの半減期は、３．２±０．４日であったことを示した。セツキシマブの半減期に比較して、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２４ｖ５の半減期を示す典型的な研究が図１９に示される。セツキシマブの半減期は、前に報告された値に類似した。抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５の薬物動態は、全身性抗体−介在性クリアランス（正常組織におけるＥＧＦＲ）の欠如と一致する。
【０５６５】
実施例７．Ａ１１活性部位抗体による腫瘍組織のイメージング及び免疫組織化学染色
本明細書に記載される研究は、本明細書に記載される活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体の標的プロテアーゼ、特にＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼが腫瘍組織において活性であることを示すために企画された。
【０５６６】
図１４Ａ−１４Ｃに示されるように、Ａ１１活性部位抗体による腫瘍組織のインビボイメージング及び免疫組織化学（ＩＨＣ）染色（Darragh et al., “Tumor detection by imaging proteolytic activity.” Cancer Res. 70 (2010): 1505-1512）は、Ｈ２９２異種移植片モデルにおいて活性ＭＴ−ＳＰ１の存在を確認した。Ａ１１は、マトリプターゼとも呼ばれる、ＭＴ−ＡＰ１プロテアーゼの活性部位に対して特異的に結合する抗体である。
【０５６７】
実施例８．抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインサイチュイメージング
この実施例は、開示される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の活性化及び結合のインサイチュイメージングの使用を記載する。結果は、開示される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体が組織により発現されるプロテアーゼにより活性化され、そしてその組織上のＥＧＦＲ標的物を結合することを示す。
【０５６８】
活性化可能抗体のインサイチュイメージングは、細胞及び組織におけるプロテアーゼ活性を特徴づけるためのユニークアプローチを表す。この技法は、活性化可能抗体活性化、及び活性化可能抗体を切断できるプロテアーゼを発現する細胞及び組織の組織学的切片における標的物への結合の検証を可能にする。そのようなインサイチュアプローチの概略図は、図１５に提供される。
【０５６９】
活性化された抗体により認識される標的物と共に共局在する部位で活性化可能抗体を切断できる細胞又は組織による抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の活性化及び結合のインサイチュイメージング（また、本明細書においては、インサイチュイメージングとしても言及される）を、次の通りにして実施した：凍結された組織切片を、ガラススライド上に置いた。標識された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体（例えば、蛍光タグにより標識された）を含む溶液を、組織上に適用し、そして１５０ ｍＭ のＮａＣｌ、１００μＭの ＺｎＣｌ2、５ ｍＭ のＣａＣｌ2 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）のインキュベーション緩衝液下で、室温（約２２−２４℃）で１時間、インキュベートした；約１μｇ／ｍｌの濃度での活性化可能抗体。そのようなインキュベーションの条件は、例えば溶液のｐＨ（例えば、約ｐＨ７〜約ｐＨ８．５の範囲内）、インキュベーション温度（例えば、約２０℃〜約４０℃の範囲内、例えば室温又は３７℃）、インキュベーション時間（例えば、約１５分〜約１５０分の範囲内）、及び／又は活性化可能抗体の濃度（例えば、約０．０５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲内）を変えることにより、組織切片における切断剤の助けになるよう調節され得る。次に、組織を徹底的に洗浄し、結合されていない材料を除去し、そして検出可能標識を測定した。例えば、蛍光タグが使用される場合、組織を蛍光顕微鏡に置いた。組織上での活性化された抗体の検出は、組織が、活性化可能抗体を切断するプロテアーゼを発現し、そしてまた、活性化された抗体が結合するＥＧＦＲ標的物を発現したことを示唆する。
【０５７０】
活性化され、そして凍結されたヒト肺癌組織を結合する抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−C２２５v５の能力を、インサイチュイメージングを用いて評価した。活性化可能抗体を、Alexa  Fluor  ６８０（登録商標）（Invitorogen）により標識し、標識された活性化可能抗体３９５４−１２０４−C２２５v５−ＡＦ６８０を生成した。標識された活性化可能抗体を、上記のように、凍結されたヒト胚癌組織サンプルと共にインキュベートした。結果は、図１６、パネルAに示される。赤色蛍光組織画像は、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の組織由来のタンパク質分解性切断により活性化されたＣ２２５ｖ５抗体の結合を示す。組織染色の同一パターンを、図１６、パネルＢに示されるように、組織へのＥＧＦＲ抗体（モノクローナルウサギ抗−ＥＧＦＲ抗体、Cell Signaling）の暴露により検出した。パネルＡに示される蛍光シグナルを、図１６、パネルＣに示されるように、広範囲の阻害剤カクテルセットIII （539134, EMD Millipore, Billerica, MA）及び５０ｍＭのＥＤＴＡの１：１００希釈溶液による組織の前処理により阻害した。青色染色は、ＤＡＰＩ核染色を表す。
【０５７１】
図１７は、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５が広範囲のヒト腫瘍サンプルにおいて活性化可能であることを示す。第２列は、種々のヒト癌組織サンプルに関して、ＥＧＦＲ抗体（モノクローナルウサギ抗−ＥＧＦＲ抗体、Cell Signaling）により検出されるように、ＥＧＦＲ受容体の発現レベルを示す。第３列は、抗体Ａ１１により検出されるように、種々のヒト癌組織サンプルにおける活性マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の量を示す。第４及び５列は、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘ）組織染色（第４列）に比べて、ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインサイチュ活性化及び結合（第５列）の評価を表す。組織サンプルに結合するＥＧＦＲ、Ａ１１及びセツキシマブ抗体の量を測定する染色は、次のように０〜３＋を得点された：０、染色なし；１＋（すなわち、「＋」）、弱い染色；２＋（すなわち、「＋＋」）、中位の染色；及び３＋（すなわち、「＋＋＋」、強い染色。活性化可能抗体インサイチュイメージング染色得点は、セツキシマブ抗体染色との比較に基づき、そして次の通りに定義される：０、染色ない；１＋（すなわち、「＋」）、親抗体に比較して弱い染色；２＋（すなわち、「＋＋」）、親抗体に比較して中位の染色；及び３＋（すなわち、「＋＋＋」）、親抗体に類似する染色。図１７に示されるように、高レベルの活性マトリプターゼが、結腸直腸癌（ＣＲＣ）腫瘍からの９つのサンプルのうち８つのサンプルにおいて観察されており、そして高レベルの活性マトリプターゼが、１０の肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍のうち５つのサンプルに観察された。活性マトリプターゼは、隣接する健康な肺組織には観察されなかった。
【０５７２】
それらのデータは、本開示の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体、例えば活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５による治療のために適切な患者集団を、効果的且つ効率的に同定するか、又は他方では、細分する方法へのインサイチュイメージングの有用性を示唆する。例えば、それらのインサイチュイメージング技法を用いて、標的物（例えば、ＥＧＦＲ）、及び抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体（例えば、ＭＴ−ＳＰ１）の切断可能部分（ＣＭ）において基質切断するプロテアーゼの両者に対して陽性の患者は、試験される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定され得る。同様に、それらのインサイチュイメージング技法を用いて、標的物（例えば、ＥＧＦＲ）、及びＣＭ（例えば、ＭＴ−ＳＰ１）における基質を分解するプロテアーゼの何れか又は両者に対して陰性の患者は、別の形の治療（すなわち、試験される抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体による治療のために適切ではない）のための適切な候補体として同定される。いくつかの実施態様によれば、そのような患者は、治療のための適切な抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体（患者の部位で患者により切断されるＣＭを含む抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体）が同定されるまで、他の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体により試験され得る。
【０５７３】
実施例９．剤に結合される活性可能抗体
この実施例は、腫瘍増殖を阻害する本開示の活性化可能抗体−剤複合体の能力を示す。
【０５７４】
活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５は、Val-Cit-基礎のリンカー (K-lock C5-vc-PAB; Concortis Biosystems Corp., San Diego, CA)を介して、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、すなわち合成抗−分裂チューブリン重合阻害剤に結合され、活性化可能抗体−剤複合体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥが生成された。３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５及びセツキシマブに対する３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥのインビボ効能を、Ｈ２９２肺癌細胞系異種移植片マウスモデルを用いて試験した。そのＨ２９２異種移植片モデルは、血清フリー媒体下でMatrigel（登録商標）により１：１で懸濁された５ Ｘ １０6 ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞(ＡＴＣＣ)により、生後６−８週の雌ＮＵ／Ｊ（ＪＡＸ＃２０１９）の右後肢脇腹に皮下播種することにより確立された。腫瘍体積の測定は、腫瘍が測定可能になると、週３度（３×）行われた。動物は、約１５０ｍｍ3−２００ｍｍ3の平均腫瘍体積を有するコホート（８匹のマウス／群）において腫瘍サイズごとに分けられ、そして治療薬が次の通りに、０日で１度、群投与された：(a) １２．５ ｍｇ/ｋｇ の３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥ、静脈内適用される; (b) ２．５ ｍｇ/ｋｇ の３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥ、静脈内適用される; (c) １２．５ ｍｇ/ｋｇのリツキサン−ＭＭＡＥ (すなわち、リツキサン−ＭＭＡＥ; リツキサマブはGenentech, So. San Francisco, CAから入手できる)、静脈内適用される; (d) １２．５ ｍｇ/ｋｇ の３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５、静脈内適用される; (e) １２．５ ｍｇ/ｋｇのセツキシマブ, 腹腔内適用される; 又は(f) １２．５ ｍｇ/ｋｇの ＩＶＩｇ、腹腔内適用される。腫瘍は、研究の期間、週２度、カリパスにより測定された。
【０５７５】
図１８に示されるように、１２．５ｍｇ／ｋｇの活性化可能抗体−剤複合体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥの単回注射は、投与の２８日後、１２．５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブの単回注射（７８％の腫瘍減少率；ｐ＝０．０００００６）と同じように、１２．５ｍｇ／ｋｇのＩＶＩｇ（９２％の腫瘍減少率；ｐ＝０．００００００３）に匹敵有意な有効性を示した。３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥの有効性は、２８日で、この用量（ｐ＝０．０３）でセツキシマブの有効性よりも有意に高かった。削減効果を、２８日で、より低い用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）の３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥ（ｐ＝０．００７）について及び１２．５ｍｇ／ｋｇの用量のリツキサン−ＭＭＡＥ（ｐ＝０．００８）について記録した。統計学的に有意な効果は、１２．５ｍｇ／ｋｇ（２８日で、ｐ＝０．０６）で活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５について観察されなかった。
【０５７６】
同じＨ２９２異種移植片腫瘍モデルにおける追加の用量分画研究を行い、１２．５ｍｇ／ｋｇの単一用量で投与されるか、又は合計５回の用量でそれぞれ２．５ｍｇ／ｋｇの用量（合計１２．５ｍｇ／ｋｇの活性化可能抗体が研究にわたって投与された）で、週２度（０，３，７，１０及び１４日目で）投与されるセツキシマブ、及び活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥの活性を比較した。この用量分画研究は、同じ対照（１２．５ｍｇ／ｋｇのＩＶＩｇ）、及びＨ２９２異種移植片モデル、ＥＧＦＲ結合アッセイ、及び細胞培養及び増殖アッセイについて記載される方法を使用した。この用量分画研究によれば、活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥは、治療されたマウスにおける体重減少の欠如により証明されるように、十分に許容された。２０％以上の体重減少を有する一匹の対照動物を、２３日目で安楽死させたが、しかし他のすべての動物は、３５日目まで生存した。
【０５７７】
有意な抗−腫瘍活性が、下記表５に示されるように全ての活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥ及びセツキシマブ治療された群に見られ、ここで１００％以上の値は腫瘍の収縮を表す。
【０５７８】
【表１１】
2019108331.tif 000040
【０５７９】
１２．４ｍｇ／ｋｇの単一用量としてのセツキシマブは、８匹のマウスのうち８匹で、腫瘍静止又は腫瘍退縮をもたらし；しかしながら、この効果は８匹のマウスのうち６匹で短命であり、３５日目で腫瘍の再増殖の証拠を示した。２．５ｍｇ／ｋｇの分割用量としてのセツキシマブは同様に、すべての動物において腫瘍静止又は退縮をもたらし、、続いて３５日目までに、８匹のマウスのうち５匹において再増殖がもたらされた。１２．５ｍｇ／ｋｇの単一用量としての活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥの投与は、より顕著な抗−腫瘍効果を有し、７匹のマウスのうち７匹で腫瘍退縮をもたらし、３５日目まで腫瘍再増殖の証拠は存在しなかった。２．５ｍｇ／ｋｇの３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥの週２度の投与は、８匹のマウスのうち８匹で腫瘍退縮をもたらし、それらのマウスのうち一匹のみが３５日目で腫瘍再増殖の証拠を示した。３５日での腫瘍体積の統計学的分析は、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥを用いて両投薬計画は、分割用量のセツキシマブより有意により有効であったことを示した（−方向ＡＮＯＶＡ、各場合、ｐ＜０．００５）。セツキシマブ単一用量群に比較する場合、同じことが真であった。３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥを用いる２種の投薬計画の活性間には、３５日目、有意な差異は存在しなかった（両側ｔ検出を用いてｐ＝０．２２）。
【０５８０】
結論として、活性化可能抗−ＥＧＦＲ抗体−剤複合体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥは、同じ用量のセツキシマブよりも卓越した活性を有すると共に、Ｈ２９２腫瘍モデルにおいて強固で且つ、耐久性のある効能を示した。活性化可能抗体−剤複合体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥは、１２．５ｍｇ／ｋｇの単一用量、又は合計５回の投与のために週２度、与えられる２．５ｍｇ／ｋｇの反復用量として投与される場合、同等に有効であった。
【０５８１】
実施例１０．剤に結合される活性化可能抗体のインビトロ特徴化
この実施例は、ＥＧＦＲへの結合を維持し、そして培養物におけるＨ２９２細胞の増殖阻害する、本開示の活性化可能抗体−剤複合体の能力を記載する。
【０５８２】
抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５を、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、すなわち本明細書における実施例に記載されるような合成抗−分裂チューブリン重合阻害剤に結合し、活性化可能抗体−剤複合体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥを生成した。抗体に対する薬物の平均比（ＤＡＲ）は、３．４４であった。
【０５８３】
ＥＬＩＳＡに基づくアッセイにおいてＥＧＦＲを結合し、そして細胞培養物におけるＨ２９２細胞増殖を阻害する、次の化合物の能力を決定した：抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体−剤複合体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥ；ｕＰＡにより活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体−剤複合体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＭＭＡＥ；抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５；ｕＰＡにより活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５；及び抗−ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５ｖ５。活性化可能抗体及び活性化可能抗体−剤複合体の活性化を、トリス（ｐＨ８．５）中、活性部位−滴定されたＰＡ（５００ｎＭ）と共に３７℃で一晩、消化することによりもたらし；活性化を、ＣＥ分析（Labchip  GXに）により測定した。ｕＰＡ−活性化された活性可能抗体及びｕＰＡ−活性化された活性化可能抗体−剤複合体を、プロテインＡを用いて精製し、そして研究の前、４℃で貯蔵した。
【０５８４】
ＥＬＩＳＡに基づく結合実験のために、ＥＧＦＲ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Sysutems）を、９６−ウェルＥＬＩＳＡのウェルに被覆した。化合物の１：３連続希釈溶液を、プレートに適用し、そして結合を可能にした。結合される抗体を、抗−ヒトＦ（ａｂ′）2ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）により可視化し、そして発色性基質ＴＭＢにより発色した。図２０Ａは、活性化可能抗体へのＭＭＡＥの結合が、ＥＧＦＲへの活性化可能抗体の結合を阻害するマスキング部分の能力に干渉しなかったことを示す。さらに、ｕＰＡ−活性化可能抗体へのＭＭＡＥの結合は、ＥＧＦＲに結合する、活性化された抗体の能力を変えなかった。
【０５８５】
細胞増殖アッセイのために、ヒト肺癌細胞系Ｈ２９２を、ＡＴＣＣから入手した。Ｈ２９２細胞を、空気中で５％ＣＯ2の雰囲気下で、３７℃で完全培地（１０％ウシ胎児血清により補充されたＲＰＭＩ−１６４０）において増殖した。Ｈ２９２細胞を、対数増殖期、収穫し、完全培地に再懸濁し、そして９６−ウェル白色チムニープレートに、ウェル当たり１０，０００個の細胞の密度でプレートした。一晩のインキュベーションに続いて、１０μｇ／ｍｌの各化合物から出発し、そして実質的に０μｇ／ｍｌの各化合物で終結する、１０−ポイント１：３連続希釈溶液を、培養における細胞に、反復して添加した。細胞を３日間、培養し、そして細胞生存率を、CellTiterGlo (Promega)及びルミノメーター（Tecan）を用いて、その製造業者のプロトコルに従って測定した。データは、Prism GraphPadを用いて分析された。図２０Ｂは、ｕＰＡ−活性化された活性化可能抗体へのＭＭＡＥの結合が活性化された抗体の細胞殺害活性を高めることを示す。さらに、活性化可能抗体へのＭＭＡＥの結合は、切断されていない活性化可能抗体による細胞殺害を阻害するマスキング部分の能力を干渉しなかった。
【０５８６】
実施例１１．抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインサイチュイメージング
この実施例は、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の活性化及び結合のために患者の組織サンプルをスクリーニングするためへのインサイチュイメージングアプローチの使用を記載する。結果は、本開示の抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体が癌患者の組織により発現されるプロテアーゼにより活性化され、そしてその組織上のＥＧＦＲ受容体に結合できることを示唆する。
【０５８７】
ヒト結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び肝臓転移組織を、標識されたＥＧＦＲ及びＡ１１抗体により、凍結組織を、それぞれ１μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌの濃度で１時間、処理することにより、ＥＧＦＲ及びＭＴ−ＳＰ１発現についてプロファイルした（図２１及び表６−８）。さらに、活性化され、そしてヒト腫瘍又は肝臓転移組織を結合する、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５V５の能力を、インサイチュイメージングを用いて評価した。活性化可能抗体を、上記のようにしてAlexa  Fluor（登録商標）680（Invitrogen）により標識した。得られる活性化可能抗体３９５４−１２０４−C２２５Ｖ５−ＡＦ６８０（また、１２０４−Ｃ２２５ｖ５又は１２０４−Ｃ２２５としても言及される）を、本明細書に記載されるインサイチュイメージングのプロトコルに従って、凍結された患者組織サンプルと共にインキュベートした。図２２は、活性化し、そして抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体を結合する癌患者の組織サンプルの能力についての結果を、表６−８に要約する。組織サンプルに結合するＥＧＦＲ及びＡ１１抗体の量を測定するＩＨＣ染色を、０〜３に得点化した：０、染色なし：１＋（すなわら、「＋」）、弱い染色；２＋（すなわち、「＋＋」）、中位の染色：及び３＋（すなわち、「＋＋＋」）、強い染色。インサイチュイメージング染色得点化は、セツキシマブ抗体染色との比較に基づき、そして次の通りに定義される：０、染色なし；１＋（すなわち、「＋」）、親抗体に比べて弱い染色；２＋（すなわち、「＋＋」）、親抗体に比べて中位の染色；及び３＋（すなわち、「＋＋＋」）、親抗体に類似する染色。
【０５８８】
【表１２】
2019108331.tif 000041
【０５８９】
＊抗体結合の量を測定するＩＨＣ染色は０〜３＋の得点を付けた：０、染色ない；１＋、弱い染色；２＋、中位の染色；及び３＋、強い染色。
＊＊ＩＨＺ染色得点化は、親抗体染色との比較に基づく：０、染色なし；１＋、親抗体に比較して弱い染色；２＋親抗体に比較して中位の染色；及び３＋、親抗体に類似する染色。
【０５９０】
【表１３】
2019108331.tif 000042
【０５９１】
＊抗体結合の量を測定するＩＨＣ染色は０〜３＋の得点を付けた：０、染色ない；１＋、弱い染色；２＋、中位の染色；及び３＋、強い染色。
＊＊ＩＨＺ染色得点化は、親抗体染色との比較に基づく：０、染色なし；１＋、親抗体に比較して弱い染色；２＋親抗体に比較して中位の染色；及び３＋、親抗体に類似する染色。
【０５９２】
【表１４】
2019108331.tif 000043
【０５９３】
【表１５】
2019108331.tif 000044
【０５９４】
【表１６】
2019108331.tif 000045
【０５９５】
＊抗体結合の量を測定するＩＨＣ染色は０〜３＋の得点を付けた：０、染色ない；１＋、弱い染色；２＋、中位の染色；及び３＋、強い染色。
＊＊ＩＨＺ染色得点化は、親抗体染色との比較に基づく：０、染色なし；１＋、親抗体に比較して弱い染色；２＋親抗体に比較して中位の染色；及び３＋、親抗体に類似する染色。
【０５９６】
実施例１２．抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインサイチュイメージングの定量化
この実施例は、抗−ＥＧＦＲ抗体ＩＨＣ及びＡ１１抗体ＩＨＣと組合して、エクスビボで生物学的組織に対する抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の活性化及び結合のインサイチュイメージングを記載する。市販の抗−ＥＧＦＲ抗体ＩＨＣの使用は、組織におけるＥＧＦＲ発現に対する親抗体（例えば、セツキシマブ）及び抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の染色の標準化を可能にする。ＥＧＦＲ抗体に対する同時染色はまた、ＥＧＦＲ発現に対して標準化されたセツキシマブ染色に比較して抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインサイチュイメージングの定性的定量化も可能にする。蛍光シグナルの定量化を、調査イメージングのための生物分析ソフトフェア、例えば、MetaMorphを用いて行うことができる。ＭＴ−ＳＰ１の活性部位を特異的に認識する抗体（抗体Ａ１１）による組織の染色をまた実施し、ＭＴ−ＳＰ１、すなわち活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５及び ３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ６の基質をタンパク質分解的に分解する酸素の活性をモニターすることができる。
【０５９７】
ＥＧＦＲ  ＩＨＣと組合して行われる細胞又は組織による抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体切断のインサイチュイメージングの定量化を次の通りに行った：凍結組織切片をガラススライド上に置き、そして１×ＰＢＳ−Ｔによりすすいだ。標識された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体（例えば、蛍光タグにより標識されている）を含む溶液を、組織上に適用し、そして例えば室温で１時間、インキュベーション緩衝液（５０ ｍＭの ＮａＣｌ、１００μＭの ＺｎＣｌ2、５ ｍＭ のＣａＣｌ2 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ７．４）下でインキュベートし；約１μｇ／ｍｌの濃度での活性化可能抗体。次に、組織を、１×ＰＢＳ−Ｔによりすすぎ、結合されていない材料を除去し、そして内因性ＩｇＧを、３％ＢＳＡによりブロックした。切片を、市販の抗−Rabbit、抗−ＥＧＦＲ抗体及び標識されたＡ１１抗体（例えば、蛍光タグにより標識された）と共に、室温で１時間インキュベートした。すすいだ後、蛍光タグにより標識された二次抗体抗−Rabbit  ＩｇＧを適用し、そして切片上で、５μｇ／ｍｌの濃度で３０分間、室温でインキュベートし、一次抗体を増幅した。切片をすすぎ、そして検出可能標識を測定した。例えば、蛍光タグが使用される場合、組織を蛍光顕微鏡に提出した。インサイチュ下で活性化され、そして受容体に結合する抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体の能力を、
次の等式により定量化した：
【０５９８】
【数２】
2019108331.tif 000046
【０５９９】
ＰｂＡ＝親抗体（例えば、セツキシマブ）に比較して抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体活性化及び結合の百分率、Ａｂ  ＥＧＦＲ＝セツキシマブ結合を伴って切片上のＥＧＦＲ  ＩＨＣの染色強度、Ｐｂ  ＥＧＦＲ＝抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体インサイチュイメージングを伴っての切片上のＥＧＦＲ  ＩＨＣの染色強度、Ａｂインサイチュイメージング＝セツキシマブ結合の強度、Ｐｂインサイチュイメージング＝抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体結合の強度。
【０６００】
ヒト食道及び膵臓癌組織サンプルを、ＥＧＦＲ及びＭＴ−ＳＰ１発現についてプロファイリングし；活性化され、そしてヒト腫瘍を結合する、抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５の能力を、インサイチュイメージングを用いて評価した。活性化可能抗体を、上記のようにしてAlexa  Fluor（登録商標）680（Invitrogen）により標識した。得られる活性化可能抗体３９５４−１２０４−C２２５Ｖ５−ＡＦ６８０を、本明細書に記載されるインサイチュイメージングのプロトコルに従って、凍結された患者組織サンプルと共にインキュベートした。さらに、ＥＧＦＲ及びAlexa  Fluor（登録商標）750標識Ａ１１抗体が、それぞれ、１ μｇ/ｍｌ及び５ μｇ/ｍｌの濃度で、１時間、凍結された組織を処理することにより使用された。図２３は、活性化し、そして抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体を結合する食道癌組織の能力についての結果を示す。活性化し、そして抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体を結合する食道及び膵臓癌患者の組織サンプルの能力に基づく結果が表９に要約される。組織サンプルに結合するセツキシマブ、ＥＧＦＲ及びＡ１１抗体の量を測定するＩＨＣ染色を、０〜３に得点化した：０、染色なし：１＋（すなわら、「＋」）、弱い染色；２＋（すなわち、「＋＋」）、中位の染色：及び３＋（すなわち、「＋＋＋」）、強い染色。抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体染色のインサイチュイメージングを、ＥＧＦＲ染色に対して標準化されたセツキシマブ抗体染色との比較に基づいて定量化し、そして上記等式により計算した。
【０６０１】
【表１７】
2019108331.tif 000047
【０６０２】
＊抗体結合の量を測定するＩＨＣ染色は０〜３＋の得点を付けた：０、染色ない；１＋、弱い染色；２＋、中位の染色；及び３＋、強い染色。
＊＊３９５４−１２０４−Ｃ２２５インサイチュイメージング得点化は、ＥＧＦＲ  ＩＨＣ染色に対して標準化された親抗体染色との比較に基づき、そして活性化の％として同定される：０、活性化なし；１００％活性化は、親抗体に対する染色に類似する染色をもたらす。
【０６０３】
図２３は、インサイチュイメージング、ＥＧＦＲ  ＩＨＣ及びＡ１１  ＩＨＣの三重染色を示す一連の写真である。像の上段は、ＥＧＦＲ発現、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰｌ１）の活性、及びインサイチュイメージング条件下でのセツキシマブの結合を示す（左から右の方へ）単一の組織断片上で行われた染色を示す。像の下段は、ＥＧＦＲ発現、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の活性及び抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５のインサイチュイメージングを示す（左から右の方へ）、単一の組織切片上で行われた染色を示す。図２３における像の右列は、セツキシマブ（上方像）、及びインサイチュイメージング条件下で組織由来のタンパク質分解切断により活性化された抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体（下方像）の結合を比較する。組織染色の同一パターンが、図２３、像の左段に示されるように、組織に市販の抗−ＥＧＦＲ抗体を暴露することにより検出された。図２３（像の中間段）は、ＥＧＦＲ発現とのマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）活性の共局在化を示す。本明細書において使用される場合、用語「共局在化」とは、ＥＧＦＲ及び／又はＡ１１染色の何れかの重なり又は他の重なりを意味するものではなく、そして用語「共局在化」とは、ＥＧＦＲ−発現患者組織におけるＭＴ−ＳＰ１活性の存在を示すために使用される。全体的に、それらのデータは、ヒト食道癌組織サンプルによる抗−ＥＧＦＲ抗体３９５４−１２０４−Ｃ２５５ｖ５の約９０％活性化を示す。
【０６０４】
他の実施態様
本発明はその詳細な説明と共に記載されて来たが、前述の記載は例示的であり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の局面、利点及び改変は、以下の範囲内である。
【図１Ａ】
2019108331.tif 000048
【図１Ｂ】
2019108331.tif 000049
【図２】
2019108331.tif 000050
【図３ａ】
2019108331.tif 000051
【図３ｂ】
2019108331.tif 000052
【図３ｃ−ｄ】
2019108331.tif 000053
【図３Ｅ】
2019108331.tif 000054
【図３Ｆ】
2019108331.tif 000055
【図３Ｇ】
2019108331.tif 000056
【図３Ｈ】
2019108331.tif 000057
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月4日(2019.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を、活性化された状態下で結合する活性化可能抗体であって、以下の：
ＥＧＦＲに対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、ここで、前記ＡＢは、（ｉ）配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３４から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列、又は（ｉｉ）配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列及び配列番号６８を含むＬ鎖アミノ酸配列を含み；
ＥＧＦＲに対する切断されていない状態での前記活性化可能抗体の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、ここで、前記マスキング部分はアミノ酸配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１４）を含み；及び
前記ＡＢと結合した切断可能部分（ＣＭ）、ここで、前記ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり、そしてアミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号１３）を含む、を含み、
ここで、前記活性化可能抗体が、切断されていない状態で、次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置：MM-CM-AB又はAB-CM-MMを有する、活性化可能抗体。
【外国語明細書】
2019108331000001.pdf