(57)【要約】      （修正有）【課題】発酵食品中における添加プロテオグリカンの経時的減少の抑制、安定的に保持するための技術の提供。【解決手段】マイクロカプセル化されたプロテオグリカン２であり食品添加用であるカプセル化プロテオグリカン１０。粒径が２５μｍ以下であるカプセル化プロテオグリカン１０。微生物に対して難分解性の物質、または微生物由来酵素に対して難分解性の物質が膜物質５として用いられているカプセル化プロテオグリカン１０。生味噌環境下（食塩１０重量％以上含有、酵素・アルコール成分含有、酸性）において、添加後１４日時点で添加されたプロテオグリカンの３０重量％以上が残存している安定性を有しているカプセル化プロテオグリカン１０。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロカプセル化されたプロテオグリカンであり、食品添加用であることを特徴とする、カプセル化プロテオグリカン。
【請求項２】
粒径が２５μｍ以下であることを特徴とする、請求項１に記載のカプセル化プロテオグリカン。
【請求項３】
粒径が１０μｍ以下であることを特徴とする、請求項１に記載のカプセル化プロテオグリカン。
【請求項４】
微生物に対して難分解性の物質、または微生物由来酵素に対して難分解性の物質が膜物質として用いられていることを特徴とする、請求項１、２、３のいずれかに記載のカプセル化プロテオグリカン。
【請求項５】
膜物質として疎水性物質が用いられていることを特徴とする、請求項１、２、３、４のいずれかに記載のカプセル化プロテオグリカン。
【請求項６】
膜物質としてツェインが用いられていることを特徴とする、請求項１、２、３、４のいずれかに記載のカプセル化プロテオグリカン。
【請求項７】
生味噌環境下（食塩１０重量％以上含有、酵素・アルコール成分含有、酸性）において、添加後１４日時点で添加されたプロテオグリカンの３０重量％以上が残存している程度の安定性を有していることを特徴とする、請求項１、２、３、４、５、６のいずれかに記載のカプセル化プロテオグリカン。
【請求項８】
生味噌環境下（食塩１０重量％以上含有、酵素・アルコール成分含有、酸性）において、添加後３０日時点で添加されたプロテオグリカンの３０重量％以上が残存している程度の安定性を有していることを特徴とする、請求項１、２、３、４、５、６、７のいずれかに記載のカプセル化プロテオグリカン。
【請求項９】
コアセルベーション法によりプロテオグリカンをマイクロカプセル化することを特徴とする、食品添加用カプセル化プロテオグリカン製造方法。
【請求項１０】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８のいずれかに記載のカプセル化プロテオグリカンが添加されていることを特徴とする、プロテオグリカン添加食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカプセル化プロテオグリカン、その製造方法、およびプロテオグリカン添加食品に係り、特に、発酵食品中における安定化技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカン（Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）は高等多細胞動物の皮膚や軟骨を由来とする糖とタンパク質の複合体であり、糖タンパク質の一種である。中心となるたんぱく質に多数の糖鎖が結合した構造を有し、糖鎖と糖鎖の間に水分を保持する機能がある。かかる機能に基づく保湿作用に加えプロテオグリカンには、細胞のよみがえり因子とされるＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、上皮細胞増殖因子）類似の作用や、抗炎症作用、骨代謝異常改善作用など、様々な機能の存在が明らかになっている。
【０００３】
プロテオグリカンは、抽出に有害な薬品が必要な上にコストが相当高かったこともあり、発見された１９７０年代以来、実用化できない期間が長期に亘った。しかし１９９０年代に、プロテオグリカンがサケ鼻軟骨に高濃度で存在することが青森県によって解明されたのに続き、弘前大学によって食用酢酸とアルコールのみによる抽出技術が確立した。現在では、高純度のプロテオグリカンを低コストで大量生産することができるようになり、食品や化粧品分野での産業創出につながっているとともに、国立大学法人弘前大学や出願人・青森県産業技術センターによる新たな効能の探索、産業での応用化等に関する研究が進められている（特許第６２６５３３５号、特許第６２５３０４７号、特許第６２１８７３２号、特許第６０９９７７７号、特許第６０７１５５８  号、特許第５９３３２６４号、特許第５６７８３９７号、特許第５４７０６１２号、特許第５２５２６２３号、特許第５１９４２５３  号、特許第４９８２８５２号、他）。
【０００４】
出願人や国立大学法人弘前大学以外にも、プロテオグリカンが言及された特許出願等はなされている。たとえば後掲特許文献１には、人の管腔表面の細胞成長促進のために用いられる組成物として、生分解性高分子製膜材によるマイクロカプセルが内部に分散している運搬体からなる組成物が開示されており、当該マイクロカプセルの芯材として、粘膜下層、骨髄、細胞外マトリックス、分離細胞外マトリックス構成要素、基底膜、コラーゲン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、糖タンパク質、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（乳酸グルコール複合）酸の適宜の組合せが用いられる、としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５３３０１５号公報「腔内組織工学のためのマイクロカプセル化された組成物」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のようにプロテオグリカンの産業化が進められる中、出願人は、プロテオグリカンを活用した高機能性食品の開発に取り組んでいる。その一テーマとして、味噌やシードル等の発酵食品におけるプロテオグリカン利用の可能性を検討しているが、これらの発酵食品に対してプロテオグリカンを添加すると、経時的にプロテオグリカンが減少することが確認された。これは、発酵食品中に存在する微生物由来の酵素による影響と考えられる。発酵食品おけるプロテオグリカンの経時的減少を抑制する技術が求められている。
【０００７】
そこで本発明が解決しようとする課題は、かかる従来技術の問題点を踏まえ、食品中、特に発酵食品中における添加プロテオグリカンの経時的減少を抑制し、安定的に保持するための技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者は上記課題について検討した結果、プロテオグリカンを食品に直接そのまま添加するのではなく、マイクロカプセル化して添加することを着想した。そこで、膜物質にツェインを用い、コアセルベーション法によりプロテオグリカンを包含したマイクロカプセル（以下、「カプセル化ＰＧ」ともいう。）を開発した。そして、カプセル化ＰＧを用いると、食品中でのプロテオグリカンの経時的減少を軽減できることを確認し、これに基づいて本発明を完成するに至った。すなわち、上記課題を解決するための手段として本願で特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は、以下の通りである。
【０００９】
〔１〕  マイクロカプセル化されたプロテオグリカンであり、食品添加用であることを特徴とする、カプセル化プロテオグリカン。
〔２〕  粒径が２５μｍ以下であることを特徴とする、〔１〕に記載のカプセル化プロテオグリカン。
〔３〕  粒径が１０μｍ以下であることを特徴とする、〔１〕に記載のカプセル化プロテオグリカン。
〔４〕  微生物に対して難分解性の物質、または微生物由来酵素に対して難分解性の物質が膜物質として用いられていることを特徴とする、〔１〕、〔２〕、〔３〕のいずれかに記載のカプセル化プロテオグリカン。
【００１０】
〔５〕  膜物質として疎水性物質が用いられていることを特徴とする、〔１〕、〔２〕、〔３〕、〔４〕のいずれかに記載のカプセル化プロテオグリカン。
〔６〕  膜物質としてツェインが用いられていることを特徴とする、〔１〕、〔２〕、〔３〕、〔４〕のいずれかに記載のカプセル化プロテオグリカン。
〔７〕  生味噌環境下（食塩１０重量％以上含有、酵素・アルコール成分含有、酸性）において、添加後１４日時点で添加されたプロテオグリカンの３０重量％以上が残存している程度の安定性を有していることを特徴とする、〔１〕、〔２〕、〔３〕、〔４〕、〔５〕、〔６〕のいずれかに記載のカプセル化プロテオグリカン。
【００１１】
〔８〕  生味噌環境下（食塩１０重量％以上含有、酵素・アルコール成分含有、酸性）において、添加後３０日時点で添加されたプロテオグリカンの３０重量％以上が残存している程度の安定性を有していることを特徴とする、〔１〕、〔２〕、〔３〕、〔４〕、〔５〕、〔６〕、〔７〕のいずれかに記載のカプセル化プロテオグリカン。
〔９〕  コアセルベーション法によりプロテオグリカンをマイクロカプセル化することを特徴とする、食品添加用カプセル化プロテオグリカン製造方法。
〔１０〕  〔１〕、〔２〕、〔３〕、〔４〕、〔５〕、〔６〕、〔７〕、〔８〕のいずれかに記載のカプセル化プロテオグリカンが添加されていることを特徴とする、プロテオグリカン添加食品。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のカプセル化プロテオグリカン、その製造方法、およびプロテオグリカン添加発酵食品は上述のように構成されるため、これらによれば、発酵食品中における添加プロテオグリカンの経時的減少を抑制し、プロテオグリカンを食品中に安定的に保持することができる。これにより、味噌等の発酵食品にプロテオグリカンの有する様々な機能性を付加することができ、価値を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明カプセル化プロテオグリカンの構成を示す概念図である。（以下は、実施例に係る各図面である。）
【図２】カプセル調製方法のスキームを示す説明図である。
【図３】カプセル化ＰＧ懸濁液および調製されたカプセル化ＰＧの写真図である。
【図４】カプセル内液の調製方法を示すフロー図である。
【図５】カプセル内液の定性分析結果を示す電気泳動パターン図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図面により本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明カプセル化プロテオグリカンの構成を示す概念図である。図中の（ａ）に示すように本カプセル化ＰＧ１０は、膜物質５によってマイクロカプセル化されたプロテオグリカン２であり、特に食品添加用である。また、図中（ｂ）に示すように、カプセル化ＰＧ１０が食品２０に添加されてなるプロテオグリカン添加食品３０も、本発明の範囲内である。なお、カプセル化ＰＧ１０が添加される対象の食品２０は発酵食品とすることができるが、それに限定されない。
【００１５】
かかる構成のカプセル化ＰＧ１０は、膜物質５によって被覆されたカプセル形態をとるため、これを発酵食品２０中に添加した場合であっても、プロテオグリカン２をそのまま添加する場合と比較して、食品３０中における添加プロテオグリカンの経時的減少を抑制することができ、プロテオグリカン２を発酵食品２０中に安定的に保持することができる。これにより、味噌等の発酵食品にプロテオグリカン２が有する様々な機能性を付加することができ、価値を高めることができる。
【００１６】
本発明のカプセル化ＰＧ１０は、その粒径を２５μｍ以下とすることができ、また、さらに小さく１０μｍ以下とすることができる。本発明カプセル化ＰＧ１０は食品添加用であり、添加された食品３０を食す際にはできる限り食感への影響を低減できるサイズがよいからである。なお、人間の食感に影響を及ぼさないとされるサイズは直径１０μｍ以下であり、したがって本発明カプセル化ＰＧ１０のサイズの粒径も１０μｍ以下とすることがより望ましい。
【００１７】
本カプセル化ＰＧ１０の膜物質５としては、微生物に対して難分解性の物質、または微生物由来酵素に対して難分解性の物質を用いることとすることができる。上述の通り、プロテオグリカンをそのまま発酵食品に対して添加した際の経時的な減少は発酵食品中に存在する微生物由来の酵素によるものと考えられ、かかる添加プロテオグリカンの経時的減少抑制および安定的保持を目的として、本発明のカプセル化によるプロテオグリカン２の被覆・保護が構想された。それによっても所期の課題を解決できるのだが、さらに膜物質５として酵素難分解性等の物質を用いることで、添加プロテオグリカンの経時的減少抑制および安定的保持の作用効果をより高めることができる。
【００１８】
膜物質５として用いる微生物に対して難分解性の物質、または微生物由来酵素に対して難分解性の物質としては、疎水性物質を用いることができる。なお、かかる疎水性物質もまた食用に適したものでなくてはなならいことは言うまでもない。たとえば、トウモロコシタンパク質であるツェインは、本カプセル化ＰＧ１０の膜物質５として好適に用いることができる。
【００１９】
特に本発明のカプセル化ＰＧ１０は、生味噌環境下（食塩１０重量％以上含有、酵素・アルコール成分含有、酸性）において、添加後１４日時点で添加されたプロテオグリカンの３０重量％以上が残存している程度の安定性を有するものとして提供することができる。さらには、添加後１４日時点で添加されたプロテオグリカンの７０重量％程度が残存している程度の安定性を有するものとして提供することも可能である。あるいはまた、同環境下において、添加後３０日時点で添加されたプロテオグリカンの３０重量％以上が残存している程度の安定性を有するものとして提供することができる。さらには、添加後３０日時点で添加されたプロテオグリカンの５０重量％以上が残存している程度の安定性を有するものとして提供することも可能である。本発明カプセル化ＰＧ１０はこのように、高浸透圧かつ酵素が存在する環境下でも安定的なカプセル化ＰＧであり、味噌への機能性付与のために利用できる他、もろみ段階での醤油などへの機能性付与のために利用することも可能である。
【００２０】
なお、以上説明した食品添加用カプセル化ＰＧを製造する方法もまた、本発明の範囲内である。同製造方法にはコアセルベーション法を好適に用いることができるが、かかる製造方法を含め、本発明の実施例を以下説明する。
【実施例】
【００２１】
本発明完成に至る研究経緯の概要説明をもって、実施例の説明とする。なお、本発明が以下の実施例に限定されるものではない。
１．研究テーマ
カプセル化プロテオグリカンとその製造方法およびカプセル化プロテオグリカン添加発酵食品
２．研究経過概要
２．−１  カプセル調製方法
（１）膜物質の選択と膜物質溶液の調製
膜物質として疎水性トウモロコシタンパク質であるツェイン、アラビアゴム、およびセラックを試験したところ、ツェインが最もマイクロカプセルを形成しやすかった。そこで、膜物質にはツェインを用いて、コアセルべーション法によるマイクロカプセルの調製方法を検討することとした。ツェインは水や濃厚エタノールには難溶解性、あるいは不溶性だが、希釈エタノールにはよく溶解する。そこで本研究では、６０％エタノールをツェインの溶媒として用い、０．２％膜物質溶液を調製した。
【００２２】
（２）芯物質溶液の調製
プロテオグリカン（以下、「ＰＧ」ともいう。）は、５０％エタノールには溶解せず、沈殿を生じることがわかっている。そこで本研究では、４０％エタノールをＰＧの溶媒として用い、０．１％芯物質溶液を調製した。なお実際には、初めにＰＧを水に溶解し、その後エタノールを加えて、約４０％エタノールとした。なお、用いたＰＧは、一丸ファルコス株式会社製のサケ鼻軟骨由来ＰＧ（Ｌｏｔ．１０１１０１）である。
【００２３】
（３）プロテオグリカンのカプセル化
調製した芯物質溶液および膜物質溶液をを混合して、芯物質膜物質溶液とした。これを撹拌しながら一晩放置し、ｐＨ７．０の２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液を毎分７．５ｍｌ添加し、さらに撹拌して、カプセル化ＰＧを調製した。ＰＩＰＥＳは、ピペラジン１．４ビス（２エタノスルフォニックアシッド）（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））である。図２に、以上説明したカプセル調製方法のスキームを示す。
【００２４】
（４）カプセル調製方法の評価
（１）〜（３）記載の方法により、分散性が良好なカプセル化ＰＧ（以下、「ＰＧカプセル」ともいう。）の懸濁液を得ることができた。しかしながら、調製に時間がかかること、しかもこれを通常の限外ろ過法で濃縮した後、遠心分離処理してカプセル化ＰＧを得るには、さらに時間を要する上、少量しか得られないという問題点が明らかになった。調製時間を短縮化するとともに収率を上げるための検討を行なうこととした。
【００２５】
（５）濃縮方法の検討
カプセル化ＰＧ懸濁液をより効率的に濃縮するために、Ｖｉｖａｆｌｏｗ（登録商標、分画分子量ＭＷ＝３００００、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）を用いて限外ろ過を行なった。その結果、カプセル化ＰＧの分散性を保持したままで１０倍以上の濃縮処理を行なうことができた。これにより、カプセル調製方法における一定の時間短縮効果および収率向上効果を得ることができた。表１に、濃縮試験結果を示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
２．−２  調製したカプセル化ＰＧの評価
（１）顕微鏡観察
図３に、カプセル化ＰＧ懸濁液および調製されたカプセル化ＰＧの写真図を示す。図中、（ａ）はカプセル化ＰＧ懸濁液、（ｂ）は光学顕微鏡画像、そして（ｃ）は電子顕微鏡画像である。図示するように、得られたカプセル化ＰＧの粒径は１μｍ前後であり、食品添加用途として食感に影響を与えないものが得られた。
【００２８】
（２）カプセル内液の定性分析
調製したカプセル化ＰＧ内にＰＧが存在しているか否かを確認した。カプセル化ＰＧ懸濁液から遠心分離によってカプセル化ＰＧを主とする沈殿を反応残液から分離し、これを洗浄回収するために蒸留水を加えての遠心分離を３回行なって沈殿（カプセル化ＰＧ）と上清（洗浄液）とに分離し、沈殿（カプセル化ＰＧ）を磨砕して内容物が外に出た状態とし、遠心分離によって膜物質を分離してカプセル内液を得た。図４は、カプセル内液の調製方法を示すフロー図である。セルロースアセテート膜電気泳動により、カプセル内液におけるＰＧの定性分析を行なった。
【００２９】
図５は、カプセル内液の定性分析結果を示す電気泳動パターン図である。パターンは左から、標品（コンドロイチン４硫酸など）、ＰＧ、カプセル内液、洗浄液である。図示するように、カプセル内液試料においてはＰＧが同定された。一方、洗浄液からはＰＧが検出されなかった。このことから、調製したカプセル化ＰＧは、その内部にＰＧが良好に含有されているとともに、カプセル外である洗浄液の方には実質的に漏出しておらず、初期目的通りにＰＧをマイクロカプセル化できていることが確認された。
【００３０】
（３）カプセル内液の定量分析
カプセル内液と洗浄液について、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いてＰＧの定量分析を行なった。
カプセル内液を蒸留水で適宜希釈し、０．４５μｍフィルターでろ過後、高速液体クロマトグラフ（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＧＰＣシステム、島津製作所製）に供した。分析条件は次の通りである。すなわち、カラムはＴＳＫｇｅｌ  Ｇ５０００―ＰＷＸＬ（Φ７．８×３００ｍｍ、東ソー製）、注入量は５０μｌ、分析時間は３０ｍｉｎ、移動相は５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃、検出には示差屈折率検出器（ＲＩＤ−２０Ａ）を用いた。
【００３１】
その結果、ＰＧはほとんどカプセル内液のみから検出され、洗浄液からはほとんど検出されなかった。定量分析結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
２．−３  発酵食品中におけるプロテオグリカンの安定性
酵素等が含まれる発酵食品中におけるＰＧの安定性について評価した。発酵食品としては、生味噌抽出液を調製して用いた。用いた生味噌はワダカン株式会社製の「マルサ蔵出し完熟」である。その８０ｇを１／１０Ｍコハク酸緩衝液に懸濁し、さらに食塩を補填したものを、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄みを取り、これを生味噌抽出液とした。
【００３４】
懸濁に用いた１／１０Ｍコハク酸緩衝液を対照とし、緩衝液、生味噌抽出液それぞれに、１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＧＦを添加し、１５℃で静置した。ここでＰＧＦとは、ＰＧ約２０％、デキストリン約８０％からなる粉末であり、カプセル化はされていない。用いたＰＧＦは、一丸ファルコス（株）製の「プロテオグリカンＦ」である。１日後、それぞれ１ｍＬずつ分取し、酵素が失活する沸騰水中で１０分加熱し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清をＨＰＬＣにより分析した。
【００３５】
その結果、緩衝液では１日後でもＰＧ濃度が高く維持されていてほとんど変化がなかったのに対し、生味噌抽出液では１日後には１／４程度にまでＰＧが減少していた。ＰＧをそのままの形態で生味噌に添加すると、相当の速さで減少することが明らかとなった。すなわち、ＰＧは酵素によって分解されやすいものと考えられ、発酵食品においてはＰＧをそのまま添加しても急速に消失してしまい、安定性が悪いことが示唆された。表３に、ＰＧのＨＰＬＣ定量分析結果を示す。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
２．−４  カプセル化ＰＧの安定性
酵素等が含まれる発酵食品中におけるカプセル化ＰＧの安定性について評価した。発酵食品および対照として、２．−３の生味噌抽出液および緩衝液を用いた。
カプセル化ＰＧ１ｇずつを精秤し、緩衝液、生味噌抽出液、緩衝液９ｍＬをそれぞれ注加した。生味噌抽出液は３０℃で静置した。そして０、１、１４、３０、６０日後に取り出し、酵素を失活させるために沸騰水中で１０分加熱した。その後、８０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離、緩衝液１ｍＬを注加しての沈殿の洗浄、８０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を５回、回収した沈殿の乳鉢での磨砕を行い、磨砕液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得た上清をＨＰＬＣにより分析した。
【００３８】
その結果、生味噌抽出液においてはカプセルＰＧ形態でのＰＧが、１４日経過時点でも約７０％残存、３０日経過時点であっても５０％以上残存していた。さらに６０日経過時点においても減少が認められなかった。このことから、ＰＧはマイクロカプセル化することによって生味噌中に安定的に保持されることが明らかとなった。発酵食品に対するＰＧ添加におけるマイクロカプセル化の有効性が示された。表４に、カプセルＰＧのＨＰＬＣ定量分析結果を示す。
【００３９】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明のカプセル化プロテオグリカン、その製造方法、およびプロテオグリカン添加食品によれば、食品中、特に発酵食品中における添加プロテオグリカンの経時的減少を抑制し、プロテオグリカンを食品中に安定的に保持することができる。これにより、味噌等の発酵食品にプロテオグリカンの有する様々な機能性を付与することができ、価値を高めることができる。実施例では味噌を採り上げたが、醤油を初めその他の発酵食品、微生物や酵素類を含む食品への応用ももちろん可能であり、プロテオグリカンの市場拡大が期待される。したがって、プロテオグリカン製造分野、食品製造分野、特に発酵食品製造分野、および関連する全分野において、産業上利用性が高い発明である。
【符号の説明】
【００４１】
２…プロテオグリカン
５…膜物質
１０…カプセル化プロテオグリカン
２０…発酵食品
３０…プロテオグリカン添加食品
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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