(57)【要約】【課題】配置した細胞の生存率が高い細胞組織体の製造方法の提供。【解決手段】細胞接着性材料からなる細胞接着部を、細胞非接着性面を有する基板上における所定の位置に所定の形状で形成する細胞接着部の形成工程と、少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する細胞の配置工程と、を含む細胞組織体の製造方法である。【選択図】図４Ｆ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着性材料からなる細胞接着部を、細胞非接着性面を有する基板上における所定の位置に所定の形状で形成する細胞接着部の形成工程と、
少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する細胞の配置工程と、
を含むことを特徴とする細胞組織体の製造方法。
【請求項２】
前記細胞接着部の形成工程が、前記細胞接着性材料を含む溶液を液滴として吐出し、前記液滴を前記細胞非接着性面を有する前記基板上へ配置することにより行う請求項１に記載の細胞組織体の製造方法。
【請求項３】
前記細胞乾燥抑制剤が、多価アルコール類、ゲル状多糖類、及び細胞外基質から選ばれる蛋白質の少なくともいずれかを含む請求項１から２のいずれかに記載の細胞組織体の製造方法。
【請求項４】
前記細胞接着性材料が、細胞外基質からなる蛋白質を含む請求項１から３のいずれかに記載の細胞組織体の製造方法。
【請求項５】
細胞接着性材料からなる細胞接着部を、細胞非接着性面を有する基板上における所定の位置に所定の形状で形成する細胞接着部の形成手段と、
少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する細胞の配置手段と、
を有することを特徴とする細胞組織体の製造装置。
【請求項６】
細胞接着性材料からなる細胞接着部を、細胞非接着性面を有する基板上における所定の位置に所定の形状で形成し、細胞接着部を形成し、
少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する、
処理をコンピュータに実行させることを特徴とする細胞組織体の製造プログラム。
【請求項７】
細胞非接着性材料からなる細胞非接着部を、細胞接着性面を有する基板上に所定の形状で形成する細胞接着部の形成工程と、
少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する細胞の配置工程と、
を含むことを特徴とする細胞組織体の製造方法。
【請求項８】
前記細胞接着部の形成工程が、前記細胞非接着性材料を含む溶液を液滴として吐出し、前記液滴を、前記細胞接着性面を有する前記基板上へ配置することにより行う請求項７に記載の細胞組織体の製造方法。
【請求項９】
細胞非接着性材料からなる細胞非接着部を形成した基板に対し、請求項２に記載の方法で、前記細胞非接着部のない基板上へ細胞接着性材料からなる細胞接着部を形成することにより、前記細胞接着部の形成工程を行う請求項７から８のいずれかに記載の細胞組織体の製造方法。
【請求項１０】
細胞非接着性材料からなる細胞非接着部を、細胞接着性面を有する基板上に所定の形状で形成する細胞接着部の形成手段と、
少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する細胞の配置手段と、
を有することを特徴とする細胞組織体の製造装置。
【請求項１１】
細胞非接着性材料からなる細胞非接着部を、細胞接着性面を有する基板上に所定の形状で形成し、細胞接着部を形成し、
少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する、
処理をコンピュータに実行させることを特徴とする細胞組織体の製造プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞組織体の製造方法、製造装置、及び製造プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞技術の進展に伴い、細胞からなる組織体を人工的に形成する技術の開発が行われている。
組織体を人工的に形成する上で細胞を任意に配置する技術は必要不可欠となるため、様々な取り組みがなされており、細胞シート法やスフェロイド積層法、ゲル押し出し法、インクジェット法等が知られている。
一方、細胞を配置するために基板そのものを工夫する取り組みもなされている。
例えば、基体上に、生体親和性粒子及び細胞支持材料前駆体を含む細胞支持材料前駆体水溶液の層を形成する。次に、細胞支持材料前駆体水溶液の層上に、細胞支持材料前駆体水溶液と接触すると細胞支持材料前駆体をゲル化させる細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液を付与する。そして、細胞支持材料の層の上に、細胞を含む細胞層形成材料を付与することにより、細胞を細胞支持材料上に接着させる三次元培養構造物の製造方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。そして、この提案の中で、細胞支持材料として、ゲル状多糖類を含んでもよいことが記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、配置した細胞の生存率が高い細胞組織体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記課題を解決するための手段としての本発明の細胞組織体の製造方法は、細胞接着性材料からなる細胞接着部を、細胞非接着性面を有する基板上における所定の位置に所定の形状で形成する細胞接着部の形成工程と、少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する細胞の配置工程と、を含む。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によると、配置した細胞の生存率が高い細胞組織体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、液滴を吐出するための用いるインクジェットヘッドの一例を示す概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、インクジェットヘッドへの入力波形の一例を示す概略図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、インクジェットヘッドへの入力波形の一例を示す概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、細胞組織体を製造する製造装置の一例を示す概略図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、細胞組織体を製造する製造装置の他の一例を示す概略図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、細胞組織体を製造する製造装置の他の一例を示す概略図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、細胞組織体を製造する製造装置の他の一例を示す概略図である。
【図４Ａ】図４Ａは、細胞組織体の製造方法を説明するための一例を示す概略図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、細胞組織体の製造方法を説明するための一例を示す概略図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、細胞組織体の製造方法を説明するための一例を示す概略図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、細胞組織体の製造方法を説明するための一例を示す概略図である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、細胞組織体の製造方法を説明するための一例を示す概略図である。
【図４Ｆ】図４Ｆは、細胞組織体の製造方法を説明するための一例を示す概略図である。
【図５Ａ】図５Ａは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である。
【図６Ａ】図６Ａは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（コンタクトプリント方式）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（コンタクトプリント方式）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（コンタクトプリント方式）。
【図６Ｄ】図６Ｄは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（コンタクトプリント方式）。
【図６Ｅ】図６Ｅは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（コンタクトプリント方式）。
【図６Ｆ】図６Ｆは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（コンタクトプリント方式）。
【図７Ａ】図７Ａは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（マスク））。
【図７Ｂ】図７Ｂは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（マスク））。
【図７Ｃ】図７Ｃは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（マスク））。
【図７Ｄ】図７Ｄは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（マスク））。
【図７Ｅ】図７Ｅは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（マスク））。
【図７Ｆ】図７Ｆは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（マスク））。
【図８Ａ】図８Ａは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（ＩＪ））。
【図８Ｂ】図８Ｂは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（ＩＪ））。
【図８Ｃ】図８Ｃは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（ＩＪ））。
【図８Ｄ】図８Ｄは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（ＩＪ））。
【図９Ａ】図９Ａは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（コンタクト））。
【図９Ｂ】図９Ｂは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（コンタクト））。
【図９Ｃ】図９Ｃは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（コンタクト））。
【図９Ｄ】図９Ｄは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（コンタクト））。
【図９Ｅ】図９Ｅは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（コンタクト））。
【図９Ｆ】図９Ｆは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（ネガ印刷方式（コンタクト））。
【図１０Ａ】図１０Ａは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（潜像＋ネガ印刷方式（ＩＪ＋ＩＪ））。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（潜像＋ネガ印刷方式（ＩＪ＋ＩＪ））。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（潜像＋ネガ印刷方式（ＩＪ＋ＩＪ））。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、細胞組織体の製造方法を説明するための他の一例を示す概略図である（潜像＋ネガ印刷方式（ＩＪ＋ＩＪ））。
【図１１Ａ】図１１Ａは、基板上の所定の位置に１〜２の細胞が配置された細胞パターンが形成された一例を示す写真である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、基板上の所定の位置に３〜４の細胞が配置された細胞パターンが形成された一例を示す写真である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、基板上の所定の位置に約１０の細胞が配置された細胞パターンが形成された一例を示す写真である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、基板上の所定の位置に２種類の細胞が配置された細胞パターンが形成された一例を示す写真である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１２Ａにおける２種類の細胞による細胞パターンについて説明するための写真である。
【図１３】図１３は、細胞組織体の製造装置における、細胞組織体の製造プログラムの処理手順の一例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
インクジェット法により基板上に細胞を配置する技術は、細胞を液体に懸濁したまま配置できるため細胞へのダメージが小さく、吐出する細胞数も制御しやすいため、細胞組織体を人工的に形成するうえでは、有効な技術である。
しかし、細胞を懸濁させた細胞懸濁液（以下、「細胞インク」ともいう）をインクジェット法で安定して吐出するには、多くの課題がある。例えば、インクジェット法の画像形成で通常使用されているようなインクの材料は、細胞へのダメージが大きいため、細胞インクでは使用できないことが多い。また、従来画像形成で用いられてきたインク中の顔料などより希薄な分散濃度で細胞インクを吐出する必要がある。更に、基板上へ細胞を着弾させた後、細胞インクの液滴の乾燥により細胞死が引き起こされてしまうため、速乾させるような従来の画像形成で用いられているインクの配合手法をそのまま転用することはできない。また、液滴同士が合一しない範囲で細胞インクを配置しなくてはいけないことから、基板上での細胞の配置密度が上げられない。
また、上記特許文献１では、生体親和性粒子の位置決め（パターン配置）の点は記載されていない。
本発明者らは、検討を重ねた結果、基板上の所定の位置に所望の数の細胞が配置された細胞パターンを有する細胞組織体を製造することができる細胞組織体の製造方法として、以下の構成の細胞組織体の製造方法が有効であることを見出した。
本発明の細胞組織体の製造方法によれば、細胞パターンを短時間で形成でき、パターン形状の形状精度を高くでき、所望の数の細胞を配置する精度を高くでき、かつ配置した細胞の生存率を高くできる。
更に、本発明の細胞組織体の製造方法によれば、複数の細胞を用いて、細胞パターンを形成することができ、複数細胞からなる細胞組織体を人工的に形成することができる。
【０００８】
（細胞組織体の製造方法、製造装置、及び製造プログラム）
本発明の細胞組織体の製造方法は、細胞接着性材料からなる細胞接着部を、細胞非接着性面を有する基板上における所定の位置に所定の形状で形成する細胞接着部の形成工程を含む。
本発明の細胞組織体の製造方法は、少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、細胞接着部へ吐出して細胞を配置する細胞の配置工程を含む。
また、本発明の細胞組織体の製造方法は、必要に応じてその他の工程を含んでもよい。
【０００９】
本発明の細胞組織体の製造装置は、細胞接着性材料からなる細胞接着部を、細胞非接着性面を有する基板上における所定の位置に所定の形状で形成する細胞接着部の形成手段を有する。
本発明の細胞組織体の製造装置は、少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、細胞接着部へ吐出して細胞を配置する細胞の配置手段を有する。
また、本発明の細胞組織体の製造装置は、必要に応じてその他の手段を有していてもよい。
【００１０】
本発明の細胞組織体の製造プログラムは、細胞接着性材料からなる細胞接着部を、細胞非接着性面を有する基板上における所定の位置に所定の形状で形成する細胞接着部を形成する処理をコンピュータに実行させる。
本発明の細胞組織体の製造プログラムは、少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、細胞接着部へ吐出して細胞を配置する処理をコンピュータに実行させる。
【００１１】
本発明の細胞組織体の製造装置は、本発明の細胞組織体の製造方法を実施することと同義であるので、本発明の製造方法の説明を通じて本発明の製造装置の詳細について、あるいは本発明の製造装置の説明を通じて本発明の製造方法の詳細について明らかにする。また、本発明の細胞組織体の製造プログラムは、ハードウェア資源としてのコンピュータ等を用いることにより、本発明の細胞組織体の製造方法を実現させることから、本発明の製造方法の説明を通じて本発明の製造プログラムの詳細についても明らかにする。
【００１２】
＜細胞接着部の形成工程、形成手段＞
細胞接着部の形成工程とは、細胞接着性材料からなる細胞接着部を、細胞非接着性面を有する基板上における所定の位置に所定の形状で形成する工程である。
細胞接着部の形成工程において、細胞接着部は基板上の所定の位置に所定の形状で形成される。本発明では、このように所定の位置に所定の形状の細胞接着部を形成することを、細胞接着部をパターン状に形成するともいう。なお、この細胞接着部の位置や形状の条件は、作業者あるいはユーザーが任意に設定することができる。作業者あるいはユーザーが設定した細胞接着部の大きさや間隔にしたがって細胞接着部は基板上に形成される。
細胞非接着性面を有する基板上へ、パターン状の細胞接着部を形成する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、例えば、以下に記載の方法が挙げられる。
【００１３】
一つの方法としては、細胞非接着性面をパターン状に形成したマスクで覆い、細胞非接着性面が表面に出ている領域とマスクで隠されている領域とを形成する。次にそれらの領域全体に細胞接着性材料を塗布し細胞接着性材料の層を形成する。そして、マスク部分を取り除く。すると、マスクで覆われていない領域に存在する細胞接着材料からなる層が残り、これにより、パターン状の細胞接着部が形成される（以下、この方法をマスクパターンによる形成方法ともいう）。
他の方法としては、細胞非接着性面を有する基板上へ、インクジェットヘッドを用いて細胞接着性材料の液滴を吐出することにより、細胞接着性材料からなる層を形成する。その際、液滴の吐出するタイミングや液滴の吐出量を調整することにより、パターン状の細胞接着部を形成する（以下、この方法をインクジェットによる形成方法ともいう）。
細胞接着性材料の液滴を吐出する際に使用するインクジェットヘッドは、以下で説明する細胞懸濁液（細胞インク）の液滴を吐出する際に使用するインクジェットヘッドと同様のものを使用することができる。そこで、インクジェットヘッドについては、下記＜＜液滴吐出用のインクジェットヘッド＞＞の欄で詳しく説明する。
また、パターン状細胞接着部の形成工程についての具体的な実施態様は、以下で詳しく説明する。
【００１４】
＜＜細胞非接着性面を有する基板＞＞
基板は、細胞非接着性面を表面に有していれば特に制限はなく、細胞接着性材料が吸着しやすければ更に好ましい。
細胞非接着性とは、少なくとも、使用する細胞接着性材料よりも目的の細胞に対し、接着性が低いことをいう。
【００１５】
基板の材質としては、例えば、下記に記載の有機材料や無機材料が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
有機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のアクリル系材料、セルロース、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコーン系材料、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸カルシウム等のアルギン酸金属塩、ポリアクリルアミド、メチルセルロース、アガロース等のゲル状材料などが挙げられる。
無機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、セラミックスなどが挙げられる。
【００１６】
また、細胞非接着性面を有する基板は、細胞非接着性を示す材料を任意の基板に塗布することによっても得ることができる。
例えば、細胞非接着性面を有する基板の好ましい実施態様として、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層や、アルギン酸金属塩（アルギン酸カルシウム等）のゲル層、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート(ｐＨＥＭＡ)層、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）層などを表面に配した基板などが挙げられる。
【００１７】
＜＜細胞接着性材料＞＞
細胞接着性材料としては、例えば、細胞外基質から選ばれるタンパク質などが挙げられる。
細胞外基質から選ばれるタンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリン、マトリゲルなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１８】
また、細胞接着性材料として、例えば、以下に記載する細胞接着性を有する粒子を使用することもできる。
細胞接着性を有する粒子は、細胞等の生体と親和性を有すれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゼラチン粒子、コラーゲン粒子などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
粒子状であるゼラチン粒子は、基材への細胞の接着性を向上することができ、非粒子状であるゼラチンと比較すると、長期間、細胞に分解されることなく細胞組織体中に存在することができる。そのため、粒子状のゼラチン粒子には、細胞の接着性を向上させ、更に、長期にわたって、細胞の栄養源として利用されるという利点がある。
細胞接着性を有する粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜、形状等を選択することができる。
細胞接着性を有する粒子の形状としては、例えば、球状、線状、網目状、不定形状などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
細胞接着性を有する粒子のキュムラント径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１μｍ以上１．０μｍ以下が好ましく、０．３０μｍ以上０．７０μｍ以下がより好ましい。なお、キュムラント径は、濃厚系粒径アナライザー（商品名：ＦＰＡＲ−１０００、大塚電子株式会社製）を用いて、下記のサンプル液の調製例により得られたサンプル液を用いて、以下の測定条件により測定することができる。
【００１９】
細胞接着性面を有する基板としては、細胞が接着すれば特に制限はなく、細胞培養などで一般的に用いられる培養皿やマイクロプレート底面などでもよいし、上記細胞接着性材料における接着性材料をコーティングした基板などでもよい。
【００２０】
−サンプル液の調製例−
純水製造装置（商品名：ＧＳＨ−２０００、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて得られた純水に、細胞接着性を有する粒子を濃度０．５質量％で分散させる。測定用の液量は５ｍＬ、分散は２０ｍｍ回転子をスターラーを用いて２００ｒｐｍ、約１日撹拌することでサンプル液を調製することができる。
【００２１】
−測定条件−
・溶媒：水（屈折率：１．３３１４、２５℃における粘度：０．８８４ｍＰａ・ｓ（ｃＰ）、ＮＤフィルターにより最適光量調整は適宜設定）
・測定プローブ：濃厚用プローブ
・測定ルーチン：測定：２５℃で１８０秒間→測定：２５℃で６００秒間（本体側を３５℃に変更すると次第に液温が２５℃から３５℃になる。その間の粒子径変化をモニタ）→測定：３５℃で１８０秒間
【００２２】
細胞接着性を有する粒子がゼラチン粒子である場合、ゼラチン粒子の原料であるゼラチンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、商品名：ＡＰＨ−２５０（新田ゼラチン株式会社製）などが挙げられる。
細胞接着性を有する粒子としては、その構造中において架橋剤により架橋されていることが好ましい。架橋剤により架橋されることにより、細胞接着性を有する粒子のキュムラント径を小さくすることができ、細胞接着性を有する粒子を含む細胞組織体上において、細胞の増殖を促進することができる。
【００２３】
架橋剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド等のアルデヒド；エチレンプロピレンジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジルエーテル；ヘキサメチレンジイソシアネート、α−トリジンイソシアネート、トリレンジイソシアネート、ナフチレン−１，５−ジイソシアネート、４，４−ジフェニルメタンジイソシアネート、トリフェニルメタン−４，４，４−トリイソシアネート等のイソシアネート；グルコン酸カルシウム、（１Ｓ，２Ｒ，６Ｓ）−２−ヒドロキシ−９−（ヒドロキシメチル）−３−オキサビシクロ［４．３．０］ノナ−４，８−ジエン−５−カルボン酸メチル（ゲニピン）、ポリフェノールと西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酸化剤との組合せ、スクシンイミド基を有する化合物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アルデヒドが好ましく、グルタルアルデヒドがより好ましい。
【００２４】
架橋剤の含有量としては、細胞接着性を有する粒子の原料全量に対して、１質量％以上２０質量％以下が好ましく、２質量％以上１０質量％以下がより好ましい。含有量が、１質量％以上２０質量％以下であると、細胞接着性を有する粒子のキュムラント径を小さくすることができ、細胞接着性を有する粒子を含む細胞組織体上において、細胞の増殖を促進することができる。
【００２５】
細胞接着性を有する粒子の含有量としては、細胞接着性を有する粒子を含有する材料の溶液全量に対して、０．５質量％以上１０質量％以下が好ましく、１質量％以上５質量％以下がより好ましい。含有量が、０．５質量％以上１０質量％以下であると、三次元の細胞集合体である細胞組織体に十分細胞を接着し、細胞の増殖を促進することができる。
【００２６】
−細胞接着性を有する粒子の作製方法−
細胞接着性を有する粒子としては、原料としてゼラチンを用いた例を挙げ、以下のようにして作製することができる。
細胞接着性を有する粒子としてゼラチンを２質量％となるように水と混ぜて６０℃の湯浴中にて溶解して２質量％ゼラチン水溶液を得る。次に、４０℃に加温した２質量％ゼラチン水溶液４０ｍＬを２００ｍＬビーカーに入れて撹拌する。その後、アセトン６０ｇを一気に添加して白濁液を得る（コアセルベーション）。
白濁液に、架橋剤として２４質量％以上２６質量％以下のグルタルアルデヒド水溶液を、例えば、１６０μＬ（ゼラチン全量に対するグルタルアルデヒドの含有量：５質量％）添加して、６０℃の湯浴中で３００ｒｐｍ程度にて撹拌させながら３０分間保持する。次第に白濁液がクリーム色に変化し、ゼラチン粒子を形成することができる。
次に、室温（２５℃）に戻して、アセトン１００ｇを添加し、ゼラチン粒子を凝集沈殿させて沈殿物を得る。
上澄み液の除去とアセトン洗浄とを数回繰り返し、得られた沈殿物から水分と未反応架橋剤とを除去し、必要に応じてろ過を行う。その後、６０℃ホットプレート上で沈殿物を乾燥して、５０℃ホットプレート上で１時間減圧乾燥してゼラチン粒子（細胞接着性を有する粒子）の粉末を得ることができる。
【００２７】
＜細胞の配置工程、配置手段＞
細胞の配置工程とは、少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、細胞接着部へ吐出して細胞を配置する工程である。
細胞の配置工程において、細胞懸濁液の液滴をパターン状の細胞接着部へ吐出することにより、パターン状の細胞接着部上へ細胞を播種することができ、細胞パターンを形成することができる。
以下、細胞の配置工程を、細胞懸濁液を液滴として吐出する液滴吐出工程と、液滴を細胞接着部へ吐出し細胞接着部上に細胞を配置する工程とに分けて説明する。
【００２８】
＜＜液滴吐出工程、液滴吐出手段＞＞
液滴吐出工程とは、少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液（細胞インク）を液滴として吐出する工程をいう。
細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液（細胞インク）の液滴を基板上へ飛翔させる手段としては、インクジェット方式による液滴吐出手段が好ましい。
インクジェット方式による液滴吐出手段としては、例えば、細胞懸濁液（細胞インク）を加圧する圧力発生手段として圧電素子を用いて細胞懸濁液の容積を変化させて液滴を吐出させる、いわゆるピエゾ方式（例えば、特公平２−５１７３４号公報参照）、発熱抵抗体を用いて細胞懸濁液を加熱して気泡を発生させる、いわゆるサーマル方式（例えば、特公昭６１−５９９１１号公報参照）、振動板と電極とを対向配置し、振動板と電極との間に発生させる静電力によって振動板を変形させることで、細胞懸濁液の容積を変化させて液滴を吐出させる静電方式（例えば、特開平６−７１８８２号公報参照）などが挙げられる。
細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液（細胞インク）を液滴として吐出するために使用するインクジェットヘッドの具体的態様について、以下説明する。
【００２９】
＜＜＜液滴吐出用のインクジェットヘッド＞＞＞
図１は、液滴を吐出するための用いるインクジェットヘッドの一例を示す概略図である。
図１では、圧力発生手段として圧電素子を用いている。
図２Ａ、及び図２Ｂは、インクジェットヘッドへの入力波形の一例を示す概略図である。
液滴吐出ヘッド１０は、細胞懸濁液１１を保持する液室１２と、ノズル１５と、膜状部材のメンブレン１３と、メンブレン１３に振動を与える加振部１６と、加振部１６を振動させるため、加振部１６に特定の駆動信号として電圧を与える駆動部１４とを有する。
液室１２には、液室内を大気に開放するための大気開放部１７が設けられている。
液滴吐出ヘッド１０は、細胞懸濁液に振動を与えることで、ノズルから細胞懸濁液の液滴が吐出される。
駆動部１４は、駆動信号として吐出波形Ｐｊを加振部１６に加えることができるようになっており、メンブレン１３の振動状態を制御することによって液室１２に保持された細胞懸濁液１１を液滴状に吐出させることが可能となっている。吐出波形Ｐｊは、メンブレン１３を共振させて、細胞懸濁液１１をより少ない電圧で吐出させるために、メンブレン１３の固有振動周期Ｔｏを含む駆動信号に設定するとよい。吐出波形Ｐｊは、三角波、正弦波のみでなく、ローパスフィルタにかけてエッジを緩やかにした三角波も用いることができる。更に駆動部１４は、駆動信号として液滴吐出後のメンブレン残留振動を抑制する免振波形Ｐｓを加振部１６に加えることができるようになっている。これによって、液滴形成後のメンブレン残留振動が早く抑制されることにより、より高周波な連続吐出が可能となる。更にサテライトやミストが減少することにより、液滴のより微小な量の制御が可能になる。免振波形Ｐｓは、三角波、正弦波のみでなく、ローパスフィルタにかけてエッジを緩やかにした三角波も用いることができる。
【００３０】
液室１２に保持される細胞懸濁液１１の量としては特に制限されないが、例えば、１μＬから１ｍＬ程度の液を保持することが可能である。特に、細胞を分散させた細胞懸濁液のように高価な液を使用する際には、少量の液量で液滴形成ができるようになっていることが好ましく、１μＬから５０μＬ程度の液量を保持することができる構成であるとよい。
メンブレン１３の形状としては、円形であっても、楕円状や四角形であってもよい。
メンブレン１３の材質としては、特に制限はなく、柔らかすぎるとメンブレンが簡単に振動してしまい、液滴が吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難となるため、ある程度の硬さがある材質であるとよい。メンブレン１３の材質としては、例えば、金属材料、セラミック材料、ある程度の硬さのある高分子材料などを用いることができる。
ノズル１５は、メンブレン１３の中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。
【００３１】
加振部１６としては、例えば、圧電素子が挙げられる。電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレン１３を変形させることができる。圧電素子の材料としては、例えば、一般的に使用されているジルコン酸チタン酸鉛を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、あるいはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたものなど、様々な圧電材料を用いることができる。
メンブレン１３を変形させるためのメンブレン１３に振動を与える手段としては、圧電素子に限られず、例えば、メンブレン１３上にメンブレンとは異なる線膨張係数が異なる材料が貼り付けられており、加熱することによって線膨張係数の差を利用してメンブレン１３を変形させることも可能である。このとき、例えば、線膨張係数の異なる材料にはヒーターが形成されており、通電によってヒーターが加熱し、メンブレン１３が変形できるようになっている。
【００３２】
次に、細胞懸濁液（細胞インク）について説明する。
細胞懸濁液（細胞インク）は、少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する。更に、細胞懸濁液（細胞インク）は、細胞を分散させる分散培を含有し、必要に応じて、分散剤、ｐＨ調整剤などのその他の添加材料を含有してもよい。
【００３３】
＜＜＜細胞＞＞＞
細胞は、その種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞が好ましく、細胞が細胞集合体を形成する場合は、細胞と細胞とが互いに接着し、物理化学的な処理を行わなければ単離しない程度の細胞接着性を有する接着性細胞がより好ましい。
【００３４】
接着性細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
分化した細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、又はそれらを何代か継代させたものでもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
原核細胞としては、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。
【００３５】
＜＜＜細胞乾燥抑制剤＞＞＞
細胞乾燥抑制剤としては、細胞の表面を覆い、細胞の乾燥を抑制する働きを有するものであり、例えば、多価アルコール類、ゲル状多糖類、及び細胞外基質から選ばれる蛋白質などが挙げられる。
【００３６】
−多価アルコール−
多価アルコールとしては、細胞へダメージを与えなければ特に制限はなく、例えば、グリセリン、ジグリセリン、ジエチレングリコール、１，３−ブタンジオール、１，２，３−ブタントリオール、１，２，４−ブタントリオール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、グリセリンが好ましい。細胞への毒性が低く、低添加量であっても乾燥を抑制する効果が期待できる。
【００３７】
−ゲル状多糖類−
ゲル状多糖類とは、ゲル状態となっている多糖類をいう。
ゲル状多糖類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルギン酸カルシウム、ジェランガム、アガロース、グァーガム、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、ローカストビーンガム、タマリンドガム、ダイユータンガム、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、アルギン酸カルシウムが好ましい。アルギン酸カルシウムは、アルギン酸のカルボキシル基にカルシウムイオンが結合した塩であり、カルシウムイオンは２価であるため、２つのカルボキシル基にまたがるかたちで結合（イオン架橋）して増粘することにより、細胞インクの乾燥を抑制することができる。このときカルシウムイオンは分散培中に含まれており、乾燥による濃縮で過剰になったカルシウムイオンと結合すると考えられ、浸透圧を調整する役割も期待できる。
【００３８】
−細胞外基質から選ばれるタンパク質−
細胞外基質から選ばれるタンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、コラーゲンが好ましい。コラーゲンは多様な種類が存在するが、濃度や温度によって増粘することが知られており、細胞インク中に含ませることで、濃度が上昇した際に増粘させるというトリガーをもたせることができる。
【００３９】
＜＜＜分散培＞＞＞
分散培としては、細胞培養用の培地や緩衝液が好ましい。
培地は、細胞組織体の形成と維持に必要な成分を含み、乾燥を防ぎ浸透圧などの外部環境を整える溶液であり、培地として知られているものであれば適宜選択して使用することができる。細胞を常時培地液内に浸しておく必要がない場合には、細胞懸濁液から培地は適宜除去することができる。
緩衝液は、細胞や目的に合わせｐＨを調整するためのものであり、公知のものを適宜選択して使用することができる。
【００４０】
＜＜細胞を配置する工程、配置する手段＞＞
細胞を配置する工程とは、液滴を細胞接着部へ吐出し、細胞を細胞接着部上に配置する工程である。
より具体的な態様としては、液滴をパターン状細胞接着部へ吐出し、細胞をパターン状細胞接着部へ播種することにより、パターン状細胞接着部上に細胞が接着された細胞パターンを形成することができる。
本発明では、基板上の所定の位置に所望の数の細胞を配置することを細胞パターンを形成するともいう。
細胞を配置する工程では、細胞インクの液滴をパターン状細胞接着部上もしくはその近傍に吐出する。すると、細胞接着部の近傍に着弾した液滴中の細胞は細胞接着部上へと遊走し、細胞接着部上で接着される。
細胞パターンにおける細胞の位置や配置される細胞の数の条件は、作業者あるいはユーザーが任意に設定することができる。
例えば、パターン状細胞接着部の位置に応じ、液滴を吐出するタイミングを調整することにより、細胞接着部に接着される細胞の位置を調整することができる。また、その際の細胞インクの吐出量（液滴数や液滴量）や細胞濃度を調整することにより、細胞接着部に接着される細胞の数を調整することができる。このようにして、細胞をパターン状細胞接着部上に配置することにより、基板上の所定の位置に所定数の細胞が規則的に配置された細胞パターンを基板上に形成することができる。
【００４１】
本発明の細胞組織体の製造方法の好ましい実施態様としては、パターン状の細胞接着部を形成し、細胞乾燥抑制剤を含有させた細胞インクの液滴をパターン状の細胞接着部へ吐出し、細胞パターンを形成することである。これらの各工程が相まって、以下に記載の効果を示す。
細胞インクの液滴が基板上に着弾し、着弾時に発生した液滴内の流れや細胞の遊走などにより細胞が細胞接着部上に接着する。細胞インクの液滴が手技に比べて非常に小さいため、細胞が細胞接着部上に接着するまでの時間が非常に短時間である。よって、本発明の細胞組織体の製造方法は、細胞パターンを短時間で形成できる。また、本発明の細胞組織体の製造方法は、細胞を所定の位置に配置する、細胞パターンの形状精度が高い。また、本発明の細胞組織体の製造方法は、所定の細胞接着部へ所定数の細胞を配置できる確率、あるいは配置した細胞数が所望の数となっている確率が高く、所望の数の細胞を配置する精度が高い。また、本発明の細胞組織体の製造方法は、配置された細胞の所定時間経過後における生存率も高い。
更に、本発明の細胞組織体の製造方法は、細胞パターンの形状精度が高いため、複数の細胞を用いて、複数の細胞からなる細胞パターンも精度よく形成することができる。
【００４２】
＜細胞組織体の製造方法、及び製造装置の実施態様＞
以下、本発明の細胞組織体の製造方法、及び該製造方法を実施する製造装置の具体的態様について説明する。しかし、本発明は、これらの実施態様に何ら限定されるものではない。
細胞組織体の製造装置は、ステージ部と、細胞懸濁液の液滴を吐出する液滴吐出手段である液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）を有する。
ステージ部は、基板を保持する。
液滴吐出ヘッドの構成は、上記＜＜液滴吐出用のインクジェットヘッド＞＞で記載したとおりである。
【００４３】
図３Ａから図３Ｄに、上記液滴吐出用のインクジェットヘッドを搭載した細胞組織体を製造する製造装置の一例を示す。
図３Ａの細胞組織体の製造装置は、ステージ部３１と、細胞懸濁液の液滴を吐出する液滴吐出手段である液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２１とを有する。
液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２１は、上述したように、液室部２５、加振部２７、駆動部２６、及びメンブレン２８を有する。また、液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２１には、大気開放部２４が形成されている。
細胞組織体の製造装置は、パターン状の細胞接着部の形成を、細胞接着性材料を含む溶液の液滴を吐出することにより行うこともできる。その場合は、図３Ｂで示すように、細胞懸濁液の液滴を吐出する液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２１の他に、細胞接着性材料を含む溶液の液滴を吐出する液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２３を有する。液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２３の基本構成は、液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２１と同様である。図３Ｂにおいて、符号２９は駆動部を、符号３０は接着性材料の溶液を保持する液室を示す。液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２３には、液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２１と同様、図面では記載を省略しているが、加振部やメンブレンが形成されている。
本発明の細胞組織体の製造装置では、２種類以上の細胞からなる細胞パターンを形成することもできる。その場合は、図３Ｃで示すように、細胞懸濁液の液滴を吐出する液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２１を複数設けることができる。図３Ｃでは、液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２１、及びインクジェットヘッド２１と同じ構成のインクジェットヘッド２２を２つ設けた例を示す。
また、液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２１及び２２を２つ設けたのに加え、液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）２３も設けた細胞組織体の製造装置の例を図３Ｄに示す。
本発明の細胞組織体の製造装置には、上記手段以外のその他の手段として、インクジェットヘッドを保持する保持部や、ステージとインクジェットヘッドの相対位置を制御する機構部等を設けてもよい。
【００４４】
次に図３Ａから図３Ｄで示すような細胞組織体の製造装置を用いて、細胞組織体を製造する方法について、具体的に説明する。
図４Ａから図４Ｆ、又は図５Ａから図５Ｄを用いて、細胞組織体の製造方法を説明する。
【００４５】
［パターン状細胞接着部の形成工程１（マスクパターンによる形成方法）］
細胞非接着性面４２を有する基板４１上へ、レーザー加工機などにより、フィルムや弱粘着テープなどへパターンを描きマスクフィルム４３を形成する。該マスクフィルムを細胞非接着性面へ貼り付ける（図４Ａ）。
次に、細胞接着性材料４４を塗布する（図４Ｂ）。必要に応じ、細胞接着性材料からなる層は乾燥させてもよい（図４Ｃ）。
その後、該マスクフィルムを剥がすことで、細胞非接着性面を有する基板に対し、細胞接着性材料からなる層のパターン４５を形成することができる（図４Ｄ）。
このとき、細胞接着性材料は、純水などに溶解して塗布することが好ましい。細胞接着性材料溶液に対する細胞接着性材料の含有量は、特に制限はないが、質量比で０．００１質量％以上１０質量％以下が好ましく、０．０１質量％以上５質量％以下がより好ましい。この含有量の範囲であると、塗布時のムラを有効に防止することができる。
パターン状細胞接着部をマスクパターンで形成すると、細胞接着部の形成工程が簡便で済む他、形成される細胞接着部はベタの平坦な膜となり、細胞との接着性に優れるため、好ましい。
【００４６】
［パターン状細胞接着部の形成工程２（インクジェットによる形成方法）］
−細胞接着性材料インクの調製−
細胞接着性材料を純水などへ溶解させ、細胞接着性材料インクを調液する。このとき、細胞接着性材料溶液に対する細胞接着性材料の含有量は、特に制限はないが、質量比で０．００１質量％以上５質量％以下が好ましく、０．００５質量％以上１質量％以下がより好ましい。この含有量の範囲であると、細胞接着機能を充分発現でき、インクジェット法において良好に液滴を吐出することができる。
必要に応じて、細胞接着性材料インクは、湿潤剤、分散剤、ｐＨ調整剤などその他の添加材料を含んでいてもよい。
【００４７】
−インクジェットによる細胞接着部のパターン形成工程−
製造装置としては、図３Ｂに示す細胞接着性材料吐出ヘッド２３を有する装置を用いることができる。
図５Ａから図５Ｂで示すように、細胞非接着性面５２を有する基板５１上へ、細胞接着性材料からなる細胞接着部のパターン５５を形成する。細胞接着性材料吐出ヘッド６１の液室へ細胞接着性材料インクを充填し、細胞非接着性面５２を有する基板５１上へ、細胞接着性材料インクの液滴５３を吐出する（図５Ａ）。液滴５３を吐出する際、吐出するタイミングや吐出する液滴の量等を調整することにより、所望のパターン形状を有する細胞接着部を形成する。これにより、細胞非接着性面を有する基板上に、パターン状の細胞接着部５５が形成できる（図５Ｂ）。
【００４８】
また、図６Ａから図６Ｆに示すように、版転写による細胞接着部のパターン形成も可能である。
図６Ｂに示すように、細胞接着性材料６３を版型６１へ塗布し、この細胞接着性材料６３を、細胞非接着性面６４を有する基板６５へ転写し、細胞接着性材料パターン６３ａを形成する以外は、上記インクジェットによる細胞接着部のパターン形成工程と同様である。
図６Ａから図６Ｆ中、６６ａは飛翔液滴、６６ｂは着弾液滴、６７は細胞、６８は細胞懸濁液、６９は細胞吐出ヘッドをそれぞれ表す。
版型に用いる材料としては、細胞接着性材料を保持することができれば特に制限はないが、一般に基材よりも柔らかい方が転写時の追従性が良くなり好ましい。また、転写時の圧力も版型のパターンを壊さなければ特に制限はない。
【００４９】
［細胞パターンの形成工程］
−細胞懸濁液（細胞インク）の調製−
細胞乾燥抑制剤を分散培へ溶解させ、細胞インク用分散培を調液する。このとき、細胞乾燥抑制剤の含有量は、特に制限はないが、細胞懸濁液における細胞乾燥抑制剤の質量比で０．００１質量％以上２０質量％以下が好ましく、０．０１質量％以上１０質量％以下がより好ましい。この含有量の範囲内であれば、細胞の種類にも依存するが、乾燥抑制効果を発揮でき、細胞へのダメージも少ない。次に、細胞インク用分散培へ、細胞を分散させ、ピペッティングでやさしく撹拌することで、細胞インクを得る。このとき、細胞懸濁液における細胞の含有量は、５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌ／ｍＬが好ましく、１×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬがより好ましい。この含有量の範囲内であれば、細胞密度が低くなったり、インクジェット法にて吐出が困難ということはない。
細胞インクの調液工程での環境温度は、４℃〜４０℃が好ましく、１５℃〜３７℃がより好ましい。３７℃を超えても直ちに細胞が死ぬわけではないが、３７℃を大きく超えたり、長時間曝されると細胞へのダメージが懸念される。また、環境温度が４℃を下回ると、細胞の生死への影響は小さいが、細胞の活性が下がり、本プロセスでの細胞接着に時間を要する傾向がみられる。
【００５０】
−細胞パターンの形成−
図４Ｅで示すように、パターン状細胞接着部を形成した基板上へ細胞インクを吐出し、配置していく。細胞インク４６を細胞吐出ヘッド４７の液室へ充填し、基板上に形成されたパターン状細胞接着部に沿って吐出させていく。このとき、細胞インクがノズルから吐出すれば、駆動信号に特に制限はない。細胞はインク液滴内では分散されているため、着弾後の位置を制御することは難しい。しかし、細胞接着部はパターン形状を有しているため、細胞接着部近傍に着弾した細胞は、細胞接着部へ遊走し、細胞接着部上へ接着することができる。図４Ｅ中、符号４８は飛翔液滴を、符号４９は着弾した液滴を、符号５０は細胞を示す。これにより、細胞が、基板上の所定の位置に規則正しく配置された、細胞パターンを形成することができる（図４Ｆ）。
また、図５Ｃも同様に、細胞パターンを形成することができる。
図５Ｃで示すように、パターン状細胞接着部を形成した基板上へ細胞インクを吐出し、配置していく。細胞インク５６を細胞吐出ヘッド５７の液室へ充填し、基板上に形成されたパターン状細胞接着部に沿って吐出させていく。細胞接着部近傍に着弾した細胞は、細胞接着部へ遊走し、細胞接着部上へ接着する。図５Ｃ中、符号５８は飛翔液滴を、符号５９は着弾した液滴を、符号６０は細胞を示す。これにより、細胞が、基板上の所定の位置に規則正しく配置された、細胞パターンを形成することができる（図５Ｄ）。
図４Ｅや図５Ｃにおいて、液滴の吐出数を変える、又は細胞インク中の細胞分散濃度を変えることで、細胞パターンにおける単位面積当たりの配置されている細胞数を制御することができる。単位面積当たりの細胞数を制御することにより、細胞間での接着やタンパク質のやりとりなどの相互作用を任意に設計できるようになる。このため、単なる細胞評価だけでなく細胞組織体としての機能評価の可能性を提示することができる。また、インクジェットを用いて微小液滴で着弾させるので、液滴の着弾後の細胞が基板上に着弾し→細胞接着部上まで遊走し→細胞接着部上に接着するまでの時間を非常に短時間で行うことができる。また、本発明によれば安定して、細胞インクの液滴を吐出することが可能であるが、仮に吐出が不安定になったとしても、インクジェットヘッドのノズル近傍を含めた液室内の撹拌を実施すれば、再度安定して吐出することができるようになる。
【００５１】
＜細胞パターンが形成された細胞組織体の具体例＞
本発明の細胞組織体の製造方法により、形成された細胞組織体の具体例を示す。
基板上に直径（φ）１５０μｍの細胞接着部のドットを形成した。１つのドットに細胞数が１個配置されるよう、細胞インクの液滴を各ドットに向けて吐出した。
細胞は、ＮＩＨ／３Ｔ３を用いた。各ドットへ細胞を１個狙って配置した結果の写真を図１１Ａに示す。
同じようにして、各ドットへ細胞を３個狙って配置した結果の写真を図１１Ｂに示す。
また、同じようにして、各ドットへ細胞を１０個狙って配置した結果の写真を図１１Ｃに示す。
図１２Ａには２種類の細胞を用いて、それぞれの細胞を規則正しく配置したときの結果（２種類の細胞からなる細胞パターンを示す）の写真を示す。
細胞は、ＮＩＨ／３Ｔ３とＮＨＤＦを用いた。
なお、図１２Ａの写真は、元はカラー写真であり、黒地に緑色と青色で色分けされていた。そのため、それぞれの細胞が配置されている様子は容易に視認できた。しかし、下記図１２Ａでは、白黒表示にしたため、補足説明として図１２Ｂを添付する。図１２Ｂにおいて、符号ａ及びｂが、それぞれ異なる２種類の細胞を示している。
【００５２】
＜細胞組織体の製造プログラム＞
細胞組織体の製造プログラムは、ハードウェア資源としてのコンピュータ等を用いることにより、本発明の細胞組織体の製造装置において、細胞組織体の製造方法を実行させるものである。
細胞組織体の製造プログラムによる処理は、上述した細胞組織体の製造装置（図３Ａから図３Ｄなどの製造装置）を構成する制御部を有するコンピュータを用いて実行することができる。
【００５３】
本発明の細胞組織体の製造プログラムの処理手順の一例を示す。図１３は、細胞組織体の製造装置における、細胞組織体の製造プログラムの処理手順の一例を示すフローチャートである。
【００５４】
前述の細胞接着性材料をパターンしたのと同様にして、細胞非接着性材料をパターンすることによっても細胞を任意に配置することができる。
例えば、図７Ａから図７Ｆ、図８Ａから図８Ｄ、及び図９Ａから図９Ｆに示すように、細胞接着性材料のパターンを、細胞接着性面（７２、８１ａ、９４）を有する基材（７１、８１、９５）へ形成することで、細胞非接着性材料パターン部（７４、８３ｃ、９３ａ）以外の箇所に細胞を配置することができる。
また、図１０Ａから図１０Ｄに示すように、細胞接着性材料パターン１０３ｃと、細胞非接着性材料パターン１０２とをインクジェット（ＩＪ）装置などで配置することで、基材１０１の特性によらず細胞を配置することも可能となる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１）
＜パターン状細胞接着部の形成＞
スライドガラス上へ細胞非接着性表面を形成するため、次のものを用意した。アルギン酸ナトリウム（ＳＫＡＴ  ＯＮＥ、株式会社キミカ製）を質量比２％となるように蒸留水へ溶解させたアルギン酸ナトリウム溶液を用意した。また、塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業株式会社製）を１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように蒸留水へ溶解させた塩化カルシウム溶液を用意した。このアルギン酸ナトリウム溶液と塩化カルシウム溶液とを質量比１：１となるように、前記スライドガラス上へ混合塗布することで、細胞非接着性の表面層として、アルギン酸カルシウムゲル層を形成した。
次に、レーザー加工機（Ｈ１０−１０６ＱＷ  Ｊ８０−８ｓｓ４２Ｈｉｐｐｏ、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社製）を用いて、厚さ５０μｍのポリイミドフィルム（３−１９６６−０３、アズワン株式会社製）へ、直径（φ）１００μｍの孔を３００μｍピッチであけ、マスクフィルムを形成した。該細胞非接着性表面を有する基板を、形成したマスクフィルムで覆った。蒸留水へ、細胞接着性材料としてフィブロネクチン（Ｆ−２００６，Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を質量比で０．１０質量％となるように細胞接着性材料の溶液を調製した。マスクフィルムを貼り合わせた細胞非接着性表面を有する基板上へ、細胞接着性材料の溶液を塗布し、乾燥させた。その後、マスクフィルムを剥がすことで、細胞非接着性面を有する基板へ、細胞接着性材料のパターン層（パターン状の細胞接着部）を形成した。
【００５７】
＜細胞インクの調製＞
形成した細胞パターンを評価するために細胞を染色した。緑色蛍光染料（商品名：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の濃度でジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と称す）へ溶解させ、無血清ダルベッコ変法イーグル培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）と混合し、濃度１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）の緑色蛍光染料含有無血清培地を調製した。次に、培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ｃｌｏｎｅ  ５６１１、ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）のディッシュに緑色蛍光染料含有無血清培地を５ｍＬ添加し、インキュベーター（ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５体積％ＣＯ２環境））内で３０分間培養した。その後、アスピレータを用いて、上澄みを除去した。ディッシュにリン酸緩衝生理食塩水（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、以下、ＰＢＳ（−）とも称する）を５ｍＬ加え、アスピレータでＰＢＳ（−）を吸引除去し、表面を洗浄した。ＰＢＳ（−）による洗浄作業を２回繰り返した後、０．０５質量％トリプシン−０．０５質量％ＥＤＴＡ溶液（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をディッシュ１枚あたり２ｍＬ加えた。
次に、インキュベーター内にて５分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した後、１０質量％ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」とも称す）及び１質量％抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、ナカライテスク株式会社製）を含むＤ−ＭＥＭを４ｍＬ加えた。次に、トリプシンを失活させた細胞懸濁液を５０ｍＬ遠沈管１本に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１，２００ｒｐｍ、５分間、５℃）を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。除去後、遠沈管に１０質量％ＦＢＳ及び１質量％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを２ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ細胞懸濁液を得た。該細胞懸濁液から１０μＬをエッペンドルフチューブに取り出し、培地を７０μＬ添加後、１０μＬを別のエッペンドルフチューブに取り出し、０．４質量％トリパンブルー染色液１０μＬを加えてピペッティングを行った。染色した細胞懸濁液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに載せた。商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（インビトロジェン社製）を用いて細胞数を計測して細胞数を求めることで、細胞数を計測した細胞懸濁液を得た。分散培としてＰＢＳ（−）を用いた。ＰＢＳ（−）へ、細胞乾燥抑制剤としてグリセリン（分子生物学用グレード、和光純薬工業株式会社製）を質量比０．５質量％となるように溶解させ、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞懸濁液を６×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬとなるように分散培へ分散させて、細胞インクを得た。
【００５８】
＜細胞パターンの形成＞
図３Ａの細胞組織体の製造装置の細胞吐出ヘッドの液室へ細胞インクを充填した。次に、上記で作製したパターン状細胞接着部のドット（直径（φ）１００μｍ）毎に、細胞インクの液滴を３滴ずつ（細胞数６個狙い）、２０ドットに滴下した。また、細胞インクの液滴を５滴ずつ（細胞数１０個狙い）、２０ドットに滴下した。
最後の細胞インクの液滴を着弾し終えてから１０分間静置した後、１０質量％ＦＢＳ及び１質量％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを静かに加えた。
このようにして、細胞パターンが形成された細胞組織体を製造した。
【００５９】
＜細胞パターンの評価＞
得られた細胞組織体の細胞パターンについて、以下の評価を実施した。評価した結果を表１に示す。
【００６０】
［細胞の初期接着時間］
１０分間の静置で細胞がパターン状細胞接着部の上に接着しているか否かを、蛍光顕微鏡（ＣＫＸ４１、オリンパス株式会社製）を用いて、以下の基準により評価した。
○：  パターン状細胞接着部の上へ細胞が接着できていることを確認できた
×：  パターン状細胞接着部の上へ細胞が接着できていることを確認できなかった
【００６１】
［細胞パターンの形状精度（パターンの解像度の評価）］
細胞パターンの形状の精度を、蛍光顕微鏡（ＣＫＸ４１、オリンパス株式会社製）を用いて以下の基準により評価した。
○：  細胞パターンが３００μｍのピッチで形成できていた
×：  細胞パターンが３００μｍより大きいピッチとなっていた
【００６２】
［所定の細胞接着部へ所定数の細胞を配置できる確率（細胞数の制御の評価）］
直径（φ）１００μｍの各細胞接着部のドットに配置されている細胞の数を、蛍光画像をもとに算出し、以下の基準により評価した。
評価に使用したドットは、６個、１０個を狙って滴下した２０ずつ、計４０のドット全てを対象にした。
○：  ドットあたりの細胞数が狙いの数に対して±２０％以下となるドットが８０％以上
×：  ドットあたりの細胞数が狙いの数に対して±２０％以下となるドットが８０％未満
【００６３】
［配置した細胞数が所望の数となっている確率（細胞密度の評価）］
直径（φ）１００μｍの各細胞接着部のドットに配置されている細胞の数を、蛍光画像をもとに算出し、以下の基準により評価した。
評価に使用したドットは、細胞数１０個を狙って滴下した２０のドットを対象にした。
○：  ドットあたりの細胞数８個以上が８０％以上
×：  ドットあたりの細胞数８個以上が８０％未満
【００６４】
［配置された細胞の所定時間経過後における生存率（細胞の生存率の評価）］
１０分間静置した細胞パターンに対し、死細胞の核染色剤としてプロピジウムイオダイド（Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ−ＰＩ、同仁化学研究所製）を蒸留水へ１ｍｇ／ｍＬで溶解させたストック溶液を、５ｍＬに１０μＬとなるように添加した。その後、インキュベーターで１０分間培養した後、蛍光顕微鏡を用いて各ドットに存在する死細胞の割合を算出し、以下の基準により評価した。
評価に使用したドットは、細胞数１０個を狙って滴下した２０のドットを対象にした。
○：  ドットあたりの細胞の生存率の平均が７５％以上
×：  ドットあたりの細胞の生存率の平均が７５％未満
【００６５】
（実施例２）
細胞乾燥抑制剤をアルギン酸ナトリウム０．１質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして、細胞パターンが形成された細胞組織体を製造し、実施例１と同様の評価を行った。実施例２の評価結果を表１に示す。
【００６６】
（実施例３）
細胞乾燥抑制剤と非接着性表面を有する基板とを下記に示すものに変更した以外は、実施例１と同様にして、細胞パターンが形成された細胞組織体を製造し、実施例１と同様の評価を行った。実施例３の評価結果を表１に示す。
細胞乾燥抑制剤は、質量比０．０５質量％コラーゲン（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ１−Ａ，新田ゼラチン株式会社製）に、非接着性表面を有する基板はジメチルポリシロキサン（ＳＹＬＧＡＲＤ１８４、東レ・ダウコーニング社製、以下、ＰＤＭＳと称す）に変更した。
ＰＤＭＳは、ベース材と硬化剤を質量比１０：１で混合した後、脱泡処理し、７０℃２時間加熱処理をして得たものである。
【００６７】
（実施例４）
細胞接着性材料をコラーゲンに変更した以外は、実施例３と同様にして、細胞パターンが形成された細胞組織体を製造した。実施例１と同様の評価を行った。実施例４の評価結果を表１に示す。
【００６８】
（実施例５）
細胞接着性材料をフィブリンに変更した以外は、実施例３と同様にして、細胞パターンが形成された細胞組織体を製造した。実施例１と同様の評価を行った。実施例５の評価結果を表１に示す。
使用したフィブリンは、フィブリノーゲン（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐｌａｓｍａ  Ｆ８６３０，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）質量比０．２質量％と、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐｌａｓｍａ  Ｔ４６４８，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）質量比０．２質量％とを混合させた後、室温で一晩静置して得たものである。
【００６９】
（実施例６）
細胞接着性材料をＲＧＤペプチド（生化学用、和光純薬工業株式会社製）０．１質量％に変更した以外は、実施例３と同様にして、細胞パターンが形成された細胞組織体を製造した。実施例１と同様の評価を行った。実施例６の評価結果を表１に示す。
【００７０】
（実施例７）
細胞接着性材料を質量比２質量％のゼラチン微粒子に変更した以外は、実施例３と同様にして、細胞パターンが形成された細胞組織体を製造した。実施例１と同様の評価を行った。実施例７の評価結果を表１に示す。
なお、ゼラチン微粒子は、ゼラチン（ＡＰＨ−２５０、新田ゼラチン株式会社製）を用いて、上述した−細胞接着性を有する粒子の作製方法−の欄で記載した方法により作製した。
【００７１】
（実施例８）
ＮＩＨ／３Ｔ３を分散させた細胞インク１と、Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＣＣ−２５０９、Ｌｏｎｚａ社製、以下ＮＨＤＦと称す）を分散させた細胞インク２とを用意した。パターン形状の細胞接着部へ、これら細胞インクを交互に配置した。
細胞インク２は、細胞をＮＨＤＦへ、染料を赤色蛍光染料（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  ＲＥＤ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）へ変更した以外は、細胞インク１と同様にして、調製した。
実施例１と同様の評価に加え、下記に示す複数細胞の評価も行った。実施例８の評価結果を表２に示す。
【００７２】
［複数細胞の配置］
細胞パターンの形状の精度を、蛍光顕微鏡（ＣＫＸ４１、オリンパス株式会社製）を用いて以下の基準により評価した。
○：  ＮＩＨ／３Ｔ３とＮＨＤＦが交互に配置された細胞パターンが３００μｍ以下のピッチで形成できていた
×：  ＮＩＨ／３Ｔ３とＮＨＤＦが交互に配置された細胞パターンが３００μｍより大きいピッチとなっていた
【００７３】
（実施例９）
パターン状細胞接着部の形成方法にインクジェット法を用いた以外は、実施例８と同様にして、細胞パターンが形成された細胞組織体を製造した。実施例８と同様の評価を行った。実施例９の評価結果を表２に示す。
【００７４】
＜パターン状細胞接着部の形成＞
−細胞接着性材料インクの調製−
細胞接着性材料としてフィブロネクチンを蒸留水へ質量比０．０５質量％となるように溶解させ、細胞接着性材料インクを調製した。
−インクジェットによるパターン状細胞接着部の形成工程−
細胞接着性材料インクを図３Ｄの製造装置の細胞接着性材料吐出ヘッドの液室へ充填した。ＰＤＭＳ基材上へ直径（φ）１００μｍのドットとなるように３００μｍピッチで吐出した後、乾燥させることで、細胞非接着性面を有する基板にパターン状の細胞接着部を形成した。
【００７５】
（実施例１０）
−コンタクトプリント方式−
パターン状細胞接着部の形成方法として、図６Ａから図６Ｆに示したコンタクトプリント方式を用い、細胞接着性材料にマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ＧＦＲ  ＲＥＦ  ３５４２３０、ＣＯＲＮＩＮＧ社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして、細胞パターンが形成された細胞組織体を製造し、実施例１と同様の評価を行った。実施例１０の評価結果を表３に示した。
【００７６】
＜パターン状細胞接着部の形成＞
−細胞接着性材料インクの調製−
細胞接着性材料としてマトリゲルを蒸留水へ質量比０．０５質量％となるように溶解させ、細胞接着性材料インクを調製した。
−コンタクトプリントによるパターン状細胞接着部の形成工程−
直径（φ）１００μｍ、高さ５０μｍの柱を形成したＰＤＭＳ版材の上に細胞接着性インクを塗布し、細胞非接着性面を有する基板（ＰＤＭＳ）上に転写させ、細胞接着部を形成した。
【００７７】
（実施例１１）
−Ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡでの細胞非接着パターン形成（ネガティブ印刷、マスク工程）−
パターン上細胞非接着部の形成方法として、図７Ａから図７Ｆに示した方式を用い、細胞非接着性材料としてｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ（Ｐｏｌｙ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）と、細胞接着性基板として６０ｍｍ  ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃａｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ  ｃｏｄｅ  ３０１０−０６０、ＡＧＣテクノグラス株式会社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして、細胞非接着性パターンを形成し、細胞接着性基板上へ細胞パターンが形成された細胞組織体を製造し、実施例１と同様の評価を行った。実施例１１の評価結果を表３に示した。
【００７８】
＜パターン状細胞接着部の形成＞
−細胞非接着性材料インクの調製−
細胞非接着性材料としてｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ５０μＬをエタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ  （９９．５）、和光純薬工業株式会社製）１ｍＬに溶解させ、細胞非接着性材料インクを調製した。
【００７９】
（実施例１２）
−アルギン酸での細胞非接着パターン形成（ネガティブ印刷、ＩＪ工程）−
パターン上細胞非接着部の形成方法として、図８Ａから図８Ｄに示した方式を用い、細胞非接着性材料に前述と同様のアルギン酸カルシウムゲルを用いた以外は、実施例１１と同様にして、細胞非接着性パターンを形成し、細胞接着性基板上へ細胞パターンが形成された細胞組織体を製造し、実施例１と同様の評価を行った。実施例１２の評価結果を表３に示した。
【００８０】
＜パターン状細胞接着部の形成＞
−細胞非接着性材料インクの調製−
細胞非接着性材料としてアルギン酸ナトリウム（ＳＫＡＴ  ＯＮＥ、株式会社キミカ製）を質量比２質量％となるように蒸留水へ溶解させたアルギン酸ナトリウム溶液と、塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業株式会社製）を１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように蒸留水へ溶解させた塩化カルシウム溶液とを用意した。
【００８１】
−インクジェットによるパターン状細胞非接着部の形成工程−
前記アルギン酸ナトリウム溶液と塩化カルシウム溶液を細胞接着性基板上へインクジェットによってそれぞれ吐出し、基板上で混合ゲル化させることで細胞非接着性パターンを細胞接着性基板上へ形成した。
【００８２】
（実施例１３）
−Ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡでの細胞非接着パターン形成（ネガティブ印刷、コンタクトプリント）−
パターン状細胞非接着性部の形成方法として、図９Ａから図９Ｆに示したコンタクトプリント方式を用いた以外は、実施例１１と同様にして、細胞非接着性パターンを形成し、細胞接着性基板上へ細胞パターンが形成された細胞組織体を製造し、実施例１と同様の評価を行った。実施例１３の評価結果を表３に示した。
【００８３】
（実施例１４）
−コラーゲン＋ＰＤＭＳでの細胞非接着パターン形成（ネガティブ印刷、ＩＪ工程）−
基板上の細胞接着性パターン及び細胞非接着性パターン形成方法として、図１０Ａから図１０Ｄに示した方法を用い、スライドガラス（Ｓ１１１１、松浪硝子工業株式会社製）、細胞接着性材料にマトリゲルを用い、細胞非接着性材料としてＰＤＭＳを用いた以外は、実施例１及び実施例１１と同様にして、細胞接着性パターンを形成し、細胞接着性基板上へ細胞パターンが形成された細胞組織体を製造し、実施例１と同様の評価を行った。実施例１４の評価結果を表３に示した。
【００８４】
＜パターン状細胞接着部の形成＞
実施例１で用いたマスクフィルム上へ塗布した後、マスクフィルムを剥がすことで細胞非接着性パターンを形成した。
前記非接着性パターンがない箇所へ、実施例９と同様にして、インクジェットによりコラーゲンを吐出し細胞接着性パターンを形成した。
【００８５】
（比較例１）
細胞接着性材料としてフィブロネクチンを用い、該細胞接着性材料をマスクパターンを介さずに塗布した（パターン状の細胞接着部ではない）以外は、実施例８と同様にして、細胞組織体を製造した。実施例８と同様の評価を行った。比較例１の評価結果を表２に示した。
【００８６】
（比較例２）
細胞インクに細胞乾燥抑制剤を含有させなかった以外は、実施例８と同様にして、細胞組織体を製造した。実施例８と同様の評価を行った。比較例２の評価結果を表２に示した。
【００８７】
（比較例３）
細胞をインクジェット法にて配置する代わりに、細胞乾燥抑制剤を含まない細胞懸濁液をＮＩＨ／３Ｔ３とＮＨＤＦをそれぞれ用意した。手作業により、それぞれの細胞懸濁液を５×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬずつ、合計１×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬとなるように播種した以外は、実施例９と同様にして、細胞組織体を製造した。実施例８と同様の評価を行った。比較例３の評価結果を表２に示した。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
【表２】
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【００９０】
【表３】
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【００９１】
比較例１の結果は、パターン状の細胞接着部が形成されていないため、着弾した際の細胞が接着する場所を制御することができなかった。したがって、狙いのピッチで細胞パターンを形成できなかっただけでなく、設定した直径（φ）１００μｍ領域での細胞の密度が低くなっていた。
比較例２の結果は、細胞インク中へ細胞乾燥抑制剤を含有させていないため、細胞の生存率は低かった。死んでしまった細胞は基板上に接着もしていなかった。
比較例３の結果は、インクジェット法による液滴吐出により、細胞を配置していないため、基板全体に細胞が接着しており、細胞パターンのパターン形状精度は悪いものであった。無血清Ｄ−ＭＥＭをやさしく流すウォッシングを実施することで細胞接着性の弱い領域の細胞は剥がれ、パターン形状の細胞接着部に沿って細胞が接着していたが、ＮＩＨ／３Ｔ３とＮＨＤＦがそれぞれランダムに接着してしまっており、２種類の細胞を任意に配置することはできなかった。また、ウォッシングにより、パターン形状の細胞接着部も剥がれている箇所があった。
【００９２】
本発明によれば、細胞パターンを形成するうえで重要な要素である、細胞の生存率、細胞パターンの解像度、細胞密度、及び細胞数の制御、すべてに対し良好な結果を示す、細胞組織体の製造方法を提供することができる。更に、本発明によれば、２種類以上の細胞を任意に配置した細胞パターンも形成することが可能となる。
【００９３】
本発明の態様は、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  細胞接着性材料からなる細胞接着部を、細胞非接着性面を有する基板上における所定の位置に所定の形状で形成する細胞接着部の形成工程と、
少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する細胞の配置工程と、
を含むことを特徴とする細胞組織体の製造方法である。
＜２＞  前記細胞接着部の形成工程が、前記細胞接着性材料を含む溶液を液滴として吐出し、前記液滴を前記細胞非接着性面を有する前記基板上へ配置することにより行う前記＜１＞に記載の細胞組織体の製造方法である。
＜３＞  前記細胞乾燥抑制剤が、多価アルコール類、ゲル状多糖類、及び細胞外基質から選ばれる蛋白質の少なくともいずれかを含む前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の細胞組織体の製造方法である。
＜４＞  前記細胞接着性材料が、細胞外基質からなる蛋白質を含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の細胞組織体の製造方法である。
＜５＞  細胞接着性材料からなる細胞接着部を、細胞非接着性面を有する基板上における所定の位置に所定の形状で形成する細胞接着部の形成手段と、
少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する細胞の配置手段と、
を有することを特徴とする細胞組織体の製造装置である。
＜６＞  細胞接着性材料からなる細胞接着部を、細胞非接着性面を有する基板上における所定の位置に所定の形状で形成し、細胞接着部を形成し、
少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する、
処理をコンピュータに実行させることを特徴とする細胞組織体の製造プログラムである。
＜７＞  細胞非接着性材料からなる細胞非接着部を、細胞接着性面を有する基板上に所定の形状で形成する細胞接着部の形成工程と、
少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する細胞の配置工程と、
を含むことを特徴とする細胞組織体の製造方法である。
＜８＞  前記細胞接着部の形成工程が、前記細胞非接着性材料を含む溶液を液滴として吐出し、前記液滴を、前記細胞接着性面を有する前記基板上へ配置することにより行う前記＜７＞に記載の細胞組織体の製造方法である。
＜９＞  細胞非接着性材料からなる細胞非接着部を形成した基板に対し、請求項２に記載の方法で、前記細胞非接着部のない基板上へ細胞接着性材料からなる細胞接着部を形成することにより、前記細胞接着部の形成工程を行う前記＜７＞から＜８＞のいずれかに記載の細胞組織体の製造方法である。
＜１０＞  細胞非接着性材料からなる細胞非接着部を、細胞接着性面を有する基板上に所定の形状で形成する細胞接着部の形成手段と、
少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する細胞の配置手段と、
を有することを特徴とする細胞組織体の製造装置である。
＜１１＞  細胞非接着性材料からなる細胞非接着部を、細胞接着性面を有する基板上に所定の形状で形成し、細胞接着部を形成し、
少なくとも細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液を液滴として、前記細胞接着部へ吐出して前記細胞を配置する、
処理をコンピュータに実行させることを特徴とする細胞組織体の製造プログラムである。
【００９４】
前記＜１＞から＜４＞及び＜７＞から＜９＞のいずれかに記載の細胞組織体の製造方法、前記＜５＞及び＜１０＞のいずれかに記載の細胞組織体の製造装置、並びに前記＜６＞及び＜１１＞のいずれかに記載の細胞組織体の製造プログラムによれば、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００９５】
【特許文献１】特開２０１７−１６９５６０号公報
【符号の説明】
【００９６】
１０      液滴吐出ヘッド
１１      細胞懸濁液
１２      液室
１３      メンブレン
１４      駆動部
１５      ノズル
１６      加振部
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
2019162097.tif 000037
【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
2019162097.tif 000039
【図９Ｂ】
2019162097.tif 000040
【図９Ｃ】
2019162097.tif 000041
【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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