(57)【要約】      （修正有）【課題】シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染を予防および治療するための組成物および方法の提供。【解決手段】式Ｉの三糖を含む、緑膿菌Ｐｓｌ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の合成オリゴ糖サブユニット。2019081761.tif 000041【選択図】図２
2019081761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌオリゴ糖の合成オリゴ糖サブユニットであって、式Ｉ：
【化１】
2019081761.tif 000029
（式中、
Ｒ1は、−ＯＨまたは
【化２】
2019081761.tif 000030
であり；
Ｒ2は、−ＯＨまたは
【化３】
2019081761.tif 000031
であり；
Ｒ3は、−ＯＸ（ここで、Ｘは、水素、アルキル基、またはアリール基である）；リンカー（ここで、前記リンカーは、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｎ3、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−Ｎ3、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、または−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−Ｎ3であることが可能であり、ｎおよびｍは、同一であるかまたは異なり、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）；またはコンジュゲーションを介して異種部分に結合されたリンカー（ここで、前記異種部分は、タンパク質、脂質、またはポリマーであることが可能である）であり；かつ
前記オリゴ糖サブユニットは、抗Ｐｓｌモノクローナル抗体ＷａｐＲ−０１６またはその抗原結合断片により特異的に結合可能である）
で示される三糖を含む、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌオリゴ糖の合成オリゴ糖サブユニット。
【請求項２】
六糖：
【化４】
2019081761.tif 000032
または十糖：
【化５】
2019081761.tif 000033
を含む、請求項１に記載のオリゴ糖サブユニット。
【請求項３】
モノクローナル抗体ＷａｐＲ−０１６が、配列番号１１および配列番号１２でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のオリゴ糖サブユニット。
【請求項４】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌオリゴ糖の合成オリゴ糖サブユニットであって、式ＩＩ：
【化６】
2019081761.tif 000034
（式中、
Ｒ4は、−ＯＨまたは
【化７】
2019081761.tif 000035
であり；
Ｒ5は、−ＯＨ、
【化８】
2019081761.tif 000036
であり；
Ｒ3は、−ＯＸ（ここで、Ｘは、水素、アルキル基、またはアリール基である）；リンカー（ここで、前記リンカーは、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｎ3、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−Ｎ3、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、または−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−Ｎ3であることが可能であり、ｎおよびｍは、同一であるかまたは異なり、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）；またはコンジュゲーションを介して異種部分に結合されたリンカー（ここで、前記異種部分は、タンパク質、脂質、またはポリマーであることが可能である）であり；かつ
前記オリゴ糖サブユニットは、抗Ｐｓｌモノクローナル抗体ＷａｐＲ−００１またはその抗原結合断片により特異的に結合可能である）
で示される四糖を含む、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌオリゴ糖の合成オリゴ糖サブユニット。
【請求項５】
四糖：
【化９】
2019081761.tif 000037
五糖：
【化１０】
2019081761.tif 000038
六糖：
【化１１】
2019081761.tif 000039
または十糖：
【化１２】
2019081761.tif 000040
を含む、請求項４に記載のオリゴ糖サブユニット。
【請求項６】
モノクローナル抗体ＷａｐＲ−００１が、配列番号５および配列番号６でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、請求項４または５に記載のオリゴ糖サブユニット。
【請求項７】
抗Ｐｓｌモノクローナル抗体ＷａｐＲ−０１６またはその抗原結合断片が、請求項５に記載の四糖にも請求項５に記載の五糖にも特異的に結合できない、請求項１に記載のオリゴ糖サブユニット。
【請求項８】
ポリペプチド、脂質、またはポリマーにコンジュゲートされた、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴ糖サブユニット。
【請求項９】
前記ポリペプチドがアルブミンである、請求項８に記載のオリゴ糖サブユニット。
【請求項１０】
前記ポリペプチドがウシ血清アルブミンである、請求項９に記載のオリゴ糖サブユニット。
【請求項１１】
（ａ）オリゴ糖サブユニットへの抗体の結合を可能にする条件下で前記抗体を請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴ糖サブユニットに接触させること；および
（ｂ）前記抗体と前記オリゴ糖サブユニットとの複合体の存在を検出すること；
を含む、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌエピトープに対する抗緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌ抗体またはその抗原結合断片の結合特性を評価する方法。
【請求項１２】
前記複合体がＥＬＩＳＡアッセイにより検出される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｃ）請求項５に記載の四糖、五糖、六糖、および十糖のそれぞれに結合する場合、前記抗体をクラスＩＩエピトープに結合するものとして分類すること；および
（ｄ）請求項５に記載の六糖または十糖には結合するが、請求項５に記載の四糖にも五糖にも結合しない場合、前記抗体をクラスＩＩＩエピトープに結合するものとして分類すること；
をさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）オリゴ糖サブユニットへのＰｓｌ特異的抗体またはその断片の結合を可能にする条件下で抗体または抗体断片のライブラリーを請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴ糖サブユニットに接触させること；
（ｂ）前記抗体と前記オリゴ糖サブユニットとの複合体の存在を検出すること；および  （ｃ）前記オリゴ糖サブユニットに結合する抗体を選択すること；
を含む緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌに結合する抗体をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
前記複合体がＥＬＩＳＡアッセイにより検出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴ糖サブユニットを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子およびその使用、特定的には、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染の予防および治療におけるその使用に関する。さらに、本開示は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染を予防および治療するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、易感染性個体内で急性および慢性感染の両方を引き起こすグラム陰性日和見病原体である（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８９（２２）：８３５３−８３５６（２００７））。このことは、部分的には、臨床使用される抗生物質に対する細菌の高い自然耐性に起因し、部分的には、高度に抗生物質耐性のバイオフィルムの形成に起因する（Ｄｒｅｎｋａｒｄ  Ｅ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ５：１２１３−１２１９（２００３）；Ｈａｎｃｏｃｋ  ＆  Ｓｐｅｅｒｔ，Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ  Ｕｐｄａｔｅ  ３：２４７−２５５（２０００））。
【０００３】
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、西洋諸国における院内感染の一般的原因である。これは、熱傷患者および免疫不全個体において菌血症の原因となる作用物質であることが多い（Ｌｙｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ２：１０５１−１０６０（２０００））。これは、特に、機械的人工呼吸器装着患者において院内感染グラム陰性肺炎の最も一般的な原因であり（Ｃｒａｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  １１：３２−５３  （１９９６））、嚢胞性線維症の個体の肺中で最も高頻度に見られる病原体である（Ｐｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＳＭ  Ｎｅｗｓ  ６：３３９−３４７（１９９８））。重篤な緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染は、全身的状態となって、敗血症をもたらす可能性がある。敗血症は、重篤な全身性炎症により特徴付けられ、多くの場合、多臓器不全および死をもたらす。
【０００４】
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌエキソ多糖は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の表面に固定されることが報告されており、宿主組織のコロニー化の易化およびバイオフィルム形成の樹立／維持に重要であると考えられている（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８６，４４６６−４４７５（２００４））。この構造は、マンノースリッチ繰り返し五糖を含む（Ｂｙｒｄ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３，６２２−６３８（２００９））
【０００５】
多剤耐性の増加に起因して、新たなシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）特異的な防止剤および治療剤の同定のための新規方針の開発が当分野において依然として必要とされている。
【０００６】
２０１２年６月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１２／０４１５３８号明細書（参照により全体として本明細書に組み込まれる）には、血清型非依存性Ｐｓｌエキソ多糖に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が記載されている。また、ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０９：１２７３−８７（参照により全体として本明細書に組み込まれる）も参照されたい。抗体は、競合結合アッセイに基づいて、３つのグループ（クラスＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ）に分類された。クラスＩおよびＩＩのエピトープに結合した抗体は、互いに非競合的であったが、クラスＩＩＩのエピトープを標的とする抗体ＷａｐＲ−０１６のみは、クラスＩおよびＩＩのエピトープを標的とする抗体と部分的に競合した。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）臨床単離物への抗ＰｓｌｍＡｂ結合に関する調査から、試験した全単離物の８５％（１４７／１７３）でＰｓｌ発現／アクセス可能性が示唆され、急性感染であることが確認されたもの（９６％）から得られた単離物では、より大きい反応性が観測された。これらの結果から、Ｐｓｌは、非ムコイドおよびムコイドの臨床単離物中の表面アクセス可能かつ優勢な新規な血清型非依存性防御抗原であることが示唆される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０４１５３８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８９（２２）：８３５３−８３５６（２００７）
【非特許文献２】Ｄｒｅｎｋａｒｄ  Ｅ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ５：１２１３−１２１９（２００３）
【非特許文献３】；Ｈａｎｃｏｃｋ  ＆  Ｓｐｅｅｒｔ，Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ  Ｕｐｄａｔｅ  ３：２４７−２５５（２０００）
【非特許文献４】Ｌｙｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ２：１０５１−１０６０（２０００
【非特許文献５】Ｃｒａｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  １１：３２−５３  （１９９６）
【非特許文献６】Ｐｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＳＭ  Ｎｅｗｓ  ６：３３９−３４７（１９９８）
【非特許文献７】Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８６，４４６６−４４７５（２００４）
【非特許文献８】Ｂｙｒｄ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３，６２２−６３８（２００９）
【非特許文献９】ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０９：１２７３−８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
新たな抗体を作製およびスクリーニングするために、ならびにワクチンの成分として使用するために、クラスＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの抗ＰｓｌＭａｂに結合するＰｓｌの領域の同定が当分野において依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌオリゴ糖の合成オリゴ糖サブユニットを提供する。
【００１１】
一態様では、式Ｉ
【化１】
2019081761.tif 000003
で示される三糖を含む、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌオリゴ糖の合成オリゴ糖サブユニットが提供される。この態様によれば、Ｒ1は、−ＯＨまたは
【化２】
2019081761.tif 000004
であることが可能であり；Ｒ2は、−ＯＨまたは
【化３】
2019081761.tif 000005
であることが可能であり；かつＲ3は、−ＯＸ（ここで、Ｘは、水素、アルキル基、またはアリール基である）；リンカー（ここで、リンカーは、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｎ3、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−Ｎ3、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、または−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−Ｎ3であることが可能であり、ｎおよびｍは、同一であるかまたは異なり、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）；またはコンジュゲーションを介して異種部分に結合されたリンカー（ここで、異種部分は、タンパク質、脂質、またはポリマーであることが可能である）であることが可能である。この態様に係るオリゴ糖サブユニットは、抗Ｐｓｌモノクローナル抗体ＷａｐＲ−０１６またはその抗原結合断片により特異的に結合可能である。
【００１２】
特定の態様では、式Ｉで示されるオリゴ糖サブユニットは、六糖：
【化４】
2019081761.tif 000006
または十糖：
【化５】
2019081761.tif 000007
を含む。
【００１３】
特定の態様では、式Ｉで示されるオリゴ糖サブユニットに特異的に結合可能なモノクローナル抗体ＷａｐＲ−０１６は、配列番号１１および配列番号１２でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む。
【００１４】
他の態様では、式ＩＩ：
【化６】
2019081761.tif 000008
で示される四糖を含む、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌオリゴ糖の合成オリゴ糖サブユニットが提供される。
【００１５】
この態様によれば、
Ｒ4は、−ＯＨまたは
【化７】
2019081761.tif 000009
であることが可能であり；Ｒ5は、−ＯＨ、
【化８】
2019081761.tif 000010
であることが可能であり；かつＲ3は、−ＯＸ（ここで、Ｘは、水素、アルキル基、またはアリール基である）；リンカー（ここで、リンカーは、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｎ3、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−Ｎ3、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、または−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−Ｎ3であることが可能であり、ｎおよびｍは、同一であるかまたは異なり、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）；またはコンジュゲーションを介して異種部分に結合されたリンカー（ここで、異種部分は、タンパク質、脂質、またはポリマーであることが可能である）であることが可能である。この態様に係るオリゴ糖サブユニットは、抗Ｐｓｌモノクローナル抗体ＷａｐＲ−００１またはその抗原結合断片により特異的に結合可能である。
【００１６】
特定の態様では、式ＩＩで示されるオリゴ糖サブユニットは、四糖：
【化９】
2019081761.tif 000011
五糖：
【化１０】
2019081761.tif 000012
六糖：
【化１１】
2019081761.tif 000013
または十糖：
【化１２】
2019081761.tif 000014
を含む。
【００１７】
特定の態様では、モノクローナル抗体ＷａｐＲ−０１６は、以上に示される四糖にも五糖にも結合しない。
【００１８】
特定の態様では、式ＩＩで示されるオリゴ糖サブユニットに特異的に結合可能なモノクローナル抗体ＷａｐＲ−００１は、配列番号５および配列番号６でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む。
【００１９】
特定の態様では、本明細書に提供されたオリゴ糖サブユニットはいずれも、ポリペプチド、脂質、またはポリマーにコンジュゲート可能である。特定の態様では、ポリペプチドは、アルブミン、例えば、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンであり得る。
【００２０】
本開示はさらに、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌエピトープに対する抗緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌ抗体またはその抗原結合断片の結合特性を評価する方法を提供する。特定の態様では、この方法は、（ａ）オリゴ糖サブユニットへの抗体の結合を可能にする条件下で抗体を本明細書に提供されるオリゴ糖サブユニットに接触させること；および（ｂ）抗体とオリゴ糖サブユニットとの複合体の存在を検出することを含む。特定の態様では、複合体は、免疫アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにより検出される。特定の態様では、この方法は、（ｃ）以上に記載の四糖、五糖、六糖、および十糖のそれぞれに結合する場合、抗体をクラスＩＩエピトープに結合するものとして分類すること；および／または（ｄ）以上に記載の六糖または十糖には結合するが、以上に記載の四糖にも五糖にも結合しない場合、抗体をクラスＩＩＩエピトープに結合するものとして分類することをさらに含み得る。
【００２１】
本開示はさらに、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌに結合する抗体をスクリーニングする方法を提供する。特定の態様では、この方法は、（ａ）オリゴ糖サブユニットへのＰｓｌ特異的抗体またはその断片の結合を可能にする条件下で抗体または抗体断片のライブラリーを本明細書に提供されるオリゴ糖サブユニットに接触させること；（ｂ）抗体とオリゴ糖サブユニットとの複合体の存在を検出すること；および（ｃ）オリゴ糖サブユニットに結合する抗体を選択することを含む。特定の態様では、複合体は、免疫アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにより検出される。
【００２２】
本開示はさらに、例えば、ワクチンとして使用するための、本明細書に提供されるオリゴ糖サブユニットを含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａは、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＰｓｌオリゴ糖の基本繰り返し構造を示している。図１Ｂは、Ｐｓｌエピトープマッピングに使用される４つの合成オリゴ糖サブユニットを示しており、化合物１は十糖であり、化合物２は五糖であり、化合物３は四糖であり、そして化合物４は六糖である。
【図２】図２は、図１Ｂに示される化合物を合成するために使用されるビルディングブロックを示している。化合物番号は、中間体構造を表し、１〜１２は、実施例１に詳述される合成スキームで参照される。
【図３Ａ−Ｄ】図３Ａ−Ｄは、合成Ｐｓｌオリゴ糖に結合する抗ＰｓｌｍＡｂを示している。四糖（３）−ＢＳＡコンジュゲート（３Ａ）、五糖（２）−ＢＳＡコンジュゲート（３Ｂ）、六糖（４）−ＢＳＡコンジュゲート（３Ｃ）、および十糖（１）−ＢＳＡコンジュゲート（３Ｄ）を、示された炭水化物濃度でマイクロタイタープレートにコートした。各オリゴ糖成分との反応性に関して、抗ＰｓｌｍＡｂのクラスＩ（Ｃａｍ−００３、●）、クラスＩＩ（ＷａｐＲ−００１、■）、クラスＩＩＩ（ＷａｐＲ−０１６、▲）、およびＲ３４７（◆）（５μｇ／ｍＬ）を試験した。光学濃度（ＯＤ）値を平均±ＳＤとして報告する。クラスＩ（Ｃａｍ−００３）、クラスＩＩ（ＷａｐＲ−００１）、およびクラスＩＩＩ（ＷａｐＲ−０１６）の抗ＰｓｌｍＡｂは、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来するＰｓｌの３つのユニークエピトープに結合することが既に示された。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ｉ．定義
用語「ａ」または「ａｎ」で修飾された実体は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子」は、「シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する１つまたは複数の結合分子を表すと理解されることに留意すべきである。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。
【００２５】
さらに、本明細書において使用される「および／または」は、他方を含めてまたは含めずに、２つの特定の特徴または成分のそれぞれの特定の開示とみなされるものとする。したがって、「Ａおよび／またはＢ」などの語句で使用される用語「および／または」は、本明細書では、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句で使用される用語「および／または」は、次の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）のそれぞれを包含することが意図される。
【００２６】
態様が言語「〜を含む」で本明細書に記載される場合は常に、「〜からなる」および／または「〜から本質的になる」という用語で記載される他の類似の態様もまた、提供されるものと理解される。
【００２７】
特に定義のない限り、本明細書において使用される科学技術用語はすべて、本開示が関連する分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、本開示において使用される用語の多くを含む一般的な辞書を当業者に提供する。
【００２８】
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）の認められた形式で表される。数値の範囲は、範囲を規定する数を包含する。特に記載のない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向に左から右に記載される。本明細書に提供される見出しは、本開示の種々の態様を限定するものではなく、そうした限定は、本明細書全体を参照することにより得られるものである。したがって、すぐ下に定義される用語は、本明細書全体を参照することにより、より十分に定義される。
【００２９】
用語「オリゴ糖」は、２つ以上の単糖を含有する分子を指す。単糖は、任意の炭水化物の基本ビルディングブロックである。単糖は、基本分子式：ＣnＨ2nＯnを有するが、多くの場合、置換を有する。オリゴ糖は、本明細書に記載の方法により、または当業者に公知の方法により、作製可能である。用語「多糖」は、用語「オリゴ糖」と互換的に使用可能であるが、一般的には、単糖よりも比較的長いストリングを指す。
【００３０】
用語「合成オリゴ糖」または「合成オリゴ糖サブユニット」は、オリゴ糖、例えば、天然に生じるオリゴ糖の一部分を意味し、インビトロ化学合成により生成されたものである。本明細書において使用されるオリゴ糖サブユニットは、より大きいオリゴ糖または多糖の一部分であり得るオリゴ糖、すなわち、２つ以上の単糖を含有する分子を指す。例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌオリゴ糖は、５つの単糖を含む繰り返しサブユニットで構成されると報告されている（図１Ａ参照）。
【００３１】
本明細書において使用される用語「コンジュゲート」は、既知の生物学的活性を有するタンパク質または他のより大きい分子、例えば、脂質またはポリマーにリンカーを介して共有結合された合成オリゴ糖またはオリゴ糖サブユニットを意味する。オリゴ糖またはオリゴ糖サブユニットは、例えば、グリコシド間の酸素または硫黄を介してコンジュゲート可能である。
【００３２】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、単数形「ポリペプチド」および複数形「ポリペプチド」を包含するものとし、アミド結合（ペプチド結合としても公知）により直鎖状に結合しているモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つまたは複数の鎖を指し、規定の長さの生成物を指さない。したがって、２つ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を指すために使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、それらの用語のいずれにも代えて、またはそれらの用語と互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾、例として、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解開裂、または非天然に生じたアミノ酸による修飾の生成物も指すものとする。ポリペプチドは、天然生物学的資源に由来し得、または組換え技術により産生することができるが、指定される核酸配列から必ずしも翻訳されない。これは、任意の様式、例として化学合成により生成することができる。
【００３３】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書において互換的に使用可能である。本明細書に開示の抗体（またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、少なくとも重鎖の可変ドメインならびに少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系の基本免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照されたい。
【００３４】
当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらは一部のサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を有することを認識する。抗体の「クラス」をＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  ＩｇＧ、またはＩｇＥとしてそれぞれ決定するのはこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1などは、十分に特性決定されており、機能的特殊化を付与することが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの改変バージョンは、本開示に照らして当業者に容易に認識可能であり、したがって本開示の範囲内である。
【００３５】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。それぞれの重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖と結合していてよい。一般に、軽鎖および重鎖は、互いに共有結合しており、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子エンジニアリングされた宿主細胞のいずれかにより生成された場合、２つの重鎖の「テール」部分が共有ジスルフィド結合または非共有結合により互いに結合している。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ形状のフォーク型末端におけるＮ末端からそれぞれの鎖の下方部におけるＣ末端に及ぶ。
【００３６】
軽鎖および重鎖の両方は、構造および機能ホモロジーの領域に分割される。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。これに関して、軽（ＶＬ）鎖および重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが認識される。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、重要な生物学的特性、例えば、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などを付与する。慣習により、定常領域ドメインの番号付与は、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠くなるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり；ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際には、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端をそれぞれ含む。
【００３７】
上記のとおり、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合することを可能とする。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、組み合わさって３次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この４元構造は、Ｙのそれぞれのアームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖のそれぞれの３つのＣＤＲにより定義される。
【００３８】
抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体には、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）2、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生された断片が含まれる。ＳｃＦｖ分子は、当分野で公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号明細書に記載されている。
【００３９】
「特異的に結合する」は、一般に、結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、およびその結合が、抗原結合ドメインとエピトープとの間でいくらかの相補性を必要とすること、を意味する。この定義によれば、結合分子は、その抗原結合ドメインを介してランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易にそのエピトープに結合する場合、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書において、特定の結合分子が特定のエピトープに結合する相対親和性を認定するために使用される。例えば、結合分子「Ａ」は、所与のエピトープに対して結合分子「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなされこともあれば、結合分子「Ａ」は、関連エピトープ「Ｄ」に対するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われることもある。
【００４０】
抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、エピトープへの参照の抗体または抗原結合断片の結合をある程度遮断するという範囲内でそのエピトープに優先的に結合する場合、所与のエピトープへの参照の抗体または抗原結合断片の結合を競合阻害すると言われる。競合阻害は、当分野において公知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより、決定可能である。結合分子は、所与のエピトープへの参照の抗体または抗原結合断片の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合阻害すると言うことができる。
【００４１】
本明細書において使用される用語「親和性」は、個別のエピトープと免疫グロブリン分子のＣＤＲとの結合の強度の尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）２７〜２８頁を参照されたい。本明細書において使用される用語「アビディティー」は、免疫グロブリン集団と抗原との複合体の全体的安定性、すなわち、免疫グロブリン混合物と抗原との機能的組み合わせ強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４頁を参照されたい。アビディティーは、集団中の個別の抗体分子と特異的エピトープとの親和性、さらには免疫グロブリンと抗原との結合価の両方に関連付けられる。例えば、２価モノクローナル抗体と、ポリマーなどの高繰り返しエピトープ構造を有する抗原と、の相互作用は、高アビディティーの１つであろう。
【００４２】
本明細書において使用される用語「治療する」または「治療」は、目的が含む所望な生理学的変化、感染、または障害を予防または遅滞（縮減）させることである療法的治療および防止的または予防的措置の両方を指す。利益または所望の臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能か検出不能かにかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、対象における感染原因物質、例えば緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のクリアランスまたは低減、疾患進行の遅延または遅滞、疾患状態の改善または緩和、および寛解（一部または完全を問わない）が含まれる。「治療」は、治療を受けない場合に予期される生存率と比較した生存率の延長も意味し得る。治療を必要とする者には、既に感染、病態、または障害を有する者ならびに病態または障害を有しやすい者または病態もしくは障害を予防すべき者、例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染を受けやすい熱傷患者または免疫抑制患者が含まれる。
【００４３】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後診断、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家畜動物、農場動物、および動物園、競技、または愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシ、クマなどが含まれる。
【００４４】
ＩＩ．シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌオリゴ糖および抗Ｐｓｌ抗体  Ｐｓｌは、インビボで上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を促進し、バイオフィルムの形成および維持に不可欠である（Ｄｉｇｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１２，２０９，１２７３−１２８７；Ｈｉｄｒｏｎ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｈｏｓｐ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２００８，２９，９９６−１０１１）。それに加えて、Ｐｓｌは、効率的オプソニン化を阻害するので、反応性酸素種の好中球産生の低減および食細胞による死滅の減少をもたらす（Ｍｉｓｈｒａ，Ｍ．．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２，１４，９５−１０６。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の表面上のＰｓｌのレクチン染色および可視化から、それがヘリカルパターンで細胞表面に固定されることが示唆される。この組織化は、他のバイオフィルム開始成分の足場を提供することにより、細胞間相互作用に寄与すると考えられる（Ｂｙｒｄ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００９，７３，６２２−６３８）。Ｐｓｌは、比較的低分子量（６．５ＫＤａ）の多糖であり、分枝五糖繰り返し単位で構成される（図１Ａ）（Ｋｏｃｈａｒｏｖａ，Ｎ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８，２６３，１１２９１−１１２９５）。
【００４５】
シュードモナスＰｓｌ標的は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌ、または他の細菌種、例えば、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、またはシュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）により産生されるＰｓｌ様オリゴ糖であり得る。
【００４６】
機能活性スクリーンと組み合わせて健常者または患者ドナーに由来する抗体ファージライブラリーを用いて、血清型非依存性Ｐｓｌエキソ多糖に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が最近同定された。Ｄｉｇｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１２，２０９，１２７３−１２８７および２０１２年６月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開２０１２／０４１５３８号明細書を参照されたい。抗ＰｓｌｍＡｂは、機能的に特徴付けられ、（ａ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害すること、（ｂ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のオプソニン食菌殺傷（ＯＰＫ）を促進、媒介、もしくは増強すること、または（ｃ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害することおよび緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進、媒介、もしくは増強することが示された。
【００４７】
クラスＩ、ＩＩ、およびＩＩＩとして参照される３つの異なるＰｓｌエピトープに結合する競合結合アッセイにより、抗体を分類した（表１）。クラスＩおよびＩＩのエピトープに結合した抗体は、互いに非競合的であったが、クラスＩＩＩのエピトープを標的とする抗体ＷａｐＲ−０１６のみは、クラスＩおよびＩＩのエピトープを標的とする抗体と部分的に競合した。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）臨床単離物への抗ＰｓｌｍＡｂ結合に関する調査から、試験した全単離物の８５％（１４７／１７３）でＰｓｌ発現／アクセス可能性が示唆され、急性感染であることが確認されたもの（９６％）から得られた単離物では、より大きい反応性が観測された。これらの結果から、Ｐｓｌは、非ムコイドおよびムコイドの臨床単離物において表面アクセス可能かつ優勢であることが示唆される。
【００４８】
【表１】
2019081761.tif 000015
【００４９】
クラスＩ抗体またはその断片は、ＷａｐＲ−００４、Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４、もしくはＣａｍ−００５の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）領域を含む抗体もしくはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌエピトープに特異的に結合可能な抗体またはその抗原結合断片を含み、ならびに／またはＷａｐＲ−００４、Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４、もしくはＣａｍ−００５のＶＨおよびＶＬを含む抗体もしくはその抗原結合断片によるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合を競合阻害可能である。
【００５０】
クラスＩＩ抗体またはその断片は、ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、もしくはＷａｐＲ−００３の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）領域を含む抗体もしくはその抗原結合断片と同一のシュードモナスＰｓｌエピトープに特異的に結合可能な抗体またはその抗原結合断片を含み、ならびに／またはＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、もしくはＷａｐＲ−００３のＶＨおよびＶＬを含む抗体もしくはその抗原結合断片によるシュードモナスＰｓｌ結合を競合阻害可能である。
【００５１】
クラスＩＩＩ抗体またはその断片は、ＷａｐＲ−０１６の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）領域を含む抗体もしくはその抗原結合断片と同一のシュードモナスＰｓｌエピトープに特異的に結合可能な抗体またはその抗原結合断片を含み、ならびに／またはＷａｐＲ−０１６のＶＨおよびＶＬを含む抗体もしくはその抗原結合断片によるシュードモナスＰｓｌ結合を競合阻害可能である。
【００５２】
抗ＰｓｌＭａｂは、２０１２年６月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１２／０４１５３８号明細書（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。表１に特徴付けられた例示的抗ＰｓｌＭａｂのＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸構造は、表２に提供される。
【００５３】
【表２】
2019081761.tif 000016
【００５４】
【表３】
2019081761.tif 000017
【００５５】
【表４】
2019081761.tif 000018
【００５６】
ＩＩ．合成オリゴ糖サブユニット
本開示は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌオリゴ糖、例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌオリゴ糖の合成オリゴ糖サブユニットを提供する。Ｐｓｌの生合成、およびこの複合糖質が緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の表面上にどのように集合するかについて、ほとんど知られていないので、抗ＰｓｌｍＡｂの結合要件を正確に規定すべく、化学合成オリゴ糖を調製した。本開示は、Ｐｓｌの報告された構造に基づいてモデリングされた一群のオリゴ糖の化学合成および特徴付けを提供し、各化合物と反応する抗ＰｓｌｍＡｂの能力を規定する（図１Ａ）。標的化合物１（図１Ｂ、化合物１）は、２つの繰り返し単位で構成される十糖である。この化合物は、繰り返しＰｓｌ多糖のすべての可能な部分構造を含有する。標的化合物２（図１Ｂ、化合物２）は、五糖であり、単一繰り返し単位を示す。標的化合物３（図１Ｂ、化合物３）は、追加の遠位グルコシドを有する繰り返し単位を含む六糖である。最後に、標的化合物４（図１Ｂ、化合物４）は、繰り返し五糖単位の分枝マンノシドが欠如した四糖である。以下の実施例に記載されるように、クラスＩＩおよびクラスＩＩＩのエピトープを標的とする抗ＰｓｌｍＡｂが合成Ｐｓｌオリゴ糖に結合することが、結合試験により確認された。興味深いことに、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対して最も防御的な機能活性を生じる、クラスＩエピトープを標的とする抗ＰｓｌｍＡｂは、合成化合物に結合できなかったことから、報告されたＰｓｌ構造に対してまだ解明されていない追加の修飾が示唆される。
【００５７】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌオリゴ糖のクラスＩＩＩエピトープを規定する合成オリゴ糖サブユニットは、式Ｉで示される三糖を含む合成オリゴ糖サブユニットとして提供される。
【化１３】
2019081761.tif 000019
【００５８】
特定の態様では、Ｒ1は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）であり得るか、または次式で示される三糖サブユニットであり得る。
【化１４】
2019081761.tif 000020
【００５９】
特定の態様では、Ｒ2は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）であり得るか、または次式で示される四糖サブユニットであり得る。
【化１５】
2019081761.tif 000021
【００６０】
特定の態様では、Ｒ3は、−ＯＸ（ここで、Ｘは、水素、アルキル基、またはアリール基である）、リンカー（限定されるものではないが、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｎ3、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−Ｎ3、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、または−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−Ｎ3を含み、ｎおよびｍは、同一であるかまたは異なり、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）、またはコンジュゲーションを介して異種部分に結合されたリンカー（ここで、異種部分は、例えば、以上に述べたように、タンパク質、脂質、またはポリマーであり得る）であり得る。他の好適なリンカーおよびコンジュゲート部分、さらにはアノマー炭素でオリゴ糖をコンジュゲートする方法は、当業者に周知である。例えば、Ｈｅｖｅｙ，Ｒａｎｄ  Ｌｉｎｇ，Ｃ．−Ｃ．，２０１２，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：５４５−５８４；Ｍｏｒｅｌｌｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２９：５７２３−５７７７；およびＣｏｓｔａｎｔｉｎｏ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃ．６：１０４５−１０６６（それぞれ参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００６１】
特定の態様では、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌオリゴ糖のクラスＩＩＩエピトープを規定する合成オリゴ糖サブユニットは、図１Ｂに化合物４として示される六糖または図１Ｂに化合物１として示される十糖を含む。
【００６２】
以上に記載の合成オリゴ糖サブユニットは、クラスＩＩＩ抗Ｐｓｌ抗体またはその抗原結合断片により特異的に結合可能である。例えば、合成オリゴ糖サブユニットは、配列番号１１および配列番号１２でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、抗Ｐｓｌモノクローナル抗体ＷａｐＲ−０１６またはその抗原結合断片により特異的に結合可能である。当業者であれば分かるであろうが、以上に記載の合成オリゴ糖サブユニットはまた、ＷａｐＲ−０１６と同一のエピトープに結合する抗Ｐｓｌ抗体により結合可能である。実施例でより詳細に説明されるように、クラスＩＩＩ抗Ｐｓｌ抗体は、図１Ｂにｆ３として示される四糖にも図１Ｂに化合物２として示される五糖にも結合しない。
【００６３】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌオリゴ糖のクラスＩＩエピトープを規定する合成オリゴ糖サブユニットは、式ＩＩで示される四糖を含む合成オリゴ糖サブユニットとして提供される。
【化１６】
2019081761.tif 000022
【００６４】
特定の態様では、Ｒ4は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）であり得るか、または次式で示される単糖サブユニットであり得る。
【化１７】
2019081761.tif 000023
【００６５】
特定の態様では、Ｒ5は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）であり得るか、または次式：
【化１８】
2019081761.tif 000024
で示される五糖サブユニットもしくは次式
【化１９】
2019081761.tif 000025
で示される単糖サブユニットであり得る。
【００６６】
特定の態様では、Ｒ3は、−ＯＸ（ここで、Ｘは、水素、アルキル基、またはアリール基である）、リンカー（限定されるものではないが、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｎ3、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｓ（ＣＨ2）m−Ｎ3、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、または−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＳＯ2（ＣＨ2）m−Ｎ3を含み、ｎおよびｍは、同一であるかまたは異なり、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）、またはコンジュゲーションを介して異種部分に結合されたリンカー（ここで、異種部分は、例えば、以上に述べたように、タンパク質、脂質、またはポリマーであり得る）であり得る。
【００６７】
特定の態様では、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌオリゴ糖のクラスＩＩエピトープを規定する合成オリゴ糖サブユニットは、図１Ｂに化合物４として示される六糖、図１Ｂに化合物１として示される十糖、図１Ｂに化合物３として示される四糖、または図１Ｂに化合物２として示される五糖を含む。
【００６８】
以上に記載の合成オリゴ糖サブユニットは、クラスＩＩ抗Ｐｓｌ抗体またはその抗原結合断片により特異的に結合可能である。例えば、合成オリゴ糖サブユニットは、配列番号５および配列番号６でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、抗Ｐｓｌモノクローナル抗体ＷａｐＲ−００１もしくはその抗原結合断片、配列番号７および配列番号８でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、抗Ｐｓｌモノクローナル抗体ＷａｐＲ−００２もしくはその抗原結合断片、または配列番号９および配列番号１０でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、抗Ｐｓｌモノクローナル抗体ＷａｐＲ−００３もしくはその抗原結合断片により、特異的に結合可能である。当業者であれば分かるであろうが、以上に記載の合成オリゴ糖サブユニットはまた、ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、およびＷａｐＲ−００３と同一のエピトープに結合する抗Ｐｓｌ抗体により結合可能である。
【００６９】
特定の態様では、本開示は、以上に記載の合成オリゴ糖サブユニットの合成中間体を提供する。図２および実施例２に非限定的な中間体の例が示される。
【００７０】
ＩＶ．オリゴ糖コンジュゲート
特定の態様では、本明細書に提供される合成オリゴ糖サブユニットは、異種分子、例えば、ポリペプチド、脂質、またはポリマーに装着可能である。特定の態様では、オリゴ糖サブユニットは、異種分子に共有結合で装着される。たとえば、それにコンジュゲートされる。オリゴ糖は、典型的には、リンカー、グリコシド間の酸素または硫黄を介して異種分子にコンジュゲートされる。
【００７１】
本明細書に提供されるオリゴ糖サブユニットは、担体へのオリゴ糖の結合を提供する従来の化学技術を用いて、リンカーを介してタンパク質担体に装着可能である。リンカーと、タンパク質担体およびオリゴ糖の両方と、の共有結合を行う方法は、当分野で周知である。非限定的な例は、ヘテロまたはホモ二官能性クロスカップリング試薬上の相補的官能基の使用を含み得る。特定の態様では、相補的官能基は、オリゴ糖上もしくはタンパク質担体上の結合に利用可能な官能基または結合のためにオリゴ糖上もしくは担体上に導入可能な官能基に対して選択される。例えば、好適な周知の活性化剤の存在下で、リンカーまたはタンパク質のいずれかのカルボン酸と、タンパク質またはリンカーの第１級または第２級アミンと、を反応させると、アミド結合が形成され；リンカーまたはタンパク質のいずれかのアミン基と、タンパク質またはリンカーのハロゲン化スルホニルと、を反応させると、共有結合でスルホンアミド結合が形成され；リンカーまたはタンパク質担体のいずれかのアルコール基またはフェノール基と、担体またはリンカーのハロゲン化アルキルまたはハロゲン化アリールと、を反応させると、担体をリンカーに共有結合するエーテル結合が形成される。同様に、これらの相補的反応をリンカーとオリゴ糖との間で行って、オリゴ糖とリンカーとの結合を形成することが可能である。
【００７２】
本明細書に提供されるオリゴ糖サブユニットにコンジュゲート可能なタンパク質の非限定的な例には、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンもしくはウシ血清アルブミン、破傷風トキソイド、免疫グロブリンＦｃ領域、またはキーホールリンペットヘモシアニンが含まれる。
【００７３】
本明細書に提供されるオリゴ糖サブユニットにコンジュゲート可能な脂質の非限定的な例には、Ｃ6〜Ｃ24脂肪酸、すなわち、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの飽和脂肪酸；およびパルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸などの不飽和脂肪酸をはじめとする脂肪酸親油鎖が含まれる。
【００７４】
本明細書に提供されるオリゴ糖サブユニットにコンジュゲート可能なポリマーの非限定的な例には、ポリアルキレングリコール鎖、たとえば、ポリエチレングリコールが含まれる。有用なポリエチレングリコールは、式Ｈ−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）nＯＨ（式中、ｎ、すなわち、エチレンオキシド単位の数は、４〜１４である）を有する。有用なポリエチレングリコール脂肪アルコールエーテルには、エチレンオキシド単位（ｎ）が１〜８でありかつアルキル基がＣ6〜Ｃ18であるものが含まれる。
【００７５】
ＶＩＩ．抗Ｐｓｌ抗体の同定およびエピトープマッピング
特定の態様では、本開示は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌエピトープに対する１種以上の抗緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌ抗体またはその抗原結合断片の結合特性を評価する方法を提供する。評価される抗体またはその断片は、Ｐｓｌへの結合が既に同定された抗体、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）への結合が既に同定された抗体もしくはその断片、さらにはランダム抗体ライブラリー、または緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に以前感染した回復期個体もしくは回復個体から調製された抗体ライブラリーを含み得る。
【００７６】
本方法は、（ａ）オリゴ糖サブユニットへの抗体の結合を可能にする条件下で１種以上の抗体またはその断片を本明細書に提供される１種以上のオリゴ糖サブユニットに接触させること；および（ｂ）抗体またはその断片とオリゴ糖サブユニットとの複合体の存在を検出することを含む。検出は、任意の好適な免疫アッセイを介するものであり得る。その多くは、当業者に公知である。特定の態様では、免疫アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイである。この方法によれば、１種以上の抗体が、本明細書に提供される四糖、五糖、六糖、および十糖のＰｓｌオリゴ糖サブユニット化合物、たとえば、図１Ｂに示される化合物１、２、３、および４のそれぞれに結合する場合、クラスＩＩエピトープに結合するものとして分類可能である。他の選択肢として、１種以上の抗体が、本明細書に提供される六糖および／または十糖のＰｓｌオリゴ糖サブユニット化合物、たとえば、図１Ｂの化合物１および４には結合するが、本明細書に提供される四糖または五糖のＰｓｌオリゴ糖サブユニット化合物、たとえば、図１Ｂの化合物２および３のいずれにも結合しない場合、クラスＩＩＩエピトープに結合するものとして分類可能である。
【００７７】
特定の態様では、この方法を用いて、改良された抗Ｐｓｌ抗体、例えば、Ｐｓｌに対してより大きい親和性またはアビディティーを呈する抗Ｐｓｌ抗体を選択することが可能である。
【００７８】
他の態様では、本方法は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌに結合する抗体をスクリーニングのために使用可能である。本方法は、（ａ）オリゴ糖サブユニットの１つ以上へのＰｓｌ特異的抗体またはその断片の結合は可能にするが、Ｐｓｌに対して特異的でない抗体は結合しない条件下で、抗体または抗体断片のライブラリーを本明細書に提供されるオリゴ糖サブユニットの１つ以上に接触させること；（ｂ）抗体またはその断片とオリゴ糖サブユニットとの複合体の存在を検出すること；および（ｃ）オリゴ糖サブユニットに結合する抗体を選択することを含み得る。
【００７９】
ファージディスプレイライブラリーなどの抗体ライブラリーは、当分野で周知である。特に、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはネズミ）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイするために利用することができる。対象の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原により、例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して選択または同定することができる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖ  ＯＥ  ＤＡＢ（軽鎖または重鎖からの個々のＦｖ領域）またはファージ遺伝子ＩＩＩもしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質に組換え融合されたジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージである。例示的な方法は、例えば、欧州特許第３６８６８４Ｂ１号明細書；米国特許第５，９６９，１０８号明細書、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１（２０００）；Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：２６８２（２００１）；Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）に記載されており、それらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））は、鎖シャフリングによる高親和性ヒト抗体の産生、ならびに大ファージライブラリーの構築のための方針としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換えを記載している。別の実施形態において、リボソームディスプレイを使用してバクテリオファージをディスプレイプラットフォームとして置き換えることができる（例えば、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０（２００１）；またはＩｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１（２００１）参照）。さらに別の実施形態において、細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングすることができる（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１（２０００））。そのような手順は、モノクローナル抗体の単離および後続のクローニングのための慣習的なハイブリドーマ技術の代替手段を提供する。
【００８０】
ＶＩＩＩ．緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌの合成オリゴ糖サブユニットを含む医薬組成物
特定の態様では、Ｐｓｌの合成オリゴ糖サブユニットは、ワクチン組成物のように免疫反応を誘導するための免疫原性組成物であり得る。特定の態様では、合成オリゴ糖サブユニットを含むタンパク質コンジュゲートは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染を治療するためのワクチンとして使用可能である。
【００８１】
本明細書において使用される用語「治療」、「治療する」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾患もしくは症状を完全にもしくは部分的に予防するという観点から予防的であることが可能であり、ならびに／または疾患および／もしくは疾患に帰属可能な有害作用の部分的もしくは完全な治癒という観点から治療的であることが可能である。本明細書において使用される「治療」には、限定されるものではないが、（ａ）疾患の素因を有する可能性がある対象において、または疾患に罹患しやすい可能性があるが、まだ疾患を有すると診断されていない対象において（たとえば、対象がシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）による感染を受けやすいが、まだ感染していない場合）、シュードモナス関連の疾患または病態が発生するのを予防すること、たとえば、限定されるものではないが、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）による感染後の疾患および／または死亡のリスクを低減すること；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）による感染後の疾患および／または死亡の発生率を低減すること；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）による感染の発生率またはリスクを低減すること；およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）による感染後の疾患の程度を低減すること；（ｂ）シュードモナス感染から生じる疾患または症状を阻害すること、たとえば、その発生を停止させること、その進行を遅延させること；あるいは（ｃ）シュードモナス（Ｐｓｅｕｔｏｍｏｎａｓ）感染から生じる疾患または症状を軽減すること、たとえば、疾患または症状の寛解を引き起こすことが含まれる。
【００８２】
グリココンジュゲートワクチンは、これまでに開発された最も安全で最も有効なワクチンの１つであり、髄膜炎や肺炎などの命にかかわる細菌感染の予防に広く使用されている（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１１，６，１０４５−１０６６）。細菌多糖のユニークエピトープに結合してさまざまな機能活性を引き起こすｍＡｂの同定は、エピトープマッピングにおける合成化学の重要性を強調し、将来的なグリココンジュゲートワクチンの開発に重要な意味を有しうる。特定的には、細菌多糖の炭水化物エピトープの注意深い選択は、最適な防御反応を引き起こすうえできわめて重要であり得る。例えば、ＷａｐＲ−０１６が、末端グルコシドを含有する六糖には強力に反応するが、類似の埋込みグルコシドを保有する化合物には十分に反応しないという観測結果は、適合する抗体を誘導するのに適した合成ワクチン設計の重要性を増大させる（以下の実施例２参照）。
【００８３】
したがって、一態様では、本開示は、治療を必要とする対象に本明細書に記載の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌの合成オリゴ糖サブユニットを含む組成物を投与することを含む、対象におけるシュードモナス感染の治療方法を提供する。特定の態様では、オリゴ糖サブユニットは、担体、例えば、ヒトもしくはウシ血清アルブミン、破傷風トキソイドなどのタンパク質、脂質、またはポリマーにコンジュゲートされる。以上に定義されたように、有効量であれば治療を行うのに十分である。特定の治療的または予防的処置を施すのに有効な量および方法は、個別の患者および疾患の病期、さらには当業者に公知の他の因子によって異なり得る。
【００８４】
本開示で使用される緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌの合成オリゴ糖サブユニットを含む組成物は、当業者に周知の薬学的に許容可能な担体を含み得る。非経口投与製剤には、無菌の水性または非水性の溶液剤、サスペンジョン剤、およびエマルジョン剤が含まれる。本明細書に開示された特定の医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性サスペンジョン剤、または溶液剤をはじめとする許容可能な剤形で、経口投与することが可能である。また、特定の医薬組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入により投与することが可能である。また、保存剤および他の添加剤、たとえば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどが存在することが可能である。本明細書に開示された治療方法に使用するための好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１６ｔｈ  ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【実施例】
【００８５】
実施例１：エピトープマッピングのための緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌのオリゴ糖サブユニットの合成
試薬および一般的手順。試薬を供給業者から入手し、購入したままの状態で使用した。標準的手順を用いてジクロロメタン（ＤＣＭ）を新たに蒸留した。他の有機溶媒を無水状態で購入し、さらなる精製を行うことなく使用した。特に断りのない限り、反応はすべて、磁気撹拌を行いながらオーブン乾燥ガラス容器内で室温で行った。使用前にモレキュラーシーブを高真空下で火炎乾燥した。浴温＜４０℃を用いて有機溶液を減圧下で濃縮した。シリカゲルＧ６０（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ、６０〜２００μｍ、６０Å）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーを行った。シリカゲル６０Ｆ２５４（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）を用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行い、適用可能な場合にはＵＶ吸収（２５４ｎｍ）により、２０％硫酸を含むエタノールをスプレーした後に約１５０℃で炭化することにより、または１０％硫酸を含むエタノール中の（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24．Ｈ2Ｏの溶液（２５ｇ／Ｌ）をスプレーした後に約１５０℃で炭化することにより、検出を行った。ｓｕｎワークステーションを備えたＶａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ−３００（３００／７５  ＭＨｚ）、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ−５００（５００／１２５  ＭＨｚ）、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ−６００（６００／１５０  ＭＨｚ）、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ−８００（８００／２００  ＭＨｚ）、およびＶａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ−９００（９００／２２５  ＭＨｚ）分光計を用いて、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを記録した。一重線（ｓ）、幅広い一重線（ｂｒ  ｓ）、二重線（ｄ）、二重線の二重線（ｄｄ）、三重線（ｔ）、または多重線（ｍ）として、多重度を引用する。ＣＯＳＹおよびＨＳＱＣ実験を用いて、スペクトルを帰属した。上付きのローマ数字Ｉが付されたシグナルは、還元末端であり、ＩＩおよびＩＩＩは、それぞれ、還元末端から２番目の糖および非還元末端であった。化学シフトはすべて、百万分率（ｐｐｍ）単位のδスケールで引用される。内部参照として残留溶媒シグナルを使用した。オートサンプラー、フラクションコレクター、ＵＶ検出器、およびｅｃｌｉｐｓｅＸＤＢ−Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×２５０ｍｍまたは９．４×２５０ｍｍ）を備えたＡｇｌｉｅｎｔ１２００シリーズのシステムを用いて、１．５ｍＬ／ｍｉｎの流量で、逆相ＨＰＬＣを行った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ５８００  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプロテオミクスアナライザーを用いて質量スペクトルを記録した。使用したマトリックスは、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）であり、ｕｌｔａｍａｒｋ１６２１が内部標準であった。
【００８６】
全脱保護の一般的手順。新たに調製したＮａＯＭｅ（ｐＨ１０）をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（２／１、ｖ／ｖ、２μｍｏｌ／ｍＬのオリゴ糖濃度）中の化合物２６（スキーム３）、化合物１９（スキーム１）、化合物２０（スキーム１）、または化合物６（図２）の溶液に添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次いで、ＭｅＯＨ中の１０％ＡｃＯＨを添加することにより中和した。懸濁液をＤＣＭで洗浄した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3およびブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を脱水し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そして濾液を減圧下で濃縮した。シリカゲル（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、１／２、ｖ／ｖ）を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、脱アシル化生成物を与えた。得られた部分脱保護化合物をｔ−ＢｕＯＨと水との混合物（１／１、ｖ／ｖ、２μｍｏｌ／ｍＬの糖濃度）に溶解させ、Ｐｄ（ＯＨ）2／Ｃ（２０ｗｔ．％、Ｄｅｇｕｓｓａタイプ）を添加した。得られた混合物を水素雰囲気下（１ｐｓｉ）に配置した。４８時間攪拌した後、触媒を濾別し、そして水で十分に洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮し、そしてＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２により粗生成物を精製した。
【００８７】
オリゴ糖合成。図２に示されるビルディングブロックを用いて、以下のスキーム１、２、および３に示される合成により、図１Ｂに示される式１〜４のオリゴ糖サブユニットを調製した。全繰返し単位を構成する共通糖部分をグリコシル供与体および受容体に変換し、これをカップリングさせて目標化合物を与えるブロック合成により、２つ以上の繰返し単位で構成されるオリゴ糖の集合を行った（Ｂｏｌｔｊｅ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．２００９，１，６１１−６２２）。合成用のビルディングブロックを図２に示す。
【００８８】
一般的要件。しかしながら、図１Ｂ中の化合物１の場合、近接するα−マンノシドのＣ−２およびアノマー中心のβ−アノマー配置により、Ｃ−１  Ｃ−２、Ｃ−３置換基が込み合った１，２，３−シス配置で配置されて、必要とされるマンノシル受容体のＣ−３ヒドロキシルの反応性が低くなるので、そのような戦略は問題があると考えられた。したがって、四糖供与体５（図２）を六糖受容体６（図２）とカップリングさせて十糖を与え、全脱保護後に目標化合物１（図１Ｂ）を提供する代替戦略を用いた。さらに、三糖１５は、四糖５および六糖６の調製のための適切な前駆体であり、合成工程（スキーム１）の所要の数を最小限に抑えるであろうと想定された。
【００８９】
β−マンノシドの配置は、主要なビルディングブロック５および６の調製の厄介な態様であった（図２）。これらの１，２−ｃｉｓグリコシドは、β面からの進入求核剤を立体的にブロックするアキシアルＣ−２置換基およびα−アノマーの追加の安定化を提供するΔアノマー効果に起因して、導入が困難であった（Ｇｒｉｄｌｅｙ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．−Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  ２０００，２０００，１４７１−１４９１；Ｃａｉ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，．Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００９，６２，２５１−３０９）。β−マンノシド結合を構築する方法は、Ｃｒｉｃｈおよび共同研究者による研究に基づき、ＳN２様に糖ヒドロキシルにより置き換えてβ−マンノシドを与えることが可能である強いエンドアノマー効果に起因して選択的に形成されるα−アノマートリフレートのインサイチュー形成を含む（Ｃｒｉｃｈ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｕｎ，Ｓ．Ｘ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，１１２１７−１１２２３；Ｃｒｉｃｈ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｕｎ，Ｓ．Ｘ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９８，５４，８３２１−８３４８）。β−マンノシド形成の前提条件は、グリコシル供与体を４，６−Ｏ−ベンジリデンアセタールにより保護することである。この保護基は、この中間体の半椅子形または舟形の配座により引き起こされる捩れ歪みに起因してオキサカルベニウム形成（ＳN１グリコシル化）に対抗することが提案されてきた。それに加えて、４，６−Ｏ−アセタールは、置換基Ｏ−６が、遷移状態で形成される電子不足アノマー中心に逆平行にその双極子を配置して不安定化効果をもたらすｔｇコンフォメーションをとるようにさせる（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，９２０５−９２１３）。
【００９０】
図２のビルディングブロックの調製。単糖７〜１２は、主要なビルディングブロック５および６の調製に好適であろうと想定された（図２）。これらの誘導体を一時保護基ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）および２−メチルナフチル（Ｎａｐ）により修飾し、これを逐次的に除去して成長オリゴ糖鎖の伸長および分岐状部分の配置を可能にし得る。さらに、Ｃ−２シリルエーテルおよびＣ−３Ｎａｐエーテルにより修飾された４，６−Ｏ−ベンジリデン保護マンノシル供与体は、最適なβ−アノマー選択率を提供した（Ｂｏｌｔｊｅ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１０，１２，４６３６−４６３９）。したがって、β−マンノシド配置のためにマンノシル供与体７および８を使用した。さらに、グリコシル化時に隣接基関与を行うようにＣ−２位がアセチルエステルにより修飾されたマンノシル供与体９（Ｗａｓｃｈｋｅ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１１，１３，３６２８−３６３１）は、分枝α−マンノシドの調製に理想的に適していると予想された。ラムノシル受容体１０（Ｍａｒｉｎｏ−Ａｌｂｅｒｎａｓ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９３，２４５，２４５−２５７）は、Ｃ−３ヒドロキシルを有し、これは、β−マンノシル化後、アノマーアリルエーテルを有する生成物を与えるであろう。このアノマーアリルエーテルは、除去されて、さらなるグリコシル化のためのトリクロロアセトイミデート脱離基に変換可能である（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ  Ｋｉｎｚｙ，Ｗ．，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４，５０，２１−１２３；Ｚｈｕ，Ｘ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｒ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００９，４８，１９００−１９３４）。最後に、グルコシル供与体１１は、ビルディングブロック１２の調製のための前駆体であった。これは、担体タンパク質へのコンジュゲーションの機会を提供するアジドプロピルスペーサにより修飾される。また、グリコシル供与体１１を骨格β−グルコシドの配置のためにも使用した。
【００９１】
スキーム１に示されるように六糖サブユニット（図１Ｂ中の式４）の合成を行った。
【化２０】
2019081761.tif 000026
【００９２】
六糖６は、２つのβ−マンノシドを含有し、グリコシドの込み合った１，２，３−ｃｉｓ構成を有する（スキーム１）。したがって、−６０℃で１−ベンゼンスルフィニルピペリジン（ＢＳＰ）および無水トリフル酸（Ｔｆ2Ｏ）を用いてチオマンノシル供与体７の前活性化を行ってから（Ｃｏｄｅｅ，Ｊ．Ｄ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００３，５，１５１９−１５２２）、受容体１０を添加することにより（Ｍａｒｉｎｏ−Ａｌｂｅｒｎａｓ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９３，２４５，２４５−２５７）、主にβ−アノマー（α／β＝１／１２）として７５％の優れた収率でた二糖１３を与えた（スキーム１）。少量の望ましくないα−アノマーは、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、容易に除去可能であった。過剰の２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（ＤＤＱ）を用いて１３のＮａｐエーテルの酸化的除去を行って（Ｇａｕｎｔ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６３，４１７２−４１７３；Ｘｉａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２０００，４１，１６９−１７３）、対応する二糖受容体１４を提供した。ＤＴＢＭＰの存在下、−７８℃でｐ−ニトロフェニルスルフェニルクロリド（ｐ−ＮＯ2Ｃ6Ｈ4ＳＣｌ）および銀トリフレートを用いてチオマンノシド８の前活性化を行ってから（Ｃｒｉｃｈ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００８，３４３，１８５８−１８６２）、受容体１４を添加することにより、所望の生成物を与えなかった。したがって、活性化剤系としてＢＳＰおよびＴｆ2Ｏを利用し、７２％の収率で主にβ−アノマー（α／β＝１／１０）として三糖１５を与えた。次いで、ＰｄＣｌ2で処理することにより１５のアノマーアリルエーテルを除去してヘミアセタール１６を与えたが、アリルエーテルからプロペン−２−オンエーテルへの予想外の酸化に起因して、収率はわずか４０％にすぎなかった。（Ｌｉ，Ｚ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９９，３１７，１９１−１９２）。この問題は、還流トルエン中でウィルキンソン触媒およびＤＩＰＥＡを用いて末端アルケンを異性化して、中間体エノールエーテルを与え、これをアセトン／水中で酸化水銀（ＩＩ）（ＩＩ）および塩化水銀（ＩＩ）で処理して開裂させ、８０％の収率で１６を与えることにより、２工程で回避された。Ｃｓ2ＣＯ3の存在下でトリクロロアセトニトリルと反応させることにより、ラクトール１６を対応するトリクロロアセトイミデート１７に変換し、そしてグルコシル受容体１２による１７のＴＭＳＯＴｆ触媒グリコシル化を行うことにより（（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ  Ｋｉｎｚｙ，Ｗ．，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４，５０，２１−１２３；Ｚｈｕ，Ｘ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｒ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００９，４８，１９００−１９３４）、Ｃ−２ベンゾエートエステルの隣接基関与に起因してα−アノマーのみとして７０％の収率で四糖１８を供給した。ピリジン中で過剰のＨＦで処理することにより、他の保護基になんら影響を及ぼすことなく、���８のＴＢＳエーテルの除去を円滑に進行させ、グリコシル受容体１９を与えた。ＤＣＭ中で四糖受容体１９によるマンノシル供与体９のＴＭＳＯＴｆ促進グリコシル化を行って（Ｗａｓｃｈｋｅ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１１，１３，３６２８−３６３１）、８２％の収率で五糖２０を提供した。溶媒としてのジエチルエーテル中で、より容易にアクセス可能な供与体フェニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシドを、活性化剤としてのＮＩＳ／ＴＭＳＯＴｆと組み合わせて使用することにより、低収率のカップリング生成物を得た。標準的条件を用いて２０のＮａｐエーテルを除去してから、活性化剤としてＮＩＳ／ＴＭＳＯＴｆを用いてグルコシル供与体１１による得られた受容体２１のグリコシル化を行って、６８％の収率で六糖２２を提供した。最後に、２２のＴＢＳエーテルのＨＦ−ピリジン媒介除去により、良好な収率で目標六糖受容体６を与えた。ＴＢＳ基とＮａｐ基との直交性があるので、最初にβ−グルコシド、次いでα−マンノシドを配置することが可能である。しかしながら、そのような戦略は、１，２−ｃｉｓ−グリコシドによりフランキングされたＣ−２ヒドロキシルのグリコシル化を必要とするので、それほど生産的でないと予想された。最後に、以上に記載のように六糖受容体６を全脱保護に付して、図１Ｂ中の式４を生成した。
【００９３】
以下のように四糖サブユニット（図１Ｂ中の式３）の合成を行った。以上に記載のように式１９（スキーム１）を全脱保護に付して、図１Ｂ中の式３を生成した。
【００９４】
以下のように五糖サブユニット（図１Ｂ中の式２）の合成を行った。以上に記載のように式２０（スキーム１）を全脱保護に付して、図１Ｂ中の式２を生成した。
【００９５】
スキーム２および３に示されるように十糖サブユニット（図１Ｂ中の式４）の合成を行った。
【化２１】
2019081761.tif 000027
【化２２】
2019081761.tif 000028
【００９６】
共通の三糖１５から出発して四糖供与体５を調製した。したがって、ＨＦピリジンで処理することにより１５のＴＢＳ基を除去し、得られた受容体２３をマンノシル供与体９とカップリングさせて四糖２４を提供した。後者の化合物を、２工程手順を用いてアノマーアリルエーテルを除去して２５を与えてから１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンの存在下で２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−フェニルアセトイミドイルクロリドで処理することにより、グリコシル供与体５に変換した。
【００９７】
０℃、ＤＣＭ中、ＴＭＳＯＴｆの存在下で５と６とをカップリングさせることにより、グリコシル供与体のＣ−２エステルの隣接基関与に起因してβ−アノマーのみとして７０％の収率で十糖２６を与えた（スキーム３）。２工程手順により２６の脱保護を容易に達成し、以上に記載の十糖１を供給した。これは、メタノール中でナトリウムメトキシドで処理してエステル保護基を除去してから、ｔＢｕＯＨとＨ2Ｏとの混合物中でＰｄ（ＯＨ）2／Ｃを用いて水素化することにより、ベンジルエーテルおよびＮａｐエーテルを除去し、かつアジドをアミノ基に変換することを含んでいた。化合物１のアノマーシグナルのＮＭＲデータ（図示せず）は、報告値に一致する。２０、１９、および６の保護基を除去することにより、それぞれ、五糖２、四糖３、および六糖４を容易に調製することが可能であった。
【００９８】
実施例２：合成オリゴ糖サブユニットを用いた緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌのエピトープマッピング
この実施例では、実施例１で生成された合成オリゴ糖サブユニットのタンパク質コンジュゲーションおよび免疫学的アッセイにより、抗Ｐｓｌモノクローナル抗体により結合されるエピトープが決定されることを実証する。
【００９９】
アミノプロピルスペーサのＳ−アセチルチオグリコリルアミド誘導体化の一般的手順。図１Ｂ中の化合物１〜４のアミノプロピル基のＳ−アセチルチオグルコイルアミド誘導体化を以下のように行った。オリゴ糖３（５．０ｍｇ、７．０７μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（５００μＬ）中にスラリー化し、Ｓ−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル（ＳＡＭＡ−ＯＰｆｐ）（３．２ｍｇ、１０．６０μｍｏｌ）を添加し、続いて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２．５μＬ、１４．１４μｍｍｏｌ）を滴下した。室温で２時間撹拌した後、混合物を濃縮し、トルエンを用いて２回共蒸発し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー（ＢｉｏｇｅｌＰ２カラム、１０％メタノール含有Ｈ2Ｏで溶出）により残渣を精製して、凍結乾燥後、白色粉末として対応するチオアセテート（５．２ｍｇ、６．３６μｍｏｌ、９０％）を与えた。このようにして、化合物１〜４のチオアセトアミド誘導体を８５〜９０％の収率で調製した。
【０１００】
Ｓ−脱アセチル化の一般的手順。以上に記載したように調製されたチオアセテート誘導体のＳ−脱アセチル化を以下のように行った。ＤＭＦ溶液（３００μＬ）中の７％ＮＨ3（ｇ）をｄｄＨ2Ｏ（４０μＬ）中の四糖３（１．２ｍｇ、１．４３ｍｍｏｌ）に対応するチオアセテート誘導体の溶液に添加し、混合物を撹拌した。［Ｍ＋Ｎａ］+の生成物ピークを示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより反応をモニターした。１時間後、溶媒を減圧下で蒸発させた。チオール誘導体化三糖を高真空下でさらに３０分間乾燥させ、次いで、さらなる精製を行うことなくただちにコンジュゲーションに使用した。他の３つのオリゴ糖サブユニットの脱アセチルを同様に行った。
【０１０１】
ＢＳＡ−マレイミドへのチオール誘導体化オリゴ糖のコンジュゲーションの一般的手順。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．による指示に従ってコンジュゲーションを行った。簡単に言えば、コンジュゲーションの直前に以上に記載のように脱保護されたチオール誘導体（タンパク質上の利用可能なＭＩ基に対して２．５ｅｑ．過剰）をｄｄＨ2Ｏ（１００μＬ）中に溶解させ、ＥＤＴＡおよびアジ化ナトリウム（２００μＬ）を含有するコンジュゲーション緩衝液リン酸ナトリウムｐＨ７．２中のマレイミド活性化タンパク質（２ｍｇ）の溶液に添加した。混合物を室温で１８時間インキュベートし、次いで、１０ｋＤａ分画分子量でＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ遠心濾過装置により精製した。遠心分離はすべて、４℃、３０００ｒｐｍで２５分間行った。反応混合物を遠心分離し、フィルターをリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４（３×２００μＬ）で洗浄した。コンジュゲートを回収して、リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（１ｍＬ）中に溶解させた。これにより、ＨＰＡＥＣ／ＰＡＤによる定量的単糖分析およびローリータンパク質濃度アッセイにより決定したとき、四糖３では７：１、五糖２では８：１、六糖４では１５：１、十糖１では５：１の炭水化物／ＢＳＡモル比のグリココンジュゲートを与えた。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ。オリゴ糖−ＢＳＡコンジュゲートの３倍段階希釈液（コンジュゲートオリゴ糖の濃度に対して）を用いてＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ）を４℃で一晩コートし、続いて、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）が追加されたＰＢＳで洗浄し、そして１％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ−Ｂ）が追加されたＰＢＳでブロックした。コートされたＥＬＩＳＡプレートを抗Ｐｓｌ抗体（５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ中でＢ）と共に４℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒト二次抗体で１時間処理し、続いて、（Ｄｉｇｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１２，２０９，１２７３−１２８７）記載されるように発色および分析を行った。
【０１０３】
免疫学的研究。競合アッセイに基づく３つのエピトープグループへの抗Ｐｓｌモノクローナル抗体の分類は、Ｄｉｇｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１２，２０９，１２７３−１２８７および２０１２年６月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１２／０４１５３８号明細書に記載された。分類は、以上の表１に示される。
【０１０４】
合成Ｐｓｌオリゴ糖の構造完全性を確認した後、合成オリゴ糖を認識する種々の抗ＰｓｌｍＡｂの能力を以下のように調べた。これらの実験では、ＥＬＩＳＡプレートのコーティングを容易にするために、オリゴ糖をＢＳＡにコンジュゲートし、続いて、各エピトープクラスに結合した代表的な抗体（クラスＩ−Ｃａｍ−００３；クラスＩＩ−ＷａｐＲ−００１；クラスＩＩＩ−ＷａｐＲ−０１６）を用いて反応性を試験した。
【０１０５】
図３Ａ〜Ｄに示されるように、代表的なクラスＩＩｍＡｂ（ＷａｐＲ−００１）が各オリゴ糖と強力に反応したことから、クラスＩＩ抗Ｐｓｌエピトープが四糖内に存在し、Ｐｓｌ繰り返し単位の分枝マンノシドを必要としないことが示唆される。Ｐｓｌは繰り返しヘテロポリマーであるので、各Ｐｓｌ五糖サブユニットは、抗体の標的として機能するであろう。理論により拘束されることを望むものではないが、この特徴は、おそらく、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）から精製された内因性Ｐｓｌで既に観測されたクラスＩＩ抗体の強力な反応性を説明する。クラスＩＩＩ抗体（ＷａｐＲ−０１６）は、四糖（３）にも五糖（２）にも結合しなかった。しかしながら、六糖４とは強力に、十糖１とは弱く反応した。これらの結果から、六糖４内にユニークに含有される末端グルコシドがクラスＩＩＩ抗体の最適な結合に重要であることが示唆された。それに加えて、天然Ｐｓｌ繰り返し単位が分岐状グルコシドを末端に有することが、この観測から示唆された。
【０１０６】
Ｐ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対して最も機能活性で防御的な抗ＰｓｌｍＡｂであることが示された代表的なクラスＩのｍＡｂ  Ｃａｍ−００３は、合成オリゴ糖のいずれにも結合しなかったことから、十分なクラスＩのＰｓｌエピトープが合成化合物中に存在しないことが示唆される。これらの結果は、十糖１が繰返し五糖のすべての可能な部分構造を含有すると推定されたので、予想外であった。この観測から、クラスＩのｍＡｂは、コンフォメーショナルエピトープまたはまだ解明されていない化学量論量未満のＰｓｌアイソフォームに結合する可能性が高い。後者の可能性は、網羅的なプロテアーゼ処理ではなく、温和なアルカリ処理が、炭水化物の精製時、ＷａｐＲ−００１およびＷａｐＲ−０１６反応性を維持しつつ、Ｃａｍ−００３反応性を消失するという観測により裏付けられる（データは示されていない）。
【０１０７】
本開示の範囲は、本開示の個別の態様の一例であることを意図して記載した特定の実施形態により限定されるものではなく、機能的に均等な組成物または方法はいずれも、本開示の範囲内である。実際に、以上の説明および添付の図面から、本明細書に提示および説明した実施形態に加えて本開示のさまざまな変更形態が当業者に自明なものとなるであろう。そのような変更形態は添付の特許請求の範囲内に包含されるものとみなされる。
【０１０８】
本明細書に挙げられた出版物および特許出願はすべて、あたかもそれぞれ個々の出版物または特許出願が具体的かつ個別的に明示されて参照により組み込まれたのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ−Ｂ】
2019081761.tif 000042
【図２】
2019081761.tif 000043
【図３Ａ−Ｄ】
2019081761.tif 000044
【配列表】
2019081761000001.app