(57)【要約】【課題】新規で、かつ高効率なロタウイルスの人工合成法を提供すること。【解決手段】１１本の分節した二本鎖ＲＮＡをゲノムとして有するロタウイルスの人工合成法であって、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを培養細胞に導入する工程を含み、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡは、それぞれ、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡであり、ｃＤＮＡを培養細胞に導入する際に、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量を他のｃＤＮＡの導入量よりも多くする、ロタウイルスの人工合成法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡをゲノムとして有するロタウイルスの人工合成法であって、
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを培養細胞に導入する工程を含み、
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡは、それぞれ、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡであり、
ｃＤＮＡを培養細胞に導入する際に、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量を他のｃＤＮＡの導入量よりも多くする、ロタウイルスの人工合成法。
【請求項２】
ＦＡＳＴタンパク質及び／又はＲＮＡキャッピング酵素をコードする核酸は、培養細胞に導入しない、請求項１に記載のロタウイルスの人工合成法。
【請求項３】
ＶＰ２遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量を他のｃＤＮＡの導入量よりも多くする、請求項１又は２に記載のロタウイルスの人工合成法。
【請求項４】
少なくともＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ及び／又はＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量が、他のｃＤＮＡの導入量に対して、２倍量以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のロタウイルスの人工合成法。
【請求項５】
ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量が、他のｃＤＮＡの導入量に対して、２倍量以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のロタウイルスの人工合成法。
【請求項６】
ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量が実質的に等量であり、かつ、他のｃＤＮＡの量に対して多い、請求項１〜３のいずれか１項に記載のロタウイルスの人工合成法。
【請求項７】
他のｃＤＮＡの導入量が実質的に等量である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のロタウイルスの人工合成法。
【請求項８】
プラスミドを用いてｃＤＮＡが導入される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のロタウイルスの人工合成法。
【請求項９】
プラスミドがＴ７プラスミドである、請求項８に記載のロタウイルスの人工合成法。
【請求項１０】
培養細胞が、ＢＨＫ／Ｔ７−９細胞、ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞、ＳＫ６．Ｔ７細胞及び２９３−３−４６細胞からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のロタウイルスの人工合成法。
【請求項１１】
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡのいずれかに、当該ｃＤＮＡに対応する遺伝子以外に由来する核酸配列が導入されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のロタウイルスの人工合成法。
【請求項１２】
ｃＤＮＡを培養細胞に導入した後に、ロタウイルスに感受性を有する細胞を用いて共培養を行う、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のロタウイルスの人工合成法。
【請求項１３】
ｃＤＮＡを培養細胞に導入した後に、共培養を行わない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のロタウイルスの人工合成法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高効率なロタウイルスの人工合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロタウイルスによる冬季乳幼児嘔吐下痢症は５歳までにほぼ１００％の乳幼児で起こる。感染力の高さゆえ、衛生状態の改善では、ロタウイルス感染を制御し得ない。世界的にみると、開発途上国を中心に毎年約２０万人以上の死亡例が報告される一方で、先進国においては入院例が多いために医療経済的見地からロタウイルスの感染予防が重要な課題となっている。
また、嘔吐下痢症以外にも、脳炎・脳症、１型糖尿病、胆道閉鎖、筋炎、乳児突然死等においてロタウイルスが直接的又は間接的に関連することが示唆されている（非特許文献１）。成人においても、免疫不全、臓器移植患者におけるロタウイルス感染は下痢の長期化による体力消耗を引き起こす。実際、成人での致死的なケースも報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
これまでに、２種のヒトロタウイルスワクチン（ＲｏｔａｒｉｘとＲｏｔａＴｅｑ）が開発されており、２種のワクチンについて優れた有効性と安全性が報告されているが、いずれも重症化を防ぐことに主眼が置かれたワクチンであり、ロタウイルスの感染の阻止に有効なワクチンが開発される目処は立っていない。ヒトロタウイルスの抗原系は多種多様であり、Ｇタイプ、Ｐタイプともに約１０種類の血清型（遺伝子型）が存在する。これら多数の血清型に広く効果的なワクチンの開発は困難を極める。
【０００４】
ロタウイルスは、レオウイルス科に属する外層と内層の２種のカプシドと最内層に存在するコアの三層からなるタンパク質に覆われた二本鎖ＲＮＡウイルスである。そして、コアを包むカプシドタンパク質の形状は正二十面体であり、ウイルスは、エンベロープを有していない。
【０００５】
ロタウイルスのゲノムは１１分節に分かれる約１８．６ｋ塩基対の二本鎖ＲＮＡであり、６つのウイルスタンパク質がウイルスの粒子を構成する。この６つの構造タンパク質（ＶＰ）は、それぞれＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６及びＶＰ７と呼ばれている。構造タンパク質に加え、非構造タンパク質（ＮＳＰ）をウイルスは有し、６つの非構造タンパク質は、それぞれＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、ＮＳＰ５及びＮＳＰ６と呼ばれている。
【０００６】
ロタウイルスについての感染性の組換えウイルスを人工合成する技術に関連して、非特許文献３〜５には、ヘルパーウイルスを用いたリバースジェネティクス法により、ウイルスゲノム１１分節のうちの１分節の人工合成について開示されている。また、特許文献１には、ロタウイルス等のレオウイルス科に属するウイルスについてリバースジェネティクスの系が開示されている。
また、非特許文献６には、ロタウイルスの１１分節のＲＮＡゲノムを発現するプラスミドに加え、組換えウイルスの人工合成を促進する因子として、コウモリレオウイルス由来の細胞融合性タンパク質ＦＡＳＴとワクシニアウイルス由来のＲＮＡキャッピング酵素を利用した、人工的に組換えロタウイルスを作製する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２１５４６６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Estes MK, Greenberg HB. 2013. Rotaviruses, p1347-1401. In Knipe DM, Howley PM (ed), Fields Virology, 6th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA
【非特許文献２】Liakopoulou E, Mutton K, Carrington D, Robinson S, Steward CG, Goulden NJ, Cornish JM, Marks DI. 2005. Rotavirus as a significant cause of prolonged diarrhoeal illness and morbidity following allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 36:691-694.
【非特許文献３】Komoto S, Sasaki J, Taniguchi K. 2006. Reverse genetics system for introduction of site-specific mutations into the double-stranded RNA genome of infectious rotavirus. Proc Natl Acad Sci USA 103:4646-4651.
【非特許文献４】Trask SD, Taraporewala ZF, Boehme KW, Dermody TS, Patton JT. 2010. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proc Natl Acad Sci USA 107:18652-18657.
【非特許文献５】Troupin C, Dehee A, Schnuriger A, Vende P, Poncet D, Garbarg-Chenon A. 2010. Rearranged genomic RNA segments offer a new approach to the reverse genetics of rotaviruses. J Virol 84:6711-6719.
【非特許文献６】Kanai Y, Komoto S, Kawagishi T, Nouda R, Nagasawa N, Onishi M, Matsuura Y, Taniguchi K, Kobayashi T. 2017. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proc Natl Acad Sci USA 114:2349-2354.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のとおり、ロタウイルスについては、これまでのところ、感染性の組換えウイルスを人工合成する技術として、有用かつ実用性の高いリバースジェネティクス法が確立されているとは言えず、病原性の解析や新規ワクチン開発の大きな障壁となっていた。
本発明が解決しようとする課題は、従来技術とは異なり極めて斬新な発明思想に基づく、新規で、かつ高効率なロタウイルスの人工合成法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、従来技術における技術思想にはない、ロタウイルスの１１分節の遺伝子のうち、当該遺伝子の導入量を調節することによりロタウイルスを高効率に人工合成することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明は、以下のとおりである。
（１）
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡをゲノムとして有するロタウイルスの人工合成法であって、
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを培養細胞に導入する工程を含み、
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡは、それぞれ、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡであり、
ｃＤＮＡを培養細胞に導入する際に、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量を他のｃＤＮＡの導入量よりも多くする、ロタウイルスの人工合成法。
（２）
ＦＡＳＴタンパク質及び／又はＲＮＡキャッピング酵素をコードする核酸は、培養細胞に導入しない、（１）に記載のロタウイルスの人工合成法。
（３）
ＶＰ２遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量を他のｃＤＮＡの導入量よりも多くする、（１）又は（２）に記載のロタウイルスの人工合成法。
（４）
少なくともＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ及び／又はＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量が、他のｃＤＮＡの導入量に対して、２倍量以上である、（１）〜（３）のいずれかに記載のロタウイルスの人工合成法。
（５）
ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量が、他のｃＤＮＡの導入量に対して、２倍量以上である、（１）〜（４）のいずれかに記載のロタウイルスの人工合成法。
（６）
ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量が実質的に等量であり、かつ、他のｃＤＮＡの量に対して多い、（１）〜（３）のいずれかに記載のロタウイルスの人工合成法。
（７）
他のｃＤＮＡの導入量が実質的に等量である、（１）〜（６）のいずれかに記載のロタウイルスの人工合成法。
（８）
プラスミドを用いてｃＤＮＡが導入される、（１）〜（７）のいずれかに記載のロタウイルスの人工合成法。
（９）
プラスミドがＴ７プラスミドである、（８）に記載のロタウイルスの人工合成法。
（１０）
培養細胞が、ＢＨＫ／Ｔ７−９細胞、ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞、ＳＫ６．Ｔ７細胞及び２９３−３−４６細胞からなる群から選択される、（１）〜（９）のいずれかに記載のロタウイルスの人工合成法。
（１１）
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡのいずれかに、当該ｃＤＮＡに対応する遺伝子以外に由来する核酸配列が導入されている、（１）〜（１０）のいずれかに記載のロタウイルスの人工合成法。
（１２）
ｃＤＮＡを培養細胞に導入した後に、ロタウイルスに感受性を有する細胞を用いて共培養を行う、（１）〜（１１）のいずれかに記載のロタウイルスの人工合成法。
（１３）
ｃＤＮＡを培養細胞に導入した後に、共培養を行わない、（１）〜（１１）のいずれかに記載のロタウイルスの人工合成法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新規で、かつ高効率なロタウイルスの人工合成法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のロタウイルス人工合成法の模式図を示す。図１Ａは、ｃＤＮＡを培養細胞に導入した後に、ロタウイルスに感受性を有する細胞を用いて共培養を行って、ロタウイルスを人工合成した場合を示す。図１Ｂは、ｃＤＮＡを培養細胞に導入した後に、共培養を行わずに、ロタウイルスを人工合成した場合を示す。
【図２】図１Ａに記載の方法に基づくロタウイルスの人工合成において、ｐＴ７／ＮＳＰ２ＳＡ１１及びｐＴ７／ＮＳＰ５ＳＡ１１の導入量を他のプラスミドの導入量に対して１倍量、３倍量、５倍量とした場合におけるロタウイルスの相対合成量の結果を示す（ＮＳＰ２及びＮＳＰ５が共に×１の場合に対して、いずれも、Ｐ＜０．０５（ｔ検定））。培養細胞として、ＣＶ−１細胞を用いた。
【図３】人工合成ロタウイルスを有するＢＨＫ／Ｔ７−９細胞の電子顕微鏡像を示す。図３Ａは、ｐＴ７／ＮＳＰ２ＳＡ１１及びｐＴ７／ＮＳＰ５ＳＡ１１の導入量を他のプラスミドの導入量に対して１倍量とした場合であり、図３Ｂは、ｐＴ７／ＮＳＰ２ＳＡ１１及びｐＴ７／ＮＳＰ５ＳＡ１１の導入量を他のプラスミドの導入量に対して３倍量とした場合の結果を示す。図３Ｃは、ＢＨＫ／Ｔ７−９細胞を３の感染多重度（ＭＯＩ）で真正のサルロタウイルスＳＡ１１−Ｌ２ウイルスを感染させた場合の結果を示す。
【図４】ＮａｎｏＬｕｃ（Ｎｌｕｃ）遺伝子を有する変異体ｒＳＡ１１−Ｎｌｕｃウイルスの合成結果を示す。図４Ａは、野生型（ｗｔ）ｒＳＡ１１ウイルス及び変異体ｒＳＡ１１−Ｎｌｕｃウイルス（それぞれｐＴ７／ＮＳＰ１及びｐＴ７／ＮＳＰ１−Ｎｌｕｃ）の合成に使用されるＮＳＰ１遺伝子を含むプラスミドの模式図を示す。ＮＳＰ１をＰＴＶ−２Ａ（２Ａ）自己タンパク質分解切断部位に融合させ、続いてＮｌｕｃのＯＲＦを融合させて、ＮＳＰ１遺伝子内の２２３−６４３のヌクレオチド配列を２Ａ−Ｎｌｕｃ遺伝子で置換した。図４Ｂは、野生型ｒＳＡ１１及び変異体ｒＳＡ１１−Ｎｌｕｃウイルスから抽出されたウイルスゲノム二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のＰＡＧＥの結果を示し、レーン１は野生型ｒＳＡ１１ウイルス由来のｄｓＲＮＡであり、レーン２は変異体ｒＳＡ１１−Ｎｌｕｃウイルス由来のｄｓＲＮＡである。左側の数字は、野生型ｒＳＡ１１ウイルスのゲノムｄｓＲＮＡセグメントの順序を示す。図４Ｃは、野生型ｒＳＡ１１ウイルス及び変異体ｒＳＡ１１−ＮｌｕｃウイルスのＮｌｕｃ活性の結果を示す。ＭＡ１０４細胞を０．０１のＭＯＩで野生型ｒＳＡ１１ウイルス及び変異体ｒＳＡ１１−Ｎｌｕｃウイルスで感染させ、次いで種々の時間インキュベートした。培養物中のＮｌｕｃ活性はルミノメトリーによって決定した。示されたデータは、３つの独立した細胞培養物からの平均Ｎｌｕｃ活性及び標準偏差（ＳＤ）である（＊  Ｐ＜０．０５（ｔ検定））。
【図５】蛍光遺伝子を有する変異体ｒＳＡ１１−ＥＧＦＰウイルス及び変異体ｒＳＡ１１−ｍＣｈｅｒｒｙウイルスの合成結果を示す。図５Ａは、野生型ｒＳＡ１１ウイルス、変異体ｒＳＡ１１−ＥＧＦＰウイルス及び変異体ｒＳＡ１１−ｍＣｈｅｒｒｙウイルス（ｐＴ７／ＮＳＰ１、ｐＴ７／ＮＳＰ１−ＥＧＦＰ及びｐＴ７／ＮＳＰ１−ｍＣｈｅｒｒｙ）の合成に使用されるＮＳＰ１遺伝子を含むプラスミドの模式図を示す。ＮＳＰ１をＰＴＶ−２Ａ自己タンパク質分解切断部位、続いてＥＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙのＯＲＦに融合させて、ＮＳＰ１遺伝子内の２２３−６４３のヌクレオチド配列を２Ａ−ＥＧＦＰ又は２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子と置換した。図５Ｂは、野生型ｒＳＡ１１ウイルス、変異体ｒＳＡ１１−ＥＧＦＰウイルス及び変異体ｒＳＡ１１−ｍＣｈｅｒｒｙウイルスから抽出されたウイルスゲノムｄｓＲＮＡのＰＡＧＥの結果を示し、レーン１は野生型ｒＳＡ１１ウイルス由来のｄｓＲＮＡであり、レーン２及び３は変異体ｒＳＡ１１−ＥＧＦＰウイルス（レーン２）及びｒＳＡ１１−ｍＣｈｅｒｒｙ（レーン３）由来のｄｓＲＮＡである。左側の数字は、野生型ｒＳＡ１１のゲノムｄｓＲＮＡセグメントの順序を示す。ＮＳＰ１−ｍＣｈｅｒｒｙは、３番目のｄｓＲＮＡセグメントに嵩なっている。図５Ｃは、変異体ｒＳＡ１１−ＥＧＦＰウイルス及び変異体ｒＳＡ１１−ｍＣｈｅｒｒｙウイルスに感染した細胞における蛍光タンパク質の発現の結果を示す。野生型ｒＳＡ１１ウイルス又は変異体ｒＳＡ１１−ＥＧＦＰウイルス及び変異体ｒＳＡ１１-ｍＣｈｅｒｒｙウイルスを、フォーカス形成のためにＣＶ−１細胞に感染させ、０.７％アガロース存在下で培養した。３４時間後、焦点におけるＥＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの発現を、特定のフィルターを用いて蛍光顕微鏡下で評価した。ロタウイルスゲノムへの蛍光遺伝子の導入により、合成したロタウイルスにおいて、蛍光発色していることを確認できた。
【図６】Ｎｌｕｃ遺伝子を有する変異体ｒＳＡ１１−Ｎｌｕｃウイルスのゲノム安定性を示す。図６Ａは、ｒＳＡ１１−ＮｌｕｃをＭＡ１０４細胞で連続した継代培養を行い、１回目の継代（Ｐ１）、３回目の継代（Ｐ３）、５回目の継代（Ｐ５）、１０回目の継代（Ｐ１０）のウイルスｄｓＲＮＡゲノムを抽出してＰＡＧＥ解析した結果を示す。レーン１は、野生型ｒＳＡ１１−Ｌ２ウイルス由来のｄｓＲＮＡであり、レーン２、３、４、５は各々Ｐ１、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ１０のｒＳＡ１１−Ｎｌｕｃ由来のｄｓＲＮＡである。左側の数字は、野生型ｒＳＡ１１−Ｌ２のゲノムｄｓＲＮＡセグメントの順序を示す。図６Ｂは、野生型ｒＳＡ１１−Ｌ２及び変異体ｒＳＡ１１−ＮｌｕｃのＮｌｕｃ活性の結果を示す。ＭＡ１０４細胞を０．０１のＭＯＩで野生型ｒＳＡ１１−Ｌ２及び変異体ｒＳＡ１１−Ｎｌｕｃ（Ｐ１、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ１０）を感染させ、１２時間インキュベートした。培養物中のＮｌｕｃ活性はルミノメトリーによって決定した。示されたデータは、３つの独立した細胞培養物からの平均Ｎｌｕｃ活性及び標準偏差（ＳＤ）である。
【図７】蛍光遺伝子を有する変異体ｒＳＡ１１−ＥＧＦＰ及び変異体ｒＳＡ１１−ｍＣｈｅｒｒｙウイルスのゲノム安定性を示す。図７Ａは、ｒＳＡ１１−ＥＧＦＰ及びｒＳＡ１１−ｍＣｈｅｒｒｙをＭＡ１０４細胞で連続した継代培養を行い、１回目の継代（Ｐ１）、３回目の継代（Ｐ３）、５回目の継代（Ｐ５）、１０回目の継代（Ｐ１０）のウイルスｄｓＲＮＡゲノムを抽出してＰＡＧＥ解析した結果を示す。レーン１、１０は、野生型ｒＳＡ１１−Ｌ２ウイルス由来のｄｓＲＮＡであり、レーン２、３、４、５は各々Ｐ１、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ１０のｒＳＡ１１−ＥＧＦＰ由来、レーン６、７、８、９は各々Ｐ１、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ１０のｒＳＡ１１−ｍＣｈｅｒｒｙ由来のｄｓＲＮＡである。左側の数字は、野生型ｒＳＡ１１−Ｌ２のゲノムｄｓＲＮＡセグメントの順序を示す。図７Ｂは、変異体ｒＳＡ１１−ＥＧＦＰ及び変異体ｒＳＡ１１−ｍＣｈｅｒｒｙのＮＳＰ１遺伝子についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。Ｐ１、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ１０ストックから抽出したウイルスｄｓＲＮＡを鋳型として、ＮＳＰ１遺伝子とＥＧＦＰあるいはｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルで分離して解析した。ＤＮＡマーカーは、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００ｂｐを示す。
【図８】グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）遺伝子を有する変異体ｒＳＡ１１−ＧＬＰ２ウイルスの合成結果を示す。図８Ａは、野生型ｒＳＡ１１ウイルス、変異体ｒＳＡ１１−ＧＬＰ２ウイルス（ｐＴ７／ＮＳＰ１、ｐＴ７／ＮＳＰ１−ＧＬＰ２）の合成に使用されるＮＳＰ１遺伝子を含むプラスミドの模式図を示す。ＮＳＰ１をＰＴＶ−２Ａ自己タンパク質分解切断部位、続いてＧＬＰ２のＯＲＦに融合させて、ＮＳＰ１遺伝子内の２２３−６４３のヌクレオチド配列を２Ａ−ＧＬＰ２遺伝子と置換した。図８Ｂは、野生型ｒＳＡ１１ウイルス、変異体ｒＳＡ１１−ＧＬＰ２ウイルスから抽出されたウイルスゲノムｄｓＲＮＡのＰＡＧＥの結果を示し、レーン１は野生型ｒＳＡ１１ウイルス由来のｄｓＲＮＡであり、レーン２は変異体ｒＳＡ１１−ＧＬＰ２ウイルス（レーン２）由来のｄｓＲＮＡである。左側の数字は、野生型ｒＳＡ１１のゲノムｄｓＲＮＡセグメントの順序を示す。
【図９】ノロウイルスカプシドＶＰ１遺伝子を有する変異体ｒＳＡ１１−ＮＶＶＰ１ウイルスの合成結果を示す。図９Ａは、野生型ｒＳＡ１１ウイルス、変異体ｒＳＡ１１−ＮＶＶＰ１ウイルス（ｐＴ７／ＮＳＰ１、ｐＴ７／ＮＳＰ１−ＮＶＶＰ１）の合成に使用されるＮＳＰ１遺伝子を含むプラスミドの模式図を示す。ＮＳＰ１をＰＴＶ−２Ａ自己タンパク質分解切断部位、続いてＶＰ１のＯＲＦに融合させて、ＮＳＰ１遺伝子内の２２３−６４３のヌクレオチド配列を２Ａ−ＶＰ１遺伝子と置換した。図９Ｂは、野生型ｒＳＡ１１ウイルス、変異体ｒＳＡ１１−ＮＶＶＰ１ウイルスから抽出されたウイルスゲノムｄｓＲＮＡのＰＡＧＥの結果を示し、レーン１は野生型ｒＳＡ１１ウイルス由来のｄｓＲＮＡであり、レーン２は変異体ｒＳＡ１１−ＮＶＶＰ１ウイルス（レーン２）由来のｄｓＲＮＡである。左側の数字は、野生型ｒＳＡ１１のゲノムｄｓＲＮＡセグメントの順序を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態について以下詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１５】
本発明のロタウイルスの人工合成法は、
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを培養細胞に導入する工程を含み、
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡは、それぞれ、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡであり、
ｃＤＮＡを培養細胞に導入する際に、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量を他のｃＤＮＡの導入量よりも多くする、
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡをゲノムとして有するロタウイルスの人工合成法である。
【００１６】
現在、ロタウイルスワクチンとしては弱毒化した生ワクチンが世界的に利用されており、ロタウイルスによる乳幼児の死亡率低下に貢献している。一方、ロタウイルスは、感染力が非常に強く、容易に拡大してしまうため、より安価で予防効果を向上させた新規ワクチンの開発が望まれている。
本発明によれば、ロタウイルスの１１分節の遺伝子のうち、当該遺伝子の導入量を調節することにより、高効率なロタウイルスの人工合成を可能としている。
また、本発明のロタウイルスの人工合成法によれば、ロタウイルスゲノムに対して改変を加えることができ、人工的に病原性を制御したロタウイルスを作製することができる。そして、本発明によりウイルスゲノムを改変したロタウイルスを効率的に人工合成することができることにより、ウイルス増殖や病原性発現のメカニズムをより容易に理解することもできることに繋がっている。
したがって、本発明のロタウイルスの人工合成法が見出されたことにより、異なる国や地域で流行しているロタウイルス株に対して、より効率的にロタウイルスワクチンを開発することが可能となり、また、より抗原性が適応したワクチン候補株を迅速に開発することも可能になる。
加えて、本発明のロタウイルスの人工合成法により製造した人工合成ロタウイルスは、改変を加えた場合であっても、継代培養してもゲノムが安定に存在する。
【００１７】
また、本発明においては、ロタウイルスの１１分節の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを用いてロタウイルスを人工合成するに際して、ｃＤＮＡを培養細胞に導入する際に、１１種のｃＤＮＡの導入量を調整することにより、ロタウイルスの人工合成効率が向上しており、好適には、１１分節の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ以外に他のタンパク質をコードする核酸を導入させることなく、ロタウイルスを人工合成することができる。
すなわち、本発明は、１１分節の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ以外に他のタンパク質をコードする核酸を導入させることなく、ロタウイルスを人工合成できるので、最少因子による高効率なロタウイルスの人工合成法を提供する。
中でも、本発明によれば、ロタウイルスの人工合成を行う際に用いるＦＡＳＴタンパク質及び／又はＲＮＡキャッピング酵素をコードする核酸を培養細胞に導入することなく、高効率なロタウイルスの人工合成を可能としている。
従来技術においては、コウモリレオウイルス由来の細胞融合性タンパク質ＦＡＳＴとワクシニアウイルス由来のＲＮＡキャッピング酵素を利用してロタウイルスを人工合成していて、従来技術によるロタウイルスの人工合成においては、これらタンパク質も発現することとなるが、これらタンパク質の生体における安全性は依然として確認されていない。
本発明によれば、これらタンパク質を利用することなく、ロタウイルスを人工合成することができるため、安全性が高い、ロタウイルスの人工合成法を提供することができる。また、新規ロタウイルスワクチンの開発の場面や、ロタウイルスベクターの臨床応用において、有用なツールを提供することもできる。
なお、本発明においては、ロタウイルスの人工合成に必須となる１１分節の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ以外に他のタンパク質をコードする核酸を導入することなくロタウイルスを人工合成できるものであって、人工合成に必須とはならない１１分節の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ以外に他のタンパク質等をコードする核酸は、１１分節の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡと共に導入してもよい。
【００１８】
本発明のロタウイルスの人工合成法においては、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを培養細胞に導入する工程を含む。
ロタウイルスは、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに由来するタンパク質としてＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６及びＶＰ７と呼ばれる構造タンパク質（ＶＰ）と、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、ＮＳＰ５及びＮＳＰ６と呼ばれる非構造タンパク質（ＮＳＰ）を有する。
ロタウイルスにおいては、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡが、それぞれ、構造タンパク質（ＶＰ）及び非構造タンパク質（ＮＳＰ）をコードしているので、本明細書において、各１１本の分節した二本鎖ＲＮＡを、コードするタンパク質に対応して、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡと呼ぶ。
本発明においては、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとして、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを培養細胞に導入する。
【００１９】
本発明における「１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ」として、本発明の人工合成法により合成することを所望するロタウイルスの１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを選択すればよいが、ｃＤＮＡとしては、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに厳密に対応したｃＤＮＡである必要はない。
本発明においては、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを培養細胞に導入することにより、１１本の遺伝子分節が、培養細胞に導入されるが、二本鎖ＲＮＡに厳密に対応したｃＤＮＡである必要はないとの意味は、構造タンパク質（ＶＰ）及び非構造タンパク質（ＮＳＰ）の全てをコードする遺伝子としてのｃＤＮＡであることを意味しておらず、ｃＤＮＡを導入することにより、１１本の遺伝子分節が発現すればよい。
すなわち、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、ＮＳＰ５及びＮＳＰ６のそれぞれのタンパク質をコードせず、１１本の分節した各二本鎖ＲＮＡにおける末端配列領域をコードするｃＤＮＡであってもよいことを意味する。
つまり、本発明においては、二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡにおいて、二本鎖ＲＮＡがコードするタンパク質に厳密に対応したｃＤＮＡである必要はないということを意味する。逆にいえば、一部のｃＤＮＡにおいては、１１種の分節した二本鎖ＲＮＡを培養細胞内で発現することができるであれば、末端配列のみをコード（すなわち、タンパク質は欠失）していてもよいことを意味する。
本発明における「１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ」は、所望のロタウイルスを人工合成するにあたり、好適には、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４及びＮＳＰ５であるタンパク質を発現し、より好適には、ＮＳＰ６であるタンパク質も発現するが、ロタウイルスを人工合成できる限り、特に限定されることなく、改変されたｃＤＮＡであってもよい。
例えば、所望のロタウイルスを人工合成するにあたり、人工合成を所望するロタウイルスのＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡのうち、その一部を別株のロタウイルスに由来するＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡに置換して用いてよく、また、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが、所望のロタウイルスのＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４及びＮＳＰ５（好適には、ＮＳＰ６も含む）のそれぞれのタンパク質をコードする場合には、各タンパク質において改変（置換、欠失又は挿入）を加えたタンパク質をコードするｃＤＮＡであってもよい。
【００２０】
本発明においては、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを、培養細胞に導入するに当たっては、プラスミドを用いることが好ましい。
本発明において、ｃＤＮＡの調製や、プラスミドを用いる場合のｃＤＮＡを含むプラスミドの調製は、特に限定されることなく、従来公知の遺伝子工学技術を用いて実施することができる。
【００２１】
本発明においては、好適には、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡをそれぞれ含むプラスミドを用いて、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが培養細胞に導入される。
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡにおいて、ＮＳＰ６のオープンリーディングフレームは、ＮＳＰ５をコードする領域に含まれるため、ＮＳＰ５をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを調製して、培養細胞に導入することにより、ＮＳＰ５とＮＳＰ６のタンパク質双方が発現してくることとなり、ロタウイルスを人工合成することができる。
【００２２】
本発明において、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドは、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡにおける、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドであることを意味する。
ここで、ＮＳＰ５をコードするプラスミドを用いることで、ＮＳＰ５とＮＳＰ６を発現させることができる。
プラスミドを用いて、ｃＤＮＡを培養細胞に導入する場合、プラスミドは、上述した「１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ」を含んでいればよい。したがって、プラスミドは、末端配列のみをコードするｃＤＮＡを含んでいてもよいし、改変されたｃＤＮＡを含んでいてもよい。
プラスミドには、１１種のタンパク質にあたる、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４及びＮＳＰ５をコードする遺伝子配列がｃＤＮＡとして挿入されていることが好ましいが、各ｃＤＮＡにおいて、末端配列のみをコードするｃＤＮＡを含んでいてもよいし、改変されたｃＤＮＡを含んでいてもよい。
ここで、プラスミドに、ＮＳＰ５をコードする遺伝子配列が挿入されていることにより、人工合成されるロタウイルスは、ＮＳＰ６も発現する。
【００２３】
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを培養細胞に導入する際には、ｃＤＮＡは、２〜１１種のプラスミドに含まれていてよい。
１１種のプラスミドを用いる場合には、１１種のプラスミドは、それぞれ、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むが、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを、所望の組合せにより、２〜１０種のプラスミドとして調製して、培養細胞に導入してもよい。
分節遺伝子をゲノムとするウイルスにおける手法における参考文献として、以下の文献が挙げられる。
Neumann G, Fujii K, Kino Y, Kawaoka Y. An improved reverse genetics system for influenza A virus generation and its implications for vaccine production. 2005, Proc Natl Acad Sci USA 102:16825-16829.
Kobayashi T, Ooms b LS, Ikizler M, Chappell JD, Dermody TS. An improved reverse genetics system for mammalian orthoreoviruses. 2010, Virology 398:194-200
これら文献に記載の方法に基づいて、また、適宜変更して、２〜１０種のプラスミドを調製して、ｃＤＮＡを培養細胞に導入してもよい。
【００２４】
ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡは、それぞれ、同一又は異なるロタウイルス由来であってよい。好適には、同一のロタウイルスに由来する１１種のＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとして含むプラスミドが用いられる。
ロタウイルスは、多数の哺乳動物及び鳥類に急性感染を起こし、抗原性もきわめて多様であるが、人工合成するロタウイルスとしては、実験動物として用いられる哺乳動物に感染するロタウイルスであってもよく、また、ワクチン製造の可能性の観点では、ヒトロタウイルスであることが好ましい。
１２種のタンパク質の中でも、ＶＰ４とＶＰ７は、独立した中和抗原を有しており、ＶＰ４によって規定される血清型はＰタイプ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）であり、ＶＰ７によって規定される血清型はＧタイプ（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）として知られている。
重要な中和抗原であるＶＰ７が規定するＧタイプにおいては、これまでに少なくとも３２種類が報告されている。その中でも、ヒトで検出されるのはＧ１〜４、９、１２の６種類が挙げられる。
ロタウイルスの代表株としては、特に限定されるものではないが、自然界に由来する株として代表例を示すと、Ｇ１として、Ｗａ（ヒト）、ＫＵ（ヒト）；Ｇ２として、ＤＳ−１（ヒト）、Ｓ２（ヒト）；Ｇ３として、ＡＵ−１（ヒト）、ＹＯ（ヒト）；Ｇ４として、ＳＴ３（ヒト）、Ｈｏｓｏｋａｗａ（ヒト）；Ｇ５として、ＯＳＵ（ブタ）；Ｇ６として、ＲＦ（ウシ）、ＷＣ３（ウシ）；Ｇ７として、Ｔｙ−３（シチメンチョウ）；Ｇ８として、６９Ｍ（ヒト）；Ｇ９として、ＷＩ６１（ヒト）；Ｇ１０として、Ｂ２２３（ウシ）；Ｇ１１として、ＹＭ（ブタ）；Ｇ１２として、Ｌ２６（ヒト）、Ｔ１５２（ヒト）；Ｇ１３として、Ｌ３３８（ウマ）；Ｇ１４として、４０３（ウマ）；Ｇ１５として、３８３（ウシ）；Ｇ１６として、ＥＴＤ（マウス）；Ｇ１７として、Ｔｙ−１（シチメンチョウ）；Ｇ１８として、ＰＯ−１３（ハト）；Ｇ１９として、０２Ｖ０００２Ｇ３（ニワトリ）；Ｇ２０として、Ｅｃｕ５３４（ヒト）；Ｇ２１として、Ａｚｕｋ−１（ウシ）；Ｇ２２として、Ｔｕ−０３Ｖ０００２Ｅ１０（シチメンチョウ）；Ｇ２３として、Ｐｈｅａ１４２４６（キジ）；Ｇ２４として、Ｄａｉ−１０（ウシ）；Ｇ２５として、ＫＥ４８５２／０７（コウモリ）；Ｇ２６として、ＴＪ４−１（ブタ）等が挙げられる。
ロタウイルスは、自然界に由来するロタウイルスに加え、塩基配列に変異を有するような改変されたロタウイルスであってもよい。
【００２５】
１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドであれば、それぞれのプラスミドにおいて、その機能を発揮するタンパク質であるＮＳＰ１とＮＳＰ６以外の１０種のタンパク質をコードしている限り、遺伝子改変されていてもよい。ＮＳＰ１とＮＳＰ６のタンパク質については、遺伝子改変によりｃＤＮＡにおいてコードされていなくてもよい。
すなわち、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡのいずれかが遺伝子改変されていてもよく、遺伝子改変の結果として、当該ｃＤＮＡに対応する遺伝子以外に由来する核酸配列が導入されていてもよい。
当該ｃＤＮＡに対応する遺伝子以外に由来する核酸配列とは、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡにおける、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡのうち、例えば、ＶＰ１遺伝子を例にして説明すると、ＶＰ１遺伝子に導入されていてもよい核酸配列とは、ＶＰ１遺伝子以外に由来する核酸配列であることを意味し、外来遺伝子に由来する核酸配列であってもよいことから、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡのいずれかが遺伝子改変されていてもよく、遺伝子改変の結果として、外来遺伝子が導入されていてもよい。
なお、１１本の分節した二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡのいずれかが遺伝子改変されている場合には、遺伝子改変前におけるｃＤＮＡの核酸配列が改変されるのであれば、ＶＰ１遺伝子に由来する核酸配列が導入されていてもよい。
１１分節の各遺伝子に対して、遺伝子改変が行われている場合には、任意の改変により人工的に病原性を制御したロタウイルスを作製することができる
また、ロタウイルスゲノムに人工的な変異を加えプラスミドを調製することで、ウイルスの性状を代えることもでき、さらに、腸管細胞への外来遺伝子を供給することもできる。
外来遺伝子に由来するタンパク質としては、特に限定されるものではないが、例えば、腸管でロタウイルスに発現させると有益なタンパク質として、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）等が挙げられる。また、ロタウイルスと同じ粘膜組織を侵入門戸とする病原体に対する免疫応答を誘導するために、特に限定されるものではないが、例えば、ノロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）及びパピローマウイルス（ＨＰＶ）等のタンパク質やその断片を発現させるために外来遺伝子としてロタウイルスに遺伝子改変させてもよい。
外来遺伝子の導入は、２〜１１種のプラスミドのいずれのプラスミドに導入してもよいが、外来遺伝子が導入されるプラスミドとして、ＮＳＰ１遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドが好適に用いられる。
また、レポータータンパク質発現ウイルスとすることもできる。
外来遺伝子の塩基数は、特に限定されるものではないが、例えば、３ｋｂｐ程度であってもよく、発現の効率からすると塩基数は小さい方が好ましいが、約２．５ｋｂｐ以下であってもよく、約１．５ｋｂｐ以下であってもよい。なお、実施例で具体的に示す導入された外来遺伝子の塩基数は、１０００ｂｐ以下である。
【００２６】
１１種のタンパク質をコードするプラスミドの調製は、特に限定されることなく、従来公知の遺伝子工学技術を用いて行うことができる。
プラスミドに挿入する前の各１１遺伝子分節（ＶＰ１遺伝子〜ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子〜ＮＳＰ５遺伝子に対応）の遺伝子も、従来公知の遺伝子工学技術により調製することができる。
また、挿入前に各遺伝子の改変を行ってもよく、プラスミドに挿入後に改変してもよい。
例えば、特開２００７−２１５４６６号公報に記載される方法及びその変法により、１１種のタンパク質をコードするプラスミドの調製を行ってもよい。
【００２７】
本発明において、ｃＤＮＡを含むプラスミドは公知のプラスミド等を利用して構築することができる。例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用したプラスミドであれば、Ｔ７発現ベクターを骨格として、これに必要な遺伝子操作（ロタウイルスｃＤＮＡ及びＨＤＶリボザイム配列などの挿入）を施すことによって目的のプラスミドを構築可能である。１種のプラスミドにおいて、複数種のｃＤＮＡを含む場合には、各ｃＤＮＡに対応してプロモーター等を組み込んで、プラスミド上で、複数種のｃＤＮＡが連続するように配置させることにより、複数種のｃＤＮＡを含むプラスミドを構築する。かかる方法は、Neumann et al., Proc Natl Acad Sci USA 2005やKobayashi et al., Virology 2010等により公知である。
既に多種多様のＴ７発現ベクターが提供されている。入手可能なＴ７発現ベクターの例として、市販のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋／−）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ社）及びｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等が挙げられる。
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ以外のＲＮＡポリメラーゼを利用する場合においては、プラスミド構築に利用できるベクターとして、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋／−）、ｐＣＲＩＩ及びｐＧＥＭ等が挙げられる。
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ以外のＲＮＡポリメラーゼとして、種々のＲＮＡポリメラーゼを利用することができ特に限定されるものではないが、例えば、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
【００２８】
本発明のロタウイルスの人工合成において、ｃＤＮＡを培養細胞に導入する工程において用いられる培養細胞としては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの恒常的発現細胞株を用いることができ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの恒常的発現細胞株としては、ＢＨＫ／Ｔ７−９細胞株（Ito et al., Microbiol Immunol 2003）を用いることが好ましいが、一過性にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現させることで、ワクチン作製に用いることが認可されているＶｅｒｏ細胞やＭＤＣＫ細胞をも含めたさまざまな哺乳動物由来の培養細胞を用いてもよい（Komoto et al., J Virol Methods 2014）。
【００２９】
従来のロタウイルスの人工合成法においては、培養細胞に導入する１１種のｃＤＮＡの導入量は、例えば、ｃＤＮＡを含むプラスミドとして導入する際においても、通常、実質的に等量で用いられる。
本発明において、実質的に等量とは、等量で培養細胞に添加して導入することをその思想とするものの、添加量において誤差があってもよいことを意味する。
【００３０】
本発明においては、ｃＤＮＡを培養細胞に導入する際に、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量を他のｃＤＮＡの導入量よりも多くする。
本発明においては、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量を、他のｃＤＮＡの導入量よりも多くすることにより、従来技術におけるように、コウモリレオウイルス由来の細胞融合性タンパク質ＦＡＳＴとワクシニアウイルス由来のＲＮＡキャッピング酵素を利用することなく、ロタウイルスを人工合成することができる。
本発明において、「ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量を他のｃＤＮＡの導入量よりも多くする」とは、本発明の技術的思想を逸脱するのでなければ、ロタウイルスを人工合成するにあたり、ｃＤＮＡの導入量を他のｃＤＮＡの導入量よりも多くするとしたｃＤＮＡ量が、他のｃＤＮＡの導入量よりも多ければよいことを意味しているのであり、仮に、本発明の技術的範囲から形式的に逸脱することを意図して、ロタウイルスの人工合成を行う上で、その導入量を多くする必要がないｃＤＮＡの導入量を、他のｃＤＮＡの導入量よりも多くするとしたｃＤＮＡ量と同等程度にまで多くすることを排除しない。
すなわち、本発明においては、他のｃＤＮＡの導入量よりも多くするｃＤＮＡは、ロタウイルスの人工合成において、導入量を多くすることが必須となるｃＤＮＡとして選択される。他のｃＤＮＡとしては、選択されるｃＤＮＡ以外のｃＤＮＡを意味するが、本発明においては、選択されるｃＤＮＡ以外のｃＤＮＡが他のｃＤＮＡの導入量よりも多くなっていることを妨げない。
選択されるｃＤＮＡ以外にも他のｃＤＮＡのうち、一部のｃＤＮＡの導入量を多くしてもよいことを意味する。
【００３１】
本発明においては、他のｃＤＮＡの導入量に対して導入量を多くするｃＤＮＡとしては、好適には、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡである。他のｃＤＮＡの導入量に対して導入量を多くするｃＤＮＡとしては、さらに好適には、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、及び／又はＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡである。
【００３２】
他のｃＤＮＡの導入量よりも多くするｃＤＮＡとして、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが選択されるが、例えば、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを他のｃＤＮＡの導入量よりも多くするｃＤＮＡとした場合を例示して説明する。
他のｃＤＮＡは、他のｃＤＮＡの導入量よりも多くするｃＤＮＡとして選択されたＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ以外のｃＤＮＡとなる。
ここで、本発明においては、ロタウイルスの効率的合成に必要でなくても、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ以外のｃＤＮＡであるＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量を、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量と同様に、他のｃＤＮＡの導入量に比して高くすることを妨げない。
また、他のｃＤＮＡの導入量よりも多くするｃＤＮＡとして、ＮＳＰ２遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが選択される場合には、他のｃＤＮＡは、他のｃＤＮＡの導入量よりも多くするｃＤＮＡとして選択されたＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ及びＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ以外のｃＤＮＡとなる。
【００３３】
中でも、少なくともＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ及び／又はＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが好適に他のｃＤＮＡの導入量に対して多く用いられるｃＤＮＡである。ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子及び／又はＮＳＰ１遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが好適に他のｃＤＮＡの導入量に対して多く用いられるｃＤＮＡであってもよい。また、これら好適なｃＤＮＡを組み合わせて、導入量を多くするｃＤＮＡとして用いてもよい。
「少なくともＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ及び／又はＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量」とは、ＮＳＰ２遺伝子か、ＮＳＰ５遺伝子の、あるいは双方の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量を意味しているのであって、ＮＳＰ２遺伝子とＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ以外のｃＤＮＡの導入量を他のｃＤＮＡの導入量に対して多くしてもよい。
【００３４】
ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ及び／又はＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量が、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ以外の導入に用いる他の各ｃＤＮＡの導入量に対して多いことが好ましい。
ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ及び／又はＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡは、同一又は異なるプラスミドに導入されていてよい。
ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ及び／又はＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドの導入量が、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミド以外の導入に用いる他のプラスミドの導入量に対して多いことが好ましく、少なくともＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドの導入量が、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミド以外の導入に用いる他の各プラスミドの導入量に対して多いか、少なくともＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドの導入量が、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミド以外の導入に用いる９種の各プラスミドの導入量に対して多いことを意味し、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドの導入量と、ＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドの導入量とが共に、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミド以外の導入に用いる他の各プラスミドの導入量に対して多くてもよい。
ＮＳＰ２遺伝子とＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが、同一のプラスミドにあってもよく、その場合、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとを含むプラスミドの導入量が、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミド以外の導入に用いる他の各プラスミドの導入量に対して多くてよい。
ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミド及び／又はＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドの導入量を調整して導入に用いることにより、より高効率でロタウイルスを人工的に合成することができる。また、導入に用いるプラスミドとして、ロタウイルスの１１分節の遺伝子に対応するｃＤＮＡを含むプラスミドのみを用いてロタウイルスを人工的に合成することができる。
【００３５】
本発明においては、他のｃＤＮＡの導入量は、実質的に等量であることが好ましく、ロタウイルスを人工合成するために導入量を多くするｃＤＮＡの導入量は、導入に用いる他のｃＤＮＡの導入量の最大量よりも多い。
「ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの導入量を他のｃＤＮＡの導入量よりも多くする」とは、その技術的思想として、導入するｃＤＮＡ量、例えば、プラスミド量の総量を、導入するプラスミドの数で除すことで求められる量よりも他のｃＤＮＡの導入量よりも多く導入するｃＤＮＡの導入量が多いことを意味し、他のｃＤＮＡの導入量が実質的に等量であるとは、導入するｃＤＮＡの総量から、多く導入するｃＤＮＡの導入量の差を求め、差分を残りの他のｃＤＮＡを導入するためのプラスミドの数で除すことで求められる量で培養細胞に導入することを意味している。
【００３６】
具体的に、例えば、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとを別々のプラスミドに含む形式で導入する場合には、そのプラスミドの量は、異なっていてもよいが、実質的に等量であることが好ましい。
ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドの量が、それぞれ、同一又は異なって、他のプラスミドの量に対して、より好適には、他のプラスミドのうち最大量の導入量となるプラスミドの量に対して、好ましくは２倍量以上であり、より好ましくは３倍量以上であり、さらに好ましくは４倍量以上であり、よりさらに好ましくは５倍量以上である。
ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドの量の上限は、それぞれ、同一又は異なって、他のプラスミドの量に対して、より好適には、他のプラスミドのうち最大量の導入量となるプラスミドの量に対して、特に限定されるものではないが、好ましくは１０倍量以下であり、より好ましくは９倍量以下であり、さらに好ましくは８倍量以下であり、よりさらに好ましくは７倍量以下であり、６倍量以下であってもよい。
ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むプラスミドの量は、異なる場合には少なくとも一方の量を、他のプラスミドの量、より好適には少なくとも最大量のプラスミドの量よりも多い〜１０倍量以下の範囲内で適宜設定してよい。
なお、上記具体的な例として、ＮＳＰ２遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとＮＳＰ５遺伝子の二本鎖ＲＮＡに対応するｃＤＮＡについて例示して記載してが、他のｃＤＮＡに比して導入量を多くするｃＤＮＡにおいて、同様の倍量によりｃＤＮＡを導入してよい。
【００３７】
プラスミドの導入量は、総量として、特に限定されないが、例えば、６ウェルプレート上で培養する場合には、１ウェルあたり５〜２２μｇといった量で導入される。
ｃＤＮＡをプラスミドとして導入する際には、特に限定されるものではないが、遺伝子導入試薬として、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｐｒｏｍｅｇｅ社）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が用いられる。
【００３８】
本発明においては、培養細胞に導入後、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、ＶＰ６遺伝子、ＶＰ７遺伝子、ＮＳＰ１遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子、ＮＳＰ３遺伝子、ＮＳＰ４遺伝子及びＮＳＰ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡの発現量が、他のｍＲＮＡの発現量よりも多くする、ロタウイルスの人工合成法であってもよい。
【００３９】
本発明においては、プラスミドを培養細胞に導入後、培養細胞を培養することにより、ロタウイルスを人工合成することができる。本発明におけるロタウイルスの人工合成法の模式図を図１に示す。
細胞培養の温度は、特に限定されず、通常細胞培養の培養温度として至適とされる温度を採用すればよい。
細胞培養に用いられる培地としては、完全培地及び不完全培地等が挙げられ、好適には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）及びＥａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）が挙げられるが、類似の組織培養培地を用いてもよい。
【００４０】
ｃＤＮＡを導入する培養細胞としては、遺伝子導入した細胞の培養に用いられる細胞を用いることができ、特に限定されないが、例えば、ＢＨＫ／Ｔ７−９細胞（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）、ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）、ＳＫ６．Ｔ７細胞（ｖａｎ  Ｇｅｎｎｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）及び２９３−３−４６細胞（Ｒａｄｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）から成る群から選ばれる培養細胞が用いられる。
Buchholz UJ, Granzow H, Schuldt K, Whitehead SS, Murphy BR, Collins PL. 2000. Chimeric bovine respiratory syncytial virus with glycoprotein gene substitutions from human respiratory syncytial virus (HRSV): effects on host range and evaluation as a live-attenuated HRSV vaccine. J Virol 74:1187-1199.
van Gennip HG, van Rijn PA, Widjojoatmodjo MN, Moormann RJ. 1999. Recovery of infectious classical swine fever virus (CSFV) from full-length genomic cDNA clones by a swine kidney cell line expressing bacteriophage T7 RNA polymerase. J Virol Methods 78:117-128.
Radecke F, Spielhofer P, Schneider H, Kaelin K, Huber M, Dotsch C, Christiansen G, Billeter MA. 1995. Rescue of measles viruses from cloned DNA. EMBO J 14:5773-5784.
【００４１】
ｃＤＮＡを培養細胞に導入した後に、ロタウイルスに感受性を有する細胞を用いて共培養を行うことが好ましい（図１Ａ）。
ロタウイルスに感受性を有する細胞としては、例えば、ＣＶ−１細胞、ＭＡ１０４細胞、ＨＴ−２９細胞、ＣａＣｏ２細胞、ＣＯＳ−７細胞、及び２９３Ｔ細胞等が挙げられる。
共培養においては、細胞培養に用いられる培地として列記した培地を用いてもよいが、中でも、不完全培地を用いることが好ましい。
【００４２】
本発明においては、ｃＤＮＡを培養細胞に導入した後に、共培養を行わなくても（図１Ｂ）、人工合成ロタウイルスを効率的に作製することができる。
【００４３】
人工合成ロタウイルスの培養においては、共培養を行う場合であっても、共培養を行わない場合であっても、培養細胞を試験管等の培養容器に播種した後、培養容器を回転させながら培養する回転培養をさらに行うことが好ましい。
回転培養では、培養液の移動が生ずるともに、細胞表層に接触する培養液の量が少なくなる状態（細胞表層の湿潤度合が低下する状態）を作ることができるため、ウイルスの宿主への感染効率の向上を期待できる。
回転培養に用いる装置としては、市販の専用装置が挙げられるが、市販の回転培養装置としては、例えば、ローテーター  ＲＴ−５５０（タイテック社）等が挙げられる。
【００４４】
培養後、凍結、融解を繰り返すことにより、人工合成したロタウイルスを細胞ライセートから取り出すことができる。また、人工合成したロタウイルスは、特に限定されるものではないが、例えば、ＭＡ１０４細胞、ＣＶ−１細胞、ＨＴ−２９細胞、ＣａＣｏ２細胞、ＣＯＳ−７細胞、及び２９３Ｔ細胞等に感染させることができる。
【００４５】
本発明において、ロタウイルスが人工合成できたことを確認する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、細胞変性効果の確認、ウイルスゲノムを抽出しての電気泳動等が挙げられる。
また、プラークアッセイ、抽出ゲノムからＲＴ−ＰＣＲ産物のダイレクトシーケンシングによって、ロタウイルスの人工合成を確認してもよい。
【実施例】
【００４６】
以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
プラスミドの作製
サルロタウイルスSA11-L2株（Taniguchi et al., 1994）のゲノム２本鎖RNAをQIAamp Viral RNA Mini kit（Qiagen社）を用いて抽出した。ReverTra Ace reverse transcriptase（Toyobo社)とPrimeStar HS DNA polymerase（Takara Bio社）を用いたRT-PCRで各11遺伝子分節（VP1〜VP4、VP6、VP7、NSP1〜NSP5）を増幅した。
既報（Komoto et al., PNAS. 2006）のように、フォワードプライマーは、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列とロタウイルス5'末端配列を含み、リバースプライマーは、ロタウイルス3'末端配列を含むように設計した。
VP1〜VP4遺伝子は、5’側プライマーにあるHindIII、EcoRI又はPstIサイトを用いて、制限酵素処理した後に、D型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列とT7 RNAポリメラーゼターミネーター配列を有するプラスミドpX8dT（Schnell et al., EMBO J. 1994）の該当制限酵素サイトに挿入した。
VP6、VP7、NSP1〜NSP5遺伝子は、5’側プライマーにあるHindIII、EcoRI又はPstIサイトを用いて、制限酵素処理した後に、D型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列とT7 RNAポリメラーゼターミネーター配列を有するプラスミドpEXR（Eurofins Genomicsで人工合成）の該当制限酵素サイトに挿入した。
作製した各pT7プラスミドにおいて、5'から3'末端側に向かって、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列、ロタウイルス遺伝子配列、HDVリボザイム配列及びT7 RNAポリメラーゼターミネーター配列が、記載順に配置されている。
【００４８】
ロタウイルスの作製
１．完全培地に懸濁させたBHK/T7-9細胞（Ito et al., Microbiol. Immunol. 2003）を６ウェルプレート(Falcon社)へ播種した。完全培地として、Dulbecco's modified Eagle medium（DMEM）（Nissui社）＋5% fetal calf serum（FCS)（Gibco社）を用いた。37℃のCO2インキュベーター(5%CO2)で静置培養した。
２．翌日、プラスミドの作製において作製したロタウイルスのゲノムをコードする11本のプラスミド（pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11-ΔPst（Komoto et al., PNAS. 2006), pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11及びpT7/NSP5SA11）を遺伝子導入した。プラスミド量は、0.75 μg/ウェルを基本とするが、pT7/NSP2SA11及び／又はpT7/NSP5SA11は3倍量の2.25 μg/ウェル又は5倍量の3.75μg/ウェルとした。
３．11本のプラスミドに対し、プラスミド総量（μg）に対して100μL/μgとなる量のOpti-MEM（Gibco社）、3 μL/μgプラスミドの遺伝子導入試薬（TransIT-LT1 Transfection Reagent（Takara Bio社））を加えて、混和した。プラスミド総量が11.25μgである場合、1125μLのOpti-MEM（Gibco社）を用いた。
４．37℃で、17分間インキュベーションした。
５．6ウェルプレートにインキュベーション後のプラスミドを滴下した後、37℃のCO2インキュベーター（5%CO2）で静置培養した。
６．翌日、不完全培地で培養した細胞を洗浄した後、CV-1細胞及びトリプシン（Type IV, from porcine pancreas）（0.3 μg/mL, Sigma-Aldrich社）を添加して、不完全培地で静置培養した。不完全培地として、FCS不含のEagle's minimum essential medium（MEM）（Nissui社）を用いた。
７．3日間静置培養の後、−80℃での凍結及び融解を2回ずつ行った。
８．融解後の細胞ライセートをトリプシン（10 μg/mL）で37℃、30分間処理した後、MA104細胞に感染させ（37℃、１時間）、ローテーター RT-550（Taitec社）を用いて、不完全培地で回転培養した（37℃）。回転培養を開始した翌日又は翌々日には、人工合成ロタウイルスの増殖に伴うMA104細胞の細胞変性効果が認められた。
９．細胞培養液からロタウイルスのゲノムRNAをQIAamp Viral RNA Mini kit（Qiagen社）を用いて抽出した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動でロタウイルスの分節ゲノムパターンを確認するとともに、遺伝子マーカーとしてVP4遺伝子分節に導入したPstIサイトの破壊（Komoto et al., PNAS. 2006）を制限酵素処理解析又はダイレクトシーケンシングを行って、回収したロタウイルスが人工合成由来であることを確認した。
また、プラークアッセイにより、ロタウイルス感染による死細胞の集団（プラーク）数を数えることで、サンプル中の感染性ウイルスを定量した結果を図２に示す。
【００４９】
ロタウイルスの作製におけるステップ５における静置培養を開始して24時間後（SA11-L2ウイルス感染BHK/T7-9細胞では、培養開始後8時間後）のBHK/T7-9細胞を2.5％パラホルムアルデヒドと0.1%グルタルアルデヒドで固定し、酢酸ウラニルで染色した後に透過型電子顕微鏡により観察した（図３）。倍率は40,000倍とした。
【００５０】
ロタウイルスの作製におけるステップ２において、11本のプラスミド（pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11-ΔPst（Komoto et al., PNAS. 2006), pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11及びpT7/NSP5SA11）のうち1本のみのプラスミド量を3倍量の2.25 μg/ウェルとし、その他のプラスミド量を0.75 μg/ウェルを基本とした以外は、ロタウイルスの作製のステップ１〜９と同様にロタウイルスを作製した。
pT7/NSP2SA11及びpT7/NSP5SA11を3倍量として加えた場合に人工合成効率が上昇したが、pT7/VP7SA11VP7又はpT7/NSP1SA11をそれぞれ3倍量とした場合にも、人工合成効率の上昇が確認された（P < 0.05 (ｔ検定)）。
すなわち、本発明において、ＶＰ７、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２又はＮＳＰ５のｃＤＮＡの導入量を他の導入量よりも多くすることにより、本実施例においては、３倍量とすることにより、ロタウイルスの人工合成効率の上昇を確認している。
【００５１】
ロタウイルスの作製におけるステップ６において、CV-1細胞及びトリプシン（Type IV, from porcine pancreas）（0.3 μg/mL, Sigma-Aldrich社）の添加に代えて、トリプシン（Type IV, from porcine pancreas）（0.3 μg/mL, Sigma-Aldrich社）のみを添加した以外は、ロタウイルスの作製のステップ１〜９を行って、人工合成ロタウイルスを作製し、回収したロタウイルスが人工合成由来であることを確認した。
pT7/NSP2SA11及びpT7/NSP5SA11の導入量を他のプラスミドの導入量に対して１倍量、３倍量、５倍量とした場合における人工合成ロタウイルスの相対合成量の結果を、ロタウイルス感染による死細胞の集団（プラーク）数を数えることで、サンプル中の感染性ウイルスを定量した結果として表１に示す（２回の実験結果を示す。）。
【００５２】
【表１】
2019050796.tif 000002
【００５３】
レポーター遺伝子を導入したプラスミドの作製
NSP1遺伝子の操作はプラスミドpT7/NSP1SA11を使用して行った。サルロタウイルスSA11-L2株のNSP1遺伝子の塩基223〜643を欠失させ、代わりにブタテスコウイルス−１の２Aプロテアーゼ（Kim et al., PLoS One. 2011）−NanoLuc（Nluc）（Promega社）をコードするcDNAを人工合成し（Eurofins Genomics社）、挿入した。PrimeSTAR HS DNA polymerase (Takara Bio社)を用いたPCRでこの変異NSP1遺伝子の全長を増幅し、PstIサイトを用いて、制限酵素処理した後にHDVリボザイム配列とT7 RNAポリメラーゼターミネーター配列を有するプラスミドpX8dT (Schnell et al., EMBO J. 1994)のPstI-SmaIサイトに挿入した。得られたプラスミドpT7/NSP1-Nluc上のNluc遺伝子の5'と3'末端にはそれぞれXhoIとNotIサイトを有している。PCRでEGFPとmCherry遺伝子（Clontech社）を増幅し、XhoI-NotIサイトを用いて、制限酵素処理した後にpT7/NSP1-Nlucの該当箇所に挿入することで、それぞれpT7/NSP1-EGFPとpT7/NSP1-mCherryを作製した。このようにして新たに作製したプラスミドは、その塩基配列を確認することで、適切なクローンであることが確認された。
【００５４】
レポーター遺伝子を発現するロタウイルスの作製
１.  完全培地に懸濁させたBHK/T7-9細胞を６ウェルプレート（Falcon社）へ播種した。
２.  翌日、ロタウイルスゲノムのNSP1遺伝子以外をコードする１０本のプラスミド（pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11-ΔPstI (Komoto et al., 2006), pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11, pT7/NSP5SA11）と共にpT7/NSP1-Nluc、pT7/NSP1-EGFP、pT7/NSP1-mCherryのいずれか１本のプラスミドの計１１本のプラスミドを遺伝子導入した。プラスミド量は0.75 μg/ウェルを基本とするが、pT7/NSP2SA11及びpT7/NSP5SA11は３倍量の2.25 μg/ウェルとした。
３.  プラスミド総量（11.25 μg）に対して、1125 μLのOPTI-MEM (Gibco社)、3 μL/μgの遺伝子導入試薬（TransIT-LT1 Transfection Reagent (Takara Bio社)）を加えて混和した。
４.  37℃で17分間インキュベーションした。
５.  ６ウェルプレートにインキュベーション後のプラスミドを滴下した後、37℃のCO2インキュベーター（5％CO2）で静置培養した。
６.  翌日、不完全培地で細胞を洗浄した後、CV-1細胞及びトリプシン（Type IV, from porcine pancreas）(0.3 μg/mL, Sigma-Aldrich社)を添加して、不完全培地で静置培養した。
７.  ３日間静置培養の後、−80℃での凍結及び融解を２回ずつ行った。
８.  融解後の細胞ライセートをトリプシン（10 μg/mL）で37℃、30分間処理した後、MA104細胞に感染させ（37℃、１時間）、ローテーターRT-550 (Taitec社)を用いて、不完全培地で５日間回転培養した（37℃）。
９.   ８のステップの感染MA104を−80℃での凍結及び融解を２回ずつ行い、融解後の細胞ライセートをトリプシン（10 μg/mL）で37℃、30分間処理した後、再度MA104細胞に感染させ（37℃、１時間）、ローテーターRT-550 (Taitec社)を用いて、不完全培地で回転培養した（37℃）。翌日には、人工合成ロタウイルスの増殖に伴うMA104細胞の細胞変性効果が認められた。
１０.  細胞培養液からロタウイルスのゲノムRNAをQIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen社)を用いて抽出した。その塩基配列を確認することで、Nluc, EGFPあるいはmCherry遺伝子をコードする人工合成ロタウイルス（rSA11-Nluc, rSA11-EGFPあるいはrSA11-mCherry）であることが確認された。さらに、rSA11-NlucのNluc発現はNano-Glo Lufiferase Assay kit (Promega社)を、rSA11-EGFPとrSA11-mCherryのEGFPとmCherry発現は共焦点レーザー顕微鏡LSM-710 (Carl Zeiss社)を用いて確認した。
結果を図４及び図５に示す。
【００５５】
レポーター遺伝子を発現するロタウイルスのゲノム安定性の検討
rSA11-Nluc、rSA11-EGFP、rSA11-mCherryをMA104細胞で連続した継代培養を行い、1回目の継代（P1）、3回目の継代（P3）、5回目の継代（P5）、10回目の継代（P10）のウイルスdsRNAゲノムを抽出してPAGE解析を行った（図６Ａ及び７Ａ）。rSA11-NlucのP1、P3、P5、P10ストックをMOI＝0.01でMA104細胞に感染させ、12時間後のNluc活性を測定した（図６Ｂ）。rSA11-EGFPとrSA11-mCherryについては、P1、P3、P5、P10ストックから抽出したdsRNAゲノムを鋳型として、NSP1遺伝子とEGFPあるいはmCherry遺伝子に特異的なプライマーを用いたRT-PCRを行い、アガロースゲル電気泳動解析を行った（図７Ｂ）。これらレポーター遺伝子を発現するロタウイルスのゲノムはいずれも、少なくとも10回の継代培養後でも安定であることが確認された。
【００５６】
また、〜1.5kbpの外来遺伝子をロタウイルスゲノム（NSP1遺伝子）に挿入した、人工合成ロタウイルスを作製できることを確認している。
【００５７】
グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）遺伝子を導入したプラスミドの作製
NSP1遺伝子の操作はプラスミドpT7/NSP1SA11を使用して行った。サルロタウイルスSA11-L2株のNSP1遺伝子の塩基223〜643を欠失させ、代わりにブタテスコウイルス−１の２Aプロテアーゼ（Kim et al., PLoS One. 2011）−GLP-2（アクセションナンバー: V01515）をコードするcDNAを人工合成し（Eurofins Genomics社）、挿入した。PrimeSTAR HS DNA polymerase (Takara Bio社)を用いたPCRでこの変異NSP1遺伝子の全長を増幅し、PstIサイトを用いて、制限酵素処理した後にHDVリボザイム配列とT7 RNAポリメラーゼターミネーター配列を有するプラスミドpX8dT (Schnell et al., EMBO J. 1994)のPstI-SmaIサイトに挿入した。得られたプラスミドpT7/NSP1-GLP2上のGLP-2遺伝子の3'末端にはNotIサイトを有している。このようにして新たに作製したプラスミドは、その塩基配列を確認することで、適切なクローンであることが確認された。
【００５８】
ＧＬＰ−２遺伝子を発現するロタウイルスの作製
１.  完全培地に懸濁させたBHK/T7-9細胞を６ウェルプレート（Falcon社）へ播種した。
２.  翌日、ロタウイルスゲノムのNSP1遺伝子以外をコードする１０本のプラスミド（pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11-ΔPstI (Komoto et al., 2006), pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11, pT7/NSP5SA11）と共にプラスミドpT7/NSP1-GLP2の計１１本のプラスミドを遺伝子導入した。プラスミド量は0.75 μg/ウェルを基本とするが、pT7/NSP2SA11及びpT7/NSP5SA11は３倍量の2.25 μg/ウェルとした。
３.  プラスミド総量（11.25 μg）に対して、1125 μLのOPTI-MEM (Gibco社)、3 μL/μgの遺伝子導入試薬（TransIT-LT1 Transfection Reagent (Takara Bio社)）を加えて混和した。
４.  37℃で17分間インキュベーションした。
５.  ６ウェルプレートにインキュベーション後のプラスミドを滴下した後、37℃のCO2インキュベーター（5％CO2）で静置培養した。
６.  翌日、不完全培地で細胞を洗浄した後、CV-1細胞及びトリプシン（Type IV, from porcine pancreas）(0.3 μg/mL, Sigma-Aldrich社)を添加して、不完全培地で静置培養した。
７.  ３日間静置培養の後、−80℃での凍結及び融解を２回ずつ行った。
８.  融解後の細胞ライセートをトリプシン（10 μg/mL）で37℃、30分間処理した後、MA104細胞に感染させ（37℃、１時間）、ローテーターRT-550 (Taitec社)を用いて、不完全培地で５日間回転培養した（37℃）。
９.  ステップ８の感染MA104を−80℃での凍結及び融解を２回ずつ行い、融解後の細胞ライセートをトリプシン（10 μg/mL）で37℃、30分間処理した後、再度MA104細胞に感染させ（37℃、１時間）、ローテーターRT-550 (Taitec社)を用いて、不完全培地で回転培養した（37℃）。翌日には、人工合成ロタウイルスの増殖に伴うMA104細胞の細胞変性効果が認められた。
１０.  細胞培養液からロタウイルスのゲノムRNAをQIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen社)を用いて抽出した。その塩基配列を確認することで、GLP-2遺伝子をコードする人工合成ロタウイルス（rSA11-GLP2）であることが確認された。
結果を図８に示す。
【００５９】
ノロウイルスカプシドVP1遺伝子を導入したプラスミドの作製
NSP1遺伝子の操作はプラスミドpT7/NSP1SA11を使用して行った。サルロタウイルスSA11-L2株のNSP1遺伝子の塩基223〜643を欠失させ、代わりにブタテスコウイルス−１の2Aプロテアーゼ（Kim et al., PLoS One. 2011）−ノロウイルスMatsudo18株のカプシドVP1（アクセションナンバー: DQ093062）をコードするcDNAを人工合成し（Eurofins Genomics社）、挿入した。PrimeSTAR HS DNA polymerase (Takara Bio社)を用いたPCRでこの変異NSP1遺伝子の全長を増幅し、PstIサイトを用いて、制限酵素処理した後にHDVリボザイム配列とT7 RNAポリメラーゼターミネーター配列を有するプラスミドpX8dT (Schnell et al., EMBO J. 1994)のPstI-SmaIサイトに挿入した。得られたプラスミドpT7/NSP1-NVVP1上のVP1遺伝子の3'末端にはNotIサイトを有している。このようにして新たに作製したプラスミドは、その塩基配列を確認することで、適切なクローンであることが確認された。
【００６０】
ノロウイルスカプシドVP1遺伝子を発現するロタウイルスの作製
１.  完全培地に懸濁させたBHK/T7-9細胞を６ウェルプレート（Falcon社）へ播種した。
２.  翌日、ロタウイルスゲノムのNSP1遺伝子以外をコードする１０本のプラスミド（pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11-ΔPstI (Komoto et al., 2006), pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11, pT7/NSP5SA11）と共にプラスミドpT7/NSP1-GLP2の計１１本のプラスミドを遺伝子導入した。プラスミド量は0.75 μg/ウェルを基本とするが、pT7/NSP2SA11及びpT7/NSP5SA11は３倍量の2.25 μg/ウェルとした。
３.  プラスミド総量（11.25 μg）に対して、1125 μLのOPTI-MEM (Gibco社)、3 μL/μgの遺伝子導入試薬（TransIT-LT1 Transfection Reagent (Takara Bio社)）を加えて混和した。
４.  37℃で17分間インキュベーションした。
５.  6ウェルプレートにインキュベーション後のプラスミドを滴下した後、37℃のCO2インキュベーター（5％CO2）で静置培養した。
６.  翌日、不完全培地で細胞を洗浄した後、CV-1細胞及びトリプシン（Type IV, from porcine pancreas）(0.3 μg/mL, Sigma-Aldrich社)を添加して、不完全培地で静置培養した。
７.  ３日間静置培養の後、−80℃での凍結及び融解を２回ずつ行った。
８.  融解後の細胞ライセートをトリプシン（10 μg/mL）で37℃、30分間処理した後、MA104細胞に感染させ（37℃、１時間）、ローテーターRT-550 (Taitec社)を用いて、不完全培地で５日間回転培養した（37℃）。
９.   ８のステップの感染MA104を−80℃での凍結及び融解を２回ずつ行い、融解後の細胞ライセートをトリプシン（10 μg/mL）で37℃、30分間処理した後、再度MA104細胞に感染させ（37℃、１時間）、ローテーターRT-550 (Taitec社)を用いて、不完全培地で回転培養した（37℃）。翌日には、人工合成ロタウイルスの増殖に伴うMA104細胞の細胞変性効果が認められた。
１０.  細胞培養液からロタウイルスのゲノムRNAをQIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen社)を用いて抽出した。その塩基配列を確認することで、ノロウイルスVP1遺伝子をコードする人工合成ロタウイルス（rSA11-NVVP1）であることが確認された。
結果を図９に示す。
【００６１】
参考文献
Taniguchi K, Nishikawa K, Kobayashi N, Urasawa T, Wu H, Gorziglia M, Urasawa S. 1994. Differences in plaque size and VP4 sequence found in SA11 virus clones having simian authentic VP4. Virology 198:325-330.
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Komoto S, Kawagishi T, Kobayashi T, Ikizler M, Iskarpatyoti J, Dermody TS, Taniguchi K. 2014. A plasmid-based reverse genetics system for mammalian orthoreoviruses driven by a plasmid-encoded T7 RNA polymerase. J Virol Methods 196:36-39.
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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