(57)【要約】      （修正有）【課題】脱ミエリン化及び／又はミエリン化不全を治療し、及び／又は、ニューロンの再ミエリン化を促進し、及び／又は、ミエリン関連疾患の発症を予防するための方法及び組成物の提供。【解決手段】ａ）医薬グレードの水と、ｂ）少なくとも１つの処理促進剤と、ｃ）前記水に懸濁されて懸濁液を形成する金ナノ結晶とを含む組成物。金ナノ結晶は、ｉ）複数の表面を含み、当該表面が、（１）有機化学成分が前記表面に吸着又は結合されていない、及び／又は、（２）実質的に清浄で、水又は前記処理促進剤の他には、前記ナノ結晶の機能性を変更する化学成分が表面に吸着又は結合されていない特性を有する。【選択図】図３７Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類におけるニューロンの再ミエリン化を促進するための組成物であって、
ａ）医薬グレードの水と、
ｂ）少なくとも１つの処理促進剤と、
ｃ）前記水に懸濁されて懸濁液を形成する金ナノ結晶とを含み、
ここで前記金ナノ結晶が、
ｉ）複数の表面を含み、当該表面が、（１）有機化学成分が前記表面に吸着又は結合されていない、及び／又は、（２）実質的に清浄で、水又は前記処理促進剤の他には、前記ナノ結晶の機能性を変更する化学成分が表面に吸着又は結合されていない、という特性からなる群から選択される少なくとも１つの特性を含み、
ii）最頻値粒子サイズが約５０ｎｍ未満であり、且つ、
iii）前記懸濁液中に約２〜２０００ｐｐｍの濃度で存在し、
ここで前記懸濁液のｐＨが約５〜約９.５であり、ゼータ電位が少なくとも約−３０ｍｖである、医薬組成物。
【請求項２】
前記懸濁液のゼータ電位が少なくとも約−４０ｍＶである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記金ナノ結晶が２〜２００ｐｐｍの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記再ミエリン化が、オリゴデンドロサイトの増殖及び分化からなる群から選択される１以上の作用を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記再ミエリン化が、中枢神経系のニューロンの再ミエリン化を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
経口投与される、請求項１〜５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
哺乳類におけるニューロンの再ミエリン化を促進するための組成物であって、元素金ナノ懸濁液を含む組成物。
【請求項８】
前記再ミエリン化が、オリゴデンドロサイトの増殖又は分化からなる群から選択される１以上の作用を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
経口投与される、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
進行性核上麻痺、アレキサンダー病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、カナヴァン病、白質ジストロフィー、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊 （Central Pontine Myelolysis：ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、ツェルウェーガー症候群、ギラン・バレー症候群（Guillain-Barre Syndrome：ＧＢＳ）、ファンデルナープ症候群、慢性炎症脱ミエリン化多発ニューロパシー（chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy：ＣＩＤＰ）、多巣性運動ニューロパシー（multifocal motor neuropathy：ＭＭＮ）、視神経脊髄炎（Neuromyelitis Optica：ＮＭＯ）、視神経炎（Optic Neuritis）、進行性多巣性白質脳症（Progressive Multifocal Leukoencephalopathy：ＰＭＬ）、軽度認識障害（Mild Cognitive Impairment：ＭＣＩ）、ウォラー変性、並びに一部の遺伝病、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、及びペリツェウス・メルツバッハー病（Pelizaeus Merzbacher Disease：ＰＭＺ）からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療に使用される、請求項１〜９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記疾患が視神経脊髄炎（Neuromyelitis Optica）を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記疾患が視神経炎（Optic Neuritis）を含む、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効量（治療的有効量又は予防的有効量の何れか）且つ有効濃度の本明細書に記載の元素金ナノ懸濁液、好ましい態様によれば表面清浄金系ナノ結晶懸濁液を、それを必要とする対象に対して投与することにより、ニューロンのミエリン化不全及び／又は脱ミエリン化の原因を治療し、及び／又は、ミエリン及び軸索に関連する疾患の発症を予防し、及び／又は、再ミエリン化を促進するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脱ミエリン化疾患は中枢神経系（「ＣＮＳ」）及び／又は末梢神経系（「ＰＮＳ」）の疾患の一つで、ニューロンのミエリン鞘が損傷を受けるものである。ミエリン鞘が損傷を受けると、通常は損傷神経におけるシグナル伝導に悪影響が生じ、及び／又は、（１又は２以上の）内在ニューロンの性能が何らかの形で異常化又は劣化する結果となる。関連するミエリンが損傷すると、どのニューロン／ミエリン鞘が損傷又は異常化したかに応じて、感覚、認知、運動能力等の機能の何れか一つ又は全てに欠損が生じる。
【０００３】
脱ミエリン化及びミエリン化不全の詳細な作用機序は、明確には分かっていない。ミエリンは、中枢神経系及び末梢神経系の各々におけるニューロンを保護する、主要タンパク質からなる覆いであることが知られている。この主要タンパク質は、哺乳類の多くのニューロンの周囲に、通常は「ミエリン鞘」（myelin sheaths）と呼ばれる鞘を形成している。欠陥のない健常なミエリン鞘によって、神経シグナルは迅速且つ完全なものとなる。なぜなら、健常なミエリン鞘は、神経軸索による電位の迅速な伝送を可能とし、及び／又は、栄養及び代謝の支援の欠落等を含む、内在するニューロンの健常な構造及び／又は機能を促進するからである。軸索からミエリンの一部又は全部が（例えば脱ミエリン化等により）除去されると、シグナルの実際の電位速度は、正常なミエリン化の速度と比べて３０倍超も遅くなりうる。
【０００４】
更に、ミエリン鞘を形成するのは、グリア細胞の原形質膜（plasma lemmal）として知られる構造（例えば、中枢神経系のオリゴデンドロサイトや、末梢神経系のシュワン（Schwann）細胞等）、別名細胞膜である。ミエリン鞘は、ミエリン化の活動期に比較的速い速度で生成される。具体的に、中枢神経系のオリゴデンドロサイトは、正常且つ健常な機能の中で十分なミエリンを形成し、天然の「再ミエリン化」を生じさせる必要がある。即ち、新たに合成されるミエリンは、定期的に産生されることが重要である。
【０００５】
再ミエリン化は、成熟ＣＮＳの裸出軸索の周囲に新たなミエリン鞘を生成することを含む。再ミエリン化の直接の結果には、ランビエ（Ranvier）絞輪へのイオンチャンネルの適切な再分配と、跳躍伝導の復元とが含まれる。即ち、再ミエリン化は、軸索のミトコンドリア量の低下により観察されるエネルギー需要の増加を、部分的に解決するものである。更に、脱ミエリン化により生じる機能障害が、再ミエリン化により回復する。また、脱ミエリン化された軸索が再ミエリン化されることにより、その後の損傷からの防護が強化されることを示す証拠もある。斯かる再ミエリン化は、オリゴデンドロサイトと軸索との間における、成長因子の適切なシグナル伝達を復旧するものと考えられる。更に、軸索とオリゴデンドロサイトとの共生関係は能動的なものであり、ミエリンの役割は単なる電気絶縁に留まらないことを示す証拠もある。具体的に、オリゴデンドロサイト細胞体が焼灼（ablation）に晒されると、脱ミエリン化が観察されないにもかかわらず、軸索が大規模な損傷を受ける場合がある。斯かるプロセスの結果、ミエリン化不全又は機能不全が生じる。
【０００６】
脱ミエリン化又はミエリン化不全は、中枢神経系及び末梢神経系における多数の後天性障害及び遺伝性疾患の双方について、その関与が示されてきた。
【０００７】
ヒト疾患の原因となる、或いはヒト疾患と関連する作用機序／結果について、少なくともその一部と相関し、或いはそれらを模倣した動物での結果を取得することを目指した、一群の条件を生成する実験系が知られている。斯かる系の一つはクプリゾン（Cuprizone）動物モデルとして知られる15。この「毒性脱ミエリン化モデル」（toxic demyelination model）は、ミトコンドリアの形態変化を生じる。この銅キレート化合物の神経毒性は、細胞呼吸の妨害によるものと推測される9。クプリゾンにより誘導される脱ミエリン化は、ミエリン鞘への直接の攻撃よりも、むしろこれを支持するオリゴデンドロサイト（希突起膠細胞）の変性により生じる10, 11, 12。
【０００８】
更に、ＭＳ病変におけるオリゴデンドログリアの死を引き起こす作用機序は明らかではない。多発性硬化症（Multiple Sclerosis：「ＭＳ」）病変におけるオリゴデンドログリアの死が、クプリゾンモデルにおけるものと同様の病理学的機序によるものかどうかは疑わしい9。ＭＳは現在、多数の異なる様相及び特徴を有する障害であると考えられている。本分野の専門家は、クプリゾンにより誘発される脱ミエリン化が、ヒトＭＳ患者におけるミエリンの損失をモデル化しているか否かについて、疑義を表している９。ＭＳの具体的な発症機序は未だ知られていない。
【０００９】
更に加えて、クプリゾン動物モデル等の毒性脱ミエリン化モデルとの関連が疑われる、脱ミエリン化を含む障害及び疾患としては、進行性核上麻痺、アレキサンダー病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、カナヴァン病、白質ジストロフィー、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊（Central Pontine Myelolysis：ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、ツェルウェーガー症候群、ギラン・バレー症候群（Guillain-Barre syndrome：ＧＢＳ）、ファンデルナープ症候群、慢性炎症脱ミエリン化多発ニューロパシー（chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy：ＣＩＤＰ）、多巣性運動ニューロパシー（multifocal motor neuropathy：ＭＭＮ）、視神経脊髄炎（Neuro脊髄炎 Optica：ＮＭＯ）、進行性多巣性白質脳症（Progressive Multifocal Leukoencephalopathy：ＰＭＬ）、ウォラー変性、及び一部の遺伝病、例えば副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、軽度認識障害（Mild Cognitive Impairment：ＭＣＩ）、別名加齢関連認知低下、及びペリツェウス・メルツバッハー病（Pelizaeus Merzbacher Disease：ＰＭＺ）が挙げられる。前述の障害のうち多くについては、治療法が殆ど或いは全く存在しないか、あったとしても有効な治療法はごく僅かである。
【００１０】
視神経脊髄炎（ＮＭＯ）はしばしばデビック疾患（Devic's disease）とも呼ばれる。
【００１１】
ＮＭＯは、患者の視神経及び脊髄に主に罹患する中枢神経系（ＣＮＳ）障害である。ＮＭＯはアジアにおける主要な神経免疫学的疾患の一つである。
【００１２】
ＮＭＯ患者の血清から発見されたＮＭＯ−免疫グロブリンＧ（immunoglobulin G：ＩｇＧ）は、マウス脳の血液脳関門又はその近傍に結合する。ＮＭＯ−ＩｇＧのエピトープはアクアポリン−４（aquaporin-4：ＡＱＰ４）として同定されている。これは、血液脳関門のアストロサイトの足突起で高濃度発現している水チャネルである。
【００１３】
ＮＭＯを特徴付けるのは、重篤な視神経炎及び脊髄炎の発症である。これらは主に縦長横断性脊髄炎（longitudinally extensive transverse myelitis：ＬＥＴＭ）として観察され、ある時は両方同時に、ある時は連続して発生する。ＮＭＯ患者の多くは血清中にＡＱＰ４に対する自己抗体を有する。従って、ＮＭＯの診断基準は、視神経炎及び脊髄炎の双方が存在することと、以下の３つの補助基準のうち少なくとも２つが満たされることとを要する。即ち、３つ以上の脊椎分節に亘る連続した脊髄病変を示すＭＲＩの証拠があること、発症時に実施した脳ＭＲＩ３４によりＭＳ診断基準の結果が陰性であること、及び、ＮＭＯ−ＩｇＧ（又は抗ＡＱＰ４抗体）の血清反応が陽性であることである。
【００１４】
このように、現在ではＮＭＯは、抗ＡＱＰ４抗体により媒介されるアストロサイト障害（astrocytopathy）であって、ＭＳ等の脱ミエリン化障害とは異なると考えられている。しかし、ＮＭＯを有する哺乳類は明らかに、脱ミエリン化又はミエリン化不全の病理学的な結果を示している。
【００１５】
ＰＮＳ及びＣＮＳにおける再生の比較
歴史的には、ＣＮＳよりもＰＮＳの方が、神経再生が遙かに有効であると考えられてきた。以前の研究者は、単にＣＮＳニューロンの固有の再生能力が劣っているものと考えていたが、ＣＮＳニューロンが末梢神経移植片を通じて成長しうるという発見により、斯かるパラダイムは疑問視されることになった。これら２つの系の比較により、ＣＮＳの抑制環境こそがＣＮＳ軸索の再生に対する最大の妨げとなっていることが立証され、惹いてはＰＮＳにおける成長を促進し、ＣＮＳにおける成長を抑制する、幾つかの因子が発見されるに至った。例えば、オリゴデンドロサイトミエリン及びシュワン細胞ミエリンは何れも、阻害分子を含む。ＣＮＳでは、軸索成長は損傷部位において、反応性のアストロサイト及びミクログリアからなるグリア性瘢痕によっても阻害される。これに対して、ＰＮＳではグリア性瘢痕は形成されず、シュワン細胞により形成されるビュングナー帯（bands of Buengner）が軸索の誘導及び再生を実際に補助する。ＣＮＳ再生とＰＮＳ再生との間のこれらの重要な相違を理解することが、許容しえない環境、即ちＣＮＳ及び慢性的に除神経されるＰＮＳにおいて、再生を改善するための方針を形成する助けとなる。
【００１６】
脱ミエリン化又はミエリン化不全を停止又は遅延化し、及び／又は、再ミエリン化を促進し、及び／又は、ミエリン及び／又は軸索の機能を保存又は復旧するのを補助する材料及び／又は処置を求める強い要請が、依然として存在する。
【００１７】
定義
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、「を含む」（comprise）という語、或いはその活用形（例えば“comprises”又は“comprising”等）は、記載された整数又は複数の整数の群を含むことを意味するが、他の整数又は複数の整数の群を除外するものではない。「を含む・含んでいる」（comprising）との語は、包括的又は開放的であり、記載されていない追加の要素又は工程を除外するものではない。「実質的にからなる」（consisting essentially of）との句は、明示された材料又は工程を含むと共に、記載された発明の基本且つ新規な特性に実質的な影響を与えない材料又は工程を含んでいてもよいことを意味する。本明細書で使用する場合、「からなる」（consisting）とは、明示された材料又は工程のみであることを意味する。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」（ther類人猿utically effective amount）とは、金ナノ結晶の濃度及び懸濁液の量において、また、必要な時間及び／又は投与に亘って、所望の治療結果を達成するのに有効な量を意味する。所望の治療結果としては、限定されるものではないが、症状の緩和、生存の延長、運動又は機能の改善、再発の重症度の低減、寛解期間の延長等が挙げられる。「治療有効量」によれば、所望の治療結果のうち任意の一つ、又は、複数の所望の治療結果の任意の組合せが達成されうる。治療結果は「治癒」（cure）である必要はない。また、治療結果には、ミエリン損傷、ミエリンの脱ミエリン化の減少、及び／又は、再ミエリン化の増加の量の測定値の相違も含まれる。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「予防有効量」（prophylactically effective amount）とは、金ナノ結晶の濃度及び懸濁液の量において、また、必要な時間及び／又は投与に亘って、所望の予防結果を達成するのに有効な量を意味する。通常、予防的用量は疾患の発症前又は初期段階の対象に対して使用されるため、予防有効量は治療有効量よりも少なくてもよい。また、予防結果には、ミエリン損傷、ミエリンの脱ミエリン化の減少、及び／又は、再ミエリン化の増加の量の測定値の相違も含まれる。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「処置」（treatment）又は「処置する」（treating）との語は、元素金系ナノ懸濁液、好ましい態様によれば、本明細書で「ＣＮＭ−Ａｕ８」と呼ばれる新規の金系ナノ結晶懸濁液を哺乳類に対して、疾患の症状を軽減又は緩和するために投与することを意味する。更に、「処置」又は「処置する」との語は、前述の金系ナノ懸濁液を哺乳類に対して、疾患の進行を防止するために投与することを意味する。また、疾患の進行の防止には、ミエリン損傷、ミエリンの脱ミエリン化の減少、及び／又は、再ミエリン化の増加の量の測定値の相違も含まれる。
【００２１】
「対象」（subject）又は「個体」（individual）又は「動物」（animal）又は「患者」（patient）又は「哺乳類」（mammal）とは、診断、予後、治療及び／又は予防が所望される任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象としては、限定されるものではないが、ヒト、家畜動物、農業用動物、動物園飼育動物、運動競技用動物、愛玩動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、肉牛、乳牛；霊長類、例えば類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジー；イヌ科、例えばイヌ及びオオカミ；ネコ科、例えばネコ、ライオン、及びトラ；ウマ科、例えばウマ、ロバ、及びシマウマ；食用動物、例えば乳ウシ、ブタ、及びヒツジ；有蹄類、例えばシカ及びキリン；齧歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、及びモルモット；等が挙げられる。特定の態様では、哺乳類はヒト対象である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
好ましい態様によれば、新規の金ナノ結晶を高純度水に分散させる。当該金ナノ結晶は、有機物又は他の不純物又はフィルムを（本明細書の定義によれば）実質的に含まないが、水に分散された状態で安定に維持されるナノ結晶性表面を有する。具体的に、溶液中の金イオンから金ナノ粒子を成長させるために、化学的還元剤及び／又は界面活性剤を必要とする化学的還元プロセスを用いて作製されたものと比較して、表面が「清浄」（clean）である。成長した金ナノ結晶の多くは、独自且つ識別可能な表面特性を有する。例えば、空間的に広がった低指数の結晶平面｛１１１｝、｛１１０｝及び／又は｛１００｝、並びに複数の斯かる平面の群（及びその等価物）を有する。結果として得られる金ナノ結晶性懸濁液又はコロイドは、所望のｐＨ範囲が例えば４．０〜９．５、但しより典型的には５．０〜９．５であり、斯かる所望のｐＨ範囲において、ゼータ電位値は少なくとも−２０ｍＶ、より典型的には少なくとも−４０ｍＶ、更に典型的には少なくとも−５０ｍＶである。
【００２３】
以下に記載の製造方法に従って調製されるこれらの金ナノ結晶の形状及び形状分布としては、限定されるものではないが、三角形（例えば四面体）、五角形（例えば五角両錐体又は十面体）、六角形（例えば六角両錐体、二十面体、八面体）、ダイヤモンド（例えば八面体、種々の伸長両錐体、融合四面体、両錐体側面）、及び「その他」（others）が挙げられる。（前述の形状を形成する）前述の空間的に広がった低指数結晶平面を含み、「清浄」表面を有するナノ結晶の形状分布は、独自のものである。
【００２４】
１００ｎｍ未満の所望の平均サイズを有する金ナノ結晶が提供される。最も望ましい金結晶性サイズ範囲には、（本明細書で詳細に開示される具体的な技法により測定及び決定され、「ＴＥＭ平均直径」（TEM average diameter）として報告されるところの）平均結晶サイズ又は「最頻値」（mode）が、大部分が１００ｎｍ未満、より典型的には５０ｎｍ未満、更に典型的には３０ｎｍ未満であるものが含まれ、本明細書に記載の好ましい態様の多くにおいては、ナノ結晶サイズ分布の最頻値が２１ｎｍ未満であり、より一層好ましい範囲としては８〜１８ｎｍの範囲内であるものが含まれる。
【００２５】
本発明によれば、治療有効量又は予防有効量を達成するべく、任意の濃度の金ナノ粒子を提供することができる。
【００２６】
好ましい態様によれば、これらの独自の表面清浄化金ナノ結晶を水に安定的に分散させた状態で産生するための新規のプロセスが提供される。本プロセスは、水中での金ナノ結晶の成長を含む。好ましい態様によれば、この水には「プロセス促進剤」（process enhancer）が添加される。このプロセス促進剤は、電気化学的刺激による成長プロセスにおいて、形成されたナノ結晶に顕著には結合せず、むしろ核生成／結晶成長を促進するものである。プロセス促進剤は、電気化学的溶液中に荷電イオンを提供することにより、結晶の成長を許容することを含むプロセスにおいて、重要な役割を果たす。これらの新規の電気化学的プロセスは、バッチ、半連続法、又は連続法の何れでも生じうる。これらのプロセスにより、結果として制御された金ナノ結晶性濃度、制御されたナノ結晶サイズ、及び制御されたナノ結晶サイズ範囲が得られると共に、制御されたナノ結晶形状及び制御されたナノ結晶形状分布も得られる。これらの金ナノ結晶を生成するための新規の製造用アセンブリが提供される。新規の接線流濾過（Tangential Flow Filtration：ＴＦＦ）技法を用いることにより、金のｐｐｍがより高いと共に、最高３，０００ｐｐｍ（即ち、３，０００μｇ／ｍｌ）の濃度でも安定な懸濁液（即ち、所望のｐＨ範囲において、ゼータ電位値が少なくとも−２０ｍＶ、より典型的には少なくとも−４０ｍＶ、更に典型的には少なくとも−５０ｍＶの懸濁液）を得ることができる。
【００２７】
本明細書で更に説明するように、全身への使用に適した、例えば、経口、静脈内、皮下、動脈内、口腔内、吸入、エアロゾル、噴霧、又は他の適切な液剤等に適した、医薬組成物が提供される。
【００２８】
本願に記載される医療／病理学的状態の何れかを治療、軽減、又は予防するための治療有効量又は予防有効量の金ナノ結晶を含む医薬組成物も提供される。好ましい態様によれば、金ナノ結晶は、経口送達される液剤により投与される。ここで、金ナノ結晶は製造時は水中に存在するところ、これは濃縮又は再構成されてもよいが、金ナノ結晶の表面が完全に乾燥したり、或いは製造当初の状態からその他の変を生じたりするまで乾燥しないことが好ましい。
【００２９】
ここで理解すべき重要な点であるが、医薬製品における目的は、薬効を達成するのに必要な最小用量を確立することにより、毒性又は合併症の可能性を最小化することである。顕著に優れた効能を有する新たな経口投与製品によれば、従来製品と比べて、より低い用量レベルで薬効を発揮でき、及び／又は、同等の用量レベルで実質的に改善された薬効を発揮できる。治療有効量等を確認するには臨床試験が必要である。しかし、例えば濃度、容量、時間、及び／又は、投薬頻度等を種々変更することにより、臨床作用の滴定が可能である。
【００３０】
本明細書で更に説明するように、全身への使用に適した、例えば、経口、静脈内、皮下、動脈内、口腔内、吸入、エアロゾル、噴霧、又は他の適切な液剤等に適した、医薬組成物が提供される。
【００３１】
適切な投薬量及び投薬計画は、主事医師又は獣医師が決定することができるが、活性を阻害及び／又は改変する所望のレベル、治療すべき具体的な状態、当該状態の重症度、投与量が治療有効量か予防有効量か、更には対象の概年齢、健康状態、及び体重に応じて異なり得る。
【００３２】
水性媒体中に含まれる金ナノ結晶の投与は、単回投与で行ってもよく、一連の投与で行ってもよい。金属系ナノ結晶を含む水性媒体は、例えばコロイド等の形態で単独で投与することも可能であるが、活性成分と他の組成物及び／又は治療剤との混合物を含メルコとも許容される。更に、これらの活性成分／懸濁液／コロイドに対して、種々の医薬組成物を添加してもよい。
【００３３】
従って、好ましい態様によれば、本発明に係る（例えば水性金系金属を含む）金ナノ結晶懸濁液又はコロイドは、第二の治療剤との組合せで投与してもよい。第二の治療剤は糖質コルチコイドを含んでいてもよい。
【００３４】
本発明に係る経口投与に適した金ナノ結晶懸濁液は、通常は水中に安定な溶液、コロイド、又は部分的に安定な懸濁液として存在する。しかし、斯かる金ナノ結晶は、非水性液体中に含まれていてもよく、各々が所定量の金ナノ結晶活性成分等を含む離散的な単位として、例えば液体カプセル、サシェ、更には錠剤として（例えば、斯かる処理が元の金ナノ結晶表面の官能性に悪影響を及ぼさない限りにおいて、懸濁液又はコロイドを乾燥することにより、活性成分金系ナノ結晶とする）；粉末又は顆粒として；水性又は非水性液体中の溶液、コロイド又は懸濁液として；又は、水中油液状エマルション又は油中水液状エマルションとして存在していてもよい。金ナノ結晶活性成分を組み合わせてボーラス、舐剤、又はペーストとしてもよい。当然ながら、異なる複数の元素金ナノ懸濁液を、本明細書で論じる処置のための材料として用いてもよい。
【００３５】
口内での経口投与に適した組成物には、１又は２以上の活性成分金ナノ結晶を、例えばスクロース、アカシア、又はトラガカント・ゴム等の風味付け基材中に含む懸濁液又はコロイドを含むロゼンジ（lozenges）；金ナノ結晶活性成分を、例えばゼラチンやグリセリン、又はスクロースやアカシア・ゴム等の不活性基材中に含む芳香錠（pastilles）；並びに、金ナノ結晶活性成分を適切な液状担体中に含む洗口液等が含まれる。
【００３６】
金ナノ結晶懸濁液又はコロイドを、例えばアトマイザ、エアロゾル、又はネブライザ手段を用い、溶液又はコロイド中の１又は２以上の成分（例えば金ナノ結晶）を、例えば霧又はスプレー中に含まれる状態として、鼻腔内又は吸入投与してもよい。
【００３７】
直腸内投与用組成物は、例えばココアバター、ゼラチン、グリセリン又はポリエチレングリコール等を含む適切な担体基材と組み合わせ、坐薬として提供してもよい。
【００３８】
膣内投与に適した組成物は、活性成分に加えて上記の担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、フォーム、又はスプレー等の、本分野で既知の適切な製剤として提供することができる。
【００３９】
非経口投与に適した組成物としては、抗酸化剤、緩衝剤、殺細菌剤、及び組成物を対象となる受容者の血液と等張にする溶質を含んでいてもよい、水性及び非水性の等張性無菌注射懸濁液又はコロイド；並びに、懸濁剤及び増粘剤を含んでいてもよい、水性及び非水性の無菌懸濁液が含まれる。本組成物は、単回投与又は多回投与分を密閉した容器、例えばアンプルやバイアル等として供してもよく、凍結乾燥状態で保存し、使用直前に注射用水等の無菌液状担体を加えるだけで使用可能としてもよい。前述したような無菌粉末、顆粒、及び錠剤から、即時使用の注射溶液、コロイド、及び懸濁液を調製してもよい。
【００４０】
好ましい単位投与組成物は、本明細書に上述したような、活性成分の一日用量又は単位や一日亜用量を含む組成物、或いはその適切な画分を含む組成物である。
【００４１】
当然ではあるが、具体的に上述した金ナノ結晶活性成分に加えて、本発明の組成物は、所期の組成物の種類に応じて本分野で従来公知の他の剤を含んでいてもよい。例えば、経口投与に適した組成物の場合、更に結合剤、甘味料、増粘剤、風味剤、崩壊剤、被覆材、保存料、潤滑剤、遅延剤、及び／又は、局所放出剤等の剤を含んでいてもよい。適切な甘味料には、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテーム、又はサッカリンが含まれる。適切な崩壊剤には、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸、又は寒天が含まれる。適切な風味剤には、ペパーミントオイル、ウィンターグリーン、チェリー、オレンジ、又はラズベリー風味のオイルが含まれる。適切な被覆材には、アクリル酸及び／又はメタクリル酸及び／又はそれらのエステルのポリマー又はコポリマー、蝋、脂肪アルコール、ゼイン、シェラック、又はグルテンが含まれる。適切な保存料には、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、α−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン、亜硫酸水素ナトリウム等が含まれる。適切な潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、タルク等が含まれる。適切な遅延剤には、一ステアリン酸グリセリルやジステアリン酸グリセリルが含まれる。
【００４２】
これらの元素金ナノ懸濁液、中でも好ましい態様によれば、実質的に表面清浄又は表面純粋な金ナノ結晶の高純度水懸濁液は、上述の発明の背景に記載した任意の障害を治療するのに用いることができる。更に、「元素金ナノ懸濁液」（elemental gold nanosuspensions）又は「元素金結晶ナノ懸濁液」（elemental gold crystal nanosuspensions）等の語句は、本明細書に明示的に記載されるＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液を指すと共に、一般的な物理特性、例えばナノ粒子サイズ、濃度、ｐＨ等が、本明細書で詳細に開示されるＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液の物理特性と同一の範囲に存在する限り、全く異なる技法で作製される他の元素金ナノ懸濁液（たとえ斯かるナノ懸濁液が特定の欠点を伴うものであったとしても）も指すものと理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、一のプラズマ４ａが生成される第一の溝部材３０ａ’を示す。この第一の溝部材３０ａ’の出口は第二の溝部材３０ｂ’に繋がる。
【００４４】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、溝部材３０ｂ’の別の構成を示す。本構成では、溝部材部分３０ａ’及び３０ｂ’が隣接して存在する。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【００４５】
【図３】図３は、本明細書の図２Ａ〜２Ｃ及び実施例１と共に用いられる溝部材３０ｂ’を示す。
【００４６】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂは、２つの溝部材３０の２つの断面図を示す。
【図４Ｂ】同上。
【００４７】
【図５Ａ】図５Ａは、実施例１にて論じるナノ結晶性懸濁液の作製に用いられるプラズマ４の作製に用いられるＡＣ変圧器の電気配線図を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、変圧器６０の模式図を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃ及び５Ｄは、それぞれ同相及び異相の関係にある２つのサイン波の模式表現を示す。
【図５Ｄ】同上。
【００４８】
【図６】図６は、電極１の構成の一つの代表的な態様を示す。
【００４９】
【図７】図７は、本明細書の実施例１で使用される金線５ａ及び５ｂの図を示す。
【００５０】
【図８】図８は、実施例１において論じる金ナノ結晶懸濁液を生成するのに使用された電力供給用電源配置の模式図である。
【００５１】
【図９】図９は、溝部材３０に位置する制御装置群２０を、溝部材３０を流通して保存容器４１へと流れ込む液体３と共に示す模式断面図である。
【００５２】
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施例１との関連で形成された乾燥金ナノ結晶の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実施例１との関連で形成された乾燥金ナノ結晶のＴＥＭ測定に由来する粒子サイズ分布ヒストグラムを示す。
【図１０Ｃ】図１０Cは、実施例１に従って作製された金懸濁液のUV−Visスペクトルパターンを示す。
【００５３】
【図１１】図１１は、金ナノ懸濁液の濃縮に用いるＴＦＦ装置の模式表現である。
【００５４】
【図１２】図１２は、実施例２において論じる冠状脳断面の作製に使用される機器及びプロセスの斜視図を示す。
【００５５】
【図１３】図１３は、実施例２のマウスグループ１〜４に存在するミエリン染色の相対量を示す棒グラフである。
【００５６】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｄは、それぞれ実施例２のマウスグループ１〜４の各々から選ばれた単一のマウスの脳梁の代表的な部分のＴＥＭ画像を示す。
【図１４Ｂ】同上。
【図１４Ｃ】同上。
【図１４Ｄ】同上。
【００５７】
【図１５】図１５は、それぞれ実施例２のマウスグループ１〜４の各々から選ばれた単一のマウスの脳梁ＴＥＭ画像において、約１００の軸索を観察することにより測定／校正されたＧ−比率の棒グラフを示す。
【００５８】
【図１６】図１６は、それぞれ実施例２のマウスグループ１〜４の各々から選ばれた単一のマウスのＧ−比率演算に関連するデータ散乱パターンを示す。
【００５９】
【図１７】図１７Ａ〜Ｄは、それぞれ実施例２のマウスグループ１〜４の各々から選ばれた単一のマウスについて生成された釣鐘曲線との比較における、実際のＧ−比率データのヒストグラムを示す。
【００６０】
【図１８】図１８は、試験期間を通じて実施例２のマウスグループ１〜４の各々により消費された液体の平均量に相当する一連のプロットを示す。
【００６１】
【図１９】図１９は、試験期間を通じて実施例２のマウスグループ１〜４の各々について測定された平均体重に相当する一連のプロットを示す。
【００６２】
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｆは、実施例３において論じるサンプル調製法の対象となる脳の複数の部分の模式図を示す。
【００６３】
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｂは、実施例３において論じるＴＥＭ画像のための薄片を得るのに用いられる、脳切片を保持及び切断するための装置を示す。
【００６４】
【図２２】図２２は、実施例３において論じる試験開始時８週齢のグループ１〜７の各マウスの、平均体重増加に相当する一連のプロットを示す。
【００６５】
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｃは、当初は４，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ１のマウスの脳梁の代表的な部分のＴＥＭ画像に相当する。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【００６６】
【図２４Ａ】図２４Ａ〜２４Ｅは、当初は４，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ２のマウスの脳梁の代表的な部分のＴＥＭ画像に相当する。
【図２４Ｂ】同上。
【図２４Ｃ】同上。
【図２４Ｄ】同上。
【図２４Ｅ】同上。
【００６７】
【図２５Ａ】図２５Ａ〜２５Ｇは、当初は４，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ３のマウスの脳梁の代表的な部分のＴＥＭ画像に相当する。
【図２５Ｂ】同上。
【図２５Ｃ】同上。
【図２５Ｄ】同上。
【図２５Ｅ】同上。
【図２５Ｆ】同上。
【図２５Ｇ】同上。
【００６８】
【図２６Ａ】図２６Ａ〜２６Ｅは、当初は４，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ４のマウスの脳梁の代表的な部分のＴＥＭ画像に相当する。再ミエリン化が観察された領域を矢印２０１で示す。
【図２６Ｂ】同上。
【図２６Ｃ】同上。
【図２６Ｄ】同上。
【図２６Ｅ】同上。
【００６９】
【図２７Ａ】図２７Ａ〜２７Ｄは、当初は４，０００×及び５，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ５のマウスの脳梁の代表的な部分のＴＥＭ画像に相当する。再ミエリン化が観察された領域を矢印２０１で示す。
【図２７Ｂ】同上。
【図２７Ｃ】同上。
【図２７Ｄ】同上。
【００７０】
【図２８Ａ】図２８Ａ〜２８Ｇは、当初は４，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ６のマウスの脳梁の代表的な部分のＴＥＭ画像に相当する。再ミエリン化が観察された領域を矢印２０１で示す。
【図２８Ｂ】同上。
【図２８Ｃ】同上。
【図２８Ｄ】同上。
【図２８Ｅ】同上。
【図２８Ｆ】同上。
【図２８Ｇ】同上。
【００７１】
【図２９Ａ】図２９Ａ〜２９Ｄは、当初は４，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ７のマウスの脳梁の代表的な部分のＴＥＭ画像に相当する。再ミエリン化が観察された領域を矢印２０１で示す。
【図２９Ｂ】同上。
【図２９Ｃ】同上。
【図２９Ｄ】同上。
【００７２】
【図３０Ａ】図３０Ａ〜３０Ｃは、当初は約１６，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ１のマウスの脳梁の代表的な部分を示す代表的なＴＥＭ画像を示す。図３０Ａでは、損傷、脱ミエリン化、及び／又は、ミエリン化不全の状態の軸索を、黒四角及び矢印２０２Ｓ（図３０Ｂ及び図３０Ｃでは矢印２０２のみ）により、星２０３を付した参照軸索との比較で示す。
【図３０Ｂ】同上。
【図３０Ｃ】同上。
【００７３】
【図３１Ａ】図３１Ａ〜３１Ｂは、当初は約１６，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ２のマウスの脳梁の代表的な部分を示す代表的なＴＥＭ画像を示す。損傷、脱ミエリン化、及び／又は、ミエリン化不全の状態の軸索を、矢印２０２により、星２０３を付した参照軸索との比較で示す。
【図３１Ｂ】同上。
【００７４】
【図３２Ａ】図３２Ａ〜３２Ｂは、当初は約１６，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ３のマウスの脳梁の代表的な部分を示す代表的なＴＥＭ画像を示す。損傷、脱ミエリン化、及び／又は、ミエリン化不全の状態の軸索を、矢印２０２により、星２０３を付した参照軸索との比較で示す。
【図３２Ｂ】同上。
【００７５】
【図３３Ａ】図３３Ａ〜３３Ｂは、当初は約１６，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ４のマウスの脳梁の代表的な部分を示す代表的なＴＥＭ画像を示す。損傷、脱ミエリン化、及び／又は、ミエリン化不全の状態の軸索を、矢印２０２により、星２０３を付した参照軸索との比較で示す。
【図３３Ｂ】同上。
【００７６】
【図３４Ａ】図３４Ａ〜３４Ｂは、当初は約１６，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ５のマウスの脳梁の代表的な部分を示す代表的なＴＥＭ画像を示す。損傷、脱ミエリン化、及び／又は、ミエリン化不全の状態の軸索を、矢印２０２により、星２０３を付した参照軸索との比較で示す。
【図３４Ｂ】同上。
【００７７】
【図３５Ａ】図３５Ａ〜３５Ｂは、当初は約１６，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ６のマウスの脳梁の代表的な部分を示す代表的なＴＥＭ画像を示す。損傷、脱ミエリン化、及び／又は、ミエリン化不全の状態の軸索を、矢印２０２により、星２０３を付した参照軸索との比較で示す。
【図３５Ｂ】同上。
【００７８】
【図３６Ａ】図３６Ａ〜３６Ｂは、当初は約１６，０００×で撮像された、実施例３におけるグループ７のマウスの脳梁の代表的な部分を示す代表的なＴＥＭ画像を示す。損傷、脱ミエリン化、及び／又は、ミエリン化不全の状態の軸索を、矢印２０２により、星２０３を付した参照軸索との比較で示す。
【図３６Ｂ】同上。
【００７９】
【図３７Ａ】図３７Ａ〜３７Ｋは、当初は１６，０００×又は４０，０００×で撮像された、グループ４のマウスの脳梁の代表的な部分に相当する代表的なＴＥＭ画像を示す。再ミエリン化が観察された領域を矢印２０Ｍで示す。
【図３７Ｂ】同上。
【図３７Ｃ】同上。
【図３７Ｄ】同上。
【図３７Ｅ】同上。
【図３７Ｆ】同上。
【図３７Ｇ】同上。
【図３７Ｈ】同上。
【図３７Ｉ】同上。
【図３７Ｊ】同上。
【図３７Ｋ】同上。
【００８０】
【図３８Ａ】図３８Ａ〜３８Ｌは、当初は１６，０００×又は４０，０００×で撮像された、グループ５のマウスの脳梁の代表的な部分に相当する代表的なＴＥＭ画像を示す。再ミエリン化が観察された領域を矢印２０Ｍで示す。
【図３８Ｂ】同上。
【図３８Ｃ】同上。
【図３８Ｄ】同上。
【図３８Ｅ】同上。
【図３８Ｆ】同上。
【図３８Ｇ】同上。
【図３８Ｈ】同上。
【図３８Ｉ】同上。
【図３８Ｊ】同上。
【図３８Ｋ】同上。
【図３８Ｌ】同上。
【００８１】
【図３９Ａ】図３９Ａ〜３９Ｊは、当初は１６，０００×又は４０，０００×で撮像された、グループ６のマウスの脳梁の代表的な部分に相当する代表的なＴＥＭ画像を示す。再ミエリン化が観察された領域を矢印２０Ｍで示す。
【図３９Ｂ】同上。
【図３９Ｃ】同上。
【図３９Ｄ】同上。
【図３９Ｅ】同上。
【図３９Ｆ】同上。
【図３９Ｇ】同上。
【図３９Ｈ】同上。
【図３９Ｉ】同上。
【図３９Ｊ】同上。
【００８２】
【図４０Ａ】図４０Ａ〜４０Ｇは、当初は１６，０００×又は４０，０００×で撮像された、グループ７のマウスの脳梁の代表的な部分に相当する代表的なＴＥＭ画像を示す。再ミエリン化が観察された領域を矢印２０Ｍで示す。
【図４０Ｂ】同上。
【図４０Ｃ】同上。
【図４０Ｄ】同上。
【図４０Ｅ】同上。
【図４０Ｆ】同上。
【図４０Ｇ】同上。
【００８３】
【図４１Ａ】図４１Ａ〜４１Ｃは、実施例３におけるグループ１のマウスの脳梁の代表的な部分に相当する代表的なＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×の画像であり、図中の各軸索のミエリンの内周（２０４Ｉ）及び外周（２０４Ｏ）を強調して示す。
【図４１Ｂ】同上。
【図４１Ｃ】同上。
【００８４】
【図４２Ａ】図４２Ａ〜４２Ｄは、実施例３におけるグループ２のマウスの脳梁の代表的な部分に相当する代表的なＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×の画像であり、図中の各軸索のミエリンの内周（２０４Ｉ）及び外周（２０４Ｏ）を強調して示す。
【図４２Ｂ】同上。
【図４２Ｃ】同上。
【図４２Ｄ】同上。
【００８５】
【図４３Ａ】図４３Ａ〜４３Ｃは、実施例３におけるグループ３のマウスの脳梁の代表的な部分に相当する代表的なＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×の画像であり、図中の各軸索のミエリンの内周及び外周を強調して示す。
【図４３Ｂ】同上。
【図４３Ｃ】同上。
【００８６】
【図４４Ａ】図４４Ａ〜４４Ｂは、実施例３におけるグループ４のマウスの脳梁の代表的な部分に相当する代表的なＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×の画像であり、図中の各軸索のミエリンの内周及び外周を強調して示す。
【図４４Ｂ】同上。
【００８７】
【図４５Ａ】図４５Ａ〜４５Ｃは、実施例３におけるグループ５のマウスの脳梁の代表的な部分に相当する代表的なＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×の画像であり、図中の各軸索のミエリンの内周及び外周を強調して示す。
【図４５Ｂ】同上。
【図４５Ｃ】同上。
【００８８】
【図４６Ａ】図４６Ａ〜４６Ｂは、実施例３におけるグループ６のマウスの脳梁の代表的な部分に相当する代表的なＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×の画像であり、図中の各軸索のミエリンの内周及び外周を強調して示す。
【図４６Ｂ】同上。
【００８９】
【図４７Ａ】図４７Ａ〜４７Ｅは、実施例３におけるグループ７のマウスの脳梁の代表的な部分に相当する代表的なＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×の画像であり、図中の各軸索のミエリンの内周及び外周を強調して示す。
【図４７Ｂ】同上。
【図４７Ｃ】同上。
【図４７Ｄ】同上。
【図４７Ｅ】同上。
【００９０】
【図４８】図４８Ａ、４８Ｂ、及び４８Ｃは、それぞれグループ１（陽性対照）、グループ２（２週陰性対照）、及びグループ３（５週陰性対照）のマウスに相当するＧ−比率データを表す修正棒グラフヒストグラムを含む。これら３つの修正棒グラフヒストグラムは比較のために併置して示す。
【００９１】
【図４９】図４９Ａ、４９Ｂ、及び４９Ｃは、それぞれグループ３（５週陰性対照）、グループ５、及びグループ７のマウスに相当するＧ−比率データを表す修正棒グラフヒストグラムを含む。これら３つの修正棒グラフヒストグラムは比較のため併置して示す。
【００９２】
【図５０】図５０Ａ、５０Ｂ、及び５０Ｃも、それぞれグループ３（５週陰性対照）、グループ４、及びグループ６のマウスに相当するＧ−比率データを表す修正棒グラフヒストグラムを含む。これら３つの修正棒グラフヒストグラムは比較のため併置して示す。
【００９３】
【図５１】図５１は、グループ１〜７の全てのマウスに相当するＧ−比率データを表す修正棒グラフヒストグラムを含む。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
金（ＣＮＭ−Ａｕ８）ナノ懸濁液の製造
好適な実施態様において、元素金ナノ結晶は高純水に懸濁され、金ナノ結晶は、有機又は他の不純物もしくは膜を実質的に含まない（本明細書に記載のように）ナノ結晶表面を有する。特に、この表面は、溶液中の金イオンから金ナノ粒子を形成するために、化学的還元剤及び／又は界面活性剤を必要とする化学的還元法を使用して作成されたものと比較して、「清浄」である。好適なナノ結晶は、本明細書に詳細に記載される新規製造法により製造される。この製造法は、添加した化学的還元剤及び／又は界面活性剤（例えば、有機化合物）、又は一般的には粒子中もしくはその上に、又は化学的に還元された粒子の表面に被覆されて一緒に運搬される他の物質の先使用を回避するか；又は、次に還元物質は、それ自体が粒子に影響を与える好ましくない方法を使用して、はぎ取られるか又は除去される。
【００９５】
好適な実施態様において、本方法は、「処理促進剤（process enhancer又はprocessing enhancer）」（一般的には、無機材料又はカーボネートなど）を含有する、水中の元素金ナノ結晶の核生成と成長を含み、ここで、処理促進剤は、形成されたナノ結晶に顕著に結合はしないが、電気化学的に刺激された成長プロセス中の核生成／成長を促進する。処理促進剤は、結晶の成長を可能にする電気化学的溶液中に荷電イオンを提供することを含む方法において、重要な役割を果たす。この処理促進剤は、溶液中にとどまるか、及び／又はコーティング（例えば、有機コーティング）を形成しないか、及び／又は形成されたナノ結晶又は形成された懸濁液に悪影響を与えないか、及び／又は、電気化学的プロセス中に破壊、留去もされないか、又は消失することもないことが、極めて重要である。好適な処理促進剤は重炭酸ナトリウムである。他の処理促進剤の例は、炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸カリウム、又は炭酸の他の塩などである。さらなる処理促進剤は、重亜硫酸又は亜硫酸のナトリウム又はカリウム塩を含む塩でもよい。金ナノ結晶を医学治療として使用できるようにするための更に別の処理促進剤は、ナトリウム又はカリウムを含む他の塩、又は本明細書に記載の電気化学的成長プロセスを助ける任意の物質であり、これは、金ナノ結晶の中又は表面上には実質的に取り込まれず、また、ナノ結晶又はナノ結晶を含む懸濁液媒体に好ましくない毒性を付与しない。
【００９６】
処理促進剤の望ましい濃度範囲は、一般的には０．０１〜２０ｇ／ガロン（０．００２６〜２．１７３０ｍｇ／ｍｌ），より一般的には，０．１〜７．５ｇ／ガロン（０．０２６４〜１．９８１３ｍｇ／ｍｌ）、及び最も一般的には０．５〜２．０４ｇ／ガロン（０．１３２１０〜０．５４ｍｇ／ｍｌ）を含む。
【００９７】
成長した金ナノ結晶は、金金属の「裸の」又は「清浄な」表面を有する（すなわち、ゼロ酸価状態で）ため、表面は高い反応性を有するか、又は高い生物触媒性（ならびに高い生物学的利用性）を有する。ナノ結晶は基本的にウォータージャケットに囲まれている。これらの特徴は、例えば還元化学プロセスから存在する有機材料を含有するナノ粒子表面と比較して、インビボで上昇した効力を提供する。「清浄な」表面はまた、又はあるいは、被覆された又は「装飾された」表面を含有するナノ粒子に対して、このナノ結晶の好ましくない毒性を低下させることができる。これらの「清浄な」金ナノ結晶の効力の上昇は、被験体における所望の治療有効量又は所望の予防有効量を達成するのに必要な低用量のために、治療指数の上昇を提供することができる。
【００９８】
被験体において相対的毒性及び／又は利点の開始の相対的速度を含む、被験体の治療のための新規ナノ結晶を使用する他の重要な利点がある。
【００９９】
本明細書の方法において、好適な金ナノ結晶は、空間的に拡張された低屈折率、結晶面｛１１１｝、｛１１０｝、及び／又は｛１００｝、及びそのような面の基（及び、その同等物）のような固有のかつ識別可能な表面特性を提供するように、成長することができる。本発明の方法に従って調製される金ナノ結晶の形は、特に限定されないが、三角形（例えば四面体）、五角形（例えば五角形両錐体又は十面体）、六角形（例えば六角形両錐体、二十面体、八面体）、菱形（例えば八面体、様々な伸長された両錐体、融合四面体、両錐体の側面図）、及び「その他」を含む。前述の空間的に拡張された低屈折率結晶面を含み、「清浄な」表面を有するナノ結晶（すなわち、本明細書に記載の様々な実施態様により成長させた）の割合は、本発明の別の新規な特徴である。また、ナノ結晶懸濁液中で形成されるか又は存在する四面体及び/又は五角形両錐体の割合も、ユニークである。
【０１００】
１００ｎｍ未満の任意の所望の平均サイズの金ナノ結晶を提供することができる。治療のための最も望ましい結晶サイズ範囲は、主に１００ｎｍ未満、より一般的には５０ｎｍ未満、更により一般的には３０ｎｍ未満である平均結晶サイズ又は「モード（最頻サイズ）」（本明細書に開示された具体的な技術により測定及び決定され、「ＴＥＭ平均直径」として報告される）を有するものであり、本明細書に開示の多くの好適な実施態様において、ナノ結晶サイズ分布のモードは２１ｎｍ未満、更に好ましくは８〜１８ｎｍの範囲内である。
【０１０１】
目標のｐＨ範囲を有するか又は有するように調整される、治療のための生じる金ナノ結晶懸濁液を提供することができる。例えば、重炭酸ナトリウム処理促進剤を用いて、本明細書に詳細に開示された量で調製される場合、ｐＨ範囲は一般的には８〜９であり、これは必要に応じて調整することができる。
【０１０２】
形成されたナノ粒子又はナノ結晶上の表面の変化（すなわち、陽性又は陰性）の性質及び／又は量は、ナノ粒子／懸濁液又はコロイドの挙動及び／又は作用に大きな影響を与え得る。例えば、被験体でインビボで形成されるアルブミンコロナのようなタンパク質コロナは、ナノ粒子の表面荷電又は表面特性により影響を受けることがある。このような表面荷電は、一般的に「ゼータ電位」と呼ばれる。ゼータ電位（陽性又は陰性）が大きいほど、溶液中のナノ粒子の安定性が大きい（すなわち、懸濁液がより安定である）。形成されたナノ粒子又はナノ結晶の表面荷電の性質及び／又は量を制御することにより、このようなナノ粒子懸濁液の性能を制御することができる。
【０１０３】
ゼータ電位は、コロイド系の電子−動力学電位の尺度として知られおり、粒子上の表面荷電としても知られている。ゼータ電位は、流体の静止層と粒子が分散している流体との間に存在する電位差である。ゼータ電位はしばしば、ミリボルト（すなわちｍＶ）で測定される。約２０〜２５ｍＶのゼータ電位値は、ある分散した粒子が分散媒体中で安定であるかどうかを決定するために選択された任意の値である。すなわち、本明細書において「ゼータ電位」が参照される場合、参照されるゼータ電位は、２重層に存在する電荷の大きさの説明又は定量である。
【０１０４】
ゼータ電位は、電気泳動移動度からヘンリー式：
【数１】
2019108387.tif 000003
（ここで、Ｚはゼータ電位であり、ＵEは電気泳動移動度であり、εは解離定数であり、ηは粘度であり、ｆ（ｋａ）はヘンリー関数であり、スモルコフスキー近似ｆ（ｋａ）＝１．５）により算出される。
【０１０５】
本明細書に記載の方法に従って調製された金ナノ結晶のゼータ電位（「ＺＰ」）は、一般的には少なくとも−２０ｍＶ、より一般的には少なくとも約−３０ｍＶ、更により一般的には少なくとも約−４０ｍＶ、及び更により一般的には少なくとも約−５０ｍＶである。
【０１０６】
懸濁液は、本明細書の実施例１で説明されるＴＦＦ技術を使用して、より高いｐｐｍレベル（例えば、最大５，０００ｐｐｍ、しかしより一般的には最大３，０００ｐｐｍ）に濃縮することができる。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
被験体の治療に使用される金ナノ懸濁液「ＣＮＭ−Ａｕ８」の製造
【０１０８】
一般に、実施例２及び３中の治療目的で使用されるＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液は、濃縮されたＣＮＭ−Ａｕ８「ニート（生の）」ナノ懸濁液であり、ニート生成物は、図１、２Ｃ、及び３に一般的に示される装置に関連する本発明のいくつかの実施態様を利用することにより作成される。上記図中のすべての溝部材３０ａ’と３０ｂ’は、それぞれ１／８”（約３ｍｍ）厚のプレキシガラス、及び１／４”（約６ｍｍ）厚のポリカーボネートから作成された。支持構造３４（多くの図には示されていないが、図１に示される）もまた、約１／４”（約６〜７ｍｍ）厚のプレキシガラスから作成された。各溝部材３０ａ’は、溝部材３０ｂ’と一体になっていた。本明細書に記載の溝部材３０ａ’の断面の形は、図４Ｂに示される形に対応する（すなわち、台形の断面）。３０ａ’の関連する大きさは、約１．５”（約３．８２ｃｍ）である「Ｓ，Ｓ」、約２．５”（約６．３５ｃｍ）である「Ｍ」、約３／４”（約１．９ｃｍ）である「Ｍ」、及び約１／２”（約１．３ｃｍ）である「ｄ」である。
【０１０９】
各溝部材部分３０ｂ’は、図４Ａに対応する断面の形を有した。溝部材部分３０ｂ’の関連する大きさは、表１に「Ｍ」（すなわち、入り口の溝と溝部材３０ｂ’の正確な部分との内側の幅）、「ＬT」（すなわち、溝部材３０ｂ’の横断長さ又はフロー長さ）、「Ｓ」（すなわち、溝部材３０ｂ’の高さ）、及び”ｄ””（すなわち、溝部材３０ｂ’内の液体３”の深さ）として報告されている。溝３０ｂ’の各側壁部分の厚さもまた、約１／４”（約６ｍｍ）厚である。
【０１１０】
溝部材３０ａ’中への投入物として使用される（すなわち、処理促進剤ＮａＨＣＯ３と組合せて使用される）水３は、脱イオン化法により生成された（本明細書において脱イオン水と称する）。混合床脱イオン化フィルターが使用された。脱イオン化処理後の総溶解溶媒（「ＴＤＳ」）は、Accumet（登録商標）AR20ｐＨ／伝導度計により測定すると、約０．２ｐｐｍであった。
【０１１１】
【表１−１】
2019108387.tif 000004
【表１−２】
2019108387.tif 000005
【０１１２】
表１は、精製水に加えられた処理促進剤（ＰＥ）（ＮａＨＣＯ3）の量が約０．５４ｍｇ／ｍｌであったことを示す。この処理促進剤の他の量も、本発明の好適な実施態様の範囲内で機能すると理解すべきである。精製水／ＮａＨＣＯ3混合物は、溝部材３０ａ’への液体３投入物として使用された。溝部材３０ａ’（ここで、プラズマ４が生成される）中の液体３’の深さ「ｄ’」は、溝部材３０ａ’に沿う種々のポイントで約７／１６”〜約１／２”（約１１ｍｍ〜約１３ｍｍ）であった。深さ「ｄ’」は、ダム８０の使用を通して部分的に制御された（図１に示される）。特にダム８０は、溝部材３０ａ’の出力端３２の近くに設置され、深さ「ｄ’」（図４Ｂにおいて「ｄ」として示される）を、約７／６”〜約１／２”（約１１〜１３ｍｍ）の深さに作成することを助けた。ダム８０の高さは約１／４”（約６ｍｍ）であると測定され、縦の長さは約１／２”（約１３ｍｍ）であると測定された。幅は完全に、溝部材３０ａ’の底の大きさ「Ｒ」を超えるものであった。従って、その運転中の溝部材３０ａ’中の液体３’の総量は、約２．１４ｍ3（約３５ｍｌ）〜約０．８９ｍ3（約１４．５８ｍｌ）であった。
【０１１３】
溝部材３０ａ’ならびに溝部材３０ｂ’への液体３’の流速は、約２１５ｍｌ／分であり、ポイント３２での溝部材３０ｂ’の外への流速は約２１５ｍｌ／分であった。他の許容される流速は、好適な金ナノ結晶懸濁液を製造する範囲内で考慮すべきである。
【０１１４】
このような液体３’の流れは、定格が０．１馬力、１０〜６００ｒｐｍのMasterflex（登録商標）L/S pump drive 40を使用して得られた。Masterflex（登録商標）L/S pump drive 40のモデル番号は、７５２３−８０であった。このポンプドライブは、Easy-Load Model No. 77201-60として知られているMasterflex（登録商標）により作製されたポンプヘッドを有した。一般的に、ポンプ４０のヘッドはペリスタヘッドとして知られている。このポンプの正確な設定は、２１５ｍｌ／分であった。直径１／４”（すなわち、サイズ０６４１９−２５）のTygon（登録商標）チューブを、ペリスタヘッドに入れた。このチューブは、Saint Gobain for Masterflex（登録商標）により作製された。チューブの一端を、溝部材３０’ａの第１の端３１につないだ。
【０１１５】
表１は、単一の電極セット１ａ／５ａがあったことを示す。各電極セット１／５の電源は、ＡＣ変圧器６０であった。特に図５Ａは、変圧器６０に接続されたＡＣ電源６２を示す。更に、例えば回路の損失率が調整できるように、コンデンサ６１が備えられた。変圧器６０の出力は、制御装置２０を介して電極１／５に接続された。実施例１の装置とともに使用される好適な変圧器は、１次コイル６０１中を流れる交流を使用して、磁束を容易に伝達するコア６０２中の交流磁束を確立するものである。
【０１１６】
２次コイル６０３を１次コイル６０１とコア６０２の近くに置いた場合、この磁束は、２次コイル６０３を１次コイル６０１に連結させる。２次コイル６０３のこの連結は、２次端子の両端に電圧を誘導する。２次端子の電圧の大きさは、２次コイル巻数と１次コイル巻数との比に正比例する。１次コイル６０１より２次コイル６０３の巻数が多いほど、電圧の上昇が大きく、巻数が少ないほど、電圧の低下を招く。
【０１１７】
本明細書に記載の操作で使用される好適な変圧器６０は、変圧器６０中の磁気分路の使用により可能になった意図的に低い出力電圧制御を有する。これらの変圧器６０は、ネオンサイン変圧器として知られている。この構成は、電極１／５への電流を制限する。出力負荷電圧の変化が大きいと、変圧器６０は出力負荷電流を比較的狭い範囲に維持する。
【０１１８】
変圧器６０は、２次開回路電圧と２次短絡電流により定格される。開回路電圧（ＯＣＶ）は、電気的な接続が存在しない場合のみ、変圧器６０の出力端子に現れる。同様に、短絡がこれらの端子にわたって置かれる場合（この場合、出力電圧はゼロに等しい）、短絡電流が出力端子からの引かれるのみである。しかし、これらの同じ端子間に負荷が接続されている場合、変圧器６０の出力電圧は、ゼロと定格ＯＣＶとの間のどこかに収まるはずである。実際、変圧器６０が適切に装填されている場合、その電圧は定格ＯＣＶの約半分であろう。
【０１１９】
変圧器６０は、平衡中点基準デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design）として知られている（例えば、以前は平衡中点接地としても知られていた）。これは、最も一般的には、中圧〜高圧定格の変圧器中、及びほとんど６０ｍＡの変圧器で見いだされる。これは「中点戻し配線（mid-point return wired）」システムで許容できる唯一のタイプの変圧器である。「平衡」変圧器６０は、１つの１次コイル６０１と、１次コイル６０１の両側に１つずつ２つの２次コイル６０３を有する（図５Ｂの略図に一般的に示される）。多くの点でこの変圧器６０は、２つの変圧器のように機能する。不平衡中点基準コア及びコイルのように、各２次コイル６０３の一端はコア６０２に結合され、続いて変圧器筐体に結合され、各２次コイル６０３の他端は、出力リード又は端子に結合されている。すなわち、コネクタ無しで、このタイプの無負荷１５，０００ボルト変圧器は、各２次端子から変圧器エンクロージャまで約７，５００ボルトであるが、２つの出力端子間では約１５，０００ボルトであろう。
【０１２０】
ライン力率１（又は１００％）を有する交流（ＡＣ）回路では、電圧と電流はそれぞれ０から始まり、頂点まで上昇し、ゼロまで降下し、負の頂点まで行き、再度ゼロに戻る。これで典型的な正弦波の１サイクルを完了する。典型的な米国出願では、これが毎秒６０回発生する。すなわち、このような電圧又は電流は、特徴的な毎秒６０サイクルの「周波数」（又は６０ヘルツ）の出力を有する。力率は、電流波形に対する電圧波形の位置に関係する。両方の波形が共にゼロを通過し、その頂点が一緒であるとき、それらは同相であり、力率は１、すなわち１００％である。図５Ｃは、互いに同相であり、１すなわち１００％の力率を有する２つの波形「Ｖ」（電圧）及び「Ｃ」（電流）を示し、一方、図５Ｄは、互いに位相がずれており、約６０％の力率を有する２つの波形「Ｖ」（電圧）及び「Ｃ」（電流）を示し、両方の波形は、同時にゼロを通過しない。この波形は位相外れであり、その力率は１００％未満である。
【０１２１】
ほとんどのそのような変圧器６０の通常の力率は、磁気シャント６０４と２次コイル６０３の影響によるところが大きく、これらは、変圧器６０回路の出力にインダクタを効果的に追加して、電極１／５への電流を制限する。入力電圧波と電流波とをより同期させる変圧器６０の１次コイル６０１の両端に置いたコンデンサ６１を使用することにより、力率をより高い力率に向上させることができる。
【０１２２】
本発明で使用される任意の変圧器６０の無負荷電圧は、その内部構造とともに重要である。本発明での使用に望ましい無負荷変圧器は、約９，０００ボルト、１０，０００ボルト、１２，０００ボルト、１５，０００ボルトのものを含む。しかしこれらの特定の無負荷電圧変圧器測定は、追加の実施態様として許容可能な範囲の電源を限定するものとみなすべきではない。本明細書に記載の操作で使用される特定の望ましい変圧器は、Franceformer製（カタログ番号９０６０−ＰＥ）であり、１次１２０ボルト、６０Ｈｚ、２次９，０００ボルト、６０ｍＡで動作する。
【０１２３】
従って変圧器６０は、同じ変圧器でも又は異なる変圧器（ならびに異なる極性）でもよい。変圧器、力率、コンデンサ６１、極性、電極のデザイン、電極の位置、電極組成、溝部材３０ａ’の断面形状、ローカル又はグローバルの電極組成、雰囲気、ローカル又はグローバルな液体３の流速、液体３’のローカル成分、溝部材３０ａ’中の種々の流体に局所的に供された液体３’の容量、隣接する（例えば、上流と下流の両方）電極セット、局所的電界濃度、溝部材で使用される任意の膜の使用及び／又は位置及び／又は組成などはすべて、処理条件だけでなく、本明細書に開示された種々の実施態様に従って作製される液体３’、ナノ結晶、及びナノ結晶／懸濁液又はコロイド中で製造される成分の組成及び／又は容量に影響を与える因子である。従って、本明細書の詳細な開示に従って、多数の実施態様を実施することができる。
【０１２４】
図６に示される電極と同様の形の電極１を用いて、プラズマ４が作製され、重さは約９．２グラムであった。この電極は、９９．９９５％（４Ｎ５）純粋な金であった。他の電極５ａは、約１ｍｍ厚の金ワイア（９９．９９５％）であり、約９ｍｍが液体３’中に沈んでいる。
【０１２５】
図２Ａ及び図２Ｃに示すように、溝部材３０ａ’からの出力は、調整液体３’であり、この調整液体３’は、直接第２の溝部材３０ｂ’中に流入した。図２Ａ、２Ｃ、及び３に示した第２の溝部材３０ｂ’は、表１に報告した測定値を有した。この溝部材３０ｂ’は、約８８５ｍｌの液体３’を含有した。表１は、図７と３に示されるような電極構成を報告し、これは、７セットの電極５／５’（図７に示される）が、図３に示されるように配置されたことを意味する（すなわち、液体３’の流れ方向に対して垂直）。各電極セット５／５’は、表１に報告されたように、直径約１．０ｍｍの９９．９９％純粋な金ワイアを含有した。液体３’と接触していた各ワイア電極５の長さ（表１で「ＷL」と報告される）は、約１”（約２５．４ｍｍ）であった。他の構成は、本開示の範囲内に適合する。
【０１２６】
図８に示されたＡＣ電源（又は変圧器）５０１ＡＣは、電源として使用された。この変圧器５０１ＡＣは、ＡＣ電圧範囲が０〜３００Ｖ、周波数範囲が１５〜１０００Ｈｚ、及び最大出力定格が約２ｋＶＡを有する交流電源（Chroma 61604）であった。図２Ａ、２Ｃ、及び３について、それぞれ独立した電極（例えば、セット２、セット３〜セット８、又はＳｅｔ９）は、図２Ａに示されるように電源５０１ＡＣに電気的に接続されていた。特に、電源５０１ＡＣは、図２Ａに示される配線図によれば、各電極セットに電気的に接続された。
【０１２７】
表１は、「セット＃」（例えば、「セット１」〜「セット８」）による電極セットのそれぞれを指す。１／５又は５／５電極セットの各電極は、特定の電圧で動作するように設定された。表１に列記された電圧は、各電極セットについて使用される電圧である。各電極の中心線から隣接する電極セットへの距離「ＣＣ」（図９を参照して）も報告されている。更に、使用される各電極１に関連した距離「Ｘ」も報告されている。電極５については、距離「Ｘ」は報告されていない。他の関連パラメータも表１に報告されている。電極１／５のためのすべての材料は、23 Lewis Street, Fort Erie, Ontario, Canada, L2A 2P6の住所を有するHi-Relから入手した。図２Ａ、図２Ｃ、及び図３を参照すると、各電極５／５’は最初に、液体３’と接触させて、単に雌レシーバ管Ｏ５に入るようにした。一定の処理時間の後、金金属は、例えば金ナノ粒子が形成される電流密度及び／又は速度を変化させた、電極５を薄くする（すなわち、直径が小さくなる）ことを引き起こした各ワイヤ電極５から、除去された。従って、電極５は雌レシーバーチューブＯ５に向かって移動させ、その結果、その上面部で液体３’に入る新鮮な厚い電極５が得られた。本質的に、ある量の処理時間が経過後に、電極５上に浸食プロファイル又はテーパリング効果が形成され（すなわち、液体３’の表面付近のワイヤの部分は、一般的には雌レシーバチューブＯ５に近い部分よりも厚かった）、そのようなワイヤ電極プロフィール又はテーパリングは製造プロセス中、所望であれば、基本的に一定に維持することができ、従って処理実験中に初期の予備平衡段階後の任意の時点で、本質的に同一の生成物が得られ、例えば、プロセスが現在のＦＤＡガイドラインの下でのｃＧＭＰ準拠、及び／又は同様にＩＳＯ９０００に準拠することを可能にした。
【０１２８】
電極５／５は、８時間あたり約１インチの速度で作動又は移動させた。試料は、平衡相からのみ回収した。例えば、濃度が平衡状態（例えば、装置内の実質的に一定の核生成及び成長状態）（平衡状態は、本明細書に開示された制御プロセスのために、処理の残りの時間中実質的に一定に維持される）に達するまで、液体３’中で製造されるナノ結晶の濃度は時間の関数として上昇するため、予備平衡相が起きる。予備平衡相は、約３０分間持続し、約１．７ガロンを生成する。
【０１２９】
８個の電極セット１／５及び５／５はすべて、２０ｇを介して制御装置２０に接続され、２０ｇは各電極セット中の各電極１／５及び５／５の高さを自動的に調整した。２つの雌レシーバチューブｏ５ａ／ｏ５ａ〜ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’は、溝部材３０ｂ’の底部に接続して、各電極セット５／５中の電極が、所望の場合及び所望であるなら、除去可能な形で各雌レシーバチューブo５に挿入するできるようにした。各雌レシーバーチューブo５はポリカーボネート製で、約１／８インチ（約３．２ｍｍ）の内径を有しており、溶剤接着剤を用いて溝部材３０ｂ’の底部に所定の位置にきちんと固定した。溝部材３０ｂ’の底部の穴は、チューブo５の一端が溝３０ｂ’の底部の表面と同一平面となるように、各チューブo５の外径がその中に固定されることを可能にした。チューブｏ５の底部は密封される。チューブｏ５の内径は、多量の液体３’が雌レシーバーチューブｏ５に入ることを有効に防止した。しかし、一部の液体は、１つ又はそれ以上の雌レシーバチューブo５の内部に流入することがある。各雌レシーバーチューブo５の長さや垂直方向の高さは約６インチ（約１５．２４ｃｍ）であるが、より短い又はより長い長さも本開示の範囲内に収まる。更に雌レシーバチューブo５はその後真っ直ぐであるとして示されているが、そのようなチューブは、溝部材３０ｂ’から離れた開口部が、所望であれば、液体３’の上面の上にあるように、Ｊ字状又はＵ字状に湾曲させることができるであろう。
【０１３０】
本明細書中に記載の実験は、以下の処理促進剤を利用した。具体的には、約２．０４ｇ／ガロン（すなわち、約０．５４ｇ／リットル）の炭酸水素ナトリウム（「ソーダ」）（化学式ＮａＨＣＯ3を有する）を水３に加え混合した。ソーダは、Alfa Aesarから入手し、ソーダは８４．０１の式量と約２．１５９ｇ／ｃｍ3の密度を有した。
【０１３１】
具体的には、６０Ｈｚの正弦波交流の周波数を使用して、本明細書の教示に従って金ナノ結晶懸濁液を作成した。ＡＣ電源５０１ＡＣは、Chroma 61604プログラマブル交流電源を利用した。印加電圧は約２２０ボルトであった。印加電流は、約６アンペアと約６．５アンペアの間であった。
【０１３２】
表１は、図１、２Ａ、及び２Ｃとともに使用される処理パラメータをまとめたものである。また、表１は：１）「製造されたＡｕ  ＰＰＭ」（例えば、金ナノ結晶の濃度）；２）「ＴＥＭ平均直径」、これは、ＴＥＭ分析により測定される、最も頻繁に発生する金ナノ結晶の直径に対応するモードである；３）「流体力学的半径」、これはZetasizer ZS-90により測定される、を開示する。これらの物理的性状解析は、本明細書の他の箇所で説明されるように行われた。
【０１３３】
透過型電子顕微鏡
具体的には、２００メッシュサイズを有するカーボンで安定化したFormyar被覆グリッドを使用して、ＴＥＭ試料を調製した。グリッドはまず、真空下のプラズマ処理により前処理した。グリッドを、長方形の濾紙片で裏打ちされた顕微鏡スライド上に置き、次に、必要なプラズマ発生器アクセサリーが設置されたDenton Vacuum装置に入れた。真空は７５ｍＴｏｒｒで維持し、プラズマを開始し、約３０秒間運転した。終了後、システムに通気し、グリッドを除去した。湿度条件により、グリッドは最大７〜１０日間安定であったが、すべての例で１２時間以内に使用した。
【０１３４】
約１μＬのＣＮＭ−Ａｕ８ナノ結晶懸濁液をグリッド上に置き、室温で２０〜３０分間空気乾燥させたか、又は小液滴が蒸発するまで乾燥した。完全に蒸発後、ＴＥＭ分析が行われるまで、グリッドをホルダープレートの上にのせた。
【０１３５】
Philips/FEI Tecnai 12透過型電子顕微鏡を使用して、すべての調製された試料を調べた。装置は１００ｋｅＶの加速電圧で運転した。ビームの位置合わせ後、最大６３０，０００×を含む種々の倍率で試料を観察した。カメラとＴＥＭ装置を制御するそれぞれiTEM及びTecnal Userインターフェースソフトウェアを備えたＰＣに直接画像を伝えるOlympus Megaview III側に取り付けたカメラを使用して、画像を収集した。
【０１３６】
図１０Ａは、本明細書の上記の手順に従って生成した乾燥ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液に対応する金ナノ結晶の、代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示す。図１０Ｂは、ＴＥＭ平均直径を計算するために使用された、測定されたＴＥＭサイズ分布に対応し、表１に参照される。
【０１３７】
ｐＨ測定
ｐＨ測定はAccume（登録商標）AR20  ｐＨ／伝導度計を用いて行い、ここで、ｐＨプローブは、目的の試料を含む５０ｍＬのバイアルに入れ、安定化させた。３つの別々のｐＨ測定値を取り、試料ごとに平均した。ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液の測定されたｐＨは、約９．０８であった。
【０１３８】
紫外可視分光法
ＵＶ−ＶＩＳ分光法を用いて、試料のエネルギー吸収スペクトルを得た。この情報は、ダブルビームCzerny-Turnerモノクロメータシステムとデュアルシリコンフォトダイオードを搭載したThermofisher Evolution 201 紫外可視分光計を使用して取得された。装置は、いくつかの溶融石英製試料ホルダー又は「キュベット」の１つを使用して、低濃度液体試料の測定を支持するように提供された。データは、約３００〜９００ｎｍの間の波長範囲にわたって、次のパラメータ（１ｎｍでの帯域幅、０．５ｎｍのデータピッチ）を使用して取得された：バンド幅１ｎｍ、データピッチ０．５ｎｍ。キセノンフラッシュランプが一次エネルギー源であった。分光計の光路は、エネルギービームが各試料キュベットの中心を通過することを可能にするように構成された。試料調製は、キュベットを充填及びキャッピングし、次に分光計の完全に囲まれた試料コンパートメント内で、キュベットホルダー中に物理的に試料を置くことに限定された。各試料のエネルギーの光吸収が測定された。データ出力を測定し、吸光度単位（ランベルト・ベールの法則による）対波長として表示された。
【０１３９】
図１０Ｃは、約３５０ｎｍ〜９００ｎｍの波長範囲についての、ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液のための紫外可視スペクトルパターンを示す。
【０１４０】
動的光散乱ゼータサイザー
ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液の動的光散乱（ＤＬＳ）測定は、Zetasizer Nano ZS-90 DLS装置で実施した。ＤＬＳでは、レーザ光が、小さな粒子及び／又はナノ結晶周りの組織化水構造体（波長よりも小さい）に当たると、光はすべての方向に散乱して、散乱強度の時間依存性変動をもたらす。強度の変動は、散乱粒子／水構造体の組み合わせのブラウン運動に起因し、結晶サイズ分布についての情報を含む。
【０１４１】
装置は、実験前に少なくとも３０分間温めた。測定は、１ｃｍ経路長の四角いガラスセル、ＰＣＳ８５０１を用いて行った。以下の手順を使用した。
【０１４２】
１．  まず、ＤＩ水１ｍｌを、１ｍｌマイクロピペットを用いてセルに添加した後、水をセルから廃棄ビーカーに注ぎ、残りの水をセル測定キャビティから振り落とした。この工程を更に２回繰り返して、セルを完全にリンスした。
【０１４３】
２．  試料１ｍｌを、１ｍｌマイクロピペットを用いてセルに添加した。その後、同じピペットで同じピペットチップを使用して、全ての液体をセルから取り出し、廃棄ビーカーに捨てた。再度、同じチップを使用して、試料１ｍｌを加えた。
【０１４４】
３．  試料を有するセルを、刻まれた文字を前方に向けて、ゼータサイザー装置の温度制御されたセルブロックに入れた。ゼータサイザーソフトウェア中の新しい実験を開いた。温度が平衡化し、レーザー出力が適切な値まで減衰した１分後に測定を開始した。すべての実験が終わった後に、結果が保存された。
【０１４５】
４．  セルを装置から取り出し、工程２で使用したものと同じピペットとチップとを使用して、セルから試料を取り出した。
【０１４６】
５．  各試料について、工程２〜４を更に２回繰り返した。
【０１４７】
６．  新しい試料について、前の試料との汚染を避けるために１ｍｌピペットの新しいピペットチップを取り出し、工程１〜５を繰り返した。
【０１４８】
データ収集及び処理は、ゼータサイザーソフトウェア、バージョン６．２０を用いて行なった。すべての実験について以下のパラメータを使用した：実験時間−２ｏ；実験−１０；溶媒−水、０ｍｍｏｌ；粘度−０．８８７２ｃＰ；屈折率−１．３３３；ブロック温度−  ＋２５℃。各実験のデータを保存した後、結果はソフトウェアの「Records View」ページで見た。粒度分布（すなわち、流体力学的半径）は、「Intensity PSD」グラフで分析した。動的光散乱法を使用して、この手順に従って製造された結晶の大きさの指標（例えば、流体力学的半径）を得た。流体力学的半径は、表１に１９．４３ｎｍとして報告されている。更に、ニートＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液の測定されたゼータ電位は−４２．９ｍＶであった。
【０１４９】
原子吸光分光法
ＡＡＳ値は、Perkin Elmer AAnalyst 400分光計システムから得られた。原子吸光分光法は、「ｐｐｍ」（百万分率）で報告される化学種の濃度を決定するために使用される。
【０１５０】
Ｉ）原理
フレーム原子吸光分析の技術は、液体試料が吸引され、エアロゾル化され、アセチレンや空気のような可燃性ガスと混合されることを必要とする。この混合物は、約２１００〜約２４００℃の温度範囲の炎の中で点火される、燃焼中、試料中の目的の元素の原子は、自由な非励起基底状態の原子に還元され、これは特徴的な波長で光を吸収する。この特徴的な波長は元素固有であり、０．０１〜０．１ｎｍまで正確である。元素固有の波長を提供するために、その陰極が測定される元素から作製されている中空陰極ランプ（ＨＣＬ）からの光線は、炎内を通過させる。光検出器は、分析対象物の吸収による光強度の減少量を検出する。バックグランドの周辺光を低減し、検出に必要なＨＣＬから特定の波長を選択するために、光検出器の前にモノクロメータが使用される。更に、重水素アークランプは、原子雲中の非原子種に起因するバックグラウンド吸光度を補正する。
【０１５１】
ＩＩ）試料調製
試料１０ｍＬ、３６％ｖ／ｖ塩酸０．６ｍｌ、及び５０％ｖ／ｖ硝酸０．１５ｍＬをガラスバイアル中で一緒に混合し、７０℃の水浴中で約１０分間インキュベートする。懸濁液中の金濃度が１０ｐｐｍ超であること予測される場合、最終の金濃度を１〜１０ｐｐｍ範囲にするために酸を添加する前に、試料をＤＩ水で希釈する。例えば、約１００ｐｐｍの金濃度について、酸を添加する前に、０．５ｍＬの試料をＤＩ水９．５ｍＬで希釈する。アリコートは調整可能なマイクロピペットで行われ、試料、ＤＩ水、及び酸の正確な量は、Ohaus PA313微量天秤によって測定される。成分の重量は、ＤＩ水及び酸による希釈のために測定された濃度を補正するために使用される。
【０１５２】
各試料を三重で調製し、水浴中でのインキュベーション後、室温まで冷却してから測定が行われる。
【０１５３】
ＩＩＩ）装置のセットアップ
以下の設定は、Perkin Elmer AAnalyst 400分光計システムに使用される。
ａ）バーナーヘッド：１０ｃｍシングルスロットタイプ、製造手順に従って三軸で位置合わせをして、２ｐｐｍの銅標準物質で最大吸光度を得る。
ｂ）ネブライザー：インパクトビーズの前にスペーサーを有するプラスチック。
ｃ）ガス流量：酸化剤（空気）流速は約１２Ｌ／分、燃料（アセチレン）流速は約１．９ｍＬ／分。
ｄ）ランプ／モノクロメーター：Ａｕの中空陰極ランプ、１０ｍＡの動作電流、１．８／１．３５ｍｍスリット、２４２．８ｎｍの波長、バックグラウンド補正（重水素ランプ）はオン。
【０１５４】
ＩＶ）分析手順
ａ）Ａｕランプと炎を約３０分間点灯して、システムをウォームアップする。
ｂ）３．７％ｖ／ｖの塩酸マトリックス中の１ｐｐｍ、４ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍのＡｕ標準物質を用いて、装置を較正する。３．７％ｖ／ｖの塩酸をブランクとして使用する。
ｃ）試料として４ｐｐｍ標準物質を測定することにより、校正スケールを確認する。測定された濃度は、３．８８ｐｐｍ及び４．１２ｐｐｍの間でなければならない。その範囲外の場合は、工程ｂ）を繰り返す。
ｄ）試料の３つのレプリカを測定する。レプリカ間の標準偏差が５％よりも高い場合には測定を繰り返し、そうでない場合は次の試料に進む。
ｅ）６つの試料を測定した後、又はそれより頻繁に、検証工程ｃ）を実行する。検証が失敗した場合は、工程ｂ）及びｃ）を実行し、最後に成功した検証の後に測定されたすべての試料を再測定する。
【０１５５】
Ｖ）データ分析
各レプリカの測定濃度値は、水及び酸による希釈について補正し、実際の試料濃度を計算する。報告されたＡｕのｐｐｍ値は、個々のレプリカについての３つの補正された値の平均値である。
【０１５６】
表１は、ＡＡＳ濃度結果を「製造されたＡｕ  ＰＰＭ」として参照し、約７．２ｐｐｍの対応する値を有する。
【０１５７】
接線流濾過（ＴＦＦ）
実施例２及び３で使用するためのニートＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁物中で製造された金ナノ結晶の濃度を上昇させるために、接線流濾過（ＴＦＦ）プロセスを使用した。ＴＦＦプロセス中の濃度は圧力駆動分離プロセスであり、膜を使用して、懸濁液中のナノ結晶から、懸濁液を含む液体を優先的に除去する。すなわち、ＴＦＦプロセスは、膜の片側の液体中で比較的高濃度の金ナノ結晶を与える。ＴＦＦプロセスでは、ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液を膜の表面に沿って、接線方向にポンピングされる。単純なＴＦＦシステムの概略を図１１に示す。
【０１５８】
供給タンク１００１は、ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液をフィードポンプ１００２と濾過モジュール１００３に提供した。濾液流１００４を廃棄した。保持液は、保持液バルブ１００５を介して迂回し、１００６として供給タンク１００１に戻した。濾過モジュール１００３内の膜の表面上の懸濁液の各パスの間に、適用される圧力は、懸濁液を含む液体の一部を、強制的に膜中を通して濾液流１００４に送った。金ナノ結晶は大きすぎて膜を通過できず、従って上流に保持され、接線流により保持液１００６に掃引された。高濃度の金ナノ結晶を有する保持液は、供給タンク１００１に戻された。ダイアフィルトレーション緩衝液が供給タンクに添加されない場合、供給タンク１００１内の液体の体積は、除去される濾液の量（すなわち、液体）だけ減少し、金ナノ結晶は懸濁液中で濃縮された。
【０１５９】
この例では、５ｋＤａ及び１０ｋＤａのＭＷＣＯセルロース膜を有するMillipore Pellicon XLカセットが使用された。保持液圧は、保持液バルブ１００５により４０ＰＳＩに設定された。１０ｋＤａ膜は、同じ膜貫通圧力下で、５ｋＤａ膜に対して約４倍高い濾液流速（これはより大きな細孔サイズについて予測される）を可能にした。同時に、１０ｋＤａの膜の細孔は、すべての形成された金ナノ結晶を保持液中に保持するのに充分に小さく、従ってＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液中で金ナノ結晶を濃縮した。ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液をＴＦＦシステム中を通過させた後、ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液中の懸濁金ナノ結晶の所望の濃度が達成され、約７．２ｐｐｍから約５１ｐｐｍ（実施例２の場合）に上昇し、ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液中の懸濁金ナノ結晶の濃度は、約７．２ｐｐｍから約５０ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍ（実施例３で使用される２つの異なるナノ懸濁液の場合）に上昇した。
【０１６０】
濃縮ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ結晶懸濁液を流体力学半径とゼータ電位の両方について性状解析して、濃縮工程がいずれかの値に影響を与えたかどうかを調べた。実施例２の懸濁液について、濃縮されたＣＮＭ−Ａｕ８（５１ｐｐｍ）ナノ懸濁液の測定されたゼータ電位は約−４５．５ｍＶであり、測定された流体力学半径は約１８ｎｍであった。実施例３の懸濁液について、濃縮されたＣＮＭ−Ａｕ８（５０ｐｐｍ）ナノ懸濁液の測定ゼータ電位は約−４３．６ｍＶであり、測定された流体力学半径は約１８．６ｎｍであった。そして濃縮されたＣＮＭ−Ａｕ８（１０００ｐｐｍ）ナノ懸濁液の測定されたゼータ電位は約−４７．２ｍＶであり、測定された流体力学半径は約２０．１ｎｍであった。従って、濃縮工程は、これらの重要な物理的性状解析パラメータのいずれにも悪影響を及ぼさなかった。
【０１６１】
ニートＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液の詳細な製造方法と詳細な物理的性状解析は、２０１３年１０月３日に公開され、標題「Novel Gold-Based Nanocrystals for Medical Treatments and Electrochemical Manufacturing Processes Therefor」の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４１４２７号に見られる（この全主題は参照のためその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１６２】
治療として金（好ましくはＣＮＭ−Ａｕ８）ナノ懸濁液を使用する方法
本発明の１つの実施態様は、脱ミエリン化又はミエリン機能不全を予防する方法、及び／又はＣＮＳニューロン及び／又はＰＮＳニューロンを含むニューロンのミエリン化又は再ミエリン化を促進するための方法、を提供する。本発明の方法の目的のために、金元素の結晶ナノ懸濁液は、ＣＮＳミエリン化の阻害を軽減するか、及び／又はＣＮＳニューロン細胞の生存を促進するか、及び／又は一部のアンタゴニストの発現を低減又は阻害することができる。好適な実施態様において、実施例１のＣＮＭ−Ａｕ８ナノ結晶懸濁液は、このような方法で使用される。
【０１６３】
本発明のさらなる実施態様は、哺乳動物のニューロン（ＣＮＳニューロンを含む）のミエリン化を促進する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、元素金結晶ナノ懸濁液を含む組成物の有効量（治療的又は予防的のいずれか）を投与することを含む方法を含む。好適な実施態様において、実施例１のＣＮＭ−Ａｕ８ナノ結晶懸濁液は、このような方法で使用される。
【０１６４】
本発明のさらなる実施態様は、ミエリン機能不全又は脱ミエリン化に関連する疾患、障害、病的状態、及び／又は傷害に罹患している動物（例えば哺乳動物）において、このような状態を治療する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、金結晶ナノ懸濁液の治療有効量を投与することから基本的になるか、又は投与することからなる方法を提供し、好適な実施態様において、実施例１のＣＮＭ−Ａｕ８ナノ結晶懸濁液が使用される。
【０１６５】
本発明の他の実施態様は、金結晶ナノ懸濁液の有効量を投与することを含む、それを必要とする哺乳動物におけるＣＮＳニューロン及び／又はＰＮＳニューロンの生存を促進するための方法を含む。好適な実施態様において、実施例１のＣＮＭ−Ａｕ８ナノ結晶懸濁液は、このような方法で使用される。
【０１６６】
本発明のさらなる実施態様は、哺乳動物における乏突起神経膠細胞分化を促進する方法であって、それが必要な哺乳動物に、金結晶ナノ懸濁液を含む組成物の有効量を投与することを含む方法を含む。好適な実施態様において、実施例１のＣＮＭ−Ａｕ８ナノ結晶懸濁液は、このような方法で使用される。
【０１６７】
本発明のさらなる実施態様は、有効量の金ナノ結晶懸濁液の提供の欠如に対して、破損ミエリン、脱ミエリン化、又はミエリン機能不全の発現を低減又は阻害する方法であって、有効量（予防的及び治療的に）の金ナノ結晶懸濁液を含む組成物を用いてニューロン（ＣＮＳ及び／又はＰＮＳ）のミエリン化を修飾することを含む方法を含む。好適な実施態様において、実施例１のＣＮＭ−Ａｕ８ナノ結晶懸濁液は、このような方法で使用される。
【０１６８】
本発明のさらなる実施態様は、実施例１のＣＮＭ−Ａｕ８ナノ結晶懸濁液の有効量の提供の非存在下で、ミエリン損傷に関連する望ましくない病理学的事象を阻害又は低減するための方法であって、その必要がある被験体に、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液を含む組成物を提供することを含む方法を含む。
【０１６９】
本発明の治療法において、ナノ懸濁液、好ましくはＣＮＭ−Ａｕ８ナノ結晶懸濁液は、経口投与、注射、及び／又は鼻を介して投与することができる。
【０１７０】
いくつかの実施態様において、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液は、ボーラス注射又は長期注入によって投与することができる。いくつかの実施態様において、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液は、例えば髄腔内又は硬膜外配置により、中枢神経系に直接投与することもできる。いくつかの実施態様において、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液は、ミエリン損傷が発現される慢性病巣に直接投与することもできる。いくつかの実施態様において、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液は、哺乳動物の血流に直接投与することもできる。
【０１７１】
本発明のある実施形態において、金ナノ懸濁液、好ましくはＣＮＭ−Ａｕ８の非結晶性懸濁液は、進行性核上麻痺、アレキサンダー病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、カナヴァン病、白質ジストロフィー、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊（Central Pontine Myelolysis：ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、ツェルウェーガー症候群、ギラン・バレー症候群（Guillain-Barre Syndrome：ＧＢＳ）、ファンデルナープ症候群、慢性炎症脱ミエリン化多発ニューロパシー（chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy：ＣＩＤＰ）、多巣性運動ニューロパシー（multifocal motor neuropathy：ＭＭＮ）、視神経脊髄炎（Neuromyelitis Optica：ＮＭＯ）、進行性多巣性白質脳症（Progressive Multifocal Leukoencephalopathy：ＰＭＬ）、ウォラー変性、並びに一部の遺伝病、例えば副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、軽度認知障害（ＭＣＩ）（年齢関連軽度認知症としても知られている）、及びペリツェウス・メルツバッハー病（Pelizaeus Merzbacher Disease：ＰＭＺ）を含む疾患の治療法として投与される。金ナノ結晶懸濁液は、ミエリン化機能不全、脱ミエリン化をもたらす損傷性事象の能力を、及び／又はミエリン化及び／又はニューロンの生存を負に制御し、及び／又は良好なミエリン（例えば、再ミエリン化）又は良好なミエリン／軸索相互作用の発現を上昇させる事象の能力を、停止、低減、防止、又は阻害する治療薬として、調製し、使用することができる。
【０１７２】
本発明の１つの実施態様は、被験体における、ミエリン機能不全又は脱ミエリン化（例えば、そのような疾患に罹患している被験体における視神経脊髄炎）に関連する疾患、障害又は傷害を治療する方法であって、被験体に治療有効量の金ナノ懸濁液、及び好適な実施態様においてＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液を、濃度、容量、及び／又は投与頻度を変化させて臨床効果を得るための用量設定により、投与することから基本的になるか、又は投与することからなる方法を提供する。
【０１７３】
更に本発明は、哺乳動物のニューロンのミエリン化（再ミエリン化を含む）を促進する方法であって、有効量（治療的及び予防的に）の金ナノ懸濁液、及び好ましくはＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液を投与することから基本的になるか、又は投与することからなる方法に関する。
【０１７４】
本発明のさらなる実施態様は、乏突起神経膠細胞の死滅又は分化の欠如に関連する疾患、障害、又は傷害、例えば視神経脊髄炎、ペリツェウス・メルツバッハー病、又は球様セル白質ジストロフィー（クラッベ病）に罹患している動物において、そのような疾患を治療する方法であって、有効量の金ナノ懸濁液、及び好適な実施態様においてＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液を投与することから基本的になるか、又は投与することからなる方法に関する。
【０１７５】
本発明の別の形態は、治療有効量の金ナノ懸濁液、及び好適な実施態様においてＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液を投与することから基本的になるか、又は投与することからなる、哺乳動物における乏突起神経膠細胞の増殖、分化、及び生存を促進する方法を含む。
【０１７６】
本明細書に開示された治療法で使用される、金ナノ懸濁液及び好適な実施態様においてＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液は、乏突起神経膠細胞によるニューロンのミエリン化を負に制御する病理的事象の能力を、停止、低減、防止、又は阻害する治療薬として、調製し、使用することができる。更に、本明細書に開示された治療法で使用される金ナノ懸濁液、好ましくはＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液は、乏突起神経膠細胞の分化、増殖、及び生存を負に制御する病理的事象の能力を、停止、低減、防止、又は阻害する治療薬として、調製し、使用することができる。
【０１７７】
本発明のさらなる実施態様は、乏突起神経膠細胞又はミエリンの破壊を含む疾患、障害、又は傷害を治療するために乏突起神経膠細胞の増殖又は生存を誘導する方法であって、疾患、障害、又は傷害の部位又はその近傍に、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液からの金ナノ結晶を、軸索伸長の阻害を減少させ、及び／又はミエリン化を促進し、及び／又は脱ミエリン化を改善するのに十分な量で、哺乳動物に送達することを含む方法を含む。
【０１７８】
本発明の治療方法において、金ナノ懸濁液は、経口投与、注射、及び／又は鼻を介して投与することができる。
【０１７９】
いくつかの実施態様において、金のナノ懸濁液、好ましくはＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液は、ボーラス注射又は長期注入によって投与することができる。いくつかの実施態様において、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液は、例えば髄腔内又は硬膜外の配置により、中枢神経系に直接投与することもできる。いくつかの実施態様において、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液は、ミエリン損傷が発現される慢性病巣に直接投与することもできる。いくつかの実施態様において、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液は、哺乳動物の血流に直接投与することもできる。
【０１８０】
本発明の方法により治療又は改善することができる疾患又は障害は、哺乳動物のニューロンのミエリン機能不全又は脱ミエリン化に関連する疾患、障害、又は傷害を含む。具体的には、そのような疾患及び障害は、ニューロンを囲むミエリンが、存在しないか、不完全であるか、正しく形成されていないか、又は悪化している、ものを含む。このような疾患としては、特に限定されないが、進行性核上麻痺、アレキサンダー病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、カナヴァン病、白質ジストロフィー、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊（Central Pontine Myelolysis：ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、ツェルウェーガー症候群、ギラン・バレー症候群（Guillain-Barre Syndrome：ＧＢＳ）、ファンデルナープ症候群、慢性炎症脱ミエリン化多発ニューロパシー（chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy：ＣＩＤＰ）、多巣性運動ニューロパシー（multifocal motor neuropathy：ＭＭＮ）、視神経脊髄炎（Neuromyelitis Optica：ＮＭＯ）、進行性多巣性白質脳症（Progressive Multifocal Leukoencephalopathy：ＰＭＬ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）（年齢関連軽度認知症としても知られている）、ウォラー変性、並びに一部の遺伝病、例えば副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、及びペリツェウス・メルツバッハー病（Pelizaeus Merzbacher Disease：ＰＭＺ）がある。
【０１８１】
本発明の方法により治療又は改善することができる疾患又は障害は、乏突起神経膠細胞の増殖や分化の死滅又は欠如に関連する疾患、障害、又は傷害を含む。このような疾患としては、特に限定されないが、進行性核上麻痺、アレキサンダー病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、カナヴァン病、白質ジストロフィー、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊（Central Pontine Myelolysis：ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、ツェルウェーガー症候群、ギラン・バレー症候群（Guillain-Barre Syndrome：ＧＢＳ）、ファンデルナープ症候群、慢性炎症脱ミエリン化多発ニューロパシー（chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy：ＣＩＤＰ）、多巣性運動ニューロパシー（multifocal motor neuropathy：ＭＭＮ）、視神経脊髄炎（Neuromyelitis Optica：ＮＭＯ）、進行性多巣性白質脳症（Progressive Multifocal Leukoencephalopathy：ＰＭＬ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）（年齢関連軽度認知症としても知られている）、ウォラー変性、並びに一部の遺伝病、例えば副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、及びペリツェウス・メルツバッハー病（Pelizaeus Merzbacher Disease：ＰＭＺ）がある。
【０１８２】
本発明の方法により治療又は改善することができる疾患又は障害は、神経変性疾患又は障害を含む。このような疾患としては、特に限定されないが、進行性核上麻痺、アレキサンダー病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、カナヴァン病、白質ジストロフィー、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊（Central Pontine Myelolysis：ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、ツェルウェーガー症候群、ギラン・バレー症候群（Guillain-Barre Syndrome：ＧＢＳ）、ファンデルナープ症候群、軽度認知障害（ＭＣＩ）（年齢関連軽度認知症としても知られている）、慢性炎症脱ミエリン化多発ニューロパシー（chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy：ＣＩＤＰ）、多巣性運動ニューロパシー（multifocal motor neuropathy：ＭＭＮ）、視神経脊髄炎（Neuromyelitis Optica：ＮＭＯ）、進行性多巣性白質脳症（Progressive Multifocal Leukoencephalopathy：ＰＭＬ）、ウォラー変性、並びに一部の遺伝病、例えば副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、及びペリツェウス・メルツバッハー病（Pelizaeus Merzbacher Disease：ＰＭＺ）がある。
【０１８３】
本発明の方法により治療又は改善することができる追加の疾患、障害、又は傷害の例としては、特に限定されないが、脊髄損傷、慢性脊髄症又は神経根障害、外傷性脳損傷、運動ニューロン疾患、軸索せん断、打撲傷、麻痺、化学療法の放射線損傷又は他の神経学的合併症、脳卒中、大腺窩（large lacunes）、中〜大血管閉塞、白質希薄化、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症（独立した不全症候群、ＡＲ、バッセン・コンツウェイグ（Bassen-Komzweig）症候群）、Ｂ１２、Ｂ６（ピリドキシンペラグラ）、チアミン、葉酸、ニコチン酸欠乏、マルキャファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、ベル麻痺、又は軸索再生、再ミエリン化、もしくは乏突起神経膠細胞の生存もしくは分化／増殖を必要とするであろう任意の神経損傷がある。
【０１８４】
実施例２
クプリゾン脱ミエリン化モデル−１６匹のマウスのパイロット試験
【０１８５】
このパイロット試験の目的は、５１ｐｐｍに濃縮され自由に摂取された「ＣＮＭ−Ａｕ８」ナノ結晶懸濁液が、マウス脳におけるニューロンのクプリゾン誘導性脱ミエリン化中に一般的に起きるミエリン鞘損傷（又は修復）の量又は程度に影響を与えるかどうかを調べることであった。クプリゾンマウスモデルは、脱ミエリン化又はミエリン機能不全として病理学的にそれ自体を発現する複数の疾患について、哺乳動物におけるミエリン鞘の損傷をシミュレートすることを意図している。
【０１８６】
表２に示すように、合計１６匹のＣ５７ＢＬ６雄マウスを４群（１群４匹）に分けた。２匹の余りのマウスはバックアップとして使用し、試験に必要とされなかった、マウスは、試験の開始時に８週齢であった。
【０１８７】
毒性クプリゾンを導入することにより脱ミエリン化を誘導し、金ナノ懸濁液で処理することにより、脱ミエリン化の低減及び／又は再ミエリン化の促進の可能性を観察する試みでは、４群のうちの２群に、クプリゾン食を５週間を与えた。表２に示すように、群３と群４（処理群と対照群の両方）中のすべてのマウスに、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液（５１ｐｐｍの金ナノ結晶濃度）を自由に与えた（マウスの唯一の飲用液として）。試験中すべてのマウスを観察し、すべての異常行動を記録することとした。
【０１８８】
表２に示すように、５週間の試験後にすべてのマウスを安楽死させた。４群のそれぞれにおいて、４群のマウスのうちの３群から脳の所定の領域を免疫染色のために固定した（例えば、存在するミエリンの相対量を決定するために）。具体的には、ブレグマ−０．８２ｍｍ〜ブレグマ−１．８２ｍｍの冠状領域は、この動物モデルの主に関係する領域である1,2。各群の４匹のマウスのうちの３匹の脳のこれらの部分を、文献3で議論されているように、ミエリンプロテオリピドタンパク質（「ＰＬＰ」）の存在について染色した。染色結果は、図１３Ａ〜１３Ｃに示される。各群の４匹目のマウスからの脳は異なる方法で処理され、具体的には透過型電子顕微鏡（「ＴＥＭ」）試験のために調製した。
【０１８９】
脳の脳梁領域は軸索が密集しており、この領域はＴＥＭ試験のための中心領域であった。群１〜群４のそれぞれ１匹のマウスについて、脳梁領域から採取した軸索／ミエリン鞘の少なくとも９個の代表的なＴＥＭ画像が、それぞれを図１４Ａ〜１４Ｄに示されている。図１４Ａ〜１４Ｄのそれぞれに、少なくとも９個のＴＥＭ画像が、各マウス脳の脳梁内で観察された軸索／ミエリンの典型的な変化を示すために、示される。この試験からの図１３Ａ〜図１３Ｃと図１４Ａ〜１４Ｄに示される結果は、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液が、ブレグマ−０．８２ｍｍ〜ブレグマ−１．８２ｍｍの観察された領域中で、マウス脳中のミエリン損傷及び／又はミエリン修復の量に好適な影響を与え（例えば、図１４Ｂ、群２と図１４Ｄ、群４とを比較）；及び、非常に重要なことは、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液が、普通食単独を提供された場合、ミエリンの存在量に悪影響を及ぼさないように思われた（例えば、図１４Ｃ−群３を参照）ことを、示唆する。
【０１９０】
材料及び方法
動物の準備及び脱ミエリン化の誘導
雄のＣ５７ＢＬ６マウスをHarlan Labsから入手した。５週間の試験を始める前に、全てのマウスを７〜１１日間観察した。５週間の試験期間中、マウスは週に一度ルーチンのケージメンテナンスを受け、行動の変化を監視され、週に一度体重を測定された。図１９は、群１〜群４のそれぞれについて各マウスの、試験期間中の平均体重増加を示す。すべての群のマウスは、多くても少なくても、自由に食べ、飲むことを許された。具体的には、すべての食事、水、ＣＮＭ−Ａｕ８（５１ｐｐｍの金）処理懸濁液を、自由に与えた。摂取された水とＣＮＭ−Ａｕ８処理懸濁液の量を毎日記録した。群１〜群４のそれぞれのマウスについて、毎日摂取された液体の平均量が図１８に示される。新鮮な水と新鮮なＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液は、毎日与えられた。
【０１９１】
８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ６マウスに、Harlan Labs（TD 06172）から得られ、あらかじめ標準飼料ペレットと混合された、０．２％クプリゾン（ビス−シクロヘキサノンオキサルジヒドラゾン）を含有する飼料ペレット（以後本明細書において「クプリゾン食」）を与えることにより、脱ミエリン化を誘導した。対照飼料ペレットは毎週交換し、一方クプリゾン食は４８時間毎に交換した。５週間の期間中、群２と群４のマウスに、表２に従ってクプリゾン食を与えた。４つの群のそれぞれについて４匹のマウスの群のサイズを使用し、２匹の雄のマウスはその攻撃性のためにケージに収容した。
【０１９２】
このパイロット試験では、２７ゲージの０．５インチ針を用いて、ペントバルビタールナトリウム（８０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することにより、マウスをペントバルビタールナトリウムを使用して麻酔した。脳虚血を最小限に抑えるために、各マウスが意識不明になった直後、灌流工程を始めた。マウス脳に免疫染色を行ったか又はＴＥＭ顕微鏡撮影を行ったかどうかに応じて、２つの異なるセットの潅流緩衝液を使用した。免疫染色に関連した灌流では、合計５０ｍｌの冷食塩水（ｄＨ2Ｏ中０．９％のＮａＣｌ）、次に合計１５０ｍｌの４℃の固定液（４％パラホルムアルデヒド（「ＰＦＡ」））を使用し、ペリスタポンプを介してマウスの循環流中に順次通した。透過型電子顕微鏡撮影に関連した灌流も同様に、５０ｍｌの冷食塩水と、次に合計１５０ｍｌの固定液（０．１Ｍカコジル酸塩中３．５％  ＰＦＡ、１．５％グルタルアルデヒド）を使用した。ペリスタポンプは、約８〜１０ｍｌ／分の速度で各液体を供給した。灌流工程全体を通して、ペリスタポンプチューブ内の気泡の形成を避けるように注意した。
【０１９３】
十分な灌流を達成するために、各マウスの心臓の右心房を小さなハサミで切開した。次に翼状針を左心室の頂部に挿入し、ピンセットで各心臓の右心室の部分を慎重に保持しながら、ポンプで上記の液体を圧送開始した。各群の３匹のマウスからの脳をパラフィンブロックのマウント（免疫染色用）のために調製し、一方、各群から１匹のマウスをＴＥＭの顕微鏡撮影のために調製した。各マウスの脳を取り出した後、それぞれを、あらかじめ調製した冷（４℃）緩衝液で後染色し、文献4に従って、免疫染色用にパラフィン包埋したか、又はＴＥＭ顕微鏡撮影用に樹脂包埋した。
【０１９４】
【表２】
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【０１９５】
免疫組織化学
ＰＬＰの免疫染色のために、ブレグマ−０．８２ｍｍ〜ブレグマ−１．８２ｍｍ（Paxinos and Franklin3によるマウスアトラスに従う）の間の厚さ７μｍの連続の冠状脳切片を、図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、カスタムホルダーを使用して調製し、次に分析した。
【０１９６】
具体的には、各マウスの脳をまず寒天ブロックに包埋した。約４０グラムの寒天粉末（トリプシン大豆寒天、ＲＥＦ  ２３６９５０、ＢＤ）を約１リットルの精製水と十分に混合し、次に混合物を頻繁に攪拌しながら加熱し、約１分間煮沸して、粉末を完全に溶解した。図１２に示すように、鋳型３０１を基部３０２に固定した。次に、固定した鋳型３０１にマウス脳を入れた。次に、加熱した寒天／水混合物の温度が室温より少し上まで低下した時、固定した鋳型３０１を充填した。約２〜３分後、鋳型３０１を基部３０２から取り上げ、脳を含む寒天ブロックを作成した。
【０１９７】
次に、寒天ブロックをホルダ３０３に入れ、各マウスの頭部に対応する脳の部分を、刃先３０４に直面するように置いた。図１２Ｂに示すように、次にホルダー３０３を、マウスの尾に対応する脳の位置に向かって移動させ、ブレグマ−０．８２に対応する位置に配置し、刃を使用して脳を刃先３０４に沿って切断した。次にホルダー３０３を、脳の尾部に向かって約１ｍｍ移動し、次に刃先３０４をブレグマ−１．８２に配置した。次に、再度脳のブロックを、同じ刃を使用して刃先３０４で切断して、ブレグマ−０．８２〜ブレグマ−１．８２の間の厚さ１ｍｍの切片を得た。
【０１９８】
既に参照した方法3に従って、パラフィン包埋切片を、１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を部分的に充填したガラス容器に入れたまま、脱ろうし、再水和し、次に、通常の１．６５ＫＷの家庭用電子レンジで、緩衝液が沸騰するまでマイクロ波加熱した。次に、脳切片を、０．３％  Ｈ2Ｏ2でクエンチし、３％正常ウマ血清及び０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ中で約１時間ブロックした。次に脳切片を、ＰＬＰに対する一次抗体すなわちマウスＩｇＧ（AbD Serotecから）と、約１：５００の希釈率で接触させて、４℃で一晩インキュベートした。脳硬膜の部分を除いて、マウス脳にはＩｇＧがほとんど存在しないため、マウスＩｇＧを一次抗体として選択した。
【０１９９】
洗浄緩衝液（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４）で洗浄した後、冠状脳切片を、ビオチン化抗マウスＩｇＧ二次抗体（Vector Laboratoriesから購入）とともに約１時間更にインキュベートし、次にペルオキシダーゼ結合アビジン−ビオチン複合体（ABC Kit, Vector Laboratories）に約３０分間曝露した。次に、ジアミノ−３，３’ベンジジン（「ＤＡＢ」、Vector Laboratories）と呼ばれる、ペルオキシダーゼ結合アビジン−ビオチン複合体と反応することが知られている物質を脳切片と接触させ、ペルオキシダーゼ結合アビジン−ビオチン複合体とＤＡＢとの間に起きる反応の量に応じて、薄茶色と濃茶色の間の色に各切片が変化するようにした。より暗い茶色は、より多くのミエリンが存在することに対応していた。図１３Ｂは、群１〜群４のそれぞれのマウスについて、代表的なミエリン染色した冠状脳切片を示す。観察された各脳切片の総面積（すなわち、各スライド上に存在する全ての脳物質の総断面積）の大きさを決定するために、褐色に染色された切片に隣接させて配置した追加の連続脳スライド標本を、ＰＬＰ抗体（上記した）で染色し、またヘマトキシリンでも染色すると、これは、脳切片を青色に変化させた（既に存在する茶色に加えて）。図１３Ｃは、群１〜群４のそれぞれの１匹のマウスについて、代表的なミエリン＋ヘマトキシリン染色した脳切片を示す。
【０２００】
具体的には、各マウスの脳の冠状部の免疫陽性ＰＬＰの量を定量するために、冠状切片（すなわち、ブレグマ−０．８２ｍｍ〜ブレグマ−１．８２ｍｍの間）を観察した。視覚的に観察された濃淡の度合い（すなわち、薄茶色〜濃い茶色）に関連した数字を主観的に割り当てるよりも、試験者によって開発されたユニークな方法を用いた。
【０２０１】
まず、特別に改造したキャノンスキャナー（出力解像度２４００ｄｐｉ）により、図１３Ｂに示した茶色に染色された冠状脳切片のそれぞれをスキャンした。次にスキャン中の各画素を評価し、最も明るい色調を「２５５」に対応させ、最も暗い色調を「１」に対応させて、１から２５５までの値を（フォトショップにより）自動的に割り当てた。次にデータをエクセルにエクスポートした。次に、１〜２５５の間の数に割り当てられた画素の総数を表にして、ヒストグラムを作成した。次に各ヒストグラムのデータを分析し、各ミエリン染色冠状スライドの「色」又は「色調」の量について、定量的な加重平均を求めた。この定量的な数（バックグラウンドの色調に対して適切に補正されている）は、各ミエリン染色冠状スライド中の同じ領域についての色の量の、直接比較を行う能力を与えた。色又は色調の測定へのバックグランド入力を説明するために、隣接する連続冠状切片を陰性対照として使用した。具体的には、隣接する連続冠状切片を一次抗体ＩｇＧを使用せずに染色した。
【０２０２】
更に、各マウス群におけるマウスについて観察した脳の冠状切片中で、脱ミエリン化を防止及び／又は再ミエリン化を促進する特定の形態に相関し得るミエリンの存在量の意味のある科学的な比較（すなわち、色又は色調の強度）を行うために、各冠状切片中に存在する脳物質の総量（すなわち、断面積）を決定することも必要であった。すなわち、図１３Ｃに示した各冠状スライド上の総脳物質領域は、色／脳物質の領域の総量を定量し標準化することができるように、測定することが必要であった。次に、単位面積当たりの色の量を使用して、ミエリンの相対的存在量を直接比較した。すなわち、ヘマトキシリンを使用して、別の直接隣接する連続冠状切片中のすべての脳物質を染色した。これらの脳切片を同様に定量し、最初の冠状スライドで測定された総「色量」（すなわち、明るさ又は暗さ）を、並置された又は連続した冠状スライドで測定された存在する脳物質の総断面積（青い色と、最小閾値より上の明るいか又は暗い茶色との両方で示される）と比較して、脳物質の単位面積あたりの色又は色調の総量を決定した。
【０２０３】
上述のように、４群のマウスがあり、そして染色目的のために、各群は３匹のマウスを有していた。染色強度は、染色工程が非常に多数の試料で実行されたときに変化し得る環境条件の関数として変化することがあるため、細心の注意を払って染色又は色強度の変動を標準化して、実験結果が歪曲されないようにした。以下の手順は周知であり、実質的に文献に従って、確立された手順が行われた。
【０２０４】
簡単に述べると、脳物質の単位面積当たりの色や色調の量が決定された後、陰性対照（上記の一次抗体を使用せずに、生じる色又は色調の強度に対応する）をそれぞれの結果から差し引いた。
【０２０５】
また、定量のために、３つの別々の染色セットを計画し、使用した。各セットは、同一の染色特性の４つのバッチを含んでいた。各バッチは、各群からの１つの試料と１つの陰性対照を含有した。各試料の染色を４回繰り返して、４つの染色バッチ得た。最後に、群１からの３つの試料及び陰性対照を、第５のバッチで染色した。
【０２０６】
各バッチ内の色や色調の相対密度はまず、各バッチの対応する群１の試料に対する相対パーセントとして提示された。群１からの３つの試料では、標準化因子は、第５のバッチの染色に従って、試料１の相対比として表した。
【０２０７】
更に、群１の試料１に対する相対密度は、各バッチの相対密度に、対応する（そして算出された）標準化因子を掛けることにより、再度計算された。
最後に、各試料で、４つのバッチから群１の試料１に対する相対密度の平均を計算し、「相対ＰＬＰ密度」であると決定し、次に棒グラフとしてプロットした（図１３Ａを参照）。ミエリン染色のすべての結果は、図１３Ａ〜１３Ｃに示される。
【０２０８】
透過型電子顕微鏡のためのマウス脳切片の調製
灌流後、試料を上記固定液中で４℃で４〜６時間後固定し、次にカコジル酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．４）で３回洗浄し、同じ緩衝液中で４℃で２〜３日間保存した。
【０２０９】
図１２に示すカスタムホルダー／手順を使用して、ブレグマ−０．８２ｍｍ〜ブレグマ−１．８２ｍｍの間の脳の部分から、冠状スライドを切断した。
【０２１０】
具体的には、各マウスの脳をまず寒天ブロックに包埋した。寒天粉末約４０グラム（トリプシン大豆寒天、ＲＥＦ２３６９５０、ＢＤ）を精製水約１リットルと十分に混合し、次に混合物を頻繁に攪拌しながら加熱し、約１分間煮沸して、粉末を完全に溶解した。図１２Ａに示すように、鋳型３０１を基部３０２に入れた。次にマウス脳を固定した鋳型３０１に入れた。加熱した寒天／水混合物の温度が室温より少し上まで低下した時、固定した鋳型３０１を充填した。約２〜３分後、鋳型３０１を基部３０２から取り上げ、脳を含む寒天ブロックを作成した。
【０２１１】
次に、寒天ブロックをホルダー３０３に入れ、各マウスの頭部に対応する脳の部分を、刃先３０４に直面するように配置した。次に、図１２Ｂに示すようにホルダー３０３を、マウスの尾に対応する脳の位置に向かって移動させ、ブレグマ−０．８２に対応する位置に配置し、刃を使用して脳を刃先３０４に沿って切断した。次にホルダー３０３を、脳の尾部に向かって約１ｍｍ移動し、次に刃先３０４をブレグマ−１．８２に配置した。次に、再度脳のブロックを、同じ刃を使用して刃先３０４で切断し、ブレグマ−０．８２〜ブレグマ−１．８２の間の厚さ１ｍｍの切片を得た。
【０２１２】
スライド組織を、カコジル酸緩衝液中の１．５％フェロシアン化カリウム及び１％四酸化オスミウム中で、４℃で約４０分間後固定した。カコジル酸緩衝液で３回洗浄した後、組織ブロックを再度、カコジル酸緩衝液中の１％の四酸化オスミウム中で、４℃で約１時間後固定し、次にｄＨ2Ｏで３回洗浄した。最後にブロックを、ｄＨ2Ｏ中の１％酢酸ウラニルで、室温で約４０分間後固定した。脱水工程後、ブロックを３０％エタノールに約５分間、５０％エタノールに約５分間、７０％エタノールに約５分間を２回、８０％エタノールに約５分間を２回、９５％エタノールに約１０分間を２回、１００％エタノールに約１０分間、約２０分間、及び３０分間で３回、プロピレンオキシドに約５分間を２回、プロピレンオキシドと樹脂（１：１比）に約６０分間浸漬し、そして最後に室温で一晩樹脂に入れた。次に試料を更に３７℃で１時間、樹脂とともにインキュベートし、次に樹脂にＤＭＰ触媒を加えて、３７℃で約１時間インキュベートし、最後に、樹脂にＤＭＰ触媒を加えて、約６０℃で約４８時間包埋した。
【０２１３】
スライド組織を、脳の中央の矢状面で切断し、中央の矢状面が位置する表面に沿って、超薄切片を切断した。ウルトラミクロトーム（Reichert Jung Ultracut, Capovani Brothers Inc.; Scotic, NY）を使用して、約９０ｎｍ厚さの切片を得て、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、Zeiss Libra 120）を用いて顕微鏡写真を得た。
【０２１４】
Ｇ比測定と定量
提供されたＴＥＭソフトウェア（Zeiss Libra 120）を用いて、４つの群のそれぞれにおける、１００個のランダムに選択された軸索の、神経軸索の断面積と総面積（すなわち、軸索とミエリン鞘をあわせた断面積）を測定し、次に、特別に改変したソフトウェアを利用して内径と外径を推定した（すなわち、軸索／髄鞘コーティングの観察された断面積は、同心円であると仮定した）。Ｇ比は、算出された軸索直径を、軸索とミエリン鞘を一緒にして計算された総外径で割ることにより算出した。Ｇ比の分布は、GraphPadソフトウェアを使用して散布プロットとして図１６に示される。
【０２１５】
データを一層明確に示すために、Ｇ比の正規分布曲線をエクセルでプロットした。具体的には、図１７Ａ〜１７Ｄは、群１〜４のそれぞれについてのヒストグラムを示す。平均値と標準偏差に従って１セットの乱数を発生させ、「ヒストグラム−頻度ランダム」という名前のヒストグラムを作成した。その後、実際のデータを使用して、「ヒストグラム−頻度オリジナル」という名前の別のヒストグラムをプロットした。次に、各群で、ランダム分布曲線とオリジナル分布曲線との差を比較した。
【０２１６】
ＰＬＰ免疫染色の定量
図１３Ａ〜１３Ｄに示すように、５週間のクプリゾン食投与後に、群２のマウスは、例えば群１、３、及び４に存在するミエリンと比較して顕著なミエリンの損失を示し、これは、群２について表２に記載された条件が、冠状軸索の少なくともいくつかの脱ミエリン化を引き起こすことに成功したことを示唆した。群１のマウス（水及び対照食）中に存在するミエリンの量と群２のマウス（水及びクプリゾン食）中に存在するミエリンの量との具体的な比較は、統計的に有意なミエリン損失（ｐ＜０．０１）を示した。更に、クプリゾン食を５週間すべてにわたって摂取し、５週間のうちの３週間のみＣＮＭ−Ａｕ８（５１ｐｐｍ）の自由摂取による処置を受けた群４のマウスは、より多くのミエリンの存在を示し、ミエリン保存及び／又は再ミエリン化を示唆した（群２体群４を比較、ｐ＜０．００５）。例えば本明細書の他の箇所で議論される、例えば図１４Ｄ中のＴＥＭ画像に示される、ミエリンの存在量も参照されたい。
【０２１７】
ＴＥＭ顕微鏡試験からのミエリン鞘の観察
図１４Ａ〜１４Ｄは、４匹の異なるマウスの脳梁領域の代表的な部分、すなわち群１〜４のそれぞれからの１匹のマウスからの領域の、断面積の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示す。表２に示す群１、２、３、及び４のマトリックス条件は、クプリゾン脱ミエリン化試験で望むであろうものと一致するデータを生じるように見え、それは、すなわち処理候補（例えば、ＣＮＭ−Ａｕ８金ナノ懸濁液）が有益な治療結果又は予防結果（例えば、脱ミエリン化を予防するか又は遅くする、及び／又は再ミエリン化を促進する）を示すかどうかを決定することを可能にする時間枠内での、群２の測定可能なミエリンの損失である。
【０２１８】
これらの４匹のマウスにおける代表的な脳梁の脳組織断面試料を、もともとは約１６，０００×倍率のＴＥＭで観察した（各顕微鏡写真上に実際の倍率を表すスケール棒が存在している）。各マウスの脳梁内の何百もの領域を観察して、ＴＥＭ顕微鏡写真の代表的なセットに到達した。すなわち、４匹のマウスの脳梁から採取した断面領域の代表画像が図１４Ａ〜１４Ｄに示されている（すなわち、各グラフに９〜１０の画像が示されている）。肉眼のみを利用すると、ミエリンの厚さと軸索の特性は、対照食を投与された２つの群（すなわち、対照群（群１）とＣＮＭ−Ａｕ８のみの処理群（群３））の間で非常によく似ていた。しかし対照的に、クプリゾン食と水を投与されたマウス群（群２）では、脳梁の観察された断面の部分で、より少ない総ミエリンの存在を明らかに示した（例えば、図示した軸索への損傷及び／又は脱ミエリン化を示唆している）。文献と一致して、クプリゾン食によって引き起こされるミエリン分解は、観察した脳梁の断面領域におけるミエリン／軸索に不均一な効果（すなわち、均一ではない）を有することが見出された。具体的には、本試験で観察された脳梁の断面では、観察された断面領域の約４０％未満が、ある量のミエリン損傷を示し、一方、残りの断面領域は対照と同様（すなわち、群１と同様）のように見えた。なお、これは、一般的であると考えられ、文献で別の場所に報告されているクプリゾンマウスモデル試験に一致することに留意すべきである。
【０２１９】
群４のマウスの脳梁の断面領域のＴＥＭ顕微鏡写真は、非常に興味深い。このマウスは、試験の５週間すべてにわたってクプリゾン食を投与され、試験の週３〜５中にＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液を自由に投与された。図１４Ｄ中のＴＥＭ顕微鏡写真は、たとえあっても脱ミエリン化軸索が非常に少ないことと、存在するミエリンの総量が対照（群１）中に存在するミエリンの総量と同様であることを示す。これらの観察結果は、図１３Ａ〜１３Ｄに示したように、群１〜４のそれぞれの３匹のマウスについて、染色された冠状脳切片の免疫染色の結果によって捕捉された存在するミエリンの総量に相当する。具体的には、マウス群１、３、及び４のそれぞれの３匹のマウスの冠状切片についての図１３Ａ〜１３Ｄに示したＰＬＰ染色の相対量は、クプリゾン食と水とを摂取した群２の３匹のマウスについてのＰＬＰ染色の相対量よりも多い（すなわち、より多くのミエリンが存在することに対応する）。
【０２２０】
Ｇ比測定とＧ比の分布
Ｇ比の測定及び定量は、軸索上に存在するミエリンコーティングの相対量の機能的及び構造的指標（すなわち軸索ミエリン化）として広く使用されている。Ｇ比が高いほど、軸索の直径に対してミエリンはより薄く、逆に、Ｇ比が低いほど、軸索に対してミエリン鞘はより厚い。すなわち、一般的に及び基準内で、報告されたＧ比が低いほど、より良好である。具体的には、脳の脳梁領域についてのミエリン化軸索の平均Ｇ比の範囲は、０．７５〜０．８１5の範囲内であることが報告されている。
【０２２１】
本試験で測定されたＧ比は、図１５に報告されている。最も高い報告されたＧ比は群２、すなわちクプリゾン食と水とを摂取したマウスに存在した。群２のマウスについて報告されたＧ比は、他の群の報告されたＧ比よりも高かった。最も低い報告されたＧ比は群１、すなわち対照飼料と水とを与えられたマウスである。
【０２２２】
興味深いのは、群１のマウス（水とクプリゾン食）と群３のマウス（ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液と対照食を自由に）とのＧ比の比較はほとんど差を示さず、それぞれ図１４Ａ及び図１４Ｃ中のＴＥＭ画像と一致していた。これらの追加データはまた、ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液が、ミエリンの存在量に関して、いかなる測定可能な負の副作用も持っていなかったことを示唆している。
【０２２３】
報告されたＧ比を更に理解するために、群１〜４のそれぞれについてデータの散乱プロットを作成した。図１６に示すように、群２のマウス（例えば、より高いＧ比；これは、あまり健康でないか又は負に修飾された軸索の機能に対応することがある）は、他の３つのマウス群に比べて最大のデータ散乱を示した。残りの３つのマウス群のデータ散乱は非常によく似ており、群１と群３の間で有効な差は観察されなかった。
【０２２４】
Ｇ比データを更に定量するために、データを図１７Ａ〜１７Ｄに異なる方法で表わした。具体的には、鐘形曲線を作成しプロットして、４つのマウス群の各々におけるＧ比のデータの連続的な確率分布を示した。図１７Ａ〜１７Ｄ中の４つのプロットはそれぞれ、その群についてＧ比データの「平均」と標準偏差から作成された「ヒストグラム−頻度ランダム」と表示された曲線を含む（内部対照として有効に作成される）。更に図１７Ａ〜１７Ｄの４つのプロットのそれぞれはまた、実際のＧ比データから作成された「ヒストグラム−頻度オリジナル」と表示された曲線も含む。
【０２２５】
図１７Ａ〜１７Ｄにプロットされたデータは、「ヒストグラム−頻度ランダム」プロットと「ヒストグラム−頻度オリジナル」プロットが、群１、３、及び４のそれぞれについて非常によく似ていることを示す。これとは対照的に、クプリゾン食を摂取したマウス（すなわち群２）は、元々のＧ比データに関連する２つの大きなピークを示す。更に「ヒストグラム−頻度オリジナル」曲線は、「ヒストグラム−頻度ランダム」分布曲線とは全く異なる。興味深いのは、群４のマウスに自由に与えられたＣＮＭ−Ａｕ８処理懸濁液が、クプリゾン食により悪影響を受けたマウスに比べて、曲線中の差を最小限に抑えるように見えたことである。群４のマウスに関連するデータについて、「オリジナル」分布曲線は「ランダム」分布曲線と基本的に同様であり、曲線のより高い比率の端に非常に小さいピークが現れるのみである。
【０２２６】
結論
データは、以下を示唆している：
１．  クプリゾン食と水を５週間投与されたマウス（すなわち表２の群２）は、試験者によって求められたミエリン損失又は損傷（例えば脱ミエリン化）を発現した。
２．  対照食及びＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液を自由に与えられたマウス（すなわち群３）は、対照食と水を与えられたマウス（群１）に比べて、異常な行動又は測定されたミエリンの差を示さなかった。
３．  自由摂取されたＣＮＭ−Ａｕ８処理懸濁液は、試験の５週間すべてにわたってクプリゾン食に曝露され、最後の３週間にＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液（５１ｐｐｍの金濃度）に曝露された群４のマウスのミエリンの存在量に正の影響を与えた（例えば、ミエリン損傷の減少、及び／又は再ミエリン化の促進）。
【０２２７】
実施例３
クプリゾン脱ミエリン化モデル−２週／５週−１０５匹のマウスの試験
【０２２８】
要約
この１０５匹のマウスの試験の目的は、マウスに提供された「ＣＮＭ−Ａｕ８」ナノ懸濁液が、（１）約５０ｐｐｍの金濃度で水瓶から自由処置として（試験の最後の３週間又は５週間すべてにわたって、マウスの唯一の飲料液として）；又は（２）約１０００ｐｐｍの金濃度で強制経口投与（試験の最後の３週間又は５週間すべてにわたって）（及び、各マウスの体重に基づいて、マウス体重１ｋｇあたり約１０ｍＬのＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液の容量「１０ｍＬ／ｋｇ」で、１日１回の強制経口投与）により、治療有効量又は予防有効量で作用し、こうして、脳梁中に存在するミエリン損傷の量に影響を与えるか、及び／又は脳梁中の少なくとも一部の軸索の再ミエリン化を促進するか、どうかを決定することであった。実施例２のように、ミエリン損傷がクプリゾン食を摂取したマウスにより誘導された。
【０２２９】
合計１０５匹のＣ５７ＢＬ６雄マウスを、表３に示されるように７群に分けた（１群１５匹のマウス）。試験の開始時に、マウスは約８週齢であった。
【０２３０】
ミエリン損傷（例えば、ミエリンの負の反応及び／又は脱ミエリン化）を誘発するために、７つの群のうちの６群（すなわち群２〜７）に、実施例２で説明したものと同じクプリゾン食を与えた。７つのマウス群と７つのマウス群が曝露された各条件は、以下に簡単に記載され、ならびに表３に要約される。
【０２３１】
群１．  群１の１５匹のマウスは、試験の５週間すべてにわたって普通食を摂取（すなわち、クプリゾン食は与えらなかった）し、また試験の５週間すべてにわたって、水も飲み、そして本明細書に記載のように処理された。
【０２３２】
群２．  群２の１５匹のマウスは、試験の２週間クプリゾン食を与えられ、同じ２週間、水を飲み、次に本明細書に記載のように、２週間後に処理された。
【０２３３】
群３．  群３の１５匹のマウスは、試験の５週間すべてにわたってクプリゾン食を与えられ、５週間すべてにわたって水をみ、次に本明細書に記載のように処理された。
【０２３４】
群４．  群４の１５匹のマウスは、試験の５週間すべてにわたってクプリゾン食を与えられ、強制経口投与により、５週間すべてにわたって、一日一回、約１０ｍＬ／ｋｇの濃縮ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液の処理容量を、約１０００ｐｐｍの金結晶濃度で与えられ、次に、本明細書に記載のように処理して、提供された金ナノ懸濁液が予防的に有効な量であったかどうかを決定した。
【０２３５】
群５．  群５の１５匹のマウスは、試験の５週間すべてにわたってクプリゾン食を与えられ、試験の最初の２週間、水を飲み、次に、強制経口投与により、次の３週間、一日一回、約１０ｍＬ／ｋｇの濃縮ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液の処理容量を、約１０００ｐｐｍの結晶金濃度で与えられ、次に、本明細書に記載のように処理して、提供された金ナノ懸濁液が治療的に有効な量であったかどうかを決定した。
【０２３６】
群６．  群６の１５匹のマウスは、試験の５週間すべてにわたってクプリゾン食を与えられ、水瓶から自由に、処理ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液を、試験の５週間すべてにわたって、約５０ｐｐｍの結晶金濃度で与えられ、次に、本明細書に記載のように処理して、提供された金ナノ懸濁液が有効な処置として作用したかどうかを決定した。
【０２３７】
群７．  群７の１５匹のマウスは、試験の５週間すべてにわたってクプリゾン食を与えられ、試験の最初の２週間、水を飲み、次に水瓶から自由に、処理ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液を、試験の次の３週間、約５０ｐｐｍの結晶金濃度で与えられ、次に、本明細書に記載のように処理して、提供された金ナノ懸濁液が有効な処置として作用したか（例えば、治療有効量として作用したか）どうかを決定した。
【０２３８】
材料及び方法
動物の準備とミエリン損傷の誘導
雄のＣ５７ＢＬ６マウスをTaconic Farmsから入手した。２／５週試験を開始する前２〜４週に、すべてのマウスを馴化させた。マウスは、日常なケージメンテナンスを受け、行動の変化を監視された。マウスは、試験の開始前、及び、次に試験中週二回、体重を測定された。図２２は、群１〜７のそれぞれのマウスについて、マウス１匹あたりの平均の体重増加を示す。
【０２３９】
群１〜７のそれぞれの１５匹のマウスは、多くても少なくても、好きなだけ、食べかつ飲むことを許された。具体的には、すべての食物、水、及びＣＮＭ−Ａｕ８（５０ｐｐｍの金濃度）処理懸濁液を自由に与えたか、又は、上述のように、強制経口投与（１０００ｐｐｍの金濃度）により提供された。新鮮な水と新鮮なＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液が、毎日提供された。
【０２４０】
２７ゲージの０．５インチ針を用いてアベルチン（２５０〜２４０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することにより、全てのマウスをアベルチンを使用して麻酔した。脳虚血を最小限に抑えるために、各マウスが意識不明になった直後、灌流工程を始めた。使用された灌流緩衝液は、ルーペ（拡大鏡）を使用して、各マウスを観察した時、肝臓が完全に透明になるまで、最大５０ｍｌの冷生理食塩水（ｄＨ2Ｏ中０．９％のＮａＣｌ）を使用し、次に合計約１５０〜１８０ｍｌの４℃の固定液（０．１Ｍカコジル酸塩中３．５％  ＰＦＡ、１．５％グルタルアルデヒド）を使用した。ペリスタポンプは、約４〜６ｍｌ／分の速度で各液体を供給した。灌流工程を通して、ペリスタポンプチューブ内の気泡の形成を避けるように注意した。
【０２４１】
十分な灌流を達成するために、各マウスの心臓の右心房を小さなハサミで切開した。次に針を左心室の頂部に挿入し、ポンプで上記の液体を圧送開始した。少なくとも１５０ｍｌのＰＦＡ（グルタルアルデヒド）が通過した後、ペリスタポンプを停止した。ハサミを使用して、頭を取り出し、頭に小さなカットを入れ、次に、脳を簡単に除去することができるまでこれを刻んだ。各マウスの脳を取り出した後、各脳を、それぞれあらかじめ調製した冷（４℃）緩衝液中で後固定し、文献4に従って、ＴＥＭの顕微鏡写真撮影用に樹脂包埋した。
【０２４２】
灌流のための原料は、以下の供給源から得た：
（１）カコジル酸ナトリウム三水和物（ＥＭ用）：Sigma Aldrich, Cat#: C0250-100G
（２）パラホルムアルデヒドＥＭグレード、プリル精製、１ｋｇ：Ted Pella, Cat#: 18501
（３）グルタルアルデヒド、５０％のＥＭグレード、１０Ｘ１０ｍｌ：Ted Pella, Cat#: 18431
（４）滅菌フィルターユニット：Fisher Scientific, Cat#: 09-740-2A
【０２４３】
【表３】
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【０２４４】
透過型電子顕微鏡のためのマウス脳切片の調製
灌流した後、試料を上記固定液中で４℃で４〜６時間後固定し、次にカコジル酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．４）で３回洗浄し、同じ緩衝液中で４℃で２〜３日間保存した。
【０２４５】
脳を、カコジル酸緩衝液から取り出し、ティッシュペーパー上に置いた。かみそりの刃を、マウスの脳マトリックス１０９の中心線に矢状に挿入した。図２１Ａに示すように、かみそりの刃をマウスの中心線に置いたまま、矢状脳マトリックス１０９の中央溝１１１中に導いた。マウスの矢状脳マトリックス１０９は、１ｍｍ間隔で離れた１３の溝からなる。脳を動かすことなく、第２の刃を、右側の中央溝から２ｍｍ離れた溝１１０Ｒに挿入し、第３の刃を、左側の中央溝から２ｍｍ離れた溝１１０Ｌに挿入した。図２０Ｂ、２０Ｃ、及び２０Ｄに示すように、脳組織１０３ａと１０３ｂの２つのミラースライドを作成した。２ｍｍの直径を有する円筒状の組織ブロック１０４Ｒと１０４Ｌは、図２０Ｃ及び２０Ｄに示すように、Harris Uni-Core (Ted Pella, Prod # 15076)により切断した。脳梁１０５Ｒ及び１０５Ｌの後方部分（すなわち膨大部）が組織スライド１０３ａ及び１０３ｂ中を走るところに、円筒状組織ブロック１０４Ｒ及び１０４Ｌを配置した。脳の中央の矢状面上にある組織ブロックの表面は標識され、ＥＭ切片がこの表面上で切断されるであろう。
【０２４６】
ブロック組織を、カコジル酸緩衝液中の１．５％のフェロシアン化カリウムと１％四酸化オスミウムで、４℃で４０分、後後固定した。カコジル酸緩衝液で３回洗浄した後、組織ブロックを再度、カコジル酸緩衝液中の１％四酸化オスミウムで、４℃で約１時間後固定し、次にｄＨ2Ｏで３回洗浄した。最後にブロックを、ｄＨ2Ｏ中の１％酢酸ウラニルで室温で約４０分間後固定した。次に、ブロックを３０％エタノールに約５分間、５０％エタノールに約５分間、７０％エタノールに約５分間を２回、８０％エタノールに約５分間を２回、９５％エタノールに約１０分間を２回、１００％エタノールに約１０分間、２０分間、及び３０分間で３回、プロピレンオキサイドに約５分間を２回、プロピレンオキサイドと樹脂（１：１比）に約６０分間、及び最後に室温の樹脂に一晩、浸漬することにより、脱水工程を行なった。次に試料を、樹脂と３７℃で約１時間インキュベートし、次に樹脂＋ＤＭＰ触媒と約３７℃で更に１時間インキュベートし、最後に樹脂＋ＤＭＰ触媒中に約６０℃で約４８時間、包埋した。
【０２４７】
ウルトラミクロトーム(Reichert Jung Ultracut, Capovani Brothers Inc.; Scotic, NY)を使用して、約９０ｎｍの厚さの切片を得て、透過型電子顕微鏡（「ＴＥＭ」、Zeiss Libra 120）を用いて、顕微鏡写真を得た。
【０２４８】
クプリゾン食への２週間の曝露後の脳梁における軸索ミエリン損傷の量と種類を評価するために、２週間クプリゾン食を食べて水だけを飲んだ後、群２の１５匹のマウスを殺処分し、他の６群の他の９０匹のマウスはすべて、表３に示すように、５週間後に殺処分した。
【０２４９】
７つのマウス群のそれぞれにおいて、各マウスからの脳の所定領域を、抽出の対象とした。脳の脳梁領域は、クプリゾン処理に敏感な軸索が密集しており、この領域は、すべてのＴＥＭ試験のための焦点領域であった。次に、いくつかの異なる定量的及び定性的評価手法を使用して、撮影した多くのＴＥＭ画像を観察し定量した。
【０２５０】
Ｉ．４，０００×と５，０００×で撮影した脳梁ＴＥＭ画像の比較
ＴＥＭ画像の最初のセットは、もともと４，０００×〜５，０００×の最も低い倍率で撮影し、このＴＥＭセットは図２３〜２９として表示される。これらの画像の各々は、それぞれのマウスの脳の全脳梁領域の小さな部分を表す。更に、これらの画像はランダムに選択されたのではなく、むしろこれらは、ミエリンに最も広範囲の損傷を示した脳梁の領域に対応するため、選択された。
【０２５１】
毒性クプリゾンモデルが、全脳梁にわたって均一なミエリン損傷をもたらしておらず、従って、クプリゾン食が原因で最大量の損傷を示す部分を選択するために、熟練したオペレータによる非常に細心の注意が必要であったことに、再度留意されたい。
【０２５２】
図２３Ａ、２３Ｂ、及び２３Ｃ（すべて、もともと４，０００×で撮影した）は、群１のマウスからのマウス脳に対応する。図２３のＴＥＭ顕微鏡写真は、図２４〜２９内の他のすべてのＴＥＭ顕微鏡写真と比較して、脳梁の軸索に存在する最大量のミエリンを示す。これらの群１のマウスの脳梁領域内のいかなる場所にも、広範な脱ミエリン化又はミエリン機能不全の領域を特定することはできなかった。
【０２５３】
群２のマウスに対応するＴＥＭ顕微鏡写真（すべて、もともと４，０００×で撮影した）は、図２４Ａ〜２４Ｅに示される。これらの代表的なＴＥＭ画像は、図２３Ａ〜２３Ｃ（すなわち、対照群１）と比較して、存在するミエリンが少ない領域を示す。群２に関連するマウス脳を観察する場合に、群２のマウス脳には、脳梁中に存在するミエリンが少ないいくつかの領域があったこと、及びこのような領域が、図２３Ａ〜２３Ｃで示される対照（群１）画像では観察されなかったことに、留意されたい。
【０２５４】
また、図２４Ａ〜２４Ｅの顕微鏡写真に示される多くの軸索が、対照群１中で観察され写真撮影されたいかなる軸索よりも大きい直径を有するようであることに留意すべきである。いくつかの軸索上の観察された正常ではない厚いミエリンは、おそらく毒性クプリゾン食に対する反応であろう。具体的には、図２４Ａ、２４Ｄ、及び２４Ｅを参照されたい。
【０２５５】
群３のマウス（すなわち、クプリゾン食を５週間投与されたマウス）の脳に対応するＴＥＭ顕微鏡写真は、図２５Ａ〜２５Ｇに示される。これらの代表的なＴＥＭ画像（すべて、もともと４，０００×で撮影した）は、クプリゾン食を２週間のみ摂取した群２のマウスに比較して、ミエリンの存在量が少ない脳梁の領域を示す。更に、対照群１のマウス中で観察され写真撮影された軸索より大きい直径と薄いミエリン鞘を有するより多くの軸索があるようである。具体的には、図２５Ｄ、図２５Ｅ、図２５Ｆ、及び図２５Ｇを参照されたい。ミエリンの損傷は、クプリゾン誘導性の脱ミエリン化13の週２〜６中の確立された知見であり、本明細書で観察されたような軸索腫脹は既に報告されている14。更に、観察された大きな軸索腫脹は、ミエリン損失に対する反応かも知れない。
【０２５６】
予防的治療群４のマウスの脳に対応するＴＥＭ画像が図２６Ａ〜２６Ｅに示され、全ての画像は本来４，０００×で撮影された。群４のマウスはクプリゾン食を５週間与えられ、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液中に存在する１０００ｐｐｍ（１０００μｇ／ｍｌ）の金濃度を、マウス体重１キログラムあたり１０ｍｌのナノ懸濁液の量（すなわち１０ｍｌ／Ｋｇ）で、一日に一回強制経口投与された。群４のＴＥＭ画像では、図２５Ａ〜２５Ｇ（すなわち群３）に示したようなミエリン損傷の領域は見られなかった。実際、群４のＴＥＭ画像は、対照群１のＴＥＭ画像と少し似ていた（比較のために図２３Ａ〜２３Ｃを参照されたい）。
【０２５７】
更に、図２６Ａ〜２６Ｅのそれぞれに存在する白矢印２０１は、文献に従うと、再ミエリン化8に一致する特性を示す軸索に対応する。具体的には、これらの印をつけた軸索２０１は、同様の又はより大きい断面積の他の軸索と比較して、薄く暗いコンパクトなミエリン鞘を示す。
【０２５８】
群５のマウスの脳に対応するＴＥＭ画像は、図２７Ａ〜２７Ｄに示される。これらのＴＥＭ画像は、ＴＥＭ画像上のスケール棒について述べたように、もともと４，０００×と５，０００×の両方で撮影された。これらの画像は、図２６Ａ〜２６Ｅのものと同様に、群３のマウスの脱ミエリン化領域のような広範なミエリン損傷の領域はなかった（例えば、群５のマウスでは広範なミエリン損傷又は脱ミエリン化を示す領域の量が著しく減少している）。群５のマウスはクプリゾン食を５週間与えられ、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液を強制経口投与により、１日１回、１０００ｐｐｍの（１０００μｇ／ｍｌ）の濃度で、かつ１０ｍｇ／ｋｇの量で、試験の週３〜５の期間、治療的処置として与えられた。図２７Ａ〜２７Ｄは、前述のＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液の強制経口投与が、群３のマウスと比較して、群５のマウスに対して治療効果（例えば、利益）を有したことを、明らかに示す。
【０２５９】
更に、図２７Ａ〜２７Ｄのそれぞれに存在する白矢印２０１は、文献に従うと再ミエリン化している8と考えられる軸索に対応する。具体的には、これらの印をつけた軸索２０１は、同様の又はより大きい断面積の他の軸索と比較して、薄く暗いコンパクトなミエリン鞘を示す。
【０２６０】
群６のマウスの脳に対応するＴＥＭ画像は、図２８Ａ〜２８Ｇに示される。これらのＴＥＭ画像もまた、画像上のスケール棒について述べたように、もともと４，０００×で撮影された。これらの画像は、図２６Ａ〜２６Ｅのものと同様に、群３のマウスで観察された好ましくない領域と同様の広範なミエリン損傷又は脱ミエリン化を示す面積又は領域の量の顕著な低下を示す。群６のマウスはクプリゾン食を５週間与えられ、ＣＮＭ−Ａｕ８予防的ナノ懸濁液を、自由に、５０ｐｐｍ濃度の金（５０μｇ／ｍｌ）で、試験の５週間すべてにわたって治療として与えられた。５０μｇ／ｍｌのＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液の自由な曝露が、群３のマウスで観察されたミエリンと比較して、群６のマウスのミエリンに対して予防効果及び／又は治療効果のいずれか又は両方を有したことを、明らかに示す。
【０２６１】
更に、図２８Ａ〜２８Ｇのそれぞれに存在する白矢印２０１は、文献に従うと再ミエリン化している8と考えられる軸索に対応する。具体的には、これらの印をつけた軸索は、同様の又はより大きい断面積の他の軸索と比較して、薄く暗いコンパクトなミエリン鞘を示す。
【０２６２】
群７のマウスに対応するＴＥＭ画像は、図２９Ａ〜２９Ｄに示される。これらのＴＥＭ画像は、画像上のスケール棒について述べたように、もともと４，０００×で撮影された。これらの画像は、図２６Ａ〜２６Ｅのものと同様に、群３のマウスの好ましくない領域と同様の広範なミエリン損傷又は脱ミエリン化を示す面積の量の顕著な低下を示す。群７のマウスはクプリゾン食を５週間与えられ、ＣＮＭ−Ａｕ８治療ナノ懸濁液を、自由に、５０ｐｐｍ濃度の金（５０μｇ／ｍｌ）で、試験の週３〜５の期間中治療として与えられた。５０μｇ／ｍｌのＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液の自由な曝露は、群３のマウスと比較して、群７のマウスに対して予防効果及び／又は治療効果のいずれか又は両方を有したことを、明らかに示す。
【０２６３】
更に、図２９Ａ〜２９Ｄのそれぞれに存在する白矢印２０１は、文献に従うと再ミエリン化している8と考えられる軸索に対応する。具体的には、これらの印をつけた軸索は、同様の又はより大きい断面積の他の軸索と比較して、薄く暗いコンパクトなミエリン鞘を示す。
【０２６４】
これらのデータは、クプリゾン食が、マウス脳の脳梁領域においていくらかの脱ミエリン化軸索をもたらすこと、及び、ＣＮＭ−Ａｕ８金ナノ結晶懸濁液が、哺乳動物が、軸索の脱ミエリン化の量を低減し、及び／又は軸索の再ミエリン化をもたらすための、効果的な治療（治療的及び予防的の両方）であることを示唆している。
【０２６５】
ＩＩ．単位面積あたりの脱ミエリン化軸索の数の定量
クプリゾン食によるミエリン損傷の量に対して、ＣＮＭ−Ａｕ８金ナノ結晶懸濁液の何らかの正の治療効果があるかどうかを判定するための別の方法は、軸索上に存在する脱ミエリン化軸索及び／又は明らかに損傷されたミエリンの数を数え、そして、マウス群１〜７のそれぞれにおける脱ミエリン化軸索の数を比較することである。この手法は、群１〜７のそれぞれのマウスからの脳の脳梁からランダムに撮った一連の同様の倍率（すなわち、元々１６，０００×で撮影した）のＴＥＭ画像を観察することにより、容易になる。群１〜７の試験の詳細は、前述したように表３に記載されている。この方法は、非ミエリン化軸索から脱ミエリン化軸索を区別し、次に各マウス群の脱ミエリン化軸索の数（単位面積あたり）を比較することを目指している。
【０２６６】
簡単に言えば、この手法では、最小の完全にミエリン化された軸索（すなわち、最小の断面積を有する完全にミエリン化された軸索）が、白い星印２０３番の各ＴＥＭ画像内で特定される。この最小の完全にミエリン化された軸索２０３は、各個々のＴＥＭ顕微鏡写真で、出発「基準軸索」として機能する。次に、すべての非ミエリン化軸索、及び／又は脱ミエリン化軸索、及び／又は基準軸索２０３とほぼ同じ断面積又はより大きな断面積の明らかに損傷されたミエリンを含有する軸索は、「脱ミエリン化」されているとして分類され、次に適切なマークで特定される。マークされた軸索は、次に個別にカウントされ、以下に詳述するように一緒に加算される。
【０２６７】
非均質な脳梁の異なる部分が互いに多少異なって見えるため、基準軸索２０３のサイズは、各ＴＥＭ顕微鏡写真で多少変化することがある。対照群１について「脱ミエリン化」軸索の平均数が決定されると、次にこの平均数は、一種の「バックグランドノイズ」として機能し、この平均数が、群２〜７のそれぞれの脱ミエリン化軸索の加重平均数から減算される。基準軸索手法を用いて、局所的な脳梁周辺のより正確な理解が得られ、損傷されたか又は脱ミエリン化された軸索のより正確な計数及び表示をもたらすと考えられる。
【０２６８】
具体的には、図３０Ａは、対照群１のマウスの脳梁領域からランダムに撮った、もともと１６，０００×で撮影された代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示す。このＴＥＭ顕微鏡写真では、完全にミエリン化された軸索の最小断面積は、白い星印で表され、２０３Ｓの番号が付いている。熟練したオペレータにより特定されるこの基準軸索２０３Ｓは、この図３０ＡのＴＥＭ顕微鏡写真で基準軸索となる。
【０２６９】
この最小の完全にミエリン化した軸索が、このＴＥＭ画像における基準軸索２０３Ｓとして熟練したオペレータにより選択されると、同じ熟練したオペレータは、実際のＴＥＭ画像を表示するタッチ画面のコンピュータ画面を使用し、スタイラスで画面にタッチし、長方形のブラックボックスを、基準軸索２０３Ｓに対応する画面の一部に置かれる（すなわち、ＴＥＭ顕微鏡写真上に置かれる）。基準軸索２０３Ｓが特定されると、オペレータにより、（１）基準軸索２０３Ｓと同じ断面積であり、ミエリン化していない（すなわち、明確に規定されるミエリンが欠如しているか、又はミエリンが明らかに損傷している）と判断されるか、又は（２）基準軸索２０３Ｓよりも大きな断面積であり、ミエリン化していない（すなわち、明確に規定されるミエリンが欠如しているか、又はミエリンが明らかに損傷している）と判断されるすべての他の軸索は、同じ方法でタッチ画面ディスプレイをタッチすることにより、別の長方形のボックスでマークされる（図３０Ａにおいてブラックボックスとして示されている）。オペレータが、すべてのそのような（１）及び（２）の軸索をマークすることを終了すると、ソフトウェアプログラムは、各顕微鏡写真上のすべての長方形のボックスを自動的にカウントする（すなわち、熟練したオペレータによりマークされ、熟練したオペレータにより損傷されていると判断されたすべての軸索（１）と（２）に対応する）。図３０Ａはまた、その上に２０２Ｓの番号が付けられた白矢印を有し、これはブラックボックスのそれぞれを指している。これらの白矢印２０２Ｓは、どの軸索（１）及び（２）がブラックボックスでマークされている（すなわち、熟練したオペレータにより損傷されていると特定されたもの）かを特定する読者を補助するために加えられている。しかし、白矢印は、すべての自動合計（例えば、損傷されたか又は脱ミエリン化された軸索（１）及び（２）の数のカウント）が行われた後に手動で追加される。
【０２７０】
図３０Ｂは、図３０Ａに示されたものと同じＴＥＭ顕微鏡写真であり、白い星印は基準軸索２０３を示し、白矢印２０２は、かってブラックボックスを有した軸索を示すが、ブラックボックスは取り除かれ、白矢印２０２のみが残っている。図３０Ｂ〜図３６Ｂに示されるすべての残りのＴＥＭ顕微鏡写真では、すべてのブラックボックスが取り除かれている。しかし、白矢印２０２は、後に用手的に加えられるが、これらは、各ＴＥＭ顕微鏡写真中の異なる基準軸索２０３を参照して測定すると、熟練したオペレータにより損傷されていると判断される軸索（１）と（２）に対応することを理解されたい。
【０２７１】
こうして、図３０Ｂは、対照群１におけるマウスの脳梁の代表的な断面を示す。図３０Ｂは、１つの白い星印２０３を基準軸索と、熟練したオペレータにより損傷されていると決定される脱ミエリン化された軸索（１）と（２）に対応する１２個の白矢印２０２とを示す。
【０２７２】
同様に、図３０Ｃは、対照群１のマウスの脳梁の別の代表的な断面に対応する。この場合、基準軸索２０３はまた、白い星印２０３を用いて同じ方法で示され、脱ミエリン化された軸索（１）と（２）のそれぞれも、２０２番の白矢印で示されている。図３０Ｃは、１１個の脱ミエリン化軸索を示す。
【０２７３】
同様に、図３１Ａ及び３１Ｂは、群２の代表的なマウスから取った２つの代表的なＴＥＭ顕微鏡写真（これも１６，０００Ｘで撮影された）を示し、また、白い星印を有する各ＴＥＭ画像中の類似の基準軸索２０３と、図３１Ａ中の１５個の脱ミエリン化軸索２０２と、及び図３１Ｂ中の１７個の脱ミエリン化軸索２０２とを特定している。
【０２７４】
同様に、群３〜７のそれぞれからのマウスはまた、これらの各群のマウスから取った脳梁の２つの類似の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真によって示されている。
【０２７５】
図３２Ａ及び３２Ｂは、群３のマウスの脳梁の代表的ＴＥＭ画像に対応し、それぞれ、基準軸索２０３と、２３個の脱ミエリン化軸索２０２と、２０個の脱ミエリン化軸索２０２と、を示す。
【０２７６】
図３３Ａ及び３３Ｂは、群４のマウスの脳梁の代表的ＴＥＭ画像に対応し、それぞれ、基準軸索２０３と、１７個の脱ミエリン化軸索２０２と、１９個の脱ミエリン化軸索２０２と、を示す。
【０２７７】
図３４Ａ及び３４Ｂは、群５のマウスの脳梁の代表的ＴＥＭ画像に対応し、それぞれ、基準軸索２０３と、１３個の脱ミエリン化軸索２０２と、１５個の脱ミエリン化軸索２０２と、を示す。
【０２７８】
図３５Ａ及び３５Ｂは、群６のマウスの脳梁の代表的ＴＥＭ画像に対応し、それぞれ、基準軸索２０３と、１８個の脱ミエリン化軸索２０２と、１５の脱ミエリン化軸索２０２と、を示す。
【０２７９】
図３６Ａ及び３６Ｂは。群７のマウスの脳梁の代表的ＴＥＭ画像に対応し、それぞれ、基準軸索２０３と、１５個の脱ミエリン化軸索２０２と、１４個の脱ミエリン化軸索２０２と、を示す。
【０２８０】
【表４】
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【０２８１】
表４は、同様にして調べた、図３０〜３６に示された代表的顕微鏡写真と同様のＴＥＭ顕微鏡写真の総数を、要約形式で示す。この点で、例えば、群１のマウスについて４５個の総ＴＥＭ顕微鏡写真が調べられた。更に、群１について調べられた４５個のＴＥＭ顕微鏡写真のうちで、合計４１９の脱ミエリン化軸索がカウントされた。表４の第４列は、「顕微鏡写真１枚あたりのカウントされた脱ミエリン化軸索の加重平均」を記載し、群１について「１０」であったことを記載する。加重平均は以下のように達成されたことに留意すべきである。
【０２８２】
群１〜７のそれぞれの中で、各マウスからの代表的な脳梁試料が、複数の場所で撮影された。各脳梁の試料について、すべての顕微鏡写真中の「カウントされた脱ミエリン化軸索の総数」が合計され、各試料の顕微鏡写真１枚当たりの脱ミエリン化軸索の平均数が決定された（結果は示していない）。いくつかのの灌流工程の変動のために、いくつかの脳梁試料は、計数のために使用することができた多数のより良好な品質の顕微鏡写真を有した。従って、脳梁の各試料の脱ミエリン化軸索の平均数は、その試料の顕微鏡写真のセットの品質に応じて、重みが割り当てられた。重みは次のように決定された。マウスの群からの脳梁の各試料について、その試料について特定された脱ミエリン化軸索の数を、その群について特定された脱ミエリン化軸索の総数で割った。これが試料の重みである。各試料の重みに、顕微鏡写真１枚当たりの脱ミエリン化軸索の試料平均を乗じた。これらの加重試料平均を各群にわたって合計し、表４に「顕微鏡写真１枚当たりのカウントされた脱ミエリン化軸索の加重平均」として報告した。
【０２８３】
表４の最後の列は、「顕微鏡写真１枚当たりの脱ミエリン化軸索の調整後加重平均」を示す。これらの数は、前の列から「１０」を減算して決定した。「１０」は、顕微鏡写真で「バックグラウンドノイズ」に有効に対応する。
【０２８４】
「顕微鏡写真１枚当たりの脱ミエリン化軸索の調整後加重平均」の最大の数は群３中に存在し、一方「顕微鏡写真１枚当たりの脱ミエリン化軸索の調整後加重平均」の最小の数は群１（すなわち対照群）中に存在する。
【０２８５】
要するに、脳梁の代表的部分の合計３１３枚のＴＥＭ顕微鏡写真は、群１〜７のそれぞれのマウスの変動する数について検討され、その結果、カウントされた脱ミエリン化軸索の総数は約４，２００であった。表２は、各マウス群についてカウントされた脱ミエリン化軸索の加重平均を報告する。
【０２８６】
ＴＥＭ顕微鏡写真１枚当たりの「脱ミエリン化」軸索の総数の測定が、できるだけ客観的であることを意図した方法で実行されたことを理解すべきである。この点において、脳梁の無作為に選択された部分は、別々に顕微鏡写真を撮られた。軸索間に十分な明確な区別を提供した顕微鏡写真（すべて、もともと１６，０００Ｘで撮影された）は、次に「脱ミエリン化」軸索をカウントするための顕微鏡写真候補であった。いくつかのマウス脳は、試料調製工程の間、完全な灌流を受けておらず、このため、ＴＥＭ画像の一部は不鮮明になったか、又は許容できないアーチファクトを含有したことに留意されたい。例えば、あまりにもぼやけていて読むことができず、及び／又は多すぎるアーチファクトを含有したランダムに選択された顕微鏡写真のすべてが取り除かれた後に、残りのすべてのＴＥＭ写真は上記したように分析され、表４に要約されている。
【０２８７】
このように、群４〜７のそれぞれのマウスに使用されたＣＮＭ−Ａｕ８金ナノ結晶懸濁液のそれぞれは、（ｉ）「顕微鏡写真１枚当たりの脱ミエリン化軸索の調整後加重平均」が、群３のマウスの「顕微鏡写真１枚当たりの脱ミエリン化軸索の調整後加重平均」より小さいことと、及び（ｉｉ）「顕微鏡写真１枚当たりの脱ミエリン化軸索の調整後加重平均」が、対照群１のマウスの「顕微鏡写真１枚当たりの脱ミエリン化軸索の調整後加重平均」より大きいことと、をもたらした。
【０２８８】
これらのデータは、クプリゾン食が、マウス脳の脳梁領域においていくつかの脱ミエリン化軸索をもたらすこと、及び、ＣＮＭ−Ａｕ８金ナノ結晶懸濁液が、哺乳動物が軸索の脱ミエリン化の量を低減するための、効果的な治療（治療的及び予防的の両方）であることを示唆している。
【０２８９】
ＩＩＩ．１６，０００×と４０，０００×で撮影した画像に示された軸索の再ミエリン化
クプリゾン食によるミエリン損傷の量に対して、ＣＮＭ−Ａｕ８金ナノ結晶懸濁液の何らかの正の治療効果があるかどうかを判定するための別の客観的方法は、群１〜７のそれぞれのマウスの脳の脳梁領域中に、何らかの再ミエリン化が観察されるかどうかを測定することである。群１〜７の試験の詳細は、前述したように表３に記載されている。
【０２９０】
この点で、図３７〜４０は、群４〜７のマウスの脳梁の代表的領域の各顕微鏡写真のスケール棒で示されるように、１６，０００×又は４０，０００×のいずれかで撮影された代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示す。なお、ＴＥＭ画像上で「２０１Ｍ」と指定されたものと類似の軸索が、群１〜３のマウスの脳梁部分に観察されなかったため、代表的なＴＥＭ画像は、予防的処理群４と６、及び治療的処理群５と７のみを示すことに留意されたい。具体的には、矢印２０１Ｍは、文献に従うと、再ミエリン化された軸索と考えられる8、薄く暗いコンパクトなミエリン化領域を示す。群１〜３のマウスに対応する代表的顕微鏡写真中に、軸索上の同様の薄く暗いコンパクトな領域は見られなかった。
【０２９１】
図３７Ａ〜３７Ｋは、１６，０００×と４０，０００×の両方で撮影された、群４のマウスからのＴＥＭ画像に対応する。これらの図は、いくつかの矢印２０１Ｍを示す。これらの矢印２０１Ｍは、文献が再ミエリン化軸索8とみなすものに向けられている。近くの又は近傍の軸索は基準点として使用することができ、これらの近隣の軸索は暗いミエリン領域がないため、より暗いミエリン領域が、試料調製又はＴＥＭイメージングプロセスのアーチファクトではないことを理解すべきである。
【０２９２】
図３８Ａ〜３８Ｌは、１６，０００×と４０，０００×の両方で撮影された、群５のマウスからのＴＥＭ画像に対応する。これらの図は、いくつかの矢印２０１Ｍを示す。これらの矢印２０１Ｍは、文献が再ミエリン化軸索8とみなすものに向けられている。近くの又は近傍の軸索は基準点として使用することができ、これらの近隣の軸索は同様の暗いミエリン領域がないため、より暗いミエリン領域が、試料調製又はＴＥＭイメージングプロセスのアーチファクトではないことを理解すべきである。
【０２９３】
図３９Ａ〜３９Ｊは、１６，０００×と４０，０００×の両方で撮影された、群６のマウスからのＴＥＭ画像に対応する。これらの図は、いくつかの矢印２０１Ｍを示す。これらの矢印２０１Ｍは、文献が再ミエリン化軸索8とみなすものに向けられている。近くの又は近傍の軸索は基準点として使用することができ、これらの近隣の軸索は同様の暗いミエリン領域がないため、より暗いミエリン領域が、試料調製又はＴＥＭイメージングプロセスのアーチファクトではないことを理解すべきである。
【０２９４】
図４０Ａ〜４０Ｇは、１６，０００×と４０，０００×の両方で撮影された、群７のマウスからのＴＥＭ画像に対応する。これらの図も、いくつかの矢印２０１Ｍを示す。これらの矢印２０１Ｍは、文献が再ミエリン化軸索8とみなすものに向けられている。近くの又は近傍の軸索は基準点として使用することができ、これらの近隣の軸索は同様の暗いミエリン領域がないため、より暗いミエリン領域が、試料調製又はＴＥＭイメージングプロセスのアーチファクトではないことを理解すべきである。
【０２９５】
矢印２０１Ｍにより示される再ミエリン化軸索の存在は、ＣＮＭ−Ａｕ８金ナノ結晶懸濁液が、再ミエリン化軸索を達成する（例えば、群１〜３のマウスで観察された同様の脳梁領域中の軸索に対して、再ミエリン化軸索の量を増加させる）ための、哺乳動物のための効果的な治療（治療的及び予防的の両方）であったことを示唆する。
【０２９６】
ＩＶ．軸索上のミエリンのＧ比測定と定量
クプリゾン食によるミエリン損傷の量に対して、ＣＮＭ−Ａｕ８金ナノ結晶懸濁液の何らかの正の治療効果があるかどうかを判定するための別の客観的方法は、文献５、６に従って、マウス群１〜７のそれぞれのマウスの脳の脳梁領域中の軸索上のミエリンのＧ比を計算し比較することである、Ｇ比の計算は、異なる病理学的効果を推定するための別の認識された手段である。
【０２９７】
具体的には、Ｇ比の測定と定量は、軸索上に存在するミエリンコーティングの相対量の機能的及び構造的な指標（すなわち、軸索ミエリン化）として広く使用されている。Ｇ比が高いほど、軸索の直径に対してミエリンはより薄く、逆に、Ｇ比が低いほど、軸索に対してミエリン鞘はより厚い。すなわち一般的に、基準内で、報告されたＧ比が低いほど、より良好である。具体的には、脳の脳梁領域のミエリン化軸索の平均Ｇ比の範囲は、０．７５〜０．８１5であることが報告されている。
【０２９８】
図４１〜４７は、それぞれ、群１〜７のそれぞれのマウスからの脳梁領域の代表的な断面領域の画像上のスケール棒上で示されるように、もともと４０，０００×で撮影した代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示す。群１〜７のための試験の詳細は、前述のように、表３に記載されている。
【０２９９】
簡単に説明すると、本明細書に記載のように、代表的なＴＥＭ画像から取られた代表軸索上の内側と外側のミエリン径をトレースでマークし、次に、測定し、合計し、平均化し、Ｇ比を決定するために使用した。
【０３００】
具体的には、７つの群のそれぞれのマウスに対応するマウスの神経軸索を含有するランダムに選択された断面領域を、最初に選択した。次に、もともと４０，０００×で撮影されたＴＥＭ顕微鏡写真は、ランダムに選択された領域からなっていた。Image Jソフトウェアを使用して、ＴＥＭ顕微鏡写真に示されている多数の軸索の周囲の内側（２０４Ｉ）及び外側（２０４０）周辺を、まずコンピュータータッチ画面上でスタイラスでトレースした。スタイラスで生成されたトレーシングを使用する測定値は、トレース軸索の内側（２０４Ｉ）と外側（２０４０）周辺で作成した。文献によれば、軸索／ミエリン鞘コーティングの観察された断面領域は、同心円であると仮定された。
【０３０１】
次に、測定された軸索の外周（２０４Ｉ）（ミエリン内周にも対応し、本明細書では両方が参照される）を、一緒した軸索とミエリン鞘の外周（２０４０）で割ることにより、Ｇ比を算出した。
【０３０２】
図４１〜４７は、その上に置かれた内側（２０４Ｉ）と外側（２０４０）ミエリン周辺に対応するトレースを有する脳梁中の神経軸索の断面の、ランダムに選択された代表的ＴＥＭ画像のいくつかを示す。
【０３０３】
図４１Ａ〜４１Ｃは、実施例３の群１のマウスの脳梁の代表的部分に対応する代表的ＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×画像であり、ミエリンの内側（２０４Ｉ）と外側（２０４０）周辺が、その上の各軸索上で標識されていることを示す。
【０３０４】
図４２Ａ〜４２Ｄは、実施例３の群２のマウスの脳梁の代表的部分に対応する代表的ＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×画像であり、ミエリンの内側（２０４Ｉ）と外側（２０４０）周辺が、その上の各軸索上で標識されていることを示す。
【０３０５】
図４３Ａ〜４３Ｃは、実施例３の群３のマウスの脳梁の代表的部分に対応する代表的ＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×画像であり、ミエリンの内側と外側周辺が、その上の各軸索上で標識されていることを示す。
【０３０６】
図４４Ａ〜４４Ｂは、実施例３の群４のマウスの脳梁の代表的部分に対応する代表的ＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×画像であり、ミエリンの内側と外側周辺が、その上の各軸索上で標識されていることを示す。
【０３０７】
図４５Ａ〜４５Ｃは、実施例３の群５のマウスの脳梁の代表的部分に対応する代表的ＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×画像であり、ミエリンの内側と外側周辺が、その上の各軸索上で標識されていることを示す。
【０３０８】
図４６Ａ〜４６Ｂは、実施例３の群６のマウスの脳梁の代表的部分に対応する代表的ＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×画像であり、ミエリンの内側と外側周辺が、その上の各軸索上で標識されていることを示す。
【０３０９】
図４７Ａ〜４７Ｅは、実施例３の群７のマウスの脳梁の代表的部分に対応する代表的ＴＥＭ顕微鏡写真画像を示す。これらの画像は高倍率４０，０００×画像であり、ミエリンの内側と外側周辺が、その上の各軸索上で標識されていることを示す。
【０３１０】
表５は、上記測定から得られた結果の要約を含む。具体的には、表５は、マークされ、加算され、測定されて、Ｇ比を計算された軸索の総数を示す。測定は、群１の少ない７７個の軸索について行われ、一方、群２の多い３７４個の軸索について行なった。
【０３１１】
表５の第４列列に報告された「平均値の標準誤差」（「ＳＥＭ」）は、母集団の標本平均の推定値の標準偏差である。（試料平均は不偏推定量であることから、ＳＥＭは、真の平均に対して、試料中の誤差の標準偏差として見ることもできる）。ＳＥＭは、試料サイズの平方根で割った、母集団の標準偏差の試料の推定値（試料標準偏差）により推定した。
【０３１２】
【表５】
2019108387.tif 000009
【０３１３】
本明細書で前に述べたように、クプリゾン食によって引き起こさミエリン分解は、ＴＥＭによって観察される脳梁の断面積の様々な部分において、ミエリン化軸索に対して不均一な効果を有することが見出された。
【０３１４】
この点で、図４８〜５０は、表５にまとめたＧ比測定値を異なった方法で表す。図４８〜５０は、Ｇ比の棒グラフのヒストグラムであり、各マウス群について、Ｙ軸上の軸索のＧ比の頻度割合と、Ｘ軸上のＧ比の分布とを示す。
【０３１５】
これらの図４８〜５０はまた、「ＮＭＹ」と表示された棒を含み、これは、ヒストグラムの他の棒のＧ比計算値の一部ではないが、面積標準化された方法で、それぞれのマウス群の「脱ミエリン化された」軸索の数を表す（すなわち、既に決定され、「単位面積あたりの脱ミエリン化軸索の数の定量」と題する本明細書のセクションＩＩで報告されているように）。ＮＭＹ棒の存在により、各チャートを、以下「修飾された棒グラフヒストグラム」と呼ぶ。
【０３１６】
マウス群１、２、３のＧ比データを含む修飾された棒グラフのヒストグラムは、それぞれ図４８Ａ、４８Ｂ、及び４８Ｃに現れる。
【０３１７】
マウス群３、５、７のＧ比データを含む修飾された棒グラフのヒストグラムは、それぞれ図４９Ａ、４９Ｂ、及び４８Ｃに現れる。
【０３１８】
マウス群３、４、６のＧ比データを含む修飾された棒グラフのヒストグラムは、それぞれ図５０Ａ、５０Ｂ、及び４８Ｃに現れる。
【０３１９】
更に図４８Ａは、マウスの対照群１のＧ比データを含む修飾された棒グラフヒストグラムを示す。各棒の上の数字に注意されたい。これらの数字は、単位面積当たりの、その上に上記したＧ比を有する軸索の、単位面積あたりの発生パーセントに対応する。具体的には、パーセント数は、以前カウントされた、同一の単位面積あたりの「脱ミエリン化された」軸索の全てを説明するために標準化されている（すなわち、パーセント番号はＮＭＹ値を含む）。修飾された棒グラフヒストグラム中の数字の両方のセットを報告することは、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液の治療効果のいくつかのより完全な理解を与えることができると考えられる。
【０３２０】
修飾された棒グラフヒストグラムの左右両側の両方の陰影領域に、更に注意されたい。これらの陰影領域は、例えば、図４８Ｂ及び４８Ｃと重複し、多少異なるか又は多少類似したデータを含む修飾された棒グラフヒストグラムの部分に注意を向けるように意図されている。また、ＮＭＹ棒２１０上のクロスハッチングにも注意されたい。同じクロスハッチングは、修飾された棒グラフヒストグラムのそれぞれの他のすべての「ＮＭＹ」棒について発生する。対照群１のマウスは正常又は健康と考えられるべきであるため、図４８Ａの修飾された棒グラフヒストグラムは、異なる群間の比較を行うための良好な出発点（すなわち、「陽性対照」）として考えることができるであろう。
【０３２１】
同様に、クプリゾン食を与えたマウスに対応する修飾された棒グラフヒストグラムが、図４８Ｂ及び４８Ｃに表わされる。図４８Ｃの修飾された棒グラフヒストグラムは、異なる群間の比較を行うための良好な出発点（すなわち「陰性対照」）として考えることができる。例えば、棒２１０ｂは、図４８Ａ中の棒２１０に対応する同じクロスハッチングを含むだけでなく、上述したように、より多くの「脱ミエリン化」された軸索を示す充実部分を含む。
【０３２２】
図４９Ａ、４９Ｂ、及び４９Ｃは、それぞれ、群３（陰性対照）、群５、及び群７のマウスに対応する修飾された棒グラフヒストグラムを含む。これら３つの修飾された棒グラフヒストグラムは、比較のために一緒に配置されている。修飾された棒グラフヒストグラムの特徴は非常に似ている。
【０３２３】
図５０Ａ、５０Ｂ、及び５０Ｃはまた、それぞれ、群３（陰性対照）、群４、及び群６のマウスに対応する修飾された棒グラフヒストグラムを含む。これら３つの修飾された棒グラフヒストグラムは、比較のために一緒に配置されている。図５０Ｂ及び５０Ｃの特徴は互いによく似ており、図５０Ａに示される陰性対照とは全く異なっている。
【０３２４】
比較を容易にするために、同じ修飾された棒グラフヒストグラムが、図５１にすべて現れる。
【０３２５】
図４８Ａ、Ｂ、及びＣ中でＧ比サイズ０．６５について、図４８Ｂは、群２が、Ｇ比サイズ０．６５を有する軸索の１７％を有したことを示すことに留意すべきである。文献に説明されているように、その軸索のミエリン化に関連した利益を上回る、軸索導体容量の無制限の拡張を可能にはしない、個々の軸索の理論的な限界がある。最適な効率の冠状軸索の予測された実験的に観察されたＧ比の範囲は、０．７６〜０．８０5の少し上までのオーダーであろう。図４８Ｂでは、０．６５のＧ比サイズを有する軸索の小集団は、通常のＧ比ものより少なく、クプリゾン食への早期応答であると考えられた。従って、そのような軸索は、正常に又は良好に機能することは期待されないであろう5。
【０３２６】
図５０Ｂ及び５０Ｃに示される同様の修飾された棒グラフヒストグラムは、（１）群４からのマウスであって、提供された金ナノ懸濁液が有効な治療量であったかどうかを判定するために、試験の５週間すべてにわたってクプリゾン食を与えられ、かつ、強制経口投与により、試験の５週間すべてにわたって、１日に１回、約１０ｍＬ／ｋｇの濃縮ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液の治療容量を、約１０００ｐｐｍの金結晶濃度で与えられたマウス、及び（２）群６からのマウスであって、提供された金ナノ懸濁液が有効な治療量として作用したかどうかを決定するために、試験の５週間すべてにわたってクプリゾン食を与えられ、かつ、水瓶から自由に、治療ＣＮＭ−Ａｕ８懸濁液を、約５０ｐｐｍの結晶性金濃度で、試験の５週間すべてにわたって飲んだマウス、に対応することに、注意されたい。
【０３２７】
図５０Ｂ及び５０Ｃは、群４のマウスと群６マウスの両方が、その軸索の約５％が０．６５のＧ比を有することを示す。このＧ比は、脱ミエリン化疾患からの回復過程にある軸索／ミエリンを表すものとして、文献に記載されている。ここで、ＣＮＳ軸索は、回復中に高再ミエリン化の初期期間を経て、最終的に通常のＧ比5に戻るしばらく前に増大した直径を示す。これらのデータは、ミエリン保存が起こり得ることを意味すると理解するべきである。
このデータ（ならびに本明細書中の他のすべてのデータ）から、必要な濃度、量、及び／又は処置時間を決定することは困難であるが、本明細書に記載のＣＮＭ−Ａｕ８処置を提供する関数として、異なる生物学的（病的）事象が発生することは明らかである。
【０３２８】
結論
データは、以下を示唆している：
１．  図４８Ａ中の修飾された棒グラフヒストグラムを、図４８Ｂ及び４８Ｃ中の修飾された棒グラフヒストグラムの１つ又は両方と比較することにより示されるように、クプリゾン食と水とを５週間与えられたマウスは、試験者によって求められていた典型的な脱ミエリン化を示した。
２．  クプリゾン食及びＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液を（強制経口投与又は自由摂取により）、試験の５週間すべてにわたって与えられたマウスは、同様の修飾された棒グラフヒストグラム（図５０Ｂ及び５０Ｃを参照）を有し、これらの両方とも陰性対照より優れていた（図５０Ａ参照）。
３．  単独のＧ比データは、ＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液が、試験の５週間すべてにわたってクプリゾン食とＣＮＭ−Ａｕ８ナノ懸濁液に曝露された群４と群６のマウスに、正の影響を与えたことを示唆する。
【０３２９】
参考文献
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14.  GAS6 Enhances Repair Following Cuprizone-Induced Demyelination.  Tsiperson V, et al.  (2010)
15.  Glial Response During Cuprizone-Induced De- and Remyelination in the CNS:  Lessons Learned.  Gudi V1, et al.  (2014)
【図１】
2019108387.tif 000010
【図２Ａ】
2019108387.tif 000011
【図２Ｂ】
2019108387.tif 000012
【図２Ｃ】
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【図３】
2019108387.tif 000014
【図４Ａ】
2019108387.tif 000015
【図４Ｂ】
2019108387.tif 000016
【図５Ａ】
2019108387.tif 000017
【図５Ｂ】
2019108387.tif 000018
【図５Ｃ】
2019108387.tif 000019
【図５Ｄ】
2019108387.tif 000020
【図６】
2019108387.tif 000021
【図７】
2019108387.tif 000022
【図８】
2019108387.tif 000023
【図９】
2019108387.tif 000024
【図１０Ａ】
2019108387.tif 000025
【図１０Ｂ】
2019108387.tif 000026
【図１０Ｃ】
2019108387.tif 000027
【図１１】
2019108387.tif 000028
【図１２】
2019108387.tif 000029
【図１３】
2019108387.tif 000030
【図１４Ａ】
2019108387.tif 000031
【図１４Ｂ】
2019108387.tif 000032
【図１４Ｃ】
2019108387.tif 000033
【図１４Ｄ】
2019108387.tif 000034
【図１５】
2019108387.tif 000035
【図１６】
2019108387.tif 000036
【図１７】
2019108387.tif 000037
【図１８】
2019108387.tif 000038
【図１９】
2019108387.tif 000039
【図２０】
2019108387.tif 000040
【図２１】
2019108387.tif 000041
【図２２】
2019108387.tif 000042
【図２３Ａ】
2019108387.tif 000043
【図２３Ｂ】
2019108387.tif 000044
【図２３Ｃ】
2019108387.tif 000045
【図２４Ａ】
2019108387.tif 000046
【図２４Ｂ】
2019108387.tif 000047
【図２４Ｃ】
2019108387.tif 000048
【図２４Ｄ】
2019108387.tif 000049
【図２４Ｅ】
2019108387.tif 000050
【図２５Ａ】
2019108387.tif 000051
【図２５Ｂ】
2019108387.tif 000052
【図２５Ｃ】
2019108387.tif 000053
【図２５Ｄ】
2019108387.tif 000054
【図２５Ｅ】
2019108387.tif 000055
【図２５Ｆ】
2019108387.tif 000056
【図２５Ｇ】
2019108387.tif 000057
【図２６Ａ】
2019108387.tif 000058
【図２６Ｂ】
2019108387.tif 000059
【図２６Ｃ】
2019108387.tif 000060
【図２６Ｄ】
2019108387.tif 000061
【図２６Ｅ】
2019108387.tif 000062
【図２７Ａ】
2019108387.tif 000063
【図２７Ｂ】
2019108387.tif 000064
【図２７Ｃ】
2019108387.tif 000065
【図２７Ｄ】
2019108387.tif 000066
【図２８Ａ】
2019108387.tif 000067
【図２８Ｂ】
2019108387.tif 000068
【図２８Ｃ】
2019108387.tif 000069
【図２８Ｄ】
2019108387.tif 000070
【図２８Ｅ】
2019108387.tif 000071
【図２８Ｆ】
2019108387.tif 000072
【図２８Ｇ】
2019108387.tif 000073
【図２９Ａ】
2019108387.tif 000074
【図２９Ｂ】
2019108387.tif 000075
【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０Ａ】
2019108387.tif 000078
【図３０Ｂ】
2019108387.tif 000079
【図３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
2019108387.tif 000081
【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３７Ｅ】
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【図３７Ｆ】
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【図３７Ｇ】
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【図３７Ｈ】
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【図３７Ｉ】
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【図３７Ｊ】
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【図３７Ｋ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【図３８Ｆ】
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【図３８Ｇ】
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【図３８Ｈ】
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【図３８Ｉ】
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【図３８Ｊ】
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【図３８Ｋ】
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【図３８Ｌ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図３９Ｅ】
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【図３９Ｆ】
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【図３９Ｇ】
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【図３９Ｈ】
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【図３９Ｉ】
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【図３９Ｊ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４０Ｆ】
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【図４０Ｇ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４７Ｄ】
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【図４７Ｅ】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月14日(2019.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類におけるニューロンの再ミエリン化を促進するための組成物であって、ここで前記ニューロンは細胞呼吸の妨害により脱ミエリン化されたものであり、
ここで前記組成物は、
ａ）医薬グレードの水と、
ｂ）少なくとも１つの処理促進剤と、
ｃ）前記水に懸濁されて懸濁液を形成する金ナノ結晶とを含み、
ここで前記金ナノ結晶が、
ｉ）複数の表面を含み、当該表面が、（１）有機化学成分が前記表面に吸着又は結合されていない、及び／又は、（２）実質的に清浄で、水又は前記処理促進剤の他には、前記ナノ結晶の機能性を変更する化学成分が表面に吸着又は結合されていない、という特性からなる群から選択される少なくとも１つの特性を含み、
ii）最頻値粒子サイズが約５０ｎｍ未満であり、且つ、
iii）前記懸濁液中に約２〜２０００ｐｐｍの濃度で存在し、
ここで前記懸濁液のｐＨが約５〜約９.５であり、ゼータ電位が少なくとも約−３０ｍｖである、医薬組成物。
【請求項２】
前記懸濁液のゼータ電位が少なくとも約−４０ｍＶである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記金ナノ結晶が２〜２００ｐｐｍの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記再ミエリン化が、オリゴデンドロサイトの増殖及び分化からなる群から選択される１以上の作用を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記再ミエリン化が、中枢神経系のニューロンの再ミエリン化を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
経口投与される、請求項１〜５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
哺乳類におけるニューロンの再ミエリン化を促進するための組成物であって、ここで前記ニューロンは細胞呼吸の妨害により脱ミエリン化されたものであり、ここで前記組成物は元素金ナノ懸濁液を含む、組成物。
【請求項８】
前記再ミエリン化が、オリゴデンドロサイトの増殖又は分化からなる群から選択される１以上の作用を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
経口投与される、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
進行性核上麻痺、アレキサンダー病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、カナヴァン病、白質ジストロフィー、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊 （Central Pontine Myelolysis：ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、ツェルウェーガー症候群、ギラン・バレー症候群（Guillain-Barre Syndrome：ＧＢＳ）、ファンデルナープ症候群、慢性炎症脱ミエリン化多発ニューロパシー（chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy：ＣＩＤＰ）、多巣性運動ニューロパシー（multifocal motor neuropathy：ＭＭＮ）、視神経脊髄炎（Neuromyelitis Optica：ＮＭＯ）、視神経炎（Optic Neuritis）、進行性多巣性白質脳症（Progressive Multifocal Leukoencephalopathy：ＰＭＬ）、軽度認識障害（Mild Cognitive Impairment：ＭＣＩ）、ウォラー変性、並びに一部の遺伝病、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、及びペリツェウス・メルツバッハー病（Pelizaeus Merzbacher Disease：ＰＭＺ）からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療に使用される、請求項１〜９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記疾患が視神経脊髄炎（Neuromyelitis Optica）を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記疾患が視神経炎（Optic Neuritis）を含む、請求項１０又は１１に記載の組成物。