(57)【要約】【課題】キシロース代謝能を有する組換え酵母における酢酸に対する代謝能を向上させる。【解決手段】アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入したキシロース代謝能を有する組換え酵母であって、ミトコンドリア外膜における細胞質NADHの再酸化に関与するNADH脱水素酵素をコードする遺伝子を抑制する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入したキシロース代謝能を有する組換え酵母であって、ミトコンドリア外膜における細胞質NADHの再酸化に関与するNADH脱水素酵素をコードする遺伝子を抑制したことを特徴とする組換え酵母。
【請求項２】
上記NADH脱水素酵素をコードする遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
(a)配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、NADHをNAD+とする反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
【請求項３】
キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項４】
上記キシロースイソメラーゼ遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項３記載の組換え酵母。
(a)配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号６に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、キシロースをキシルロースにする酵素活性を有するタンパク質
【請求項５】
更にキシルロキナーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項６】
ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群から選ばれる酵素をコードする遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項７】
上記ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群は、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼであることを特徴とする請求項６記載の組換え酵母。
【請求項８】
上記組換え酵母は、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子を高発現することを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項９】
上記組換え酵母は、エタノールをアセトアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子の発現量が低下したものであることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれか一項記載の組換え酵母を、キシロースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
【請求項１１】
上記培地はセルロースを含有しており、上記エタノール発酵では、少なくとも上記セルロースの糖化が同時に進行することを特徴とする請求項１０記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシロース代謝能を有する組換え酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系バイオマスは、エタノール等の有用なアルコールや有機酸の原料として有効に利用されている。セルロース系バイオマスを利用したエタノール製造において、エタノール生産量を向上させるため、基質として５単糖のキシロースを利用できる酵母が開発されている。例えば、特許文献１は、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子とS. cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を染色体に組み込んだ酵母を開示している。
【０００３】
また、酢酸は、セルロース系バイオマスの加水分解物に多く含まれ、酵母のエタノール発酵を阻害することが知られている。特に、キシロースの資化遺伝子を導入した酵母においては、キシロースを糖源としたエタノール発酵を著しく阻害することが知られている（非特許文献１及び２）。
【０００４】
一方、セルロース系バイオマスをセルラーゼで糖化したものを発酵したもろみには、主として、未発酵残査、難発酵残渣、酵素及び発酵用微生物が含まれている。もろみを含む反応液を次に行う発酵に再利用することで発酵用微生物の再利用ができ、発酵用微生物の新規投入量を削減でき、低コスト化を図ることができる。しかし、この場合、もろみに含まれる酢酸も同時に持ち込まれることになり、その結果、再利用を繰り返すことで発酵培地に含まれる酢酸の濃度が上昇し、エタノール発酵を阻害する虞がある。また、発酵槽内のもろみを、減圧に保持したフラッシュタンクに送り、フラッシュタンク内でエタノールを除去した後、もろみを発酵槽に返送するような連続発酵法においても、酢酸をもろみから取り除くことは難しいため、酢酸による発酵阻害が重要な問題となる。したがって、発酵液中の酢酸を発酵工程中に低減させることは、コスト低減を図る上で非常に有意義な事項であると考えられる。
【０００５】
酢酸による発酵阻害を回避するため、エタノール発酵で一般的に用いられる菌株であるサッカロマイセス・セレビシエのLPP1遺伝子やENA1遺伝子の過剰発現（非特許文献３）、FPS1遺伝子の破壊（非特許文献４）により、酢酸存在下でエタノールの発酵能力が改善されている報告がある。しかしながら、これらの報告は、グルコースを基質とした場合のエタノール発酵の結果であり、酢酸により発酵が著しく阻害されるキシロースを基質とした場合のエタノール発酵に対する効果は不明である。また、これらに報告された変異酵母を用いたとしても、上述したような発酵菌体再利用や連続発酵の際に問題になる酢酸の持ち込み量を減らすことには繋がらない。さらに、酢酸存在下でのエタノール発酵能力が改善されたとしても、培地に含有される酢酸自体を代謝分解しなければ、酵母自体が生産する酢酸により、再利用する度に含有酢酸量が増加してしまう。
【０００６】
酢酸による発酵阻害を回避する別の方法としては、培地中の酢酸をエタノール発酵と同時に代謝させることが考えられる。しかし、酢酸の代謝は好気的な反応であり、エタノールの代謝経路と重複する。そのため、好気的な条件で発酵を行うと酢酸を代謝させることができる可能性はあるものの、同時に目的物質であるエタノールも代謝される。
【０００７】
エタノールが代謝されない嫌気的な条件で酢酸を代謝させるために、サッカロマイセス・セレビシエのグルセリン生産経路のGPD1・GPD2遺伝子を破壊した株に、アセトアルデヒド脱水素酵素(EC 1.2.1.10)をコードするmhpF遺伝子を導入することで、酢酸を資化させた報告がある（非特許文献５、特許文献２、非特許文献６、特許文献３及び特許文献４）。なお、アセトアルデヒド脱水素酵素は以下の可逆反応を触媒する。
【０００８】
アセトアルデヒド＋NAD＋＋コエンザイムA⇔アセチルコエンザイムA＋NADH＋H+
なお、GPD1・GPD2遺伝子によるグルセリン生産経路は、下記式に示すように、代謝で発生する余剰の補酵素NADHをNAD＋に酸化する経路である。
【０００９】
0.5グルコース＋NADH＋H+＋ATP→グリセリン＋NAD＋＋ADP＋Pi
よってGPD1・GPD2遺伝子を破壊することでこの反応経路を破壊し、mhpFを導入することで余剰の補酵素NADHを供給し、下記の反応が進む。
アセチルコエンザイムA＋NADH＋H+→アセトアルデヒド＋NAD＋＋コエンザイムA
また、アセチルコエンザイムAは酢酸からアセチル-CoA合成酵素により合成され、アセトアルデヒドはエタノールに変換されることから、最終的には下記反応式になり、余剰の補酵素NADHが酸化されると同時に、酢酸も代謝される。
酢酸＋2NADH＋2H+＋ATP→エタノール＋NAD＋＋AMP＋Pi
【００１０】
上述したように、酵母に対する酢酸代謝能の付与メカニズムは、グリセリン経路を破壊する必要がある。しかしながら、GPD1遺伝子及びGPD2遺伝子の重複破壊株は、発酵能力が大幅に低下することが知られており、産業レベルでの実用性は低い。また、非特許文献５及び特許文献２は、キシロース資化酵母に関する報告ではなく、キシロース資化時に効果があるか不明である。
【００１１】
また、GPD1遺伝子及びGPD2遺伝子を破壊する代わりに、キシロース代謝経路を構成するキシロースレダクターゼ（XR）及びキシリトールデヒドロゲナーゼ（XDH）を導入することで、XRとXDH間の補酵素依存性の違いによる細胞内の酸化還元状態の不均衡を生じさせことで、余剰の補酵素NADHを供給する報告がある（非特許文献７）。すなわち、XRはキシロースをキシリトールに変換する際に補酵素として、おもにNADPHを使用する（NADPH をNADP+に変換）。一方、XDHはキシリトールをキシルロースへと変換する際に補酵素として、NAD+を使用する（NAD+をNADHに変換）。この様に両酵素の補酵素に対する要求性にアンバランスがあるためNADHが蓄積する。しかし、このXR・XDH導入酵母におけるキシロースからのエタノール発酵は、中間代謝物キシリトールが蓄積する。その結果、酢酸は代謝されるものの、糖質からのエタノール収率が悪いため実用的ではない。
【００１２】
さらに、GPD1遺伝子及びGPD2遺伝子の非破壊株にmhpF遺伝子を導入した報告もある（非特許文献８）。しかしながら、非特許文献８には、mhpF遺伝子の導入により酢酸の生産量が減少するものの、培地中の酢酸が減少するといった報告はない。さらに、この非特許文献８もまたキシロース資化酵母に関する報告ではない。
【００１３】
ところで、キシロースイソメラーゼ（XI）遺伝子(シロアリの腸内原生生物由来)を導入したキシロース資化酵母に関する報告（特許文献５）、さらにXI遺伝子（Piromyces sp. E2由来）を導入したキシロース資化酵母に対して、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子（Bifidobacterium adolescentis由来）を導入した報告がある（特許文献６）。しかしながら、これら文献には、キシロース資化時の酢酸資化についてはなんら報告されていない。
【００１４】
一方、NDE1遺伝子及びNDE2遺伝子は、細胞のミトコンドリア外膜での細胞質NADHの再酸化のためのNADH脱水素酵素である。NDE1遺伝子及びNDE2遺伝子に関しては、これまで酵母細胞による乳酸生産(特許文献７)、キシリトール生産(特許文献８)、イソブタノール(特許文献９)において、NDE遺伝子を抑制することで生産性が向上することが報告されている。
【００１５】
以上のように、従来技術ではキシロースを資化しながら、エタノール発酵する条件で、酢酸を効率よく代謝・分解させる技術は報告されていない。なお、特許文献１０には、キシロース代謝能を有する組換え酵母に対して、特定のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入することで酢酸代謝能を付与する技術が開示されている。しかしながら、特許文献１０に開示された組換え酵母でも、培地中に蓄積される酢酸を効率よく代謝することは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開2009-195220号公報
【特許文献２】WO 2011/010923
【特許文献３】WO 2011/140386
【特許文献４】WO 2014/074895
【特許文献５】特開2011-147445号公報
【特許文献６】特開2010-239925号公報
【特許文献７】US2015/0024444
【特許文献８】US2005/0148055 A1
【特許文献９】WO2014/004616 A2
【特許文献１０】WO2014/133092 A1
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】FEMS Yeast Research, vol. 9, 2009, 358-364
【非特許文献２】Enzyme and Microbial Technology 33, 2003, 786-792
【非特許文献３】Biotechnol. Bioeng. 2009 103(3):500-512
【非特許文献４】Biotechnol. Lett. 2011 33: 277-284
【非特許文献５】Appl. Environ. Microbiol. 2010 76:190-195
【非特許文献６】Appl. Environ. Microbiol. 2015 81:8108-8117
【非特許文献７】Nat Commun. 2013;4:2580
【非特許文献８】Biotechnol. Lett. 2011 33:1375-1380
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、特に、キシロース代謝能を有する組換え酵母における酢酸に対する代謝能を向上させること、また、酢酸代謝能に優れた組換え酵母を用いたエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、ミトコンドリア外膜における細胞質NADHの再酸化に関与するNADH脱水素酵素をコードする遺伝子を抑制することで、キシロース代謝能を有する酵母に対して特定のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入した組換え酵母における酢酸の代謝分解能を向上できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００２０】
本発明は以下を包含する。
（１）アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入したキシロース代謝能を有する組換え酵母であって、ミトコンドリア外膜における細胞質NADHの再酸化に関与するNADH脱水素酵素をコードする遺伝子を抑制したことを特徴とする組換え酵母。
（２）上記NADH脱水素酵素をコードする遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
(a)配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、NADHをNAD+とする反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
（３）キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（４）上記キシロースイソメラーゼ遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（３）記載の組換え酵母。
(a)配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号６に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、キシロースをキシルロースにする酵素活性を有するタンパク質
（５）更にキシルロキナーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（６）ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群から選ばれる酵素をコードする遺伝子が導入されたものであることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（７）上記ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群は、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼであることを特徴とする（６）記載の組換え酵母。
（８）上記組換え酵母は、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子を高発現することを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（９）上記組換え酵母は、エタノールをアセトアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子の発現量が低下したものであることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（１０）上記（１）〜（９）いずれかに記載の組換え酵母を、キシロースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
（１１）上記培地はセルロースを含有しており、上記エタノール発酵では、少なくとも上記セルロースの糖化が同時に進行することを特徴とする（１０）記載のエタノールの製造方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る組換え酵母は、優れた酢酸代謝活性を有するため、培地に含まれる酢酸濃度を低減することができる。したがって、本発明に係る組換え酵母を利用したエタノールの製造方法では、培地中の酢酸濃度を低減することができ、酢酸に起因する発酵阻害を効果的に回避することができる。その結果、本発明に係るエタノールの製造方法は、キシロースを糖源としたエタノール発酵の効率を高く維持することができ、優れたエタノール収率を達成することができる。したがって、本発明に係るエタノールの製造方法は、例えば、組換え酵母を再利用する場合や連続培養に使用する場合において酢酸の持ち込み量を低減することができ、優れたエタノール収率を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例で作製したNADH脱水素酵素遺伝子を抑制した変異株及びコントロール株を使用した場合における培地中の酢酸濃度及びエタノール濃度を測定した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
本発明に係るエタノールの製造方法は、キシロース代謝能を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入した組換え酵母であって、ミトコンドリア外膜における細胞質NADHの再酸化に関与するNADH脱水素酵素をコードする遺伝子を抑制した組換え酵母である。本発明に係る組換え酵母は、培地に含まれる酢酸を代謝することができる。したがって、本発明に係る組換え酵母を利用したエタノールの製造方法によれば、エタノール発酵に伴って培地中の酢酸濃度が低減するといった特徴がある。
【００２４】
＜組換え酵母＞
本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入し、且つ、ミトコンドリア外膜における細胞質NADHの再酸化に関与するNADH脱水素酵素をコードする遺伝子（以下、NADH脱水素酵素遺伝子と称する）を抑制した、キシロース代謝能を有する組換え酵母である。ここで、キシロース代謝能を有するとは、本来的にはキシロース代謝能を有しない酵母に対してキシロース代謝関連酵素遺伝子を導入することでキシロース代謝能を獲得すること、或いは、本来的にキシロース代謝関連酵素遺伝子を備えておりキシロース代謝能を有していることの両方を意味する。より具体的に、キシロース代謝能を有する酵母としては、本来的にはキシロース代謝能を有しない酵母に対して、キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されることによりキシロース代謝能が付与された酵母、その他のキシロース代謝関連遺伝子が導入されることによりキシロース代謝能が付与された酵母を挙げることができる。
【００２５】
本発明に係る組換え酵母は、上記NADH脱水素酵素遺伝子が抑制されているという特徴を有する。ここで、NADH脱水素酵素遺伝子を抑制するとは、上述したNADH脱水素酵素遺伝子の発現量が低下するように改変することを意味する。上記NADH脱水素酵素遺伝子としては、特に限定されず、例えば、サッカロマイセス・セレビシエにおけるNDE1遺伝子及びNDH2遺伝子を挙げることができる。当該NDE1遺伝子のコーディング領域の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。また、NDE2遺伝子のコーディング領域の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。
【００２６】
ただし、NADH脱水素酵素遺伝子としては、配列番号１〜４にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００２７】
また、NADH脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１〜４にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２又は４のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、NADH脱水素酵素活性（NADHをNAD+に変換する反応を触媒する活性）を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００２８】
さらに、NADH脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１〜４にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２又は４のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、NADH脱水素酵素活性（NADHをNAD+に変換する反応を触媒する活性）を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜１５個、最も好ましくは２〜７個である。
【００２９】
さらにまた、NADH脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１〜４にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１又は３の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつNADH脱水素酵素活性（NADHをNAD+に変換する反応を触媒する活性）を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００３０】
上述したように、配列番号１又は３と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号２又は４とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、NADH脱水素酵素遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のNADH脱水素酵素活性（NADHをNAD+に変換する反応を触媒する活性）を測定すればよい。NADH脱水素酵素活性とは、NADHからユビキノン（CoQ）へ電子2つを転移させる酸化還元酵素活性と同義である。NADH脱水素酵素は、NADHとデシルユビキノンをそれぞれNAD+とデシルユビキノールに変換する反応を触媒する。したがって、NADH脱水素酵素活性は、例えば、340nmの吸光度の変化によって算出したNADHの減少量に基づいて評価することができる。
【００３１】
ところで、本発明に係る組換え酵母は、キシロース代謝能、すなわち培地中に含まれるキシロースを資化してエタノールを生産することができる。なお、培地中に含まれるキシロースとは、キシロースを構成糖とするキシランやヘミセルロース等を糖化するプロセスによって得られたものでも良いし、培地に含まれるキシランやヘミセルロース等が糖化酵素により糖化されることで培地に供給されるものであってもよい。後者の場合は、所謂、同時糖化発酵の系を意味する。
【００３２】
キシロース代謝能を有するとは、本来的にはキシロース代謝能を有しない酵母に対してキシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されることによりキシロース資化能が付与された酵母、その他のキシロース資化関連遺伝子が導入されることによりキシロース資化能が付与された酵母を挙げることができる。
【００３３】
キシロースイソメラーゼ遺伝子（XI遺伝子）としては、特に限定されず、如何なる生物種由来の遺伝子を使用しても良い。例えば、特開2011-147445号公報に開示されたシロアリの腸内原生生物由来の複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子を、特に制限されることなく使用することができる。また、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、嫌気性のカビであるピロマイセス（Piromyces）sp. E2種由来（特表2005-514951号公報）、嫌気性のカビであるシラマイセス・アベレンシス（Cyllamyces aberensis）由来、バクテリアであるバクテロイデス・セタイオタミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）由来、バクテリアであるクロストリディウム・ファイトファーメンタス由来、ストレプトマイセス・ムリナスクラスター由来の遺伝子を利用することもできる。
【００３４】
具体的に、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。このヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子のコーディング領域の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５及び６に示す。
【００３５】
ただし、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、配列番号５及び６にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００３６】
また、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号５及び６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号６のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００３７】
さらに、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号５及び６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号６のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。
【００３８】
さらにまた、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号５及び６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号５の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００３９】
上述したように、配列番号５と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号６とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、キシロースイソメラーゼ遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のキシロースイソメラーゼ活性を測定すればよい。キシロースイソメラーゼ活性とは、キシロースをキシルロースに異性化する活性を意味する。よって、キシロースイソメラーゼ活性は、基質としてキシロースを含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、キシロースの減少量及び/又はキシルロースの生成量を測定することで評価できる。
【００４０】
特に、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、配列番号６に示すアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基に対して特定の変異を導入したアミノ酸配列からなり、キシロースイソメラーゼ活性が向上した変異型キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子を使用することが好ましい。具体的に、変異型キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子としては、配列番号６に示すアミノ酸配列における３３７番目のアスパラギンがシステインに置換されたアミノ酸配列をコードする遺伝子を挙げることができる。配列番号６に示すアミノ酸配列における３３７番目のアスパラギンがシステインに置換されたアミノ酸配列からなるキシロースイソメラーゼは、野生型のキシロースイソメラーゼと比較して優れたキシロースイソメラーゼ活性を有する。なお、変異型キシロースイソメラーゼは、上記３３７番目のアスパラギンをシステインに置換したものに限定されず、上記３３７番目のアスパラギンをシステイン以外のアミノ酸に置換したものでも良いし、上記３３７番目のアスパラギンに加えて更に異なるアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものでも良いし、上記３３７番目のアスパラギン以外の他のアミノ酸残基を置換したものでも良い。
【００４１】
一方、キシロースイソメラーゼ遺伝子以外のキシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
【００４２】
キシロース代謝関連遺伝子としては、特に限定されないが、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を挙げることができる（Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66:3381-3386及びToivari MN et al., Metab. Eng. 3:236-249参照）。その他にも、キシロースリダクターゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子を利用することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することができる。キシルロキナーゼ遺伝子としては、Pichia stipitis由来のキシルロキナーゼ遺伝子を利用することもできる。
【００４３】
また、キシロース代謝能を本来的に有する酵母としては、特に限定されないが、Pichia stipitis、Candida tropicalis及びCandida prapsilosis等を挙げることができる。
【００４４】
一方、キシロース代謝能を有する酵母に導入するアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、特に限定されず、如何なる生物由来の遺伝子を使用しても良い。また、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、酵母等の真菌以外の生物、例えば、細菌や動物、植物、昆虫、藻類由来の遺伝子を使用する場合、導入する酵母におけるコドン使用頻度に併せて塩基配列を改変した遺伝子を使用することが好ましい。
【００４５】
より具体的に、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、大腸菌におけるmhpF遺伝子や、Applied and Environmental Microbiology, May 2004, p. 2892-2897, Vol. 70, No. 5に開示されるようにEntamoeba histolyticaにおけるALDH1遺伝子を使用することができる。ここで、大腸菌におけるmhpF遺伝子の塩基配列及びmhpF遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７及び８に示す。
【００４６】
ただし、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、配列番号７及び８にて特定されるものに限定されず、EC番号１．２．１．１０に定義される酵素であれば、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、例えば、大腸菌におけるadhE遺伝子、Clostridium beijerinckii由来のアセトアルデヒド脱水素遺伝子及びChlamydomonas reinhardtii由来のアセトアルデヒド脱水素遺伝子を挙げることができる。ここで、大腸菌におけるadhE遺伝子の塩基配列及びadhE遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９及び１０に示す。
【００４７】
また、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号７及び８、９及び１０にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号８又は１０のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００４８】
さらに、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号７及び８、９及び１０にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号８又は１０のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。
【００４９】
さらにまた、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号７及び８、９及び１０にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号７又は９の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００５０】
上述したように、配列番号７又は９と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号８又は１０とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のアセトアルデヒド脱水素酵素活性を測定すればよい。アセトアルデヒド脱水素酵素活性は、基質としてアセトアルデヒド、CoA及びNAD+を含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、生成したアセチルリン酸をリン酸アセチル転移酵素の作用によりアセチルリン酸に変換して測定でき、或いは生成するNADHを分光学的に計測して測定することができる。
【００５１】
ところで、本発明に係る組換え酵母は、更に他の遺伝子が導入された酵母であってもよい。他の遺伝子としては特に限定されないが、例えば、グルコース等の糖代謝に関与する遺伝子を導入したものであっても良い。一例として組換え酵母は、β−グルコシダーゼ遺伝子を導入することでβ−グルコシダーゼ活性を有する酵母とすることができる。
【００５２】
ここでβ−グルコシダーゼ活性とは、糖のβ-グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する活性を意味する。すなわち、β−グルコシダーゼは、セロビオース等のセロオリゴ糖をグルコースに分解することができる。β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞表層提示型遺伝子として導入することもできる。ここで、細胞表層提示型遺伝子とは、当該遺伝子がコードするタンパク質が細胞の表層にディスプレイされるように発現するように改変された遺伝子である。例えば、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子とは、βグルコシダーゼ遺伝子と細胞表層局在タンパク質遺伝子とを融合した遺伝子である。細胞表層局在タンパク質とは、酵母の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。例えば、凝集性タンパク質であるα-またはａ-アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などが挙げられる。一般に細胞表層局在タンパク質は、N末端側に分泌シグナル配列及びC末端側にGPIアンカー付着認識シグナルを有している。分泌シグナルを有する点では分泌性タンパク質と共通しているが、細胞表層局在タンパク質はGPIアンカーを介して細胞膜に固定されて輸送される点が分泌性タンパク質と異なる。細胞表層局在タンパク質は、細胞膜通過の際、GPIアンカー付着認識シグナル配列が選択的に切断され、新たに突出したC末端部分でGPIアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼC（PI-PLC）によりGPIアンカーの根元部分が切断される。ついで、細胞膜から切り離されたタンパク質は細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に局在する（例えば、特開2006-174767号公報参照）。
【００５３】
βグルコシダーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、Aspergillus aculeatus由来のβグルコシダーゼ遺伝子（Murai et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:4857-4861）を挙げることができる。その他にも、βグルコシダーゼ遺伝子としては、Aspergillus oryzae由来のβグルコシダーゼ遺伝子、Clostridium cellulovorans由来のβグルコシダーゼ遺伝子及びSaccharomycopsis fibligera由来のβグルコシダーゼ遺伝子等を利用することができる。
【００５４】
また、本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、βグルコシダーゼ遺伝子に加えて、或いはβグルコシダーゼ遺伝子以外に、セルラーゼを構成する他の酵素をコードする遺伝子を導入したものでもよい。βグルコシダーゼ以外にセルラーゼを構成する酵素としては、結晶セルロースの末端からセロビオースを遊離するエキソ型のセロビオハイドロラーゼ（CBH1及びCBH2）、結晶セルロースを分解できないが非結晶セルロース（アモルファスセルロース）鎖をランダムに切断するエンド型のエンドグルカナーゼ（EG）を挙げることができる。
【００５５】
また、組換え酵母に導入する他の遺伝子としては、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH1遺伝子）、酢酸をアセチル-CoAに変換する活性を有するアセチル-CoA合成酵素遺伝子（ACS1遺伝子）、アセトアルデヒドを酢酸に変換する活性を有する遺伝子（ALD4遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子）を挙げることができる。なお、エタノールをアセトアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH2遺伝子）を破壊しても良い。
【００５６】
さらに、本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH1遺伝子）を高発現する特徴を有するものが好ましい。当該遺伝子を高発現させるには、内在する当該遺伝子のプロモーターを高発現用プロモーターに置換する、当該遺伝子を発現可能に有する発現ベクターを酵母に導入するといった方法が挙げられる。
【００５７】
Saccharomyces cerevisiaeのADH1遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１及び１２に示す。ただし、高発現対象のアルコール脱水素酵素遺伝子としては、配列番号１１及び１２にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００５８】
また、アルコール脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１１及び１２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１２のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００５９】
さらに、アルコール脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１１及び１２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１２のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、アルコール脱水素酵素を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。
【００６０】
さらにまた、アルコール脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１１及び１２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１１の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００６１】
上述したように、配列番号１１と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号１２とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば酵母等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のアルコール脱水素酵素活性を測定すればよい。アセトアルデヒドをエタノールに変換するアルコール脱水素酵素活性は、基質としてアルデヒド及びNADH又はNADPHを含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、生成するアルコールを計測するか、又はNAD+若しくはNADP+を分光学的に計測して測定することができる。
【００６２】
さらに、本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、エタノールをアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH2遺伝子）の発現量が低下した特徴を有するものが好ましい。当該遺伝子の発現量を低下させるには、内在する当該遺伝子のプロモーターを改変する、当該遺伝子を欠損させるといった方法が挙げられる。当該遺伝子を欠損させる際には、二倍体の組換え酵母に存在する一対のADH2遺伝子のうち一方を欠損させても良いし、両方を欠損させても良い。遺伝子の発現を抑制する手法としては、所謂、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を挙げることができる。
【００６３】
Saccharomyces cerevisiaeのADH2遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３及び１４に示す。ただし、対象のアルコール脱水素酵素遺伝子としては、配列番号１３及び１４にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００６４】
また、アルコール脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１３及び１４にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１４のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００６５】
さらに、アルコール脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１３及び１４にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１４のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。
【００６６】
さらにまた、アルコール脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１３及び１４にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１３の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００６７】
上述したように、配列番号１３と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号１４とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、エタノールをアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば酵母等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のアルコール脱水素酵素活性を測定すればよい。エタノールをアルデヒドに変換するアルコール脱水素酵素活性は、基質としてアルコールとNAD+又はNADP+を含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、生成するアルデヒドを計測するか、NADH又はNADPHを分光学的に計測して測定することができる。
【００６８】
さらに、組換え酵母に導入する他の遺伝子としては、バイオマスを構成するヘミセルロースに含まれる5炭糖であるL-アラビノースの代謝経路に関与する遺伝子を挙げることができる。このような遺伝子としては、例えば、原核生物由来のL-アラビノースイソメラーゼ遺伝子、L-リブロキナーゼ遺伝子、L-リブロース-5-ホスフェート4-エピメラーゼ遺伝子や、真核生物由来のL-アラビトール-4-デヒドロゲナーゼ遺伝子、L-キシロースレダクターゼ遺伝子を挙げることができる。
【００６９】
特に、組換え酵母に導入する他の遺伝子としては、培地中のキシロースの利用を促進できるような遺伝子を挙げることができる。具体的には、キシルロースを基質としてキシルロース-5-リン酸を生成する活性を有するキシルロキナーゼをコードする遺伝子を挙げることができる。キシルロキナーゼ遺伝子を導入することによって、ペントースリン酸経路の代謝流束を向上させることができる。
【００７０】
さらに組換え酵母は、ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群から選ばれる酵素をコードする遺伝子が導入することができる。ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素としては、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼを挙げることができる。これら酵素をコードする遺伝子を１種以上導入することが好ましい。また、これら遺伝子のうち２種以上組み合わせて導入することがより好ましく、３種以上組み合わせて導入することが更に好ましく、全種類の遺伝子を導入することが最も好ましい。
【００７１】
より具体的にキシルロキナーゼ（XK）遺伝子としては、特に由来生物を限定せずに用いることができる。なおXK遺伝子は、キシルロースを資化する細菌や酵母など多くの微生物が保持している。XK遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩのＨＰ等の検索により適宜入手できる。好ましくは、酵母、乳酸菌、大腸菌、植物などに由来するXK遺伝子が挙げられる。XK遺伝子としては、例えば、S. cerevisiae S288C 株由来のXK遺伝子であるXKS1（GenBank：Z72979）（CDSのコード領域の塩基配列及びアミノ酸配列）が挙げられる。
【００７２】
また、より具体的にトランスアルドラーゼ（TAL）遺伝子、トランスケトラーゼ（TKL）遺伝子、リブロース-5-リン酸エピメラーゼ（RPE）遺伝子、リボース-5-リン酸ケトイソメラーゼ（RKI）遺伝子は、特に由来生物を限定せずに用いることができる。これら遺伝子はペントースリン酸経路を備える多くの生物であれば保持している。例えば、S.cerevisiaeなど汎用酵母もこれらの遺伝子を保持している。これらの遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩ等のＨＰにアクセスすることにより適宜入手できる。好ましくは、真核細胞又は酵母等、宿主真核細胞と同一の属、さらに好ましくは宿主真核細胞と同一種に由来の各遺伝子が挙げられる。TAL遺伝子としてはTAL1遺伝子、TKL遺伝子としてはTKL1遺伝子及びTKL2遺伝子、RPE遺伝子としてはRPE1遺伝子、RKI遺伝子としてはRKI1遺伝子を好ましく用いることができる。例えば、これら遺伝子としては、S. cerevisiae S288 株由来のTAL1遺伝子であるTAL1遺伝子（GenBank：U19102）、S. cerevisiae S288 株由来のTKL1遺伝子（GenBank：X73224）、S. cerevisiae S288 株由来のRPE1遺伝子（Genbank：X83571）、S. cerevisiae S288 株由来のRKI1遺伝子（GenBank：Z75003）が挙げられる。
【００７３】
＜組換え酵母の作製＞
本発明に係る組換え酵母は、例えば、キシロース代謝能を有しない酵母に対して、上述したアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子及び上述したキシロース代謝関連酵素遺伝子を導入するとともに、当該酵母ゲノムにおけるNADH脱水素酵素遺伝子の発現量が低下するように改変することで作製することができる。或いは、本発明に係る組換え酵母は、例えば、キシロース代謝能を有する酵母に対して、上述したアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入するとともに、当該酵母ゲノムにおけるNADH脱水素酵素遺伝子を破壊することで作製することができる。なお、本発明に係る組換え酵母を作製するに際して、上述した他の遺伝子を導入しても良いし、エタノールをアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH2遺伝子）の発現量を低下するよう改変しても良い。
【００７４】
NADH脱水素酵素遺伝子等の発現量を低下させるには、内在する当該遺伝子のプロモーターを改変する、当該遺伝子を欠損させるといった方法が挙げられる。当該遺伝子を欠損させる際には、二倍体の組換え酵母に存在する一対の遺伝子のうち一方を欠損させても良いし、両方を欠損させても良い。遺伝子の発現を抑制する手法としては、所謂、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を挙げることができる。
【００７５】
また、キシロース代謝関連遺伝子やアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子及び他の遺伝子等を酵母に導入する際、全ての遺伝子を同時に導入しても良いし、異なる発現ベクターを利用して逐次導入しても良い。
【００７６】
宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないがCandida Shehatae、Pichia stipitis、Pachysolen tannophilus、Saccharomyces cerevisiae及びSchizosaccaromyces pombeなどの酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。また、酵母としては、実験面での利便性のために使われる実験株でも良いし、実用面での有用性のために使われている工業株（実用株）でも良い。工業株としては、例えば、ワイン、清酒や焼酎作りに用いられる酵母株を挙げることができる。
【００７７】
また、宿主となる酵母としては、ホモタリック性を有する酵母を使用することが好ましい。特開2009-34036号公報に開示される手法によれば、ホモタリック性を有する酵母を利用することで、簡便にゲノムへの多コピー遺伝子導入が可能となる。ホモタリック性を有する酵母とは、ホモタリックな酵母と同義である。ホモタリック性を有する酵母としては、特に限定されず、如何なる酵母をも使用することができる。ホモタリック性を有する酵母としては、Saccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。その他にもホモタリック性を有する酵母としては、アルコール酵母（台研396号、NBRC0216）（出典：「アルコール酵母の諸特性」酒研会報、No37、p18-22(1998.8)）、ブラジルと沖縄で分離したエタノール生産酵母（出典：「ブラジルと沖縄で分離したSaccharomyces cerevisiae野生株の遺伝学的性質」日本農芸化学会誌、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4)）及び180（出典「アルコール発酵力の強い酵母のスクリーニング」日本醸造協会誌、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6)）を挙げることができる。また、ヘテロタリックな表現型を示す酵母においても、HO遺伝子を発現可能に導入することによってホモタリック性を有する酵母として使用することができる。すなわち、本発明において、ホモタリック性を有する酵母とは、HO遺伝子を発現可能に導入された酵母も含む意味である。
【００７８】
なかでも、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、従来ワイン醸造の場面で利用されてきた安全性を確認されている菌株であるため好ましい。また、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、後述する実施例で示したように、高糖濃度の条件下におけるプロモーター活性が優れた菌株であるため好ましい。特にSaccharomyces cerevisiae OC-2株は、高糖濃度条件においてピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーター活性が優れているため好ましい。
【００７９】
また、導入する遺伝子のプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
【００８０】
すなわち、上述した遺伝子は、発現を制御するプロモーターやその他の発現制御領域とともに酵母のゲノムに導入してもよい。または、上述した遺伝子は、宿主となる酵母のゲノムに本来的に存在する遺伝子のプロモーターやその他の発現制御領域により発現制御されるように導入してもよい。
【００８１】
また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００８２】
＜エタノール製造＞
以上で説明した組換え酵母を使用してエタノールを製造する際には、少なくともキシロースを含有する培地にてエタノール発酵培養を行う。すなわち、エタノール発酵を行う培地とは、炭素源として少なくともキシロースを含有することとなる。なお、培地には、予めグルコース等の他の炭素源が含まれていても良い。
【００８３】
また、エタノール発酵に利用する培地に含まれるキシロースは、バイオマス由来とすることができる。言い換えると、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスと、セルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースを糖化してキシロースを生成するヘミセルラーゼとを含む組成であってもよい。ここで、セルロース系バイオマスとしては、従来公知の前処理を施したものであっても良い。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、セルロース系バイオマスの粉砕処理等を挙げることができる。また、前処理としては、例えば、粉砕したセルロース系バイオマスを希硫酸溶液やアルカリ溶液、イオン液体に浸漬する処理、水熱処理、微粉砕処理といった処理を適用しても良い。これら前処理により、バイオマスの糖化率を向上させることができる。
【００８４】
なお、以上で説明した組換え酵母を使用してエタノールを製造する際には、上記培地が更にセルロース及びセルラーゼを含む組成であってもよい。この場合、上記培地には、セルラーゼがセルロースに作用することで生成するグルコースを含有することとなる。エタノール発酵に利用する培地がセルロースを含有する場合、当該セルロースは、バイオマス由来とすることができる。言い換えると、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスに含まれるセルラーゼを糖化できるセルラーゼを含む組成であってもよい。
【００８５】
また、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスを糖化処理した後の糖化液を添加してもよい。この場合、糖化液には、残存するセルロースやセルラーゼとセルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースに由来するキシロースとが含まれる。
【００８６】
以上のように、本発明に係るエタノールの製造方法は、少なくともキシロースを糖源とするエタノール発酵の工程を含むこととなる。本発明に係るエタノールの製造方法は、キシロースを糖源としたエタノール発酵によりエタノールを製造することができる。本発明に係る組換え酵母を利用したエタノールの製造方法では、エタノール発酵の後、培地からエタノールを回収する。エタノールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、組換え酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
【００８７】
一般に、バイオマスに由来する糖を利用してエタノールを製造する場合、上述した前処理や糖化処理において酢酸やフルフラールといった発酵阻害物質が生産される場合がある。特に酢酸については、酵母の生育・増殖を阻害し、キシロースを糖源とするエタノール発酵の効率を低下させることが知られている。
【００８８】
しかしながら、本発明に係る組換え酵母は、上述したようにNADH脱水素酵素遺伝子の発現量を低減するように改変されているため細胞内においてNADHが蓄積されると考えられる。細胞内に蓄積したNADHは、アセトアルデヒド脱水素酵素による酢酸代謝分解反応に利用される。したがって、本発明に係る組換え酵母は、培地に含まれる酢酸濃度を低く抑えることができる。よって、本発明に係るエタノールの製造方法は、上述したNADH脱水素酵素遺伝子を抑制していない組換え酵母を使用した場合と比較して優れたエタノール収率を達成できる。
【００８９】
また、本発明に係るエタノールの製造方法によれば、組換え酵母を所定期間培養した後においても培地中の酢酸濃度が低いため、所定期間培養後の培地の一部を利用して新たに培養を開始する連続培養系に使用しても、酢酸の持ち込み量を低減できる。また、本発明に係るエタノールの製造方法によれば、エタノール発酵工程の終了後、菌体を回収して再利用する場合でも同様な理由から酢酸の持ち込み量を低減できる。
【００９０】
また、本発明に係るエタノールの製造方法は、培地に含まれるセルロースをセルラーゼにより糖化する工程と、キシロースと糖化により生成されたグルコースとを糖源とするエタノール発酵の工程とが同時に進行する、いわゆる同時糖化発酵処理としても良い。ここで、同時糖化発酵処理とは、セルロース系バイオマスを糖化する工程とエタノール発酵工程とを区別せずに同時に実施する処理を意味する。
【００９１】
なお、糖化方法としては、特に限定されないが、セルラーゼやヘミセルラーゼ等のセルラーゼ製剤を利用する酵素法等を挙げることができる。セルラーゼ製剤は、セルロース鎖及びヘミセルロース鎖の分解に関与する複数の酵素を含んでおり、エンドグルカナーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、グルコシダーゼ活性及びキシロシダーゼ活性等の複数の活性を示す。セルラーゼ製剤としては、特に限定されないが、例えば、Trichoderma reeseiや、Acremonium cellulolyticusなどが生産するセルラーゼを挙げることができる。セルラーゼ製剤としては、市販されているものを使用しても良い。
【００９２】
同時糖化発酵処理では、セルロース系バイオマス（前処理後であってもよい）を含む培地にセルラーゼ製剤と上述した組換え微生物とを加え、所定の温度範囲で当該組換え酵母を培養する。培養温度としては特に限定されないが、エタノール発酵の効率を考慮して25〜45℃とすることができ、30〜40℃とすることが好ましい。また、培養液のpHを4〜6とすることが好ましい。また、培養に際して、攪拌や振とうしてもよい。さらに、先に酵素の至適温度（40〜70℃）で糖化を行い、その後、温度を所定の温度（30〜40℃）に下げて酵母を添加するといった変則的な同時糖化発酵でもよい。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９４】
〔実施例１〕
本実施例では、キシロースイソメラーゼ遺伝子及び大腸菌のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子等を導入し、NADH脱水素酵素遺伝子を破壊した組換え酵母を作製し、この組換え酵母の酢酸代謝能を評価した。
【００９５】
＜導入ベクターの作製＞
（１）XI・XKS1・TKL1・TAL1・RKI1・RPE1遺伝子導入及びGRE3遺伝子破壊用プラスミド
GRE3遺伝子座にGRE3遺伝子を破壊しながら、ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子の377番目のアミノ酸をアスパラギンからスレオニンに置換され、キシロースの資化速度が向上した変異遺伝子（XI_N337C； WO2014/156194参照）、酵母由来のキシルロキナーゼ（XKS1）遺伝子、ペントースリン酸回路のトランスケトラーゼ1（TKL1）遺伝子、トランスアルドラーゼ1（TAL1）遺伝子、リブロースリン酸エピメラーゼ1（RPE1）遺伝子、リボースリン酸ケトイソメラーゼ（RKI1）遺伝子を酵母に導入するために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_GRE3- P_HOR7- TKL1- TAL1-FBA1_P-P_ADH1-RPE1- RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1- P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3を作製した。
【００９６】
このプラスミドには、5’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株由来の、HOR7プロモーターが付加されたTKL1遺伝子、FBA1プロモーターが付加されたTAL1遺伝子、ADH1プロモーターが付加されたRKI1遺伝子、TEF1プロモーターが付加されたRPE1遺伝子、TDH1プロモーターとDIT1ターミネーターが付加されたXI_N337C（全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）、TDH3プロモーターとHIS3ターミネーターが付加されたXKS1遺伝子、酵母ゲノム上への相同組換え領域として、GRE3遺伝子の5’側末端より上流約700bpの領域の遺伝子配列（5U_GRE3）、及びGRE3遺伝子3’側末端より下流の約800bpの領域のDNA配列（3U_GRE3）、並びにマーカーとして、G418遺伝子を含む遺伝子配列（G418 marker）が含まれるように構築した。なお、マーカー遺伝子は両側にLoxP配列を導入することで、マーカー除去が可能な配列にしている。
【００９７】
なお、各DNA配列は、下記表１のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されており、それらを用いて、Saccharomyces cerevisiae BY4742ゲノム、XI_N337C合成遺伝子DNA、LoxP配列の合成DNAを鋳型に目的のDNA断片を増幅し、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）等を用いて順次DNA断片を結合、プラスミドpUC19にクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
【００９８】
【表１】
2019024451.tif 000003
【００９９】
（２）mhpF・ADH1遺伝子導入及びADH2遺伝子破壊用プラスミド
ADH2遺伝子座にADH2遺伝子を破壊しながら、E. coli由来のアセトアルデヒド脱水素遺伝子（mhpF）及び酵母由来のアルコールデヒドロゲナーゼ１（ADH1）遺伝子を酵母に導入するために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2を作製した。
【０１００】
このプラスミドには、5’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株由来の、TDH3プロモーターが付加されたADH1遺伝子、HOR7プロモーターとDIT1ターミネーターが付加されたmhpF遺伝子（NCBIアクセスNo.945008、全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）、酵母ゲノム上への相同組換え領域として、ADH2遺伝子の5’側末端より上流約700bpの領域の遺伝子配列（5U_ADH2）及びADH2遺伝子3’側末端より下流の約800bpの領域のDNA配列（3U_ADH2）、並びにマーカーとしてURA3遺伝子を含む遺伝子配列（URA3 marker）が含まれるように構築した。
【０１０１】
なお、各DNA配列は、下記表２のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されており、それらを用いて、Saccharomyces cerevisiae BY4742ゲノムもしくはmhpF合成遺伝子DNAを鋳型に目的のDNA断片を増幅させ、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いて順次DNA断片を結合、プラスミドpUC19にクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
【０１０２】
【表２】
2019024451.tif 000004
【０１０３】
（３）adhE・ADH1遺伝子導入及びADH2遺伝子破壊用プラスミド
ADH2遺伝子座にADH2遺伝子を破壊しながら、E. coli由来のアセトアルデヒド脱水素遺伝子（adhE）及び酵母由来のアルコールデヒドロゲナーゼ１（ADH1）遺伝子を酵母に導入するために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-adhE-HOR7_P-URA3-3U_ADH2を作製した。
【０１０４】
このプラスミドには、5’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株由来の、TDH3プロモーターが付加されたADH1遺伝子、HOR7プロモーターとDIT1ターミネーターが付加されたadhE遺伝子（NCBIアクセスNo.945837、全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）、酵母ゲノム上への相同組換え領域としてADH2遺伝子の5’側末端より上流約700bpの領域の遺伝子配列（5U_ADH2）及びADH2遺伝子3’側末端より下流の約800bpの領域のDNA配列（3U_ADH2）、並びにマーカーとしてURA3遺伝子を含む遺伝子配列（URA3 marker）が含まれるように構築した。
【０１０５】
なお、各DNA配列は、下記表３のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されており、それらを用いて、プラスミドpUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T- mhpF -HOR7_P-URA3-3U_ADH2もしくは adhE合成遺伝子DNAを鋳型に目的のDNA断片を増幅、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いて順次DNA断片を結合、プラスミドpUC19にクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
【０１０６】
【表３】
2019024451.tif 000005
【０１０７】
（４）NDE1遺伝子破壊用プラスミド
NDE1遺伝子を破壊するために必要な配列を含むプラスミド、PUC19-5U_NDE1-RPL41B_T-eutE-TDH3_P-LoxP66-P_CYC1-HPH-T_URA3-CYC1_T-Crei-GAL1_P-LoxP71-3U_NDE1を作製した。このプラスミドには、酵母ゲノム上への相同組換えおよびNDE1遺伝子を破壊するための領域として、NDE1遺伝子の上流約800bpのDNA配列（5U_NDE1）、NDE1遺伝子の下流約1050bpのDNA配列（3U_NDE1）、並びにTDH3プロモーターとRPL41Bターミネーターが付加されたeutE遺伝子（NCBIアクセスNo.946943、全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）、マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を含む遺伝子配列（HPH marker）が含まれるように構築した。
【０１０８】
なお、各DNA配列は、下記表４のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されており、それらを用いて、酵母OC2株のゲノムDNA、あるいはハイグロマイシン耐性遺伝子含有プラスミドを鋳型に目的のDNA断片を増幅、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いて順次DNA断片を結合、プラスミドpUC19にクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
【０１０９】
eutE遺伝子は、E. coli由来のアルデヒド酸化還元酵素をコードしている。eutE遺伝子のコーディング領域の塩基配列及びeutE遺伝子がコードするアルデヒド酸化還元酵素のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１５及び１６に示す。
【０１１０】
【表４】
2019024451.tif 000006
【０１１１】
（５）URA3遺伝子導入用断片
機能していないURA3遺伝子座のURA3遺伝子を相同組換えにより野生型に戻すための野生型URA3遺伝子断片をOC2株より増幅した。本DNA断片は下記表５のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。
【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
（６）Cre遺伝子発現用プラスミド
Cre遺伝子をマルチコピーで発現するためのプラスミドpYES-Creを作製した。このプラスミドはｐYES6/CT（ライフテクノロジー）に、ガラクトースで誘導されるプロモーターであるGAL１プロモーターと融合したCre遺伝子（NCBIアクセスNo.NP_415757.1、全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）を導入して構築した。
【０１１４】
なお、構築に必要な各DNA配列は下記表６のプライマーを用いて増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されており、プラスミドYES6/CT又はCre合成遺伝子DNAを鋳型に目的のDNA断片を増幅、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いてDNA断片を結合し最終目的のプラスミドを作製した。
【０１１５】
【表６】
2019024451.tif 000008
【０１１６】
＜ベクター導入酵母株の作製＞
2倍体酵母のSaccharomyces cerevisiae OC2株（NBRC2260）を5-フルオロオロチン酸添加培地で選抜し（Boeke, J.D., et al. 1987 Methods Enzymol.;154:164-75.）、ウラシル要求性となった株（OC2U）を宿主とした。酵母の形質転換はFrozen-EZ Yeast Transformation II（ZYMO RESEARCH）を用い、添付のプロトコルに従って行った。
【０１１７】
上記（１）で作製したプラスミド：pUC-5U_GRE3-P_HOR7-TKL1-TAL1-FBA1_P-P_ADH1-RPE1-RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3の相同組換え部位をPCRで増幅した断片を用いて、OC2U株の形質転換を行い、G418を含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された選択株をUz1252株と命名した。本株を胞子形成培地（1% リン酸カリウム、0.1% イーストエキストラクト、0.05% ブドウ糖、2% 寒天）で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のGRE3遺伝子座領域に変異型XI遺伝子、TKL1遺伝子、TAL1遺伝子、RPE1遺伝子、RKI1遺伝子及びXKS1遺伝子が組み込まれGRE3遺伝子が破壊されている株を取得した。これをUz1252株とした。Uz1252株にCre遺伝子発現用プラスミドを導入し、LoxP配列に挟まれているG418マーカー遺伝子をCre/LoxP部位特異的組換え反応により除去後、最終的にCreプラスミドが脱落した株を選抜しUz1252m株とした。
【０１１８】
次に、上記（２）で作製したプラスミド：プラスミドpUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2、上記（３）で作製したプラスミド：pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-adhE-HOR7_P-URA3-3U_ADH2の各プラスミドの相同組換え部位間をPCRで増幅した断片と、OC2株ゲノムから直接増やしたURA3遺伝子導入用断片を用いて、上記Uz1252m株の形質転換を行い、ウラシルを含まないSD寒天培地もしくはG418を含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された選択株をそれぞれ、Uz1298及びUz1317株と命名した。
【０１１９】
なお、それぞれの株はヘテロに（1コピー）組換えが起こっていることを確認した。そして、Uz1298及びUz1317株を胞子形成培地で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行い、それぞれ、Uz1319及びUz1318株と命名した。
【０１２０】
次に、上記（４）で作製したプラスミドpUC19-5U_NDE1-RPL41B_T-eutE-TDH3_P-LoxP66-P_CYC1-HPH-T_URA3-CYC1_T-Crei-GAL1_P-LoxP71-3U_NDE1のプラスミドの相同組換え部位間をPCRで増幅した断片を用いて、上記Uz1252m、Uz1318及びUz1319株の形質転換を行い、ハイグロマイシンを含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された選択株を、それぞれUz2452、Uz2454及びUz2456株と命名した。Uz2452、Uz2454及びUz2456株を胞子形成培地で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行い、それぞれUz2452dS、Uz2454dS及びUz2456dS株と命名した。
本実施例で作製した株の遺伝子型を表７にまとめた。
【０１２１】
【表７】
2019024451.tif 000009
【０１２２】
＜発酵試験＞
以上のように作製した株からそれぞれ発酵能力が高い株を選び、フラスコ発酵試験を以下のように実施した。まず、グルコース濃度20g/LのYPD液体培地（イーストエキストラクト 10ｇ/L、ペプトン 20g/L、グルコース 20g/L）を20ml分注した100ml容バッフル付きフラスコに供試株を植菌し、30℃ 120rpmで24時間培養を行った。集菌後、エタノール生産用の培地（グルコース46g/L、キシロース40g/L、イーストエキストラクト10g/L、ペプトン20g/L及び酢酸3.0g/L）を8ml分注した10ml容フラスコに植菌し（菌濃度0.3g乾燥菌体/L）、振盪培養（80rpm、振幅35mm、30℃）、温度を31度又は34度にて発酵試験を行った。なお、フラスコにつける栓は、内径1.5mmニードルを通したゴム製で、ニードルの先に逆止弁を取り付けることでフラスコが嫌気的に保たれるようにした。
【０１２３】
発酵液中のエタノール及び酢酸についてHPLC（LC-10A；島津製作所）を使用して、下記条件にて濃度を測定した。
カラム：AminexHPX-87H
移動相：0.01N H2SO4
流量：0.6ml/min
温度：30℃
検出器：示差屈折率検出器 RID-10A
【０１２４】
＜発酵試験結果＞
発酵試験の結果を表８及び図１に示した。
【０１２５】
【表８】
2019024451.tif 000010
【０１２６】
表８及び図１に示したように、NDE1遺伝子非破壊株（Uz1252m株）と比較して、2コピーのNDE1遺伝子のうち1コピーを破壊したヘテロ破壊株（Uz2452株、Uz2454株及びUz2456株）及び2コピーのNDE1遺伝子を破壊したホモ破壊株（Uz2452dS株、Uz2454dS株及びUz2456dS株）を用いた場合には、培地中の酢酸濃度がより低下していることが分かった。本実施例によりNADH脱水素酵素遺伝子の発現量を低減するように改変した組換え酵母では、培地中の酢酸に対する代謝分解能が優れることが明らかとなった。
【０１２７】
また、ホモ破壊株（Uz2452dS株、Uz2454dS株及びUz2456dS株）を用いた場合には、培地に含まれる酢酸がほぼ完全に代謝されていた。この結果より、NADH脱水素酵素遺伝子の発現量をより低減することで、酢酸代謝能をより向上できることが明らかとなった。
【図１】
2019024451.tif 000011
【配列表】
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