(57)【要約】      （修正有）【課題】非天然存在ポックスウィルスの提供。【解決手段】異種または外因性抗原、エピトープまたは免疫原およびフラジェリンまたはその機能可能に結合する部分をコードするＤＮＡを含有し、そして発現する、組換えまたは合成または操作または非天然存在ポックスウィルス。該ポックスウィルスは、ワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１Ｌを含有し、そして発現するように、含有すること、または操作されることができる。該ポックスウイルは、哺乳動物に関して弱毒化されていることも可能であり、例えば、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ．１、ＮＹＶＡＣ．２、アビポックス、カナリアポックス、鶏痘ウィルス、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ、ＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種または外因性抗原、エピトープまたは免疫原およびフラジェリンまたはその機能可能に結合する部分をコードするＤＮＡを含有し、そして発現する、組換えまたは合成の、または操作された、または非天然存在のポックスウィルス。
【請求項２】
ワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１Ｌを含有し、そして発現する、請求項１のポックスウィルス。
【請求項３】
ワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１Ｌを含有し、そして発現するよう操作された、請求項２のポックスウィルス。
【請求項４】
ポックスウィルスが、哺乳動物に対して弱毒化されている、請求項３のポックスウィルス。
【請求項５】
ポックスウィルスが、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ．１、ＮＹＶＡＣ．２、アビポックス、カナリアポックス、鶏痘ウィルス、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ、ＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮである、請求項４のポックスウィルス。
【請求項６】
哺乳動物において、抗原、エピトープまたは免疫原に対する免疫学的応答を誘起（induce）する方法であって、該哺乳動物に、請求項１〜５のいずれか一項のポックスウィルスあるいは該ポックスウィルスを含有する免疫学的または免疫原性組成物を投与することを含む方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項のポックスウィルスを含有する免疫学的または免疫原性組成物。
【請求項８】
抗原、エピトープまたは免疫原が、少なくとも１つのプラスモジウム（Plasmodium）抗原である、請求項１〜５のいずれか一項のポックスウィルス。
【請求項９】
プラスモジウム抗原（単数または複数）、エピトープ（単数または複数）または免疫原（単数または複数）が、ＳＥＲＡ、ＡＢＲＡ、Ｐｆｈｓｐ７０、ＡＭＡ−１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ１６、ＣＳＰ、ＰｆＳＳＰ２、ＬＳＡ−１リピート不含、ＭＳＡ−１、ＡＭＡ−１またはその組み合わせ（単数または複数）を含む、請求項８のポックスウィルス。
【請求項１０】
ポックスウィルスが、プラスモジウム抗原（単数または複数）ＣＳＰ、ＰｆＳＳＰ２、ＬＳＡ−１リピート不含、ＭＳＡ−１、ＳＥＲＡ、ＡＭＡ−１およびＰｆｓ２５をコードするＤＮＡを含有し、そしてこれを発現する、請求項９のポックスウィルス。
【請求項１１】
ポックスウィルスが、ＮＹＶＡＣポックスウィルスである、請求項１０のポックスウィルス。
【請求項１２】
請求項８のポックスウィルスを含む、抗マラリア免疫原性または免疫学的組成物。
【請求項１３】
請求項９のポックスウィルスを含む、抗マラリア免疫原性または免疫学的組成物。
【請求項１４】
請求項１０のポックスウィルスを含む、抗マラリア免疫原性または免疫学的組成物。
【請求項１５】
請求項１１のポックスウィルスを含む、抗マラリア免疫原性または免疫学的組成物。
【請求項１６】
哺乳動物において、マラリアまたはマラリア原虫（Plasmodium）に対する免疫原性または免疫学的応答を誘起するための方法であって、該哺乳動物に、請求項８のポックスウィルスあるいは該ポックスウィルスを含有する免疫学的または免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１７】
哺乳動物において、マラリアまたはマラリア原虫（Plasmodium）に対する免疫原性または免疫学的応答を誘起するための方法であって、該哺乳動物に、請求項９のポックスウィルスあるいは該ポックスウィルスを含有する免疫学的または免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
哺乳動物において、マラリアまたはマラリア原虫（Plasmodium）に対する免疫原性または免疫学的応答を誘起するための方法であって、該哺乳動物に、請求項１０のポックスウィルスあるいは該ポックスウィルスを含有する免疫学的または免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
哺乳動物において、マラリアまたはマラリア原虫（Plasmodium）に対する免疫原性または免疫学的応答を誘起するための方法であって、該哺乳動物に、請求項１１のポックスウィルスあるいは該ポックスウィルスを含有する免疫学的または免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願および／または援用
本出願は、２０１３年１２月３０日出願の米国仮出願第６１／９２１，７４８号に優先権を主張する。
【０００２】
前述の出願（単数または複数）、および該出願またはその審査に引用されるすべての文書（「出願引用文書」）、および出願引用文書中に引用されるかまたは参照されるすべての文書、および本明細書に引用されるかまたは参照されるすべての文書（「本明細書引用文書」）、および本明細書引用文書に引用されるかまたは参照されるすべての文書は、任意の製造者の指示、説明、製品明細、および本明細書または本明細書に援用される任意の文書に言及される任意の製品に関する製品シートは、本明細書に援用され、そして本発明の実施に使用可能である。より具体的には、すべての参照文書は、各個々の文書が特にそして個々に、援用されると示されるのと同じ程度まで、本明細書に援用される。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、修飾ポックスウィルス、および該ポックスウィルスを作製し、そして用いる方法に関する。
特定の実施態様において、本発明は、外因性または異種遺伝子産物（単数または複数）、例えばマラリア原虫（Plasmodium）由来のもの、特異的ポックスウィルス複製制御因子、および免疫反応増進のためのアジュバントを発現する組換えポックスウィルス、ならびにこうしたポックスウィルスを含有する免疫原性組成物またはワクチン、ならびにマラリア原虫（Plasmodium）感染に対して、免疫、例えば防御免疫を提供するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
例えば、コードポックスウィルス（Chordopoxvirinae）亜科ポックスウィルス（脊椎動物（vertebrates）のポックスウィルス）のような、ポックスウィルス、例えば、とりわけ、オルトポックスウィルスおよびアビポックスウィルス、例えば、ワクシニア  ウィルス（例えば、ワイエス株、ＷＲ株（例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１３５４）、コペンハーゲン株、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ．１、ＮＹＶＡＣ．２、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ）、カナリアポックスウィルス（例えば、ウィートリーＣ９３株、ＡＬＶＡＣ）、鶏痘ウィルス（例えば、ＦＰ９株、ウェブスター株、ＴＲＯＶＡＣ）、ハトポックス（ｄｏｖｅｐｏｘ）、ハトポックス（ｐｉｇｅｏｎｐｏｘ）、ウズラポックス（ｑｕａｉｌｐｏｘ）、およびラクーンポックス、に関する情報、とりわけ、これらの合成または非天然存在組換え体、これらの使用、およびこうした組換え体を作製しそして用いるための方法は、科学的文献および特許文献において見出すことが可能であり、例えば以下がある：
米国特許第４，６０３，１１２号、第４，７６９，３３０号、第５，１１０，５８７号、第５，１７４，９９３号、第５，３６４，７７３号、第５，７６２，９３８号、第５，４９４，８０７号、第５，７６６，５９７号、第７，７６７，４４９号、第６，７８０，４０７号、第６，５３７，５９４号、第６，２６５，１８９号、第６，２１４，３５３号、第６，１３０，０６６号、第６，００４，７７７号、第５，９９０，０９１号、第５，９４２，２３５号、第５，８３３，９７５号、第５，７６６，５９７号、第５，７５６，１０１号、第７，０４５，３１３号、第６，７８０，４１７号、第８，４７０，５９８号、第８，３７２，６２２号、第８，２６８，３２９号、第８，２６８，３２５号、第８，２３６，５６０号、第８，１６３，２９３号、第７，９６４，３９８号、第７，９６４，３９６号、第７，９６４，３９５号、第７，９３９，０８６号、第７，９２３，０１７号、第７，８９７，１５６号、第７，８９２，５３３号、第７，６２８，９８０号、第７，４５９，２７０号、第７，４４５，９２４号、第７，３８４，６４４号、第７，３３５，３６４号、第７，１８９，５３６号、第７，０９７，８４２号、第６，９１３，７５２号、第６，７６１，８９３号、第６，６８２，７４３号、第５，７７０，２１２号、第５，７６６，８８２号、および第５，９８９，５６２号、ならびに、
パニカリ（Panicali）, D. Proc. Natl. Acad. Sci. 1982; 79; 4927-493、パニカリ D. Proc. Natl. Acad. Sci. 1983; 80（17）: 5364-8、マケット（Mackett）, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 1982; 79: 7415-7419、スミス（Smith）GL. Proc. Natl. Acad. Sci. 1983; 80（23）: 7155-9、スミス GL. Nature 1983; 302: 490-5、サリバン（Sullivan）VJ. Gen. Vir. 1987; 68: 2587-98、パーカス（Perkus）M Journal of Leukocyte Biology 1995; 58:1-13、イールマ（Yilma）TD. Vaccine 1989; 7: 484-485、ブロシアー（Brochier）B. Nature 1991; 354: 520-22、ウィクター（Wiktor）, TJ. Proc. Natl Acd. Sci. 1984; 81: 7194-8、ルプレクト（Rupprecht）, CE. Proc. Natl Acd. Sci. 1986; 83: 7947-50、ポーレット（Poulet）, H Vaccine 2007; 25（Jul）: 5606-12、ウェイヤー（Weyer）J. Vaccine 2009; 27（Nov）: 7198-201、ブラー（Buller）, RM Nature 1985; 317（6040）: 813-5、ブラー RM. J. Virol. 1988; 62（3）:866-74、Flexner, C. Nature 1987; 330（6145）: 259-62、シダ（Shida）, H. J. Virol. 1988; 62（12）: 4474-80、コトワル（Kotwal）, GJ. J. Virol. 1989; 63（2）: 600-6、チャイルド（Child）, SJ. Virology 1990; 174（2）: 625-9、メイヤー（Mayr） A. Zentralbl Bakteriol 1978; 167（5,6）: 375-9、アントワーヌ（Antoine） G. Virology. 1998; 244（2）: 365-96、ワイアット（Wyatt）, LS. Virology 1998; 251（2）: 334-42、サンチョ（Sancho）, MC.  J. Virol. 2002; 76（16）; 8313-34、ギャレゴ−ゴメス（Gallego-Gomez）, JC. J. Virol. 2003; 77（19）; 10606-22）、ゴーベル（Goebel） SJ. Virology 1990; （a,b） 179: 247-66、タータグリア（Tartaglia）, J. Virol. 1992; 188（1）: 217-32、ナジェラ（Najera） JL. J. Virol. 2006; 80（12）: 6033-47、ナジェラ, JL. J. Virol. 2006; 80: 6033-6047、ゴメス（Gomez）, CE. J. Gen. Virol. 2007; 88: 2473-78、ムーイジ（Mooij）, P. Jour. Of Virol. 2008; 82: 2975-2988、ゴメス, CE. Curr. Gene Ther. 2011; 11: 189-217、コックス（Cox）,W. Virology 1993; 195: 845-50、パーカス, M. Jour. Of Leukocyte Biology 1995; 58: 1-13、ブランチャード（Blanchard） TJ. J Gen Virology 1998; 79（5）: 1159-67、アマラ（Amara） R. Science 2001; 292: 69-74、ヘル（Hel）, Z., J. Immunol. 2001; 167: 7180-9、ジェラルディ（Gherardi） MM.  J. Virol. 2003; 77: 7048-57、ディディエーローレント（Didierlaurent）, A. Vaccine 2004; 22: 3395-3403、ビシト（Bissht） H. Proc. Nat. Aca. Sci. 2004; 101: 6641-46、マカーディー（McCurdy） LH. Clin. Inf. Dis 2004; 38: 1749-53、アール（Earl） PL. Nature 2004; 428: 182-85、チェン（Chen） Z. J. Virol. 2005; 79: 2678-2688、ナジェラ JL. J. Virol. 2006; 80（12）: 6033-47、ナム（Nam） JH. Acta. Virol. 2007; 51: 125-30、アントニス（Antonis） AF. Vaccine 2007; 25: 4818-4827、B ウェイヤー（Weyer） J. Vaccine 2007; 25: 4213-22、フェリエ−レンバート（Ferrier-Rembert） A. Vaccine 2008; 26（14）: 1794-804、コーベット（Corbett） M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2008; 105（6）: 2046-51、カウフマン（Kaufman） HL., J. Clin. Oncol. 2004; 22: 2122-32、アマト（Amato）, RJ. Clin. Cancer Res. 2008; 14（22）: 7504-10、ドレイサー（Dreicer） R. Invest New Drugs 2009; 27（4）: 379-86、カントフ（Kantoff） PW.J. Clin. Oncol. 2010, 28, 1099-1105、アマト RJ. J. Clin. Can. Res. 2010; 16（22）: 5539-47、キム（Kim）, DW. Hum. Vaccine. 2010; 6: 784-791、オーダード（Oudard）, S. Cancer Immunol. Immunother. 2011; 60: 261-71、ワイアット, LS. Aids Res.  Hum. Retroviruses. 2004; 20: 645-53、ゴメス, CE. Virus Research 2004; 105: 11-22、ウェブスター（Webster）, DP. Proc. Natl. Acad. Sci. 2005; 102: 4836-4、フアン（Huang）, X. Vaccine 2007; 25: 8874-84、ゴメス, CE. Vaccine 2007a; 25: 2863-85、エステバン（Esteban） M. Hum. Vaccine 2009; 5: 867-871、ゴメス, CE. Curr. Gene therapy 2008; 8（2）: 97-120、ウェラン（Whelan）, KT. Plos one 2009; 4（6）: 5934、スクリバ（Scriba）, TJ. Eur. Jour. Immuno. 2010; 40（1）: 279-90、コルベット（Corbett）, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2008; 105: 2046-2051、ミッジレー（Midgley）, CM. J. Gen. Virol. 2008; 89: 2992-97、フォン・クレンペルフーバー（Von Krempelhuber）, A. Vaccine 2010; 28: 1209-16、ペロー（Perreau）, M. J. Of Virol. 2011; Oct: 9854-62、パンタレオ（Pantaleo）, G. Curr Opin HIV-AIDS. 2010; 5: 391-396があり、これらは各々、参照により、この明細書に組込まれる。 
【０００５】
ＶＰ１２０９またはＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７として知られる、特定のＮＹＶＡＣ−プラスモジウム組換え体に関する情報は、タイン（Tine）ら、“ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７：プラスモジウムに対する、ポックスウィルス・ベクターの多重抗原熱帯熱（falciparum）、マラリア多重段階ワクチン候補” Infect. Immun. 1996, 64（9）:3833、およびオッケンハウス（Ockenhouse）ら、“熱帯熱（falciparum）マラリアに関するポックスウィルス・ベクターの多重抗原熱帯性マラリア多重段階ワクチン候補ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７のＩ／ＩＩａ期安全性、免疫原性、および有効性試験”、1998;177:1664-73に論じられており、これらは各々、本明細書に援用される。
【０００６】
こうした情報にもかかわらず、現在まで、ヒトに使用するための認可された組換えポックスウィルスワクチンはない; ロリエー（Rollier）CS. Curr. Opin. Immun. 2011; 23（Jun）: 377-82を参照されたい。
【０００７】
さらに、マラリアは、世界中で最も重要な寄生虫疾患と見なされている。マラリアは、世界中で２億を超える臨床エピソードを引き起こし、６５万５，０００の死を生じ、その大部分はアフリカの子供達である；ＷＨＯグローバル・マラリア・プログラム  ２０１１を参照されたい。さらに、流行地域は大部分、貧困国であり、アフリカのみで、ほぼ３０億ドルが費やされるため、経済的ロスは増大する; テクレハイマノット（Teklehaimanot）A. J. Trop. Med. Hyg. 2007; 77（6）: 138-44を参照されたい。室内スプレー、殺虫ネット、試験のための迅速な診断などの、制御・介入のための方法およびアプローチに向けて、特に、妊娠女性および小児に対して、かなりの努力および援助が向けられてきた; アポンテ（Aponte）,JJ. Lancet 2009; 374（9700）: 1533-44.、メネンデス（Menendez）C. Lancet Infect. Dis. 2007; 7（2）: 126-35を参照されたい。しかし、これらの制御・介入プログラムは、ある程度の成功を収めたが、社会における、疾患コストおよび負担を実質的に減少させるためには、この疾患の罹患率および死亡率を減少させるため、マラリアに対するワクチンが非常に重要であることがわかる；マラリア根絶: Vaccines PloS Med. 2011; 8（1）: e1000398を参照されたい。集中した努力および戦略的ゴールが、国際組織ＰＡＴＨ、マラリア  ワクチン  イニシアチブ（ＭＶＩ）によって示され、これは、２０２０年までに、マラリア  ワクチンが、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）に対して、８０％の防御効率を提供するというものである。
【０００８】
本明細書における、いかなる文献の引用または特定も、その文献が、本発明の先行技術として利用できることを認めたことを意味しない。
【０００９】
［発明の目的および／または概略］
本発明は、ポックスウィルス（例えば、組換えポックスウィルス）、免疫原性または免疫学的組成物、あるいは、ほんの弱くまたは最適以下の免疫相関性のワクチン誘導を認識し、そして説明するように努力する；例えば、スミス, JM. AIDS Res. Hum. Retroviruses 2004; 20: 1335-1347、ハンケ（Hanke）, T. J. Gen. Virol. 2007; 88: 1-12、サンドストローム（Sandstrom）, E. J. Inf. Dis. 2008; 198: 1482-90、ウォーカー（Walker）, BD. Science 2008; 320: 760-4、セカリー（Sekaly）, RP. J. Exp. Med. 2008; 205: 7-12、ラークス−ンガーム（Rerks-Ngarm） S. 2009; N Engl J Med 361: 2209-2220を参照されたい。
【００１０】
用語「ポックスウィルス」には、コードポックスウィルス亜科（Chordopoxvirinae）ポックスウィルス、例えば、オルトポックスウィルス（orthopoxviruses）およびアビポックスウィルス（avipoxviruses）、例えばワクシニアウィルス（例えばワイエス株、ＷＲ株（たとえば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１３５４）、コペンハーゲン株、ＮＹＶＡＣ、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ）、カナリアポックスウィルス（例えば、ウィートリーＣ９３株、ＡＬＶＡＣ）、鶏痘ウィルス（例えば、ＦＰ９株、ウェブスター株、ＴＲＯＶＡＣ）、ハトポックス（dovepox）、ハトポックス（pigeonpox）、ウズラポックス、およびアライグマポックスが含まれ；そしてこれには特に、米国特許第５，９９０，０９１号、第６，１３０，０６６号および第６，００４，７７７号の転写および／または翻訳因子（単数または複数）もまた、発現するポックスウィルスを含めて、本明細書に引用される文献のポックスウィルスが含まれる。
【００１１】
これに関して、１つの側面において、本発明は、合成の、または非天然存在であるポックスウィルス、すなわち、たとえば、組換えを通じて、操作された、合成の、または非天然存在ポックスウィルス、好適には、哺乳動物に対して弱毒化されたポックスウィルス、例えば、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ．１、ＮＹＶＡＣ．２、アビポックス（avipox）、カナリアポックス（canarypox）、鶏痘ウィルス（fowlpox）、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮであって、そうした操作を通じて、フラジェリン（またはその機能可能に結合する部分）および／またはワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１ＬをコードするＤＮＡを含有し、そして、こうしたＤＮＡを発現する、前記ポックスウィルスを提供する。好適には、該ポックスウィルスは、フラジェリン（またはその機能可能に結合する部分）およびワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１ＬをコードするＤＮＡを含有し、そして発現する。
【００１２】
したがって、哺乳動物に対する弱毒化ポックスウィルス、例えば、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ．１、ＮＹＶＡＣ．２、アビポックス、カナリアポックス、鶏痘ポックス、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮに関して、本発明は、合成または非天然存在である、すなわち、たとえば、組換えを通じて、好適には、非本質領域中において、フラジェリン（またはその機能可能に結合する部分）および／またはワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１ＬをコードするＤＮＡを含有し、そして、こうしたＤＮＡを発現するように、設計され（engineered）るかまたは操作（manipulated）された、ポックスウィルスを含む。
フラジェリン（またはその機能可能に結合する部分）および／またはワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１ＬをコードするＤＮＡを含有し、そして発現する、合成の、または、非天然存在の、または、操作された、または組換えポックスウィルスは、また、ポックスウィルスに対して外来性（foreign）、または外因性（exogenous）、または異種性（heterologous）である、１またはそれより多い抗原（単数または複数）、免疫原（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）をコードするＤＮＡを含有し、そして発現するよう、操作され（manipulated）、設計（engineered）されることも可能である。
【００１３】
本発明は、また、例えば、免疫原性（immunogenic）または、免疫学的（immunological）またはワクチン組成物のような、こうした操作された、または、合成された、または非天然存在の、または組換え、ポックスウィルスを含有する組成物、たとえば、免疫応答、たとえば、防御免疫反応（protective immune response）を刺激するための、たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで使用する抗体を生成するための、こうしたポックスウィルスまたは組成物の使用、ならびに、こうしたポックスウィルスおよび組成物を作製する方法、ならびに、こうしたポックスウィルスおよび組成物を用いる方法も含む。こうした組成物は、先行技術の組換えポックスウィルス免疫原性または免疫学的またはワクチン組成物中に見られる組換えポックスウィルスの量と類似のポックスウィルスの量を含有することも可能である。同様に、免疫または防御免疫反応を誘導（induce）するための方法において、投与すべき組成物および／またはポックスウィルスの量は、組換えポックスウィルス組成物または組換えポックスウィルスによって免疫または防御免疫反応を誘導するため、先行技術の方法において投与される量と類似であることも可能である。フラジェリンを発現するＮＹＶＡＣ（ＦｌｉＣ）は、天然痘（smallpox）を含むポックスウィルス感染に向けられる新規ワクチンであることも可能である。
【００１４】
別の側面において、本発明は、合成の、または非天然存在である、ポックスウィルス、すなわち、たとえば、組換えによって操作された、合成の、または非天然存在の、ポックスウィルス、好適には、哺乳動物に対して弱毒化された、ポックスウィルス、たとえば、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ．１、ＮＹＶＡＣ．２、アビポックス、カナリアポックス、鶏痘ポックス、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮを提供することであって、こうした操作を通じて、好適には、非必須領域中に（in a non-essential region）、フラジェリン（またはその機能可能に結合する部分）および／またはワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１ＬをコードするＤＮＡを含有し、そして、こうしたＤＮＡを発現し、並びに、マラリア原虫（Plasmodium）の遺伝子産物をコードするＤＮＡ（単数または複数）を含有し、そして、マラリア原虫（Plasmodium）の遺伝子産物をコードするＤＮＡ（単数または複数）を発現する、前記ポックスウィルスを提供する。したがって、例えば、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ．１、ＮＹＶＡＣ．２、アビポックス、カナリアポックス、鶏痘ウィルス（fowlpox）、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮのような、哺乳動物に対して弱毒化されたポックスウィルスに関して、本発明は、合成の、または非天然存在の、すなわち、たとえば、組換えを通じて、設計され、操作された、フラジェリン（またはその機能可能に結合する部分）および／またはワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１ＬをコードするＤＮＡを含有し、そして、マラリア原虫（Plasmodium）遺伝子産物をコードするＤＮＡ（単数または複数）を発現する、ポックスウィルスを含む。本発明の、操作された、合成の、非天然存在の、および／または組換えの、ポックスウィルスは、したがって、プラスモジウムの遺伝子産物（単数または複数）、およびフラジェリン（またはその機能可能に結合する部分）（そして場合によってまたＫ１Ｌも）を共発現する（co-expresses）。本発明は、また、こうして操作された、または、合成の、または、非天然存在の、または、組換えポックスウィルス、例えば、免疫原性、または免疫学的、またはワクチン組成物を含有する組成物を含み、たとえば、免疫原性、または免疫学的、またはワクチン組成物；免疫反応、たとえば、防御免疫反応を刺激するための、たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで使用するための抗体を生産するための、こうしたポックスウィルスまたは組成物の使用；ならびに、こうしたポックスウィルスおよび組成物を作製する方法；ならびに、こうしたポックスウィルスおよび組成物を用いる方法も含む。こうした組成物は、先行技術の組換えポックスウィルスの、免疫原性または免疫学的またはワクチン組成物中に見られる組換えポックスウィルスの量と、類似のポックスウィルスの量を含有することも可能である。同様に、免疫または防御免疫反応を誘導するための方法において、投与すべき組成物および／またはポックスウィルスの量は、組換えポックスウィルス組成物または組換えポックスウィルスによって、免疫または防御免疫反応を誘導するため、先行技術の方法において投与される量と類似であることも可能である。
【００１５】
免疫原性または免疫学的組成物は、免疫反応を刺激し、この反応は防御性であってもよいが、そうである必要はない。ワクチンは、防御免疫反応を刺激する。好適には、マラリア原虫（Plasmodium）またはマラリアに対するワクチンは、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）に対して、少なくとも８０％の防御効率（ワクチンを投与された被験体の少なくとも８０％において防御）を提供する。フラジェリンをコードするＤＮＡならびに／あるいは抗原（単数および複数）または免疫原（単数および複数）、たとえば、マラリア原虫（Plasmodium）抗原（単数または複数）または免疫原（単数または複数）をコードするＤＮＡのための単数または複数の遺伝子座（locus or loci）として非必須領域以外を用いる場合、当業者は、相補性宿主細胞またはヘルパーウィルスを使用することも可能である。たとえば、米国特許第５，７６６，８８２号を参照されたい。
【００１６】
マラリア原虫（Plasmodium）の遺伝子産物（単数または複数）をコードするＤＮＡは、好適には、マラリア原虫（Plasmodium）抗原（単数または複数）または免疫原（単数または複数）、例えば、ＳＥＲＡ、ＡＢＲＡ、Ｐｆｈｓｐ７０、ＡＭＡ−１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ１６、ＣＳＰ、ＰｆＳＳＰ２、ＬＳＡ−１リピート不含（LSA-1 repeatless）、ＭＳＡ−１、ＡＭＡ−１またはその組み合わせをコードする。マラリア原虫（Plasmodium）の遺伝子産物（単数または複数）をコードするＤＮＡは、好適には、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７と類似の、ＣＳＰ、ＰｆＳＳＰ２、ＬＳＡ−１リピート不含、ＭＳＡ−１、ＳＥＲＡ、ＡＭＡ−１およびＰｆｓ２５の配列をコードする。ベクターは、好適には、ＮＹＶＡＣである。ベクターは、また、米国特許第５，９９０，０９１号、第６，１３０，０６６号および第６，００４，７７７号のような、転写および／または翻訳因子も、また、発現することができる。いかなる１つの特定の理論に束縛されることは望まないが、ＮＹＶＡＣベクターのような弱毒化ベクターにおいて発現される場合、フラジェリン（またはその機能可能に結合する部分）は、アジュバントまたは免疫刺激効果を有することも可能である。フラジェリン（またはその機能可能に結合する部分）を発現するベクターが、好適には、ＮＹＶＡＣベクターである場合、これは、好適には、「増進された（enhanced）」ＮＹＶＡＣベクター（すなわち、ワクシニアＫ１Ｌも、また、含有し、そして、発現する）である。好適には、フラジェリン（またはその機能可能に結合する部分）を含有し、そして発現する「増進された」複製可能な（competent）ＮＹＶＡＣベクターは、また、熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰ（Plasmodium falciparum CSP）、ＰｆＳＳＰ２、ＬＳＡ−１リピート不含、ＭＳＡ−１、ＳＥＲＡ、ＡＭＡ−１およびＰｆｓ２５も含有し、そして発現する。こうしたベクターは、ヒトにおいて、限定された複製レベルのための容量を有する一方、病原性因子のオープン  リーディング  フレームが欠失しているかまたは破壊された（deleted or disrupted）ので、確立された、ＮＹＶＡＣのベクター安全性プロファイルを保持し、そしてマラリアワクチンに望ましい免疫学的または免疫原性反応を得ることも可能である（ナジェラ, JL. 2010; Plos one（5）: e11406、キブラー（Kibler）, KV. Plos one 2011; 6: e25674）。
【００１７】
本発明の組成物は、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７組成物におけるように、ある量の、操作された、合成の、非天然存在の、または組換えフラジェリン−プラスモジウム−ポックスウィルス（また、好適には、ワクシニアＫ１Ｌを含有し、そして、発現する）を含有することも可能であり；そして本発明の免疫または防御免疫反応を誘導するための方法において、投与すべき組成物および／またはポックスウィルスの量は、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７を含む先行技術の方法において投与される量に類似であることも可能である。
【００１８】
いかなる１つの特定の理論に束縛されることも望ましくないが、本発明は、自己補助（ｓｅｌｆ−ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）免疫原性、免疫学的またはワクチン組成物（ポックスウィルスによる、特に、ワクシニアＫ１Ｌの発現を伴う、フラジェリンまたはその機能可能に結合する部分の発現による）を提供する。これらのベクター（フラジェリンまたはその機能可能に結合する部分を発現するポックスウィルス）は、自然（innate）免疫、および、たとえば、マラリア原虫（Plasmodium）感染に対する、防御免疫を提供可能なロバストな、獲得免疫反応（adaptive immune responses）の進展（development）に重要な、重要な炎症誘発カスケード（単数または複数）の引金を引くことが可能である。本発明は、したがって、マラリア原虫（Plasmodium）免疫原（単数または複数）または抗原（単数または複数）のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生に有用な、複製可能な（replication competent）、操作された、合成の、非天然存在、または組換えポックスウィルス；および生じた免疫原（単数または複数）または抗原（単数または複数）を提供する。したがって、１つの側面において、本発明は、少なくとも、１つのマラリア原虫（Plasmodium）抗原（単数および複数）または免疫原（単数および複数）をコードするＤＮＡおよび、少なくとも１つの、フラジェリンまたはその機能可能に結合する部分および／またはワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１Ｌ、および、好適には、フラジェリンまたはその機能可能に結合する部分およびワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１ＬをコードするＤＮＡ配列の両方、好適には、ポックスウィルスのゲノムの非本質的領域において、該コードするＤＮＡ配列を、その中に含む、組換えポックスウィルスに関係する。ポックスウィルスは、好適には、ＮＹＶＡＣである。好適な側面では、組換えポックスウィルスは、プラスモジウム、ＳＥＲＡ、ＡＢＲＡ、Ｐｆｈｓｐ７０、ＡＭＡ−１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ１６、ＰｆＳＳＰ２、ＬＳＡ−１、ＬＳＡ−１リピート不含（repeatless）、ＭＳＡ−１、ＣＳＰ、ＭＳＡ−１  Ｎ−末端（terminal）ｐ８３またはＭＳＡ−１  Ｃ−末端（terminal）ｇｐ４２遺伝子を発現する。好適には、複数のプラスモジウム遺伝子を、宿主において、発明の、組換えポックスウィルス、ＮＹＶＡＣ、たとえば、ＣＳＰ、ＰｆＳＳＰ２、ＬＳＡ−１−リピート不含（repeatless）、ＭＳＡ−１、ＳＥＲＡ、ＡＭＡ−１およびＰｆｓ２５によって、ワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１Ｌおよびフラジェリンまたは少なくとも１つのその機能可能に結合する部分をコードするＤＮＡの、少なくとも１つ又は両方と組み合わせて、共発現される。好適には、組換えポックスウィルスＮＹＶＡＣは、ヒトで、限定された複製の能力を提供するが、まだ弱毒化された毒性を維持する、Ｋ１Ｌ遺伝子を含む；そして、このＮＹＶＡＣは、ＣＳＰ、ＰｆＳＳＰ２、ＬＳＡ１−リピート不含（repeatless）、ＭＳＡ−１、ＳＥＲＡ、ＡＭＡ−１、Ｐｆｓ２５、ＡＢＲＡ、Ｐｆｈｓｐ７０、またはＰｆｓ１６、P. falciparum抗原（単数および複数）をコードし、発現するＤＮＡを含む。そして、好適には、このＫ１ＬおよびP. falciparum抗原（単数および複数）をコードする前記ＤＮＡを含むＮＹＶＡＣは、また、フラジェリン、またはその機能可能に結合���る部分をコードするＤＮＡを含む。それらは、好適な実施態様であるが、本発明は、たとえば、P. falciparumの抗原の１又はそれ以上、または、これらのほんの幾つかを、フラジェリン、またはその機能可能に結合する部分および／またはＫ１Ｌと同様に発現する、たとえば、ＮＹＶＡＣのような組換えポックスウィルスを含む。
【００１９】
前記P. falciparum抗体は、個別に、または、組合せで、また、フラジェリン、またはフラジェリンの機能可能に結合する部分、および、また好適には、Ｋ１Ｌを含み、および、発現する、単一のポックスウィルスベクター（たとえば、ＮＹＶＡＣｓ）によって、発現されることができる。そして、これらの単一のポックスウィルスベクターは、免疫原性、免疫学的またはワクチン組成物において、お互いの組合せで使用することができる。
【００２０】
本発明は、また、ポックスウィルス、たとえば、ＣＳＰ、ＰｆＳＳＰ２、ＬＳＡ１−リピート不含、ＳＥＲＡ、またはＭＳＡ−１  Ｎ−末端ｐ８３、およびＣ−末端ｇｐ４２のプロセッシング断片（processing fragments）を発現する、ＮＹＶＡＣ単一の組換え体において、遺伝子Ｋ１Ｌおよびフラジェリン、またはフラジェリンの機能可能に結合する部分、のうちの少なくとも、１つとの組合せとして含む。
【００２１】
本発明は、また、組換え遺伝子産物と同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、プラスモジウム（Plasmodium）遺伝子産物を製造するための、マラリアまたはプラスモジウム（Plasmodium）遺伝子を発現する 複製可能な（replication competent）ポックスウィルスの製造および使用する方法に関する。
【００２２】
他の側面において、本発明は、その組成物を接種（inoculated）された宿主動物における、免疫学的反応を誘導するための組成物に関する。当該組成物は、自然免疫（innate immunity）を誘導するためのアジュバント（adjuvant）を含むことができる。組成物は、合成の、または、操作した（engineered）、または非天然存在の、または組換えポックスウィルス、たとえば、好適には、その非必須領域中に、１又は２以上の抗原（単数および複数）又は免疫原をコードするＤＮＡ、たとえば、１又は２以上のPlasmodium抗原（単数および複数）又は免疫原、およびフラジェリンまたはその機能可能に結合する部分、および、所望により、またＫ１ＬをコードするＤＮＡを含有するＮＹＶＡＣを含む。また、動物に、その組成物またはその組成物のポックスウィルスを接種又は投与することによって、動物において、そのような免疫学的反応を誘導する方法を含む。免疫反応は、保護免疫反応であることが可能で、従って、その組成物はワクチンであることができる; しかし、それは、保護免疫反応を引き出す必要はなく、免疫原性または免疫学的組成物であることができる。好適には、ポックスウィルスのＤＮＡは、フラジェリンまたは、少なくとも、１つのフラジェリンの機能可能に結合する部分、および、Ｋ１Ｌを組合せて、１又はそれ以上、そして、好適には、プラスモディウムのＳＥＲＡ、ＡＢＲＡ、Ｐｆｈｓｐ７０、ＡＭＡ−１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ１６、ＰｆＳＳＰ２、ＬＳＡ−１、ＬＳＡ−１−リピート不含、ＭＳＡ−１、ＣＳＰ、ＭＳＡ−１  Ｎ−末端ｐ８３およびＭＳＡ−１  Ｃ−末端ｇｐ４２の全てをコードし、そして、それを発現する。
【００２３】
ＴＬＲ５  ＰＡＭＰの引き金を引くのに不可欠な、フラジェリンの部分は、フラジェリンの機能可能な結合部分である。そのようなポックスウィルスによって、たとえば、ＣＳＰ、ＰｆＳＳＰ２、ＬＳＡ−１−リピート不含、ＭＳＡ−１、ＳＥＲＡ、ＡＭＡ−１、及びＰｆｓ２５のようなマラリア原虫遺伝子（Plasmodium genes）の複数が、好適には、宿主または動物に共発現する。そして、好適には、ポックスウィルスは、宿主域遺伝子Ｋ１Ｌを含み、そして、また、フラジェリンまたはその機能可能に結合する部分を発現する。そして、好適には、ポックスウィルスは、ＮＹＶＡＣポックスウィルスである。そのようなポックスウィルスは、哺乳類、たとえば、ヒトにおいて、弱毒性の毒性プロファイルを保持しながら、制限された複製能力（capacity）を有する。したがって、本明細書において、動物または宿主は、好適には、ヒトのような哺乳動物である。
【００２４】
さらに、任意の以前知られている製品と、その製品を作ることのプロセス、または、その製品使用方法を、出願人が、権利をリザーブし、ここで、任意の以前知られている製品、プロセスまたは方法について放棄を開示することによって、本発明に包含しないことは、本発明の目的である。さらに、本発明は、出願人が、権利をリザーブし、ここで、任意の以前に開示されている製品、その製品の製造方法またはその製品の使用方法について放棄することを開示することによって、本発明の範囲に、USPTO（35 U.S.C. §112, 第１パラグラフ）またはEPO（ＥＰＣ８３条）の記載要件および実施可能要件を充足しない、任意の製品、プロセス、または製品の製造または製品の使用方法を含めることを意図しないことに留意が必要である。
【００２５】
本明細書において、特に、クレームおよび／または段落において、「含むcomprises」、「含まれるcomprised」、「含まれているcomprising」等の用語は、米国特許法において解釈される意味を有し、たとえば、それらは、「含むincludes」、「含まれるincluded」、「含まれているincluding」等を意味する。そして、「基本的に〜を含む“consisting essentially of”」および「基本的に〜を含む“consists essentially of”」という用語は、米国特許法において解釈される意味を有し、たとえば、それらは、明示的に規定されていない要素を許容するが、先行技術に見出された、または、本発明の基本的な又は新規な特徴に影響する、要素を排除する。
【００２６】
これらおよび他の実施態様は開示されるか、以下の発明の詳細な説明から自明およびそれによって含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
下記の発明の詳細な説明は、実施例により記載されるが、本発明を開示された特定の実施態様のみに限定する趣旨ではなく、一緒にある図と共に最もよく理解され、ここに、参照により引用される。ここで、:
【図１】図１は、実施例１に関する、プライマーの位置（primer locations）を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｋ１Ｌ発現カセットヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｐｆ７．２を製造するため、図１のＸｈｏＩおよびＳｐｅＩサイトの間に挿入するための、Ｋ１Ｌ発現カセットを図解したものである。
【図３Ａ】図３Ａは、発明の組換え体による発現の結果を含む。
【図３Ｂ】図３Ｂは、発明の組換え体による発現の結果を含む。
【図３Ｃ】図３Ｃは、発明の組換え体による発現の結果を含む。
【図３Ｄ】図３Ｄは、発明の組換え体による発現の結果を含む。
【００２８】
［発明の詳細な説明］
【００２９】
ポックスウィルスベクター
天然痘の撲滅キャンペーンの成功は、前例のない医療成果である（Henderson DA. Sci. Am 1976:235; 25-33）。しかし、ワクチン接種者のサブポピュレーションに、実質的なリスクを提起される重大な副作用があった。これらのリスクは、予防接種のための、ポックス ウィルスの病原性の複製可能なワクチン株（virulent replication competent vaccine strains）の使用に付随した。これらのワクチン株は、それらの接種者および密接な接触者に、特に、皮膚免疫の異常を伴う重要なリスクを齎し、生命を脅かす、ワクチン接種後の副作用を、しばしば、引き起こした。これらのイベントの性質と頻度は、十分に報告されている（Bray, M Antiviral research 2003; 58: 101-14、Engler, RJM J. Allergy Clinical Immunology 2002; 110: 357-65、 Halsell JS JAMA 2003; 289: 3283-9、Kretzschmar,  M. Plos Medicine 2006; 3（8）: 1341-51、Casey, CG. JAMA 2005; 294: 2734-43）。重大なリスクは、天然痘ワクチン接種に付随したが、これらのリスクは、公衆衛生に齎す、恐ろしいパンデミックである天然痘に照らして、許容された。
【００３０】
天然痘が根絶されたことの、世界保健機構からの通知と、組換え分子技術の登場が同時にされ、興味のある異種のターゲット遺伝子を運び、および届ける能力を有する、真核生物の組換え発現ベクトルとしての、ワクシニアの関心は、リニューアルされた（Panicali, D. Proc. Natl. Acad. Sci. 1982; 79; 4927-493、Panicali D. Proc. Natl. Acad. Sci. 1983; 80（17）: 5364-8、Mackett, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 1982; 79: 7415-7419、Smith GL. Proc. Natl. Acad. Sci. 1983; 80（23）: 7155-9、Smith GL. Nature 1983; 302: 490-5、Sullivan VJ. Gen. Vir. 1987; 68: 2587-98）。重要なことに、これらの重要な研究は、ゲノムの安定性、ゲノム操作と増幅の容易さ、そして、重要なことは、発展途上で第三世界の国におけるマラリアなどの、改善された熱帯病ワクチンのための、重要なまだ充足していないニーズに対処するのに重要である、堅牢な保存安定性の属性を持つ、新規ワクチンのベクターとして、組換えワクシニアの可能性を強調する土台を提供した。
【００３１】
ヒトにおける、その長い使用の歴史、任意の数の抗原（単数および複数）やこれらの組み合わせ、を発現する、合成の組換え体を製造する能力に加えて、ワクシニアは、おそらく、「普遍的な予防接種のビークル」である可能性を有して、組換えワクチンの製造のためのエキサイティングな新しい道を提供する（Perkus M Journal of Leukocyte Biology 1995; 58:1-13）。.組換えワクシニアベクターが、新しいワクチン技術の開発のため、獣医業界によって急速に採用された（Yilma TD. Vaccine 1989; 7: 484-485、Brochier B. Nature 1991; 354: 520-22、Wiktor, TJ. Proc. Natl Acd. Sci. 1984; 81: 7194-8、Rupprecht, CE. Proc. Natl Acd. Sci. 1986; 83: 7947-50、Poulet, H Vaccine 2007; 25（Jul）: 5606-12、Weyer J. Vaccine 2009; 27（Nov）: 7198-201）。しかしながら、もし、組換えワクシニア ベクターを、一般的なヒトの集団において使用することに、規制当局の承認を得る必要があるのであれば、ヒトのワクチンとして、よくとり上げられる安全性の問題は、検討しなければならない主なハードルとして残るであろう。厳格で継続的な臨床安全性試験を、今日、続けていることは、これらの安全性の懸念とともにある。さらに、生ウィルスワクチンに対する、安全性の懸念を構築するのは、我々の人口のかなりの割合が、癌やＨＩＶ感染症などの様々な病状を通して、高い免疫妥協された（immuno-compromised）、という事実である（Parrino J.J.Allergy Clin. Immunol. 2006;118（6）:1320-26、Jacobs BL. Antiviral Therapy 2009; 84（1）: 1-13）。 今日まで、ヒトの使用のために認可された組換えポックス ウィルス ワクチンはない（Rollier CS. Curr. Opin. Immun. 2011; 23（Jun）: 377-82）。
【００３２】
改善されたウィルス性のワクチンベクターのためのポックスウィルス 弱毒化
多くの仕事が、弱毒性ワクシニアウィルス株の開発に集中された。研究室の研究は、あるワクシニア遺伝子の欠損は、動物モデルにおける製造した組換え体の毒性を減少させることを示した（Buller, RM Nature 1985; 317（6040）: 813-5、Buller RM. J. Virol. 1988; 62（3）:866-74、Flexner, C. Nature 1987; 330（6145）: 259-62、Shida, H. J. Virol. 1988; 62（12）: 4474-80、Kotwal, GJ. J. Virol. 1989; 63（2）: 600-6、Child, SJ. Virology 1990; 174（2）: 625-9）。２つの極めて弱毒化されたワクシニア株である、修飾されたワクシニア  アンカラ（Modified Vaccinia Ankara （ＭＶＡ））およびＮＹＶＡＣの２つが、最も顕著に研究され、ヒト組織において、非複製ベクターとして見出された。ＭＶＡおよびＮＹＶＡＣの両方の組換え体は、精力的に、前臨床において研究され、そして、多くが、後期フェーズＩＩ／ＩＩＩ臨床試験を通して開発された（made their way）。両ウィルスは、広く研究され、ゲノムレベルで特徴づけられた。
【００３３】
ＭＶＡは、プライマリ鶏胚線維芽細胞（chicken embryo fibroblasts （ＣＥＦ））において、ワクシニア アンカラの高い連続継代（serial passage）によって、１９７０年代に開発された。高い連続継代は、全部で、３０数ｋｂの多くの大規模なゲノム削除と、重要なことは、ヒトと他の哺乳類における、ウィルスの複製機能の損失を齎した（Mayr A. Zentralbl Bakteriol 1978; 167（5,6）: 375-9、Antoine G. Virology. 1998; 244（2）: 365-96、Wyatt, LS. Virology 1998; 251（2）: 334-42、Sancho, MC.  J. Virol. 2002; 76（16）; 8313-34、Gallego-Gomez, JC. J. Virol. 2003; 77（19）; 10606-22）。ＮＹＶＡＣ株は、病因、毒性および宿主域規制機能（host range regulatory functions）に関与していた１８のオープン  リーディング  フレーム（ORFs）（open reading frames）の正確な削除による、ワクシニアのコペンハーゲン株のプラークの単離（plaque isolate）から派生した（Goebel SJ. Virology 1990; （a,b）179: 247-66、Tartaglia, J. Virol. 1992; 188（1）: 217-32、Patent5,762,938、Najera JL. J. Virol. 2006; 80（12）: 6033-47）。
【００３４】
ＭＶＡとＮＹＶＡＣ株は、動物モデルにおける複製する能力に関する前臨床試験と、広範なヒトの臨床試験での安全性を評価する臨床設定とが、直接、比較された（ナジェラ（Najera）,JL. J. Virol. 2006; 80: 6033-6047、Gomez, CE. J. Gen. Virol. 2007; 88: 2473-78、Mooij, P. J. Virol. 2008; 82: 2975-2988、Gomez, CE. Curr. Gene Ther. 2011; 11: 189-217）。無毒で非複製であっても、これらワクチンのベクターは、その安全性が繰り返し示された。しかし、重要なことは、多種の発現されたターゲットの抗原（単数および複数）に対して、細胞・体液性の両方の免疫応答を刺激することが、まだ可能であるということである（Cox,W. Virology 1993; 195: 845-50、Perkus, M. Jour. Of Leukocyte Biology 1995; 58: 1-13、Blanchard TJ. J Gen Virology 1998; 79（5）: 1159-67、Ockenhouse CF. J. Infec. Dis. 1998; 177: 1664-73、Amara R. Science 2001; 292: 69-74、Hel, Z., J. Immunol. 2001; 167: 7180-9、Gherardi MM.  J. Virol. 2003; 77: 7048-57、Didierlaurent, A. Vaccine 2004; 22: 3395-3403、Bissht H. Proc. Nat. Aca. Sci. 2004; 101: 6641-46、McCurdy LH. Clin. Inf. Dis 2004; 38: 1749-53、Earl PL. Nature 2004; 428: 182-85、Chen Z. J. Virol. 2005; 79: 2678-2688、ナジェラ（Najera）JL. J. Virol. 2006; 80（12）: 6033-47、Nam JH. Acta. Virol. 2007; 51: 125-30、Antonis AF. Vaccine 2007; 25: 4818-4827、B Weyer J. Vaccine 2007; 25: 4213-22、Ferrier-Rembert A. Vaccine 2008; 26（14）: 1794-804、Corbett M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2008; 105（6）: 2046-51）。
【００３５】
組換えＭＶＡ、ＮＹＶＡＣおよび他の非複製（non-replicating）ポックスウィルス  ベクター（vectors）に対する、後期のヒトの臨床試験データ量は顕著に大きくなっている。これらの試験の多くは、ワクチン開発、癌免疫治療という、最も困難な２つの分野に焦点を当てたものであった（Kaufman HL., J. Clin. Oncol. 2004; 22: 2122-32、Amato, RJ. Clin. Cancer Res. 2008; 14（22）: 7504-10、Dreicer R. Invest New Drugs 2009; 27（4）: 379-86、Kantoff PW.J. Clin. Oncol. 2010, 28, 1099-1105、Amato RJ. J. Clin. Can. Res. 2010; 16（22）: 5539-47、Kim, DW. Hum. Vaccine. 2010; 6: 784-791、Oudard, S. Cancer Immunol. Immunother. 2011; 60: 261-71）およびＨＩＶ（Wyatt, LS. Aids Res.  Hum. Retroviruses. 2004; 20: 645-53、Gomez, CE. Virus Research 2004; 105: 11-22、Webster, DP. Proc. Natl. Acad. Sci. 2005; 102: 4836-4、Huang, X. Vaccine 2007; 25: 8874-84、Gomez, CE. Vaccine 2007a; 25: 2863-85、Esteban M. Hum. Vaccine 2009; 5: 867-871、Gomez, CE. Curr. Gene therapy 2008; 8（2）: 97-120、Whelan, KT. Plos one 2009; 4（6）: 5934、Scriba, TJ. Eur. Jour. Immuno. 2010; 40（1）: 279-90、Corbett, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2008; 105: 2046-2051、Midgley, CM. J. Gen. Virol. 2008; 89: 2992-97、Von Krempelhuber, A. Vaccine 2010; 28: 1209-16、Perreau, M. J. Of Virol. 2011; Oct: 9854-62、Pantaleo, G. Curr Opin HIV-AIDS. 2010; 5: 391-396）。
【００３６】
全体的な安全性データは、副作用に関連する最小限のベクターについては優れており、これは、潜在的免疫不全である、癌およびＨＩＶワクチンのターゲット人口の大部分に関連する潜在的なリスクを考慮すると、極めて重要である。重要なことは、ワクチンの有効性を判断する際、臨床データの圧倒的な部分が、ＮＹＶＡＣおよびＭＶＡおよび他の弱毒ポックスウィルスのベクターが、これらのベクターの継続的な開発とテストを、奨励し、そして、サポートの両方をする程度に、重要な相関免疫反応を引き出すことができることを示唆する。しかし、共に癌およびＨＩＶワクチンへの取り組みに纏わる研究は、ワクチン接種者からの免疫応答は確かに奨励されているが、多くの後期試験は、さらに臨床開発を進めるために必要な、主な目的を達成することに失敗したことを示す。このポイントについて、弱いまたは準最適免疫相関のみの、ワクチン誘導に纏わるデータは、これらの失敗を評価することに焦点を置いている（Smith, JM. AIDS Res. Hum. Retroviruses 2004; 20: 1335-1347、Hanke, T. J. Gen. Virol. 2007; 88: 1-12、Sandstrom, E. J. Inf. Dis. 2008; 198: 1482-90、Walker, BD. Science 2008; 320: 760-4、Sekaly, RP. J. Exp. Med. 2008; 205: 7-12、Rerks-Ngarm S. 2009; N Engl J Med 361: 2209-2220）。
【００３７】
もし、たとえば、癌腫瘍関連抗原（単数および複数）（cancer Tumor Associated Antigens） （ＴＡＡｓ）とＨＩＶのような、弱い免疫性抗原をターゲットにした、遺伝子組換えワクチンが、有効であるならば、第二世代のＭＶＡとＮＹＶＡＣウィルスベクターを改善し、そして、開発に焦点を当てた新たな努力があるべきである。明らかに、ワクチン接種者の安全のために不可欠な弱毒の表現型を維持しながら、たぶん、ヒトにおける、より堅牢なワクチン増幅プロファイルを通じて、ウィルスの発現を高めることにフォーカスする改善が必要である。開発の仕事は、ＮＹＶＡＣおよびＭＶＡのような、非複製のウィルスのベクターの、さらなるゲノムの修飾、ワクチン投与のルート、免疫（immunization）のプライミング プロトコル、免疫刺激のシグナル伝達分子の共発現、および、強化された免疫原性の新規アジュバント戦略を含む、様々な戦略に焦点を当ててきた。
【００３８】
より強い免疫反応を引き出すための、ＮＹＶＡＣのさらなる修飾
ＮＹＶＡＣからターゲット抗原（単数および複数）の発現を高める方法の１つは、ウィルスが、病原性（avirulent）の複製の幾らか制限されたレベルを潜在的に提供する、感染サイクル（infectious cycle）に、ＮＹＶＡＣが後に移行できるように、再操作することである。重要なことは、複製能力は、弱毒化を排除しないことである（Parker SD. 2007: Vaccine 25; 6764-73）。理想的には、このレベルの複製は、ＮＹＶＡＣと比較して、強化されるだろうが、親のコペンハーゲン株から得られた複製より少ない。より堅牢な（robust）複製および発現は、プロセッシングのためのより高い抗原負荷（antigen load）を提供する。重要なことは、潜在的に、より強い自然免疫反応の引き金を引く、自然に発生するウィルス感染サイクルの、より良い模倣である。病原性として操作された、弱毒の組換えワクシニア ベクターのいくつかの例があるが、しかし、重要なことは、複製欠損のＮＹＶＡＣ株のワクチンの安全性とほぼ同じマージンを示しながら、複製可能ということである（Verardi, PH. J. Virol. 2001; 75（1）: 11-8、Langland, JO. Virology 2002; 299（1）: 133-41、Langland, JO. Virology 2004; 324（2）: 419-29、Langland, JO. J. Virology 2006; 80（20）: 10083-95、Legrand, FA. Proc. Natl. Acd. Sci. 2005; 102（8）: 2940-5、Denes, B. J. Gene Med. 2006; 8 （7）: 814-23、Day, SL. J. Immunol. 2008; 180（11）: 7158-66、Jacobs, BL, Antiviral Res. 2009; 84: 1-13、Vijaysri, S. Vaccine 2008; 26: 664-676、Dai, K. Vaccine 2008; 26: 5062-71、Huang, X. Plos One 2009; 4: e4180）。ＮＹＶＡＣを製造するために、コペンハーゲン株から特に削除された、または、ＭＶＡを製造するために、プライマリー鶏細胞における連続継代により失われた、ウィルス性のコードされた遺伝子は、抗ウィルスの宿主免疫応答の制御および／または抑制のために、特に、進化していた、主に（predominately）ウィルスの遺伝子機能である。このような要因は、病原性因子と呼ばれる。これらの要因は、ウィルスの宿主域、病理学および特定の宿主における病原性を決定できる（McFadden G. Nat. Rev. 2005; 3: 201-13）。膨大な研究の焦点は、これらの病原因子と宿主域を決定する上でのその重要性を研究することに専念した。これらの宿主域の遺伝子が特定の宿主ターゲットと接触する方法の理解は、ウィルスの病因および特定の宿主の免疫反応の廃止に関して、機能を解明した。ポックスウィルスにおいて、同定されている、約１２の別の宿主域遺伝子ファミリーがある（Werden, SJ. Adv. Vir. Res. 2008; 71: 135-171、Bratke, KA. Inf. Gen. and Evol. 2013; 14: 406-25）。ＮＹＶＡＣまたはＭＶＡに基づくワクチンの免疫原性のプロファイルを強化する多くの試みは、これらの高度弱毒化ベクターから、もともと、削除されたのと相違する宿主域遺伝子の繰返し（iterations）を復元することを観察した。伝統的な複製能力と複製欠損したＮＹＶＡＣおよびＭＶＡベクターを用いた、比較研究において、長期的な免疫応答が、伝統第一世代の複製可能なワクシニア ベクターを用いた免疫において、より堅牢であることは、明らかだった（Ferrier-Rembert, A. Vaccine 2008; 26: 1794-1804）。さらに、非複製ワクシニアベースのベクターを用いた、ヒトの準最適な（suboptimal）臨床試験と相まって（Rerks-Ngarm, 2009）、優れた安全性プロファイルを提供しつつ、複製が欠損されたベクターは、いくつかの場合、堅牢で、長期に継続する、獲得免疫反応���刺激するに十分な抗原負荷（antigen load）を提供しない、そして、ウィルス複製の、あるレベルは、より強力なワクチン免疫を提供するであろうことが、本技術分野の数人によって提案された。
【００３９】
以前に特定された、宿主域遺伝子Ｃ７ＬおよびＫ１Ｌは、ウィルスを複製サイクルに、さらに移行することを可能にするために、ＮＹＶＡＣの弱毒ゲノムの中に挿入し返す（reinsert back）ための、自明な選択のターゲットであった（Perkus, ME. Virology 1990; 170: 276-86、Tartaglia, J. Virology 1992;188: 217-232、 Shisler, JL. J. Virol. 2004; 78: 3553-60、Bradley, RR. Virus Res. 2005; 114: 104-12）。Ｃ７Ｌは、Ｉ型インターフェロンにより誘導された、宿主抗ウィルス活性を阻害することが知られていた（Meng, X J. Virol. 2009; 83:10627-636、Backes, S. J. Gen. Virol. 2010; 91: 470- 482）。さらに、Ｃ７ＬおよびＫ１Ｌは、感染した細胞におけるＰＫＲ活性の阻害を通して、ｅＩＦ２αのリン酸化、および、アポトーシスの誘導を阻害した（ナジェラ（Najera）, JL. J. Virol 2006; 80: 6033-47、Willis, KL. Virology 2009; 394: 73-81）。特に、Ｃ７Ｌが、ＮＹＶＡＣに戻されるように操作された場合、生成した、修飾されたＮＹＶＡＣ−Ｃ７Ｌウィルスは、ヒトおよびネズミの両細胞において、複製能力があることが発見された。Ｉｎ  ｖｉｖｏで、弱毒のプロファイルを維持しながら、宿主制限のＮＹＶＡＣベクターと比較して、発現されたＨＩＶの抗原（単数および複数）に対して、明らかに優れた免疫応答をもって、高められたウィルス発現を示すために、マウス モデルが使用された（ナジェラ（Najera）, JL. J. Virol. 2006; 80: 6033-47、ナジェラ（Najera）. JL. 2010）。他の実施例において、ＮＹＶＡＣのゲノム修飾は、Ｃ７ＬおよびＫ１Ｌの両方の再挿入を用いて、さらに、Ｉ型ＩＮＦ阻害剤において、Ｂ１９Ｒを除去する追加の修飾、という、さらに１工程がとられた（Kibler, KV. 2011;、 Gomez, CE. Jour. Of Virol. 2012; 5026-38）。 想像したように、Ｃ７ＬおよびＫ１Ｌ（ＮＹＶＡＣ＋Ｃ７Ｌ，Ｋ１Ｌ）の両方を含む、ＮＹＶＡＣベクターは、様々な異なるヒト培養細胞において、複製可能であることが判明した。重要なことは、（ＮＹＶＡＣ＋Ｃ７Ｌ、Ｋ１Ｌ）は、コペンハーゲンおよびＮＹＣＢＨなどの野生型の複製可能な株と比較して、まだ、高度弱毒表現型を保持することが見出だされた。
生物分布解析（Bio-distribution analysis）は、Ｂ１９Ｒの削除などの他のゲノム修飾は、（ＮＹＶＡＣ＋Ｃ７Ｌ，Ｋ１Ｌ）と比較して、潜在的に、Ｉ型ＩＮＦの活性化を通した、ＰＫＲ活性化を通して、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）センサーの誘導を齎し、さらなる弱毒化を許容することを示した（Kibler, KV. 2011）。
【００４０】
本発明の特定の発明的実施態様は、たとえば、これらのベクターがさらに、より病原性の親の複製可能なコペンハーゲン株と複製欠損株である、ＮＹＶＡＣまたはＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮ、カナリアポックス（canarypox）または鶏痘ポックス（fowlpox）またはＡＬＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣの中間のレベルに、特異的にヒトの組織において複製され、そして、少なくとも１つのワクチンのターゲット抗原（単数および複数）を共発現するように開発されるように、宿主域遺伝子Ｋ１Ｌ（ＮＹＶＡＣ＋Ｋ１Ｌ）を含むように修飾されたＮＹＶＡＣベクターである、宿主域遺伝子Ｋ１Ｌを含む、ＮＹＶＡＣまたは（哺乳類について）他の弱毒ポックスウィルスである。好適には、そのようなベクターは、また、フラジェリンまたはその機能可能に結合する部分をコードし、そして発現するＤＮＡも含む。
【００４１】
ワクチン対する免疫応答を高める方法
ワクチンを運ぶルート 
ＨＩＶ試験において、弱毒のベクターであるＮＹＶＡＣとＭＶＡを用いて得られた準最適の結果を考慮し、代替品が、効果を高める希望を持って、これらの制限に対処するために探された。広範な研究が、組織培養において、ＭＶＡおよびＮＹＶＡＣを直接比較して行われた（ナジェラ（Najera） et al., 2006）、ゲノムプロファイリング研究 （Guerra et al., 2004, 2006）、 およびヒトの臨床試験における免疫原性（Gomez et al., 2007a, b）。重要なことは、接種経路とｉｎ  ｖｉｖｏで伝播するウィルスの能力を比較する研究が行われた（Gomez, CE. 2007; 88: 2473-2478、Gomez, CE. Vaccine 2007b: 25; 1969-92）。ＮＹＶＡＣとＭＶＡは、非常に弱毒化されたけれど、それらは両方ともに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、潜在的に、免疫学的関連性に関して、相違を示した（Mooij, P. J. Virol. 2008; 82（6）: 2975-88）。
【００４２】
ＨＩＶ、Ｓａｒｓコロナ ウィルスを含む、多くのウィルスのウィルス伝達の通常のモードは、粘膜表面を通してである。粘膜のサイトでの、細胞介在性応答は、保護のために重大であると信じられている。いくつかの初期の研究からの臨床データは、経皮（cutanous）または筋肉内のルートでの免疫が、末端の（distal）表面粘膜サイトで、重要な細胞応答を齎すことができるかどうかに関しては不明確だった（Benson, J. 1998; J. Virol. 72: 4170-82、Belyakov, IM. J. Clin. Invest 1998; 102: 2072-2081、Cromwell, MA. J. Virol. 2000; 74: 8762-66、Stevceva, L. Genes Immun. 2000; 1: 308-15、Hel, Z. J. Immunol. 2001; 167: 7180-91、Stittelaar, KJ. Vaccine 2001; 19: 3700-09、Stevceva, L. Jour. Of Virol. 2002; 76（22）: 11659-76）。いくつかの最近の研究は、予防接種の粘膜のルートは有利である可能性を示す（Huang, X. Vaccine 2007; 25: 8874-84、Gherardi, MM. J. Gen. Virol. 2005; 86: 2925-36、Neutra, MR. Nat. Rev. Immunol. 2006; 6:148-158、Karkhanis, Curr. Pharm. Des 2007; 13: 2015-23、Corbett, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2008; 105（6）: 2046-51、Belyakov, IM. J. Immunol. 2009; 183: 6883-6892）。さらに、予防接種の粘膜ルートは、既存の免疫（immunity）の克服に効果的に見える。強い抗ベクター反応は、発現された抗原ターゲットの抗原負荷を減少することができ、したがって、潜在的に獲得免疫応答を制限する（Naito, T. J. Gen. Virol. 2007; 88: 61-70）。
【００４３】
免疫開始（Immunization Priming）
プライムブースト（Prime boost）は、免疫反応を高めるため、予防接種のプロトコルにおいてルーティンで使用される。古典的な免疫研究は、一度活性化され、そして停止を許容され、その後、再活性化された、免疫システムは、Ｂ細胞とＴ細胞の両方の応答に、顕著な増大（boost）を齎すことを示すことを明らかにした（Murphy, K. Janesway C. Immunology 7th ed. 2008; New York, NY）。同じ生存中の組換えウィルスベクターを、宿主細胞による、直接の抗原発現に、繰り返し使用する場合、強い抗ベクター免疫反応（開始ワクチンにより誘導された）は、次のブースト（boost）の効果をブロックできる。本質的に、ブースト ワクチン（boost vaccine）は、宿主細胞からウィルスの発現が、免疫シグナルと共に、別の（foreign）蛋白質を発現できる前に抑制され（quelled）、したがって、元のワクチンを接種するメリットを、ほとんどを提供しない。ベクター特異的免疫を克服するためには、ブーストと異なるベクターを使用することが重要である。プライム ブースト プロトコルは、本分野において、よく知られている（Hu, SL. Science1992; 255: 456-459、Richmond, JFL. Virology 1997; 230: 265-274、Brown, S. Viruses 2010; 2: 435-467）。ＤＮＡなどの別のベクターシステムから、興味のある抗原を発現し、その後、組換えウィルス ベクターを使用して、ブーストする（boosting）、プライム ブースト レジメン（Prime boost regimens）は、ワクチンの有効性を高める（Ramsay, AJ. Immunol. Cell Biol. 1997;75: 382-388、Ramshaw, IA. Immunol. Today 2000; 21: 163-165、Estcourt, MJ. Int. Immunol. 2002; 14: 31-37、Hodge, JW. Can. Res. 2003; 63（22）:7942-9、Woodland, DL. Trends Immunol. 2004; 25（2）: 98-104、Webster, DP. Proc. Nat Acad. Sci. USA 2005; 102（13）: 4836-41、Harari, AJ. Exp. Med. 2008; 205: 63-77、Melief, CJM. 2008; Immunity 29: 372-83、Brave, A. Mol. Ther. 2007; 15: 1724-1733、Robinson, HL. Hum. Vaccine 2009; 5: 436-438、Gudmundsdotter, L. Vaccine 2009; 27: 4468-4474、Ishizaki, HJ. Immunother. 2010; 33（6）: 609-17、Krupa, M. Vaccine 2011; 29（7）: 1504-13）。
【００４４】
重要なことに、組換えＮＹＶＡＣとＭＶＡのベクターについては、後期段階の臨床データの多くは、ＨＩＶワクチンにフォーカスされている。明らかに、理想的な ＨＩＶワクチンのためには、強い細胞性免疫、記憶細胞（memory cells）および粘膜表面および体全体の抗体を引き出す、獲得免疫システム（adaptive immune system）の両方の力（arms）を刺激することが重要である（Demberb, T. Int. Rev. Immunol. 2009; 28（1）: 20-48、Neutra, MR. Nat. Rev. Immunol. 2006; 6:148-158）。さらに、臨床研究は、ＨＩＶウィルスの負荷を含む能力は、堅牢な、細胞性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答と強く関連している、ことを示す（Dorrell, L. Vaccines 2005; 4（4）: 513-20、Kuroda, MJ. 1999; 162: 5127-33、Shen, X. J. Immunol. 2002; 169: 4222-29、Carrington, M. Ann. Rev. Med. 2003; 54: 535-51、Frahm, N. J. Virol. 2005; 79: 10218-25、Dorrell, L. J. Virol. 2006; 80（10）: 4705-16、Dorrell, L. Vaccine 2007; 25: 3277-83、Frahm N. Nat. Immunol. 2006; 7: 173-8、Wilson NA. J. Virol. 2006; 80: 5875-85、Harari, AJ. Exp. Med. 2008; 205: 63-77、McCormack, S. Vaccine 2008; 26: 3162-74、Mooij, PJ. Virol. 2008; 82: 2975-88、Van Montfoort, N. Proc. Natl. Acad. Sci. 2009; 106; 6730-35、Quakkelaar ED. Plosone 6; 2011: e16819）。明らかに、獲得免疫システム（adaptive immune system）の両方の力（arms）を刺激する、免疫レジメ（immunization regimens）および抗原のデリバリーのモード（modes of antigen delivery）は、組換えワクチンのデザインに、明確な利点を提供する（Dorrell, L. 2005 and 2007、 Sekaly, RP. J. Exp. Med. 2008; 205: 7-12）。
アジュバントとして免疫刺激系遺伝子発現（Immuno-stimulatory gene expression as an adjuvant ）
【００４５】
共刺激性分子（Co-stimulation molecules）
免疫を最適化する別の方法は、Ｔ細胞の共刺激を通じてである。Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＴ細胞の対応する受容体との共刺激分子の相互作用に加えて（along with）、ＭＨＣペプチド複合体が、Ｔ細胞の受容体との相互作用に依存する。発現される抗原（単数および複数）が、ＴＡＡｓなどの不十分な免疫原性のみである場合、共刺激が特に重要である。Ｔ細胞表面抗原である、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４のためのリガンドおよびヒト共刺激分子（ＴＲＩＣＯＭ）のトライアド（triad）である、Ｂ７．１のような共刺激分子の使用は、広く研究されてきた（Damle, NK. J. Immunol, 1992; 148: 1985-92、Hodge, JW. Can. Res. 1999; 59: 5800-7、Von Mehren, M. Clin. Cancer Res. 2000; 6: 2219-28、Lu, M. Proc. Natl . Acad. Sci. 2004; 101（suppl2）: 14567-71、Gulley, JL. Clin. Can. Res. 2005; 11: 3353-62、Arlen, PM. J. Urol. 2005; 174: 539-46、Nam, JH. Acta. Virl. 2007; 51: 125-30、Madan, RA. Exp. Opin. Invest. Drugs 2009; 18: 1001-11）。データは、共刺激分子を介して強化された免疫応答が、持続的な活性化とＴ細胞におけるシグナル伝達につながることを示唆する。さらに、共刺激（co-stimulation）は、より効果的なターゲットの細胞溶解を齎す、ＣＴＬ結合力（avidity）を増加することが示唆される（Oh, S. J. Immunol. 2003; 170: 2523-30、Hodge, JW. J. Immunol. 2005; 174: 5994-6004）。自然（Innate）免疫の活性化は、共刺激性分子の発現を制御できる。
【００４６】
サイトカイン（Cytokines）
免疫アジュバントを使用する理由は、抗原提示細胞（Antigen Presenting Cells）（Apc）とＴ細胞の相互作用によってワクチンへの免疫反応を高めることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、およびＦＬＴ−３リガンドなどの様々なサイトカインの共発現は、広く研究されてきた。
ターゲットである発現した抗原（単数および複数）の近くの（in the vicinity with）サイトカインの共発現は、ＡＰＣｓに対して増強されたプレゼンテーションを齎す、免疫のサイトへの、樹状細胞（dendritic cells）（Dc）の、補充（recruitment）を増強することが見出された。サイトカインの共発現は、再び、不十分な免疫原性のＴＡＡｓに対する反応を高める（boost）ために、癌ベースのワクチンにおいて、高度に利用されてきた（Kass, E. Cancer Res. 2001; 61: 206-14、Davis, ID. J. Immunothere. 2006; 29: 499-511、Arlen, PM. J. Urol. 2007; 178: 1515-20、Lechleider, RJ. Clin. Can. Res. 2008; 14: 5284-91、Gulley, JL. Can. Immunol. Immunother. 2010; 59: 663-74、Kantoff, PW. N. Eng. Jour. Med. 2010; 363-411-22、Lutz, E. Ann. Sur. 2011; 253: 328-35）。自然（Innate）免疫の活性化は、サイトカインの発現を制御できる。
【００４７】
自然免疫活性化（Innate Immunity Activation）
自然免疫における Toll 様受容体の役割（Role of Toll-Like Receptors in Innate Immunity）
免疫反応は、自然および獲得免疫（innate and adaptive immunity）に、古典的に、分類されている。獲得応答は、さらに、細胞性および体液性（humoral）に細分化される。自然と獲得応答の比較分析において、獲得免疫は、侵略する病原体に集中する（trafficking to converge on the invading pathogen）免疫細胞、サイトカインおよび抗体のさらなる誘導を齎す、Ｔ細胞とＢ細胞の抗原特異的な受容体の特異性によって制御される。さらに、同じ病原体への後続の獲得応答のいずれも、より急速に再生することができるように、メモリーＴおよびＢ細胞（memory T and B-cell）の応答が生成される（ジェインウェイ（２００２））。自然免疫は、すべての脊椎動物（vertebrates）で見出される。もともと、自然応答は、古代宿主防御の痕跡とみなされ、そして、即時宿主防御−より重要な獲得応答を引き継ぐことができるまでの、一時的なおよび高度の非特異的反応−として単純に使用された、と考えられた。しかし、最近の研究は、自然免疫システムが、異質な病原体（foreign pathogens）の重要な署名（signatures）を識別する能力を持つ、高度の特異性を有することを示した。外国病原体（foreign pathogens）の署名（signatures）を識別する能力は、指定された受容体の極めて保護されたファミリー（a highly conserved family）である、ショウジョウバエ（Drosophila）で特定されたＴｏｌｌ蛋白質に相同なＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）に関連付けられる（Lemaitre, B. Cell 86; 973-83）。 
【００４８】
ＴＬＲｓは、ロイシン豊富な繰返し領域（ＬＲＲ）と細胞内シグナル伝達ドメイン（cytoplasmic signaling domain）と、細胞外（excellular）の ドメインを有する、タイプ１の膜内在性糖タンパク質（integral membrane glycoproteins）である。ＬＲＲドメインは、リガンド結合のために重要である（Akira, S. Phil. Trans R. Soc. B 2011; 366: 2748-55）。初期の研究は、特定のＴＬＲｓ（ＴＬＲ−４）が、リポ多糖（ＬＰＳ）、グラム陰性菌の細胞壁成分の認識に関与していたことを示す。ＬＰＳ認識と哺乳類のＴＬＲｓの関連（connection）は、ＴＬＲｓと病原体関連の分子パターン（ＰＡＭＰ）認識の間に必要な、重要なリンクを提供した（Poltorak, A. Science 1998; 282（5396）: 2085-88、Qureshi, ST. J. Exp. Med. 1999; 189（4）: 615-25、Hoshino, K. J. Immunol. 1999; 162（7）: 3749-52）。
【００４９】
今日まで、ＴＬＲファミリーの１２のメンバーが、哺乳類で確認されている（Akira, S. Cell 2006; 124: 783-01、Beutler, B. Nature 2004; 430: 257-63、Medzhitov, R. Nature 2007; 449: 819-826）。ＴＬＲｓは、細菌やウィルスの病原体由来の様々なコンポーネントを認識できる。ＬＰＳに加えて、細胞壁のコンポーネント、細菌やウィルスのＤＮＡが、（ＣｐＧ）を介して、ＴＬＲ−９で認識される（Hemmi, H. Nature 2000; 408: 740-5）。ｓｓＲＮＡは、ＴＬＲｓ７および８によって（Hemmi, H. Nat. Immunol. 2002; 3: 196-200、Diebold, S. Science 2004; 505: 1529-31）、ｄｓＲＮＡは、ＴＬＲ−３によって（Alexopoulou, L. Nature 2001; 413: 732-38）、そして、細菌性フラジェラのコンポーネントである、フラジェリン（Flagellin）のような細菌性蛋白質が認識される。フラジェラは、細菌運動（bacterial motility）に関与しており、ＴＬＲ−５によって検出される（Hayashi, F. Nature 2001; 410: 1099-1103、Uematsu, S. Nat. Immunol. 2006; 7: 868-874）。ＴＬＲｓは、細胞内の配置に関して、分類することができる。ＴＬＲ１，２，４−６は、細胞表面に、ＴＬＲ３，７−９は、エンドソーム内にある （Kumar H. Biochem. Biophy. Res. Commun. 2009; 388: 621-5）。
【００５０】
一旦、ＴＬＲ特定リガンドにより、引き金がひかれたら、ＴＩＲドメインを含む（TIR-Domain containing）誘導インターフェロンＢ（ＴＲＩＦ）または骨髄分化初期応答遺伝子（Myeloid Differentiation Primary Response Gene)（ＭｙＤ８８）と呼ばれるアダプター分子（adapter molecules）を介して、シグナル伝達プロセスが発生する。この結果、炎症性サイトカインとＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を齎す、ＮＦ−ＫＢやＩＲＦ転写因子を活性化する、ＴＲＩＦおよびＭｙＤ８８の介在を通して、サイトソリック・シグナリング複合体（cytosolic signaling complexes）を産生する（Yamamoto M. Science 2003; 301（5633）: 640-3、Kawai T. Semin. Immunol. 2007; 19（1）: 24-32、O’Neill LA. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7: 353-64）。さらに、これらの転写因子の活性化は、補完および凝固カスケード（complement and coagulation cascades）の活性化と、食作用およびアポトーシス（phagocytosis and apoptosis）の誘導を齎す（Adams, S. Immunotherapy 2009; （6）: 949-64）。これらのすべてのプロセスは、免疫保護の、自然および獲得という力を開始する重要な役割を果たす（Hoebe K. Nat. Immunol. 2004; 5（10）: 971-4、Akira S. Nat. Immunol. 2001; 2（8）: 675-80、Medzhitov, R. Nature 1997; 388（6640）: 394-7）。
【００５１】
Ｔｏｌｌ様受容体とウィルス感染（Toll-Like Receptors and Viral Infection）
ＴＬＲｓが、ウィルス感染の制御に関与していたという最初の証拠は、いくつかのウィルスが、特に、ＴＬＲシグナル応答（signaling responses）をターゲットにし、かつブロックする遺伝子を発現したという知見から得られた。ＴＬＲｓは、多くの異なるウィルス性高分子の文脈で（in context with）、多種多様なウィルスファミリーに対する抗ウィルス応答に関与することが示されている。そのリストは、長く、広範囲に見直された（Carty, M. Clinical and Exp. Immunol. 2010; 161: 397-406）。形質細胞様樹状細胞（Plasmacytoid dendritic cells）（pDC） は、Ｉ型ＩＦＮを製造し、抗ウィルス応答に重要な、特殊な免疫細胞である（Gilliet M. Nat. Rev. Immunolo. 2008; 8: 594-606、Theofilopoulos AN. Ann. Rev. Immunol. 2005; 23: 307-36）。エンドソームにおいて、ウィルス核酸による、ＴＬＲｓ７と９のシグナル伝達が、ｐＤＣｓの活性化を促進することが示されている。ＴＬＲｓ７と８が、Ｇ／ＵリッチのｓｓＲＮＡを検出する一方、ＴＬＲ９は、ＤＮＡにおけるＣｐＧを検出する（Diebold SS. Science 2004; 303: 1529-31、Krieg AM. Ann. Rev. Immunol. 2002; 20: 709-60、Heil F. Science 2004; 303: 1526-29）。ＴＬＲ７−９シグナル伝達（signaling）は、アダプター（adaptor）ＭｙＤ８８ が介在する（Akira S. Nat. Rev. Immunol. 2004; 4: 499-511）。 
【００５２】
ワクシニアは、感染によって、ｐＤＣｓを活性化することが示されている。単球（monocytes）、大食細胞（macrophages）および、ケラチノサイト（keratinocytes）などのヒト細胞において、ＮＦ−ＫＢの活性化は、ＴＬＲ２、３および４を通して仲介される（Bauernfeind, F. Nat. Immunol. 2009; 10: 1139-41、Howell, MD. Immunity 2006; 24: 341-8、Carty, M. Clinical and Exp. Immunol. 2010; 161: 397-406）。比較すると、マウスにおいては、 Ａ／ＴリッチのウィルスＤＮＡは、ＴＬＲ８により検出され、活性化されたｐＤＣｓからＩＮＦ応答を齎す（Martinez, J. Proc. Nat. Acad. Sci. 2010; 107: 6442-7）。重要なことは、マウスのこの応答は、ＴＬＲ−９と独立であることが示された。興味深いことに、ヒトのｐＤＣｓは、ＴＬＲ８を発現せず、ＴＬＲ７と９のみである。しかし、ヒトの従来のＤＣｓは、ＴＬＲ８を発現し、これらはＩＦＮ応答において、役割を果たす可能性がある（Iwasaki A. Nat. Immunol 2004; 5: 987-95）。ワクシニアは、ＴＬＲシグナル伝達のモードをターゲットとする複数の遺伝子をコードすることに留意することは重要である。Ａ４６Ｒは、ＭｙＤ８８の活性を阻害することが示されている一方、Ａ５２ＲとＣ４Ｌは、ＴＬＲが介在するＮＦ−ＫＢの活性化を阻害する（Stack, J. J. Exp. Med. 2005; 201: 1007-18、Maloney, G. J. Biol. Chem 2005; 280: 30838-44、Stuart W. Jour. Gen. Virol. 2012; 93: 2098-108）。その他のウィルスは、ＴＬＲの活性をブロックする方法を開発した。Ｃ型肝炎ＨＣＶは、ＴＲＩＦ複合体を開裂する、そのプロテアーゼＮＳ３／４ａの活性を通して、ＴＬＲのシグナル伝達を阻害することが示された。一方、ＮＳ５ａは、直接ＭｙＤ８８を阻害する（Li, K. Proc. Nat. Acad. Sci. 2005; 102: 2992-7、Abe T. J. Virol. 2007; 81: 8953-66.）。
【００５３】
ＴＬＲｓ発現プロファイル（ＴＬＲｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ）
ＴＬＲｓは、宿主防衛システム（host defense system）の最前線（forefront）にあり、病原体の検出のためのシステム全体のネットワーク（system wide network）を提供する。ヒトにおいて、ＴＬＲｓを発現する、１０の異なるネットワークは、様々な異なる細胞の種類で決定された。重要なことは、ＴＬＲｓは、免疫系の細胞に見つかるだけでなく、腸管、泌尿生殖器および、呼吸器管（respiratory tracts）の上皮細胞（epithelial cells）、病原体の侵入部位に潜在的に重要な領域において発現されている（Guillot, L. J. Bio. Chem. 2004; 280: 5571-80、Vora, P. J. Immunol. 2004; 173（9）: 5398-405）。細胞の種類による、ＴＬＲの発現プロファイルは、十分に確立されている；ｍＤＣｓは、ＴＬＲｓ（１−６，８）を発現し、ｐＤＣｓは、ＴＬＲ（７，９）を発現し、ニュートロフィル（neutrophils）は、ＴＬＲ（１，２，４−１０）を発現し、ＮＫ細胞は、ＴＬＲ１を発現し、単球は、ＴＬＲ３を除くすべてを発現し、Ｂ−リンパ球（lymphocytes）は、ＴＬＲ（９，１０）を発現し、活性化されたＴ−細胞は、ＴＬＲ２を発現し、レギュラトリー（regulatory）Ｔ−細胞は、ＴＬＲ（８，１０）を発現する（Kadowaki, N. J. Exp. Med 2001; 194（6）: 863-869、Bernasconi, NL. Blood 2003; 101（11）: 4500-04、Hayashi, F. Blood 2003; 102（7）: 2660-69、Muzio M. J. Immunol. 2000; 164（11）: 5998-6004、Hasan, U. J. Immunol. 2005; 174（5）: 2942-50、Peng, G. Science 2005; 309（5739）: 1380-84）。 
【００５４】
デザイナーワクチンのアジェバント（designer vaccine adjuvants）に重要なＴＬＲアゴニスト
ＴＬＲ特異的な活性化されているリガンドと、異なる種類の細胞において、発現されている補体についての情報を持つことによって、現在、ワクチンの免疫原性を高めるために、アジュバントとして、ワクチン製剤において、活性化リガンドを使用して、特異的に、ＴＬＲｓをターゲットにすることが可能である。このようなデザイナーワクチン（designer vaccine）において、 ワクチン接種の場所またはルート（皮膚、鼻腔内粘膜（mucosol intranasal））、望まれる免疫応答の種類（細胞性（cellular）、体液性（humoral）または両方、ＴＨ１または２））、ワクチンの種類（サブユニット（subunit）、ウィルス性（viral）または（bacterial）、 生（live）、死滅）に関して、ワクチンの最適化のために、ＴＬＲの活性化コンポーネントを組込むことが可能である。ウィルス特定的なＴＬＲｓを、自然に活性化する、生きている組換えのワクシニアベクターを使用する本実施例において、ワクチンに対する免疫応答をさらに刺激する、アジュバント（adjuvanting）効果を提供する、追加のＴＬＲの活性化を採用する（recruit）ために、１つまたは複数の追加のＴＬＲリガンド（単数および複数）（または、少なくとも、そのリガンドの操作可能な結合部分）を共発現することは、極めて有利である。感染の特定のクラスを制御し、宿主に対してダメージを誘導した免疫応答を制限するために、自然免疫システムの活性化によって決定される、厳格な規制を、認識することは極めて重要である。たとえば、ウィルスの自然免疫活性化は、インターフェロンおよびプログラムされた細胞死を誘導することができ、一方、細菌の自然免疫活性化は、活性酸素種を誘導し、およびセル存続を促進する；獲得免疫応答は、このパターンに従う。自然免疫の活性化は、同様の感染症に対して、適切な獲得（acquired）免疫応答に対する、感染症の各クラスについて、最適化される。ＮＹＶＡＣなどのウィルスのベクターによって発現される抗原（単数および複数）に対するほとんどの免疫応答は、抗ウィルスであると期待されている。しかし、フラジェリンのような、細菌ＰＡＭＰを、ウィルスのベクターに新規に包含することは、予測される抗ウィルス応答および抗細菌の応答の追加配列を誘導する。抗ウィルス ・抗菌の２つの反応の誘導と共に（新規ワクチンの性質によって決まる非自然な応答）、マラリア原虫感染症が発生した場合に、この２つのクラスの自然応答のワクチン誘導は、免疫反応の活力と幅を高めるべきである。将来、ワクチンの有効性をさらに高めるために、自然マラリア免疫活性剤（innate Plasmodium immune activators）が使えるかもしれない。
【００５５】
ワクチンのアジュバントとしての、フラジェリン、ＴＬＲ５リガンド
フラジェリンは、運動（motility）を担当する、ある細菌が有する構造体である、フラジェラの不可欠なコンポーネント（integral component）である。 サルモネラの分離株には、フラジェラー抗原（flagellar antigens）をコードする、２つの遺伝子がある。ＦｌｉＣは、フェーズＩのフラジェリンをコードし、ＦｌｊＢは、フェーズＩＩのフラジェリンをコードする （Zieg J. Science 1977; 196: 170-2.）。ＦｌｉＣとＦｌｊＢの両方は、フラジェラー（flagellar）構造の一部を形成する、ＮとＣのドメインをコードする（McQuiston JR. J. Clin. Microbio. 2004; 42: 1923-32）。重要なことは、両者は、ＴＬＲ５によって認識されるモチーフ（motifs）を含む。
【００５６】
ＴＬＲ５による、フラジェリンの検出に加えて、ＮＬＲＣ４インフラマソーム複合体（inflammasome complex）に基づく、２つ目のフラジェリン検出システムがある（Zhao Y. Nature 2011; 477: 596-600）。ＮＬＲＣ４インフラマソーム複合体の活性化のメカニズムは、広く研究された（Franchi, L. Nat. Immunol. 2006; 7: 576-682.、Franchi, L. Eur. J. Immunol. 2007; 37: 3030-39、Miao, EA. Nat. Immunol. 2006; 7: 569-75.、Miao EA., Proc. Nat. Acad. Sci. 2008; 105: 2562-67、Miao EA. Proc. Nat. Acad. Sci. 2010; 107: 3076-80）。インフラマソームの活性化は、成熟したＩＬ−ＩＢ、ＩＬ−１８、および炎症促進性の（pro-inflammatory）サイトカインのリリースに導いた（Jordan, JA. J. Immunol. 2001; 167: 7060-68、Birrell MA. Pharmacol. Ther. 2011; 130: 364-70、Suttwala, FS. J. Exp. Med. 2007; 204: 3235-45）。インフラマソーム（inflammasome）のコンポーネントは、細胞質中に見つかった、したがって、フラジェリンのシグナル伝達は、細胞質で検出される（Franchi L. Nat. Immunol. 2012; 13: 325-32）。 
【００５７】
興味深いことに、ＴＬＲ５のリガンドである、フラジェリンは、アジュバントとして、ワクチン製剤（vaccine formulations）で有用性を示した（Wang, BZ. J. Virol. 2008; 82: 11813-23、Huleatt, JW. Vaccine 2008; 26: 201-14、Le Moigne, V. Mol. Immunolo. 2008; 45: 2499-2507、Wang, BZ. Clin. and Vaccine Immunol. 2012; 19（8）: 1119-25）。
さらに、 フラジェリンは、ワクチン抗原製剤（vaccine antigen preparations）において、物理的な連合（physical association）（製造混合物（formulation mixtures））において、効果的なアジュバントであることが示されたか、または、標的抗原との融合（fusion）で発現されるか、または、最終的に、ウィルス様粒子（virus-like particles）（ＶＬＰｓ）のように、ターゲット抗原（単数および複数）とともに、ウィルス粒子の中に一緒に組み込まれた（Huleatt, JW. Vaccine 2008; 26: 201-14、Mizel, SB. Clin. Vaccine. Immunol. 2009; 16: 21-28、Wang, BZ. J. Virol. 2008; 82: 11813-23）。フラジェリンとＴＬＲ５の認識は、中央の可変領域と関連付けられていない（Anderson -Nissen E. Proc. Nat. Acd. Sci. 2005; 102: 9247-52.）。しかし、過免疫中央可変領域（hyperimmune central variable region）を除去することの重要性については、矛盾した報告がある（Ben-Yedidia T. Immuno Lett. 1998; 64: 9-15、Nempont C. J. Immunolo. 2008; 181: 2036-43）。興味深いことは、フラジェリンのアジュバント効果は、特定の粘膜免疫応答を制御するかもしれないことを示唆するレポートがあり、そして、さらなる示唆は、たとえば、鼻腔内のような粘膜表面のような、免疫の特定ルートを介すると、より効果的であろうということである（De FiletteM. Virology 2008; 337: 149-61、Liang B. J. Virol. 2001; 75: 5416-20）。
【００５８】
したがって、本発明の特定の発明的実施態様は、以下を含む：１つまたは複数の外因性または異種の抗原（単数および複数）または免疫原（単数および複数）（immunogens）の組換え、または合成され、または操作された、非自然発生する、ポックス ウィルスと、アジュバントとしての、１つまたは複数のＰＡＭＰモジュレーターの共発現。
従って、本発明は、共発現された抗原（単数および複数）または免疫原（単数および複数）に対する獲得免疫応答の活性化のために、ＴＬＲ５の活性化に関与する、フラジェリンＰＡＭＰを、特異的に発現するように、開発された、ポックスウィルス  ベクターを含む。ある実施態様において、ポックスウィルスは、ＮＹＶＡＣ、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ、カナリアポックス、鶏痘ポックス、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣのような、弱毒ポックスウィルス（哺乳類に対して）である。そのような実施態様において、共発現された抗原（単数および複数）または免疫原（単数および複数）に対する獲得免疫応答の活性化のために、ＴＬＲ５の活性化に関与する、フラジェリンＰＡＭＰを、特異的にターゲットにし、および、引き金を引くと、該ポックスウィルスは、細菌のタンパク質フラジェリンの全体または操作可能な結合部分のコーディングＤＮＡを含み、発現する。フラジェリンの操作可能な結合の部分は、ＴＬＲ５受容体に結合して、活性化に関与する部分であり、ターゲットのワクチン抗原に対する免疫刺激炎症促進性の応答のカスケードを齎す。フラジェリンまたは操作可能な結合の部分は、ペプチドまたは、抗原（単数および複数）、または免疫原（単数および複数）との融合として、発現され、オプションの多様性を提供する。フラジェリンまたはその操作可能な結合部分の発現の鍵は、フラジェリンが、実施可能に（operably） および特異的に、ＴＬＲ５を作動し、発現された抗原（単数および複数）又は免疫原（単数および複数）に対して、さらにアジュバントの獲得免疫応答を刺激する。 
【００５９】
本発明は、従って、合成の、操作の、組換えの、または、非自然発生のポックス ウィルス、たとえば、ワクシニア、ヒトの組織において、親の複製可能な株、たとえば、コペンハーゲン株、と複製欠損株、たとえば、ＮＹＶＡＣ、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ（たとえば、ベクターに存在するＫ１Ｌを介して）のそれの、中間のレベルに、特異的に複製されるように開発されたベクター、を含む。そして、さらに、フラジェリンまたはその操作可能な結合の部分（たとえば、ＴＬＲ５の活性化に関与するフラジェリンＰＡＭＰをデリバーするために）と、獲得免疫応答が望まれており、それによりポックスウィルスが、１またはいくらかのＴＬＲｓに対してアゴニスト（単数および複数）を提供する、少なくとも、１つの抗原（単数および複数）または免疫原の共発現のために開発された。たとえば、ＴＬＲ５および抗原（単数および複数）または免疫原（単数および複数）に対する免疫刺激炎症促進性の（pro-inflammatory）応答の結果のカスケードである。そのような実施態様において、ＮＹＶＡＣベクターは好適である。 
【００６０】
マラリア      
マラリアは、世界で最も重要な寄生虫病の１つと考えられている。マラリアが原因で、世界中で、２億以上の臨床的エピソードがあり、６５５０００人が死亡し、多くはアフリカの子供たちである（ＷＨＯグローバルマラリアプログラム（Global Malaria Program）２０１１）。さらに、風土性の国のほとんどは、貧困で、アフリカだけでも、３０数億ドルのかかり、経済的損失は拡大する （Teklehaimanot A. J. Trop. Med. Hyg. 2007; 77（6）: 138-44）。屋内散布、殺虫網、迅速な診断テスト、特に、妊娠中の女性、子供について、コントロール−介入（intervention）の方法やアプローチに向けられた、相当な努力と資源があった（Aponte JJ. Lancet 2009; 374（9700）: 1533-44.、Menendez C. Lancet Infect. Dis. 2007; 7（2）: 126-35）。しかし、これらコントロール−介入プログラムが、成功の程度を測定するものであったので、実質的に、病気コストと社会負担を削減するために、マラリアワクチンは、この病気の罹患率と死亡率（morbidity and mortality）を減らすために重要であると認識されている（Malaria Eradication: Vaccines PloS Med. 2011; 8（1）: e1000398）。 集中した努力と戦略的な目標は、国際的組織ＰＡＴＨ、マラリア ワクチン イニシアチブ（ＭＶＩ）によって、２０２０年までに、マラリア ワクチンは、マラリア（P. falciparum.）に対して、８０％の防護効果を提供する、ことが設定された（put forth）。重要なことは、もし、ワクチンが、マラリア撲滅に貢献する場合は、マラリア伝染（transmission）を防止するのに影響を与える必要があり、これらは、伝染阻止ワクチンとして知られている。
【００６１】
集中的な、マラリアワクチンの研究は数十年に及ぶが、まだ、特に、異なった寄生虫のライフ ステージの間の抗原発現および、寄生虫（parasite）のライフ サイクルの複雑さに関連する相当なハードル、特に、異なる寄生虫の単離からの、抗原または、重要なエピトープの変異性、を乗り越えなくてはならない。繰り返される自然暴露によって、多くは、抗寄生虫の免疫を開発するが、予防接種で、これを再生することは困難であった（Langhorne, J. Nat. Immunity 2008; 9: 725-32.、Goodman AL. Ann. Trop. Med. Parasitol. 2010; 104: 189-211）。ワクチン候補は、前赤内期の肝臓感染ステージ（pre-erythrocytic liver stage）、血液期（blood stage）または伝染ブロック ステージ（transmission blocking stage）をターゲットにしている（Dubovsky F. In: Plotkin SA Vaccines 2004; p1283-9.、Plos Med 2011; 8（1）: e1000400.、Aide P. Arch Dis. Child. 2007; 92（6）: 476-9）。
【００６２】
前赤内期の（pre-erythrocytic）ワクチンにおいて、免疫応答は、蚊によって運ばれた、侵入する、マラリア原虫スポロゾイト（Plasmodium sporozoites）に対して、抗体を作ることに向けられ（direct）、そして、寄生虫が赤血球細胞に侵入することを阻止又は制限するという望みをもって、したがって、臨床症状（symptomology）および、さらなる感染症や伝染のいかなる危険を避けるために、感染された肝細胞を、体液性および細胞性免疫のターゲットにする。前赤内期のワクチン（Pre-erythrocytic）は、マラリアに対して、最初に試みられた現代ワクチンであり、そして、現在、グラクソスミスクライン（ＧＳＫ）のＲＴＳ，Ｓワクチンの基礎である、現在、第ＩＩＩ相試験にある、臨床パイプラインに沿って最も開発されている（furthest）（Nussenzweig RS. Nature 1967; 216（5111）: 160-2.、Rieckmann KH. Bull. WHO 1979; 57（Suppl. 1: 261-5.）。ＧＳＫのワクチンは、スポロゾイト周囲（circumsporozoite）蛋白質（ＣＳＰ）とＢ型肝炎の表面の抗原（ＨＢｓＡｇ）の中央リピート領域を、免疫原性のキャリアとして、使用する。大人と子供における、ＲＴＳ，Ｓの有効性の結果がレビュウされている（Bojang KA. Vaccine 2005; 23（32）: 4148-57.、Macete E. Trop. Int. Med. Health 2007; 12（1）: 37-46.、Alonso PL. Lancet 2004; 364（9443）: 1411-20.、Alonso PL. Lancet 2005; 366 （9502）: 2012-8）。いくつかのワクチンは、ＭＶＡなどのウィルスのベクターを含む種々の方法を通して、弱毒スポロゾイト（sporozoites）またはスポロゾイト抗原をデリバーすることに焦点を当てている（Hoffman SL. J. Infectious Dis. 2002; 185（8）:1155-64.、Bejon P. N. Jour. Med. 2008; 359:2521-32.、Roestenberg M. Lancet 2011; 377（9779）: 1770-6.、Hoffman SL. Hum. Vacc. 2010; 6（1）: 97-106.、Hill AV. Philos. Trans. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2011; 366（1579）: 2806-14.、Liu MA. Immunity 2010; 33（4）: 504-15.、Draper SJ. Cell Host Microb 2009; 5（1）: 95-105）。ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７は、蚊によるマラリア原虫（Plasmodium）の伝染をブロックすることが示されている抗体の誘導を含む、スポロゾイト、および、他のすべてのライフサイクル  ステージに対する、免疫応答に向けられ、−ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７．１およびＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７．２は、免疫原性が向上することが予測される。
【００６３】
無性の血液ステージワクチン（asexual blood stage vaccines）は、赤血球細胞の寄生虫感染を阻止することを意図する。この病気の臨床症状の発症につながる、迅速な寄生虫複製の段階である。このステージに対する（directed）ワクチンは、感染のレベル、そして、したがって、症状の重症度の制限又は減少することを望むのみであり、したがって、血液期ワクチン（blood stage vaccines）は、多成分マラリア ワクチンの一部としてのみ、考えられるべきである（Thera MA N. Jour. Med. 2011; 365（11）: 1004-13）。 評価された、ターゲットの血液期抗原は、頂端膜タンパク質（apical membrane protein）（ＡＭＡ１）、メロゾイト表面蛋白質（merozoite surface protein）（ＭＳＰ）１、２および３、（ＳＥＲＡ５）、赤血球結合の抗原（erythrocyte binding antigen）１７５（ＥＢＡ  １７５）、グルタミンリッチのタンパク質ロング合成ペプチド（glutamine-rich protein long synthetic peptide）（ＧＲＵＲＰ） および、リングに感染した（ring-infected erythrocyte）赤血球表面抗原 （ＲＥＳＡ）（ＷＨＯ，“The Rainbow Tables” Initiative for Vaccine Research 2010）であった。血液期候補ワクチン（blood-stage candidate vaccines）に対する、４０のフェーズＩ／ＩＩ試験の結果は非常に失望するものであり、せいぜい、「寄生虫密度の減少（reduced parasite density）」を示した（Goodman, AL. Ann. Trop. Med. Parasitol. 2010; 104（3）: 189-211、Genton B. J. Inf. Dis. 2002; 185（6）:820-7.、Ogutu, BR. Plos ONE 2009; 4（3） e4708、Thera MA. N. Eng. J. Med. 2011; 365（11）: 1004-13、Sheehy, SH. Mol. Ther. 2012; 20（12）: 2355-68）。 血液期抗原の抗原性変異は、これらの抗原に対するワクチンの最大のハードルの１つを表す（Ellis RD. Human Vaccines 2010; 6（8）: 627-34）。しかし、自然獲得免疫 （または、１０００照射した蚊の咬傷（bites）） は、マラリア原虫の感染に対する抵抗性を誘導する−これは、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７．１など新規ワクチンの開発を奨励する。
多くのマラリアワクチン研究（前赤内期の（pre-erythrocytic））は、キメラの齧歯動物/ヒトモデル（chimeric rodent/human）の開発のために、臨床試験に入る前に、様々なワクチン候補およびヒトマラリア（P. falciparum）に適用されるワクチンのデリバリー  プラットフォームについての、より良い評価を期待して、ローデント マラリア種（rodent malaria species）を使用した研究に専念された（Mlambo, G. Eukaryot. Cell 2008;7（11）; 1875-1879、Langhorne J. Chem. Immunol. 2002; 80: 204-228）。P. yoelii およびP. chabaudiのローデント マラリア種は、ＭＳＰ１とＡＭＡ１を発現するワクチンによって、血液期寄生虫血症（blood stage parasitemia）に対する保護を示すために、使用された（Draper SJ. Nat. Med. 2008; 14: 819-821、Biswas, S. J. Immunol. 2012; 188（10）: 5041-53）。３番目のローデント（齧歯動物）モデルである、P. bergheiは、前赤内期の（pre-erythrocytic）および伝染阻止ワクチンの研究に幅広く使用された（Kaba SA. J. Immunol. 2009; 183（11）: 7268-77、Sridhar, S. J. Virol. 2008; 82（8）: 3822-33、Blagborough AM. Vaccine 2009; 27（38）: 5187-94）。
P. bergheiは、P. yoeliiまたはP. chabaudiのいずれかに対してよりも、保護応答を生成することが非常により難しいことが証明された（Yoshida S. Plos ONE 2010; 5（10） e13727、Weiss R. Vaccine 2010; 28（28）: 4515-22）。大きな関心のP. bergheiシステムを、１つのモデルとして作成するのはこの困難性であり、おそらく、マラリア（P. falciparum）のための、潜在的な前赤内期のワクチンについて、より良い前臨床分析につながる（Goodman, AL. Sci Rep. 2013; 3: 1706）。異なるポックスウィルス ワクチン ベクター種により誘導された、免疫応答の複雑さは、十分に理解されていない。ＣＳＰを発現する異なったポックスウィルス ベクターによる免疫の場合、ＮＹＶＡＣは、マウスの高レベルの保護を誘導することによって、際立つ（stands out）。ＣＳＰを発現する、ワクシニア ウィルス株、ＷＲおよびワイエスからの乏しい結果の完全な理解は達成されていない。P. berghei CSP を発現する、ＮＹＶＡＣ−Ｋ１Ｌにより誘導された高いレベルの保護によっは、マラリアＣＳＰを表現することによる保護の高レベルは、ＮＹＶＡＣに基づくベクターは、ヒトのマラリア  ワクチン候補として、可能性があるという理解を深めた（Lanar DE, Infect Immun. 1996; May;64（5）:1666-71）。
【００６４】
性的段階のワクチン（Sexual Stage vaccines）、や伝染阻止ワクチンは、蚊の中腸（midgut）における配偶子（gametes）の受精（fertilization）をブロックすることによって、したがって、さらに、ベクターにおける更なる開発と、新しい感染症の後のラウンドを阻止する、プラスモディア（Plasmodia）の性的な段階をターゲットにするワクチンである。 完全には理解されていないが、摂取性的段階の抗体（ingested sexual stage antibodies）、補体（complement）、およびサイトカイン（cytokines）が、ベクターにおいて、オーシストの形体形成（oocyst development）を抑制するといわれている。初期の前臨床研究において、ターゲットにされた、４つのメインの性的段階の抗原があり、ガメトサイトＰ２３０、Ｐ４８／４５からの抗原、および、ジゴテ（zygote）Ｐ２８およびＰ２５からの抗原である（Arevalo-Herrera M. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2011; 106 suppl. 1:202-11）。Ｐ２５は、臨床試験後期ステージに達している、唯一の性的段階の抗原（sexual stage antigen）である。追加の伝染阻止ワクチンのターゲットは、オーキネイト（ookinete）の抗原が含まれる（DinglasanRR. Trends Parasitol. 2008;24（8） :364-70）。興味深いことには、蚊の中腸抗原アミノペプチダーゼ−Ｎ（ＡｇＡＰＮ１）に対して、生成された抗体は、オーキネイトの侵入を阻止するのに効果的であることが示されている（Dinglasan RR. Proc. Nat. Acd. Sci. 2007; 104（33）: 13461-6）。
【００６５】
大きな期待は、現在、フェーズＩＩＩの後期段階にある、ＧＳＫのＲＴＳ，Ｓマラリア  ワクチンに置かれている。最新のＲＴＳ，Ｓトライアルからのデータは（２０１１）、５−１７月齢の子供のターゲット人口を含む。１４ヶ月のフォローアップを使用して、ワクチンは、最初の臨床的エピソードによってスコアされたように、５０．４％の効果があることが分かった （N. Eng. Jour. Med 2011 First Results of Phase 3 trial of RTS,S/AS01）。 現在、追加の大規模なフェーズＩＩＩ  ＲＴＳ，Ｓトライアルが、丁度、６−１２週齢の子供のターゲット人口における有効性を確立できるか観察することが進行中である。しかし、その結果は、ＲＴＳ，Ｓは、トライアルから有望であったので、このワクチンが完全に効果があるものではないことがわかった。既に、第二世代のワクチンが、より良い保護を提供する事が、不可避に必要であることが、許認可される前でさえ、既に明らかである。上述のように、集中した努力と国際組織ＰＡＴＨおよびマラリア ワクチン イニシアチブ（Malaria Vaccine Initiative）（ＭＶＩ）によって設定され（put forth）、２０２０年までに、マラリア ワクチンは、８０％に近づく効果を提供するという、戦略的目標がある。ベクター制御と医薬治療のような、非ワクチン的なアプローチと方法が、マラリアやその他のいくつかの感染症を制御することに失敗したことは明らかである（Henderson DA. Vaccine 1999; 17（sup3）: 53-55）。 多くの研究者は、成功したマラリアワクチンは、この複雑な寄生生物の複数の段階をターゲットとする、多段階、多成分のワクチンだけが達成できると信じている（Richie TL. Nature 2002; （415）:694-701.、Heppner DG. Vaccine 2005; 23: 2243-50.、Malaria Eradication: Vaccines PloS Med. 2011; 8（1）: e1000398）。  興味あることに、流行（endemic）地域における自然保護は、多種多様なマラリア抗原に対する、長年に亘る複雑でない暴露（uncomplicated exposure）により獲得された、免疫応答の遅い獲得によって達成されているように見える。セミ免疫（Semi-immune）の大人は、無症候性寄生虫血症（asymptomatic parasitemia）を受けやすいままであるが、しかし、臨床疾病から保護されていることが重要である。しかし、この防御免疫は、短命で（short-lived）、繰り返されるマラリアの曝露なしには、たった数年後には失われる （Thera MA. Annu. Rev. Med. 2012; 63: 345-357）。
【００６６】
本発明の特定の実施態様は、以下を含む：
好適には、ポックスウィルスのベクターによる、そして、より好適には、Ｋ１Ｌ経由で生殖能力を持つポックス ウィルス ベクターよる、フラジェリンまたはその操作可能な結合部位およびマラリア原虫抗原（単数および複数）または 免疫原（immunogen）（単数および複数）の共発現。
本発明は、ポックスウィルス、たとえば、特に、マラリア抗原の共発現する、獲得免疫応答の活性化のための、ＴＬＲ５の活性化に関与するフラジェリンＰＡＭＰを提供するために開発された、ワクシニア  ベクターを含む。本発明は、従って、非自然発生の、または合成の、または操作した、または組換えポックス ウィルスを含む。たとえば、複数のマラリア抗原（P. falciparum）および細菌のタンパク質であるフラジェリンの全体または結合部分である、ＤＮＡを含む、ワクシニアベクターと、そして、獲得免疫応答が望まれているその発現である。そして、好適には、ポックスウィルスのベクターは、Ｋ１Ｌを介して、生殖機能を有する、フラジェリンの結合の部分は、ＴＬＲ５受容体に結合し、活性化する部分であり、共発現のマラリア抗原（単数および複数）（P. falciparum）に対する、免疫刺激の炎症性反応をするカスケードを齎す。
【００６７】
フラジェリンまたはその操作可能な結合の部分が（ペプチドまたは融合のどちらかとして）、マラリア抗原（単数および複数）と共に発現される態様は、オプションの多様性を提供する。鍵は、発現されたフラジェリンまたはその一部が、特異的に、ＴＬＲ５を作動させ、さらに、共発現のマラリア抗原に対して、アジュバント獲得免疫応答を刺激することができることである。特に好ましい実施態様は、非自然発生する、または組換え、または合成、または操作されたポックスウィルスであり、たとえば、Ｋ１Ｌ、フラジェリンまたはその操作可能な結合部分、および、１つ以上のマラリア抗原（単数および複数）または免疫原（単数および複数）を共発現する、ワクシニアである。強化されたＮＹＶＡＣまたはＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮ  ベクター（たとえば、Ｋ１Ｌを発現する１つ）は、ヒト組織において、より病原性の親の複製可能な株であるコペンハーゲンと複製欠損の株である、ＮＹＶＡＣまたはＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮの中間のレベルまで複製する。そのような強化されたベクターが、さらに、獲得免疫応答が望まれている、少なくとも１つのマラリア抗原（単数および複数）（P. falciparum）または免疫原（単数および複数）および、細菌のタンパク質であるフラジェリンの全体または結合の部分（ここで、フラジェリンの結合の部分は、ＴＬＲ５受容体に結合し、そして活性化に関係する部分である）を共発現するとき、共発現のマラリア抗原（単数および複数）または免疫原（単数および複数））に対する、免疫刺激炎症性応答のカスケードが生じる。フラジェリンの配列および種およびフラジェリンが発現される態様 （ペプチドか融合としてか）は、マラリア（P. falciparum）に対する獲得免疫応答をさらに刺激するために、ＴＬＲ５を特異的に、作動することが選択される。
【００６８】
本発明は、また、フラジェリンまたはその操作可能な結合の部分と、ｉｎ  ｖｉｖｏで、共発現される、マラリア抗原（単数および複数）（P. falciparum）または免疫原（単数および複数）を含む。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、発明的な組換えで細胞を感染させた後、発現物は収集され、そして、収集されたマラリア発現物は、また適切なキャリアを含む、ワクチン、抗原または、免疫学的組成物の形態で使用することができる。
【００６９】
別途、本発明のウィルスのベクター システム、特に、好適なポックスウィルス ベクターシステムは、また適切なキャリアを含む、ワクチン、免疫学的または免疫原性組成物の形態で使用されることができる。組成物中の、組換えポックスウィルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、投与または接種後、マラリア生産物およびフラジェリンまたはその結合操作可能な部分を発現する。好適には、ポックスウィルスは、たとえば、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ、アビポックス（ａｖｉｐｏｘ）、カナリアポックス（ｃａｎａｒｙｐｏｘ）、または鶏痘ポックス（ｆｏｗｌｐｏｘ）のような、たとえば、Ｋ１Ｌ由来の（哺乳類に対して）弱毒化したポックスウィルスのように、いくつかの生殖能力、を有する。
【００７０】
発現された物を含むか、組換えポックスウィルスを含む、本発明の抗原性、免疫性またはワクチン組成物は、典型的なマラリア抗原免疫またはワクチンの組成物（たとえば、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７）として同じ方法で投与される。医療技術の当業者は、特定の個人の年齢、体重および、一般的な健康のような要素を考慮して、過度な実験なしに、この開示から、投与量を決定できる。
【００７１】
さらに、発明の組換えポックスウィルスとそれからの発現物は、動物の免疫や抗体応答を刺激する。それらの抗体から、当該分野においてよく知られた方法で、モノクローナル抗体を製造でき、そして、それらのモノクローナル抗体は、特定のマラリア抗原の存在又は不存在、そして、そこからマラリアの存在又は不存在を決定するために、または、マラリアやマラリア抗原に対する免疫反応が、単純に刺激されているのか否かについて決定するために、良く知られた抗体結合アッセイ、診断するキットまたはテストが使用される。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって製造されるイムノブロブリンである。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基（single antigenic determinant）と反応し、従来の血清由来の抗体よりも、より高い特異性を提供する。さらに、多数のモノクローナル抗体をスクリーニングすることは、必要な特異性、結合活性（avidity）、およびアイソタイプを有する個々の抗体を選択することを可能にする。ハイブリドーマ細胞種は、化学的に同一の抗体の一定した、安価なソースを提供し、そのような抗体の製造を簡単に標準化することができる。モノクローナル抗体の製造方法は、当業者によく知られている、たとえば、ここで、参照により組み込まれた、Koprowski, H. et al., １９８９年４月１日に発行された米国特許番号４，１９６，２６５号。モノクローナル抗体の使用が知られている。そのような使用の１つは、診断方法である、たとえば、ここで、参照により組み込まれた、David, G. and Greene, H., １９８３年３月８日に発行された米国特許番号４，３７６，１１０号。免疫吸着クロマトグラフィーによる材料の回収にも、モノクローナル抗体が使用されてもいる、たとえば、ここで、参照により組み込まれた、Milstein, C., 1980, Scientific American 243:66, 70。
【００７２】
本発明は、さらに、次の実施例において説明される。しかし、説明の目的のためのみに与えられ、いかなる方法であっても、本発明を限定するものではない。
【００７３】
［実施例］
本発明の実施態様は、ＮＹＶＡＣ−ＰＦ７．１（ＡＭＡ１修復（repair）＋ＦｌｉＣ）およびＮＹＶＡＣ−ＰＦ７．２（ＡＭＡ１修復（repair） ＋ＦｌｉＣ＋Ｋ１Ｌ）を含む。
【００７４】
実施例１：マラリアのＮＹＶＡＣ−ＰＦ７．１（ＡＭＡ１修復＋ＦｌｉＣ）およびＮＹＶＡＣ−ＰＦ７．２（ＡＭＡ１修復＋ＦｌｉＣ＋Ｋ１Ｌ）のための、改善されたＮＹＶＡＣ  ワクチンベクターの開発は、参照により組み込んだ米国特許番号５７６６５９７号に記載されていた、ＮＹＶＡＣ−ＰＦ７を基にした。これらの遺伝子配列の修飾、ドナープラスミドの開示および、組換えウィルスの構築のために使用される方法は、以下に詳細に、説明（set forth）される。
【００７５】
ドナープラスミドの構築および ＮＹＶＡＣ−ＰＦ７．１のためのプライマー配列 
ＦｌｉＣ
サルモネラ（Salmonella enterica）の乾燥ペレットは、容易に入手でき、ニューハンプシャー大学から得た（たとえば、Robert Mooney）。サルモネラのコードする配列とフランキング（flanking）配列を、プライマーＲＷ３およびＲＷ４を用いて増幅され、その後、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで分解し、１．５ｋｂの断片を得た。
【００７６】
RW3: tattcaagcttgaattcgtgtcggtgaatcaatcg 
【００７７】
RW4: aactctagaggatccaataacatcaagttgtaattg
【００７８】
ＦｌｉＣをコードする配列を含む、１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片は、プラスミドｐＳＶ−βＧａｌ（プロメガ、マディソン、ＷＩ）の、２．７ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片に挿入され、プラスミドｐＲＷ２を製造した。
【００７９】
参照により組み込まれた米国特許番号５７６６５９７号に、以前に記載されていた、Ｐｉプロモーターは、ＦｌｉＣの発現を制御するために使用された。
【００８０】
Ｐｉプロモーター配列：
ACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGTAGTAGGGTACTCGTGATTAATTTTATTGTTAAACTTGTCTTAACTCTTAAGTCTTATTAATATG
【００８１】
Ｐｉによって、プロモートされた断片は、ＩＤＴ（コーラルビレ、ＩＡ）により合成された。Ｐｉによってプロモートされた合成断片は、５’および３’  ＦｌｉＣコーディング配列を含んだ。この断片は、ｐＺＥｒＯ−２（インビトロゲン、 カールスバッド、ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩの間に挿入され、プラスミドｐＲＷ８を生成した。
【００８２】
ｐＲＷ８挿入物（insertion）の配列：
AGATCTACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGTAGTAGGGTACTCGTGATTAATTTTATTGTTAAACTTGTCTTAACTCTTAAGTCTTATTAATATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCCCAGTCCGCTCTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCCGGTCTGGTACCTCCGTTCTGGCGCAGGCGAACCAGGTTCCGCAAAACGTCCTCTCTTTACTGCGTTAATTTTTATCTCGAGGCCAATTAGGCCTATTATATTTTTTATCTAAAAAACTAAAAATAAACATTGATTAAATTTTAATATAATACTTAAAAATGGATGTTGTGTCGTTAGATAAACCGTTTATGTATTTTGAGGAAATTGATAATGAGTTAGATTACGAACCAGAAAGTGCAAATGAGGTCGCAAAAAAACTGCCGTATCAAGGACAGTTAAAAGAATTC
【００８３】
ＡＭＡ１修復
オリジナルのＮＹＶＡＣ−ＰＦ７における、ＡＭＡコーディング  シーケンスは、完全な正しいＡＭＡ１の発現のためには、修飾される必要のあるいくつかの領域を有する。最初に、構築された修復（constructed repairs）は、５−アミノ酸（ＲＲＩＫＳまたはＩＫＳＲＲと呼ばれる、両方、異なる末端から読むと、同じ挿入物）を除去し、ＡＭＡ１の３７７と３７８のアミノ酸の間に偶発的に挿入する。２番目に、ＡＭＡ１コーディング配列のヌクレオチドの位置（１４３６−１４４２）の間に見出された、早期転写終止シグナル（an early transcription termination signal）（Ｔ５ＮＴ）をコードする配列を修飾する必要がある。最後に、オリジナルのＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７の３‘の、ＡＭＡ１コーディング配列の、不必要なＤＮＡ配列を除去する。ＩＫＳＲＲを修復する一義的な実験は、ＣＥＦ細胞の小さいＰｆ７プラーク（plaques）が、ＮＹＶＡＣプラーク（plaques）のサイズと同じくらいに、plaquesのサイズが増加するように変化することを示した。
【００８４】
ｐＲＷ５５の構築（construction）
ＡＭＡ１修復およびＰｉ亢進したＦｌｉＣを含むプラスミドｐＲＷ５５は、次の方法で構築された。Ｐｉ亢進したＦｌｉＣの全長は、１．３ｋｂのｐＲＷ２  ＢｂｓＩ−ＫｐｎＩ断片の挿入、それに続く、プライマーＶＣ１０６／ＶＣ１０７を用いたＰＣＲにより、構築された。その断片は、ｐＲＷ８のＢｂｓＩとＫｐｎＩのサイトの間に、ＦｌｉＣの中央コード部分（central coding portion）を含む。プライマーＶＣ６８／ＶＣ１０５を用いたＮＹＶＡＣからのＰＣＲ産物は、プライマーＶＣ９８／ＶＣ１０６を用いたＰＣＲのためにＶＣ１０６／１０７断片と結合された。Ｐｆ７と、プライマーペアである、ＶＣ１１０／ＶＣ９１、ＶＣ１０３／ＶＣ１０９およびＶＣ１０８／１０４から派生した３つのＰＣＲ断片は、ＰＣＲのために、プライマーＶＣ１１０／ＶＣ１０４と結合された。プライマーＶＣ９８／ＶＣ１０６およびＶＣ１１０／ＶＣ１０４から派生した断片は、ＰＣＲのために、ＶＣ９７／ＶＣ９８と結合され、ついで、ｐＵＣ１９のＳａｌＩサイトに挿入するために、ＳａｌＩで消化され（Yanisch-Perron, C. Gene 1985; 33（1）:103-19）、プラスミドｐＲＷ５５を製造した。
【００８５】
プライマーの配列 
VC68: aatagacctgcttcgttggcctc
VC91: AGCACTTTTGATCATACTAGCGTTCTTATTTTTG  
VC97: cctacaggtcgaCCATTACACCAGGAACATACATACC  
VC98: cctacaggtcgaCCATATCCGTTTTTGCCAATATCAC 
VC103: GAACGCTAGTATGATCAAAAGTGCTTTTCTTCCCACTGGTGCT
VC104: tagtCTCctcgagCTGACagatctATAAAAATTAATAGTATGGTTTTTCCATCAG 
VC105: gatctGTCAGctcgagGAGactagtCGTAgggccCggccgtggcaatattctgta
VC106: GATGGAAAAACCATACTATTAATTTTTATAGATCTACTGTAAAAATAGAAACTAT
VC107: atattgccacggccGggcccTACGactagtCTCCTCGAGATAAAAATTAACGCAG  
VC108: AGCTCCAAGAATaTTcATTTCAGATGATAAAGACAGTTTAAAATG
VC109: CATCTGAAATgAAtATTCTTGGAGCTATAATTTTTTTATTCCCTTCATCATC 
VC110: TGACTAAATATTTAACATTCCCAAGATGATTC
【００８６】
３．９ｋｂのｐＲＷ５５挿入物（insertion）の配列：
CATCCACTATATTGTTTTGCACATCTCTACCATTAACTAGAAACAAATCAAAGAAAATCAAAAACACAATGACTAAATATTTAACATTCCCAAGATGATTCATTTTATATTGTAATTATATATTTTCAATTTTGAGGATCAGCTTACATCATGCAGTGGTTAAACAAAAACATTTTTATTCTCAAATGAGATAAAGTGAAAATATATATCATTATATTACAAAGTACAATTATTTAGGTTTAATCATGAGAAAATTATACTGCGTATTATTATTGAGCGCCTTTGAGTTTACATATATGATAAACTTTGGAAGAGGACAGAATTATTGGGAACATCCATATCAAAATAGTGATGTGTATCGTCCAATCAACGAACATAGGGAACATCCAAAAGAATACGAATATCCATTACACCAGGAACATACATACCAACAAGAAGATTCAGGAGAAGACGAAAATACATTACAACACGCATATCCAATAGACCACGAAGGTGCCGAACCCGCACCACAAGAACAAAATTTATTTTCAAGCATTGAAATAGTAGAAAGAAGTAATTATATGGGTAATCCATGGACGGAATATATGGCAAAATATGATATTGAAGAAGTTCATGGTTCAGGTATAAGAGTAGATTTAGGAGAAGATGCTGAAGTAGCTGGAACTCAATATAGACTTCCATCAGGGAAATGTCCAGTATTTGGTAAAGGTATAATTATTGAGAATTCAAATACTACTTTTTTAACACCGGTAGCTACGGGAAATCAATATTTAAAAGATGGAGGTTTTGCTTTTCCTCCAACAGAACCTCTTATGTCACCAATGACATTAGATGAAATGAGACATTTCTATAAAGATAATAAATATGTAAAAAATTTAGATGAATTGACTTTATGTTCAAGACATGCAGGAAATATGATTCCAGATAATGATAAAAATTCAAATTATAAATATCCAGCTGTTTATGATGACAAAGATAAAAAGTGTCATATATTATATATTGCAGCTCAAGAAAATAATGGTCCTAGATATTGTAATAAAGACGAAAGTAAAAGAAACAGCATGTTTTGTTTTAGACCAGCAAAAGATATATCATTTCAAAACTATACATATTTAAGTAAGAATGTAGTTGATAACTGGGAAAAAGTTTGCCCTAGAAAGAATTTACAGAATGCAAAATTCGGATTATGGGTCGATGGAAATTGTGAAGATATACCACATGTAAATGAATTTCCAGCAATTGATCTTTTTGAATGTAATAAATTAGTTTTTGAATTGAGTGCTTCGGATCAACCTAAACAATATGAACAACATTTAACAGATTATGAAAAAATTAAAGAAGGTTTCAAAAATAAGAACGCTAGTATGATCAAAAGTGCTTTTCTTCCCACTGGTGCTTTTAAAGCAGATAGATATAAAAGTCATGGTAAGGGTTATAATTGGGGAAATTATAACACAGAAACACAAAAATGTGAAATTTTTAATGTCAAACCAACATGTTTAATTAACAATTCATCATACATTGCTACTACTGCTTTGTCCCATCCCATCGAAGTTGAAAACAATTTTCCATGTTCATTATATAAAGATGAAATAATGAAAGAAATCGAAAGAGAATCAAAACGAATTAAATTAAATGATAATGATGATGAAGGGAATAAAAAAATTATAGCTCCAAGAATATTCATTTCAGATGATAAAGACAGTTTAAAATGCCCATGTGACCCTGAAATGGTAAGTAATAGTACATGTCGTTTCTTTGTATGTAAATGTGTAGAAAGAAGGGCAGAAGTAACATCAAATAATGAAGTTGTAGTTAAAGAAGAATATAAAGATGAATATGCAGATATTCCTGAACATAAACCAACTTATGATAAAATGAAAATTATAATTGCATCATCAGCTGCTGTCGCTGTATTAGCAACTATTTTAATGGTTTATCTTTATAAAAGAAAAGGAAATGCTGAAAAATATGATAAAATGGATGAACCACAAGATTATGGGAAATCAAATTCAAGAAATGATGAAATGTTAGATCCTGAGGCATCTTTTTGGGGGGAAGAAAAAAGAGCATCACATACAACACCAGTTCTGATGGAAAAACCATACTATTAATTTTTATAGATCTACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGTAGTAGGGTACTCGTGATTAATTTTATTGTTAAACTTGTCTTAACTCTTAAGTCTTATTAATATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCCCAGTCCGCTCTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCCGGTCTGCGTATCAACAGCGCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTTACCGCGAACATCAAAGGTCTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGCGCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCTAACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTGAACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAGGACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGTGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTGAAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGATACGCTGAATGTGCAACAAAAATATAAGGTCAGCGATACGGCTGCAACTGTTACAGGATATGCCGATACTACGATTGCTTTAGACAATAGTACTTTTAAAGCCTCGGCTACTGGTCTTGGTGGTACTGACCAGAAAATTGATGGCGATTTAAAATTTGATGATACGACTGGAAAATATTACGCCAAAGTTACCGTTACGGGGGGAACTGGTAAAGATGGCTATTATGAAGTTTCCGTTGATAAGACGAACGGTGAGGTGACTCTTGCTGGCGGTGCGACTTCCCCGCTTACAGGTGGACTACCTGCGACAGCAACTGAGGATGTGAAAAATGTACAAGTTGCAAATGCTGATTTGACAGAGGCTAAAGCCGCATTGACAGCAGCAGGTGTTACCGGCACAGCATCTGTTGTTAAGATGTCTTATACTGATAATAACGGTAAAACTATTGATGGTGGTTTAGCAGTTAAGGTAGGCGATGATTACTATTCTGCAACTCAAAATAAAGATGGTTCCATAAGTATTAATACTACGAAATACACTGCAGATGACGGTACATCCAAAACTGCACTAAACAAACTGGGTGGCGCAGACGGCAAAACCGAAGTTGTTTCTATTGGTGGTAAAACTTACGCTGCAAGTAAAGCCGAAGGTCACAACTTTAAAGCACAGCCTGATCTGGCGGAAGCGGCTGCTACAACCACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCTGCTTTGGCACAGGTTGACACGTTACGTTCTGACCTGGGTGCGGTACAGAACCGTTTCAACTCCGCTATTACCAACCTGGGCAACACCGTAAACAACCTGACTTCTGCCCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACCTCCGTTCTGGCGCAGGCGAACCAGGTTCCGCAAAACGTCCTCTCTTTACTGCGTTAATTTTTATCTCGAGGAGACTAGTCGTAGGGCCCGGCCGTGGCAATATTCTGTATTACGTATTATATATGTAATAAACGTTCACGTAAATACAAAACAGAGAACAAAGTCTAGATTTTTGACTTACATAAATGTCTGGGATAGTAAAATCTATCATATTGAGCGGACCATCTGGTTCAGGAAAGACAGCCATAGCCAAAAGACTATGGGAATATATTTGGATTTGTGGTGTCCCATACCACTAGATTTCCTCGTCCTATGGAACGAGAAGGTGTCGATTACCATTACGTTAACAGAGAGGCCATCTGGAAGGGAATAGCCGCCGGAAACTTTCTAGAACATACTGAGTTTTTAGGAAATATTTACGGAACTTCTAAAACTGCTGTGAATACAGCGGCTATTAATAATCGTATTTGTGTGATGGATTTAAACATCGACGGTGTTAGAAGTTTTAAAAATACTTACCTAATGCCTTACTCGGTGTATATAAGACCTACCTCTCTTAAAATGGTTGAGACCAAGCTTCGTTGTAGAAACACTGAAGCTAACGATGAGATTCATCGTCGCGTGATATTGGCAAAAACGGATATGGATGAGGCCAACGAAGCAGGTCTATTCGACACTATTATTATTGAAGATGATGTGAATTTAGCATATAGTAAGTTAATTCAGATACTACAGGACCGTATTAGAATGTATTTTAACACTAATTAAAGACTTAAGACTTAAAACTTGATAATTAATAATATAACTCGTTTTTATATGTGGCTATTTCAACGTCTAATGTATTAGTTAAATATTAAAACTTACCACGTAAAACTTAAAATTTAAAATGATATTTCATTGACAGATAGATCACACATTATGAACTTTCAAGGACTTGTGTTAACTGACAATTGCAAAAATCAATGGGTCGTTGGACCATTAATAGGAAAAGG
【００８７】
図１は、プライマーの配置を説明する。
【００８８】
追加ドナー プラスミド構築と、ＮＹＶＡＣ−ＰＦ７．２に特異的プライマー配列（ＡＭＡ１修復（ repair）＋ＦｌｉＣ＋Ｋ１Ｌ）
Ｋ１Ｌをコードする配列（Gillard et al., 1986）をプロモートする、ワクシニアウィルス  コペンハーゲン株Ｋ１Ｌは、TOP Gene Technologies社（モントリオール、カナダ）で、Perkus et al., １９８９年に開示された、ＢｇｌＩＩ（partial）−ＨｐａＩ断片に似たフラグメントとして合成された；ＸｈｏＩは、５’末端に追加され、ＳｐｅＩは、ＨｐａＩの３’末端に追加された。合成ＤＮＡは、中間のクローニングシャトルｐＡＰＧ１０の、ＡｓｃＩとＰａｃＩサイトの間に挿入され、プラスミドｐＫ１Ｌを製造した。
【００８９】
プラスミドｐＲＷ５６は、ｐＲＷ５５のＸｈｏＩとＳｐｅＩサイトの間に、Ｋ１Ｌ発現カセットを含む、ｐＫ１Ｌから得た１ＫｂのＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ断片の挿入によって構築された。図２Ａ、２Ｂに、合成のＤＮＡ配列とその位置を示す。
【００９０】
組換えウィルスの生成
Ｉｎ  ｖｉｖｏ組換え（ＩＶＲ）は、製造元の仕様書に従って、Lipofectamine 2000（インビトロゲン、カールスバッド、カルフォルニア）による、０．１の感染効率（multiplicity of infection）（MOI）で、ドナー プラスミド（８ｕｇ）を、１Ｅ６ポックスウィルスが感染したベロ細胞に、トランスフェクションすることによって行われた。ドナー  プラスミドｐＲＷ５５は、ＡＭＡ１修復とＦｌｉｃを含む組換えＮＹＶＡＣ−ＰＦ７．１を製造するために、ＮＹＶＡＣ−ＰＦ７を用いた、ＩＶＲにおいて使用された。ドナー  プラスミドｐＲＷ５６は、ＡＭＡ１修復、ＦｌｉｃプラスＫ１Ｌを含むＮＹＶＡＣ−ＰＦ７．２を製造するために、ＮＹＶＡＣ−ＰＦ７．１を用いた、ＩＶＲにおいて使用された。
【００９１】
組換えは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって識別された。簡単に言えば、１つのＰＣＲプライマーは、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７に存在しない、新たに挿入された配列内に配置された。第１に対する第二のプライマーは、ドナー プラスミドの外の配列に配置されていた。ドナー プラスミドの外のプライマーの位置は、ドナー プラスミドの増幅がないことで確認した。
【００９２】
ＩＶＲの後、ウィルスは、連続して、９６穴プレートで希釈された。各穴において、１−１０％の間で、ＰＣＲ分析が使用された。ＰＣＲでポジティブと判別された穴は、感染のいくつかのラウンドのために、繰り返し連続して希釈され、さらにＰＣＲによりテストされた。
【００９３】
ＰＣＲ分析のいくつかのラウンド後、ＰＣＲのプライマーの２番目のセットは、純度を評価するために使用された。第二のプライマーセットは、挿入サイトに並ぶ、オリジナルのＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７に存在する配列を含んだ；ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７  コントロール  ウィルスを入れると、挿入を含む組換えＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７．１より小さいＰＣＲのフラグメントを生成する。９６穴のフォーマットを用いたＰＣＲによる純度の高いレベルの検出に続いて、ウィルスは、アガロースの下、プラーク化することにより、更に精製された（Perkus M. et al., 1993）。よく単離されたプラークを、アガロース（agarose）から拾い、ＰＣＲのプライマーの両方のセットを用い、ＰＣＲ法により、増幅され、そして、スクリーンされた。精製は、時に、１つ以上のラウンドの、アガロースの下のプラーク精製が必要であった。
【００９４】
一度、純粋な組換えが認められた後は、ウィルス ストックが増幅された。すべて挿入（insertions）は、アガロースのゲルのＰＣＲフラグメント解析によって、正しいサイズが評価された、そして、最終的に、全ての挿入の塩基配列とフランキング  シーケンス（flanking sequences）が確認された。発現解析は、ウェスタンブロッティングによって確認された。図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄは、発明の組換えによる発現を表した。ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７と比較し、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７．１の構築（construction）には、Ｐｆｓ２５またはＣＳＰの修飾を伴わなかった；新たなワクチン候補であるＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７．１によって、または、ＲＲＩＫＳの潜在的に有害な効果を、ＡＭＡ１から除外することによって、発現された、ＦｌｉＣ生存シグナルのせいかもしれないが、図に表された、増加した発現レベルに留意することは重要である。
【００９５】
図３Ａは、感染後２日目の細胞溶解液からのP. falciparum ＣＳＰの発現を示す：細胞溶解液（cell lysates）は、比色検出を伴うウェスタンブロッティングのために、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された：P. falciparum CSP リピート配列（repeat sequence）（NANP）5に対する（directed）、ウサギの抗体（Alpha Diagnostics社、サンアントニオ、TX）。レーン：１＆４、ＮＹＶＡＣ：２＆５、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７．１；３＆６、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７。レーン１乃至３と比較し、溶解液の２０％をレーン４乃至６に負荷した。
【００９６】
図３Ｂは、感染後２日目の感染された細胞媒体（Cell media）から分泌されたP. falciparum ＣＳＰの発現を示す：細胞媒体は、比色検出（colorimetric detection）を伴ったウェスタンブロッティングのため、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された。P. falciparum CSPリピート配列（repeat sequence）（ＮＡＮＰ）５に対する（directed）、ウサギの抗体（Alpha Diagnostics社、サンアントニオ、TX）。レーン：１、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７；２、ＮＹＶＡＣ；３、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７．１。
【００９７】
図３Ｃは、感染後２日目のP. falciparum Pfs25の発現を示す：溶解液は、ウェスタンブロッティングおよび比色検出（colorimetric detection）のために、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された：ウサギの抗Ｐｆｓ２５抗血清（ATCC、マナサス、VA）。レーン：１、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７  上清：２、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７  セルペレット：３、ＮＹＶＡＣ  上清：４、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７．１  上清；５、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７．１  セルペレット；６、ＮＹＶＡＣ  セルペレット；７、感染していないセルペレット；８、分子量マーカー。
【００９８】
図３Ｄは、感染後２日目のＦｌｉＣの発現を示す：ウェスタンブロッティングおよび比色検出（colorimetric detection）より分析された１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。マウス抗ＦｌｉＣ抗体（バイオリガンド、サンディエゴ、CA）。レーン１、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７．１  細胞；２、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７．１  上清（supernatant）；３、ＮＹＶＡＣ  上清；４、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７  上清；５、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７  細胞；６、ＮＹＶＡＣ  細胞。
【００９９】
参考文献
1: Abe T, Kaname Y, Hamamoto I, Tsuda Y, Wen X, Taguwa S, Moriishi K, Takeuchi O, Kawai T, Kanto T, Hayashi N, Akira S, Matsuura Y. Hepatitis C virus nonstructural protein 5A modulates the toll-like receptor-MyD88-dependent signaling pathway in macrophage cell lines. J Virol. 2007 Sep;81（17）:8953-66. Epub 2007 Jun 13. PubMed PMID: 17567694; PubMed Central PMCID: PMC1951400.
2: Adams S. Toll-like receptor agonists in cancer therapy. Immunotherapy. 2009 Nov;1（6）:949-64. doi: 10.2217/imt.09.70. Review. PubMed PMID: 20563267; PubMed Central PMCID: PMC2886992.
3: Agnandji ST, Lell B, Soulanoudjingar SS, Fernandes JF, Abossolo BP, Conzelmann C, Methogo BG, Doucka Y, Flamen A, Mordmuller B, Issifou S, Kremsner PG, Sacarlal J, Aide P, Lanaspa M, Aponte JJ, Nhamuave A, Quelhas D, Bassat Q, Mandjate S, Macete E, Alonso P, Abdulla S, Salim N, Juma O, Shomari M, Shubis K, Machera F, Hamad AS, Minja R, Mtoro A, Sykes A, Ahmed S, Urassa AM, Ali AM, Mwangoka G, Tanner M, Tinto H, D'Alessandro U, Sorgho H, Valea I, Tahita MC, Kabore W, Ouedraogo S, Sandrine Y, Guiguemde RT, Ouedraogo JB, Hamel MJ, Kariuki S, Odero C, Oneko M, Otieno K, Awino N, Omoto J, Williamson J, Muturi-Kioi V, Laserson KF, Slutsker L, Otieno W, Otieno L, Nekoye O, Gondi S, Otieno A, Ogutu B, Wasuna R, Owira V, Jones D, Onyango AA, Njuguna P, Chilengi R, Akoo P, Kerubo C, Gitaka J, Maingi C, Lang T, Olotu A, Tsofa B, Bejon P, Peshu N, Marsh K, Owusu-Agyei S,Asante KP, Osei-Kwakye K, Boahen O, Ayamba S, Kayan K, Owusu-Ofori R, Dosoo D, Asante I, Adjei G, Adjei G, Chandramohan D, Greenwood B, Lusingu J, Gesase S, Malabeja A, Abdul O, Kilavo H, Mahende C, Liheluka E, Lemnge M, Theander T, Drakeley C, Ansong D, Agbenyega T, Adjei S, Boateng HO, Rettig T, Bawa J, Sylverken J, Sambian D, Agyekum A, Owusu L, Martinson F, Hoffman I, Mvalo T, Kamthunzi P, Nkomo R, Msika A, Jumbe A, Chome N, Nyakuipa D, Chintedza J, Ballou WR, Bruls M, Cohen J, Guerra Y, Jongert E, Lapierre D, Leach A, Lievens M, Ofori-Anyinam O, Vekemans J, Carter T, Leboulleux D, Loucq C, Radford A, Savarese B, Schellenberg D, Sillman M, Vansadia P; RTS,S Clinical Trials Partnership.First results of phase 3 trial of RTS,S/AS01 malaria vaccine in African children. N Engl J Med. 2011 Nov 17;365（20）:1863-75. doi: 10.1056/NEJMoa1102287. Epub 2011 Oct 18. PubMed PMID: 22007715.
4: Aide P, Bassat Q, Alonso PL. Towards an effective malaria vaccine. Arch Dis Child. 2007 Jun;92（6）:476-9. Review. PubMed PMID: 17515617; PubMed Central PMCID: PMC2066178.
5: Akira S. Innate immunity and adjuvants. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2011 Oct 12;366（1579）:2748-55. doi: 10.1098/rstb.2011.0106. Review. PubMed PMID: 21893536; PubMed Central PMCID: PMC3146784.
6: Akira S, Uematsu S, Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 2006 Feb 24;124（4）:783-801. Review. PubMed PMID: 16497588.
7: Akira S, Takeda K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 2004 Jul;4（7）:499-511. Review. PubMed PMID: 15229469.
8: Akira S, Takeda K, Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nat Immunol. 2001 Aug;2（8）:675-80. Review. PubMed PMID: 11477402.
9: Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, Flavell RA. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 2001 Oct 18;413（6857）:732-8. PubMed PMID: 11607032.
10: Alonso PL, Sacarlal J, Aponte JJ, Leach A, Macete E, Aide P, Sigauque B, Milman J, Mandomando I, Bassat Q, Guinovart C, Espasa M, Corachan S, Lievens M, Navia MM, Dubois MC, Menendez C, Dubovsky F, Cohen J, Thompson R, Ballou WR. Duration of protection with RTS,S/AS02A malaria vaccine in prevention of Plasmodium falciparum disease in Mozambican children: single-blind extended follow-up of a randomised controlled trial. Lancet. 2005 Dec 10;366（9502）:2012-8. PubMed PMID: 16338450.
11: Alonso PL, Sacarlal J, Aponte JJ, Leach A, Macete E, Milman J, Mandomando I,  Spiessens B, Guinovart C, Espasa M, Bassat Q, Aide P, Ofori-Anyinam O, Navia MM, Corachan S, Ceuppens M, Dubois MC, Demoitie MA, Dubovsky F, Menendez C, Tornieporth N, Ballou WR, Thompson R, Cohen J. Efficacy of the RTS,S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparum infection and disease in young African children: randomised controlled trial. Lancet. 2004 Oct 16-22;364（9443）:1411-20.  PubMed PMID: 15488216.
12: Amara RR, Villinger F, Altman JD, Lydy SL, O'Neil SP, Staprans SI, Montefiori DC, Xu Y, Herndon JG, Wyatt LS, Candido MA, Kozyr NL, Earl PL, Smith JM, Ma HL, Grimm BD, Hulsey ML, Miller J, McClure HM, McNicholl JM, Moss B, Robinson HL. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Science. 2001 Apr 6;292（5514）:69-74. PubMed PMID: 11393868.
13: Amato RJ, Shingler W, Naylor S, Jac J, Willis J, Saxena S, Hernandez-McClain J, Harrop R. Vaccination of renal cell cancer patients with modified vaccinia ankara delivering tumor antigen 5T4 （TroVax）administered with interleukin 2: a phase II trial. Clin Cancer Res. 2008 Nov 15;14（22）:7504-10. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-08-0668. PubMed PMID: 19010868.
14: Andersen-Nissen E, Smith KD, Strobe KL, Barrett SL, Cookson BT, Logan SM, Aderem A. Evasion of Toll-like receptor 5 by flagellated bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 28;102（26）:9247-52. Epub 2005 Jun 13. PubMed PMID: 15956202;  PubMed Central PMCID: PMC1166605.
15: Antoine G, Scheiflinger F, Dorner F, Falkner FG. The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. Virology. 1998 May 10;244（2）:365-96. Review. Erratum in: Virology. 2006 Jul 5;350（2）:501-2. PubMed PMID: 9601507.
16: Antonis AF, van der Most RG, Suezer Y, Stockhofe-Zurwieden N, Daus F, Sutter G, Schrijver RS. Vaccination with recombinant modified vaccinia virus Ankara expressing bovine respiratory syncytial virus （bRSV） proteins protects calves against RSV challenge. Vaccine. 2007 Jun 15;25（25）:4818-27. Epub 2007 Apr 20. PubMed PMID: 17499893.
17: Aponte JJ, Schellenberg D, Egan A, Breckenridge A, Carneiro I, Critchley J,Danquah I, Dodoo A, Kobbe R, Lell B, May J, Premji Z, Sanz S, Sevene E, Soulaymani-Becheikh R, Winstanley P, Adjei S, Anemana S, Chandramohan D, Issifou  S, Mockenhaupt F, Owusu-Agyei S, Greenwood B, Grobusch MP, Kremsner PG, Macete E, Mshinda H, Newman RD, Slutsker L, Tanner M, Alonso P, Menendez C. Efficacy and safety of intermittent preventive treatment with sulfadoxine-pyrimethamine for malaria in African infants: a pooled analysis of six randomised, placebo-controlled trials. Lancet. 2009 Oct 31;374（9700）:1533-42. doi: 10.1016/S0140-6736（09）61258-7. Epub 2009 Sep 16. Review. PubMed PMID: 19765816.
18: Arlen PM, Skarupa L, Pazdur M, Seetharam M, Tsang KY, Grosenbach DW, Feldman J, Poole DJ, Litzinger M, Steinberg SM, Jones E, Chen C, Marte J, Parnes H, Wright J, Dahut W, Schlom J, Gulley JL. Clinical safety of a viral vector based prostate cancer vaccine strategy. J Urol. 2007 Oct;178（4 Pt 1）:1515-20. Epub 2007 Aug 16. PubMed PMID: 17707059.
19: Arlen PM, Gulley JL, Todd N, Lieberman R, Steinberg SM, Morin S, Bastian A, Marte J, Tsang KY, Beetham P, Grosenbach DW, Schlom J, Dahut W. Antiandrogen, vaccine and combination therapy in patients with nonmetastatic hormone refractory prostate cancer. J Urol. 2005 Aug;174（2）:539-46. PubMed PMID: 16006888.
20: Arevalo-Herrera M, Solarte Y, Marin C, Santos M, Castellanos J, Beier JC, Valencia SH. Malaria transmission blocking immunity and sexual stage vaccines for interrupting malaria transmission in Latin America. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2011 Aug;106 Suppl 1:202-11. Review. PubMed PMID: 21881775.
21: Backes S, Sperling KM, Zwilling J, Gasteiger G, Ludwig H, Kremmer E, Schwantes A, Staib C, Sutter G. Viral host-range factor C7 or K1 is essential for modified vaccinia virus Ankara late gene expression in human and murine cells, irrespective of their capacity to inhibit protein kinase R-mediated phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha. J Gen Virol. 2010 Feb;91（Pt 2）:470-82. doi: 10.1099/vir.0.015347-0. Epub 2009 Oct 21. PubMed PMID: 19846675.
22: Bauernfeind F, Hornung V. TLR2 joins the interferon gang. Nat Immunol. 2009 Nov;10（11）:1139-41. doi: 10.1038/ni1109-1139. PubMed PMID: 19841644.
23: Bejon P, Lusingu J, Olotu A, Leach A, Lievens M, Vekemans J, Mshamu S, Lang T, Gould J, Dubois MC, Demoitie MA, Stallaert JF, Vansadia P, Carter T, Njuguna P, Awuondo KO, Malabeja A, Abdul O, Gesase S, Mturi N, Drakeley CJ, Savarese B, Villafana T, Ballou WR, Cohen J, Riley EM, Lemnge MM, Marsh K, von Seidlein L. Efficacy of RTS,S/AS01E vaccine against malaria in children 5 to 17 months of age. N Engl J Med. 2008 Dec 11;359（24）:2521-32. doi: 10.1056/NEJMoa0807381. Epub  2008 Dec 8. PubMed PMID: 19064627; PubMed Central PMCID: PMC2655100.
24: Belyakov IM, Ahlers JD. What role does the route of immunization play in the  generation of protective immunity against mucosal pathogens? J Immunol. 2009 Dec 1;183（11）:6883-92. doi: 10.4049/jimmunol.0901466. Review. PubMed PMID: 19923474.
25: Belyakov IM, Ahlers JD, Brandwein BY, Earl P, Kelsall BL, Moss B, Strober W, Berzofsky JA. The importance of local mucosal HIV-specific CD8（+） cytotoxic T lymphocytes for resistance to mucosal viral transmission in mice and enhancement of resistance by local administration of IL-12. J Clin Invest. 1998 Dec 15;102（12）:2072-81. PubMed PMID: 9854042; PubMed Central PMCID: PMC509161.
26: Ben-Yedidia T, Arnon R. Effect of pre-existing carrier immunity on the efficacy of synthetic influenza vaccine. Immunol Lett. 1998 Nov;64（1）:9-15. PubMed PMID: 9865596.
27: Benson J, Chougnet C, Robert-Guroff M, Montefiori D, Markham P, Shearer G, Gallo RC, Cranage M, Paoletti E, Limbach K, Venzon D, Tartaglia J, Franchini G. Recombinant vaccine-induced protection against the highly pathogenic simian immunodeficiency virus SIV（mac251）: dependence on route of challenge exposure. J Virol. 1998 May;72（5）:4170-82. PubMed PMID: 9557706; PubMed Central PMCID: PMC109646.
28: Bernasconi NL, Onai N, Lanzavecchia A. A role for Toll-like receptors in acquired immunity: up-regulation of TLR9 by BCR triggering in naive B cells and constitutive expression in memory B cells. Blood. 2003 Jun 1;101（11）:4500-4. Epub 2003 Jan 30. PubMed PMID: 12560217.
29: Beutler B. Inferences, questions and possibilities in Toll-like receptor signalling. Nature. 2004 Jul 8;430（6996）:257-63. Review. PubMed PMID: 15241424.
30: Birrell MA, Eltom S. The role of the NLRP3 inflammasome in the pathogenesis of airway disease. Pharmacol Ther. 2011 Jun;130（3）:364-70. doi: 10.1016/j.pharmthera.2011.03.007. Epub 2011 Mar 21. Review. PubMed PMID: 21421008.
31: Bisht H, Roberts A, Vogel L, Bukreyev A, Collins PL, Murphy BR, Subbarao K, Moss B. Severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein expressed by attenuated vaccinia virus protectively immunizes mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Apr 27;101（17）:6641-6. Epub 2004 Apr 19. PubMed PMID: 15096611; PubMedCentral PMCID: PMC404098.
32: Biswas S, Spencer AJ, Forbes EK, Gilbert SC, Holder AA, Hill AV, Draper SJ. Recombinant viral-vectored vaccines expressing Plasmodium chabaudi AS apical membrane antigen 1: mechanisms of vaccine-induced blood-stage protection. J Immunol. 2012 May 15;188（10）:5041-53. doi: 10.4049/jimmunol.1101106. Epub 2012 Apr 13. PubMed PMID: 22504652; PubMed Central PMCID: PMC3378655.
33: Blagborough AM, Sinden RE. Plasmodium berghei HAP2 induces strong malaria transmission-blocking immunity in vivo and in vitro. Vaccine. 2009 Aug 20;27（38）:5187-94. doi: 10.1016/j.vaccine.2009.06.069. Epub 2009 Jul 9. Review. PubMed PMID: 19596419.
34: Blanchard TJ, Alcami A, Andrea P, Smith GL. Modified vaccinia virus Ankara undergoes limited replication in human cells and lacks several immunomodulatory proteins: implications for use as a human vaccine. J Gen Virol. 1998 May;79 （ Pt 5）:1159-67. PubMed PMID: 9603331.
35: Bojang KA, Olodude F, Pinder M, Ofori-Anyinam O, Vigneron L, Fitzpatrick S, Njie F, Kassanga A, Leach A, Milman J, Rabinovich R, McAdam KP, Kester KE, Heppner DG, Cohen JD, Tornieporth N, Milligan PJ. Safety and immunogenicty of RTS,S/AS02A candidate malaria vaccine in Gambian children. Vaccine. 2005 Jul 14;23（32）:4148-57. Epub 2005 Apr 15. PubMed PMID: 15964483.
36: Bradley RR, Terajima M. Vaccinia virus K1L protein mediates host-range function in RK-13 cells via ankyrin repeat and may interact with a cellular GTPase-activating protein. Virus Res. 2005 Dec;114（1-2）:104-12. Epub 2005 Jul 20. PubMed PMID: 16039000.
37: Bratke KA, McLysaght A, Rothenburg S. A survey of host range genes in poxvirus genomes. Infect Genet Evol. 2013 Mar;14:406-25. doi: 10.1016/j.meegid.2012.12.002. Epub 2012 Dec 23. PubMed PMID: 23268114.
38: Bray M. Pathogenesis and potential antiviral therapy of complications of smallpox vaccination. Antiviral Res. 2003 Apr;58（2）:101-14. Review. PubMed PMID: 12742570.
39: Brochier B, Kieny MP, Costy F, Coppens P, Bauduin B, Lecocq JP, Languet B, Chappuis G, Desmettre P, Afiademanyo K, et al. Large-scale eradication of rabies  using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 1991 Dec 19-26;354（6354）:520-2. PubMed PMID: 1758494.
40: Brown SA, Surman SL, Sealy R, Jones BG, Slobod KS, Branum K, Lockey TD, Howlett N, Freiden P, Flynn P, Hurwitz JL. Heterologous Prime-Boost HIV-1 Vaccination Regimens in Pre-Clinical and Clinical Trials. Viruses. 2010 Feb 1;2（2）:435-467. PubMed PMID: 20407589; PubMed Central PMCID: PMC2855973.
41: Brave A, Boberg A, Gudmundsdotter L, Rollman E, Hallermalm K, Ljungberg K, Blomberg P, Stout R, Paulie S, Sandstrom E, Biberfeld G, Earl P, Moss B, Cox JH, Wahren B. A new multi-clade DNA prime/recombinant MVA boost vaccine induces broad and high levels of HIV-1-specific CD8（+） T-cell and humoral responses in mice. Mol Ther. 2007 Sep;15（9）:1724-33. Epub 2007 Jun 19. PubMed PMID: 17579577.
42: Buller RM, Chakrabarti S, Cooper JA, Twardzik DR, Moss B. Deletion of the vaccinia virus growth factor gene reduces virus virulence. J Virol. 1988 Mar;62（3）:866-74. PubMed PMID: 3339716; PubMed Central PMCID: PMC253644.
43: Buller RM, Smith GL, Cremer K, Notkins AL, Moss B. Decreased virulence of recombinant vaccinia virus expression vectors is associated with a thymidine kinase-negative phenotype. Nature. 1985 Oct 31-Nov 6;317（6040）:813-5. PubMed PMID: 4058585.
44: Carrington M, O'Brien SJ. The influence of HLA genotype on AIDS. Annu Rev Med. 2003;54:535-51. Epub 2001 Dec 3. Review. PubMed PMID: 12525683.
45: Carty M, Bowie AG. Recent insights into the role of Toll-like receptors in viral infection. Clin Exp Immunol. 2010 Sep;161（3）:397-406. doi: 10.1111/j.1365-2249.2010.04196.x. Review. PubMed PMID: 20560984; PubMed Central PMCID: PMC2962956.
46: Casey CG, Iskander JK, Roper MH, Mast EE, Wen XJ, Torok TJ, Chapman LE, Swerdlow DL, Morgan J, Heffelfinger JD, Vitek C, Reef SE, Hasbrouck LM, Damon I,  Neff L, Vellozzi C, McCauley M, Strikas RA, Mootrey G. Adverse events associated  with smallpox vaccination in the United States, January-October 2003. JAMA. 2005 Dec 7;294（21）:2734-43. PubMed PMID: 16333009.
47: Chen Z, Zhang L, Qin C, Ba L, Yi CE, Zhang F, Wei Q, He T, Yu W, Yu J, Gao H, Tu X, Gettie A, Farzan M, Yuen KY, Ho DD. Recombinant modified vaccinia virus Ankara expressing the spike glycoprotein of severe acute respiratory syndrome coronavirus induces protective neutralizing antibodies primarily targeting the receptor binding region. J Virol. 2005 Mar;79（5）:2678-88. PubMed PMID: 15708987; PubMed Central PMCID: PMC548443.
48: Child SJ, Palumbo GJ, Buller RM, Hruby DE. Insertional inactivation of the large subunit of ribonucleotide reductase encoded by vaccinia virus is associated with reduced virulence in vivo. Virology. 1990 Feb;174（2）:625-9. PubMed PMID: 2154895.
49: Corbett M, Bogers WM, Heeney JL, Gerber S, Genin C, Didierlaurent A, Oostermeijer H, Dubbes R, Braskamp G, Lerondel S, Gomez CE, Esteban M, Wagner R, Kondova I, Mooij P, Balla-Jhagjhoorsingh S, Beenhakker N, Koopman G, van der Burg S, Kraehenbuhl JP, Le Pape A. Aerosol immunization with NYVAC and MVA vectored vaccines is safe, simple, and immunogenic. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 12;105（6）:2046-51. doi: 10.1073/pnas.0705191105. Epub 2008 Feb 11. PubMed PMID: 18270165; PubMed Central PMCID: PMC2538878.
50: Cox WI, Tartaglia J, Paoletti E. Induction of cytotoxic T lymphocytes by recombinant canarypox （ALVAC） and attenuated vaccinia （NYVAC） viruses expressing the HIV-1 envelope glycoprotein. Virology. 1993 Aug;195（2）:845-50. PubMed PMID: 8337851.
51: Cromwell MA, Veazey RS, Altman JD, Mansfield KG, Glickman R, Allen TM, Watkins DI, Lackner AA, Johnson RP. Induction of mucosal homing virus-specific CD8（+） T lymphocytes by attenuated simian immunodeficiency virus. J Virol. 2000 Sep;74（18）:8762-6. PubMed PMID: 10954580; PubMed Central PMCID: PMC116390.
52: Dai K, Liu Y, Liu M, Xu J, Huang W, Huang X, Liu L, Wan Y, Hao Y, Shao Y. Pathogenicity and immunogenicity of recombinant Tiantan Vaccinia Virus with deleted C12L and A53R genes. Vaccine. 2008 Sep 15;26（39）:5062-71. doi: 10.1016/j.vaccine.2008.06.011. Epub 2008 Jun 23. PubMed PMID: 18573290.
53: Damle NK, Klussman K, Linsley PS, Aruffo A. Differential costimulatory effects of adhesion molecules B7, ICAM-1, LFA-3, and VCAM-1 on resting and antigen-primed CD4+ T lymphocytes. J Immunol. 1992 Apr 1;148（7）:1985-92. PubMed PMID: 1372018.
54: Davis ID, Chen Q, Morris L, Quirk J, Stanley M, Tavarnesi ML, Parente P, Cavicchiolo T, Hopkins W, Jackson H, Dimopoulos N, Tai TY, MacGregor D, Browning J, Svobodova S, Caron D, Maraskovsky E, Old LJ, Chen W, Cebon J. Blood dendritic cells generated with Flt3 ligand and CD40 ligand prime CD8+ T cells efficiently in cancer patients. J Immunother. 2006 Sep-Oct;29（5）:499-511. PubMed PMID: 16971806.
55: Day SL, Ramshaw IA, Ramsay AJ, Ranasinghe C. Differential effects of the type I interferons alpha4, beta, and epsilon on antiviral activity and vaccine efficacy. J Immunol. 2008 Jun 1;180（11）:7158-66. PubMed PMID: 18490714.
56: De Filette M, Min Jou W, Birkett A, Lyons K, Schultz B, Tonkyro A, Resch S, Fiers W. Universal influenza A vaccine: optimization of M2-based constructs. Virology. 2005 Jun 20;337（1）:149-61. PubMed PMID: 15914228.
57: Demberg T, Robert-Guroff M. Mucosal immunity and protection against HIV/SIV infection: strategies and challenges for vaccine design. Int Rev Immunol. 2009;28（1）:20-48. doi: 10.1080/08830180802684331. Review. PubMed PMID: 19241252; PubMed Central PMCID: PMC3466469.
58: Didierlaurent A, Ramirez JC, Gherardi M, Zimmerli SC, Graf M, Orbea HA, Pantaleo G, Wagner R, Esteban M, Kraehenbuhl JP, Sirard JC. Attenuated poxviruses expressing a synthetic HIV protein stimulate HLA-A2-restricted cytotoxic T-cell responses. Vaccine. 2004 Sep 3;22（25-26）:3395-403. PubMed PMID: 15308364.
59: Diebold SS, Kaisho T, Hemmi H, Akira S, Reis e Sousa C. Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA. Science.  2004 Mar 5;303（5663）:1529-31. Epub 2004 Feb 19. PubMed PMID: 14976261. 
60: Dinglasan RR, Jacobs-Lorena M. Flipping the paradigm on malaria transmission-blocking vaccines. Trends Parasitol. 2008 Aug;24（8）:364-70. doi: 10.1016/j.pt.2008.05.002. Epub 2008 Jul 1. Review. PubMed PMID: 18599352.
61: Dinglasan RR, Kalume DE, Kanzok SM, Ghosh AK, Muratova O, Pandey A, Jacobs-Lorena M. Disruption of Plasmodium falciparum development by antibodies against a conserved mosquito midgut antigen. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Aug 14;104（33）:13461-6. Epub 2007 Aug 2. PubMed PMID: 17673553; PubMed Central PMCID: PMC1948931.
62: Dorrell L, Williams P, Suttill A, Brown D, Roberts J, Conlon C, Hanke T, McMichael A. Safety and tolerability of recombinant modified vaccinia virus Ankara expressing an HIV-1 gag/multiepitope immunogen （MVA.HIVA） in HIV-1-infected persons receiving combination antiretroviral therapy. Vaccine. 2007 Apr 30;25（17）:3277-83. Epub 2007 Jan 11. PubMed PMID: 17257714.
63: Dorrell L, Yang H, Ondondo B, Dong T, di Gleria K, Suttill A, Conlon C, Brown D, Williams P, Bowness P, Goonetilleke N, Rostron T, Rowland-Jones S, Hanke T, McMichael A. Expansion and diversification of virus-specific T cells following immunization of human immunodeficiency virus type 1 （HIV-1）-infected individuals with a recombinant modified vaccinia virus Ankara/HIV-1 Gag vaccine. J Virol. 2006 May;80（10）:4705-16. PubMed PMID: 16641264; PubMed Central PMCID: PMC1472080.
64: Dorrell L. Therapeutic immunization strategies for the control of HIV-1. Expert Rev Vaccines. 2005 Aug;4（4）:513-20. Review. PubMed PMID: 16117708.
65: Draper SJ, Goodman AL, Biswas S, Forbes EK, Moore AC, Gilbert SC, Hill AV. Recombinant viral vaccines expressing merozoite surface protein-1 induce antibody- and T cell-mediated multistage protection against malaria. Cell Host Microbe. 2009 Jan 22;5（1）:95-105. doi: 10.1016/j.chom.2008.12.004. PubMed PMID: 19154991; PubMed Central PMCID: PMC2663714.
66: Draper SJ, Moore AC, Goodman AL, Long CA, Holder AA, Gilbert SC, Hill F, Hill AV. Effective induction of high-titer antibodies by viral vector vaccines. Nat Med. 2008 Aug;14（8）:819-21. doi: 10.1038/nm.1850. Epub 2008 Jul 27. PubMed PMID:  18660818.
67: Dreicer R, Stadler WM, Ahmann FR, Whiteside T, Bizouarne N, Acres B, Limacher JM, Squiban P, Pantuck A. MVA-MUC1-IL2 vaccine immunotherapy （TG4010） improves PSA doubling time in patients with prostate cancer with biochemical failure. Invest New Drugs. 2009 Aug;27（4）:379-86. doi: 10.1007/s10637-008-9187-3. Epub 2008 Oct 18. PubMed PMID: 18931824.
68: Denes B, Gridley DS, Fodor N, Takatsy Z, Timiryasova TM, Fodor I. Attenuation of a vaccine strain of vaccinia virus via inactivation of interferon viroceptor.  J Gene Med. 2006 Jul;8（7）:814-23. PubMed PMID: 16634110.
69: Earl PL, Americo JL, Wyatt LS, Eller LA, Whitbeck JC, Cohen GH, Eisenberg RJ, Hartmann CJ, Jackson DL, Kulesh DA, Martinez MJ, Miller DM, Mucker EM, Shamblin JD, Zwiers SH, Huggins JW, Jahrling PB, Moss B. Immunogenicity of a highly attenuated MVA smallpox vaccine and protection against monkeypox. Nature. 2004 Mar 11;428（6979）:182-5. PubMed PMID: 15014500.
70: Ellis RD, Sagara I, Doumbo O, Wu Y. Blood stage vaccines for Plasmodium falciparum: current status and the way forward. Hum Vaccin. 2010 Aug;6（8）:627-34. Review. PubMed PMID: 20519960; PubMed Central PMCID: PMC3056062.
71: Ember SW, Ren H, Ferguson BJ, Smith GL. Vaccinia virus protein C4 inhibits NF-κB activation and promotes virus virulence. J Gen Virol. 2012 Oct;93（Pt 10）:2098-108. doi: 10.1099/vir.0.045070-0. Epub 2012 Jul 12. PubMed PMID: 22791606; PubMed Central PMCID: PMC3541790.
72: Engler RJ, Kenner J, Leung DY. Smallpox vaccination: Risk considerations for  patients with atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol. 2002 Sep;110（3）:357-65.  PubMed PMID: 12209080.
73: Estcourt MJ, Ramsay AJ, Brooks A, Thomson SA, Medveckzy CJ, Ramshaw IA. Prime-boost immunization generates a high frequency, high-avidity CD8（+） cytotoxic T lymphocyte population. Int Immunol. 2002 Jan;14（1）:31-7. PubMed PMID: 11751749.
74: Esteban M. Attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC as promising vaccine candidates against HIV/AIDS. Hum Vaccin. 2009 Dec;5（12）:867-71. Epub 2009 Dec 3.  Review. PubMed PMID: 19786840.
75: Ferrier-Rembert A, Drillien R, Tournier JN, Garin D, Crance JM. Short- and long-term immunogenicity and protection induced by non-replicating smallpox vaccine candidates in mice and comparison with the traditional 1st generation vaccine. Vaccine. 2008 Mar 25;26（14）:1794-804. doi: 10.1016/j.vaccine.2007.12.059. Epub 2008 Feb 12. PubMed PMID: 18336966.
76: Flexner C, Hugin A, Moss B. Prevention of vaccinia virus infection in immunodeficient mice by vector-directed IL-2 expression. Nature. 1987 Nov 19-25;330（6145）:259-62. PubMed PMID: 3118219.
77: Frahm N, Kiepiela P, Adams S, Linde CH, Hewitt HS, Sango K, Feeney ME, Addo MM, Lichterfeld M, Lahaie MP, Pae E, Wurcel AG, Roach T, St John MA, Altfeld M, Marincola FM, Moore C, Mallal S, Carrington M, Heckerman D, Allen TM, Mullins JI, Korber BT, Goulder PJ, Walker BD, Brander C. Control of human immunodeficiency virus replication by cytotoxic T lymphocytes targeting subdominant epitopes. Nat Immunol. 2006 Feb;7（2）:173-8. Epub 2005 Dec 20. PubMed PMID: 16369537.
78: Frahm N, Adams S, Kiepiela P, Linde CH, Hewitt HS, Lichterfeld M, Sango K, Brown NV, Pae E, Wurcel AG, Altfeld M, Feeney ME, Allen TM, Roach T, St John MA, Daar ES, Rosenberg E, Korber B, Marincola F, Walker BD, Goulder PJ, Brander C. HLA-B63 presents HLA-B57/B58-restricted cytotoxic T-lymphocyte epitopes and is associated with low human immunodeficiency virus load. J Virol. 2005 Aug;79（16）:10218-25. PubMed PMID: 16051815; PubMed Central PMCID: PMC1182636.
79: Franchi L, Munoz-Planillo R, Nunez G. Sensing and reacting to microbes through the inflammasomes. Nat Immunol. 2012 Mar 19;13（4）:325-32. doi: 10.1038/ni.2231. Review. PubMed PMID: 22430785; PubMed Central PMCID: PMC3449002.
80: Franchi L, Stoolman J, Kanneganti TD, Verma A, Ramphal R, Nunez G. Critical role for Ipaf in Pseudomonas aeruginosa-induced caspase-1 activation. Eur J Immunol. 2007 Nov;37（11）:3030-9. PubMed PMID: 17935074.
81: Franchi L, Amer A, Body-Malapel M, Kanneganti TD, Ozoren N, Jagirdar R, Inohara N, Vandenabeele P, Bertin J, Coyle A, Grant EP, Nunez G. Cytosolic flagellin requires Ipaf for activation of caspase-1 and interleukin 1beta in salmonella-infected macrophages. Nat Immunol. 2006 Jun;7（6）:576-82. Epub 2006 Apr 30. PubMed PMID: 16648852.
82: Gallego-Gomez JC, Risco C, Rodriguez D, Cabezas P, Guerra S, Carrascosa JL, Esteban M. Differences in virus-induced cell morphology and in virus maturation between MVA and other strains （WR, Ankara, and NYCBH）of vaccinia virus in infected human cells. J Virol. 2003 Oct;77（19）:10606-22. PubMed PMID: 12970445; PubMed Central PMCID: PMC228399.
83: Genton B, Betuela I, Felger I, Al-Yaman F, Anders RF, Saul A, Rare L, Baisor  M, Lorry K, Brown GV, Pye D, Irving DO, Smith TA, Beck HP, Alpers MP. A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua  New Guinea. J Infect Dis. 2002 Mar 15;185（6）:820-7. Epub 2002 Feb 14. PubMed PMID: 11920300.
84: Gherardi MM, Esteban M. Recombinant poxviruses as mucosal vaccine vectors. J Gen Virol. 2005 Nov;86（Pt 11）:2925-36. Review. PubMed PMID: 16227213.
85: Gherardi MM, Najera JL, Perez-Jimenez E, Guerra S, Garcia-Sastre A, Esteban M. Prime-boost immunization schedules based on influenza virus and vaccinia virus vectors potentiate cellular immune responses against human immunodeficiency virus Env protein systemically and in the genitorectal draining lymph nodes. J Virol. 2003 Jun;77（12）:7048-57. PubMed PMID: 12768024; PubMed Central PMCID: PMC156204.
86: Gillard S, Spehner D, Drillien R, Kirn A. Localization and sequence of a vaccinia virus gene required for multiplication in human cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Aug;83（15）:5573-7. PubMed PMID: 3461450; PubMed Central PMCID: PMC386330.
87: Gilliet M, Cao W, Liu YJ. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nat Rev Immunol. 2008 Aug;8（8）:594-606. doi: 10.1038/nri2358. Review. PubMed PMID: 18641647.
88: Goebel SJ, Johnson GP, Perkus ME, Davis SW, Winslow JP, Paoletti E. The complete DNA sequence of vaccinia virus. Virology. 1990 Nov;179（1）:247-66, 517-63. PubMed PMID: 2219722.
89: Goodman AL, Forbes EK, Williams AR, Douglas AD, de Cassan SC, Bauza K, Biswas S, Dicks MD, Llewellyn D, Moore AC, Janse CJ, Franke-Fayard BM, Gilbert SC, Hill AV, Pleass RJ, Draper SJ. The utility of Plasmodium berghei as a rodent model for anti-merozoite malaria vaccine assessment. Sci Rep. 2013;3:1706. doi: 10.1038/srep01706. PubMed PMID: 23609325; PubMed Central PMCID: PMC3632886.
90: Goodman AL, Draper SJ. Blood-stage malaria vaccines - recent progress and future challenges. Ann Trop Med Parasitol. 2010 Apr;104（3）:189-211. doi: 10.1179/136485910X12647085215534. Review. PubMed PMID: 20507694.
91: Gudmundsdotter L, Nilsson C, Brave A, Hejdeman B, Earl P, Moss B, Robb M, Cox J, Michael N, Marovich M, Biberfeld G, Sandstrom E, Wahren B. Recombinant Modified Vaccinia Ankara （MVA）effectively boosts DNA-primed HIV-specific immune responses in humans despite pre-existing vaccinia immunity. Vaccine. 2009 Jul 16;27（33）:4468-74. doi: 10.1016/j.vaccine.2009.05.018. Epub 2009 May 29. PubMed PMID: 19450644.
92: Guillot L, Le Goffic R, Bloch S, Escriou N, Akira S, Chignard M, Si-Tahar M.  Involvement of toll-like receptor 3 in the immune response of lung epithelial cells to double-stranded RNA and influenza A virus. J Biol Chem. 2005 Feb 18;280（7）:5571-80. Epub 2004 Dec 3. PubMed PMID: 15579900.
93: Gulley JL, Arlen PM, Madan RA, Tsang KY, Pazdur MP, Skarupa L, Jones JL, Poole DJ, Higgins JP, Hodge JW, Cereda V, Vergati M, Steinberg SM, Halabi S, Jones E, Chen C, Parnes H, Wright JJ, Dahut WL, Schlom J. Immunologic and prognostic factors associated with overall survival employing a poxviral-based PSA vaccine in metastatic castrate-resistant prostate cancer. Cancer Immunol Immunother. 2010 May;59（5）:663-74. doi: 10.1007/s00262-009-0782-8. Epub 2009 Nov 5. PubMed PMID: 19890632; PubMed Central PMCID: PMC2832083.
94: Gulley JL, Arlen PM, Bastian A, Morin S, Marte J, Beetham P, Tsang KY, Yokokawa J, Hodge JW, Menard C, Camphausen K, Coleman CN, Sullivan F, Steinberg SM, Schlom J, Dahut W. Combining a recombinant cancer vaccine with standard definitive radiotherapy in patients with localized prostate cancer. Clin Cancer Res. 2005 May 1;11（9）:3353-62. Erratum in: Clin Cancer Res. 2006 Jan 1;12（1）:322. PubMed PMID: 15867235.
95: Gomez CE, Perdiguero B, Najera JL, Sorzano CO, Jimenez V, Gonzalez-Sanz R, Esteban M. Removal of vaccinia virus genes that block interferon type I and II pathways improves adaptive and memory responses of the HIV/AIDS vaccine candidate NYVAC-C in mice. J Virol. 2012 May;86（9）:5026-38. doi: 10.1128/JVI.06684-11. Epub 2012 Mar 14. PubMed PMID: 22419805; PubMed Central PMCID: PMC3347383.
96: Gomez CE, Najera JL, Krupa M, Esteban M. The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer.  Curr Gene Ther. 2008 Apr;8（2）:97-120. Review. PubMed PMID: 18393831.
97: Gomez CE, Najera JL, Domingo-Gil E, Ochoa-Callejero L, Gonzalez-Aseguinolaza G, Esteban M. Virus distribution of the attenuated MVA and NYVAC poxvirus strains in mice. J Gen Virol. 2007 Sep;88（Pt 9）:2473-8. PubMed PMID: 17698656.
98: Gomez CE, Najera JL, Jimenez V, Bieler K, Wild J, Kostic L, Heidari S, Chen M, Frachette MJ, Pantaleo G, Wolf H, Liljestrom P, Wagner R, Esteban M. Generation and immunogenicity of novel HIV/AIDS vaccine candidates targeting HIV-1 Env/Gag-Pol-Nef antigens of clade C. Vaccine. 2007 Mar 1;25（11）:1969-92. Epub 2006 Dec 6. PubMed PMID: 17224219.
99: Gomez CE, Najera JL, Jimenez EP, Jimenez V, Wagner R, Graf M, Frachette MJ, Liljestrom P, Pantaleo G, Esteban M. Head-to-head comparison on the immunogenicity of two HIV/AIDS vaccine candidates based on the attenuated poxvirus strains MVA and NYVAC co-expressing in a single locus the HIV-1BX08 gp120 and HIV-1（IIIB）Gag-Pol-Nef proteins of clade B. Vaccine. 2007 Apr 12;25（15）:2863-85. Epub 2006 Oct 16. PubMed PMID: 17113200.
100: Gomez CE, Abaitua F, Rodriguez D, Esteban M. Efficient CD8+ T cell response to the HIV-env V3 loop epitope from multiple virus isolates by a DNA prime/vaccinia virus boost （rWR and rMVA strains） immunization regime and enhancement by the cytokine IFN-gamma. Virus Res. 2004 Sep 15;105（1）:11-22. PubMed PMID: 15325077.
101: Halsell JS, Riddle JR, Atwood JE, Gardner P, Shope R, Poland GA, Gray GC, Ostroff S, Eckart RE, Hospenthal DR, Gibson RL, Grabenstein JD, Arness MK, Tornberg DN; Department of Defense Smallpox Vaccination Clinical Evaluation Team. Myopericarditis following smallpox vaccination among vaccinia-naive US military personnel. JAMA. 2003 Jun 25;289（24）:3283-9. PubMed PMID: 12824210.
102: Hanke T, Goonetilleke N, McMichael AJ, Dorrell L. Clinical experience with plasmid DNA- and modified vaccinia virus Ankara-vectored human immunodeficiency virus type 1 clade A vaccine focusing on T-cell induction. J Gen Virol. 2007 Jan;88（Pt 1）:1-12. Review. Erratum in: J Gen Virol. 2008 Feb;89（Pt 2）:609. Goonetilleke, Nilu [added]. PubMed PMID: 17170430.
103: Harari A, Bart PA, Stohr W, Tapia G, Garcia M, Medjitna-Rais E, Burnet S, Cellerai C, Erlwein O, Barber T, Moog C, Liljestrom P, Wagner R, Wolf H, Kraehenbuhl JP, Esteban M, Heeney J, Frachette MJ, Tartaglia J, McCormack S, Babiker A, Weber J, Pantaleo G. An HIV-1 clade C DNA prime, NYVAC boost vaccine regimen induces reliable, polyfunctional, and long-lasting T cell responses. J Exp Med. 2008 Jan 21;205（1）:63-77. doi: 10.1084/jem.20071331. Epub 2008 Jan 14. PubMed PMID: 18195071; PubMed Central PMCID: PMC2234371.
104: Hasan U, Chaffois C, Gaillard C, Saulnier V, Merck E, Tancredi S, Guiet C, Briere F, Vlach J, Lebecque S, Trinchieri G, Bates EE. Human TLR10 is a functional receptor, expressed by B cells and plasmacytoid dendritic cells, which activates gene transcription through MyD88. J Immunol. 2005 Mar 1;174（5）:2942-50. PubMed PMID: 15728506.
105: Hayashi F, Means TK, Luster AD. Toll-like receptors stimulate human neutrophil function. Blood. 2003 Oct 1;102（7）:2660-9. Epub 2003 Jun 26. PubMed PMID: 12829592.
106: Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hawn TR, Yi EC, Goodlett DR, Eng JK, Akira S, Underhill DM, Aderem A. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature. 2001 Apr 26;410（6832）:1099-103. PubMed PMID: 11323673.
107: Heil F, Hemmi H, Hochrein H, Ampenberger F, Kirschning C, Akira S, Lipford G, Wagner H, Bauer S. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 2004 Mar 5;303（5663）:1526-9. Epub 2004 Feb 19. PubMed PMID: 14976262.
108: Hel Z, Tsai WP, Thornton A, Nacsa J, Giuliani L, Tryniszewska E, Poudyal M, Venzon D, Wang X, Altman J, Watkins DI, Lu W, von Gegerfelt A, Felber BK, Tartaglia J, Pavlakis GN, Franchini G. Potentiation of simian immunodeficiency virus （SIV）-specific CD4（+） and CD8（+） T cell responses by a DNA-SIV and NYVAC-SIV prime/boost regimen. J Immunol. 2001 Dec 15;167（12）:7180-91. PubMed PMID: 11739541.
109: Hemmi H, Kaisho T, Takeuchi O, Sato S, Sanjo H, Hoshino K, Horiuchi T, Tomizawa H, Takeda K, Akira S. Small anti-viral compounds activate immune cells via the TLR7 MyD88-dependent signaling pathway. Nat Immunol. 2002 Feb;3（2）:196-200. Epub 2002 Jan 22. PubMed PMID: 11812998.
110: Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, Kaisho T, Sato S, Sanjo H, Matsumoto M, Hoshino K, Wagner H, Takeda K, Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 2000 Dec 7;408（6813）:740-5. Erratum in: Nature 2001 Feb 1;409（6820）:646. PubMed PMID: 11130078.
111: Henderson DA. Lessons from the eradication campaigns. Vaccine. 1999 Oct 29;17 Suppl 3:S53-5. PubMed PMID: 10559535.
112: Henderson DA. The eradication of smallpox. Sci Am. 1976 Oct;235（4）:25-33. PubMed PMID: 788150.
113: Heppner DG Jr, Kester KE, Ockenhouse CF, Tornieporth N, Ofori O, Lyon JA, Stewart VA, Dubois P, Lanar DE, Krzych U, Moris P, Angov E, Cummings JF, Leach A, Hall BT, Dutta S, Schwenk R, Hillier C, Barbosa A, Ware LA, Nair L, Darko CA, Withers MR, Ogutu B, Polhemus ME, Fukuda M, Pichyangkul S, Gettyacamin M, Diggs C, Soisson L, Milman J, Dubois MC, Garcon N, Tucker K, Wittes J, Plowe CV, Thera MA, Duombo OK, Pau MG, Goudsmit J, Ballou WR, Cohen J. Towards an RTS,S-based, multi-stage, multi-antigen vaccine against falciparum malaria: progress at the Walter Reed Army Institute of Research. Vaccine. 2005 Mar 18;23（17-18）:2243-50. Review. PubMed PMID: 15755604.
114: Hill AV. Vaccines against malaria. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2011 Oct 12;366（1579）:2806-14. doi: 10.1098/rstb.2011.0091. Review. PubMed PMID: 21893544; PubMed Central PMCID: PMC3146776.
115: Hodge JW, Chakraborty M, Kudo-Saito C, Garnett CT, Schlom J. Multiple costimulatory modalities enhance CTL avidity. J Immunol. 2005 May 15;174（10）:5994-6004. Erratum in: J Immunol. 2005 Jun 15;174（12）:8220. PubMed PMID: 15879092; PubMed Central PMCID: PMC1924685.
116: Hodge JW, Poole DJ, Aarts WM, Gomez Yafal A, Gritz L, Schlom J. Modified vaccinia virus ankara recombinants are as potent as vaccinia recombinants in diversified prime and boost vaccine regimens to elicit therapeutic antitumor responses. Cancer Res. 2003 Nov 15;63（22）:7942-9. PubMed PMID: 14633725.
117: Hodge JW, Sabzevari H, Yafal AG, Gritz L, Lorenz MG, Schlom J. A triad of costimulatory molecules synergize to amplify T-cell activation. Cancer Res. 1999 Nov 15;59（22）:5800-7. PubMed PMID: 10582702.
118: Hoebe K, Janssen E, Beutler B. The interface between innate and adaptive immunity. Nat Immunol. 2004 Oct;5（10）:971-4. Review. PubMed PMID: 15454919.
119: Hoffman SL, Billingsley PF, James E, Richman A, Loyevsky M, Li T, Chakravarty S, Gunasekera A, Chattopadhyay R, Li M, Stafford R, Ahumada A, Epstein JE, Sedegah M, Reyes S, Richie TL, Lyke KE, Edelman R, Laurens MB, Plowe CV, Sim BK. Development of a metabolically active, non-replicating sporozoite vaccine to prevent Plasmodium falciparum malaria. Hum Vaccin. 2010 Jan;6（1）:97-106. Epub 2010 Jan 21. Review. PubMed PMID: 19946222.
120: Hoffman SL, Goh LM, Luke TC, Schneider I, Le TP, Doolan DL, Sacci J, de la Vega P, Dowler M, Paul C, Gordon DM, Stoute JA, Church LW, Sedegah M, Heppner DG, Ballou WR, Richie TL. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 2002 Apr 15;185（8）:1155-64. Epub 2002 Apr 1. PubMed PMID: 11930326.
121: Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T, Takeda Y, Takeda K, Akira S. Cutting edge: Toll-like receptor 4 （TLR4）-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 1999 Apr 1;162（7）:3749-52. PubMed PMID: 10201887.
122: Howell MD, Gallo RL, Boguniewicz M, Jones JF, Wong C, Streib JE, Leung DY. Cytokine milieu of atopic dermatitis skin subverts the innate immune response to vaccinia virus. Immunity. 2006 Mar;24（3）:341-8. PubMed PMID: 16546102.
123: Hu SL, Abrams K, Barber GN, Moran P, Zarling JM, Langlois AJ, Kuller L, Morton WR, Benveniste RE. Protection of macaques against SIV infection by subunit vaccines of SIV envelope glycoprotein gp160. Science. 1992 Jan 24;255（5043）:456-9. PubMed PMID: 1531159.
124: Huang X, Lu B, Yu W, Fang Q, Liu L, Zhuang K, Shen T, Wang H, Tian P, Zhang L, Chen Z. A novel replication-competent vaccinia vector MVTT is superior to MVA for inducing high levels of neutralizing antibody via mucosal vaccination. PLoS One. 2009;4（1）:e4180. doi: 10.1371/journal.pone.0004180. Epub 2009 Jan 13. PubMed PMID: 19159014; PubMed Central PMCID: PMC2613559.
125: Huang X, Liu L, Ren L, Qiu C, Wan Y, Xu J. Mucosal priming with replicative Tiantan vaccinia and systemic boosting with DNA vaccine raised strong mucosal and systemic HIV-specific immune responses. Vaccine. 2007 Dec 17;25（52）:8874-84. Epub 2007 Sep 24. PubMed PMID: 18061316.
126: Huleatt JW, Nakaar V, Desai P, Huang Y, Hewitt D, Jacobs A, Tang J, McDonald W, Song L, Evans RK, Umlauf S, Tussey L, Powell TJ. Potent immunogenicity and efficacy of a universal influenza vaccine candidate comprising a recombinant fusion protein linking influenza M2e to the TLR5 ligand flagellin. Vaccine. 2008 Jan 10;26（2）:201-14. Epub 2007 Nov 20. PubMed PMID: 18063235.
127: Ishizaki H, Song GY, Srivastava T, Carroll KD, Shahabi V, Manuel ER, Diamond DJ, Ellenhorn JD. Heterologous prime/boost immunization with p53-based vaccines combined with toll-like receptor stimulation enhances tumor regression. J Immunother. 2010 Jul-Aug;33（6）:609-17. doi: 10.1097/CJI.0b013e3181e032c6. PubMed PMID: 20551836; PubMed Central PMCID: PMC3523364.
128: Iwasaki A, Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat Immunol. 2004 Oct;5（10）:987-95. Review. PubMed PMID: 15454922.
129: Jacobs BL, Langland JO, Kibler KV, Denzler KL, White SD, Holechek SA, Wong S, Huynh T, Baskin CR. Vaccinia virus vaccines: past, present and future. Antiviral Res. 2009 Oct;84（1）:1-13. doi: 10.1016/j.antiviral.2009.06.006. Epub 2009 Jun 26. Review. PubMed PMID: 19563829; PubMed Central PMCID: PMC2742674.
130: Jordan JA, Guo RF, Yun EC, Sarma V, Warner RL, Crouch LD, Senaldi G, Ulich TR, Ward PA. Role of IL-18 in acute lung inflammation. J Immunol. 2001 Dec 15;167（12）:7060-8. PubMed PMID: 11739527.
131: Kaba SA, Brando C, Guo Q, Mittelholzer C, Raman S, Tropel D, Aebi U, Burkhard P, Lanar DE. A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria. J Immunol. 2009 Dec 1;183（11）:7268-77. doi: 10.4049/jimmunol.0901957. Epub 2009 Nov 13. PubMed PMID: 19915055.\
132: Kadowaki N, Ho S, Antonenko S, Malefyt RW, Kastelein RA, Bazan F, Liu YJ. Subsets of human dendritic cell precursors express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens. J Exp Med. 2001 Sep 17;194（6）:863-9. PubMed PMID: 11561001; PubMed Central PMCID: PMC2195968.
133: Kantoff PW, Schuetz TJ, Blumenstein BA, Glode LM, Bilhartz DL, Wyand M, Manson K, Panicali DL, Laus R, Schlom J, Dahut WL, Arlen PM, Gulley JL, Godfrey WR. Overall survival analysis of a phase II randomized controlled trial of a Poxviral-based PSA-targeted immunotherapy in metastatic castration-resistant prostate cancer. J Clin Oncol. 2010 Mar 1;28（7）:1099-105. doi: 10.1200/JCO.2009.25.0597. Epub 2010 Jan 25. PubMed PMID: 20100959; PubMed Central PMCID: PMC2834462.
134: Kantoff PW, Higano CS, Shore ND, Berger ER, Small EJ, Penson DF, Redfern CH, Ferrari AC, Dreicer R, Sims RB, Xu Y, Frohlich MW, Schellhammer PF; IMPACT Study Investigators. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. 2010 Jul 29;363（5）:411-22. doi: 10.1056/NEJMoa1001294. PubMed PMID: 20818862.
135: Karkhanis LU, Ross TM. Mucosal vaccine vectors: replication-competent versus replication-deficient poxviruses. Curr Pharm Des. 2007;13（19）:2015-23. Review. PubMed PMID: 17627535.
136: Kass E, Panicali DL, Mazzara G, Schlom J, Greiner JW. Granulocyte/macrophage-colony stimulating factor produced by recombinant avian poxviruses enriches the regional lymph nodes with antigen-presenting cells and acts as an immunoadjuvant. Cancer Res. 2001 Jan 1;61（1）:206-14. PubMed PMID: 11196163.
137: Kaufman HL, Wang W, Manola J, DiPaola RS, Ko YJ, Sweeney C, Whiteside TL, Schlom J, Wilding G, Weiner LM. Phase II randomized study of vaccine treatment of advanced prostate cancer （E7897）: a trial of the Eastern Cooperative Oncology Group. J Clin Oncol. 2004 Jun 1;22（11）:2122-32. PubMed PMID: 15169798.
138: Kawai T, Akira S. TLR signaling. Semin Immunol. 2007 Feb;19（1）:24-32. Epub 2007 Feb 1. Review. PubMed PMID: 17275323. 
139: Kibler KV, Gomez CE, Perdiguero B, Wong S, Huynh T, Holechek S, Arndt W, Jimenez V, Gonzalez-Sanz R, Denzler K, Haddad EK, Wagner R, Sekaly RP, Tartaglia J, Pantaleo G, Jacobs BL, Esteban M. Improved NYVAC-based vaccine vectors. PLoS One. 2011;6（11）:e25674. doi: 10.1371/journal.pone.0025674. Epub 2011 Nov 9. PubMed PMID: 22096477; PubMed Central PMCID: PMC3212513.
140: Kim DW, Krishnamurthy V, Bines SD, Kaufman HL. TroVax, a recombinant modified vaccinia Ankara virus encoding 5T4: lessons learned and future development. Hum Vaccin. 2010 Oct;6（10）:784-91. Epub 2010 Oct 1. Review. PubMed PMID: 20975327.
141: Kotwal GJ, Moss B. Vaccinia virus encodes two proteins that are structurally related to members of the plasma serine protease inhibitor superfamily. J Virol. 1989 Feb;63（2）:600-6. Erratum in: J Virol 1990 Feb;64（2）:966. PubMed PMID: 2783466; PubMed Central PMCID: PMC247729.
142: Kotwal GJ, Moss B. Analysis of a large cluster of nonessential genes deleted from a vaccinia virus terminal transposition mutant. Virology. 1988 Dec;167（2）:524-37. PubMed PMID: 2849238.
143: Krieg AM. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. Annu Rev Immunol. 2002;20:709-60. Epub 2001 Oct 4. Review. PubMed PMID: 11861616.
144: Krupa M, Canamero M, Gomez CE, ナジェラ（Najera） JL, Gil J, Esteban M. Immunization with recombinant DNA and modified vaccinia virus Ankara （MVA） vectors delivering  PSCA and STEAP1 antigens inhibits prostate cancer progression. Vaccine. 2011 Feb 4;29（7）:1504-13. doi: 10.1016/j.vaccine.2010.12.016. Epub 2010 Dec 21. PubMed PMID: 21182993.
145: Kumar H, Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and innate immunity. Biochem Biophys Res Commun. 2009 Oct 30;388（4）:621-5. doi: 10.1016/j.bbrc.2009.08.062. Epub 2009 Aug 15. Review. PubMed PMID: 19686699.
146: Kuroda MJ, Schmitz JE, Charini WA, Nickerson CE, Lifton MA, Lord CI, Forman MA, Letvin NL. Emergence of CTL coincides with clearance of virus during primary simian immunodeficiency virus infection in rhesus monkeys. J Immunol. 1999 May 1;162（9）:5127-33. PubMed PMID: 10227983.
147: Lanar DE, Tine JA, de Taisne C, Seguin MC, Cox WI, Winslow JP, Ware LA, Kauffman EB, Gordon D, Ballou WR, Paoletti E, Sadoff JC. Attenuated vaccinia virus-circumsporozoite protein recombinants confer protection against rodent malaria. Infect Immun. 1996 May;64（5）:1666-71. PubMed PMID: 8613376; PubMed Central PMCID: PMC173977.
148: Langhorne J, Ndungu FM, Sponaas AM, Marsh K. Immunity to malaria: more questions than answers. Nat Immunol. 2008 Jul;9（7）:725-32. doi: 10.1038/ni.f.205. Review. PubMed PMID: 18563083.
149: Langhorne J, Quin SJ, Sanni LA. Mouse models of blood-stage malaria infections: immune responses and cytokines involved in protection and pathology. Chem Immunol. 2002;80:204-28. Review. PubMed PMID: 12058640.
150: Langland JO, Kash JC, Carter V, Thomas MJ, Katze MG, Jacobs BL. Suppression of proinflammatory signal transduction and gene expression by the dual nucleic acid binding domains of the vaccinia virus E3L proteins. J Virol. 2006 Oct;80（20）:10083-95. PubMed PMID: 17005686; PubMed Central PMCID: PMC1617298.
151: Langland JO, Jacobs BL. Inhibition of PKR by vaccinia virus: role of the N- and C-terminal domains of E3L. Virology. 2004 Jul 1;324（2）:419-29. PubMed PMID: 15207627.
152: Langland JO, Jacobs BL. The role of the PKR-inhibitory genes, E3L and K3L, in determining vaccinia virus host range. Virology. 2002 Jul 20;299（1）:133-41. PubMed PMID: 12167348.
153: Le Moigne V, Robreau G, Mahana W. Flagellin as a good carrier and potent adjuvant for Th1 response: study of mice immune response to the p27 （Rv2108） Mycobacterium tuberculosis antigen. Mol Immunol. 2008 May;45（9）:2499-507. doi: 10.1016/j.molimm.2008.01.005. Epub 2008 Mar 4. PubMed PMID: 18289677.
154: Lechleider RJ, Arlen PM, Tsang KY, Steinberg SM, Yokokawa J, Cereda V, Camphausen K, Schlom J, Dahut WL, Gulley JL. Safety and immunologic response of a viral vaccine to prostate-specific antigen in combination with radiation therapy when metronomic-dose interleukin 2 is used as an adjuvant. Clin Cancer Res. 2008 Aug 15;14（16）:5284-91. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-07-5162. PubMed PMID: 18698048; PubMed Central PMCID: PMC2639763.
155: Legrand FA, Verardi PH, Chan KS, Peng Y, Jones LA, Yilma TD. Vaccinia viruses with a serpin gene deletion and expressing IFN-gamma induce potent immune responses without detectable replication in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Feb 22;102（8）:2940-5. Epub 2005 Feb 10. PubMed PMID: 15705716; PubMed Central PMCID: PMC548597.
156: Lemaitre B, Nicolas E, Michaut L, Reichhart JM, Hoffmann JA. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 1996 Sep 20;86（6）:973-83. PubMed PMID: 8808632.
157: Li K, Foy E, Ferreon JC, Nakamura M, Ferreon AC, Ikeda M, Ray SC, Gale M Jr, Lemon SM. Immune evasion by hepatitis C virus NS3/4A protease-mediated cleavage of the Toll-like receptor 3 adaptor protein TRIF. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Feb 22;102（8）:2992-7. Epub 2005 Feb 14. PubMed PMID: 15710891; PubMed Central PMCID: PMC548795.
158: Liang B, Hyland L, Hou S. Nasal-associated lymphoid tissue is a site of long-term virus-specific antibody production following respiratory virus infection of mice. J Virol. 2001 Jun;75（11）:5416-20. PubMed PMID: 11333927; PubMed Central PMCID: PMC114951.
159: Liu M, Acres B, Balloul JM, Bizouarne N, Paul S, Slos P, Squiban P. Gene-based vaccines and immunotherapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Oct 5;101 Suppl 2:14567-71. Epub 2004 Aug 27. Review. PubMed PMID: 15333750; PubMed Central PMCID: PMC521989.
160: Liu MA. Immunologic basis of vaccine vectors. Immunity. 2010 Oct 29;33（4）:504-15. doi: 10.1016/j.immuni.2010.10.004. Review. PubMed PMID: 21029961.
161: Lutz E, Yeo CJ, Lillemoe KD, Biedrzycki B, Kobrin B, Herman J, Sugar E, Piantadosi S, Cameron JL, Solt S, Onners B, Tartakovsky I, Choi M, Sharma R, Illei PB, Hruban RH, Abrams RA, Le D, Jaffee E, Laheru D. A lethally irradiated allogeneic granulocyte-macrophage colony stimulating factor-secreting tumor vaccine for pancreatic adenocarcinoma. A Phase II trial of safety, efficacy, and immune activation. Ann Surg. 2011 Feb;253（2）:328-35. doi: 10.1097/SLA.0b013e3181fd271c. PubMed PMID: 21217520; PubMed Central PMCID: PMC3085934.
162: Macete E, Aponte JJ, Guinovart C, Sacarlal J, Ofori-Anyinam O, Mandomando I, Espasa M, Bevilacqua C, Leach A, Dubois MC, Heppner DG, Tello L, Milman J, Cohen J, Dubovsky F, Tornieporth N, Thompson R, Alonso PL. Safety and immunogenicity of the RTS,S/AS02A candidate malaria vaccine in children aged 1-4 in Mozambique. Trop Med Int Health. 2007 Jan;12（1）:37-46. PubMed PMID: 17207146.
163: Mackett M, Smith GL, Moss B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Dec;79（23）:7415-9. PubMed PMID: 6296831; PubMed Central PMCID: PMC347350.
164: Madan RA, Arlen PM, Mohebtash M, Hodge JW, Gulley JL. Prostvac-VF: a vector-based vaccine targeting PSA in prostate cancer. Expert Opin Investig Drugs. 2009 Jul;18（7）:1001-11. doi: 10.1517/13543780902997928. Review. PubMed PMID: 19548854; PubMed Central PMCID: PMC3449276.
165: malERA Consultative Group on Monitoring, Evaluation, and Surveillance. A research agenda for malaria eradication: monitoring, evaluation, and surveillance. PLoS Med. 2011 Jan 25;8（1）:e1000400. doi: 10.1371/journal.pmed.1000400. Review. PubMed PMID: 21311581; PubMed Central PMCID: PMC3026689.
166: malERA Consultative Group on Vaccines. A research agenda for malaria eradication: vaccines. PLoS Med. 2011 Jan 25;8（1）:e1000398. doi: 10.1371/journal.pmed.1000398. Review. PubMed PMID: 21311586; PubMed Central PMCID: PMC3026701.
167: Maloney G, Schroder M, Bowie AG. Vaccinia virus protein A52R activates p38 mitogen-activated protein kinase and potentiates lipopolysaccharide-induced interleukin-10. J Biol Chem. 2005 Sep 2;280（35）:30838-44. Epub 2005 Jul 5. PubMed PMID: 15998638.
168: Martinez J, Huang X, Yang Y. Toll-like receptor 8-mediated activation of murine plasmacytoid dendritic cells by vaccinia viral DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Apr 6;107（14）:6442-7. doi: 10.1073/pnas.0913291107. Epub 2010 Mar 22. PubMed PMID: 20308556; PubMed Central PMCID: PMC2851984.
169: Mayr A, Stickl H, Muller HK, Danner K, Singer H. [The smallpox vaccination strain MVA: marker, genetic structure, experience gained with the parenteral vaccination and behavior in organisms with a debilitated defence mechanism （author's transl）]. Zentralbl Bakteriol B. 1978 Dec;167（5-6）:375-90. German. PubMed PMID: 219640.
170: McCormack S, Stohr W, Barber T, Bart PA, Harari A, Moog C, Ciuffreda D, Cellerai C, Cowen M, Gamboni R, Burnet S, Legg K, Brodnicki E, Wolf H, Wagner R, Heeney J, Frachette MJ, Tartaglia J, Babiker A, Pantaleo G, Weber J. EV02: a Phase I trial to compare the safety and immunogenicity of HIV DNA-C prime-NYVAC-C boost to NYVAC-C alone. Vaccine. 2008 Jun 13;26（25）:3162-74. doi: 10.1016/j.vaccine.2008.02.072. Epub 2008 May 6. PubMed PMID: 18502003.
171: McCurdy LH, Larkin BD, Martin JE, Graham BS. Modified vaccinia Ankara: potential as an alternative smallpox vaccine. Clin Infect Dis. 2004 Jun 15;38（12）:1749-53. Epub 2004 May 19. PubMed PMID: 15227622.
172: McFadden G. Poxvirus tropism. Nat Rev Microbiol. 2005 Mar;3（3）:201-13. Review. PubMed PMID: 15738948.
173: Medzhitov R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 2007 Oct 18;449（7164）:819-26. Review. PubMed PMID: 17943118.
174: Medzhitov R, Janeway CA Jr. Decoding the patterns of self and nonself by the innate immune system. Science. 2002 Apr 12;296（5566）:298-300. PubMed PMID: 11951031.
175: Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway CA Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature. 1997 Jul 24;388（6640）:394-7. PubMed PMID: 9237759.
176: Melief CJ. Cancer immunotherapy by dendritic cells. Immunity. 2008 Sep 19;29（3）:372-83. doi: 10.1016/j.immuni.2008.08.004. Review. PubMed PMID: 18799145.
177: Menendez C, D'Alessandro U, ter Kuile FO. Reducing the burden of malaria in pregnancy by preventive strategies. Lancet Infect Dis. 2007 Feb;7（2）:126-35. Review. PubMed PMID: 17251083.
178: Miao EA, Mao DP, Yudkovsky N, Bonneau R, Lorang CG, Warren SE, Leaf IA, Aderem A. Innate immune detection of the type III secretion apparatus through the NLRC4 inflammasome. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Feb 16;107（7）:3076-80. doi: 10.1073/pnas.0913087107. Epub 2010 Feb 1. PubMed PMID: 20133635; PubMed Central PMCID: PMC2840275.
179: Midgley CM, Putz MM, Weber JN, Smith GL. Vaccinia virus strain NYVAC inducessubstantially lower and qualitatively different human antibody responses comparedwith strains Lister and Dryvax. J Gen Virol. 2008 Dec;89（Pt 12）:2992-7. doi: 10.1099/vir.0.2008/004440-0. PubMed PMID: 19008384; PubMed Central PMCID: PMC2885029.
180: Milstein C. Monoclonal antibodies. Sci Am. 1980 Oct;243（4）:66-74. PubMed PMID: 6158758.
181: Mizel SB, Graff AH, Sriranganathan N, Ervin S, Lees CJ, Lively MO, Hantgan RR, Thomas MJ, Wood J, Bell B. Flagellin-F1-V fusion protein is an effective plague vaccine in mice and two species of nonhuman primates. Clin Vaccine Immunol. 2009 Jan;16（1）:21-8. doi: 10.1128/CVI.00333-08. Epub 2008 Nov 5. PubMed PMID: 18987167; PubMed Central PMCID: PMC2620661.
182: Mlambo G, Kumar N. Transgenic rodent Plasmodium berghei parasites as tools for assessment of functional immunogenicity and optimization of human malaria vaccines. Eukaryot Cell. 2008 Nov;7（11）:1875-9. doi: 10.1128/EC.00242-08. Epub 2008 Sep 19. Review. PubMed PMID: 18806208; PubMed Central PMCID: PMC2583535.
183: Mooij P, Balla-Jhagjhoorsingh SS, Koopman G, Beenhakker N, van Haaften P, Baak I, Nieuwenhuis IG, Kondova I, Wagner R, Wolf H, Gomez CE, Najera JL, Jimenez V, Esteban M, Heeney JL. Differential CD4+ versus CD8+ T-cell responses elicited by different poxvirus-based human immunodeficiency virus type 1 vaccine candidates provide comparable efficacies in primates. J Virol. 2008 Mar;82（6）:2975-88. doi: 10.1128/JVI.02216-07. Epub 2008 Jan 9. PubMed PMID: 18184713; PubMed Central PMCID: PMC2258966.
184: Muzio M, Bosisio D, Polentarutti N, D'amico G, Stoppacciaro A, Mancinelli R, van't Veer C, Penton-Rol G, Ruco LP, Allavena P, Mantovani A. Differential expression and regulation of toll-like receptors （TLR） in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells. J Immunol. 2000 Jun 1;164（11）:5998-6004. PubMed PMID: 10820283.
185: Naito T, Kaneko Y, Kozbor D. Oral vaccination with modified vaccinia virus Ankara attached covalently to TMPEG-modified cationic liposomes overcomes pre-existing poxvirus immunity from recombinant vaccinia immunization. J Gen Virol. 2007 Jan;88（Pt 1）:61-70. PubMed PMID: 17170437; PubMed Central PMCID: PMC2501116.
186: NAM JH, BANG HS, CHO HW, CHUNG YH. Different contribution of co-stimulatory molecules B7.1 and B7.2 to the immune response to recombinant modified vaccinia virus ankara vaccine expressing prM/E proteins of Japanese encephalitis virus and two hepatitis B virus vaccines. Acta Virol. 2007;51（2）:125-30. PubMed PMID: 17900219.
187: Nempont C, Cayet D, Rumbo M, Bompard C, Villeret V, Sirard JC. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J Immunol. 2008 Aug 1;181（3）:2036-43. PubMed PMID: 18641341.
188: Neutra MR, Kozlowski PA. Mucosal vaccines: the promise and the challenge. Nat Rev Immunol. 2006 Feb;6（2）:148-58. Review. PubMed PMID: 16491139. 
189: Nussenzweig RS, Vanderberg J, Most H, Orton C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 1967 Oct 14;216（5111）:160-2. PubMed PMID: 6057225.
190: Najera JL, Gomez CE, Garcia-Arriaza J, Sorzano CO, Esteban M. Insertion of vaccinia virus C7L host range gene into NYVAC-B genome potentiates immune responses against HIV-1 antigens. PLoS One. 2010 Jun 30;5（6）:e11406. doi: 10.1371/journal.pone.0011406. PubMed PMID: 20613977; PubMed Central PMCID: PMC2894869.
191: Najera JL, Gomez CE, Domingo-Gil E, Gherardi MM, Esteban M. Cellular and biochemical differences between two attenuated poxvirus vaccine candidates （MVA and NYVAC） and role of the C7L gene. J Virol. 2006 Jun;80（12）:6033-47. PubMed PMID: 16731942; PubMed Central PMCID: PMC1472566.
192: O'Neill LA, Bowie AG. The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 2007 May;7（5）:353-64. Review. PubMed PMID: 17457343.
193: Ockenhouse CF, Sun PF, Lanar DE, Wellde BT, Hall BT, Kester K, Stoute JA, Magill A, Krzych U, Farley L, Wirtz RA, Sadoff JC, Kaslow DC, Kumar S, Church LW, Crutcher JM, Wizel B, Hoffman S, Lalvani A, Hill AV, Tine JA, Guito KP, de Taisne C, Anders R, Ballou WR, et al. Phase I/IIa safety, immunogenicity, and efficacy trial of NYVAC-Pf7, a pox-vectored, multiantigen, multistage vaccine candidate for Plasmodium falciparum malaria. J Infect Dis. 1998 Jun;177（6）:1664-73. PubMed PMID: 9607847.
194: Ogutu BR, Apollo OJ, McKinney D, Okoth W, Siangla J, Dubovsky F, Tucker K, Waitumbi JN, Diggs C, Wittes J, Malkin E, Leach A, Soisson LA, Milman JB, Otieno L, Holland CA, Polhemus M, Remich SA, Ockenhouse CF, Cohen J, Ballou WR, Martin SK, Angov E, Stewart VA, Lyon JA, Heppner DG, Withers MR; MSP-1 Malaria Vaccine Working Group. Blood stage malaria vaccine eliciting high antigen-specific antibody concentrations confers no protection to young children in Western Kenya. PLoS One. 2009;4（3）:e4708. doi: 10.1371/journal.pone.0004708. Epub 2009 Mar 5. PubMed PMID: 19262754; PubMed Central PMCID: PMC2650803.
195: Oh S, Hodge JW, Ahlers JD, Burke DS, Schlom J, Berzofsky JA. Selective induction of high avidity CTL by altering the balance of signals from APC. J Immunol. 2003 Mar 1;170（5）:2523-30. PubMed PMID: 12594278.
196: Oudard S, Rixe O, Beuselinck B, Linassier C, Banu E, Machiels JP, Baudard M, Ringeisen F, Velu T, Lefrere-Belda MA, Limacher JM, Fridman WH, Azizi M, Acres B, Tartour E. A phase II study of the cancer vaccine TG4010 alone and in combination with cytokines in patients with metastatic renal clear-cell carcinoma: clinical and immunological findings. Cancer Immunol Immunother. 2011 Feb;60（2）:261-71. doi: 10.1007/s00262-010-0935-9. Epub 2010 Nov 11. PubMed PMID: 21069322.
197: Panicali D, Davis SW, Weinberg RL, Paoletti E. Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983 Sep;80（17）:5364-8. PubMed PMID: 6310573; PubMed Central PMCID: PMC384256.
198: Panicali D, Paoletti E. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Aug;79（16）:4927-31. PubMed PMID: 6289324; PubMed Central PMCID: PMC346798.
199: Pantaleo G, Esteban M, Jacobs B, Tartaglia J. Poxvirus vector-based HIV vaccines. Curr Opin HIV AIDS. 2010 Sep;5（5）:391-6. doi: 10.1097/COH.0b013e32833d1e87. Review. PubMed PMID: 20978379.
200: Parrino J, Graham BS. Smallpox vaccines: Past, present, and future. J Allergy Clin Immunol. 2006 Dec;118（6）:1320-6. Review. PubMed PMID: 17157663.
201: Peng G, Guo Z, Kiniwa Y, Voo KS, Peng W, Fu T, Wang DY, Li Y, Wang HY, Wang RF. Toll-like receptor 8-mediated reversal of CD4+ regulatory T cell function. Science. 2005 Aug 26;309（5739）:1380-4. PubMed PMID: 16123302.
202: Perkus ME, Tartaglia J, Paoletti E. Poxvirus-based vaccine candidates for cancer, AIDS, and other infectious diseases. J Leukoc Biol. 1995 Jul;58（1）:1-13.  Review. PubMed PMID: 7616101.
203: Perkus ME, Goebel SJ, Davis SW, Johnson GP, Limbach K, Norton EK, Paoletti E. Vaccinia virus host range genes. Virology. 1990 Nov;179（1）:276-86. PubMed PMID: 2171207.
204: Perkus ME, Limbach K, Paoletti E. Cloning and expression of foreign genes in vaccinia virus, using a host range selection system. J Virol. 1989 Sep;63（9）:3829-36. PubMed PMID: 2547999; PubMed Central PMCID: PMC250976.
205: Perkus ME, Kauffman EB, Taylor J, Mercer S, Smith D, Vanderhoven J, Paoletti E. Methodology of using vaccinia virus to express foreign genes in tissue culture. Journal of tissue culture methods. 1983; 15:72-81.
206: Perreau M, Welles HC, Harari A, Hall O, Martin R, Maillard M, Dorta G, Bart PA, Kremer EJ, Tartaglia J, Wagner R, Esteban M, Levy Y, Pantaleo G. DNA/NYVAC vaccine regimen induces HIV-specific CD4 and CD8 T-cell responses in intestinal mucosa. J Virol. 2011 Oct;85（19）:9854-62. doi: 10.1128/JVI.00788-11. Epub 2011 Jul 20. PubMed PMID: 21775454; PubMed Central PMCID: PMC3196391.
207: Poltorak A, He X, Smirnova I, Liu MY, Van Huffel C, Du X, Birdwell D, Alejos E, Silva M, Galanos C, Freudenberg M, Ricciardi-Castagnoli P, Layton B, Beutler B. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 1998 Dec 11;282（5396）:2085-8. PubMed PMID: 9851930.
208: Poulet H, Minke J, Pardo MC, Juillard V, Nordgren B, Audonnet JC. Development and registration of recombinant veterinary vaccines. The example of the canarypox vector platform. Vaccine. 2007 Jul 26;25（30）:5606-12. Epub 2006 Dec 8. Review. PubMed PMID: 17227690.
209: Quakkelaar ED, Redeker A, Haddad EK, Harari A, McCaughey SM, Duhen T, Filali-Mouhim A, Goulet JP, Loof NM, Ossendorp F, Perdiguero B, Heinen P, Gomez CE, Kibler KV, Koelle DM, Sekaly RP, Sallusto F, Lanzavecchia A, Pantaleo G, Esteban M, Tartaglia J, Jacobs BL, Melief CJ. Improved innate and adaptive immunostimulation by genetically modified HIV-1 protein expressing NYVAC vectors. PLoS One. 2011 Feb 15;6（2）:e16819. doi: 10.1371/journal.pone.0016819. PubMed PMID: 21347234; PubMed Central PMCID: PMC3039654.
210: Qureshi ST, Lariviere L, Leveque G, Clermont S, Moore KJ, Gros P, Malo D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 （Tlr4）. J Exp Med. 1999 Feb 15;189（4）:615-25. Erratum in: J Exp Med 1999 May 3;189（9）:following 1518. PubMed PMID: 9989976; PubMed Central PMCID: PMC2192941.
211: Ramsay AJ, Leong KH, Ramshaw IA. DNA vaccination against virus infection and enhancement of antiviral immunity following consecutive immunization with DNA and viral vectors. Immunol Cell Biol. 1997 Aug;75（4）:382-8. Review. PubMed PMID: 9315482.
212: Ramshaw IA, Ramsay AJ. The prime-boost strategy: exciting prospects for improved vaccination. Immunol Today. 2000 Apr;21（4）:163-5. Review. PubMed PMID: 10740236.
213: Rerks-Ngarm S, Pitisuttithum P, Nitayaphan S, Kaewkungwal J, Chiu J, Paris R, Premsri N, Namwat C, de Souza M, Adams E, Benenson M, Gurunathan S, Tartaglia J, McNeil JG, Francis DP, Stablein D, Birx DL, Chunsuttiwat S, Khamboonruang C, Thongcharoen P, Robb ML, Michael NL, Kunasol P, Kim JH; MOPH-TAVEG Investigators. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N Engl. J Med. 2009 Dec 3;361（23）:2209-20. doi: 10.1056/NEJMoa0908492. Epub 2009 Oct 20. PubMed PMID: 19843557.
214: Richie TL, Saul A. Progress and challenges for malaria vaccines. Nature. 2002 Feb 7;415（6872）:694-701. Review. PubMed PMID: 11832958.
215: Richmond JF, Mustafa F, Lu S, Santoro JC, Weng J, O'Connell M, Fenyo EM, Hurwitz JL, Montefiori DC, Robinson HL. Screening of HIV-1 Env glycoproteins for  the ability to raise neutralizing antibody using DNA immunization and recombinant vaccinia virus boosting. Virology. 1997 Apr 14;230（2）:265-74. PubMed PMID: 9143282.
216: Rieckmann KH, Beaudoin RL, Cassells JS, Sell KW. Use of attenuated sporozoites in the immunization of human volunteers against falciparum malaria. Bull World Health Organ. 1979;57 Suppl 1:261-5. PubMed PMID: 120773; PubMed Central PMCID: PMC2395727.
217: Robinson HL. Working towards an HIV/AIDS vaccine. Hum Vaccin. 2009 Jul;5（7）:436-8. PubMed PMID: 19662687.
218: Roestenberg M, Teirlinck AC, McCall MB, Teelen K, Makamdop KN, Wiersma J, Arens T, Beckers P, van Gemert G, van de Vegte-Bolmer M, van der Ven AJ, Luty AJ, Hermsen CC, Sauerwein RW. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 2011 May 21;377（9779）:1770-6. doi: 10.1016/S0140-6736（11）60360-7. Epub 2011 Apr 22. PubMed PMID: 21514658.
219: Rollier CS, Reyes-Sandoval A, Cottingham MG, Ewer K, Hill AV. Viral vectors as vaccine platforms: deployment in sight. Curr Opin Immunol. 2011 Jun;23（3）:377-82. doi: 10.1016/j.coi.2011.03.006. Epub 2011 Apr 20. Review. PubMed PMID: 21514130.
220: Rupprecht CE, Wiktor TJ, Johnston DH, Hamir AN, Dietzschold B, Wunner WH, Glickman LT, Koprowski H. Oral immunization and protection of raccoons （Procyon lotor） with a vaccinia-rabies glycoprotein recombinant virus vaccine. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Oct;83（20）:7947-50. PubMed PMID: 3464010; PubMed Central PMCID: PMC386841.
221: Sancho MC, Schleich S, Griffiths G, Krijnse-Locker J. The block in assembly of modified vaccinia virus Ankara in HeLa cells reveals new insights into vaccinia virus morphogenesis. J Virol. 2002 Aug;76（16）:8318-34. PubMed PMID: 12134037; PubMed Central PMCID: PMC155139.
222: Sandstrom E, Nilsson C, Hejdeman B, Brave A, Bratt G, Robb M, Cox J, Vancott T, Marovich M, Stout R, Aboud S, Bakari M, Pallangyo K, Ljungberg K, Moss B, Earl P, Michael N, Birx D, Mhalu F, Wahren B, Biberfeld G; HIV Immunogenicity Study 01/02 Team. Broad immunogenicity of a multigene, multiclade HIV-1 DNA vaccine boosted with heterologous HIV-1 recombinant modified vaccinia virus Ankara. J Infect Dis. 2008 Nov 15;198（10）:1482-90. doi: 10.1086/592507. PubMed PMID: 18808335.
223: Scriba TJ, Tameris M, Mansoor N, Smit E, van der Merwe L, Isaacs F, Keyser A, Moyo S, Brittain N, Lawrie A, Gelderbloem S, Veldsman A, Hatherill M, Hawkridge A, Hill AV, Hussey GD, Mahomed H, McShane H, Hanekom WA. Modified vaccinia Ankara-expressing Ag85A, a novel tuberculosis vaccine, is safe in adolescents and children, and induces polyfunctional CD4+ T cells. Eur J Immunol. 2010 Jan;40（1）:279-90. doi: 10.1002/eji.200939754. Erratum in: Eur J Immunol. 2011 May;41（5）:1501. PubMed PMID: 20017188; PubMed Central PMCID: PMC3044835.
224: Sekaly RP. The failed HIV Merck vaccine study: a step back or a launching point for future vaccine development? J Exp Med. 2008 Jan 21;205（1）:7-12. doi: 10.1084/jem.20072681. Epub 2008 Jan 14. PubMed PMID: 18195078; PubMed Central PMCID: PMC2234358.
225: Sheehy SH, Duncan CJ, Elias SC, Choudhary P, Biswas S, Halstead FD, Collins KA, Edwards NJ, Douglas AD, Anagnostou NA, Ewer KJ, Havelock T, Mahungu T, Bliss CM, Miura K, Poulton ID, Lillie PJ, Antrobus RD, Berrie E, Moyle S, Gantlett K, Colloca S, Cortese R, Long CA, Sinden RE, Gilbert SC, Lawrie AM, Doherty T, Faust SN, Nicosia A, Hill AV, Draper SJ. ChAd63-MVA-vectored blood-stage malaria vaccines targeting MSP1 and AMA1: assessment of efficacy against mosquito bite challenge in humans. Mol Ther. 2012 Dec;20（12）:2355-68. doi: 10.1038/mt.2012.223. Epub 2012 Oct 23. PubMed PMID: 23089736; PubMed Central PMCID: PMC3519995.
226: Shen X, Wong SB, Buck CB, Zhang J, Siliciano RF. Direct priming and cross-priming contribute differentially to the induction of CD8+ CTL following exposure to vaccinia virus via different routes. J Immunol. 2002 Oct 15;169（8）:4222-9. PubMed PMID: 12370352.
227: Shida H, Hinuma Y, Hatanaka M, Morita M, Kidokoro M, Suzuki K, Maruyama T, Takahashi-Nishimaki F, Sugimoto M, Kitamura R, et al. Effects and virulences of recombinant vaccinia viruses derived from attenuated strains that express the human T-cell leukemia virus type I envelope gene. J Virol. 1988 Dec;62（12）:4474-80. PubMed PMID: 3184271; PubMed Central PMCID: PMC253556.
228: Shisler JL, Jin XL. The vaccinia virus K1L gene product inhibits host NF-kappaB activation by preventing IkappaBalpha degradation. J Virol. 2004 Apr;78（7）:3553-60. PubMed PMID: 15016878; PubMed Central PMCID: PMC371086.
229: Smith GL, Murphy BR, Moss B. Construction and characterization of an infectious vaccinia virus recombinant that expresses the influenza hemagglutinin gene and induces resistance to influenza virus infection in hamsters. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983 Dec;80（23）:7155-9. PubMed PMID: 6580632; PubMed Central PMCID: PMC390012.
230: Smith GL, Mackett M, Moss B. Infectious vaccinia virus recombinants that express hepatitis B virus surface antigen. Nature. 1983 Apr 7;302（5908）:490-5. PubMed PMID: 6835382.
231: Smith JM, Amara RR, Campbell D, Xu Y, Patel M, Sharma S, Butera ST, Ellenberger DL, Yi H, Chennareddi L, Herndon JG, Wyatt LS, Montefiori D, Moss B, McClure HM, Robinson HL. DNA/MVA vaccine for HIV type 1: effects of codon-optimization and the expression of aggregates or virus-like particles on the immunogenicity of the DNA prime. AIDS Res Hum Retroviruses. 2004 Dec;20（12）:1335-47. PubMed PMID: 15650426.
232: Sridhar S, Reyes-Sandoval A, Draper SJ, Moore AC, Gilbert SC, Gao GP, Wilson JM, Hill AV. Single-dose protection against Plasmodium berghei by a simian adenovirus vector using a human cytomegalovirus promoter containing intron A. J Virol. 2008 Apr;82（8）:3822-33. doi: 10.1128/JVI.02568-07. Epub 2008 Feb 6. PubMed PMID: 18256155; PubMed Central PMCID: PMC2293012.
233: Stack J, Haga IR, Schroder M, Bartlett NW, Maloney G, Reading PC, Fitzgerald KA, Smith GL, Bowie AG. Vaccinia virus protein A46R targets multiple Toll-like-interleukin-1 receptor adaptors and contributes to virulence. J Exp Med. 2005 Mar 21;201（6）:1007-18. Epub 2005 Mar 14. PubMed PMID: 15767367; PubMed Central PMCID: PMC2213104.
234: Stevceva L, Alvarez X, Lackner AA, Tryniszewska E, Kelsall B, Nacsa J, Tartaglia J, Strober W, Franchini G. Both mucosal and systemic routes of immunization with the live, attenuated NYVAC/simian immunodeficiency virus SIV（gpe） recombinant vaccine result in gag-specific CD8（+） T-cell responses in mucosal tissues of macaques. J Virol. 2002 Nov;76（22）:11659-76. PubMed PMID: 12388726; PubMed Central PMCID: PMC136754.
235: Stevceva L, Abimiku AG, Franchini G. Targeting the mucosa: genetically engineered vaccines and mucosal immune responses. Genes Immun. 2000 Jun;1（5）:308-15. Review. PubMed PMID: 11196691.
236: Stittelaar KJ, Kuiken T, de Swart RL, van Amerongen G, Vos HW, Niesters HG, van Schalkwijk P, van der Kwast T, Wyatt LS, Moss B, Osterhaus AD. Safety of modified vaccinia virus Ankara （MVA） in immune-suppressed macaques. Vaccine. 2001 Jun 14;19（27）:3700-9. PubMed PMID: 11395204.
237: Sullivan V, Smith GL. Expression and characterization of herpes simplex virus type 1 （HSV-1）glycoprotein G （gG） by recombinant vaccinia virus: neutralization of HSV-1 infectivity with anti-gG antibody. J Gen Virol. 1987 Oct;68 （ Pt 10）:2587-98. PubMed PMID: 2822841.
238: Sutterwala FS, Mijares LA, Li L, Ogura Y, Kazmierczak BI, Flavell RA. Immune recognition of Pseudomonas aeruginosa mediated by the IPAF/NLRC4 inflammasome. J Exp Med. 2007 Dec 24;204（13）:3235-45. Epub 2007 Dec 10. PubMed PMID: 18070936; PubMed Central PMCID: PMC2150987.
239: Tartaglia J, Perkus ME, Taylor J, Norton EK, Audonnet JC, Cox WI, Davis SW, van der Hoeven J, Meignier B, Riviere M, et al. NYVAC: a highly attenuated strain of vaccinia virus. Virology. 1992 May;188（1）:217-32. PubMed PMID: 1566575.
240: Teklehaimanot A, McCord GC, Sachs JD. Scaling up malaria control in Africa: an economic and epidemiological assessment. Am J Trop Med Hyg. 2007 Dec;77（6 Suppl）:138-44. Review. PubMed PMID: 18165486.
241: Theofilopoulos AN, Baccala R, Beutler B, Kono DH. Type I interferons （alpha/beta） in immunity and autoimmunity. Annu Rev Immunol. 2005;23:307-36. Review. PubMed PMID: 15771573.
242: Thera MA, Plowe CV. Vaccines for malaria: how close are we? Annu Rev Med. 2012;63:345-57. doi: 10.1146/annurev-med-022411-192402. Epub 2011 Nov 10. Review. PubMed PMID: 22077719; PubMed Central PMCID: PMC3338248.
243: Thera MA, Doumbo OK, Coulibaly D, Laurens MB, Ouattara A, Kone AK, Guindo AB, Traore K, Traore I, Kouriba B, Diallo DA, Diarra I, Daou M, Dolo A, Tolo Y, Sissoko MS, Niangaly A, Sissoko M, Takala-Harrison S, Lyke KE, Wu Y, Blackwelder WC, Godeaux O, Vekemans J, Dubois MC, Ballou WR, Cohen J, Thompson D, Dube T, Soisson L, Diggs CL, House B, Lanar DE, Dutta S, Heppner DG Jr, Plowe CV. A field trial to assess a blood-stage malaria vaccine. N Engl J Med. 2011 Sep 15;365（11）:1004-13. doi: 10.1056/NEJMoa1008115. PubMed PMID: 21916638; PubMed Central PMCID: PMC3242358.
244: Uematsu S, Jang MH, Chevrier N, Guo Z, Kumagai Y, Yamamoto M, Kato H, Sougawa N, Matsui H, Kuwata H, Hemmi H, Coban C, Kawai T, Ishii KJ, Takeuchi O, Miyasaka M, Takeda K, Akira S. Detection of pathogenic intestinal bacteria by Toll-like receptor 5 on intestinal CD11c+ lamina propria cells. Nat Immunol. 2006 Aug;7（8）:868-74. Epub 2006 Jul 9. PubMed PMID: 16829963.
245: van Montfoort N, Camps MG, Khan S, Filippov DV, Weterings JJ, Griffith JM, Geuze HJ, van Hall T, Verbeek JS, Melief CJ, Ossendorp F. Antigen storage compartments in mature dendritic cells facilitate prolonged cytotoxic T lymphocyte cross-priming capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Apr 21;106（16）:6730-5. doi: 10.1073/pnas.0900969106. Epub 2009 Apr 3. PubMed PMID: 19346487; PubMed Central PMCID: PMC2672553.
246: Verardi PH, Jones LA, Aziz FH, Ahmad S, Yilma TD. Vaccinia virus vectors with an inactivated gamma interferon receptor homolog gene （B8R） are attenuated In vivo without a concomitant reduction in immunogenicity. J Virol. 2001 Jan;75（1）:11-8. PubMed PMID: 11119568; PubMed Central PMCID: PMC113892.
247: Vijaysri S, Jentarra G, Heck MC, Mercer AA, McInnes CJ, Jacobs BL. Vaccinia viruses with mutations in the E3L gene as potential replication-competent, attenuated vaccines: intra-nasal vaccination. Vaccine. 2008 Jan 30;26（5）:664-76.  Epub 2007 Dec 4. PubMed PMID: 18096276; PubMed Central PMCID: PMC2576474.
248: von Krempelhuber A, Vollmar J, Pokorny R, Rapp P, Wulff N, Petzold B, Handley A, Mateo L, Siersbol H, Kollaritsch H, Chaplin P. A randomized, double-blind, dose-finding Phase II study to evaluate immunogenicity and safety of the third generation smallpox vaccine candidate IMVAMUNE. Vaccine. 2010 Feb 3;28（5）:1209-16. doi: 10.1016/j.vaccine.2009.11.030. Epub 2009 Nov 25. PubMed PMID: 19944151; PubMed Central PMCID: PMC2814951.
249: von Mehren M, Arlen P, Tsang KY, Rogatko A, Meropol N, Cooper HS, Davey M, McLaughlin S, Schlom J, Weiner LM. Pilot study of a dual gene recombinant avipox  vaccine containing both carcinoembryonic antigen （CEA） and B7.1 transgenes in patients with recurrent CEA-expressing adenocarcinomas. Clin Cancer Res. 2000 Jun;6（6）:2219-28. PubMed PMID: 10873071.
250: Vora P, Youdim A, Thomas LS, Fukata M, Tesfay SY, Lukasek K, Michelsen KS, Wada A, Hirayama T, Arditi M, Abreu MT. Beta-defensin-2 expression is regulated by TLR signaling in intestinal epithelial cells. J Immunol. 2004 Nov 1;173（9）:5398-405. PubMed PMID: 15494486.
251: Walker BD, Burton DR. Toward an AIDS vaccine. Science. 2008 May 9;320（5877）:760-4. doi: 10.1126/science.1152622. Review. PubMed PMID: 18467582.
252: Wang BZ, Gill HS, Kang SM, Wang L, Wang YC, Vassilieva EV, Compans RW. Enhanced influenza virus-like particle vaccines containing the extracellular domain of matrix protein 2 and a Toll-like receptor ligand. Clin Vaccine Immunol. 2012 Aug;19（8）:1119-25. doi: 10.1128/CVI.00153-12. Epub 2012 May 30. PubMed PMID: 22647270; PubMed Central PMCID: PMC3416094.
253: Wang BZ, Quan FS, Kang SM, Bozja J, Skountzou I, Compans RW. Incorporation of membrane-anchored flagellin into influenza virus-like particles enhances the breadth of immune responses. J Virol. 2008 Dec;82（23）:11813-23. doi: 10.1128/JVI.01076-08. Epub 2008 Sep 10. PubMed PMID: 18786995; PubMed Central PMCID: PMC2583664.
254: Webster DP, Dunachie S, Vuola JM, Berthoud T, Keating S, Laidlaw SM, McConkey SJ, Poulton I, Andrews L, Andersen RF, Bejon P, Butcher G, Sinden R, Skinner MA, Gilbert SC, Hill AV. Enhanced T cell-mediated protection against malaria in human challenges by using the recombinant poxviruses FP9 and modified vaccinia virus Ankara. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Mar 29;102（13）:4836-41. Epub 2005 Mar 21.  PubMed PMID: 15781866; PubMed Central PMCID: PMC555695.
255: Weiss R, Gabler M, Jacobs T, Gilberger TW, Thalhamer J, Scheiblhofer S. Differential effects of C3d on the immunogenicity of gene gun vaccines encoding Plasmodium falciparum and Plasmodium berghei MSP1（42）. Vaccine. 2010 Jun 17;28（28）:4515-22. doi: 10.1016/j.vaccine.2010.04.054. Epub 2010 May 15. PubMed PMID: 20438877.
256: Werden SJ, Rahman MM, McFadden G. Poxvirus host range genes. Adv Virus Res. 2008;71:135-71. doi: 10.1016/S0065-3527（08）00003-1. Review. PubMed PMID: 18585528.
257: Weyer J, Rupprecht CE, Nel LH. Poxvirus-vectored vaccines for rabies-a review. Vaccine. 2009 Nov 27;27（51）:7198-201. doi: 10.1016/j.vaccine.2009.09.033. Review. PubMed PMID: 19925953.
258: Weyer J, Rupprecht CE, Mans J, Viljoen GJ, Nel LH. Generation and evaluation  of a recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine for rabies. Vaccine. 2007 May 22;25（21）:4213-22. Epub 2007 Mar 22. PubMed PMID: 17434244.
259: Whelan KT, Pathan AA, Sander CR, Fletcher HA, Poulton I, Alder NC, Hill AV, McShane H. Safety and immunogenicity of boosting BCG vaccinated subjects with BCG: comparison with boosting with a new TB vaccine, MVA85A. PLoS One. 2009 Jun 16;4（6）:e5934. doi: 10.1371/journal.pone.0005934. Erratum in: PLoS One. 2011;6（2）.doi:10.1371/annotation/ec8cc565-bf24-4898-b7ba-6e0423d5809f. PubMed PMID: 19529780; PubMed Central PMCID: PMC2694271.
260: Wiktor TJ, Macfarlan RI, Reagan KJ, Dietzschold B, Curtis PJ, Wunner WH, Kieny MP, Lathe R, Lecocq JP, Mackett M, et al. Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Nov;81（22）:7194-8. PubMed PMID: 6095272; PubMed Central PMCID: PMC392104.
261: Willis KL, Patel S, Xiang Y, Shisler JL. The effect of the vaccinia K1 protein on the PKR-eIF2alpha pathway in RK13 and HeLa cells. Virology. 2009 Nov 10;394（1）:73-81. doi: 10.1016/j.virol.2009.08.020. Epub 2009 Sep 9. PubMed PMID:  19744687; PubMed Central PMCID: PMC2767412.
262: Wilson NA, Reed J, Napoe GS, Piaskowski S, Szymanski A, Furlott J, Gonzalez EJ, Yant LJ, Maness NJ, May GE, Soma T, Reynolds MR, Rakasz E, Rudersdorf R, McDermott AB, O'Connor DH, Friedrich TC, Allison DB, Patki A, Picker LJ, Burton DR, Lin J, Huang L, Patel D, Heindecker G, Fan J, Citron M, Horton M, Wang F, Liang X, Shiver JW, Casimiro DR, Watkins DI. Vaccine-induced cellular immune responses reduce plasma viral concentrations after repeated low-dose challenge with pathogenic simian immunodeficiency virus SIVmac239. J Virol. 2006 Jun;80（12）:5875-85. PubMed PMID: 16731926; PubMed Central PMCID: PMC1472612.
263: Woodland DL. Jump-starting the immune system: prime-boosting comes of age. Trends Immunol. 2004 Feb;25（2）:98-104. Review. PubMed PMID: 15102369.
264: Wyatt LS, Earl PL, Liu JY, Smith JM, Montefiori DC, Robinson HL, Moss B. Multiprotein HIV type 1 clade B DNA and MVA vaccines: construction, expression, and immunogenicity in rodents of the MVA component. AIDS Res Hum Retroviruses. 2004 Jun;20（6）:645-53. PubMed PMID: 15242542.
265: Wyatt LS, Carroll MW, Czerny CP, Merchlinsky M, Sisler JR, Moss B. Marker rescue of the host range restriction defects of modified vaccinia virus Ankara. Virology. 1998 Nov 25;251（2）:334-42. PubMed PMID: 9837798.
266: Yamamoto M, Sato S, Hemmi H, Hoshino K, Kaisho T, Sanjo H, Takeuchi O, Sugiyama M, Okabe M, Takeda K, Akira S. Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling pathway. Science. 2003 Aug 1;301（5633）:640-3. Epub 2003 Jul 10. PubMed PMID: 12855817.
267: Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene. 1985;33（1）:103-19. Erratum in: Gene. 1992 May 1;114（1）:81-3. PubMed PMID: 2985470.
268: Yilma TD. Prospects for the total eradication of rinderpest. Vaccine. 1989 Dec;7（6）:484-5. PubMed PMID: 2609722.
269: Yoshida S, Nagumo H, Yokomine T, Araki H, Suzuki A, Matsuoka H. Plasmodium berghei circumvents immune responses induced by merozoite surface protein 1- and apical membrane antigen 1-based vaccines. PLoS One. 2010 Oct 28;5（10）:e13727. doi: 10.1371/journal.pone.0013727. PubMed PMID: 21060850; PubMed Central PMCID: PMC2965677.
270: Zhao Y, Yang J, Shi J, Gong YN, Lu Q, Xu H, Liu L, Shao F. The NLRC4 inflammasome receptors for bacterial flagellin and type III secretion apparatus.  Nature. 2011 Sep 14;477（7366）:596-600. doi: 10.1038/nature10510. PubMed PMID: 21918512.
271: Zieg J, Silverman M, Hilmen M, Simon M. Recombinational switch for gene expression. Science. 1977 Apr 8;196（4286）:170-2. PubMed PMID: 322276.
【０１００】
このように、詳細に、本発明の好適な実施態様を記載したが、多くの明らかなそのバリエ―ションが、本件発明の神髄または範囲から離れることなく可能であるので、上記パラグラフにおいて規定された発明は、上記開示において記載された特別な態様には限定されないと理解すべきである。
【図１】
2019162120.tif 000002
【図２Ａ】
2019162120.tif 000003
【図２Ｂ】
2019162120.tif 000004
【図３Ａ】
2019162120.tif 000005
【図３Ｂ】
2019162120.tif 000006
【図３Ｃ】
2019162120.tif 000007
【図３Ｄ】
2019162120.tif 000008
【配列表】
2019162120000001.app
【外国語明細書】
2019162120000001.pdf
2019162120000002.pdf
2019162120000003.pdf
2019162120000004.pdf