(57)【要約】      （修正有）【課題】等温での核酸増幅反応及び／又はＲＴ-ＰＣＲでの核酸増幅反応に有用な、熱安定性に優れる鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼの内、一部のアミノ酸配列を塩基性アミノ酸改変した、鎖置換活性を有するサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ若しくはその一部における、特定のアミノ酸配列の改変を有する変異型ＤＮＡポリメラーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むその一部に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、６８７、６８８及び６８９番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した、鎖置換活性を有するサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むその一部に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、６８７、６８８及び６８９番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した、鎖置換活性を有するサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むその一部の配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列において、６８７、６８８及び６８９番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した、鎖置換活性を有するサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むその一部において、６８７、６８８及び６８９番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した、鎖置換活性を有するサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記その一部が、配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
前記塩基性アミノ酸がリジン又はアルギニンである請求項１〜５のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
改変された塩基性アミノ酸がすべてリジンである請求項１〜６のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していない、請求項１〜７のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼを含む、核酸増幅用試薬。
【請求項１０】
基質、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマー、及び緩衝液を更に含む、請求項９に記載の核酸増幅用試薬。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドプライマー対を２対以上含む、請求項１０に記載の核酸増幅用試薬。
【請求項１２】
マンガン塩及びマグネシウム塩からなる群より選択される少なくとも１種の塩を更に含む、請求項９〜１１のいずれかに記載の核酸増幅用試薬。
【請求項１３】
等温核酸増幅方法又はＲＴ−ＰＣＲ方法に用いられる、請求項９〜１２のいずれかに記載の核酸増幅用試薬。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ又は請求項９〜１３のいずれかに記載の核酸増幅用試薬を用いる等温核酸増幅方法。
【請求項１５】
等温核酸増幅方法がＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）法、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法、Ｓｍａｒｔ Ａｍｐ（ＳＭＡＰ）法及びＩｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎd Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮ）法からなる群から選択されるいずれかである請求項１４に記載の等温核酸増幅方法。
【請求項１６】
等温核酸増幅方法がＬＡＭＰ法である請求項１４又は１５に記載の等温核酸増幅方法。
【請求項１７】
標的遺伝子がＤＮＡである請求項１４〜１６のいずれかに記載の等温核酸増幅方法。
【請求項１８】
標的遺伝子がＲＮＡである請求項１４〜１６のいずれかに記載の等温核酸増幅方法。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ又は請求項９〜１３のいずれかに記載の核酸増幅用試薬を用いるＲＴ−ＰＣＲ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規核酸合成酵素の分野に関する。さらに詳しくは、鎖置換活性を有する変異型ＤＮＡポリメラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型核酸からのＤＮＡの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。中でも、核酸増幅法は、研究分野のみならず、遺伝子診断、親子鑑定といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。
【０００３】
核酸増幅法は現在までに様々な方法が開発されており、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＴＲＣ）法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）法などの核酸増幅法が比較的一般に普及している。
【０００４】
特に食品、環境中の微生物検査などにおいては、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用したＬＡＭＰ法などの等温増幅法による核酸増幅法が普及している。この方法はＤＮＡの変性を行わず、等温で増幅できるため、複雑な装置を必要とせず、短時間でターゲットを増幅することができる。
【０００５】
等温増幅法で使用する既存の鎖置換能を有するポリメラーゼとしては、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、９６−７ＤＮＡポリメラーゼなどが知られている。
【０００６】
これら等温増幅で使用される鎖置換能を有するポリメラーゼは一般的に熱安定性が低く、６０℃を超えるような高温での反応は難しい。プライミングの特異性を高めるためや、また核酸の中には高次構造を組むものも存在しており高次構造を崩すため、より高温での反応が求められているが、上記の鎖置換を有するポリメラーゼでは対応が難しかった。また熱安定性の低さから、反応の途中で失活してしまうため、上記の鎖置換を有するポリメラーゼでは十分な反応ができていないという問題があった。
【０００７】
この欠点を克服するために、例えば特許文献１には、新規な鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ ｓａｔｓｕｍａｅ由来のものが報告されている。また特許文献２には、９０℃以上の温度にも耐性のある耐熱性のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに変異を導入することで鎖置換活性を持たせた変異体も報告されているが、いずれのＤＮＡポリメラーゼにおいても、伸長性および鎖置換活性は十分なものではなかった。
【０００８】
一方、等温増幅だけでなく核酸増幅法の中では増幅能力の高いＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）も広く普及している。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
【０００９】
検出対象核酸がＲＮＡである場合、たとえば病原性微生物の検出において対象がＲＮＡウイルスであるとき、あるいは遺伝子の発現量をｍＲＮＡの定量によって測定するときなどは、逆転写酵素によりＲＮＡをｃＤＮＡに変換する反応（逆転写反応）をＰＣＲの前に行うＲＴ−ＰＣＲも広く行われている。
【００１０】
ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲは、温度サイクルを実施する機器は必要なものの、その高い増幅効率から、数コピーの標的核酸を、可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅することを可能にする。なかでもＲＴ−ＰＣＲはＲＮＡの検出には欠かせない技術であり、ＲＮＡウイルスの検出やｍＲＮＡの解析など、診断用途でも広く利用されている。
【００１１】
ＲＴ−ＰＣＲには、ＤＮＡポリメラーゼの他に、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写活性を持つ酵素が必要になる。ＤＮＡポリメラーゼの中には、ＴＴＨ ＤＮＡポリメラーゼやＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼなど、この逆転写活性を併せ持つポリメラーゼが存在しており、これらの酵素を用いれば、１つの酵素でＲＴ−ＰＣＲを可能にする。このようなＲＴ−ＰＣＲは、非常に効率の高い反応ではあるが、ＲＮＡは高次構造を組みやすい特徴があり、強固な高次構造が形成されているとＲＴ反応が阻害されやすく、更なる改良が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０５５７３７
【特許文献２】ＷＯ２０１７／０９０６８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、等温での核酸増幅反応及び／又はＲＴ-ＰＣＲでの核酸増幅反応に有用な、熱安定性に優れる鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは鋭意検討した結果、鎖置換活性を有する特定のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の伸長性および鎖置換能が、鎖置換活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体や一般的によく使用されている９６−７ＤＮＡポリメラーゼよりも優れていることを見出し、本発明に到達した。さらに、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼはＭｎ存在下で逆転写活性を有することから、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体では増幅できないＲＮＡからの増幅が可能である。そこで本発明者らは更に検討を重ね、鎖置換活性を持つ特定のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体が、ＲＴ−ＰＣＲ反応においても、鎖置換活性のない野生型Ｔｔｈと比較し、より高効率な増幅を可能にすることをも見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は主として以下のような構成からなる。
［項１］  配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むその一部に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、６８７、６８８及び６８９番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した、鎖置換活性を有するサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
［項２］  配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むその一部に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、６８７、６８８及び６８９番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した、鎖置換活性を有するサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
［項３］  配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むその一部の配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列において、６８７、６８８及び６８９番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した、鎖置換活性を有するサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
［項４］  配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むその一部において、６８７、６８８及び６８９番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した、鎖置換活性を有するサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
［項５］  前記その一部が、配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列からなる、項１〜４のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
［項６］  前記塩基性アミノ酸がリジン又はアルギニンである項１〜５のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
［項７］  改変された塩基性アミノ酸がすべてリジンである項１〜６のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
［項８］  ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していない、項１〜７のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
［項９］  項１〜８のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼを含む、核酸増幅用試薬。
［項１０］  基質、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマー、及び緩衝液を更に含む、項９に記載の核酸増幅用試薬。
［項１１］  オリゴヌクレオチドプライマー対を２対以上含む、項１０に記載の核酸増幅用試薬。
［項１２］  マンガン塩及びマグネシウム塩からなる群より選択される少なくとも１種の塩を更に含む、項９〜１１のいずれかに記載の核酸増幅用試薬。
［項１３］  等温核酸増幅方法又はＲＴ−ＰＣＲ方法に用いられる、項９〜１２のいずれかに記載の核酸増幅用試薬。
［項１４］  項１〜８のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ又は項９〜１３のいずれかに記載の核酸増幅用試薬を用いる等温核酸増幅方法。
［項１５］  等温核酸増幅方法がＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）法、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法、Ｓｍａｒｔ Ａｍｐ（ＳＭＡＰ）法及びＩｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎd Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮ）法からなる群から選択されるいずれかである項１４に記載の等温核酸増幅方法。
［項１６］  等温核酸増幅方法がＬＡＭＰ法である項１４又は１５に記載の等温核酸増幅方法。
［項１７］  標的遺伝子がＤＮＡである項１４〜１６のいずれかに記載の等温核酸増幅方法。
［項１８］  標的遺伝子がＲＮＡである項１４〜１６のいずれかに記載の等温核酸増幅方法。
［項１９］  項１〜８のいずれかに記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ又は項９〜１３のいずれかに記載の核酸増幅用試薬を用いるＲＴ−ＰＣＲ方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、従来の鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ）よりも多くの増幅産物を得ることも可能となり得る。これにより、ＬＡＭＰ法などの等温での核酸増幅における増幅量の増加や、それに伴う精度および時間の短縮が見込める。また、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは逆転写活性を有することから、ＤＮＡのみならず、ＲＮＡを標的遺伝子とすることができる点も優位な点である。よって本発明により、等温増幅においてもＲＴ−ＰＣＲの反応においても優れた効果を発揮することができる、汎用性の高い新規ＤＮＡポリメラーゼの提供が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例３において、改変型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ΔＴａｑ改変型）、および、改変型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（ΔＴｔｈ改変型）を用いたＲＣＡ法での鎖置換活性の評価結果を示す図である。
【図２】実施例４において、改変型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（ΔＴｔｈ改変型）の熱安定性を評価した結果を示す図である。
【図３】実施例５において、野生型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼおよび改変型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ改変型）を用いたＲＴ−ＰＣＲの増幅曲線並びにＣｔ値の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
特定の実施形態において、本発明は、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ若しくはその一部（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に寄与するＮ末端のドメインを欠失させたＤＮＡポリメラーゼ）において、特定のアミノ酸改変を有する変異型ＤＮＡポリメラーゼを提供する。このサーマス・サーモフィルス由来のＤＮＡポリメラーゼの全長アミノ酸配列を配列番号１に示す。配列番号１において、Ｎ末端から２９１番目（つまり、１〜２９１番目）に示されるアミノ酸配列は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に寄与するドメインを構成することが知られている。本発明においては、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に寄与するＮ末端のドメインを欠失させたサーマス・サーモフィルス由来ＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、配列番号１の２９２番目からＣ末端（つまり、２９２〜８３４番目）に示されるアミノ酸配列において特定のアミノ酸改変を有する変異型ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。
【００２０】
本発明の実施形態の一つは、配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むその一部における６８７、６８８及び６８９番目に相当する３箇所のアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の変異型ＤＮＡポリメラーゼである。改変前のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むその一部のアミノ酸配列と完全に一致する場合に限られるものではなく、ＤＮＡポリメラーゼ活性が維持される限り特に制限されないが、例えば、これらのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するものであればよく、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、なかでも９９％以上の同一性を有するものを好適に使用することができる。さらに、改変前のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むその一部のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。ここで「１又は数個」とは、ＤＮＡポリメラーゼ活性が維持される限り特に制限されないが、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個である。
【００２１】
本明細書において、配列番号１の２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むその一部とは、配列番号１における連続したアミノ酸配列であって少なくとも２９２番目〜８３４番目に記載のアミノ酸配列を含む限り、特に限定されない。具体的には、配列番号１の２９２番目〜８３４番目を含み、且つそのＮ末端側に配列番号１と同一の連続した配列を有するものをいう。好ましくは、配列番号１の２９２番目〜８３４番目のアミノ酸配列を含み、且つそのＮ末端側に配列番号１と同一の連続した配列を１又は数個含むものであり、特に好ましくは配列番号１の２９２番目〜８３４番目のアミノ酸配列からなるものである。
【００２２】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、ルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｐ６８７Ｋ」などの表記を用いる。「Ｐ６８７Ｋ」は、第６８７番目のプロリンをリジンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。たとえば「Ｐ６８７Ｋ／Ｙ６８８Ｋ」は、第６８７番目のプロリンをリジンに置換し、かつ、第６８８番目のチロシンをリジンに置換したことを示す。また、本明細書において「変異型ＤＮＡポリメラーゼ」という場合の「変異型」とは、従来知られたＤＮＡポリメラーゼとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。
【００２３】
本発明において塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンが挙げられる。より好ましくはアルギニンまたはリジンであり、特に好ましくはリジンである。改変される３箇所の塩基性アミノ酸は、それぞれ異なるアミノ酸であってもよいし、異なっていてもよいが、改変される少なくとも２箇所が同じ塩基性アミノ酸であることが好ましく、改変される３箇所すべて同じ塩基性アミノ酸であることがとりわけ好ましい。より好ましい態様としては、改変される少なくとも２箇所がリジンであり、とりわけ好ましくは改変される３箇所すべてがリジンである。リジンのｐＫａは１０．５４、アルギニンのｐＫａは１２．４８、ヒスチジンのｐＫａは６．０４であることから、塩基性の強さが同程度のリジンとアルギニンでは同様な効果が得られるものと期待することができる。
【００２４】
ＤＮＡポリメラーゼとは１本鎖の核酸を鋳型として、それに相補的な塩基配列を持つＤＮＡ鎖を合成する酵素を意味する。また、鎖置換活性とは鋳型となる二本鎖ＤＮＡの水素結合を自ら解離しつつ、新しいＤＮＡ鎖を複製する活性を意味する。鎖置換活性は、後述の鎖置換活性測定法に記載の方法に従って測定することができる。
【００２５】
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しているが、本発明における変異型ＤＮＡポリメラーゼは当該活性を欠くものであってもよい。例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に寄与するアミノ酸を置換もしくは欠失させるような変異の導入や、前記活性に重要なドメインを欠失させる方法が知られている。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでは配列番号３におけるＮ末端から２８９番目のアミノ酸が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に寄与し、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼでは配列番号１におけるＮ末端から２９１番目のアミノ酸が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に寄与している。そのため、この領域のアミノ酸を欠失させることで５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させることができる。このように５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを欠失させたＤＮＡポリメラーゼ（即ち、配列番号１の２９２番目〜８３４番目に示されるアミノ酸配列から構成されるＤＮＡポリメラーゼ）において、６８７、６８８及び６８９番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した変異体であっても、ＤＮＡポリメラーゼ活性を維持したまま、優れた鎖置換活性や熱安定性を示し得ることが、後述の実施例の結果に示されている。
【００２６】
本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは優れた逆転写活性を有することから、標的核酸としてはＤＮＡのみならず、ＲＮＡであってもよい。特にＲＮＡから開始する逆転写から増幅反応までをワンステップで効率的に行うことが可能である点が、従来から知られている鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼと比べて顕著に優れている。更に、後述の実施例の結果に示されるように、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＴ−ＰＣＲにおいて用いられた場合に、野生型ＤＮＡポリメラーゼよりもＣｔ値を低下させ、優れた逆転写活性（ＲＴ活性）を示すことも明らかとなっている。従って、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡを標的遺伝子とするＲＴ−ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼとしても非常に有益である。
【００２７】
本発明における変異型ＤＮＡポリメラーゼは、核酸増幅反応に広く適用することが可能であるが、特に等温核酸増幅やＲＴ−ＰＣＲにおいて好適に用いることができる。等温核酸増幅としては、特に限定されるものではないが、例えばＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）法、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法、Ｓｍａｒｔ Ａｍｐ（ＳＭＡＰ）法及びＩｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮ）法などが挙げられる。特にはＬＡＭＰ法に用いることが好ましい。等温核酸増幅は、上述した通り、サーマルサイクラーのような温度サイクルを制御するための高価な装置を用いることなく、一つの酵素で核酸を増幅することができる点で有用であり、近年広く用いられるようになってきている。ＲＴ−ＰＣＲとしては、ＲＴ−ＰＣＲやｑＲＴ−ＰＣＲなどが挙げられるが、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、それをＰＣＲで増幅するものであれば特に限定されない。
【００２８】
本発明において、等温核酸増幅に用いられる反応温度としては、特に限定されないが、例えば３０〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃である。本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、このような温度範囲において良好な活性が維持されるものであり、効果的に核酸を増幅することが可能である。
【００２９】
本発明において、ＲＴ−ＰＣＲに用いられる反応温度としては、特に限定されないが、例えば、４０〜８０℃での逆転写反応後に９０〜１００℃での熱変性と４０〜８０℃での会合・伸長反応を行う熱サイクル条件が挙げられ、好ましくは、５５〜６５℃での逆転写反応後に９４〜９８℃での熱変性と５５〜６５℃での会合・伸長反応を行う熱サイクル条件（例えば、６０℃での逆転写反応後に９５℃での熱変性と６０℃での会合・伸長反応を行う熱サイクル条件）である。本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、このような温度範囲において良好な活性が維持されるものであり、効果的に核酸を増幅することが可能である。
【００３０】
更なる実施形態として、本発明は、前記のような変異型ＤＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅用試薬を提供する。この核酸増幅用試薬は、任意の核酸増幅反応に用いられ得るが、優れた鎖置換活性を示すことができ、更には優れたＲＴ活性をも示すことができるという観点から、好ましくは、等温核酸増幅用試薬、ＲＴ−ＰＣＲ反応用試薬として用いられる。本発明の核酸増幅用試薬における前記変異型ＤＮＡポリメラーゼの量は、本発明の効果を奏する限りにおいて限定されないが、例えば、核酸増幅反応における終濃度が０．１〜２０Ｕ／２０μｌとなるような量を例示することができる。
【００３１】
更に、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼを、上述のような等温核酸増幅やＲＴ−ＰＣＲに用いる場合の試薬の構成としては、限定はされないが、該変異型ＤＮＡポリメラーゼに加えて、ｄＮＴＰｓのような基質、マグネシウム塩またはマンガン塩、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマー及び緩衝液（例えば、核酸増幅反応用緩衝液）を含むことが好ましい。限定はされないが、等温核酸増幅に用いる試薬とする場合には、オリゴヌクレオチドプライマーは２対以上であってもよい。また、ＲＴ−ＰＣＲに用いる試薬とする場合には、マンガン塩及び／又はマグネシウム塩などの塩を含むことが好ましい。マンガン塩としては、例えば、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガン等を挙げることができる。マグネシウム塩としては、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等のマグネシウム塩を挙げることができる。本発明の核酸増幅用試薬は、必要に応じて、さらに他の塩類や保護剤などを適宜含めることができる。
【００３２】
本発明における等温核酸増幅用試薬は、特定の実施形態において、ＬＡＭＰ法に好適に用いられる。ＬＡＭＰ法の場合は、オリゴヌクレオチドプライマーが一般に２対以上必要であるとされている。２対のオリゴヌクレオチドプライマーとしては、標的核酸の配列に基づき設計される、インナー（Ｉｎｎｅｒ）プライマー２種類とアウター（Ｏｕｔｅｒ）プライマー２種類が用いられる。さらに、ループ（Ｌｏｏｐ）プライマー対を含めて、３対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてもよい。オリゴヌクレオチドプライマーは蛍光標識されたものを用いることもできる。
【００３３】
本発明における変異型ＤＮＡポリメラーゼは、少量のＤＮＡサンプルをランダムプライマーで多量に増幅する全ゲノム増幅に用いることもでき、また少量のＲＮＡサンプルをランダムプライマー等で多量に増幅する方法においても用いることができる。また、全ゲノム増幅でランダムプライマーの代わりにプライマーゼを使用してもよい。
【００３４】
本発明において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したときに、配列番号１の当該位置と対応する位置をいうものとする。
【００３５】
本発明において使用するベクターは、変異型ＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよび発現を可能とするものであれば特に制限されるものではないが、例えばファージおよびプラスミドが挙げられる。プラスミドとしてはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また別なプラスミドの例としては、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＳＰ７３、ｐＧＷ７、ｐＥＴ３Ａ、ｐＥＴ１１Ｃなどがある。ファージとしては、たとえばλｇｔ１１、λＤＡＳＨ、λＺａｐＩＩなどが挙げられる。本発明において使用する宿主細胞としては、大腸菌、酵母などが挙げられる。大腸菌としては、例えばＪＭ１０９、１０１、ＸＬ１、ＰＲ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳなどが挙げられる。酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｒｙｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．などが挙げられる。本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼを製造する場合には、例えば、上記変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を上記ベクターに挿入して組換え発現ベクターとし、更に、この組換え発現ベクターにて宿主細胞を形質転換する。
【００３６】
更に具体的に、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法としては、従来の公知の方法が使用できる。一例として、上記組換え宿主細胞を培養して、変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現させる。例えば大腸菌を宿主として、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３０℃〜３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を７０℃、１時間熱処理し、遠心することで宿主由来のタンパク質を除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することで、目的タンパク質の発現を確認することができる。
【００３７】
上記方法により選抜された菌株から精製された変異型ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば７０℃、１時間処理し、その後硫安沈殿により変異型ＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液を透析等の方法により脱塩を行った後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度にまで純化される。
【００３８】
［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法］
純化されたＤＮＡポリメラーゼは、以下に示す方法でＤＮＡポリメラーゼ活性を測定することができる。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０，５０％  グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて、７５℃にて１０分間反応する。（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ  塩酸およびエタノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２８１０  ＴＲ）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ  塩化マグネシウム１５ｍＭ  ジチオスレイトール１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ  活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ  ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％  トリクロロ酢酸（２ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍｌ  仔牛胸腺ＤＮＡ
【００３９】
［鎖置換活性測定法］
鎖置換活性の強弱は、以下に示す方法で確認することができる。（１）下記のＡ液２μｌ、Ｂ液２．５μｌ、Ｃ液１μｌ、Ｄ液２μｌ、及び２０ｎｇのＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（ＴａＫａＲａ製）、酵素溶液、滅菌水をマイクロチューブに加えて２０μｌにし、５０℃にて３０分間反応する。（２）その後氷冷し、５μｌを１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅長、および増幅量を確認する。このとき、増幅長が高分子側にシフトしているほど、鎖置換活性が高いことを示す。
Ａ：Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒ
Ｂ：２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（Ｔｏｙｏｂｏ製）
Ｃ：１μＭ  プライマー（配列番号５） 
Ｄ：１％  Ｔｗｅｅｎ２０
【実施例】
【００４０】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４１】
（実施例１）
改変型ＤＮＡポリメラーゼプラスミドの作製
人工合成により作成したＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号２）およびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号４）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、それぞれ野生型Ｔｔｈ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを組み込んだプラスミドを作製した（それぞれｐＴｔｈ、ｐＴａｑ；野生型）。変異をもつプラスミドの作製には、ｐＴｔｈ、ｐＴａｑを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。変異に関して、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに対しては配列番号３においてＰ６８５Ｋ／Ｙ６８６Ｋ／Ｅ６８７Ｋとなる変異型をコードする塩基配列を導入し、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼに対しては、配列番号１においてＰ６８７Ｋ／Ｙ６８８Ｋ／Ｅ６８９Ｋとなる変異型をコードする塩基配列を導入した（ｐＴａｑ改変型、ｐＴｔｈ改変型）。また５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させるため、配列番号３においてＮ末端から２８９番目までのアミノ酸を欠失させたＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、および配列番号１においてＮ末端から２９１番目までのアミノ酸を欠失させたＴｔｈＤＮＡポリメラーゼをコードする塩基配列を含むプラスミドも作成した。作成には前記変異プラスミドを鋳型に、同様のキットを用いて作製した（ｐΔＴａｑ改変型、ｐΔＴｔｈ改変型）。得られたプラスミドはエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
【００４２】
（実施例２）
変異ＤＮＡポリメラーゼの作製
実施例１で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３０℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３０℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を７０℃にて１時間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  塩化カリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、各ＤＮＡポリメラーゼを得た。
【００４３】
上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は、以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。
【００４４】
（試薬）
Ａ液：  ４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１６ｍＭ  塩化マグネシウム、１５ｍＭ  ジチオスレイトール、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
Ｂ液：  １．５μｇ／μｌ  活性化仔牛胸腺ＤＮＡ  
Ｃ液：  １．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ  ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）  
Ｄ液：  ２０％  トリクロロ酢酸（２ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液：  １ｍｇ／ｍｌ  仔牛胸腺ＤＮＡ
【００４５】
（方法）
Ａ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ及び滅菌水１０μｌを、マイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μｌを加えて、７５℃で１０分間反応する。その後冷却し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２８１０  ＴＲ）を用いて計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分当り１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
【００４６】
（実施例３）
ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法による活性評価
ＲＣＡ法にて改変型Ｔａｑ（ΔＴａｑ改変型ポリメラーゼ：Ｐ６８５Ｋ／Ｙ６８６Ｋ／Ｅ６８７Ｋの変異を有すると共に、Ｎ末端から２８９番目までのアミノ酸を欠失させたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、改変型Ｔｔｈ（ΔＴｔｈ改変型ポリメラーゼ：Ｐ６８７Ｋ／Ｙ６８８Ｋ／Ｅ６８９Ｋの変異を有すると共に、Ｎ末端から２９１番目までのアミノ酸を欠失させたＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ）の伸長性についての比較を実施した。比較には９６−７  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ニッポンジーン製）を使用し、２０μｌ反応系あたり８Ｕの改変型Ｔａｑ、改変型Ｔｔｈを使用した。
【００４７】
ＲＣＡは、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒ用い、１×  Ｂｕｆｆｅｒ、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、各１ｐｍｏｌもしくは６ｐｍｏlのプライマー（配列番号５）、Ｍ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（ＴａＫａＲａ製）２０ｎｇ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０および各酵素８Ｕを含む２０μｌの反応液を調製した。反応は５０℃、３０分でＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ（商標登録）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ製）を用いて行った。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【００４８】
結果を図１に示す。電気泳動のバンドが高分子側にシフトしているほど、鎖置換活性が高く、伸長性が優れていることを表す。この結果から明らかなように、改変型Ｔｔｈが最も増幅量が多く、より長鎖の増幅産物が確認できた。これは改変型Ｔｔｈの方が、鎖置換活性が高い、また伸長性が高いことを示しており、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼが優れた効果を奏することを示している。
【００４９】
（実施例４）
熱安定性の評価
ＲＣＡ法により、改変型Ｔｔｈ（ΔＴｔｈ鎖置換ポリメラーゼ：Ｐ６８７Ｋ／Ｙ６８８Ｋ／Ｅ６８９Ｋの変異とＮ末端から２９１番目までのアミノ酸を欠失したＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ）とＢｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ製）の熱安定性についての比較を実施した。
【００５０】
改変型ＴｔｈとＢｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ製）に関して８０℃２０分間の加熱処理を実施した場合と、実施しない場合で反応を実施した。
改変型ＴｔｈのＲＣＡは、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×  Ｂｕｆｆｅｒ、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｐｍｏｌのプライマー（配列番号５）、Ｍ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（ＴａＫａＲａ製）２０ｎｇ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０および、加熱処理有りもしくは加熱処理無しの改変型Ｔｔｈ８Ｕを含む２０μｌの反応液を調製した。一方、Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ製）のＲＣＡは添付のＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて、１×  Ｂｕｆｆｅｒ、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｐｍｏｌのプライマー（配列番号５）、Ｍ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（ＴａＫａＲａ製）２０ｎｇ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０および、加熱処理有りもしくは加熱処理無しのＢｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ製）８Ｕを含む２０μｌの反応液を調製した。反応は６０℃、1時間でＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ（商標登録）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ製）を用いて行った。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【００５１】
結果を図２に示す。Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔに関して、加熱処理した場合では増幅が起こっておらず、テンプレートのＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡのバンドのみが観測される。一方、改変型Ｔｔｈは加熱の有無に関係なく、良好な増幅を示していおり、熱安定性が非常に高いことがわかる。
以上のことから、熱安定性が高く、反応サイクルの熱によりほとんど失活しないことから、ＬＡＭＰ法での増幅量の増加が期待でき、精度および時間の短縮が見込める。
【００５２】
（実施例５）
ＲＴ−ＰＣＲ法による評価
実施例２で作製したＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（野生型）、Ｔｔｈ改変型ポリメラーゼ：Ｐ６８７Ｋ／Ｙ６８８Ｋ／Ｅ６８９Ｋの変異を有するＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ）を本実施例では使用し、ＲＮＡからの１ステップでのＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＴ−ＰＣＲにはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および２．５ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、インフルエンザウイルスＲＮＡを増幅する４ｐｍｏｌのプライマー（配列番号６及び７）、２ｐｍｏｌの検出プローブ（配列番号８）、０．６ｍｇのポリメラーゼ抗体、１Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液に精製したインフルエンザウイルスＲＮＡを１０５コピー、１０４コピー、１０３コピー、１０２コピー添加し、９０℃、３０秒の前反応の後、６０℃、１０分の逆転写反応、９５℃、６０秒での再度、前反応後、９５℃、１５秒→６０℃、４５秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＡＢＩ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
【００５３】
図３に、ＲＴ−ＰＣＲの増幅曲線、Ｃｔ値、ＰＣＲ効率をまとめた結果を示す。野生型のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼとＴｔｈ改変型ポリメラーゼを比較すると、Ｃｔ値はＴｔｈ改変型ポリメラーゼの方が明らかに小さい。これはＲＴの効率がＴｔｈ改変型ポリメラーゼの方が高いことを意味する。理論に束縛されることは望まないが、ＲＮＡは高次構造をとりやすいことが知られているため、高い鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼに改変することで、ＲＮＡの高次構造を壊しながらＲＴ反応をより効率的に実施できたことが推察された。
また、改変型ＤＮＡポリメラーゼ酵素量を１Ｕから２Ｕに変更した以外は前記と同様の方法でＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、２Ｕの場合でもＣｔ値の低下が認められ、ＲＴの効率が向上していることが確認された。
【００５４】
本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼの評価
上記の各実施例の結果に示されるように、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、高い鎖置換活性を示し、良好な伸長性を発揮し、尚且つ熱安定性にも優れることが確認された。本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼで確認された熱安定性は、実施例５に示すようなＲＴ−ＰＣＲの高温サイクルにも十分耐えるものであった。更に、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼをＲＴ−ＰＣＲに用いると、野生型のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼよりも高いＲＴ活性を示すことも確認された。
以上の通り、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、反応温度を高温側にシフトすることが可能になり、更には鎖置換反応時の失活を抑え増幅量の増加が期待でき、核酸増幅反応の精度及び時間の短縮が期待できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、等温での核酸増幅やＲＴ−ＰＣＲでの核酸増幅において有用な技術を提供しうるものである。遺伝子研究の分野から、医療、診断分野に至るまで幅広く適用されるものであり、今後の産業の発達に大きく寄与するできるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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