(57)【要約】【課題】煩雑な操作を必要とせず、標的ＲＮＡの濃度を高精度に定量することができるＲＮＡ濃度定量方法の提供。【解決手段】ＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量方法であって、粒子に固定化した特定の塩基配列を用いて標的ＲＮＡを捕捉する標的ＲＮＡ捕捉工程と、前記標的ＲＮＡを前記粒子に捕捉したまま一本鎖ｃＤＮＡを合成する一本鎖ｃＤＮＡ合成工程と、前記一本鎖ｃＤＮＡの特定の塩基配列に対してＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行うＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応工程と、前記粒子、及び前記ＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応による前記粒子上の反応産物を光学的に検出する光学的検出工程と、前記光学的検出工程における検出結果に基づいて、粒子数及び前記粒子上の前記反応産物の有無を計数する反応産物計数工程と、を一連の工程で行うＲＮＡ濃度定量方法である。【選択図】図１１
2019024453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量方法であって、
粒子に固定化した特定の塩基配列を用いて標的ＲＮＡを捕捉する標的ＲＮＡ捕捉工程と、
前記標的ＲＮＡを前記粒子に捕捉したまま一本鎖ｃＤＮＡを合成する一本鎖ｃＤＮＡ合成工程と、
前記一本鎖ｃＤＮＡの特定の塩基配列に対してＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行うＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応工程と、
前記粒子、及び前記ＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応による前記粒子上の反応産物を光学的に検出する光学的検出工程と、
前記光学的検出工程における検出結果に基づいて、粒子数及び前記粒子上の前記反応産物の有無を計数する反応産物計数工程と、を一連の工程で行うことを特徴とするＲＮＡ濃度定量方法。
【請求項２】
前記粒子が、磁気ビーズである請求項１に記載のＲＮＡ濃度定量方法。
【請求項３】
前記粒子が、金被覆粒子である請求項１から２のいずれかに記載のＲＮＡ濃度定量方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応工程における前記ＤＮＡ増幅反応が、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法である請求項１から３のいずれかに記載のＲＮＡ濃度定量方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応工程における前記ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応が、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ法である請求項１から４のいずれかに記載のＲＮＡ濃度定量方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のＲＮＡ濃度定量方法を用いてＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量用デバイスであって、
ＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応試薬を貯蔵する貯蔵領域と、
前記粒子に前記標的ＲＮＡを捕捉する標的ＲＮＡ捕捉領域と、
前記標的ＲＮＡを前記粒子に捕捉したまま一本鎖ｃＤＮＡを合成する一本鎖ｃＤＮＡ合成領域と、
前記一本鎖ｃＤＮＡの特定の塩基配列に対してＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行うＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応領域と、
前記粒子、及び前記ＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応による前記粒子上の反応産物を光学的に検出するための光学的検出領域と、
全ての反応後の溶液を溜める廃液貯蔵領域と、を有することを特徴とするＲＮＡ濃度定量用デバイス。
【請求項７】
請求項６に記載のＲＮＡ濃度定量用デバイスを用いてＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量用装置であって、
前記粒子を撹拌する撹拌機構と、
前記デバイス上の少なくともＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応手段の温度を制御する温度調節機構と、
前記粒子、及び前記ＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応による前記粒子上の前記反応産物を光学的に検出する、少なくとも光源及び受光素子を有する光学的検出機構と、を備えることを特徴とするＲＮＡ濃度定量用装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ濃度定量方法、ＲＮＡ濃度定量用デバイス、及びＲＮＡ濃度定量用装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の活動において必要とされるタンパク質の生産が起こる際は、まず設計図に相当するゲノムＤＮＡから、目的の遺伝子の部分配列についてｍＲＮＡが転写及び合成される。
【０００３】
ある生物由来試料において、どの遺伝子が発現しているかを確認するには、転写産物であるｍＲＮＡを含むｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出及び精製し、分析することにより推定することが可能である。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、「ＰＣＲ」とも称することがある）を用いた特異的核酸配列の検出及び定量は、核酸の分析技術の大きな発展に寄与している。
第３世代のＰＣＲと呼ばれるデジタルＰＣＲでは、標的核酸の濃度の絶対定量が可能となっている。デジタルＰＣＲは、標的核酸が含まれる試料溶液を希釈して微小区画に分割し、微小区画内にてＰＣＲ増幅を行う。このとき、微小区画内には標的核酸が１分子入る又は１分子も入らない条件とすることにより、標的核酸を含む微小区画では増幅シグナルがポジティブとなり、標的核酸を含まない微小区画では増幅シグナルがネガティブとなる。この増幅シグナルがポジティブである微小区画の数と増幅シグナルがネガティブである微小区画の数を直接計数することにより、試料溶液中に含まれる標的核酸の濃度を定量することができる。
【０００５】
また、１細胞中又は少数細胞中の遺伝子発現を網羅的かつ精密に解析するための試料調整方法を提供するために、細胞中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを増幅する方法であって、（１）第１鎖ｃＤＮＡを合成する工程、（２）反応試薬を除去する工程、（３）ポリヌクレオチド配列を付加する工程、（４）第２鎖ｃＤＮＡを合成する工程、（５）ＤＮＡ増幅反応を行う工程を含む方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
さらに、単一細胞の遺伝子発現を好適に定量解析するために、単一細胞を採取する工程と、細胞溶解工程と、ＤＮＡ分解工程と、ｍＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）にハイブリダイズさせる工程と、単一細胞由来ｃＤＮＡ固定化担体ライブラリーを作製する工程と、増幅反応を行いながらその増幅量を検出する工程を有する核酸検出方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、煩雑な操作を必要とせず、標的ＲＮＡの濃度を高精度に定量することができるＲＮＡ濃度定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するための手段としての本発明のＲＮＡ濃度定量方法は、ＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量方法であって、粒子に固定化した特定の塩基配列を用いて標的ＲＮＡを捕捉する標的ＲＮＡ捕捉工程と、前記標的ＲＮＡを前記粒子に捕捉したまま一本鎖ｃＤＮＡを合成する一本鎖ｃＤＮＡ合成工程と、前記一本鎖ｃＤＮＡの特定の塩基配列に対してＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行うＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応工程と、前記粒子、及び前記ＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応による前記粒子上の反応産物を光学的に検出する光学的検出工程と、前記光学的検出工程における検出結果に基づいて、粒子数及び前記粒子上の前記反応産物の有無を計数する反応産物計数工程と、を一連の工程で行う。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、煩雑な操作を必要とせず、標的ＲＮＡの濃度を高精度に定量することができるＲＮＡ濃度定量方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明のＲＮＡ濃度定量方法のフローを示す図である。
【図２】図２は、オリゴ（ｄＴ）が修飾された磁気ビーズの一例を示す模式図である。
【図３】図３は、ｍＲＮＡのポリＡ配列がオリゴ（ｄＴ）とハイブリダイズして磁気ビーズに捕捉された状態の一例を示す模式図である。
【図４】図４は、一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程の一例を示す模式図である。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法の一例を示す模式図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法の一例を示す模式図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法の一例を示す模式図である。
【図６Ａ】図６Ａは、複数のプライマーを用いたＲｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎの一例を示す模式図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、複数のプライマーを用いたＲｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎの一例を示す模式図である。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法の一例を示す模式図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法の一例を示す模式図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法の一例を示す模式図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法の一例を示す模式図である。
【図８】図８は、粒子の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した画像の一例を示す写真である。
【図９】図９は、粒子における反応シグナルの輝度値情報の一例を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ポアソン分布に基づいて、ｍＲＮＡの捕捉数を確率計算した一例を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明のＲＮＡ濃度定量方法を用いてＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量用デバイス及びＲＮＡ濃度定量用装置の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（ＲＮＡ濃度定量方法）
本発明のＲＮＡ濃度定量方法は、ＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量方法であって、粒子に固定化した特定の塩基配列を用いて標的ＲＮＡを捕捉する標的ＲＮＡ捕捉工程と、前記標的ＲＮＡを前記粒子に捕捉したまま一本鎖ｃＤＮＡを合成する一本鎖ｃＤＮＡ合成工程と、前記一本鎖ｃＤＮＡの特定の塩基配列に対してＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行うＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応工程と、前記粒子、及び前記ＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応による前記粒子上の反応産物を光学的に検出する光学的検出工程と、前記光学的検出工程における検出結果に基づいて、粒子数及び前記粒子上の前記反応産物の有無を計数する反応産物計数工程と、を一連の工程で連続して行い、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００１２】
第１世代のＰＣＲは、アガロースゲル電気泳動によるエンドポイント分析を行って定性的結果を得ることができる。第２世代のリアルタイムＰＣＲは、蛍光プローブを用いて各サイクル後の増幅の進行をモニターすることができ、ＰＣＲのサイクル数から初期核酸濃度を推定することができる。しかし、リアルタイムＰＣＲでは、未知の濃度を推定するためには、内在性コントロールや外部コントロールと比較して検量線を作成し、コントロールとの相対値で濃度を定量するため、核酸配列毎の増幅効率のバイアスによって定量の精度が制限される。
【００１３】
そこで、デジタルＰＣＲは、検量線を必要としない高感度で高精度な分析手法として、低濃度試料の定量や、遺伝子間での発現量の比較、レアバリアント解析などで活用されている。さらに、ＰＣＲだけでなく、微小区画の中で等温増幅を行うデジタル等温増幅技術も開発されている。
【００１４】
しかし、従来のデジタルＰＣＲやデジタル等温増幅などのデジタル核酸分析法は、（１）生体組織や血液などの試料からの標的核酸の抽出及び精製、（２）標的核酸を含む試料溶液の微小区画化、（３）核酸の増幅、及び（４）増幅シグナルの検出の４つの基本要素によって成り立つ。現在上市されているデジタルＰＣＲの装置では、これらの４つの基本要素は、別々のプラットフォームによって実施されている。具体的には、（１）試料からの標的核酸の抽出作業を行い、その後、（２）デバイスや装置を用いて試料溶液の微小区画化を実施し、（３）微小区画化された試料溶液をサーマルサイクラーに移してＰＣＲ増幅を行い、最後に、（４）増幅シグナル読取り装置に増幅産物の入ったデバイスを移動し、増幅シグナルを読み取るという工程を含む。つまり、従来のデジタル核酸分析法では、デジタルＰＣＲで標的核酸の濃度を定量するために、各工程に対して別々の装置の使用とそれに伴うハンドリングが必要となり、半日近い作業時間を要してしまうという問題があるという知見に基づくものである。
【００１５】
ここで、従来のＰＣＲやリアルタイムＰＣＲでは、試料からの標的核酸の抽出作業では、磁気ビーズを用いてＲＮＡを捕捉し、ｃＤＮＡ合成をして増幅反応の準備をする方法が知られている。例えば、オリゴ（ｄＴ）が修飾された磁気ビーズにてｍＲＮＡを捕捉し、洗浄、及び精製をした後に逆転写酵素によって、磁気ビーズ上でｃＤＮＡ合成を行う方法や、さらに、磁気ビーズ上に固定されたｃＤＮＡについて増幅反応を行う方法が報告されている。このように、第１世代のＰＣＲや第２世代のリアルタイムＰＣＲをプラットフォームとした場合は、標的核酸の抽出と増幅反応の２工程で行うことにより煩雑さを減らす技術の開発がされている。
しかし、第３世代のデジタルＰＣＲに関して、一連の工程を連続で行い、ハンドリングや総分析時間を省略する方法は提案されていない。
その理由として、デジタルＰＣＲでは、サンプル溶液の微小区画化が必要なためであると考えられる。微小区画化は、主に、マイクロ流路でＷａｔｅｒ  ｉｎ  Ｏｉｌドロップレットを作成する方法、及びマイクロナノサイズのウェルを利用する方法がある。
【００１６】
マイクロ流路でドロップレットを作成する場合、フローフォーカス型の流路や、Ｔジャンクション型の流路を用いて、流体のせん断速度にてドロップレットを生成する。しかし、液滴生成部分は微細な構造であり、磁気ビーズ等の固体粒子やゴミが詰まることによりドロップレットが作成できないといった問題が発生する。また、ドロップレットは、振動や急激な温度変化によって融合してしまい、増幅シグナルの読取り時には初期の液滴量の５割程度まで減少してしまうという問題がある。また、マイクロナノウェルを利用する微小区画化では、ウェルの中にサンプル溶液を充てんする際に気泡が入って増幅反応へと移行できず、デバイスと検体をロスしてしまうという問題がある。
このように、微小区画化工程にデジタル核酸分析の技術的問題が存在し、各工程を一連の工程で連続して同一プラットフォームで実施するための障壁にもなっている。そのため、本発明のＲＮＡ濃度定量方法は、従来のデジタル核酸分析用のシステムでは、デジタル核酸分析における微小区画化の煩雑さと工程の一元化が困難であるという問題があるという知見に基づき、微小区画化を不要としたＲＮＡ濃度定量方法及びＲＮＡ濃度定量装置を提案するものである。
【００１７】
本発明のＲＮＡ濃度定量方法を、図１を参照して説明する。
図１は、本発明のＲＮＡ濃度定量方法のフローを示す図である。まず、生体試料を採取し、ＲＮａｓｅの不活化処理を行った上で、細胞を破壊し、特定の塩基配列（ＲＮＡ捕捉用の核酸プローブ）が修飾された粒子を用いて標的ＲＮＡの捕捉を行う（工程１）。続いて、必要に応じて、ＲＮＡを捕捉している粒子を洗浄液で洗浄し、粒子に付着している破壊された細胞や核酸断片を取り除く精製工程を行う（工程１−１）。適切に洗浄されたＲＮＡを捕捉している粒子を逆転写反応試薬と混合し、一本鎖ｃＤＮＡ合成を行う（工程２）。合成された一本鎖ｃＤＮＡは、粒子に修飾された核酸プローブにより、粒子上に捕捉された状態を維持し、一本鎖ｃＤＮＡの特定の塩基配列と相補的に結合するプライマー乃至核酸プローブを用いてＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行うことにより、粒子上にて蛍光標識されながら反応産物が増える（工程３）。反応産物が捕捉された粒子と、核酸が何も捕捉されていない粒子に対し、適切な光を照射して観察し、粒子による散乱光（ネガティブシグナル）、及びＤＮＡの蛍光標識からの蛍光（ポジティブシグナル）を検出し、それぞれの数量を光学的に検出する（工程４）。工程４で検出されたネガティブシグナル（反応シグナルがネガティブ）の数及びポジティブシグナル（反応シグナルがポジティブ）の数の結果に基づいて、ポアソン分布から粒子に捕捉されたＲＮＡの有無を計数する（工程５）。これにより、ＲＮＡ濃度を定量することができる。
【００１８】
本発明のＲＮＡ濃度定量方法によれば、粒子に修飾された核酸プローブにより標的ＲＮＡを捕捉して一本鎖ｃＤＮＡ合成を行うことにより、核酸プローブを含む一本鎖ｃＤＮＡを粒子上に捕捉することができる。また、粒子状に捕捉された一本鎖ｃＤＮＡの一部と相補的に結合するプライマー又はプローブを用いることにより、ｃＤＮＡを包含した反応産物が生成され、粒子上に反応産物が固定化された状態となるため、粒子を微小区画とみなすことが可能となる。また、粒子ごとに反応及び検出を行うことができる。これらの構成により、従来のデジタル核酸分析法で用いていた微小区画化が不要となり、ＲＮＡの濃度の定量を一元化された工程（連続した工程）にて実施することが可能となる。
連続とは、各工程を途切れることなく、一連の流れで行うことを意味する。
【００１９】
本発明による一つの例として、ｍＲＮＡの濃度の定量を挙げることができる。サンプル中に含まれるｍＲＮＡの濃度を定量する場合の実施形態を以下に示す。
【００２０】
＜標的ＲＮＡ捕捉工程＞
標的ＲＮＡ捕捉工程は、粒子に固定化した特定の塩基配列を用いて標的ＲＮＡを捕捉する工程である。
標的ＲＮＡとは、検出することを目的としているＲＮＡを意味する。
【００２１】
生体試料は、動物、植物、及び微生物等の細胞、並びに組織等のＲＮＡを含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
生体試料から細胞等を採取する方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜、公知の方法を選択することができ、例えば、培養細胞をトリプシンで処理することにより細胞を剥離及び浮遊させ、トリプシンを失活させた後、細胞懸濁液を遠心して上清を除去し、得られた細胞塊を緩衝液に懸濁し、血球計算板等を用いて細胞数をカウントしながら５００細胞／ｍＬ程度に希釈し、顕微鏡下、ピペットを用いて細胞希釈液の液滴から細胞を吸引してチューブに吐出する。ＲＮＡ分解を回避するため、採取した細胞は低温に維持することが好ましい。
【００２２】
細胞の細胞膜を溶解して細胞中のＲＮＡを抽出する方法は、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ等のタンパク質分解酵素；チオシアン酸グアニジン、グアニジン塩酸等のカオトロピック塩；Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳ等の界面活性剤などを用いることができる。
次に、抽出された核酸のうち、ＤＮＡを、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）により分解する。これにより、生体試料に含まれるゲノムＤＮＡを分解することができ、核酸としてＲＮＡのみを含む試料を得ることができる。具体的には、生体試料にＤＮａｓｅ  Ｉ等を加えてインキュベートし、反応後速やかにＥＤＴＡを添加して加熱することにより、ＤＮａｓｅ  Ｉを失活させることができる。
さらに、ＲＮａｓｅの不活化処理を行うことが好ましい。
ＲＮａｓｅの不活化処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販品を使用することができる。
【００２３】
生体試料の血球細胞中のＲＮＡを採取する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜、公知の方法を選択することができ、例えば、市販品を使用することができるが、採血直後に血球細胞内ＲＮＡの安定化が可能な試薬と血液とを混合し、ＲＮＡの安定化を行った後にＲＮＡ抽出キットを用いることが好ましい。
また、細胞内のＲＮＡの安定化することが可能な試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡ採血管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）、ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｈｉｅｌｄ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）などが挙げられる。
【００２４】
特定の塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、オリゴ（ｄＴ）などが挙げられる。
粒子としては、例えば、図２に示すように、オリゴ（ｄＴ）２２が修飾された磁気ビーズ２１などが挙げられる。磁気ビーズ以外にも、例えば、標的とするｍＲＮＡの一部の塩基配列が修飾された粒子も用いることができる。ｍＲＮＡの３’末端は、ポリアデニル化されていることから、その表面に複数のオリゴ（ｄＴ）２２が修飾された磁気ビーズ２１は、試料中に含まれるＲＮＡの中からｍＲＮＡを選択的に捕捉することができる。
粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、単分散の粒子が好ましい。
【００２５】
標的とするｍＲＮＡの一部の塩基配列が修飾された粒子としては、標的とするｍＲＮＡの一部の塩基配列が修飾されていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラス等のガラス材料；ポリエステル樹脂、ポリスチレン、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ  Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ  Ｓｔｙｒｅｎｅ樹脂）、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等のプラスチック；アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、ニトロセルロース、キチン、キトサンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。さらに、粒子として磁化された、又は磁性体を内包した、或いは磁化可能な磁気ビーズを用いることによって、分離処理等について、自動化、効率化、又は迅速化することができる。
【００２６】
図３は、ｍＲＮＡのポリＡ配列がオリゴ（ｄＴ）とハイブリダイズして磁気ビーズに捕捉された状態の一例を示す模式図である。図３に示すように、標的核酸配列であるＡ、Ｂ、及びＣが含まれたｍＲＮＡ（符号：２３）のポリＡ配列が、オリゴ（ｄＴ）２２とハイブリダイズして磁気ビーズ２１に捕捉される。
【００２７】
粒子と標的ｍＲＮＡとの濃度としては、一つの粒子に対して、ｍＲＮＡが一分子又はゼロとなるような割合が好ましく、粒子がｍＲＮＡのコピー数の０．５倍から３倍程度になるように調製することが好ましい。
【００２８】
オリゴ（ｄＴ）を粒子に固定化する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、共有結合、イオン結合、物理吸着、生物学的結合（例えば、ビオチンと、アビジン又はストレプトアビジンとの結合、抗原と抗体との結合等）によって固定化する方法などが挙げられる。
オリゴ（ｄＴ）としては、スペーサー配列、例えば、１個〜１０個の炭素原子を含む炭化水素基を介して、粒子に固定してもよい。
【００２９】
共有結合を介したオリゴ（ｄＴ）の粒子への固定化としては、例えば、オリゴ（ｄＴ）に官能基を導入し、かつ官能基と反応性を有する官能基を粒子表面に導入して両者を反応させることにより実施することができる。例えば、オリゴ（ｄＴ）にアミノ基を導入し、粒子に活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基又はイソシアネート基を導入することにより共有結合を形成できる。
また、オリゴ（ｄＴ）にメルカプト基を導入し、粒子に活性エステル基、マレイミド基又はジスルフィド基を導入してもよい。
活性エステル基としては、例えば、ｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド基などが挙げられる。
【００３０】
官能基を粒子の表面に導入する方法としては、例えば、所定の官能基を有するシランカップリング剤によって粒子を処理する方法などが挙げられる。
シランカップリング剤としては、例えば、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−β−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランなどが挙げられる。
【００３１】
結合部位となる官能基を粒子に導入する別の方法としては、プラズマ処理などが挙げられる。このようなプラズマ処理により、固相の表面に、水酸基やアミノ基等の官能基を導入することができる。プラズマ処理は、当業者には既知の装置を用いて行うことができる。
【００３２】
物理吸着によってオリゴ（ｄＴ）を粒子に固定する方法としては、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン等）により表面処理した粒子に、オリゴ（ｄＴ）の荷電を利用して静電結合させる方法などが挙げられる。
【００３３】
粒子に対する固定されたオリゴ（ｄＴ）の含有量としては、１０１２分子以上であることが好ましい。
粒子の平均径としては、５０μｍ以下が好ましい。
オリゴ（ｄＴ）を固定化して細胞由来のｍＲＮＡをハイブリダイズさせる粒子の総表面積としては、０．１ｃｍ２以上、及び溶液中における粒子の占有体積率としては、１％以下であることが好ましい。
粒子の好適な数としては、粒子に固定されたオリゴ（ｄＴ）数及び粒子の径によって適宜選択することができるが、オリゴ（ｄＴ）固定量が、５×１０１２分子／ｃｍ２の条件の際、粒子の平均径が１．０μｍである場合は、粒子の数は１０７〜１０８が好ましく、粒子の平均径が２．８μｍである場合は、１０６〜１０７が好ましい。
【００３４】
オリゴ（ｄＴ）が固定された粒子にｍＲＮＡをハイブリダイズさせる反応としては、オリゴ（ｄＴ）固定化粒子とポリＡ配列を有するｍＲＮＡを含む試料とを緩衝液中でインキュベーションすることにより実施できる。
ハイブリダイゼーションのためのインキュベーションとしては、温度７０℃で５分間程度穏やかな撹拌下で行い、その後、０．１℃／秒間程度でゆっくりと室温（２３℃）にまで温度を低下させることが好ましい。
緩衝液としては、ＲＮａｓｅ活性が極力除去された緩衝液が好ましい。また、インキュベーション後、試料中の担体非結合成分を洗浄及び除去することが好ましい。
【００３５】
＜精製工程＞
精製工程は、ＲＮＡを捕捉している粒子を洗浄液で洗浄し、粒子に付着している破壊された細胞や核酸断片を取り除く工程である。
【００３６】
洗浄液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、緩衝液、タンパク質変性剤、核酸分解酵素の不活化としてのキレート剤を含むことが好ましい。
前記緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、マッキルベイン緩衝液などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記タンパク質変性剤としては、例えば、尿素、塩酸グアニジン、界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
キレート剤としては、例えば、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＧＬＤＡ、ＨＥＤＴＡ、ＧＥＤＴＡ、ＴＴＨＡ、ＨＩＤＡ、ＤＨＥＧなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３７】
精製工程としては、磁界の印加と除去を繰り返すことにより磁気ビーズを撹拌する方法、緩やかな加振によりビーズを撹拌する方法を用いることが好ましい。精製工程において、撹拌することにより、洗浄効率を上げることができる。
【００３８】
＜一本鎖ｃＤＮＡ合成工程＞
一本鎖ｃＤＮＡ合成工程は、標的ＲＮＡを粒子に捕捉したまま一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程である。
【００３９】
図４は、一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程の一例を示す模式図である。図４に示すように、粒子２１上に捕捉されたｍＲＮＡ（２３）を鋳型として、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとして用いて逆転写反応を行い、標的核酸配列Ａ、Ｂ、及びＣの相補鎖配列ａ、ｂ、及びｃを含むｃＤＮＡ（符号：２４）を合成する。このｃＤＮＡは、粒子２１に修飾されたオリゴ（ｄＴ）を塩基配列の一部としており、オリゴ（ｄＴ）を粒子から外す反応を実施しない限り、ｃＤＮＡは粒子２１上に捕捉された状態となる。
【００４０】
＜ＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応工程＞
ＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応工程は、一本鎖ｃＤＮＡの特定の塩基配列に対してＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行う工程である。
【００４１】
ＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応工程としては、一本鎖ｃＤＮＡ合成工程において粒子上に合成されたｃＤＮＡの特定の塩基配列と相補的に結合するプライマー乃至核酸プローブを用いてＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行い、さらに、反応産物に対してもＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行う。本発明では、粒子上に捕捉されたｍＲＮＡの数量を計数するため、ｃＤＮＡを包含した反応産物が生成されることが好ましい。
【００４２】
ｃＤＮＡを包含して反応産物が生成される反応としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（以下、「ＲＣＡ」とも称することがある）法や、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＨＣＲ」とも称することがある）法などが挙げられる。ＨＣＲは、酵素反応を用いずに標的分子の分子量を増加させる高分子合成反応である。
【００４３】
図５Ａ〜図５Ｃは、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法の一例を示す模式図である。
図５Ａ〜図５Ｃに、環状プローブを用いたＲＣＡにおいて、ｃＤＮＡの標的核酸配列の一部と相補的な核酸配列を有する環状プローブ２５を示す。環状プローブ２５はＰａｄｌｏｃｋ  ｐｒｏｂｅであってもよく、例として、図中の配列Ａの真ん中付近から両側の塩基配列をそれぞれ両末端に持つＰａｄｌｏｃｋ  ｐｒｏｂｅであってもよい。環状プローブ２５は、ｃＤＮＡのａ配列にハイブリダイズした後、ライゲーションで環状プローブとすることができる。プライマー２６は、ｃＤＮＡの配列ｃとの相補的な配列Ｃを持ち、環状プローブ２５のＤに相補的な配列ｄを持つように設計された塩基配列を用いることができる。適切な温度でｍＲＮＡを乖離させた後に、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素が反応する適切な温度でインキュベートすれば、プライマー２６によってｃＤＮＡに繋がったまま環状プローブに沿って環状プローブのコピー配列２７が連鎖的に合成される。
【００４４】
さらに、別の態様としては、粒子上に捕捉されたｍＲＮＡに対してＲＣＡでＤＮＡ増幅反応を行うことも可能である。しかし、ｍＲＮＡは、比較的不安定な性質を持つため、逆転写反応を行って生成されたｃＤＮＡに対して増幅反応を行うことが好ましい。
【００４５】
ＲＣＡによる増幅反応としては、複数のプライマーを用いることも可能である。図６Ａ及び図６Ｂは、複数のプライマーを用いたＲｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎの一例を示す模式図である。
【００４６】
図６Ａに、環状プローブ２５にアニーリングした、プライマー２６とは別のプライマー２８を示す。プライマー２６とプライマー２８の２本でＲＣＡを行うと、環状プローブ２５は、プライマー２６を基にした増幅産物２９でｃＤＮＡに繋がれたままとなり、さらにプライマー２８を基にした増幅産物３０が環状プローブ２５に沿って合成されていく。これにより、ｃＤＮＡに繋がった増幅産物量がおよそ２倍になって合成される。つまり、ｎ本のプライマーを用いてＲＣＡを行えば、ｎ倍の増幅産物が生成することが可能である。
このことを利用すれば、標的ｍＲＮＡの種類に合わせてプライマー数を変え、増幅産物からの蛍光強度を段階的に変化させることにより、複数種の標的ｍＲＮＡの濃度を一度に定量することが可能となる。
【００４７】
図７Ａ〜図７Ｄは、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法の一例を示す模式図である。
図７Ａ〜図７Ｄにおいて、ヘアピンプローブ３１、及び３２を用いて、適切な温度でインキュベートすることにより（図７Ａ）、ｃＤＮＡ（２４）とヘアピンプローブ３１とがハイブリダイズし（図７Ｂ）、ヘアピンプローブ３１に対して、ヘアピンプローブ３２がハイブリダイズする（図７Ｃ）。さらに、ヘアピンプローブ３５をハイブリダイズするように、この反応が次々に起こることにより、ｃＤＮＡに繋がる形で反応産物が形成されていく（図７Ｄ）。また、ヘアピンプローブは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎであってもよい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎがハイブリダイズすることにより、クエンチングが外れ、蛍光を発するようになる。
【００４８】
＜光学的検出工程＞
光学的検出工程は、粒子、及びＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応による粒子上の反応産物を光学的に検出する工程である。
【００４９】
光学的検出工程においては、反応産物が捕捉され、反応シグナルがポジティブ（ポジティブシグナル）である粒子、及び標的ＲＮＡを捕捉していない、反応シグナルがネガティブ（ネガティブシグナル）である粒子を光学的に検出する。これにより、粒子ごとの反応の有無を検出することができる。
【００５０】
光学的に検出するための光源としては、例えば、指向性が高いレーザー、ＬＥＤ、ハロゲンランプ、水銀灯等の光源などが挙げられる。これらの中でも、指向性が高いレーザーが好ましい。ＬＥＤ、ハロゲンランプ、水銀灯等の光源を用いる場合は、特定の周波数をカットするフィルターを光学系に組み込むことで利用が可能である。
【００５１】
散乱光及び蛍光の観察としては、蛍光顕微鏡、ＣＣＤカメラによる画像解析、光電子増倍管等の光センサによる電気信号等により検出することが可能である。
光学的検出については、粒子が凝集している場合、ＲＮＡ濃度定量用装置の撹拌機構（加振機構）１を用いてデバイス内にて緩やかに溶液を撹拌し、磁気ビーズを分散させる工程を含んでもよい。また、ＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応領域から光学的検出領域までの間にフローフォーカス型の流路を設けて、流体のせん断力によって凝集体を分散させる方法を用いることも可能である。
【００５２】
画像解析による光学的検出としては、粒子が磁気ビーズである場合は、例えば、光学的検出領域内にて発生させた磁場に磁気ビーズを引き付けて画像を撮影することができる。発生させる磁場は、複数の平行線、格子状、アレイ状などであってもよい。
光センサによる光学的検出としては、流路を流れる粒子を定点で観測する方法や、分散した粒子に対して光を照射して検出することが可能である。光センサからの電気信号を波形解析し、散乱光の信号と蛍光の信号を判別することが可能である。
【００５３】
図８は、粒子の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した画像の一例を示す写真である。反応産物が捕捉された直径２．８μｍの粒子である磁気ビーズを、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を含む溶液と混合して反応産物を蛍光標識し、５０７ｎｍ付近のバンドパスフィルタを通して蛍光観察した画像であり、磁気ビーズ周辺において１０μｍ程度にわたり蛍光が観察されている。
【００５４】
図９は、粒子における反応シグナルの輝度値情報の一例を示すグラフである。輝度値情報の算出としては、蛍光顕微鏡に付属の画像解析ソフトや、市販の画像解析ソフトなどを用いることができる。
図９では、ＲＮＡが捕捉された反応シグナルがポジティブである粒子と、ＲＮＡを捕捉していない反応シグナルがネガティブである粒子との、粒子の中心線付近を一次元でスキャンした輝度値情報をグラフで表している。粒子は、直径２．８μｍである。図９における実線は反応シグナルがポジティブである粒子から得た輝度、破線は反応シグナルがネガティブである粒子から得た輝度である。反応シグナルネガティブである粒子からは光の散乱光が検出されるため、反応シグナルがポジティブの輝度値に対して輝度増加の幅と高さとがどちらも小さい。このように、光学的な検出によって反応産物を捕捉している反応シグナルがポジティブである粒子と、捕捉していない反応シグナルがネガティブである粒子とを区別することが可能である。
【００５５】
また、光学的検出における他の態様として、金で被覆された粒子を用いることができる。金被覆された粒子を用いる場合、多数の反応産物分子が捕捉された反応シグナルがポジティブである粒子では表面増強ラマン散乱が起こり、反応シグナルがネガティブである粒子より強いシグナルが検出することが可能である。
被覆は、粒子の一部でもよく、粒子の全体でもよい。
【００５６】
＜反応産物計数工程＞
反応産物計数工程は、光学的検出工程における検出結果に基づいて、粒子数及び粒子上の反応産物の有無を計数する工程である。
【００５７】
粒子の個数Ｍに対するｍＲＮＡの数Ｎを０．０１、０．１、１、及び５とした時、粒子１個あたりにｍＲＮＡがいくつ捕捉されるかを、下記式（１）のポアソン分布に基づいて確率計算し、図示すると図１０のようになる。
【００５８】
【数１】
2019024453.tif 000003
【００５９】
図１０において、横軸は、粒子に捕捉されるＲＮＡの数が０の場合、１分子の場合、２分子以上の場合を表し、縦軸は、それぞれの確率を表している。
【００６０】
Ｎ／Ｍが０．０１の場合、つまり粒子がＲＮＡに対して１００倍多いときは、ＲＮＡを捕捉していない反応シグナルがネガティブである粒子が９９％、１分子のｍＲＮＡを捕捉する反応シグナルがポジティブである粒子が１％である。
Ｎ／Ｍが０．１の場合、ＲＮＡを捕捉していない反応シグナルがネガティブである粒子が９０．５％、１分子のｍＲＮＡを捕捉する反応シグナルがポジティブである粒子が９５％、２分子以上のｍＲＮＡを捕捉する反応シグナルがポジティブである粒子が０．５％である。
【００６１】
一方、Ｎ／Ｍが１以上の場合、一つの粒子上に複数のＲＮＡが捕捉される確率が高まっていくことがわかる。ポアソン分布に基づく確率計算により濃度を算出するため、ネガティブシグナルが少なくとも１回以上あらわれるような濃度比とする必要がある。
ここで、粒子上に捕捉されているＲＮＡの数が０．５倍から３程度の場合に確率計算における精度が高くなるため、統計計算による濃度算出の精度を上げるためにはＮ／Ｍの値が０．５から３の範囲内に調整することが好ましい。
このように、粒子の総量、ポジティブシグナルの総量、ネガティブシグナルの総量から、ポアソン分布に基づき統計計算を行うことにより初期のＲＮＡ濃度を定量することが可能である。
【００６２】
（ＲＮＡ濃度定量用デバイス、及びＲＮＡ濃度定量用装置）
本発明のＲＮＡ濃度定量用デバイスは、本発明のＲＮＡ濃度定量方法を用いてＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量用デバイスであって、ＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応試薬を貯蔵する貯蔵領域と、粒子に標的ＲＮＡを捕捉する標的ＲＮＡ捕捉領域と、標的ＲＮＡを前記粒子に捕捉したまま一本鎖ｃＤＮＡを合成する一本鎖ｃＤＮＡ合成領域と、ＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行うＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応領域と、粒子、及びＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応による粒子上の反応産物を光学的に検出するための光学的検出領域と、全ての反応後の溶液を溜める廃液貯蔵領域と、を有し、更に必要に応じてその他の領域を有する。
本発明のＲＮＡ濃度定量用装置は、本発明のＲＮＡ濃度定量用デバイスを用いてＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量用装置であって、粒子を撹拌する撹拌機構（加振機構）と、デバイス上の少なくともＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応手段の温度を制御する温度調節機構と、粒子、及びＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応による粒子上の反応産物を光学的に検出する、少なくとも光源及び受光素子を有する光学的検出機構と、を備え、更に必要に応じてその他の機構を備える。
【００６３】
本発明のＲＮＡ濃度定量方法における標的ＲＮＡ捕捉工程以降の工程は、例えば、マイクロ流路によって繋がれた反応領域内で実施することができ、一つの装置と一つのＲＮＡ濃度定量用デバイス（カートリッジ）を用いて実施することができる。
【００６４】
図１１を用いて、本発明のＲＮＡ濃度定量用デバイス及びＲＮＡ濃度定量用装置を説明する。
【００６５】
図１１は、本発明のＲＮＡ濃度定量方法を用いてＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量用デバイス及びＲＮＡ濃度定量用装置の一例を示す模式図である。
ＲＮＡ濃度定量用装置１８は、撹拌機構（加振機構）１、温度調節機構２、光学的検出機構３、及びＲＮＡ濃度定量用デバイス１１を装填する装填部（図示せず）を有する。ＲＮＡ濃度定量用装置１８は、装填部にＲＮＡ濃度定量用デバイス１１が装填されると、各工程を自動で行う。
ＲＮＡ濃度定量用デバイス１１は、ＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応試薬を貯蔵する貯蔵領域１０、標的ＲＮＡ捕捉工程の標的ＲＮＡを捕捉するための標的ＲＮＡ捕捉領域１２、ＲＮＡを捕捉している粒子を洗浄液で洗浄し、付着しているタンパク質や核酸断片を取り除いて精製を行うＲＮＡ精製領域１３を有しており、図１１に示すように、連通路を介して接続されている。連通路は、適宜必要に応じて、外部駆動力により、流れを切り替えて粒子及びＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応試薬等を逆に移動させたり、せき止めたりしてもよい。
ＲＮＡ捕捉領域１２では、撹拌機構（加振機構）１によって、粒子とＲＮＡと反応液とが撹拌される。
なお、撹拌機構（加振機構）１としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜、公知の機構を選択することができ、例えば、ＲＮＡ捕捉領域１２を加振させることにより、ＲＮＡ捕捉領域１２内の液体、粒子、ＲＮＡなどを撹拌させる構成としてもよい。
【００６６】
標的ＲＮＡ捕捉領域１２では、粒子上の核酸プローブによってＲＮＡが捕捉され、続いてＲＮＡ精製領域１３では、洗浄液によって粒子上に捕捉されたＲＮＡが精製される。ＲＮＡ精製領域１３の下流側には一本鎖ｃＤＮＡ合成領域１４が設けられている。この一本鎖ｃＤＮＡ合成領域１４は、温度調節機構２により、適切な温度に制御され、逆転写酵素により標的ＲＮＡを前記粒子に捕捉したまま一本鎖ｃＤＮＡを合成する領域である。
一本鎖ｃＤＮＡ合成領域１４で適切な温度に制御されたＲＮＡに対してＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行うＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応領域１５上にてｃＤＮＡと相補的に結合させる反応が実施され、蛍光標識された反応産物が粒子上に捕捉される。
なお、一本鎖ｃＤＮＡ合成領域１４とＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応領域１５の領域は同一の領域であってもよい。
最後に、光学的検出機構３により、光学的検出領域１６にて粒子からの散乱光と、粒子上に捕捉された反応産物からの蛍光が検出され、それぞれの総量が計数される。その後、全ての反応液は、廃液貯蔵領域１１に回収される。
なお、ＲＮＡを定量するためのＲＮＡ濃度定量用デバイス（カートリッジ）１１は、試料間のコンタミネーションを避けるため、使い捨てであることが好ましい。
温度調節機構及び光学的検出機構としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜、公知の機構を選択することができる。
【００６７】
各領域における粒子の移動は、例えば、ＲＮＡ濃度定量用装置に設けられる磁力を発するプローブ（図示せず）を用いることができる。また、別の態様としては、シリンジや圧力制御されたポンプなどを用いた送液機構や、遠心力による送液機構、毛管力による送液機構を用いることができる。
【００６８】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  ＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量方法であって、
粒子に固定化した特定の塩基配列を用いて標的ＲＮＡを捕捉する標的ＲＮＡ捕捉工程と、
前記標的ＲＮＡを前記粒子に捕捉したまま一本鎖ｃＤＮＡを合成する一本鎖ｃＤＮＡ合成工程と、
前記一本鎖ｃＤＮＡの特定の塩基配列に対してＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行うＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応工程と、
前記粒子、及び前記ＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応による前記粒子上の反応産物を光学的に検出する光学的検出工程と、
前記光学的検出工程における検出結果に基づいて、粒子数及び前記粒子上の前記反応産物の有無を計数する反応産物計数工程と、を一連の工程で行うことを特徴とするＲＮＡ濃度定量方法である。
＜２＞  前記粒子が、磁気ビーズである前記＜１＞に記載のＲＮＡ濃度定量方法である。
＜３＞  前記粒子が、金被覆粒子である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＲＮＡ濃度定量方法である。
＜４＞  前記ＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応工程における前記ＤＮＡ増幅反応が、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のＲＮＡ濃度定量方法である。
＜５＞  前記ＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応工程における前記ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応が、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ法である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＲＮＡ濃度定量方法である。
＜６＞  前記標的ＲＮＡ捕捉工程が、ＲＮａｓｅの不活化処理を含む前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のＲＮＡ濃度定量方法である。
＜７＞  前記標的ＲＮＡ捕捉工程後、前記一本鎖ｃＤＮＡ合成工程前に、細胞や核酸断片を取り除く精製工程をさらに含む前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のＲＮＡ濃度定量方法である。
＜８＞  前記光学的検出工程における光学的に検出するための光源が、レーザー、ＬＥＤ、ハロゲンランプ、及び水銀灯のいずれかである前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載のＲＮＡ濃度定量方法である。
＜９＞  前記光源が、レーザーである前記＜８＞に記載のＲＮＡ濃度定量方法である。
＜１０＞  前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載のＲＮＡ濃度定量方法を用いてＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量用デバイスであって、
ＤＮＡ乃至高分子合成反応試薬を貯蔵する貯蔵領域と、
前記粒子に前記標的ＲＮＡを捕捉する標的ＲＮＡ捕捉領域と、
前記標的ＲＮＡを前記粒子に捕捉したまま一本鎖ｃＤＮＡを合成する一本鎖ｃＤＮＡ合成領域と、
前記一本鎖ｃＤＮＡの特定の塩基配列に対してＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応を行うＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応領域と、
前記粒子、及び前記ＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応による前記粒子上の反応産物を光学的に検出するための光学的検出領域と、
全ての反応後の溶液を溜める廃液貯蔵領域と、を有することを特徴とするＲＮＡ濃度定量用デバイスである。
＜１１＞  前記＜１０＞に記載のＲＮＡ濃度定量用デバイスを用いてＲＮＡの濃度を定量するＲＮＡ濃度定量用装置であって、
前記粒子を撹拌する撹拌機構と、
前記デバイス上の少なくともＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応手段の温度を制御する温度調節機構と、
前記粒子、及び前記ＤＮＡ増幅反応乃至ハイブリダイゼーションによる高分子合成反応による前記粒子上の前記反応産物を光学的に検出する、少なくとも光源及び受光素子を有する温度調節機構と、を備えることを特徴とするＲＮＡ濃度定量用装置である。
【００６９】
前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載のＲＮＡ濃度定量方法、前記＜１０＞に記載のＲＮＡ濃度定量用デバイス、及び前記＜１１＞に記載のＲＮＡ濃度定量用装置は、前記本発明の目的を達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００７０】
【特許文献１】特許第５９０６３０６号公報
【特許文献２】特許第５０７３９６７号公報
【符号の説明】
【００７１】
１      撹拌機構（加振機構）
２      温度調節機構
３      光学的検出機構
１０      貯蔵領域
１１      ＲＮＡ濃度定量用デバイス（カートリッジ）
１２      標的ＲＮＡ捕捉領域
１４      一本鎖ｃＤＮＡ合成領域
１５      ＤＮＡ増幅反応乃至高分子合成反応領域
１６      光学的検出領域
１７      廃液貯蔵領域
１８      ＲＮＡ濃度定量用装置
２１      粒子（磁気ビーズ）
２６、２８      プライマー
２９、３０      反応産物（又は増幅産物）
【図１】
2019024453.tif 000004
【図２】
2019024453.tif 000005
【図３】
2019024453.tif 000006
【図４】
2019024453.tif 000007
【図５Ａ】
2019024453.tif 000008
【図５Ｂ】
2019024453.tif 000009
【図５Ｃ】
2019024453.tif 000010
【図６Ａ】
2019024453.tif 000011
【図６Ｂ】
2019024453.tif 000012
【図７Ａ】
2019024453.tif 000013
【図７Ｂ】
2019024453.tif 000014
【図７Ｃ】
2019024453.tif 000015
【図７Ｄ】
2019024453.tif 000016
【図８】
2019024453.tif 000017
【図９】
2019024453.tif 000018
【図１０】
2019024453.tif 000019
【図１１】
2019024453.tif 000020