(57)【要約】【課題】簡便かつ温和な条件でＧｒｏＥＬの集合及び離散状態ならびに集合状態の形状を制御する手段の提供。【解決手段】５ｍＭ以上の濃度のＡＴＰを含むＡＴＰ含有液中で、重合していないＧｒｏＥＬとＡＴＰとを接触させることにより、複数の前記ＧｒｏＥＬどうしが重合してなるチューブ状の複合体を形成せしめる。これにより、複数のＧｒｏＥＬどうしが重合してなるチューブ状の複合体と、５ｍＭ以上の濃度のＡＴＰとを含む、ＧｒｏＥＬ含有液を得ることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＧｒｏＥＬどうしが重合してなるチューブ状の複合体と、５ｍＭ以上の濃度のＡＴＰとを含む、ＧｒｏＥＬ含有液。
【請求項２】
ＡＴＰの濃度が５〜１０ｍＭである請求項１記載のＧｒｏＥＬ含有液。
【請求項３】
ＧｒｏＥＬが大腸菌の野生型のものである請求項１又は２記載のＧｒｏＥＬ含有液。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項記載のＧｒｏＥＬ含有液を製造する方法であって、
５ｍＭ以上の濃度のＡＴＰを含むＡＴＰ含有液中で、重合していないＧｒｏＥＬと前記ＡＴＰとを接触させることにより、複数の前記ＧｒｏＥＬどうしが重合してなるチューブ状の複合体を形成せしめることを特徴とする、ＧｒｏＥＬ含有液の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３いずれか１項記載のＧｒｏＥＬ含有液のＡＴＰの濃度を４ｍＭ以下に下げることによって、上記チューブ状の複合体から個々の重合していないＧｒｏＥＬへと脱重合させる方法。
【請求項６】
請求項１〜３いずれか１項記載のＧｒｏＥＬ含有液とＧｒｏＥＳとを混合して、ＧｒｏＥＳの濃度をＧｒｏＥＬの濃度と同じかそれ以上にすることによって、上記チューブ状の複合体から個々の重合していないＧｒｏＥＬへと脱重合させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧｒｏＥＬ含有液、ＧｒｏＥＬ含有液の製造方法、および、ＧｒｏＥＬ含有液の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シャペロニンは、基質タンパク質の正しいフォールディングを介助するいわゆる分子シャペロンの１種である。シャペロニンファミリーは、分子量５０ｋＤａ〜６０ｋＤａのタンパク質であり、リング状の複合体構造をとり、ＡＴＰ依存的に基質タンパク質のフォールディングを介助するという共通の特徴を有している。大腸菌のシャペロニンＧｒｏＥＬは、ＡＴＰとＧｒｏＥＳ依存的に基質タンパク質のフォールディングを介助することが明らかにされている。
【０００３】
大腸菌の野生型シャペロニンＧｒｏＥＬは、ＧｒｏＥＬサブユニットの７量体が１つのリングを構成し、このリングがさらに背中合わせに２つ重なった状態の合計で１４量体の構造をしている。すなわち野生型シャペロニンＧｒｏＥＬは、７つのＧｒｏＥＬサブユニットで包囲されてなり、基質タンパク質を内包可能な空洞を、２つ有している。また、ひとつのＧｒｏＥＬサブユニットはＡＴＰ結合部位を含む赤道ドメインと、基質タンパク質とＧｒｏＥＳの結合部位を含む頂点ドメインと、その両ドメインをつなぐ中間ドメインとから構成されている。
【０００４】
こういったことから、ＧｒｏＥＬ、さらにはＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳとの複合体は、従来から提案されるリポソームに代わる薬物送達システム（ＤＤＳ）キャリア候補として注目されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１７−３８６１０号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１６／１８５９５５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＧｒｏＥＬをＤＤＳキャリアとして実用的に用いるための課題は多く、その一つとして、ＧｒｏＥＬどうしの集合や離散、内包物の放出を操作したり、ＧｒｏＥＬを集合させるときの形態を制御する技術の提供が挙げられる。ここで、ＤＤＳキャリアとしての実用を考慮すると、ＧｒｏＥＬの形態制御の際に生体への負荷が高い工程を伴う技術や、複雑な化学合成を伴う技術は好ましくない。
【０００７】
上記事情を考慮し、本発明は、簡便かつ温和な条件でＧｒｏＥＬの集合及び離散状態ならびに集合状態の形状を制御する手段の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らが鋭意検討した結果、本発明を完成した。
本発明のＧｒｏＥＬ含有液は、複数のＧｒｏＥＬどうしが重合してなるチューブ状の複合体と、５ｍＭ以上、好ましくは５〜１０ｍＭの濃度のＡＴＰとを含む。ＧｒｏＥＬは、大腸菌の野生型のものであってもよい。
このようなＧｒｏＥＬ含有液の製造方法として、５ｍＭ以上の濃度のＡＴＰを含むＡＴＰ含有液中で、重合していないＧｒｏＥＬと前記ＡＴＰとを接触させることにより、複数の前記ＧｒｏＥＬどうしが重合してなるチューブ状の複合体を形成せしめることを特徴とする製造方法が提供される。
本発明によれば、（Ｉ）上述のＧｒｏＥＬ含有液のＡＴＰの濃度を４ｍＭ以下に下げることによって、あるいは、（ＩＩ）上述のＧｒｏＥＬ含有液とＧｒｏＥＳとを混合して、ＧｒｏＥＳの濃度をＧｒｏＥＬの濃度と同じかそれ以上にすることによって、上記チューブ状の複合体から個々の重合していないＧｒｏＥＬへと脱重合させることができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＧｒｏＥＬ含有液におけるＡＴＰの濃度の調節によって、複数のＧｒｏＥＬをチューブ状に配列して重合せしめること、および、それを脱重合せしめることができる。このことは、ＧｒｏＥＬを一次元的に伸長するように集積させたり、それを離散させたりするという、形態制御の一手段が提供されたと解釈することができる。本発明のＧｒｏＥＬ含有液は、チューブ状に配列したＧｒｏＥＬを貯蔵している状態であると解釈でき、そのようにチューブ状に配列したＧｒｏＥＬを貯蔵できることは、ＤＤＳの分野において、薬剤カプセルの局所集積、取り込み濃度のチューブ長さによる制御、複数種類の薬剤をも併せ持つ薬剤ナノテープとして細胞周囲に配置できる、などという利点があり得る。一般的に生体内のＡＴＰの濃度は４ｍＭ未満であるから、例えば、ＤＤＳキャリアとして、チューブ状の複合体を含む本発明のＧｒｏＥＬ含有液を用いて、生体外ではＧｒｏＥＬをチューブ状の複合体として取り扱い、生体内ではその複合体から離散したＧｒｏＥＬを用いるなどといった応用が考えられる。その際、ＧｒｏＥＬに内包物を入れておくと、ＧｒｏＥＬの離散により内包物は放出されると通常考えられる。
【００１０】
さらに、本発明によれば、ＧｒｏＥＬ含有液にＧｒｏＥＳを所定条件で添加することによって、チューブ状の複合体を離散状態にするよう制御することができ、上述のＡＴＰ濃度による制御の場合と同様に、ＤＤＳキャリアとしてのＧｒｏＥＬの形態制御の一手段として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＧｒｏＥＬＷＴのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【図２】ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８ＡのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【図３】ＧｒｏＥＬＷＴ、ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａ、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８ＡのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【図４】ＧｒｏＥＬＷＴ、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８ＡのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【図５】ＧｒｏＥＬＷＴのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【図６】ＧｒｏＥＬＷＴのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【図７】ＧｒｏＥＬＷＴ及びＧｒｏＥＬＤ５２，３９８ＡのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【図８】ＧｒｏＥＬＷＴのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【図９】ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８ＡのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【図１０】ＧｒｏＥＬＷＴのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【図１１】ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８ＡのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【図１２】ＧｒｏＥＬＷＴのＴＥＭ像である。
【図１３】ＧｒｏＥＬＷＴのＴＥＭ像である。
【図１４】ＧｒｏＥＬＷＴのＴＥＭ像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳述する。
本発明の含有液にはチューブ状の複合体が含まれる。チューブ状の複合体は、複数のＧｒｏＥＬどうしが重合してなるものである。ＧｒｏＥＬは７量体のリング構造を形成し、リング構造が背中合わせに結合すると１４量体のダブルリング構造となる。前記ダブルリング構造は、直径４〜８ｎｍ程度（大腸菌野生型では約５ｎｍ）の空洞を有する立体構造である。本発明では、上記７量体及び１４量体のものを「重合していないＧｒｏＥＬ」と呼ぶ。
【００１３】
本発明では、ＧｒｏＥＬは、野生型であってもよいし、変異型であってもよい。野生型のＧｒｏＥＬは大腸菌由来のものであり、ＡＴＰの加水分解の時間が約８秒と極めて短時間である。そのため、野生型のＧｒｏＥＬについては、そのままでは薬物送達システム用のキャリア素材として採用することは必ずしも好適ではない。
【００１４】
本発明では、ＧｒｏＥＬは変異型であってもよい。変異型の類型として、野生型ＧｒｏＥＬに対してＡＴＰ加水分解活性（ＡＴＰ代替化合物を含む）が低下した変異型タンパク質が挙げられる。そのような変異型のＧｒｏＥＬは特に限定は無く、例えば、リング構造を構成するＧｒｏＥＬ７量体の全部がＡＴＰ加水分解活性低下型を示すものなどが好ましく挙げられる。なお、野生型又は変異型のＧｒｏＥＬはＡＴＰと結合し得るものが好ましい。
【００１５】
野生型ＧｒｏＥＬ（以下、ＧｒｏＥＬＷＴとも表記する。）に対してＡＴＰ加水分解活性が低下した変異型のＧｒｏＥＬの具体例として、ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａを挙げることができる。ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａは、具体的には、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を指すものである。当該ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａでは、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列のうちの３９８番のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）に置換されたＧｒｏＥＬ変異体である。野生型ＧｒｏＥＬでのＡＴＰ加水分解を含む反応サイクル時間が約８秒であるところ、当該変異体ではシャペロニン複合体における解離半減期が３０〜６０分となる（Rye et al., Cell, Vol.97, 1999）。
【００１６】
変異型のＧｒｏＥＬとしては、配列番号１に記載のアミノ酸配列中、第３９８番目のアラニン以外の１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、シャペロニン活性を有するものも同様に用いることができる。大腸菌以外のバクテリア由来のＧｒｏＥＬ様タンパク質やその変異体で、当該条件を満たすものもここに含まれる。
【００１７】
ここで、配列番号１のアミノ酸配列のうち第３９８番目以外のアラニン以外の変異に関する範囲としては、好適には配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、配列相同性にて７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を示す領域を有するものであることが好適である。また、当該第３９８番目のアラニン以外の位置におけるアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加した変異部位の数としては、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下であり、さらに好ましくは２５以下、特に好ましくは１０以下が好適である。
【００１８】
変異型のＧｒｏＥＬの別の具体例としてＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａが好適に挙げられる。ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を指すものである。当該ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａでは、ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａにおいて第５２番目のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）に置換されたＧｒｏＥＬ変異体であり、ＡＴＰの加水分解活性が著しく低下した性質を有する。
【００１９】
ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａではシャペロニン複合体における解離半減期が約６日という著しく長い時間を示す。これは、ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａの約１５０〜３００倍という飛躍的に高い値である（特許第５５４０３６７号公報、Koike-Takeshita et al., J. Biol. Chem. 2014）。ここで、ＧｒｏＥＬにおける第５２番目のアラニンへの変異置換が相乗的にＡＴＰ加水分解活性を低下させるという知見は、本発明者らが初めて見出した知見である（国際公開ＷＯ２０１６／１８５９５５号）。
【００２０】
変異型のＧｒｏＥＬとしては、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第５２番目及び第３９８番目のアラニン以外の１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、シャペロニン活性を有するものも同様に用いることができる。大腸菌以外のバクテリア由来のＧｒｏＥＬ様タンパク質やその変異体で、当該条件を満たすものもここに含まれる。
【００２１】
ここで、配列番号２のアミノ酸配列のうち第５２番目及び第３９８番目以外のアラニン以外の変異に関する範囲としては、好適には配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、配列相同性にて７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を示す領域を有するものであることが好適である。また、第５２番目及び第３９８番目のアラニン以外の位置におけるアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加した変異部位の数としては、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下であり、さらに好ましくは２５以下、特に好ましくは１０以下が好適である。
【００２２】
変異型のＧｒｏＥＬを調製する手法は特に限定は無く、例えば、野生型ＧｒｏＥＬに変異を導入することで調製することが可能である。変異導入方法としては、通常用いられる方法を特に制限なく用いることができる。例えば、ＰＣＲを用いる方法や、部位特異的突然変異導入キット（例えば、Stratagene社製等）等の遺伝子工学的手法を用いることができる。なお、導入する変異としては、シャペロニン活性やＡＴＰ加水分解活性に影響が少ない変異、ニュートラルな中立的変異、別途の機能を追加する変異、等を許容して含むものであっても良い。
【００２３】
上述の重合していないＧｒｏＥＬが複数重合してチューブ状の複合体が形成される。このとき、ＧｒｏＥＬが有する空洞が連なるように重合する。図２は、後述する実施例におけるＴＥＭ画像及びＤＬＳ測定結果である。図２のＴＥＭ画像にチューブ状の複合体が観察されている。４分、１０分及び３０分のＴＥＭ像にはチューブ状の複合体が特に明瞭に描写されている。このように、５〜１０個程度の球状体が線状に連なっているものがチューブ状の複合体である。
【００２４】
このようなチューブ状の複合体は、ＧｒｏＥＬを一次元的に伸長するように集積させたものであると評価することができる。一つのチューブにおいて重合するＧｒｏＥＬ１４量体の個数は２以上であれば特に限定は無い。
【００２５】
チューブ状の複合体を得ることは、ＤＤＳの技術において例えば、薬剤カプセルの局所集積、取り込み濃度のチューブ長さによる制御、光ピンセット（０．２〜２０μｍ前後の微粒子をトラップ）などで１つ１つのチューブのハンドリングが可能となり、複数種類の薬剤をも併せ持つ薬剤ナノテープとして細胞周囲に配置できる、などといった意義がある。
【００２６】
本発明者らの新知見によれば、ＧｒｏＥＬ含有液におけるＡＴＰの濃度の制御により、ＧｒｏＥＬを重合させてチューブ状の複合体を得たり、その複合体から重合していないＧｒｏＥＬを得るように脱重合させることができる。ＧｒｏＥＬの空洞内に物質を内包させておけば、脱重合によって内包物は通常、拡散／放出される。
【００２７】
本発明では、ＧｒｏＥＬを含む液状体をＧｒｏＥＬ含有液と呼ぶ。ＧｒｏＥＬ含有液においてＧｒｏＥＬは重合していないものであってもよいし、重合してチューブ状の複合体を形成していてもよい。液状体は、溶液、懸濁液、その他、液体様のものを特に限定無く挙げることができる。液状体における媒体としては、生化学で用いられる緩衝液等を特に限定無く用いることができる。そのような緩衝液の非限定的な例として、ＫＣｌやＭｇＣｌ２などを含んだＮ‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐Ｎ’‐２‐エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）などが挙げられる。
【００２８】
本発明によれば、重合していないＧｒｏＥＬとＡＴＰとを接触させ、結果的にＡＴＰの濃度が５ｍＭ以上になるようにすれば、ＧｒｏＥＬどうしが重合してなるチューブ状の複合体を形成せしめることができる。後述の実施例において実証されるように、野生型のＧｒｏＥＬＷＴの場合にチューブ状の複合体がもっとも形成されにくく、上述のようにＡＴＰの加水分解活性を低下させた変異型のＧｒｏＥＬにおいてチューブ状の複合体を形成し易くなる傾向がある。そして、野生型のＧｒｏＥＬＷＴの場合であってもＡＴＰの濃度が５ｍＭに達すればチューブ状の複合体を形成することから、どのようなＧｒｏＥＬであっても５ｍＭ以上の濃度のＡＴＰを含む液状体中ではチューブ状の複合体を形成することが判明した。ＡＴＰの濃度の上限については特に限定は無く、実際の取り扱い易さなどを考慮して例えば、１０ｍＭなどが好適に挙げられる。
【００２９】
ＧｒｏＥＬどうしが重合してチューブ状の複合体を形成する際の、ＡＴＰとの相互作用のメカニズムについては厳密には判明していないものの、概略、以下のようであると推察される。ＧｒｏＥＬにＡＴＰが結合すると構造変化が起き、変性ポリペプチドやＧｒｏＥＳが結合する部位である、疎水性のアミノ酸残基で構成されたＨとＩヘリックスが露出することが知られている（タンパク質科学、後藤祐児、桑島邦博、谷澤克之行編、化学同人）。この状態のＧｒｏＥＬ同士が、互いに疎水性相互作用で連結すると考えられる。
【００３０】
重合していないＧｒｏＥＬとＡＴＰとを接触させる方法は特に限定は無い。ＧｒｏＥＬ含有液にＡＴＰ又はＡＴＰ含有液を加えて最終的にＡＴＰの濃度が５ｍＭ以上になるように調節してもよいし、ＡＴＰの濃度が５ｍＭ以上であるＡＴＰ含有液にＧｒｏＥＬ又はＧｒｏＥＬ含有液を加えてもよい。
【００３１】
ＧｒｏＥＬどうしを重合させてチューブ状の複合体を得る際の反応温度は室温程度でよく、例えば、５〜６０℃といった温度範囲を挙げることができる。反応時間は３０秒〜３０分程度が挙げられ、それ以降は、ＡＴＰの濃度が５ｍＭ以上を維持すればチューブ状の複合体を含むＧｒｏＥＬ含有液が安定的に維持される。
【００３２】
本発明によれば、ＧｒｏＥＬに特に化学的な修飾を施すことなく、チューブ状の複合体を形成させることができる。そのような、特段の化学的修飾を施されていないＧｒｏＥＬどうしが重合してなるチューブ状の複合体の形成は従来は得られなかったものであり、そういった複合体を含むＧｒｏＥＬ含有液もまた本発明の一形態である。このようにチューブ状の複合体が含まれる含有液は、保管や運搬に優れ、生体へも投与しやすい。
【００３３】
本発明者らのさらなる新知見によれば、ＧｒｏＥＬ含有液中でひとたび形成されたチューブ状の複合体については、当該含有液のＡＴＰ濃度を４ｍＭ未満にまで下げることにより、チューブ状の複合体は、個々の重合していないＧｒｏＥＬへと脱重合する。このように、含有液中のＡＴＰ濃度を上げたり下げたりすることにより、チューブ状の複合体の形成と乖離とを制御することができる。
【００３４】
後述の実施例において実証されるように、ＧｒｏＥＬは野生型であっても、変異型であっても、ＡＴＰ濃度を４ｍＭ未満にすれば脱重合が生じる。上述のＧｒｏＥＬの重合におけるＡＴＰの影響を考慮すると、ＡＴＰの加水分解活性が高い野生型であっても、前記活性が低い変異型であっても、同様に、ＡＴＰ濃度を４ｍＭ未満にすれば脱重合が生じることから、どのようなＧｒｏＥＬであってもＡＴＰ濃度を４ｍＭ未満にすればチューブ状の複合体が脱重合することとが判明した。上述の脱重合のためのＡＴＰ濃度の下限値は特に限定は無く、ゼロであってもよい。
【００３５】
なお、ヒトの生体内では、ＡＴＰの濃度は通常は３ｍＭ程度、すなわち４ｍＭ未満である。したがって、チューブ状の複合体を含有する本発明のＧｒｏＥＬ含有液を生体内に投与することによって、生体内では、個々のＧｒｏＥＬへと脱重合する。このように、生体外ではチューブ状の複合体を形成させたまま保管ができ、それを生体内に投与することによって個々のＧｒｏＥＬへと変換できることは、ＤＤＳの分野において例えば、薬剤カプセルの局所集積、取り込み濃度のチューブ長さによる制御、１つ１つのチューブを光ピンセット（０．２〜２０μｍ前後の微粒子をトラップ）などでのハンドリングが可能であり、複数種類の薬剤をも併せ持つ薬剤ナノテープとして１つ１つの細胞周囲に配置して選択的な細胞に効率的に選択的な薬剤を投与することが可能になるというような利点が考えられる。また、チューブ状の複合体は遠心分離によって長さに応じて簡便に分離が可能で、投与前の集積も容易である。こういった利点を享受できるということは、チューブ状の複合体を含む本発明のＧｒｏＥＬ含有液それ自体の意義であると解釈することができる。
【００３６】
本発明によれば、ＧｒｏＥＬ含有液中でひとたび形成されたチューブ状の複合体については、ＧｒｏＥＳと混合することによっても、チューブ状の複合体を個々の重合していないＧｒｏＥＬへと脱重合させることができる。この場合、最終的にＧｒｏＥＳとＧｒｏＥＬの濃度は同じかＧｒｏＥＳの方が高濃度になるようにすることが必要である。ここで、ＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳの濃度はモル濃度である。
【００３７】
ＧｒｏＥＳの本体（細胞内小器官局在化ペプチドを除いた領域）は、ＧｒｏＥＬとの結合能を有しシャペロニン複合体の頂上部分を構成し得るサブユニットであって、複合体が分子シャペロン活性を発揮するために補助因子として機能する領域である。そういったサブユニットは、通常は７量体で１分子を構成しＧｒｏＥＬリング構造の補助因子として機能する。
【００３８】
ＧｒｏＥＳ本体としては、上記機能を奏するＧｒｏＥＳ様のタンパク質であれば如何なるタンパク質も用いることができる。例えば、大腸菌由来のＧｒｏＥＳ、大腸菌以外のバクテリア由来のＧｒｏＥＳ相同タンパク質、ファージ由来のＧｒｏＥＳ様の立体構造及び類似機能を有するタンパク質、更には、これらのタンパク質由来の変異タンパク質なども好適に用いることができる。
【００３９】
ＧｒｏＥＳの一例として配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる野生型ＧｒｏＥＳが挙げられる。また、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含んでなり、シャペロニン複合体の形成において上述の機能を有するタンパク質もＧｒｏＥＳとして扱うことができる。
【００４０】
また、配列番号３に記載のアミノ酸配列中、１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列をアミノ酸配列を含んでなり、シャペロニン複合体の形成において上述の機能を有するタンパク質もＧｒｏＥＳとして扱うことができ、大腸菌以外のバクテリア由来のＧｒｏＥＳ様タンパク質又はその変異体で、当該条件を満たすものもここに含まれる。ここで、配列番号３のアミノ酸配列の変異に関する範囲として、好適には、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して、配列相同性にて７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を示す領域を有するものであることが好適である。また、配列番号３のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加した変異部位の数としては、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、さらに好ましくは５以下が好適である。また、配列番号３に対して変異を有するアミノ酸配列を含んでなり、シャペロニン複合体の形成において上記機能を有するものもＧｒｏＥＳとして用いることができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に記載された態様に限定されるわけではない。
【００４２】
実施例１〜３：
この例では、濃度５ｍＭのＡＴＰ存在下で濃度５μＭのＧｒｏＥＬを処理した。
ＨＫＭ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．４）に、ＡＴＰを終濃度５ｍＭとなるように加えた後、実施例１では野生型ＧｒｏＥＬ（ＧｒｏＥＬＷＴ）を、実施例２ではＧｒｏＥＬ変異体（ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａ）を、実施例３ではＧｒｏＥＬ変異体（ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａ）を、それぞれ、終濃度５μＭとなるように混合して室温静置した。ＡＴＰとＧｒｏＥＬが接触した時点を反応開始（ｔ＝０）とし、反応開始後３０秒から透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察に供し、さらに動的光散乱(ＤＬＳ)測定に供した。
なお、ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａのアミノ酸配列及びＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１及び配列番号２である。
【００４３】
比較例１、２：
この例では、濃度５ｍＭのＡＤＰ存在下で濃度５μＭのＧｒｏＥＬを処理した。
ＨＫＭ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．４）に、ＡＤＰを終濃度５ｍＭとなるように加えた後、比較例１では野生型ＧｒｏＥＬ（ＧｒｏＥＬＷＴ）を、比較例２ではＧｒｏＥＬ変異体（ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａ）を、それぞれ、終濃度５μＭとなるように混合して室温静置した。ＡＤＰとＧｒｏＥＬが接触した時点を反応開始（ｔ＝０）とし、反応開始後４分でＤＬＳ測定、ＴＥＭ観察に供した。
【００４４】
実施例４、５：
この例では、濃度５ｍＭのＡＴＰ存在下で濃度０．１μＭのＧｒｏＥＬを処理した。
ＨＫＭ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．４）に、ＡＴＰを終濃度５ｍＭとなるように加えた後、実施例４では野生型ＧｒｏＥＬ（ＧｒｏＥＬＷＴ）を、実施例５ではＧｒｏＥＬ変異体（ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａ）を、それぞれ、終濃度０．１μＭとなるように混合して室温静置した。ＡＴＰとＧｒｏＥＬが接触した時点を反応開始（ｔ＝０）とし、反応開始後４分でＤＬＳ測定、ＴＥＭ観察に供した。
【００４５】
比較例３、４：
この例では、濃度４ｍＭのＡＴＰ存在下で濃度５μＭのＧｒｏＥＬを処理した。
ＨＫＭ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．４）に、ＡＴＰを終濃度４ｍＭとなるように加えた後、比較例３では野生型ＧｒｏＥＬ（ＧｒｏＥＬＷＴ）を、比較例４ではＧｒｏＥＬ変異体（ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａ）を、それぞれ、終濃度５μＭとなるように混合して室温静置した。ＡＴＰとＧｒｏＥＬが接触した時点を反応開始（ｔ＝０）とし、反応開始後４分でＤＬＳ測定、ＴＥＭ観察に供した。
【００４６】
実施例６、７：
この例では、ＡＴＰの濃度を４ｍＭから６ｍＭに変えたことの他は、比較例３、４と同様の処理及び観察を行った。実施例６では野生型ＧｒｏＥＬ（ＧｒｏＥＬＷＴ）を、実施例７ではＧｒｏＥＬ変異体（ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａ）を、それぞれ用いた。
【００４７】
比較例５、６：
この例では、濃度３ｍＭのＡＴＰと濃度０．３ｍＭのＡＤＰ（生理的濃度）存在下で濃度５μＭのＧｒｏＥＬを処理した。
ＨＫＭ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．４）に、ＡＴＰを終濃度３ｍＭ、ＡＤＰを終濃度０．３ｍＭとなるように加えた後、比較例５では野生型ＧｒｏＥＬ（ＧｒｏＥＬＷＴ）を、比較例６ではＧｒｏＥＬ変異体（ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａ）を、それぞれ、終濃度５μＭとなるように混合して室温静置した。ＡＴＰとＧｒｏＥＬが接触した時点を反応開始（ｔ＝０）とし、反応開始後４分でＤＬＳ測定、ＴＥＭ観察に供した。
【００４８】
実施例８、９：
この例では、濃度５ｍＭのＡＴＰ存在下で形成した５μＭのＧｒｏＥＬ（チューブ状態）を濃度３ｍＭのＡＴＰと濃度０．３ｍＭのＡＤＰ（生理的濃度）条件下へ移行させた。
試料中のＡＴＰ濃度を低下させるために、ＨＫＭ緩衝液（濃度１００ｍＭのＫＣｌ、濃度５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む濃度２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．４）に、ＡＤＰを終濃度０．７５ｍＭとなるように加えた後、実施例８では野生型ＧｒｏＥＬ（ＧｒｏＥＬＷＴ）を、実施例９ではＧｒｏＥＬ変異体（ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａ）を、それぞれ終濃度５μＭとなるように混合した試料液Ａを調製した。
【００４９】
ＨＫＭ緩衝液（濃度１００ｍＭのＫＣｌ、濃度５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む濃度２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．４）に、ＡＴＰを終濃度５ｍＭとなるように加えた後、実施例８では野生型ＧｒｏＥＬ（ＧｒｏＥＬＷＴ）を、実施例９ではＧｒｏＥＬ変異体（ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａ）を、それぞれ終濃度５μＭとなるように混合して室温静置し、試料液Ｂを調製した。
【００５０】
試料液Ｂを調製後、直ちに、試料液Ａ：試料液Ｂ＝２：３の体積比となるように両者を混合し、ＡＴＰ：ＡＤＰ＝１０：１となる終濃度３ｍＭのＡＴＰ、終濃度０．３ｍＭのＡＤＰ存在下で終濃度５μＭのＧｒｏＥＬＷＴ（実施例８）またはＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａ（実施例９）となる試料液Ｃを調製した。試料液Ｃが調製された時点を反応開始（ｔ＝０）とし、試料液Ｃを反応開始後３０秒からＴＥＭ観察に供し、反応開始後１分からＤＬＳ測定に供した。
【００５１】
実施例１０、１１：
この例では、濃度５ｍＭのＡＴＰ存在下で形成したＧｒｏＥＬチューブへＧｒｏＥＳを添加した。
実施例１０では、ＧｒｏＥＬＷＴを用いた。ＨＫＭ緩衝液（濃度１００ｍＭのＫＣｌ、濃度５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む濃度２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．４）に、ＡＴＰを終濃度５ｍＭとなるように加えた後、ＧｒｏＥＬＷＴを終濃度５μＭとなるように混合してチューブを形成させた後、ＧｒｏＥＳを終濃度１０μＭとなるように加えた。ＧｒｏＥＳ添加後時点を反応開始（ｔ＝０）とし、反応開始後３０秒からＴＥＭ観察に供し、反応開始後１分からＤＬＳ測定に供した。ここで用いたＧｒｏＥＳのアミノ酸配列は配列番号３のとおりである。
【００５２】
実施例１１では、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａを用いた。ＨＫＭ緩衝液（濃度１００ｍＭのＫＣｌ、濃度５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む濃度２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．４）に、ＡＴＰを終濃度５ｍＭとなるように加えた後、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａを終濃度５μＭとなるように混合してチューブを形成させた。室温静置４分後、ＧｒｏＥＳを終濃度１０μＭとなるように加えた。ＧｒｏＥＳ添加後時点を反応開始（ｔ＝０）とし、反応開始後３０秒からＴＥＭ観察に供し、反応開始後１分からＤＬＳ測定に供した。
【００５３】
実施例１におけるＧｒｏＥＬ含有液、及び、ＡＴＰを存在させないことの他は実施例１と同様にして得たＧｒｏＥＬ含有液について、遠心分離の操作を行い、その後、ＴＥＭ観察に供した。
【００５４】
上記のように調製した各種試料について、以下の測定に供した。
【００５５】
ＧｒｏＥＬのサイズ特性評価：
試料調製１分後、２分後、４分後、６分後、１０分後、３０分後、６０分後の各試料を、ＺＥＮ１０１０セルを測定容器としたＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いた動的光散乱強度（ＤＬＳ）により測定した。ＧｒｏＥＬのサイズ分布は、装置付属のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒ  ７．１１で描画した。
【００５６】
ＴＥＭ観察：
試料調製から３０秒後、２分後、４分後、６分後、１０分後、３０分後、６０分後時点の各試料を、５ｍＭのＡＴＰを含むＨＫＭ緩衝液で試料中のＧｒｏＥＬまたはＧｒｏＥＬ変異体が０．１μＭになるように希釈し、直ちにＴＥＭ観察試料に供した。
ＴＥＭグリッドの調製は次のように行った。イオンコーターＩＢ−２（エイコーエンジニアリング）を用い、３ｍＡ、３０秒間の条件下でグロー放電を行い、コロジオン支持膜付２００メッシュ銅グリッド（ＥＭジャパン）を親水化処理した。グリッド親水化処理後１時間以内に、経時試料の希釈液２μＬをグリッドに２０秒間乗せて濾紙で吸い取り、超純水６μＬを乗せて濾紙で直ちに吸い取り、次いで０．５％リンタングステン酸（ｐＨ４．０）６μＬを乗せて２０秒後に濾紙で吸い取った。調製した試料グリッドはドライキーパー（サンプラテック）で一夜乾燥した。
【００５７】
画像取得アプリケーションＤｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ  Ｖｅｒ．  ２．１１１４０４．０が付属した冷却ＣＣＤカメラＯＲＩＵＳ  ＳＣ２００（Ｇａｔａｎ）を搭載した透過型電子顕微鏡ＪＥＭ２１００（日本電子）を用い、加速電圧１００ｋＶで試料グリッドを観察し、撮影した。
【００５８】
結果と考察：
ＧｒｏＥＬチューブの形成と維持時間：
【００５９】
実施例１〜３について：
終濃度５ｍＭのＡＴＰ存在下の５μＭのＧｒｏＥＬＷＴは（実施例１）、ＤＬＳ測定により、反応開始後１分から１０分までは約３９ｎｍをピークとする平均試料サイズを、反応開始後３０分経過時点では約３４ｎｍをピークとする平均試料サイズを、反応開始後６０分経過時点でも約２７ｎｍをピークとする平均試料サイズを示し、ＡＴＰ非存在下で示される約２０ｎｍの平均試料サイズよりも大きいことを示した。ＴＥＭ観察の結果、少なくとも反応開始後４分まではＧｒｏＥＬＷＴチューブが存在することが確認された。図１はＴＥＭ画像及びＤＬＳ測定結果である。
【００６０】
終濃度５ｍＭのＡＴＰ存在下の５μＭのＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａでは（実施例３）、ＤＬＳ測定により、試料調製後１分から６０分まで約５１ｎｍをピークとする平均試料サイズを示し、ＡＴＰ非存在下で示される約２０ｎｍの平均試料サイズよりも２倍以上大きいことを示した。ＴＥＭ観察の結果、試料調製後３０秒から２分の間は５個以下のＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａが長辺方向に連結し、チューブ形成の初期を示した。試料調製４分以降は、５個以上のＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａが連結したチューブ状態が形成、維持されることを示した。図２はＴＥＭ画像及びＤＬＳ測定結果である。
【００６１】
終濃度５ｍＭのＡＴＰ存在下の５μＭのＧｒｏＥＬＷＴ、ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａ、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａの反応開始後４分時点の比較では（実施例１〜３）、ＤＬＳ測定により、各試料の平均試料サイズはＧｒｏＥＬＷＴで約３３ｎｍ、ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａで約４９ｎｍ、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａで５４ｎｍだった。ＴＥＭ観察の結果、ＧｒｏＥＬＷＴ、ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａでは４〜５個程度のＧｒｏＥＬチューブが形成されており、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａでは１０個程度連結長したＧｒｏＥＬチューブを含むことが分かり、ＧｒｏＥＬのＡＴＰ加水分解活性が低下するほどＧｒｏＥＬ同士で連結する個数が増えることが示された。図３は、ＧｒｏＥＬＷＴ、ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａ、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８ＡチューブのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【００６２】
実施例４、５について：
終濃度５ｍＭのＡＴＰ存在下の０．１μＭのＧｒｏＥＬＷＴは（実施例４）、ＤＬＳ測定により、５ｍＭのＡＴＰ存在下の時の平均試料サイズ３３ｎｍよりも小さいが、ＡＴＰ非存在下で示される約２０ｎｍの平均試料サイズよりもやや大きい約２８ｎｍのピークを示した。終濃度５ｍＭのＡＴＰ存在下の０．１μＭのＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａは（実施例５）、ＤＬＳ測定により、５ｍＭのＡＴＰ存在下の時の平均試料サイズ５４ｎｍよりも小さいが、ＡＴＰ非存在下で示される約２０ｎｍの平均試料サイズよりも大きい約３７ｎｍのピークを示した。ＴＥＭ観察の結果、０．１μＭ条件下でＧｒｏＥＬチューブは形成されていた。図４は、ＧｒｏＥＬＷＴ、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８ＡチューブのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【００６３】
これらの結果から、５ｍＭのＡＴＰ存在下では、ＧｒｏＥＬＷＴ、ＧｒｏＥＬＤ３９８Ａ、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａは０．１μＭ〜５μＭの範囲でＧｒｏＥＬチューブを形成することができ、ＡＴＰ加水分解活性が遅いＧｒｏＥＬ変異体ほどチューブの鎖長と形成維持時間が長いことが確認された。
【００６４】
ＧｒｏＥＬチューブ形成におけるヌクレオチド濃度の影響：
【００６５】
実施例１、６、比較例１、３について：
ＡＴＰの終濃度が４〜６ｍＭの範囲であるＧｒｏＥＬＷＴのＤＬＳの結果（比較例３、実施例１、実施例６）、平均試料サイズは、終濃度４ｍＭのＡＴＰのときに約２０ｎｍ、終濃度５ｍＭのＡＴＰのときに約３３ｎｍ、終濃度６ｍＭのＡＴＰのときに約５２ｎｍのピークを示した。ＡＴＰ非存在下のＧｒｏＥＬは平均試料サイズが２０ｎｍであることから、終濃度４ｍＭのＡＴＰ存在下では、ＧｒｏＥＬＷＴはチューブを形成していないことが示唆され、ＴＥＭ観察の結果とも一致した。終濃度５ｍＭ以上のＡＴＰではＧｒｏＥＬＷＴのチューブ形成がＤＬＳとＴＥＭで示され、ＡＴＰ濃度依存的にＧｒｏＥＬＷＴチューブが長くなる可能性を示した。また、５ｍＭのＡＴＰ存在下（実施例１）ではＧｒｏＥＬＷＴチューブが形成されるのに対し、５ｍＭのＡＤＰ存在下（比較例１）ではＧｒｏＥＬＷＴチューブが形成されないことがＤＬＳとＴＥＭで示された。図５は、ＧｒｏＥＬＷＴのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【００６６】
実施例３、７、比較例２、４について：
ＡＴＰの終濃度が４〜６ｍＭの範囲であるＧｒｏＥＬＤ５２，３９８ＡのＤＬＳの結果（比較例４、実施例２、実施例７）、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａの平均試料サイズは、終濃度４ｍＭのＡＴＰのときに約２０ｎｍ、終濃度５ｍＭのＡＴＰのときに約５３ｎｍ、終濃度６ｍＭのＡＴＰのときに約９０ｎｍのピークを示した。ＡＴＰ非存在下のＧｒｏＥＬは平均試料サイズが２０ｎｍであることから、終濃度４ｍＭのＡＴＰ存在下では、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａはチューブを形成していないことが示唆された。ＴＥＭ観察の結果、終濃度４ｍＭのＡＴＰではＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａのチューブは形成されておらず、終濃度５ｍＭ以上のＡＴＰではＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａのチューブ形成が確認された。５ｍＭのＡＴＰ存在下（実施例３）でＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａチューブが形成されるのに対し、５ｍＭのＡＤＰ存在下（比較例２）ではＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａチューブが形成されないことがＤＬＳで示された。図６はＧｒｏＥＬＷＴのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【００６７】
比較例５、６について：
細胞内ヌクレオチド濃度である３ｍＭをＡＴＰの終濃度としたとき、５μＭのＧｒｏＥＬＷＴ（比較例５）、５μＭのＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａ（比較例６）の各ＤＬＳ測定結果はＡＴＰ非存在下の平均試料サイズと同じ約２０ｎｍのピークを示し、いずれのＧｒｏＥＬもチューブを形成しないＡＴＰ濃度であることが分かった。図７は、ＧｒｏＥＬＷＴ、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８ＡのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【００６８】
実施例８について：
５ｍＭのＡＴＰ存在下でＧｒｏＥＬチューブを形成させた５μＭのＧｒｏＥＬＷＴのタンパク質濃度を変えずに３ｍＭのＡＴＰ／０．３ｍＭのＡＤＰ（生理的濃度）存在下へ移行させると、ＤＬＳ測定の結果から、５ｍＭのＡＴＰ存在下では約４０ｎｍをピークとする平均試料サイズであったものが、３ｍＭのＡＴＰ／０．３ｍＭのＡＤＰ存在下移行後約２０ｎｍをピークとする平均試料サイズに減少することが分かった。ＴＥＭ観察の結果、３ｍＭのＡＴＰ存在下移行後３０秒の時点でＧｒｏＥＬＷＴチューブを確認したが、１０分時点でチューブは分解されていた。図８は、ＧｒｏＥＬＷＴのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。ＤＬＳについては、測定時間２分のものを図示している。
【００６９】
実施例９について：
５ｍＭのＡＴＰ存在下でＧｒｏＥＬチューブを形成させた５μＭのＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａのタンパク質濃度を変えずに３ｍＭのＡＴＰ／０．３ｍＭのＡＤＰ（生理的濃度）存在下へ移行させると、ＤＬＳ測定の結果から、５ｍＭのＡＴＰ存在下では約５０ｎｍをピークとする平均試料サイズであったものが、３ｍＭのＡＴＰ存在下移行後は約２０ｎｍをピークとする平均試料サイズに減少することが分かった。ＴＥＭ観察の結果、３ｍＭのＡＴＰ／０．３ｍＭのＡＤＰ存在下へ移行後３０秒の時点でＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａチューブを確認したが、ＡＴＰ濃度減少前に比べるとＧｒｏＥＬ連結個数は約半分になっており、１０分時点でチューブは分解されていた。ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａチューブも周囲のヌクレオチド濃度が５ｍＭから３ｍＭへ減少すると、濃度変化後１０分までにチューブを分解して１分子毎に分散することを示した。図９は、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８ＡのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。ＤＬＳについては、測定時間２分のものを図示している。
【００７０】
これらの結果から、ＧｒｏＥＬチューブ形成には終濃度５ｍＭ以上のＡＴＰが必要であることが分かった。また、終濃度４ｍＭのＡＴＰ以下ではＧｒｏＥＬチューブが形成されず、細胞内ヌクレオチド濃度である終濃度３ｍＭのＡＴＰではＧｒｏＥＬチューブが自然発生しないことを示唆した。また、ＡＤＰではＧｒｏＥＬチューブを形成できないことが分かった。終濃度５ｍＭのＡＴＰを基準に、ＧｒｏＥＬチューブの形成・分解となるヌクレオチド濃度を定めることができると言える。
【００７１】
ＧｒｏＥＬチューブ形成におけるＧｒｏＥＳの影響：
【００７２】
実施例１０、１１について：
５ｍＭのＡＴＰ存在下で形成された５μＭのＧｒｏＥＬＷＴ（チューブ状）に１０μＭのＧｒｏＥＳを添加したものについて（実施例１０）、計測したＤＬＳの結果は、ＧｒｏＥＳ添加前は平均試料サイズが約４０ｎｍであったものが、ＧｒｏＥＳの添加後１分の時点で約２０ｎｍに減少し、ＧｒｏＥＬＷＴチューブが速やかに分解されてＧｒｏＥＬＷＴに戻ることを暗示した。ＴＥＭ観察の結果、ＧｒｏＥＬＷＴでは、ＧｒｏＥＳ添加後３０秒の時点ではＧｒｏＥＬＷＴチューブと１分子ＧｒｏＥＬＷＴの両方が見られたが、添加後２分経過時点でＧｒｏＥＬＷＴチューブは完全に消失していた。図１０は、ＧｒｏＥＬＷＴのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【００７３】
５ｍＭのＡＴＰ存在下で形成された５μＭのＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａチューブに１０μＭのＧｒｏＥＳを添加したものについて（実施例１１）、計測したＤＬＳの結果は、ＧｒｏＥＳ添加前は平均試料サイズが約７１ｎｍであったものが、ＧｒｏＥＳの添加後１分の時点で約６１ｎｍに減少し、１０分の時点で約４１ｎｍに減少した。ＴＥＭ観察の結果、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａでは、ＧｒｏＥＳ添加後３０秒の時点ではＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａチューブと１分子ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａの両方が見られたが、添加後１０分時点でＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａチューブはほぼ消失していた。図１１は、ＧｒｏＥＬＤ５２，３９８ＡのＴＥＭ像及びＤＬＳ測定結果である。
【００７４】
これらの結果は、ＧｒｏＥＳはＧｒｏＥＬチューブを分解する能力を持つことを示した。ＡＴＰ加水分解活性が低下しているＧｒｏＥＬＤ５２，３９８Ａは、５ｍＭのＡＴＰ存在下で形成したチューブを６０分経過後も維持しているが、ＧｒｏＥＳを添加することにより１０分程度で強制的にチューブが分解されていることから、ヌクレオチド濃度の変化を伴わずにチューブを分解する２つ目の手段になることが分かった。
【００７５】
実施例１におけるＧｒｏＥＬ含有液、及び、ＡＴＰを存在させないことの他は実施例１と同様にして得たＧｒｏＥＬ含有液について、遠心分離の操作を行った後の、ＴＥＭ観察結果は以下のとおりである。図１２は、遠心分離前の氷上静置した状態におけるＴＥＭ像である。氷上静置の状態では、上方と下方に大きな差が見られなかった。図１３は、３０００×ｇの遠心分離の操作後のＴＥＭ像である。この状態では、上方より下方に分子量の大きなチューブが若干多く見えた。図１３は、１９０００×ｇの遠心分離の操作後のＴＥＭ像である。この状態では、明らかに下方にチューブが多く見られた。この現象は、ＡＴＰ（−）では見られなかった。以上のことから、チューブ状の複合体を形成させると、ＧｒｏＥＬを遠心分離によって集積させることが可能になることが判った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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