(57)【要約】【課題】熱安定性が高く、かつ、比活性の高いタンパク質およびその製造方法ならびにタンパク質組成物を提供し、保存安定性が高く、かつ高感度にＮＭＮ測定が可能なＮＭＮの測定用組成物や測定キットを安価に提供する。【解決手段】以下の（１）〜（３）の性質を有する、タンパク質。（１）ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）にアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生成する活性を有する。（２）７０℃で４５分間安定である。（３）比活性が１５（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）以上である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）の性質を有する、タンパク質。
（１）ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）にアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生成する活性を有する。
（２）７０℃で４５分間安定である。
（３）比活性が１５（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）以上である。
【請求項２】
以下の（４）の性質をさらに有する、請求項１に記載のタンパク質。
（４）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来であるか、またはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の遺伝子の移入による形質転換体由来である。
【請求項３】
以下の（５）〜（７）の性質をさらに有する、請求項１または２に記載のタンパク質。
（５）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した前記タンパク質の分子量が２０，０００〜３０，０００である。
（６）ニッケルイオンで活性化される。
（７）至適ｐＨが７〜８である。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、タンパク質組成物。
【請求項６】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を組換えベクターに挿入する工程と、前記工程で得られた組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、形質転換体を製造する工程と、前記工程で得られた形質転換体を培地に培養し、培養液からＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有するタンパク質を採取する工程と、を含む、タンパク質の製造方法。
【請求項７】
宿主細胞が微生物である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、ＮＭＮを測定する方法。
（Ａ）試料と請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項５に記載のタンパク質組成物とを接触せしめ、試料中のＮＭＮをＮＡＤに変換せしめる工程
（Ｂ）変換された試料中のＮＡＤを下記式（１）の酵素サイクリング法により反応せしめる工程。
【化１】
2019024468.tif 000004
（Ｃ）ホルマザン色素の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程
（Ｄ）検出されたシグナルの変化量に基づき、試料が含有するＮＭＮの量を算出する工程
【請求項９】
テトラゾリウム塩が２‐（２‐メトキシ‐４‐ニトロフェニル）‐３‐（４−ニトロフェニル）‐５‐（２、４‐ジスルホフェニル）‐２Ｈ‐テトラゾリウム一ナトリウム（ＷＳＴ−８）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
脱水素酵素が１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
下記の成分（Ａ）〜（Ｅ）を含む、ＮＭＮの測定用組成物。
（Ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項５に記載のタンパク質組成物
（Ｂ）ＮＡＤをＮＡＤＨに変換せしめる脱水素酵素
（Ｃ）脱水素酵素の基質
（Ｄ）テトラゾリウム塩
（Ｅ）テトラゾリウム塩をホルマザン色素に変換せしめる還元酵素
【請求項１２】
テトラゾリウム塩がＷＳＴ−８である、請求項１１に記載の測定用組成物。
【請求項１３】
脱水素酵素が１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼである、請求項１１または１２に記載の測定用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は耐熱性が高く、かつ高比活性なＮＭＮＡＴおよびその製造方法、タンパク質組成物ならびにそれを用いた検体中ＮＭＮの高感度測定方法および測定組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（以下ＮＭＮと記載）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと記載）の中間代謝産物である。ＮＭＮはサーチュインと呼ばれる抗老化に関与する酵素の一つであるＳＩＲＴ１を活性化することが報告されており（例えば非特許文献１）、ＮＭＮの投与による作用として、インスリン抵抗性改善や脂質異常症の改善（例えば非特許文献１）、ミトコンドリア機能改善（例えば非特許文献２）、老化に伴う体重増加の抑制やエネルギー代謝亢進、老化に関する遺伝子の抑制（例えば非特許文献３）などが報告されている。また、ＮＭＮは初期の糖尿病性腎症の予後マーカーとして使用できることも報告されている（例えば非特許文献４）。
【０００３】
ＮＭＮの測定方法はニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄｅｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、以下ＮＭＮＡＴと記載）を用いた測定方法が知られている（例えば特許文献１）。
【０００４】
ＮＭＮＡＴは真核生物から原核生物、古細菌にいたるまで様々な生物種で同定されている。真核生物由来のものとしては例えば、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（例えば非特許文献５）、マウス（例えば非特許文献６）、ブタ肝臓（例えば非特許文献７）、シロイヌナズナ（例えば非特許文献８）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（例えば非特許文献９）由来などのＮＭＮＡＴが報告されている。また、原核生物由来のものとしては例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（例えば非特許文献９、１０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（例えば非特許文献１１）由来などのＮＭＮＡＴが、古細菌由来のものとしては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（例えば非特許文献１２）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（例えば非特許文献１３）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（例えば非特許文献１４）由来ＮＭＮＡＴなどが知られている。
【０００５】
これらのＮＭＮＡＴのいくつかについては熱安定性が調べられている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＮＭＮＡＴは６５℃、５分間のインキュベーションで６５％の活性が失われ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来ＮＭＮＡＴは６０℃、５分間のインキュベーションで９５％の活性が失われるという報告があり（例えば非特許文献９）、公知の真核生物および原核生物由来ＮＭＮＡＴの熱安定性は低い。一方、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ＮＭＮＡＴは７０℃で６時間のインキュベーションで安定（例えば非特許文献１２）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来ＮＭＮＡＴは８０℃で２時間のインキュベーションで安定（例えば非特許文献１３）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ−３由来ＮＭＮＡＴは８０℃で３０分間のインキュベーションで安定（例えば非特許文献１４）という報告があり、古細菌由来のＮＭＮＡＴの熱安定性は高い。
【０００６】
一方、古細菌由来のＮＭＮＡＴの比活性についても報告があり、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ＮＭＮＡＴの比活性は７０℃条件下で１８７  Ｕ／ｍｇ（例えば非特許文献１２）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来ＮＭＮＡＴの比活性は７０℃条件下で８．８  Ｕ／ｍｇ（例えば非特許文献１２）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ−３由来ＮＭＮＡＴの比活性は７０℃条件下で１４．９  Ｕ／ｍｇ（例えば非特許文献１３）である。特に、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ＮＭＮは比活性が高く、３７℃においても高い比活性を有していると考えられる。
【０００７】
一方、古細菌由来ＮＭＮＡＴを大腸菌で組換えタンパク質として生産した場合の生産量は、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ＮＭＮＡＴでは３〜４  ｍｇ／培養液１Ｌ（非特許文献１２）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ−３由来ＮＭＮＡＴでは３．３  ｍｇ／培養液７Ｌ（例えば非特許文献１３）と少ない。
【０００８】
なお、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  ＤＳＭ５７９株のゲノム配列はすでに解読されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＤａｔａｂａｓｅのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＰ００８２２６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開昭５９−１６６０９９
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ．  Ｍｅｔａｂ．  １４（４），  ５２８−５３６，  ２０１１
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ．  １５５（７），  １６２４−１６３８，  ２０１３
【非特許文献３】Ｃｅｌｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ２４（６），  ７９５−８０６，  ２０１６
【非特許文献４】Ｃｕｒｒ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．  Ｒｅｖ．  １２（２），  ９５−１０４，  ２０１６
【非特許文献５】Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ（Ｌａｎｄｍａｒｋ  Ｅｄ）．  １４，  ４１０−４３１，  ２００９
【非特許文献６】ＰＬｏｓ．  Ｏｎｅ．  ７（１２），  ｅ５３２７１，  ２０１２.
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ８０，  ３１８−３２３，  １９６１
【非特許文献８】Ｐｌａｎｔ．  Ｊ．  ４９（４），  ６９４−７０３，  ２００７
【非特許文献９】Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  １２０（２），  ４４０−４５０，  １９６７
【非特許文献１０】Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８１（１７），  ５５０９−５５１１，  １９９９
【非特許文献１１】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７（５），  ３６９８−３７０７，  ２００１
【非特許文献１２】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３３１，  ２９２−２９８，  ２００１
【非特許文献１３】Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７９（２４），  ７７１８−７７２３，  １９９７
【非特許文献１４】Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｔａｌ．  Ｂ．  Ｅｎｚｙｍ．  ２３，  ２７３−２７９，  ２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＮＭＮの測定用組成物や測定用キットを作製するにあたり、保存安定性を向上させるためには含有するＮＭＮＡＴの熱安定性が高いものが望ましい。また、酵素の使用量を減少させるために比活性が高いものが望ましい。さらに、測定用組成物や測定用キットの培養コストを低減するために使用するＮＭＮＡＴの培養液１Ｌあたりの生産量は多いことが好ましい。
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、熱安定性が高く、かつ、比活性の高いタンパク質およびその製造方法ならびにタンパク質組成物を提供し、保存安定性が高く、かつ高感度にＮＭＮ測定が可能なＮＭＮの測定用組成物や測定キットを安価に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、熱安定性と比活性とが高いＮＭＮＡＴ活性を有するタンパク質を見出した。本タンパク質は、培養液１Ｌあたりの生産量が高いことを初めて見出した。本発明のタンパク質の特性を利用して、保存安定性が高く、かつ高感度なＮＭＮの測定用組成物や測定キットを安価に創出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明としては以下のものが挙げられる。
［１］
以下の（１）〜（３）の性質を有する、タンパク質。
（１）ＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有する。
（２）７０℃で４５分間安定である。
（３）比活性が１５（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）以上である。
［２］
以下の（４）の性質をさらに有する、タンパク質。
（４）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来であるか、またはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の遺伝子の移入による形質転換体由来である。
［３］
以下の（５）〜（７）の性質をさらに有する、［１］または［２］に記載のタンパク質。
（５）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した前記タンパク質の分子量が２０，０００〜３０，０００である。
（６）ニッケルイオンで活性化される。
（７）至適ｐＨが７〜８である。
［４］
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである、［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
［５］
［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質を含む、タンパク質組成物。
［６］
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを含むポリヌクレオチド。
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された塩基配列を有し、かつ、ＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｃ）配列番号２に示す塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ、ＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
［７］
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを含むポリヌクレオチド。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
［８］
［６］または［７］に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
［９］
［８］に記載の組換えベクターを導入した、形質転換体。
［１０］
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を組換えベクターに挿入する工程と、前記工程で得られた組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、形質転換体を製造する工程と、前記工程で得られた形質転換体を培地に培養し、培養液からＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有するタンパク質を採取する工程を含む、タンパク質の製造方法。
［１１］
宿主細胞が微生物である、［１０］に記載の製造方法。
［１２］
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、ＮＭＮを測定する方法。
（Ａ）試料と［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質または［５］に記載のタンパク質組成物とを接触せしめ、試料中のＮＭＮをＮＡＤに変換せしめる工程
（Ｂ）変換された試料中のＮＡＤを下記式（１）の酵素サイクリング法により反応せしめる工程
【化１】
2019024468.tif 000002
（Ｃ）ホルマザン色素の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程
（Ｄ）検出されたシグナルの変化量に基づき、試料が含有するＮＭＮの量を算出する工程
［１３］
テトラゾリウム塩が２‐（２‐メトキシ‐４‐ニトロフェニル）‐３‐（４−ニトロフェニル）‐５‐（２、４‐ジスルホフェニル）‐２Ｈ‐テトラゾリウム一ナトリウム（以下、ＷＳＴ−８）である、［１２］に記載の方法。
［１４］
脱水素酵素が１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼである、［１２］または［１３］に記載の方法。
［１５］
下記の成分を含む、ＮＭＮの測定用組成物。
（Ａ）［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質または［５］に記載のタンパク質組成物
（Ｂ）ＮＡＤをＮＡＤＨに変換せしめる脱水素酵素
（Ｃ）脱水素酵素の基質
（Ｄ）テトラゾリウム塩
（Ｅ）テトラゾリウム塩をホルマザン色素に変換せしめる還元酵素
［１６］
テトラゾリウム塩がＷＳＴ−８である、［１５］に記載の測定用組成物。
［１７］
脱水素酵素が１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼである、［１５］または［１６］に記載の測定用組成物。
［１８］
［１５］〜［１７］のいずれかに記載の測定用組成物を用いて、被検体由来の試料中のＮＭＮの量を算出する工程を含む、ＮＭＮが関与する疾患および／または状態を、診断および／または管理する方法。
［１９］
ＮＭＮが関与する疾患および／または状態が、インスリン抵抗性、脂質異常症、糖尿病性腎症、またはアルツハイマー病である［１８］に記載の方法。
［２０］
ＮＭＮが関与する疾患および／または状態の診断および／または管理用組成物である、［１５］〜［１７］のいずれかに記載の測定用組成物。
［２１］
前記ＮＭＮが関与する疾患および／または状態が、インスリン抵抗性、脂質異常症、糖尿病性腎症、またはアルツハイマー病である［２０］に記載の測定用組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、熱安定性と比活性が高く、生産量の多いＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  ＤＳＭ５７９株由来組換え体ＮＭＮＡＴを取得することにより、保存安定性が高く、かつ高感度なＮＭＮの測定用組成物や測定キットを安価に製造することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例４において、組換え体ＮＭＮＡＴの熱安定性。
【図２】実施例５において、金属塩の種類と濃度を変えた時の組換え体ＮＭＮＡＴの示す比活性。
【図３】実施例６において、緩衝液および各ｐＨにおけるＮＭＮＡＴの相対活性。
【図４】実施例７において、０〜１０  μＭのβ‐ＮＭＮを試料とした時の１０分間の反応時間の反応タイムコース。
【図５】実施例７において、０〜１０  μＭのβ‐ＮＭＮを試料とした時の１分間あたりの吸光度変化。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、以下の（１）〜（３）の性質を有する、タンパク質（以下、ＮＭＮＡＴとも記載）である。
（１）ＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有する。
（２）７０℃で４５分間安定である。
（３）比活性が１５（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）以上、好ましくは１７（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）以上、より好ましくは１９（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）以上である。
【００１８】
本明細書において、「安定」とは、７０℃で４５分間処理する前に対して、その処理をした後のＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性が、９０％以上残存することを意味し、好ましくは９３％以上、より好ましくは９６％以上残存する。
【００１９】
本発明のタンパク質は、以下の（５）〜（７）の性質をさらに有することがさらに好適である。
（５）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した本発明のタンパク質の分子量が２０，０００〜３０，０００である。
（６）ニッケルイオンで活性化される。
（７）至適ｐＨが７〜８である。
【００２０】
本明細書において、「活性化される」とは、ＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性が、金属塩（例えばニッケルイオン）が存在しない場合に比べて強まることを意味する。
【００２１】
本発明のタンパク質は、金属塩の存在下で活性化される。金属塩としては、例えばＮｉＣｌ2、ＣｏＣｌ2、ＭｇＣｌ2、およびＭｎＣｌ2が挙げられ、その濃度は例えば、下限が１  ｍＭ以上、好ましくは２  ｍＭ以上、より好ましくは４  ｍＭ以上、上限は特に設けないが好ましくは８  ｍＭ以下、よりに好ましくは６  ｍＭ以下である。
【００２２】
本明細書において、「至適ｐＨ」とは、ＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を高く保つことができるｐＨの領域を意味する。ｐＨは、公知の緩衝液、酸や塩基により調整することができ、もちろんそれらは用いなくともよい。
【００２３】
本発明のタンパク質（以下ＮＭＮＡＴとも記載）は、（１）〜（３）の性質を有する以外には、由来、剤型、結晶型、添加物、商品名等により限定されない。
【００２４】
本発明のタンパク質は、ＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有するものであれば由来は限定されず、例えば天然の生物由来であってもよいが、培養等が容易で酵素の取得が容易となる点で、微生物由来である酵素が好ましい。好ましい微生物由来の本発明のタンパク質としては、例えばＴｈｅｒｍｕｓ属由来のものが挙げられ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のものがより好ましい。つまり、本発明のタンパク質は、以下の（４）の性質をさらに有することがより好ましい。
（４）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来であるか、またはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の遺伝子の移入による形質転換体由来である。
【００２５】
このような微生物はバイオリソースセンターから購入可能（例えば、ドイツのＤＳＭＺなどから）である。
【００２６】
分離した微生物の同定は、実験書（鈴木健一朗ら、微生物の分類・同定実験法― 分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に、シュプリンガー・フェアラーク東京）等に従うことにより同定することができ、又、市販の各種菌株同定キット（日本ビオメリュー社等）を使用することによっても可能であり、さらには、財団法人日本食品分析センター（東京都渋谷区元代々木町５２番１号）等に依頼して同定することもよい。
【００２７】
かくして得られた本発明のタンパク質を形成する天然の微生物は、さらにＮＴＧ等の薬剤、紫外線、および／または放射線で処理した変異株とすることもできる。該変異株によって、本発明のタンパク質の生産性を向上することや、本発明のタンパク質の変異体を形成させることが可能であり、安定性、生産性、反応性等が優れた性質を有する変異体を形成することも可能である。
【００２８】
また、得られた本発明のタンパク質をコードする塩基配列やその情報は、本発明のタンパク質やそれを形成する天然の微生物を用いた、プロテインシーケンス、ＤＮＡシーケンスや公知遺伝子工学手法で取得できる。配列番号２は、本発明のタンパク質において好ましい例であるＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の遺伝子の塩基配列を示す。
【００２９】
本発明のタンパク質は、（１）〜（３）の性質を有するものであれば特に限定されないが、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかであるタンパク質が挙げられる。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
【００３０】
本明細書において、「１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加された」という場合、置換、欠失、挿入等されるアミノ酸の個数は、結果として得られるタンパク質がＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有する限り特に限定されない。また、ここでの「複数個」は、２以上の整数個を意味し、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、よりさらに好ましくは２個、３個、４個である。タンパク質における置換、欠失、挿入等の位置は、結果として得られるタンパク質がＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有する限り、Ｎ末端でも、Ｃ末端でも、その中間であってもよい。
【００３１】
本明細書において、「配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列とＹ％以上の配列同一性を有する」とは、２つのタンパク質のアミノ酸配列の一致が最大になるように整列（アライメント）させたときに、共通するアミノ酸残基数の、配列番号Ｘに示す全アミノ酸数に対する割合が、Ｙ％以上であることを意味する。
【００３２】
本発明のタンパク質の二次構造、三次構造、および四次構造は、特に限定されない。
【００３３】
本発明は、本発明のタンパク質を含むタンパク質組成物である。本発明のタンパク質組成物は、適宜必要に応じて、安定化剤又は賦型剤として、各種の塩類、糖類、酵素、脂質、界面活性化剤等をさらに含んでもよい。また、適宜必要に応じて本発明のタンパク質組成物を凍結乾燥する場合、本発明のタンパク質組成物は、安定化剤又は賦型剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミン等を好ましくは０．５〜１０質量％を含んでもよい。
【００３４】
本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを含むポリヌクレオチドである。
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された塩基配列を有し、かつ、ＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｃ）配列番号２に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有し、かつ、ＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
【００３５】
本明細書において、「１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された」という場合、置換、欠失、挿入等される塩基の個数は、結果として得られるポリヌクレオチドがＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されない。また、ここでの「複数個」は、２以上の整数個を意味し、好ましくは２〜６０個、より好ましくは２〜１５個、さらに好ましくは２〜５個、よりさらに好ましくは２個、３個、４個である。ポリヌクレオチドにおける置換、欠失、挿入等の位置は、結果として得られるポリヌクレオチドがＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有するタンパク質をコードする限り、３’末端でも、５’末端でも、その中間であってもよい。
【００３６】
本明細書において、「配列番号Ｘに示される塩基配列とＹ％以上の配列同一性を有する」とは、２つのポリヌクレオチドの塩基配列の一致が最大になるように整列（アライメント）させたときに、共通する塩基数の、配列番号Ｘに示す全塩基数に対する割合が、Ｙ％以上であることを意味する。
【００３７】
また、本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを含むポリヌクレオチドであってもよい。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
【００３８】
常法を用いて宿主細胞に導入することにより本発明のポリヌクレオチドを含む、本発明の形質転換体を得ることができる。そのためには、形質転換体において導入ポリヌクレオチドを発現させるための組換えベクターとして、本発明のポリヌクレオチドを導入（挿入）した本発明の組換えベクターを使用することができる。このような組換えベクターとしては、微生物、好ましくは原核細胞、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌を宿主細胞として導入し、得られた形質転換体を培養した場合に、ＮＭＮＡＴを含む培養物が得られる組換えベクターであれば特に限定されないが、宿主細胞内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドのうち、遺伝子組換え用として構築されたものが好ましい。
【００３９】
本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を組換えベクターに挿入する工程と、前記工程で得られた組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、形質転換体を製造する工程と、前記工程で得られた形質転換体を培地に培養し、培養液からＮＭＮにアデノシン三リン酸のアデニル酸を転移しＮＡＤを生成する活性を有するタンパク質を採取する工程を含む、タンパク質の製造方法（以下、ＮＭＮＡＴの製造方法とも記載）である。
【００４０】
本発明は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、ＮＭＮを測定する方法（以下測定方法と記載）である。
（Ａ）試料と本発明のタンパク質（ＮＭＮＡＴ）またはタンパク質組成物とを接触せしめ、試料中のＮＭＮをＮＡＤに変換せしめる工程
（Ｂ）変換された試料中のＮＡＤを下記式（１）の酵素サイクリング法により反応せしめる工程。
【化２】
2019024468.tif 000003
（Ｃ）ホルマザン色素の変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程
（Ｄ）検出されたシグナルの変化量に基づき、試料が含有するＮＭＮの量を算出する工程
【００４１】
本発明の測定方法の工程（Ａ）は、ＮＭＮをＮＡＤに変換せしめる工程であり、特に限定されないが、例えば特許文献１に記載されるように（例えば特許請求の範囲）、ＮＭＮおよびＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を含む試料に、金属イオン（例えばマグネシウムイオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、好ましくはニッケルイオン、コバルトイオン、より好ましくはニッケルイオン）の存在下で本発明のタンパク質またはタンパク質組成物を接触せしめ、ＮＭＮをＮＡＤに、ＡＴＰをピロリン酸（ＰＰｉ）に変換させることができる。このようにＮＭＮをＮＡＤに変換する方法については、上記の方法に限定されず、公知の方法であればいずれも採用することができる。
【００４２】
本発明の測定方法の工程（Ａ）において使用するＮＭＮＡＴの量は、試料中のＮＭＮが測定できれば特に限定されず、試料に含まれるＮＭＮの存在量、目的とするＮＭＮを変換せしめる程度、使用する装置、ＮＭＮＡＴの純度、および／または経済的な事情等に応じて好ましい結果が得られるように決定し得る。本発明の測定方法の工程（Ａ）において、更に、ＡＴＰ等を使用する場合、その種類と量についても同様である。
【００４３】
本発明の測定方法の工程（Ａ）において使用するＮＭＮＡＴの量は、例えば、下限が０．０１  Ｕ／ｍＬ以上、好ましくは０．１  Ｕ／ｍＬ以上、より好ましくは０．５  Ｕ／ｍＬ以上、上限は特に設けないが、１００  Ｕ／ｍＬ以下、好ましくは５０  Ｕ／ｍＬ以下、より好ましくは２０  Ｕ／ｍＬ以下である。
【００４４】
本発明の測定方法の工程（Ａ）は、少なくともＡＴＰの存在下であることが好ましい。上記条件下で使用するＡＴＰの量は、例えば、下限が０．０１  ｍＭ以上、好ましくは０．１  ｍＭ以上、より好ましくは０．５  ｍＭ以上、上限は特に設けないが好ましくは５０  ｍＭ以下、よりに好ましくは２０  ｍＭ以下である。
【００４５】
本発明の測定方法の工程（Ａ）は、少なくとも金属イオンとして金属塩（例えばＮｉＣｌ2、ＣｏＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＭｎＣｌ2）の存在下であることが好ましい。上記条件下で使用する金属塩の量は、例えば、下限が０．０１  ｍＭ以上、好ましくは０．１  ｍＭ以上、より好ましくは１．０  ｍＭ以上、さらに好ましくは２．０  ｍＭ以上、上限は特に設けないが好ましくは３０  ｍＭ以下、よりに好ましくは１０  ｍＭ以下である。
【００４６】
本発明の測定方法の工程（Ｂ）は、工程（Ａ）にて変換された試料中のＮＡＤの変化量を検出する方法である。ＮＡＤの変化量は公知の方法で検出することができる。一般的にはＮＡＤの変化に伴う吸光スペクトルや吸光強度の変化を装置を用いて光学的方法で検出する方法が例示され、ＮＡＤの酸化還元に伴う吸収スペクトルや特定波長における吸光強度の変化を検出する方法でもよい。ＮＡＤの酸化還元に伴う電位差を測定する場合は電極を使用することもできる。また、感度向上等を目的としてＮＡＤサイクリング反応を用いることもできる。
【００４７】
本発明の工程（Ｂ）は下記式（１）の酵素サイクリング法により反応せしめＮＡＤの変化量を定量する工程であり、使用する酵素サイクリング法は特に限定されないが、例えば特許第４１２７７６７号公報に記載されるようにサイクリング反応をさせることができる。このようにＮＡＤのサイクリング反応を用いてＮＡＤを定量する方法については、上記の方法に限定されず、公知の酵素サイクリング法であればいずれも採用することができる。
【００４８】
式（１）中の脱水素酵素の基質（式（１）中では、脱水素酵素基質と記載）としては、特に限定されないが、Ｌ−ラクテート、エタノール、グリセロール、グリセロール−３−ホスフェート、グルコース、Ｌ−マレート、Ｌ−グルタメイト、３α−ヒドロキシステロイド、および１２α−ヒドロキシステロイドが挙げられる。この中でも好ましくは、１２α−ヒドロキシステロイドであり、より好ましくはコール酸（塩）である。
【００４９】
脱水素酵素の基質の量は、１２α−ヒドロキシステロイドを使用する場合、使用するコール酸の量は、例えば、下限が０．０１  ｍＭ以上、好ましくは０．１  ｍＭ以上、より好ましくは０．２  ｍＭ以上、さらに好ましくは１．０  ｍＭ以上、上限は特に設けないが好ましくは１００  ｍＭ以下、よりに好ましくは５０  ｍＭ以下である。
【００５０】
式（１）中の脱水素酵素としては、脱水素酵素の基質を反応生成物に変換できる酵素であれば特に限定されず、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、グルタメイトデヒドロゲナーゼ、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、および１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが挙げられる。この中で好ましくは１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼである。
【００５１】
脱水素酵素の量は、１２α−ヒドロキシステロイドを使用する場合、使用する１２α−ヒドロキシステロイドの量は、例えば、下限が０．１  Ｕ／ｍＬ以上、好ましくは０．２  Ｕ／ｍＬ以上、より好ましくは１．０  Ｕ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２．０  Ｕ／ｍＬ以上、上限は特に設けないが好ましくは１００  Ｕ／ｍＬ以下、よりに好ましくは５０  Ｕ／ｍＬ以下である。
【００５２】
式（１）中の反応生成物としては、脱水素酵素の基質によって適宜変わるため特に限定されないが、例えば、ピルビン酸、アセトアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、ジヒドロキシアセトンホスフェート、グルコノ−δ−ラクトン、オキサロ酢酸、２−オキソグルタレイト、３−ケトステロイド、および１２−ケトステロイドが挙げられる。
【００５３】
式（１）中のテトラゾリウム塩としては、特に限定されないが、例えば、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム（ＷＳＴ−８）、２−（４−インドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム、２−（４−インドフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウムが挙げられる。この中で好ましくはＷＳＴ−８である。
【００５４】
テトラゾリウム塩の量は、ＷＳＴ−８を使用する場合、使用するＷＳＴ−８の量は、例えば、下限が０．０１  ｍＭ以上、好ましくは０．０２  ｍＭ以上、より好ましくは０．１  ｍＭ以上、さらに好ましくは０．２  ｍＭ以上、上限は特に設けないが好ましくは３０  ｍＭ以下、よりに好ましくは１０  ｍＭ以下である。
【００５５】
式（１）中の還元酵素としては、テトラゾリウム塩をホルマザン色素に変換できる還元酵素であれば特に限定されない。還元酵素は、好ましくはジアホラーゼ（ＤＩ）である。
【００５６】
還元酵素の量は、ＤＩを使用する場合、使用するＤＩの量は、例えば、下限が０．０１  Ｕ／ｍＬ以上、好ましくは０．１  Ｕ／ｍＬ以上、より好ましくは１．０  Ｕ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２．０  Ｕ／ｍＬ以上、上限は特に設けないが好ましくは５００  Ｕ／ｍＬ以下、よりに好ましくは３００  Ｕ／ｍＬ以下である。
【００５７】
式（１）中のホルマザン色素は、テトラゾリウム塩によって適宜変わるため特に限定されない。ホルマザン色素は、好ましくは水溶性ホルマザン色素である。
【００５８】
本発明は、下記の成分を含む、ＮＭＮの測定用組成物である。
（Ａ）本発明のタンパク質またはタンパク質組成物
（Ｂ）ＮＡＤをＮＡＤＨに変換せしめる脱水素酵素
（Ｃ）脱水素酵素の基質
（Ｄ）テトラゾリウム塩
（Ｅ）テトラゾリウム塩をホルマザン色素に変換せしめる還元酵素
【００５９】
（Ｂ）ＮＡＤをＮＡＤＨに変換せしめる脱水素酵素は、（Ｃ）脱水素酵素の基質、（Ｄ）テトラゾリウム塩、および（Ｅ）テトラゾリウム塩をホルマザン色素に変換せしめる還元酵素は、それぞれ、式（１）中の脱水素酵素、脱水素酵素の基質、テトラゾリウム塩、および還元酵素と同義である。
【００６０】
本発明は、本発明の測定用組成物を用いて、被検体由来の試料中のＮＭＮの量を算出する工程を含む、ＮＭＮが関与する疾患および／または状態を、診断および／または管理する方法である。
【００６１】
上述した本発明の測定用組成物は、ＮＭＮが関与する疾患および／または状態の測定用組成物であることもできる。
【００６２】
本発明の測定用組成物およびそれを用いた方法は、ＮＭＮが関与する疾患および／または状態を、高特異度及び高感度に診断および／または管理することができるものである。これらは、例えば、ＮＭＮが関与する疾患の疑いのある被験者のスクリーニングおよびＮＭＮが関与する疾患と診断されて治療を受けた患者の再発の管理に使用することができる。
【００６３】
本発明の測定用組成物におけるＮＭＮが関与する疾患および／または状態としては、例えばインスリン抵抗性、脂質異常症、糖尿病性腎症、アルツハイマー病が挙げられ、これらの疾患および／または状態を測定することができる。
【実施例】
【００６４】
［実施例１］
＜Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  ＤＳＭ５７９株由来ＮＭＮＡＴ組換え体酵素の製造＞
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  ＤＳＭ５７９株より染色体ＤＮＡを、フェノール・クロロホルム法にて抽出した。配列番号３に記載の塩基配列をセンスプライマー、配列番号４に記載の塩基配列をアンチセンスプライマーとして、ＫＯＤ  ＦＸ（品番：ＫＦＸ−１０１，東洋紡社製）を用いてＰＣＲを行い、約６００  ｂｐのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩ（品番：１１６１Ａ，タカラバイオ社製）とＨｉｎｄＩＩＩ（品番：１０６０Ａ，タカラバイオ社製）で消化し、発現ベクターであるｐＥＴ２１ａ（＋）ベクター（品番：６９７４０−３，Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入して、ＮＭＮＡＴ／ｐＥＴ２１ａ（＋）発現用プラスミドを得た。上記発現プラスミドをＯｎｅ  ｓｈｏｔ  ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（品番：Ｃ６０００−０３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に形質転換し、ＮＭＮＡＴをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体、ＮＭＮＡＴ／ｐＥＴ−２１ａ（＋）／ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。
【００６５】
［実施例２］
＜組換えＮＭＮＡＴの培養と可溶化＞
実施例１記載の形質転換体１コロニーを５０  μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地５  ｍＭに植菌し、試験管にて２５℃で１６時間培養してシードとした。上記のシードを５０  μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む液体培地（１％  グリセロール、２％  ソルビトール、３％  ミースト、１％  ラクトース、０．０５％  アデカノールＬＧ−１０９（ＡＤＥＫＡ社製））１．６  Ｌに１／１０００量植菌し、ジャーファーメンターにて２８℃、ｐＨ６．８、６５０  ｒｐｍの条件で２４時間培養した。同条件で２つのジャーファーメンターにて培養した（３．２  Ｌ培養）。２４時間後、培養液を遠心分離して集菌した後、菌体を１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解し、超音波発生器で破砕し、可溶化した。可溶化液を７０℃で３０分間反応させた後、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
【００６６】
［実施例３］
＜組換え体ＮＭＮＡＴの精製＞
実施例２で得られた粗酵素液を１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）溶液で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに吸着させた。その後０および０．５  Ｍ  塩化カリウムを含む１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）溶液を用いた１０  ＣＶ（Ｃｏｌｕｍｎ  Ｖｏｌｕｍｅ）のリニアグラジエントにより溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて組換え体ＮＭＮＡＴの溶出画分を確認した後、溶出画分の溶液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心式フィルターユニット（ミリポア社製）で濃縮し、３  Ｍ  塩化カリウムを添加した。３  Ｍ  塩化カリウムを添加したＮＭＮＡＴを含む溶液を、３  Ｍ  塩化カリウムを含む１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに吸着させ、３および０  Ｍ  塩化カリウムを含む１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液を用いた１０  ＣＶのリニアグラジエントにより溶出した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認後回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心式フィルターユニット（ミリポア社製）で濃縮した後、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）で脱塩した。脱塩したＮＭＮＡＴを含む溶液を１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）溶液で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに吸着させた。その後０および０．５  Ｍ  塩化カリウムを含む１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）溶液を用いた１０  ＣＶのリニアグラジエントにより溶出した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認後回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心式フィルターユニット（ミリポア社製）で濃縮した後、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で透析し、組換え体ＮＭＮＡＴ酵素溶液１４  ｍＬを得た。得られたＮＭＮＡＴ酵素溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行ったところ、２０ｋＤａと２９ｋＤａの間にＮＭＮＡＴのバンドが確認された。また、２８０  ｎｍの吸光度を用いてタンパク質濃度を計算したところ、３２．７  ｍｇ／ｍＬ（培養液３．２Ｌあたり）であり、培養液１ＬあたりのＮＭＮＡＴ生産量は１４３．１  ｍｇであった。
【００６７】
［実施例４］
＜組換え体ＮＭＮＡＴの熱安定性＞
実施例３で精製した組換え体ＮＭＮＡＴの熱安定性を調べるため、７０℃で１５分、３０分、４５分間インキュベーション後の残存活性を調べた。試薬の組成は以下の通りである。
＜Ｒ１試薬＞
１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）
１ｍＭ  ＭｇＣｌ2
１ｍＭ  β−ＮＭＮ
１ｍＭ  ＡＴＰ
２０Ｕ／ｍＬ  １２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
４ｍＭ  コール酸ナトリウム
（試料）
ＮＭＮＡＴを１０  ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて希釈し、ＮＭＮＡＴ溶液を作製した。作製したＮＭＮＡＴ溶液を４つに分注し、それぞれを、４℃保存、７０℃で１５分間インキュベート、７０℃で３０分間インキュベート、７０℃で４５分間インキュベートし、それぞれについて活性測定を行った。（活性測定）
活性の測定には７０８０形日立自動分析装置を使用した。測定パラメーターを以下に示す。
（７０８０形日立自動分析装置測定パラメーター）
分析方法              レートＡ
測定波長（副／主）    ４０５ｎｍ／３４０ｎｍ
反応時間              ５分
測光ポイント          １０−１３
試料量                ５μＬ
Ｒ１試薬量            １５０μＬ
（ＮＭＮＡＴ活性値算出方法）
ＮＭＮＡＴ活性値（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）
＝｛（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）／ＮＡＤＨミリモル吸光係数｝÷｛（試料量）／（試料量＋Ｒ１試薬量）｝
＝｛（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）／６．２２｝÷｛（試料量）／（試料量＋Ｒ１試薬量）｝÷１０００
５  μＬの試料と１５０  μＬのＲ１試薬を混合し、３７℃でインキュベートし反応を開始した。反応開始後３−４分（測光ポイント１０−１３）の試料の吸光度変化の値から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度変化の値を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出し、前記の式を用いてＮＭＮＡＴ活性値（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を算出した。４℃保存したＮＭＮＡＴの活性値を１００％とした時の各インキュベート時間（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ（ｍｉｎ））における残存活性率（Ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ（％））を図１に示した。
活性測定の結果、ＮＭＮＡＴ活性は７０℃で４５分間のインキュベーションを行った後でも９８％以上残存することが示された（図１）。
【００６８】
［実施例５］
＜組換え体ＮＭＮＡＴの金属塩の影響と比活性＞
実施例３で精製した組換え体ＮＭＮＡＴの金属塩の影響と比活性を調べるため、Ｒ１試薬中の金属塩の種類と濃度を変えて活性測定を行った。金属塩としてＮｉＣｌ2、ＣｏＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＭｎＣｌ2を使用し、濃度は１  ｍＭ、２  ｍＭ、４  ｍＭ、６  ｍＭ、８  ｍＭ、１０  ｍＭで測定を行った。試薬の組成は以下の通りである。
＜Ｒ１試薬＞
１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）
１〜１０ｍＭ  上記各金属塩
１ｍＭ  β−ＮＭＮ
１ｍＭ  ＡＴＰ
２０Ｕ／ｍＬ  １２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
４ｍＭ  コール酸ナトリウム
（試料）
１０  ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて希釈したＮＭＮＡＴ溶液。
（活性測定）
活性の測定には７０８０形日立自動分析装置を使用した。測定パラメーターを以下に示す。
（７０８０形日立自動分析装置測定パラメーター）
分析方法              レートＡ
測定波長（副／主）    ４０５ｎｍ／３４０ｎｍ
反応時間              ５分
測光ポイント          １０−１３
試料量                ５μＬ
Ｒ１試薬量            １５０μＬ
５  μＬの試料と１５０  μＬのＲ１試薬を混合し、３７℃でインキュベートし反応を開始した。反応開始後３−４分（測光ポイント１０−１３）の試料の吸光度変化の値から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度変化の値を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出し、前記の式を用いてＮＭＮＡＴ活性値（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を算出した。さらに、得られたＮＭＮＡＴ活性値（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を試料中ＮＭＮＡＴ溶液の濃度（ｍｇ／ｍＬ）で除算し、ＮＭＮＡＴ比活性（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）を算出した。各金属塩（Ｄｉｖａｌｅｎｔ  ｍｅｔａｌ）の種類と濃度におけるＮＭＮＡＴ比活性（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）を図２に示した。
図２に示す通り、４  ｍＭニッケルイオン存在下での組換え体ＮＭＮＡＴの比活性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は１９．２（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）であった。
【００６９】
［実施例６］
＜組換えＮＭＮＡＴの至適ｐＨ＞
実施例３で精製した組換え体ＮＭＮＡＴの至適ｐＨを調べるため、Ｒ１の緩衝液の種類とｐＨを変えて活性測定を行った。緩衝液として酢酸（ａｃｅｔａｔｅ）‐ＮａＯＨ（ｐＨ５．１〜６．０）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０〜７．９）、リン酸カリウム（Ｐｉｋ）緩衝液（ｐＨ６．３〜７．５）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７〜８．９）、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）‐ＮａＯＨ（ｐＨ８．９〜９．７）を使用した。試薬の組成は以下の通りである。
＜Ｒ１試薬＞
１００ｍＭ  各緩衝液（各ｐＨ）
１ｍＭ  ＮｉＣｌ2
１ｍＭ  β−ＮＭＮ
１ｍＭ  ＡＴＰ
２０Ｕ／ｍＬ  １２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
４ｍＭ  コール酸ナトリウム
（試料）
１０  ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて希釈したＮＭＮＡＴ溶液。
（活性測定）
活性の測定には７０８０形日立自動分析装置を使用した。測定パラメーターを以下に示す。
（７０８０形日立自動分析装置測定パラメーター）
分析方法              レートＡ
測定波長（副／主）    ４０５ｎｍ／３４０ｎｍ
反応時間              ５分
測光ポイント          １０−１３
試料量                ５μＬ
Ｒ１試薬量            １５０μＬ
５  μＬの試料と１５０  μＬのＲ１試薬を混合し、３７℃でインキュベートし反応を開始した。反応開始後３−４分（測光ポイント１０−１３）の試料の吸光度変化の値から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度変化の値を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出し、前記の式を用いてＮＭＮＡＴ活性値（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を算出した。もっとも高い活性を示したＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．８）の活性を１００％としたときの、各緩衝液の各ｐＨにおけるＮＭＮＡＴ活性の相対値（％）を図３に示した。至適ｐＨは７〜８であることが示された。
【００７０】
［実施例７］
＜ＮＭＮ測定試薬の検討＞
実施例３で精製した組換え体ＮＭＮＡＴを用いて、ＮＭＮ測定試薬を作製した。試薬の組成は以下のとおりである。
＜Ｒ１試薬＞
２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
４ｍＭ  ＮｉＣｌ2
１ｍＭ  ＡＴＰ
０．４ｍＭ  ＷＳＴ−８
１Ｕ／ｍＬ  組換えＮＭＮＡＴ
３０Ｕ／ｍＬ  １２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
＜Ｒ２試薬＞
２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
２４ｍＭ  コール酸ナトリウム
１８０Ｕ／ｍＬ  ジアホラーゼ
０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
（試料）
０〜１０  μＭ  β‐ＮＭＮ
（活性測定）
活性の測定には７１７０形日立自動分析装置を使用した。測定パラメーターを以下に示す。
（７１７０形日立自動分析装置測定パラメーター）
分析方法              レートＡ
測定波長（副／主）    ６００ｎｍ／４５０ｎｍ
反応時間              １０分
測光ポイント          ２６−３０
試料量                ５μＬ
Ｒ１試薬量            １５０μＬ
Ｒ２試薬量            ５０μＬ
５  μＬの試料と１５０  μＬのＲ１試薬を混合して３７℃で４．５分間インキュベートした後（測光ポイント１−１６）、５０  μＬのＲ２試薬を添加して反応を開始した（測光ポイント１７）。Ｒ２試薬の添加による反応開始後約３−４分（測光ポイント２６−３０）の試料の吸光度から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出した。β‐ＮＭＮの各濃度における４５０  ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ．）のタイムコース（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）を図４に、β‐ＮＭＮの各濃度（μＭ）における１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を図５に示した。
組換え体ＮＭＮＡＴを用いて、ＮＭＮ測定が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明により製造したＮＭＮＡＴは、試料中のＮＭＮを測定する測定キットの原料として使用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列番号１は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の遺伝子の塩基配列を示す。
配列番号３は、センスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４は、アンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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