(57)【要約】【課題】本発明は、ＴＦＰＩ阻害ペプチドを含む、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）に結合するペプチド、およびそれらの組成物を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、第１のペプチドおよび第２のペプチドを含むペプチド複合体であって、３０〜６０個のアミノ酸を含み、少なくとも２つの異なるＴＦＰＩエピトープに結合し、２つ以上のＴＦＰＩ機能を阻害する、ペプチド複合体等を提供する。本ペプチドは、ＴＦＰＩの阻害、凝固因子欠乏対象におけるトロンビン形成の向上、対象における血餅形成の増加、対象における血液凝固障害の治療、ＴＦＰＩの精製、およびＴＦＰＩ結合性化合物の特定のために使用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のペプチドおよび第２のペプチドを含むペプチド複合体であって、３０〜６０個のアミノ酸を含み、少なくとも２つの異なるＴＦＰＩエピトープに結合し、２つ以上のＴＦＰＩ機能を阻害する、ペプチド複合体。
【請求項２】
第１のペプチドおよび第２のペプチドを含むペプチド複合体であって、
（ａ）前記第１のペプチドが、式（ＸＩＩＩ）：
Ｘ６００１−Ｘ６００２−Ｘ６００３−Ｘ６００４−Ｘ６００５−Ｘ６００６−Ｘ６００７−Ｘ６００８−Ｘ６００９−Ｘ６０１０−Ｘ６０１１−Ｘ６０１２−Ｘ６０１３−Ｘ６０１４−Ｘ６０１５−Ｘ６０１６−Ｘ６０１７−Ｘ６０１８−Ｘ６０１９−Ｘ６０２０（ＸＩＩＩ）（配列番号３１５３）の構造を含み、
式中、Ｘ６００１は、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、Ｄｏｐａ、Ｂｈｆ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｎｍｆ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００２は、Ｑ、Ｇ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００３は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｓ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００４は、Ａｉｂ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ａ、Ｂｈｋ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ｋ、Ｎ、Ｎｍｋ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００５は、ａ、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、ＮプロピルＧ、ａｚｅ、ｐｉｐ、ｔｉｃ、ｏｉｃ、ｈｙｐ、ｎｍａ、Ｎｃｇ、Ａｂｇ、Ａｐｇ、ｔｈｚ、ｄｔｃ、Ｂａｌ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００６は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｃｉｔ、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ｅｃｌ、Ｅｅａ、Ｅｅｃ、Ｅｅｆ、Ｎｉｆ、Ｅｅｗ、Ａｉｂ、Ｂｔｑ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００７は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ｔｌｅ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎｍｖ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００８は、Ｆ、Ｈ、１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ｐｍｙ、Ｙ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００９は、Ａｉｂ、Ｖ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ａｂｕ、Ｃｐｇ、Ｔｌｅ、Ｌ−２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、Ａ、ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｎｍｄ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ａｉｂ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＮｍｆからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１１は、Ａ、ａ、Ｇ、ｐ、Ｓａｒ、ｃ、ｈｃｙ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｋ、Ｇ、およびＮｍｇからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１２は、Ｙ、Ｔｙｍ、Ｐｔｙ、Ｄｏｐａ、およびＰｍｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１３は、Ａｉｂ、Ｃ、Ｆ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１４は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｈｃｙ、Ｂｈｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１５は、Ｒ、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１６は、Ｌ、Ｈｃｙ、Ｈｌｅ、およびＡｍｌからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１７は、Ａ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｓ、Ｄｅｇ、Ｅｂｃ、Ｅｃａ、Ｅｇｚ、Ａｉｃ、Ａｐｃ、Ｅｇｔ、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｂｈｒ、Ｃｉｔ、Ｄ、Ｄａｐ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１８は、Ａ、Ａｉｂ、Ｈｃｙ、ｈｃｙ、Ｃ、ｃ、Ｌ、Ｎｌｅ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｂａｌ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１９は、Ｋ、Ｒ、Ｈａｒ、Ｂｈｋ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０２０は、Ｋ、Ｌ、Ｈｃｙ、Ａｍｌ、Ａｉｂ、Ｂｈｌ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎｍｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
（ｂ）前記第２のペプチドが、式（ＸＩＶ）：
Ｘ７００１−Ｘ７００２−Ｘ７００３−Ｘ７００４−Ｘ７００５−Ｘ７００６−［Ｘ７００７−Ｘ７００８−Ｘ７００９−Ｘ７０１０−Ｘ７０１１−Ｘ７０１２−Ｘ７０１３−Ｘ７０１４−Ｘ７０１５−Ｘ７０１６−Ｘ７０１７−Ｘ７０１８］−Ｘ７０１９−Ｘ７０２０−Ｘ７０２１−Ｘ７０２２−Ｘ７０２３（ＸＩＶ）（配列番号３１５４）の構造を含み、
式中、Ｘ７００１は、存在するか、または存在せず、Ｘ７００１が存在する場合、Ｘ７００１は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００２は、存在するか、または存在せず、Ｘ７００２が存在する場合、Ｘ７００２は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００３は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００５は、ＲまたはＷであり、
Ｘ７００６は、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００７は、Ｏｒｎ、ｈｏｍｏＫ、Ｃ、Ｈｃｙ、Ｄａｐ、およびＫからなる群から選択される、好ましくは、ＣおよびＨｃｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００８は、Ａ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００９は、ａ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、ｐ、Ｒ、Ｓｅｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１０は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１１は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１２は、Ａ、ａ、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、ｋ、Ｌ、ｌ、Ｍ、ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、ｎｌｅ、Ｐ、ｐ、Ｒ、ｒ、Ｓ、ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、ｔ、Ｖ、ｖ、Ｗ、およびｗからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１３は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｅａｇ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１８は、ＣおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＣであり、
Ｘ７０１９は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２０は、ＦおよびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２１は、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２３は、存在するか、または存在せず、Ｘ７０２３が存在する場合、Ｘ７０２３は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｄ、Ｅ、Ｅａｇ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
前記ペプチドは、Ｘ７００７とＸ７０１８との間の連結により生成される環状構造として含む、ペプチド複合体。
【請求項３】
Ｘ６００１は、１Ｎｉ、Ｂｔａ、Ｄｏｐａ、Ｆ、Ｌ、Ｙ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００２は、Ｑであり、
Ｘ６００３は、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、およびＣからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００４は、Ｋ、Ａｉｂ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｙ、Ｍ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００５は、ｐ、Ｎｍｇ、ＮプロピルＧ、ａｚｅ、ｐｉｐ、ｔｉｃ、ｏｉｃ、ｈｙｐ、ａ、Ａｉｂ、Ｄ、ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｃ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００６は、Ｃ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｎｌｅ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｉ、Ｃｉｔ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００７は、Ｔｌｅ、Ｖ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００８は、Ｈ、１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ｐｍｙ、Ｆ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００９は、Ｖ、Ａｂｕ、またはＴｌｅであり、
Ｘ６０１０は、Ｄ、Ｐ、Ｃ、Ｔ、Ａ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｆ、Ｈ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１１は、Ｇ、ａ、ｃ、ｈｃｙ、またはＳａｒであり、
Ｘ６０１２は、Ｙであり、
Ｘ６０１３は、Ｆ、１Ｎｉ、Ｂｔａ、およびＣからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１４は、Ａｉｂ、Ｃ、Ｅ、Ｈｃｙ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＡｉｂからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１５は、Ｒであり、
Ｘ６０１６は、Ｌ、Ａｍｌ、Ｈｌｅ、およびＨｃｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１７は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ａｉｃ、Ｅｃａ、Ｄｅｇ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｋ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１８は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ｌ、Ｈｃｙ、Ｎ、Ｍ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１９は、Ｋであり、
Ｘ６０２０は、Ｌ、Ａｍｌ、Ｈｃｙ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項２に記載のペプチド複合体。
【請求項４】
前記第１のペプチドおよび／または第２のペプチドは、Ｘ６００１および／またはＸ７００１に連結され、ＦＡＭ−Ｔｔｄｓ、ＰＥ、Ｐａｌｍ、２−フェニルアセチル、３−フェニルプロピオニル、２−（ナフタ−２−イル）アセチル、ヘキサノイル、２−メチルプロピオニル、３−メチルブタノイル、２−ナフチルスルホニル、１−ナフチルスルホニル、アセチル、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、ＡＯＡ、Ｏｘｍｅ−ＡＯＡ、Ｍｅｏｘ−Ｌｅｖ、レブリン酸（Ｌｅｖ）、およびペンチン酸（Ｐｙｎ）からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸（複数を含む）および／または部分をさらに含む、請求項２または請求項３に記載のペプチド複合体。
【請求項５】
前記第１のペプチドおよび／または第２のペプチドは、それぞれＸ６０２０に連結されたＸ６０２１またはＸ７０２３に連結されたＸ７０２４をさらに含み、Ｘ６０２１および／またはＸ７０２４は、Ｈｌｙ、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｅａｇ、Ｈｃｙ、Ｐｅｎ、Ｃ、ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−マレイミドプロピオニル（ＥｔＳＨ））、Ｋ（Ｔｄｔｓ−マレイミド）、Ｋ（ＡＯＡ）、Ｋ（Ｍｙｒ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ｍｙｒ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ｐａｌｍ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ａｃ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−γＧｌｕ−Ｍｙｒ）、Ｋ（ＡｌｂｕＴａｇ）、Ｋ（４ＰＢＳＡ）、Ｃｅａ、およびアミドからなる群から選択されるＣ末端アミノ酸（複数を含む）および／または部分を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項６】
Ｘ７００１は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００２は、Ｈ、Ｆ、Ｍ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００３は、ＦおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００４は、Ｋであり、
Ｘ７００５は、Ｗであり、
Ｘ７００６は、ＦおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００７は、Ｃであり、
Ｘ７００８は、Ａ、Ｇ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００９は、Ｍ、Ｓｅｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１０は、Ｋ、Ｐ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１１は、Ｄであり、
Ｘ７０１２は、Ｆ、Ｌ、ｌ、Ｍ、およびＳｅｍからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１３は、Ｄ、Ｇ、Ｋ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１４は、Ｇであり、
Ｘ７０１５は、ＩおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１６は、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓｅｍ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１７は、ＳおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１８は、Ｃであり、
Ｘ７０１９は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２０は、Ｗであり、
Ｘ７０２１は、Ｖであり、
Ｘ７０２２は、Ｆ、Ｌ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２３は、存在するか、または存在せず、Ｘ７０２３が存在する場合、Ｘ７０２３は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸配列であり、
前記ペプチドは、Ｘ７００７とＸ７０１８との間の連結により生成される環状構造として含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項７】
前記第１のペプチドおよび前記第２のペプチドは、好ましくは約１〜１００Åの長さであるリンカー部分によって連結される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項８】
前記リンカー部分は、約５〜５０Åの長さである、請求項７に記載のペプチド複合体。
【請求項９】
前記リンカー部分は、約１０〜３０Åの長さである、請求項８に記載のペプチド複合体。
【請求項１０】
前記リンカー部分は、構造Ｚ１−２０を含み、式中、Ｚは、アミノ酸、ヒドロキシ酸、エチレングリコール、プロピレングリコール、または前述のいずれかの組み合わせである、請求項７〜９のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項１１】
Ｚは、Ｇ、ｓ、Ｓ、ａ、Ａ、Ｂａｌ、Ｇａｂａ、Ａｈｘ、Ｔｔｄｓ、または前述のいずれかの組み合わせである、請求項１０に記載のペプチド複合体。
【請求項１２】
前記リンカー部分は、オキシム、ヒドラジド、スクシンイミド、チオエーテル、トリアゾール、第２級アミン、アミド、またはジスルフィドによって、前記第１のペプチドおよび／または前記第２のペプチドに結合される、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項１３】
前記第１のペプチドの前記Ｃ末端は、前記リンカー部分によって前記第２のペプチドの前記Ｎ末端に連結される、請求項７〜１２のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項１４】
前記第１のペプチドは、式（ＸＩＩＩ）の構造を含み、リンカー部分は、前記Ｎ末端、前記Ｃ末端、またはＸ６００１、Ｘ６００４、Ｘ６００６、Ｘ６０１０、Ｘ６０１４、もしくはＸ６０２０の側鎖で、前記第１のペプチドに結合する、請求項７〜１３のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項１５】
前記第１のペプチドは、配列番号１７８または配列番号４２６１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項１６】
前記第２のペプチドは、配列番号１０４４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項１７】
前記アミノ酸配列は、配列番号４２６０に示される、請求項１または請求項２に記載のペプチド複合体。
【請求項１８】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ結合ドメイン、抗体もしくはその断片、ヒドロキシエチルデンプン、プロリン−アラニン−セリン多量体（ＰＡＳ化）、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸、またはポリシアル酸に共役される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項１９】
ＴＦＰＩ阻害剤であって、
アミノ酸残基Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５によって画定される第１の結合部位、ならびに
アミノ酸残基Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６によって画定される第２の結合部位で、ヒトＴＦＰＩに結合する、ＴＦＰＩ阻害剤。
【請求項２０】
前記第１の結合部位は、アミノ酸残基Ａ２７、Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｋ３６、Ｉ３８、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５によって画定される、請求項１９に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【請求項２１】
前記第１の結合部位は、アミノ酸残基Ａ２７、Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｋ３６、Ａ３７、Ｉ３８、Ｆ４４、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５によって画定される、請求項２０に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【請求項２２】
ペプチドである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【請求項２３】
リンカー部分によって連結される第１のペプチドおよび第２のペプチドを含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【請求項２４】
前記リンカー部分は、約１〜１００Åの長さ、約５〜５０Å、または約１０〜３０Åの長さである、請求項２３に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【請求項２５】
前記リンカー部分は、構造Ｚ１−２０を含み、式中、Ｚは、アミノ酸、ヒドロキシ酸、エチレングリコール、プロピレングリコール、または前述のいずれかの組み合わせである、請求項２３または請求項２４に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【請求項２６】
Ｚは、Ｇ、ｓ、Ｓ、ａ、Ａ、Ｂａｌ、Ｇａｂａ、Ａｈｘ、Ｔｔｄｓ、または前述のいずれかの組み合わせである、請求項２５に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【請求項２７】
対象の治療のための方法における使用のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のペプチド複合体または請求項１９〜２６のいずれか一項に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【請求項２８】
前記方法は、血液凝固障害の治療のための方法である、請求項２７に記載のペプチド複合体またはＴＦＰＩ阻害剤。
【請求項２９】
医薬の製造のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のペプチド複合体または請求項１９〜２６のいずれか一項に記載のＴＦＰＩ阻害剤の使用。
【請求項３０】
血液凝固障害の治療のための医薬の製造のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のペプチド複合体または請求項１９〜２６のいずれか一項に記載のＴＦＰＩ阻害剤の使用。
【請求項３１】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のペプチド複合体または請求項１９〜２６のいずれか一項に記載のＴＦＰＩ阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項３２】
前記組成物は、さらなる薬学的に効果的な薬剤を含む、請求項３１に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
血液凝固障害を治療する方法における使用のための、請求項３１に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
疾患に罹患している、または疾患に罹患する危険性のある対象を治療するための方法であって、前記対象に、請求項３１に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３５】
前記疾患は、血液凝固障害である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＴＦＰＩ結合性化合物を識別するための方法であって、（ａ）ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）およびＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）を含むペプチドを、試験化合物と接触させること並びに、（ｂ）ヒトＴＦＰＩ残基Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６に対応するＫＤ１−ＫＤ２アミノ酸残基によって画定されるＴＦＰＩ結合部位に対する、前記試験化合物の結合を検出することと、を含む、方法。
【請求項３７】
ステップ（ｂ）は、ヒトＴＦＰＩ残基Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５に対応するＫＤ１アミノ酸残基によって画定されるＴＦＰＩ結合部位に対する、前記試験化合物の結合を検出することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＴＦＰＩ結合部位は、ヒトＴＦＰＩ残基Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、Ｉ５５Ａ２７、Ｄ３１、Ｋ３６、Ａ３７、Ｉ３８、Ｆ４４、およびＩ４６に対応するＫＤ１アミノ酸残基によって画定される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
配列番号１３３７〜１３５５および４２４０〜４２６８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ペプチド。
【請求項４０】
セリンプロテアーゼによるＴＦＰＩの分解を阻害するための方法であって、ＴＦＰＩを、式（ＸＩＶ）：
Ｘ７００１−Ｘ７００２−Ｘ７００３−Ｘ７００４−Ｘ７００５−Ｘ７００６−［Ｘ７００７−Ｘ７００８−Ｘ７００９−Ｘ７０１０−Ｘ７０１１−Ｘ７０１２−Ｘ７０１３−Ｘ７０１４−Ｘ７０１５−Ｘ７０１６−Ｘ７０１７−Ｘ７０１８］−Ｘ７０１９−Ｘ７０２０−Ｘ７０２１−Ｘ７０２２−Ｘ７０２３（ＸＩＶ）（配列番号３１５４）の構造を有するペプチドと接触させることを含み、
式中、Ｘ７００１は、存在するか、または存在せず、Ｘ７００１が存在する場合、Ｘ７００１は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００２は、存在するか、または存在せず、Ｘ７００２が存在する場合、Ｘ７００２は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００３は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００５は、ＲまたはＷであり、
Ｘ７００６は、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００７は、Ｏｒｎ、ｈｏｍｏＫ、Ｃ、Ｈｃｙ、Ｄａｐ、およびＫからなる群から選択される、好ましくは、ＣおよびＨｃｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００８は、Ａ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００９は、ａ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、ｐ、Ｒ、Ｓｅｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１０は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１１は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１２は、Ａ、ａ、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、ｋ、Ｌ、ｌ、Ｍ、ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、ｎｌｅ、Ｐ、ｐ、Ｒ、ｒ、Ｓ、ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、ｔ、Ｖ、ｖ、Ｗ、およびｗからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１３は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｅａｇ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１８は、ＣおよびＤ、好ましくはＣからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１９は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２０は、ＦおよびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２１は、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２３は、存在するか、または存在せず、Ｘ７０２３が存在する場合、Ｘ７０２３は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｄ、Ｅ、Ｅａｇ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
前記ペプチドは、Ｘ７００７とＸ７０１８との間の連結により生成される環状構造として含み、それによって、前記セリンプロテアーゼによるＴＦＰＩの分解が阻害される、方法。
【請求項４１】
Ｘ７００１は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００２は、Ｈ、Ｆ、Ｍ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００３は、ＦおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００４は、Ｋであり、
Ｘ７００５は、Ｗであり、
Ｘ７００６は、ＦおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００７は、Ｃであり、
Ｘ７００８は、Ａ、Ｇ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００９は、Ｍ、Ｓｅｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１０は、Ｋ、Ｐ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１１は、Ｄであり、
Ｘ７０１２は、Ｆ、Ｌ、ｌ、Ｍ、およびＳｅｍからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１３は、Ｄ、Ｇ、Ｋ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１４は、Ｇであり、
Ｘ７０１５は、ＩおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１６は、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓｅｍ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１７は、ＳおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１８は、Ｃであり、
Ｘ７０１９は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２０は、Ｗであり、
Ｘ７０２１は、Ｖであり、
Ｘ７０２２は、Ｆ、Ｌ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２３は、存在するか、または存在せず、Ｘ７０２３が存在する場合、Ｘ７０２３は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸配列であり、
前記ペプチドは、Ｘ７００７とＸ７０１８との間の連結により生成される環状構造として含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ペプチドは、式（ＸＩＩＩ）：
Ｘ６００１−Ｘ６００２−Ｘ６００３−Ｘ６００４−Ｘ６００５−Ｘ６００６−Ｘ６００７−Ｘ６００８−Ｘ６００９−Ｘ６０１０−Ｘ６０１１−Ｘ６０１２−Ｘ６０１３−Ｘ６０１４−Ｘ６０１５−Ｘ６０１６−Ｘ６０１７−Ｘ６０１８−Ｘ６０１９−Ｘ６０２０（ＸＩＩＩ）（配列番号３１５３）の構造を含むペプチドをさらに含むペプチド複合体の一部であって、
式中、Ｘ６００１は、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、Ｄｏｐａ、Ｂｈｆ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｎｍｆ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００２は、Ｑ、Ｇ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００３は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｓ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００４は、Ａｉｂ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ａ、Ｂｈｋ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ｋ、Ｎ、Ｎｍｋ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００５は、ａ、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、ＮプロピルＧ、ａｚｅ、ｐｉｐ、ｔｉｃ、ｏｉｃ、ｈｙｐ、ｎｍａ、Ｎｃｇ、Ａｂｇ、Ａｐｇ、ｔｈｚ、ｄｔｃ、Ｂａｌ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００６は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｃｉｔ、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ｅｃｌ、Ｅｅａ、Ｅｅｃ、Ｅｅｆ、Ｎｉｆ、Ｅｅｗ、Ａｉｂ、Ｂｔｑ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００７は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ｔｌｅ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎｍｖ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００８は、Ｆ、Ｈ、１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ｐｍｙ、Ｙ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００９は、Ａｉｂ、Ｖ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ａｂｕ、Ｃｐｇ、Ｔｌｅ、Ｌ−２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、Ａ、ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｎｍｄ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ａｉｂ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＮｍｆからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１１は、Ａ、ａ、Ｇ、ｐ、Ｓａｒ、ｃ、ｈｃｙ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｋ、Ｇ、およびＮｍｇからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１２は、Ｙ、Ｔｙｍ、Ｐｔｙ、Ｄｏｐａ、およびＰｍｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１３は、Ａｉｂ、Ｃ、Ｆ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１４は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｈｃｙ、Ｂｈｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１５は、Ｒ、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１６は、Ｌ、Ｈｃｙ、Ｈｌｅ、およびＡｍｌからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１７は、Ａ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｓ、Ｄｅｇ、Ｅｂｃ、Ｅｃａ、Ｅｇｚ、Ａｉｃ、Ａｐｃ、Ｅｇｔ、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｂｈｒ、Ｃｉｔ、Ｄ、Ｄａｐ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１８は、Ａ、Ａｉｂ、Ｈｃｙ、ｈｃｙ、Ｃ、ｃ、Ｌ、Ｎｌｅ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｂａｌ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１９は、Ｋ、Ｒ、Ｈａｒ、Ｂｈｋ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０２０は、Ｋ、Ｌ、Ｈｃｙ、Ａｍｌ、Ａｉｂ、Ｂｈｌ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎｍｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記プロテアーゼは、エラスターゼ、トロンビン、プラスミン、ＦＸａ、またはキマーゼである、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）に結合するペプチドおよびその使用に関する。
関連出願の相互参照および参照による援用
【０００２】
本出願は、２０１２年３月２１日出願の米国仮特許出願第６１／６１３，８６５号の利益を主張し、これは、参照することによりその全体が本明細書において援用される。以下の出願もまた、参照することによりそれらの全体が本明細書において援用される：２００８年１２月１９日出願の米国仮特許出願第６１／１３９，２７２号、２００９年１２月２１日出願の米国特許出願第１２／６４３，８１８号、２００９年１２月２１日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６９０６０号、２０１０年３月１９日出願の米国仮特許出願第６１／３１５，７５８号、２０１１年２月１１日出願の米国特許出願第１３／０２６，０７０号、および２０１１年２月１１日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２４６０４号。
【０００３】
本明細書と同時に提出されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、参照することによりその全体が組み込まれ、これは、２０１３年１月３１日に作成された「４４２４１Ｅ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名前がつけられた１，２４８，６００バイトのＡＳＣＩＩテキストファイルとして特定される。
【背景技術】
【０００４】
止血は、血液凝固因子が媒介する一連の事象がプロトロンビンからトロンビンへの変換をもたらす、複雑な凝固カスケードに依存する。第Ｘ因子（ＦＸ）活性化は、凝固カスケードの内因性および外因性経路の両方の中心的事象である。外因性経路は、凝固カスケードの主要な活性化因子として提案されている（Ｍａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｃａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２７，１６８７−１６９３（２００７））。循環する組織因子（ＴＦ）および活性化された第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）は、相互作用して「外因性複合体」を形成し、これがＦＸの活性化を媒介する。凝固カスケードは、内因性経路により増幅され、その間に、第ＸＩＩ因子、第ＸＩ因子、第ＩＸ因子、および第ＶＩＩＩ因子の連続的活性化が、ＦＸ活性化も媒介する「内因性」ＦＩＸａ−ＦＶＩＩＩａ複合体の形成をもたらす。活性化されたＦＸは、身体がフィブリンを形成し効果的に出血を抑制するために必要なトロンビン形成を促進する。
【０００５】
血友病等の重度の出血性障害は、血液凝固カスケードの途絶により引き起こされる。血友病の最も一般的な型である血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子の欠乏に起因し、一方、血友病Ｂは、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の欠乏に関連している。血友病Ｃは、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）の欠乏により引き起こされる（Ｃａｗｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９１（１２），４５８１−４５９２（１９９８））。現在、血友病および他の凝固疾患の治療法はない。因子補充療法は、血液凝固障害の最も一般的な治療法である。しかしながら、血液凝固因子は、典型的には、投与後すぐに血流から除去される。効果的であるためには、患者は血漿由来または組み換え因子濃縮物の頻繁な静脈内注入を受けなければならず、これは不快であり、臨床上の設定を必要とし、高価で時間を要する。さらに、因子補充療法の治療有効性は、阻害抗体の形成後に劇的に減少し得る。重度の血友病Ａに罹患した患者の約３０％は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を中和する阻害抗体を発現する（Ｐｅｅｒｌｉｎｃｋ  ａｎｄ  Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１２，５７９−５９０（２００６））。抗因子抗体を有する患者に対する治療オプションはほとんどない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、当該分野において、血液凝固障害を治療するための組成物および方法が必要とされている。本発明は、そのような組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えば、第１のペプチドおよび第２のペプチドを含むペプチド複合体を含み、このペプチド複合体は、３０〜６０個のアミノ酸を含む。様々な実施形態において、本明細書に記載される２つ以上のペプチド（例えば、式（Ｉ）〜（ＸＩＶ）のいずれかによって包含されるペプチド）は、ペプチド複合体（例えば、２つのペプチド（同じであっても、異なっていてもよい）を含む二量体、３つのペプチド（これらのうちの２つ以上は、同じであっても、異なっていてもよい）を含む三量体等）を作製するために連結されるか、または融合される。様々な実施形態において、ペプチド複合体は、少なくとも２つの異なるＴＦＰＩエピトープに結合し、随意に、ＴＦＰＩの少なくとも２つの機能を阻害する。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドまたはペプチド複合体は、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、および／またはＦＸＩの非存在下で、ＴＦＰＩ−１（例えば、ＴＦＰＩ−１α）に結合し、随意に、ＴＦＰＩ制御トロンビン生成を改善する。ペプチド複合体を含む組成物（例えば、薬学的組成物）もまた提供される。
【０００８】
さらに、本発明は、本発明のペプチドまたはペプチド複合体を使用する方法を提供する。例えば、本発明は、ＴＦＰＩを阻害する方法を提供し、本方法は、ＴＦＰＩを本明細書に記載のペプチドと接触させることを含む。本発明はまた、凝固因子欠乏対象におけるトロンビン形成を向上させる方法、対象における血餅形成を増加させる方法、および対象における血液凝固障害を治療する方法を提供する。本方法は、全体的に、本明細書において、例えば「本発明の方法」とも呼ばれる。本方法は、所望の効果を達成するのに効果的な量、例えば、トロンビン形成を向上させるのに効果的な量、血餅形成を向上させるのに効果的な量、または対象における血液凝固障害を治療するのに効果的な量で、本明細書に提供されるペプチドまたはペプチド複合体を対象に投与することを含む。本発明のさらなる態様は、医薬の製造のための本発明のペプチドの使用、ＴＦＰＩを示す細胞を標的とするための方法、疾患に罹患している、または疾患に罹患する危険性のある対象を治療または診断するための方法、ＴＦＰＩを精製する方法、およびＴＦＰＩ結合性化合物を識別する方法を含む。逆の意味が明示的に示されない限り、本発明の１つのペプチドまたは本発明の方法に関して本明細書に提供される説明は、それぞれ、ありとあらゆる本発明のペプチドおよび本発明の方法に適用される。また、逆の意味が明示的に示されない限り、本発明のペプチドまたはその使用に関して本明細書に提供される説明は、本発明のペプチド複合体に適用される。
【０００９】
本発明はまた、アミノ酸残基Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５によって画定される第１の結合部位、ならびにアミノ酸残基Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６によって画定される第２の結合部位で、ヒトＴＦＰＩに結合するＴＦＰＩ阻害剤も含む。ＴＦＰＩ結合性化合物を識別するための方法もまた提供される。本方法は、（ａ）ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）およびＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）を含むペプチドを、試験化合物と接触させることと、（ｂ）ヒトＴＦＰＩ残基Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６に対応するＫＤ１−ＫＤ２アミノ酸残基によって画定されるＴＦＰＩ結合部位に対する、試験化合物の結合を検出することと、を含む。
【００１０】
以下の番号を付した項は、それぞれ、本発明の１つ以上の例示的変形例を簡潔に定義する。
【００１１】
項１．第１のペプチドおよび第２のペプチドを含むペプチド複合体であって、３０〜６０個のアミノ酸を含み、少なくとも２つの異なるＴＦＰＩエピトープに結合し、２つ以上のＴＦＰＩ機能を阻害する、ペプチド複合体。
【００１２】
項２．第１のペプチドおよび第２のペプチドを含むペプチド複合体であって、
（ａ）第１のペプチドは、式（ＸＩＩＩ）：
Ｘ６００１−Ｘ６００２−Ｘ６００３−Ｘ６００４−Ｘ６００５−Ｘ６００６−Ｘ６００７−Ｘ６００８−Ｘ６００９−Ｘ６０１０−Ｘ６０１１−Ｘ６０１２−Ｘ６０１３−Ｘ６０１４−Ｘ６０１５−Ｘ６０１６−Ｘ６０１７−Ｘ６０１８−Ｘ６０１９−Ｘ６０２０（ＸＩＩＩ）（配列番号３１５３）の構造を含み、
式中、Ｘ６００１は、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、Ｄｏｐａ、Ｂｈｆ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｎｍｆ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００２は、Ｑ、Ｇ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００３は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｓ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００４は、Ａｉｂ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ａ、Ｂｈｋ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ｋ、Ｎ、Ｎｍｋ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００５は、ａ、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、ＮプロピルＧ、ａｚｅ、ｐｉｐ、ｔｉｃ、ｏｉｃ、ｈｙｐ、ｎｍａ、Ｎｃｇ、Ａｂｇ、Ａｐｇ、ｔｈｚ、ｄｔｃ、Ｂａｌ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００６は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｃｉｔ、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ｅｃｌ、Ｅｅａ、Ｅｅｃ、Ｅｅｆ、Ｎｉｆ、Ｅｅｗ、Ａｉｂ、Ｂｔｑ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００７は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ｔｌｅ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｎｍｖ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００８は、Ｆ、Ｈ、１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ｐｍｙ、Ｙ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００９は、Ａｉｂ、Ｖ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ａｂｕ、Ｃｐｇ、Ｔｌｅ、Ｌ−２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、Ａ、ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｎｍｄ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ａｉｂ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＮｍｆからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１１は、Ａ、ａ、Ｇ、ｐ、Ｓａｒ、ｃ、ｈｃｙ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｋ、Ｇ、およびＮｍｇからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１２は、Ｙ、Ｔｙｍ、Ｐｔｙ、Ｄｏｐａ、およびＰｍｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１３は、Ａｉｂ、Ｃ、Ｆ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１４は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｈｃｙ、Ｂｈｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１５は、Ｒ、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１６は、Ｌ、Ｈｃｙ、Ｈｌｅ、およびＡｍｌからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１７は、Ａ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｓ、Ｄｅｇ、Ｅｂｃ、Ｅｃａ、Ｅｇｚ、Ａｉｃ、Ａｐｃ、Ｅｇｔ、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｂｈｒ、Ｃｉｔ、Ｄ、Ｄａｐ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１８は、Ａ、Ａｉｂ、Ｈｃｙ、ｈｃｙ、Ｃ、ｃ、Ｌ、Ｎｌｅ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｂａｌ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１９は、Ｋ、Ｒ、Ｈａｒ、Ｂｈｋ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０２０は、Ｋ、Ｌ、Ｈｃｙ、Ａｍｌ、Ａｉｂ、Ｂｈｌ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎｍｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
（ｂ）第２のペプチドは、式（ＸＩＶ）：
Ｘ７００１−Ｘ７００２−Ｘ７００３−Ｘ７００４−Ｘ７００５−Ｘ７００６−［Ｘ７００７−Ｘ７００８−Ｘ７００９−Ｘ７０１０−Ｘ７０１１−Ｘ７０１２−Ｘ７０１３−Ｘ７０１４−Ｘ７０１５−Ｘ７０１６−Ｘ７０１７−Ｘ７０１８］−Ｘ７０１９−Ｘ７０２０−Ｘ７０２１−Ｘ７０２２−Ｘ７０２３（ＸＩＶ）（配列番号３１５４）の構造を含み、
式中、Ｘ７００１は、存在するか、または存在せず、Ｘ７００１が存在する場合、Ｘ７００１は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００２は、存在するか、または存在せず、Ｘ７００２が存在する場合、Ｘ７００２は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００３は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００５は、ＲまたはＷであり、Ｘ７００６は、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００７は、Ｏｒｎ、ｈｏｍｏＫ、Ｃ、Ｈｃｙ、Ｄａｐ、およびＫからなる群から選択される、好ましくは、ＣおよびＨｃｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００８は、Ａ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００９は、ａ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、ｐ、Ｒ、Ｓｅｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１０は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１１は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１２は、Ａ、ａ、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、ｋ、Ｌ、ｌ、Ｍ、ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、ｎｌｅ、Ｐ、ｐ、Ｒ、ｒ、Ｓ、ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、ｔ、Ｖ、ｖ、Ｗ、およびｗからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１３は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｅａｇ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１８は、ＣおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくは、Ｃであり、Ｘ７０１９は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２０は、ＦおよびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２１は、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２３は、存在するか、または存在せず、Ｘ７０２３が存在する場合、Ｘ７０２３は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｄ、Ｅ、Ｅａｇ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、ペプチドは、Ｘ７００７とＸ７０１８との間の連結により生成される環状構造として含む、ペプチド複合体。
【００１３】
項３．
Ｘ６００１は、１Ｎｉ、Ｂｔａ、Ｄｏｐａ、Ｆ、Ｌ、Ｙ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００２は、Ｑであり、Ｘ６００３は、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、およびＣからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００４は、Ｋ、Ａｉｂ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｙ、Ｍ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００５は、ｐ、Ｎｍｇ、ＮプロピルＧ、ａｚｅ、ｐｉｐ、ｔｉｃ、ｏｉｃ、ｈｙｐ、ａ、Ａｉｂ、Ｄ、ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｃ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００６は、Ｃ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｎｌｅ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｉ、Ｃｉｔ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００７は、Ｔｌｅ、Ｖ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００８は、Ｈ、１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ｐｍｙ、Ｆ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００９は、Ｖ、Ａｂｕ、またはＴｌｅであり、Ｘ６０１０は、Ｄ、Ｐ、Ｃ、Ｔ、Ａ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｆ、Ｈ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１１は、Ｇ、ａ、ｃ、ｈｃｙ、またはＳａｒであり、Ｘ６０１２は、Ｙであり、Ｘ６０１３は、Ｆ、１Ｎｉ、Ｂｔａ、およびＣからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１４は、Ａｉｂ、Ｃ、Ｅ、Ｈｃｙ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＡｉｂからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１５は、Ｒであり、Ｘ６０１６は、Ｌ、Ａｍｌ、Ｈｌｅ、およびＨｃｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１７は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ａｉｃ、Ｅｃａ、Ｄｅｇ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｋ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１８は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ｌ、Ｈｃｙ、Ｎ、Ｍ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１９は、Ｋであり、Ｘ６０２０は、Ｌ、Ａｍｌ、Ｈｃｙ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸である、項２に記載のペプチド複合体。
【００１４】
項４．第１のペプチドおよび／または第２のペプチドは、Ｘ６００１および／またはＸ７００１に連結され、ＦＡＭ−Ｔｔｄｓ、ＰＥ、Ｐａｌｍ、２−フェニルアセチル、３−フェニルプロピオニル、２−（ナフタ−２−イル）アセチル、ヘキサノイル、２−メチルプロピオニル、３−メチルブタノイル、２−ナフチルスルホニル、１−ナフチルスルホニル、アセチル、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、ＡＯＡ、Ｏｘｍｅ−ＡＯＡ、Ｍｅｏｘ−Ｌｅｖ、レブリン酸（Ｌｅｖ）、およびペンチン酸（Ｐｙｎ）からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸（複数を含む）および／または部分をさらに含む、項２または項３に記載のペプチド複合体。
【００１５】
項５．第１のペプチドおよび／または第２のペプチドは、それぞれＸ６０２０に連結されたＸ６０２１またはＸ７０２３に連結されたＸ７０２４をさらに含み、Ｘ６０２１および／またはＸ７０２４は、Ｈｌｙ、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｅａｇ、Ｈｃｙ、Ｐｅｎ、Ｃ、ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−マレイミドプロピオニル（ＥｔＳＨ））、Ｋ（Ｔｄｔｓ−マレイミド）、Ｋ（ＡＯＡ）、Ｋ（Ｍｙｒ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ｍｙｒ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ｐａｌｍ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ａｃ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−γＧｌｕ−Ｍｙｒ）、Ｋ（ＡｌｂｕＴａｇ）、Ｋ（４ＰＢＳＡ）、Ｃｅａ、およびアミドからなる群から選択されるＣ末端アミノ酸（複数を含む）および／または部分を含む、項２〜４のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【００１６】
項６．
Ｘ７００１は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００２は、Ｈ、Ｆ、Ｍ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００３は、ＦおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００４は、Ｋであり、Ｘ７００５は、Ｗであり、Ｘ７００６は、ＦおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００７は、Ｃであり、Ｘ７００８は、Ａ、Ｇ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００９は、Ｍ、Ｓｅｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１０は、Ｋ、Ｐ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１１は、Ｄであり、Ｘ７０１２は、Ｆ、Ｌ、ｌ、Ｍ、およびＳｅｍからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１３は、Ｄ、Ｇ、Ｋ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１４は、Ｇであり、Ｘ７０１５は、ＩおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１６は、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓｅｍ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１７は、ＳおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１８は、Ｃであり、Ｘ７０１９は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２０は、Ｗであり、Ｘ７０２１は、Ｖであり、Ｘ７０２２は、Ｆ、Ｌ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２３は、存在するか、または存在せず、Ｘ７０２３が存在する場合、Ｘ７０２３は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ペプチドは、Ｘ７００７とＸ７０１８との間の連結により生成される環状構造として含む、項２〜５のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【００１７】
項７．第１のペプチドおよび第２のペプチドは、好ましくは約１〜１００Åの長さであるリンカー部分によって連結される、項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【００１８】
項８．リンカー部分は、約５〜５０Åの長さである、項７に記載のペプチド複合体。
【００１９】
項９．リンカー部分は、約１０〜３０Åの長さである、項８に記載のペプチド複合体。
【００２０】
項１０．リンカー部分は、構造Ｚ１−２０を含み、式中、Ｚは、アミノ酸、ヒドロキシ酸、エチレングリコール、プロピレングリコール、または前述のいずれかの組み合わせである、項７〜９のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【００２１】
項１１．Ｚは、Ｇ、ｓ、Ｓ、ａ、Ａ、Ｂａｌ、Ｇａｂａ、Ａｈｘ、Ｔｔｄｓ、または前述のいずれかの組み合わせである、項１０に記載のペプチド複合体。
【００２２】
項１２．リンカー部分は、オキシム、ヒドラジド、スクシンイミド、チオエーテル、トリアゾール、第２級アミン、アミド、またはジスルフィドによって、第１のペプチドおよび／または第２のペプチドに結合される、項７〜１１のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【００２３】
項１３．第１のペプチドのＣ末端は、リンカー部分によって第２のペプチドのＮ末端に連結される、項７〜１２のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【００２４】
項１４．第１のペプチドは、式（ＸＩＩＩ）の構造を含み、リンカー部分は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＸ６００１、Ｘ６００４、Ｘ６００６、Ｘ６０１０、Ｘ６０１４、もしくはＸ６０２０の側鎖で、第１のペプチドに結合する、項７〜１３のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【００２５】
項１５．第１のペプチドは、配列番号１７８または配列番号４２６１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【００２６】
項１６．第２のペプチドは、配列番号１０４４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【００２７】
項１７．アミノ酸配列は、配列番号４２６０に示される、項１または項２に記載のペプチド複合体。
【００２８】
項１８．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ結合ドメイン、抗体もしくはその断片、ヒドロキシエチルデンプン、プロリン−アラニン−セリン多量体（ＰＡＳ化）、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸、またはポリシアル酸に共役される、項１〜１７のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【００２９】
項１９．ＴＦＰＩ阻害剤であって、アミノ酸残基Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５によって画定される第１の結合部位、ならびにアミノ酸残基Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６によって画定される第２の結合部位で、ヒトＴＦＰＩに結合する、ＴＦＰＩ阻害剤。
【００３０】
項２０．第１の結合部位は、アミノ酸残基Ａ２７、Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｋ３６、Ｉ３８、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５によって画定される、項１９に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【００３１】
項２１．第１の結合部位は、アミノ酸残基Ａ２７、Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｋ３６、Ａ３７、Ｉ３８、Ｆ４４、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５によって画定される、項２０に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【００３２】
項２２．ペプチドである、項１９〜２１のいずれか一項に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【００３３】
項２３．リンカー部分によって連結される第１のペプチドおよび第２のペプチドを含む、項１９〜２１のいずれか一項に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【００３４】
項２４．リンカー部分は、約１〜１００Åの長さ、約５〜５０Å、または約１０〜３０Åの長さである、項２３に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【００３５】
項２５．リンカー部分は、構造Ｚ１−２０を含み、式中、Ｚは、アミノ酸、ヒドロキシ酸、エチレングリコール、プロピレングリコール、または前述のいずれかの組み合わせである、項２３または項２４に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【００３６】
項２６．Ｚは、Ｇ、ｓ、Ｓ、ａ、Ａ、Ｂａｌ、Ｇａｂａ、Ａｈｘ、Ｔｔｄｓ、または前述のいずれかの組み合わせである、項２５に記載のＴＦＰＩ阻害剤。
【００３７】
項２７．対象の治療のための方法における使用のための、項１〜１８のいずれか一項に記載のペプチド複合体または項１９〜２６のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【００３８】
項２８．本方法は、血液凝固障害の治療のための方法である、項２７に記載のペプチド複合体またはＴＦＰＩ阻害剤。
【００３９】
項２９．医薬の製造のための、項１〜１８のいずれか一項に記載のペプチド複合体または項１９〜２６のいずれか一項に記載のＴＦＰＩ阻害剤の使用。
【００４０】
項３０．血液凝固障害の治療のための医薬の製造のための、項１〜１８のいずれか一項に記載のペプチド複合体または項１９〜２６のいずれか一項に記載のＴＦＰＩ阻害剤の使用。
【００４１】
項３１．項１〜１８のいずれか一項に記載のペプチド複合体または項１９〜２６のいずれか一項に記載のＴＦＰＩ阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【００４２】
項３２．組成物は、さらなる薬学的に効果的な薬剤を含む、項３１に記載の薬学的組成物。
【００４３】
項３３．血液凝固障害を治療する方法における使用のための、項３１に記載の薬学的組成物。
【００４４】
項３４．疾患に罹患している、または疾患に罹患する危険性のある対象を治療するための方法であって、対象に、項３１に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
【００４５】
項３５．疾患は、血液凝固障害である、項３４に記載の方法。
【００４６】
項３６．ＴＦＰＩ結合性化合物を識別するための方法であって、（ａ）ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）およびＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）を含むペプチドを、試験化合物と接触させることと、（ｂ）ヒトＴＦＰＩ残基Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６に対応するＫＤ１−ＫＤ２アミノ酸残基によって画定されるＴＦＰＩ結合部位に対する、試験化合物の結合を検出することと、を含む、方法。
【００４７】
項３７．ステップ（ｂ）は、ヒトＴＦＰＩ残基Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５に対応するＫＤ１アミノ酸残基によって画定されるＴＦＰＩ結合部位に対する、試験化合物の結合を検出することをさらに含む、項３６に記載の方法。
【００４８】
項３８．ＴＦＰＩ結合部位は、ヒトＴＦＰＩ残基Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、Ｉ５５Ａ２７、Ｄ３１、Ｋ３６、Ａ３７、Ｉ３８、Ｆ４４、およびＩ４６に対応するＫＤ１アミノ酸残基によって画定される、項３７に記載の方法。
【００４９】
項３９．配列番号１３３７〜１３５５および４２４０〜４２６８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ペプチド。
【００５０】
項４０．セリンプロテアーゼによるＴＦＰＩの分解を阻害するための方法であって、ＴＦＰＩを、式（ＸＩＶ）：
Ｘ７００１−Ｘ７００２−Ｘ７００３−Ｘ７００４−Ｘ７００５−Ｘ７００６−［Ｘ７００７−Ｘ７００８−Ｘ７００９−Ｘ７０１０−Ｘ７０１１−Ｘ７０１２−Ｘ７０１３−Ｘ７０１４−Ｘ７０１５−Ｘ７０１６−Ｘ７０１７−Ｘ７０１８］−Ｘ７０１９−Ｘ７０２０−Ｘ７０２１−Ｘ７０２２−Ｘ７０２３（ＸＩＶ）（配列番号３１５４）の構造を有するペプチドと接触させることを含み、
式中、Ｘ７００１は、存在するか、または存在せず、Ｘ７００１が存在する場合、Ｘ７００１は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００２は、存在するか、または存在せず、Ｘ７００２が存在する場合、Ｘ７００２は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００３は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００５は、ＲまたはＷであり、Ｘ７００６は、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００７は、Ｏｒｎ、ｈｏｍｏＫ、Ｃ、Ｈｃｙ、Ｄａｐ、およびＫからなる群から選択される、好ましくは、ＣおよびＨｃｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００８は、Ａ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００９は、ａ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、ｐ、Ｒ、Ｓｅｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１０は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１１は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１２は、Ａ、ａ、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、ｋ、Ｌ、ｌ、Ｍ、ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、ｎｌｅ、Ｐ、ｐ、Ｒ、ｒ、Ｓ、ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、ｔ、Ｖ、ｖ、Ｗ、およびｗからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１３は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｅａｇ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１８は、ＣおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくは、Ｃであり、Ｘ７０１９は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２０は、ＦおよびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２１は、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２３は、存在するか、または存在せず、Ｘ７０２３が存在する場合、Ｘ７０２３は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｄ、Ｅ、Ｅａｇ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、ペプチドは、Ｘ７００７とＸ７０１８との間の連結により生成される環状構造として含み、それによって、セリンプロテアーゼによるＴＦＰＩの分解が阻害される、方法。
【００５１】
項４１．Ｘ７００１は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００２は、Ｈ、Ｆ、Ｍ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００３は、ＦおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００４は、Ｋであり、Ｘ７００５は、Ｗであり、Ｘ７００６は、ＦおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００７は、Ｃであり、Ｘ７００８は、Ａ、Ｇ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００９は、Ｍ、Ｓｅｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１０は、Ｋ、Ｐ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１１は、Ｄであり、Ｘ７０１２は、Ｆ、Ｌ、ｌ、Ｍ、およびＳｅｍからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１３は、Ｄ、Ｇ、Ｋ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１４は、Ｇであり、Ｘ７０１５は、ＩおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１６は、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓｅｍ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１７は、ＳおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１８は、Ｃであり、Ｘ７０１９は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２０は、Ｗであり、Ｘ７０２１は、Ｖであり、Ｘ７０２２は、Ｆ、Ｌ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２３は、存在するか、または存在せず、Ｘ７０２３が存在する場合、Ｘ７０２３は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ペプチドは、Ｘ７００７とＸ７０１８との間の連結により生成される環状構造として含む、項４０に記載の方法。
【００５２】
項４２．ペプチドは、式（ＸＩＩＩ）：
Ｘ６００１−Ｘ６００２−Ｘ６００３−Ｘ６００４−Ｘ６００５−Ｘ６００６−Ｘ６００７−Ｘ６００８−Ｘ６００９−Ｘ６０１０−Ｘ６０１１−Ｘ６０１２−Ｘ６０１３−Ｘ６０１４−Ｘ６０１５−Ｘ６０１６−Ｘ６０１７−Ｘ６０１８−Ｘ６０１９−Ｘ６０２０（ＸＩＩＩ）（配列番号３１５３）の構造を有するペプチドをさらに含むペプチド複合体の一部であって、
式中、Ｘ６００１は、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、Ｄｏｐａ、Ｂｈｆ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｎｍｆ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００２は、Ｑ、Ｇ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００３は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｓ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００４は、Ａｉｂ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ａ、Ｂｈｋ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ｋ、Ｎ、Ｎｍｋ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００５は、ａ、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、ＮプロピルＧ、ａｚｅ、ｐｉｐ、ｔｉｃ、ｏｉｃ、ｈｙｐ、ｎｍａ、Ｎｃｇ、Ａｂｇ、Ａｐｇ、ｔｈｚ、ｄｔｃ、Ｂａｌ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００６は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｃｉｔ、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ｅｃｌ、Ｅｅａ、Ｅｅｃ、Ｅｅｆ、Ｎｉｆ、Ｅｅｗ、Ａｉｂ、Ｂｔｑ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００７は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ｔｌｅ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎｍｖ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００８は、Ｆ、Ｈ、１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ｐｍｙ、Ｙ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６００９は、Ａｉｂ、Ｖ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ａｂｕ、Ｃｐｇ、Ｔｌｅ、Ｌ−２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、Ａ、ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｎｍｄ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ａｉｂ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＮｍｆからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１１は、Ａ、ａ、Ｇ、ｐ、Ｓａｒ、ｃ、ｈｃｙ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｋ、Ｇ、およびＮｍｇからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１２は、Ｙ、Ｔｙｍ、Ｐｔｙ、Ｄｏｐａ、およびＰｍｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１３は、Ａｉｂ、Ｃ、Ｆ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１４は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｈｃｙ、Ｂｈｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１５は、Ｒ、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１６は、Ｌ、Ｈｃｙ、Ｈｌｅ、およびＡｍｌからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１７は、Ａ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｓ、Ｄｅｇ、Ｅｂｃ、Ｅｃａ、Ｅｇｚ、Ａｉｃ、Ａｐｃ、Ｅｇｔ、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｂｈｒ、Ｃｉｔ、Ｄ、Ｄａｐ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１８は、Ａ、Ａｉｂ、Ｈｃｙ、ｈｃｙ、Ｃ、ｃ、Ｌ、Ｎｌｅ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｂａｌ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０１９は、Ｋ、Ｒ、Ｈａｒ、Ｂｈｋ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６０２０は、Ｋ、Ｌ、Ｈｃｙ、Ａｍｌ、Ａｉｂ、Ｂｈｌ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎｍｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸である、項４０または項４１に記載の方法。
【００５３】
項４３．プロテアーゼは、エラスターゼ、トロンビン、プラスミン、ＦＸａ、またはキマーゼである、項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】血液凝固カスケードの図である。
【図２】組織因子経路阻害剤１の２次構造の図である。
【図３】組織因子、第Ｘａ因子（ＦＸａ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、およびＴＦＰＩを含む四元複合体の形成の図である。
【図４】ペプチドＪＢＴ０２９３に関するアミノ酸置換（太字および下線）を示す様々なＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）のアミノ酸配列の一覧である。
【図５】ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）のｍＲＮＡ表示選択の図である。
【図６Ａ】ＥＣ５０結合ＥＬＩＳＡを示す図である。
【図６Ｂ】実施例１に記載のＩＣ５０ＥＬＩＳＡを示す図である。
【図７】ビオチニル化ペプチドＪＢＴ０１３２の、％ＯＤ（ｙ軸）および濃度［ｎＭ］（ｘ軸）を比較した結合ＥＬＩＳＡ曲線である。
【図８】図８Ａ〜Ｄは、本発明の例示的ペプチドの、％ＯＤ（ｙ軸）および濃度［ｎＭ］（ｘ軸）を比較した競合ＥＬＩＳＡ曲線である。
【図９】図９Ａ及びＢは、ペプチドＪＢＴ０１２０およびＪＢＴ０１３２の、時間（秒）（ｘ軸）に対するＲＵ（ｙ軸）をプロットしたセンサグラムである。
【図１０】図１０Ａ及びＢは、組織因子経路阻害剤１および組織因子経路阻害剤２とのペプチドＪＢＴ０１２０相互作用の、時間（秒）（ｘ軸）に対するＲＵ（ｙ軸）をプロットしたセンサグラムである。
【図１１】図１１Ａ及びＢは、血漿ベース分析における、ペプチドＪＢＴ０１２０およびペプチドＪＢＴ０１３２の生成されたトロンビンの量（ｎＭ）（ｙ軸）および時間（分）（ｘ軸）を比較したグラフである。
【図１２】様々なＴＦＰＩ結合性ペプチドのアミノ酸配列、ＦＸａ阻害分析において観察されたＴＦＰＩのＥＣ５０およびパーセント阻害、外因性テナーゼ阻害分析において観察されたＴＦＰＩのＥＣ５０およびパーセント阻害、ならびに、血漿ベース分析におけるＦＥＩＢＡ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）Ｉｍｍｕｎａｔｅ、または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）相当物活性（ｍＵ／ｍＬ）を列挙した表である。「＊」は、陰性対照を示す。
【図１３】同上
【図１４】同上
【図１５】同上
【図１６】同上
【図１７】同上
【図１８】同上
【図１９】いくつかのＴＦＰＩ結合性ペプチドのＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果を列挙した表である。「＊」は、陰性対照を示す。
【図２０】同上
【図２１】同上
【図２２】様々なＴＦＰＩ結合性ペプチドのアミノ酸配列、ＦＸａ阻害分析において観察されたＴＦＰＩのＥＣ５０およびパーセント阻害、外因性テナーゼ阻害分析において観察されたＴＦＰＩのＥＣ５０およびパーセント阻害、ならびに、血漿ベース分析におけるＦＥＩＢＡ、ＦＶＩＩＩ  Ｉｍｍｕｎａｔｅ、またはＦＩＸ等価活性（ｍＵ／ｍＬ）を列挙した表である。「＊」は、陰性対照を示す。
【図２３】同上
【図２４】同上
【図２５】同上
【図２６】同上
【図２７】同上
【図２８】同上
【図２９】同上
【図３０】同上
【図３１】ＰＥＧ化ＴＦＰＩ結合性ペプチドの薬物動態特性（ペプチドの濃度（ｙ軸）対投与後の時間（ｘ軸））を、ＰＥＧを有さない同じペプチドの薬物動態特性と比較したグラフである。ペプチドは、１０ｍｇ／ｋｇの用量でＣ５７Ｂｌ６マウスに静脈内投与した。各時点でのペプチドの存在について、３つの生体試料を分析した。
【図３２】本発明の様々なペプチドのアミノ酸配列およびＩＣ５０またはＥＣ５０値を列挙した表である。「＊」は、陰性対照を示す。
【図３３】同上
【図３４】同上
【図３５】同上
【図３６】同上
【図３７】同上
【図３８】同上
【図３９】同上
【図４０】１０ｍｇ／ｋｇの用量でのマウスに対する皮下投与後の、ＰＥＧ化ＴＦＰＩ結合性ペプチドの薬物動態特性（ペプチドの濃度（ｎＭ）（ｙ軸）対投与後の時間（分）（ｘ軸））を示すグラフである。
【図４１】血友病Ａ患者血漿の血漿ベース分析における、ペプチドＪＢＴ１８５５の生成トロンビンの量（ｎＭ）（ｙ軸）および時間（分）（ｘ軸）を相関させたグラフである。
【図４２】ＪＢＴ−１８５５（静脈内もしくは皮下投与）、抗ＴＦＰＩ抗体（静脈内投与）、またはビヒクル（静脈内投与）（ｘ軸）で処置したマウスの爪切り後に観察される失血量（μＬ、ｙ軸）を示すグラフである。
【図４３】遊離ＴＦＰＩ１６０およびＪＢＴ０３０３に結合したＴＦＰＩ１６０のＨＳＱＣシグナルの化学シフトの差（ｙ軸）に対し、ＴＦＰＩ１６０アミノ酸残基（ｘ軸）をプロットしたグラフである。
【図４４】非複合化（遊離）ＴＦＰＩ１６０と比較した、ＴＦＰＩ１６０がＪＢＴ０３０３に複合化した場合のＨＳＱＣシグナルの化学シフト変化の領域を示すＴＦＰＩの二次構造のリボンモデルである。
【図４５】遊離ＴＦＰＩ１６０およびＪＢＴ０１２２に結合したＴＦＰＩ１６０のＨＳＱＣシグナルの化学シフトの差（ｙ軸）に対し、ＴＦＰＩ１６０アミノ酸残基（ｘ軸）をプロットしたグラフである。
【図４６】非複合化（遊離）ＴＦＰＩ１６０と比較した、ＴＦＰＩ１６０がＪＢＴ０１２２に複合化した場合のＨＳＱＣシグナルの化学シフト変化の領域を示すＴＦＰＩタンパク質の二次構造のリボンモデルである。
【図４７】ＨＳＱＣ、ＨＮＣＡＣＢ、ＨＮＣＡ、ＨＮＣＯ、およびＨＮＮスペクトルに基づく、ＪＢＴ０７８８のカルボニル炭素（Ｃ）、アルファ炭素（ＣＡ）、ベータ炭素（ＣＢ）、アミドプロトン（Ｈ）、およびアミド窒素（Ｎ）の帰属を列挙した表である。
【図４８】遊離ＪＢＴ０７８８の二次構造のリボンモデルである。
【図４９】ＨＳＱＣ、ＨＮＣＡＣＢ、ＨＮＣＡ、ＨＣＣＯＣＡ、およびＨＮＣＯスペクトルに基づく、ＴＦＰＩ１６０と複合化したＪＢＴ０７８８のカルボニル炭素（Ｃ）、アルファ炭素（ＣＡ）、ベータ炭素（ＣＢ）、アミドプロトン（Ｈ）、およびアミド窒素（Ｎ）の帰属を列挙した表である。
【図５０】ＴＦＰＩ１６０と複合化した場合のＪＢＴ０７８８の二次構造のリボンモデルである。
【図５１】ＨＳＱＣ、ＨＮＣＡＣＢ、およびＨＮＮスペクトルに基づく、ＪＢＴ０６１６のカルボニル炭素（Ｃ）、アルファ炭素（ＣＡ）、ベータ炭素（ＣＢ）、アミドプロトン（Ｈ）、およびアミド窒素（Ｎ）の帰属を列挙した表である。
【図５２】遊離ＪＢＴ０６１６の二次構造のリボンモデルである。
【図５３】ＨＳＱＣ、ＨＮＣＯ、ＨＮＣＡ、およびＨＮＣＯＣＡスペクトルに基づく、ＴＦＰＩと複合化したＪＢＴ０６１６のカルボニル炭素（Ｃ）、アルファ炭素（ＣＡ）、ベータ炭素（ＣＢ）、アミドプロトン（Ｈ）、およびアミド窒素（Ｎ）の帰属を列挙した表である。
【図５４】ＴＦＰＩ１６０と複合化した場合のＪＢＴ０６１６の二次構造のリボンモデルである。
【図５５】スティックとして表示されるタンパク質−タンパク質相互作用を推進することが提案されている残基を有するＪＢＴ０３０３と複合化したＫＤ１（残基２２〜７９）の、エネルギー的に最小限化された最善モデルのリボン構造である。イタリック体および下線の残基はＪＢＴ０３０３に属し、残りの残基はＴＦＰＩのＫＤ１に属する。
【図５６】ＪＢＴ２３１７について試料弾性（ｍｍ）を時間（秒）（ｓ）と相関させた回転トロンボエラストグラムである。
【図５７】ＪＢＴ２３２９について試料弾性（ｍｍ）を時間（秒）（ｓ）と相関させた回転トロンボエラストグラムである。
【図５８】コンピュータデバイスの図である。
【図５９】ＫＤ１タンパク質の三次元（３Ｄ）モデルの図である。
【図６０】ＴＦＰＩ結合性ペプチドの３Ｄモデルの図である。
【図６１】タンパク質およびペプチドの相互作用をモデル化する方法の図である。
【図６２】本発明の様々なペプチドのアミノ酸配列およびＩＣ５０またはＥＣ５０値を列挙した表である。「ｎ．ａ．」の表示は、「未分析」である。進行曲線データは、組み換えヒト全長ＴＦＰＩを用いた実施例３に記載のＦＸａ阻害分析を使用して得られた。進行曲線分析の分析濃度は、０．００２５％（ペプチド希釈緩衝液中に使用された０．１％Ｔｗｅｅｎ８０）であった。
【図６３】ペプチドＪＢＴ２３２５〜ＪＢＴ２３２９の濃度（ｎＭ）（ｙ軸）を、静脈内投与後の時間（時間）（ｘ軸）と相関させたグラフである。より重い重量のＰＥＧ部分を含むペプチドは、マウスにおいてより長い生体内半減期を示した。各時点は、ＥＬＩＳＡにより定量された３つの独立した試料の平均で示されている。
【図６４】図６４Ａ〜Ｃは、ペプチドＪＢＴ２４０１、ＪＢＴ２４０４、およびＪＢＴ２４１０（ｎＭ）（ｙ軸）を、静脈内投与後の時間（時間）（ｘ軸）と相関させたグラフである。各時点は、ＥＬＩＳＡにより定量化された３つの独立した試料の平均で示されている。黒丸は静脈内データを表し、黒三角は皮下データを表す。
【図６５】本発明の様々なペプチドのアミノ酸配列を列挙した表である。
【図６６】図６６Ａ及びＢは、２つのトレーサー：ＪＢＴ２２７１（配列番号４０３３）、ＪＢＴ１８５７のビオチニル化誘導体（図６６Ａ）、およびＪＢＴ２３１６（配列番号１３１３）、ＪＢＴ１８３７のビオチニル化誘導体（図６６Ｂ）を使用した、ＴＦＰＩ結合性ペプチドＪＢＴ１８３７（配列番号１０４４）およびＪＢＴ１８５７（配列番号１７８）ならびにペプチド複合体ＪＢＴ２５４７（配列番号４２６０）のＩＣ５０曲線を示す。
【図６７】トレーサーペプチドであるＪＢＴ２２７１（配列番号４０３３）（Ｙ軸）によるＴＦＰＩ結合の％阻害として示されるＪＢＴ２５４７（配列番号４２６０）およびＪＢＴ１８５７（配列番号１７８）（Ｘ軸）を用いたＫｏｆｆ分析の結果を示す棒グラフである。
【図６８】図６８Ａ〜Ｆは、ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体を用いたＦＸａ阻害分析の結果を示す。図６８Ａ〜６８Ｄは、０．５ｎＭ  完全長ヒトＴＦＰＩ（図６８Ａ）、０．５ｎＭ  ヒトＴＦＰＩ  １−１６０（図６８Ｂ）、０．５ｎＭ  マウスＴＦＰＩ  １−１６０（図６８Ｃ）、または０．５ｎＭ  カニクイザルＴＦＰＩ  １−１６０（図６８Ｄ）で行われたＦＸａ阻害分析において、ＪＢＴ１８３７（三角、配列番号１０４４）、ＪＢＴ１８５７（丸、配列番号１７８）、ＪＢＴ２５４７（ひし形、配列番号４２６０）、およびＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７（四角）の濃度（μＭ）（Ｘ軸）を、ＴＦＰＩの阻害の割合と相関させたグラフである。図６８Ｅは、ＦＸａ阻害分析において、ＴＦＰＩ濃度の増加（左から右に０．１〜１０ｎＭ）に伴うＪＢＴ２５４７によるＴＦＰＩ阻害を示す。データ点をシグモイド用量反応式によって適合させ、ＥＣ５０（ｎＭ）および最大阻害（％）を得た。図６８Ｆは、完全長ヒトＴＦＰＩ濃度の増加の存在下、ＪＢＴ２５４７（ひし形）、ＪＢＴ２５４８（丸）、ＪＢＴ１８３７（三角）、およびＪＢＴ１８３７とＪＢＴ１８５７の組み合わせ（四角）（１μＭペプチド）によって、ＴＦＰＩ阻害（％）を相関させたグラフである。
【図６９】ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体を用いた外因性テナーゼ阻害分析の結果を示す。図６９Ａは、０．０６３ｎＭ  完全長ヒトＴＦＰＩを用いて行われた外因性テナーゼ阻害分析において、ＪＢＴ１８３７（三角、配列番号１０４４）、ＪＢＴ１８５７（丸、配列番号１７８）、ＪＢＴ２５４７（ひし形、配列番号４２６０）、およびＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７（四角）（μＭ）（Ｘ軸）を、ＴＦＰＩの阻害の割合と相関させたグラフである。図６９Ｂは、外因性テナーゼ阻害分析において、ＴＦＰＩ濃度の増加（左から右に０．０３１〜１０ｎＭ）に伴うＪＢＴ２５４７によるＴＦＰＩ阻害を示す。データ点をシグモイド用量反応式によって適合させ、ＥＣ５０（ｎＭ）および最大阻害（％）を得た。図６９Ｃは、ＪＢＴ１８３７（三角、配列番号１０４４）、ＪＢＴ２５４８（丸、配列番号４２６１）、ＪＢＴ２５４７（ひし形、配列番号４２６０）、およびＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７（四角）（１μＭ）（Ｘ軸）によって媒介されたＴＦＰＩの最大阻害の割合（Ｙ軸）を、外因性テナーゼ阻害分析において使用された完全長ヒトＴＦＰＩの濃度と相関させたグラフである。図６９Ｄは、ＪＢＴ１８３７（三角、配列番号１０４４）、ＪＢＴ２５４８（丸、配列番号４２６１）、ＪＢＴ２５４７（ひし形）；配列番号４２６０、およびＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７（四角）（１μＭ）のＥＣ５０を、外因性テナーゼ阻害分析において使用された完全長ヒトＴＦＰＩの濃度（ｎＭ）と相関させたグラフである。ＥＣ５０を、ＴＦＰＩ濃度対完全長ＴＦＰＩ濃度の増加に伴うペプチド濃度応答を適合させることによって計算した。
【図７０】図７０Ａ〜Ｃは、第ＦＶＩＩＩ因子阻害血漿中で行われたトロンビン生成分析の結果を示す。図は、１．２５ｎＭ  ｆｌＴＦＰＩ（図７０Ａ）、３．７５ｎＭ  ｆｌＴＦＰＩ（図７０Ｂ）、および１０ｎＭ  ｆｌＴＦＰＩ（図７０Ｃ）の存在下、ピークの第ＩＩａ因子（トロンビン）生成（ｎＭ）（Ｙ軸）を、ＪＢＴ１８３７（三角）、ＪＢＴ１８５７（丸）、ＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７の組み合わせ（四角）、およびＪＢＴ２５４７（ひし形）の濃度（ｎＭ）（Ｘ軸）と相関させる。点線−プール正常血漿（ＰＮＰ）、実線−ＦＶＩＩＩ阻害血漿（ＰＮＰ＋ａＦＶＩＩＩ）。
【図７１】図７１Ａ及びＢは、細胞に基づいた外因性テナーゼ分析において、ＪＢＴ２５４７、ＪＢＴ１８３７、および１８５７（図７１Ａ）、またはＪＢＴ２５４７（ひし形）、ＪＢＴ１８３７（三角）、ＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７（四角）、およびＪＢＴ２５４８（丸）（図７１Ｂ）の様々な濃度（Ｘ軸）で達成されたＴＦＰＩの阻害の割合（Ｙ軸）を相関させたグラフである。
【図７２】図７２Ａ〜Ｃは、さらなる外部ヒト完全長ＴＦＰＩ（白丸）の不在下、およびますます増加する外部完全長ＴＦＰＩ（２ｎＭ、黒三角、１０ｎＭ、黒四角）の存在下、ＦＶＩＩＩで阻害された全血中のＪＢＴ２５４７（図７２Ａ）、ＪＢＴ１８３７（図７２Ｂ）、またはＪＢＴ１８５７（図７２Ｃ）のますます増加する濃度（１０、１００、１０００ｎＭ）の凝血促進効果を示す。ＦＶＩＩＩで阻害された全血および正常全血の凝固時間を参照として与えられる。＋＝凝固時間は達成されなかった。
【図７３】ペプチド結合のための求核または求電子の反応基の非限定例を列挙する表である。
【図７４】異なる種からのＴＦＰＩ  ＫＤ１−ＫＤ２の配列アラインメントである。１０〜２５Å２の接触面を有する残基＝４１、５６、５９、６０、６７、７１、７４、９６、１０６、１３０、１３２、１３３、１３６、１３７、１４２、２６〜６０Å２の接触面を有する残基＝７５、８０、８２、８４、８５、８７、１４５、６１〜１００Å２の接触面を有する残基＝６３、６５、１３１、１４６、１００Å２超の接触面を有する残基＝８３、１３４。
【図７５】ＪＢＴ１８５７およびＪＢＴ１８３７と複合化したＫＤ１−ＫＤ２のモデルのリボン構造である。
【図７６】図７６Ａ〜Ｄは、本発明の様々なペプチドのアミノ酸配列を列挙した表である。
【図７７】本発明の様々なペプチドのアミノ酸配列を列挙した表である。
【図７８】図７８Ａ〜ＡＡは、本発明の様々なペプチドのアミノ酸配列を列挙した表である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、ペプチドおよびペプチド複合体を提供する。様々な実施形態において、ペプチドまたはペプチド複合体は、組織因子経路阻害剤１に結合し、いくつかの場合において、血液凝固カスケード内での組織因子経路阻害剤１（本明細書においてＴＦＰＩと呼ばれる）の阻害活性をブロックする。血管損傷後、組織因子（ＴＦ）複合体は、第Ｖｌｌａ因子と複合化して、第ＩＸ因子および第Ｘ因子を活性化する「外因性複合体」または「外因性テナーゼ複合体」を形成する（図１）。ＴＦＰＩは、ＴＦ／ＦＶＩＩａ外因性複合体活性の主要な天然制御因子であり、ひいては、トロンビン生成の制御における役割を担う（Ｐａｎｔｅｌｅｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４９，２０１６−２０３１（２００２））。ＴＦＰＩは、３つのＫｕｎｉｔｚ型阻害ドメインを含む、４３ｋＤａのセリンプロテアーゼ阻害剤である（図２）。ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１は、ＦＶＩＩａに結合し、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２は、ＦＸａに結合し、それにより、阻害剤は、ＴＦ／ＦＶＩＩａ外因性複合体の活性をブロックする四元ＦＸａ−ＴＦＰＩ−ＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体を形成することができる（図３）。また、ＦＸａのＴＦＰＩ結合は、凝固カスケードの一般的経路を下方制御し、その間、ＦＸａは、プロトロンビンをトロンビンに変換する（Ａｕｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｅｓｔｈ．Ａｎａｌｇ．，１０３（４），８４１−８４５（２００６））。本発明は、血液凝固カスケードに対するＴＦＰＩの阻害活性をブロックし、それによりトロンビン形成を向上させる、例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチドを提供する。本開示の文脈において、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（ＸＩＶ）のいずれかによって包含される任意のペプチドおよび本明細書に記載される任意のＴＦＰＩ結合性ペプチドはまた、「本発明のペプチド」および「本明細書に記載されるペプチド」としても称される。
【００５６】
いくつかのＴＦＰＩ結合性ペプチドのアミノ酸配列が、本明細書に提供される。通常のアミノ酸は、表１に記載されるような標準的な１文字または３文字コードに従い識別される。
【表１】
2019108360.tif 000002
【００５７】
非従来的なアミノ酸および追加的ペプチド構成単位の例は、表２に見られる３文字コード（一般的な４文字略語であるＴｔｄｓおよびＤｏｐａを除く）に従い識別される。３つ、４つまたは７つの数字／文字の表示または略語で指定される追加的構成単位もまた、表２に列挙されている。いくつかの構成単位の構造は、構成単位をペプチドに導入するための例示的試薬とともに示されている（例えば、２−ナフチルスルホニルに対し提供された構造は、塩化物を含む）。
【表２】
2019108360.tif 000003
2019108360.tif 000004
2019108360.tif 000005
2019108360.tif 000006
2019108360.tif 000007
2019108360.tif 000008
2019108360.tif 000009
2019108360.tif 000010
2019108360.tif 000011
2019108360.tif 000012
2019108360.tif 000013
2019108360.tif 000014
2019108360.tif 000015
2019108360.tif 000016
【００５８】
本明細書に提供されるペプチドのアミノ酸配列は、当業者に理解されるような典型的なペプチド配列形式で示されている。例えば、従来のアミノ酸の３文字コードもしくは１文字コード、または３つ、４つ、または７つの数字／文字コードの追加的構成単位は、ペプチド配列内の指定の位置におけるアミノ酸または構成単位の存在を示す。それぞれの非従来的アミノ酸または構成単位に対するコードは、配列内の次および／または前のアミノ酸または構成単位に対するコードに、ハイフンで接続される。隣接アミノ酸は、化学結合（典型的にはアミド結合）により接続される。化学結合の形成は、アミノ酸が隣接アミノ酸の左に位置する場合（例えば、Ｈｌｅ−隣接アミノ酸）、その１−カルボキシル基からヒドロキシル基を除去し、アミノ酸が隣接アミノ酸の右に位置する場合（例えば、隣接アミノ酸−Ｈｌｅ）、そのアミノ基から水素を除去する。両方の修飾は、明示的にハイフンが示されることなく、同じアミノ酸に適用され得る、またアミノ酸配列内に存在する隣接する従来のアミノ酸に適用され得ることが理解される。アミノ酸がアミノ酸側鎖内に２つ以上のアミノおよび／またはカルボキシ基を含有する場合、２−もしくは３−アミノ基および／または１−カルボキシ基が一般にペプチド結合の形成に使用される。非従来的アミノ酸については、３文字コードが使用され、第１の文字は、Ｃ−α−原子の立体化学を示す。例えば、大文字の第１の文字は、アミノ酸のＬ型がペプチド配列内に存在することを示し、一方小文字の第１の文字は、対応するアミノ酸のＤ型がペプチド配列内に存在することを示す。１文字コードが使用される場合、小文字はＤアミノ酸を表し、一方大文字はＬアミノ酸を表す。逆の意味が指定されない限り、アミノ酸配列は、本明細書において、Ｎ末端からＣ末端の方向で示される。
【００５９】
本明細書に記載のいくつかのＴＦＰＩ結合性ペプチド配列のＣ末端は、ＯＨ、ＮＨ２、または、ハイフンによりＣ末端アミノ酸コードに連結された特定の終端アミンに対する略語を含有することにより、明示的に示される。本明細書に記載のいくつかのペプチドのＮ末端は、水素（遊離Ｎ末端の場合）、または、ハイフンによりＮ末端アミノ酸コードに連結された特定の終端カルボン酸もしくは他の化学基に対する略語を含有することにより、明示的に示される。
【００６０】
本発明は、アミノ酸配列Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１（配列番号３１０９）を含み、式中、（アミノ酸の１文字コードを使用して）Ｘ７は、Ｌ、Ｐ、Ｋ、Ｓ、Ｗ、Ｖ、Ｎ、およびＱからなる群から選択され、Ｘ８は、Ｌ、Ｒ、Ｎ、Ｆ、およびＩからなる群から選択され、Ｘ９は、Ｙ、Ｖ、Ｐ、およびＣからなる群から選択され、Ｘ１０は、Ｆ、Ｌ、およびＧからなる群から選択され、Ｘ１１は、Ｌ、Ｗ、Ｖ、Ａ、Ｍ、Ｔ、およびＳからなる群から選択され、Ｘ１２は、Ｔ、Ｆ、Ｖ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、およびＹからなる群から選択され、Ｘ１３は、Ｉ、Ｍ、Ｇ、Ｑ、Ｄ、およびＲからなる群から選択され、Ｘ１４は、Ｇ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｍ、およびＨからなる群から選択され、Ｘ１５は、Ｎ、Ｐ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、およびＹからなる群から選択され、Ｘ１６は、Ｍ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｇ、およびＫからなる群から選択され、Ｘ１７は、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＬからなる群から選択され、Ｘ１８は、Ｍ、Ｋ、Ｌ、およびＩからなる群から選択され、Ｘ１９は、Ｙ、Ｇ、Ｒ、およびＳからなる群から選択され、Ｘ２０は、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｃ、およびＹからなる群から選択され、Ｘ２１は、Ａ、Ｖ、Ｋ、およびＥからなる群から選択される、ペプチドを提供する。
【００６１】
上記のコア構造Ｘ７〜Ｘ２１に加え、具体的に企図される他の構造は、１つ以上の追加的アミノ酸がコア構造に結合した（例えば、アミノ酸配列Ｘ７〜Ｘ２１のＮ末端またはＣ末端に連結した）構造である。したがって、本発明は、コア構造を有し、
Ｘ６、
Ｘ５Ｘ６、
Ｘ４Ｘ５Ｘ６、
Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号３１１０）、
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号３１１１）、および
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号３１１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
式中、Ｘ６は、コア構造アミノ酸配列のＸ７に直接連結し、Ｘ１は、ＴおよびＧからなる群から選択され、Ｘ２は、ＦおよびＶからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＦからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｄ、Ｑ、およびＳからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｅ、Ｔ、Ｎ、およびＳからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、およびＡからなる群から選択される、１つ以上のＮ末端アミノ酸（複数を含む）をさらに含むペプチドを含む。本発明のペプチドは、一態様において、アミノ酸配列ＱＳＫＫＮＶＦＶＦＧＹＦＥＲＬＲＡＫ（配列番号１）を含む、またはその配列からなる。
【００６２】
別の実施形態において、コア構造を有する本発明のペプチドは、
Ｘ２２、
Ｘ２２Ｘ２３、
Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４、
Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５（配列番号３１１３）、
Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６（配列番号３１１４）、および
Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７（配列番号３１１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
式中、Ｘ２２は、コア構造アミノ酸配列のＸ２１に直接連結し、Ｘ２２は、Ｑ、Ｉ、Ｅ、Ｗ、Ｒ、Ｌ、およびＮからなる群から選択され、Ｘ２３は、Ｌ、Ｖ、Ｍ、およびＲからなる群から選択され、Ｘ２４は、Ｋ、Ｌ、Ａ、およびＹからなる群から選択され、Ｘ２５は、Ｆであり、Ｘ２６は、Ｇであり、Ｘ２７は、Ｔである、１つ以上のＣ末端アミノ酸（複数を含む）を含む。
【００６３】
一態様において、本発明のペプチドは、アミノ酸配列ＶＩＶＦＴＦＲＨＮＫＬＩＧＹＥＲＲＹ（配列番号４）を含む、またはその配列からなる。また、本発明のペプチドは、コア構造のＮ末端およびＣ末端の両方において、追加のアミノ酸を含むことも企図される。この態様において、ペプチドは、アミノ酸配列ＴＦＶＤＥＲＬＬＹＦＬＴＩＧＮＭＧＭＹＡＡＱＬＫＦ（配列番号３）、ＧＶＷＱＴＨＰＲＹＦＷＴＭＷＰＤＩＫＧＥＶＩＶＬＦＧＴ（配列番号５）、ＫＷＦＣＧＭＲＤＭＫＧＴＭＳＣＶＷＶＫＦ（配列番号６）、またはＡＳＦＰＬＡＶＱＬＨＶＳＫＲＳＫＥＭＡ（配列番号７）を含むか、またはその配列からなる。
【００６４】
本発明は、アミノ酸配列Ｘ３Ｘ４Ｘ５−Ｆ−Ｘ７−ＮＶＦ−Ｘ１１Ｘ１２−ＧＹ−Ｘ１５Ｘ１６−ＲＬＲＡＫ−Ｘ２２（配列番号２）を含むペプチドを含み、式中、Ｘ３は、ＹまたはＦであり、Ｘ４は、ＱまたはＳであり、Ｘ５は、ＮまたはＳであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｎ、またはＱであり、Ｘ１１は、Ｖ、Ａ、Ｓ、またはＴであり、Ｘ１２は、Ｆ、Ａ、Ｄ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ１５は、Ｆ、Ｋ、またはＹであり、Ｘ１６は、ＥまたはＤであり、Ｘ２２は、ＬまたはＮである、ペプチドをさらに含む。
【００６５】
さらに、本発明は、ＴＦＰＩに結合するペプチドであって、式（Ｉ）：Ｘ１００１−Ｘ１００２−Ｘ１００３−Ｘ１００４−Ｘ１００５−Ｘ１００６−Ｘ１００７−Ｘ１００８−Ｘ１００９−Ｘ１０１０−Ｘ１０１１−Ｘ１０１２−Ｘ１０１３−Ｘ１０１４−Ｘ１０１５−Ｘ１０１６−Ｘ１０１７−Ｘ１０１８−Ｘ１０１９−Ｘ１０２０（配列番号３１１６）の構造を有するペプチドを提供する。式（Ｉ）中、Ｘ１００１は、Ｂｈｆ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｆ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００２は、Ｇ、Ｋ、およびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００３は、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｓ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００４は、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｋ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｋ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００５は、ａ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂａｌ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００６は、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｔｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ  Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎｍｖ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００８は、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００９は、Ａ、Ａｉｂ、ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１０は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｆ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１１は、Ａｉｂ、Ｃ、Ｋ、Ｇ、およびＮｍｇからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１２は、Ｙであり、Ｘ１０１３は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１４は、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｅ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１５は、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１６は、Ｌであり、Ｘ１０１７は、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｒ、Ｃ、Ｃｈａ、Ｃｉｔ、Ｄ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｅ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１８は、Ａ、Ｂａｌ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１９は、Ｂｈｋ、Ｋ、Ｒ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。Ｘ１０２０は、式（Ｉ）内に存在するか、または存在しない（すなわち、いくつ���の場合において、本発明のペプチドは、構造Ｘ１００１−Ｘ１００２−Ｘ１００３−Ｘ１００４−Ｘ１００５−Ｘ１００６−Ｘ１００７−Ｘ１００８−Ｘ１０１０−Ｘ１０１１−Ｘ１０１２−Ｘ１０１３−Ｘ１０１４−Ｘ１０１５−Ｘ１０１６−Ｘ１０１７−Ｘ１０１８−Ｘ１０１９（配列番号３１１６）を含む）。Ｘ１０２０が存在する場合、Ｘ１０２０は、Ａｉｂ、Ｂｈｌ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎｍｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００６６】
例えば、本発明のペプチドは、式（Ｉ）の構造を有し、式中、Ｘ１００１は、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎｍｆ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００２は、Ｑであり、Ｘ１００３は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００４は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｋ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００５は、ａ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂａｌ、Ｃ、ｄ、Ｅ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００６は、Ａ、Ｂｔｑ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００７は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００８は、Ｆ、Ｈ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００９は、ｆ、Ｉ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１１は、ＧおよびＮｍｇからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１２は、Ｙであり、Ｘ１０１３は、Ａｉｂ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｌ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１４は、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｅ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１５は、ＥおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１６は、Ｌであり、Ｘ１０１７は、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｒ、Ｃ、Ｃｈａ、Ｃｉｔ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｆ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１８は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１９は、ＫおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０２０は、Ａｉｂ、Ｂｈｌ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸である（Ｘ１０２０がペプチド内に存在する場合）。
【００６７】
一態様において、本発明のペプチドは、式（Ｉ）の構造を有し、式中、Ｘ１００１は、Ｆ、Ｌ、Ｙ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００２は、Ｑであり、Ｘ１００３は、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＣからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００４は、Ａｉｂ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｙ、Ｍ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００５は、ａ、Ａｉｂ、Ｄ、ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｃ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００６は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００７は、ＩおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００８は、Ｆ、Ｈ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１００９は、Ｖであり、Ｘ１０１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｆ、Ｈ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１１は、Ｇであり、Ｘ１０１２は、Ｙであり、Ｘ１０１３は、ＣまたはＦであり、Ｘ１０１４は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＡｉｂからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１５は、Ｒであり、Ｘ１０１６は、Ｌであり、Ｘ１０１７は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｋ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１８は、Ａ、Ｌ、Ｎ、Ｍ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１９は、Ｋであり、Ｘ１０２０は、ＫまたはＬである。
【００６８】
アミノ酸Ｘ１０２０が式（Ｉ）に存在しない場合、本発明のペプチドは、一態様において、ペプチドが式（ＩＩ）：Ｘ１０００−Ｘ１００１−Ｘ１００２−Ｘ１００３−Ｘ１００４−Ｘ１００５−Ｘ１００６−Ｘ１００７−Ｘ１００８−Ｘ１００９−Ｘ１０１０−Ｘ１０１１−Ｘ１０１２−Ｘ１０１３−Ｘ１０１４−Ｘ１０１５−Ｘ１０１６−Ｘ１０１７−Ｘ１０１８−Ｘ１０１９（ＩＩ）（配列番号３１２２）の構造を有するか、またはその構造からなるように、式（Ｉ）のＮ末端にアミノ酸Ｘ１０００をさらに含む。Ｘ１０００がペプチド内に存在する場合、Ｘ１０００は、Ａ、Ｅ、およびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、一方Ｘ１００１〜Ｘ１０１９のアミノ酸は、上に定義された通りである。
【００６９】
追加的態様において、本発明のＴＦＰＩ結合性ペプチドは、式（ＩＩＩ）：Ｘ１００１−Ｑ−Ｘ１００３−Ｘ１００４−Ｘ１００５−Ｘ１００６−Ｉ／Ｖ−Ｘ１００８−Ｖ−Ｘ１０１０−Ｇ−Ｙ−Ｃ／Ｆ−Ｘ１０１４−Ｒ−Ｌ−Ｘ１０１７−Ｘ１０１８−Ｋ−Ｋ／Ｌ（ＩＩＩ）（配列番号３１１７）の構造を有する。本明細書において使用される場合、「／」により分離されるアミノ酸表示は、示された位置での代替のアミノ酸残基を指す。例えば、式（ＩＩＩ）に関して、７位でのアミノ酸残基は、イソロイシンまたはバリンである。式（ＩＩＩ）中のＸ１００１、Ｘ１００３、Ｘ１００４、Ｘ１００５、Ｘ１００６、Ｘ１００８、Ｘ１０１０、Ｘ１０１４、Ｘ１０１７、およびＸ１０１８は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸から選択される。例えば、式（ＩＩＩ）中、Ｘ１００１は、随意に、Ｂｈｆ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｆ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎｍｆ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｆ、Ｌ、Ｙ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ１００３は、随意に、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｓ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり（例えば、アミノ酸は、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＣであり）、Ｘ１００４は、随意に、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｋ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｋ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｋ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａｉｂ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｙ、Ｍ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ１００５は、随意に、ａ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂａｌ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、ａ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂａｌ、Ｃ、ｄ、Ｅ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり（例えば、アミノ酸は、ａ、Ａｉｂ、Ｄ、ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｃ、またはＭであり）、Ｘ１００６は、随意に、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｔｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｂｔｑ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ１００８は、随意に、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｆ、Ｈ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０１０は、随意に、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｆ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｆ、Ｈ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ１０１４は、随意に、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｅ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｅ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、またはＡｉｂ）であり、Ｘ１０１７は、随意に、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｒ、Ｃ、Ｃｈａ、Ｃｉｔ、Ｄ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｅ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｒ、Ｃ、Ｃｈａ、Ｃｉｔ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｆ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｋ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸）であり、ならびに／または、Ｘ１０１８は、随意に、Ａ、Ｂａｌ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｌ、Ｎ、Ｍ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸）である。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、アミノ酸配列のＮまたはＣ末端に結合した１つ以上の追加的アミノ酸残基を含む。例えば、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１つの構造を有するペプチドは、いくつかの実施形態において、Ｘ１００１に直接連結した１つ以上のＮ末端アミノ酸（複数を含む）をさらに含み、Ｎ末端アミノ酸（複数を含む）は、Ｘ１０００、Ｘ９９９−Ｘ１０００、Ｘ９９８−Ｘ９９９−Ｘ１０００、Ｘ９９７−Ｘ９９８−Ｘ９９９−Ｘ１０００（配列番号３１２３）、Ｘ９９６−Ｘ９９７−Ｘ９９８−Ｘ９９９−Ｘ１０００（配列番号３１２４）、Ｘ９９５−Ｘ９９６−Ｘ９９７−Ｘ９９８−Ｘ９９９−Ｘ１０００（配列番号３１２５）、Ｘ９９４−Ｘ９９５−Ｘ９９６−Ｘ９９７−Ｘ９９８−Ｘ９９９−Ｘ１０００（配列番号３１２６）、Ｘ９９３−Ｘ９９４−Ｘ９９５−Ｘ９９６−Ｘ９９７−Ｘ９９８−Ｘ９９９−Ｘ１０００（配列番号３１２７）、Ｘ９９２−Ｘ９９３−Ｘ９９４−Ｘ９９５−Ｘ９９６−Ｘ９９７−Ｘ９９８−Ｘ９９９−Ｘ１０００（配列番号３１２８）、Ｘ９９１−Ｘ９９２−Ｘ９９３−Ｘ９９４−Ｘ９９５−Ｘ９９６−Ｘ９９７−Ｘ９９８−Ｘ９９９−Ｘ１０００（配列番号３１２９）、およびＸ９９０−Ｘ９９１−Ｘ９９２−Ｘ９９３−Ｘ９９４−Ｘ９９５−Ｘ９９６−Ｘ９９７−Ｘ９９８−Ｘ９９９−Ｘ１０００（配列番号３１３０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ペプチドが１つ以上のＮ末端アミノ酸を含む場合、Ｘ１０００は、ＡまたはＫであり、Ｘ９９９は、ＶまたはＫであり、Ｘ９９８は、ＱまたはＫであり、Ｘ９９７は、ＬまたはＫであり、Ｘ９９６は、ＲまたはＫであり、Ｘ９９５は、ＧまたはＫであり、Ｘ９９４は、ＶまたはＫであり、Ｘ９９３は、ＧまたはＫであり、Ｘ９９２は、ＳまたはＫであり、Ｘ９９１は、Ｋであり、Ｘ９９０は、Ｋである。
【００７１】
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に記載されるコア構造に加えて、具体的に企図される他の構造は、１つ以上の追加的アミノ酸が、Ｘ１０２０に直接結合したコア構造のＣ末端に結合した構造である。例えば、Ｃ末端付加は、随意に、Ｘ１０２１、Ｘ１０２１−Ｘ１０２２、Ｘ１０２１−Ｘ１０２２−Ｘ１０２３、およびＸ１０２１−Ｘ１０２２−Ｘ１０２３−Ｘ１０２４（配列番号３１３１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ１０２１は、ＴまたはＫであり、Ｘ１０２２は、ＳまたはＫであり、Ｘ１０２３およびＸ１０２４は、Ｋである。
【００７２】
本発明は、さらに、アミノ酸配列Ａｃ−ＦＱＳＫ−Ｎｍｇ−ＮＶＦＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ−ＮＨ２（式ＩＶ）（配列番号１６４）との少なくとも６０％の同一性（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるＴＦＰＩ結合性ペプチドを含む。いくつかの場合において、ペプチドは、本明細書に記載のような式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなる。本発明はまた、配列番号８〜９７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチド（例えば、配列番号８〜７４１および９６２〜９７２（例えば、配列番号８〜７４１、９６２〜９６８、９７１、もしくは９７２）からなる群から選択される、ならびに／または７４２〜９６１（例えば、配列番号７４４〜９６１）からなる群から選択される、ならびに／または配列番号９７３〜９７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなるペプチド）を含む。
【００７３】
本発明は、環状構造を有するペプチドを含む。この点において、本発明は、ペプチド内に環状構造（例えば、Ｎ末端およびＣ末端アミノ酸以外のアミノ酸の間の連結により形成される１つ以上のループ）を有するペプチド、末端アミノ酸とペプチド配列内のアミノ酸との相互作用により形成される環状構造を有するペプチド、ならびに先頭部から後尾部に環化したペプチドを含む。ペプチドはまた、周囲の追加的アミノ酸または化学置換基により形成されるより大きな環状構造の一部であってもよい。本発明のペプチドは、いくつかの場合において、分子内ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、システイン残基により形成される。非システイン残基同士、または非システイン残基およびシステイン残基により形成される環状構造を有するペプチドもまた提供される。例えば、一実施形態において、本発明のペプチドは、環化を媒介する少なくとも１つの非従来的アミノ酸または化学部分を含む。好適な非従来的アミノ酸または化学部分は、ＦＡ１９２０５、ＦＡ１９２０４、ＦＡ１９２０３、ＦＡ０３２０２、Ｈｃｙ、ｈｃｙ、Ｃｅａ、およびｃを含むが、これらに限定されない。環化を担うアミノ酸または部分は、ループ構造の形成を可能にするように十分離間しており、例えば、アミノ酸または部分は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ以上の残基により離間している。
【００７４】
一態様において、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の構造を有するペプチドは、システインが分子内ジスルフィド結合を形成するように、少なくとも３つのアミノ酸残基により離間した少なくとも２つのシステイン残基を含有する（例えば、ペプチドは、２つのシステイン残基を含有する）。いくつかの場合において、システインは、３つ以上のアミノ酸残基により離間している。例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の構造を有するペプチドにおいて、Ｘ１０００、Ｘ１００１、Ｘ１００３、Ｘ１００４、Ｘ１００５、Ｘ１００６、Ｘ１０１０、Ｘ１０１１、Ｘ１０１３、Ｘ１０１４、Ｘ１０１７、Ｘ１０１８、Ｘ１０２０、およびＸ１０２１のいずれか２つは、随意に、ジスルフィド架橋を形成することができるシステインである。したがって、いくつかの態様において、ペプチドは、２つのシステイン残基を含有し、Ｘ１０００、Ｘ１００５、Ｘ１０１０、およびＸ１０１４の１つがシステインであり、Ｘ１００６、Ｘ１０１０、Ｘ１０１７、およびＸ１０２１の１つがシステインである。本発明は、システイン対の可能な組み合わせの全てを企図し、例えば、Ｘ１０００およびＸ１００６がＣである；Ｘ１０００およびＸ１０１０がＣである；Ｘ１０００およびＸ１０１７がＣである；Ｘ１００５およびＸ１０１７がＣである；Ｘ１０１０およびＸ１０１７がＣである；Ｘ１０１０およびＸ１０２１がＣである；またはＸ１０１４およびＸ１０２１がＣである。本発明の他の例示的環状ペプチドは、例えば、ＪＢＴ２４４１、ＪＢＴ２４５０、ＪＢＴ２４６６〜ＪＢＴ２４６９、ＪＢＴ２４８９〜ＪＢＴ２４９５、ＪＢＴ２４９７〜ＪＢＴ２４９９、およびＪＢＴ２５１３〜ＪＢＴ２５１８（それぞれ、配列番号４１５９、４１６７、４１８１〜４１８４、４２０４〜４２１０、４２１２〜４２１４、および４２２８〜４２３３）を含む。
【００７５】
本発明は、さらに、式（Ｖ）：Ｘ２００１−Ｘ２００２−Ｘ２００３−Ｘ２００４−Ｘ２００５−Ｘ２００６−［Ｘ２００７−Ｘ２００８−Ｘ２００９−Ｘ２０１０−Ｘ２０１１−Ｘ２０１２−Ｘ２０１３−Ｘ２０１４−Ｘ２０１５−Ｘ２０１６−Ｘ２０１７−Ｘ２０１８］−Ｘ２０１９−Ｘ２０２０−Ｘ２０２１−Ｘ２０２２−Ｘ２０２３（Ｖ）（配列番号３１１８）の構造を有する、ＴＦＰＩに結合するペプチドを提供し、ペプチドは、Ｘ２００７とＸ２０１８との間の連結、例えばジスルフィド結合により生成される環状構造を形成する（式（Ｖ）内において括弧として示される）。式（Ｖ）中、Ｘ２００１、Ｘ２００２、およびＸ２０２３は、独立して、存在する、または存在しない。存在する場合、Ｘ２００１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２００２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０２３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸である。さらに、Ｘ２００３は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２００４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２００５は、Ｗであり、Ｘ２００６は、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２００７は、Ｃ、Ｈｃｙ、Ｄａｐ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、ＣまたはＨｃｙ）であり、Ｘ２００８は、Ａ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２００９は、ａ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ｍ、Ｎｌｅ、ｐ、Ｒ、Ｓｅｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０１０は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０１１は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０１２は、Ａ、ａ、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、ｋ、Ｌ、ｌ、Ｍ、ｍ、Ｎｌｅ、ｎｌｅ、Ｐ、ｐ、Ｒ、ｒ、Ｓ、ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、ｔ、Ｖ、ｖ、Ｗ、およびｗからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０１３は、Ａ、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０１５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０１８は、ＣおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり（例えば、Ｘ２０１８は、Ｃであり）、Ｘ２０１９は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０２０は、ＦおよびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０２１は、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０２２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００７６】
いくつかの場合において、式（Ｖ）の構造を有する本発明のペプチド中、Ｘ２００１は、随意に、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり（Ｘ２００１が存在する場合）、Ｘ２００２は、随意に、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり（例えば、Ｈ、Ｆ、Ｍ、またはＲ）であり（Ｘ２００２が存在する場合）、Ｘ２００３は、随意に、Ａ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｆ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、ＦまたはＹ）であり、Ｘ２００４は、随意に、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｋ）であり、Ｘ２００５は、随意に、Ｗであり、Ｘ２００６は、随意に、Ｆ、Ｈ、Ｋ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、ＦまたはＨ）であり、Ｘ２００７は、随意に、ＣおよびＨｃＹからなる群から選択されるアミノ酸であり（例えば、Ｘ２００７は、Ｃであり）、Ｘ２００８は、随意に、Ａ、Ｇ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２００９は、随意に、ａ、Ａ、Ｋ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、ｍ、Ｎｌｅ、Ｓｅｍ、およびｐからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｍ、Ｎｌｅ、ｐ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｍ、Ｓｅｍ、またはＶ）；Ｘ２０１０は、随意に、からなる群から選択されるアミノ酸Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、およびＳ、例えば、からなる群から選択されるアミノ酸Ａ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、ＲおよびＳ（例えば、Ｋ、Ｐ、またはＲ）であり、Ｘ２０１１は、随意に、Ｄ、Ｇ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、ＤまたはＳ）であり、Ｘ２０１２は、随意に、Ａ、ａ、Ｄ、ｄ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｋ、ｋ、Ｌ、ｌ、Ｍ、ｍ、Ｎｌｅ、Ｐ、Ｓ、およびｓからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｄ、ｄ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｋ、ｋ、Ｌ、ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｐ、Ｓ、およびＳｅｍからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｆ、Ｌ、ｌ、Ｓｅｍ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ２０１３は、随意に、Ａ、Ｄ、ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｓ、およびｓからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｄ、Ｇ、Ｋ、またはＳ）であり、Ｘ２０１４は、随意に、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、ＤまたはＧ）であり、Ｘ２０１５は、随意に、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、ＩまたはＴ）であり、Ｘ２０１６は、随意に、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｓ、Ｓｅｍ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓｅｍ、またはＹ）であり、Ｘ２０１７は、随意に、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、ＳまたはＴ）であり、Ｘ２０１８は、随意に、Ｃであり、Ｘ２０１９は、随意に、Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、ＡまたはＶ）であり、Ｘ２０２０は、随意に、ＦおよびＷからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｗ）であり、Ｘ２０２１は、随意に、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｖ）であり、Ｘ２０２２は、随意に、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｆ、Ｌ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ２０２３は、随意に、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｌ  Ｍ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸配列）である（Ｘ２０２３が存在する場合）。
【００７７】
本発明は、さらに、ＴＦＰＩに結合するペプチドであって、式（ＶＩ）：Ｘ２００１−Ｘ２００２−Ｆ／Ｙ−Ｋ−Ｗ−Ｆ／Ｈ−［Ｃ−Ｘ２００８−Ｍ／Ｖ−Ｘ２０１０−Ｄ−Ｘ２０１２−Ｘ２０１３−Ｇ−Ｉ／Ｔ−Ｘ２０１６−Ｓ／Ｔ−Ｃ］−Ａ／Ｖ−Ｗ−Ｖ−Ｘ２０２２−Ｘ２０２３（ＶＩ）（配列番号３１１９）の構造を有するペプチドを含む。式（ＶＩ）の構造を有するペプチド中、Ｘ２００１、Ｘ２００２、およびＸ２０２３は、それぞれ独立して、存在するか、または存在しない。Ｘ２００１、Ｘ２００２、および／またはＸ２０２３が存在する場合、Ｘ２００１、Ｘ２００２、およびＸ２０２３のうちのいずれかは、独立して、任意のアミノ酸から選択される。さらに、Ｘ２００８、Ｘ２０１０、Ｘ２０１２、Ｘ２０１３、Ｘ２０１６、およびＸ２０２２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸から選択される。
【００７８】
いくつかの態様において、式（ＶＩ）のペプチド中、Ｘ２００１は、随意に、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸）であり（Ｘ２００１が存在する場合）、Ｘ２００２は、随意に、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｈ、Ｆ、Ｍ、またはＲ）であり（Ｘ２００２が存在する場合）、Ｘ２００８は、随意に、Ａ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｇ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０１０は、随意に、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｋ、Ｐ、またはＲ）であり、Ｘ２０１２は、随意に、Ａ、ａ、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｉ、Ｋ、ｋ、Ｌ、ｌ、Ｍ、ｍ、Ｎｌｅ、ｎｌｅ、Ｐ、ｐ、Ｒ、ｒ、Ｓ、ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、ｔ、Ｖ、ｖ、Ｗ、およびｗからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、ａ、Ｄ、ｄ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｋ、ｋ、Ｌ、ｌ、Ｍ、ｍ、Ｎｌｅ、Ｐ、Ｓ、ｓ、およびＳｅｍからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｄ、ｄ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｋ、ｋ、Ｌ、ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｐ、Ｓ、およびＳｅｍからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｆ、Ｌ、ｌ、Ｓｅｍ、またはＭ）であり、Ｘ２０１３は、随意に、Ａ、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｄ、ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｓ、およびｓからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｄ、Ｇ、Ｋ、またはＳ）であり、Ｘ２０１６は、随意に、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｓ、Ｓｅｍ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｓ、およびＳｅｍからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｆ、Ｓｅｍ、またはＭ）であり、Ｘ２０２２は、随意に、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｆ、Ｌ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、またはＷ）であり、ならびに／あるいは、Ｘ２０２３は、随意に、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｌ  Ｍ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、またはＹ）である（Ｘ２０２３が存在する場合）。
【００７９】
本発明のＴＦＰＩ結合性ペプチドは、一態様において、式ＶＩＩ：Ａｃ−ＦＹＹＫＷＨ［ＣＧＭＲＤＭＫＧＴＭＳＣ］ＡＷＶＫＦ−ＮＨ２（ＶＩＩ）（配列番号１０４０）の配列との少なくとも６０％の同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む。随意に、ペプチドは、本明細書において定義される式（Ｖ）〜（ＶＩＩ）のアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなる。本発明はまた、配列番号１００１〜１２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチド（例えば、配列番号１００１〜１２１２および１２９０〜１２９１（例えば、配列番号１００１〜１２０、１２９０、もしくは１２９１）からなる群から選択される、ならびに／または配列番号１２１３〜１２８９からなる群から選択される、ならびに／または配列番号１２９２および１２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチド）も含む。本発明はまた、配列番号１３３７〜１３５５および４２４０〜４２６８（ＪＢＴ０４９６、ＪＢＴ１１６５、ＪＢＴ２３３０〜ＪＢＴ２３３８、ＪＢＴ２３４１、ＪＢＴ２３４２、ＪＢＴ２３４６〜２３４８、ＪＢＴ２３５６、ＪＢＴ２４５７、ＪＢＴ２５３８、ＪＢＴ２５１９〜ＪＢＴ２５２３、ＪＢＴ２５２７〜ＪＢＴ２５２９、ＪＢＴ２５３１〜ＪＢＴ２５３４、ＪＢＴ２５３７、ＪＢＴ２５３９〜ＪＢＴ２５４１、ＪＢＴ２５４３〜ＪＢＴ２５５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む（またはそのアミノ酸配列からなる）ペプチドも含む。
【００８０】
本発明は、式（ＶＩＩＩ）：Ｘ３００１−Ｘ３００２−Ｘ３００３−Ｘ３００４−Ｘ３００５−Ｘ３００６−Ｘ３００７−Ｘ３００８−Ｘ３００９−Ｘ３０１０−Ｘ３０１１−Ｘ３０１２−Ｘ３０１３−Ｘ３０１４−Ｘ３０１５−Ｘ３０１６−Ｘ３０１７−Ｘ３０１８−Ｘ３０１９−Ｘ３０２０−Ｘ３０２１（ＶＩＩＩ）（配列番号３１２０）の構造の少なくともアミノ酸３〜２１（Ｘ３００３〜Ｘ３０２１）を含むＴＦＰＩ結合性ペプチドを提供する。式（ＶＩＩＩ）中、Ｘ３００１およびＸ３００２は、独立して、ペプチド中に存在するか、または存在しない。存在する場合、Ｘ３００１は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｈ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００２は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ｉ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸である。さらに、Ｘ３００３は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００４は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００５は、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００６は、Ａ、Ｗ、Ｃ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、およびＨからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００７は、Ｑ、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００８は、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００９は、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１０は、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１１は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｃ、Ｆ、およびＨからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１２は、Ａ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１３は、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１４は、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１５は、Ａ、Ｋ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１６は、Ａ、Ｆ、Ｋ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１７は、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｈ、Ａ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１８は、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１９は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０２０は、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｉ、およびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０２１は、Ａ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、およびＧからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００８１】
本発明のいくつかの態様において、ペプチドは、式（ＶＩＩＩ）の配列を含み、式中、Ｘ３００１は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｈ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｈ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（Ｘ３００１が存在する場合）であり、Ｘ３００２は、随意に、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ｉ、およびＬからなる群から選択されるアミノ、例えば、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ｉ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸（Ｘ３００２が存在する場合）であり、Ｘ３００３は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００４は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＰからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００５は、随意に、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００６は、随意に、Ｐ、Ｈ、およびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００７は、随意に、Ｃ、Ｇ、Ｒ、Ｗ、Ａ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｌ、Ｃ、Ｒ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００８は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００９は、随意に、Ｃ、Ｉ、Ｒ、Ｖ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｒ、Ｖ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１０は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１１は、随意に、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、Ｃ、Ｆ、およびＨからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｃ、Ｆ、およびＨからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１２は、随意に、ＨおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｈ）であり、Ｘ３０１３は、随意に、Ｃ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｖ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１４は、随意に、Ａ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｒ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１５は、随意に、ＫまたはＲであり、Ｘ３０１６は、随意に、ＫまたはＲであり、Ｘ３０１７は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｈ、Ａ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｈ、Ａ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０１８は、随意に、Ａ、Ｋ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｋ、Ｃ、Ｉ、Ｒ、またはＷ）であり、Ｘ３０１９は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３０２０は、随意に、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｖ、Ｉ、およびＰからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｃ、Ｍ、Ｉ、またはＰ）であり、Ｘ３０２１は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、およびＧからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｆ、およびＧからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００８２】
本発明は、さらに、ＴＦＰＩに結合し、式（ＩＸ）：Ｘ３００１−Ｘ３００２−Ｘ３００３−Ｘ３００４−Ｘ３００５−Ｘ３００６−Ｘ３００７−Ｘ３００８−Ｘ３００９−Ｘ３０１０−Ｘ３０１１−Ｈ−Ｘ３０１３−Ｘ３０１４−Ｋ／Ｒ−Ｒ−Ｘ３０１７−Ｘ３０１８−Ｘ３０１９−Ｘ３０２０−Ｘ３０２１（ＩＸ）（配列番号３１２１）の構造の少なくともアミノ酸３〜２１（Ｘ３００３〜Ｘ３０２１）を含む、ペプチドを提供する。式（ＩＸ）中、Ｘ３００１およびＸ３００２は、独立して、ペプチド中に存在するか、または存在しない。存在する場合、Ｘ３００１および／またはＸ３００２は、独立して、任意のアミノ酸から選択される。同様に、Ｘ３００３、Ｘ３００４、Ｘ３００５、Ｘ３００６、Ｘ３００７、Ｘ３００８、Ｘ３００９、Ｘ３０１０、Ｘ３０１１、Ｘ３０１３、Ｘ３０１４、Ｘ３０１７、Ｘ３０１８、Ｘ３０１９、Ｘ３０２０、およびＸ３０２１は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸から選択される。存在する場合、Ｘ３００１は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｈ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｈ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｈ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸）である。同様に、存在する場合、Ｘ３００２は、随意に、からＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ｉ、およびＬなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ｉ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ｉ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸）である。また、式（ＩＸ）に関して、Ｘ３００３は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ３００４は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＰからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＰからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＰからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ３００５は、随意に、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ３００６は、随意に、Ａ、Ｗ、Ｃ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、およびＨからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｐ、Ｈ、およびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３００７は、随意に、Ｑ、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｇ、Ｒ、Ｗ、Ａ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｌ、Ｃ、Ｒ、またはＷ）であり、Ｘ３００８は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ３００９は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｉ、Ｒ、Ｖ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｃ、Ｒ、Ｖ、またはＫ）であり、Ｘ３０１０は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｃ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ３０１１は、随意に、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｃ、Ｆ、およびＨからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、Ｃ、Ｆ、およびＨからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｃ、Ｆ、およびＨからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ３０１３は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｖ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、またはＩ）であり、Ｘ３０１４は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｒ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ３０１７は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｈ、Ａ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｈ、Ａ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｈ、Ａ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸）であり、Ｘ３０１８は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｋ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｋ、Ｃ、Ｉ、Ｒ、またはＷ）であり、Ｘ３０１９は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、およびＩからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｃ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、またはＩ）であり、Ｘ３０２０は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｉ、およびＰからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｖ、Ｉ、およびＰからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｃ、Ｍ、Ｉ、またはＰ）であり、ならびに／あるいはＸ３０２１は、随意に、Ａ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、およびＧからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、およびＧからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｆ、およびＧからなる群から選択されるアミノ酸）である。
【００８３】
本発明のＴＦＰＩ結合性ペプチドは、いくつかの態様において、式（Ｘ）：Ａｃ−ＧＹＡＳＦＰＷＦＶＱＬＨＶＨＫＲＳＷＥＭＡ−ＮＨ２（Ｘ）（配列番号２２３）の配列との少なくとも６０％の同一性（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む。随意に、ペプチドは、本明細書において定義される式（ＶＩＩＩ）〜（ＩＸ）のアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなる。本明細書において使用される場合、「少なくとも６０％の同一性」および同様の用語は、例えば、６０％から１００％の任意の整数、例えば、６０％、６１％、６２％等を包含する。また、「少なくとも［パーセンテージ］の同一性」という用語は、本発明のペプチドのアミノ酸の総数で除した同一のアミノ酸の数以上である任意のパーセンテージを包含する（［少なくともパーセンテージの同一性］≧［同一のアミノ酸の数］／［本発明のペプチドのアミノ酸の総数］）。
【００８４】
本発明はまた、配列番号２００１〜２４９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチド（例えば、配列番号２００１〜２２９６および２４９８（例えば、配列番号２００１〜２１２６、２１２８〜２２９６、もしくは２４９８）からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびに／または配列番号２２９７〜２４９７（例えば、配列番号２２９８〜２４９７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチド）も含む。本発明は、さらに、配列番号３００１〜３１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチド（例えば、配列番号３００１〜３０６４（例えば、配列番号３００１〜３０４８、３０５１〜３０５３、３０５５、もしくは３０５７〜３０６４）からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびに／または配列番号３０６５〜３０８４（例えば、配列番号３０６６〜３０８４）からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびに／または配列番号３０８５〜３１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなるペプチド）を提供する。
【００８５】
配列番号１〜７のペプチドはまた、いくつかの態様において、配列番号１〜７のＮまたはＣ末端に結合した１つ以上のアミノ酸を含む。例えば、本発明は、その全てが配列番号１のアミノ酸配列を含む、ＪＢＴ００４７、ＪＢＴ００５１、ＪＢＴ００５５、ＪＢＴ０１３１、ＪＢＴ０１３２、ＪＢＴ０１３３、ＪＢＴ０１５５、ＪＢＴ０１５８、ＪＢＴ０１６２、ＪＢＴ０１６３、ＪＢＴ０１６４、ＪＢＴ０１６６、ＪＢＴ０１６９、ＪＢＴ０１７０、ＪＢＴ０１７１、ＪＢＴ０１７４、ＪＢＴ０１７５、またはＪＢＴ０２９３のアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチドを含む。配列番号２ののアミノ酸配列を含む例示的ペプチドは、ＪＢＴ０２９４、ＪＢＴ０２９５、ＪＢＴ０２９６、ＪＢＴ０２９７、ＪＢＴ０２９８、ＪＢＴ０２９９、ＪＢＴ０３００、ＪＢＴ０３０１、ＪＢＴ０３０２、ＪＢＴ０３０３、ＪＢＴ０３０４、ＪＢＴ０３０５、ＪＢＴ０３０６、ＪＢＴ０３０７、ＪＢＴ０３０８、ＪＢＴ０３０９、ＪＢＴ０３１０、またはＪＢＴ０３１１のアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチドを含む。配列番号３のアミノ酸配列を含む例示的ペプチドは、ＪＢＴ００４９、ＪＢＴ００５３、ＪＢＴ００５７、ＪＢＴ０１９０、ＪＢＴ０１９３、またはＪＢＴ０１９７のアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなる。本発明は、さらに、その全てが配列番号４のアミノ酸配列を含む、ＪＢＴ００５０、ＪＢＴ００５４、ＪＢＴ００５８、ＪＢＴ０１２９、ＪＢＴ０１３０、ＪＢＴ０２０５、ＪＢＴ０２０８、ＪＢＴ０２１１、ＪＢＴ０２１２、ＪＢＴ０２１７、ＪＢＴ０２１８、またはＪＢＴ０２１９のアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチドを含む。配列番号５を含む例示的ペプチドは、ＪＢＴ０１０１、ＪＢＴ００５２、ＪＢＴ０１０３、ＪＢＴ０１７８、またはＪＢＴ０１８２のアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチドを含む。本発明は、さらに、そのそれぞれが配列番号６のアミノ酸配列を含む、ＪＢＴ０１２０、ＪＢＴ０１２４、ＪＢＴ０２４７、ＪＢＴ０２４８、ＪＢＴ０２５１、またはＪＢＴ０２５２のアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチドを含む。配列番号７のアミノ酸配列を含むペプチド、例えば、ＪＢＴ０１２２、ＪＢＴ０１２６、ＪＢＴ０２２１、ＪＢＴ０２２４、ＪＢＴ０２２５、ＪＢＴ０２２６、ＪＢＴ０２２８、ＪＢＴ０２３２、またはＪＢＴ０２３３のアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなるペプチドもまた、本発明により提供される。本明細書に記載のペプチドは、実施例１の表５、および図１２〜１８に示される。
【００８６】
本発明は、さらに、式（ＸＩ）：Ｘ４００１−Ｑ−Ｘ４００３−Ｘ４００４−Ｘ４００５−Ｘ４００６−Ｘ４００７−Ｘ４００８−Ｘ４００９−Ｘ４０１０−Ｘ４０１１−Ｘ４０１２−Ｘ４０１３−Ｘ４０１４−Ｒ−Ｘ４０１６−Ｘ４０１７−Ｘ４０１８−Ｘ４０１９−Ｘ４０２０（ＸＩ）（配列番号３１５１）の構造を有するＴＦＰＩ結合性ペプチドを含む。式（ＸＩ）に関して、Ｘ４００１は、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、およびＤｏｐａからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｆ、Ｙ、１Ｎｉ、Ｂｔａ、またはＤｏｐａ）であり、Ｘ４００３は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｅｄｅ（Ｏ）、およびＣｍｃからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｄ、Ｅ、またはＳ）であり、Ｘ４００４は、Ａｉｂ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｋ）であり、Ｘ４００５は、ａ、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、ＮプロピルＧ、ａｚｅ、ｐｉｐ、ｔｉｃ、ｏｉｃ、ｈｙｐ、ｎｍａ、Ｎｃｇ、Ａｂｇ、Ａｐｇ、ｔｈｚ、およびｄｔｃからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、ｐ、Ｎｍｇ、ＮプロピルＧ、ａｚｅ、ｐｉｐ、ｔｉｃ、ｏｉｃ、またはｈｙｐ）であり、Ｘ４００６は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｃｉｔ、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ｅｃｌ、Ｅｅａ、Ｅｅｃ、Ｅｅｆ、Ｎｉｆ、およびＥｅｗからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｃ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｎｌｅ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｉ、またはＣｉｔ）であり、Ｘ４００７は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、およびＴｌｅからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、ＶまたはＴｌｅ）であり、Ｘ４００８は、Ｆ、Ｈ、１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ｐｍｙ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｈ、１Ｎｉ、２Ｎｉ、またはＰｍｙ）であり、Ｘ４００９は、Ａｉｂ、Ｖ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ａｂｕ、Ｃｐｇ、Ｔｌｅ、およびＬ−２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｖ、Ａｂｕ、またはＴｌｅ）であり、Ｘ４０１０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｎｍｄ、およびＣ（ＮＥＭ）からなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｄ、Ｐ、Ｃ、またはＴ）であり、Ｘ４０１１は、Ａ、ａ、Ｇ、ｐ、Ｓａｒ、ｃ、およびｈｃｙからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｇ、ａ、ｃ、ｈｃｙ、またはＳａｒ）であり、Ｘ４０１２は、Ｙ、Ｔｙｍ、Ｐｔｙ、Ｄｏｐａ、およびＰｍｙからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｙ）であり、Ｘ４０１３は、Ｃ、Ｆ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、およびＢｔａからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｆ、１Ｎｉ、またはＢｔａ）であり、Ｘ４０１４は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＨｃｙからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａｉｂ、Ｃ、Ｅ、またはＨｃｙ）であり、Ｘ４０１６は、Ｌ、Ｈｃｙ、Ｈｌｅ、およびＡｍｌからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４０１７は、Ａ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｓ、Ｄｅｇ、Ｅｂｃ、Ｅｃａ、Ｅｇｚ、Ａｉｃ、Ａｐｃ、およびＥｇｔからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ａｉｃ、Ｅｃａ、またはＤｅｇ）であり、Ｘ４０１８は、Ａ、Ａｉｂ、Ｈｃｙ、ｈｃｙ、Ｃ、ｃ、Ｌ、Ｎｌｅ、Ｍ、Ｎ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ｌ、またはＨｃｙ）であり、Ｘ４０１９は、Ｋ、Ｒ、およびＨａｒからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｋ）であり、Ｘ４０２０は、Ｋ、Ｌ、Ｈｃｙ、およびＡｍｌからなる群から選択されるアミノ酸（例えば、Ｌ、Ａｍｌ、およびＨｃｙ）である。
【００８７】
式（ＸＩ）のＴＦＰＩ結合性ペプチドは、式（ＸＩＩ）：Ｘ５００１−Ｑ−Ｘ５００３−Ｘ５００４−Ｘ５００５−Ｘ５００６−Ｉ／Ｖ−Ｘ５００８−Ａｉｂ／Ｖ−Ｘ５０１０−Ｇ−Ｙ−Ｘ５０１３−Ｘ５０１４−Ｒ−Ｌ−Ｘ５０１７−Ｘ５０１８−Ｋ−Ｋ／Ｌ（ＸＩＩ）（配列番号３１５２）の構造を有さない。式（ＸＩＩ）中、Ｘ５００１は、Ｆ、Ｌ、Ｍ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５００３は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５００４は、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５００５は、ａ、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、Ｑ、Ｒ、およびｐからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５００６は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５００８は、Ｆ、Ｈ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５０１０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｄ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５０１３は、Ａｉｂ、Ｃ、およびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５０１４は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５０１７は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｎｖｅ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５０１８は、Ａ、Ｃ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００８８】
一態様において、本明細書に記載のＴＦＰＩ結合性ペプチドは、Ｎ末端アミノ酸（複数を含む）および／または部分をさらに含む。例えば、式（ＸＩ）のＴＦＰＩ結合性ペプチドは、Ｘ４００１に連結したＮ末端アミノ酸（複数を含む）および／または部分をさらに含むか、あるいは式（ＸＩＩＩ）および（ＸＩＶ）のＸ６００１および／またはＸ７００１（以下に記載の）は、Ｎ末端アミノ酸（複数を含む）または部分に連結する。Ｎ末端アミノ酸（複数を含む）および／または部分は、随意に、ＦＡＭ−Ｔｔｄｓ、プロリン−グルタメートタグ（「ＰＥ」）、Ｐａｌｍ、２−フェニルアセチル、３−フェニルプロピオニル、２−（ナフタ−２−イル）アセチル、ヘキサノイル、２−メチルプロピオニル、３−メチルブタノイル、２−ナフチルスルホニル、アセチル、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、ＡＯＡ、Ｏｘｍｅ−ＡＯＡ、Ｍｅｏｘ−Ｌｅｖ、レブリン酸（Ｌｅｖ）、およびペンチン酸（Ｐｙｎ）、および１−ナフチルスルホニルからなる群から選択される。代替として、またはそれに加えて、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、式（ＸＩ）、式（ＸＩＩＩ）、および／または式（ＸＩＶ）のＴＦＰＩ結合性ペプチド）は、Ｃ末端アミノ酸に連結した１つ以上のアミノ酸（複数を含む）および／または部分（例えば、Ｘ４０２０、Ｘ６０２０、Ｘ７０２２、またはＸ７０２３）をさらに含む。Ｃ末端アミノ酸（複数を含む）および／または部分は、随意に、Ｃ、ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−マレイミドプロピオニル（ＥｔＳＨ））、ＦＡ１９２０５、ＦＡ１９２０４、ＦＡ１９２０３、ＦＡ０３２０２、Ｋ（Ｔｄｔｓ−マレイミド）、Ｋ（ＡＯＡ）、Ｃｅａ、およびアミドからなる群から選択される。代替として、Ｃ末端アミノ酸（複数を含む）および／または部分はまた、Ｅａｇ、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｈｌｙ、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｈｃｙ、Ｐｅｎ、Ｋ（Ｍｙｒ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ｍｙｒ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ｐａｌｍ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ａｃ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−γＧｌｕ−Ｍｙｒ）、Ｋ（ＡｌｂｕＴａｇ）、およびＫ（４ＰＢＳＡ）からなる群から選択される。式（ＸＩ）の文脈において、Ｃ末端アミノ酸（複数を含む）および／または部分は、本明細書において、Ｘ４０２１として示される。式（ＸＩＩＩ）および（ＸＩＶ）の文脈において、Ｃ末端アミノ酸（複数を含む）および／または部分は、それぞれ、Ｘ６０２１およびＸ７０２４として示される。
【００８９】
一実施形態において、ペプチドは、Ｘ４０１８とＸ４０２１との間に形成される環状構造を有する。この点において、Ｘ４０１８は、随意に、Ｃまたはｃであり、Ｘ４０２１は、随意に、Ｃｅａである。別の実施形態において、ペプチドは、Ｘ４０１１とＸ４０１４との間に形成される環状構造を有する。この点において、Ｘ４０１１は、随意に、ｃまたはｈｃｙであり、Ｘ４０１４は、随意に、ＣまたはＨｃｙである。
【００９０】
本発明はまた、配列番号４０２２、４０２４、４０３２、４０３６〜４０４７、４０４９〜４０７８、４０８６〜４０９７、４１００〜４１２７、４１２９〜４１７０、４１７３〜４１９５、４２００〜４２１４、４２１７〜４２２５、４２２８、４２３０、４２３１、４２３８、および４２３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド、ならびに、配列番号１２９４〜１３３６、４００２、４０１３、４０２１、４０２３、４０２５〜４０３１、４０３３−４０３５、４０４８、４０７９〜４０８５、４０９８、４０９９、４１２８、４１７１、４１７２、４１９６〜４１９９、４２１５、４２１６、４２２６、４２７７、４２２９、４２３２、および４２３３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む。
【００９１】
ある特定の実施形態において、本発明のペプチドは、ＪＢＴ００４７、ＪＢＴ００４９、ＪＢＴ０１０１、ＪＢＴ０１２０、またはＪＢＴ０１２２のアミノ酸配列、あるいは本明細書に記載の本発明のペプチドのいずれか（例えば、配列番号１〜３１０８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、もしくはそのアミノ酸配列からなるペプチド、例えば、配列番号８〜７４１、７４４〜９６８、９７１〜９７８、１００１〜１２１０、１２１３〜１２８９、１２９０〜１２９３、２００１〜２１２６、２１２８〜２２９６、２２９８〜２４９８、３００１〜３０４８、３０５１〜３０５３、３０５５、３０５７〜３０６４、および３０６７〜３１０８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、もしくはそのアミノ酸配列からなるペプチド；配列番号４０２２、４０２４、４０３２、４０３６〜４０４７、４０４９〜４０７８、４０８６〜４０９７、４１００〜４１２７、４１２９〜４１７０、４１７３〜４１９５、４２００〜４２１４、４２１７〜４２２５、４２２８、４２３０、４２３１、４２３８、および４２３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、もしくはそのアミノ酸配列からなるペプチド；または、配列番号１２９４〜１３３６、４００２、４０１３、４０２１、４０２３、４０２５〜４０３１、４０３３〜４０３５、４０４８、４０７９〜４０８５、４０９８、４０９９、４１２８、４１７１、４１７２、４１９６〜４１９９、４２１５、４２１６、４２２６、４２７７、４２２９、４２３２、および４２３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはそのアミノ酸配列からなるペプチド）、または配列番号１３３７〜１３５５、３１４６〜３１５４、および４２４０〜４２６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはそのアミノ酸配列からなるペプチド、あるいは上記のいずれかの変異体を含むか、またはそれらからなる。「変異体」とは、１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、または親アミノ酸配列へのアミノ酸付加を含むペプチドを意味する。変異体は、本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有しながら、ＴＦＰＩに結合する、および／またはＴＦＰＩ活性を阻害する能力を保持するペプチドを含むが、これに限定されない。一実施形態において、ペプチドは、ＪＢＴ０１３２、ＪＢＴ０３０３、ＪＢＴ０１９３、ＪＢＴ０１７８、ＪＢＴ０１２０、またはＪＢＴ０２２４のアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなる。
【００９２】
一態様において、本発明のペプチドは、４０個以下のアミノ酸、例えば３５個以下のアミノ酸からなる。随意に、本発明のペプチドは、２５個以下のアミノ酸、または１０個以下のアミノ酸からなる。様々な実施形態において、ペプチドは、１５〜３５個のアミノ酸残基（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のアミノ酸残基）を含む。しかしながら、１つ以上の欠失を含む本明細書に記載のペプチドは、ペプチドがＴＦＰＩに結合し、随意に凝固カスケードのＴＦＰＩ阻害をブロックする限り、本明細書の文脈において好適であることも企図される。いくつかの態様において、アミノ酸は、Ｎ末端において、および／またはＣ末端において、アミノ酸配列内から除去される。そのようなペプチド断片は、３〜１４個のアミノ酸残基（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸残基）を含み得る。
【００９３】
随意に、本発明のペプチドは、ＴＦＰＩに結合する、および／またはＴＦＰＩを阻害するペプチドの能力を破壊しない１つ以上のアミノ酸置換（本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかを参照して）を含む。例えば、ＪＢＴ０２９４、ＪＢＴ０２９５、ＪＢＴ０２９６、ＪＢＴ０２９７、ＪＢＴ０２９８、ＪＢＴ０２９９、ＪＢＴ０３００、ＪＢＴ０３０１、ＪＢＴ０３０２、ＪＢＴ０３０３、ＪＢＴ０３０４、ＪＢＴ０３０５、ＪＢＴ０３０６、ＪＢＴ０３０７、ＪＢＴ０３０８、ＪＢＴ０３０９、ＪＢＴ０３１０、またはＪＢＴ０３１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチドは、ＪＢＴ０２９３のアミノ酸配列の置換突然変異体（Ｎ末端でフェニルアラニン残基に、およびＣ末端でリシン残基に直接連結した配列番号１のアミノ酸配列）である（図４を参照）。
【００９４】
アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減する、（２）酸化に対する感受性を低減する、（３）結合親和性を改変する、および／または（４）ペプチドに対する他の物理化学的もしくは機能的特性を与える、もしくは修飾するアミノ酸置換を含むが、これに限定されない。一態様において、置換は、保存的置換であり、アミノ酸残基は、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、およびシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、およびイソロイシン）、ならびに芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。しかしながら、当業者は、得られるペプチドが全体的または部分的にＴＦＰＩ活性を下方制御する能力を保持する限り、保存的置換の形成に限定されないことが理解される。本発明はまた、当該技術分野において周知である非定型の非自然発生的アミノ酸を含むＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）を包含する。例示的な非自然発生的アミノ酸は、オルニチン、シトルリン、ヒドロキシプロリン、ホモセリン、フェニルグリシン、タウリン、ヨードチロシン、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、ｙ−アミノ酪酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、ノルロイシン、ノルバリン、サルコシン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、３−メチルアミノ酸、α−Ｃ−メチルアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、２−アミノ−イソ酪酸、β−ホモグルタミン酸、β−ホモフェニルアラニン、β−ホモリシン、β−ホモロイシン、β−ホモアスパラギン、β−ホモグルタミン、β−ホモアルギニン、β−ホモセリン、β−ホモチロシン、β−ホモアスパラギン酸、β−ホモバリン、β−ホモアスパラギン、（Ｓ）−シクロヘキシルアラニン、（Ｓ）−シトルリン、（Ｓ）−２，４−ジアミノ酪酸、（Ｓ）−２，４−ジアミノ酪酸、（Ｓ）−ジアミノプロピオン酸、（Ｓ）−２−プロパルギルグリシン、（Ｓ）−Ｎ（オメガ）−ニトロ−アルギニン、Ｌ−ホモフェニルアラニン、（Ｓ）−ホモ−アルギニン、（Ｓ）−ホモ−シトルリン、（Ｓ）−ホモ−システイン、（Ｓ）−２−アミノ−５−メチル−ヘキサン酸、（Ｓ）−ホモ−リシン、（Ｓ）−ノルロイシン、（Ｓ）−Ｎ−メチルアラニン、（Ｓ）−Ｎ−メチル−アスパラギン酸、（Ｓ）−Ｎ−メチル−グルタミン酸、（Ｓ）−Ｎ−メチル−フェニルアラニン、Ｎ−メチル−グリシン、（Ｓ）−Ｎ−メチル−リシン、（Ｓ）−Ｎ−メチル−ロイシン、（Ｓ）−Ｎ−メチル−アルギニン、（Ｓ）−Ｎ−メチル−セリン、（Ｓ）−Ｎ−メチル−バリン、（Ｓ）−Ｎ−メチル−チロシン、（Ｓ）−２−アミノ−ペンタン酸、（Ｓ）−２−ピリジル−アラニン、（Ｓ）−オルニチン、Ｌ−フェニルグリシン、４−フェニル−酪酸、およびセレノメチオニンを含む。個々のアミノ酸は、適宜、ＬまたはＤ型立体化学を有し得るが、典型的には、Ｌ型立体化学がペプチド内のアミノ酸の全てに対し使用される。
【００９５】
本発明は、さらに、本明細書に提供されるアミノ酸配列内に挿入された、および／またはＮ末端もしくはＣ末端に結合した１つ以上のアミノ酸を含むＴＦＰＩ結合性ペプチド（ＴＦＰＩ阻害ペプチド）変異体を含む。一態様において、ペプチドは、さらに、ペプチドの溶解度を増加させるためのＮ末端および／またはＣ末端における１つまたは２つのリシンを含むがこれに限定されない、ペプチドの合成、取扱い、または使用を容易化する１つ以上のアミノ酸を含む。好適な融合タンパク質は、一般にタンパク質配列の一部として認識されない、１つ以上のポリペプチド、ポリペプチド断片、またはアミノ酸に連結したＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）を含むタンパク質を含むが、これに限定されない。一態様において、融合タンパク質は、２つ以上のペプチドの全アミノ酸配列を含むか、または代替として、２つ以上のペプチドの一部（断片）を含む。本明細書に記載のＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）の全てまたは一部に加えて、融合タンパク質は、随意に、所望の生物活性／機能を含む任意の好適なペプチドの全てまたは一部を含む。実際に、いくつかの態様において、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は、例えば、長期循環半減期を有するペプチド、マーカータンパク質、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）の精製を容易にするペプチド、多量体タンパク質の形成を促進するペプチド配列、または上記のいずれか断片の１つ以上に機能的に連結する。好適な融合タンパク質は、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｓｔｒｅｐタグ、およびｍｙｃタグを含むが、これらに限定されない。随意に、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は、ペプチドの半減期を向上させる１つ以上の実体に融合される。半減期は、例えば、ＴＦＰＩ結合性ペプチドの分子量を増加させて腎クリアランスを回避すること、および／またはｎＦｃ受容体媒介再循環経路のためにリガンドを組み込むことにより増加させることができる。一実施形態において、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、（以下でより詳細に説明されるように）アルブミンポリペプチドまたはその断片（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に融合または化学的に共役している。アルブミン断片は、全長アルブミンタンパク質の１０％、２５％、５０％、または７５％を含む。代替として、またはそれに加えて、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、生体内に投与された場合にアルブミンに結合するアルブミン結合ドメインまたは脂肪酸を含む。アルブミン結合ドメインの一例は、４−（ｐ−ヨードフェニル）−ブタン酸由来の部分である「ａｌｂｕ−タグ」である（Ｄｕｍｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４７：３１９６−３２０１（２００８））。他の好適な融合パートナーは、プロリン−アラニン−セリン多量体（ＰＡＳ化）および抗体またはその断片（例えば、抗体のＦｃ部分）を含むが、これらに限定されない。
【００９６】
一実施形態において、２つ以上のＴＦＰＩ結合性ペプチドが互いに融合する、多量体化ドメインにより連結される、または化学結合を介して結合してＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）複合体を生成する。ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、同じまたは異なっていてもよい。したがって、本発明は、随意に１つ以上のリンカーにより結合した、本明細書に記載のペプチドのいずれかを含むか、またはそれからなるホモ二量体（すなわち、２つの同一のＴＦＰＩ結合性ペプチドを含む二量体）、ホモ多量体（すなわち、３つ以上の同一のＴＦＰＩ結合性ペプチドを含む複合体）、ヘテロ二量体（すなわち、２つの異なるＴＦＰＩ結合性ペプチドを含む二量体）、およびヘテロ多量体（すなわち、３つ以上のＴＦＰＩ結合性ペプチドを含む複合体であり、ＴＦＰＩ結合性ペプチドの少なくとも２つが異なる）を提供する。
【００９７】
この点において、本発明は、第１のペプチドおよび第２のペプチドを含むペプチド複合体を提供する。本明細書に記載のペプチドのいずれかは、ペプチド複合体に対して好適なサブユニット（例えば、第１のペプチドまたは第２のペプチド）である。いくつかの実施形態において、ペプチド複合体は、２５〜１００個のアミノ酸、例えば、３０〜８０個のアミノ酸、３０〜６０個のアミノ酸、または３０〜５０個のアミノ酸を含む。第１のペプチドおよび第２のペプチドは、ヒトＴＦＰＩの異なる領域（エピトープ）に結合し得、ペプチド複合体は、ＦＸａに結合するＴＦＰＩおよびＦＶＩＩａに結合するＴＦＰＩ等であるが、これらに限定されない、２つ以上のＴＦＰＩ機能を阻害する。本発明の様々な実施形態において、ペプチド複合体によって媒介される少なくとも１つのＴＦＰＩ（例えば、ＴＦＰＩ−１）活性の阻害のレベルは、単独で、または組み合わせて、第１のペプチドまたは第２のペプチドによって達成される阻害のレベルよりも大きい。ＴＦＰＩ上の異なる領域（エピトープ）は、同じＴＦＰＩポリペプチド上、または異なるＴＦＰＩポリペプチド上であり得る。本明細書に記載される単量体ＴＦＰＩ結合性ペプチドの機能的な特徴ならびに治療的および診断的適用はまた、本明細書に記載されるペプチド複合体に適用できる。同様に、単量体ＴＦＰＩ結合性ペプチドへの修飾の説明はまた、ペプチド複合体に関する。
【００９８】
本発明は、式（ＸＩＩＩ）：Ｘ６００１−Ｘ６００２−Ｘ６００３−Ｘ６００４−Ｘ６００５−Ｘ６００６−Ｘ６００７−Ｘ６００８−Ｘ６００９−Ｘ６０１０−Ｘ６０１１−Ｘ６０１２−Ｘ６０１３−Ｘ６０１４−Ｘ６０１５−Ｘ６０１６−Ｘ６０１７−Ｘ６０１８−Ｘ６０１９−Ｘ６０２０（ＸＩＩＩ）（配列番号３１５３）の構造を有する第１のペプチドを含むペプチド複合体を提供する。式（ＸＩＩＩ）中、
Ｘ６００１は、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、Ｄｏｐａ、Ｂｈｆ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｎｍｆ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、１Ｎｉ、Ｂｔａ、Ｄｏｐａ、Ｆ、Ｌ、Ｙ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００２は、Ｑ、Ｇ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｑであり、
Ｘ６００３は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｓ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、およびＣからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００４は、Ａｉｂ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ａ、Ｂｈｋ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ｋ、Ｎ、Ｎｍｋ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｋ、Ａｉｂ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｙ、Ｍ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００５は、ａ、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、ＮプロピルＧ、ａｚｅ、ｐｉｐ、ｔｉｃ、ｏｉｃ、ｈｙｐ、ｎｍａ、Ｎｃｇ、Ａｂｇ、Ａｐｇ、ｔｈｚ、ｄｔｃ、Ｂａｌ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、ｐ、Ｎｍｇ、ＮプロピルＧ、ａｚｅ、ｐｉｐ、ｔｉｃ、ｏｉｃ、ｈｙｐ、ａ、Ａｉｂ、Ｄ、ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｃ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００６は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｃｉｔ、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ｅｃｌ、Ｅｅａ、Ｅｅｃ、Ｅｅｆ、Ｎｉｆ、Ｅｅｗ、Ａｉｂ、Ｂｔｑ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｎｌｅ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｉ、Ｃｉｔ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００７は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ｔｌｅ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎｍｖ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｔｌｅ、Ｖ、またはＩであり、
Ｘ６００８は、Ｆ、Ｈ、１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ｐｍｙ、Ｙ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｈ、１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ｐｍｙ、Ｆ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００９は、Ａｉｂ、Ｖ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ａｂｕ、Ｃｐｇ、Ｔｌｅ、Ｌ−２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、Ａ、ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｖ、Ａｂｕ、またはＴｌｅであり、
Ｘ６０１０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｎｍｄ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ａｉｂ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＮｍｆからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｄ、Ｐ、Ｃ、Ｔ、Ａ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｆ、Ｈ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１１は、Ａ、ａ、Ｇ、ｐ、Ｓａｒ、ｃ、ｈｃｙ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｋ、Ｇ、およびＮｍｇからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｇ、ａ、ｃ、ｈｃｙ、またはＳａｒであり、
Ｘ６０１２は、Ｙ、Ｔｙｍ、Ｐｔｙ、Ｄｏｐａ、およびＰｍｙからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｙであり、
Ｘ６０１３は、Ａｉｂ、Ｃ、Ｆ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｆ、１Ｎｉ、Ｂｔａ、およびＣからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１４は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｈｃｙ、Ｂｈｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａｉｂ、Ｃ、Ｅ、Ｈｃｙ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＡｉｂからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６０１５は、Ｒ、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｒであり、
Ｘ６０１６は、Ｌ、Ｈｃｙ、Ｈｌｅ、およびＡｍｌからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｌ、Ａｍｌ、Ｈｌｅ、およびＨｃｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１７は、Ａ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｓ、Ｄｅｇ、Ｅｂｃ、Ｅｃａ、Ｅｇｚ、Ａｉｃ、Ａｐｃ、Ｅｇｔ、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｂｈｒ、Ｃｉｔ、Ｄ、Ｄａｐ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ａｉｃ、Ｅｃａ、Ｄｅｇ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｋ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、およびＭからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１８は、Ａ、Ａｉｂ、Ｈｃｙ、ｈｃｙ、Ｃ、ｃ、Ｌ、Ｎｌｅ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｂａｌ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ｌ、Ｈｃｙ、Ｎ、Ｍ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１９は、Ｋ、Ｒ、Ｈａｒ、Ｂｈｋ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｋであり、
Ｘ６０２０は、Ｋ、Ｌ、Ｈｃｙ、Ａｍｌ、Ａｉｂ、Ｂｈｌ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎｍｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｌ、Ａｍｌ、Ｈｃｙ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００９９】
代替として、第１のペプチドは、本明細書に記載の式（Ｉ）〜（ＩＶ）および（ＸＩ）のうちのいずれか１つの構造を有する。第１のペプチドは、様々な実施形態において、配列番号８〜９７８、４０２２、４０２４、４０３２、４０３６〜４０４７、４０４９〜４０７８、４０８６〜４０９７、４１００〜４１２７、４１２９〜４１７０、４１７３〜４１９５、４２００〜４２１４、４２１７〜４２２５、４２２８、４２３０、４２３１、４２３８、４２３９、４００２、４０１３、４０２１、４０２３、４０２５〜４０３１、４０３３〜４０３５、４０４８、４０７９〜４０８５、４０９８、４０９９、４１２８、４１７１、４１７２、４１９６〜４１９９、４２１５、４２１６、４２２６、４２７７、４２２９、４２３２、および４２３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む（またはそれらからなる）。
【０１００】
第２のペプチドは、一態様において、式（ＸＩＶ）：Ｘ７００１−Ｘ７００２−Ｘ７００３−Ｘ７００４−Ｘ７００５−Ｘ７００６−［Ｘ７００７−Ｘ７００８−Ｘ７００９−Ｘ７０１０−Ｘ７０１１−Ｘ７０１２−Ｘ７０１３−Ｘ７０１４−Ｘ７０１５−Ｘ７０１６−Ｘ７０１７−Ｘ７０１８］−Ｘ７０１９−Ｘ７０２０−Ｘ７０２１−Ｘ７０２２−Ｘ７０２３（ＸＩＶ）（配列番号３１５４）の構造を有する。式（ＸＩＶ）中、
Ｘ７００１は、存在するか、または存在せず、Ｘ７００１が存在する場合、Ｘ７００１は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００２は、存在するか、または存在せず、Ｘ７００２が存在する場合、Ｘ７００２は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｈ、Ｆ、Ｍ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００３は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、ＦまたはＹであり、
Ｘ７００４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｋであり、
Ｘ７００５は、ＲまたはＷ、例えば、Ｗであり、
Ｘ７００６は、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、ＦまたはＨであり、
Ｘ７００７は、Ｏｒｎ、ｈｏｍｏＫ、Ｃ、Ｈｃｙ、Ｄａｐ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、ＣまたはＨｃｙであり、
Ｘ７００８は、Ａ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｇ、またはＳであり、
Ｘ７００９は、ａ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、ｐ、Ｒ、Ｓｅｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｍ、Ｓｅｍ、またはＶであり、
Ｘ７０１０は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｋ、Ｐ、またはＲであり、
Ｘ７０１１は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｄであり、
Ｘ７０１２は、Ａ、ａ、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、ｋ、Ｌ、ｌ、Ｍ、ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、ｎｌｅ、Ｐ、ｐ、Ｒ、ｒ、Ｓ、ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、ｔ、Ｖ、ｖ、Ｗ、およびｗからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｆ、Ｌ、ｌ、Ｍ、およびＳｅｍからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１３は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｅａｇ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｄ、Ｇ、Ｋ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｇであり、
Ｘ７０１５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、ＩまたはＴであり、
Ｘ７０１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓｅｍ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、ＳまたはＴであり、
Ｘ７０１８は、ＣおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｃであり、
Ｘ７０１９は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、ＡまたはＶであり、
Ｘ７０２０は、ＦおよびＷからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｗであり、
Ｘ７０２１は、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ｖであり、
Ｘ７０２２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群、例えば、Ｆ、Ｌ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２３は、存在するか、または存在せず、Ｘ７０２３が存在する場合、Ｘ７０２３は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｄ、Ｅ、Ｅａｇ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、ペプチドは、Ｘ７００７とＸ７０１８との間の連結により生成された環状構造を有する。
【０１０１】
代替として、第２のペプチドは、本明細書に記載の式（Ｖ）〜（ＶＩＩ）のうちのいずれか１つの構造を有する。第２のペプチドは、いくつかの実施形態において、配列番号１００１〜１３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか（またはそれらからなる）。式（ＸＩＩＩ）および式（ＸＩＶ）のペプチドはペプチド複合体の第１および第２のペプチドとして本明細書に参照される一方、式（ＸＩＩＩ）または式（ＸＩＶ）の構造を有する単量体ペプチドもまた、企図される。
【０１０２】
異なるＴＦＰＩエピトープに結合するＴＦＰＩ結合性ペプチドの例には、ペプチドのＪＢＴ００４７クラスの一例であるＪＢＴ１８５７（例えば、式（Ｉ）〜（ＩＶ）および（ＸＩ）として表され、これらの例は、図３２、６２、および６５に記載される）、およびペプチドのＪＢＴ０１２０クラスの一例であるＪＢＴ１８３７（例えば、式（Ｖ）〜（ＶＩＩ）として表され、これらの例は、図３４に記載される）が含まれる。したがって、一態様において、本発明は、配列番号１７８（ＪＢＴ１８５７）または配列番号４２６１（ＪＢＴ２５４８）と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドサブユニット（例えば、第１のペプチド）を含むペプチド複合体を提供する。さらに、本発明は、配列番号１０４４（ＪＢＴ１８３７）と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドサブユニット（例えば、第２のペプチド）を含むペプチド複合体を提供する。例示的なＴＦＰＩ結合性ペプチド二量体には、ＪＢＴ２４９６（配列番号４２１１）、ＪＢＴ２５４７（配列番号４２６０）、ＪＢＴ２５２１（配列番号４２４２）、ＪＢＴ２５２２（配列番号４２４３）、ＪＢＴ２５２３（配列番号４２４４）、およびＪＢＴ２５３３（配列番号４２５０）が含まれる。
【０１０３】
本開示の様々な態様において、ペプチド複合体のペプチドサブユニット（例えば、第１のペプチドおよび第２のペプチド）は、一緒に直接融合されるか、またはリンカー部分によって連結される。例えば、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、あるペプチド上の求核反応部分を別のペプチド上の求電子反応部分と反応させることによって、または酸化によって、一緒に共役して、ジスルフィドを形成する。例示的な実施形態において、第１および第２のペプチドは、アミド結合、例えば、あるペプチド上のアミンと別のペプチド上のカルボキシル基との反応時に形成するアミド結合によって連結される。ペプチドが、随意に、共役前に誘導体化剤で誘導体化されることが理解される。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、第１のペプチドおよび第２のペプチド（および随意にさらなるペプチド）は、リンカー部分によって連結される。任意のリンカー部分は、ペプチド複合体の文脈における使用に好適である。リンカー部分は、本発明のいくつかの態様において、その立体構造のうちの１つにおいて、約１Å〜約１００Å、例えば、約５Å〜約８０Å（約５Å〜約５０Å）、約１０Å〜約７０Å（約１０Å〜約６０Å、約１０Å〜約５０Å、約１０Å〜約４０Å、または約１０Å〜約３０Å）の距離を架橋する。したがって、リンカーは、その立体構造のうちの１つにおいて、随意に、約１Å〜約１００Åの長さ、例えば、約５Å〜約５０Åまたは約１０Å〜約３０Åの長さである。より長い長さのリンカー（約１００Å超）もまた、企図される。例えば、随意に約２ｋＤａ〜約６０ｋＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーもまた、ペプチド複合体における使用のために企図される。生体適合性ポリマーとしては、ＰＥＧ、ＰＳＡ、プロリン−アラニン−セリン多量体、およびヒドロキシエチルデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
ある限定されない実施例において、リンカー部分は、第１のペプチドおよび第２のペプチドのそれぞれと反応させることができる（第１および第２のペプチドへの共役前に）少なくとも２つの反応基を有する分子である。いくつかの実施形態において、リンカー部分は、２つの反応基のみを有し、二価性である。反応基は、両方とも求核、両方とも求電子的、または求核と求電子的反応基の組み合わせである。反応基の限定されない組み合わせを図７３に示す。リンカー部分は、例えば、システイン、オキシム、ヒドラジド、スクシンイミド、チオエーテル、トリアゾール、第２級アミン、アミド、ジスルフィド等の化学的連結反応から得られる構造要素を含有し得る。様々な実施形態において、リンカー部分は、オキシム、ヒドラジド、スクシンイミド、チオエーテル、トリアゾール、第２級アミン、アミド、またはジスルフィドを介して第１のペプチドおよび／または第２のペプチドに結合している。リンカー部分および反応基のさらなる説明は、国際特許公開第ＷＯ２０１１／１４３２０９号に提供され、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１０６】
疎水性リンカーはまた、本発明の文脈における使用に好適である。疎水性リンカーは、当該技術分野で公知である。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ，カリフォルニア州，１９９６）を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。好適な疎水性リンカー部分には、例えば、８−ヒドロキシオクタン酸および８−メルカプトオクタン酸が含まれる。また、疎水性リンカー部分、例えば、ポリアルキレングリコールは、本発明の文脈における使用に好適である。いくつかの実施形態において、リンカー部分は、約１から約６０個の原子長さの原子鎖を含む。いくつかの実施形態において、鎖原子は全て、炭素原子である。いくつかの実施形態において、リンカーの骨格中の鎖原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、およびＳからなる群から選択される。鎖原子およびリンカーは、より可溶性のあるペプチド複合体を提供するために、それらの予想された溶解度（親水性）に従って選択され得る。
【０１０７】
一態様において、リンカー部分は、構造Ｚ１−２０を有し、式中、Ｚは、オリゴマー構築ブロックを含む。オリゴマー構築ブロックの例としては、アミノ酸、ヒドロキシ酸、エチレングリコール、プロピレングリコール、または前述のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、リンカー部分は、随意に、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、または４〜２０アミノ酸を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｚは、Ｇ、ｓ、Ｓ、ａ、Ａ、Ｂａｌ、Ｇａｂａ、Ａｈｘ、Ｔｔｄｓ、または前述のいずれかの組み合わせ（例えば、Ａ、Ｓ、またはＡおよびＳの組み合わせを含むペプチド１０量体）である。所望により、リンカー部分は、アミン、エーテル、チオエーテル、マレアミド、ジスルフィド、アミド、エステル、アルケン、シクロアルケン、アルキン、トリゾイル、カルバミン酸塩、炭酸塩、カテプシンＢ開裂可能、またはヒドラゾンを含む。
【０１０８】
「第１のペプチド」および「第２のペプチド」という用語は、ペプチドの特定の物理的な順番を暗示することを意図しないが、ペプチド複合体の異なるサブユニットを識別するにすぎない。ペプチド複合体のサブユニットは、第１のペプチドおよび第２のペプチドがＴＦＰＩと相互に作用する限り、多くの立体構造のいずれかに連結され得る。例えば、第１のペプチドのＣ末端は、第２のペプチドのＮ末端に接続され、第１のペプチドのＮ末端は、第２のペプチドのＣ末端に接続され、第１の（または第２の）ペプチドのＮ末端またはＣ末端は、第２の（または第１の）ペプチドの内部接触ポイントに接続されるか、あるいは第１および第２のペプチドは、内部接触ポイント（すなわち、ペプチドのアミノ酸配列内に位置するが、Ｎ末端またはＣ末端には位置しない接触ポイント）を介して接続される。式（ＸＩＩＩ）の第１のペプチドにおける連結部分に対する例示的な接触ポイントは、アミン、カルボン酸、チオール、アルケン、アルキン、アジド、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、およびハロゲン等であるが、これらに限定されない、アミノ酸側鎖中の適切な官能基を介した、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボン酸、Ｘ６００４、Ｘ６００６、Ｘ６００１０、またはＸ６００１４である。２つ以上のリンカーが、使用されてもよく、例えば、第１の連結部分は、第１のペプチドのＮ末端および第２のペプチドのＣ末端で結合し、第２の連結部分（同じ種類の部分であっても、異なる種類の部分であってもよい）は、第１のペプチドのＣ末端で結合し、第２のペプチドのＮ末端で結合している。可能な立体構造の論考は第１および第２のペプチドを指すが、さらなるペプチドが本明細書に記載の第１のおよび／または第２のペプチドに連結され得ることが理解されよう。
【０１０９】
本発明には「誘導体」が含まれ、誘導体は、アミノ酸の付加、欠失、または置換とは異なるいくつかの様式で化学的に修飾されているＴＦＰＩ結合性ペプチドを含む。この点において、本明細書に提供される本発明のペプチドは、ポリマー、脂質、他の有機部分、および／または無機部分と化学結合している。ペプチドおよびタンパク質修飾の例は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９６）に記載されている。本明細書に記載のＴＦＰＩ結合性ペプチドは、随意に、別の部分（例えば、ペプチド部分）への共役を促進する官能基を含む。例示的な官能基は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、ハロゲン化アルキル誘導体（例えば、ハロアセチル誘導体）、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、チオール−ジスルフィド交換試薬（例えば、ピリジルジスルフィドまたはＴＮＢチオール）、ジアゾアルカン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ’−ジスクシニルカーボネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメート、およびヒドラジン誘導体を含むが、これらに限定されない。マレイミドは、例えば、生体内でアルブミンと結合するＴＦＰＩ結合性ペプチドの生成に有用である。
【０１１０】
いくつかの状況において、誘導体は、溶解度、安定性、吸収、または循環半減期を増加させるために調製される。様々な化学修飾は、薬剤の任意の望ましくない副作用を排除または軽減する。一態様において、本発明は、１つ以上の水溶性ポリマー結合を含むように共有結合的に修飾されたＴＦＰＩ結合性ペプチドを含む。水溶性ポリマー（または他の化学部分）は、任意のアミノ酸残基に結合するが、いくつかの実施形態においては、ＮまたはＣ末端への結合が望ましい。随意に、ポリマーは、ポリマーの結合を促進する官能基を提供する１つ以上のアミノ酸または構成単位を介してペプチドに結合する。例えば、ＪＢＴ２３１５は、例えばマレイミドポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の付加を促進するＣ末端システイン（式（ＸＩ）に関しては位置Ｘ４０２１）を含む。有用なポリマーは、ＰＥＧ（例えば、約４０ｋＤ、３０ｋＤ、２０ｋＤ、１０ｋＤ、５ｋＤ、または１ｋＤのサイズのＰＥＧ）、ポリオキシエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、ならびに上記のいずれかの混合物を含むが、これらに限定されない。一態様において、本発明のペプチドは、ＰＥＧ化ペプチドである。ＰＥＧ部分は、異なる形状、例えば、直線状または分岐状で利用可能である。水溶性ポリマーの結合に関するさらなる議論については、米国特許第４，６４０，８３５号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，３０１，１４４号、米国特許第４，６７０，４１７号、米国特許第４，７９１，１９２号、および米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい。ペプチド半減期または安定性の改善に有用な他の部分は、本明細書に記載され、例えば、アルブミン（本発明のペプチドへの共役を可能とするように随意に修飾されている）、脂肪酸鎖（例えば、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸、例えばＣ１４脂肪酸）、抗体またはその断片（例えば、抗体のＦｃ部分）、およびプロリン−アラニン−セリン多量体を含む。
【０１１１】
別の態様において、ペプチド誘導体は、特定の細胞型、組織、および／または器官に特異的な標的化部分を含む。代替として、ペプチドは、精製、検出、多量体化、相互作用パートナーとの結合、およびペプチド活性の特性決定を促進する１つ以上の化学部分に連結している。例示的な化学部分は、ビオチンである。本発明のＴＦＰＩ結合性ペプチドへの結合に好適な他の部分は、感光剤、染料、蛍光染料、放射性核種、放射性核種含有複合体、酵素、毒素、および細胞毒性薬を含むが、これらに限定されない。感光剤は、例えば、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ、Ｖｉｓｕｄｙｎｅ、Ｌｅｖｕｌａｎ、Ｆｏｓｃａｎ、Ｍｅｔｖｉｘ、Ｈｅｘｖｉｘ（登録商標）、Ｃｙｓｖｉｅｗ（商標）、Ｌａｓｅｒｐｈｙｒｉｎ、Ａｎｔｒｉｎ、Ｐｈｏｔｏｃｈｌｏｒ、Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓ、Ｐｈｏｔｒｅｘ、Ｌｕｍａｃａｎ、Ｃｅｖｉｒａ、Ｖｉｓｏｎａｃ、ＢＦ−２００  ＡＬＡ、およびＡｍｐｈｉｎｅｘを含む。所望により、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｓｔｒｅｐタグ、またはｍｙｃタグがペプチドに共役される。
【０１１２】
さらに、一態様において、本発明のペプチドは、ペプチドのＮ末端アミノ酸においてアシル化される。別の態様において、本発明のペプチドは、ペプチドのＣ末端アミノ酸においてアミド化される。なおさらなる態様において、本発明のペプチドは、ペプチドのＮ末端アミノ酸においてアシル化され、ペプチドのＣ末端アミノ酸においてアミド化される。
【０１１３】
誘導体はまた、修飾もしくは非タンパク原性アミノ酸または修飾結合基を含むペプチドを含む（例えば、Ｇｒａｎｔ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）を参照されたい）。修飾アミノ酸は、例えば、アミノおよび／またはカルボキシル基が別の基で置き換えられたアミノ酸を含む。限定されない例は、チオアミド、尿素、チオ尿素、アシルヒドラジド、エステル、オレフィン、スルホンアミド、リン酸アミド、ケトン、アルコール、ボロン酸アミド、ベンゾジアゼピン、および他の芳香族または非芳香族ヘテロ環を組み込んだ修飾アミノ酸を含む（Ｅｓｔｉａｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｒｇｅｒｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ  １，Ｐａｒｔ  ４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００２）を参照されたい）。修飾アミノ酸は、多くの場合、アミド結合の代わりに、上述の官能基の少なくとも１つを有するペプチドに接続される。非タンパク原性アミノ酸は、β−アラニン（Ｂａｌ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、４−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、６−アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、タウリン、サルコシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、システイン酸（Ｃｏｈ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、メチオニンスルホキシド（Ｍｅｏ）、メチオニンスルホン（Ｍｏｏ）、ホモセリンメチルエステル（Ｈｓｍ）、プロパルギルグリシン（Ｅａｇ）、５−フルオロトリプロファン（５Ｆｗ）、６−フルオロトリプトファン（６Ｆｗ）、３’，４’−ジメトキシフェニル−アラニン（Ｅａｒ）、３’，４’−ジフルオロフェニルアラニン（Ｄｆｆ）、４’−フルオロフェニル−アラニン（Ｐｆｆ）、１−ナフチル−アラニン（１Ｎｉ）、１−メチルトリプトファン（１Ｍｗ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ベンゾチエニルアラニン（Ｂｔａ）、Ｌ−ホモ−システイン（Ｈｃｙ）、Ｎ−メチル−フェニルアラニン（Ｎｍｆ）、２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、３，３−ジフェニルアラニン（Ｅｂｗ）、ホモフェニルアラニン（Ｈｆｅ）、およびＳ−ベンジル−Ｌ−システイン（Ｅｃｅ）を含むが、これらに限定されない。非タンパク原性アミノ酸の多くの構造を、表２に示す。これらの、および他の非タンパク原性アミノ酸は、Ｄ型またはＬ型異性体として存在し得る。修飾リンカーの例は、柔軟性リンカー４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（Ｔｔｄｓ）、グリシン、６−アミノヘキサン酸、ベータ−アラニン（Ｂａｌ）、ペンチン酸（Ｐｙｎ）、ならびにＴｔｄｓ、グリシン、６−アミノヘキサン酸、およびＢａｌの組合せを含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
本発明のペプチドを構成するアミノ酸のホモログは、表３に示され得る。任意の実施形態において、ＴＦＰＩ結合性ペプチドの１つ以上のアミノ酸が、ホモログで置換されている。
【表３】
2019108360.tif 000017
2019108360.tif 000018
【０１１５】
誘導体はまた、例えばフッ素、塩素、ヨウ素、または臭素でのハロゲン化により修飾されたアミノ酸等の、修飾された置換基を有するアミノ酸を含むペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、ハロゲン化芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニンを含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチド内のアミノ酸を連結するペプチド（ＣＯ−ＮＨ）結合は、逆転されて、「逆修飾」ペプチド、すなわち基準ペプチドと比較して反対方向にアセンブルされたアミノ酸残基を含むペプチド（ＮＨ−ＣＯ結合）を形成する。逆修飾ペプチドは、基準ペプチドと同じアミノ酸キラリティを有する。「反転修飾」ペプチドは、基準ペプチドと同じ方向にアセンブルされているアミノ酸を含む本発明のペプチドであるが、アミノ酸のキラリティが反転している。したがって、基準ペプチドがＬ型アミノ酸を含む場合、「反転修飾」ペプチドはＤ型アミノ酸を含み、またその逆も成り立つ。反転修飾ペプチドは、ＣＯ−ＮＨペプチド結合を含む。「逆反転修飾」ペプチドは、反対方向にアセンブルされ、反転したキラリティを有するアミノ酸残基を含むペプチドを指す。逆反転アナログは、逆転した末端および逆転した方向のペプチド結合（すなわち、ＮＨ−ＣＯ）を有するが、基準ペプチド内に見られる側鎖トポロジーを近似的に維持する。逆反転ペプチド模倣薬は、参照することにより本明細書に組み込まれるＭｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９，３２３０−３２３７（１９９７）に記載の方法を含む、標準的方法を使用して調製される。部分的逆反転ペプチドは、アミノ酸配列の一部分のみが逆転され、鏡像異性体アミノ酸残基で置き換えられたペプチドである。
【０１１７】
本発明のＴＦＰＩ結合性ペプチド（ＴＦＰＩ阻害ペプチドを含む）は、様々な手法で調製される。一態様において、ペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５，２１４９（１９６３）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．，１０，３９４−４１４（１９８５）、Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５，６２４７（１９９３）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，４４，１８３（１９９４）、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，６０７０（１９９６）、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒｅｅｍａｎ（１９６９）、Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１０５−２５３（１９７６）、およびＥｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．２，ｐｐ．２５７−５２７（１９７６）に記載の技術を含む、固相合成技術により合成される。代替として、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は、ペプチドを発現するように培養される宿主細胞内に、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）をコードする核酸を導入することによって、組み換え技術により発現される。そのようなペプチドは、標準的タンパク質精製技術を使用して、細胞培養物から精製される。
【０１１８】
本発明はまた、本発明のペプチドをコードする核酸配列を含む核酸を包含する。ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子を調製する方法は、当該技術分野において周知である。一態様において、本明細書に記載のペプチドをコードするＤＮＡ／ＲＮＡ分子は、化学合成技術を使用して、および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して生成される。所望により、ペプチドコード配列は、発現ベクター内に組み込まれる。当業者には、これらに限定されるものではないが、プラスミド、プラスミド−リポソーム複合体、およびウイルスベクター等、当該技術分野において知られている複数の発現ベクターのいずれも、本発明の文脈において好適であることが理解される。これらの発現ベクターのいずれも、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載の標準的組み換えＤＮＡ技術を使用して調製される。随意に、核酸は、１つ以上の制御配列、例えばプロモーター、活性化因子、エンハンサー、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、または転写もしくは翻訳の制御に関連した他のシグナルに機能的に連結する。
【０１１９】
また、本発明のペプチド（またはペプチド複合体）あるいはペプチドをコードする核酸のいずれも、組成物（例えば、薬学的組成物）中に提供される。この点において、ペプチド（またはペプチド複合体）は、本明細書においてさらに説明されるように、生理学的に許容される（すなわち、薬理学的に許容される）担体、緩衝剤、賦形剤、または希釈剤とともに製剤化される。随意に、ペプチドは、本発明により包含される、生理学的に許容される塩の形態である。「生理学的に許容される塩」は、薬学的に許容される任意の塩を意味する。適切な塩のいくつかの例は、酢酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、およびシュウ酸塩を含む。所望により、組成物は、１つ以上の追加的な薬学的に効果的な薬剤を含む。
【０１２０】
本明細書に記載のペプチドは、随意に、少なくとも１つのＴＦＰＩ−１（例えば、ＴＦＰＩ−１αまたはＴＦＰＩ−１β）活性、例えば、これらに限定されないが、血液凝固カスケードを下方制御する活性を阻害する。いかなる特定の作用機序にも束縛されないが、阻害の提案される機序は、四元ＴＦ−ＦＶＩＩＡ−ＦＸＡ−ＴＦＰＩ複合体の形成の防止を含み得る。ペプチドは、ＦＸａに対するＴＦＰＩの（競合的またはアロステリックに）結合を阻害（例えば、第Ｘａ因子に対するＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の結合を阻害、もしくは第Ｘａ因子の外部位に対するＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の結合を妨害）してもよく、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体を阻害（例えば、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体に対するＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の結合を阻害）してもよく、ＴＦ単独を阻害してもよく、および／またはＦＶＩＩａ単独を阻害してもよい。ＴＦＰＩ活性が消失すると、ＴＦおよびＦＶＩＩは自由にＦＸを活性化し、一方これがプロトロンビンからトロンビンへの変換を向上させる。驚くべきことに、一実施形態において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１に結合する本発明のペプチドは、ＦＸａのＴＦＰＩ媒介阻害に干渉する。したがって、本発明は、例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１に結合する本明細書に記載のペプチドを対象に投与することにより、凝固カスケードの外因性および／もしくは共通経路のＴＦＰＩ媒介下方制御を阻害する、ならびに／またはプロトロンビンからトロンビンへのＦＸａ媒介変換を向上させる方法を提供する。
【０１２１】
一態様において、本発明のペプチドは、モデルおよび／または血漿系においてＴＦＰＩ拮抗作用を示す。ＴＦＰＩ阻害活性を決定するための例示的モデル系は、外因性テナーゼ分析であり、これは、ＴＦＰＩ（ＦＸ活性化反応の天然の阻害剤である）の存在下で候補ペプチドが外因性複合体媒介ＦＸ活性化を修復する能力を試験するものである（例えば、Ｌｉｎｄｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７４，９１０−９１５（１９９５）を参照されたい）。ＴＦＰＩ阻害活性を特性決定するための別のモデル系は、ＦＸａ阻害分析であり、ＴＦＰＩの存在下でＦＸａ活性が測定される（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１，３３５３−３３５７（１９９４）を参照されたい）。外因性テナーゼ分析およびＦＸａ阻害分析は、実施例３においてさらに説明される。随意に、本発明のペプチドは、１×１０−４Ｍ以下、１×１０−５Ｍ以下、１×１０−６Ｍ以下、または１×１０−７Ｍ以下の半数効果濃度（ＥＣ５０）で、ＴＦＰＩの存在下でＦＸ活性化を向上させる。
【０１２２】
一態様において、ＴＦＰＩ拮抗活性は、血漿ベース分析において特性決定される。トロンビン形成は、候補ペプチドの存在下、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ活性を実質的に欠失した血漿（例えば、残留凝固因子活性が１％未満）において誘発される。トロンビン形成は、実施例４に記載のように、蛍光性または発色基質を使用して検出することができる。トロンビン活性を測定するためのシステムは、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ（Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により提供される。プロトロンビン変換は、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｐｈ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して測定され、得られたデータは、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶから入手可能なＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ（商標）ソフトウェアによって得られる、Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍにコンパイルされる。ある特定の実施形態において、ＴＦＰＩ阻害ペプチドは、分析中に生成されたピークトロンビンの量を増加させ、および／またはピークトロンビン形成を達成するのに必要な時間を短縮する。例えば、ペプチドは、ＦＶＩＩＩの非存在下（例えば、ＦＶＩＩＩ枯渇血漿中）で、正常血漿中でのＴＦＰＩ依存性トロンビン生成のレベルの少なくとも１％まで、ＴＦＰＩ制御トロンビン生成を改善する。一般に、正常（罹患していない）血漿は、約０．５Ｕ／ｍＬから約２Ｕ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子を含有する。したがって、いくつかの場合において、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は、ＦＶＩＩＩの非存在下において、０．５Ｕ／ｍＬから２Ｕ／ｍＬのＦＶＩＩＩの存在下で観察されるレベルの少なくとも約１％までトロンビン形成を向上させる。さらなる実施形態において、ペプチドは、第ＶＩＩＩ因子の非存在下において、正常血漿中、すなわち、生理学的レベルの第ＶＩＩＩ因子の存在下でのトロンビン形成のレベルの少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約７％、または少なくとも約１０％までトロンビン形成を向上させる。様々な態様において、ペプチドは、生体内でのＴＦＰＩ阻害活性を特性決定するために、トロンビン欠乏または血友病の動物モデルに投与される。そのような生体内モデルは、当該技術分野において知られており、例えば、血友病Ａを誘発するために抗ＦＶＩＩＩ抗体が投与されたマウス（Ｔｒａｎｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０２，３６１５−３６２０（２００３））、凝固因子ノックアウトモデル、例えば、これらに限定されないが、ＦＶＩＩＩノックアウトマウス（Ｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１０（１），１１９−１２１（１９９５））およびＦＩＸノックアウトマウス（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９４（２１），１１５６３−６６（１９９７））、ラビットにおける誘発血友病Ａ（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，４２（４），５０９−５２１（１９７３））、ならびに、Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ  ＨＡイヌ（Ｌｏｚｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９９，１２９９１−１２９９６（２００２））を含む。
【０１２３】
各種ペプチドは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、モルモット、および霊長類を含むがこれらに限定されない、任意の源からのＴＦＰＩに結合する。一実施形態において、ペプチドは、ヒトＴＦＰＩに結合する。随意に、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は、２つ以上の種からのＴＦＰＩに結合する（すなわち、ペプチドは、複数の種の間で交差反応性である）。ある特定の態様において、ペプチドは、１×１０−４Ｍ以下、１×１０−５Ｍ以下、１×１０−６Ｍ以下、または１×１０−７Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、ＴＦＰＩに結合する。親和性は、例えば、限定されることなく、親和性ＥＬＩＳＡ分析、競合ＥＬＩＳＡ分析、および／または表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標））分析等の様々な技術の１つ、２つまたはそれ以上を使用して決定することができる。競合（ＩＣ５０）ＥＬＩＳＡ分析を使用して特性決定する場合、本発明のペプチドは、随意に、約５０，０００ｎＭ以下のＩＣ５０を示す。例えば、ペプチドは、約１０，０００ｎＭ以下のＩＣ５０、例えば約５，０００ｎＭ以下、約１，０００ｎＭ以下、または約５００ｎＭ以下のＩＣ５０を示す。一態様において、ペプチドは、約２５０ｎＭ以下、例えば約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下のＩＣ５０を示す。例示的ペプチドおよびそのＩＣ５０値は、図３２〜３９に記載されるが、いくつかの場合において、ペプチドは、そのＩＣ５０値に基づいて、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群、Ｅ群、Ｆ群およびＧ群に分類される（実施例１の表４を参照されたい）。様々な態様において、本発明は、表４に定義されるようなＡ群、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群、Ｅ群、Ｆ群、および／またはＧ群に含まれるペプチドを提供する。親和性はまた、速度論的方法、または平衡／溶液法により決定することができる。そのような方法は、本明細書においてより詳細に説明されているか、または当該技術分野において知られている。
【０１２４】
本発明のペプチドを特性決定するための別の好適な分析法は、ｋｏｆｆ分析であり、これは、ＴＦＰＩからのペプチドの放出を検査するものである。ｋｏｆｆ分析結果は、解離速度定数ではないが、ＴＦＰＩとのインキュベーション期間後の試験ペプチドによりＴＦＰＩ結合からブロックされた競合物ペプチドのパーセンテージである。例示的ｋｏｆｆ分析は、１）ＴＦＰＩ被覆マイクロタイタープレートの、約９０％のＴＦＰＩ占有率をもたらす量の試験ペプチドでのインキュベーション、２）未結合試験ペプチドの除去、３）ＴＦＰＩに対する結合に関して試験ペプチドと競合する、ビオチニル化トレーサー（すなわち競合物）ペプチドの添加、４）試験ペプチドにより解放された結合部位がトレーサーにより占有される期間でのインキュベーション、５）未結合トレーサーおよび試験ペプチドの除去、ならびに６）ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体を使用した発色反応による結合トレーサーの検出のステップを含む。得られるシグナルは、試験ペプチドにより自由となった結合部位を示す。インキュベーション期間中にＴＦＰＩから解離しない試験ペプチドは、完全に解離する検体と比較して弱い信号を生成する。
【０１２５】
全ての結合剤および結合分析と同様に、当業者は、結合剤が、生物学的に（例えば治療上）効果的となるために検出され得るように結合するべきではない様々な部分が網羅され、列挙するには現実的ではないことが認識される。したがって、「特異的に結合する」という用語は、ＴＦＰＩではない無関係な対照タンパク質に対する結合よりも大きい親和性でＴＦＰＩに結合するペプチドの能力を指す。例えば、ペプチドは、対照タンパク質に対する親和性よりも少なくとも５、１０、１５、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、または１０，０００倍大きい親和性でＴＦＰＩに結合し得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ペプチドの結合が副作用をもたらし得る、ヒトにおけるタンパク質または他の自然発生的物質である「抗標的」に対する結合よりも大きい親和性で、ＴＦＰＩに結合する。ペプチドまたはタンパク質のいくつかのクラスが、潜在的な抗標的である。ＴＦＰＩ阻害ペプチドは、血流内および／または内皮でその活性を発揮するため、血漿タンパク質は、潜在的な抗標的となる。Ｋｕｎｉｔｚドメイン（ＫＤ）を含有するタンパク質は、異なるタンパク質のＫＤが有意な類似性を共有するため、潜在的抗標的である。組織因子経路阻害剤２（ＴＦＰＩ−２）は、ＴＦＰＩ−１αと極めて類似し、ＴＦＰＩ−１αと同様にＫＤを含有する（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１，３３５３−３３５７（１９９４））。したがって、一態様において、本発明のペプチドは、ＴＦＰＩ−２等の抗標的に対する親和性よりも少なくとも５、１０、１５、２５、または５０倍大きい親和性で、ＴＦＰＩに結合する。
【０１２６】
随意に、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、本明細書に記載の１つ以上の所望の特徴を示し、ペプチドのアミノ酸配列は、所望により、結合、安定性、および／または活性を最適化するために修飾され得る。例示的なＴＦＰＩ結合性ペプチドは、２０ｎＭ以下のＫＤでＴＦＰＩに結合し、および／または、抗標的に対する結合親和性よりも少なくとも１００倍大きいＴＦＰＩに対する結合親和性を示す。代替として、またはそれに加えて、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、ＴＦＰＩの存在下において、５０ｎＭ以下のＥＣ５０（任意の好適な分析法、例えば本明細書に記載の分析法を使用して測定される）でＦＸ活性化を向上させる、および／または第ＶＩＩＩ因子の非存在下において、生理学的レベルの第ＶＩＩＩ因子を含有する血漿中でのトロンビン形成のレベルの少なくとも約２０％（例えば、４０％）までトロンビン形成を向上させる。代替として、またはそれに加えて、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、所望のレベルの血漿安定性（例えば、１２時間後に用量の５０％以上が血漿中に残留する）を達成し、および／または所望の生体内半減期（例えば、少なくとも２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、もしくは１０時間）を示す。代替として、またはそれに加えて、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、所望のレベルのバイオアベイラビリティ、例えば、皮下投与後の所望のレベルのバイオアベイラビリティ（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、もしくは５０％以上）を示し、および／または生体内で所与の用量において所望のレベルのＴＦＰＩ阻害活性を示す。
【０１２７】
本発明は、さらに、ＴＦＰＩ−１を阻害する方法を含む。この方法は、ＴＦＰＩを、本明細書に記載のようなＴＦＰＩ結合性ペプチドと接触させることを含む。任意の程度のＴＦＰＩ活性阻害が企図される。例えば、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は、外因性経路のＴＦＰＩ阻害を、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％）低減する。いくつかの実施形態において、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は、ペプチドの非存在下でのＴＦＰＩ活性と比較して、外因性経路内のＴＦＰＩ活性を、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％低減する。
【０１２８】
本発明の一態様において、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、生体内または生体外でＴＦＰＩを検出および／または定量するために使用される。試料中のＴＦＰＩを検出および／または定量する例示的方法は、（ａ）試料を本発明のＴＦＰＩ結合性ペプチドと接触させることと、（ｂ）ＴＦＰＩ結合性ペプチドのＴＦＰＩに対する結合を検出することとを含む。
【０１２９】
本発明は、さらに、ＴＦＰＩが位置する生物学的構造（細胞表面および内膜を含むがこれらに限定されない）を標的とするための方法を含む。この方法は、生物学的構造（例えば、細胞表面上にＴＦＰＩを示す細胞を含むがこれに限定されない）を、ペプチドに追加的機能性を追加する部分に随意に結合した本明細書に記載のＴＦＰＩ結合性ペプチドと接触させることを含む。部分は、染料（例えば、蛍光染料）、放射性核種もしくは放射性核種含有複合体、タンパク質（例えば、酵素、毒素、もしくは抗体）または細胞毒性薬であってもよい。例えば、ペプチドは、ペプチド検出および／もしくは精製を促進するエフェクター部分に結合もしくは結合し、ならびに／または治療特性を備える。一態様において、ＴＦＰＩ結合性ペプチドまたはペプチド結合体は、哺乳動物内のＴＦＰＩ表示細胞を標的とするために哺乳動物に投与される。随意に、方法は、ＴＦＰＩに対するＴＦＰＩ結合性ペプチドの結合を検出することをさらに含む。方法は、ＴＦＰＩが好適な診断マーカーとなる、またはＴＦＰＩ発現細胞が治療アプローチの標的となる疾患の治療および診断に有用である。
【０１３０】
ペプチド−ＴＦＰＩ複合体は、直接的または間接的に検出される。検出部分は、生物学的物質を同定するために当該技術分野において広く使用されており、例えば、染料（例えば、蛍光染料）、放射性核種および放射性核種含有複合体、ならびに酵素を含む。いくつかの態様において、ペプチド−ＴＦＰＩ結合は、間接的に検出される。この点において、ペプチドは、随意に、ペプチド−ＴＦＰＩ結合に大きく干渉することなく本発明のペプチドと結合する相互作用パートナーと接触させられ、相互作用パートナーが検出される。例示的な相互作用パートナーは、抗体、抗原結合性抗体断片、アンチカリンおよび抗体模倣薬、アプタマー、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、ならびにスピーゲルマーを含むが、これらに限定されない。随意に、相互作用パートナーは、相互作用パートナー−ペプチド複合体の検出を促進するための検出部分を含む。ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、いくつかの実施形態において、相互作用パートナーの結合を促進するように修飾される。例えば、一態様において、ＴＦＰＩ結合性ペプチドはビオチンに結合され、ストレプトアビジンを含む相互作用パートナーがビオチンに結合する。例示的相互作用パートナーは、ホースラディッシュペルオキシダーゼに融合したストレプトアビジンを含み、これは、例えばＥＬＩＳＡに類似した分析法において検出される。代替として、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、抗体エピトープを含むように修飾され、対応する抗体のペプチド−ＴＦＰＩ複合体に対する結合が検出される。抗体およびその断片等の検出方法は、当該技術分野において周知である。
【０１３１】
ペプチド−ＴＦＰＩ複合体および相互作用パートナー−ペプチド複合体は、これらに限定されないが、生化学分析（例えば、酵素的分析）、分光法（例えば、光学密度、蛍光、ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、蛍光偏光、電気化学発光、またはＮＭＲに基づく検出）、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、および単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）等の複数の方法のいずれかを使用して同定される。ペプチド−ＴＦＰＩ複合体または相互作用パートナー−ペプチド複合体の蛍光検出を促進する検出可能部分は、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、テトラメチルローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ローダミンＢ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ（商標）−Ｘ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−Ｘ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、Ｂ−フィコエリスリン、Ｒ−フィコエリスリン、アロフィコシアニン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、および蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびその誘導体）を含むが、これらに限定されない。蛍光検出部分を含むＴＦＰＩ結合性ペプチドの例は、ＪＢＴ２４５４（ＦＡＭ−Ｔｔｄｓ−ＦＱＳＫｐＮＶＨＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ−ＮＨ２（配列番号４１７１））であり、これは、５，６−カルボキシフルオレセインで標識化される。
【０１３２】
放射性標識もまた、生体材料（例えば、ＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ結合性ペプチド、またはＴＦＰＩ結合性ペプチド−ＴＦＰＩ複合体）の検出に使用され、いくつかの場合において、キレート剤、例えば、（限定されないが）ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＣＤＴＡ（シクロヘキシル１，２−ジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＨＢＥＤ（Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）、ＨＥＤＴＡ（ヒドロキシエチルジアミン三酢酸）、またはＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）等を使用してペプチドまたは相互作用パートナーに結合される。放射性標識の例は、９９ｍＴｃ、２０３Ｐｂ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１４ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１４９Ｔｂ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈおよび１１１Ａｇを含む。常磁性金属もまた、随意にキレート剤複合体を介したＴＦＰＩ結合性ペプチドまたは相互作用パートナーに対する結合に好適な検出可能部分である。常磁性金属の例は、例えば、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｙｂ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、およびＥｒを含む。
【０１３３】
ＴＦＰＩ結合性ペプチド自体は、いくつかの態様において、検出可能な置換基または核種を有する１つ以上のアミノ酸を含むように修飾される。この点において、一実施形態において、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、検出可能な同位体（例えば、１３Ｃ、１４Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ、１８Ｏもしくは１５Ｎ）を含む少なくとも１つのアミノ酸、および／または、例えば１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒもしくは８２Ｂｒでハロゲン化されたアミノ酸を含む。ハロゲン化に好適なアミノ酸は、チロシンおよびトリプトファンを含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
本発明はまた、疾患もしくは障害に罹患している、または疾患もしくは障害に罹患する危険性のある対象を診断するための方法を提供し、疾患または障害は、異常なＴＦＰＩ活性に関連または起因する。この方法は、ＴＦＰＩ結合性ペプチドを対象に投与することと、ＴＦＰＩ−ペプチド複合体を検出することとを含む。いくつかの場合において、ペプチドは、検出可能部分に結合し、方法は、検出可能部分を検出することを含む。例示的な検出可能部分は、本明細書に記載される。他の場合において、方法は、ＴＦＰＩ結合性ペプチドに結合するＴＦＰＩ結合性ペプチド相互作用パートナーを対象に投与することと、相互作用パートナーを検出することとを含む。所望により、相互作用パートナーは、検出可能部分を含むか、またはそれに結合し、検出可能部分が検出される。検出可能部分の存在は、ＴＦＰＩの存在を示し、それにより、ＴＦＰＩに関連した疾患または障害（例えば、（ｉ）ＴＦＰＩを阻害することにより治療可能である、または（ｉｉ）ＴＦＰＩを阻害することにより改善もしくは予防され得る症状を含む、疾患または障害）の診断が可能となる。対象へのペプチドの投与を望まない場合、対象から生体試料を採取し、本明細書に記載のＴＦＰＩ結合性ペプチドと接触させ、ＴＦＰＩ−ペプチド複合体を検出する。
【０１３５】
本発明のペプチドは、ＴＦＰＩに結合し、したがって、生体試料（例えば、血清等の生体液）、発光抽出物、組織標本、培養液等からＴＦＰＩまたは組み換えＴＦＰＩを精製するのに有用である。本発明は、ＴＦＰＩの商業生産、またはＴＦＰＩ分子を特性決定する方法においてＴＦＰＩ結合性ペプチドを使用する方法を含む。例えば、本発明は、ＴＦＰＩを精製する方法を含む。この方法は、ＴＦＰＩとペプチドとの間で複合体を形成させるのに適切な条件下で、ＴＦＰＩを含有する試料を、本明細書に記載のようなペプチドに接触させることと、複合体を試料から除去することと、随意に、複合体を解離してＴＦＰＩを放出することとを含む。ＴＦＰＩとペプチドとの間で複合体を形成させるのに適切な例示的条件は、実施例に記載されており、そのような条件は、ＴＦＰＩ−ペプチド複合体を解離するように容易に変更され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＴＦＰＩの回収を容易化するために、支持体、例えば固体支持体に固定される。例えば、一実施形態において、ペプチドは、クロマトグラフィー固定相（例えば、シリカ、親和性クロマトグラフィービーズ、またはクロマトグラフィー樹脂）に固定され、ＴＦＰＩ−ペプチド複合体が形成されるようにＴＦＰＩを含有する試料が固定相に適用され、試料の残りは固定相から除去され、ＴＦＰＩが固定相から溶出される。この点において、本発明のペプチドは、一態様において、親和性クロマトグラフィー技術における使用に好適である。
【０１３６】
凝固因子欠乏対象におけるトロンビン形成を向上させる方法もまた提供される。この方法は、ＴＦＰＩを阻害するために効果的な条件下で、本明細書に記載のペプチドを対象に投与することを含む。この点において、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、対象におけるトロンビン形成を向上させるのに効果的な量および条件下で投与される。「凝固因子欠乏」とは、トロンビン形成に必要な１つ以上の血液因子、例えばＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、またはＦＸＩ等の欠乏に罹患した対象を意味する。実際に、一実施形態において、対象は、ＦＶＩＩＩが欠乏している。代替として、またはそれに追加して、対象は、第ＩＸ因子が欠乏している。凝固因子欠乏は、臨床試料中の因子の量を検査することにより識別される。当業者は、凝固因子欠乏の程度に従って血友病を分類する。軽度の血友病に罹患した対象は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の正常量（１Ｕ／ｍＬ）の約５％から３０％を有する。中等度の血友病は、正常な第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第ＸＩ因子レベルの約１％から５％を特徴とし、重度の血友病に罹患した対象は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第ＸＩ因子の正常量の１％未満を有する。欠乏は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）試験により間接的に識別され得る。ＡＰＴＴ試験は、血餅が形成されるのに必要な時間の長さを測定するものであり、この時間は、正常な凝固因子レベルの患者と比較して、第ＶＩＩＩ因子欠乏（血友病Ａ）、第ＩＸ因子欠乏（血友病Ｂ）、および第ＸＩ因子欠乏（血友病Ｃ）に罹患した患者において、より長い。重度および中等度の第ＶＩＩＩ因子欠乏に罹患した患者のほぼ１００％は、ＡＰＴＴにより診断され得る。本発明は、さらに、凝固因子欠乏に罹患していない対象におけるトロンビン形成を向上させることをさらに含む。方法は、トロンビン形成を向上させるのに効果的な条件下で、本明細書に記載のペプチドを、対象（例えば、正常な生理学的レベルの凝固因子を有する対象）に投与することを含む。
【０１３７】
一態様において、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、対象における血餅形成を増加させるために使用される。血餅形成を増加させる方法は、血餅形成を増加させるのに効果的な量および条件下で、本明細書に記載のペプチドを対象に投与することを含む。この方法は、有益な（例えば治療上の）効果を達成するために、凝固カスケードを完全に修復する必要はないことが理解される。凝固因子欠乏に関連した症状の発症または重症度を低減するトロンビンまたは血餅形成の、いかなる向上または増加も企図される。トロンビン形成および凝血の促進における方法の有効性を決定する方法は、当該技術分野において知られており、本明細書に記載される。
【０１３８】
本発明は、さらに、対象における血液凝固障害を治療する方法であって、対象における血液凝固障害を治療するのに効果的な量および条件下で、１つ以上のＴＦＰＩ結合性ペプチド（またはペプチド複合体（複数を含む））、例えば本明細書に記載のペプチドの任意の１つ以上を対象に投与することを含む方法を含む。一態様において、ペプチドは、ＴＦＰＩ活性を阻害する組み換えまたは合成ペプチドである。「凝固障害」は、血液凝固因子活性不全および血小板活性不全によりもたらされる出血性障害を含む。血液凝固因子は、第Ｖ因子（ＦＶ）、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩＩ、ＦＩＩ（低プロトロンビン血症に関連する）、およびフォン・ヴィレブランド因子を含むが、これらに限定されない。因子欠乏は、例えば、因子の生体内半減期の短縮、因子の結合特性の改変、因子の遺伝的欠陥、および因子の血漿中濃度の低減により引き起こされる。凝固障害は、先天性または後天性であってもよい。潜在的な遺伝的欠陥は、その非存在、存在、および／または置換がそれぞれ凝固因子の活性に対し悪影響を及ぼす、凝固因子をコードするヌクレオチド配列内の欠失、付加、および／または置換を含む。凝固障害はまた、凝固因子に対する阻害物質または自己免疫（例えば、抗体）の発達から生じる。一例において、凝固障害は血友病Ａである。代替として、凝固障害は、血友病Ｂまたは血友病Ｃである。
【０１３９】
血小板障害は、血小板機能不全または血液循環における異常低血小板数によりもたらされる。低血小板数は、例えば、産生不足、血小板分離、または制御不能な血小板破壊に起因し得る。血小板減少症（血小板欠乏）は、化学療法および他の薬物療法、放射線療法、手術、偶発的な失血、ならびに他の疾患状態を含む、様々な理由で存在し得る。血小板減少症に関連する例示的な疾患状態は、再生不良性貧血；乳癌に関連した特発性血小板減少性紫斑病を含む特発性または免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）；ＨＩＶ関連ＩＴＰおよびＨＩＶ関連血栓性血小板減少性紫斑病；血小板減少症をもたらす転移性腫瘍；新生児ループス症候群脾腫を含む全身性紅斑性狼瘡；ファンコニ症候群；ビタミンＢ１２欠乏；葉酸欠乏；メイ・ヘグリン異常；ウィスコット−アルドリッチ症候群；慢性肝疾患；血小板減少症に関連した骨髄異形成症候群；発作性夜間血色素尿症；Ｃ７Ｅ３  Ｆａｂ（アブシキシマブ）治療後の急性重篤性血小板減少症；母体同種免疫性血小板減少症を含む同種免疫性血小板減少症；抗リン脂質抗体および血栓症に関連した血小板減少症；自己免疫性血小板減少症；カルボプラチン誘発性血小板減少症およびヘパリン誘発性血小板減少症を含む薬剤誘発性免疫性血小板減少症；胎児血小板減少症；妊娠性血小板減少症；ヒューズ症候群；ルポイド血小板減少症；偶発性および／もしくは大量失血；骨髄増殖症候群；悪性腫瘍に罹患した患者における血小板減少症；癌患者における血栓性血小板減少性紫斑病／溶血性尿毒症症候群として発現する血栓性微小血管症を含む血栓性血小板減少性紫斑病；輸血後紫斑病（ＰＴＰ）；自己免疫性溶血性貧血；潜在空腸憩室穿孔；赤芽球癆；自己免疫性血小板減少症；流行性腎症；リファンピシン関連急性腎不全；パリス−トルソー血小板減少症；新生児同種免疫性血小板減少症；発作性夜間ヘモグロビン尿症；胃癌における血液学的変化；溶血性尿毒症症候群（例えば、小児期における尿毒症状態）；ならびにＡ型肝炎ウイルスを含むウイルス感染に関連した血液学的徴候およびＣＭＶ関連血小板減少症である。血小板障害はまた、フォン・ヴィレブランド病、腫瘍随伴性血小板機能異常症、グランツマン血小板無力症、およびベルナール・スーリエ病を含むが、これらに限定されない。ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）による治療効果がある追加的な出血性障害は、外傷により誘発される出血症状；１つ以上の接触因子、例えばＦＸＩ、ＦＸＩＩ、プレカリクレイン、および高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ）の欠乏；ビタミンＫ欠乏；無フィブリノゲン血、低フィブリノゲン血および異常フィブリノゲン血を含むフィブリノゲン障害；ならびにアルファ２−抗プラスミン欠乏を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は、過度の出血、例えば、手術、外傷、脳内出血、肝臓病、腎臓病、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、低体温、月経、妊娠、およびデング出血熱による過度の出血を治療するために使用される。上記は全て、本開示の文脈において「血液凝固障害」とみなされる。
【０１４０】
一態様において、本発明のＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は、対象における１つ以上の抗凝固因子の効果を（全体的または部分的に）逆転するために使用される。多くの抗凝固因子が当該技術分野において知られており、例えば、ヘパリン；ワルファリンまたはジクマロール等のクマリン誘導体；ＴＦＰＩ；ＡＴ  ＩＩＩ；ループス性抗凝固因子；線虫抗凝固ペプチド（ＮＡＰｃ２）；ＦＶＩＩａ阻害剤；活性部位ブロックＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａｉ）；活性部位ブロックＦＩＸａ（ＦＩＸａｉ）；ＦＩＸａ阻害剤；フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ＤＸ−９０６５ａ、およびラザキサバン（ＤＰＣ９０６）を含むＦＸａ阻害剤；活性部位ブロックＦＸａ（ＦＸａｉ）；活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）および可溶性トロンボモジュリンを含むＦＶａまたはＦＶＩＩＩａの阻害剤；ヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、およびキシメラガトランを含むトロンビン阻害剤；ならびに凝固因子（例えば、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩＩＩ、ＦＩＩ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、フォン・ヴィレブランド因子、プレカリクレイン、または高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ））に結合する抗体または抗体断片を含む。
【０１４１】
本明細書において使用される場合、「治療する」および「治療」は、血液凝固障害に関連した症状の重症度および／または発症の任意の低減を指す。したがって、「治療する」および「治療」は、治療的および予防的措置を含む。当業者には、血液凝固障害またはそれに関連した症状からの保護またはその改善のいかなる程度であっても、人間の患者等の対象に有益であることが理解される。患者の生活の質は、対象における症状の任意の程度の重症度を低減することにより、および／または症状の出現を遅延させることにより改善される。したがって、一態様における方法は、対象が血液凝固障害を発症する危険性があることが決定された（例えば、凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、もしくはＦＸＩ）が検出された））後可能な限り速やかに、または、血液凝固障害（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、または血友病Ｃ）が検出された後可能な限り速やかに実行される。追加的態様において、ペプチドは、損傷または手術中の過度の失血に対する全体的または部分的な保護のために投与される。
【０１４２】
上記を鑑みて、本発明は、対象の治療のための方法、例えばＴＦＰＩの阻害が有益となる疾患の治療のための方法における使用のためのペプチド（またはペプチド複合体）を提供する。一態様において、疾患または障害は、血液凝固障害である。対象は、疾患もしくは障害に罹患している、または疾患もしくは障害（もしくは過度の失血等の有害な生物学的事象）に罹患する危険性がある。方法は、疾患または障害を、全体的または部分的に治療または予防するのに効果的な量および条件下で、本発明のペプチド（またはペプチド複合体）を対象に投与することを含む。本発明は、さらに、医薬の製造における使用のためのペプチド（またはペプチド複合体）を提供する。例えば、ペプチド（またはペプチド複合体）は、本明細書において詳細に説明される血液凝固障害の治療のための医薬の製造において使用することができる。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチド複合体またはペプチド（例えば、ＴＦＰＩ結合性ペプチド、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）をコードする核酸配列を含む核酸を対象に投与することが有利である。一態様において、そのような核酸は、ペプチド複合体またはペプチド（例えば、ＴＦＰＩ結合性ペプチド、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）の代わりに、またはそれに加えて提供される。発現ベクター、核酸制御配列、投与方法等は、本明細書および米国特許出願公開第２００３００４５４９８号においてさらに説明されている。
【０１４４】
特定の対象に対する特定の投与計画は、使用される本発明のＴＦＰＩ阻害ペプチド、投与されるＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）の量、投与経路、治療されている特定の病気、受容者に関連した考慮点、ならびに任意の副作用の原因および程度にある程度依存する。対象（例えば、人間等の哺乳動物）に投与されるペプチドの量、および投与条件（例えば、投与のタイミング、投与経路、用法・用量）は、妥当な時間枠において所望の生物学的応答に影響を与えるのに十分である。用量は、典型的には、使用される特定のＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）、対象の年齢および体重、ならびに対象における任意の疾患または障害の存在および重症度を含む様々な因子に依存する。用量のサイズはまた、投与の経路、タイミング、および頻度により決定される。したがって、臨床医学者は、用量を滴定し、投与経路を変更して、最適な治療効果を得ることができ、また従来の範囲決定技術は、当業者に知られている。純粋に例示を目的として、一態様において、方法は、上述の因子に依存して、例えば約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上を投与することを含む。他の実施形態において、用量は、１μｇ／ｋｇから約７５ｍｇ／ｋｇまで、または５μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまで、または１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であってもよい。ある特定の実施形態において、用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ）のペプチドを含む。多くの血液凝固障害の慢性的性質を考慮すると、対象は、数週間、数ヶ月、または数年継続する治療経過にわたってＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）を投与されること、および毎日または毎週１回以上の投薬を必要とし得ることが想定される。他の実施形態において、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は、急性状態（例えば、手術もしくは外傷によりもたらされる出血、または凝固補充療法を受けている対象における因子阻害剤／自己免疫エピソード）を治療するために、比較的短い治療期間、例えば１日から１４日間投与される。
【０１４５】
本明細書に記載のペプチドを含む薬学的組成物等の、生理学的に許容される組成物を投与する好適な方法は、当該技術分野において周知である。ペプチドを投与するために２つ以上の経路を使用することができるが、特定の経路は、別の経路よりも迅速で効果的な反応を提供することができる。状況に依存して、薬学的組成物は、体腔内に適用もしくは注入される、皮膚もしくは粘膜を通して吸収される、摂取される、吸入される、および／または血液循環内に導入される。一態様において、本発明のペプチドを血液循環内に導入するために、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は静脈内、動脈内、または腹腔内投与される。特に低分子量治療薬に対しては、非静脈内投与もまた適切である。ある特定の状況において、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）を含む薬学的組成物を、経口的、局所的、舌下的、経膣的、経直腸的、経肺的に；脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、門脈内、病巣内、髄内、くも膜下、心室内、経皮的、皮下、鼻腔内、経尿道的、もしくは腸内手段による注入を通して；徐放系により；または移植デバイスにより送達することが望ましい。所望により、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は、関心領域に供給する動脈内または静脈内投与を介して、例えば脚への送達のために大腿動脈を介して、領域的に投与される。一実施形態において、ペプチドは、例えば、米国特許第５，４３９，６８６号および米国特許第５，４９８，４２１号、ならびに米国特許出願公開第２００３／００５９４７４号、米国特許出願公開第２００３／００６４０３３号、米国特許出願公開第２００４／００４３０７７号、米国特許出願公開第２００５／００４８１２７号、米国特許出願公開第２００５／０１７０００５号、米国特許出願公開第２００５／０１４２２０５号、米国特許出願公開第２００５／１４２２０１号、米国特許出願公開第２００５／０２３３９４５号、米国特許出願公開第２００５／０１４７６８９号、米国特許出願公開第２００５／０１４２２０６号、米国特許出願公開第２００６／００２４３７９号、米国特許出願公開第２００６／０２６０７７７号、米国特許出願公開第２００７／０２０７２１０号、米国特許出願公開第２００７／００９２４５２号、米国特許出願公開第２００７／０２８１０３１号、および米国特許出願公開第２００８／００２６０６８号に記載されるように、微小粒子内に組み込まれる。代替として、組成物は、所望の分子が吸収またはカプセル化された膜、スポンジ、または別の適切な材料の移植を介して投与される。移植デバイスが使用される場合、一態様におけるデバイスは、任意の好適な組織内に移植され、所望の分子の送達は、様々な態様において、拡散、時限放出性ボーラス、または継続投与により行われる。他の態様において、ＴＦＰＩ阻害ペプチドは、外科手術もしくは損傷の治療中、露出した組織に直接投与されるか、または、血液処置における輸血を介して投与される。治療薬送達手法は、当業者に周知であり、そのいくつかは、例えば米国特許第５，３９９，３６３号においてさらに説明されている。
【０１４６】
投与を容易化するために、一実施形態におけるＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）またはペプチド複合体は、担体（すなわち、ビヒクル、アジュバント、緩衝剤、または希釈剤）を含む生理学的に許容される組成物に製剤化される。使用される具体的担体は、溶解度およびペプチドとの反応性の欠如等の物理化学的考慮点、ならびに投与経路によってのみ制限される。生理学的に許容される担体は、当該技術分野において周知である。注射用途に好適な例示的薬学的形態は、限定されることなく、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照されたい）。注射製剤は、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ．ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ  ２３８−２５０（１９８２）、およびＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，ｐａｇｅｓ  ６２２−６３０（１９８６））においてさらに説明されている。本明細書に記載のペプチドを含む薬学的組成物は、随意に、そのような薬学的組成物の使用に関する説明を提供する包装材料とともに容器内に入れられる。一般に、そのような説明は、試薬濃度、および、ある特定の実施形態においては、薬学的組成物を再構成するために必要となり得る賦形剤成分または希釈剤の相対量を説明する明確な表現を含む。
【０１４７】
適切な場合、本発明のＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）またはペプチド複合体は、追加的または増強された生物学的効果を達成するために、他の物質および／または他の治療様式と組み合わせて投与される。同時治療薬は、血漿由来または組み換え凝固因子、血友病予防治療薬、免疫抑制剤、血漿因子阻害抗体拮抗剤（すなわち、抗阻害剤）、抗線維素溶解薬、抗生物質、ホルモン療法薬、抗炎症薬（例えば、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）またはステロイド系抗炎症物質）、凝固促進剤、および鎮痛剤を含むが、これらに限定されない。一態様において、方法は、従来の補充因子治療計画に対する補助療法であり、例えば、ＦＸＩＩＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩ（例えば、ＨＥＭＯＬＥＶＥＮ（登録商標）（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ  ｅｔ  ｄｅｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、レ・ジュリス、フランス）およびＦＸＩ濃縮物（ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、ハートフォードシャー、イギリス））、ＦＸ、ＦＩＸ（例えば、ＢＥＮＥＦＩＸ（登録商標）第ＩＸ凝固因子（Ｗｙｅｔｈ、マディソン、ニュージャージー州）；ＡＬＰＨＡＮＩＮＥ（登録商標）ＳＤ（Ｇｒｉｆｏｌｓ、ロサンゼルス、カリフォルニア州）；ＭＯＮＯＮＩＮＥ（登録商標）（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）；ＢＥＢＵＬＩＮ-ＶＨ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ、ディアフィールド、イリノイ州）；ＰＲＯＦＩＬＮＩＮＥ（登録商標）ＳＤ（Ｇｒｉｆｏｌｓ、ロサンゼルス、カリフォルニア州）；またはＰＲＯＰＬＥＸ  Ｔ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ、ディアフィールド、イリノイ州））、ＦＶＩＩＩ（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ、ディアフィールド、イリノイ州）；ＨＥＬＩＸＡＴＥ（登録商標）ＦＳ（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、キング・オブプロシア、ペンシルバニア州）；ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ、マディソン、ニュージャージー州）、ＸＹＮＴＨＡ（商標）（Ｗｙｅｔｈ、マディソン、ニュージャージー州）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ（登録商標）およびＫＯＧＥＮＡＴＥ（登録商標）ＦＳ（Ｂａｙｅｒ、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）；ＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）（Ｇｒｉｆｏｌｓ、ロサンゼルス、カリフォルニア州）；ＨＥＭＯＰＨＩＬ  Ｍ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ、ディアフィールド、イリノイ州）；ＫＯＡＴＥ（登録商標）−ＤＶＩ（Ｔａｌｅｃｒｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ−ＵＳＡ、リサーチ・トライアングル・パーク、ノースカロライナ州）；またはＭＯＮＡＲＣ−Ｍ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ、ディアフィールド、イリノイ州））、ＦＶＩＩａ（例えば、ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標）ＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、プリンストン、ニュージャージー州）およびＦＶＩＩ濃縮物（Ｂａｘｔｅｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ウィーン、オーストリア、もしくはＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、ハートフォードシャー、イギリス））、ＦＶ、ＦＶａ、ＦＩＩ、および／またはＦＩＩを対象に投与することを含む。いくつかの場合において、対象はまた、第ＶＩＩＩ因子阻害剤迂回活性を有���る凍結乾燥無菌ヒト血漿分画である、ＦＥＩＢＡ  ＶＨ  Ｉｍｍｕｎｏ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ウィーン、オーストリア）を投与される。ＦＥＩＢＡ  ＶＨ  Ｉｍｍｕｎｏ（商標）は、近似的に等しい単位の第ＶＩＩＩ因子阻害剤迂回活性およびプロトロンビン複合体因子（第ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、およびＸ因子ならびにタンパク質Ｃ）を含有する。他の例示的同時治療薬は、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ）、フォン・ヴィレブランド因子、組織因子、およびトロンビンを含むが、これらに限定されない。代替として、またはそれに追加して、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）は、１つ以上の異なるＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）と同時製剤化される。一態様において、ＴＦＰＩ結合性ペプチドの投与は、所望の生物学的応答を達成するために必要な同時治療薬の用量の低減を可能にする。
【０１４８】
したがって、本発明は、それぞれその医薬に好適な計画に従い投与される１つ以上の追加的な好適な物質と組み合わせて、本発明のＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）（または複数のＴＦＰＩ結合性ペプチド、もしくはペプチド複合体）を対象に投与することを含む。投与方針は、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）（またはペプチド複合体）および１つ以上の追加的な好適な薬剤（複数を含む）の併用投与（すなわち、実質的に同時の投与）および非併用投与（すなわち、重複の有無にかかわらす、異なる時間での任意の順番の投与）を含む。同じまたは別個の組成物として、ならびに同じまたは異なる投与経路で、異なる成分が随意に投与されることが理解される。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、部分、例えば検出部分等の治療的または診断的部分、および上述の同時治療薬に結合する。代替として、またはそれに追加して、ペプチドは、（ａ）ペプチドに結合し、かつ（ｂ）治療活性である、かつ／または相互作用パートナー（例えば、治療的、診断的、もしくは検出薬剤）に追加的機能性を提供する部分に結合している、相互作用パートナー（例えば、抗体、抗体断片、アンチカリン、アプタマー、またはスピーゲルマー）と組み合わせて投与される。好適な部分は、感光剤、染料、放射性核種、放射性核種含有複合体、酵素、毒素、抗体、抗体断片、および細胞毒性薬を含むがこれらに限定されず、いくつかの場合において、部分は、治療活性を有する（すなわち、有利な、または所望の生物学的効果を達成する）。ペプチド結合体またはペプチド−相互作用パートナー対は、本明細書に記載の方法のいずれにおける使用にも、例えば疾患もしくは障害に罹患している、または疾患もしくは障害に罹患する危険性のある対象を治療する方法における使用に好適である。
【０１５０】
本発明は、さらに、セリンプロテアーゼによるＴＦＰＩの分解を阻害するための方法を提供する。プロテアーゼ分解は、研究設定におけるＴＦＰＩの処理を複雑にし得る。さらに、ＴＦＰＩ阻害が様々な医学的状態（例えば、血友病）を改善するために望ましいが、ＴＦＰＩは、他の臨床実施形態において、例えば、凝固を低減するために望ましくあり得る。「阻害する」とは、プロテアーゼによる分解または開裂から、全体的部分的な保護を意味する。セリンプロテアーゼは、よく特徴決定され、例えば、エラスターゼ、トロンビン、プラスミン、ＦＸａ、またはキマーゼが含まれる。本方法は、ＴＦＰＩを、式（ＸＩＶ）：
Ｘ７００１−Ｘ７００２−Ｘ７００３−Ｘ７００４−Ｘ７００５−Ｘ７００６−［Ｘ７００７−Ｘ７００８−Ｘ７００９−Ｘ７０１０−Ｘ７０１１−Ｘ７０１２−Ｘ７０１３−Ｘ７０１４−Ｘ７０１５−Ｘ７０１６−Ｘ７０１７−Ｘ７０１８］−Ｘ７０１９−Ｘ７０２０−Ｘ７０２１−Ｘ７０２２−Ｘ７０２３（ＸＩＶ）（配列番号３１５４）の構造を有するペプチドと接触させることを含み、
式中、Ｘ７００１は、存在するか、または存在せず、Ｘ７００１が存在する場合、Ｘ７００１は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００２は、存在するか、または存在せず、Ｘ７００２が存在する場合、Ｘ７００２は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００３は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００５は、ＲまたはＷであり、
Ｘ７００６は、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００７は、Ｏｒｎ、ｈｏｍｏＫ、Ｃ、Ｈｃｙ、Ｄａｐ、およびＫからなる群から選択される、好ましくは、ＣおよびＨｃｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００８は、Ａ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７００９は、ａ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、ｐ、Ｒ、Ｓｅｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１０は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１１は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１２は、Ａ、ａ、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、ｋ、Ｌ、ｌ、Ｍ、ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、ｎｌｅ、Ｐ、ｐ、Ｒ、ｒ、Ｓ、ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、ｔ、Ｖ、ｖ、Ｗ、およびｗからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１３は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｄ、ｄ、Ｅ、ｅ、Ｅａｇ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｍｏｏ、Ｎｌｅ、Ｒ、Ｓ、Ｓｅｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１８は、ＣおよびＤ、好ましくはＣからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０１９は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２０は、ＦおよびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２１は、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７０２３は、存在するか、または存在せず、Ｘ７０２３が存在する場合、Ｘ７０２３は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃｏｎ、Ｃｏｎ（Ｍｅｏｘ）、Ｄ、Ｅ、Ｅａｇ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ペプチドは、Ｘ７００７とＸ７０１８との間の連結により生成される環状構造として含み、それによって、セリンプロテアーゼによってＴＦＰＩ分解が阻害される。随意に、Ｘ７００１は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００２は、Ｈ、Ｆ、Ｍ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００３は、ＦおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００４は、Ｋであり、Ｘ７００５は、Ｗであり、Ｘ７００６は、ＦおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００７は、Ｃであり、Ｘ７００８は、Ａ、Ｇ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７００９は、Ｍ、Ｓｅｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１０は、Ｋ、Ｐ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１１は、Ｄであり、Ｘ７０１２は、Ｆ、Ｌ、ｌ、Ｍ、およびＳｅｍからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１３は、Ｄ、Ｇ、Ｋ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１４は、Ｇであり、Ｘ７０１５は、ＩおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１６は、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓｅｍ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１７は、ＳおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０１８は、Ｃであり、Ｘ７０１９は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２０は、Ｗであり、Ｘ７０２１は、Ｖであり、Ｘ７０２２は、Ｆ、Ｌ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ７０２３は、存在するか、または存在せず、Ｘ７０２３が存在する場合、Ｘ７０２３は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ペプチドは、Ｘ７００７とＸ７０１８との間の連結により生成される環状構造として含む。「接触」は、生体外または生体内で行われ得る。本明細書に記載の投与考慮の用量および経路は、タンパク質分解を阻害する方法に適用できる。
【０１５１】
ペプチドは、随意に、ペプチド複合体の一部であり、式（ＸＩＩＩ）：
【０１５２】
Ｘ６００１−Ｘ６００２−Ｘ６００３−Ｘ６００４−Ｘ６００５−Ｘ６００６−Ｘ６００７−Ｘ６００８−Ｘ６００９−Ｘ６０１０−Ｘ６０１１−Ｘ６０１２−Ｘ６０１３−Ｘ６０１４−Ｘ６０１５−Ｘ６０１６−Ｘ６０１７−Ｘ６０１８−Ｘ６０１９−Ｘ６０２０  （ＸＩＩＩ）（配列番号３１５３）の構造を有するペプチドをさらに含み、
【０１５３】
式中、Ｘ６００１は、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、Ｄｏｐａ、Ｂｈｆ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｎｍｆ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００２は、Ｑ、Ｇ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００３は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ａ、Ａｉｂ、Ｂｈｓ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００４は、Ａｉｂ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ａ、Ｂｈｋ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ｋ、Ｎ、Ｎｍｋ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００５は、ａ、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、ｐ、Ｑ、Ｒ、ＮプロピルＧ、ａｚｅ、ｐｉｐ、ｔｉｃ、ｏｉｃ、ｈｙｐ、ｎｍａ、Ｎｃｇ、Ａｂｇ、Ａｐｇ、ｔｈｚ、ｄｔｃ、Ｂａｌ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００６は、Ａ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｃｉｔ、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｅｄｅ（Ｏ）、Ｃｍｃ、Ｅｃｌ、Ｅｅａ、Ｅｅｃ、Ｅｅｆ、Ｎｉｆ、Ｅｅｗ、Ａｉｂ、Ｂｔｑ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００７は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ｔｌｅ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎｍｖ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００８は、Ｆ、Ｈ、１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ｐｍｙ、Ｙ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６００９は、Ａｉｂ、Ｖ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇ、Ａｂｕ、Ｃｐｇ、Ｔｌｅ、Ｌ−２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、Ａ、ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｎｍｄ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ａｉｂ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＮｍｆからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１１は、Ａ、ａ、Ｇ、ｐ、Ｓａｒ、ｃ、ｈｃｙ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｋ、Ｇ、およびＮｍｇからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１２は、Ｙ、Ｔｙｍ、Ｐｔｙ、Ｄｏｐａ、およびＰｍｙからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１３は、Ａｉｂ、Ｃ、Ｆ、１Ｎｉ、Ｔｈｉ、Ｂｔａ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１４は、Ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｈｃｙ、Ｂｈｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１５は、Ｒ、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、
【０１５４】
Ｘ６０１６は、Ｌ、Ｈｃｙ、Ｈｌｅ、およびＡｍｌからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１７は、Ａ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、ｃ、Ｃｈａ、Ｄａｂ、Ｅａｇ、Ｅｅｗ、Ｈ、Ｈａｒ、Ｈｃｉ、Ｈｌｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｐａ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｓ、Ｄｅｇ、Ｅｂｃ、Ｅｃａ、Ｅｇｚ、Ａｉｃ、Ａｐｃ、Ｅｇｔ、（オメガ−メチル）−Ｒ、Ｂｈｒ、Ｃｉｔ、Ｄ、Ｄａｐ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１８は、Ａ、Ａｉｂ、Ｈｃｙ、ｈｃｙ、Ｃ、ｃ、Ｌ、Ｎｌｅ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｂａｌ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０１９は、Ｋ、Ｒ、Ｈａｒ、Ｂｈｋ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６０２０は、Ｋ、Ｌ、Ｈｃｙ、Ａｍｌ、Ａｉｂ、Ｂｈｌ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎｍｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１５５】
本発明は、さらに、ＴＦＰＩ結合性ペプチド等のＴＦＰＩ結合性化合物を同定するための方法を提供する。一態様において、方法は、（ａ）ＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体の形成を可能とする条件下で、ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）を含むペプチドを、本明細書に記載のＴＦＰＩ結合性ペプチドおよび試験化合物と接触させることを含む。方法は、さらに、（ｂ）ステップ（ａ）において形成されたＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体を測定することと、（ｃ）試験化合物の存在下で形成されたＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体の数を、試験化合物の非存在下で形成されたＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体の数と比較することとを含む。試験化合物の非存在下で形成されたＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体の数と比較した、試験化合物の存在下で形成されたＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体の数の低減は、試験化合物がＴＦＰＩ結合性化合物であることを示す。一態様において、方法は、さらに、ステップ（ｃ）における比較のために、試験化合物の非存在下でＫＤ１−ＴＦＰＩ結合複合体を形成することを含むが、これは、情報を別個に得ることができる限り（例えば、以前に調製された参照標準から）必要ではない。
【０１５６】
ＫＤ１、ＴＦＰＩ結合性ペプチド、および試験化合物は、随意にＴＦＰＩ結合性ペプチドおよび／または試験化合物の添加前および／または添加後の洗浄ステップとともに、同時にまたは順次組み合わされる。一実施形態において、ＫＤ１を含むペプチドは、ＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体の形成を可能にする条件下で、本明細書に記載のＴＦＰＩ結合性ペプチドと接触させられ、未結合ＴＦＰＩ結合性ペプチドが除去され、残りのＫＤ−ペプチド複合体が試験化合物と接触させられる。ＴＦＰＩ−ペプチド複合体からのＴＦＰＩ結合性ペプチドの転換が検出され、これは試験化合物がＴＦＰＩ結合性化合物であることを示す。転換は、例えば、試験化合物への暴露前および暴露後のＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体の数を測定することにより検出される。
【０１５７】
ＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体は、試料中のペプチドを検出するための当該技術分野において知られた検出手段を含む、任意の好適な検出手段を使用して検出および／または測定（定量）される。例えば、本発明の一実施形態において、ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、シグナルを生成する標識を含む。例示的な標識は、本明細書に記載されており、例えば、放射性核種、蛍光染料、同位体、酵素基質、および酵素を含む。方法は、ＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体により生成されたシグナルを測定することと、試験化合物の存在下で形成されたＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体により生成されたシグナルを、試験化合物の非存在下で形成されたＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体により生成されたシグナルと比較することとを含む。（試験化合物に暴露されなかったＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体の同様の試料により生成されたシグナルと比較した）試験化合物に暴露されたＫＤ１−ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体を含む試料からのシグナルの低減は、複合体形成が阻害または妨害されたこと、および試験化合物がＴＦＰＩ結合性化合物であることを示す。
【０１５８】
本発明はまた、ＴＦＰＩ−ＦＸａ相互作用に干渉するＴＦＰＩ結合性化合物を同定する方法を提供する。方法は、少なくとも部分的に、ＴＦＰＩ  ＫＤ１がＦＸａの外部位に結合し、ＴＦＰＩのＦＸａ活性の阻害に寄与するという驚くべき発見に基づく。一態様において、方法は、ＦＸａに対するＫＤ１の結合を可能にする条件下、試験化合物の存在下で、本質的にＫＤ１からなるペプチド（すなわち、ＫＤ２の非存在下でＫＤ１を含むペプチド）を、ＦＸａと接触させることを含む。方法は、さらに、試験化合物の存在下でのＫＤ１−ＦＸａ結合を、試験化合物の非存在下でのＫＤ１−ＦＸａ結合と比較することを含む。試験化合物の非存在下でのＫＤ１−ＦＸａ結合と比較した、試験化合物の存在下でのＫＤ１−ＦＸａ結合の低減は、試験化合物がＴＦＰＩ結合性化合物であることを示す。ＫＤ１−ＦＸａ結合は、任意の方法、例えば本明細書に記載の方法を使用して検出および／または定量することができる。例えば、ＫＤ１またはＦＸａが標識化され、試験化合物に暴露されたＫＤ１−ＦＸａ複合体により生成されたシグナルが、試験化合物に暴露されなかったＫＤ１−ＦＸａ複合体により生成されたシグナルと比較される。
【０１５９】
ＴＦＰＩ結合性化合物を同定するための本発明の方法は、当該技術分野において知られた様々なハイスループットスクリーニング技術に有効である。任意の「試験化合物」（例えば、小分子、ペプチド、タンパク質（例えば抗体もしくはその断片）、ペプチド模倣薬、またはポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡ））が、本明細書に記載の方法を使用したスクリーニングに好適である。所望により、試験化合物の集合、集団、またはライブラリが、本明細書に記載の方法を使用して、ＴＦＰＩ結合（および、随意に、抗ＴＦＰＩ活性）に関してスクリーニングされる。ペプチドおよび／または有機分子を含む化学ライブラリ、天然産物ライブラリ、およびコンビナトリアルライブラリを含むがこれらに限定されないＴＦＰＩ阻害剤の同定に使用される複数の異なるライブラリがある。いくつかの態様において、化学ライブラリは、他のスクリーニング法により「ヒット」または「リード」として同定される既知の化合物（複数を含む）の構造的アナログからなる。天然産物ライブラリは、微生物、動物、植物、または海洋生物から単離された、またはそれらにより産生された物質の集合である。コンビナトリアルライブラリは、典型的には混合物としての多数のペプチドまたは有機化合物で構成される。また、本明細書に記載の方法は、酵母ディスプレイライブラリ、細菌ディスプレイライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、リボソームディスプレイライブラリ、ｍＲＮＡディスプレイライブラリ、ＲＮＡライブラリ、またはＤＮＡライブラリ等のディスプレイまたは核酸ライブラリのスクリーニングに有用である。ディスプレイライブラリをスクリーニングする１つの方法は、実施例１において例示される。本発明に含まれるハイスループットスクリーニング法は、数十から数百、数千もの試験化合物のスクリーニングを可能にする自動化された手順を含む。
【０１６０】
別の態様において、ＴＦＰＩ結合性化合物を同定するための本発明の方法は、ＫＤ１を含む（またはＫＤ１からなる）ペプチドを、試験化合物と接触させることと、ヒトＴＦＰＩ残基Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３２、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、およびＩｌｅ５５に対応するＫＤ１アミノ酸残基により画定されるＴＦＰＩ結合部位、例えば、ヒトＴＦＰＩ残基Ａｌａ２７、Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｌｙｓ３６、Ｉｌｅ３８、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、およびＩｌｅ５５により画定される結合部位に対する、試験化合物の結合を検出することとを含む。一実施形態において、結合部位は、ヒトＴＦＰＩ残基Ａｌａ２７、Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｌｙｓ３６、Ａｌａ３７、Ｉｌｅ３８、Ｐｈｅ４４、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、およびＩｌｅ５５に対応するアミノ酸残基により画定される。結合部位は、複数の機能分析においてＴＦＰＩ活性を阻害するＴＦＰＩ結合性ペプチドであるＪＢＴ１８５７のＴＦＰＩ結合部位に対応する。ＪＢＴ１８５７は、例えば、式（Ｉ）〜（ＩＶ）および（ＸＩ）として本明細書に示されるペプチドのＪＢＴ００４７クラスのペプチドの一例であり、これらの例を図３２、６２、および６５に記載する。
【０１６１】
さらに、ＫＤ１−ＫＤ２を含むペプチド（ＴＦＰＩポリペプチドに連結するＫＤ１およびＫＤ２の領域を含む）を試験化合物と接触させる、ならびにヒトＴＦＰＩ残基Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６に対応するＫＤ１−ＫＤ２アミノ酸残基によって画定されるＴＦＰＩ結合部位への試験化合物の結合を検出するための方法を提供する。結合部位は、ＪＢＴ１８３７のＴＦＰＩ結合部位、多くの機能的分析におけるＴＦＰＩ活性を阻害するＴＦＰＩ結合性ペプチドに対応する。ＪＢＴ１８３７は、例えば、式（Ｖ）〜（ＶＩＩ）として本明細書に示されるペプチドのＪＢＴ０１２０クラスのペプチドの一例であり、これらの例を図３４に説明する。
【０１６２】
本明細書に記載のＴＦＰＩ結合部位アミノ酸残基は、ヒトＴＦＰＩアミノ酸配列に関連し、番号は、ヒトＴＦＰＩのＮ末端に対する列挙されたアミノ酸の位置を指す。ＴＦＰＩ結合部位の位置をを例示することのみを目的として、ＫＤ１を含むヒトＴＦＰＩの断片のアミノ酸配列は、配列番号４２３４（ＤＳＥＥＤＥＥＨＴＩＩＴＤＴＥＬＰＰＬＫＬＭＨＳＦＣＡＦＫＡＤＤＧＰＣＫＡＩＭＫＲＦＦＦＮＩＦＴＲＱＣＥＥＦＩＧＧＣＥＧＮＱＮＲＦＥＳＬＥＥＣＫＫＭＣＴＲＤＮＡ（ＫＤ１をコードするアミノ酸２６〜７５は太字で示される）として提供される。他のＴＦＰＩポリペプチドの対応するアミノ酸（例えば、異なる生物からのＴＦＰＩポリペプチド、またはＴＦＰＩポリペプチド断片）は、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４２３４と整列させることにより同定される。一実施形態において、ＴＦＰＩ  ＫＤ１を含むペプチドは、ＴＦＰＩ活性に関連するＴＦＰＩタンパク質の他の領域を含まないが、他の実施形態は、ヒトＴＦＰＩ（ＫＤ１およびＫＤ２を含む）のアミノ酸１〜１６０を含む、または全長ヒトＴＦＰＩ（ＫＤ１〜ＫＤ３を含有する）を含むペプチドの使用を伴う。
【０１６３】
本明細書において定義されるＴＦＰＩ結合部位に対する試験化合物の結合は、本明細書に記載の検出方法を含む複数の方法のいずれかを使用して検出される。結合を検出するための例示的方法は、ＴＦＰＩ結合部位内のアミノ酸残基における化学シフトを認識する核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用する。ＴＦＰＩアミノ酸位置２８〜３０、３２、４６、４７、および５５、ならびに随意に位置２７、３１、３６〜３８、および４４における化学シフトは、試験化合物とＴＦＰＩ上のそれらのアミノ酸接触ポイントとの相互作用を示す。同様に、ＴＦＰＩアミノ酸位置４１、５３、５９、６０、９６、１０６、１３０、１３３、１３６、１３７、１４２、６３、６５、６７、７１、７４、７５、８０、８２〜８５、８７、１３１、１３４、１４５、および１４６における化学シフトは、試験化合物とＴＦＰＩ上のそれらのアミノ酸接触ポイントとの相互作用を示す。試験化合物の結合から生じる特定のアミノ酸での化学シフトの存在または非存在を決定するために、ＫＤ１−試験化合物複合体から得られたＮＭＲデータが、遊離ＫＤ１ペプチド（例えば、遊離ＫＤ１ペプチドまたは遊離ＫＤ１−ＫＤ２ペプチド）から得られたＮＭＲデータと比較される。試験化合物とＴＦＰＩとの間の結合を検出するためのＮＭＲの使用は、実施例においてさらに説明される。
【０１６４】
代替として、本明細書において定義されるＴＦＰＩ結合部位に対する試験化合物の結合は、その天然結合パートナー、例えばＦＶＩＩａまたはＦＸａとの相互作用するＴＦＰＩ  ＫＤ１、随意にＫＤ２と組み合わせた能力の変化を検出することにより、間接的に決定される。この点において、方法は、一態様において、ＦＶＩＩａに対するＫＤ１の結合を可能にする条件下、試験化合物の存在下で、ＴＦＰＩ  ＫＤ１を含むペプチドを、ＦＶＩＩａと接触させることを含み、ＫＤ１−ＦＶＩＩａ結合が、試験化合物の非存在下でのＫＤ１−ＦＶＩＩａ結合と比較される。代替として、またはそれに追加して、方法は、ＦＸａに対するＫＤ１の結合を可能にする条件下、試験化合物の存在下で、ＴＦＰＩ  ＫＤ１を含むペプチドを、ＦＸａと接触させることを含み、試験化合物の存在下でのＫＤ１−ＦＸａ結合が、試験化合物の非存在下でのＫＤ１−ＦＸａ結合と比較される。随意に、ＫＤ１を含むペプチドは、ＫＤ２も含み、方法は、ＦＸａに対するＫＤ２の結合を可能にする条件下、試験化合物の存在下で、ペプチドをＦＸａと接触させることを含み、ＫＤ２−ＦＸａ結合が、試験化合物の非存在下でのＫＤ２−ＦＸａ結合と比較される。（試験化合物の非存在下でのＫＤ１−ＦＶＩＩａ結合、ＫＤ１−ＦＸａ結合、またはＫＤ２−ＦＸａ結合と比較した）試験化合物の存在下でのＫＤ１−ＦＶＩＩａ結合、ＫＤ１−ＦＸａ結合、またはＫＤ２−ＦＸａ結合の低減は、試験化合物がＴＦＰＩ結合性化合物であることを示す。方法は、随意に、試験化合物の存在下での結合の比較のための参照として、試験化合物の非存在下でＫＤ１および／またはＫＤ２をＦＶＩＩａおよび／またはＦＸａに接触させることを含む。
【０１６５】
ＦＶＩＩａまたはＦＸａに対するＫＤの結合は、検出可能な標識を使用した本明細書に記載の方法等の、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための任意の好適な方法を使用して決定および／または定量される。ＴＦＰＩ結合部位に対する試験化合物の結合は、代替として、酵素的分析を使用して検出される。ＦＶＩＩａまたはＦＸａ酵素活性は、ＴＦＰＩ  ＫＤ１またはＫＤ２に対するタンパク質の結合を評価するための好適な代理であり、本明細書において定義されるＴＦＰＩ結合部位に結合する試験化合物は、ＴＦＰＩ活性を阻害し、ＦＶＩＩａおよびＦＸａ活性の増加をもたらす。ＦＶＩＩａまたはＦＸａ活性を評価するための酵素的分析は、本明細書において詳細に説明される。
【０１６６】
本発明は、さらに、本発明の方法においてＴＦＰＩ結合性化合物として同定される化合物、および１つ以上の同定された化合物を含む組成物をさらに含む。本明細書に記載のように同定されたＴＦＰＩ結合性化合物（例えば、ＴＦＰＩ結合性ペプチド）を単離または精製するための方法は、当該技術分野において知られており、上述されている。いくつかの態様において、本明細書に記載のように同定されるＴＦＰＩ結合性化合物は、１つ以上のＴＦＰＩ活性を下方制御または除去するＴＦＰＩ阻害剤である。本発明は、アミノ酸残基Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５によって画定される第１の結合部位（例えば、アミノ酸残基Ａ２７、Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｋ３６、Ｉ３８、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５によって画定される結合部位、例えば、アミノ酸残基Ａ２７、Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｋ３６、Ａ３７、Ｉ３８、Ｆ４４、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５によって画定される結合部位）、ならびにアミノ酸残基Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６によって画定される第２の結合部位でヒトＴＦＰＩに結合するＴＦＰＩ阻害剤を提供する。アミノ酸指定は、ヒトＴＦＰＩ中のアミノ酸残基位置に対応する。様々な態様において、ＴＦＰＩ阻害剤は、ペプチドである。ＴＦＰＩ阻害剤は、様々な態様において、本明細書に記載のリンカー部分によって連結される、第１のペプチドおよび第２のペプチドを含む。
【０１６７】
一実施形態において、本発明は、ＦＸａ活性を阻害する化合物を精製するための方法を含む。化合物−ＫＤ１複合体の形成を可能にする条件下、ＴＦＰＩ  ＫＤ１を含むペプチドを、化合物と接触させることと、未結合化合物を除去することと、化合物−ＫＤ１複合体を解離して、ＴＦＰＩに結合する化合物を放出することとを含む。血液凝固障害を治療するための医薬等の医薬の製造のための、本明細書に記載のように同定および／または精製されるＴＦＰＩ阻害剤の使用、ならびに、疾患に罹患している、または疾患に罹患する危険性のある対象を治療するための方法であって、ＴＦＰＩ阻害剤を対象に投与することを含む方法が提供される。
【０１６８】
さらに、ヒトＴＦＰＩを阻害する方法であって、ヒトＴＦＰＩを、アミノ酸残基Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３２、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、およびＩｌｅ５５により画定される結合部位でヒトＴＦＰＩと結合する阻害剤と接触させることを含む方法が提供される。本発明の別の態様は、疾患に罹患している、または疾患に罹患する危険性のある対象を治療するための方法を含む。方法は、アミノ酸残基Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３２、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、およびＩｌｅ５５により画定される結合部位でヒトＴＦＰＩと結合する阻害剤を、対象に投与することを含む。一態様において、ヒトＴＦＰＩ結合部位は、アミノ酸残基Ａｌａ２７、Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｌｙｓ３６、Ａｌａ３７、Ｉｌｅ３８、Ｐｈｅ４４、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、およびＩｌｅ５５により画定される結合部位等、アミノ酸残基Ａｌａ２７、Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｌｙｓ３６、Ｉｌｅ３８、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、およびＩｌｅ５５により画定される。代替として、またはさらに、ＴＦＰＩを阻害する方法は、ヒトＴＦＰＩを、アミノ酸残基Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６によって画定される結合部位でヒトＴＦＰＩに結合する阻害剤と接触させることを含む。本発明は、さらに、疾患に罹患している、または疾患に罹患する危険性のある対象を治療する方法を提供し、本方法は、対象に、アミノ酸残基Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６によって画定される結合部位でヒトＴＦＰＩに結合する阻害剤を提供する方法を提供する。様々な態様において、阻害剤は、アミノ酸残基Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５（ならびに随意に、Ａ２７、Ｄ３１、Ｋ３６、Ａ３７、Ｉ３８、およびＦ４４）によって画定される結合部位、ならびにアミノ酸残基Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｎ１３３、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｌ１３１，Ｍ１３４、Ｎ１４５、およびＩ１４６によって画定される結合部位でＴＦＰＩに結合する。
【０１６９】
本明細書において定義されるＴＦＰＩ結合部位（複数を含む）と接触し、１つ以上のＴＦＰＩ活性を阻害（下方制御または除去）する任意の阻害剤が、この方法の文脈における使用に好適である。ＴＦＰＩ阻害剤は、随意に、ＴＦＰＩ結合性ペプチド、例えば、本明細書に記載の特徴を有するＴＦＰＩ結合性ペプチドである。
【０１７０】
本発明は、さらに、コンピュータ記憶媒体および本明細書において定義されるＴＦＰＩ結合部位における候補ＴＦＰＩ化合物をモデル化するための方法を含む。タンパク質の三次元（３Ｄ）モデル化は、化合物とＴＦＰＩ中の標的アミノ酸との間のフィッティングを決定するために、様々な試験ＴＦＰＩ結合性化合物（例えば、ペプチドまたは小分子）の３Ｄモデルと併せて使用することができる。試験化合物のＴＦＰＩ阻害における有効性は、化合物が生物学的応答を達成するために十分な期間ＴＦＰＩに対する結合を維持しない場合制限され得るため、結合を維持する２者の傾向を予測して、親和性評価を生成することができる。
【０１７１】
親和性評価を考慮して、ＴＦＰＩタンパク質の３Ｄ表面および対応する化合物の表面へのフィッティングを分析することにより、表面と化合物との間の接触ポイントの数、および接触ポイントにおける結合の強度の両方を改善するために、化合物（例えば、ペプチド）の修飾を生成することができる。この技術を使用して、化学ベースの候補およびペプチドベースのＴＦＰＩ阻害剤の有効性を同様にモデル化することができ、これは、ＴＦＰＩ結合性化合物の合理的設計を容易化する。ＫＤ１（随意にＫＤ２に連結される）の三次元（３Ｄ）表面のコンピュータモデルにより、様々なペプチドまたは化学薬品の、ＴＦＰＩ結合部位を画定しＫＤ１（および随意にＫＤ２）を阻害する同定されたサブセットのアミノ酸に結合する能力を試験することができる。一態様において、ＫＤ１タンパク質の表面、特にＫＤ１内の標的アミノ酸により境界される表面は、コンピュータ上の３Ｄ空間内でモデル化される。例えば、様々なペプチドの３Ｄモデルは、標的ＴＦＰＩアミノ酸のうちのいくつにペプチドが接触するかを決定するため、および、どれ程の期間ペプチドが標的表面に対する結合を維持するかを予測する親和性評価を生成するために、表面に照合され得る。
【０１７２】
ペプチドモデルを変更し、コンピュータモデリングを反復することにより、ペプチドファミリーに対して親和性評価が迅速に生成され得る。最も有望なペプチド変異体（例えば、親ペプチドのアミノ酸配列内に１つ以上の置換を含む第２のペプチド）を、所望によりさらなる物理的試験のために選び出すことができる。
【０１７３】
本発明は、コンピュータのプロセッサ上で実行されると、ＴＦＰＩ  ＫＤ１タンパク質および試験化合物における選択された三次元（３Ｄ）ポイント間の相互作用をモデル化する方法を実行する、コンピュータにより実行可能な命令を有するコンピュータ記憶媒体を提供する。方法は、ＴＦＰＩ  ＫＤ１タンパク質のタンパク質構造３Ｄモデルを得ることと、タンパク質構造における、Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３２、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、およびＩｌｅ５５を含む選択されたサブセットのアミノ酸間の３Ｄ関係を決定することと、選択されたサブセットのアミノ酸により境界される表面をモデル化することと、試験化合物の試験化合物３Ｄモデルを得ることと、試験化合物３Ｄモデルを、選択されたサブセットのアミノ酸が結合した表面に照合することと、表面の選択されたサブセットのアミノ酸と、試験化合物３Ｄモデルとの間の接触ポイントを識別することとを含む。随意に、方法は、表面と試験化合物３Ｄモデルとの間の接触ポイントの数を決定することと、接触ポイントの数に対応する試験化合物３Ｄモデルの親和性評価を記録することと、をさらに含む。一態様において、選択されたサブセットのアミノ酸は、Ａｌａ２７、Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｌｙｓ３６、Ａｌａ３７、Ｉｌｅ３８、Ｐｈｅ４４、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、およびＩｌｅ５５を含む。方法は、随意に、第２の試験化合物に基づく更新された試験化合物３Ｄモデルを得ることと、更新された試験化合物３Ｄモデルを、選択されたサブセットのアミノ酸により境界される表面に照合することと、表面の選択されたサブセットのアミノ酸と、更新された試験化合物３Ｄモデルとの間の識別された接触ポイントを、コンピュータのディスプレイ上で識別することとをさらに含む。一実施形態において、方法は、表面と更新された試験化合物３Ｄモデルとの間の接触ポイントの数を決定することと、表面と更新された試験化合物３Ｄモデルとの間の各接触ポイントの結合タイプを決定することと、表面と更新された試験化合物３Ｄモデルとの間の接触ポイントの数および各接触ポイントの結合タイプの総計に基づき、新たな親和性評価を記録することと、をさらに含む。次いで、所望により、更新された親和性評価は、新たな親和性評価と比較され、試験化合物または第２の試験化合物が、より高い親和性評価を有するか否かが決定される。接触ポイントは、コンピュータ上に表示することができ、それにより、ＴＦＰＩ結合性化合物の最適化または設計が容易化される。
【０１７４】
さらに、本発明は、コンピュータのプロセッサ上で実行されると、ＴＦＰＩ  ＫＤ１−ＫＤ２タンパク質および試験化合物における選択された三次元（３Ｄ）ポイント間の相互作用をモデル化する方法を実行する、コンピュータにより実行可能な命令を有するコンピュータ記憶媒体を提供する。本方法は、ＴＦＰＩ  ＫＤ１−ＫＤ２タンパク質領域のタンパク質構造３Ｄモデルを得ることと、タンパク質構造における、Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｎ１３３、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｌ１３１、Ｍ１３４、Ｎ１４５、およびＩ１４６を含む選択されたサブセットのアミノ酸間の３Ｄ関係を決定することと、選択されたサブセットのアミノ酸により境界される表面をモデル化することと、試験化合物の試験化合物３Ｄモデルを得ることと、試験化合物３Ｄモデルを、選択されたサブセットのアミノ酸により境界される表面に照合することと、表面の選択されたサブセットのアミノ酸と、試験化合物３Ｄモデルとの間の接触ポイントを識別することと、を含む。本方法はまた、随意に、表面と試験化合物３Ｄモデルとの間の複数の接触ポイントを決定することと、接触ポイントの数に対応する試験化合物３Ｄモデルの親和性評価を記録することと、をさらに含む。様々な実施形態において、本方法は、Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５（および、随意にＡ２７、Ｄ３１、Ｋ３６、Ａ３７、Ｉ３８、および／またはＦ４４）、ならびにＲ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６を含む選択されたサブセットのアミノ酸間の３Ｄ関係を決定することと、を含む。
【０１７５】
別の実施形態において、コンピュータ記憶媒体は、コンピュータのプロセッサ上で実行されると、ペプチドを、ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１タンパク質（ＫＤ１）における選択された三次元ポイント（３Ｄ）と比較する方法を実行する、コンピュータにより実行可能な命令を有し、本方法は、ＫＤ１タンパク質のタンパク質構造を形成することと、ＫＤ１タンパク質における、Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３２、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、およびＩｌｅ５５を含む選択されたサブセットのアミノ酸の三次元モデルを決定することと、ペプチドの三次元モデルを決定することと、ペプチドの３Ｄモデルを、選択されたサブセットのアミノ酸の３Ｄモデルにフィッティングすることと、選択されたサブセットのアミノ酸に対する、ペプチドと接触するサブセット内のアミノ酸の数、および各接触ポイントでの結合強度に基づく、ペプチドの親和性を生成することと、を含む。代替として、コンピュータにより実行可能な命令は、ペプチドを、ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１およびＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ１−ＫＤ２）内の選択された三次元ポイント（３Ｄ）と比較する方法を実行し、本方法は、ＫＤ１−ＫＤ２タンパク質のタンパク質構造を形成することと、ＫＤ１−ＫＤ２タンパク質における、Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６（随意に、Ｆ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５と組み合わせて（ならびに、随意にさらにＡ２７、Ｄ３１、Ｋ３６、Ａ３７、Ｉ３８、および／またはＦ４４と組み合わせて））を含む選択されたサブセットのアミノ酸の三次元モデルを決定することと、ペプチドの三次元モデルを決定することと、ペプチドの３Ｄモデルを、選択されたサブセットのアミノ酸の３Ｄモデルにフィッティングすることと、選択されたサブセットのアミノ酸に対する、ペプチドの親和性を生成することと、を含む。
【０１７６】
さらに、試験化合物を、ＴＦＰＩ  ＫＤ１タンパク質またはＴＦＰＩ  ＫＤ１−ＫＤ２タンパク質における選択された三次元ポイントと比較する方法が提供される。方法は、コンピュータのメモリ内に、ＫＤ１タンパク質のタンパク質構造を形成することと、コンピュータのプロセッサにおいて、ＫＤ１タンパク質における、Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３２、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、およびＩｌｅ５５を含む選択されたサブセットのアミノ酸の三次元モデルを決定することと、コンピュータのプロセッサにおいて、試験化合物の三次元モデルを決定することと、コンピュータのプロセッサにおいて、試験化合物の３Ｄモデルを、選択されたサブセットのアミノ酸の３Ｄモデルにフィッティングすることと、コンピュータのプロセッサにおいて、選択されたサブセットのアミノ酸に対する、試験化合物と接触するサブセット内のアミノ酸の数、および各接触ポイントでの結合強度に基づく、試験化合物の親和性を生成することと、を含む。代替として、本方法は、コンピュータのプロセッサにおいて、ＫＤ１−ＫＤ２タンパク質における、Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｎ１３３、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｌ１３１、Ｍ１３４、Ｎ１４５、およびＩ１４６、随意にＦ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＩ５５と組み合わせて（ならびに、さらに随意にＡ２７、Ｄ３１、Ｋ３６、Ａ３７、Ｉ３８、および／またはＦ４４と組み合わせて）を含む選択されたサブセットのアミノ酸の三次元モデルを決定することを含む。方法は、いくつかの実施形態において、試験化合物と選択されたサブセットのアミノ酸の３Ｄモデルとの間のフィッティングの３Ｄ表示を表示することと、随意に、複数の試験化合物に対して、本明細書に記載のステップを反復することと、複数の試験化合物のそれぞれに対する各親和性を保存することと、をさらに含む。
【０１７７】
図５８を参照すると、請求される方法および装置を実行するための例示的システムは、コンピュータ１１０の形態の汎用コンピュータデバイスを含む。点線の輪郭で示されたコンポーネントは、技術的にはコンピュータ１１０の一部ではないが、図５８の例示的実施形態を示すために使用されている。コンピュータ１１０のコンポーネントは、プロセッサ１２０、システムメモリ１３０、メモリ／グラフィックスインターフェース１２１およびＩ／Ｏインターフェース１２２を含み得るが、これらに限定されない。システムメモリ１３０およびグラフィックスプロセッサ１９０は、メモリ／グラフィックスインターフェース１２１に結合されてもよい。モニタ１９１または他のグラフィック出力デバイスは、グラフィックプロセッサ１９０に結合されてもよい。
【０１７８】
プロセッサ１２０、メモリ／グラフィックスインターフェース１２１およびＩ／Ｏインターフェース１２２の間の高速システムバス１２３、メモリ／グラフィックスインターフェース１２１およびシステムメモリ１３０の間のフロントサイドバス１２４、ならびにメモリ／グラフィックスインターフェース１２１およびグラフィックスプロセッサ１９０の間のアドバンストグラフィックスプロセッシング（ＡＧＰ）バス１２５を含む、一連のシステムバスが、様々なシステムコンポーネントを結合してもよい。システムバス１２３は、いくつかの種類のバス構造のいずれであってもよく、例えば、限定されないが、そのようなアーキテクチャは、業界標準アーキテクチャ（ＩＳＡ）バス、マイクロチャネルアーキテクチャ（ＭＣＡ）バス、およびエンハンストＩＳＡ（ＥＩＳＡ）バスを含む。システムアーキテクチャが発展するに従い、他のバスアーキテクチャおよびチップセットが使用されてもよいが、多くの場合、一般にこのパターンに従う。例えば、ＩｎｔｅｌおよびＡＭＤ等の企業は、それぞれ、インテルハブアーキテクチャ（ＩＨＡ）およびＨｙｐｅｒｔｒａｎｓｐｏｒｔ（商標）アーキテクチャをサポートしている。
【０１７９】
コンピュータ１１０は、典型的には、様々なコンピュータ可読媒体を含む。コンピュータ可読媒体は、コンピュータ１１０によりアクセス可能な任意の利用可能な媒体であってもよく、揮発性および不揮発性媒体、リムーバブルおよび非リムーバブル媒体の両方を含む。例として、限定されないが、コンピュータ可読媒体は、コンピュータ記憶媒体を含んでもよい。コンピュータ記憶媒体は、コンピュータにより実行可能な命令、データ構造、プログラムモジュールまたは他のデータ等、情報記憶のための任意の方法または技術で実装される、揮発性および不揮発性、リムーバブルおよび非リムーバブル媒体の両方を含む。コンピュータ記憶媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリもしくは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）もしくは他の光学ディスク記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置もしくは他の磁気記憶デバイス、または、電子データを物理的に具現化する他の物理記憶素子を含み、ラジオ波または変調された搬送波信号等の任意の伝播媒体を除く。
【０１８０】
システムメモリ１３０は、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）１３１およびランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）１３２等の揮発性および／または不揮発性メモリの形態のコンピュータ記憶媒体を含む。システムＲＯＭ１３１は、永久的なシステムデータ１４３、例えばコンピュータに特異的な構成データを含有してもよい。ＲＡＭ１３２は、典型的には、プロセッサ１２０にすぐにアクセス可能な、および／またはプロセッサ１２０上で現在操作されているデータおよび／またはプログラムモジュールを含有する。例として、限定されないが、図５８は、オペレーティングシステム１３４、アプリケーションプログラム１３５、他のプログラムモジュール１３６、およびプログラムデータ１３７を示す。
【０１８１】
Ｉ／Ｏインターフェース１２２は、システムバス１２３を、様々な内部および外部デバイスをコンピュータ１１０に結合する複数の他のバス１２６、１２７および１２８に結合してもよい。シリアルペリフェラルインタフェース（ＳＰＩ）バス１２６は、起動中等におけるコンピュータ１１０内の要素間の情報の転送に役立つ基本ルーチンを含有する、基本入力／出力システム（ＢＩＯＳ）メモリ１３３に接続してもよい。
【０１８２】
スーパー入力／出力チップ１６０は、例えばフロッピーディスク１５２、キーボード／マウス１６２、およびプリンタ１９６等の、複数の「レガシー」周辺機器に接続するように使用されてもよい。スーパーＩ／Ｏチップ１６０は、いくつかの実施形態において、ローピンカウント（ＬＰＣ）バス等のバス１２７により、Ｉ／Ｏインターフェース１２２に接続されてもよい。スーパーＩ／Ｏチップ１６０の様々な実施形態は、商業市場において広く入手可能である。一実施形態において、バス１２８は、ペリフェラルコンポーネントインターコネクト（ＰＣＩ）バスであってもよい。
【０１８３】
コンピュータ１１０はまた、他のリムーバブル／非リムーバブル揮発性／不揮発性コンピュータ記憶媒体を含んでもよい。単なる例として、図５８は、非リムーバブル不揮発性機器媒体からの読み出し、またはそれへの書き込みを行うハードディスクドライブ１４０を示す。ハードディスクドライブ１４０は、従来のハードディスクドライブであってもよい。
【０１８４】
リムーバブル媒体、例えばユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）メモリ１５３、ファイヤーワイヤー（ＩＥＥＥ１３９４）、またはＣＤ／ＤＶＤドライブ１５６は、直接、またはインターフェース１５０を通してＰＣＩバス１２８に接続されてもよい。例示的な動作環境において使用され得る他のリムーバブル／非リムーバブル揮発性／不揮発性コンピュータ記憶媒体は、磁気テープカセット、フラッシュメモリカード、デジタルバーサタイルディスク、デジタルビデオテープ、ソリッドステートＲＡＭ、ソリッドステートＲＯＭ等を含むが、これらに限定されない。
【０１８５】
上述の、および図５８に示されるドライブおよびその関連したコンピュータ記憶媒体は、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュールおよびコンピュータ１１０の他のデータの記憶を提供する。例えば、図５８において、ハードディスクドライブ１４０は、オペレーティングシステム１４４、アプリケーションプログラム１４５、他のプログラムモジュール１４６、およびプログラムデータ１４７を記憶するものとして示されている。これらのコンポーネントは、オペレーティングシステム１３４、アプリケーションプログラム１３５、他のプログラムモジュール１３６、およびプログラムデータ１３７と同じまたは異なってもよいことに留意されたい。ここで、最低でもそれらが異なるコピーであることを示すために、オペレーティングシステム１４４、アプリケーションプログラム１４５、他のプログラムモジュール１４６、およびプログラムデータ１４７には、異なる数字が付されている。ユーザは、マウス／キーボード１６２または他の入力デバイスの組み合わせ等の入力デバイスを通して、コンピュータ２０内にコマンドおよび情報を入力することができる。他の入力デバイス（図示せず）は、マイク、ジョイスティック、ゲームパッド、サテライトディッシュ、スキャナ等を含み得る。これらの、および他の入力デバイスは、多くの場合、Ｉ／Ｏインターフェースバスの１つ、例えばＳＰＩ  １２６、ＬＰＣ  １２７、またはＰＣＩ  １２８を通してプロセッサ１２０に接続されるが、他のバスが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、スーパーＩ／Ｏチップ１６０を介して、パラレルポート、赤外線インターフェース、ゲームポート等（図示せず）に他のデバイスが結合されてもよい。
【０１８６】
コンピュータ１１０は、１つ以上のリモートコンピュータ、例えばリモートコンピュータ１８０への論理通信ポートを使用して、ネットワーク環境においてネットワークインターフェースコントローラ（ＮＩＣ）１７０を介して動作し得る。リモートコンピュータ１８０は、パーソナルコンピュータ、サーバ、ルータ、ネットワークＰＣ、ピアデバイスまたは他の共通ネットワークノードであってもよく、典型的には、コンピュータ１１０に関連して上述した要素の多くまたは全てを含む。図５８に示されるＮＩＣ  １７０とリモートコンピュータ１８０との間の論理接続は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、またはその両方を含み得るが、他のネットワークを含んでもよい。そのようなネットワーク環境は、オフィス、企業規模のコンピュータネットワーク、イントラネット、およびインターネットにおいて一般的である。
【０１８７】
図５９は、ＴＦＰＩタンパク質を含む代表的アミノ酸２０２、２０４、２０６を示すＴＦＰＩタンパク質２００の３Ｄモデルを示す。対象となるＴＦＰＩタンパク質の特定領域はＫＤ１であり、具体的に示されていない。示される表面は、タンパク質を構成するアミノ酸の配置により形成される。ＫＤ１領域における特定のアミノ酸により形成される表面は、ＴＦＰＩ阻害剤を研究または形成する際に対象となる。本明細書においてより詳細に議論されるように、ＫＤ１の生物学的効果は、ＫＤ１領域内のある特定のアミノ酸に結合することにより阻害される。具体的には、これらの標的アミノ酸は、Ａｌａ２７、Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｌｙｓ３６、Ａｌａ３７、Ｉｌｅ３８、Ｐｈｅ４４、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、およびＩｌｅ５５を含む。
【０１８８】
図６０は、上に列挙した標的アミノ酸の少なくとも一部に結合するペプチド３００を示す。
【０１８９】
図６１は、ＫＤ１およびペプチドの相互作用のモデル化を実行する方法の図である。
【０１９０】
タンパク質の３Ｄモデルを得ることができ（ブロック３０２）、コンピュータ１１０のメモリ１４０に記憶することができる。モデルは、既知のツールを使用してローカルで生成することができるか、または、公共のソースから得ることができる。一実施形態において、タンパク質は、ＴＦＰＩ  ＫＤ１  ２００である。
【０１９１】
タンパク質構造内の選択されたサブセットのアミノ酸の間の３Ｄ関係が決定され得る（ブロック３０４）。一実施形態において、選択されたサブセットのアミノ酸は、Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ａｌａ３０、Ａｓｐ３２、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７およびＩｌｅ５５を含み、随意に、Ａｌａ２７、Ａｓｐ３１、Ｌｙｓ３６、およびＩｌｅ３８をさらに含み、随意に、Ａｌａ３７およびＰｈｅ４４をさらに含む。代替として、またはそれに加えて、選択されたサブセットのアミノ酸は、Ｒ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６を含む。阻害（例えば、治療）効果を有するために、ここで列挙した全てのアミノ酸が必要とされるわけではない。すなわち、この群のさらなるサブセットもまた対象となる特性を有し得る。
【０１９２】
対象となる特定のサブセットのアミノ酸において、選択されたサブセットのアミノ酸により境界される表面がモデル化され得る。各側に対象となるさらなるアミノ酸を有さないそれらのアミノ酸により、外周が画定され得る。サブセット内の各アミノ酸の３Ｄ位置により、表面のテクスチャが画定され得る（ブロック３０６）。
【０１９３】
対象となる候補ＴＦＰＩ結合性化合物（例えば、ペプチド）の３Ｄモデルが生成され、コンピュータ１１０のメモリ１４０に記憶され得る（ブロック３０８）。
【０１９４】
ペプチド３Ｄモデルは、選択されたサブセットのアミノ酸により境界される表面に照合またはフィッティングされ得る（ブロック３１０）。対象となるポイント、すなわちＫＤ１の選択されたアミノ酸上で２つの間の最善のフィッティングが生成され得る。そのような３Ｄモデリングおよびフィッティングのためにいくつかのコンピュータツールが利用可能であり、３Ｄモデルを形成し、互いに照合するために使用され得る。一例は、「ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ｓ．Ｊ．，ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ａ．Ｄ．Ｊ．，Ｋｒｚｅｍｉｎｓｋｉ，Ｍ．，ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｍ．，Ｔｈｕｒｅａｕ，Ａ．，Ｈｓｕ，Ｖ．，Ｗａｓｓｅｎａａｒ，Ｔ．ａｎｄ  Ｂｏｎｖｉｎ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．（２００７），ＨＡＤＤＯＣＫ  ｖｅｒｓｕｓ  ＨＡＤＤＯＣＫ：Ｎｅｗ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ＨＡＤＤＯＣＫ２．０  ｏｎ  ｔｈｅ  ＣＡＰＲＩ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，６９：７２６-７３３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏｔ．２１７２３」に記載のＨＡＤＤＯＣＫツールである。
【０１９５】
表面の選択されたサブセットのアミノ酸の表面のモデルと、試験化合物（例えば、ペプチド）３Ｄモデルとの間の接触ポイントが識別され、記憶され、随意にコンピュータ１１０のモニタ１９１上に表示され得る（ブロック３１２）。化合物（例えば、ペプチド）は、接触ポイントの数または接触ポイントでの結合の強度を増加させるように変更され得る。この効果のモデル化を容易化するために、以下でさらに説明されるメトリックを生成して、対象となるタンパク質、我々の例においてはＫＤ１に結合する化合物の親和性を測定することができる。
【０１９６】
さらに、表面と化合物３Ｄモデルとの間の接触ポイントが計数され得（ブロック３１４）、接触ポイントの数に対応して化合物３Ｄモデルの親和性評価が記録され得る（ブロック３１６）。例えば、上に列挙したアミノ酸の１４個全てが標的とされ、実際に１４個のうち１２個に化合物３Ｄモデルが接触または結合した場合、１２／１４または０．８６の親和性評価が計算および記録され得る。
【０１９７】
しかしながら、どれ程強固に候補化合物が結合しているか、ひいては、どれ程長くＫＤ１に対する結合を維持し得るかの目安としての親和性評価は、対象となる結合の数だけでなく、結合の種類の点でもより正確に説明され得る。各接触ポイントの結合の種類もまた決定され得る（ブロック３１８）。ＴＦＰＩ結合性ペプチドに関して、４オングストローム以下の分子間距離を有する疎水結合は、２．６〜３．２オングストロームの分子間距離を有する結合から区別され得る。一実施形態において、３．２オングストローム未満の結合には１．５の重みが割り当てられてもよく、３．２オングストロームを超える結合には１．２５の重みが割り当てられてもよい。これを使用して、または別の重み付けを使用して、結合の種類を考慮して親和性評価が更新または再計算され得る（ブロック３２０）。例えば、上記の例において、結合のうち５個が短い結合であり、結合のうちの７個が長い結合である場合、新たな親和性評価は、（５＊１．５＋７＊１．２５）／１４＝１．１６となり得る。
【０１９８】
ＫＤ１からの７個のアミノ酸のみが標的とされ、４個が短い結合で接続する場合、親和性評価は（４＊１．５）／７＝０．８６となり得る。しかしながら、この場合、他の親和性評価との比較がなされる際に、より少数の標的とされるアミノ酸が考慮される。例えば、全ての所望の標的部位に基づき、全ての評価が標準に対して正規化され得る。
【０１９９】
それ以上反復が行われない場合、ブロック３２２からの分岐はなくてもよく、その結果が今後の分析および決定のための記憶され得る（ブロック３２４）。追加のペプチドまたは以前に試験されたペプチドの変異体が分析される場合、ブロック３２２からの「はい」の分岐が採用され得、対象となるペプチドの新たな、もしくは更新されたモデルが生成され得るか、またはその他の様式で取得され、記憶され得る（ブロック３２６）。ブロック３１０から３２０までのステップが繰り返されてもよく、現在の実行結果が以前の実行結果と比較され、どのペプチド／変異体がより高い親和性評価を有するかを決定することができ、可能な物理的試験を含むさらなる実験の価値がある。
【０２００】
３Ｄモデル化により特定部位を標的とし、比較評価を生成することができる能力により、Ｘ線結晶解析の時間およびコストを回避しながら、数千とは言わないまでも数百の試料を処理し、比較的容易に比較することができる。この技術は、ＴＦＰＩ  ＫＤ１からのＦ２８、Ｋ２９、Ａ３０、Ｄ３２、Ｉ４６、Ｆ４７、Ｉ５５、Ａ２７、Ｄ３１、Ｋ３６、Ｉ３８、Ｆ２、Ａ３７、およびＦ４４アミノ酸、ならびに／またはＴＦＰＩ  ＫＤ１−ＫＤ２からのＲ４１、Ｙ５３、Ｃ５９、Ｅ６０、Ｑ６３、Ｒ６５、Ｅ６７、Ｅ７１、Ｋ７４、Ｍ７５、Ｎ８０、Ｎ８２、Ｒ８３、Ｉ８４、Ｉ８５、Ｔ８７、Ｆ９６、Ｃ１０６、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｎ１３３、Ｍ１３４、Ｎ１３６、Ｆ１３７、Ｅ１４２、Ｎ１４５、およびＩ１４６アミノ酸に関連したモデル化に、特に適用することができる。
【０２０１】
本明細書において引用される全ての出版物、特許および特許出願は、個々の出版物または特許出願がそれぞれ参照することにより組み込まれることが具体的および個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、文書全体は、統合された開示として関連することを意図し、特徴の組み合わせが本文書の同じ文章または段落または項において一緒に見出されないとしても、本明細書に記載の特徴の全ての組み合わせが企図されることが理解されるべきである。例えば、タンパク療法が記載されている場合、ポリヌクレオチド療法（タンパク質をコードするポリヌクレオチド／ベクターを使用する）を含む実施形態が具体的に企図され、またその反対も成り立つ。上記の発明は、明確な理解のために図および例を用いてある程度詳細に説明されているが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱せずに、ある特定の変更および修正が本発明になされてもよいことが容易に明らかとなる。本発明は、例えば、具体的に上述された変形例より多少なりとも範囲が狭い本発明の全ての実施形態を含む。属として記載された本発明の態様に関して、全ての個々の種は、個々に、本発明の別個の態様とみなされる。「１つ」（「ａ」または「ａｎ」）を用いて説明または請求される本発明の態様に関して、より限定された意味が文脈により明確に必要とされない限り、これらの用語は「１つ以上」を意味することを理解されたい。組の中の１つ以上として記載される要素に関して、その組の中の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。最後に、請求要素が、「手段」という語、および任意の構造の列挙のない機能を列挙することにより定義されない限り、任意の請求要素の範囲が、３５米国特許法第１１２条、第６項の適用に基づき解釈されることを意図しない。
実施例
【０２０２】
このように概略的に説明される本発明は、例示を目的として示され、本発明の限定を意図しない以下の実施例を参照することでより容易に理解される。
実施例１
【０２０３】
以下の実施例は、ＴＦＰＩに対する結合のためのペプチドの生成、同定、およびスクリーニングを説明する。
【０２０４】
ペプチド候補は、商業的供給業者（例えば、ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＳＡＳ（ストラスブール、フランス）およびＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ（ベルリン、ドイツ））から得た。候補ペプチドを合成するための方法は、上述されている。候補ペプチドは、＞９０％または＞６０％の純度のトリフルオロアセテート（ＴＦＡ）塩として合成された。全てのペプチドを、ＤＭＳＯ中に、１０ｍＭの保存濃度まで溶解した。ＴＦＰＩ結合性ペプチド配列を、ｍＲＮＡディスプレイライブラリを使用して同定した。ｍＲＮＡディスプレイ技術は、開始プール内の１０１４個の異なる配列の多様性を可能とし、例えば、ファージディスプレイに必要な生体内ステップを回避することから、他のライブラリスクリーニング技術よりも優れている。簡潔には、この技術は、ピューロマイシン分子を介してｍＲＮＡをそのコードされた候補ペプチドに直接結合させることを含む（図５）。ｍＲＮＡディスプレイ法は、国際特許公開第２００５／０５１９８５号およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３１８，２６８−２９３（２０００）においてさらに説明されている。ＴＦＰＩは、ビオチンを介して固体支持体に固定し、候補ペプチド−ＲＮＡ複合体に暴露した。ＴＦＰＩ結合候補ペプチド−ＲＮＡ複合体を単離し、ＲＮＡを逆転写してコーディングＤＮＡを得た。競合的排除法を使用して、６〜１０回の選択ラウンド後に高親和性結合剤が得られた。候補ペプチドの多くは、３１アミノ酸の長さ（２７個の無作為アミノ酸および両方の末端に位置する２個のアミノ酸）であった。
【０２０５】
選択されたペプチドを合成し、マイクロアレイベースの走査分析を使用したペプチド最適化に供して、ＴＦＰＩ結合親和性を保持するペプチド断片を同定した。例えば、その配列が１９アミノ酸分重複したペプチドの一連の２０アミノ酸断片を使用して、ＪＢＴ００４７のマイクロアレイベースの走査を行った。簡潔には、Ｎ末端アミノオキシ酢酸修飾ペプチドを、Ｃｏｒｎｉｎｇエポキシドスライドガラス上にプリントした。洗浄および乾燥後、スライドをＴＥＣＡＮ  ＨＳ４００（商標）インキュベーションステーション内で処理した。スライドを、０．１％ＴＷＥＥＮ２０（登録商標）を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中で２分間洗浄し、トリスベースのＴ−２０  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）緩衝液（５ｍＭ  ＣａＣｌ２）（Ｐｉｅｒｃｅ）中で３０分間ブロックした。ブロック後、スライドをＴＢＳＴ中で２．５分間洗浄した。続いて、スライドをＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６４９標識化ＴＦＰＩ（トリスベースＴ−２０  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）緩衝液（５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中１μｇ／ｍＬ）で４５分間インキュベートし、連続流ＴＢＳＴで１０分間、２回洗浄した。スライドを生理食塩水−クエン酸ナトリウム緩衝液で２分間の最終洗浄に供し、４分間空気乾燥した。Ａｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４０００Ｂスキャナでスライドを走査し、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェアで走査を分析した。ＮおよびＣ末端切断分析により、走査分析を補完した。マイクロアレイ走査結果は、ペプチドＪＢＴ０２９３がＴＦＰＩに最も高い親和性で結合したことを示した。ＪＢＴ０２９３のアミノ酸配列に基づく一連の置換突然変異を生成し、ＴＦＰＩ結合特性に関して試験した。
【０２０６】
ＴＦＰＩに対するペプチドのサブセットの親和性は、ビオチニル化ペプチドを用いて行った酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に類似した分析法（結合（ＥＣ５０）ＥＬＩＳＡ）により実証された。９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中の３μｇ／ｍＬのＴＦＰＩで一晩被覆した。プレートを３５０μｌの洗浄緩衝液（ＨＮａＴ：１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．３５）で３回洗浄し、続いて２００μｌのＨＮａＴ中の２％酵母抽出物で２時間ブロックした。次いで、プレートを３５０μｌのＨＮａＴで３回洗浄した。ビオチニル化された候補ペプチドを、ＤＭＳＯストックから、ＨＮａＴ中１／２００に希釈した。１０ｍＭペプチド原液の１／２００希釈中に沈殿物が出現しなかった場合、初期ペプチド濃度は５０μＭであった。沈殿物が形成された場合、ペプチド原液のＤＭＳＯ中での事前希釈を行った。希釈されたペプチドをＭａｘｉｓｏｒｐプレートに塗布し、連続希釈物（１／３）を生成し、希釈物を室温で１．５時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、３回の洗浄ステップを行った（３５０μｌ  ＨＮａＴ）。結合したペプチドは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジンでのインキュベーション（１時間）に続くＨＮａＴによる３回の洗浄ステップ、続いて添加したＴＭＢ（３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン）の発色変換により検出された。この分析を図６Ａに示す。
【０２０７】
一般に、固定ＴＦＰＩに対するペプチドの結合は、バックグラウンドを大幅に超えていた。ビオチニル化ペプチドのＥＣ５０値を、図３２〜３９に示す。１つのＴＦＰＩ結合性ペプチド、ＪＢＴ０１３２の結合曲線を、図７に示す。ＪＢＴ０１３２のＥＣ５０は、約２．２ｎＭと計算された。
【０２０８】
さらに、ビオチニル化ＴＦＰＩ結合性ペプチドを、ＴＦＰＩ結合に関して非ビオチニル化候補ペプチドと競合する「トレーサー」として使用して、競合（ＩＣ５０）ＥＬＩＳＡを行った。分析原理を図６Ｂに示す。９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中の３μｇ／ｍＬのＴＦＰＩで一晩被覆した。ＴＦＰＩの濃度は、分析の特定の条件に依存して変更することができ、本明細書において参照される他のＩＣ５０ＥＬＩＳＡ分析では、被覆緩衝液は、０．０５μｇ／ｍＬのＴＦＰＩを含有した。プレートを３５０μｌの洗浄緩衝液（ＨＮａＴ：１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．３５）で３回洗浄し、２００μｌのＨＮａＴ中の２％酵母抽出物で２時間ブロックした。次いで、プレートを３５０μｌのＨＮａＴで３回洗浄した。ビオチニル化されたトレーサーペプチドを、結合ＥＬＩＳＡにおいて決定されたそれぞれのＥＣ９０値（ｎ＞２の場合は中央値）に対応する濃度で塗布した。ペプチドの競合物原液（１０ｍＭ）を、ＨＳＡを含まないＨＮａＴ中で１／３３．３に希釈し、連続１／３希釈物を、３％ＤＭＳＯを含むＨＮａＴで調製した。特定の分析において使用される希釈法は、ペプチドの親和性に依存する。希釈物を、さらに、ビオチニル化トレーサーペプチドで１：６の比（２０μｌの競合物希釈液および１００μｌのトレーサーペプチド）で希釈した。競合物およびトレーサーペプチドの混合物を、ＴＦＰＩ被覆マイクロタイタープレートに塗布し、１．５時間インキュベートした。プレートを３５０μｌのＨＮａＴで３回洗浄した。ＨＲＰ共役ストレプトアビジンをマイクロタイタープレートに塗布し、混合物を１時間インキュベートし、プレートを３５０μｌのＨＮａＴで３回洗浄し、ＴＭＢ（３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン）を塗布し、その後のＨＲＰによるＴＭＢの発色変換を検出することにより、ペプチド−ＴＦＰＩ結合が検出された。代表的非ビオチニル化ペプチドのＩＣ５０グラフを、図８Ａ〜８Ｄに示す。ペプチドＪＢＴ０３０３、ＪＢＴ０１２０、およびＪＢＴ０２２４のＩＣ５０測定結果を表３に示す。
【表３】
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【０２０９】
競合ＥＬＩＳＡ（ＩＣ５０）分析に加えて、より多数のペプチドを並行して測定するためにスクリーニング分析を使用した。スクリーニングＥＬＩＳＡは、競合ＩＣ５０  ＥＬＩＳＡと同様であるが、ただし競合物の３つの異なる濃度のみが使用された（ＪＢＴ００４７クラスに対しては３００ｎＭ、１００ｎＭおよび３３．３ｎＭ、ならびにＪＢＴ０１２２クラスに対しては５００００ｎＭ、１６６６７ｎＭおよび５５５６ｎＭ）。いくつかの場合において、スクリーニング結果は、競合ペプチド（ＪＢＴ００４７ファミリーに対しては競合ペプチドＪＢＴ０４７７、およびＪＢＴ０１２２ファミリーに対しては競合ＪＢＴ１６９７）に対するトレーサーシグナルのパーセント阻害として表現された。本明細書に記載の方法に従い調製およびスクリーニングされたペプチドの競合ＩＣ５０分析結果およびスクリーニング分析結果を、図３２〜３９に示す。図３２〜３９に示される平均ＩＣ５０値は、表３に示される値よりも多数の分析に基づいており、したがって、値は若干異なり得る。スクリーニングＥＬＩＳＡの結果は、トレーサーペプチドＪＢＴ０１３１結合のパーセント阻害として示される。ＩＣ５０  ＥＬＩＳＡを使用して分析されたいくつかのペプチドは、図３２〜３９において、表４に記載のようなその結合親和性に従い分類される。
【表４】
2019108360.tif 000020
【０２１０】
本明細書に記載の方法を用いて同定された例示的ＴＦＰＩ結合性ペプチドを、表５に示す。いくつかのペプチドはビオチニル化されたが、多くは、溶解度を促進するＮおよびＣ末端リシンを有する。いくつかのペプチドは、以下に記載されるように、モデルおよび／または血漿分析系においてＴＦＰＩ阻害活性を示した。
【表５】
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2019108360.tif 000022
2019108360.tif 000023
【０２１１】
この実施例は、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（例えば、ＴＦＰＩ阻害ペプチド）を生成および特性決定する例示的方法を提供する。表５中の全てのペプチドが、ヒトＴＦＰＩ−１αに結合することが判明した。変異分析では、ＴＦＰＩ結合性ペプチド内の少なくとも１つのアミノ酸が、ＴＦＰＩに対する親和性を保持しながら置換され得ることが示された。ＥＬＩＳＡ分析において試験された表５のペプチドは、１０μＭ（１×１０−５Ｍ）未満のＥＣ５０および５０μＭ未満のＩＣ５０で、ＴＦＰＩ−１αと結合した。
実施例２
【０２１２】
選択されたＴＦＰＩ結合性ペプチドを、「抗標的」結合に関してさらに特性決定した。この実施例は、ＴＦＰＩ阻害ペプチドが非ＴＦＰＩ−１タンパク質に対してより低い親和性を示すことを実証する。
【０２１３】
ＴＦＰＩ−２が、ＴＦＰＩ−１との類似性のため抗標的として選択された。ヒトＴＦＰＩ−１（Ｃ末端で１０  Ｈｉｓ−タグに融合した残基２９〜２８２、分子量４１ｋＤａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州；カタログ番号２９７４−ＰＩ））マウスＴＦＰＩ−１（Ｃ末端で１０  Ｈｉｓ−タグに融合した残基２９〜２８９；分子量４１ｋＤａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２９７５−ＰＩ））、およびＴＦＰＩ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）に対するＴＦＰＩ結合ペプチドの結合反応速度を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（商標）表面プラズモン共鳴分析（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ、イギリス）を使用して試験した。５００ＲＵを目標とし、アミンカップリング化学により、ＴＦＰＩタンパク質をＣ１チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｏｒｄｅｒ  Ｃｏｄｅ：ＢＲ−１００５−４０）上に固定した。いくつかのＴＦＰＩ結合性ペプチドを、固定ＴＦＰＩタンパク質との相互作用の検体として使用した。３０μｌ／分の流量を利用した。１８０秒後、１８０μｌのペプチド溶液を、３．８４ｎＭから６５６．２５ｎＭの範囲の６つの異なる濃度で注入し、続いて４８０秒間の解離時間を設けた。チップを４５μｌの１０ｍＭ  ＮａＯＨで再生した。各結合実験を先に行い、続いてＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｐ２０）と１％ＤＭＳＯおよび０．８％Ｐ８０で、４回の測定を行った。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してデータを分析した。センサグラムを１：１ラングミュア結合曲線にフィッティングして、ｋｏｎおよびｋｏｆｆを決定し、ＫＤを計算した。
【０２１４】
ある特定の試験ペプチド、例えばＪＢＴ００５０、ＪＢＴ０１２１、ＪＢＴ０２０５およびＪＢＴ０２１１は、ブランク細胞に結合したが、それらのセンサグラムからの結合定数は決定することができなかった。ＪＢＴ０１３３は、ＴＦＰＩ−１に対する弱い結合を示した。他のペプチドからのセンサグラムは、信頼性のある結合定数を与えた。いくつかのＴＦＰＩ阻害ペプチドのＢＩＡｃｏｒｅ分析からの結果を、表６および図１９〜２１に示す。表６に列挙されたペプチドのそれぞれが、１０μＭ未満のＫＤを示した。以下に列挙されるペプチドに加えて、ＪＢＴ０３７５およびＪＢＴ０４７７、つまりアミノ酸位置５（ＪＢＴ０３７５）またはアミノ酸位置５および１０（ＪＢＴ０４７７）におけるＪＢＴ０２９３の置換突然変異もまた、１０μＭ未満のＫＤを示した。また、ＪＢＴ１８３７（配列番号１０４４）は１０μＭ未満のＫＤを示した（ＫＤ＝０．５ｎＭ；ｋｏｎ＝８ｘ１０３  １／Ｍｓ；ｋｏｆｆ＝１．３ｘ１０−６  １／ｓ）。ペプチドの２つのセンサグラムを、図９Ａおよび９Ｂに示す。
【表６】
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【０２１５】
ＴＦＰＩ−２抗標的との相互作用もまた検査した。候補ペプチドのヒトＴＦＰＩ−２との相互作用から生成された最大シグナルは、相互作用パートナーとしてのＴＦＰＩ−１で得られたシグナルよりもはるかに低かった。低ＴＦＰＩ−２結合シグナルの反応速度分析は、失敗する傾向にあり、したがって、センサグラムの視覚的な比較を用いて結合親和性を推定した。ＴＦＰＩ−１およびＴＦＰＩ−２に対するＪＢＴ０１２０の結合を示すセンサグラムを、図１０Ａおよび１０Ｂとして示す。ＪＢＴ０１２０は、ＴＦＰＩ−１に対する結合親和性と比較して１０倍低い親和性でＴＦＰＩ−２に結合する。ＪＢＴ０１３２もまた、ＴＦＰＩ−２よりもＴＦＰＩ−１に対して少なくとも１０倍大きい親和性を示すことが判明した。
【０２１６】
この実施例により示されたデータは、ＴＦＰＩ結合性ペプチドが、ＴＦＰＩ−１に特異的に結合することを裏付けている。
実施例３
【０２１７】
以下の実施例は、ＦＸａ阻害および外因性テナーゼ阻害分析を用いた、実施例１において同定された選択されたペプチドのＴＦＰＩ阻害活性の特性決定を説明する。両方の分析とも、血漿系における活性を予測するものである。外因性テナーゼ分析は、（ａ）ＦＸａおよびＴＦＰＩの相互作用、ならびに（ｂ）ＦＸａ−ＴＦＰＩ複合体のＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体との相互作用に対するペプチドの影響に対する洞察を提供する。ＦＸａ阻害分析は、ＦＸａおよびＴＦＰＩの相互作用のみに対するペプチドの影響を測定するものである。
【０２１８】
外因性テナーゼ複合体は、凝固プロセスの開始後のＦＸおよびＦＩＸ活性化に関与する。外因性複合体は、ＦＶＩＩａ、組織因子（ＴＦ）、およびＦＸ基質で構成される。外因性テナーゼ複合体のＴＦＰＩ媒介阻害に対するペプチドの影響を決定するために、結合酵素分析を確立した。ペプチドを１０ｍＭ原液から１／６．２５に希釈し（ＤＭＳＯ中）、緩衝液またはＤＭＳＯ中での連続１／４希釈によりさらに希釈して、望ましくない沈殿を防止した。ＴＦＰＩをＨＮａＣａ−ＨＳＡまたはＢＳＡ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＨＳＡまたはＢＳＡ、ｐＨ７．３５）中に希釈した。全てＨＮａＣａ−ＨＳＡ中に希釈されたＦＶＩＩａ、脂質化ＴＦ、リン脂質小胞（ＤＯＰＣ／ＰＯＰＳ８０／２０）、およびＦＸａに特異的な発色基質（Ｓ−２２２２（ＤｉａＰｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＯＨから入手可能））を、９６ウェルプレートに加えた。インキュベーション期間後、ＴＦＰＩおよびペプチド希釈物を添加し、２．５％ＤＭＳＯの最終濃度を得た（ペプチド原液中に存在する場合）。ＦＸをウェルに添加することにより、ＦＸ活性化を開始した。ＦＸａ媒介発色基質変換を、マイクロプレートリーダを使用して吸光度の増加を観察することにより決定した。ある特定の時点で生成されたＦＸａの量を、ＯＤ読取値から計算した。反応開始後２０分後に生成されたＦＸａを、ペプチド濃度対ＴＦＰＩ阻害（％）のプロットからのＥＣ５０の計算に考慮した。
【０２１９】
ＴＦＰＩの機能阻害もまた、ＦＸａ阻害分析を使用して検査した。共にＨＮａＣａ−ＨＳＡ中に希釈されたＦＸａ特異的発色基質（Ｓ−２２２２）およびＴＦＰＩを、９６ウェルプレートに加えた。ペプチドを１０ｍＭ原液から１／６．２５に希釈し（ＤＭＳＯまたはＡｑｕａ−Ｄｅｓｔ中）、緩衝液またはＤＭＳＯ中での連続１／４希釈によりさらに希釈して、望ましくない沈殿を防止した。ペプチド希釈物（２．５μｌ）を９６ウェルプレートに添加し、２．５％ＤＭＳＯの最終濃度を得た（ペプチド原液中に存在する場合）。発色基質の変換をＦＸａの添加により誘発し、変換の速度をマイクロプレートリーダで測定した。ＴＦＰＩはＦＸａを徐々に阻害するため、１１５分後のＯＤ読取値を、ペプチド濃度対ＴＦＰＩ阻害（％）のプロットからのＥＣ５０の計算に考慮した。
【０２２０】
外因性テナーゼ分析およびＦＸａ阻害分析の結果を、表７および図２２〜２７に示す。
【表７】
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【０２２１】
表７を参照すると、ＪＢＴ０１２０、ＪＢＴ０１３２、およびＪＢＴ０２２４は、＜２μＭのＥＣ５０で、ＴＦＰＩ−１の存在下で外因性複合体媒介ＦＸ活性化を修復し、約２０％から約６０％のＴＦＰＩ活性阻害をもたらした。ＪＢＴ００４７（ＥＣ５０＝１．４μＭ）、ＪＢＴ０１３１（ＥＣ５０＝２．２μＭ）、およびＪＢＴ０２９３（ＥＣ５０＝２．９μＭ）もまた、ＴＦＰＩ−１の存在下で外因性複合体活性を修復した。さらに、ＦＸａ阻害分析において、ＪＢＴ０１２０、ＪＢＴ０１３２、ＪＢＴ０２２４、およびＪＢＴ０３０３は、＜５μＭのＥＣ５０で、ＴＦＰＩ−１の存在下でＦＸａ活性を修復し、約５％から約５０％のＴＦＰＩ活性阻害をもたらした。ＪＢＴ００４７（ＥＣ５０＝０．７μＭ）、ＪＢＴ０１３１（ＥＣ５０＝８．２μＭ）、ＪＢＴ０２９３（ＥＣ５０＝１．３μＭ）、ＪＢＴ０２９７（ＥＣ５０＝０．６μＭ）、およびＪＢＴ０３０５（ＥＣ５０＝２．３μＭ）もまた、ＦＸａ阻害分析において、ＴＦＰＩ−１の存在下でＦＸａの活性を修復した。この実施例は、本発明のペプチドがＴＦＰＩ拮抗剤であることを裏付けている。
実施例４
【０２２２】
この実施例において、血漿ベース分析を使用してペプチドのＴＦＰＩ阻害活性が確立される。
【０２２３】
トロンビン生成に対するペプチドの影響を、トロンビン特異的蛍光性基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣの緩やかな開裂後、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）リーダ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ；３９０ｎｍ励起フィルタおよび４６０ｎｍ発光フィルタ）における較正された自動化トロンボグラフィーにより２回測定した（Ｈｅｍｋｅｒ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈａｅｍｏｓｔ．Ｔｈｒｏｍｂ．，３３，４−１５（２００３））。ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ欠乏に罹患した患者の血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、オーバーランドパーク、カンザス州）を、試験用に入手した。血漿それぞれの残留凝固因子活性は、１％未満であった。抗体媒介ＦＶＩＩＩ欠乏のモデルとして、凍結プール正常血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、オーバーランドパーク、カンザス州）を、ヤギにおいて惹起した高力価、加熱不活性化抗ヒトＦＶＩＩＩ血漿（４４９０  ＢＵ／ｍＬ；Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ウィーン、オーストリア）でインキュベートし、５０ＢＵ／ｍＬを得た。血漿をトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、エセックス・ジャンクション、バーモント州）と混合して第ＸＩＩａ因子汚染を阻害し、４０μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。
【０２２４】
事前に加温した（３７℃）血漿（８０μＬ）を、９６ウェルマイクロプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ、透明Ｕ字底；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、ウォーザン、マサチューセッツ州）の各ウェルに加えた。組織因子によりトロンビン生成を誘発するために、少量（１２ｐＭ）の組み換えヒト組織因子を含有する１０μＬのＰＰＰ低試薬、ならびにホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンで構成されるリン脂質小胞（４８μＭ）（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ、マーストリヒト、オランダ）を添加した。ペプチドをＤＭＳＯで１０ｍＭ原液から１／７．５に希釈し、Ａｑｕａ−Ｄｅｓｔでさらに１／８．３３に希釈して、１２％のＤＭＳＯ濃度を得、最終分析ミックス中０．５％のＤＭＳＯ濃度を得た。事前に加温（３７℃）したリーダ内にプレートを設置する直前に、５μＬの５ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水またはＡｑｕａ−Ｄｅｓｔ中１２％のＤＭＳＯを添加し、続いてペプチド希釈物または参照タンパク質（ＦＶＩＩＩ  Ｉｍｍｕｎａｔｅ参照標準（Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ウィーン、オーストリア）；Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｂｙ−Ｐａｓｓｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＦＥＩＢＡ）参照標準（Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ウィーン、オーストリア）；ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（ノボ・ノルディスク社、デンマーク）；および精製ヒト血漿ＦＩＸ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、サウスベンド、インディアナ州））を添加した。各ウェル内に、蛍光性基質を含有する２０μＬのＦｌｕＣａ試薬（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ、マーストリヒト、オランダ）およびＨＥＰＥＳ緩衝ＣａＣｌ２（１００ｍＭ）を分注することにより、トロンビン生成を開始した。蛍光強度を３７℃で記録した。
【０２２５】
得られたトロンビン生成曲線のパラメータを、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ（商標）ソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ、マーストリヒト、オランダ）およびトロンビン較正器を使用して計算し、内部フィルタおよび基質消費効果について較正した（Ｈｅｍｋｅｒ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈａｅｍｏｓｔ．Ｔｈｒｏｍｂ．，３３，４−１５（２００３））。参照タンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩ  Ｉｍｍｕｎａｔｅ（登録商標）参照標準、ＦＥＩＢＡ参照標準）に等しいある特定のペプチド濃度の活性を生成するトロンビンを計算するために、標準濃度に対して各トロンビン生成曲線のピークでのトロンビン量（ピークトロンビン、ｎＭ）をプロットし、非直線アルゴリズムによりフィッティングした。この較正に基づき、ＦＶＩＩＩ  Ｉｍｍｕｎａｔｅ、ＦＩＸ、ＦＥＩＢＡ、またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ等価活性を計算した。様々なペプチドに対する結果を、図１２〜１８および２８〜３０に示す。代表的な結果を、表８に示す。（＊は、異なるドナーからＦＶＩＩＩ欠乏血漿が得られたことを示す。）
【表８】
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【０２２６】
表８を参照すると、ＪＢＴ０１２０、ＪＢＴ０１３２、ＪＢＴ０２２４、およびＪＢＴ０３０３は、ＦＶＩＩＩ枯渇血漿におけるＴＦＰＩ依存性トロンビン生成を、ＦＶＩＩＩを含有する血漿におけるトロンビン生成のレベルの１％を超えるレベルまで改善した（％ＦＶＩＩＩ等価活性）。試験したペプチドは、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿において約５％〜４０％のＦＶＩＩＩ等価活性を示した。ＪＢＴ０１２０およびＪＢＴ０１３２は、図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、ピークトロンビンおよびピーク時間を用量依存的に改善した。
【０２２７】
ＪＢＴ０２９３のアミノ酸配列に基づく置換突然変異もまた、実施例３に記載されるＦＸａ阻害および外因性テナーゼ阻害分析とともに、血漿ベース分析において試験した。代表的な結果を、表９に示す。
【表９】
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【０２２８】
さらに、ＪＢＴ０２９３配列のアミノ酸位置５および１０における置換を除いてＪＢＴ０２９３のアミノ酸配列を含むＪＢＴ０４７７は、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿において、ＦＶＩＩＩの４１３ｍＵ／ｍＬと等価のトロンビン生成を改善する（１μＭペプチドで）。ＪＢＴ０２９３の置換突然変異は、ＴＦＰＩに対する親和性に関して極めて最適化されたペプチドをもたらし、ＦＸａ阻害、外因性テナーゼ阻害、および血漿ベース分析において活性を改善した。
実施例５
【０２２９】
以下の実施例は、本発明のペプチドが、ペプチドの物理化学的または薬物動態学的特性を向上させる部分の付加により修飾され得ることを示す。以下に示されるように、本明細書に記載のペプチドに対する４０ｋＤａのＰＥＧの付加は、ペプチドの薬物動態学的挙動を改善した。実施例はまた、タンパク質分解に対する感受性を低減するためのＴＦＰＩ結合性ペプチドＪＢＴ１８５７の最適化を説明している。
【０２３０】
化学的または生物学的部分をペプチドに結合させる方法は、当該技術分野において知られている。本明細書に記載のペプチドにＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を付加するために、ペプチドのＮ末端にアルデヒドおよびケトンへのカップリングのための官能基（ＡＯＡ＝アミノオキシアセテート）を付加した。代替として、ペプチドのＣ末端部分にマレイミドとのカップリングのためのシステインを付加した（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。ペプチド（ＪＢＴ１５８６）ＡＯＡ−ＦＱＳＫＧＮＶＦＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ−ＮＨ２（配列番号１６６）および（ＪＢＴ１５８７）Ａｃ−ＦＱＳＫＧＮＶＦＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬＣ−ＮＨ２（配列番号１６７）を、それぞれＰＥＧによるＮ末端およびＣ末端修飾に使用した。ＡＯＡ−ＦＱＳＫＧＮＶＦＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ−ＮＨ２（配列番号１６６）およびＡｃ−ＦＱＳＫＧＮＶＦＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬＣ−ＮＨ２（配列番号１６７）を、それぞれ過剰の４０ｋＤａのｍＰＥＧ−プロピオンアルデヒド（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−４００ＡＬ２、ＮＯＦ、日本）および４０ｋＤａのｍＰＥＧ−マレイミド（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−４００ＭＡ、ＮＯＦ、日本）でインキュベートした。得られたＰＥＧ化ペプチドＪＢＴ１８５２およびＪＢＴ１８５５は、出発構造Ａｃ−ＦＱＳＫＧＮＶＦＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ−ＮＨ２（ＪＢＴ０７４０）（配列番号６６）と比較して、同様の親和性を示す。
【０２３１】
得られたＰＥＧ化ペプチドは、マウスにおいて大幅に増加した血漿安定性および延長された血漿半減期を示した。図３１は、マウスへの静脈内投与後の、Ｃ末端ＰＥＧ化ペプチドＪＢＴ１８５５（Ａｃ−ＦＱＳＫＧＮＶＦＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬＣ（ＰＥＧ（４０ｋＤ））−ＮＨ２）（配列番号２５２）と比較した遊離ペプチドＪＢＴ０７４０（Ａｃ−ＦＱＳＫＧＮＶＦＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ−ＮＨ２）（配列番号６６）の薬物動態分析の結果を示す。未ＰＥＧ化ペプチドとは対照的に、ＰＥＧ化ペプチドは、投与後１００分で、マウス血漿中高濃度で存在する。未ＰＥＧ化ペプチドは、血漿から急速に排除される。図４０は、皮下注射後のＪＢＴ１８５５の薬物動態分析の結果を示す。ＪＢＴ１８５５はまた、実施例４に記載の分析において、トロンビン生成を大きく改善した（図４１）。
【０２３２】
また、ＪＢＴ１８５２およびＪＢＴ１８５５ペプチドを、実施例１〜４に記載の分析において特性決定し、ＪＢＴ０７４０およびＪＢＴ００４７ファミリー内の他のペプチドと比較した。代表的な結果を、以下に記載する表１０に示す。
【表１０】
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【０２３３】
また、表１０に列挙されるペプチドを、ＴＦＰＩ−２抗標的との相互作用に関して分析したが、生成されたシグナルは、信頼性のある親和性測定には低すぎた。データは、ＰＥＧ化が本発明のペプチドの阻害活性を除去しない、またはＴＦＰＩ−１の選択性に悪影響を及ぼさないことを示唆している。
細胞ベース外因性テナーゼ分析
【０２３４】
細胞ベース外因性テナーゼ分析を使用して、ＦＸからＦＸａへの外因性テナーゼ複合体媒介変換を修復する上述のＴＦＰＩ結合性ペプチドの能力を決定した。また、本発明の例示的ＴＦＰＩ結合性ペプチドであるＪＢＴ０７４０に対するＰＥＧ化の影響を探求するために、細胞ベース外因性テナーゼ分析を使用した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を計数し、９６ウェルプレート（黒色平坦、透明底部）内の完全成長培地内に、ウェル当たり１．５×１０４細胞の密度で播種した。細胞を一晩増殖させ（約１６時間から１８時間）、事前に加温した基礎培地で２回洗浄し、２００μｌの基礎培地中、３７℃で４時間１ｎｇ／ｍＬの組み換えＴＮＦα（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号Ｔ６６７４））で刺激し、２００μｌの事前に加温した細胞培養緩衝液で２回洗浄した。ＦＶＩＩａ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＴＦＰＩ結合性ペプチド（０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０を含む、もしくは含まないＤＭＳＯもしくはＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水中に溶解）、またはαＴＦＰＩ抗体を含有する緩衝液（５０μｌ）を、細胞に適用し、３７℃で２０分間インキュベートし、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体を形成させ、ＴＦＰＩ拮抗剤をＴＦＰＩに結合させた。インキュベーション期間後、ＦＸおよびＦＸａ特異的基質（Ｆｌｕｏｐｈｅｎ  ＦＸａ（ＨＹＰＨＥＮ  ＢｉｏＭｅｄ））を含有する５０μｌの細胞培養液を適用し、細胞に対し、１００μｌの細胞培養緩衝液ミックスの最終体積を得た。最終濃度は、  ３９ｐＭ  ＦＶＩＩａ、１７０ｎＭ  ＦＸ、２５０μＭ  Ｆｌｕｏｐｈｅｎ  ＦＸａ、および２．５％ＤＭＳＯ（ペプチドをＤＭＳＯ中に溶解した場合）であった。
【０２３５】
刺激されたＨＵＶＥの表面上のＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体により発生する、ＦＸａによるＦＸａ特異的蛍光性基質変換を検出するために、事前に加温した（３７℃）蛍光リーダに９６ウェルプレートを移した。９分間のインキュベーション後に計測した読取値を、ＴＦＰＩ結合性ペプチドまたは抗体のＴＦＰＩ阻害効果の計算に使用した。以下のペプチド（ＪＢＴ００４７ファミリーに属する）の様々な濃度において観察されたＴＦＰＩのパーセント阻害の概算値を、表１１に示す：ＪＢＴ０７１７（Ａｃ−ＦＱＳＫ−Ｎｍｇ−ＮＶＦＶＤＧＹＦＥＲＬＲＡＫＬ−ＮＨ２）（配列番号６１）、ＪＢＴ０７４０（Ａｃ−ＦＱＳＫＧＮＶＦＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ−ＮＨ２）（配列番号６６）、ＪＢＴ１５８４（Ａｃ−ＦＱＳＫ−Ｎｍｇ−ＮＶＦＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ−ＮＨ２）（配列番号１６４）、およびＪＢＴ１８５７（Ａｃ−ＦＱＳＫｐＮＶＨＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ−ＮＨ２）（配列番号１７８）。
【表１１】
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【０２３６】
また、ＰＥＧ化ペプチドを、細胞ベース外因性テナーゼ分析を使用して試験した。ＪＢＴ０７４０（配列番号６６）を、１ｋＤのＰＥＧ部分にＮ末端で共役させてＪＢＴ１８５３を、またはＣ末端で結合させてＪＢＴ１８５４を生成した。ＪＢＴ１８５３およびＪＢＴ１８５４は、分析に使用したペプチドの量に依存して、ＴＦＰＩを２０％以下阻害した。４０ｋＤのＰＥＧ部分をＣ末端に有するＪＢＴ１８５５（親ペプチド、ＪＢＴ０７４０）は、細胞ベース分析において、４０ｋＤのＰＥＧ部分をＮ末端に有するＪＢＴ１８５２よりも良好に作用した。ＪＢＴ１８５５は、２０〜３０％ＴＦＰＩ阻害を媒介し、一方ＪＢＴ１８５２は、ＴＦＰＩ活性を１０％以下阻害した。
【０２３７】
また、ＪＢＴ０１２０ファミリーのペプチド、ＪＢＴ０１２０、ＪＢＴ０４１５、ＪＢＴ０４４４、ＪＢＴ１４２６、およびＪＢＴ１８３７を、細胞ベース外因性テナーゼ分析において試験すると、ＪＢＴ００４７ファミリーのペプチドと比較してＴＦＰＩをより低い程度まで阻害することが判明した。低減された、または部分阻害活性が、本発明のいくつかの実施形態において所望され得る。ＪＢＴ００４７ファミリーのペプチドと同様に、ペプチド最適化により、ＪＢＴ０１２０ファミリーペプチドのＴＦＰＩ阻害活性が増加した。
【０２３８】
ＪＢＴ１８５７の安定性および阻害活性を検査する過程で、ペプチドのアミノ酸配列が、Ｖａｌ９とＡｓｐ１０との間にプロテアーゼ開裂部位を含有することが決定された。位置９におけるＴｌｅの置換（ＪＢＴ２４３１を生成する）および位置１０におけるＰｒｏの置換（ＪＢＴ２４３２を生成する）が、ペプチドの開裂をブロックし、ペプチドの血漿安定性を、２７％（ＪＢＴ１８５７）から８２％（ＪＢＴ２４３１）および７６％（ＪＢＴ２４３２）まで約３倍向上させた。追加的な推定開裂部位が、Ｇｌｙ１１とＴｙｒ１２との間に特定された。Ｇ１１ａ置換（ＪＢＴ２４１４を生成する）は、ペプチドの安定性をさらに１００％まで改善した。全ての安定性は、ヒト血漿中での２４時間のインキュベーション後の定量ＥＬＩＳＡにより決定した。
【０２３９】
上述の結果は、非従来的アミノ酸を利用した本明細書に記載のＴＦＰＩ結合性ペプチドの最適化が、ＴＦＰＩ阻害および血漿安定性を改善したことを実証している。さらに、本発明のＰＥＧ化ペプチドは、細胞ベース外因性テナーゼ分析においてＴＦＰＩ活性を阻害し、Ｃ末端ＰＥＧ化ペプチドがＮ末端ＰＥＧ化ペプチドよりも良好に作用する。本発明のＴＦＰＩ結合性ペプチドは、遊離ＴＦＰＩおよび細胞結合ＴＦＰＩの両方の活性を阻害する。
実施例６
【０２４０】
以下の実施例は、本明細書に記載のペプチドの、動物モデルにおける出血を低減する能力を示す。
【０２４１】
１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６ＮＣｒｌマウスを、試験前の２週間飼育した。爪切りの３０分前に、動物に、（ａ）ＪＢＴ１８５５（１０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈から静脈内（ｉ．ｖ．）投与もしくは頸部領域に皮下（ｓ．ｃ．）投与するか、（ｂ）抗ＴＦＰＩ抗体（１８ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を投与するか、または（ｃ）ビヒクル（１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３５；１０ｍＬ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）を投与した。爪切りの１０分前に、動物を８０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで麻酔した。出血をもたらすために、右後足の小指の爪を取り除いた。採血のために、足を０．９％ＮａＣｌ溶液に６０分間浸漬した。分光測光により、溶解後に失血を定量した。実験の間中、温度を３７℃で一定に維持した。試験の結果を図４２に示し、表１２に要約する。
【表１２】
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【０２４２】
本発明のＰＥＧ化ペプチドであるＪＢＴ１８５５の静脈内または皮下投与は、ビヒクル単独での処理と比較して、マウスにおける失血を低減した。
実施例７
【０２４３】
以下の実施例は、核磁気共鳴およびＸ線結晶学によるＴＦＰＩペプチド相互作用の特性決定を説明する。具体的には、拮抗ペプチドＪＢＴ０３０３、ＪＢＴ０１２２、およびＪＢＴ０４１５のＴＦＰＩ結合部位；ＴＦＰＩ１６０と相互作用するＪＢＴ０３０３、ＪＢＴ０１２２、およびＪＢＴ０４１５の残基；ならびに、複合化および遊離ＪＢＴ０３０３、ＪＢＴ０１２２、およびＪＢＴ０４１５の２次構造を、２Ｄ１５Ｎ異核単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）スペクトルを使用して、分子レベルで調査した。ＪＢＴ１８５７およびＴＦＰＩのＫＤ１の相互作用を、Ｘ線結晶学を使用して検査し、ＪＢＴ１８５７結合を媒介するＴＦＰＩ  ＫＤ１の残基をマッピングした。
ＴＦＰＩ１６０に対するＪＢＴ０３０３の結合部位の特定
【０２４４】
ＴＦＰＩ１６０の１５Ｎ標識化調製物を、ＪＢＴ０３０３によるＴＦＰＩ１６０の滴定実験に使用した。ペプチドの量を増加させない、または増加させた約５００μＭの１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０試料のＨＳＱＣスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ  ６００ＭＨｚ分光器で、３０℃で記録した。ペプチド−タンパク質相互作用は、緩やかな交換挙動（ｋｅｘ＜＜Δω）を示したが、これは、各ＴＦＰＩ残基が、遊離タンパク質およびタンパク質−ペプチド複合体に対し決められたシグナルをもたらすことを意味する。混合物が種の集団に従い平均化された位置で１つだけのピークをもたらす急速な交換挙動（ｋｅｘ＞＞Δω）とは異なり、緩やかな交換挙動は、ペプチド結合後のシグナルの追跡が不可能である。したがって、結合部位を特定するために、ＴＦＰＩ１６０−ＪＢＴ０３０３複合体のシフトしたピークを帰属する必要があった。これには、１３Ｃ／１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０およびＪＢＴ０３０３の試料の調製が必要であった。
【０２４５】
まず、９９２μＭの１３Ｃ／１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０および１１９０μＭのＪＢＴ０３０３で試料を調製した。しかしながら、ＮＭＲ試料は、複合体の帰属を不可能とする低品質のスペクトルをもたらした。試料は、恐らくは高分子量凝集体の形成に起因してゲル化した。そのため、得られたＮＭＲデータは、主に、同位体標識化ＴＦＰＩ１６０の最も柔軟な部位から生じるシグナルを示した。したがって、さらなる実験のために、試料条件を再調査した。ＴＦＰＩ１６０−ＪＢＴ０３０３複合体に対して行った一連の１５Ｎ−ＨＳＱＣ実験から、試料希釈および高温でのデータ取得によりゲル形成が回避され得ると結論付けた。１３Ｃ／１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０の最終濃度は３３１μＭであり、ＪＢＴ０３０３の最終濃度は３９７μＭであった。スペクトル品質は改善された。より低い濃度および低減された信号対雑音比に起因して、ＨＮＣＡ、ＨＮＣＯ、およびＨＮＣＯＣＡ実験に基づき帰属を行う必要があった。
【０２４６】
以前に帰属された４つの残基を除き、ａｐｏ−ＴＦＰＩ１６０において帰属され得る全ての残基を、ＴＦＰＩ１６０−ＪＢＴ０３０３複合体において帰属することができた。いくつかの残基の帰属は、３Ｄスペクトルにおけるピークの欠損に起因して不明瞭であった。さらに、３つの残基のピークは、元の滴定実験からのＨＳＱＣスペクトルにおいてのみ視認可能であった。しかしながら、近傍の全てのピークは明瞭に帰属され、したがって、これらの残基の帰属は正しいと考えられる。
【０２４７】
遊離ＴＦＰＩ１６０と比較した、ＪＢＴ０３０３に結合した１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０のＨＳＱＣシグナルの化学シフト変化を、図４３に示す。最も大きい化学シフトを生じる残基は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１にのみ存在した。残基Ｆ２５、Ｆ２８、Ｄ３２、Ａ３７、Ｔ４８、およびＹ５６の化学シフトが最もシフトした（＞２ｐｐｍ）。残基Ｉ３８、Ｉ４６、Ｆ４７、およびＦ５４もまた、１．５ｐｐｍ超シフトした。残基２０〜２４が帰属されていないため、Ｆ２５の残基Ｎ末端がＪＢＴ０３０３との相互作用に関与するかどうかは不明である。Ｌ１９は、約０．６ｐｐｍまでの化学シフトの変化を示す。したがって、ＴＦＰＩの残基１〜１８内のアミノ酸がペプチド結合に関与するという以前の考えとは対照的に、現在のデータは、存在するとしても、ＴＦＰＩのＮ末端尾部に対するペプチド結合は僅かであることを示唆している。遊離ＴＦＰＩ１６０と比較した、ＪＢＴ０３０３に結合したＴＦＰＩ１６０のＨＳＱＣシグナルの化学シフト変化の領域を示すＴＦＰＩタンパク質の２次構造のリボンモデルを、図４４に示す。
【０２４８】
ＴＦＰＩ１６０に対するＪＢＴ０３０３の結合部位をより具体的に特定するために、１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０および１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０＋ＪＢＴ０３０３のアミド交換率を決定した。アミド交換実験は、主に、アミド基のＨ交換を測定することにより、ペプチド骨格の環境内の変化を検出するものである。Ｈ２Ｏ周波数に、緩和により消散しない十分高いパワーが照射され、Ｈ２Ｏシグナルの完全な飽和および抑制が得られる。このＨ２Ｏシグナル抑制の方法の副次的作用は、溶媒と交換する交換可能アミドＮＨに抑制が移動することである（Ｈ／Ｈ交換）。飽和移動は、半定量的であるＨ／Ｈ交換率に依存する。効果は、より保護されたＮＨ基に対して低減される（すなわち、非保護ＮＨは、保護ＮＨよりも減衰される）。保護ＮＨがリガンドのＨ−アルファに近接して存在する場合、ａｐｏ型と比較してより高い交換率が観察される。同様に、Ｈ交換は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒのＯＨ基により媒介され得る。
【０２４９】
ａｐｏ  １５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０および１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０−ＪＢＴ０３０３複合体の水抑制なし、またはありでのＨＳＱＣスペクトルを記録した。ＴＦＰＩ１６０の各残基の相対的交換率を、水抑制あり、およびなしでのＨＳＱＣスペクトル中のピーク強度の比を計算することにより決定した。１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０および１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０＋ＪＢＴ０３０３のデータセットの比較は、ＴＦＰＩ残基２５、２６、３６、６２、６３、１２７、１３２、および１５２が複合体において１０％超減少したアミド交換率を示し、一方残基２９、３０、４２、４５、４９、５０、５６、６６、および９８が１０％超増加した交換率を示すことを明らかにした。
【０２５０】
アミド交換実験に起因する制約が、精密ＨＡＤＤＯＣＫモデルの計算に含められた：（ａ）ねじり角がＪＢＴ０３０３のＫ４、Ｋ５、Ｖ７、Ｆ８、Ｙ１２−Ａ１８に対するＴＡＬＯＳの計算から採用される（化学シフト実験）、（ｂ）１．５ｐｐｍを超える化学シフト変化を有するＫＤ１の残基：Ｆ２５、Ｆ２８、Ｄ３２、Ａ３７、Ｉ３８、Ｉ４６、Ｆ４７、Ｔ４８、Ｆ５４、およびＹ５６が、ＪＢＴ０３０３結合に関与する（化学シフト実験）、（ｃ）ＪＢＴ０３０３の両親媒性ヘリックスの疎水側がＫＤ１に結合する：ＪＢＴ０３０３のＹ１２またはＬ１６またはＬ２０が、ＫＤ１のＤ３２またはＡ３７またはＩ３８またはＦ５４またはＹ５６に結合する（化学シフト実験）、（ｄ）ＪＢＴ０３０３のＲ１５またはＫ１９が、ＫＤ１のＤ３１またはＤ３２またはＥ６０に結合する（化学シフト実験）、（ｅ）ＪＢＴ０３０３のＦ８またはＶ９が、ＫＤ１のＦ２５またはＦ２８に結合する（化学シフト実験）、（ｆ）ＪＢＴ０３０３のＹ１２またはＦ１３が、ＫＤ１のＩ４６またはＦ４７またはＴ４８に結合する（化学シフト実験）、（ｇ）ＪＢＴ０３０３のＱ２が、ＫＤ１のＹ５６に結合する（化学シフト実験）、（ｈ）ＪＢＴ０３０３のＦ１が、ＫＤ１のＭ３９またはＦ６６に結合する（アミド交換実験）、（ｉ）ＪＢＴ０３０３のＳ３またはＫ４またはＫ５が、Ｆ６６に結合する（アミド交換実験）、（ｊ）ＪＢＴ０３０３のＶ７またはＦ８またはＶ９が、ＫＤ１のＦ２５またはＣ２６またはＮ６２またはＱ６３に結合する（アミド交換実験）、（ｋ）ＪＢＴ０３０３のＶ９またはＤ１０またはＧ１１またはＲ１５が、ＫＤ１のＦ２８またはＫ２９またはＡ３０に結合する（アミド交換実験）、（ｌ）ＪＢＴ０３０３のＹ１２またはＦ１３が、ＫＤ１のＮ４５に結合する（アミド交換実験）、（ｍ）Ｙ１２またはＦ１３またはＥ１４またはＲ１５が、ＫＤ１のＲ４９またはＱ５０に結合する（アミド交換実験）、ならびに、（ｎ）ＪＢＴ０３０３のＬ２０が、ＫＤ１のＫ３６に結合する（アミド交換実験）。データは、ＫＤ１＋ＪＢＴ０３０３複合体の本質的に１つのモデルに収束した。
ＴＦＰＩ１６０に対するＪＢＴ０１２２の結合部位の特定
【０２５１】
１３Ｃ／１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０＋ＪＢＴ０３０３複合体と同様に、１３Ｃ／１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０＋ＪＢＴ０１２２のＮＭＲ試料は、ゲルの形成に起因して低い品質のスペクトルを生成した。７２３μＭの１３Ｃ／１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０＋ＪＢＴ０１２２の濃度は、より高次の凝集体の形成をもたらした。試料を３６１．５μＭに希釈し、スペクトルを３７℃で記録すると、改善されたスペクトル品質が得られた。ＨＮＣＯ、ＨＮＣＡ、およびＨＮＣＯＣＡスペクトルを得た。５つの残基を除いて、以前に帰属されたａｐｏ−ＴＦＰＩ１６０のピークの全てを、ＴＦＰＩ１６０−ＪＢＴ０１２２複合体において帰属することができた。最も大きい化学シフト変化を生じ、ペプチドと相互作用しやすい残基は、多くの場合、３Ｄスペクトルにおいてピークをもたらさなかった。しかしながら、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）とＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）との間の結合部領域におけるピークもまた、低い強度を示した。したがって、これらのピークの帰属は不明瞭である。いくつかのピークは、元の滴定実験のＨＳＱＣにおいてのみ視認可能であった。それらの帰属は、ＴＦＰＩ１６０およびＴＦＰＩ１６０＋ＪＢＴ０１２２のＨＳＣＱスペクトルにおいてピークが重なったため、ほとんどの場合において確かであった。
【０２５２】
遊離ＴＦＰＩ１６０と比較した、ＪＢＴ０１２２に結合した１５Ｎ−ＴＦＰＩ１６０のＨＳＱＣシグナルの化学シフト変化を、図４５に示す。ＫＤ２の残基に対してのみ、大幅な化学シフト変化が見られた。一般に、ＴＦＰＩ１６０に対するＪＢＴ０１２２の結合によりもたらされる化学シフト変化の程度は、ＪＢＴ０３０３の結合によりもたらされる化学シフト変化の程度よりも顕著ではなかった。化学シフトの最も強い摂動を有する残基は、Ｆ９６、Ｇ１２８、Ｇ１２９、Ｇ１３２、Ｎ１３３、およびＮ１３６であった。Ｃ９７、Ｅ１０１、Ｔ１１１、Ｆ１１４、Ｎ１３５、およびＦ１３７が摂動し、０．５ｐｐｍを超える化学シフト変化を示した。遊離ＴＦＰＩ１６０と比較した、ＪＢＴ０１２２に結合したＴＦＰＩ１６０のＨＳＱＣシグナルの化学シフト変化の領域を示すＴＦＰＩタンパク質の２次構造のリボンモデルを、図４６に示す。
ＴＦＰＩ１６０と相互作用したＪＢＴ０１２２の残基の同定
【０２５３】
ＪＢＴ０１２２の逐次的な骨格シグナル帰属のために、１３Ｃ／１５Ｎ標識化ペプチドを組み換えにより生成した。簡潔には、ペプチドを、大腸菌において、チオレドキシンとの融合タンパク質として発現させた。３．０ｇ／Ｌの１３Ｃグルコースおよび１．０ｇ／Ｌの１５ＮＨ４Ｃｌを含有するＭ９培地を使用して、１３Ｃ／１５Ｎ標識化ペプチドを調製した。Ｎｉキレートカラムおよびポリ−ヒスチジンタグを使用して、融合タンパク質を親和性精製した。ペプチドを、トロンビンにより開裂した。チオレドキシン／ｈｉｓ−タグおよびトロンビンを、それぞれＮｉキレートカラムおよびベンズアミジンカラムを使用して除去した。次いで、逆相クロマトグラフィーによりペプチドを精製した。純度、完全性、および同一性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、および質量分析により検証した。組み換えＪＢＴ０１２２はＪＢＴ０７８８と命名され、そのＮ末端に２つの追加的残基、すなわちグリシンおよびセリンを有したが、これは、トロンビン開裂部位の残りを表している。
【０２５４】
ＪＢＴ０７８８の帰属は、Ｖａｒｉａｎ  ６００ＭＨｚ分光計で、１０℃で記録されたＨＳＱＣ、ＨＮＣＡＣＢ、ＨＮＣＡ、ＨＮＣＯ、およびＨＮＮスペクトルに基づいて行い、ＳＰＡＲＫＹソフトウェアを使用して帰属された。スペクトル品質を改善するために、ＴＦＰＩ１６０を用いたＮＭＲ実験と比較して温度を下げた。記録されたスペクトルから、ほとんどの残基のカルボニル炭素（Ｃ）、アルファ炭素（ＣＡ）、ベータ炭素（ＣＢ）、アミドプロトン（Ｈ）、およびアミド窒素（Ｎ）を帰属した。残基Ｈ１３およびＲ１７に対する帰属は、不明瞭であった。ＨＮＣＯＣＡは、これらの残基に対する明瞭な帰属をもたらした。
【０２５５】
ＪＢＴ０７８８の帰属表を図４７に示す。残基４〜１２に対する２組のシグナルが、ＪＢＴ０７８８のスペクトルにおいて観察された。ＪＢＴ０７８８の１次構造が影響されていないことを考慮して、２組のシグナルは、Ｆ６とＰ７との間のペプチド結合のシス／トランス異性化から生じる可能性が高い。ＨＳＱＣスペクトルにおける対応するシグナルの強度に基づき、主要：非主要立体構造に対して７６：２４の比が決定された。プロリンのＣαシフトから判断されるように、主要立体構造は、その６３．１６ｐｐｍというＣα値が非主要立体構造のＣα値（６２．４９ｐｐｍ）より高いことから、トランスである可能性が高い。
【０２５６】
帰属の１つの目的は、Ｃα化学シフトからペプチドの２次構造を抽出することであった。Ｃα化学シフトは、角度φおよびΨにより、ひいてはペプチドの２次構造により影響される。β鎖において、Ｃαは、一般により低いｐｐｍにシフトするが、α螺旋においては、Ｃαは、一般により高いｐｐｍにシフトする。測定されたＣα値を、列挙されたランダムコイル値から差し引くことにより、β鎖における残基に対して負の値が計算され、α螺旋における残基に対して正の値が計算される。したがって、連続した負の値の集団は、β鎖を示し、一方連続した正の値の集団は、α螺旋を示す。
【０２５７】
ＪＢＴ０７８８は、増加したＣα値の広いパッチ（Δδ（Ｃα）＝Ｃα測定-Ｃαランダムコイル）を示し、これは、残基８から２６を含むα螺旋を示している。天然タンパク質の３次構造内の安定なα螺旋のΔδ（Ｃα）値は、典型的には３〜４ｐｐｍである。ＪＢＴ０７８８のα螺旋のΔδ（Ｃα）値は、約１．７ｐｐｍまで上昇するが、これは、タンパク質内の平均螺旋よりも高い柔軟性を示している。ＪＢＴ０７８８の別の特徴は、α螺旋に対し直接Ｎ末端である位置７におけるプロリンであり、これは、タンパク質中のα螺旋がしばしばＮ末端でプロリンにより終端されるため、良好に適合する。残基６は、大きな負の値を有するが、これは、そのＮ末端隣接物をβ鎖様立体構造に強制することが知られている隣接プロリンによりもたらされる。Ｃ末端残基３１の大きな正の値はまた、Ｃ末端隣接物を有さない残基に典型的である。ＪＢＴ０７８８におけるＦ６とＰ７との間のペプチド結合は、２つの立体構造、トランス（７６％）、およびシス立体構造（２４％）をとる。この位置における立体構造は、連続した残基の立体構造に影響する。トランス異性体において、α螺旋は、Ｐ７の直後に開始し、シス異性体のα螺旋は、Ｌ１２までは開始しない。遊離ＪＢＴ０７８８の２次構造を示すリボンモデルを、図４８に示す。
【０２５８】
ＪＢＴ０７８８内の化学シフトもまた、ＴＡＬＯＳソフトウェアを使用したねじれ角の計算に使用することができる。ＴＡＬＯＳは、所与のタンパク質またはペプチド配列の５種類（ＨＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＯ、Ｎ）の化学シフト帰属の組み合わせを使用した、φおよびΨ骨格ねじれ角度の実験的予測のためのデータベースシステムである。ＴＡＬＯＳ手法は、多くの種類の２次化学シフト（すなわち、化学シフトとその対応するランダムコイル値との間の差）がタンパク質二次構造と相関するという所見の拡張である。ＴＡＬＯＳの目標は、タンパク質骨格の角度φおよびΨに対する定量的予測を行うために、２次シフトおよび配列情報を使用すること、およびこれらの予測における不確かさの目安を提供することである。ＴＡＬＯＳは、所与の残基の２次シフトを使用して、その残基のφおよびΨ角度を予測する。ＴＡＬＯＳはまた、所与の残基の予測を行う際に、次の、および前の残基からの情報を含む。ＴＡＬＯＳの裏にある考えは、標的タンパク質中のトリプレットに類似した二次シフトおよび配列を有する既知の構造のタンパク質中の残基のトリプレットに対する配列を見出すことができる場合、既知の構造におけるφおよびΨ角度は、標的における角度の有用な予測因子となることである。実際には、ＴＡＬＯＳは、標的タンパク質中の所与のトリプレットに対し１０個のベストマッチをデータベースから検索する。
【０２５９】
ＴＦＰＩ１６０と複合化したＪＢＴ０７８８のＨＳＱＣスペクトルを帰属するために、４００μＭの１３Ｃ／１５Ｎ−ＪＢＴ０７８８および４００μＭのＴＦＰＩ１６０からなる試料を調製した。ペプチドおよびＴＦＰＩ１６０の以前のＮＭＲ試料と同様に、試料はゲル化した。試料を希釈し、ペレットを重水素化ＤＭＳＯに溶解し、約３００μＭの１３Ｃ／１５Ｎ−ＪＢＴ０７８８＋ＴＦＰＩ１６０および５％のＤＭＳＯの最終濃度を得た。４０℃で測定を行った。これは、得られるスペクトルの品質を改善した。部分的に凝集した試料の緩和特性を考慮して、実験はＴＲＯＳＹモードで行った。試料中の低濃度のタンパク質−ペプチド複合体のため、Ｖａｒｉａｎ  ６００ＭＨｚ分光器において凍結探針技術を使用した。凍結探針技術を利用して三重共鳴実験を２回行うと、得られたデータ品質は、ＪＢＴ０７８８の骨格シフトを得るのに十分であった。ＨＮＣＡ、ＨＮＣＯＣＡ、およびＨＮＣＯスペクトルに基づき、ＴＦＰＩ１６０と複合化したＪＢＴ０７８８の帰属を行った。記録されたスペクトルから、ほとんどの残基のカルボニル炭素（ＣＯ）、アルファ炭素（ＣＡ）、アミドプロトン（Ｈ）、およびアミド窒素（Ｎ）を帰属した。ＴＦＰＩ１６０に複合化したＪＢＴ０７８８の帰属表を図４９に示す。
【０２６０】
ａｐｏ−ＪＢＴ０７８８の特徴は、恐らくはＦ６とＰ７との間のペプチド結合のシス／トランス異性化から生じる、アミノ酸残基４〜１２に対する２組のシグナルの存在である。ＪＢＴ０７８８−ＴＦＰＩ１６０複合体においては、１組のピークのみが観察され、これは、立体構造の１つのみがＴＦＰＩ１６０に結合することを示唆している。ａｐｏ−ＪＢＴ０７８８はまた、増加したＣα値の広いパッチ（Δδ（Ｃα）＝Ｃα測定−Ｃαランダムコイル＝正）を示し、これは、残基８から残基２６に達するα螺旋を示している。上述のように、天然タンパク質の３次構造内の安定なα螺旋のΔδ（Ｃα）値は、典型的には３〜４ｐｐｍである。ａｐｏ−ＪＢＴ０７８８のα螺旋のΔδ（Ｃα）値は、約１．７ｐｐｍまで増加するが、これは、タンパク質内の平均螺旋よりも高い柔軟性を示している。ＴＦＰＩと複合化すると、残基８から２６は、３〜５ｐｐｍの値を示し、これは、安定なα螺旋（複数を含む）の形成を示している。ＴＦＰＩ１６０と複合化した際のＪＢＴ０７８８の２次構造を示すリボンモデルを、図５０に示す。ＴＦＰＩ１６０との結合によりもたらされたＪＢＴ０７８８内の大きな化学シフト変化は、ペプチドの長さにわたり均一に分布している。化学シフトの最も強い摂動を受ける残基は、４ｐｐｍを超える残基Ｓ５、Ａ９、Ｑ１１、Ｙ２８、およびＫ２９であった。残基Ｙ３、Ａ４、Ｖ１０、Ｌ１２、Ｓ１５、Ｍ２１、Ａ２２、Ｌ２３、およびＡ２４は、３ｐｐｍ超摂動した。
ＴＦＰＩ１６０と相互作用したＪＢＴ０３０３の残基の同定
【０２６１】
ＪＢＴ０１２２に関して上述したのと同じ手順を使用して、ＪＢＴ０３０３を組み換えにより生成し、１３Ｃおよび１５Ｎで同位体標識化した。組み換えＪＢＴ０３０３はＪＢＴ０６１６と命名され、そのＮ末端に追加的グリシンおよびセリンを有した。ＪＢＴ０６１６の帰属は、Ｖａｒｉａｎ  ５００ＭＨｚ分光計で、１０℃で記録され、ＳＰＡＲＫＹソフトウェアを使用して帰属されたＨＳＱＣ、ＨＮＣＡＣＢ、およびＨＮＮスペクトルに基づいて行った。ＪＢＴ０６１６のスペクトル品質はＪＢＴ０７８８のスペクトル品質より良好であったが、緩衝液、温度、ＮＭＲ管、およびＮＭＲパラメータに関する実験条件は同一であった。ほとんどの残基のアルファ炭素（ＣＡ）、ベータ炭素（ＣＢ）、アミドプロトン（Ｈ）、およびアミド窒素（Ｎ）を帰属した。帰属は、主に、ＨＮＣＡではなく、より感受性が低いがより情報量の多いＨＮＣＡＣＢに基づいた。ＨＮＮスペクトルと組み合わせると、これは、全てのＪＢＴ０３０３誘導残基の明瞭な帰属をもたらした。
【０２６２】
ＪＢＴ０６１６の帰属表を図５１に示す。２次構造は、Ｃα化学シフトから抽出し、Ｈ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＯ、およびＮの帰属を使用したＴＡＬＯＳにより決定した。ＪＢＴ０７８８と同様に、ＪＢＴ０６１６は、α螺旋立体構造を示す正のΔδ（Ｃα）値のパッチを示した。螺旋は、ペプチドのＣ末端部に位置し、残基１０〜１８を含んでいた。ＪＢＴ０７８８に関しては、約１．８ｐｐｍまでのΔδ（Ｃα）値が算出され、この螺旋は、そのような短いペプチドに対しては比較的安定であることが認められた。ＪＢＴ０６１６の２次構造を示すリボンモデルを、図５２に示す。Ｃ末端残基２０の大きな正の値は、ＪＢＴ０７８８中の残基３１と同様に、Ｃ末端隣接物を有さない残基に典型的である。ＪＢＴ０６１６のＮ末端残基１〜９は、僅かに正のΔγ（Ｃα）値を示したが、これはα螺旋構造の優先性を示唆している。
【０２６３】
過剰の非標識化ＴＦＰＩ１６０を含む１３Ｃ／１５Ｎ標識化ペプチド試料を使用して、ＴＦＰＩ１６０と複合化したＪＢＴ０６１６の帰属を行った。ＨＳＱＣ、ＨＮＣＡ、ＨＮＣＯＣＡ、およびＨＮＣＯスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ  ８００ＭＨｚ分光計で記録し、ＳＰＡＲＫＹソフトウェアを使用して帰属した。スペクトルを３０℃で記録した。これらのスペクトルを使用して、図５３中の表に示されるように、ほとんどの残基のアルファ炭素（ＣＡ）、ベータ炭素（ＣＯ）、アミドプロトン（Ｈ）、およびアミド窒素（Ｎ）を帰属した。ＴＦＰＩ１６０と複合化したＪＢＴ０６１６の２次構造を、Ｃα化学シフトから抽出し、ＴＡＬＯＳにより計算した。遊離ペプチドと同様に、ＴＦＰＩ１６０と複合化したＪＢＴ０６１６は、α螺旋立体構造を示す正のΔδ（Ｃα）値のＣ末端パッチを示した。α螺旋の安定性は、複合体形成後に増加する。この所見は、ＪＢＴ０６１６のＣ末端領域が、コア結合モチーフであることを示唆している。Ｎ末端のΔδ（Ｃα）値もまた変化するが、より低い程度である。ＴＦＰＩと複合化した場合のＪＢＴ０６１６の２次構造を、図５４中のリボンモデルに示す。
【０２６４】
複合体形成後の化学シフトの最も大幅な変化は、ＪＢＴ０６１６の残基Ｑ２、Ｋ５、Ｆ８、Ｖ９、およびＡ１８に対して観察され、７ｐｐｍを超えるものであった。残基Ｆ１３、Ｒ１７、Ｋ１９、およびＬ２０もまた摂動し、４ｐｐｍを超える化学シフト変化を示した。Ｎ末端における残基の大きな化学シフト変化は、それがＴＦＰＩ１６０に対するペプチドの結合を推進する両親媒性Ｃ末端α螺旋だけではないことを示した。
【０２６５】
ＪＢＴ０４７７置換の分析と組み合わせたＮＭＲ実験の結果を使用して、ＨＡＤＤＯＣＫ（高不明確性推進タンパク質−タンパク質ドッキング（Ｈｉｇｈ  Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  Ｄｒｉｖｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＤＯＣＫｉｎｇ））ソフトウェアを使用した、ＪＢＴ０３０３と複合化したＫＤ１のモデルを形成した。ＨＡＤＤＯＣＫは、生体分子複合体のモデル化のための情報化柔軟性ドッキング手法である。ＨＡＤＤＯＣＫは、ドッキングプロセスを推進するために、不明確相互作用制約（ＡＩＲ）における特定または予測されたタンパク質インターフェースからの情報をコードする点で、ａｂ−ｉｎｉｔｉｏドッキング法とは区別される。化学シフトデータにより明らかとされるようなＴＦＰＩ１６０およびペプチド上の結合部位の特定、ソフトウェアＴＡＬＯＳにより決定されるようなペプチドのねじれ角、ならびにＪＢＴ０４７７の置換分析は、モデル計算の制約を提供する。
【０２６６】
ＫＤ１−ＪＢＴ０３０３  ＨＡＤＤＯＣＫモデルの計算には、以下の制約が使用された：（ａ）ねじれ角は、ＪＢＴ０３０３のＫ４、Ｋ５、Ｖ７、Ｆ８、Ｙ１２−Ａ１８に対するＴＡＬＯＳの計算から得られた、（ｂ）１．５ｐｐｍを超える化学シフト変化を有するＫＤ１の残基は、ＪＢＴ０３０３：Ｆ２５、Ｆ２８、Ｄ３２、Ａ３７、Ｉ３８、Ｉ４６、Ｆ４７、Ｔ４８、Ｆ５４、およびＹ５６への結合に関与する、（ｃ）ＪＢＴ０３０３の両親媒性螺旋の疎水側がＫＤ１に結合する：ＪＢＴ０３０３のＹ１２またはＬ１６またはＬ２０は、ＫＤ１のＤ３２またはＡ３７またはＩ３８またはＦ５４またはＹ５６に結合する、（ｄ）ＪＢＴ０３０３のＲ１５またはＫ１９が、ＫＤ１のＤ３１またはＤ３２またはＥ６０に結合する、（ｅ）ＪＢＴ０３０３のＦ８またはＶ９が、ＫＤ１のＦ２５またはＦ２８に結合する、（ｆ）ＪＢＴ０３０３のＹ１２またはＦ１３が、ＫＤ１のＩ４６またはＦ４７またはＴ４８に結合する、ならびに、（ｇ）ＪＢＴ０３０３のＱ２が、ＫＤ１のＹ５６に結合する。Ｑ２  ＪＢＴ０３０３-Ｙ５６  ＫＤ１相互作用もまた、モデル計算の制約として考慮された。
【０２６７】
複合体形成時、ＪＢＴ０３０３のＫ５に対し、大きな化学シフト変化が観察された。ペプチド−タンパク質相互作用を推進すると考えられるＪＢＴ０３０３の残りの残基に対しては、モデルはデータと良好に一致している。最も低いエネルギーを有するＫＤ１−ＪＢＴ０３０３のモデルは、ＪＢＴ０３０３のＦ８をＴＦＰＩのＦ２５およびＦ２８に近接して配置し、これは、観察される化学シフト変化および置換分析からのデータを説明している。ＪＢＴ０３０３のＶ９は、Ｆ５４を含むＫＤ１の疎水性パッチと相互作用する。ＪＢＴ０３０３のＹ１２、Ｆ１３、Ｌ１６、およびＬ２０もまた、ＫＤ１の疎水性パッチに面する。Ｆ２８、Ｉ４６、Ｔ４８に対するＹ１２の近接性、Ｆ４７、Ｔ４８に対するＦ１３の近接性、Ｆ５４に対するＬ１６の近接性およびＡ３７、Ｉ３８に対するＬ２０の近接性は、複合体中のそれらの残基のＮＭＲ化学シフトの観察される摂動をもたらし、Ｙ１２およびＬ１６の保存は、これらの残基とタンパク質との広範囲の相互作用に起因し得る。ＪＢＴ０３０３のＫ１９は、ＫＤ１のＤ３２との相互作用を可能にする位置にある。ＪＢＴ０３０３のＲ１５の役割は、ＫＤ１の疎水性パッチおよびＤ３２との相互作用であると思われる。さらに、モデルは、負に帯電したアスパラギン酸塩がＪＢＴ０３０３の位置１０において好ましい理由を説明し、負に帯電したアスパラギン酸塩はＫＤ１の正に帯電したＫ２９と相互作用し得る。ＪＢＴ０３０３の位置１１におけるグリシンは、この位置での立体的および構造的制約に起因して存在する。ＪＢＴ０３０３と複合化したＫＤ１のＨＡＤＤＯＣＫモデル（ＫＤ１を含むＴＦＰＩ残基２２〜７９）を、図５５に示す。
ＫＤ１に結合したＪＢＴ０７４０およびＪＢＴ１８５７のモデル
【０２６８】
共にＪＢＴ０３０３の誘導体である、ペプチドＪＢＴ０７４０およびＪＢＴ１８５７（ＦＱＳＫ−ｄＰ−ＮＢＨＢＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ（配列番号１７８））は、ＦＸａ−ＴＦＰＩ阻害分析において大幅に向上したＥＣ５０値（それぞれ０．１１μＭおよび０．００２３μＭ）、ならびにＢｉａｃｏｒｅにより決定されるより低いＫｄを示す。ＴＦＰＩ  ＫＤ１（ＴＦＰＩ１６０の残基２２〜７９）と複合化したＪＢＴ０７４０およびＪＢＴ１８５７のモデルは、ＪＢＴ０３０３の場合と同様の制約を使用して、ＨＡＤＤＯＣＫにより計算した：（ａ）ＪＢＴ０３０３誘導体の位置５における置換を考慮するために、ＪＢＴ０７４０およびＪＢＴ１８５７の残基４および５のねじれ角に対する制約が修正された、（ｂ）ねじれ角は、ＪＢＴ０３０３のＶ７、Ｆ８、Ｙ１２−Ａ１８に対するＴＡＬＯＳの計算から得られ、ＪＢＴ０３０３とは対照的に、Ｋ４およびＮｍｅｔＧ５／ｄＰ５において、ＰｈｉおよびＰｓｉに対し固定値は与えられなかった、（ｃ）ＮｍｅｔＧ５およびｄＰ５は、シス立体構造にある、（ｄ）１．５ｐｐｍを超える化学シフト変化を有するＫＤ１の残基は、ＪＢＴ０３０３：Ｆ２５、Ｆ２８、Ｄ３２、Ａ３７、Ｉ３８、Ｉ４６、Ｆ４７、Ｔ４８、Ｆ５４、およびＹ５６への結合に関与する、（ｅ）ＪＢＴ０３０３の両親媒性螺旋の疎水側がＫＤ１に結合する、（ｆ）ＪＢＴ０３０３のＹ１２またはＬ１６またはＬ２０が、ＫＤ１のＤ３２またはＡ３７またはＩ３８またはＦ５４またはＹ５６に結合する、（ｇ）ＪＢＴ０３０３の残基Ｒ１５またはＫ１９が、ＫＤ１のＤ３１またはＤ３２またはＥ６０に結合する、（ｈ）ＪＢＴ０３０３の残基Ｆ８またはＶ９が、ＫＤ１のＦ２５またはＦ２８に結合する、（ｉ）ＪＢＴ０３０３のＹ１２またはＦ１３が、ＫＤ１のＩ４６またはＦ４７またはＴ４８に結合する、ならびに（ｊ）ＪＢＴ０３０３の残基Ｑ２は、ＫＤ１のＹ５６に結合する。
【０２６９】
ＪＢＴ０７４０およびＪＢＴ１８５７のエネルギー的に最も有利なＨＡＤＤＯＣＫモデルは、ＪＢＴ０３０３と比較して異なる結合様式を示した。最も明らかな差は、残基５から１１の領域に見られた。ペプチドのＮ末端およびＣ末端においては、それほど大きくはない偏差が観察された。しかしながら、末端の異なる結合もまた、ＴＦＰＩに対するＪＢＴ０３０３誘導体の最適化された結合に寄与する可能性がある。
ＫＤ１に結合したＪＢＴ１８５７のＸ線結晶構造
【０２７０】
ＫＤ１結合性ペプチドＪＢＴ１８５７と複合化したＫＤ１の結晶構造を決定した。ＴＦＰＩを大腸菌において組み換えにより発現させ、封入体から酸化的に巻き戻した。ＫＤ１およびＫＤ２を連結するＴＦＰＩ結合部配列内にトロンビン開裂部位を含むＴＦＰＩアミノ酸１〜１５０（ＴＦＰＩ１−１５０−Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＭＡＤＳＥＥＤＥＥＨＴＩＩＴＤＴＥＬＰＰＬＫＬＭＨＳＦＣＡＦＫＡＤＤＧＰＣＫＡＩＭＫＲＦＦＦＮＩＦＴＲＱＣＥＥＦＩＹＧＧＣＥＧＮＱＮＲＦＥＳＬＥＥＣＫＫＭＣＴＲＤＮＡＮＲＬＶＰＲＧＳＱＱＥＫＰＤＦＣＦＬＥＥＤＰＧＩＣＲＧＹＩＴＲＹＦＹＮＮＱＴＫＱＣＥＲＦＫＹＧＧＣＬＧＮＭＮＮＦＥＴＬＥＥＣＫＮＩＣＥＤＧ（配列番号４２３５））を、大腸菌発現ベクター（ｐＥＴ１９ｂ）内にクローン化した。ＴＦＰＩ  １−１５０−トロンビン配列は、組み換え発現のアーチファクトであって、野生型ＴＦＰＩアミノ酸配列の一部ではない２つのアミノ酸をＮ末端に有する。Ｋｕｎｉｔｚドメイン１および２をコードする配列は太字で示されている。大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）をＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）内で培養し、ＴＦＰＩ  １−１５０−トロンビンを、不溶性封入体として発現させた。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘによるインキュベーションでの大腸菌の溶解により封入体を採取し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０による洗浄後に精製した。封入体を８Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０に溶解し、ＴＦＰＩ  １−１５０−トロンビンを２０ｍＭ  ＤＴＴの添加後に還元した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ１０および１．１ｍＭ酸化グルタチオンを含有する緩衝液中に急速に１／１０希釈し、続いて２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７に対する過度の透析を行うことにより、酸化的巻き戻しを行った。巻き戻したＴＦＰＩ１−１５０−トロンビンを、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ陰イオン交換およびペプチド親和性（ＪＢＴ１３１）培地を使用した連続精製プロトコルにより精製した。精製されたＴＦＰＩ１−１５０−ＴＦＰＩを、トロンビン（１Ｕトロンビン／ｍｇ  ＴＦＰＩ１−１５０−トロンビン、開裂部位、ＬＶＰＲ／ＧＳ）によるインキュベーションでタンパク質分解的に消化させると、Ｎｔｅｒｍ  ＫＤ１−トロンビン（ＭＡＤＳＥＥＤＥＥＨＴＩＩＴＤＴＥＬＰＰＬＫＬＭＨＳＦＣＡＦＫＡＤＤＧＰＣＫＡＩＭＫＲＦＦＦＮＩＦＴＲＱＣＥＥＦＩＧＧＣＥＧＮＱＮＲＦＥＳＬＥＥＣＫＫＭＣＴＲＤＮＡＮＲＬＶＰＲ（配列番号４２３６））およびＫＤ２−トロンビン（ＧＳＱＱＥＫＰＤＦＣＦＬＥＥＤＰＧＩＣＲＧＹＩＴＲＹＦＹＮＮＱＴＫＱＣＥＲＦＫＹＧＧＣＬＧＮＭＮＮＦＥＴＬＥＥＣＫＮＩＣＥＤＧ（配列番号４２３７））が生成された。トロンビン除去用のベンズアミジンセファロースを使用し、続いてＪＢＴ１３１ペプチド親和性カラムを使用して、Ｎｔｅｒｍ  ＫＤ１−トロンビンを消化混合物から精製した。精製されたＮｔｅｒｍ  ＫＤ１−トロンビンを、ＪＢＴ１８５７との複合体形成およびさらなる結晶化に使用した。
【０２７１】
固相合成により拮抗ペプチドＪＢＴ１８５７を調製した。１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５、２０％ＰＥＧ４０００、６００ｍＭ  ＮａＣｌで、等モル複合体の共結晶化に成功した。結晶は２．５Åより良好な分解能で回折したが、いくつかの非欠面双晶が見られた。回折データを、ＣＣＰ４プログラムパッケージからのｉＭｏｓｆｌｍおよびＳＣＡＬＡで処理すると、単位格子寸法ａ＝１１３．６７Å、ｂ＝６９．３２Å、ｃ＝４２．３７Å、α＝９０．０°、β＝９２．９７°、γ＝９０．０°、空間群Ｃ２の単斜晶型であることが判明した（Ｌｅｓｌｉｅ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，６２（Ｐｔ  １），４８−５７（２００６）、Ｅｖａｎｓ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，６２（Ｐｔ  １），７２−８２（２００６））。自己回転計算では、約２倍の非結晶学的対称性が示された。これと一致して、１７０°回転に関連した非対称単位において２つの分子が位置特定された。プログラムＰＨＡＳＥＲを使用し、また、利用可能なＫｕｎｉｔｚドメイン２結晶構造の構造集合体を検索モデルとして使用して、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ検索を行った（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，４０（Ｐｔ  ４），６５８−６７４（２００７））。単位格子は、約６４％の溶媒を含有した。非結晶学的電子密度平均化、ならびにモデル構築およびモデル精密化を、Ｃｏｏｔ、Ｒｅｆｍａｃ、ＭＡＩＮ、およびＣＮＳプログラムで行った。現在のモデルは、ＪＢＴ１８５７ペプチドの両方のコピーおよびタンパク質との相互作用に対して完全に定義され、現在のＲ＝０．２５７、Ｒｆｒｅｅ＝０．２９８、理想的配置からの偏差ｒｍｓ（結合）＝０．００８Å、ｒｍｓ（角度）＝１．８°であった。
【０２７２】
ＪＢＴ１８５７構造：ＪＢＴ１８５７の構造は、（ｉ）アセチル化Ｐｈｅ１ＡＰ−Ｇｌｎ２ＡＰからなるＮ末端アンカー、（ｉｉ）Ｓｅｒ３ＡＰ−Ａｓｎ６ＡＰを含むΩ状ループ、（ｉｉｉ）Ｖａｌ７ＡＰおよびＨｉｓ８ＡＰから構築される中間セグメント、（ｉｖ）Ｖａｌ９ＡＰ−Ｇｌｙ１１ＡＰを含有するきついグリシンループ、ならびに（ｖ）Ｔｙｒ１２ＡＰ−Ｌｅｕ２０ＡＰを含むＣ末端α螺旋にセグメント化され得る。本明細書において使用される場合、下付文字ＡＰは、「拮抗ペプチド」ＪＢＴ１８５７における配列番号を示す。α螺旋の立体構造は、螺旋の中央（位置１７ＡＰ）に位置する非天然αメチルアラニン、α螺旋の１〜４水素結合パターンを完結するＣ末端アミド、ならびにＨｉｓ８ＡＰ、Ｔｙｒ１２ＡＰ、およびＰｈｅ１３ＡＰの芳香族側鎖による積層クラスタにより安定化される。これらの効果が協同して、溶液中でＣ末端α螺旋を自然発生的に安定化し、これは、ペプチドに対する円偏光二色性データと一致する。観察される芳香族側鎖積層（Ｈｉｓ８ＡＰ、Ｔｙｒ１２ＡＰ、Ｐｈｅ１３ＡＰ）は、位置１１ＡＰにおけるグリシンによってのみ達成され得るきつい湾曲を強制する。この構造的制約は、任意の他のアミノ酸によるＧｌｙ１１ＡＰの置き換え後の結合親和性の劇的な損失により反映される。Ｎ末端ループセグメントの立体構造は、きつい湾曲の立体構造を誘導することが知られているＤプロリン、およびＳｅｒ３ＡＰのカルボニル酸素のＡｓｎ６ＡＰのアミド窒素との１〜４水素結合によりある程度安定化される。全ての環側鎖（Ｔｙｒ１ＡＰ、Ｐｒｏ５ＡＰ、Ｈｉｓ８ＡＰ、Ｔｙｒ１２ＡＰ、Ｐｈｅ１３ＡＰ）は同じ方向を向き、これによってそれらはＴＦＰＩのＫＤ１ドメインと相互作用し得る。
【０２７３】
ＪＢＴ１８５７およびＫＤ１の相互作用：ＪＢＴ１８５７とＫＤ１との間の相互作用を決定した。疎水性接触は、≦４Åの分子間距離を有する相互作用であり、一方水素結合は、２．６〜３．２Åの距離を有する。Ｐｈｅ１ＡＰは、非特異的にＴＦＰＩと相互作用し、Ｐｈｅ２およびＡｌａ２７と接触する。対照的に、Ｇｌｎ２ＡＰは、ＴＦＰＩの深く埋没したポケットに接触し、Ｐｈｅ２８、Ｌｙｓ２９、Ｉｌｅ４６、およびＰｈｅ４７との疎水性相互作用を成す。さらに、Ｇｌｎ２ＡＰのアミド基は、Ｐｈｅ２８−ＣＯ、Ｐｈｅ４４−ＣＯ、およびＩｌｅ４６−ＮＨとの３つのＨ結合を形成する。Ｓｅｒ３ＡＰ−Ａｓｎ６ＡＰを含むＪＢＴ１８５７のΩループは、タンパク質との比較的制限された疎水性相互作用を媒介し、Ｓｅｒ３ＡＰ、Ｐｒｏ５ＡＰ、およびＡｓｎ６ＡＰは、Ｌｙｓ２９およびＰｈｅ４７と相互作用する。ＪＢＴ１８５７の中間セグメントのＶａｌ７ＡＰもまた、Ｌｙｓ２９およびＰｈｅ４７に結合する。Ｈｉｓ８ＡＰは、主に、Ｔｙｒ１２ＡＰおよび部分的にＰｈｅ１３ＡＰとの分子内芳香族積層相互作用に寄与し、ＴＦＰＩのＡｌａ３０との疎水性相互作用を示す。同様に、グリシン−ループＶａｌ９ＡＰ−Ｇｌｙ１１ＡＰは、Ｋｕｎｉｔｚドメインとのいくつかの接触に寄与する。Ｖａｌ９ＡＰは、Ａｌａ３０のカルボニル基との水素結合およびＡｓｐ３２との疎水性相互作用を形成することにより、ＫＤ１と直接相互作用する。Ｔｙｒ１２ＡＰは、そのヒドロキシル基を介したＩｌｅ５５のアミド窒素との水素結合、およびＡｓｐ３０との疎水性相互作用を媒介する。Ｌｅｕ１６ＡＰは、Ｉｌｅ５５との疎水性接触の一部である。ペプチドのＣ末端螺旋のタンパク質との概して疎水性の相互作用の他に、Ａｒｇ１５ＡＰとＡｓｐ３２との間に静電相互作用がある。さらに、Ｌｙｓ１９ＡＰは、Ａｌａ３７のカルボニル基に対する水素結合、ならびにＬｙｓ３６およびＩｌｅ３８との接触を形成することにより、ＴＦＰＩとの結合に寄与する。ＴＦＰＩ接触表面は、いくつかの図示される突然変異多発領域を有する全体的に疎水性の特徴を有し、ＪＢＴ１８５７との複合体形成の原動力は、立体的表面相補性である。
【０２７４】
この実施例は、本発明の例示的ペプチドの２次構造の特性決定を説明し、構造をペプチドの阻害機能に関連付けるものである。実施例はまた、ＴＦＰＩ活性を阻害するＴＦＰＩ結合性ペプチドであるＪＢＴ１８５７と相互作用するＴＦＰＩアミノ酸残基を特定する。
実施例８
【０２７５】
以下の実施例は、ペプチドの物理化学的または薬物動態学的特性を向上させる部分の付加により修飾される追加的ＴＦＰＩ結合性ペプチドを説明する。実施例は、さらに、回転トロンボエラストグラフィーを使用して全血中の血餅形成を評価するための方法を説明する。
【０２７６】
ＪＢＴ１８５７（ＪＢＴ００４７ペプチドファミリー）を、異なるＰＥＧ部分に結合させ、ＰＥＧ化ペプチドの結合親和性およびＴＦＰＩ阻害活性を検査した。Ｃ末端システインの付加によりＪＢＴ１８５７を修飾してＪＢＴ２３１５（Ａｃ−ＦＱＳＫｐＮＶＨＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬＣ−ＮＨ２（配列番号４０７７））を生成し、これを、実施例５に記載の方法を使用して、５ｋＤ、１２ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、および４０ｋＤとサイズを増加させた直線マレイミドＰＥＧ部分とＣ末端で共役させた。得られたＰＥＧ化ペプチドは、以下のように指定された。
【表１３】
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ＰＥＧ化ペプチドの安定性、結合親和性、およびＴＦＰＩ阻害活性
【０２７７】
ＰＥＧ化ペプチドは、マウスおよびヒト血漿中で大幅に増加した血漿安定性を示した。ペプチドを、マウスまたはヒト血漿の試料に添加し、添加から２４時間後に血漿中に残留するペプチドの初期量のパーセンテージを、０．０５ｍｇ／ｍＬのＴＦＰＩ（２．２６ｎＭのトレーサーペプチドＪＢＴ２２７１）で被覆したＭａｘｉｓｏｒｐプレート上で、ＩＣ５０  ＥＬＩＳＡにより測定した。２４時間後、ＪＢＴ１８５７およびＪＢＴ２３１７の初期量の約１０％未満が血漿中に残留し、一方ＰＥＧ化ＴＦＰＩ結合性ペプチドの初期量の４０％以上が残留した。ＪＢＴ２３２７およびＪＢＴ２３２９の約６０％以上が検出された。ＰＥＧ化ペプチドはまた、未修飾ペプチドと比較して、ヒト血漿中ではるかにより安定である。ＰＥＧ化ペプチドの約６０％以上が、２４時間後に残留した。未修飾ペプチドは、マウス血漿中よりもヒト血漿中でより安定であり、初期量の約２０％以上が２４時間のインキュベーション後に残留した。
【０２７８】
また、ＰＥＧ化ペプチドを、実施例１〜４に記載の分析において特性決定し、ＪＢＴ１８５７と比較した。代表的な結果を、以下に記載する表１４に示す。実施例４に記載されるようにトロンビン生成分析を行ったが、結果は、ピークトロンビン（ｎＭ）最大半量を改善したペプチドの濃度に対応するＥＣ５０として示される。
【表１４】
2019108360.tif 000032
【０２７９】
ＮＥＭでブロックしたＣ末端システインの付加は、ＪＢＴ１８５７と比較して、ＪＢＴ２３１７の結合親和性またはＦＸａ阻害、外因性テナーゼ分析、もしくはトロンビン生成分析におけるペプチドの活性に大きく影響しなかった。ＰＥＧサイズは、ＴＦＰＩ−１の存在下でのＦＸａの活性を修復するＴＦＰＩ結合性ペプチドの能力に大きく影響しなかった。実施例３の外因性テナーゼ分析において、阻害活性は、２０ｋＤのＰＥＧまでの、より高い分子量のＰＥＧ部分に従い増加した。３０ｋＤまたは４０ｋＤのＰＥＧ部分では、活性はさらなる改善を示さなかった。ヒト血漿を使用した実施例４のトロンビン生成分析において、ＥＣ５０は、ＰＥＧサイズとともに減少し、ＴＦＰＩの最大阻害（ピークＦＩＩａ（ｎＭ）により測定される）は、ＰＥＧサイズとともに増加した。マウス血漿中では、ＴＦＰＩ結合性ペプチドに対する４０ｋＤのＰＥＧの結合は、ＴＦＰＩの最大阻害を増加させた。
【０２８０】
また、ＦＸをＦＸａに変換するために外因性テナーゼ複合体活性を修復するＰＥＧ化ＴＦＰＩ結合性ペプチドの能力を、実施例５の方法を用いた細胞ベース外因性テナーゼ分析を使用して決定した。ＮＥＭでブロックされたＣ末端システインの付加は、ＪＢＴ１８５７と比較して、細胞ベース外因性テナーゼ分析におけるＪＢＴ２３１７の活性に大きく影響しなかった。ＪＢＴ２３１７へのＰＥＧ部分（５ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、または４０ｋＤ）の結合は、ＴＦＰＩ阻害活性を５〜２０％増加させた。
回転トロンボエラストグラフィー
【０２８１】
本ペプチドの存在下または非存在下での全血調製物を用いて、ヒト全血血餅形成および硬度の連続的粘弾性評価を、回転トロンボエラストグラフィーにより行った。健常個体からの血液試料を、２１ゲージ翼状針を使用して、クエン酸Ｓａｒｓｔｅｄｔ  Ｍｏｎｏ  Ｓ（０．１０６Ｍまたは３．２％（ｗ／ｖ）クエン酸Ｎａ）（５ｍＬ）中に導入し、クエン酸塩１部を血液９部と混合した。血液試料の一部を、ヤギにおいて惹起したより高い力価の加熱不活性化抗ヒトＦＶＩＩＩ抗血清（３８７６ＢＵ／ｍＬ；Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ウィーン、オーストリア）でインキュベートし、５１ＢＵ／ｍＬを得た。多量のペプチドをＤＭＳＯまたはＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（０．１％Ｔｗｅｅｎ８０あり、またはなし）に溶解することにより、試験試料を調製した。
【０２８２】
ＲＯＴＥＭトロンボエラストグラフィー凝固分析計（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ、ミュンヘン、ドイツ）を３７℃で使用して、記録を行った。簡潔には、加熱キュベットホルダ内の使い捨てキュベット内に血液を入れる。使い捨てピン（センサ）を、回転軸の先端に固定する。軸は、高精度ボールベアリングシステムによりガイドされ、逆方向および順方向に回転する。軸は、弾性測定用のバネに接続される。軸上の小型ミラーに対する光の反射により、軸の正確な位置が検出される。試料が凝固する際の弾性の損失が、軸の回転の変化をもたらす。得られたデータは、コンピュータ分析され、トロンボエラストグラムとして可視化される。トロンボエラストグラムは、弾性（ｍｍ）対時間（秒）を示す。血餅形成が開始するまでは約ゼロの弾性が観察される。ゼロ線の上または下の鏡像トレースは、軸の回転に対する血餅形成の効果を示す。
【０２８３】
各実験の開始前に、ＦＸＩＩａ媒介接触活性化を阻害するために、クエン酸全血をトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｓｓｅｘ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＶＴ、ＵＳＡ）と混合し、ＦＸＩＩａの特異的阻害のための最終濃度６２μｇ／ｍＬを得た。分析手順は以下の通りであった：２０μＬの試験試料または対照に、３００μＬの事前に加温（３７℃）したＣＴＩ処理クエン酸全血を添加し、続いて組み換えヒト組織因子（ｒＴＦ、３ｐＭ）（ＴＳ４０、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含有する２０μＬのＴＦ  ＰＲＰ試薬の１：１５希釈液を添加した。２０μＬの２００ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｓｔａｒ−ＴＥＭ（登録商標）、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ、ミュンヘン、ドイツ）の添加により凝固を開始し、少なくとも１２０分間、記録を進行させた。分析物中ｎｒＴＦの最終濃度は、１１または４４ｆＭであった。
【０２８４】
凝固時間（ＣＴ）、血餅形成時間（ＣＦＴ）、および最大血餅硬度（ＭＣＦ）のトロンボエラストグラフィーパラメータを、製造者の説明に従い記録した。ＣＴは、測定開始から血餅形成開始までの時間として定義される。ＣＦＴは、血餅形成開始から２０ｍｍの振幅に達するまでの時間として定義される。ＭＣＦは、分析中の２つのトレースの間の振幅の最大差である。速度（ｍｍ／秒）対時間（秒）のグラフを得るために、トロンボエラストグラムのデータの１次導関数をプロットする。このグラフから、最高速度（ｍａｘＶ）が決定される。最高速度が得られる時間（ｍａｘＶ−ｔ）もまた決定される。
【０２８５】
例示的結果を、図５６および５７に示す。ＪＢＴ１８５７およびＪＢＴ２３１７は、Ｈｅｍ  Ａ血液における凝固パラメータを修復した。ＰＥＧ化（４０ｋＤ）ＴＦＰＩ結合性ペプチドＪＢＴ２３２９もまた、図５７に示されるように、Ｈｅｍ  Ａ血液における長期凝固パラメータを修復した。ＪＢＴ２３１７のＰＥＧ化は、凝固時間および血餅形成時間を短縮する。
爪切り試験
【０２８６】
ナイーブマウスにおける失血に対するＪＢＴ２３２９の効果もまた試験した。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、ビヒクル、１ｍｇ／ｋｇのＪＢＴ２３２９、または０．１ｍｇ／ｋｇのＪＢＴ２３２９（各群に対してＮ＝１９または２０）を、爪切りの３０分前に１０ｍＬ／ｋｇで静脈内投与した。爪切りの１０分前に、動物を８０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタール（ｉ．ｐ．）で麻酔した。時間＝０分に、右後足の小指の爪を、爪床の直前で切断した。事前に０．９％ＮａＣｌ溶液を充填したバイアルに、足を移動した。爪切り後最初の３０分間、およびその後次の３０分間の血液試料を分析用に採取し、群に対する平均採取体積を計算および比較した。ビヒクル処理マウスにおける平均失血量は、最初の３０分間で約３０．５μＬ、次の３０分間で５２．１μＬであり、結果として６０分間で約８２．６μＬの失血量であった。一方、０．１ｍｇ／ｋｇのＪＢＴ２３２９の投与により、最初の３０分間で失血量は約５０％低減（１６．０μＬ）、次の３０分間で約６４％低減され（１８．７μＬ）、結果として、ビヒクル処理マウスと比較して、６０分間で約６０％全失血量が低減された（３４．７μＬ）。ＪＢＴ２３２９の用量を１．０ｍｇ／ｋｇに増加させると、さらに少なくとも約１０％失血量が低減され；最初の３０分間で１２．２μＬが採取され、次の３０分間で１０．６μＬが採取され、結果として全体で６０分間の採取期間で２２．８μＬが採取された。また、ＪＢＴ２３２９は、皮下投与された場合、ビヒクル処理ナイーブマウスと比較して出血を効率的に低減し、１０ｍｇ／ｋｇのＪＢＴ２３２９の皮下注射は、ビヒクル処理対象と比較して、爪切り後の６０分間で失血量を約５８％低減した。
【０２８７】
上述の結果は、ペプチドのＣ末端に結合した直線ＰＥＧ部分を含むＪＢＴ１８５７誘導体、およびＮ末端にＰＥＧ部分を含むＪＢＴ１５８６誘導体を使用して得られた。代替の結合部位または代替の化学部分を含むペプチドもまた生成した。４０ｋＤの直線ＰＥＧ部分を、ＪＢＴ１８５７の残基１４に結合させ、ＪＢＴ２４０４を生成した。ＪＢＴ２３２９の直線４０ｋＤ  ＰＥＧ部分を、４０ｋＤの分岐ＰＥＧ部分で置き換え、ＪＢＴ２４０１を生成した。また、ＪＢＴ１８５７を、Ｃ末端にＫ（Ｔｔｄｓ−マレイミドプロピオニル）（ＪＢＴ２３７４）を含むように修飾した。ＪＢＴ２３７４を使用して、ＪＢＴ２３７４のＨＳＡ結合体であるＪＢＴ２４１０を生成した。ＪＢＴ１８５７のＫ（ＡＯＡ）を含む誘導体であるＪＢＴ２３７５を使用して、ＰＳＡアルデヒドをペプチドＪＢＴ１８５７に結合させ、ＪＢＴ２４３０を得た。上述の分析法を使用して、ＪＢＴ２４０１、ＪＢＴ２４０４、ＪＢＴ２４１０、およびＪＢＴ２４３０を特性決定した。代表的な結果を、表１５に要約する。
【表１５】
2019108360.tif 000033
【０２８８】
この実施例は、本発明の例示的ＴＦＰＩ結合性ペプチドであるＪＢＴ１８５７が、ＴＦＰＩの有効な阻害剤であり、活性の損失なしに機能化およびＰＥＧと共役し得ることを実証している。いくつかの機能分析において、ＰＥＧ化はＴＦＰＩ阻害活性を増加させた。驚くべきことに、より高重量のＰＥＧ部分に共役したペプチドは、向上したＴＦＰＩ阻害活性を示した。４０ｋＤの直線ＰＥＧ部分を含むＪＢＴ２３２９は、臨床的に関連した動物モデルにおいて、失血量を大幅に低減した。ＪＢＴ１８５７のアミノ酸配列内のＰＥＧ結合、分岐ＰＥＧ部分の使用、ならびにＨＳＡおよびＰＳＡの結合は、ペプチドの活性を無効化しなかった。
実施例９
【０２８９】
以下の実施例は、本発明の２つのＴＦＰＩ結合性ペプチド、ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７の特性決定を説明する。ＪＢＴ１８３７（Ａｃ−ＳＹＹＫＷＨ［ＣＡＭＲＤＭＫＧＴＭＴＣ］ＶＷＶＫＦ−ＮＨ）（配列番号１０４４）は、ＴＦＰＩのＫＤ１およびＫＤ２に結合するＪＢＴ０１２０ファミリーの環状ペプチドである。ＪＢＴ１８５７（Ａｃ−ＦＱＳＫｐＮＶＨＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ−ＮＨ２）（配列番号１７８）は、ＴＦＰＩのＫＤ１に結合するＪＢＴ００４７ファミリーの直線ペプチドである。実施例１〜４に記載の分析を使用して、ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７の親和性およびＴＦＰＩ阻害活性を検査したが、その結果を表１６に要約する。
【表１６】
2019108360.tif 000034
【０２９０】
ＢｉａＣｏｒｅで測定されたヒトＴＦＰＩに対するペプチドの親和性は、１ｎＭ未満であった。ＥＬＩＳＡ（ＩＣ５０）により測定された親和性は、ＪＢＴ１８３７では４．８ｎＭであり、ＪＢＴ１８５７では２．５ｎＭであった。ＪＢＴ１８３７は、ＪＢＴ１８５７よりも緩やかにヒトＴＦＰＩから解離した（すなわち、ＪＢＴ１８３７は、ＪＢＴ１８５７と比較して、より長期間ヒトＴＦＰＩに対する結合を維持した）。ＦＸａ阻害分析は、全長ヒトＴＦＰＩ（「ｆｌＴＦＰＩ」）および切断ヒトＴＦＰＩ（２５４アミノ酸「Ｒ＆Ｄ  ＴＦＰＩ」）（０．１ｎＭ  ＦＸａ、０．５ｎＭ  ＴＦＰＩ、０．２５％ＤＭＳＯ）の両方を使用して行った。切断ＴＦＰＩの活性は、０．５ｎＭ  ＴＦＰＩにおいて、ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７の両方により完全に阻害され、一方全長ＴＦＰＩは、ＪＢＴ１８５７およびＪＢＴ１８３７により、それぞれ８５％および９５％阻害された。より高いｆｌＴＦＰＩ濃度（例えば、１０ｎＭ  ｆｌＴＦＰＩ）では、ＪＢＴ１８３７は、ＴＦＰＩ活性を完全に阻害し、一方ＪＢＴ１８５７は、ＴＦＰＩ活性を部分的に阻害した。ＦＸａ阻害試験においてｆｌＴＦＰＩを使用した場合、ＥＣ５０もまたより高かった。
【０２９１】
外因性テナーゼ分析において、切断ＴＦＰＩの約８５％が両方のペプチドにより阻害された。全長ＴＦＰＩ活性は、ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７により、それぞれ約５６％および４８％阻害された。驚くべきことに、細胞ベース外因性テナーゼ分析において、ＪＢＴ１８３７は、細胞関連ＴＦＰＩの活性を約５０％阻害し、ＪＢＴ１８５７は、細胞結合ＴＦＰＩ活性をほぼ完全に阻害した。血漿ベース機能分析において、ＪＢＴ１８３７は、ヒトＦＶＩＩＩ阻害血漿およびＦＩＸ欠乏血漿においてＪＢＴ１８５７よりも効率的にＴＦＰＩを阻害した。実施例８に記載のＲＯＴＥＭ分析において、ＪＢＴ１８３７は、ＦＶＩＩＩ阻害血液における血液凝固パラメータを補正した。ＪＢＴ１８５７もまた、血液凝固パラメータにプラスの影響を与えたが、分析においてその作用はＪＢＴ１８３７よりも非効率的であった。
【０２９２】
この実施例は、ＴＦＰＩタンパク質の異なる領域を標的とする環状および直線ＴＦＰＩ結合性ペプチドの親和性およびＴＦＰＩ阻害活性を比較した。ＪＢＴ１８３７（ＪＢＴ０１２０ファミリーに属する環状ペプチド）およびＪＢＴ１８５７（ＪＢＴ００４７ファミリーに属する直線ペプチド）は、１ｎＭ未満の親和性でヒトＴＦＰＩに効率的に結合し、有効な阻害剤である。ＦＸａ−ＴＦＰＩ相互作用は、低いＴＦＰＩ濃度で両方のペプチドにより完全にブロックされ、一方ＪＢＴ１８５７によるＴＦＰＩ阻害は、より高い濃度のＴＦＰＩの存在下で低減する。ペプチドは両方とも、外因性テナーゼ分析において全長ＴＦＰＩの活性を部分的に阻害し、ＪＢＴ１８５７は、ＪＢＴ１８３７と比較して、細胞ベース外因性テナーゼ分析においてＴＦＰＩ活性をより大きな程度まで阻害する。ＪＢＴ１８５７と比較して、ＪＢＴ１８３７は、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿においてより効率的にＴＦＰＩを阻害する。ペプチドは両方とも、凝固時間を短縮することによりＦＶＩＩＩ阻害ヒト全血の凝固パラメータを改善し、一方ＪＢＴ１８５７は、ＪＢＴ１８３７と比較して、より低い程度まで血餅形成速度を改善する。
実施例１０
【０２９３】
この実施例は、臨床的に関連した動物モデルにおける本発明のＴＦＰＩ結合性ペプチドの生体内活性を示す。以下に説明されるように、例示的ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、最適以下の用量のＦＶＩＩＩおよびＦＩＸとともに投与された場合、動物における失血を大幅に低減した。
【０２９４】
ヒトおよびマウスＴＦＰＩと交差反応するＰＥＧ化（４０ｋＤ）ＴＦＰＩ結合性ペプチド（ＪＢＴ００４７ファミリー）であるＪＢＴ２３２９を、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスおよびＦＩＸノックアウトマウスの尾端出血モデルにおいて試験した。ＦＶＩＩＩノックアウトマウスは、血友病Ａ患者の状態を厳密に反映しており、尾端出血モデルは、例えば、出血時間、失血量、または生存率を測定することにより薬物の有効性を評価するための研究において広く使用されている。市販のｒＦＶＩＩＩであるＡＤＶＡＴＥは参照として機能し、ＡＤＶＡＴＥ緩衝液処理動物は、陰性対照として機能した。各群は、１６匹のＦＶＩＩＩノックアウトマウス（雌８匹＋雄８匹）を含んでいた。尾端を切断する３０分前に、ＪＢＴ２３２９（１ｍｇ／ｋｇもしくは０．１ｍｇ／ｋｇ）または抗ＴＦＰＩ抗体（ｍａＴＦＰＩ；１８ｍｇ／ｋｇ）を投与した。尾を切断する５分前に、ＡＤＶＡＴＥ（１０ＩＵ／ｋｇもしくは５０ＩＵｍｇ／ｋｇ）またはＡＤＶＡＴＥ緩衝液を投与した。試験物質および対照物質は、側部尾静脈からの静脈内ボーラスとして投与した。１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇキシラジンの腹腔内投与により、動物を麻酔した。約１０分後、尾端の２ｍｍを切断した。尾端を温かい生理食塩水（約３７℃）中に設置し、６０分間の観察期間にわたって血液を採取した。重量測定法により血液量を決定した。６０分間の観察期間の最後に、動物を麻酔から覚める前に頸椎脱臼により安楽死させた。
【０２９５】
緩衝液処理動物における全失血量中央値は、９３０ｍｇであった。マウス抗ＴＦＰＩ抗体（ｍａＴＦＰＩ）で処理した対象における全失血量中央値は、７２４ｍｇであった。全失血量中央値の低減は、対象にＡＤＶＡＴＥとともにｍａＴＦＰＩが投与された場合により顕著であった。ｍａＴＦＰＩ＋１０ＩＵ／ｋｇ  ＡＤＶＡＴＥの組み合わせは、１３６ｍｇの全失血量中央値をもたらし、ｍａＴＦＰＩ＋５０ＩＵ／ｋｇ  ＡＤＶＡＴＥで処理された動物では、１３ｍｇの全失血量中央値が得られた。１０ＩＵ／ｋｇまたは５０ＩＵ／ｋｇのＡＤＶＡＴＥのみで処理された動物の失血量中央値は、それぞれ、７９８ｍｇおよび３６４ｍｇの失血量中央値であった。ＡＤＶＡＴＥ単独に勝るｍａＴＦＰＩ＋ＡＤＶＡＴＥの組み合わせ処理の優位性は、ｍａＴＦＰＩ＋５０ＩＵ／ｋｇ  ＡＤＶＡＴＥ対５０ＩＵ／ｋｇ  ＡＤＶＡＴＥ（ｐ＝０．００１０）において統計的に示された。統計的に有意に優れているわけではないが、ｍａＴＦＰＩ＋１０ＩＵ／ｋｇ  ＡＤＶＡＴＥで処理された動物における失血量は、１０ＩＵ／ｋｇ  ＡＤＶＡＴＥ単独で処理された動物よりも明らかに低かった。
【０２９６】
２．５％レベルでの緩衝液に勝る統計的に有意な優位性として定義される有効性は、１ｍｇ／ｋｇで１０ＩＵ／ｋｇおよび５０ＩＵ／ｋｇのＡＤＶＡＴＥと組み合わせて投与されたＪＢＴ２３２９、ならびに０．１ｍｇ／ｋｇで５０ＩＵ／ｋｇ  ＡＤＶＡＴＥと組み合わせて投与されたＪＢＴ２３２９に対して示された（ｐ＜０．０００４）。ＡＤＶＡＴＥと組み合わせてＪＢＴ２３２９で処理された動物は、臨床的に関連した失血量の低減を示したが、結果は統計的に有意ではなかった（ｐ≧０．０５０６）。ＡＤＶＡＴＥを含まない１ｍｇ／ｋｇのＪＢＴ２３２９の投与は、緩衝液処理動物において観察される全失血量中央値（９３０ｍｇ）を超えて全失血量中央値を低減しなかった。
【０２９７】
また、ＪＢＴ２３２９を、血友病Ｂヒト患者の臨床的に関連したモデルであるＦＩＸノックアウト尾端出血マウスモデルにおいて試験した。方法は、ＦＶＩＩＩノックアウトモデルに関して上述した方法と実質的に同様であった。ＡＤＶＡＴＥの代わりに、組み換えＦＩＸ（ｒＦＩＸ）が参照として機能した。緩衝液処理動物における全失血量中央値は、９３５ｍｇであった。マウス抗ＴＦＰＩ抗体（ｍａＴＦＰＩ）で処理した動物における全失血量中央値は、７７４ｍｇであった。動物がｍａＴＦＰＩおよびｒＦＩＸの併用処理を受けた場合、全失血量中央値はさらに低減された。ｍａＴＦＰＩ＋１０ＩＵ／ｋｇ  ｒＦＩＸの組み合わせは、２５ｍｇの全失血量中央値をもたらし、ｍａＴＦＰＩ＋５０ＩＵ／ｋｇ  ｒＦＩＸで処理された動物は、１０ｍｇの全失血量中央値を示した。１０ＩＵ／ｋｇまたは２５ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸのみで処理された動物の失血量中央値は、それぞれ、８８８ｍｇおよび７７４ｍｇの失血量中央値であった。
【０２９８】
２．５％レベルでの緩衝液に勝る統計的に有意な優位性として定義される有効性は、１ｍｇ／ｋｇで１０ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸと組み合わせて投与されたＪＢＴ２３２９、ならびに０．１ｍｇ／ｋｇで１０ＩＵ／ｋｇ  ｒＦＩＸと組み合わせて投与されたＪＢＴ２３２９に対して示された。ｒＦＩＸ単独の投与に勝る、ｒＦＩＸと組み合わせたＪＢＴ２３２９の優位性が観察され（ｐ＜０．０１７２）、一方、１ｍｇ／ｋｇ  ＪＢＴ２３２９単独での処理は、緩衝液処理動物と比較して、全失血量中央値の有意な低減をもたらさなかった（ｐ＝０．３２１）。
【０２９９】
要約すると、ＪＢＴ２３２９は、試験された全ての用量において、最適以下の用量のＦＶＩＩＩおよびｒＦＩＸとともに同時投与された場合、臨床的に関連した失血量の低減を促進した。さらに、ＪＢＴ２３２９の静脈内投与は、全ての処理群にわたる全ての対象において、いかなる急性毒性の徴候も見せずに十分な耐性を示した。
実施例１１
【０３００】
本明細書に記載のＴＦＰＩ結合性ペプチドは、生体試料等の試料中のＴＦＰＩの検出に好適である。この実施例は、ＥＬＩＳＡに類似した分析形式において、本発明のペプチドを使用してＴＦＰＩを検出するための方法を説明する。
【０３０１】
ＪＢＴ１８５７のペプチド配列を、ビオチニル−Ｔｔｄｓ部分の付加によりＮ末端修飾し、ＪＢＴ２２７１（ビオチニル−Ｔｔｄｓ−ＦＱＳＫｐＮＶＨＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ−ＮＨ２（配列番号４０３３））を生成した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、室温で１時間、様々なＴＦＰＩ濃度（０〜３μｇ／ｍＬ、ヒト組み換えＴＦＰＩ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むウェル当たり５０μｌの被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．３）で被覆した。プレートを３５０μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．３５）で３回洗浄した。次いで、プレートを、室温で１時間、１００μｌのブロック緩衝液（２％酵母抽出物、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．３５）でブロックした。次いで、プレートを３５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。洗浄緩衝液中の異なる濃度（１００〜０ｎＭ）のＪＢＴ２２７１溶液５０μｌを、各ウェルに添加した。プレートを１時間インキュベートし、３５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。各ウェルに、５０μｌのストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、洗浄緩衝液中１：２００）を添加する。室温で１時間のインキュベーション期間後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ溶液（ＳｅｒａｍｕｎＢｌａｕ  ｆａｓｔ、Ｓｅｒａｍｕｎ）を各ウェルに添加した。室温で１．５分間のインキュベーション後、ウェル当たり５０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより、反応を停止させた。光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５）で、４５０ｎｍおよび６２０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０３０２】
ＪＢＴ２２７１は、ウェル当たり僅か４．１×１０−１４モルのＴＦＰＩの検出を可能にした。上述の分析結果は、本発明のペプチドが、試料中のＴＦＰＩの特定および／または定量のための強力なツールであることを示している。
実施例１２
【０３０３】
この実施例は、ＴＦＰＩ結合性ペプチドの特性決定のための例示的ｋｏｆｆ分析の条件を説明する。
【０３０４】
マイクロタイタープレート（９６ウェル、Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）のウェルを、室温で２時間、被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．３）中の１．６ｎＭ  ＴＦＰＩで被覆する。次いで、プレートを、３５０μｌの洗浄緩衝液（１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．３５）で３回洗浄し、ウェルを１００μｌのブロック緩衝液（２％酵母抽出物、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．３５）でブロックする。２４時間のインキュベーション期間を使用した場合、ウェルを少なくとも１時間ブロックする。１５分間のインキュベーション期間に使用した対照ウェルを、さらに２３．５時間ブロックする。
【０３０５】
２４時間のインキュベーション期間の間、ウェルを３５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、洗浄緩衝液中の試験ペプチド５０μｌでインキュベートする。試験ペプチドの濃度は、例えば本明細書に記載のＴＦＰＩ  ＩＣ５０ＥＬＩＳＡ分析において決定される、個々のＩＣ９０濃度に依存する。ＴＦＰＩ被覆ウェルを、約１５分間試験ペプチドに暴露する。続いて、ウェルを３５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、５０μｌのトレーサーペプチド（競合物）を添加する。例示的なトレーサーペプチドは、ＪＢＴ２２７１（洗浄緩衝液中１．１３ｎＭ）である。対照ウェル（最大シグナル）を、トレーサーのみでインキュベートする。ＴＦＰＩがないブランクウェルを、トレーサーのみでインキュベートする。トレーサーペプチドの添加により、２４時間のインキュベーション期間が開始する。
【０３０６】
試験ペプチドのＩＣ９０濃度が最大シグナルの９０％の低減をもたらす場合、１５分間のインキュベーション期間を対照として用いる。さらに２３．５時間ブロックしたウェルを、３５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、ブロック緩衝液を除去する。続いて、洗浄緩衝液中の検体５０μｌを添加し、ウェルを１５分間インキュベーションする。利用する試験ペプチドの濃度は、例えばＴＦＰＩ  ＩＣ５０ＥＬＩＳＡ分析を使用して決定される、ペプチドのＩＣ９０濃度に依存する。１５分間のインキュベーションに続き、３５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、５０μｌのトレーサーペプチドを添加する。対照ウェル（最大シグナル）を、トレーサーのみでインキュベートする。ＴＦＰＩがないブランクウェルもまた、トレーサーのみでインキュベートする。
【０３０７】
プレートを３５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、５０μｌのストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、洗浄緩衝液中１：２００）を各ウェルに添加する。室温で１時間のインキュベーション期間後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄する。ＴＭＢ溶液（ウェル当たり５０μｌ；ＳｅｒａｍｕｎＢｌａｕ  ｆａｓｔ、Ｓｅｒａｍｕｎ）を添加する。室温で１．５分間のインキュベーション後、ウェル当たり５０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により、反応を停止させる。光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍおよび６２０ｎｍにおける吸光度を測定する。分析結果は、トレーサーのみに暴露されたＴＦＰＩ被覆ウェルに対する、試験ペプチドおよびトレーサーペプチドに暴露されたウェルの補正された光学密度（ＯＤ４５０〜ＯＤ６２０）のパーセンテージとして示される。
実施例１３
【０３０８】
ＴＦＰＩは、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）を介してＦＶＩＩａに結合することにより、ＦＶＩＩａ／ＴＦ活性を阻害する。この実施例は、ＴＦＰＩのＦＶＩＩａ／ＴＦの阻害に対するＴＦＰＩ結合性ペプチドの影響を評価するための例示的方法を説明する。
【０３０９】
２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．３において、９６ウェルプレートで２５℃で反応速度測定を行った。それぞれ１００ｎＭおよび５ｎＭの最終濃度の２０μｌの可溶性組織因子（残基３３〜２５１；Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ）および２０μｌのＦＶＩＩａ（ＥＲＬ）を混合し、１５分間インキュベートした。様々な最終濃度（０〜２μＭ）の２０μｌのＴＦＰＩ結合性ペプチドを混合物に添加し、さらに１５分間インキュベートした。ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ複合体の残留活性を測定するために、反応混合物を２０μｌのＴＦＰＩ（２００ｎＭ）で６０分間インキュベートした。発色基質Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ−ｔＰＡ（Ｒｏｃｈｅ）（１ｍＭ）の添加により、反応を開始させた。Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ｉＥＭＳ  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｅｒを使用して、３０分間４０５ｎｍにおける吸光度の変化を監視した。ＴＦＰＩの非存在下で測定したＦＶＩＩａ／ｓＴＦ活性を、分析に関して「１００％活性」とみなした。残留活性に対するペプチド濃度をプロットすることにより、ＥＣ５０値を決定した。
【０３１０】
ＪＢＴ１８５７およびＪＢＴ１８３７を、ＴＦＰＩ１６０、ＴＦＰＩ１−１５０−トロンビン、ＮＴｅｒｍＫＤ１、ＫＤ１、およびＫＤ２（陰性対照）に対してスクリーニングした。ＪＢＴ１８５７は、ＴＦＰＩ１６０、ＴＦＰＩ１−１５０−トロンビン、ＮＴｅｒｍＫＤ１、およびＫＤ１に対して約０．２１〜０．２３μＭのＥＣ５０を示した。ＫＤ１およびＫＤ２に結合するＪＢＴ１８３７は、ＴＦＰＩ１６０およびＴＦＰＩ１−１５０−トロンビンに対して約０．１７〜０．１９μＭのＥＣ５０を示し、一方、ＮＴｅｒｍＫＤ１およびＫＤ１が関与する分析における活性は、ほぼバックグラウンドであった。
【０３１１】
上述の結果は、ＴＦＰＩ結合性ペプチドが、ＴＦＰＩ−ＦＶＩＩａ／ＴＦ相互作用を効率的に阻害することを示している。ＪＢＴ１８５７は、最小限の機能的物質としてＫＤ１を含有するＴＦＰＩ断片を効率的に阻害した。したがって、この酵素的分析は、ＪＢＴ１８５７の結合部位をＫＤ１内に位置付けるＸ線結晶学的データを裏付ける。ＪＢＴ１８３７は、最初の２つのＫｕｎｉｔｚドメインを含有するＴＦＰＩ断片を阻害し、これは、ＪＢＴ１８３７結合部位（複数を含む）が、ＴＦＰＩのＫＤ１−リンカー−ＫＤ２領域内に位置することを示唆している。トロンビン開裂ＴＦＰＩ（１〜１５０）のＫｕｎｉｔｚドメインおよび断片の組み合わせは、発色分析において、ＪＢＴ１８３７の阻害活性を修復しなかった。本明細書に記載の酵素的分析は、ＴＦＰＩに対するＴＦＰＩ結合性ペプチド（または試験化合物）の結合を検出するための好適な代理であり、ＴＦＰＩ結合性化合物のＴＦＰＩ阻害作用を検査するのに有用である。
実施例１４
【０３１２】
この実施例は、生体内における例示的ＴＦＰＩ結合性ペプチドに対するＰＥＧおよびＨＳＡ結合体の影響を説明する。
【０３１３】
薬物動態分析のために、Ｃ５７Ｂｌ６マウスを、異なる分子量のＰＥＧおよびＨＳＡに共役した様々なＴＦＰＩ結合性ペプチドで処理した。ペプチド−ＰＥＧおよびペプチド−ＨＳＡ結合体の用量を、１ｍｇ／ｋｇ（ペプチド含量）に正規化した。正規化により、異なる分子量の結合体間の比較可能性が確実となる。ペプチド結合体を１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３５に溶解し、尾静脈を介して静脈内投与、または頸部領域に皮下投与した。投与後いくつかの時点で、３匹の動物（球後）から採血を行い、ヘパリン化バイアルに採取した。試料を遠心分離し、血漿中のペプチド−結合体含量をＥＬＩＳＡにより定量した。
【０３１４】
図６３は、投与後いくつかの時点で血漿中で検出されたＰＥＧ化ＴＦＰＩ−ペプチドの濃度を示し、表１７は、ＪＢＴ２３２５〜ＪＢＴ２３２９、ＪＢＴ２４０１、ＪＢＴ２４０４、およびＪＢＴ２４１０の最終半減期およびバイオアベイラビリティに関する詳細な情報を提供する。
【表１７】
2019108360.tif 000035
【０３１５】
ＪＢＴ２３２９、ＪＢＴ２４０１、およびＪＢＴ２４０４は、４０ｋＤａ直線ＰＥＧに共役したペプチド（ＪＢＴ２３２９およびＪＢＴ２４０４）または４０ｋＤａ分岐ＰＥＧに共役したペプチド（ＪＢＴ２４０１）である。４０ｋＤａの結合体は、静脈内投与後、より小さいＰＥＧに共役したペプチドと比較して、より長い最終半減期（ＨＬ＿λ＿ｚ）を示した。ペプチドの皮下投与から得られた濃度−時間曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を、静脈内投与後に生成されたＡＵＣと比較し、ペプチドのバイオアベイラビリティを計算した。結果を表１６に示す。データは、より高分子量の分子へのＴＦＰＩ結合性ペプチド結合が、３０％を超える皮下バイオアベイラビリティを可能にすることを示している。
【０３１６】
図６４Ａ〜Ｃは、マウスに対するペプチドの皮下および静脈内投与から得られたＪＢＴ２４０１、ＪＢＴ２４０４、およびＪＢＴ２４１０の薬物動態プロファイルを示す。ＪＢＴ２４０４は、式（ＸＩ）に対し位置Ｘ４０１４でシステインに共役したＰＥＧを含む。ＪＢＴ２４０１は、分岐ＰＥＧを含み、ＪＢＴ２４１０は、ＨＳＡに共役している。図６４Ａは、内部位置におけるＴＦＰＩ結合性ペプチドへのより高分子量の分子の融合が、半減期を増加させることを示している。半減期はまた、分岐ＰＥＧ（ＪＢＴ２４０１）およびＨＳＡを使用した場合に増加し、これは、よりサイズの小さいＰＥＧを有する結合体（例えば、ＪＢＴ２３２５）または遊離ペプチドと比較して、ＪＢＴ２４１０の生体内半減期を増加させた（図３１を参照されたい）。
【０３１７】
この実施例は、本明細書に記載の様々なペプチドの生体内特性が、より高分子量の分子（ＰＥＧ等）および／またはｎＦｃＲリガンド（ＨＳＡ等）との共役により改善され得ることを示している。
実施例１５
【０３１８】
以下の実施例は、単独でおよびＪＢＴ１８５７の存在下、Ｘ線結晶学によるＴＦＰＩのＫＤ１−ＫＤ２とのＪＢＴ１８３７の相互作用の特性決定を説明する。
ネイティブＰＡＧＥ
【０３１９】
ネイティブＰＡＧＥを行い、ＴＦＰＩの異なる領域に結合するＴＦＰＩ結合性ペプチドがＴＦＰＩ  ＫＤ１−ＫＤ２に同時に結合し得ることを確認した。１５％のポリアクリルアミド−ゲル（ＳＤＳを含まない）を、（１）ＫＤ１−ＫＤ２を含むＴＦＰＩ断片、（２）ＫＤ１−ＫＤ２およびＪＢＴ１８５７、（３）ＫＤ１−ＫＤ２およびＪＢＴ１８３７、ならびに（４）ＪＢＴ１８５７およびＪＢＴ１８３７の両方を含むＫＤ１−ＫＤ２を含む試料上のネイティブゲル電気泳動のために使用した。グリセリンおよびポンソーレッドを、タンパク質試料に添加した。陰極緩衝液を、１リットルの水中に２５ｍＭ  イミダゾールを溶解し、ＨＣｌを用いてｐＨを７に調節することによって得た。１リットルの水中７．５ｍＭ  イミダゾールおよび５０ｍＭ  トリシンを溶解することによって、透明な陽極緩衝液を、調製した。水をそれぞれの溶液に添加して、２リットルの最終体積を得た。Ｓｅｒｖａ  Ｂｌｕｅ  Ｇ（０．０２％  ｗ／ｖ  最終）を２リットルの陽極緩衝液に添加して、ｂｌｕｅ  ｓｔｏｃｋ  １０Ｘ陽極緩衝液（ｂｌｕｅ  ｓｔｏｃｋ  １０Ｘ）を得た。ゲルは、３０分間８０Ｖ、次いで、約３時間２５０Ｖで起動した。Ｃｈａｋａｖａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．，１２；（１６）（２００８）に記載されるように、ゲルを染色し、脱染色した。
【０３２０】
ＫＤ１−ＫＤ２は、単一バンドとしてゲル中で視覚化された。ＪＢＴ１８５７および／またはＪＢＴ１８３７と組み合わせたＫ１−Ｋ２を含む試料は、電荷比に対してより高い分子量への初期ＫＤ１−ＫＤ２バンドのシフトを得た。ＫＤ１−ＫＤ２およびＪＢＴ１８３７の混合後、部分沈殿が観察され、複合体形成後、溶解度の減少を示した。ＪＢＴ１８５７は、完全ＫＤ１−ＫＤ２バンドをシフトしたが、一方ＪＢＴ１８３７は、約１／３の初期バンドをシフトした。さらに、ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７の両方の存在下、ＫＤ１−ＫＤ２バンドは、電荷比に対して最も高い分子量にシフトし、これはＫＤ１−ＫＤ２、ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７からなる三重複合体の形成を示す。したがって、ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７は、同時にＴＦＰＩに結合することができる。
材料および方法−ＪＢＴ１８３７とＫＤ１−ＫＤ２との相互作用
【０３２１】
結晶成長：初期結晶は、０．４μｌの１：１複合体（１．５ｍｇ／ｍｌ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を０．２μｌの沈殿剤（２０％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ６０００、５０ｍＭ  イミダゾールｐＨ８．０）と混合することによって、２０℃で形成した。結晶は、１μｌのタンパク質を０．５μｌの沈殿物（２０％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ６０００、５０ｍＭ  イミダゾールｐＨ８．０）と混合することによって、２０℃で再生成した。抗凍結剤（３０％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ  ６０００、３４％  グリセロール）を結晶滴（２５％  グリセロールの最終濃度）に添加して、液体窒素でフラッシュ冷却中、障害から得られた結晶および氷形成を防止した。
【０３２２】
データ処理：８７．２６Åから１．９５Åまで回折データを回収し、ＭＯＳＦＬＭおよびｉＭＯＳＦＬＭパッケージ（Ｌｅｓｌｉｅ，（２００６）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６２，４８−５７）を使用し、続いて、ＣＣＰ４一式（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ４０，６５８−６７４）を使用して統合し、スケーリングすることによって評価した。結晶は、ａ＝４２．３５Å、ｂ＝４４．１３Å、ｃ＝１７４．５３Å、α＝β＝γ＝９０．０°の単位格子寸法を有し、斜方晶系の空間群Ｐ  ２１２１２１に属し、２つは、非対称単位中で複合体化する。ＰＨＡＳＥＲプログラム（ＭｃＣｏｙ，上記参照）、ならびに２つの検索アンサンブルであるＫＤ２（１ＴＦＸ）の結晶構造（Ｂｕｒｇｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６９，３９５−４０７）および事前に溶解したＫＤ１結晶構造を使用して、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ検索を行った。単位格子は、約５４％の溶媒を含有した。非結晶学的電子密度の平均化、モデル構築、およびモデル精密化を、プログラムＣｏｏｔ  ａｎｄ  Ｒｅｆｍａｃ（ＭｃＣｏｙ、上記参照、Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５３，２４０−５５）で行った。現在のモデルは、ＪＢＴ１８３７ペプチド（２３ＡＡ）の両方のコピーおよびタンパク質との相互作用に対して完全に定義され、現在のＲ＝０．２１３、Ｒｆｒｅｅ＝０．２４５、理想的配置からの偏差ｒｍｓ（結合）＝０．００９８Å、ｒｍｓ（角度）＝１．２８°であった。
【０３２３】
相互作用面の分析：ＫＤ１−ＫＤ２およびＪＢＴ１８３７の相互作用面を、ＰＤＢｅＰＩＳＡで分析した。単一アミノ酸の影響を、複合体形成後のそれらの溶媒露出面積（埋没した溶媒露出面積ＢＳＡＡ）の全還元によって加重し、２Ｄ−相互作用−マトリックスを生成することによって考慮される。
材料および方法-ＫＤ１−ＫＤ２とＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７との相互作用
【０３２４】
結晶成長：初期結晶は、０．４μｌの１：１：１複合体（１．５ｍｇ／ｍｌ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を０．２μｌの沈殿物（２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５％  ＰＥＧ  ４００、１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５）と混合することによって、２０℃で形成された。結晶は、１μｌのタンパク質を０．５μｌの沈殿物（１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５％  ＰＥＧ  ４００、１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５）と混合することによって、再生成され、２０℃で最適化された。抗凍結剤（２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２５％  グリセロール）を、結晶滴（２．３Ｍの最終濃度（ＮＨ４）２ＳＯ４および２０％  グリセロール）に逐次添加して、液体窒素によるフラッシュ冷却中、障害から得られた結晶および氷生成を防止した。この滴は、冷凍油で被覆し、結晶を収穫した。
【０３２５】
データ処理：７４．３Åから２．７Åの回析データを回収し、ＭＯＳＦＬＭおよびｉＭＯＳＦＬＭパッケージを使用して評価し、続いて、ＣＣＰ４一式（Ｌｅｓｌｉｅ，（２００６）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６２，４８−５７，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５０，７６０−３（１９９４））を使用して、統合し、スケーリングした。結晶は、ａ＝７９．０７Å、ｂ＝７９．０７Å、ｃ＝２１８．１７Å、α＝β＝γ＝９０．０°の単位格子寸法を有する正方晶系の空間群Ｐ  ４３２１２に属する。
Ｘ線結晶学結果
【０３２６】
ＫＤ１−ＫＤ２構造は、Ｌ２１からＥ１４８の電子密度で定義され、化学的に存在するときに、残基Ｄ１４９およびＧ１５０は、２つの結晶学的に独立した分子のコピーで立体構造的に不規則である。
【０３２７】
両方のドメインは、Ｋｕｎｉｔｚ型構造を示す。構造の僅か約１／３が、二次構造要素に関与し、これらは、Ｓ２４−Ａ２７（ＫＤ１）／Ｄ９５−Ｆ９８（ＫＤ２）（α１／α３）およびＬ６９−Ｍ７５／Ｌ１４０−Ｅ１４８（α２／α４）で２つの短いα螺旋要素、ならびにＭ３９−Ｎ４５／Ｉ１１０−Ｎ１１６（β１／β３）およびＲ４９−Ｉ５５／Ｋ１２０−Ｋ１２６（β２／β４）を含む二本鎖のβシートである。これらの要素は、ＫＤ１においてＣ２６−Ｃ７６、Ｃ３５−Ｃ５９、およびＣ５１−Ｃ７２ならびにＫＤ２においてＣ９５−Ｃ１４７、Ｃ１０６−Ｃ１３０、およびＣ１２２−Ｃ１４３を含む３つの正準ジスルフィド結合によって安定化されるトポロジカルなフレームワークを形成する。
【０３２８】
これは、ＫＤ１、ＫＤ２、およびＸ線結晶学によって解明されたそれらのリンカーからなるＴＦＰＩの第１の構造である。驚くべきことに、ＪＢＴ１８３７は、両方のＫｕｎｉｔｚドメインが、２回対称を介して関連する異なる立体構造状態において、ＫＤ１−ＫＤ２を固定する。さらに、ＴＦＰＩの立体構造は、２つの回転である、Ｔ７７−Ａ８１からのβ回転（ｔβ）およびＱ９０−Ｋ９３からのγ回転（ｔγ）によって本質的に安定化される。ｔβは、３つの水素結合（Ｏ  Ｋ７４−Ｎ  Ｎ８２、Ｏ  Ｎ８０−Ｎζ  Ｋ７４、Ｏ  Ｎ８２−Ｎε  Ｈ２３）によって安定化され、ホモログＫｕｎｉｔｚドメインおよびＫＤ１単独の結晶構造と比較した２つの残基によってＫＤ１においてα２の短縮をもたらす。ｔγは、４つの水素結合（Ｏ  Ｔ８８−Ｎ  Ｄ９５、Ｏ  Ｑ９０−Ｎ  Ｋ９３、Ｏ  Ｋ９３−Ｎ  Ｑ９０、Ｏγ  Ｔ８８−Ｏδ  Ｄ９５）によって安定化される。
【０３２９】
２３量体ペプチドＪＢＴ１８３７は、（ｉ）ピン、Ｙ２ＡＰ−Ａ８ＡＰおよびＴ１７ＡＰ−Ｆ２３ＡＰを含む二本鎖βシートと、（ｉｉ）針孔、Ｄ１１ＡＰ−Ｔ１５ＡＰを含むβ回転にセグメント化され得るβヘアピン様構造を前提とする。（下付文字ＡＰは、拮抗ペプチド（ＪＢＴ１８３７）における配列番号を示す。）βシートは、ジスルフィド架橋（Ｃ７ＡＰおよびＣ１８ＡＰ）ならびにＹ３ＡＰ、Ｗ５ＡＰ、およびＷ２０ＡＰの側鎖を含む疎水性ジッパーによって安定化される。
【０３３０】
ＰＩＳＡサーバーによるＫＤ１−ＫＤ２とＪＢＴ１８３７との間の相互作用の分析は、１３４０Å２の全ての相互作用面を得た。相互作用面の２／３超は、ＴＦＰＩに広がる残基と相互作用するＪＢＴ１８３７において、疎水性アンカーからなり、これには、相互作用マトリックスによって示されるように、ＫＤ１、ＫＤ２、およびリンカーが含まれ、これらの要約を表１８、および図７４に提供する。
【表１８】
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【０３３１】
疎水性接触に加えて、マトリックスは、例えば、Ｍ１３４のカルボニル酸素を有するＨ６ＡＰおよびＱ６３のカルボニル酸素を有するＷ５ＡＰのＮεの側鎖間の水素結合、ならびにＭ１６ＡＰ−Ｃ１８ＡＰおよびＲ８３−Ｉ８５を含む短いβ鎖によってＴＦＰＩ−ＪＢＴ１８３７複合体を安定化させる極性相互作用を識別する。さらに、Ｋ４ＡＰのＮζは、Ｅ６７およびＥ１４２の側鎖によって等距離に調整される。
【０３３２】
ＪＢＴ１８３７の安定化におけるその役割の他に、Ｃ７ＡＰ−Ｃ１８ＡＰのジスルフィド架橋は、Ｅ７１、Ｍ７５、Ｎ８２、およびＩ８４によって形成された疎水性空洞に完全に収まり、そのため、ＴＦＰＩ−ＪＢＴ１８３７複合体を安定化させる際に重要な役割を果たす。
【０３３３】
ＴＦＰＩは、主に、異なる種を通じて保存されているが、リンカーおよびＫＤ２（Ｍ１３４、Ｉ１４６）内の重要な残基のみが、ヒト種に近い相対物によって共有される（図７４）。さらに、マカクザルにおけるＡ８１Ｖ置換は、立体障害によるリンカーのβ回転を不安定にさせ、ＪＢＴ１８３７とのその後の相互作用を損なう。
【０３３４】
以前に解かれたＫＤ１＋ＪＢＴ１８５７複合体のＫＤ１は、三元構造の配置のモデルを提供するために、ＫＤ１−ＫＤ２＋ＪＢＴ１８３７複合体上に重ね合わせられた。このモデルは、ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７がＫＤ１の反対側の部位に結合することを示唆している。ＪＢＴ１８５７のＣ末端およびＪＢＴ１８３７のＮ末端は、２０Å離間しており、そのため、約１０アミノ酸に対応する約２０Å長のリンカー部分は、ＪＢＴ１８５７およびＪＢＴ１８３７に接続し、サブユニットをＴＦＰＩ上の各結合部位に結合させる。
【０３３５】
ＫＤ１−ＫＤ２＋ＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７結晶は、正方晶空間群Ｐ４３２１２に属し、２．７Åの最大解像度まで回析する。螺旋軸は、軸消滅によって確認され、細胞含有物分析は、非対称単位中に７２ｋＤａの質量を示した。三元複合体が結晶化されると仮定すると、これは、非対称単位中で３つ（６２ｋＤａ；６１％  溶媒）または４つ（８２ｋＤａ；４６％  溶媒）のコピーに対応する。しかしながら、構造は、場合により、ＫＤ１−ＫＤ２分子構造の固有の柔軟性により、完全に解かれ得なかった。ＴＦＰＩとＪＢＴ１８３７との間の相互作用、ならびにペプチドで誘発されたＴＦＰＩの立体構造の分析は、ＪＢＴ１８３７がヒト以外の種のＴＦＰＩに結合し得ないことを示唆している。ＪＢＴ１８３７が交差反応し、ひいては、望ましくない副作用を最小限に抑えるため、ＪＢＴ１８３７の高い選択性が有利である。ＪＢＴ１８５７は、異なる部位でＴＦＰＩに結合し、ネイティブＰＡＧＥは、両方のペプチドが同時にＴＦＰＩに結合することができることを実証した。この分析は、ＫＤ１−ＫＤ２＋ＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７の結晶構造に基づくモデルによってさらに確認される（図７５）。ＪＢＴ１８５７のＣ末端およびＪＢＴ１８３７のＮ末端は、僅か２０Å離れており、および例えば、１０Ａｌａ（またはＳｅｒ）のリンカーは、ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７の両方をＴＦＰＩ内のそれらの結合部位に結合させ得る。
実施例１６
【０３３６】
以下の実施例は、ＴＦＰＩに結合するペプチド複合体の特性決定を説明する。
【０３３７】
ＴＦＰＩ結合性ペプチドは、本明細書に記載されるように生成された。ペプチドは、９０％超の純度を有するトリフルオロ酢酸塩（ＴＦＡ）として合成し、１０ｍＭの原液濃縮物にＤＭＳＯ中で溶解した。
【０３３８】
ビオチン化ＴＦＰＩ結合性ペプチドを、ＴＦＰＩ結合に関して非ビオチン化候補ペプチドと競合する「トレーサー」として使用して、競合（ＩＣ５０）ＥＬＩＳＡを行った。分析原理を図６Ｂに示す。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中の０．０５μｇ／ｍＬのＴＦＰＩで一晩被覆した。プレートを３５０μｌの洗浄緩衝液（ＨＮａＴ：１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、ｐＨ７．３５）で３回洗浄し、および２００μｌ  ＨＮａＴ中２％  酵母抽出物で２時間ブロックした。次いで、プレートを、３５０μｌ  ＨＮａＴで３回洗浄した。ビオチン化されたトレーサーペプチドを、結合ＥＬＩＳＡにおいて決定されたそれぞれのＥＣ９０値（ｎ＞２の場合は中央値）に対応する濃度で塗布した。候補ペプチドの競合物原液（１０ｍＭまたはＤＭＳＯ中で予め希釈）を、ＨＮａＴ中で１／３３．３に希釈し、連続１／３希釈物を、３％  ＤＭＳＯを含むＨＮａＴで調製した。特定の分析において使用される希釈法は、ペプチドの親和性に基づいて調節された。希釈物を、さらに、ビオチン化トレーサーペプチドで１：６の比（２０μｌの競合希釈液および１００μｌのトレーサーペプチド）で希釈した。競合物およびトレーサーペプチドの混合物を、ＴＦＰＩ被覆マイクロタイタープレートに塗布し、１．５時間インキュベートした。プレートを３５０μｌのＨＮａＴで３回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ストレプトアビジンをマイクロタイタープレートに塗布し、混合物を１時間インキュベートし、プレートを３５０μｌのＨＮａＴで３回洗浄し、ＴＭＢ（３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン）を塗布し、その後のＨＲＰによるＴＭＢの発色変換を検出することにより、ペプチド−ＴＦＰＩ結合が検出された。代表的なペプチドＪＢＴ１８５７（配列番号１７８）、ＪＢＴ１８３７（配列番号１０４４）、およびペプチド複合体ＪＢＴ２５４７（Ａｃ−ＦＱＳＫｐＮＶＨＶＤＧＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＹＹＫＷＨ［ＣＡＭＲＤＭＫＧＴＭＴＣ］ＶＷＶＫＦ−ＮＨ２（配列番号４２６０））のＩＣ５０グラフを、図６６Ａおよび６６Ｂに示す。
【０３３９】
ＴＦＰＩ内の２つの異なる部位に結合する２つの異なるＴＦＰＩ結合性ペプチド（ＪＢＴ１８５７およびＪＢＴ１８３７）を含むＴＦＰＩ阻害ペプチド複合体ＪＢＴ２５４７は、１．３３ｘ１０−９ＭのＩＣ５０（トレーサーＪＢＴ２２７１）および５．５７ｘ１０−１０ＭのＩＣ５０（トレーサーＪＢＴ２３１６）を示し、これは、ペプチドサブユニットのＩＣ５０と同等またはそれより低かった。
【０３４０】
さらに、完全長ＴＦＰＩへのＪＢＴ２５４７結合は、表面プラズモン共鳴分析（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ、ＵＫ）において特徴決定された。組み換え、完全長ＴＦＰＩ−１を、５００ＲＵを目標とし、ＣＭ５チップ上に固定した。ペプチドを、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液、ｐＨ７．４、０．１％  ＤＭＳＯ中、１〜１６ｎＭの範囲の濃度で、３０μＬ／分の流量で注入した。続いて、ペプチドを、６００秒間解離した。ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、データを分析し、これは、ＪＢＴ２５４７が１ｎＭ未満の結合定数を有する完全長ＴＦＰＩに堅く結合することを示した。７．４９ｘ１０−１２ＭであるＫＤを計算した。
実施例１７
【０３４１】
この実施例は、ｋｏｆｆ分析を使用してＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体の結合親和性を特徴決定するための例示的な方法を説明する。
【０３４２】
マイクロタイタープレートのウェル（９６ウェル、Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．３）中の１．６ｎＭ  ＴＦＰＩで、室温で２時間被覆した。次いで、プレートを３５０μｌの洗浄緩衝液（１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、ｐＨ７．３５）で３回洗浄し、ウェルを１００μｌのブロッキング緩衝液（２％  酵母抽出物、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、ｐＨ７．３５）でブロックした。２４時間のインキュベーション期間を使用した場合、ウェルを少なくとも１時間ブロックした。１５分間のインキュベーション期間に使用された対照ウェルを、さらに２３．５時間ブロックした。
【０３４３】
２４時間のインキュベーション期間、ウェルを３５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、洗浄緩衝液中５０μｌの試験ペプチド（ＪＢＴ２５４７（配列番号４２６０）またはＪＢＴ１８５７（配列番号１７８））でインキュベートした。試験ペプチドの濃度は、例えば、本明細書に記載のＴＦＰＩ  ＩＣ５０  ＥＬＩＳＡ分析において決定される個々のＩＣ９０濃度に基づいて調節された。ＴＦＰＩ被覆ウェルを、約１５分間試験ペプチドに暴露した。続いて、ウェルを３５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、５０μｌのトレーサー（競合物）ペプチド（ＪＢＴ２２７１（配列番号４０３３））を添加した。対照ウェル（最大シグナル）を、トレーサーのみでインキュベートした。ＴＦＰＩ被覆がないブランクウェルを、トレーサーのみでインキュベートした。トレーサーペプチドの添加により、２４時間のインキュベーション期間が開始した。
【０３４４】
試験ペプチドのＩＣ９０濃度が最大シグナルの９０％の低減をもたらした場合、１５分間のインキュベーション期間を対照として用いた。さらに２３．５時間ブロックしたウェルを、３５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、ブロック緩衝液を除去した。続いて、洗浄緩衝液中の５０μｌの検体を添加し、ウェルを１５分間インキュベーションした。利用する試験ペプチドの濃度は、例えばＴＦＰＩ  ＩＣ５０ＥＬＩＳＡ分析を使用して決定される、ペプチドのＩＣ９０濃度に基づいて調節された。１５分間のインキュベーションに続き、３５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、５０μｌのトレーサーペプチドを添加した。対照ウェル（最大シグナル）を、トレーサーのみでインキュベートした。ＴＦＰＩがないブランクウェルもまた、トレーサーのみでインキュベートした。
【０３４５】
プレートを３５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、５０μｌのＨＲＰ共役ストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、洗浄緩衝液中１：２００）を各ウェルに添加した。室温で１時間のインキュベーション期間後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＴＭＢ溶液（ウェル当たり５０μｌ；ＳｅｒａｍｕｎＢｌａｕ  ｆａｓｔ、Ｓｅｒａｍｕｎ）を添加した。室温で１．５分間のインキュベーション後、ウェル当たり５０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により、反応を停止した。光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍおよび６２０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０３４６】
分析結果は、トレーサーのみに暴露されたＴＦＰＩ被覆ウェルに対する、試験ペプチドおよびトレーサーペプチドに暴露されたウェルの補正された光学密度（ＯＤ４５０〜ＯＤ６２０）のパーセンテージとして図６７に示される。２４時間後、ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体は、ＴＦＰＩへのトレーサーの結合を継続してブロックした。対照的に、ＪＢＴ１８５７は、２４時間のインキュベーション期間中、ＴＦＰＩから解離した。したがって、ＪＢＴ２５４７は、そのペプチドサブユニットであるＪＢＴ１８５７のうちの１つよりも著しく緩やかにＴＦＰＩから解離した。
【０３４７】
ＴＦＰＩに対するＪＢＴ２５２８の親和性はまた、本明細書に記載の方法を使用して決定した：ＫＤ＝１．６ｎＭ；ｋｏｎ＝６．５ｘ１０５  １／Ｍｓ；ｋｏｆｆ＝９．７  １０−４  １／ｓ。ＪＢＴ２５２８は、ＴＦＰＩ  ＫＤ１に結合する。
実施例１８
【０３４８】
この実施例は、マウスおよびヒト血漿におけるＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体ＪＢＴ−２５４７の血漿安定性を説明する。ＪＢＴ２５４７（配列番号４２６０）およびＪＢＴ１８５７（配列番号１７８）をマウスまたはヒト血漿の試料に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後に残留する初期量のペプチドのパーセンテージを、０．０５ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩ（２．２６ｎＭ  トレーサーペプチドＪＢＴ２２７１）で被覆したＭａｘｉｓｏｒｐプレート上で、ＩＣ５０  ＥＬＩＳＡにより決定した。５％未満の初期量のＪＢＴ１８５７は、インキュベーション期間後、マウス血漿中に残留したが、１５％の初期量のＪＢＴ−２５４７が同じインキュベーション期間後残留した。同様に、ＪＢＴ２５４７は、ＪＢＴ１８５７およびＪＢＴ１８３７と比較して、ヒト血漿中でより安定であり、ＪＢＴ１８５７の元の量の２７％およびＪＢＴ１８３７の４６％が２４時間後に残留し、一方ＪＢＴ２５４７の元の量の５４％が検出された。したがって、ＪＢＴ１８５７およびＪＢＴ１８３７の複合体は、安定性を増加し、血漿プロテアーゼに対して耐性である。ＪＢＴ２５２８（Ｈｅｘ−ＦＱＳＫｐ−Ｃ（Ａｃｍ）−ＶＨ−Ｔｌｅ−ＤａＹＦＥＲＬ−Ａｉｂ−ＡＫＬ−ＮＨ２（配列番号４２４６））はまた、増加した安定性を示した：元の量の９３％が、２４時間後にヒト血漿中に残留し、元の量の３５％が、２４時間後にマウス血漿中に残留した。
実施例１９
【０３４９】
以下の実施例は、実施例３に記載のＦＸａ阻害および外因性テナーゼ阻害分析を使用して、ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体およびＴＦＰＩ結合性ペプチドモノマーのＴＦＰＩ阻害活性の特徴決定を説明する。
【０３５０】
ペプチドを、１または１０ｍＭ  ストック（ＤＭＳＯ中）から１．２５Ｘ反応緩衝液＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０（３１．２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；２１８．７５ｍＭ  ＮａＣｌ；６．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２；０．１２５％  ＢＳＡ；ｐＨ７．３５）中で希釈した。ＴＦＰＩ、ＦＶＩＩａ、および脂質化ＴＦを、１．２５Ｘ反応緩衝液中で希釈した。全てＡｑｕａ  ｄｅｓｔ．に希釈されたリン脂質小胞（ＤＯＰＣ／  ＰＯＰＳ  ８０／２０）、およびＦＸａに特異的な発色基質（Ｓ−２２２２（ＤｉａＰｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＯＨから入手可能））を、９６ウェルプレートに加えた。インキュベーション期間後、ＴＦＰＩおよびペプチド希釈物を添加した。外因性テナーゼ阻害分析におけるＴＦＰＩ濃度は、０．０６２５ｎＭであった。ＦＸをウェルに添加することにより、ＦＸ活性化を開始した。ＦＸａ媒介発色基質変換を、マイクロプレートリーダを使用して吸光度の増加を観察することにより決定した。ある特定の時点で生成されたＦＸａの量を、ＯＤ読取値から計算した。反応開始後２０分後に生成されたＦＸａを、ペプチド濃度対ＴＦＰＩ阻害（％）のプロットからのＥＣ５０の計算に考慮した。
【０３５１】
ＴＦＰＩの機能阻害もまた、ＦＸａ阻害分析を使用して検査した。共にＡｑｕａ  ｄｅｓｔ．中に希釈されたＦＸａ特異的発色基質（Ｓ−２２２２）およびリン脂質小胞（ＤＯＰＣ／ＰＯＰＳ  ８０／２０）、ならびに１．２５Ｘ反応緩衝液中に希釈されたＴＦＰＩタンパク質（完全長ヒトＴＦＰＩ、ヒトＴＦＰＩ  １−１６０、マウスＴＦＰＩ  １−１６０、およびカニクイザルＴＦＰＩ  １−１６０）を、９６ウェルプレートに加えた。ＦＸａ阻害分析におけるＴＦＰＩ濃度は、０．５ｎＭであった。ペプチドを、１または１０ｍＭ  ストック（ＤＭＳＯ中）から１．２５Ｘ反応緩衝液＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０中で希釈した。ペプチド希釈物（２．５μｌ）を９６ウェルプレートに添加した。発色基質の変換をＦＸａの添加により誘発し、変換の速度をマイクロプレートリーダで測定した。１１５分後のＯＤ読取値を、ペプチド濃度対ＴＦＰＩ阻害のプロットからのＥＣ５０の計算に考慮した。
【０３５２】
ＦＸａ阻害分析および外因性テナーゼ分析の結果を、表１９および図６８Ａおよび６８Ｂに示す。
【表１９】
2019108360.tif 000037
【０３５３】
ＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ２５４７、ＪＢＴ２５２８、ならびにＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７の組み合わせは、ＦＸａ阻害分析において、０．５ｎＭ  完全長およびＣ末端切断ＴＦＰＩ  １−１６０（表１９および図６８Ａおよび６８Ｂ）を非常に効率的に阻害した。ＪＢＴ１８５７は、それぞれ、４．３および３．１ｎＭのＥＣ５０を有する、両方のＴＦＰＩをあまり効率的に阻害しなかった。ほぼ１００％の最大阻害によって示されるように、１００ｎＭ超の濃度で、ＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ２５４７、ならびにＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７の組み合わせは、ＴＦＰＩ活性を完全にブロックした。ＪＢＴ１８５７（およびＪＢＴ２５２８）は、ＴＦＰＩの部分的阻害剤であり、高く、飽和する濃度でいくつかの残留するＴＦＰＩ阻害活性を示した。完全長およびＣ末端切断ＴＦＰＩの両方の阻害は、ペプチドの結合エピトープがＫｕｎｉｔｚドメイン１および２内にあり、ＴＦＰＩのＣ末端領域がＴＦＰＩ活性の効率的阻害に必要とされないことを確認する。
【０３５４】
候補ペプチドはまた、マウスおよびカニクイザルＴＦＰＩの阻害について分析された。Ｃ末端切断されたマウスおよびサルＴＦＰＩタンパク質（ＴＦＰＩ  １−１６０）を、本明細書に記載されるように行われたＦＸａ阻害分析において使用した。結果を表２０および図６８Ｃおよび６８Ｄに示す。
【表２０】
2019108360.tif 000038
【０３５５】
ＪＢＴ１８３７は、最大１０μＭまでマウスＴＦＰＩ  １−１６０を阻害しなかった（図６８Ｃ）。カニクイザルＴＦＰＩは、μＭ濃度で僅かに弱く阻害し、これは、ＪＢＴ１８３７の結合とは不適合である種間配列の差による可能性が高い（図６８Ｄ）。ＪＢＴ１８５７は、マウスＴＦＰＩを効率的に阻害し、７．２ｎＭのＥＣ５０を得、これはヒトＴＦＰＩの阻害に相当する。カニクイザルＴＦＰＩは、ＪＢＴ１８５７によって効率的に阻害せず、これは、ＪＢＴ１８５７の結合部位内のＡｌａからＰｒｏの置換による可能性がある。
【０３５６】
ＪＢＴ２５４７は、マウスおよびカニクイザルＴＦＰＩの両方を最も効率的に阻害した。ＪＢＴ２５４７は、ＪＢＴ１８５７ならびにＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７の組み合わせと比較して、約２００倍および１０倍多くＥＣ５０の減少を介在した。これは、さらに、２つのペプチド実体の分子融合がそのＴＦＰＩ阻害活性を増加させることを示す。
【０３５７】
ペプチド複合体が高濃度のＴＦＰＩを効率的に阻害することを示すために、ペプチドは、ヒトＴＦＰＩ濃度を増加させる際に滴定された。ＪＢＴ２５４７は、化学量論的に、および試験した全ての濃度（最大１０ｎＭ）でＴＦＰＩ活性を完全に（１００％）阻害した（図６８Ｅおよび６８Ｆ）。対照的に、ペプチドＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ２５４８（ＪＢＴ１８５７の誘導体）は、高濃度でのＴＦＰＩの部分的阻害剤である（図６８Ｄ）。ペプチド複合体を形成するために、ＴＦＰＩ阻害ペプチドの連結は、ＴＦＰＩ活性の阻害を向上させる。
【０３５８】
外因性テナーゼ分析において、ＪＢＴ２５４７は、０．３ｎＭのＥＣ５０を有するＴＦＰＩの存在下で、外因性複合体媒介ＦＸの活性化を修復して、低いＴＦＰＩ濃度（０．０６３ｎＭ）でＴＦＰＩ活性のほぼ１００％の阻害を得た。ＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ１８５７、およびＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７の組み合わせは、より高いＥＣ５０によって示されるように、ＴＦＰＩをあまり効率的に阻害せず、最大阻害を減少させた（図６９Ａ）。ペプチド複合体が高濃度のＴＦＰＩを効率的に阻害することを実証するために、ＪＢＴ２５４７は、ＴＦＰＩ濃度を増加させる際に滴定された。ＪＢＴ２５４７は、試験した全ての濃度（最大１０ｎＭ）でＴＦＰＩ活性を効率的に阻害し、試験されたペプチドの最も低いＥＣ５０を有した（図６９Ｂ〜６９Ｄ）。対照的に、ペプチドＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ２５４８、ならびにペプチドＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７の組み合わせは、高濃度でＴＦＰＩａｔを部分的に阻害し（図６９Ｃ〜６９Ｄ）、ＪＢＴ２５４７と比較して、より高いＥＣ５０を有した。
【０３５９】
ＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ１８５７、ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７の混合物、ならびにＪＢＴ２５４７のＴＦＰＩ拮抗活性はまた、反応システムにおいて決定され、Ｃａ２＋、リン脂質（ＰＬ）＋Ｃａ２＋、およびＰＬ＋Ｃａ２＋＋タンパク質Ｓの存在下、ＦＸａがＴＦＰＩによって阻害された。ペプチドがＴＦＰＩの活性をブロックする有効性は、ＪＢＴ１８５７、ＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７の組み合わせ、ならびにＪＢＴ２５４７の順に増加する。ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７は、ＴＦＰＩを完全には阻害せず、具体的には、補因子タンパク質Ｓの存在下では阻害しなかった。ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７の混合物は、個々のペプチドよりもＴＦＰＩ拮抗剤としてより強力であった。融合ペプチドＪＢＴ２５４７は、最高に優れたＴＦＰＩ拮抗剤であり、５０ｎＭの濃度で、ペプチド複合体は、ＰＬ＋Ｃａ２＋＋タンパク質Ｓの存在下でさえ、ＴＦＰＩをほぼ完全にブロックした。
【０３６０】
この実施例は、例えば、分子の融合によって、本発明の２つのＴＦＰＩ結合性ペプチドの連結がＴＦＰＩ阻害活性を改善することを実証する。ＪＢＴ１８３７は、一次ＴＦＰＩ−ＦＸａ複合体（遭遇複合体）の形成を防止し、高濃度で、ＦＸａのＴＦＰＩ阻害を完全にブロックすることができる。ＪＢＴ１８５７の存在下、一次ＴＦＰＩ−ＦＸａ複合体（遭遇複合体）を形成することが依然として可能であるため、ＪＢＴ１８５７は、弱い遭遇から堅いＴＦＰＩ−ＦＸａ複合体への遷移を防止し、ＴＦＰＩを部分的に阻害する。２つのＴＦＰＩ結合性ペプチドの分子の融合は、それぞれのペプチド単独およびペプチドサブユニットの混合物よりも高い阻害活性度を示した（すなわち、この効果は、添加剤よりも高かった）。
実施例２０
【０３６１】
この実施例では、ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体のＴＦＰＩ阻害活性は、実施例４の血漿に基づいた分析を使用して特徴決定する。生理学的条件（約０．２ｎＭ  完全長ＴＦＰＩ）、ならびに上昇した完全長ＴＦＰＩ血漿レベルを模倣する条件（最大１０ｎＭ  完全長ＴＦＰＩ）下、ＴＦＰＩ結合性ペプチドを試験した。
【０３６２】
外因性ｆｌＴＦＰＩの不在または存在下、トロンビン生成に対するペプチドの影響を、トロンビン特異的蛍光性基質の緩やかな開裂後、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）リーダ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ；３９０ｎｍ励起フィルタおよび４６０ｎｍ発光フィルタ）における較正された自動化トロンボグラフィーにより２回測定した（Ｈｅｍｋｅｒ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈａｅｍｏｓｔ．Ｔｈｒｏｍｂ．，３３，４−１５（２００３））。抗体媒介ＦＶＩＩＩ欠乏のモデルとして、凍結プール正常血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ、ＫＮ）を、ヤギにおいて惹起した高力価、加熱不活性化抗ヒトＦＶＩＩＩ血漿（４４９０  ＢＵ／ｍｌ；Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ウィーン、オーストリア）でインキュベートし、５０ＢＵ／ｍＬを得た。また、カニクイザルおよびマーモセットザルの血漿を用いて、分析を行った。血漿をトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｓｓｅｘ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＶＴ）と混合して第ＸＩＩａ因子汚染を阻害し、４０μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。
【０３６３】
事前に加温した（３７℃）血漿（８０μＬ）を、９６ウェルマイクロプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ、透明Ｕ字底；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の各ウェルに加えた。組織因子によりトロンビン生成を誘発するために、組み換えヒト組織因子（１２ｐＭ）を含有する１０μＬのＰＰＰ低試薬、ならびにホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンで構成されるリン脂質小胞（４８μＭ）（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ、マーストリヒト、オランダ）を添加した。事前に加温した（３７℃）リーダ内にプレートを設置する直前に、５μＬのペプチド溶液を添加し、１〜１００ｎＭの血漿濃度を得た。最終的に、５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を含む５μＬのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水または５μＬの完全長ＴＦＰＩ（ｆｌＴＦＰＩ）希釈剤を添加した。ｆｌＴＦＰＩタンパク質（３５５７ｎＭ）は、ＳＫ  Ｈｅｐ細胞中で発現され、精製された。ｆｌＴＦＰＩの血漿濃度は、０．３１から１０ｎＭの間で変動し、これは、外因性ｆｌＴＦＰＩ血漿濃度の約２から５０倍の増加に相当する。蛍光性基質およびＨＥＰＥＳ緩衝ＣａＣｌ２（１００ｍＭ）を含有する２０μＬのＦｌｕＣａ試薬（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ、マーストリヒト、オランダ）の添加によって、トロンビン生成を開始した。蛍光強度を３７℃で記録した。得られたトロンビン生成曲線のパラメータを、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ（商標）ソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ、マーストリヒト、オランダ）およびトロンビン較正器を使用して計算し、内部フィルタおよび基質消費効果について較正した（Ｈｅｍｋｅｒ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈａｅｍｏｓｔ．Ｔｈｒｏｍｂ．，３３、４−１５（２００３））。最終血漿希釈、ＴＦ濃度、およびヒト血漿分析のための分析温度は、それぞれ、１：１．５、１ｐＭ、および３７℃であった。最終血漿希釈、ＴＦ濃度、ならびにマウスＣ５７Ｂ１６血漿分析およびマウスＦＶＩＩ−／−血漿分析のための分析温度は、それぞれ、１：２．４、０．４  ｐＭ、および３３℃であった。最終血漿希釈、ＴＦ濃度、ならびにカニクイザルおよびマーモセットザル血漿分析のための分析温度は、それぞれ、１：１．５、０．６  ｐＭ、および３７℃であった。
【０３６４】
ヒトＦＶＩＩＩ阻害血漿のトロンビン生成の改善のための代表的な結果を表２１に示す。
【表２１】
2019108360.tif 000039
【０３６５】
ＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ１８５７、ＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７の混合物、ならびにＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７（ＪＢＴ２５４７）の複合体は、同様のＥＣ５０を有するＦＶＩＩＩ阻害血漿のトロンビン生成を改善した。ポリクローナル抗ＴＦＰＩ抗体に対して最大効率は、ＪＢＴ２５４７に対して最も高く、これは、本明細書に記載の２つのＴＦＰＩ結合性ペプチドの融合が血漿中のＴＦＰＩ活性の阻害を向上させることを示す。
【０３６６】
図７０Ａ〜７０Ｃは、トロンビン生成分析におけるｆｌＴＦＰＩ血漿レベル（１．２５、３．７５、および１０ｎＭ）の上昇したレベルに対する１〜１００ｎＭの融合ペプチドＪＢＴ２５４７（ひし形）の阻害活性を示す。ＪＢＴ１８３７（三角形）およびＪＢＴ１８５７（丸）と比較して、ＪＢＴ２５４７は、非常に高いｆｌＴＦＰＩ血漿レベルの存在下で、トロンビンピークを増加させる実質的により大きな能力を示す。ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７（四角形）の組み合わせは、各単量体のペプチドを単独で上回る反応を改善したが、モノマーの組み合わせは、ペプチド複合体によって達成された活性化のレベルに達成しなかった。ＪＢＴ２５４７のＴＦＰＩ拮抗の可能性はまた、生理学的ｆｌＴＦＰＩ血漿濃度よりも５０倍高いものに相当する最大１０ｎＭのｆｌＴＦＰＩの広い濃度範囲の存在下で試験した。５０〜１００ｎＭの濃度のＪＢＴ２５４７は、１０ｎＭ  ｆｌＴＦＰＩの抗凝固効果を完全に補正し、トロンビンピーク値は、正常な血漿レベルまたはそれ以上に達した。５０ｎＭ未満のＪＢＴ２５４７の濃度は、ｆｌＴＦＰＩ依存性様式でＦＶＩＩＩ阻害血漿のトロンビン生成を改善した。
【０３６７】
いくつかの動物血漿を用いたトロンビン生成実験の結果を、表２２および２３に要約する。
【表２２】
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【表２３】
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【０３６８】
ＪＢＴ１８３７は、関連する濃度でマウスおよびマーモセットザルＴＦＰＩを阻害しなかった。カニクイザルＴＦＰＩは、μＭ濃度でのみ不十分に阻害された。ＪＢＴ１８５７は、マウスおよびマーモセットサルＴＦＰＩを効率的に阻害したが、一方カニクイザルＴＦＰＩは、ＪＢＴ１８５７によってあまり効率的に阻害せず、これは、ヒト、マウス、およびマーモセットザルＴＦＰＩにおいてＡｌａとして保存されているＪＢＴ１８５７の結合部位内のＡｌａからＰｒｏアミノ酸置換による可能性が高い。カニクイザルＴＦＰＩは、融合ペプチドＪＢＴ２５４７によって最も効率的に阻害する。
実施例２１
【０３６９】
この実施例は、細胞ベース外因性テナーゼ分析において、ＦＸからＦＸａへの外因性テナーゼ複合体媒介変換を修復する上述のＴＦＰＩ結合性ペプチドの能力を説明する。この分析は、実施例５に記載されるように行われた。１００ｎＭ  ポリクローナル抗ヒトＴＦＰＩ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ２９７４）の存在下、反応から９分後に得られたＦＸａ濃縮物を１００％に設定し、抗体に暴露されなかった試料を、０％  ＴＦＰＩ阻害効果に設定し、ペプチドの阻害活性の評価を可能にした。分析結果を、図７１Ａおよび７１Ｂに示す。ＪＢＴ２５４７は、ＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ１８５７、ＪＢＴ２５４８、およびＪＢＴ１８５７とＪＢＴ１８３７の混合物と比較して、ＨＵＶＥＣ  ＴＦＰＩの改善された阻害を示した。ＴＦＰＩの完全阻害は、約１０ｎＭの低い濃度で達成された。
実施例２２
【０３７０】
この実施例は、回転トロンボエラストグラフィー（ＲＯＴＥＭ）を使用して、全血中の血餅形成を評価するための方法を説明する。この分析は、実施例８に記載されるように行われた。分析手順は以下の通りであった：３００μＬの事前に加温（３７°Ｃ）したＣＴＩ処理したクエン酸加全血を、ペプチド試料（１０、１００、１０００ｎＭ  最終分析濃度）または対照に添加し、続いて組み換えヒト組織因子（ｒＴＦ、３ｐＭ）（ＴＳ４０、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ、マーストリヒト、オランダ）を含有するＴＦ  ＰＲＰ試薬の１：１５希釈液を添加した。ある実験では、２または１０ｎＭの最終濃度で外因性完全長ＴＦＰＩ（ｆｌＴＦＰＩ）を添加して、正常値を超える最大５０倍のｆｌＴＦＰＩ血漿レベルを模擬実験した。２０μＬの２００ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｓｔａｒ−ＴＥＭ（登録商標）、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ、ミュンヘン、ドイツ）の添加により凝固を開始し、少なくとも１２０分間、記録を継続した。分析中ｒＴＦの最終濃度は、４４ｆＭであった。凝固時間（ＣＴ）、血餅形成時間（ＣＦＴ）、および最大血餅硬度（ＭＣＦ）のトロンボエラストグラフィーパラメータを、製造者の説明に従い記録した。ＣＴは、測定開始から血餅形成開始までの時間として定義される。ＣＦＴは、血餅形成開始から２０ｍｍの振幅に達するまでの時間として定義される。ＭＣＦは、分析中の２つのトレースの間の振幅の最大差である。
【０３７１】
ＴＦＰＩ阻害ペプチドの不在下、完全長ＴＦＰＩのＦＶＩＩＩ阻害全血への添加は、実質的には、凝固時間の著しい増加によって示されるように、凝固を阻害した（図７２Ａ〜７２Ｃ）。ＪＢＴ２５２８およびＪＢＴ１８３７は、ＦＶＩＩＩ阻害血漿の全体的な止血パラメータを改善した（それぞれ、ＥＣ５０＝１１ｎＭおよび４ｎＭ）。ＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ２５４８は、濃度依存的様式で正常なレベルまで凝固時間を減少させることによって凝固を改善した（図７２Ｂおよび７２Ｃ；白丸）。これらのペプチドは、増加したＴＦＰＩ濃度（例えば、１０ｎＭ）でＦＶＩＩＩ阻害血液の凝固時間に達することができなかった。対照的に、１００ｎＭ超のＪＢＴ２５４７の濃度は、ＦＶＩＩＩ阻害全血の正常な凝固を完全に修復し、これに、２ｎＭおよび１０ｎＭの完全長ＴＦＰＩを添加した。
【０３７２】
この実施例は、ＴＦＰＩ結合性ペプチド複合体がＴＦＰＩを効率的に中和し、ＴＦＰＩ濃度が増加したときでさえ、正常な凝固を修復することをさらに確認する。
実施例２３
【０３７３】
血小板は、完全長ＴＦＰＩを含み、これは、血小板の活性化の際に血漿に放出され、損傷部位での血漿中の完全長ＴＦＰＩの５０〜７５％に近い血漿中の血小板ＴＦＰＩ濃度をもたらす。この実施例は、本発明のペプチドによる血小板ＴＦＰＩの阻害を示す。
【０３７４】
血液採取および血漿調製：血液試料は、複数の異なるドナーから採取された。９容量の静脈血を、５００μｇ／ｍｌのＣＴＩを含むか、または含まない１容量の１．０９クエン酸三ナトリウムに静脈穿刺によって採取し、多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製のために２５０ｘｇで１５分間、または少血小板血漿（ＰＰＰ）の調製のために２８６０ｘｇで遠心分離した。ＰＰＰをアリコートし、急速凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。正常な血漿プール（ＮＰ）を使用した実験では、２５人を超える健常な個人から採取された血液は、血液細胞から血漿を分離するために２０００ｘｇで１５分間遠心分離し、１１０００ｘｇで５分間、再度遠心分離して、少血小板血漿を得た。
【０３７５】
血小板の単離：血液（４５ｍｌ）を、７．５ｍｌのクエン酸／デキストロース（ＡＣＤ、８０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、５２ｍＭ  クエン酸、１８３ｍＭ  グルコース）上に回収し、２４８ｘｇで１５分間遠心分離した。残留赤血球を除去するために、上清（多血小板血漿、ＰＲＰ）を、さらに２４８ｘｇで５分間遠心分離した。続いて、ＰＲＰを２７６０ｒｐｍ（１３６０ｘｇ）で１５分間遠心分離し、血小板をスピンダウンした。血小板ペレットを、２０ｍｌ（第１の洗浄）および１５ｍｌ（第２の洗浄）の血小板緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５％  ウシ血清アルブミン、および０．２％  グルコース、ｐＨ６．６）中で再懸濁することによって２回洗浄し、続いて、２７６０ｒｐｍ（１３６０ｘｇ）で１５分間遠心分離した。第２の洗浄ステップ後、血小板を３．５ｍｌの血小板緩衝液（ｐＨ７．５）中で再懸濁し、血小板濃度をＣｏｕｌｔｅｒカウンターで決定した。最終的に、血小板懸濁液を、血小板緩衝液（ｐＨ７．５）による希釈によって必要とされる血小板濃度まで希釈し、４０μｌの合成ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＲＧＤＳ）の２５ｍｇ／ｍｌ溶液を、３．５ｍｌの血小板懸濁液ごとに添加して、室温で保存中、血小板凝集を阻害した。
【０３７６】
血小板ＴＦＰＩの機能的な特徴付け：ＴＦＰＩは、１００ｎｇ／ｍｌのコンバルキシンを用いて、３７℃で１５分間血小板を活性化することにより、単離された血小板から放出された。血小板は、エッペンドルフ遠心分離管中、遠心分離（２８００ｘｇで１５分間）によってスピンダウンし、上清を血小板ＴＦＰＩの源として回収した。血小板ＴＦＰＩは、基準として組み換えＴＦＰＩを使用して、完全長ＴＦＰＩ  ＥＬＩＳＡで定量化した。血小板ＴＦＰＩの機能活性は、２つの分析システム：１）モデルシステムにおけるＦＶＩＩａ触媒ＦＸの活性化、および２）ＴＦＰＩ欠乏血漿中のトロンビン生成の阻害において、組み換えＴＦＰＩの活性と比較した。
【０３７７】
モデル分析において、ＴＦ−ＦＶＩＩａ触媒ＦＸの活性化における組み換えまたは血小板ＴＦＰＩの濃度の変化の影響を、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）緩衝液中で、３７℃で決定され、これには、２ｐＭ  ＦＶＩＩａ、５ｎＭ  ＴＦ、１００ｎＭ  ＦＸ、および４００ｕＭ  Ｆｌｕｏｐｈｅｎ  ＦＸａを含有する。この分析では、ＦＶＩＩａ、ＴＦ、ＴＦＰＩ、およびＦｌｕｏｐｈｅｎ  ＦＸａを、ＨＥＰＥＳ緩衝液中、３７℃で７分間プレインキュベートし、ＦＸの活性化を、ＦＸを添加することによって開始した。生成されたＦＸａによるｆｌｕｏｐｈｅｎ  ＦＸａ変換のプログレス曲線は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）リーダ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で決定し、基質消費に対するトロンビン生成曲線の補正のためにも使用される手法（Ｈｅｍｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈａｅｍｏｓｔ  Ｔｈｒｏｍｂ，３２，２４９−５３（２００２））によって、Ｆｌｕｏｐｈｅｎ  Ｆｘａの消費およびいわゆる内部フィルタ効果について補正した（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ  Ｓ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６，ｖｏｌ  １，ｐｐ１３，１１８，ｖｏｌ  ２，ｐｐ１８２-１８５）。ＦＸａ生成の時間的経過およびそれにおけるＴＦＰＩの効果は、Ｆｌｕｏｐｈｅｎ  ＦＸａ変換の補正されたプログレス曲線の一次導関数を取ることによって得られた。代替として、ＴＦ−ＦＶＩＩａ触媒ＦＸの活性化におけるＴＦＰＩの効果はまた、ＦＸａに特異的な発色基質、例えば、１２５μＭ  ＣＳ−１１（６５）に従った。
【０３７８】
トロンビン生成分析において、ＴＦＰＩ枯渇血漿を、様々な量の組み換えＴＦＰＩまたは血小板由来ＴＦＰＩで再構成し、トロンビン生成を、Ｈｅｍｋｅｒらによる上記に記載された較正自動化トロンボグラフィー（ＣＡＴ）法を使用して決定した。様々な濃度の組み換えＴＦ（０．１〜１０ｐＭ）、１６ｍＭ  ＣａＣｌ２、３０μＭ  リン脂質小胞（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、２０／２０／６０、Ｍ／Ｍ／Ｍ）および３０〜５０μｇ／ｍｌ  トウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）の添加によって、トロンビン生成を、血漿中で開始した。ＰＲＰ中の実験では、リン脂質小胞を血漿に添加しなかった。血漿中のトロンビン活性は、蛍光基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ  （ＢＡＣＨＥＭ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で継続的にモニタリングした。蛍光は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）リーダ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，ヘルシンキ，フィンランド）で読み取り、トロンビン生成曲線は、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ（商標）ソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ，マーストリヒト、オランダ）を使用して算出した。
【０３７９】
組み換え、血漿、および血小板ＴＦＰＩにおける本発明のペプチド効果の分析：ＴＦＰＩの抗凝固活性におけるＴＦＰＩ結合性ペプチドの効果を、モデルシステム（ＦＸａの阻害およびＴＦＰＩによるＴＦ−ＦＶＩＩａ触媒ＦＸ活性化）ならびに血漿（組み換えもしくは血小板ＴＦＰＩまたは血小板で再構成されたＮＰ、ＰＰＰ、ＰＲＰ、またはＴＦＰＩ枯渇血漿）中で試験した。ＴＦＰＩによるＦＸａの阻害におけるペプチド効果は、１２５μＭ  ＣＳ−１１（６５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、または３ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するＨＮＢＳＡ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．７、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）、そして、存在する場合、様々な濃度のペプチドおよびＴＦＰＩ、８０ｎＭ  タンパク質Ｓおよび／または３０μＭリン脂質小胞（２０：６０：２０  ＤＯＰＳ／ＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ）中で続き、これを、３７℃で１０分間プレインキュベートした。ｈＦＸａを添加し、発色基質変換の定常状態速度に達するまで（約６０分）、Ｕｌｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，バーリントン，ヴァージニア州，米国）中で、４０５ｎｍの吸収度での増加が続いた。発色基質変換のプログレス曲線を、緩やかな堅い結合阻害に対して統合反応速度式にフィッティングさせた（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６８，２６９５０−５５（１９９３））：
Ａｔ＝Ａ０＋（ｖｓ．ｔ）＋（ｖ０−ｖｓ）．（１−ｅｘｐ（−ｋｏｂｓ．ｔ））／ｋｏｂｓ
ここで、Ａｔは、時間ｔでの４０５ｎｍの吸収度であり、Ａ０は、４０５ｎｍの初期吸収度であり、ｖｓは、最終定常速度であり、ｖ０は、初期速度であり、ｋｏｂｓは、ｖ０からｖｓ（ＦＸａ−ＴＦＰＩからＦＸａ−ＴＦＰＩ＊）の遷移における見かけの速度定数である。ＴＦＰＩの不在下、ＦＸａによる発色基質変換の速度と比較して、値ｖ０およびｖｓは、弛緩および堅固なＦＸａ−ＴＦＰＩ複合体形成の程度を表す。
【０３８０】
ＴＦＰＩによるＴＦ−ＦＶＩＩａ触媒ＦＸ活性化の阻害におけるペプチド効果を、２ｐＭ  ＦＶＩＩａ、５ｎＭ  ＴＦ、１００ｎＭ  ＦＸ、４００μＭ  Ｆｌｕｏｐｈｅｎ  ＦＸａ、および様々な量のペプチドおよびＴＦＰＩ（組み換えまたは血小板由来）を含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）緩衝液中３７℃で測定した。この分析では、ＦＶＩＩａ、ＴＦ、ＴＦＰＩ、ペプチド、およびＦｌｕｏｐｈｅｎ  ＦＸａは、ＨＥＰＥＳ緩衝液中、３７℃で７分間プレインキュベートし、ＦＸの活性化を、ＦＸを添加することによって開始した。生成されたＦＸａによるＦｌｕｏｐｈｅｎ  ＦＸａ変換のプログレス曲線は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）リーダ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，ヘルシンキ，フィンランド）で決定し、基質に対するトロンビン生成曲線の補正のためにも使用される手法によって、Ｆｌｕｏｐｈｅｎ  Ｆｘａの消費およびいわゆる内部フィルタ効果について補正した。ＦＸａ生成の時間的経過およびそれにおけるＴＦＰＩの効果は、Ｆｌｕｏｐｈｅｎ  ＦＸａ変換の補正されたプログレス曲線の一次導関数を取ることによって得られた。代替として、ＴＦ−ＦＶＩＩａ触媒ＦＸの活性化におけるＴＦＰＩの効果はまた、ＦＸａに特異的な発色基質、例えば、１２５μＭ  ＣＳ−１１（６５）に従った。
【０３８１】
血漿および血小板ＴＦＰＩにおけるペプチドの効果は、組み換えまたは血小板ＴＦＰＩまたは血小板で再構成されたＮＰ、ＰＰＰ、ＰＲＰ、またはＴＦＰＩ枯渇血漿中で以下に記載されるように決定されたトロンビン生成におけるそれらの影響を測定することによって評価された。ＰＲＰまたは血小板で再構成されたＴＦＰＩ枯渇血漿中の実験では、血小板は、８０ｎｇ／ｍｌのコンバルキシンまたは４０ｕｇ／ｍｌのＨｏｒｍコラーゲン（ウェル中最終濃度）で非活性化または活性化された。血友病血漿を模擬実験するために、ヤギ阻害剤血漿の存在下、この１μｌを８０μｌの血漿に添加し、ＦＶＩＩＩを中和して、トロンビン生成実験を行った。
【０３８２】
トロンビン生成実験では、血漿をマイクロタイタープレートに添加し、存在する場合、適切な量のリン脂質、血小板、ＴＦＰＩ、抗ＦＶＩＩＩ、抗ＴＦＰＩ抗体、ペプチドと混合し、３７℃で７分間インキュベートした。このプレインキュベーション後、ＴＦおよび血小板活性化因子（存在する場合）を直ちに添加し、続いて、トロンビン生成を開始する混合蛍光性基質／ＣａＣｌ２混合物（ＦｌｕＣａ）を添加した。
【０３８３】
結果：血小板上清ＴＦＰＩは、濃度依存的様式で、ＴＦ−ＦＶＩＩａ触媒ＦＸの不活性化を阻害した。抗ＴＦＰＩ抗体のカクテルによって、血小板上清による阻害を防止し、これは、ＴＦ−ＦＶＩＩａ触媒ＦＸの活性化の阻害剤である血小板上清中のＴＦＰＩであったことを強調した。しかしながら、血小板上清および抗ＴＦＰＩの存在下、ＦＸの活性化の速度は、血小板上清を含まないＦＸの活性化の速度よりも速く、これは、血小板上清が少量のＦＸ活性化因子、例えば、ＦＶＩＩａを含んだことを示唆していた。これは、血小板上清は、較正曲線が緩衝液中組み換えＴＦＰＩで作成される分析混合物中よりも分析混合物中に存在する場合、さらなるＦＶＩＩａが阻害されなければならないという事実のため、データが血小板ＴＦＰＩ濃度の過小評価であることを示唆している。
【０３８４】
血小板ＴＦＰＩの機能活性はまた、ＴＦＰＩ欠乏血漿中で試験され、組み換え非グリコシル化ＴＦＰＩの活性と比較された。異なるドナーからの血小板ＴＦＰＩの濃度は、組み換え非グリコシル化ＴＦＰＩを較正器として使用したＥＬＩＳＡで決定された。滴定は、ＴＦＰＩ欠乏血漿中の異なるＴＦＰＩ調製で作製されなかったが、トロンビン生成に対する血小板および組み換えＴＦＰＩの効果の検査は、濃度ベースで血小板および組み換えＴＦＰＩが、同様の抗凝固活性を示すことを示した。
【０３８５】
ＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ１８５７、ＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７、およびＪＢＴ２５４７（５０ｎＭ）は、血小板ＴＦＰＩの能力をブロックして、ＴＦ−ＦＶＩＩａ触媒ＦＸの活性化を阻害した。融合ペプチドは、最も効率的であり、ＴＦＰＩの抗凝固活性を完全にブロックした。ＪＢＴ１８５７は、最も効率的ではなく、その後に、ＪＢＴ１８３７、およびＪＢＴ１８３７とＪＢＴ１８５７の混合物が続いた。ＪＢＴ２５４７による滴定は、１０ｎＭの濃度がほぼ完全に血小板ＴＦＰＩの活性を阻害したことを示した。
【０３８６】
多血小板血漿（ＰＲＰ）および少血小板血漿（ＰＰＰ）中のトロンビン生成の阻害における血漿および血小板ＴＦＰＩの効果をさらに解明するために、さらなる研究が行われた。血小板ＴＦＰＩおよび血漿由来ＴＦＰＩによるトロンビン生成の下方調節間で区別するために、実験は、血小板（血小板ＴＦＰＩの源）および／または様々な量の添加、精製されたＴＦＰＩ（血漿ＴＦＰＩレベルの変動を模擬実験する）が補完されたＴＦＰＩ枯渇血漿中で行われた。コンバルキシン活性化血小板を追加されたＴＦＰＩ枯渇血漿中の予備実験は、抗ＴＦＰＩ抗体がトロンビン生成を向上させたことを示し、これは、血小板から放出されたＴＦＰＩがトロンビン生成を阻害することを示した。
【０３８７】
ＰＲＰ中のトロンビン生成は、ＴＦを必要としたように思われた。ＣＴＩを含まないＰＲＰおよびＣＴＩを後で添加したＰＲＰ中で、ＥＴＰおよびトロンビンピーク高さは、ＴＦ濃度（Ｔは必要とされなかった）による影響をほとんど受けず、遅延時間のみが、ＴＦを増加する際に短縮された。ＰＲＰがクエン酸塩＋ＣＴＩにおいて収集された血液から調製された場合、遅延時間およびトロンビンピークはともに、ＴＦ濃度によって影響を受け、ＰＲＰ中で行われた実験は、血液がＣＴＩ中で収集されなければならないことを必要とすることを示した。
【０３８８】
上記の実験では、ＴＦおよびＣａ２＋でトロンビン生成を開始する前に、血漿をコンバルキシンで前活性化し、血小板ＴＦＰＩの放出を促進した。コンバルキシンは生理学的誘因ではないため、ＰＲＰ中のトロンビン生成と非活性化血小板ならびにコンバルキシン、コラーゲン、およびＣａ−イオノフォアにより前活性化された血小板との比較が行われた。血小板がトロンビンを生成する能力は、活性化因子なし＝イオノフォア＜コラーゲン＜コンバルキシンの順で増加したように思われた。
【０３８９】
さらに、上記の実験では、ＴＦの存在下、血小板を、活性化因子で７分間プレインキュベート（前活性化）し、蛍光発生基質／Ｃａ２＋混合物でトロンビン生成を開始した。蛍光発生基質／Ｃａ２＋混合物でトロンビン生成を開始する前に、血小板活性化因子であるコンバルキシンをＰＲＰに１０〜１５秒間添加する場合、実質的には、ＰＲＰ中ほどトロンビンを生成せず、トロンビン生成を開始する前に、血小板をコンバルキシンで前活性化した。これらの結果を考慮して、今後の研究は、血小板の前活性化を含まず、コラーゲンまたは活性化因子なしは、主に、ＰＲＰ中の実験に使用されよう。
【０３９０】
ＴＦＰＩ拮抗の効果は、初めに、ＣＴＩ上で採取した血液から調製されたＰＲＰ中で試験された。０．１ｐＭ  ＴＦ＋コラーゲンでＰＲＰ中で誘発されたトロンビン生成を、実質的には、抗ＴＦＰＩカクテルおよびＪＢＴ２５４７の両方によって向上させた。これは、ＴＦＰＩが血小板上でトロンビン生成の主要な調節因子であり、ＪＢＴ２５４７がＴＦＰＩの抗凝固活性を中和する際に抗ＴＦＰＩカクテルと同じくらい有効であることを示す。ＴＦＰＩは、豊富な量（１０ｐＭ）のＴＦで誘発されたＰＲＰ中でトロンビン生成をほとんど下方調節しなかった。
【０３９１】
低ＴＦ（１ｐＭ）のＰＲＰ中で生成されたトロンビンの主要部分は、内因性Ｘａｓｅを介して生成されると思われ、したがって、ＦＶＩＩＩを必要とする。ＪＢＴ２５４７および抗ＴＦＰＩカクテルの両方は、実質的には、ＰＲＰ中でトロンビン生成を増加させ、ＦＶＩＩＩは、血友病血漿を代表する状態の抗ＦＶＩＩＩで中和された。ＪＢＴ２５４７はまた、コラーゲンで活性化されないか、または活性化された血小板が補完されたＴＦＰＩ枯渇血漿中でトロンビン生成を向上させた。
【０３９２】
大過剰であると見られるＴＦＰＩ（サブｎＭ範囲）に対するＪＢＴ２５４７の親和性であると考えられる４μＭ  ペプチドを用いて、ＪＢＴ２５４７を用いた実験を行った。実際には、ＰＰＰおよびＰＲＰの両方において、５〜１０ｎＭのＪＢＴ２５４７は、ＴＦＰＩを完全に阻害するには十分であった。
【０３９３】
血漿中、血漿または血小板由来のＴＦＰＩが、ＴＦＰＩ抗体カクテルまたはＪＢＴ２５４７によって完全に阻害されるかどうかを試験するために、ＴＦＰＩ抗体カクテルの不在または存在下、ＴＦＰＩ滴定がＰＰＰおよびＰＲＰ中で行われた。血漿中および血小板から放出されるものに存在するＴＦＰＩ上でのＴＦＰＩ濃度の増加は、トロンビン生成を徐々に阻害した。ＴＦＰＩ抗体カクテルの存在下、全てのトロンビン生成曲線は同じであり、これは、ＴＦＰＩ抗体カクテルが部分的なＴＦＰＩ阻害剤ではないが、ＴＦＰＩを完全に中和することを示す。
【０３９４】
ＰＰＰ中、低濃度の添加したＴＦＰＩ（０．０５〜０．５ｎＭ）は、実質的には、トロンビン生成を阻害し、全ＴＦＰＩ（血漿ＴＦＰＩ＋添加したＴＦＰＩ）の関数として、トロンビン生成パラメータのプロット（ｌｏｇ  ｌａｇ  ｔｉｍｅまたはｌｎ  ＥＴＰ）は、血漿が約０．３ｎＭ  ＴＦＰＩを含有するとすれば、直線にフィットされ得る。これは、添加したＴＦＰＩの抗凝固活性が血漿中に存在するＴＦＰＩのものと同様であることを示した。ＰＲＰ中、非常に大量の添加したＴＦＰＩが、トロンビン生成を阻害するために必要とされた。
【０３９５】
ペプチド複合体ＪＢＴ２５４７は、２ｎＭの有効濃度（ＥＣ５０）を有するＰＰＰ中の３〜４倍のトロンビン生成を向上させ、８ｎＭのＥＣ５０を有するＰＲＰ中の２倍のトロンビン生成を向上させた。阻害ＦＶＩＩＩ抗体を添加して、血友病患者のＰＲＰを模擬するＰＲＰ中のトロンビン生成は、ペプチド複合体によって３倍向上させた。本明細書に記載のデータは、本発明のペプチドが血漿由来、組み換え、および血小板由来のＴＦＰＩと結合し、および血小板および血漿ＴＦＰＩの抗凝固効果をブロックすることによってトロンビン生成を向上させることを確立する。
実施例２４
【０３９６】
この実施例は、血友病関節出血のマウスモデルにおける本発明のペプチドの止血効果を説明する。
【０３９７】
この試験の目的は、血友病Ａのマウスモデルにおける穿刺で誘発した関節血症における本発明の例示的ＰＥＧ化ペプチドの効果を評価することであった。ペプチドＪＢＴ２３２９は、尾静脈注射を介して重症血友病（Ｅ１６  ＦＶＩＩＩ  Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｆ８ｔｍ  ｌ  ｋａｚ／Ｊ）に罹患しているＦＶＩＩＩ欠乏マウスに１ｍｇ／ｋｇの用量で投与された。様々な用量の組み換えＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ；１０、５０、および１００ＩＵ／ｋｇ）はまた、単独でまたはＪＢＴ２３２９と組み合わせて投与された。それぞれの生成物の投与後、右膝関節包を３０ゲージ針で穿刺して、出血を誘発した。損傷してから３日後に動物を殺処分し、出血を肉眼的および組織学的方法を介して評価した。出血を評価するための動物モデルおよび方法は、Ｈａｋｏｂｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１４，８０４−８０９（２００８）においてさらに記載される。視覚的および組織学的出血スコアを含む要約出血スコア（ＳＢＳ）を、各関節に割り当てた。損傷前の本発明のＰＥＧ化ペプチドの投与は、関節出血を大幅に減少させた。１ｍｇ／ｋｇのＪＢＴ２３２９の保護効果は、ＳＢＳによって決定されるように、１０ＩＵ／ｋｇの効果よりも著しく多いＡＤＶＡＴＥであったが、１００ＩＵ／ｋｇ未満のＡＤＶＡＴＥであった。１ｍｇ／ｋｇ  ＪＢＴ２３２９および５０ＩＵ／ｋｇ  ＡＤＶＡＴＥによって与えられる保護効果の有意な差異はなかった。本明細書に記載の結果は、本発明のペプチドが血友病Ａの生体内モデルにおける出血に対する予防または保護効果を提供することをさらに確認する。
実施例２５
【０３９８】
この実施例は、クリアランスおよび細胞内分解を媒介する受容体に結合するＴＦＰＩの能力における本発明のペプチドを説明する。また、ペプチド結合ＴＦＰＩの薬物動態も説明される。
【０３９９】
低密度のリポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）への完全長ＴＦＰＩ（ｆｌ−ＴＦＰＩ）の結合が、３７℃でＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（商標）表面プラズモン共鳴分析（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ、イギリス）を使用して研究された。ＬＲＰは、製造業者のプロトコルに従って、ビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチン化された。製造業者のプロトコルに従って、標準アミンカップリング化学を使用してＳｅｒｉｅｓ  ＳセンサチップＣ１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にニュートラアビジン固定化（２５００ＲＵ）した後、ビオチン化組み換えヒトＬＲＰ−１  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ  Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ビオチン−ニュートラアビジン相互作用を介して表面に結合して、４５０ＲＵを得た。固定化した後、ｆｌ−ＴＦＰＩを、泳動緩衝液（ＨＢＳ−Ｎ、０．１％  Ｐ８０、５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で希釈された１０ｎＭの単一濃縮物中で３０μＬ／分の流速で注入した。この流れを泳動緩衝液の状態に変化させることによって、ｆｌ−ＴＦＰＩを解離した。ｆｌ−ＴＦＰＩおよびＬＲＰの相互作用が、ペプチド（ＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ１８５７、ＪＢＴ２３２９（ＪＢＴ１８５７＋４０ｋＤ  ＰＥＧ）、またはＪＢＴ２５４７（ＪＢＴ１８３７＋ＪＢＴ１８５７））またはポリエチレングリコール（４０ｋＤ）の存在下、試験された場合、１μＭの最終濃度のペプチドまたはＰＥＧをｆｌ−ＴＦＰＩに添加した。
【０４００】
ＴＦＰＩは、速いｏｎおよびｏｆｆ速度で固定化したＬＲＰと効率的に相互作用した。ｋｕｎｉｔｚドメイン３（ＫＤ３）およびＣ末端を欠いている切断型ＴＦＰＩは、ＬＲＰと相互作用しない。目視検査によって、ＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ１８５７、またはＪＢＴ２３２９に結合するｆｌ−ＴＦＰＩは依然として、ＬＲＰと相互作用することは明らかであった。融合ペプチドＪＢＴ２５４７に複合体化したＴＦＰＩは、単一ペプチドと複合体化したＴＦＰＩに対して観察された反応よりも高い反応を得た。ペプチド複合体（ＪＢＴ２５４７）の存在および不在下、ＬＲＰ−ｆｌ−ＴＦＰＩの相互作用の変化しない関連性および解離速度は、異なる結果がｆｌ−ＴＦＰＩ−ＪＢＴ２５４７複合体の増加した分子量、ならびにＪＢＴ２５４７によるｆｌ−ＴＦＰＩへのＬＲＰおよびペプチドの潜在的な同時結合と関連することを示唆している。ｆｌ−ＴＦＰＩ  ＬＲＰの相互作用の僅かな減少は、ＴＦＰＩがＪＢＴ２３２９（ＰＥＧ化したＪＢＴ１８５７）に結合した場合に観察された一方で、４０ｋＤ  ＰＥＧ単独では、分析システムに影響を及ぼさず、これは、高次に水和されたＰＥＧ連結ペプチドがｆｌ−ＴＦＰＩ  ＬＲＰの相互作用を若干妨げることを示唆している。
【０４０１】
アシアロ糖タンパク受容体（ＡＳＧＰＲ）とのＴＦＰＩの相互作用はまた、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（商標）表面プラズモン共鳴分析（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ、イギリス）を使用して、２５℃で評価された。製造業者のプロトコルに従って、標準アミンカップリング化学を使用してＳｅｒｉｅｓ  ＳセンサチップＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＡＳＧＰＲ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、４７０ＲＵ）を固定化した後、ｆｌ−ＴＦＰＩを、泳動緩衝液（ＨＢＳ  ｐＨ７．４、０．１％  Ｐ８０、５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で希釈された３．８４ｎＭ〜１５０ｎＭの範囲の濃度で単一サイクル分析モードにおいて、３０μＬ／分の流速で注入した。続いて、ｆｌ−ＴＦＰＩを、この流れを泳動緩衝液状態に変化させることによって解離した。ｆｌ−ＴＦＰＩおよびＡＳＧＰＲの相互作用が、ＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ１８５７、ＪＢＴ２３２９、またはＪＢＴ２５４７の存在下、試験された場合、１μＭの最終濃度のペプチドをｆｌ−ＴＦＰＩに添加した。
【０４０２】
Ｆｌ−ＴＦＰＩは、速いｏｎおよびｏｆｆ速度で固定化したＡＳＧＰＲと効率的に相互作用した。Ｃ末端が切断されたＴＦＰＩは、ＡＳＧＰＲと相互作用しない。ＪＢＴ１８５７またはＪＢＴ２５４７に結合するｆｌ−ＴＦＰＩがＡＳＧＰＲと相互作用したことは目視検査から明らかであった。ＬＲＰと同様に、融合ペプチドＪＢＴ２５４７と複合体化したＴＦＰＩは、より高い反応を生じた。また、ｆｌ−ＴＦＰＩとＬＲＰの相互作用と同様に、ＪＢＴ２３２９は、ＡＳＧＰＲ−ｆｌ−ＴＦＰＩの相互作用を減退した一方で、４０ｋＤａ  ＰＥＧ単独では、分析システムに影響を及ぼさなかった。このデータは、本発明の高次に水和されたＰＥＧ連結ペプチドが立体障害を介してＴＦＰＩ−ＡＳＧＰＲの相互作用を妨げることを示唆している。
【０４０３】
生体内でＴＦＰＩの薬物動態におけるＴＦＰＩ結合性ペプチドの影響を試験するために、マウス群（Ｃ５７Ｂｌ６、雄、２０〜２５ｇ）を、ヒトｆｌ−ＴＦＰＩ（７７５ｎＭ、５ｍＬ／ｋｇ、静脈投与）、１０倍のモル過剰のＪＢＴ２５２８と複合体化したヒトｆｌ−ＴＦＰＩ（７７５ｎＭ  ヒトｆｌ−ＴＦＰＩ、７７５２ｎＭ  ＪＢＴ２５２８、５ｍＬ／ｋｇ、静脈投与）、または１０倍のモル過剰のＪＢＴ２５３４と複合体化したヒトｆｌ−ＴＦＰＩ（７７５ｎＭ  ヒトｆｌ−ＴＦＰＩ、７７５２ｎＭ  ＪＢＴ２５３４、５ｍＬ／ｋｇ、静脈投与）で処置した。ＪＢＴ２５２８は、ＪＢＴ２５３４と同じペプチド配列を有するが、４０ｋＤ  ＰＥＧ修飾を欠いている。したがって、ＪＢＴ２５２８は、分析において、ＰＥＧ化の可能性がある影響に対する対照としての役割を果たす。様々な時点で、３匹のマウスを殺処分し、血液を心臓穿刺によって採取し、さらなる分析のために血漿を単離し、冷凍保存した（＜−６０℃）。サンプリング時点は、以下の通りであった：ｆｌ−ＴＦＰＩ、０．５、１、２分、ｆｌ−ＴＦＰＩ-ＪＢＴ２５２８、０．５、１、２、３、５、８分、およびｆｌ−ＴＦＰＩ-ＪＢＴ２５３４、１、２、５、１０、２０、３５分。
【０４０４】
血漿試料は、ヒトＴＦＰＩに特異的なＥＬＩＳＡを用いてヒトＴＦＰＩに対して分析した。定量化のために、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）のウェルを、１μｇ／ｍＬのモノクローナル抗ヒトＫＤ２特異的ＴＦＰＩ抗体（Ｓａｎｑｕｉｎ、Ｗｈｉｔｅ  ｌａｂｅｌ；ＭＷ１８４５）で４℃で一晩被覆し、続いて、０．１  ％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）を含有するＴＢＳで３回の洗浄サイクルを行った。ウェルを、２％の脂肪を含まない乾燥ミルク（ＢｉｏＲａｄ）を含有するＴＢＳで室温で１時間ブロックした。１００μＬの希釈試料をウェルに塗布し、室温で２時間インキュベートした。ＴＢＳＴ（５回）で洗浄した後、ウェルを、０．５μｇ／ｍＬのポリクローナルウサギ抗ｈＴＦＰＩ抗体（ＡＤＧ７２；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで５回洗浄し、および０．２μｇ／ｍＬのヤギ抗ウサギＨＲＰ標識抗体（Ａ０５４５；Ｓｉｇｍａ）でさらに１時間インキュベートした。１００μＬの基質（ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＰ、ＫＬＰ）の添加により発色し、５０μＬの１Ｍ  ＨＣｌで停止させた。４５０ｎｍの吸収度を、マイクロタイタープレートリーダ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ａｐｐｌｉｓｋａｎ  Ｒｅａｄｅｒ）で測定した。ＳＫＨｅｐ細胞によって発現し、精製された内因性ｆｌ−ＴＦＰＩを、定量化のために、０．２５〜１６ｎｇ／ｍｌの濃度で標準タンパク質として使用した（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ）。期待されたヒトＴＦＰＩ濃度に応じて、血漿試料を、１／２０〜１／８００に希釈した。
【０４０５】
ヒトｆｌ−ＴＦＰＩは、非常に短い半減期を有し、生体内で非常に不良な回復を有した。初期の時点（０．５分）で、期待されたＴＦＰＩレベルの僅か１０分の１が観察された。ｆｌ−ＴＦＰＩの回復および半減期は、ｆｌ−ＴＦＰＩが試験ペプチドと複合体化した場合に、変化しないままであった。この実験は、ＴＦＰＩ結合性ペプチドのＰＥＧ化がｆｌ−ＴＦＰＩに対してより長い半減期をもたらさず、ＴＦＰＩのクリアランスに影響を及ぼさないことを示す。
【０４０６】
この実施例は、本発明の代表的なペプチドが、クリアランス受容体とのＴＦＰＩの相互作用を著しく減退せず、生体内でＴＦＰＩの半減期を増加させないことを実証する。
実施例２６
【０４０７】
この実施例は、ＴＦＰＩのタンパク質分解を阻害するための本発明のペプチドの能力を実証する。
【０４０８】
ＴＦＰＩは、エラスターゼ、トロンビン、プラスミン、ＦＸａ、およびキマーゼを含むいくつかの酵素によってタンパク質分解を不活性化にする。例えば、Ｈａｍｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２７４，３０５６−３０７７（２００７）を参照のこと。好中球エラスターゼによるｆｌ−ＴＦＰＩのタンパク質分解における融合タンパク質ＪＢＴ２５４７、ならびに個々のペプチドサブユニットＪＢＴ１８３７およびＪＢＴ１８５７の影響が試験された。好中球エラスターゼは、Ｋｕｎｉｔｚ１ドメインとＫｕｎｉｔｚ２ドメインとの間に位置するＬｙｓ８６およびＧｌｎ９０内にＴＦＰＩを開裂する代表的なプロテアーゼである。
【０４０９】
ｆｌ−ＴＦＰＩのタンパク質分解のために、５ｎＭ  ｆｌ−ＴＦＰＩを、反応緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）中５ｎＭ好中球エラスターゼ（ヒト好中球から精製、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で、３７℃でインキュベートした。１μＭ  ＪＢＴ１８３７、ＪＢＴ１８５７、またはＪＢＴ２５４７を用いて、およびそれを用いずに反応を行った。タンパク質分解を、ウェスタンブロット分析によってモニタリングした。アリコートを、０、５、１５、３０、および６０分後反応混合物から得られ、還元状態でＳＤＳ負荷緩衝液中で９６℃で５分間直ちに加熱した。試料を４〜２０％  Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、タンパク質を、ＰＶＤＦ膜に移動した。脂肪を含まない乾燥ミルクで膜をブロックした後、ＴＦＰＩタンパク質を、ヒトＴＦＰＩ（ＡＦ２９７４、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および二次抗ウサギ−ＨＲＰ共役抗体（Ｓｉｇｍａ）に対してウサギポリクローナル抗体で検出した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を適用して、膜上に捕捉した化学発光シグナルを発生した。発生したバンドを、密度によって定量化した。
【０４１０】
ペプチドの不在下、好中球エラスターゼによるｆｌ−ＴＦＰＩの段階的分解は、１時間以内に観察された。無傷ｆｌ−ＴＦＰＩに対応するウェスタンブロットにおいて視覚化した約４３ｋＤのバンドは、ほぼ完全に消失し、一方２つの開裂産物は、ペプチド結合Ｔ８７〜Ｔ８８の開裂によって形成された。ＪＢＴ２５４７が存在した場合、ｆｌ−ＴＦＰＩのタンパク質分解は、モニタリング時間中ブロックされ、これは、ＪＢＴ２５４７が生体外でエラスターゼにより分解からｆｌ−ＴＦＰＩを保護することを示す。個々のペプチドサブユニットは、ｆｌ−ＴＦＰＩ開裂における異なる効果を媒介した。ＪＢＴ１８３７は、ＪＢＴ２５４７に対して観察された結果と同様に、タンパク質分解からｆｌ−ＴＦＰＩを１時間保護した。対照的に、ＪＢＴ１８５７は、エラスターゼ開裂において僅かな効果があったか、または全く効果がなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２−０１】
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【図３０−０１】
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【図３２−３６】
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【図３３】
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【図３４−０１】
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【図３４−０２】
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【図３４−０３】
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【図３４−０４】
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【図３４−０５】
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【図３４−０６】
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【図３４−０７】
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【図３４−０８】
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【図３４−０９】
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【図３４−１０】
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【図３５】
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【図３６−０１】
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【図３６−０２】
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【図３６−０３】
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【図３６−０４】
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【図３６−０５】
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【図３６−０６】
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【図３６−０７】
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【図３６−０８】
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【図３６−０９】
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【図３６−１０】
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【図３６−１１】
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【図３６−１２】
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【図３６−１３】
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【図３６−１４】
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【図３６−１５】
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【図３６−１６】
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【図３６−１７】
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【図３７】
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【図３８−０１】
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【図３８−０２】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２−０１】
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【図６２−０２】
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【図６２−０３】
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【図６２−０４】
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【図６２−０５】
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【図６２−０６】
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【図６３】
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【図６４−Ａ】
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【図６４−Ｂ】
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【図６４−Ｃ】
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【図６５−０１】
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【図６５−０２】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６７】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６８Ｃ】
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【図６８Ｄ】
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【図６８Ｅ】
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【図６８Ｆ】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図６９Ｃ】
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【図６９Ｄ】
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【図７０Ａ】
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【図７０Ｂ】
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【図７０Ｃ】
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【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【図７２Ａ】
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【図７２Ｂ】
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【図７２Ｃ】
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【図７３−０１】
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【図７３−０２】
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【図７３−０３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６Ａ】
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【図７６Ｂ】
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【図７６Ｃ】
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【図７６Ｄ】
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【図７７】
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【図７８Ａ】
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【図７８Ｂ】
2019108360.tif 000310
【図７８Ｃ】
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【図７８Ｄ】
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【図７８Ｅ】
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【図７８Ｆ】
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【図７８Ｇ】
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【図７８Ｈ】
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【図７８Ｉ】
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【図７８Ｊ】
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【図７８Ｋ】
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【図７８Ｌ】
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【図７８Ｍ】
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【図７８Ｎ】
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【図７８Ｏ】
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【図７８Ｐ】
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【図７８Ｑ】
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【図７８Ｒ】
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【図７８Ｓ】
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【図７８Ｔ】
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【図７８Ｕ】
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【図７８Ｖ】
2019108360.tif 000330
【図７８Ｗ】
2019108360.tif 000331
【図７８Ｘ】
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【図７８Ｙ】
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【図７８Ｚ】
2019108360.tif 000334
【図７８ＡＡ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月13日(2019.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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