(57)【要約】      （修正有）【課題】アテローム硬化型プラーク形成を阻害する治療方法および組成物の提供。【解決手段】アテローム性動脈硬化症を有する対象における、アテローム硬化型病変の数、総領域、重症度、または不安定性の増加の阻害に使用するための、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体または抗原結合タンパク質を含む医薬組成物であって、前記抗体または抗原結合タンパク質は配列番号２、３、４、７、８、および１０を有する重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、前記医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象にＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物を投与することを含む、対象におけるアテローム硬化型プラーク形成を阻害する方法。
【請求項２】
対象におけるアテローム硬化型プラーク形成の阻害に使用するための、ＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物。
【請求項３】
対象が非高脂血症性である、請求項１または２に記載の方法または医薬組成物。
【請求項４】
対象が見かけ上健康である、請求項１または２に記載の方法または医薬組成物。
【請求項５】
対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置するまたはその進行を阻害する方法であって：
卒中または心筋梗塞を患っている対象を選択すること；および
対象にＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物を投与し、それによりアテローム性動脈硬化症を処置するまたはその進行を阻害することを含む前記方法。
【請求項６】
卒中または心筋梗塞を患っている対象における、アテローム性動脈硬化症の処置またはその進行の阻害に使用するための、ＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物。
【請求項７】
対象が非高脂血症性である、請求項５または６に記載の方法または医薬組成物。
【請求項８】
非高脂血症性の対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置するまたはその進行を阻害する方法であって：
アテローム性動脈硬化症を有するまたは発症するリスクがあることが知られている、非高脂血症性である対象を選択すること；および
対象にＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物を投与し、それによりアテローム性動脈硬化症を処置するまたはその進行を阻害することを含む前記方法。
【請求項９】
アテローム性動脈硬化症を有するまたは発症するリスクがあることが知られている非高脂血症性の対象における、アテローム性動脈硬化症の処置またはその進行の阻害に使用するための、ＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物。
【請求項１０】
対象が見かけ上健康である、請求項８または９に記載の方法または医薬組成物。
【請求項１１】
対象が非高コレステロール血症性である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項１２】
対象が非高トリグリセリド血症性である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項１３】
対象は、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病、川崎病、慢性炎症性疾患、および高血圧症からなる群から選択される疾患または障害を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項１４】
対象は炎症マーカーのレベルが上昇している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項１５】
炎症マーカーはＣ反応性タンパク質である、請求項１４に記載の方法または医薬組成物
。
【請求項１６】
炎症マーカーは炎症性サイトカインである、請求項１４に記載の方法または医薬組成物。
【請求項１７】
ＰＣＳＫ９インヒビターはＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体または抗原結合タンパク質である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項１８】
抗体または抗原結合タンパク質は配列番号１２、１３、１４、１６、１７、および１８を有する重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法または医薬組成物。
【請求項１９】
抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲおよび配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１７に記載の方法または医薬組成物。
【請求項２０】
抗体または抗原結合タンパク質は配列番号２、３、４、７、８、および１０を有する重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法または医薬組成物。
【請求項２１】
抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲおよび配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項２０に記載の方法または医薬組成物。
【請求項２２】
抗体または抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号１および６；または１１および１５に記載の重鎖および軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体と同じＰＣＳＫ９上のエピトープに結合する、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項２３】
抗体または抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号１および６；または１１および１５に記載の重鎖および軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体と、ＰＣＳＫ９との結合について競合する、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項２４】
ＰＣＳＫ９インヒビターは、対象におけるアテローム硬化型プラーク形成を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少させる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項２５】
対象はヘテロ接合性の家族性高コレステロール血症（ｈｅＦＨ）を有する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項２６】
対象は家族性高コレステロール血症ではない高コレステロール血症（ｎｏｎＦＨ）の形態を有する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項２７】
対象は抗体または抗原結合タンパク質の投与の前および／または間に別の脂質修飾剤をうける、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項２８】
治療的脂質修飾剤はスタチン、エゼチミブ、フィブラート、ナイアシン、オメガ−３脂肪酸、および胆汁酸レジンからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法または医薬組成物。
【請求項２９】
スタチンは、セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチンおよびプラバスタチンからなる群から選
択される、請求項２８に記載の方法または医薬組成物。
【請求項３０】
対象は抗体または抗原結合タンパク質の投与の前および／または間に別の脂質修飾剤をうけていない、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項３１】
抗体または抗原結合タンパク質は皮下に投与される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む単位剤形。
【請求項３３】
ＰＣＳＫ９インヒビターは、抗体または抗原結合性フラグメントであり、単位剤形は７５ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、または３００ｍｇの抗体または抗原結合性フラグメントを含む、請求項３２に記載の単位剤形。
【請求項３４】
プレフィルドシリンジ、プレフィルド自動注射器、バイアル、カートリッジ、再使用可能シリンジ、および再使用可能自動注射器からなる群から選択される、請求項３３に記載の単位剤形。
【請求項３５】
密閉されている、請求項３４に記載の単位剤形。
【請求項３６】
抗体または抗原結合性フラグメントの量が密閉されている剤形に示される、請求項３４〜３５のいずれか１項に記載の単位剤形。
【請求項３７】
請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物および容器を含む製品。
【請求項３８】
請求項３２〜３６に記載の１つまたはそれ以上の単位剤形および使用のための指示書を含む、請求項３７に記載の製品。
【請求項３９】
（ａ）対象におけるアテローム硬化型プラーク形成の阻害；
（ｂ）卒中または心筋梗塞を患っている対象における、アテローム性動脈硬化症の処置またはその進行の阻害；または
（ｃ）アテローム性動脈硬化症を有するまたは発症するリスクがあることが知られている非高脂血症性の対象における、アテローム性動脈硬化症の処置またはその進行の阻害
のための医薬の製造における請求項１〜３８のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年６月７日に出願された米国仮出願第６１／８３２，４５９号；２０１３年６月７日に出願された欧州特許出願第１３３０５７６２．０号；２０１３年１０月１７日に出願された米国仮出願第６１／８９２，２１５号；２０１３年１０月１８日に出願された欧州特許出願第１３３０６４３６．０号；２０１４年２月２６日に出願された米国仮出願第６１／９４４，８５５号；および２０１４年５月２３日に出願された米国仮出願第６２／００２，５０８号の利益を主張する。上記の出願のそれぞれの内容は、参照によって本明細書にそれらの全体が組み入れられる。
【０００２】
本発明は、アテローム性動脈硬化症のための治療的処置の分野に関する。より具体的には、本発明は、対象におけるアテローム硬化型プラーク形成を阻害する、プロタンパク質コンバターゼ  サブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）インヒビターの投与に関する。
【背景技術】
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は、西洋世界における主要な死因および心血管罹病率を代表している。アテローム性動脈硬化症のリスク因子には、高い低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベル、低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールレベル、高血圧症、真性糖尿病、家族歴、男性の性別、タバコの煙、および高い血清コレステロールが含まれる。
【０００４】
プロタンパク質コンバターゼ  サブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）は、分泌性サブチラーゼファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属するプロタンパク質コンバターゼである。タンパク質コンバターゼ  サブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）は、ＬＤＬ代謝に関与し、肝臓、腎臓、および腸において主に発現されるセリンプロテアーゼである。ＰＣＳＫ９が、循環からのＬＤＬクリアランスの主経路である肝臓におけるＬＤＬエンドサイトーシスを媒介している、ＬＤＬ受容体の分解を促進することにより、血漿ＬＤＬコレステロールを増加させることを証拠は示唆している。
【０００５】
血清総コレステロール、ＬＤＬコレステロールおよび血清トリグリセリドを減少させるためのＰＣＳＫ９インヒビター（抗ＰＣＳＫ９抗体）の使用は、特許文献１、特許文献２、および特許文献３に記載されている。それにもかかわらず、ＰＣＳＫ９インヒビターが、対象におけるアテローム硬化型プラーク形成の進行を減少または阻害することは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第８，０６２，６４０号
【特許文献２】米国特許第８，３５７，３７１号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１３／００６４８３４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
当技術分野においてアテローム硬化型プラーク形成を阻害する治療方法に関する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、対象におけるアテローム硬化型プラーク形成を阻害するための方法および組成物を提供することによって治療的方法のための当技術分野における必要性に対処する。ある態様において、本発明の方法および組成物は、アテローム性動脈硬化症を有するまたは発症するリスクのある対象を選択すること、および対象にプロタンパク質コンバターゼ
サブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）インヒビター（例えば、抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合タンパク質）を含む医薬組成物を投与することを一般的に含む。他の態様において、本発明は、対象におけるアテローム硬化型プラーク形成の阻害における使用のための、ＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物を提供する。さらに他の態様において、本発明は、対象にＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物を投与することにより、対象におけるアテローム硬化型プラーク形成を阻害する方法を提供する。
【０００９】
ある実施形態において、対象は非高脂血症性である。他の実施形態において、対象は見かけ上健康である。
【００１０】
別の態様において、本発明は、対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置するまたはその進行を阻害する方法であって：（ａ）卒中または心筋梗塞を患っている対象を選択すること；および（ｂ）対象にＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物を投与し、それによりアテローム性動脈硬化症を処置するまたはその進行を阻害することを含む方法を提供する。一実施形態において、対象は非高脂血症性である。
【００１１】
別の態様において、本発明は、卒中または心筋梗塞を患っている対象における、アテローム性動脈硬化症の処置またはその進行の阻害に使用するための、ＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、非高脂血症性の対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置するまたはその進行を阻害する方法であって：（ａ）アテローム性動脈硬化症を有するまたは発症するリスクがあることが知られている、非高脂血症性である対象を選択すること；および（ｂ）対象にＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物を投与し、それによりアテローム性動脈硬化症を処置するまたはその進行を阻害することを含む方法を提供する。一実施形態において、対象は見かけ上健康である。別の実施形態において、対象は非高コレステロール血症性である。別の実施形態において、対象は非高トリグリセリド血症性である。
【００１３】
別の態様において、本発明は、アテローム性動脈硬化症を有するまたは発症するリスクがあることが知られている非高脂血症性の対象における、アテローム性動脈硬化症の処置またはその進行の阻害に使用するための、ＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
ある実施形態において、対象は、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病、川崎病、慢性炎症性疾患、および高血圧症からなる群から選択される疾患または障害を有する。別の実施形態において、対象は、炎症マーカーのレベルが上昇している。さらなる実施形態において、炎症マーカーは、Ｃ反応性タンパク質である。別のさらなる実施形態において、炎症マーカーは、炎症性サイトカインである。
【００１５】
ある例示的な実施形態において、ＰＣＳＫ９インヒビターは、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体または抗原結合タンパク質である。他の実施形態において、抗体は、配列番号１２、１３、１４、１６、１７、および１８を有する、重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号１１のア
ミノ酸配列を有するＨＣＶＲおよび配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。ある実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号２、３、４、７、８、および１０を有する、重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲおよび配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。一実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、それぞれ、配列番号１および６；または１１および１５に記載の重鎖および軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体と同じＰＣＳＫ９上のエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、それぞれ、配列番号１および６；または１１および１５に記載の重鎖および軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体と、ＰＣＳＫ９との結合について競合する。
【００１６】
別の実施形態において、ＰＣＳＫ９インヒビターは、対象におけるアテローム硬化型プラーク形成を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少させる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、対象は、ヘテロ接合性の家族性高コレステロール血症（ｈｅＦＨ）を有する。他の実施形態において、対象は、家族性高コレステロール血症ではない高コレステロール血症（ｎｏｎＦＨ）の形態を有する。
【００１８】
ある実施形態において、対象は、抗体または抗原結合タンパク質の投与の前および／または間に別の脂質修飾剤（ｌｉｐｉｄ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）をうける。治療的脂質修飾剤は、スタチン、コレステロール取込インヒビター、エゼチミブ、フィブラート、ナイアシン、オメガ−３脂肪酸、および胆汁酸レジンを含む。スタチンは、セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチンおよびプラバスタチンを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、皮下に投与される。
【００２０】
本発明はまた、ＰＣＳＫ９インヒビターの医薬組成物を含む単位剤形を提供する。ある実施形態において、ＰＣＳＫ９インヒビターは抗体または抗原結合性フラグメントであり、単位剤形は７５ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、または３００ｍｇの抗体または抗原結合性フラグメントを含む。単位剤形は、プレフィルドシリンジ、プレフィルド自動注射器、バイアル、カートリッジ、再使用可能シリンジ、または再使用可能自動注射器であってもよい；単位剤形は密閉され、さらに用量を示してもよい。
【００２１】
本発明はまた、ＰＣＳＫ９インヒビターの医薬組成物および容器を含み、いくつかの実施形態において、使用のための指示書も含む、製品またはキットを提供する。
【００２２】
本発明はまた、（ａ）対象におけるアテローム硬化型プラーク形成の阻害；（ｂ）卒中または心筋梗塞を患っている対象における、アテローム性動脈硬化症の処置またはその進行の阻害；または（ｃ）アテローム性動脈硬化症を有するまたは発症するリスクがあることが知られている非高脂血症性の対象における、アテローム性動脈硬化症の処置またはその進行の阻害のための医薬の製造におけるＰＣＳＫ９インヒビターを含む組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａ−Ｄは、１８週の処置期間後、いくつかのパラメータにおける、ｍＡｂ３１６Ｐ、アトルバスタチン、およびそれらの組合せの効果を示す一連のグラフを示す図である。図１Ａは平均血漿総コレステロールにおける効果を示す図である；図１Ｂはトリグリセリドレベルにおける効果を示す図である。図１Ｃおよび１Ｄは、処置の１２週後、ＦＰＬＣリポタンパク質分離し、ｍＡｂ３１６Ｐ単独（図１Ｃ）およびアトルバスタチンとの組合せ（図１Ｄ）の効果を試験することによって評価されるような、コレステロールに関するリポタンパク質プロファイルを示す図である。対照と比較して＊＊＊Ｐ＜０．００４５；アトルバスタチンと比較して†††Ｐ＜０．００４５；３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐと１０ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐを比較して‡‡‡Ｐ＜０．００４５（群当りｎ＝１５）。
【図２】図２Ａは、肝臓低密度リポタンパク質受容体タンパク質レベルにおける、ｍＡｂ３１６Ｐ、アトルバスタチン、およびそれらの組合せの効果のグラフを示す図である。対照と比較して＊＊＊Ｐ＜０．００４５；アトルバスタチンと比較して†Ｐ＜０．０５；††Ｐ＜０．０１；†††Ｐ＜０．００４５；３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐと１０ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐを比較して‡Ｐ＜０．０５（群当りｎ＝８）。図２Ｂは、非ＨＤＬコレステロールレベルにおける、ｍＡｂ３１６Ｐ、アトルバスタチン、およびそれらの組合せの効果のグラフを示す図である。対照と比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１；アトルバスタチンと比較して＃Ｐ＜０．０５；＃＃Ｐ＜０．０１；＃＃＃Ｐ＜０．００１。
【図３】図３Ａ−Ｆは、プラーク形態における、ｍＡｂ３１６Ｐ、アトルバスタチン、およびそれらの組合せの効果を示す一連の写真の図である。それぞれ、処置の１８週後、対照（図３Ａ）、３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐ（図３Ｂ）、１０ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐ（図３Ｃ）、アトルバスタチン（図３Ｄ）、３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐ＋アトルバスタチン（図３Ｅ）および１０ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐ＋アトルバスタチン（図３Ｆ）群についての大動脈起始部領域のクロスセクションにおける、ヘマトキシリン−フロキシン−サフラン−染色したアテローム硬化型病変の代表的なイメージ。
【図４】図４Ａ−Ｄは、大動脈起始部および大動脈弓のアテローム性動脈硬化症発生における、ｍＡｂ３１６Ｐ、アトルバスタチン、およびそれらの組合せの効果を示す一連のグラフを示す図である。処置の１８週後、クロスセクションあたりの総病変領域（図４Ａ）および病変の数（図４Ｂ）を評価した。病変重症度を評価し、病変なし、軽度（タイプＩ−ＩＩＩ）および重篤（タイプＩＶ−Ｖ）病変に分類した（図４Ｃ）。大動脈弓における総プラーク量（図４Ｄ）を、オイル−レッドＯ染色後に分析した。データは、染色された領域のパーセンテージとして表される。対照と比較して＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００４５；アトルバスタチンと比較して†Ｐ＜０．０５；††Ｐ＜０．０１；†††Ｐ＜０．００４５；３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐと１０ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐを比較して‡Ｐ＜０．０５；‡‡Ｐ＜０．０１；‡‡‡Ｐ＜０．００４５（起始部領域において群当りｎ＝８および大動脈弓においてｎ＝６〜７）。
【図５】図５は、平均血漿総コレステロールとアテローム硬化型病変領域の間の相関性を示すグラフの図である。病変領域の平方根を、平均総コレステロールに対してプロットした。直線回帰分析を行った。
【図６】図６は、病変組成における、ｍＡｂ３１６Ｐ、アトルバスタチン、およびそれらの組合せの効果を示す一連の写真の図である。対照ならびにｍＡｂ３１６Ｐ単独およびアトルバスタチンとの組合せでの処置の１８週後についての、マクロファージのＭａｃ−３での免疫染色、続いて平滑筋細胞（ＳＭＣ）のコラーゲンおよびアルファアクチンのシリウスレッド染色の代表的なイメージ。
【図７−１】７Ａ−Ｃは、病変組成における、ｍＡｂ３１６Ｐ、アトルバスタチン、およびそれらの組合せの効果を示す一連のグラフの図である。マクロファージ量（図７Ａ左）および壊死量（図７Ａ右）を、不安定化因子としてのコレステロール性裂ならびに安定化因子としてのＳＭＣ量（図７Ｂ左）およびコラーゲン量（図７Ｂ右）を含めて、病変サイズに関して是正後に重篤（タイプＩＶ−Ｖ）な病変において決定した。対照と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；アトルバスタチンと比較して＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１。プラーク安定性指標を、安定化因子と不安定化因子の比として計算した（図７Ｃ）。対照と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００４５；アトルバスタチンと比較して†Ｐ＜０．０５、†††Ｐ＜０．００４５；３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐを１０ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐと比較して‡Ｐ＜０．０５（群当りｎ＝１５）。
【図７−２】図７−１の続き。
【図８】図８Ａ−Ｃは、血管炎症のマーカーにおける、ｍＡｂ３１６Ｐ、アトルバスタチン、およびそれらの組合せの効果を示す一連のグラフの図である。内皮に接着している単球の数（図８Ａ）および大動脈起始部領域におけるＴ細胞の数（図８Ｂ）を、クロスセクションあたり決定した。加えて、細胞接着分子１（ＩＣＡＭ−１）を、染色された領域のパーセンテージとして決定した（図８Ｃ）。代表的なイメージを含ませた。対照と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００４５；アトルバスタチンと比較して†Ｐ＜０．０５、†††Ｐ＜０．００４５。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明が記載される前に、方法および条件は変動し得ることから、本発明は記載される特定の方法および実験条件に限定されるものではないことが理解される。また、本明細書に使用される用語は特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、本発明の範囲は添付請求の範囲だけによって限定されることから、限定することを意図とするものではないことが理解される。
【００２５】
他に規定されない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される用語「約」は、特に記載された数値を参照して使用される場合に、その値が記載された値から１％以下まで変動し得ることを意味する。例えば、本明細書に使用される表現「約１００」は、９９および１０１ならびにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。
【００２６】
本明細書に記載のものと同様または同等のいずれの方法および材料を本発明の実施において使用されることができるが、例示的な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物および本明細書に同時に出願される配列表は、参照によって本明細書にそれらの全体が組み入れられる。
【００２７】
アテローム性動脈硬化を阻害するための方法
本発明の方法は、アテローム性動脈硬化症を有するまたは発症するリスクのある対象を選択すること、およびこれらの対象にＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物を投与することを含む。
【００２８】
アテローム性動脈硬化症のリスク因子は、当業者に周知されており、高い低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベル、低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールレベル、高血圧症、真性糖尿病、家族歴、男性の性別、タバコの煙、および高い血清コレステロールを含むが、これらに限定されない。所与の対象について、これらのリスク因子を評価する方法も、当業者に周知されている。
【００２９】
ある実施形態において、選択される対象は非高脂血症性である。「非高脂血症性」は、非高コレステロール血症性および／または非高トリグリセリド血症性対象である対象である。「非高コレステロール血症性」は、高コレステロール血症対象に関して確立された現行の判定基準に適合しない対象である。「非高トリグリセリド血症性」は、高トリグリセリド血症対象に関して確立された現行の判定基準に適合しない対象である（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１３ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙを参照されたい）。高コレステロール血症対象は、＞１６０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬレベル、または＞１３０ｍｇ／ｄＬおよび男性の性別、早発性冠状動脈性心疾患の家族歴、タバコ喫煙（１日当り１０を超える）、高血圧症、低いＨＤＬ（＜３５ｍｇ／ｄＬ）、真性糖尿病、
高インスリン血症、腹部肥満、高いリポタンパク質（ａ）、および脳血管障害または閉塞性末梢血管疾患の個人歴からなる群から選択される少なくとも２つのリスク因子を有する。高トリグリセリド血症対象は、＞２５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド（ＴＧ）レベルを有する。したがって、非高脂血症性の対象は、コレステロールおよびトリグリセリドレベルが、高コレステロール血症および高トリグリセリド血症対象の双方に関して上記のように設定された限度未満であるものと規定される。ある実施形態において、選択される対象は、非高脂血症性でも高脂血症の処置を受けてもいない。
【００３０】
ある実施形態において、選択される対象は見かけ上健康である。本明細書に使用される「見かけ上健康」は、心筋梗塞などの急性で有害な心血管事象を以前に有していなかった個体（すなわち、一次的な有害な心血管事象による、二次的な有害な心血管事象の上昇したリスクがない個体）を意味する。見かけ上健康な個体はまた、疾患の症状を他に示さない。
【００３１】
ある実施形態において、選択される対象は、急性の有害な心血管事象、例えば、心筋梗塞、卒中、狭心症および／または末梢性の動脈管疾患を以前に患っている。一実施形態において、選択される対象は、急性の有害な心血管事象、例えば、心筋梗塞、卒中、狭心症および／または末梢性の動脈管疾患を以前に患っているが、非高脂血症性である。一実施形態において、選択される対象は、急性の有害な心血管事象、例えば、心筋梗塞、卒中、狭心症および／または末梢性の動脈管疾患を以前に患っているが、非高脂血症性でも高脂血症の処置を受けてもいない。
【００３２】
ある実施形態において、選択される対象は、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病、川崎病、慢性炎症性疾患、および高血圧症からなる群から選択される疾患または障害を有する。一実施形態において、選択される対象は、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病、川崎病、慢性炎症性疾患、および高血圧症からなる群から選択される疾患または障害を有するが、非高脂血症性である。一実施形態において、選択される対象は、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病、川崎病、慢性炎症性疾患、および高血圧症からなる群から選択される疾患または障害を有するが、非高脂血症性でも高脂血症の処置を受けてもいない。
【００３３】
ある実施形態において、選択される対象は、炎症マーカーのレベルが上昇している。一実施形態において、選択される対象は、炎症マーカーのレベルが上昇しているが、非高脂血症性である。全身性炎症の任意のマーカーを、本発明の目的に利用し得る。好適な炎症マーカーは、Ｃ反応性タンパク質（例えば、参照によりそれらの全体において組み入れられる、米国特許第７，９６４，６１４号を参照されたい、）、サイトカイン（例えば、Ｉｌ−６、ＩＬ−８、および／またはＩＬ−１７）、および細胞接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＢＬ−ＣＡＭ、ＬＦＡ−２、ＶＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ、およびＰＥＣＡＭ）を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
炎症マーカーのレベルは、任意の当業者によって認識されるアッセイによって得ることができる。典型的には、レベルは、体液、例えば、血液、リンパ、唾液、尿などにおけるマーカーのレベルを測定することによって測定される。レベルは、マーカーの存在を決定するためのＥＬＩＳＡ、もしくはイムノアッセイまたは他の従来技術によって決定することができる。炎症マーカーのレベルが上昇するかを決定するために、対象において測定されるマーカーのレベルを好適な対照（例えば、所定値および／または適合健康対象から得られた値）と比較することができる。
【００３５】
一実施形態において、本発明は、対象におけるアテローム硬化型プラーク形成の阻害、ならびに対象におけるアテローム性動脈硬化症の処置またはその進行の阻害に使用するための、ＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物を提供する。
【００３６】
本発明はまた、アテローム硬化型プラーク形成の阻害、および対象におけるアテローム性動脈硬化症の処置またはその進行の阻害を含む、本明細書に記載される任意の方法のための医薬の製造のためのＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物の使用を提供する。
【００３７】
ＰＣＳＫ９インヒビター
ある態様において、本発明の方法は、対象にＰＣＳＫ９インヒビターを含む治療的組成物を投与することを含む。
【００３８】
本明細書で使用される「ＰＣＳＫ９インヒビター」は、インビトロまたはインビボで、ヒトＰＣＳＫ９と結合するまたは相互作用するおよびＰＣＳＫ９の正常な生物学的機能を阻害する、任意の剤である。ＰＣＳＫ９インヒビターのカテゴリーの非限定的例は、小分子ＰＣＳＫ９アンタゴニスト、拮抗性核酸分子（例えば、ＲＮＡｉ分子）ペプチドベースＰＣＳＫ９アンタゴニスト（例えば、「ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）」分子）、およびヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを含む。
【００３９】
本明細書で使用される用語「プロタンパク質コンバターゼ  サブチリシン／ケキシンタイプ９」または「ＰＣＳＫ９」は、配列番号１９７に示される核酸配列および配列番号１９８のアミノ酸配列を有するＰＣＳＫ９、または生物学的に活性なそのフラグメントをいう。
【００４０】
ある実施形態において、ＰＣＳＫ９インヒビターの投与は、未処置の対象におけるアテローム硬化型プラーク形成に対して、対象（例えば、ヒト対象）におけるアテローム硬化型プラーク形成を少なくとも１０％（例えば、１０％  ２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）減少させる。
【００４１】
ある実施形態において、ＰＣＳＫ９インヒビターは、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体または抗原結合タンパク質である。本明細書に使用される用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互連結された２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）をいう。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ  ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域で分散されている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、下記の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。本発明の異なる実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよいまたは天然でまたは人工的に修飾し得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲのサイド−バイ−サイド分析に基づいて規定し得る。
【００４２】
本明細書に使用される用語「抗体」はまた、完全抗体分子および抗原結合タンパク質の抗原結合フラグメントを含む。本明細書に使用される用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」、「抗原結合タンパク質」などは、複合体を形成するために抗原を特異的に結合する、任意の自然発生、酵素的に得られる、合成、または遺伝的に操作されたポリペプチドもしくは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、タンパク質分解のような任意の好適な標準的技術、または抗体の可変および場合
により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現にかかわる組換遺伝子操作技術を用いて、例えば、完全抗体分子から導き得る。そのようなＤＮＡは、公知であり、および／または例えば、商業ソース、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から利用可能であり、もしくは合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つまたはそれ以上の可変および／または定常ドメインを好適な立体配置に配置するために、またはコドンを導入し、システイン残基を作出し、アミノ酸を修飾し、付加しまたは欠失させる等のために、化学的にまたは分子生物学的技術を用いることによって配列決定され、操作される。
【００４３】
抗原結合フラグメントまたは抗原結合タンパク質の非限定的例は：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、または拘束性ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位を含む。ドメイン特異抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小分子免疫医薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の改変分子も、本明細書に使用される表現「抗原結合フラグメント」および「抗原結合タンパク質」内に包含される。
【００４４】
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であってよく、に１つまたはそれ以上のフレームワーク配列に隣接するまたはそれとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを一般的に含む。ＶＬドメインに関連するＶＨドメインを有する抗原結合フラグメントでは、ＶＨおよびＶＬドメインは互いに任意の好適な配置に対して位置付けられる。例えば、可変領域は二量体であってよく、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含有する。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶＨまたはＶＬドメインを含有してよい。
【００４５】
ある実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含有してよい。非限定的な、本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見出される可変および定常ドメインの例示的立体配置は：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬを含む。上記に掲載された任意の例示的立体配置を含む、可変および定常ドメインの任意の立体配置において、可変および定常ドメインは、互いに直接結合されるかまたは完全なもしくは部分的なヒンジまたはリンカー領域によって結合される。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子中で隣接した可変および／または定常ドメイン間のフレキシブルまたはセミフレキシブル結合をもたらす、少なくとも２つ（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０またはそれ以上）のアミノ酸からなり得る。その上、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いとおよび／または１つまたはそれ以上の単量体ＶＨまたはＶＬドメインとの非共有結合（例えば、ジスルフィド結合による）において、上記に掲載された任意の可変および定常ドメイン立体配置のホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含んでよい。
【００４６】
完全抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単一特異性または多重特異性（例え
ば、二重特異性）であってよい。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、ここで各可変ドメインは別々の抗原または同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合する能力がある。本明細書に開示の例示的二重特異性抗体フォーマットを含む、任意の多重特異性抗体フォーマットは、当技術分野で利用可能なルーチン技術を用いて本発明の抗体の抗原結合フラグメントとの関連で使用するのに適合される。
【００４７】
抗体の定常領域は、補体を固定し、細胞依存性細胞傷害を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、細胞傷害を媒介する抗体に望ましいかどうかの基礎のもとに選択される。
【００４８】
本明細書に使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本発明のヒト抗体は、それでも、例えばＣＤＲおよび特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコード化されないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含んでよい。しかしながら、本明細書に使用される用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種、例えばマウス、の生殖細胞系列から由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列へグラフトされている、抗体を含むことを意図していない。
【００４９】
本明細書に使用される用語「組換えヒト抗体」は、宿主細胞にトランスフェクトされる組換え発現ベクター用いて発現される抗体（以下でさらに記載される）、組換え型コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体（以下でさらに記載される）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離される抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照されたい）、または他のＤＮＡ配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングが関与している任意の他の手段により調製、発現、作出または単離される抗体などの、組換え手段により調製、発現、作出または単離される全てのヒト抗体を含むことを意図している。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある実施形態では、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についての動物トランスジェニックが使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発）に供されるため、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来しそれらに関連するが、インビボにてヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然に存在しないことがある。
【００５０】
ヒト抗体は、ヒンジ不均一性に関連する二形態で存在し得る。第一形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されるおよそ１５０〜１６０ｋＤａの安定な四鎖構築物を含む。第二形態では、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって結合されず、約７５〜８０ｋＤａの分子が共有結合性にカップルした軽鎖および重鎖（半抗体）から構成され形成される。これらの形態は、親和性精製後でさえ、分離することは極度に困難である。
【００５１】
様々なインタクトＩｇＧアイソタイプにおける第二形態の出現の頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の差違に因るが、これに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて典型的に観測されるレベルにまで、第二形態の出現を有意に減少し得る（例えば、Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：１０５を参照されたい）。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１つまたはそれ以上の変異を有する抗体を包含し、これは、例えば産生において、望まれる抗体形態の収率を改善す
るため望ましい。
【００５２】
本明細書に使用される「単離された抗体」は、その天然環境の少なくとも１つ成分から同定および分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物体の少なくとも１つ成分から、または抗体が天然で存在するまたは天然で産生される組織または細胞から、分離または除去された抗体は、本発明の目的に関する「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内のインサイチュでの抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離ステップに供された抗体である。ある実施形態によると、単離された抗体は、他の細胞の物質および／または化学物質が実質的に無いものである。
【００５３】
用語「特異的に結合する」などは、抗体またはその抗原結合タンパク質が生理的条件下に比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。抗体が抗原に特異的に結合するかを決定するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。例えば、本発明の関連で使用されるＰＣＳＫ９に「特異的に結合する」抗体は、約１０００ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満または約０．５ｎＭ未満と表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定されるＫＤで、ＰＣＳＫ９またはその部分と結合する抗体を含む。しかしながら、ヒトＰＣＳＫ９と特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば他の（非ヒト）種からのＰＣＳＫ９分子との交差反応性を有し得る。
【００５４】
例示的な非限定的なＰＣＳＫ９インヒビターは、本明細書に記載され、例えば、各々が本明細書中に参照によりそれらの全体において組み入れられる、米国特許出願公開ＵＳ２０１３０１１５２２３、ＵＳ２０１３００７１４０５、ＵＳ２０１３００６４８３４、ＵＳ２０１３００６４８２５、ＵＳ２０１２０１２２９５４、ＵＳ２０１２００１５４３５、ＵＳ２０１１０３１３０２４、ＵＳ２０１１００１５２５２、ＵＳ２０１１０２３０５４２、ＵＳ２０１１０００９６２８、およびＵＳ  Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｕｍｂｅｒ  ６１／６８２，３４９に記載されたインヒビターを含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９インヒビターは、国際公開第ＷＯ２０１１／０７２２６３号に記載されたＡｂ「ＬＧＴ２０９」のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体；国際公開第ＷＯ２０１０／０２９５１３号に記載されたＡｂ「Ｌ１Ｌ３」のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体；国際公開第ＷＯ２０１１／１１１００７号に記載されたＡｂ「５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３」のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体；国際公開第ＷＯ２０１１／１１１００７号に記載されたＡｂ「５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３」のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体；国際公開第ＷＯ２００９／０２６５５８号に記載されたＡｂ「３１Ｈ４」のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体；米国特許出願公開第ＵＳ２００９／０２３２７９５号に記載されたＡｂ「１Ｂ２０」のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体；米国特許出願公開第ＵＳ２００９／０１４２３５２号に記載されたＡｂ「２１Ｂ１２」のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体；米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／０１９５９１０号に記載されたＡｂ「５０８．２０．２８」のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体；または米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／０１９５９１０号に記載されたＡｂ「５０８．２０．３３」のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体を含む、抗体である。
【００５５】
本発明の方法および組成物において有用な抗ＰＣＳＫ９抗体は、抗体が由来する対応する生殖細胞系配列と比べて、重鎖および軽鎖の可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含んでよい。そのような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから利用可能な生殖細胞系配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示のいずれかのアミノ酸配列から由来する抗体、
およびその抗原結合フラグメントの使用にかかわる方法を含み、ここで１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つまたはそれ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖細胞系配列の対応する残基に、または別のヒト生殖細胞系配列の対応する残基に、または対応する生殖細胞系列残基の保存的アミノ酸置換に突然変異される（そのような配列変化は本明細書において総称して「生殖細胞系突然変異」といわれる）。本明細書に開示の重鎖および軽鎖可変領域配列を始めとして、当業者は、１つまたはそれ以上の個々の生殖細胞系突然変異またはその組合せを含む、多数の抗体および抗原結合フラグメントを容易に産生することができる。ある実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全ては、抗体が由来する元の生殖細胞系配列に見出される残基に復帰突然変異される。他の実施形態において、ある残基だけ、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内またはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見出される変異残基だけ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３内に見出される変異残基だけが元の生殖細胞系配列に復帰突然変異される。他の実施形態において、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／または１つまたは複数のＣＤＲ残基は、異なる生殖細胞系配列（すなわち、抗体が元々由来する生殖細胞系配列と異なる生殖細胞系配列）の対応する残基に突然変異される。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の２つまたはそれ以上の生殖細胞系突然変異の任意の組合せを含んでもよく、例えば、ここである個々の残基は、特定の生殖細胞系配列の対応する残基に突然変異され、一方で元の生殖細胞系配列と異なるある他の残基は維持され、または異なる生殖細胞系配列の対応する残基に突然変異される。一度得られると、１つまたはそれ以上の生殖細胞系突然変異を含有する抗体およびその抗原結合フラグメントは、結合特異性改善、結合親和性増加、アンタゴニストまたはアゴニスト生物学的特性の改善または強化（場合に応じて）、免疫原性低減等のような１つまたはそれ以上の望まれる性質を容易に検査されることができる。この一般的な様式で得られる抗体および抗原結合フラグメントの使用は、本発明内に包含される。
【００５６】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の保存的置換を有する本明細書に開示のいずれかのＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のバリアントを含む抗ＰＣＳＫ９抗体の使用にかかわる方法を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示のいずれかのＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列に対して、例えば、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１の保存されたアミノ酸置換でＨＣＶＲ；ＬＣＶＲ；ＣＤＲ；ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ；ＨＣＶＲおよびＣＤＲ；ＬＣＶＲおよびＣＤＲ；またはＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよびＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＰＣＳＫ９抗体の使用を含む。ある実施形態において、置換は、ＣＤＲアミノ酸配列、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３にある。他の実施形態、他の実施形態において、置換は、ＣＤＲ３アミノ酸配列にある。
【００５７】
本明細書に使用される用語「表面プラズモン共鳴」は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、バイオセンサマトリックス内のタンパク質濃度変化の検出により、リアルタイム相互作用の解析を可能にする光学的現象をいう。
【００５８】
本明細書に使用される用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数をいうことが意図される。
【００５９】
用語「エピトープ」は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特異的な抗原結合部位と結合する抗原決定基をいう。単一抗原は、一を超えるエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原における異なる領域に結合し得るおよび異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座的または直鎖状であってよい。立体配座
的エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並んだアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある環境において、エピトープは、抗原において糖、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
【００６０】
ある実施形態によると、本発明の方法に使用される抗ＰＣＳＫ９抗体は、ｐＨ依存的な結合特性を有する抗体である。本明細書で使用される、表現「ｐＨ依存的な結合」は、抗体または抗原結合タンパク質が、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＰＣＳＫ９との結合の減少」を示すことを意味する（本発明の開示の目的のため、両方の表現を互換的に使用し得る）。例えば、「ｐＨ依存的な結合特性を有する」抗体は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨでより高い親和性でＰＣＳＫ９に結合する、抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。ある実施形態において、本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、酸性ｐＨよりも中性ｐＨで、少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００倍以上より高い親和性でＰＣＳＫ９に結合する。
【００６１】
本発明のこの態様によると、ｐＨ依存的な結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体は、親抗ＰＣＳＫ９抗体に対して、１つまたはそれ以上のアミノ酸バリエーションを有し得る。例えば、ｐＨ依存的な結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体は、例えば、親抗ＰＣＳＫ９抗体の１つまたはそれ以上のＣＤＲにおいて、１つまたはそれ以上のヒスチジン置換または挿入を含有し得る。したがって、本発明のある実施形態によると、親抗体の１つまたはそれ以上のＣＤＲの１つまたはそれ以上のアミノ酸のヒスチジン残基での置換を除いて、親抗ＰＣＳＫ９抗体のＣＤＲアミノ酸配列と同一である、ＣＤＲアミノ酸配列（例えば、重鎖および軽鎖ＣＤＲ）を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体を投与することを含む方法が提供される。ｐＨ依存的な結合を有する抗ＰＣＳＫ９抗体は、親抗体の単一ＣＤＲ内または親抗ＰＣＳＫ９抗体の複数（例えば、２、３、４、５、または６）ＣＤＲにわたり分布する、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９以上のヒスチジン置換を有し得る。例えば、本発明は、親抗ＰＣＳＫ９抗体の、ＨＣＤＲ１中に１つまたはそれ以上のヒスチジン置換、ＨＣＤＲ２中に１つまたはそれ以上のヒスチジン置換、ＨＣＤＲ３中に１つまたはそれ以上のヒスチジン置換、ＬＣＤＲ１中に１つまたはそれ以上のヒスチジン置換、ＬＣＤＲ２中に１つまたはそれ以上のヒスチジン置換、および／またはＬＣＤＲ３中に１つまたはそれ以上のヒスチジン置換を含む、ｐＨ依存的な結合を有する抗ＰＣＳＫ９抗体の使用を含む。
【００６２】
本明細書に使用される、表現「酸性ｐＨ」は、６．０以下（例えば、約６．０未満、約５．５未満、約５．０未満等）のｐＨを意味する。表現「酸性ｐＨ」は、約６．０、５．９５、５．９０、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０以下のｐＨ値を含む。本明細書に使用される、表現「中性ｐＨ」は、約７．０〜約７．４のｐＨを意味する。表現「中性ｐＨ」は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、および７．４のｐＨ値を含む。
【００６３】
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成する方法は当技術分野で公知である。いずれかのそのような公知方法は、ヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合するヒト抗体を作るために本発明の関連で使用されることができる。
【００６４】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術またはモノクローナル抗体を生成する任意の他の公知の方法を用いて、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するＰＣＳＫ９に対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術には、
マウスが、抗原刺激に応答してヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内因性マウス定常領域座に作動可能に連結されたヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの生成が関与する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、単離され、ヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ＤＮＡは、次いで完全ヒト抗体を発現する能力がある細胞において発現される。
【００６５】
一般に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは目的とする抗原でチャレンジされ、リンパ性細胞（例えば、Ｂ細胞）は抗体を発現するマウスから回収される。リンパ性細胞をミエローマ細胞株と融合して不死化ハイブリドーマ細胞株を調製し得る、このようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、目的とする抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、単離し、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域に連結し得る。そのような抗体タンパク質を、ＣＨＯ細胞などの細胞において産生し得る。あるいは、抗原特異的なキメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを、抗原特異的なリンパ球から直接単離し得る。
【００６６】
最初に、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、高親和性キメラ抗体が単離される。抗体は、特徴付けられ、親和性、選択性、エピトープ等を含めた、望ましい特性について、当業者に公知の標準的な手順を用いて選択される。マウス定常領域は、野生型ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４、または修飾型ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４などの、本発明の完全ヒト抗体を生成するために、望まれるヒト定常領域で置き換えられる。選択された定常領域が特殊用途に従って変わり得る一方で、高親和性抗原結合および標的特異性特性は可変領域に存在する。
【００６７】
一般に、本発明の方法に使用することができる抗体は、上記のように、固相に固定化されるかまたは液相で抗原に結合することにより測定される場合に、高親和性を有する。マウス定常領域は、本発明の完全ヒト抗体を生成するために、望まれるヒト定常領域で置き換えられる。選択された定常領域が特殊用途に従って変わり得る一方で、高親和性抗原結合および標的特異性特性は可変領域に存在する。
【００６８】
本発明の方法の関連で使用されることができるＰＣＳＫ９に特異的に結合するヒト抗体または抗体の抗原結合フラグメントの具体例には、配列番号１および１１または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を有する実質的なその類似配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）を含む、任意の抗体または抗原結合性フラグメントが含まれる。あるいは、本発明の方法の関連で使用されることができるＰＣＳＫ９に特異的に結合するヒト抗体または抗体の抗原結合フラグメントの具体例には、配列番号３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５、９３、１０１、１０９、１１７、１２５、１３３、１４１、１４９、１５７、１６５、１７３、１８１、および１８９または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を有する実質的なその類似配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）を含む、任意の抗体または抗原結合性フラグメントが含まれる。抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号６および１５または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を有する実質的なその類似配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＶＲ１、ＬＣＶＲ２、ＬＣＶＲ３）を含んでよい。あるいは、抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号４１、４９、５７、６５、７３、８１、８９、９７、１０５、１１３、１２１、１
２９、１３７、１４５、１５３、１６１、１６９、１７７、１８５、および１９３または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を有する実質的なその類似配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＶＲ１、ＬＣＶＲ２、ＬＣＶＲ３）を含んでよい。
【００６９】
２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、最適配列アラインメントを用いて、参照アミノ酸配列（すなわち、配列番号で識別されるアミノ酸配列）の全体長に対しおよび／または２つのアミノ酸配列間の最適配列アラインメントの領域に対し決定され、ここで、最適配列アラインメントは、公知のツール、例えば、Ａｌｉｇｎ、標準設定を用いて、好ましくは、ＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５で得ることができる。
【００７０】
本発明のある実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号１／６および１１／１５からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）からの６つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む。あるいは、本発明のある実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号３７／４１、４５／４９、５３／５７、６１／６５、６９／７３、７７／８１、８５／８９、９３／９７、１０１／１０５、１０９／１１３、１１７／１２１、１２５／１２９、１３３／１３７、１４１／１４５、１４９／１５３、１５７／１６１、１６５／１６９、１７３／１７７、１８１／１８５、および１８９／１９３からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）からの６つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む。
【００７１】
本発明のある実施形態において、本発明の方法に使用することができる抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号２／３／４／７／８／１０（ｍＡｂ３１６Ｐ）および１２／１３／１４／１６／１７／１８（ｍＡｂ３００Ｎ）（米国特許出願公開第２０１０／０１６６７６８号を参照されたい）および１２／１３／１４／１６／１７／１８から選択されるＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、ここで、配列番号１６は、アミノ酸残基３０でのロイシンについてヒスチジンの置換（Ｌ３０Ｈ）を含む。
【００７２】
本発明のある実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号１／６および１１／１５からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。ある例示的な実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号１のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号６のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。ある例示的な実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号１１のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号１５のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。ある例示的な実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号１１のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号１５のＬＣＶＲアミノ酸配列であって、アミノ酸残基３０でのロイシンについてヒスチジンの置換（Ｌ３０Ｈ）を含むアミノ酸配列を含む。
【００７３】
ある実施形態において、抗体または抗原結合タンパク質は、ＡＰＯＥ＊３Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスに毎週の皮下注射により投与した場合に、下記の特性の１つまたはそれ以上を示す：
ａ．３ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、未処理対照群に対して約３７％総コレステロールレベルを減少させる；
ｂ．１０ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、未処理対照群に対して約４６％総コレステロールレベルを減少させる；
ｃ．３ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、未処理対照群に対して約４８％総コレステロールレベルを減少させる；
ｄ．１０ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、未処理対照群に対して約５８％総コレステロールレベルを減少させる；
ｅ．３ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチン単独での処置に対して、約３６％総コレステロールレベルを減少させる；
ｆ．１０ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチン単独での処置に対して、約４８％総コレステロールレベルを減少させる；
ｇ．３ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、未処理対照群に対して約３３％トリグリセリドレベルを減少させる；
ｈ．１０ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、未処理対照群に対して約３６％トリグリセリドレベルを減少させる；
ｉ．３ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンでの処置に対して、約４０％トリグリセリドレベルを減少させる；
ｊ．１０ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチン単独と組み合わせて投与する場合に、３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンでの処置に対して、約５１％トリグリセリドレベルを減少させる；
ｋ．３ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、未処理対照群に対して肝臓ＬＤＬＲ発現を増加させる；
ｌ．１０ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、未処理対照群に対して約１７８％肝臓ＬＤＬＲ発現を増加させる；
ｍ．３ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチン単独での処置に対して、約７１％肝臓ＬＤＬＲ発現を増加させる；
ｎ．１０ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチン単独での処置に対して、約１４０％肝臓ＬＤＬＲ発現を増加させる；
ｏ．３ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、未処理対照群に対して約７０％アテローム硬化型病変サイズを減少させる；
ｐ．１０ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、未処理対照群に対して約８７％アテローム硬化型病変サイズを減少させる；
ｑ．３ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、未処理対照群に対して約８８％アテローム硬化型病変サイズを減少させる；
ｒ．１０ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、未処理対照群に対して約９８％アテローム硬化型病変サイズを減少させる；
ｓ．３ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチン単独での処置に対して、約８２％相対アテローム硬化型病変サイズを減少させる；
ｔ．１０ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチン単独での処置に対して、約９７％相対アテローム硬化型病変サイズを減少させる；
ｕ．３ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチン単独での処置に対して、約７２％トリグリセリドレベルを減少させる；
ｖ．１０ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチン単独での処置に対して、約７９％トリグリセリドレベルを減少させる；
ｗ．３ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチン単独での処置に対して、約２２％総コレステロールレベルを減少させる；
ｘ．１０ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチン単独での処置に対して、約３４％総コレステロールレベルを減少させる；
ｙ．３ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、未処理対照群に対して約２３６％未病大動脈セグメントのパーセンテージを増加させる；
ｚ．１０ｍｇ／ｋｇで投与する場合に、未処理対照群に対して約５４９％未病大動脈セグメントのパーセンテージを増加させる；
ａａ．３ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、対照に対して約６０７％未病大動脈セグメントのパーセンテージを増加させる；および
ｂｂ．３ｍｇ／ｋｇを３．６ｍｇ／ｋｇ／日アトルバスタチンと組み合わせて投与する場合に、対照に対して約１１１８％未病大動脈セグメントのパーセンテージを増加させる。
【００７４】
医薬組成物および投与の方法
本発明は、対象にＰＣＳＫ９インヒビターを投与することを含む方法であって、ＰＣＳＫ９インヒビターが医薬組成物内に含有される方法を含む。本発明の医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、および適切な移動、送達、耐容性などをもたらす他の剤で製剤化される。多数の適切な製剤は、全ての薬化学者に公知の処方集に見出されることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）。これらの製剤は、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ジェリー剤、ワックス、オイル、脂質類、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）を含有する脂質（陽イオン性または陰イオン性）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト剤、水中油および油中水乳剤、乳剤カルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、およびカルボワックスを含有する半固形混合物を含む。Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ
ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」
ＰＤＡ  （１９９８）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１も参照されたい。
【００７５】
種々の送達システムは、公知であり、本発明の医薬組成物を投与するのに使用されることができ、例えば、リポソームへのカプセル化、マイクロ粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現する能力がある組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）。投与の方法は、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、吸入、および経口経路を含む。組成物は、任意の従来の経路により、例えば、点滴およびボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚ライニング（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜等）を介した吸収により投与されて、他の生物学的に活性な因子と併せて投与される。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、標準針およびシリンジで皮下または静脈内に送達されることができる。加えて、ペン送達デバイスおよび自動注射器送達デバイスは、本発明の医薬組成物を送達するのに容易に用途を有する。そのような送達デバイスは、再使用可能または使い捨てであり得る、また可変用量または一定用量を投与するため適合し得る。再使用可能送達デバイスは一般に、医薬組成物を含有する交換可能カートリッジを利用する。一度カートリッジ内の全ての医薬組成物が投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは容易に廃棄されることができて、医薬組成物を含有する新しいカートリッジで置き換えられる。送達デバイスは、次に再使用されることができる。使い捨て送達デバイスでは、置き換え可能カートリッジはない。むしろ、使い捨て送達デバイスは、デバイス内のリザーバ中に保持された医薬組成物をプレフィルドされてくる。一度リザーバで医薬組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。可変性の投薬に適合される送達デバイスは、用量容積の範囲内に用量を設定するための機構を含んでもよい（いくつかのケースでは
、範囲をカートリッジに含有される総容積未満の値に制限し得る）。固定性の投薬に適合される送達デバイスは、送達デバイスが作動する場合に、カートリッジの総容積を送達する機構を含んでもよい。そのようなケースでは、カートリッジは、プレフィルドシリンジであってよい。
【００７７】
多数の送達デバイスが、本発明の医薬組成物の送達に用途を有する。ほんのわずかの例には、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ
ＭＩＸ  ７５／２５１ｍペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれるが、限定されない。ほんのわずかの、本発明の医薬組成物の皮下送達に適用を有する使い捨てペン送達デバイスの例には、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射器（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）、ならびにＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）が含まれるが、限定されない。いくつかの実施形態において、再使用可能ペンまたは自動注射器は、一定用量を送達する。他の実施形態において、再使用可能ペンまたは自動注射器は、可変用量を送達することができる。異なる実施形態において、再使用可能ペンまたは自動注射器は、単回用量または複数回用量を送達することができる。
【００７８】
ある実施形態において、医薬組成物は、制御放出システムで送達される。ある実施形態において、マイクロポンプを含めた、ポンプを使用し得る（Ｌａｎｇｅｒ、ｓｕｐｒａ；
Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．
１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態において、高分子材料を使用することができる；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ  （ｅｄｓ．）、１９７４、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。なお別の実施形態において、制御放出システムは、組成物の標的の近傍に入れられることができるため、全身用量のわずかだけを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、１９８４、ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ｓｕｐｒａ、ｖｏｌ．  ２、ｐｐ．  １１５−１３８を参照されたい）。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３による総説において論じられている。
【００７９】
注射可能製剤は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴等のための剤形を含んでよい。これらの注射可能製剤は、公知の方法によって調製してもよい。例えば、注射可能製剤は、例えば、上記の抗体またはその塩を通常注射に使用される水性媒体または油性媒体に溶解、懸濁または乳化することによって調製してもよい。注射のための水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースを含有する等張液、およびアルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］等の適切な可溶化剤と組み合わせて使用し得る他の補助剤等がある。油性媒体としては、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の可溶化剤と組み合わせて使用し得るゴマ油、ダイズ油等が用いられる。そのように調製される注射は、適切なアンプルに充填される。
【００８０】
有利なこととして、上記に記載の経口または非経口使用のための医薬組成物は、有効成分の用量を適合させるのに適している単位用量での剤形に調製される。本明細書に使用される「単位剤形」は、それぞれ単位が、薬学的な希釈剤、担体またはビヒクルとの結合において望まれる治療効果を産するよう計算した活性物質（すなわち、ＰＣＳＫ９インヒビター）の所定量を含有する、ヒトおよび／または動物対象のための単一剤形として好適な物理的に個別の単位をいう。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９インヒビターは抗体または抗原結合タンパク質であり、単位剤形は７５ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、または３００ｍｇの抗体または抗原結合タンパク質を含む。液体医薬組成物のための好適な単位剤形の例は、アプリケーター、例えば、バイアル、プレフィルドシリンジおよび再使用可能シリンジを含めた、シリンジ、プレフィルド自動注射器および再使用可能自動注射器を含めた、自動注射器、カートリッジ、ならびにアンプルを含む；他の好適な単位剤形は、錠剤、丸剤、カプセル、坐剤、ウエハ、前述のいずれかの分割された複数のもの、ならびに本明細書に記載のようなまたは一般に当技術分野において知られている他の形態を含む。単位剤形を、密閉してもよい。アプリケーター内に医薬組成物を含有する単位剤形のため、ＰＣＳＫ９インヒビターの量をアプリケーターに示してもよい。
【００８１】
本発明は、（ａ）本発明の医薬組成物を含む１つまたはそれ以上の単位剤形、および（ｂ）容器またはパッケージを含む製品またはキットを含む。製品またはキットは、（ｃ）標識または使用のための指示書を伴うパッケージ添付物をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、製品は、（ｄ）脂質修飾療法の１つまたはそれ以上の単位剤形（例えば、活性成分としてＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターを含む錠剤のブリスター）をさらに含むことができる。
【００８２】
用量および投与レジメン
本発明の方法および組成物に従って対象に投与されるＰＣＳＫ９インヒビター（例えば、抗ＰＣＳＫ９抗体）の量は、一般に、治療的有効量である。本明細書に使用される語句「治療的有効量」は、アテローム硬化型病変において検出可能な減少をもたらすＰＣＳＫ９インヒビターの用量を意味する。例えば、ＰＣＳＫ９インヒビターの「治療的有効量」は、例えば、本明細書の例で示されているように、ヒト患者に投与される場合に、例えば、硬化性病変領域または病変重症度において少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少を引き起こすＰＣＳＫ９インヒビターの量を含む。あるいは、動物モデルを使用して、候補ＰＣＳＫ９インヒビターの特定量が治療的有効量かどうかを確立することができる。
【００８３】
抗ＰＣＳＫ９抗体のケースにおいて、治療的有効量は、抗ＰＣＳＫ９抗体の約０．０５ｍｇ〜約６００ｍｇ、例えば、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１．０ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２．０ｍｇ、約３ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２７０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２９０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３１０ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３３０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３７０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約３９０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４１０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４３
０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４７０ｍｇ、約４８０ｍｇ、約４９０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５１０ｍｇ、約５２０ｍｇ、約５３０ｍｇ、約５４０ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５６０ｍｇ、約５７０ｍｇ、約５８０ｍｇ、約５９０ｍｇ、または約６００ｍｇであってよい。
【００８４】
ある実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体は、７５ｍｇの用量で対象に投与される。ある実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体は、１５０ｍｇの用量で対象に投与される。ある実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体は、３００ｍｇの用量で対象に投与される。
【００８５】
個々の用量内に含有される抗ＰＣＳＫ９抗体の量は、患者体重の１キログラム当りの抗体のミリグラム（すなわち、ｍｇ／ｋｇ）という形で表現してもよい。例えば、抗ＰＣＳＫ９抗体は、約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量で患者に投与してもよい。
【００８６】
本発明のある実施形態によると、ＰＣＳＫ９インヒビターの複数回用量を、規定の時間経過にわたって対象に投与し得る。本発明のこの態様による方法は、ＰＣＳＫ９インヒビターの複数回用量を対象に逐次的に投与することを含む。本明細書に使用される「逐次的に投与すること」は、ＰＣＳＫ９インヒビターの各用量が、異なる時点、例えば、所定のインターバル（例えば、時間、日、週または月）により分離された異なる日に対象に投与されることを意味する。本発明は、患者にＰＣＳＫ９インヒビターの単一の初期用量、続いてＰＣＳＫ９インヒビターの１つまたはそれ以上の二次用量、場合により、続いてＰＣＳＫ９インヒビターの１つまたはそれ以上の三次用量を逐次的に投与することを含む方法を含む。
【００８７】
用語「初期用量」、「二次用量」、および「三次用量」は、ＰＣＳＫ９インヒビターの投与の時間的なシークエンスをいう。したがって、「初期用量」は処置レジメン（「ベースライン用量」ともいう）の最初に投与される用量である；「二次用量」は「初期用量」の後に投与される用量である；および「三次用量」は「二次用量」の後に投与される用量である。しかしながら、ある実施形態において、初期、二次および／または三次用量に含有されるＰＣＳＫ９インヒビターの量は、処置の過程の間に互いに変動する（例えば、必要に応じて上下に調節される）。初期、二次、および三次用量は、全て同じ量のＰＣＳＫ９インヒビターを含有し得る。
【００８８】
ある実施形態において、それぞれ二次および／または三次用量は、直前の用量の１〜３０日（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日以上）後に投与される。本明細書に使用される語句「直前の用量」は、複数回投与のシークエンスにおいて、介在する用量がなく、そのシークエンス中のすぐ次の用量の投与前に患者に投与されるＰＣＳＫ９インヒビターの用量を意味する。
【００８９】
ある実施形態において、方法は、患者に任意数の二次および／または三次用量のＰＣＳＫ９インヒビターを投与することを含む。例えば、ある実施形態において、わずか単回の二次用量が患者に投与される。他の実施形態において、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８以上）の二次用量が、患者に投与される。同様に、ある実施形態において、わずか単回の三次用量が患者に投与される。他の実施形態において、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８以上）の三次用量が、患者に投与される。
【００９０】
複数回の二次用量がかかわる実施形態において、それぞれの二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与してもよい。例えば、それぞれの二次用量は、直前の用量の１〜２９日後に患者に投与してもよい。同様に、複数回の三次用量がかかわる実施形態において、そ
れぞれの三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与してもよい。例えば、それぞれの三次用量は、直前の用量の１〜６０日後に患者に投与してもよい。あるいは、二次および／または三次用量が患者に投与される頻度は、処置レジメンの過程にわたって変化することができる。投与の頻度も、診察後に個々の患者の要求に応じて、医師による処置の過程の間に調節し得る。
【００９１】
ある実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体は、対象に約７５ｍｇの初期用量を隔週で投与される。
【００９２】
さらなる実施形態において、抗体は、対象に約１５０ｍｇの初期用量を隔週で投与される。
【００９３】
一実施形態において、初期用量を、初期用量期間の間に投与し、その後、対象のＬＤＬ−Ｃ値をモニターし、ＬＤＬ−Ｃ値を測定して標的ＬＤＬ−Ｃ値であるかまたはそれ未満であるかを決定することによって、初期用量を二次用量に変化させるべきかを決定する。例えば、対象は、１デシリットルあたり１００ミリグラム（ｍｇ／ｄＬ）の標的ＬＤＬ−Ｃ値で、７５ｍｇの抗体の初期用量での処置で開始されてもよい。対象のＬＤＬ−Ｃが初期用量期間の終了時に標的ＬＤＬ−Ｃ値に到達した場合、対象は初期用量での処置を継続されるが、その標的値に到達しない場合には二次用量に変更される。一実施形態において、初期用量は約７５ｍｇで隔週投与される、標的ＬＤＬ−Ｃ値は１００ｍｇ／ｄＬであり、必要の場合には、二次用量が１５０ｍｇで隔週投与される。例えば、対象を最初に処置の約８週後モニターし、それらのＬＤＬ−Ｃ値が１００ｍｇ／ｄＬを超える場合には、対象を１５０ｍｇでの二次用量、隔週投与に用量設定を上げることができる。モニタリングを、処置期間にわたり継続してもよい。別の実施形態において、初期用量は７５ｍｇの抗体を隔週であり、標的ＬＤＬ−Ｃ値は７０ｍｇ／ｄＬであり、標的ＬＤＬ−Ｃ値に到達しない場合には二次用量は１５０ｍｇを隔週である。
【００９４】
従来の療法および併用療法
ある実施形態によると、本発明の方法は、本発明の医薬組成物の投与の時間または直前に、高コレステロール血症および／またはアテローム性動脈硬化症の処置のための治療レジメン中の対象に、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む医薬組成物を投与することを含む。例えば、以前に高コレステロール血症および／またはアテローム性動脈硬化症と診断された患者は、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む医薬組成物の投与の前および／または同時に別の脂質修飾療法の安定的な治療レジメンを処方され、摂取してきたものであってもよい。他の実施形態において、対象は、脂質修飾療法で以前に処置されていない。
【００９５】
ある実施形態によると、本発明の方法は、同時の脂質修飾療法の非存在下で、対象に、単独療法として、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む医薬組成物を投与することを含む。
【００９６】
ある実施形態によると、本発明の方法はまた、別の脂質修飾療法と組み合わせて、対象に、抗ＰＣＳＫ９インヒビターを含む医薬組成物を投与することを含む。
【００９７】
本明細書に使用される脂質修飾療法は、例えば、（１）スタチン（例えば、セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン等）などの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル（ＨＭＧ）−補酵素Ａ（ＣｏＡ）レダクターゼを阻害することによってコレステロール合成の細胞枯渇を誘導する剤；（２）コレステロール取込および／または胆汁酸再吸収を阻害する剤（例えば、エゼチミブ）；（３）リポタンパク質カタボリズムを増加させる剤（例えば、ナイアシン）；および／または（４）２２−ヒドロキシコレステロールなどのコレステロール除去の役割を果たすＬＸＲ転写因子のアクチベータを含む。脂質修飾療法
はまた、エゼチミブ＋シンバスタチン；スタチンと胆汁樹脂（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）；ナイアシン＋スタチン（例えば、ナイアシンとロバスタチン）などの治療剤の固定組合せ；またはオメガ−３−脂肪酸エチルエステル（例えば、オマコル（Ｏｍａｃｏｒ））などの他の脂質低下剤との固定組合せを含む。
【実施例】
【００９８】
下記の実施例は、本発明の方法および組成物の作り方および使用の仕方の完全な開示および説明を当業者に提供するために提案され、発明者らがそれらの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００９９】
ヒトＰＣＳＫ９に対するヒト抗体の生成
ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体を、米国特許第８，０６２，６４０号に記載のように生成した。下記の実施例で使用される例示的なＰＣＳＫ９インヒビターは、「ｍＡｂ３１６Ｐ」として指定され、ここで「アリロクマブ」としても知られているヒト抗ＰＣＳＫ９抗体である。ｍＡｂ３１６Ｐは、下記のアミノ酸配列特性を有する：配列番号１を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；配列番号６を含む軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）；配列番号２を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）；配列番号３を含むＨＣＤＲ２；配列番号４を含むＨＣＤＲ３；配列番号７を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）；配列番号８を含むＬＣＤＲ２；および配列番号１０を含むＬＣＤＲ３。
【実施例２】
【０１００】
高心血管リスクの患者における低比重リポタンパクコレステロール目標の達成：管理ケア試験集団からの結果
背景：ＵＳガイドラインは患者の心血管（ＣＶ）リスクプロファイルに基づくＬＤＬ−Ｃ目標を支持している、しかしながら、特異的な高ＣＶリスク状態でのＬＤＬ−Ｃ目標達成の現実社会でのパターンについて知られていることはわずかである。
方法：ＯｐｔｕｍＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＭＰＡＣＴデータベース（大きいＵＳマルチペイヤークレームデータベース）から、２０１１年７月〜２０１２年６月の間のＬＤＬ−Ｃ測定および高いＣＶリスク状態で患者を識別した。最新のＬＤＬ−Ｃ測定を指標日と規定し、高ＣＶリスク状態を以下の通りプレ指標期間（ｐｒｅ−ｉｎｄｅｘ  ｐｅｒｉｏｄ）の間の階層構造に識別した：最近の急性冠動脈症候群（ＡＣＳ、６月プレ指標日以内）、冠血管事象（心筋梗塞、不安定狭心症についての入院、冠動脈血管再生）、卒中、および末梢血管疾患（ＰＶＤ）。
結果：トータルで、１１０，７３９患者が、算入判定基準を満たしていた。中央値（ＩＱＲ）年齢は５９（５３〜６５）年であり、５３．７％が男性であり、中央値（ＩＱＲ）のＬＤＬ−Ｃは１１６（９２〜１４３）ｍｇ／ｄＬであった。指標日時点で、２．７％が最近ＡＣＳを有していたが、４２．１％、９．２％、および４６．０％は、それぞれ冠血管事象、卒中、およびＰＶＤの証拠を有していた。下記の表（表１）は、異なる高ＣＶリスク状態についての、指標日時点でのＬＤＬ−Ｃレベルによる患者の概要分布を表している。
【０１０１】
【表１】
2019108353.tif 000002
【０１０２】
結論：高ＣＶリスク患者の大きい同年輩のコホートにおいて、わずかが、＜７０ｍｇ／ｄＬ（非常に高いＣＶリスクについてのオプションの目標）または＜１００ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ−Ｃ目標を達成した。ＬＤＬ−Ｃ目標達成がより高いＣＶリスクを表す状態を伴う患者において少しばかり改善し、最近ＡＣＳを伴う患者においては最高を達成したが、これらの患者の大多数は依然としてＬＤＬ−Ｃ目標より上であった。これらのデータは、ＬＤＬ−Ｃ目標達成におけるギャップに対処し、高リスク患者におけるＣＶ転帰を改善する、継続的な努力に関する必要性が存在することを示す。
【実施例３】
【０１０３】
高心血管リスク管理ケア試験集団における低比重リポタンパクコレステロール目標の達成および脂質低減療法
背景：ＵＳガイドラインはＬＤＬ−Ｃを減少させる第一選択療法としてスタチンを支持しているが、スタチンおよび他の脂質低減療法（ＬＬＴ）でのＬＤＬ−Ｃ目標達成の現実社会でのパターンについて知られていることはわずかである。
方法：ＯｐｔｕｍＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＭＰＡＣＴデータベース（大きいＵＳマルチペイヤークレームデータベース）から、２０１１年７月〜２０１２年６月の間のＬＤＬ−Ｃ測定および高いＣＶリスク状態（冠血管事象（心筋梗塞、不安定狭心症についての入院、冠動脈血管再生）、卒中、および末梢血管疾患）で患者を識別した。ＬＬＴ処方を、最新のＬＤＬ−Ｃ測定（指標日）の時点で評価し、高作用強度スタチン（アトルバスタチン４０／８０ｍｇ、ロスバスタチン２０／４０ｍｇ、シンバスタチン８０ｍｇ）、標準作用強度スタチン（他のスタチン）、非スタチンＬＬＴ（エゼチミブ、ナイアシン、フィブラート、胆汁酸捕捉因子）、およびＬＬＴなしとして分類した。
結果：トータルで、１１０，７３９患者が、算入判定基準を満たしていた。中央値（ＩＱＲ）年齢は５９（５３〜６５）年であり、５３．７％が男性であり、中央値（ＩＱＲ）のＬＤＬ−Ｃは１１６（９２〜１４３）ｍｇ／ｄＬであった。指標日時点で、１０．８％が高作用強度スタチンであり、２６．９％が標準作用強度スタチンであり、５．３％が非スタチンＬＬＴであり、５７．０％がＬＬＴなしであった。下記の表（表２）は、異なるＬＬＴタイプについての、指標日時点でのＬＤＬ−Ｃレベルによる患者の概要分布を表している。
【０１０４】
【表２】
2019108353.tif 000003
【０１０５】
結論：この高ＣＶリスクの患者の大きい同年輩の集団において、わずかが、＜７０ｍｇ／ｄＬ（非常に高いＣＶリスクについてのオプションの目標）または＜１００ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ−Ｃ目標を達成した。さらに、高作用強度スタチンを受けたにもかかわらず、多くの他の患者はＬＤＬ−Ｃ目標に到達しなかった。これらのデータは、ＬＬＴへの接着性を改善する継続的な努力ならびに目標達成およびＣＶ転帰を改善する新しい療法に関する必要性が存在することを示す。
【実施例４】
【０１０６】
ＰＣＳＫ−９に対するモノクローナル抗体ＭＡｂ３１６Ｐは、ＡＰＯＥ＊３Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰトランスジェニックマウスおいて、用量依存的にアテローム性動脈硬化症を低下させ、より安定なプラーク表現型を誘導し、アトルバスタチンの効果を強化する
背景
この試験のねらいは、ＡＰＯＥ＊３Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿脂質、アテローム性動脈硬化症発生、ならびに病変組成における、ｍＡｂ３１６Ｐの二剤形、単独およびアトルバスタチンとの組合せの効果を調査することであった。これは、残遺リポタンパク質（ｒｅｍｎａｎｔ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）の蓄積および増加した超ＬＤＬ（ＶＬＤＬ）コレステロールとＬＤＬ−Ｃ比によって特徴付けられる、ヒトにおける家族性異βリポ蛋白血症（ＦＤ）の全ての特性を伴う高脂血症およびアテローム性動脈硬化症についての確立されたモデルである。ＡＰＯＥ＊３Ｌｅｉｄｅｎマウスは、ａｐｏＢ−含有リポタンパク質のクリアランスが非常に迅速である正常な野生型マウスと対照的に、（Ｖ）ＬＤＬのクリアランスが障害されＴＧレベルが増加し、それにより、ヒトにおいて認められた緩徐なクリアランスを模倣する。ＡＰＯＥ＊３Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスにおけるリポタンパク質プロファイルは、ＦＤ患者のプロファイルが反映されており、スタチン、フィブラート、ナイアシン、およびコレステリルエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）インヒビターを含む、脂質修飾療法への類似した応答を伴っている。このことは、スタチン処置での全てのａｐｏＢ−含有リポタンパク質サブフラクションにおけるコレステロールの匹敵する減少によって示されている。ｍＡｂ３１６Ｐが単独で、アテローム性動脈硬化症の進行を減少し、アトルバスタチンのアテロプロテクティブ効果に付加することができるとの仮説が立てられた。ＡＰＯＥ＊３Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスにおいてアトルバスタチンによるアテローム性動脈硬化症の阻害は、以前観測されていた。
【０１０７】
方法
ｉ）動物
その天然フランキング領域の制御下でヒトＣＥＴＰを発現する、９０匹の雌性ＡＰＯＥ＊３Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰトランスジェニックマウス（９〜１３週齢）を、使用した。
試験の間、マウスを、１２時間の明暗サイクルでの標準条件下に収容し、食物および水を自由に摂取させた。動物実験は、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの施設内の動物管理および利用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【０１０８】
ｉｉ）実験計画
マウスは、１５％（ｗ／ｗ）カカオバターおよび０．１５％コレステロール（Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｔｙｐｅ  ｄｉｅｔ［ＷＴＤ］；  Ｈｏｐｅ  Ｆａｒｍｓ、Ｗｏｅｒｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含有する、半合成コレステロール豊富化食餌を、３週の導入期間に与えられて、血漿総コレステロール（ＴＣ）レベルを〜１５ｍｍｏｌ／Ｌまで増加させた。体重（ＢＷ）および食物摂取を、試験の間に定期的にモニターした。ＢＷ、ＴＣ、血漿  ＴＧ、および齢に基づいてマッチングさせた後、マウス（ｎ＝１５／群）は、ＷＴＤ単独を与えられるあるいはｍＡｂ３１６Ｐ（３もしくは１０ｍｇ／ｋｇ）単独またはアトルバスタチン（３．６ｍｇ／ｋｇ／ｄ）との組合せの二剤形での処置を、１８週与えられた、またアトルバスタチン単独群を付加した。ＭＡｂ３１６Ｐを毎週皮下注射を介して投与し、アトルバスタチンを食餌に付加した。アトルバスタチンの用量を、約２０％〜３０％のＴＣ減少を試みるために計算した。処置期間の終了時に、全ての動物を、ＣＯ２吸入によって屠殺した。肝臓および心臓を単離して、肝臓のＬＤＬＲタンパク質レベル、脂質量、アテローム性動脈硬化症発生、およびプラーク組成を評価した。
【０１０９】
ｉｉｉ）血漿脂質、リポタンパク質分析、およびＭＡｂ３１６Ｐレベルの測定
血漿を、２〜４週ごとに、４時間の絶食後に尾静脈出血を介して、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）コーティングカップに採取した血液から単離した。血漿ＴＣおよびＴＧを、製造業者のプロトコル（カタログ番号１４５８２１６およびカタログ番号１４８８８７２、それぞれ；Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ）に従って酵素性キットを用いて決定し、平均血漿ＴＣおよびＴＧレベルを計算した。ＴＣに関するリポタンパク質プロファイルを、処置の４、１２、および１８週後の高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によるリポタンパク質分離後に測定した。ＭＡｂ３１６Ｐレベルを、ヒトＦｃ酵素結合免疫吸着検査法によって測定した。
【０１１０】
ｉｖ）肝臓のＬＤＬＲタンパク質レベル
肝臓組織を、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ［ｐＨ＝７．４］、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、０．２５％デオキシコール酸、１％  ＮＰ−４０［Ｉｇｅｐａｌ］、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、プロテアーゼインヒビターカクテル［ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ］、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）中でホモジナイズし、次に６５００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。細胞ライセート中のタンパク質濃度を、製造業者の指示書に従ってビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。５０μｇのタンパク質ライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次にポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。ブロットをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからのヤギ抗マウスＬＤＬＲ、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃからのウサギ抗ヤギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはＳｉｇｍａからのマウス抗α−チューブリンおよびＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのウマ抗マウスＨＲＰ（製造業者の指示書に従う）で処理し；ブロットをＷｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発色し、Ｃｈｅｍｉ−Ｄｏｃ−ｉｔイメージングシステムで処理した。タンパク質バンドの強度を、イメージＪソフトウェアを使用して定量化した。
【０１１１】
ｖ）アテローム性動脈硬化症の組織学的な評価
心臓を、単離し、ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。全大動脈起始部領
域のクロスセクション（各々５μｍ）を、ヘマトキシリン−フロキシン−サフランで染色した。各マウスについて、５０μｍのインターバルで４つのセクションを、アテローム硬化型病変の定量的および定性的な評価のために使用した。アテローム硬化型病変サイズおよび重症度を決定するため、病変を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ分類に従った５つのカテゴリーＩ）早期の脂肪線条、ＩＩ）規則的な脂肪線条、ＩＩＩ）軽度プラーク、ＩＶ）中等度プラーク、およびＶ）重篤プラークに分類した。クロスセクションあたりの総病変領域および病変の数ならびに未病セグメントパーセンテージを計算した。病変重症度を全ての病変のパーセンテージとして評価するため、タイプＩ−ＩＩＩ病変を軽度な病変として分類し、タイプＩＶ−Ｖ病変を重篤な病変として分類した。胸大動脈における総プラーク量を決定するために、灌流−固定された大動脈（大動脈起源から横隔膜）は、血管外の脂肪が洗浄され、長軸方向に開かれ、正面を留められ、脂質についてオイルレッドＯで以前にＶｅｒｓｃｈｕｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．  ２００５；２５：１６１−１６７）によって記載されたように染色された。データを、分析した表面について標準化し、染色された領域のパーセンテージとして表した。写真／イメージをＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡で撮り、病変領域をＣｅｌｌ  Ｄイメージングソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いて測定した。
【０１１２】
大動脈起始部では、病変組成を、重篤な病変（タイプＩＶ−Ｖ）に関して病変領域のパーセンテージとして決定する前に、マウス抗ヒトアルファアクチン（１：８００；  Ｍｏｎｏｓａｎ、Ｕｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で平滑筋細胞（ＳＭＣ）およびラット抗マウスＭａｃ−３（１：２５；  ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）でマクロファージを免疫染色し、続いてシリウスレッド染色でコラーゲンを染色した。壊死領域およびコレステロール性裂、内皮への単球接着、大動脈起始部領域におけるＴ細胞存在量ならびにプラーク安定性指標（不安定化因子としてのマクロファージおよび壊死領域に対する安定化因子としてのコラーゲンとＳＭＣ領域の比として規定される）の計算を、以前にＫｕｈｎａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．  ２０１２；３０：１０７−１１６）、Ｓｔａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．  １９９５；１５：１５１２−１５３１）およびＫｕｈｎａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１３；  ８：  ｅ６６４６７）によって記載されたように決定した。ラット抗マウスＣＤ５４抗体  ＧＴＸ７６５４３（ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、ＵＳＡ）を、細胞接着分子１（ＩＣＡＭ−１）の免疫染色に使用した。病変の写真／イメージをＮｕａｎｃｅ２マルチスペクトルイメージングシステムを伴うＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４０顕微鏡で撮り、染色された領域をイメージＪソフトウェアを用いて定量した。
【０１１３】
ｖｉ）肝臓脂質分析ならびに胆汁酸および中性ステロールの糞便排泄
肝臓組織サンプルをリン酸緩衝生理食塩水中でホモジナイズし、タンパク質含有量を測定した。脂質を、以前にＰｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．  １９９９；３０：４９１−５００）によって記載されたように、抽出し、シリカゲルプレート上で高速薄層クロマトグラフィーによって分離し、ＴＩＮＡ２．０９ソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ  Ｉｓｏｔｏｐｅｎ  Ｍｅｓｓｇｅｒａｔｅ  Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。
【０１１４】
マウスをケージあたりマウス五匹を収容し、糞便をそれぞれ７２時間および４８時間の２つの連続期間の間に採取した。凍結乾燥した糞便のアリコートを、以前にＰｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．  ２００３；２３：８９２−８９７）によって記載されたように、ガス液体クロマトグラフィーによって中性および酸性ステロール量の決定のため使用した。
【０１１５】
ｖｉｉ）フローサイトメトリー分析
処置の８週後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、新鮮な血液サンプルから単離し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を用いて、ＧＲ−１＋（好中球／顆粒球）、ＧＲ−１−（リンパ球／単球）、ＣＤ３＋（Ｔ−細胞）、ＣＤ１９＋（Ｂ−細胞）およびＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ６ＣｌｏｗおよびＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ６Ｃｈｉ（単球）細胞に選別した。下記のコンジュゲートしたモノクローナル抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎからのものを使用した：ＧＲ−１  ＦＩＴＣ、ＣＤ３  ＰｅｒＣｐＣｙ５−５、ＣＤ１９  Ｖ４５０、ＣＤ１１ｂ  ＡＰＣおよびＬｙ６Ｃ  ＰＥ−Ｃｙ７。
【０１１６】
ｖｉｉｉ）統計分析
群間の差の有意性を、独立サンプルに関するＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、続いて独立サンプルに関するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−検定を用いて、ノンパラメトリックに計算した。直線回帰を使用して、変量間の相関関係を評価した。アテローム硬化型病変領域は血漿コレステロール曝露に二次的な依存関係を示したので、それを平方根変換を用いて変換した。ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２０  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（ＳＰＳＳ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＵＳＡ）を、統計学的分析のため使用した。全群を対照群およびアトルバスタチン群と比較し、３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐをアトルバスタチンの有り無しのいずれかで１０ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐと比較した。値を平均±ＳＤとして表した。Ｐ−値＜０．０５は、単一比較に関して統計的に有意と考えられた。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を使用して、多重比較のケースにおける有意水準を決定した。図において、多重比較について補正後の有意な効果は、対照群と比較して＊＊＊で示され、アトルバスタチン群と比較して†††で示され、３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐと１０ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐと比較して‡‡‡で示される。
【０１１７】
結果
ｉ）ＭＡｂ３１６Ｐおよびアトルバスタチン単独処置ならびにそれらの組合せはＡＰＯＥ＊３Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスにおける血漿総コレステロールおよびトリグリセリドを低下させる
循環ｍＡｂ３１６Ｐレベルが、ｍＡｂ３１６Ｐを投与した全群において検出され、１８週の試験の間、５〜１２μｇ／ｍＬ（３ｍｇ／ｋｇ用量）および１２〜３０μｇ／ｍＬ（１０ｍｇ／ｋｇ用量）の間で変動した。コレステロール含有ＷＴＤ（対照群）におけるＡＰＯＥ＊３Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスは、それぞれ平均血漿ＴＣならびに１６．２±１．８ｍｍｏｌ／Ｌおよび２．９±０．６ｍｍｏｌ／Ｌに到達した（図１Ａおよび１Ｂ）。対照と比較して、ｍＡｂ３１６Ｐは、平均血漿ＴＣ（−３７％、Ｐ＜０．００１；−４６％、Ｐ＜０．００１）およびＴＧ（−３３％、Ｐ＜０．００１；−３９％、Ｐ＜０．００１）を低下させ、さらにアトルバスタチンとの組合せでＴＣ（−４８％、Ｐ＜０．００１；−５８％、Ｐ＜０．００１）を低下させた。アトルバスタチンと比較して、両方の組合せ処置は、アトルバスタチン単独よりも大きな程度まで、ＴＣ（−３６％、Ｐ＜０．００１；−４８％、Ｐ＜０．００１）およびＴＧ（−４０％、Ｐ＜０．００１；−５１％、Ｐ＜０．００１）を低下させた。ｍＡｂ３１６Ｐ単独（−１４％、Ｐ＜０．０１；３ｍｇ
ｍＡｂ３１６Ｐ対１０ｍｇ  ｍＡｂ３１６Ｐ）およびアトルバスタチンとの組合せ（−１９％、Ｐ＜０．００１；３ｍｇ  ｍＡｂ３１６Ｐ＋アトルバスタチン対１０ｍｇ  ｍＡｂ３１６Ｐ＋アトルバスタチン）後のＴＣにおける減少は、用量依存的であり、試験の間で持続性であった。ｍＡｂ３１６Ｐ（図１Ｃ）、アトルバスタチン、およびそれらの組合せ（図１Ｄ）後のＴＣ減少は、ａｐｏＢ含有リポタンパク質に限られている。ＢＷ（ゲイン）および食物摂取において効果がないことが、対照と比較した、任意の処置群において注目された。
【０１１８】
ｉｉ）ＭＡｂ３１６Ｐ（アトルバスタチン有り無し）は、低比重リポタンパク受容体分解を減少させることによって血漿脂質を低下させ、非ＨＤＬコレステロールを減少させる
肝臓ＬＤＬＲタンパク質レベルを測定して、ｍＡｂ３１６ＰによるＰＣＳＫ９阻害が、ＬＤＬＲ分解をレスキューすることにより血漿脂質を低下させるかどうかを検証した（図２Ａ）。肝臓ＬＤＬＲタンパク質レベルは、ｍＡｂ３１６Ｐ処置単独（＋８０％、Ｐ＜０．０１；＋１３３％、Ｐ＜０．０１）およびアトルバスタチンと併せた（＋９８％、Ｐ＜０．００１；＋１７８％、Ｐ＜０．０５）後に増加した。アトルバスタチン単独と比較して、両方の組合せ処置は、より大きな程度までＬＤＬＲタンパク質レベルを増加させた（＋７１％、Ｐ＜０．００４５；＋１４０％、Ｐ＜０．０１）。ＬＤＬＲタンパク質レベルと血漿ＴＣとの間の逆相関により、ｍＡｂ３１６ＰによるＴＣの低下におけるＬＤＬＲの関与が確認された（Ｒ２＝０．５０、Ｐ＜０．００１）。
【０１１９】
非ＨＤＬコレステロールレベルも測定して、ｍＡｂ３１６ＰによるＰＣＳＫ９阻害が、このようなレベルをＬＤＬＲの上方制御により低下させるかどうかを検証した（図２Ｂ）。
【０１２０】
ｉｉｉ）ＭＡｂ３１６Ｐは肝臓脂質ならびに糞便の胆汁酸および中性ステロール排泄に影響しない
肝臓脂質代謝および糞便への排泄におけるリポタンパク質代謝におけるｍＡｂ３１６Ｐ誘導性の変更の帰結を評価するため、便中の肝臓脂質および胆汁酸および中性ステロールの排泄を決定した。ＭＡｂ３１６Ｐは、肝臓重量にもコレステロールおよびＴＧの肝臓内容量にも影響しなく、一方でアトルバスタチンおよび組合せ処置は、対照群と比較して、肝臓重量（それぞれ、−１５％、Ｐ＝０．０６７；−１７％、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後；−２０％、Ｐ＜０．００４５）および肝臓コレステリルエステル（それぞれ、−４８％、Ｐ＜０．００４５；−４１％、Ｐ＜０．００４５および−４４％、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後）の有意な低下をもたらしたが、肝臓トリグリセリドにおける変化はなかった（表３）。胆汁酸および中性ステロールの糞便アウトプットは処置により変化しなかった（表４）。これらのデータは、血漿コンパートメントからコレステロールがより大規模に流入するにもかかわらず、肝臓のコレステロールホメオスタシスがｍＡｂ３１６Ｐおよびスタチン処置の間に維持されることを示す。
【０１２１】
【表３】
2019108353.tif 000004
【０１２２】
【表４】
2019108353.tif 000005
【０１２３】
ｉｖ）ＭＡｂ３１６Ｐは用量依存的にアテローム性動脈硬化症発生を減少させ、アトルバスタチンのアテロプロテクティブ効果を強化する
アトルバスタチンの非存在および存在下で、アテローム性動脈硬化症発生におけるｍＡｂ３１６Ｐの効果を、処置の１８週後に大動脈起始部および大動脈弓において評価した。アテローム硬化型病変の代表的なイメージは、図３に示されるように、ｍＡｂ３１６Ｐ、アトルバスタチン、およびそれらの組合せが、病変進行を減少させることを示す。アテローム性動脈硬化症発生における減少を確認するため、クロスセクションあたりの病変領域および病変の数（図４Ａおよび図４Ｂ）を、病変重症度（図４Ｃ）と共に評価した。対照群について、総病変領域はクロスセクションあたり２７８±８９×１０３μｍ２であり、クロスセクションあたり４．０±０．７病変からなっていた。ＭＡｂ３１６Ｐは、対照と比較して、アテローム硬化型病変サイズを用量依存的に低下させ（−７１％、Ｐ＜０．００１；−８８％、Ｐ＜０．００１）、アトルバスタチンの効果を用量依存的に増強した（−８９％、Ｐ＜０．００１；−９８％、Ｐ＜０．００１）。加えて、ｍＡｂ３１６Ｐ（アトルバスタチン有り無し）は、病変の数も低下させた（それぞれ、−１７％、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後；−３０％、Ｐ＜０．００４５および−４１％、Ｐ＜０．００１；−７７％、Ｐ＜０．００１）。ｍＡｂ３１６Ｐ（単独およびアトルバスタチンとの組合せ）で処置したマウスは、対照と比較して、より病変なしのセクションおよびより少数の重篤な（タイプＩＶ−Ｖ）病変を有していた。アトルバスタチン単独は、病変サイズを低下させ（−３５％、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後）、病変または未病セグメントの数に影響のないより小さい程度まで重症度を減少させた。アトルバスタチン単独処置と比較すると、組合せは、病変サイズ（−８２％、Ｐ＜０．００１；−９７％、Ｐ＜０．００１）および病変の数（−３８％、Ｐ＜０．００１；−７６％、Ｐ＜０．００１）をさらに低下させ、未病セグメントの量を増加させた。
【０１２４】
アテローム性動脈硬化症の発生する傾向がある大動脈に沿って別のスポットでの病変発生におけるｍＡｂ３１６Ｐ処置の効果を評価するため、大動脈弓におけるプラーク表面を測定した（図４Ｄ）。この部位で、病変発生は、大動脈起始部と比較して、遅延性である。大動脈起源におけるアテローム発生における影響と一致して、１０ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐ単独（−６７％、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後）およびアト
ルバスタチンと併せた両方の用量（−７３％、Ｐ＜０．００４５；−７３％、Ｐ＜０．００４５）は、総プラーク領域を減少させた。
【０１２５】
ｍＡｂ３１６Ｐおよびアトルバスタチンの抗アテローム生成効果が評価され（図５）、大動脈起始部における血漿ＴＣレベルおよびアテローム硬化型病変領域の間の強い相関性が観測（Ｒ２＝０．８４、Ｐ＜０．００１；図５）された、これはアテローム性動脈硬化症の発生におけるコレステロールの重要な役割を示している。
【０１２６】
ｖ）ＭＡｂ３１６Ｐは単球およびＴ細胞リクルートを減少させ、病変安定性指標を改善する
血管壁炎症の機能性マーカーとして、活性化した内皮に接着している単球の数（図８Ａ）および大動脈起始部領域におけるＴ細胞の数（図８Ｂ）を、クロスセクションあたり計数し、計算した（図７Ａ）。対照群において、５．７±４．２の接着している単球および１６．７±７．７のＴ細胞が存在した。単独およびアトルバスタチンと併せて投与すると、ｍＡｂ３１６Ｐの高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）は、接着している単球（−５７％、Ｐ＜０．０１、Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後、および−７５％、Ｐ＜０．００１）およびＴ細胞の存在量（−３７％、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後、および−６２％、Ｐ＜０．００１）を減少させた。ｍＡｂ３１６Ｐが単球接着を減少させる機構を明確に示すため、免疫組織化学による内皮性のＩＣＡＭ−１発現を評価した（図８Ｃ）。対照について、３９％の内皮がＩＣＡＭ−１について陽性であり、１０ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ３１６Ｐ単独処置後の１９％（Ｐ＜０．００１）およびアトルバスタチンと組み合わせて与えたときの１６％（Ｐ＜０．００１）と比較された。したがって、単球接着における減少は、ｍＡｂ３１６Ｐ処置単独およびアトルバスタチンとの組合せの後の内皮細胞における接着分子発現における減少によって補強された。
【０１２７】
病変形態を調査した後、プラーク組成における処置効果を、図６中の代表的なイメージによって示されるような、最も脆弱な病変と考えられる、重篤な病変（タイプＩＶ−Ｖ）において分析した。プラーク安定性が必ずしも病変のサイズに依存的であるとは限らないことを説明するため、対照群およびｍＡｂ３１６Ｐ群についての類似サイズの病変の代表的なイメージを含ませた。病変マクロファージ領域（図７Ａ左）＋病変壊死性のコア領域（コレステロール性裂を含む）（図７Ａ右）を不安定化因子として定量し、一方で線維性キャップにおけるＳＭＣ（図７Ｂ左）およびコラーゲン領域（図７Ｂ右）を安定化因子として定量した。全てを、総病変領域のパーセンテージとして表した。対照群における病変は、１０．３％のマクロファージ、４．８％の壊死性のコアおよびコレステロール性裂、３．１％のキャップにおけるＳＭＣおよび４８．４％のコラーゲンからなっていた。対照群についての病変安定性指標（図７Ｃ）は、３．５±０．８であった。アトルバスタチンと組み合わせて投与すると、ｍＡｂ３１６Ｐの低用量（３ｍｇ／ｋｇ）は、不安定化因子（−２６％、Ｐ＜０．０５，Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後）を減少させ、安定化因子（＋１９％、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後）を増加させたが、一方で高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）単独およびアトルバスタチンとの組合せは、不安定化因子（−３７％、Ｐ＜０．００１；＋７３％、Ｐ＜０．００１）を減少させ、安定化因子（＋１９％、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後；＋２９％、Ｐ＜０．００１）を増加させた。したがって、ＭＡｂ３１６Ｐは、病変安定性指標の単独（＋２４％、Ｎ．Ｓ．；＋１１３％、Ｐ＜０．００４５）およびアトルバスタチンと併せたもの（＋１１６％、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後；５５６％、Ｐ＜０．００１）における増加によって示されるような、病変安定性を改善した。
【０１２８】
ｖｉ）ＭＡｂ３１６Ｐは循環単球を減少させる傾向がある
白血球数におけるｍＡｂ３１６Ｐ単独およびアトルバスタチンとの組合せの効果を、フローサイトメトリーによって評価した。興味深いことに、ｍＡｂ３１６Ｐ単独およびアト
ルバスタチンと併せたものは、ＰＢＭＣ集団のパーセンテージとして表すと、顆粒球／好中球（−２０％、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後；−３４％、Ｐ＜０．００１）および単球（−２８％、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．多重比較について補正後；−３９％、Ｐ＜０．００１）を減少させた。より具体的には、ｍＡｂ３１６Ｐ単独およびアトルバスタチンとの組合せは、炎症誘発性Ｌｙ６Ｃｈｉ（−８％、Ｐ＝０．０６１；−１９％、Ｐ＜０．００１）減少させ、抗炎症性Ｌｙ６Ｃｌｏｗ（＋１２％、Ｐ＝０．０８９；＋３５％、Ｐ＜０．００１）単球を増加させる傾向がある。したがって、血管リクルートにおけるｍＡｂ３１６Ｐの効果および単球の接着は、循環単球における減少によって増大される。
【０１２９】
【表５】
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【０１３０】
概要
本試験は、アテローム性動脈硬化症発生におけるｍＡｂ３１６Ｐ自体およびアトルバスタチンとの組合せの効果を調査するよう計画された。総合すると、これらのデータは、ｍＡｂ３１６Ｐが、血漿コレステロール、アテローム性動脈硬化症の進行およびプラーク脆弱性を用量依存的に低下させ、ＡＰＯＥ＊３Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスにおけるアトルバスタチンの有益な効果を強化することを実証する。本試験は、ＰＣＳＫ９に対する抗体が、アテローム性動脈硬化症発生を減少させることを示す最初の試験である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
2019108353.tif 000013
【図７−２】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月27日(2019.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化症を有する対象における、アテローム硬化型病変の数、総領域、重症度、または不安定性の増加の阻害に使用するための、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体または抗原結合タンパク質を含む医薬組成物であって、前記抗体または抗原結合タンパク質は配列番号２、３、４、７、８、および１０を有する重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
対象のアテローム硬化型病変の数の増加の阻害に使用するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
対象のアテローム硬化型病変の総領域の増加の阻害に使用するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
対象のアテローム硬化型病変の重症度の増加の阻害に使用するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
対象のアテローム硬化型病変の不安定性の増加の阻害に使用するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
対象におけるアテローム硬化型病変の数、総領域、重症度、および不安定性の増加の阻害に使用するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
以下の条件：
ａ）対象は、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病、川崎病、慢性炎症性疾患、および高血圧症からなる群から選択される疾患または障害を有する、；
ｂ）対象は、ヘテロ接合性の家族性高コレステロール血症（ｈｅＦＨ）を有する；なら
びに
ｃ）対象は、家族性高コレステロール血症ではない高コレステロール血症（ｎｏｎＦＨ）の形態を有する；
の１つまたはそれ以上がみたされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
対象は炎症マーカーのレベルが上昇している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
炎症マーカーはＣ反応性タンパク質または炎症性サイトカインである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲおよび配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
抗体または抗原結合タンパク質は、対象におけるアテローム硬化型病変の数、総領域、重症度、または不安定性の増加を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％阻害する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
対象は抗体または抗原結合タンパク質の投与の前および／または間に別の脂質修飾剤をうける、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
治療的脂質修飾剤はスタチン、エゼチミブ、フィブラート、ナイアシン、オメガ−３脂肪酸、および胆汁酸レジンからなる群から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
スタチンは、セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチンおよびプラバスタチンからなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
対象は抗体または抗原結合タンパク質の投与の前および／または間に別の脂質修飾剤をうけていない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
抗体または抗原結合タンパク質は皮下に投与される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2019108353000001.pdf