(57)【要約】【課題】ＨＴＰゲノム操作プラットフォームによる微生物株の改良の提供。【解決手段】本開示は、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、および高度な機械学習プロトコールを統合するＨＴＰ微生物ゲノム操作プラットフォームを提供する。この統合プラットフォームは、一式のＨＴＰ分子ツールセットを利用して、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生み出す。これらのライブラリーは、とりわけ、科学的洞察および反復パターン認識から得られる。本明細書に記載のＨＴＰゲノム操作プラットフォームは、微生物株宿主にとらわれず、したがって、分類群全体にわたってインプリメントすることができる。さらに、開示したプラットフォームは、目的の任意の微生物宿主パラメータをモジュレートまたは改善するようにインプリメントすることができる。【選択図】図５
2019162131.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１２月７日に出願された米国仮出願第６２／２６４，２３２号、２０１６年４月２７日に出願された米国非仮出願第１５／１４０，２９６号、および２０１６年７月２９日に出願された米国仮出願第６２／３６８，７８６号の優先権の利益を主張し、これらのそれぞれは、すべての目的のために、すべての記載、参照、図面および特許請求の範囲を含むその全体において参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、ハイスループット（ＨＴＰ）微生物ゲノム操作を対象とする。開示されるＨＴＰゲノム操作プラットフォームは、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、および高度な機械学習プロトコールを統合する。この統合プラットフォームは、一式のＨＴＰ分子ツールセットを利用して、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生み出す。これらのライブラリーは、とりわけ、科学的洞察および反復パターン認識から得られる。
配列表に関する陳述
【０００３】
本願に添付された配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供されており、参照により本明細書に組み込まれている。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＺＹＭＲ＿００１＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、約５ＫＢであり、２０１６年１２月７日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００４】
人間は、目的の産物を生成するのに千年間にわたって微生物細胞の生合成経路の力を利用してきており、その最古の例としては、アルコール、酢、チーズ、およびヨーグルトがある。これらの産物は、今日でも依然として大きな需要があり、また、微生物が産生可能な産物のレパートリーが増え続けている。遺伝子操作技術の出現により、科学者は、様々な生物体中に新規生合成経路を設計およびプログラムして、広い範囲の工業、医療用、および消費者向け製品を生産することが可能になった。実際に、微生物細胞培養が、低分子、抗生物質、ワクチン、殺虫剤、酵素、燃料、および工業用化学物質におよぶ産物を生産するのに現在使用されている。
【０００５】
最新の工業用微生物によって産生される多数の産物を考慮すると、エンジニアが、所与の微生物が標的産物を産生することができる速度および効率を改善するのに極めて大きいプレッシャーの下にあることは驚くに当たらない。
【０００６】
様々な手法が、関与する微生物を「改良する」ことによって生物学に基づく工業プロセスの経済性を改善するのに使用されてきた。例えば、多くの製薬工業および化学工業では、微生物培養の親株が化学物質またはＵＶ放射線への曝露によって連続的に変異され、生産性、収率、および力価などの性能増大について引き続いてスクリーニングされる、微生物株改良プログラムを利用する。この変異誘発プロセスは、株が産物性能の適当な増大を実証するまで広範に繰り返される。次いで後続の「改善された」株は、商業生産で利用される。
【０００７】
上記に暗示したように、変異誘発による改善された工業用微生物株の同定は、時間がかかり、非効率である。このプロセスは、まさにその本質から、計画性のないものであり、産物産出について望ましい結果を有する変異の際の１つのつまずきを利用する。
【０００８】
伝統的な微生物株改良プログラムが非効率であるだけでなく、このプロセスは、高い程度の有害な変異誘発性ロード（mutagenic  load）を有する工業用株に至る場合もある。
これらのタイプのプログラムに供された工業用株における変異の蓄積は、かなり大きなものとなり得、性能改善の速度における最終的な停滞に至り得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
よって、伝統的な株改良プログラムに固有の上述した欠点を被らず、有益な変異を発見および統合するプロセスを大いに加速する工業用微生物を操作する新しい方法についての当技術分野における大きな必要性が存在する。
【００１０】
さらに、微生物株改良の分野において現在使用されている時代遅れの有害なプロセスによって開発された工業用株を「再建する」方法の緊急の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、伝統的な微生物株改良プログラムに関連した無数の問題を被らないハイスループット（ＨＴＰ）微生物ゲノム操作プラットフォームを提供する。
【００１２】
さらに、本明細書で教示されるＨＴＰプラットフォームは、数１０年のランダム変異誘発に基づく株改良プログラムによって有益でない変異を蓄積してきた工業用微生物を再建する（rehabilitate）ことができる。
【００１３】
開示されるＨＴＰゲノム操作プラットフォームは、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、および高度な機械学習プロトコールを統合する。この統合プラットフォームは、一式のＨＴＰ分子ツールセットを利用して、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生み出す。これらのライブラリーは、とりわけ、科学的洞察および反復パターン認識から得られる。
【００１４】
教示されるＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、微生物において試験するための特定のゲノム変更のライブラリーを提供することによって、ゲノム操作プロセスのドライバーとして機能する。特定のライブラリーまたはライブラリーの組合せを利用して操作された微生物は、結果として生じる成果、例えば、目的の産物の産生についてＨＴＰ様式で効率的にスクリーニングされる。ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを利用して微生物において試験するための特定のゲノム変更を明らかにし、次いでこれらの変更を内包する宿主微生物ゲノムを引き続いてスクリーニングするこのプロセスは、効率的な反復様式でインプリメントされる。一部の態様では、ゲノム操作キャンペーンの反復サイクルまたは「ラウンド」は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ超の反復／サイクル／ラウンドであり得る。
【００１５】
よって、一部の態様では、本開示は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００またはそれ超の「ラウンド」のＨＴＰ遺伝子操作（例えば、ＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、ＳＴＯＰスワップ、またはこれらの組合せのラウンド）を行う方法を教示する。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、各後続のＨＴＰ遺伝子操作ラウンドが先のラウンドの遺伝子操作で同定された遺伝的バリエーションに基づく線形手法を教示する。他の実施形態では、本開示は、各後続のＨＴＰ遺伝子操作ラウンドが先に行われた分析を含む任意の先のラウンドの遺伝子操作、および別個のＨＴＰ遺伝子操作ブランチで同定された遺伝的バリエーションに基づく非線形手法を教示する。
【００１７】
これらの反復サイクルからのデータは、大規模データ分析およびパターン認識を可能にし、それは統合プラットフォームによって利用され、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー実装の後続のラウンドを通知する。したがって、教示されるプラットフォームで利用されるＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、大規模データパターン認識アルゴリズムから利益を得、各反復ラウンドの微生物操作によってより有益となる高度に動的なツールである。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子設計ライブラリーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、またはそれ超の個々の遺伝子変化（例えば、少なくともＸの数のＰＲＯスワップライブラリーにおけるプロモーター：遺伝子組合せの）を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は、ＨＴＰ株改良法の微生物株への適用を記述する実例およびテキストを提供する。一部の実施形態では、本開示の株改良法は、任意の宿主細胞に適用可能である。
【００２０】
一部の実施形態では、本開示は、所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法であって、ａ）同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと；ｂ）所望の表現型について最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；ｃ）それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；ｄ）所望の表現型について後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；ｅ）微生物が所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の微生物株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップとを含む、方法を教示する。
【００２１】
一部の実施形態では、本開示は、最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー、開始／停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つであることを教示する。
【００２２】
一部の実施形態では、本開示は、それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を作製する方法であって、組み合わされた遺伝的バリエーションのそれぞれが、最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーまたは先行するステップのＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーに由来する、方法を教示する。
【００２３】
一部の実施形態では、後続の複数の微生物における遺伝的バリエーションの組合せは、最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーまたは先行するステップのＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーにおける遺伝的バリエーションのすべての可能な組合せのサブセットを含むことになる。
【００２４】
一部の実施形態では、本開示は、後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーまたは先行するステップのＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーにおける遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーであることを教示する。
【００２５】
例えば、先のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが遺伝的バリエーションＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤのみを有している場合、前記バリエーションの部分的コンビナトリアルは、それぞれがＡＢ、ＡＣ、またはＡＤの遺伝的バリエーションのユニークな組合せのいずれかを含む３種の微生物を含む後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを含むことができる（変異が表される順序は重要でない）。先行するステップのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーの遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーは、それぞれがＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＢＣ、ＢＤ、またはＣＤの遺伝的バリエーションのユニークな組合せのいずれかを含む６種の微生物を含むはずである。
【００２６】
一部の実施形態では、本開示の方法は、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用してゲノムを撹乱することを教示する。
【００２７】
現在開示した方法の一部の実施形態では、最初の複数の微生物は、工業生産株微生物に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む。
【００２８】
現在開示した方法の一部の実施形態では、最初の複数の微生物は、Ｓ１Ｇｅｎ１で表される工業生産株微生物、およびＳｎＧｅｎｎで表されるこれらに由来する任意の数の後続の微生物世代を含む。
【００２９】
一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、ａ）参照微生物株および第２の微生物株を提供するステップであって、第２の微生物株は、参照微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；ｂ）参照微生物株または第２の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、参照微生物株と第２の微生物株との間の複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップとを含む、方法を教示する。
【００３０】
ＳＮＰスワップライブラリーの一部の実施形態では、参照微生物株のゲノムが撹乱されて、第２の微生物株内に見出される同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される。
【００３１】
本開示のＳＮＰスワップライブラリー方法の一部の実施形態では、第２の微生物株のゲノムが撹乱されて、参照微生物株内に見出されない同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される。
【００３２】
一部の実施形態では、ＳＮＰスワップライブラリーの遺伝的バリエーションは、参照微生物株と第２の微生物株との間で同定されたすべての遺伝的バリエーションのサブセットを含む。
【００３３】
一部の実施形態では、ＳＮＰスワップライブラリーの遺伝的バリエーションは、参照微生物株と第２の微生物株との間の同定された遺伝的バリエーションのすべてを含む。
【００３４】
一部の実施形態では、本開示は、工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、ａ）親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、工業用微生物株は、親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；ｂ）親系統微生物株または工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、親系統微生物株と工業用微生物株との間の複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと；ｃ）参照微生物株に対する表現型性能改善について最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、前記微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；ｄ）それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；ｅ）参照微生物株に対する表現型性能改善について後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、前記微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；ｆ）微生物株が、工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の微生物株を含む新しいＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップとを含む、方法を教示する。
【００３５】
一部の実施形態では、本開示は、工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、親系統微生物株のゲノムが撹乱されて、工業用微生物株内に見出される同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、方法を教示する。
【００３６】
一部の実施形態では、本開示は、工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、工業用微生物株のゲノムが撹乱されて、親系統微生物株内に見出されない同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、方法を教示する。
【００３７】
一部の実施形態では、本開示は、プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、ａ）基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；ｂ）基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、基準微生物株に内在する標的遺伝子の１つに作動可能に連結したプロモーターラダー由来のプロモーターの１つを含む、ステップとを含む、方法を教示する。
【００３８】
一部の実施形態では、本開示は、所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法であって、ａ）基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；ｂ）基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、基準微生物株に内在する標的遺伝子の１つに作動可能に連結したプロモーターラダー由来のプロモーターの１つを含む、ステップと；ｃ）所望の表現型について最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；ｄ）それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；ｅ）所望の表現型について後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；ｆ）微生物が所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップとを含む、方法を教示する。
【００３９】
一部の実施形態では、本開示は、ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、ａ）基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；ｂ）基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した基準微生物株に内在する標的遺伝子の１つを含む、ステップとを含む、方法を教示する。
【００４０】
一部の実施形態では、本開示は、所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法であって、ａ）基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；ｂ）基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した基準微生物株に内在する標的遺伝子の１つを含む、ステップと；ｃ）所望の表現型について最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；ｄ）それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；ｅ）所望の表現型について後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；ｆ）微生物が所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップとを含む、方法を教示する。
【００４１】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）（１）１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および（２）対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された（populated  with）予測モデルにアクセスするステップと；（ｂ）遺伝子変
化を表す予測モデルに試験入力（test  input）を適用するステップであって、試験入力
は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと；（ｃ）予測モデルに少なくとも部分的に基づいて候補微生物株の表現型性能を予測するステップと；（ｄ）これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて候補微生物株の第１のサブセットを選択するステップと；（ｅ）候補微生物株の第１のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと；（ｆ）これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて候補微生物株の第２のサブセットの選択物を得るステップと；（ｇ）（２）選択された候補微生物株の第２のサブセットの対応する測定された性能とともに（１）選択された候補微生物株の第２のサブセットに対応する入力を予測モデルの訓練セットに加えるステップと；（ｈ）少なくとも１つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで、（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップとによって候補微生物株の設計を反復して改善することを教示する。一部の場合では、予測モデルへの試験入力の第１の適用の間に、試験入力によって表される遺伝子変化が、１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み、試験入力の後続の適用の間に、試験入力によって表される遺伝子変化が、候補微生物株の先に選択された第２のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む。
【００４２】
一部の実施形態では、第１のサブセットの選択は、上位性効果に基づき得る。これは、第１のサブセットの第１の選択の間に、１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと、少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも２つの候補微生物株を第１のサブセットに含めるために選択するステップとによって達成することができる。
【００４３】
一部の実施形態では、本発明は、候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用する方法であって、少なくとも１つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと；少なくとも２つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも２つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、相違点の程度が、少なくとも２つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと；選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップとを含む、方法を教示する。一部の場合では、少なくとも２つの選択された遺伝子変化が設計される微生物バックグラウンド株は、測定された応答性能を表すデータが得られた少なくとも１つの微生物バックグラウンド株と同じである。
【００４４】
一部の実施形態では、本開示は、単一タイプの遺伝子微生物ライブラリーのみを利用するＨＴＰ株改良法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰスワップライブラリーのみを利用するＨＴＰ株改良法を教示する。他の実施形態では、本開示は、ＰＲＯスワップライブラリーのみを利用するＨＴＰ株改良法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＳＴＯＰスワップライブラリーのみを利用するＨＴＰ株改良法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、開始／停止コドンスワップライブラリーのみを利用するＨＴＰ株改良法を教示する。
【００４５】
他の実施形態では、本開示は、２つまたはそれ超のタイプの遺伝子微生物ライブラリーを利用するＨＴＰ株改良法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰスワップライブラリーおよびＰＲＯスワップライブラリーを組み合わせるＨＴＰ株改良法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰスワップライブラリーおよびＳＴＯＰスワップライブラリーを組み合わせるＨＴＰ株改良法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＰＲＯスワップライブラリーおよびＳＴＯＰスワップライブラリーを組み合わせるＨＴＰ株改良法を教示する。
【００４６】
他の実施形態では、本開示は、複数のタイプの遺伝子微生物ライブラリーを利用するＨＴＰ株改良法を教示する。一部の実施形態では、遺伝子微生物ライブラリーは、組合せ変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子に適用されるプロモーター／ターミネーター組合せラダー）を生成するように組み合わせられる。さらに他の実施形態では、本開示のＨＴＰ株改良法は、１つまたは複数の伝統的な株改良法と組み合わせることができる。
【００４７】
一部の実施形態では、本開示のＨＴＰ株改良法は、改良された宿主細胞をもたらす。すなわち、本開示は、１つまたは複数の宿主細胞性質を改善する方法を教示する。一部の実施形態では、改善される宿主細胞性質は、宿主細胞によって産生される目的の産物の体積生産性、比生産性、収率、または力価からなる群から選択される。一部の実施形態では、改善される宿主細胞性質は、体積生産性である。一部の実施形態では、改善される宿主細胞性質は、比生産性である。一部の実施形態では、改善される宿主細胞性質は、収率である。
【００４８】
一部の実施形態では、本開示のＨＴＰ株改良法は、ＨＴＰ株改良法に供されない対照宿主細胞に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれ超の少なくとも１つの宿主細胞性質の改善（例えば、これらの間の任意の範囲および部分範囲を組み入れての、目的の生体分子の収率または生産性のＸ％の改善）を呈する宿主細胞をもたらす。一部の実施形態では、本開示のＨＴＰ株改良法は、ＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、ＳＴＯＰスワップ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００４９】
よって、一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワップ方法は、ＳＮＰスワップ方法に供されない対照宿主細胞に対して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれ超の少なくとも１つの宿主細胞性質の改善（例えば、これらの間の任意の範囲および部分範囲を組み入れての、目的の生体分子の収率または生産性のＸ％の改善）を呈する宿主細胞をもたらす。
【００５０】
よって、一部の実施形態では、本開示のＰＲＯスワップ方法は、ＰＲＯスワップ方法に供されない対照宿主細胞に対して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれ超の少なくとも１つの宿主細胞性質の改善（例えば、これらの間の任意の範囲および部分範囲を組み入れての、目的の生体分子の収率または生産性のＸ％の改善）を呈する宿主細胞をもたらす。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法であって、
ａ．同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと；
ｂ．該所望の表現型について該最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｃ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｄ．該所望の表現型について該後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｅ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、ゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目２）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー、開始／停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目３）
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーである、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目４）
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーのサブセットである、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目５）
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、先行するＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーである、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目６）
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、先行するＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーのサブセットである、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目７）
前記ゲノムを撹乱するステップが、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用することを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目８）
前記最初の複数の微生物が、工業生産株微生物に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目９）
前記最初の複数の微生物が、Ｓ１Ｇｅｎ１で表される工業生産株微生物、およびＳｎＧｅｎｎで表されるこれらに由来する任意の数の後続の微生物世代を含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１０）
ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
ｃ．参照微生物株および第２の微生物株を提供するステップであって、該第２の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｄ．該参照微生物株または該第２の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第２の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
を含む、方法。
（項目１１）
前記参照微生物株のゲノムが撹乱されて、前記第２の微生物株内に見出される前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、項目１０に記載のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
（項目１２）
前記第２の微生物株のゲノムが撹乱されて、前記参照微生物株内に見出されない前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、項目１０に記載のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
（項目１３）
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第２の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、項目１０に記載のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
（項目１４）
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第２の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目１０に記載のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
（項目１５）
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、
ａ．親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと；
ｃ．参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該個々の微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
（項目１６）
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第２の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、項目１５に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目１７）
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第２の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目１５に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目１８）
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目１５に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目１９）
前記親系統微生物株のゲノムが撹乱されて、前記工業用微生物株内に見出される前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、項目１５に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目２０）
前記工業用微生物株のゲノムが撹乱されて、前記親系統微生物株内に見出されない前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、項目１５に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目２１）
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
ｃ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｄ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと
を含む、方法。
（項目２２）
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法であって、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｆ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
（項目２３）
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目２２に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法。
（項目２４）
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
ｃ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｄ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目２５）
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法であって、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つを含む、ステップと；
ｃ．該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｆ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
（項目２６）
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目２５に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法。
（項目２７）
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるためのハイスループット（ＨＴＰ）ゲノム操作システムであって、
１つまたは複数のプロセッサー、および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと；
ｂ．該所望の表現型について該最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｃ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｄ．該所望の表現型について該後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｅ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
（項目２８）
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと；
ｂ．該所望の表現型について該最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｃ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｄ．該所望の表現型について該後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｅ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
（項目２９）
ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．参照微生物株および第２の微生物株を提供するステップであって、該第２の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．該参照微生物株または該第２の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第２の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
（項目３０）
ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．参照微生物株および第２の微生物株を提供するステップであって、該第２の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．該参照微生物株または該第２の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第２の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
（項目３１）
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと；
ｃ．参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
（項目３２）
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと；
ｃ．参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
（項目３３）
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
（項目３４）
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
（項目３５）
所望の表現型を獲得するためにプロモータースワッピングによって微生物を進化させるゲノム操作システムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｆ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
（項目３６）
所望の表現型を獲得するためにプロモータースワッピングによって微生物を進化させるための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｆ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
（項目３７）
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つを含む、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
（項目３８）
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つを含む、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
（項目３９）
所望の表現型を獲得するために微生物をターミネータースワッピングによって進化させるゲノム操作システムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つを含む、ステップと；
ｃ．該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｆ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
（項目４０）
所望の表現型を獲得するために微生物をターミネータースワッピングによって進化させるための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つを含む、ステップと；
ｃ．該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｆ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
（項目４１）
候補微生物株の設計を反復して改善するためのコンピューター実装方法であって、
ａ．（１）１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および（２）対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと；
ｂ．遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと；
ｃ．該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと；
ｄ．これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第１のサブセットを選択するステップと；
ｅ．該候補微生物株の該第１のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと；
ｆ．これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第２のサブセットの選択物を得るステップと；
ｇ．（２）該選択された候補微生物株の第２のサブセットの対応する測定された性能とともに、（１）該選択された候補微生物株の第２のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと；
ｈ．（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップと
を含む、方法。
（項目４２）
（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップが、少なくとも１つの候補微生物株の測定された表現型性能が、性能測定基準を満たすまで（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すことを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記予測モデルへの試験入力の第１の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み；
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第２のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記候補微生物株の前記第１のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
上位性効果に少なくとも部分的に基づく前記第１のサブセットの前記選択が、
該第１のサブセットの第１の選択の間に、
前記１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと；
少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの候補微生物株を該第１のサブセットに含めるために選択するステップと
を含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記第１のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第１のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第１のサブセット候補微生物株が、該第１のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと；
少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第１のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの候補微生物株を該第１のサブセットに含めるために選択するステップと
をさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
候補微生物株の設計を反復して改善するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．（１）１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および（２）対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと；
ｂ．遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと；
ｃ．該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと；
ｄ．これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第１のサブセットを選択するステップと；
ｅ．該候補微生物株の該第１のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと；
ｆ．これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第２のサブセットの選択物を得るステップと；
ｇ．（２）該選択された候補微生物株の第２のサブセットの対応する測定された性能とともに、（１）該選択された候補微生物株の第２のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと；
ｈ．（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
（項目４８）
前記命令が、前記１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、前記システムに、少なくとも１つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで（ｂ）〜（ｇ）を繰り返させる、項目４７に記載のシステム。
（項目４９）
前記予測モデルへの試験入力の第１の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み；
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第２のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、項目４７に記載のシステム。
（項目５０）
前記候補微生物株の前記第１のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、項目４７に記載のシステム。
（項目５１）
前記命令が、前記１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、前記システムに、前記第１のサブセットの第１の選択の間に、
前記１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと；
少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの候補微生物株を該第１のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、項目５０に記載のシステム。
（項目５２）
前記命令が、前記１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、前記システムに、前記第１のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第１のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第１のサブセット候補微生物株が、該第１のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと；
少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第１のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの候補微生物株を該第１のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、項目５１に記載のシステム。
（項目５３）
候補微生物株の設計を反復して改善するための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．（１）１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および（２）対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと；
ｂ．遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと；
ｃ．該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと；
ｄ．これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第１のサブセットを選択するステップと；
ｅ．該候補微生物株の該第１のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと；
ｆ．これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第２のサブセットの選択物を得るステップと；
ｇ．（２）該選択された候補微生物株の第２のサブセットの対応する測定された性能とともに、（１）該選択された候補微生物株の第２のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと；
ｈ．（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
（項目５４）
前記命令が、実行されるとき、前記１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、少なくとも１つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで（ｂ）〜（ｇ）を繰り返させる、項目５３に記載のコンピューター可読媒体。
（項目５５）
前記予測モデルへの試験入力の第１の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み；
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第２のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、項目５３に記載のコンピューター可読媒体。
（項目５６）
前記候補微生物株の前記第１のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、項目５３に記載のコンピューター可読媒体。
（項目５７）
前記命令が、実行されるとき、前記１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、前記第１のサブセットの第１の選択の間に、
前記１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと；
少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの候補微生物株を該第１のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、項目５６に記載のコンピューター可読媒体。
（項目５８）
前記命令が、実行されるとき、前記１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、前記第１のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第１のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第１のサブセット候補微生物株が、該第１のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと；
少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第１のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの候補微生物株を該第１のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、項目５３に記載のコンピューター可読媒体。
（項目５９）
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するためのコンピューター実装方法であって、
少なくとも１つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと；
少なくとも２つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも２つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと；
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
を含む、方法。
（項目６０）
前記少なくとも２つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも１つの微生物バックグラウンド株と同じである、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
少なくとも１つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと；
少なくとも２つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも２つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと；
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
（項目６２）
前記少なくとも２つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも１つの微生物バックグラウンド株と同じである、項目６１に記載のシステム。
（項目６３）
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
少なくとも１つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと；
少なくとも２つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも２つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと；
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
（項目６４）
前記少なくとも２つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも１つの微生物バックグラウンド株と同じである、項目６３に記載のコンピューター可読媒体。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、多様性プール中のバリエーションを増加させるための本開示のＤＮＡ組換えの方法を示す。物理的または酵素的／化学的な手段により、ＤＮＡ切片、例えば、関連のある種からのゲノム領域を切断することができる。切断したＤＮＡ領域を融解し、再アニールさせ、その結果、オーバーラップする遺伝子領域が、ポリメラーゼ伸長反応を開始する。産物が１つまたは複数の出発配列に由来するエレメントを含むキメラＤＮＡに再アセンブルされるまで、後続の融解／伸長反応を実施する。
【００５２】
【図２】図２は、選択された配列の改変（例えば、スワップするための１００個のＳＮＰ）を用いて、新しい宿主生物を生成するための本開示の方法の概要を示す。手短に述べると、方法は以下を含む：（１）所望のＤＮＡ挿入断片を、設計し、アセンブリー反応において１つまたは複数の合成オリゴを組み合わせることによって生成する、（２）ＤＮＡ挿入断片を、形質転換プラスミド中にクローニングする、（３）完成したプラスミドを、所望の産生株中に移入させ、そのプラスミドが宿主株のゲノム中に組み込まれる、および、（４）選択マーカーおよび他の望まれないＤＮＡエレメントを、宿主株からループアウトする。ＤＮＡアセンブリーの各ステップは、追加の、品質管理（ＱＣ）のステップ、例えば、増幅およびシーケンシングのためにプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ細菌中にクローニングするステップも含むことができる。
【００５３】
【図３】図３は、本開示の形質転換プラスミドアセンブリー、および宿主生物中へのそのプラスミドの組込みを示す。挿入断片ＤＮＡ（insert  DNA）を、アセンブリー反応において１つまたは複数の合成オリゴを組み合わせることによって生成する。所望の配列を含有するＤＮＡ挿入断片に、ゲノムの標的領域に相同なＤＮＡの領域を隣接させる。これらの相同領域は、ゲノムの組込みを促進し、一旦組み込まれると、続くステップでベクター骨格のＤＮＡをループアウトするように設計されたダイレクトリピート領域を形成する。アセンブルされたプラスミドは、挿入断片ＤＮＡを含有し、任意選択で、１つまたは複数の選択マーカーも含有する。
【００５４】
【図４】図４は、選択された、宿主株に由来するＤＮＡの領域をループアウトするための手順を示す。挿入されたＤＮＡおよび宿主ゲノムのダイレクトリピート領域は、組換え事象において「ループアウトする」ことができる。選択マーカーについて対抗選択された細胞は、ダイレクトリピート領域が隣接するループＤＮＡの欠失を含有する。
【００５５】
【図５】図５は、本開示の株改良プロセスの実施形態を示す。遺伝子改変を含有する宿主株配列（遺伝子設計）を、多様な株バックグラウンドにおいて、株性能の改善（株構築）について試験する。有益な変異を示す株を分析し（ヒットＩＤおよび分析）、データを、さらに分析するために、ライブラリー（とりわけ、例えば、ＳＮＰスワップライブラリー、ＰＲＯスワップライブラリーおよびそれらの組合せ）に保存する。追加の反復分析のために、本開示の選択規則により、１つまたは複数のライブラリーに由来するエレメントの組合せについて予測される効果に基づいて新たに提案される宿主株配列が生成される。
【００５６】
【図６Ａ】図６は、本開示の実施形態のうちの１つのＤＮＡアセンブリー、形質転換および株スクリーニングのステップを示す。図６Ａは、ＤＮＡ断片を構築するためのステップ、前記ＤＮＡ断片をベクター中にクローニングするためのステップ、前記ベクターを宿主株中に形質転換するためのステップ、および選択配列を対抗選択によりループアウトするためのステップを示す。図６Ｂは、ハイスループット培養するためのステップ、スクリーニングするためのステップ、および選択された宿主株を評価するためのステップを示す。この図はまた、培養物タンク中の、選択された株の培養、スクリーニングおよび評価を行う任意選択のステップも示す。
【図６Ｂ】図６は、本開示の実施形態のうちの１つのＤＮＡアセンブリー、形質転換および株スクリーニングのステップを示す。図６Ａは、ＤＮＡ断片を構築するためのステップ、前記ＤＮＡ断片をベクター中にクローニングするためのステップ、前記ベクターを宿主株中に形質転換するためのステップ、および選択配列を対抗選択によりループアウトするためのステップを示す。図６Ｂは、ハイスループット培養するためのステップ、スクリーニングするためのステップ、および選択された宿主株を評価するためのステップを示す。この図はまた、培養物タンク中の、選択された株の培養、スクリーニングおよび評価を行う任意選択のステップも示す。
【００５７】
【図７】図７は、本開示の自動化されたシステムの一実施形態を示す。本開示は、宿主生物のクローニング、形質転換、培養、スクリーニングおよび／またはシーケンシングが可能な多様なモジュールを有する自動化されたロボットシステムの使用を教示する。
【００５８】
【図８】図８は、本開示の宿主株改良プログラムの実施形態の概要を示す。
【００５９】
【図９】図９は、およそ３．２×１０６個の塩基対を含むＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムを描写する。
【００６０】
【図１０】図１０は、本開示の形質転換の実験結果を示す。０．５ｋｂ〜５．０ｋｂの範囲のＤＮＡ挿入断片を、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムの（相対的な位置１〜２４として示す）多様な領域への挿入に対して標的化した。明るい色により、組込みの成功を示し、一方、より暗い色により、挿入の失敗を示す。
【００６１】
【図１１】図１１は、第２のラウンドのＨＴＰ操作ＰＲＯスワッププログラムの結果を示す。ＰＲＯスワップの第１のラウンドの間に同定したプロモーター：：遺伝子の上位の組合せを、本開示の方法に従って分析して、宿主の性能に対して相加的またはコンビナトリアルに有益な効果を示す可能性があろう、前記変異の組合せを同定した。したがって、第２のラウンドのＰＲＯスワップ変異体は、多様なプロモーター：：遺伝子の変異の対の組合せを含んだ。結果として得られた第２のラウンドの変異体を、選択された生体分子の宿主細胞の収率の差についてスクリーニングした。有益な効果を示すことが予測されていた、変異の組合せの対が、円を用いて強調されている。
【００６２】
【図１２】図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換したプラスミドに関するプラスミドアセンブリーの成功について試験した実験結果を示す。１ｋｂおよび２ｋｂの挿入配列を含有するプラスミドについては、４つのコロニーを選べば、１３％の失敗率を実践するのに十分である。より大きな挿入は、一貫性のある結果をなしとげるのに、追加のコロニースクリーニングを必要とする場合がある。
【００６３】
【図１３】図１３は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの挿入ベクターによる形質転換の成功について試験した実験結果を示す。２ｋｂおよび５ｋｂのＤＮＡ挿入断片のサイズは、高い形質転換率を示し、アセンブリーの失敗率は低かった。
【００６４】
【図１４】図１４は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるループアウト選択の結果を示す。形質転換された細菌のスクロース耐性により、ｓａｃＢ選択マーカーがループアウトされたことが示される。ＤＮＡ挿入断片のサイズが、ループアウト効率に影響を及ぼすようには見えない。
【００６５】
【図１５】図１５は、相関性の尺度を使用して計算した類似性マトリックスである。マトリックスにより、ＳＮＰバリアント間の機能類似性が描写される。低い機能類似性を有するＳＮＰの統合は、より高い機能類似性を有するＳＮＰの統合とは対照的に、株性能を改善する可能性がより高いことが期待される。
【００６６】
【図１６】図１６Ａ〜Ｂは、上位性マッピングの実験結果を示す。低い機能類似性を有するＳＮＰスワップとＰＲＯスワップとの組合せにより、改良された株性能が得られる。図１６Ａは、すべてのＳＮＰ／ＰＲＯスワップの機能類似性によりクラスター化された樹状図を示す。図１６Ｂは、産物の収率により測定した場合の、宿主株の、統合したＳＮＰの性能を示す。より大きなクラスターの距離が、宿主株の統合性能の改善と相関する。
【００６７】
【図１７】図１７Ａ〜Ｂは、多様性プール中の株バリアント間のＳＮＰの差を示す。図１７Ａは、この実験の株の間の関係を示す。株Ａは、野生型の宿主株である。株Ｂは、中間の、操作された株である。株Ｃは、工業生産用の株である。図１７Ｂは、各株において、ユニークなＳＮＰおよび共有されているＳＮＰの数を同定するグラフである。
【００６８】
【図１８】図１８は、本開示の方法に従う第１のラウンドのＳＮＰスワッピングの実験を示す。（１）ＣからのＳＮＰをすべて、基準株Ａ中に個々および／またはコンビナトリアルにクローニングする（ＡからＣへの「ウェーブアップ」）。（２）ＣからのＳＮＰをすべて、市販株Ｃから個々および／またはコンビナトリアルに除去する（ＣからＡへの「ウェーブダウン」）。（３）ＢからのＳＮＰをすべて、基準株Ａ中に個々および／またはコンビナトリアルにクローニングする（ＡからＢへのウェーブアップ）。（４）ＢからのＳＮＰをすべて、市販株Ｂから個々および／またはコンビナトリアルに除去する（ＢからＡへのウェーブダウン）。（５）ＣにユニークなＳＮＰをすべて、個々および／またはコンビナトリアルに市販株Ｂ中にクローニングする（ＢからＣへのウェーブアップ）。（６）ＣにユニークなＳＮＰをすべて、市販株Ｃから個々および／またはコンビナトリアルに除去する（ＣからＢへのウェーブダウン）。
【００６９】
【図１９】図１９は、プロモータースワップのプロセスにおいて利用される遺伝子標的の例を示す。
【００７０】
【図２０】図２０は、同定した遺伝子標的についてプロモータースワップのプロセスを実施するために利用されている例示的なプロモーターライブラリーを示す。ＰＲＯスワップ（すなわち、プロモータースワップ）のプロセスにおいて利用されるプロモーターは、Ｐ１〜Ｐ８であり、それらの配列および同一性は、表１に見出すことができる。
【００７１】
【図２１】図２１は、プロモータースワッピングの遺伝子の結果は、標的とされる特定の遺伝子に依存することを示す。
【００７２】
【図２２】図２２は、リシンの収率に対する性能に有意に影響を及ぼす改変を示す、例示的なＨＴＰプロモータースワッピングのデータを示す。Ｘ軸は、プロモータースワップ遺伝子設計微生物株ライブラリー内の異なる株を表し、Ｙ軸は、各株についてのリシンの収率の相対的な値を含む。グラフ上の各文字が、ＰＲＯスワップの標的遺伝子を表す。各データ点が、反復を表す。データは、本明細書に記載の、ＨＴＰの適用例に適応させた分子ツール（すなわち、ＰＲＯスワップ）は、目的の化合物または分子を産生するために、効率的に、微生物株を創製し、その株性能を最適化することが可能であることを実証している。この場合、目的の化合物は、リシンであった；しかし、教示するＰＲＯスワップの分子ツールを利用して、任意の目的の化合物の産生を最適化し、かつ／または増加させることができる。当業者であれば、いかにして所望の化合物の産生をコードする標的遺伝子を選び、次いで、教示するＰＲＯスワップの手順を利用するかを理解するはずである。本明細書で教示するリシンの収率の増加を例示するのに示したデータと、本出願中に提示する詳細な開示とにより、ＰＲＯスワップの分子ツールが、ＨＴＰゲノム操作の広く適用可能な進歩となり得ることを当業者は容易に認識するはずである。
【００７３】
【図２３】図２３は、検討中のインプットデータについての相対的な株性能の分布を示す。ゼロの相対的な性能は、操作された株がプレート中の基準株に等しく良好に機能したことを示す。本明細書に記載するプロセスは、ゼロを有意に上回って機能する可能性がある株を同定するように設計される。
【００７４】
【図２４】図２４は、相対的な株性能の平均変化（増加または減少）を示す線形回帰係数値を示し、該株性能は、表示する株中に組み入れている各遺伝子変化と関連がある。
【００７５】
【図２５】図２５は、予測される株の設計の上位１００個についての変化の組成（composition  of  change）を示す。ｘ軸に、潜在的な遺伝子変化（ｄｓｓ変異はＳＮＰスワップであり、Ｐｃｇ変異はＰＲＯスワップである）のプールを列挙し、ｙ軸に、順位を示す。黒色のセルにより、候補の設計における特定の変化の存在を示し、一方、白色のセルにより、そうした変化の不在を示す。この特定の例では、上位１００個の設計はすべて、ｐｃｇ３１２１＿ｐｇｉ、ｐｃｇ１８６０＿ｐｙｃ、ｄｓｓ＿３３９およびｐｃｇ０００７＿３９＿ｌｙｓａの変化を含有する。加えて、上位の候補の設計は、ｄｓｓ＿０３４、ｄｓｓ＿００９の変化を含有する。
【００７６】
【図２６】図２６は、本開示の実施形態のうちの１つの、ＤＮＡアセンブリーおよび形質転換のステップを示す。フローチャートは、ＤＮＡ断片を構築するためのステップ、前記ＤＮＡ断片をベクター中にクローニングするためのステップ、前記ベクターを宿主株中に形質転換するためのステップ、および選択配列を対抗選択によりループアウトするためのステップを示す。
【００７７】
【図２７】図２７は、ハイスループット培養するためのステップ、スクリーニングするためのステップ、および選択された宿主株を評価するためのステップを示す。この図はまた、培養物タンク中の、選択された株の培養、スクリーニングおよび評価を行う任意選択のステップも示す。
【００７８】
【図２８】図２８は、本開示のプロモーターラダーに従って一連の調節性の発現を示す、例示的なプロモーターの発現プロファイルを示す。プロモーターＡの発現は、細菌培養の誘導期にピークに達し、一方、プロモーターＢおよびＣはそれぞれ、対数期および定常期にピークに達する。
【００７９】
【図２９】図２９は、本開示のプロモーターラダーに従って一連の調節性の発現を示す、例示的なプロモーターの発現プロファイルを示す。プロモーターＡの発現は、選択された基質を添加すると、即時にピークに達するが、基質の濃度が低下するにつれて、検出不能なレベルに急速に戻る。プロモーターＢの発現は、選択された基質を添加すると、即時にピークに達し、基質の対応する低下と一緒に、ゆっくり低下して、検出不能なレベルに戻る。プロモーターＣの発現は、選択された基質を添加すると、ピークに達し、培養全体を通して、基質が消散してしまった後でさえ、高度な発現状態を維持する。
【００８０】
【図３０】図３０は、本開示のプロモーターラダーに従って一連の構成性の発現レベルを示す、例示的なプロモーターの発現プロファイルを示す。プロモーターＡは、最も低い発現を示し、それに続いて、プロモーターＢおよびＣがそれぞれ、発現レベルを増加させる。
【００８１】
【図３１】図３１は、株改良のための本開示のＬＩＭＳシステムの実施形態を図示する。
【００８２】
【図３２】図３２は、本開示のＬＩＭＳシステムの実施形態のクラウドコンピューティングの実装を図示する。
【００８３】
【図３３】図３３は、本開示の反復予測株設計ワークフローの実施形態を示す。
【００８４】
【図３４】図３４は、本開示の実施形態に従う、コンピューターシステムの実施形態を図示する。
【００８５】
【図３５】図３５は、本開示の一実施形態に従うＤＮＡアセンブリーに関連するワークフローを示す。このプロセスは、４つの段階：重要部分（part）の生成、プラスミドアセンブリー、プラスミドのＱＣ、および形質転換のためのプラスミドの調製に分けられる。重要部分の生成の間に、オリゴのシーケンシングのベンダーから、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩＭＳ）により設計されたオリゴを発注し、宿主生物から標的配列をＰＣＲにより増幅するために使用する。これらのＰＣＲの重要部分は、清浄して、混入物を除去し、断片の分析により、すなわち、観察される断片サイズと理論的な断片サイズとのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの品質管理比較、およびＤＮＡの定量を行って、成功について評価する。重要部分を、酵母中にアセンブリーベクターと一緒に形質転換し、プラスミド中に相同組換えによりアセンブルする。アセンブルされたプラスミドを、酵母から単離し、Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換して、続いて、アセンブリーの品質管理および増幅を行う。プラスミドアセンブリーの品質管理の間に、各プラスミドのいくつかの複製物を単離し、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用して増幅し、正確なアセンブリーについて酵素消化および断片の分析により評価する。ＱＣプロセス中に同定した正確にアセンブルされたプラスミドをヒットピッキングし、恒久的なストックを生成し、プラスミドＤＮＡを抽出し、定量してから、標的宿主生物中に形質転換する。
【００８６】
【図３６】図３６は、ターミネーターＴ１〜Ｔ８の効果を、２つの培地中で２つの時点にわたり特徴付けた実験結果を示す。条件Ａおよび条件Ｃは、ＢＨＩ培地についての２つの時点を表し、一方、Ｂ点およびＤ点は、ＨＴＰ試験培地についての２つの時点を表す。
【００８７】
【図３７】図３７は、ＵＶ変異誘発などの従来の株改良アプローチの有効性と、本開示のＨＴＰ操作の方法論とを比較した実験結果を示す。圧倒的多数のＵＶ変異は、宿主細胞の性能の目立った増加をもたらさなかった。対照的に、本開示のＰＲＯスワップの方法論は、宿主細胞の性能の１．２〜２倍の増加を示す変異体を高い比率で産生した。
【００８８】
【図３８】図３８は、第１のラウンドのＨＴＰ操作ＳＮＰスワッププログラムの結果を示す。１８６個の個別のＳＮＰ変異を同定し、基準株上に個々にクローニングした。結果として得られた変異体を、選択された生体分子の宿主細胞の収率の差についてスクリーニングした。
【００８９】
【図３９】図３９は、第２のラウンドのＨＴＰ操作ＳＮＰスワッププログラムの結果を示す。第１のラウンドのＳＮＰスワッププログラムからの１７６個の個別のＳＮＰ変異を、第１のラウンドのＳＮＰプログラムの間に同定した有益なＳＮＰを含有する第２のラウンドの宿主細胞株中に個々にクローニングした。したがって、結果として得られた変異体は、２つの変異を組み合わせた対の効果を表す。選択された生体分子に関して、宿主細胞の収率（Ｙ軸）および生産性（Ｘ軸）における差についてのスクリーニングの結果を示す。
【００９０】
【図４０】図４０は、タンク発酵のバリデーション実験の結果を示す。ＨＴＰ  ＳＮＰスワップの第２のラウンドからの変異の上位の対を、発酵タンク中で培養した。選択された生体分子（すなわち、リシン）に関して、宿主細胞の収率および生産性についての結果を示す。認め得るように、本発明者らは、１つのラウンドのゲノム操作において、ＰＲＯスワップ手順を利用して、特定のＰＲＯスワップ変異体（ｚｗｆ）が、基準株と比較して（すなわち、基準株と、基準株＋ｚｗｆとを比較して）、選択された生体分子の収率の増加を示すことを決定した。次いで、本発明者らは、別のラウンドのゲノム操作を実施し、この場合、ＳＮＰスワップ手順を使用して、前記ＰＲＯスワップ変異体と組み合わせた場合に、生体分子の収率に影響を及ぼすことができる有益なＳＮＰ変異を決定した。ＰＲＯスワップ手順とＳＮＰスワップ手順との組合せにより、これまでのＰＲＯスワップのみの変異体よりも（すなわち、基準株＋ｚｗｆ＋ＳＮＰ１２１と、これまでに論じた基準株＋ｚｗｆとを比較して）、さらに高い収率を有する変異体が創製された。この図は、本開示のＰＲＯスワップ手順とＳＮＰスワップ手順とを組み合わせることによってなしとげることができる収率の劇的な改善を示す。ＰＲＯスワップゲノム操作キャンペーンとＳＮＰスワップゲノム操作キャンペーンとを組み合わせる態様では、目的の生体分子／産物の収率および／または生産性を、基準株と比べて、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％またはそれ超だけ増加させることができる。
【００９１】
【図４１】図４１は、第１のラウンドのＨＴＰ操作ＰＲＯスワッププログラムの結果を示す。本開示の方法に従って、宿主の性能と関連があると考えられる、選択された遺伝子を、プロモーターラダーと組み合わせて、第１のラウンドのＰＲＯスワップライブラリーを創製した。結果として得られた変異体を、選択された生体分子（すなわち、リシン）の宿主細胞の収率の差についてスクリーニングした。
【００９２】
【図４２】図４２は、本開示の実施形態に従って、微生物株を設計するための変異の選択における上位性効果の考慮事項を示すフローチャートである。
【００９３】
【図４３】図４３Ａ〜Ｂは、本開示の方法に従うＡ．ｎｉｇｅｒの形質転換およびバリデーションの結果を示す。図４３Ａは、Ａ．ｎｉｇｅｒの形質転換体の９６ウェル培地プレートの写真である。形質転換された培養物は、ａｙｇＡにおける変異を含み、このことにより、細胞が、黒色の代わりに、より薄い黄色に見えるようになる（形質転換されたウェルは、白色の円で囲まれている）。図４３Ｂは、形質転換されたＡ．ｎｉｇｅｒの変異体の次世代シーケンシングの結果を示す。Ｘ軸は、形質転換されていない親株との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。Ｙ軸は、期待される変異との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。チャートの右下辺りのデータ点は、親株との高い類似性、および期待される形質転換された配列との低い類似性を示す。チャートの左上辺りのデータ点は、期待される形質転換された配列に対する高い類似性、および親株との低い同一性を示す。中央にあるデータ点は、複数の核を有する異核共存体を表す可能性がある。
【００９４】
【図４４】図４４Ａ〜Ｂは、Ａ．ｎｉｇｅｒにおけるＳＮＰスワップのインプリメンテーションを示す。図４４Ａは、ＳＮＰスワップの各ＳＮＰについての遺伝子の編集の設計を示す。図はさらに、ｐｙｒＧ遺伝子を、ａｙｇＡ野生型遺伝子の遺伝子座中に導入する共形質転換も示す。図４４Ｂは、Ａ．ｎｉｇｅｒの形質転換体をスクリーニングするための９６ウェル培地プレートの２つの写真である。薄黄色のコロニーは、ａｙｇＡ遺伝子の破壊が成功している形質転換体を表わす。
【００９５】
【図４５】図４５は、次世代シーケンシングの結果に基づく、成功したＡ．ｎｉｇｅｒ変異体形質転換体（上のボックス）を同定する品質管理（ＱＣ）チャートを示す。培養プレートから選択された黄色コロニーのうち、全部で２９．２％が、期待されるＳＮＰの遺伝子変化を示す。
【００９６】
【図４６】図４６は、形質転換されたＡ．ｎｉｇｅｒの変異体の次世代シーケンシングの結果を示す。Ｘ軸は、形質転換されていない親株との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。Ｙ軸は、期待される変異との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。チャートの右下辺りのデータ点は、親株との高い類似性、および期待される形質転換された配列との低い類似性を示す。チャートの左上辺りのデータ点は、期待される形質転換された配列に対する高い類似性、および親株との低い同一性を示す。中央にあるデータ点は、複数の核を有する異核共存体を表す可能性がある。
【００９７】
【図４７】図４７は、本開示の収率モデルに関して、訓練データの測定された性能と比した予測される性能のドットプロットである。基礎をなすモデルは、（４次多項式カーネルを用いる）カーネルリッジ回帰モデルである。モデルを、１８６４個のユニークな遺伝子構築物および関連する表現型の性能に対して訓練する。適合させたモデルは、０．５２のｒ２値を有する。
【００９８】
【図４８】図４８は、本開示の予測アルゴリズムにより生成された候補の設計の遺伝子構成を示す。これらの候補の設計を、ＨＴＰの構築および分析に提出した。ここでは、候補の設計は、親株ｉｄと導入された変異（複数可）との組合せとして定義される。
【００９９】
【図４９】図４９は、本開示の予測アルゴリズムにより生成され、本開示のＨＴＰ構築法に従って構築した候補の設計の測定された性能と比した予測される性能のドットプロットである。この図は、モデルが、候補株の性能を許容できる精度内で予測することができることを示す。
【０１００】
【図５０】図５０は、親株に対する候補株の収率のパーセント変化を示す箱ひげ図である。ｙ軸上では、０．０１の値が、１％に相当する。この図は、コンピューターモデルにより設計された株（薄い灰色）が、それらに対応する親株を上回る測定可能な改善をなしとげることを示す。加えて、図は、これらのモデル基準株の改善の大きさが、ヒト専門家が設計した株によりなしとげられた改善に匹敵することも示す。
【０１０１】
【図５１】図５１は、コンピューターモデルにより設計された株（暗灰色）およびヒト専門家により設計された株（薄い灰色）についての収率による性能の分布を示す。コンピューターにより設計された株は、より密な分布を示し、獲得中央値がより高かった。
【０１０２】
【図５２】図５２は、コンピューターにより生成された候補株（薄い灰色）またはヒト専門家により生成された候補株（暗灰色）の絶対的な収率を示す箱ひげ図である。結果は、親株毎に総計されている。
【発明を実施するための形態】
【０１０３】
定義
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。
【０１０４】
用語「ａ」または「ａｎ」は、そのエンティティの１つまたは複数を指し、すなわち、複数形の指示対象を指すことができる。したがって、用語「ａ」または「ａｎ」、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用される。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による「要素」への言及は、文脈により唯一の要素が存在することが明確に要求されない限り、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、用語「細胞生物」、「微生物（microorganism）」、また
は「微生物（microbe）」は、広く解釈されるべきである。これらの用語は、互換的に使
用され、これらに限定されないが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌および原生生物を含む。一部の実施形態では、本開示は、本開示内に存在するリスト／表および図面の「微生物（microorganism）」または「細胞生物」ま
たは「微生物（microbe）」に言及する。この特徴付けは、表および図面の同定された分類学的な属だけでなく、同定された分類学的な種、ならびに前記表または図面内の任意の生物体の様々な新規のおよび新しく同定または設計された株も参照することができる。同じ特徴付けが、実施例などの本明細書の他の部分におけるこれらの用語の記述にも当てはまる。
【０１０６】
用語「原核生物」は、当技術分野で認識されており、核または他の細胞小器官を含有しない細胞を指す。原核生物は一般に、２つのドメイン、細菌および古細菌の１つに分類される。古細菌と細菌ドメインの生物体間の決定的な差異は、１６ＳリボソームＲＮＡ内のヌクレオチド塩基配列の基本的な差異に基づく。
【０１０７】
用語「古細菌」は、Ｍｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ門の生物体のカテゴリー分類を指し、典型的には、珍しい環境内で見つかり、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如を含めたいくつかの判定基準によって原核生物の残りと区別される。ｓｓｒＲＮＡ分析に基づいて、古細菌は、２つの系統学的に別個の群：ＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａからなる。これらの生理機能に基づいて、古細菌は、３つのタイプ：メタン生成菌（メタンを産生する原核生物）；高度好塩菌（非常に高濃度の塩（ＮａＣｌ）で生きる原核生物）；および高度（超）好熱菌（thermophilus）（非常に高温で生きる原核生物）へと整理することができる。古細菌を細菌と区別する統一的古細菌フィーチャ（すなわち、細胞壁内にムレインが無いこと、エステル連結膜脂質など）に加えて、これらの原核生物は、これらをその特定の生息環境に適応させるユニークな構造的または生化学的属性を呈する。Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａは、超好熱性硫黄依存性原核生物から主になり、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａは、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。
【０１０８】
「細菌」または「真正細菌」は、原核生物体のドメインを指す。細菌は、以下の少なくとも１１の別個の群を含む：（１）２つの主要な亜門：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、その他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）が存在するグラム陽性（グラム＋）細菌；（２）Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む）；（３）ラン藻類、例えば、酸素発生型光合成生物；（４）スピロヘータおよび関連種；（５）Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ；（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ；（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も）；（１０）放射線抵抗性ミクロコッカスおよび類縁体；（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。
【０１０９】
「真核生物」は、細胞が、膜内に囲まれた核および他の小器官を含有する任意の生物体である。真核生物は、分類群ＥｕｋａｒｙａまたはＥｕｋａｒｙｏｔａに属する。真核細胞を原核細胞（上述の細菌および古細菌）から分離する決定的なフィーチャは、これらが膜結合型小器官、特に、遺伝物質を含有し、核包膜によって囲まれている核を有することである。
【０１１０】
用語「遺伝的に改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、および「組換え株」は、本明細書で互換的に使用され、本開示のクローニングおよび形質転換方法によって遺伝的に改変された宿主細胞を指す。よって、この用語は、宿主細胞（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞、ＣＨＯ、ヒト細胞など）であって、それが由来した天然に存在する生物体と比較して、それが変更された、改変された、または異なる遺伝子型および／または表現型（例えば、遺伝子改変が微生物のコーディング核酸配列に影響するとき）を呈するように遺伝的に変更、改変、または操作された、宿主細胞を含む。一部の実施形態では、この用語は、問題の特定の組換え宿主細胞だけでなく、このような宿主細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。
【０１１１】
用語「野生型微生物」または「野生型宿主細胞」は、天然に存在する細胞、すなわち、遺伝的に改変されていない細胞を記述する。
【０１１２】
用語「遺伝子操作された」は、宿主細胞のゲノムの任意のマニピュレーション（例えば、核酸の挿入、欠失、変異、または置き換えによる）を指すことができる。
【０１１３】
用語「対照」または「対照宿主細胞」は、遺伝子改変または実験処置の効果を決定するための適切な比較宿主細胞（comparator  host  cell）を指す。一部の実施形態では、対照宿主細胞は、野生型細胞である。他の実施形態では、対照宿主細胞は、処置宿主細胞を差別化する遺伝子改変（複数可）を除いて、遺伝的に改変された宿主細胞と遺伝的に同一である。一部の実施形態では、本開示は、対照宿主細胞としての親株（例えば、株改良プログラムの基礎として使用されたＳ１株）の使用を教示する。他の実施形態では、宿主細胞は、処置宿主細胞において試験されている特異的プロモーターまたはＳＮＰを欠く遺伝的に同一の細胞であり得る。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子（複数可）」は、遺伝子の１つまたは複数の代替形態のいずれかを意味し、これらの対立遺伝子すべては、少なくとも１つの形質または特性と関係する。二倍体細胞では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占有する。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座（locus）」（遺伝子座（loci）複数形）
は、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見出される染色体上の具体的な１つもしくは複数の場所または部位を意味する。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝的に連結された」は、２種またはそれ超の形質であって、これらが交雑によって分離するのが困難であるように、繁殖中に高い割合で共遺伝される、形質を指す。
【０１１７】
本明細書で使用される「組換え」または「組換え事象」は、染色体交差または独立組合せを指す。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、用語「表現型」は、個々の遺伝子構造（すなわち、遺伝子型）と環境との間の相互作用から生じる個々の細胞、細胞培養物、生物体、または生物体の群の観察可能な特性を指す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、用語「キメラの」または「組換えの」は、核酸配列またはタンパク質配列を記述するとき、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドもしくは２つの異種ポリペプチドを連結して単一の巨大分子にする、または少なくとも１つの天然の核酸もしくはタンパク質配列の１つもしくは複数のエレメントを再編成する核酸またはタンパク質配列を指す。例えば、用語「組換えの」は、例えば、化学合成による、または遺伝子操作技法による核酸の単離セグメントのマニピュレーションによる、配列の２つの別の方法で分離されたセグメントの人工の組合せを指すことができる。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、天然に存在することが知られていない、または天然に存在しないヌクレオチド配列である。一般に、このような合成ヌクレオチド配列は、任意の他の天然に存在するヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも１つのヌクレオチド差異を含む。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはこれらの類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造を指し、よって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。これは、修飾核酸、例えば、メチル化および／またはキャッピングされた核酸、修飾塩基、主鎖修飾を含有する核酸なども含む。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用される。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連したＤＮＡの任意のセグメントを指す。よって、遺伝子は、これらに限定されないが、コード配列および／またはこれらの発現に要求される調節配列を含む。遺伝子は、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含み得る。遺伝子は、目的の源からのクローニング、または公知のもしくは予測された配列情報からの合成を含めた、様々な源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含み得る。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、用語「相同の」または「相同体」または「オルソログ」は、当技術分野で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指す。用語「相同性」、「相同の」、「実質的に同様の」、および「実質的に対応する」は、本明細書で互換的に使用される。これらは、核酸断片であって、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介し、またはある特定の表現型を生じさせる核酸断片の能力に影響しない、核酸断片を指す。これらの用語は、本開示の核酸断片の修飾、例えば、最初の無修飾断片と比べて得られる核酸断片の機能的性質を実質的に変更しない１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入も指す。したがって、当業者が十分に理解するように、本開示は、具体的な例示的な配列より多くを包含することが理解される。これらの用語は、１つの種、亜種、種類、栽培品種、または株内に見出される遺伝子と、別の種、亜種、種類、栽培品種、または株内の対応するまたは等価な遺伝子との間の関係を記述する。本開示の目的に関して、相同配列が比較される。「相同配列」または「相同体」または「オルソログ」は、機能的に関連していると見なされ、考えられ、または知られている。機能的関係は、これらに限定されないが、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じもしくは同様の生物学的機能を含めた、いくつかのやり方のいずれか１つにおいて示され得る。好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方が示される。相同性は、当技術分野で容易に利用可能なソフトウェアプログラム、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（F.M.  Ausubelら編、１９８７
年）補遺３０、セクション７．７１８、表７．７１に論じられたものなどを使用して決定することができる。いくつかの整列プログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、およびＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。別の整列プログラムは、デフォルトパラメータを使用するＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、用語「内在性の」または「内在性遺伝子」は、天然に存在する遺伝子であって、それが宿主細胞ゲノム内に天然に見出される場所における天然に存在する遺伝子を指す。本開示との関連で、異種プロモーターを内在性遺伝子に作動可能に連結することは、既存の遺伝子であって、その遺伝子が天然に存在する場所における、既存の遺伝子の前に異種プロモーター配列を遺伝的に挿入することを意味する。本明細書に記載の内在性遺伝子は、本開示の方法のいずれかによって変異された天然に存在する遺伝子の対立遺伝子を含み得る。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、用語「外因性の」は、用語「異種の」と互換的に使用され、その生来の源（native  source）以外の何らかの源に由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性遺伝子」は、非生来の源または場所由来であり、生物系に人工的に供給されたタンパク質または遺伝子を指す。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を指す。例えば、変異は、サイレント置換、付加、または欠失を生じさせるが、コードされるタンパク質の性質もしくは活性、またはタンパク質が作製される方法を変更しない変更を含有する。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質修飾」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸修飾、欠失、および／または挿入を指す。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、用語、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」は、このような配列の最小限のサイズ特性を有する部分、または最大で全長分子の、および全長分子を含めた、全長分子の任意のより大きい断片を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物活性部分をコードすることができる。遺伝子調節エレメントの生物活性部分は、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの１つの部分を単離し、本明細書に記載の活性を評価することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの部分は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであり得、最大で全長ポリペプチドまで伸び得る。使用される部分の長さは、特定の用途に依存する。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の部分は、１２ヌクレオチドという短さであり得；一部の実施形態では、それは、２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの部分は、４アミノ酸という短さであり得る。完全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの部分は一般に、４アミノ酸より長いはずである。
【０１２９】
バリアントポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリングなどの変異誘発および組換え誘導（recombinogenic）手順に由来する配列も包含する。このようなＤＮＡシャッフリングのストラテジーは、当技術分野で公知である。例えば、Stemmer（１９９４年）、PNAS、
９１巻：１０７４７〜１０７５１頁；Stemmer（１９９４年）、Nature、３７０巻：３８
９〜３９１頁；Crameriら（１９９７年）、Nature  Biotech.、１５巻：４３６〜４３８
頁；Mooreら（１９９７年）、J.  Mol.  Biol.、２７２巻：３３６〜３４７頁；Zhangら
（１９９７年）、PNAS、９４巻：４５０４〜４５０９頁；Crameriら（１９９８年）、Nature、３９１巻：２８８〜２９１頁；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および同
第５，８３７，４５８号を参照。
【０１３０】
本明細書に開示のポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に関して、オリゴヌクレオチドプライマーを、目的の任意の生物体から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応で使用するのに設計することができる。ＰＣＲプライマーを設計しＰＣＲクローニングするための方法は、当技術分野で一般に公知であり、Sambrookら（２００１年）、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual（３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Plainview、New  York）に開示されている。Innisら編（１９９０年）、PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications（Academic  Press、New  York）；InnisおよびGelfand編（１９９５年）、PCR  Strategies（Academic  Press、New  York）；ならびにInnisおよびGelfand編（１９９９年）PCR  Methods  Manual（Academic  Press、New  York）も参照。ＰＣＲの公知の方法としては、これらに限定されないが、対プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを使用する方法が挙げられる。
【０１３１】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、増幅標的にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼを結合させ、それによって、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための作用物質の存在下で、かつ適当な温度およびｐＨで配置されたとき、ＤＮＡ合成の開始点として機能を果たすことができるオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは、好ましくは、増幅の効率を最大にするために一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための作用物質の存在下で伸長産物の合成をプライムするのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、プライマーの温度および組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含有量）を含めた多くの因子に依存する。一対の双方向性プライマーは、ＰＣＲ増幅などのＤＮＡ増幅の技術分野で一般に使用されるように、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーからなる。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有のエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が生来の遺伝子に由来する場合があり、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成される場合があり、または合成ＤＮＡセグメントを含むことさえできる。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型における、または発達の異なる段階における、または異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を指示することができることが当業者によって理解されている。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は、完全に画定されていないので、あるバリエーションのＤＮＡ断片は、同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識されている。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、語句「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書で互換的に使用される。組換えコンストラクトは、核酸断片の人工の組合せ、例えば、天然に一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む。例えば、キメラコンストラクトは、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが、天然に見出されるものと異なる様式で配列されている調節配列およびコード配列を含み得る。このようなコンストラクトは、それ自体で使用することができ、またはベクターと併せて使用することができる。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本開示の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を順調に形質転換、選択、および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントをよく知っている。当業者は、異なる独立した形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Jonesら（１９８５
年）、EMBO  J.、４巻：２４１１〜２４１８頁；De  Almeidaら（１９８９年）、Mol.  Gen.  Genetics、２１８巻：７８〜８６頁）、よって、所望の発現レベルおよびパターン
をディスプレイする系（line）を得るために、複数の事象がスクリーニングされなければならないことも認識する。このようなスクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析によってなしとげることができる。ベクターは、自発的に複製する、または宿主細胞の染色体内に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロ−ウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自律複製していない裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡなどでもあり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟）の産生を指す。
【０１３４】
「作動可能に連結した」は、本文脈において、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、前記さらなるポリヌクレオチドの転写をもたらす連続した配置を意味する。
【０１３５】
本明細書で使用される用語「目的の産物」または「生体分子」は、供給原料から微生物によって産生される任意の産物を指す。一部の場合では、目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコールなどであり得る。例えば、目的の産物または生体分子は、任意の一次または二次細胞外代謝産物であり得る。一次代謝産物は、とりわけ、エタノール、クエン酸、乳酸、グルタミン酸、グルタメート、リシン、トレオニン、トリプトファン、および他のアミノ酸、ビタミン、多糖などであり得る。二次代謝産物は、とりわけ、ペニシリンのような抗生物質化合物、またはシクロスポリンＡのような免疫抑制剤、ジベレリンのような植物ホルモン、ロバスタチンのようなスタチン薬、グリセオフルビンのような殺真菌薬などであり得る。目的の産物、または生体分子は、微生物によって産生される任意の細胞内コンポーネント、例えば、カタラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼ、および多くのその他を含めた微生物酵素でもあり得る。細胞内コンポーネントとして、組換えタンパク質、例えば、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなども挙げることができる。
【０１３６】
用語「炭素源」は一般に、細胞増殖のための炭素の源として使用されるのに適した物質を指す。炭素源としては、これらに限定されないが、バイオマス加水分解物、デンプン、スクロース、セルロース、ヘミセルロース、キシロース、およびリグニン、ならびにこれらの基質のモノマーコンポーネントが挙げられる。炭素源は、これらに限定されないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含めた様々な形態での様々な有機化合物を含み得る。これらとしては、例えば、様々な単糖、例えば、グルコース、デキストロース（Ｄ−グルコース）など、マルトース、オリゴ糖、多糖、飽和もしくは不飽和脂肪酸、スクシネート、ラクテート、アセテート、エタノールなど、またはこれらの混合物がある。光合成生物は、光合成の産物として炭素源をさらに産生することができる。一部の実施形態では、炭素源は、バイオマス加水分解物およびグルコースから選択され得る。
【０１３７】
用語「供給原料」は、他の産物が作製され得る微生物または発酵プロセスに供給される原料または原料の混合物として定義される。例えば、バイオマスまたはバイオマスに由来する炭素化合物などの炭素源は、発酵プロセスにおいて目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）を産生する微生物の供給原料である。しかし、供給原料は、炭素源以外の栄養分を含有し得る。
【０１３８】
用語「体積生産性」または「生産速度」は、単位時間当たり、媒体の体積当たりに形成される産物の量として定義される。体積生産性は、１時間当たり１リットル当たりのグラム（ｇ／Ｌ／ｈ）で報告することができる。
【０１３９】
用語「比生産性」は、産物の形成の速度として定義される。比生産性は、１時間当たり細胞乾燥重量（ＣＤＷ）１グラム当たりの産物のグラム（ｇ／ｇ  ＣＤＷ／ｈ）での比生産性として本明細書でさらに定義される。所与の微生物のＯＤ６００に対するＣＤＷの関係を使用して、比生産性を、１時間当たり６００ｎｍにおける培養ブロスの光学密度（ＯＤ）当たり培養培地１リットル当たりの産物のグラム（ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ）として表現することもできる。
【０１４０】
用語「収率」は、原料の単位重量当たりに得られる産物の量として定義され、基質１ｇ当たりの産物のｇ（ｇ／ｇ）として表現することができる。収率は、理論的収率のパーセンテージとして表現することができる。「理論的収率」は、産物を作製するのに使用される代謝経路の化学量論比によって決まる所与の量の基質あたりに産生され得る産物の最大量として定義される。
【０１４１】
用語「力価（titre）」または「力価（titer）」は、溶液の強度または溶液中の物質の濃度として定義される。例えば、発酵ブロス中の目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）の力価は、発酵ブロス１リットル当たりの溶液中の目的の産物のｇ（ｇ／Ｌ）として記述される。
【０１４２】
用語「総力価」は、プロセスにおける初期体積またはプロセスにおける操作体積に対する、プロセスから取り出され、回収される溶液中の目的の産物、適用可能な場合、気相中の目的の産物、および任意の目的の産物を含むがこれらに限定されない、プロセスにおいて産生されるすべての目的の産物の和として定義される。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー」または「ライブラリー」は、本開示による遺伝子撹乱のコレクションを指す。一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、ｉ）データベースまたは他のコンピューターファイル中の配列情報のコレクション、ｉｉ）上述の一連の遺伝子エレメントをコードする遺伝子コンストラクトのコレクション、またはｉｉｉ）前記遺伝子エレメントを含む宿主細胞株として顕在化させ得る。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、個々のエレメントのコレクション（例えば、ＰＲＯスワップライブラリーのプロモーターのコレクションまたはＳＴＯＰスワップライブラリーのターミネーターのコレクション）を指すことができる。他の実施形態では、本開示のライブラリーは、遺伝子エレメントの組合せ、例えば、プロモーター：：遺伝子、遺伝子：ターミネーター、またはさらにはプロモーター：遺伝子：ターミネーターの組合せも指すことができる。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、宿主生物におけるライブラリーの各メンバーを適用する効果と関連したメタデータをさらに含む。例えば、本明細書で使用されるライブラリーは、特定の種における１つまたは複数の表現型に対するこれらの組合せの結果として生じる効果と一緒に、プロモーター：：遺伝子配列組合せのコレクションを含み、よって、将来のプロモータースワップにおいて前記組合せを使用することについて将来の予測値を改善することができる。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、用語「ＳＮＰ」は、核内低分子多形（複数可）を指す。一部の実施形態では、本開示のＳＮＰは、広く解釈されるべきであり、一塩基多型、配列挿入、欠失、反転、および他の配列置き換えを含む。本明細書で使用される場合、用語「非同義の」または「非同義ＳＮＰ」は、宿主細胞タンパク質におけるコード変化をもたらす変異を指す。
【０１４５】
ゲノム操作の「ハイスループット（ＨＴＰ）」方法は、自動化設備（例えば、液体ハンドラーまたはプレートハンドラーマシン）の少なくとも１つのピースを利用して、前記方法の少なくとも１つのステップを実行することができる。
【０１４６】
株改良の伝統的な方法
株改良の伝統的な手法は、２つのタイプの手法：指向株操作およびランダム変異誘発に広く分類され得る。
【０１４７】
株改良の指向操作方法は、特定の生物体の少数の遺伝子エレメントの計画された撹乱を伴う。これらの手法は、典型的には、特定の生合成プログラムまたは発生プログラムをモジュレートすることに着目し、前記経路に影響する遺伝因子および代謝因子の先の知識を利用する。その最も単純な実施形態では、指向操作は、特徴付けられた形質（例えば、遺伝子、プロモーター、または測定可能な表現型を生じさせることができる他の遺伝子エレメント）を、１つの生物体から同じまたは異なる種の別の生物体への移入を伴う。
【０１４８】
株操作のランダム手法は、性能改善を同定するように設計された広範なスクリーニングに加えて、親株のランダム変異誘発を伴う。これらのランダム変異を生じさせる手法には、紫外線への曝露、またはメタンスルホン酸エチルなどの変異誘発化学物質が含まれる。ランダムで概ね予測不可能であるが、株改良のこの伝統的手法は、より指向性の遺伝子マニピュレーションと比較していくつかの利点を有していた。第１に、多くの工業用生物体は、これらの遺伝子レパートリーおよび代謝レパートリーの観点からあまりよく特徴付けられておらず（かつあまりよく特徴付けられていないままであり）、代替の指向改善手法を不可能でなくとも困難にした。
【０１４９】
第２に、比較的よく特徴付けられたシステムにおいてでさえ、工業的性能改善をもたらす遺伝子型の変化は、予測するのが困難であり、時に、既知および未知の機能の多くの遺伝子における累積的変異を必要とする上位性表現型として現れるだけである。
【０１５０】
さらに、長年、所与の工業用生物体において指向ゲノム変異を引き起こすのに要求される遺伝的ツールは、利用可能でなく、または非常に遅く、かつ／もしくは使用するのが困難であった。
【０１５１】
しかし、伝統的な株改良プログラムの適用の拡大により、所与の株系統における獲得が次第に低減し、最終的にさらなる株効率の可能性が枯渇する。有益なランダム変異は、相対的に希有な事象であり、大きいスクリーニングプールおよび高い変異率を必要とする。これは必然的に、「改善された」株における多くの中立のかつ／または有害な（もしくは部分的に有害な）変異の不慮の蓄積をもたらし、それは、最終的に将来の効率向上に対して重荷となる。
【０１５２】
伝統的な累積的改善手法の別の制限事項は、任意の株測定基準に対する任意の特定の変異の効果について分かっている情報が皆無かそれに近いことである。これは基本的に、有益な変異を組み合わせ、統合し、または中立のもしくは有害な変異誘発の「荷物（baggage）」を除去する研究者の能力を制限する。
【０１５３】
変異誘発系統内の株間で変異をランダムに組み換える他の手法および技術が存在する。例えば、ＤＮＡシャッフリング、進化、または分子育種と時に呼ばれる反復的配列組換えのいくつかのフォーマットおよび例は、１９９４年２月１７日に出願された米国特許出願第０８／１９８，４３１号、１９９５年２月１７日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１２６号、１９９５年４月１８日に出願された第０８／４２５，６８４号、１９９５年１０月３０日に出願された第０８／５３７，８７４号、１９９５年１１月３０日に出願された第０８／５６４，９５５号、１９９６年３月２５日に出願された第０８／６２１，８５９号、１９９６年３月２５日に出願された第０８／６２１，４３０号、１９９６年４月１８日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５４８０号、１９９６年５月２０日に出願された第０８／６５０，４００号、１９９６年７月３日に出願された第０８／６７５，５０２号、１９９６年９月２７日に出願された第０８／７２１，８２４号、および１９９６年９月２７日に出願された第０８／７２２，６６０号；Stemmer、Science、２７０巻：１５１０頁（１９９５年）；Stemmerら、Gene、１６４巻：４９〜５３頁（１９９５年）；Stemmer、Bio/Technology、１３巻：５４９〜５５３頁（１９９５年）；Stemmer、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁（１９９４年）；Stemmer、Nature、３７０巻：３８９〜３９１頁（１９９４年）；Crameriら、Nature  Medicine、２巻（１号）：１〜３頁（１９９６年）；Crameriら、Nature  Biotechnology、１４巻：３１５〜３１９頁（１９９６年）に記載されている。これらのそれぞれは、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５４】
これらとしては、プロトプラスト融合、および変異された株全体にわたるゲノム組換えを促進する全ゲノムシャッフリングなどの技法が挙げられる。酵母および糸状菌などの一部の工業用微生物について、天然の接合サイクル（mating  cycle）もペアワイズゲノム
組換えのために活用することができる。このように、有害な変異を、変異体を親株で「戻し交配する」ことによって除去し、有益な変異を統合することができる。さらに、２つの異なる株系統由来の有益な変異を潜在的に組み合わせることができ、それにより、単一の株系統をそのままで変異させることから入手可能であり得るものよりもさらなる改善可能性がもたらされる。しかし、これらの手法は、多くの制限を受けやすく、それらは、本開示の方法を使用して回避される。
【０１５５】
例えば、上述した伝統的な組換え手法は、遅く、変異をスワップするのに相対的に少数のランダム組換えクロスオーバー事象を利用し、したがって、任意の所与のサイクルまたは期間内に試みることができる組合せの数が限定される。さらに、先行技術における自然組換え事象は、本質的にランダムであるが、これらもゲノムの位置的バイアスを受けやすい。
【０１５６】
最も重要なことに、伝統的な手法はまた、個々の変異の影響についてわずかな情報しか提供せず、組み換えられた変異のランダムな分配に起因して、多くの特定の組合せを生成および評価することができない。
【０１５７】
伝統的な株改良プログラムに関連した上述の問題の多くを克服するために、本開示は、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、データ分析、および機械学習プロトコールを統合するユニークなＨＴＰゲノム操作プラットフォームを示す。この統合プラットフォームは、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを構築するのに使用される一式のＨＴＰ分子ツールセットを利用する。これらの遺伝子設計ライブラリーは、以下で詳しく述べられる。
【０１５８】
教示されるＨＴＰプラットフォームおよびそのユニークな微生物遺伝子設計ライブラリーは、微生物株発生および進化のパラダイムを基本的にシフトする。例えば、工業用微生物株を開発する伝統的な変異誘発ベース方法は、最終的に、何年ものランダム変異誘発にわたって蓄積された重い変異誘発性ロードを背負った微生物に至る。
【０１５９】
この問題を解決する（すなわち、これらの微生物によって蓄積された遺伝的荷物を除去する）能力は、数十年にわたって微生物研究者が成し遂げられなかった。しかし、本明細書に開示のＨＴＰプラットフォームを利用すると、これらの工業用株を「再建する」ことができ、有害である遺伝子変異を同定および除去することができる。調和して、有益と同定される遺伝子変異を保持し、一部の場合では、改善することができる。結果として生じる微生物株は、これらの親株と比較して優れた表現型形質（例えば、目的の化合物の改善された産生）を実証する。
【０１６０】
さらに、本明細書に教示のＨＴＰプラットフォームは、微生物株性能に対して個々の変異が有する効果を同定し、特徴付け、定量することができる。この情報、すなわち、所与の遺伝子変化ｘが宿主細胞表現型ｙに対してどのような効果を有するか（例えば、目的の化合物または産物の産生）を生成することができ、次いで、以下で論じられる微生物ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーに記憶することができる。すなわち、各遺伝子順列についての配列情報および宿主細胞表現型に対するその効果が１つまたは複数のデータベースに記憶され、後続の分析（例えば、以下で論じられる上位性マッピング（epistasis  mapping））に利用可能である。本開示は、遺伝子挿入コンストラクトの形態で、または前記遺伝子順列を含有する１種または複数の宿主細胞生物体の形態で貴重な遺伝子順列を物理的に保存／記憶する方法も教示する（例えば、以下で論じられるライブラリーを参照）。
【０１６１】
これらのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーをて洗練されたデータ分析および機械学習プロセスと統合された反復プロセスと結びつけると、宿主細胞を改善するための劇的に異なる方法が出現する。したがって、教示されるプラットフォームは、宿主細胞株を開発する先に論じられた伝統的な方法と基本的に異なる。教示されるＨＴＰプラットフォームは、先の方法に関連した欠点の多くを被らない。これらおよび他の利点は、以下で論じられる、ＨＴＰ分子ツールセットおよび得られる遺伝子設計ライブラリーを参照して明らかである。
遺伝子設計＆微生物操作：一式のＨＴＰ分子ツールおよびＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを利用する株改良の系統的なコンビナトリアル手法
【０１６２】
上述した通り、本開示は、株全体にわたる遺伝子変化の反復性系統的導入および除去によって微生物生物体を操作するための新規ＨＴＰプラットフォームおよび遺伝子設計ストラテジーを提供する。プラットフォームは、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーの創製を可能にし、所与の宿主株への遺伝子変更の効率的なインプリメンテーションを可能にする一式の分子ツールによって支持される。
【０１６３】
本開示のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、特定の微生物株バックグラウンド内に導入され得る可能な遺伝子変更の源として機能を果たす。このように、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、所与の微生物株の初期のまたはさらなる操作に適用され得る遺伝的多様性の宝庫または遺伝子撹乱のコレクションである。宿主株へのインプリメンテーションのために遺伝子設計をプログラムするための技法は、本明細書にその全体が参照により組み込まれている「Microbial  Strain  Design  System  and  Methods  for  Improved  Large
Scale  Production  of  Engineered  Nucleotide  Sequences」という表題の、係属中の米国特許出願第１５／１４０，２９６号に記載されている。
【０１６４】
このプラットフォームで利用されるＨＴＰ分子ツールセットは、とりわけ、（１）プロモータースワップ（ＰＲＯスワップ）、（２）ＳＮＰスワップ、（３）開始／停止コドン交換、（４）ＳＴＯＰスワップ、および（５）配列最適化を含み得る。本開示のＨＴＰ方法は、（６）上位性マッピングプロトコール、を含めたＨＴＰツールセットの統合／コンビナトリアル使用を指示するための方法も教示する。上述した通り、この一式の分子ツールは、単独または組合せのいずれかで、ＨＴＰ遺伝子設計宿主細胞ライブラリーの創製を可能にする。
【０１６５】
実証されるように、教示されるＨＴＰ微生物操作プラットフォームとの関連で上述のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを利用すると、有益な「原因となる」変異または遺伝子区画の同定および統合、ならびにまた、受動変異または有害な変異または遺伝子区画の同定および除去が可能になる。この新しい手法は、伝統的なランダム変異誘発または指向遺伝子操作（directed  genetic  engineering）によって達成することができなかった株性能の急速な改善を可能にする。遺伝的荷重を除去し、または遺伝的荷重を有さない株内に有益な変化を統合すると、さらなる改善を可能にし得る追加のランダム変異誘発の新しい、ロバストな出発点も提供される。
【０１６６】
一部の実施形態では、本開示は、オルソゴナルな有益な変化が、変異誘発株系統の様々な個別分岐にわたって同定されるので、これらを、より良好に働く株へと急速に統合することもできることを教示する。これらの変異はまた、変異誘発系統の一部でない株、例えば、指向遺伝子操作によって獲得される改良を有する株へと統合され得る。
【０１６７】
一部の実施形態では、本開示は、それが、発現および非発現遺伝子エレメントを含む複数の異なるゲノム領域にわたって変異のゲノムワイドコンビナトリアル効果を分析し、集められた情報（例えば、実験結果）を使用して株を増強させることが予期される変異組合せを予測するという点で公知の株改良手法と異なる。
【０１６８】
一部の実施形態では、本開示は、ｉ）開示される発明を介した改良に適用できる工業用微生物および他の宿主細胞、ｉｉ）下流分析のための多様性プールの生成、ｉｉｉ）大きいバリアントプールをハイスループットスクリーニングおよびシーケンシングするための方法およびハードウェア、ｉｖ）ゲノムワイド変異の相乗効果の機械学習コンピューター分析および予測のための方法およびハードウェア、ならびにｖ）ハイスループット株操作のための方法を教示する。
【０１６９】
以下の分子ツールおよびライブラリーは、例示的な微生物例の観点から論じられている。当業者は、本開示のＨＴＰ分子ツールは、真核細胞およびより高等の生命体を含めた任意の宿主細胞に適合することを認識する。
【０１７０】
微生物操作プラットフォームで利用される様々なＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーの創製を可能にする同定されたＨＴＰ分子ツールセットのそれぞれを、次に論じる。
【０１７１】
１．プロモータースワップ：プロモータースワップ微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
一部の実施形態では、本開示は、全宿主株表現型に対する有益な効果（例えば、収率または生産性）を生じさせるのに最適な発現性質を有するプロモーターを選択する方法を教示する。
【０１７２】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度（例えば、以下に論じられるプロモーターラダー）、または優れた調節性質（例えば、選択された遺伝子のより厳格な調節制御）を呈する、宿主細胞内の１つもしくは複数のプロモーターを同定し、かつ／または１つもしくは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を教示する。これらの同定および／または生成されるプロモーターの特定の組合せを、以下でより詳細に説明されるプロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０１７３】
次いで、問題のプロモーターラダーは、目的の所与の遺伝子と関連させられる。よって、プロモーターＰ１〜Ｐ８（一連の発現強度を呈するように同定および／または生成された８つのプロモーターを表す）を有し、プロモーターラダーを微生物中の目的の単一遺伝子と関連させる（すなわち、所与の標的遺伝子に作動可能に連結した所与のプロモーターで微生物を遺伝的に操作する）場合、８つのプロモーターの各組合せの効果を、操作された微生物が標的遺伝子と関連した特定のプロモーター（複数可）を除いて他の点では同一の遺伝的バックグラウンドを有することを考慮して、各コンビナトリアル取り組みの結果として生じる操作された株のそれぞれを特徴付けることによって確認することができる。
【０１７４】
このプロセスを介して操作された結果として生じる微生物は、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成する。
【０１７５】
ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、このプロセスを介して形成される実際の物理的な微生物株コレクションを指すことができ、各メンバー株は、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドにおいて、特定の標的遺伝子に作動可能に連結した所与のプロモーターを代表し、前記ライブラリーは、「プロモータースワップ微生物株ライブラリー」と呼ばれる。
【０１７６】
さらに、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、遺伝子撹乱のコレクションを指すことができ、この場合、所与のプロモーターｘは、所与の遺伝子ｙに作動可能に連結しており、前記コレクションは、「プロモータースワップライブラリー」と呼ばれる。
【０１７７】
さらに、プロモーターＰ１〜Ｐ８を含む同じプロモーターラダーを利用して微生物を操作することができ、ここで、８つプロモーターのそれぞれは、１０の異なる遺伝子標的に作動可能に連結される。この手順の結果は、目的の標的遺伝子に作動可能に連結した特定のプロモーターを除いて、他の点では遺伝的に同一と仮定される８０の微生物である。これらの８０の微生物は、適切にスクリーニングし、特徴付け、別のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生じさせることができる。ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー内の微生物株を特徴付けると、リレーショナルデータベース、オブジェクト指向データベース、または大規模分散ＮｏＳＱＬデータベースを含めた任意のデータ記憶コンストラクトに記憶することができる情報およびデータが生じる。このデータ／情報は、例えば、所与の遺伝子標的に作動可能に連結しているときの所与のプロモーター（例えば、Ｐ１〜Ｐ８）の効果であり得る。このデータ／情報は、プロモーターＰ１〜Ｐ８のうちの２つまたはそれ超を所与の遺伝子標的に作動可能に連結することから生じるより広いセットのコンビナトリアル効果でもあり得る。
【０１７８】
８のプロモーターおよび１０の標的遺伝子の上述の例は、単に例示的であり、その理由は、この概念は、一連の発現強度および任意の所与の数の標的遺伝子の呈示に基づいて一緒にグループ化された任意の所与の数のプロモーターを用いて適用することができるためである。当業者は、任意の遺伝子標的の前に２つまたはそれ超のプロモーターを作動可能に連結する能力も認識する。よって、一部の実施形態では、本開示は、プロモーターラダー由来の１、２、３、またはそれ超のプロモーターが１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結したプロモータースワップライブラリーを教示する。
【０１７９】
要約すると、様々なプロモーターを利用して生物体内の様々な遺伝子の発現を駆動することは、目的の形質を最適化する強力なツールである。本発明者らが開発したプロモータースワッピングの分子ツールは、少なくとも１つの条件下で少なくとも１つの遺伝子座の発現を変更することが実証されたプロモーター配列のラダーを使用する。次いでこのラダーは、ハイスループットゲノム操作を使用して生物体内の遺伝子の群に系統的に適用される。この群の遺伝子は、いくつかの方法のいずれか１つに基づいて目的の形質に影響を与える高い見込みを有すると決定される。これらは、目的の形質に対する公知の機能もしくは影響に基づく選択物、または先に決定された有益な遺伝的多様性に基づくアルゴリズム選択物を含み得る。一部の実施形態では、遺伝子の選択物は、所与の宿主内のすべての遺伝子を含み得る。他の実施形態では、遺伝子の選択物は、ランダムに選択された所与の宿主内のすべての遺伝子のサブセットであり得る。
【０１８０】
次いで、遺伝子に連結したプロモーター配列を含有する生物体の結果として生じるＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、ハイスループットスクリーニングモデルにおいて性能について評価され、性能を増大させるプロモーター−遺伝子連鎖が決定され、情報がデータベースに記憶される。遺伝子撹乱（すなわち、所与の遺伝子ｙに作動可能に連結した所与のプロモーターｘ）のコレクションは、「プロモータースワップライブラリー」を形成し、これは、微生物操作処理で利用される潜在的な遺伝子変更の源として利用することができる。経時的に、より大きいセットの遺伝子撹乱は、より多様な宿主細胞バックグラウンドに対してインプリメントされるので、各ライブラリーは、実験的に確認されたデータのコーパスとしてより強力になり、それを使用して目的の任意のバックグラウンドに対する標的とした変化をより正確かつ予想通りに設計することができる。
【０１８１】
生物体内の遺伝子の転写レベルは、生物体挙動に影響するための重要な管理点である。転写は、翻訳（タンパク質発現）としっかりと共役し、このタンパク質は、生物体挙動を決定する量で発現される。細胞は、数千の異なるタイプのタンパク質を発現し、これらのタンパク質は、多数の複雑なやり方で相互作用して機能を生み出す。一連のタンパク質の発現レベルを系統的に変更することによって、機能は、複雑性のために、予測することが困難であるように変更され得る。一部の変更は、性能を増大させることができ、したがって、性能を評価するための機構と連関して、この技法は、機能が改善された生物体の生成を可能にする。
【０１８２】
低分子合成経路との関連で、酵素は、基質で始まり、目的の低分子で終わる、直鎖または分岐鎖中で該酵素の低分子基質および産物を介して相互作用する。これらの相互作用は、順次連結されるので、このシステムは、分散制御を呈し、１つの酵素の発現の増大は、別の酵素が律速となるまで経路フラックスを増大させることができるだけである。
【０１８３】
代謝制御分析（ＭＣＡ）は、実験データおよび第１原理から、どの１つまたは複数の酵素が律速であるかを決定するための方法である。しかし、ＭＣＡは、それが新しい律速な酵素を決定するのに各発現レベル変化後に広範な実験を必要とするので、限定されている。プロモータースワッピングは、この状況において有利であり、その理由は、プロモーターラダーを経路内の各酵素に適用することによって、律速の酵素が見出され、同じことを後続のラウンドで行って律速となる新しい酵素を見出すことができるためである。さらに、機能の読み取りは、目的の低分子のより良好な産生であるので、どの酵素が律速であるかを決定する実験は、産生を増大させる操作と同じであり、よって開発時間を短縮する。一部の実施形態では、本開示は、多ユニット酵素の個々のサブユニットをコードする遺伝子へのＰＲＯスワップの適用を教示する。さらに他の実施形態では、本開示は、個々の酵素、または生合成経路全体の調節を担う遺伝子にＰＲＯスワップ技法を適用する方法を教示する。
【０１８４】
一部の実施形態では、本開示のプロモータースワップツールを使用して、選択された遺伝子標的の最適の発現を同定することができる。一部の実施形態では、プロモータースワップの目標は、標的遺伝子の発現を増大させて代謝経路または遺伝経路における障壁を低減することであり得る。他の実施形態では、プロモータースワップの目標は、標的遺伝子の発現が要求されないとき、前記標的遺伝子の発現を低減して宿主細胞内の不要なエネルギー消費を回避することであり得る。
【０１８５】
転写、輸送、またはシグナル伝達のような他の細胞系という状況で、様々な合理的な方法を使用して、どのタンパク質が発現変化の標的であり、その変化が何であるべきかを経験的に試みて見出すことができる。これらの合理的な方法は、性能を改善するものを見出すのに試験されなければならない撹乱の数を低減するが、これらは、かなりのコストでそれを行う。遺伝子欠失スタディにより、その存在が特定の機能に極めて重要であるタンパク質が同定され、次いで重要な遺伝子を過剰発現させることができる。タンパク質相互作用の複雑性に起因して、これは、性能の増大において効果的でないことが多い。細胞におけるタンパク質レベルの関数として転写またはシグナル伝達挙動を第１原理から記述することを試みる異なるタイプのモデルが開発された。これらのモデルは、多くの場合、発現変化が異なる機能または改善された機能をもたらし得る標的を示唆する。これらのモデルの根底をなす仮定は、過度に単純化されており、パラメータは、測定するのが困難であり、したがって、これらが行う予測は、特に非モデル生物体について誤っていることが多い。遺伝子欠失およびモデル化の両方を用いると、ある特定の遺伝子にどのように影響するかを決定するのに要求される実験は、性能を改善する変化を起こすための後続の仕事と異なる。プロモータースワッピングは、これらの課題を回避し、その理由は、特定の撹乱の重要性を強調する構築された株も、すでに改良された株であるためである。
【０１８６】
よって、特定の実施形態では、プロモータースワッピングは、
【０１８７】
１．「ラダー」として作用する一連の「ｘ」プロモーターを選択するステップ。理想的にはこれらのプロモーターは、多重ゲノム遺伝子座全体にわたって高度に多様な発現をもたらすことが示されているが、唯一の要件は、これらが遺伝子発現を何らかのやり方で撹乱することである。
【０１８８】
２．標的にする一連の「ｎ」遺伝子を選択するステップ。このセットは、ゲノム内のあらゆるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはＯＲＦのサブセットであり得る。サブセットは、先に実証された有益な撹乱（先のプロモータースワップもしくは先のＳＮＰスワップ）との関連によって、先に生成された撹乱間の上位性相互作用に基づくアルゴリズム選択、標的にする有益なＯＲＦに関する仮説に基づく他の選択判定基準によって、またはランダム選択を介して、機能に関連したＯＲＦについてのアノテーションを使用して選択することができる。他の実施形態では、「ｎ」標的化遺伝子は、非コードＲＮＡを含めた非タンパク質コード遺伝子を含み得る。
【０１８９】
３．以下の遺伝子改変を迅速に、かつ一部の実施形態では、並行して実行するためのハイスループット株操作：生来のプロモーターが標的遺伝子ｎの前に存在し、その配列が公知であるとき、生来のプロモーターをラダー内のｘプロモーターのそれぞれで置き換える。生来のプロモーターが存在せず、またはその配列が未知であるとき、ラダー内のｘプロモーターのそれぞれを遺伝子ｎの前に挿入する（例えば、図２１を参照）。このように、株の「ライブラリー」（ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーとも呼ばれる）が構築され、ライブラリーの各メンバーは、他の点では同一の遺伝子状況（genetic  context）においてｎ標的に作動可能に連結したｘプロモーターの一事例である。先に記載したように、プロモーターの組合せを挿入し、ライブラリーが構築される組み合わせの可能性（combinatorial
possibility）の範囲を拡張することができる。
【０１９０】
４．１つまたは複数の測定基準に対する株の性能が最適化されている性能を示す状況における株のライブラリーのハイスループットスクリーニング。
を含むマルチステッププロセスである。
【０１９１】
この基本プロセスを拡張して、とりわけ、（１）相互作用プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化として、単一株バックグラウンド内に複数の有益な撹乱を統合することによって、株性能をさらに改善することができる。複数の撹乱は、確定した変化の特定のセット、または変化の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。例えば、標的のセットが経路内のあらゆる遺伝子である場合、撹乱のライブラリーを株の先のライブラリーの改善された１つまたは複数のメンバー内に逐次再生すると、任意の所与の反復においてどの遺伝子が律速であるかにかかわらず経路内の各遺伝子の発現レベルを最適化することができ；（２）ライブラリーの個々のおよびコンビナトリアル生成の結果として生じる性能データを、そのデータを使用して各撹乱の相互作用に基づいて撹乱の最適のセットを予測するアルゴリズムに送り；（３）上記２つの手法の組合せをインプリメントする（図２０を参照）。
【０１９２】
上記に論じた分子ツールまたは技法は、プロモータースワッピングとして特徴付けられるが、プロモーターに限定されず、一連の標的の発現レベルを系統的に変更する他の配列変化を含み得る。一連の遺伝子の発現レベルを変更するための他の方法は、ａ）リボソーム結合部位（または真核生物内のコザック配列）のラダー；ｂ）各標的の開始コドンの他の開始コドンのそれぞれでの置き換え（すなわち、以下に論じられる開始／停止コドン交換）；ｃ）転写物の５’もしくは３’末端への、または任意の他の場所における配列を安定化し、または不安定にする様々なｍＲＮＡの結合、ｄ）タンパク質中の任意の場所における配列を安定化し、または不安定にする様々なタンパク質の結合を含み得る。
【０１９３】
手法は、工業用微生物を用いて本開示において例示されているが、所望の形質が遺伝子変異体の集団において同定され得る任意の生物体に適用可能である。例えば、これは、ＣＨＯ細胞、酵母、昆虫細胞、藻類、および植物などの多細胞生物の性能を改善するのに使用することができる。
２．ＳＮＰスワップ：ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
【０１９４】
ある特定の実施形態では、ＳＮＰスワッピングは、微生物株の改良のランダム変異誘発手法ではなく、むしろ、株全体にわたる個々の核内低分子多形ヌクレオチド変異（Small
Nuclear  Polymorphism  nucleotide  mutation）（すなわち、ＳＮＰ）の系統的な導
入または除去を伴う（それが名称「ＳＮＰスワッピング」の由来である）。
【０１９５】
このプロセスを介して操作される結果として生じる微生物は、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成する。
【０１９６】
ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、このプロセスを介して形成される実際の物理的な微生物株コレクションを指すことができ、各メンバー株は、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドにおいて、所与のＳＮＰの存在または非存在を代表し、前記ライブラリーは、「ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー」と呼ばれる。
【０１９７】
さらに、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、遺伝子撹乱のコレクションを指すことができ、この場合、所与のＳＮＰが存在し、または所与のＳＮＰが存在せず、前記コレクションは、「ＳＮＰスワップライブラリー」と呼ばれる。
【０１９８】
一部の実施形態では、ＳＮＰスワッピングでは、同定された有益な性能効果を有する標的ＳＮＰ「ビルディングブロック」の最適な組合せを用いて宿主生物を再構築する。よって、一部の実施形態では、ＳＮＰスワッピングでは、反復プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化としてのいずれかで、単一株バックグラウンド内に複数の有益な変異を統合することを伴う。複数の変化は、確定した変化の特定のセット、または変異の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。
【０１９９】
他の実施形態では、ＳＮＰスワッピングでは、反復プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化としてのいずれかで、株から有害と同定された複数の変異の除去も関与する。複数の変化は、規定された変化の特定のセット、または変異の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、有益なＳＮＰの付加ならびに有害なおよび／または中立の変異の除去の両方を含む。
【０２００】
ＳＮＰスワッピングは、変異誘発および目的とする形質改善のための選択に供された株の系統における有益および有害な変異の両方を同定および活用する強力なツールである。ＳＮＰスワッピングは、ハイスループットゲノム操作技法を利用して、変異誘発系統における個々の変異の影響を系統的に決定する。ゲノム配列は、既知の性能改善を有する変異誘発系統の１つまたは複数の世代にわたる株について決定される。次いでハイスループットゲノム操作が系統的に使用されて、より早期の系統株における改良された株由来の変異を反復し、かつ／またはより後期の株内の変異をより早期の株配列に戻す。次いでこれらの株の性能が評価され、目的の改善された表現型に対する各個々の変異の寄与を決定することができる。上述した通り、このプロセスから生じる微生物株が分析され／特徴付けられ、宿主株全体にわたる微生物株改良を通知することができるＳＮＰスワップ遺伝子設計ライブラリーの基礎を形成する。
【０２０１】
有害な変異を除去すると、即時に性能を改善することができ、変異誘発荷重に供されていない株バックグラウンド内の有益な変異を統合すると、株性能を迅速かつ大いに改善することができる。ＳＮＰスワッピングプロセスを介して生成される様々な微生物株は、ＨＴＰ遺伝子設計ＳＮＰスワッピングライブラリーを形成し、それは、様々な付加／欠失／または統合されたＳＮＰを含むが、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドを有する微生物株である。
【０２０２】
先に論じた通り、性能改善のためのランダム変異誘発および後続のスクリーニングは、工業用株改良のために一般に使用される技法であり、大規模製造に現在使用されている多くの株は、長年、時に数十年の期間にわたって反復してこのプロセスを使用して開発されてきた。ゲノム変異の生成のランダム手法、例えば、ＵＶ放射線またはメタンスルホン酸エチルなどの化学的変異誘発物質への曝露は、工業用株改良の好適な方法であった。その理由は、１）工業用生物体は、遺伝的または代謝的にあまりよく特徴付けられておらず、指向改善手法のための標的選択を困難または不可能にする場合があり、２）相対的に十分に特徴付けられたシステムにおいてでさえ、工業的性能改善をもたらす変化は、予測するのが困難であり、既知の機能を有さない遺伝子の撹乱を必要とする場合があり、３）所与の工業用生物体において指向ゲノム変異を作製するための遺伝的ツールは、利用可能でなく、または非常に遅く、かつ／もしくは使用するのが困難である場合があるためである。
【０２０３】
しかし、このプロセスの上述の利益にもかかわらず、いくつかの公知の不利点も存在する。有益な変異は、相対的に希有な事象であり、定まったスクリーニング能力を用いてこれらの変異を見出すために、変異率は、十分に高くなければならない。これにより、望まれない中立のおよび部分的に有害な変異が有益な変化とともに株内に組み入れられることが多い。経時的に、この「変異誘発荷重」が蓄積し、全体的なロバスト性、および増殖速度などの重要な形質が欠損した株を生じる。最終的に、「変異誘発荷重」は、ランダム変異誘発による性能のさらなる改善を得ることをますます困難または不可能にする。適当なツールを用いない場合、株系統の個別分岐および並列分岐に見出される有益な変異を統合することが不可能である。
【０２０４】
ＳＮＰスワッピングは、変異誘発系統内の株を比較するとき観察される一部またはすべての変異を系統的に反復し、または戻すことによってこれらの制限事項を克服する一手法である。このように、有益な（「原因となる」）変異を同定および統合することもでき、かつ／または有害な変異を同定および除去することもできる。これにより、さらなるランダム変異誘発または標的化遺伝子操作によって達成することができなかった株性能の迅速な改善が可能になる。
【０２０５】
遺伝的荷重を除去し、または有益な変化を遺伝的荷重が無い株内に統合すると、さらなる改善を可能にすることができる追加のランダム変異誘発の新しいロバストな出発点ももたらされる。
【０２０６】
さらに、オルソゴナルな有益な変化が、変異誘発株系統の様々な個別分岐にわたって同定されるので、これらを、より良好に働く株へと急速に統合することができる。これらの変異はまた、変異誘発系統の一部でない株、例えば、指向遺伝子操作によって獲得される改良を有する株へと統合され得る。
【０２０７】
変異誘発系統内の株間の変異をランダムに組み換える他の手法および技術が存在する。これらとしては、プロトプラスト融合、および変異された株全体にわたるゲノム組換えを促進する全ゲノムシャッフリングなどの技法が挙げられる。酵母および糸状菌などの一部の工業用微生物について、天然の接合サイクルもペアワイズゲノム組換えのために活用することができる。このように、有害な変異を、変異体を親株で「戻し交配する」ことによって除去し、有益な変異を統合することができる。しかし、これらの手法は、多くの制限を受けやすく、それは、本開示のＳＮＰスワッピング方法を使用して回避される。
【０２０８】
例えば、これらの手法は、変異をスワップするのに相対的に少数のランダム組換えクロスオーバー事象を利用するので、株性能を最適化するのに組換えおよびスクリーニングの多くのサイクルを要し得る。さらに、天然の組換え事象は、本質的にランダムであるが、これらもゲノムの位置的偏りを受けやすく、一部の変異は、対処するのが困難であり得る。これらの手法はまた、追加のゲノムシーケンシングおよび分析を伴わない個々の変異の影響についてわずかな情報しか提供しない。ＳＮＰスワッピングは、これらの基本的な制限事項を克服し、その理由は、それがランダム手法ではなく、むしろ、株全体にわたる個々の変異の系統的な導入または除去であるためである。
【０２０９】
一部の実施形態では、本開示は、多様性プールの生物体の中に存在するＳＮＰ配列多様性を同定するための方法を教示する。多様性プールは、分析に利用される所与の数ｎの微生物であり得、前記微生物のゲノムは、「多様性プール」を代表する。
【０２１０】
特定の態様では、多様性プールは、特定の時点における「ベースライン」または「参照」遺伝子配列を有する元の親株（Ｓ１）（Ｓ１Ｇｅｎ１）、および次いで前記Ｓ１株に由来し／それから開発された、かつＳ１のベースラインゲノムに関して異なるゲノムを有する任意の数の後続の子孫株（Ｓ２−ｎ）（Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎ）であり得る。
【０２１１】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、多様性プール内の微生物ゲノムをシーケンシングして各株内に存在するＳＮＰを同定することを教示する。一実施形態では、多様性プールの株は、歴史的な微生物産生株である。よって、本開示の多様性プールは、例えば、工業用参照株、および伝統的な株改良プログラムを介して産生された１つまたは複数の変異工業用株を含み得る。
【０２１２】
一部の実施形態では、多様性プール内のＳＮＰは、「参照株」を参照して決定される。一部の実施形態では、参照株は、野生型株である。他の実施形態では、参照株は、任意の変異誘発に供される前の元の工業用株である。参照株は、専門家が定義することができ、元の野生型株または元の工業用株である必要はない。基準株は、前記参照株に由来し、またはそれから開発された後続の株が比較される「基準」、「参照」、または元の遺伝的バックグラウンドと見なされるものを単に代表する。
【０２１３】
多様性プール内のすべてのＳＮＰが同定されると、本開示は、ＳＮＰスワッピングの方法およびスクリーニング方法を教示して、個々にかつ／または群内でＳＮＰの効果（例えば、目的の表現型の創製）を描写する（すなわち、定量し、特徴付ける）。
【０２１４】
一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中からの株）内で同定された１つまたは複数のＳＮＰを参照株（Ｓ１Ｇｅｎ１）または野生型株に導入する（「ウェーブアップ」）ステップを含む。
【０２１５】
他の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中からの株）内で同定された１つまたは複数のＳＮＰを除去する（「ウェーブダウン」）ステップを含む。
【０２１６】
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＮＰ変化（導入または除去のいずれか）を含むそれぞれの生成された株は、培養され、本開示の１つまたは複数の判定基準（例えば、目的の化学物質または産物の産生）下で分析される。分析された宿主株のそれぞれからのデータは、宿主株内に存在する特定のＳＮＰまたはＳＮＰの群と関連付けられ、または相関付けられ、将来使用するために記録される。よって、本開示は、任意の数の目的の微生物遺伝的または表現型形質に対する所与のＳＮＰの効果を同定することができる、大きい、高度にアノテートされたＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの創製を可能にする。これらのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーに記憶された情報は、ＨＴＰゲノム操作プラットフォームの機械学習アルゴリズムに知らせ、プロセスの将来の反復を指示し、それは最終的に、高度に望ましい性質／形質を有する進化した微生物生物体をもたらす。
３．開始／停止コドン交換：開始／停止コドン微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
【０２１７】
一部の実施形態では、本開示は、開始および停止コドンバリアントをスワップする方法を教示する。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物の典型的な停止コドンは、それぞれＴＡＡ（ＵＡＡ）およびＴＧＡ（ＵＧＡ）である。単子葉植物の典型的な停止コドンは、ＴＧＡ（ＵＧＡ）であり、一方、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは一般に、停止コドンとしてＴＡＡ（ＵＡＡ）を使用する（Dalphinら（１９９６年）、Nucl.  Acids  Res.
、２４巻：２１６〜２１８頁）。他の実施形態では、本開示は、ＴＡＧ（ＵＡＧ）停止コドンの使用を教示する。
【０２１８】
本開示は、開始コドンをスワップすることを同様に教示する。一部の実施形態では、本開示は、ほとんどの生物体（特に真核生物）によって利用されているＡＴＧ（ＡＵＧ）開始コドンの使用を教示する。一部の実施形態では、本開示は、原核生物は、ＡＴＧ（ＡＵＧ）を最も多く使用し、その後にＧＴＧ（ＧＵＧ）およびＴＴＧ（ＵＵＧ）が続くことを教示する。
【０２１９】
他の実施形態では、本発明は、ＡＴＧ開始コドンをＴＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＡＴＧ開始コドンをＧＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＧＴＧ開始コドンをＡＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＧＴＧ開始コドンをＴＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＴＴＧ開始コドンをＡＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＴＴＧ開始コドンをＧＴＧで置き換えることを教示する。
【０２２０】
他の実施形態では、本発明は、ＴＡＡ停止コドンをＴＡＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＴＡＡ停止コドンをＴＧＡで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＴＧＡ停止コドンをＴＡＡで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＴＧＡ停止コドンをＴＡＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＴＡＧ停止コドンをＴＡＡで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＴＡＧ停止コドンをＴＧＡで置き換えることを教示する。
４．Ｓｔｏｐスワップ：最適化配列微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
【０２２１】
一部の実施形態では、本開示は、細胞遺伝子転写の最適化によって宿主細胞生産性を改善する方法を教示する。遺伝子転写は、転写開始（ＲＮＡｐ動員および転写複合体形成）、伸長（鎖合成／拡張）、ならびに転写終結（ＲＮＡｐ脱離および終結）を含めたいくつかの別個の生物学的現象の結果である。多くの関心が、遺伝子の転写モジュレーションによる（例えば、プロモーターを変更し、または調節転写因子を誘導することによる）遺伝子発現の制御に注がれているが、比較的少ない取り組みが遺伝子ターミネーター配列のモジュレーションを介した転写のモジュレーションに向けて行われている。
【０２２２】
転写が遺伝子発現レベルに影響を与える最も明白なやり方は、Ｐｏｌ  ＩＩ開始の速度によるものであり、これは、プロモーターまたはエンハンサー強度およびトランス活性化因子の組合せによってモジュレートすることができる（Kadonaga,  JT.、２００４年、「Regulation  of  RNA  polymerase  II  transcription  by  sequence-specific  DNA  binding  factors」、Cell.、２００４年１月２３日；１１６巻（２号）：２４７〜５７
頁）。真核生物では、伸長速度も、オルタナティブスプライシングに影響を与えることによって遺伝子発現パターンを決定する場合がある（Cramer  P.ら、１９９７年、「Functional  association  between  promoter  structure  and  transcript  alternative  splicing.」、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.、１９９７年１０月１４日；９４巻（２
１号）：１１４５６〜６０頁）。遺伝子上の終結の失敗は、プロモーターのＰｏｌ  ＩＩへのアクセシビリティを低減することによって下流遺伝子の発現を損なわせ得る（Greger
IH.ら、２０００年、「Balancing  transcriptional  interference  and  initiation
on  the  GAL7  promoter  of  Saccharomyces  cerevisiae.」、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.、２０００年７月１８日；９７巻（１５号）：８４１５〜２０頁）。このプロセスは、転写干渉として公知であり、下等真核生物において特に関連しており、その理由は、これらが密集した遺伝子を有することが多いためである。
【０２２３】
終結配列も、配列が属する遺伝子の発現に影響し得る。例えば、スタディは、真核生物における非効率な転写終結は、スプライスされていないプレｍＲＮＡを蓄積させることを示す（West,  S.およびProudfoot,  N.J.、２００９年、「Transcriptional  Termination  Enhances  Protein  Expression  in  Human  Cells」、Mol  Cell.、２００９年２月１３日；３３巻（３〜９号）；３５４〜３６４頁を参照）。他のスタディも、３’末端プロセシングが非効率な終結によって遅延され得ることを示した（West,  Sら、２００８年、「Molecular  dissection  of  mammalian  RNA  polymerase  II  transcriptional  termination.」、Mol  Cell.、２００８年３月１４日；２９巻（５号）：６００〜１０頁）。転写終結も、合成の部位から転写物を放出することによってｍＲＮＡ安定性に影響し得る。
真核生物における転写機構の終結
【０２２４】
真核生物における転写終結は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに関連したタンパク質因子によって認識されるターミネーターシグナルを介して働く。一部の実施形態では、切断・ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）および切断刺激因子（ＣｓｔＦ）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのカルボキシル末端ドメインからポリＡシグナルに移動する。一部の実施形態では、ＣＰＳＦ因子およびＣｓｔＦ因子はまた、終結部位に他のタンパク質を動員し、次いでこれは、転写物を切断し、転写複合体からｍＲＮＡを解放する。終結は、ｍＲＮＡ転写物のポリアデニル化も誘発する。バリデートされた真核生物終結因子の実例およびこれらの保存構造は、本文書の後の部分で論じられている。
原核生物における転写の終結
【０２２５】
原核生物では、Ｒｈｏ非依存性およびＲｈｏ依存性終結と呼ばれる２つの主要機構が転写終結を媒介する。Ｒｈｏ非依存性終結シグナルは、外因性転写終結因子を要求せず、その理由は、一連のウリジン（Ｕ）残基とともにこれらの配列から転写されるＲＮＡにおけるステムループ構造の形成が、転写複合体からのＲＮＡ鎖の放出を促進するためである。一方、Ｒｈｏ依存性終結は、ｍＲＮＡ上でＲｈｏと呼ばれる転写終結因子およびシス作用エレメントを必要とする。Ｒｈｏの最初の結合部位、Ｒｈｏ利用（ｒｕｔ）部位は、実際のターミネーター配列の上流の、高シチジン／低グアノシン含有量、および合成されているＲＮＡにおける相対的に小さい二次構造によって特徴付けられる伸長された（約７０ヌクレオチド、時に８０〜１００ヌクレオチド）一本鎖領域である。ポリメラーゼ休止部位と遭遇すると、終結が起こり、転写物がＲｈｏのヘリカーゼ活性によって放出される。
ターミネータースワッピング（ＳＴＯＰスワップ）
【０２２６】
一部の実施形態では、本開示は、最適な発現性質を有する終結配列（「ターミネーター」）を選択して、全体的な宿主株生産性に対して有益な効果を生じさせる方法を教示する。
【０２２７】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度を呈する、宿主細胞内の１つもしくは複数のターミネーターを同定し、かつ／または１つもしくは複数のターミネーターのバリアントを生成する（例えば、以下に論じられるターミネーターラダー）方法を教示する。これらの同定および／または生成されるターミネーターの特定の組合せを、以下でより詳細に説明されるターミネーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０２２８】
次いで、問題のターミネーターラダーは、目的の所与の遺伝子と関連させられる。よって、ターミネーターＴ１〜Ｔ８（１つまたは複数のプロモーターと組み合わされるとき、一連の発現強度を呈するように同定および／または生成された８つのターミネーターを表す）を有し、ターミネーターラダーを宿主細胞内の目的の単一遺伝子と関連させる（すなわち、所与の標的遺伝子の３’末端に作動可能に連結した所与のターミネーターで宿主細胞を遺伝的に操作する）場合、ターミネーターの各組合せの効果を、操作された宿主細胞が標的遺伝子と関連した特定のプロモーター（複数可）を除いて他の点では同一の遺伝的バックグラウンドを有することを考慮して、各コンビナトリアル取り組みの結果として生じる操作された株のそれぞれを特徴付けることによって確認することができる。このプロセスを介して操作される結果として生じる宿主細胞は、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成する。
【０２２９】
ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、このプロセスを介して形成される実際の物理的な微生物株コレクションを指すことができ、各メンバー株は、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドにおいて、特定の標的遺伝子に作動可能に連結した所与のターミネーターを代表し、前記ライブラリーは、「ターミネータースワップ微生物株ライブラリー」または「ＳＴＯＰスワップ微生物株ライブラリー」と呼ばれる。
【０２３０】
さらに、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、遺伝子撹乱のコレクションを指すことができ、この場合、所与のターミネーターｘは、所与の遺伝子ｙに作動可能に連結しており、前記コレクションは、「ターミネータースワップライブラリー」または「ＳＴＯＰスワップライブラリー」と呼ばれる。
【０２３１】
さらに、プロモーターＴ１〜Ｔ８を含む同じターミネーターラダーを利用して微生物を操作することができ、ここで、８つのターミネーターそれぞれは、１０の異なる遺伝子標的に作動可能に連結している。この手順の結果は、目的の標的遺伝子に作動可能に連結した特定のターミネーターを除いて、他の点では遺伝的に同一と仮定される８０の宿主細胞株である。これらの８０の宿主細胞株は、適切にスクリーニングし、特徴付け、別のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生じさせることができる。ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー内の微生物株を特徴付けると、リレーショナルデータベース、オブジェクト指向データベース、または大規模分散ＮｏＳＱＬデータベースを限定することなく含めた任意のデータベースに記憶することができる情報およびデータが生じる。このデータ／情報は、例えば、所与の遺伝子標的に作動可能に連結しているときの所与のターミネーター（例えば、Ｔ１〜Ｔ８）の効果を含み得る。このデータ／情報は、プロモーターＴ１〜Ｔ８のうちの２つまたはそれ超を所与の遺伝子標的に作動可能に連結することから生じるより広いセットのコンビナトリアル効果でもあり得る。
【０２３２】
８のターミネーターおよび１０の標的遺伝子の上述の例は、単に例示的であり、その理由は、この概念は、一連の発現強度および任意の所与の数の標的遺伝子の呈示に基づいて一緒にグループ化された任意の所与の数のプロモーターを用いて適用することができるためである。
【０２３３】
要約すると、様々なターミネーターを利用して生物体内の様々な遺伝子の発現をモジュレートすることは、目的の形質を最適化する強力なツールである。本発明者らが開発したターミネータースワッピングの分子ツールは、少なくとも１つの条件下で少なくとも１つの遺伝子座の発現を変更することが実証されたターミネーター配列のラダーを使用する。次いでこのラダーは、ハイスループットゲノム操作を使用して生物体内の遺伝子の群に系統的に適用される。この群の遺伝子は、いくつかの方法のいずれか１つに基づいて目的の形質に影響を与える高い見込みを有すると決定される。これらは、公知の機能に基づく選択、または目的の形質に対する影響、または先に決定された有益な遺伝的多様性に基づくアルゴリズムによる選択を含み得る。
【０２３４】
次いで、遺伝子に連結したターミネーター配列を含有する生物体の結果として生じるＨＴＰ遺伝子設計微生物ライブラリーが、ハイスループットスクリーニングモデルにおいて性能について評価され、性能を増大させるプロモーター−遺伝子連鎖が決定され、情報がデータベースに記憶される。遺伝子撹乱（すなわち、所与の遺伝子ｙに連結した所与のターミネーターｘ）のコレクションは、「ターミネータースワップライブラリー」を形成し、これは、微生物操作処理で利用される潜在的な遺伝子変更の源として利用することができる。経時的に、より大きいセットの遺伝子撹乱は、より大きい多様性の微生物バックグラウンドに対してインプリメントされるので、各ライブラリーは、実験的に確認されたデータのコーパスとしてより強力になり、それを使用して目的の任意のバックグラウンドに対する標的とした変化をより正確かつ予想通りに設計することができる。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、本発明の遺伝子設計ライブラリーのいずれかと関連したメタデータ内に埋もれた先の実験結果に基づく、宿主細胞内への１つまたは複数の遺伝子変化の導入を教示する。
【０２３５】
よって、特定の実施形態では、ターミネータースワッピングは、以下を含むマルチステッププロセスである。
【０２３６】
１．「ラダー」として作用する一連の「ｘ」ターミネーターを選択するステップ。理想的にはこれらのターミネーターは、多重ゲノム遺伝子座全体にわたって高度に多様な発現をもたらすことが示されているが、唯一の要件は、これらが遺伝子発現を何らかのやり方で撹乱することである。
【０２３７】
２．標的にする一連の「ｎ」遺伝子を選択するステップ。このセットは、ゲノム内のあらゆるＯＲＦ、またはＯＲＦのサブセットであり得る。サブセットは、先に実証された有益な撹乱（先のプロモータースワップ、ＳＴＯＰスワップもしくはＳＮＰスワップ）との関連によって、先に生成された撹乱間の上位性相互作用に基づくアルゴリズム選択、標的にする有益なＯＲＦに関する仮説に基づく他の選択判定基準によって、またはランダム選択を介して、機能に関連したＯＲＦについてのアノテーションを使用して選択することができる。他の実施形態では、「ｎ」標的化遺伝子は、非コードＲＮＡを含めた非タンパク質コード遺伝子を含み得る。
【０２３８】
３．以下の遺伝子改変を迅速に、かつ並行して実行するためのハイスループット株操作：生来のターミネーターが標的遺伝子ｎの３’末端に存在し、その配列が公知であるとき、生来のターミネーターをラダー内のｘターミネーターのそれぞれで置き換える。生来のターミネーターが存在せず、またはその配列が未知であるとき、ラダー内のｘターミネーターのそれぞれを遺伝子停止コドンの後に挿入する。
【０２３９】
このように、株の「ライブラリー」（ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーとも呼ばれる）が構築され、ライブラリーの各メンバーは、他の点では同一の遺伝子状況においてｎ標的に連結したｘターミネーターの一事例である。先に記載したように、ターミネーターの組合せを挿入し、ライブラリーが構築される組み合わせの可能性の範囲を拡張することができる。
【０２４０】
４．１つまたは複数の測定基準に対する株の性能が最適化されている性能を示す状況における株のライブラリーのハイスループットスクリーニング。
【０２４１】
この基本プロセスを拡張して、とりわけ、（１）相互作用プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化としてのいずれかで、単一株バックグラウンド内に複数の有益な撹乱を統合することによって、株性能をさらに改善することができる。複数の撹乱は、確定した変化の特定のセット、または変化の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。例えば、標的のセットが経路内のあらゆる遺伝子である場合、撹乱のライブラリーを株の先のライブラリーの改善された１つまたは複数のメンバー内に逐次再生すると、任意の所与の反復においてどの遺伝子が律速であるかにかかわらず経路内の各遺伝子の発現レベルを最適化することができ；（２）ライブラリーの個々のおよびコンビナトリアル生成の結果として生じる性能データを、そのデータを使用して各撹乱の相互作用に基づいて撹乱の最適のセットを予測するアルゴリズムに送り；（３）上記２つの手法の組合せをインプリメントする。
【０２４２】
手法は、工業用微生物を用いて本開示において例示されているが、所望の形質が遺伝子変異体の集団において同定され得る任意の生物体に適用可能である。例えば、これは、ＣＨＯ細胞、酵母、昆虫細胞、藻類、および植物などの多細胞生物の性能を改善するのに使用することができる。
５．配列最適化：最適化配列微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
【０２４３】
一実施形態では、提供した開示の方法は、宿主生物が発現する１つまたは複数のコドン最適化遺伝子を含む。様々な宿主内での発現を改善するためにコドンを最適化するための方法は、当技術分野で公知であり、文献において記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００７／０２９２９１８号を参照）。特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好適なコドンを含有する最適化されたコード配列（Murrayら、（１９８９年）、Nucl.  Acids  Res.、１７巻：４７７〜５０８頁も参照）を調製して、例えば、翻訳の速度を増大させ、または非最適配列から産生される転写物と比較して、より長い半減期などの望ましい性質を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができる。
【０２４４】
タンパク質発現は、転写、ｍＲＮＡプロセシング、ならびに翻訳の安定性および開始に影響するものを含めた多数の因子によって支配される。よって、最適化は、任意の特定の遺伝子のいくつかの配列フィーチャのいずれかに対処することができる。具体例として、希少コドン誘導翻訳休止は、タンパク質発現を低減し得る。希少コドン誘導翻訳休止は、宿主生物において稀に使用される目的のポリヌクレオチド中のコドンの存在が、利用可能なｔＲＮＡプールにおけるその不足に起因してタンパク質翻訳に対して負の効果を有し得ることを含む。
【０２４５】
代替の翻訳開始も、異種タンパク質発現を低減し得る。代替翻訳開始は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として機能することができるモチーフを偶然に含有する合成ポリヌクレオチド配列を含み得る。これらの部位は、遺伝子内部部位から短縮タンパク質の翻訳を開始することができる。精製中に除去することが困難であり得る短縮タンパク質を産生する可能性を低減する一方法は、最適化ポリヌクレオチド配列から推定上の内部ＲＢＳ配列を排除するステップを含む。
【０２４６】
リピート誘導ポリメラーゼのスリッページは、異種タンパク質発現を低減し得る。リピート誘導ポリメラーゼのスリッページは、フレームシフト変異をもたらし得るＤＮＡポリメラーゼのスリッページまたはスタッタリングを引き起こすことが示されているヌクレオチド配列リピートを伴う。このようなリピートは、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページも引き起こし得る。高いＧ＋Ｃ含有量偏りを有する生物体では、ＧまたはＣヌクレオチドリピートから構成されるより高い程度のリピートが存在し得る。したがって、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページを誘導する可能性を低減する一方法は、ＧまたはＣヌクレオチドの長いリピートを変更するステップを含む。
【０２４７】
二次構造の干渉も異種タンパク質発現を低減し得る。二次構造は、ＲＢＳ配列または開始コドンを隔離することができ、タンパク質発現の低減と相関している。ステムループ構造も、転写休止および減衰に関与することができる。最適化ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列のＲＢＳおよび遺伝子コード領域内に最小限の二次構造を含有して、転写および翻訳の改善を可能にすることができる。
【０２４８】
例えば、最適化プロセスは、宿主が発現する所望のアミノ酸配列を同定することによって始めることができる。アミノ酸配列から、候補ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ配列を設計することができる。合成ＤＮＡ配列の設計中に、コドン使用の頻度を、宿主発現生物体のコドン使用と比較することができ、希有な宿主コドンを合成配列から除去することができる。さらに、合成候補ＤＮＡ配列を、望ましくない酵素制限部位を除去し、任意の所望のシグナル配列、リンカー、または非翻訳領域を付加または除去するために修飾することができる。合成ＤＮＡ配列は、翻訳プロセスを妨害し得る二次構造、例えば、Ｇ／Ｃリピートおよびステムループ構造の存在について分析することができる。
６．上位性マッピング  −  有益な遺伝子統合（genetic  consolidation）を可能にする予測的分析用ツール
【０２４９】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞内に有益な遺伝子変更を予測し、組み合わせるための上位性マッピング法（epistasis  mapping  method）を教示する。遺伝子変更は、上述のＨＴＰ分子ツールセット（例えば、プロモータースワップ、ＳＮＰスワップ、開始／停止コドン交換、配列最適化）のいずれかによって生み出すことができ、これらの遺伝子変更の効果は、得られたＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの特徴付けから分かる。よって、本明細書で使用される場合、用語の上位性マッピングは、宿主性能の増大を生じさせる可能性のある遺伝子変更の組合せ（例えば、有益なＳＮＰまたは有益なプロモーター／標的遺伝子の関連付け）を同定する方法を含む。
【０２５０】
諸実施形態では、本開示の上位性マッピング法は、２つの異なる機能群からの有益な変異の組合せは、同じ機能群からの変異の組合せと比較して、宿主性能を改善する可能性が高いというアイデアに基づく。例えば、Costanzo、The  Genetic  Landscape  of  a  Cell、Science、３２７巻、５９６４号、２０１０年１月２２日、４２５〜４３１頁を参照
（その全体が本明細書に参照により組み込まれている）。
【０２５１】
同じ機能群からの変異は、同じ機構によって働く可能性が高く、よって、全体的な宿主性能に対して負または中立の上位性を呈する可能性が高い。対照的に、異なる機能群からの変異は、独立した機構によって働く可能性が高く、それは、宿主性能の改善、および一部の事例では相乗効果をもたらし得る。例えば、図１９を参照すると、ｌｙｓＡおよびｚｗｆは、異なる経路で働いてリシンの産生を達成する遺伝子である。これらの遺伝子の個々の性能の相違点に基づくと、これらの遺伝子を使用する遺伝子変化は、相加的な統合効果をもたらすはずである。これは、図１６Ｂおよび実施例６に示した通り、ｌｙｓＡおよびｚｗｆの組合せの統合効果を実際に測定して裏付けられた。
【０２５２】
よって、一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰ変異を分析して、異なる機能群に属すると予測されるＳＮＰを同定する方法を教示する。一部の実施形態では、ＳＮＰ機能群類似度は、変異相互作用プロファイルの余弦類似度（相関係数と類似、図１６Ａを参照）を計算することによって決定される。本開示は、変異類似度マトリックス（図１５を参照）またはデンドログラム（図１６Ａを参照）を介してＳＮＰを比較することも例示する。
【０２５３】
よって、上位性マッピング手順は、１つまたは複数の遺伝的バックグラウンドにおいて適用される遺伝子変異の多様性を、１つまたは複数の遺伝的バックグラウンド内に前記変異を効率的かつ有効に統合する目的で、グループ化および／またはランク付けするための方法を提供する。
【０２５４】
諸態様では、統合は、標的生体分子を産生させるのに最適化された新規株を生み出す目的で実施される。教示した上位性マッピング手順によって、変異の機能分類を同定することが可能であり、このような機能分類は、望ましくない上位性効果を最小限にする統合ストラテジーを可能にする。
【０２５５】
先に説明した通り、工業発酵で使用するための微生物の最適化は、経済、社会、および自然界に関する広い暗示を含む重要で困難な問題である。伝統的に、微生物操作は、ランダム変異誘発の遅く不確かなプロセスによって実施されてきた。このような手法は、細胞の自然進化能力を活用して、人工的に課された選択圧に適応させる。このような手法はまた、有益な変異の珍しさ、基礎をなす適応度地形の荒削りさによって制限されており、より一般に、細胞生物学および分子生物学における現況技術を十分に利用しない。
【０２５６】
最新の手法は、機構レベルでの細胞機能の新しい理解および特定の表現型目標への標的化遺伝子マニピュレーションを実施する新しい分子生物学ツールを活用する。実際には、このような合理的手法は、生物学の根本的な複雑性によって混乱する。原因となる機構は、特に、それぞれに有益な効果が観察された２つまたはそれ超の変化を組み合わせようと試みる場合、理解が不十分である。時に、遺伝子変化のこのような統合は、正の結果（所望の表現型活性の増大によって測定される）を生じるが、正味の正の結果は、予期されたものより低くなり得、一部の場合では、予期されたものより高くなり得る。他の事例では、このような組合せは、正味の中立効果または正味の負の効果を生む。この現象は、上位性と呼ばれ、微生物操作（および一般に遺伝子操作）の基本的な課題の１つである。
【０２５７】
上述した通り、本ＨＴＰゲノム操作プラットフォームは、伝統的な微生物操作手法に関連した問題の多くを解決する。本ＨＴＰプラットフォームは、自動化技術を使用して、数百または数千の遺伝子変異を一度に実施する。特定の態様では、上述した合理的手法と異なり、開示したＨＴＰプラットフォームは、その全体が本明細書に参照により組み込まれている、Microbial  Strain  Design  System  And  Methods  For  Improved  Large-Scale  Production  Of  Engineered  Nucleotide  Sequencesという表題の米国出願第１５／１４０，２９６号に開示されている通り、数千の変異体の並列構築を可能にして、関連したゲノム空間の大きいサブセットをより有効に探索する。「あらゆること」を試すことによって、本ＨＴＰプラットフォームは、本発明者らの限られた生物学的理解によって誘導される困難を回避する。
【０２５８】
しかし同時に、本ＨＴＰプラットフォームは、ゲノム空間の組合せによる爆発的サイズ、および遺伝的相互作用の複雑性を考慮して生成されたデータセットを解明する計算手法の有効度によって基本的に制限されるという問題に直面する。所望の結果を生じる組合せの非ランダム選択を最大にするやり方で広大なコンビナトリアル空間のサブセットを探索する技法が必要とされる。
【０２５９】
いくぶん類似のＨＴＰ手法が、酵素最適化の場合において有効であると証明された。このニッチな問題において、目的のゲノム配列（１０００塩基の程度の）は、物理的構成が幾分複雑なタンパク質鎖をコードする。正確な構成は、その構成要素の原子成分間の集団電磁相互作用によって決定される。短いゲノム配列および物理的に制約された折り畳み問題のこの組合せは、貪欲最適化ストラテジーに具体的に役に立つ。すなわち、あらゆる残基において配列を個々に変異させ、結果として生じる変異体をシャッフルして、配列活性応答モデル化（Sequence  Activity  Response  modeling）に適合する分解能で局所的配列空間を有効にサンプリングすることが可能である。
【０２６０】
しかし、生体分子の完全ゲノム最適化に関して、このような残基中心の手法は、いくつかの重要な理由で不十分である。第１に、生体分子のゲノム最適化に伴う関連した配列空間の指数関数的増大のため。第２に、生体分子合成における調節、発現、および代謝相互作用の複雑性の追加のため。本発明者らは、教示される上位性マッピング手順を介してこれらの問題を解決した。
【０２６１】
変異のコレクション間の上位性相互作用を、前記変異を１つまたは複数の遺伝的バックグラウンド内により効率的かつ有効に統合する目的で、モデル化するための教示される方法は、当技術分野において革新的であり、高度に必要とされる。
【０２６２】
上位性マッピング手順を記述する場合、用語「より効率的な」および「より有効な」は、特定の表現型の目的に関して統合株の中での望ましくない上位性相互作用の回避を指す。
【０２６３】
プロセスを上記で一般に詳しく述べてきたので、より具体的なワークフロー例を次に記載する。
【０２６４】
第１に、Ｍ個の変異のライブラリーおよび１つまたは複数の遺伝的バックグラウンド（例えば、親菌株）から始める。ライブラリーの選択も遺伝的バックグラウンドの選択も、ここに記載した方法に特異的でない。しかし特定のインプリメンテーションでは、変異のライブラリーは、もっぱら、または組合せで：ＳＮＰスワップライブラリー、プロモータースワップライブラリー、または本明細書に記載の任意の他の変異ライブラリーを含み得る。
【０２６５】
一インプリメンテーションでは、単一の遺伝的バックグラウンドのみが提供される。この場合、別個の遺伝的バックグラウンド（微生物変異体）のコレクションが、この単一のバックグラウンドから最初に生成される。これは、変異の一次ライブラリー（またはそのあるサブセット）を所与のバックグラウンドに適用して、例えば、特定のＳＮＰのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーまたは特定のプロモーターのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを所与の遺伝的バックグラウンドに適用して、それに組み入れられている所与のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーからの特定の遺伝子変更を除いて同一の遺伝的バックグラウンドを有する微生物変異体の集団（おそらく１００または１，０００）を生み出すことによって達成され得る。以下に詳述する通り、この実施形態は、コンビナトリアルライブラリーまたはペアワイズライブラリーをもたらし得る。
【０２６６】
別のインプリメンテーションでは、別個の公知の遺伝的バックグラウンドのコレクションを単に与えることができる。以下に詳述する通り、この実施形態は、コンビナトリアルライブラリーのサブセットをもたらし得る。
【０２６７】
特定のインプリメンテーションでは、遺伝的バックグラウンドの数およびこれらのバックグラウンド間の遺伝的多様性（変異の数または配列編集距離などで測定した）は、この方法の有効度を最大にするように決定される。
【０２６８】
遺伝的バックグラウンドは、天然の、生来の、もしくは野生型株、または変異された、操作された株であり得る。Ｎ個の別個のバックグラウンド株は、ベクトルｂで表すことができる。一例では、バックグラウンドｂは、Ｎ個の一次変異ｍ０＝（ｍ１、ｍ２、…  ｍＮ）を野生型バックグラウンド株ｂ０に適用して、Ｎ個の変異されたバックグラウンド株ｂ＝ｍ０ｂ０＝（ｍ１ｂ０、ｍ２ｂ０、…  ｍＮ  ｂ０）（式中、ｍｉｂ０は、変異ｍｉのバックグラウンド株ｂ０への適用を表す）を形成することによって形成される操作されたバックグラウンドを表すことができる。
【０２６９】
いずれの場合にも（すなわち、単一の提供された遺伝的バックグラウンドまたは遺伝的バックグラウンドのコレクション）、結果は、Ｎ個の遺伝的に別個のバックグラウンドのコレクションである。関連した表現型が各バックグラウンドについて測定される。
【０２７０】
第２に、Ｍ個の変異のコレクションｍ１内の各変異が、Ｎ個のバックグラウンド株ｂのコレクション内の各バックグラウンドに適用されて、Ｍ×Ｎ個の変異体のコレクションが形成される。Ｎ個のバックグラウンドが変異の一次セットｍ０（上述した）を適用することによってそれ自体得られたインプリメンテーションでは、変異体の結果として生じるセットは、時に、コンビナトリアルライブラリーまたはペアワイズライブラリーと呼ばれる。公知のバックグラウンドのコレクションが明示的に提供された別のインプリメンテーションでは、変異体の結果として生じるセットは、コンビナトリアルライブラリーのサブセットと呼ぶことができる。操作されたバックグラウンドベクトルの生成と同様に、諸実施形態では、入力インターフェース２０２は、変異ベクトルｍ１およびバックグラウンドベクトルｂ、ならびに外積などの指定されたオペレーションを受け取る。
【０２７１】
上記操作されたバックグラウンド例を続けて、Ｍ×Ｎコンビナトリアルライブラリーの形成は、ｍ１×ｍ０ｂ０、ｂ＝ｍ０ｂ０のＮ個のバックグラウンドに適用されたｍ１の外積によって形成された行列によって表すことができ、この場合、ｍ１中の各変異は、ｂ内の各バックグラウンド株に適用される。結果として生じるＭ×Ｎ行列の各ｉ番目の行は、バックグラウンドコレクションｂ内のすべての株へのｍ１内のｉ番目の変異の適用を表す。一実施形態では、ｍ１＝ｍ０であり、行列は、出発株ｂ０への同じ変異のペアワイズ適用を表す。その場合、行列は、その対角線回りで対称であり（Ｍ＝Ｎ）、対角線は、任意の分析において無視することができ、その理由は、それが同じ変異の２回の適用を表すためである。
【０２７２】
諸実施形態では、Ｍ×Ｎ行列の形成は、入力インターフェース２０２に化合物発現ｍ１×ｍ０ｂ０を入力することによって達成することができる。発現のコンポーネントベクトルは、直接入力することができ、これらの要素は、１つもしくは複数のＤＮＡ仕様を介して、またはインタープリター２０４によるインタープリテーション中にベクトルの検索を可能にするライブラリー２０６への呼出しとして明示的に指定される。「Microbial  Strain  Design  System  and  Methods  for  Improved  Large  Scale  Production  of  Engineered  Nucleotide  Sequences」という表題の米国特許出願第１５／１４０，２９
６号に記載されている通り、インタープリター２０４、実行エンジン２０７、発注エンジン（order  placement  engine）２０８、およびファクトリー２１０を介して、ＬＩＭＳシステム２００は、入力された発現によって指定された微生物株を生成する。
【０２７３】
第３に、図４２を参照すると、分析装置２１４は、Ｍ×Ｎコンビナトリアルライブラリー行列（４２０２）内の各変異体について表現型応答を測定する。したがって、応答のコレクションは、Ｍ×Ｎ応答行列Ｒと解釈することができる。Ｒの各要素は、ｒｉｊ＝ｙ（ｍｉ，ｍｊ）として表すことができ、式中、ｙは、変異ｍｉによって変異された、操作されたコレクションｂ内のバックグラウンド株ｂｊの応答（性能）を表す。単純性および実用性のために、本発明者らは、ペアワイズ変異を仮定し、この場合、ｍ１＝ｍ０である。今回の場合のように、変異のセットがペアワイズ変異ライブラリーを表す場合、結果として生じる行列は、遺伝子相互作用行列、またはより特定すれば、変異相互作用行列とも呼ばれる場合がある。
【０２７４】
当業者は、一部の実施形態では、上位性効果および予測的株設計に関するオペレーションは、ＬＩＭＳシステム２００の自動手段を通じて、例えば、分析装置２１４によって、または人によるインプリメンテーションによって、または自動化手段およびマニュアル手段の組合せを通じて完全に実施することができることを認識する。オペレーションが完全に自動化されていない場合、ＬＩＭＳシステム２００のエレメント、例えば、分析装置２１４は、例えば、その独自のオペレーション可能な能力を通じた結果を生成するのではなく、オペレーションを人が遂行した結果を受け取ることができる。本明細書の他の場所で記載されている通り、分析装置２１４などのＬＩＭＳシステム２００のコンポーネントは、１つまたは複数のコンピューターシステムによって完全または部分的にインプリメントすることができる。一部の実施形態では、特に、予測的株設計に関するオペレーションが自動化手段およびマニュアル手段の組合せによって実施される場合、分析装置２１４は、コンピューターハードウェア、ソフトウェア、もしくはファームウェア（またはこれらの組合せ）だけでなく、以下の表５に列挙されたもの、例えば、「性能を評価する」のカテゴリー下に列挙された装置などの人のオペレーターが運転する装置も含み得る。
【０２７５】
第４に、分析装置２１２は、応答行列を正規化する。正規化は、バイアスを除去し、かつ／またはこの方法に特異的な効果の関連した部分を単離する目的で測定された応答値を調整するマニュアルおよび／またはこの実施形態では、自動化プロセスからなる。図４２に関して、第１のステップ４２０２は、正規化された測定データを得ることを含み得る。一般に、予測的株設計および上位性マッピングを対象とする請求項において、用語「性能尺度」または「測定された性能」などは、未処理であっても、何らかの様式で処理された、例えば、正規化データであっても測定データを反映する測定基準を記述するのに使用され得る。特定のインプリメンテーションでは、正規化は、測定された応答値から先に測定されたバックグラウンド応答を減じることによって実施することができる。そのインプリメンテーションでは、結果として生じる応答要素は、ｒｉｊ＝ｙ（ｍｉ，ｍｊ）−ｙ（ｍｊ）として形成することができ、式中、ｙ（ｍｊ）は、一次変異ｍｊを親株ｂ０に適用することによって引き起こされた操作されたコレクションｂ内の操作されたバックグラウンド株ｂｊの応答である。正規化された応答行列の各行は、その対応する変異の応答プロファイルとして扱われることに留意されたい。すなわち、ｉ番目の行は、ｊ＝１〜Ｎについてすべてのバックグラウンド株ｂｊに適用された対応する変異ｍｉの相対的効果を記述する。
【０２７６】
ペアワイズ変異の例に関して、２つの変異の結果として生じる株の組み合わされた性能／応答は、個々に、変異のそれぞれに対する株の性能／応答より大きい、小さい、またはそれに等しい場合がある。この効果は、「上位性」として公知であり、一部の実施形態では、ｅｉｊ＝ｙ（ｍｉ，ｍｊ）−（ｙ（ｍｉ）＋ｙ（ｍｊ））として表すことができる。この数学的表現の変形は、可能であり、例えば、どのように個々の変化が生物学的に相互作用するかに依存し得る。上述したように、同じ機能群からの変異は、同じ機構によって働く可能性が高く、よって、全体的な宿主性能に対して負または中立の上位性を呈する可能性が高い。対照的に、異なる機能群からの変異は、独立した機構によって働く可能性が高く、それは、例えば、重複する変異効果を低減することによって宿主性能の改善をもたらし得る。よって、同じでない応答を生じる変異は、同様の応答を生じる変異より相加的な様式で組み合わさる可能性が高い。これは、次ステップにおける類似度の計算につながる。
【０２７７】
第５に、分析装置２１４は、応答の中の類似度、ペアワイズ変異例では、応答行列（４２０４）内のｉ番目の変異の効果とｊ番目（例えば、一次）変異の効果との間の類似度を測定する。Ｒのｉ番目の行は、Ｎ個のバックグラウンド株上のｉ番目の変異ｍｉの性能効果を表し、そのそれぞれは、それ自体上述した操作された変異の結果であり得ることを想起されたい。よって、ｉ番目の変異の効果とｊ番目の変異の効果との間の類似度は、ｉ番目の行とｊ番目の行との間の類似度ｓｉｊ、それぞれρｉおよびρｊによって表されて類似度行列Ｓを形成することができ、その一例は、図１５に例示されている。類似度は、多くの公知の技法、例えば、相互相関または絶対余弦類似度、例えば、ｓｉｊ＝ａｂｓ（ｃｏｓ（ρｉ，ρｊ））を使用して測定され得る。
【０２７８】
余弦類似度のような測定基準の代替または補足として、応答プロファイルをクラスター化して類似度の程度を決定することができる。クラスタリングは、適当な距離尺度（例えば、Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ、Ｈａｍｍｉｎｇなど）と併せて距離に基づくクラスタリングアルゴリズム（例えば、ｋ−平均、階層的凝縮型など）を使用することによって実施することができる。代替として、クラスタリングは、適当な類似度尺度（例えば、余弦、相関など）とともに類似度に基づくクラスタリングアルゴリズム（例えば、スペクトル、ミンカットなど）を使用して実施することができる。もちろん、任意の数の標準的な機能的なオペレーション（例えば、指数関数）を介して類似度尺度にマッピングすることができ、逆もまた同様である。一インプリメンテーションでは、階層的凝縮型クラスタリングを絶対余弦類似度と併せて使用することができる（図１６Ａを参照）。
【０２７９】
クラスタリングの一例として、Ｃを変異ｍｉのｋ個の別個クラスターへのクラスタリングとする。Ｃを、ｃｉｊが、変異ｉがクラスターｊに属する程度、０から１の値であるクラスターメンバーシップ行列とする。そのとき、変異ｉとｊとの間のクラスターに基づく類似度は、Ｃｉ×Ｃｊ（Ｃのｉ番目の行とｊ番目の行とのドット積）によって与えられる。一般に、クラスターに基づく類似度行列は、ＣＣＴ（すなわち、Ｃ×Ｃ−転置行列）によって与えられる。ハードクラスタリング（変異が正確に１つのクラスターに属する）の場合では、２つの変異間の類似度は、これらが同じクラスターに属する場合、１であり、そうでない場合、０である。
【０２８０】
Costanzo、The  Genetic  Landscape  of  a  Cell、Science、３２７巻、５９６４号
、２０１０年１月２２日、４２５〜４３１頁（その全体が本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている通り、変異応答プロファイルのこのようなクラスタリングは、細胞の根本的な機能的な機構のおおよそのマッピングに関係する。すなわち、一緒にクラスター化する変異は、根本的な生物学的プロセスまたは代謝経路に関係付けられる傾向がある。このような変異は、「機能群」と本明細書で呼ばれる。この方法の重要な知見は、２つの変異が同じ生物学的プロセスまたは経路によって働く場合、観察される効果（特に観察される利益）は、重複し得ることである。反対に、２つの変異が遠位機構によって働く場合、有益な効果が重複する可能性は低い。
【０２８１】
第６に、上位性効果に基づいて、分析装置２１４は、図４２（４２０６）に示した通り、同じでない応答に至る変異の対を選択し、例えば、これらの余弦類似度測定基準は、類似度閾値未満に入り、またはこれらの応答は、十分に分離したクラスター内に入る（例えば、図１５および図１６Ａにおける）。これらの相違点に基づいて、選択された変異の対は、同様の対より良好にバックグラウンド株内に統合するはずである。
【０２８２】
十分に異なった応答に至る選択された変異の対に基づいて、ＬＩＭＳシステム（例えば、インタープリター２０４、実行エンジン２０７、発注依頼者（order  placer）２０８
、およびファクトリー２１０のすべて、またはある組合せ）を使用して、これらの選択された変異を有する微生物株を設計することができる（４２０８）。諸実施形態では、本明細書で以下に、かつ他の場所で記載する通り、上位性効果を、予測モデルに組み入れる、またはそれと併せて使用して株選択を重み付けまたは選別することができる。
【０２８３】
ある好適な予測モデルを介してライブラリーからの変異のコレクションを特定のバックグラウンド内に統合することによって得られる仮定の株の性能（別名スコア）を推定することが可能であると仮定される。教示される方法で利用される代表的な予測モデルは、「ゲノムワイド遺伝子設計判定基準の効果のコンピューター分析および予測」というより大きいセクションに見出される「予測的株設計」という表題の以下のセクションに提供されている。
【０２８４】
線形回帰などの予測的株設計技法を使用する場合、分析装置２１４は、例えば、回帰結果を選別して十分に同じでない変異のみを保存することによって、低い類似度尺度を有する変異にモデルを制限することができる。代替として、予測モデルは、類似度行列を用いて重み付けることができる。例えば、一部の実施形態は、類似度行列を使用する重み付き最小二乗回帰を使用して、提案された変異の相互依存性を特徴付けることができる。一例として、重み付けは、回帰モデルに「カーネル」トリックを施すことによって実施することができる。（「カーネルトリック」が多くの機械学習モデル化手法に一般的である程度に、この再重み付けストラテジーは、線形回帰に制限されない）。
【０２８５】
このような方法は、当業者に公知である。諸実施形態では、カーネルは、要素１−ｗ＊ｓｉｊを有する行列であり、式中、１は、恒等行列の要素であり、ｗは、０から１の間の実数値である。ｗ＝０であるとき、これは、標準回帰モデルに変換される。実際には、ｗの値は、ペアワイズコンビナトリアルコンストラクトおよびこれらの付随効果ｙ（ｍｉ，ｍｊ）に対して評価されるとき、予測モデルの精度（ｒ２値または二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ））に関係する。１つの単純なインプリメンテーションでは、ｗは、ｗ＝１−ｒ２と定義される。この場合、モデルが完全に予測的であるとき、ｗ＝１−ｒ２＝０であり、統合は、予測モデルだけに基づき、上位性マッピング手順は、役割を果たさない。一方、予測モデルがまったく予測的でない場合、ｗ＝１−ｒ２＝１であり、統合は、上位性マッピング手順だけに基づく。各反復中、精度を評価してモデル性能が改善しているかどうかを決定することができる。
【０２８６】
本明細書に記載の上位性マッピング手順は、どのモデルが分析装置２１４によって使用されているかに依存しないことが明らかであるはずである。このような予測モデルを考慮すると、コンビナトリアル統合（combinatorial  consolidation）を介して変異ライブラリーにアクセス可能なすべての仮定の株をスコア付けおよびランク付けすることが可能である。
【０２８７】
一部の実施形態では、上位性効果を説明するために、同じでない変異応答プロファイルを分析装置２１４が使用して、予測モデルからの各仮定の株に関連したスコアおよびランクを強化することができる。この手順は、同じでない応答プロファイルを有する候補株（例えば、多様なクラスターから引き出される株）を支持するための、スコアの再重み付けとして広く考えることができる。１つの単純なインプリメンテーションでは、株は、相違点閾値を満たさない、または同じクラスターから引き出された構成要素の変異（適当な重み付けを有する）の数によって低減されたそのスコアを有し得る。特定のインプリメンテーションでは、仮定の株の性能推定値は、仮定の株に関連した構成要素の変異（やはり適当な重み付けを有する）のすべての対に関連した類似度行列の項の和によって低減され得る。仮定の株は、これらの強化されたスコアを使用して再ランク付けすることができる。実際には、このような再重み付け算出は、最初のスコア推定値と併せて実施することができる。
【０２８８】
結果は、混乱させる上位性相互作用をより有効に回避するように強化されたスコアおよびランクを有する仮定の株のコレクションである。仮定の株をこの時構築することができ、またはこれらは、続いて分析または使用するために別の計算方法に送ることができる。
【０２８９】
当業者は、本明細書に記載の上位性マッピングおよび反復性予測的株設計は、ペアワイズ変異のみを使用することに限定されず、はるかに多くの変異をバックグラウンド株に同時に適用するように拡張することができることを認識する。別の実施形態では、追加の変異を、本明細書に記載の予測方法に従って選択された変異を使用して既に変異された株に順次適用することができる。別の実施形態では、上位性効果は、互いにわずかに異なるいくつかの株バックグラウンドに同じ遺伝子変異を適用し、改変された株バックグラウンドの中の正の応答プロファイルにおける任意の有意差に留意することによってインピュートされる。
遺伝子設計に受け入れられる生物体
【０２９０】
開示されるＨＴＰゲノム操作プラットフォームは、工業用微生物細胞培養物（例えば、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＡ．ｎｉｇｅｒ）で例示されるが、所望の形質を遺伝子変異体の集団内で同定することができる任意の宿主細胞生物体に適用可能である。
【０２９１】
よって、本明細書で使用される場合、用語「微生物」は、広く解釈されるべきである。これは、これらに限定されないが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌および原生生物を含む。しかし、ある特定の態様では、「高等」真核生物、例えば、昆虫、植物、および動物を本明細書に教示の方法において利用することができる。
【０２９２】
本開示は、原核宿主細胞（実施例１〜９）および真核宿主細胞（実施例１０〜１１）の両方についての実施例を提供する。
【０２９３】
適当な宿主細胞としては、これらに限定されないが、細菌細胞、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。一例示的な実施形態では、適当な宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  ｉｎ  Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．から入手可能なＳＨｕｆｆｌｅ（商標）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ）が含まれる。
【０２９４】
本開示の他の適当な宿主生物としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物が挙げられる。一部の実施形態では、好適なＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株／種としては、寄託基準株がＤＳＭ４４５４９であるＣ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、寄託基準株がＡＴＣＣ１３０３２であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、および寄託基準株がＡＴＣＣ６８７１であるＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓが挙げられる。一部の実施形態では、本開示の好適な宿主は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【０２９５】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の、特に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種の適当な宿主株は、特に、公知の野生型株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ  ＡＴＣＣ１４０２０；ならびにこれらから調製されるＬ−アミノ酸産生変異体または株、例えば、Ｌ−リシン産生株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７１２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６３、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＭ５８−１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＧ５２−５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ５７１４、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ１２８６６などである。
【０２９６】
用語「Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ」も、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍについて使用されている。Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ種のいくつかの代表は、例えば、株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９など、先行技術においてＣ．ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓとも呼ばれている。
【０２９７】
一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、真核細胞である。適当な真核宿主細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、動物細胞、および植物細胞が挙げられる。適当な真菌宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられる。ある特定の好適な真菌宿主細胞には、酵母細胞および糸状菌細胞が含まれる。適当な糸状菌宿主細胞としては、例えば、ＥｕｍｙｃｏｔｉｎａおよびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門の任意のフィラメント形が挙げられる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Hawksworthら、In  Ainsworth  and  Bisby's  Dictionary  of  The  Fungi、８版、１９９５年、CAB  International、University  Press、Cambridge、UKを参照）。糸状菌は、キチン、セルロース、およ
び他の複合多糖から構成される細胞壁を有する栄養菌糸体によって特徴付けられる。糸状菌宿主細胞は、酵母と形態学的に別個のものである。
【０２９８】
ある特定の例示的であるが限定されない実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフおよび同義語もしくは分類学的均等物の種の細胞であり得る。一実施形態では、糸状菌は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅ、およびＡ．ｎｉｇｅｒ群のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉからなる群から選択される。一実施形態では、糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである。
【０２９９】
別の実施形態では、真菌種の特定の変異体が、本明細書に提供される方法およびシステムのために使用される。一実施形態では、本明細書に提供されるハイスループットおよび／または自動化方法およびシステムに適した真菌種の特定の変異体が使用される。このような変異体の例は、プロトプラストが非常に良好な株（strains  that  protoplast  very  well）；主として、またはより好ましくは、単核を有するプロトプラストのみを産生
する株；マイクロタイタープレート中で効率的に再生する株、より速く再生する株および／またはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）分子を効率的に取り込む株、低粘度の培養物、例えば、培養において、単一クローンの単離を防止し、かつ／または培養物の粘性を上昇させるほどもつれていない菌糸を産生する細胞などを産生する株、ランダム組込みが低減された（例えば、障害のある非相同末端接合経路）株、またはこれらの組合せであり得る。
【０３００】
さらに別の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用するための特定の変異体株は、例えば、ウリジン要求性変異体株などの選択可能マーカー遺伝子を欠く株であり得る。これらの変異体株は、それぞれｐｙｒＧまたはｐｙｒＥ遺伝子によってコードされるオロチジン５ホスフェートデカルボキシラーゼ（ＯＭＰＤ）またはオロテートｐ−リボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴ）のいずれかを欠損している場合がある（T.  Goosenら、Curr  Genet.、１９８７年、１１巻：４９９〜５０３頁；J.  Begueretら、Gene.、１９８４年、３２巻：４８７〜９２頁）。
【０３０１】
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用するための具体的な変異体株は、より短い菌糸およびより酵母様の外観によって特徴付けられる緻密な細胞形態を有する株である。
【０３０２】
適当な酵母宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａが挙げられる。一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、藻類細胞、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．Ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）である。
【０３０４】
他の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。適当な原核細胞としては、グラム陽性、グラム陰性、およびグラム不定細菌細胞が挙げられる。宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓの種であり得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【０３０５】
一部の実施形態では、細菌宿主株は、工業用株である。多数の細菌工業用株が公知であり、本明細書に記載の方法および組成物において適している。
【０３０６】
一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｒｕｂｉ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｒｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のものである。特定の実施形態では、宿主細胞は、これらに限定されないが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含めた工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｅ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ���である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｚ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、などである。
【０３０７】
本開示は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト（２９３、ＷＩ３８、ＰＥＲ．Ｃ６、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞を含む）、マウス（３Ｔ３、ＮＳ０、ＮＳ１、Ｓｐ２／０を含む）、ハムスター（ＣＨＯ、ＢＨＫ）、サル（ＣＯＳ、ＦＲｈＬ、Ｖｅｒｏ）、およびハイブリドーマ細胞株を含めて、様々な動物細胞型での使用にも適している。
【０３０８】
様々な実施形態では、原核生物株および真核生物株の両方を含めた本開示の実践において使用され得る株は、いくつかの培養株コレクション、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）から公的に容易にアクセス可能である。
【０３０９】
一部の実施形態では、本開示の方法は、多細胞生物にも適用可能である。例えば、プラットフォームは、作物の性能を改善するのに使用することができる。生物体は、複数の植物、例えば、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ、Ｆｅｔｕｃｏｉｄｅａｅ、Ｐｏａｃｏｉｄｅａｅ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｓｏｒｇｕｍ、Ｓｅｔａｒｉａ、Ｚｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ａｖｅｎａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｐｏａ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｃｏｉｘ、Ｏｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｅａｅ、Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ、またはＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅを含み得る。例えば、植物は、トウモロコシ、イネ、ダイズ、綿、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、エンドウマメ、マメ、レンズマメ、ピーナッツ、ヤムビーン、ササゲ、ハッショウマメ、クローバー、アルファルファ、ルピナス、カラスノエンドウ、ハス、スイートクローバー、フジ、スイートピー、モロコシ、キビ、ヒマワリ、キャノーラなどであり得る。同様に、生物体は、複数の動物、例えば、非ヒト哺乳動物、魚、昆虫などを含み得る。
遺伝子設計＆ＨＴＰ微生物操作プラットフォームにおいて利用するための遺伝的多様性プールの生成
【０３１０】
一部の実施形態では、本開示の方法は、遺伝子設計として特徴付けられる。本明細書で使用される場合、用語の遺伝子設計は、新しい優れた宿主細胞を設計および生み出すために特定の遺伝子、遺伝子の部分、プロモーター、停止コドン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または他のＤＮＡ配列の最適のバリアントを同定および選択することによる宿主生物のゲノムの再構築または変更を指す。
【０３１１】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子設計法における第１のステップは、新しい宿主ゲノムを再構築することができる複数の配列バリエーションを有する最初の遺伝的多様性プール集団を得ることである。
【０３１２】
一部の実施形態では、本明細書に教示の遺伝子設計法における後続のステップは、上述のＨＴＰ分子ツールセット（例えば、ＳＮＰスワッピングまたはプロモータースワッピング）の１つまたは複数を使用して、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを構築することであり、次いでこのライブラリーは、宿主細胞において試験するための特定のゲノム変更のライブラリーを提供することによってゲノム操作プロセスのドライバーとして機能する。
既存の野生型株からの多様性プールの利用
【０３１３】
一部の実施形態では、本開示は、所与の野生型集団の微生物の中に存在する配列多様性を同定するための方法を教示する。したがって、多様性プールは、分析に利用される所与の数ｎの野生型微生物であり得、前記微生物のゲノムは、「多様性プール」を代表する。
【０３１４】
一部の実施形態では、多様性プールは、前記野生型微生物の中で天然の遺伝的バリエーション中に存在する既存の多様性の結果であり得る。このバリエーションは、所与の宿主細胞の株バリアントから生じる場合があり、または完全に異なる種である微生物の結果である場合がある。遺伝的バリエーションは、天然に存在するか否かにかかわらず、株の遺伝子配列の任意の差異を含み得る。一部の実施形態では、遺伝的バリエーションは、とりわけ、ＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、開始／停止コドンスワップ、またはＳＴＯＰスワップを含み得る。
既存の工業用株バリアントからの多様性プールの利用
【０３１５】
本開示の他の実施形態では、多様性プールは、伝統的な株改良プロセスの間に創製された株バリアント（例えば、ランダム変異を介して生成され、長年にわたって収率改善のために選択された１種または複数の宿主生物株）である。よって、一部の実施形態では、多様性プールまたは宿主生物は、歴史的な産生株のコレクションを含み得る。
【０３１６】
特定の態様では、多様性プールは、特定の時点で「ベースライン」遺伝子配列を有する元の親微生物株（Ｓ１）（Ｓ１Ｇｅｎ１）、およびさらに、前記Ｓ１株に由来し、／それから開発された、かつＳ１のベースラインゲノムに関して異なるゲノムを有する任意の数の後続の子孫株（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５など、Ｓ２−ｎに一般化可能）（Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎ）であり得る。
【０３１７】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、多様性プール内の微生物ゲノムをシーケンシングして各株に存在するＳＮＰを同定することを教示する。一実施形態では、多様性プールの株は、歴史的な微生物産生株である。よって、本開示の多様性プールは、例えば、工業用基準株、および伝統的な株改良プログラムを介して産生された１種または複数の変異工業用株を含み得る。
【０３１８】
多様性プール内のすべてのＳＮＰが同定されたら、本開示は、個々にかつ群において、ＳＮＰの効果（例えば、目的の表現型の創製）を描写する（すなわち、定量し、特徴付ける）ためのＳＮＰスワッピングの方法およびスクリーニング方法を教示する。よって、上述した通り、教示したプラットフォームにおける最初のステップは、複数の配列バリエーション、例えば、ＳＮＰを有する最初の遺伝的多様性プール集団を得ることであり得る。次いで、教示したプラットフォームにおける後続のステップは、上述のＨＴＰ分子ツールセット（例えば、ＳＮＰスワッピング）の１つまたは複数を使用して、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを構築することであり得、次いでこのライブラリーは、微生物において試験するための特定のゲノム変更のライブラリーを提供することによってゲノム操作プロセスのドライバーとして機能する。
【０３１９】
一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中からの株）内で同定された１つまたは複数のＳＮＰを基準株（Ｓ１Ｇｅｎ１）または野生型株に導入するステップを含む。
【０３２０】
他の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中からの株）内で同定された１つまたは複数のＳＮＰを除去するステップを含む。
変異誘発を介した多様性プールの創製
【０３２１】
一部の実施形態では、細胞の所与の多様性プール集団における目的の変異は、変異誘発化学物質または放射線を含めた、株を変異させる任意の手段によって人工的に生成することができる。用語「変異誘発させること」は、細胞核酸材料において１つまたは複数の遺伝子改変を誘導するための方法を指すのに本明細書で使用される。
【０３２２】
用語「遺伝子改変」は、ＤＮＡの任意の変更を指す。代表的な遺伝子改変は、ヌクレオチド挿入、欠失、置換、およびこれらの組合せを含み、単一塩基という小さいものまたは数万塩基という大きいものであり得る。よって、用語「遺伝子改変」は、染色体の領域を含むＤＮＡの位置または配向が変更されるヌクレオチド配列の反転および他の染色体再配列を包含する。染色体再配列は、染色体内再配列または染色体間再配列を含むことができる。
【０３２３】
一実施形態では、本主張の主題において使用される変異誘発方法は、実質的にランダムであり、その結果、遺伝子改変は、変異誘発される核酸材料内の任意の利用可能なヌクレオチド位置で行うことができる。別の言い方をすれば、一実施形態では、変異誘発させることは、特定のヌクレオチド配列における出現の優先または頻度の増加を示さない。
【０３２４】
本開示の方法は、これらに限定されないが、紫外光、Ｘ線照射、ガンマ照射、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、メチルニトロソ尿素（methyinitrosourea）（ＭＮＵ
）、プロカルバジン（ＰＲＣ）、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、アクリルアミドモノマー（ＡＡ）、クロラムブシル（ＣＨＬ）、メルファラン（ＭＬＰ）、シクロホスファミド（ＣＰＰ）、硫酸ジエチル（ＤＥＳ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、マイトマイシン−Ｃ（ＭＭＣ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、３Ｈ２Ｏ、およびウレタン（ＵＲ）を含めた任意の変異誘発剤を使用することができる（例えば、Rinchik、１９９１年；Markerら、１９９７年；およびRussell、１９９０年を参照）。追加の変異誘発剤は、http://www.iephb.nw.ru/〜spirov/hazard/mutagen_lst.htmlに
記載されているものを含めて当業者に周知である。
【０３２５】
用語「変異誘発させること」は、細胞機能を変更（例えば、標的化変異によって）またはモジュレートすることによって、変異誘発の速度、品質、または程度を増強する方法も包含する。例えば、細胞を変質させ、またはモジュレートすることによって、ＤＮＡ修復、変異誘発物質代謝、変異誘発物質感受性、ゲノム安定性、またはこれらの組合せが機能していない、または欠損しているようにすることができる。よって、通常ゲノム安定性を維持する遺伝子機能の破壊を使用して変異誘発を増強することができる。破壊の代表的な標的としては、これらに限定されないが、ＤＮＡリガーゼＩ（Bentleyら、２００２年）
およびカゼインキナーゼＩ（米国特許第６，０６０，２９６号）が挙げられる。
【０３２６】
一部の実施形態では、本開示の切断酵素をコードする核酸を生成するために、部位特異的変異誘発（例えば、トランスフォーマー部位指向変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの市販キットを使用するプライマー指向変異誘発）を使用して、核酸配列全体にわたって複数の変化をもたらす。
【０３２７】
１種または複数の変異誘発剤に曝露した際の遺伝子改変の頻度は、処置の用量および／または繰り返しを変更することによってモジュレートすることができ、特定の用途に合わせることができる。
【０３２８】
よって、一部の実施形態では、本明細書で使用される「変異誘発」は、エラープローンＰＣＲ変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発、部位指向変異誘発、および本明細書に記載の技法のいずれかによる反復的配列組換えを含めて、変異を誘導するためのすべての当技術分野で公知の技法を含む。
多様性を生成するための単一遺伝子座変異
【０３２９】
一部の実施形態では、本開示は、ゲノムＤＮＡの選択された部分を導入し、欠失させ、または置き換えることによって細胞集団を変異させることを教示する。よって、一部の実施形態では、本開示は、特定の遺伝子座に変異を標的化するための方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ領域を選択的に編集するための遺伝子編集技術、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮＳ、またはＣＲＩＳＰＲの使用を教示する。
【０３３０】
他の実施形態では、本開示は、宿主生物の外で選択されたＤＮＡ領域を変異させ、次いで変異配列を宿主生物内に挿入して戻すことを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、生来のプロモーターまたは合成プロモーターを変異させて、様々な発現性質を有する一連のプロモーターバリアント（以下のプロモーターラダーを参照）を生成することを教示する。他の実施形態では、本開示は、ＰｒｏＳＡＲなどの単一遺伝子最適化技法に適合する（本明細書に参照により組み込まれている、Foxら、２００７年、「Improving
catalytic  function  by  ProSAR-driven  enzyme  evolution.」、Nature  Biotechnology、２５巻（３号）、３３８〜３４３頁）。
【０３３１】
一部の実施形態では、ＤＮＡの選択された領域は、自然バリアントの遺伝子シャッフリング、または合成オリゴでのシャッフリング、プラスミド−プラスミド組換え、ウイルスプラスミド組換え、ウイルス−ウイルス組換えを介してｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成される。他の実施形態では、ゲノム領域は、エラープローンＰＣＲを介して生成される（例えば、図１を参照）。
【０３３２】
一部の実施形態では、選択された遺伝子領域内で変異を生成するステップは、「リアセンブリーＰＣＲ」によって実践される。簡単に言えば、オリゴヌクレオチドプライマー（オリゴ）が、目的の核酸配列のセグメントをＰＣＲ増幅するために合成され、その結果、オリゴヌクレオチドの配列は、２つのセグメントの接合部と重複する。重複領域は、典型的には、長さが約１０〜１００ヌクレオチドである。セグメントのそれぞれは、一連のこのようなプライマーで増幅される。次いでＰＣＲ産物は、アセンブリープロトコールに従って「リアセンブルされる」。簡単に説明すると、アセンブリープロトコールでは、ＰＣＲ産物は、例えば、ゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーによって最初に精製されてプライマーから離れる。精製産物は、一緒に混合され、追加のプライマーの非存在下で（「セルフプライミング」）、ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）および適切な緩衝塩の存在下で、約１〜１０サイクルの変性、リアニーリング、および伸長に供される。遺伝子に隣接するプライマーを用いた後続のＰＣＲが使用されて、完全にリアセンブルおよびシャッフルされた遺伝子の収量が拡大される。
【０３３３】
本開示の一部の実施形態では、上記に論じたものなどの変異ＤＮＡ領域は、変異体配列について富化され、その結果、複数の変異体スペクトル、すなわち、変異の可能な組合せが、より効率的にサンプリングされる。一部の実施形態では、変異配列は、アセンブリー反応の前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで親和性精製材料を増幅する好適なステップを用いて、ｍｕｔＳタンパク質親和性マトリックスを介して同定される（Wagnerら、Nucleic  Acids  Res.、２３巻（１９号）：３９４４〜３９４８頁（１９９５年）；Suら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.(U.S.A.)、８３巻：５０５７〜５０６１頁（１９８６年））。次いでこの増
幅された材料は、本願の後の部分に記載されているアセンブリーまたはリアセンブリーＰＣＲ反応にかけられる。
プロモーターラダー
【０３３４】
プロモーターは、遺伝子が転写される速度を調節し、様々なやり方で転写に影響を与えることができる。構成的プロモーターは、例えば、内部または外部の細胞条件にかかわらず、定速でこれらの関連する遺伝子の転写を指示し、一方、調節可能プロモーターは、内部および／または外部の細胞条件、例えば、増殖速度、温度、具体的な環境化学物質に対する応答などに応じて遺伝子が転写される速度を増減する。プロモーターは、これらの正常な細胞コンテクストから単離することができ、操作されて、実質的に任意の遺伝子の発現を調節することができ、細胞増殖、産物収率、および／または目的の他の表現型の有効な改変を可能にする。
【０３３５】
一部の実施形態では、本開示は、下流の遺伝子設計法で使用するためのプロモーターラダーライブラリーを生成するための方法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度または優れた調節性質を呈する、１つもしくは複数のプロモーターを同定し、かつ／または宿主細胞内で１つもしくは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を教示する。これらの同定および／または生成されたプロモーターの特定の組合せは、以下でより詳細に説明されるプロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０３３６】
一部の実施形態では、本開示は、プロモーターラダーの使用を教示する。一部の実施形態では、本開示のプロモーターラダーは、連続した範囲の発現プロファイルを呈するプロモーターを含む。例えば、一部の実施形態では、プロモーターラダーは、刺激に応答して、または構成的発現を通じて一連の発現強度を呈する天然の、生来の、または野生型プロモーターを同定することによって創製される（例えば、図２０および図２８〜３０を参照）。これらの同定されたプロモーターは、プロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０３３７】
他の実施形態では、本開示は、異なる条件にわたって一連の発現プロファイルを呈するプロモーターラダーの創製を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、発現ピークが発酵の異なる段階全体にわたって広がったプロモーターのラダーを生み出すことを教示する（例えば、図２８を参照）。他の実施形態では、本開示は、特異的刺激に応答して異なる発現ピークダイナミクスを有するプロモーターのラダーを生み出すことを教示する（例えば、図２９を参照）。当業者は、本開示の調節プロモーターラダーは、任意の１つまたは複数の調節プロファイルの代表であり得ることを認識する。
【０３３８】
一部の実施形態では、本開示のプロモーターラダーは、応答の連続的な範囲にわたって予測可能な様式で遺伝子発現を撹乱するように設計される。一部の実施形態では、プロモーターラダーの連続的な特質は、株改良プログラムに追加の予測力を付与する。例えば、一部の実施形態では、選択された代謝経路のスワッピングプロモーターまたは終結配列は、非常に最適の発現比またはプロファイルを同定する宿主細胞性能曲線を生成することができ、標的とした遺伝子が特定の反応または遺伝的カスケードにとってもはや制限因子でない一方、不適切な環境下で不要な過剰発現または誤発現も回避する株を生成する。一部の実施形態では、プロモーターラダーは、所望のプロファイルを呈する天然の、生来の、または野生型プロモーターを同定することによって創製される。他の実施形態では、プロモーターラダーは、天然に存在するプロモーターを変異させて複数の変異プロモーター配列を得ることによって創製される。これらの変異プロモーターのそれぞれは、標的遺伝子発現に対する効果について試験される。一部の実施形態では、編集されたプロモーターは、様々な条件にわたって発現活性について試験され、その結果、各プロモーターバリアントの活性が記録され／特徴付けられ／アノテートされ、かつデータベース内に記憶される。結果として生じる編集されたプロモーターバリアントは、引き続いて組織化されて、これらの発現の強度に基づいて配列されたプロモーターラダーにされる（例えば、頂部付近に高度発現バリアントおよび底部付近に減弱された発現を有し、したがって、用語「ラダー」をもたらす）。
【０３３９】
一部の実施形態では、本開示は、同定された天然に存在するプロモーターおよび変異されたバリアントプロモーターの組合せであるプロモーターラダーを教示する。
【０３４０】
一部の実施形態では、本開示は、以下の判定基準：１）構成的プロモーターのラダーを表した；および２）短いＤＮＡ配列、理想的には１００塩基対未満によってコードされ得る、の両方を満たした天然の、生来の、または野生型プロモーターを同定する方法を教示する。一部の実施形態では、本開示の構成的プロモーターは、２つの選択された成長条件（典型的には、工業的な培養中に経験した条件の間で比較した）にわたって一定の遺伝子発現を呈する。一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、約６０塩基対のコアプロモーターおよび長さが２６から４０塩基対の間の５’ＵＴＲからなる。
【０３４１】
一部の実施形態では、上述の同定した天然に存在するプロモーター配列の１つまたは複数が、遺伝子編集のために選択される。一部の実施形態では、天然のプロモーターは、上述した変異方法のいずれかを介して編集される。他の実施形態では、本開示のプロモーターは、所望の配列を有する新しいプロモーターバリアントを合成することによって編集される。
【０３４２】
２０１５年１２月７日に出願された米国特許出願第６２／２６４，２３２号の開示全体は、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０３４３】
本開示のプロモーターの非網羅的なリストを、以下の表１に提供する。プロモーター配列のそれぞれは、異種プロモーターまたは異種プロモーターポリヌクレオチドと呼ぶことができる。
【表１Ａ】
2019162131.tif 000003
【０３４４】
一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、上記表由来のプロモーターと少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、または７５％の配列同一性を呈する。
ターミネーターラダー
【０３４５】
一部の実施形態では、本開示は、ＲＮＡコードエレメントの末端の３’位で１つまたは複数の転写終結配列を提供することによって、遺伝子操作された宿主株を改良する方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、終結配列を付加すると、遺伝子操作された宿主内の選択された遺伝子のＲＮＡ転写の効率が改善されることを教示する。他の実施形態では、本開示は、終結配列を付加すると、遺伝子操作された宿主内の選択された遺伝子のＲＮＡ転写の効率が低減されることを教示する。よって、一部の実施形態では、本開示のターミネーターラダーは、一連の転写効率を呈する一連のターミネーター配列（例えば、１つの弱いターミネーター、１つの平均のターミネーター、および１つの強いプロモーター）を含む。
【０３４６】
転写終結配列は、転写で、オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列の下流に配置されたとき、オープンリーディングフレームの転写を終了させる任意のヌクレオチド配列であり得る。このような配列は、当技術分野で公知であり、原核生物、真核生物、またはファージ起源のものであり得る。ターミネーター配列の例としては、これらに限定されないが、ＰＴＨ−ターミネーター、ｐＥＴ−Ｔ７ターミネーター、Ｔ３−Ｔφターミネーター、ｐＢＲ３２２−Ｐ４ターミネーター、水疱性口内炎（vesicular  stomatitus）ウイルスターミネーター、ｒｒｎＢ−Ｔ１ターミネーター、ｒｒｎＣターミネ
ーター、ＴＴａｄｃ転写ターミネーター、ならびに酵母認識終結配列、例えば、Ｍａｔα（α−因子）転写ターミネーター、生来のα−因子転写終結配列、ＡＤＲ１転写終結配列、ＡＤＨ２転写終結配列、およびＧＡＰＤ転写終結配列が挙げられる。転写ターミネーター配列の非網羅的なリストは、ｉＧＥＭレジストリにおいて見出すことができ、これは、http://partsregistry.org/Terminators/Catalogで利用可能である。
【０３４７】
一部の実施形態では、転写終結配列は、ポリメラーゼ特異的であっても非特異的であってもよいが、本実施形態において使用するために選択される転写ターミネーターは、選択されたプロモーターとの「機能的組合せ」を形成するべきであり、ターミネーター配列は、プロモーターで開始するＲＮＡポリメラーゼのタイプによって転写を終結することができるべきであることを意味する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、真核生物ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーターおよび真核生物ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩターミネーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ７ターミネーター、Ｔ３プロモーターおよびＴ３ターミネーター、酵母認識プロモーターおよび酵母認識終結配列などは一般に、機能的組合せを形成するはずであることを教示する。使用される転写終結配列の実体（identity）は、転写が所与のプロモーターから終結される効率に基づいて選択することもできる。例えば、異種転写ターミネーター配列は、ＲＮＡコードエレメントの転写的に下流に提供されて、所与のプロモーターから少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の終結効率を達成することができる。
【０３４８】
一部の実施形態では、操作された発現コンストラクトからのＲＮＡ転写の効率は、ＲＮＡコードエレメントの末端の３’位で２つまたはそれ超のヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列を提供することによって改善することができる。特定の理論によって束縛されることを望むことなく、二次構造は、転写伸長複合体を不安定化させ、ポリメラーゼをＤＮＡ鋳型から解離した状態にし、それによって、非機能的配列の非生産的転写を最小限にし、所望のＲＮＡの転写を増大させる。したがって、２つまたはそれ超の隣接するヘアピンを含む二次構造を形成する終結配列を提供することができる。一般に、ヘアピンは、それ自体で折り返してアームが一本鎖ループによって接続されている対を成したステム領域を形成することができるパリンドロームヌクレオチド配列によって形成することができる。一部の実施形態では、終結配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の隣接するヘアピンを含む。一部の実施形態では、隣接するヘアピンは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の対を成していないヌクレオチドによって分離されている。一部の実施形態では、ヘアピンステムは、長さが４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ超の塩基対を含む。ある特定の実施形態では、ヘアピンステムは、長さが１２〜３０塩基対である。ある特定の実施形態では、終結配列は、約９〜２５塩基対を含むステム領域を有する２つまたはそれ超の中型のヘアピンを含む。一部の実施形態では、ヘアピンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのループ形成領域を含む。一部の実施形態では、ループ形成領域は、４〜８ヌクレオチドを含む。特定の理論によって束縛されることを望むことなく、二次構造の安定性は、終結効率と相関し得る。ヘアピン安定性は、その長さ、それが含有するミスマッチまたはバルジの数、および対を成した領域の塩基組成によって決定される。グアニンとシトシンとの間の対合は、３つの水素結合を有し、２つしか有さないアデニン−チミン対合と比較してより安定である。ヘアピン形成パリンドロームヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはそれ超であり得る。一部の実施形態では、ヘアピン形成パリンドロームヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は、少なくとも８０％である。一部の実施形態では、終結配列は、原核生物、真核生物、またはファージ起源の１つまたは複数の転写ターミネーター配列に由来する。一部の実施形態では、一連の４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超のアデニン（Ａ）をコードするヌクレオチド配列が、終結配列の３’に提供される。
【０３４９】
一部の実施形態では、本開示は、一連のタンデム終結配列の使用を教示する。一部の実施形態では、一連の２、３、４、５、６、７、またはそれ超の第１の転写ターミネーター配列を、ｄｓＲＮＡコードエレメントの最終ヌクレオチドの３’に直接、またはｄｓＲＮＡコードエレメントの最終ヌクレオチドの３’に、少なくとも１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１，０００、もしくはそれ超のヌクレオチドの距離で配置することができる。タンデム転写ターミネーター配列間のヌクレオチドの数は、様々であり得、例えば、転写ターミネーター配列は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、またはそれ超のヌクレオチドによって分離され得る。一部の実施形態では、転写ターミネーター配列は、構造予測アルゴリズムによって決定されるこれらの予測された二次構造に基づいて選択することができる。構造予測プログラムは、当技術分野で周知であり、例えば、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを含む。
【０３５０】
当業者は、本開示の方法は、任意の終結配列に適合することを認識する。一部の実施形態では、本開示は、Pfeifer-Sancarら、２０１３年「Comprehensive  analysis  of  the
Corynebacterium  glutamicum  transcriptome  using  an  improved  RNAseq  technique」、Pfeifer-Sancarら、BMC  Genomics、２０１３年、１４巻：８８８頁）に開示さ
れたアノテートされたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍターミネーターの使用を教示する。他の実施形態では、本開示は、http://partsregistry.org/Terminators/Catalogで利用可能であるｉＧＥＭレジストリにおいて見出される転写ターミネーター配列の使用を教示する。本開示の転写ターミネーター配列の非網羅的なリストを以下の表１．１に提供する。
【表１Ｂ−１】
2019162131.tif 000004
【表１Ｂ−２】
2019162131.tif 000005
【表１Ｂ−３】
2019162131.tif 000006
【表１Ｂ−４】
2019162131.tif 000007
仮説主導型多様性プールおよびヒルクライミング
【０３５１】
本開示は、本開示のＨＴＰゲノム操作方法は、宿主細胞性能の有意な獲得を達成するのに先の遺伝的知識を必要としないことを教示する。実際に、本開示は、ランダム変異誘発、および既存の宿主細胞バリアントの中での遺伝的多様性の同定（例えば、野生型宿主細胞と工業用バリアントとの間の比較など）を含めたいくつかの機能にとらわれない（functionally  agnostic）手法を介して多様性プールを生成する方法を教示する。
【０３５２】
しかし、一部の実施形態では、本開示は、下流のＨＴＰ操作に使用される遺伝的多様性変異を設計する仮説主導方法も教示する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、選択された変異の指向設計を教示する。一部の実施形態では、指向変異が、本開示の操作ライブラリー（例えば、ＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、またはＳＴＯＰスワップ）中に組み入れられる。
【０３５３】
一部の実施形態では、本開示は、遺伝子アノテーション、仮定された（もしくは確認された）遺伝子機能、またはゲノム内の場所に基づく指向変異の創製を教示する。本開示の多様性プールは、文献において宿主細胞の性能の増大に関連した特異的代謝経路または遺伝経路に関与すると仮定された遺伝子内の変異を含み得る。他の実施形態では、本開示の多様性プールは、宿主性能の改善に関連したオペロン内に存在する遺伝子への変異も含み得る。さらに他の実施形態では、本開示の多様性プールは、アルゴリズムが予測した機能または他の遺伝子アノテーションに基づく遺伝子への変異も含み得る。
【０３５４】
一部の実施形態では、本開示は、仮説主導型変異の標的に優先順位をつけるための「シェル」ベースの手法を教示する。標的優先順位付けのシェルメタファーは、少数の主要遺伝子のみが宿主細胞の性能の特定の態様（例えば、単一生体分子の産生）のほとんどを担うという仮説に基づく。これらの主要遺伝子は、シェルのコアに位置しており、その後、第２の層における二次効果遺伝子、第３のシェルにおける三次効果などが続く。例えば、一実施形態では、シェルのコアは、選択された代謝経路内の極めて重要な生合成酵素（例えば、クエン酸の産生）をコードする遺伝子を含み得る。第２のシェルに位置した遺伝子は、産物転換またはフィードバックシグナル伝達を担う生合成経路内の他の酵素をコードする遺伝子を含み得る。この例示的なメタファー下の第３の段の遺伝子は、生合成経路の発現のモジュレーションまたは宿主細胞内の全般的な炭素フラックスの調節を担う調節遺伝子を含みやすい。
【０３５５】
本開示は、あらゆる同定された変異からの性能獲得を最適化するための「ヒルクライム」法も教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＨＴＰ多様性ライブラリー内のランダム、天然の、または仮説主導型変異が、宿主細胞性能に関連した遺伝子の同定をもたらすことができることを教示する。例えば、本方法は、遺伝子コード配列に、またはその付近に位置した１つまたは複数の有益なＳＮＰを同定することができる。この遺伝子は、宿主細胞性能に関連している場合があり、その同定は、生物体のコンビナトリアル遺伝子変異空間における性能「ヒル」の発見に類似し得る。
【０３５６】
一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰ変異において具現化された同定されたヒル周囲のコンビナトリアル空間を探索する方法を教示する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、その遺伝子ノード（すなわち、ヒルクライミング）から得られる性能獲得を最適化するための同定された遺伝子および関連した調節配列の撹乱を教示する。よって、本開示の方法によれば、遺伝子は、ランダム変異誘発から供給された多様性ライブラリー内で最初に同定することができるが、同じ遺伝子内の別の配列の指向変異によって株改良プログラムにおいて使用するために後に改善され得る。
【０３５７】
ヒルクライミングの概念は、単一遺伝子配列を囲繞するコンビナトリアル空間の探索を超えて拡張することもできる。一部の実施形態では、特定の遺伝子内の変異は、宿主細胞性能に対する特定の代謝経路または遺伝経路の重要性を明らかにすることができる。例えば、一部の実施形態では、単一ＲＮＡ分解遺伝子内の変異が有意な宿主性能獲得をもたらしたという発見を、宿主生物から追加の性能獲得を引き出すための手段として関連したＲＮＡ分解遺伝子を変異させるための基礎として使用することができる。当業者は、上記のバリアントが指向遺伝子設計へのシェルおよびヒルクライム手法を記述することを認識する。ハイスループットスクリーニング。
細胞培養および発酵
【０３５８】
本開示の細胞は、任意の所望の生合成反応または選択に適切に改変された慣例的な栄養培地中で培養することができる。一部の実施形態では、本開示は、プロモーターを活性化するための誘導培地中での培養を教示する。一部の実施形態では、本開示は、形質転換体（例えば、抗生物質）の選択剤、または阻害条件（例えば、高エタノール条件）下で増殖させるのに適した生物体の選択を含めた選択剤を含む培地を教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞増殖のために最適化された培地中の増殖細胞培養を教示する。他の実施形態では、本開示は、産物収率のために最適化された培地中の増殖細胞培養を教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞増殖を誘導することができ、最終産物産生に必要な前駆体（例えば、エタノール産生のための高レベルの糖）も含有する培地中の増殖培養を教示する。
【０３５９】
例えば、温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに使用するのに適したものであり、当業者に明らかである。述べたように、多くの参考文献が、細菌、植物、動物（哺乳動物を含む）、および古細菌起源の細胞を含めた多くの細胞の培養および産生に利用可能である。例えば、Sambrook、Ausubel（すべて上記）、ならびにBerger、Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques、Methods  in  Enzymology、１５
２巻、Academic  Press,  Inc.、San  Diego、CA；ならびにFreshney（１９９４年）、Culture  of  Animal  Cells、a  Manual  of  Basic  Technique、３版、Wiley-Liss、New
York、およびそれに引用された参考文献；DoyleおよびGriffiths（１９９７年）、Mammalian  Cell  Culture:Essential  Techniques、John  Wiley  and  Sons、NY；Humason
（１９７９年）、Animal  Tissue  Techniques、４版、W.H.  Freeman  and  Company；
ならびにRicciardelleら、（１９８９年）、In  Vitro  Cell  Dev.  Biol.、２５巻：１０１６〜１０２４頁を参照。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。植物細胞培養および再生について、Payneら（１９９２年）、Plant  Cell  and  Tissue  Culture  in  Liquid  Systems、John  Wiley  &  Sons,  Inc.、New  York、N.Y.；GamborgおよびPhillips（編）（１９９５年）、Plant  Cell,  Tissue  and  Organ  Culture;  Fundamental  Methods  Springer  Lab  Manual、Springer-Verlag（Berlin  Heidelberg  N.Y.）；Jones編（１９８４年）、Plant  Gene  Transfer  and  Expression  Protocols、Humana  Press、Totowa、N.J．、ならびにPlant  Molecular  Biology（１９
９３年）、R.  R.  D.  Croy編、Bios  Scientific  Publishers、Oxford、U.K.  ISBN  0  12  198370  6。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。一般に細胞培養培地は、AtlasおよびParks（編）、The  Handbook  of  Microbiological  Media（１９９３年）、CRC  Press、Boca  Raton、Fla.に示されており、これは、参照により本明細書に組み込まれている。細胞培養の追加の情報は、Sigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのLife  Science  Research  Cell  Culture  Catalogue（「Sigma-LSRCCC」）、および例えば、やはりSigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのThe  Plant
Culture  Catalogue  and  supplement（「Sigma-PCCS」）などの入手可能な市販の文
献に見出され、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【０３６０】
使用される培養培地は、適当な様式で、それぞれの株の要求を満たさなければならない。様々な微生物の培養培地の記載は、American  Society  for  Bacteriologyの「Manual
of  Methods  for  General  Bacteriology」（Washington  D.C.、USA、１９８１年）に存在する。
【０３６１】
本開示は、目的の産物を発酵調製するためのプロセスであって、ａ）適当な培地中で本開示による微生物を培養し、発酵ブロスをもたらすステップと；ｂ）ａ）の発酵ブロス中、かつ／または微生物の細胞内で目的の産物を濃縮するステップとを含む、プロセスをさらに提供する。
【０３６２】
一部の実施形態では、本開示は、生成される微生物を、所望の有機−化学化合物を産生させる目的で、例えば、ＷＯ０５／０２１７７２に記載されているように連続的に、あるいはバッチプロセス（バッチ培養）またはフェドバッチもしくは繰り返しフェドバッチプロセスで不連続に培養することができることを教示する。公知の培養方法についての全般的な特質の概要は、Chmiel（Bioprozesstechnik.  1:  Einfuehrung  in  die  Bioverfahrenstechnik（Gustav  Fischer  Verlag、Stuttgart、１９９１年））による教科書、またはStorhas（Bioreaktoren  and  periphere  Einrichtungen（Vieweg  Verlag、Braunschweig/Wiesbaden、１９９４年））による教科書において入手可能である。
【０３６３】
一部の実施形態では、本開示の細胞は、バッチまたは連続発酵条件下で増殖される。
【０３６４】
古典的なバッチ発酵は、クローズドシステムであり、培地の組成は、発酵の開始時に設定され、発酵中に人為的な変更に供されない。バッチシステムの変形は、フェドバッチ発酵であり、これは、本開示においても使用を見出す。この変形では、基質は、発酵が進行するにつれて徐々に添加される。フェドバッチシステムは、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性がある、および培地中の基質の量が限定されていることが望ましい場合、有用である。バッチ発酵およびフェドバッチ発酵は、一般的であり、当技術分野で周知である。
【０３６５】
連続発酵は、目的の所望の生体分子産物を処理および回収するために、規定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、等量の馴化培地が同時に除去されるシステムである。一部の実施形態では、連続発酵は一般に、一定の高密度で培養物を維持し、この場合、細胞は、主に、対数期増殖にある。一部の実施形態では、連続発酵は一般に、静止または後期対数／静止期増殖で培養物を維持する。連続発酵システムは、定常状態増殖条件を維持しようと努める。
【０３６６】
連続発酵プロセスのための栄養分および成長因子をモジュレートするための方法、ならびに産物形成の速度を最大化するための技法は、工業微生物学の技術分野で周知である。
【０３６７】
例えば、本開示の培養のための炭素源の限定されないリストとしては、糖および炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、サトウダイコンまたはサトウキビ加工からのスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物、およびセルロースなど；油脂、例えば、ダイズ油、ヒマワリ油、落花生油、およびココナツ脂肪など；脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸など；アルコール、例えば、グリセロール、メタノール、およびエタノールなど；ならびに有機酸、例えば、酢酸または乳酸などが挙げられる。
【０３６８】
本開示の培養のための窒素源の限定されないリストとしては、有機窒素含有化合物、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、トウモロコシ浸出液、ダイズ粉、および尿素；または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、アンモニウムクロリド、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源は、個々に、または混合物として使用され得る。
【０３６９】
本開示の培養のための可能なリン源の限定されないリストとしては、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩が挙げられる。
【０３７０】
培養培地は、例えば、金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、および鉄などの塩化物または硫酸塩、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの形態で塩をさらに含み得、これらは、増殖に必要である。
【０３７１】
最後に、アミノ酸などの必須の成長因子、例えば、ホモセリンおよびビタミン、例えば、チアミン、ビオチン、またはパントテン酸を、上述した物質に加えて使用することができる。
【０３７２】
一部の実施形態では、培養物のｐＨは、これらに限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水を含めた任意の酸もしくは塩基または緩衝塩；あるいは適当な様式でのリン酸または硫酸などの酸性化合物によって制御することができる。一部の実施形態では、ｐＨは一般に、６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８の値に調整される。
【０３７３】
一部の実施形態では、本開示の培養物は、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を含み得る。一部の実施形態では、本開示の培養物は、例えば、抗生物質などの適当な選択物質を添加することによって、培養物のプラスミドを安定化するように改変される。
【０３７４】
一部の実施形態では、培養は、好気性条件下で実行される。これらの条件を維持するために、酸素または酸素含有気体混合物、例えば、空気などが、培養物に導入される。過酸化水素を富化させた液体を使用することが同様に可能である。発酵は、適切な場合、高圧で、例えば、０．０３〜０．２ＭＰａの高圧で実行される。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、特に好ましくは３０℃〜３７℃である。バッチプロセスまたはフェドバッチプロセスでは、培養は、好ましくは、回収されるのに十分な目的の所望の産物（例えば、有機−化学化合物）の量が形成されるまで継続される。この目的は通常、１０時間〜１６０時間以内に達成することができる。連続プロセスでは、より長い培養時間が可能である。微生物の活動により、発酵培地中で、かつ／または前記微生物の細胞内で目的の産物が濃縮（蓄積）される。
【０３７５】
一部の実施形態では、培養は、嫌気性条件下で実行される。
スクリーニング
【０３７６】
一部の実施形態では、本開示は、ハイスループット初期スクリーニングを教示する。他の実施形態では、本開示は、性能データのロバストなタンクベースの検証も教示する（図６Ｂを参照）。
【０３７７】
一部の実施形態では、ハイスループットスクリーニングプロセスが、バイオリアクター内の株の性能を予測するのに設計される。先に記載した通り、培養条件は、生物体に適しており、バイオリアクター条件を反映しているように選択される。個々のコロニーが精選され、９６ウェルプレート中に移され、適当な量の時間にわたってインキュベートされる。細胞は、追加のシード培養のために新しい９６ウェルプレートに、または産生培養に引き続いて移される。培養物は、様々な長さの時間にわたってインキュベートされ、この場合、複数の測定を行うことができる。これらは、産物、バイオマス、またはバイオリアクター内の株の性能を予測する他の特性の測定を含み得る。ハイスループット培養結果は、バイオリアクター性能を予測するのに使用される。
【０３７８】
一部の実施形態では、タンクベースの性能検証が使用されて、ハイスループットスクリーニングによって単離された株の性能が確認される。発酵プロセス／条件は、クライアントサイトから得られる。候補株は、生産性または収率などの関連した株性能特性について、ベンチスケール発酵反応器（例えば、本開示の表５に開示した反応器）を使用してスクリーニングされる。
産物回収および定量
【０３７９】
目的の産物の産生についてスクリーニングするための方法は、当業者に公知であり、本明細書全体にわたって論じられている。このような方法は、本開示の株をスクリーニングするとき使用することができる。
【０３８０】
一部の実施形態では、本開示は、非分泌型細胞内産物を産生するように設計された株を改善する方法を教示する。例えば、本開示は、細胞内酵素、油、医薬品、または他の貴重な低分子もしくはペプチドを産生する細胞培養物のロバスト性、収率、効率、または全体的な望ましさを改善する方法を教示する。非分泌型細胞内産物の回収または単離は、本明細書に記載のものを含めて当技術分野で周知である溶解技法および回収技法によって達成することができる。
【０３８１】
例えば、一部の実施形態では、本開示の細胞は、遠心分離、濾過、沈殿、または他の方法によって回収することができる。次いで回収された細胞は、当業者に周知である凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または他の方法を含めた任意の好都合な方法によって破壊される。
【０３８２】
結果として生じる目的の産物、例えば、ポリペプチドは、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって回収／単離および任意選択で精製することができる。例えば、産物ポリペプチドは、これらに限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、または沈降を含めた慣例的な手順によって栄養培地から単離することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製ステップで使用することができる。（例えば、ともに参照により本明細書に組み込まれている、Parryら、２００１年、Biochem.  J.、３５３巻：１１７頁、およびHongら、２０
０７年、Appl.  Microbiol.  Biotechnol．、７３巻：１３３１頁に記載の細胞内タンパ
ク質の精製を参照）。
【０３８３】
上述した参考文献に加えて、様々な精製方法は、例えば、Sandana（１９９７年）、Bioseparation  of  Proteins、Academic  Press,  Inc.；Bollagら（１９９６年）、Protein  Methods、２版、Wiley-Liss、NY；Walker（１９９６年）、The  Protein  Protocols
Handbook、Humana  Press、NJ；HarrisおよびAngal（１９９０年）、Protein  Purification  Applications:  A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；HarrisおよびAngal  Protein  Purification  Methods:A  Practical  Approach
、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；Scopes（１９９３年）、Protein  Purification:  Principles  and  Practice、３版、Springer  Verlag、NY；JansonおよびRyden（１９９８年）、Protein  Purification:  Principles,  High  Resolution  Methods
and  Applications、２版、Wiley-VCH、NY；ならびにWalker（１９９８年）、Protein
Protocols  on  CD-ROM、Humana  Press、NJに示されたものを含めて、当技術分野で周知である。これらの文献のすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【０３８４】
一部の実施形態では、本開示は、分泌産物を産生させるように設計された株を改良する方法を教示する。例えば、本開示は、貴重な低分子またはペプチドを産生する細胞培養物のロバスト性、収率、効率、または全体的な望ましさを改善する方法を教示する。
【０３８５】
一部の実施形態では、免疫学的方法は、本開示の細胞によって産生される分泌型または非分泌型産物を検出および／または精製するのに使用することができる。一例示的手法では、従来の方法を使用して産物分子に対して（例えば、インスリンポリペプチドまたはその免疫原性断片に対して）産生される抗体は、ビーズ上に固定化され、エンドグルカナーゼが結合している条件下で細胞培養培地と混合され、沈降される。一部の実施形態では、本開示は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の使用を教示する。
【０３８６】
他の関連した実施形態では、米国特許第５，５９１，６４５号、米国特許第４，８５５，２４０号、米国特許第４，４３５，５０４号、米国特許第４，９８０，２９８号、およびSe-Hwan  Paekら、「Development  of  rapid  One-Step  Immunochromatographic  assay,  Methods」、２２巻、５３〜６０頁、２０００年）に開示された免疫クロマトグラ
フィーが使用される。これらの文献のそれぞれは、本明細書に参照により組み込まれている。一般的な免疫クロマトグラフィーは、２つの抗体を使用することによって検体を検出する。第１の抗体は、試験溶液中に、または試験溶液が滴下される、多孔質膜から作製されたおよそ矩形状をした試験片の末端の部分に存在する。この抗体は、ラテックス粒子または金コロイド粒子で標識される（この抗体は、以下で標識抗体と呼ばれる）。滴下された試験溶液が検出されるべき検体を含むとき、標識抗体は、検体を認識して検体と結合する。検体と標識抗体との複合体は、アブソーバーに向けて毛管現象によって流れ、このアブソーバーは、濾紙から作製され、標識抗体を含んだ末端と反対の末端に結合している。流れている間に、検体と標識抗体との複合体は、多孔質膜の中間に存在している第２の抗体（これは、以下でタッピング抗体（tapping  antibody）と呼ばれる）によって認識お
よび捕捉され、この結果として、複合体は、可視シグナルとして多孔質膜上の検出部分に現れ、検出される。
【０３８７】
一部の実施形態では、本開示のスクリーニング方法は、測光検出技法（吸収、蛍光）に基づく。例えば、一部の実施形態では、検出は、抗体に結合したＧＦＰなどのフルオロフォア検出剤の存在に基づき得る。他の実施形態では、測光検出は、細胞培養からの所望の産物の蓄積に基づき得る。一部の実施形態では、産物は、培養物または前記培養物からの抽出物のＵＶを介して検出可能であり得る。
【０３８８】
当業者は、本開示の方法が、目的の任意の望ましい生体分子産物を産生する宿主細胞に適合することを認識する。以下の表２は、本開示の範囲内に含まれる産物カテゴリー、生体分子、および宿主細胞の限定されないリストを提示する。これらの例は、例示的な目的で提供されており、決して本開示の技術の適用性を限定するように意味していない。
【表２−１】
2019162131.tif 000008
【表２−２】
2019162131.tif 000009
【表２−３】
2019162131.tif 000010
選択判定基準および目標
【０３８９】
本開示の方法に適用される選択判定基準は、株改良プログラムの具体的な目標によって変動する。本開示は、任意のプログラム目標を満たすように適応させることができる。例えば、一部の実施形態では、プログラム目標は、差し迫った期限を伴わずに反応の単一バッチ収率を最大化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、生合成収率をリバランスして、特異的な産物を産生させ、または特定の比の産物を産生させることであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、産物の化学構造を改変すること、例えば、ポリマーの炭素鎖を長くすることであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、性能特性、例えば、収率、力価、生産性、副生成物排除、プロセスエクスカーションに対する寛容性、最適な増殖温度、および増殖速度を改善することであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、微生物によって産生される目的の産物の体積生産性、比生産性、収率、または力価によって測定した宿主性能の改善である。
【０３９０】
他の実施形態では、プログラム目標は、入力量当たりの最終産物収率（例えば、スクロース１ポンド当たりに産生されるエタノールの合計量）の観点から市販の株の合成効率を最適化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、例えば、バッチ完了率、または連続培養システムにおける歩留まり率の観点から測定した、合成速度を最適化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、特定のファージに対する株の耐性を増大させること、またはさもなければ培養条件下で株の活力／ロバスト性を増大させることであり得る。
【０３９１】
一部の実施形態では、株改良プロジェクトは、１つを超える目標を対象とする場合がある。一部の実施形態では、株プロジェクトの目標は、品質、信頼性、または全体的な収益性次第であり得る。一部の実施形態では、本開示は、上述した株性質の１つまたは複数を有する関連した選択された変異または変異の群の方法を教示する。
【０３９２】
当業者は、特定のプロジェクト目標を満たすように株選択判定基準をどのように合わせるかを認識する。例えば、反応が飽和しているときの株の単一バッチ最大収量の選択は、単一バッチ収量が高い株を同定するのに適切であり得る。一連の温度および条件にわたる収率の一貫性に基づく選択は、ロバスト性および信頼性が増大した株を同定するのに適切であり得る。
【０３９３】
一部の実施形態では、初期のハイスループットフェーズおよびタンクベースの検証の選択判定基準は、同一となる。他の実施形態では、タンクベースの選択は、追加のおよび／または異なる選択判定基準下で働き得る。例えば、一部の実施形態では、ハイスループット株選択は、単一バッチ反応完了収率に基づき得る一方、タンクベースの選択は、反応速度に対する収率に基づく選択を含むように拡張することができる。
シーケンシング
【０３９４】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の生物体の全ゲノムシーケンシングを教示する。他の実施形態では、本開示は、本開示の方法の品質対照としてのプラスミド、ＰＣＲ産物、および他のオリゴのシーケンシングも教示する。大および小プロジェクトのためのシーケンシング法は、当業者に周知である。
【０３９５】
一部の実施形態では、核酸をシーケンシングするための任意のハイスループット技法を、本開示の方法において使用することができる。一部の実施形態では、本開示は、全ゲノムシーケンシングを教示する。他の実施形態では、本開示は、遺伝的バリエーションを同定するためのアンプリコンシーケンシング、ウルトラディープシーケンシングを教示する。一部の実施形態では、本開示は、タグメンテーションを含めたライブラリー調製の新規方法も教示する（ＷＯ／２０１６／０７３６９０を参照）。ＤＮＡシーケンシング技法としては、標識ターミネーターまたはプライマー、およびスラブまたはキャピラリーにおけるゲル分離を使用する古典的ジデオキシシーケンシング反応（サンガー法）；可逆的に終止される標識ヌクレオチドを使用する合成によるシーケンシング、ピロシーケンシング；４５４シーケンシング；標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーへの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション；ライゲーションが後に続く標識クローンのライブラリーへの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを使用する合成によるシーケンシング；重合ステップ中の標識ヌクレオチドの組み入れのリアルタイムモニタリング；ポロニーシーケンシング；およびＳＯＬｉＤシーケンシングが挙げられる。
【０３９６】
本開示の一態様では、固体表面上の個々の分子を空間的に単離するステップであって、個々の分子が並行してシーケンシングされる、ステップを含むシーケンシングのハイスループット方法が使用される。このような固体表面として、非多孔性表面（Ｓｏｌｅｘａシーケンシング、例えば、Bentleyら、Nature、４５６巻：５３〜５９頁（２００８年）ま
たはＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓシーケンシング、例えば、Drmanacら、Science、３２７巻：７８〜８１頁（２０１０年）などにおける）、ビーズ結合鋳型または粒子結合鋳型を含み得るウェルのアレイ（４５４、例えば、Marguliesら、Nature、４３７巻：
３７６〜３８０頁（２００５年）、またはイオントレントシーケンシング、米国特許公開２０１０／０１３７１４３号もしくは同第２０１０／０３０４９８２号を用いてなど）、微細加工膜（ＳＭＲＴシーケンシング、例えば、Eidら、Science、３２３巻：１３３〜１３８頁（２００９年）を用いてなど）、またはビーズアレイ（ＳＯＬｉＤシーケンシングまたはポロニーシーケンシング、例えば、Kimら、Science、３１６巻：１４８１〜１４１４頁（２００７年）を用いるような）を挙げることができる。
【０３９７】
別の実施形態では、本開示の方法は、単離分子が固体表面上で空間的に単離される前または後のいずれかに単離分子を増幅するステップを含む。事前の増幅は、エマルジョンＰＣＲなどのエマルジョンに基づく増幅、またはローリングサークル増幅を含み得る。Ｓｏｌｅｘａに基づくシーケンシングも教示されており、この場合、Bentleyら（上記に引用
した）に、かつ製造者の指示（例えば、ＴｒｕＳｅｑ（商標）試料調製キットおよびデータシート、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、２０１０年）に；かつさらに、参照により組み込まれている以下の参考文献：米国特許第６，０９０，５９２号；同第６，３００，０７０号；同第７，１１５，４００号；およびＥＰ０９７２０８１Ｂ１に記載されている通り、個々の鋳型分子が固体表面上で空間的に単離され、その後これらがブリッジＰＣＲによって並行して増幅されて別個のクローン集団またはクラスターを形成し、次いでシーケンシングされる。
【０３９８】
一実施形態では、固体表面上で配置および増幅された個々の分子は、１ｃｍ２当たり少なくとも１０５クラスターの密度で；または１ｃｍ２当たり少なくとも５×１０５の密度で；または１ｃｍ２当たり少なくとも１０６クラスターの密度でクラスターを形成する。一実施形態では、相対的に高い誤り率を有するシーケンシング化学反応が使用される。このような実施形態では、このような化学反応によって生じる平均品質スコアは、配列リード長の単調低下関数である。一実施形態では、このような低下は、配列リードの０．５パーセントが１〜７５位に少なくとも１つの誤差を有し；配列リードの１パーセントが７６〜１００位に少なくとも１つの誤差を有し；配列リードの２パーセントが１０１〜１２５位に少なくとも１つの誤差を有することに対応する。
ゲノムワイド遺伝子設計判定基準の効果のコンピューター分析および予測
【０３９９】
一部の実施形態では、本開示は、所与の宿主株内に組み入れている特定の遺伝子変更の効果を予測する方法を教示する。さらなる態様では、本開示は、所与の宿主株内に、前記宿主が特定の表現型形質または株パラメータを有するために組み入れるべきである提案された遺伝子変更を生成するための方法を提供する。所与の態様では、本開示は、新規宿主株を設計するのに利用することができる予測モデルを提供する。
【０４００】
一部の実施形態では、本開示は、各ラウンドのスクリーニングの性能結果を分析する方法、およびその後のラウンドのスクリーニングで株性能を増強すると予測される新しく提案されたゲノムワイド配列修飾をおこすための方法を教示する。
【０４０１】
一部の実施形態では、本開示は、システムが、先のスクリーニング結果に基づいて宿主株に提案された配列修飾をおこすことを教示する。一部の実施形態では、本システムの推奨は、直前のスクリーニングからの結果に基づく。他の実施形態では、本システムの推奨は、先行するスクリーニングのうちの１つまたは複数の累積的結果に基づく。
【０４０２】
一部の実施形態では、本システムの推奨は、先に開発されたＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーに基づく。例えば、一部の実施形態では、本システムは、同じまたは異なる宿主生物において、先のスクリーニングからの結果を保存し、異なるプロジェクトにこれらの結果を適用するように設計される。
【０４０３】
他の実施形態では、本システムの推奨は、科学的洞察に基づく。例えば、一部の実施形態では、推奨は、遺伝子の公知の性質（アノテートされた遺伝子データベースおよび関連した文献などの源からの）、コドン最適化，転写スリップ、ｕＯＲＦ、または他の仮説主導型配列、および宿主最適化に基づく。
【０４０４】
一部の実施形態では、システムまたは予測モデルが推奨した宿主株への提案された配列修飾は、（１）プロモータースワップ、（２）ＳＮＰスワップ、（３）開始／停止コドン交換、（４）配列最適化、（５）Ｓｔｏｐスワップ、および（５）上位性マッピングを含む開示した分子ツールセットの１つまたは複数の利用によって実行される。
【０４０５】
本明細書に記載のＨＴＰ遺伝子操作プラットフォームは、任意の特定の微生物または表現型形質（例えば、特定の化合物の産生）に関してとらわれない。すなわち、本明細書に教示のプラットフォームおよび方法は、任意の宿主細胞とともに利用して、任意の所望の表現型形質を有するように前記宿主細胞を操作することができる。さらに、１つの新規宿主細胞を生み出すのに使用される所与のＨＴＰ遺伝子操作プロセスから学習した教訓を、教示された方法の間に行われる無数のプロセスパラメータの記憶、特徴付け、および分析の結果として、任意の数の他の宿主細胞に適用することができる。
【０４０６】
上位性マッピングセクションにおいて言及したように、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーからの変異のコレクションをある好適な予測モデルを介して特定のバックグラウンド内に統合することによって得られる仮定の株の性能（別名スコア）を推定することが可能である。このような予測モデルを考慮すると、コンビナトリアル統合を介して変異ラブラリーにアクセス可能なすべての仮定の株をスコア付けおよびランク付けすることが可能である。以下のセクションは、本ＨＴＰプラットフォームにおいて利用される特定のモデルを概説する。
予測的株設計
【０４０７】
遺伝子変化および株性能を記述し、株内の変化の組成に基づいて株性能を予測し、高い予測された性能を有する候補設計を推奨し、予測を選別して二次の考慮事項、例えば、既存の株に対する類似度、上位性、または予測における信頼度を最適化する方法を含む、予測的株設計の手法が本明細書に記載されている。
株設計モデルへの入力
【０４０８】
一実施形態では、例示を容易にする目的で、入力データは、２つのコンポーネント：（１）遺伝子変化のセットおよび（２）相対的株性能を含み得る。当業者は、このモデルは、オーバーフィッティングの対抗する考慮事項に留意しながら、容易に拡張して多種多様な入力を考慮することができることを認識する。遺伝子変化に加えて、調整され得る入力パラメータ（独立変数）の一部は、細胞型（属、種、株、系統発生的特徴付けなど）、および発酵が細胞を用いて行われている下でのプロセスパラメータ（例えば、環境条件、装置のハンドリング、修飾技法など）である。
【０４０９】
遺伝子変化のセットは、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーと呼ばれる遺伝子撹乱の先に論じたコレクションに由来し得る。相対的株性能は、任意の所与のパラメータまたは目的の表現型形質（例えば、目的の化合物、低分子、または産物の産生）に基づいて評価することができる。
【０４１０】
細胞型は、一般的なカテゴリー、例えば、原核生物システムおよび真核生物システム、属、種、株、組織培養物（分散細胞に対して）などにおいて指定され得る。調整され得るプロセスパラメータは、温度、圧力、反応器構成、および培地組成が挙げられる。反応器構成の例には、プロセスがバッチであっても連続であっても、反応器の体積、および連続である場合、体積流量などが含まれる。もしあれば、細胞が存在する、支持構造体を指定することもできる。培地組成の例としては、電解質の濃度、栄養分、老廃物、酸、ｐＨなどが挙げられる。
予測的株設計モデルを生み出すのに次に使用される最初の線形回帰モデルにおいて利用される選択されたＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーからの遺伝子変化のセット
【０４１１】
遺伝子変化の表からのエントリーの一例示的セットを以下の表３に示す。各行は、株７００００５１４７３における遺伝子変化、および変化の機構についてのメタデータ、例えば、プロモータースワップまたはＳＮＰスワップを示す。ａｃｅＥ、ｚｗｆ、およびｐｙｃは、すべて、クエン酸サイクルに関連する。
【０４１２】
この場合、株７００００５１４７３は、合計７つの変化を有する。「最後の変化」は、この株内の変化がこの株系統における最近の修飾を表すことを意味する。よって、この株の性能をその親の性能と比較することは、「最後の変化」の変異の性能に関するデータ点を表す。
【表３】
2019162131.tif 000011
構築された株（built  strain）性能評価
【０４１３】
教示したモデルの目標は、株に導入される遺伝子変化の組成に基づいて株性能を予測することである。比較のための標準を構築するために、株性能をアッセイプレート１つ当たり、株１つ当たりの性能の中央値を最初に算出することによって一般的な参照株と比べて算出する。次いで、相対的性能を、同じプレート内の操作された株と一般的な参照株との間の平均性能の差異として計算する。プレート内の比較に算出を制限することにより、検討中の試料がすべて同じ実験条件を受けたことを保証する。
【０４１４】
図２３は、検討中の入力データについての相対的株性能の分布を示す。ゼロの相対的性能は、操作された株がプレート内基準または「参照」株と同等によく働いたことを示す。ゼロを有意に上回って働きやすい株を同定する予測モデルの能力が目的のものである。さらに、かつより一般的に、いくつかの判定基準によって任意の所与の株がその親より性能が優れているかどうかが、目的のものである。実際には、判定基準は、親レベルを超えるある閾値を満たす、または超える産物力価であり得るが、所望の方向で親からの統計的に有意な差異を有することも、代替としてまたは追加的に使用することができる。基準株または「参照」株の役割は、プレート内またはプレート間で比較を行うための付加された正規化因子として単に機能を果たすことである。
【０４１５】
留意すべき概念は、親株と参照株との間の差異のものである。親株は、現在のラウンドの変異誘発について使用したバックグラウンドである。参照株は、特にプレート間で比較を促進するためにあらゆるプレートで実行される対照株であり、典型的には、上記に言及した「基準株」である。しかし、基準株（例えば、全体的な性能をベンチマークするのに使用される野生型株または工業用株）は、所与のラウンドの株改良において変異誘発標的であるという意味において必ずしも「基準」である必要はないので、より記述的な用語は、「参照株」である。
【０４１６】
要約すると、基準／参照株は、一般に、構築された株の性能をベンチマークするのに使用され、一方、親株は、関連した遺伝的バックグラウンドにおける特異的な遺伝子変化の性能をベンチマークするのに使用される。
線形回帰を用いた構築された株の性能のランク付け
【０４１７】
開示したモデルの目標は、構築された株内に導入される遺伝子変化の組成の関数として相対的株性能を記述することによって構築された株の性能をランク付けることである。本開示全体にわたって論じられるように、様々なＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、操作された株内に導入される可能な遺伝子変化（例えば、遺伝子撹乱／変更）のレパートリーを提供する。線形回帰は、現在記載されている例示的な予測モデルの基礎である。
【０４１８】
以下の表は、回帰に基づくモデル化のための例示的な入力を含有する。株性能は、株内に含有される遺伝子変化の組成の関数として、一般的な基準株と比べてランク付けされる。
【０４１９】
各列の見出しは、遺伝子変化を表し、「１」は、変化の存在を表し、「０」は、変化の非存在を表す。「ＤＳＳ」は、特定のライブラリー（相対的性能（relative  _perf）後
の最初の３列）からのＳＮＰスワップを指す。最後の３列は、プロモータースワップであり、この場合、ｐｃｇＸＸＸＸは、特定のプロモーターを表し、最後の３文字は、プロモーターが適用されている遺伝子を表す。遺伝子は、中央代謝に関連している。プロモーターは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来である（したがって「ｃｇ」表示）。利用されるプロモーターについてのさらなる情報は、プロモーターＰ１〜Ｐ８を列挙する表１、および本願の配列表に見出すことができる。さらに、各プロモーターＰ１〜Ｐ８についての詳細な情報は、２０１５年１２月７日に出願され、「Promoters  from  Corynebacterium  glutamicum」という表題の米国仮出願第６２／２６４，２３２号に見出すことができ、これは、参照により本明細書に組み込まれている。参照の容易さのために、以下の表において、ｐｃｇ３１２１＝Ｐ８；ｐｃｇ０７５５＝Ｐ４；およびｐｃｇ１８６０＝Ｐ３である。
【表４Ａ】
2019162131.tif 000012
構築された株を特徴付けるための線形回帰
【０４２０】
線形回帰は、インプリメンテーションおよび解釈の容易さのために、記載されたＨＴＰゲノム操作プラットフォームにとって魅力的な方法である。結果として生じる回帰係数は、各遺伝子変化の存在に帰することができる相対的株性能の平均の増大または低下として解釈することができる。
【０４２１】
例えば、図２４で分かるように、本技法は、本発明者らに、ｐｇｉプロモーターをｐｃｇ３１２１に変化させると、任意の負の上位性相互作用の非存在下で、相対的株性能が平均でおよそ５ユニット改善され、よって潜在的に高度に望ましい変化であると結論付けることを可能にする（注意：入力は、無単位正規化値である）。
【０４２２】
したがって、教示した方法は、様々な教示したライブラリーからの自己のゲノム内に導入された様々な遺伝子撹乱を有する構築された株を記述し／特徴付け、ランク付けるための線形回帰モデルを使用する。
予測的設計モデル化
【０４２３】
構築した株からのデータを利用した上述した線形回帰モデルは、まだ構築されていない株についての性能予測を行うのに使用することができる。
【０４２４】
手順は、以下の通り要約することができる：遺伝子変化のすべての可能な構成をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成する、それに続き、回帰モデルを使用して相対的株性能を予測する、それに続き、性能による候補株設計を注文する。よって、未だ構築されていない株の性能を予測するための回帰モデルを利用することによって、本方法は、より少ない実験を同時に行いながらより高い性能の株の産生を可能にする。
構成の生成
【０４２５】
まだ構築されていない株の性能を予測するモデルを構築するとき、第１のステップは、設計候補の配列を生成することである。これは、株内の遺伝子変化の総数を固定し、次いで遺伝子変化のすべての可能な組合せを明確にすることによって行われる。例えば、潜在的な遺伝子変化／撹乱の総数を２９（例えば、２９の可能なＳＮＰ、もしくは２９の異なるプロモーター、または遺伝子撹乱のユニバースが２９である限り、これらの任意の組合せ）に設定し、次いで２９の潜在的な遺伝子変化のすべての可能な３メンバー組合せを設計する決定を下すことができ、３，６５４の候補株設計がもたらされる。
【０４２６】
上述の３，６５４候補株にコンテクストを提供するために、ｎ！／（（ｎ−ｒ）！＊ｒ！）を使用してｎの可能なメンバーからサイズｒの非重複グループの数を算出することができることを考慮されたい。ｒ＝３である場合、ｎ＝２９は、３，６５４を与える。よって、２９の潜在的な変化のすべての可能な３メンバー組合せを設計する場合、結果は、３，６５４候補株である。２９の潜在的な遺伝子変化は、図２５のｘ軸に存在する。
新しい株設計の性能の予測
【０４２７】
入力としてコンビナトリアル構成を用いて上で構築した線形回帰を使用して、次いで、各候補設計の予期される相対的性能を予測することができる。図２５は、上位１００の予測された株設計についての変化の組成を要約する。ｘ軸は、潜在的な遺伝子変化（２９の可能な遺伝子変化）のプールを列挙し、ｙ軸は、ランク順序を示す。黒色セルは、候補設計における特定の変化の存在を示し、一方、白色セルは、その変化の非存在を示す。この特定の例では、上位１００設計のすべては、変化ｐｃｇ３１２１＿ｐｇｉ、ｐｃｇ１８６０＿ｐｙｃ、ｄｓｓ＿３３９、およびｐｃｇ０００７＿３９＿ｌｙｓａを含有する。さらに、最上位候補設計は、変化ｄｓｓ＿０３４、ｄｓｓ＿００９を含有する。
【０４２８】
予測精度は、新しい知見がモデルを反復して保持および再フィットするにつれて経時的に増大するはずである。本発明者らによるスタディからの結果は、予測モデルを反復して保持および改善することができる方法を例示する。図４７は、モデル予測を観測された測定値と比較するものである。モデル予測の品質は、予測値と観測値との間の関連性の強度を示す相関係数、または平均モデル誤差の尺度である二乗平均平方根誤差を含めたいくつかの方法によって評価することができる。モデル評価のための選択された測定基準を使用して、システムは、モデルが保持されるべきときの規則を定義することができる。
【０４２９】
上記モデルに対して２つの述べられていない仮定は、（１）上位性相互作用が存在しないこと、および（２）予測モデルを構築する（例えば、図２４に例示された構築された株のデータ、またはモデルを構築するための参照として使用されるあらゆるデータセットから）利用される遺伝子変化／撹乱はすべて、遺伝子変化の提案された組合せとして、同じバックグラウンドにおいて作製されたこと（例えば、図２５に例示された）を含む。
二次フィーチャのフィルタリング
【０４３０】
上記実例は、予測された宿主細胞性能に基づく線形回帰予測に着目した。一部の実施形態では、本線形回帰方法は、非生体分子因子、例えば、飽和バイオマス、耐性、または他の測定可能な宿主細胞フィーチャに適用することもできる。よって、本開示の方法は、構築するための候補に優先順位を付けるとき、予測された性能以外の他のフィーチャを考慮することも教示する。追加の関連したデータが存在すると仮定して、非線形項も、回帰モデルに含められる。
既存の株との密接な関係
【０４３１】
すでに構築されたものと同様である予測された株は、最上位の予測された候補でないにもかかわらず、時間およびコスト削減をもたらすことができる。
変化の多様性
【０４３２】
上述のモデルを構築するとき、遺伝子変化は、上位性相互作用の存在に起因して真に相加的となる（線形回帰によって仮定し、上記仮定として述べた通り）と確認することができない。したがって、遺伝子変化相違点の知識は、正の相加性の見込みを増大させるのに使用することができる。例えば、上記の最上位にランク付けされた株由来の変化ｄｓｓ＿０３４およびｄｓｓ＿００９（これらはＳＮＰスワップである）が同じ代謝経路上にあり、同様の性能特性を有すると分かると、その情報を使用して、変化の同じでない組成を有する別の最上位ランクの株を選択することができる。上位性マッピングに関して上記セクションに記載した通り、予測された最良の遺伝子変化を選別して十分に同じでない応答プロファイルを有する変異に選択を制限することができる。代替として、線形回帰は、予測に重み付けするために類似度行列を使用する重み付き最小二乗回帰であり得る。
予測された性能の多様性
【０４３３】
最後に、予測モデルを検証し、引き続いて改善するために、中程度のまたは不満足な予測された性能を有する株を設計するように選択することができる。
反復株設計最適化
【０４３４】
上記例について記載したように、上位１００の株設計のすべては、変化ｐｃｇ３１２１＿ｐｇｉ、ｐｃｇ１８６０＿ｐｙｃ、ｄｓｓ＿３３９、およびｐｃｇ０００７＿３９＿ｌｙｓａを含有する。さらに、最上位の候補株設計は、変化ｄｓｓ＿０３４、ｄｓｓ＿００９を含有する。
【０４３５】
諸実施形態では、発注エンジン２０８は、最上位の候補変異を組み入れている微生物株を製造するために工場注文（factory  order）をファクトリー２１０に出す。フィードバック−ループ様式では、結果を分析装置２１４によって分析して、どの微生物が所望の表現型性質を呈するかを決定することができる（３１４）。分析フェーズ中に、修飾された株培養物が評価されて、これらの性能、すなわち、工業規模で産生される能力を含めて、これらの所望の表現型性質の発現が決定される。例えば、分析フェーズでは、とりわけ、プレートの画像データが使用されて、コロニー健康の指標として微生物コロニー増殖が測定される。分析装置２１４が使用されて、遺伝子変化が表現型性能と相関付けられ、結果として生じる遺伝子型−表現型相関データをライブラリー内に保存して（それは、ライブラリー２０６内に記憶され得る）、将来の微生物産生を知らせる。
【０４３６】
特に、十分に高い測定された性能を実際にはもたらす候補変化を、上記表４などの表にデータベース中の行として加えることができる。このようにして、最良に働く変異が、教師付き機械学習様式で予測的株設計モデルに加えられる。
【０４３７】
ＬＩＭＳは、先のファクトリーランから発生した相関に基づいて、設計／構築／試験／分析サイクルを反復する。後続のサイクル中に、分析装置２１４は、単独で、または人のオペレーターと併せて、相関データを使用して遺伝子改変を微調整することによってより微細な粒度を有するより良好な表現型性能を達成して、入力インターフェース２０２に入力して戻すための基準株としての最良候補を選択することができる。このようにして、本開示の実施形態の実験室情報管理システム（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）は、品質改善フィードバックループをインプリメントする。
【０４３８】
つまり、図３３のフロー図を参照して、反復予測的株設計ワークフローを以下の通り記述することができる。
・入出力変数、例えば、入力として遺伝子変化および出力として性能フィーチャの訓練セットを生成する（３３０２）。生成は、先の遺伝子変化およびこれらの遺伝子変化を組み入れている微生物株の対応する測定された性能に基づいて分析装置２１４によって実施することができる。
・訓練セットに基づいて初期モデル（例えば、線形回帰モデル）を開発する（３３０４）。これは、分析装置２１４によって実施することができる。
・設計候補株を生成する（３３０６）
○一実施形態では、分析装置２１４は、変化の組合せの形態でバックグラウンド株に行われる遺伝子変化の数を固定することができる。これらの変化を表すために、分析装置２１４は、インタープリター２０４に、変化のこれらの組合せを表す１つまたは複数のＤＮＡの仕様を提供することができる。（これらの遺伝子変化またはこれらの変化を組み入れる微生物株は、「試験入力」と呼ばれる場合がある）。インタープリター２０４は、１つまたは複数のＤＮＡの仕様を解釈し、エグゼキューションエンジン２０７は、ＤＮＡの仕様を実行してこれらの変化について個々の候補設計株を表す分解された出力を有するＤＮＡの仕様をポピュレートする。
・モデルに基づいて、分析装置２１４は、各候補設計株の予期される性能を予測する（３３０８）。
・分析装置２１４は、最高の予測された性能を有する限られた数の候補設計、例えば１００を選択する（３３１０）。
○上位性マッピングに関して本明細書の他の場所で記載したように、分析装置２１４は、例えば、上位性効果について上位の設計を選別し、または予測モデル内に、上位性を計算に入れることによって上位性などの二次効果について説明することができる。
・発注エンジン２０８によって作成された工場注文に基づいて選別された候補株を構築する（ファクトリー２１０で）（３３１２）。
・分析装置２１４は、選択された株の実際の性能を測定し、これらの優れた実際の性能に基づいて限られた数のこれらの選択された株を選択し（３３１４）、設計変化およびこれらの結果として生じる性能を予測モデルに加える（３３１６）。線形回帰の例において、設計変化およびこれらの関連した性能のセットを表４中の新しい行として加える。
・次いで分析装置２１４は、新しい設計候補株の生成に戻って反復し（３３０６）、停止条件が満たされるまで反復し続ける。停止条件は、例えば、性能測定基準、例えば、収率、増殖速度、または力価を満たす少なくとも１つの微生物株の測定された性能を含み得る。
【０４３９】
上記例では、株設計の反復最適化は、フィードバックおよび線形回帰を使用して機械学習をインプリメントする。一般に、機械学習は、限られた数の標識データの例を使用し、次いで未知のデータに対して同じタスクを実施して、情報タスク（分類または回帰など）の性能における性能判定基準、例えば、パラメータ、技法、または他のフィーチャの最適化として記述することができる。上記線形回帰の例のものなどの教師付き機械学習では、機械（例えば、演算デバイス）は、例えば、訓練データが呈するパターン、カテゴリー、統計的関係、または他の属性を同定することによって学習する。次いで学習の結果が使用されて、新しいデータが、同じパターン、カテゴリー、統計的関係、または他の属性を呈するかどうかが予測される。
【０４４０】
本開示の実施形態は、訓練データが入手可能であるとき、他の教師付き機械学習技法を使用することができる。訓練データの非存在下で、諸実施形態では、教師なし機械学習が使用される場合がある。代替として、諸実施形態では、少量の標識データおよび大量の未標識データを使用して、半教師付き機械学習が使用され得る。諸実施形態では、フィーチャ選択が使用されて最も関連したフィーチャのサブセットが選択されることによって機械学習モデルの性能が最適化される場合もある。選択される機械学習手法のタイプに応じて、線形回帰の代替として、またはそれに加えて、諸実施形態では、例えば、ロジスティック回帰、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、デシジョンツリー、隠れマルコフモデル、ベイジアンネットワーク、グラムシュミット、強化ベースの学習、階層的クラスタリングを含めたクラスターに基づく学習、遺伝的アルゴリズム、および当技術分野で公知の任意の他の適当な学習機械が使用され得る。特に、諸実施形態では、ロジスティック回帰が使用されて分類自体とともに分類（例えば、異なる機能群への遺伝子の分類）の確率が提供され得る。例えば、Shevade、A  simple  and  efficient  algorithm  for  gene  selection  using  sparse  logistic  regression、Bioinformatics、１９巻、１７号、２００３年、２２４６〜２２５３頁、Lengら、Classification  using  functional  data  analysis  for  temporal  gene  expression  data、Bioinformatics、２２巻、１号、Oxford  University  Press（２００６年）、６８〜７６頁を参
照。これらのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０４４１】
諸実施形態では、グラフィックスプロセシングユニット（ＧＰＵ）加速アーキテクチャが使用される場合があり、これは、特に、ディープニューラルネットワーク（ＤＮＮ）として公知の形態で、機械学習タスクの実施において評判が増大していることが見出されている。本開示の実施形態では、ＧＰＵに基づく機械学習、例えば、GPU-Based  Deep  Learning  Inference:  A  Performance  and  Power  Analysis、NVidia  Whitepaper、２
０１５年１１月、Dahlら、Multi-task  Neural  Networks  for  QSAR  Predictions、コンピューターサイエンス学科、トロント大学、２０１４年６月（arXiv:1406.1231  [stat.ML]）に記載されているものが使用され得る。これらの文献のすべては、本明細書にその全体が参照により組み込まれている。本開示の実施形態に適用可能な機械学習技法は、他の参考文献の中でも、Libbrechtら、Machine  learning  applications  in  genetics  and  genomics、Nature  Reviews:  Genetics、１６巻、２０１５年６月、Kashyapら、Big  Data  Analytics  in  Bioinformatics:  A  Machine  Learning  Perspective、Journal  of  Latex  Class  Files、１３巻、９号、２０１４年９月、Prompramoteら、Machine  Learning  in  Bioinformatics、Bioinformatics  Technologiesの第５章、１１７〜１５３頁、Springer  Berlin  Heidelberg、２００５年にも見出すことができ、これらのすべては、本明細書にその全体が参照により組み込まれている。
反復予測的株設計：例
【０４４２】
以下は、上記に概説した反復予測的株設計ワークフローの例示的用途を提供するものである。
【０４４３】
訓練入力変数および出力変数の初期セットを調製した。このセットは、確定した遺伝子組成を有する１８６４のユニークな操作された株を含んでいた。各株は、５から１５の間の操作された変化を含有していた。合計３３６のユニークな遺伝子変化が該訓練に存在した。
【０４４４】
初期の予測コンピューターモデルを開発した。インプリメンテーションは、一般化線形モデル（４次多項式カーネルを用いたカーネルリッジ回帰）を使用した。インプリメンテーションは、２つの個別の表現型（収率および生産性）をモデル化する。これらの表現型を、以下に示す通り、加重和として組み合わせてランク付けのための単一スコアを得た。様々なモデルパラメータ、例えば、正則化係数を、指定された訓練データに対してｋ倍交差検証を介してチューニングした。
【０４４５】
インプリメンテーションは、上記上位性マッピングセクションに記載した相互作用効果のいずれの明確な分析も組み入れない。しかし、当業者が理解するはずであるように、インプリメントされる一般化線形モデルは、カーネルの２、３、および４次項を通じて暗黙的に相互作用効果を捕捉することができる。
【０４４６】
モデルを訓練セットに対して訓練した。フィットされたモデルは、収率に関して０．５２のＲ２値（決定の係数）および生産性に関して０．６７のＲ２値を有する。図４７は、収率モデルの訓練データへの有意な品質フィッティングを実証する。
【０４４７】
候補株を生成した。本例は、親株への新しい遺伝子変化の導入に関連した連続構築制約（serial  build  constraint）を含む（本例では、ただ１つの新しい変異を操作して同
時に株内に入れた）。ここでは、候補は、所望の数の変化の関数として単に見なされない。代わりに、分析装置２１４は、出発点として、高性能測定基準を有すると分かっている先に設計された株（「シード株」）のコレクションを選択した。分析装置２１４は個々に、遺伝子変化をシード株のそれぞれに適用した。導入された遺伝子変化は、シード株内に既に存在するものを含まなかった。様々な技術的、生物学的、または他の理由で、ある特定の変異、例えば、ｏｐｃａ＿４が明示的に要求され、または例えば、ｄｓｓ＿４２２が明示的に除外された。１６６の入手可能なシード株およびモデルによって特徴付けられた３３６の変化を使用して、６２３９の新規候補株を設計した。
【０４４８】
モデルに基づいて、分析装置２１４は、候補株設計の性能を予測した。分析装置２１４は、目的の２つの表現型（収率および生産性）に関する予測された性能に基づいて「最良」から「最悪」に候補をランク付けた。具体的には、分析装置２１４は、加重和を使用して候補株をスコア付けした：
【０４４９】
スコア＝０．８＊ｙｉｅｌｄ／ｍａｘ（ｙｉｅｌｄｓ）＋０．２＊ｐｒｏｄ／ｍａｘ（ｐｒｏｄｓ）、
式中、ｙｉｅｌｄは、候補株について予測された収率を表し、
ｍａｘ（ｙｉｅｌｄｓ）は、すべての候補株に対する最大収率を表し、
ｐｒｏｄは、候補株についての生産性を表し、
ｍａｘ（ｐｒｏｄｓ）は、すべての候補株に対する最大収率を表す。
【０４５０】
分析装置２１４は、能力の制約およびオペレーションの制約の両方を課すことによって候補のランク付けされたリストから推奨の最終セットを生成した。本例では、能力限界は、４８のコンピューター生成候補設計株で設定した。オペレーションの制約に起因して、本例では、ただ１つのシード株を９６ウェルプレートの１列当たりに使用した。これは、シード株を選択した後、その株に対して最大で８つの変化を構築することができたが、わずか６のシード株しか任意の所与の週内に選択することができなかったことを意味する。
【０４５１】
訓練されたモデル（上述した）を使用して各候補株の予期される性能（収率および生産性についての）を予測した。分析装置２１４は、上記に与えたスコア付関数を使用して候補株をランク付けた。能力およびオペレーションの制約を適用して４８の候補株の選別されたセットを得た。選別された候補株のこのセットを図４８に表す。
【０４５２】
選別された候補株を、発注エンジン２０８が作成した工場注文に基づいて構築した（ファクトリー２１０において）（３３１２）。注文は、候補株に対応するＤＮＡの仕様に基づいた。
【０４５３】
実際には、ビルドプロセスは、予期された失敗率を有し、それによって株のランダムセットを構築しない。このビルドサイクルについて、候補株のおおよそ２０％が構築するのに失敗し、３７の構築された株（built  strain）をもたらした。
【０４５４】
分析装置２１４を使用して選択された株の実際の収率および生産性性能を測定した。分析装置２１４は、３つの判定基準：モデル精度；株性能の改善；および人間の専門家が作成した設計との同等性（または改善）に基づいてモデルおよび推奨株を評価した。
【０４５５】
収率および生産性表現型を、推奨株について測定し、モデルが予測した値と比較した。図４９に示した通り、モデルは、有用な予測的有用性を実証する。特に、推奨株について予測された収率値は、対応する観察結果と０．５９のピアソン−ｒ相関係数を有する。
【０４５６】
次に、分析装置２１４は、推奨株のそれぞれの親株からのパーセンテージ性能変化を計算した。このデータを図５０に（薄灰色で）示す。本発明者らは、予測された株の多くが、実際には、これらの直接の親に対して予期された性能獲得を呈することを見出した。特に、最良の予測された株は、その直接の親に対して６％の収率の改善を示した。
【０４５７】
上述したモデルに基づく株設計プロセスと並行して、４８の株のコレクションを、人間の専門家が独立に設計した。これらの株のうち、３７を順調に構築し、試験した。このデータは、モデルに基づく株設計が、人間の専門家が設計した株と同等に働くことを実証した。これらの専門家は、本発明の譲受人が雇用した、または別段に従事させている本開示の実施形態に精通している高度に熟練した（例えば、Ｐｈ．Ｄ．レベル）科学者である。２つの方法を比較するために、本発明者らは、各群の性能分布を最初に検査した（図５１）。この実験では、モデルに基づく株の平均収率は、人間の専門家が作成した設計に対して１％の増大を示した。
【０４５８】
次いで本発明者らは、バックグラウンドによってグループ化された人間の専門家が設計した、およびコンピューターモデルが設計した株、すなわち、同じ親をもつ新しい株を比較した（図５２）。やはり、本発明者らは、コンピューターが作成した設計は、人間の専門家が作成した設計と同等に、かつ一部の場合では、それより良好に働き、さらに、より少ないばらつきを生じる傾向があることを見出した。最後に、本発明者らは、人間の専門家およびモデルが設計した株の親株に対する変化率を比較した（図５０）。やはり、これらの集団は、同等の獲得を示した。
【０４５９】
表にした要約統計については表４．１を参照。
【０４６０】
【表４Ｂ】
2019162131.tif 000013
【０４６１】
予測、それに続く構築、それに続く試験サイクルの各ラウンドの最後に、本発明者らは、モデル予測の品質の評価および新しいデータの先のモデルへの反復組み入れに興味を持った。前者、モデル評価について、本発明者らは、モデル予測を実験的測定値と比較することによって予測精度を測定することに着目した。予測精度は、予測値と観測値との間の関連性の強度を示す相関係数、または平均モデル誤差の尺度である二乗平均平方根誤差を含めたいくつかの方法によって評価することができる。
【０４６２】
実験の多くのラウンドにわたって、モデル予測がずれる場合があり、新しい遺伝子変化を訓練入力に加えて予測精度を改善することができる。本例に関して、設計変化およびこれらの結果として生じる性能を予測モデルに加えた（３３１６）。
サービスとしてのゲノム設計および操作
【０４６３】
本開示の実施形態では、図３１のＬＩＭＳシステムソフトウェア３２１０を、図３２のクラウドコンピューティングシステム３２０２において実装して、複数のユーザーが本開示の実施形態によって微生物株を設計および構築するのを可能にすることができる。図３２は、本開示の実施形態によるクラウドコンピューティング環境３２０４を例示する。図３４に例示したものなどのクライアントコンピューター３２０６は、インターネットなどのネットワーク３２０８を介してＬＩＭＳシステムにアクセスする。諸実施形態では、ＬＩＭＳシステムアプリケーションソフトウェア３２１０は、クラウドコンピューティングシステム３２０２内に存在する。ＬＩＭＳシステムは、図３４に例示したタイプの１つまたは複数のプロセッサーを使用して１つまたは複数のコンピューターシステムを使用することができる。クラウドコンピューティングシステム自体は、ネットワーク３２０８を介してＬＩＭＳシステムアプリケーション３２１０をクライアントコンピューター３２０６にインターフェースをとるためのネットワークインターフェース３２１２を含む。ネットワークインターフェース３２１２は、アプリケーションプログラミングインターフェース（ＡＰＩ）を含むことによって、クライアントコンピューター３２０６におけるクライアントアプリケーションがＬＩＭＳシステムソフトウェア３２１０にアクセスするのを可能にすることができる。特に、ＡＰＩを通じて、クライアントコンピューター３２０６は、限定することなく、入力インターフェース２０２、インタープリター２０４、エグゼキューションエンジン２０７、発注エンジン２０８、ファクトリー２１０をランさせるソフトウェア、ならびに試験装置２１２および分析装置２１４を含めたＬＩＭＳシステム２００のコンポーネントにアクセスすることができる。サービス型ソフトウェア（ＳａａＳ）のソフトウェアモジュール３２１４は、クライアントコンピューター３２０６へのサービス型ＬＩＭＳシステムソフトウェア３２１０を提供する。クラウド管理モジュール３２１６は、クライアントコンピューター３２０６によるＬＩＭＳシステム３２１０へのアクセスを管理する。クラウド管理モジュール３２１６は、マルチテナントアプリケーションを使用するクラウドアーキテクチャ、当技術分野で公知の仮想化または他のアーキテクチャが、複数のユーザーにサービスすることを可能にし得る。
ゲノム自動化
【０４６４】
本開示の方法を自動化すると、同時に複数の試験株バリアントからの標的産物のハイスループット表現型スクリーニングおよび同定が可能になる。
【０４６５】
上述のゲノム操作予測モデルリングプラットフォームは、数百および数千の変異体株がハイスループット様式で構築される事実を前提としている。以下に記載のロボットシステムおよびコンピューターシステムは、このようなハイスループットプロセスを実行することができる構造機構である。
【０４６６】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞生産性を改善し、または工業用株を再建する方法を教示する。このプロセスの一部として、本開示は、ＤＮＡをアセンブルし、新しい株を構築し、プレート中の培養物をスクリーニングし、タンク発酵のモデルにおける培養物をスクリーニングする方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、新しい宿主株を創製および試験する上述の方法の１つまたは複数は、自動化ロボットによって助けられることを教示する。
【０４６７】
一部の実施形態では、本開示は、図６に表したハイスループット株操作プラットフォームを教示する。
ＨＴＰロボットシステム
【０４６８】
一部の実施形態では、本開示の自動化された方法は、ロボットシステムを含む。本明細書に概説したシステムは一般に、９６−または３８４−ウェルマイクロタイタープレートの使用を対象とするが、当業者が十分に理解するように、任意の数の異なるプレートまたは構成を使用することができる。さらに、本明細書に概説したステップのいずれか、またはすべてを自動化することができ、よって例えば、システムは、完全または部分的に自動化され得る。
【０４６９】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、１つまたは複数の作業モジュールを含む。例えば、一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、ＤＮＡ合成モジュール、ベクタークローニングモジュール、株形質転換モジュール、スクリーニングモジュール、およびシーケンシングモジュールを含む（図７を参照）。
【０４７０】
当業者が十分に理解するとおり、自動化システムは、これらに限定されないが、液体ハンドラー；１つまたは複数のロボットアーム；マイクロプレートを適所配置するためのプレートハンドラー；プレートシーラー、プレートピアサー、非交差汚染プレート上のウェルの蓋を除去および交換するための自動化蓋ハンドラー；使い捨てチップを用いて試料分配するための使い捨てチップアセンブリー；試料分配のための洗浄可能なチップアセンブリー；９６ウェルローディングブロック；一体型サーマルサイクラー；冷却された試薬ラック；マイクロタイタープレートピペットポジション（任意選択で冷却された）；プレートおよびチップのためのスタッキングタワー；磁気ビーズ処理ステーション；濾過システム；プレートシェーカー；バーコードリーダーおよびアプリケーター；ならびにコンピューターシステムを含めた多種多様なコンポーネントを含み得る。
【０４７１】
一部の実施形態では、本開示のロボットシステムは、ハイスループットピペット操作を可能にして遺伝子標的化および組換え用途のプロセスにおけるすべてのステップを実施する自動化液体および粒子ハンドリングを含む。これは、液体および粒子マニピュレーション、例えば、吸引、分注、混合、希釈、洗浄、正確な容量移送；ピペットチップの取戻しおよび廃棄；ならびに単一試料吸引からの複数の送達についての同一体積の繰り返しピペット操作などを含む。これらのマニピュレーションは、交差汚染のない液体、粒子、細胞、および生物体移送である。機器は、フィルター、膜、および／または娘プレートへのマイクロプレート試料の自動化複製、高密度移送、フルプレート連続希釈、ならびに大容量オペレーションを遂行する。
【０４７２】
一部の実施形態では、本開示の特注自動化液体ハンドリングシステムは、ＴＥＣＡＮ機械（例えば、特注ＴＥＣＡＮ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｅｖｏ）である。
【０４７３】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、マルチウェルプレート、ディープウェルプレート、スクウェアウェルプレート、試薬トラフ、試験管、ミニチューブ、マイクロチューブ、クライオバイアル、フィルター、マイクロアレイチップ、光ファイバー、ビーズ、アガロースゲルおよびアクリルアミドゲルのためのプラットフォームに適合し、他の固相マトリックスまたはプラットフォームは、アップグレード可能なモジュラーデッキ上に収容されている。一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、ソースおよび産出試料、試薬、試料および試薬希釈、アッセイプレート、試料および試薬リザーバー、ピペットチップ、ならびにアクティブチップ洗浄ステーションを配置するための多位置作業面のための少なくとも１つのモジュラーデッキを含有する。
【０４７４】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、ハイスループット電気穿孔システムを含む。一部の実施形態では、ハイープット電気穿孔システムは、９６または３８４−ウェルプレート内で細胞を形質転換することができる。一部の実施形態では、ハイスループット電気穿孔システムとしては、ＶＷＲ（登録商標）ハイスループット電気穿孔システム、ＢＴＸ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＭＸｃｅｌｌ（商標）、または他のマルチウェル電気穿孔システムが挙げられる。
【０４７５】
一部の実施形態では、一体型サーマルサイクラーおよび／または温度調節器が、制御ブロックまたはプラットフォームなどの熱交換器の温度を安定化させるのに使用されて、０℃〜１００℃に試料をインキュベートする正確な温度制御をもたらす。
【０４７６】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、液体、粒子、細胞、および多細胞生物をロボット制御でマニピュレートすることができる、単一もしくは複数の磁気プローブ、親和性プローブ、レプリケーター、またはピペッタを有する交換可能なマシンヘッド（単一またはマルチチャネル）に適合する。マルチウェルまたはマルチチューブ磁気分離器および濾過ステーションは、単一または複数の試料フォーマットにおいて液体、粒子、細胞、および生物体をマニピュレートする。
【０４７７】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、カメラビジョンおよび／または分光計システムに適合する。よって、一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、進行中の細胞培養における色および吸収の変化を検出およびロギングすることができる。
【０４７８】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、複数のハードウェアアドオンに柔軟であり、適応できることによって、システムが複数のアプリケーションを実行することを可能にするように設計される。ソフトウェアプログラムモジュールは、方法の創製、改変、および試行を可能にする。システムの診断モジュールは、セットアップ、機器整列、およびモータ動作を可能にする。特注のツール、実験機器、ならびに液体および粒子移送パターンは、異なるアプリケーションをプログラムおよび実施することを可能にする。データベースは、方法およびパラメータ記憶を可能にする。ロボットインターフェースおよびコンピューターインターフェースは、機器間の通信を可能にする。
【０４７９】
よって、一部の実施形態では、本開示は、図２６に表したハイスループット株操作プラットフォームを教示する。
【０４８０】
当業者は、本開示のＨＴＰ操作方法を実行することができる様々なロボットプラットフォームを認識する。以下の表５は、図２６に記載した本開示のＨＴＰ操作ステップの各ステップを実行することができる科学的装置の非排他的リストを提供する。
【表５Ａ−１】
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【表５Ａ−２】
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【表５Ａ−３】
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【表５Ａ−４】
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【表５Ａ−５】
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【表５Ａ−６】
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【表５Ａ−７】
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コンピューターシステムハードウェア
【０４８１】
図３４は、本開示の実施形態による非一時的コンピューター可読媒体（例えば、メモリー）内に記憶されたプログラムコードを実行するのに使用され得るコンピューターシステム８００の一例を例示する。コンピューターシステムは、入力／出力サブシステム８０２を含み、これは、アプリケーションに応じて人間のユーザーおよび／または他のコンピューターシステムとインターフェースで接続するのに使用することができる。Ｉ／Ｏサブシステム８０２は、例えば、キーボード、マウス、グラフィカルユーザーインターフェース、タッチスクリーン、または入力のための他のインターフェース、および例えば、ＬＥＤもしくは他のフラットスクリーンディスプレイ、あるいはアプリケーションプログラムインターフェース（ＡＰＩ）を含めた出力のための他のインターフェースを含み得る。ＬＩＭＳシステムのコンポーネントなどの本開示の実施形態の他のエレメントは、コンピューターシステム８００のもののようなコンピューターシステムで実装することができる。
【０４８２】
プログラムコードは、二次メモリー８１０もしくはメインメモリー８０８または両方内の永続記憶装置などの非一時的媒体内に記憶することができる。メインメモリー８０８として、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）などの揮発性メモリー、またはリードオンリーメモリー（ＲＯＭ）などの不揮発性メモリー、ならびに指示およびデータにより速くアクセスするための異なるレベルのキャッシュメモリーを挙げることができる。二次メモリーとして、永続記憶装置、例えば、ソリッドステートドライブ、ハードディスクドライブ、または光ディスクなどを挙げることができる。１つまたは複数のプロセッサー８０４は、１つまたは複数の非一時的媒体からのプログラムコードを読み込み、コードを実行してコンピューターシステムが本明細書の実施形態によって実施される方法をなしとげることを可能にする。当業者は、プロセッサー（複数可）は、ソースコードを取り込み、ソースコードを解釈またはコンパイルして、プロセッサー（複数可）８０４のハードウェアゲートレベルで理解可能であるマシンコードにすることができることを理解する。プロセッサー（複数可）８０４は、計算集約型タスクを扱うためのグラフィックスプロセシングユニット（ＧＰＵ）を含み得る。特に、機械学習では、１つまたは複数のＣＰＵ  ８０４は、大量のデータの処理を１つまたは複数のＧＰＵ  ８０４にオフロードすることができる。
【０４８３】
プロセッサー（複数可）８０４は、１つまたは複数の通信インターフェース８０７、例えば、ネットワークインターフェースカード、ＷｉＦｉトランシーバーなどを介して外部ネットワークと通信することができる。バス８０５は、Ｉ／Ｏサブシステム８０２、プロセッサー（複数可）８０４、周辺デバイス８０６、通信インターフェース８０７、メモリー８０８、および永続記憶装置８１０を通信可能にカップルする。本開示の実施形態は、この代表的なアーキテクチャに限定されない。代替の実施形態は、異なる配置およびタイプのコンポーネント、例えば、入出力コンポーネントおよびメモリーサブシステムのための別個のバスを使用することができる。
【０４８４】
当業者は、本開示の実施形態のエレメントの一部またはすべて、およびこれらの付随するオペレーションは、コンピューターシステム８００のもののような１つまたは複数のプロセッサーおよび１つまたは複数のメモリーシステムを含む１つまたは複数のコンピューターシステムによって完全または部分的にインプリメントされ得ることを理解する。特に、本明細書に記載のＬＩＭＳシステム２００ならびに任意のロボットおよび他の自動化システムまたはデバイスのエレメントは、コンピューター実装することができる。一部のエレメントおよび機能性は、ローカルにインプリメントすることができ、他のものは、例えば、異なるサーバーを通じたネットワークにわたって分散様式で、例えば、クライアント−サーバー様式でインプリメントすることができる。特に、図３２に示したように、サーバーサイドオペレーションを、サービス型ソフトウェア（ＳａａＳ）様式で複数のクライアントに利用可能にすることができる。
【０４８５】
本文脈における用語のコンポーネントは、ソフトウェア、ハードウェア、もしくはファームウェア（またはこれらの任意の組合せ）コンポーネントを広く指す。コンポーネントは、典型的には、指定された入力（複数可）を使用して有用なデータまたは他の出力を生成することができる機能コンポーネントである。コンポーネントは、自己充足型であってもよく、または自己充足型でなくてもよい。アプリケーションプログラム（「アプリケーション」とも呼ばれる）は、１つもしくは複数のコンポーネントを含み得、またはコンポーネントは、１つもしくは複数のアプリケーションプログラムを含むことができる。
【０４８６】
一部の実施形態は、他のモジュールまたはアプリケーションコンポーネントとともにコンポーネントの一部、すべてを含み、またはどれも含まない。なおさらに、様々な実施形態は、これらのコンポーネントの２つもしくはそれ超を単一モジュール内に組み入れ、かつ／またはこれらのコンポーネントの１つもしくは複数の機能性の一部を異なるコンポーネントと結びつけることができる。
【０４８７】
用語「メモリー」は、情報を記憶させるのに使用される任意のデバイスまたは機構であり得る。本開示の一部の実施形態によれば、メモリーは、これらに限定されないが、揮発性メモリー、不揮発性メモリー、およびダイナミックメモリーの任意のタイプを包含するように意図されている。例えば、メモリーは、ランダムアクセスメモリー、メモリー記憶デバイス、光学メモリーデバイス、磁気媒体、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、ハードドライブ、ＳＩＭＭ、ＳＤＲＡＭ、ＤＩＭＭ、ＲＤＲＡＭ、ＤＤＲ  ＲＡＭ、ＳＯＤＩＭＭＳ、消去可能プログラム可能リードオンリーメモリー（ＥＰＲＯＭ）、電気的消去可能プログラム可能リードオンリーメモリー（ＥＥＰＲＯＭ）、コンパクトディスク、ＤＶＤなどであり得る。一部の実施形態によれば、メモリーは、１つまたは複数のディスクドライブ、フラッシュドライブ、データベース、ローカルキャッシュメモリー、プロセッサーキャッシュメモリー、リレーショナルデータベース、フラットデータベース、サーバー、クラウドベースプラットフォームなどを含み得る。さらに、当業者は、情報を記憶するための多くの追加のデバイスおよび技法をメモリーとして使用することができることを十分に理解する。
【０４８８】
メモリーは、プロセッサー上の１つまたは複数のアプリケーションまたはモジュールをランさせるための指示を記憶させるのに使用され得る。例えば、メモリーは、一部の実施形態では、本願に開示のモジュールおよび／またはアプリケーションの１つまたは複数の機能性を実行するのに必要な指示のすべてまたは一部を収納するのに使用することができる。
遺伝子設計予測に基づくＨＴＰ微生物株操作：例示的なワークフロー
【０４８９】
一部の実施形態では、本開示は、本開示のコンピューター分析システムの推奨に基づく新しい宿主生物の指向操作を教示する。
【０４９０】
一部の実施形態では、本開示は、すべての遺伝子設計およびクローニング方法に適合する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、伝統的なクローニング技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、制限酵素消化、ライゲーション、相同組換え、ＲＴ  ＰＣＲ、および当技術分野で一般に公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Sambrookら（２００１年）、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual（３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Plainview、New  York）に開示されているその他
のものなどの使用を教示する。
【０４９１】
一部の実施形態では、クローン化された配列は、本明細書に教示のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーのいずれか由来の可能なもの、例えば、プロモータースワップライブラリー由来のプロモーター、ＳＮＰスワップライブラリー由来のＳＮＰ、開始コドンもしくは停止コドン交換ライブラリー由来の開始コドンもしくは停止コドン、ＳＴＯＰスワップライブラリー由来のターミネーター、または配列最適化ライブラリー由来の配列最適化を含み得る。
【０４９２】
さらに、特定の構築物内に含まれるべき正確な配列組合せは、上位性マッピング機能によって知らされ得る。
【０４９３】
他の実施形態では、クローン化された配列は、合理的な設計（仮説主導型）に基づく配列および／または科学刊行物などの他のソースに基づく配列も含むことができる。
【０４９４】
一部の実施形態では、本開示は、ｉ）カスタムメイドＳＮＰ特異的ＤＮＡを生成するステップと、ｉｉ）ＳＮＰ特異的プラスミドをアセンブルするステップと、ｉｉｉ）ＳＮＰ特異的ＤＮＡで標的宿主細胞を形質転換するステップと、ｉｖ）任意の選択マーカーをループアウトさせるステップとを含む、指向操作の方法を教示する（図２を参照）。
【０４９５】
図６Ａは、ＤＮＡを取得およびアセンブルステップと、ベクターをアセンブルするステップと、宿主細胞を形質転換するステップと、選択マーカーを除去するステップとを含む、本開示の株操作法の一般的なワークフローを表す。
特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを構築する
【０４９６】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞生物体のＤＮＡセグメントを挿入することおよび／または置き換えることおよび／または変更することおよび／または欠失させることを教示する。一部の態様では、本明細書に教示の方法は、宿主生物のゲノム内に組み入れる目的のオリゴヌクレオチド（すなわち、標的ＤＮＡセグメント）を構築することを伴う。一部の実施形態では、本開示の標的ＤＮＡセグメントは、公知の鋳型からのコピーもしくはカット、変異、またはＤＮＡ合成を含む、当技術分野で公知の任意の方法を介して得ることができる。一部の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ配列を生成するための市販の遺伝子合成産物（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）、ＧｅｎｅＭａｋｅｒ（商標）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）、Ａｎａｇｅｎ（商標）、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ（商標）、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（商標）、ＧｅＮＯｓｙｓ，Ｉｎｃ．、またはＱｉａｇｅｎ（商標））に適合する。
【０４９７】
一部の実施形態では、標的ＤＮＡセグメントは、宿主生物の選択されたＤＮＡ領域内にＳＮＰを組み入れる（例えば、有益なＳＮＰを付加する）ように設計されている。他の実施形態では、ＤＮＡセグメントは、宿主生物のＤＮＡからＳＮＰを除去する（例えば、有害なまたは中立のＳＮＰを除去する）ように設計されている。
【０４９８】
一部の実施形態では、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の酵素合成または化学合成の方法のいずれかを使用して合成することができる。オリゴヌクレオチドは、固体支持体、例えば、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレンビーズ、またはＣＰＧを含有し得る熱可塑性ポリマーから構成される膜上で合成することができる。オリゴヌクレオチドは、アレイ上で、マイクロフルイディクスを使用して並列のマイクロスケールで（Tianら、Mol.  BioSyst.、５巻、７１４〜７２２頁（２００９年））、または両方の組合せを提供する公知の技術で（Jacobsenら、米国特許出願第２０１１／０１７２１２７号を参照）合成することもできる。
【０４９９】
アレイ上の、またはマイクロフルイディクスによる合成は、より低い試薬使用を通じてコストを低減することによって、慣例的な固体支持体合成に対して利点を提供する。遺伝子合成に要求される規模は低く、したがって、アレイから、またはマイクロフルイディクスを通じて合成されるオリゴヌクレオチド産物の規模は、許容される。しかし、合成されるオリゴヌクレオチドは、固体支持体合成を使用するときより低い品質のものである（Tian、以下を参照；Staehlerら、米国特許出願第２０１０／０２１６６４８号も参照）。
【０５００】
多数の進歩が、それが１９８０年代に最初に記載されて以来、伝統的な４ステップホスホラミダイト化学において達成されている（例えば、ペルオキシアニオンの脱保護を使用するSierzchalaら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１２５巻、１３４２７〜１３４４１頁（２００３年）；代替の保護基についてHayakawaら、米国特許第６，０４０，４３９号；ユニバーサル支持体についてAzhayevら、Tetrahedron、５７巻、４９７７〜４９８６頁（２００１年）；大孔ＣＰＧの使用によるより長いオリゴヌクレオチドの改善された合成についてKozlovら、Nucleosides,  Nucleotides,  and  Nucleic  Acids、２４巻（５〜７号）、
１０３７〜１０４１頁（２００５年）；および改善された誘導体化についてDamhaら、NAR、１８巻、３８１３〜３８２１頁（１９９０年）を参照）。
【０５０１】
合成のタイプにかかわらず、次いで結果として生じるオリゴヌクレオチドは、より長いオリゴヌクレオチドのためのより小さいビルディングブロックを形成することができる。一部の実施形態では、より小さいオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知のプロトコール、例えば、ポリメラーゼ鎖アセンブリー（ＰＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および熱力学的にバランスの取れたインサイドアウト合成（thermodynamically  balanced
inside-out  synthesis）（ＴＢＩＯ）を使用して一緒に繋ぐことができる（Czarら、Trends  in  Biotechnology、２７巻、６３〜７１頁（２００９年）を参照）。ＰＣＡでは、所望のより長い産物の全長にまたがるオリゴヌクレオチドが、複数のサイクル（典型的には約５５サイクル）においてアニールおよび伸長されて完全長産物を最終的に達成する。ＬＣＲは、リガーゼ酵素を使用して２つのオリゴヌクレオチドを繋ぎ、これらはともにアニールされて第３のオリゴヌクレオチドになる。ＴＢＩＯ合成は、所望の産物の中心から開始し、遺伝子の５’末端における順方向鎖と、かつ遺伝子の３’末端における逆方向鎖と相同である重複オリゴヌクレオチドを使用することによって両方向で漸次伸長される。
【０５０２】
より大きい二本鎖ＤＮＡ断片を合成する別の方法は、トップストランドＰＣＲ（ＴＳＰ）によってより小さいオリゴヌクレオチドを組み合わせることである。本方法では、複数のオリゴヌクレオチドが所望の産物の全長にわたり、隣接するオリゴヌクレオチド（複数可）に対して重複領域を含有する。増幅は、ユニバーサル順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いて、かつ複数のサイクルの増幅を介して実施することができ、全長の二本鎖ＤＮＡ産物が形成される。次いでこの産物は、任意選択の誤差補正およびさらなる増幅を受けることができ、それにより、所望の二本鎖ＤＮＡ断片最終産物がもたらされる。
【０５０３】
ＴＳＰの一方法では、全長の所望の産物を形成するのに組み合わされるより小さいオリゴヌクレオチドのセットは、４０〜２００塩基の間の長さであり、互いに少なくとも約１５〜２０塩基重複する。実用的な目的のために、重複領域は、オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングを保証するために最低でも十分長く、使用される反応温度でアニールするために十分高い融解温度（Ｔｍ）を有するべきである。重複は、所与のオリゴヌクレオチドが隣接するオリゴヌクレオチドによって完全に重複されるポイントまで伸長することができる。重複の量は、最終産物の品質に対していずれの効果も有さないようである。アセンブリー内の最初および最後のオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、順方向および逆方向の増幅プライマーのための結合部位を含有するべきである。一実施形態では、最初および最後のオリゴヌクレオチドの末端側終端配列は、同じ相補性を有する配列を含有してユニバーサルプライマーの使用を可能にする。
特注プラスミドアセンブリング／クローニング
【０５０４】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物のゲノム内に所望の標的ＤＮＡ切片（例えば、特定のＳＮＰを含有する）を挿入することができるベクターを構築するための方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ、相同アーム、および少なくとも１つの選択マーカーを含むベクターをクローニングする方法を教示する（図３を参照）。
【０５０５】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物内への形質転換に適した任意のベクターに適合する。一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞に適合するシャトルベクターの使用を教示する。一実施形態では、本明細書に提供される方法において使用するためのシャトルベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主細胞に適合するシャトルベクターである。本明細書に提供される方法において使用するためのシャトルベクターは、本明細書に記載の選択および／または対抗選択のためのマーカーを含み得る。マーカーは、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意のマーカーであり得る。シャトルベクターは、任意の調節配列（複数可）および／または当技術分野で公知の前記シャトルベクターのアセンブリーにおいて有用な配列をさらに含み得る。シャトルベクターは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなど本明細書に提供される宿主細胞内での繁殖に必要とされ得る任意の複製起点をさらに含むことができる。調節配列は、当技術分野で公知の、または本明細書に提供される任意の調節配列、例えば、宿主細胞の遺伝機構によって使用される、プロモーター、開始、停止、シグナル、分泌、および／または終結配列などであり得る。ある特定の事例では、標的ＤＮＡは、任意のリポジトリまたはカタログ製品から入手可能なベクター、コンストラクト、またはプラスミド、例えば、市販のベクター（例えば、ＤＮＡ２．０特注またはＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクターを参照）内に挿入することができる。ある特定の事例では、標的ＤＮＡは、任意のリポジトリまたはカタログ製品から入手可能なベクター、コンストラクト、またはプラスミド、例えば、市販のベクター（例えば、ＤＮＡ２．０特注またはＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクターを参照）内に挿入することができる。
【０５０６】
一部の実施形態では、本開示のアセンブリー／クローニング方法は、以下のアセンブリーストラテジー：ｉ）ＩＩ型慣習的クローニング、ｉｉ）ＩＩ  Ｓ型媒介または「ゴールデンゲート」クローニング（例えば、Engler,  C.、R.  Kandzia、およびS.  Marillonnet、２００８年、「A  one  pot,  one  step,  precision  cloning  method  with  high-throughput  capability」、PLos  One、３巻：ｅ３６４７頁；Kotera,  I.およびT.  Nagai、２００８年、「A  high-throughput  and  single-tube  recombination  of  crude  PCR  products  using  a  DNA  polymerase  inhibitor  and  type  IIS  restriction  enzyme」、J  Biotechnol、１３７巻：１〜７頁；Weber,  E.、R.  Gruetzner、S.  Werner、C.  Engler、およびS.  Marillonnet、２０１１年、Assembly  of  Designer  TAL  Effectors  by  Golden  Gate  Cloning、PloS  One、６巻：ｅ１９７２２頁を参照）、ｉｉｉ）ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え、ｉｖ）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング、エキソヌクレアーゼ媒介アセンブリー（Aslanidisおよびde  Jong、１９９０年、「Ligation-independent  cloning  of  PCR  products  (LIC-PCR)」、Nucleic  Acids  Research、１８巻、２０号、６０６９頁）、ｖ）相同組換え、ｖｉ）非相同末端結合、ｖｉｉ）ギブソンアセンブリー（Gibsonら、２００９年、「Enzymatic  assembly  of  DNA  molecules  up  to  several  hundred  kilobases」、Nature  Methods、６巻、３４３〜３４５頁）、またはこれらの組合せの少なくとも１つを使用することができる。モジュラーＩＩＳ型ベースアセンブリーストラテジーは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１５４１４７に開示されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０５０７】
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの選択マーカーを有するベクターをクローニングすることを教示する。選択圧下で原核細胞（例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ゼオシン、スペクチノマイシン／ストレプトマイシンに対する）、または真核細胞（例えば、ジェネテシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン）内の選択について抗生物質耐性機能をコードすることが多い様々な選択マーカー遺伝子が当技術分野で公知である。他のマーカーシステム、例えば、順調に形質導入された宿主細胞において発現されるＸ−ｇａｌまたは緑色もしくは赤色蛍光タンパク質などの蛍光レポーターの存在下で陽性クローンを選択するのに細菌において使用される周知のブルー／ホワイトスクリーニングシステムは、望まれるまたは望まれない細胞のスクリーニングおよび同定を可能にする。そのほとんどが原核生物系内でのみ機能的である選択マーカーの別のクラスは、産生細胞を死滅させる毒性遺伝子産物を発現する、「デス遺伝子（death  gene）」とも呼ばれることが多い対抗選択可能マーカー遺伝子に関する。このような遺伝子の例としては、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｇａｔａ−１、またはｃｃｄＢが挙げられ、その機能は、（Reyratら、１９９８年、「Counterselectable  Markers:  Untapped  Tools  for  Bacterial  Genetics  and  Pathogenesis」、Infect  Immun.、６６巻（９号）：４０１１〜４０１７頁）に記載されている。
プロトプラスト形成法
【０５０８】
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、糸状菌細胞由来のプロトプラストの生成を使用する。プロトプラストを調製するための適当な手順は、例えば、ＥＰ２３８，０２３およびYeltonら（１９８４年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８１巻：１４７０〜１４７４頁）に記載されたものを含めて任意の当技術分野で公知のものであり得る。一実施形態では、プロトプラストは、１種または複数の溶菌酵素またはこれらの混合物を用いて糸状菌細胞の培養物を処理することによって生成される。溶菌酵素は、ベータ−グルカナーゼおよび／またはポリガラクツロナーゼであり得る。一実施形態では、プロトプラストを生成するための酵素混合物は、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ濃縮物である。酵素処理の後、プロトプラストは、例えば、遠心分離などの当技術分野で公知の方法を使用して単離することができる。
【０５０９】
前培養および実際のプロトプラスト形成（protoplasting）ステップを変えて、プロト
プラストの数および形質転換効率を最適化することができる。例えば、接種量の変動、接種方法、前培養培地、前培養時間、前培養温度、混合条件、洗浄緩衝液組成、希釈比、溶菌酵素処理中の緩衝液組成、使用される溶菌酵素のタイプおよび／または濃度、溶菌酵素とのインキュベーションの時間、プロトプラスト洗浄手順および／または緩衝液、実際の形質転換中のプロトプラストおよび／またはポリヌクレオチドおよび／または形質転換試薬の濃度、形質転換中の物理的パラメータ、最大で得られる形質転換体までの形質転換後の手順が存在し得る。
【０５１０】
プロトプラストは、浸透圧安定化緩衝液中に再懸濁させることができる。このような緩衝液の組成は、種、アプリケーション、および必要性に応じて変動し得る。しかし、典型的には、これらの緩衝液は、０．５から２Ｍの間のスクロース、シトレート、マンニトール、またはソルビトールのようないずれかの有機成分を含有する。より好ましくは、０．７５から１．５Ｍの間；１Ｍが最も好適である。さもなければ、これらの緩衝液は、０．１から１．５Ｍの濃度でＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、またはＭｇＣｌ２のような無機浸透圧安定化成分を含有する。好ましくは０．２から０．８Ｍの間；より好ましくは０．３から０．６Ｍの間、最も好ましくは０．４Ｍである。最も好適な安定化緩衝液は、ＳＴＣ（ソルビトール、０．８Ｍ；ＣａＣｌ２、２５ｍＭ；Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ；ｐＨ８．０）またはＫＣｌ−シトレート（ＫＣｌ、０．３〜０．６Ｍ；シトレート、０．２％（ｗ／ｖ））である。プロトプラストは、１×１０５から１×１０１０細胞／ｍｌの間の濃度で使用することができる。好ましくは、濃度は、１×１０６から１×１０９の間であり；より好ましくは、濃度は、１×１０７から５×１０８の間であり；最も好ましくは、濃度は、１×１０８細胞／ｍｌである。ＤＮＡは、０．０１から１０μｇの間；好ましくは０．１から５μｇの間、さらにより好ましくは０．２５から２μｇの間；最も好ましくは０．５から１μｇの間の濃度で使用される。トランスフェクションの効率を増大させるため、キャリアＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡまたは非コードベクターＤＮＡのような）を形質転換混合物に添加することができる。
【０５１１】
一実施形態では、生成および後続の単離の後、プロトプラストは、１種または複数の凍結保護物質と混合される。凍結保護物質は、グリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリオール、糖、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルセルロース、Ｃ−連結凍結防止糖タンパク質（Ｃ−ＡＦＧＰ）、またはこれらの組合せであり得る。本明細書に提供される方法およびシステムにおいて凍結保護物質として使用するためのグリコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、またはこれらの組合せから選択することができる。本明細書に提供される方法およびシステムにおいて凍結保護物質として使用するためのポリオールは、プロパン−１，２−ジオール、プロパン−１，３−ジオール、１，１，１−トリス−（ヒドロキシメチル）エタン（ＴＨＭＥ）、および２−エチル−２−（ヒドロキシメチル）−プロパン−１，３−ジオール（ＥＨＭＰ）、またはこれらの組合せから選択することができる。本明細書に提供される方法およびシステムにおいて凍結保護物質として使用するための糖は、トレハロース、スクロース、グルコース、ラフィノース、デキストロース、またはこれらの組合せから選択することができる。一実施形態では、プロトプラストは、ＤＭＳＯと混合される。ＤＭＳＯは、少なくとも、多くて、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖ、それ未満、それ超、それに等しい、または約その値の最終濃度でプロトプラストと混合することができる。プロトプラスト／凍結保護物質（例えば、ＤＭＳＯ）混合物は、貯蔵前にマイクロタイタープレートに分配することができる。プロトプラスト／凍結保護物質（例えば、ＤＭＳＯ）混合物は、本明細書に提供される長期貯蔵（例えば、数時間、数日、数週間、数カ月、数年）にわたって、本明細書に提供される任意の温度、例えば、−２０℃または−８０℃などで貯蔵することができる。一実施形態では、追加の凍結保護物質（例えば、ＰＥＧ）が、プロトプラスト／ＤＭＳＯ混合物に添加される。さらに別の実施形態では、追加の凍結保護物質（例えば、ＰＥＧ）が、貯蔵前にプロトプラスト／ＤＭＳＯ混合物に添加される。ＰＥＧは、本明細書に提供される任意のＰＥＧであり得、本明細書に提供される任意の濃度（例えば、ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）で添加することができる。
プロトプラスト形質転換方法
【０５１２】
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、本明細書に記載の糸状菌細胞に由来するプロトプラストへの核酸の移送を必要とする。別の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムによって利用される形質転換は、本明細書に記載した通り、本質的にハイスループットであり、かつ／または部分的もしくは完全に自動化されている。本実施形態に付け加えて、形質転換は、本明細書に記載のコンストラクトまたは発現コンストラクトをマイクロタイタープレートのウェルに添加し、その後、本明細書に提供される方法によって生成されたプロトプラストをマイクロタイタープレートの各ウェルにアリコートすることによって実施される。プロトプラストの形質転換／トランスフェクションの適当な手順は、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＮＬ９９／００６１８号、同ＰＣＴ／ＥＰ９９／２０２５１６号、FinkelsteinおよびBall（編）、Biotechnology  of
filamentous  fungi,  technology  and  products、Butterworth-Heinemann（１９９
２年）、BennettおよびLasure（編）、More  Gene  Manipulations  in  fungi、Academic  Press（１９９１年）、Turner  ：Puhler（編）、Biotechnology、完全に改訂された
第２版、VHC（１９９２年）protoplast  fusion  に記載されたもの、ならびにＥＰ６３
５５７４Ｂに記載されたＣａ−ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換を含めて、任意の当技術分野で公知のものであり得る。代替として、糸状菌宿主細胞またはこれらに由来するプロトプラストの形質転換は、電気穿孔、例えば、ChakrabortyおよびKapoor、Nucleic  Acids  Res.、１８巻：６７３７頁（１９９０年）によって記載された電気穿孔など、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換、例えば、Christiansenら、Curr.  Genet.、２９巻：１００〜１０２頁（１９９５年）；Durandら、Curr.  Genet.、３１巻：１５８〜１６１頁（１９９７年）；およびBarcellosら、Can.  J.  Microbiol.、４４巻：１１３７〜１１４１頁（１９９８年）に記載されたものなどのＤＮＡの微
粒子導入、または細胞の「磁気微粒子銃（magneto-biolistic）」トランスフェクション
、例えば、米国特許第５，５１６，６７０号および同第５，７５３，４７７号に記載されたものなどによっても実施することができる。一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムで使用される形質転換手順は、本明細書に提供されるハイスループットおよび／または自動化を受けやすいもの、例えば、ＰＥＧ媒介形質転換などである。
【０５１３】
本明細書に記載の方法を使用して生成されるプロトプラストの形質転換は、当技術分野で公知の任意の形質転換試薬を使用することによって促進することができる。適当な形質転換試薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）またはＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（登録商標）Ｄ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製）、ＬＹＰＯＶＥＣ（登録商標）またはＬＩＰＯＧＥＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ製）から選択することができる。一実施形態では、ＰＥＧが最も好適な形質転換／トランスフェクション試薬である。ＰＥＧは、異なる分子量で入手可能であり、異なる濃度で使用することができる。好ましくは、ＰＥＧ４０００が、１０％から６０％の間、より好ましくは２０％から５０％の間、最も好ましくは３０％で使用される。一実施形態では、ＰＥＧは、本明細書に記載した通り、貯蔵前にプロトプラストに添加される。
宿主細胞の形質転換
一部の実施形態では、本開示のベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはＴｉ媒介遺伝子移入を含めた様々な技法のいずれかを使用して宿主細胞内に導入することができる（Christie,  P.J.およびGordon,  J.E.、２０１４年、「The  Agrobacterium  Ti  Plasmids」、Microbiol  SPectr.、２０１４年；２巻（６号）；１０．１１２８頁を参照）。特定の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔が挙げられる（Davis,  L.、Dibner,  M.、Battey,  I.、１９８６年、「Basic  Methods  in  Molecular  Biology」）。形質転換の他の方法としては、例えば、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔が挙げられる。例えば、Gietzら、Nucleic  Acids  Res.、２７巻：６９〜７４頁（１９９２年）；Itoら、J.  Bacterol.、１５３巻
：１６３〜１６８頁（１９８３年）；ならびにBeckerおよびGuarente、Methods  in  Enzymology、１９４巻：１８２〜１８７頁（１９９１年）を参照。一部の実施形態では、形
質転換宿主細胞は、組換え宿主株と呼ばれる。
【０５１４】
一部の実施形態では、本開示は、本開示の９６−ウェルプレートロボットプラットフォームおよび液体ハンドリング機械を使用する細胞のハイスループット形質転換を教示する。
【０５１５】
一部の実施形態では、本開示は、上述した１種または複数の選択マーカーを有する形質転換細胞をスクリーニングすることを教示する。このような一実施形態では、カナマイシン耐性マーカー（ＫａｎＲ）を含むベクターで形質転換された細胞を、有効量のカナマイシン抗生物質を含有する培地に蒔く。カナマイシンが入った培地上で目に見えるコロニー形成単位は、ベクターカセットをこれらのゲノム内に組み入れたと推定される。所望の配列の挿入は、関連した挿入部位のＰＣＲ、制限酵素分析、および／またはシーケンシングを介して確認することができる。
選択された配列のループアウト
【０５１６】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物からＤＮＡの選択された領域をループアウトする方法を教示する。ループアウト法は、Nakashimaら、２０１４年、「Bacterial  Cellular  Engineering  by  Genome  Editing  and  Gene  Silencing.」、Int.  J.  Mol.
Sci.、１５巻（２号）、２７７３〜２７９３頁に記載された通りのものであり得る。一部の実施形態では、本開示は、陽性形質転換体から選択マーカーをループアウトすることを教示する。ループアウト欠失技法は、当技術分野で公知であり、（Tearら、２０１４年、「Excision  of  Unstable  Artificial  Gene-Specific  inverted  Repeats  Mediates  Scar-Free  Gene  Deletions  in  Escherichia  coli.」、Appl.  Biochem.  Biotech.、１７５巻：１８５８〜１８６７頁）に記載されている。本明細書に提供される方法
で使用されるループアウト法は、シングルクロスオーバー相同組換えまたはダブルクロスオーバー相同組換えを使用して実施することができる。一実施形態では、本明細書に記載の選択された領域のループアウトは、本明細書に記載のシングルクロスオーバー相同組換えを使用することを必然的に伴い得る。
【０５１７】
第１に、ループアウトベクター（loop  out  vector）が、宿主生物のゲノム内の選択
された標的領域内に挿入される（例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ、または他の遺伝子編集技法を介して）。一実施形態では、シングルクロスオーバー相同組換えが、図３に表したものなどの環状プラスミドまたはベクターをループインするために、環状プラスミドまたはベクターと宿主細胞ゲノムとの間に使用される。挿入されるベクターは、既存のまたは導入される近傍の宿主配列のダイレクトリピートである配列を用いて設計することができ、その結果、ダイレクトリピートがルーピングおよび欠失を予定しているＤＮＡの領域に隣接する。挿入されると、ループアウトプラスミドまたはベクターを含有する細胞を、選択領域の欠失について対抗選択することができる（例えば、図４；選択遺伝子に対する耐性の欠如を参照）。
【０５１８】
当業者は、ループアウト手順の記載は、ゲノムから望まれない領域を欠失させるための一例示的方法を代表するにすぎないことを認識する。実際に、本開示の方法は、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮＳ、ＦＯＫ、または他のエンドヌクレアーゼを介した遺伝子編集を含めて、ゲノム欠失の任意の方法に適合する。当業者は、相同組換え技法を介してゲノムの望まれない領域を置き換える能力も認識する。
【実施例】
【０５１９】
以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を例証するために提供するのであって、それらには、いかなる場合であっても、本開示を制限する意図はない。特許請求の範囲により定義される、本開示の精神の範囲内に包含されるその変化および他の使用は、当業者により認識される。
【０５２０】
簡潔な目次を、下記に提供するが、これはもっぱら、読者を支援するためである。
この目次により、本出願の実施例または開示の範囲を制限する意図は全くない。
【表５Ｂ−１】
2019162131.tif 000021
【表５Ｂ−２】
2019162131.tif 000022
（実施例１）
ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのＨＴＰ形質転換およびＳＮＰライブラリー創製の実証
【０５２１】
この実施例は、本開示のＨＴＰ遺伝子操作法の実施形態を示す。宿主細胞を、異なるサイズの多様なＳＮＰ配列を用いて形質転換し、すべて、ゲノムの異なるエリアを標的化する。結果から、本開示の方法により、任意の種類の迅速な遺伝子変化を、宿主細胞のゲノム全体にわたり生成することが可能であることが示されている。
Ａ．形質転換ベクターのクローニング
【０５２２】
「カスタムプラスミドアセンブリー／クローニング」のセクションにおける上記の記載の通り、および図３に示すように、多様なＳＮＰを、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ２１３００）からランダムに選び、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍクローニングベクター中に、酵母相同組換えクローニングの技法を使用してクローニングして、各ＳＮＰがダイレクトリピート領域に隣接する、ベクターをアセンブルした。
【０５２３】
この実施例のためのＳＮＰカセットは、０．５Ｋｂ、１Ｋｂ、２Ｋｂおよび５Ｋｂの範囲のダイレクトリピートホモロジーアームの様々な長さを含むように設計した。さらに、ＳＮＰカセットは、下記でより詳細に記載する通り、ゲノムの種々の明確に異なる領域を標的とする相同組換えのために設計した。
【０５２４】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムのサイズは、３，２８２，７０８ｂｐである（図９を参照されたい）。ゲノムを、２４個の等しいサイズの遺伝子領域に恣意的に分け、ＳＮＰカセットを、２４個の領域のそれぞれを標的とするように設計した。したがって、この実施例のために、全部で９６個の明確に異なるプラスミドをクローニングした（４つの異なる挿入断片サイズ×２４個の明確に異なるゲノム領域）。
【０５２５】
各ＤＮＡ挿入断片を、相同領域のＰＣＲ増幅により、商業的に供給されているオリゴ、および鋳型としての、上に記載した宿主株のゲノムＤＮＡを使用して産生した。ゲノム中に導入しようとするＳＮＰを、オリゴのテールにコードした。酵母において、ＰＣＲ断片を、ベクターの骨格中に相同組換えを使用してアセンブルした。
【０５２６】
ベクター中への各ＳＮＰおよびホモロジーアームのクローニングを、図６、図３および表５に記載するＨＴＰ操作のワークフローに従って実施した。
Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉ中へのアセンブルされたクローンの形質転換
【０５２７】
最初に、標準的な熱ショック形質転換の技法を使用して、ベクターをＥ．ｃｏｌｉ中へ形質転換して、正確にアセンブルされたクローンを同定し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換のためのベクターＤＮＡを増幅した。
【０５２８】
例えば、形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細菌を、アセンブリーの成功について試験した。各Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換プレートからの４つのコロニーを培養し、正確なアセンブリーについてＰＣＲにより試験した。このプロセスを、２４個の形質転換の場所のそれぞれおよび４つの異なる挿入断片サイズのそれぞれ（すなわち、この実施例の９６個の形質転換体のすべて）について繰り返した。この実験からの結果を、各処理（挿入断片サイズおよびゲノムの場所）について試験した４つのコロニーから同定した正確なコロニーの数として表した（図１２を参照されたい）。より長い５ｋｂの挿入断片は、より短い対応物と比較して、アセンブリー効率の減少を示した（ｎ＝９６）。
Ｃ．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中へのアセンブルされたクローンの形質転換
【０５２９】
バリデートしたクローンを、電気穿孔によりＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞に形質転換した。各形質転換について、１μｇのＤＮＡ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を、挿入断片サイズの関数として決定した（図１３を参照されたい）。また、Ｃｏｒｙｎｅのゲノムへの組込みを、ホモロジーアームの長さの関数としても分析し、結果は、より短いアームは、より低い効率を有することを示した（図１３を参照されたい）。
【０５３０】
また、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ形質転換体中の標的化したゲノムの場所に関するゲノムへの組込み効率も分析した。ゲノムの１位および２位は、ゲノムの残りの部分と比較して、若干より低い組込み効率を示した（図１０を参照されたい）。
Ｄ．選択マーカーのループアウト
【０５３１】
挿入断片カセットの組込みに成功したことが同定されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの培養物を、５％のスクロースを含有する培地上で培養し、対抗選択して、ｓａｃｂ選択遺伝子をループアウトした。種々のダイレクトリピートホモロジーアームについてのスクロース耐性の頻度は、アームの長さに関して有意には変化しなかった（図１４を参照されたい）。これらの結果から、ループアウト効率が、０．５ｋｂ〜５ｋｂのホモロジーアームの長さにわたり一様に維持されることが示唆された。
【０５３２】
ループアウト事象をさらにバリデートするために、スクロース耐性を示すコロニーを培養し、シーケンシングにより分析した。
【０５３３】
挿入断片のゲノム領域のシーケンシングについての結果を、下記の表６に要約する。
【表６】
2019162131.tif 000023
【０５３４】
シーケンシングの結果から、ループアウトの１０〜２０％の効率が示された。実際のループアウトはおそらく、挿入断片配列に若干依存する。しかし、１０〜２０個のスクロース耐性のコロニーを選ぶことによって、高い成功率がもたらされる。
Ｅ．要約
【０５３５】
下記の表７に、本発明のＨＴＰゲノム操作法の効率の定量的な評価を示す。酵母ホモロジーの方法論についての構築物のアセンブリーの率として、期待されるＤＮＡ構築物を、１０個の試験したコロニーのうちの約９個において得た。２ｋｂのホモロジーアームを有するＳＮＰ構築物によるＣｏｒｙｎｅの形質転換により、平均して１マイクログラムのＤＮＡ当たり５１コロニー形成単位（ＣＦＵ／μｇ）が得られ、前記コロニーの９８％が、正確に組み込まれたＳＮＰ挿入断片を示した（標的化効率）。ループアウト効率として、スクロースに曝露する場合に、耐性となる細胞が０．２％に留まり、これらの１３％が、正確にループアウトされた配列を示した。
【表７】
2019162131.tif 000024
（実施例２）
ＨＴＰゲノム操作−工業用微生物株を再建／改良するための、ＳＮＰライブラリーのインプリメンテーション
【０５３６】
この実施例は、本開示のＨＴＰ株改良プログラムのＳＮＰスワップライブラリーのいくつかの態様を例示する。具体的には、実施例は、現時点で存在する工業用株を再建するためのいくつかの想定されるアプローチを示す。この実施例は、「基準」株と「中間」株と工業用株との間に存在し得る遺伝子の複数の差により生み出される表現型の解空間を探索する、ウェーブアップおよびウェーブダウンのアプローチについて記載する。
Ａ．多様性プール中のＳＮＰの同定
【０５３７】
本開示の方法を使用する例示的な株改良プログラムを、工業生産用微生物株に対して実施した；これを、本明細書では「Ｃ」と呼ぶ。このプログラムについての多様性プールの株を、Ａ、ＢおよびＣにより表す。株Ａは、あらゆる変異誘発の前の、元々の、産生のための宿主株を表した。株Ｃは、現在の工業用株を表し、従来の株改良プログラムによる長年の変異誘発および選択を受けている。株Ｂは、「中位」の株を表し、何らかの変異誘発を受けており、株Ｃの先行株であった。（図１７Ａを参照されたい）。
【０５３８】
株Ａ、株Ｂおよび株Ｃについて、シーケンシングし、それらのゲノムを、株間の遺伝子の差について分析した。全部で３３２個の非同義ＳＮＰを同定した。これらのうち、１３３個のＳＮＰがＣにユニークであり、加えて、１５３個がＢおよびＣにより共有され、４６個が株Ｂにユニークであった（図１７Ｂを参照されたい）。これらのＳＮＰを、下流の株改良サイクルのために多様性プールとして使用する。
Ｂ．ＳＮＰスワッピングの分析
【０５３９】
実施例２のパートＡの多様性プールから同定したＳＮＰを分析して、宿主細胞の性能に対するそれらの効果を決定する。株性能の最初の「学習」のラウンドを、下に記載し、図１８に図示した通り、６つのステップに分解する。
【０５４０】
第１に、ＣからのＳＮＰをすべて、基準株Ａ中に個々および／またはコンビナトリアルにクローニングする。これは、最少２８６個の個別の形質転換体に相当する。これらの形質転換体の目的は、有益なＳＮＰを同定することである。
【０５４１】
第２に、ＣからのＳＮＰをすべて、市販株Ｃから個々および／またはコンビナトリアルに除去する。これは、最少２８６個の個別の形質転換体に相当する。これらの形質転換体の目的は、中立のＳＮＰおよび有害なＳＮＰを同定することである。また、追加の任意選択のステップ３〜６についても、下に記載する。２つの遺伝的な時点（genetic  time  point）（基準株Ａおよび工業用株Ｃ）からのＳＮＰを付加および減じる、第１および第２のステップを、本明細書では「ウェーブ」と呼び、ウェーブは、「ウェーブアップ」（基準株へのＳＮＰの付加、第１のステップ）および「ウェーブダウン」（工業用株からのＳＮＰの除去、第２のステップ）を含む。ウェーブの概念を、ＳＮＰのさらなる付加／削減に拡張する。
【０５４２】
第３に、ＢからのＳＮＰをすべて、基準株Ａ中に個々および／またはコンビナトリアルにクローニングする。これは、最少１９９個の個別の形質転換体に相当する。これらの形質転換体の目的は、有益なＳＮＰを同定することである。形質転換体のうちのいくつかはまた、第１のステップで産生する形質転換体についてのバリデーションデータとしても役立つ。
【０５４３】
第４に、ＢからのＳＮＰをすべて、市販株Ｂから個々および／またはコンビナトリアルに除去する。これは、最少１９９個の個別の形質転換体に相当する。これらの形質転換体の目的は、中立のＳＮＰおよび有害なＳＮＰを同定することである。形質転換体のうちのいくつかはまた、第２のステップで産生する形質転換体についてのバリデーションデータとしても役立つ。
【０５４４】
第５に、ＣにユニークなＳＮＰ（すなわち、Ｂ中には存在しない）をすべて、個々および／またはコンビナトリアルに市販株Ｂ中にクローニングする。これは、最少４６個の個別の形質転換体に相当する。これらの形質転換体の目的は、有益なＳＮＰを同定することである。形質転換体のうちのいくつかはまた、第１および第３のステップで産生する形質転換体についてのバリデーションデータとしても役立つ。
【０５４５】
第６に、ＣにユニークなＳＮＰをすべて、市販株Ｃから個々および／またはコンビナトリアルに除去する。これは、最少４６個の個別の形質転換体に相当する。これらの形質転換体の目的は、中立のＳＮＰおよび有害なＳＮＰを同定することである。形質転換体のうちのいくつかはまた、第２および第４のステップで産生する形質転換体についてのバリデーションデータとしても役立つ。
【０５４６】
これらのステップのそれぞれから収集するデータを使用して、各ＳＮＰを、疎明の、有益、中立または有害として分類する。
Ｃ．ＳＮＰの有益な組合せを決定するための、上位性マッピングの利用
【０５４７】
実施例２のパートＢで同定した有益なＳＮＰを、組み合わせた場合に、宿主の性能を改善する可能性があるＳＮＰを同定するために、本開示の上位性マッピング法により分析する。
【０５４８】
実施例１の操作法を使用して、新たに操作された株バリアントを創製して、ＳＮＰの組合せを、上位性マッピングによる予測に従って試験する。ＳＮＰの統合は、逐次的に行うことができ、または代替的に、複数の分枝にわたって行うこともでき、したがって、１つ超の改良された株が、有益なＳＮＰのサブセットを伴い存在し得る。ＳＮＰの統合は、株改良の複数のラウンドにわたり、有益なＳＮＰの最適な組合せを含有する最終の株を産生するまで続け、最終の株は、中立のＳＮＰまたは有害なＳＮＰの荷物をいずれも有さない。
（実施例３）
ＨＴＰゲノム操作−Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中でのリシンの産生における株性能を改善するための、ＳＮＰスワップライブラリーのインプリメンテーション
【０５４９】
この実施例では、実施例２のＳＮＰスワップＨＴＰ設計株改良プログラムの一部を例示的に実行し、目標は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中でのリシンの産生の収率および生産性の改善をもたらすことである。
【０５５０】
この実施例のセクションＢは、本開示のＨＴＰ株改良プログラムの、変異を統合するステップをさらに示す。したがって、この実施例は、本開示のＨＴＰ株改良法の第１、第２および第３のラウンドの統合についての実験結果を提供する。
【０５５１】
第２および第３のラウンドの統合のための変異は、別個の遺伝子ライブラリースワップに由来する。したがってまた、これらの結果により、ＨＴＰ株プログラムの、多分枝平行トラック（multi-branch  parallel  tracks）を実施する能力、および本開示の種々の形態の遺伝子設計ライブラリーに伴うメタデータ中に埋め込むことができる有益な変異の「メモリー」も示される。
【０５５２】
上記のように、提供された参照の基準参照株（株Ａ）および第２の「操作された」株（株Ｃ）のゲノムについてシーケンシングし、遺伝子の差をすべて同定した。基準株は、ＵＶ変異誘発を経験したことがないＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍバリアントであった。操作された株もまた、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株であり、これは、従来の変異改善プログラムの数ラウンド後に基準株から産生されていた。この実施例は、１８６個の明確に異なる非同義ＳＮＰの、株Ａと株Ｃとの間で同定した差についてのＳＮＰスワップの結果を提供する。
Ａ．ＨＴＰ操作およびハイスループットスクリーニング
【０５５３】
本開示のクローニングおよび形質転換の方法に従って、１８６個の同定したＳＮＰのそれぞれを個々に、基準株中に付加して戻した。単一のＳＮＰを含む新たに創製した株をそれぞれ、リシンの収率について、産物力価での性能を評価するように設計した小規模の培養において試験した。小規模の培養は、工業規模の培養からの培地を使用して実施した。標準的な比色分析アッセイを用いて、産物力価を光学的に炭素消耗時に測定した（すなわち、単一バッチの収率を表す）。手短に述べると、濃縮アッセイ混合物を調製し、これを発酵試料に、試薬の最終濃度が、１６０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、０．２ｍＭのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ、０．２Ｕ／ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ、および０．００５Ｕ／ｍＬのリシンオキシダーゼとなるように添加した。反応を終点まで進行させ、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００プレート分光光度計を使用して、光学密度を５６０ｎｍの波長において測定した。実験の結果を、下記の表８に要約し、図３８に示す。
【表８−１】
2019162131.tif 000025
【表８−２】
2019162131.tif 000026
【表８−３】
2019162131.tif 000027
【表８−４】
2019162131.tif 000028
【表８−５】
2019162131.tif 000029
【表８−６】
2019162131.tif 000030
【表８−７】
2019162131.tif 000031
【表８−８】
2019162131.tif 000032
【表８−９】
2019162131.tif 000033
【表８−１０】
2019162131.tif 000034
【表８−１１】
2019162131.tif 000035
【表８−１２】
2019162131.tif 000036
Ｂ．第２のラウンドのＨＴＰ操作およびハイスループットスクリーニング−ＳＮＰスワップライブラリーと選択されたＰＲＯスワップヒットとの統合
【０５５４】
本開示のＨＴＰ方法の強みの１つは、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを、宿主細胞の表現型に対する各ＳＮＰ／プロモーター／ターミネーター／開始コドンの効果と関連がある情報と一緒に保存する能力である。本発明者らは先に、プロモータースワップの実験を実施したことがあり、この実験で、生合成の収率に対してプラス効果を有する、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのいくつかのｚｗｆプロモータースワップを同定した（例えば、図２２中の標的「Ｎ」についての結果を参照されたい）。
【０５５５】
本発明者らは、実施例５から、先に同定したｚｗｆプロモータースワップのうちの１つもまた含むように、この実施例の基準株Ａを改変した。表８中の、上に記載した最初のスクリーニングから同定した上位の１７６個のＳＮＰを、この新しい基準株中に再導入して、新しいＳＮＰスワップ遺伝子設計微生物ライブラリーを創製した。これまでのステップと同様に、単一のＳＮＰを含む新たに創製した各株も、リシンの収率について試験した。また、選択されたＳＮＰ変異体株を、上に記載した比色分析法を使用して、２４時間時のリシンの産生を測定することによって、生産性のプロキシについても試験した。このステップからの結果を、下記の表９に要約し、図３９に示す。
【表９−１】
2019162131.tif 000037
【表９−２】
2019162131.tif 000038
【表９−３】
2019162131.tif 000039
【表９−４】
2019162131.tif 000040
【表９−５】
2019162131.tif 000041
【表９−６】
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【表９−７】
2019162131.tif 000043
【表９−８】
2019162131.tif 000044
【表９−９】
2019162131.tif 000045
【表９−１０】
2019162131.tif 000046
【表９−１１】
2019162131.tif 000047
【表９−１２】
2019162131.tif 000048
【０５５６】
ＳＮＰスワップのこの第２のラウンドからの結果から、ｚｗｆプロモータースワップ変異を含む基準株において、基準株のリシンの収率および生産性を増加させることが可能ないくつかのＳＮＰが同定された（例えば、図３９の右手上部の隅にあるＳＮＰ０８４およびＳＮＰ１２１を参照されたい）。
Ｃ．タンク培養のバリデーション
【０５５７】
上記のＨＴＰのステップの間に同定した上位のＳＮＰを含有する株を、中型の試験発酵タンク中に培養した。手短に述べると、各株の小型の１００ｍｌの培養物を、一晩成長させ、次いで、等しい播種量を有する試験発酵タンクに５リットルの培養物を播種するために使用した。播種物は、ＯＤ６００の測定値に従って同じ細胞密度を含有するように基準に合わせた（normalized）。
【０５５８】
結果として得られたタンク培養物は、培養を３日間進行させてから収集した。収率および生産性の測定値を、発酵全体を通して種々の点でタンクから採取した試料中の基質および産物の力価から計算した。試料を、特定の低分子の濃度について、高圧液体クロマトグラフィーにより、適切な標準物質を使用して分析した。この実験についての結果を、下記の表１０に要約し、図４０に示す。
【表１０】
2019162131.tif 000049
【０５５９】
小規模のハイスループット培養物により予測されるように、ｚｗｆプロモータースワップとＳＮＰ１２１との組合せを含む株についてのより大きなタンク培養物は、参照の基準株に対して、収率および生産性の有意な増加を示した。例えば、この株の生産性は、基準株の生産性、３．２９ｇ／Ｌ／時間と比較して、４．５ｇ／Ｌ／時間に急増した（２ラウンドのＳＮＰスワップだけで、生産性が３７．０％増加した）。
（実施例４）
ＨＴＰゲノム操作−工業用微生物株を改良するための、プロモータースワップライブラリーのインプリメンテーション
【０５６０】
これまでの実施例は、工業用株を再建するために、本開示のＨＴＰ株改良プログラムの力を実証してきた。実施例２および３は、種々の基準株、中間株および工業用株における、現存する遺伝子の多様性を探索する、ＳＮＰスワップの技法およびライブラリーのインプリメンテーションについて記載した。
【０５６１】
この実施例は、本開示のＰＲＯスワップの技法を使用するＨＴＰ株改良プログラムの実施形態を示す。実施例３とは異なり、この実施例は、ＰＲＯスワップライブラリーの生成による変異のデノボ生成のための方法を教示する。
Ａ．プロモータースワッピングのための標的の同定
【０５６２】
前述のように、プロモータースワッピングは、標的とするための「ｎ個」の遺伝子のセットを選択するステップを含む、多段階ステップのプロセスである。
【０５６３】
この実施例では、発明者らは、潜在的な経路遺伝子２３個の群を同定して、本開示のプロモーターラダー法により、モジュレートした（分子リシンを産生する例示的な代謝経路における、過剰発現に対して１９個の遺伝子および下方制御に対して４＋個の転用遺伝子（ｄｉｖｅｒｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ））（図１９を参照されたい）。
Ｂ．プロモーターラダーの創製
【０５６４】
プロモータースワップのプロセスのインプリメンテーションにおける別のステップは、「ラダー」として働く「ｘ個」のプロモーターのセットの選択である。これらのプロモーターが複数のゲノム遺伝子座にわたって高度に変動する発現をもたらすことが示されていれば理想的であるが、それらが遺伝子の発現を何らかの様式で撹乱させることが唯一の要件である。
【０５６５】
特定の実施形態では、目的の標的遺伝子と関連がある天然の、生来のまたは野生型のプロモーターを同定し、次いで、前記プロモーターを変異させて、複数の変異プロモーター配列を得ることによって、これらのプロモーターラダーを生み出す。これらの変異プロモーターのそれぞれは、標的遺伝子の発現に対する効果について試験される。一部の実施形態では、編集されたプロモーターは、様々な条件にわたって発現活性について試験され、その結果、各プロモーターバリアントの活性が記録され／特徴付けられ／アノテートされ、かつデータベース内に記憶される。結果として生じる編集されたプロモーターバリアントは、引き続いて組織化されて、これらの発現の強度に基づいて配列された「ラダー」にされる（例えば、頂部付近に高度発現バリアントおよび底部付近に減弱された発現を有し、したがって、用語「ラダー」をもたらす）。
【０５６６】
例示的な本実施形態では、発明者らは、図１９中の同定した標的遺伝子のそれぞれについて、プロモーターラダー：ＯＲＦの組合せを創製した。
Ｃ．ラダーからのプロモーターと標的遺伝子との関連性
【０５６７】
プロモータースワップのプロセスのインプリメンテーションにおける別のステップは、種々の株のＨＴＰ操作であり、これらの株は、特定の標的遺伝子と関連があるプロモーターラダーからの所与のプロモーターを含む。
【０５６８】
生来のプロモーターが標的遺伝子ｎの前に存在し、その配列が分かっている場合には、生来のプロモーターを、ラダー中のｘプロモーターのそれぞれでの置換えを実施することができる。生来のプロモーターが存在しないかまたはその配列が分かっていない場合には、遺伝子ｎの前に、ラダー中のｘプロモーターのそれぞれの挿入を実施することができる。このようにして、株のライブラリーを構築し、この場合、ライブラリーの各メンバーが、ｎ標的に作動可能に連結しているｘプロモーターの一例であり、は、他の点では同一の遺伝子状況である（例えば、図２０を参照されたい）。
Ｄ．株のＨＴＰスクリーニング
【０５６９】
プロモータースワップのプロセスにおける最後のステップは、上記のライブラリーにおける株のＨＴＰスクリーニングである。得られた株のそれぞれが、ｎ標的に連結しているｘプロモーターの一例を表し、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドである。
【０５７０】
発明者らは、１つまたは複数の測定基準に対するそれらの性能を特徴付けるシナリオにおいて、各株のＨＴＰスクリーニングをインプリメントすることによって、所与の測定基準（例えば、目的の分子の産生の最適化）に関して、プロモーター／標的遺伝子のどの関連性が最も有益であるかを決定することができる。図２０（プロモーターＰ１〜Ｐ８の、目的の遺伝子に対する効果）を参照されたい。
【０５７１】
図１９〜２２に示す例示的な実施形態では、発明者らは、プロモータースワップのプロセスを利用して、リシンの産生を最適化した。上に記載したＰｒｏスワップ方法の適用例を、下の実施例５に記載する。
（実施例５）
ＨＴＰゲノム操作−リシンの産生に関して、株性能を改善するためのＰＲＯスワップライブラリーのインプリメンテーション
【０５７２】
以下のセクションは、実施例４に記載の、本開示のＰＲＯスワップＨＴＰ設計株改良プログラムツールの例示的なインプリメンテーションを示す。この実施例では、宿主細胞のリシンの収率を増加させるために、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を、本開示のＰＲＯスワップ方法に供した。
Ａ．プロモータースワップ
【０５７３】
プロモータースワップを、実施例４の記載の通り実施した。図１９中のリシン生合成経路から選択した遺伝子を、プロモーターＰ１〜Ｐ８を使用してプロモータースワップに対して標的化した。
Ｂ．ＨＴＰ操作およびハイスループットスクリーニング
【０５７４】
プロモータースワップのＨＴＰ操作を、実施例１および３に記載の通り実施した。結果として得られたプロモータースワップ株のＨＴＰスクリーニングを、実施例３に記載の通り実施した。全部で１４５個のＰＲＯスワップを実施した。実験の結果を、下記の表１１に要約し、図４１に示す。
【表１１−１】
2019162131.tif 000050
【表１１−２】
2019162131.tif 000051
【表１１−３】
2019162131.tif 000052
【表１１−４】
2019162131.tif 000053
【表１１−５】
2019162131.tif 000054
【表１１−６】
2019162131.tif 000055
【表１１−７】
2019162131.tif 000056
【表１１−８】
2019162131.tif 000057
【表１１−９】
2019162131.tif 000058
【表１１−１０】
2019162131.tif 000059
【０５７５】
プロモータースワップライブラリーのスクリーニングの結果は、可視化すると、測定している性能の測定基準と最も密接に相関する遺伝子標的を同定するのに役立つ。この場合、遺伝子標的ｐｇｉ、ｚｗｆ、ｐｐｃ、ｐｃｋ、ｆｂｐおよびｄｄｈは、プロモータースワップにより、基準株に対して、収率の大きなゲインがもたらされる遺伝子と同定された。
【０５７６】
表１１から選択した株を、上記の通り、小型のプレート中で再培養し、リシンの収率について試験した。この二次スクリーニングからの結果を、図２２に示す。
（実施例６）
上位性マッピング−変異の有益な統合を予測するためのアルゴリズムツール
【０５７７】
この実施例は、本開示のＨＴＰ株改良プログラムの一部として利用する予測モデリング技法の実施形態を記載する。本開示は、（上に記載の、遺伝子設計ライブラリーの使用による）潜在的に有益な変異の最初の同定の後の、ＨＴＰ株改良の第２、第３、第４のおよびさらにそれらに続くラウンドにおける、有益な変異を統合する方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、変異の統合が、前記変異それぞれの個々の性能に基づき得ることを教示する。他の実施形態では、本開示は、２つまたはそれ超の変異が、単一の宿主細胞中に統合する場合に、相加効果または相乗効果を示す可能性を予測するための方法を教示する。下記の実施例は、本開示の予測ツールの実施形態を示す。
【０５７８】
実施例３および５のＳＮＰスワップライブラリーおよびプロモータースワッピング（ＰＲＯスワップ）ライブラリーから選択した変異を分析して、宿主の株性能の改善をもたらす可能性が最も高いＳＮＰ／ＰＲＯスワップの組合せを同定した。
【０５７９】
本開示の「上位性マッピング」のセクションの記載の通り、ＳＮＰスワップライブラリーの配列を、コサイン類似性マトリックスを使用して相互に比較した。分析の結果から、各ＳＮＰ／ＰＲＯスワップの組合せについて、機能類似性スコアを得た。すべてのＳＮＰ／ＰＲＯスワップの間の機能類似性の視覚的表現を、図１５にヒートマップに示す。また、結果として得られた、機能類似性スコアを使用して、それぞれのＳＮＰ／ＰＲＯスワップ間の類似性の距離を示す樹状図も展開した（図１６Ａ）。
【０５８０】
同じまたは類似の機能群（すなわち、高い機能類似性を有するＳＮＰ／ＰＲＯスワップ）からの変異は、同じ機構により働く可能性が高く、したがって、組み合わせた場合に、全般的な宿主の性能に対して、負または中立の上位性を示す可能性が高い。対照的に、異なる機能群からの変異は、独立の機構により働く可能性がより高く、したがって、宿主の性能に対して、有益な相加的またはコンビナトリアルな効果をもたらす可能性が高い。
【０５８１】
上位性に対する生物学的経路の効果を示すために、多様な機能類似性を示すＳＮＰスワップとＰＲＯスワップとを組み合わせ、宿主株において試験した。実施例１の記載の通り、ＳＮＰ／ＰＲＯスワップの３つの組合せ：ｉ）Ｐｃｇ０００７：：ｚｗｆのＰＲＯスワップ＋Ｐｃｇ１８６０：：ｐｙｃのＰＲＯスワップ、ｉｉ）Ｐｃｇ０００７：：ｚｗｆのＰＲＯスワップ＋ＳＮＰ３０９、およびｉｖ）Ｐｃｇ０００７：：ｚｗｆのＰＲＯスワップ＋Ｐｃｇ０００７：：ｌｙｓＡのＰＲＯスワップを、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノム中に操作した（機能類似性の関係については、図１５および図１６Ａを参照されたい）。
【０５８２】
ＳＮＰ／ＰＲＯスワップの組合せを含有するそれぞれの宿主細胞の性能を、実施例３の記載の通り試験し、ｚｗｆのＰＲＯスワップのみを含有する対照の宿主細胞の性能と比較した。下記の表１２および１３に、それぞれの株について、宿主細胞の収率（９６時間における測定）および生産性（２４時間における測定）の結果を要約する。
【表１２】
2019162131.tif 000060
【表１３】
2019162131.tif 000061
【０５８３】
各ＳＮＰ／ＰＲＯスワップの組合せについての宿主の収率による性能の結果はまた、図１６Ｂにも示す。２４時間時の測定および９６時間時の測定の両方で、より低い機能類似性を示すＳＮＰ／ＰＲＯスワップを組み合わせた宿主株が、組み合わせたＳＮＰがより高い機能類似性を示す株より性能が優れていた。
【０５８４】
したがって、上位性マッピングの手順は、設計した遺伝子変化の有効なおよび／またはプラスの統合について予測／プログラミング／情報提供を行うのに有用である。上位性マッピングの手順による分析的洞察から、微生物株の開発のその後のラウンドを導くことができる予測規則のセットの創製が可能になる。上位性ライブラリーから得られる予測のための洞察は、微生物のタイプおよび標的分子のタイプにわたって使用することができる。
（実施例７）
ＨＴＰゲノム操作−Ｐｒｏスワップ変異の統合および多因子のコンビナトリアル試験
【０５８５】
これまで実施例は、少数の事前選択したＰＲＯスワップ変異とＳＮＰスワップライブラリーとを統合するための方法を示してきた（実施例３）。他の実施例は、相加的または相乗的に有益な宿主細胞の特性をもたらす可能性が最も高い変異の統合を選択するための上位性による方法を示してきた（実施例６）。この実施例は、本開示のＨＴＰ方法により、複数の遺伝子／遺伝子設計ライブラリーの組合せ（例えば、ＰＲＯスワップライブラリー×ＳＮＰライブラリー、またはＰＲＯスワップライブラリー内の組合せ）のコンビナトリアルな統合により創製される大きな解空間を有効に探索することが可能になることを示す。
【０５８６】
本開示のＨＴＰ株改良法のこの例示的な適用例では、実施例５で宿主の性能に対してプラス効果を有することが同定されているプロモータースワップを元々のＰＲＯスワップライブラリーと二次の組合せで統合する。ＰＲＯスワップ変異を統合する決定は、収率または生産性に対するそれぞれの変異の全般的な効果、および２つの変異の組合せが相加的または相乗的な効果をもたらす可能性に基づいた。
【０５８７】
例えば、出願人らは、実施例６の上位性マッピングの結果に基づいて、Ｐｃｇ０００７：：ｚｗｆおよびＰｃｇ０００７：：ｌｙｓＡの組み合わせを選択したことについて言及する。
Ａ．ＰＲＯスワップ株操作のための統合のラウンド
【０５８８】
先の実施例１の記載の通り、株を形質転換した。手短に述べると、所望のＰＲＯスワップ変異を１つすでに含有する株をもう一度、第２の所望のＰＲＯスワップ変異を用いて形質転換した。全部で１４５個の、実施例５からの試験済のＰＲＯスワップを、５３個の第２のラウンドの統合株へと統合して、それらはそれぞれ、有益な相加効果または相乗効果を示すことが期待される２つのＰＲＯスワップ変異を含んだ。
【０５８９】
結果として得られた第２のラウンドの株を、実施例３の記載の通りもう一度スクリーニングした。この実験からの結果を、下記の表１４に要約し、図１１に示す。
【表１４−１】
2019162131.tif 000062
【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
2019162131.tif 000065
【０５９０】
上位性モデルにより予測されたように、Ｐｃｇ０００７：：ｚｗｆ変異およびＰｃｇ０００７：：ｌｙｓＡ変異を含む、第２のラウンドのＰＲＯスワップ株は、最高の収率改善のうちの１つを示し、収率を、Ｐｃｇ０００７：：ｌｙｓＡ単独に対してほぼ３０％改善し、基準株に対して３５．５％改善した（図１１上の円で囲んだデータ点を参照されたい）。
【０５９１】
単一の変異および統合した二重の変異の解空間を探索するためのＨＴＰ方法はまた、第３、第４およびその後の変異の統合にも適用することができる。また、例えば、開示する、ｚｗｆ、ｐｙｃおよびｌｙｓａに対応する３つの変化の統合株にも注目されたい；この株は、上記の表１４に示す２つの変化の統合において同定した上位のヒットの中から作製し、これらのヒットは、本開示の上位性による方法によって同定されたものである。この３つの変化の統合株について、タンク中で妥当性をさらにバリデートしたところ、親、または親＋ｚｗｆと比較して有意に改善されていた（上記の表１０および図４０を参照されたい）。
（実施例８）
ＨＴＰゲノム操作−工業用宿主株を改善するための、ターミネーターライブラリーのインプリメンテーション
【０５９２】
本実施例では、本開示のＨＴＰ方法を、ＳＴＯＰスワップを含む追加のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーに適用する。実施例は、本開示によれば、（例えば、ＰＲＯスワップ、ＳＮＰスワップ、ＳＴＯＰスワップ等の）基本の遺伝子設計ライブラリーからのエレメントを組み合わせて、より複雑な遺伝子設計ライブラリー（例えば、プロモーターおよびターミネーターの両方が組み入れられているＰＲＯ−ＳＴＯＰのスワップライブラリー）を生み出すことができることをさらに示す。本開示は、一部の実施形態では、これまでに開示した遺伝子設計ライブラリーのうちのいずれかの組合せから得られるライブラリーを含めた、一切の可能な遺伝子設計ライブラリーを教示する。
【０５９３】
この実施例では、小規模の実験を実施して、遺伝子の発現に対する本発明のＳＴＯＰスワップ方法の効果を実証した。下に記載するように、本開示のターミネーターＴ１〜Ｔ８と、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの２つの生来のプロモーターのうちの１つとの対を形成し、蛍光タンパク質の発現に影響を及ぼすそれらの能力について分析した。
Ａ．ＤＮＡ構築物のアセンブリー
【０５９４】
ターミネーターＴ１〜Ｔ８とＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの２つの生来のプロモーターのうちの１つ（例えば、Ｐｃｇ０００７またはＰｃｇ００４７）との、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現する対を形成した。ＤＮＡの増幅およびアセンブリーを促進するために、プロモーター−ＹＦＰ−ターミネーターの最終の配列を、２つの部分に分けて合成した。第１の部分は、（５’から３’へ）ｉ）ベクターのホモロジーアーム、ｉｉ）選択されたプロモーター、およびｉｉｉ）ＹＦＰ遺伝子の２／３をコードした。第２の部分は、（５’から３’へ）ｉｖ）ＹＦＰ遺伝子の次の２／３、ｖ）選択されたターミネーター、およびｖｉ）第２の、ベクターのホモロジーアームをコードした。各部分を、合成オリゴヌクレオチドを使用して増幅し、ゲル上で精製した。酵母相同組換えを使用して、ゲル上で精製したアンプリコンをベクターの骨格とアセンブルした。
Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉ中へのアセンブルされたクローンの形質転換
【０５９５】
正確にアセンブルされたクローンを同定し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換のためのベクターＤＮＡを増幅するために、プロモーター−ＹＦＰ−ターミネーターの配列を含有するベクターのそれぞれを個々に、Ｅ．ｃｏｌｉ中へ形質転換した。正確にアセンブルされたベクターを、制限酵素消化およびサンガーシーケンシングにより確認した。陽性クローンを、後に使用するために−２０℃で保存した。
Ｃ．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中へのアセンブルされたクローンの形質転換
【０５９６】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞中へ、ベクターの検証したクローンを個々に、電気穿孔により形質転換した。各ベクターを、異種の黄色蛍光タンパク質の発現を可能にするが、宿主細胞にとって有害にならないように経験的に決定されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノム内の中立の組込み部位に組み込まれるように設計した。組込みを促進するために、発現ベクターは、所望の組込み部位に相同な約２ｋｂｐの配列（すなわち、ホモロジーアーム）をさらに含み、それによって、上に記載した各遺伝子カセットが、ホモロジーアーム（homology  am）の下流に挿入された。ゲノム中への組込みは、シングルクロスオーバーによる組込みにより行った。次いで、形質転換したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍを、正確な組込みについてＰＣＲにより試験した。各遺伝子構築物について実施した形質転換のそれぞれについて、このプロセスを繰り返した。
Ｄ．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中の個々のターミネーター構築物の評価
【０５９７】
次いで、プロモーター−ＹＦＰ−ターミネーターの構築物を含有する各Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換体の表現型を、発現を評価するために、培地の２つのタイプ（ブレインハートインフュージョン−ＢＨＩ培地およびＨＴＰ試験培地）中で、２つの時点において試験した。手短に述べると、ＰＣＲにより確認した形質転換体４〜６つを選び、９６ウェルフォーマット中の選択培地中で培養した。次いで、最初の培養物を、選択ＢＨＩ培地または選択種培地中に分割した。４８時間時に、種培地中の培養物を、選択ＨＴＰ試験培地またはＢＨＩ培地中に播種し、２つの時点において分析し、これらの時点は、成長曲線の異なる部分を表した。ＨＴＰ試験培地の培養物の場合の時点は、播種してから４８および９６時間後であった。選択ＢＨＩ培地中の培養物は、播種してから４８および７２時間後に分析した。
【０５９８】
培養物の分析は、ベンチトップ型フローサイトメーターを使用して実施した。手短に述べると、培養物を、２００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１：１００で希釈した。各培養物に関して、３０００〜５０００個の個別事象（すなわち、細胞）の間で、黄色の蛍光について分析した。ベンチトップ型フローサイトメーターが、各「事象」の黄色の蛍光のヒストグラムをプロットし、各ウェル内の蛍光の中央値を計算する。図３６は、（４〜６つの生物学的複製物にわたる）各構築物についての蛍光の中央値の平均を示す。エラーバーは、各データ点の９５％信頼区間を示す。条件Ａ〜Ｄはそれぞれ、単一の培地および単一の時点を指す。したがって、条件Ａおよび条件Ｂは、ＢＨＩ培地についての２つの時点を表し、一方、Ｃ点およびＤ点は、ＨＴＰ試験培地についての２つの時点を表す。任意単位（例えば、ＡＵ）は、ベンチトップ型フローサイトメーターが記録した蛍光の中央値を表すことに留意されたい。
【０５９９】
結果から、ＳＴＯＰスワップ遺伝子設計ライブラリーのターミネーター１〜８は、ＹＦＰ発現を連続的な範囲でもたらすことが示されている。したがって、これらのターミネーターにより、ターミネーターラダーが形成され、このラダーは、本開示のＨＴＰ方法に従って、後の遺伝子設計ライブラリー中にインプリメントすることができる。
（実施例９）
ＨＴＰツールセットと従来のＵＶ変異との比較
【０６００】
この実施例は、本開示のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーが、従来の変異による株改良プログラムよりも有益であることを実証する。本明細書のこの部分における実験では、本開示のＨＴＰ方法によりなしとげる表現型の改善について、改善の大きさおよびスピードを、従来のＵＶ変異誘発に対して定量する。
【０６０１】
本開示は、宿主細胞の株改良プログラムを加速させるための新しい方法を教示する。一部の実施形態では、本開示のＨＴＰ株改良プログラムは、遺伝子の撹乱を生成し、同定するＨＴＰツールセットの能力に依存する。本発明者らは、本開示のプロモータースワップ技法と従来のＵＶ変異アプローチとを比較する小型の平行追跡型の株改良プログラムを実施することによって、ＨＴＰツールセットの利益を定量することを試みた。
【０６０２】
ＵＶおよびプロモータースワップの両方による遺伝子の撹乱についての出発点として、目的の生化学的代謝産物を産生する参照基準株を選んだ。
Ａ．ＵＶ変異
【０６０３】
基準株の培養物を、１０のＯＤ６００に基準に合わせたＯＤである培養物においてＢＨＩ培地中で成長させた。この培養物を、無菌のペトリ皿中にアリコートし、小型の磁気撹拌棒を使用してかき混ぜた。次いで、２５４ｎｍの波長のＵＶトランスイルミネーターを、ＵＶ曝露の５および９分時に培養物上で反転させ、一定分量を採取した。これらの試料を１０倍段階希釈して、各希釈物を、ＢＨＩ培地のＱ−ｔｒａｙ上に蒔いた。自動化コロニーピッキング機器を使用して、これらのＱ−ｔｒａｙから、各ＵＶ曝露点からのコロニーをおよそ２５００個選び取り、下記の通り性能を評価した。
Ｂ．プロモータースワップ
【０６０４】
１５個の遺伝子標的について、基準株中に、ＰＲＯスワップ構築物を、表１に記載したＰ１、Ｐ３、Ｐ４およびＰ８から選択されるプロモーターの全部またはサブセットのいずれかを使用して生成した。目的の産物の生合成における最後のステップは、律速補助因子の可能性があるＳ−アデノシルメチオニンを利用するＯ−メチルトランスフェラーゼ酵素によって触媒される。したがって、ＰＲＯスワップのための遺伝子標的は、それらがこの補助因子または上流の代謝産物の生合成に直接関与するということに基づいて選択された。
Ｃ．ＵＶおよびプロモータースワップライブラリーの評価
【０６０５】
この実施例のために開発した各Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の表現型を、選択された生体分子を産生するその能力について試験した。手短に述べると、各ＰＲＯスワップ株からの、配列が確認されたコロニー４〜６つ、および各ＵＶ株についての単一のコロニーを選び、液体産生培地中、９６ウェルフォーマット中の選択培地中で増殖した。
【０６０６】
９６ウェルマイクロウェルプレート中でバイオマスを増殖させた後に、細胞塊を、９６ウェルマイクロウェルプレート中の基質を含有する発酵培地に添加し、生物変換を２４時間進行させた。各株について、２４時間時に採取した試料から、産物の力価を、高速液体クロマトグラフィーを使用して決定した。各遺伝子の撹乱（ＵＶおよびＰＲＯスワップ）についての力価の結果を分析した。各複製物についての結果を平均し、前記株の全般的な性能を表すために割り当てた。次いで、基準株の収率に対する比として表現する、測定した収率に対する各変異の効果に基づいて、株をカテゴリーに分けた。
【０６０７】
図３７に、この実験の結果を要約し、ｉ）収率を変化させなかった、ｉｉ）１．２〜１．４倍の収率の改善をもたらした、ｉｉｉ）１．４〜１．６倍の収率の改善をもたらした、ｉｖ）１．６〜１．８倍の収率の改善をもたらした、またはｖ）１．８〜２倍の収率の改善をもたらした各株改良の技法について、株の数を提示する。
【０６０８】
結果は、本開示のＨＴＰツールセットは、従来のＵＶ変異誘発アプローチに対して有益であることを示している。例えば、ＰＲＯスワップ株は、収率のプラスの変化をより高い率で示し、したがって、株を有意に改良することができる変異を提供する可能性がより高かったことを、図３７の結果は実証している。最も特筆すべきは、ＰＲＯスワップライブラリーにおいては、１．６、１．８および２倍の増加を示す優れた改良株の発生率が高く、ＵＶライブラリーにおいては、改善がほとんど〜全く同定されなかったことである。
【０６０９】
また、結果により、本開示のＰＲＯスワップ方法の加速された改善速度が強調されることからも、結果は重要である。実際に、ＰＲＯスワップライブラリーについての結果は、１００個未満の、プロモーター：：遺伝子の撹乱に基づき、一方、ＵＶ変異の結果は、４，０００個超の明確に異なる変異体株のスクリーニングを含んだ。したがって、本開示の方法は、性能における大きなゲインを株に付与することが可能な遺伝子の撹乱を同定する前にスクリーニングしなければならない変異体の数を劇的に低下させる。
（実施例１０）
真核生物におけるＨＴＰ操作法の適用
【０６１０】
これまでの実施例は、原核細胞に対するＨＴＰ株改良プログラムの適用を示している。この実施例は、同じ技法を真核細胞に適用できることを実証する。具体的には、実施例１０および１１は、クエン酸の工業生産用のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのためのＳＮＰスワップ株改良プログラムについて記載する。
Ａ．Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのプロトプラストの形成および形質転換
【０６１１】
真核生物の真菌株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、ＡＴＣＣ１０１５のプロトプラストの大きな体積（５００ｍｌ）を、ベータ−グルカナーゼ活性を含有する市販の酵素混合物を使用して生成した。プロトプラストを、酵素混合物から遠心分離により単離し、最終的に、塩化カルシウムを含有する緩衝液中に再懸濁させた。
【０６１２】
ジメチルスルホキシドおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の懸濁液を含有する容器中に、プロトプラストをアリコートし、−８０℃で凍結した。一部の実施形態では、本開示は、各ウェル中に、２５〜５０マイクロリットルのプロトプラストを含有する９６ウェルマイクロタイタープレートのストックを、この技法を使用するゲノム編集の大規模なキャンペーンのための大きなバッチ中で調製し、凍結することができることを教示する。
【０６１３】
従来のＰＥＧカルシウム媒介型形質転換を、９６ウェル中でＤＮＡとプロトプラスト−ＰＥＧの混合物とを組み合わせる自動化された液体ハンドラーにより実施した。形質転換の後に、液体を取り扱う追加の自動化されたステップを使用して、選択培地上に形質転換体（transformation）を蒔いた。
Ｂ．形質転換体の自動化されたスクリーニング
【０６１４】
下記でより詳細に論じるように、Ａ．ｎｉｇｅｒ細胞は、機能性のｐｙｒＧ遺伝子により形質転換されていた；このことにより、形質転換された細胞は、ウラシルの非存在下で成長することが可能であった。この実施例のｐｙｒＧ遺伝子を、さらに設計して、Ａ．ｎｉｇｅｒの野生型ａｙｇＡ遺伝子の場所に組み入れ、したがって、天然に存在するａｙｇＡ遺伝子中に、変異を組み入れた。さらに、ａｙｇＡ遺伝子の破壊により、胞子の色が黄色になり、このことから、形質転換体を同定するための二次スクリーニングの方法も提供される。
【０６１５】
ウラシルを有さない選択培地上で成長させた形質転換体を単離し、第２のマイクロタイタープレートの個々のウェル中に入れた。第２のマイクロタイタープレート中の形質転換体を２〜３日間成長および胞子形成させた後、水および少量の洗剤からなる液体中に再懸濁させて、保存および下流の自動化されたスクリーニングに適切な胞子のストックを生成した。
【０６１６】
次いで、上記の胞子のストックのそれぞれの少量の一定分量を使用して、第３の９６ウェルＰＣＲプレート中の液体培地に播種した。これら少量の培養物を、据置型インキュベーター中で一晩成長させ、その結果、黄色色素を含有する胞子が出芽し、選択および下流のステップにより適している菌糸を形成する。
【０６１７】
培養するステップの後に、第３のＰＣＲプレートの菌糸を、市販の緩衝液を添加し、培養物を９９℃に２０分間加熱することによって溶解した。次いで、プレートを遠心分離して、ＤＮＡ懸濁液の上清を細胞／オルガネラのペレットから分離した。次いで、ＤＮＡ抽出物を使用して、ＰＣＲ分析を行って、所望のＤＮＡ改変を含む細胞株を同定した。
Ｃ．ＳＮＰの組込みのための共形質転換−ＳＮＰの設計
【０６１８】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ遺伝子ａｙｇＡのＤＮＡ配列を得、適切なリーディングフレームを決定した。４つの明確に異なるタイプの変異を設計し、これらは、組み込まれた場合には、ヌル変異という結果になった。
【０６１９】
変異は、停止コドンをインフレームに組み入れている単一の塩基対の変化；小さな、２つの塩基対の欠失：３つの塩基対の組込み；およびより大きな、１００個の塩基対の欠失を含んだ；これらはいずれも、適切に組み込まれた場合には、ａｙｇＡ活性を排除する。ａｙｇＡ活性を欠く株は、黄色胞子の表現型を有する。設計を、ギブソンアセンブリーを使用して構築物を構築するために使用したオリゴマーのセットを予測したｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの構築物として生成した。
Ｄ．共形質転換による、ＳＮＰの組込み
【０６２０】
上に記載した形質転換のアプローチを使用して、小さな変化を含有するアンプリコンを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株１０１５のゲノム中に組み入れた。これまでに論じたように、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのこの株は、非機能性のｐｙｒＧ遺伝子を含み、したがって、外因性ウラシルの非存在下で成長することは不可能であった。ｐｙｒＧ遺伝子の組込みに成功している細胞は、この時点では、ウラシルの非存在下で成長することが可能であった。これらのｐｙｒＧ＋形質転換体のうち、ａｙｇＡ遺伝子中に小さな変異もまた組み込んだ分離株は、黄色胞子の表現型を示した。（図４３Ａ）。変異の存在はまた、ＳＮＰの交換について標的化される領域を含有する小さなアンプリコンのシーケンシングによっても検出される（図４３Ｂ）。
（実施例１１）
ＨＴＰゲノム操作−真核生物Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ１１４１４においてクエン酸の産生を改善するための、ＨＴＰ  ＳＮＰライブラリー株改良プログラムのインプリメンテーション
【０６２１】
上記の実施例１０は、本開示の遺伝子操作技法をハイスループットの様式で自動化するための技法について記載した。この実施例は、上に記載した技法を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ１１４１４の特定のＨＴＰ株改良に適用する。
【０６２２】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒは、発酵によるクエン酸の大規模産生のために使用される、糸状菌の種である。この種の複数の株は、単離され、クエン酸および他の有機酸を産生する種々の能力を有することが示されている。クエン酸の産生を改善するために、本開示のＨＴＰ株操作法を使用して、原因となる対立遺伝子を組み合わせ、有害な対立遺伝子を排除することができる。
Ａ．天然のＡ．ｎｉｇｅｒ株バリアントに由来するＳＮＰについての遺伝子設計ライブラリーのライブラリーの同定
【０６２３】
２０世紀前半に、Ａ．ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ１０１５は、クエン酸の産生体であることが同定された。後に、ＡＴＣＣ１１４１４と名付けられた、この株の分離株は、その親に対して、クエン酸の収率の増加を示すことが見出された。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ１０１５は、硝酸アンモニウムを含有するが、鉄カチオンおよびマンガンカチオンの両方を欠く培地中で、１４０グラムのグルコースから平均して７グラムのクエン酸を産生する。他方、分離株ＡＴＣＣ１１４１４は、同じ条件下で、収率の１０倍の増加を示す（７０グラムのクエン酸）。さらに、クエン酸産生培地中で、株ＡＴＣＣ１１４１４の胞子は、株１０１５の胞子よりも良好に出芽および成長する。
【０６２４】
表現型のこれらの差について潜在的な遺伝子源を同定するために、株ＡＴＣＣ１０１５および株ＡＴＣＣ１１４１４の両方のゲノムについて、シーケンシングおよび分析した。結果として得られた分析から、株１０１５と株１１４１４とを区別する４２個のＳＮＰを同定した。
Ｂ．原因となる対立遺伝子の交換
【０６２５】
形質転換のために、プロトプラストを株ＡＴＣＣ１０１５（「基準株」）から調製した。次いで、本開示の遺伝子編集の技法（「ウェーブアップ」、図４４Ａ）により、上記で同定した４２個のＳＮＰのそれぞれを、基準株中に個々に導入した。各ＳＮＰを、上に記載した機能性のｐｙｒＧおよびａｙｇＡ遺伝子変異と共に共形質転換した。ａｙｇＡ遺伝子座への遺伝子の標的化に成功した形質転換体は、黄色の胞子をもたらした（図４４Ｂ）。
Ｃ．成功した組込みについてのスクリーニング
【０６２６】
上述の通り、推定ＳＮＰを含有する形質転換体を単離し、胞子のストックを増殖させた。推定ＳＮＰを含有するＤＮＡ領域を含有するアンプリコンを、次世代シーケンシングにより分析した。このアプローチを使用すれば、親ＤＮＡの存在下であっても、各形質転換体内で、成功した組込みの事象を決定することが可能である。こうすることが可能であることは、同じ細胞中に異なる遺伝子型を有する核を含有する異核共存体として成長することができる真菌中で標的化を決定するのに必須である。
【０６２７】
所望のＳＮＰ変化の存在について、形質転換体をさらにバリデートした。分離株のおよそ３０％において、黄色胞子の表現型を有する共形質転換体はまた、クエン酸ＳＮＰの適切な組込みも含有した（図４５および４６）。
【０６２８】
クエン酸の産生に有益なＳＮＰを同定するために、創製したＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを表現型によりスクリーニングすることを本発明者らは期待している。本発明者らは、本明細書に記載するゲノム操作のＨＴＰ方法の状況でこの情報を利用して、クエン酸の産生が増加するＡ．ｎｉｇｅｒ株を得る。
【０６２９】
本発明のさらなる実施形態
本開示が企図する他の主題を、以下の番号を付けた実施形態において示す。
１．
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法であって、
ａ．同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと；
ｂ．該所望の表現型について該最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｃ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｄ．該所望の表現型について該後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｅ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、ゲノム操作のＨＴＰ方法。
２．
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー、開始／停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つを含む、実施形態１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
３．
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーである、実施形態１〜２のいずれか１つに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
４．
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーのサブセットである、実施形態１〜２のいずれか１つに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
５．
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、先行するＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーである、実施形態１〜２のいずれか１つに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
６．
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、先行するＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーのサブセットである、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
７．
前記ゲノムを撹乱するステップが、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用することを含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
８．
前記最初の複数の微生物が、工業生産株微生物に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
９．
前記最初の複数の微生物が、Ｓ１Ｇｅｎ１で表される工業生産株微生物、およびＳｎＧｅｎｎで表されるこれらに由来する任意の数の後続の微生物世代を含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
１０．
ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．参照微生物株および第２の微生物株を提供するステップであって、該第２の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．該参照微生物株または該第２の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第２の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
を含む、方法。
１１．
前記参照微生物株のゲノムが撹乱されて、前記第２の微生物株内に見出される前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、実施形態１０に記載のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
１２．
前記第２の微生物株のゲノムが撹乱されて、前記参照微生物株内に見出されない前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、実施形態１０に記載のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
１３．
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第２の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、実施形態１０〜１２のいずれか１つに記載のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
１４．
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第２の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、実施形態１０〜１２のいずれか１つに記載のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
１５．
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、
ａ．親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって
、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと；
ｃ．参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該個々の微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
１５．１．
同定された遺伝的バリエーションが、プロモータースワップライブラリー由来の人工プロモータースワップ遺伝的バリエーションをさらに含む、実施形態１５に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建または改善するための方法。
１６．
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、参照微生物株と第２の微生物株との間のすべての同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、実施形態１５〜１５．１のいずれか１つに記載の工業用微生物株の表現型性能を再建または改善するための方法。
１７．
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第２の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、実施形態１５〜１５．１のいずれか１つに記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１８．
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、実施形態１５〜１７のいずれか１つに記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１９．
前記親系統微生物株のゲノムが撹乱されて、前記工業用微生物株内に見出される前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、実施形態１５〜１８のいずれか１つに記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
２０．
前記工業用微生物株のゲノムが撹乱されて、前記親系統微生物株内に見出されない前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、実施形態１５〜１８のいずれか１つに記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
２１．
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと
を含む、方法。
２２．
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法であって、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｆ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
２３．
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、実施形態２２に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法。
２３．１．
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップにおいてスクリーニングされた個々の微生物株中に存在するすべての遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、実施形態２２に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法。
２４．
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つを含む、ステップと
を含む、方法。
２５．
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法であって、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つを含む、ステップと；
ｃ．該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｆ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、
ステップと
を含む、方法。
２６．
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、実施形態２５に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法。
２６．１．
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップにおいてスクリーニングされた個々の微生物株に存在するすべての遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、実施形態２５に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法。
２７．
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるためのハイスループット（ＨＴＰ）ゲノム操作システムであって、
１つまたは複数のプロセッサー、および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと；
ｂ．該所望の表現型について該最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｃ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｄ．該所望の表現型について該後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｅ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
２８．
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと；
ｂ．該所望の表現型について該最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｃ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｄ．該所望の表現型について該後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｅ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
２９．
ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．参照微生物株および第２の微生物株を提供するステップであって、該第２の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．該参照微生物株または該第２の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第２の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
３０．
ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．参照微生物株および第２の微生物株を提供するステップであって、該第２の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．該参照微生物株または該第２の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第２の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
３１．
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと；
ｃ．参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
３２．
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと；
ｃ．参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
３３．
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
３４．
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
３５．
所望の表現型を獲得するためにプロモータースワッピングによって微生物を進化させるゲノム操作システムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｆ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
３６．
所望の表現型を獲得するためにプロモータースワッピングによって微生物を進化させるための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｆ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
３７．
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つを含む、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
３８．
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つを含む、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
３９．
所望の表現型を獲得するために微生物をターミネータースワッピングによって進化させるゲノム操作システムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つを含む、ステップと；
ｃ．該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｆ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
４０．
所望の表現型を獲得するために微生物をターミネータースワッピングによって進化させるための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の１つを含む、ステップと；
ｃ．該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｄ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｅ．該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｆ．微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
４１．
候補微生物株の設計を反復して改善するためのコンピューター実装方法であって、
ａ．（１）１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および（２）対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと；
ｂ．遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと；
ｃ．該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと；
ｄ．これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第１のサブセットを選択するステップと；
ｅ．該候補微生物株の該第１のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと；
ｆ．これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第２のサブセットの選択物を得るステップと；
ｇ．（２）該選択された候補微生物株の第２のサブセットの対応する測定された性能とともに、（１）該選択された候補微生物株の第２のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと；
ｈ．（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップと
を含む、方法。
４２．
（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップが、少なくとも１つの候補微生物株の測定された表現型性能が、性能測定基準を満たすまで（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すことを含む、実施形態４１に記載の方法。
４３．
前記予測モデルへの試験入力の第１の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み；
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第２のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、実施形態４１に記載の方法。
４４．
前記候補微生物株の前記第１のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、実施形態４１に記載の方法。
４５．
上位性効果に少なくとも部分的に基づく前記第１のサブセットの前記選択が、
該第１のサブセットの第１の選択の間に、
前記１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと；
少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの候補微生物株を該第１のサブセットに含めるために選択するステップと
を含む、実施形態４４に記載の方法。
４６．
前記第１のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第１のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第１のサブセット候補微生物株が、該第１のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと；
少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第１のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの候補微生物株を該第１のサブセットに含めるために選択するステップと
をさらに含む、実施形態４５に記載の方法。
４７．
候補微生物株の設計を反復して改善するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
ａ．（１）１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および（２）対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと；
ｂ．遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと；
ｃ．該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと；
ｄ．これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第１のサブセットを選択するステップと；
ｅ．該候補微生物株の該第１のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと；
ｆ．これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第２のサブセットの選択物を得るステップと；
ｇ．（２）該選択された候補微生物株の第２のサブセットの対応する測定された性能とともに、（１）該選択された候補微生物株の第２のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと；
ｈ．（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
４８．
前記命令が、前記１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、前記システムに、少なくとも１つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで（ｂ）〜（ｇ）を繰り返させる、実施形態４７に記載のシステム。
４９．
前記予測モデルへの試験入力の第１の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み；
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第２のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、実施形態４７に記載のシステム。
５０．
前記候補微生物株の前記第１のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、実施形態４７に記載のシステム。
５１．
前記命令が、前記１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、前記システムに、前記第１のサブセットの第１の選択の間に、
前記１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと；
少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの候補微生物株を該第１のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、実施形態５０に記載のシステム。
５２．
前記命令が、前記１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、前記システムに、前記第１のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第１のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第１のサブセット候補微生物株が、該第１のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと；
少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第１のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの候補微生物株を該第１のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、実施形態５１に記載のシステム。
５３．
候補微生物株の設計を反復して改善するための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
ａ．（１）１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および（２）対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと；
ｂ．遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと；
ｃ．該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと；
ｄ．これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第１のサブセットを選択するステップと；
ｅ．該候補微生物株の該第１のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと；
ｆ．これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第２のサブセットの選択物を得るステップと；
ｇ．（２）該選択された候補微生物株の第２のサブセットの対応する測定された性能とともに、（１）該選択された候補微生物株の第２のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと；
ｈ．（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
５４．
前記命令が、実行されるとき、前記１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、少なくとも１つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで（ｂ）〜（ｇ）を繰り返させる、実施形態５３に記載のコンピューター可読媒体。
５５．
前記予測モデルへの試験入力の第１の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み；
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第２のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、実施形態５３に記載のコンピューター可読媒体。
５６．
前記候補微生物株の前記第１のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、実施形態５３に記載のコンピューター可読媒体。
５７．
前記命令が、実行されるとき、前記１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、前記第１のサブセットの第１の選択の間に、
前記１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと；
少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの候補微生物株を該第１のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、実施形態５６に記載のコンピューター可読媒体。
５８．
前記命令が、実行されるとき、前記１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、前記第１のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第１のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第１のサブセット候補微生物株が、該第１のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと；
少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第１のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの候補微生物株を該第１のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、実施形態５３に記載のコンピューター可読媒体。
５９．
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するためのコンピューター実装方法であって、
少なくとも１つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと；
少なくとも２つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも２つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと；
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
を含む、方法。
６０．
前記少なくとも２つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも１つの微生物バックグラウンド株と同じである、実施形態５９に記載の方法。
６１．
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作用的にカップリングされ、該１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるとき、該システムに、
少なくとも１つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと；
少なくとも２つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも２つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと；
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
６２．
前記少なくとも２つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも１つの微生物バックグラウンド株と同じである、実施形態６１に記載のシステム。
６３．
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するための命令を記憶している１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、１つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該１つまたは複数の演算デバイスの少なくとも１つに、
少なくとも１つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと；
少なくとも２つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも２つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも２つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと；
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
６４．
前記少なくとも２つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも１つの微生物バックグラウンド株と同じである、実施形態６３に記載のコンピューター可読媒体。
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参照による組込み
本明細書に引用したすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている。しかし、本明細書に引用した任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、これらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれかの国における共通の一般的知識の一部を形成するという承認または何らかの形式の示唆として解釈されず、かつそのように解釈されるべきでない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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