(57)【要約】      （修正有）【課題】筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及びベッカー型筋ジストロフィーを処置するための改善された組成物及び方法の提供。【解決手段】患者に約３０ｍｇ／ｋｇの用量のエテプリルセンを週１回投与することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法。いくつかの実施形態において、エテプリルセンは、単回用量で、又は静脈内に投与される。いくつかの実施形態において、患者は、ジストロフィン遺伝子のエキソン５１をスキッピングすることによって補正され得るアウトオブフレーム欠失（複数可）を有する、又は小児科の患者である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この特許出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９３，４６３号の利益を主張する。上記で参照された仮特許出願の全体の内容は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、患者において筋ジストロフィーを処置する改善された方法に関する。本発明はまた、ヒトジストロフィン遺伝子においてエキソンスキッピングを促進するのに適した組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
アンチセンス技術は、種々の異なるレベル（転写、スプライシング、安定性、翻訳）での遺伝子発現に影響を与える一連の化学を使用して開発されている。その研究の多くは、広範囲の適応症における異常または疾患に関連する遺伝子を補正または補償するアンチセンス化合物の使用に焦点を当ててきた。アンチセンス分子は特異性を伴って遺伝子発現を阻害することができ、このために、遺伝子発現のモジュレーターとしてのオリゴヌクレオチドに関する多くの研究努力は、標的となる遺伝子の発現、またはシス作用性エレメントの機能を阻害することに焦点を当ててきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的には、センス鎖（例えば、ｍＲＮＡ）、またはあるウイルスＲＮＡ標的の場合はマイナス鎖のいずれかであるＲＮＡを指向している。特定の遺伝子下方調節の所望の効果を達成するために、オリゴヌクレオチドは一般に、標的とされたｍＲＮＡの崩壊を促進するか、ｍＲＮＡの翻訳をブロックするか、またはシス作用性ＲＮＡエレメントの機能をブロックし、それによって、標的タンパク質の新規合成、またはウイルスＲＮＡの複製を効果的に防止する。
【０００４】
しかし、このような技術は、目的が未変性タンパク質の産生を上方調節すること、または翻訳の未成熟な終結を誘発する変異、例えば、ナンセンス変異もしくはフレームシフト変異を補償することである場合、有用ではない。これらの場合において、欠陥のある遺伝子転写物は、標的とされた分解または立体的阻害に供されるべきではなく、したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチド化学は、標的ｍＲＮＡの崩壊を促進するべきではなく、または翻訳をブロックするべきではない。
【０００５】
種々の遺伝学的疾患において、遺伝子の最終的な発現に対する変異の効果は、スプライシングプロセスの間の標的とされたエキソンスキッピングのプロセスによってモジュレートすることができる。スプライシングプロセスは、プレｍＲＮＡにおける隣接するエキソン−イントロンジャンクションを近傍に導き、かつイントロンの終わりにおけるホスホジエステル結合の切断を行う、複雑な多構成要素の機構によって方向付けられ、これはエキソンの間のホスホジエステル結合のそれに続く再形成を伴い、これは一緒にスプライシングされる。この複雑かつ高度に正確なプロセスは、相対的に短い半保存的ＲＮＡセグメントであるプレｍＲＮＡにおける配列モチーフによって媒介され、次いでスプライシング反応に関与する様々な核スプライシング因子が配列モチーフに結合する。スプライシング機構が、プレｍＲＮＡプロセシングに関与するモチーフを解読または認識する方法を変更することによって、差次的にスプライシングされたｍＲＮＡ分子を生じさせることが可能である。ヒト遺伝子の大部分は、正常な遺伝子発現の間に選択的にスプライシングされることが今や認識されてきたが、関与する機構は同定されてこなかった。Ｂｅｎｎｅｔｔら（米国特許第６，２１０，８９２号）は、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ  Ｈが媒介する切断を誘発しないアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体を使用した、野性型細胞のｍＲＮＡプロセシングのアンチセンスのモジュレーションについて記載している。これによって、膜貫通ドメインをコードするエキソンを欠いている可溶性ＴＮＦスーパーファミリー受容体の産生のために、特異的エキソンを欠いている選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ（例えば、Ｓａｚａｎｉ，  Ｋｏｌｅら、２００７年によって記載されているような）を産生することができることにおける有用性が見出される。
【０００６】
正常に機能しているタンパク質が、その中の変異のために未成熟に終結される場合、アンチセンス技術によっていくつかの機能タンパク質の産生を回復させるための手段はスプライシングプロセスの間の介入によって可能であることが示されてきており、疾患をもたらす変異と関連するエキソンをいくつかの遺伝子から特異的に欠失させることができる場合、未変性タンパク質の同様の生物学的特性を有するか、またはエキソンと関連する変異によってもたらされる疾患を改善するのに十分な生物活性を有する、短縮されたタンパク質産物を産生することができることがある（例えば、Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ，  Ｓａｍｂａｄｅら、１９９６年；Ｗｉｌｔｏｎ，  Ｌｌｏｙｄら、１９９９年；ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，  Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔら、２００１年；Ｌｕ，  Ｍａｎｎら、２００３年；Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，  Ｊａｎｓｏｎら、２００４年を参照されたい）。Ｋｏｌｅら（米国特許第５，６２７，２７４号；同第５，９１６，８０８号；同第５，９７６，８７９号；および同第５，６６５，５９３号）は、標的とされたプレｍＲＮＡの崩壊を促進しない修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体を使用した、異常なスプライシングに対抗する方法を開示している。Ｂｅｎｎｅｔｔら（米国特許第６，２１０，８９２号）は、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ  Ｈが媒介する切断を誘発しないアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体をまた使用した、野性型細胞のｍＲＮＡプロセシングのアンチセンスのモジュレーションを記載している。
【０００７】
標的とされたエキソンスキッピングのプロセスは、多くのエキソンおよびイントロンが存在するか、エキソンの遺伝子構成において重複性が存在するか、またはタンパク質が１つもしくは複数の特定のエキソンを伴わずに機能することができる、長い遺伝子において特に有用である可能性が高い。様々な遺伝子における変異によってもたらされる切断と関連する遺伝学的疾患の処置のための遺伝子プロセシングを再指向させる努力は、（１）スプライシングプロセスに関与するエレメントと完全もしくは部分的にオーバーラップするか、または（２）そのエレメントにおいて起こる特定のスプライシング反応を正常に媒介するスプライシング因子の結合および機能を撹乱するためにエレメントに十分に近い位置においてプレｍＲＮＡに結合する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に焦点を合わせてきた。
【０００８】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現の欠陥によってもたらされる。タンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡの２百万超のヌクレオチドに亘って広がる７９のエキソンを含有する。エキソンのリーディングフレームを変化させるか、もしくは終止コドンを導入するか、または全アウトオブフレームエキソン（複数可）の除去、または１つもしくは複数のエキソンの重複によって特徴付けられる、任意のエキソンの変異は、機能的ジストロフィンの産生を撹乱する可能性を有し、ＤＭＤをもたらす。
【０００９】
疾患の発症は、生まれた時に上昇したクレアチンキナーゼレベルによって実証することができ、かなりの運動欠陥が生まれた年において存在し得る。７歳または８歳までに、ＤＭＤを有する大部分の患者は歩行がますます困難となり、床から起き上がり、階段を上がる能力を失いだし、１０〜１４歳までに大部分は車椅子に依存するようになる。ＤＭＤは一様に致命的であり、罹患した個人は典型的には、１０歳代後半または２０歳代前半に呼吸不全および／または心不全で死亡する。ＤＭＤの連続的な進行は、疾患の全ての段階における治療的介入を可能とする。しかし、処置は現在グルココルチコイドに限定されており、これは重量増加、行動変化、思春期変化、骨粗鬆症、クッシング様顔貌、成長阻害、および白内障を含めた多数の副作用と関連している。結果的に、この疾患の基礎的原因を処置するより良好な治療を開発することが是非とも必要である。
【００１０】
変異、典型的には１つまたは複数のエキソンの欠失が、全ジストロフィン転写物に沿った正確なリーディングフレームをもたらし、その結果、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳が未成熟で終結しない場合、筋ジストロフィーのより重度でない形態であるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）が生じることが見出されてきた。変異したジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングにおける上流および下流のエキソンの接合によって遺伝子の正確なリーディングフレームが維持される場合、結果は、いくらかの活性を保持する短い内部欠失を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、ベッカー表現型がもたらされる。
【００１１】
何年にも亘って、ジストロフィンタンパク質のリーディングフレームを変化させないエキソン（複数可）の欠失は、ＢＭＤ表現型を生じさせ、一方では、フレームのシフトをもたらすエキソン欠失は、ＤＭＤを生じさせることが公知であった（Ｍｏｎａｃｏ，  Ｂｅｒｔｅｌｓｏｎら、１９８８年）。一般に、リーディングフレームを変化させ、したがって、適切なタンパク質翻訳を中断する点変異およびエキソン欠失を含めたジストロフィン変異は、ＤＭＤをもたらす。一部のＢＭＤおよびＤＭＤ患者は、複数のエキソンをカバーするエキソン欠失を有することにも留意すべきである。
【００１２】
アンチセンスオリゴリボヌクレオチドによる変異体ジストロフィンプレｍＲＮＡスプライシングのモジュレーションは、インビトロおよびインビボの両方で報告されてきた（例えば、Ｍａｔｓｕｏ，  Ｍａｓｕｍｕｒａら、１９９１年；Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，  Ｎｉｓｈｉｏら、１９９５年；Ｐｒａｍｏｎｏ，  Ｔａｋｅｓｈｉｍａら、１９９６年；Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，  Ｅｐｅｒｏｎら、１９９７年；Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，  Ｍａｎｏｈａｒａｎら、１９９８年；Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，  Ｍａｎｎら、２００３年を参照されたい）。
【００１３】
ｍｄｘマウスモデルにおける特異的および再現性のあるエキソンスキッピングの最初の例は、Ｗｉｌｔｏｎらによって報告された（Ｗｉｌｔｏｎ，  Ｌｌｏｙｄら、１９９９年）。アンチセンス分子をドナースプライス部位に向けることによって、培養細胞の処理の６時間以内に、ジストロフィンｍＲＮＡにおいて一貫した効率的なエキソン２３スキッピングが誘発された。Ｗｉｌｔｏｎらはまた、より長いアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、マウスジストロフィンのプレｍＲＮＡのアクセプター領域を標的とすることを記載している。イントロン２３ドナースプライス部位に向けられた最初のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、初代培養した筋芽細胞において一貫したエキソンスキッピングを誘発した一方で、この化合物は、より高いレベルのジストロフィンを発現している不死化された細胞培養物においてはるかにより効率的ではないことが見出された。しかし、精巧な標的化およびアンチセンスオリゴヌクレオチド設計によって、特定のエキソン除去の効率は、ほぼ一桁分増大した（Ｍａｎｎ，  Ｈｏｎｅｙｍａｎら、２００２年）。
【００１４】
最近の研究は、ジストロフィンが存在しないことによって影響を受ける組織における最小の有害効果を伴う、持続性のジストロフィン発現を達成する試みに取り組み始めた。ＤＭＤを有する４人の患者の前脛骨筋中へのエキソン５１（ＰＲＯ０５１）を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの筋肉内注射は、臨床的に明らかな有害効果を伴わずにエキソン５１の特異的スキッピングをもたらした（Ｍａｎｎ，  Ｈｏｎｅｙｍａｎら、２００２年；ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，  Ｊａｎｓｏｎら、２００７年）。ｍｄｘマウスにおいてエキソン２３を標的とした細胞透過性ペプチドに結合体化されたアンチセンスホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）の全身送達に注目した研究は、検出可能な毒性を伴わずに、骨格筋および心筋において高く持続性のジストロフィンタンパク質産物を産生した（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，  Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８年；Ｗｕ，  Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８年；Ｙｉｎ，  Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８年）。
【００１５】
ＤＭＤの処置のためのスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の安全性および有効性を試験する最近の臨床治験は、スプライソゾームの立体的遮断によるプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを誘発するＳＳＯ技術に基づいている（Ｃｉｒａｋら、２０１１年；Ｇｏｅｍａｎｓら、２０１１年；Ｋｉｎａｌｉら、２００９年；ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、２００７年）。しかし、これらの成功にも関わらず、ＤＭＤを処置するために利用可能な薬理学的な選択肢は限定されている。特に、負に帯電しているホスホロチオエート骨格を利用するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ドリサペルセン）は、臨床治験において、タンパク尿、尿中α１−ミクログロブリンの増加、血小板減少および注射部位の反応、例えば、紅斑および炎症と関連付けられてきた。
【００１６】
本出願の譲受人によって開発されているエテプリルセンは、その安全性および有効性を試験する臨床試験の対象であり、臨床開発が進行中である。エテプリルセンは、ドリサペルセンと構造的に別個であるオリゴヌクレオチドである。具体的には、エテプリルセンの化学骨格は、ホスホロジアミデートモルホリノ（ｍｏｐｈｏｌｉｎｏ）（ＰＭＯ）であり、一方、ドリサペルセンの化学骨格は、２’Ｏ−メチルホスホロチオエート（２’−ＯＭｅ）である。これらの構造的差異、および臨床成績に対するこれらの潜在的な影響は最近記載された。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１４年）３巻、ｅ１５２；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．６（オンラインで２０１４年３月１１日に公表された）を参照されたい。
【００１７】
エテプリルセンの配列は、従前記載されてきた。例えば、出願人等に独占的に許諾されている米国特許第７，８０７，８１６号を参照されたい。しかし、米国特許第７，８０７，８１６号は、エテプリルセンについての最適な投薬スケジュールおよび投与経路を明確に考察していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第６，２１０，８９２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６２７，２７４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９１６，８０８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９７６，８７９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，６６５，５９３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
このように、患者において筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤおよびＢＭＤを処置するための改善された組成物および方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、この疾患の基礎的原因に取り組むことによってＤＭＤの処置における主要な進展を示す、エキソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドであるエテプリルセンの治療効果の説得力のあるエビデンスに少なくとも部分的に基づいている。エキソン５１をスキッピングするアンチセンスオリゴヌクレオチドであるエテプリルセンによる処置は、新規なジストロフィンの確かな増加を生じさせ、６分歩行試験（６ＭＷＴ）によって測定されるように、歩行能力を安定化（例えば、歩行運動を安定化）したという新規な知見は、疾患の経過を変化させる可能性を強調する。著しく、薬物に関連する有害事象は、１年に亘り投与された５７６回の注入において見られなかった。他のエキソンに適用するとき、エキソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、ジストロフィン遺伝子における欠失によってＤＭＤを有する患者の推定７０％〜８０％を処置することができた。
【００２１】
したがって、１つの態様において、本発明は、それを必要とする患者においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法であって、患者に約３０ｍｇ／ｋｇの用量のエテプリルセンを週１回投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、エテプリルセンは、単回用量で投与される。いくつかの実施形態において、エテプリルセンは、静脈内に投与される。いくつかの実施形態において、患者は、ジストロフィン遺伝子のエキソン５１をスキッピングすることによって補正され得るアウトオブフレーム欠失（複数可）を有する。いくつかの実施形態において、患者は、小児科の患者である。
【００２２】
別の態様において、本発明は、それを必要とする患者においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法であって、患者に約３０ｍｇ／ｋｇの用量のエテプリルセンを週１回投与することを含み、患者に、エテプリルセンの初回用量の前の少なくとも２４週間、経口コルチコステロイドが投与される、方法に関する。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明は、それを必要とする患者においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法であって、患者に約３０ｍｇ／ｋｇの単回用量のエテプリルセンを週１回静脈内に投与することを含み、患者が、ジストロフィン遺伝子のエキソン５１をスキッピングすることによって補正され得るアウトオブフレーム欠失（複数可）を有する、方法を提供する。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、それを必要とする患者においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法であって、患者に約５０ｍｇ／ｋｇの用量のエテプリルセンを週１回投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、エテプリルセンは、単回用量で投与される。いくつかの実施形態において、エテプリルセンは、静脈内に投与される。いくつかの実施形態において、患者は、ジストロフィン遺伝子のエキソン５１をスキッピングすることによって補正され得るアウトオブフレーム欠失（複数可）を有する。いくつかの実施形態において、患者は、小児科の患者である。また他の実施形態において、患者に、エテプリルセンの初回用量の前の少なくとも２４週間、経口コルチコステロイドが投与される。
【００２５】
別の態様において、本発明は、それを必要とする患者においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法であって、患者に約５０ｍｇ／ｋｇの単回用量のエテプリルセンを週１回患者に静脈内に投与することを含み、患者が、ジストロフィン遺伝子のエキソン５１をスキッピングすることによって補正され得るアウトオブフレーム欠失（複数可）を有する、方法に関する。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する患者においてジストロフィン産生を増大させる方法であって、患者に約３０ｍｇ／ｋｇの用量のエテプリルセンを週１回投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、週１回の約５０ｍｇ／ｋｇの用量のエテプリルセンが投与される。いくつかの実施形態において、エテプリルセンは、単回用量で投与される。いくつかの実施形態において、エテプリルセンは、静脈内に投与される。他の実施形態において、患者は、ジストロフィン遺伝子のエキソン５１をスキッピングすることによって補正され得るアウトオブフレーム欠失（複数可）を有する。いくつかの実施形態において、患者は、小児科の患者である。他の実施形態において、患者に、エテプリルセンの初回用量の前の少なくとも２４週間、経口コルチコステロイドが投与される。
【００２７】
したがって、本発明は、標的領域に特異的にハイブリダイズし、エキソンスキッピングを誘発し、それによって、疾患を処置する、ヒトジストロフィン遺伝子のエキソンにおける標的領域に相補的な少なくとも１０の連続したヌクレオチドを含む長さが２０〜５０のヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与することによって、患者においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を処置する方法に関する。一実施形態において、有効量は、被験体におけるジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％へと増加させ、健康な同等の人と比べて患者において、例えば、６ＭＷＴにおける２０％の不足から歩行距離を安定化し、維持し、または改善させるのに十分な期間、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態において、有効量は、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。さらに別の実施形態において、有効量は、約３０ｍｇ／ｋｇまたは約５０ｍｇ／ｋｇである。
【００２８】
別の態様において、有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間、または少なくとも４８週間、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、それによって、被験体におけるジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％へと増加させ、健康な同等の人と比べて患者において、例えば、６ＭＷＴにおける２０％の不足から歩行距離を安定化し、または改善させる。一実施形態において、処置は、患者において正常の２０〜６０％、または３０〜５０％にジストロフィン陽性線維の数を増加させる。いくつかの実施形態において、処置は、週１回の注入によるなど全身投与による。他の実施形態において、処置は、別の治療剤、例えば、ステロイドを被験体に投与することを含む。
【００２９】
別の態様において、本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子のエキソンにおける標的領域に相補的な少なくとも１０の連続したヌクレオチドを含む長さが２０〜５０のヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの組成物を投与することによって、患者においてＤＭＤまたはＢＭＤを処置する方法を提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的領域に特異的にハイブリダイズし、エキソンスキッピングを誘発し、それによって被験体を処置する。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、実質的に荷電していない。別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つのサブユニットのモルホリノ窒素と隣接するサブユニットの５’環外炭素とを接合するリン含有サブユニット間連結によって連結しているモルホリノサブユニットを含む。さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つのサブユニットのモルホリノ窒素と隣接するサブユニットの５’環外炭素とを接合する実質的に荷電していないリン含有サブユニット間連結によって連結しているモルホリノサブユニットを含む。他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノサブユニットおよびホスホロジアミデートサブユニット間連結を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキソン５１、エキソン５０、エキソン５３、エキソン４５、エキソン４６、エキソン４４、エキソン５２、エキソン５５およびエキソン８からなる群から選択される、ヒトジストロフィン遺伝子のエキソンにおける標的領域に相補的な、少なくとも１０、１２、１５、１７、または２０の連続したヌクレオチドを含む長さが２０〜５０、３０〜５０、または２０〜３０のヌクレオチドである。一実施形態において、アンチセンスは、長さが２０〜５０、３０〜５０、または２０〜３０のヌクレオチドであり、少なくとも２０の連続したヌクレオチドであるエテプリルセン（配列番号１０００）を含む。別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが２０〜５０、３０〜５０、または２０〜３０のヌクレオチドであり、配列番号１００１、配列番号１００２、配列番号１００３、配列番号１００４、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７、または配列番号１００８として記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１０、１２、１５、１７、または２０の連続したヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが２０〜５０、３０〜５０、または２０〜３０のヌクレオチドであり、表３および４に記載されているヌクレオチド配列の少なくとも１０、１２、１５、１７、または２０の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のウラシル塩基は、任意選択でチミン塩基である。
【００３１】
一実施形態において、組成物は、エテプリルセン（配列番号１０００）、および任意選択で、薬学的に許容される担体を含む。別の実施形態において、組成物は、配列番号１０００〜１００８、例えば、配列番号１０００、配列番号１００１、配列番号１００２、配列番号１００３、配列番号１００４、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７、および配列番号１００８からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表３および４において記載されているヌクレオチド配列の任意の１つまたは組合せであり、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のウラシル塩基は、任意選択でチミン塩基である。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取込みを増強する１つまたは複数の部分または結合体、例えば、アルギニンに富んだペプチドに化学的に連結する。
【００３２】
別の態様において、本発明は、被験体におけるジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも約２０％へと増加させ、健康な同等の人と比べて患者において、例えば、６ＭＷＴにおける２０％の不足から歩行距離を安定化し、または改善させるのに十分な期間、エテプリルセン（配列番号１０００）を含む少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの組成物を投与することによって、患者においてＤＭＤまたはＢＭＤを処置する方法を提供する。別の実施形態において、有効量は、エテプリルセン（配列番号１０００）、および任意選択で、薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水を含む、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの組成物である。
【００３３】
別の態様において、エテプリルセン（配列番号１０００）を含む組成物の有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間、または少なくとも４８週間、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、それによって、被験体におけるジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％へと増加させ、健康な同等の人と比べて患者において、例えば、６ＭＷＴにおける２０％の不足から歩行距離を安定化し、または改善させる。いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、処置なしで予想される歩行運動の喪失を遅延させ、または低減させる。いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、患者において安定的な歩行距離を安定化し、維持し、または増加させる。例えば、処置は、患者において安定的な歩行距離をベースラインから、３メートル超、５メートル超、６メートル超、７メートル超、８メートル超、９メートル超、１０メートル超、１５メートル超、２０メートル超、２５メートル超、３０メートル超または５０メートル超（中間の全ての整数を含めた）へと増加し得る。
【００３４】
本発明の他の態様は、ＤＭＤを有する患者において処置なしで予想される進行性呼吸筋機能障害および／または不全を遅延させ、または低減させる本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、エテプリルセンによる処置に関する。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、処置なしで予想される人工呼吸による補助の必要性を低減または排除し得る。一実施形態において、疾患の経過を追跡するための呼吸機能の測定、および有望な治療的介入の評価には、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）および努力肺活量（ＦＶＣ）が含まれる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置を必要とする患者においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するための方法であって、前記患者に約３０ｍｇ／ｋｇの用量のエテプリルセンを週１回投与することを含む、方法。
（項目２）
エテプリルセンが、単回用量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目３）
エテプリルセンが、静脈内に投与される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記患者が、ジストロフィン遺伝子のエキソン５１をスキッピングすることによって補正され得るアウトオブフレーム欠失（複数可）を有する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記患者が、小児科の患者である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記患者に、エテプリルセンの初回用量の前の少なくとも２４週間、経口コルチコステロイドが投与される、項目１に記載の方法。
（項目７）
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置を必要とする患者においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するための方法であって、前記患者に約３０ｍｇ／ｋｇの単回用量のエテプリルセンを週１回静脈内に投与することを含み、前記患者が、ジストロフィン遺伝子のエキソン５１をスキッピングすることによって補正され得るアウトオブフレーム欠失（複数可）を有する、方法。
（項目８）
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置を必要とする患者においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するための方法であって、前記患者に約５０ｍｇ／ｋｇの用量のエテプリルセンを週１回投与することを含む、方法。
（項目９）
エテプリルセンが、単回用量で投与される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
エテプリルセンが、静脈内に投与される、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記患者が、ジストロフィン遺伝子のエキソン５１をスキッピングすることによって補正され得るアウトオブフレーム欠失（複数可）を有する、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記患者が、小児科の患者である、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記患者に、エテプリルセンの初回用量の前の少なくとも２４週間、経口コルチコステロイドが投与される、項目８に記載の方法。
（項目１４）
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置を必要とする患者においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するための方法であって、前記患者に約５０ｍｇ／ｋｇの単回用量のエテプリルセンを週１回静脈内に投与することを含み、前記患者が、ジストロフィン遺伝子のエキソン５１をスキッピングすることによって補正され得るアウトオブフレーム欠失（複数可）を有する、方法。
（項目１５）
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する患者においてジストロフィン産生を増大させるための方法であって、前記患者に約３０ｍｇ／ｋｇの用量のエテプリルセンを週１回投与することを含む、方法。
（項目１６）
エテプリルセンが、単回用量で投与される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
エテプリルセンが、静脈内に投与される、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記患者が、ジストロフィン遺伝子のエキソン５１をスキッピングすることによって補正され得るアウトオブフレーム欠失（複数可）を有する、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記患者が、小児科の患者である、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記患者に、エテプリルセンの初回用量の前の少なくとも２４週間、経口コルチコステロイドが投与される、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する患者においてジストロフィン産生を増大させるための方法であって、前記患者に約５０ｍｇ／ｋｇの用量のエテプリルセンを週１回投与することを含む、方法。
（項目２２）
エテプリルセンが、単回用量で投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
エテプリルセンが、静脈内に投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記患者が、ジストロフィン遺伝子のエキソン５１をスキッピングすることによって補正され得るアウトオブフレーム欠失（複数可）を有する、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記患者が、小児科の患者である、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記患者に、エテプリルセンの初回用量の前の少なくとも２４週間、経口コルチコステロイドが投与される、項目２１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１−１】図１Ａは、ホスホロジアミデート連結を有する例示的なモルホリノオリゴマー構造を示す。
【図１−２】図１Ｂは、本発明の一実施形態によるアルギニンに富んだペプチドおよびアンチセンスオリゴマーの結合体を示す。
【図１−３】図１Ｃは、図１Ｂにおけるような結合体を示すが、骨格連結は、１つまたは複数の正に荷電している基を含有する。
【図１−４】図１Ｄ〜Ｇは、Ｄ〜Ｇと指定される例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの繰り返しサブユニットセグメントを示す。
【図２】図２は、ＤＭＤ患者を処置するための試験デザインの略図である。１２人のＤＭＤ患者は、二重盲検、プラセボ対照試験２０１において３つのコホートの１つに無作為化された。コホート１、エテプリルセン３０ｍｇ／ｋｇ／週；コホート２、エテプリルセン５０ｍｇ／ｋｇ／週；およびコホート３、プラセボ／遅延エテプリルセン。第２５週において、コホート３におけるプラセボで処置された患者は、３０ｍｇ／ｋｇ／週または５０ｍｇ／ｋｇ／週のエテプリルセンによるオープンラベル処置に切り替えた。患者は、オープンラベル延長試験２０２の元でエテプリルセンのこれらの同じ用量に維持された。筋生検。ジストロフィンの分析のために、患者はベースラインにおいて二頭筋生検、および第４８週において三角筋生検を受けた。さらなる二頭筋生検を、第１２週（コホート２における患者およびコホート３における２人の患者から）または第２４週（コホート１における患者およびコホート３における２人の患者から）において得た。有効性評価。６ＭＷＴを機能的帰結の尺度として使用し、処置前、および処置後１２週間毎に第４８週まで行った。
【図３】図３は、１２週間、２４週間、および４８週間のエテプリルセンの後のジストロフィン陽性筋線維を示す。パネルＡおよびＢは、処置群による第１２週、第２４週、および第４８週における、ジストロフィン陽性線維の百分率におけるベースラインからの平均絶対変化を示す。パネルＡにおいて、＊Ｐ値は、第１２週および第２４週からのプールした結果を使用した、エテプリルセンおよびプラセボの間の比較のためであり、等効果として処置による順位化されたデータについての共分散分析モデル、ならびに共変数としてベースライン値およびＤＭＤ診断からの時間に基づく。示される平均変化は、記述統計学に基づく。†Ｐ値は、第４８週の値とベースラインとを比較する対応のあるｔ検定からである。‡第１２週および第２４週において生検を行ったプラセボで処置された患者からの結果をプールする。§プラセボ／遅延エテプリルセン患者は、第２５週においてエテプリルセンを与えられ始め、第４８週において全部で２４の用量を与えられた。略語：ＢＬ＝ベースライン；ＮＡ＝適用せず；ＮＤ＝実施せず；ＮＳ＝有意差なし；ＳＥ＝標準誤差。
【図４−１】図４は、ジストロフィンと関連する糖タンパク質複合体に対するエテプリルセンの効果を示す。（Ａ）全ての試験参加患者に対する処置と関連した、ジストロフィン陽性線維の時間依存的な増加の代表例。（Ｂ）ＤＭＤ（ａ）および正常な（ｃ）対照患者（試験には存在しない）から、ならびにベースライン（ｂ）および第４８週（ｄ）における患者６からの筋肉におけるｎＮＯＳμ染色は、エテプリルセンによるｎＮＯＳμ結合の回復を示す。第４８週における患者６におけるβ−サルコグリカン（ｅ）およびγ−サルコグリカン（ｆ）染色は、エテプリルセンによるサルコグリカン複合体の回復を示す。（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲは、患者１２の筋肉における処置後のスキッピング産物（２８９ｂｐ）を示す。
【図４−２】図４は、ジストロフィンと関連する糖タンパク質複合体に対するエテプリルセンの効果を示す。（Ａ）全ての試験参加患者に対する処置と関連した、ジストロフィン陽性線維の時間依存的な増加の代表例。（Ｂ）ＤＭＤ（ａ）および正常な（ｃ）対照患者（試験には存在しない）から、ならびにベースライン（ｂ）および第４８週（ｄ）における患者６からの筋肉におけるｎＮＯＳμ染色は、エテプリルセンによるｎＮＯＳμ結合の回復を示す。第４８週における患者６におけるβ−サルコグリカン（ｅ）およびγ−サルコグリカン（ｆ）染色は、エテプリルセンによるサルコグリカン複合体の回復を示す。（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲは、患者１２の筋肉における処置後のスキッピング産物（２８９ｂｐ）を示す。
【図５】図５は、エテプリルセンの機能的有効性を図によって示す。黒紫色のラインは、２０１の開始からエテプリルセンを与えられた６人の評価可能な患者についての、時間に亘る６ＭＷＴでの歩行した距離におけるベースラインからの変化を示す（第２４週またはそれを過ぎてその測定を行うことができなかった２人の少年は、この分析から除外された）。灰色のラインは、プラセボを最初の２４週間およびエテプリルセンを最後の２４週間に与えられた４人の患者についての、６ＭＷＴでの歩行した距離におけるベースラインからの変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の実施形態は、ヒトジストロフィン遺伝子においてエキソンスキッピングを誘発するように特に設計されているアンチセンス化合物を投与することによって、筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤおよびＢＭＤを処置する改善された方法に関する。ジストロフィンは筋機能においてきわめて重要な役割を果たしており、様々な筋肉に関連する疾患は、この遺伝子の変異した形態によって特徴付けられる。したがって、ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている改善された方法は、ヒトジストロフィン遺伝子の変異した形態、例えば、ＤＭＤおよびＢＭＤにおいて見出される変異したジストロフィン遺伝子においてエキソンスキッピングを誘発するために使用し得る。
【００３７】
変異によってもたらされる異常なｍＲＮＡスプライシング事象によって、これらの変異したヒトジストロフィン遺伝子は、欠陥のあるジストロフィンタンパク質を発現するか、または測定可能なジストロフィンを全く発現せず、これは様々な形態の筋ジストロフィーをもたらす状態である。この状態を治療するために、本発明のアンチセンス化合物は、変異したヒトジストロフィン遺伝子のプロセシングを受ける前のＲＮＡの選択された領域にハイブリダイズし、さもないと異常にスプライシングされるジストロフィンｍＲＮＡにおけるエキソンスキッピングおよび差次的なスプライシングを誘発し、それによって筋細胞が機能的ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を生じさせることを可能とする。ある特定の実施形態において、このように得られたジストロフィンタンパク質は、必ずしもジストロフィンの「野性型」形態ではないが、むしろ切断型であるが依然として機能的または半機能的形態のジストロフィンである。
【００３８】
筋細胞中の機能的ジストロフィンタンパク質のレベルを増加させることによって、これらおよび関連する実施形態は、筋ジストロフィー、特に、異常なｍＲＮＡスプライシングによる欠陥のあるジストロフィンタンパク質の発現によって特徴付けられる筋ジストロフィーのこれらの形態、例えば、ＤＭＤおよびＢＭＤの予防法および処置において有用である。本明細書に記載の方法は、筋ジストロフィーを有する患者のための改善された処置の選択肢をさらに提供し、筋ジストロフィーの関連性のある形態を処置する代替方法を超えてかなりの実際的な利点を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、改善された方法は、従前のアプローチより高い用量で、および／またはより長い持続期間、ヒトジストロフィン遺伝子においてエキソンスキッピングを誘発するための、アンチセンス化合物の投与に関する。
【００３９】
このように、本発明は、患者においてエキソンスキッピングを誘発することによって、筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤおよびＢＭＤを処置する改善された方法に関する。いくつかの実施形態において、エキソンスキッピングは、電荷的中性のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、例えば、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエキソン中の標的配列に選択的に結合するエテプリルセンを含む有効量の組成物を投与することによって誘発される。いくつかの実施形態において、本発明は、疾患を処置するのに十分な期間に亘って、本明細書に記載のアンチセンス、例えば、エテプリルセンを含む有効量、例えば、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇまたは約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの組成物でＤＭＤまたはＢＭＤを処置する方法に関する。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態は、ＤＭＤを処置するための疾患修飾治療としてエテプリルセンの使用に関する。理論に束縛されるものではないが、エテプリルセンによって現在までに見られる臨床的有効性は、その独特の化学組成によるその安全性プロファイルに由来し得、これは電荷的中性のホスホロジアミデート部分によって連結しているモルホリン環に結合したヌクレオチドによって特徴付けられる。
【００４１】
エテプリルセンで１年間処置されているＤＭＤ患者において、ジストロフィン陽性線維の平均百分率は、ベースラインに比べて正常の４７％に増加した。増加の規模は、処置の持続期間によって決まった。ジストロフィンレベルの有意な増加は、コホート１における患者（３０ｍｇ／ｋｇ）から採取した第２４週の生検材料において、およびコホート３における患者（エテプリルセンを第２５週において開始した）からの第４８週の生検材料において観察された。
【００４２】
エテプリルセンの臨床的利益は、エキソンスキッピングを誘発し、機能的ジストロフィン産生を回復させるその能力を反映した。臨床的効果を、個々の筋肉群における強さの評価を超える持久力および筋肉の能力の尺度である６ＭＷＴで評価した。最初から３０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのエテプリルセンを与えられた患者は、第１２週〜第２４週の間の新規なジストロフィン発現におけるエテプリルセンによって誘発される増加と一致して、４８週間に亘り安定的な歩行距離を維持した。対照的に、プラセボ／遅延エテプリルセンコホートにおける患者は、第３６週までに７０メートルを失ったが、第４８週（エテプリルセンを開始した２４週間後）までに安定化したようであった。これは、臨床的影響が、試験の開始から３０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのエテプリルセンを週１回与えられた患者において見られたのと同じ時間フレームである。両方のコホートは、下記のように１２０週に亘り安定的な６ＭＷＴの結果を維持した。
【００４３】
１２０週において、６ＭＷＴを行うことができた３０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇのエテプリルセンコホートにおける患者（修正された治療意図に基づく、またはｍＩＴＴ集団；ｎ＝６）は、歩行能力においてベースラインからの１３．９メートル、または５パーセント未満の僅かな低下を伴って、全体的な安定性を経験した。２４週間のプラセボに続いて第２５週において処置を開始したプラセボ／遅延処置コホート（ｎ＝４）と比較して、６４．９メートルの統計的に有意な処置の利益（ｐ≦０．００６）がｍＩＴＴ集団について観察された。試験においてより早期の実質的な低下を経験した後（エテプリルセン（ｅｔｉｐｌｅｒｓｅｎ）による処置の前）、プラセボ／遅延処置コホートはまた、第３６週から第１２０週に亘り１．５年超歩行能力の安定化を示し、この期間に、この時間フレームに亘って９．５メートルの低下を伴って、意味あるレベルのジストロフィンが恐らく産生された。試験が連続２日で行われたとき、これらの分析は、最大６ＭＷＴスコアに基づいた。
【００４４】
最大吸気圧および最大呼気圧（ＭＩＰおよびＭＥＰ）によって測定するような両方の投薬コホートにおける第１２０週までのベースラインからの呼吸筋機能は、ＭＩＰにおける１４．６パーセントの平均増加、およびＭＥＰにおける１５．０パーセントの平均増加を示した。予測されるＭＩＰパーセント（体重について調節したＭＩＰ）および予測されるＭＥＰパーセント（年齢について調節したＭＥＰ）の分析は、予測されるＭＩＰパーセントにおいてベースラインにおける９０．２パーセントから第１２０週における９５．２パーセントへの平均増加、および予測されるＭＥＰパーセントにおいてベースラインにおける７９．３パーセントから第１２０週における７９．６パーセントへの僅かな平均増加を示した。さらに、ベースラインから第１２０週への８．７パーセントの、肺気量の尺度である努力肺活量（ＦＶＣ）における平均増加が存在し、予測されるＦＶＣパーセント（年齢および身長について調節したＦＶＣ）は、ベースラインにおける１０１パーセント、および第１２０週における９３パーセントを伴って、第１２０週まで９０パーセントの平均超で維持された。
【００４５】
本発明は、疾患の基礎的原因に取り組むことによってＤＭＤの処置における主要な進展を示す、エテプリルセンの治療効果のエビデンスに少なくとも部分的に基づいている。したがって、本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子のエキソンにおける標的領域に相補的であり、標的領域に特異的にハイブリダイズし、エキソンスキッピングを誘発し、疾患を処置するアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、エテプリルセンを含む、有効量の組成物を投与することによる、患者においてＤＭＤまたはＢＭＤを処置する方法に関する。一実施形態において、処置は、それを必要とする被験体に、任意選択で、医薬製剤または剤形の部分として、１種または複数の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、表３および４において示すヌクレオチド配列）を投与することによる。処置は、有効量の１種または複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによって、被験体においてエキソンスキッピングを誘発することを含み、エキソンは、ジストロフィン遺伝子からのエキソン１〜７９の任意の１つまたは複数である。好ましくは、エキソンは、ヒトジストロフィン遺伝子からのエキソン４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６または８である。
【００４６】
他に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等である任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、下記の用語を、下記で定義する。
【００４７】
Ｉ．定義
「約」とは、参照の分量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％ほど変動する、分量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。
【００４８】
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列「Ｔ−Ｇ−Ａ（５’−３’）」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ（５’−３’）」に対して相補的である。相補性は、「部分的」であり得、ここでは、核酸の塩基のいくつかのみが、塩基対合則によってマッチする。あるいは、核酸の間に「完全な」または「全体的」相補性が存在し得る。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して有意な効果を有する。完全な相補性が所望であることが多い一方で、いくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに関して、１つまたは複数ではあるが、好ましくは６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つのミスマッチを含むことができる。オリゴマー内の任意の場所におけるバリエーションが含まれる。ある特定の実施形態において、オリゴマーの末端近くの配列におけるバリエーションは一般に、内部におけるバリエーションより好ましく、存在する場合、典型的には、５’端および／または３’端の約６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチド以内である。
【００４９】
「細胞透過性ペプチド」および「ＣＰＰ」という用語は互換的に使用され、輸送ペプチド、担体ペプチド、またはペプチド伝達ドメインとまた称されるカチオン性細胞透過性ペプチドを指す。ペプチドは、本明細書に示されているように、所与の細胞培養集団の細胞の１００％以内の細胞透過を誘発する能力を有し、全身投与によってインビボで複数の組織内での巨大分子のトランスロケーションを可能とする。好ましいＣＰＰの実施形態は、下記でさらに記載されているようなアルギニンに富んだペプチドである。
【００５０】
「アンチセンスオリゴマー」および「アンチセンス化合物」および「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、環状サブユニットの配列を指し、これはそれぞれが、サブユニット間連結によって連結される塩基対合部分を担持し、サブユニット間連結は、塩基対合部分がワトソン−クリック塩基対合によって核酸（典型的にはＲＮＡ）中の標的配列にハイブリダイズし、標的配列内で核酸：オリゴマーヘテロ二重鎖を形成することを可能とする。環状サブユニットは、リボースもしくは別のペントース糖、または好ましい実施形態において、モルホリノ基（下記のモルホリノオリゴマーの記載を参照されたい）をベースとする。オリゴマーは、標的配列と相補性な正確または近似の配列を有し得る。オリゴマーの末端近くの配列におけるバリエーションは一般に、内部におけるバリエーションより好ましい。
【００５１】
このようなアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳をブロックもしくは阻害するか、または天然のプレｍＲＮＡスプライスプロセシングを阻害するように設計することができ、このようなアンチセンスオリゴマーは、ハイブリダイズする標的配列に「向けられ」または「標的として」いると言われてもよい。標的配列は典型的には、ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドン、翻訳抑制オリゴマー、またはプロセシングを受ける前のｍＲＮＡのスプライス部位、スプライシング抑制オリゴマー（ＳＳＯ）を含めた領域である。スプライス部位のための標的配列は、プロセシングを受ける前のｍＲＮＡ中の通常のスプライスアクセプタージャンクションの１〜約２５塩基対下流にその５’端を有するｍＲＮＡ配列を含み得る。好ましい標的配列は、スプライス部位を含むプロセシングを受ける前のｍＲＮＡの任意の領域であるか、またはエキソンコード配列内に完全に含有され、またはスプライスアクセプターもしくはドナー部位にまたがる。オリゴマーが上記の様式で標的の核酸を標的としているとき、オリゴマーはより一般に、生物学的に関連する標的、例えば、タンパク質、ウイルス、または細菌を「標的として」いると言われる。
【００５２】
「モルホリノオリゴマー」または「ＰＭＯ」（ホスホロアミデートモルホリノオリゴマーまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー）という用語は、モルホリノサブユニット構造から構成されるオリゴヌクレオチド類似体を指し、（ｉ）構造は、１〜３個の原子長、好ましくは２個の原子長であり、好ましくは荷電していないか、またはカチオン性であり、１つのサブユニットのモルホリノ窒素と隣接するサブユニットの５’環外炭素とを接合する、リン含有連結によって一緒に連結されており、（ｉｉ）各モルホリノ環は、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリンまたはピリミジン塩基対合部分を担持する。例えば、好ましいホスホロジアミデート連結タイプを示す図１Ａにおける構造を参照されたい。バリエーションが結合または活性を妨害しない限り、この連結に対してバリエーションを作製することができる。例えば、リンに付着している酸素は、硫黄で置換され得る（チオホスホロジアミデート）。５’酸素は、アミノまたは低級アルキル置換アミノで置換されていてもよい。リンに付着しているペンダント窒素は、置換されていないか、（任意選択で置換されている）低級アルキルで一置換、または二置換されていてもよい。プリンまたはピリミジン塩基対合部分は典型的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミンまたはイノシンである。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特徴は、これらの全てが参照により本明細書中に組み込まれている米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号、同第８，２９９，２０６号および同第７，９４３，７６２号（カチオン性連結）において詳述されている。修飾されたサブユニット間連結および末端基は、これらの全内容が参照により本明細書中に組み込まれているＰＴＣ出願ＵＳ２０１１／０３８４５９および公報ＷＯ／２０１１／１５０４０８において詳述されている。
【００５３】
「ＡＶＮ−４６５８」としてもまた公知の「エテプリルセン」は、塩基配列５’−ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ−３’（配列番号１０００）を有するＰＭＯである。エテプリルセンは、ＣＡＳ登録番号１１７３７５５−５５−９で登録されている。化学名は、以下：
ＲＮＡ，［Ｐ−デオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）］（２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコ）（２’ａ→５’）（Ｃ−ｍ５Ｕ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−ｍ５Ｕ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−ｍ５Ｕ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−ｍ５Ｕ−ｍ５Ｕ−ｍ５Ｕ−Ｃ−ｍ５Ｕ−Ａ−Ｇ），５’−［Ｐ−［４−［［２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］カルボニル］−１−ピペラジニル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルホスホンアミデート］、および
Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−５’−Ｏ−｛Ｐ−［４−（１０−ヒドロキシ−２，５，８−トリオキサデカノイル）ピペラジン−１−イル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルホスホンアミドイル｝−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコグアニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコグアニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコグアニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコグアニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコグアニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコグアノシン
を含む。
【００５４】
エテプリルセンは、下記の構造：
【００５５】
【化１】
2019108349.tif 000002
を有する。
【００５６】
「アミノ酸サブユニット」または「アミノ酸残基」は、α−アミノ酸残基（−ＣＯ−ＣＨＲ−ＮＨ−）またはβ−アミノ酸残基または他のアミノ酸残基（例えば、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎＣＨＲ−ＮＨ−）を指すことができ、Ｒは、側鎖（水素を含み得る）であり、ｎは、１〜６、好ましくは１〜４である。
【００５７】
「天然アミノ酸」という用語は、天然に見出されるタンパク質中に存在するアミノ酸を指す。「非天然アミノ酸」という用語は、天然に見出されるタンパク質において存在しないアミノ酸を指し、例には、ベータ−アラニン（β−Ａｌａ）、６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）および６−アミノペンタン酸を含む。
【００５８】
「エキソン」は、タンパク質をコードする核酸の規定されたセクション、またはプロセシングを受ける前の（または前駆体）ＲＮＡのいずれかの一部がスプライシングによって除去された後の成熟形態のＲＮＡ分子において示される核酸配列を指す。成熟ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または機能的形態の非コードＲＮＡ、例えば、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡでよい。ヒトジストロフィン遺伝子は、約７９のエキソンを有する。
【００５９】
「イントロン」は、タンパク質に翻訳されない核酸領域（遺伝子内）を指す。イントロンは、ｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）に転写され、それに続いて成熟ＲＮＡの形成の間にスプライシングによって除去される非コードセクションである。
【００６０】
「有効量」または「治療有効量」は、単回用量として、または一連の用量の一部として、所望の治療効果を生じさせるのに有効な、ヒト被験体に投与される治療化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの量を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、この効果は典型的には、選択した標的配列の翻訳または天然のスプライス−プロセシングを阻害することによってもたらされる。いくつかの実施形態において、有効量は、被験体を処置するある期間、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物である。一実施形態において、有効量は、被験体におけるジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％へと増加させる、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物である。別の実施形態において、有効量は、健康な同等の人と比べて患者において、例えば、６ＭＷＴにおける２０％の不足から歩行距離を安定化し、維持し、または改善させる、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物である。別の実施形態において、有効量は、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。さらに別の実施形態において、有効量は、約３０ｍｇ／ｋｇまたは約５０ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間、または少なくとも４８週間、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、それによって、被験体におけるジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％へと増加させ、健康な同等の人と比べて患者において、例えば、６ＭＷＴにおける２０％の不足から歩行距離を安定化し、または改善させる。一実施形態において、処置は、患者においてジストロフィン陽性線維の数を正常の２０〜６０％、または３０〜５０％へと増加させる。
【００６１】
「エキソンスキッピング」は一般に、全エキソン、またはその一部が、所与のプロセシングを受ける前のＲＮＡから除去され、それによって成熟ＲＮＡ、例えば、タンパク質に翻訳される成熟ｍＲＮＡにおいて存在することから除外されるプロセスを指す。したがって、スキッピングされるエキソンによって別途コードされるタンパク質の一部は、タンパク質の発現した形態において存在せず、典型的には変化してはいるがまだ機能的形態であるタンパク質を生じさせる。ある特定の実施形態において、スキッピングされるエキソンは、異常なスプライシングをさもないともたらすその配列における変異または他の変化を含有し得る、ヒトジストロフィン遺伝子からの異常なエキソンである。ある特定の実施形態において、スキッピングされるエキソンは、ヒトジストロフィン遺伝子のエキソン１〜７９（例えば、３−８、１０−１６、１９−４０、４２−４７および５０−５５）の任意の１つまたは複数であるが、ヒトジストロフィン遺伝子のエキソン４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および８が好ましい。
【００６２】
「ジストロフィン」は、ロッド形状の細胞質タンパク質であり、筋線維の細胞骨格と周囲の細胞外マトリックスとを細胞膜を介して接続するタンパク質複合体の非常に重要な部分である。ジストロフィンは、複数の機能的ドメインを含有する。例えば、ジストロフィンは、約アミノ酸１４〜２４０においてアクチン結合ドメイン、および約アミノ酸２５３〜３０４０において中央ロッドドメインを含有する。この大きな中央ドメインは、約１０９アミノ酸の２４スペクトリン様三重らせんエレメントによって形成され、これはアルファ−アクチニンおよびスペクトリンとの相同性を有する。リピートは典型的には、またヒンジ領域と称される４つのプロリンに富んだ非リピートセグメントによって中断される。リピート１５および１６は、ジストロフィンのタンパク質分解性切断のための主要な部位を提供するように思われる１８アミノ酸のストレッチによって分離されている。大部分のリピートの間の配列同一性は、１０〜２５％の範囲である。１つのリピートは、３つのアルファ−ヘリックス：１、２および３を含有する。アルファ−ヘリックス１および３はそれぞれ、７つのヘリックスターンによって形成され、疎水性界面によってコイルドコイルとしておそらく相互作用する。アルファ−ヘリックス２はより複雑な構造を有し、グリシンまたはプロリン残基によって分離される４つおよび３つのヘリックスターンのセグメントによって形成される。各リピートは２つのエキソンによってコードされ、アルファ−ヘリックス２の最初の部分におけるアミノ酸４７および４８の間のイントロンによって典型的には中断される。他のイントロンは、リピートにおける異なる位置において見出され、ヘリックス−３に亘って通常点在している。ジストロフィンはまた、約アミノ酸３０８０〜３３６０において、システインに富んだセグメント（すなわち、２８０アミノ酸中の１５システイン）を含めてシステインに富んだドメインを含有し、粘菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のアルファ−アクチニンのＣ末端ドメインとの相同性を示す。カルボキシ末端ドメインは、ほぼアミノ酸３３６１〜３６８５において存在する。
【００６３】
ジストロフィンのアミノ末端はＦ−アクチンに結合し、カルボキシ末端は筋細胞膜においてジストロフィンが関連するタンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に結合する。ＤＡＰＣは、ジストログリカン、サルコグリカン、インテグリンおよびカベオリンを含み、これらの構成要素のいずれかにおける変異は、常染色体性遺伝した筋ジストロフィーをもたらす。ジストロフィンが存在しないときＤＡＰＣは不安定化し、これはメンバータンパク質のレベルの減少をもたらし、進行性の線維損傷および膜漏出に至る。様々な形態の筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）において、筋細胞は、主に遺伝子配列における変異（これは不正確なスプライシングをもたらす）によって、変化した機能的に欠陥のある形態のジストロフィンを産生するか、またはジストロフィンを全く産生しない。欠陥のあるジストロフィンタンパク質の優勢な発現、またはジストロフィンもしくはジストロフィン様タンパク質の完全な欠乏は、上で述べたように筋変性の急速な進行をもたらす。これに関しては、「欠陥のある」ジストロフィンタンパク質は、当技術分野において公知のようにＤＭＤもしくはＢＭＤを有する特定の被験体において産生されるジストロフィンの形態によって、または検出可能なジストロフィンが存在しないことによって特徴付けられ得る。
【００６４】
本明細書において使用する場合、「機能」および「機能的」などという用語は、生物学的、酵素的、または治療的機能を指す。
【００６５】
「機能的」ジストロフィンタンパク質は一般に、典型的にはＤＭＤまたはＢＭＤを有する特定の被験体において存在するジストロフィンタンパク質の変化した、または「欠陥のある」形態と比較して、別途筋ジストロフィーの特徴である筋組織の進行性の分解を低減させるのに十分な生物活性を有するジストロフィンタンパク質を指す。ある特定の実施形態において、機能的ジストロフィンタンパク質は、当技術分野で通例の技術によって測定して、野性型ジストロフィンのインビトロまたはインビボでの生物活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％（中間の全ての整数を含めた）を有し得る。一例として、筋肉培養物におけるインビトロでのジストロフィンに関連する活性は、筋管サイズ、筋原線維の組織化（または解体）、収縮能、およびアセチルコリン受容体の自発的クラスター形成によって測定することができる（例えば、Ｂｒｏｗｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１２巻：２０９〜２１６頁、１９９９年を参照されたい）。動物モデルはまた、疾患の病因を研究するための貴重なリソースであり、ジストロフィンに関連する活性を試験する手段を提供する。ＤＭＤ研究のために最も広範に使用される動物モデルの２つは、ｍｄｘマウスおよびゴールデンレトリーバ筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）イヌであり、これらの両方は、ジストロフィンネガティブである（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＆  Ｍｏｒｇａｎ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ、８４巻：１６５〜１７２頁、２００３年を参照されたい）。これらおよび他の動物モデルを使用して、様々なジストロフィンタンパク質の機能的活性を測定することができる。含まれるのは、ジストロフィンの切断型、例えば、特定の本発明のエキソンスキッピングアンチセンス化合物によって産生される形態である。
【００６６】
ジストロフィン合成または産生の「回復」という用語は一般に、本明細書に記載のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置に続いて、筋ジストロフィーを有する患者におけるジストロフィンの切断型を含めたジストロフィンタンパク質の産生を指す。いくつかの実施形態において、処置は、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（中間の全ての整数を含めた）の、患者における新規なジストロフィン産生の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、被験体におけるジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％〜１００％へと増加させる。他の実施形態において、処置は、被験体におけるジストロフィン陽性線維の数を正常の約２０％〜約６０％、または約３０％〜約５０％へと増加させる。処置に続く患者におけるジストロフィン陽性線維のパーセントは、公知の技術を使用して筋生検によって決定することができる。例えば、筋生検は、患者における適切な筋肉、例えば、上腕二頭筋から採取し得る。
【００６７】
陽性ジストロフィン線維の百分率の分析は、処置前および／もしくは処置後、または処置の経過に亘る時点において行い得る。いくつかの実施形態において、処置後の生検は、処置前の生検と反対側の筋肉から採取する。処置前および処置後のジストロフィン発現試験は、ジストロフィンのための任意の適切なアッセイを使用して行い得る。一実施形態において、免疫組織化学の検出は、ジストロフィンのためのマーカー、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である抗体を使用して、筋生検からの組織切片で行う。例えば、ジストロフィンのための高度に感受性のマーカーであるＭＡＮＤＹＳ１０６抗体を使用することができる。任意の適切な二次抗体を使用し得る。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ジストロフィン陽性線維パーセントは、陽性線維の数を計数した総線維で割ることによって計算される。正常な筋肉試料は、１００％ジストロフィン陽性線維を有する。したがって、ジストロフィン陽性線維パーセントは、正常に対する百分率として表すことができる。処置前の筋肉における微量レベルのジストロフィン、および復帰突然変異線維の存在について調節するために、ベースラインは、処置後の筋肉におけるジストロフィン陽性線維を計数するとき、各患者からの処置前の筋肉の切片を使用して設定することができる。これは、その患者における処置後の筋肉の切片におけるジストロフィン陽性線維を計数するための閾値として使用し得る。他の実施形態において、抗体染色した組織切片はまた、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像分析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を使用したジストロフィンの定量化のために使用することができる。総ジストロフィン蛍光シグナル強度は、正常に対する百分率として報告することができる。さらに、モノクローナルまたはポリクローナル抗ジストロフィン抗体によるウエスタンブロット分析を使用して、ジストロフィン陽性線維の百分率を決定することができる。例えば、Ｎｏｖａｃａｓｔｒａからの抗ジストロフィン抗体ＮＣＬ−Ｄｙｓ１を使用することができる。ジストロフィン陽性線維の百分率はまた、サルコグリカン複合体（β、γ）および／または神経型ＮＯＳの成分の発現を決定することによって分析することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、エテプリルセンによる処置は、処置なしで予想されるＤＭＤを有する患者における進行性呼吸筋機能障害および／または不全を遅延させ、または低減させる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、処置なしで予想される人工呼吸による補助の必要性を低減または排除し得る。一実施形態において、疾患の経過を追跡するための呼吸機能の測定、および有望な治療的介入の評価には、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）および努力肺活量（ＦＶＣ）が含まれる。ＭＩＰおよびＭＥＰは、人がそれぞれ、吸入および呼息の間に生じさせることができる圧力のレベルを測定し、呼吸筋の強さについての感受性の尺度である。ＭＩＰは、横隔膜筋力低下の尺度である。
【００７０】
一実施形態において、ＭＥＰは、ＭＩＰおよびＦＶＣを含めた他の肺機能試験における変化の前に低下し得る。別の実施形態において、ＭＥＰは、呼吸機能障害の早期の指標であり得る。別の実施形態において、ＦＶＣを使用して、最大吸気の後の努力性呼息の間に排出される空気の総容量を測定し得る。ＤＭＤを有する患者において、ＦＶＣは、１０代前半まで身体的成長と随伴して増加する。しかし、成長が遅延し、または疾患の進行に発育阻止され、筋力低下が進行するにつれ、肺活量は下降相に入り、１０〜１２歳以降は１年当たり約８〜８．５パーセントの平均速度で低下する。別の実施形態において、予測されるＭＩＰパーセント（体重について調節したＭＩＰ）、予測されるＭＥＰパーセント（年齢について調節したＭＥＰ）ならびに予測されるＦＶＣパーセント（年齢および身長について調節したＦＶＣ）は、支持的分析である。
【００７１】
「単離した」とは、その天然の状態において材料に通常伴う構成要素が実質的または本質的にない材料を意味する。例えば、「単離したポリヌクレオチド」は、本明細書において使用する場合、天然の状態においてポリヌクレオチドに隣接する配列から精製または取り出されたポリヌクレオチド、例えば、フラグメントに通常隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを指し得る。
【００７２】
本明細書において使用する場合、「十分な長さ」とは、標的ジストロフィンプレｍＲＮＡにおける少なくとも８、より典型的には８〜３０の連続的な核酸塩基に対して相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、十分な長さのアンチセンスは、標的ジストロフィンプレｍＲＮＡにおいて少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の連続的な核酸塩基を含む。他の実施形態において、十分な長さのアンチセンスは、標的ジストロフィンプレｍＲＮＡ中に少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の連続した核酸塩基を含む。十分な長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ジストロフィン遺伝子のエキソン１〜７９の任意の１つまたは複数に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも最小数のヌクレオチドを有する。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子のエキソン４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６または８の任意の１つまたは複数に特異的にハイブリダイズすることができる最小数のヌクレオチドを有する。好ましくは、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０またはそれより多いヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含めた、長さが約１０〜約５０のヌクレオチドである。一実施形態において、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、長さが１０〜約３０のヌクレオチドである。別の実施形態において、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、長さが１５〜約２５のヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、長さが２０〜３０、または２０〜５０のヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、長さが２５〜２８のヌクレオチドである。
【００７３】
「増強する」もしくは「増強すること」または「増大する」もしくは「増大すること」または「刺激する」もしくは「刺激すること」とは一般に、アンチセンス化合物なしまたは対照化合物によってもたらされる反応と比較して、細胞または被験体においてより大きな生理学的反応（すなわち、下流の効果）を生じさせるか、またはもたらす１つまたは複数のアンチセンス化合物または組成物の能力を指す。測定可能な生理学的反応は、当技術分野における理解および本明細書における記載から明らかな他の反応の中で、筋組織における機能的形態のジストロフィンタンパク質の発現の増大、またはジストロフィンに関連する生物活性の増大を含み得る。約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％だけの筋機能における増大または改善を含めて、筋機能の増大はまた測定することができる。筋線維の約１％、２％、％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％におけるジストロフィン発現の増大を含めて、機能的ジストロフィンを発現している筋線維の百分率をまた測定することができる。例えば、線維の２５〜３０％が、ジストロフィンを発現している場合、概ね４０％の筋機能の改善が起こり得ることが示されてきた（例えば、ＤｅｌｌｏＲｕｓｓｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９巻：１２９７９〜１２９８４頁、２００２年を参照されたい）。「増大された」または「増強された」量は典型的には、「統計的に有意な」量であり、アンチセンス化合物なし（薬剤が存在しないこと）または対照化合物によってもたらされる量の１．１倍、１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれを超える（例えば、５００倍、１０００倍）（１の間および１を超える全ての整数および小数点を含めた、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）である増大を含み得る。
【００７４】
「低減する」または「阻害する」という用語は、診断の技術分野における通例の技術によって測定して、関連する生理学的反応または細胞反応、例えば、本明細書に記載されている疾患もしくは状態の症状を「減少させる」１種または複数の本発明のアンチセンス化合物の能力に関し得る。関連する生理学的反応または細胞反応（インビボもしくはインビトロ）は、当業者には明らかであり、筋ジストロフィーの症状もしくは病理学における低減、または欠陥のある形態のジストロフィン、例えば、ＤＭＤもしくはＢＭＤを有する個体において発現している変化した形態のジストロフィンの発現における低減を含み得る。反応における「減少」は、非アンチセンス化合物または対照組成物によって生じる反応と比較して統計的に有意であり得、中間の全ての整数を含めた、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少を含み得る。
【００７５】
また含まれるのは、本発明のオリゴマーのジストロフィン標的化配列を発現することができるベクター送達系、例えば、本明細書に記載のような表３および４に示される配列およびその改変体の任意の１つまたは複数を含むポリヌクレオチド配列を発現するベクターである。「ベクター」または「核酸構築物」とは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、酵母またはウイルスに由来し、ポリヌクレオチドがその中に挿入またはクローニングすることができる、ポリヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡ分子を意味する。ベクターは好ましくは、１つまたは複数の独特な制限部位を含有し、標的細胞もしくは組織または前駆細胞もしくはその組織を含めた規定された宿主細胞において自律複製することができるか、あるいはクローニングされた配列が、再現性があるように確定した宿主のゲノムと組み込まれ得る。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製と無関係である染色体外実体として存在するベクター、例えば、直鎖状もしくは閉環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体でよい。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有することができる。代わりに、ベクターは、宿主細胞中に導入されたとき、ゲノム中に組み込まれ、かつその中にベクターが組み込まれている染色体（複数可）と一緒に複製されるものでよい。
【００７６】
個体（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）または細胞の「処置」は、個体または細胞の自然の成り行きを変化させる試みにおいて使用される任意のタイプの介入である。処置には、これらに限定されないが、医薬組成物の投与が含まれ、予防的に、または病的事象の開始もしくは病原体との接触に続いて行い得る。処置は、特定の形態の筋ジストロフィーにおけるように、ジストロフィンタンパク質と関連する疾患または状態の症状または病理学に対して任意の望ましい効果を含み、例えば、処置される疾患または状態の１つまたは複数の測定可能なマーカーにおける最小の変化または改善を含み得る。また含まれるのは、処置されている疾患もしくは状態の進行の速度を低減させ、その疾患もしくは状態の発症を遅延するか、またはその発症の重症度を低減させることに向けることができる「予防的」処置である。「処置」または「予防法」は、疾患もしくは状態、またはその関連する症状の完全な根絶、治癒、または予防を必ずしも示さない。
【００７７】
一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、新規なジストロフィン産生を増大させ、処置なしで予想される歩行運動の喪失を遅延させ、または低減させる。例えば、処置は、被験体において歩行能力（例えば、歩行運動の安定化）を安定化し、維持し、改善させ、または増加させ得る。いくつかの実施形態において、処置は、例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄら（参照により本明細書中に組み込まれているＭｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、２０１０年；４２巻：９６６〜７４頁）によって記載されている６分歩行試験（６ＭＷＴ）によって測定するような、患者における安定的な歩行距離を維持または増加させる。６分歩行距離（６ＭＷＤ）における変化は、絶対値、百分率の変化または予測値％の変化として表し得る。いくつかの実施形態において、処置は、６ＭＷＴにおいて、健康な同等の人と比べて被験体において２０％の不足から、安定的な歩行距離を維持し、または改善させる。健康な同等の人の典型的な成績と比べた６ＭＷＴにおけるＤＭＤ患者の成績は、予測値％を計算することによって決定することができる。例えば、予測６ＭＷＤ％は、男性についての下記の等式：１９６．７２＋（３９．８１×年齢）−（１．３６×年齢２）＋（１３２．２８×身長、メートル）を使用して計算し得る。女性について、予測６ＭＷＤ％は、下記の等式：１８８．６１＋（５１．５０×年齢）−（１．８６×年齢２）＋（８６．１０×身長、メートル）を使用して計算し得る（参照により本明細書中に組み込まれているＨｅｎｒｉｃｓｏｎら、ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．、２０１２年、第２版）。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、患者において、ベースラインから３メートル超、５メートル超、６メートル超、７メートル超、８メートル超、９メートル超、１０メートル超、１５メートル超、２０メートル超、２５メートル超、３０メートル超または５０メートル超（中間の全ての整数を含めた）に安定的な歩行距離を増加させる。
【００７８】
ＤＭＤを有する患者における筋機能の喪失は、正常な小児期の成長および発育のバックグラウンドに対して起こり得る。実際に、ＤＭＤを有するより若年の小児は、進行性の筋肉の機能低下に関わらず約１年に亘って６ＭＷＴの間に歩行した距離の増加を示し得る。いくつかの実施形態において、ＤＭＤを有する患者からの６ＭＷＤを、典型的に発育している対照被験体と、年齢および性別がマッチした被験体からの現存する規範的データと比較する。いくつかの実施形態において、正常な成長および発育は、規範的データにフィットさせた年齢および身長をベースとした等式を使用して説明することができる。このような等式を使用して、ＤＭＤを有する被験体において６ＭＷＤを予測されるパーセント（予測される％）値に変換することができる。ある特定の実施形態において、予測６ＭＷＤ％データの分析は、正常な成長および発育を説明する方法を表し、早期の年齢（例えば、７歳と等しい、またはこれ未満）において機能を得ることは、ＤＭＤを有する患者において改善する能力よりはむしろ安定的な能力を表すことを示し得る（参照により本明細書中に組み込まれているＨｅｎｒｉｃｓｏｎら、ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．、２０１２年、第２版）。
【００７９】
「被験体」は、本明細書において使用する場合、本発明のアンチセンス化合物で処置することができる、症状を示すか、または症状を示す危険性がある任意の動物を含み、例えば、ＤＭＤもしくはＢＭＤ、またはこれらの状態と関連する症状のいずれか（例えば、筋線維の喪失）を有するか、または有する危険性がある被験体である。適切な被験体（患者）は、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、もしくはモルモット）、家畜、および家庭の動物またはペット（例えば、ネコもしくはイヌ）を含む。ヒトではない霊長類、および好ましくは、ヒト患者が含まれる。
【００８０】
「小児科の患者」は、本明細書において使用する場合、１〜２１歳（両端を含む）の患者である。
【００８１】
「アルキル」または「アルキレン」は両方とも、１〜１８個の炭素を含有する飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。例には、これらに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルが含まれる。「低級アルキル」という用語は、１〜８個の炭素を含有する本明細書に定義されているようなアルキル基を指す。
【００８２】
「アルケニル」は、２〜１８個の炭素を含有し、かつ少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、不飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。例には、これらに限定されないが、エテニル、プロペニル、イソ−プロペニル、ブテニル、イソ−ブテニル、ｔｅｒｔ−ブテニル、ｎ−ペンテニルおよびｎ−ヘキセニルが含まれる。「低級アルケニル」という用語は、２〜８個の炭素を含有する本明細書に定義されているようなアルケニル基を指す。
【００８３】
「アルキニル」は、２〜１８個の炭素を含有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、不飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。例には、これらに限定されないが、エチニル、プロピニル、イソ−プロピニル、ブチニル、イソ−ブチニル、ｔｅｒｔ−ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニルが含まれる。「低級アルキニル」という用語は、２〜８個の炭素を含有する本明細書に定義されているようなアルキニル基を指す。
【００８４】
「シクロアルキル」は、単環式または多環式アルキルラジカルを指す。例には、これらに限定されないが、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが含まれる。
【００８５】
「アリール」は、１８個までの炭素を含有し、１つまたは複数の閉環（複数可）を有する環状芳香族炭化水素部分を指す。例には、これらに限定されないが、フェニル、ベンジル、ナフチル、アントラセニル、フェナントラセニルおよびビフェニルが含まれる。
【００８６】
「アラルキル」は、式ＲａＲｂのラジカルを指し、Ｒａは、上記に定義されているようなアルキレン鎖であり、Ｒｂは、１つまたは複数の上記に定義されているようなアリールラジカル、例えば、ベンジル、ジフェニルメチルなどである。
【００８７】
「チオアルコキシ」は、式−ＳＲｃのラジカルを指し、Ｒｃは、本明細書に定義されているようなアルキルラジカルである。「低級チオアルコキシ」という用語は、１〜８個の炭素を含有する本明細書に定義されているようなアルコキシ基を指す。
【００８８】
「アルコキシ」は、式−ＯＲｄａのラジカルを指し、Ｒｄは、本明細書に定義されているようなアルキルラジカルである。「低級アルコキシ」という用語は、１〜８個の炭素を含有する本明細書に定義されているようなアルコキシ基を指す。アルコキシ基の例には、これらに限定されないが、メトキシおよびエトキシが含まれる。
【００８９】
「アルコキシアルキル」は、アルコキシ基で置換されているアルキル基を指す。
【００９０】
「カルボニル」は、Ｃ（＝Ｏ）−ラジカルを指す。
【００９１】
「グアニジニル」は、Ｈ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２）−ＮＨ−ラジカルを指す。
【００９２】
「アミジニル」は、Ｈ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２）ＣＨ−ラジカルを指す。
【００９３】
「アミノ」は、ＮＨ２ラジカルを指す。
【００９４】
「アルキルアミノ」は、式−ＮＨＲｄまたは−ＮＲｄＲｄのラジカルを指し、各Ｒｄは、独立に、本明細書に定義されているようなアルキルラジカルである。「低級アルキルアミノ」という用語は、１〜８個の炭素を含有する本明細書に定義されているようなアルキルアミノ基を指す。
【００９５】
「複素環」とは、飽和、不飽和、または芳香族であり、窒素、酸素および硫黄から独立に選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する、５〜７員単環式、または７〜１０員二環式の複素環式環を意味し、窒素および硫黄ヘテロ原子は、任意選択で酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意選択で四級化されてもよく、上記の複素環のいずれかがベンゼン環に縮合している二環式環を含む。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して付着し得る。複素環は、下記に定義するようなヘテロアリールを含む。このように、下記に列挙したヘテロアリールに加えて、複素環はまた、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオピラニルなどを含む。
【００９６】
「ヘテロアリール」は、窒素、酸素および硫黄から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を有し、少なくとも１個の炭素原子を含有する５〜１０員の芳香族複素環式環を意味し、単環式環および二環式環系の両方を含む。代表的なヘテロアリールは、ピリジル、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、キノリニル、ピロリル、インドリル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル、フタラジニル、およびキナゾリニルである。
【００９７】
「任意選択で置換されているアルキル」、「任意選択で置換されているアルケニル」、「任意選択で置換されているアルコキシ」、「任意選択で置換されているチオアルコキシ」、「任意選択で置換されているアルキルアミノ」、「任意選択で置換されている低級アルキル」、「任意選択で置換されている低級アルケニル」、「任意選択で置換されている低級アルコキシ」、「任意選択で置換されている低級チオアルコキシ」、「任意選択で置換されている低級アルキルアミノ」および「任意選択で置換されているヘテロシクリル」という用語は、置換されているとき、少なくとも１個の水素原子が置換基で置き換えられていることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２個の水素原子が置換されている。これに関しては、置換基は、重水素、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されている複素環、任意選択で置換されているシクロアルキル、オキソ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲｘ、ＮＲｘＲｙ、ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｍＲｘおよび−ＳＯｍＮＲｘＲｙを含み、式中、ｍは、０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同じまたは異なり、独立に、水素、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されている複素環または任意選択で置換されているシクロアルキルであり、前記任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されている複素環および任意選択で置換されているシクロアルキル置換基のそれぞれは、オキソ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲｘ、ＮＲｘＲｙ、ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｍＲｘおよび−ＳＯｍＮＲｘＲｙの１つまたは複数でさらに置換され得る。
【００９８】
アンチセンス分子の命名システムは、異なるアンチセンス分子を区別するために提案および公開された（Ｍａｎｎら（２００２年）、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｅｄ、４巻、６４４〜６５４頁を参照されたい）。下記に示すように、全てが同じ標的領域に向いているいくつかの僅かに異なるアンチセンス分子を試験するときに、この命名法は特に意味を持った。
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）。
【００９９】
最初の文字は、種（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス、Ｃ：イヌ）を指定する。「＃」は、標的ジストロフィンエキソン数を指定する。「Ａ／Ｄ」は、それぞれ、エキソンの始まりおよび終わりにおけるアクセプターまたはドナースプライス部位を示す。（ｘｙ）は、アニーリング座標を表し、「−」または「＋」は、それぞれ、イントロンまたはエキソン配列を示す。例えば、Ａ（−６＋１８）は、標的エキソンに先行するイントロンの最後の６塩基、および標的エキソンの最初の１８塩基を示す。最も近いスプライス部位はアクセプターであり、そのためこれらの座標は、「Ａ」が先行する。ドナースプライス部位におけるアニーリング座標の記載は、Ｄ（＋２−１８）でよく、最後の２エキソン塩基および最初の１８イントロン塩基は、アンチセンス分子のアニーリング部位に対応する。完全なエキソンアニーリング座標は、Ａ（＋６５＋８５）によって表され、すなわち、そのエキソンの開始からの６５番目および８５番目のヌクレオチドの間の部位である。
【０１００】
ＩＩ．アンチセンスオリゴヌクレオチドの構築
リン含有骨格連結を有するモルホリノオリゴヌクレオチドに関する本発明の例示的実施形態を、図１Ａ〜１Ｃにおいて例示する。図１Ｃに示されているようなホスホロジアミデート連結したモルホリノオリゴヌクレオチドが好ましく、本発明の一態様によると、修飾されて、好ましくはその骨格連結の１０％〜５０％において正に荷電している基を含有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含めた、荷電していない骨格連結を有するモルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、これらの全てが参照により本明細書において明確に組み込まれている（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、１９９７年）において、ならびに共有の米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号、同第８，２９９，２０６号および同第７，９４３，７６２号において詳述されている。
【０１０１】
モルホリノをベースとするサブユニットの重要な特性には、１）オリゴマー形態で安定的な荷電していない、または正に荷電している骨格連結によって連結される能力；２）形成されたポリマーが、相対的に短いオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜１５の塩基）における約４５℃超のＴｍ値の標的ＲＮＡを含めた相補的塩基標的核酸とハイブリダイズすることができるように、ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシルおよびイノシン）を支持する能力；３）オリゴヌクレオチドが哺乳動物細胞中に能動的または受動的に輸送される能力；ならびに４）それぞれ、リボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼＨ分解に抵抗するアンチセンスオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘテロ二重鎖の能力が含まれる。
【０１０２】
特許請求した主題のアンチセンスオリゴヌクレオチドについての例示的な骨格構造は、それぞれ荷電していないまたは正に荷電しているリン含有サブユニット連結によって連結している図１Ｄ〜Ｇにおいて示すモルホリノサブユニットタイプを含む。図１Ｄは、５原子繰返し単位骨格を形成するリン含有連結を示し、モルホリノ環は、１原子ホスホアミド連結によって連結している。図１Ｅは、６原子繰返し単位骨格を生じさせる連結を示す。この構造において、５’モルホリノ炭素をリン基と連結する原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素、または好ましくは酸素であり得る。リンからペンダントであるＸ部分は、フッ素、アルキルもしくは置換アルキル、アルコキシもしくは置換アルコキシ、チオアルコキシもしくは置換チオアルコキシ、または非置換、一置換、もしくは二置換窒素（モルホリンもしくはピペリジンなどの環状構造を含む）であり得る。アルキル、アルコキシおよびチオアルコキシは好ましくは、１〜６個の炭素原子を含む。Ｚ部分は硫黄または酸素であり、好ましくは酸素である。
【０１０３】
図１Ｆおよび１Ｇにおいて示される連結は、７原子単位長さの骨格のために設計される。構造１Ｆにおいて、Ｘ部分は、構造１Ｅにおける通りであり、Ｙ部分は、メチレン、硫黄、または好ましくは、酸素であり得る。構造１Ｇにおいて、Ｘ部分およびＹ部分は、構造１Ｅにおける通りである。特に好ましいモルホリノオリゴヌクレオチドは、図１Ｅにおいて示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成されるものを含み、Ｘ＝ＮＨ２、Ｎ（ＣＨ３）２、または１−ピペラジンまたは他の荷電している基であり、Ｙ＝Ｏであり、Ｚ＝Ｏである。
【０１０４】
実質的に荷電していないオリゴヌクレオチドを、本発明の一態様によって修飾し、例えば、２〜５の荷電していない連結毎に約１まで、例えば、１０の荷電していない連結毎に約４〜５の荷電している連結を含み得る。特定の実施形態において、骨格連結の約２５％がカチオン性であるとき、アンチセンス活性における最適な改善を見ることができる。特定の実施形態において、増強は、少数、例えば、１０〜２０％のカチオン性連結において見ることができ、またはカチオン性連結の数は、５０〜８０％の範囲内、例えば、約６０％である。
【０１０５】
完全なカチオン性連結オリゴマーを含めた任意の数のカチオン性連結を有するオリゴマーを提供する。しかし好ましくは、オリゴマーは、部分的に荷電している（例えば、１０％〜８０％）。好ましい実施形態において、連結の約１０％〜６０％、好ましくは２０％〜５０％は、カチオン性である。
【０１０６】
一実施形態において、カチオン性連結は、骨格に沿って散在している。部分的に荷電しているオリゴマーは好ましくは、少なくとも２つの連続的な荷電していない連結を含有する。すなわち、オリゴマーは好ましくは、その全体の長さに沿って厳密に交互になっているパターンを有さない。
【０１０７】
また考慮されるのは、カチオン性連結のブロックおよび荷電していない連結のブロックを有するオリゴマーである。例えば、荷電していない連結の中央ブロックは、カチオン性連結のブロックが隣接してもよく、または逆もまた同じである。一実施形態において、オリゴマーは、ほぼ等しい長さの５’、３’および中央領域を有し、中央領域におけるカチオン性連結の百分率は、約５０％超、好ましくは約７０％超である。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、混合物または荷電していない骨格連結およびカチオン性骨格連結を有するオリゴヌクレオチドの合成に関して上および下で引用した参照文献において詳述した方法を用いて、段階的固相合成によって調製することができる。場合によっては、さらなる化学部分をアンチセンス化合物に加えて、例えば、薬物動態を増強し、または化合物の捕捉または検出を促進することが望ましくあり得る。このような部分は、標準的な合成法によって共有結合的に付着させ得る。例えば、ポリエチレングリコール部分または他の親水性ポリマー、例えば、１〜１００のモノマーサブユニットを有するものの付加は、溶解度の増強において有用であり得る。
【０１０９】
レポーター部分、例えば、フルオレセインまたは放射性標識した基を、検出の目的のために付着し得る。代わりに、オリゴマーに付着したレポーター標識は、標識抗体またはストレプトアビジンを結合することができるリガンド、例えば、抗原またはビオチンであり得る。アンチセンス化合物の付着または修飾のための部分の選択において、一般に当然ながら、生体適合性であり、望ましくない副作用を伴わずに被験体において耐容性を示す可能性が高い基の化合物を選択することが望ましい。
【０１１０】
アンチセンス適用における使用のためのオリゴマーは一般に、長さが約１０〜約５０のサブユニット、より好ましくは約１０〜３０のサブユニット、および典型的には１５〜２５の塩基の範囲である。例えば、アンチセンス化合物のために有用な長さである１９〜２０のサブユニットを有する本発明のオリゴマーは理想的に、２〜１０個、例えば、４〜８つのカチオン性連結、および残りの荷電していない連結を有し得る。１４〜１５のサブユニットを有するオリゴマーは理想的には、２〜７つ、例えば、３つ、４つ、または５つのカチオン性連結、および残りの荷電していない連結を有し得る。好ましい実施形態において、オリゴマーは、２５〜２８のサブユニットを有する。
【０１１１】
各モルホリノ環構造は、塩基対合部分を支持し、典型的には細胞におけるまたは処置されている被験体における選択したアンチセンス標的にハイブリダイズするように設計される塩基対合部分の配列を形成する。塩基対合部分は、天然ＤＮＡまたはＲＮＡにおいて見出されるプリンまたはピリミジン（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）、あるいは類似体、例えば、ヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基構成要素）または５−メチルシトシンであり得る。
【０１１２】
上で述べたように、特定の実施形態は、ＰＭＯ−Ｘオリゴマーおよび修飾された末端基を有するものを含めた、新規なサブユニット間連結を含むオリゴマーを対象とする。いくつかの実施形態において、これらのオリゴマーは、対応する無修飾オリゴマーよりＤＮＡおよびＲＮＡに対してより高い親和性を有し、他のサブユニット間連結を有するオリゴマーと比較して、改善された細胞送達、効力、および／または組織分布特性を示す。様々な連結タイプおよびオリゴマーの構造的特徴および特性は、下記の考察においてより詳細に記載する。これらおよび関連するオリゴマーの合成は、参照によりその全体が組み込まれている共有の米国特許出願第１３／１１８，２９８号に記載されている。
【０１１３】
ある特定の実施形態において、本発明は、ヒト疾患と関連する標的配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、薬学的に許容されるその塩を提供し、それは、式：
【０１１４】
【化２】
2019108349.tif 000003
を有するヌクレオチドの配列を含み、式中、
Ｎｕは、核酸塩基であり、
Ｒ１は、式：
【０１１５】
【化３】
2019108349.tif 000004
を有し、
ｑは、０、１、または２であり、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アラルキル、およびホルムアミジニル基からなる群より選択され、
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アシル、Ｃ１〜Ｃ１０アミノアシル、天然または非天然のアルファまたはベータアミノ酸のアシル部分、Ｃ１〜Ｃ１０アラルキル、およびＣ１〜Ｃ１０アルキルからなる群より選択され、あるいは
Ｒ２およびＲ３は接合して、５〜７員環を形成し、環は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニル、ハロゲン、およびＣ１〜Ｃ１０アラルキルからなる群より選択される置換基で任意選択で置換されていてもよく、
Ｒ４は、電子対、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アラルキルからなる群より選択され、
Ｒｘは、サルコシンアミド、ヒドロキシル、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、およびピペラジニルからなる群より選択され、
Ｒｙは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、アミノ酸、ホルムアミジニル基、およびＣ１〜Ｃ６アシルからなる群より選択され、
Ｒｚは、電子対、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アシルからなる群より選択される。
【０１１６】
Ｎｕは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、およびヒポキサンチンからなる群より選択され得る。より好ましくは、Ｎｕは、チミンまたはウラシルである。
【０１１７】
好ましい実施形態において、本発明は、式：
【０１１８】
【化４】
2019108349.tif 000005
を有するヌクレオチドの配列を有するオリゴヌクレオチド、薬学的に許容されるその塩を提供し、
式中、Ｎｕは、核酸塩基であり、
Ｒ１は、Ｒ１’およびＲ１’’からなる群より選択され、ここでＲ１’は、ジメチル−アミノであり、Ｒ１’’は、式：
【０１１９】
【化５】
2019108349.tif 000006
を有し、
式中、少なくとも１つのＲ１は、Ｒ１’’であり、
ｑは、０、１、または２であり、ただし、Ｒ１の少なくとも１つは、ピペリジニル部分であり、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アラルキル、およびホルムアミジニル基からなる群より選択され、
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アシル、Ｃ１〜Ｃ１０アミノアシル、天然または非天然のアルファまたはベータアミノ酸のアシル部分、Ｃ１〜Ｃ１０アラルキル、およびＣ１〜Ｃ１０アルキルからなる群より選択され、あるいは
Ｒ２およびＲ３は接合して、５〜７員環を形成し、環は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニル、ハロゲン、およびＣ１〜Ｃ１０アラルキルからなる群より選択される置換基で任意選択で置換されていてもよく、
Ｒ４は、電子対、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびアラルキルからなる群より選択され、
Ｒｘは、サルコシンアミド、ヒドロキシル、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、およびピペラジニルからなる群より選択され、
Ｒｙは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、アミノ酸、ホルムアミジニル基、およびＣ１〜Ｃ６アシルからなる群より選択され、
Ｒｚは、電子対、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アシルからなる群より選択される。
【０１２０】
Ｎｕは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、およびヒポキサンチンからなる群より選択され得る。より好ましくは、Ｎｕは、チミンまたはウラシルである。
【０１２１】
Ｒ１基の約９０〜５０％は、ジメチルアミノ（すなわち、Ｒ１’）である。より好ましくは、Ｒ１基の９０〜５０％は、ジメチルアミノである。最も好ましくは、Ｒ１基の約６６％は、ジメチルアミノである。
【０１２２】
Ｒ１’’は、
【０１２３】
【化６】
2019108349.tif 000007
からなる群より選択され得る。
【０１２４】
好ましくは、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、式：
【０１２５】
【化７】
2019108349.tif 000008
を有し、
式中、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｒｚ、およびＮｕは、上記の通りである。最も好ましくは、Ｎｕは、チミンまたはウラシルである。
【０１２６】
チミン（Ｔ）は、上記の化学修飾を含有する好ましい塩基対合部分（ＮｕまたはＰｉ）であるが、当業者に公知の任意の塩基サブユニットは、塩基対合部分として使用することができる。
【０１２７】
オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、各分子における十分な数の対応する位置が互いに水素結合することができるヌクレオチドによって占められているとき、互いに相補的である。このように、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、安定的および特異的結合が、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間に起こるように、十分な程度の相補性または正確なペアリングを示すために使用される用語である。アンチセンス分子の配列が特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的配列のものに１００％相補的である必要はないことが当技術分野で理解される。標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への化合物の結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨げ、有用性の喪失をもたらすとき、アンチセンス分子は特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が望ましい条件下で、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイまたは治療的処置の場合、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイの場合、生理学的条件下で、アッセイが行われる条件下で、非標的配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避する十分な程度の相補性が存在する。
【０１２８】
上記の方法を使用して、その生物学的機能に影響を与えることなしに短縮されることができるタンパク質内からの任意のエキソンを欠失させることができるアンチセンス分子を選択し得る一方、エキソン欠失は、短縮され転写されたｍＲＮＡにおいてリーディングフレームのシフトをもたらすべきではない。このように、３つのエキソンの直鎖状の配列において、最初のエキソンの末端がコドンにおける３つのヌクレオチドの２つをコードし、次のエキソンが欠失している場合、直線状配列における第３のエキソンは、コドンのためのヌクレオチドトリプレットを完成することができる単一のヌクレオチドから開始しなければならない。第３のエキソンが単一のヌクレオチドで開始しない場合、リーディングフレームのシフトが存在し、これは切断または非機能タンパク質の産生をもたらす。
【０１２９】
構造タンパク質中のエキソンの末端におけるコドン配置は、必ずしもコドンの末端において切断されるとは限らなくてもよく、結果的に、プレｍＲＮＡから複数のエキソンを欠失させ、ｍＲＮＡのインフレームのリーディングを確実にすることを必要とし得ることを認識されたい。このような状況において、複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の方法によって選択される必要があり得、それぞれは、欠失されるエキソンにおけるスプライシングを誘発するのに関与する異なる領域を対象とする。
【０１３０】
アンチセンス分子の長さは、プレｍＲＮＡ分子内の意図する場所に選択的に結合することができる限り変化し得る。このような配列の長さは、本明細書に記載されている選択手順によって決定することができる。一般に、アンチセンス分子は、長さが約１０のヌクレオチドから長さが約５０のヌクレオチドまでである。しかし、この範囲内のヌクレオチドの任意の長さは方法において使用し得ることが認識される。好ましくは、アンチセンス分子の長さは、長さが１０〜３０のヌクレオチドである。
【０１３１】
アンチセンス分子を産生する大部分の一般の方法は、２’ヒドロキシリボース位のメチル化であり、ホスホロチオエート骨格の組込みは、ＲＮＡに表面上は似ているが、ヌクレアーゼ分解に対して非常により抵抗性である分子を生じさせる。
【０１３２】
アンチセンス分子との二本鎖形成の間にプレｍＲＮＡの分解を回避するために、この方法において使用されるアンチセンス分子を適合させて、内因性リボヌクレアーゼＨによる切断を最小化または防止し得る。細胞内、またはリボヌクレアーゼＨを含有する粗抽出液中の非メチル化オリゴヌクレオチドによるＲＮＡの処置は、プレｍＲＮＡ：アンチセンスオリゴヌクレオチド二本鎖の分解をもたらすため、この特性は高度に好ましい。このような分解を迂回することができ、または誘発しない修飾されたアンチセンス分子の任意の形態を、本方法において使用し得る。ＲＮＡと二本鎖を形成するとき、細胞リボヌクレアーゼＨによって切断されないアンチセンス分子の一例は、２’−Ｏ−メチル誘導体である。２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチドは、細胞の環境および動物組織において非常に安定的であり、ＲＮＡとのこれらの二本鎖は、これらのリボ−またはデオキシリボ−カウンターパートより高いＴｍ値を有する。
【０１３３】
リボヌクレアーゼＨを活性化しないアンチセンス分子は、公知の技術（例えば、米国特許第５，１４９，７９７号を参照されたい）によって作製することができる。デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列であり得るこのようなアンチセンス分子は、その１つのメンバーとしてオリゴヌクレオチドを含有する二本鎖分子へのリボヌクレアーゼＨの結合を立体的に妨害し、または防止する任意の構造的修飾を単純に含有し、この構造的修飾は、二本鎖形成を実質的に妨害せず、または混乱させない。二本鎖形成に関与するオリゴヌクレオチドのポーションは、そこへのリボヌクレアーゼＨの結合に関与するこれらのポーションと実質的に異なるため、リボヌクレアーゼＨを活性化しない多数のアンチセンス分子が利用可能である。例えば、このようなアンチセンス分子は、オリゴヌクレオチドであり得、ヌクレオチド間架橋ホスフェート残基の少なくとも１つ、または全ては、修飾されたホスフェート、例えば、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートおよびホスホロアミデートである。例えば、ヌクレオチド間架橋ホスフェート残基の１つおきは、記載されているように修飾し得る。別の非限定的例において、このようなアンチセンス分子は、ヌクレオチドの少なくとも１つ、または全てが、２’低級アルキル部分（例えば、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖状または分岐状で飽和または不飽和のアルキル、例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−プロペニル、およびイソプロピル）を含有する分子である。例えば、ヌクレオチドの１つおきは、記載されているように修飾し得る。
【０１３４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい形態のアンチセンス分子である一方、本発明は、これらに限定されないが、下記に記載されているようなものなどのオリゴヌクレオチド模倣物を含めた他のオリゴマーアンチセンス分子を包含する。
【０１３５】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体例には、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。この明細書において定義するように、修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格においてリン原子を保持するもの、および骨格においてリン原子を有さないものを含む。この明細書の目的のために、および当技術分野で時々参照されるように、これらのヌクレオシド間骨格においてリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
【０１３６】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間連結、すなわち、骨格の両方は、新規な基で置き換えられている。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されてきたオリゴヌクレオチド模倣物である１つのこのようなオリゴマー化合物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。核酸塩基は保持され、骨格のアミドポーションのアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している。
【０１３７】
修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有し得る。オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当技術分野で単純に「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換を含み得る。特定の核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニンを含めたＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃だけ増加させることが示されてきており、さらにより特定すると、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と合わせたときに、現在好ましい塩基置換である。
【０１３８】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを増強させる１つまたは複数の部分または結合体に、オリゴヌクレオチドに化学的に連結することを伴う。このような部分には、これらに限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール（ｄｏｄｅｃａｎｄｉｏｌ）またはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が含まれる。
【０１３９】
所与の化合物における全ての位置が均一に修飾されていることは必要なく、実際は、上記の修飾の複数は、単一の化合物中に、またはそれどころかオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにおいて組み込み得る。本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、本発明の状況において、アンチセンス分子、特に、オリゴヌクレオチドであり、それぞれが少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドで構成されている、２つまたはそれ超の化学的に別個な領域を含有する。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞の取込みの増加を与えるようにオリゴヌクレオチドが修飾されている少なくとも１つの領域、および標的核酸への結合親和性の増加のためのさらなる領域を含有する。
【０１４０】
ＩＩＩ．ペプチド輸送体
本発明のアンチセンス化合物は、ＣＰＰ、好ましくは、細胞中への化合物の輸送を増強するのに有効なアルギニンに富んだペプチド輸送部分に結合体化されたオリゴヌクレオチド部分を含み得る。輸送部分は、例えば、図１Ｂおよび１Ｃにおいて示すように、オリゴマーの末端に好ましくは付着している。ペプチドは、中間の全ての整数を含めて、所与の細胞培養集団の細胞の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％内で細胞透過を誘発する能力を有し、全身投与によって、複数の組織内でインビボでの巨大分子のトランスロケーションを可能とする。一実施形態において、細胞透過性ペプチドは、アルギニンに富んだペプチド輸送体であり得る。別の実施形態において、細胞透過性ペプチドは、ペネトラチンまたはＴａｔペプチドであり得る。これらのペプチドは当技術分野で周知であり、例えば、参照によりその全体が組み込まれている米国特許出願公開第２０１０−００１６２１５Ａ１号に開示されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドへのペプチドの結合体化への特に好ましいアプローチは、参照によりその全体が組み込まれているＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／１５０９６０において見出すことができる。本発明のペプチド結合体化オリゴヌクレオチドの好ましい一実施形態は、ＣＰＰおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの間のリンカーとしてグリシンを利用する。例えば、好ましいペプチド結合体化ＰＭＯは、Ｒ６−Ｇ−ＰＭＯからなる。
【０１４１】
上記のような輸送部分は、付着した輸送部分の非存在下でのオリゴマーの取込みと比べて、付着したオリゴマーの細胞侵入を大いに増強することが示されてきた。取込みは好ましくは、結合体化されていない化合物と比べて、少なくとも１０倍、より好ましくは２０倍増強される。
【０１４２】
アルギニンに富んだペプチド輸送体（すなわち、細胞透過性ペプチド）の使用は、本発明の実行において特に有用である。特定のペプチド輸送体は、筋細胞を含めた初代細胞中へのアンチセンス化合物の送達において高度に有効であることが示されてきた（Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｏｄａら、２００７年；Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，  Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８年；Ｗｕ，  Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８年）。さらに、他の公知のペプチド輸送体、例えば、ペネトラチンおよびＴａｔペプチドと比較して、本明細書に記載されているペプチド輸送体は、アンチセンスＰＭＯに結合体化したとき、いくつかの遺伝子転写物のスプライシングを変化させる増強された能力を示す（Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｏｄａら、２００７年）。
【０１４３】
リンカーを除いた例示的なペプチド輸送体を、下記で表１において示す。
【０１４４】
【表１】
2019108349.tif 000009
ＩＩＩ．製剤および処置
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴマーの治療的送達に適した製剤または組成物を提供する。したがって、特定の実施形態において、本発明は、１種または複数種の薬学的に許容される担体（添加物）および／または希釈剤と一緒に製剤した、治療有効量の１つまたは複数の本明細書に記載されているオリゴマーを含む薬学的に許容される組成物を提供する。本発明のオリゴマーを単独で投与することは可能である一方、化合物を医薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。
【０１４５】
本発明の組成物は、単独でまたは別の治療と組み合わせて投与し得る。さらなる治療は、本発明の組成物の投与の前に、併行的に、または続いて投与し得る。例えば、組成物は、ステロイドおよび／または抗生物質と組み合わせて投与し得る。ステロイドは、グルココルチコイドまたはプレドニゾンであり得る。グルココルチコイド、例えば、コルチゾールは、炭水化物、脂肪およびタンパク質の代謝を制御し、かつリン脂質の放出を防止し、好酸球作用およびいくつかの他の機序を減少させることによって抗炎症性である。ミネラルコルチコイド、例えば、アルドステロンは、主に、腎臓におけるナトリウム貯留を促進することによって電解質および水のレベルを制御する。コルチコステロイドは、脊椎動物の副腎皮質において天然に産生されるステロイドホルモン、および研究室において合成されるこれらのホルモンの類似体を含む化学物質の１クラスである。コルチコステロイドは、ストレス応答、免疫応答、および炎症のレギュレーション、炭水化物代謝、タンパク異化、血中電解質レベル、および挙動を含めた広範囲の生理学的過程に関与している。コルチコステロイドには、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、およびプレドニゾンが含まれる。
【０１４６】
投与することができる他の薬剤は、患者の細胞およびＤＭＤのマウスモデルにおいてアンチセンスが媒介するエキソンスキッピングを増強することが示されてきたリアノジン受容体のアンタゴニスト、例えば、ダントロレンを含む（参照により本明細書中に組み込まれているＧ．  Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｌ  Ｍｅｄ、４巻、１６４号、ｒａ１６０（２０１２年））。
【０１４７】
核酸分子の送達のための方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒら、１９９２年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．、２巻：１３９頁；およびＤｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ｅｄ．  Ａｋｈｔａｒ、Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５に記載されている。これらおよび他のプロトコルは、本発明の単離したオリゴマーを含めた実際上任意の核酸分子の送達のために利用することができる。
【０１４８】
下記で詳述するように、本発明の医薬組成物は、下記のために適合されたものを含めた、固体または液体形態での投与のために特別に製剤され得る：（１）経口投与、例えば、水薬（水性または非水性の液剤または懸濁剤）、錠剤、例えば、口腔、舌下、および全身的吸収を標的としたもの、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌への適用のためのペースト剤；（２）非経口投与、例えば、皮下、筋内、静脈内もしくは硬膜外注射による、例えば、無菌液剤もしくは懸濁剤、または持続放出製剤として；（３）局所適用、例えば、皮膚に適用するクリーム剤、軟膏剤、または制御放出パッチまたはスプレー剤として；（４）膣内または直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム剤またはフォーム剤として；（５）舌下；（６）目；（７）経皮的；あるいは（８）経鼻。
【０１４９】
「薬学的に許容される」という語句は、本明細書において、合理的な利益／リスク比と釣り合った、過剰な毒性も刺激もアレルギー反応も他の問題も合併症も伴わない、妥当な医学的判断の範囲内で、人間および動物の組織と接触させる使用に適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
【０１５０】
「薬学的に許容される担体」という語句は、本明細書において使用する場合、体の１つの器官または一部から、体の別の器官または一部に対象化合物を運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、もしくはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ））、または溶媒封入材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に対して傷害性でないという意味で「許容され」なくてはならない。
【０１５１】
薬学的に許容される担体としての役割を果たすことができる材料のいくつかの例には、これらに限定されないが、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン；（３）セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）トラガカント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ろう；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝化溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；ならびに（２２）医薬製剤中で用いられる他の無毒性の適合性物質が含まれる。
【０１５２】
本発明のアンチセンスオリゴマーを有する製剤に適した薬剤のさらなる非限定的例には、ＰＥＧが結合体化された核酸、リン脂質が結合体化された核酸、親油性部分を含有する核酸、ホスホロチオエート、様々な組織中への薬物の侵入を増強することができるＰ糖タンパク質阻害剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５）；生分解性ポリマー、例えば、埋込み後の持続放出送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏグリコリド）ミクロスフィア（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ  Ｆら、１９９９年、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、８巻、４７〜５８頁）Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．；および負荷されたナノ粒子、例えば、血液脳関門を越えて薬物を送達することができ、かつニューロン取込み機構を変化させることができる、ポリブチルシアノアクリレートでできたもの（Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２３巻、９４１〜９４９頁、１９９９年）が含まれる。
【０１５３】
本発明はまた、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾されたリポソーム（ＰＥＧ−修飾された分岐状および非分岐状のもの、もしくはこれらの組合せ、または長期循環リポソームもしくはステルスリポソーム）を含む組成物の使用を特徴とする。本発明のオリゴマーはまた、様々な分子量の共有結合的に付着したＰＥＧ分子を含むことができる。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増大させるための方法を提供する。このクラスの薬物担体は、単核食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン化および排除に抵抗し、それによってカプセル化された薬物についてより長い血液循環時間および組織曝露の増強を可能とする（Ｌａｓｉｃら、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、１９９５年、９５巻、２６０１〜２６２７頁；Ｉｓｈｉｗａｔａら、Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．、１９９５年、４３巻、１００５〜１０１１頁）。このようなリポソームは、おそらく血管新生された標的組織における血管外漏出および捕捉によって、腫瘍において選択的に蓄積することが示されてきた（Ｌａｓｉｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５年、２６７巻、１２７５〜１２７６頁；Ｏｋｕら、１９９５年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、１２３８巻、８６〜９０頁）。長期循環リポソームは、特に、ＭＰＳの組織において蓄積することが公知である従来のカチオン性リポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態および薬力学を増強する（Ｌｉｕら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９９５年、４２巻、２４８６４〜２４８７０頁；Ｃｈｏｉら、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌら、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄら、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９６／１０３９２号）。長期循環リポソームはまた、代謝的に活発なＭＰＳ組織、例えば、肝臓および脾臓における蓄積を回避するこれらの能力に基づいて、カチオン性リポソームと比較してより大きな程度まで薬物をヌクレアーゼ分解から保護する可能性が高い。
【０１５４】
さらなる実施形態において、本発明は、米国特許第６，６９２，９１１号、同第７，１６３，６９５号および同第７，０７０，８０７号において記載されるような、送達のために調製されるオリゴマー組成物を含む。これに関しては、一実施形態において、本発明は、（米国特許第７，１６３，６９５号、同第７，０７０，８０７号、および同第６，６９２，９１１号において記載される）単独での、あるいはＰＥＧ（例えば、分岐状もしくは非分岐状ＰＥＧ、または両方の混合物）と組み合わせた、ＰＥＧおよび標的化部分と組み合わせた、あるいは架橋剤と組み合わせた上記のいずれかと組み合わせた、リシンおよびヒスチジン（ＨＫ）のコポリマーを含む組成物中の本発明のオリゴマーを提供する。特定の実施形態において、本発明は、グルコン酸で修飾されたポリヒスチジンまたはグルコニル化（ｇｌｕｃｏｎｙｌａｔｅｄ）−ポリヒスチジン／トランスフェリン−ポリリシンを含む組成物中のアンチセンスオリゴマーを提供する。当業者はまた、ＨｉｓおよびＬｙｓと同様の特性を有するアミノ酸が、組成物内で置換され得ることを認識する。
【０１５５】
本明細書に記載されているオリゴマーの特定の実施形態は、塩基性官能基、例えば、アミノまたはアルキルアミノを含有してもよく、このように、薬学的に許容される酸と共に薬学的に許容される塩を形成することができる。「薬学的に許容される塩」という用語は、この点において、本発明の化合物の比較的毒性のない無機および有機の酸付加塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクルまたは剤形製造工程においてインサイチュで調製することができ、あるいはその遊離塩基の形態の精製した本発明の化合物と適切な有機酸または無機酸とを別々に反応させ、それに続く精製の間にこのように形成された塩を単離することによって調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプシル酸（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅら（１９７７年）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。
【０１５６】
対象オリゴマーの薬学的に許容される塩には、例えば、無毒性の有機酸または無機酸からの、化合物の従来の無毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、このような従来の無毒性塩には、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などに由来するもの；および有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸（ｉｓｏｔｈｉｏｎｉｃ）などから調製された塩が含まれる。
【０１５７】
特定の実施形態において、本発明のオリゴマーは、１つまたは複数の酸性官能基を含有してもよく、したがって薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。「薬学的に許容される塩」という用語は、これらの場合、本発明の化合物の比較的毒性のない無機および有機の塩基付加塩を指す。これらの塩は同様に、投与ビヒクルまたは剤形製造工程においてインサイチュで調製することができ、あるいはその遊離酸の形態の精製した化合物と、適切な塩基、例えば、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩または炭酸水素塩とを、アンモニアとを、または薬学的に許容される有機第一級、第二級もしくは第三級アミンとを別々に反応させることによって調製することができる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類塩には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびアルミニウム塩などが含まれる。塩基付加塩の形成のために有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅら、上述を参照されたい）。
【０１５８】
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、矯味矯臭剤および香料、保存剤および抗酸化剤はまた、組成物中に存在することができる。
【０１５９】
薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
【０１６０】
本発明の製剤には、経口、経鼻、局所（口腔および舌下を含めた）、直腸、膣および／または非経口投与に適したものが含まれる。製剤は、単位剤形で好都合に提示し得、製剤分野で周知の任意の方法によって調製し得る。単一の剤形を生成するために担体材料と合わせることができる活性成分の量は、処置されている宿主、特定の投与モードによって変化する。単一の剤形を生成するために担体材料と合わせることができる活性成分の量は一般に、治療効果を生じさせる化合物の量である。一般に、１００パーセントの内、この量は、約０．１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは、約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、約１０パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
【０１６１】
特定の実施形態において、本発明の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、およびポリマー担体、例えば、ポリエステルおよびポリ無水物から選択される賦形剤；ならびに本発明のオリゴマーを含む。特定の実施形態において、上記の製剤は、本発明の経口的に生物が利用可能なオリゴマーを与える。
【０１６２】
これらの製剤または組成物を調製する方法は、本発明のオリゴマーを、担体、および任意選択で、１種または複数種の補助成分と合わせるステップを含む。一般に、製剤は、本発明の化合物と、液体担体、または微粉化した固体担体、または両方とを、均質および密接に合わせ、次いで必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。
【０１６３】
経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれが、活性成分として所定の量の本発明の化合物を含有する、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤（香味を付けた基剤、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用した）、散剤、顆粒剤の形態、あるいは水性もしくは非水性液体中の液剤または懸濁剤として、あるいは水中油型もしくは油中水型液体乳剤として、あるいはエリキシル剤またはシロップ剤として、あるいは香錠（不活性な基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアを使用した）として、ならびに／あるいは口内洗浄剤などとしてでよい。本発明のオリゴマーはまた、ボーラス、舐剤またはペースト剤として投与され得る。
【０１６４】
経口投与のために本発明の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤、トローチ剤（ｔｒｏｕｃｈｅｓ）など）において、活性成分は、１種または複数種の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、ならびに／あるいは下記のいずれか：（１）充填剤または増量剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア；（３）保湿剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケート、および炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；（６）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物および界面活性剤、例えば、ポロキサマーおよびラウリル硫酸ナトリウム；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、および非イオン性界面活性剤；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ；（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、およびこれらの混合物；（１０）着色剤；ならびに（１１）制御放出剤、例えば、クロスポビドンまたはエチルセルロースと混合され得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、医薬組成物はまた、緩衝剤を含み得る。同様のタイプの固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤、および高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、ソフトおよびハードシェルのゼラチンカプセル中の充填剤として用い得る。
【０１６５】
錠剤は、任意選択で１種または複数種の補助成分と共に、圧縮または成形によって作製し得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性な希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散化剤を使用して調製し得る。成形錠剤は、適切な機械において不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末化した化合物の混合物を成形することによって作製し得る。
【０１６６】
本発明の医薬組成物の錠剤、および他の固体剤形、例えば、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶性コーティング、および医薬製剤の技術分野において周知の他のコーティングと共に任意選択で刻み目を付け、または調製し得る。これらはまた、例えば、所望の放出プロファイルを提供するために変化する割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフィアを使用して、その中の活性成分の緩徐な放出または制御放出を提供するために製剤され得る。これらは、急速放出のために製剤され得る（例えば、凍結乾燥）。これらは、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、または滅菌水もしくはいくつかの他の無菌の注射用媒体に使用の直前に溶解させることができる無菌の固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって無菌化し得る。これらの組成物はまた、乳白剤を任意選択で含有してもよく、これらが、任意選択で遅延された様式で、胃腸管の特定の部分において活性成分（複数可）のみまたはそれを優先的に放出する組成であり得る。使用することができる包埋組成物の例には、ポリマー物質およびろうが含まれる。活性成分はまた、適切な場合、上記の賦形剤の１つまたは複数を有するマイクロカプセル化された形態でよい。
【０１６７】
本発明の化合物の経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロ乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で通常使用される不活性な希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含有し得る。
【０１６８】
不活性な希釈剤に加えて、経口組成物はまた、佐剤、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、香料および保存剤を含むことができる。
【０１６９】
懸濁剤は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにこれらの混合物として、懸濁化剤を含有し得る。
【０１７０】
直腸または膣投与のための製剤は、１種または複数種の本発明の化合物と、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤ろうまたはサリチレートを含む１種または複数種の適切な非刺激性の賦形剤または担体とを混合することによって調製してもよく、かつ室温で固体であるが体温で液体であり、したがって、直腸または膣腔内で融解して活性化合物を放出する、坐剤として提示し得る。
【０１７１】
本明細書において提供するようなオリゴマーの局所または経皮的投与のための製剤または剤形には、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチおよび吸入剤が含まれる。活性オリゴマーは、無菌条件下にて、薬学的に許容される担体と、および必要とし得る任意の保存剤、緩衝液、または噴霧体と混合し得る。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、本発明の活性化合物に加えて、賦形剤、例えば、動物性および植物性脂肪、油、ろう、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクならびに酸化亜鉛、またはこれらの混合物を含有し得る。
【０１７２】
散剤およびスプレー剤は、本発明のオリゴマーに加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含有することができる。スプレー剤は、通例の噴霧体、例えば、クロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えば、ブタンおよびプロパンをさらに含有することができる。
【０１７３】
経皮パッチは、体への本発明のオリゴマーの制御された送達を提供するさらなる利点を有する。このような剤形は、オリゴマーを適当な媒体に溶解または分散させることによって作製することができる。吸収増強剤をまた使用して、皮膚を横切る薬剤のフラックスを増大させることができる。このようなフラックスの速度は、当技術分野において公知の他の方法の中で、速度制御膜を提供することによって、または薬剤をポリマーマトリックスもしくはゲルに分散させることによって制御することができる。
【０１７４】
非経口投与に適した医薬組成物は、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図するレシピエントの血液と等張とする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤（ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含有し得る、１種または複数種の薬学的に許容される無菌等張性の水性液剤もしくは非水性液剤、分散剤、懸濁剤または乳剤、あるいは使用の直前に無菌の注射用溶液または分散剤に再構成し得る無菌の粉末と組み合わせて、１種または複数種の本発明のオリゴマーを含有し得る。本発明の医薬組成物において用い得る適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および適切なこれらの混合物、植物性油、例えば、オリーブ油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが含まれる。例えば、コーティング材料、例えば、レシチンの使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって、適当な流動性を維持することができる。
【０１７５】
これらの組成物はまた、佐剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散化剤を含有し得る。対象オリゴマーに対する微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含むことによって確実にし得る。組成物中に等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことがまた望ましくあり得る。さらに、注射用医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによってもたらし得る。
【０１７６】
場合によっては、薬物の効果を延長させるために、皮下注射または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、当技術分野において公知の他の方法の中でも、水溶性が乏しい結晶性またはアモルファス材料の液体懸濁物を使用することによって達成し得る。そして薬物の吸収の速度は溶解のその速度によって決まり、これはまた、結晶サイズおよび結晶形態によって決まり得る。代わりに、非経口的に投与された薬物形態の吸収の遅延は、油性ビヒクルに薬物を溶解または懸濁させることによって達成される。
【０１７７】
注射用デポー形態は、生分解性ポリマー、例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド中で対象オリゴマーのマイクロカプセル化マトリックスを形成させることによって作製し得る。オリゴマーとポリマーの比、および用いる特定のポリマーの性質によって、オリゴマー放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。デポー注射用製剤はまた、身体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロ乳剤中に薬物を捕捉することによって調製し得る。
【０１７８】
本発明のオリゴマーが医薬としてヒトおよび動物に投与されるとき、これらはそれ自体で、または薬学的に許容される担体と組み合わせて、例えば、０．１〜９９％（より好ましくは、１０〜３０％）の活性成分を含有する医薬組成物として与えることができる。
【０１７９】
上で述べたように、本発明の製剤または調製物は、経口的に、非経口的に、全身性に、局所的に、直腸に、または筋肉内投与により与え得る。これらは典型的には、それぞれの投与経路に適した形態で与えられる。例えば、これらは、錠剤またはカプセル剤形態で、注射、吸入、眼用ローション剤（ｅｙｅ  ｌｏｔｉｏｎ）、軟膏剤、坐剤などによる、注射、注入または吸入による投与；ローション剤または軟膏剤による局所；および坐剤による直腸で投与される。
【０１８０】
「非経口投与」および「非経口的に投与された」という語句は、本明細書において使用する場合、通常、注射による、経腸および局所投与以外の投与モードを意味し、これらに限定されないが、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内注射および注入が含まれる。
【０１８１】
「全身投与」、「全身的に投与された」、「末梢投与」および「末梢的に投与された」という語句は、本明細書において使用する場合、中枢神経系中への直接の投与以外の、化合物、薬物または他の材料が患者の系に入り、したがって代謝および他の同様のプロセスに供されるような、化合物、薬物または他の材料の投与、例えば、皮下投与を意味する。
【０１８２】
選択した投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用し得る本発明のオリゴマー、および／または本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対して受容できないほど毒性であることを伴わずに、特定の患者、組成物、および投与モードについて所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変化し得る。
【０１８３】
選択した投与量レベルは、用いられる本発明の特定のオリゴマー、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、用いられる特定のオリゴマーの排泄または代謝の速度、吸収の速度および程度、処置の持続期間、用いられる特定のオリゴマーと組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、身体全体の健康および従前の病歴、ならびに医学の技術分野において周知の同様の要因を含めた種々の要因によって決まる。
【０１８４】
当技術分野で通常の技量を有する医師または獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで医薬組成物中に用いられる本発明の化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増大させることができる。一般に、本発明の化合物の適切な１日用量は、治療効果を生じさせるのに有効な最も低い用量である化合物の量である。このような有効用量は一般に、上記の要因によって決まる。一般に、患者のための本発明の化合物の経口、静脈内、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、筋肉内および皮下用量は、示される効果のために使用されるとき、１日当たり体重１キログラム毎に約０．０００１〜約１００ｍｇの範囲である。
【０１８５】
本発明のオリゴマー（例えば、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー；エテプリルセン）の好ましい用量は一般に、約２０〜１００ｍｇ／ｋｇで投与される。場合によって、１００ｍｇ／ｋｇ超の用量が必要であり得る。ｉ．ｖ．投与のために、好ましい用量は、約０．５ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、中間の全ての整数を含めた、約２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。好ましい実施形態において、オリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで投与される。別の好ましい実施形態において、オリゴマーは、５０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０１８６】
所望される場合、活性化合物の有効な１日用量は、任意選択で単位剤形にて、１日を通して適当な間隔で別々に投与される、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを超える部分用量として投与され得る。特定の状況において、投薬は、１日毎に１回の投与である。特定の実施形態において、投薬は、必要に応じ、機能的なジストロフィンタンパク質の所望される発現を維持するための、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、８日毎、９日毎、１０日毎、１１日毎、１２日毎、１３日毎、１４日毎、または１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、１０週間毎、１１週間毎、１２週間毎、または１カ月毎、２カ月毎、３カ月毎、４カ月毎、５カ月毎、６カ月毎、７カ月毎、８カ月毎、９カ月毎、１０カ月毎、１１カ月毎、１２カ月毎に１回または複数回の投与である。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマー（例えば、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー；エテプリルセン）は一般に、定期的間隔（例えば、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月）で投与される。オリゴマーは、定期的間隔、例えば、毎日；２日に１回；３日に１回；３〜７日に１回；３〜１０日に１回；７〜１０日に１回；毎週１回；２週間に１回；毎月１回で投与し得る。例えば、オリゴマーは、静脈内注入によって週１回投与し得る。オリゴマーは、より長期間に亘って、例えば、数週間、数カ月または数年間、断続的に投与し得る。例えば、オリゴマーは、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、４カ月に１回、５カ月に１回、６カ月に１回、７カ月に１回、８カ月に１回、９カ月に１回、１０カ月に１回、１１カ月に１回または１２カ月に１回投与し得る。さらに、オリゴマーは、１年に１回、２年に１回、３年に１回、４年に１回または５年に１回投与し得る。投与に続いて、抗生物質、ステロイドもしくは他の治療剤の投与をしてもよく、またはこれらと併行的に行ってもよい。処置レジメンは、処置下の被験体の免疫アッセイ、他の生化学的試験および生理学的検査の結果に基づいて、示されるように調節し得る（用量、頻度、経路など）。
【０１８８】
核酸分子は、これらに制限されないが、本明細書に記載され、当技術分野において公知のような、リポソーム中へのカプセル化、イオン導入による、または他のビヒクル、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体付着性ミクロスフィア中への組込みによるものを含めて、当業者には公知の種々の方法によって細胞に投与することができる。特定の実施形態において、マイクロ乳化技術を利用して、親油性（水不溶性）医薬品のバイオアベイラビリティーを改善し得る。例には、トリメトリン（Ｔｒｉｍｅｔｒｉｎｅ）（Ｄｏｒｄｕｎｏｏ，  Ｓ．  Ｋ．ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、１７頁（１２号）、１６８５〜１７１３頁、１９９１年およびＲＥＶ５９０１（Ｓｈｅｅｎ，  Ｐ．  Ｃ．ら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、８０巻（７号）、７１２〜７１４頁、１９９１年）が含まれる。様々な利益のなかでもとりわけ、マイクロ乳化は、吸収を循環器系の代わりにリンパ系に優先的に向けることによって増強されたバイオアベイラビリティーを実現し、これによって肝臓を迂回し、肝胆道循環における化合物の破壊を防止する。
【０１８９】
本発明の一態様において、製剤は、本明細書において提供するようなオリゴマーおよび少なくとも１種の両親媒性担体から形成されるミセルを含有し、ミセルは、約１００ｎｍ未満の平均直径を有する。より好ましい実施形態は、約５０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルを提供し、さらにより好ましい実施形態は、約３０ｎｍ未満、またはさらに約２０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルを提供する。
【０１９０】
全ての適切な両親媒性担体が意図される一方、現在好ましい担体は一般に、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）ステータスを有し、かつ本発明の化合物を可溶化することができ、溶液が複雑な水相（例えば、ヒト消化管において見出されるもの）と接触するとき、より後の段階でマイクロ乳化することができることの両方であるものである。通常、これらの要件を満足させる両親媒性成分は、２〜２０のＨＬＢ（親水親油バランス）値を有し、これらの構造は、Ｃ−６〜Ｃ−２０の範囲の直鎖脂肪族ラジカルを含有する。例は、ポリエチレングリコール化（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）脂肪酸グリセリドおよびポリエチレングリコールである。
【０１９１】
両親媒性担体の例には、飽和および一不飽和ポリエチレングリコール化（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｙｚｅｄ）脂肪酸グリセリド、例えば、完全または部分的に水素付加した様々な植物性油から得られるものが含まれる。このような油は有利には、トリ−、ジ−、およびモノ−脂肪酸グリセリド、ならびに対応する脂肪酸のジ−およびモノ−ポリエチレングリコールエステルからなり、特に好ましい脂肪酸組成物は、カプリン酸４〜１０％、カプリン酸３〜９％、ラウリン酸４０〜５０％、ミリスチン酸１４〜２４％、パルミチン酸４〜１４％およびステアリン酸５〜１５％を含む。別の有用なクラスの両親媒性担体には、飽和もしくは一不飽和脂肪酸（ＳＰＡＮ−シリーズ）または対応するエトキシ化類似体（ＴＷＥＥＮ−シリーズ）を伴う部分的にエステル化されたソルビタンおよび／またはソルビトールが含まれる。
【０１９２】
Ｇｅｌｕｃｉｒｅ−シリーズ、Ｌａｂｒａｆｉｌ、Ｌａｂｒａｓｏｌ、またはＬａｕｒｏｇｌｙｃｏｌ（全てＧａｔｔｅｆｏｓｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｉｎｔ  Ｐｒｉｅｓｔ、Ｆｒａｎｃｅによって製造および配布されている）、ＰＥＧ−モノ−オレエート、ＰＥＧ−ジ−オレエート、ＰＥＧ−モノ−ラウレートおよびジ−ラウレート、レシチン、ポリソルベート８０など（米国および世界中のいくつかの会社によって生産および配布されている）を含めて、市販の両親媒性担体は特に有用であり得る。
【０１９３】
特定の実施形態において、送達は、適切な宿主細胞中への本発明の組成物の導入のための、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフィア、脂質粒子、小胞などの使用によって起こり得る。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、ナノ粒子などのいずれか中にカプセル化されて、送達のために製剤され得る。このような送達ビヒクルの製剤および使用は、公知および従来の技術を使用して行うことができる。
【０１９４】
本発明における使用に適した親水性ポリマーは、容易に水溶性であり、小胞形成脂質に共有結合的に付着させることができ、毒性効果を伴わずにインビボで耐容性を示す（すなわち、生体適合性である）ものである。適切なポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ポリラクチドとまた称される）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとまた称される）、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー、およびポリビニルアルコールが含まれる。特定の実施形態において、ポリマーは、約１００ダルトンもしくは１２０ダルトンから、約５，０００ダルトンもしくは１０，０００ダルトンまで、または約３００ダルトン〜約５，０００ダルトンの分子量を有する。他の実施形態において、ポリマーは、約１００〜約５，０００ダルトンの分子量を有し、または約３００〜約５，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。特定の実施形態において、ポリマーは、７５０ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ（７５０））である。ポリマーはまた、その中のモノマーの数によって定義し得る。本発明の好ましい実施形態は、少なくとも約３種のモノマーのポリマーを利用し、このようなＰＥＧポリマーは、３種のモノマーからなる（ほぼ１５０ダルトン）。
【０１９５】
本発明における使用に適し得る他の親水性ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン（ｐｏｌｙｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｉｎｅ）、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、および誘導体化セルロース、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースが含まれる。
【０１９６】
特定の実施形態において、本発明の製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）（ｐｏｌｙ（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、多糖類、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリレート、ならびにそのブレンド、混合物、またはコポリマーからなる群より選択される生体適合性ポリマーを含む。
【０１９７】
シクロデキストリンは、それぞれ、ギリシャ文字α、βまたはγと指定される、６つ、７つまたは８つのグルコース単位からなる環状オリゴ糖である。グルコース単位は、α−１，４−グルコシド結合によって連結している。糖単位のいす形配座の結果として、全ての第二級ヒドロキシル基（Ｃ−２、Ｃ−３における）は、環の１つの側面上に位置しており、一方、Ｃ−６における全ての第一級ヒドロキシル基は、他の側面上に配置されている。その結果、外側の面は親水性であり、シクロデキストリンを水溶性とする。対照的に、シクロデキストリンの空洞は、原子Ｃ−３およびＣ−５の水素によって、ならびにエーテル様酸素で裏打ちされているため疎水性である。これらのマトリックスは、例えば、ステロイド化合物、例えば、１７α−エストラジオールを含めた種々の比較的疎水性の化合物と共に複合体を形成することが可能となる（例えば、ｖａｎ  Ｕｄｅｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．  Ｏｒｇ．  Ｃｕｌｔ．、３８巻：１−３−１１３（１９９４年）を参照されたい）。複合体形成は、ファンデルワールス相互作用によって、および水素結合形成によって起こる。シクロデキストリンの化学的性質の一般的概説について、Ｗｅｎｚ、Ａｇｎｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、３３巻：８０３〜８２２頁（１９９４年）を参照されたい。
【０１９８】
シクロデキストリン誘導体の物理化学的特性は、種類および置換度によって強力に決まる。例えば、水中のこれらの溶解度は、不溶性（例えば、トリアセチル−β−シクロデキストリン）から１４７％可溶性（ｗ／ｖ）（Ｇ−２−β−シクロデキストリン）までの範囲である。さらに、これらは、多くの有機溶媒中で可溶性である。シクロデキストリンの特性により、様々な製剤構成要素の溶解度を増大または減少させることによって、これらの溶解度の制御をすることができる。
【０１９９】
多数のシクロデキストリンおよびこれらの調製のための方法が記載されてきた。例えば、Ｐａｒｍｅｔｅｒ（Ｉ）ら（米国特許第３，４５３，２５９号）およびＧｒａｍｅｒａら（米国特許第３，４５９，７３１号）は、電気的中性のシクロデキストリンを記載した。他の誘導体には、カチオン性特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩ）、米国特許第３，４５３，２５７号］、不溶性架橋シクロデキストリン（Ｓｏｌｍｓ、米国特許第３，４２０，７８８号）、およびアニオン性特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）、米国特許第３，４２６，０１１号］が含まれる。アニオン性特性を有するシクロデキストリン誘導体の中で、カルボン酸、亜リン酸、亜ホスフィン酸（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｕｓ  ａｃｉｄ）、ホスホン酸、リン酸、チオホスホン酸（ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、チオスルフィン酸（ｔｈｉｏｓｕｌｐｈｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、およびスルホン酸が、親シクロデキストリンに付加されてきた［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）、上述を参照されたい］。さらに、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体は、Ｓｔｅｌｌａらによって記載されてきた（米国特許第５，１３４，１２７号）。
【０２００】
リポソームは、水性の内部コンパートメントを封入する少なくとも１つの脂質二重層膜からなる。リポソームは、膜タイプにより、およびサイズにより特性決定し得る。小型単層小胞（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＳＵＶ）は単一の膜を有し、典型的には直径が０．０２〜０．０５μｍの範囲であり、大型単層小胞（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＬＵＶＳ）は典型的には、０．０５μｍより大きい。少層大型小胞（ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌｌａｒ  ｌａｒｇｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）および多層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）は、複数の通常同心円状膜の層を有し、典型的には０．１μｍより大きい。いくつかの非同心円状膜を有するリポソーム、すなわち、より大型小胞内に含有されるいくつかのより小型小胞は、多胞体小胞（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）と称される。
【０２０１】
本発明の一態様は、本発明のオリゴマーを含有するリポソームを含む製剤に関し、リポソーム膜は、増大した運搬能力を有するリポソームを提供するように製剤される。代わりにまたはさらに、本発明の化合物は、リポソームのリポソーム二重層中に含有し得、またはリポソームのリポソーム二重層上に吸着し得る。本発明のオリゴマーは、脂質界面活性剤（ｌｉｐｉｄ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）と共に凝集させ、リポソームの内側空間内に運んでもよい。これらの場合、リポソーム膜は、活性剤−界面活性剤凝集物の破壊効果に抵抗するように製剤される。
【０２０２】
本発明の一実施形態によると、ＰＥＧ鎖が、脂質二重層の内面からリポソームによってカプセル化された内部空間中に伸長し、脂質二重層の外部から周囲の環境中に伸長するように、リポソームの脂質二重層は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化された脂質を含有する。
【０２０３】
本発明のリポソーム内に含有される活性剤は、可溶化形態である。界面活性剤および活性剤の凝集物（例えば、目的とする活性剤を含有する乳剤またはミセル）は、本発明によるリポソームの内部空間内に捕捉し得る。界面活性剤は、活性剤を分散および可溶化するように作用し、これらに限定されないが、変化する鎖長（例えば、約Ｃ１４〜約Ｃ２０）の生体適合性リゾホスファチジルコリン（ＬＰＧ）を含めた任意の適切な脂肪族、脂環式または芳香族の界面活性剤から選択され得る。ポリマー誘導体化脂質は、ミセル／膜融合を阻害するように作用し、界面活性剤分子へポリマーを加えることによって界面活性剤のＣＭＣを減少させ、ミセル形成を助長するため、ポリマー誘導体化脂質、例えば、ＰＥＧ−脂質をまた、ミセル形成のために利用し得る。好ましいのは、マイクロモル濃度範囲のＣＭＯを有する界面活性剤である。より高いＣＭＣの界面活性剤を利用して、本発明のリポソーム内に捕捉されたミセルを調製し得る。
【０２０４】
本発明にしたがうリポソームは、当技術分野において公知の種々の技術のいずれかによって調製し得る。例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９６／１４０５７；Ｎｅｗ  ＲＲＣ，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０年）、３３〜１０４頁；Ｌａｓｉｃ  ＤＤ，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＢＶ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９３年を参照されたい。例えば、リポソーム中で望ましい誘導体化された脂質の最終モルパーセントに相当する脂質濃度で、予め形成されたリポソームを脂質グラフトポリマーから構成されるミセルに曝露させることになどによって、親水性ポリマーで誘導体化した脂質を予め形成されたリポソーム中に拡散させることによって、本発明のリポソームは調製し得る。親水性ポリマーを含有するリポソームはまた、当技術分野において公知のように、均質化、脂質領域水和（ｌｉｐｉｄ−ｆｉｅｌｄ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）、または押出技術によって形成することができる。
【０２０５】
別の例示的な製剤手順において、活性剤は、リゾホスファチジルコリン、または疎水性分子を容易に可溶化する他の低ＣＭＣの界面活性剤（ポリマーグラフト脂質を含めた）中で超音波処理によって最初に分散させる。次いで、このように得られた活性剤のミセル懸濁物を使用して、適切なモルパーセントのポリマーグラフト脂質、またはコレステロールを含有する乾燥した脂質試料を再水和させる。次いで、脂質および活性剤懸濁物を、当技術分野において公知のような押出技術を使用してリポソームに形成し、このように得られたリポソームを、標準的なカラム分離によってカプセル化されていない溶液から分離する。
【０２０６】
本発明の一態様において、リポソームは、選択したサイズ範囲の実質的に均一なサイズを有するように調製される。１つの有効なサイジング方法は、選択した均質な孔径を有する一連のポリカーボネート膜を通してリポソームの水性懸濁物を押し出すことを伴い、膜の孔径は、その膜を通す押出によって生成したリポソームの最も大きなサイズにおおよそ相当する。例えば、米国特許第４，７３７，３２３号（１９８８年４月１２日）を参照されたい。特定の実施形態において、試薬、例えば、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）を利用して、細胞中にポリヌクレオチドまたはタンパク質を導入し得る。
【０２０７】
本発明の製剤の放出の特徴は、封入材料、カプセル化された薬物の濃度、および放出調節剤の存在によって決まる。例えば、胃におけるように低ｐＨにおいてのみ、または腸におけるようにより高いｐＨで放出するｐＨ感受性コーティングを使用して、例えば、放出をｐＨ依存性であるように操作することができる。腸溶性コーティングを使用して、胃を通過する後まで放出が起こることを防止することができる。複数のコーティング、または異なる材料中にカプセル化されたシアナミドの混合物を使用して、胃における最初の放出、それに続く腸におけるその後の放出を得ることができる。放出はまた、水の取込みまたはカプセルからの拡散による薬物の放出を増大させることができる、塩またはポア形成剤を含むことによって操作することができる。薬物の溶解度を改変させる賦形剤をまた使用して、放出速度を制御することができる。マトリックスの分解またはマトリックスからの放出を増強する薬剤をまた組み込むことができる。これらは、化合物によって、薬物に加え、別々の相として加えることができ（すなわち、微粒子として）、またはポリマー相に同時溶解することができる。殆どの場合、量は、０．１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）であるべきである。分解増強剤のタイプには、無機塩、例えば、硫酸アンモニウムおよび塩化アンモニウム、有機酸、例えば、クエン酸、安息香酸、およびアスコルビン酸、無機塩基、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛、および水酸化亜鉛、ならびに有機塩基、例えば、硫酸プロタミン、スペルミン、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミン、ならびに界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）が含まれる。マトリックスに微小構造を加えるポア形成剤（すなわち、水溶性化合物、例えば、無機塩および糖）を、微粒子として加える。範囲は典型的には、１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）である。
【０２０８】
腸における粒子の滞留時間を変化させることによって、取込みをまた操作することができる。例えば、粒子を粘膜の接着性ポリマーでコーティングすることによって、または封入材料として粘膜の接着性ポリマーを選択することによって、これは達成することができる。例には、遊離カルボキシル基を有する大部分のポリマー、例えば、キトサン、セルロース、特に、ポリアクリレートが含まれる（本明細書において使用する場合、ポリアクリレートは、アクリレート基および修飾されたアクリレート基、例えば、シアノアクリレートおよびメタアクリレートを含むポリマーを指す）。
【０２０９】
オリゴマーは、手術デバイスもしくは医療デバイスまたはインプラント内に含有されるように製剤され得るか、あるいはこれらによって放出されるように適合され得る。特定の態様において、インプラントは、オリゴマーでコーティングまたは別の方法で処理し得る。例えば、ヒドロゲル、または他のポリマー、例えば、生体適合性および／または生分解性ポリマーを使用して、インプラントを本発明の組成物でコーティングし得る（すなわち、組成物は、ヒドロゲルまたは他のポリマーを使用することによって医療デバイスと共の使用のために適合し得る）。医療デバイスを薬剤でコーティングするためのポリマーおよびコポリマーは、当技術分野において周知である。インプラントの例には、これらに限定されないが、ステント、薬物溶出ステント、縫合糸、プロテーゼ、血管カテーテル、透析カテーテル、血管移植片、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、埋め込み式電気除細動器、ＩＶ針、接骨（ｂｏｎｅ  ｓｅｔｔｉｎｇ）および骨形成のためのデバイス、例えば、ピン、ネジ、プレート、および他のデバイス、ならびに創傷治癒のための人工組織マトリックスが含まれる。
【０２１０】
本明細書において提供する方法に加えて、本発明によって使用するためのオリゴマーは、ヒトまたは動物用の薬における使用のために、他の医薬から類推して任意の好都合な方法における投与のために製剤され得る。アンチセンスオリゴマーおよびこれらの対応する製剤は、筋ジストロフィーの処置において、単独で、または他の治療ストラテジ、例えば、筋芽細胞移植、幹細胞治療、アミノグリコシド抗生物質、プロテアソーム阻害剤の投与、および上方調節治療（例えば、ユートロフィン（ジストロフィン常染色体パラログ）の上方調節）と組み合わせて投与され得る。
【０２１１】
当業者は任意の特定の動物および状態のための最適な投与経路および任意の投与量を容易に決定することができるため、記載される投与経路はガイドとしてのみ意図される。インビトロおよびインビボの両方での細胞中への新規な機能的遺伝物質を導入するための複数のアプローチが試みられてきた（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１２７５〜１２８０頁）。これらのアプローチは、修飾されたレトロウイルス中に発現する遺伝子の組み込み（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）同上；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９１年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５１巻（１８号）、ｓｕｐｐｌ．：５０７４Ｓ〜５０７９Ｓ頁）；非レトロウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）中への組み込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、６８巻：１４３〜１５５頁；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２巻：４３１〜４３４頁）；またはリポソームを介した異種性プロモーター−エンハンサーエレメントに連結している導入遺伝子の送達（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）、同上；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９年）、Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．、２９８巻：２７８〜２８１頁；Ｎａｂｅｌら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：１２８５〜１２８８頁；Ｈａｚｉｎｓｋｉら（１９９１年）、Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．、４巻：２０６〜２０９頁；およびＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８７年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８４巻：７８５１〜７８５５頁）；リガンド特異的なカチオンベースの輸送系へのカップリング（ＷｕおよびＷｕ（１９８８年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：１４６２１〜１４６２４頁）、またはネイキッドＤＮＡ発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌら（１９９０年）、同上）；Ｗｏｌｆｆら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻：１４６５〜１４６８頁）を含む。組織中への導入遺伝子の直接注射は、局在化された発現のみを生じさせる（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２年）、同上）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１年）、同上；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９年）、同上；Ｎａｂｅｌ（１９９０年）、同上；およびＨａｚｉｎｓｋｉら（１９９１年）、同上）。Ｂｒｉｇｈａｍらのグループ（Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．（１９８９年）、２９８巻：２７８〜２８１頁およびＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１年）、３９頁（アブストラクト））は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内または気管内投与に続く、マウスの肺のインビボでのトランスフェクションのみを報告している。ヒト遺伝子治療手順の総論の一例は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２年）２５６巻：８０８〜８１３頁である。
【０２１２】
Ｖ．キット
本発明はまた、遺伝性疾患を有する患者の処置のためのキットを提供し、このキットは、その使用のための説明書と一緒に適切な容器中に包装された、少なくとも１種のアンチセンス分子（例えば、ジストロフィン遺伝子のエキソン１〜７９の任意の１つまたは複数；例えば、本明細書において表３および４に記載のエキソン５１に特異的にハイブリダイズすることができる１種または複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む。キットはまた、周辺的試薬、例えば、緩衝液、安定剤などを含有し得る。当技術分野の当業者は、上記の方法の適用は、多くの他の疾患の処置における使用に適したアンチセンス分子を同定するために広範な適用を有することを認識すべきである。
【実施例】
【０２１３】
ＶＩＩ．実施例
材料および方法
患者
適格の患者は、エキソン５１をスキッピングすることによって補正することができるＤＭＤ遺伝子のアウトオブフレーム欠失を有する７〜１３歳（両端を含む）であった。患者は、安定的な心臓および肺機能、ならびに安定的な用量のグルココルチコイドを登録の前少なくとも２４週間有すると確認された。ベースラインにおいて６分歩行試験（６ＭＷＴ）で２００メートル〜４００メートル（±１０％）歩行することができた患者のみが登録された。
【０２１４】
試験デザイン
この１年の治験は、２相において行われた。（１）処置は、第２４週まで二重盲検であり、（２）その後、オープンラベルであった。主要エンドポイントは、ジストロフィン線維のパーセント、および６分歩行試験（６ＭＷＴ）によって測定するような歩行運動の変化であった。
【０２１５】
試験２０１は、エテプリルセンの単一施設無作為化二重盲検プラセボ対照複数用量の有効性、安全性および忍容性治験であった。ＤＭＤを有する１２人の患者は、３群：エテプリルセン３０ｍｇ／ｋｇ／週（コホート１）；エテプリルセン５０ｍｇ／ｋｇ／週（コホート２）；またはプラセボ／遅延エテプリルセン（コホート３）の１つに無作為化された。全ての患者は、エテプリルセンまたはプラセボ／遅延エテプリルセン投薬を毎週静脈内に与えられた。プラセボで処置された患者は、第２５週において、毎週のエテプリルセン３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２）または５０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２）にクロスオーバーした。定期的な来診において有効性および安全性を評価し、独立したデータ安全性モニタリング委員会が全ての患者の福祉を確実にした。全ての患者は、ベースラインにおいて二頭筋生検を受けた。５０ｍｇ／ｋｇの群および２人のプラセボで処置された患者について第１２週において、ならびに３０ｍｇ／ｋｇの群および２人のプラセボで処置された患者について第２４週において、反対の腕（二頭筋）において経過観察の生検を行った。
【０２１６】
患者は、試験２０２、長期間オープンラベル延長試験の元で、３０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのエテプリルセンによる毎週の投薬を続けた。全ての有効性評価は、第４８週において全ての患者における第３の生検（左三角筋における）を含めた試験２０２の間に行い続けた。有害事象のモニタリングを、試験を通して続けた。試験デザインの略図を図２に示す。
【０２１７】
試験薬
エテプリルセン［配列５’−ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ−３’］（配列番号１０００）は、リン酸緩衝生理食塩水（１００ｍｇ／ｍｌ）の使い捨てのバイアル中でＳａｒｅｐｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．によって供給された。エテプリルセンを１５０ｍｌの生理食塩水で再構成し、６０分に亘り注入した。試験２０１の最初の２４週間の間に投与したプラセボは、リン酸緩衝生理食塩水の同一のバイアルとして供給し、エテプリルセンと同じ様式で投与した。
【０２１８】
安全性および忍容性のモニタリング
有害事象、生命徴候、身体検査、心電図、心エコー図、および臨床検査試験の評価によって安全性を評価した。さらに、血清シスタチンＣおよび尿シスタチンＣおよびＫＩＭ−１の定期的評価によって腎臓機能をモニターした。
【０２１９】
薬物動態および免疫の評価
エテプリルセンの薬物動態パラメーターは、蛍光検出生化学分析法による有効および感受性の陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーを使用して、１２回目の用量の後に採取した血漿および尿から確立した。血漿濃度の分析のための単一の試料を、第２４週、第２５週、および第３６週に採取した。新規なジストロフィンタンパク質に対する免疫応答を、従前に公表された方法に従ってＥＬＩＳＰＯＴで第２４週まで６週間毎に測定した。
【０２２０】
生化学的有効性評価
処置前および処置後のジストロフィン発現試験は、エテプリルセンおよび他のエキソンスキッピング候補の従前の試験において使用されるジストロフィンについての高度に感受性のマーカーであるＭＡＮＤＹＳ１０６［Ｇｌｅｎ  Ｍｏｒｒｉｓから頂いた、ＭＤＡモノクローナル抗体ライブラリー］に基づいた。少なくとも２００μｍ隔てられた３つの１０μｍの冷凍した切片を、ＭＡＮＤＹＳ１０６、それに続いて二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４ヤギ抗マウス抗体）で染色した。ジストロフィン陽性線維パーセントを、陽性線維の数を計数した総線維で割ることによって計算した。正常な筋肉試料は１００％ジストロフィン陽性線維を有するため、ジストロフィン陽性線維パーセントは、正常に対する百分率として表す。同じ抗体染色した切片を、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像分析ソフトウェアを使用してジストロフィンの定量化のために使用した。総ジストロフィン蛍光シグナル強度は、正常に対する百分率として報告した。
【０２２１】
支持的測定は、サルコグリカン複合体（β、γ）、神経型ＮＯＳの成分の発現、およびウエスタンブロット（Ｎｏｖａｃａｓｔｒａからの抗ジストロフィン抗体ＮＣＬ−Ｄｙｓ１による）を含んだ。エキソンスキッピングの確認のためのＲＴ−ＰＣＲ分析は、従前に記載されたようなジストロフィン特異的リバースプライマーを使用して４００ｎｇの総ＲＮＡで行った。
【０２２２】
臨床的有効性評価
ＭｃＤｏｎａｌｄら（参照により本明細書中に組み込まれているＭｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、２０１０年；４２巻：９６６〜７４頁）によるＤＭＤを有する患者のために確立されたプロトコールを使用して、６ＭＷＴを行った。探索的機能的帰結は、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ評価、定量的筋肉試験、９ホールペグ試験、肺機能試験（ＰＦＴ）、時限機能試験、および生活の質の評価を含んだ。
【０２２３】
統計解析
全ての統計分析のために、ＳＡＳバージョン９．３（Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用した。等効果として処置による混合モデル、変量効果として処置内に入る被験体、筋生検データの分析のための共変数としてベースライン値およびＤＭＤ診断からの時間を使用した。等効果として処置、時間、および処置時間相互作用条件による混合モデル反復測定（ＭＭＲＭ）、変量効果として処置内に入る被験体、ならびに６ＭＷＴデータの分析のための共変数としてベースライン値およびＤＭＤ診断からの時間を使用した。安全性および筋生検の分析を、治療意図に基づく集団において行った。６ＭＷＴを含めた歩行運動に関連する帰結の分析は、登録の数週間以内に疾患の進行の徴候、および６ＭＷＴにおける有意な低下を示し、第２４週またはそれ超において歩行運動の測定を行うことができなかったコホート１における２人の患者を除外した修正された治療意図に基づく（ｍＩＴＴ）集団を使用した。
【０２２４】
実施例１：被験体の特徴
この試験における１２人の患者のベースライン特性を、表２において要約する。エキソン５１スキッピングの影響を受けやすい５つの異なる遺伝子型を、試験集団において表した。ベースラインにおける６分歩行試験（６ＭＷＴ）における平均距離は、ＤＭＤを有する小児の他の試験におけるものと同様であり、予想どおりに、年齢がマッチした健康な小児において典型的には観察される６００メートル超をはるかに下回った。サンプリングの確率的性質によって、３０ｍｇ／ｋｇのコホートは、他のコホートと比べて僅かにより年長、より体重が重く、より身長が高く、ベースラインにおいてより低い平均６ＭＷＴ距離を有した。全ての患者は、計画通りに試験医薬の全ての注入を与えられ、全ての評価を完了した。
【０２２５】
【表２】
2019108349.tif 000010
実施例２：安全性、および有害事象の欠如
エテプリルセンは、４８週間の処置を通して、処置に関連する有害事象、重篤な有害事象、中断または飲み忘れた用量を伴わずに耐容性良好であった。さらに、臨床的に意味がある変化は、身体検査または生命徴候において観察されなかった。心電図、心エコー図、およびＰＦＴは安定的なままであり、化学的性質は、血液学的、腎臓、凝固または肝機能において臨床的に意味がある変化を示さなかった。軽度および一過性のタンパク尿が、単一のプラセボで処置された被験体において観察された。
【０２２６】
実施例３：薬物動態プロファイル
第１２週におけるＰＫパラメーターの分析は、急速な吸収を明らかにした。血漿クリアランスは、平均して３０ｍｇ／ｋｇについて３３９±７５．８ｍＬ／時間／ｋｇとなり、５０ｍｇ／ｋｇについて３１９±１２５ｍＬ／時間／ｋｇとなった。半減期は、平均して３０ｍｇ／ｋｇについて３．３０±０．３４１時間、および５０ｍｇ／ｋｇについて３．１７±０．２４９時間となったが、腎クリアランスは、総全身クリアランスの概ね６５〜７０％を占めた。
【０２２７】
実施例４：有効性
第４８週において、エテプリルセンは、ジストロフィン陽性線維の数および強度における強い増加を生じさせた。図３に示されているように、中止なしで４８週間３０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのエテプリルセンを与えられた患者は、ベースラインに対して正常の４７％への、ジストロフィン陽性線維の百分率における平均増加を示した（ｐ≦０．００１）。３０（５２％；ｐ≦０．００１）ｍｇ／ｋｇおよび５０（４３％；ｐ≦０．００８）ｍｇ／ｋｇのコホートが別々に分析されたとき、増加は同様であったが、これは新規なジストロフィンの産生に対するエテプリルセンの効果がこの範囲の用量内の用量と無関係であることを示唆する。
【０２２８】
生検材料をずらした時点で採取し（図２を参照されたい）、新規なジストロフィン産生に対する処置の持続期間の影響を評価した。第１２週において、５０ｍｇ／ｋｇのコホートは、検出不可能なレベルの新規なジストロフィンを有した。第２４週において、３０ｍｇ／ｋｇのコホートは、正常の２３％へのジストロフィン陽性線維の百分率の増加を示し（ｐ≦０．００２）、第４８週において、３０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのエテプリルセンによる処置の２４週間後に、プラセボ／遅延エテプリルセンコホートにおける４人の患者は、ベースラインに対して正常の３８％への増加を示した（ｐ≦０．００９）。一緒に、処置の持続期間は、新規なジストロフィン産生を均一に回復させるエテプリルセンの能力において重要な役割を果たすことをこれらのデータは示唆する。これらの知見と一致して、エテプリルセンはまた、３つの処置群全てにおいて第４８週において平均蛍光シグナル強度を有意に増加させた（全てのｐ値≦０．０２３）。
【０２２９】
図４は、ジストロフィン陽性線維の百分率に対するエテプリルセンの時間依存的効果（パネルＡ）を例示し、これは筋鞘におけるβ−およびγ−サルコグリカンならびにｎＮＯＳμの回復を伴った（パネルＢ）。ジストロフィン発現およびエキソンスキッピングは、全ての患者においてウエスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲによって確認された。代表的な患者からのＲＴ−ＰＣＲ結果を、パネルＣにおいて示す。これらのデータは、患者における機能的ジストロフィンの増加を確認した。
【０２３０】
実施例５：機能的帰結
歩行能力の進行性の喪失は、ＤＭＤの普遍的な顕著な特徴であり、大部分の患者は７歳または８歳までに機能的な悪化を示し、１０〜１４歳までには車椅子に依存するようになる。これと一致して、この試験においてプラセボ／遅延エテプリルセンコホートに割り当てられた少年は、従前の試験によって予測される速度で第１２週後に歩行能力の低下を示し、結果的に第４８週までに概ね６０メートルの喪失となった（図５）。好対照で、エテプリルセンで処置された患者は、第４８週までに約７メートルのベースラインからの平均増加を伴って、試験の持続期間に亘り安定的な歩行距離を維持した。エテプリルセンで処置された患者と、プラセボ／遅延エテプリルセンコホートにおける患者との間の差異は、第３２週において最初に統計的に有意となった（３９メートルの差異；ｐ≦０．０５）。興味深いことに、プラセボ／遅延エテプリルセンコホートにおける患者は、第３６週の後、すなわち、第２５週においてエテプリルセンによる処置を開始した１２週〜２４週間後に安定化したようであった。従前に留意されるように、登録の数週間以内に疾患の急速な進行の徴候および６ＭＷＴにおける有意な低下を示し、２４週間またはそれを過ぎて歩行運動の測定を行うことができなかった２人の少年は、この分析から除外された。しかし、両者は処置に関連する有害事象を伴わずに第４８週までエテプリルセンに留まり、それぞれ、ＰＦＴおよび９ホールペグ試験によって測定するように、安定的な肺機能および上肢機能を維持した。
【０２３１】
特に、６ＭＷＴにおいて評価可能な、４８週間エテプリルセンを与えられた患者（ｎ＝６）は、プラセボ／遅延コホートと比較して、６ＭＷＴにおいて有意に（ｐ≦０．００１）改善した（６７．３ｍ）。
【０２３２】
両方のコホートは、以下で記載のように１２０週間に亘り安定的な６ＭＷＴの結果を維持した。１２０週において、６ＭＷＴを行うことができた３０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇのエテプリルセンコホートにおける患者（修正された治療意図に基づくまたはｍＩＴＴ集団；ｎ＝６）は、歩行能力においてベースラインからの１３．９メートル、または５パーセント未満の僅かな低下を伴って、全体的な安定性を経験した。２４週間のプラセボに続いて第２５週において処置を開始したプラセボ／遅延処置コホート（ｎ＝４）と比較して、６４．９メートルの統計的に有意な処置の利益（ｐ≦０．００６）がｍＩＴＴ集団について観察された。試験においてより早期の実質的な低下を経験した後（エテプリルセンによる処置の前）、プラセボ／遅延処置コホートはまた、第３６週から第１２０週に亘り１．５年超歩行能力の安定化を示し、この期間に、この時間フレームに亘って９．５メートルの低下を伴って、意味あるレベルのジストロフィンが恐らく産生された。試験が連続２日で行われたとき、これらの分析は、最大６ＭＷＴスコアに基づいた。
【０２３３】
実施例６：免疫応答
エテプリルセンおよびプラセボで処置された患者の間で、第２４週を含めた評価した任意の時点における、ジストロフィンペプチドのプール（全タンパク質に亘り拡張する）へのインターフェロン−γが誘発するスポット形成コロニーの数において差異は存在しなかったが、これは、エテプリルセンで処置された患者における新たに発現されたジストロフィンはＴ細胞応答を引き出さなかったことを示す。
【０２３４】
実施例７：肺機能
最大吸気圧および最大呼気圧（ＭＩＰおよびＭＥＰ）によって測定するような両方の投薬コホートにおける第１２０週までのベースラインからの呼吸筋機能は、ＭＩＰにおける１４．６パーセントの平均増加、およびＭＥＰにおける１５．０パーセントの平均増加を示した。予測されるＭＩＰパーセント（体重について調節したＭＩＰ）および予測されるＭＥＰパーセント（年齢について調節したＭＥＰ）の分析は、予測されるＭＩＰパーセントにおいてベースラインにおける９０．２パーセントから第１２０週における９５．２パーセントへの平均増加、および予測されるＭＥＰパーセントにおいてベースラインにおける７９．３パーセントから第１２０週における７９．６パーセントへの僅かな平均増加を示した。さらに、ベースラインから第１２０週への８．７パーセントの、肺気量の尺度である努力肺活量（ＦＶＣ）における平均増加が存在し、予測されるＦＶＣパーセント（年齢および身長について調節したＦＶＣ）は、ベースラインにおける１０１パーセント、および第１２０週における９３パーセントを伴って、第１２０週まで９０パーセントの平均超で維持された。
【０２３５】
本明細書において引用される全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が特におよび個々に参照により組み込まれていることが示されるかのように参照により本明細書に組み込まれている。
【０２３６】
【化８】
2019108349.tif 000011
【０２３７】
【化９】
2019108349.tif 000012
【０２３８】
【化１０】
2019108349.tif 000013
【０２３９】
【化１１】
2019108349.tif 000014
【０２４０】
【化１２】
2019108349.tif 000015
配列表
本出願において提供する核酸配列に関して、オリゴマーの使用によって、ＴおよびＵは互換的であることを当業者は認識する。
【０２４１】
【表３】
2019108349.tif 000016
【０２４２】
【表４−１】
2019108349.tif 000017
【０２４３】
【表４−２】
2019108349.tif 000018
【０２４４】
【表４−３】
2019108349.tif 000019
【０２４５】
【表４−４】
2019108349.tif 000020
【０２４６】
【表４−５】
2019108349.tif 000021
【０２４７】
【表４−６】
2019108349.tif 000022
【０２４８】
【表４−７】
2019108349.tif 000023
【０２４９】
【表４−８】
2019108349.tif 000024
【０２５０】
【表４−９】
2019108349.tif 000025
【０２５１】
【表４−１０】
2019108349.tif 000026
【０２５２】
【表４−１１】
2019108349.tif 000027
【０２５３】
【表４−１２】
2019108349.tif 000028
【０２５４】
【表４−１３】
2019108349.tif 000029
【０２５５】
【表４−１４】
2019108349.tif 000030
【０２５６】
【表４−１５】
2019108349.tif 000031
【０２５７】
【表４−１６】
2019108349.tif 000032
【０２５８】
【表４−１７】
2019108349.tif 000033
【０２５９】
【表４−１８】
2019108349.tif 000034
【０２６０】
【表４−１９】
2019108349.tif 000035
【０２６１】
【表４−２０】
2019108349.tif 000036
【０２６２】
【表４−２１】
2019108349.tif 000037
【０２６３】
【表４−２２】
2019108349.tif 000038
【０２６４】
【表４−２３】
2019108349.tif 000039
【０２６５】
【表４−２４】
2019108349.tif 000040
【０２６６】
【表４−２５】
2019108349.tif 000041
【０２６７】
【表４−２６】
2019108349.tif 000042
【０２６８】
【表４−２７】
2019108349.tif 000043
【０２６９】
【表４−２８】
2019108349.tif 000044
【０２７０】
【表４−２９】
2019108349.tif 000045
【０２７１】
【表４−３０】
2019108349.tif 000046
【０２７２】
【表４−３１】
2019108349.tif 000047
【０２７３】
【表４−３２】
2019108349.tif 000048
【０２７４】
【表４−３３】
2019108349.tif 000049
【０２７５】
【表４−３４】
2019108349.tif 000050
【０２７６】
【表４−３５】
2019108349.tif 000051
【図１−１】
2019108349.tif 000052
【図１−２】
2019108349.tif 000053
【図１−３】
2019108349.tif 000054
【図１−４】
2019108349.tif 000055
【図２】
2019108349.tif 000056
【図３】
2019108349.tif 000057
【図４−１】
2019108349.tif 000058
【図４−２】
2019108349.tif 000059
【図５】
2019108349.tif 000060
【配列表】
2019108349000001.app
【外国語明細書】
2019108349000001.pdf