(57)【要約】【課題】エクソソームの膜に存在するタンパク質について、精度の高い検出方法を提供する。【解決手段】生体試料中のエクソソームの膜に存在するタンパク質の検出方法であって、ウシ血清アルブミン溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームと、該タンパク質に対する抗体とを接触させ、該タンパク質と該抗体との複合体を検出する工程を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中のエクソソームの膜に存在するタンパク質の検出方法であって、
ウシ血清アルブミン溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームと、該タンパク質に対する抗体とを接触させ、該タンパク質と該抗体との複合体を検出する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ウシ血清アルブミン溶液の濃度が０．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウシ血清アルブミン溶液の濃度が１％（ｗ／ｖ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウシ血清アルブミン溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームの濃度が、前記生体試料中のエクソソームの濃度の１．５倍〜１０倍である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ウシ血清アルブミン溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームの濃度が、前記生体試料中のエクソソームの濃度の２．５倍〜５倍である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生体試料が凍結された試料である場合、当該試料を４℃〜６０℃で融解する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
融解する工程を４℃〜３７℃で行う、請求項６記載の方法。
【請求項８】
エクソソームの膜に存在するタンパク質が糖タンパク質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
糖タンパク質がＣＥＡファミリーメンバーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＥＡファミリーメンバーが、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ １、及びＣＥＡＣＡＭ ６からなる群から選ばれる１以上である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
生体試料が体液である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
体液が血清又は血漿である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
癌の遠隔転移を検出するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
癌が大腸癌、胃癌、及び食道癌からなる群から選ばれる１以上である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
癌が大腸癌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
癌の遠隔転移の診断のための検査方法であって、
（１）請求項１に記載の方法により、被験者に由来する生体試料中のエクソソームの膜に存在するタンパク質を検出し、該タンパク質の濃度を測定すること、
（２）（１）により得られたタンパク質の濃度と基準値とを比較することを含み、
被験者におけるタンパク質の濃度が基準値よりも高いことが癌の遠隔転移の指標となる、方法。
【請求項１７】
基準値が、遠隔転移の有無が既知の患者集団におけるＲＯＣ曲線に基づいて設定されるカットオフポイントである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
癌が大腸癌、胃癌、及び食道癌からなる群から選ばれる１以上である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
癌が大腸癌である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エクソソームの膜に存在するタンパク質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エクソソームは、細胞から分泌される直径約40nm〜約150nmの小胞であり、タンパク質、mRNA、miRNAなどの分子を内包している。腫瘍細胞から分泌されるエクソソームは腫瘍細胞種によって異なる分子を内包しているため、エクソソーム由来の分子はバイオマーカーとして注目されている。近年、血清中の癌細胞由来のエクソソームを腫瘍マーカーとして用いた癌の診断が報告されている（非特許文献１及び２）。しかしながら、エクソソームの膜上に存在するとされるタンパク質の測定は、CD９、CD63、CD81などの分子に限られており、細胞機能に関係するとされるCEAファミリーやインテグリンなどの膜タンパク質は、多数存在するにも関わらず、エクソソームの膜上のそれらのタンパク質を測定した報告はない。
【０００３】
現在、血液中の癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen、CEA、CEACAM 5）は、臨床において一般的な腫瘍マーカーであり、大腸癌などの再発の診断に用いられている。CEAは分子量約20万の糖タンパク質であり、ヒト大腸癌組織及び胎児腸管において発見され、また、CEAと似た構造を有する複数のタンパク質も発見された。これらは、CEAファミリーとして、統一された新しい名称と分類が決められ、それによりCEAファミリーは、CEACAM（CEA-related cell adhesion molecule）及びPSG（pregnancy-specific glycoprotein）の2つのグループに分類されることとなった。CEAはCEACAM 1、CEACAM 3、CEACAM 4、CEACAM 6、CEACAM 7及びCEACAM 8と共にCEACAMのグループに属する。しかしながら、CEAは癌の再発の診断マーカーとして用いられているが、癌の早期診断のためのマーカーとして用いられているとの報告はない。そして、CEA以外のCEAファミリーメンバーは腫瘍マーカーとして用いられているとの報告もない。
【０００４】
また、一般に、CEAなどのタンパク質を腫瘍マーカーとして用いた癌の診断では、偽陽性や偽陰性が散見され、偽陽性のために必要のない検査が行われたり、偽陰性のために癌の再発の発見が遅れたりして、患者に不要な負担が生じる。したがって、精度の高いタンパク質の検出方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yoshioka, Y. et al. Ultra-sensitive liquid biopsy of circulating extracellular vesicles using ExoScreen. Nature communications 5, 3591 (2014)
【非特許文献２】Melo, S.A. et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature 523, 177-182 (2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、エクソソームの膜に存在するタンパク質について、精度の高い検出方法を提供することを課題とする。また、本発明は、癌の検出、特に癌の遠隔転移の検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、単に血清から得たエクソソームを検出するだけでは、エクソソームの膜に存在するCEAを検出することが出来ないが、ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin ; BSA）の存在下であれば、エクソソームの膜に存在するCEAの検出が可能であることを偶然にも見出した。また、エクソソームの膜に存在するCEAの測定値を用いて大腸癌の遠隔転移診断をしたところ、精度の高い診断が可能であることも見出した。
【０００８】
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりのものを提供する。
［１］生体試料中のエクソソームの膜に存在するタンパク質の検出方法であって、
ウシ血清アルブミン溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームと、該タンパク質に対する抗体とを接触させ、該タンパク質と該抗体との複合体を検出する工程を含む、方法。
［２］前記ウシ血清アルブミン溶液の濃度が０．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）である、［１］に記載の方法。
［３］前記ウシ血清アルブミン溶液の濃度が１％（ｗ／ｖ）である、［２］に記載の方法。
［４］前記ウシ血清アルブミン溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームの濃度が、前記生体試料中のエクソソームの濃度の１．５倍〜１０倍である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記ウシ血清アルブミン溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームの濃度が、前記生体試料中のエクソソームの濃度の２．５倍〜５倍である、［４］に記載の方法。
［６］生体試料が凍結された試料である場合、当該試料を４℃〜６０℃で融解する工程をさらに含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］融解する工程を４℃〜３７℃で行う、［６］記載の方法。
［８］エクソソームの膜に存在するタンパク質が糖タンパク質である、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］糖タンパク質がＣＥＡファミリーメンバーである、［８］に記載の方法。
［１０］ＣＥＡファミリーメンバーが、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ １、及びＣＥＡＣＡＭ ６からなる群から選ばれる１以上である、［９］に記載の方法。
［１１］生体試料が体液である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］体液が血清又は血漿である、［１１］に記載の方法。
［１３］癌の遠隔転移を検出するための、［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］癌が大腸癌、胃癌、及び食道癌からなる群から選ばれる１以上である、［１３］に記載の方法。
［１５］癌が大腸癌である、［１４］に記載の方法。
［１６］癌の遠隔転移の診断のための検査方法であって、
（１）[１]に記載の方法により、被験者に由来する生体試料中のエクソソームの膜に存在するタンパク質を検出し、該タンパク質の濃度を測定すること、
（２）（１）により得られたタンパク質の濃度と基準値とを比較することを含み、
被験者におけるタンパク質の濃度が基準値よりも高いことが癌の遠隔転移の指標となる、方法。
［１７］基準値が、遠隔転移の有無が既知の患者集団におけるＲＯＣ曲線に基づいて設定されるカットオフポイントである、［１６］に記載の方法。
［１８］癌が大腸癌、胃癌、及び食道癌からなる群から選ばれる１以上である、［１６］又は［１７］に記載の方法。
［１９］癌が大腸癌である、［１８］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の検出方法によれば、エクソソームの膜に存在するタンパク質について、精度の高い検出が可能である。また、生体試料が凍結された試料である場合も、エクソソームの膜に存在するタンパク質の検出が可能であり、さらに融解温度を適当な温度に設定することで、より精度の高い検出が可能となる。さらに、上記の精度の高い検出方法を用いることにより、癌の検出、特に癌の遠隔転移の検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】BSAの有無及び溶媒の量の違いによるCEAの測定値の変化を示す図である。各グラフは、対象とした8例の大腸癌患者由来のCEAの測定値を繋いだものである。
【図２】凍結された血清の融解温度の違いによる、血清中のエクソソームの量の変化を示す図（Ａ）、エクソソームの膜に存在するCEAの測定値の変化を示す図（Ｂ）である。各グラフは、対象とした8例の大腸癌患者由来のCEAの測定値を繋いだものである。
【図３】凍結された血清の融解温度が4℃、25℃又は37℃である場合の血清中のエクソソームのROC曲線を示す図（Ａ）、さらに血清中のCEAのROC曲線を示す図（Ｂ）である。
【図４】エクソソームのCEA及び血清中のCEAのROC曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、生体試料中のエクソソームの膜に存在するタンパク質（以下「エクソソーム膜タンパク質」と略記する。）の検出方法（以下、「本発明の検出方法」と略記する場合がある。）を提供する。当該方法は、
（１）ウシ血清アルブミン（BSA）溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームと、該タンパク質に対する抗体とを接触させ、
（２）該タンパク質と該抗体との複合体を検出することを含む、
また、本発明は、上記検出方法に基づいて、癌の遠隔転移を診断するための検査方法（以下、「本発明の検査方法」と略記する場合がある。）を提供する。当該方法は、
（１）上記の本発明の検出方法により、被験者に由来する生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の濃度を測定すること、及び
（２）（１）により得られた該タンパク質の濃度と基準値とを比較することを含む。比較の結果、被験者における該タンパク質の濃度が基準値よりも高い場合、癌の遠隔転移があると診断することができる。
【００１２】
生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の検出方法
本発明の検出方法に用いる生体試料は、生体から得られた試料であれば特に限定されない。生体から得られた試料としては、例えば、体液及び細胞の培養上清などが挙げられ、好ましくは体液である。体液としては、例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、汗、乳汁、鼻汁、精液、胸水、消化管分泌液、脳脊髄液、組織間液、及びリンパ液などが挙げられ、好ましくは血清又は血漿である。細胞の培養上清としては、当該細胞由来のエクソソーム以外のエクソソームを含まない培養上清が挙げられる。そのような培養上清としては、例えば、目的の細胞を適した条件下で培養後、当該細胞由来のエクソソーム以外のエクソソームを除くために培地を無血清培地に交換して培養し、その培養液を遠心して得られる上清などが挙げられる。生体試料は凍結されていなくてもよいし、凍結されていてもよい。
【００１３】
本発明の検出方法において、生体試料からエクソソームを単離する方法は特に限定されない。そのような方法としては、例えば、超遠心法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法、免疫沈降法、ポリマー沈殿法、及びサイズ排除法などが挙げられる。また、市販のキットを用いて生体試料からエクソソームを単離することができる。そのようなキットとしては、例えば、ExoQuickTM（System Biosciences）、miRCURYTM Exosome Isolation Kit（タカラバイオ）、Total Exosome Isolation（ライフテクノロジーズ）、ExoTrapTM Exosome Isolation Spin Column Kit for Protein Research（コスモ・バイオ）、exoEasy Maxi Kit（キアゲン）などが挙げられる。
【００１４】
生体試料から単離したエクソソームをウシ血清アルブミン（BSA）溶液中に分散させる方法は特に限定されない。例えば、生体試料から単離したエクソソームのペレットをBSA溶液で分散させる方法や、当該ペレットをMilliQ水などで分散させた後にBSAを添加する方法などが挙げられる。BSA溶液中のBSAの濃度は特に限定されないが、下限は0.5%(w/v)以上が好ましく、0.8%(w/v)以上がより好ましく、1%(w/v)以上がさらに好ましく、上限は5%(w/v)以下が好ましく、4%(w/v)以下がより好ましく、3%(w/v)以下がさらに好ましい。BSAの濃度は0.5%(w/v)〜5%(w/v)が好ましく、0.8%(w/v)〜4%(w/v)がより好ましく、1%(w/v)〜3%(w/v)がさらに好ましく、1%(w/v)が特に好ましい。
【００１５】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、単に血清からエクソソームを得るだけではエクソソームの膜に存在するCEAを検出することができず、BSAの存在下であれば検出が可能になるメカニズムとしては、BSAが抗原抗体反応を促進する可能性、BSAがエクソソーム同士の結合を阻害していることが推定される。したがって、本発明の検出方法を用いて、従来の検出方法では検出することができなかったエクソソーム膜タンパク質も検出し得る。
【００１６】
本発明の検出方法における検出対象であるエクソソーム膜タンパク質としては、エクソソームの膜に存在し、かつその一部が抗原性を有し抗体と反応可能な程度に膜外に露出しているタンパク質であれば特に制限はないが、例えば、テトラスパニン、細胞接着分子、抗原提示関連タンパク質、サイトカイン受容体等が挙げられる。また、癌患者の体液中のエクソソームの膜に多く存在することが知られているタンパク質などが挙げられる。テトラスパニンとしては、例えば、CD9、CD37、CD63、CD81などが挙げられる。細胞接着分子としては、例えば、インテグリン、CEAファミリーメンバー、ICAM-1（intercellular adhesion molecule-1）、CD31などが挙げられる。抗原提示関連タンパク質としては、例えば、MHC I、MHC IIなどが挙げられる。サイトカイン受容体としては、例えば、EGFRvIIIなどが挙げられる。癌患者の体液中のエクソソームの膜に多く存在することが知られているタンパク質としては、例えば、CD9、CD24、CD91、CD147、caveolin-1、glypican-1、EpCAM（Epithelial cell adhesion molecule）などが挙げられる。
【００１７】
エクソソーム膜タンパク質のうち、糖タンパク質であるCD9、CD37、CD63、インテグリン、CEAファミリーメンバー、ICAM-1、CD31、MHC I、MHC II、EGFRvIII、CD24、CD147、glypican-1、EpCAMが好ましく、CEAファミリーメンバーがより好ましい。CEAファミリーメンバーとしては、例えば、CEA、CEACAM 1、CEACAM 3、CEACAM 4、CEACAM 6、CEACAM 7、CEACAM 8などが挙げられ、好ましくはCEA、CEACAM 1、CEACAM 6である。
【００１８】
本発明の検出方法に用いられる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、市販の抗体を用いることもできる。当該抗体は、抗体の結合性フラグメント（例えば、Fab、F(ab’)2）、組換え抗体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。
【００１９】
本発明の検出方法において、生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の検出方法は、抗原抗体反応を用いた方法であれば特に限定されない。そのような方法としては、例えば、ELISA法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）、化学発光酵素免疫測定法（Chemiluminescent Enzyme Immuno Assay ; CLEIA法）、化学発光免疫測定法（Chemiluminescent Immuno Assay ; CLIA法）、電気化学発光免疫測定法（Electro-chemiluminescence immunoassay ; ECLIA法）、放射免疫測定法（Radioimmunoassay：RIA法）、蛍光抗体法、ラテックス凝集法、ウエスタンブロッティング法などが挙げられる。感度および実施しやすさの観点から、ELISA法が好ましい。また、エクソソーム膜タンパク質に特異的な抗体を含む市販のキットを用いてエクソソーム膜タンパク質を検出することができる。そのようなキットとしては、例えば、CEA (human) ELISA kit (abnova, Taipei city, Taiwan)、Human CEACAM-1 DuoSet (R&D Systems, Minneapolis, MN)、Human CEACAM-6 DuoSet (R&D Systems, Minneapolis, MN)、癌胎児性抗原キットCEA・アボット, アーキテクト i2000 (Abbott Japan, Chiba, Japan)などが挙げられる。
【００２０】
生体試料から単離したエクソソームと、エクソソーム膜タンパク質に対する抗体との接触は、これらの抗体と、溶液中の該タンパク質が相互作用できる方法であれば、態様、順序、具体的方法などは特に限定されない。接触は、例えば抗体が固相化されたプレートに、該溶液を添加することなどにより行うことができる。また、例えば該溶液中のエクソソーム膜タンパク質をSDS-PAGEなどの手段によって分離し、メンブレンに移して固定した後、抗体と接触させることによっても行うことができる。
【００２１】
なお、かかる接触を保つ時間は、前記抗体と、エクソソーム膜タンパク質とが結合して複合体を形成するのに十分な時間であれば特に限定されないが、通常、数秒〜十数時間である。また、接触を行う温度条件は、通常4℃〜50℃であり、4℃〜37℃が好ましく、15℃〜30℃程度の室温が最も好ましい。さらに、反応を行うpH条件は、5.0〜9.0が好ましく、特に6.0〜8.0の中性域が好ましい。
【００２２】
本発明の好ましい態様において、エクソソーム膜タンパク質の検出は、サンドイッチELISA法により行うが、抗原抗体反応を用いた方法であればこの方法に限定されるものではない。サンドイッチELISA法は、例えば次のように行なう。まず、一次抗体をELISA用プレートのウェル表面に固相化する。次いでウェル表面への非特異的な吸着を防ぐためにブロッキングを行なった後、生体試料から単離したエクソソームを添加し、該抗体と接触させて複合体を形成させる。該抗体と結合しなかったエクソソームを洗浄により除去した後、標識した二次抗体をウェルに加えて複合体を形成させ、該標識により検出・定量を行なう。定量は、用いた標識に基づき検出したシグナルを、標準試料を使用して作成した検量線を利用して数値化することや、タンパク質の濃度を測定する等の自体公知の方法により行なうことができる。
【００２３】
生体試料から単離したエクソソームをBSA溶液中に分散させた際、前記BSA溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームの濃度が、前記生体試料中のエクソソームの濃度より高い場合、さらに精度の高い検出が可能である。そのような場合としては、例えば、生体試料から単離したエクソソームのペレットを当該生体試料よりも少ない量のBSA溶液中に分散させた場合が挙げられる。前記BSA溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームの濃度が、前記生体試料中のエクソソームの濃度の1.5倍〜10倍であることが好ましく、2倍〜7.5倍であることがより好ましく、2.5倍〜5倍であることがさらに好ましい。
【００２４】
本発明者らは、凍結された血清を用いてエクソソームの膜に存在するCEAを検出した場合に、意外なことに、凍結された血清を融解する温度の違いによってCEAの測定値が変化することを見出した。したがって、一実施態様において、本発明の検出方法は、生体試料が凍結された試料である場合に、当該試料を特定の温度で融解する工程をさらに含む。かかる融解温度の下限は4℃以上が好ましく、10℃以上がより好ましく、20℃以上がさらに好ましく、上限は60℃以下が好ましく、50℃以下がより好ましく、40℃以下がさらに好ましく、37℃以下が特に好ましい。融解温度は、4℃〜60℃が好ましく、4℃〜37℃がより好ましく、10℃〜33℃がさらに好ましく、20℃〜30℃がよりさらに好ましく、25℃が特に好ましい。
【００２５】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、融解温度の違いにより測定値が変化するメカニズムとしては、エクソソーム膜タンパク質が糖タンパク質である場合、凍結融解による糖鎖の水和量の変化が抗体の反応性に変化を与えていることが推定される。したがって、凍結された血清を用いる場合には、検出するエクソソーム膜タンパク質は、糖タンパク質であることが好ましい。
【００２６】
本発明の検出方法により、癌の遠隔転移を検出することができる。かかる癌としては、例えば、検出の対象である生体試料中のエクソソーム膜タンパク質がCEAファミリーメンバーである場合には、大腸癌、小腸癌、胆道癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、甲状腺髄様癌、子宮癌、及び卵巣癌などが挙げられ、好ましくは大腸癌、胃癌、及び食道癌であり、より好ましくは大腸癌である。また、検出の対象である生体試料中のエクソソーム膜タンパク質がCD24、EpCAMである場合は卵巣癌等、CD91である場合は肺癌等、CD9、CD147である場合は大腸癌等、CD63、caveolin-1である場合はメラノーマ等、glypican-1である場合は膵臓癌、乳癌等が挙げられるが、これらの組合せに限定されるものではない。
【００２７】
癌の遠隔転移の診断のための検査方法
上述のように、本発明の検出方法を用いて、被験者に由来する生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の濃度を測定し、該タンパク質濃度と基準値とを比較することで、癌の有無、特に癌の遠隔転移の有無を判定することができる。該基準値としては、癌（特に、癌の遠隔転移）の有無が既知の患者集団について作成したROC曲線に基づいて設定されるカットオフポイントや、健常人に由来する生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の濃度を挙げることができる。
【００２８】
例えば、本発明の検査方法において、被験者に由来する生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の濃度と基準値とを比較し、被験者におけるタンパク質の濃度が基準値よりも高いことが癌の遠隔転移の指標となる。被験者におけるタンパク質の濃度と基準値とを比較して、被験者におけるタンパク質の濃度が高い場合、被験者において癌が遠隔転移している可能性があると判定することができる。また、本発明の検出方法により、エクソソーム膜タンパク質の検出データや該タンパク質の濃度の測定データを収集することや、それらのデータから、癌が存在している、あるいは癌が遠隔転移している確率や可能性などを分析、評価することができる。
【００２９】
「カットオフポイント（カットオフ値）」とは、その値を基準として疾患を判定した場合に、高い感度および高い特異度の両方を満足できる値である。例えば、癌を有する被験者のうち、癌の遠隔転移の存在が認められる被験者で高い陽性率を示し、かつ癌の遠隔転移の存在が認めらない被験者で高い陰性率を示す値をカットオフポイントとして設定することができる。本発明の検査方法において、カットオフポイントを用いる場合には、そのカットオフポイントをあらかじめ設定しておくことが望ましい。
【００３０】
カットオフポイントの算出方法は、この分野において周知である。例えば、転移の有無が既知の癌患者群における生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の測定値に基づいて解析ソフトを用いてROC曲線を作成し、感度と特異度が可能な限り100%に近いときの値（即ち、座標(0,1)に最も近い距離にあるROC曲線上の点に対応するカットオフ値）を求め、その値を被験者における癌の遠隔転移の判定のためのカットオフポイントとすることができる。例えば、血清中のエクソソームの膜に存在するCEAを用いて被験者が大腸癌の遠隔転移を有するか否かを調べる場合、凍結された血清を25℃で融解し、1%(w/v) BSAを用いて血清中のエクソソームのペレットを分散させた（分散させた液体中のエクソソームの濃度は血清中のエクソソームの濃度の5倍）条件下で得られる好適なカットオフポイントは2.29ng/mLであるが、この数値は、母集団の数や他の条件により変動し得るものであり、この数値に限定されるものではない。
【００３１】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
対象
以下の実施例では、2014年11月〜2016年5月に和歌山県立医科大学第2外科にて手術を施行した大腸癌患者を対象とした。本研究は、和歌山県立医科大学倫理委員会の承認を受けて行った。
【００３３】
実施例1. 血清中のエクソソームのCEAの測定値変化
同一の患者から得られたエクソソームのペレットを異なる溶媒を用いて分散させ、エクソソームの膜に存在するCEAの測定値の変化を調べた。本試験は、手術を施行した大腸癌患者のうち8例を対象とした。
【００３４】
1. エクソソームの調製
大腸癌患者の手術中に7mlの全血を採取した。採取した全血を血清分離試験管に入れて遠心し（1000g、10分、4℃）、血清を分離した。分離した血清をエッペンドルフチューブに250μlずつ分注し、測定に用いるまでの間、-20℃で凍結保存した。
【００３５】
凍結された血清を25℃で30分間融解した。ExoQuickTMExosome Precipitation Solution (System Bioscience, Palo Alto,CA, USA)を用いて、血清からエクソソームを得た。具体的には、63μlのExoQuickTM Exosome Precipitation Solutionを融解した250μlの血清に添加し、室温で30分間インキュベートした後に遠心し（1500g、30分、4℃）、上清を吸引除去してエクソソームのペレットを得た。
【００３６】
2. エクソソームのCEAの測定
250μlの血清から得られたエクソソームのペレットにMilliQ水（250μl又は50μl）、又は1%(w/v) BSA（250μl又は50μl）を添加して、ペレットを分散させた。1例の患者につき、これら4通りの溶液を調製し、エクソソームのCEAを測定した。測定は、CEA (human) ELISA kit (abnova, Taipei city, Taiwan)を用いて行った。
【００３７】
3. 結果
結果を図１に示す。250μlのMilliQ水を用いた場合(1x, H2O)、及び50μlのMilliQ水を用いた場合(5x, H2O)のいずれも、8例ともエクソソームのCEAを測定できなかった。250μlの1%(w/v) BSAを用いた場合(1x, 1%(w/v) BSA)、1例のみエクソソームのCEAを測定できた。50μlの1%(w/v) BSAを用いた場合(5x, 1%(w/v) BSA)、5例においてエクソソームのCEAを測定できた。
【００３８】
実施例2. 凍結血清の融解温度による血清中エクソソームのCEAの測定値変化
凍結された血清を異なる温度で融解し、血清中のエクソソームの量及びエクソソームの膜に存在するCEAの測定値の変化を調べた。本試験は、手術を施行した大腸癌患者のうち8例を対象とした。
【００３９】
1. エクソソームの定量及びエクソソームのCEAの測定
エクソソームの調製は、同一の患者から採取して凍結された血清を4℃、25℃、又は37℃で30分間融解した点を除き、実施例1と同様の方法により行った。エクソソームの定量は、EXOCET Exosome Quantitation Kit (System Bioscience, Palo Alto,CA, USA)を用いて行った。エクソソームのCEAの測定は、50μlの1%(w/v) BSAを用いてエクソソームのペレットを分散させた点を除き、実施例1と同様の方法により行った。
【００４０】
2. 結果
結果を図２に示す。エクソソームの量に関しては、融解温度の違いによる一定の傾向は認められなかった(図２Ａ)。エクソソームのCEAの測定値に関しては、融解温度の違いによる一定の傾向は認められず、融解温度によって測定値が変化することが示された(図２Ｂ)。
【００４１】
実施例3.血清中のエクソソームのCEA値を用いた遠隔転移診断率の凍結血清の融解温度による変化
凍結された血清を異なる温度で融解し、血清中のエクソソームの膜に存在するCEAを測定してROC曲線を作成し、大腸癌患者の遠隔転移の有無を比較検討した。本試験は、手術を施行した大腸癌患者のうち32例を対象とした。
【００４２】
1. エクソソームのCEAの測定
エクソソームの調製は、同一の患者から採取して凍結された血清を4℃、25℃、又は37℃で30分間融解した点を除き、実施例1と同様の方法により行った。エクソソームのCEAの測定は、50μlの1%(w/v) BSAを用いてエクソソームのペレットを分散させた点を除き、実施例1と同様の方法により行った。また、比較のために、血液採取後すぐに分離した血清を用いて、血清中のCEAを測定した。血清の分離は実施例1と同様の方法により行った。血清中のCEAの測定は、癌胎児性抗原キットCEA・アボット, アーキテクト i2000 (Abbott Japan, Chiba, Japan)を用いて行った。
【００４３】
2. 統計
エクソソームのCEA及び血清中のCEAについてROC曲線を作成した。精度はarea under the ROC curve （ROC曲線下面積）に基づいて検討した。ROC曲線から適切なカットオフポイントを選択し、感度、特異度、及び正しい分類を示した。統計処理にはSTATA software program ver. 13 (StataCorp, College Station, TX, USA)を用いた。
【００４４】
3. 結果
結果を図３に示す。それぞれの温度で融解した血清から得られたエクソソームのCEAのarea under the ROC curveは、4℃で融解した場合は0.7276（4 degrees Celsius ROC area）、25℃で融解した場合は0.8654（25 degrees Celsius ROC area）、37℃で融解した場合は0.8077（37 degrees Celsius ROC area）であった（図３Ａ）。血清中のCEAのarea under the ROC curveは0.7692（CEA ROC area）であった（図３Ｂ）。本結果より、25℃で融解した血清から得られたエクソソームのCEA値は、他の温度で融解した血清から得られたエクソソームのCEA値及び血清中のCEA値と比べて優れている可能性が示唆された。また、適切なカットオフポイント（Cut point）を選択し、感度（Sensitivity）、特異度（Specificity）、正しい分類（Correctly Classified）を比較した表を以下に示す（表１）。25℃で融解した血清から得られたエクソソームのCEAのカットオフポイントを2.29ng/mLとした場合、感度は83.33％、特異度は96.15％、正しい分類は93.75％であった。本結果より、エクソソームのCEA値を用いた大腸癌の遠隔転移診断は、診断精度が高い可能性が示唆された。
【００４５】
【表１】
2019168223.tif 000002
【００４６】
実施例4. 血清中のエクソソームのCEAと血清中のCEAを用いた遠隔転移診断率の比較―Validation study―
凍結された血清を25℃で融解し、血清中のエクソソームの膜に存在するCEAを測定してROC曲線を作成し、大腸癌患者の遠隔転移の有無を比較検討した。本試験は、手術を施行した大腸癌患者のうち100例を対象とした。
【００４７】
1. エクソソームのCEAの測定
エクソソームの調製は、実施例1と同様の方法により行った。すなわち、凍結された250μlの血清を25℃で30分間融解し、ExoQuickTMExosome Precipitation Solution (System Bioscience, Palo Alto,CA, USA)を用いて血清からエクソソームのペレットを得た。エクソソームのCEAの測定は、50μlの1%(w/v) BSAを用いてエクソソームのペレットを分散させた点を除き、実施例1と同様の方法により行った。また、比較のために、実施例3と同様の方法により血清中のCEAを測定した。
【００４８】
2. 結果
エクソソームのCEA及び血清中のCEAについて、実施例3と同様の方法によりROC曲線を作成した。結果を図４に示す。エクソソームのCEAのarea under the ROC curve（eCEA ROC area）は0.8793であった。また、適切なカットオフポイントを選択し、感度、特異度、正しい分類を比較した表を以下に示す（表２）。エクソソームのCEAのカットオフポイントを2.29ng/mLとした場合、感度は76.92％、特異度は95.40％、正しい分類は93.00％であった。本結果より、血清中のCEA値と比べて、エクソソームのCEA値を用いた大腸癌の遠隔転移診断は、診断精度が高い可能性が示唆された。
【００４９】
【表２】
2019168223.tif 000003
【００５０】
実施例5. エクソソームのCEACAMs（CEACAM 1及びCEACAM 6）を用いた遠隔転移診断の可能性
CEAファミリーメンバーであるCEACAM 1及びCEACAM 6についても、大腸癌の遠隔転移診断に用いることが可能であるかを調べた。本試験は、手術を施行した大腸癌患者のうち16例を対象とした。
【００５１】
1. エクソソームのCEACAM 1及びCEACAM 6の遠隔転移診断の可能性
エクソソームの調製は、実施例1と同様の方法により行った。すなわち、凍結された250μlの血清を25℃で30分間融解し、ExoQuickTMExosome Precipitation Solution (System Bioscience, Palo Alto,CA, USA)を用いて血清からエクソソームのペレットを得た。エクソソームのCEACAM 1の測定は、エクソソームのペレットに100μlの1%(w/v) BSAを添加してペレットを分散させ、Human CEACAM-1 DuoSet (R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて行った。エクソソームのCEACAM 6の測定は、Human CEACAM-6 DuoSet (R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いた点を除き、エクソソームのCEACAM 1の測定と同様の方法により行った。また、比較のために、血清中のCEACAM 1及びCEACAM 6を測定した。測定には-20℃で凍結保存していた血清を用いた。血清中のCEACAM 1及びCEACAM 6の測定は、Human CEACAM-1 DuoSet及びHuman CEACAM-6 DuoSetを用いて行った。
【００５２】
2. 結果
結果を表３に示す。エクソソームのCEACAM 1（eCEACAM1）及びエクソソームのCEACAM 6（eCEACAM6）の測定値は、遠隔転移を有するステージであるステージ4で高値となった。本結果より、エクソソームのCEACAM 1及びCEACAM 6の測定値は、癌診断、特に遠隔転移診断に有用である可能性が示唆された。
【００５３】
【表３】
2019168223.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の検出方法によれば、エクソソーム膜タンパク質について、精度の高い検出が可能である。また、生体試料が凍結された試料である場合もエクソソーム膜タンパク質について、精度の高い検出が可能である。さらに、上記検出方法を用いて、癌の遠隔転移の検出が可能である。
【図１】
2019168223.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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