(57)【要約】      （修正有）【課題】所定数の目的の塩基配列を含む核酸を、所望の分子数（コピー数）だけ容器に分注された核酸試料含有容器を提供する。【解決手段】目的の塩基配列及び目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、目的の塩基配列を有さず、検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を含有する核酸試料含有容器１である。目的の塩基配列のコピー数が１，０００未満かつ、コピー数の変動係数（ＣＶ値）が２０％未満である態様が好ましく、前記核酸分子が人工合成核酸分子である態様がより好ましく、第一の核酸分子が、目的の塩基配列を同一分子内に複数有する態様が更に好ましい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の塩基配列、及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、
前記目的の塩基配列を有さず、前記検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を含有することを特徴とする核酸試料含有容器。
【請求項２】
前記第一の核酸分子が、前記目的の塩基配列を同一分子内に複数有する請求項１に記載の核酸試料含有容器。
【請求項３】
前記第一の核酸分子中の複数の前記目的の塩基配列を有する場合、
一の目的の塩基配列と他の目的の塩基配列との間に、天然の核酸合成酵素により増幅不可能な人工核酸を少なくとも１塩基有する請求項２に記載の核酸試料含有容器。
【請求項４】
前記目的の塩基配列の数が１，０００未満かつ、前記目的の塩基配列の数の変動係数（ＣＶ値）が２０％未満である請求項１から３のいずれかに記載の核酸試料含有容器。
【請求項５】
前記核酸分子が人工合成核酸分子である請求項１から４のいずれかに記載の核酸試料含有容器。
【請求項６】
前記第一の核酸分子と、前記第二の核酸分子とを含有する固体粒子及びゲル粒子のいずれかである請求項１から５のいずれかに記載の核酸試料含有容器。
【請求項７】
可溶性である請求項６に記載の核酸試料含有容器。
【請求項８】
着色されている請求項１から７のいずれかに記載の核酸試料含有容器。
【請求項９】
前記第一の核酸分子中の少なくとも目的の塩基配列が、一本鎖核酸である請求項１から８のいずれかに記載の核酸試料含有容器。
【請求項１０】
前記目的の塩基配列の５’側に前記検出用配列を有する請求項９に記載の核酸試料含有容器。
【請求項１１】
目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する分散相形成工程と、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅する増幅工程と、
前記分散相において前記検出用塩基配列が増幅された陽性分散相と前記検出用塩基配列が増幅されなかった陰性分散相を判別する判別工程と、
前記判別工程で判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別する選別工程と、
前記選別工程で選別した、前記陽性分散相を容器に分注する分注工程と、
を含むことを特徴とする核酸試料含有容器の製造方法。
【請求項１２】
前記分散相が前記目的の塩基配列を１つ含む確率が、９０％以上である請求項１１に記載の核酸試料含有容器の製造方法。
【請求項１３】
前記判別工程は、前記分散相が生ずる光信号を検出して、前記陽性分散相と前記陰性分散相を判別する請求項１１から１２のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法。
【請求項１４】
前記分注工程は、前記判別工程において、前記目的の塩基配列の数が特定されている前記核酸を含む前記分散相を分注する請求項１１から１３のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法。
【請求項１５】
前記分散相形成工程は、前記核酸が１つの前記分散相に多くとも１分子含まれるような前記核酸の濃度の核酸含有液で行う請求項１１から１４のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法。
【請求項１６】
前記分注工程は、インクジェット方式で行う請求項１１から１５のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法。
【請求項１７】
前記分注工程は、判別された前記分散相の数を分注前に計数して行う請求項１１から１６のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法。
【請求項１８】
目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する分散相形成手段と、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅する増幅手段と、
前記分散相において前記検出用塩基配列が増幅された陽性分散相と前記検出用塩基配列が増幅されなかった陰性分散相を判別する判別手段と、
前記判別手段で判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別する選別手段と、
前記選別手段で選別した、前記陽性分散相を容器に分注する分注手段と、
を有することを特徴とする核酸試料含有容器の製造装置。
【請求項１９】
目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成させ、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅させ、
前記検出用塩基配列が増幅された陽性分散相と前記検出用塩基配列が増幅されなかった陰性分散相を判別させ、
前記判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別させ、
前記選別した、前記陽性分散相を容器に分注させる、
制御処理をコンピュータに実行させること特徴とする核酸試料含有容器の製造プログラム。
【請求項２０】
検出用塩基配列及び該検出用塩基配列と異なる塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、
検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を有することを特徴とする核酸試料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸試料含有容器、核酸試料含有容器の製造方法、核酸試料含有容器の製造装置及び核酸試料含有プログラム、並びに、核酸試料
に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分析技術は、食品検査、血液検査、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）鑑定など、様々な分野で広く活用されている。代表的な核酸分析技術としては、例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が挙げられる。
【０００３】
リアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲの過程で、核酸増幅に応じた蛍光を適時検出し、コピー数が定められた標準試料系列と目的とする検体中の核酸の検出値とを相対比較することにより、検体中の核酸の量を定量する方法である。
しかし、検体中の核酸を定量する際には、検体中の血球、糖、脂肪などといったＰＣＲ反応阻害物から核酸のみを抽出する必要があり、また、目的とする核酸がＲＮＡである場合には、ｃＤＮＡへの逆転写が必要となる。このため、検体中の核酸を定量するためには核酸抽出効率や逆転写効率などの核酸分子の取り出し効率を考慮する必要が生じる。
そこで、従来、核酸取り出し効率を考慮するために、例えば、濃度が規定された標準核酸試料を内部標準として反応系に添加した上で、抽出、逆転写、リアルタイムＰＣＲを行い初期核酸量及び各工程の効率を定量する方法が一般的に行われている。
【０００４】
従来、内部標準として用いられる核酸標準試料においては、核酸濃度が低い領域の標準試薬を作製するために、例えば、特定の塩基配列を有するＤＮＡ断片を限界希釈し、得られた希釈液の定量的ＰＣＲの結果から、目的とするコピー数を含む希釈液を選別する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、遺伝子組み換え技術により特定のコピー数のＤＮＡ断片を細胞に導入し、ＤＮＡ断片を導入した細胞を手技で単離することにより、目的のコピー数のＤＮＡ断片を含有する標準試薬の製造方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
更に、ドロップレット又はゲルドロップレット内で、核酸の目的の塩基配列を有する領域を増幅し、核酸増幅反応が起きたドロップレット又はゲルドロップレットをソーティング（選別）する方法が提案されている（例えば、特許文献３参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、所定数の目的の塩基配列を含む核酸を、所望の分子数（既知のコピー数）含有する核酸試料含有容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するための手段としての本発明の核酸試料含有容器は、目的の塩基配列、及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、前記目的の塩基配列を有さず、前記検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を含有する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によると、所定数の目的の塩基配列を含む核酸を、所望の分子数（既知のコピー数）含有する核酸試料含有容器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はコピー数と変動係数ＣＶとの関係を示す図である。
【図２】図２は、本発明の核酸試料含有容器の一例を示す図である。
【図３】図３は、マイクロ流路の中で溶液を分散相に区分する分散相形成手段の一例を示す図である。
【図４】図４は、マイクロ流路の中で溶液を分散相に区分する分散相形成手段のその他の一例を示す図である。
【図５】図５は、増幅手段の一例を示す図である。
【図６】図６は、判別手段及び選別手段における選別機構の一例を示す図である。
【図７】図７は、分注手段における吐出機構の一例を示す図である。
【図８】図８は、分注手段における吐出機構及び計数機構の一実施形態を示す説明図である
【図９】図９は、制御部のハードウェアブロックを例示する図である。
【図１０】図１０は、制御部の機能ブロックを例示する図である。
【図１１】図１１は、非一過性記録媒体に記憶された核酸試料含有容器の製造プログラムの処理手順の一例を示すフローチャートである。
【図１２】図１２は、制御部の機能ブロックの他の一例を例示する図である。
【図１３】図１３は、分注手段における吐出機構及び計数機構の動作の一例を示すフローチャートである。
【図１４】図１４は、目的の塩基配列を有する核酸を含む分散相が容器に分注された直後の様子の一例を示す説明図である。
【図１５】図１５は、目的の塩基配列を有する核酸を含む分散相が容器に分注され、分散相が溶解した後の様子の一例を示す説明図である。
【図１６】図１６は、非一過性記録媒体に記憶された核酸試料含有容器の製造プログラムの処理手順の他の一例を示すフローチャートである。
【図１７】図１７は、本発明の核酸試料含有容器の製造に係る結果の一例を示す図である。
【図１８】図１８は、本発明の核酸試料含有容器の製造に係る結果のその他の一例を示す図である。
【図１９】図１９は、本発明の核酸試料含有容器の製造に係る選別手段の動作の一例を示す図である。
【図２０】図２０は、本発明の核酸試料含有容器の製造に係る選別手段の動作の一例を示す図である。
【図２１】図２１は、本発明の核酸試料含有容器の製造に係る結果の一例を示す図である。
【図２２】図２２は、本発明の核酸試料含有容器の製造に係る結果の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（核酸試料含有容器）
本発明の核酸試料含有容器は、目的の塩基配列、及び目的の塩基配列とは異なる塩基配列の検出用塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、前記目的の塩基配列を有さず、前記検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を含有し、溶液、さらに必要に応じてその他の材料を含有する。
【００１０】
本発明者らは、所定数の目的の塩基配列を含む核酸を、所望の分子数（既知のコピー数）含有する核酸試料含有容器について検討したところ、以下の知見を得た。
上記リアルタイムＰＣＲを用いた定量方法に用いる標準核酸試料は、従来技術に示すように、目的の塩基配列を有する核酸の希釈液に対するリアルタイムＰＣＲの結果から、特定の分子数（コピー数）を含む希釈液を選別する場合において、１００分子数（コピー数）未満の核酸の希釈を行う際にはポアソン分布の影響により希釈液に含まれる核酸の分子数（コピー数）の不確かさが大きくなるため、任意の分子数の核酸を含む標準試薬を作製することは難しいという問題がある。
また、従来の方法では、遺伝子組み換え技術を用いて目的の塩基配列を導入した細胞を使用する場合には、遺伝子組み換え、細胞培養などの煩雑な作業が要求され、短時間で標準核酸試料を作製することが難しいという問題がある。また、目的の塩基配列を有する核酸を細胞に導入し、単離した細胞を処理して標準核酸試料を作製するため、作製された標準核酸試料には細胞由来の夾雑物（タンパク質や脂質など）が混入しているため、反応系を汚染する可能性があるという問題がある。
また、従来の方法では、複数種の核酸を微小区画化により個別に増幅し、核酸増幅反応を起こした微小区画（ドロップレット又はゲルドロップレット）をソーティング（選別）する方法が記載されているが、微小区画には複数種の核酸が含まれているため、陽性検出された微小区画内に１種類の核酸分子のみの存在を保証することは困難であり、所望の分子数（所定数のコピー数、又は特定コピー数とも称する）の目的の塩基配列を有する核酸試料を得ることが難しいという問題がある。
さらに、これらの従来技術により製造される標準核酸試料は、溶液又は懸濁液の状態で存在しているため、使用者が任意の反応系に必要量の標準核酸試料を添加することが難しいという問題がある。
【００１１】
本発明の核酸試料含有容器においては、第一の核酸分子を所定数容器に含有することにより、核酸試料である第一の核酸分子の保存性及び使用者の操作性に優れ、さらに、含有する核酸の分子数（目的の塩基配列のコピー（単位）数）が既知であるため、任意の反応系に微量の必要量の核酸試料を添加することができる。なお、ここで微量とは、１分子以上１，０００分子以下程度の分子数を意味する。
【００１２】
また、本発明においては、所定の塩基配列を基本単位として、コピーと称することがあり、所定の塩基配列を単位としてその数を数えることがある（例えば、１つの目的の塩基配列は１コピーなど）。さらに、この所定の塩基配列と、その他の塩基配列とを含む、１つにつながれた核酸の１つの単位を、例えば、１分子と称することがある。
【００１３】
コピー数とは、前記ウェルに含まれる核酸中の標的もしくは特定の塩基配列の数（センス鎖の数）を意味している。
標的の塩基配列とは、少なくともプライマー及びプローブ領域の塩基配列が決まっているものを指し、特に、塩基配列の全長が定められているものを特定の塩基配列とも呼称する。
特定コピー数とは、前記コピー数のうち、標的の塩基配列の数が一定以上の精度で特定されていることを意味する。
すなわち、実際に容器（例えば、粒子、ウェルなどが挙げられる）に含まれている標的の塩基配列の数として既知ということができる。つまり、本願における特定コピー数は、従来の系列希釈により得られるコピー数（算出推定値）よりも、数としての精度、信頼性が高く、特に、１，０００以下の低コピー数領域であってもポアソン分布によらない制御された値となる。制御された値は、概ね、不確かさを表す変動係数ＣＶが平均コピー数ｘに対し、ＣＶ＜１／√ｘもしくはＣＶ≦２０％のどちらかの値の大きさの中に収まっていることが好ましい。それゆえ、当該特定コピー数の標的の塩基配列を含む容器（例えば、粒子、ウェルなどが挙げられる）を用いることで、従来よりも正確に標的の塩基配列を有する試料の定性的、定量的な検査を行うことが可能となる。
なお、標的の塩基配列（センス鎖）と相補的な塩基配列を有する相補鎖（アンチセンス鎖）とが一体となっている二本鎖ＤＮＡのような核酸分子場合においては、単に、センス鎖の標的の塩基配列の数のみをコピー数とするのではなく、「センス鎖における標的の塩基配列」と「アンチセンス鎖における標的の塩基配列の相補鎖」の合計のコピー数が、反応系に存在する標的の塩基配列の「コピー数」と考える必要がある。
また、本発明においては、核酸の特定コピー数は、核酸の所定数又は絶対数と称することもある。
核酸の特定コピー数は、１コピー以上１，０００コピー以下が好ましく、１００コピー以下が好ましく、２０コピー以下がより好ましく、１０コピー以下がさらに好ましい。
【００１４】
−核酸−
核酸は、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖、及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸の断片、あるいはこれら核酸又はその断片のアナログなども含まれる。
核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。また、核酸としては、プラスミドも使用することができる。核酸は修飾又は変異されていてもよい。
核酸又は核酸断片のアナログとしては、核酸又は核酸断片に非核酸成分を結合させたもの、核酸又は核酸断片を蛍光色素や同位元素等の標識剤で標識したもの（例えば、蛍光標識色素や放射性同位体で標識されたプライマーやプローブ）、核酸又は核酸断片を構成するヌクレオチドの一部の化学構造を変化させた人工核酸（例えば、ＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡなど）などが挙げられる。
また、核酸としては、後述する目的の塩基配列を同一分子上に複数有する場合、個々の目的の塩基配列と間に天然の核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）により増幅不可能な人工核酸を少なくとも１塩基有することが好ましい。個々の目的の塩基配列と間に天然の核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）により増幅不可能な人工核酸を少なくとも１塩基有することにより、１分子に複数の目的の塩基配列を有している場合においても、目的の塩基配列が１コピー毎に増幅されるため、目的の塩基配列を有する核酸の分子数が少ない場合であっても、一度に複数の増幅産物を得ることができる。
これらは、生物から得られる天然物又はそれらの加工物であってもよく、また、遺伝子組換技術を利用して製造されたもの、化学的に合成された人工合成核酸分子などでもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。人工合成核酸分子とすることにより、不純物が少なくなり、低分子化することが可能となるため、初期反応効率を向上させることができる。
なお、人工合成核酸分子としては、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡと同様の構成成分（塩基、デオキシリボース、リン酸）からなる核酸を人工的に合成した核酸を意味する。人工合成核酸分子としては、例えば、タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸に限らず、任意の塩基配列を有する核酸を含む。
【００１５】
−−第一の核酸分子−−
第一の核酸分子は、目的の塩基配列、及び目的の塩基配列とは異なる塩基配列の検出用塩基配列を有する。
また、本発明の核酸試料含有容器は、第一の核酸分子を所定数有する。
第一の核酸分子の所定数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１００分子以下が好ましい。
第一の核酸分子の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸分子（ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ）、一本鎖核酸分子（ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）、二本鎖核酸分子及び一本鎖核酸分子が混在した核酸分子などが挙げられる。なお、二本鎖核酸分子及び一本鎖核酸分子が混在した核酸分子とは、第一の核酸分子中に、二本鎖である部分と一本鎖である部分が混在している核酸分子を意味する。
【００１６】
−−−目的の塩基配列−−−
目的の塩基配列としては、後述する検出用塩基配列と異なる塩基配列であれば特に制限はなく、適宜選択できる。以下、目的の塩基配列を検出用塩基配列とは異なる塩基配列（異配列）などと称することがある。目的の塩基配列としては、例えば、以下のものが挙げられる。
感染症検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない非天然の塩基配列、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１７】
非天然の塩基配列を用いる場合、ＧＣ含有率が目的の塩基配列の３０％以上７０％以下であることが好ましい。
【００１８】
目的の塩基配列の塩基長としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２０塩基対（又はｍｅｒ）以上１０，０００塩基対（又はｍｅｒ）以下の塩基長などが挙げられる。
【００１９】
目的の塩基配列の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸（ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ）、一本鎖核酸（ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）、二本鎖核酸分子及び一本鎖核酸分子が混在した核酸などが挙げられる。これらの中でも、目的の塩基配列が、一本鎖核酸であることが好ましい。目的の塩基配列が一本鎖核酸であると、目的の塩基配列のセンス鎖のみを用いることができ、アンチセンス鎖をも含む二本鎖核酸を用いる場合と比べて、核酸試料含有容器内の目的の塩基配列のコピー数をさらに高精度に制御できる。
【００２０】
感染症検査に用いられる塩基配列を用いる場合、その感染症特有の塩基配列を含んでいれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、公定法や通知法で指定されている塩基配列を含んでいることが好ましい。
【００２１】
本発明の核酸試料含有容器に含まれる目的の塩基配列については、使用者の用途によって、任意に選択することができ、例えば、公知の標準核酸試料に用いられる塩基配列などが好ましい。公知の標準核酸試料に用いられる塩基配列を選択することにより、例えば、リアルタイムＰＣＲの内部標準などに用いることができる。
【００２２】
−−−検出用塩基配列−−−
検出用塩基配列は、上述した目的の塩基配列とは異なる塩基配列であり、目的の塩基配列を有する核酸の有無を確かめるのに使用する塩基配列である。検出用塩基配列としては、本発明の実施時において少なくともプライマー領域及びプローブ領域が既知の塩基配列であればよく、かつ、検出用塩基配列が増幅する条件にある場合には前記目的の塩基配列は増幅しない、塩基配列である。
検出用塩基配列としては、目的の塩基配列と異なる塩基配列であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
検出用塩基配列としては、後述する増幅手段により増幅されるため、検出用塩基配列のＧＣ含有率は、３０％以上７０％以下であることが好ましい。
検出用塩基配列の塩基長としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２０塩基対（又はｍｅｒ）以上１，０００塩基対（又はｍｅｒ）以下が好ましい。
検出用塩基配列のコピー（単位）数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
検出用塩基配列の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸（ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ）、一本鎖核酸（ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）、二本鎖核酸分子及び一本鎖核酸分子が混在した核酸などが挙げられる。これらの中でも、検出用塩基配列が、一本鎖核酸（ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）であることが好ましい。検出用塩基配列が一本鎖核酸であると、後述する本発明の核酸試料含有容器の製造方法において、目的の塩基配列のコピー数を変化させることなく第一の核酸分子を検出することができるため、本発明の核酸試料含有容器に含有させる目的の塩基配列のコピー数の精度を向上させることができる。なお、検出用塩基配列が一本鎖核酸であるとは、第一の核酸分子中の検出用塩基配列が少なくとも一本鎖核酸であることを意味する。
検出用塩基配列の第一の核酸分子における位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、検出用塩基配列が一本鎖核酸分子であり、かつ検出用塩基配列が目的の塩基配列の５’末端側に存在することで、後述する本発明の核酸試料含有容器の製造方法において、第一の核酸分子における目的の塩基配列のコピー数を変化させることなく、目的の塩基配列を検出することができるため、本発明の核酸試料含有容器に含有させる目的の塩基配列のコピー数の精度を向上させることができる。また、上記構成とすることによる相乗効果によって、本発明の核酸試料含有容器に含有させる目的の塩基配列のコピー数の精度をより向上させることができる。
また、目的の塩基配列と検出用塩基配列との距離としては、十分に離れていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５００塩基対（又はｍｅｒ）以上離れていることが好ましい。ただし、検出用塩基配列が一本鎖核酸かつ目的の塩基配列の５’側に存在する場合には、この限りではない。目的の塩基配列と検出用塩基配列との距離が、十分に離れていることにより、後述する本発明の核酸試料含有容器の製造方法において、第一の核酸分子における目的の塩基配列のコピー数を変化させることなく、目的の塩基配列を検出することができるため、本発明の核酸試料含有容器に含有させる目的の塩基配列のコピー数の精度を向上させることができる。
【００２３】
−−第二の核酸分子−−
第二の核酸分子は、上述した目的の塩基配列を有さず、検出用塩基配列を有する核酸分子である。
第二の核酸分子における検出用塩基配列は、本発明の核酸試料含有容器の製造において、第一の核酸分子における検出用塩基配列を鋳型に増幅された塩基配列である。
【００２４】
本発明の核酸試料含有容器においては、核酸は乾燥状態、又は溶液に分散している状態が好ましい。乾燥状態であると、核酸が酵素により分解される可能性を低減することができ、さらに常温で保存することができる。
【００２５】
−溶液−
溶液としては、核酸に影響を与えずに分散させることができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、ヌクレアーゼフリー水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液、及びこれらの混合液体などが挙げられる。これらの中でも、水、緩衝液が好ましく、水、ヌクレアーゼフリー水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）などが好ましい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２６】
溶液としては、後述する本発明の核酸試料含有容器の製造方法において用いる核酸増幅試薬などが残存していてもよい。核酸増幅試薬などについては後述する本発明の核酸試料含有容器の製造方法にて詳細に説明するため、説明を省略する。
【００２７】
また、本発明の核酸試料含有容器の第一の核酸及び第二の核酸においては、分散相に内包されている状態、又は分散相に担持されている状態であってもよい。
【００２８】
−分散相−
分散相とは、微小な大きさに区分された区画を意味する。
分散相としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液相の分散相、固相の分散相などが挙げられる。
【００２９】
液相の分散相としては、例えば、水−油系エマルションを形成する油中水滴（Ｗ／Ｏ型）又は水中油滴（Ｏ／Ｗ型）、ミセルなどが挙げられる。
分散相の容積は、後述する本発明の核酸試料含有容器の製造方法における分散相の調製における、連続相の流量、分散相の流量、流路の幅、流路の高さ、界面活性剤の濃度、溶液の粘性、流路の圧力損失などにより、制御することができる。分散相の容積としては、１fＬ以上１μＬ以下であることが好ましい。
【００３０】
固相の分散相としては、例えば、核酸を捕捉可能な粒子上に核酸含有液内の核酸を１分子単位で捕捉するものなどが挙げられる。
粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブが表面に修飾された粒子や、カオトロピック物質の存在下で核酸を固層吸着させるシリカ粒子などが挙げられる。
【００３１】
目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブが表面に修飾された粒子としては、目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブが表面に修飾されていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラス等のガラス材料；ポリエステル樹脂、ポリスチレン、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ  Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ  Ｓｔｙｒｅｎｅ樹脂）、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等のプラスチック；アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、ニトロセルロース、キチン、キトサンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。さらに、粒子として磁化された、又は磁性体を内包した、或いは磁化可能な磁気ビーズを用いることによって、分離処理等について、自動化、効率化、又は迅速化することができる。
【００３２】
目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブが表面に修飾された粒子の数としては、一つの粒子に対して、目的の塩基配列を有する核酸が一分子以下となるような割合が好ましく、例えば、目的の塩基配列を有する核酸の数に対して、粒子の数が１倍以上１０倍以下程度になるように調整することが好ましい。
【００３３】
目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブを粒子の表面に修飾する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、共有結合、イオン結合、物理吸着、生物学的結合（例えば、ビオチンと、アビジン又はストレプトアビジンとの結合、抗原と抗体との結合等）によって固定化する方法などが挙げられる。
目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブとしては、スペーサー配列、例えば、１個以上１０個以下の炭素原子を含む炭化水素基を介して、粒子に固定してもよい。
【００３４】
共有結合を介した目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブの粒子への固定化としては、例えば、目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブに官能基を導入し、かつ官能基と反応性を有する官能基を粒子表面に導入して両者を反応させることにより実施することができる。例えば、目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブにアミノ基を導入し、粒子に活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基又はイソシアネート基を導入することにより共有結合を形成できる。
また、目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブにメルカプト基を導入し、粒子に活性エステル基、マレイミド基又はジスルフィド基を導入してもよい。
活性エステル基としては、例えば、ｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド基などが挙げられる。
【００３５】
官能基を粒子の表面に導入する方法としては、例えば、所定の官能基を有するシランカップリング剤によって粒子を処理する方法などが挙げられる。
シランカップリング剤としては、例えば、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−β−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランなどが挙げられる。
【００３６】
結合部位となる官能基を粒子に導入する別の方法としては、プラズマ処理などが挙げられる。このようなプラズマ処理により、固相の表面に、水酸基やアミノ基等の官能基を導入することができる。プラズマ処理は、当業者には既知の装置を用いて行うことができる。
【００３７】
物理吸着によって目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブを粒子に固定する方法としては、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン等）により表面処理した粒子に、オリゴ（ｄＴ）の荷電を利用して静電結合させる方法などが挙げられる。
また、分散相の形状としては、特に制限はなく、例えば球形などが挙げられる。
【００３８】
分散相が液相である場合は、連続相により上述した溶液を微小区画に区分した分散相とすることが好ましい。
連続相とは、他の液体が分散している分散系中の液体を意味する。ここでは、分散媒と同義であり、溶液を区分して分散相に区分し、区分した分散相を輸送するために用いる液体を意味する。
【００３９】
連続相としては、溶液を区分することができるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、例えば、分散相が水性である場合は、フルオロカーボン系のオイル、ミネラルオイルなどが挙げられる。
【００４０】
また、水性の溶液を油性の連続相を用いて分散相に区分する場合、溶液及び連続相のいずれかに界面活性剤を添加することが好ましい。界面活性剤を添加することで、区分した分散相の安定性を向上させることができる。
【００４１】
界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４２】
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４３】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ  ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズなど）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４４】
−容器−
容器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、開閉可能な容器や密閉容器、内容物を包含する外殻を有する粒子状の核酸試料含有容器（粒子状容器）などが挙げられる。これらの中でも、粒子状容器が好ましい。容器が粒子状容器であると、保存性及び操作性に優れ、含有する目的の塩基配列のコピー（単位）数が既知である核酸試料含有容器とすることができる。
【００４５】
核酸試料含有容器の形状、大きさ、容積、材質、色、数については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
核酸試料含有容器の大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粒子状容器である場合には、短軸長が０．１ｍｍ以上であり、０．３ｍｍが好ましく、０．５ｍｍであることがより好ましい。粒子状容器の短軸長が０．１ｍｍ以上であると、使用者が摘むなどの操作性に優れる粒子状容器とすることができる。
【００４７】
核酸試料含有容器の形状としては、増幅可能な試薬を配することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、Ｕ底、Ｖ底等の凹部、基板上の区画、球形などが挙げられる。
【００４８】
核酸試料含有容器の凹部又は区画などの数としては、２以上の複数であることが好ましく、５以上がより好ましく、５０以上が更に好ましい。
核酸試料含有容器としては、凹部又は区画などの数が２以上である基材で連結されたマイクロチューブ、マルチウェルプレートなどを好適に用いることができる。
基材で連結されたマイクロチューブとしては、例えば、２連、３連、４連、６連、８連、１２連、１６連、２４連、又は４８連マイクロチューブが挙げられる。
マルチウェルプレートとしては、例えば、２４穴、４８穴、９６穴、３８４穴、又は１,５３６穴のウェルプレートが挙げられる。
【００４９】
核酸試料含有容器の容積としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、核酸試料含有容器を核酸検査装置の反応容器として用いる場合、試料の量を考慮すると、１０μＬ以上１,０００μＬ以下が好ましい。ただし、核酸試料含有容器として粒子状容器を反応系に添加する場合には、２００μＬ以下であり、２０μＬ以下が好ましく、２μＬ以下がより好ましい。核酸試料含有容器の容積が２００μＬ以下であると、核酸試料含有容器を添加する反応系の体積変化を少なくすることができる。
【００５０】
核酸試料含有容器の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、不溶性、可溶性などが挙げられる。
不溶性の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
可溶性の材質としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、アガロースゲル、糖などが挙げられる。
【００５１】
核酸試料含有容器の色としては、例えば、透明、半透明、着色、完全遮光などが挙げられる。核酸試料含有容器が着色されていると、使用者が着色によって核酸試料含有容器の情報を視認することができ、操作性を向上させることができる。
【００５２】
−−基材−−
基材としては、核酸試料含有容器が基材に設けられたプレート状のものが好ましいが、８連チューブ等の連結タイプのウェルチューブであってもよい。
基材としては、その材質、形状、大きさ、構造などについて特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
基材の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックスなどが挙げられる。これらの中でも、プラスチックスが好ましい。
プラスチックスとしては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、板状、プレート状などが好ましい。
基材の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造であっても複数層構造であっても構わない。
【００５３】
−−粒子状容器−−
粒子状容器としては、第一の核酸分子と第二の核酸分子とを内包する外殻を有するか、第一の核酸分子と第二の核酸分子とを含有する固体状又はゲル状の粒子とすることなどが挙げられる。
第一の核酸分子と第二の核酸分子とを内包する外殻としては、例えば、カプセル状の粒子などが挙げられる。
【００５４】
また、本発明の核酸試料含有容器としては、第一の核酸分子及び第二の核酸分子を含む核酸を含有する分散相と、連続相と、分散相及び連続相を内包する保護部材とを有していてもよい。
【００５５】
固体状の粒子としては、例えば、第一の核酸分子と第二の核酸分子とを含む分散相を散在して含有する錠剤状の粒子などが挙げられる。具体的には、例えば、医薬品用カプセル、リポソーム、マイクロカプセルなどが挙げられる。
ゲル状の粒子としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、アガロースゲルなどを含む粒子などが挙げられる。具体的には、例えば、人工イクラなどが挙げられる。
【００５６】
粒子状容器の容積としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２００μＬ以下であり、２０μＬ以下が好ましく、２μＬ以下がより好ましい。容積が２００μＬ以下であると、粒子状容器を添加する反応系の体積変化を少なくすることができる。
【００５７】
核酸試料含有容器としては、核酸試料含有容器中に含まれる核酸の情報、分散相の情報などを付与しておいてもよい。
【００５８】
核酸試料含有容器中に含まれる核酸の情報としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、目的の塩基配列における配列、目的の塩基配列を有する核酸の分子数、含まれている核酸の分子数の不確かさ、核酸の種類などが挙げられる。これらは１種単独でもよく、２種以上を併用して付与してもよい。
【００５９】
分散相の情報としては、分注されている核酸のコピー数、核酸が分散している溶液の種類、分散相の不確かさ、分散相の充填精度などが挙げられる。これらは１種単独でもよく、２種以上を併用して付与してもよい。
【００６０】
容器内に分注されている核酸のコピー数の平均値と標準偏差は、１つの陽性分散相内に含まれる目的の塩基配列のコピー数の平均値と標準偏差を、以下の式１から式５に基づき算出することから求めることができる。式１から式５を用いることにより、１つの陽性分散相当たりに含まれる目的の塩基配列のコピー数の平均値と標準偏差を、ポアソン分布を考慮して求めることができる。
【００６１】
【数１】
2019162101.tif 000003
【００６２】
【数２】
2019162101.tif 000004
【００６３】
【数３】
2019162101.tif 000005
【００６４】
【数４】
2019162101.tif 000006
【００６５】
【数５】
2019162101.tif 000007
【００６６】
式１中、ｋは１つの陽性分散相に含まれるコピー数であり、λはサンプルを測定した全分散相のうち、陽性分散相（Ｐｏｓｉ）の割合、Ｐは全陽性分散相中の目的の塩基配列が所定のコピー数入っている陽性分散相の確率、式２中の左辺は１つの陽性分散相内に含まれるコピー数の平均値、式３中のσ１は１つの陽性分散相内に含まれるコピー数の標準偏差、式４及び式５中のＮは陽性分散相の特定の区画数、ｍは特定区画数の陽性分散相内に含まれるコピー数の平均値、式５中のσｍは特定区画数の陽性分散相内に含まれるコピー数の標準偏差を意味する。
陽性分散相とは、本発明の核酸試料含有容器の製造方法において説明する吐出機構の検出器により分散相中の標識が検出された分散相を意味し、陰性分散相（Ｎｅｇａ）とは、吐出機構の検出器により分散相中の標識が検出されなかった分散相を意味する。なお、標識が検出されなかったとは、標識を検出すると認める閾値を超えなかったことを意味する。
【００６７】
また、陽性分散相が目的の塩基配列を１つのみ含む確率としては、９０％以上であることが好ましい。なお、陽性分散相が目的の塩基配列を１つのみ含む確率とは、各々の陽性分散相が包含する離散的なコピー数の確率Ｐの内、目的の塩基配列を１つのみ含む陽性分散相の確率を意味する。
【００６８】
上記「不確かさ」とは、「測定の結果に付随した、合理的に測定量に結びつけられ得る値のばらつきを特徴づけるパラメータ」であるとＩＳＯ／ＩＥＣ  Ｇｕｉｄｅ９９：２００７［国際計量計測用語−基本及び一般概念並びに関連用語（ＶＩＭ）］に定義されている。
ここで、「合理的に測定量に結びつけられ得る値」とは、測定量の真の値の候補を意味する。即ち、不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器などに起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。不確かさが大きいほど、測定結果として予想されるばらつきが大きくなる。
不確かさとしては、例えば、測定結果から得られる標準偏差であってもよく、真の値が所定の確率以上で含まれている値の幅として表す信頼水準の半分の値としてもよい。
不確かさを算出する方法としては、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ  ｉｎ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ（ＧＵＭ：ＩＳＯ／ＩＥＣ  Ｇｕｉｄｅ９８−３）、及びＪａｐａｎ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  Ｂｏａｒｄ  Ｎｏｔｅ  １０  試験における測定の不確かさに関するガイドラインなどに基づき算出することができる。不確かさを算出する方法としては、例えば、測定値などの統計を用いたタイプＡ評価法と、校正証明書、製造者の仕様書、公表されている情報などから得られる不確かさの情報を用いたタイプＢ評価法の２つの方法を適用することができる。
不確かさは、操作及び測定などの要因から得られる不確かさを全て標準不確かさに変換することにより、同じ信頼水準で表現することができる。標準不確かさとは、測定値から得られた平均値のばらつきを示す。
不確かさを算出する方法の一例としては、例えば、不確かさを引き起こす要因を抽出し、それぞれの要因の不確かさ（標準偏差）を算出する。さらに、算出したそれぞれの要因の不確かさを平方和法により合成し、合成標準不確かさを算出する。合成標準不確かさの算出において、平方和法を用いるため、不確かさを引き起こす要因の中で不確かさが十分に小さい要因については無視することができる。不確かさは合成標準不確かさを期待値で除した変動係数（ＣＶ値）を用いてもよい。
【００６９】
変動係数とは、目的の塩基配列を有する核酸を容器（例えば、粒子、ウェルなどが挙げられる）に充填する際に生じる各容器に充填される目的の塩基配列を有する核酸数（又は、核酸の数）のばらつきの相対値を意味する。即ち、変動係数とは、容器に充填した目的の塩基配列を有する核酸の数の充填精度を意味する。変動係数とは、標準偏差σを平均値ｘで除した値である。ここでは、標準偏差σを平均コピー数（平均充填コピー数）ｘで除した値を変動係数ＣＶとすると、下記式６の関係式になる。
【００７０】
【数６】
2019162101.tif 000008
【００７１】
一般的に、核酸は分散液中でポアソン分布のランダムな分布状態を取っている。そのため、段階希釈法、即ち、ポアソン分布におけるランダムな分布状態では、標準偏差σは、平均コピー数ｘと下記式７の関係式を満たすとみなすことができる。これより、核酸の分散液を段階希釈法により希釈した場合、標準偏差σと平均コピー数ｘとから平均コピー数ｘの変動係数ＣＶ（ＣＶ値）を、上記式６及び式７から導出された下記式８を用いて求めると、表１及び図１に示すようになる。なお、ポアソン分布に基づくばらつきを持ったコピー数の変動係数のＣＶ値は図１から求めることができる。
【００７２】
【数７】
2019162101.tif 000009
【００７３】
【数８】
2019162101.tif 000010
【００７４】
【表１】
2019162101.tif 000011
【００７５】
表１及び図１の結果から、例えば、容器に１００コピー数の核酸を段階希釈法により充填する場合には、最終的に反応溶液中に充填される核酸の特定コピー数はその他の精度を無視しても、少なくとも１０％の変動係数（ＣＶ値）を持つことがわかる。
【００７６】
核酸試料含有容器に含有する目的の塩基配列の数の充填精度（ＣＶ値）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２０％未満が好ましい。
【００７７】
核酸試料含有容器の情報を付与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、情報の内容に応じて核酸試料含有容器を着色する方法、情報の内容を粒子に印刷する方法などが挙げられる。
情報の内容に応じて核酸試料含有容器を着色する方法を用いることにより、使用者が核酸試料含有容器の情報を視認することができ、操作性を向上させることができる。
【００７８】
−その他の材料−
その他の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分散相の溶液以外の溶液、蛍光物質（蛍光標識試薬）、消光物質などが挙げられる。
【００７９】
分散相の溶液以外の溶液としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、核酸を溶解しない油系溶媒等が挙げられる。
分散相の溶液以外の溶液としては、例えば、プロトン性極性溶媒、非プロトン性極性溶媒、非極性溶媒などが挙げられる。
【００８０】
蛍光物質（蛍光標識試薬）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光色素などが挙げられる。
【００８１】
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類が好ましく、特にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、Ｅｖａ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ（登録商標）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）、ＲＯＸ、ＦＩＴＣがより好ましい。
【００８２】
消光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡなどが挙げられる。
【００８３】
図２は、本発明の核酸試料含有容器の一例を示す図である。なお、図２においては、核酸試料含有容器がカプセル状のものについて説明を行うが、本発明はこの形態に限定されるものではない。
図２に示すように、核酸試料含有容器１は目的の塩基配列を有する核酸１２０を有する分散相１１０を内包している。また、図２に示すように、１つの分散相１１０に１分子の核酸を含むため、核酸試料含有容器１に分注する分散相１１０の数を制御することにより、核酸試料含有容器１が含有する目的の塩基配列を有する核酸１２０の数を任意の数に制御することができている。
【００８４】
本発明の核酸試料含有容器は、核酸試料を粒子の形状にしたことにより、操作性を向上させることができる。核酸試料の操作性が向上したことにより、任意の実験系に目的の塩基配列を有する極微量の核酸を必要な量添加することができるため、使用者の要求に応じた反応系を作り出すことができる。なお、ここで極微量とは、１分子以上１，０００分子以下程度の分子数を意味する。
また、本発明の核酸試料含有容器は、核酸試料が粒子に内包されているため、核酸の保存性に優れる。
さらに、本発明の核酸試料含有容器は、製造において核酸試料含有容器に含まれる目的の塩基配列を有する核酸のコピー（単位）数を厳密に制御することができるため、含有する目的の塩基配列のコピー（単位）数を把握することができる。
【００８５】
（核酸試料含有容器の製造方法、核酸試料含有容器の製造装置、核酸試料含有容器の製造プログラム）
本発明の核酸試料含有容器の製造装置は、本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムを読み出して実行することで、本発明の核酸試料含有容器の製造方法を実行する装置として動作する。すなわち、本発明の核酸試料含有容器の製造装置は、本発明の核酸試料含有容器の製造方法と同様の機能をコンピュータに実行させる本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムを有する。なお、本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムは、本発明の核酸試料含有容器の製造装置によって実行されることに限定されるものではない。例えば、本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムは、他のコンピュータ又はサーバによって実行されてもよく、本発明の核酸試料含有容器の製造装置、他のコンピュータ、及びサーバのいずれかが協働して実行されてもよい。
つまり、本発明の核酸試料含有容器の製造装置は、本発明の核酸試料含有容器の製造方法を実施することと同義であるので、主に本発明の核酸試料含有容器の製造装置の説明を通じて本発明の製造方法の詳細についても明らかにする。また、本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムは、ハードウェア資源としてのコンピュータ等を用いることにより、本発明の核酸試料含有容器の製造装置として実現させるため、本発明の製造装置の説明を通じて本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムの詳細についても明らかにする。
【００８６】
本発明の核酸試料含有容器の製造方法は、
目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する分散相形成工程と、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅する増幅工程と、
前記分散相において前記検出用塩基配列が増幅された陽性分散相と前記検出用塩基配列が増幅されなかった陰性分散相を判別する判別工程と、
前記判別工程で判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別する選別工程と、
前記選別工程で選別した、前記陽性分散相を容器に分注する分注工程と、
を含み、更に必要に応じてその他の工程を有する。
【００８７】
本発明の核酸試料含有容器の製造装置は、
目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する分散相形成手段と、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅する増幅手段と、
前記分散相において前記検出用塩基配列が増幅された陽性分散相と前記検出用塩基配列が増幅されなかった陰性分散相を判別する判別手段と、
前記判別手段で判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別する選別手段と、
前記選別手段で選別した、前記陽性分散相を容器に分注する分注手段と、
を有し、更に必要に応じてその他の手段を有する。
【００８８】
本発明の核酸試料含有容器の製造方法は核酸試料含有容器の製造装置により好適に行うことができる。つまり、分散相形成工程は分散相形成手段により好適に行うことができ、増幅工程は増幅手段により好適に行うことができ、判別工程は判別手段により好適に行うことができ、選別工程は選別手段により好適に行うことができ、分注工程は分注手段により好適に行うことができ、その他の工程はその他の手段により行うことができる。
【００８９】
本発明は、従来技術の核酸試料含有容器の製造方法では、所定数の目的の塩基配列を含む核酸を、短時間で夾雑物をほぼ含むことなく容器に分注することが困難であるという知見に基づくものである。
具体的には、例えば、従来技術では、目的の塩基配列を有する核酸の希釈液に対するリアルタイムＰＣＲの結果から、特定の分子数を含む希釈液を選別する場合には、任意の分子数の核酸を含む標準試薬を作製し、分注することが難しいという問題があった。この場合、標準試薬を作製する際に要する時間及び標準試薬を作製できる量は、リアルタイムＰＣＲを行う装置の性能に依存するため、短時間で標準試薬を作製し、分注できないことがある。
また、例えば、従来技術では、遺伝子組み換え技術を用いて目的の塩基配列を導入した細胞を使用する場合には、遺伝子組み換え、細胞培養などの煩雑な作業が要求され、短時間で核酸を分注することが難しいという問題がある。この場合、目的の塩基配列を導入した細胞を単離する際に、細胞由来の夾雑物（タンパク質や脂質など）が、分注した容器を汚染してしまうことがある。
さらに、従来技術では、核酸の目的の塩基配列を有する部分を増幅し、核酸増幅反応が起きたドロップレット又はゲルドロップレットをソーティング（選別）する方法では、目的の塩基配列を所望のコピー数（特定コピー数）分注することは難しいことがある。
【００９０】
本発明の核酸試料含有容器の製造方法は、所定数の目的の塩基配列を含む核酸を、夾雑物が少なく、短時間で容器に分注することができる。
【００９１】
＜分散相形成手段及び分散相形成工程＞
分散相形成手段は、目的の塩基配列及び目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する。
分散相形成工程は、分散相形成手段により、目的の塩基配列及び目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成させる。
【００９２】
分散相形成手段としては、後述する核酸含有液を区分して、分散相を複数形成する（微小区画化する）ことができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、例えば、ドロップレットジェネレータなどが挙げられる。高速に核酸含有液を複数の分散相に区分する手段として、マイクロ流路を用いたドロップレット生成や、マイクロ・ナノスケールのウェルに核酸含有液を充填する方法などが挙げられる。
核酸含有液の分散相の形成が自動化された装置として、例えば、ドロップレットジェネレータを用いることもできる。
ドロップレットジェネレータとしては、公知のものを利用することができ、例えば、バイオ・ラッド社製のＡｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｏｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ、特許第３７４６７６６号に記載のエマルション（分散相）の製造装置などが挙げられる。特許第３７４６７６６号に記載のエマルションの製造装置は、マイクロチャネル（マイクロ流路）を流れる連続相に対し、分散相を連続相の流れに交差する向きで排出し、連続相のせん断力により分散相を製造する。
また、分散相に連続的な複数のスプリッタを通過させることで、より高速に溶液を区分することも好ましい。
【００９３】
＜＜核酸含有液＞＞
核酸含有液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、本発明の核酸試料含有容器に用いる溶液と同様のものを使用することができるため、説明を省略する。
【００９４】
また、核酸含有液は、後述する増幅工程において、検出用塩基配列を増幅させるために、プライマー及び核酸増幅試薬、及び標識用試薬を含むことが好ましい。
【００９５】
プライマーは、ＰＣＲ法を用いて検出用塩基配列を増幅する場合、検出用塩基配列と相補的塩基配列を有する１８ｍｅｒから３０ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドであり、増幅したい領域を挟むようにフォワードプライマーとリバースプライマーとが２か所設定される。
核酸増幅試薬としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、４種の塩基（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ）、Ｍｇ２＋（２ｍＭの塩化マグネシウム）、最適ｐＨ（ｐＨ７．５〜９．５）を保持するバッファー、ｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ヌクレアーゼフリー水などが挙げられる。
核酸含有液に検出用塩基配列を増幅させるためのプライマー及び核酸増幅試薬を含有させることにより、後述する判別工程において、分散相に含まれる目的の塩基配列のコピー数を変化させることなく、分散相に目的の塩基配列が含まれていることを検出することができる。
【００９６】
標識用試薬としては、検出用塩基配列の増幅により標識として判別可能になるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、分散相に対して光学的標識（蛍光標識）を行うことができるものが好ましい。光学的標識を行う試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔａｑ  Ｍａｎ  ｐｒｏｂｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎなどの核酸プローブや、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、Ｅｖａ  Ｇｒｅｅｎなどのインターカレータを利用できる。
また、インターカレータを利用する場合は、検出用塩基配列を増幅した後に、核酸含有液にインターカレータを添加する方式も利用可能である。
【００９７】
＜＜分散相＞＞
分散相とは、上述した核酸含有液が微小な大きさの単位に区分されたもの意味する。以下、分散相を、「微小区画」と称することがある。
【００９８】
分散相としては、目的の塩基配列を有する核酸を含む領域であり、目的の塩基配列を有する核酸を分散させる核酸含有液が微小な大きさに区分された区画を意味する。分散相の詳細な説明については、本発明の核酸試料含有容器における分散相と同様であるため、説明を省略する。
【００９９】
なお、分散相形成手段により溶液を分散相に区分する際は、目的の塩基配列と増幅される前の検出用塩基配列とを有する核酸が、１つの分散相に多くとも１つ（１分子）含まれるような核酸の濃度の核酸含有液で行うことが好ましい。
１つの分散相に、目的の塩基配列を有する核酸が多くとも１分子含まれるような核酸の濃度としては、例えば、１０個から１００個の分散相に対して、目的の塩基配列を有する核酸が含まれる分散相が１つとなるような核酸の濃度が好ましい。
溶液を目的の塩基配列を有する核酸が含まれる分散相が１つとなるような核酸の濃度とすることで、分散相に含まれる核酸の数は０分子（核酸が含まれていない）又は１分子となることが見込まれ、後述する分注手段により分散相を分注する際に、分注する核酸の分子数をより正確に制御することができる。
【０１００】
−−核酸−−
核酸は、本発明の核酸試料含有容器に用いることができるものと同じものを使用することができるため、説明を省略する。
【０１０１】
−−−目的の塩基配列−−−
目的の塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、本発明の核酸試料含有容器に用いることができるものと同じものを使用することができるため、説明を省略する。
【０１０２】
また、本発明においては、目的の塩基配列そのものの数を、コピー数ともいう。さらに、この目的の塩基配列を有し、その他の塩基配列（例えば、後述する検出用塩基配列）も含む、１つにつながれた核酸の１つの単位を、例えば、１分子ともいう。本発明では、１分子の核酸に含まれる目的の塩基配列は１コピーであることが好ましい。また、本発明においては、目的の塩基配列と後述する検出用塩基配列とを有する核酸に対して、検出用塩基配列を増幅させるため、増幅前と増幅後で、目的の塩基配列のコピー数は変化しない。
【０１０３】
−−−検出用塩基配列−−−
検出用塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、本発明の核酸試料含有容器に用いることができるものと同じものを使用することができるため、説明を省略する。
【０１０４】
＜増幅手段及び増幅工程＞
増幅手段は、分散相において前記検出用塩基配列を増幅する。
増幅工程では、増幅手段により、分散相の中で前記検出用塩基配列を増幅させる。
増幅手段としては、精密な温度制御ができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、例えば、サーマルサイクラー、リアルタイムＰＣＲ装置、ホットプレートなどが挙げられる。
【０１０５】
検出用塩基配列を増幅する手法としては、特に制限なく、目的に応じて適宜選択でき、例えば、ＰＣＲ法、等温増幅法などが挙げられる。
等温増幅法としては、例えば、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＲＣＡ法、ＳＭＡＰ法、ＲＰＡ法、ＨＣＲ法などが挙げられる。
ＲＣＡ法を用いる場合、例えば、まず、３’末端に配置した検出用塩基配列を有する核酸において、３’末端と５’末端の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いて核酸を環状化し、ライゲーション反応を行うことで、環状化核酸を得る。次に、得られた環状に対する伸長反応プライマーを用いて、検出用塩基配列を有する核酸断片を増幅することが可能である。
また、３’末端に配置された検出用塩基配列と相補的な塩基配列を含む予め環状化された環状プローブを用いて核酸増幅反応を行うこともできる。この場合は、後述する光学的標識用試薬として、検出用塩基配列と特異的に結合するプローブなどの標識を用いることが好ましい。
また、増幅手段は、マイクロ流路上で分散相に含まれる検出用塩基配列を増幅させる形態でも、チューブに取り分けられた分散相に含まれる検出用塩基配列を増幅させる形態でもよい。
【０１０６】
増幅手段は、分散相の中で検出用塩基配列を増幅することで、分散相に含まれる目的の塩基配列を有する核酸の分子数を正確に制御することができる。例えば、増幅手段が検出用塩基配列を増幅する前の分散相に、目的の塩基配列を１コピー有する核酸が１分子含まれているとする。この場合、増幅手段が検出用塩基配列を増幅した後の分散相に含まれる目的の塩基配列は、増幅前と変わらずに１コピーのままである。後述する分注手段は、後述する容器などに対して、目的の塩基配列のコピー数が特定されている核酸を含む分散相を分注することにより、目的の塩基配列を所望のコピー数（所定数）分注することができる。
【０１０７】
＜判別手段及び判別工程＞
判別手段は、分散相において検出用塩基配列が増幅された分散相（陽性分散相）と検出用塩基配列が増幅されなかった分散相（陰性分散相）を判別する。
判別工程では、分散相において判別手段により、検出用塩基配列が増幅された分散相（陽性分散相）と検出用塩基配列が増幅されなかった分散相（陰性分散相）を判別させる。
【０１０８】
判別手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、例えば、分散相に光学的標識を行う標識用試薬が含まれている場合は、光源と受光素子を有する光学的判別手段などが挙げられる。
判別手段を光学的判別手段とすることにより、判別手段は、分散相が生ずる光信号を検出して、検出用塩基配列が増幅された核酸を含む分散相を判別することができる。具体的な光学的判別手段の判別の手法としては、例えば、分散相が生ずる光信号の強度に対する閾値を設定し、検出した光信号の強度が閾値を上回った場合に、分散相に目的の塩基配列を有する核酸が含まれると判別する手法が挙げられる。
【０１０９】
光学的判別手段としては、光源から分散相に光を照射し、照射された光に応じた分散相の光信号を検出できる受光素子を有するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択できる。
光源としては、分散相の光信号を励起できるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、水銀ランプやハロゲンランプなどの一般的なランプに特定の波長を照射するようにフィルタをかけたものや、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）、レーザーなどを用いることが可能である。ただし、特に１ｎＬ以下の微小な液滴を形成するときには、狭い領域に高い光強度を照射する必要があるため、レーザーを用いるのが好ましい。レーザー光源としては、固体レーザーやガスレーザー、半導体レーザーなど一般的に知られている多種のレーザーを用いることが可能である。
受光素子は、分散相から発せられる光信号を受光できる素子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴に特定の波長を有する光を照射して液滴内の分散相からの光信号を受光する光学センサが好ましい。受光素子としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の１次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光素子として、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等の２次元素子を用いてもよい。
【０１１０】
また、判別手段は、分散相において検出用塩基配列が増幅された陽性分散相と検出用塩基配列が増幅されなかった陰性分散相を判別するのと同時に、陽性分散相を計数することが好ましい。判別手段が、陽性分散相と陰性分散相を判別するのと同時に、陽性分散相を計数することにより、後述する分注工程で分注する陽性分散相の数を調節することができる。
【０１１１】
＜選別手段及び選別工程＞
選別手段は、前記判別手段で判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別する。
選別工程では、選別手段により、前記判別工程で判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別させる。
【０１１２】
選別手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、例えば、電気力学的な機構、流路を変形させて流体の流れを制御する機構、機械的なバルブなどを用いた機構などが挙げられる。
選別手段を電気力学的な機構とすることにより、選別手段は、前記陽性分散相を高速に選別することができる。具体的な電気力学的な機構としては、例えば、不平等電界を形成し、誘電泳動によって狙いの分散相のみを引き寄せる手法が挙げられる。
また、前記判別手段及び判別工程において検出された光信号と同期させることにより、分散相の選別を好適に行うことができる。
【０１１３】
選別手段で選別された陽性分散相は、後述の分注機構に輸送されることが好ましい。
【０１１４】
＜分注手段及び分注工程＞
分注手段は、前記選別手段で選別した、陽性分散相を容器に分注する。
分注工程では、分注手段により、選別工程で選別した、陽性分散相を容器に分注させる。
【０１１５】
分注手段は、容器へ分注するための吐出機構を有する。
吐出機構は、選別機構が選別した目的の塩基配列を有する核酸を含む分散相を容器に分注する。
吐出機構としては、特に制限はなく、適宜選択でき、例えば、分散相を容器に輸送可能な流路、オンデマンド方式のもの、コンティニュアス方式ものなどが挙げられる。これらの中でも、分散相を容器に輸送可能な流路が好ましい。
分散相を容器に輸送可能な流路としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分散相を搬送可能なチューブなどが挙げられる。
オンデマンド方式の吐出機構としては、例えば、吐出ヘッドなどが挙げられる
【０１１６】
吐出ヘッドの方式としては、例えば、インクジェット方式などが挙げられる。
インクジェット方式の吐出ヘッドとしては、圧力印加方式、サーマル方式、静電方式のものなどが挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。
【０１１７】
静電方式は、分散相を保持して液滴を形成する吐出機構に対向して電極を設置する必要がある。本発明の核酸試料含有容器の製造装置では、吐出機構が容器に対向して配置されることがあり、分散相の配置の自由度を上げるため電極の配置は無いほうが好ましい。
サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である核酸への影響や、ヒーター部への焦げ付き（コゲーション）が懸念される。熱による影響は、分散相の含有物や分注物の用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から好ましい。
【０１１８】
圧力印加方式としては、例えば、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式などが挙げられる。
【０１１９】
吐出機構においては、さらに、分散相に含まれる標識を検出可能な検出器を備えてもよい。
検出器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、光学的増幅検出機構（判別手段）と同様のものを用いることができる。
【０１２０】
上述した核酸試料含有容器の製造装置が行う各種処理は、核酸試料含有容器の製造装置を形成する制御部を有するコンピュータにより実行される。
コンピュータとしては、記憶、演算、制御などの装置を備えた機器であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パーソナルコンピュータなどが挙げられる。
【０１２１】
本発明の核酸試料含有容器の製造装置により製造された核酸試料含有容器は、容器に分注されている目的の塩基配列のコピー（単位）数が制御されているので、食品検査、血液検査などに好適に利用できる。なお、容器としては、例えば、粒子、バイオ分野において一般的に用いられるウェルが形成されたプレートなどがあげられる。また、プレートにおけるウェルの数は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単数であってもよく、複数であってもよい。
【０１２２】
粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、本発明の核酸含有容器に記載したものなどが挙げられる。
【０１２３】
プレートとしては、１穴マイクロチューブ、８連チューブ、９６穴、３８４穴のウェルプレートなどを用いることが好ましいが、ウェルが複数である場合には、これらのプレートにおけるウェルには同じ個数の核酸を分注することも可能であるし、異なる水準の個数を入れることも可能である。また、核酸が含まれないウェルが存在していてもよい。特に核酸の量を定量的に評価するリアルタイムＰＣＲ装置やデジタルＰＣＲ装置の評価に用いるプレートを作製する際には、複数水準の数の核酸が分注されたものを用いることが好ましい。例えば、核酸が、おおよそ１個、２個、４個、８個、１６個、３２個、６４個の７水準で分注したプレートを作製することが考えられる。このようなプレートを用いることによって、リアルタイムＰＣＲ装置やデジタルＰＣＲ装置の定量性、線形性、評価下限値などを調べられる他、次世代シークエンサーの発現量解析におけるリファレンスとして用いることが可能である。
【０１２４】
ウェルの中には、あらかじめ水性の液体を充填しておいてもよい。
ウェルの中に充填する水性の液体としては、例えば、ヌクレアーゼフリー水、核酸増幅試薬、核酸保存試薬などが挙げられ、水性の液体をウェルの中に充填しておくことにより、すぐに核酸試料を次の反応に用いることができる。
【０１２５】
＜その他の手段及びその他の工程＞
その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、計数工程、などが挙げられる。
計数工程は、計数手段により好適に行うことができる。
【０１２６】
計数手段としては、例えば、上述した選別機構と吐出機構との間の流路内で分散相の数を計数してもよいし、吐出機構内の分散相の数を計数してもよいし、吐出機構により吐出された分散相の数を計数してもよい。吐出機構により吐出された分散相の数を計数する場合、計数手段は、吐出機構により吐出された連続相の液滴に含まれる分散相の数を計数する。
計数手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、例えば、標識用試薬として光学的標識（蛍光標識）を用いた場合は、光源と受光素子を有する光学的計数機構などが挙げられる。
【０１２７】
光学的計数機構としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、光学的増幅検出機構（判別手段）と同様のものを用いることができる。
また、吐出機構により吐出された連続相の液滴に含まれる分散相の数を計数する場合、光学的計数機構が照射する光は、飛翔中の液滴に含まれる分散相の数を計数するため、液滴が通過する領域を連続的に照射したもの、液滴の吐出に同期して液滴吐出動作に対して所定時間遅延を付けたタイミングでパルス的に照射するものなどが好ましい。
【０１２８】
計数手段により、吐出された核酸含有液の液滴に含まれる分散相の数を計数することで、実際に吐出された液滴に含まれる分散相の数を特定することができるので、容器に分注する分散相の数を正確に制御することができる。
【０１２９】
本発明の核酸試料含有容器の製造方法においては、核酸を含む細胞を分注した後に細胞を単離する手法で核酸を分注する手法ではなく、細胞を介せずに核酸を分注するため、反応系への細胞由来の夾雑物（タンパク質や脂質など）などの混入を防ぐことができる。
【０１３０】
以下、本発明の核酸試料含有容器の製造方法について、図面を参照して詳細に説明する。なお、以下の説明では、マイクロ流路を用いて核酸含有液を区分して分散相を形成する場合を例として説明する。
【０１３１】
図３は、マイクロ流路の中で核酸含有液である溶液Ｘを分散相に区分する分散相形成手段の一例を示す図である。
図３に示すように、目的の塩基配列Ａ及び目的の塩基配列Ａの存在を確認するための検出用塩基配列Ｂを有する核酸５００を含む溶液Ｘは、分散相形成手段６０１の左上の流路を流れている。また、核酸増幅試薬及び蛍光標識試薬を含む溶液Ｙは分散相形成手段６０１の左下の流路を流れている。溶液Ｘと溶液Ｙとは、１本の流路で合流し、混合される。
【０１３２】
また、マイクロ流路上で溶液Ｘと溶液Ｙとを混合する場合、２本の流路が１本の流路に合一した後に、溶液Ｘと溶液Ｙとを撹拌することができる流路を設けてもよい。溶液Ｘと溶液Ｙとを撹拌することできる流路としては、例えば、蛇行流路や、ピラーアレイ流路、広がり流路、狭まり流路などが挙げられる。
【０１３３】
次に、溶液Ｘと溶液Ｙの混合により得られた混合液は、図３の中央上下から流れ込む連続相流体であるオイルからのせん断力によってドロップレットとして分散相に区分され、図３の流路下流（右側）に輸送される。
【０１３４】
図３では、１つの分散相に、核酸５００が多くとも１分子含まれるような核酸濃度の溶液を用いている。そのため、分散相によっては、核酸５００を１分子含む分散相５１０と、核酸５００を含まない分散相５１１が形成される。
【０１３５】
分散相形成手段６０１にマイクロ流路を用いることにより、溶液Ｘと溶液Ｙとの混合液を非常に高速に分散相に区分することができる。具体的には、マイクロ流路を用いて核酸含有液を分散相に区分することにより、１秒間に１０００個程度の速度で、高速に分散相を形成させることができる。
【０１３６】
図４は、マイクロ流路の中で溶液Ｘを分散相に区分する分散相形成手段のその他の一例を示す図である。
目的の塩基配列Ａ及び目的の塩基配列Ａの存在を確認するための検出用塩基配列Ｂを有する核酸５００を含む核酸含有液である溶液Ｘは、分散相形成手段６０１の右上の流路を流れている。また、核酸増幅試薬及び蛍光標識試薬を含む溶液Ｙは分散相形成手段６０１の左上の流路を流れている。液Ｘと溶液Ｙとは、１本の流路で合流し、混合される。
【０１３７】
次に、混合された溶液Ｘと溶液Ｙの混合液は、分散相形成手段６０１の中央左下から流れ込む連続相流体であるオイルからのせん断力によってドロップレットとして分散相に区分され、図４の右側の流路下流に輸送される。
【０１３８】
図５は、増幅手段の一例を示す図である。
増幅手段６０２は、核酸５００を含む分散相５１０に対して、ＰＣＲ法を用いた核酸増幅反応を行うことで、核酸５００に含まれる検出用塩基配列Ｂを増幅させて、分散相５１０を光学的に標識する。
【０１３９】
具体的には、増幅手段６０２は、核酸５００、核酸増幅試薬、及び蛍光標識試薬を含む分散相５１０を、複数の温度帯を有する蛇行流路に流通させて、分散相５１０の温度を上下させる。分散相５１０が複数の温度帯を行き来することにより、核酸増幅試薬によって分散相５１０に含まれる核酸５００の検出用塩基配列Ｂの塩基配列が増幅される。その結果、分散相５１０は、検出用塩基配列Ｂが増幅された核酸５００を含む分散相５１２となる。そして、分散相５１２は、検出用塩基配列Ｂが増幅されたことに起因して、蛍光標識試薬が検出用塩基配列Ｂと反応し、分散相５１２が光学的に標識された状態となる。
光学的に標識された分散相５１２は、図６に示す判別手段６０３の光源により光が照射された際に、核酸５００が含まれない分散相５１１より強い蛍光を発するため、光学的に標識された分散相５１２と核酸５００が含まれない分散相５１１とを、判別することが容易になる。
【０１４０】
図６は、検出用塩基配列Ｂが増幅された核酸を含む分散相を判別する判別手段及び分散相を誘電泳動により選別する選別手段における判別機構及び選別機構の一例を示す図である。
判別手段６０３は、検出用塩基配列Ｂが増幅された分散相５１２からの蛍光を検出し、検出用塩基配列Ｂが増幅された核酸５００を含む分散相５１２と核酸５００が含まれない分散相５１１を判別する。
【０１４１】
判別手段６０３の光学検出機構が蛍光検出を行う場合、光源と受光素子を有し、受光素子は、検出用塩基配列Ｂが増幅されて光学的標識をされた状態である分散相５１２が、光源からの光を励起光として吸収して発する蛍光を受光する。蛍光は、分散相５１２から四方八方に発せられるため、受光素子は蛍光を受光可能な任意の位置に配置することができる。この際、コントラストを向上させるために、光源から出射される光が直接入射しない位置に受光素子を配置することが好ましい。
判別手段６０３は、受光素子が受光した蛍光の強度に基づいて、検出用塩基配列Ｂが増幅された核酸を含む分散相５１２と核酸５００が含まれない分散相５１１を判別する。
【０１４２】
陰極６０４ａ及び陽極６０４ｂからなる選別機構６０４は、誘電泳動により検出用塩基配列Ｂが増幅された核酸を含む分散相５１２と核酸５００が含まれない分散相５１１を選別する。
選別機構６０４は、検出用塩基配列Ｂが増幅された核酸５００を含む分散相５１２が選別機構６０４の周辺を通過する際に、図６上部に示す陰極６０４ａ及び陽極６０４ｂに適切な電圧を印加することにより、不平等電界を選別機構６０４周辺に形成する。不平等電界により分極した分散相５１２は、不平等電界によって誘電泳動して選別機構６０４側に引き寄せられて、図６右上の流路を流れていき、吐出機構へ輸送される。
選別機構６０４は、核酸５００が含まれない分散相５１１が選別機構６０４の周辺を通過する際には、陰極６０４ａ及び陽極６０４ｂに電圧を印加しない。よって、核酸５００が含まれない分散相５１１は、誘電泳動することなく、図６右下の流路へ流れて廃棄される。
このとき、選別機構６０４により選別された検出用塩基配列Ｂが増幅された分散相５１２が流れる流路は、核酸５００が含まれない分散相５１１が流れる廃棄用の流路よりも１．２倍から１．５倍の流体抵抗を持つようにすることが好ましい。前述した流体抵抗とすることで、電界が印加されていない状態では全ての分散相が廃棄用の流路へ流れるため、検出用塩基配列Ｂが増幅された核酸を含む分散相５１２をより確実に選別することができる。
【０１４３】
図７は、吐出機構の一例を示す図である。
図７に示すように、吐出機構６０５は、判別手段６０３と同様の検出機構６０６、分散相を輸送可能な流路６０７を有している。なお、以下の説明では、検出用塩基配列Ｂが増幅された核酸を含む分散相５１２を、選別された分散相３５０と称することがある。
【０１４４】
図７に示すように、吐出機構６０５は、選別機構６０４により選別された分散相３５０をカプセル１００に分注している。このとき、カプセル１００に分注する分散相３５０の数は、検出機構６０６により検出された標識に基づき制御されている。
【０１４５】
次に、本発明の核酸試料含有容器の製造方法の分注手段として、インクジェット方式の吐出機構を用いて分散相を容器に分注する場合について図面を参照して説明する。なお、図３から図６までに示した分散相の選別までは、マイクロ流路を用いて核酸含有液を区分して分散相を形成する場合と同様であるため、説明を省略する。
【０１４６】
図８は、吐出機構及び計数機構の一実施形態を示す説明図である。
吐出機構１０は、液室１１と、メンブレン１２と、駆動素子１３とを有している。液室１１は、液室１１内を大気に開放する大気開放部１１５を上部に有しており、オイル３００中に混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能に構成されている。なお、以下では、検出用塩基配列Ｂが増幅された核酸を含む分散相５１２を、選別された分散相３５０と称することがある。
【０１４７】
メンブレン１２は、液室１１の下端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２の略中心には貫通孔であるノズル１２１が形成されており、液室１１に保持されたオイル３００はメンブレン１２の振動によりノズル１２１から液滴３１０として吐出される。メンブレン１２の振動の慣性により液滴３１０を形成するため、高表面張力（高粘度）のオイル３００でも吐出が可能である。メンブレン１２の平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
【０１４８】
メンブレン１２の材質としては特に限定はないが、柔らか過ぎるとメンブレン１２が簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。メンブレン１２の材質としては、例えば、金属材料やセラミック材料、ある程度硬さのある高分子材料等を用いることができる。
【０１４９】
ノズル１２１は、メンブレン１２の略中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル１２１の径としては特に限定はないが、選別された分散相３５０がノズル１２１に詰まることを避けるため、選別された分散相３５０の大きさの２倍以上とすることが好ましい。
【０１５０】
一方で、液滴が大きくなり過ぎると微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、ノズル１２１の径は２００μｍ以下であることが好ましい。つまり、吐出機構１０においては、ノズル１２１の径は、典型的には１０μｍ〜２００μｍの範囲となる。
【０１５１】
駆動素子１３は、メンブレン１２の下面側に形成されている。駆動素子１３の形状は、メンブレン１２の形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２の平面形状が円形である場合には、ノズル１２１の周囲に平面形状が円環状（リング状）の駆動素子１３を形成することが好ましい。
【０１５２】
駆動手段２０は、メンブレン１２を振動させて液滴３１０を形成する吐出波形と、液滴３１０を形成しない範囲でメンブレン１２を振動させる撹拌波形とを駆動素子１３に選択的に（例えば、交互に）付与することができる。
【０１５３】
例えば、吐出波形及び撹拌波形を何れも矩形波とし、吐出波形の駆動電圧よりも撹拌波形の駆動電圧を低くすることで、撹拌波形の印加により液滴３１０が形成されないようにすることができる。つまり、駆動電圧の高低により、メンブレン１２の振動状態（振動の程度）を制御することができる。
【０１５４】
吐出機構１０では、駆動素子１３がメンブレン１２の下面側に形成されているため、駆動素子１３によりメンブレン１２が振動すると、液室１１の下部方向から上部方向への流れを生じさせることが可能である。
【０１５５】
つまり、駆動手段２０は、吐出波形を駆動素子１３に加え、メンブレン１２の振動状態を制御することにより、液室１１に保持されたオイル３００をノズル１２１から液滴３１０として吐出させることができる。
【０１５６】
また、吐出機構１０において、液室１１内のオイル３００中に気泡が混入する場合がある。この場合でも、吐出機構１０では、液室１１の上部に大気開放部１１５が設けられているため、オイル３００中に混入した気泡を、大気開放部１１５を通じて外気に排出できる。これによって、気泡排出のために大量の液を捨てることなく、連続して安定的に液滴３１０を形成することが可能となる。
【０１５７】
なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲でメンブレン１２を振動させ、積極的に気泡を液室１１の上方に移動させてもよい。
【０１５８】
計数機構の光源３０は、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。なお、飛翔中とは、液滴３１０が吐出機構１０から吐出されてから、容器に着滴するまでの状態を意味する。飛翔中の液滴３１０は、光Ｌが照射される位置では略球状となっている。又、光Ｌのビーム形状は略円形状である。
【０１５９】
ここで、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１０倍〜１００倍程度であることが好ましい。これは、液滴３１０の位置ばらつきが存在する場合においても、光源３０からの光Ｌを確実に液滴３１０に照射するためである。
【０１６０】
ただし、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１００倍を大きく超えることは好ましくない。これは、液滴３１０に照射される光のエネルギー密度が下がるため、光Ｌを励起光として発する蛍光Ｌｆの光量が低下し、受光素子６０で検出し難くなるからである。
【０１６１】
光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましく、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザー等が好適に用いられる。光Ｌがパルス光である場合のパルス幅は１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。単位パルス当たりのエネルギーとしては、集光の有無等、光学系に大きく依存するが、概ね０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。
【０１６２】
なお、光源３０が発する光Ｌと比較して選別された分散相３５０の発する蛍光Ｌｆが弱いため、受光素子６０の前段（受光面側）に光Ｌの波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、受光素子６０において、非常にコントラストの高い選別された分散相３５０の画像を得ることができる。フィルタとしては、例えば、光Ｌの波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタ等を用いることができる。
【０１６３】
また、前述のように、光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましいが、光源３０から発せられる光Ｌを連続発振の光としてもよい。この場合には、連続発振の光が飛翔中の液滴３１０に照射されるタイミングで受光素子６０が光を取り込み可能となるように制御し、受光素子６０に蛍光Ｌｆを受光させることが好ましい。
【０１６４】
制御部７０は、駆動手段２０及び光源３０を制御する機能を有している。また、制御部７０は、受光素子６０が受光した光量に基づく情報を入手し、液滴３１０に含有された選別された分散相３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する機能を有している。
【０１６５】
以上より、本発明の核酸試料含有容器の製造方法を用いることにより、所望の数の分散相３５０をカプセル１００に分注することが可能であるため、カプセル１００を密閉して製造した容器１に含有する分散相３５０、即ち、目的の塩基配列のコピー数を既知数（所定数）に制御することができる。
【０１６６】
図９は、制御部のハードウェアブロックを例示する図である。図１０は、制御部の機能ブロックを例示する図である。図１１は、吐出機構及び計数機構の動作の一例を示すフローチャートである。
【０１６７】
図９に示すように、制御部７０は、ＣＰＵ７１と、ＲＯＭ７２と、ＲＡＭ７３と、Ｉ／Ｆ７４と、バスライン７５とを有している。ＣＰＵ７１、ＲＯＭ７２、ＲＡＭ７３、及びＩ／Ｆ７４は、バスライン７５を介して相互に接続されている。
【０１６８】
ＣＰＵ７１は、制御部７０の各機能を制御する。記憶手段であるＲＯＭ７２は、ＣＰＵ７１が制御部７０の各機能を制御するために実行するプログラムや、各種情報を記憶している。記憶手段であるＲＡＭ７３は、ＣＰＵ７１のワークエリア等として使用される。また、ＲＡＭ７３は、所定の情報を一時的に記憶することができる。Ｉ／Ｆ７４は、吐出機構１０を他の機器等と接続するためのインターフェイスである。吐出機構１０は、Ｉ／Ｆ７４を介して、外部ネットワーク等と接続されてもよい。
【０１６９】
図１０に示すように、制御部７０は、区分制御部７１０と、判別制御部７２０と、選別制御部７３０と、分注制御部７４０とを有している。
制御部７０は、本発明の核酸試料含有容器の製造装置全体を制御する。
【０１７０】
次に、分注手段にインクジェット方式を用いた場合の制御部７０の制御について図１２から図１６を用いて説明する。
【０１７１】
図１２に示すように、制御部７０は、区分制御部７１０と、判別制御部７２０と、選別制御部７３０と、分注制御部７４０とを有している。選別制御部７３０は、電界制御部７３１を有している。分注制御部７４０は、吐出制御部７４１と、分散相計数部７４２と、光源制御部７４３と、を有している。
制御部７０は、本発明の核酸試料含有容器の製造装置全体を制御する。
【０１７２】
図１２及び図１３を参照しながら、吐出機構１０の分散相数（粒子数）計数について説明する。まず、ステップＳ１１において、制御部７０の吐出制御部７４１は、駆動手段２０に吐出の指令を出す。吐出制御部７４１から吐出の指令を受けた駆動手段２０は、駆動素子１３に駆動信号を供給してメンブレン１２を振動させる。メンブレン１２の振動により、選別された分散相３５０を含有する液滴３１０が、ノズル１１１から吐出される。
【０１７３】
次に、ステップＳ１２において、制御部７０の光源制御部７４３は、液滴３１０の吐出に同期して（駆動手段２０から吐出機構１０に供給される駆動信号に同期して）光源３０に点灯の指令を出す。これにより、光源３０が点灯し、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。
【０１７４】
なお、ここで、同期するとは、吐出機構１０による液滴３１０の吐出と同時に（駆動手段２０が吐出機構１０に駆動信号を供給するのと同時に）発光することではなく、液滴３１０が飛翔して所定位置に達したときに液滴３１０に光Ｌが照射されるタイミングで、光源３０が発光することを意味する。つまり、光源制御部７４３は、吐出機構１０による液滴３１０の吐出（駆動手段２０から吐出機構１０に供給される駆動信号）に対して、所定時間だけ遅延して発光するように光源３０を制御する。
【０１７５】
例えば、吐出機構１０に駆動信号を供給した際に吐出する液滴３１０の速度ｖを予め測定しておく。そして、測定した速度ｖに基づいて液滴３１０が吐出されてから所定位置まで到達する時間ｔを算出し、吐出機構１０に駆動信号を供給するタイミングに対して、光源３０が光を照射するタイミングをｔだけ遅延させる。これにより、良好な発光制御が可能となり、光源３０からの光を確実に液滴３１０に照射することができる。
制御部７０の分散相計数部７４２は、受光素子６０からの情報に基づいて、液滴３１０に含有された選別された分散相３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する。ここで、受光素子６０からの情報とは、選別された分散相３５０の輝度値（光量）や面積値である。
【０１７６】
分散相計数部７４２は、例えば、受光素子６０が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、選別された分散相３５０の個数を計数することができる。この場合には、受光素子６０として１次元素子を用いても２次元素子を用いても構わない。
【０１７７】
受光素子６０として２次元素子を用いる場合は、分散相計数部７４２は、受光素子６０から得られた２次元画像に基づいて、選別された分散相３５０の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、分散相計数部７４２は、画像処理により選別された分散相３５０の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、選別された分散相３５０の個数を計数することができる。
【０１７８】
このように、選別された分散相３５０を縣濁したオイル３００を保持する吐出機構１０に、駆動手段２０から駆動信号を供給して、選別された分散相３５０を含有する液滴３１０を吐出させ、飛翔中の液滴３１０に光源３０から光Ｌを照射する。そして、飛翔する液滴３１０に含有された選別された分散相３５０が光Ｌを励起光として蛍光Ｌｆを発し、蛍光Ｌｆを受光素子６０が受光する。更に、受光素子６０からの情報に基づいて、分散相計数部７４２が、飛翔する液滴３１０に含有された選別された分散相３５０の個数を計数（カウント）する。
【０１７９】
つまり、飛翔する液滴３１０に含有された選別された分散相３５０の個数を実際にその場で観察するため、選別された分散相３５０の個数の計数精度を従来よりも向上させることが可能となる。又、飛翔する液滴３１０に含有された選別された分散相３５０に光Ｌを照射して蛍光Ｌｆを発光させて蛍光Ｌｆを受光素子６０で受光するため、高いコントラストで選別された分散相３５０の画像を得ることが可能となり、選別された分散相３５０の個数の誤計数の発生頻度を低減できる。
【０１８０】
なお、本実施例において計数機構は、吐出機構が吐出した液滴に含まれる分散相の数を計数する形態としたが、計数機構の形態はこれに限定されるものではない。計数機構の形態としては、例えば、選別機構６０４により選別された検出用塩基配列Ｂが増幅された分散相５１２が流れる流路内で計数する形態でもよいし、吐出機構１０の液室１１内で計数する形態でもよい。
【０１８１】
図１４は、目的の塩基配列を有する核酸を含む分散相が容器に分注された直後の様子の一例を示す説明図である。
ウェル５２０には、あらかじめ水性の液体５１５が充填されている。オイル３００の比重が水性の液体５１５より小さい場合は、ウェル５２０に液滴３１０が着弾した直後は、図１４のように、選別された分散相３５０を含む油層５１４とオイル５１３とが、水性の液体５１５の上部に位置する。
【０１８２】
図１５は、目的の塩基配列を有する核酸を含む分散相が容器に分注され、分散相が破壊された後の様子の一例を示す説明図である。
ウェル５２０に着弾した液滴３１０に含まれる選別された分散相３５０の水溶性成分は水性の核酸含有液に溶解する。そのため、選別された分散相３５０に含まれる目的の塩基配列Ａを有する核酸５００及び増幅された検出用塩基配列Ｂは、水性の液体５１５に溶解する。
【０１８３】
また、オイル３００の比重が水性の液体５１５より大きい場合は、選別された分散相３５０は、オイル３００と共に水性の液体５１５の下に沈みこみ、オイル３００の界面と接触して融合することで、水性の液体５１５に溶解する。
選別された分散相３５０が水性の液体５１５に接触できなかった場合には、遠心分離を行い比重に基づく層分離を形成することで水性の液体５１５に、選別された分散相３５０を溶解させることができる。
【０１８４】
次に、本発明の核酸試料含有容器の製造方法と同様の機能をコンピュータに実行させる本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムについて説明する。本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムによる処理は、本発明の核酸試料含有容器の製造装置を構築する制御部７０を有するコンピュータを用いて実行することができる。
【０１８５】
図１１は、核酸試料含有容器の製造プログラムの処理手順の一例を示すフローチャートである。
【０１８６】
ステップＳ１０１では、制御部７０は、分散相形成手段６０１により、目的の塩基配列Ａ及び目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列Ｂを有する核酸５００を含む溶液Ｘと核酸増幅試薬及び蛍光標識試薬を含む溶液Ｙとを混合し、溶液Ｘと溶液Ｙとの混合液を微小区画化し、分散相を形成させると、処理をＳ１０２に移行する。
ステップＳ１０２では、制御部７０は、増幅手段６０２により、核酸５００、核酸増幅試薬及び蛍光標識試薬を含む分散相５１０に対して、蛇行流路を流れている間に複数の温度帯に温度を上下させると、処理をＳ１０３に移行する。分散相５１０の温度を複数の温度帯に温度を上下させることで、検出用塩基配列Ｂを増幅させて、分散相５１２が光学的に標識された状態にする。
ステップＳ１０３では、制御部７０は、判別手段６０３により、検出用塩基配列Ｂが増幅された陽性分散相５１２から生じる蛍光を検出すると、処理をＳ１０４に移行する。
ステップＳ１０４では、制御部７０は、選別機構６０４により、判別手段６０３の検出結果に基づき、誘電泳動により検出用塩基配列Ｂが増幅された陽性分散相５１２を選別させると、処理をＳ１０５に移行する。ここで、検出用塩基配列Ｂが増幅された陽性分散相５１２を選別するとは、Ｓ１０３で検出した分散相の光信号の強度に基づいて、選別機構６０４により検出用塩基配列Ｂが増幅された陽性分散相５１２のみを吐出機構１０に輸送することを意味する。
ステップＳ１０５では、制御部７０は、吐出機構１０により、検出用塩基配列Ｂが増幅された陽性分散相５１２をカプセル１００に分注させると、処理をＳ１０６に移行させる。
ステップＳ１０６では、制御部７０は、光源３０及び受光素子６０により、分注した陽性分散相５１２を検出し、検出した陽性分散相５１２の数が、ユーザーの設定した所望の数（例えば、カプセル５２０に分注する分散相の数）に達していない場合は、処理をＳ１０５に戻す。一方、制御部７０は、計数した数が、ユーザーの設定した所望の数に達している場合は、本処理を終了する。
【０１８７】
また、図１１に示した処理手順を複数回繰り返すことで、複数のカプセル５２０に核酸を分注してもよい。
【０１８８】
図１６は、核酸試料含有容器の製造プログラムの処理手順の他の一例を示すフローチャートである。
【０１８９】
また、図１６におけるステップＳ２０１はＳ１０１と、ステップＳ２０２はＳ１０２と、ステップＳ２０３はＳ１０３と、ステップＳ２０４はＳ１０４と、ステップＳ２０６はＳ１０５と、同様の処理であるため、説明を省略する。
【０１９０】
ステップＳ２０５では、制御部７０は、光源３０及び受光素子６０により、Ｓ２０４で選別された陽性分散相５１２の数を流路内で計数させると、処理をＳ２０６に移行する。
【０１９１】
ステップＳ２０７では、制御部７０は、Ｓ２０５で計数させた陽性分散相５１２の数に基づいて、Ｓ２０６で分注させた陽性分散相５１２の数がユーザーの設定した所望の数（例えば、ウェル５２０に分注する分散相の数）に達しているか否かを判定する。制御部７０は、分注した陽性分散相５１２の数がユーザーの設定した所望の数に達していないと判定した場合は、処理をＳ２０６に戻す。一方、制御部７０は、分注した陽性分散相５１２の数がユーザーの設定した所望の数に達していると判定した場合は、本処理を終了する。
【０１９２】
また、図１６に示した処理手順を複数回繰り返すことで、複数のウェル５２０に核酸を分注してもよい。
【０１９３】
（核酸試料）
本発明の核酸試料は、検出用塩基配列及び該検出用塩基配列と異なる塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を有し、更に必要に応じてその他の部材を有する。
本発明の核酸試料の形態としては、特に制限はなく、例えば、分散相などが挙げられる。分散相としては、本発明の核酸試料含有容器において説明したものと同様であるため、説明を省略する。
【実施例】
【０１９４】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【０１９５】
（実施例１）
＜核酸（ｄｓＤＮＡ）試料含有容器（粒子状容器）の作製＞
−核酸・核酸増幅試薬・蛍光標識試薬の混合液の調製−
鋳型となる核酸としてＤＮＡ６００−Ｇ（国立研究開発法人産業技術総合研究所製、ＮＭＩＪ  ＣＲＭ  ６２０５−ａ、配列番号１参照）と、核酸増幅試薬として核酸に相補的なフォワードプライマー（配列番号２参照）及びリバースプライマー（配列番号３参照）、蛍光標識試薬として核酸のフォワードプライマーとリバースプライマーの間の一部に相補的な塩基配列と、蛍光色素としてＦＡＭと、消光物質としてＴＡＭＲＡを有するＴａｑＭａｎプローブ（配列番号４参照）、Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（バイオ・ラッド社製、ｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（ｎｏ  ｄＵＴＰ）、１８６−３０２５)、ＮＦＷ（（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ  ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ−Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ、１０９７７−０１５）を用いて、表２に示す混合比で試薬を調製し、最後にデジタルＰＣＲ用プレート（バイオ・ラッド社製、ｄｄＰＣＲ９６−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ、１２００１９２５）に２２μLずつ充填した。各試薬はＮＦＷを用いて表２に記載の濃度に希釈して用いた。
【０１９６】
【表２】
2019162101.tif 000012
【０１９７】
−分散相形成工程−
ドロップレットジェネレータ（バイオ・ラッド社製、装置名Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ)を用いて調製した混合液を分散相に区分した。移動相の溶媒としては、バイオ・ラッド社製のＡｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  Ｏｉｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓを用いた。作製されたドロップレット懸濁液は、プレートシーラー（バイオ・ラッド社製、商品名：ＰＸ１  Ｐｌａｔｅ  Ｓｅａｌｅｒ）を用いてアルミシーリングの後に、直ちに次の増幅工程を行った。
【０１９８】
−増幅工程−
増幅工程は、サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社製、装置名：Ｔ１００サーマルサイクラー）により表３に示すサーマルサイクル過程によって行われた。
【０１９９】
【表３】
2019162101.tif 000013
【０２００】
−核酸増幅の確認と不確かさの算出−
核酸増幅が行われた分散相（陽性分散相とも称することがある）は、ドロップレットリーダー（バイオ・ラッド社製、装置名：ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ）によって蛍光を確認すると共に、検出結果（図１７、及び表４）に基づき、分散相内に含まれる各コピー数の確率を、ポアソン分布を考慮した計算処理（式１）によって算出した。算出した結果（表４におけるＤ０２の場合）を表５に示す。
【０２０１】
【表４】
2019162101.tif 000014
【０２０２】
【表５】
2019162101.tif 000015
【０２０３】
−分散相の判別及び選別工程−
核酸増幅された分散相（陽性分散相）の選別と粒子状容器内への分注は、例えば、図６に示す選別機構６０４を用いて判別・選別した。陽性分散相の検出結果を図１８に示す。また、陽性分散相（実線）に対して不平等電界を生じさせるために印加波形（点線）を印加した（図１９）。陽性分散相５１２が選別される様子を図２０に示す。選別した陽性分散相は、次工程の分注工程における吐出機構に導入された。
【０２０４】
−分散相の分注工程−
図７に示すような粒子状容器の内部に分注するための流路を設け、選別した分散相の数を検出しながら分注した。粒子状容器として用いるカプセルは、ＭＰカプセル５号（アズワン株式会社製）を用いた。分注したカプセルには算出した分散相に１滴に含まれる目的の塩基配列のコピー数から求められる粒子状容器内の目的の塩基配列のコピー数の総数、ＤＮＡコピー数の不確かさの情報を着色により表示して視認可能な状態にした。
【０２０５】
（実施例２）
＜核酸（ｄｓＤＮＡ）試料含有容器の作製＞
実施例１と同様の方法で、分散相を容器内に分注した。容器には、ＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｂａｒｃｏｄｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。
容器に陽性分散相を分注した後、容器を真空乾燥した。乾燥させた容器（プレート）の側面にバーコードを付した。バーコードには、容器中に分注した目的の塩基配列のコピー数の総数の算出結果（分散相１滴に含まれる目的の塩基配列のコピー数から算出）と、容器中に分注したｄｓＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を計数したコピー数の不確かさの情報をバーコードにより参照可能にした。
【０２０６】
（実施例３）
＜ＲＮＡ試料含有容器の作製＞
−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイズ核酸溶液の調製−
鋳型となる核酸としてＲＮＡ５００−Ａ（国立研究開発法人産業技術総合研究所製、ＮＭＩＪ  ＣＲＭ  ６２０４−ａ、配列番号５参照）とｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）（配列番号６参照）とを表６の組成で混合した後に、９５℃で２分間熱変性し、１時間かけて常温まで冷却して十分にハイブリダイズさせ、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖を合成した。その後、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（タカラバイオ株式会社製）を５μＬ添加して、常温で３０分間静置し、一本鎖ＤＮＡを除去した。その後、８０℃、１５分間不活性化処理を行い、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉを不活化し、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイズ核酸溶液を得た。
【０２０７】
【表６】
2019162101.tif 000016
【０２０８】
鋳型となる核酸としてＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイズ溶液と、核酸増幅試薬として核酸に相補的なフォワードプライマー（配列番号７参照）及びリバースプライマー（配列番号８参照）、蛍光標識試薬として核酸のフォワードプライマーとリバースプライマーの間の一部に相補的な塩基配列と、蛍光色素としてＦＡＭと、消光物質としてＴＡＭＲＡを有するＴａｑＭａｎプローブ（配列番号９参照）とを用いた以外は、実施例１と同様にして、核酸・核酸増幅試薬・蛍光標識試薬の混合液の調製、分散相の形成、増幅工程、及び核酸増幅の確認と不確かさの算出を行った。組成を下記表７に示す。結果を図１８、図２１、表８、及び表９（表８におけるＦ０５の場合）に示す。
【０２０９】
【表７】
2019162101.tif 000017
【０２１０】
【表８】
2019162101.tif 000018
【０２１１】
【表９】
2019162101.tif 000019
【０２１２】
−分散相の判別及び選別工程−
実施例１と同様にして、得られた分散相を判別及び選別した。
【０２１３】
−分散相の分注工程−
実施例２と同様にして、選別された分散相を容器内に分注した。容器には、ＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｂａｒｃｏｄｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。容器（プレート）に陽性分散相を分注した後、真空乾燥により乾燥させた。乾燥させた容器（プレート）の側面にバーコードを付した。バーコードには、容器（プレート）中に分注した目的の塩基配列のコピー数の総数の算出結果（分散相１滴に含まれる目的の塩基配列のコピー数から算出）と、容器中に分注したＲＮＡコピー数の不確かさの情報をバーコードにより参照可能にした。
【０２１４】
（実施例４）
＜核酸（ｓｓＤＮＡ）試料含有容器の作製＞
−核酸・核酸増幅試薬・蛍光標識試薬の混合液の調製−
鋳型となる核酸としてｋ０３＿ｓｓＤＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、配列番号１０参照）と、核酸増幅試薬として核酸に相補的なフォワードプライマー（配列番号１１参照）及びリバースプライマー（配列番号１２参照）、蛍光標識試薬として核酸のフォワードプライマーとリバースプライマーの間の一部に相補的な塩基配列と、蛍光色素としてＦＡＭと、消光物質としてＺＥＮ及びＴＡＭＲＡを有するＴａｑＭａｎプローブ（配列番号１３参照）とを用いた以外は、実施例１と同様にして、核酸・核酸増幅試薬・蛍光標識試薬の混合液の調製、分散相の形成、増幅工程、及び核酸増幅の確認と不確かさの算出を行った。組成を下記表１０に、増幅工程におけるサーマルサイクル過程を表１１に示す。結果を図２２、表１２、及び表１３（表１２におけるＥ１１の場合）に示す。
【０２１５】
【表１０】
2019162101.tif 000020
【０２１６】
【表１１】
2019162101.tif 000021
【０２１７】
【表１２】
2019162101.tif 000022
【０２１８】
【表１３】
2019162101.tif 000023
【０２１９】
−分散相の判別及び選別工程−
実施例１と同様にして、得られた分散相を判別及び選別した。
【０２２０】
−分散相の分注工程−
実施例２と同様にして、選別された分散相を容器内に分注した。容器には、ＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｂａｒｃｏｄｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。容器（プレート）に陽性分散相を分注した後、真空乾燥により乾燥させた。乾燥させた容器（プレート）の側面にバーコードを付した。バーコードには、容器（プレート）中に分注した目的の塩基配列のコピー数の総数の算出結果（分散相１滴に含まれる目的の塩基配列のコピー数から算出）と、容器中に分注したｓｓＤＮＡコピー数の不確かさの情報をバーコードにより参照可能にした。
【０２２１】
本発明の態様は、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  目的の塩基配列、及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、
前記目的の塩基配列を有さず、前記検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を含有することを特徴とする核酸試料含有容器である。
＜２＞  前記第一の核酸分子が、前記目的の塩基配列を同一分子内に複数有する前記＜１＞に記載の核酸試料含有容器である。
＜３＞  前記第一の核酸分子中の複数の前記目的の塩基配列を有する場合、
一の目的の塩基配列と他の目的の塩基配列との間に、天然の核酸合成酵素により増幅不可能な人工核酸を少なくとも１塩基有する前記＜２＞に記載の核酸試料含有容器である。
＜４＞  前記目的の塩基配列の数が１，０００未満かつ、前記目的の塩基配列の数の変動係数（ＣＶ値）が２０％未満である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
＜５＞  前記核酸分子が人工合成核酸分子である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
＜６＞  前記第一の核酸分子と前記第二の核酸分子とを内包する外殻を有する前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
＜７＞  前記第一の核酸分子と、前記第二の核酸分子とを含有する固体粒子及びゲル粒子のいずれかである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
＜８＞  可溶性である前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
＜９＞  着色されている前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の核酸試料含有試料である。
＜１０＞  核酸を含有する分散相と、連続相と、前記分散相及び前記連続相を内包する保護部材とを有する核酸試料含有容器である。
＜１１＞  前記第一の核酸分子が、一本鎖核酸分子である前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
＜１２＞  前記目的の塩基配列の５’側に前記検出用配列を有する前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
＜１３＞  目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する分散相形成工程と、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅する増幅工程と、
前記検出用塩基配列が増幅された前記分散相を判別する判別工程と、
前記判別工程で判別した、前記検出用塩基配列が増幅された前記核酸を含む前記分散相を分注する分注工程と、
を含むことを特徴とする核酸試料含有容器の製造方法である。
＜１４＞  前記分散相が目的の塩基配列を１つ含む確率が、９０％以上である前記＜１３＞に記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
＜１５＞  前記判別工程は、前記分散相が生ずる光信号を検出して、前記検出用塩基配列が増幅された前記核酸を含む前記分散相を判別する前記＜１３＞から＜１４＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
＜１６＞  前記分注工程は、前記判別工程において、前記目的の塩基配列の数が特定されている前記核酸を含む前記分散相を分注する前記＜１３＞から＜１５＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
＜１７＞  前記分散相形成工程は、前記核酸が１つの前記分散相に多くとも１分子含まれるような前記核酸の濃度の核酸含有液で行う前記＜１３＞から＜１６＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
＜１８＞  前記分注工程は、インクジェット方式で行う前記＜１２＞から＜１５＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
＜１９＞  前記分注工程は、吐出された液滴に含まれる前記分散相の数を計数して行う前記＜１３＞から＜１８＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
＜２０＞  前記分注工程は、判別された前記分散相の数を分注前に計数して行う前記＜１３＞から＜１９＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
＜２１＞  目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する分散相形成手段と、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅する増幅手段と、
前記検出用塩基配列が増幅された前記分散相を判別する判別手段と、
前記判別手段で判別した、前記検出用塩基配列が増幅された前記核酸を含む前記分散相を容器に分注する分注手段と、
を有することを特徴とする核酸試料含有容器の製造装置である。
＜２２＞  目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成させ、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅させ、
前記検出用塩基配列が増幅された前記分散相を判別させ、
前記判別手段で判別した、前記検出用塩基配列が増幅された前記核酸を含む前記分散相を容器に分注させる、
制御処理をコンピュータに実行させること特徴とする核酸試料含有容器の製造プログラムを記憶した非一過性記録媒体である。
＜２３＞  検出用塩基配列及び該検出用塩基配列と異なる塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、
検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を有することを特徴とする核酸試料である。
【０２２２】
前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器、前記＜１３＞から＜２０＞のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法、前記＜２１＞に記載の核酸試料含有容器の製造装置、前記＜２２＞に記載の核酸試料含有容器の製造プログラム、及び前記＜２３＞に記載の核酸試料によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０２２３】
【特許文献１】特開２０１４−３３６５８号公報
【特許文献２】特開２０１５−１９５７３５号公報
【特許文献３】特開２００８−２４５６１２号公報
【符号の説明】
【０２２４】
１            核酸試料含有容器（粒子状）
１１            分散相
１２、５００    核酸
７０            制御部
４１０            吐出機構
６０１            区分手段
６０２            核酸増幅機構
６０３            増幅検出機構
６０４            選別機構
６０５            吐出機構
【図１】
2019162101.tif 000024
【図２】
2019162101.tif 000025
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2019162101.tif 000035
【図１３】
2019162101.tif 000036
【図１４】
2019162101.tif 000037
【図１５】
2019162101.tif 000038
【図１６】
2019162101.tif 000039
【図１７】
2019162101.tif 000040
【図１８】
2019162101.tif 000041
【図１９】
2019162101.tif 000042
【図２０】
2019162101.tif 000043
【図２１】
2019162101.tif 000044
【図２２】
2019162101.tif 000045
【配列表】
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