(57)【要約】      （修正有）【課題】抗原成分及びアジュバント成分を含むワクチン組成物の提供。【解決手段】アジュバント成分は、Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびに、サポニン及びステロールの組み合わせ、または油、及び任意に、１つ以上の乳化剤を含む油相、のいずれかを含み、油相がワクチン組成物の２〜２０ｖ／ｖ％を構成し、抗原成分が、ＥＨＶ抗原またはリーシュマニア抗原である、ワクチン組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原成分及びアジュバント成分を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント成分が、Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびに
ａ．サポニン及びステロールの組み合わせ、または
ｂ．油、及び任意に、１つ以上の乳化剤を含む油相、を含み、前記油相が前記ワクチン組成物の２〜２０ｖ／ｖ％を構成し、
前記抗原成分が、ＥＨＶ抗原またはリーシュマニア抗原である、前記ワクチン組成物。
【請求項２】
前記アジュバントが、前記Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびに
ａ．前記サポニン及び前記ステロールの前記組み合わせ、または
ｂ．前記油、及び任意に、１つ以上の乳化剤を含む前記油相、から本質的になり、前記油相が前記ワクチン組成物の２〜２０ｖ／ｖ％を構成する、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
非リポソーム組成物である、請求項１または２に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項４】
前記サポニンがもしあれば、Ｑｕｉｌ  Ａであり、前記ステロールがもしあれば、コレステロールであり、前記油がもしあれば、ＳＰ−Ｏｉｌである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項５】
前記サポニンが５〜１００μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項６】
前記ステロールが５〜１００μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項７】
前記ステロール及び前記サポニンが各々、５０μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項８】
前記油相が、前記ワクチン組成物の５〜１０ｖ／ｖ％の量で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項９】
前記抗原がＥＨＶ抗原であり、前記油相が、前記組成物の５ｖ／ｖ％の量で存在する、請求項１、２、３、４、７のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項１０】
前記抗原がリーシュマニア抗原であり、前記油相が、前記組成物の１０ｖ／ｖ％の量で存在する、請求項１、２、３、４、７のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項１１】
前記Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドが２０〜５００μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項１２】
前記Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドが１００〜２５０μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１１に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項１３】
前記Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドが修飾される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項１４】
前記修飾Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＪＵ修飾またはＥ修飾される、請求項１３に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項１５】
前記修飾Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、配列番号７、配列番号８、または配列番号９である、請求項１４に記載の前記ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０００１］
本発明は、リーシュマニア及びウマ科ウマウイルスワクチンに対する免疫応答を増強させるための新規のアジュバントに関する。
【背景技術】
【０００２】
［０００２］
ウマヘルペスウイルスは、ウイルス誘発性流産、不全麻痺等の神経疾患、上気道の感染症、及びウマ新生仔疾患（ＮＦＤ）の原因であるウマの主要な病原菌である。ＮＦＤは、出生時期が迫った胎仔の経胎盤感染によって引き起こされ、このような胎仔は、生まれつき病弱であり、重篤な呼吸器疾患を有し、このうち一部はＥＨＶ−１による肝臓感染症により黄疸を呈する場合がある。これらの動物は、通常、生後数日以内に死亡する。ウマ鼻腔肺炎ウイルス（ＥＨＶ−４）は、急性気道疾患（「鼻腔炎」）の主因であり、生後２年以内にほとんどのウマに感染する。鼻腔炎は、発熱、食欲不振、及び後に粘液膿性になる多量の鼻漿液の分泌を特徴とする。稀な場合として、ＥＨＶ４感染が妊娠した雌ウマの流産を引き起こすこともある。さらに、ＥＨＶ１及びＥＨＶ４は、終生持続する潜伏感染症として定着する。ウイルスが再活性化すると、疾患が再発し、ウイルスの出芽により、他の動物に伝播する。
【０００３】
［０００３］
ウマヘルペスウイルス感染及びそれらの疾患の制御は、特に、ＥＨＶ１媒介流産、不全麻痺、及び出生時期が迫った胎仔の経胎盤感染によって引き起こされるウマ新生仔疾患に対して、不十分なままである。不活性化ワクチンならびに修飾生ワクチンが利用可能であるが、どちらのワクチンも感染を十分に阻止するとは思われず、それらは野生型ウイルスによる潜伏の定着を防止することもない。したがって、これらのウイルスの野外感染、特に、ＥＨＶ１によって引き起こされる感染症に対する保護を向上させる、安全なワクチンが大いに必要とされる。
【０００４】
［０００４］
リーシュマニア症は、ヒト、イヌ科動物（イヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル）、ならびにネコ科動物（ライオン、トラ、家猫、野生の猫、他の大型猫、ならびにチーター及びオオヤマネコを含むその他のネコ科動物）の主要かつ重篤な寄生虫性疾患である。リーシュマニア症の病原体は、寄生原生動物であり、ドノバンリーシュマニア複合体に属する。この寄生虫は、南ヨーロッパ、アフリカ、アジア、南アメリカ、及び中央アメリカの温帯地方及び亜熱帯地方に幅広く分布する（Ｄｅｓｊｅｕｘ  Ｐ．，Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，２００１，９５：２３９−４３）。リーシュマニアドノバニインファンタム（Ｌ．インファンタム）は、南ヨーロッパ、アフリカ、及びアジアにおけるネコ科動物及びイヌ科動物の疾患の原因である。南アメリカ及び中央アメリカでは、この病原体は、リーシュマニアドノバニチャガシ（Ｌ．チャガシ）であり、これはＬ．インファンタムと密接に関係している。ヒトでは、この病原体は、リーシュマニアドノバニドノバニ（Ｌ．ドノバニ）であり、これはＬ．インファンタム及びＬ．チャガシと密接に関係している。
【０００５】
［０００５］
これらの寄生虫は、内臓リーシュマニア症及び／または皮膚リーシュマニア症を引き起こす。内臓リーシュマニア症は、発熱、悪液質、肝脾腫大（肝臓及び膵臓の肥大）、ならびに血球減少症等の臨床症状をもたらす。皮膚リーシュマニア症は、自己限定及びさらに
は自己回復皮膚型から致死的な全身性疾患まで様々な提示で生じる。皮膚リーシュマニア症の病変は、体のいたる場所に生じ得るが、最も一般的な部位は、環境に曝露される部位であり、それ故にサシチョウバエによる刺傷を起こしやすい部位である。初期の丘疹は、潰瘍を急速に引き起こす。全身性リーシュマニア症は稀であるが、速やかに治療されない場合、常に致死的である。全身性リーシュマニア症は、体内器官、具体的には、膵臓及び肝臓に影響を及ぼす。
【０００６】
［０００６］
イヌ科動物において、疾患は、皮膚症状もしくは内臓症状、または皮膚症状及び内臓症状の両方を伴い、治療を行わない場合は、致死的である。
【０００７】
［０００７］
多くの治療が説明されているが、治療自体の毒性または動物が再発する傾向のため、いずれの治療も十分に満足できるものではない。
【０００８】
［０００８］
したがって、ＥＨＶ及びリーシュマニア感染症から家畜を守るための新たなワクチン製剤が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｄｅｓｊｅｕｘ  Ｐ．，Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，２００１，９５：２３９−４３
【発明の概要】
【００１０】
［０００９］
本発明は、一態様において、ＥＨＶ抗原またはリーシュマニア抗原からなる群から選択される抗原成分、及びアジュバント成分を含むワクチン組成物であって、該アジュバント成分が、Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびに、サポニン及びステロールの組み合わせ、または油、及び任意に、１つ以上の乳化剤を含む油相、を含み、該油相がワクチン組成物の２〜２０ｖ／ｖ％を構成する、ワクチン組成物を提供することによって当該技術分野の難点に対処する。
【００１１】
［００１０］
一連の実施形態において、Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、修飾及び／または安定化され得、２０〜５００μｇ／用量、例えば、１００〜２５０μｇ／用量の量で存在する。
【００１２】
［００１１］
一連の実施形態において、アジュバント成分は、Ｑｕｉｌ  Ａ等のサポニンまたはその精製画分、及びコレステロール等のステロールを含み、それぞれ、約５〜１００μｇ／ｍＬの量である。特定の実施形態において、Ｑｕｉｌ  Ａ及びコレステロールの各々は、５０μｇ／ｍＬの量で存在する。
【００１３】
［００１２］
別の実施形態において、油、及び任意に、少なくとも１つの乳化剤（例えば、２つの乳化剤）が存在し、油相は、ワクチン組成物の２〜２０ｖ／ｖ％（例えば、約５％〜約１０％）を構成する。特定の実施形態において、油は、ＳＰ油である。
【００１４】
［００１３］
本発明のある特定の実施形態において、ワクチン製剤は、非リポソーム製剤である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［００１４］
選択された実施形態の詳細な説明
以下の非限定的な定義は、本発明のより良好な理解を提供する。
【００１６】
［００１５］
「約」または「およそ」は、測定可能な数値変数に関連して使用される場合、「約３週間」が１７日〜２５日であり、約２週間〜約４週間が１０日〜４０日である週単位の時間間隔に関して「約」が使用されない限り、その変数の表示値と、表示値の実験誤差以内（例えば、平均の９５％信頼区間以内）の変数値または表示値の１０パーセント以内の変数値のいずれか大きい方のすべての変数値を指す。
【００１７】
［００１６］
「アジュバント」とは、抗原に対する体液性または細胞性免疫応答を増強する任意の物質を意味する。アジュバントは、通常、注射部位からの抗原の放出の遅延及び免疫系の刺激という２つの目的を達成するために使用される。
【００１８】
［００１７］
「抗体」とは、特異抗原に対する免疫応答の結果としてその抗原に結合することのできる免疫グロブリン分子を指す。免疫グロブリンは、「定常」及び「可変」領域を有する「軽」及び「重」ポリペプチド鎖からなる血漿タンパク質であり、定常領域の組成物に基づいて複数のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）に分けられる。
【００１９】
［００１８］
「抗原」または「免疫原」とは、免疫応答を刺激する任意の物質を指す。この用語には、死滅した、不活性化された、弱毒化された、または修飾された生の細菌、ウイルス、または寄生虫が含まれる。抗原という用語はまた、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、合成ペプチド、タンパク質抽出物、細胞（腫瘍細胞を含む）、組織、多糖、もしくは脂質、またはその断片が、単独で、またはそれらの任意の組み合わせで含まれる。抗原という用語にはまた、抗イディオタイプ抗体等の抗体またはその断片、及び抗原または抗原決定基（エピトープ）を模倣し得る合成ペプチドミモトープが含まれる。
【００２０】
［００１９］
「バクテリン」とは、ワクチン組成物または免疫原性組成物の成分として用いられ得る１つ以上の死滅した細菌の懸濁液を意味する。
【００２１】
［００２０］
「緩衝液」とは、別の化学物質の濃度の変化を防ぐ化学系、例えば、水素イオン濃度（ｐＨ）の大きな変化を防ぐ緩衝液として作用するプロトンドナー系及び受容体系を意味する。緩衝液のさらなる例は、弱酸及びその塩（共役塩基）の混合物または弱塩基及びその塩（共役酸）の混合物を含有する溶液である。
【００２２】
［００２１］
「細胞性免疫応答」または「細胞媒介性免疫応答」は、Ｔリンパ球または他の白血球細胞またはその両方によって媒介される免疫応答であり、サイトカイン、ケモカイン、及び活性化されたＴ細胞、白血球細胞、またはその両方により産生される類似の分子の産生が含まれる。
【００２３】
［００２２］
「〜から本質的になる」とは、アジュバント製剤に適用される場合、列挙されていないさらなるアジュバント剤または免疫調節剤が測定可能なアジュバント効果または免疫調節効果を発揮する量でこれらの薬剤を含有しない製剤を指す。
【００２４】
［００２３］
「用量」とは、対象に与えられるワクチンまたは免疫原性組成物を指す。「第１回用量」または「初回ワクチン」とは、０日目に与えられた組成物等の用量を指す。「第２回用量」または「第３回用量」または「年１回用量」とは、第１回用量と同じワクチンまたは免疫原性組成物であっても、そうなくてもよい、第１回用量の後に与えられた組成物の量を指す。
【００２５】
［００２４］
「体液性免疫応答」とは、抗体によって媒介される免疫応答を指す。
【００２６】
［００２５］
対象における「免疫応答」とは、抗原に対する体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性及び細胞性免疫応答の発現を指す。免疫応答は、通常、当該技術分野において知られている標準的な免疫アッセイ及び中和アッセイを用いて判定され得る。
【００２７】
［００２６］
抗原の「免疫学的に防御可能な量」または「免疫学的に有効な量」または「免疫応答を生じさせるのに有効な量」は、受容者において免疫原性応答を誘発するのに有効な量である。免疫原性応答は、診断目的もしくは他の試験のために十分であり得るか、または疾患病原体の感染により生じる健康への悪影響もしくはその合併症を含む疾患の兆候もしくは症状を予防するために適し得る。体液性免疫または細胞媒介性免疫のいずれかまたはその両方が誘発すればよい。免疫原性組成物に対する動物の免疫原性応答は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイを介して間接的に、または、野生型株での攻撃の後の兆候及び症状のモニタリングを介して直接的に判断され得、一方、ワクチンがもたらした防御免疫は、例えば、対象の死亡率、罹患率、温度値、全身状態ならびに健康状態及び動作全体等の臨床的兆候の低減を測定することによって判断することができる。免疫応答は、細胞性免疫及び／または体液性免疫の誘発を含み得るが、これらに限定されない。
【００２８】
［００２７］
「免疫原性」とは、免疫または抗原応答を引き起こすことを意味する。したがって、免疫原性組成物は、免疫応答を誘発する任意の組成物であり得る。
【００２９】
［００２８］
「免疫刺激性分子」とは、免疫応答を生じさせる分子を指す。
【００３０】
［００２９］
「脂質」とは、水中で不溶性であるが、無極性有機溶剤中では溶解可能であり、手触りが油っぽく、かつ炭水化物及びタンパク質と共に生細胞の主要な構造材料を構成する、脂肪、油、ワックス、ステロール、及びトリグリセリドを含む、有機化合物群のいずれかを指す。
【００３１】
［００３０］
「薬学的に許容される」とは、医学的な正しい判断の範囲内にある、不必要な毒性、刺激、アレルギー応答等を伴わずに対象の組織と接触させての使用に好適な、妥当な損益比
に見合う、かつそれらの意図された使用にとって有効な物質を指す。
【００３２】
［００３１］
「反応源性」とは、アジュバント組成物、免疫原性組成物、またはワクチン組成物の投与に応答して対象において引き起こされる副作用を指す。それは、投与部位で生じ得、通常、多くの症状の発症に関して評価される。これらの症状は、炎症、発赤、及び膿瘍が含まれ得る。それはまた、発生率、期間、及び重症度に関しても評価される。「低」反応は、例えば、動悸によってのみ検出可能であり、目視によっては検出不可能な腫れを伴うか、または短期間のものであり得る。より重度な反応は、例えば、目で見ることができる反応、または長期間の反応である。
【００３３】
［００３２］
「室温」とは、１８〜２５℃の温度を意味する。
【００３４】
［００３３］
「サポニン」とは、ステロイド構造またはトリテルペノイド構造の疎水性領域を伴う親水性領域（通常、いくつかの糖鎖）からなる、植物由来の界面活性グリコシド群を指す。
【００３５】
［００３４］
「ステロイド」とは、有機溶剤中では容易に溶解可能であり、水中ではわずかに溶解する、生化学クラスの脂質に属するあらゆる有機化合物群を指す。ステロイドは、３つの融合シクロヘキサン（６個の炭素）環に４つ目のシクロペンタン（５個の炭素）環を加えたものからなる、４つの融合した環系を含む。
【００３６】
［００３５］
「ステロール」とは、テルペノイド前駆体から生物学的に産生される、動物における化合物を指す。それらは、通常、炭素−３に付着しているヒドロキシル（ＯＨ）基を有する、ステロイド環構造を含む。脂肪酸置換基の炭化水素鎖は、様々な長さがあり、通常、１６〜２０個の炭素原子であり、飽和または不飽和であり得る。ステロイドは、一般に、環構造において１つ以上の二重結合を含有し、環に付着している様々な置換基も含有する。ステロール及びそれらの脂肪酸エステルは、本質的には水中で不溶性である。
【００３７】
［００３６］
「対象」とは、アジュバント組成物の投与が望ましい任意の動物を指す。それには、霊長類、家畜、ペット動物、実験室試験用の動物、捕獲した野生動物、鳥類（卵内のものを含む）、爬虫類、及び魚類を含む、哺乳動物及び非哺乳動物が含まれる。したがって、この用語には、サル、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、他の家禽、カエル、及びトカゲが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
［００３７］
「治療有効量」とは、抗原またはワクチンを与えた対象において、ウイルスまたは細菌等の病原菌の感染により生じる健康への悪影響またはその合併症を含む疾患の兆候または症状を予防または低減させるために十分な免疫応答を誘発するだろう抗原またはワクチンの量を指す。体液性免疫もしくは細胞媒介性免疫または体液性免疫及び細胞媒介性免疫の両方を誘発すればよい。ワクチンに対する動物の免疫原性応答は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイを介して間接的に、または野生型株での攻撃の後の兆候及び症状のモニタリングを介して直接的に評価され得る。ワクチンがもたらした防御免疫は、例えば、対象の死亡率、罹患率、温度値、全身状態ならびに健康状態及び動作全体等の臨床的兆候の減少を測定することにより評価することができる。治療的に有効なワクチンの量
は、使用される特定のアジュバント、使用される特定の抗原、または対象の状態に応じて変化し得、当業者によって決定され得る。
【００３９】
［００３８］
「治療すること」は、そのような用語が適用される障害、状態、もしくは疾患を予防すること、またはそのような障害、状態、もしくは疾患の１つ以上の症状を予防するもしくは低減させることを指す。
【００４０】
［００３９］
「治療」は、上記に定義した「治療する」行為を指す。
【００４１】
［００４０］
「トリテルペノイド」は、何千もの方法で集合及び修飾され得る、炭素数５個のイソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）単位６個に由来する、大きなかつ種々のクラスの天然に生じる有機分子を指す。ほとんどは、官能基及びそれらの基本的な炭素骨格が互いに異なる多環構造である。これらの分子は、すべてのクラスの生物において見ることができる。
【００４２】
［００４１］
「ワクチン」とは、本明細書において定義される場合、抗原を含む組成物を指す。対象へのワクチンの投与により、通常は１つ以上の特異的疾患に対する免疫応答が生じる。治療的に有効なワクチンの量は、使用される特定の抗原または対象の状態に応じて変化し得、当業者により決定され得る。
【００４３】
［００４２］
上述のように、本発明は、ＥＨＶ抗原またはリーシュマニア抗原からなる群から選択される抗原成分及びアジュバント成分を含むワクチン組成物であって、該アジュバント成分は、Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびに、サポニン及びステロールの組み合わせ、または油を含み、該油がワクチン組成物の２〜２０ｖ／ｖ％を構成する（または異なる一連の実施形態において、それらから本質的になる、またはさらに異なる一連の実施形態において、それらからなる）、ワクチン組成物を提供する。
【００４４】
［００４３］
一連の実施形態において、本発明のワクチン組成物は、非リポソームワクチン組成物である。油が存在する実施形態において、抗原は、通常、水相中に分散されるか、または溶解され得、リポソームまたは類似の構造によって覆われない。サポニン及びステロールが存在する実施形態において、該サポニン及び該ステロールは、らせん状ミセルを形成し得、抗原は該らせん状ミセルと混合され得るが、その内部には取り込まれ得ない。
【００４５】
［００４４］
抗原
［００４５］
リーシュマニアまたはＥＨＶ由来の異なる抗原は、本発明に好適である。抗原には、（不活化された、弱毒化された、及び修飾された生の）全生物、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、合成ペプチド、タンパク質抽出物、多糖、炭水化物、脂肪酸、テイコ酸、ペプチドグリカン、脂質、または糖脂質が含まれるが、これらに限定されず、単独で、またはその任意の組み合わせであり得る。
【００４６】
［００４６］
対象において疾患を生じさせない、生の、修飾された生の、及び弱毒化されたウイルス
株は、非毒性の形態で単離されているか、または、適切な細胞系における連続継代または紫外線もしくは化学的突然変異原への曝露を含む、当技術分野において周知の方法を用いて弱毒化されている。不活化されたかまたは死滅したウイルス株は、ホルマリン、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）、殺菌性放射線、熱での処理、または他のそのような方法を含む、当業者に知られている方法によって不活性化されているものである。
【００４７】
［００４７］
免疫応答を誘発するために用いられる抗原の量は、用いられる抗原、対象、及び所望の応答レベルに応じて著しく変化し、当業者によって決定され得る。修飾された生のＥＨＶまたは弱毒化されたＥＨＶを含有するワクチンでは、抗原の治療効果量は、通常、約１０２組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）５０〜約１０１０ＴＣＩＤ５０の範囲を含む。多くのそのようなウイルスでは、治療有効用量は、通常、約１０２ＴＣＩＤ５０〜約１０８ＴＣＩＤ５０の範囲を含む。いくつかの実施形態において、治療有効用量の範囲は、約１０３ＴＣＩＤ５０〜約１０６ＴＣＩＤ５０の範囲を含む。いくつかの他の実施形態において、治療有効用量の範囲は、約１０４ＴＣＩＤ５０〜約１０５ＴＣＩＤ５０の範囲を含む。
【００４８】
［００４８］
不活化されたＥＨＶを含有するワクチンでは、抗原の治療有効量は、通常、１用量当たり少なくとも約１００相対単位であり、多くの場合、１用量当たり約１，０００〜約４，５００相対単位の範囲を含む。他の実施形態において、抗原の治療有効量は、１用量当たり約２５０〜約４，０００相対単位の範囲を含むか、１用量当たり約５００〜約３，０００相対単位の範囲を含むか、１用量当たり約７５０〜約２，０００相対単位の範囲を含むか、または１用量当たり約１，０００〜約１，５００相対単位の範囲を含む。
【００４９】
［００４９］
ワクチンにおいて投与されるリーシュマニア抗原のための細胞の数は、１用量当たり約１×１０２〜約１×１０１０の範囲を含む。他の実施形態において、細胞の数は、１用量当たり約１×１０３〜約１×１０９の範囲を含むか、１用量当たり約１×１０４〜約１×１０８の範囲を含むか、１用量当たり約１×１０５〜約１×１０７の範囲を含むか、または１用量当たり約１×１０６〜約１×１０８の範囲を含む。
【００５０】
［００５０］
不活化ウイルスを含有するワクチンにおける抗原の治療有効量はまた、相対効力（ＲＰ）／ｍＬの観点から測定することができる。治療有効量は、多くの場合、約０．１〜約５０ＲＰ／ｍＬの範囲を含む。他の実施形態において、抗原の治療有効量は、約０．５〜約３０ＲＰ／ｍＬの範囲を含むか、約１〜約２５ＲＰ／ｍＬの範囲を含むか、約２〜約２０ＲＰ／ｍＬの範囲を含むか、約３〜約１５ＲＰ／ｍＬの範囲を含むか、または約５〜約１０ＲＰ／ｍＬの範囲を含む。
【００５１】
［００５１］
リーシュマニア抗原の好適な非限定的な例には、全生物、タンパク質抽出物、糖タンパク質、外側カプシドタンパク質及び抽出物、ならびに該外側カプシドタンパク質をコードする核酸配列が含まれる。特定の抗原には、Ｇｐ６３、ＰＳＡ−２、及びフコースマンノースリガンドが含まれ得る。別の一連の実施形態において、リーシュマニア排泄分泌抗原（ＥＳＡ）が使用され得る。少なくとも１７のＥＳＡの相対分子量が１１、１３、１６、１８、２１、２３、２６、２９、３３、３５、４２、５１、５４、５８、６４、７０、及び８０ｋＤａであるＥＳＡが特定されている。２つの部分であるＦ１（１１、１３、及び１６ｋＤａ）及びＦ３（２６、２９、及び３３ｋＤａ）は、それらがＮＡＤＰＨオキシダーゼ及びＳＯＤ活性、ならびに刺激されたＲＡＷ  ２６４．７マクロファージにおいてＮ
Ｏｘ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１２の産生を著しく誘発するとき、高度に免疫原性であることが見出された。さらに、これらの抗原はまた、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の産生の増加を伴ってヒト末梢血単核細胞の著しい増殖を誘発した。Ｇｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，２０１２；１３２（３），３５５−３６１を参照されたい。
【００５２】
［００５２］
ＥＨＶの最も一般的な種は、ＥＨＶ−１及びＥＨＶ−４である。ＥＨＶは、１１の糖タンパク質（ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＭ、及びｇＮ）を含有する非晶質エンベロープによって被われているウイルスゲノムを含有する正２０面体ヌクレオカプシドからなる。Ｐａｉｌｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｅｎ  Ｖｅｔ  Ｓｃ
Ｊ，２００８；２：６８−９１を参照されたい。
【００５３】
［００５３］
ＥＨＶ抗原の好適な非限定的な例には、（不活化された、弱毒化された、及び修飾された生の）全ウイルス、タンパク質抽出物、エンベロープタンパク質、及び該タンパク質をコードする核酸配列、ならびに組換えサブユニット抗原またはベクター抗原が含まれる。
【００５４】
［００５４］
サポニン及びＣｐＧ
［００５５］
アジュバント組成物での使用に好適なトリテルペノイドサポニンは、キラヤサポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）、トマチン、朝鮮人参抽出物、マッシュルーム、及びステロイドサポニンに構造が類似しているアルカノイドグリコシドを含む、植物由来のまたは合成等価物の多くの源に由来し得る。したがって、アジュバント組成物での使用に好適なトリテルペノイドには、サポニン、スクアレン、及びラノステロールが含まれる。アジュバント組成物で用いるのに適しているトリテルペノイドの量は、使用されるトリテルペノイドの性質に依存する。しかしながら、それらは、通常、約１μｇ〜約５，０００μｇ／用量の量で用いられる。それらはまた、約１μｇ〜約４，０００μｇ／用量、約１μｇ〜約３，０００μｇ／用量、約１μｇ〜約２，０００μｇ／用量、及び約１μｇ〜約１，０００μｇ／用量の量で用いられる。それらはまた、約５μｇ〜約７５０μｇ／用量、約５μｇ〜約５００μｇ／用量、約５μｇ〜約２００μｇ／用量、約５μｇ〜約１００μｇ／用量、約１５μｇ〜約１００μｇ／用量、約３０μｇ〜約７５μｇ／用量の量で用いられる。
【００５５】
［００５６］
サポニンを用いる場合、アジュバント組成物は、通常、キラヤサポナリアの樹皮から得られる、免疫学的に活性なサポニン画分を含有する。サポニンは、例えば、商業的に入手することができる、Ｑｕｉｌ  Ａまたは別の精製されたもしくは部分的に精製されたサポニン調製物であり得る。例えば、Ｑｕｉｌｌ  Ａは、米国では、Ｅ．Ｍ  Ｓｅｒｇｅａｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙにより販売されている。ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、及びＱＳ−２１は、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から入手され得る。したがって、サポニン抽出物は、混合物として、またはＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、及びＱＳ−２１等の精製された個別の成分として用いることができる。一実施形態において、Ｑｕｉｌ  Ａは、少なくとも８５％の純度である。他の実施形態において、Ｑｕｉｌ  Ａは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の純度である。
【００５６】
［００５７］
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、特異的な塩基配列の背景におけるメチル化されていない
ＣＧジヌクレオチドの存在を特徴とする（ＣｐＧモチーフ）、最近記載されたクラスの薬物療法剤である。（Ｈａｎｓｅｌ  ＴＴ，Ｂａｒｎｅｓ  ＰＪ（ｅｄｓ）：Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  Ａｓｔｈｍａ，Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ＣＯＰＤ．Ｐｒｏｇ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，２００１，ｖｏｌ３１，ｐｐ２２９−２３２であり、これは参照により本明細書に組み込まれる）。これらのＣｐＧモチーフは、ＣＧジヌクレオチドが抑制されており、かつ、存在する場合には通常はメチル化されている、真核細胞のＤＮＡにおいては見られないが、細菌ＤＮＡには存在し、ＣｐＧモチーフは細菌ＤＮＡに対して免疫刺激特性を付与する。
【００５７】
［００５８］
本発明のアジュバントは、いわゆる、Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、より好ましくは、修飾されたＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドを用いる。Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、通常、６〜２０ヌクレオチド長のパリンドロームの存在を特徴とするＣｐＧオリゴヌクレオチドである。Ｐクラスオリゴヌクレオチドは、インビトロ及び／またはインビボでコンカテマーに自発的に自己集合する能力を有する。これらのオリゴヌクレオチドは、厳密に言えば、一本鎖であるが、パリンドロームの存在により、コンカテマーの形成、または場合によりステムアンドループ構造の形成を可能にする。Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドの全体の長さは、１９〜１００ヌクレオチドであり、例えば、１９〜３０ヌクレオチド、３０〜４０ヌクレオチド、４０〜５０ヌクレオチド、５０〜６０ヌクレオチド、６０〜７０ヌクレオチド、７０〜８０ヌクレオチド、８０〜９０ヌクレオチド、９０〜１００ヌクレオチドである。
【００５８】
［００５９］
本発明の一態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメイン、少なくとも２つのパリンドローム領域を含有し、１つのパリンドローム領域が、少なくとも６ヌクレオチド長の５’パリンドローム領域であり、少なくとも８ヌクレオチド長の３’パリンドローム領域に直接またはスペーサを介して接続される。
【００５９】
［００６０］
Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で知られている技術に従って修飾され得る。例えば、Ｊ修飾とは、ヨード修飾されたヌクレオチドを指す。Ｅ修飾とは、エチル修飾されたヌクレオチド（複数を含む）を指す。したがって、Ｅ修飾Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドはＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、少なくとも１つのヌクレオチド（好ましくは５’ヌクレオチド）がエチル化される。さらなる修飾には、６−ニトロ−ベンズイミダゾールの付着、Ｏ−メチル化、プロイニル−ｄＵによる修飾、イノシン修飾、（好ましくは、ウリジンへの）２−ブロモビニルの付着が含まれる。
【００６０】
［００６１］
Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、ホスホジエステル結合及びホスホロチオエート結合が含まれるが、これらに限定されない、修飾されたヌクレオチド間結合も含有し得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、合成されても、商業的供給源から得られてもよい。
【００６１】
［００６２］
Ｐクラスオリゴヌクレオチド及び修飾Ｐクラスオリゴヌクレオチドは、２００８年６月１２日に公開された公開ＰＣＴ出願第ＷＯ２００８／０６８６３８号においてさらに開示されている。修飾Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドの好適な非限定的な例を、以下に提供する（「＊」は、ホスホロチオエート結合を指し、「＿」は、ホスホジエステル結合を指す）。
【００６２】
配列番号１  ５’Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ−Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’
配列番号２  ５’Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’
配列番号３  ５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ  ３’
配列番号４  ５’ＪＵ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’
配列番号５  ５’ＪＵ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ  ３’
配列番号６  ５’ＪＵ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ  ３’
配列番号７  ５’ＥＵ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’
配列番号８  ５’ＪＵ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ  ３’
配列番号９  ５’ＪＵ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ  ３’
配列番号１０  ５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’。
【００６３】
［００６３］
アジュバント組成物で用いるＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドの量は、使用されるＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド及びその対象とする種の性質に依存する。しかしながら、それらは、通常、約２０μｇ〜約５００μｇ／ｍＬの量で用いられる。それらはまた、約２５μｇ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、約４０μｇ〜約２５０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ〜約２００μｇ／ｍＬ、約１００ｇ〜約２００μｇ／ｍＬの量で用いられる。
【００６４】
［００６４］
ステロール
［００６５］
アジュバント組成物での使用に好適なステロールには、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール、及びコレステロールが含まれる。これらのステロールは、当該技術分野で周知であり、商業的に購入され得る。例えば、コレステロールは、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１２ｔｈ  Ｅｄ．，ｐ．３６９に開示されている。アジュバント組成物での使用に好適なステロールの量は、使用されるステロールの性質に依存する。しかしながら、それらは、通常、約１μｇ〜約５，０００μｇ／ｍＬの量で用いられる。それらはまた、約１μｇ〜約４，０００μｇ／ｍＬ、約１μｇ〜約３，０００μｇ／ｍＬ、約１μｇ〜約２，０００μｇ／ｍＬ、及び約１μｇ〜約１，０００μｇ／ｍＬの量で用いられる。それらはまた、約５μｇ〜約７５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ〜約５００μｇ／ｍＬ、約５μｇ〜約２００μｇ／ｍＬ、約５μｇ〜約１００μｇ／ｍＬ、約１５μｇ〜約１００μｇ／ｍＬ、及び約３０μｇ〜約７５μｇ／ｍＬの量で用いられる。
【００６５】
［００６６］
本発明に従ってサポニン及びステロールを含有する組成物の調製は、当技術分野の技量内である。簡潔に言えば、水性混合物が調製され、当該混合物は、抗原、Ｐクラス免疫調節性オリゴヌクレオチド、及びサポニンからなる。次いで、該ステロールを、その混合物に徐々に添加する（または滴加する）。
【００６６】
［００６７］
油相
［００６８］
さらなる実施形態において、アジュバント成分は、ワクチン組成物の約２〜約２０ｖ／ｖ％、例えば、約３〜約１５ｖ／ｖ％、約５〜約１５ｖ／ｖ％、約１０〜約１５ｖ／ｖ％、約１０〜約２０ｖ／ｖ％等の量で油相を構成する。油相は、通常、油、及び任意に、１つ以上の乳化剤を含む。一実施形態において、油相は、２つの乳化剤を含み、これらのうちの一方は、脂溶性であり、もう一方は水溶性である。
【００６７】
［００６９］
複数の油及びそれらの組み合わせは、本発明の使用に好適である。これらの油には、動物油、植物油、ならびに非代謝油が含まれるが、これらに限定されない。本発明に好適な植物油の非限定的な例は、トウモロコシ油、ピーナッツ油、大豆油、ココナツ油、及びオリーブ油である。動物油の非限定的な例は、スクアランである。非代謝油の好適な非限定的な例には、軽油、直鎖または分岐の飽和油、スクアラン等が含まれる。
【００６８】
［００７０］
一連の実施形態において、本発明のアジュバント製剤で用いる油は、軽油である。本明細書で用いる場合、「鉱油」という用語は、蒸留技術によってペトロラタムから得られる液体炭化水素の混合物を指す。この用語は、「液体パラフィン」及び「液体ペトロラタム」、及び「白色鉱油」と同義である。この用語はまた、「軽質鉱油」、すなわち、ペトロラタムの蒸留により同様に得られるが、但し、白色鉱油よりもわずかに低い比重である油を含むことも、意図する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０、７８８頁及び１３２３頁）を参照されたい。鉱油は、例えば、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｐａ．）、ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）等の種々の商業的供給源から得ることが可能である。好ましい鉱油は、ＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）の名前で市販されている軽質鉱油である。
【００６９】
［００７１］
別の一連の実施形態において、油はＳＰ油である、これは、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（ＢＡＳＦ，Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪから入手可能）、スクアラン（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹから入手可能）、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）から構成される。スクアランは、約５ｗ／ｖ％で使用され、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーは、約２．５ｗ／ｖ％で使用され、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）は、緩衝液、水、生理食塩水、または細胞培養増殖培地のいずれかの薬学的に許容される希釈剤において調製された約０．２ｗ／ｖ％で使用される。
【００７０】
［００７２］
油相には、任意の乳化剤が存在する場合、油及び油溶性乳化剤（例えばＳＰＡＮ８０）が含まれる。油相の体積は、油及び油溶性乳化剤の体積の合計として計算される。したがって、例えば、油の体積が組成物の１０％であり、油溶性乳化剤の体積が組成物の２％である場合、油相は組成物の１２ｖ／ｖ％で存在し得る。同様に、油が組成物の約５％の量で存在し、かつ油溶性乳化剤が組成物の約６％の量で存在する場合、油相は組成物の約１１ｖ／ｖ％の量で存在する。
【００７１】
［００７３］
本発明のエマルションでの使用に好適な乳化剤には、天然の生物学的に適合性のある乳化剤及び非天然の合成界面活性剤が含まれる。生物学的に適合性のある乳化剤には、リン脂質化合物及びリン脂質の混合物が含まれる。好ましいリン脂質は、大豆レシチンまたは卵レシチン等のホスファチジルコリン（レシチン）である。レシチンは、粗植物油を水で洗浄し、得られた含水ゴムを分離及び乾燥することにより、ホスファチド及びトリグリセリドの混合物として得られ得る。精製された生成物は、トリグリセリド及び植物油をアセトン洗浄により除去した後に残留する、アセトン不溶性リン脂質及び糖脂質の混合物を分画することにより得られ得る。あるいは、レシチンは、種々の商業的供給源から得られ得る。他の好適なリン脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。リン脂質は、天然源から単離されても、または慣用的に合成されてもよい。
【００７２】
［００７４］
さらなる実施形態において、本明細書で使用される乳化剤は、レシチンを含まない、または免疫学的に有効ではない量でレシチンを使用する。
【００７３】
［００７５］
本発明のアジュバント製剤での使用に好適な非天然の合成乳化剤には、例えば、脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤（ＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の名前で市販されている）等のソルビタン系の非イオン性界面活性剤、ポリエトキシ化ソルビトールの脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮ（登録商標））、ヒマシ油等の源から得られる脂肪酸のポリエチレングリコールエステル（ＥＭＵＬＦＯＲ（登録商標））；ポリエトキシ化脂肪酸（例えば、ＳＩＭＵＬＳＯＬ  Ｍ−５３の名前で入手可能なステアリン酸）、ポリエトキシ化イソオクチルフェノール／ホルムアルデヒド重合体（ＴＹＬＯＸＡＰＯＬ（登録商標））、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ＢＲＩＪ（商標登録））；ポリオキシエチレンノンフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標登録）Ｎ）、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標登録）Ｘ））が挙げられる。好ましい合成界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ−８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）及びＳＰＡＮ−８０（ソルビタンモノオレエート）等のＳＰＡＮ（登録商標）及びＴＷＥＥＮ（登録商標）の名前で入手可能な界面活性剤である。
【００７４】
［００７６］
一般的に言うと、乳化剤（複数を含む）は、０．０１体積％〜１０体積％、好ましくは０．１体積％〜５体積％、より好ましくは１体積％〜３体積％の量でワクチン組成物内に存在し得る。
【００７５】
［００７７］
油相を含むワクチン組成物の調製は、直接的であり、抗原、Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、及び任意に、水溶性乳化剤を含む水相を油、及び任意に、脂溶性乳化剤を含有する油相と混合させることを必要とする。得られた混合物は、乳化される。
【００７６】
［００７８］
組成物の他の成分には、担体、溶剤、及び希釈剤等の薬学的に許容される賦形剤、等張剤、緩衝剤、安定剤、保存剤、血管収縮剤、抗細菌剤、抗真菌剤等が含まれ得る。典型的な担体、溶剤、及び希釈剤には、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、油等が含まれる。代表的な等張剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が含まれる。有用な安定剤には、ゼラチン、アル
ブミン等が含まれる。
【００７７】
［００７９］
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング剤、アジュバント、安定剤、希釈剤、保存剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤等が含まれる。担体（複数を含む）は、組成物の他の成分と適合し、対象に対して有害ではないという意味で「許容できる」ものでなくてはならない。典型的には、担体は無菌であり発熱物質を有しておらず、かつ、用いられる投与様式に基づいて選抜される。組成物を含む薬学的に許容される担体の好ましい製剤が、米国（ＵＳ）農務省または米国食品医薬品局または米国以外の国における同等の政府機関により公表された適用規制において認可される薬学的担体であることは、当業者に周知である。したがって、組成物の商業生産のために薬学的に許容される担体は、米国または外国における適切な政府機関により既に認可されているかまたは認可されるであろう担体である。
【００７８】
［００８０］
組成物には、任意に、薬学的ビヒクル、賦形剤、または媒質として働く、適合可能な薬学的に許容される（すなわち、無菌もしくは非毒性の）液体、半固体、または固体の希釈剤が含まれ得る。希釈剤には、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等が含まれ得る。等張剤には、中でも、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれ得る。安定剤には、中でもアルブミンが含まれる。
【００７９】
［００８１］
組成物はまた、例えばゲンタマイシン、メルチオラート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）、またはクロロクレゾールを含む、抗生物質または保存剤を含有し得る。選択される様々なクラスの抗生物質または保存剤が当業者に周知である。
【００８０】
［００８２］
組成物の投与及びその使用
［００８３］
組成物の用量サイズは、典型的には、対象及び抗原に応じて、約０．５ｍＬ〜約５ｍＬの範囲を含む。例えば、イヌまたはネコでは、約０．５〜約１ｍＬの一用量が一般的に用いられるが、大型動物においては、約１〜５ｍＬの一用量が一般的に用いられる。しかしながら、これらのアジュバントはまた、マイクロドースで製剤化され得るが、一方、約１００〜約５００μＬの用量を用いることができる。
【００８１】
［００８４］
アジュバント組成物の投与の経路には、皮下、筋肉内、非経口、経口、口鼻、経鼻、気管内、局所等が含まれるが、これらに限定されない。注射器、ドロッパー、無針注射デバイス、パッチ等を含む、任意の好適なデバイスが、組成物を投与するために用いられ得る。使用のために選択された経路及びデバイスは、アジュバントの組成物、抗原、及び対象に依存し、それらは、当業者は周知である。
【００８２】
［００８５］
本発明は、以下の非限定的な例においてさらに説明されるであろう。
【実施例】
【００８３】
［００８６］
実施例１：リーシュマニア抗原
［００８７］
５０匹の研究室で育てられた雄及び雌のビーグル犬をＭａｒｓｈａｌｌ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＮＹ）から入手し、５匹ずつ１０群に無作為に分けた（表１）。これらのイヌは、第１回注射時、３〜４月齢であった。３回の注射を２１日間隔で投与し、注射部位を観察し、アッセイのために血液試料を所定の間隔で収集した。配列番号８のＰ−ＣｐＧをこの研究のために用いた。
【００８４】
【表１】
2019108328.tif 000002
【００８５】
［００８８］
ＰＭＢＣを、−１日目、７日目、２８日目、及び４９日目に単離した。単離されたＰＢＭＣを、（ＭＥＤＩＡ）において培養し、ＦＭＬ（２０ｕｇ／ｍＬ）、ＬＩＣＥ（リーシュマニアインファンタム粗抽出物、１７．５ｕｇ／ｍＬ）、及びＣｏｎＡ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ、２．５ｕｇ／ｍＬ）で刺激した。市販のキットを用いて、ＩＦＮ−ｇをＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。実験の結果を以下の表に要約する。
【００８６】
【表２】
2019108328.tif 000003
【００８７】
【表３】
2019108328.tif 000004
【００８８】
［００８９］
総合すれば、これらのデータは、ＩＦＮ−ｇ刺激指数について、ＱＣを含むＣｐＧ（１００μｇ）がＦＭＬにおいて最良のアジュバントであると思われることを示す。ＳＰ油を含むＣｐＧ（１００μｇ）は、最も高いＩＦＮ−ｇ  ＳＦＣを誘発しただけでなく、最も高い背景刺激も有した。驚くべきことに、陽性対照であるＬｅｉｓｈｍｕｎｅワクチンは、５００μｇ／用量のＱｕｉｌ  Ａでアジュバント化されたとしても、陰性対照（ＰＢＳまたはＦＭＬ単独で）よりもわずかに良好であった。つまり、ＣｐＧの添加により、Ｑｕｉｌ  Ａを１０倍低下させることが可能であり、依然として優れた結果を得た。これまでに知られているアジュバントＭＰＤ及びＥ−ＳＡの効果は、Ｌｅｉｓｈｍｕｎｅ（登録商標）に匹敵する、またはそれよりもわずかに良好であるが、ＱＣを含むＣｐＧよりは劣っている。
【００８９】
［００９０］
実施例２：ＥＨＶ抗原
［００９１］
動物
［００９２］
異種交配させた１１〜１２月齢の雄及び雌ウマを、１群当たり５頭のウマを含む処置群に割り当てた。ウマを、ワクチン接種段階中、外構中に維持した。ほぼすべてのウマが生
後間もなくＥＨＶに曝露するため、ウマは完全にナイーブなわけではない。ＳＮ力価を用いて低力価を有する動物を選択するが、以前の曝露が試験結果の解釈に影響を及ぼす可能性がある。この研究において、従来の死滅したＥＨＶ−１を抗原として使用した。
【００９０】
［００９３］
実験設計を表４に提供する。
【００９１】
【表４】
2019108328.tif 000005
【００９２】
［００９４］
結果を以下の表に要約する。
【００９３】
【表５】
2019108328.tif 000006
【００９４】
【表６】
2019108328.tif 000007
【００９５】
【表７】
2019108328.tif 000008
【００９６】
【表８】
2019108328.tif 000009
【００９７】
［００９５］
これらの結果は、Ｐクラスオリゴヌクレオチドが、Ｑｕｉｌ  Ａ／コレステロール及びＳＰ油と組み合わせて、強力なアジュバント効果を提供することを示す。
【００９８】
［００９６］
本明細書で引用されるすべての刊行物（特許刊行物及び非特許刊行物の両方）は、本発明が関連する当業者の技術の水準を示す。これらの刊行物はすべて、個々の刊行物が各々参照により組み込まれたものとして明確かつ個別に示された場合と同じ程度に参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００９９】
［００９７］
本明細書において本発明を特定の実施形態を参照して説明してきたが、これらの実施形態が本発明の原理及び用途の単なる例示であることを理解されたい。したがって、例示の実施形態に多くの修正を加えることができ、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、他の構成を考案することができることを理解されたい。
【配列表】
2019108328000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月4日(2019.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原成分及びアジュバント成分を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント成分が、ＰクラスＣｐＧオリゴヌクレオチド、ならびに、サポニン及びステロールの組み合わせを含み、そして、前記抗原成分が、リーシュマニア抗原である、前記ワクチン組成物。
【請求項２】
前記アジュバントが、前記ＰクラスＣｐＧオリゴヌクレオチド、ならびに、前記サポニン及び前記ステロールの前記組み合わせ、から本質的になる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
非リポソーム組成物である、請求項１または２に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項４】
前記サポニンがＱｕｉｌ  Ａであり、前記ステロールがコレステロールである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項５】
前記サポニンが５〜１００μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項６】
前記ステロールが５〜１００μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項７】
前記ステロール及び前記サポニンが各々、５０μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項８】
前記抗原が、フコースマンノースリガンド（ＦＭＬ）である、請求項１−７のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項９】
前記ＰクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドが２０〜５００μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項１０】
前記ＰクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドが１００〜２５０μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項９に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項１１】
前記ＰクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドが修飾されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項１２】
前記修飾ＰクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＪＵ修飾またはＥ修飾されている、請求項１１に記載の前記ワクチン組成物。
【請求項１３】
前記修飾ＰクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドが、配列番号７、配列番号８、または配列番号９である、請求項１２に記載の前記ワクチン組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
［００９７］
本明細書において本発明を特定の実施形態を参照して説明してきたが、これらの実施形態が本発明の原理及び用途の単なる例示であることを理解されたい。したがって、例示の実施形態に多くの修正を加えることができ、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、他の構成を考案することができることを理解されたい。
本発明は、非限定的に、以下の態様を含む。
［態様１］
抗原成分及びアジュバント成分を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント成分が、Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびに
ａ．サポニン及びステロールの組み合わせ、または
ｂ．油、及び任意に、１つ以上の乳化剤を含む油相、を含み、前記油相が前記ワクチン組成物の２〜２０ｖ／ｖ％を構成し、
前記抗原成分が、ＥＨＶ抗原またはリーシュマニア抗原である、前記ワクチン組成物。
［態様２］
前記アジュバントが、前記Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびに
ａ．前記サポニン及び前記ステロールの前記組み合わせ、または
ｂ．前記油、及び任意に、１つ以上の乳化剤を含む前記油相、から本質的になり、前記油相が前記ワクチン組成物の２〜２０ｖ／ｖ％を構成する、態様１に記載のワクチン組成物。
［態様３］
非リポソーム組成物である、態様１または２に記載の前記ワクチン組成物。
［態様４］
前記サポニンがもしあれば、Ｑｕｉｌ  Ａであり、前記ステロールがもしあれば、コレステロールであり、前記油がもしあれば、ＳＰ−Ｏｉｌである、態様１〜３のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
［態様５］
前記サポニンが５〜１００μｇ／ｍＬの量で存在する、態様１〜４のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
［態様６］
前記ステロールが５〜１００μｇ／ｍＬの量で存在する、態様１〜５のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
［態様７］
前記ステロール及び前記サポニンが各々、５０μｇ／ｍＬの量で存在する、態様１〜６のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
［態様８］
前記油相が、前記ワクチン組成物の５〜１０ｖ／ｖ％の量で存在する、態様１〜４のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
［態様９］
前記抗原がＥＨＶ抗原であり、前記油相が、前記組成物の５ｖ／ｖ％の量で存在する、態様１、２、３、４、７のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
［態様１０］
前記抗原がリーシュマニア抗原であり、前記油相が、前記組成物の１０ｖ／ｖ％の量で存在する、態様１、２、３、４、７のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
［態様１１］
前記Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドが２０〜５００μｇ／ｍＬの量で存在する、態様１〜１０のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
［態様１２］
前記Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドが１００〜２５０μｇ／ｍＬの量で存在する、態様１１に記載の前記ワクチン組成物。
［態様１３］
前記Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドが修飾される、態様１〜１２のいずれか一項に記載の前記ワクチン組成物。
［態様１４］
前記修飾Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＪＵ修飾またはＥ修飾される、態様１３に記載の前記ワクチン組成物。
［態様１５］
前記修飾Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、配列番号７、配列番号８、または配列番号９である、態様１４に記載の前記ワクチン組成物。
【外国語明細書】
2019108328000001.pdf