(57)【要約】【課題】  反応場のサイズにばらつきがある場合であっても、従来よりも簡便な方法で、分析結果の信頼度を高める。【解決手段】  サンプル中の分析対象物の濃度を分析する際に、前記サンプルを含む液体を分割して生成された複数の反応場に関する、陽性反応場の数に関する情報、および、陰性反応場の数に関する情報の少なくとも１つの情報と、前記サンプル中または前記複数の反応場の少なくとも一部中の分析対象物の数または濃度と、が対応づけられたテーブルを用いて、分析対象物の数または濃度を導出する。【選択図】  図１
2019024366.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の分析対象物の濃度を分析する分析システムであって、
前記サンプルを含む液体を分割して生成された複数の反応場に関する、前記分析対象物が検出される反応場である陽性反応場の数に関する情報、および、前記分析対象物が検出されない反応場である陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報を取得する分析対象物情報取得部と、
前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報と、前記サンプル中または前記複数の反応場のうちの少なくとも一部中の分析対象物の数または濃度と、が対応付けられたテーブルと、前記分析対象物情報取得部で取得された、前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報と、に基づいて、前記サンプル中の前記分析対象物の数または濃度を導出する導出部と、を有することを特徴とする分析システム。
【請求項２】
前記テーブルは、複数の反応場のそれぞれのサイズに関する情報に基づいて生成されたテーブルであることを特徴とする請求項１に記載の分析システム。
【請求項３】
前記分析対象物情報取得部は、前記複数の反応場について前記分析対象物の検出を行うことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の分析システム。
【請求項４】
前記複数の反応場のそれぞれのサイズに関する情報を取得するサイズ情報取得部と、
前記サイズ情報取得部で取得された前記サイズに関する情報に基づいて、前記テーブルを生成するテーブル生成部をさらに有することを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項５】
前記テーブル生成部は、前記サイズ情報取得部で取得された前記サイズに関する情報をもとに、前記分析対象物の数を仮定してポアソンモデルに基づいてシミュレーションすることによって前記テーブルを生成することを特徴とする請求項４に記載の分析システム。
【請求項６】
複数の前記テーブルを記憶する記憶部と、
前記サイズ情報取得部で取得された、前記テーブルの生成に用いたサイズに関する情報とは別のサイズに関する情報に基づいて、前記記憶部に記憶された複数の前記テーブルの中から濃度の導出に用いるテーブルを選択するテーブル選択部と、をさらに有することを特徴とする請求項４または請求項５に記載の分析システム。
【請求項７】
前記複数の反応場のそれぞれのサイズに関する情報を取得するサイズ情報取得部と、
複数の前記テーブルを記憶する記憶部と、
前記サイズ情報取得部で取得された前記サイズに関する情報に基づいて、前記記憶部に記憶された複数の前記テーブルの中から濃度の導出に用いるテーブルを選択するテーブル選択部と、をさらに有することを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項８】
前記サイズ情報取得部および前記分析対象物情報取得部が、前記複数の反応場の少なくとも一部を撮像する撮像手段を含むことを特徴とする請求項４乃至請求項７のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項９】
前記テーブルが有する前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報が離散的であり、
前記導出部は、前記テーブルの有する前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報を補完して、前記サンプル中の前記分析対象物の数または濃度を導出することを特徴とする請求項１乃至請求項８のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項１０】
前記液体を分割して前記複数の反応場を生成する反応場生成部をさらに有することを特徴とする請求項１乃至請求項９のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項１１】
前記反応場生成部が、前記液体が、前記液体と非相溶な第２の液体中に液滴状に分散されたエマルジョンを生成する手段であることを特徴とする請求項１０に記載の分析システム。
【請求項１２】
前記反応場生成部が、膜乳化法または機械乳化法によって前記エマルジョンを生成する手段であることを特徴とする請求項１１に記載の分析システム。
【請求項１３】
前記液体は前記分析対象物を検出可能にするための薬剤を含有しており、
前記複数の反応場のそれぞれにおいて前記薬剤による反応を進行させ、前記分析対象物を検出可能にする反応部をさらに有することを特徴とする請求項１乃至請求項１２のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項１４】
前記分析対象物が、核酸であることを特徴とする請求項１乃至請求項１３のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項１５】
前記薬剤が、前記核酸を増幅させるための増幅試薬と、前記核酸と相互作用して蛍光を発する蛍光試薬と、を含むことを特徴とする請求項１４に記載の分析システム。
【請求項１６】
前記反応が、ＰＣＲを含むことを特徴とする請求項１４または請求項１５に記載の分析システム。
【請求項１７】
前記反応部が、前記複数の反応場のそれぞれの温度を調節する温度調節器を有することを特徴とする請求項１３乃至請求項１６のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項１８】
前記複数の反応場のサイズの分布が、多分散であることを特徴とする請求項１乃至請求項１７のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項１９】
サンプル中の分析対象物の濃度を分析する分析システムであって、
前記サンプルを含む液体を分割して生成された、サイズの分布が多分散である複数の反応場について、前記分析対象物が検出される反応場である陽性反応場の数に関する情報、および、前記分析対象物が検出されない反応場である陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報を取得する分析対象物情報取得部と、
前記分析対象物情報取得部で取得された、前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報に基づいて、前記複数の反応場のサイズの分布を単分散とみなして前記サンプル中または前記複数の反応場の少なくとも一部中の前記分析対象物の数または濃度を導出する導出部と、
前記複数の反応場のサイズの分布を単分散とみなして導出される前記サンプル中または前記複数の反応場の少なくとも一部中の前記分析対象物の数または濃度を、前記複数の反応場のサイズの分布に応じて補正するためのテーブルに基づいて、前記導出部で導出された前記サンプル中または前記複数の反応場の少なくとも一部中の前記分析対象物の数または濃度を補正する補正部と、を有することを特徴とする分析システム。
【請求項２０】
前記テーブルが、
前記サンプル中または前記複数の反応場の少なくとも一部中の分析対象物の数または濃度と、
前記分析対象物の数または濃度と前記複数の反応場のサイズの分布とに基づいて確率論的に推定される、前記陽性反応場の数に関する情報および前記陰性反応場の数に関する情報の少なくとも一方の情報から前記複数の反応場のサイズの分布を単分散とみなして導出される前記サンプル中または前記複数の反応場の少なくとも一部中の分析対象物の数または濃度と、
が対応付けられたテーブルであることを特徴とする請求項１９に記載の分析システム。
【請求項２１】
サンプル中の分析対象物の濃度を分析する分析方法であって、
前記サンプルを含む液体を分割して生成された複数の反応場について、前記分析対象物が検出された反応場である陽性反応場の数に関する情報、および、前記分析対象物が検出されなかった反応場である陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報を取得する分析対象物情報取得工程と、
前記分析対象物情報取得部で取得された、前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報と、
前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報と、前記サンプル中または前記複数の反応場の少なくとも一部中の分析対象物の数または濃度と、が対応付けられたテーブルと、
に基づいて、前記サンプル中の前記分析対象物の数または濃度を導出する導出工程と、を有することを特徴とする分析方法。
【請求項２２】
コンピュータに、分析対象物を含むサンプルを含む液体を分割して生成された複数の反応場に関する、前記分析対象物が検出された反応場である陽性反応場の数に関する情報、および、前記分析対象物が検出されなかった反応場である陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報を含む検出データの処理を実行させるプログラムであって、
前記処理が、
前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報と、
前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報と、前記サンプル中または前記複数の反応場の少なくとも一部中の分析対象物の数または濃度とが対応付けられたテーブルと、
に基づいて、前記サンプル中の前記分析対象物の数または濃度を導出する導出ステップと、を有することを特徴とするプログラム。
【請求項２３】
請求項２２に記載のプログラムを格納した、コンピュータが読み取り可能な記憶媒体。
【請求項２４】
サンプル中の分析対象物の濃度を分析する分析方法であって、
前記サンプルを含む液体を分割して生成された、サイズの分布が多分散である複数の反応場について、前記複数の反応場における前記分析対象物が検出された反応場である陽性反応場の数に関する情報、および、前記分析対象物が検出されなかった反応場である陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報を取得する分析対象物情報取得工程と、
前記分析対象物情報取得部で取得された、前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報に基づいて、前記複数の反応場のサイズの分布を単分散とみなして前記サンプル中の前記分析対象物の数または濃度を導出する導出工程と、
前記導出工程で導出された前記サンプル中の前記分析対象物の数または濃度を、前記複数の反応場のサイズの分布に応じて補正する補正工程と、を有することを特徴とする分析方法。
【請求項２５】
コンピュータに、分析対象物を含むサンプルを含む液体を分割して生成された、サイズの分布が多分散である複数の反応場に関する、前記分析対象物が検出された反応場である陽性反応場の数に関する情報、および、前記分析対象物が検出されなかった反応場である陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報を含む検出データの処理を実行させるプログラムであって、
前記処理が、
前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報に基づいて、前記複数の反応場のサイズの分布を単分散とみなして前記サンプル中の前記分析対象物の数または濃度を導出する導出ステップと、
前記導出ステップで導出された前記サンプル中の前記分析対象物の数または濃度を、前記複数の反応場のサイズの分布に応じて補正する補正ステップと、を有することを特徴とするプログラム。
【請求項２６】
請求項２５に記載のプログラムを格納した、コンピュータが読み取り可能な記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析システム、分析方法、プログラム、および記憶媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の塩基配列を有する核酸（標的核酸）を分析対象物として定量分析する方法として、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ；ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が注目されている。
【０００３】
デジタルＰＣＲでは、標的核酸を含むサンプルを、標的核酸を増幅するための増幅試薬、標的核酸を検出するための蛍光試薬などと混合して希釈し、物理的に独立した多数の反応場に分割する。このとき、それぞれの反応場に含まれる標的核酸の数が１個または０個のいずれかとなるようにサンプルを希釈（以下、このような希釈を「限界希釈」と称する）しておく。そして、複数の反応場のそれぞれにおいて独立にＰＣＲを生じさせ、標的核酸を増幅して検出可能にする。これにより、増幅後にシグナルが検出された反応場の数（陽性反応場数）および／または増幅後にシグナルが検出されなかった反応場の数（陰性反応場数）から、サンプル中の標的核酸の濃度を取得することができる。
【０００４】
デジタルＰＣＲにおいてサンプルを含む反応液を物理的に独立した多数の反応場に分割する方法として、反応液の液滴をオイル中に形成する方法、すなわち、油中水型エマルジョン（Ｗ／Ｏエマルジョン）を形成する方法がある。この方法では、油中水型エマルジョン中の１つ１つの液滴を反応場として用いる（特許文献１）。油中水型エマルジョンを形成する方法としては、マイクロ流路デバイスを用いた方法や、機械撹拌を用いた方法などがあるが、特に、油中水型エマルジョンの形成を高速に行った場合には、液滴のサイズ、すなわち反応場のサイズにばらつきが生じやすい。
【０００５】
また、定量分析のダイナミックレンジを拡大する目的で、サイズをばらつかせた反応場を用いるデジタルＰＣＲも提案されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１２−５０３７７３号公報
【特許文献２】特表２０１４−５０５４７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
反応場のサイズがばらついている場合に分析対象物の濃度または数を計算する方法としては、反応場のサイズに関する情報と、当該反応場における分析対象物の存在に関する情報とを、１つ１つの反応場ごとに対応付けて計算する方法が考えられる。しかしながらこの方法では、極めて煩雑な計算が必要となる。
【０００８】
一方、反応場のサイズのばらつきを無視して反応場のサイズの分布を単分散とみなせば、特許文献１に記載されているような従来の計算方法で、分析対象物の濃度または数を簡便に計算することができる。しかしながらこの方法では、反応場のサイズのばらつきが大きくなるにつれて、分析結果の信頼度が低下してしまう。
【０００９】
そこで本発明では、上述の課題に鑑み、反応場のサイズにばらつきがある場合であっても、従来よりも簡便な方法で、分析結果の信頼度を高めることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一側面としての分析システムは、サンプル中の分析対象物の濃度を分析する分析システムであって、前記サンプルを含む液体を分割して生成された複数の反応場に関する、前記分析対象物が検出される反応場である陽性反応場の数に関する情報、および、前記分析対象物が検出されない反応場である前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報を取得する分析対象物情報取得部と、前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報と、前記サンプル中または前記複数の反応場の少なくとも一部中の分析対象物の数または濃度と、が対応付けられたテーブルと、前記分析対象物情報取得部で取得された、前記陽性反応場の数に関する情報、および、前記陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報と、に基づいて、前記サンプル中の前記分析対象物の数または濃度を導出する導出部と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、反応場のサイズにばらつきがある場合であっても、従来よりも簡便な方法で、分析結果の信頼度を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１の実施形態に係る分析システムの構成を模式的に示す図である。
【図２】情報処理ユニットのハードウエア構成を模式的に示す図である。
【図３】第１の実施形態に係る分析システムによる分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図４】第２の実施形態に係る分析システムの構成を模式的に示す図である。
【図５】第２の実施形態に係る分析システムによる分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図６】第３の実施形態に係る分析システムの構成を模式的に示す図である。
【図７】第３および第４の実施形態に係る分析システムによる分析処理の手順の一部を示すフローチャートである。
【図８】第４の実施形態に係る分析システムの構成を模式的に示す図である。
【図９】サーマルサイクル後のエマルジョン１〜４の蛍光顕微鏡画像である。
【図１０】サーマルサイクル後のエマルジョン５〜８の蛍光顕微鏡画像である。
【図１１】比較例１、実施例１，２のそれぞれにおける、相対希釈倍率とサンプル中の分析対象物の濃度の計算結果との関係を示すグラフである。
【図１２】比較例２、実施例３，４のそれぞれにおける、相対希釈倍率とサンプル中の分析対象物の濃度の計算結果との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、当業者の通常の知識に基づいて、以下の実施の形態に対して適宜変更、改良等が加えられたものも本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
（第１の実施形態）
本発明の第１の実施形態に係る分析システムについて、図面を参照しながら説明する。
【００１５】
［分析システムの構成］
図１は、本実施形態に係る分析システムの構成を模式的に示す図である。本実施形態に係る分析システム１は、反応場生成ユニットＵ１と、反応ユニットＵ２と、検出ユニットＵ３と、情報処理ユニットＵ４と、を有する。各ユニット間は、部分的にまたは全体的に、ＬＡＮまたはインターネットなどのネットワークを介して接続されていてもよい。
【００１６】
＜反応場生成ユニット＞
反応場生成ユニットＵ１は、サンプル中の分析対象物を含む反応液などの液体を分割して、互いに物理的に独立した、複数の反応場を生成するユニットである。
【００１７】
（反応場）
本明細書において反応場とは、液液界面、気液界面、および固液界面からなる群から選択される少なくとも１つの界面によって囲まれた空間をいう。反応場における反応はこの閉じた空間内で生じ、他の反応場とは独立して反応が進行する。換言すれば、１つの反応場における反応は、上述の界面によって規定される空間内に閉じ込められた物質のみが関与する。
【００１８】
例えば、マイクロプレートのようなプレート上の複数のウエルに反応液がそれぞれ分注されている場合、それぞれのウエルに分注されているそれぞれの反応液が反応場となる。この場合、反応場はウエルの壁面と反応液との間の固液界面と、大気と反応液との間の気液界面と、によって囲まれている。あるいは、反応液が、油中水型エマルジョン（Ｗ／Ｏエマルジョン）などのエマルジョンにおける液滴を形成している場合は、エマルジョン中の各液滴が反応場となる。この場合、反応場は連続相と分散相との間の液液界面によって囲まれている。
【００１９】
（分析対象物）
本明細書において分析対象物とは、サンプル中に含まれ、定量分析の対象となる化合物や粒子をいう。本実施形態に係る分析対象物は、後述する反応場中での反応によって検出可能にすることができるものであれば、特に限定はされず、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素などが挙げられる。
【００２０】
本明細書において「検出可能にする」とは、後述する反応ユニットＵ２における反応によって分析対象物に由来するシグナルを検出可能にすることをいう。例えば、もともとは検出不可能な程に微弱だったシグナルが、反応ユニットＵ２における増幅反応により分析対象物の数または濃度が増加することでシグナルが増強することによって、検出可能になる。また、反応によって所定のシグナルを発する物質が分析対象物から生成されることでも、分析対象物を検出可能にすることができる。あるいは、分析対象物が化学変化するなどしてシグナルを発するように変化しても、分析対象物を検出可能にすることができる。
【００２１】
核酸は、詳しくは後述するが、核酸を増幅させるための増幅試薬と、核酸と相互作用して蛍光を発する蛍光試薬と、を核酸を検出可能にするための薬剤として用い、ＰＣＲなどの核酸増幅反応によって検出可能にすることができる。また、ペプチドやタンパク質は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法などによって検出可能にすることができる。なお、分析対象物は上記の核酸、ペプチド、タンパク質などを含む物質であってもよい。例えば、核酸、ペプチド、およびタンパク質の少なくともいずれかが共有結合等で結合または付着した分子、マイクロ粒子、ナノ粒子、細胞などが挙げられる。
【００２２】
例えば、ヒトから採取した血液や、そこから抽出された核酸などを検体とし、該検体に含まれ得る、がんや感染症などの疾病に関わる遺伝子を含む核酸を分析対象物とすれば、当該疾病の診断などに有用な情報が得られると期待できる。また、食品を検体とすれば、遺伝子組換え作物（ＧＭＯ）の評価などの食品検査を行うことができる。あるいは、環境中の土壌や水を検体とすれば、環境モニタリングを行うことができる。
【００２３】
本実施形態において核酸を分析対象物とする場合、核酸は、増幅の対象になる鋳型核酸であれば特に限定されず、ＤＮＡ（ＤｅｏｘｙｒｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であってもよいし、ＲＮＡ（ＲｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であってもよい。核酸の形態も特に限定されず、直鎖状の核酸であってもよく、また環状の核酸であってもよい。また、核酸は単一の塩基配列を有する１種類の核酸であってもよく、また、種々の塩基配列をそれぞれ有する複数種類の核酸（例えば相補的ＤＮＡライブラリーなど）であってもよい。
【００２４】
（検体）
本明細書において検体とは、生物や食品、環境などから採取または抽出された、サンプルの供給源である。一般には、定量分析されたサンプル中の分析対象物の濃度は、検体中の濃度に換算した上で、医療診断や食品、環境の評価などの各種の目的に利用される。
【００２５】
（サンプル）
本明細書においてサンプルとは、本実施形態に係る分析に供するものをいい、本実施形態では、サンプル中の分析対象物の濃度が測定される。サンプルは、検体そのものであってもよいし、検体に対して精製や濃縮、分析対象物の化学修飾や断片化など、分析のための前処理や調整を施したものであってもよい。サンプル中の分析対象物の濃度（単位体積当たりの数）は特に限定されないが、複数の反応場を生成したときに、複数の反応場のそれぞれに含まれる分析対象物の数が１個または０個となるような量であることが好ましい。このようにすることで、分析結果の信頼度を向上させることができる。
【００２６】
反応場生成ユニットＵ１は、サンプル注入部１０１と、反応場生成部１０２と、容器１０３と、を有する。
【００２７】
（サンプル注入部）
サンプル注入部１０１は、サンプルを含む液体である反応液を反応場生成部１０２へと注入する部分である。
【００２８】
サンプル注入部１０１から注入された反応液は、反応場生成部１０２へと送液される。このとき、反応液は、ポンプ等の送液手段（不図示）によって送液されてもよい。また、サンプル注入部１０１から注入された反応液は、反応場生成部１０２へと送液される間に、エマルジョンを形成するための連続相としてのオイルと混合されてもよい。あるいは、サンプル注入部１０１からサンプルのみが注入され、反応場生成部１０２へと送液される間に、分析対象物を検出するための薬剤等と混合されて反応液を生成してもよい。
【００２９】
（反応液）
本明細書において反応液とは、分析対象物を含むサンプルと、当該分析対象物を検出可能にするための薬剤と、を少なくとも含む液体をいう。反応液は、水を含む水性液体であることが好ましい。
【００３０】
（分析対象物を検出可能にするための薬剤）
分析対象物が核酸である場合は、ＰＣＲ法に代表されるような、酵素を用いた核酸増幅反応を用いて核酸を増幅することで、分析対象物を検出可能にすることができる。ここで、核酸増幅反応としては、反応場をサーマルサイクルに供することで反応を進行させるＰＣＲ法やＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法や、反応場をサーマルサイクルに供さずに温度調節することで反応を進行させるＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などを好ましく使用することができる。
【００３１】
核酸増幅反応を用いる場合は、核酸を増幅させるための増幅試薬と、核酸と相互作用して蛍光を発する蛍光試薬と、を核酸を検出可能にするための薬剤として用いる。
【００３２】
増幅試薬は、分析対象物である標的核酸の有する所定の塩基配列に相補的な塩基配列を有する１つまたは一対のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）と、核酸合成反応を促進するする生体触媒であるポリメラーゼと、を含有する。ポリメラーゼは、耐熱ポリメラーゼであることが好ましく、耐熱ＤＮＡポリメラーゼであることがより好ましい。また、増幅試薬は、核酸の原料としてのｄＮＴＰ（ＤｅｏｘｙｒｉｂｏＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−５’−ＴｒｉＰｈｏｓｐｈａｔｅ）などのリボ核酸を含有する。さらに、増幅試薬は、反応液中の水素イオン濃度（ｐＨ）をコントロールするための緩衝液または緩衝剤や、塩を含むことが好ましい。なお、増幅試薬は、上記各成分を含む市販のキットを用いてもよい。
【００３３】
プライマーとしては、標的核酸の一部の領域の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、核酸増幅反応に用いることができるオリゴヌクレオチドであれば特に限定されない。ここで、ストリンジェントな条件とは、プライマーと鋳型核酸との間に少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の配列同一性があるときに、該プライマーが鋳型核酸に特異的にハイブリダイズできる条件である。プライマーは、標的核酸の塩基配列に基づいて適宜設計できる。また、プライマーは、核酸増幅法の種類に応じて設計されることが望ましい。プライマーの長さは、通常、５〜５０ヌクレオチド、好ましくは、１０〜４０ヌクレオチドである。なお、プライマーは、分子生物学領域において一般に用いられる核酸合成方法により生成することができる。
【００３４】
緩衝液または緩衝剤としては、任意の適切な緩衝液または緩衝剤を用いることができる。緩衝液または緩衝剤は、反応液の水素イオン濃度（ｐＨ）を、所望の反応が効率的に起こり得るｐＨ、または、その近傍に維持するよう構成することが好ましい。ＰＣＲを実施する場合、反応液のｐＨは、例えば６．５〜９．０の間で、使用する増幅試薬の各成分にあわせて任意に選択することができる。緩衝液または緩衝剤の種類は、分子生物学領域で一般に使用されるものを使用することができ、例えば、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）バッファー、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸）バッファー、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）バッファーなどを使用することができる。
【００３５】
塩としては、例えば、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、およびこれらの組み合わせから適宜選択されたものを使用することができる。
【００３６】
蛍光試薬は、核酸と相互作用して蛍光を発する薬剤であり、一般的にＰＣＲ法に用いられる、蛍光インターカレーター（蛍光色素）やプローブアッセイ用のプローブ（蛍光標識プローブ）を用いることができる。蛍光インターカレーターとしては、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（「ＳＹＢＲ」はモレキュラープローブスの登録商標）、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎなどを好適に用いることができる。蛍光標識プローブとしては、標的核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（プローブ）であって、一方の末端（５´末端）がレポーターで修飾され、もう一方の末端（３´末端）がクエンチャーで修飾されたものを用いることができる。レポーターとしてはＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ＩｓｏＴｈｉｏＣｙａｎａｔｅ）やＶＩＣなどの蛍光物質を、クエンチャーとしてＴＡＭＡＲＡなどの蛍光物質や、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＤＡＢＣＹＬ、ＭＧＢなどを用いることができる。蛍光標識プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（「ＴａｑＭａｎ」はロシュダイアグノスティックスの登録商標）プローブなどを用いることができる。なお、ここでは蛍光試薬を用いる場合について説明したが、蛍光以外の発光を利用する発光試薬を使用してもよい。
【００３７】
一方、分析対象物がペプチドやタンパク質である場合は、ＥＬＩＳＡ法のような、分析対象物を特異的に反応する抗体（または抗原）と酵素を用いた抗原抗体反応および酵素反応により、分析対象物を検出可能にすることができる。より具体的には、例えば、分析対象物に酵素で標識された抗体（または抗原）を抗原抗体反応によって複合化させ、この酵素の酵素反応によって生じる発色または発光物質を検出する。なお、分析対象物と抗原抗体反応を生じさせる抗体（または抗原）は予め酵素標識されていなくてもよく、抗原抗体反応後に酵素によって標識されてもよい。
【００３８】
ＥＬＩＳＡ法を用いる場合は、抗体（または抗原）と酵素を含む試薬を、分析対象物を検出可能にするための薬剤として用いる。ＥＬＩＳＡ法に用いる試薬として市販されているキットを用いてもよい。
【００３９】
なお、発生させる蛍光の波長が異なるなど、複数の分析対象物を区別できるようにそれぞれ検出可能にする複数種類の薬剤を用いれば、複数種類の分析対象物を一度の分析でまとめて検出することもできる。
【００４０】
（反応場生成部）
反応場生成部１０２は、サンプル注入部１０１から注入された反応液を分割して、互いに物理的に独立した、複数の反応場を生成する。反応液を分割して複数の反応場を生成する方法としては、例えば、下記の方法が挙げられる。
【００４１】
第１の方法として、マイクロウエルプレートのような、基板上に複数の微小なウエルが形成されたガラスや樹脂の基板を用い、それぞれのウエルに反応液を分注する方法が挙げられる。これにより、微小なウエルのそれぞれの内部が反応場となる。
【００４２】
第２の方法として、表面に所定のパターン形状で撥水処理または撥油処理が施されたガラスや樹脂の基板を用い、基板上に反応液を塗布する方法が挙げられる。例えば格子状に撥水処理が施されたガラス基板上に水性の反応液を塗布すれば、それぞれの格子の内側に液滴が形成され、この複数の液滴のそれぞれが反応場となる。
【００４３】
第３の方法として、反応液と、反応液と相溶しない液体（以下、「非相溶液体」と称する）とから、非相溶液体中に反応液が液滴状に分散しているエマルジョンを形成する方法が挙げられる。この方法は、換言すれば、非相溶液体が連続相であり、反応液が分散相であるエマルジョンを形成する方法である。例えば、水を含む水性液体である反応液と、油性液体（オイル）と、を混同して、油中水型エマルジョン（Ｗ／Ｏエマルジョン）を形成すれば、オイル中に分散している反応液からなる液滴のそれぞれが反応場となる。
【００４４】
反応場生成部１０２は、これらの中でも第３の方法、すなわち、反応液と非相溶液体とから、非相溶液体中に反応液が液滴状に分散したエマルジョンを形成する方法によって反応場を生成することが好ましい。すなわち、反応場生成部１０２は、反応液と、反応液と非相溶な非相溶液体とから、エマルジョンを生成するエマルジョン生成部であることが好ましい。
【００４５】
（エマルジョン生成部）
エマルジョンを生成する方法としては、特に限定はされず、従来公知の乳化方法を利用できる。例えば、撹拌装置や超音波破砕装置などにより機械的エネルギーを付与することでエマルジョンを形成する機械乳化法が挙げられる。また、マイクロ流路乳化法やマイクロ流路分岐乳化法などのマイクロ流路デバイスを用いた方法、乳化膜を用いる膜乳化法などが挙げられる。これらの方法は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。これらの中でも機械的乳化法や膜乳化法は、マイクロ流路デバイスを用いた方法に比べて液滴のサイズのばらつき（分散）が大きくなる傾向にあるものの、スループット良くエマルジョンを形成できるため好ましい。また、エマルジョンを形成する装置の装置構成を単純にできること、液滴のサイズのばらつきが比較的低いエマルジョンを形成できることなどから、膜乳化法が特に好ましい。すなわち、反応場生成部１０２は、膜乳化手段または機械的乳化手段であることがより好ましく、膜乳化手段であることが特に好ましい。
【００４６】
膜乳化法は、分散相または連続相、あるいは分散相および連続相の混合物を複数の細孔やスリットを有する乳化膜に透過させることでエマルジョンを形成する方法である。膜乳化法において分散相または連続相、あるいは分散相および連続相の混合物を乳化膜に透過させる回数は特に限定はされず、１回であってもよいし、複数回であってもよい。
【００４７】
膜乳化法としては、直接膜乳化法やポンピング乳化法などを用いることができる。直接膜乳化法とは、乳化膜を介して分散相を一定圧力で押し出すことにより、押し出される側をゆっくり流れている連続相中に、エマルジョンを形成する方法である。ポンピング乳化法とは、連続相を採取したシリンジと分散相を採取したシリンジとで乳化膜を挟み、２つのシリンジから液体を交互に押し出して乳化膜を通過させることによって、エマルジョンを調製する方法である。なおポンピング乳化法においては、２つのシリンジの一方に連続相と分散相の混合物を採取しておき、もう一方のシリンジは空にしておいてもよい。ポンピング乳化法においては、それぞれシリンジと接続可能な一対のコネクターの間に乳化膜を挟み込んだポンピング式の乳化デバイスを用いることができる。
【００４８】
膜乳化法で使用する乳化膜としては、複数の細孔を有する多孔質体の膜や、スリットを有する膜を用いることができる。具体的には、ＳＰＧ（シラス多孔質ガラス）などの多孔質ガラス膜、ポリカーボネート製メンブレンフィルター、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製メンブレンフィルター、などを用いることができる。また、乳化膜の表面は疎水化処理されていることがより好ましい。乳化膜の孔径は、形成しようとする油中水型エマルジョン中の液滴のサイズに応じて選択することができ、０．２μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましく、５μｍ以上５０μｍ以下であることがより好ましい。
【００４９】
（オイル）
反応液が水を含む水性液体である場合は、反応液と相溶しない非相溶液体として、油性液体（オイル）を用いることができる。この場合、反応場生成手段１０２によって、Ｗ／Ｏエマルジョンが生成される。
【００５０】
オイルとしては、炭化水素系オイル、シリコーンオイル、フッ素系オイルなどを用いることができる。炭化水素系オイルとしては、ミネラルオイル；スクワランオイル、オリーブオイルなどの動植物由来のオイル；ｎ−ヘキサデカンなどの炭素原子数１０〜２０のパラフィン系炭化水素；炭素原子数１０〜２０のオレフィン系炭化水素などを用いることができる。炭化水素系オイルの市販品としては、例えば、ＴＥＧＯＳＯＦＴ  ＤＥＣ（炭酸ジエチルヘキシル）（エボニック製、「ＴＥＧＯＳＯＦＴ」はエボニックの登録商標）を用いることができる。フッ素系オイルとしては、ＨＦＥ−７５００（２−（トリフルオロメチル）−３−エトキシドデカフルオロヘキサン）などを用いることができる。フッ素系オイルの市販品としては、例えば、ＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ  ＦＣ−４０、ＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ  ＦＣ−４０、ＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ  ＦＣ−３２８３（スリーエム製、「ＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ」はスリーエムの登録商標）などを用いることができる。また、炭化水素系オイル、シリコーンオイル、フッ素系オイルを適宜組み合わせて用いてもよい。
【００５１】
（その他添加剤）
エマルジョンを生成する際に、界面活性剤をさらに添加してもよい。界面活性剤を添加することで、エマルジョン中の液滴のサイズの制御やエマルジョンを安定に維持するなどの効果が期待できる。界面活性剤としては、乳化処理において一般的に用いられている従来公知の界面活性剤を用いることができ、例えば、非イオン性界面活性剤、フッ素系樹脂、ホスホコリン含有樹脂などを用いることが好ましい。非イオン系界面活性剤としては炭化水素系界面活性剤や、シリコーン系界面活性剤、フッ素系界面活性剤を用いることができる。
【００５２】
炭化水素系非イオン性界面活性剤の市販品としては、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン  ブロックコポリマー）（シグマ−アルドリッチ製、「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ」はＢＡＳＦの登録商標）、Ｓｐａｎ  ６０（ソルビタンモノステアラート）（東京化成工業製、「Ｓｐａｎ」はクローダインターナショナルの登録商標）、Ｓｐａｎ  ８０（ソルビタンモノオレアート）（シグマ−アルドリッチ製、「Ｓｐａｎ」はクローダインターナショナルの登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル）（シグマ−アルドリッチ製、「Ｔｒｉｔｏｎ」はユニオンカーバイドの登録商標）、Ｔｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）（以上、シグマ−アルドリッチ製、「Ｔｗｅｅｎ」はクローダインターナショナルの登録商標）、などを用いることができる。シリコーン系非イオン性界面活性剤としては、ＡＢＩＬ  ＥＭ９０（セチルジメチコンコポリオール（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ１０−１ジメチコン））、ＡＢＩＬ  ＥＭ１２０（ビス−（グリセリル／ラウリル）グリセリルラウリルジメチコン）、ＡＢＩＬ  ＥＭ１８０（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ１０−１ジメチコン）、ＡＢＩＬ  ＷＥ０９（イソステアリン酸ポリグリセリル−４、セチルジメチコンコポリオール、ラウリン酸ヘキシル）（以上、エボニック製、「ＡＢＩＬ」はエボニックの登録商標）、などを用いることができる。フッ素系樹脂としては、Ｋｒｙｔｏｘ−ＡＳ（「Ｋｒｙｔｏｘ」はケマーズの登録商標）などを用いることができる。ホスホコリン含有樹脂としては、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−Ｓ（日油製、「Ｌｉｐｉｄｕｒｅ」は日油の登録商標）などを用いることができる。
【００５３】
エマルジョンにおける界面活性剤の濃度は、特に限定はされないが、０．０１質量％以上１０質量％以下とすることが好ましく、０．１質量％以上８質量％以下とすることがより好ましく、１質量％以上４質量％以下とすることがさらに好ましい。
【００５４】
エマルジョンにおける、反応液（分散相）に対する非相溶液体（連続相）の体積比は特に限定はされないが、１以上３００以下であることが好ましく、１以上１５０以下であることがより好ましい。
【００５５】
エマルジョン中の液滴のサイズは特に限定はされないが、直径で、１μｍ以上３００μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以上２００μｍ以下であることがより好ましく、２０μｍ以上１５０μｍ以下であることがさらに好ましい。液滴の直径を３００μｍ以下とすることで、臨床検査などのように、検体量やサンプル量が数十〜数百μＬ程度と少ない場合であっても、液滴の数（反応場の数）を多くすることができ、分析の精度が高めることができる。また、液滴の直径を３００μｍ以下とすることで、エマルジョンの安定性を高めることができる。
【００５６】
エマルジョン中の液滴のサイズの分布は、多分散であることが好ましい。なお、本明細書において、多分散とは、単分散ではないこと、すなわち、液滴のサイズが均一でなく、ばらついていることをいう。エマルジョン中の液滴のサイズの分布は、単分散に近い分布（例えば、液滴直径の変動係数（ＣＶ）が数％以下）であってもよく、複数のサイズの液滴が混合されていてもよい。機械的乳化法や膜乳化法により生成したエマルジョン中の液滴のサイズの分布は、一般に、液滴直径の変動係数（ＣＶ）が１０〜２０％程度、あるいはそれ以上の分布を有する場合が多い。特に、エマルジョンの形成を高速に行った場合は、エマルジョン中の液滴のサイズは多分散になりやすい。本実施形態によれば、液滴のサイズにばらつきがある場合であっても、信頼度の高い定量分析を行うことができる。
【００５７】
エマルジョン中の液滴の数は、１００個以上１，０００，０００，０００個以下であることが好ましく、１００個以上２０，０００，０００個以下であることがより好ましく、２，０００個以上２０，０００，０００個以下であることがより好ましい。後述する通り、本発明者らによる試算では、デジタル分析において分析結果の信頼度を確保するためには、少なくとも１００個以上の液滴が分析対象物を含むと判定されることが好ましいため、液滴の数は１００個以上であることが好ましい。例えば、臨床検査の場合、反応液の量は一般に、０．０１ｍＬ〜０．５ｍＬ程度で設定される場合が多く、液滴のサイズが１０μｍ〜２００μｍ程度である場合は、液滴の数としておよそ２，０００個〜１，０００，０００，０００個の間で設定されることになる。
【００５８】
（容器）
容器１０３は、反応場生成部１０２で生成された複数の反応場を保持する容器である。反応場生成部１０２がエマルジョン生成部である場合は、容器１０３は、エマルジョン生成部によって生成されたエマルジョンを収容する容器である。また、反応場生成部１０２が、基板上に複数の微小なウエルが形成されたガラスや樹脂の基板を用い、それぞれのウエルに反応液を分注することで複数の反応場を生成する場合には、ウエルが形成された基板が容器１０３となる。
【００５９】
容器１０３は複数の反応場を保持した状態で、搬送ユニット（不図示）によって反応場生成ユニットＵ１から反応ユニットＵ２へ、そして検出ユニットＵ３へと搬送される。なお、搬送ユニット（不図示）によって容器１０３をユニット間で搬送する場合について説明するが、これに限定はされず、分析システム１の操作者が容器１０３を搬送してもよい。
【００６０】
容器１０３は、サンプル注入部１０１および反応場生成部１０２の一部または全部とともに、反応場生成ユニットＵ１から着脱可能に構成されていることが好ましい。すなわち、反応場生成ユニットＵ１は、サンプル注入部１０１、反応場生成部１０２、容器１０３の各機能を備えたカートリッジが、反応場生成ユニットＵ１の本体から着脱可能な構成であることが好ましい。このような構成とすることで、サンプル間でのコンタミを防ぐことができる。なお、当該カートリッジは、後述する反応制御器２０１を備えていてもよい。
【００６１】
＜反応ユニット＞
反応ユニットＵ２は、反応制御器２０１を有し、反応場生成ユニットＵ１が生成した複数の反応場のそれぞれにおいて反応を進行させるユニットである。この反応により、複数の反応場のそれぞれに含まれている分析対象物を検出可能にすることができる。
【００６２】
（反応）
分析対象物が核酸である場合は、上述の通り、ＰＣＲ法に代表されるような、酵素を用いた核酸増幅反応を用いて核酸を増幅することで、分析対象物を検出可能にすることがでる。核酸増幅反応としては、上述の通り、ＰＣＲ法やＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法などを好ましく用いることができる。これらの核酸増幅反応を行う場合には、反応場をサーマルサイクルに供したり、一定の温度に維持したり、所定のプロファイルで温度を与えたりするなど、反応場の温度を調節することで反応を制御することが好ましい。あるいは、所定の形状のマイクロ流路を有するマイクロ流路デバイスのマイクロ流路中に反応場を流すことで、反応を制御する方法も知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１０４６（１９９８））。
【００６３】
分析対象物がペプチドやタンパク質である場合は、上述の通り、ＥＬＩＳＡ法のような、酵素反応と抗原抗体反応とを組み合わせた分子生物学的手法によって、分析対象物を検出可能にすることができる。この場合は、反応場の温度を所定の温度に維持するように、反応場の温度を調節することが好ましい。
【００６４】
（反応制御器）
反応制御器２０１は、容器１０３中の複数の反応場のそれぞれにおける反応を制御する。反応制御器２０１は、容器１０３中の複数の反応場のそれぞれにおいて反応を進行させる反応部ということもできる。反応制御器２０１が複数の反応場のそれぞれにおける反応を制御する方法は特に限定はされず、例えば、反応場の温度を制御することで反応を制御してもよいし、マイクロ流路中における反応場の位置や速度を制御することで反応場を制御してもよい。すなわち、反応制御器２０１は、加熱器や冷却器などの温度調節器を有していてもよいし、マイクロ流路に接続されるポンプを有していてもよい。
【００６５】
また、反応制御器２０１は、反応場における反応の種類に応じて、複数の反応場のそれぞれに熱、磁場、電場、電流、光、および放射線からなる群から選択される少なくとも１つを付与するものであってもよい。なお、反応ユニットＵ２としては、市販のサーマルサイクラーを用いることもできる。
【００６６】
＜検出ユニット＞
検出ユニットＵ３は、複数の反応場のそれぞれのサイズの検出と、複数の反応場のそれぞれについて分析対象物の検出と、を行うユニットである。検出ユニットＵ３は、複数の反応場のそれぞれにおける分析対象物の存在に関する情報を取得する分析対象物情報取得部３０１と、複数の反応場のそれぞれのサイズに関する情報を取得するサイズ情報取得部３０２と、を有する。
【００６７】
なお、検出ユニットＵ３による検出は、容器１０３に保持された複数の反応場のうち、一部の反応場を取り出して実施してもよいが、計測可能なすべての反応場について実施することが好ましい。これにより、検出を行う反応場の数を増やすことができ、分析結果の信頼度を向上させることができる。
【００６８】
（分析対象物情報取得部）
分析対象物情報取得部３０１は、複数の反応場のそれぞれについて分析対象物の検出を行う部分である。分析対象物情報取得部３０１は、反応ユニットＵ２において反応が進行した複数の反応場のそれぞれについて、分析対象物に由来するシグナルの検出を行う。分析対象物情報取得部３０１は、分析対象物に由来するシグナルの検出を行い、複数の反応場のそれぞれについて、分析対象物が含まれていたか否かを判定する。これにより、分析対象物情報取得部３０１は複数の反応場のそれぞれにおける分析対象物の存在に関する情報（分析対象物情報）を取得する。シグナルとしては、光が好適に用いられる。
【００６９】
本明細書においては、分析対象物情報取得部３０１によってシグナルが検出された反応場、すなわち、分析対象物が含まれていた反応場を「陽性反応場」と称する。また、分析対象物情報取得部３０１によってシグナルが検出されなかった反応場、すなわち、分析対象物が含まれていなかった反応場を「陰性反応場」と称する。なお、本明細書においては、分析対象物情報取得部３０１によって検出されたシグナルの強度が、予め設定された閾値よりも弱い場合にはシグナルは検出されなかったものとみなす。すなわち、反応場に分析対象物が含まれていたか否かは、その反応場からのシグナルの強度を所定の閾値と比較することで行う。
【００７０】
例えば、分析対象物が核酸であり、分析対象物を検出可能にするための薬剤として増幅試薬および蛍光試薬を用いた場合は、分析対象物情報取得部３０１は、分析対象物に由来するシグナルとして、所定の波長の蛍光を検出することが好ましい。
【００７１】
分析対象物情報取得部３０１が蛍光などの光をシグナルとして検出する場合、分析対象物情報取得部３０１は、光源３０３ａと、検出器３０４ａと、制御部（不図示）と、で構成することができる。光源３０３ａは、検出したいシグナルに応じた波長の光を、容器１０３に保持された複数の反応場のそれぞれに照射する。検出器３０４ａは、光が照射された複数の反応場のそれぞれから発せられたシグナルを検出する。すなわち、光源３０３ａは励起手段として機能し、検出器３０４ａは光検出手段として機能する。
【００７２】
検出器３０４ａとしては、フォトダイオードやラインセンサ、イメージセンサ（撮像素子）等を用いることができ、中でも、多数の反応場について一括してシグナルの検出ができる点で、イメージセンサを用いることが好ましい。イメージセンサとしては、ＣＣＤ（電荷結合素子、Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）やＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｅｎｓｏｒ）を用いることができる。あるいは、検出器３０４ａとしては、イメージセンサを備えたデジタルカメラを用いてもよい。また、検出器３０４ａによって光を検出する場合は、光学フィルターを用いて反応場からの光の波長を調整してもよい。
【００７３】
分析対象物情報取得部３０１は、流路中を流れる複数の反応場について順次検出を行うフローサイトメーターであってもよい。あるいは、分析対象物情報取得部３０１は、複数の反応場について、二次元的に励起および検出を行うものであってもよい。すなわち、平面状に並べた複数の反応場に対して二次元的に光を照射して励起させ、反応場から発せられたシグナルをイメージセンサを用いて二次元的に検出する構成であってもよい。この構成は、多数の反応場についてスループットよくシグナルの検出を行うことができるため好ましい。
【００７４】
なお、分析対象物情報取得部３０１の有する光源３０３ａは、互いに異なる複数の波長の光を反応場に照射する光源であってもよい。例えば、光源３０３ａは、波長可変光源であってもよいし、波長が互いに異なる光をそれぞれ発する光源を複数有していてもよい。これにより、発生させる蛍光の波長が異なるなど、複数の分析対象物を区別できるようにそれぞれ検出可能にする複数種類の薬剤を用いることで、複数種類の分析対象物を一度の分析でまとめて検出することができる。
【００７５】
（サイズ情報取得部）
サイズ情報取得部３０２は、複数の反応場のそれぞれのサイズの検出を行う部分である。サイズ情報取得部３０２は、反応ユニットＵ２において反応が進行した複数の反応場のそれぞれについて、複数の反応場のそれぞれのサイズの検出を行う。
【００７６】
サイズ情報取得部３０２は、検出器３０４ｂと、制御部（不図示）と、で構成することができる。検出器３０４ｂは、反応場からの光を検出する。検出器３０４ｂとしては、検出器３０４ａと同様の検出器を用いることができる。また、検出器３０４ａが検出器３０４ｂの機能を兼ね備えてもよい。サイズ検出部３０２は、光源３０３ｂをさらに有していてもよい。光源３０３ｂは、光源３０３ａと波長の異なる光を発する光源であることが好ましい。なお、光源３０３ｂが波長可変光源である場合は、光源３０３ｂが光源３０３ａの機能を兼ね備えてもよい。
【００７７】
サイズ情報取得部３０２は、反応場からの散乱光を検出して、反応場のサイズの検出を行うことが好ましい。また、サイズ情報取得部３０２が有する検出器３０４ｂとしては、多数の反応場を一括して検出できる点で、イメージセンサを用いることが好ましい。
【００７８】
サイズ情報取得部３０２は、視野内に多数の反応場が含まれる反応場の画像を取得し、制御部（不図示）によってその画像データから反応場のサイズを取得することが特に好ましい。この場合は、例えば、一般に使用されている画像解析ソフトウエアを用いて、取得した画像データを解析して、それぞれの反応場のサイズに関する情報を取得することができる。例えば、反応場が液滴の場合で、該液滴の形状が真球とみなせる場合は、前記画像より液滴の半径、直径、断面積、および体積からなる少なくとも１つの情報を取得することができる。
【００７９】
＜情報処理ユニット＞
情報処理ユニットＵ４は、検出ユニットＵ３の検出結果（反応場のそれぞれのサイズに関する情報および反応場のそれぞれにおける分析対象物の存在に関する情報）に基づいて、サンプル中の分析対象物の数または濃度を導出するユニットである。
【００８０】
図２は、情報処理ユニットＵ４のハードウエア構成図である。情報処理ユニットＵ４は、ハードウエア的には、ＣＰＵ４５１と、ＲＯＭ４５２と、ＲＡＭ４５３と、ストレージ４５４と、入出力Ｉ／Ｆ４５５と、通信Ｉ／Ｆ４５６と、画像出力Ｉ／Ｆ４５７と、を有する。
【００８１】
ＣＰＵ４５１は、ＲＯＭ４５２に記憶されているプログラムまたはＲＡＭ４５３にロードされたプログラムを実行し、情報処理ユニットＵ４が有する各部の制御を行う。ＲＯＭ４５２は、不揮発性のメモリであり、情報処理ユニットＵ４の初期動作において必要なプログラムなどを記憶する。ＲＡＭ４５３は、揮発性のメモリであり、ＲＯＭ４５２またはストレージ４５４、あるいは外部記憶装置（不図示）に格納されているプログラムの読み出しに用いられる。また、ＲＡＭ４５３は、これらのプログラムを実行するときに、ＣＰＵ４５１の作業領域としても利用される。
【００８２】
ストレージ４５４には、オペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラムなど、ＣＰＵ４５１に実行させるための種々のプログラムおよびプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。また、ストレージ４５４には、検出ユニットＵ３から与えられた測定データを解析し、分析結果を出力するためのプログラムがインストールされている。
【００８３】
ストレージ４５４のような記憶媒体に格納されたプログラムをＲＡＭ４５３にロードし、ＲＡＭ４５３にロードされたプログラムに従ってＣＰＵ４５１が動作することにより、図１に示す各部の機能、および後述する図３に示す各処理が実行される。
【００８４】
入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）４５５には、マウスやキーボード、タッチパネルなどで構成された入力部４０７が接続されており、ユーザが入力部４０７を使用することにより、情報処理ユニットＵ４にデータが入力される。画像出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）４５７は、液晶パネル等で構成された表示部４０８に接続されており、画像データに応じた映像信号を、表示部４０８に出力する。表示部４０８は、入力された映像信号をもとに、画像を表示する。また、情報処理ユニットＵ４は、通信インターフェース（Ｉ／Ｆ）４５６を介して反応場生成ユニットＵ１、反応ユニットＵ２、検出ユニット、搬送ユニット（不図示）の各ユニットに接続されている。情報処理ユニットＵ４は、通信インターフェース４５６により、上述の各ユニットに対してデータの送受信が可能となる。
【００８５】
情報処理ユニットＵ４は、その機能として、図１に示すように、記憶部４０１と、制御部４０２と、分布データ生成部４０３と、テーブル生成部４０４と、濃度導出部４０６と、を有する。
【００８６】
制御部４０２は、反応場生成ユニットＵ１、反応ユニットＵ２、検出ユニットＵ３、搬送ユニット（不図示）の各部の動作を制御する部分である。
【００８７】
（記憶部）
記憶部４０１は、検出ユニットＵ３または入力部４０７から受信したデータや情報処理ユニットＵ４による各種処理によって生成されたデータを記憶する部分である。本実施形態では、記憶部４０１は、陽性反応場の数に関する情報、および、陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報と、分析対象物の数に関する情報と、が対応付けられたテーブルを記憶する。なお、ここでいう「数に関する情報」は、例えば、数そのものや、割合を含む。また、以下の説明においては、「陽性反応場の数に関する情報、および、陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報」を「ネガポジ情報」と称することもある。また、検出ユニットＵ３等から取得されるネガポジ情報を含むデータを「検出データ」と称することもある。
【００８８】
記憶部４０１が記憶するテーブルは、上述のように、分析対象物情報取得部３０１で取得されるネガポジ情報と、分析対象物の数または濃度と、が対応付けられたテーブルであり、検量線情報と言うこともできる。ここでいう分析対象物の数または濃度は、サンプル中の分析対象物の数または濃度であってもよいし、反応液中の分析対象物の数または濃度であってもよいし、複数の反応場の少なくとも一部中の分析対象物の数または濃度であってもよい。
【００８９】
記憶部４０１が記憶するテーブルは、複数の反応場のそれぞれのサイズに関する情報に基づいて理論的に生成されたテーブルであってもよいし、分析対象物の濃度が既知の標準試料を用いて実験的に取得されたテーブルであってもよい。記憶部４０１が記憶するテーブルは、複数の反応場のそれぞれのサイズに関する情報に基づいて理論的に生成されたテーブルであることが好ましい。このようなテーブルは標準試料を用意することなく取得することができ、かつ、反応場のサイズの分布を反映することができるため好ましい。
【００９０】
記憶部４０１が記憶するテーブルは、後述するテーブル生成部４０４で生成されたテーブルであってもよいし、分析システム１以外の装置で生成されたものであってもよい。テーブルが分析システム１以外の装置で生成された場合は、情報処理ユニットＵ４は、通信Ｉ／Ｆ４５６等を介してテーブルを取得して、記憶部４０１に記憶することができる。
【００９１】
（分布データ生成部）
分布データ生成部４０３は、反応場のそれぞれのサイズに関する情報を検出ユニットＵ３から取得し、分布データを生成する。より具体的には、分布データ生成部４０３は、反応場のサイズの分布を複数の区間（階級）に分け、区間ごとの反応場の個数の情報を含む分布データ（サイズ分布データ）を生成する。
【００９２】
例えば、複数の反応場のそれぞれの形状がほぼ球形である場合において、反応場のサイズが球相当径で最小１０μｍ、最大２１０μｍであったとする。この場合、分布データ生成部４０３は、例えば、反応場のサイズの分布を２０μｍ刻みで１０個の区間に分ける。そして、各区間に含まれるサイズを有する複数の反応場について、その個数を集計する。なお、分布データ生成部４０３が分布データを生成する際の区間の数や区間の幅については特に限定はされず、サイズ情報取得部３０２の分解能に応じて決定してもよいし、統計処理における一般的な方法によって決定してもよい。
【００９３】
（テーブル生成部）
テーブル生成部４０４は、濃度導出部４０６における分析対象物の数または濃度の導出に用いるテーブルを、サイズ情報取得部３０２で取得されたサイズに関する情報に基づいて生成する。テーブル生成部４０４によって生成されたテーブルは、記憶部４０１によって記憶され、濃度導出部４０６における分析対象物の数または濃度の導出の際に用いられる。
【００９４】
テーブル生成部４０４は、サイズ情報取得部３０２で取得されたサイズに関する情報をもとに、分析対象物の数を仮定してポアソンモデルに基づいてシミュレーションすることによってテーブルを生成することが好ましい。テーブル生成部４０４がテーブルを生成する具体的な方法は、例えば下記の（１）〜（６）の工程を含む。
（１）分布データ生成部４０３から分布データを取得する。
（２）分布データの取得の際に検出対象とされた複数の反応場について、当該複数の反応場を生成する前に、当該複数の反応場に相当する液体中に含まれていた分析対象物の数（設定値１）を仮定する。
（３）分布データ中の複数の区間のそれぞれに、仮定した分析対象物を振り分ける。ここでは、全反応場の総体積に対する、それぞれの区間に含まれる反応場の総体積の割合に比例して、それぞれの区間に分析対象物が割り振られるものとする。
（４）分布データ中の複数の区間のそれぞれにおいて、分析対象物が含まれる反応場の数と含まれない反応場の数を、ポアソンモデルに基づいて確率論的に計算する。分析対象物が含まれる反応場の数を陽性反応場の数、分析対象物が含まれない反応場の数を陰性反応場の数とする。例えば、複数の区間のそれぞれにおいて、分析対象物が１つも含まれない反応場の割合をポアソンモデルに基づいて計算し、それに基づいて陰性反応場および陽性反応場の数を算出してもよい。
（５）区間ごとに計算された陽性反応場の数および陰性反応場の数をそれぞれ合計し、全反応場中の陽性反応場の数および陰性反応場の数を算出する。これにより、陽性反応場の数および陰性反応場の数と、分析対象物の数（設定値１）とを対応付ける。このとき、陽性反応場の割合、陰性反応場の割合を算出して、分析対象物の数（設定値１）と対応付けてもよい。
（６）（２）〜（５）の処理を設定値を変えつつ行い、ｎ個の設定値（設定値１〜ｎ）のそれぞれに、陽性反応場の数に関する情報、および、陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報を対応付ける。これにより、ネガポジ情報と、分析対象物の数または濃度と、が対応付けられたテーブルを生成する。
【００９５】
テーブル生成部４０４がテーブルを生成するタイミングは特に限定はされず、例えば、分析システム１による分析の度に毎回行ってもよいし、複数回に１回行ってもよいし、分析システム１のユーザの操作に応じて行ってもよい。あるいは、分析システム１を定期的にメンテナンスする際に行ってもよいし、分析システム１を出荷または設置する際に行ってもよい。
【００９６】
（濃度導出部）
濃度導出部４０６は、陽性反応場の数に関する情報、および、陰性反応場の数に関する情報、からなる群から選択される少なくとも１つの情報と、記憶部４０１に記憶されたテーブルと、に基づいて、サンプル中の分析対象物の数または濃度を導出する。以下では、濃度導出部４０６がサンプル中の分析対象物の濃度を導出する場合について説明するが、濃度導出部４０６がサンプル中の分析対象物の数を導出する場合についても同様である。
【００９７】
より具体的には、濃度導出部４０６は、記憶部４０１に記憶された濃度の導出に用いるテーブルを参照し、分析対象物情報取得部３０１で取得されたネガポジ情報に対応する、分析対象物の数を取得する。そして、濃度導出部４０６は、得られた分析対象物の数を分析対象物情報取得部３０１が検出対象とした反応場の総体積で除することで、反応液中の分析対象物の濃度を算出する。さらに、濃度導出部４０６は、反応液中の分析対象物の濃度に希釈倍率を掛けることで、サンプル中の分析対象物の濃度を算出する。あるいは導出部４０６は、記憶部４０１に記憶されたテーブルを参照し、分析対象物情報取得部３０１で取得されたネガポジ情報に対応する、反応液中またはサンプル中の分析対象物の濃度を直接取得してもよい。
【００９８】
濃度導出部４０６は、陽性反応場の割合および陰性反応場の割合の少なくとも一方の情報と、記憶部４０１に記憶されたテーブルと、に基づいて、サンプル中の分析対象物の濃度を導出することが好ましい。このように割合の情報を用いることで、テーブルを生成したときの複数の反応場のサイズの分布と、分析対象物情報取得部３０１が検出対象とした複数の反応場のサイズの分布が完全に一致していない場合であっても、濃度の導出を適切に行うことができる。
【００９９】
なお、上述の通り、テーブル生成部４０４によって生成されるテーブルが有するネガポジ情報は、離散的となる。本実施形態において記憶部４０１に記憶されたテーブルが有するネガポジ情報は離散的であっても連続的であってもよいが、実際にはテーブルが有するネガポジ情報は離散的であることが多い。テーブルが有するネガポジ情報が離散的である場合には、分析対象物情報取得部３０１で取得されたネガポジ情報と一致するデータがテーブルに含まれない場合もある。そのような場合には、濃度導出部４０６は、記憶部４０１に記憶されたテーブルの有する離散的なネガポジ情報を補完して、サンプル中の分析対象物の数または濃度を導出することが好ましい。補完の方法は特に限定はされず、分析対象物情報取得部３０１で取得されたネガポジ情報に最も近いテーブル中の２つのネガポジ情報に基づいて、２点間を直線または曲線で近似することで補完してもよい。あるいは、分析対象物情報取得部３０１で取得されたネガポジ情報に最も近いテーブル中のネガポジ情報に基づいて、濃度の導出を行ってもよい。
【０１００】
［分析システムの動作］
次に、本実施形態に係る分析システム１を用いた分析方法について、図３を用いて説明する。図３は、第１の実施形態に係る分析システムによる分析処理の手順を示すフローチャートである。
【０１０１】
Ｓ３０１にて、分析対象物の定量分析を行うサンプルが準備される。ここでは、検体を希釈、前処理するなどして、サンプルを準備する。なお、サンプルの準備は、分析システム１内で行ってもよいし、分析システム１外の装置、例えば、市販の検体前処理装置を用いて行ってもよい。
【０１０２】
Ｓ３０２にて、反応場生成ユニットＵ１は、サンプルを含む反応液を分割して、互いに独立した、複数の反応場を生成する。
【０１０３】
Ｓ３０３にて、反応ユニットＵ２は、複数の反応場のそれぞれにおいて反応を進行させ、分析対象物を検出可能にする。
【０１０４】
Ｓ３０４にて、情報処理ユニットＵ４は、テーブルを生成するか否かの判別を行う。テーブルを生成する場合（Ｓ３０４でＹｅｓ）にはＳ３０５の処理を行い、テーブルを生成しない場合（Ｓ３０４でＮｏ）にはＳ３０９まで処理をスキップする。なお、情報処理ユニットＵ４がテーブル生成部４０４を有していない場合などには、Ｓ３０４をスキップし、Ｓ３０９に進んでもよい。
【０１０５】
Ｓ３０５にて、検出ユニットＵ３は、複数の反応場のそれぞれを観察して、複数の反応場のそれぞれのサイズの検出を行う。これにより、複数の反応場のそれぞれのサイズに関する情報を取得する。
【０１０６】
Ｓ３０６にて、情報処理ユニットＵ４は、反応場のそれぞれのサイズに関する情報を検出ユニットＵ３から取得し、反応場のサイズの分布を示す分布データを生成する。
【０１０７】
Ｓ３０７にて、情報処理ユニットＵ４は、生成された分布データに基づいて、テーブルを生成する。本実施形態ではテーブル生成部４０４が、ネガポジ情報と、分析対象物の数または濃度と、が対応付けられたテーブルを分布データに基づいて生成する。情報処理ユニットＵ４がテーブルを生成する方法の詳細については、上述のとおりである。
【０１０８】
Ｓ３０８にて、情報処理ユニットＵ４は、生成されたテーブルを記憶部４０１に記憶させる。
【０１０９】
Ｓ３０９にて、検出ユニットＵ３は、複数の反応場のそれぞれを観察して、分析対象物の検出を行う。これにより、情報処理ユニットＵ４は、ネガポジ情報を取得する。
【０１１０】
Ｓ３１０にて、情報処理ユニットＵ４は、検出ユニットＵ３で取得されたネガポジ情報と、記憶部４０１に記憶されているテーブルと、に基づいて、サンプル中の分析対象物の濃度を導出する。情報処理ユニットＵ４の濃度導出部４０６が濃度を導出する方法の詳細については、上述のとおりである。
【０１１１】
このように本実施形態では、検出ユニットＵ３で取得されたネガポジ情報をもとに、記憶部４０１に記憶されたテーブルを用いて分析対象物の濃度の導出を行う。このとき、テーブルには反応場のサイズ分布の情報が反映されているため、反応場のサイズにばらつきがある場合であっても分析結果の信頼度を高めることができる。また、本実施形態では反応場のサイズ分布の情報が予め反映されたテーブルを用いて濃度の導出を行うため、濃度導出部４０６における濃度の導出の際に、１つ１つの反応場ごとにネガポジ情報とサイズに関する情報とを対応付けて計算処理を行う必要がない。したがって、本実施形態によれば、反応場にばらつきがある場合であっても、従来よりも簡便な方法で、分析結果の信頼度を高めることができる。
【０１１２】
また本実施形態によれば、分析対象物情報取得部３０１で取得された情報と、サイズ情報取得部３０２で取得された情報と、を統合する必要がないため、サイズ分布とネガポジ情報とを切り分けて別々に扱うことができるというメリットもある。
【０１１３】
また本実施形態によれば、反応場を生成するたびに同一または同形状のサイズ分布の反応場が生成されるとみなせる場合には、テーブルの生成を省略して既にあるテーブルを流用することもできる（Ｓ３０４でＮｏ）。これにより、サイズ検出やテーブル生成の工程を省略することができ、分析を迅速化することもできる。一方、本実施形態では反応場のサイズ分布を取得し、そのサイズ分布に基づいてテーブルを生成することもできる。これによれば、分析の対象とした反応場のサイズ分布をテーブルに確実に反映させることができるので、分析結果の信頼度をより高めることができる。
【０１１４】
（第２の実施形態）
次に、本発明の第２の実施形態に係る分析システムについて、図面を参照しながら説明する。なお、第１の実施形態と同様の構成には第１の実施形態と同じ参照符号を付し、詳細な説明を省略する。
【０１１５】
［分析システムの構成］
図４は、本実施形態に係る分析システムの構成を模式的に示す図である。本実施形態に係る分析システム２は、分析システム１と同様に、反応場生成ユニットＵ１と、反応ユニットＵ２と、検出ユニットＵ３と、情報処理ユニットＵ４と、を有する。分析システム２が有する反応場生成ユニットＵ１、反応ユニットＵ２、検出ユニットＵ３の構成については分析システム１と同様である。
【０１１６】
＜情報処理ユニット＞
本実施形態に係る分析システム２が有する情報処理ユニットＵ４は、その機能として、図４に示すように、分析システム１が有する情報処理ユニットＵ４の各部に加えて、テーブル選択部４０５を有する。
【０１１７】
（記憶部）
本実施形態に係る記憶部４０１は、複数のテーブルを記憶する。記憶部４０１が記憶する複数のテーブルのそれぞれは、互いに異なるサイズ分布にそれぞれに対応している。以下、このような複数のテーブルの集合を、ライブラリと称することがある。
【０１１８】
（テーブル選択部）
テーブル選択部４０５は、濃度導出部４０６における濃度の導出に用いるテーブルを、記憶部４０１が記憶している複数のテーブルの中から、分布データ生成部４０３が生成した分布データに基づいて選択する。テーブル選択部４０５によって選択されたテーブルは、濃度導出部４０６における濃度の導出の際に用いられる。
【０１１９】
テーブル選択部４０５は、記憶部４０１が記憶しているライブラリの中に、分布データに応じた適切なテーブルが存在するか否かを判別してもよい。分布データに応じた適切なテーブルが存在しない場合は、その分布データを用いて、テーブル生成部４０４がテーブルを生成してもよい。
【０１２０】
［分析システムの動作］
次に、本実施形態に係る分析システム２を用いた分析方法について、図５を用いて説明する。図５は、第２の実施形態に係る分析システムによる分析処理の手順を示すフローチャートである。
【０１２１】
Ｓ５０１〜Ｓ５０５の各処理は、Ｓ３０１〜Ｓ３０３、Ｓ３０５〜Ｓ３０６の各処理と同様であるため、説明を省略する。
【０１２２】
Ｓ５０６にて、情報処理ユニットＵ４は、記憶部４０１が記憶しているライブラリの中に、分布データ生成部４０３で生成された反応場のサイズの分布を示す分布データに応じた適切なテーブルが存在するか否かの判別を行う。適切なテーブルが存在する場合（Ｓ５０６でＹｅｓ）にはＳ５０９まで処理をスキップし、適切なテーブルが存在しない場合（Ｓ５０６でＮｏ）にはＳ５０７の処理を行う。なお、例えば反応場のサイズの分布が予めある程度予測されており、ライブラリの中に適切なテーブルが存在することが明らかである場合などには、Ｓ５０６をスキップしてもよい。
【０１２３】
Ｓ５０７にて、情報処理ユニットＵ４は、生成された分布データに基づいて、テーブルを生成する。本実施形態ではテーブル生成部４０４が、ネガポジ情報と、分析対象物の数または濃度と、が対応付けられたテーブルを分布データに基づいて生成する。情報処理ユニットＵ４がテーブルを生成する方法の詳細については、上述のとおりである。
【０１２４】
Ｓ５０８にて、情報処理ユニットＵ４は、生成されたテーブルをライブラリに追加して、記憶部４０１に記憶させる。
【０１２５】
Ｓ５０９にて、テーブル選択部４０５は、記憶部４０１が記憶しているライブラリの中から、分布データ生成部４０３で生成された分布データに基づいてテーブルを選択する。
【０１２６】
Ｓ５１０にて、検出ユニットＵ３は、複数の反応場のそれぞれを観察して分析対象物の検出を行う。これにより、複数の反応場のネガポジ情報を取得する。
【０１２７】
Ｓ５１１にて、情報処理ユニットＵ４は、検出ユニットＵ３で取得されたネガポジ情報と、テーブル選択部４０５によって選択されたテーブルと、に基づいて、サンプル中の分析対象物の濃度を導出する。情報処理ユニットＵ４の濃度導出部４０６が濃度を導出する方法の詳細については、第１の実施形態と同様である。
【０１２８】
このように本実施形態では、第１の実施形態と同様に、検出ユニットＵ３で取得されたネガポジ情報をもとに、記憶部４０１に記憶されたテーブルを用いて分析対象物の濃度の導出を行う。このとき、テーブルには反応場のサイズ分布の情報が反映されているため、第１の実施形態と同様に、反応場のサイズにばらつきがある場合であっても、従来よりも簡便な方法で、分析結果の信頼度を高めることができる。
【０１２９】
また本実施形態によれば、一度取得または生成したテーブルをライブラリとして記憶しておくことで、次に同一または同形状のサイズ分布の反応場が生成されたときに、そのテーブルをライブラリの中から選択して流用することができる。これにより、サイズ検出やテーブル生成の工程を省略することができ、分析をさらに迅速化することもできる。
【０１３０】
（第３の実施形態）
次に、本発明の第３の実施形態に係る分析システムについて、図面を参照しながら説明する。なお、上述の各実施形態と同様の部分については説明を省略する。
【０１３１】
［分析システムの構成］
図６は、本実施形態に係る分析システムの構成を模式的に示す図である。本実施形態に係る分析システム３は、分析システム１〜２と同様に、反応場生成ユニットＵ１と、反応ユニットＵ２と、検出ユニットＵ３と、情報処理ユニットＵ４と、を有する。分析システム３が有する反応場生成ユニットＵ１、反応ユニットＵ２、検出ユニットＵ３の構成については分析システム１〜２と同様である。
【０１３２】
＜情報処理ユニット＞
本実施形態に係る分析システム３が有する情報処理ユニットＵ４は、その機能として、図６に示すように、分析システム１が有する情報処理ユニットＵ４の各部に加えて、補正部４０９を有する。
【０１３３】
（記憶部）
本実施形態に係る記憶部４０１は、反応場のサイズ分布を単分散とみなして導出される分析対象物の数または濃度を補正するためのテーブルを記憶する。当該テーブルは、反応場のサイズ分布を単分散とみなして導出される分析対象物の数または濃度に関する情報と、反応場の有するサイズ分布を反映して導出される分析対象物の数または濃度に関する情報と、が対応付けられたテーブルであることが好ましい。また、当該テーブルは、反応場のサイズ分布を単分散とみなして導出される分析対象物の数または濃度に関する情報と、反応場の有するサイズ分布を反映して導出される分析対象物の数または濃度に関する情報と、の間のズレに関する情報を含んでいてもよい。
【０１３４】
記憶部４０１が記憶するテーブルは、複数の反応場のそれぞれのサイズに関する情報に基づいて理論的に生成されたテーブルであってもよいし、分析対象物の濃度が既知の標準試料を用いて実験的に取得されたテーブルであってもよい。記憶部４０１が記憶するテーブルは、複数の反応場のそれぞれのサイズに関する情報に基づいて理論的に生成されたテーブルであることが好ましい。このようなテーブルは標準試料を用意することなく取得することができ、かつ、反応場のサイズの分布を反映することができるため好ましい。
【０１３５】
（テーブル生成部）
本実施形態に係るテーブル生成部４０４は、補正部４０９における濃度の補正に用いるテーブルを、サイズ情報取得部３０２で取得されたサイズに関する情報に基づいて生成する。テーブル生成部４０４によって生成されたテーブルは、記憶部４０１によって記憶され、補正部４０９における濃度の補正の際に用いられる。
【０１３６】
テーブル生成部４０４は、サイズ情報取得部３０２で取得されたサイズに関する情報をもとに、分析対象物の数を仮定してポアソンモデルに基づいてシミュレーションすることによってテーブルを生成することが好ましい。テーブル生成部４０４がテーブルを生成する具体的な方法は、例えば下記の（１）〜（６）の工程を含む。
（１）分布データ生成部４０３から分布データを取得する。
（２）分布データの取得の際に検出対象とされた複数の反応場について、当該複数の反応場を生成する前に、当該複数の反応場に相当する液体中に含まれていた分析対象物の数または濃度（設定値１）を仮定する。
（３）分布データ中の複数の区間のそれぞれに、仮定した分析対象物を振り分ける。ここでは、全反応場の総体積に対する、それぞれの区間に含まれる反応場の総体積の割合に比例して、それぞれの区間に分析対象物が割り振られるものとする。
（４）分布データ中の複数の区間のそれぞれにおいて、分析対象物が含まれる反応場の数と含まれない反応場の数を、ポアソンモデルに基づいて確率論的に計算する。分析対象物が含まれる反応場の数を陽性反応場の数、分析対象物が含まれない反応場の数を陰性反応場の数とする。例えば、複数の区間のそれぞれにおいて、分析対象物が１つも含まれない反応場の割合をポアソンモデルに基づいて計算し、それに基づいて陰性反応場および陽性反応場の数を算出してもよい。
（５）区間ごとに計算された陽性反応場の数および陰性反応場の数をそれぞれ合計し、全反応場中の陽性反応場の数および陰性反応場の数を算出する。
（６）得られた陽性反応場の数および陰性反応場の数の少なくとも一方の情報を用いて、反応場のサイズ分布が単分散であるとみなして、複数の反応場を生成する前に、当該複数の反応場に相当する液体中に含まれていた分析対象物の数または濃度を逆算する。これにより、分析対象物の数または濃度（設定値１）と、分析対象物の数または濃度と反応場のサイズ分布とに基づいて確率論的に推定されるネガポジ情報から反応場のサイズ分布を単分散とみなして導出される分析対象物の数または濃度と、を対応付ける。換言すれば、これにより、反応場のサイズ分布を単分散とみなして導出される分析対象物の数または濃度と、反応場の有するサイズ分布を反映して導出される分析対象物の数または濃度（設定値１）とを対応付ける。
【０１３７】
ここで、分析対象物の数または濃度の計算は、従来行われているデジタル分析における濃度計算方法を採用して実施することができる。
【０１３８】
まず、反応ユニットＵ２における反応の前に、それぞれの反応場が含む分析対象物が１個または０個のいずれかであるとみなせる場合について説明する。この場合は、陽性反応場の数ｘを、検出ユニットＵ３が分析対象物の検出の対象とした体積Ｖｓの反応液中に含まれていた分析対象物の数とみなすことができる。よって、下記式（１）により、反応液中の分析対象物の濃度λｒを計算することができる。なお、検出ユニットＵ３が分析対象物の検出の対象とした体積Ｖｓは、検出ユニットＵ３から取得される反応場のサイズに関する情報に基づいて算出することができる。
λｒ＝ｘ／Ｖｓ・・・式（１）
【０１３９】
また、例えば、反応ユニットＵ２における反応の前に、１つの反応場に複数個の分析対象物が入り得るとみなせる場合は、ポアソンモデルによる補正を行うことで、分析対象物の濃度を計算することができる。この場合は、反応ユニットＵ２における反応の前にそれぞれの反応場に含まれていた分析対象物の平均個数Ｃを推定することにより、分析対象物の濃度算出を行う。具体的には、検出ユニットＵ３が分析対象物の検出の対象とした反応場について、１つの反応場に含まれる分析対象物の平均個数をＣとすると、１つの反応場にｎ個の分析対象物が含まれる確率は、ポアソンモデルの式から、下記式（２）のように表される。
【０１４０】
【数１】
2019024366.tif 000003
【０１４１】
ここで、１つの反応場が分析対象物を１つも含まない確率は、式（２）においてｎ＝０として、下記式（３）で表される。
Ｐ（０，Ｃ）＝ｅ−Ｃ・・・式（３）
【０１４２】
反応ユニットＵ２における反応の前に１つの反応場中に少なくとも１つの分析対象物が含まれていれば、その反応場からはシグナルを検出することができるが、反応の前にその反応場に含まれていた分析対象物の数の情報までは分からない。そこで、検出ユニットＵ３が検出対象とした反応場の総数に対する陰性反応場の割合に基づいて、式（３）を用いて、検出対象とした反応液中に含まれていた分析対象物の個数を推定する。
【０１４３】
具体的には、陽性反応場の個数または陰性反応場の個数と、検出対象とした反応場の総数とから、シグナルが検出されなかった反応場の割合Ｆ０を算出する。そして、下記式（４）から、検出対象とした反応場に、反応ユニットＵ２における反応の前に１つの反応場に含まれていた分析対象物の平均個数Ｃを推定する。
Ｃ＝−ｌｎ（Ｆ０）・・・式（４）
【０１４４】
ここで、検出ユニットＵ３が分析対象物の検出対象とした反応場の平均体積をｖとすると、下記式（５）により、反応液中の分析対象物の濃度λｒを計算することができる。なお、検出ユニットＵ３が分析対象物の検出の対象とした平均体積ｖは、検出ユニットＵ３から取得される反応場のサイズに関する情報に基づいて算出することができる。
λｒ＝Ｃ／ｖ・・・式（５）
【０１４５】
なお、反応液中の分析対象物の濃度λｒは、分析対象物の平均個数Ｃと反応場の数を乗じて得られる分析対象物の総数と、反応場の平均体積ｖと反応場の数を乗じて得られる反応場の総体積と、に基づいて算出してもよい。
【０１４６】
このようにして得られた、反応液中の分析対象物の濃度は、検体またはサンプルから反応液を調整した際の希釈倍率を用いることによって、検体またはサンプル中の分析対象物の濃度に換算することができる。
【０１４７】
（７）（２）〜（６）の処理を設定値を変えつつ行う。これにより、ｎ個の設定値（設定値１〜ｎ）のそれぞれに、反応場のサイズ分布およびポアソンモデルに基づいて得られるネガポジ情報から、反応場のサイズ分布を単分散とみなして逆算して得られる分析対象物の数または濃度を対応付ける。これにより、反応場のサイズ分布を単分散とみなして導出される分析対象物の数または濃度に関する情報と、反応場の有するサイズの分布を反映して導出される分析対象物の数または濃度に関する情報と、が対応付けられたテーブルを生成する。
【０１４８】
テーブル生成部４０４がテーブルを生成するタイミングは特に限定はされず、例えば、分析システム１による分析の度に毎回行ってもよいし、複数回に１回行ってもよいし、分析システム１のユーザの操作に応じて行ってもよい。あるいは、分析システム１を定期的にメンテナンスする際に行ってもよいし、分析システム１を出荷または設置する際に行ってもよい。
【０１４９】
（濃度導出部）
本実施形態に係る濃度導出部４０６は、分析対象物情報取得部３０１で取得されたネガポジ情報に基づいて、反応場のサイズの分布を単分散とみなして、サンプル中の分析対象物の数または濃度を導出する。
【０１５０】
（補正部）
補正部４０９は、濃度導出部４０６によって導出されたサンプル中の分析対象物の数または濃度を、記憶部４０１に記憶されたテーブルによって補正する。
【０１５１】
［分析システムの動作］
次に、本実施形態に係る分析システム３を用いた分析方法について、図３および図７を用いて説明する。図７は、第３および第４の実施形態に係る分析システムによる分析処理の手順の一部を示すフローチャートである。
【０１５２】
Ｓ３０１〜Ｓ３０６の各処理は、第１の実施形態と同様である。
【０１５３】
Ｓ３０７にて、情報処理ユニットＵ４は、生成された分布データに基づいて、テーブルを生成する。本実施形態ではテーブル生成部４０４が、反応場のサイズ分布を単分散とみなして導出される分析対象物の数または濃度を補正するためのテーブルを、分布データに基づいて生成する。情報処理ユニットＵ４がテーブルを生成する方法の詳細については、上述のとおりである。
【０１５４】
Ｓ３０８〜Ｓ３０９の各処理は、第１の実施形態と同様である。
【０１５５】
Ｓ３１０にて、情報処理ユニットＵ４は、検出ユニットＵ３で取得されたネガポジ情報と、記憶部４０１に記憶されているテーブルと、に基づいて、サンプル中の分析対象物の濃度を導出する。ここで、本実施形態では、図７に示される手順で濃度の導出を行う。
【０１５６】
Ｓ７０１にて、情報処理ユニットＵ４は、検出ユニットＵ３で取得されたネガポジ情報に基づき、反応場のサイズ分布が単分散であるとみなして、分析対象物の数または濃度を導出する。
【０１５７】
Ｓ７０２にて、情報処理ユニットＵ４は、Ｓ７０１にて導出された数または濃度を、記憶部４０１に記憶されたテーブルを用いて補正する。
【０１５８】
このように本実施形態では、サイズ分布を無視して、単分散とみなして導出された濃度を、記憶部４０１に記憶されたテーブルによって補正することで、サンプル中の分析対象物の濃度を取得する。本実施形態でも第１の実施形態と同様に、テーブルには反応場のサイズ分布の情報が反映されているため、反応場のサイズにばらつきがある場合であっても、従来よりも簡便な方法で、分析結果の信頼度を高めることができる。また本実施形態によれば、第１の実施形態で述べたその他の効果も得られる。
【０１５９】
（第４の実施形態）
次に、本発明の第４の実施形態に係る分析システムについて、図面を参照しながら説明する。なお、上述の各実施形態と同様の部分については説明を省略する。
【０１６０】
［分析システムの構成］
図８は、本実施形態に係る分析システムの構成を模式的に示す図である。本実施形態に係る分析システム４は、分析システム１〜３と同様に、反応場生成ユニットＵ１と、反応ユニットＵ２と、検出ユニットＵ３と、情報処理ユニットＵ４と、を有する。分析システム４が有する反応場生成ユニットＵ１、反応ユニットＵ２、検出ユニットＵ３の構成については分析システム１〜３と同様である。
【０１６１】
＜情報処理ユニット＞
本実施形態に係る分析システム４が有する情報処理ユニットＵ４は、その機能として、図８に示すように、分析システム３が有する情報処理ユニットＵ４の各部に加えて、テーブル選択部４０５を有する。
【０１６２】
（記憶部）
本実施形態に係る記憶部４０１は、複数のテーブルを記憶する。記憶部４０１が記憶する複数のテーブルのそれぞれは、互いに異なるサイズ分布にそれぞれに対応している。以下、このような複数のテーブルの集合を、ライブラリと称することがある。
【０１６３】
（テーブル選択部）
テーブル選択部４０５は、補正部４０９における濃度の補正に用いるテーブルを、記憶部４０１が記憶している複数のテーブルの中から、分布データ生成部４０３が生成した分布データに基づいて選択する。テーブル選択部４０５によって選択されたテーブルは、補正部４０９における濃度の補正の際に用いられる。
【０１６４】
テーブル選択部４０５は、記憶部４０１が記憶しているライブラリの中に、分布データに応じた適切なテーブルが存在するか否かを判別してもよい。分布データに応じた適切なテーブルが存在しない場合は、その分布データを用いて、テーブル生成部４０４がテーブルを生成してもよい。
【０１６５】
［分析システムの動作］
次に、本実施形態に係る分析システム４を用いた分析方法について、図５および図７を用いて説明する。図７は、第３および４の実施形態に係る分析システムによる分析処理の手順の一部を示すフローチャートである。
【０１６６】
Ｓ５０１〜Ｓ５０６の各処理は、第２の実施形態と同様である。
【０１６７】
Ｓ５０７にて、情報処理ユニットＵ４は、生成された分布データに基づいて、テーブルを生成する。本実施形態ではテーブル生成部４０４が、反応場のサイズ分布を単分散とみなして導出される分析対象物の数または濃度を補正するためのテーブルを、分布データに基づいて生成する。情報処理ユニットＵ４がテーブルを生成する方法の詳細については、第３の実施形態と同様である。
【０１６８】
Ｓ５０８〜Ｓ５１０の各処理は、第２の実施形態と同様である。
【０１６９】
Ｓ５１１にて、情報処理ユニットＵ４は、検出ユニットＵ３で取得されたネガポジ情報と、テーブル選択部４０５によって選択されたテーブルと、に基づいて、サンプル中の分析対象物の濃度を導出する。ここで、本実施形態では第３の実施形態と同様に、図７に示される手順で濃度の導出を行う。
【０１７０】
Ｓ７０１〜Ｓ７０２の各処理は、第３の実施形態と同様である。
【０１７１】
このように本実施形態では、サイズ分布を無視して、単分散とみなして導出された濃度を、記憶部４０１に記憶されたテーブルによって補正することで、サンプル中の分析対象物の濃度を取得する。本実施形態でも第２の実施形態と同様に、テーブルには反応場のサイズ分布の情報が反映されているため、反応場のサイズにばらつきがある場合であっても分析結果の信頼度を高めることができる。また本実施形態によれば、第２の実施形態で述べたその他の効果も得られる。
【０１７２】
［その他の実施形態］
本発明の実施形態として分析システム１〜４について説明したが、本発明はこれに限定はされず、本発明は分析システム１〜４を構成する各部の一部からなる分析システムによっても実現可能である。
【０１７３】
また、第３および第４の実施形態では、テーブルによって反応場のサイズ分布を単分散とみなして導出される分析対象物の数または濃度を補正する場合について説明したが、本発明はこれに限定はされない。例えば、テーブルによってネガポジ情報を補正して、補正されたネガポジ情報を用いて、反応場のサイズ分布を単分散とみなして、分析対象物の数または濃度を導出してもよい。すなわち、第３および第４の実施形態において、記憶部４０１はネガポジ情報を補正するためのテーブルを記憶し、補正部４０９は記憶部４０１に記憶されたテーブルに基づいてネガポジ情報を補正してもよい。そして、補正部４０９によって補正されたネガポジ情報に基づいて、濃度導出部４０６が分析対象物の数または濃度を導出してもよい。
【０１７４】
また、本発明は、上述の実施形態の１以上の機能を実現するプログラムを、ネットワーク又はコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を介してシステム又は装置に供給し、そのシステム又は装置のコンピュータにおける１つ以上のプロセッサーがプログラムを読出し実行する処理でも実現可能である。また、１以上の機能を実現する回路（例えば、ＡＳＩＣ）によっても実現可能である。
【実施例】
【０１７５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【０１７６】
（準備例１）
＜エマルジョン１の生成＞
ＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ  ５（５ｎｇ／μＬ、型番ＭＲ４０５、タカラバイオ社製）の１０倍希釈液を２μＬ、ＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ／  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｇｒｏｕｐ（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）（フォワードプライマー、リバースプライマーそれぞれ２．０μＭ、型番ＭＲ２０１、タカラバイオ社製）を４μＬ、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（型番ＲＲ４２０、タカラバイオ社製）を１０μＬ、滅菌蒸留水を４μＬ、用意して混合した。
【０１７７】
この混合液に下記のサーマルサイクル条件でサーマルサイクルを施してＰＣＲを行い、大腸菌１６Ｓ  ｒＤＮＡのアンプリコンを取得した。アガロースゲル電気泳動により４１３ｂｐの増幅産物が得られたことを確認した。アンプリコンの濃度がおおよそ５×１０４コピー／μＬ程度となるよう溶液を希釈して、テンプレート１とした。
【０１７８】
［サーマルサイクル条件］
１）初期変性（９５℃２分間）  １サイクル
２）ＰＣＲ（９５℃２０秒間、５５℃２０秒間、７４℃２０秒間）３５サイクル
３）保持（４℃）１サイクル
【０１７９】
市販のインターカレーター法のＰＣＲ試薬（ｄｄＰＣＲ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）１０μＬに、上述のテンプレート１を２μＬ、ＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ／  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｇｒｏｕｐ（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）（フォワードプライマー、リバースプライマーそれぞれ２．０  μＭ、型番ＭＲ２０１、タカラバイオ社製）を１μＬ、滅菌蒸留水を７μＬ、それぞれ添加し混合し、分散相とした。
【０１８０】
上述の分散相に、連続相として、市販のデジタルＰＣＲ用のオイル（Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  Ｏｉｌ  ｆｏｒ  Ｅｖａｇｒｅｅｎ、バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）を５０μＬ添加した。この混合液をボルテックスミキサーで撹拌して、油中水型エマルジョンであるエマルジョン１を生成した。
【０１８１】
＜エマルジョンを用いたＰＣＲ＞
得られたエマルジョン１に下記のサーマルサイクル条件でサーマルサイクルを施してＰＣＲを行った。
【０１８２】
［サーマルサイクル条件］
１）酵素活性化（９５℃５分間）  １サイクル
２）ＰＣＲ（９５℃３０秒間、５５℃１分間）  ５０サイクル
３）信号安定化（４℃５分間、９０℃５分間）  １サイクル
４）保持（４℃）  １サイクル
【０１８３】
＜サーマルサイクル後の液滴の計測＞
サーマルサイクル後のエマルジョン１を、ガラス製沈査用プレート（ＭＵＲ−３００、松浪硝子工業株式会社）に２０μＬ採取し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００、株式会社キーエンス）を用いて観察した。観察は、１つの視野につき、同一視野において可視光像と蛍光像（励起波長４８０／３０ｎｍ、吸収波長５１０ｎｍ）を内蔵のカメラ（撮像素子：１５０万画素ＣＣＤイメージセンサ）で撮影し、これを５つの視野において行った。撮影した画像の一例を図９（ａ）に示す。
【０１８４】
得られた可視光像より、画像処理ソフトウエアを用いて、それぞれの液滴の直径を計測した。このとき、計測の分解能は１０μｍであり、直径１０μｍ以下の液滴は計測対象外とした。また、得られた蛍光像より、目視による判定によって、それぞれの液滴について遺伝子増殖による蛍光増強の有無を判定し、分析対象物が検出されたか否かを判定した。可視光像と蛍光像とを重ね合わせることで、それぞれの液滴のサイズの情報と分析対象物が検出されたか否かの情報とを対応付けたデータを作成した。
【０１８５】
得られたデータについて、液滴のサイズを複数の区間に分け、度数分布データを作成した。具体的には、液滴径が２０μｍ以上３０μｍ未満を１つの区間として、以降同様にして、計測の分解能である１０μｍを区間の幅として、液滴径を１８個の区間に分けた。そして、区間ごとに液滴の数、陽性液滴の数、陰性液滴の数、をそれぞれ集計した。この結果を表１にまとめて示す。
【０１８６】
【表１】
2019024366.tif 000004
【０１８７】
表中、液滴径は液滴の平均直径、Ｔｏｔａｌは液滴の総数、Ｐｏｓｉｔｉｖｅは蛍光増強があった液滴（陽性液滴）の数、Ｎｅｇａｔｉｖｅは蛍光増強がなかった液滴（陰性液滴）の数、をそれぞれ示す（以降、同様である）。
【０１８８】
（準備例２）
準備例１において、テンプレート１を１０倍に希釈して、テンプレート２とした。すなわち、テンプレート２では、アンプリコンの濃度がおおよそ５×１０３コピー／μＬ程度となっている。テンプレート１の代わりにテンプレート２を用いて分散相を形成したこと以外は準備例１と同様にして、エマルジョン２を生成した。
【０１８９】
このエマルジョン２について、準備例１と同様にサーマルサイクルを施してＰＣＲを行い、準備例１と同様にサーマルサイクル後の液滴を計測した。撮影した画像の一例を図９（ｂ）に示す。計測結果を表１にまとめて示す。
【０１９０】
（準備例３）
準備例１において、テンプレート１を１００倍に希釈して、テンプレート３とした。すなわち、テンプレート３では、アンプリコンの濃度がおおよそ５×１０２コピー／μＬ程度となっている。テンプレート１の代わりにテンプレート３を用いて分散相を形成したこと以外は準備例１と同様にして、エマルジョン３を生成した。
【０１９１】
このエマルジョン３について、準備例１と同様にサーマルサイクルを施してＰＣＲを行い、準備例１と同様にサーマルサイクル後の液滴を計測した。撮影した画像の一例を図９（ｃ）に示す。計測結果を表１にまとめて示す。
【０１９２】
（準備例４）
準備例１において、テンプレート１を１０００倍に希釈して、テンプレート４とした。すなわち、テンプレート４では、アンプリコンの濃度がおおよそ５×１０コピー／μＬ程度となっている。テンプレート１の代わりにテンプレート４を用いて分散相を形成したこと以外は準備例１と同様にして、エマルジョン４を生成した。
【０１９３】
このエマルジョン４について、準備例１と同様にサーマルサイクルを施してＰＣＲを行い、準備例１と同様にサーマルサイクル後の液滴を計測した。撮影した画像の一例を図９（ｄ）に示す。計測結果を表１にまとめて示す。
【０１９４】
（準備例５）
準備例１において、１６Ｓ  ｒＤＮＡ（ＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ／  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｇｒｏｕｐ）の代わりにＨｕｍａｎ  β−Ａｃｔｉｎ（Ｈｕｍａｎ  ＡＣＴＢ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いたこと以外は準備例１と同様にして、ＰＣＲを行った。Ｈｕｍａｎ  β−Ａｃｔｉｎのアンプリコンの濃度がおおよそ５×１０４コピー／μＬ程度となるよう溶液を希釈して、テンプレート５とした。テンプレート１の代わりにテンプレート５を用いて分散相を形成したこと以外は準備例１と同様にして、エマルジョン５を生成した。
【０１９５】
このエマルジョン５について、準備例１と同様にサーマルサイクルを施してＰＣＲを行い、準備例１と同様にサーマルサイクル後の液滴を計測した。撮影した画像の一例を図１０（ａ）に示す。計測結果を表２にまとめて示す。
【０１９６】
【表２】
2019024366.tif 000005
【０１９７】
（準備例６）
準備例５において、テンプレート５を１０倍に希釈して、テンプレート６とした。すなわち、テンプレート６では、アンプリコンの濃度がおおよそ５×１０３コピー／μＬ程度となっている。テンプレート５の代わりにテンプレート６を用いて分散相を形成したこと以外は準備例５と同様にして、エマルジョン６を生成した。
【０１９８】
このエマルジョン６について、準備例５と同様にサーマルサイクルを施してＰＣＲを行い、準備例５と同様にサーマルサイクル後の液滴を計測した。撮影した画像の一例を図１０（ｂ）に示す。計測結果を表２にまとめて示す。
【０１９９】
（準備例７）
準備例５において、テンプレート５を１００倍に希釈して、テンプレート７とした。すなわち、テンプレート７では、アンプリコンの濃度がおおよそ５×１０２コピー／μＬ程度となっている。テンプレート５の代わりにテンプレート７を用いて分散相を形成したこと以外は準備例５と同様にして、エマルジョン７を生成した。
【０２００】
このエマルジョン７について、準備例５と同様にサーマルサイクルを施してＰＣＲを行い、準備例５と同様にサーマルサイクル後の液滴を計測した。撮影した画像の一例を図１０（ｃ）に示す。計測結果を表２にまとめて示す。
【０２０１】
（準備例８）
準備例５において、テンプレート５を１０００倍に希釈して、テンプレート８とした。すなわち、テンプレート８では、アンプリコンの濃度がおおよそ５×１０コピー／μＬ程度となっている。テンプレート５の代わりにテンプレート８を用いて分散相を形成したこと以外は準備例５と同様にして、エマルジョン８を生成した。
【０２０２】
このエマルジョン８について、準備例５と同様にサーマルサイクルを施してＰＣＲを行い、準備例５と同様にサーマルサイクル後の液滴を計測した。撮影した画像の一例を図１０（ｄ）に示す。計測結果を表２にまとめて示す。
【０２０３】
（比較例１）
準備例１〜４のエマルジョン１〜４について、液滴を用いるデジタルＰＣＲで一般に行われている方法で、サンプル中の分析対象物（標的核酸）の濃度を計算した。具体的には、全区間の液滴の総数の合計、全区間の陰性液滴の数の合計を用いて陰性液滴の割合を計算し、式（４）を用いて１つの反応場に含まれていた分析対象物の平均個数Ｃを算出した。そして、平均個数Ｃと全区間の液滴の総数の合計とを掛け合わせて、検出対象とした全液滴に含まれていた分析対象物の総数を算出した。その後、各区間の液滴の総数とその区間の液滴の液滴径とから、各区間に含まれる液滴の体積を計算し、検出対象とした液滴の総体積を計算した。そして、検出対象とした全液滴に含まれていた分析対象物の総数を検出対象とした全液滴の総体積で割ることで反応液における濃度を算出し、それに希釈倍率１０倍を掛けることで、サンプル中の分析対象物の濃度に換算した。結果を表３に示す。
【０２０４】
【表３】
2019024366.tif 000006
【０２０５】
（実施例１）
エマルジョン１〜４について、各エマルジョンの液滴のサイズの分布に基づいて陽性液滴および陰性液滴の数と分析対象物の数とを対応付けたテーブルを生成し、そのテーブルとネガポジ情報とに基づいて、分析対象物の濃度を計算した。
【０２０６】
（テーブルの生成）
サーマルサイクル後のエマルジョン１〜４の液滴のサイズの分布は、表１のとおりであった。このサイズの分布に基づいて、エマルジョン１〜４のそれぞれについて、陽性液滴および陰性液滴の数と分析対象物の数（標的核酸のコピー数）とを対応付けたテーブル（検量線）を、第１の実施形態で述べた手順で作成した。
【０２０７】
具体的なテーブルの作成手順について、エマルジョン１を例に説明する。まず、表１に示されるサイズ分布を有する複数の液滴が、エマルジョン形成前に含んでいた分析対象物の総数（設定値）を、１００，０００コピーと仮定した。次に、表１に示される複数の区間のそれぞれに、仮定した１００，０００コピーの分析対象物を振り分けた。このとき、全液滴の総体積に対する、それぞれの区間に含まれる液滴の総体積の割合に比例させて、それぞれの区間に分析対象物を振り分けた。
【０２０８】
次に、複数の区間のそれぞれについて、分析対象物が１つも含まれない液滴の割合を、ポアソンモデルに基づいて確率論的に計算した。そして、得られた割合を１から差し引くことで、分析対象物を１つ以上含む液滴の割合を計算した。分析対象物を１つも含まない液滴はすべて陰性液滴、分析対象物を１つ以上含む液滴はすべて陽性液滴となるものとして、得られた割合と、区間に含まれる液滴の総数とを掛け合わせることで、陰性液滴および陽性液滴の数を計算した。
【０２０９】
エマルジョン形成前に含まれていた分析対象物の総数（設定値）を３０，０００コピー、１０，０００コピー、３，０００コピー、１，０００コピー、３００コピー、１００コピー、３０コピー、１０コピー、３コピーと仮定した場合についても同様にそれぞれ計算して、陽性液滴および陰性液滴の数を計算した。計算結果をまとめて表４に示す。
【０２１０】
【表４】
2019024366.tif 000007
【０２１１】
表４をもとに、全区間の陽性液滴の数、全区間の陰性液滴の数をそれぞれ合計することで、仮定したエマルジョン形成前に含んでいた分析対象物の総数ごとに、全液滴中の陽性液滴および陰性液滴の数を計算した。これにより、分析対象物の数と、陽性液滴および陰性液滴の数と、が対応付けられたテーブルを作成した。
【０２１２】
エマルジョン２〜４についても上述の手順でテーブルを作成した。エマルジョン１〜４について、作成したテーブルを表５に示す。
【０２１３】
【表５】
2019024366.tif 000008
【０２１４】
（濃度の計算）
表１に示すように、エマルジョン１において陰性液滴の数は合計１９０個であった。これと表５に示されるテーブルとを比較して、サンプル中の分析対象物の数を計算した。具体的には、表５のエマルジョン１に関するテーブルにおいては、陰性液滴が１４０個のときに分析対象物が３，０００コピー、陰性液滴が２２５個のときに分析対象物が１，０００コピーとなる。エマルジョン１の検出結果では陰性液滴の数は１９０個であったため、テーブル中の上記２点の間を直線近似することで、陰性液滴の数が１９０個のときの分析対象物の数を計算した。その結果、本実施例において、エマルジョン１における分析対象物の数は、１，８３０コピーと推定できた。これを検出対象とした全液滴の総体積で除した結果、反応液中の分析対象物の濃度は７，９７０コピー／μＬとなり、希釈倍率１０倍を掛けたところ、サンプル中の分析対象物の濃度は７９，７００コピー／μＬと計算された。
【０２１５】
エマルジョン２〜４についてもエマルジョン１と同様にして計算を行い、サンプル中の分析対象物の濃度を計算した。計算結果をまとめて表６に示す。
【０２１６】
【表６】
2019024366.tif 000009
【０２１７】
（実施例２）
実施例１では、テーブルの作成時に、エマルジョン形成前に含まれていた分析対象物の総数（設定値）を上述のように大まかに仮定したが、本実施例ではより細かく仮定して、より詳細なテーブルを作成して、分析対象物の濃度を計算した。具体的には、本実施例では１コピー刻みで設定値を仮定して、実施例１と同様の手順で計算を行ってテーブルを作成した。
【０２１８】
エマルジョン１について作成したテーブルのうち、分析対象物の数（設定値）が１，５２０コピーから１，５３０コピーまでの部分を表７に示す。
【０２１９】
【表７】
2019024366.tif 000010
【０２２０】
表１に示すように、エマルジョン１において陰性液滴の数は合計１９０個であった。これと表７に部分的に示されるテーブルとを比較して、サンプル中の分析対象物の数を計算した。表７においては、陰性液滴の数が１９０個のときの分析対象物の数は１，５２２コピーから１，５２６コピーであったため、これらの平均値を算出することで、陰性液滴が１９０個のときの分析対象物の数を計算した。その結果、本実施例において、エマルジョン１における分析対象物の数は、１，５２４コピーと推定できた。これを検出対象とした全液滴の総体積で除した結果、反応液中の分析対象物の濃度は６，６６０コピー／μＬとなり、希釈倍率１０倍を掛けたところ、サンプル中の分析対象物の濃度は６６，６００コピー／μＬと計算された。
【０２２１】
エマルジョン２について作成したテーブルのうち、分析対象物の数（設定値）が１０９コピーから１１４コピーまでの部分を表８に示す。
【０２２２】
【表８】
2019024366.tif 000011
【０２２３】
表１に示すように、エマルジョン２において陰性液滴の数は合計５７３個であった。これと表８に部分的に示されるテーブルとを比較して、サンプル中の分析対象物の数を計算した。表８においては、陰性液滴の数が５７３個のときの分析対象物の数は１１１コピーから１１２コピーであったため、これらの平均値を算出することで、陰性液滴が１９０個のときの分析対象物の数を計算した。その結果、本実施例において、エマルジョン１における分析対象物の数は、１１２コピーと推定できた。これを検出対象とした全液滴の総体積で除した結果、反応液中の分析対象物の濃度は３５２コピー／μＬとなり、希釈倍率１０倍を掛けたところ、サンプル中の分析対象物の濃度は３，５２０コピー／μＬと計算された。
【０２２４】
エマルジョン３について作成したテーブルのうち、分析対象物の数（設定値）が２３コピーから２８コピーまでの部分を表９に示す。
【０２２５】
【表９】
2019024366.tif 000012
【０２２６】
表１に示すように、エマルジョン３において陰性液滴の数は合計１，５７１個であった。これと表９に部分的に示されるテーブルとを比較して、サンプル中の分析対象物の数を計算した。表９においては、陰性液滴の数が１，５７３個のときの分析対象物の数は２５コピー、陰性液滴の数が１，５７０個のときの分析対象物の数は２６コピーであった。エマルジョン３の検出結果では陰性液滴の数は１，５７１個であったため、テーブル中の上記２点の間を直線近似することで、陰性液滴の数が１，５７１個のときの分析対象物の数を計算した。その結果、本実施例において、エマルジョン３における分析対象物の数は、２６コピーと推定できた。これを検出対象とした全液滴の総体積で除した結果、反応液中の分析対象物の濃度は３８コピー／μＬとなり、希釈倍率１０倍を掛けたところ、サンプル中の分析対象物の濃度は３８０コピー／μＬと計算された。
【０２２７】
エマルジョン４について作成したテーブルのうち、分析対象物の数（設定値）が３コピーから８コピーまでの部分を表１０に示す。
【０２２８】
【表１０】
2019024366.tif 000013
【０２２９】
表１に示すように、エマルジョン４において陰性液滴の数は合計９７８個であった。これと表１０に部分的に示されるテーブルとを比較して、サンプル中の分析対象物の数を計算した。表１０においては、陰性液滴の数が９７８個のときの分析対象物の数は６コピーであったため、本実施例において、エマルジョン４における分析対象物の数は、６コピーと推定できた。これを検出対象とした全液滴の総体積で除した結果、反応液中の分析対象物の濃度は１４．７コピー／μＬとなり、希釈倍率１０倍を掛けたところ、サンプル中の分析対象物の濃度は１４７コピー／μＬと計算された。
【０２３０】
上述のエマルジョン１〜３についての計算結果をまとめて表１１に示す。
【０２３１】
【表１１】
2019024366.tif 000014
【０２３２】
＜比較例１と実施例１，２の比較＞
表３，６，１１に示されるように、比較例１、実施例１，２のそれぞれにおいて、エマルジョン１，２，３，４は、それぞれ、エマルジョン１に対する相対希釈倍率が１倍、１０倍、１００倍、１０００倍に相当する。したがって、エマルジョン１，２，３，４においてサンプル中の分析対象物の濃度は、それぞれ、エマルジョン１に対して１倍、０．１倍、０．０１倍、０．００１倍となるはずである。
【０２３３】
図１１は、比較例１、実施例１，２のそれぞれにおける、相対希釈倍率とサンプル中の分析対象物の濃度の計算結果との関係を示すグラフである。図１１（ａ）は比較例１の結果、図１１（ｂ）は実施例１の結果、図１１（ｃ）は実施例２の結果を、横軸を相対希釈倍率、縦軸を濃度の計算結果とした両対数グラフでそれぞれ示している。
【０２３４】
上述のように、相対希釈倍率と濃度は、相対希釈倍率をｙ、濃度をｘとすると、ｙ＝ａｘ−１が成り立つ。したがって、両対数グラフにおいては両者の関係は傾きが−１の直線で表されるはずである。図１１（ａ）〜（ｃ）において、エマルジョン１においてサンプル中の分析対象物の濃度が５×１０４コピー／μＬであったと仮定したときの相対希釈倍率と濃度の関係を、点線で示した。また、図１１（ａ）〜（ｃ）において、実線は両対数グラフにおいて比較例１、実施例１，２の結果を累乗近似したときの近似曲線を示している。図１１（ａ）〜（ｃ）を比較すると、図１１（ｂ），（ｃ）では、図１１（ａ）よりも、実線の傾きが点線の傾きに近いことがわかった。具体的には、近似曲線の傾きは、比較例１では−０．７７、実施例１では−０．９１、実施例２では−０．８９となった。このことから、実施例１，２では、比較例１よりも真の値に近い結果が得られたこと、すなわち、定量分析の信頼度が高いことがわかった。実施例１，２では、特に希釈倍率の低い部分、すなわち、サンプル中の分析対象物の濃度が高い部分において、真の値に近い結果が得られることがわかった。以上から、本発明によれば、液滴のサイズにばらつきがある場合であっても、信頼度の高い分析結果が得られることがわかった。
【０２３５】
（比較例２）
準備例５〜８のエマルジョン５〜８について、比較例１と同様の手順で、サンプル中の分析対象物の濃度を計算した。結果を表１２に示す。
【０２３６】
【表１２】
2019024366.tif 000015
【０２３７】
（実施例３）
エマルジョン５〜８について、各エマルジョンの液滴のサイズの分布に基づいて陽性液滴および陰性液滴の数と分析対象物の数とを対応付けたテーブルを生成し、そのテーブルとネガポジ情報とに基づいて、分析対象物の濃度を計算した。
【０２３８】
（テーブルの生成）
エマルジョン５〜８のそれぞれについて、実施例１と同様にして、陽性液滴および陰性液滴の数と分析対象物の数とを対応付けたテーブル（検量線）を作成した。作製したテーブルを表１３に示す。
【０２３９】
【表１３】
2019024366.tif 000016
【０２４０】
（濃度の計算）
実施例１と同様に、エマルジョン５〜８のそれぞれについて、陰性液滴の総数と表１３に示されるテーブルとを比較して、サンプル中の分析対象物の数を計算した。計算結果をまとめて表１４に示す。
【０２４１】
【表１４】
2019024366.tif 000017
【０２４２】
（実施例４）
準備例５〜８のエマルジョン５〜８について、ネガポジ情報から反応場のサイズの分布を単分散とみなして算出される分析対象物の濃度を補正するためのテーブルを各エマルジョンのサイズの分布に基づいて生成した。そして、生成したテーブルを用いて分析対象物の濃度を計算した。
【０２４３】
（テーブルの生成）
サーマルサイクル後のエマルジョン５〜８の液滴のサイズの分布は、表２のとおりであった。このサイズの分布に基づいて、エマルジョン５〜８のそれぞれについて、第２の実施形態で述べた手順でテーブル（補正テーブル）を作成した。
【０２４４】
具体的なテーブルの作成手順について、エマルジョン５を例に説明する。実施例３と同様に、エマルジョン形成前に含まれていた分析対象物の総数（設定値）を仮定して、そのときの陽性液滴および陰性液滴の数を計算した。この結果は実施例３と同様であり、表１３に示したとおりである。
【０２４５】
次に、設定値ごとに算出されたネガポジ情報をもとに、今度はエマルジョン中の液滴のサイズの分布を単分散とみなして、分析対象物の数と、サンプル中の分析対象物の濃度（λ２とする）を計算した。ここでの計算は比較例１と同様、式（４）に基づいて行った。また、設定値をエマルジョン中の液滴の総体積で割り、それに希釈倍率１０倍を掛けることで、設定値のサンプル中の分析対象物の濃度（λ１とする）を算出した。また、本実施例では、λ２のλ１に対するズレ率（（λ２−λ１）／λ１×１００％）を、設定値ごとにそれぞれ算出した。結果を表１５に示す。
【０２４６】
【表１５】
2019024366.tif 000018
【０２４７】
（濃度の計算）
表１２に示すように、エマルジョン５について、反応場のサイズの分布を単分散とみなしてネガポジ情報から算出される、サンプル中の分析対象物の濃度（λ２）は１６，８００コピー／μＬであった。これと補正テーブル（表１５）を比較して、サンプル中の分析対象物の濃度を計算した。
【０２４８】
まず、表１５中の分析対象物の濃度の逆算値（λ２）について、１１，０００コピー／μＬと１７，０００コピー／μＬの２点を直線近似して、λ２が１６，８００コピー／μＬの場合のズレ率を−７８％と計算した。そして、このズレ率を用いて、エマルジョン５のネガポジ情報から計算して得られた濃度λ２を以下の通り補正して、サンプル中の分析対象物の濃度を算出した。
１６，８００／（１−０．７８）＝７６，０００（コピー／μＬ）
【０２４９】
エマルジョン６〜８についても同様に、補正テーブルを生成し、その補正テーブルを用いてサンプル中の分析対象物の濃度を算出した。エマルジョン６〜８の補正テーブルを表１６〜１８に示し、エマルジョン５〜８のサンプル中の分析対象物の濃度の計算結果をまとめて表１９に示す。
【０２５０】
【表１６】
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【０２５１】
【表１７】
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【０２５２】
【表１８】
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【０２５３】
【表１９】
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【０２５４】
＜比較例２と実施例３，４の比較＞
表１２，１４，１９に示されるように、比較例２、実施例３，４のそれぞれにおいて、エマルジョン５，６，７，８は、それぞれ、エマルジョン５に対する相対希釈倍率が１倍、１０倍、１００倍、１０００倍に相当する。したがって、エマルジョン５，６，７，８においてサンプル中の分析対象物の濃度は、それぞれ、エマルジョン５に対して１倍、０．１倍、０．０１倍、０．００１倍となるはずである。
【０２５５】
図１２は、比較例２、実施例３，４のそれぞれにおける、相対希釈倍率とサンプル中の分析対象物の濃度の計算結果との関係を示すグラフである。図１２（ａ）は比較例２の結果、図１２（ｂ）は実施例３の結果、図１２（ｃ）は実施例４の結果を、横軸を相対希釈倍率、縦軸を濃度の計算結果とした両対数グラフでそれぞれ示している。
【０２５６】
上述のように、相対希釈倍率と濃度は、相対希釈倍率をｙ、濃度をｘとすると、ｙ＝ａｘ−１が成り立つ。したがって、両対数グラフにおいては両者の関係は傾きが−１の直線で表されるはずである。図１２（ａ）〜（ｃ）において、エマルジョン５においてサンプル中の分析対象物の濃度が５×１０４コピー／μＬであったと仮定したときの相対希釈倍率と濃度の関係を、点線で示した。また、図１２（ａ）〜（ｃ）において、実線は両対数グラフにおいて比較例２、実施例３，４の結果を累乗近似したときの近似曲線を示している。図１２（ａ）〜（ｃ）を比較すると、図１２（ｂ），（ｃ）では、図１２（ａ）よりも、実線の傾きが点線の傾きに近いことがわかった。具体的には、近似曲線の傾きは、比較例２では−０．７７、実施例３では−０．９１、実施例４では−０．９３となった。このことから、実施例３，４では、比較例２よりも真の値に近い結果が得られたこと、すなわち、定量分析の信頼度が高いことがわかった。実施例３，４では、特に希釈倍率の低い部分、すなわち、サンプル中の分析対象物の濃度が高い部分において、真の値に近い結果が得られることがわかった。以上から、本発明によれば、液滴のサイズにばらつきがある場合であっても、信頼度の高い分析結果が得られることがわかった。
【符号の説明】
【０２５７】
１  分析システム
３０１  分析対象物情報取得部
４０１  記憶部
４０６  濃度導出部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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