(57)【要約】【課題】小児がんのための新規な尿中腫瘍マーカーを同定し、小児がんの評価に使用すること。【解決手段】対象の尿中代謝物を測定することにより、対象において、小児がんを検出、小児がんのリスクを予測する、小児がんのステージを判定する、小児がんの予後を判定する、及び／又は小児がんに対する治療の効果をモニタリングするための方法、装置及びキットを提供する。【選択図】図４１
2019168319.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小児がんの評価方法であって、
対象由来の尿サンプル中の尿中代謝物を測定するステップ、
上記測定結果に基づいて対象における小児がんを評価するステップ
を含み、
尿中代謝物が、
（i）3-メトキシチラミン硫酸塩、バニルラクテート、ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、フェノールグルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、3-メトキシチロシン、3-メトキシチラミン、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及びドーパミンからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；
（ii）N-アセチルシステイン、シスタチオニン、及びS-アデノシルホモシステインからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；
（iii）コルチゾール21-グルクロニド及びコルチゾールからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；並びに
（iv）キサントプテリンである代謝物
からなる群より選択される少なくとも1つの代謝物を含む（但し、尿中代謝物は、ホモバニリン酸のみ又はバニリルマンデル酸のみではない）、方法。
【請求項２】
尿中代謝物が、
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも2つの代謝物の組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（ii）の群より選択される少なくとも2つの代謝物の組み合わせ；
（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（iii）の群より選択される少なくとも2つの代謝物の組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも2つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも2つの代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも2つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；又は
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
小児がんが神経芽腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対象が0〜15歳の児である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
がんの評価が、対象における小児がんの検出、対象における小児がんのリスク予測、対象における小児がんのステージ判定、対象における小児がんの予後判定、又は対象に存在する小児がんに対する治療の効果のモニタリングである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
評価ステップが、健常児又は低リスク児サンプルにおける尿中代謝物の測定値、小児がんに罹患している又は小児がんの既知のステージに罹患している患者のサンプルにおける尿中代謝物の測定値、特定の予後を示す小児がんを有する患者のサンプルにおける尿中代謝物の測定値、小児がんの治療を受けた患者のサンプルにおける尿中代謝物の測定値及び別の時点で取得された対象のサンプルにおける尿中代謝物の測定値、から選択される基準値との比較を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
尿中代謝物の測定を液体クロマトグラフィ質量分析法（LC/MS）により行う、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
小児がんの評価装置であって、
尿サンプル中の尿中代謝物を測定する測定部と、
上記測定部で測定した尿中代謝物の測定値を基準値又は前回の測定値と比較する比較部と、
上記比較部で得られた比較結果から小児がんを評価する判定部と
を含み、
尿中代謝物が、
（i）3-メトキシチラミン硫酸塩、バニルラクテート、ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、フェノールグルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、3-メトキシチロシン、3-メトキシチラミン、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及びドーパミンからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；
（ii）N-アセチルシステイン、シスタチオニン、及びS-アデノシルホモシステインからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；
（iii）コルチゾール21-グルクロニド及びコルチゾールからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；並びに
（iv）キサントプテリンである代謝物
からなる群より選択される少なくとも1つの代謝物を含む（但し、尿中代謝物は、ホモバニリン酸のみ又はバニリルマンデル酸のみではない）ことを特徴とする装置。
【請求項９】
尿中代謝物が、
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも2つの代謝物の組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（ii）の群より選択される少なくとも2つの代謝物の組み合わせ；
（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（iii）の群より選択される少なくとも2つの代謝物の組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも2つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも2つの代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；
（i）の群より選択される少なくとも2つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ；又は
（i）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つの代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つの代謝物との組み合わせ
を含む、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
測定部が液体クロマトグラフィ質量分析（LC/MS）装置を備える、請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
小児がんの治療の有効性の評価方法であって、
被験治療薬又は治療法による処置を受けた小児がんを有する動物からの尿サンプルにおいて、尿中代謝物を測定するステップ、
上記測定結果に基づいて小児がんに対する被験治療薬又は治療法の有効性を評価するステップ
を含み、
尿中代謝物が、
（i）3-メトキシチラミン硫酸塩、バニルラクテート、ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、フェノールグルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、3-メトキシチロシン、3-メトキシチラミン、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及びドーパミンからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；
（ii）N-アセチルシステイン、シスタチオニン、及びS-アデノシルホモシステインからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；
（iii）コルチゾール21-グルクロニド及びコルチゾールからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；並びに
（iv）キサントプテリンである代謝物
からなる群より選択される少なくとも1つの代謝物を含む（但し、尿中代謝物は、ホモバニリン酸のみ又はバニリルマンデル酸のみではない）、方法。
【請求項１２】
被験治療薬又は治療法による処置を行う前に、小児がんを有する動物からの尿サンプルにおいて、尿中代謝物を測定するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
小児がんを有する動物が、小児がんを患うヒト、又は小児がんモデル動物である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の尿の代謝物情報に基づいて、対象の疾患、特に小児がんの状態を評価するための方法、キット及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
「小児がん」は小児の病死原因の第1位であるが、対策は未だ不十分である。一般的に、「小児がん」のほとんどは病期が早期であればあるほど治療成績が良く、早期発見は予後に直結することが確認されている。しかしながら、早期診断が非常に難しいため、発見時に他臓器浸潤や遠隔転移をきたしていることが多く、治療が困難になる場合が多い。また、外科的切除が困難な場合や外科的切除を行っても腫瘍の残存の可能性がある場合は、化学療法や放射線治療を行うことが多く、有用な腫瘍マーカーが見つかっていない腫瘍では、画像診断以外に有効な効果判定の手段がない。例えば、神経芽腫、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍といった腫瘍がこれにあたる。残存腫瘍の評価にはCT（コンピュータ断層撮影）やPET（陽電子放射断層撮影）検査等の画像検査が有効であるが、それらの検査でも判断できない場合には残存腫瘤の生検又は切除を行わなければならず、結果として大きな侵襲が必要となる。一方、PET検査等で残存腫瘍が評価できても、「小児がん」の多くは長期にわたって画像診断を継続しなければならず、これらの検査自体による発がん性については議論がある。
【０００３】
小児がんの1種である神経芽細胞腫のがん検査のために、例えば尿中代謝物としてカテコールアミン代謝物（バニリルマンデル酸（VMA）やホモバニリン酸（HVA））を検出する方法及び装置が報告されている（例えば、特許文献１〜３）。これらのバイオマーカーは有用であるが、検出されないケースもあると言われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平5-113438号公報
【特許文献２】特公平7-92456号公報
【特許文献３】特公平6-58364号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
尿中代謝物は、血中の物質と比較すると酵素の影響を受けにくく構造的に安定しているため、腫瘍マーカーとなる可能性が十分にある。その上、尿中マーカーは、尿を検体に用いるため小児でも容易に採取でき、がんのスクリーニング用途としても非常に利用しやすい。そのため、本発明は、小児がんのための新規な尿中マーカーを同定し、小児がん検査などの小児がんの評価に使用することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、小児がん患児の尿と同年代の健康な児の尿中代謝物を液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS: Liquid Chromatograph/Mass Spectrometer）により網羅的に解析し、腫瘍マーカーの探索を行ったところ、健常児と小児がん患者の間で変化する代謝物を複数特定し、多変量解析を踏まえて、小児がんの評価に有望な尿中腫瘍マーカー群を特定するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、対象の尿中代謝物を測定することにより、対象において、小児がん（特に神経芽腫）を検出、小児がんのリスクを予測する、小児がんのステージを判定する、小児がんの予後を判定する、及び／又は小児がんに対する治療の効果をモニタリングするための方法、装置及びキットに関する。
【０００８】
一態様において、本開示は、小児がんの評価方法であって、
対象由来の尿サンプル中の尿中代謝物を測定するステップ、
上記測定結果に基づいて対象における小児がんを評価するステップ
を含み、
尿中代謝物が、
（i）3-メトキシチラミン硫酸塩、バニルラクテート、ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、フェノールグルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、3-メトキシチロシン、3-メトキシチラミン、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及びドーパミンからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；
（ii）N-アセチルシステイン、シスタチオニン、及びS-アデノシルホモシステインからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；
（iii）コルチゾール21-グルクロニド及びコルチゾールからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；並びに
（iv）キサントプテリンである代謝物
からなる群より選択される少なくとも1つの代謝物を含む（但し、尿中代謝物は、ホモバニリン酸のみ又はバニリルマンデル酸のみではない）、方法を提供する。
【０００９】
別の態様において、本開示は、小児がんの評価装置であって、
尿サンプル中の尿中代謝物を測定する測定部と、
上記測定部で測定した尿中代謝物の測定値を基準値又は前回の測定値と比較する比較部と、
上記比較部で得られた比較結果から小児がんを評価する判定部と
を含み、
尿中代謝物が、
（i）3-メトキシチラミン硫酸塩、バニルラクテート、ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、フェノールグルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、3-メトキシチロシン、3-メトキシチラミン、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及びドーパミンからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；
（ii）N-アセチルシステイン、シスタチオニン、及びS-アデノシルホモシステインからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；
（iii）コルチゾール21-グルクロニド及びコルチゾールからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；並びに
（iv）キサントプテリンである代謝物
からなる群より選択される少なくとも1つの代謝物を含む（但し、尿中代謝物は、ホモバニリン酸のみ又はバニリルマンデル酸のみではない）ことを特徴とする装置を提供する。
【００１０】
また別の態様において、本開示は、小児がんの治療の有効性の評価方法であって、
被験治療薬又は治療法による処置を受けた小児がんを有する動物からの尿サンプルにおいて、尿中代謝物を測定するステップ、
上記測定結果に基づいて小児がんに対する被験治療薬又は治療法の有効性を評価するステップ
を含み、
尿中代謝物が、
（i）3-メトキシチラミン硫酸塩、バニルラクテート、ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、フェノールグルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、3-メトキシチロシン、3-メトキシチラミン、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及びドーパミンからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；
（ii）N-アセチルシステイン、シスタチオニン、及びS-アデノシルホモシステインからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；
（iii）コルチゾール21-グルクロニド及びコルチゾールからなる群より選択される少なくとも1つの代謝物；並びに
（iv）キサントプテリンである代謝物
からなる群より選択される少なくとも1つの代謝物を含む（但し、尿中代謝物は、ホモバニリン酸のみ又はバニリルマンデル酸のみではない）、方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、低侵襲性で、簡便かつ低コストに小児がんを評価するための方法、装置及びキットが提供される。尿による検査のため、臨床現場における採取法も非常に簡便になり、医療従事者の利便性も大きく向上する。したがって、本発明は、小児がんの診断、小児がん検査、治療評価、創薬などの分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】尿中腫瘍マーカー候補を抽出するための解析フロー例である。
【図２】がん検査モデルによる解析フロー例である。
【図３】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図４】尿中腫瘍マーカー（バニルラクテート）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図５】尿中腫瘍マーカー（ホモバニリン酸）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図６】尿中腫瘍マーカー（バニリルマンデル酸）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図７】尿中腫瘍マーカー（3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図８】尿中腫瘍マーカー（フェノールグルクロニド）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図９】尿中腫瘍マーカー（3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図１０】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチロシン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図１１】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図１２】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図１３】尿中腫瘍マーカー（ドーパミン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図１４】尿中腫瘍マーカー（N-アセチルシステイン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図１５】尿中腫瘍マーカー（シスタチオニン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図１６】尿中腫瘍マーカー（S-アデノシルホモシステイン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図１７】尿中腫瘍マーカー（コルチゾール21-グルクロニド）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図１８】尿中腫瘍マーカー（コルチゾール）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図１９】尿中腫瘍マーカー（キサントプテリン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図２０】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩及びバニルラクテート）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図２１】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩及びホモバニリン酸）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図２２】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩及びバニリルマンデル酸）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図２３】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩及び3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図２４】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩及びフェノールグルクロニド）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図２５】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩及び3-メトキシチロシン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図２６】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩及びドーパミン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図２７】尿中腫瘍マーカー（ホモバニリン酸及びバニリルマンデル酸）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図２８】尿中腫瘍マーカー（ホモバニリン酸及び3-メトキシチロシン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図２９】尿中腫瘍マーカー（バニリルマンデル酸及び3-メトキシチラミン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図３０】尿中腫瘍マーカー（ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸及び3-メトキシチラミン硫酸塩）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図３１】尿中腫瘍マーカー（N-アセチルシステイン及びシスタチオニン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図３２】尿中腫瘍マーカー（シスタチオニン及びS-アデノシルホモシステイン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図３３】尿中腫瘍マーカー（コルチゾール21-グルクロニド及びコルチゾール）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図３４】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩及びN-アセチルシステイン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図３５】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩及びシスタチオニン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図３６】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩及びS-アデノシルホモシステイン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図３７】尿中腫瘍マーカー（ホモバニリン酸及びN-アセチルシステイン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図３８】尿中腫瘍マーカー（ホモバニリン酸及びシスタチオニン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図３９】尿中腫瘍マーカー（ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸及びシスタチオニン）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図４０】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩及びコルチゾール21-グルクロニド）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図４１】尿中腫瘍マーカー（3-メトキシチラミン硫酸塩及びコルチゾール）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図４２】尿中腫瘍マーカー（ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸及びコルチゾール21-グルクロニド）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図４３】尿中腫瘍マーカー（ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3-メトキシチラミン硫酸塩及びコルチゾール21-グルクロニド）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図４４】尿中腫瘍マーカー（ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3-メトキシチラミン硫酸塩、シスタチオニン、N-アセチルシステイン及びコルチゾール21-グルクロニド）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図４５】尿中腫瘍マーカー（ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3-メトキシチラミン硫酸塩及びコルチゾール）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図４６】治療前及び治療後の小児がん患児の尿検体を用いて、尿中腫瘍マーカー（ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3-メトキシチラミン硫酸塩、シスタチオニン、N-アセチルシステイン及びコルチゾール21-グルクロニド）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図４７】本発明を適用した装置の構成例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明が提供する方法、装置及びキットでは、小児がん（特に神経芽腫）に関連する新規な尿中腫瘍マーカー及びマーカー群を利用する。この尿中腫瘍マーカーは、小児がんの発症や進行に伴って、また治療前後でその尿中レベルが変動する代謝物であるため、小児がんの検出、小児がんのリスク予測、小児がんのステージ判定、小児がんの予後判定、及び／又は小児がんに対する治療効果のモニタリングなどに有用である。
【００１４】
本発明においてマーカーとして利用する尿中代謝物は、血中の物質と比較すると酵素の影響を受けにくく構造的に安定しているため、腫瘍マーカーとしての利便性が高い。その上、尿を検体に用いるため小児でも容易に採取でき、がんのスクリーニング用途としても非常に利用しやすい。
【００１５】
本発明に係る小児がんの評価方法は、対象由来の尿サンプル中の、尿中代謝物を測定するステップと、その測定結果に基づいて対象における小児がんを評価するステップを含む。
【００１６】
用語「尿中代謝物」又は「尿中腫瘍マーカー」又は「バイオマーカー」とは、小児がんの検出等のために測定する対象となる尿中代謝物、すなわち以下の表に列挙される尿中代謝物を意味する。また「マーカー群」とは、2以上の尿中腫瘍マーカーからなる組み合わせである。「測定する」とは、代謝物の尿サンプル中の相対存在量又は絶対濃度を求めることを意味する。相対存在量とは、意図的に添加した標準物質に対して、目的とする代謝物の測定強度の比である。一方、絶対濃度とは、目的とする代謝物に対して、あらかじめ同じ代謝物を用いて検量線（代謝物の濃度と代謝物の測定強度との関係）を作成し、測定された強度からその絶対濃度を算出する方法である。また本発明では、「尿中腫瘍マーカーを測定する」とは、尿中腫瘍マーカーである代謝物を測定してもよいし、又はその派生物若しくは誘導体を測定してもよい。「派生物」及び「誘導体」とは、尿中腫瘍マーカーである代謝物から派生する物質及び当該代謝物に由来する物質をそれぞれ意味する。「派生物」及び「誘導体」には、例えば、代謝物の断片、修飾された代謝物などが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００１７】
本発明において使用する主な尿中腫瘍マーカーを以下の表1にまとめる。健常な児58名、小児がん患者（神経芽腫）6名の尿中代謝物を網羅的に解析し、その結果に対して、ウィルコクソン順位和検定、ランダムフォレスト解析により、重要な代謝物を30個抽出した。その中から、構造既知で、その代謝経路がわかっているものだけを抜き出した代謝物が表1に示される。表中、「代謝物」の欄では、データベースによる検索の結果、構造がわかった代謝物の名称を示す。また、「質量」の欄には、「検出プラットフォーム」の欄に記載された検出手段により検出した場合の質量を示す。「検出プラットフォーム」の欄における「LC/MS Neg」及び「LC/MS Pos」とは、それぞれ「液体クロマトグラフ質量分析装置（LC/MS）の負イオン検出モード」及び「液体クロマトグラフ質量分析装置（LC/MS）の正イオン検出モード」を表している。なお、この表では、検出プラットフォームとして、LC/MS正イオン検出モード又はLC/MS負イオン検出モードの一方が記載されているが、用いる装置によっては、正イオン検出モードと負イオン検出モードを高速に反転できる場合があり、その場合には、検出プラットフォームとして、正イオン検出モードと負イオン検出モードの双方が記載される。
【００１８】
【表１】
2019168319.tif 000003
【００１９】
また、表1に示される代謝物は、表1の「代謝経路」の項目に示すように、チロシン代謝に関係するもの、メチオニン・システイン・SAM・代謝に関係するもの（本明細書中、「メチオニン系代謝」と省略する）、コルチコステロイドに関係するもの、プテリン代謝に関係するものに分けられる。
【００２０】
一実施形態において、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示す3-メトキシチラミン硫酸塩（3-methoxytyramine sulfate）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量246.04416として計測される化合物を測定する。
【００２１】
一実施形態において、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示すコルチゾール（cortisol）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量361.20204として計測される化合物を測定する。
【００２２】
一実施形態において、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示すコルチゾール21-グルクロニド（cortisol 21-glucuronide）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量537.23413として計測される化合物を測定する。
【００２３】
一実施形態では、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示すN-アセチルシステイン（N-acetylcysteine）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量162.02304として計測される化合物を測定する。
【００２４】
一実施形態では、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示す3-メトキシチロシン（3-methoxytyrosine）を測定する。すなわち、LC/MS正イオン検出モードで質量212.09174として計測される化合物を測定する。
【００２５】
一実施形態では、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示すフェノールグルクロニド（phenol glucuronide）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量269.06667として計測される化合物を測定する。
【００２６】
一実施形態において、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示す3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート（3,4-dihydroxyphenylacetate）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量123.04515として計測される化合物を測定する。
【００２７】
一実施形態では、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示す3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩（3,4-dihydroxyphenylacetate sulfate）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量246.99179として計測される化合物を測定する。
【００２８】
一実施形態では、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示すホモバニリン酸（homovanillate）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量181.05063として計測される化合物を測定する。
【００２９】
一実施形態では、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示すキサントプテリン（xanthopterin）を測定する。すなわち、LC/MS正イオン検出モードで質量180.0516として計測される化合物を測定する。
【００３０】
一実施形態において、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示すバニルラクテート（vanillactate）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量211.06119として計測される化合物を測定する。
【００３１】
一実施形態において、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示す3-メトキシチラミン（3-methoxytyramine）を測定する。すなわち、LC/MS正イオン検出モードで質量168.10191として計測される化合物を測定する。
【００３２】
一実施形態において、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示すバニリルマンデル酸（vanillylmandelate）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量197.04555として計測される化合物を測定する。
【００３３】
一実施形態において、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示すS-アデノシルホモシステイン（S-adenosylhomocysteine）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量383.11431として計測される化合物を測定する。
【００３４】
一実施形態において、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示す3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール（3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol）を測定する。すなわち、LC/MS正イオン検出モードで質量167.07028として計測される化合物を測定する。
【００３５】
一実施形態において、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示すドーパミン（dopamine）を測定する。すなわち、LC/MS正イオン検出モードで質量154.08626として計測される化合物を測定する。
【００３６】
一実施形態において、尿中腫瘍マーカーとして、表1に示すシスタチオニン（cystathionine）を測定する。すなわち、LC/MS正イオン検出モードで質量223.07471として計測される化合物を測定する。
【００３７】
なお、表1に示した代謝物の解析に使用した質量分析計は非常に高分解能であるため、質量が小数点以下2桁、3桁、4桁又は5桁程度まで測定可能であるが、分解能の低い質量分析計を使用する場合には、整数質量又は小数点以下1桁の質量を測定することになる。
【００３８】
本発明では、表1に示した尿中腫瘍マーカーを1つ使用して、小児がんの評価や治療の効果のモニタリングを行うことができる。これらの代謝物について、単回帰による解析結果は図３〜１９に示されている。具体的には、
（i）3-メトキシチラミン硫酸塩、バニルラクテート、ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、フェノールグルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、3-メトキシチロシン、3-メトキシチラミン、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及びドーパミンからなる群より選択されるチロシン系代謝経路の代謝物；
（ii）N-アセチルシステイン、シスタチオニン、及びS-アデノシルホモシステインからなる群より選択されるメチオニン系代謝経路の代謝物；
（iii）コルチゾール21-グルクロニド及びコルチゾールからなる群より選択されるコルチコステロイド系代謝経路の代謝物；並びに
（iv）キサントプテリンであるプテリン系代謝経路の代謝物
からなる群より選択される少なくとも1つの代謝物を測定する（但し、ホモバニリン酸のみ又はバニリルマンデル酸のみを測定する場合を除く）。
【００３９】
また本発明では、尿中腫瘍マーカーを少なくとも2つ、あるいは3つ以上組み合わせて使用することによって、より正確かつ高精度の小児がん評価や、治療の効果のモニタリングが可能となる。例えば、表1に示す尿中腫瘍マーカーを組み合わせることができる。マーカーの組み合わせは特に限定されるものではない。好ましい実施形態では、異なる代謝経路に関係する尿中腫瘍マーカーを組み合わせて使用する。具体的には、
（i）3-メトキシチラミン硫酸塩、バニルラクテート、ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、フェノールグルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、3-メトキシチロシン、3-メトキシチラミン、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及びドーパミンからなる群より選択されるチロシン系代謝経路の代謝物；
（ii）N-アセチルシステイン、シスタチオニン、及びS-アデノシルホモシステインからなる群より選択されるメチオニン系代謝経路の代謝物；
（iii）コルチゾール21-グルクロニド及びコルチゾールからなる群より選択されるコルチコステロイド系代謝経路の代謝物；並びに
（iv）キサントプテリンであるプテリン系代謝経路の代謝物
からなる群より選択される少なくとも2つの代謝物であって、
−（i）の群より選択される少なくとも1つのチロシン系代謝経路の代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つのコルチコステロイド系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（i）の群より選択される少なくとも1つのチロシン系代謝経路の代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つのメチオニン系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（i）の群より選択される少なくとも2つのチロシン系代謝経路の代謝物の組み合わせ；
−（i）の群より選択される少なくとも1つのチロシン系代謝経路の代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つのプテリン系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（iii）の群より選択される少なくとも1つのコルチコステロイド系代謝経路の代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つのプテリン系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（ii）の群より選択される少なくとも1つのメチオニン系代謝経路の代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つのプテリン系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（ii）の群より選択される少なくとも2つのメチオニン系代謝経路の代謝物の組み合わせ；
−（ii）の群より選択される少なくとも1つのメチオニン系代謝経路の代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つのコルチコステロイド系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（iii）の群より選択される少なくとも2つのコルチコステロイド系代謝経路の代謝物の組み合わせ
−（i）の群より選択される少なくとも1つのチロシン系代謝経路の代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つのメチオニン系代謝経路の代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つのコルチコステロイド系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（i）の群より選択される少なくとも1つのチロシン系代謝経路の代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つのメチオニン系代謝経路の代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つのプテリン系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（i）の群より選択される少なくとも1つのチロシン系代謝経路の代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つのコルチコステロイド系代謝経路の代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つのプテリン系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（ii）の群より選択される少なくとも1つのメチオニン系代謝経路の代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つのコルチコステロイド系代謝経路の代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つのプテリン系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（i）の群より選択される少なくとも2つのチロシン系代謝経路の代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つのコルチコステロイド系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（i）の群より選択される少なくとも2つのチロシン系代謝経路の代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つのメチオニン系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（i）の群より選択される少なくとも2つのチロシン系代謝経路の代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つのプテリン系代謝経路の代謝物との組み合わせ；
−（i）の群より選択される少なくとも1つのチロシン系代謝経路の代謝物と、（ii）の群より選択される少なくとも1つのメチオニン系代謝経路の代謝物と、（iii）の群より選択される少なくとも1つのコルチコステロイド系代謝経路の代謝物と、（iv）の群より選択される少なくとも1つのプテリン系代謝経路の代謝物との組み合わせ
を測定する。
【００４０】
なお、単独の尿中腫瘍マーカーの場合は個別に評価していけばよいが、2個以上の複数の尿中腫瘍マーカーを検討する場合には、その組み合わせが多様となるため、評価が非常に煩雑である。そこで、2個以上の組み合わせについて、どのような組み合わせが良いかを判断する基準として、以下に示す精度変数R2Yと予測変数Q2という評価変数を用いることができる。
【数１】
2019168319.tif 000004
【００４１】
ここで、Yobsは実測値、YcalcはOPLSによる計算値、Ypredは交差検証を行った際の予測値、
2019168319.tif 000005
は平均値を表す。交差検証とは、データを分割し、その一部をまず解析して残る部分でその解析のテストを行い、解析自身の妥当性の検証・確認に当てる手法を示す。これによれば、精度変数R2Yの値が1に近いほどモデルの精度は高く、予測変数のQ2値が1に近いほどモデルの予測性は高いといえる。この精度変数及び予測変数の値の高い組み合わせを小児がんの評価に使用することで、より高精度な評価が可能になると考えられる。
【００４２】
なお、尿中腫瘍マーカーの組み合わせは、評価対象となる小児がんの種類、対象の種類、性別、年齢や、小児がんの評価の目的などに応じて、適宜選択することができる。
【００４３】
具体的な実施形態において、例えば以下の組み合わせを測定する。
2019168319.tif 000006
【００４４】
尿中腫瘍マーカーの識別の方法の一例として、多変量解析の一種である部分最小二乗法、特にOPLS-DAを用いることができる。代謝物解析では健常者に対してがん患者で変動する代謝物が多数見つかる場合がある。この多次元データをそのまま用いるとデータが持つ特徴がわかりにくい場合があるため、2次元又は3次元データに縮約して視覚化することが好ましい。例えば、図３〜４６に、プロットした解析結果の例を示している。多変量解析としては、主成分分析などの当技術分野で公知の解析方法を使用することも可能である。
【００４５】
本発明において評価対象となるがんは、小児がんである。小児がんとは、小児、特に0〜15歳までの児がかかる悪性腫瘍の総称である。具体的には、白血病、脳腫瘍（神経膠腫、胚細胞腫瘍、髄芽腫等）、脊髄腫瘍、神経芽腫（神経芽細胞腫とも称される）、リンパ腫、網膜芽細胞腫、悪性骨腫瘍（骨肉腫、ユーイング肉腫等）、腎臓の悪性腫瘍（腎芽腫、ウィルムス腫瘍等）、横紋筋肉腫、肝芽腫、胚細胞腫瘍などが含まれる。特に本発明は、神経芽腫の評価に適用することが好ましい。がんには、原発性、転移性、再発性のものがあり、またその進行度と広がりの程度からステージに分類されている。この原発性、転移性又は再発性の違いや、ステージの違いに応じて、必要な処置（治療方法）も異なる。
【００４６】
尿サンプルとは、対象から採取した尿、及び当該尿を処理して得られるサンプル（例えば、トルエン、キシレン、塩酸などの保存料を添加した尿）を意味する。
【００４７】
また対象は、小児、具体的には0〜15歳までの児である。しかし、ヒトに限定されるものではなく、その他の哺乳動物、例えば霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、ウサギなど）などであってもよい。
【００４８】
尿中腫瘍マーカーの測定は、尿サンプル中のその量又は濃度を、好ましくは半定量的又は定量的に測定することを意味し、その量は、絶対量であってもよいし又は相対量であってもよい。測定は、直接的又は間接的に行うことができる。直接的な測定は、サンプル中に存在する尿中代謝物の分子数と直接相関するシグナルに基づいて、その量又は濃度を測定することを含む。そのようなシグナルは、例えば尿中代謝物の特定の物理的又は化学的な特性に基づいている。間接的な測定は、二次成分（すなわち尿中代謝物以外の成分）、例えばリガンド、標識又は酵素反応生成物から得られるシグナルの測定である。
【００４９】
本発明の一実施形態では、尿中腫瘍マーカー、すなわち尿中代謝物を測定するが、その測定方法は、当技術分野で公知の方法又は手段を用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、尿中腫瘍マーカーの測定は、尿中代謝物に特有の物理的又は化学的特性を測定するための手段、例えば正確な分子量又はNMRスペクトル等を測定するための手段によって行うことができる。尿中代謝物を測定するための手段としては、質量分析計、NMR分析計、二次元電気泳動装置、クロマトグラフ、液体クロマトグラフ質量分析装置（LC/MS）等の分析装置が挙げられる。これら分析装置を単独で使用して尿中腫瘍マーカーを測定してもよいが、複数の分析装置により尿中腫瘍マーカーを測定してもよい。
【００５０】
あるいは、測定対象の代謝物を検出するための試薬、例えば免疫反応試薬、酵素反応試薬などが利用できる場合には、そのような試薬を利用して尿中の代謝物を測定することができる。
【００５１】
表1に示された尿中代謝物は、LC/MSにより見出されたものであるため、LC/MSを使用すればこれらの尿中代謝物を測定することができる。
【００５２】
以上のようにして、対象から採取した尿サンプルに含まれる尿中腫瘍マーカーを測定し、その結果に基づいて対象における小児がんを評価することが可能である。さらに、対象から複数の時点に採取した尿サンプルにおいて尿中腫瘍マーカーを測定してもよい。
【００５３】
本発明の小児がんの評価方法によって、小児がんの存在や進行を早期に判定することができる。すなわち、現在利用可能な診断手法又は基準によっては認識されない初期ステージの小児がんの有無を判定したり、小児がんの悪性度や予後を予測することができる。そのため、対象は、小児がんの治療を早期に受けたり、特定の悪性度などに適した治療を受けたりすることが可能となる。また、小児がんの治療の効果についてモニターすることができ、治療の効果に応じて治療の停止、継続又は変更を検討することが可能となる。さらに、尿サンプルを利用することから低侵襲性であり、簡便かつ低コストに小児がんを評価でき、定期的な採血が困難な小児では特に大きな利点である。
【００５４】
本発明の小児がんの評価方法は、尿中代謝物である尿中腫瘍マーカーを測定するための手段を備えたキット及び／又は装置を用いることによって、容易かつ簡便に行うことができる。
【００５５】
本発明に係る小児がんの評価用キットは、少なくとも以下の手段を含む：
尿サンプル中の尿中代謝物、好ましくは上記表1に示される尿中代謝物の少なくとも1つを測定するための手段。
【００５６】
本発明のキットの一例は、質量分析用試薬セットであり、例えば同位体標識試薬、分画用ミニカラム、緩衝液等により構成される。キットの別の例は、免疫反応用試薬セットであり、例えば、一次抗体を固定した基板、二次抗体等により構成される。また別の例として、酵素反応用試薬セットは、例えば、酵素、緩衝液等により構成される。本発明のキットは、本発明の方法を実施するための手順及びプロトコールを記載した説明書、小児がんの評価において使用する基準値又は基準範囲を示した表などを含んでもよい。
【００５７】
本発明のキットに含まれる構成要素は、個別に提供されてもよいし、又は単一の容器内に提供されてもよい。好ましくは、本発明のキットは、本発明の方法を実施するために必要な構成要素の全てを、即時に使用することができるように、例えば調整された濃度の構成要素として含む。
【００５８】
本発明に係る小児がんの評価装置は、以下の手段を備える：
尿サンプル中の尿中代謝物、好ましくは上記表1に示される尿中代謝物の少なくとも1つを測定する測定部と、
上記測定部で測定した尿中代謝物の測定値を基準値又は前回の測定値と比較する比較部と、
上記比較部で得られた比較結果から小児がんを評価する判定部。
【００５９】
また、本発明に係る小児がんの評価装置は、多変量解析を用いる場合、以下の手段を備える：
尿サンプル中の尿中代謝物、好ましくは上記表1に示される尿中代謝物の少なくとも二つ以上を測定する測定部と、
上記測定部で測定した説明変数（尿中代謝物の量若しくは濃度、又は健常児に対して小児がん患者で増減している代謝物の観測されたイオンの強度比）から多変量解析して得られたがん検査モデルに基づいて計算された目的変数の計算値（健常か小児がんかを示す指標）を、基準値又は前回の目的変数の計算値と比較する比較部と、
上記比較部で得られた比較結果から小児がんを評価する判定部。
【００６０】
本発明の装置は、好ましくは、本発明の方法を実施することができるように、上記の測定部、比較部及び判定部が互いに動作可能なように連結されたシステムである。本発明の装置の一実施形態を図４７に示す。
【００６１】
ここで、測定部は、上述のように、尿サンプル中の尿中代謝物を測定するための手段を含み、例えば質量分析計、NMR分析計、二次元電気泳動装置、クロマトグラフ、液体クロマトグラフ質量分析装置等の分析装置を備えている。
【００６２】
測定部は、上述したような分析装置等から得られた測定値を処理するソフトウエアと計算機よりなるデータ解析部を備えている。データ解析部は、上述したような分析装置等から得られた測定値に基づいて検量線等のデータを参照することで、尿サンプルに含まれる尿中代謝物の量若しくは濃度を算出する。一方、データ解析部は、多変量解析を用いる場合には、上記測定部で測定した説明変数（尿中代謝物の量若しくは濃度、又は健常児に対して小児がん患者で増減している代謝物の観測されたイオンの強度比）から多変量解析して得られたがん検査モデルに基づいて計算された目的変数の計算値（健常か小児がんかを示す指標）を算出する。データ解析部は、例えば、シグナル表示部分、測定値を分析するユニット、コンピュータユニット等を含むことができる。
【００６３】
また、比較部は、尿中代謝物の量若しくは濃度に関する基準値を記憶装置（データベース）等から読み出し、上記測定部で測定した尿中代謝物の測定値と基準値とを比較する。一方、比較部は、多変量解析を用いる場合には、目的変数の基準値を記憶装置（データベース）等から読み出し、上記測定部で得られた目的変数の計算値と基準値とを比較する。このとき、比較部は、尿中腫瘍マーカーの種類に応じて適切な基準値を選択して読み出す。あるいは、同一対象における経時的モニタリングの場合には、比較部は、前回の測定値を記憶装置（データベース）等から読み出し、測定部で測定した尿中代謝物の測定値と比較する。
【００６４】
さらに、判定部は、比較部において尿中代謝物の測定値と基準値とを比較した結果に基づいて、あるいは比較部において複数の時点における尿中代謝物の測定値を比較した結果に基づいて、小児がんを評価する。一方、判定部は、多変量解析を用いる場合、比較部において目的変数の計算値と基準値を比較した結果に基づいて、あるいは比較部において複数の時点における目的変数の計算値を比較した結果に基づいて、小児がんを評価する。ここで、判定部は、対象における小児がんの存在や小児がんの種類等を示す情報を取得する。好ましい装置は、専門の臨床医の知識がなくても使用することができるものであり、例えば、単にサンプルを付加すればよい電子的装置がある。
【００６５】
本発明の装置は、データ保存部、データ出力・表示部などをさらに備えるものであってもよい。
【００６６】
本明細書中、「小児がんの評価」とは、対象における小児がんを検出すること、対象における小児がんのリスクを予測すること、対象における小児がんのステージを判定すること、対象における小児がんの予後を判定すること、対象に存在する小児がんに対する治療の効果をモニタリングすることを含む意味である。小児がんの悪性度、例えばステージや予後（転移、再発など）に応じて適用すべき治療が異なることから、小児がんのステージや予後を判定することは重要である。また本発明において「評価」は、既に評価又は診断された小児がんの継続的なモニタリング、及び既に行った小児がんの評価又は診断の確認も包含する。
【００６７】
なお、本発明に係る小児がんの評価方法、評価用キット及び評価装置による「評価」は、統計学的に有意な割合の対象を評価できることを意図している。よって本発明に係る小児がんの評価方法、評価用キット及び評価装置による「評価」には、評価対象の全て（すなわち100％）について必ず正しい結果が得られない場合も含まれる。統計的に有意な割合は、様々な周知の統計評価ツール、例えば信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、マン・ホイットニー検定等を用いて決定することができる。好ましい信頼区間は、少なくとも90％である。p値は、好ましくは、0.1、0.01、0.05、0.005又は0.0001である。より好ましくは、対象の少なくとも60％、少なくとも80％又は少なくとも90％を、本発明に係る小児がんの評価方法、評価用キット及び評価装置によって適切に評価することができる。
【００６８】
小児がんの評価の具体例は次のとおりである。一実施形態において、対象の尿サンプル中の尿中腫瘍マーカー（尿中代謝物）を測定し、その測定値を基準値と比較する。
【００６９】
基準値は、特定の小児がんの存在の指標となる尿中代謝物の量若しくは濃度、又はその量若しくは濃度の範囲である。一方、多変量解析を用いる場合、健常児と小児がん患者を識別する目的変数の計算値が基準値となる。例えば、基準値は、健常児（集団）又は小児がんの低リスク者（集団）に由来するものとすることができる。あるいは、基準値は、特定の小児がんに罹患している又は小児がんの既知のステージに罹患している又は特定の予後を示す小児がんを有する患者（患者集団）に由来するものとすることができる。個々の対象に適用する基準値は、対象動物の種類、年齢、性別などの様々な生理学的パラメータに応じて変化しうる。
【００７０】
好ましくは、尿中腫瘍マーカーの量又は濃度と特定の小児がんの存在及び／又は特定のステージ若しくは予後の小児がんとの相関をデータベースとして記録する。そして、測定された尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーの測定値を、データベース中の基準値と比較することができる。このようなデータベースは、小児がん、特に小児がんの有無や特定のステージ若しくは予後の指標となる基準値又は基準範囲として有用である。
【００７１】
表1に示した尿中代謝物は、小児がん患者と健常児においてその量又は濃度に差があり、小児がんの存在により、また治療の開始前又は開始後に、その量又は濃度が変化する。例えば、表1に示す尿中腫瘍マーカーのうち、フェノールグルクロニド及びN-アセチルシステインは、健常児と比較して小児がん患者においてその量又は濃度が減少し、3-メトキシチラミン硫酸塩、バニルラクテート、ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、3-メトキシチロシン、3-メトキシチラミン、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、ドーパミン、シスタチオニン、S-アデノシルホモシステイン、コルチゾール21-グルクロニド、コルチゾール及びキサントプテリンは、小児がん患者においてその量又は濃度が上昇する。
【００７２】
従って、基準値が健常児（集団）又は小児がんの低リスク児（集団）に由来するとき、小児がんの存在に関連して尿中代謝物の量又は濃度が高くなることがわかっている代謝物をマーカーとして使用する場合には、尿中代謝物の量又は濃度が基準値と同程度又はそれより低い場合には、対象が小児がんを発症している可能性が低く、基準値より高い場合には、対象が小児がんを発症している可能性が高いことを示す。一方、小児がんの存在に関連して尿中代謝物の量又は濃度が低くなることがわかっている代謝物をマーカーとして使用する場合には、尿中代謝物の量又は濃度が基準値と同程度又はそれより高い場合には、対象が小児がんを発症している可能性が低く、基準値より低い場合には、対象が小児がんを発症している可能性が高いことを示す。
【００７３】
基準値が特定の小児がんに罹患している又は小児がんの既知のステージに罹患している又は特定の予後を示す小児がんを有する患者（患者集団）に由来するとき、小児がんの存在に関連して尿中代謝物の量又は濃度が高くなることがわかっている代謝物をマーカーとして使用する場合には、尿中腫瘍マーカーの量又は濃度が基準値と同程度又は有意差がないあるいは基準値より高いと判断される場合には、対象がその特定の小児がんを発症している可能性が高い又はその既知のステージの小児がんを発症している可能性が高い又はその特定の予後を示す可能性が高いことを示す。一方、小児がんの存在に関連して尿中代謝物の量又は濃度が低くなることがわかっている代謝物をマーカーとして使用する場合には、尿中腫瘍マーカーの量又は濃度が基準値と同程度又は有意差がないあるいは基準値より低いと判断される場合には、対象がその特定の小児がんを発症している可能性が高い又はその既知のステージの小児がんを発症している可能性が高い又はその特定の予後を示す可能性が高いことを示す。さらに、複数の尿中腫瘍マーカーを用いた多変量解析を実施することも可能である。
【００７４】
別の実施形態では、対象から複数の時点で尿サンプルを採取し、それぞれの測定時点における尿サンプルに含まれる尿中腫瘍マーカーを測定し、尿中腫瘍マーカーの測定値をそれぞれの測定時点で比較する。より具体的には、第1の時点における尿中腫瘍マーカーの量又は濃度（a）と第2の時点における尿中腫瘍マーカーの量又は濃度（b）とを比較する。多変量解析を行った場合には、例えば、１つの成分の第1の時点における計算値と第2の時点における計算値とを比較する。測定は、経時的に少なくとも2回、3回、4回、5回、10回、15回、20回、30回、又はそれ以上の回で、例えば1日、2日、5日、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、半年、1年、2年、3年、5年、又はそれ以上の期間を空けて、行うことができる。この比較によって、経時的なモニタリングを行うことができ、小児がんの進行、小児がんの転移又は再発などを評価することができる。
【００７５】
また別の実施形態では、本発明に使用される尿中腫瘍マーカーを利用して、対象における小児がんに対する治療（治療薬又は治療法）の効果をモニタリングすることができる。具体的には、
（a）治療薬又は治療法による処置を受ける前に、小児がんを有する患者からの尿サンプルにおいて尿中代謝物を測定するステップ、
（b）治療薬又は治療法による処置を受けた後に、小児がんを有する患者からの尿サンプルにおいて尿中代謝物を測定するステップ、
（c）必要に応じて、ステップ（b）を繰り返すステップ、
（d）（a）〜（c）の測定結果に基づいて小児がんに対する治療薬又は治療法の効果をモニタリングするステップ
を含む。
【００７６】
上記方法では、治療薬又は治療法による処置を受ける前に、小児がんを有する患者から尿サンプルを採取し、尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する。小児がんを有する患者に治療薬又は治療法による処置が行われた後、適当な時期に尿サンプルを採取して、尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する。例えば、処置の直後、30分後、1時間後、3時間後、5時間後、10時間後、15時間後、20時間後、24時間（1日）後、2〜10日後、10〜20日後、20〜30日後、1ヶ月〜6ヵ月後に尿サンプルを採取する。尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーの測定については前記と同様に行うことができる。本発明の尿中腫瘍マーカーは、例えば図４６に示されるように、治療前後のがん患者を識別することができる。そのため、治療前後に尿中腫瘍マーカーを測定することによって、その治療薬又は治療法による処置の効果をモニタリングすることが可能となる。モニタリングの結果に基づいて、治療の停止、継続又は変更を検討する一助となる。
【００７７】
さらに小児がんの評価方法は、他の従来公知の小児がんの診断方法と組み合わせて行ってもよい。そのような公知の小児がんの診断方法としては、画像検査（例えば超音波検査、コンピュータ断層撮影（CT）、X線検査、磁気共鳴撮影（MRI）、ポジトロンCT（PET）等）、内視鏡検査、生検による病理検査（骨髄液又は脳脊髄液検査等）、血中がんマーカーの測定などが挙げられる。
【００７８】
上述の評価結果に基づいて、医師は、対象の小児がんについて診断を行い、適切な処置を行うことができる。すなわち本発明は、対象において小児がんを評価し、治療する方法にも関する。例えば、本発明に係る小児がんの評価方法に従って対象における小児がんを評価し、対象が小児がんを発症している可能性が高いと評価された場合、対象において小児がんを治療する又は小児がんの進行を予防する処置を行う。また、対象における小児がんのステージが進行している又は小児がんの予後が悪い可能性が高いと評価された場合には、治療を継続したり、必要であれば治療法の変更を検討する。あるいは、対象において小児がんが存在する可能性が高いと評価された場合には、上述したような他の小児がんの診断方法を行って、がんの存在を確定する。さらに、治療前後での評価結果に基づいて、治療の効果をモニタリングし、治療の停止、継続又は変更を決定する。
【００７９】
小児がんは、外科手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、陽子線治療、重粒子線治療などを、単独で又は適宜組み合わせて行うことができる。小児がんの治療は、小児がんの種類、ステージ、悪性度、患児の性別、年齢及び状態、患児の治療に対する応答性などを考慮して、当業者であれば適宜選択することができる。
【００８０】
本発明を適用した例として、検査センタにおけるがん検査について説明する。検査センタでは、被検査者からの請求等に応じてがん検査の案内を行う。被検査者は一次検査の申し込みに際し、検査のバイオマーカー数の選択を行ってもよい。例えば、バイオマーカー数としては1〜3種類の代謝物が挙げられる。これは、他のバイオマーカーと組み合わせて、全がん検査（いろいろながんを一度に解析する）として利用することもできる。
【００８１】
続いて、検査センタは尿採取に必要な検査キットを被検査者に渡す。必要に応じて郵送などにより送付する。被検査者は検査キットを受け取った後、検査センタに検体を渡す、又は送付等行う。検査センタでは、検体を続く検査のため必要に応じて、約−80℃に冷凍保存しておく。検査センタでは一次検査を行い、検査結果を被検査者に送る。
【００８２】
被検査者は、一次検査の結果を受け取り、内容に応じて二次検査の申し込みを行ってもよいし、より詳細な診断を受けてもよい。これにより、一次検査でのがんの疑いを確証したり、さらにはがんの部位及び／又はがん種を特定することが可能となる。
【００８３】
また、本発明に使用される尿中腫瘍マーカーを利用して、小児がんの治療（治療薬又は治療法）の有効性を評価する、あるいは小児がんの治療薬候補をスクリーニングすることができる。具体的には、小児がんの治療の有効性を評価する方法、又は小児がんの治療薬候補をスクリーニング方法は、
（a）被験治療薬又は治療法による処置を受けた小児がんを有する動物からの尿サンプルにおいて、尿中代謝物を測定するステップ、
（b）（a）の測定結果に基づいて小児がんに対する被験治療薬又は治療法の有効性を評価するステップ
を含む。
【００８４】
本発明の方法では、小児がんを有する動物、すなわち小児がんを発症している又は発症リスクのある動物から尿サンプルを採取し、尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する。好ましくは、被験治療薬又は治療法による処置を行う前に、小児がんを有する動物から尿サンプルを採取し、尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する。小児がんを有する動物に被験治療薬又は治療法による処置が行われた後、適当な時期に尿サンプルを採取して、尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する。例えば、処置の直後、30分後、1時間後、3時間後、5時間後、10時間後、15時間後、20時間後、24時間（1日）後、2〜10日後、10〜20日後、20〜30日後、1ヶ月〜6ヵ月後に尿サンプルを採取する。尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーの測定、小児がんの評価については前記と同様に行うことができる。
【００８５】
対象となる動物は、小児がんを患うヒトであってもよいし、あるいは小児がんモデル動物（マウス、ラット、ウサギなど）であってもよい。一般的には、モデル動物において被験治療薬又は治療法の有効性が確認された後に、ヒトにおいて、例えば臨床試験などにより有効性の評価が行われる。
【００８６】
評価又はスクリーニングの対象となる被験治療薬又は治療法の種類は特に限定されるものではない。例えば、被験治療薬又は治療法は、任意の物質的因子、具体的には、天然に生じる分子、例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体、例えば、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸、二本鎖RNA（RNAi）等）など；天然に生じない分子、例えば低分子有機化合物（無機及び有機化合物ライブラリー、又はコンビナトリアルライブラリー等）など；並びにそれらの混合物を挙げることができる。また治療薬又は治療法は、単一物質であってもよいし、複数の物質から構成される複合体や、食品及び食餌等であってもよい。さらに、被験治療薬又は治療法は、上記のような物質的因子に加えて、放射線、紫外線などであってもよい。
【００８７】
動物の被験治療薬又は治療法による処置は、その治療薬又は治療法の種類により異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、被験治療薬の投与量、投与期間、投与経路などの投与条件は、当業者であれば適切に決定することができる。
【００８８】
また、被験治療薬又は治療法の有効性は、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、被験治療薬又は治療法で処置する時間又は期間、量（大小）、回数などが挙げられる。例えば、被験治療薬の希釈系列を調製するなどして複数の用量を設定することができる。
【００８９】
さらに、複数の被験治療薬又は治療法の相加作用、相乗作用などを検討する場合には、治療薬又は治療法を組み合わせて用いてもよい。
【００９０】
被験治療薬又は治療法の処置後の動物から採取した尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定し、処置前の量又は濃度と比較することによって、被験治療薬又は治療法が、小児がんの消失、小児がんの縮小、小児がんによる症状の改善、小児がんの進行の停止又は減速化に有効であるか否かを評価することができる。
【００９１】
例えば、健常児と比較して小児がん患者においてその量又は濃度が減少する尿中代謝物について、処置後の測定値が処置前の測定値より高いことは、被験治療薬又は治療法が、小児がんの消失、小児がんの縮小、小児がんによる症状の改善、小児がんの進行の停止又は減速化に有効であることを示す。一方、処置後の測定値が処置前の測定値より低い又は処置前の測定値と有意差がないことは、被験治療薬又は治療法が小児がんの治療に有効ではないことを示す。
【００９２】
また、例えば小児がん患者においてその量又は濃度が上昇する尿中代謝物について、処置後の測定値が処置前の測定値より低いことは、被験治療薬又は治療法が、小児がんの消失、小児がんの縮小、小児がんによる症状の改善、小児がんの進行の停止又は減速化に有効であることを示す。一方、処置後の測定値が処置前の測定値より高い又は処置前の測定値と有意差がないことは、被験治療薬又は治療法が小児がんの治療に有効ではないことを示す。
【００９３】
さらに、これらの複数の尿中腫瘍マーカーを用いた多変量解析を実施することも可能である。例えば、尿中腫瘍マーカー2種又は3種、4種、5種又は6種を用いた場合、図２０〜４６に示すようなOPLS-DA解析結果が得られるが、判別線（例えば、横軸の成分の計算値が０を通る直線）によって、健常児と小児がん患者を識別できることがわかる。すなわち、新しい対象の場合、横軸の成分の計算値が小児がん患者の領域から健常児の領域に移ることによって、被験治療薬又は治療法が、小児がんの消失、小児がんの縮小、小児がんによる症状の改善、小児がんの進行の停止又は減速化に有効であることがわかる。一方、横軸の成分の計算値が小児がん患者の領域のままであった場合には、被験治療薬又は治療法が小児がんの治療に有効でないことを示している。
【００９４】
以上から、本発明に係る小児がんの治療の有効性の評価方法により、小児がんを治療又は予防するための治療薬又は治療法を見出し、さらには治療薬又は治療法の有効性を確認することができる。
【００９５】
以下に実施例を例示し、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のために提供するものであり、本出願において開示する発明の範囲を限定したり制限したりするものではない。
【実施例】
【００９６】
［実施例１］小児がんと関連する尿中代謝物の網羅的解析
（１−１）小児がんと関連する尿中代謝物の網羅的解析スキーム
小児がんマーカーを同定するため、名古屋大学医学系研究科病態外科学講座小児外科学において、健常な児58名、治療前の小児がん患者6名について尿中代謝物の網羅的解析を行った。
【００９７】
尿中代謝物の網羅的解析による腫瘍マーカーの探索は、以下の(1)〜(7)のように実施した。このフローを図１に示す。基本的には、小児がん患児の尿と同年代の健康な児の尿中代謝物について、液体クロマトグラフ質量分析装置（LC/MS）を用いて網羅的に解析し、健常な児に対して小児がん患者で有意に増減している代謝物を特定し、多変量解析により健常な児と小児がん患者を識別できる尿中腫瘍マーカーを見出すというものである。
【００９８】
(1) 健常児、小児がん患者（治療前後）の尿検体を、臨床的付加情報を含めて、複数の検体を入手する。
(2) 入手した尿検体について、液体クロマトグラフ質量分析装置（LC/MS）による網羅的解析を行う。最終的には、LC/MSで取得したデータから健常児とがん患者尿を識別するために、できるだけ多くの代謝物を計測する。そのために、液体クロマトグラフィにおける複数の分離モード（逆相モードと親水性相互作用モード）と質量分析計における正負エレクトロスプレーイオン化法を組み合わせて、複数の分析を行う。
(3) 得られたデータについてデータ前処理を行い、場合によりウィルコクソン順位和検定により健常児に対してがん患者で有意な差がある尿中代謝物に対して、p値による絞り込むを行う。このときの有意水準は5％とする。
(4) 上位の検定では重要な腫瘍マーカー候補を絞り込むことはできるものの定量的な評価が難しいため、絞り込んだ代謝物に対して、機械学習のひとつであるランダムフォレスト（RF：Random Forest）法を用いて、代謝物の重要度の評価を定量的に行う。重要度という数値が高いほど重要な代謝物となり、上位にランク付けされる。
(5) ランダムフォレスト解析で抽出した代謝物において、その中から2種類を抽出して、精度変数R2Yと予測変数Q2を計算し、予測変数の値の大きい順に並べ、上位にランクされた代謝物を抽出する。
(6) 腫瘍マーカー候補について、公共データベース等の検索の結果で構造が既知物質であることが判明した場合は、その代謝経路解析を行う。それが生体外の薬物等に由来するものでなければ、腫瘍マーカー候補となる。
(7) 最終的に抽出した腫瘍マーカー候補群を用いて、OPLS判別分析法により健常者とがん患者を識別するための判別式を計算し、がん検査モデルを構築する。
尿中代謝物のうち、公共データベース等で検索されない構造未知の代謝物については、得られた正負のマススペクトル、及び正負の質量分析／質量分析スペクトル（MS/MSスペクトル）から構造未知代謝物の構造を推定する。推定した構造について、In−Silicoでのフラグメンテーション解析を行い、測定したMS/MSスペクトルとの一致度を評価する。それが高い場合には、推定構造は正しいものと判断する。構造推定できた場合には、代謝経路解析を実施したうえで、腫瘍マーカー候補となる。
(8) 以上の結果を踏まえて、腫瘍マーカーを含め、検査に向けた最終的な定量アッセイを決定する。
【００９９】
上述したLC/MSによる尿中代謝物網羅的解析結果における統計解析で以下の3点に留意した。
【０１００】
(i)データ前処理
LC/MSによる網羅的解析で得られる結果は、例えば、代謝物に関する情報（構造未知と構造既知代謝物）と、LC/MSによる測定条件に関する情報と、各検体における診療情報と、各代謝物において測定されたイオン強度（観測されたピークの面積値）と液体クロマトグラフにおける溶出時間とで表示される。
【０１０１】
LC/MSにより測定されたイオン強度を考えた場合、そのダイナミックレンジが大きいので、そのまま計算すると、一番大きい変数がすべての分散の計算で支配的になる。そこで、支配的な変数による影響を取り除く必要がある。ここでは、まず、中央値を1として全検体の値を補正した。また、尿検体は身体の状況によってその濃度が異なることが予想される。これを補正するには、尿中クレアチニンの定量による補正法、あるいは凝固点降下により測定された尿中溶質の濃度による補正法を実施した。今回は、後者を用いた。実際の測定には、アドバンスインスツルメンツ社の微量自動浸透圧計フィスケ 210（サンプル量：20uL、測定時間：90秒、測定範囲：0〜2000mOsm/kgH20）を用いた。
【０１０２】
(ii)検定と機械学習
非常に多くの代謝物が検出される中で、健常な小児に対して小児がん患者で有意に増減している代謝物を効率的に特定するために、ウィルコクソン順位和検定により健常児に対してがん患者で有意な差がある尿中代謝物に対して、p値（5％）による絞り込むを行ったのち、機械学習のひとつであるランダムフォレスト（RF：Random Forest）法を用いて、代謝物の重要度の評価を定量的に行った。重要度という数値が高いほど重要な代謝物となり、上位にランク付けされる。ランダムフォレスト解析で抽出した代謝物において、その中から2種類を抽出して、精度変数R2Yと予測変数Q2を計算し、予測変数の値の大きい順に並べ、上位にランクされた代謝物を抽出する。
【０１０３】
(iii)多変量解析
尿中代謝物によるがん検査スキームにおいて、多変量解析は、データの視覚化、又は回帰・判別の予測モデル構築のために用いられている。多変量解析の手法として良く知られ、また代謝物解析で比較的用いられる方法として、主成分分析（PCA: Principal Component Analysis）、部分最小二乗法（PLS: Partial Least Squares）などいくつかの種類がある。PLSには、派生した方法として、PLS判別法、OPLS判別分析等がある。PCAは、説明変数の分散最大化を基準とした次元削減法であるのに対し、PLSは、目的変数と説明変数の共分散の最大化を基準としている。従って、PCAとPLSの違いは、その計算に群情報を用いるか否かであり、前者は教師なし、後者は教師あり次元削減法として区別されている。
【０１０４】
今回の解析では、PCAでまずデータ全体を概観し、代謝物データに加えて群情報（健常な児、治療前小児がん患者）が与えられるOPLS-DAを用いた。
【０１０５】
（１−２）検定の結果
健常な児58名及び小児がん患者6名（神経芽腫）の尿検体について、液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による網羅的解析を行った。その結果検出された代謝物（1331種）に対して、ウィルコクソン順位和検定により、健常な児に対して小児がん患者で有意差のある代謝物を272種まで絞込み、その上でランダムフォレストにより、上位30種まで絞り込んだ。その結果を表2に示した。加えて、この表では、公共データベース検索により確認される代謝経路、観測されたイオンの質量、その際に分析モードを示した。この中でXと記載しているものは、構造が未知の代謝物である。分析モードにおける、LC/MS Neg、LC/MS Posは、それぞれLC/MSにおける負イオン測定、正イオン測定を表す。
【０１０６】
【表２】
2019168319.tif 000007
【０１０７】
表2に示されるように、尿中代謝物として、構造のわかっている3-メトキシチラミン硫酸塩（3-methoxytyramine sulfate）、コルチゾール（cortisol）、コルチゾール21-グルクロニド（cortisol 21-glucuronide）、N-アセチルシステイン（N-acetylcysteine）、3-メトキシチロシン（3-methoxytyrosine）、フェノールグルクロニド（phenol glucuronide）、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート（3,4-dihydroxyphenylacetate）、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩（3,4-dihydroxyphenylacetate sulfate）、ホモバニリン酸（homovanillate）、キサントプテリン（xanthopterin）、バニルラクテート（vanillactate）、3-メトキシチラミン（3-methoxytyramine）、バニリルマンデル酸（vanillylmandelate）、S-アデノシルホモシステイン（S-adenosylhomocysteine）、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール（3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol）、ドーパミン（dopamine）、及びシスタチオニン（cystathionine）の18種、構造のわかっていないX-A、X-B、X-C、X-D、X-E、X-F、X-Gの7種が抽出された。なお、計測された代謝物の中で、明らかに薬などの外因性代謝物と考えられるものは候補から除外した。
【０１０８】
今回対象としている小児がんの中の神経芽腫は、小児期にできる固形腫瘍で、神経芽腫の細胞はカテコラミンという物質を作ることが多い。その結果、尿中のバニリルマンデル酸（VMA）及びホモバニリン酸（HVA）という物質の濃度が高くなることが既に知られている（例えば特許文献１〜３）。これらの物質はチロシン代謝経路に関与していることが確認されており、今回の網羅的分析でも両方の物質が検出されている。ホモバニリン酸（HVA）及びバニリルマンデル酸（VMA）は、通常液体クロマトグラフ質量分析計により検出・定量される。現在、それぞれの基準値が決まっている。これらの代謝物をLC/MSにより検出して、OPLS判別分析を行った結果をそれぞれ図５及び６に示した。
【０１０９】
あわせて、健常な児と小児がん患者を識別するための識別ラインを0.05に設定した場合のがん検査モデルを設定した。なお、代謝物を2個以上用いる場合には、がん検査モデルで使用するような判別分析が可能となる。すなわち、予測値が0より大きいとがんのリスクが高いと判断する（例えば図２）。しかし、代謝物1個での解析では、単回帰分析しかできない。この場合、図５に示すような結果となるが、予測値が0より大きいとがんのリスクが高いと判断するとなると、健常者すべてががんのリスクが高いと判断されてしまう。この場合、識別するのに適当な閾値、例えば図５では0.05を設定して判断することになる。
【０１１０】
健常な児と小児がん患者における識別に関して、以下の表3及び4のような結果が得られた。なお、この場合のがん検査モデルは以下の式に従った。
【数２】
2019168319.tif 000008
【表３】
2019168319.tif 000009
【表４】
2019168319.tif 000010
【０１１１】
さらに、複数の尿中腫瘍マーカーを用いた多変量解析を実施することも可能である。この場合のがん検査モデル式は以下の通りである。
【数３】
2019168319.tif 000011
【０１１２】
例えば、健常な児（58名）に対して小児がん患者（神経芽腫6名）について、尿中腫瘍マーカー2種（バニリルマンデル酸（VMA）とホモバニリン酸（HVA））を用いた場合、上記のがん検査モデルにより計算すると、図２７に示すような解析結果が得られる。また、表5に示すように、健常な児と小児がん患者を高い精度で求めることができる。すなわち、有力なバイオマーカーの数を1個から2個にすることによって、予測におけるエラー率が小さくなっていることがわかる。このように、既存のバイオマーカーVMA又はHVAであっても、これらを組み合わせるか又は他のバイオマーカーと組み合わせて新しいがん検査モデルにすることによって、予測性は高くなることが確認できた。
【表５】
2019168319.tif 000012
【０１１３】
OPLS判別分析法の場合、以上のような形でがん検査モデルで評価することも可能であるが、さらにバイオマーカー数が多くなった場合には、以下のような指標を用いて判断することも可能である。
【数４】
2019168319.tif 000013
【０１１４】
ここで、Yobsは実測値、YcalcはOPLSによる計算値、Ypredは交差検証を行った際の予測値、
2019168319.tif 000014
は平均値を表す。交差検証とは、データを分割し、その一部をまず解析して残る部分でその解析のテストを行い、解析自身の妥当性の検証・確認に当てる手法を示す。これによれば、R2Y値が1に近いほどモデルの精度は高く、Q2値が1に近いほどモデルの予測性は高いといえる。
【０１１５】
そこで、バイオマーカー数を増やした場合のがん検査モデルの良否は、Q2をベースに判断する、予測性が高いがん検査モデルを採用することとした。このとき、基準となるケースはVMA＋HVAの組み合わせの場合と考え、その際のR2Y値、Q2値を計算した。
R2Y＝0.621
Q2＝0.326
【０１１６】
一方、これら2つの尿中腫瘍マーカー（チロシン代謝系）に加えて、健常な児と小児がん患者で大きな変化が観測された他の代謝経路の代謝物質（例えばコルチゾール21グルクロナイド）を加えて3種のバイオマーカーを用いて同様の計算を行うと、図４２に示すような結果が得られた。すなわち、表6に示すように、結果がさらに改善された。特に、健常な児の評価で改善が見られる（図２７との比較）。
【表６】
2019168319.tif 000015
【０１１７】
［実施例２］小児がんと関連する尿中腫瘍マーカーのさらなる解析（１）
表2に示した尿中腫瘍マーカーにおいて、代謝物構造のわかっているものだけを考慮すると、表7のようになる。
【表７】
2019168319.tif 000016
【０１１８】
がん検査モデルにおいて、これらの尿中腫瘍マーカーを単独で使用した場合の、単回帰による解析結果を図３〜１９に示す。
【０１１９】
また、表7に示した尿中腫瘍マーカーのうち2つの組み合わせについて検討した。全部で136通りの組み合わせがあり、その組み合わせのR2Y及びQ2を求め、数値が高い順に並べた。
【表８】
2019168319.tif 000017
2019168319.tif 000018
2019168319.tif 000019
2019168319.tif 000020
2019168319.tif 000021
【０１２０】
以上の解析により、マーカーの組み合わせにより、予測の精度が高まることがわかった。今回の解析で特に高い値を示したのは、3-メトキシチラミン硫酸塩とコルチゾールの組み合わせであった。具体的には、R2Y＝0.893、Q2＝0.851だった。次に高かったのは、3-メトキシチラミン硫酸塩とコルチゾール21-グルクロニドの組み合わせであった。具体的には、R2Y＝0.888、Q2＝0.832だった。以上から、3-メトキシチラミン硫酸塩とコルチゾールの組み合わせ、及び3-メトキシチラミン硫酸塩とコルチゾール21-グルクロニドの組み合わせは特に有力なバイオマーカーと判断した。
【０１２１】
このような解析の中で、尿中代謝物の代謝経路に着目した。具体的には、
（i）表7の3、6、8、10、11、13、19、20、22、25、27に示されるチロシン系代謝経路の尿中腫瘍マーカー；
（ii）表7の1、12、18に示されるメチオニン系代謝経路（メチオニン・システイン・SAM・代謝）の尿中腫瘍マーカー；
（iii）表7の15、17に示されるコルチコステロイド系代謝経路の尿中腫瘍マーカー；
（iv）表7の7に示されるプテリン系代謝経路の尿中腫瘍マーカー
に着目して、図３〜１９に示される結果及び表8のように計算した予測値を解析した。図３〜１９から、チロシン系代謝経路に関与する代謝物の場合、6人目の小児がん患者の値が負の値になる、又は正の値でも小さい値となる傾向が見られる。一方で、メチオニン系代謝経路に関係する代謝物、コルチコステロイド系代謝経路に関係する代謝物では、6人目の小児がん患者の値が比較的大きい。これらの特徴を表9にまとめた。
【０１２２】
【表９】
2019168319.tif 000022
【０１２３】
以上の考察を踏まえて、単回帰あるいはOPLS判別による予測値を示すグラフの一覧を、代謝系毎に表10に纏めた。
【０１２４】
【表１０】
2019168319.tif 000023
【０１２５】
表10では、チロシン系、メチオニン系、コルチコステロイド系、プテリン系に加えて、これらを組み合わせた、チロシン系＋メチオニン系、チロシン系＋コルチコステロイド系、チロシン系＋メチオニン系＋コルチコステロイド系についても記載している。
表10に示す尿中腫瘍マーカーの組み合わせについて、上記と同様にがん検査モデルで評価を行った。その結果を図２０〜４４に示す。
【０１２６】
例えば、チロシン系代謝経路の尿中代謝物とメチオニン系代謝経路の尿中代謝物を組み合わせて評価した場合（例えば図３４〜３９）は、チロシン系代謝経路の尿中代謝物のみを組み合わせて評価した場合（例えば図２０〜３０）やメチオニン系代謝経路の尿中代謝物のみを組み合わせて評価した場合（例えば図３１〜３２）と比べて、擬陽性の出現率が低くなり、より高精度な評価が可能になることがわかる。
【０１２７】
同様に、チロシン系代謝経路の尿中代謝物とコルチコステロイド系代謝経路の尿中代謝物を組み合わせて評価した場合（例えば図４０〜４２）は、チロシン系代謝経路の尿中代謝物のみを組み合わせて評価した場合（例えば図２０〜３０）やコルチコステロイド系代謝経路の尿中代謝物のみを組み合わせて評価した場合（例えば図３３）と比べて、擬陽性の出現率が低くなり、より高精度な評価が可能になることがわかる。
【０１２８】
また、チロシン系代謝経路の尿中代謝物とメチオニン系代謝経路の尿中代謝物とコルチコステロイド系代謝経路の尿中代謝物を組み合わせて評価した場合（例えば図４３〜４４）は、いずれかの代謝経路の尿中代謝物のみを組み合わせて評価した場合に比べて、擬陽性の出現率が低くなり、さらに高精度な評価が可能になることがわかる。
【０１２９】
このように、尿中腫瘍マーカーを組み合わせて使用する場合には、異なる代謝経路に関係する尿中代謝物を組み合わせることで、より精度の高い評価が可能となることがわかった。
【０１３０】
さらに、既存のVMA、HVAは臨床に使用されていることから、これらの組み合わせを検討することも有用である。例えば、VMA（チロシン系）、HVA（チロシン系）、3-メトキシチラミン硫酸塩（チロシン系）及びコルチゾール（コルチコステロイド系）の4種のバイオマーカーを組み合わせた場合についても検討した。その結果、R2Y＝0.878、Q2＝0.786という高い数値を示した。この場合のOPLS判別法による結果を図４５に示した。小児がんを識別する能力が上がっていることがわかる。
【０１３１】
［実施例３］小児がんと関連する尿中腫瘍マーカーのさらなる解析（２）
小児がん患者6名について、治療前後の尿中代謝物の解析を行った。具体的には、ホモバニリン酸（VHA）、バニリルマンデル酸（VMA）、3-メトキシチラミン硫酸塩、シスタチオニン、N-アセチルシステイン及びコルチゾール21-グルクロニドの7種の尿中腫瘍マーカーを組み合わせて、実施例２と同様に予測値を求めた。
【０１３２】
その結果を図４６に示す。この結果からわかるように、治療前の小児がん患者と治療後の小児がん患者の2群が識別できている。そのため、尿中腫瘍マーカーを使用して、小児がんの治療経過を観察したり、治療薬の治療効果を評価できることがわかった。
【０１３３】
既に実施した予備評価により、従来優れた診断法がなかった小児がん診断の分野において、「尿検体を用いた小児がん診断」という新しい領域が創生される可能性が示された。また、尿による検査のため、臨床現場における採取法もこれまでの血液に対して非常に簡便になり、医療従事者の利便性も大きく向上する。
【０１３４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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