(57)【要約】【課題】肝星細胞の活性化を抑制し、筋線維芽細胞を制御して、肝線維化、肝硬変、又は、肝癌を治療又は予防し得る抗線維化剤を提供する。【解決手段】一般式（１）で表される化合物、及び／又はその薬学的に許容される塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を有効成分とする抗線維化剤（一般式（１）中、Ｒ1は、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ2は、水素原子又は置換されていてもよい炭化水素基である。）。【化１】2019108291.tif 000023【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）で表される化合物、及び／又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗線維化剤。
【化１】
2019108291.tif 000020
（前記一般式（１）中、Ｒ1は、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ2は、水素原子又は置換されていてもよい炭化水素基である。）
【請求項２】
前記一般式（１）で表される化合物が、下記式（ａ）で表される化合物を含む、請求項１に記載の抗線維化剤。
【化２】
2019108291.tif 000021
【請求項３】
前記一般式（１）で表される化合物が、下記式（ｂ）で表される化合物を含む、請求項１又は２に記載の抗線維化剤。
【化３】
2019108291.tif 000022
【請求項４】
肝線維化、肝硬変若しくは肝癌の予防又は治療に使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の抗線維化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗線維化剤に関する。より具体的には、本発明は、肝等の線維化を抑制し、肝硬変又は癌を治療することのできる抗線維化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肝癌患者数の増大が問題となっている。２０１２年度国立がん研究センターの報告によると、国内の肝癌死亡者数は男女ともに全癌中４位であり、２０１０年には年間３３０００人にも及んでいる。肝癌は、Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルス感染、多量飲酒や糖尿病肥満と関連する非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を土台として発生する。即ち、肝癌は慢性炎症と線維化肝を母地として生じ、病因の如何を問わず年率８％で発癌し、一旦肝癌が生じると再発と肝内転移を繰り返す。肝硬変とは、肝実質がＩ型コラーゲンなどの細胞外マトリックス蛋白で置換されて機能的肝細胞が減少する病態である。この線維性肝臓は、生理的状態ではビタミンＡ貯蔵を主機能とする肝星細胞（Ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ、ＨＳＣ）が活性化して形質を変えた筋線維芽細胞（Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＭＦＢ）で肝実質が置換される病態である。この形質転換には、トランスフォーミング増殖因子−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−β）や結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＴＧＦ）が関与し、これらの因子が肝星細胞の持続活性化や実質での筋線維芽細胞の増加が肝細胞機能を低下させる要因であり、肝癌発症に寄与することが報告されている（非特許文献１及び２）。そのため、肝星細胞の活性化抑制と筋線維芽細胞の制御が肝繊維化及び肝癌の治療法開発に繋がると考えられている。
【０００３】
肝疾患の治療又は予防剤は、これまでにも種々知られている。
例えば、特許文献１〜３には、メナテトレノン（ビタミンＫ−ＩＩ）を有効成分とする肝疾患治療・予防剤が、肝細胞癌の細胞増殖を抑制したり、肝細胞癌治療後の門脈浸潤の発生を抑制したりできることが報告されている。また、例えば、特許文献４には、メナテトレノンが、慢性肝疾患由来、肝硬変由来、又は、Ｃ型肝炎ウイルス性肝硬変由来の肝癌の発癌を抑制し得ることが報告されている。また、例えば、特許文献５には、アポトーシス促進活性または抗増殖活性に関係する１，４−ナフトキノン系化合物を抗癌剤として使用することが提案されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００１，１７：１６６８
【非特許文献２】Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１２，５６：７６９
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−６７５１３号公報
【特許文献２】特開２００４−１０７３３０号公報
【特許文献３】特開２００４−２０３７４５号公報
【特許文献４】国際公開第２００５／０６５６７１号パンフレット
【特許文献５】特表２００９−５３４４４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１〜３で、肝細胞癌の細胞増殖を抑制したり、肝細胞癌治療後の門脈浸潤の発生を抑制したりできる肝疾患治療・予防剤の有効成分として報告され、特許文献４で、慢性肝疾患由来、肝硬変由来、又は、Ｃ型肝炎ウイルス性肝硬変由来の肝癌の発癌を抑制し得るとして報告されたメナテトレノン（ビタミンＫ−ＩＩ）は、化学構造上は２−メチル−１，４−ナフトキノンの３位誘導体である。また、特許文献５でアポトーシス促進活性および抗増殖活性が実証された１，４−ナフトキノン系化合物は２−メチル−１，４−ナフトキノンの３位誘導体のみである。従って、これらの薬剤の抗癌作用は、２−メチル−１，４−ナフトキノンの３位誘導体という共通構造が関係していると考えられる。
【０００７】
しかも、これらの薬剤は、発癌の抑制、又は、一旦発癌した場合の治療薬であって、発癌の前段階である肝線維化（肝硬変）の治療又は予防については、一切検討されていない。
【０００８】
肝線維化と肝癌の発症の作用機序は異なる。肝癌は、肝線維化が進行して発症するので、肝癌の母地となる肝線維化を予防又は治療することは肝癌を予防する上で非常に有効である。しかしながら、肝線維化（肝硬変）を特効的に治療できる薬は未だ開発されていない。
【０００９】
このような従来技術を背景として、肝線維化を治療又は予防し得る新たな治療技術の開発が切望されている。
【００１０】
本発明の目的は、肝星細胞の活性化を抑制し、筋線維芽細胞を制御して、肝線維化、肝硬変、又は、肝癌を治療又は予防し得る抗線維化剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねたところ、２−メチル−１，４−ナフトキノンの３位誘導体ではない特定の化学構造を有する化合物が、肝星細胞の活性化マーカーであるＡｌｐｈａ−Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ａｃｔｉｎ（αＳＭＡ）の発現を減弱させる、及び／又はサイトグロビン（ＣＹＧＢ）の発現を誘導する特性を有することが分かった。サイトグロビン発現の誘導は、肝硬変・肝癌治療としての作用を発揮すると予想される。サイトグロビンは生理的状態では非活性化肝星細胞に発現するガス分子運搬体であり、活性酸素等のスカベンジャーとしても機能する。肝硬変になるとサイトグロビン陰性の星細胞が主体となるため微小環境は低酸素となり、酸化ストレス、持続炎症を伴いながら発癌の母地となる。また、癌細胞は低酸素環境で管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）を産生しながら成長する。従って、低酸素環境による発癌及び癌細胞の成長を防ぐためにサイトグロビンの発現も有効であると考えられる。
【００１２】
このように、本発明者らは、特定の化合物を有効成分とする抗線維化剤により、αＳＭＡ発現を減弱し、及び／又はサイトグロビン発現を増強することができ、肝硬変等の肝線維化の治療・予防、ひいては線維化した組織を母地として発症する肝癌の治療・予防に有効であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１３】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  下記の一般式（１）で表される化合物、及び／又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗線維化剤。
【００１４】
【化１】
2019108291.tif 000002
（前記一般式（１）中、Ｒ1は、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ2は、水素原子又は置換されていてもよい炭化水素基である。）
項２．  前記一般式（１）で表される化合物が、下記式（ａ）で表される化合物を含む、請求項１に記載の抗線維化剤。
【００１５】
【化２】
2019108291.tif 000003
項３．  前記一般式（１）で表される化合物が、下記式（ｂ）で表される化合物を含む、項１又は２に記載の抗線維化剤。
【００１６】
【化３】
2019108291.tif 000004
項４．  肝線維化、肝硬変若しくは肝癌の予防又は治療に使用される、項１又は２に記載の抗線維化剤。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の抗線維化剤は、星細胞の活性化を抑制し、筋線維芽細胞を制御することができるので、肝等の組織の線維化の予防乃至治療に有効であり、更に、組織の線維化によって生じる癌等の疾患の予防乃至治療にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実験例１のｈＣＯＬ１Ａ２−ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを有するＬＸ−２細胞の構築を表した模式図である。
【図２】実験例１のＬＸ−２細胞の細胞数に対する相対的蛍光シグナル強度を示すグラフである。
【図３】実験例１のＬＸ−２細胞のｍＣｈｅｒｒｙシグナルの相対値を示すグラフである。
【図４】実験例１のｈＣＯＬ１Ａ２−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を導入した細胞と導入していない細胞の顕微鏡写真と蛍光染色写真である。
【図５】ＬＸ−２細胞におけるｈＣＯＬ１Ａ２−ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを用いた細胞評価系による抗線維化剤のスクリーニング候補化合物を表した図である。
【図６】実験例２のＨＨＳｔｅＣ細胞における、各候補化合物の濃度に対するαＳＭＡとＣＹＧＢのｍＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフである。
【図７】実験例３の各候補化合物を添加して培養したＨＨＳｔｅＣ細胞におけるαＳＭＡとＣＹＧＢのｍＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフである。
【図８】実験例４の各化合物を添加して培養したＨＨＳｔｅＣ細胞について、各化合物の濃度に対する生細胞数の相対値を示すグラフである。
【図９】実験例４の各化合物を添加して培養したＨＨＳｔｅＣ細胞における、各化合物の濃度に対するαＳＭＡとＣＹＧＢのｍＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフである。
【図１０】実験例５の各化合物を添加して培養したＨＨＳｔｅＣ細胞におけるαＳＭＡとＣＹＧＢのｍＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフである。
【図１１】実験例６の各化合物を添加して培養したＨＨＳｔｅＣ細胞における、各化合物の濃度に対するαＳＭＡ、ＣＹＧＢ、ＰＰＡＲγ、ＣＯＬ１Ａ１の発現量の相対値を示すグラフである。
【図１２】実験例７の各化合物を添加して培養したＨＨＳｔｅＣ細胞における、各化合物の濃度に対するαＳＭＡ、ＣＹＧＢ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２のｍＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフである。
【図１３】実験例８の各マウスモデルにおける、Ｃ１５投与量に対する血清ＡＬＴ値を示すグラフである。
【図１４】実験例８の各マウスモデルのシリウスレッド染色された肝組織の顕微鏡写真である。
【図１５】実験例８の各マウスモデルの肝組織における、シリウスレッド染色から算出したＣ１５投与量に対する肝線維化面積比を示すグラフである。
【図１６】実験例８の各マウスモデルにおける、Ｃ１５投与量に対するＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ１Ａ２のｍＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の抗線維化剤は、前述の一般式（１）〜（７）で表される化合物、及び、その薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする。
以下、本発明の抗線維化剤について詳述する。
【００２０】
有効成分
本発明の抗線維化剤では、有効成分として、一般式（１）で表される化合物、及び／又はその薬学的に許容される塩を使用する。一般式（１）で表される化合物は、１，４−ナフトキノン骨格を有する化合物である。以下、本発明の抗線維化剤について説明する。
【００２１】
【化４】
2019108291.tif 000005
【００２２】
前記一般式（１）中、Ｒ1は、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基である。αＳＭＡの発現をより効率良く減弱させる等の観点からは、Ｒ1は、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましい。当該アルキル基としては、具体的には、メチル基、エチル基、１−プロピル基、及びイソプロピル基が挙げられ、好ましくは、メチル基又はエチル基が挙げられ、より好ましくはメチル基が挙げられる。
【００２３】
前記一般式（１）中、Ｒ2は、水素原子又は置換されていてもよい炭化水素基である。置換されていてもよい炭化水素基は、直鎖状又は分岐状の鎖状炭化水素基であってよく、飽和炭化水素又は不飽和炭化水素基であってよい。置換されていてもよい炭化水素基の炭素数としては、抗線維化能の観点から、例えば１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、１〜４、１〜３、１〜２又は１が挙げられる。炭素数１〜２０の炭化水素基としては、例えば、炭素数１〜２０のアルキル基、又は、炭素数２〜２０のアルケニル基等が挙げられる。
【００２４】
炭素数１〜２０のアルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、１−メチルエチル、ｎ−ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、ｎ−ペンチル、１−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、１，１−ジメチルプロピル、１-メチルペンチル、２−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１−エチルブチル、１，２，２−トリメチルプロピル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ−オクタデシル、ｎ−ノナデシル、又はｎ−イコシル等が挙げられる。
【００２５】
炭素数２〜２０のアルケニル基としては、少なくとも１の二重結合を有していればよく、例えば、ビニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、１−ペンテニル、１−ヘキセニル、１−ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、ノナデセニル、イコセニル、−ＣＨ2ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ3）2、ＣＨ2ＣＨ2Ｃ（ＣＨ3）＝ＣＨ2が挙げられる。
【００２６】
置換されていてもよい炭化水素基が置換された炭化水素基である場合、その置換基としては、炭化水素基以外の基であり、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基等が挙げられ、好ましくは水酸基が挙げられる。置換されていてもよい炭化水素の例としては、ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）Ｃ（ＣＨ3）＝ＣＨ2が挙げられる。
【００２７】
αＳＭＡの発現をより効率的に減弱させる等の観点から、Ｒ2は、水素原子又は無置換の炭化水素基であることが好ましい。また、サイトグロビンの発現をより強く誘導させる等の観点から、Ｒ2は、水素原子であることが好ましい。
【００２８】
上記一般式（１）で表される化合物の好ましい例としては、下記式（ａ）（ラパコール；Ｌａｐａｃｈｏｌ）、式（ｂ）（２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン：ローソン；Ｌａｗｓｏｎｅ）、式（ｃ）（２−ヒドロキシ−３−メチル−１，４−ナフトキノン）、式（ｄ）（２−メトキシ−３−メチル−１，４−ナフトキノン）、式（ｅ）（２−ヒドロキシ−３−（２−ヒドロキシ−３−メチル−３−ブテン−１−イル）−１，４−ナフトキノン）で表される化合物が挙げられる。
【００２９】
【化５】
2019108291.tif 000006
【００３０】
【化６】
2019108291.tif 000007
【００３１】
【化７】
2019108291.tif 000008
【００３２】
【化８】
2019108291.tif 000009
【００３３】
【化９】
2019108291.tif 000010
【００３４】
一般式（１）で示される化合物は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３５】
前記一般式（１）で示される化合物の塩としては、薬学的に許容される塩であれば特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸塩；モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩等のアミン塩等が挙げられる。これらの塩は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３６】
他の成分
本発明の抗線維化剤は、前述の有効成分の他に、治療対象となる疾患の種類に応じて、他の薬理活性成分を含んでいてもよい。
【００３７】
また、本発明の抗線維化剤は、前記有効成分の他に、所望の投与形態及び製剤形態に調製するために、必要に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を含んでいてもよい。このような担体や添加剤としては、希釈剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、甘味剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、界面活性剤、保湿剤、保存剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、粘稠化剤等が挙げられる。
【００３８】
剤型
本発明の抗線維化剤の剤型については、特に制限されず、その投与形態等に応じて適宜設定すればよい。本発明の抗線維化剤の剤型として、具体的には、注射剤、シロップ剤、細胞懸濁液、リポソーム製剤等の液状製剤；錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤等の固形状製剤等が挙げられる。また、注射剤にする場合には、使用前に生理食塩水等で溶解する用時調製用粉末（例えば凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。
【００３９】
投与対象
本発明の抗線維化剤は、生体内で肝星細胞の活性化を抑制することによって予防又は治療効果が期待される疾患、若しくは、筋線維芽細胞を制御することによって予防又は治療効果が期待される疾患に適用して使用される。
本発明の抗線維化剤は、肝線維化、肝硬変の予防又は治療、若しくは、肝線維化や肝硬変等によって発症する肝癌の予防又は治療にも有効である。
【００４０】
更に、本発明の抗線維化剤は、肝だけでなく、他の組織の線維化に対しても予防や治療に有効であり、線維化組織を母地とする癌の予防や治療にも有効である。すなわち、本発明の抗線維化剤は、肝以外の組織の線維化や癌の予防乃至治療目的で使用することもできる。本発明の抗線維化剤により線維化の予防乃至治療対象となる組織（肝以外）としては、例えば、肺、乳房、心臓、胃、腸、皮膚、骨髄等の組織が挙げられる。
また、癌（肝癌以外）としては、例えば、肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、舌癌、甲状腺癌、腎臓癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫等が挙げられる。
【００４１】
本発明の抗線維化剤において、投与対象となる生物は、線維化が抑制され、が求められる生物であればよく、ヒトの他、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ等の哺乳動物等が挙げられる。
【００４２】
投与方法
本発明の抗線維化剤の投与形態としては、例えば、局所投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経直腸的、皮内投与等の非経口投与；経口投与が挙げられ、適用する疾患の種類等に応じて適宜設定すればよい。本発明の抗線維化剤の投与形態として、好ましくは経口投与が挙げられる。
【００４３】
本発明の抗線維化剤の投与量については、適用する疾患の種類、投与対象者の年齢、性別、体重、症状の程度、投与形態等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、有効成分である一般式（１）で表される化合物及び／又はその塩の総量が１日当たり、５００〜５０００μｇ程度となる量を１回又は数回に別けて投与すればよい。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。なお、図面において、「*」はP＜0.05、「**」はP＜0.01、「***」はP＜0.001であることを示している。
【００４５】
実験例１
（抗線維化物質のスクリーニング）
抗線維化物質の候補化合物をスクリーニングするために、ヒトＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ２）遺伝子プロモーターの下流にｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を組み込んだレンチウイルスを作製し、ヒト肝星細胞株ＬＸ−２細胞にｈＣＯＬ１Ａ２−ｍＣｈｅｒｒｙ  ｒｅｐｏｒｔｅｒを導入した（図１）。
【００４６】
得られた組み換えＬＸ−２細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、又は、サプリメント（ＦＧＦ−２(繊維芽細胞増殖因子−２)、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）添加ＤＭＥＭ培地を含む９６ウェルプレートに、１×１０4、２×１０4、又は、４×１０4ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞濃度となるように播種し、３７℃で７２時間培養した。ＦＧＦ−２は、ＣＯＬ１Ａ２発現抑制作用を持つ。培養後、ｍＣｈｅｒｒｙシグナル強度の測定を行った（励起波長、蛍光波長）。図２に、ＬＸ−２細胞の細胞数に対する相対的蛍光シグナル強度を表すグラフを示し、図３に、各細胞濃度で播種したウェル（Ｓ−：サプリメント無添加、Ｓ＋：サプリメント添加）における相対的シグナル強度を表すグラフを示す。図２のグラフから、細胞数が増加するにつれシグナル強度が増大したこと、及び、図３のグラフから、ＣＯＬ１Ａ２発現抑制作用を持つＦＧＦ２含有サプリメントを添加するとｍＣｈｅｒｒｙシグナルがいずれの細胞数でも減弱したことで、ＬＸ−２細胞にｈＣＯＬ１Ａ２遺伝子が正しく導入されていることが確認された。
【００４７】
図４の上段に、ｈＣＯＬ１Ａ２−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が導入された細胞（hCOL1A2 pro-mCherry）と未導入（No introduction）の細胞との顕微鏡写真を示し、図４の下段に、ｈＣＯＬ１Ａ２−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が導入された細胞（hCOL1A2 pro-mCherry）と未導入の細胞（No introduction）との蛍光シグナルを示す。図４の写真より、ｈＣＯＬ１Ａ２−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が導入された細胞で、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子に由来する蛍光シグナルが検出された。
【００４８】
次いで、ｈＣＯＬ１Ａ２−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の導入が確認された組み換えＬＸ−２細胞を用いて、抗線維化物質の候補化合物スクリーニングを行った。候補化合物として、大阪大学産学連携保有の化合物１８８０種を用いた。スクリーニングは、組み換えＬＸ−２細胞を１×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように、ＤＭＥＭ培地を含む９６ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間培養した。その後、候補化合物を１０μＭとなるように添加し、３７℃で３日間培養を行った。培養後、細胞の蛍光シグナルを測定し、サプリメントの効果の５０％以上のものを選択した。
【００４９】
スクリーニングの結果、ヒットした１０種の化合物を図５に示す。また、具体的な化合物を下記表１に示す。
【００５０】
【表１】
2019108291.tif 000011
【００５１】
実験例２
（スクリーニング化合物によるαＳＭＡとサイトグロビンの発現への影響）
ＨＨＳｔｅＣ細胞（ヒト肝星細胞、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）を２×１０5ｃｅｌｌ／ウェルとなるように、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む無血清ＳｔｅＣＭ培地を含む６ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間培養した。その後、図５に示す候補化合物Ｃ１〜Ｃ１０を０．３〜３０μＭとなるように０．１％ＤＭＳＯ含有無血清ＤＭＥＭ培地で調製・添加し、３７℃で３日間培養を行った。また、コントロールとして、これらの化合物不含の０．１％ＤＭＳＯ含有無血清ＤＭＥＭ培地を添加し、前記と同条件で培養を行った。培養後、αＳＭＡ（α−Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ａｃｔｉｎ）及びサイトグロビン（ＣＹＧＢ）のｍＲＮＡ発現量の測定を行った。
【００５２】
αＳＭＡ及びサイトグロビンのｍＲＮＡ発現量の測定は、以下のとおりに行った。まず、培養後のＨＨＳｔｅＣ細胞を回収した。次いで、ＨＨＳｔｅＣ細胞から全ＲＮＡの抽出を行い、（リアルタイム）ＲＴ−ＰＣＲにより、αＳＭＡ及びサイトグロビンのｍＲＮＡの発現量を測定した。また、コントロールにおけるαＳＭＡ及びサイトグロビンのｍＲＮＡ発現量を１として、各化合物を添加した場合のαＳＭＡ及びサイトグロビンの発現量の相対値を求めた。ＰＣＲで使用した各プライマーの塩基配列を表２に示す。
【００５３】
【表２】
2019108291.tif 000012
【００５４】
図６に、候補化合物の濃度に対するαＳＭＡの相対ｍＲＮＡ量及びサイトグロビン（ＣＹＧＢ）相対ｍＲＮＡ量を表すグラフを示す。図６のグラフから、Ｃ２（ラパコール（Ｌａｐａｃｈｏｌ））を用いた場合に、αＳＭＡの活性が最も抑制され、かつ、サイトグロビン（ＣＹＧＢ）の活性が最も増大することが示された。
【００５５】
実験例３
（選択された化合物によるαＳＭＡとサイトグロビンの発現への影響）
また、実験例２で使用した化合物のうち、Ｃ２：ラパコール及びＣ３：シトロプテンを使用し、培地中の候補化合物の添加濃度を１０μＭにしたこと以外は、前記実験例２と同条件で、αＳＭＡ及びサイトグロビンの発現量の測定を行った。候補化合物を添加しない場合（Ｓ−）のαＳＭＡ及びサイトグロビンのｍＲＮＡ発現量をそれぞれ１として、各化合物Ｃ２及びＣ３によるαＳＭＡ及びサイトグロビンの発現量の相対値を求めた。
【００５６】
各条件でのαＳＭＡ及びサイトグロビン（ＣＹＧＢ）の発現量の相対値を表すグラフを図７に示す。図７のグラフから、Ｃ３：シトロプテンは、Ｓ−の場合に比べてαＳＭＡの発現を有意に抑制するものではなく、且つ、サイトグロビン（ＣＹＧＢ）の発現を有意に誘導するものではなかった。一方、Ｃ２：ラパコールは、Ｓ−の場合に比べて有意にαＳＭＡの発現を抑制し、且つ、有意にサイトグロビン（ＣＹＧＢ）の発現を誘導した。
【００５７】
実験例４
（１，４−ナフトキノン系化合物によるαＳＭＡとサイトグロビンの発現への影響）
次に、Ｃ２：ラパコールの類似体として、下記表３及び表４に示す１，４−ナフトキノン系化合物（Ｃ１１〜Ｃ１８）を用意した。
ＨＨＳｔｅＣ細胞（ヒト肝星細胞、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）を２×１０5ｃｅｌｌ／ウェルとなるように、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む無血清ＳｔｅＣＭ培地を含む６ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間培養した。その後、候補化合物（Ｃ１１〜Ｃ１８）を０．３〜３０μＭとなるように０．１％ＤＭＳＯ含有無血清ＤＭＥＭ培地で調製・添加し、３７℃で２日間培養を行った。また、コントロールとして、これらの化合物不含の０．１％ＤＭＳＯ含有無血清ＤＭＥＭ培地を添加し、前記と同条件で培養を行った。培養後、生細胞数の計測とαＳＭＡ及びサイトグロビンのｍＲＮＡ発現量の測定とを行った。
細胞数の計測は、ＣＣＫ８（同仁化学）によって行い、コントロールの細胞数を１として、各候補化合物を添加した場合の細胞数の相対値を求めた。
また、αＳＭＡ及びサイトグロビンのｍＲＮＡ発現量の測定は、前述の実験例２と同条件で行った。コントロールにおけるαＳＭＡ及びサイトグロビンのｍＲＮＡ発現量を１として、各化合物を添加した場合のαＳＭＡ及びサイトグロビンの発現量の相対値を求めた。
【００５８】
【表３】
2019108291.tif 000013
【００５９】
【表４】
2019108291.tif 000014
【００６０】
図８に、各化合物の濃度と、各化合物を当該濃度で添加して培養したＨＨＳｔｅＣ細胞数の相対値との関係を表すグラフを図８に示す。図８からは、Ｃ１３及びＣ１４の化合物は、濃度が一定以上になると生細胞数が減少し、濃度が３０μＭ以上であると細胞毒性が見られた。その他の化合物では、濃度が３０μＭでも細胞毒性が見られなかった。
【００６１】
図９に、各化合物の濃度と、各化合物を当該濃度で添加して培養したＨＨＳｔｅＣ細胞におけるαＳＭＡ及びＣＹＧＢのｍＲＮＡの発現量の相対値との関係を表すグラフを図９に示す。図９からは、いずれの化合物を添加しても、化合物の濃度が１μＭの場合、０．３μＭの場合と比較してαＳＭＡ発現の減弱が認められた。中でも、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７は、濃度がさらに増加すると、αＳＭＡ発現が減弱する傾向が見られた。このうち、Ｃ１２（ビタミンＫ２）は、抗癌作用が報告されている化合物であるが、αＳＭＡ発現を減弱する作用つまり抗線維化能も有することが分かった。また、Ｃ１１（ビタミンＫ１）は、Ｃ１２と構造が極めて類似し、２−メチル−１，４−ナフトキノンの３位誘導体という共通構造を有する化合物であり、Ｃ１２と同様に、αＳＭＡ発現を減弱する作用つまり抗線維化能を有することが分かった。一方、前述の一般式（１）の構造を有するＣ１５、Ｃ１６、Ｃ１７及びＣ１８の化合物が、Ｃ１１及びＣ１２に共通する２−メチル−１，４−ナフトキノンの３位誘導体という特徴的な構造を有さないにもかかわらず、予想外にも、αＳＭＡ発現を減弱する作用つまり抗線維化能が見出された。特にＣ１７は、Ｃ１２と比べても、αＳＭＡ発現を減弱する傾向が顕著であった。従って、αＳＡＭの発現の減弱効果の観点からは、Ｃ１５、Ｃ１６及びＣ１７、中でも特にＣ１７は、細胞障害性が弱く且つ抗線維化能が高い、特に有力な抗線維化物質であると考えられる。
【００６２】
また、いずれの化合物を添加しても、サイトグロビンの発現量の増大が認められた。サイトグロビンの発現量は、化合物の濃度が増加するにつれて、概ね増大する傾向が見られた。このうち、Ｃ１２（ビタミンＫ２）は、抗癌作用が報告されている化合物であるが、サイトグロビンの発現量を増大させる作用つまり抗線維化能も有することが分かった。また、Ｃ１１（ビタミンＫ１）は、Ｃ１２と構造が極めて類似した、２−メチル−１，４−ナフトキノンの３位誘導体という共通構造を有する化合物であり、Ｃ１２と同様に、サイトグロビンの発現量を増大させる作用つまり抗線維化能を有することが分かった。一方、前述の一般式（１）の構造を有するＣ１５、Ｃ１６、Ｃ１７及びＣ１８の化合物が、Ｃ１１及びＣ１２に共通する２−メチル−１，４−ナフトキノンの３位誘導体という特徴的な構造を有さないにもかかわらず、予想外にも、サイトグロビンの発現量を増大する作用つまり抗線維化能が見出された。特にＣ１５（Ｌａｗｓｏｎｅ）は、Ｃ１２と比べても、サイトグロビンの発現量を増大させる傾向が顕著であった。従って、サイトグロビンの発現量の増大効果の観点からは、Ｃ１５（Ｌａｗｓｏｎｅ）は、細胞障害性が弱く且つ抗線維化能が高い、特に有力な抗線維化物質であると考えられる。
【００６３】
実験例５
（１，４−ナフトキノン化合物によるαＳＭＡとサイトグロビンの発現への影響）
Ｃ２：ラパコール、Ｃ１５：ローソン、及びＣ１２：ビタミンＫ２を使用し、前記実験例２と同条件で、αＳＭＡ及びサイトグロビンの発現量の測定を行った。なお、これらの化合物を添加しない（Veh）コントロールについても、前記と同様に試験を行った。コントロールのαＳＭＡ及びサイトグロビンのｍＲＮＡ発現量をそれぞれ１として、各条件でのαＳＭＡ及びサイトグロビンの発現量の相対値を求めた。各条件でのαＳＭＡ及びサイトグロビン（ＣＹＧＢ）の発現量の相対値を表すグラフを図１０に示す。
【００６４】
また、実験例２で得られた、Ｃ２の濃度に対するαＳＭＡの相対ｍＲＮＡ量及びサイトグロビン（ＣＹＧＢ）相対ｍＲＮＡ量を表すグラフ（図６）と、実験例４で得られた、Ｃ１２及びＣ１５の濃度に対するαＳＭＡの相対ｍＲＮＡ量及びサイトグロビン（ＣＹＧＢ）相対ｍＲＮＡ量を表すグラフ（図９）とにおいて、αＳＭＡの相対ｍＲＮＡ量を０．５倍まで抑制する濃度と、サイトグロビン（ＣＹＧＢ）相対ｍＲＮＡ量を２倍まで増強させる濃度とについて、下記表５にまとめた。図１０及び表５から、Ｃ２は、特にαＳＭＡ発現の抑制能が高く、その能力は、より低濃度で発揮されることがわかった。また、Ｃ１５は、特にサイトグロビン（ＣＹＧＢ）発現の誘導能が高く、その能力は、より低濃度で発揮されることがわかった。
【００６５】
【表５】
2019108291.tif 000015
【００６６】
実験例６
（Ｌａｗｓｏｎｅ（Ｃ１５）によるαＳＭＡとサイトグロビンの発現への影響）
ＨＨＳｔｅＣ細胞（ヒト肝星細胞、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）を２×１０5ｃｅｌｌ／ウェルとなるように、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む無血清ＳｔｅＣＭ培地を含む６ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間培養した。その後、表６に示す化合物ＩＣＧ−００１及びＣ１５を０．３〜１２μＭとなるように０．１％ＤＭＳＯ含有無血清ＤＭＥＭ培地で調製・添加し、３７℃で２日間培養を行った。また、コントロールとして、これらの化合物不含の０．１％ＤＭＳＯ含有無血清ＤＭＥＭ培地を添加し、前記と同条件で培養を行った。培養後、αＳＭＡ（α−Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ａｃｔｉｎ）及びサイトグロビン（ＣＹＧＢ）のｍＲＮＡ発現量の測定を行った。
【００６７】
【表６】
2019108291.tif 000016
【００６８】
αＳＭＡ及びサイトグロビンのｍＲＮＡ発現量の測定は、以下のとおりに行った。まず、培養後のＨＨＳｔｅＣ細胞を回収した。αＳＭＡ、サイトグロビン、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、及び、ＣＯＬ１Ａ１のｍＲＮＡ発現量の測定を行った。αＳＭＡ、サイトグロビン、ＰＰＡＲγ、ＣＯＬ１Ａ１のｍＲＮＡ発現量の測定について、αＳＭＡ、サイトグロビンは、実験例２と同様の方法で、ＰＰＡＲγ、ＣＯＬ１Ａ１は、表７に示すプライマーを用いたこと以外は、実験例２と同様の方法で、ＲＴ−ＰＣＲにより行った。コントロールにおけるαＳＭＡ、サイトグロビン、ＰＰＡＲγ、ＣＯＬ１Ａ１のｍＲＮＡ発現量をそれぞれ１として、各化合物を添加した場合のαＳＭＡ、サイトグロビン、ＰＰＡＲγ、ＣＯＬ１Ａ１のｍＲＮＡ発現量の相対値を求めた。
【００６９】
【表７】
2019108291.tif 000017
【００７０】
図１１に、各化合物の濃度に対するαＳＭＡの相対ｍＲＮＡ量、サイトグロビン（ＣＹＧＢ）相対ｍＲＮＡ量、ＰＰＡＲγ相対ｍＲＮＡ量、ＣＯＬ１Ａ１相対ｍＲＮＡ量を表すグラフを示す。図１１のグラフから、Ｃ１５は、特に、αＳＭＡ発現抑制能、ＰＰＡＲγ発現抑制能、ＣＯＬ１Ａ１発現抑制能が、ＩＣＧ−００１よりも低濃度で発揮されることが示された。
【００７１】
実験例７
（Ｌａｗｓｏｎｅ（Ｃ１５）のＴＧＦβ１シグナリングに与える影響）
ＨＨＳｔｅＣ細胞（ヒト肝星細胞、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）を１×１０5ｃｅｌｌ／ウェルとなるように、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む血清ＳｔｅＣＭ培地を含む１２ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間培養した。その後、Ｌａｗｓｏｎｅ（Ｃ１５）を３又は１０μＭとなるように０．１％ＤＭＳＯ含有無血清ＤＭＥＭ培地で調製・添加し、その添加３時間後に、線維化を促進するサイトカインであるトランスフォーミング増殖因子β１（ｈＴＧＦβ１）を２ｎｇ／ｍｌ添加し、３７℃で２日間培養を行った。また、コントロールとして、化合物Ｃ１５とｈＴＧＦβ１を添加せずに、前記と同条件で培養を行った。
【００７２】
培養後、αＳＭＡ、サイトグロビン、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２のｍＲＮＡ発現量の測定を行った。αＳＭＡ、サイトグロビン、ＣＯＬ１Ａ１のｍＲＮＡの発現量の測定は、実験例６と同様の方法で、ＣＯＬ１Ａ２は、表８に示すプライマーを用いたこと以外は、実験例６と同様の方法で、ＲＴ−ＰＣＲにより行った。コントロールにおけるαＳＭＡ、サイトグロビン、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２のｍＲＮＡ発現量をそれぞれ１として、Ｃ１５とｈＴＧＦβ１をそれぞれ所定量添加した場合のαＳＭＡ、サイトグロビン、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２のｍＲＮＡ発現量の相対値を求めた。
【００７３】
【表８】
2019108291.tif 000018
【００７４】
図１２に、各化合物の濃度に対するαＳＭＡ、サイトグロビン（ＣＹＧＢ）、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２の相対ｍＲＮＡ量を表すグラフを示す。図１２のグラフから、Ｃ１５は、ｈＴＧＦβ１によって促進されるαＳＭＡ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２の発現を抑制し、ｈＴＧＦβ１によって抑制されるサイトグロビン（ＣＹＧＢ）の発現を促進したことが示された。
【００７５】
実験例８
（肝線維化マウスモデルによるＬａｗｓｏｎｅ（Ｃ１５）の線維化抑制能の評価）
８週齢のＩＣＲマウス（７週齢マウスを購入後順化）に、生理食塩水に肝線維化病変を誘発するチオアセトアミド（ＴＡＡ）を添加したものを、週２回、計１５回にわたって腹腔内投与し、肝線維化マウスモデルを作製した。なお、ＴＡＡの投与量は、１回目が１００μｇ／ｇ体重、２〜５回目が２００μｇ／ｇ体重、６〜９回目が３００μｇ／ｇ体重、１０〜１５回目が４００μｇ／ｇ体重とした。ＴＡＡの投与の１３回目から、並行して、１０％ＤＭＳＯ／９０％オリーブオイル中にＬａｗｓｏｎｅ（Ｃ１５）を添加したものを、８日間に４回、経口投与した。Ｌａｗｓｏｎｅの１回投与量は、１０又は１００ｍｇ／ｋｇ体重とした。コントロールとして、Ｌａｗｓｏｎｅ（Ｃ１５）を含ませなかった（０ｍｇ／ｋｇ体重（ＶＥＨ）とした）こと以外は同じ条件で肝線維化マウスモデルに経口投与した。また、ＴＡＡの代わりに、ＣＮＴ（１v/v％ ＤＭＳＯと９９v/v％ コーンオイルとの混合溶媒）を用いた以外は、同じ条件で腹腔内投与し、Ｌａｗｓｏｎｅの１回投与量を１００ｍｇ／ｋｇ体重又は０ｍｇ／ｋｇ体重（ＶＥＨ）としたこと以外は同じ条件で経口投与したモデルも作製した。
【００７６】
最終投与２４時間後に、マウスの血液を採取し、肝細胞障害マーカーとして血清ＡＬＴ値を測定した。Ｃ１５投与量に対する血清ＡＬＴ量を表すグラフを図１３に示す。
【００７７】
また、肝を摘出し、シリウスレッド染色による肝線維化面積比を測定した。シリウスレッド染色（コラーゲンＩが染色される）した肝組織の顕微鏡写真を図１４に示す。図１４において、上段の写真は、ヘマトキシリン・エオジン染色を表し、下段の写真は、シリウスレッド染色を表す。シリウスレッド染色から算出したＣ１５投与量に対する肝線維化面積比を表すグラフを図１５に示す。
【００７８】
更に、肝組織中のＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ１Ａ２のｍＲＮＡの発現量を測定した。マウスＣＯＬ１Ａ１及びマウスＣＯＬ１Ａ２のｍＲＮＡの発現量の測定は、表９に示すプライマーを用いたこと以外は実験例６と同様の方法で行った。コントロール（ＣＮＴ添加且つＣ１５が０ｍｇ／ｋｇ）におけるαＳＭＡ、サイトグロビン、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２のｍＲＮＡ発現量を１として、Ｃ１５を添加した場合のαＳＭＡ、サイトグロビン、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２のｍＲＮＡ発現量の相対値を求めた。Ｃ１５投与量に対するＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ１Ａ２のｍＲＮＡの相対発現量を表すグラフを図１６に示す。
【００７９】
【表９】
2019108291.tif 000019
【００８０】
図１３〜図１６から、肝線維化マウスモデル（チオアセトアミドの段階的増量投与法）に対して、Ｌａｗｓｏｎｅ（Ｃ１５）が線維化抑制能を発揮するか検討したところ、Ｃ１５投与により、肝細胞障害マーカー（血清ＡＬＴ値）の有意な低下、線維化面積比（Ｓｉｒｕｓ  ｒｅｄ  染色面積）の有意な低下、並びにＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ１Ａ２発現の優位な低下が観察された。つまり、生体レベルでＬａｗｓｏｎｅ  （Ｃ１５）が抗線維化作用を持つことが証明された。なお、ＣＮＴ投与群では肝線維化は誘発されず、且つ、Ｃ１５の投与前（０ｍｇ／ｋｇ）後（１００ｍｇ／ｋｇ）において血清ＡＬＴ量、肝線維化面積比、並びにＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ１Ａ２発現のいずれにも変化は見られなかった。
【００８１】
実験例９
エポキシビーズ（商品名FG beads(R)、多摩川精機株式会社）を用い、当該商品のプロトコルに従ってLawsone（Ｃ１５）をエポキシビーズと化学反応させ、Lawsone-マグネットビーズを作製した。100万個のHHSteC細胞をLysis Buffer (プロメガ社)で溶解し、10,000ｇでの遠心後の上清（タンパク溶液）を回収した。１ｍｇタンパク相当のタンパク溶液と0.1ｍｇのLawsone-マグネットビーズとを150 mM KCl溶液中で４℃一晩反応させた。反応後のLawsone-マグネットビーズを洗浄後、ウエスタンブロット用サンプルバッファーを用いてLawsone-マグネットビーズに吸着したタンパクを抽出した。抽出したタンパクをSDS-PAGEで分離し、銀染色で可視化した。銀染色後、Lawsone-マグネットビーズ由来抽出物に特異的に認められたバンドを単離し、マススペクトロメトリー解析を行った。その結果、Lawsone（Ｃ１５）に特異的に結合したタンパク質は、これまでビタミンＫ類と結合することが報告されていないHSD17B4と同定された。
【配列表フリーテキスト】
【００８２】
配列番号１はαＳＭＡに対するフォワードプライマーである。
配列番号２はαＳＭＡに対するリバースプライマーである。
配列番号３はサイトグロビンに対するフォワードプライマーである。
配列番号４はサイトグロビンに対するリバースプライマーである。
配列番号５はＰＰＡＲγに対するフォワードプライマーである。
配列番号６はＰＰＡＲγに対するリバースプライマーである。
配列番号７はＣＯＬ１Ａ１に対するフォワードプライマーである。
配列番号８はＣＯＬ１Ａ１に対するリバースプライマーである。
配列番号９はＣＯＬ１Ａ２に対するフォワードプライマーである。
配列番号１０はＣＯＬ１Ａ２に対するリバースプライマーである。
配列番号１１はマウスＣＯＬ１Ａ１に対するフォワードプライマーである。
配列番号１２はマウスＣＯＬ１Ａ１に対するリバースプライマーである。
配列番号１３はマウスＣＯＬ１Ａ２に対するフォワードプライマーである。
配列番号１４はマウスＣＯＬ１Ａ２に対するリバースプライマーである。
【図１】
2019108291.tif 000024
【図２】
2019108291.tif 000025
【図３】
2019108291.tif 000026
【図４】
2019108291.tif 000027
【図５】
2019108291.tif 000028
【図６】
2019108291.tif 000029
【図７】
2019108291.tif 000030
【図８】
2019108291.tif 000031
【図９】
2019108291.tif 000032
【図１０】
2019108291.tif 000033
【図１１】
2019108291.tif 000034
【図１２】
2019108291.tif 000035
【図１３】
2019108291.tif 000036
【図１４】
2019108291.tif 000037
【図１５】
2019108291.tif 000038
【図１６】
2019108291.tif 000039
【配列表】
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