(57)【要約】【課題】安定同位体で標識された多数の標識代謝物を簡便かつ安価に製造できる標識代謝物の製造方法、及び該製造方法を利用した代謝物の定量方法、並びに標識代謝物製造キットの提供を目的とする。【解決手段】分子内の化合物の少なくとも１つの原子が安定同位体で置換されて標識された標識化合物を細胞抽出液中で代謝させ、安定同位体で標識された標識代謝物を製造する、標識代謝物の製造方法。また、該標識代謝物の製造方法により製造した標識代謝物を内部標準物質とした質量分析により、代謝物を定量する、代謝物の定量方法。補酵素が添加された細胞抽出液を備える、安定同位体で標識された標識代謝物を製造するための標識代謝物製造キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子内の少なくとも１つの原子が安定同位体で置換されて標識された標識化合物を細胞抽出液中で代謝させ、安定同位体で標識された標識代謝物を製造する、標識代謝物の製造方法。
【請求項２】
前記細胞抽出液に補酵素を添加する、請求項１に記載の標識代謝物の製造方法。
【請求項３】
前記安定同位体が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ及び３４Ｓからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の標識代謝物の製造方法。
【請求項４】
前記細胞抽出液が、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来、小麦胚芽由来、又はタバコ培養細胞由来の細胞抽出液である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の標識代謝物の製造方法。
【請求項５】
前記標識化合物が、１３Ｃ標識グルコースである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の標識代謝物の製造方法。
【請求項６】
前記標識化合物が、１８Ｏ標識アデノシン三リン酸である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の標識代謝物の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の標識代謝物の製造方法により製造した標識代謝物を内部標準物質とした質量分析により、代謝物を定量する、代謝物の定量方法。
【請求項８】
細胞抽出液を備える、安定同位体で標識された標識代謝物を製造するための標識代謝物製造キット。
【請求項９】
ろ過手段をさらに備える、請求項８に記載の標識代謝物製造キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識代謝物の製造方法、代謝物の定量方法、及び標識代謝物製造キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の質量分析技術の進歩により、メタボローム解析は、基礎研究分野のみならず、医療、創薬、食品、農業、環境等の様々な分野で広く普及している。メタボローム解析においては、質量分析のピーク強度やピーク面積から測定対象の代謝物の相対量を解析することが主流である。しかし、測定毎の前処理法や分析方法、分析条件を揃えることは困難であり、また代謝物毎にイオン化効率も異なるため、測定されたサンプルデータはそのままでは比較や統合が行えない。この問題を解決する方法としては、安定同位体標識（ＳＩ標識）された標識代謝物を内部標準物質とした質量分析により、測定対象の代謝物を定量する絶対定量法が知られている。
【０００３】
しかし、ＳＩ標識化合物は一般に高価であり、また合成が困難なものも多い。そのため、メタボローム解析のような測定対象の代謝物が数百種類にものぼる網羅的な解析においては、それら全ての代謝物に対応する標識代謝物を個別に用意することは現実的ではない。そこで、ＳＩ標識化合物を含む培地で細胞を培養し、培養細胞中でＳＩ標識化合物を代謝させ、得られたＳＩ標識細胞から抽出した標識代謝物を内部標準物質として使用することが提案されている（特許文献１、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−３３７１７６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗｕ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３３６，  １６４−１７１  （２００５）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１等の方法では、ＳＩ標識化合物を用いた細胞培養だけでなく、標識代謝物を得るためにクエンチング、細胞破砕、抽出等も行うため、それらを実施するための設備が必要なうえ、作業も煩雑である。また、標識代謝物によっては、細胞から抽出するまでに細胞中で消費されたり、細胞からの抽出効率が低かったりすることで充分な量が得られにくい。特に中心代謝系、なかでも解糖系やペントースリン酸系等の代謝物であるリン酸化化合物をＳＩ標識した標識代謝物を簡便かつ安価に得ることは難しい。ＳＩ標識細胞から抽出した抽出液中には、標的とする標識代謝物以外にも数多くの未知代謝物が存在する。そのため、質量分析計にて本抽出液を内部標準液として取得したデータは、複雑性を増し、時には誤同定につながるケースもある。したがって、純度が高くかつ包括的に標識代謝物のみを調製できる手法が理想的と考えられる。
近年、トランスオミクス解析、コホート解析や薬物動態解析等の絶対定量を必要とするメタボローム解析の重要性が増していることから、より簡便かつ安価に純度の高い多数の標識代謝物を製造できる方法が求められている。
【０００７】
本発明は、安定同位体で標識された多数の標識代謝物を簡便かつ安価に製造できる標識代謝物の製造方法、及び該製造方法を利用した代謝物の定量方法、並びに標識代謝物製造キットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の態様を有する。
［１］分子内の少なくとも１つの原子が安定同位体で置換されて標識された標識化合物を細胞抽出液中で代謝させ、安定同位体で標識された標識代謝物を製造する、標識代謝物の製造方法。
［２］前記細胞抽出液に補酵素を添加する、［１］に記載の標識代謝物の製造方法。
［３］前記安定同位体が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ及び３４Ｓからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１］又は［２］に記載の標識代謝物の製造方法。
［４］前記細胞抽出液が、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来、小麦胚芽由来、又はタバコ培養細胞由来の細胞抽出液である、［１］〜［３］のいずれかに記載の標識代謝物の製造方法。
［５］前記標識化合物が、１３Ｃ標識グルコースである、［１］〜［４］のいずれかに記載の標識代謝物の製造方法。
［６］前記標識化合物が、１８Ｏ標識アデノシン三リン酸である、［１］〜［４］のいずれかに記載の標識代謝物の製造方法。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の標識代謝物の製造方法により製造した標識代謝物を内部標準物質とした質量分析により、代謝物を定量する、代謝物の定量方法。
［８］細胞抽出液を備える、安定同位体で標識された標識代謝物を製造するための標識代謝物製造キット。
［９］ろ過手段をさらに備える、［８］に記載の標識代謝物製造キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、安定同位体で標識された多数の標識代謝物を簡便かつ安価に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】例１におけるろ液のＩＣ−ＭＳによる測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［標識代謝物の製造方法］
本発明の標識代謝物の製造方法は、分子内の少なくとも１つの原子が安定同位体で置換されて標識された標識化合物を細胞抽出液中で代謝させ、安定同位体で標識された標識代謝物を製造する方法である。
【００１２】
細胞抽出液としては、特に限定されず、植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞等から抽出した細胞抽出液を使用できる。例えば、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来、小麦胚芽由来、タバコ培養細胞由来、マウスＬ−細胞由来、エールリッヒ腹水癌細胞由来、Ｈｅｌａ細胞由来、ＣＨＯ細胞由来、出芽酵母由来等の細胞抽出液が挙げられる。なかでも、細胞抽出液としては、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来、小麦胚芽由来又はタバコ培養細胞由来の細胞抽出液が好ましく、特に、無細胞タンパク質合成に利用され多くの酵素が活性を維持され、且つ、比較的安価である点から、大腸菌由来の細胞抽出液が好ましい。大腸菌由来の抽出液は、公知の方法で調製したものを使用してもよく、市販品を使用してもよい。
【００１３】
細胞抽出液の調製方法としては、公知の方法を採用でき、例えば、以下の方法が挙げられる。細胞をフレンチプレスやグラスビーズにて破砕し、遠心分離にて不溶成分を沈殿させて分離する。得られた溶液をインキュベーションすることによりＤＮＡ、ＲＮＡを分解し、透析やゲルろ過等を用いてタンパク質以外の大腸菌由来のＤＮＡ、ＲＮＡ、その他の代謝化合物などの低分子を除去する。
【００１４】
細胞抽出液としては、例えば無細胞タンパク質合成キット（商品名：無細胞くん、大陽日酸社製）の構成要素であるＳ３０細胞抽出液、もしくはキット内液を使用してもよい。大腸菌Ｓ３０細胞抽出液は、増殖させた大腸菌の菌体を破砕して細胞破砕液を得て、この細胞破砕液を３０，０００ｘｇの遠心分離にかけて分離した上清から得たものである。このキットは、細胞抽出液にアミノ酸、目的タンパク質の遺伝子、エネルギー液を加え試験管内でタンパク質を合成するためのキットである。このキットに含まれる細胞抽出液は、その作成工程において細胞膜、膜タンパク質、核酸やアミノ酸等の低分子化合物は除去されているが、その他の可溶性のタンパク質は除去されておらず、大腸菌の中心代謝に関わる多くの酵素はその活性を維持したまま抽出液内に存在している。
【００１５】
標識化合物は、生体内で代謝される化合物であって、分子内の少なくとも１つの原子が安定同位体で置換されて標識された化合物である。細胞抽出液に標識化合物を加えることで、該細胞抽出液中に含まれる残存代謝により該標識化合物が化学変換され、安定同位体で標識された複数の標識代謝物が一度に合成される。
【００１６】
標識対象の化合物は、生体内で代謝される化合物であればよく、代謝の原料化合物であってもよく、中間体であってもよい。標識対象の化合物の具体例としては、例えば、解糖系、ペントースリン酸系及びクエン酸回路で代謝される化合物であるグルコース、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸や、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、α―ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等が挙げられる。
【００１７】
標識化合物の標識に用いる安定同位体としては、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３４Ｓが挙げられる。
標識化合物中の安定同位体の数は、１つであってもよく、２つ以上であってもよい。また、標識化合物中の安定同位体は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。
【００１８】
標識化合物の具体例としては、例えば、２Ｈ標識グルコース、１３Ｃ標識グルコース、１８Ｏ標識ＡＴＰ、１５Ｎ標識アンモニウム塩等が挙げられる。なかでも、解糖系やペントースリン酸系等の中心代謝に関わる多くの標識代謝物が簡便かつ安価に得られることから、１３Ｃ標識グルコース、１８Ｏ標識ＡＴＰが好ましい。
標識化合物としては、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１９】
１３Ｃ標識グルコースは、グルコースの分子内の炭素原子が１３Ｃで置換されて標識された標識化合物である。１３Ｃ標識グルコースとしては、グルコースが代謝分解された代謝物が全て１３Ｃ標識される点から、グルコースの全ての炭素原子が１３Ｃで置換された１３Ｃ標識グルコースが好ましい。
【００２０】
１８Ｏ標識ＡＴＰは、ＡＴＰの分子内の酸素原子が１８Ｏで置換されて標識された標識化合物である。１８Ｏ標識ＡＴＰとしては、γ位のリン酸の転移先の化合物を１８Ｏ標識できる点から、ＡＴＰのγ位の酸素原子が１８Ｏで置換されて標識された１８Ｏ標識ＡＴＰが好ましい。
【００２１】
標識化合物の製造方法は、特に限定されず、公知の方法を採用できる。
【００２２】
反応液中の標識化合物の濃度は、０．１〜５００ｍＭが好ましく、１〜１００ｍＭがより好ましい。標識化合物の濃度が前記範囲の下限値以上であれば、標識代謝物が得られやすい。標識化合物の濃度が前記範囲の上限値以下であれば、より多種類の標識代謝物が合成されやすい。
【００２３】
細胞抽出液を調製する際には、目的の標識代謝物が生成される代謝に関わる補酵素の量が精製等によって少なくなることがある。この場合には、充分な量の標識代謝物が得られやすい点から、細胞抽出液に補酵素を添加することが好ましい。
【００２４】
添加する補酵素としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、コエンザイムＡ、ピリドキサールリン酸等が挙げられる。解糖系やペントースリン酸系等の中心代謝に関わる標識代謝物を製造する場合には、ＮＡＤ及びＮＡＤＰを添加することがより好ましい。
添加する補酵素は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。
【００２５】
補酵素を添加する場合、補酵素の添加量は、反応液の総量に対して、０．１〜２００ｍＭが好ましく、１〜１００ｍＭがより好ましい。補酵素の添加量が前記範囲の下限値以上であれば、標識代謝物が得られやすい。補酵素の添加量が前記範囲の上限値以下であれば、より多種類の標識代謝物が得られる。
【００２６】
細胞抽出液中で標識化合物を代謝させる際の反応温度は、２０〜４０℃が好ましく、２３〜３７℃がより好ましい。
反応時間は、３０分〜１０時間が好ましく、必要とする代謝物によって反応条件は最適化できる。
【００２７】
反応後には、反応液からタンパク質等の高分子化合物を除去して標識代謝物を精製することが好ましい。標識代謝物を精製する方法としては、限外ろ過が好ましい。限外ろ過は、精製作業が簡便であり、大腸菌系以外の細胞抽出液、例えばウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来、小麦胚芽由来等の細胞抽出液を用いた場合にも応用可能であり、技術の一般化や商品化が極めて容易である。細胞抽出液中の一部の酵素が、欠損あるいは失活している場合においては、無細胞系外で別途調製した酵素を添加してもよい。
【００２８】
本発明の製造方法で得られる標識代謝物は、例えば、定量した後に、メタボローム解析における質量分析の内部標準溶液として利用することができる。本発明の製造方法で得た標識代謝物を定量する方法としては、特に限定されず、例えば、別途調製した安定同位体で標識していない濃度既知の非標識代謝物を内部標準物質とする質量分析が挙げられる。
【００２９】
以上説明したように、本発明の標識代謝物の製造方法においては、安定同位体で標識された標識同位体を細胞抽出液中で代謝させることで、安定同位体で標識された複数の標識代謝物を製造できる。本発明の製造方法では、恒温槽等の簡易な設備で反応を実施でき、精製も簡便である。そのため、特許文献１等の従来の標識細胞を培養する方法のように細胞培養やクエンチング、細胞破砕、抽出等を行う設備も必要なく、作業も簡便である。また、個々の標識代謝物の合成する必要が無いため、多数の標識代謝物でも短時間に低コストに製造できる。
また、本発明では、用途に合わせてその代謝経路上流の標識化合物を用いることで、所望の標識代謝物の混合物を簡便に得ることができる。
【００３０】
［標識代謝物製造キット］
本発明の標識代謝物製造キットは、安定同位体で標識された標識代謝物を製造するためのキットであって、細胞抽出液を備える。また、本発明の標識代謝物製造キットは、さらに補酵素を備えてもよい。
細胞抽出液及び補酵素としては、前述した標識代謝物の製造方法で挙げたものと同じものが挙げられる。
【００３１】
標識代謝物製造キットの細胞抽出液への補酵素の添加量は、最終的な反応液の総量に対して、０．０１〜５００ｍＭとなる量が好ましく、１〜１００ｍＭとなる量がより好ましい。
【００３２】
本発明の標識代謝物製造キットは、ろ過手段をさらに備えることが好ましい。これにより、反応後の反応液から標識代謝物を簡便に精製できる。
ろ過手段としては、限外ろ過膜が好ましい。
【００３３】
［代謝物の定量方法］
本発明の代謝物の定量方法は、本発明の標識代謝物の製造方法により製造した標識代謝物を内部標準物質とした質量分析により、代謝物を定量する方法である。本発明の代謝物の定量方法は、メタボローム解析に特に有用である。
本発明の代謝物の定量方法は、質量分析における内部標準物質として、本発明の標識代謝物の製造方法により製造した標識代謝物を用いる以外は、公知の方法を採用できる。標識代謝物は、本発明の製造方法により製造した後に前記した方法で定量してから内部標準物質として用いる。
【００３４】
本発明では、例えば、標識代謝物を内部標準物質とした代謝物の質量分析における、内部標準物質である標識代謝物由来のピーク強度と、測定対象の代謝物由来のピーク強度とを比較することで、測定対象の代謝物を定量することができる。
【００３５】
測定対象の代謝物としては、特に限定されず、例えば、生体から採取した組織（脳、脊髄、胃、膵臓、腎臓、肝臓、甲状腺、胆嚢、肺、小腸、大腸等）、生体液（血液、尿等）、細胞（肝細胞、免疫細胞、幹細胞、癌細胞等）等に含まれる代謝物や植物や微生物等の生体試料が挙げられる。
【００３６】
測定対象の代謝物の調製方法としては、特に限定されず、公知の方法を採用できる。例えば、細胞や組織の場合、ホモジナイザー等で破砕し、遠心分離により不溶性物質を除去した後にクロロホルム等の有機溶剤及び水等を用いて代謝物を抽出する方法が挙げられる。
【００３７】
測定に用いる質量分析装置としては、特に限定されず、例えば、イオンクロマトグラフ質量分析（ＩＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）等が挙げられる。
質量分析装置におけるイオン化方法は、特に限定されず、例えば、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化法）、ＥＩ（電子イオン化法）、ＣＩ（化学イオン化法）等が挙げられる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［例１］
標識化合物として、グルコースの全ての炭素原子が１３Ｃで置換された１３Ｃ標識グルコース（シグマアルドリッチ社製）を用意した。
大腸菌由来の細胞抽出液が含まれている無細胞くん内液（大陽日酸社製）と、２００ｍＭの１３Ｃ標識グルコース水溶液と、２０ｍＭのＮＡＤ水溶液と、２０ｍＭのＮＡＤＰ水溶液とを表１に示す割合で混合し、３７℃で２時間反応させた。次いで、限外ろ過膜を用いて反応液をろ過し、無細胞系内に含まれるタンパク質等を除去して反応を停止させ、ろ液をイオンクロマトグラフ質量分析（ＩＣ−ＭＳ）により分析した。なお、無細胞くん内液は、主要構成成分として、大腸菌抽出液Ｓ３０、ＮＴＰ、Ｆｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ、クレアチンキナーゼ、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、酢酸アンモニウム、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ポリエチレングリコール、酢酸マグネシウム、ｔＲＮＡ、Ｄ−グルタミン酸、クレアチンリン酸、ＤＴＴ、０．０５％ＮａＮ３及びｃＡＭＰを含む。
また、１３Ｃ標識グルコースの代わりに非標識グルコースを用いる以外は、上記と同様に反応を行い、ろ液を分析した。また、ネガティブコントロールとして、無細胞くん内液のみで同様の操作を行ってろ液を分析した。
ろ液の分析は、グルコース、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）、フルクトース−１，６−ビスリン酸（ＦＢＰ）、２−ホスホグリセリン酸（２−ＰＧＡ）、３−ホスホグリセリン酸（３−ＰＧＡ）、２，３−ビスホスホグリセリン酸（２，３−ＢＰＧＡ）、ラクテート（Ｌａｃ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）について行った。結果を図１に示す。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
図１に示すように、１３Ｃ標識グルコースは非標識グルコースと同様に細胞抽出液中で代謝され、１３Ｃで標識された標識グルコース−６−リン酸、標識フルクトース−６−リン酸、標識フルクトース−１，６−ビスリン酸、標識２−ホスホグリセリン酸、標識３−ホスホグリセリン酸、標識１，３−ビスホスホグリセリン酸、標識ラクテート及び標識ホスホエノールピルビン酸が生成したことが確認された。
【図１】
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