(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩＬ−４発生を劇的に抑制する効果のある機能強化乳酸菌を提供する。【解決手段】機能強化乳酸菌は、配列表１（ＴＰＫＫＰＮＳＡＬＲＫ）記載の第１のアミノ酸配列と第１のアミノ酸配列よりＣ末端側に配列表２（ＲＧＧＲＶＫＤＬＰＧＶＲＹ）記載の第２のアミノ酸配列とを含むＳ１２リボソームタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するように改変された野生株由来の機能強化乳酸菌であって、前記変異が第１のアミノ酸配列のＮ末端側から３位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する、または第２のアミノ酸配列のＮ末端側から６位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異であることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ）の第１のアミノ酸配列と第１のアミノ酸配列よりＣ末端側に配列番号２（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ）の第２のアミノ酸配列とを含むＳ１２リボソームタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するように改変された野生株由来の機能強化乳酸菌であって、
前記変異が第１のアミノ酸配列のＮ末端側から３位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する、または第２のアミノ酸配列のＮ末端側から６位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異であることを特徴とする機能強化乳酸菌。
【請求項２】
配列番号３（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｘａ１−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｘａ２−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｘａ３−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ）（Ｘａ１はＴｙｒまたはＰｈｅ、Ｘａ２はＩｌｅまたはＭｅｔ、Ｘａ３はＩｌｅまたはＬｅｕ）のアミノ酸配列を含むＳ１２リボソームタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するように改変された機能強化乳酸菌であって、
前記変異が配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端側から３位または４８位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異であることを特徴とする機能強化乳酸菌。
【請求項３】
前記第１のアミノ酸配列のＮ末端側から３位のアミノ酸残基がリシン残基から他のアミノ酸残基に置換されたことを特徴とする請求項１記載の機能強化乳酸菌。
【請求項４】
前記第２のアミノ酸配列のＮ末端側から６位のアミノ酸残基がリシン残基から他のアミノ酸残基に置換されたことを特徴とする請求項１記載の機能強化乳酸菌。
【請求項５】
前記他のアミノ酸残基がアスパラギン残基、アルギニン、トレオニン残基、メチオニン残基のいずれかであることを特徴とする請求項３記載の機能強化乳酸菌。
【請求項６】
前記他のアミノ酸残基がアスパラギン残基、グルタミン酸、アルギニンのいずれかであることを特徴とする請求項４記載の機能強化乳酸菌。
【請求項７】
前記野生株はラクトバシラス目であることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれかに記載の機能強化乳酸菌。
【請求項８】
前記変異は生体調節機能を高める変異であることを特徴とする請求項７記載の機能強化乳酸菌。
【請求項９】
前記変異はタンパク質生産機能を高める変異であることを特徴とする請求項７記載の機能強化乳酸菌。
【請求項１０】
前記野生株はラクトバチラス・ラムノサスであることを特徴とする請求項８の記載の機能強化乳酸菌。
【請求項１１】
前記野生株はラクトコッカス・ラクチスであることを特徴とする請求項９の記載の機能強化乳酸菌。
【請求項１２】
抗生物質を含む培地に乳酸菌を培養する工程と、培地上に出現したコロニーに対しＳ１２リボソームタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列または翻訳後のアミノ酸残基の変異を特定する工程と、前記乳酸菌の機能を確認する工程を含む機能強化乳酸菌の製造方法。
【請求項１３】
前記乳酸菌の機能を確認する工程は、前記乳酸菌のプロバイオティクス機能を確認する工程であることを特徴とする請求項１２に記載の機能強化乳酸菌の製造方法。
【請求項１４】
前記乳酸菌の機能を確認する工程は、前記乳酸菌の組換えタンパク質生産機能を確認する工程であることを特徴とする請求項１２に記載の機能強化乳酸菌の製造方法。
【請求項１５】
抗生物質を含む培地に乳酸菌を培養する工程と、培地上に出現したコロニーに対しＳ１２リボソームタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列もしくはコードされたアミノ酸残基の変異を特定する工程と、前記乳酸菌の機能を確認する工程を含む、乳酸菌の機能強化方法。
【請求項１６】
前記乳酸菌の機能を確認する工程は、前記乳酸菌のプロバイオティクス機能を確認する工程であることを特徴とする請求項１５に記載の乳酸菌の機能強化方法。
【請求項１７】
前記乳酸菌の機能を確認する工程は、前記乳酸菌の組換えタンパク質生産機能を確認する工程であることを特徴とする請求項１５に記載の乳酸菌の機能強化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、乳酸菌の有する生体調節機能およびタンパク質生産能を強化した乳酸菌およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年プロバイオティクス乳酸菌が注目されている。プロバイオティクスとは、現在は、国連食糧農業機関と世界保健機関により、「適正量を摂取した際に宿主に有用な作用を示す生菌体」と定義されている。様々なプロバイオティクスの中でも、特に乳酸菌やビフィズス菌に関する研究結果が数多く報告されている。特に腸内環境改善作用は乳酸菌やビフィズス菌がヒトの健康に有用であると考えられ、免疫調節作用は近年アレルギーや癌予防の分野で注目を集めている。
【０００３】
一方、アレルギー疾患やアトピー性体質の患者数は年々増加しており、特に先進国において深刻な問題となっている。このアレルギー疾患増加の原因の１つとして「Ｈｙｇｉｅｎｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ（衛生仮説）」が知られている。環境が衛生的になり、幼少期に細菌等にさらされる機会が減少したため、免疫応答が生来の２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞優位から１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞優位に変化せず、Ｔｈ２優位の免疫応答が持続していることや、制御性Ｔ細胞が十分に誘導されていないのがその原因と考えられている。一旦アレルギー反応が生じると、体内で、このＴｈ２はサイトカインであるＩＬ−４を産生し、このＩＬ−４はＢ細胞を刺激して、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）という抗体の産出を促す。さらにＩＬ−４はＴ細胞も増加させ、その結果ＩｇＥがさらに増加し、アレルギーが加速的に悪化する。
【０００４】
そこで、プロバイオティック乳酸菌がＴｈ１／Ｔｈ２バランスを調節する作用を有することが注目されている。プロバイオティック乳酸菌の免疫調節作用は、動物モデルにおけるサイトカイン産生調節や免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）産生抑制効果として知られている。この免疫調節作用のメカニズムの解明はまだ十分ではないが、菌体刺激によりマクロファージなどがインターロイキン（ＩＬ）−１２を産生し、これによりＴｈ１／Ｔｈ２バランスがＴｈ１寄りに傾き、ＩＦＮ−γが産生されるからと考えられている（非特許文献１）。
【０００５】
特に、以前よりプロバイオティック乳酸菌として知られているラクトバチラス・ラムノサスＧＧ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ、以降ＬＧＧ）の野生株によるアトピー性皮膚炎発症予防作用が注目されている。一例として、ＬＧＧを妊婦に対して投与すると、乳児のアトピー性皮膚炎の発症率が低下することが報告されている（非特許文献２）。具体的には、妊婦をＬＧＧ投与群とプラセボ投与群に分け、生後その子どものアトピー性皮膚炎の有症率、皮疹スコア、血清総ＩｇＥ、アレルゲン皮膚テストの陽性率を解析し、経時的に調査した。その結果、血清総ＩｇＥ値および皮膚テストの陽性率では２群間で差異が認められなかったにもかかわらず、２歳時の有病率については、プラセボ投与群におけるが４６％であったのに対し、ＬＧＧ投与群では２３％と半減しており、４歳時および７歳時においてもその有病率に有意な差が生じることが確認された。
【０００６】
乳酸菌以外では、所望の特性を有する変異株を取得する方法として、抗生物質の存在下で生育可能な変異株をスクリーニングすることにより、Ｓ１２リボソームタンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子に突然変異を生じさせる方法が提案されている（特許文献１）。例えば、抗生物質非生産性の放線菌に抗生物質の一種であるリファンピシン耐性を付与することで、検出可能レベルの抗生物質生産能を引き出し、有用代謝産物として未知の抗生物質が産出されたことが報告されている（非特許文献３）。
【０００７】
また、遺伝子組換えの分野では、ウシβラクトグロブリンという乳清に含まれるタンパク質を分泌する乳酸菌の組換体を構築したことが報告されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−１７３６２７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｕｒｏｓａｋｉ  Ｓ、Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｙ、Ｉｔｏ  Ｋ、Ｉｎｏｋｕｃｈｉ  Ｔ、Ｋｕｓａｋａ  Ｈ、Ｉｋｅｄａ  Ｈ、Ｙｏｓｈｉｋａｉ  Ｙ  “Ｈｅａｔ−ｋｉｌｌｅｄ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌ−１３７  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｆｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＥ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ”、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０２（１）、５７−６４（１９９８）
【非特許文献２】Ｋａｌｌｉｏｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ”、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３５７、１０７６−１０７９（２００１）
【非特許文献３】Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｈｏｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．“Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｏｒ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ１２”、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７、４６２−４６４  （２００９）
【非特許文献４】重盛駿、“生理活性タンパク質を産生する乳酸菌組換え体の構築と応用に関する研究”、信州大学審査学位論文（２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、ＬＧＧ乳酸菌の自然株や組換え体の中からはＩＬ−４発生を劇的に抑制する効果のあるものは未だ発見されておらず、アトピー性皮膚炎発症の予防になるといっても、その効果は十分なものではなかった。
【００１１】
そこで本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、機能強化された乳酸菌の変異株を取得する方法を見出し、この方法によりＩＬ−４の発生を顕著に抑える特性を示す等、新規な菌株を作りだすことに成功した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示の一態様に係る機能強化乳酸菌は、配列番号１（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ）の第１のアミノ酸配列と第１のアミノ酸配列よりＣ末端側に配列番号２（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ）の第２のアミノ酸配列とを含むＳ１２リボソームタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するように改変された野生株由来の機能強化乳酸菌であって、前記変異が第１のアミノ酸配列のＮ末端側から３位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する、または第２のアミノ酸配列のＮ末端側から６位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異であることを特徴とする。
【００１３】
本開示の一態様に係る機能強化乳酸菌は、配列番号３（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｘａ１−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｘａ２−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｘａ３−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ）（Ｘａ１はＴｙｒまたはＰｈｅ、Ｘａ２はＩｌｅまたはＭｅｔ、Ｘａ３はＩｌｅまたはＬｅｕ）のアミノ酸配列を含むＳ１２リボソームタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するように改変された機能強化乳酸菌であって、前記変異が配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端側から３位または４８位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異であることを特徴とする。
【００１４】
前記第１のアミノ酸配列のＮ末端側から３位のアミノ酸残基がリシン残基から他のアミノ酸残基に置換されてもよい。
【００１５】
前記第２のアミノ酸配列のＮ末端側から６位のアミノ酸残基がリシン残基から他のアミノ酸残基に置換されてもよい。
【００１６】
前記他のアミノ酸残基がアスパラギン残基、アルギニン、トレオニン残基、メチオニン残基のいずれかであってもよい。
【００１７】
前記他のアミノ酸残基がアスパラギン残基、グルタミン酸、アルギニンのいずれかであってもよい。
【００１８】
前記野生株はラクトバシラス目であってもよい。
【００１９】
前記変異は生体調節機能を高める変異であってもよい。
【００２０】
前記変異は組換えタンパク質生産機能を高める変異であってもよい。
【００２１】
前記野生株はラクトバチラス・ラムノサスであってもよい。
【００２２】
前記野生株はラクトコッカス・ラクチスであってもよい。
【００２３】
本開示の一態様に係る機能強化乳酸菌製造方法は、抗生物質を含む培地に乳酸菌を培養する工程と、培地上に出現したコロニーに対しＳ１２リボソームタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列または翻訳後のアミノ酸残基の変異を特定する工程と、前記乳酸菌の機能を確認する工程を含む。
【００２４】
前記乳酸菌の機能を確認する工程は、前記乳酸菌のプロバイオティクス機能を確認する工程であってもよい。
【００２５】
前記乳酸菌の機能を確認する工程は、前記乳酸菌の組換えタンパク質生産機能を確認する工程であってもよい。
【００２６】
本開示の一態様に係る乳酸菌の機能強化方法は、抗生物質を含む培地に乳酸菌を培養する工程と、培地上に出現したコロニーに対しＳ１２リボソームタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列またはコードされたアミノ酸残基の変異を特定する工程と、前記乳酸菌の機能を確認する工程を含む。
【００２７】
前記乳酸菌の機能を確認する工程は、前記乳酸菌のプロバイオティクス機能を確認する工程であってもよい。
【００２８】
前記乳酸菌の機能を確認する工程は、前記乳酸菌の組換えタンパク質生産機能を確認する工程であってもよい。
【発明の効果】
【００２９】
本開示の一態様によれば、乳酸菌が本来有する機能がさらに強化された乳酸菌変異株を得ることができる。例えば抗アレルギー効果が強化された乳酸菌変異株を高い確率で得ることができる。また遺伝子組み換えによる組換えタンパク質生産機能が高い乳酸菌変異株を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本開示の一態様におけるプロバイオティクス機能を有する乳酸菌の野生株と変異株の電子顕微鏡写真
【図２】本開示の一態様におけるプロバイオティクス機能を有する乳酸菌変異株および野生株の形状的分布を示すグラフ
【図３】実施例１におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ発現量を測定したグラフ
【図４】実施例２におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ発現量を測定したグラフ
【図５】実施例３におけるＬＧＧ経口投与マウス脾臓組織におけるｉｌ−４ｍＲＮＡの発現を示すグラフ
【図６】実施例５における乳酸菌変異株のＧＦＰ発現解析結果の写真
【図７】実施例７における増殖と形質転換の確認結果を示す表
【図８】実施例７におけるｒＩＬ６ｓｃＦｖの分泌前駆体（３４．０ｋＤａ）および分泌型ｒＩＬ６ｓｃＦｖの発現解析結果の写真（ＣＥＬＬおよびＳＵＰ）
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本開示の一態様に係る実施の形態（以下、本実施の形態）について図面を参照して詳細に説明する。
【００３２】
本実施の形態では、乳酸菌野生株として、まずラクトバチラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ、以降、ＬＧＧ）、例えばＡＴＣＣ（登録商標）５３１０３ＴＭ（ＡＴＣＣ、米国）を用いる。ＬＧＧを培養する際はＭＲＳ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｙ、米国）を使用する。ＭＲＳ培地は、ＭＲＳを１１ｇ、微生物培地用寒天粉末を３ｇ、それぞれ蒸留水２００ｍＬに混合し、滅菌処理（１２１°Ｃ、１５分）後、シャーレに約２０ｍＬずつ流し込んで作成する。以下、乳酸菌変異株の製造方法について順次説明する。
【００３３】
（前培養と寒天培地に生育する菌数の測定）
先ず、前記ＭＲＳ培地に終濃度１％になるようＬＧＧ野生株（ＷＴ）を播種し、３７°Ｃで一晩インキュベートした。次に、前記野生株の培養液１０μＬを９９０μＬの滅菌超純水と懸濁したのち、ＭＲＳ寒天培地に１ｍＬ塗布し、３７°Ｃで二晩静置培養した。その後、火炎滅菌した先曲がり白金耳を用いて、生育したＬＧＧを全て１０ｍＬの滅菌超純水に回収した。回収し懸濁した菌液をボルテックスミキサーで撹拌した後、１２０μＬ取り、さらに１０８０μＬの滅菌超純水と混合して１０倍希釈を行った。この工程を繰り返し１０７〜１０１０に段階希釈した菌液をＭＲＳ寒天培地に塗布し、３７°Ｃで二晩静置培養した。培養後、各プレートに生育したシングルコロニーをカウントした。
【００３４】
（最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の検討）
その後、培養液１０μＬを９９０μＬの滅菌超純水と懸濁したのち、抗生物質であるストレプトマイシン（ＳＭ）を０．２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬ、５１２μｇ／ｍＬ、１０２４μｇ／ｍＬ含むＭＲＳ寒天培地にそれぞれ塗布し、３７°Ｃで３日間静置培養した。また、毎日生育状況を目視で観察し、シングルコロニー数をカウントした。
【００３５】
（薬剤耐性変異株の選抜）
サテライトコロニーやＳＭ要求株を除去し、ＭＴの選抜を行った。２５６μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＳＭ）を含むＭＲＳ培地に生育したシングルコロニー（１２１個）をそれぞれナンバリングし、サテライトコロニーを除去するため、再び同濃度ＳＭ含ＭＲＳ培地に滅菌爪楊枝を用いて播種した。その結果、１０８個のシングルコロニーの生育を確認した。続いて、生育条件にＳＭを必要とするＳＭ要求株を除去するため、ＳＭを含まないＭＲＳ寒天培地に植え継いだ結果、１０８個のシングルコロニー全てにおいて生育を確認した。
【００３６】
さらに、ストレプトマイシン（ＳＭ）抵抗性を調べるため、２５６μｇ／ｍＬに生育した１０８個のコロニーを釣菌し、０μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、５１２μｇ／ｍＬ、１０２４μｇ／ｍＬのＳＭを含むＭＲＳ寒天培地にそれぞれ植え継いだ。その結果、ほとんどのＭＴはＳＭ濃度が１０２４μｇ／ｍＬの寒天培地においても生育可能であったが、１２８μｇ／ｍＬあるいは５１２μｇ／ｍＬを生育限界値とする株が一部に存在した。
【００３７】
（取得した薬剤耐性変異株の分類）
ＬＧＧのＳ１２リボソームタンパク質をコードする遺伝子に特異的に結合するプライマーを用いて、コロニーダイレクトＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によりＳ１２領域を増幅し、ＤＮＡシーケンス解析（電気泳動）に供した。塩基配列における変異を確認後、アミノ酸レベルにおける変異で分類した（表１）。その結果、ヌクレオチドの変異では８タイプの変異が生じていた。その変異をアミノ酸レベル（配列番号４）の変異に置き換えると、７タイプの変異が確認できた。特に、Ｓ１２リボソームタンパク質Ｎ末端から５６番目のリシン（Ｋ＝Ｌｙｓ）が他のアミノ酸（Ｎ＝Ａｓｎ、Ｔ＝Ｔｈｒ、Ｍ＝Ｍｅｔ、Ｒ＝Ａｒｇ）に、１０１番目のリシン（Ｋ＝Ｌｙｓ）が他のアミノ酸（Ｎ＝Ａｓｎ、Ｒ＝Ａｒｇ、Ｅ＝Ｇｌｕ）に変化していることが明らかとなった。
【表１】
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【００３８】
（形状的特徴づけ）
図１に野生株（ＷＴ）、Ｋ１０１Ｅ変異株（Ｎｏ．６）、Ｋ５６Ｔ変異株（Ｎｏ．１０）、Ｋ５６Ｍ変異株（Ｎｏ．２７）の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。いずれの写真も×７５００の倍率で撮影した。ＷＴと比較して、Ｎｏ．６とＮｏ．２７は菌体の表面の様子が異なることが確認された。
【００３９】
図２に、それぞれ５０サンプルの菌体を観察し（×５０００）、デジタルノギス（シンワ測定（株））を用いてこれらの短径を測定し、分布を表示したグラフを示す。図２において、ＡはＳＥＭを用いて、ＢはＴＥＭを用いて、それぞれ観測した結果を示す。いずれにおいても、Ｋ５６Ｍ変異株（Ｎｏ．２７）は野生株（ＷＴ）と比較して有意にその短径が太くなっていることが確認された（ｐ＜０．０１）。
【００４０】
なお、本実施の形態において、アミノ酸の変異位置（５６番目、１０１番目）はＬＧＧ野生株の中でも特にＡＴＣＣ（登録商標）５３１０３ＴＭのＳ１２リボソームタンパク質のＮ末端を基準にしたものである。もちろん他のＬＧＧ野生株すべてのアミノ酸（コード遺伝子）の配列が保存されているとは限らず、前記アミノ酸の変異位置に相当する部分が変異を受けておれば、その他の部分については、自然な変異または欠落による誤差があってもよい。
【００４１】
また、前記変異位置は、Ｓ１２リボソームタンパク質（配列番号４）全体の中で特定することに限定されない。例えば、Ｓ１２リボソームタンパク質において配列番号１（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ）で示される第１のアミノ酸配列のＮ末端側から３位のアミノ酸残基（Ｌｙｓ）を、または配列番号２（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ）で示される第２のアミノ酸配列のＮ末端側から６位のアミノ酸残基（Ｌｙｓ）を、それぞれ他のアミノ酸残基に置換するとしてもよい。
【００４２】
また、Ｓ１２リボソームタンパク質において配列番号３（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｘａ１−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｘａ２−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｘａ３−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ）で示されるアミノ酸配列のＮ末端側から３位または４８位のアミノ酸残基（Ｌｙｓ）を他のアミノ酸残基に置換するとしてもよい。なお配列番号３において、Ｘａ１、Ｘａ２、Ｘａ３はラクトバチラス・ラムノサスＧＧの場合、それぞれＴｙｒ、Ｉｌｅ、Ｉｌｅを表し、後述のラクトコッカス・ラクチスの場合、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕを表す。
【００４３】
以上、本実施の形態において取得された乳酸菌変異株は野生株における特定のＳ１２リボゾームタンパク質の特定の位置のアミノ酸残基が置換されるようにこれをコードする遺伝子が変異を受けたものであり、野生株と比べて形状的な特徴を有する。さらに、形状的特徴だけでなく、乳酸菌が元来有する機能が強化されていることが実証された。これについて以下、実施例で説明する。
【実施例】
【００４４】
以下、本開示の一態様に係る実施例について説明する。
（実施例１）
本実施例ではＬＧＧのＫ５６Ｍ変異株の有用代謝産物による抗アレルギー効果の検証実験とその結果について説明する。
【００４５】
（死菌調整）
ＭＲＳ（−）液体培地に終濃度１％になるようＬＧＧ野生株（ＷＴ）を播種し、３７°Ｃで一晩インキュベートし、一晩培養した菌液を５％の濃度で接種した。次に、ＯＤ６００が１．０付近になるまでインキュベートし、遠心分離（３，０００×ｇ、４°Ｃ、２０分）により菌体を回収した。その後リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄（ｗａｓｈ）し、さらに８０°Ｃのウォーターバスで３０分の熱処理し、死菌を調製した。なお、前記熱処理後の菌液をＭＲＳ（−）寒天培地に１ｍＬ播種し、その後の経過を観察し、完全に死滅していることを確認した。
【００４６】
（アレルギーモデルマウス）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー（株）、メス、４週齢）を２週間予備飼育の後、６週齢目と７週齢目に５０μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）と水酸化アルミニウムゲル（Ａｌｕｍ）２ｍｇを含むＰＢＳ２００μＬを腹腔内投与し、アレルギー感作させた。
【００４７】
（抗アレルギー効果の検証）
さらに８週齢目に前記マウスを安楽死させた後、脾臓を摘出し、すりつぶしてから１０ｍＬのコンプリートＲＰＭＩ１６４０培地で回収した。遠心分離（７００×ｇ、２０°Ｃ、５分）し、滅菌超純水７ｍＬとコンプリートＲＰＭＩ１６４０培地３ｍＬに５秒間浸すことで赤血球を溶血させ、上記のコンプリートＲＰＭＩ１６４０培地５ｍＬに懸濁した。
【００４８】
前記脾細胞を２４ウェルプレート（日本ジェネティクス（株））に２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播き、そこにＬＧＧ野生株とＬＧＧ変異株（Ｋ５６Ｍ）の死菌を脾臓細胞に対し、それぞれ×０．６２５、×１．２５の二種類の濃度で添加した。その後、３７°Ｃ、５％のＣＯ２条件下で３時間培養した。さらにその後、コントロールとしてのコンプリートＲＰＭＩ１６４０培地またはＯＶＡ（最終１０００μｇ／ｍＬ）で再刺激し、３７°Ｃ、５％のＣＯ２条件下で７２時間培養した。
【００４９】
（マウス脾臓細胞からのトータルＲＮＡ抽出）
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  ＲＮＡ  Ｐｌａｎｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、独）を用いて、培養したマウス脾臓細胞からトータルＲＮＡを抽出した。細胞培養液を遠心分離（１１０００×ｇ、１分）し、上清を除去して細胞ペレットを回収した。溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）を３５０μＬ、２−メルカプトエタノールを３．５μＬ、それぞれ混合した溶液３５０μＬを細胞培養ウェルに添加した後、細胞入り試料採取用チューブ（１．５ｍＬ）に移し、ピペッティングにより完全に溶解した。溶解液をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）フィルターに添加し、遠心分離（１１０００×ｇ、１分）して濾過した。
【００５０】
濾液を試料採取用チューブ（２ｍＬ）に回収後、７０％エタノールを３５０μＬ添加した。なお、７０％エタノールは９９．５％エタノール（ナカライテスク）を滅菌超純水にて希釈し調製した。ピペッティングによりよく混合した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡカラム（以降、スピンカラム）に移し、遠心分離（１１０００×ｇ、３０秒）を行った。ＲＮＡカラムを新しい試料採取用チューブ（２ｍＬ）にセットし、ＭＤＢ３５０μＬを添加して遠心分離（１１０００×ｇ、１分）を行い、メンブレンの脱塩処理を行った。
【００５１】
次に、ＤＮＡ分解酵素溶液（ｒＤＮａｓｅ）１０μＬとｒＤＮａｓｅ反応緩衝液９０μＬを混合し、ＤＮａｓｅ反応混合物を調製した。ＤＮａｓｅ反応混合物９５μＬをスピンカラムに添加し、室温（１８〜２５°Ｃ）で１５分インキュベートした。
【００５２】
次に、洗浄液（Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）を２００μＬ、スピンカラムに添加し、遠心分離（１１０００×ｇ、３０秒）を行った。スピンカラムを新しい試料採取用チューブ（２ｍＬ）にセットし、洗浄液（Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）を６００μＬ添加し、遠心分離（１１０００×ｇ、３０秒）を行った。さらに、濾液を捨て、洗浄液を２５０μＬ、スピンカラムに添加し遠心分離（１１０００×ｇ、２分）した。再び濾液を捨て、遠心分離（１５０００×ｇ、１分）を行い、メンブレン乾燥を行った。
【００５３】
最後に、スピンカラムを１．５ｍＬチューブ（（株）イナ・オプティカ）にセットし、ＲＮａｓｅフリーのＨ２Ｏを４０μＬ添加し、遠心分離（１１０００×ｇ、１分）し、トータルＲＮＡを抽出した。
【００５４】
（ｃＤＮＡ合成）
前記マウス脾臓由来のトータルＲＮＡと逆転写酵素（プライムスクリプト（登録商標）ＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔ、タカラバイオ（株））を用い、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡは、滅菌超純水を用いて、４０μＬにメスアップした。
【００５５】
（リアルタイム定量的ＰＣＲ）
前記ｃＤＮＡを鋳型として、マウスβ−ａｃｔｉｎプライマー（タカラバイオ（株））とマウス免疫関連遺伝子プライマー（タカラバイオ（株））を用いてリアルタイム定量的ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によりＩＬ−４ｍＲＮＡ発現量を測定した。  
【００５６】
（実験結果）
図３にＩＬ−４ｍＲＮＡ発現量を測定したグラフを示す。図３において、ＬＧＧ野生株（ＷＴ）と比較してＫ５６Ｍ変異株（Ｎｏ．２７）の有意な現象が見られた（ｐ＜０．０５）。アレルギー感作マウスから抽出された脾臓細胞（ＯＶＡ）におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ発現量は約１７０（非感作マウスとの相対比較）に達したのに対し、ＬＧＧ野生株の死菌を添加した脾臓細胞（ＷＴ）ではその約１２％減の１５０程度に抑えられた。一方、ＬＧＧ変異株（Ｋ５６Ｍ）の死菌を×０．６２５の濃度で添加した脾臓細胞（Ｎｏ．２７）では、ＩＬ−４ｍＲＮＡ発現量は約１２０（対ＯＶＡで３０％減）に抑えられた。
【００５７】
（実施例２）
本実施例ではＫ１０１Ｅ変異株（Ｎｏ．６）の有用代謝産物による抗アレルギー効果の検証実験の結果について説明する。なお、実験条件については実施例１と同じであるため、ここでは省略し、実験結果のみ示す。
【００５８】
（実験結果）
図４にＩＬ−４ｍＲＮＡ発現量を測定したグラフを示す。図４において、ＬＧＧ野生株（ＷＴ）と比較して１０１Ｅ変異株（Ｎｏ．６）の有意な現象が見られた（ｐ＜０．０５）。図４において、アレルギー感作マウスから抽出された脾臓細胞（ＯＶＡ）におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ相対発現量は約８５（非感作マウスとの相対比較）に達したのに対し、ＬＧＧ野生株の死菌を添加した脾臓細胞（ＷＴ）ではその約１０％減の７７程度に抑えられた。一方、ＬＧＧ変異株（Ｋ１０１Ｅ）の死菌を×０．６２５の濃度で添加した脾臓細胞（Ｎｏ．６）では、ＩＬ−４ｍＲＮＡ相対発現量は約５２で、対ＯＶＡで約４０％減に抑えられた。さらに、ＬＧＧ変異株（Ｋ１０１Ｅ）の死菌を×１．２５の濃度で添加した場合、ＩＬ−４ｍＲＮＡ相対発現量は約３５で、対ＯＶＡで約６０％減と大幅に抑制されていることが示された。
【００５９】
（実施例３）
本実施例では、ＬＧＧ経口投与による抗アレルギー作用を検証する。まず、実施例１と同様の方法で前培養したＬＧＧ野生株と変異株を、あらかじめ温めておいたＭＲＳ培地に５％の濃度で播種した。５時間インキュベート後、遠心分離（３０００×ｇ、４°Ｃ、２０分）により回収した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄（ｗａｓｈ）したのち、１×１０９ｃｅｌｌｓ／２００μＬ／ｍｏｕｓｅとなるように調製した。
【００６０】
（経口投与実験スケジュールと実験群）
アレルギーモデルマウスは、６週齢および７週齢のマウスに、ＯＶＡ５０μｇおよび水酸化アルミニウムゲル（シグマアルドリッチ）２ｍｇを含むＰＢＳ２００μＬを腹腔内投与して感作させることにより作成した。また、経口ゾンデ法（マウス用経口ゾンデ、φ１．９×Ｌ３８ｍｍ、フチガミ）により、５週齢から８週齢まで、１×１０９ｃｅｌｌｓ／２００μＬ／マウスとなるように、ＬＧＧを週３回投与した。実験群は、Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ（ＮＴ群）、ＰＢＳ群、ＬＧＧ野生株（ＷＴ群）、ＬＧＧ変異株（Ｎｏ．６群）、ＬＧＧ変異株（Ｎｏ．１０群）、ＬＧＧ変異株（Ｎｏ．２７群）の６群を設定し、独立して３回の実験を行った。
【００６１】
前記の最終感作から１週間後すなわち８週齢に、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、脾臓を摘出し電子天秤（ＧＸ−２０００、Ａ＆Ｄ株式会社）により脾臓重量を小数点第一位（ｍｇ）まで測定した。さらに実施例１と同様の方法を用いて調製しマウス脾臓細胞を２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬずつ２４穴プレートに播き、３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下で３時間培養した。その後、ＯＶＡ（最終１０００μｇ／ｍＬ）で刺激し、７２時間培養した。さらに、実施例１と同様の方法によりトータルＲＮＡを回収し、逆転写反応により合成したｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイム定量的ＰＣＲにより発現解析を行った。
【００６２】
（採血と血清の調製）
前記の安楽死させたマウスから１８Ｇの注射針を用い心臓穿刺により採血を行った。ブロックインキュベータ（ＢＩ−５１６Ｃ、（株）アステック）を用い、２４°Ｃで３０分放置し、その後４°Ｃで一晩静置した。翌日、マイクロ冷却遠心機（３５００、久保田商事（株））を用いて、遠心分離（１０００×ｇ、４°Ｃ、３０分）後、マイクロチップを用いて血清を回収し、−８０°Ｃで保存した。
【００６３】
（ＥＬＩＳＡ法による血清トータルＩｇＥ量の測定）
前記血清サンプルを５０倍に希釈し、マウスＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ定量化キット（Ｂｅｔｈｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）を用いて、ＩｇＥの発現解析を行った。キャプチャー抗体としてアフィニティ精製済みヤギ抗マウスＩｇＥ抗体（Ａ９０−１１５Ａ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０００倍希釈し、９６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株））に１００μＬ／ｗｅｌｌで播き、４°Ｃで一晩静置した。
【００６４】
翌日、ＰＢＳ−Ｔ（ナカライテスク（株））で洗浄後、ブロッカー１（ＰＢＳ−Ｔ＋５％ＢＳＡ）を２００μＬ／ｗｅｌｌで播き、室温で３０分静置した。
【００６５】
次に、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、希釈した血清サンプルを添加し、濃度既知の抗原タンパク質（マウスＩｇＥキャリブレータ―、ＲＣ９０−１１５）を１００μＬ／ｗｅｌｌを１／５段階希釈によりスタンダード曲線を作製し、室温で１時間静置した。次に、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＨＲＰ標準抗体（ヤギ抗マウスＩｇＥ−ＨＲＰ標識、Ａ９０−１１５Ｐ）をブロッカー２（プロッカー１＋５％牛胎仔血清；ＦＣＳ）で７５０００倍希釈し１００μＬ／ｗｅｌｌで播き、室温で１時間静置した。さらに、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、基質ＴＭＢ（ナカライテスク（株））を１００μＬ／ｗｅｌｌで播き、遮光して室温で１５分程度ほど発色させ、１ｍｏｌ／Ｌの硫酸（ナカライテスク（株））を１００μＬ／ｗｅｌｌで播き、発色反応を止め、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６６】
（ＥＬＩＳＡ法による血清ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の測定）
前記血清サンプルを、アッセイ用バッファーを用いて２倍に希釈し、ＬＥＧＥＮＤ  ＭＡＸＴＭ  （登録商標）マウスＯＶＡ特異的ＩｇＥ−ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国）を用いて、ＯＶＡ特異的ＩｇＥの発現解析を行った。ＯＶＡプレコーテッド９６ウェルストリップμプレートを洗浄バッファーで洗浄後、スタンダードウェルに５０μＬのマトリクスサンプルウェルに５０μＬのアッセイ用バッファーＡを加え、スタンダードもしくはサンプルを５０μＬ／ｗｅｌｌで播き、室温で２時間静置した。スタンダード曲線は濃度既知の抗原タンパク質を１／２段階希釈により作製した。
【００６７】
洗浄バッファーで洗浄後、マウスＩｇＥ検出抗体（Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで播き、室温で１時間静置した。洗浄バッファーで洗浄後、アビジン−ＨＲＰを１００μＬ／ｗｅｌｌで播き、室温で３０分間静置した。洗浄バッファーで洗浄後、基質溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌで播き、遮光して室温で１５分静置し、発色反応を行った。停止液を１００μＬ／ｗｅｌｌで播き、発色反応を止め、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６８】
（実験結果）
経口投与スケジュールにおける最終感作の一週間後において、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスから摘出された脾臓のＯＶＡの再感作後のトータルＲＮＡを抽出し、ｉｌ−４ｍＲＮＡ発現の解析を行った（図５）。Ｋ１０１Ｅ変異株（Ｎｏ．６の群）はＰＢＳ群と比較し有意にｉｌ−４ｍＲＮＡ発現量を抑制した（ｐ＜０．０５）。
【００６９】
（実施例４）
本実施例ではＬＧＧ株に代えてラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）の一野生株であるＭＧ１３６３より耐抗生物質変異株を取得した結果について説明する。なお、ＭＧ１３６３は０．５％グルコース（ナカライ）を含むＭ１７ｂｒｏｔｈ（ベクトンディキンソン）（ＧＭ１７）で培養した。
【００７０】
（薬剤耐性変異株の取得）
ストレプトマイシン（ＳＭ）５１２μｇ／ｍＬを含むＧＭ１７寒天培地で生育したシングルコロニーをナンバリングし、滅菌爪楊枝を用いて同濃度のＧＭ１７寒天培地に植え継ぎ、３０°Ｃで２日間静置培養し、２５コロニーの耐性株を取得した。得られたコロニーをＧＭ１７寒天培地に植え継ぎ、マスタープレートとした。マスタープレートで得られたコロニーを、ストレプトマイシン０μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬ、５１２μｇ／ｍＬ、１０２４μｇ／ｍＬをそれぞれ含むＧＭ１７寒天培地に植え継ぎ、抗生物質耐性能を検討した。
【００７１】
次に、コロニーダイレクトＰＣＲ法によって、リボソームＳ１２領域を増幅した。このとき、フォワードプライマーとして配列番号５（５’−ＧＧＧＴＴＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＣＧＡＴＴＧ−３’）のオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号６（５’−ＴＣＴＣＡＴＣＧＣＴＴＣＧＣＡＧＡＡＡＴＧＴＣＧ−３’）のオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた。
【００７２】
（アガロースゲル電気泳動）
電気泳動は核酸用アガロース寒天粉末０．５ｇを５０ｍＬのＴＡＥ（ナカライテスク（株）、ｐＨ８．０）で溶解した１．０％濃度のゲルを用いて行った。また、泳動緩衝液には同様にＴＡＥを用いた。ＤＮＡラダーマーカーには、１００ｂｐ  ＤＮＡラダーおよび１ｋｂｐ  ＤＮＡラダー（ＢｉｏＬａｂｓ）を用いた。１００Ｖの定電圧を約４０分間通電した。ＤＮＡフラグメントを可視化するため、エチジウムブロマイド  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（終濃度１０μｇ／ｍＬ）をあらかじめゲルに添加した。泳動装置はＭｕｐｉｄ−２  Ｐｌｕｓ（コスモ・バイオ（株））を用い、フラグメントの検出はＧｅｌ  Ｄｏｃ（登録商標）  ＥＺ  Ｉｍａｇｅｒ（バイオラッドラボラトリーズ（株））を用いて行った。
【００７３】
（アガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製
目的のＤＮＡ断片を含むゲルをフルオロハンディーＬＥＤ（日本ジェネティクス（株））照射下で切り出し、ＦａｓｔＧｅｎｅ（登録商標）Ｇｅｌ／ＰＣＲ抽出キット（日本ジェネティクス（株））  を用いてＤＮＡを抽出した。ＬＥＤ照射下で切断した目的のＤＮＡ断片を含むゲルを１．５ｍＬマイクロチューブに移し、ピペットチップでゲルを粉砕した後、５００μＬのＧＰ１を加えた。その後、ボルテックスで混和し、５５°Ｃで約５分放置した後、再びボルテックスミキサーで混和することでゲルを完全に溶解させた。溶解後、サンプルをスピンカラムに移し、同カラムに５００μＬのＧＰ２を加えて遠心分離（１５，５００×ｇ、４°Ｃ、３０秒）し、流出液を除去した。さらに遠心分離（１５，５００×ｇ、４°Ｃ、２ｍｉｎ）して、カラムを乾燥させた。カラムを新しい１．５  ｍＬマイクロチューブに移し、１０μＬのＧＰ３を慎重に加え、２分放置し、遠心分離（１５，５００×ｇ、４°Ｃ、２分）し、ＤＮＡ溶液を得た。
【００７４】
以上のように調製したＤＮＡ溶液のシークエンス解析はユーロフィンジェノミクス（株）に委託した。結果は、遺伝子解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（登録商標）Ｖｅｒ．１５．０．７  （ＧＥＮＥＴＹＸ社）  を用いて解析した。
【００７５】
（実験結果）
ストレプトマイシン（ＳＭ）が１０２４μｇ／ｍＬの濃度において７つのシングルコロニーが目視で観察された。ＳＭが５１２μｇ／ｍＬのとき変位は起きなかった。結果を表２に示す。なお、７個のシングルコロニーのうち２個がＫ５６Ｒ変異株であり、３個がＫ１０１Ｒ変異株であった。なお、ＭＧ１３６３ＭＴの遺伝子レベルでの特徴付けを行うため、ゲノム上の３０Ｓリボソームタンパク質１２Ｓ領域をコロニーダイレクトＰＣＲにて増幅し、ＤＮＡシークエンス解析に供した。
【表２】
2019162039.tif 000004
【００７６】
（実施例５）
本実施例では、前記乳酸菌変異株（Ｋ５６Ｔ）が組換えタンパク質高生産株として利用できることを示す。具体的には前記ＭＧ１３６３の野生株と変異株をそれぞれ組換え遺伝子発現宿主として、ＧＦＰ発現変異株の作出を試みた。ＧＦＰ遺伝子発現ベクターは、既に構築されているｐＮＺ８１４８＃２から生成されたｐＮＺ８１４８＃３：ＳＥＣ−ＧＦＰを用いた。このｐＮＺ８１４８＃２は、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有する広宿主域ベクターｐＮＺ８１４８（ｎｉｓＡ プロモーター（ＰｎｉｓＡ）の下流にマルチクローニング部位を有す）から構築された組換え遺伝子の分泌型発現ベクターであり（非特許文献４）、誘導剤（ナイシン）添加によりタンパク質生産を開始する性質を有する。ｐＮＺ８１４８＃３：ＳＥＣは、このｐＮＺ８１４８＃２：ＳＥＣのプロモーターＰｎｉｓＡを恒常的発現プロモーターであるＰ２３に置換したものであり、誘導剤なしの条件下で、タンパク質を常時発現させるプラスミドである。ｐＮＺ８１４８＃３：ＳＥＣ−ＧＦＰは、このｐＮＺ８１４８＃３にさらにＧＦＰ遺伝子を導入したプラスミドベクターである。
【００７７】
（野生株と変異株のコンピテントセル作製）
まず、前記遺伝子発現プラスミドをＭＧ１３６３ＭＴ（変異株）、ＷＴ（野生株）に導入するためのコンピテントセルの作製を行った。双方の株をＧＭ１７に終濃度１％となるように接種し、３０°Ｃで一晩静置培養した。続いて、３０°Ｃに温めておいたＳＧ−ＧＭ１７（０．５Ｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ，  ２．５％  ｇｌｙｃｉｎｅ  ｉｎ  ＧＭ１７）にそれぞれ培養した双方の株を終濃度５％となるように接種し、３０°Ｃで２４時間静置培養した。さらに、３０°Ｃに温めておいたＳＧ−ＧＭ１７に培養した双方の株を終濃度１％となるように接種し、３０°Ｃで２４時間静置培養した。その後、３０°Ｃに温めておいた４０ｍＬのＳＧ−ＧＭ１７に前培養したＭＧ１３６３ＭＴ、ＷＴをそれぞれ５ｍＬ接種し、ＯＤ６００が０．２−０．３になるまで３０°Ｃ、約４時間静置培養した。
【００７８】
その後、遠心分離（６，０００×ｇ、４°Ｃ、２０ｍｉｎ）し上清を除去した。除去後、エレクトロポレーション（電気穿孔法）バッファー（０．５Ｍサッカロース、１０％  グリセリン）４０ｍＬを添加した後、同様に遠心分離し洗浄した。同様に上清を除去した後、エレクトロポレーションバッファーにＥＤＴＡ（５０ｍＭ）２０ｍＬを加えて再び懸濁し、氷上で１５分静置した後、同様に遠心分離を行った。さらに上清を除去し、エレクトロポレーションバッファー１０ｍＬで洗浄、遠心分離して同様に上清を除去した。最後に、エレクトロポレーションバッファー４００μＬで懸濁し、コンピテントセルとした。
【００７９】
（野生株と変異株への形質転換）
ＭＧ１３６３への遺伝子導入は、エレクトロポレーション（電気穿孔法）により行った。前記コンピテントセルに１００−５００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＮＺ８１４８＃３：ＳＥＣ、またはｐＮＺ８１４８＃３：ＳＥＣ−ＧＦＰ）を加えて混和した。その後、氷冷した２ｍｍキュベット（バイオラッド）に移し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（登録商標）  Ｓｙｓｔｅｍ  （バイオラッド）  でパルス（２，０００Ｖ、２５μＦ、２００Ω）を印加し、１ｍＬのＧＭ１７ＳＯＣ培地（ＧＭ１７中、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２）に素早く懸濁した。その後、１．５ｍＬマイクロチューブに移し、３０°Ｃのブロックインキュベータで２時間培養した。ＧＭ１７ｃｍ寒天培地に適当量を塗り広げ、３０°Ｃで一晩静置培養した。確認したコロニーを５つ選び釣菌し、ＧＭ１７ｃｍ液体培地ですすぎ、３０°Ｃで一晩静置培養した。
【００８０】
前培養として、前記ＭＧ１３６３ＭＴ（ＧＦＰ）、ＷＴ（ＧＦＰ）  をＧＭ１７ｃｍに終濃度１％で接種した後、３０°Ｃで一晩静置培養した。培養終了後、遠心分離（８，０００×ｇ、４°Ｃ、５分）により菌体と培養液上清に分離した。その後、菌液を３０°Ｃに温めておいたＧＭ１７ｃｍに終濃度５％となるように接種し、３０°Ｃで４時間、７時間、１２時間、静置培養した。培養終了後、遠心分離（８，０００×ｇ、４°Ｃ、５分）により菌体と培養液上清に分離した。
【００８１】
（培養液上清画分の調製）
前記培養液上清１，５００μＬに１００％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ３００μＬを加え、ボルテックスを用いて混和し、氷上で３時間放置することでタンパク質を濃縮した。遠心分離（２０，０００×ｇ，４°Ｃ，１５分）により沈殿物を回収し、４００μＬのアセトンを用いてペレットを遠心分離  （２０，０００×ｇ，４°Ｃ，１５分）の後、洗浄した。アセトンを用いた洗浄をもう一度行い、ペレットからＴＣＡを完全に除去した。さらに、５５°Ｃのブロックインキュベータにて乾燥したペレットを０．０５Ｍ水酸化ナトリウム１００μＬに溶解した。溶解したサンプルと等量の２×Ｓａｍｐｌｅバッファーを添加し、９５°Ｃで５分加熱することでＳＤＳ化した。
【００８２】
（ＧＦＰの発現解析）
前記調製サンプルを、リアルスラブ電気泳動装置ＢＥ−Ｓ２１（バイオクラフト）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、３０％（ｗ／ｖ）アクリルアミドと１．５Ｍトリス塩酸等を含む１５％の分離ゲル、及び３０％（ｗ／ｖ）アクリルアミドと０．５Ｍトリス塩酸等を含む濃縮ゲルを作製した。分子量マーカーにはＡｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｍａｋｅｒ−Ｌｏｗ  Ｒａｎｇｅ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）  を用いた。マーカーを５μＬ／ｗｅｌｌ、培養液上清画分サンプルを１０μＬ／ｗｅｌｌ適用し、ＳＤＳランニングバッファーを用いて１２５Ｖで約２時間通電し電気泳動を行った。
【００８３】
前記電気泳動より得られたゲルからの膜転写には、ミニトランスブロットセル（バイオラッド）を用いた。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ  ０．４５μｍ  ＰＶＤＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）  を１００％メタノールにそれぞれ１５分浸し、その後転写バッファー（ナカライテスク（株））に浸した。同様に、フィルターペーパー（クロマトグラフィー紙（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）  も転写バッファーに浸した。フィルターペーパーでＰＶＤＦ膜およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲルを挟み込み、転写バッファーを用いて１００Ｖで１時間通電することで電気泳動により分離し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜へ転写した。
【００８４】
（ウェスタンブロッティング）
転写後のＰＶＤＦ膜を３％のスキムミルク（森永ミルク工業（株））を含むＴＢＳ−Ｔ（ナカライテスク（株）、ｐＨ７．４）で１時間ブロッキングした後、さらに適量のＴＢＳ−Ｔで１０分の振盪洗浄を３回行い、一次抗体溶液として、マウス抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（１／１０００）を含むＴＢＳ−Ｔに４°Ｃで一晩振盪した。適量のＴＢＳ−Ｔで１０分の振盪洗浄を３回行い、二次抗体溶液として、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−複合ヤギ抗マウスＩｇＥ抗体（１／５０００）（シグマアルドリッチ）を含むＴＢＳ−Ｔに室温で１時間振盪した。その後、同様に適量のＴＢＳ−Ｔで１０分の振盪洗浄を３回行った後、ＥＣＬプライムウェスタンブロッティング検出試薬（ＲＰＮ２２３２、ＧＥヘルスケア）を用い、バンドは  ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ５００（ＧＥヘルスケア）を用いて検出した。
【００８５】
（実験結果）
前記５つのコロニーに由来するＭＧ１３６３ＭＴ（ＧＦＰ）と１つのＭＧ１３６３ＷＴ（ＧＦＰ）をそれぞれＧＭ１７ｃｍで培養し、組換えタンパク質の発現を誘導した。ここでＭＴは変異株（Ｋ５６Ｔ）を、ＷＴは野生株をそれぞれ表す。また、（ＧＦＰ）はＧＦＰ遺伝子発現ベクター（前記ＰＮＺ８１４８＃３：ＳＥＣ−ＧＦＰ）を導入したものであることを意味する。誘導後、培養液上清におけるタンパク質溶液を調製した。調製したタンパク質溶液をウェスタンブロッティングに供し、ＧＦＰの発現を解析した（図６）。培養４時間後において５つの変異株（ＭＴ）のサンプルを全てウェスタンブロッティングに供したところ、いくつかのＭＴのバンドの濃さは、コロニーにより異なるが、全体的に濃くなっていた。
【００８６】
（実施例６）
本実施例では、さらにラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）の別の野生株であるＮＺ９０００より耐抗生物質変異株を取得した結果について説明する。
【００８７】
（薬剤耐性変異株の取得）
ストレプトマイシン（ＳＭ）を５１２μｇ／ｍＬもしくは１０２４μｇ／ｍＬの濃度で含むＭＲＳ（ＳＭ）寒天培地にＮＺ９０００を１ｍＬ播種し、２日間３７°Ｃでインキュベートした。その結果、ＳＭが１０２４μｇ／ｍＬの濃度において６つのシングルコロニーが目視で観察された。ＳＭが５１２μｇ／ｍＬのとき変位は起きなかった。結果を表３に示す。なお、６個のシングルコロニーのうち５個がＫ５６Ｎ変異株であり、１個がＫ５６Ｑ変異株であった。またストレプトマイシンに依存したＰ１０４Ｌ変異株も得られた。
【表３】
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【００８８】
（実施例７）
本実施例では、実施例６で生成されたＮＺ９０００変異株に対し、ＩＬ６ｓｃＦｖ遺伝子の発現ベクターとして用いる乳酸菌用プラスミド（ｐＮＺ８１４８＃２：ＳＥＣ−ＩＬ６ｓｃＦｖ）を電気穿孔法により導入して生成した組換え株を、グルコース０．５％含むＳＧ寒天培地（ＳＧ−ＧＭ１７）を使って培養した結果について説明する。
【００８９】
図７に示されるように、Ｋ５６Ｎ変異株の組換株（Ｎｏ．１）とＫ５６Ｑ変異株の組換え株（Ｎｏ．２１）は、野生株に単に遺伝子組換えを施したノーマル株（Ｎｏ．４）と同様に顕著な増殖と形質転換が確認された。ストレプトマイシン依存性を有するＰ１０４Ｌ変異株（Ｎｏ．８）については顕著な増殖も形質転換も観測されなかった。５１２μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む寒天培地で培養された株（ストレプトマイシン敏感感受性株、Ｎｏ．１７）については顕著な増殖は確認されなかったが、形質転換は確認された。
【００９０】
図８は、ウェスタンブロッティングにおいて、ナイシン添加培地で培養した図７で示された変異株の細胞（ＣＥＬＬ）および細胞抽出液（ＳＵＰ）よりｒＩＬ６ｓｃＦｖの分泌前駆体（３４．０ｋＤａ）および分泌型ｒＩＬ６ｓｃＦｖ（３１．２ｋＤａ）の分子量に一致するバンドを観察したものである。
【００９１】
図８において、細胞におけるｒＩＬ６ｓｃＦｖ（ＣＥＬＬ）は、Ｋ５６Ｎ変異株（＃１）、ノーマル（＃４）、Ｋ５６Ｑ変異株の順に、ｒＩＬ６ｓｃＦｖ分泌前駆体のバンドが顕著に検出された。ストレプトマイシン敏感感受性株（＃１７）は野生株（ＷＴ−ＶＣ）と同様、バンドは全く確認されなかった。野生株に対してＩＬ６ｓｃＦｖ遺伝子を発現させた株（ＷＴ−ＩＬ６ｓｃＦｖ）は弱いながらもバンドが検出された。
【００９２】
細胞抽出液におけるｒＩＬ６ｓｃＦｖ（ＳＵＰ）については、ＷＴ−ＩＬ６ｓｃＦｖが最も顕著に、続けてＫ５６Ｎ変異株（＃１）、ノーマル株（Ｎｏ．４）の順にシングルバンドが確認された。ストレプトマイシン敏感株（＃１７）とＫ５６Ｑ変異株（＃２１）は野生株（ＷＴ−ＶＣ）と同様、バンドは全く検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、アトピー性皮膚炎の発症率の低減、花粉症症状の低減、感染症の予防に利用することができる。また、組換えタンパク質高生産株として利用することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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