(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞を胚体内胚葉細胞へと分化誘導させるための改良された方法の提供。【解決手段】少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤とアクチビンとを含む組成物、少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤とアクチビンとを含むキット。これらの組成物またはキットを用いて、分化期の哺乳類多能性幹細胞をＤＮＡ脱メチル化剤に曝露することにより、内胚葉細胞の改良された形態及び改善された産生量につながる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤とアクチビンとを含む組成物。
【請求項２】
前記ＤＮＡ脱メチル化剤がシチジン類似体である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＤＮＡ脱メチル化剤が５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、ゼブラリン、プソイドイソシチジン、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン、２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）又はシトシン−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシドからなる群から選択される請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＤＮＡ脱メチル化剤が５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン及び２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）からなる群から選択される請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＤＮＡ脱メチル化剤が５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）である請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＤＮＡ脱メチル化剤が５−アザシチジン（アザシチジン）である請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
前記アクチビンがアクチビンＡ又はアクチビンＢである請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤とアクチビンとを含むキット。
【請求項９】
前記ＤＮＡ脱メチル化剤がシチジン類似体である請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ脱メチル化剤が５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、ゼブラリン、プソイドイソシチジン、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン、２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）又はシトシン−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシドからなる群から選択される請求項８又は９に記載のキット。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ脱メチル化剤が５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン及び２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）からなる群から選択される請求項８又は９に記載のキット。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ脱メチル化剤が５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）である請求項８又は９に記載のキット。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ脱メチル化剤が５−アザシチジン（アザシチジン）である請求項８又は９に記載のキット。
【請求項１４】
前記アクチビンがアクチビンＡ又はアクチビンＢである請求項８〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
哺乳類多能性幹細胞をさらに含む請求項８〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
前記哺乳類多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞の胚体内胚葉細胞への分化誘導に関する。より詳しくは、本発明は、内胚葉への分化の間の哺乳類多能性幹細胞、特にｈＰＳ細胞のＤＮＡ脱メチル化剤での処理に関する。本発明者らは、本明細書に開示されるように、分化期の哺乳類多能性幹細胞、特にｈＰＳ細胞をＤＮＡ脱メチル化剤に曝露することにより、内胚葉細胞の改良された形態及び改善された産生量をもたらすことを発見した。また、ＤＮＡ脱メチル化剤での処理は、幹細胞マーカーＯｃｔ４の発現の有意なダウンレギュレーションと、内胚葉特異的マーカー、特に、ｓｏｘ１７、ｃｘｃｒ４及びｈｈｅｘの改善された発現をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞は、適当な条件下で、３種の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）のあらゆるタイプの特殊化した細胞を形成する能力だけでなく、自己再生する能力を有するので、ヒト多能性幹細胞は種々のヒト細胞型への到達性に大変革をもたらすことが予測される。内胚葉層は、障害又は損傷が今日見られる多くの病態及び臨床的障害に関連する腸、膵臓、肝臓及び肺、すなわち、人体の器官を生じるため、内胚葉層に主要な関心がある。よって、大きな期待が、補充療法のための臓器特異的組織のインビトロ開発に寄せられている。
【０００３】
上記器官に発達するための３種の胚葉のうち、そのユニークな機能に起因して、内胚葉、より詳しくは、胚体内胚葉は、臓器特異的組織の産生において中心的な役割を果たす。よって、最終的に、臓器特異的細胞及び組織の質と量に影響を与えるインビトロで誘導された内胚葉細胞の特性を改善するための持続する必要がある。しかし、ヒト多能性幹細胞を内胚葉へ分化させるための今までに確認されたわずかな要因だけでは、初期内胚葉の発生は十分に理解されていない。よって、内胚葉の発生に影響を与える、いまだに未確認の要因をさらに発見することが重要であり、内胚葉器官の細胞及び組織のインビトロでの産生のための培養条件を最適化するために役立つ。
【０００４】
正常な胚形成及び発生の際のＤＮＡメチル化の重要性は長い間疑われており、ＤＮＡ脱メチル化剤の適用はゲノム中の遺伝子の大規模な広範な再活性化を引き起こす可能性がある。ＤＮＡ脱メチル化は、おそらく、通常メチル化及びサイレンス化された心筋形成に必要な遺伝子を活性化することにより、ｈＥＳ細胞の心臓原基への分化を誘導するために使用することができることを以前の研究で明らかにした（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ユンら２００６
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞が、当技術分野の方法の現在利用可能な状態により得られた内胚葉細胞と比較して、改良された特徴を有する胚体内胚葉細胞へと分化する改良された方法について記載する。
【０００７】
本発明は、第１の態様において、哺乳類多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）、特に、ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞由来の胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）を産生する方法を提供し、該方法において、哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹細胞がＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される。
【０００８】
よって、分化条件下で、哺乳類多能性幹細胞を培養し、ＤＥ細胞を得ることと、
前記分化期の哺乳類多能性幹細胞をＤＮＡ脱メチル化剤に曝露することとを含む哺乳類多能性幹細胞由来のＤＥ細胞を産生する方法を提供する。
【０００９】
特に、分化条件下で、ヒト多能性幹細胞を培養し、ＤＥ細胞を得ることと、前記分化期のヒト多能性幹細胞をＤＮＡ脱メチル化剤に曝露することとを含むヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞由来のＤＥ細胞を産生する方法を提供する。
【００１０】
哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞の胚体内胚葉細胞への分化の間に、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞を５−アザ−２−デオキシシチジン又は５−アザシチジンなどのＤＮＡ脱メチル化剤に曝露し、ゲノムの断片を脱メチル化し、遺伝子の転写活性化を可能にする。
【００１１】
前記ＤＮＡ脱メチル化剤への曝露は、哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞のＤＥ細胞への分化の間の任意の時点に行ってもよい。
【００１２】
本発明による方法の結果として、改良された特性を有する、胚体内胚葉細胞と、胚体内胚葉細胞を含む細胞組成物とが得られる。よって、さらなる態様では、本発明は、本発明の方法により得られる１つ又は複数の胚体内胚葉細胞と、前記１つ又は複数の前記内胚葉細胞を含む又はからなる１つ又は複数の細胞組成物とに関する。
【００１３】
他の態様では、本発明は、腸、膵臓、肝臓及び／又は肺の細胞又は組織を産生するための本発明の前記１つ又は複数の胚体内胚葉細胞又は前記１つ又は複数の細胞組成物のさらなる使用に関する。本発明の前記１つ又は複数の胚体内胚葉細胞又は前記１つ又は複数の細胞組成物は、例えば、肝前駆細胞、又は肝組織を含む十分に成熟した肝細胞様細胞を産生するために使用される場合がある。また、本発明の前記１つ又は複数の胚体内胚葉細胞又は前記１つ又は複数の細胞組成物は、膵前駆細胞か、膵星細胞又はランゲルハンス細胞などの十分に成熟した膵臓細胞か、膵臓組織かを産生するために使用される場合がある。
【００１４】
他の態様では、本発明は、創薬プロセス又は毒性試験などの医薬品及び毒性スクリーニングでの、本発明の前記１つ又は複数の胚体内胚葉細胞又は１つ又は複数の細胞組成物のさらなる使用を提供する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹細胞からの胚体内胚葉細胞の産生時のＤＮＡ脱メチル化剤の使用を提供する。
【００１６】
さらに他の態様では、本発明は、本発明の方法の実施に有用なキットに関する。この態様には、少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤を含むキットが含まれる。本発明の前記方法で使用される成分に関して本明細書に記載される詳細が、本発明のキットに含まれる成分にも適用されることが理解される。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は組成物に関する。かかる組成物は、哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を産生するのに、特に有用である。この態様には、少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤と、アクチビンＡ又はＢなどのアクチビンとを含む組成物が含まれる。本発明の前記方法で使用される成分に関して本明細書に記載される詳細が、本発明の組成物に含まれる成分にも適用されることが理解される。
【００１８】
本発明は、哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞へと分化するための方法を提供し、前記方法は、ＤＮＡ脱メチル化剤を含む、支持培養及び分化培地中で、前記哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞を培養することを含む。よって、哺乳類幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、内胚葉への分化の間に、ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される。
【００１９】
よって、本発明は、哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性細胞から胚体内胚葉細胞を産生する方法を提供し、前記哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、内胚葉への分化の間に、ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される。
【００２０】
哺乳類多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞、特に、ｈＰＳ細胞由来の胚体内胚葉細胞を産生する方法は、分化条件下で、哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹細胞を培養し、前記胚体内胚葉細胞を得ることと、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹細胞をＤＮＡ脱メチル化剤に曝露することとを含むと記載される場合がある。
【００２１】
本発明による方法で使用される前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素活性を妨害する任意の化合物を含む場合がある。適当なＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）又はゼブラリンのシチジン類似体などのヌクレオシド類似体タイプ、及びプロカイン、ＲＧ１０８、Ｓ−５−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、コーヒー酸、クロロゲン酸、没食子酸エピガロカテキン、ヒドララジン塩酸塩、プロカインアミド塩酸塩又はプサムマプリンＡなどの非ヌクレオシドタイプである。
【００２２】
よって、本発明の方法で使用されるＤＮＡ脱メチル化剤は、前記ヌクレオシド類似体タイプの１つであってもよい。また、本発明の方法で使用される前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、前記非ヌクレオシドタイプの１つであってもよい。また、本発明の方法で使用される前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、両方のタイプの混合物であってもよい。
【００２３】
本発明の方法で使用される場合がある前記ヌクレオシド類似体タイプのＤＮＡ脱メチル化剤の非限定的な例は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）及びゼブラリンである。前記非ヌクレオシドタイプの非限定的な例は、プロカイン、ＲＧ１０８、Ｓ−５−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、コーヒー酸、クロロゲン酸、没食子酸エピガロカテキン、ヒドララジン塩酸塩、プロカインアミド塩酸塩又はプサムマプリンＡである。
【００２４】
よって、本発明の方法で使用される前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、ゼブラリン、プロカイン、ＲＧ１０８、Ｓ−５−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、コーヒー酸、クロロゲン酸、没食子酸エピガロカテキン、ヒドララジン塩酸塩、プロカインアミド塩酸塩、プサムマプリンＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つである場合がある。
【００２５】
本発明の方法で使用される前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、ゼブラリン、プソイドイソシチジン、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン、２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）又はシトシン−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシドなどのシチジン類似体である場合がある。
【００２６】
よって、本発明の方法で使用される前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン及び２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）からなる群から選択されるシチジン類似体である場合がある。
【００２７】
よって、本発明の方法で使用される前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）及び５−アザシチジン（アザシチジン）からなる群から選択されるシチジン類似体であってもよい。また、本発明の方法で使用される前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）又は５−アザシチジン（アザシチジン）ではないシチジン類似体であってもよい。よって、本発明の方法で使用される前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン及び２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）からなる群から選択されるシチジン類似体である場合がある。
【００２８】
よって、本発明の方法で使用される前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、５−アザ−２−デオキシシチジンである場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、５−アザシチジンである場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、ゼブラリンである場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、プソイドイソシチジンである場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、５−フルオロ−２−デオキシシチジンである場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンである場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンである場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、６−アザシチジンである場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）である場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、シトシン−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシドである場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、プロカインである場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、ＲＧ１０８である場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、Ｓ−５−アデノシル−Ｌ−ホモシステインである場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、コーヒー酸である場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、クロロゲン酸である場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、没食子酸エピガロカテキンである場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、ヒドララジン塩酸塩である場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、プロカインアミド塩酸塩である場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、プサムマプリンＡである場合がある。
【００２９】
前記分化期のｈＰＳ細胞は、１種のＤＮＡ脱メチル化剤に曝露されるだけでなく、２、３、４、５、６又は７種の上述のＤＮＡ脱メチル化剤の組み合わせのように、１又は２種以上のさらなるＤＮＡ脱メチル化剤に曝露されてもよい。
【００３０】
前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、例えば、２種の上述のＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、５−アザシチジン（アザシチジン）及び５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）の組み合わせか、５−アザシチジン及びゼブラリンの組み合わせかに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、５−アザシチジン（アザシチジン）及び５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンの組み合わせに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）及び５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンの組み合わせに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、５−アザシチジン（アザシチジン）及び２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンの組み合わせに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）及び２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンの組み合わせに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、５−アザシチジン（アザシチジン）及び６−アザシチジンの組み合わせに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）及び６−アザシチジンの組み合わせに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、５−アザシチジン（アザシチジン）及び２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）の組み合わせに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）及び２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）の組み合わせに曝露される場合がある。
【００３１】
また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、５−アザ−２−デオキシシチジンと、プロカイン、ＲＧ１０８、Ｓ−５−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、コーヒー酸、クロロゲン酸、没食子酸エピガロカテキン、ヒドララジン塩酸塩、プロカインアミド塩酸塩及びプサムマプリンＡのうち１つとの組み合わせなどのヌクレオシド類似体タイプのＤＮＡ脱メチル化剤と非ヌクレオシドタイプのＤＮＡ脱メチル化剤との組み合わせに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、３種の上述のＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）及びゼブラリンの組み合わせに曝露される場合がある。
【００３２】
前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、一般に、約１ｎＭないし約１０μＭの範囲例えば約１ｎＭないし約５μＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。
【００３３】
前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、例えば、約１ｎＭないし約１μＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約５００ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約２５０ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約１００ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約５０ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約２５ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約１５ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約１０ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約５ｎＭないし約５００ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約５ｎＭないし約２５０ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約５ｎＭないし約１００ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約５ｎＭないし約５０ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約５ｎＭないし約２５ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約５ｎＭないし約１５ｎＭの範囲例えば約１０ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約７．５ｎＭないし約２５０ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約７．５ｎＭないし約１００ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約７．５ｎＭないし約５０ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約７．５ｎＭないし約２５ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約７．５ｎＭないし約１２．５ｎＭの範囲の濃度の前記ＤＮ���脱メチル化剤に曝露される場合がある。
【００３４】
例えば、５−アザ−２−デオキシシチジンが前記ＤＮＡ脱メチル化剤として使用される場合、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、１ｎＭないし約１μＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約５００ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約２５０ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約１００ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約５０ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約２５ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約１５ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約１ｎＭないし約１０ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約５ｎＭないし約５００ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。よって、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約５ｎＭないし約２５０ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約５ｎＭないし約１００ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約５ｎＭないし約５０ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約５ｎＭないし約２５ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約５ｎＭないし約１５ｎＭの範囲例えば約１０ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約７．５ｎＭないし約２５０ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約７．５ｎＭないし約１００ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約７．５ｎＭないし約５０ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈ���Ｓ細胞は、約７．５ｎＭないし約２５ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。また、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、約７．５ｎＭないし約１２．５ｎＭの範囲の濃度の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。
【００３５】
５−アザシチジン又はゼブラリンが前記ＤＮＡ脱メチル化剤として使用される場合に、同様の濃度が用いられてもよい。また、例えば、プソイドイソシチジン、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン、２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）又はシトシン−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシド、特に、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン又は２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）などの他のシチジン類似体の場合に、同様の濃度が用いられてもよい。
【００３６】
前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、多能性幹細胞段階と内胚葉段階の間のいかなる段階で前記ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露されてもよい（又は前記ＤＮＡ脱メチル化剤で処理されてもよい）。よって、前記ＤＮＡ脱メチル化剤への曝露は、哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞のＤＥ細胞への分化の間に行われる場合がある。
【００３７】
前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞が、分化２日目ないし７日目の間のような、細胞倍加時間によって証明される最大の増殖能を示すときに、前記分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞が、通常、前記ヌクレオシド類似体タイプの前記ＤＮＡ脱メチル化剤（例えば、５アザ−２デオキシシチジン、５−アザシチジン、ゼブラリン）に曝露される。よって、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、分化２日目に、分化培地に添加される場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、分化３日目に、分化培地に添加される場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、分化４日目に、分化培地に添加される場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、分化５日目に、分化培地に添加される場合がある。また、前記ＤＮＡ脱メチル化剤は、分化６日目に、分化培地に添加される場合がある。前記非ヌクレオシドタイプのＤＮＡ脱メチル化剤（例えば、プロカイン、ＲＧ１０８、Ｓ−５−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン）は、効果を生じるのに細胞増殖が必要ないので、分化プロトコールの任意の時点で添加することができる。
【００３８】
驚くべきことに、分化期の哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞のＤＮＡ脱メチル化剤での処理が、胚体内胚葉細胞の改良された形態及び改善された産生量をもたらすことを発見した。また、脱メチル化剤での処理が、より純粋で均一な内胚葉細胞集団をもたらす（図１Ａ〜Ｂ）。また、驚くべきことに、ＤＮＡ脱メチル化剤での処理は、内胚葉細胞での幹細胞マーカーＯｃｔ４の発現の有意なダウンレギュレーション（図１Ｃ及びＤ）と、ＤＥ特異的マーカーｓｏｘ１７、ｃｘｃｒ４及びｈｈｅｘの改善されたタンパク質及び遺伝子発現とをもたらす（図１Ｄ）。哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞の胚体内胚葉への分化に関与するＤＮＡ脱メチル化及び増殖因子の適用で、かかる効果が示されることは初めてであると考えられる。理論に拘束されることなく、ゲノムレベルで関与する増殖因子の作用は、メチル化の広範な非存在により増強されると理解される。
【００３９】
本発明の開始材料は、哺乳類胚性幹細胞又は哺乳類人工多能性幹細胞などのいかなるタイプの哺乳類多能性幹細胞であってもよい。
【００４０】
本発明で使用される前記哺乳類多能性幹細胞は、例えば、ヒト多能性幹細胞、霊長類多能性幹細胞、マウス多能性幹細胞、ラット多能性幹細胞、イヌ多能性幹細胞、ネコ多能性幹細胞、ブタ多能性幹細胞、ウシ多能性幹細胞又はウマ多能性幹細胞である場合がある。
【００４１】
特に、本発明の開始材料は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞又はヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞などのいかなるタイプのヒト多能性幹細胞であってもよい。
【００４２】
よって、ＤＥ細胞を得るための開始材料として使用される前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である場合がある。かかるｈＥＳ細胞を得るための種々の技術は、当業者に公知である。しかし、好ましくは、本発明による使用のための前記ｈＥＳ細胞は、例えば、チャンら（２００８）に記載され、さらにメルカデルらによりＥｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（第１版，２００９）に記載された単一割球除去法を使用することなどにより、ヒト胚を破壊することなく得られた（又は入手された）ｈＥＳ細胞である。使用に適したｈＥＳ細胞株は、ＮＩＨ幹細胞レジストリー、英国幹細胞バンク及び欧州ｈＥＳＣレジストリーに収載され、依頼に応じて入手可能な、例えば、細胞株ＳＡ１６７、ＳＡ１８１、ＳＡ４６１（セラーティス社，ヨーテボリ，スウェーデン）である。他の使用に適した細胞株は、全て、（アドバンスト・セル・テクノロジー社ウースター，マサチューセッツ州，米国に割り当てられ）国際幹細胞レジストリーで収載された、細胞株ＭＡ０１及びＭＡ０９などのクリマンスカヤら（２００６）により樹立された細胞株と、細胞株ＭＡ１２６、ＭＡ１２７、ＭＡ１２８及びＭＡ１２９などのチャンら（２００８）により樹立された細胞株とである。
【００４３】
また、内胚葉細胞及び／又は肝前駆細胞を得るための開始材料として使用される場合があるヒト多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞である場合がある。かかるｈｉＰＳ細胞を得るための種々の技術は、科学文献に記載され、よって、当業者に公知である［例えば、タカハシら（２００７）；チョウら（２００９）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版）のユー及びトムスン参照］。
【００４４】
本発明の開始材料は、哺乳類胚性幹細胞又は哺乳類人工多能性幹細胞などのいかなるタイプの哺乳類多能性幹細胞であってもよく、該哺乳類多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞ではない。
【００４５】
哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞をＤＥ細胞に分化させるための適切な条件は、公知である（例えば、ハイ２００８，ブローレン２０１０及びデュアン２０１０参照）。例えば、国際公開第２００９／０１３２５４号Ａ１には、ｈＰＳ細胞から胚体内胚葉細胞を得るための適切なプロトコールが記載される（実施態様１から４）。
【００４６】
一般に、内胚葉細胞を得るために、哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、アクチビンＡ又はＢなどのアクチビンを含む分化培地で培養される。前記分化培地は、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、フェニル酪酸（ＰＢ）、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、エンチノスタット又はパノビノスタットなどのヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤をさらに含む場合がある。前記分化培地は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２及びＦＧＦ４などの１又は２種以上の増殖因子、及び／又はＦＢＳ又はＦＣＳなどの血清をさらに含む場合がある。前記分化培地は、例えばＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３−阻害剤、又はＷｎｔ３ＡなどのＷｎｔシグナル活性化剤を含む場合がある。前記分化培地は、ＬＹ２９４００２などのＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３キナーゼ）阻害剤をさらに含む場合がある。
【００４７】
アクチビンの濃度は、通常、約５０ないし約１５０ｎｇ／ｍｌ例えば約８０ないし約１２０ｎｇ／ｍｌの範囲である。例えば、アクチビンは、約５０ｎｇ／ｍｌ又は約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、分化培地に含まれる場合がある。前記ＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、通常、約０．５ないし約２ｍＭの範囲である。前記ＨＤＡＣ阻害剤は、例えば、約０．５ｍＭ又は約１ｍＭの濃度で分化培地に含まれる場合がある。前記１又は２種以上の増殖因子の濃度は、使用される特定の化合物により異なってもよい。例えば、ＦＧＦ２の濃度は、通常、約２ないし約５０ｎｇ／ｍｌ例えば約２ないし約１０ｎｇ／ｍｌの範囲である。ＦＧＦ２は、例えば、約４又は約５ｎｇ／ｍｌの濃度で、分化培地に含まれる場合がある。例えば、ＦＧＦ１の濃度は、通常、約５０ないし約２００ｎｇ／ｍｌ例えば約８０ないし約１２０ｎｇ／ｍｌの範囲である。ＦＧＦ１は、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で分化培地に含まれる場合がある。例えば、ＦＧＦ４の濃度は、通常、約２０ないし約４０ｎｇ／ｍｌの範囲である。ＦＧＦ４は、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌの濃度で分化培地に含まれる場合がある。含まれる場合、血清の濃度は、通常、例えば約０．１ないし約０．５％、約０．２ないし約１．５％ｖ／ｖ、約０．２ないし約１％ｖ／ｖ、約０．５ないし１％ｖ／ｖ又は約０．５ないし約１．５％ｖ／ｖなどの約０．１ないし約２％ｖ／ｖの範囲である。血清は、例えば、約０．２％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ又は約１％ｖ／ｖの濃度で、分化培地に含まれる場合がある。含まれる場合、前記ＧＳＫ３阻害剤の濃度は、通常、約０．０５ないし約５μＭなどの約０．１ないし約１０μＭの範囲である。含まれる場合、前記Ｗｎｔシグナル活性化剤の濃度は、通常、約０．０５ないし約１０ｎｇ／ｍｌ例えば約０．５ないし約５μＭの範囲である。前記ＰＩ３Ｋ阻害剤の濃度は、例えば、通常、約０．１ないし１０μＭ例えば約１ないし５μＭの範囲である。
【００４８】
分化培地は、ＰＥＳＴ及び／又はグルタマックスなどの他のサプリメントをさらに含んでもよい。また、分化培地は、ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含んでもよい。ＰＥＳＴの濃度は、通常、約０．１ないし約０．５％ｖ／ｖ、例えば、約０．１ないし約０．２５％ｖ／ｖの範囲である。グルタマックスの濃度は、通常、約０．５ないし約１．５％ｖ／ｖの範囲、例えば、約０．７５ないし１．２５％ｖ／ｖ、例えば約１％ｖ／ｖである。また、分化培地は、ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含んでもよい。前記ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、通常、約１ないし約１０μＭの範囲、例えば、約２．５ないし約７．５μＭ、例えば約５μＭである。
【００４９】
分化培地の基礎を形成する培地は、ＲＰＭＩ  １６４０又はアドバンストＲＰＭＩ  １６４０培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＨＣＭ培地、ＨＢＭ培地又はウィリアムＥ基礎培地などの哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞を培養するのに適したいかなる培地であってもよい。よって、前記分化培地は、上述の成分を含む又は補充したＲＰＭＩ  １６４０又はアドバンストＲＰＭＩ  １６４０培地である場合がある。また、分化培地は、上述の成分を含む又は補充したＤＭＥＭであってもよい。よって、分化培地は、上述の成分を含む又は補充したＨＣＭ培地であってもよい。よって、分化培地は、上述の成分を含む又は補充したＨＢＭ培地であってもよい。よって、分化培地は、上述の成分を含む又は補充したウィリアムＥ基礎培地であってもよい。
【００５０】
内胚葉分化のため、哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、上述のようなアクチビン含有分化培地で、最大１０日間正常に培養される。前記哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞は、例えば、約４ないし約９日間、約４ないし約７日間又は約７ないし約９日間などの約４ないし約１０日間、前記分化培地中で培養される場合がある。
【００５１】
哺乳類多能性幹細胞、特に、ｈＰＳ細胞から胚体内胚葉細胞を得るための基本的な、非限定的な培養条件が、本明細書の実施例２に記載される。
【００５２】
また、本発明の内胚葉細胞は、ゼノフリー（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）条件下で得られる場合がある。よって、このように、本発明の方法で使用される前記開始材料は、動物由来成分を含まない条件下で得られた又は樹立されたゼノフリーｈＰＳ細胞又は細胞株などのゼノフリー物質であってもよい。また、本発明の方法を通じて、細胞は、真にゼノフリーの内胚葉細胞を生じさせるゼノフリー条件下で、完全に培養されてもよい。かかる細胞又は細胞株は、ゼノフリーではない細胞中の非ヒトのシアル酸Ｎｅｕ５Ｇｃ又は他の非ヒトマーカーの存在によって、ゼノフリーではない組成物から区別することができる（マーティンら２００５）。
【００５３】
本発明の方法の結果として、当技術の方法の現在利用可能な状態と比較して、改良された特徴を有する内胚葉細胞例えばＤＥ細胞が得られる。
【００５４】
本発明により得られた胚体内胚葉細胞の集団又は細胞組成物は、ＤＮＡ脱メチル化剤で処理せずに得られた細胞集団又は細胞組成物と比較して、Ｏｃｔ４のような幹細胞マーカーの改良されたより低い発現を示す。また、胚体内胚葉細胞の集団又は細胞組成物は、胚体内胚葉細胞に特徴的な多くのマーカー、特に、ｓｏｘ１７、ｃｘｃｒ４及びｈｈｅｘの増加した遺伝子発現を示す。また、得られた胚体内胚葉細胞の集団又は細胞組成物は、ＤＮＡ脱メチル化剤で処理せずに得られた胚体内胚葉細胞の集団又は細胞組成物と比較して、より高純度で均一である。
【００５５】
本発明の前記１つ又は複数の細胞組成物は、細胞の少なくとも７０％例えば７５％、８０％、９０％又は９５％が本発明の内胚葉細胞である点で、さらに、特徴付けられてもよい。
【００５６】
一旦得られた本発明の前記１つ又は複数の内胚葉細胞、又は前記１つ又は複数の細胞組成物が、腸、膵臓、肝臓及び／又は肺の細胞又は組織を産生するためにさらに使用されてもよい。本発明の前記１つ又は複数の内胚葉細胞、又は前記１つ又は複数の細胞組成物が、例えば、肝前駆細胞か、又は肝組織を含む十分に成熟した肝細胞様細胞かを産生するために使用されてもよい。また、本発明の前記１つ又は複数の内胚葉細胞、又は前記１つ又は複数の細胞組成物が、膵前駆細胞か、又は膵星細胞又はランゲルハンス細胞又は膵臓組織などの十分に成熟した膵臓細胞かを産生するために使用されてもよい。
【００５７】
また、本発明の前記１つ又は複数の内胚葉細胞、又は前記１つ又は複数の細胞組成物が、創薬プロセス又は毒性試験などの医薬品及び毒性スクリーニングでさらに使用されてもよい。
【００５８】
また、本発明は、キットを提供する。かかるキットは、本発明の方法、すなわち、ヒト多能性幹細胞などの哺乳類多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を産生するための本発明の方法を実施するのに、特に有用である。本発明によるキットは、少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤を含む。
【００５９】
上述のように、本発明の方法で使用される成分に関して本明細書に記載される詳細が、本発明のキットに含まれる成分にも適用されることが理解される。
【００６０】
よって、本発明のキットに含まれる少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、ゼブラリン、プソイドイソシチジン、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン、２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）又はシトシン−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシドなどのシチジン類似体である場合がある。
【００６１】
本発明のキットに含まれる少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン及び２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）からなる群から選択されるシチジン類似体である場合がある。
【００６２】
本発明のキットに含まれる少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）又は５−アザシチジン（アザシチジン）であってもよい。また、本発明のキットに含まれる少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）又は５−アザシチジン（アザシチジン）ではないシチジン類似体であってもよい。
【００６３】
本発明のキットは、哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹細胞をさらに含む場合がある。よって、本発明のキットは、哺乳類胚性幹細胞、特に、ヒト胚性幹細胞、及び／又は哺乳類人工多能性幹細胞、特に、ヒト人工多能性幹細胞を含む場合がある。前記哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹細胞は、細胞懸濁液として適切に提供されてもよく、凍結状態で提供されてもよい。
【００６４】
本発明のキットは、アクチビンＡ又はＢなどのアクチビンをさらに含む場合がある。
【００６５】
本発明のキットは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２及びＦＧＦ４などの１又は２種以上の増殖因子、及び／又はＦＢＳ又はＦＣＳなどの血清をさらに含む場合がある。
【００６６】
本発明のキットは、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）又は５−アザシチジン（アザシチジン）と、哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト胚性幹細胞又はヒト人工多能性幹細胞などのヒト多能性幹細胞とを含む場合がある。
【００６７】
本発明のキットは、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）又は５−アザシチジン（アザシチジン）と、アクチビンＡ又はＢなどのアクチビンと、哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト胚性幹細胞又はヒト人工多能性幹細胞などのヒト多能性幹細胞とを含む場合がある。
【００６８】
本発明のキットの成分は、同じ又は別の容器で提供されてもよい。例えば、前記少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤及びアクチビンは、同じ容器で提供されてもよい。哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹細胞がキットに含まれている場合、前記哺乳類多能性幹細胞、例えば、ヒト多能性幹細胞は、一般に、他の成分を含む１個又は複数の容器とは異なる容器で提供される。
【００６９】
また、本発明は、組成物を提供する。かかる組成物は、哺乳類多能性幹細胞、特に、ヒト多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を産生するのに特に有用である。本発明の組成物は、少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤と、アクチビンＡ又はＢなどのアクチビンとを含む。
【００７０】
上述のように、本発明の方法で使用される成分に関して本明細書に記載される詳細が、本発明の組成物に含まれる成分にも適用されることが理解される。
【００７１】
よって、本発明の組成物に含まれる少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、ゼブラリン、プソイドイソシチジン、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン、２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）又はシトシン−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシドなどのシチジン類似体である場合がある。
【００７２】
本発明の組成物に含まれる少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン及び２’，２’−ジフルオロ−デオキシシチジン（ゲムシタビン）からなる群から選択されるシチジン類似体である場合がある。
【００７３】
本発明の組成物に含まれる少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）又は５−アザシチジン（アザシチジン）であってもよい。また、本発明の組成物に含まれる少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）又は５−アザシチジン（アザシチジン）ではないシチジン類似体であってもよい。
【００７４】
本発明の組成物は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２及びＦＧＦ４などの１又は２種以上の増殖因子、及び／又はＦＢＳ又はＦＣＳなどの血清をさらに含んでもよい。
【００７５】
よって、本発明の組成物は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）と、アクチビンＡ又はＢなどのアクチビンとを含んでもよい。
【００７６】
本発明の組成物は、５−アザシチジン（アザシチジン）と、アクチビンＡ又はＢなどのアクチビンとを含む場合がある。
【００７７】
定義
本明細書で用いられるところの「多能性の」又は「多能性」は、３種の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）の全ての種類の特殊化した細胞を形成する可能性を指し；子に発達可能な完全な胚を形成する能力である「全能性の」又は「全能性」とは区別されなければならない。
【００７８】
本明細書で用いられるところの「ヒト多能性幹細胞」（ｈＰＳ）は、適当な条件下で、自己再生する能力と、３種の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）のあらゆる種類の特殊化した細胞を形成する能力とを有するヒト細胞を指す。ｈＰＳ細胞は、８〜１２週齢のＳＣＩＤマウスでテラトーマを形成する能力及び／又は組織培養で３種全ての胚葉の同定可能な細胞を形成する能力を有する場合がある。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を含む種々のタイプの胚細胞（例えばトムスンら（１９９８）、ハインズら（２００４）参照）及び人工多能性幹細胞［例えば、タカハシら（２００７）；チョウら（２００９）；ユー及びトムスン  ｉｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版）参照］が、ヒト多能性幹細胞の定義に含まれる。本明細書に記載される種々の方法は、種々の源からのｈＰＳ細胞を利用してもよい。例えば、使用に適したｈＰＳ細胞は、例えば、チャンら（２００８）に記載され、さらにメルカデルらによりＥｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔｈｏｄ（第１版，２００９）に記載された単一割球除去法を使用することによる非破壊法の使用により、発生中の胚から得られたものである場合がある。さらに又はあるいは、適当なｈＰＳ細胞は、樹立された細胞株から得られてもよく、また、成体幹細胞であってもよい。
【００７９】
本明細書で用いられるところの「ｈｉＰＳ細胞」は、ヒト人工多能性幹細胞を指す。ｈｉＰＳ細胞は、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８などの多能性に関連する遺伝子の発現の誘導による、非多能性細胞、典型的には、成体体細胞由来の多能性幹細胞の一種である。
【００８０】
本明細書で用いられるところの「胚体内胚葉（ＤＥ）」、「胚体内胚葉の細胞」及び「胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）」は、胚体内胚葉細胞か、胚体内胚葉細胞に似た有意な数の細胞を含む組成物かに典型的な、タンパク質及び／又は遺伝子発現及び形態を示す細胞を指す。胚体内胚葉は、腸、膵臓、肝臓及び肺の細胞を生じる胚葉細胞（ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｌａｙｅｒ）である。ＤＥ細胞は、内胚葉マーカーＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＨＨＥＸ、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４及びＧＡＴＡ６の正の遺伝子及びタンパク質発現により、特徴付けられ、このように、同定される場合がある。前記２種のマーカーＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４は、ＤＥに特異的であり、ｈＰＳ細胞では検出されない。最後に、ＤＥ細胞は、未分化細胞マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１の遺伝子及びタンパク質発現を示さないが、低Ｎａｎｏｇ発現を示し得る。
【００８１】
本明細書で用いられるところの「肝前駆体」又は「肝前駆細胞」は、肝細胞経路に入った、肝細胞を生じる細胞を指す。よって、「肝前駆体」は、それらが腸、膵臓及び肺の細胞に発達する可能性を失ったという点で、「内胚葉細胞」から区別される。「肝前駆体」は、一般に、初期肝マーカーＥｐＣＡＭ、ｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ受容体）、ＡＦＰ、ＣＫ１９、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰα及びβの正の遺伝子及びタンパク質発現により、特徴付けられ、このように、同定される場合がある。肝前駆体は、ＤＥマーカーＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７の遺伝子及びタンパク質発現を示さない。最後に、「肝前駆体」は、未分化細胞マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１の遺伝子及びタンパク質発現を示さず、また成熟肝マーカーＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ１９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６及びＰＸＲの遺伝子及びタンパク質発現も示さない。
【００８２】
本明細書で用いられるところの「肝細胞」又は「肝細胞様細胞」は、十分に分化した肝細胞を指す。「肝細胞」又は「肝細胞様細胞」は、一般に、成熟肝マーカーＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＳＴＡ１−１、ＯＡＴＰ−２、ＮＴＣＰ、アルブミン、ＰＸＲ、ＣＡＲ及びＨＮＦ４ａ（アイソフォーム１＋２）などの正の遺伝子及びタンパク質発現により特徴付けられ、このように、同定される場合がある。また、「肝細胞」又は「肝細胞様細胞」は、未分化細胞マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１の遺伝子及びタンパク質発現を示さない。ＤＥ細胞と比較して、「肝細胞」又は「肝細胞様細胞」は、ＤＥ細胞マーカーＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４の遺伝子及びタンパク質発現を示さない。「肝前駆体」と比較して、「肝細胞」又は「肝細胞様細胞」は、肝前駆体マーカーサイトケラチン１９及びＡＦＰの遺伝子及びタンパク質発現を示さない。
【００８３】
本明細書で意味する場合、遺伝子又はタンパク質が「発現する」と解釈されるのは、実験で、前記遺伝子又はタンパク質の発現レベルを測定するときに、測定された発現レベルが測定の標準偏差の３倍より大きく、前記発現レベル及び標準偏差が発現レベルの１０の別々の測定で測定されるときである。１０の別個の測定での発現レベルの測定は、好ましくは、バックグラウンドシグナルに対して補正される。
【００８４】
本明細書で用いられるところのＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム（「ＮａＢ」）、フェニル酪酸（「ＰＢ」）、トリコスタチンＡ及びバルプロ酸（「ＶＡ」）などのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を指す。
【００８５】
本明細書で用いられるところの「ＧＳＫ阻害剤」は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（特に、ＧＳＫ３α又はＧＳＫ３βを含むＧＳＫ３）を阻害する化合物を指す。
【００８６】
本明細書で用いられるところの「Ｗｎｔシグナル活性化剤」は、Ｗｎｔシグナルを活性化する化合物を指す。
【００８７】
本明細書で用いられるところのＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば、シチジン類似体のようなヌクレオシド類似体、特に５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）及びゼブラリン、及び非ヌクレオシドタイプ例えばＲＧ１０８、Ｓ−５−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン及びプロカインなどのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素活性を妨害する化合物を意味することを意図する。
【００８８】
本明細書で用いられるところの「ＦＧＦ」は線維芽細胞増殖因子を意味し、好ましくは、ヒト及び／又は組換え起源であり、それらに属するサブタイプは、例えば「ｂＦＧＦ」（塩基性線維芽細胞増殖因子を意味し、ＦＧＦ２とも称される場合がある）及びＦＧＦ４である。「ａＦＧＦ」は、酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ１とも称される場合がある）を意味する。
【００８９】
本明細書で用いられるところの「アクチビン」という用語は、例えば、「アクチビンＡ」又は「アクチビンＢ」などの細胞増殖及び分化の調節を含む広範な生物活性を示すＴＧＦ−βファミリーメンバーを意味することを意図する。アクチビンは、リガンドの一般的なＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する。
【００９０】
本明細書で用いられるところの「ＲＯＣＫ阻害剤」という用語は、ＲＯＣＫ  Ｒｈｏ結合タンパク質キナーゼ活性の阻害剤を意味することを意図する。
【００９１】
本明細書で用いられるところの「ゼノフリー（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）」という用語は、非ヒト動物成分への直接又は間接的な曝露の完全な回避を意味することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１Ａ−１Ｂ】ｈＰＳ分化の間の５−アザ−デオキシシチジン処理あり及びなしのｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の胚体内胚葉細胞（基本プロトコールＡ及びＢで得られた）の特性化
【図１Ｃ１−１Ｃ２】同上
【図１Ｄ１−１Ｄ２】同上
【図１Ｄ３−１Ｄ４】同上
【図１Ｄ５−１Ｄ６】同上
【図１Ｄ７】同上
【図２Ａ】ｈＰＳ分化の間の５−アザ−デオキシシチジン処理ありの２７種の異なるｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ株由来の胚体内胚葉細胞（それぞれ、基本プロトコールＡ及びＢで得られた）の特性化
【図２Ｂ】同上
【図２Ｃ】同上
【図２Ｄ】同上
【図３Ａ−３Ｂ】ｈＰＳ分化の間の５−アザ−デオキシシチジン又は５−アザシチジンでの処理あり又はなしの３種のｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ株由来の胚体内胚葉細胞（それぞれ、基本プロトコールＡ及びＢで得られた）の特性化
【図３Ｃ−３Ｄ】同上
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００９３】
一般的な培養及び継代技術の例が、国際公開第２００４／０９９３９４号、国際公開第２００３／０５５９９２号、国際公開第２００７／０４２２２５号、国際公開第２００７／１４０９６８号、国際公開第２０１１１１６９３０号の出願で開示される。
【００９４】
以下の実施例に記載されるように、開始材料は、ヒト多能性幹細胞、特に、ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞である。
【実施例１】
【００９５】
ｈＰＳ細胞型のメンテナンス
全ての（上で定義した）ｈＰＳ細胞が、本発明の開始材料として使用することができる。以下の例では、特に、胚体内胚葉は、ｍＥＦフィーダー細胞で、樹立された未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からインビトロで誘導され（ハインズら２００４）、フィーダーを含まない条件下で、維持された。本実験で使用される細胞株は、限定されるものではないが、ｈＥＳ細胞株ＳＡ１６７、ＳＡ１８１、ＳＡ４６１（セラーティス  アーベー，ヨーテボリ，スウェーデン）であり、それらはハインズら２００４によって記載されるように増殖させることができる。これらの細胞株は、ＮＩＨ幹細胞レジストリー、英国幹細胞バンク及び欧州ｈＥＳＣレジストリーに収載され、依頼に応じて入手可能である。
【００９６】
ｈＥＳＣから得られたｈＰＳとともに、ｈｉＰＳ（ヒト人工多能性幹）細胞も、本発明の実施例の肝細胞の誘導のために使用された。
【００９７】
本発明で使用されるｈｉＰＳＣ株は、以下のように誘導される：ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＲＬ２４２９、ＡＴＣＣ）は、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で、３７℃で、１０％ウシ胎仔血清、グルタマックス（１ｘ）、５Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが追加されたＤＭＥＭで維持された。線維芽細胞は、マウスＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ｍｙｃをエンコードする組換体レンチウイルスで形質導入され、５日間培養された。その後、形質導入された細胞は、トリプシンで分散し、それらの通常の増殖培地中に５ｘ１０３細胞／ｃｍ２の密度で、マイトマイシンＣ処理ヒト皮膚線維芽細胞フィーダー細胞上に播種した。２４時間後、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で、３７℃で、前記培地を２０％ノックアウト血清リプレースメント、１ｘ非必須アミノ酸、グルタマックス（１ｘ）、５Ｕ／ｍｌのペニシリン、５μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μＭの２−メルカプトエタノール及び３０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを追加したノックアウトＤＭＥＭで交換した。培地の体積の半分を毎日交換し、約３０日後、ｉＰＳ細胞のコロニーが出現した。ｉＰＳコロニーを採取し、ＤＥＦ−ＣＳ（登録商標）で増大し、細胞バンクを調製した。その後、保存された細胞は、内在性Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの発現、導入遺伝子のサイレンシング、インビトロでの３種全ての胚葉の代表的な細胞型へ分化する可能性を検査し、ＳＴＲプロファイリング及び親の線維芽細胞の細胞株（ＡＴＣＣ）との比較によりそれらの確実性を確認することにより特徴付けられた。レンチウイルスを用いた初期化の他に、ｈｉＰＳＣ株は、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソームプラスミドベクター、タンパク質及びｍＲＮＡ又は他の技術を用いて初期化することができる。他の使用に適した細胞株は、全てが国際幹細胞レジストリーで収載された、細胞株ＭＡ１２６、ＭＡ１２７、ＭＡ１２８及びＭＡ１２９（アドバンスト・セル・テクノロジー社ウースター，マサチューセッツ州，米国）などのチャンら（２００８）により樹立された細胞株である。これらの細胞株は、単一割球除去法を使用することにより、ヒト胚を破壊することなく得られた（又は入手された）。
【実施例２】
【００９８】
肝細胞様細胞を産生するためのｈＰＳ細胞型の分化
肝細胞様細胞は、以下の典型的な基本プロトコールＡ及びＢを使用することにより、ｈＰＳ細胞から誘導されてもよい。
【００９９】
プロトコールＡ：
未分化ｈＰＳ細胞が分離され、新たに調製した０日目培地に、直接播種された。異なる培地が新たに調製され、０、１、２、３、４、５、７日目に添加された。前処理培地は、セレクティス  アーベー（アルヴィド  ヴァーグレーンス  ベッカ  ２０、４１３５６  ヨーテボリ、スウェーデン）から入手可能である。
０日目
前処理培地
ＣＨＩＲ９９０２１  ３μＭ
ＲＯＣＫ阻害剤  ５μＭ
１日目
前処理培地
ＣＨＩＲ９９０２１  ３μＭ
２日目
ＲＰＭＩ  １６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１ｘ）
アクチビンＡ  ５０ｎｇ／ｍｌ
ＣＨＩＲ９９０２１  ３μＭ
ＬＹ２９４００２  ５μＭ
３日目
ＲＰＭＩ  １６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１ｘ）
アクチビンＡ  ５０ｎｇ／ｍｌ
ＬＹ２９４００２  ５μＭ
４〜７日目
ＲＰＭＩ  １６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１ｘ）
アクチビンＡ  ５０ｎｇ／ｍｌ
【０１００】
７日目に、細胞が継代される。細胞は、３７℃で、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔで３〜７分間インキュベートされ、同量のＶｉｔｒｏＨＥＳが添加され、細胞懸濁液が２００〜３００ｇで、５〜６分間遠心分離された。その後、細胞は、５００００〜３５００００細胞／ｃｍ２、例えば、１０００００〜３０００００細胞／ｃｍ２などの好ましくは１５００００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、フィブロネクチン系コーティング上に再播種される。
【０１０１】
プロトコールＢ：
未分化ｈＰＳ細胞が分離され、新たに調製した０日目培地に、直接播種された。異なる培地が新たに調製され、０、１、２、３、４、５、７日目に添加された。前処理培地は、セレクティス  アーベー（アルヴィド  ヴァーグレーンス  ベッカ  ２０、４１３５６  ヨーテボリ、スウェーデン）から入手可能である。
０日目
前処理培地
ＣＨＩＲ９９０２１  ３μＭ
ＲＯＣＫ阻害剤  ５μＭ
１日目
ＲＰＭＩ  １６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１ｘ）
アクチビンＡ  ５０ｎｇ／ｍｌ
ＣＨＩＲ９９０２１  ３μＭ
ＬＹ２９４００２  ５μＭ
２日目
ＲＰＭＩ  １６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１ｘ）
アクチビンＡ  ５０ｎｇ／ｍｌ
ＬＹ２９４００２  ５μＭ
３〜７日目
ＲＰＭＩ  １６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１ｘ）
アクチビンＡ  ５０ｎｇ／ｍｌ
継代ｄ７については、プロトコールＡを参照されたい。
【実施例３】
【０１０２】
ＤＮＡ脱メチル化で処理したｈＥＳＣ及びｈｉＰＳ細胞での改良された胚体内胚葉表現型の検証
【０１０３】
手順：
基本プロトコールＡに続いて（ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の胚体内胚葉の両方で）、細胞が、プレ内胚葉段階の間の異なる時点で、異なる期間、例えば、プロトコールの２〜３、２〜４、３〜４及び４〜６日目に、１０ｎＭ  ５−アザ−２−デオキシシチジンで処理された（ｈＥＳＣ−ＤＥ：５ａｚａｄＣなし  ｎ＝４、５ａｚａｄＣ  ｄ２−３  ｎ＝４、ｄ３−４  ｎ＝１、ｄ２−４  ｎ＝１、ｄ４−６  ｎ＝１；ｈｉＰＳＣ−ＤＥ：５ａｚａｄＣなし  ｎ＝５、５ａｚａｄＣ  ｄ２−３  ｎ＝５、ｄ３−４  ｎ＝２、ｄ２−４  ｎ＝１、ｄ４−６  ｎ＝１；ｎは個々の実験の数である）。
【０１０４】
ｍＲＮＡ発現の解析のために、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来のＤＥ細胞が、プロトコールの７日目に収集され、遺伝子発現がｑＲＴ−ＰＣＲを用いて解析され、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰに対して正規化され、結果が較正物質に対して正規化された相対定量として表わされた。
【０１０５】
結果：
図１Ａ：
２〜３日目に１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで処理されたｈＥＳＣに由来するＤＥ（図１Ａ２）は、未処理の対照ＤＥ（図１Ａ１）と比較して、より均一であり、より顕著な細胞間接着を有する。対照ＤＥでのより高いＯｃｔ４の発現及びＮａｎｏｇ  ｍＲＮＡの発現に従って（図１Ｄを比較）、対照ＤＥでの未分化細胞の存在に留意されたい（図１Ａ１）。２〜４、３〜４及び４〜６日に、１００ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで細胞を処理したときにも、同様の結果が得られた。１ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンは、効果がより低かった（データは示されない）。
【０１０６】
図１Ｂ：
２〜３日目に１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで処理したＨｉＰＳＣ由来のＤＥ（図１Ｂ２）は、対照ＤＥ（図１Ｂ１）と比較して、よりコンフルエントであり、より顕著な細胞間接着を有する。２〜４、３〜４及び４〜６日に、１００ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで細胞を処理したときにも、同様の結果が得られた。１ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンは、効果がより低かった（データは示されない）。
【０１０７】
図１Ｃ：
２〜３日目に１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで処理したＨｉＰＳＣ由来のＤＥは、未処理の対照と比較して、７日目にはるかに少ないＯｃｔ４−免疫陽性細胞を有し、すなわち、より少ない未分化細胞が残り、脱メチル化剤での処理後、ＤＥはより均一である。
【０１０８】
図１Ｄ：
未処理の対照と比較して、２〜３、３〜４、２〜４及び４〜６日目に１０ｎＭの５ａｚａｄＣで処理したｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来のＤＥでは、幹細胞マーカーＯｃｔ４の発現は、はるかに低かった（図１Ｄ１）。５ａｚａｄＣ処理ｈＥＳＣ由来のＤＥでは、幹細胞マーカーＮａｎｏｇのｍＲＮＡ発現が大幅に減少したのに対して、ｈｉＰＳＣ由来のＤＥでは、幹細胞マーカーＮａｎｏｇのｍＲＮＡ発現は主に影響を受けない（図１Ｄ１）。未処理の対照と比較して、５ａｚａｄＣ処理ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来のＤＥで、ＤＥマーカーＳｏｘ１７、Ｃｘｃｒ４、ＦｏｘＡ２及びｈＨｅｘの発現は増加し、効果はｈｉＰＳＣ由来のＤＥと比較してｈＥＳＣ由来のＤＥでより強い（図１Ｄ３〜６）。Ｓｏｘ７のｍＲＮＡレベルを増加させる２〜４及び４〜６日の５ａｚａｄＣ処理を除き、対照及び５ａｚａｄＣ処理ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来のＤＥの両方で、胚体外マーカーＳｏｘ７の発現は非常に低い。
【０１０９】
まとめると、内胚葉発生中のＤＮＡ脱メチル化剤での細胞の処理は、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の細胞の両方で、改良されたＤＥ形態及び改善されたＤＥ細胞の産生量につながった（図１Ａ〜Ｂ）。また、結果として、免疫細胞化学で検出されたように幹細胞マーカーＯｃｔ４のより大幅な減少と（図１Ｃ）、明確に特徴づけるＤＥマーカーＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＨＥＸ、Ｆｏｘａ２の改良された発現と、胚体外内胚葉マーカーＳｏｘ７及び幹細胞マーカーＯｃｔ４及びＮａｎｏｇの減少につながる（図１Ｄ）。よって、胚体内胚葉細胞のより均一な集団を産生することを望む当業者は、１又は２種以上のＤＮＡ脱メチル化剤から選択し、それらを多能性幹細胞型の分化期、例えば２〜３又は３〜４日に使用することができる。
【実施例４】
【０１１０】
ＤＥ分化期におけるＤＮＡ脱メチル化剤での処理による２７個のｈＰＳＣ株の一団に由来する高度に均一な胚体内胚葉
【０１１１】
手順：
基本プロトコールＡ又はＢに続いて、２７個のｈＰＳＣ株由来の細胞は、胚体内胚葉へのｈＰＳの分化期の２〜３日目に、１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで処理された（プロトコールＡ：ＣｈｉＰＳＣ１４、ＣｈｉＰＳＣ１９、ＣｈｉＰＳＣ２２、Ｐ１１０１５、ＳＡ１６７、ＳＡ１８１、ＳＡ４６１及びＶａｌ９；プロトコールＢ：ＣｈｉＰＳＣ４、ＣｈｉＰＳＣ６ｂ、ＣｈｉＰＳＣ７、ＣｈｉＰＳＣ８、ＣｈｉＰＳＣ９、ＣｈｉＰＳＣ１０、ＣｈｉＰＳＣ１１、ＣｈｉＰＳＣ１３、ＣｈｉＰＳＣ１５、ＣｈｉＰＳＣ１７、ＣｈｉＰＳＣ１８、ＣｈｉＰＳＣ１９、ＣｈｉＰＳＣ２０、ＣｈｉＰＳＣ２１、ＣｈｉＰＳＣ２３、ＣｈｉＰＳＣ２４、Ｐ１１０１２、Ｐ１１０２１、Ｐ１１０２５及びＳＡ１２１）。
【０１１２】
２７個のｈＰＳＣ株のうち２３個は、プロトコールＡ及びＢの両方で試験された。これらの２３株のうち、わずか４細胞株（ＣｈｉＰＳＣ１４、ＣｈｉＰＳＣ２３、Ｐ１１０１５及びＰ１１０３２）は、２種類のプロトコールのうちの１種類でのみ分化させることができた。４個のｈＰＳＣ株（ＣｈｉＰＳＣ８、ＣｈｉＰＳＣ９、ＣｈｉＰＳＣ１０及びＣｈｉＰＳＣ１１）は、プロトコールＢでのみ試験された。
【０１１３】
ｍＲＮＡ発現の解析のために、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来のＤＥ細胞は、プロトコールの７日目に収集され、遺伝子発現がｑＲＴ−ＰＣＲを用いて解析され、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰに対して正規化され、結果が較正物質に対して正規化された相対定量として提示された。
【０１１４】
結果：
図２Ａ〜Ｄ：
ｈＰＳの胚体内胚葉への分化期の２〜３日目のＤＮＡ脱メチル化処理を含む基本プロトコールＡ又はＢを用いることで、２７個の異なるｈＰＳＣ株からの未分化幹細胞は、未分化ｈＥＳＣ（ＳＡ１８１）及びｈｉＰＳＣ（ＣｈｉＰＳＣ４）と比較して、幹細胞マーカーＯｃｔ−４及びＮａｎｏｇの低ｍＲＮＡ発現レベル（図２Ａ、Ｂ）及びＤＥマーカーＳｏｘ１７及びＣｘｃｒ４の高レベル（図２Ｃ、Ｄ）を示す、高度に均一なＤＥへと分化させることができた。
【０１１５】
まとめると、胚体内胚葉へのｈＰＳの分化期の細胞のＤＮＡ脱メチル化剤での処理は、幹細胞マーカーの低発現レベル及びＤＥマーカーの高発現レベルを有する均一なＤＥの試験された全てのｈＰＳＣ株からの誘導を可能にする。均一なＤＥの誘導は、試験された全ての株から得ることができる均一な肝細胞培養物の誘導に不可欠である（データは示されない）。
【０１１６】
よって、所定のあらゆるｈＰＳＣ株から胚体内胚葉細胞の均一な集団を産生することを望む当業者は、胚体内胚葉へのｈＰＳ細胞の分化期、例えば２〜３日目に、ＤＮＡ脱メチル化剤での処理を含めることができる。
【実施例５】
【０１１７】
５−アザ−２−デオキシシチジン及び５−アザシチジンの両方のＤＮＡ脱メチル化剤が、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来のＤＥの胚体内胚葉表現型を改良する。
【０１１８】
手順：
基本プロトコールＡ（ｈＰＳＣ株Ｐ１１０３２及びＳＡ１８１）又はＢ（ｈＰＳＣ株Ｐ１１０１２）に続いて、３個の異なるｈＰＳＣ株に由来する細胞は、ｈＰＳの胚体内胚葉への分化期、２〜３日目に、１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジン又は１μＭの５−アザシチジンのいずれかで処理された。
【０１１９】
ｍＲＮＡ発現の解析のために、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来のＤＥ細胞はプロトコールの７日目に収集され、遺伝子発現がｑＲＴ−ＰＣＲを用いて解析され、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰに対して正規化され、結果が較正物質に対して正規化された相対定量として提示された。
【０１２０】
結果：
図３：
Ａ，Ｂ）脱メチル化剤で処理しない場合、３種のｈＰＳＣ株Ｐ１１０３２、ＳＡ１８１及びＰ１１０１２は、幹細胞マーカーＯｃｔ４及びＮａｎｏｇの比較的高いｍＲＮＡ発現をともなう不均一なＤＥを産生した（図３Ａ，Ｂ）。ＤＮＡ脱メチル化剤５−アザ−２−デオキシシチジン（５ａｚａｄＣ）及び５−アザシチジン（５ａｚａＣ）での処理は、Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇ  ｍＲＮＡを有意に減少させ（図３Ａ，Ｂ）、これにより、これら３種のｈＰＳＣ株からの均一なＤＥ集団の誘導を可能にした。
Ｃ，Ｄ）１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジン又は１μＭの５−アザシチジンでの処理時に、ＤＥマーカーＳｏｘ１７及びＣｘｃｒ４のｍＲＮＡ発現での有意な変化を観察することはできなかった（図３Ｃ，Ｄ）。
【０１２１】
まとめると、未処理の場合、不均一なＤＥであるのに対して、５−アザ−２−デオキシシチジン（５ａｚａｄＣ）及び５−アザシチジン（５ａｚａＣ）の両方のＤＮＡ脱メチル化剤での処理は、ｈＰＳＣ株からの均一なＤＥの誘導が可能となる。
【０１２２】
よって、均一な胚体内胚葉細胞の集団を産生することを望む当業者は、１又は２種以上のＤＮＡ脱メチル化剤から選択し、胚体内胚葉への多能性幹細胞型の分化期、例えば２〜３日にそれらを使用することができる。
【０１２３】
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【図１Ａ−１Ｂ】
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【図１Ｃ１−１Ｃ２】
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【図１Ｄ１−１Ｄ２】
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【図１Ｄ３−１Ｄ４】
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【図１Ｄ５−１Ｄ６】
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【図１Ｄ７】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図３Ｃ−３Ｄ】
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