(57)【要約】      （修正有）【課題】自己免疫失患において出現する抗燐脂質抗体の主要な対応抗原であるβ2GPIの発現を抑制することが可能な核酸複合体の提供。【解決手段】式１で表される核酸複合体。式１：2019024444.tif 000250（Ｘは、8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の配列を有する標的塩基配列群のいずれかにストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む、β2GPIの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端又は5’末端はＳ３に結合；Ｌ１及びＬ２は夫々独立して、糖リガンド；Ｓ１〜Ｓ３は夫々独立して、リンカー）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１で表される核酸複合体。
式１：
【化１】
2019024444.tif 000214
（式１中、
Ｘは、8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表1-1〜1-4に記載された標的塩基配列のいずれかにストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む、β2GPIの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端はＳ３に結合し、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
【請求項２】
下記式１で表される核酸複合体。
式１：
【化２】
2019024444.tif 000215
（式１中、
Ｘは、8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表1-1〜1-4に記載されたアンチセンス塩基配列のいずれかの少なくとも8塩基を連続して含む、β2GPIの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端はＳ３に結合し、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
【請求項３】
下記式１で表される核酸複合体。
式１：
【化３】
2019024444.tif 000216
（式１中、
Ｘは、8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表1-1〜1-4のに記載された標的塩基配列のいずれかと相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端はＳ３に結合し、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
【請求項４】
下記式２で表される構造を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式２：
【化４】
2019024444.tif 000217
（式２中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎは０〜９９の整数であり、
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式２−１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
式２−１：
【化５】
2019024444.tif 000218
ｐ１およびｐ２は、それぞれ独立して、１、２または３の整数であり、
ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
ただし、ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよく、ｑ１〜ｑ４が２〜１０の時、それぞれの−［Ｐ２−Ｑ１］−，−［Ｑ２−Ｐ３］−，−［Ｐ５−Ｑ３］−，−［Ｑ４−Ｐ６］−の組み合わせは同一または異なっていてもよい。）
【請求項５】
Ｐ１およびＰ４が、それぞれ独立して、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−である請求項４に記載の核酸複合体。
【請求項６】
−（Ｐ２−Ｑ１）q1−および−（Ｐ５−Ｑ３）q3−がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３−１〜式３−３で表されるいずれかの構造である、請求項４または５に記載の核酸複合体。
式３−１：
【化６】
2019024444.tif 000219
式３−２：
【化７】
2019024444.tif 000220
式３−３：
【化８】
2019024444.tif 000221
（式３−１〜式３−３中、
ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、式３−１〜式３−３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。）
【請求項７】
下記式４−１〜式４−９で表されるいずれかの構造を有する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式４−１：
【化９】
2019024444.tif 000222
式４−２：
【化１０】
2019024444.tif 000223
式４−３：
【化１１】
2019024444.tif 000224
式４−４：
【化１２】
2019024444.tif 000225
式４−５：
【化１３】
2019024444.tif 000226
式４−６：
【化１４】
2019024444.tif 000227
式４−７：
【化１５】
2019024444.tif 000228
式４−８：
【化１６】
2019024444.tif 000229
式４−９：
【化１７】
2019024444.tif 000230
（式４−１〜４−９中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義である。）
【請求項８】
下記式５で表される構造を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式５：
【化１８】
2019024444.tif 000231
（式５中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２はそれぞれ前記と同義である。）
【請求項９】
Ｐ１が−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−である請求項８に記載の核酸複合体。
【請求項１０】
下記式６−１〜式６−９で表されるいずれかの構造を有する、請求項８または９に記載の核酸複合体。
式６−１：
【化１９】
2019024444.tif 000232
式６−２：
【化２０】
2019024444.tif 000233
式６−３：
【化２１】
2019024444.tif 000234
式６−４：
【化２２】
2019024444.tif 000235
式６−５：
【化２３】
2019024444.tif 000236
式６−６：
【化２４】
2019024444.tif 000237
式６−７：
【化２５】
2019024444.tif 000238
式６−８：
【化２６】
2019024444.tif 000239
式６−９：
【化２７】
2019024444.tif 000240
（式６−１〜６−９中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、Ｌ１およびｑ２は、それぞれ前記と同義である。）
【請求項１１】
下記式７−１〜式７−９で表されるいずれかの構造を有する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式７−１：
【化２８】
2019024444.tif 000241
式７−２：
【化２９】
2019024444.tif 000242
式７−３：
【化３０】
2019024444.tif 000243
式７−４：
【化３１】
2019024444.tif 000244
式７−５：
【化３２】
2019024444.tif 000245
式７−６：
【化３３】
2019024444.tif 000246
式７−７：
【化３４】
2019024444.tif 000247
式７−８：
【化３５】
2019024444.tif 000248
式７−９：
【化３６】
2019024444.tif 000249
（式７−１〜７−９中、
Ｘ、Ｓ３、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ前記と同義である。）
【請求項１２】
前記糖リガンドが、Ｎ−アセチルガラクトサミンである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項１３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、表1-1〜1-4のアンチセンス塩基配列に記載された群から選択される塩基配列を含む、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれる表1-1〜1-4のアンチセンス塩基配列が、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列である、請求項１３に記載の核酸複合体。
【請求項１５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、5’末端近傍および／または3’末端近傍が糖部修飾ヌクレオチドで構成される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項１６】
Ｘが、表2-1〜表2-3、表3-1〜表3-2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
細胞内に導入するための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
静脈内投与または皮下投与される、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導入することを含む、β2GPI遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項２２】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、β2GPI関連疾患の治療方法。
【請求項２３】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、β2GPI関連疾患の治療に用いるための医薬。
【請求項２４】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、β2GPI関連疾患の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸複合体および該核酸複合体を含む医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬として、アプタマー、アンチセンス、デコイ核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｎｔｉｍｉＲＮＡ等が知られている。核酸医薬は、細胞内のあらゆる遺伝子を制御できる汎用性の高さから、今まで治療困難とされてきたさまざまな疾患への臨床応用が期待されている。
また、核酸医薬は、細胞内における標的選択性と活性の高さから抗体、低分子医薬に次ぐ、次世代医薬として期待されている。
しかしながら、核酸医薬は、標的組織への送達が困難であることが問題点として挙げられる。
【０００３】
インビボにおける効果的な核酸医薬の送達法の１つとして、標的化化合物と核酸との核酸複合体（コンジュゲート）を用いることが報告されている。標的化化合物としては、細胞外に発現する受容体に結合可能なリガンドが挙げられる。その中でも特に、肝細胞に極めて高発現しているアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合可能であるリガンドとしてＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等を利用した核酸複合体が複数報告されている。近年では、これらのリガンドとｓｉＲＮＡ類とを結合した核酸複合体が肝細胞に効率的に送達されることが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
標的化化合物とオリゴヌクレオチドの複合体として、特許文献１および２には、例えば、以下に示す核酸複合体が開示されている。
【０００５】
【化１】
2019024444.tif 000002
（式中、Ａｃはアセチル基を表す。以下、本明細書において同様である。）
【０００６】
また、特許文献３には、特許文献１および２と同様の糖リガンド−テザーユニットを有する以下の構造を有する核酸複合体が開示されている。
【０００７】
【化２】
2019024444.tif 000003
【０００８】
また、特許文献４には、糖リガンド−テザーユニットとして、以下に示す構造を有する核酸複合体が開示されている。
【０００９】
【化３】
2019024444.tif 000004
【００１０】
β2-Glycoprotein1（β2GPI）（別名apolipoprotein H、apoHとも言う）は、326アミノ酸から構成される糖蛋白質であり、5つのドメイン構造が連なった高次構造を有する。β2GPIは多彩な生理作用を有すると考えられており、血小板凝集反応、凝固・線溶反応、酸化LDLのマクロファージへの取り込みに関与していることが報告されている（非特許文献２）。
【００１１】
疾患との関連について、β2GPIは抗リン脂質抗体症候群(APS)や全身性エリテマトーデス(SLE)といった自己免疫疾患において出現する抗リン脂質抗体の主要な対応抗原であることが知られている。抗β2GPI抗体は疾患の病態形成にも深く関与しており、β2GPIと抗β2GPI抗体によって形成される複合体は血管内皮細胞、単球、血小板、栄養芽細胞(trophoblast)といった様々な細胞の膜上受容体に活性化シグナルを発生させ、その結果、血栓症や妊娠異常といったAPSに特徴的な病態を引き起こし得ることが動物モデルを用いた研究ならびに臨床研究より明らかとなっている（非特許文献３）。β2GPIおよび抗β2GPI抗体からなる免疫複合体の形成を特異的に阻害することにより、上記の疾患を予防あるいは治療できると期待できるが、β2GPIは血中に50-500μg/mLという比較的高濃度で存在しており、これら全てのβ2GPIを例えば一般的な抗体医薬によって阻害し続けることは容易ではない（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００９／０７３８０９号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０７５０３５号
【特許文献３】国際公開第２０１５／１０５０８３号
【特許文献４】国際公開第２０１４／１７９６２０号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー  （Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ），２０１４年，第１３６巻，ｐ１６９５８−１６９６１
【非特許文献２】アナルズ・オブ・ザ・ニューヨークアカデミー・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）, ２０１３年，第１２８５巻，ｐ４４−５８
【非特許文献３】ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），２０１３年，  第３６８巻，ｐ１０３３−１０４４
【非特許文献４】ジャーナル・オブ・トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ），２０１１年,第９巻，ｐ１２７５−１２８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、β2GPIの発現を抑制することが可能な核酸複合体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下に関する。
［１］
下記式１で表される核酸複合体。
式１：
【化４】
2019024444.tif 000005
（式１中、
Ｘは、8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表1-1〜1-4に記載された標的塩基配列のいずれかにストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む、β2GPIの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端はＳ３に結合し、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
［２］
下記式１で表される核酸複合体。
式１：
【化５】
2019024444.tif 000006
（式１中、
Ｘは、8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表1-1〜1-4に記載されたアンチセンス塩基配列のいずれかの少なくとも8塩基を連続して含む、β2GPIの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端はＳ３に結合し、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
［３］
下記式１で表される核酸複合体。
式１：
【化６】
2019024444.tif 000007
（式１中、
Ｘは、8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表1-1〜1-4のに記載された標的塩基配列のいずれかと相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端はＳ３に結合し、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
［４］
下記式２で表される構造を有する、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式２：
【化７】
2019024444.tif 000008
（式２中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎは０〜９９の整数であり、
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式２−１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
式２−１：
【化８】
2019024444.tif 000009
ｐ１およびｐ２は、それぞれ独立して、１、２または３の整数であり、
ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
ただし、ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよく、ｑ１〜ｑ４が２〜１０の時、それぞれの−［Ｐ２−Ｑ１］−，−［Ｑ２−Ｐ３］−，−［Ｐ５−Ｑ３］−，−［Ｑ４−Ｐ６］−の組み合わせは同一または異なっていてもよい。）
［５］
Ｐ１およびＰ４が、それぞれ独立して、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−である［４］に記載の核酸複合体。
［６］
−（Ｐ２−Ｑ１）q1−および−（Ｐ５−Ｑ３）q3−がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３−１〜式３−３で表されるいずれかの構造である、［４］または［５］に記載の核酸複合体。
式３−１：
【化９】
2019024444.tif 000010
式３−２：
【化１０】
2019024444.tif 000011
式３−３：
【化１１】
2019024444.tif 000012
（式３−１〜式３−３中、
ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、式３−１〜式３−３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。）
［７］
下記式４−１〜式４−９で表されるいずれかの構造を有する、［４］〜［６］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式４−１：
【化１２】
2019024444.tif 000013
式４−２：
【化１３】
2019024444.tif 000014
式４−３：
【化１４】
2019024444.tif 000015
式４−４：
【化１５】
2019024444.tif 000016
式４−５：
【化１６】
2019024444.tif 000017
式４−６：
【化１７】
2019024444.tif 000018
式４−７：
【化１８】
2019024444.tif 000019
式４−８：
【化１９】
2019024444.tif 000020
式４−９：
【化２０】
2019024444.tif 000021
（式４−１〜４−９中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義である。）
［８］
下記式５で表される構造を有する、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式５：
【化２１】
2019024444.tif 000022
（式５中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２はそれぞれ前記と同義である。）
［９］
Ｐ１が−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−である［８］に記載の核酸複合体。
［１０］
下記式６−１〜式６−９で表されるいずれかの構造を有する、［８］または［９］に記載の核酸複合体。
式６−１：
【化２２】
2019024444.tif 000023
式６−２：
【化２３】
2019024444.tif 000024
式６−３：
【化２４】
2019024444.tif 000025
式６−４：
【化２５】
2019024444.tif 000026
式６−５：
【化２６】
2019024444.tif 000027
式６−６：
【化２７】
2019024444.tif 000028
式６−７：
【化２８】
2019024444.tif 000029
式６−８：
【化２９】
2019024444.tif 000030
式６−９：
【化３０】
2019024444.tif 000031
（式６−１〜６−９中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、Ｌ１およびｑ２は、それぞれ前記と同義である。）
［１１］
下記式７−１〜式７−９で表されるいずれかの構造を有する、［６］〜［８］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式７−１：
【化３１】
2019024444.tif 000032
式７−２：
【化３２】
2019024444.tif 000033
式７−３：
【化３３】
2019024444.tif 000034
式７−４：
【化３４】
2019024444.tif 000035
式７−５：
【化３５】
2019024444.tif 000036
式７−６：
【化３６】
2019024444.tif 000037
式７−７：
【化３７】
2019024444.tif 000038
式７−８：
【化３８】
2019024444.tif 000039
式７−９：
【化３９】
2019024444.tif 000040
（式７−１〜７−９中、
Ｘ、Ｓ３、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ前記と同義である。）
［１２］
前記糖リガンドが、Ｎ−アセチルガラクトサミンである、［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１３］
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、表1-1〜1-4のアンチセンス塩基配列に記載された群から選択される塩基配列を含む、［３］〜［１２］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１４］
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれる表1-1〜1-4のアンチセンス塩基配列が、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列である、［１３］に記載の核酸複合体。
［１５］
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、5’末端近傍および／または3’末端近傍が糖部修飾ヌクレオチドで構成される、［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１６］
Ｘが、表2-1〜表2-3、表3-1〜表3-2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかである、［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１７］
［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
［１８］
細胞内に導入するための、［１７］に記載の医薬組成物。
［１９］
静脈内投与または皮下投与される、［１７］または［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］
［１７］〜［１９］のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
［２１］
［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の核酸複合体または［１７］〜［１９］のいずれか１項に記載の医薬組成物を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導入することを含む、β2GPI遺伝子の発現を抑制する方法。
［２２］
［１７］〜［１９］のいずれか１項に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、β2GPI関連疾患の治療方法。
［２３］
［１７］〜［１９］のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、β2GPI関連疾患の治療に用いるための医薬。
［２４］
［１７］〜［１９］のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、β2GPI関連疾患の治療剤。
［２５］
β2GPI関連疾患が、自己免疫疾患または血栓症である、［２２］に記載の治療方法。
［２６］
β2GPI関連疾患が、自己免疫疾患または血栓症である、［２３］に記載の医薬。
［２７］
β2GPI関連疾患が、自己免疫疾患または血栓症である、［２４］に記載の治療剤。
【発明の効果】
【００１６】
例えば本発明の核酸複合体を含む医薬組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、各種関連疾患を治療することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の核酸複合体は、下記式１で表される核酸複合体である。
式１：
【００１８】
【化４０】
2019024444.tif 000041
【００１９】
式１中、
Ｘは、8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表1-1〜1-4に記載された「標的塩基配列」のいずれかにストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む、β2GPIの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端はＳ３に結合し、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。
【００２０】
本発明において、Ｓ１およびＳ２は、Ｓ３のベンゼン環上の置換位置に対して、それぞれオルト位、メタ位、パラ位でベンゼン環と結合し得るが、下記式１−１で表される核酸複合体であることが好適である。式１におけるＳ１およびＳ２のベンゼン環への結合手は、ベンゼン環上のＳ３の置換位置以外で任意の位置であり得ることを意味する。
式１−１：
【００２１】
【化４１】
2019024444.tif 000042
【００２２】
式１−１中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義である。
本明細書において、前記と同義とは、式１−１中を例示して説明すると、式１−１中のＸ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２それぞれについて、式１において前記するＸ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２それぞれについての定義と同様の基であり得ることを意味している。
【００２３】
本発明において、Ｘは、8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
また、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表1-1〜1-4に記載された「標的塩基配列」のいずれかにストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む、β2GPIの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
さらにまた、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＳ３に結合する。
【００２４】
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドである。
本発明において、糖リガンドとしては、標的細胞に発現している受容体に結合可能な糖類（単糖、二糖、三糖および多糖等）に由来する基を意味する。本発明においては、糖リガンドがＯ−結合によりＳ１およびＳ２のリンカーに結合している場合には、糖リガンドを構成する糖類の結合に関与する水酸基を除いた部分が糖類に由来する基としての糖リガンドを意味する。
本発明においては、オリゴヌクレオチドの標的細胞となる糖リガンドを選択すればよい。
単糖としては、例えば、アロース、アルトース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、Ｄ−フシトール、Ｌ−フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、Ｄ−ガラクトサミニトール、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース−６−リン酸、グロース、グリセルアルデヒド、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース−６−リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロース、およびキシルロース等が挙げられる。
二糖、三糖、多糖としては、例えば、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、２−デオキシリボース、２−デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース（ｅｖｅｍｉｔｒｏｓｅ）、フルクトオリゴ糖、ガルトオリゴ糖（ｇａｌｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β−マルトース、マルトリオース、マンナン−オリゴ糖、マンニノトリオース、メレチトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、シアル酸含有糖鎖、ニゲロース、ノジリミシン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α，α−トレハロース、トラハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロース等が挙げられる。
【００２５】
糖類における各単糖は、Ｄ体またはＬ体であってもよく、Ｄ体とＬ体の任意割合による混合物であってもよい。
糖類は、デオキシ糖（アルコールヒドロキシ基を水素原子に置換したもの）、アミノ糖（アルコールヒドロキシ基をアミノ基に置換したもの）、チオ糖（アルコールヒドロキシ基をチオールに置換したもの、またはＣ＝ＯをＣ＝Ｓに置換したもの、または環酸素を硫黄に置換したもの）、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖（環炭素を窒素に置換したもの）、イミノ糖（環酸素を窒素に置換したもの）、ホスファノ糖（環酸素をリンに置換したもの）、ホスファ糖（環炭素をリンに置換したもの）、Ｃ−置換単糖（非末端炭素原子における水素原子を炭素原子で置換したもの）、不飽和単糖、アルジトール（カルボニル基をＣＨＯＨ基で置換したもの）、アルドン酸（アルデヒド基をカルボキシ基に置換したもの）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸等を含んでいてもよい。
アミノ糖としては、糖類におけるアミノ単糖として、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン（ｋａｎｓｏｓａｍｉｎｅ）、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン（ｐｕｒｐｕｒｏｓａｍｉｎｅ）、ロドサミン等が挙げられる。また、アミノ糖のアミノ基は、アセチル基等で置換されていてもよい。
シアル酸含有糖鎖としては、ＮｅｕＡｃを糖鎖非還元末端に含有する糖鎖が挙げられ、ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃを含有する糖鎖や、Ｎｅｕ５Ａｃα（２−６）Ｇａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃ等が挙げられる。
糖類における各単糖は、標的細胞に発現している受容体に結合可能であることを限度として、置換基で置換されていてもよく、例えば、水酸基が置換されていてもよく、各単糖における水素原子がアジドおよび／または置換されていてもよいアリール基で１〜複数置換されていてもよい。
【００２６】
糖リガンドとしては、標的とする各臓器に対応して標的細胞の表面に発現する受容体に結合する糖リガンドを選択することが好ましく、例えば、標的細胞が肝細胞である場合、肝細胞表面に発現する受容体に対する糖リガンドが好ましく、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対する糖リガンドがより好ましい。
【００２７】
ＡＳＧＰＲに対する糖リガンドとしては、マンノースまたはＮ−アセチルガラクトサミンが好ましく、Ｎ−アセチルガラクトサミンがより好ましい。
ＡＳＧＰＲに対してより親和性の高い糖リガンドとして、例えばＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １７，７２５４  （２００９）、およびＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １３４，  １９７８  （２０１２）等に記載の糖誘導体が知られており、これらを用いてもよい。
【００２８】
本発明において、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、リンカーである。
Ｓ１とＳ２は、糖リガンドであるＬ１とＬ２と、ベンゼン環とを連結する構造であれば特に限定されるものではなく、核酸複合体において用いられる公知の構造を採用してもよい。Ｓ１とＳ２は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
糖リガンドであるＬ１とＬ２は、Ｓ１およびＳ２とグリコシド結合により連結していることが好ましく、Ｓ１およびＳ２は、ベンゼン環と、例えば、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−結合によりそれぞれ連結していてもよい。
【００２９】
Ｓ３は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであるＸと、ベンゼン環とを連結する構造であれば特に限定されるものではなく、核酸複合体において用いられる公知の構造を採用してよい。
オリゴヌクレオチドであるＸは、Ｓ３とホスホジエステル結合により連結していることが好ましく、Ｓ３は、ベンゼン環と、例えば、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−結合により連結していてもよい。
【００３０】
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３のリンカーとしては、例えば、国際公開第２００９／０７３８０９号、国際公開第２０１３／０７５０３５号、国際公開第２０１５／１０５０８３号、国際公開第２０１４／１７９６２０号、国際公開第２０１５／００６７４０号に開示される構造を採用してもよい。
【００３１】
本発明において、核酸複合体は、下記式２で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式２：
【００３２】
【化４２】
2019024444.tif 000043
【００３３】
式２中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
【００３４】
Ｐ１およびＰ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−ＣＯ−ＮＨ−であることが好ましく、−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−ＣＯ−ＮＨ−であることがより好ましく、−ＮＨ−ＣＯ−であることがさらに好ましい。
Ｐ１またはＰ４が、例えば、−ＮＨ−ＣＯ−である場合、−ＮＨ−ＣＯ−ベンゼン環という部分構造を有する。
【００３５】
Ｐ２およびＰ５は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、存在しないか、−ＣＯ−Ｏ−または−ＣＯ−ＮＨ−であることが好ましく、存在しないか、−ＣＯ−ＮＨ−であることがより好ましい。Ｐ２およびＰ５が、例えば、−ＣＯ−ＮＨ−である場合、Ｂ１−ＣＯ−ＮＨ−Ｑ１およびＢ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｑ３という部分構造を有する。
【００３６】
Ｐ３およびＰ６は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、−Ｏ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−であることが好ましく、−ＮＨ−ＣＯ−であることがより好ましい。Ｐ３およびＰ６が、例えば、−ＮＨ−ＣＯ−である場合、それぞれ、Ｂ１−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ２およびＢ２−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４という部分構造を有する。
【００３７】
Ｔ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、−Ｏ−または−Ｓ−であることが好ましく、−Ｏ−であることがより好ましい。
【００３８】
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎは０〜９９の整数であるが、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンであることが好ましく、無置換の炭素数１〜１２のアルキレンであることがより好ましく、無置換の炭素数１〜６のアルキレンであることがさらに好ましく、無置換の炭素数１〜４のアルキレンであることがよりさらに好ましい。
【００３９】
−（Ｐ２−Ｑ１）q1−および−（Ｐ５−Ｑ３）q3−がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３−１〜式３−３で表されるいずれかの構造であることが好適である。
式３−１：
【００４０】
【化４３】
2019024444.tif 000044
式３−２：
【００４１】
【化４４】
2019024444.tif 000045
式３−３：
【００４２】
【化４５】
2019024444.tif 000046
【００４３】
式３−１〜３−３中、
ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、式３−１〜式３−３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。
【００４４】
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数である。
【００４５】
【化４６】
2019024444.tif 000047
【００４６】
Ｂ１およびＢ２は、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、イミノ二酢酸等の非天然アミノ酸を含むアミノ酸、または1，3−プロパンジオール等のアミノアルコールに由来する基であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がグルタミン酸およびアスパラギン酸に由来する基である場合、グルタミン酸およびアスパラギン酸のアミノ基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、−ＮＨ−ＣＯ−結合であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がリジンに由来する基である場合、リジンのカルボキシル基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、−ＣＯ−ＮＨ−結合であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がイミノ二酢酸に由来する基である場合、イミノ二酢酸のアミノ基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、−ＣＯ−結合となることが好ましい。Ｂ１およびＢ２は、具体的には、以下の構造を持つことが好ましい。
【００４７】
【化４７】
2019024444.tif 000048
【００４８】
ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよい。
ｑ１〜ｑ４が２〜１０のとき、それぞれの−［Ｐ２−Ｑ１］−，−［Ｑ２−Ｐ３］−，−［Ｐ５−Ｑ３］−，−［Ｑ４−Ｐ６］−の組み合わせは同一または異なっていてもよい。それぞれの−［Ｐ２−Ｑ１］−，−［Ｑ２−Ｐ３］−，−［Ｐ５−Ｑ３］−，および−［Ｑ４−Ｐ６］−の組み合わせが同一または異なるとは、−［Ｐ２−Ｑ１］−，−［Ｑ２−Ｐ３］−，−［Ｐ５−Ｑ３］−，および−［Ｑ４−Ｐ６］−で示される各２〜１０の単位が、同一である場合と異なる場合があることを意味する。
【００４９】
本発明において、核酸複合体は、下記式４−１〜４−９で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式４−１：
【００５０】
【化４８】
2019024444.tif 000049
式４−２：
【００５１】
【化４９】
2019024444.tif 000050
式４−３：
【００５２】
【化５０】
2019024444.tif 000051
式４−４：
【００５３】
【化５１】
2019024444.tif 000052
式４−５：
【００５４】
【化５２】
2019024444.tif 000053
式４−６：
【００５５】
【化５３】
2019024444.tif 000054
式４−７：
【００５６】
【化５４】
2019024444.tif 000055
式４−８：
【００５７】
【化５５】
2019024444.tif 000056
式４−９：
【００５８】
【化５６】
2019024444.tif 000057
【００５９】
式４−１〜４−９中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義であり、好適な構造も同様である。
【００６０】
本発明において、核酸複合体は、下記式５で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式５では、式２におけるＰ１とＰ４、Ｐ２とＰ５、Ｐ３とＰ６、Ｑ１とＱ３、Ｑ２とＱ４、Ｂ１とＢ２、Ｔ１とＴ２、Ｌ１とＬ２、ｐ１とｐ２、ｑ１とｑ３ならびにｑ２とｑ４がそれぞれ同一である。
式５：
【００６１】
【化５７】
2019024444.tif 000058
【００６２】
式５中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２はそれぞれ前記と同義であり、好適な構造も同様である。
また、式５におけるＸ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２は、各々、上述した好適な基であって良いが、Ｐ１が−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−であることが好ましい。
式５における−（Ｐ２−Ｑ１）q1−は、存在しないか、または上記式３−１〜式３−３で表されるいずれかの構造であることが好適である。
【００６３】
本発明において、核酸複合体は、下記式６−１〜６−９で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式６−１：
【００６４】
【化５８】
2019024444.tif 000059
式６−２：
【００６５】
【化５９】
2019024444.tif 000060
式６−３：
【００６６】
【化６０】
2019024444.tif 000061
式６−４：
【００６７】
【化６１】
2019024444.tif 000062
式６−５：
【００６８】
【化６２】
2019024444.tif 000063
式６−６：
【００６９】
【化６３】
2019024444.tif 000064
式６−７：
【００７０】
【化６４】
2019024444.tif 000065
式６−８：
【００７１】
【化６５】
2019024444.tif 000066
式６−９：
【００７２】
【化６６】
2019024444.tif 000067
【００７３】
式６−１〜式６−９中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、およびＬ１は、それぞれ前記と同義であり、好適な構造も同様である。
【００７４】
本発明において、核酸複合体は、下記式７−１〜式７−９のいずれかで表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式７−１：
【００７５】
【化６７】
2019024444.tif 000068
式７−２：
【００７６】
【化６８】
2019024444.tif 000069
式７−３：
【００７７】
【化６９】
2019024444.tif 000070
式７−４：
【００７８】
【化７０】
2019024444.tif 000071
式７−５：
【００７９】
【化７１】
2019024444.tif 000072
式７−６：
【００８０】
【化７２】
2019024444.tif 000073
式７−７：
【００８１】
【化７３】
2019024444.tif 000074
式７−８：
【００８２】
【化７４】
2019024444.tif 000075
式７−９：
【００８３】
【化７５】
2019024444.tif 000076
【００８４】
式７−１〜式７−９中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、好適な構造も同様である。Ｌ１とＬ２は同一であってもよく、異なっていてもよく、同一であることが好適である。
式７−１〜式７−９において、各アルキレン基部分を鎖長の異なるアルキレン鎖を導入することにより、また、アミド結合等を他の結合に置換することにより、式７−１〜式７−９で表される構造を有する核酸複合体以外の核酸誘導体を製造することもできる。
【００８５】
本発明において、核酸複合体は、下記式１１で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式１１：
【００８６】
【化７６】
2019024444.tif 000077
【００８７】
式１１中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２は、それぞれ前記と同義であり、好適な構造も同様である。
Ｐ７およびＰ８は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ５、Ｑ６およびＱ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n8−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ８は０〜９９の整数であり、
Ｂ３は、本明細書中ではブランチャーユニットと呼ばれ、下記式１１−１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ５およびＱ６との結合手を意味し、
式１１−１：
【００８８】
【化７７】
2019024444.tif 000078
【００８９】
式１１−１中、トリアゾール環を有する基における置換は、該トリアゾール環の1位および3位の窒素原子のいずれかである。
ｑ５およびｑ６は、それぞれ独立して、０〜１０の整数である。
【００９０】
Ｐ７は、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＯ−または-ＣＯ−ＮＨ−であることが好ましく、−Ｏ−または−ＮＨ−ＣＯ−であることがより好ましい。。Ｐ７が、例えば、−Ｏ−である場合、ベンゼン環−Ｏ−という部分構造を有する。
【００９１】
Ｐ８は、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、存在する場合、−ＣＯ−Ｏ−または−ＣＯ−ＮＨ−であることが好ましく、−ＣＯ−ＮＨ−であることがより好ましい。Ｐ８が、例えば、−ＣＯ−ＮＨ−である場合、Ｑ６−ＣＯ−ＮＨ−という部分構造を有する。
【００９２】
Ｑ５、Ｑ６およびＱ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n8−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ８は０〜９９の整数であるが、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンであることが好ましく、無置換の炭素数１〜１２のアルキレンであることがより好ましく、無置換の炭素数１〜６のアルキレンであることがさらに好ましく、無置換の炭素数１〜４のアルキレンであることがよりさらに好ましい。
【００９３】
−（Ｐ７−Ｑ５）q5−は、−Ｏ−（ＣＨ2）m15−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m16−ＮＨであり、ｍ１５およびｍ１６は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であることが好適である。
【００９４】
本発明において、核酸複合体は、下記式１２−１〜式１２−１２のいずれかで表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式１２−１：
【００９５】
【化７８】
2019024444.tif 000079
式１２−２：
【００９６】
【化７９】
2019024444.tif 000080
式１２−３：
【００９７】
【化８０】
2019024444.tif 000081
式１２−４：
【００９８】
【化８１】
2019024444.tif 000082
式１２−５：
【００９９】
【化８２】
2019024444.tif 000083
式１２−６：
【０１００】
【化８３】
2019024444.tif 000084
式１２−７：
【０１０１】
【化８４】
2019024444.tif 000085
式１２−８：
【０１０２】
【化８５】
2019024444.tif 000086
式１２−９：
【０１０３】
【化８６】
2019024444.tif 000087
式１２−１０：
【０１０４】
【化８７】
2019024444.tif 000088
式１２−１１：
【０１０５】
【化８８】
2019024444.tif 000089
式１２−１２：
【０１０６】
【化８９】
2019024444.tif 000090
【０１０７】
式１２−１〜１２−１２中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２は、それぞれ前記と同義であり、ｎ１’〜ｎ１２’はそれぞれ独立して、１〜１０の整数である。
【０１０８】
本発明の核酸複合体は、式１で表される核酸複合体において、式２および式１１の構造を併せて持つ核酸複合体であることが好ましく、該核酸複合体において、式１１の構造であって、式２が、式４−１〜式４−９であってもよく、式６−１〜式６−９であってもよく、式７−１〜式７−９であってもよく、式２が、式４−１〜式４−９、式６−１〜式６−９、あるいは式７−１〜式７−９である場合に、式１１が、式１２−１〜式１２−１２であってもよい。本発明の核酸複合体は、式１で表される核酸複合体において、式４−１〜式４−９のいずれか１つの構造および式１２−１〜式１２−１２のいずれか１つの構造を併せて持つ核酸複合体、式６−１〜式６−９のいずれか１つの構造および式１２−１〜式１２−１２のいずれか１つの構造を併せて持つ核酸複合体、式７−１〜式７−９のいずれか１つの構造および式１２−１〜式１２−１２のいずれか１つの構造を併せて持つ核酸複合体であることがより好適である。
【０１０９】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするβ2GPIをコードする遺伝子(以下、β2GPI遺伝子ともいう)は、Genbank  Accession  No.NM_000042として登録されている、β2GPIの完全長mRNAに対応するcDNA塩基配列(配列番号1)が挙げられる。
【０１１０】
本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドとは標的遺伝子をコードするDNA、
このようなDNAから転写されるmRNA前駆体およびmRNAに対して相補的なオリゴヌクレオチドであり、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするDNA、mRNA前駆体またはmRNAと二本鎖を形成することによりDNA、mRNA前駆体またはmRNAの働きを抑制する。アンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的となるDNA、mRNA前駆体またはmRNAと完全に相補的であるもののみならず、DNA、mRNA前駆体またはmRNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる限り、1もしくは数個のミスマッチが存在するものも含まれる。本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、標的遺伝子にハイブリダイズする核酸であれば、ヘアピンオリゴマー、環状オリゴマーの形態中に導入されてもよく、内部または末端のバルジまたはループなどの構造要素を含有してもよい。
【０１１１】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ヌクレオチドまたは該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなる分子であってもよく、例えばデオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、リボヌクレオチドの重合体であるRNA、DNAとRNAとからなるキメラ核酸およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体が挙げられる。またRNA中のウラシル（U）は、DNAにおいてはチミン（T）に一義的に読み替えることができる。
【０１１２】
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等が挙げられる。ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばDNAまたはRNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、または可視化させるために、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
【０１１３】
ヌクレオチドに修飾を施した分子としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等が挙げられる。
【０１１４】
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
【０１１５】
2’-修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’-OH基がOR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、BrおよびIからなる群(Rはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数1〜6のアルキルであり、R’はアルキレン、好ましくは炭素数1〜6のアルキレンである)から選択される置換基で置換された2’-修飾ヌクレオチドが挙げられ、好ましくはF、メトキシ基が挙げられる。また、2-(methoxy)ethoxy基、3-aminopropoxy基、2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基、3-(N,N-dimethylamino)propoxy基、2-[2-(N,N-Dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2-(methylamino)-2-oxoethoxy基、2-(N-methylcarbamoyl)ethoxy基および2-cyanoethoxy基からなる群から選択される置換基で置換された2’-修飾ヌクレオチド等も挙げられる。より好ましくはメトキシ基および2-(methoxy)ethoxy基からなる群から選択される置換基で置換された2’-修飾ヌクレオチド等が挙げられる。
【０１１６】
また、糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)も好適に用いられる。
具体的には、2'位の酸素原子と4'位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA) [Tetrahedron Letters, 38, 8735, (1997)およびTetrahedron, 54, 3607,(1998)]、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]、Constrained Ethyl (cEt)[The Journal of Organic Chemistry 75, 1569 (2010)]、Amido-Bridged Nucleic Acid (AmNA)[ChemBio Chem 13, 2513 (2012)]および2’-O,4’-C-Spirocyclopropylene bridged nucleic acid (scpBNA)[Chem. Commun., 51, 9737 (2015)]等が挙げられる。
【０１１７】
さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等も糖部修飾ヌクレオチドとして挙げられる。
【０１１８】
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられ、好ましくはリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチドが挙げられる。
【０１１９】
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基、ハロゲン基で置換されたもの、メチル基が水素、ヒドロキシメチル、炭素数2〜6のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものが挙げられる。なお、シトシン（C）の代わりに5-メチルシトシン（5-mC）を塩基修飾ヌクレオチドとして用いることも、本発明の好ましい形態の一つである。
【０１２０】
ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、コレステロール、脂肪酸、トコフェロール、レチノイドなどの脂質類、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)などの糖類、フル抗体、Fab、VHHなどの抗体、低密度リポタンパク質（LDL）、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、RGD、NGR、R9、CPPなどのペプチド類、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、葉酸などの低分子、合成ポリアミノ酸などの合成ポリマー、核酸アプタマー、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンなどの色素、Cy3シリーズ、Alexaシリーズ、ブラックホールクエンチャーなどの蛍光団等の別の化学物質を、直接またはリンカーを介して付加したものも挙げられる。具体的にはポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、GalNAc付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、脂肪酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6-FAM付加ヌクレオチド誘導体およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等が挙げられ、好ましくはGalNAc付加ヌクレオチド誘導体が挙げられる。これらは、固相上での伸長反応時に、固相上で反応可能な修飾剤を反応させることで、5’末端、3’末端および／または配列内部に修飾を施すことができる。また、アミノ基、メルカプト基、アジド基または３重結合などの官能基を導入した核酸をあらかじめ合成および精製しておき、それらに修飾剤を作用させることで得ることもできる。
【０１２１】
ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
【０１２２】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）で置換されたものも包含する。
本明細書において「相補」とは、2つの塩基間で塩基対合をし得る関係を意味し、例えば、アデニンとチミンまたはウラシルとの関係、並びにグアニンとシトシンとの関係のように緩やかな水素結合を介して、二重鎖領域全体として２重螺旋構造をとるものをいう。
【０１２３】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、8〜80塩基であり、8〜30塩基が好ましい。例えば、8〜20塩基、10〜20塩基、13〜20塩基、13〜16塩基、13塩基、14塩基、15塩基、16塩基、17塩基、18塩基、19塩基、20塩基であり得る。
【０１２４】
特定の好ましい具体的な塩基配列は本明細書中に記載されるが、表1-1〜1-4に記載されたアンチセンス塩基配列の中から選択された少なくとも8個の連続した塩基を含む長さ8〜80塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドと言える。表１に記載されたアンチセンス塩基配列の中から選択された、より好ましくは９個以上、さらに好ましくは１０個以上、より一層好ましくは１１個以上、特に好ましくは１２個以上、最も好ましくは１３個の連続した塩基を含む、長さ8〜80塩基、好ましくは８〜30塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドと言える。
【０１２５】
【表１】
2019024444.tif 000091
【０１２６】
【表２】
2019024444.tif 000092
【０１２７】
【表３】
2019024444.tif 000093
【０１２８】
【表４】
2019024444.tif 000094
【０１２９】
典型的な好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドには、表1-1〜1-4に記載されたアンチセンス塩基配列の5’末端から少なくとも8個、より好ましくは９個以上、さらに好ましくは１０個以上、より一層好ましくは１１個以上、特に好ましくは１２個以上の連続した核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。同様に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表１に記載されたアンチセンス塩基配列の3’末端から少なくとも8個以上、より好ましくは９個以上、さらに好ましくは１０個以上、より一層好ましくは１１個以上、特に好ましくは１２個以上の連続した核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１３０】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、後述する、表2-1〜2-3、または表3-1〜3-2またはに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、表2-1〜2-3および表3-1〜3-2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該表に記載のβ2GPI相対発現量が、表2-1〜2-3では0.65以下、表3-1〜3-2では0.3以下であるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることがより好ましく、さらに好ましくはβ2GPI相対発現量が表2-1〜2-3では0.6以下、表3-1〜3-2では0.2以下であるアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に好ましくはβ2GPI相対発現量が表2-1〜2-3では0.55以下、表3-1〜3-2では0.1以下であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【０１３１】
表2-1〜2-3に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける、小文字で表されるヌクレオチドはDNAを、大文字で表されるヌクレオチドは2'-O-メチル化RNAを示し、表3-1〜3-2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける、小文字で表されるヌクレオチドはDNAを、大文字で表されるヌクレオチドはLNAを、mCは5-メチルシトシンLNAを示す。および  また、表2-1〜表2-3、表3-1〜表3-2に記載のいずれのアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける各ヌクレオチドは、すべてリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合で置換（すなわち、ホスホロチオエート修飾）されている。
【０１３２】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、β2GPI遺伝子の一部の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸を含み、かつβ2GPIの発現を抑制する核酸が用いられるが、該核酸のうち1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が欠失、置換または付加したものを用いてもよい。
【０１３３】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内に導入されると、相補的なmRNAおよびmRNA前駆体と結合し、mRNAおよびmRNA前駆体が蛋白質に翻訳されるのを立体的に阻害してβ2GPI遺伝子の発現を抑制することができる。
また、細胞内に導入されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内において、相補的なmRNAおよびmRNA前駆体と結合し、mRNAおよびmRNA前駆体を切断することもある。このような例として、RNAとDNAの二重鎖のRNA鎖を切断するエンドヌクレアーゼであるRNaseHを介した作用が知られている。細胞内のアンチセンスオリゴヌクレオチドがmRNAおよびmRNA前駆体と二重鎖を形成するとRNaseHに認識され、相補的なmRNA鎖を酵素的に分解することができる。
【０１３４】
RNaseHによるmRNAおよびmRNA前駆体の切断を誘導するには、４〜８０個の連続したDNA領域を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。この場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは0〜80%の糖部修飾ヌクレオチドを持つことが好ましく、10〜60%がより好ましく、20〜50%がさらに好ましい。また、糖部修飾ヌクレオチドを持つ場合の連続したDNA領域は、４〜２０個がより好ましく、４〜１５個がさらに好ましく、５〜１０個が最も好ましい。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける糖部修飾ヌクレオチドの位置は、5’末端近傍および／または3’末端近傍に配置することが好ましく、5’末端から全長の長さの30%以内の位置および／または3’末端から全長の長さの30%以内の位置に配置することがより好ましく、糖部修飾ヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から全長の長さの25%以内の位置および／または3’末端から全長の長さの25%以内の位置に配置することがさらに好ましい。
【０１３５】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5’末端近傍および／または3’末端近傍が糖部修飾ヌクレオチドであることが特に好ましい。本明細書中、5’末端近傍が糖部修飾ヌクレオチドであるとは、5’末端から１〜４個、好ましくは2〜4個の連続するヌクレオチドが糖部修飾ヌクレオチドであることを意味し、3’末端近傍が糖部修飾ヌクレオチドであるとは、3’末端から１〜４個、好ましくは2〜4個の連続するヌクレオチドが糖部修飾ヌクレオチドであることを意味する。すなわち、本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その5’末端から１〜4個のヌクレオチドが糖部修飾ヌクレオチドであるアンチセンスヌクレオチドを用いることが好ましく、より好ましくは5’末端から2〜4個のヌクレオチドが糖部修飾ヌクレオチドであるものを用いることができる。本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その3’末端から1〜４個のヌクレオチドが糖部修飾ヌクレオチドであるアンチセンスヌクレオチドを用いることが好ましく、より好ましくは3’末端から2〜4個のヌクレオチドが糖部修飾ヌクレオチドであるものを用いることができる。
【０１３６】
本発明において、ストリンジェントな条件とは、本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドがβ2GPI遺伝子の標的塩基配列に対してはハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしないか、するとしても標的塩基配列にハイブリダイズする量よりも大幅に少なく、相対的に無視できる程度の微量しかハイブリダイズしない条件を意味する。ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には６xＳＳＣ（0.9M NaCl, 0.09M クエン酸三ナトリウム）または６xＳＳＰＥ（3M NaCl, 0.2M NaH2PO4, 20mM EDTA・2Na, pH7.4）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５xＳＳＣにより洗浄する条件が、ストリンジェントな条件の一例として挙げられるが、これに限定されるものではない。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることができる。具体的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【０１３７】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等が挙げられる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、CEM法[Nucleic Acid Research, 35, 3287 (2007)]等を挙げることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)により合成することができる。合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護および目的物の精製等を行う。精製により、純度90%以上、好ましくは95%以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを得るのが望ましい。本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型としてファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6RNAポリメラーゼを用いた転写による方法が挙げられる。
【０１３８】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、トランスフェクション用の担体、好ましくはカチオン性リポソーム等のカチオン性担体を用いて細胞内に導入することができる。また、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法またはマイクロインジェクション法などにより、直接細胞内に導入することもできる。
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴ核酸と二重鎖を形成させ、二重鎖核酸として細胞内に導入することで標的遺伝子の発現抑制を誘導することもできる（特許文献  国際公開第2005/113571号パンフレット）。この場合の二重鎖核酸をリガンドで修飾する位置は、相補的なオリゴ核酸の5’末端または3’末端が好ましい。
【０１３９】
本発明のβ2GPI遺伝子の一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Genbank  Accession  No.NM_000042として登録されているヒトβ2GPIの完全長mRNAのcDNA塩基配列(配列番号１)あるいはゲノム配列に基づいて設計することができる。ヒトβ2GPIの完全長mRNAのcDNAは例えば、Genbank  Accession  No.NM_000042として登録されており、またヒトβ2GPIのmRNA前駆体を含むゲノム配列は、例えばGenbank  Accession  No. NC_000017.11として登録されている。
【０１４０】
β2GPI遺伝子の一部の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸のうち、β2GPIの発現抑制活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば表1〜表３に記載された群から選択される塩基配列で構成されるアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、8〜80塩基であり、8〜30塩基が好ましい。例えば、8〜20塩基、10〜20塩基、13〜20塩基、13〜16塩基13塩基、14塩基、15塩基、16塩基、17塩基、18塩基、19塩基、20塩基であり得る。
【０１４１】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入することにより、β2GPIの発現を抑制することができる。例えば本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、数nM〜数μMの濃度で、細胞に導入した後、24時間以上、例えば48時間培養した段階でβ2GPIのmRNAの発現を抑制することができる。
【０１４２】
また、本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドのβ2GPIのmRNAの発現抑制活性の評価は、該アンチセンスオリゴヌクレオチドをカチオン性リポソームなどを用いて、もしくは該アンチセンスオリゴヌクレオチドをそのまま、あるいは該アンチセンスオリゴヌクレオチドを何らかのリガンドと結合させて、ヒト細胞株などへ導入し、一定時間培養した後、当該ヒト細胞株におけるβ2GPIのmRNAの発現量を定量することにより行うことができる。
【０１４３】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リガンドを含んでもよい。該リガンドは、本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端および／または配列内部を、直接修飾するものであってもよい。
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれるリガンドとしては、生体分子と親和性のある分子であれば良いが、例えば、コレステロール、脂肪酸、トコフェロール、レチノイドなどの脂質類、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)などの糖類、フル抗体、Fab、VHHなどの抗体、低密度リポタンパク質（LDL）、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、RGD、NGR、R9、CPPなどのペプチド類、葉酸などの低分子、合成ポリアミノ酸などの合成ポリマー、あるいは核酸アプタマーなどがあげられるがこれらに限定されず、これらを適宜組み合わせて用いることもできる。
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドにリガンドを付加する方法としては、例えば、固相上での伸張反応時に、固相上で反応可能な修飾剤を反応させることで、5'末端、3'末端および／または配列内部に修飾を施すことができるが、これに限定されない。また、アミノ基、メルカプト基、アジド基または３重結合などの官能基を導入した核酸をあらかじめ合成および精製しておき、それらに修飾剤を作用させることでコンジュゲート核酸を得ることもできる。
【０１４４】
本発明の核酸複合体の製造法について説明する。なお、以下に示す製造法において、定義した基が該製造法の条件下で変化するかまたは該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法］等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
式１で表される核酸重合体は、固相合成によっても合成することができる。
【０１４５】
式１で表される核酸重合体は、核酸複合体として公知のリンカー構造の合成方法を参考にして合成することができる。
式１で表される核酸複合体における、Ｓ１をリンカーとしたＬ１−ベンゼン環ユニットやＳ２をリンカーとしたＬ２−ベンゼン環ユニットの合成は、例えば、式２で表される核酸複合体を例として説明する。
式２で表される核酸複合体におけるＬ１−ベンゼン環ユニットやＬ２−ベンゼン環ユニットは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６ならびにＴ１およびＴ２により連結している。
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６ならびにＴ１およびＴ２の−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−または−ＣＯ−ＮＨ−結合は、例えば、第４版実験化学講座１９「有機化合物の合成Ｉ」丸善（１９９２年）、第４版実験化学講座２０「有機化合物の合成ＩＩ」、丸善（１９９２年））等に記載の結合反応の方法を参考にして、式２で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
また、ベンゼン環から順次、Ｑ１を部分構造として有する化合物、Ｂ１を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｌ１−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
Ｌ１とＱ２を部分構造として有する化合物を別途合成し、Ｌ１とＱ２を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Ｑ１およびＢ１を部分構造として有するＬ１−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
Ｌ２−ベンゼン環ユニットについても同様に、ベンゼン環から順次、Ｑ３を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｌ２−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
Ｌ２とＱ４を部分構造として有する化合物を別途合成し、Ｌ２とＱ４を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Ｑ３およびＢ２を部分構造として有するＬ２−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、Ｌ２−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
【０１４６】
Ｑ１を部分構造として有する化合物、Ｑ３を部分構造として有する化合物としては、炭素数１〜１０のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−の両末端に、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基を有する化合物が挙げられる。
Ｂ１を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物としては、下記式２−１で表されるいずれかの構造を有し、各構造における末端の黒丸点において、それぞれ、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、またはチオール基を有する化合物が挙げられる。
式２−１：
【０１４７】
【化９０】
2019024444.tif 000095
【０１４８】
Ｂ１を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物の具体例としては、グリコール、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、Ｔｒｉｓ、イミノ二酢酸、２−アミノ−１，３−プロパンジオール等が挙げられ、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、イミノ二酢酸が好ましい。具体的には、Ｂ１およびＢ２は以下の構造が好ましい。
【化９１】
2019024444.tif 000096
【０１４９】
Ｌ１、Ｑ２およびＢ１を部分構造として有する化合物を合成してから、Ｑ１とベンゼン環を有する化合物と結合することにより、Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造を製造してもよい。
Ｌ２、Ｑ４およびＢ２を部分構造として有する化合物を合成してから、Ｑ３とベンゼン環を有する化合物と結合することにより、Ｌ２−ベンゼン環ユニット構造を製造してもよい。
本発明においては、［Ｌ１−Ｔ１−（Ｑ２−Ｐ３）q2−］p1−Ｂ１−（Ｐ２−Ｑ１）q1−Ｐ１−である部分構造と、［Ｌ２−Ｔ２−（Ｑ３−Ｐ６）q4−］p2−Ｂ２−（Ｐ５−Ｑ３）q3−Ｐ２−である部分構造とは同一または異なっていても良いが、同一であることが好ましい。
【０１５０】
糖リガンドのＬ１−Ｔ１−Ｑ２に相当するユニットとして、例えば、Ｌ３−Ｔ１−Ｑ２−ＣＯＯＨ、Ｌ３−Ｔ１−（Ｑ２−Ｐ３）q2-1−Ｑ２−ＮＨ2等が挙げられる。具体的には、Ｌ３−Ｏ―炭素数１〜１２のアルキレン―ＣＯＯＨや、Ｌ３−炭素数１〜１２のアルキレン−ＣＯ−ＮＨ−炭素数２〜１２のアルキレン−ＮＨ2等が挙げられる。
Ｌ３は、脱保護することにより、Ｌ１となる糖リガンド誘導体であれば特に限定されない。糖リガンドの置換基としては、糖質化学の分野で汎用される置換基であれば特に限定されないが、Ａｃ基が好ましい。
【０１５１】
Ｓ１をリンカーとしたＬ１−ベンゼン環ユニットやＳ２をリンカーとしたＬ２−ベンゼン環ユニットの合成は、具体的には実施例に記載の方法を参考にして、アルキレン鎖の炭素数を適宜増減し、また、末端アミノ基や末端カルボキシル基を、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−または−ＣＯ−ＮＨ−結合を形成し得る基に変換した化合物を用いることにより、合成することができる。また、Ｌ１の糖リガンドについても、実施例においては、マンノースまたはＮ−アセチルガラクトサミンを例示しているが、他の糖リガンドに変更して実施することができる。
【０１５２】
式１で表される核酸複合体における、Ｓ３をリンカーとしたＸ−ベンゼン環ユニットの合成は、例えば、式１２で表される核酸複合体を例として説明する。
式１２で表される核酸複合体におけるＸ−ベンゼン環ユニットは、オリゴヌクレオチドの結合以外に、Ｐ７およびＰ８により表される結合を有する。
Ｐ７およびＰ８の−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−または−ＣＯ−ＮＨ−結合は、例えば、第４版実験化学講座１９「有機化合物の合成Ｉ」丸善（１９９２年）、第４版実験化学講座２０「有機化合物の合成ＩＩ」、丸善（１９９２年））に記載の結合反応の方法を参考にして、式１２で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
また、ベンゼン環から順次、Ｑ５を部分構造として有する化合物、Ｂ３を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｘ−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
【０１５３】
ＸとＱ７を部分構造として有する化合物や、ＸとＱ６を部分構造として有する化合物を別途合成し、ＸとＱ７を部分構造として有する化合物やＸとＱ６を部分構造として有する化合物をベンゼン環およびＱ５を部分構造として有するＸ−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させて、Ｂ３部分を構築することにより、Ｘ−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
具体的には、ベンゼン環およびＱ５を部分構造として有するＸ−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物の末端にアジド基を有する場合を例にとると、実施例に開示するような末端結合性官能基化したオリゴヌクレオチドを反応させることにより、環化付加させて、トリアゾール環を形成させて、Ｂ３部分を構築することにより、Ｘ−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
【０１５４】
Ｑ５を部分構造として有する化合物、Ｑ６を部分構造として有する化合物、Ｑ７を部分構造として有する化合物としては、炭素数１〜１０のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n8−ＣＨ2ＣＨ2−の両末端に、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基を有する化合物が挙げられる。
【０１５５】
Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造、Ｌ２−ベンゼン環ユニット構造と、Ｘ−ベンゼン環ユニット構造とは、それぞれ順次製造していくことができるが、Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造およびＬ２−ベンゼン環ユニット構造を合成してから、Ｘ−ベンゼン環ユニット構造を結合させることが好ましい。特に、オリゴヌクレオチド部分を有するＸについては、糖リガンド複合体合成の最終工程近くで化合物内に導入することが好ましい。
【０１５６】
本発明においては、下記式８〜式１０で表される化合物が合成中間体として得られる。
式８：
【０１５７】
【化９２】
2019024444.tif 000097
【０１５８】
（式８中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、−ＣＯ−Ｒ４、または−ＣＯ−Ｂ４−［（Ｐ９−Ｑ８）q7−Ｔ３−Ｌ３］p3であり、
Ｐ９およびＴ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ８は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n1−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ１は０〜９９の整数であり、
Ｂ４は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式８−１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、カルボニル基またはＰ９との結合点であり、ｍ７、ｍ８、ｍ９およびｍ１０は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
式８−１：
【０１５９】
【化９３】
2019024444.tif 000098
【０１６０】
ｐ３は、１、２または３の整数であり、
ｑ７は、０〜１０の整数であり、
Ｌ３は、糖リガンドであり、
Ｙは-Ｏ−（ＣＨ2）m11−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m12−ＮＨであり、ｍ１１およびｍ１２は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であり、
Ｒ３は、水素原子、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−ＣＯ−Ｒ４、−ＣＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n2−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ3、または−ＣＯ−Ｑ９−Ｂ５−（Ｑ１０−Ｐ１０）q8−Ｘ１あり、ｎ２は０〜９９の整数であり、
Ｐ１０は、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ９およびＱ１０は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n3−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ３は０〜９９の整数であり、
Ｂ５は、下記式８−２で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ９およびＱ１０との結合手を意味し、
式８−２：
【０１６１】
【化９４】
2019024444.tif 000099
【０１６２】
式８−２中、トリアゾール環を有する基における置換は、該トリアゾール環の1位および3位の窒素原子のいずれかである。
ｑ８は、０〜１０の整数であり、
Ｘ１は、水素原子または固相担体であり、
Ｒ４は、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２〜１０のアルキル基である。）
【０１６３】
本発明においては、下記式９で表される化合物が合成中間体として得られる。
式９：
【０１６４】
【化９５】
2019024444.tif 000100
【０１６５】
（式９中、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−ＣＯ−Ｒ４'、または−ＣＯ−Ｑ１１−（Ｐ１１−Ｑ１１'）q9−Ｔ４−Ｌ４であり、
Ｐ１１およびＴ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ１１およびＱ１１'は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n4−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ４は０〜９９の整数であり、
ｑ９は、０〜１０の整数であり、
Ｌ４は、糖リガンドであり、
Ｙ'は-Ｏ−（ＣＨ2）m11'−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m12'−ＮＨであり、ｍ１１'およびｍ１２'は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であり、
Ｒ３'は、水素原子、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−ＣＯ−Ｒ４'、−ＣＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n2'−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ3、または−ＣＯ−Ｑ９'−Ｂ５'−（Ｑ１０'−Ｐ１０'）q8'−Ｘ１'であり、ｎ２'は０〜９９の整数であり、
Ｐ１０'は、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ９'およびＱ１０'は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n3'−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ３'は０〜９９の整数であり、
Ｂ５'は、下記式９−１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ９'およびＱ１０'との結合手を意味し、
式９−１：
【０１６６】
【化９６】
2019024444.tif 000101
【０１６７】
式９−１中、トリアゾール環を有する基における置換は、該トリアゾール環の1位および3位の窒素原子のいずれかである。
ｑ８'は、０〜１０の整数であり、
Ｘ１'は、水素原子または固相担体であり、
Ｒ４'は、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２〜１０のアルキル基である。）
【０１６８】
本発明においては、下記式１０で表される化合物が合成中間体として得られる。
式１０：
【０１６９】
【化９７】
2019024444.tif 000102
【０１７０】
式１０中、
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、ｔ−ブトキシ基、ベンジルオキシ基、−ＮＨ−Ｒ１０、または−ＮＨ−Ｑ１２−（Ｐ１２−Ｑ１２'）q10−Ｔ４−Ｌ４であり、
Ｐ１２およびＴ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ１２およびＱ１２'は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ2−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ2は０〜９９の整数であり、
Ｌ４は、糖リガンドであり、
Ｙ２は-Ｏ−（ＣＨ2）ｍ９−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）ｍ１０−ＮＨであり、ｍ９、ｍ１０は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であり、
ｑ１０は、０〜１０の整数であり、
Ｒ９は、水素原子、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−ＣＯ−Ｒ１０、−ＣＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n6−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ3、または−ＣＯ−Ｑ１３−Ｂ６−（Ｑ１４−Ｐ１３）q11−Ｘ２であり、ｎ６は０〜９９の整数であり、
Ｐ１３は、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ１３およびＱ１４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n7−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ７は０〜９９の整数であり、
Ｂ６は、下記式１０−１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ１３およびＱ１４との結合手を意味し、
式１０−１：
【０１７１】
【化９８】
2019024444.tif 000103
【０１７２】
式１０−１中、トリアゾール環を有する基における置換は、該トリアゾール環の1位および3位の窒素原子のいずれかである。
ｑ１１は、０〜１０の整数であり、
Ｘ２は、水素原子または固相担体であり、
Ｒ１０は、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２〜１０のアルキル基である。）
【０１７３】
以下、本発明に関連して、製造方法を一例として示す。なお、以下の製造方法１〜製造方法１７に関する記載において、本発明の核酸誘導体等における式１〜式１２で表される化合物とで、基を表す記号として同一の記号が用いられているものがあるが、両者は切り離して理解されるものであり、製造方法１〜製造方法１２に対して記載される基の説明により、本発明が限定的に解釈されるものではない。また、本発明における核酸誘導体に関し、オリゴヌクレオチドを表すＸを、製造方法１〜製造方法１７では、−Ｏ−Ｘとして記載する。
【０１７４】
製造方法１
本発明における核酸誘導体は、式（Ｉ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
【０１７５】
【化９９】
2019024444.tif 000104
【０１７６】
（式中、Ｐ１はＦｍｏｃ等の塩基により脱保護可能な保護基であり、ＤＭＴｒはｐ，ｐ’−ジメトキシトリチル基を表し、Ｒは糖リガンド-テザーユニットを表し、Ｒ’は、Ｒ中の糖リガンドの各水酸基がアセチル基等の塩基で脱保護可能な保護基で保護された基を表し、Ｐｏｌｙｍｅｒは固相担体を表し、Ｑ’は−ＣＯ−である。）
【０１７７】
工程１
化合物（Ｉ−Ｂ）は、化合物（Ｉ−Ａ）とｐ，ｐ’−ジメトキシトリチルクロリドを、ピリジン等の溶媒中、必要に応じて共溶媒の存在下、０℃と１００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
共溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
【０１７８】
工程２
化合物（Ｉ−Ｃ）は、化合物（Ｉ−Ｂ）を、無溶媒でまたは溶媒中、１〜１０００当量の２級アミン存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
２級アミンとしては、例えばジエチルアミン、ピペリジン等が挙げられる。
【０１７９】
工程３
化合物（１−Ｅ）は、化合物（Ｉ−Ｃ）と化合物（Ｉ−Ｄ）を、無溶媒でまたは溶媒中、１〜３０当量の塩基、縮合剤および必要に応じて０．０１〜３０当量の添加剤の存在下、室温と２００  ℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
塩基としては、例えば炭酸セシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
縮合剤としては、例えば１，３−ジシクロヘキサンカルボジイミド（DCC）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）、カルボニルジイミダゾール、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルホロホスファート、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスファート、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、ヨウ化  ２−クロロ−１−メチルピリジニウム等が挙げられる。
添加剤としては、例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
化合物（Ｉ−Ｄ）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １３６，  １６９５８，  （２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０１８０】
工程４
化合物（Ｉ−Ｆ）は、化合物（Ｉ−Ｅ）とコハク酸無水物を、溶媒中、１〜３０当量の塩基存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
【０１８１】
溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
【０１８２】
塩基としては、工程３で例示したものが挙げられる。
【０１８３】
工程５
化合物（Ｉ−Ｇ）は、化合物（Ｉ−Ｆ）と末端がアミノ化された固相担体とを、無溶媒でまたは溶媒中、１〜３０当量の塩基、縮合剤および必要に応じて０．０１〜３０当量の添加剤の存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応した後、無水酢酸／ピリジン溶液と室温と２００℃の間の温度で５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
塩基、縮合剤および添加剤としては、それぞれ工程３で例示したものがあげられる。
アミノ化された固相担体としては、例えば長鎖アルキルアミン細孔性ガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）等  があげられ、これらは市販品として得ることができる。
【０１８４】
工程６
式（Ｉ’）で表される糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットを有する核酸複合体は、化合物（Ｉ−Ｇ）を用い、公知のオリゴヌクレオチド化学合成法で対応するヌクレオチド鎖を伸長した後に、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製を行うことで製造することができる。
【０１８５】
公知のオリゴヌクレオチド化学合成法としては、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、ＣＥＭ法  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３５，  ３２８７  （２００７）を参照）等をあげることができ、例えば、ＡＢＩ３９００ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。
【０１８６】
固相からの脱離、脱保護は、オリゴヌクレオチド化学合成後、溶媒または無溶媒中、−８０  ℃から２００  ℃の間の温度で、１０秒間から７２時間塩基で処理することにより製造することができる。
【０１８７】
塩基としては、例えばアンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ピペリジン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）、炭酸カリウム等が挙げられる。
【０１８８】
溶媒としては、水、メタノール、エタノール、ＴＨＦ等が挙げられる。
【０１８９】
オリゴヌクレオチドの精製は、Ｃ１８逆相カラムあるいは陰イオン交換カラム、好ましくは前述２つの手法を組み合わせにより可能である。精製後の核酸複合体純度は、９０％以上、好ましくは９５％以上とするのが望ましい。
【０１９０】
また、上記工程３において、必要により、化合物（Ｉ−Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（Ｉ−Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ−Ｑ’がＲ−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンである）、工程３において、化合物（Ｉ−Ｃ）と、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程３と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’−ＮＨ2（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’−ＮＨ2（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １３６，  １６９５８  （２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。ここで、Ｑ４’において、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンにおける置換基およびアルキレン部分は上記と同様である。
【０１９１】
Ｑが−ＣＯ−である場合を例示して示しているが、Ｑが−ＣＯ−でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０１９２】
製造方法２
本発明における核酸誘導体は、式（ＩＩ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
【０１９３】
【化１００】
2019024444.tif 000105
【０１９４】
（式中、ＤＭＴｒ、Ｒ、Ｒ’、Ｘ、Ｑ’、およびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義。ＴＢＤＭＳはｔ−ブチルジメチルシリル基、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を表す）
【０１９５】
工程７
化合物（ＩＩ−Ａ）は、化合物（Ｉ−Ａ）、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリドおよびジメチルアミノピリジンをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の溶媒中、好ましくは２等量の塩基の存在下、０℃〜１００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
塩基としては、製造方法１の工程３で例示したものが挙げられる。。
【０１９６】
工程８
化合物（ＩＩ−Ｂ）は、化合物（ＩＩ−Ａ）を用い、製造方法１の工程１と同様の条件にて製造することができる。
【０１９７】
工程９
化合物（ＩＩ−Ｃ）は、化合物（ＩＩ−Ｂ）とフッ化ｎ−テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を、溶媒中、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
【０１９８】
工程１０
化合物（ＩＩ−Ｄ）は、化合物（ＩＩ−Ｃ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
【０１９９】
工程１１
化合物（ＩＩ−Ｅ）は、化合物（ＩＩ−Ｄ）および化合物（Ｉ−Ｄ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
【０２００】
工程１２〜１４
化合物（ＩＩ’）は、化合物（ＩＩ−Ｅ）を用い、製造方法１の工程４〜工程６と同様の条件にて製造することができる。
【０２０１】
また、上記工程１１において、必要により、化合物（Ｉ−Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（ＩＩ−Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ−Ｑ’が−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレン）、工程１１において、化合物（ＩＩ−Ｃ）と、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程１１と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’−ＮＨ2（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’−ＮＨ2（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １３６，  １６９５８  （２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２０２】
Ｑが−ＣＯ−である場合を例示して示しているが、Ｑが−ＣＯ−でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０２０３】
製造方法３
本発明における核酸誘導体は、式（ＩＩＩ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
【０２０４】
【化１０１】
2019024444.tif 000106
【０２０５】
（式中、ＤＭＴｒ、Ｆｍｏｃ、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＸおよびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義である。）
【０２０６】
化合物（ＩＩＩ’）は、化合物（ＩＩＩ−Ａ）を用い、製造方法１の工程１から工程６と同様の条件にて製造することができる。。なお、化合物（ＩＩＩ−Ａ）は市販品として得ることができる。
【０２０７】
工程１５
化合物（ＩＩＩ−Ｂ）は、化合物（ＩＩＩ−Ａ）を用い、製造法１の工程１と同様の条件にて製造することができる。
化合物（ＩＩＩ−Ａ）は市販品として購入することができる。
【０２０８】
工程１６
化合物（ＩＩＩ−Ｃ）は、化合物（ＩＩＩ−Ｂ）を用い、製造法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
【０２０９】
工程１７
化合物（ＩＩＩ−Ｅ）は、化合物（ＩＩＩ−Ｃ）を用い、製造法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
【０２１０】
工程１８〜２０
化合物（ＩＩＩ’）は、化合物（ＩＩＩ−Ｅ）を用い、製造方法１の工程４〜工程６と同様の条件にて製造することができる。
【０２１１】
また、上記工程１７において、必要により、化合物（Ｉ−Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（ＩＩＩ−Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ−Ｑ’が−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレン）、工程１７において、化合物（ＩＩＩ−Ｃ）と、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程１７と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’−ＮＨ2（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’−ＮＨ2（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３６，  １６９５８  （２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２１２】
Ｑが−ＣＯ−である場合を例示して示しているが、Ｑが−ＣＯ−でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０２１３】
製造方法４
本発明における核酸誘導体は、式（ＩＶ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
【０２１４】
【化１０２】
2019024444.tif 000107
【０２１５】
（式中、ＤＭＴｒ、Ｆｍｏｃ、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＸおよびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義である。）
【０２１６】
化合物（ＩＶ’）は、化合物（ＩＶ−Ａ）を用い、製造方法１の工程１から工程６と同様の条件にて製造することができる。。なお、化合物（ＩＶ−Ａ）は市販品として得ることができる。
【０２１７】
また、上記工程２３において、必要により、化合物（Ｉ−Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（ＩＶ−Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ’−Ｑ’が−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンである）、工程２３において、化合物（ＩＶ−Ｃ）と、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程２３と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’−ＮＨ2（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’−ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １３６，  １６９５８  （２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２１８】
Ｑが−ＣＯ−である場合を例示して示しているが、Ｑが−ＣＯ−でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０２１９】
製造方法５
本発明における核酸誘導体は、式（Ｖ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
【０２２０】
【化１０３】
2019024444.tif 000108
【０２２１】
（式中、ＤＭＴｒ、Ｒ、Ｒ’、Ｘ、Ｑ’、ＴＢＤＭＳ、ＦｍｏｃおよびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義。）
【０２２２】
化合物（Ｖ’）は、化合物（ＩＶ−Ａ）を用い、製造方法２の工程１から工程７と同様の条件にて製造することができる。。なお、化合物（ＩＶ−Ａ）は市販品として得ることができる。
【０２２３】
また、上記工程３１において、必要により、化合物（Ｉ−Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（Ｖ−Ｄ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ’−Ｑ’が−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンである）、工程３１において、化合物（Ｖ−Ｄ）と、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程３１と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’−ＮＨ2（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４’−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’−ＮＨ2（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １３６，  １６９５８  （２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２２４】
Ｑが−ＣＯ−である場合を例示して示してるが、Ｑが−ＣＯ−でない場合の化合物についても、Ｑ−ＯＨの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０２２５】
製造方法６
オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
【０２２６】
【化１０４】
2019024444.tif 000109
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
【０２２７】
工程３５
化合物（Ｉ−Ｈ）は、化合物（ＩＩ−Ｅ）と２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホジアミダイトを、無溶媒でまたは溶媒中、塩基および反応促進剤共存下、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、製造方法１の工程２で例示したものがあげられる。
塩基としては、製造方法１の工程３で例示したものがあげられる。
反応促進剤としては、例えば、１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、５−エチルチオテトラゾール、５−ベンジルチオテトラゾール等があげられ、市販品として購入できる。
【０２２８】
工程３６
オリゴヌクレオチド鎖を伸長し、最後に化合物（Ｉ−Ｈ）を用い、オリゴヌクレオチドの５'末端を糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットで修飾した後、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製を行うことにより、化合物(I'')を製造することができる。ここで、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製は、それぞれ製造方法１の工程７と同様にして製造できる。
【０２２９】
製造方法７
オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
【０２３０】
製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
【０２３１】
【化１０５】
2019024444.tif 000110
【０２３２】
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
【０２３３】
製造方法８
オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
【０２３４】
製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
【０２３５】
【化１０６】
2019024444.tif 000111
【０２３６】
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
【０２３７】
製造方法９
オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
【０２３８】
製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
【０２３９】
【化１０７】
2019024444.tif 000112
【０２４０】
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
【０２４１】
製造方法１０
オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
【０２４２】
製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
【０２４３】
【化１０８】
2019024444.tif 000113
【０２４４】
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
【０２４５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記の公知オリゴヌクレオチド合成法に準じて得ることができる。
【０２４６】
製造方法１２
本発明における核酸誘導体は、式（ＶＩ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。。
【０２４７】
【化１０９】
2019024444.tif 000114
【０２４８】
(式中、ＤＭＴｒ、Ｒ、Ｒ'、Ｘ、Ｑ'、Ｐｏｌｙｍｅｒ、およびＦｍｏｃは前記と同義であり、ＴＢＳはｔ−ブチルジメチルシリル基を表し、Ｒ０およびＲｘは、同一または異なって、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキレンまたはＣ３−Ｃ８のシクロアルキレンを表し、ＷはＣ１〜Ｃ１０のアルキレン、Ｃ３−Ｃ８のシクロアルキレンであるか、Ｒ０と一緒になって、Ｃ４−Ｃ８の含窒素複素環を形成してもよい。)
【０２４９】
工程４５
化合物（ＶＩ−Ｂ）は化合物（ＶＩ−Ａ）を用い、製造方法１の工程１と同様の条件にて製造することができる。
化合物（ＶＩ−Ａ）は市販品として、または公知の方法（例えばバイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ，第１１巻，３８３−３８６頁）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２５０】
工程４６
化合物（ＶＩ−Ｃ）は化合物（ＶＩ−Ｂ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
【０２５１】
工程４７
化合物（ＶＩ−Ｄ）は化合物（ＶＩ−Ｃ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
【０２５２】
工程４８
化合物（ＶＩ−Ｅ）は化合物（ＶＩ−Ｄ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
【０２５３】
工程４９
化合物（ＶＩ−Ｇ）は化合物（ＶＩ−Ｅ）と化合物（ＶＩ−Ｆ）とを用い、製造方法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
【０２５４】
工程５０
化合物（ＶＩ−Ｈ）は化合物（ＶＩ−Ｇ）を用い、製造方法２の工程９と同様の条件にて製造することができる。
【０２５５】
工程５１〜５３
化合物（ＶＩ’）は化合物（ＶＩ−Ｈ）、化合物（ＶＩ−Ｉ）および化合物（ＶＩ−Ｊ）を用い、製造方法１の工程４〜６と同様の条件にて製造することができる。
【０２５６】
工程４５〜５３は公知の方法（例えば国際公開第２０１５／１０５０８３号記載の方法）、またはそれに準じた方法でも実施することができる。
化合物（ＶＩ−Ｆ）は公知の方法（例えば、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ），  １３６巻，  １６９５８貢，  ２０１４年記載の方法）、またはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２５７】
製造方法１３
式２においてＰ１およびＰ４が−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−または−Ｓ−ＣＯ−である、糖リガンド−テザーーユニットは以下の方法で製造することができる。
【０２５８】
【化１１０】
2019024444.tif 000115
【０２５９】
（式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｔ１、Ｔ２、L１、Ｌ２、ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４はそれぞれ前記と同義であり、ｑ２'はｑ２より１小さい整数を表し、ｑ４'はｑ４より１小さい整数を表し、Ｐ１'およびＰ４'は、それぞれ独立して、−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−または−Ｓ−ＣＯ−を表し、ＺはＨ、ＯＨ、ＮＨ2、ＳＨ、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メタンスルホニルオキシ、p-トルエンスルホニルオキシまたはカルボン酸を表し、Ｂ１'およびＢ２'は下記式の構造体のいずれか１つを表し、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３、ＰＧ４、ＰＧ５、ＰＧ６およびＰＧ７はそれぞれ適切な保護基を表す。）
式：
【０２６０】
【化１１１】
2019024444.tif 000116
【０２６１】
ｍ１、ｍ２、ｍ３またはｍ４はそれぞれ独立して、０〜１０の整数を表す。
【０２６２】
工程５４
化合物（ＶＩＩ−Ｃ）は、化合物（ＶＩＩ−Ａ）と化合物（ＶＩＩ−Ｂ）を、テトロヒドロフラン等の溶媒中、トリフェニルホスフィンポリマー担持体を加え、氷冷下、ジイソプロピルアゾジカルボキシレートトルエン溶液を反応させることにより製造することができる。
溶媒としては製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
化合物（ＶＩＩ−Ａ）は市販品として得ることができる。
【０２６３】
工程５５
化合物（ＶＩＩ−Ｄ）は化合物（ＶＩＩ−Ｃ）を用い、メタノール等の溶媒中、氷冷下、塩基の存在下、反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造工程１の工程３で例示したものが挙げられる。
【０２６４】
工程５６
化合物（ＶＩＩ−Ｆ）は化合物（ＶＩＩ−Ｄ）および化合物（ＶＩＩ−Ｅ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２６５】
工程５７
化合物（ＶＩＩ−Ｈ）は化合物（ＶＩＩ−Ｆ）および化合物（ＶＩＩ−Ｇ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２６６】
工程５８
化合物（ＶＩＩ−Ｊ）は化合物（ＶＩＩ−Ｈ）および化合物（ＶＩＩ−Ｉ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
また、ＤＰ工程と工程５８を繰り返し行うことで、望みのｑ１の値をもつ化合物（ＶＩＩ−Ｊ）を製造することができる。
【０２６７】
工程５９
化合物（ＶＩＩ−Ｌ）は化合物（ＶＩＩ−Ｊ）および化合物（ＶＩＩ−Ｋ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２６８】
工程６０
化合物（ＶＩＩ−Ｎ）は化合物（ＶＩＩ−Ｌ）および化合物（ＶＩＩ−Ｍ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２６９】
工程６１〜６３
化合物（ＶＩＩ’）は化合物（ＶＩＩ−Ｏ）、化合物（ＶＩＩ−Ｐ）および化合物  （ＶＩＩ−Ｑ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
また、ＤＰ工程と工程６１を繰り返し行うことで、望みのｑ3の値をもつ化合物（ＶＩＩ'）を製造することができる。
【０２７０】
工程ＤＰ
有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで製造することができる。
化合物（ＶＩＩ−Ｂ）、化合物（ＶＩＩ−Ｅ）、化合物（ＶＩＩ−Ｇ）、化合物（ＶＩＩ−Ｉ）、化合物（ＶＩＩ−Ｋ）、化合物（ＶＩＩ−Ｍ）、化合物（ＶＩＩ−Ｏ）、化合物（ＶＩＩ−Ｐ）および化合物（ＶＩＩ−Ｑ）は市販品として、または「実験化学講座第４版  有機合成、ｐ．  ２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ７th  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせること、もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２７１】
製造方法１４
式４においてＰ７が−Ｏ−である、ユニットは以下の方法で製造することができる。
【０２７２】
【化１１２】
2019024444.tif 000117
【０２７３】
（式中、Ｑ５、Ｐ７、ｑ５はそれぞれ前記と同義であり、ｑ５''はｑ５より２小さい整数を表し、ｑ５'はｑ５より１小さい整数を表し、Ｚ２はＨ、ＯＨ、ＮＨ2またはＳＨを表し、ＰＧ８およびＰＧ９はそれぞれ適切な保護基を表し、ＬＣは糖リガンド−テザーユニットを表し、Ｅはカルボン酸またはマレイミドを表す。）
【０２７４】
工程６４
化合物（ＶＩＩＩ−Ｃ）は化合物（ＶＩＩＩ−Ａ）および化合物（ＶＩＩＩ−Ｂ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
また、ＤＰ工程と工程６４を繰り返し行うことで、望みのｑ5''の値をもつ化合物（ＶＩＩＩ−Ｃ）を製造することができる。  化合物（ＶＩＩＩ−Ｂ）は市販品として、または「実験化学講座第４版  有機合成、ｐ．  ２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ７th  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせること、もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２７５】
工程６５
化合物（ＶＩＩＩ’）は化合物（ＶＩＩＩ−Ｃ）および化合物（ＶＩＩＩ−Ｄ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
化合物（ＶＩＩＩ−Ｄ）は市販品として、または「実験化学講座第４版  有機合成、ｐ．  ２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ７th  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせること、もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２７６】
工程ＤＰ
有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで製造することができる。
【０２７７】
製造方法１５
式２においてＰ１およびＰ４が−Ｏ−である、糖リガンド−テザーユニットは以下の方法で製造することができる。
【０２７８】
【化１１３】
2019024444.tif 000118
【０２７９】
（式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｌ１、Ｌ２、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ２'、ｑ４' 、Ｚ、Ｂ１'、Ｂ２’はそれぞれ前記と同義であり、ＰＧ１０、ＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３、ＰＧ１４およびＰＧ１５はそれぞれ適切な保護基を表す）
式：
【０２８０】
【化１１４】
2019024444.tif 000119
【０２８１】
ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は前記と同義である。
【０２８２】
工程６６
化合物（ＩＸ−Ｃ）は化合物（ＩＸ−Ａ）と化合物（ＩＸ−Ｂ）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドな等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温〜２００℃にて５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、製造工程１の工程２に例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造工程１の工程３で例示したものが挙げられる。
【０２８３】
工程６７
化合物（ＩＸ−Ｅ）は化合物化合物（ＩＸ−Ｃ）と化合物（ＩＸ−Ｄ）をＮ，  Ｎ’−ジメチルホルムアミド等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温〜２００℃で５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造工程１の工程３で例示したものが挙げられる。
化合物（ＩＸ−Ａ）は市販品として得ることができる。
【０２８４】
工程６８
化合物（ＩＸ−Ｇ）は化合物（ＩＸ−Ｅ）および化合物（ＩＸ−Ｆ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２８５】
工程６９
化合物（ＩＸ−Ｉ）は化合物（ＩＸ−Ｇ）および化合物（ＩＸ−Ｈ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
また、ＤＰ工程と工程６９を繰り返し行うことで、望みのｑ１の値をもつ化合物（ＶＩＩ−Ｊ）を製造することができる。
【０２８６】
工程７０
化合物（ＩＸ−Ｋ）は化合物（ＩＸ−Ｉ）および化合物（ＩＸ−Ｊ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２８７】
工程７１
化合物（ＩＸ−Ｍ）は化合物（ＩＸ−Ｋ）および化合物（ＩＸ−Ｌ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２８８】
工程７２−７４
化合物（ＩＸ’）は化合物（ＩＸ−Ｍ），  化合物（ＩＸ−Ｎ），  化合物（ＩＸ−Ｏ）および化合物（ＩＸ−Ｐ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
また、ＤＰ工程と工程７２を繰り返し行うことで、望みのｑ３の値をもつ化合物（ＩＸ’）を製造することができる。
【０２８９】
工程ＤＰ
有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで製造することができる。
【０２９０】
化合物（ＩＸ’−Ｂ），  化合物（ＩＸ’−Ｄ），  化合物（ＩＸ’−Ｆ），  化合物（ＩＸ’−Ｈ），  化合物（ＩＸ’−Ｊ），  化合物（ＩＸ’−Ｌ），  化合物（ＩＸ’−Ｎ），  化合物（ＩＸ’−Ｏ）および化合物（ＩＸ’−Ｐ）は市販品として、または「実験化学講座第４版  有機合成、ｐ．  ２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ７th  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせること、もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２９１】
製造方法１６
式１〜式８の核酸複合体の製造方法として、以下の方法も用いることができる。
【０２９２】
【化１１５】
2019024444.tif 000120
【０２９３】
（式中、ＬＣ、Ｑ５、Ｑ６、Ｑ７、Ｐ７、Ｐ８、ｑ５'、ｑ６およびＸは前記と同義である。）
【０２９４】
工程７５
化合物（Ｘ−Ｂ）は化合物（ＸＩＩＩ’’）と化合物（Ｘ−Ａ）を溶媒中、０℃〜１０
０℃で１０秒間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては水、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
化合物（ＶＩＩＩ’）は製造法１４を用いることで、得ることができる。
【０２９５】
化合物（Ｘ−Ａ）は公知の方法（例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），  第２１巻，  １８７−２０２頁，  ２０１０年、またはカレント・プロトコールズ・イン・ヌクレイック・アシッド・ケミストリー  （Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），  ２０１０年，  ９月；  ＣＨＡＰＴＥＲ：  Ｕｎｉｔ  ４．４１）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２９６】
工程７６
化合物（Ｘ’）は化合物（Ｘ−Ｂ）を用いて炭酸ナトリウム水溶液またはアンモニア水
中等ｐＨ８以上の条件下、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
【０２９７】
製造方法１７
式１〜式８の核酸複合体の製造方法として、以下の方法も用いることができる。
【０２９８】
【化１１６】
2019024444.tif 000121
【０２９９】
（式中、ＬＣ、Ｑ５、Ｑ６、Ｑ７、Ｐ７、Ｐ８、ｑ５'、ｑ６およびＸは前記と同義である。）
【０３００】
工程７７
化合物（ＸＩ−Ａ）は化合物（ＸＩＩＩＩ‘’）を用いて、公知の方法（例えばバイオ
コンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），  第２６巻，  １４５１−１４５５頁，  ２０１５年に記載の方法）またはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物（ＶＩＩＩ’’’）は製造法１４を用いることで、得ることができる。
【０３０１】
工程７８
化合物（ＸＩ’）は化合物（ＸＩ−Ａ）と化合物（ＸＩ−Ｂ）を用いて、公知の方法（
例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），  第２６巻，  １４５１−１４５５頁，  ２０１５年に記載の方法）またははそれに準じた方法で得ることができる。
化合物（ＸＩ−Ｂ）はバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），  第２６巻，  １４５１−１４５５頁，  ２０１５年に記載の方法）またははそれに準じた方法で得ることができる。
【０３０２】
工程７９
また別の方法として、化合物（ＸＩ’）は、公知の方法（例えばバイオコンジュゲート
ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），  第２２巻，１７２３−１７２８頁，  ２０１１年を参照）あるいははそれに準じた方法で、化合物（ＸＩ−Ａ）から直接得ることができる。
【０３０３】
本明細書における核酸複合体は、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の塩として得ることも可能である。
【０３０４】
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、アミノ酸付加塩としては、例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニン等の付加塩が挙げられる。
【０３０５】
本明細書の核酸複合体の塩を調製したい場合には、該複合体が所望の塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、該複合体を適当な溶媒に溶解または懸濁し、対応する酸または塩基を加え、単離・精製すればよい。また、該複合体塩を形成する対イオンを異なる対イオンに変換する際には、該複合体塩を適当な溶媒に溶解または懸濁した後、酸、塩基および／または塩（塩化ナトリウム、塩化アンモニウム等の無機塩等）を数当量〜大過剰量加えて単離、精製すればよい。
【０３０６】
本明細書の核酸複合体の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、全ての可能な異性体およびそれらの混合物も本発明に包含される。
【０３０７】
また、本明細書の核酸複合体は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもああり、これらの付加物も本発明に包含される。
【０３０８】
さらに、本発明の核酸複合体は、分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）（例えば、重水素原子等）で置換されたものも包含される。
【０３０９】
本発明の医薬組成物は、式１で表される核酸複合体を含む。本発明の核酸複合体は、Ｌ１およびＬ２の糖リガンドを有することにより、標的細胞に認識され、細胞内に導入される。
本発明の核酸複合体は、哺乳動物に投与して、生体内において、標的遺伝子の発現を低下または停止させることで抑制し、標的遺伝子に関連する疾患の治療に用いることができる。
本発明の核酸複合体を治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、特に限定されるものではないが、例えば、静脈内投与、皮下投与および筋肉内投与等が挙げられ、好ましくは静脈内投与である。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドに換算した1日投与量が0.1μg〜1000 mgとなるように投与すればよく、1日投与量が1〜100 mgとなるように投与することがより好ましい
【０３１０】
静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば注射剤があげられ、調製した液剤をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該液剤から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該液剤を凍結乾燥して使用する、および/または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトースもしくはグリシン等の賦形剤を加えた液剤を凍結乾燥して使用することもできる。
注射剤の場合、液剤または溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤、またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
【０３１１】
本発明の組成物を、哺乳動物の細胞に投与することで、本発明の組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導入することができる。
【０３１２】
インビボにおける本発明の核酸複合体の哺乳動物の細胞への導入方法は、インビボにおいて行うことのできる公知のトランスフェクションの手順に従って行えばよい。本発明の組成物を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、肝臓へ送達され、肝臓または肝細胞内に本発明の組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することができる。
【０３１３】
肝臓または肝細胞内に本発明の組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドが導入されると、その肝細胞内のβ2GPI遺伝子の発現を低下させ、β2GPI関連疾患を治療あるいは予防することができる。β2GPI関連疾患としては、自己免疫疾患または血栓症が挙げられ、具体的には、全身性エリテマトーデス(SLE)、抗リン脂質抗体症候群、末期腎不全患者における血液透析合併症および動脈硬化が挙げられる。投与対象は、哺乳動物であり、ヒトであることが好ましい。
【０３１４】
また、本発明の核酸複合体は、前記疾患の治療剤または予防剤に関するインビボの薬効評価モデルにおいて、β2GPI遺伝子を抑制することの有効性を検証するためのツールとして使用することもできる。インビボの薬効評価モデルとしては、ループスアンチコアグラント(LA)試験等が挙げられる。ここで、LAは、抗β2GPI抗体と同じく抗リン脂質抗体の一種であり、採血した血液のリン脂質依存性凝固反応をインビトロで阻害する活性を示す。LAは主にSLEやAPSといった疾患で出現し、抗β2GPI抗体と同様に血栓症や不育症の発症あるいは病態と相関することが数多く報告されている（“ブラッド(blood)”、2003年、第101巻、第5号、p1827-1832）。そして、抗β2GPI抗体は、β2GPIを介してリン脂質結合活性を獲得することから、β2GPI依存的なLA活性を発揮することも報告されている（“トロンボシスアンドヘモスタシス(Thrombosis and Haemostasis)”、1998、第79巻、第1号、p79-86）。さらに、このβ2GPI依存性LAは病態の発症率と強く相関することが報告されており(“ブラッド(blood)”、2004年、第104巻、第12号、p3598-3602）、血中β2GPIの発現抑制によってLA活性を解除できれば、β2GPI関連疾患に対する新規かつ有効な治療法を提供可能であると考えられる。臨床検査においてLAは、活性化部分トロンボプラスチン時間、カオリン凝固時間および／または希釈ラッセル蛇毒時間(dRVVT)を測定することで検出することができる。
【０３１５】
本発明の核酸複合体を、β2GPI関連疾患の治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、好ましくは静脈内投与、皮下投与または筋肉内投与をあげることができ、より好ましくは皮下投与が挙げられる。
【０３１６】
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドに換算した1日投与量が0.1μg〜1000 mgとなるように投与すればよく、1日投与量が1〜100 mgとなるように投与することが好ましい。
【実施例】
【０３１７】
次に、参考例、実施例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および試験例に限定されるものではない。なお、実施例および参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHzまたは400MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。また、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとはbroadを意味し、見かけ上幅広いシグナルであることを表す。
UPLC分析は以下の条件を用いた。
移動相A：  0.1%ギ酸含有水溶液、B：  アセトニトリル溶液
グラジエント：  移動相Bが10%-90%のリニアグラジエント（3分間）
カラム：  Waters社製ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 μm、内経 2.1 x 50 mm)
流速：  0.8 mL/min
PDA検出波長：  254 nm (検出範囲190-800 nm)
【０３１８】
表X-1〜表X-4に参考例化合物を示す。
【０３１９】
【表５】
2019024444.tif 000122
【０３２０】
【表６】
2019024444.tif 000123
【０３２１】
【表７】
2019024444.tif 000124
【０３２２】
【表８】
2019024444.tif 000125
（表中Resinは固相合成用レジンを表す。以下、本明細書において同様である。）
【０３２３】
【表９】
2019024444.tif 000126
【０３２４】
【表１０】
2019024444.tif 000127
【０３２５】
【表１１】
2019024444.tif 000128
【０３２６】
【表１２】
2019024444.tif 000129
【０３２７】
【表１３】
2019024444.tif 000130
【０３２８】
【表１４】
2019024444.tif 000131
【０３２９】
参考例１
【０３３０】
【化１１７】
2019024444.tif 000132
【０３３１】
化合物2の合成
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物1 (0.8755 g, 1.9567 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)に溶解し、1, 3−ジシクロヘキサンカルボジイミド（DCC, 0.4247 g, 2.0584 mmol)とN-ヒドロキシスクシミド (0.2412 g, 2.0958 mmol)を室温にて一晩撹拌した。反応混合物から析出した固体を除き、減圧下、溶媒を留去した。得られた混合物をN, N'-ジメチルホルムアミド (DMF)に溶解し、2-アミノエチルマレイミド臭酸塩 (0.6479 g, 2.5491 mmol)とジイソプロピルエチルアミン (1.7 mL, 9.7835 mmol)を加えた後、室温で一晩撹拌した。減圧下、反応液の溶媒を留去し、逆相カラムクロマトグラフィー (水/メタノール=80/20)で溶出させることにより、化合物2 (0.8502 g, 収率76%)を得た。
ESI-MS m/z: 570 (M + H)+;
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.45-1.56 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 1.97 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.00 (3H, s), 2.11 (3H, s), 3.18-3.19 (2H, m), 3.38-3.45 (3H, m), 3.64-3.71 (1H, m), 3.85-3.89 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.48 (1H, d, J = 8.6 Hz), 4.95-4.98 (1H, m), 5.21 (1H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.81-7.87 (2H, m).
【０３３２】
化合物4の合成
工程１
化合物1 (0.9602 g, 2.1460 mmol)をN,N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、N-Boc-エチレンジアミン （シグマアルドリッチ社製, 0.6877 g, 4.292 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン (1.90 mL, 10.87 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (和光純薬工業社製, 1.6437 g, 4.3229 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物3の粗精製物を得た。
ESI-MS m/z: 590 (M + H)+
【０３３３】
工程２
化合物4の合成工程1で合成した化合物3 (1.2654 g, 2.1460 mmol)をジクロロメタン (15 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸 (4 mL)を加えて、室温にて一晩攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、逆相カラムクロマトグラフィー (水/メタノール=80/20)で溶出させることにより、化合物4 (0.3879 g, 収率37 %)を得た。
ESI-MS m/z: 490 (M + H)+;
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.46-1.52 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 2.00 (3H, s), 2.08 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.11 (3H, s), 2.85 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.27 (2H, dd, J = 12.3, 6.2 Hz), 3.67-3.69 (1H, m), 3.68-3.73 (1H, m), 3.86-3.90 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.49 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.97 (1H, dd, J = 11.3, 3.4 Hz), 5.22 (1H, d, J = 3.5 Hz), 7.86 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.95-8.02 (1H, m).
【０３３４】
参考例２
【０３３５】
【化１１８】
2019024444.tif 000133
【０３３６】
参考例2工程１
(9H-フルオレン-9-イル)メチル((2R,3R)-1,3-ジヒドロキシブタン-2-イル)カルバマート (化合物1, Chem-Impex International, Inc社製, 1.50 g, 4.58 mmol)をピリジン (20 mL)に溶解し、氷冷下、4,4'-ジメトキシトリチルクロライド (東京化成工業社製, 1.71 g, 5.04 mmol)を加えた後、室温にて2時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=90/10)で精製することにより、化合物2 (1.07 g, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 630 (M + H)+
【０３３７】
参考例2工程2
参考例2の工程1で合成した化合物2 (1.07 g, 1.699 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてピペリジン (0.336 mL, 3.40 mmol)を加えて3時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物3 (0.59 g, 収率85 %)を得た。
ESI-MS m/z: 408 (M + H)+
【０３３８】
参考例3
【０３３９】
【化１１９】
2019024444.tif 000134
【０３４０】
参考例3工程1
5-ヒドロキシイソフタル酸ジメチル (化合物1, 和光純薬工業社製, 5.0443 g, 24 mmol)をテトラヒドロフラン (和光純薬工業社製25 mL)に溶解し、2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-エタノール (東京化成工業社製, 4.0343 g, 25.03 mmol）、およびトリフェニルホスフィン ポリマー担持体 （シグマアルドリッチ社製, 6.61 g, 25.2 mmol）を加えた後、氷冷下、40％ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(DIAD)トルエン溶液 (東京化成工業社製, 13.26 mL, 25.2 mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、ろ液を留去した後、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5〜80/20)で精製することにより、化合物2 (5.3071 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 254 (M + H)+, 脱Boc体として検出
【０３４１】
参考例3工程2
参考例3工程1で合成した化合物2 (5.3071 g, 15.02 mmol)をメタノール (25 mL)に溶解し、氷冷下、2mol/L水酸化ナトリウム水溶液 (和光純薬工業社製, 13 mL)を加え、室温にて4時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 324 (M - H)-
【０３４２】
参考例3工程3
参考例3工程2で合成した化合物3 (1.9296 g, 5.93 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (70 mL)に溶解し、N-1-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル)-エチレンジアミン塩酸塩 (3.3493 g, 11.86 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (5.18 mL, 29.7 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (4.5168 g,  11.88 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物4 (3.4407 g, 収率68%)を得た。
ESI-MS m/z: 898 (M + HCOO)-
【０３４３】
参考例3工程4
参考例3工程3で合成した化合物4 (1.6087 g, 1.884 mmol)をジクロロメタン (20 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (5mL, 64.9 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物5 (2.4079 g)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 798(M + HCOO)-
【０３４４】
参考例3工程5
参考例3工程4で合成した化合物5 (386 mg, 0.512 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)に溶解し、氷冷下、塩化ベンゾイル (175 mg, 1.024 mmol)を加えて、室温にて1時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物6 (373 mg, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 888(M + H)+
【０３４５】
参考例3工程6
参考例3工程5で合成した化合物6 (108 mg, 0.122 mmol)をジクロロメタン (5 mL)に溶解し、室温にてジエチルアミン (0.5 mL,4.8 mmol)を加えて1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物7 (54.9 mg)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 444(M + H)+
【０３４６】
参考例3工程7
参考例3工程6で合成した化合物7 (180 mg, 0.406 mmol)、Nα,Nε-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-リジン (ノババイオケム社製, 295 mg, 0.852 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.354 mL,2.029 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (324 mg, 0.852 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物8 (450 mg)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1101(M + H)+
【０３４７】
参考例3工程8
参考例3工程7で合成した化合物8 (2.1558 g, 1.9593 mmol)をジクロロメタン (20 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (5 mL)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物9を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 700(M + H)+
【０３４８】
参考例４
【０３４９】
【化１２０】
2019024444.tif 000135
（図中、Bnはベンジル基を表す。）
【０３５０】
参考例4工程1
参考例3に記載の方法で合成した化合物1(0.5716 g, 0.7582 mmol)、バイオコンジュゲート・ケミストリー (Bioconjugate Chemistry), 第22巻, 690-699頁, 2011年に記載された方法で合成したドデカン酸モノベンジルエステル (0.4859 g, 1.5164 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.662 mL, 3.79 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (0.5766 g, 1.516 mmol)をN,Nジメチルホルムアミド(12 mL)に溶解し、室温にて1時間攪拌した。反応液を氷冷し、飽和クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物2 (0.88 g, 収率84%)を得た。
ESI-MS m/z: 1057(M + H)+
【０３５１】
参考例4工程2
参考例4工程1で合成した化合物2 (0.7545 g, 0.714 mmol)をジクロロメタンテトラヒドロフラン (20 mL)に溶解し、室温にてジエチルアミン (5 mL,47.9 mmol)を加えて終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 612(M + H)+
【０３５２】
参考例4工程3
参考例4工程2で合成した化合物3 (0.437 g, 0.7143 mmol)、Nα,Nε-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-リジン (ノババイオケム社製, 0.5483 g, 1.583 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.624 mL, 3.57 mmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (0.5703 g, 1.5 mmol)を加えて、室温にて2時間攪拌した。反応液に10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物4の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1269(M + H)+
【０３５３】
参考例4工程4
参考例4工程3で合成した化合物4 (0.906 g, 0.7143 mmol)をジクロロメタン (12 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (3mL, 38.9 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物5の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 869(M + H)+
【０３５４】
参考例５
【０３５５】
【化１２１】
2019024444.tif 000136
【０３５６】
参考例5工程1
参考例3に記載の方法で合成した化合物1 (100 mg, 0.091 mmol)をメタノール (3 mL)に溶解し、酢酸 (2 μL)を添加した後、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液留分を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物2を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 967 (M + H)+
【０３５７】
参考例5工程2
参考例5工程1で合成した化合物2 (50 mg, 0.052 mmol)およびN-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシミド (48 mg, 0.155 mmol)をテトラヒドロフラン (2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン (0.045 mL, 0.259  mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物3 (18 mg, 収率30%)を得た。
ESI-MS m/z: 1160 (M + H)+
【０３５８】
参考例5工程3
参考例5工程2で合成した化合物3 (18 mg, 0.016 mmol)をジクロロメタン (2 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (0.2 mL, 2.6 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、ジエチルエーテルにて晶析した後、化合物4 (7.5 mg, 収率64%)を白色固体として得た。
ESI-MS m/z: 759 (M + H)+
【０３５９】
参考例6
【０３６０】
【化１２２】
2019024444.tif 000137
【０３６１】
参考例6工程1
参考例3に記載の方法で合成した化合物1 (0.9372 g, 2.8809 mmol)、β-アラニンメチルエステル塩酸塩 (東京化成工業株式会社製, 0.8082 g, 5.7902 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物2を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 495 (M + H)+
【０３６２】
参考例6工程2
参考例6工程1で合成した化合物2 (0.9622 g, 1.952 mmol)を用い、参考例3の工程4と同様の方法で化合物3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 396 (M + H)+
【０３６３】
参考例6工程3
参考例6工程2で合成した化合物3 (0.1146 g, 0.290 mmol)およびN-スクシンイミジル15-アジド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸(N3-PEG4-NHS， 東京化成工業株式会社製, 0.0750 g, 0.1931 mmol)を用い、参考例5の工程2と同様の方法で化合物4を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 669 (M + H)+
【０３６４】
参考例6工程4
参考例6工程3で合成した化合物4 (0.1291 g, 0.193 mmol)を用い、参考例3の工程2と同様の方法で化合物5を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 641 (M + H)+
【０３６５】
参考例6工程5
参考例6工程4で合成した化合物5 (0.1252 g, 0.193 mmol)およびL-グルタミン酸 ジ-tert-ブチルエステル  (渡辺化学株式会社製, 0.1180 g, 0.399 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物6 (0.0521 g, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 1124 (M + H)+
【０３６６】
参考例6工程6
参考例6工程5で合成した化合物6 (0.0521 g, 0.0464 mmol)を用い 、参考例3の工程4と同様の方法で化合物7 (36 mg, 収率86%)を得た。
ESI-MS m/z: 899 (M + H)+
【０３６７】
参考例７
【０３６８】
【化１２３】
2019024444.tif 000138
【０３６９】
参考例7工程1
参考例3に記載の方法で合成した化合物1 (0.2586 g, 0.3695 mmol)とジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁, 2014年に記載された方法で合成した参考例1に記載の化合物1 (0.8559 g, 1.7927 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物2 (0.5272 g, 収率61%)を得た。
ESI-MS m/z: 2418 (M + H)+
【０３７０】
参考例7工程2
参考例7工程1で合成した化合物2 (0.2653 g, 0.1097 mmol)を用い、参考例5の工程1と同様の方法で化合物3 (0.1524 g, 収率61%)を得た。
ESI-MS m/z: 2284 (M + H)+
【０３７１】
参考例8:化合物A1およびB1の合成
【０３７２】
【化１２４】
2019024444.tif 000139
【０３７３】
化合物A1の合成
参考例7に記載の方法で合成した化合物1 (0.0152 g, 0.006657 mmol)を用い、参考例5の工程2と同様の方法で化合物A1 (0.0077 g, 収率47%)を得た。
ESI-MS m/z: 1239(M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (34H, m), 1.77 (12H, d, J = 1.5 Hz), 1.89 (12H, s), 2.01-2.14 (10H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (14H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (14H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).
【０３７４】
化合物B1の合成
化合物1 (0.0150 g, 0.00657 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物B1 (0.0062 g, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 1279(M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (30H, m), 1.77 (12H, s), 1.89 (12H, s), 2.01-2.14 (8H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.33-2.38 (2H, m), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (14H, m), 3.58-3.63 (16H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (12H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).
【０３７５】
参考例9:化合物B2およびB3の合成
【０３７６】
【化１２５】
2019024444.tif 000140
【０３７７】
化合物B2の合成
参考例6に記載の方法で合成した化合物1 (0.00436 g, 0.00681 mmol)および参考例1の化合物4 (0.010 g, 0.020 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物B2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1584(M + H)+
【０３７８】
化合物B3の合成
参考例6に記載の方法で合成した化合物2 (0.0100 g, 0.01112 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物B3 (0.0223 g, 収率72%)を得た。
ESI-MS m/z: 1393(M + 2H)2+
【０３７９】
参考例10：化合物C1およびD1の合成
【０３８０】
【化１２６】
2019024444.tif 000141
【０３８１】
参考例10工程1
参考例4に記載の方法で合成した化合物1 (0.1952 g, 0.225 mmol)とジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁、2014年に記載された方法で合成した参考例1の化合物1 (0.4162 g, 0.93 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物2 (334.8 mg, 収率58%)を得た。
ESI-MS m/z: 1294 (M + 2H)2+
【０３８２】
参考例10工程2
参考例10工程1で合成した化合物2 (0.1459 g, 0.056 mmol)を用い、参考例5の工程1と同様の方法で化合物D1 (112 mg, 収率80%)を得た。
ESI-MS m/z: 1249 (M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (44H, m), 1.77 (12H, d, J = 1.5 Hz), 1.89 (12H, s), 2.01-2.20 (12H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (10H, m), 3.58-3.64 (4H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (12H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).
【０３８３】
参考例10工程3
参考例10工程2で合成した化合物D1 (0.1091 g, 0.044 mmol)および参考例2の化合物3 (0.0748 g, 0.184 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物3を粗生成物として得た。
ESI-MS m/z: 1292 (M + 2H)2+, 脱DMTr体として検出
【０３８４】
参考例10工程4
参考例10工程3で合成した化合物3 (0.161 g, 0.05586 mmol)をジクロロメタン (5 mL)に溶解し、コハク酸無水物 (東京化成工業社製, 0.1182 g, 1.181 mmol）、N,N-ジメチルアミノピリジン (0.0224 g,0.183 mmol)、およびトリエチルアミン(0.55 mL, 3.95 mmol)を加えて、室温にて一晩攪拌した。反応液を氷冷し、水を加え、酢酸エチルで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物4の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1342(M + 2H)2+, 脱DMTr体として検出
【０３８５】
参考例10工程5
参考例10工程4で合成した化合物4 (0.0816 g, 0.02734 mmol)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (0.0221 g, 0.05827 mmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（0.02 mL, 0.1094 mmol）をN,N-ジメチルホルムアミド(4 mL)に溶解し、LCAA-CPG (Chem Gene社製, 0.4882 g)を加え、室温にて終夜攪拌した。混合物を濾別し、ジクロロメタン、10%メタノールジクロロメタン溶液、およびジエチルエーテルで順次洗浄した後、無水酢酸/ピリジン溶液と作用させることにより、化合物C1（49.5 μmol/g, 収率89%）を得た。なお、収率は1%トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン溶液を固相担持体に添加し、DMTr基に由来する吸収から計算できる固相担体への導入率より算出した。
【０３８６】
参考例11
【０３８７】
【化１２７】
2019024444.tif 000142
【０３８８】
化合物1（1.200 g, 3.640 mmol）から、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Journal of Medicinal Chemistry）, 第59巻, 2718-2733頁, 2016年に記載された方法で化合物2（1.050 g, 収率50%）を合成した。
ESI-MS m/z: 582 (M + H)+
【０３８９】
参考例12
【０３９０】
【化１２８】
2019024444.tif 000143
【０３９１】
化合物1（4.000g, 10.27 mmol）をジクロロメタン（60 mL）に溶解し、ベンジル-2-(2-ヒドロキシエトキシ)エチルカーバメイト（2.700 g, 11.30 mmol）、およびトリフルオロメタンスルホン酸（0.1360 mL, 1.541 mmol）を加えて、還流条件下で終夜攪拌した。反応液に10 wt% 炭酸カリウム水溶液を加え、ジクロロメタンと分液した後、有機相を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、2-メチルテトラヒドロフランへと置換濃縮した。残渣をへプタンに滴下し、得られた結晶をろ過することにより、化合物2（5.130 g, 収率88%）を得た。
ESI-MS m/z: 570 (M + H)+
【０３９２】
参考例13
【０３９３】
【化１２９】
2019024444.tif 000144
【０３９４】
参考例1の化合物1（898.0 mg, 2.007 mmol）をジクロロメタン（15 mL）に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（338.0 mg, 2.208 mmol）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（343 mg, 2.208 mmol）、およびN-1-Z-1, 3-ジアミノプロパン塩酸塩（0.4910 mL, 2.208 mmol）を加え、室温で3時間攪拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンで分液した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=90/10）で精製することにより、化合物2（873.0 mg, 収率68%）を得た。
ESI-MS m/z: 639 (M + H)+
【０３９５】
参考例14
【０３９６】
【化１３０】
2019024444.tif 000145
【０３９７】
参考例14工程1
参考例1の化合物1 (3.00 g, 6.70 mmol)をジクロロメタン (60 mL)に溶解し、室温にてL-リジンベンジルエステル二p-トルエンスルホン酸塩 (1.75 g, 3.02 mmol)、トリエチルアミン(0.935 mL, 6.70 mmol), 1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (1.29 g, 6.70 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (103 mg, 0.670 mmol)を加えて2.5時間撹拌した。反応液を水と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物2を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1096 (M + H)+
【０３９８】
参考例14工程2
参考例14工程1で合成した化合物2 (2.30 g, 2.10 mmol)をテトラヒドロフラン (46 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 424 mg)を加え、水素雰囲気下で終夜撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1006 (M + H)+
【０３９９】
参考例15
【０４００】
【化１３１】
2019024444.tif 000146
【０４０１】
参考例15工程1
イミノ二酢酸 (東京化成工業社製, 1.5 g, 6.43 mmol,)を塩化メチレン(30 mL)に溶解し、ペンタフルオロトリフルオロ酢酸(東京化成工業社製, 2.75 mL, 16.08 mmol)、トリエチルアミン(4.48 mL, 32.2 mmol)を加えて4時間撹拌した。反応液に10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。そこに、参考例11に記載の方法で合成した化合物1 (2 g, 3.45 mmol)を酢酸エチル(10 mL)とアセトニトリル(10 mL)との混合液に溶解し、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液部分を減圧下、溶媒を留去する事により、化合物2の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1091(M+H)+
【０４０２】
参考例15工程2
参考例15工程1で合成した化合物2 (1.5 g,1.37 mmol)を用い、参考例1化合物4の合成の工程2と同様の方法で化合物3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 990(M+H)+
【０４０３】
参考例16
【０４０４】
【化１３２】
2019024444.tif 000147
【０４０５】
参考例16工程1
N-(t-ブトキシカルボニル)-L-グルタミン酸 (東京化成工業社製)を用いて、参考例11に記載の方法で合成した化合物1 (1.855 g, 3.19 mmol)を用い、参考例15の工程1と同様の方法で化合物2の粗精製物を得た。
ESI-MS m/z: 1105(M+H)+
【０４０６】
参考例16工程2
参考例16工程1で合成した化合物2(1.421 g, 1.2866 mmol)を用い、参考例1化合物4の合成の工程2と同様の方法で化合物3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1004(M+H)+
【０４０７】
参考例17
【０４０８】
【化１３３】
2019024444.tif 000148
【０４０９】
ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Journal of Organic Chemistry）, 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した化合物1 (90 mg, 0.173 mmol) をテトラヒドロフラン (1 mL) に溶解し、トリフェニルホスフィン、ポリマー担持 (シグマアルドリッチ社製, 63 mg, 0.189 mmol) を加えて、加熱環流下3時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物2 (70 mg, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 516 (M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ0.89 (3H, s), 1.42-1.48 (2H, m), 1.52-1.61 (2H, m), 1.85 (1H, br s), 2.68 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.06-3.07 (2H, m), 3.39-3.44 (3H, m), 3.51-3.55 (3H, m), 3.78 (6H, s), 6.80-6.85 (4H, m), 7.17-7.23 (1H, m), 7.27-7.33 (6H, m), 7.41-7.43 (2H, m).
【０４１０】
参考例18
【０４１１】
【化１３４】
2019024444.tif 000149
【０４１２】
参考例18工程1
化合物1 (東京化成工業社製, 0.500 g, 3.73 mmoL)を用いて参考例2の工程1と同様の方法で化合物2の粗生成物 (1.5 g) を得た。
ESI-MS m/z: 435 (M-H)-
【０４１３】
参考例18工程2
参考例18工程1で合成した化合物2の粗生成物 (1.5 g) と1,4-Diaminobutane (東京化成工業社製, 3.29 g, 37.3 mmol)を用いて参考例3の工程3と同様の方法で化合物3 (0.18 g, 2 段階収率10%)を得た。
ESI-MS m/z: 551 (M+HCOO)-
1H-NMR (400 MHz, MeOD)：δ1.09 (3H, s), 1.45-1.52 (4H, m), 2.80 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.91 (2H, s), 3.05 (1H, d, J = 8.8 Hz), 3.12-3.16 (4H, m), 3.24 (1H, s), 3.43 (1H, d, J = 10.8 Hz), 3.62-3.66 (7H, m), 6.71-6.76 (4H, m), 7.05-7.11 (1H, m), 7.12-7.20 (6H, m), 7.28-7.32 (2H, m).
【０４１４】
参考例19
【０４１５】
【化１３５】
2019024444.tif 000150
【０４１６】
ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Journal of Organic Chemistry）, 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した化合物1 (110 mg, 0.212 mmol) をテトラヒドロフラン (2 mL) に溶解し、N-(1R,8S,9s)-Bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyloxycarbonyl-1,8-diamino-3,6-dioxaoctane (東京化成工業社製, 72 mg, 0.222 mmol) を加えて、室温にて1時間撹拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物2 (160 mg, 収率90 %)を得た。ESI-MS m/z: 845 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ0.88 (3H, s), 0.91-1.09 (3H, m), 1.20-1.25 (1H, m), 1.52-1.59 (4H, m), 1.80-1.85 (2H, m), 2.19-2.25 (4H, m), 2.59-2.68 (1H, m), 2.84-2.90 (4H, m), 3.02-3.11 (3H, m), 3.35-3.44 (5H, m), 3.49-3.53 (5H, m), 3.54-3.58 (2H, m), 3.62 (5H, s), 3.78 (6H, s), 4.13 (2H, d, J = 6.4 Hz), 4.21 (2H, t, J = 7.2 Hz), 6.79-6.84 (4H, m), 7.18-7.21 (1H, m), 7.24-7.27 (2H, m), 7.28-7.32 (4H, m), 7.39-7.44 (2H, m).
【０４１７】
参考例20
【０４１８】
【化１３６】
2019024444.tif 000151
【０４１９】
参考例20工程1
化合物1 (AstaTech社製, 100 mg, 1.148 mmol)およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH (渡辺化学工業社製, 532 mg, 1.205 mmol)を用いて参考例3の工程3と同様の方法で化合物2 (410 mg, 収率70%)を得た。
ESI-MS m/z: 511 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 0.06 (6H, s), 0.90 (9H, s), 2.76-2.85 (1H, m), 3.65-3.86 (5H, m), 4.02-4.23 (3H, m), 4.32-4.40 (4H, m), 5.55 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.31 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.40 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.59 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.76 (2H, d, J = 7.6 Hz).
【０４２０】
参考例20工程2
参考例20工程1で合成した化合物2 (410 mg, 0.803 mmol)を用いて参考例2の工程1と同様の方法で化合物3の粗生成物(680 mg)を得た。
ESI-MS m/z: 814 (M+H)+
【０４２１】
参考例20工程3
参考例20工程2で合成した化合物3の粗生成物 (680 mg)を用いて参考例2の工程5と同様の方法で化合物4 (330 mg, 2段階収率70％)を得た。
ESI-MS m/z: 519 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ0.02-0.09 (6H, m), 0.89 (9H, d, J = 28.8 Hz), 2.84-2.94 (1H, m), 3.24-3.30 (2H, m), 3.46 (1H, t, J = 7.2 Hz), 3.52-3.68 (2H, m), 3.75-3.80 (1H, m), 3.82 (6H, d, J = 2.4 Hz), 3.89-3.96 (1H, m), 4.05-4.17 (1H, m), 4.27-4.37 (1H, m), 6.82-6.89 (4H, m), 7.22-7.27 (1H, m), 7.29-7.34 (6H, m), 7.41-7.45 (2H, m)
【０４２２】
参考例21
【０４２３】
【化１３７】
2019024444.tif 000152
【０４２４】
参考例21工程1
N-(Tert-ブトキシカルボニル)-1,3-ジアミノプロパン（東京化成工業社製，1.788 g, 10.26 mmol）をジクロロメタン（22.8 mL）に溶解し、トリエチルアミン（1.907 mL, 13.68 mmol)を加え、室温で15分撹拌した。反応液に、オーガニックレター（Organic Letter）, 第16巻, 6318-6321頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物1（1.126 g, 6.84 mmol）のジクロロメタン溶液（5 mL)を滴下し、室温で2時間撹拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル＝35/65）で精製することにより、化合物2（1.65 ｇ，収率80％）を得た。
ESI-MS m/z: 303 (M+H)+
【０４２５】
参考例21工程2
参考例21工程1で合成した化合物2 (1.65 g, 5.46 mmol)を用いて参考例1化合物4の合成の工程2と同様の方法で化合物3 (1.10 g, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 203 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.74 (2H, dt, J = 12.0, 6.0 Hz), 2.95 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.18 (1H, s), 3.60 (2H, td, J = 6.0, 5.2 Hz), 7.54 (2H, dt, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.76 (2H, dt, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.97 (1H, br s).
【０４２６】
参考例22
【０４２７】
【化１３８】
2019024444.tif 000153
【０４２８】
参考例22工程1
化合物1 (東京化成社製, 1.2 g, 4.24mmol)を用いて参考例2の工程1と同様の方法で化合物2の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 608(M+Na)+
【０４２９】
参考例22工程2
参考例22工程1で合成した化合物2の粗生成物を用いて参考例2の工程5もしくは実施例1の工程11に記載された方法で化合物3 (1.34 g, 2段階収率52%) を得た。
ESI-MS m/z: 386(M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ3.34 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.47 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 6.78-6.84 (4H, m), 7.17-7.21 (1H, m), 7.27-7.35 (6H, m), 7.42-7.46 (2H, m).
【０４３０】
参考例22工程3
参考例22工程2で合成した化合物3 (1.15 g,3.16  mmol)およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH(渡辺化学工業社製, 1.677 g, 3.8  mmol)を用いて参考例3の工程3と同様の方法で化合物4 (560 mg, 収率31%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.00-0.07 (6H, m), 0.83-0.89 (9H, m), 3.18-3.26 (2H, m), 3.39-3.46 (2H, m), 3.61-3.68 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.89 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz), 4.03 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz), 4.15-4.20 (1H, m), 4.22-4.28 (1H, m), 4.32-4.40 (2H, m), 5.65-5.88 (1H, m), 6.76-6.85 (4H, m), 7.16-7.23 (1H, m), 7.25-7.34 (8H, m), 7.36-7.44 (4H, m), 7.50-7.64 (2H, m), 7.72-7.79 (2H, m).
【０４３１】
参考例23
第Y-1表に記載された化合物１〜５およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OHを用いて、参考例22と同様の方法により、第Y-2表に記載された化合物６〜１０を得た。
参考例22の化合物３とFmoc-Thr(tBuMe2Si)-OHを用いて、参考例22と同様の方法により第Y-2表に記載した化合物１１を得た。
第Y-1表に記載された化合物１とFmoc-Thr(tBuMe2Si)-OHを用いて、参考例22と同様の方法により第Y-2表に記載した化合物１２を得た。
本実施例により合成した化合物のNMR分析データを第Y-3表に示す。
【０４３２】
【表１５】
2019024444.tif 000154
【０４３３】
【表１６】
2019024444.tif 000155
【０４３４】
【表１７】
2019024444.tif 000156
【０４３５】
参考例24
【０４３６】
【化１３９】
2019024444.tif 000157
【０４３７】
参考例22に記載の方法で合成した化合物1 (2.487 g, 3.16  mmol)を用いて参考例2工程2と同様の方法で化合物2を得た (1.2 g, 収率67%)。
ESI-MS m/z: 587(M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ-0.01-0.07 (6H, m), 0.86-0.90 (9H, m), 3.15-3.21 (2H, m), 3.41-3.48 (3H, m), 3.72 (1H, dd, J = 10.0, 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 3.84 (1H, dd, J = 10.0, 4.8 Hz), 6.79-6.84 (4H, m), 7.18-7.23 (1H, m), 7.27-7.33 (6H, m), 7.40-7.44 (2H, m), 7.72-7.75 (1H, br m).
【０４３８】
参考例25
第Y-2表に記載した化合物６〜１２を用いて参考例24と同様の方法により第Z-1表に記載した化合物１〜７を得た。
本実施例により合成した化合物の質量分析結果を第Z-2表に示す。
【０４３９】
【表１８】
2019024444.tif 000158
【０４４０】
【表１９】
2019024444.tif 000159
【０４４１】
参考例26
【０４４２】
【化１４０】
2019024444.tif 000160
【０４４３】
参考例26工程1
化合物1 (2.00 g, 9.47 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (40 mL)に溶解し、室温にてイミノ二酢酸ジ-tert-ブチルエステル (5.11 g, 20.84 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (4.00 g, 20.84 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (145 mg, 0.947 mmol)を加えて2時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製した。さらにメタノールでスラリー精製することにより、化合物2 (4.07 g, 収率65 %)を得た。
ESI-MS m/z: 664 (M - H)-
【０４４４】
参考例26工程2
参考例26工程1で合成した化合物2 (2.66 g, 4.00 mmol)をテトラヒドロフラン (53 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 490 mg)を加え、水素雰囲気下で3時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物3 (2.86 g, 定量的)を得た。
ESI-MS m/z: 634 (M - H)-
【０４４５】
参考例26工程3
参考例26工程2で合成した化合物3（871.0 mg, 1.370 mmol）をN, N'-ジメチルホルムアミド（17 mL）に溶解し、O-(7-アザベンゾトリアゾール-１-イン)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（625.0 mg, 1.644 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（0.5730 mL, 3.290 mmol）、およびドデカン二酸モノベンジルエステル（527.0 mg, 1.644 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=60/40）で精製することにより、化合物4（1.030 g, 収率80%）を得た。
ESI-MS m/z: 939 (M + H)+
【０４４６】
参考例26工程4
参考例26工程3で合成した化合物4（1.030 g, 1.098 mmol）をジクロロメタン（10 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（10.00 mL, 130.0 mmol）を加え、室温で1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物5の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 713 (M - H)-
【０４４７】
参考例27
【０４４８】
【化１４１】
2019024444.tif 000161
【０４４９】
参考例27工程1
化合物1（2.000 g, 12.98 mmol）をN, N'-ジメチルホルムアミド（30 mL）に溶解し、炭酸水素カリウム（1.559 g, 15.57 mmol）および塩化ベンジル（2.328 mL, 19.47 mmol）を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウムを加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=50/50）で精製することにより、化合物2（2.850 g, 収率90%）を得た。
ESI-MS m/z: 243 (M - H)-
【０４５０】
参考例27工程2
参考例27工程1で合成した化合物2（2.500 g, 10.24 mmol）をN, N'-ジメチルホルムアミド（30 mL）に溶解し、炭酸カリウム（5.660 g, 40.90 mmol）およびtert-ブチルブロモ酢酸（3.300 mL, 22.52 mmol）を加え、90℃で4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウムを加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=75/25）で精製することにより、化合物3（4.300 g, 収率89%）を得た。
ESI-MS m/z: 472 (M - H)-
【０４５１】
参考例27工程3
参考例27工程2で合成した化合物3（1.000 g, 2.116 mmol）をジクロロメタン（10 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（10.00 mL, 130.0 mmol）を加え、室温で6時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物4の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 359 (M - H)-
【０４５２】
参考例27工程4
参考例27工程3で合成した化合物4（350.0 mg, 0.9710 mmol）をN, N'-ジメチルホルムアミド（7 mL）に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（327.0 mg, 2.137 mmol）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（410.0 mg, 2.137 mmol）、およびイミノジ酢酸ジ-tert-ブチルエステル（524.0 mg, 2.137 mmol）を加え、室温で5時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=60/40）で精製することにより、化合物5（617.0 mg, 収率78%）を得た。
ESI-MS m/z: 814 (M - H)-
【０４５３】
参考例27工程5
参考例27工程4で合成した化合物5（610.0 mg, 0.7490 mmol）をジクロロメタン（6 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（6 mL, 78.00 mmol）を加え、室温で1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物6の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 590 (M + H)+
【０４５４】
参考例28
【０４５５】
【化１４２】
2019024444.tif 000162
【０４５６】
参考例28工程1
参考例26に記載に方法で合成した化合物1 (474 mg, 0.744 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー (Journal of Medicinal Chemistry), 第54巻, 2433-2446頁, 2011年に記載された方法で合成したtrans-シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸モノベンジルエステル (0.234 mg, 0.893 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.312 mL, 1.79 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (339 mg, 0.893 mmol)を加えて6時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物2 (448 mg, 収率68 %)を得た。
ESI-MS m/z: 879 (M - H)-
【０４５７】
参考例28工程2
参考例28工程1で合成した化合物2 (341 mg, 0.387 mmol)をジクロロメタン (3.4 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (3.4 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸し、ヘプタンでスラリー精製することにより、化合物3 (254 mg, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 656 (M + H)+
【０４５８】
参考例29
【０４５９】
【化１４３】
2019024444.tif 000163
【０４６０】
参考例29工程1
化合物1 (500 mg, 2.75 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてイミノジ酢酸ジ-tert-ブチルエステル (1.48 g, 6.04 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (1.16 g, 6.04 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (42.0 mg, 0.275 mmol)を加えて4時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物2 (329 mg, 収率19 %)を得た。
ESI-MS m/z: 635 (M - H)-
【０４６１】
参考例29工程2
参考例29工程1で合成した化合物2 (323 mg, 0.507 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (6v5 mL)に溶解し、室温にて炭酸カリウム (84.0 mg, 0.609 mmol)、ブロモ酢酸ベンジル (139 mg, 0.609 mmol)を加えて3時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物3 (313 mg, 収率79 %)を得た。
ESI-MS m/z: 783 (M - H)-
【０４６２】
参考例29工程3
参考例29工程2で合成した化合物3 (312 mg, 0.398 mmol)をジクロロメタン (3.1 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (3.1 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸することにより、化合物4 (252 mg, 定量的)を得た。
ESI-MS m/z: 561 (M + H)+
【０４６３】
参考例30
【０４６４】
【化１４４】
2019024444.tif 000164
【０４６５】
参考例30工程1
化合物1 (2.00 g, 9.47 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (40 mL)に溶解し、室温にて2-アミノ-1,3-プロパンジオール (1.90 g, 20.84 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (4.00 g, 20.84 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (145 mg, 0.947 mmol)を加えて2時間撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル/メタノール=70/30)で精製した。さらに酢酸エチルでスラリー精製することにより、化合物2 (2.68 g, 収率79 %)を得た。
ESI-MS m/z: 356 (M - H)-
【０４６６】
参考例30工程2
参考例30工程1で合成した化合物2 (500 mg, 1.40 mmol)をアセトニトリル (10 mL)に懸濁し、室温にてアクリル酸tert-ブチルエステル (3.59 g, 28.0 mmol)、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド (40%水溶液; 1.76 mL, 702 mmol)を加えて終夜撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物3 (300 mg, 収率24 %)を得た。
ESI-MS m/z: 871 (M + H)+
【０４６７】
参考例30工程3
参考例30工程2で合成した化合物3 (340 mg, 0391 mmol)をテトラヒドロフラン (6.8 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 31.3 mg)を加え、水素雰囲気下で6時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=30/70)で精製することにより、化合物4 (235 mg, 収率72 %)を得た。
ESI-MS m/z: 841 (M + H)+
【０４６８】
参考例30工程4
参考例30工程3で合成した化合物4 (232 mg, 0.276 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (4.6 mL)に溶解し、室温にてドデカン酸モノベンジルエステル (0.133 mg, 0.414 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.145 mL, 0.829 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (158 mg, 0.414 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=30/70)で精製することにより、化合物5 (274 mg, 収率87 %)を得た。
ESI-MS m/z: 1141 (M - H)-
【０４６９】
参考例30工程5
参考例30工程4で合成した化合物5 (273 mg, 0.239 mmol)をジクロロメタン (2.7 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (2.7 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸することにより、化合物6 (231 mg, 定量的)を得た。
ESI-MS m/z: 919 (M + H)+
【０４７０】
参考例31
【０４７１】
【化１４５】
2019024444.tif 000165
【０４７２】
参考例31工程1
4-ニトロイソフタル酸1 (500 mg, 2.37 mmol)およびN-Boc-エチレンジアミン (808 mg, 5.21 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてトリエチルアミン (0.90 mL, 7.11 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（703 mg, 5.21 mmol）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（1.36 g, 7.11 mmol）を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物2 (650 mg, 収率55 %)を得た。
【０４７３】
参考例31工程2
参考例31工程1で合成した化合物2 (500 mg, 1.01 mmol)および亜鉛末 (330 mg, 5.05 mmol)をメタノール (3.5 mL)およびテトラヒドロフラン (3.5 mL)に懸濁し、0℃にて塩化アンモニウム (378 mg, 7.07 mmol)の水溶液を滴下し、室温にて24時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物3 (160 mg, 収率34 %)を得た。
【０４７４】
参考例31工程3
参考例31工程2で合成した化合物3 (200 mg, 0.430 mmol)およびN-ベンジルオキシカルボニル-グリシン（ベンジルオキシカルボニルを、Cbzとも記載する。） (90.0 mg, 0.430 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (2.0 mL)に溶解し、室温にてジイソプロピルエチルアミン (0.220 mL, 1.29 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (245 mg, 0.645 mmol)を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物4 (180 mg, 収率64 %)を得た。
ESI-MS m/z: 657 (M + H)+
【０４７５】
参考例32
【０４７６】
【化１４６】
2019024444.tif 000166
【０４７７】
参考例32工程1
3,5-ジニトロ安息香酸1 (500 mg, 2.36 mmol)およびN-Cbz-エチレンジアミン (588 mg, 2.83 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (5.0 mL)に溶解し、室温にてトリエチルアミン (0.65 mL, 4.72 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（380 mg, 2.83 mmol）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（675 mg, 3.54 mmol）を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物2 (445 mg, 収率48 %)を得た。
【０４７８】
参考例32工程2
参考例32工程1で合成した化合物2 (200 mg, 0.515 mmol)をエタノール (5.0 mL)に溶解し、室温にて塩化スズ(II) (584 mg, 3.09 mmol)および濃塩酸 (0.2 mL)を加え、80℃で16時間撹拌した。反応液を後処理し、化合物3 (180 mg,定量的)を得た。
ESI-MS m/z: 329 (M + H)+
【０４７９】
参考例33
【０４８０】
【化１４７】
2019024444.tif 000167
【０４８１】
参考例33工程1
参考例3に記載の方法で合成した化合物1 (8.17 g, 23.12 mmol)を用いて参考例3の工程4と同様の方法で化合物2 (3.7 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 254(M+H)+
【０４８２】
参考例33工程2
参考例33工程1で得られた化合物2 (3.7 g, 14.63 mmol)を用いて参考例3の工程5と同様の方法で化合物3 (3.82 g, 収率67%)を得た。
ESI-MS m/z: 432(M+HCOO)-
【０４８３】
参考例33工程3
参考例33工程2で得られた化合物3 (3.82 g, 9.86 mmol)を用いて参考例1の工程2と同様の方法で化合物4(3.08 g, 収率87%)を得た。
ESI-MS m/z: 360(M+H)+
【０４８４】
参考例34
【化１４８】
2019024444.tif 000168
【０４８５】
参考例34工程1
化合物1 (2g, 9.53mmol)とtert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-ペンタノール (東京化成社製, 2g,10mmol)を用い、参考例3の工程1と同様の方法で化合物2 (2.40 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 296(M+H)+, 脱Boc体として検出
【０４８６】
参考例34工程2
参考例34工程1で合成した化合物2を用いて、参考例3の工程2〜4および参考例4の工程1〜4と同様の方法で化合物3 (1.579g,収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 910 (M+H)+
【０４８７】
参考例35:化合物D2の合成
【０４８８】
【化１４９】
2019024444.tif 000169
【０４８９】
参考例35工程1
参考例11に記載の方法で合成した化合物1 (1.015 g, 1.748 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (12 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 187 mg)を加え、水素雰囲気下で6時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例26で合成した化合物5（250.0 mg, 0.350 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（26.80 mg, 0.1750 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（402.0 mg, 2.099 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=87/13）で精製することにより、化合物2（617.0 mg, 収率88%）を得た。
ESI-MS m/z: 1215 (M + 2H) 2+
【０４９０】
参考例35工程2
参考例35工程1で合成した化合物2 (0.7380 g, 0.3040 mmol)をテトラヒドロフラン (7 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 135.90 mg)を加え、水素雰囲気下で終夜撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=87/13）で精製することにより、化合物D2（581 mg, 収率82%）を得た。
ESI-MS m/z: 1170 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.12-2.36 (106H, m), 2.91-3.19 (8H, m), 3.23-3.55 (14H, m), 3.60-3.76 (4H, m), 3.78-3.94 (8H, m), 3.95-4.10 (16H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.8 Hz), 4.92-5.01 (4H, m), 5.17-5.24 (4H, m), 6.98 (1H, s), 7.64 (2H, s), 7.81-7.95 (4H, m), 8.28-8.38 (2H, m), 8.44-8.56 (2H, m), 10.13 (1H, s)
【０４９１】
参考例36:化合物D3の合成
【０４９２】
【化１５０】
2019024444.tif 000170
【０４９３】
参考例36工程1
参考例12に記載の方法で合成した化合物1 (500 mg, 0.879 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (6.5 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 94 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例26で合成した化合物5（126.0 mg, 0.176 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（13.47 mg, 0.088 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（202.0 mg, 1.055 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物2（249.7 mg, 収率60%）を得た。
ESI-MS m/z: 1191 (M + 2H) 2+
【０４９４】
参考例36工程2
参考例36工程1で合成した化合物2 (0.242 g, 0.102 mmol)をテトラヒドロフラン (3.6 mL)および水（1.2 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 45 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D3（216 mg, 収率93%）を得た。
ESI-MS m/z: 1146 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.15-1.65 (20H, m), 1.68-2.15 (52H, m), 3.13-3.29 (6H, m), 3.40-3.67 (16H, m), 3.71-3.96 (11H, m), 3.98-4.14 (16H, m), 4.55 (4H, t, J = 8.8 Hz), 4.93-5.06 (4H, m), 5.12-5.28 (4H, m), 6.56 (1H, s), 6.98 (1H. s), 7.64 (2H, s), 7.77-7.93 (4H, m), 8.26-8.49 (3H, m), 10.10 (1H, s)
【０４９５】
参考例37:化合物D4の合成
【０４９６】
【化１５１】
2019024444.tif 000171
【０４９７】
参考例37工程1
参考例13に記載の方法で合成した化合物1 (430 mg, 0.674 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 79 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例26で合成した化合物5（105.0 mg, 0.148 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（11.31 mg, 0.074 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（170.0.0 mg, 0.887 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物2（218.1 mg, 収率56%）を得た。
ESI-MS m/z: 1329 (M + 2H) 2+
【０４９８】
参考例37工程2
参考例37工程1で合成した化合物2 (0.210 g, 0.079 mmol)をテトラヒドロフラン (3.1 mL)および水（1.0 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 39 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D4 （192.7 mg, 収率95%）を得た。
ESI-MS m/z: 1284 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.17-1.65 (42H, m), 1.69-2.13 (61H, m), 2.95-3.17 (16H, m), 3.65-3.77 (3H, m), 3.79-3.94 (6H, m), 3.96-4.10 (16H, m), 4.48 (4H, d, J = 8.4 Hz), 4.96 (4H, dd, J = 2.4, 11.2 Hz), 5.21 (4H, d, J = 3.2 Hz), 7.01 (1H, s), 7.64-7.92 (11H, m), 8.26-8.48 (4H, m), 10.14 (1H, s)
【０４９９】
参考例38：化合物D5の合成
【０５００】
【化１５２】
2019024444.tif 000172
【０５０１】
参考例38工程1
参考例12に記載の方法で合成した化合物1 (450 mg, 0.791 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 85 mg)を加え、水素雰囲気下で5時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例27で合成した化合物6（94 mg, 0.158 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（133.0 mg, 0.871 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（182.0 mg, 0.950 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物2（99 mg, 収率28%）を得た。
ESI-MS m/z: 1129 (M + 2H) 2+
【０５０２】
参考例38工程2
参考例38工程1で合成した化合物2 (80 mg, 0.035 mmol)をテトラヒドロフラン (1.7 mL)および水（0.85 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 26 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D5（57.5 mg, 収率75%）を得た。
ESI-MS m/z: 1084 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.69-2.21 (46H, m), 3.14-3.65 (28H, m), 3.67-4.22 (27H, m), 4.43-4.66 (4H, m), 4.69-4.88 (4H, m), 4.89-5.08 (4H, m), 5.12-5.32 (4H, m), 6.54-6.68 (1H, br), 7.01 (2H, s), 7.78-8.09 (3H, m), 8.13-8.31 (2H, m), 8.58-8.75 (2H, m)
【０５０３】
参考例39：化合物D6の合成
【０５０４】
【化１５３】
2019024444.tif 000173
【０５０５】
参考例39工程1
参考例13に記載の方法で合成した化合物1 (418 mg, 0.655 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 77 mg)を加え、水素雰囲気下で5時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例27で合成した化合物6（85 mg, 0.144 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（121.0 mg, 0.791 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（165.0 mg, 0.863 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物2（99 mg, 収率28%）を得た。
ESI-MS m/z: 1268 (M + 2H) 2+
【０５０６】
参考例39工程2
参考例39工程1で合成した化合物2 (186 mg, 0.073 mmol)をテトラヒドロフラン (2.8 mL)および水（0.93 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 40 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D6（156.7 mg, 収率87%）を得た。
ESI-MS m/z: 1222 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.36-1.62 (27H, m), 1.67-2.17 (64H, m), 2.92-3.21 (15H, m), 3.58-3.77 (2H, m), 3.80-3.95 (7H, m), 3.97-4.13 (15H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.8 Hz), 4.88-5.02 (7H, m), 5.10-5.24 (3H, m), 6.95-7.00 (1H, m), 7.26-7.31 (2H, m), 7.72-7.88 (8H, m), 8.10-8.20 (2H, m), 8.51-8.60 (2H, m)
【０５０７】
参考例40
【０５０８】
【化１５４】
2019024444.tif 000174
【０５０９】
参考例40工程1
参考例38に記載の方法で合成した化合物D5 (171 mg, 0.079 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (3.4 mL)に溶解し、グリシンベンジル p-トルエンスルホン酸塩（32.0 mg, 0.095 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（12.09 mg, 0.079 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（18.16 mg, 0.095 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物2（55.7 mg, 収率31%）を得た。
ESI-MS m/z: 1158 (M + 2H) 2+
【０５１０】
参考例40工程2
参考例40工程1で合成した化合物2 (54 mg, 0.023 mmol)をテトラヒドロフラン (0.83 mL)および水（0.28 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 18 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物3（50.1 mg, 収率97%）を得た。
ESI-MS m/z: 1112 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 0.96-1.06 (3H, m), 1.71-2.20 (54H, m), 3.41-3.64 (15H, m), 3.68-4.20 (32H), 4.55 (4H, d, J = 8.4 Hz), 4.81 (4H, s), 4.94-5.02 (4H, m), 5.17-5.25 (4H, m), 6.63-6.76 (2H, m), 6.93-7.02 (2H, m), 7.84-8.00 (3H, m), 8.17-8.30 (2H, m), 8.58-8.70 (2H, m)
【０５１１】
参考例41:化合物D7の合成
【０５１２】
【化１５５】
2019024444.tif 000175
【０５１３】
参考例41工程1
参考例11に記載の方法で合成した化合物1 (500 mg, 0.861 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて参考例27で合成した化合物3 (113 mg, 0.172 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (198 mg, 1.03 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (13.2 mg, 0.086 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物2 (195 mg, 収率48%)を得た。
ESI-MS m/z: 1186 (M + 2H) 2+
【０５１４】
参考例41工程2
参考例41工程1で合成した化合物2 (194 mg, 0.082 mmol)をテトラヒドロフラン (2.9 mg)および水 (1.0 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 35.7 mg)を加え、水素雰囲気下で8時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D7（183 mg, 収率98%）を得た。
ESI-MS m/z: 1141 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.21-1.45 (m, 40H), 1.76-2.18 (m, 50H), 3.00-3.09 (m, 8H), 3.40-4.20 (m, 32H), 4.47 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 4.96 (dd, J = 3.1, 11.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 6.98 (s, 1H), 7.65 (s, 2H), 7.84 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 8.31 (brs, 1H), 8.44 (brs, 1H), 10.11 (s, 1H).
【０５１５】
参考例42：化合物D8の合成
【０５１６】
【化１５６】
2019024444.tif 000176
【０５１７】
参考例42工程1
参考例11に記載の方法で合成した化合物1 (500 mg, 0.861 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて参考例29で合成した化合物4 (97.0 mg, 0.172 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (198 mg, 1.03 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (13.2 mg, 0.086 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=85/15)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物2 (179 mg, 収率46%)を得た。
ESI-MS m/z: 1138 (M + 2H) 2+
【０５１８】
参考例42工程2
参考例42工程1で合成した化合物2 (175 mg, 0.077 mmol)をテトラヒドロフラン (2.6 mg)および水 (0.9 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 32.4 mg)を加え、水素雰囲気下で1時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D8（160 mg, 収率95%）を得た。
ESI-MS m/z: 1093 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.23-1.45 (m, 32H), 1.77 (s, 12H), 1.89 (s, 12H), 1.99 (s, 12H), 2.10 (s, 12H), 3.01-3.11 (m, 8H), 3.69-4.02 (m, 34H), 4.47-4.50 (m, 4H), 4.94-4.98 (m, 4H), 5.21 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 6.92 (s, 1H), 6.94 (s, 2H), 7.87 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.33 (brs, 2H), 8.50 (brs, 2H).
【０５１９】
参考例43:化合物D9の合成
【０５２０】
【化１５７】
2019024444.tif 000177
【０５２１】
参考例43工程1
参考例13に記載の方法で合成した化合物1 (500 mg, 0.784 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて参考例30で合成した化合物6 (144 mg, 0.157 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (180 mg, 0.941 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (12.0 mg, 0.078 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=80/20)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物2 (191 mg, 収率43%)を得た。
ESI-MS m/z: 1431 (M + 2H) 2+
【０５２２】
参考例43工程2
参考例43工程1で合成した化合物2 (186 mg, 0.065 mmol)をテトラヒドロフラン (2.8 mg)および水 (0.9 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 34.3 mg)を加え、水素雰囲気下で1時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D9（174 mg, 収率97%）を得た。
ESI-MS m/z: 1386 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ):1.25-4.02 (m, 164H), 4.18-4.26 (m, 2H), 4.47 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 4.96 (dd, J = 3.1, 11.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.6 Hz, 4H), 7.74-7.91 (m, 13H), 8.18 (s, 2H), 8.36 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 10.27 (brs, 1H).
【０５２３】
参考例44：化合物A2の合成
【０５２４】
【化１５８】
2019024444.tif 000178
【０５２５】
参考例44工程1
参考例31に記載の方法で合成した化合物1 (150 mg, 0.228 mmol)をジクロロメタン (1.5 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (1.5 mL)を加えて4時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸するした。残渣をN, N'-ジメチルホルムアミド (3 mL)に溶解し、室温にて参考例14の化合物3 (574 mg, 0.571 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (109 mg, 0.571 mmol)、トリエチルアミン (0.159 mL, 1.14 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (3.50 mg, 0.023 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物2 (242 mg, 収率44%)を得た。
ESI-MS m/z: 1216 (M + 2H) 2+
【０５２６】
参考例44工程2
参考例44工程1 (242 mg, 0.100 mmol)を テトラヒドロフラン/水 (4/1; 12 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 44.6 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて6-マレイミドヘキサン酸 (23.2 mg, 0.110 mmol)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (55.2 mg, 0.199 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をHP20レジン (アセトン/水)で精製精製することにより、化合物A2 (97.4 mg, 収率39%)を得た。
ESI-MS m/z: 1245 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ):1.14-2.16 (100H, m), 2.96-2.98 (4H, m), 3.24-3.41 (18H, m), 3.69-3.73 (4H, m), 3.83-3.91 (6H, m), 4.14-4.16 (2H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.6 Hz), 4.96 (4H, dd, J = 3.6, 11.3 Hz), 5.21 (4H, d, J = 3.2 Hz), 7.01 (2H, s), 7.73-7.75 (2H, m), 7.83-7.94 (7H, m), 8.05-8.08 (2H, m), 8.14-8.20 (3H, m), 8.55-8.56 (2H, m), 10.24 (1H, brs).
【０５２７】
参考例45：化合物A3の合成
【０５２８】
【化１５９】
2019024444.tif 000179
【０５２９】
参考例45工程1
参考例32に記載の方法で合成した化合物1 (75.0 mg, 0.228 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (3.0 mL)に溶解し、室温にて参考例14の化合物3 (574 mg, 0.571 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.199 mL, 1.14 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (217 mg, 0.571 mmol)を加えて終夜撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物2 (202 mg, 収率38%)を得た。
ESI-MS m/z: 1152 (M + 2H) 2+
【０５３０】
参考例45工程2
参考例45工程1で合成した化合物2 (196 mg, 0.085 mmol)を テトラヒドロフラン/水 (4/1; 10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 36.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて6-マレイミドヘキサン酸 (19.8 mg, 0.094 mmol)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (47.0 mg, 0.170 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をHP20レジン (アセトン/水)で精製精製することにより、化合物A3 (42.4 mg, 収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 1182 (M + 2H) 2+
【０５３１】
参考例46:化合物D10
【０５３２】
【化１６０】
2019024444.tif 000180
【０５３３】
参考例34に記載の方法で合成した化合物1を用い、参考例10の工程1および2と同様の方法で化合物D10 (2.2 g, 収率58%)を得た。
ESI-MS m/z: 2437(M+H)+
【０５３４】
参考例47：化合物A4の合成
【０５３５】
【化１６１】
2019024444.tif 000181
【０５３６】
参考例47工程1
参考例33に記載の方法で合成した化合物1 (0.101 g, 0.282 mmol)を用いて、参考例15の化合物2 (0.607 g, 0.613 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法によって化合物2 (0.25 g, 収率39%)を得た。
ESI-MS m/z: 2304(M+H)+
【０５３７】
参考例47工程2
参考例47工程1で合成した化合物2 (0.255 g, 0.111 mmol)を用いて、参考例3の工程2と同様の方法によって化合物3 (0.15 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 2170(M+H)+
【０５３８】
参考例47工程3
参考例47工程2で合成した化合物3 (20.8 mg, 9.59 μmol)を用いて、参考例5の工程2と同様の方法によって化合物A4 (5.5 mg, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 1182(M+2H)2+
【０５３９】
参考例48：化合物A5の合成
【０５４０】
【化１６２】
2019024444.tif 000182
【０５４１】
参考例48工程1
参考例33に記載の方法で合成した化合物1 (0.099g, 0.277 mmol)を用いて、参考例16の工程2で合成した化合物3 (0.618 g, 0.615 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法によって化合物2 (0.343 g, 収率53%)を得た。
ESI-MS m/z: 2333(M+H)+
【０５４２】
参考例48工程2
参考例48工程1で合成した化合物2を用いて、参考例10の工程1および2と同様の方法で化合物A5 (6.9 mg, 収率28%)を得た。
ESI-MS m/z: 2392(M+H)+
【０５４３】
参考例49：化合物A6の合成
【０５４４】
【化１６３】
2019024444.tif 000183
【０５４５】
参考例7に記載に方法で合成した化合物1 (0.048 g, 0.021 mmol)と3-マレイミドプロピオン酸 N-スクシンイミジル (東京化成社製, 0.017 g, 0.064 mmol)を用いて参考例8の化合物A1の合成と同様の方法で化合物A6 (0.040 g, 収率78%)を得た。
ESI-MS m/z: 2480(M+HCOO)-
【０５４６】
参考例50：化合物A7の合成
【０５４７】
【化１６４】
2019024444.tif 000184
【０５４８】
工程131
参考例10に記載の方法で合成した化合物D1 (23.6 mg, 9.46 μmol)とN-(2-アミノエチル)マレイミド トリフルオロ酢酸塩 (シグマアルドリッチ社製, 7.21 mg, 0.028 μmol)を用いて参考例3の工程3と同様の方法で化合物A7 (9.1 mg, 収率36%)を得た。
ESI-MS m/z: 1310(M+2H)2+
【０５４９】
参考例51
【０５５０】
【化１６５】
2019024444.tif 000185
【０５５１】
参考例51工程1
参考例7に記載の方法で合成した化合物1 (0.122 g, 0.054 mmol)と、バイオコンジュゲート・ケミストリー (Bioconjugate Chemistry), 第22巻, 690-699頁, 2011年に記載された方法と同様の方法を用いて合成したヘキサン酸モノベンジルエステルを用い、参考例4工程1と同様にして、化合物2 (0.076 g, 収率56%)を得た。
ESI-MS m/z: 2503(M+H)+
【０５５２】
参考例51工程2
参考例51工程1で合成した化合物2 (0.076 g, 0.03 mmol)を用いて参考例3の工程1と同様の方法にて化合物3 (0.030 g, 収率40%)を得た。
ESI-MS m/z: 2412(M+H)+
【０５５３】
参考例52
【０５５４】
【化１６６】
2019024444.tif 000186
【０５５５】
参考例6に記載の方法で合成した化合物1 (4.36 mg, 0.006 mmol)と参考例1の化合物4 (10 mg, 0.02 mmol) を用い、参考例3の工程7と同様の方法で化合物2 (7 mg, 収率65%)を得た。
ESI-MS m/z: 1581 (M - H)-
【０５５６】
参考例53：化合物C2の合成
【０５５７】
【化１６７】
2019024444.tif 000187
【０５５８】
参考例53工程1
参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (0.2011 g, 0.079 mmol)を用いて、参考例10の工程3を用いて化合物1 (0.129 g, 収率55%)を得た。
ESI-MS m/z: 2972 (M+HCOO)-
【０５５９】
参考例53工程2
参考例53工程1で合成した化合物1(0.129 g, 0.044 mmol)を用いて、参考例10の工程4を用いて化合物2の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1535 (M+HCOOH-2H)2-
【０５６０】
参考例53工程3
参考例53工程2で合成した化合物2 (0.0467 g, 0.013 mmol)を用いて、参考例10の工程5を用いて、化合物C2(19.4 μmol/g, 収率35%)を得た。
【０５６１】
参考例54:化合物C3の合成
【０５６２】
【化１６８】
2019024444.tif 000188
【０５６３】
参考例54工程1
参考例10に記載の方法で合成した化合物D1 (100 mg, 0.040mmol) および参考例17の化合物2を用い、参考例10の工程3と同様の方法で化合物1 (90 mg, 収率76%) を得た。
ESI-MS m/z: 1335 (M-DMTr+2H)2+
【０５６４】
参考例54工程2
参考例54工程1で合成した化合物1 (90 mg, 0.030 mmol) を用い、参考例10の工程4と同様の方法で化合物2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1558 (M+HCOOH-2H)2-
【０５６５】
参考例54工程3
参考例54工程2で合成した化合物2の粗生成物を用い、参考例10の工程5と同様の方法で化合物C3 (21.5 μmol/g, 2段階収率32%) を得た。
【０５６６】
参考例55：化合物C4の合成
【０５６７】
【化１６９】
2019024444.tif 000189
【０５６８】
参考例55工程1
参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例17で合成した化合物2を用い、参考例10の工程3と同様の方法で化合物1 (90 mg, 収率76%) を得た。
ESI-MS m/z: 1356 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出
【０５６９】
参考例55工程2
参考例55工程1で合成した化合物1 (90 mg, 0.030 mmol) を用い、参考例10の工程4と同様の方法で化合物2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1579 (M+HCOOH-2H)2-
【０５７０】
参考例55工程3
参考例55工程2で合成した化合物2の粗生成物を用い、参考例10の工程5と同様の方法で化合物C4 (17.0 μmol/g, 2段階収率26%) を得た。
【０５７１】
参考例56：化合物C5の合成
【０５７２】
【化１７０】
2019024444.tif 000190
【０５７３】
参考例56工程1
参考例46に記載の方法でで合成した化合物D10 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例18の工程2で合成した化合物3を用い、参考例10の工程3と同様の方法で化合物1 (50 mg, 収率42%) を得た。
ESI-MS m/z: 1363 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出
【０５７４】
参考例56工程2
参考例56工程1で合成した化合物1 (50 mg, 0.017 mmol) を用い、参考例10の工程4と同様の方法で化合物2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1587 (M+HCOOH-2H)2-
【０５７５】
参考例56工程3
参考例56工程2で合成した化合物2の粗生成物を用い、参考例10の工程5と同様の方法で化合物C5 (0.5 μmol/g, 2段階収率1%) を得た。
【０５７６】
参考例57：化合物C6の合成
【０５７７】
【化１７１】
2019024444.tif 000191
【０５７８】
参考例57工程1
参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例19nの化合物2を用い、参考例10の工程3と同様の方法で化合物1 (40 mg, 収率30%) を得た。
ESI-MS m/z: 1532 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出
【０５７９】
参考例57工程2
参考例57工程1で合成した化合物1(40 mg, 0.012 mmol) を用い、参考例10の工程4と同様の方法で化合物2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1582 (M+2H)2+
脱DMTr体として検出
【０５８０】
参考例57工程3
参考例57工程2で合成した化合物2の粗生成物を用い、参考例10の工程5と同様の方法で化合物C6 (0.2 μmol/g, 2段階収率1%) を得た。
【０５８１】
参考例58：化合物C7の合成
【０５８２】
【化１７２】
2019024444.tif 000192
【０５８３】
参考例58工程1
参考例10に記載の方法で合成したD1 (70 mg, 0.028 mmol) および参考例21の化合物3を用い、参考例10の工程3と同様の方法で化合物1 (58 mg, 収率77%) を得た。
ESI-MS m/z: 1341 (M+2H)2+
【０５８４】
参考例58工程2
参考例58工程1で合成した化合物1 (58 mg, 0.022 mmol) をメタノール (0.15  mL) に溶解し、ジャーナルオブオーガニックケミストリー（Journal of Organic Chemistry）, 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した参考例17の化合物1 (16.9 mg, 0.032 mmol)、1 mol /L SODIUM L-ASCORBATE水溶液 (0.022 mL, 0.022 mmol)、20 mmol/L 硫酸銅(II)水溶液 (0.011 mL, 0.22 μmol)、および10 mmol/L Tris(2-benzimi
dazolylmethyl)amine / DMSO溶液 (0.022 mL, 0.22μmol)を加え、室温にて3時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム／メタノール=80/20）にて精製し、化合物2 (7 mg, 収率10%) を得た。
ESI-MS m/z: 1450 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出
【０５８５】
参考例58工程3
参考例58工程2で合成した化合物2 (10 mg, 3.13 μmol) を用い、参考例10の工程4と同様の方法で化合物3の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1500 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出
【０５８６】
参考例58工程4
参考例58工程3で合成した化合物3の粗生成物を用い、参考例10の工程5と同様の方法で化合物C7 (8.4 μmol/g,収率27%) を得た。
【０５８７】
参考例59
【０５８８】
【化１７３】
2019024444.tif 000193
【０５８９】
参考例59工程1
参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (74.1 mg, 0.029 mmol)と参考例22の化合物2 (15 mg, 0.027 mmol)を用いて、参考例3の工程3と同様の方法、またはバイオコンジュゲートケミストリー, 第26巻,1451-1455頁, 2015年に記載の方法にて化合物1の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1392(M +H)+, 脱DMTr体として検出
【０５９０】
参考例59工程2
参考例59工程1で合成した化合物1 (0.083 g, 0.027 mmol)を用いて、国際公開公報2015105083号に記載の方法により化合物2の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 2669(M+H)+ , 脱DMTr体として検出
【０５９１】
参考例59工程3
参考例59工程2で合成した化合物2 (0.08 g, 0.027 mmol)を用いて、参考例10の工程4と同様の方法で化合物3の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1556(M+HOOH-2H)2-
1H-NMR (400 MHz, MeOD)：δ1.45-1.86 (48H, m), 1.93 (12H, s), 1.94 (12H, s), 2.02 (12H, s), 2.13 (12H, s), 2.16-2.28 (17H, m), 2.48 (4H, s), 3.10-3.16 (6H, m), 3.36-3.56 (19H, m), 3.77 (6H, s), 3.80-3.89 (6H, m), 3.98-4.35 (30H, m), 4.53-4.59 (4H, m), 4.66-4.72 (1H, m), 5.04-5.10 (4H, m), 5.31-5.36 (4H, m), 6.81-6.88 (4H, m), 7.17-7.23 (1H, m), 7.26-7.32 (6H, m), 7.38-7.44 (2H, m), 7.54 (2H, br s), 7.90 (1H, br s).
【０５９２】
参考例60
化合物D1、および第Z-1表記載の構造または参考例20の化合物4を用い、参考例59工程1および工程2と同様の方法にて、第P-1表および第P-2表に記載した化合物を得た。
本実施例により合成した化合物の質量分析結果を第P-3表に示す。
【０５９３】
【表２０】
2019024444.tif 000194
【０５９４】
【表２１】
2019024444.tif 000195
【０５９５】
【表２２】
2019024444.tif 000196
【０５９６】
【表２３】
2019024444.tif 000197
【０５９７】
参考例61：化合物C8の合成
【０５９８】
【化１７４】
2019024444.tif 000198
【０５９９】
参考例59に記載の化合物1を用いて、参考例10の工程5と同様の方法で化合物C8 (10.0 μmol/g) を得た
【０６００】
参考例62：C9〜C17の合成
第P-1表および第P-2表に記載した化合物を用いて、参考例61と同様の方法で第Q-1表および第Q-2表記載の化合物を得た。
本実施例により合成した化合物の担持量を第Q-3表に示す。
【０６０１】
【表２４】
2019024444.tif 000199
【０６０２】
【表２５】
2019024444.tif 000200
【０６０３】
【表２６】
2019024444.tif 000201
【０６０４】
【表２７】
2019024444.tif 000202
【０６０５】
実施例１：化合物１の合成
【０６０６】
【化１７５】
2019024444.tif 000203
【０６０７】
参考例化合物Ａ１と、モレキュールズ (Molecules), 第17巻, 13825-13843頁, 2012年に記載された方法で合成した末端チオール化されたオリゴヌクレオチドを加えて、室温にて4時間静置した。反応混合物に炭酸ナトリウムを加え、4℃で一晩静置した。陰イオン交換クロマトグラフィー (GE Healthcare, MonoQ 5/50GL, 10μm, 5.0 mm x 50 mm、A液： 10 mmol/L Tris緩衝液/30%アセトニトリル, B液: 10 mmol/L Tris緩衝液/30%アセトニトリル/1 mol/L NaBrによるグラジエント)あるいは逆相液体クロマトグラフィー (ウォーターズ, X BridgeC18, 5μm, 4.6 mmx250 mm、0.1 mol/L酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:アセトニトリルによるグラジエント)のいずれかの方法で精製することにより化合物１を得た。
【０６０８】
実施例２〜７：化合物２〜７の合成
実施例1とは塩基配列の異なるオリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様にして、化合物２〜７を合成した。
本実施例により合成した化合物におけるオリゴヌクレオチド以外の構造(糖リガンド−テザー−ブランチャー構造)を以下に示す。
【０６０９】
【化１７６】
2019024444.tif 000204
【０６１０】
本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を以下表に示す。
【０６１１】
【表２８】
2019024444.tif 000205
【０６１２】
表R-1中、小文字はDNAを、大文字はLNAを、C(M)は5-メチルシトシンLNAを、X1は糖リガンド−テザー−ブランチャー構造を、^はリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合で置換されていること（ホスホロチオエート修飾）をそれぞれ示す。
【０６１３】
参考試験例1：β2GPI mRNAのノックダウン活性の測定
96ウェルの培養プレートにヒト肝臓癌由来の細胞株であるHuh7細胞（国立研究開発法人  医薬基盤・健康・栄養研究所  JCRB細胞バンクより入手）を、5,000細胞/80μL/ウェルとなるよう播種した。培地は、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むMEM培地(ライフテクノロジー社製、カタログ番号11095-098)を用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表2-1〜表2-3、表3-1〜表3-2に記載のものをジーンデザイン社または北海道システムサイエンス社にて合成して利用した。
表2-1〜表2-3のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、小文字はDNAを、大文字は2’-O-メチル化RNAを示す。表3-1〜表3-2のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、小文字はDNAを、大文字はLNAを示し、mCは5-メチルシトシンLNAを示す。なお、表2-1〜表2-3、表3-1〜表3-2のいずれのアンチセンスオリゴヌクレオチドも各ヌクレオチドはリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合で置換されている。
このアンチセンスオリゴヌクレオチドとLipofectamine LTX & Plus試薬(ライフテクノロジー社製、カタログ番号15338)とをOpti-MEM 培地(ライフテクノロジー社製、カタログ番号11058-021)で希釈して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの終濃度が100nMとなるように20μLのアンチセンスオリゴヌクレオチド/Lipofectamine混合液を各々96ウェルの培養プレートに添加し、37℃、5% CO2条件下で24時間培養した。その後、細胞をPBS（Phosphate buffered saline）で洗浄し、各々のプレートからCells-to-Ctキット（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号:AM1728）を用いて製品に添付された説明書に記載された方法に従いcDNAを合成した。このcDNA 5μLをMicroAmpOptical 96ウェルプレート（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4326659）に加え、更に10μLのTaqMan Gene Expression Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4369016）、3μLのUltraPure Distilled Water（ライフテクノロジーズ社製、カタログ番号:10977-015）、1μLのhuman β2GPIプローブ、1μLのヒト GAPDHプローブを添加した。ABI7900 HTリアルタイムPCRシステムを用いて、ヒト β2GPI遺伝子およびヒト GAPDH（D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）のリアルタイムPCRを行った。GAPDHは構成的発現遺伝子であり内部対照として測定し、β2GPI発ｆ現量を補正した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加せずにトランスフェクション試薬だけでHuh7細胞を処理した時のβ2GPI mRNA量を1.0として、各アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した時のβ2GPI mRNA相対発現量を算出した。本実験を2回行い、β2GPI mRNA相対発現量の平均値を表2-1〜表2-3および表3-1〜表3-2に示した。
【０６１４】
【表２９】
2019024444.tif 000206
【０６１５】
【表３０】
2019024444.tif 000207
【０６１６】
【表３１】
2019024444.tif 000208
【０６１７】
【表３２】
2019024444.tif 000209
【０６１８】
【表３３】
2019024444.tif 000210
【０６１９】
試験例1  核酸複合体のヒト初代肝細胞に対するin vitroノックダウン試験
実施例1〜3で得られた化合物1〜3を用いて、ヒト初代肝細胞におけるin vitroノックダウン活性を測定した。最終濃度が300、100、30、または10 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20 μLずつ分注した後、プレーティングメディウム (バイオプレディックインターナショナル社製、カタログ番号 LV0304-2)に懸濁させたヒト初代肝細胞(バイオプレディックインターナショナル社製、カタログ番号HEP187)を、細胞数10000 cells/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、インキュベーションメディウム (バイオプレディックインターナショナル社製、カタログ番号LV0304-2)を添加して、各核酸複合体をヒト初代肝細胞に供した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。各核酸複合体を添加した細胞を37℃の5% CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール (東洋紡社製、カタログ番号 SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、β2GPI遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、β2GPIのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるβ2GPIのmRNAの準定量値を1として、β2GPIのmRNAの準定量値から、β2GPIのmRNAの発現率を求めた。得られたβ2GPIのmRNAの発現率の結果を表S-1に示す。
表S-1から明らかなように、各核酸複合体は、ヒト初代肝細胞に添加後のβ2GPI遺伝子のmRNAの発現を抑制した。
【０６２０】
【表３４】
2019024444.tif 000211
【０６２１】
試験例2  核酸複合体のマウス初代肝細胞に対するin vitroノックダウン試験
実施例4〜7で得られた化合物4〜7を用いて、マウス初代肝細胞におけるin vitroノックダウン活性を測定した。最終濃度が300、100、30、または10 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号 31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20μLずつ分注した後、プライマリヘパトサイトゾウイングアンドプレーティングサプリメント (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements ) (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号CM3000)を含むウィリアムズイーメディウム (William's E Medium) (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号A12176-01)に懸濁させたシーディーワン(CD-1)由来マウス初代肝細胞(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号MSCP10)を、細胞数10000cells/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、プライマリヘパトサイトメンテナンスサプリメント （Primary Hepatocyte Maintenance Supplements）(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号 CM4000)を含むウィリアムズイーメディウムを添加して、各核酸複合体をマウス初代肝細胞に供した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。各核酸複合体を添加した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール (東洋紡社製、カタログ番号 SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)をプローブとして 、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、β2GPI遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、β2GPIのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるβ2GPIのmRNAの準定量値を1として、β2GPIのmRNAの準定量値から、β2GPIのmRNAの発現率を求めた。得られたβ2GPIのmRNAの発現率を表S-2に示す。
【０６２２】
【表３５】
2019024444.tif 000212
【０６２３】
表S-2から明らかなように、各核酸複合体は、マウス初代肝細胞に添加後のβ2GPI遺伝子のmRNAの発現を抑制した。
【０６２４】
試験例3  核酸複合体のマウスにおけるin vivoノックダウン試験
化合物4〜7を用いて、それぞれ以下の方法によりマウスin vivoノックダウン試験を実施した。なお、各核酸複合体は、試験に合わせてリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で希釈して用いた。マウス (BALB/cA、日本クレアより入手)を馴化飼育後、各核酸複合体を1 mg/kg、または0.3 mg/kgずつマウスに皮下注投与した。また、コントロール群としてはDPBSのみをマウスに皮下注投与した。投与から3日後に安楽死させ、肝臓を採取し液体窒素で凍結保存した。肝臓凍結サンプルをトリゾール(登録商標)アールエヌエーアイソレーションリージェンツ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号15596026)およびマグナピュア96 (MagNA Pure 96) (ロシュ・ライフサイエンス社製)を用い、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収を行った。さらにトランスクリプターファーストストランドシーディーエヌエーシンセシスキット (ロシュ・ライフサイエンス社製、カタログ番号 04897030001)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。得られたcDNAを鋳型とし、タックマン(登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、β2GPI遺伝子およびgapdh遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、β2GPIのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定したDPBS投与群におけるβ2GPIのmRNAの準定量値を1として、β2GPIのmRNAの発現率を求めた。得られたβ2GPIのmRNAの発現率を表S-3に示す。
【０６２５】
【表３６】
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【０６２６】
表S-3から明らかなように、本発明の核酸複合体をマウスに投与して、肝臓中のβ2GPI遺伝子の発現を低下させることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０６２７】
本発明の核酸複合体は、哺乳動物に投与して、生体内において、β2GPI関連疾患を治療するために用いることができる。
【配列表】
2019024444000001.app