(57)【要約】【課題】これまでに作出できなかった新たな色調の花色を有する新規マンデビラ属植物を提供することにある。【解決手段】候補マンデビラ属植物の花弁からカロテノイド色素を抽出し、該カロテノイド色素抽出液中に、ネオキサンチン又はその誘導体が存在する場合には、親マンデビラ属植物として選定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
花弁中に少なくとも１種類以上のカロテノイド色素を含むマンデビラ属植物であって、前記カロテノイド色素が、ネオキサンチン又はその誘導体であることを特徴とするマンデビラ属植物。
【請求項２】
前記カロテノイド色素が、ネオキサンチンジミリステート、ネネオキサンチン３−Ｏ−ミリステート−３’−Ｏ−パルミテート、ネオキサンチン３−Ｏ−パルミテート−３’−Ｏ−ミリステート、ネオキサンチンジパルミテート又はこれらの組み合せであることを特徴とする、請求項１に記載のマンデビラ属植物。
【請求項３】
花弁中に少なくとも１種類以上のカロテノイド色素を含むマンデビラ属植物であって、前記カロテノイド色素が、図１、２及び５に示されるクロマトグラフ中のピークＡ、ピークＣ又はピークＤに相当する化合物であることを特徴とするマンデビラ属植物。
【請求項４】
花弁中にネオキサンチンシンターゼを含むマンデビラ属植物。
【請求項５】
ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、−１０〜７０のａ*値、及び０〜８０のｂ*値の花色を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のマンデビラ属植物。
【請求項６】
ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、０〜３０のａ*値、及び０〜５のｂ*値の花色以外の花色を有する、請求項５に記載のマンデビラ属植物。
【請求項７】
ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、−５〜２０のａ*値、及び３〜７０のｂ*値の花色、又は５０〜７０のａ*値、及び５〜７０のｂ*値の花色を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のマンデビラ属植物。
【請求項８】
新鮮な花弁１ｇあたり、０．０２ｍｇ以上のアントシアニン色素を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のマンデビラ属植物。
【請求項９】
前記アントシアニン色素がシアニジンである、請求項８に記載のマンデビラ属植物。
【請求項１０】
０９Ｍ１１１−１（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９８）である、マンデビラ属植物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマンデビラ属植物の子孫。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマンデビラ属植物の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマンデビラ属植物の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
【請求項１４】
白〜ピンク〜赤色（ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、０〜６０のａ*値、及び０〜４０のｂ*値の花色）の花弁を有するマンデビラ属植物と交雑が可能な、花弁中にカロテノイド色素を含む親マンデビラ属植物の選定方法であって、
候補マンデビラ属植物の花弁中に、カロテノイド色素としてネオキサンチン又はその誘導体が存在する場合には、親マンデビラ属植物として選定することを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記カロテノイド色素が、ネオキサンチンジミリステート、ネネオキサンチン３−Ｏ−ミリステート−３’−Ｏ−パルミテート、ネオキサンチン３−Ｏ−パルミテート−３’−Ｏ−ミリステート、ネオキサンチンジパルミテート又はこれらの組み合せであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
白〜ピンク〜赤色（ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、０〜６０のａ*値、及び０〜４０のｂ*値の花色）の花弁を有するマンデビラ属植物と交雑が可能な、花弁中にカロテノイド色素を含む親マンデビラ属植物の選定方法であって、
候補マンデビラ属植物の花弁中に、カロテノイド色素として図１、２及び５に示されるクロマトグラフ中のピークＡ、ピークＣ又はピークＤに相当する化合物が存在する場合には、親マンデビラ属植物として選定することを特徴とする方法。
【請求項１７】
白〜ピンク〜赤色（ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、０〜６０のａ*値、及び０〜４０のｂ*値の花色）の花弁を有するマンデビラ属植物と交雑が可能な、親マンデビラ属植物の選定方法であって、
候補マンデビラ属植物の花弁中に、ネオキサンチンシンターゼが存在する場合には、親マンデビラ属植物として選定することを特徴とする方法。
【請求項１８】
ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、候補マンデビラ属植物の花弁の色調を測定し、ａ*値が−１０〜７０であり、かつｂ*値が０〜８０である場合に、親マンデビラ属植物として選定する、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ａ*値が０〜３０であり、かつｂ*値が０〜５である場合には、親マンデビラ属植物の選定から除外する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、候補マンデビラ属植物の花弁の色調を測定し、ａ*値が−５〜２０であり、かつｂ*値が３〜７０である場合、又はａ*値が５０〜７０であり、かつｂ*値が５〜７０である場合に、親マンデビラ属植物として選定する、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
候補マンデビラ属植物の花弁中のアントシアニン色素の量を測定し、新鮮な花弁１ｇあたり０．０２ｍｇ以上のアントシアニン色素を含む場合に、親マンデビラ属植物として選定する、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アントシアニン色素がシアニジンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
親マンデビラ属植物として０９Ｍ１１１−１（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９８）を選定する、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、−１０〜７０のａ*値、及び０〜８０のｂ*値の花色の花弁を有するマンデビラ属植物を産生するための方法であって、
請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法により、第１のマンデビラ属親植物を選定する工程、及び
選定した第１のマンデビラ属親植物と第２のマンデビラ属親植物とを交雑させる工程、
を含む、方法。
【請求項２５】
前記第２のマンデビラ属親植物が、白〜ピンク〜赤色（ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、０〜６０のａ*値、及び０〜４０のｂ*値の花色）の花弁を有する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、花弁中に少なくとも１種類以上のカロテノイド色素を含む新規マンデビラ(Mandevilla)属植物、ならびに、白〜ピンク〜赤色の花弁を有するマンデビラ属植物と交雑が可能な、花弁中にカロテノイド色素を含む親マンデビラ属植物の選定方法、及び該親マンデビラ属植物の選定方法を用いたマンデビラ属交雑植物の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンデビラ属(Genus Mandevilla)植物（ディプラデニア(Dipladenia)ともいう）は、キョウチクトウ科(family Apocynaceae)に属する、つる性の木本又は直立の草本で、熱帯アメリカ、例えば、メキシコからアルゼンチンにかけて約１３０種が原生している。
園芸的には１８６８年頃に英国にて、マンデビラ・スプレンデンス(Mandevilla splendens)を片親に（もう片方の親は不明）、マンデビラｘアマビリス(Mandevilla x amabilis（syns. M. amonea）が作出された。１９６０年には米国で、M. amoneaとラベルされた株から得られた実生が開花し、これが現在でも広く流通する“Alice du Pont“(日本名「ローズジャイアント(Rose Giant)」)となった（以下、非特許文献１、２参照）。
【０００３】
２０００年頃までは、園芸的に流通している品種は、主にこの“Alice du Pont”とその自然突然変異の枝代わり品種や放任受粉させて得られた実生から選抜された品種、又はやはり来歴が不明なマンデビラ・サンデリ（Mandevilla sanderi）とその枝代わりや放任受粉による実生選抜品種、あるいは野生種のままであるマンデビラ・ラクサ(Mandevilla laxa)（Chilean Jasmine）やマンデビラ・ボリビエンシス（Mandevilla boliviensis）といったものが存在するにすぎなかった（以下、特許文献１参照）。
【０００４】
サントリーフラワーズ（株）は、１９９８年に、大輪咲きタイプ「ホワイト」（Mandevilla amabilis x boliviensis 'Sunmandeho'、品種登録出願第８７２１号）を販売した（以下、特許文献２参照）。
【０００５】
また、サントリーフラワーズ（株）は、２００３年には、同じく大輪咲きタイプ「ピンク」（Mandevilla hybrida 'Sunmandecos'、品種登録出願第１４７５６号)を販売した（以下、特許文献４参照）。
【０００６】
サントリーフラワーズ（株）は、２００５年には、つる咲きタイプ「レッド」(Madevilla hybrida 'Sunmanderemi')（以下、特許文献５参照、品種登録出願第１５８６２号)、「トロピカルピーチ」(Mandevilla hybrida 'Sunmandetomi')（以下、特許文献６参照、品種登録出願第１５８６３号）を販売し、つる咲きタイプ「ルビーピンク」(Sunparagropi)（品種登録出願第２４４７１号）、つる咲きタイプ「レッドベルベット」（Mandevilla hybrida ‘Sunpararenga’）（以下、特許文献１４参照、品種登録出願第２３３３３号）、及びつる咲きタイプ（海外ではPrettyタイプと呼称）「Sundaville Pretty Rose」(Mandevilla hybrida 'Sunparaprero')（以下、特許文献１５参照）を販売した。
【０００７】
サントリーフラワーズ（株）は、２００７年には、大輪咲き「クリムゾンキング」(Mandevilla hybrida 'Sunmandecrikin')（以下、特許文献７参照、品種登録出願第１７４０９号）を販売した。
【０００８】
サントリーフラワーズ（株）は、同年、早咲きタイプ「クリムゾン」（Mandevilla hybrida 'Sunmandecrim'）を販売した（以下、特許文献３参照、品種登録出願第１４７５５号）。
サントリーフラワーズ（株）は、早咲きタイプ「ルージュ」(Mandevilla hybrida 'Sunmandecripi')（以下、特許文献８参照、品種登録出願第２３６０４号）、「ミルキーピンク」(Mandevilla hybrida 'Sunparapibra')（以下、特許文献９参照、品種登録出願第２４４７０号））も販売している。
【０００９】
上記大輪咲き「クリムゾンキング」と早咲きタイプ「クリムゾン」は、今までには無かった真紅のマンデビラであり、これらの新品種の登場により、市場は拡大を始め、サントリーフラワーズ（株）の競合各社もマンデビラの育種に取り組み始めた。
【００１０】
以下の特許文献１０（譲受人、Syngenta Participations AG）には、母体として特許文献３に記載された早咲きタイプ「クリムゾン」と同一であるフランスにおいて'Sundaville'（登録商標）Red, 'Moulin Rouge'として提供された品種、父体として特許文献１に記載された'Helle'として記載された'My Fair Lady'TMとして提供された品種を交配させて得たMandevilla sanderi (Hemsl.) Woodson 'Fisrix Pinka'という新品種が記載されている。
【００１１】
特許文献１１〜１３（譲受人、Floraquest Pty. Ltd.、及びProtected Plant Promotions Australia Pty. Ltd.）には、母体としてコードナンバーＸ０２．５で識別されるMandevilla hybrida、父体として特許文献３に記載された早咲きタイプ「クリムゾン」（Mandevilla hybrida 'Sunmandecrim'）を交配させて得たMandevilla hybrida 'Ginger'なる新品種が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国植物特許第９１１７号公報
【特許文献２】米国植物特許第１１５５６号公報
【特許文献３】米国植物特許第１５５３９号公報
【特許文献４】米国植物特許第１５２０２号公報
【特許文献５】米国植物特許第１６４４９号公報
【特許文献６】米国植物特許第１６３６３号公報
【特許文献７】米国植物特許第１７７３６号公報
【特許文献８】米国植物特許第１８５７８号公報
【特許文献９】米国植物特許第１９６４９号公報
【特許文献１０】米国植物特許第２０６４４号公報
【特許文献１１】米国植物特許第２０７７６号公報
【特許文献１２】米国植物特許第２０７７７号公報
【特許文献１３】米国植物特許第２０９１９号公報
【特許文献１４】米国植物特許第２０５４２号公報
【特許文献１５】米国植物特許第１９３９９号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】The New York Botanical Garden Illustrated Encyclopedia of Horticulture, Vol.6, p. 2129-2130, Garland Publishing, Inc. (1981)
【００１４】
【非特許文献２】Mbberley's Plant-book, Third Edition, p. 520, Cambridge University Press (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
マンデビラ属植物の販売品種は、これまで白、ピンク、赤色の花色を有する品種のみであった。黄色の花色を有する野生種は存在し、近年黄色の花色を有する品種（Ｏｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅ）が発売されたが、これらは、白、ピンク、赤系の花色を有する品種との交雑が出来ないため、黄色の花色を有する品種を交配親とした交雑植物はこれまでに作出されていない。そのため黄色の花色を有する品種と従来の白〜ピンク〜赤系の花色（ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、０〜６０のａ*値、及び０〜４０のｂ*値の花色）を有する品種との交雑による新たな色表現は実現できなかった。本発明が解決しようとする課題は、これまでに作出できなかった新たな色調の花色を有する新規マンデビラ属植物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、このたび、赤品種と白品種を交配した実生株の中で、特別な色調を持つ系統０９Ｍ１１１−１を取得し、花弁の色素分析を行ったところ、微量ではあるが特有のカロテノイド色素を有することを見出した。驚くべきことに、かかる特有のカロテノイド色素を有するマンデビラ属植物を白、ピンク、赤系の花色を有するマンデビラ属植物の品種と交配したところ、交雑種子が得られ、これまでに作出できなかった新たな色調の花色を有する交雑植物を作出することに成功した。
【００１７】
具体的には、本発明は以下のとおりである。
［１］  花弁中に少なくとも１種類以上のカロテノイド色素を含むマンデビラ属植物であって、前記カロテノイド色素が、ネオキサンチン又はその誘導体であることを特徴とするマンデビラ属植物。
［２］  前記カロテノイド色素が、ネオキサンチンジミリステート、ネネオキサンチン３−Ｏ−ミリステート−３’−Ｏ−パルミテート、ネオキサンチン３−Ｏ−パルミテート−３’−Ｏ−ミリステート、ネオキサンチンジパルミテート又はこれらの組み合せであることを特徴とする、１に記載のマンデビラ属植物。
［３］  花弁中に少なくとも１種類以上のカロテノイド色素を含むマンデビラ属植物であって、前記カロテノイド色素が、図１、２及び５に示されるクロマトグラフ中のピークＡ、ピークＣ又はピークＤに相当する化合物であることを特徴とするマンデビラ属植物。
［４］  花弁中にネオキサンチンシンターゼを含むマンデビラ属植物。
［５］  ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、−１０〜７０のａ*値、及び０〜８０のｂ*値の花色を有することを特徴とする、１〜４のいずれかに記載のマンデビラ属植物。
［６］  ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、０〜３０のａ*値、及び０〜５のｂ*値の花色以外の花色を有する、５に記載のマンデビラ属植物。
［７］  ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、−５〜２０のａ*値、及び３〜７０のｂ*値の花色、又は５０〜７０のａ*値、及び５〜７０のｂ*値の花色を有する、１〜４のいずれかに記載のマンデビラ属植物。
［８］  新鮮な花弁１ｇあたり、０．０２ｍｇ以上のアントシアニン色素を含む、１〜７のいずれかに記載のマンデビラ属植物。
［９］  前記アントシアニン色素がシアニジンである、８に記載のマンデビラ属植物。
［１０］  ０９Ｍ１１１−１（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９８）である、マンデビラ属植物。
［１１］  １〜１０のいずれかに記載のマンデビラ属植物の子孫。
［１２］  １〜１０のいずれかに記載のマンデビラ属植物又はその子孫の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
［１３］  １〜１０のいずれかに記載のマンデビラ属植物又はその子孫の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
［１４］  白〜ピンク〜赤色（ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、０〜６０のａ*値、及び０〜４０のｂ*値の花色）の花弁を有するマンデビラ属植物と交雑が可能な、花弁中にカロテノイド色素を含む親マンデビラ属植物の選定方法であって、
候補マンデビラ属植物の花弁中に、カロテノイド色素としてネオキサンチン又はその誘導体が存在する場合には、親マンデビラ属植物として選定することを特徴とする方法。
［１５］  前記カロテノイド色素が、ネオキサンチンジミリステート、ネネオキサンチン３−Ｏ−ミリステート−３’−Ｏ−パルミテート、ネオキサンチン３−Ｏ−パルミテート−３’−Ｏ−ミリステート、ネオキサンチンジパルミテート又はこれらの組み合せであることを特徴とする、１４に記載の方法。
［１６］  白〜ピンク〜赤色（ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、０〜６０のａ*値、及び０〜４０のｂ*値の花色）の花弁を有するマンデビラ属植物と交雑が可能な、花弁中にカロテノイド色素を含む親マンデビラ属植物の選定方法であって、
候補マンデビラ属植物の花弁中に、カロテノイド色素として図１、２及び５に示されるクロマトグラフ中のピークＡ、ピークＣ又はピークＤに相当する化合物が存在する場合には、親マンデビラ属植物として選定することを特徴とする方法。
［１７］  白〜ピンク〜赤色（ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、０〜６０のａ*値、及び０〜４０のｂ*値の花色）の花弁を有するマンデビラ属植物と交雑が可能な、親マンデビラ属植物の選定方法であって、
候補マンデビラ属植物の花弁中に、ネオキサンチンシンターゼが存在する場合には、親マンデビラ属植物として選定することを特徴とする方法。
［１８］  ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、候補マンデビラ属植物の花弁の色調を測定し、ａ*値が−１０〜７０であり、かつｂ*値が０〜８０である場合に、親マンデビラ属植物として選定する、１４〜１７のいずれかに記載の方法。
［１９］  前記ａ*値が０〜３０であり、かつｂ*値が０〜５である場合には、親マンデビラ属植物の選定から除外する、１８に記載の方法。
［２０］  ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、候補マンデビラ属植物の花弁の色調を測定し、ａ*値が−５〜２０であり、かつｂ*値が３〜７０である場合、又はａ*値が５０〜７０であり、かつｂ*値が５〜７０である場合に、親マンデビラ属植物として選定する、１４〜１７のいずれかに記載の方法。
［２１］  候補マンデビラ属植物の花弁中のアントシアニン色素の量を測定し、新鮮な花弁１ｇあたり０．０２ｍｇ以上のアントシアニン色素を含む場合に、親マンデビラ属植物として選定する、１４〜２０のいずれかに記載の方法。
［２２］  前記アントシアニン色素がシアニジンである、２１に記載の方法。
［２３］  親マンデビラ属植物として０９Ｍ１１１−１（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９８）を選定する、１４〜２２のいずれかに記載の方法。
［２４］  ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、−１０〜７０のａ*値、及び０〜８０のｂ*値の花色（例えば、黄〜アプリコット〜オレンジ色、特に、アイボリー、ライトイエロー、黄、アプリコット、オレンジピンク、オレンジレッド、オレンジ）の花弁を有するマンデビラ属植物を産生するための方法であって、
１４〜２３のいずれかに記載の方法により、第１のマンデビラ属親植物を選定する工程、及び
選定した第１のマンデビラ属親植物と第２のマンデビラ属親植物とを交雑させる工程、
を含む、方法。
［２５］  前記第２のマンデビラ属親植物が、白〜ピンク〜赤色（ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、０〜６０のａ*値、及び０〜４０のｂ*値の花色）の花弁を有する、２４に記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、これまで交雑することの出来なかった、白〜ピンク〜赤系の花色を有するマンデビラ属植物の品種と黄色色素をもつ品種との交雑により、これまで存在しなかった新たな色調の花弁を有する新規なマンデビラ属植物を作製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のマンデビラ属植物（４９９０）花弁のアセトン抽出物のＨＰＬＣ−ＰＤＡ（４５０ｎｍ）のクロマトグラムである。
【図２】本発明のマンデビラ属植物（０９Ｍ１１１−１）花弁のアセトン抽出物のＨＰＬＣ−ＰＤＡ（４５０ｎｍ）のクロマトグラムである。
【図３】従来のマンデビラ属植物（Ｏｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅ）花弁のアセトン抽出物のＨＰＬＣ−ＰＤＡ（４５０ｎｍ）のクロマトグラムである。
【図４】本発明のマンデビラ属植物品種と既存のマンデビラ属植物品種の花色の分光測色計データである。
【図５】本発明のマンデビラ属植物（０９Ｍ１１１−１）および既存のマンデビラ属植物（Ｏｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅ）のＨＰＬＣ−ＰＤＡ（４５０ｎｍ）のクロマトグラムである。
【図６】本発明のマンデビラ属植物（０９Ｍ１１１−１）のＨＰＬＣ−ＰＤＡ（４５０ｎｍ）クロマトグラフで観察されたピークの切り出し吸収スペクトルである。
【図７】本発明のマンデビラ属植物（０９Ｍ１１１−１）の1Ｈ-ＮＭＲスペクトル（５．３−６．９ｐｐｍ）である。
【図８】既存のマンデビラ属植物（Ｏｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅ）の1Ｈ-ＮＭＲスペクトル（５．３−６．９ｐｐｍ）である。
【図９】本発明のマンデビラ属植物（０９Ｍ１１１−１）の高分解能質量抽出イオンクロマトグラムである（（ａ）ｍ／ｚ  １０２１．８１−１０２１．８３；（ｂ）ｍ／ｚ  １０４９．８４−１０４９．８６；（ｃ）ｍ／ｚ  １０７７．８７−１０７７．８９）。
【図１０】既存のマンデビラ属植物（Ｏｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅ）の高分解能質量抽出イオンクロマトグラムである（（ａ）ｍ／ｚ  １０２１．８１−１０２１．８３；（ｂ）ｍ／ｚ  １０４９．８４−１０４９．８６；（ｃ）ｍ／ｚ  １０７７．８７−１０７７．８９）。
【図１１】既存のマンデビラ属植物（Ｏｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅ）の高分解能質量抽出イオンクロマトグラムである（（ａ）ｍ／ｚ  １００５．８２−１００５．８３；（ｂ）ｍ／ｚ  １０３３．８５−１０３３．８７；（ｃ）ｍ／ｚ  １０６１．８８−１０６１．９０）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の第１の態様において、花弁中に少なくとも１種類以上のカロテノイド色素を含むマンデビラ属植物であって、前記カロテノイド色素が、図１、２及び５に示されるクロマトグラフ中のピークＡ、ピークＣ又はピークＤに相当する化合物であることを特徴とするマンデビラ属植物が提供される。
【００２１】
カロテノイド色素は、黄色、橙色、赤色などを示す天然色素の一群であり、これまでに極めて多くの種類のカロテノイドが動植物から単離・同定されている。カロテノイドは一般に８個のイソプレン単位が結合して構成された化学式Ｃ40Ｈ56の基本骨格を有するテルペノイドの一種として知られ、テトラテルペンに分類される。カロテノイドは、その分子構造中の共役二重結合によって、４００〜５００ｎｍの間に極大をもつ異なる吸収スペクトルを示し、これにより、黄色〜橙色〜赤色の色を呈する。
【００２２】
本発明者らは、さらに鋭意検討した結果、これらのピークに相当する化合物を同定することに成功し、これらのピークに相当する化合物が、ネオキサンチンの基本骨格を有するという驚くべき知見を得た。
【００２３】
したがって、本発明のさらなる態様において、花弁中に少なくとも１種類以上のカロテノイド色素を含むマンデビラ属植物であって、前記カロテノイド色素が、ネオキサンチン又はその誘導体であることを特徴とするマンデビラ属植物が提供される。
【００２４】
ネオキサンチンは、植物ホルモンアブシジン酸の生合成における中間体であり、ビオラキサンチンからネオキサンチンシンターゼによって合成され、以下の化学構造を有する。
【化１】
2019162154.tif 000002
ネオキサンチン及びビオラキサンチンは共に、カロテノイド由来の黄色の色素であるキサントフィルの一種であるが、下記の実施例にも示されるとおり、ビオラキサンチン誘導体が既存のマンデビラ属植物（Ｏｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅ）にも存在する一方で、ネオキサンチン誘導体が本発明のマンデビラ属植物（０９Ｍ１１１−１）にしか存在しないことは極めて意外である。
【００２５】
ネオキサンチン誘導体としては、例えば、ネオキサンチンの脂肪酸エステルが挙げられる。脂肪酸エステルを形成する脂肪酸としては、例えば、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。ネオキサンチン誘導体は、好ましくは、ネオキサンチンの３位及び３’位のヒドロキシル基にそれぞれ脂肪酸が結合したネオキサンチンジエステルであり、特に好ましくは、ネオキサンチンジミリステート、ネネオキサンチン３−Ｏ−ミリステート−３’−Ｏ−パルミテート、ネオキサンチン３−Ｏ−パルミテート−３’−Ｏ−ミリステート、ネオキサンチンジパルミテートである。
【００２６】
また、本発明のマンデビラ属植物は、花弁中に、カロテノイド色素としてネオキサンチン又はその誘導体を含むことから、その生合成に関与する酵素として、ネオキサンチンシンターゼを含むものと考えられる。ネオキサンチンシンターゼは、ビオラキサンチンにアレン基を導入してネオキサンチンに変換する酵素であり、ビオラキサンチンを基質としてネオキサンチンを生成する。したがって、本発明のさらなる態様において、花弁中にネオキサンチンシンターゼを含むマンデビラ属植物が提供される。
【００２７】
本発明のマンデビラ属植物は、ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、−１０〜７０のａ*値、及び０〜８０のｂ*値の花色を有してもよい。この場合、好適には、０〜３０のａ*値、及び０〜５のｂ*値の花色以外の花色を有する。最適には、−５〜２０のａ*値、及び３〜７０のｂ*値の花色、又は５０〜７０のａ*値、及び５〜７０のｂ*値の花色を有する。
【００２８】
ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系は、国際照明委員会（ＣＩＥ）で規格化された表色系であり、色調を表す表記法として広く知られており、ＣＩＥ１９７６（Ｌ*ａ*ｂ*）表色系とも称される。Ｌ*ａ*ｂ*表色系においては、明度をＬ*で表し、そして色相と彩度を示す色度をａ*とｂ*で表している。ａ*とｂ*はそれぞれ色の方向を示しており、ａ*は赤方向、−ａ*は緑方向、ｂ*は黄方向、そして−ｂ*は青方向を示している。Ｌ*、ａ*及びｂ*の各値は、三刺激値Ｘ、Ｙ、Ｚから以下の等式から得ることができる。
Ｌ* = 116 (Y/Y0)1/3 - 16;
ａ* = 500 [(X/X0)1/3 - (Y/Y0)1/3]; 及び
ｂ*= 200 [(Y/Y0)1/3 - (Z/Z0)1/3]
ただし、X/X0、Y/Y0及びZ/Z0は > 0.008856であり、式中、X0、Y0及びZ0は標準光源の三刺激値を表す。
なお２つの異なる色、Ｌ*1、ａ*1及びｂ*1とＬ*2、ａ*2及びｂ*2との色差ΔEは次式から求めることができる。
ΔE = √(Ｌ*2-Ｌ*1)2 + (ａ*2-ａ*1)2 + (ｂ*2-ｂ*1)2
【００２９】
ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系による色の解析は、積分球型の分光測色計によって簡便に行うことができ、例えば市販のスペクトロフォトメーター（ＣＭ−２０２２，コニカミノルタ）を使用することができる。
【００３０】
また、本発明のマンデビラ属植物は、新鮮な花弁１ｇあたり、０．０２ｍｇ以上のアントシアニン色素を含んでもよく、好適には０．０５ｍｇ以上、最適には０．０７ｍｇ以上のアントシアニン色素を含む。
【００３１】
アントシアニン色素は、植物に含まれ、赤色、青色、紫色の花色を呈することが知られている。アグリコンであるアントシアニジン部位のＢ環のヒドロキシ基の数により、ペラルゴジニン、シアニジン及びデルフィニジンの３系統に分類される。発色団はアグリコン部分で、ペラルゴニジンは鮮赤色、シアニジンは赤紫色、デルフィニジンは紫赤色を呈することが知られている。本発明のマンデビラ属植物に含まれる主要なアントシアニン色素は、シアニジンである。
【００３２】
本発明のマンデビラ属植物は、上記要件を満たす限り、特に限定されないが、好適には０９Ｍ１１１−１、及び０９Ｍ１１１−１を親植物とする交雑植物が挙げられる。０９Ｍ１１１−１の培養苗は、２０１５年１０月９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）にブダペスト条約に基づいて寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９８）。
【００３３】
本発明は、上記マンデビラ属植物の子孫を包含する。このような子孫は、上記マンデビラ属植物と同じ所望の形質を有することが好ましい。本発明は、上記マンデビラ属植物又はその子孫の栄養繁殖体（挿し木、種子等）、植物体の一部（花、茎、枝、葉、根等）、組織、又は細胞も包含する。さらに、本発明は、上記マンデビラ属植物又はその子孫の切り花、又は該切り花から作成された加工品も包含する。
【００３４】
本発明の第２の態様において、白〜ピンク〜赤色の花弁を有するマンデビラ属植物と交雑が可能な、花弁中にカロテノイド色素を含む親マンデビラ属植物の選定方法であって、
候補マンデビラ属植物の花弁からカロテノイド色素を抽出し、該カロテノイド色素抽出液中に、カロテノイド色素として図１、２及び５に示されるクロマトグラフ中のピークＡ、ピークＣ又はピークＤに相当する化合物（具体的には、上記ネオキサンチン又はその誘導体）、あるいはネオキサンチンシンターゼが存在する場合には、親マンデビラ属植物として選定することを特徴とする方法が提供される。ネオキサンチンシンターゼの確認は、当業者に慣習的な方法、例えば、ＰＣＲ法によるネオキサンチンシンターゼ遺伝子の同定や質量分析によるネオキサンチンシンターゼの直接的な同定により実施できる。
【００３５】
マンデビラ属植物は、花の構造が特殊であり、人為的な受粉による人工交配が技術的に難しい。約１３０種以上も原種が存在するにも拘わらず、園芸的に利用されているのは１０数種に過ぎない。このため、黄色の花色を有する野生種は存在するものの、黄色の花色を有する従来の品種を交配親とした交雑マンデビラ属植物はこれまでに作出されておらず、黄色の花色を有するマンデビラ品種と従来の白〜ピンク〜赤系の花色を有するマンデビラ品種との交雑による新たな色表現は実現できなかった。しかしながら、本発明の方法により、白〜ピンク〜赤色の花弁を有するマンデビラ属植物と交雑が可能な、カロテノイド系の花色を有するマンデビラ属植物を親植物として容易に選定することが可能となる。
【００３６】
上記本発明の親マンデビラ属植物の選定方法において、ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、候補マンデビラ属植物の花弁の色調を測定し、ａ*値が−１０〜７０であり、かつｂ*値が０〜８０である場合に、親マンデビラ属植物として選定してもよい。この場合、好適には、ａ*値が０〜３０であり、かつｂ*値が０〜５である場合には、親マンデビラ属植物の選定から除外される。最適には、ＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系において、候補マンデビラ属植物の花弁の色調を測定し、ａ*値が−５〜２０であり、かつｂ*値が３〜７０である場合、又はａ*値が５０〜７０であり、かつｂ*値が５〜７０である場合に、親マンデビラ属植物として選定する。
【００３７】
また、上記本発明の親マンデビラ属植物の選定方法において、候補マンデビラ属植物の花弁中のアントシアニン色素の量を測定し、新鮮な花弁１ｇあたり０．０２ｍｇ以上、好適には０．０５ｍｇ以上、最適には０．０７ｍｇ以上のアントシアニン色素を含む場合に、親マンデビラ属植物として選定してもよい。アントシアニン色素は、好適には、シアニジンである。
【００３８】
親マンデビラ属植物は、上記本発明の選定方法において得られたものである限り、特に限定されないが、好適には、０９Ｍ１１１−１、及び０９Ｍ１１１−１を親植物とする交雑植物が挙げられる。
【００３９】
さらに、本発明は、花弁中にカロテノイド色素を含むマンデビラ属植物を産生するための方法であって、上記本発明の親マンデビラ属植物の選定方法により、第１のマンデビラ属親植物を選定する工程、及び前記第１のマンデビラ属親植物と第２のマンデビラ属親植物とを交雑させる工程を含む方法を包含する。
【００４０】
第２のマンデビラ属親植物は、第１のマンデビラ属親植物と交雑できる限り特に制限されないが、白〜ピンク〜赤色の花弁を有するマンデビラ属植物が好ましい。例えば、大輪咲き「クリムゾンキング」(Mandevilla hybrida 'Sunmandecrikin')、大輪咲きタイプ「ホワイト」（Mandevilla amabilis x boliviensis 'Sunmandeho'）及びつる咲きタイプ「トロピカルピーチ」(Mandevilla hybrida 'Sunmandetomi')が挙げられる。
【００４１】
交雑は、自然交配又は人工交配によって行う。マンデビラ属植物においては、種子の成熟期間が６ヶ月程度と通常の植物に比べて非常に長くかかるため、交配後、種子がある程度成熟するまでの期間、該花柱を切断しないよう維持することが重要となる。
【００４２】
本発明により、これまでに作出できなかった新たな色調、特に黄〜アプリコット〜オレンジ色（例えば、アイボリー、ライトイエロー、黄、アプリコット、オレンジピンク、オレンジレッド、オレンジ）の花色を有する新規マンデビラ属植物を作出することができる。
【実施例】
【００４３】
１．マンデビラ属植物の作出
交配用素材としてサントリーフラワーズ（株）にて保有していた花色が赤い品種ＭＲ−７（その後枯死）を母親、花色が白のサンパラソルクリアホワイト（登録品種名：Sunparacoho）を父親とした交配を２００９年５月にサントリーフラワーズ（株）グローバルブリーディング＆リソースセンター（東近江市）温室内で実施した。２００９年１１月に交配種子を収穫した。２００９年１１月に温室内にて播種した。発芽した実生株から生育の良い１００株を選抜し、９ｃｍポットに鉢上げし、夜最低１６℃で管理した温室内で育苗した後、２０１０年５月に１８ｃｍポットに移植し、サントリーフラワーズ（株）グローバルブリーディング＆リソースセンター内の屋外圃場にて栽培試験を行った。２０１０年９月に開花株を花色の新規性、生育力、耐暑性を指標に選抜し、アプリコット色の花色（Ｌ*＝８１．８、ａ*＝１１．７、ｂ*＝２８．３）を持つ０９Ｍ１１１−１を選抜した。
【００４４】
２０１０年１０月に０９Ｍ１１１−１の自殖交配をサントリーフラワーズ（株）グローバルブリーディング＆リソースセンター温室内で実施した。２０１１年５月に自殖種子を収穫した。２０１１年１１月に温室内にて播種した。発芽した実生株から生育の良い１００株を選抜し、９ｃｍポットに鉢上げし、夜最低１６度で管理した温室内で育苗した後、２０１２年５月に１８ｃｍポットに移植し、サントリーフラワーズ（株）屋外圃場にて栽培試験を行った。２０１２年９月に開花株から花色を指標に黄色味を強く示す個体０９Ｍ１１１−１ｓｅｌｆ−１を選抜した。その後、２０１３年５月に０９Ｍ１１１−１を母親、０９Ｍ１１１−１ｓｅｌｆ−１を父親とする交配をサントリーフラワーズ（株）グローバルブリーディング＆リソースセンター温室内で実施した。２０１３年１１月に交配種子を収穫した。２０１３年１１月に温室内にて播種した。発芽した実生株から生育の良い１００株を選抜、９ｃｍポットに鉢上げし、夜最低１６度で管理した温室内で育苗した後、２０１４年５月に１８ｃｍポットに移植し、サントリーフラワーズ（株）グローバルブリーディング＆リソースセンター内の屋外圃場にて栽培試験を行った。２０１４年９月に開花株から花色の新規性、生育力、耐暑性を指標に選抜し、黄色の花色（Ｌ*＝８２．４、ａ*＝８．６、ｂ*＝４８．０）を持つ＃４９９０を選抜した。
【００４５】
２０１３年５月にサントリーフラワーズ（株）グローバルブリーディング＆リソースセンター内の屋外圃場において、０９Ｍ１１１−１ｓｅｌｆ−１と花弁シアニジン含量の高い複数の赤色系統を近接配置し、放任授粉を実施。０９Ｍ１１１−１ｓｅｌｆ−１を母親とする結実種子を２０１３年１１月に収穫した。２０１３年１１月に温室内にて播種した。発芽した実生株から生育の良い１００株を選抜し、９ｃｍポットに鉢上げし、夜最低１６度で管理した温室内で育苗した後、２０１４年５月に１８ｃｍポットに移植し、サントリーフラワーズ（株）屋外圃場で管理した。２０１４年９月に開花株から花色の新規性、生育力、耐暑性を指標に選抜し、オレンジレッドの花色（Ｌ*＝３６．２、ａ*＝５４．０、ｂ*＝４１．４）を持つ＃４８９１を選抜した。
【００４６】
例２．カロテノイド色素の分析
マンデビラ属植物品種として、４９９０、０９Ｍ１１１−１及びＯｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅの花弁中のカロテノイド色素について、次のようにして含有成分の定量とした。
黄色素を良好に分析出来るフォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）による検出が可能な高速液体クロマトグラフィー分離−ＰＤＡシステム（ＨＰＬＣ−ＰＤＡ）にて定量分析を行った。
検液の調製方法は、凍結乾燥処理を行った乾燥花弁５ｍｇをガラスバイアルに秤量し、アセトン０．５ｍＬを添加し、超音波洗浄器（アズワン，ＡＳ５２ＧＴＵ）にて２０分間、２５℃で超音波照射を行い黄色素成分の抽出操作を行った。ＨＰＬＣ−ＰＤＡの検液は、黄色素成分が抽出された上清０．３ｍＬを細孔サイズ０．４５μｍのフィルター（ナカライテスク、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系））にてろ過を行った。
高速液体クロマトグラフィー分離−フォトダイオードアレイ検出器（ＨＰＬＣ−ＰＤＡ）の機器構成は、送液ユニットＬＣポンプにはＮｅｘｅｒａ  ＬＣ−３０ＡＤ（島津製作所）、ＰＤＡ検出器はＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所）を用い、分離カラムにはＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−３  ２．０×１００  ｍｍ（野村化学）を用いた。ＬＣ移動相の送液は、移動相Ａはメタノール／水（８０／２０，ｖｏｌ／ｖｏｌ）、移動相Ｂはｔ−ブチルメチルエーテル／メタノール／水（７８／２０／２，ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用い、バイナリーグラジエント勾配を１５分間で移動相Ｂ濃度を０％から１００％まで変化させ、流速０．４ｍＬ／分で行った。花弁から抽出した検液は１０μＬ注入した。
ＰＤＡ検出器の吸光度測定は２００−８００ｎｍの範囲で行い、特に黄色系の補色である青色系の吸収帯４４０−４９０ｎｍに着目した。定量値は４５０ｎｍのＬＣ−ＰＤＡから得られた各ピークの吸光度を用いた。
結果を図１〜図３に示す。
【００４７】
例３．フラボノイドの分析
マンデビラの花弁を採取後、凍結乾燥し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）にて花弁からフラボノイドを抽出した。このうち０．２ｍｌを分取し乾燥させた後、６Ｎ  ＨＣｌ  ０．２ｍｌに溶解させ、１００℃で２０分間処理することでアントシアニジンを得た。これを０．２ｍｌの１−ペンタノールで抽出し、ＨＰＬＣ分析に供試した。分析は、ＯＤＳ−Ａ３１２カラム（１５ｃｍ＿６  ｍｍ；ＹＭＣ）を用い、イソクラティック溶媒（ＡｃＯＨ：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ，１５：２０：６５，ｖ／ｖ／ｖ）にて、流速１ｍｌ／１分で行った。
次に、上記で調整した花弁抽出液のうち、２００μｌを分取し乾燥後、６ユニットのβ−グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及び１ユニットのナリンギナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー０．２ｍｌに溶解させ３０℃で１６時間処理し、酵加水分解によりフラボノールを得た。これに、０．１％ＴＦＡを含有する９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル２００μｌを加え、反応を停止後、ＨＰＬＣ分析に供試した。分析は、Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＦＣ−ＯＤＳカラム（１５ｃｍ＿４．６ｍｍ；島津製作所）にて、流速０．６ｍｌ／分で、溶媒Ａ（Ｈ2Ｏ：ＴＦＡ，９９．９：０．１，ｖ／ｖ）及び溶媒Ｂ（Ｈ2Ｏ：アセトニトリル：ＴＦＡ，９．９：９０：０．１，ｖ／ｖ）を用いて行った。グラジェント分析の条件は、次のとおりである。
０        分：溶媒Ｂ  ２０％
０−１０  分：溶媒Ｂ  ７０％
１０−１６分：溶媒Ｂ  ７０％
１６−１７分：溶媒Ｂ  ２０％
１７−２８分：溶媒Ｂ  ２０％
アントシアニジンおよびフラボノールはフォトダイオードアレイ検出器（ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ，島津製作所）を用いて、２５０−４００ｎｍの吸光度にて検出した。
結果を以下の表に示す。
【表１】
2019162154.tif 000003
【００４８】
例４．色彩測定
本発明において作出された品種及び既存の品種の花冠平開部の色彩値をスペクトロフォトメーター（ＣＭ２０２２、ミノルタ）を利用し、Ｄ６５照明を用いて測定した。測定値はＣＩＥ  Ｌ*ａ*ｂ*表色系（Ｃ．Ｉ．Ｅ．，１９８６；Ｇｏｎｎｅｔ・Ｈｉｅｕ，１９９２；ＭｃＬａｒｅｎ，１９７６）に従って数値化した。各品種について３つの個別の花を測定し、その平均値を代表値とした。色度ａ*、ｂ*を座標軸とした散布図で花色の分布を２次元的に示し、色グループごとの分布を確認した。
結果を図４に示す。
【００４９】
例５．黄色色素の分析
０９Ｍ１１１−１とＯｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅとの比較によって特徴的な黄色色素成分の解析を実施した。
本発明における花弁を特徴づける黄色色素成分の構造解析は、以下のとおり、（ｉ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）による吸収スペクトル、（ｉｉ）プロトン核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲ）及び（ｉｉｉ）高分解能質量分析スペクトル（ＨＲＭＳ）に基づいて行った。
【００５０】
（ｉ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）による黄色色素成分の検出
オンラインで分離と紫外可視分光光度データの取得ができる、高速液体クロマトグラフィー−フォトダイオードアレイ検出器（ＨＰＬＣ−ＰＤＡ）によって、数種含有される黄色色素成分の吸収スペクトルを取得した。ＰＤＡは、黄色系統を現わす４００〜５００ｎｍの範囲での吸収スペクトルが得られる必要がある。実際のＰＤＡデータの取得は、２００〜８００ｎｍの範囲で行った。
検液の調製方法は、凍結乾燥処理を行った乾燥花弁それぞれ５．０ｍｇをガラスバイアルに秤量し、抽出溶媒としてアセトン０．５ｍＬ添加、その後超音波洗浄器（アズワン，ＡＳ５２ＧＴＵ）にて２０分間、２５°Ｃの設定温度にて超音波を照射し、黄色素成分の抽出を行った。検液は、黄色素成分が抽出された上澄み液０．３ｍＬを細孔サイズ０．４５μｍのフィルター（ナカライテスク、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系））にてろ過を行った。
ＨＰＬＣの条件として、分離カラムにはオクタデシル基（Ｃ１８）およびトリアコンチル基（Ｃ３０）を化学修飾した逆相系カラム、移動相には３００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲で吸収スペクトルの妨害とならないｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル／メタノール／水系の混合溶液を用いることが望ましい。
【００５１】
ＨＰＬＣ−ＰＤＡの機器構成は、送液ユニットＬＣポンプにはＮｅｘｅｒａ  ＬＣ−３０ＡＤ（島津製作所）、ＰＤＡ検出器はＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所）を用い、分離カラムにはＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−３（２．０×１００ｍｍ）（野村化学）を用いた。ＬＣ移動相の送液は、移動相Ａはメタノール／水（８０／２０  ｖｏｌ／ｖｏｌ）、移動相Ｂはｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル／メタノール／水（７８／２０／２  ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用い、バイナリーグラジエント勾配を１５分間で移動相Ｂ濃度を０％から１００％まで変化させ、流速０．４ｍＬ／分で行った。分析には花弁抽出液１０μＬ注入した。
【００５２】
図５に０９Ｍ１１１−１およびＯｐａｌｅ  ＣｉｔｒｉｎｅのＰＤＡ  ４５０ｎｍのクロマトグラムを示す。
【００５３】
スペクトルを比較して、図中に付したピークＡ（保持時間  １２．０分）、ピークＣ（保持時間  １２．２分）、ピークＤ（保持時間  １２．４分）のピークが０９Ｍ１１１−１に含まれているが、Ｏｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅには含まれていないことが明らかとなった。ピークに対応するＰＤＡ検出器で取得した吸収スペクトルを図６に示す。すべてのピークの切り出し吸収スペクトルにおいて、カロテノイド化合物に特徴的な３本のピーク（４１９，４４３，４７０ｎｍ）が観測された。３本の吸収極大波長より、これらは、α−カロテン、β−カロテン、ルテイン、ビオラキサンチン、ネオキサンチンなどを骨格に持つカロテノイドおよびそれらのエステル体と推定された。
【００５４】
（ｉｉ）黄色色素の1Ｈ−ＮＭＲ分析
図５中で０９Ｍ１１１−１に特徴的にみられたピークＡ、Ｃ、Ｄのカロテノイド骨格の化学構造決定を行うため、多くの化学構造情報を与える1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った。
1Ｈ−ＮＭＲ測定のために必要な試料量１ｍｇ程度を得るために、乾燥花弁は３ｇ程度必要とし、濃縮操作などを必要とする。カロテノイドは異性化や酸素付加などの反応が容易に起こるため、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などの酸素付加防止剤の存在下、試料保存は窒素封入し遮光条件下で行うことが望ましい。また、一般的にカロテノイドの1Ｈ−ＮＭＲ測定は重クロロホルムで行うことが多いが、重クロロホルムは分解すると塩酸を生成し、酸に不安定なＣ−５，６エポキシカロテノイドは、酸によってＣ−５，８エポキシ基に変化することもある。０９Ｍ１１１−１およびＯｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅともに重クロロホルム中で変色したので、ルテインエポキシドやビオラキサンチン、ネオキサンチンなどのＣ−５，６エポキシカロテノイドが含まれていることが明らかとなった。
試料調製の詳細は、下記（１）黄色色素成分の抽出、（２）中圧液体クロマトグラフィーによる黄色色素画分の分取、（３）ケン化によるエステル結合脂肪鎖とトリアシルグリセロールの除去、（４）重ベンゼンに溶解した試料の分析に記載する。
【００５５】
（１）黄色色素成分の抽出
１％ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含むアセトン１００ｍＬ中に凍結乾燥処理を行った乾燥花弁それぞれ２．９７ｇを浸漬させ、１時間室温にて撹拌、黄色色素成分の抽出を行った。その後、減圧下で２０  ｍＬ程度まで濃縮を行った。
【００５６】
（２）中圧液体クロマトグラフィーによる黄色色素画分の分取
濃縮した検体から黄色色素成分を濃縮するため、中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）にて精製を行った。ＭＰＬＣの機器構成は、装置本体はＳｍａｒｔ  Ｆｌａｓｈ  ＥＰＣＬＣ  ＡＩ−５８０Ｓ（山善）、分離カラムにはＨＩ−ＦＬＡＳＨ  ＯＤＳ−ＳＭ（５０μｍ  Ｓｉｚｅ  Ｌ  ２６×１００  ｍｍ  ３５ｇ）（山善）を用いた。ＬＣ移動相の送液は、移動相Ａはメタノール、移動相Ｂはアセトンを用い、バイナリーグラジエント勾配０〜３分は移動相Ｂ４０％、その後２４分間で移動相Ｂ濃度を１００％にし、流速は２０ｍｌ／分で行った。４５０ｎｍの吸収波長が観測された溶出画分１８〜２３分の溶出液を回収、その後乾固した。
【００５７】
（３）ケン化によるエステル結合脂肪鎖とトリアシルグリセロールの除去
上記（１）および（２）の操作では、花弁に含有されるトリアシルグリセロールやカロテノイドエステルの脂肪鎖はＮＭＲによるカロテノイド骨格の解析に妨害となるシグナルを与える。ケン化によってエステルの加水分解を行う。
ケン化は、（２）で乾固した試料に５％ＫＯＨメタノール１０ｍｌを加え、室温で２０分間反応を行った。水とジクロロメタン各１０ｍｌを加え、ジクロロメタン層を水および飽和食塩水で洗浄後、３０°Ｃ、減圧下で溶媒を留去した。さらに高純度の1Ｈ−ＮＭＲ用試料を得るためにＨＰＬＣで精製を行った。ＨＰＬＣ精製の条件は、送液ユニットＬＣポンプにはＬＣ−１０Ａ（島津製作所）、ＵＶ−ｖｉｓ検出器はＳＰＤ−１０Ａ（島津製作所）を用い、分離カラムにはＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ１２０（２０×２５０ｍｍ）（資生堂）を用いた。ＬＣ移動相の送液は９０％アセトニトリル水溶液を流速１０ｍＬ／分で行った。ＵＶ−ｖｉｓ検出器、４５０ｎｍを観測しながら吸収が確認出来た範囲の溶出液を分画、乾燥固化を行い1Ｈ−ＮＭＲ用試料とした。
【００５８】
（４）重ベンゼンに溶解した試料の1Ｈ−ＮＭＲ分析
ケン化処理後の黄色色素成分は重ベンゼンに溶解しＮＭＲ測定を行った。1Ｈ−ＮＭＲデータ取得は、ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ  ＨＤ４００（ブルカー）で行った。図７に０９M111-1の４００ＭＨｚ  1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの５．３〜６．９ｐｐｍの範囲の拡大図を示す。カロテノイドの共役二重結合のメチン（＝ＣＨ−）の化学構造情報が現れる。６．０６ｐｐｍに特徴的なシグナルが観測されている。このシグナルは、ネオキサンチン構造図中の８アレン構造（Ｃ＝Ｃ＝Ｃ）の部分構造を示している。一方、Ｏｐａｌｅ  ＣｉｔｒｉｎｅのＮＭＲスペクトル（図８）からは６．０〜６．１ｐｐｍの範囲にシグナルが観測されず、図８中の７（５．９１ｐｐｍ）、４’（５．５３ｐｐｍ）、７’（５．４５ｐｐｍ）に相当するシグナルが観測された。このシグナルからルテインエポキシドが含有される可能性が推定された。
【００５９】
（ｉｉｉ）ＬＣ−ＡＰＣＩ−ＨＲＭＳによる、エステル鎖長の同定
それぞれのピークに相当するカロテノイドエステルを同定するため、精密質量分析測定より求められる化学組成を決定する。花弁からの抽出物には、トリアシルグリセロールなどの黄色色素以外の化合物、さらには数種類のカロテノイドエステルが含有されるため、質量分析に液体クロマトグラフィー分離をオンライン結合することは有効な手法となる。質量分析のイオン化法は、カロテノイドの質量分析の報告がある大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）で行う。質量分離部は、トリアシルグリセロールとの質量分離や高精度に化学組成を決定するため分解能６０，０００以上での質量スペクトルが得られる電場型フーリエ変換型の質量分析計であるＯｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳで行う。
精密質量の測定に用いる検液の調製方法は、凍結乾燥処理を行った乾燥花弁それぞれ５０．０ｍｇをガラスバイアルに秤量し、抽出溶媒としてアセトン１．０ｍＬ添加、その後、超音波洗浄器（アズワン，ＡＳ５２ＧＴＵ）にて３０分間、２５°Ｃの設定温度にて超音波を照射し、黄色素成分の抽出操作を行った。検液は、黄色素成分が抽出された上澄み液０．３ｍＬを細孔サイズ０．４５μｍのフィルター（ナカライテスク、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系））にてろ過を行った。
【００６０】
高速液体クロマトグラフィー−大気圧化学イオン化精密質量分析（ＨＰＬＣ−ＡＰＣＩ−ＨＲＭＳ）の機器構成は、送液ユニットＬＣポンプにはＮｅｘｅｒａ  ＬＣ−３０ＡＤ（島津製作所）、分離カラムにはＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−３（２．０×１００ｍｍ）（野村化学）を用いた。ＬＣ移動相の送液は、移動相Ａはメタノール／水（８０／２０  ｖｏｌ／ｖｏｌ）、移動相Ｂはｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル／メタノール／水（７８／２０／２  ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用い、バイナリーグラジエント勾配を１５分間で移動相Ｂ濃度を０％から１００％まで変化させ、流速０．４ｍＬ／分で行った。分析には花弁抽出液１０μＬ注入した。質量分析部は、ＡＰＣＩイオン源を取り付けたＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅ  ＭＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いた。質量分析測定は、正イオン測定モード、設定分解能６０，０００、ｍ／ｚ  １５０〜２０００の範囲で測定を行った。
【００６１】
質量分析データからのカロテノイド化合物の同定は、（ｉ）ＨＰＬＣ−ＰＤＡによる吸収スペクトルおよび（ｉｉ）1Ｈ−ＮＭＲでの解析から推測されるカロテノイド骨格にラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸などの脂肪酸が修飾されたときの化学組成から求められるプロトン付加イオンの精密質量の理論値に相当するイオンの質量抽出イオンクロマトグラムから行った。図９に０９Ｍ１１１−１、図１０にＯｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅのネオキサンチンジエステルおよび同質量のビオラキサンチンジエステルの脂肪酸がミリスチン酸、パルミチン酸に相当する高分解能質量抽出イオンクロマトグラム（ａ）ｍ／ｚ  １０２１．８１〜１０２１．８３（ｂ）ｍ／ｚ  １０４９．８４〜１０４９．８６（ｃ）ｍ／ｚ  １０７７．８７〜１０７７．８９を示す。図９の０９Ｍ１１１−１のクロマトグラムでは、ネオキサンチンジミリステート、ネオキサンチンミリステートパルミテート、ネオキサンチンジパルミテート、ビオラキサンチンジミリステート、ビオラキサンチンミリステートパルミテート、ビオラキサンチンジパルミテートが検出された。一方、図１０のＯｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅの高分解能質量抽出イオンクロマトグラムでは、ビオラキサンチンジミリステート、ビオラキサンチンミリステートパルミテート、ビオラキサンチンジパルミテートのみが検出された。
図１１（参考データ）：Ｏｐａｌｅ  Ｃｉｔｒｉｎｅの高分解能質量抽出イオンクロマトグラムクロマトグラム、（ａ）ｍ／ｚ  １００５．８２〜１００５．８３（ｂ）ｍ／ｚ  １０３３．８５〜１０３３．８７（ｃ）ｍ／ｚ  １０６１．８８〜１０６１．９０。検出されたピークは、ルテインエポキシドジエステルに相当する。
【００６２】
結果：（ｉ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）による吸収スペクトル、（ｉｉ）プロトン核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲ）、（ｉｉｉ）高分解能質量分析スペクトル（ＨＲＭＳ）の構造解析により、ピークＡは組成式Ｃ68Ｈ108Ｏ6を有するネオキサンチンジミリステートであり、ピークＣは組成式Ｃ70Ｈ112Ｏ6を有するネオキサンチン３−Ｏ−ミリステート−３’−Ｏ−パルミテート又はネオキサンチン３−Ｏ−パルミテート−３’−Ｏ−ミリステートであり、そして、ピークＤは組成式Ｃ72Ｈ116Ｏ6を有するネオキサンチンジパルミテートであることが同定された。
【受託番号】
【００６３】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９８
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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