(57)【要約】【課題】コーンNSPを分解するヘミセルラーゼ、それをコードするＤＮＡ、及びそれらの利用法を提供する。【解決手段】配列番号の４の１〜５３５位、配列番号６の１〜４４８位、配列番号９の１〜１８３位、配列番号１２の１〜５２７位、又は配列番号１４の１〜６０８位のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列、もしくは、前記アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】図２
2019162036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ１）〜（Ｅ３）のいずれかのタンパク質：
（Ａ１）配列番号４の１〜５３５位のアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ａ２）配列番号４の１〜５３５位のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ａ３）配列番号４の１〜５３５位のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｂ１）配列番号６の１〜４４８位のアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｂ２）配列番号６の１〜４４８位のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｂ３）配列番号６の１〜４４８位のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｃ１）配列番号９の１〜１８３位のアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｃ２）配列番号９の１〜１８３位のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｃ３）配列番号９の１〜１８３位のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｄ１）配列番号１２の１〜５２７位のアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｄ２）配列番号１２の１〜５２７位のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｄ３）配列番号１２の１〜５２７位のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｅ１）配列番号１４のアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｅ２）配列番号１４の１〜６０８位のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｅ３）配列番号１４の１〜６０８位のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ｂ１）、（Ｂ２）、（Ｂ３）、（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（Ｄ１）、（Ｄ２）、及び（Ｄ３）から選ばれ、かつ、β-1,4-キシラ
ナーゼ活性を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記（Ｅ１）、（Ｅ２）、及び（Ｅ３）から選ばれ、かつ、α-L-アラビノフラノシダ
ーゼ活性を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質の２又はそれ以上を含むヘミセルラーゼ製剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のＤＮＡの発現が強化された宿主。
【請求項８】
細菌または真菌である、請求項７に記載の宿主。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項４に記載のヘミセルラーゼ製剤でヘミセルロース系基質を処理することを含む、糖化物の製造方法。
【請求項１０】
前記ヘミセルロース系基質がバイオマス資源である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質の１種又は２種以上を含む、動物用飼料添加物。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質の１種又は２種以上を含む、動物用飼料。
【請求項１３】
パエニバチルス・エスピーＡＪ１１１２２９株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２４１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘミセルラーゼ、それをコードするＤＮＡ、及びそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、穀物等のバイオマスの持つエネルギーを利用したバイオ燃料生産が注目されているが、効率性や、食料との競合等の問題点から、その副産物の有効利用が期待されている。副産物として、DDGS（dried distillers grains with solubles：可溶性物質が添加さ
れた穀物蒸留粕の乾燥物）がある。DDGSは、穀物の澱粉を炭素源としてエタノール発酵を行い、エタノールを蒸留した後の残渣に発酵液中のエタノール以外の可溶性物質を加え、それを乾燥したものであり、穀物としてコーン（トウモロコシ）が主として用いられるため、コーン蒸留粕と呼ばれることもある。DDGSは、タンパク質、脂質が豊富なため、配合飼料の原料として利用されているが、糖類はセルロースやヘミセルロース等のNSP（non-starch polysaccharides：非澱粉性多糖類。食物繊維とも呼ばれる。）がかなりの部分を
占めており、その利用は限られている。ヘミセルロースは、植物組織からアルカリ抽出される多糖類の総称であり、キシラン、アラビノキシラン、キシログルカン及びグルコマンナンなどが含まれる。
【０００３】
ヘミセルロースの分解に関しては、例えば、非特許文献１には、アスペルギルス・オリゼ（Aspergilllus oryzae）が産生する、GHファミリー10及び11に各々属する２種のキシ
ラナーゼによる不溶性アラビノキシランの可溶化について記載されている。これらのキシラナーゼは、カラスムギふすま、及びコムギふすまに対しては活性を有しているが、コーンふすまに対しては1/100程度の活性しかない。
【０００４】
また、コーンNSPからアラビノキシランを可溶化するキシラナーゼとして、特許文献１
にはフザリウム・バーティシリオイデス（Fusarium verticillioides）由来のキシラナーゼが、特許文献２にはアスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）由来のキシラナーゼが、各々記載されている。
【０００５】
さらに、コーンNSPから単糖を遊離する酵素として、特許文献３にはバクテロイデス・
オバタス（Bacteroides ovatus）由来のα−キシロシダーゼが記載されている。
【０００６】
また、パエニバチルス（Paenibacillus）属細菌が産生するキシラナーゼに関する報告
は多く、例えば、特許文献４にはパエニバチルス・パブリ（P. pabuli）由来のキシラナ
ーゼが記載されている。このキシラナーゼは、コムギ、オオムギのNSPに対しては、不溶
性アラビノキシラン分解活性を有することが示されているが、コーンNSPについては不明
である。
【０００７】
また、非特許文献２には、パエニバチルス・カードラノリティカス（P. curdlanolyticus）由来のキシラナーゼの3CBM（3 carbohydrate-binding module）が不溶性アラビノキ
シランの分解に寄与していることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2014/020142
【特許文献２】WO2014/020143
【特許文献３】WO2008/037757
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Rose, D. J. et al., Food Anal. Methods, 4:66-72, 2011
【非特許文献２】Sakka M. et al., Appl. Environ. Microbiol., 77(12):4260-4263, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ヘミセルラーゼ、特にコーンNSPを分解し得るヘミセルラーゼ、それをコー
ドするＤＮＡ、及びそれらの利用法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、パエニバチルス属細菌からコーンNSPを分解する新規なヘミセルラーゼを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおり例示できる。
（１）下記（Ａ１）〜（Ｅ３）のいずれかのタンパク質：
（Ａ１）配列番号４の１〜５３５位のアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ａ２）配列番号４の１〜５３５位のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ａ３）配列番号４の１〜５３５位のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｂ１）配列番号６の１〜４４８位のアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｂ２）配列番号６の１〜４４８位のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｂ３）配列番号６の１〜４４８位のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｃ１）配列番号９の１〜１８３位のアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｃ２）配列番号９の１〜１８３位のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｃ３）配列番号９の１〜１８３位のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｄ１）配列番号１２の１〜５２７位のアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｄ２）配列番号１２の１〜５２７位のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｄ３）配列番号１２の１〜５２７位のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｅ１）配列番号１４の１〜６０８位のアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｅ２）配列番号１４の１〜６０８位のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｅ３）配列番号１４の１〜６０８位のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有す
るアミノ酸配列を含み、かつ、ヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質。
（２）前記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ｂ１）、（Ｂ２）、（Ｂ３）、（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（Ｄ１）、（Ｄ２）、及び（Ｄ３）から選ばれ、かつ、β-1,4-キ
シラナーゼ活性を有する、前記タンパク質。
（３）前記（Ｅ１）、（Ｅ２）、及び（Ｅ３）から選ばれ、かつ、α-L-アラビノフラノ
シダーゼ活性を有する、前記タンパク質。
（４）前記タンパク質の２又はそれ以上を含むヘミセルラーゼ製剤。
（５）前記タンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）前記ＤＮＡを含むベクター。
（７）前記ＤＮＡの発現が強化された宿主。
（８）細菌または真菌である、前記宿主。
（９）前記タンパク質、又は前記ヘミセルラーゼ製剤でヘミセルロース系基質を処理することを含む、糖化物の製造方法。
（１０）前記ヘミセルロース系基質がバイオマス資源である、前記方法。
（１１）前記タンパク質の１種又は２種以上を含む、動物用飼料添加物。
（１２）前記タンパク質の１種又は２種以上を含む、動物用飼料。
（１３）パエニバチルス・エスピーＡＪ１１１２２９株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２４１）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、コーンNSPを分解するヘミセルラーゼが提供される。同ヘミセルラーゼ
は、例えば、バイオマス資源からの糖化物生産に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Xyn43Aによるコムギアラビノキシラン分解反応液のクロマトグラム。
【図２】各種酵素によるコーンDDGSからのアラビノキシランの遊離を示す図（酵素濃度10μg/mL）
【図３】異なる酵素濃度でのコーンDDGSからのアラビノキシランの遊離を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
＜１＞ヘミセルラーゼ
ヘミセルラーゼとは、ヘミセルロースを加水分解する酵素（EC 3.2.1.8、又はEC 3.2.1.89）の総称である。ヘミセルロースは、植物組織からアルカリ抽出される多糖類であり
、主な多糖類としては、キシラン、アラビノキシラン、キシログルカン及びグルコマンナンなどがある。ヘミセルロースを加水分解する活性を、ヘミセルラーゼ活性という。本発明のヘミセルラーゼは、少なくともキシラン及び／又はアラビノキシランを分解する活性を有する。したがって、ヘミセルラーゼは、キシラナーゼ（EC 3.2.1.8）又はアラビノキシラナーゼということもできる。キシラナーゼ及びアラビノキシラナーゼには、キシラン又はアラビノキシランの骨格を形成するキシロース糖間のβ-1,4-グリコシド結合を切断
する活性を有するものがある。そのようなヘミセルラーゼ、例えばXyn5A、Xyn10B、Xyn11A、Xyn30Aと名付けられたヘミセルラーゼは、β-1,4-キシラナーゼ（エンド-1,4-β-キシラナーゼ）ということができる。また、本発明のヘミセルラーゼの一形態、例えば上記Xyn5A、Xyn10B、Xyn11A、Xyn30Aは、コーンのアラビノキシランを分解する活性を有してい
る。コーンのアラビノキシランは、アラビノースに加え、4-O-メチルグルクロン酸で主鎖キシロースが修飾されており、グルクロノアラビノキシランとも呼ばれる。したがって、このようなコーンのアラビノキシランを分解するヘミセルラーゼは、グルクロノアラビノキシラン エンド-1,4-β-キシラナーゼ（EC 3.2.1.136）ということもできる。また、本
発明のヘミセルラーゼの一形態、例えばXyn43Aは、α-L-アラビノフラノシダーゼ活性を
有しており、α-L-アラビノフラノシダーゼ（EC 3.2.1.55）ということもできる。また、本発明において、ヘミセルラーゼ活性とは、不溶性アラビノキシランから可溶性アラビノキシランを生成する活性ということもできる。
【００１７】
本発明のヘミセルラーゼは、コーンNSP、特にコーンNSPに含まれるアラビノキシランを分解する活性を有する。アラビノキシランを分解する活性とは、不溶性アラビノキシランから可溶性アラビノキシランを生成する活性を意味する。アラビノキシラン分解活性は、例えば、コーンNSP、又は可溶性アラビノキシランを除いたコーン蒸留粕（コーンDDGS）
を基質として酵素反応を行い、可溶性アラビノキシランの生成量を測定することにより、検出又は測定することができる。具体的には、後述する実施例３又は実施例８に記載の方法を例示することができる。可溶性アラビノキシランは、フロログルシン酢酸法（Sakka M. et al., Appl. Environ. Microbiol., 77(12):4260-4263, 2011）により測定することができる。
【００１８】
本発明のヘミセルラーゼとして具体的には、（１）配列番号の４の１〜５３５位、（２）配列番号６の１〜４４８位、（３）配列番号９の１〜１８３位、（４）配列番号１２の１〜５２７位、又は（５）配列番号１４の１〜６０８位、のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。これらのアミノ酸配列を含むタンパク質を、各々順にXyn5A、Xyn10B、Xyn11A、Xyn30A、Xyn43Aと呼ぶ。これらの
ヘミセルラーゼのうち、Xyn10B及びXyn11Aは、ビーチウッドキシラン、及び不溶性コムギアラビノキシランの両方を分解する活性を有する。また、Xyn5Aは不溶性コムギアラビノ
キシランを分解する活性を有するが、ビーチウッドキシランを分解する活性は有さない。一方、Xyn30Aは、不溶性コムギアラビノキシランを分解する活性は有さないが、ビーチウッドキシランを分解する活性を有する。また、Xyn43Aは、α-L-アラビノフラノシダーゼ
（EC 3.2.1.55）活性を有する。
【００１９】
また、上記ヘミセルラーゼは、１種単独でもヘミセルラーゼ活性を有するが、２種又は３種以上を組み合わせることによって、比活性が増大する。これらの酵素を組み合わせて含むヘミセルラーゼ製剤は、ヘミセルロースの分解に有用である。酵素の組み合わせは任意であってよいが、具体的には、例えば、Xyn5AとXyn10B、Xyn5AとXyn30A、Xyn5AとXyn43A、Xyn10BとXyn30A、Xyn10BとXyn43A、及びXyn30AとXyn43Aの組み合わせが挙げられる。
これらの製剤において、ヘミセルラーゼの配合比は特に制限されないが、２種の酵素の組み合わせの場合は、例えば95：5〜5：95、又は70：30〜30：70の重量比が挙げられる。
【００２０】
ヘミセルラーゼは、ヘミセルラーゼ活性が維持されている限り、前記アミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントであってもよい。なお、このようなヘミセルラーゼ活性が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。本発明において、上記タンパク質名で特定されるタンパク質には、それぞれ、上記例示したタンパク質に加えて、その保存的バリアント、及び、それらのタンパク質又はバリアントと他のペプチドとの融合タンパク質が含まれるものとする。すなわち、例えば、「Xyn5A」という用語は、配列
番号４の１〜５３５位のアミノ酸配列を有するXyn5Aに加えて、その保存的バリアントや
、前駆体等を包含するものとする。
以下、ヘミセルラーゼの保存的バリアントについて例示する。
【００２１】
ヘミセルラーゼは、ヘミセルラーゼ活性が維持されている限り、前記（１）〜（５）のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、１〜１０個、１〜８個、１〜５個、又は１〜３個であってよい。
【００２２】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、
置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場
合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミ
ノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入
、付加、または逆位等には、タンパク質が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００２３】
また、ヘミセルラーゼは、ヘミセルラーゼ活性が維持されている限り、前記（１）〜（５）のアミノ酸配列全体に対して、高い相同性、例えば、90％以上、95％以上、97％以上、又は99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指す。
【００２４】
また、ヘミセルラーゼは、他のペプチドとの融合タンパク質であってもよい。他のペプチドとしては、マーカーペプチド（マーカータンパク質）、ペプチドタグ、及び、プロ配列又はプレプロ配列、例えば分泌シグナルペプチド等が挙げられる。ヘミセルラーゼに連結されるペプチドは一種だけでもよく、２又はそれ以上のペプチドであってもよい。尚、ヘミセルラーゼがシグナルペプチドとの融合タンパク質の場合は、分泌可能な宿主細胞中で発現した後、シグナルペプチドが切断されてヘミセルラーゼ部分のみが細胞外に分泌され得る。また、分泌されない場合であっても、宿主細胞内でシグナルペプチドが切断されて、成熟タンパク質が生成することがある。ヘミセルラーゼが融合タンパク質の場合、前記の相同性は、それらの他のペプチドを除いた成熟タンパク質部分における相同性である。
【００２５】
マーカーペプチドとしては、マーカーとして機能し得るペプチドであれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のFc領域、HRP、GFPなどを具体的に挙げることができる。また、ペプチドタグとしては、特に制限されないが、Mycタ
グ、Hisタグ、FLAGタグ、GSTタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。また、分泌シグナルペプチドとしては、ヘミセルラーゼ自体の分泌シグナルペプチドの他、ヘミセルラーゼをコードするＤＮＡを発現させる宿主で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、コリネ型細菌を宿主として用いる場合は、コリネ型細菌由来のSec系及びTat系分泌経路の分泌シグナルペプチド（WO01/23591、WO2005/103278参照）が挙げられる。融合タンパク質は、常法により作製することができる。
【００２６】
＜２＞ヘミセルラーゼをードするＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記のヘミセルラーゼをコードする。具体的には、前記（１）〜（５）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、より具体的には、配列番号３の115〜1719位（Xyn5Aをコードする）、配列番号５の136〜1479位（Xyn10Bをコードする）、配列番号８の85〜633位（Xyn11Aをコードする）、配列番号１１の109〜1689位（Xyn30Aをコードする）
、及び、配列番号１３の79〜1902位の塩基配列（Xyn43Aをコードする）を有するＤＮＡが挙げられる。また、これらのアミノ酸配列を有するタンパク質の保存的バリアントをコードするＤＮＡであってもよい。さらに、上記配列の5'末端側に、開始コドン、及び／又は他のペプチドをコードする塩基配列を含んでいてもよい。また、上記配列の3'末端に終始コドンを含んでいてもよい。
【００２７】
本発明のＤＮＡは、これらのものに限定されず、コード領域において各アミノ酸をコードするコドンを同じアミノ酸をコードする他の等価のコドンに置換したものであってもよい。
【００２８】
また、本発明のＤＮＡには、前記塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ、又は前記相補的な塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘミセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば
、50％以上、65％以上、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダ
イズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサ
ザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃
度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイ
ゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1％ SDSが挙げられる。
【００２９】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの非限定的な例としては、Myers 及び Miller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Ｍath. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunsch (1970) J. Ｍol. Biol. 48:443 453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性を検索する方法、Karlin 及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877に記載されているような、改良された、Karlin及びAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムが挙げられる。
【００３０】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、HigGlns et al. (1988) Gene 73:237 244 (1988)、HigGlns et al. (1989) CABIOS 5:151 153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 331によく記載されている。
【００３１】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア
＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸
配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、
スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパ
ク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的
としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用
できる。また、PSI-BLAST (BLAST 2.0)を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を
行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００３２】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００３３】
＜３＞ヘミセルラーゼの製造
本発明のヘミセルラーゼは、例えば、実施例３に示したように、パエニバチルス・エスピー（Paenibacillus sp.）H2C株の培養液から取得することができる。H2C株は、2016年4月15日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NPMD）（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  122号室）に、識別の表示AJ111229、受託番
号NITE BP-02241として、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００３４】
また、本発明のヘミセルラーゼは、それらをコードするＤＮＡを適当な宿主で発現させることにより製造することができる。ヘミセルラーゼをコードするＤＮＡ（同ＤＮＡ又はそれにプロモーター等の配列が付加されたものを、ヘミセルラーゼ遺伝子とも記載する）は、それらのアミノ酸配列が明らかとなったので、化学合成することによって調製することができる。また、それらの配列に基づいてパエニバチルス・エスピーH2C株からＰＣＲ
法等によりクローニングすることもできる。
【００３５】
本発明において、「ヘミセルラーゼ遺伝子の発現が強化された宿主」とは、ヘミセルラーゼ遺伝子が発現可能な状態で導入された宿主、及び、ヘミセルラーゼ遺伝子を保持する微生物において同遺伝子の発現が強化された宿主を意味する。
【００３６】
宿主は、ヘミセルラーゼを発現できるものであれば特に制限されない。宿主としては、例えば、細菌、真菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。好ましい宿主としては、細菌や真菌等の微生物が挙げられる。
【００３７】
細菌としては、グラム陰性細菌やグラム陽性細菌が挙げられる。グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）
属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する
細菌が挙げられる。グラム陽性細菌としては、バチルス（Bacillus）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌等のコリネ型細菌、放線菌が挙げられる。エシェリ
ヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。コリネ型細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）やコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株
（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株；エシェリヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株やそのrecA-株であるBLR(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれ
らの派生株が挙げられる。
【００３８】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所1230
1 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する
登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。また、BL21(DE3)株は、例えば、ライフ
テクノロジーズ社より入手可能である（製品番号C6000-03）。
【００３９】
ヘミセルラーゼ遺伝子を宿主に導入する手法は特に制限されない。宿主において、ヘミセルラーゼ遺伝子は、当該宿主で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主において、ヘミセルラーゼ遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。宿主は、ヘミセルラーゼ遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピーで有していてもよい。宿主は、１種類のヘミセルラーゼ遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類のヘミセルラーゼ遺伝子を有していてもよい。
【００４０】
ヘミセルラーゼ遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、ヘミセルラーゼ遺伝子固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、ヘミセルラーゼ遺伝子の固有のプロモーターよりも強力なプロモーターであってもよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において機能する強力なプロモーターとしては、例えば、T7プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプ
ロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌において機能する強力なプロモーターとしては、人為的に設計変更されたP54-6プロモー
ター（Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（EF-Tu）プロモータ
ー（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、真菌、例えばタラロマイセス・セルロリティカス（Talaromyces cellulolyticus）等において機能するプロモーターとしては、例えば、glaAプロモーターや、セルラーゼ遺伝子やキシラナーゼ遺伝子等の糖質加水分解酵素をコードする遺伝子のプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic
promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００４１】
また、ヘミセルラーゼ遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、ヘミセルラーゼ遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体
的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。
【００４２】
ヘミセルラーゼ遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主に導入することができる。ヘミセルラーゼ遺伝子を含むベクターを、ヘミセルラーゼ遺伝子の発現ベクターまたは組み換えベクターともいう。ヘミセルラーゼ遺伝子の発現ベクターは、例えば、ヘミセルラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主で機能するベクターと連結することにより、構築することができる。ヘミセルラーゼ遺伝子の発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同ベクターが導入された形質転換体が得られる、すなわち、同遺伝子を宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、ベクターは、形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック
社）、pKK233‐2（クロンテック社）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター
（キアゲン社）、pCold TF DNA（TaKaRa）、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号
明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報
に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11；特開平10-215883号公報に記載のpVK7；特開平9-070291号公報に記載のpVC7が挙げられる。Talaromyces cellulolyticus等の真菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pANC202（J Ind Microbiol Biotechnol. 2013 Aug;40(8):823-30）が挙げられる。発現ベク
ターの構築の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含むヘミセルラーゼ遺伝子をそのままベクターに組み込んでもよく、ヘミセルラーゼのコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してからベクターに組み込んでもよく、ベクター上にもともと備わっているプロモーターの下流にヘミセルラーゼのコード領域を組み込んでもよい。
【００４３】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００４４】
また、ヘミセルラーゼ遺伝子は、例えば、宿主の染色体上へ導入することができる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーショ
ン(Red-driven integration)法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製
起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ
以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トラン
スポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入すること
もできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。染色体への遺伝子の導
入の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含むヘミセルラーゼ遺伝子をそのまま染色体に組み込んでもよく、ヘミセルラーゼのコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してから染色体に組み込んでもよく、染色体上にもともと存在するプロモーターの下流にヘミセルラーゼのコード領域を組み込んでもよい。
【００４５】
また、本発明のヘミセルラーゼをコードする遺伝子を保持するパエニバチルス属細菌の同遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を、より強力な発現調節配列で置換することによって、ヘミセルラーゼ遺伝子の発現を強化することができる。
【００４６】
染色体上に遺伝子が導入されたことは、例えば、同遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、または同遺伝子の塩基配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCRによって確認できる。
【００４７】
形質転換法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol.
Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。また、形質転換法としては、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、形質転換法としては、コリネ
型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791号公報）を利用することもできる。
【００４８】
ヘミセルラーゼ遺伝子を有する宿主を培地で培養することにより、ヘミセルラーゼを発現することができる。その際、必要に応じて、ヘミセルラーゼ遺伝子の発現誘導を行うことができる。遺伝子の発現誘導の条件は、遺伝子の発現系の構成等の諸条件に応じて適宜選択することができる。
【００４９】
培地や培養条件は、ヘミセルラーゼ遺伝子を有する宿主が増殖でき、ヘミセルラーゼが生産される限り、特に制限されない。培地や培養条件は、宿主の種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。培養は、例えば、細菌や真菌等の微生物を培養に利用される通常の培地を用いて通常の条件で実施することができる。細菌を培養するための具体的な培地組成や培養条件については、例えば、エシェリヒア・コリやコリネ型細菌等の細菌を利用した各種物質生産に利用される培地組成や培養条件を参照することができる。
【００５０】
培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、当業者が適宜設定することができる。
【００５１】
炭素源は、ヘミセルラーゼ遺伝子を有する宿主が利用できるものであれば、特に限定されない。炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。また、炭素源としては、後述のヘミセルロース成分を含むバイオマスも挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【００５２】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【００５３】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【００５４】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【００５５】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビ
タミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【００５６】
培養は、例えば、液体培地を用いて、通気培養または振盪培養により、好気的に行うことができる。培養温度は、例えば、15〜43℃であってよい。培養中のpHは、例えば、5〜9であってよい。培養期間は、例えば、2時間〜20日であってよい。培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、ま
たはそれらの組み合わせにより実施することができる。また、培養は、前培養と本培養とに分けて実施してもよい。例えば、前培養を寒天培地等の固体培地上で行い、本培養を液体培地で行ってもよい。
【００５７】
上記のようにしてヘミセルラーゼ遺伝子を有する宿主を培養することにより、ヘミセルラーゼを含有する培養物が得られる。ヘミセルラーゼは、例えば、宿主の菌体内および／または培地中に蓄積し得る。「菌体」は、宿主の種類に応じて、適宜「細胞」と読み替えてよい。
【００５８】
ヘミセルラーゼが生産されたことは、例えば、培養上清又は菌体抽出物等の適当な画分のヘミセルラーゼ活性を測定することにより確認できる。
【００５９】
ヘミセルラーゼは、培養物等に含まれたまま使用してもよく、適宜、培養物等から分離
精製し粗酵素画分又は精製酵素として使用してもよい。
【００６０】
すなわち、例えば、宿主の菌体内にヘミセルラーゼが蓄積する場合、適宜、菌体を破砕、溶解、または抽出等し、ヘミセルラーゼを回収することができる。菌体は、遠心分離等により培養物から回収することができる。細胞の破砕、溶解、または抽出等は、公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、例えば、超音波破砕法、ダイノミル法、ビーズ破砕、フレンチプレス破砕、リゾチーム処理が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。また、例えば、培地にヘミセルラーゼが蓄積する場合、遠心分離等により培養上清を取得し、培養上清からヘミセルラーゼを回収することができる。
【００６１】
ヘミセルラーゼの精製は、酵素の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。ヘミセルラーゼの精製は、所望の程度に行うことができる。
【００６２】
また、精製されたヘミセルラーゼに限られず、ヘミセルラーゼを含有する任意の画分を「ヘミセルラーゼ」としてヘミセルロースの分解等の用途に利用してもよい。ヘミセルラーゼを含有する画分は、ヘミセルラーゼがヘミセルロースに作用できるように含有される限り特に制限されない。そのような画分としては、例えば、培養物、培養上清、菌体処理物（破砕物、溶解物、抽出物（無細胞抽出液）、等）、それらの部分精製物（粗精製物）、それらの組み合わせが挙げられる。これらの画分は、いずれも、単独で利用されてもよいし、精製されたヘミセルラーゼと共に利用されてもよい。
【００６３】
なお、培養物には、本発明のヘミセルラーゼとともに、前記のような本発明のヘミセルラーゼとは異なる他の酵素も生成蓄積し得る。ヘミセルラーゼは、そのような他の酵素との混合物として回収されてもよく、そのような他の酵素と分離して回収されてもよい。
【００６４】
ヘミセルラーゼは、適宜、製剤化してもよい。剤形は特に制限されず、ヘミセルラーゼの使用用途等の諸条件に応じて適宜設定することができる。剤形としては、例えば、液剤、懸濁剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤が挙げられる。製剤化にあたっては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、矯味剤、矯臭剤、香料、希釈剤、界面活性剤等の薬理学的に許容される添加剤を使用することができる。
【００６５】
＜４＞ヘミセルラーゼの利用
ヘミセルラーゼは、ヘミセルロースの分解等の用途に利用できる。例えば、ヘミセルラーゼでヘミセルロース系基質を処理することにより、糖化物を製造することができる。
ヘミセルラーゼは、ヘミセルラーゼをそのまま用いてもよいし、ヘミセルラーゼとヘミセルラーゼ以外の成分を含む酵素製剤として用いてもよい。セルラーゼ以外の成分としては、担体、賦形剤、ｐＨ調整剤等が挙げられ、通常の酵素製剤に用いられる成分を適宜使用することができる。ヘミセルラーゼは、遊離の状態で利用されてもよいし、樹脂等の固相に固定化された固定化酵素の状態で利用されてもよい。また、本発明のヘミセルラーゼの２種又は３種以上を含むヘミセルラーゼ製剤（ヘミセルラーゼ混合物）を用いてもよい。又、他の酵素、例えば、本発明のヘミセルラーゼとは異なるヘミセルラーゼや、キシラナーゼ、キシロビアーゼ（β−キシロシダーゼ）、アラビノフラノシダーゼ、及びセルラーゼを併用してもよい。複数の酵素を使用する場合は、それらの酵素は同時にヘミセルロース系基質に作用させてもよく、順次又は別々に作用させてもよい。
【００６６】
ヘミセルロース系基質としては、例えばヘミセルロースを含むバイオマス資源が挙げられる。バイオマス資源とは、植物や藻類が生産する、ヘミセルロース成分を含むセルロース系及び／又はリグノセルロース系バイオマスを包含し、そのようなバイオマスには、例えば、コーンDDGS等のDDGS、バガス、木材、ふすま、麦わら、稲わら、もみがら、大豆粕、大豆オカラ、コーヒー粕、コメ糠等が含まれる。
【００６７】
バイオマス資源の分解または糖化のための手法としては、公知の方法を用いることが出来る。例えば用いられるバイオマス資源は、乾燥物でも、また湿潤物でもよいが、処理効率を高めるために予め100-1000μmサイズに粉砕されていることが好ましい。この粉砕は
ボールミル、振動ミル、カッターミル、ハンマーミル等の機械を用いて行うことが出来る。粉砕したバイオマス資源を水性媒体中に懸濁し、本発明のヘミセルラーゼ、及び必要に応じてセルラーゼを加え、攪拌しながら加温して、バイオマス資源を分解または糖化することが出来る。
上記方法において、反応液のpHおよび温度は、ヘミセルラーゼ及びセルラーゼが失活しない範囲であればよい。例えば、一般的に常圧で反応を行う限り、温度は5-70℃、好ましくは25-60℃、より好ましくは35〜50℃、pHは3.0〜10.0好ましくは5.0〜8.0の範囲でよい。例えば、セルラーゼとしてNovozymes社のCellic Ctecを用いる場合は、35〜55℃、pH4.5〜6.0の条件が挙げられる。酵素量としては、0.1〜0.5%(w/w TS, total solid)が挙げられる。反応時間は、酵素量等により適宜設定することができる。
本発明のヘミセルラーゼの酵素量は特に制限されず、予備実験を行う等して適宜設定すればよい。
【００６８】
上記のようにしてバイオマス資源を分解すると、好ましい形態では主としてグルコースが生成するが、キシロース、マンノース、アラビノース等の糖も生成する。得られた糖液は、用途に応じて、さらに化学反応又は酵素反応によって異性化又は分解させてもよい。
得られた糖液は、用途に応じて、そのまま使用することもできるし、水分を除去して乾燥物として使用することもできる。また、糖液中の成分は適宜分画して使用してもよい。分画物には、粗精製物及び精製物も含まれる。精製物としてはグルコースが挙げられる。
【００６９】
前記方法により得られた糖液又はその分画物は、例えば、発酵法により目的物質の製造における炭素源として用いることができる。目的物質としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコールが挙げられる。その他、酢酸、乳酸、プロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、核酸が挙げられる。
【００７０】
また、本発明のヘミセルラーゼは、動物飼料組成物の成分として利用することもできる。動物飼料組成物は、ヘミセルラーゼを含むこと以外は、摂取させる動物の種類に応じて、通常の飼料組成物と同様の成分を用いて、通常の方法により製造することができる。ヘミセルラーゼもしくはそれを含む酵素製剤、又は後述するヘミセルラーゼを含む動物用飼料添加物を、飼料組成物の製造工程のいずれかの段階で添加するか、または、通常の飼料組成物にセルラーゼもしくはそれを含む酵素製剤、又は動物用飼料添加物を添加、混合することによって、本発明の動物飼料組成物が得られる。ヘミセルラーゼは１種でもよく、２種以上の組み合わせであってもよい。ヘミセルラーゼ以外の飼料の成分は特に制限されないが、ヘミセルロース系基質を含むバイオマス資源、例えば大豆粕、コーン、DDGS、マイロ、大麦、小麦、小麦フスマ、キャッサバ、米ぬか等を含むことが好ましい。また、動物飼料組成物は、本発明のヘミセルラーゼ以外のヘミセルラーゼ、及び／又は他の酵素、例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、フィターゼ、リパーゼ等を含んでいてもよい。飼料の対象となる動物は特に制限されないが、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ等の反芻動物や、ブタ、イノシシ等の家畜、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等の家禽類等が挙げられる。飼料の形態は特に制限されず、マッシュ状、ペレット状
、粒状、クランブル状、フレーク状、粉末状等、いずれの形態であってもよい。
【００７１】
また、ヘミセルラーゼ又はそれを含む酵素製剤は、動物用飼料添加物として使用することもできる。動物用飼料添加物は、典型的には、動物用飼料投与前に飼料に添加、混合される。また、動物用飼料添加物は、飼料とは別に動物に投与されるか、又は、飼料とは別体として、飼料と同時に動物に投与されてもよい。後者のように、動物用飼料添加物が、投与前に動物用飼料と混合されない場合は、動物用飼料添加物は動物用飼料利用促進用の酵素製剤ということもできる。本発明において「動物用飼料添加物」とは、このような酵素製剤を包含するものである。
【００７２】
動物用飼料添加物は、ヘミセルラーゼ又はそれを含む酵素製剤そのものであってもよく、他の飼料添加物成分を含んでいてもよい。他の飼料添加物成分を含む場合、飼料添加物（飼料添加物組成物）は、摂取させる動物の種類に応じて、通常の飼料添加物と同様の成分を用いて、通常の方法により製造することができる。ヘミセルラーゼもしくはそれを含む酵素製剤を、飼料添加物の製造工程のいずれかの段階で添加するか、または、通常の飼料組成物にセルラーゼ又はそれを含む酵素製剤を添加、混合することによって、本発明の動物飼料組成物が得られる。ヘミセルラーゼは１種でもよく、２種以上の組み合わせであってもよい。
【００７３】
ヘミセルラーゼ以外の成分としては、担体、賦形剤、崩壊剤、希釈剤、抗酸化剤、粘結剤、栄養補助成分、栄養成分の利用促進剤等が挙げられる。担体としては、澱粉、マルトデキストリン、炭酸カルシウム、サイクロデキストリン、小麦又は小麦成分、スクロース、グルコース、硫酸ナトリウム、タルク、ポリビニルアルコール、ソルビトール、グリセロール、安息香酸塩、ソルビン酸塩、プロピレングリコール、1,3-プロパンジオール、パラベン、食塩、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、ピロ亜硫酸塩、ギ酸塩等が挙げられる。賦形剤としては、微結晶セルロース等のセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、グリシン、澱粉、ラクトース、高分子量ポリエチレングリコール等が挙げられる。崩壊剤としては、澱粉、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、特定の複合ケイ酸塩（certain complex silicate）等が挙げられる。希釈剤としては、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等が挙げられる。抗酸化剤としては、エトキシキン、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール等が挙げられる。粘結剤としては、アルギン酸ナトリウム、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロピレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等が挙げられる。栄養補助成分としては、アミノ酸、ビタミン、ミネラル等が挙げられる。栄養成分の利用促進剤等としては、抗菌剤、抗生物質、着香料、呈味料、酵素、生菌剤等が挙げられる。
【００７４】
上記のような各成分は、１種でもよく、任意の複数種の組み合わせであってもよい。また、動物用飼料添加物は、本発明のヘミセルラーゼ以外の酵素を含んでいてもよい。そのような酵素は、動物用飼料について記載したのと同様であってよい。
【００７５】
動物用飼料添加物の形態は特に制限されず、マッシュ状、ペレット状、粒状、クランブル状、フレーク状、粉末状等、いずれの形態であってもよい。飼料添加物が粉末状の場合は、酵素を含む溶液をそのまま、又は酵素溶液を上記のような成分と混合したものを、スプレードライ等で粉末化することにより、製造することができる。
【００７６】
本発明のセルラーゼ、それを含む酵素製剤、及び動物用飼料添加物は、飼料を動物に摂取させる前に、飼料の前処理剤として使用してもよい。前処理の条件は、前記のバイオマス資源の分解または糖化における反応条件に準じて設定することができる。
飼料又は飼料添加物中のヘミセルラーゼの含量は特に制限されず、飼料に含まれるバイ
オマス資源の種類や量に応じて適宜設定することができる。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００７８】
〔実施例１〕コーンNSP分解菌の分離と菌株同定
１）集積培養によるコーンNSP分解菌のスクリーニング
NSPとしてコーン種皮由来不溶性繊維抽出物（日食セルファー、日本食品化工製、セル
ファー（CELLFER）は同社の商標）を唯一の炭素源とする培地を調製し、日本国内より採
取した約５０の土壌試料を用いて集積培養を行った。集積培養用の培地は、NH4NO3 1.0g
、K2HPO41.0g、NaH2PO4・2H2O 1.3g、MgSO4・7H2O 0.2g、FeSO4・7H2O 0.01g、MnSO4・7H2O 0.01g、ZnSO4・7H2O 0.01g、CaCl2・2H2O 0.01g および日食セルファー2gを、超純水
で1.0Lになるように溶解することにより調製した。この培地のpHは6.7であった。以下、
この培地をコーンNSP含有集積培養培地とよぶ。また、この培地に寒天を加えた固体培地
をコーンNSP含有集積培養固体培地とよぶ。さらに、固体培地上で生育した微生物が生産
するキシラナーゼの活性をハローによって観察する目的で、日食セルファーの代わりに0.5%Oat spelt（スペルト小麦）由来不溶性キシラン（Sigma）を加えた固体培地も調製した。その際、超音波洗浄器（FU-10C、東京硝子器械）を用いた超音波処理により、キシラン粒子を均一化した。以下、この培地をOat speltキシラン含有集積培養固体培地とよぶ。
【００７９】
土壌試料スパチュラ１杯分を滅菌水1mLに懸濁し、１分間程度静置した。上清を50μL取り、培養試験管中のコーンNSP含有集積培養培地2mLに植菌した。これをウォーターバスシェーカーパーソナル11（タイテック）を用いて、室温にて160rpmで振とう培養した。２週間以上経過後、培養試験管を目視で観察し、コーンNSPに起因する培地の濁りが減少した
試験管を選抜した。
【００８０】
２）ジニトロサリチル酸法によるコーンNSP加水分解活性の測定
上記培養液を遠心分離（4℃、20,400×g、10分間）し、培養上清を得た。この培養上清を用いて以下の手順でコーンNSPの加水分解反応を行い、生じた還元末端量を、ジニトロ
サリチル酸を用いた発色法（Sumner, J.B. et al., J. Biol. Chem. 65, 393-395, 1925
）で定量した。まず、コーンNSP（日食セルファー）を、終濃度1.5%となるようにpH6.0に調整した50 mM Britton-Robinson緩衝液に懸濁した。この懸濁液を超音波洗浄器を用いて30分間超音波処理し、基質溶液とした。基質溶液80μLに酵素試料20μLを加え、37℃で24時間反応した。酵素反応後、1M NaOH 100μLを加えて反応を停止した。遠心分離（4℃、7,000×g、5分間）にて不溶性基質を沈澱させ、上清を100μL回収した。
【００８１】
上記上清100μLに前記Sumner, J.B. et al.に記載の方法で調製した発色試薬100μLを
加え、100℃で5分間煮沸した。氷冷した後、超純水550μLを加えて希釈した。波長545nm
における吸光度を測定し、基質の加水分解により生じた還元末端量を定量した。
【００８２】
以上のように培養上清についてコーンNSP加水分解活性を測定し、コーンNSP加水分解能を示す試験管を特定した。
【００８３】
３）単一クローンの取得と菌株の同定
コーンNSP加水分解活性が認められた試験管の培養液をコーンNSP含有集積培養固体培地に塗布し、室温にて培養した。生育した微生物を滅菌水に懸濁し、段階希釈した後、Oat speltキシラン含有集積培養固体培地に塗布し、室温で培養した。キシラナーゼ活性によ
る固体培地上のハローを指標として、単一クローンを取得し、H2C株と命名した。
【００８４】
H2C株の同定は、形態観察、生理・生化学的性状試験および16S rDNAの塩基配列解析に
よって行った。本菌は運動性を有するグラム陰性の桿菌で、芽胞を形成し、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応はともに陽性を示す微生物であることがわかった。これらの性状に加え、16S rDNAの塩基配列解析においてパエニバチルス（Paenibacillus）属の塩基
配列と94.4〜97.4%の高い相同性を示したことなどから、パエニバチルス属に分類される
ことが明らかとなった。さらに、細菌同定検査キットAPI50CHB (ビオメリュー)を用いた
生理・生化学試験を行った。その結果、H2C株はL-アラビノース、D-キシロースおよびグ
ルコースなどを酸化し、グリセロール、エリスリトールおよびD-アラビノースなどを酸化せず、β-ガラクトシダーゼ活性を示し、アセトインを産生せず、ゼラチンを加水分解せ
ず、硝酸塩を還元しなかった。これらの性状と完全に一致するパエニバチルス属の既知種は見当たらなかった。以上のことから、H2C株はパエニバチルス属に含まれると考えられ
たが、16S rDNA塩基配列解析の結果及び生理・生化学性状試験の結果は、共にH2C株がパ
エニバチルス属の既知種とは異なることを示唆し、パエニバチルス属の新種と構成する可能性も考えられた。以上より、本菌をパエニバチルス・エスピー（Paenibacillus sp.）H2C株と命名した。
【００８５】
〔実施例２〕ゲノム配列の決定
H2C株のゲノム配列を、以下の手順で次世代シーケンサーにより解析した。
H2C株を50mLのLB培地に植菌し、30℃、120rpmで２日間振とう培養した。得られた菌体
を遠心分離により集菌し、Genomic tip 100/G（Qiagen）を用いて、添付の説明書に従っ
てゲノムDNAの抽出を行った。得られたゲノムDNAを用い、Nextera DNA Sample Prep Kit
（Illumina）によりライブラリー調製を行い、次世代シークエンサーMiSeq v2（Illumina）、及びMiSeq Reagent Kit v2 500 cycle（illumina）を用いてゲノム配列を解析した。Genaris Annotation System（ジナリス）によりORF予測、およびアノテーションの付与を行った。得られた配列をアセンブルした結果、109のコンティグが得られ、6,988,404bpの塩基配列が決定された。また、遺伝子同定の結果、6,128のCDSが予測された。
【００８６】
〔実施例３〕コーンNSP分解活性による酵素の同定（Xyn5A、Xyn10B、Xyn11A、Xyn30A）
H2C株の培養液上清をコーンNSP加水分解活性を指標に分画し、同活性を有する酵素とその遺伝子の特定を行った。
１）フロログルシン酢酸法によるコーンNSP加水分解活性の測定法
コーンNSP（日食セルファー）を基質として反応を行い、コーンNSPから遊離して生じた可溶性アラビノキシランの量をフロログルシン酢酸法（Sakka M. et al., Appl. Environ. Microbiol., 77(12):4260-4263, 2011）により測定することで、酵素活性を評価した。
【００８７】
まず、日食セルファーを、終濃度2.5%となるように50mM Britton-Robinson緩衝液（pH 6.0）に懸濁し、基質溶液とした。基質溶液400μLに酵素試料100μLを加え、pH6.0、37℃で２時間反応した。酵素反応後、100℃で５分間煮沸して反応を停止した。遠心分離（4℃、7,000×g、5分間）にて不溶性基質を沈澱させ、上清を100μL回収した。一方、酢酸11mL、塩酸0.2mL、20%フロログルシノール（東京化成）を含むエタノール溶液0.5mL、1.75%
グルコース溶液0.1mLを混合し、フロログルシン酢酸試薬を調製した。前記上清100μLに
フロログルシン酢酸試薬500μLを加え、100℃で25分間煮沸した。氷冷した後、波長552nmおよび510nmにおける吸光度を測定し、その差分(A552-A510)を算出した。同様に上清の代わりに標準品としてキシロース溶液を用いて発色反応と吸光度の測定を行い、A552-A510
の値で検量線を作成した。この検量線を用いて各試料中に含まれるペントース量を算出し、酵素反応による加水分解で生じた可溶性アラビノキシランの量とした。
【００８８】
２）H2C株培養上清の調製
H2C株の培養にはLB培地を用いた。誘導物質として、コーンNSP（日食セルファー）を終濃度0.2%になるように加えた。振とう培養装置（エイブル、ML-316）にて、30℃で振とう培養した。48時間後、1.5LのH2C株培養液を取得した。培養液を遠心分離（4℃、29,100×
g、10分間）し、得られた上清をフィルターろ過（0.20μm）した。この上清に硫酸アンモニウムを終濃度0.7Mとなるように添加し溶解させ、生じた沈殿物を遠心分離（4℃、29,100×g、10分間）により除去 した。得られた上清をフィルターろ過（0.20μm）し、酵素精製の出発材料として用いた。
【００８９】
３）カラムクロマトグラフィーによる分画法
酵素の分画、精製は、以下に示す各種のカラムクロマトグラフィーの組み合わせにより行った。得られた画分のコーンNSP加水分解活性は、フロログルシン酢酸法により測定し
た。
【００９０】
（ａ）HiLoad 16/10 Phenylsepharoseによる疎水性相互作用クロマトグラフィー
２）で調製した試料を、0.7M硫酸アンモニウムを含む0.05M Tris-HCl緩衝液（pH 7.0）を用いて平衡化したHiLoad 16/10 Phenylsepharoseカラム（GE Healthcare）にアプライ
した。カラムを同緩衝液で洗浄した後、0.7〜0 Mの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により、吸着タンパク質を溶出した。
【００９１】
（ｂ）HiTrap Q HPによる陰イオン交換クロマトグラフィー
遠心式フィルターユニット（Amicon Ultra-15 10kDa、メルクミリポア）により試料中
の緩衝液を20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）に交換した。この試料を、同緩衝液を用いて平衡化したHiTrap Q HP, 5mLカラム（GE Healthcare）にアプライした。カラムを同緩衝
液で洗浄した後、0〜1M のNaCl直線濃度勾配により、吸着タンパク質を溶出した。
【００９２】
（ｃ）HiTrap SP HPによる陽イオン交換クロマトグラフィー
Amicon Ultra-15 10kDaにより試料中の緩衝液を50mM MESナトリウム緩衝液（pH 6.0）
に交換した。この試料を、同緩衝液で平衡化したHiTrap SP HP, 5mLカラム（GE Healthcare）にアプライした。カラムを同緩衝液で洗浄した後、0〜1MのNaCl直線濃度勾配により
、吸着タンパク質を溶出した。
【００９３】
（ｄ）HiLoad 16/600 Superdex 200pgによるゲルろ過クロマトグラフィー
Amicon Ultra-15 10kDaにより試料を濃縮した。この試料を、100 mM NaClを含む20mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.0）を用いて平衡化したHiLoad 16/600 Superdex 200 pgカラム（GE
Healthcare）にアプライし、同緩衝液により溶出した。
【００９４】
４）N末端アミノ酸配列解析
精製した画分をAmicon Ultra-15 10kDaにより濃縮し、4〜20%ミニプロティアンTGXプレキャストゲル（バイオラド）を用いて電気泳動により、分離した。分離したタンパク質を、iBlot Dry Blotting system（Thermofisher scientific）を用いて、ゲルからPVDF膜（Min iBlot Gel Transfer Stacks、ThermoFisher scientific）に転写した後、CBB Stain One（ナカライテスク）を用いて染色した。バンドを切り出し、プロテインシーケンサー
（Procise492H、Applied Biosystems）を用いて、N末端アミノ酸配列を決定した。
【００９５】
５）各酵素の精製
ａ）Xyn5AおよびXyn10B
２）で調製した試料を、HiLoad 16/10 Phenylsepharoseカラムクロマトグラフィーに供した。その結果、硫酸アンモニウム濃度0.05Mおよび0.45Mで溶出した２つの画分が高いコーンNSP加水分解活性を示した。硫酸アンモニウム濃度0.05Mで溶出した画分を回収し、緩衝液を交換した後、HiTrap Q HPカラムクロマトグラフィーに供した。その結果、非吸着
画分にコーンNSP加水分解活性が確認された。さらに、HiTrap SP HPカラムクロマトグラ
フィーに供したところ、非吸着画分にコーンNSP加水分解活性が確認された。この画分をSDS-PAGEにより分離したところ複数のバンドが確認され、それぞれのバンドについてN末端
アミノ酸解析の結果、配列番号１および配列番号２に示す部分配列を得た。
【００９６】
これらの部分配列をH2C株ゲノムがコードすると推定されるタンパク質配列に対して検
索した結果、配列番号１の部分配列は、配列番号３の塩基配列がコードする配列番号４の1〜8位のアミノ酸配列に一致した。この配列番号４のタンパク質はGHファミリー5のタン
パク質と相同性の高いことからXyn5Aとした。N末端アミノ酸解析の結果から、Xyn5Aの成
熟タンパク質のアミノ酸配列は配列番号４の1〜535位であり、配列番号３の115〜1719位
の塩基配列にコードされると推定された。また、配列番号２の部分配列は、配列番号５の塩基配列がコードする配列番号６の1〜15位のアミノ酸配列に一致した。この配列番号６
のタンパク質はGHファミリー10のタンパク質と相同性の高いことからXyn10Bとした。N末
端アミノ酸解析の結果から、Xyn10Bの成熟タンパク質のアミノ酸配列は配列番号６の1〜448位であり、配列番号５の136〜1479位の塩基配列にコードされると推定された。
配列番号４の-38〜-1位、及び配列番号６の-45〜-1位は、シグナルペプチドと推定される。
【００９７】
ｂ）Xyn11A
ａ）のHiLoad 16/10 Phenylsepharoseカラムクロマトグラフィーにおいて、硫酸アンモニウム濃度0.45 Mで溶出した画分を回収し、緩衝液を交換した後、HiTrap SP HPカラムクロマトグラフィーに供した。コーンNSP加水分解活性を示す画分をSDS-PAGEに供した結果
、単一バンドが確認された。このバンドのN末端アミノ酸解析を行った結果、配列番号７
に示す部分配列を得た。この配列をH2C株ゲノムがコードすると推定されるタンパク質配
列に対して検索した結果、配列番号８の塩基配列がコードする配列番号９の29〜38位のアミノ酸配列に一致した。このタンパク質はGHファミリー11のタンパク質と相同性の高いことからXyn11Aとした。N末端アミノ酸解析の結果から、Xyn11Aの成熟タンパク質のアミノ
酸配列は配列番号９の1〜183位であり、配列番号８の85〜633位の塩基配列にコードされ
ると推定された。配列番号９の-28〜-1位は、シグナルペプチドと推定される。
【００９８】
ｃ）Xyn30A
ｂ）のHiTrap SP HPカラムクロマトグラフィーの結果、非吸着画分にもコーンNSP加水
分解活性が確認された。得られた非吸着画分をHiTrap Q HPカラムクロマトグラフィーに
供した後、非吸着画分をさらにHiLoad 16/600 Superdex 200 pgカラムクロマトグラフィ
ーに供した。コーンNSP加水分解活性を示す画分をSDS-PAGEに供した結果、単一バンドが
確認された。このバンドのN末端アミノ酸解析の結果、配列番号１０に示す部分配列を得
た。この配列をH2C株ゲノムがコードすると推定されるタンパク質配列に対して検索した
結果、配列番号１１の塩基配列がコードする配列番号１２の37〜50位のアミノ酸に一致した。このタンパク質はGHファミリー30のタンパク質と相同性の高いことからXyn30Aとした。N末端アミノ酸解析の結果から、Xyn30Aの成熟タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１
２の1〜527位であり、配列番号１１の109〜1689位の塩基配列にコードされると推定され
た。配列番号１２の-36〜-1位は、シグナルペプチドと推定される。
【００９９】
ｄ）Xyn43A
H2C株ゲノム配列の解析の結果、GHファミリー43酵素と相同性の高い酵素の遺伝子が見
出され、この酵素をXyn43Aと名付けた。実施例１０に示すように、配列番号１４のアミノ酸配列は、Xyn43Aの前駆体（プロ配列）のアミノ酸配列であると推定される。Xyn43Aの成熟タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１４の1〜608位であり、配列番号１３の79〜1902位の塩基配列にコードされると推定された。配列番号１４の-26〜-1位は、シグナルペプ
チドと推定される。
【０１００】
〔実施例５〕NSP分解酵素のE. coliでの調製
H2C株の培養液上清から同定された４酵素、及び、ゲノム解析により同定されたXyn43A
の組換え酵素を調製した。これらの酵素を、NSP分解酵素と記載することがある。
【０１０１】
１）Xyn10B、Xyn11A、Xyn30A、Xyn43Aの発現株構築
H2C株のゲノムDNAを鋳型として、プライマーP1およびP2（配列番号１５および１６）を用いてXyn10Bをコードする塩基配列を含む領域のPCR増幅を行った。PCR増幅はPrimeStar Max（タカラバイオ）を用いて行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製
し、98℃にて10秒、55℃にて10秒、68℃にて10秒の反応を30サイクル行った。得られたPCR断片を、NdeI、XhoIで消化されたpET-21b(+)ベクター（メルクミリポア）とIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech）を用いて連結した。この連結反応液でE. coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを抽出した。このプラスミドを用いてE. coli BL21(DE3)を形質転換し、Xyn10Bの発現株を得た。同様にしてプライマーP3お
よびP4（配列番号１７および１８）を用いてXyn11Aの発現株を、プライマーP5およびP6（配列番号１９および２０）を用いてXyn30Aの発現株を、プライマーP7およびP8（配列番号２１および２２）を用いてXyn43Aの発現株を、各々作製した。これらの発現株では、Xyn10B、Xyn11A、Xyn30Aについては成熟酵素のC末端にHis-tagが付与されたタンパク質が、Xyn43Aについてはシグナルペプチドを含む前駆体タンパク質のC末端にHis-tagが付与されたタンパク質が発現される。尚、Xyn43Aのシグナルペプチドは、発現後に切断され、成熟タンパク質が生成していると推定される。
【０１０２】
２）Xyn5Aの発現株構築
H2C株のゲノムDNAを鋳型として、プライマーP9およびP10（配列番号２３および２４）
を用いてPCR増幅を行った。PCR増幅は前記と同様にして行った。得られたPCR断片を、BamHI、HindIIIで消化されたpETDuet-1ベクター（メルクミリポア）とIn-Fusion HD Cloning
Kit（Clontech）を用いて連結した。この連結反応液でE. coli JM109を形質転換し、ア
ンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを抽出した。このプラスミドを用いてE. coli BL21(DE3)を形質転換し、Xyn5Aの発現株を得た。本発現株では、N末端にHis-tagが付与されたXyn5Aが発現される。
【０１０３】
３）フザリウム・バーティシリオイデス（Fusarium verticillioides）キシラナーゼのE.
coliでの発現株の構築
対照として、WO2014/020142に記載のFusarium verticillioides由来のキシラナーゼをE. coliで発現する株を構築し、精製酵素を調製した。まず、WO2014/020142のSEQ ID No. 6に記載のFvexyn4遺伝子の配列をE. coliコドンに最適化し、上流にNdeI、下流にXhoIサ
イトを付加した配列をGenScript社に合成委託し、pUC57ベクターのEcoRVサイトに挿入さ
れた形で受領した。次に当該プラスミドを制限酵素NdeI/XhoIで処理した後、アガロース
ゲル電気泳動を行い、Fvexyn4遺伝子を含むDNA断片をゲルから回収した。NdeI/XhoIで処
理したpET21-b(+)にDNA Ligation Kit（タカラバイオ）を用いて連結し、発現型プラスミドを作製した。この溶液でE. coliJM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを抽出した。これらのプラスミドを用いてE. coli BL21(DE3)を形質転換し
た。本形質転換株では、C末端にHis-tagが付与されたFveXyn4が発現される。
【０１０４】
４）組換え酵素の精製
各形質転換株をアンピシリン100mg/Lを含むＬＢ培地で37℃、6時間生育させた。得られた培養液1.6 mLをアンピシリン100mg/Lを含むOvernight Express Instant TB Medium（メルク）160mLに植菌し、坂口フラスコを用いて振とう培養を行った。培養条件はXyn5A、Xyn30Aでは30℃、18時間、Xyn11A、Xyn10B、Xyn43A、FveXyn4では18℃、40時間とした。
培養終了後、得られた培養液より菌体を遠心分離により集め、20mM Tris-HCl（pH7.6）、300mM NaCl、10mM imidazoleからなる緩衝液に懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。
【０１０５】
得られた可溶性画分を、前記緩衝液で平衡化したHis-tagタンパク質精製カラムHisTALON Superflow Cartridge（Clontech製、CV=5 ml。HisTALON、Superflowは同社の商標）に
供して、担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）を前記緩衝液を用いて洗い流した後、前記緩衝液のimidazoleを150mMとした溶液で、5ml/min
の流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。
【０１０６】
酵素が含まれる溶出画分を集めて、Amicon Ultra-15 10kDaを用いて、50mM Britton-Robinson緩衝液（pH 6.0）にバッファー交換し、精製酵素溶液とした。
【０１０７】
また、対照のために、飼料用酵素として市販されているEconase XT（ABVista。Econaseは同社の商標）からキシラナーゼをWO2014/020142の方法に従って精製した。
【０１０８】
得られたそれぞれの精製酵素の濃度をプロテインアッセイLowryキット（ナカライテス
ク）を用いて、Quick Start BSA Standard set（Bio-rad）を標品として測定した。
【０１０９】
〔実施例６〕Xyn5A、Xyn10B、Xyn11A、Xyn30Aのβ-1,4-キシラナーゼ活性の評価
実施例５で調製したXyn5A、Xyn10B、Xyn11A、Xyn30Aの各精製酵素のキシラナーゼ活性
の評価を行った。活性評価の基質としてビーチウッド由来可溶性キシラン（Sigma、X4252）および不溶性コムギアラビノキシラン（Megazyme、P-WAXYI）を用い、酵素反応により
生じた還元末端の生成量を評価した。いずれの基質もβ1−4結合したキシロースを主鎖とする多糖類である。まず、これらの基質を終濃度1.875%となるようにpH6.0に調整した50 mM Britton-Robinson緩衝液に懸濁し、超音波洗浄器による超音波処理を30分間行い、基
質溶液とした。この基質溶液80μLと実施例５で調製した精製酵素溶液の希釈液20μLを加え、37℃で10分間反応した。ブランク試料として酵素溶液の代わりに50 mM Britton-Robinson緩衝液（pH6.0）でも反応を行った。酵素反応後、1M NaOH 100μLを加えて反応を停
止した。遠心分離（4℃、20,400×g、10分間）にて不溶性基質を沈澱させ、上清を回収した。この上清中の還元末端量を、実施例１と同様にしてジニトロサリチル酸法により定量した。標準品としてキシロース溶液を用いて発色反応と吸光度を、同様にして測定することで検量線を作成し、基質の加水分解により生じた還元末端量を定量した。各試料における還元末端量からブランク試料の還元末端量を差し引き、酵素反応により生成した還元末端量を算出した。
【０１１０】
各NSP分解酵素による還元末端生成活性の遊離活性を表１に示す。Xyn5Aは不溶性コムギアラビノキシランのみに、Xyn30Aはビーチウッドキシランのみに、還元末端生成活性を示した。また、Xyn10BおよびXyn11Aは両方の基質に対して還元末端生成活性を示した。以上から、これら４酵素はβ-1,4-キシラナーゼ活性を有することが示された。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
〔実施例７〕Xyn43Aによるα-L-アラビノフラノシダーゼ活性の評価
Xyn43Aが属すると考えられるGHファミリー43は、アラビノキシランから側鎖アラビノースを遊離するα-L-アラビノフラノシダーゼ活性を有することが報告されている（Lagaert
et al., Biotechnology Advances 32, 316-332, 2014）。そこで、Xyn43Aの有するアラ
ビノフラノシダーゼ活性を確認するため、Xyn43Aによる不溶性コムギアラビノキシラン（Megazyme、P-WAXYI）分解反応を行い、アラビノキシランの遊離を評価した。コムギアラ
ビノキシランは、キシラン主鎖にアラビノフラノース（アラビノース）残基がα-1,2および／またはα-1,3結合で結合した構造を有する。
【０１１３】
実施例５で調製したXyn43Aの酵素溶液の希釈液を用いて、実施例６と同様にして不溶性コムギアラビノキシランを基質とする酵素反応を行い、上清を回収した。この上清を希釈し、糖分析用イオンクロマトグラフ（Thermofisher scientific, Dionex ICS-5000+）を
用いて分離した。カラムはCarboPac SA10-4μm（Thermofisher scientific）を使用し、1mM水酸化カリウムで溶出した。分離した糖はパルスドアンペロメトリ検出（PAD）法によ
り検出した。別途、キシロース、アラビノースおよびグルコース標準品を同じ条件で分離し、試料に含まれる各成分の濃度を定量した。
【０１１４】
その結果を図１に示す。Xyn43Aで反応を行った反応液上清からは標品アラビノースと同じ保持時間にピークが検出される一方、ブランク試料ではピークは検出されなかった。以上からXyn43Aはα-L-アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示された。生じたアラ
ビノース量を定量し、酵素重量あたりのアラビノース遊離活性を算出すると2.0μmol/min/mgであった。
【０１１５】
〔実施例８〕各NSP分解酵素のコーンNSP分解活性の評価
１）DDGS分解反応
各NSP分解酵素の活性は、コーンに含まれる不溶性のアラビノキシランを分解し、可溶
化する活性で評価した。まず、飼料として市販されているコーンDDGSを粉砕後、0.25mmメッシュのふるいにかけた。次にコーンDDGSに含まれる可溶性アラビノキシランを予め取り除くため、コーンDDGS 500mgを50mLのチューブ（ファルコン）に量り取り、20mLの蒸留水に懸濁し、37℃で30分間撹拌した。遠心（8,000rpm, 10分）でDDGSを回収し、上清を取り除いた。
【０１１６】
回収したDDGSを10mLの100 mM Britton-Robinson緩衝液（pH 6.5）に懸濁し、蒸留水を
加えて18mLとした。このDDGS懸濁液を、撹拌しながら1.5mLチューブに0.45mLずつ分注し
た。実施例５で調製した酵素溶液を、50 mM Britton-Robinson緩衝液（pH 6.5）で終濃度100μgタンパク質/mLとなるように希釈し、酵素希釈液とした。酵素希釈液を、前記の1.5mLチューブ中のDDGS懸濁液に0.05mLずつ分注し、合計で0.5mLとなるようにした（反応液
中の酵素濃度10μg/mL、DDGS濃度約25mg/mL）。これらのチューブをローテーターに設置
し、37℃のインキュベーター内で５時間撹拌することで、DDGSの分解反応を行った。それぞれの酵素は３反応ずつ行い、対照として、酵素希釈液の代わりに50mM Britton-Robinson緩衝液（pH 6.5）を添加した反応も行った。また、酵素の混合による効果を評価するた
め、２種類の酵素希釈液を等量ずつ混合した組成でも反応を行った（反応液中に各酵素は5μg/mLずつ含まれ、酵素濃度の合計は10μg/mLとなる）。
【０１１７】
反応後、各チューブを100℃、２分間加熱することで反応を停止した。さらに反応液を
孔径0.22μm のUltrafree-MC遠心式フィルターユニット（メルクミリポア）で遠心ろ過することでDDGSを取り除き、ろ液を回収し可溶性画分とした。
【０１１８】
２）可溶性画分に含まれるアラビノキシラン量の測定
可溶性画分を0.4 Mの硫酸に混合し、125℃で１時間加熱することにより加水分解した。この加水分解物を、実施例７と同様にして糖分析用イオンクロマトグラフにより分離し、キシロース及びアラビノースの濃度を定量した。可溶性画分に含まれるキシロースとアラビノース濃度を合計した値を遊離アラビノキシラン濃度とした。
得られた結果を図２に示す（N=3、エラーバーは標準偏差）。
【０１１９】
パエニバチルス由来のNSP分解酵素は、いずれもコーンDDGSからアラビノキシランを遊
離する活性を有することが確認された。また、いずれの酵素もEconase XTから精製したキシラナーゼと比べてより多くのアラビノキシランを遊離できることが示された。さらに、異なる酵素を混合することにより、酵素を単独で作用させた場合よりもさらに多くのアラビノキシランを遊離できた。
【０１２０】
〔実施例９〕NSP分解酵素の添加濃度と遊離アラビノキシラン濃度の評価
酵素濃度とDDGSからの遊離アラビノキシラン濃度との関係を評価するため、実施例８より酵素濃度が低い条件におけるコーンDDGS分解活性を評価した。
実施例５で調製した精製酵素溶液を終濃度0.1μg/mLまたは1μg/mLとなるように希釈した溶液を用い、実施例８の１）と同様の方法で反応を行った（反応液中の酵素濃度は10ng/mLまたは100ng/mL）。また、実施例８の２）と同様の方法で可溶性画分に含まれるアラ
ビノキシラン濃度を定量した。
【０１２１】
結果を図３に示す（N=3、エラーバーは標準偏差）。Xyn5Aは酵素濃度が10ng/mL及び100ng/mLのいずれの条件においても、FveXyn4と比較してより多くのアラビノキシランをDDGSから遊離することが示された。
【０１２２】
〔実施例１０〕Xyn43Aの成熟タンパク質N末端の解析
実施例５と同様にして精製したXyn43Aを限外ろ過により濃縮し、Mini-Protean TGX Precast Gels 4-20%（Bio-Rad）を用いてSDS-PAGEに付した後、iBlot Gel Transfer Stacks
（ThermoFisher scientific）及びiBlot Dry Blotting systemを用いてPVDF膜に転写した。PVDF膜をCBB（CBB Stain One、ナカライテスク）を用いて染色しバンドを切り出し、プロテインシーケンサー（Procise492H、Applied Biosystems）を用いて10アミノ酸のN末端アミノ酸配列を決定した。結果を配列番号２５に示す。配列番号１４に示すXyn43Aのアミノ酸配列と比較すると、N末端から27〜36番位（配列番号１４では1〜10位）のアミノ酸配列と7アミノ酸が一致した。以上からN末端から26位（配列番号１４の-1位）のAlaと2位（配列番号１４の1位）のAlaの間で切断が起こり、成熟タンパク質が生じていると推察された。アミノ酸配列が完全には一致しなかった原因としては、精製酵素への前駆体の混入が考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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