(57)【要約】【課題】標的物質を高感度に検出可能なプローブ分子として利用可能なアプタマーの製造方法およびそのアプタマーを具備したセンサーを提供する。【解決手段】アプタマーの製造方法によれば、異なる塩基配列を持った複数の核酸を、多環芳香族に吸着させ、前記多環芳香族に吸着した前記複数の核酸に、検出対象としたい標的物質を供給し、前記標的物質と会合して前記多環芳香族から脱離した核酸を選別する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる塩基配列を持った複数の核酸を、多環芳香族に吸着させ、
前記多環芳香族に吸着した前記複数の核酸に、検出対象としたい標的物質を供給し、
前記標的物質と会合して前記多環芳香族から脱離した核酸を選別する、
アプタマーの製造方法。
【請求項２】
前記多環芳香族がカラムの表面に形成され、
前記異なる塩基配列を持った複数の核酸を前記カラムに送り込んだ後、前記標的物質を前記カラムに送り込み、前記カラムから排出された核酸を回収する、
請求項１記載のアプタマーの製造方法。
【請求項３】
前記カラムに、アプタマーが応答してほしくない夾雑物を送り込んで、前記カラムから排出された核酸を破棄した後、前記標的物質を前記カラムに送り込み、前記カラムから排出された核酸を回収する、
請求項２記載のアプタマーの製造方法。
【請求項４】
前記多環芳香族がグラフェンパウダーであり、
前記標的物質と会合して前記グラフェンパウダーから脱離した核酸と、前記グラフェンパウダーに吸着した核酸とを、電気泳動によって分離した後、前記グラフェンパウダーから脱離した核酸を回収する、
請求項１記載のアプタマーの製造方法。
【請求項５】
少なくとも２つの電極が接続されたグラフェン膜と、
前記グラフェン膜上に吸着された、請求項１〜４のいずれか１つに記載のアプタマーの製造方法により得られたアプタマーと、
を具備し、
前記アプタマーが前記標的物質と会合して前記グラフェン膜から脱離することを、前記グラフェン膜の電気特性として検出するセンサー。
【請求項６】
少なくとも２つの電極が接続されたカーボンナノチューブと、
前記カーボンナノチューブ上に吸着された、請求項１〜４のいずれか１つに記載のアプタマーの製造方法により得られたアプタマーと、
を具備し、
前記アプタマーが前記標的物質と会合して前記カーボンナノチューブから脱離することを、前記カーボンナノチューブの電気特性として検出するセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、アプタマーの製造方法およびセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
グラフェン膜やカーボンナノチューブは、その表面での物質の結合、吸着、あるいは近接に対して大きな電気特性の変化（高い感度）を示す。この特性を利用して、グラフェン膜あるいはカーボンナノチューブの表面に、特定の化学物質、核酸、ウイルス、あるいは微生物（以下、標的物質と呼ぶ）と会合する分子（以下プローブ分子と呼ぶ）を配置し、当該プローブ分子と標的物質との会合を検出する高感度センサーが提案されている。
【０００３】
プローブ分子としては、生物特有の特定の物質を選択的に認識する能力を生かしたものが多く提案されており、特定の化学反応を選択的に促進する能力を持つ酵素や、生物の免疫系において異物、非自己、病原体を認識し捕捉する抗体や、核酸塩基配列によって特定の物質に会合するアプタマーや、アミノ酸配列によって特定の物質に会合するペプチドアプタマーなどが用いられている。
【０００４】
標的物質としては、感染症や疾患の原因となるウイルスや微生物、病状や健康状態の指標となる核酸や内分泌物や血球、匂い成分や揮発性有機化学物質である低分子化合物などが、幅広く提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１６−４５０３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の実施形態は、標的物質を高感度に検出可能なプローブ分子として利用可能なアプタマーの製造方法およびそのアプタマーを具備したセンサーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の実施形態のアプタマーの製造方法によれば、異なる塩基配列を持った複数の核酸を、多環芳香族に吸着させ、前記多環芳香族に吸着した前記複数の核酸に、検出対象としたい標的物質を供給し、前記標的物質と会合して前記多環芳香族から脱離した核酸を選別する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】低分子化合物をハプテンとして高分子担体に担持させた場合の問題を説明するための模式図。
【図２】SELEX法によるアプタマーの製造方法を示す模式図。
【図３】CE-SELEX法によるアプタマーの製造方法を示す模式図。
【図４】（ａ）〜（ｄ）は、第１実施形態によるアプタマーの製造方法を示す模式図。
【図５】実施形態のセンサーの模式図。
【図６】（ａ）及び（ｂ）は、図５に示すセンサーにおける標的物質の検出を説明するための模式図。
【図７】（ａ）〜（ｄ）は、第２実施形態によるアプタマーの製造方法を示す模式図。
【図８】（ａ）〜（ｃ）は、第２実施形態によるアプタマーの製造方法を示す模式図。
【図９】（ａ）〜（ｄ）は、第３実施形態によるアプタマーの製造方法を示す模式図。
【図１０】実施形態のセンサーの模式図。
【図１１】（ａ）及び（ｂ）は、図１０に示すセンサーにおける標的物質の検出を説明するための模式図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ケミカルセンサーまたはバイオセンサーにおいて低分子化合物の検出には、特有の難しさがあった。ひとつは、そのサイズが非常に小さいことに由来する。
【００１０】
例えば、シックハウス症候群の原因となるホルムアルデヒドは０．３ｎｍ程度の大きさであり、蚊がヒトを探す際に嗅ぎ分けていると言われているオクテノールが約１ｎｍ、毒物であるPCB（ポリ塩化ビニル）やDDT(ジクロロジフェニルトリクロロエタン)、禁止薬物のモルヒネやコカインが１〜１．３ｎｍ程度の大きさである。
【００１１】
このような小さな分子を、数ｎｍ〜十ｎｍ強の酵素や抗体のような大きな分子で捕捉した場合、大きな分子の先端部で小さな標的物質を捕捉したことが、下地のグラフェンやカーボンナノチューブに伝わりにくい。
【００１２】
さらに、抗体は生体の免疫系を用いて生物合成するため、生体が異物として認識できないような低分子化合物は、抗体が合成されないという課題もあった。この問題は、低分子化合物をハプテンとして、大きな高分子担体に担持させてやることにより解決し得るが、高分子担体に担持させることにより抗原としての活性が変化してしまうリスクがあり、また少なくとも、高分子担体と結合させた部位はエピトープとして用いることができなくなってしまうという課題があった。この問題は低分子であるほど深刻である。
【００１３】
図１は、低分子化合物をハプテンとして高分子担体に担持させた場合の問題を説明するための模式図である。
【００１４】
例えば、図１に示すように、ホルムアルデヒドなどは、高分子１００に担持させた時点で、その構造の原型がほぼ分からなくなってしまい、メタノール、アセトアルデヒド、ギ酸などと区別が付かなくなってしまう。
【００１５】
一方、低分子化合物を標的とするような分子サイズが小さいアプタマーやペプチドアプタマーは製造が困難であるという課題があった。
【００１６】
例えば、アプタマーの場合、SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)法を用いて、標的物質と強く会合する核酸配列を選別する。
【００１７】
図２は、SELEX法によるアプタマーの製造方法を示す模式図である。
【００１８】
初めにランダム配列の核酸をライブラリとして用意して、標的物質４０を担持したカラム７０に通すことによって、標的物質４０に会合する核酸５１をカラム７０に捕捉させることによって、選別する。選別された核酸は、PCR(Polymerase Chain Reaction)等の手法によって増幅される。捕捉した核酸群の中に非特異吸着によって紛れ込んだものや弱い会合で捕捉されたようなものがある場合には、再び上記の選別プロセスを繰り返すことにより、より結合力の高い配列が優先的に選別される。
【００１９】
ところが、この方法では、標的物質４０をカラム７０に担持させてしまうため、標的物質４０が低分子化合物の場合、標的物質４０の抗原としての活性が変化してしまうリスクがあった。さらに、標的物質４０においてカラム７０との結合に用いた部位はエピトープとして使えなくなってしまうという課題もあった。
【００２０】
そこで標的物質をカラムに担持させずに分収する方法としてCE-SELEX (Capillary Electrophoresis Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)法が提案されている。
【００２１】
図３は、CE-SELEX法によるアプタマーの製造方法を示す模式図である。
【００２２】
これはキャピラリ中で電気泳動を行うことによって、標的物質４０と会合した核酸５１と、フリーの核酸５１とを、表面電荷の違いにより、分離するという方法である。ところがこの方式においても、標的物質４０が低分子化合物の場合には、保持する電荷が余り大きくないため、分離が難しいという課題があった。
【００２３】
以下、図面を参照し、実施形態について説明する。なお、各図面中、同じ要素には同じ符号を付している。
【００２４】
実施形態は、アプタマーの製造方法に関するもので、特にグラフェンやカーボンナノチューブの近傍において、標的物質との会合を行うことによって、高感度なケミカルセンサーまたはバイオセンサーを実現するためのアプタマーの製造方法に関する。なお、ここでいう会合とは、化学的な結合や水素結合に加えて、電荷による引力、疎水性相互作用、ファンデルワールス力などによる弱い結合や吸着を含む概念を表す。
【００２５】
図４（ａ）〜（ｄ）は、第１実施形態によるアプタマーの製造方法を示す模式図である。
【００２６】
第１実施形態では、ｓｐ２結合を持った多環芳香族６０を表面に持ったカラム７０を用いて、核酸５１の選別を行っている。ここで、ｓｐ２結合を持った多環芳香族６０としては、グラファイト、グラフェン、カーボンナノチューブ、フラーレンなどを用いることができる。なお、これら多環芳香族は部分的に水酸基等の極性基を持っていた方が好ましい。
【００２７】
初めにランダム塩基配列（異なる塩基配列）を持った複数の一本鎖核酸のライブラリを用意する。
【００２８】
図４（ａ）に示すように、一本鎖核酸５１はその塩基配列により、単独で折り返しによる二重らせん構造（ステムループと呼ばれる）を形成するものや、四重らせん構造（グアニンを多く含む配列に現れることからグアニン四重鎖と呼ばれる）のようなより複雑な構造を形成するものがある。このような高次構造を形成した核酸５１は、π結合を持った塩基部分が立体構造の内側に隠されてしまうため、多環芳香族との吸着が起こりにくくなっている。
【００２９】
そこで、図４（ｂ）に示すように、一本鎖核酸５１のランダムライブラリを、多環芳香族６０付きカラム７０に通すことにより、高次構造を形成して多環芳香族６０に吸着しない核酸５１を分離する。
【００３０】
ここで、高次構造を形成していないフリーな核酸は、π結合を持った塩基部分が露出しているため、多環芳香族に吸着する。この際多環芳香族が部分的に極性基を持っているとより吸着しやすい。
【００３１】
十分に洗浄を行うことにより、多環芳香族６０付きカラム７０には、吸着した核酸５１が捕捉された状態となる。
【００３２】
次に、図４（ｃ）に示すように、検出対象としたい標的物質４０を、多環芳香族６０付きカラム７０へ流し込む。
【００３３】
図４（ｄ）に示すように、標的物質４０と会合して高次構造を取った核酸５１は、多環芳香族６０との吸着能が弱まるため、多環芳香族６０から脱離し、カラム７０から排出される。このようにして標的物質４０と会合した核酸５１が選別され、この核酸５１を回収した後、PCR等により複製増幅することにより、標的物質４０と結合能力を持ったアプタマーを得ることができる。
【００３４】
本実施形態によれば、標的物質４０と会合した核酸５１の立体構造の変化を認識して、アプタマーとして選別するため、標的物質４０が低分子化合物であっても選別が可能である。また、得られたアプタマーは、標的物質４０との会合により、立体構造が変化し、多環芳香族と吸脱着する。したがって、本実施形態で得られたアプタマーを、グラフェンあるいはカーボンナノチューブ上に固定すれば、高感度のケミカルセンサーまたはバイオセンサーを実現することができる。また、グラフェンあるいはカーボンナノチューブが部分的に極性基を持っていた方がより好ましい。
【００３５】
図５は、グラフェン膜１５を用いたセンサーの模式図である。  
図６（ａ）及び（ｂ）は、そのセンサーにおける標的物質４０の検出を説明するための模式図である。
【００３６】
グラフェン膜１５が、下地（例えば絶縁膜）１２上に固定され、少なくとも２つの電極１６、１７に接続されている。
【００３７】
あるいは、グラフェン膜１５の下が中空となっていて、２つの電極１６、１７でグラフェン膜１５が両持ち構造となっていても構わない。
【００３８】
２つの電極１６、１７は絶縁膜１８で被覆されていて、グラフェン膜１５を含む領域上に検体液を溜めるためのウェル１９が形成されている。
【００３９】
図６（ａ）に示すように、グラフェン膜１５の表面には前記方法により得られたアプタマー５０が固定されている。
【００４０】
例えば、アプタマー５０の片側末端は、リンカーを介してグラフェン膜１５と固定されている。リンカーとグラフェン膜１５の結合は、リンカー末端にピレン等の多環芳香族を修飾してπ結合同士の相互作用で吸着させることができる。あるいは、リンカーは、グラフェン膜１５の炭素原子に対して共有結合を形成しても構わない。
【００４１】
あるいは、アプタマー５０自体がグラフェンに吸着する能力を持っているため、その吸着力を利用してアプタマー５０をグラフェン膜１５に固定しても構わない。なお、この場合にはリンカーは必ずしも必要ではない。
【００４２】
上記いずれの固定方式の場合においても、初めの標的物質４０がない状態では、図６（ａ）に示すように、アプタマー５０はグラフェン膜１５の表面に吸着している。アプタマー５０は負電荷に帯電しているため、グラフェン膜１５には負電荷が注入され、フェルミレベルが変調している。なお、この際グラフェン膜１５が部分的に極性基を持っていると、アプタマー５０がより吸着しやすくなるため、好ましい。
【００４３】
ここに標的物質４０が来ると、図６（ｂ）に示すように、アプタマー５０が標的物質４０と会合して高次構造を形成し、グラフェン膜１５から脱離する。これにより、アプタマー５０の負電荷がグラフェン膜１５に注入されなくなるためフェルミレベルが変調し、アプタマー５０と標的物質４０との会合をグラフェン膜１５の電気特性として検出することができる。なお、この際、標的物質４０が大きな電荷を持っている場合には、その電荷の近接をグラフェン膜１５の電気特性として検出することも可能である。
【００４４】
なお、このセンサーにおけるアプタマー５０としては、以下に説明する第２実施形態、第３実施形態によって得られたアプタマーも用いることができる。
【００４５】
図７（ａ）〜図８（ｃ）は、第２実施形態によるアプタマーの製造方法を示す模式図である。
【００４６】
第２実施形態においては、アプタマーが夾雑物に対して、標的物質と同じように応答しないことを確認している。
【００４７】
第１実施形態と同様、図７（ａ）に示すように、初めにランダム塩基配列（異なる塩基配列）を持った複数の一本鎖核酸５１のライブラリを用意する。そして、図７（ｂ）に示すように、一本鎖核酸５１のランダムライブラリを、多環芳香族６０付きカラム７０に通すことにより、高次構造を形成して多環芳香族６０に吸着しない核酸５１を分離する。
【００４８】
そして、ランダムライブラリの核酸５１を吸着させた多環芳香族６０付きカラム７０に対し、図７（ｃ）に示すように、アプタマーが応答してほしくない夾雑物９０を流し込む。
【００４９】
夾雑物９０と会合して高次構造を取った核酸５１は、多環芳香族６０との吸着能が弱まるため、図７（ｄ）に示すように、多環芳香族６０から脱離し、カラム７０から排出される。このようにして、夾雑物９０に会合して多環芳香族６０付きカラム７０から脱離した核酸を排除する。
【００５０】
なお、図７（ｃ）及び（ｄ）では、１種類の夾雑物９０をカラム７０に供給した例を示すが、アプタマーが応答してほしくない夾雑物が複数種考えられる場合には、複数種の夾雑物をカラム７０に流し込んでも構わない。
【００５１】
そして、十分に洗浄を行うことにより、図８（ａ）に示すように、多環芳香族６０付きカラム７０には、夾雑物９０との結合能を持たない核酸５１が捕捉された状態となる。
【００５２】
以降、第１実施形態と同様、図８（ｂ）に示すように、検出対象としたい標的物質４０を、多環芳香族６０付きカラム７０へ流し込む。
【００５３】
そして、図８（ｃ）に示すように、標的物質４０と会合して高次構造を取った核酸５１は、多環芳香族６０との吸着能が弱まるため、多環芳香族６０から脱離し、カラム７０から排出される。このようにして標的物質４０と会合した核酸５１が選別され、この核酸５１を回収した後、PCR等により複製増幅することにより、標的物質４０と結合能力を持ったアプタマーを得ることができる。
【００５４】
第２実施形態においても、標的物質４０と会合した核酸５１の立体構造の変化を認識して、アプタマーとして選別するため、標的物質４０が低分子化合物であっても選別が可能である。また、得られたアプタマーは、標的物質４０との会合により、立体構造が変化し、多環芳香族と吸脱着する。したがって、本実施形態で得られたアプタマーを、グラフェンあるいはカーボンナノチューブ上に固定すれば、高感度のケミカルセンサーまたはバイオセンサーを実現することができる。
【００５５】
さらに、第２実施形態によれば、特定の標的物質４０のみを選択的に認識できるアプタマーを得ることができる。なお、第２実施形態においても、多環芳香族とグラフェンあるいはカーボンナノチューブは、部分的に極性基を持っていた方が好ましい。
【００５６】
図９（ａ）〜（ｄ）は、第３実施形態によるアプタマーの製造方法を示す模式図である。
【００５７】
第３実施形態においては、多環芳香族として断片化したグラフェン６０を含むグラフェンパウダー８０を用いる。
【００５８】
図９（ａ）に示すグラフェンパウダー８０をランダムライブラリの核酸５１と混合すると、図９（ｂ）に示すように、高次構造を形成していない核酸５１がグラフェンパウダー８０に吸着する。ここで電気泳動を行えば、グラフェンパウダー８０に吸着した核酸５１と、高次構造を取ってグラフェンパウダー８０に吸着していない核酸５１とを分離できる。
【００５９】
グラフェンパウダー８０に吸着していない核酸５１を除去した後、図９（ｃ）に示すようにグラフェンパウダー８０に標的物質４０を混合すると、図９（ｄ）に示すように、標的物質４０に会合し高次構造を取った核酸５１がグラフェンパウダー８０から脱離する。
【００６０】
ここで再び電気泳動を行うことにより、標的物質４０に会合するアプタマーを選別することができる。選別されたアプタマーはPCR等によって複製増幅することにより、標的物質４０と結合能力を持ったアプタマーを得ることができる。なお、この際グラフェンパウダー８０は部分的に極性基を持っていた方が好ましい。
【００６１】
第３実施形態においても、標的物質４０と会合した核酸５１の立体構造の変化を認識して、アプタマーとして選別するため、標的物質４０が低分子化合物であっても選別が可能である。また、得られたアプタマーは、標的物質４０との会合により、立体構造が変化し、多環芳香族と吸脱着する。したがって、本実施形態で得られたアプタマーを、グラフェンあるいはカーボンナノチューブ上に固定すれば、高感度のケミカルセンサーまたはバイオセンサーを実現することができる。また、この際グラフェンあるいはカーボンナノチューブが部分的に極性基を持っているとより好ましい。
【００６２】
なお、第３実施形態の場合も、第２実施形態と同様に、夾雑物に会合する核酸を除去することが可能である。具体的には、標的物質との会合を確認する前に、夾雑物を混合して、グラフェンパウダーから脱離した核酸を電気泳動によって除去すればよい。
【００６３】
以上説明した実施形態のアプタマー製造方法によれば、ｓｐ２結合を持った多環芳香族がフリーの一本鎖核酸とπ結合同士の相互作用によって吸着しやすい特性を利用して、標的物質に会合して高次構造を取った核酸を選別する。
【００６４】
この方法では標的物質だけを認識する訳ではなく、核酸自体の立体構造の変化を認識して選別するため、標的物質が分子サイズの小さな低分子化合物（例えば、ホルムアルデヒド、オクテノール、PCB（ポリ塩化ビニル）、DDT(ジクロロジフェニルトリクロロエタン、モルヒネ、コカインなど）であっても、フリーの一本鎖核酸と、標的物質に会合した核酸との分離が可能である。
【００６５】
さらに標的物質との会合により、アプタマー自体の立体構造が変化し、多環芳香族との吸脱着が起こるため、下地のセンサー部位にグラフェンやカーボンナノチューブを用いることにより、非常に高感度なケミカルセンサーまたはバイオセンサーを実現することができる。
【００６６】
図５、図６（ａ）及び（ｂ）に示すセンサーでは、グラフェン膜１５を用いたが、そのグラフェン膜１５の代わりにカーボンナノチューブを用いてもよい。
【００６７】
図１０は、カーボンナノチューブ２５を用いたセンサーの模式図である。  
図１１（ａ）及び（ｂ）は、カーボンナノチューブ２５を用いたセンサーにおける標的物質４０の検出を説明するための模式図である。
【００６８】
カーボンナノチューブ２５に少なくとも２つの電極１６、１７が接続され、前述した実施形態のアプタマー５０がカーボンナノチューブ２５上に吸着され、アプタマー５０が標的物質４０と会合して高次構造を取ってカーボンナノチューブ２５から脱離することを、カーボンナノチューブ２５の電気特性として検出する。またこの際、カーボンナノチューブ２５が部分的に極性基を持っているとより好ましい。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００７０】
１５…グラフェン膜、２５…カーボンナノチューブ、４０…標的物質、５０…アプタマー、５１…核酸、６０…多環芳香族、７０…カラム、８０…グラフェンパウダー、９０…夾雑物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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