(57)【要約】【課題】タンパク質分解酵素によるタンパク質又はペプチドの切断部位を検出するための方法を提供すること。【解決手段】  検出用ペプチドが固定されている単位領域を複数有するペプチドアレイを用い、以下の（１）〜（５）の工程を含む、タンパク質又はペプチドの酵素切断部位を検出する方法：  （１）ペプチドアレイをタンパク質分解酵素で処理する工程、  （２）酵素処理後にペプチドアレイを洗浄する工程、  （３）酵素処理後の検出用ペプチドをペプチドアレイから遊離する工程、  （４）遊離した酵素処理後の検出用ペプチドのアミノ酸配列を同定する工程、  （５）酵素処理後の検出用ペプチドのアミノ酸配列と酵素処理前の検出用ペプチドのアミノ酸配列とを単位領域ごとに対比することによって、各単位領域における検出用ペプチドの酵素切断部位を検出する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出用ペプチドが固定されている単位領域を複数有するペプチドアレイを用い、以下の（１）〜（５）の工程を含む、タンパク質又はペプチドの酵素切断部位を検出する方法：
（１）ペプチドアレイをタンパク質分解酵素で処理する工程、
（２）酵素処理後にペプチドアレイを洗浄する工程、
（３）酵素処理後の検出用ペプチドをペプチドアレイから遊離する工程、
（４）遊離した酵素処理後の検出用ペプチドのアミノ酸配列を同定する工程、
（５）酵素処理後の検出用ペプチドのアミノ酸配列と酵素処理前の検出用ペプチドのアミノ酸配列とを単位領域ごとに対比することによって、各単位領域における検出用ペプチドの酵素切断部位を検出する工程。
【請求項２】
前記各単位領域の検出用ペプチドは、前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列と相同領域を有する２〜２０残基のアミノ酸配列を有するペプチドであり、かつ、
前記各単位領域の検出用ペプチドは、前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列のＮ末端側から順次１〜１０ｍｅｒずつずれるように設計されているペプチドである、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記ペプチドアレイは、各単位領域の表面に解離性リンカーを介して各検出用ペプチドを固定しているものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドアレイが、他の単位領域と検出用ペプチドが相違する単位領域を複数有するものであって、このペプチドアレイに対して、単一又は混合型のタンパク質分解酵素にて酵素処理することを特徴とする請求項１〜３の何れか１項記載の検出方法。
【請求項５】
前記ペプチドアレイが、検出用ペプチドが同一である単位領域を有するものであって、このペプチドアレイ内を複数に区分けし、当該区分けごとに異なるタンパク質分解酵素にて酵素処理することを特徴とする請求項１〜３の何れか１項記載の検出方法。
【請求項６】
前記タンパク質分解酵素が、動物由来酵素、植物由来酵素及び微生物由来酵素から選ばれる１種又は２種以上のものである請求項１〜５の何れか１項記載の検出方法。
【請求項７】
複数のペプチドアレイを使用する検出方法であって、反応温度、反応ｐＨ、反応時間、酵素濃度及び基質濃度から選ばれる１種又は２種以上の酵素反応条件を変更してそれぞれのペプチドアレイに対して酵素反応処理を行う請求項１〜６の何れか１項記載の検出方法。
【請求項８】
前記同定工程が、単位領域ごとに質量分析法により行われる請求項１〜７の何れか１項記載の検出方法。
【請求項９】
タンパク質又はペプチドから分解物を製造するに際し、以下の（ａ）により選択されたタンパク質分解酵素を用いることを特徴とする、タンパク質分解物又はペプチド分解物の製造方法：
（ａ）請求項１〜８の何れか１項に記載の検出方法の結果に基づき作成したタンパク質分解酵素とアミノ酸配列の酵素切断部位との対応関係を指標として、２種以上のタンパク質分解酵素から構成される酵素情報群から、単数又は複数のタンパク質分解酵素を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質又はペプチドの酵素切断部位検出方法、及びタンパク質の分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品及び食品等の幅広い分野において、既知のタンパク質から、タンパク質分解酵素により所望の機能性ペプチド又は所望のタンパク質の分解物を得る、タンパク質の分解物の製造方法は、工業的に行われている。
【０００３】
機能性ペプチドは、アミノ酸が２〜５０個結合した化合物であり、ペプチドを構成するアミノ酸の種類と配列により、血圧降下作用や抗菌作用等の様々な有用な生理活性を有するペプチドが存在する。このような有用な生理活性を有するペプチドは、機能性ペプチドとして食品や医薬品として広く利用されている。
また、タンパク質分解物は、グルテン、大豆タンパク等の植物由来；コラーゲン、乳タンパク（例えば、カゼイン、ホエイタンパク）等の動物由来等の安定的に大量入手可能な原材料から製造されている。このようなタンパク質分解物は、食品の品質改善剤、風味改善剤や医薬品の保湿剤、サプリメント等として広く利用されている。
【０００４】
このようなことから、所望の機能性ペプチド及び所望のタンパク質分解物を得るためには、出発原料のタンパク質又はペプチドを設計どおりに効率よく加工することが必要となる。設計どおりに効率よく加工するためには、出発原料のアミノ酸配列のペプチド結合部位から標的となる切断部位を設定し、この標的部位を切断できる特異性の高いタンパク質分解酵素の性状を把握し、これを利用する必要がある。
【０００５】
タンパク質分解酵素の基質特異性を確認する手段として、ペプチドアレイを用いる方法が知られている。
ペプチドアレイは、ペプチドを固定化した単位領域が多数存在しているものであり、ペプチド固相合成法により固相担体に配置した単位領域にペプチドをスポット合成したものであり、単位領域ごとにペプチドの種類を変えることができるものである。このため、ペプチドアレイは、一度に多量のペプチドと反応性物質との反応を網羅的に評価する手法として有用であり、機能性ペプチドの探索にも用いられている（非特許文献１）。
【０００６】
また、非特許文献２には、プロテアーゼでアミノ酸配列が切断された場合に蛍光を呈するように設計したペプチドを基質として基板上に固定化したペプチドアレイを用いて、プロテアーゼ活性の有無を判定する技術が開示されている。
【０００７】
また、非特許文献３には、ペプチドアレイにて、機能性ペプチドの製造及び機能性の探索が行われていることが開示されている。
この機能性ペプチドを有するペプチドアレイは、アミノ酸のＣ末端を光照射により開裂する光解離性架橋剤（フォトリンカー）を介して固相担体の表面に機能性ペプチドを単位領域ごとに固定したものである。当該ペプチドアレイは、固相担体に固定化されているフォトリンカーにアミノ酸のＣ末端を固定化し、この固定化されたアミノ酸のＮ末端にさらにアミノ酸を結合させながら、目的のペプチドになるまでアミノ酸のＮ末端側でアミノ酸配列の延長を行うことにより製造することができる。
【０００８】
このようにして製造されたペプチドアレイに光を照射後、光解離したペプチドを含む各領域をプレート上にある各穴にパンチアウトし、各穴に緩衝液を加えてＣ末端が拘束されていない状態のペプチドを緩衝液中に遊離させ、この液中に反応性物質を加えて、その遊離ペプチドの機能性を確認している。このように、ペプチドの機能性（反応性）においてそのＣ末端が重要な役割を果たす場合もあるため、固定状態ではなく遊離状態のペプチドを用いてペプチド機能性確認が行われている。
【０００９】
また、非特許文献２には、蛍光検出によるペプチドアレイが、タンパク質の機能評価をこの代用ペプチドで行うために、利用されることもあることが開示されている。これは、機能性タンパク質の当該機能性を発現しているアミノ酸配列部分とほぼ同じ構造を持つペプチドは、当該機能性もある程度保持していることから、タンパク質の機能をペプチドで代用することができるためである。さらに、非特許文献２には、ペプチドアレイを用いて、タンパク質分解酵素による基質配列の切断の有無（プロテアーゼ活性）を検出する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】本多裕之著、生物工学会誌、第95巻第2号、第64‐70頁、2017
【非特許文献２】片山佳樹著、臨床検査、Vol.50、No.12、第1538‐1548頁、2006
【非特許文献３】M. Ochiai et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 76, 819, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、ペプチドアレイを用いてタンパク質分解酵素によるタンパク質又はペプチドの切断部位を精度良く検出する方法は知られていない。
そこで、本発明は、タンパク質分解酵素によるタンパク質又はペプチドの切断部位を精度良く検出することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らが検討した結果、非特許文献２に記載されているような蛍光検出によるペプチドアレイを用いた従来の技術では、タンパク質分解酵素により基質が分解されるか否かについての判定は可能であるが、タンパク質又はペプチドの切断部位まで検出して特定することはできなかった。
【００１３】
さらに、本発明者らは、機能性ペプチドの機能性を評価する際に用いられる手法（具体的には、合成された機能性ペプチドを固相担体から遊離させて反応性物質と反応させる手法）を用いて、タンパク質分解酵素の基質特異性についても検討を行った。
しかしながら、ペプチドアレイから遊離したペプチドを酵素分解反応に供した後、当該反応液中の加水分解物を解析したとしても、この分解物中にはタンパク質分解酵素や複数のペプチド分子が混在することから、タンパク質又はペプチドの切断部位まで精度良く検出することは困難であった。
【００１４】
そこで、本発明者らは、さらに鋭意検討を行った結果、ペプチドアレイから検出用ペプチドを解離する際の解離タイミングを調整することによって、タンパク質分解酵素によるタンパク質又はペプチドの酵素切断部位を効率よく検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
従来のペプチドアレイにより機能性ペプチドを評価するプロセスは、上述のようにペプチドの遊離状態での機能性を評価するため、光解離性リンカーを光解離させた後、Ｃ末端の拘束状態から遊離した状態で機能性ペプチドを反応させる。これに対し、本技術のペプチドアレイのプロセスは、アレイ上に固定されたペプチドを酵素処理した後に、アレイから酵素処理したペプチドを遊離させるので、従来の機能性ペプチドアレイのプロセスとは、全く異なる考え方にて行われる。
【００１６】
タンパク質又はペプチドから目的とするアミノ酸配列部分を酵素により切り出し、この切り出されたペプチドを含む所望の分解物にするためには、各々のタンパク質分解酵素の基質特異性を十分に把握することが必要となる。さらに、各々のタンパク質分解酵素の基質特異性の情報をまとめて酵素群としてデータ管理し、その酵素群のなかから所望の分解物の設計及び加工に適したタンパク質分解酵素を選択できることが望ましい。
【００１７】
すなわち、本発明者らは、固相担体に固定化された検出用ペプチドを酵素処理した後、酵素処理後の検出用ペプチドを解離させ、当該酵素処理後のペプチドのアミノ酸配列を解析することにより、検出用ペプチドのアミノ酸配列の酵素切断部位を検出する方法を見出した。
この検出方法を用いることにより、本発明者らは、タンパク質分解酵素と当該酵素によるアミノ酸配列の切断部位との対応関係を明らかにすることができることを見出した。さらに、本発明者らは、この対応関係によって、アミノ酸配列中の標的となる結合部位を効率よく切断できる特異性の高いタンパク質分解酵素を選択することが可能となることを見出した。
本発明者らは、このようにして好適なタンパク質分解酵素を選択できることにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを含む分解物を効率的に製造できることを見出した。
そして、本発明者らは、以上のことを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１８】
〔１〕  検出用ペプチドが固定されている単位領域を複数有するペプチドアレイを用い、以下の（１）〜（５）の工程を含む、タンパク質又はペプチドの酵素切断部位を検出する方法：
（１）ペプチドアレイをタンパク質分解酵素で処理する工程、
（２）酵素処理後にペプチドアレイを洗浄する工程、
（３）酵素処理後の検出用ペプチドをペプチドアレイから遊離する工程、
（４）遊離した酵素処理後の検出用ペプチドのアミノ酸配列を同定する工程、
（５）酵素処理後の検出用ペプチドのアミノ酸配列と酵素処理前の検出用ペプチドのアミノ酸配列とを単位領域ごとに対比することによって、各単位領域における検出用ペプチドの酵素切断部位を検出する工程。
〔２〕  前記各単位領域の検出用ペプチドは、前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列と相同領域を有する２〜２０残基のアミノ酸配列を有するペプチドであり、かつ前記各単位領域の検出用ペプチドは、前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列のＮ末端側から順次１〜１０ｍｅｒずつずれるように設計されているペプチドである、前記〔１〕記載の検出方法。
〔３〕  前記ペプチドアレイは、各単位領域の表面に解離性リンカーを介して各検出用ペプチドを固定しているものである前記〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕  前記ペプチドアレイが、他の単位領域と検出用ペプチドが相違する単位領域を複数有するものであって、このペプチドアレイに対して、単一又は混合型のタンパク質分解酵素にて酵素処理することを特徴とする前記〔１〕〜〔３〕の何れか１記載の検出方法。
〔５〕  前記ペプチドアレイが、検出用ペプチドが同一である単位領域を有するものであって、このペプチドアレイ内を複数に区分けし、当該区分けごとに異なるタンパク質分解酵素にて酵素処理することを特徴とする前記〔１〕〜〔３〕の何れか１記載の検出方法。
〔６〕  前記タンパク質分解酵素が、動物由来酵素、植物由来酵素及び微生物由来酵素から選ばれる１種又は２種以上のものである前記〔１〕〜〔５〕の何れか１記載の検出方法。
〔７〕  複数のペプチドアレイを使用する検出方法であって、反応温度、反応ｐＨ、反応時間、酵素濃度及び基質濃度から選ばれる１種又は２種以上の酵素反応条件を変更してそれぞれのペプチドアレイに対して酵素反応処理を行う前記〔１〕〜〔６〕の何れか１記載の検出方法。
〔８〕  前記同定工程が、単位領域ごとに質量分析法により行われる前記〔１〕〜〔７〕の何れか１記載の検出方法。
〔９〕  タンパク質又はペプチドから分解物を製造するに際し、以下の（ａ）により選択されたタンパク質分解酵素を用いることを特徴とする、タンパク質分解物又はペプチド分解物の製造方法：
（ａ）前記〔１〕〜〔８〕の何れか１に記載の検出方法の結果に基づき作成したタンパク質分解酵素とアミノ酸配列の酵素切断部位との対応関係を指標として、２種以上のタンパク質分解酵素から構成される酵素情報群から、単数又は複数のタンパク質分解酵素を選択する工程。
【発明の効果】
【００１９】
本技術によれば、タンパク質分解酵素によるタンパク質又はペプチドの切断部位を精度良く検出することができる。これにより、機能性ペプチド等の所望のアミノ酸配列を有するペプチドを含む酵素分解物の製造にあたって、標的となるアミノ酸配列の結合位置を特異的に切断できるタンパク質分解酵素を好適に選択することができる。
なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本技術のペプチドアレイの概略を示す図である。本技術はこれに限定されるものではない。
【図２】本技術のタンパク質又はペプチドの酵素切断部位の検出方法における基本原理の概略を示す図である。（１）固相担体の表面に解離性リンカーを介して固定されているペプチド；（２）固定されているペプチドに対する酵素処理；（３）解離処理により、リンカーから遊離される酵素処理後のペプチド。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
次に、本技術の好ましい実施形態について説明する。
ただし、本技術は以下の好ましい実施形態に限定されず、本技術の範囲内で自由に変更することができるものである。
尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
また、本明細書においてタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列の表記は、各アミノ酸に対応するアルファベット一文字の略号を使用する。
また、本明細書において「タンパク質分解酵素」は、単に「酵素」ともいう。
【００２２】
＜タンパク質又はペプチドの切断部位検出方法＞
本技術のタンパク質又はペプチドの切断部位検出方法の基本原理は、（ａ）固相担体の表面に固定されているペプチドをタンパク質分解酵素にて酵素処理する工程、（ｂ）表面に固定されているペプチドを遊離させる工程、（ｃ）酵素処理前のペプチドと酵素処理後のペプチドとのアミノ酸配列を対比して、酵素処理によって切断される部位を検出する工程を含むものである。
本技術において、酵素処理により分解されたか否かにかかわらず、酵素処理後に表面に固定されているペプチド又はアミノ酸を「酵素処理後の検出用ペプチド」という。
【００２３】
本技術によれば、固相担体に固定されているペプチドに対して酵素処理することで、ペプチドの酵素切断部位を精度良く検出することができる。
さらに、ペプチドの酵素切断部位のデータ及びこの切断酵素のデータを紐付けした対応関係のデータ蓄積により、タンパク質分解酵素の選択及びペプチドの酵素切断部位の検出を容易にすることも可能である。
本技術の検出方法において、図１に示すようなペプチドアレイを用いることが好ましい。
【００２４】
図２を参照して、本技術のタンパク質又はペプチドの酵素切断部位の検出方法における基本原理の概略を以下に説明するが、本技術はこれに限定されるものではない。
本技術の検出方法の一例として、以下の工程１〜工程３により、タンパク質又はペプチドの酵素切断部位を検出する方法がある。
工程１：固相担体の単位領域３の表面に解離性リンカー４を介して固定されているペプチド（又はタンパク質）５を酵素処理すること。
工程２：（ａ）ペプチド５をタンパク質分解酵素６により処理すること、（ｂ）当該酵素６が切断可能なペプチド５のペプチド結合部位を切断すること、（ｃ）ペプチド５は切断後に解離性リンカーに固定されているペプチド（又はアミノ酸）７と、溶液中に遊離するペプチド（又はアミノ酸）８とに成ること。
工程３：（ａ）洗浄によりペプチド８と酵素６とを除去すること、（ｂ）固定されているペプチド７を物理的手段又は化学的手段（図中←）により遊離させ回収すること、そして、（ｃ）固定されていたペプチド５のアミノ酸配列と、回収されたペプチド７のアミノ酸配列とを対比することで、酵素処理によって切断されたタンパク質又はペプチドのペプチド結合部位を検出すること。
【００２５】
本技術は、タンパク質分解酵素の特異性（特に、タンパク質又はペプチドの切断部位）を研究する場合、既知のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を切断部位探索のための指標として使用することが望ましい。
これにより、酵素によるアミノ酸配列の切断部位を容易に検出でき、さらに酵素の特異性の各種データをより精度よく得ることができる。種々の酵素に関する各種データを蓄積することで精度の高い酵素情報群を得、所望のタンパク質若しくはペプチド分解物や所望のペプチドを含む分解物等を得る際に、この酵素情報群に基づき適切な酵素を選択することも容易となる。
【００２６】
さらに、本技術のタンパク質又はペプチドの切断部位検出方法は、ペプチドアレイを用いて、タンパク質分解酵素によりタンパク質又はペプチドを加水分解した際に開裂するペプチド結合を切断部位として検出する方法であることが、好適である。
本技術の検出方法は、（Ａ）ペプチドアレイに固定されている検出用ペプチドを酵素処理する工程、（Ｂ）酵素処理後のペプチドをペプチドアレイから遊離する工程、（Ｃ）ペプチドの酵素切断部位を検出する工程、を少なくとも含む方法であることが望ましい。
遊離工程前に、ペプチドアレイを洗浄する工程を行うことが、好適である。
検出工程前に、酵素処理後の検出用ペプチドのアミノ酸配列を同定する工程を行うことが、好適である。
同定工程前に、酵素処理後の検出用ペプチドを含む単位領域ごとに回収する工程を行うことが、好適である。
【００２７】
さらに、本技術は、検出用ペプチドが固定されている単位領域を複数有するペプチドアレイを用い、以下の（１）〜（５）の工程を含む、タンパク質又はペプチドの酵素切断部位を検出する方法であることが好適である。
（１）ペプチドアレイをタンパク質分解酵素で処理する工程、
（２）酵素処理後にペプチドアレイを洗浄する工程、
（３）酵素処理後の検出用ペプチドをペプチドアレイから遊離する工程、
（４）遊離した酵素処理後の検出用ペプチドのアミノ酸配列を同定する工程、
（５）酵素処理後の検出用ペプチドのアミノ酸配列と酵素処理前の検出用ペプチドのアミノ酸配列とを単位領域ごとに対比することによって、各単位領域における検出用ペプチドの酵素切断部位を検出する工程。
【００２８】
本技術の検出方法を、より詳細に説明するため、本技術の一実施形態として、以下の［１］ペプチドアレイ及びその作成工程、［２］酵素処理工程、［３］洗浄工程、［４］酵素処理物の遊離工程、［５］酵素処理物の同定工程、及び［６］酵素切断部位検出工程について説明するが、本技術はこれに限定されるものではない。
【００２９】
［１］ペプチドアレイ及びその作成工程
本技術のペプチドアレイは、固相担体の表面にある所定のスポット（所謂、単位領域）上に、Ｃ末端側が固定されたペプチドが整列したマイクロアレイの１種である。本技術のペプチドアレイであれば、各単位領域に百〜数千種類のペプチドを固定化し、当該ペプチドを網羅的に解析することも可能である。
【００３０】
本技術のペプチドアレイの実施形態の一例を図１に示すが、これに限定されるものではない。
本技術の第一実施形態のペプチドアレイ１は、１つの固相担体２の表面上に単数又は複数の単位領域３を有する。この１つの単位領域３には、検出用ペプチド５が複数存在し、検出用ペプチド群を形成する。当該検出用ペプチド５は解離性リンカー４を介して固相担体２の表面に固定化されている。
前記検出用ペプチド群は、単数又は複数のペプチド５から構成されており、当該ペプチド群は同一のアミノ酸配列を有するペプチド５のみからなる。前記検出用ペプチド群は、単位領域３ごとにアミノ酸配列が異なるものが好適である。
また、各単位領域３の検出用ペプチドは、他の単位領域の検出用ペプチドと、アミノ酸配列が相違することが好適である。また、各単位領域３に存在する検出用ペプチドは、２〜２０のアミノ酸残基からなるペプチドであることが好適である。また、各単位領域の検出用ペプチド５は、元となる長鎖ペプチドの一部と同一のアミノ酸配列を有するペプチドであり、かつ元となる長鎖ペプチドのＮ末端側から１〜３ｍｅｒずつＣ末端側方向にずらしながら設計されたペプチドから選択された一つであることが好適である。
【００３１】
なお、本技術のペプチドアレイの他の実施形態の一例として、ペプチドアレイ１上に存在する複数の単位領域３を、単数又は複数の領域群３１に、区分けすることができる。この区分けは、裁断や仕切り等でもよい。区分けされた領域群３１の検出用ペプチド群は、他の領域群３１の検出用ペプチド群と同じ種類の構成や同じ配置にしてもよい。区分けされた領域群３１ごとに、酵素の種類や酵素反応条件を適宜変更してもよい。
【００３２】
本技術の方法に用いるペプチドアレイの基本的構成について、以下に説明する。
前記ペプチドアレイは、固相担体上に複数の単位領域が存在するものである。１つの単位領域内には、検出用ペプチドを単数又は複数含む検出用ペプチド群が１つ形成されている。この単数又は複数の検出用ペプチドは、固相担体表面上の単位領域に固定されている。さらに好ましくは、この検出用ペプチドは、解離性リンカーを介して単位領域に固定されている。
前記検出用ペプチド群は、複数の検出用ペプチドから構成されているものが好ましい。より好ましくは、当該検出用ペプチド群内の検出用ペプチドは、同一のアミノ酸配列を有するペプチドのみから構成されることである。
また、前記検出用ペプチド群は、単位領域ごとにアミノ酸配列が異なるペプチド群であることが、好ましい。
【００３３】
前記検出用ペプチドは、任意のアミノ酸配列を有するペプチドを使用することができるため、特に制限されない。
前記検出用ペプチドは、既知のタンパク質又は既知のペプチドのアミノ酸配列と同じ配列である必要はなく、ランダムに作成したアミノ酸配列を使用してもよい。
前記検出用ペプチドのアミノ酸配列の鎖長は、２〜２０残基であることが好ましく、４〜１２残基であることがより好ましい。
【００３４】
本技術における各単位領域における検出用ペプチド（群）は、以下のようにして、検出用ペプチドのアミノ酸配列を設計した後、ペプチドアレイ上に合成し、固定化されていることが好ましい。
これにより、酵素処理後の作業が容易であり、酵素切断部位の検出の精度も高くなる。さらに、検出用ペプチド群の種類及び群数を調整することにより、検出の作業効率及び検出の精度も向上する。
【００３５】
前記検出用ペプチド（群）は、目的とするタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列の一部を構成するアミノ酸配列から構成されること、又は、目的とするタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列と相同領域を有するアミノ酸配列から構成されることが好ましい。
さらに、前記ペプチドアレイの各単位領域に存在する検出用ペプチド（群）は、目的とするタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列と相同領域を有する２〜２０のアミノ酸残基から構成されるペプチド（群）であることが望ましい。当該アミノ酸配列の鎖長は、４〜１２残基であることが、より好ましい。これにより、検出用ペプチド群の群数を抑えて作業効率を良好にしつつ、酵素切断部位の検出の精度を良好にすることができる。
【００３６】
本技術の検出用ペプチドは、目的のタンパク質又はペプチド由来のペプチドのアミノ酸配列の一部又は全部と相同性を有するように作成されたものが好ましい。
前記検出用ペプチドにおいて、前記アミノ酸配列に対する相同性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％である。このときの検出用ペプチドは、１若しくは数個（好適には１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されていてもよい。なお、相同性はアミノ酸配列同士を対比することで求めることができる。
前記検出用ペプチドは、当該由来のペプチドと実質同一又は１００％であることが好ましい。また、固定化部分のアミノ酸の損傷を回避するため、固定化側の末端アミノ酸に、さらに１又は２個のアミノ酸を付加してもよい。
【００３７】
さらに、目的タンパク質又は目的ペプチドの全アミノ酸配列を網羅するように、目的タンパク質又は目的ペプチドのアミノ酸配列に基づき検出用ペプチドを複数設計することが好ましい。
このようにして設計された検出用ペプチドは、検出用ペプチド群として単位領域ごとに固定されていることが好ましい。また、前記検出用ペプチド群のペプチドのアミノ酸配列は、他の検出用ペプチド群のアミノ酸配列と一部オーバーラップしていてもよい。
なお、目的ペプチドは、目的タンパク質を元に作成されたものであってもよく、例えば、目的タンパク質のアミノ酸配列の一部であってもよく、目的タンパク質の全アミノ酸配列を複数分割したものでもよい。
【００３８】
好適には、目的タンパク質又は目的ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端側から順次１〜１０ｍｅｒ（好適には１〜３ｍｅｒ）ずつＣ末端側方向にずらして、検出用ペプチドのアミノ酸配列を複数設計する。ずらした後のアミノ酸配列の一部が、ずらす前と重複するように設計することが好ましい。このようにして設計したアミノ酸配列を有する複数のペプチドから選択し、これを検出用ペプチドとして用いる。そして、設計した検出用ペプチドになるように、ペプチドアレイ上の単位領域に検出用ペプチド群を合成する。また同様にして、これ以外の設定検出用ペプチドを単位領域上に合成する。
ペプチドアレイ上に、目的タンパク質又は目的ペプチドの全アミノ酸配列を網羅するように、検出用ペプチド群を作成してもよいし、目的タンパク質又は目的タンパク質の全アミノ酸配列の一部から検出用ペプチド群を作成してもよい。
【００３９】
ペプチドアレイには、目的タンパク質又は目的ペプチドのＮ末端側から順次１〜１０ｍｅｒずつＣ末端側方向にずらして設計した複数のペプチドが、それぞれ検出用ペプチドとして単位領域ごとに存在することが好ましい。
さらに、設計されたペプチドは、目的タンパク質又は目的ペプチドのアミノ酸配列と相同領域を有するペプチドであり、かつ２〜２０残基からなるペプチドであることが望ましい。
検出用ペプチドのアミノ酸配列を少しずつずらすことにより、タンパク質又はペプチドの酵素切断部位のマッピングを精度良く行うことができる。そして、所望の結合部位を切断するための適切な酵素を選択することができる。
【００４０】
前記各単位領域には、他の単位領域とアミノ酸配列の異なる検出用ペプチドを有することが好ましい。当該単位領域は、ペプチドアレイに複数存在することが好ましい。これにより、ペプチドアレイに異なる検出用ペプチド群を有することができる。そして、かかる異なる検出用ペプチド群に対して、同一酵素反応条件下で単一酵素又は混合型酵素を用いることができる。
【００４１】
前記各単位領域には、他の単位領域とアミノ酸配列が同一である検出用ペプチドを有することが好ましい。これにより、ペプチドアレイに同一の検出用ペプチド群を有することができる。そして、この群を複数に区分けし、当該区分けごとに異なるタンパク質分解酵素で処理することができる。
【００４２】
本技術のペプチドアレイに含まれる固相担体としては、解離性リンカーをスポット合成できるものであれば特に制限されないが、セルロース膜、ニトロセルロース膜、ポリスチレン樹脂、又はガラスプレート等を例示することができる。固相担体は、プレート状、シート状、膜状の何れでもよい。
【００４３】
前記検出用ペプチドは、解離性リンカーを介して固相担体に固定化されていることが望ましい。解離性リンカーを用いることで、固定化されているペプチドを必要に応じて解離することができ、解離後のペプチドのアミノ酸配列を容易に判定しやすい。
【００４４】
本技術の解離性リンカーは、物理的手段（例えば、光、温度等）及び化学的手段（例えば、酵素、ｐＨ調整剤等）により、検出用ペプチドのＣ末端が、当該リンカーから解離することが可能なものであればよい。
前記解離性リンカーとして、例えば、光解離性リンカー、還元処理型解離性リンカー、酵素解離性リンカー、温度解離性リンカー、ｐＨ解離性リンカー等が挙げられる。これらを単独で又は２種以上用いることも可能である。
【００４５】
光反応性の解離性リンカーで固定する際に用いる光解離性リンカーは、ペプチドアレイの固相担体とペプチドのＣ末端とに結合して固相担体とペプチドとを架橋する化合物であり、所定の波長を有する光の照射により前記ペプチドとの結合が切断され、ペプチドを遊離させることができる性質を有するものである。
また、本技術に使用する光反応性架橋剤は、光照射によって分解する構造を有する架橋剤であれば特に制限されない。かかる光反応性架橋剤としては、Ｆｍｏｃフォトリンカー等を例示することができる。
【００４６】
還元処理型解離性リンカーは、ペプチドアレイの固相担体とペプチドのＣ末端とに結合して固相担体とペプチドとを架橋する化合物であり、還元操作によるリンカー部位の切断により、ペプチドを回収することができる。かかる還元処理型解離性リンカーとしては、ジスルフィドリンカー等を例示することができる。
酵素解離性リンカーは、ペプチドアレイの固相担体とペプチドのＣ末端とに結合して固相担体とペプチドとを架橋する化合物であり、エステラーゼ酵素等で処理してリンカー部位を切断してペプチドを回収することができる。かかる酵素解離性リンカーとしては、エステラーゼ酵素により解離させるエステルリンカー等を例示することができる。
【００４７】
このうち、解離処理が容易で検出用ペプチドの損傷が少ない、光反応性の解離性リンカーが好ましい。
【００４８】
本技術におけるペプチドアレイの作成方法は、特に制限されない。
本技術におけるペプチドアレイは、公知のペプチドアレイの作成方法を適用して作成することができる。
本技術のペプチドアレイに含まれる検出用ペプチドの作成方法は、例えば、Ｆｍｏｃ（Fluorenylmethoxycarbonyl）法又はＢｏｃ（tert-Butyloxycarbonyl）法等のペプチド固相合成法を採用することができ、ペプチド自動合成機等を用いて作成することもできる。
【００４９】
本技術のペプチドアレイは、検出用ペプチドが固相担体の表面上の単位領域に固定化されるように合成する工程を含むことにより製造されることが望ましい。より好ましくは、当該合成工程において、単位領域の表面に解離性リンカーを介して検出用ペプチドを合成することである。また、当該合成工程において、単数又は複数の検出用ペプチドを含む検出用ペプチド群を、単位領域ごとに合成することも可能である。
【００５０】
また、本技術のペプチドアレイは、各単位領域に存在する検出用ペプチドを、目的タンパク質又は目的ペプチドに基づきペプチドのアミノ酸配列や鎖長（例えば、２〜２０残基、順次１〜１０ｍｅｒずれ等）等を設計する工程を含むことにより、製造されることが望ましい。
【００５１】
また、ペプチドアレイを作成する際に、検出用ペプチド群の検出用ペプチドのアミノ酸配列、検出用ペプチド群中のペプチド数、ペプチドアレイ上の検出用ペプチド群の単位領域の位置等の作成情報を、データベース上に保管することが望ましい。これにより、酵素処理前のアミノ酸配列、ペプチド数量、ペプチド群数及びその位置等が容易に検索することができる。
【００５２】
なお、本技術におけるペプチドアレイの作成方法の一態様としては、以下の（ア）〜（オ）の工程によるＦｍｏｃ固相合成法による光解離性リンカーを含むペプチドアレイの作成方法を例示することができる。
（ア）固相担体上に整列するスポット（微小領域）に９−フルオレニルメトキシ基（Ｆｍｏｃ基）で保護した光反応性架橋剤をスポット合成した後、ピペリジンを添加して前記Ｆｍｏｃ基を脱保護した後、固相担体をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide：DMF）で洗浄し、さらにメタノールで洗浄して乾燥させる。
（イ）Ｎ末端がＦｍｏｃ基で保護されたアミノ酸と、前記（ア）にて脱保護した前記光反応性架橋剤とをカップリング反応により結合させる。
（ウ）さらに、光反応性架橋剤と結合した前記アミノ酸をピペリジン添加により脱保護した後、固相担体を再度ＤＭＦで洗浄し、さらにメタノールで洗浄して乾燥させる。
（エ）Ｎ末端をＦｍｏｃ基で保護されたアミノ酸と、前記（ウ）にて脱保護したアミノ酸とを結合させる。
（オ）前記（ウ）及び（エ）の工程を繰り返すことで、固相担体の解離性リンカー上に１残基ずつアミノ酸配列を伸長させることで、所望のアミノ酸配列を有するペプチドが固相担体上に解離性リンカーを介して固定化されたペプチドアレイを得る。
【００５３】
［２］酵素処理工程
本酵素処理工程は、前記ペプチドアレイを、タンパク質分解酵素にて酵素処理をする工程である。かかる酵素処理工程は、ペプチドアレイ上にタンパク質分解酵素溶液を添加することにより行うことができる。
【００５４】
具体的には、本酵素処理工程は、ペプチドアレイ上にある検出用ペプチド（群）に対して酵素加水分解反応にて行うことができる。
タンパク質分解酵素により検出用ペプチドが分解されなかった場合、この検出用ペプチドは、分解されずにペプチドアレイの表面に固定されている。一方で、タンパク質分解酵素により検出用ペプチドが分解された場合、検出用ペプチドは、表面に固定されているペプチド又はアミノ酸と、遊離したペプチド又はアミノ酸とになる（例えば、図２参照）。
これにより、検出用ペプチドに対する酵素の切断有無又は酵素の切断部位を検出することが可能となる。また、検出用ペプチド群中の酵素分解の有無の割合により、酵素切断強度（切断の強弱）を検出することも可能となる。
【００５５】
本酵素処理工程に用いるタンパク質分解酵素は、アミノ酸配列中のペプチド結合を切断する作用を有する限り、どのようなタンパク質分解酵素を使用してもよく、酵素特異性が未知又は既知である酵素であってもよい。また、当該酵素は、プロテアーゼであっても、ペプチダーゼであってもよい。
また、タンパク質分解酵素としては、例えば、微生物由来酵素、動物由来酵素、植物由来酵素から選ばれる１種又は２種以上のものが挙げられる。
また、タンパク質分解酵素は、単一のタンパク質分解酵素であっても、複数種のタンパク質分解酵素からなる混合型酵素組成物であってもよい。
なお、単一の酵素は高純度に精製された酵素であってもよい。混合型酵素は、高純度に精製されていない粗酵素であってもよく、また複数の精製酵素を組み合わせたものでもよい。
【００５６】
さらに、タンパク質分解酵素は、エンドプロテアーゼ（エンドぺプチダーゼ）であってもエキソプロテアーゼ（エキソペプチダーゼ）であっても良いが、エンドプロテアーゼ（エンドぺプチダーゼ）であることが好ましい。
かかるタンパク質分解酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、スブチリシン、エラスターゼ、テルモリシン、パパイン、カテプシン、カスパーゼ、キモシン（レンネット）、パンクレアチン又はこれらの混合物を例示することができる。
【００５７】
本酵素処理工程では、まず、タンパク質分解酵素を水に溶解してタンパク質分解酵素溶液を調製する。タンパク質分解酵素は、４〜１０℃の冷水に分散し、溶解して使用することが好ましい。当該タンパク質分解酵素の溶解液の濃度は特に限定されず、通常、酵素濃度が０．０１〜１０％程度となる量で使用することが効率性及び操作性の点から望ましい。複数種のタンパク質分解酵素を用いる場合、１種類ずつ溶解することが望ましいが、添加の順番は特に制限されない。また、ｐＨ調整剤を用いて、タンパク質酵素分解溶液のｐＨを調製することができる。ｐＨ調整剤は特に限定されないが、例えば、塩酸、クエン酸、アスコルビン酸等が挙げられる。
【００５８】
タンパク質分解酵素の使用量は、基質濃度、酵素力価、反応温度、及び反応時間等により異なるが、一般的には、基質となるペプチド１ｇ当たり１００〜２０００単位（活性単位）の割合が望ましい態様として挙げられる。
【００５９】
タンパク質分解酵素溶液の調製した後は、当該溶液に前記ペプチドアレイを添加して加水分解反応を行う。加水分解反応にあたり、反応系の温度反応継続時間は、特に限定されない。
【００６０】
続いて、必要に応じて酵素反応を停止させる。酵素反応の停止は、通常、加水分解液中の酵素を失活させることにより行われ、例えば、加熱失活処理等の常法により実施することができる。加熱失活処理の条件（加熱温度、加熱時間等）は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができ、例えば、８０〜１３０℃の温度範囲で３０分間〜２秒間の保持時間で行うことができる。
【００６１】
［３］洗浄工程
次に、酵素処理後のペプチドアレイを洗浄することが好ましい。ペプチドアレイを洗浄することによって、ペプチドアレイの固相担体上に固定されている酵素処理物以外の不純物を除去することができる。この洗浄により、酵素により切断され溶液中に遊離しているペプチドと、固定されている検出用ペプチドとを、簡単に分けることができる。
より具体的には、ペプチドアレイから酵素溶液を除去した後、さらに、純水及び／又はエタノール等有機溶媒が含まれる洗浄液で洗浄して、ペプチドアレイの固相担体上に固定化された酵素処理物以外の不純物を除去してから乾燥させる。
【００６２】
なお、酵素反応後に速やかにペプチドアレイから酵素溶液を除去して、エタノール等の水溶性有機溶媒を含む洗浄液で洗浄することにより酵素変性させることも可能である。これによって、実質的に酵素反応を停止させることが可能であるため、本技術において前記加熱失活処理等により酵素を失活させる工程は、適宜省略することも可能である。
【００６３】
［４］酵素処理物の遊離工程
続いて、本遊離工程では、前記ペプチドアレイ上に固定されている酵素処理物を遊離させる。遊離させる場合、固定化に使用した解離性リンカーの解離条件に従って処理する。これにより、固定されている酵素処理後の検出用ペプチドが、遊離することになる。
【００６４】
本遊離工程の一例として、光解離性リンカーを用いる場合、光照射により前記光反応性リンカーを開裂させることで、固相担体の単位領域表面に固定されている検出用ペプチド群を、固相担体のリンカーから解離させ、検出用ペプチド（群）を遊離させる。
光照射のために用いる光源としては、市販のＵＶ照射機等を用いることができる。また、照射する光の波長、強度及び照射時間は特に制限されず、使用する光反応性リンカーの特性に応じて決定することができるが、光源としては、好ましくは２５４〜３６５ｎｍ範囲の波長、より好ましくは３１２〜３６５ｎｍ範囲の波長を含むことが好ましい。照射時間は、０．５〜４時間が好ましく、１〜２時間がより好ましい。
【００６５】
遊離工程後に、酵素処理後の検出用ペプチドを含む単位領域ごとに回収する工程を含むことが好ましいが、洗浄工程後に回収工程を行ってもよい。解離性リンカーの解離条件に合わせて、回収工程の順番を適宜変更してもよい。
例えば、光解離性リンカーの場合、光照射後でも固相担体に検出用ペプチドが付着した状態にあるため、この固相担体部分を乾燥した状態で回収することは容易である。さらに、溶液によってこの固相担体部分から検出用ペプチドを容易に溶出させることができる。
回収工程の一例として、遊離工程後で乾燥状態にあるペプチドアレイの固相担体上の単位領域ごとに、パンチアウト等を行う。これにより、各単位領域に存在する検出用ペプチド（群）を回収することができる。乾燥したパンチアウト物は、９６Ｗｅｌｌプレート等のウェル内に入っており、このウェル内に溶液を添加して、酵素処理後の検出用ペプチド（群）を溶出させる。溶出された酵素処理後の検出用ペプチド（群）の同定を行う。
【００６６】
［５］酵素処理物の同定工程
前記［４］遊離工程にて、遊離させた酵素処理物である検出用ペプチド（群）を回収し、酵素処理後の検出用ペプチド（群）のアミノ酸配列が同定可能な構造解析法にて同定する。
一例として、本同定工程では、前記［４］遊離工程にて遊離させた酵素処理後の検出用ペプチドの構造を特定するために、遊離した検出用ペプチドを溶媒にて溶出させた後、これを回収し、所定の構造解析法により前記酵素処理物の構造（アミノ酸配列）を決定すること等が挙げられる。
本同定工程における構造解析法としては、特に限定されないが、好ましくは質量分析法を用いることができる。さらに、クロマトグラフ質量分析を用いることが好ましい。クロマトグラフを用いることにより、検出用ペプチド群におけるペプチドの酵素切断割合も容易に検出することができる。
さらに、好ましくは液体クロマトグラフ質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）を用いることができる。ＬＣ／ＭＳは、ガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）と比較し、作業が簡便であり、容易にペプチドを回収することができる。溶出条件は、構造解析法に応じて適宜設定することもできる。
【００６７】
［６］酵素切断部位検出工程
本酵素切断部位検出工程は、酵素処理前後の検出用ペプチド（群）のアミノ酸配列を単位領域ごとに対比することにより、各単位領域における検出用ペプチド（群）の酵素切断部位を検出する工程を含むものである。
検出用ペプチドは、前記目的タンパク質又はペプチドの一部であるので、各単位領域の検出用ペプチド（群）の酵素切断部位の検出結果を総合的に検討することにより、元となった目的タンパク質又はペプチドの酵素切断部位の検出を容易に行うことができる。
【００６８】
本検出工程の一例として、前記酵素処理後の検出用ペプチドのアミノ酸配列を決定した後、酵素処理前の検出用ペプチドのアミノ酸配列と、酵素処理後の検出用ペプチドのアミノ酸配列とを対比することにより、検出用ペプチドの酵素切断部位を検出する。
【００６９】
より具体的な一例として、酵素処理前の検出用ペプチド及び酵素処理後の検出用ペプチドを、Ｃ末端側のアミノ酸残基から順次対比する。これにより、酵素処理後の検出用ペプチドのＮ末端側のアミノ酸残基と、このアミノ酸のＮ末端側に隣接していた切断前のアミノ酸残基が判断できる。
そして、酵素処理後の検出用ペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸と、当該アミノ酸のＮ末端側に隣接するアミノ酸とのペプチド結合を、使用した酵素による検出用ペプチドの酵素切断部位として検出する。
【００７０】
さらに、酵素処理後の検出用ペプチド群のペプチド数の絶対評価又は相対評価により、酵素切断部位で切断された割合を検出することも可能である。
絶対評価として、例えば、酵素処理後の検出用ペプチド群のピーク面積や検出信号量等が挙げられる。
相対評価として〔酵素処理後の検出用ペプチド群／酵素処理前の検出用ペプチド群〕の対比が挙げられる。この酵素処理前の検出用ペプチド群（ペプチド数）は、ペプチドアレイ上で酵素処理前の１〜５群程度を任意に選択し、そのペプチド数やピーク面積等の平均値であってもよい。相対評価として、例えば、１／３以下のとき切断強度が「低」、１／３超〜２／３以下のとき切断強度が「中」、２／３超のとき切断強度が「高」と判定することが可能である。
【００７１】
これにより、使用したタンパク質分解酵素の特異性（酵素切断部位）を検出することができる。さらに、酵素処理後の検出用ペプチド群中のペプチド数を検出することにより、酵素切断部位における切断強度（強弱）も検出することができる。
【００７２】
本検出工程の一態様では、例えば、ペプチドアレイにＦＹＱＫＦＰＱＹＬＱのアミノ酸配列からなる１０残基の検出用ペプチドが含まれる単位領域が存在する場合であって、当該ペプチドの酵素分解物としてＦＰＱＹＬＱの構造が特定された場合には、前記ペプチドのＮ末端から４番目のアミノ酸であるＫ（リジン）とこれに隣接する５番目のＦ（フェニルアラニン）の間のペプチド結合をタンパク質分解酵素による切断部位として検出することができる。
また、ＦＹＱＫＦＰＱＹＬＱからなるアミノ酸配列を含むタンパク質についても同様に、当該アミノ酸配列中のリジン残基とフェニルアラニン残基とのペプチド結合部位を、当該タンパク質の切断部位の一部として検出することができる。
【００７３】
また、本検出工程の一態様として、液体クロマトグラフ質量分析法により酵素処理物の構造解析をする場合、解析の結果得られたクロマトグラムにおいて酵素分解物（酵素により切断された酵素処理後の検出用ペプチド）を示すピーク面積から、ペプチドの切断部位の切断強度を検出することができる。この切断強度は、酵素処理前の検出用ペプチドのピーク面積を基準（相対評価）にして検出してもよく、また酵素処理後のピーク面積を基準（絶対評価：例えば、高中低）にして検出してもよい。
【００７４】
すなわち、クロマトグラムで検出された酵素分解物のピーク面積が大きい程、酵素分解物の量も多くなることから、前記ピーク面積が大きい程タンパク質分解酵素による切断強度が高く、基質となるペプチドに対する特異性が高いことを意味する。
【００７５】
さらに、本技術の検出方法として、複数ペプチドアレイを使用し、各ペプチドアレイにおける酵素濃度等の酵素反応条件の設定をペプチドアレイごとに変更することで、切断強度の変動を検出することも可能である。
【００７６】
具体的な一例として、前記ペプチドアレイを複数使用し、反応温度、反応ｐＨ、反応時間、酵素濃度及び基質濃度から選ばれる１種又は２種以上の酵素反応条件を変更して、それぞれのペプチドアレイに対して酵素処理を行うことが望ましい。
このとき、使用するペプチドアレイは、例えば、単位領域数、検出用ペプチドの種類、検出用ペプチド群の並び方等が同じペプチドアレイであることが、望ましい。
これにより、酵素反応条件の変更と、酵素切断部位の変化（切断部位及び切断強弱）との関連性を明らかにすることができる。
そして、タンパク質分解酵素の特異性をより細かくデータとして蓄積することができる。さらに、目的の分解物を得るために、種々の酵素反応条件を適用することができる。また、目的の分解物を得るために、設定した酵素反応条件において適したタンパク質分解酵素を選択することも可能となる。
【００７７】
＜タンパク質加水分解物又はペプチド加水分解物の製造方法＞
本技術において、前述した検出用ペプチドの切断部位検出方法を用いることによって、タンパク質又はペプチドの原料から目的とする分解物を製造する際に、好適なタンパク質分解酵素を単数又は複数選択することができる。
【００７８】
本技術の製造方法において目的とする分解物とは、必要とするペプチド又は不要なペプチドの何れでもよく、またこれらを含む分解物であってもよい。
例えば、不要なペプチドとして、エピトープ部分、苦味ペプチド等が挙げられる。
例えば、必要なペプチドとして、例えば、エピトープ部分を除いたペプチド、機能性ペプチド等及びこれらを含む分解物等が挙げられる。当該機能性ペプチドには、例えば、苦味低減ペプチド、呈味性ペプチド、物性改良ペプチド、生理活性ペプチド、医薬用途的ペプチド等が挙げられる。
また、必要なペプチドを含む分解物の場合、さらに、必要なペプチドの効能、風味等を向上させるため、必要なペプチドを分離精製することが好ましい。
また、不要なペプチドを含む分解物の場合、さらに分解物の効能、風味等を改善又は向上させるため、不要なペプチドを除去又は低減することが好ましい。
【００７９】
本技術の前記検出方法の検出結果に基づき、タンパク質分解酵素と、アミノ酸配列の酸素切断部位との対応関係を作成することができる。作成された対応関係を指標として、２種以上のタンパク質分解酵素から構成される酵素情報群から、タンパク質分解酵素を選択することができる。
【００８０】
前記対応関係に基づき選択されたタンパク質分解酵素は、アミノ酸配列中の標的とするペプチド結合部位を特異的に切断することが可能である。当該選択された酵素により、機能性ペプチド等の所望のアミノ酸配列を有するペプチド又は当該ペプチドを含む分解物を効率よく製造することができる。
【００８１】
前記検出方法に基づき得られた１つのタンパク質分解酵素と当該酵素のアミノ酸配列の切断部位との対応関係を、当該タンパク質分解酵素の名前にて、及び／又は、各アミノ酸配列の切断部位の名前にて、ファイリングし、データベース上に記憶することが可能である。
また、このファイリングは、酵素名、当該酵素のアミノ酸配列の切断部位、当該アミノ酸配列を含むタンパク質名、当該酵素反応条件（例えば、温度、ｐＨ、反応時間、基質濃度、切断強度等）の項目を設けて行うことが可能である。項目が多いほど、目的とする分解物を精度良く得ることができるので好適である。また、これら項目同士をアクセス可能なように紐付けしておくことが好ましい。
これにより、酵素ごとのタンパク質又はペプチドの酵素切断部位のマッピング化をすることができる。酵素反応条件に基づき、目的の分解物を効率よく得ることができる。
【００８２】
本技術の製造方法において、酵素反応条件に基づき、前記対応関係を指標として、前記酵素群からタンパク質分解酵素を選択することが好ましい。さらに各種酵素反応条件を設定することにより、当該酵素反応条件に対応した適切な酵素を選択することができる。当該適切な酵素を用いることで、目的とする分解物を効率的に得ることができる。
【００８３】
本技術の製造方法において、目的ペプチドのアミノ酸配列に基づき、前記対応関係を指標として、当該酵素切断部位及びタンパク質分解酵素を選択することが好ましい。目的ペプチドを設定することにより、目的ペプチドの製造条件に対応した適切な酵素を選択することができる。当該適切な酵素を用いることで、分解物中の目的ペプチドを効率的に得ることができる。
【００８４】
本技術の酵素切断部位の検出方法とその検出結果及び／又は当該検出結果と分解物の製造方法を、装置のＣＰＵ等を含む制御部、及び記憶媒体（ＵＳＢメモリ、ＨＤＤ、ＣＤ、ネットワークサーバ等）等を備えるハードウエア資源にプログラムとして格納し、制御部によって実現させることも可能である。
また、本技術は、本技術の酵素切断部位の検出方法及び／又は当該検出結果と分解物の製造方法として、コンピュータを機能させるためのプログラムとすることも可能である。
【００８５】
本技術の対応関係を用いることにより、過度にタンパク質を分解することのない酵素を選択することが可能である。また、当該対応関係を用いることにより、苦味が生じるアミノ酸残基の切断を回避する酵素を選択することが可能である。また、当該対応関係を用いることにより、エピトープ部分を切断する酵素を選択することが可能である。
したがって、本技術の対応関係を用いることにより、最終的に、機能性ペプチド等の所望のアミノ酸配列を有するペプチドを含む分解物、苦味が抑制された分解物、エピトープを除いた分解物等所望のタンパク又はペプチドの分解物を効率的に製造することができる。
【００８６】
前記のとおり、本技術のタンパク質分解物の製造方法は、前記対応関係を用いたタンパク質分解酵素の選択法を特徴とする。
本技術において、標的部位を切断する特異性の高いタンパク質分解酵素の選択法は、例えば、以下の態様を例示することができる。
【００８７】
前記酵素選択法の一態様としては、２種以上のタンパク質分解酵素からなる酵素群を設定し、前述したタンパク質又はペプチドの切断部位検出方法により、当該酵素群を構成する各タンパク質分解酵素による一のタンパク質の切断部位を検出する。
次に、得られた各タンパク質分解酵素による前記タンパク質に対する切断部位に係るデータから、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを含む加水分解物を製造するにあたって、標的部位を切断する特異性が最も高いタンパク質分解酵素又はその組合せを最適な酵素として選択する。
【００８８】
さらに、タンパク質分解酵素の選択法の別の態様としては、以下の方法を例示することもできる。
複数種のタンパク質分解酵素について、前述したタンパク質又はペプチドの切断部位検出方法によって、各タンパク質分解酵素による任意のペプチドの切断部位を検出する工程を実施し、各タンパク質分解酵素と当該タンパク質分解酵素が分解能を示すペプチド結合（２種のアミノ酸の組合せ）の組合せを要素として含むデータベースを構築する。
次に、所望のアミノ酸配列からなるペプチドを含むタンパク質加水分解物を製造するにあたって、標的部位を切断する特異性の高いタンパク質分解酵素を前記データベースで照合して選択する。
【００８９】
本技術の製造方法において、前述したタンパク質又はペプチドの切断部位検出方法の検出結果に基づき、（ａ）タンパク質分解酵素と、（ｂ）当該酵素によるアミノ酸配列の酵素切断部位と、の対応関係データが、データベース（記憶部）上に保存されている。当該対応関係データは、それぞれのタンパク質分解酵素の名前で分類し保存されてもよい。好ましくは、酵素選択効率を良くするため、これら酵素と酵素切断部位との対応関係データをまとめて酵素情報群データとしてデータベース（記憶部）上に保存し管理することがよい。
【００９０】
一例として、以下の手順１〜５にて、目的ペプチドを含む分解物を製造することができる。
手順１：目的とするペプチドを入力設定した場合、当該ペプチドと相同領域を有するタンパク質又はペプチドを、タンパク質又はペプチドデータを有するデータベース（記憶部）上から探索し、単数又は複数を選択し表示する。表示されたタンパク質又はペプチドから使用するものを入力設定してもよい。
【００９１】
手順２：選択されたタンパク質又はペプチドと、目的ペプチドとのアミノ酸配列との対比により、酵素切断部位を特定する。具体的には、目的ペプチドの両端のＮ末端及びＣ末端と、これらにそれぞれ隣接するＣ末端とＮ末端が、酵素切断部位として特定される。さらに目的ペプチドの両末端以外のアミノ酸配列は切断されないものとして特定される。
【００９２】
手順３：データベース上の酵素情報群から、特定された酵素切断部位と特定された酵素切断不可部位に適合する酵素を単数又は複数選択する。
これにより最適な酵素が特定され、さらに当該酵素データの反応条件が特定される。また、酵素が複数選択された場合、そのなかから最適な酵素を入力設定し、適宜酵素の反応条件も入力設定してもよい。
【００９３】
手順４：表示部には、特定されたタンパク質又はペプチドの原料、タンパク質分解酵素、酵素反応条件等の製造条件が表示される。
【００９４】
手順５：特定された条件にてタンパク質又はペプチドの原料から目的ペプチドを含む分解物の製造が開始され、当該分解物が製造される。
目的ペプチドを含む分解物を製造した後、さらに分離精製を行い、目的ペプチドの純度を高めることも可能である。
【００９５】
例えば、後記〔実施例〕の化１〜３を参照して具体的な例を挙げると、目的ペプチドとしてＬＰ（１７６と１７７番目）を入力設定した場合、酵素情報群（化１〜３参照）より、Aspergillus酵素とαｓ２−Casein（一部のときペプチド）が特定される。これにより、ＬＰを含む分解物を製造することができる。
また、目的ペプチドとしてＬＰＱ（１７６〜１７８番目）を入力設定した場合、Bacillus酵素とαｓ２−Casein（一部のときペプチド）が特定される。これにより、ＬＰＱを含む分解物を製造することができる。
さらに、苦味低減の入力設定をした場合、Ｃ末端にプロリンのない、ＬＰＱが特定されることになる。これにより、ＬＰの配列を有するペプチドを含み、かつ苦味が低減された分解物を得ることができる。
【００９６】
また、本技術の製造方法を用いれば、使用するタンパク質又はペプチドの原料、使用する単数又は複数のタンパク質分解酵素、及び酵素反応条件を、入力設定することにより、データベース上の酵素情報群にアクセスし、製造のシミュレートすることも可能である。これにより、酵素切断部位及びその切断強度の予測が可能となる。さらに、原料から得られる分解物中のペプチドの種類や鎖長や分解度等を予測することも可能である。また、分解物の風味（苦味等）等もある程度予測することができる。
【００９７】
以上のとおり、本技術によれば、所望のアミノ酸配列からなるペプチドを含むタンパク質加水分解物を製造するにあたって、タンパク質から当該ペプチドを切出すことができる最適なタンパク質酵素を選択することができる。
本技術によれば、所望のアミノ酸配列からなるペプチドを含むタンパク質の加水分解物の製造において、タンパク質から当該ペプチドを効率的に切出すことができる。
さらに、本技術において、必要に応じて、タンパク質の過度な加水分解を抑制して苦味が生じにくい加水分解物を製造することができる。
【実施例】
【００９８】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００９９】
製造例１〜３にて、後記実施例にて使用するペプチドアレイを作成した。
下記表１に、配列番号１（αｓ２‐カゼイン）、配列番号２（αｓ２‐カゼインの一部）及び配列番号３（β-ＬＧ）を示す。
【０１００】
【表１】
2019024372.tif 000002
【０１０１】
［製造例１］
ペプチド自動合成機（ＩＮＴＡＶＩＳ社製）を用いて、Ｆｍｏｃ固相合成法により、光反応性架橋剤としてＦｍｏｃ-フォトリンカーｓｃ−２９４９７７Ａ（Santa Cruz Biotechnology社製）を架橋剤としてセルロース膜上にペプチドを１残基ずつ伸長させてスポット合成し、表２に示したペプチド６７種を含むペプチドアレイを作成した。
当該６７種のペプチドは、２０７残基のアミノ酸配列からなるαｓ２‐カゼインのアミノ酸配列（配列番号１）の一部を構成する１０残基のペプチドである。
各々のペプチドは、αｓ２‐カゼインのＮ末端のリジン残基から、Ｃ末端側に３残基ずつずれた（αｓ２‐カゼインのＣ末端を含むペプチドのみ２残基のずれ）アミノ酸を、各ペプチドのＮ末端として合成した１０残基のペプチドである。各々のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と相同領域を有するペプチドである。
例えば、表２中において、Ｎｏ．１は配列番号１のＮ末端側の１番目〜１０番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．２は配列番号１の４番目〜１４番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．３は配列番号１の７番目〜１７番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、ＮＯ．４は配列番号１の１０番目〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．５は配列番号１３番目〜２３番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．６７は配列番号１の１９８番目〜２０７番目のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【０１０２】
【表２】
2019024372.tif 000003
【０１０３】
［製造例２］
製造例１と同様の方法で、表３に示したペプチド３０種を含むペプチドアレイを作成した。
当該ペプチドアレイに含まれるペプチドは、αｓ２‐カゼインのアミノ酸配列中のＮ末端から３７残基分の配列（配列番号２）の一部を構成するペプチドであり、各々のペプチドは、前記配列のＮ末端に位置するグルタミン残基から、Ｃ末端側に１残基ずつずれたアミノ酸をＮ末端として合成した７残基のペプチドとした。各々のペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と相同領域を有するペプチドである。
例えば、表３中において、Ｎｏ．１は配列番号２のＮ末端側の１番目〜７番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．２は配列番号２の２番目〜８番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．３は配列番号２の３番目〜９番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．４は配列番号２の４番目〜１０番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．５は配列番号２の５番目〜１１番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．３０は配列番号２の３０番目〜３７番目のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【０１０４】
【表３】
2019024372.tif 000004
【０１０５】
［製造例３］
製造例１と同様の手順で、以下の表４に示したペプチド１５６種を含むペプチドアレイを作成した。
当該ペプチドアレイに含まれるペプチドは、１６２残基のアミノ酸配列からなるβ‐ラクトグロブリンのアミノ酸配列（配列番号３）の一部を構成する１５６種のペプチドであり、各々のペプチドは、β‐ラクトグロブリンのＮ末端に位置するロイシン残基から、Ｃ末端側に１残基ずつずれたアミノ酸をＮ末端として合成した７残基のペプチドである。各々のペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と相同領域を有するペプチドである。
例えば、表４中において、Ｎｏ．１は配列番号３のＮ末端側の１番目〜７番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．２は配列番号３の２番目〜８番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．３は配列番号３の３番目〜９番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．４は配列番号３の４番目〜１０番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．５は配列番号３の５番目〜１１番目のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｎｏ．１５６は配列番号３の１５６番目〜１６２番目のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【０１０６】
【表４】
2019024372.tif 000005
【０１０７】
［実施例１］
本発明のタンパク質合成酵素によるタンパク質又はペプチドの切断部位検出方法の精度を検証するために、実施例１では、タンパク質合成酵素としてタンパク質に対する分解特性が良く知られているトリプシンを用いて試験を行った。
【０１０８】
（１）加水分解処理
製造例１にて作成したペプチドアレイをトリプシン酵素製剤（4,500,000unit/g、Ｗａｋｏ社製）の０．０１％水溶液（450unit/ml）中で３７℃、２時間加水分解処理し、分解後に純水でリンスした後、７０％エタノールでリンスしてから乾燥させた。
【０１０９】
（２）酵素分解物の遊離・回収
前記（１）加水分解処理にて乾燥したペプチドアレイに、３１２〜３６５ｎｍ範囲の波長を含む紫外光を２時間照射してＦｍｏｃ-フォトリンカーを開裂させ、セルロース膜上に固定化されている酵素分解物を遊離させた。その後、ペプチドアレイを９６ｗｅｌｌのフィルタープレート（MultiSreen Solvinert「MSRLN0410」、メルクミリポア社製）にパンチアウトし、各ｗｅｌｌに２％アセトニトリル溶液を２００μＬを添加し、２５℃で１時間静置してペプチドを溶出した。溶出後、５００×Ｇで１０分間遠心処理し、ペプチド溶出液を９６ｗｅｌｌプレートに回収した。
【０１１０】
（３）酵素分解物の構造解析
以下の条件にて、前記（２）酵素分解物の遊離・回収にて溶出した酵素分解物の液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を行い、酵素分解物の構造を特定した。
〔液体クロマトグラフ〕
カラム：TSKgel ODS-100V 5μm(2.0mm I.D.×250mm L)（東ソー社製）
流速：０．２ｍｌ／分
溶出液Ａ：０．２％ギ酸溶液
溶出液Ｂ：０．２％ギ酸‐アセトニトリル溶液
グラジエント：溶離液Ｂの割合を５％から１２分後に８０％に上昇させる直線グラジエント
〔質量分析〕
使用機器：TSQ Quantum Discovery MAX（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）
分析モード：SIM測定（各ペプチドの分子量に応じて測定するｍ／ｚを設定）
【０１１１】
（４）結果
前記（３）酵素分解物の構造解析の液体クロマトグラフ質量分析の結果、クロマトグラムのピークとして検出された酵素分解物のアミノ酸配列と、前記製造例１にて固相合成したペプチドのアミノ酸配列とを対比して、表１に記載した各々のペプチドの切断部位を検出した。さらに、各々のペプチドの切断部位から、αｓ２‐カゼインの切断部位を検出した結果、表５のとおりとなった。
表５において切断部位の表記は、切断されたペプチド結合によって結合していたαｓ２‐カゼイン中のアミノ酸残基の番号（Ｎ末端側からカウント）と、当該アミノ酸残基の一文字表記を示す。すなわち、「１−２（Ｋ−Ｎ）」との表記は、αｓ２‐カゼインのＮ末端から１番目のリジン残基（Ｋ）と２番目の残基（Ｎ）の結合が切断されたことを示すものである。かかる表記は、表６以降も同様である。
【０１１２】
なお、切断部位の判断は、液体クロマトグラフ質量分析のクロマトグラムにおいて検出された酵素分解物に対応するピークの面積により判断した。具体的には、当該ピーク面積の平均値が５．０×１０７以上である場合には、当該酵素分解物は、タンパク質合成酵素による加水分解で生じたものとして切断部位を特定した。さらに、当該ピーク面積の平均値が１．０×１０８以上であった場合はペプチドが高度に切断されたものとして切断強度を「高」と定義し、ピーク面積の平均値が５．０×１０７以上１．０×１０８未満であった場合にはペプチドが中程度に切断されたものとして切断強度を「中」と定義した。
【０１１３】
【表５】
2019024372.tif 000006
【０１１４】
表５にて示した切断部位を、下記の化１にて、αｓ２−カゼインのアミノ酸配列上に模式的に示した。化１に、トリプシン酵素と、当該酵素によるαｓ２−カゼイン由来の配列番号１の切断部位の対応関係を示す。
化１において矢印で示した切断部位のうち、切断強度が「高」の場合には実線の矢印、切断強度が「中」の場合には点線の矢印で表記した。
【０１１５】
【化１】
2019024372.tif 000007
【０１１６】
以上のとおり、本実施例において、αｓ２−カゼインの切断部位として２７カ所が検出され、当該切断箇所は、塩基性アミノ酸であるリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）のカルボキシ基側のペプチド結合を加水分解するというトリプシンの性質と適合するものであった。さらに、酵素切断部位検出ツールである「ExPASy」のPeptide Cutterによる解析では、αｓ２−カゼインのトリプシンによる切断部位は２９ヶ所で、当該２９カ所の切断部位は、本実施例にて同定された前記２７カ所の切断部位を全て含むことが確認された。したがって、本発明によるアミノ酸配列の切断部位の同定結果は、トリプシンによるαｓ２−カゼインの加水分解において、前記検出ツールと約９３％の割合で一致することがわかった。
【０１１７】
［実施例２］
実施例２では、複数のタンパク質酵素を含む酵素組成物を用いて、加水分解反応時の温度を変えてペプチドの切断部位の検出を行った。
【０１１８】
（１）加水分解処理
製造例２にて作成したペプチドアレイをBacillus subtilis由来の微生物酵素製剤（150,000unit/g、天野エンザイム社製）の０．５％水溶液（750unit/mL）、又はAspergillus niger由来の微生物酵素製剤（11unit/g、DSM社製プロリン特異的エンドプロテアーゼ製剤）の５０％水溶液（5.5unit/mL）で加水分解し、分解後に純水でリンスした後、７０％エタノールでリンスしてから乾燥させた。なお、Bacillus subtilis由来の微生物酵素製剤については、酵素分解時の温度条件を変更して加水分解を行った。したがって、合計以下の４通りの条件で加水分解を行った。
〔加水分解条件〕
(1)Bacillus subtilis由来の微生物酵素製剤にて、３７℃５時間加水分解
(2)Bacillus subtilis由来の微生物酵素製剤にて、５０℃５時間加水分解
(3)Bacillus subtilis由来の微生物酵素製剤にて、６３℃５時間加水分解
(4)Aspergillus niger由来の微生物酵素製剤にて、５０℃５時間加水分解
【０１１９】
（２）酵素分解物の遊離・回収
実施例１の（２）酵素分解物の遊離・回収と同様の手順で、加水分解後の酵素分解物を紫外光照射によりセルロース膜から遊離させた後、回収した。
【０１２０】
（３）酵素分解物の構造解析
実施例１の（３）酵素分解物の構造解析と同様の手順で、液体クロマトグラフ質量分析により酵素分解物の構造を解析した。
【０１２１】
（４）結果
実施例１と同様の手順で、３７残基のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号２）の切断部位を同定した結果、表６のとおりとなった。Bacillus subtilis由来の微生物酵素製剤にて３７℃で加水分解した場合と、温度条件を５０℃とした場合とでは、いずれも同じ１７箇所の切断箇所が検出されたが、前記ペプチドのＮ末端から１６番目のグルタミン残基（Ｑ）と１７番目のリジン残基（Ｋ）とのペプチド結合の切断強度が５０℃における加水分解の方が高くなる傾向が確認された。また、温度条件を６３℃とした場合の切断部位は１６箇所と、３７℃及び５０℃の場合よりも切断部位が減少した。
一方、Aspergillus niger由来の微生物酵素製剤による切断部位は１３箇所となった。
以上のことから、本発明によるタンパク質又はペプチドの切断部位検出方法は、タンパク質分解酵素が複数の酵素からなる組成物であり、さらに加水分解時の温度変化に伴って酵素活性が変化した場合にも有効であることが示唆された。
【０１２２】
【表６】
2019024372.tif 000008
【０１２３】
表６にて示した切断部位を、下記の化２にて、αｓ２‐カゼインのアミノ酸配列上に模式的に示した。化２に、B.subtilis由来酵素（それぞれ３７℃、５０℃、６３℃）と、当該酵素によるαｓ２‐カゼイン由来の配列番号２の切断部位の対応関係及びA.niger由来酵素（５０℃）と、当該酵素によるαｓ２‐カゼイン由来の配列番号２の切断部位の対応関係を示す。
化２において矢印で示した切断部位のうち、切断強度が「高」の場合には実線の矢印、切断強度が「中」の場合には点線の矢印で表記した。
【０１２４】
【化２】
2019024372.tif 000009
【０１２５】
［実施例３］
実施例３では、複数のタンパク質酵素を含む酵素組成物を用いて、加水分解反応の反応継続時間を変えてタンパク質の切断部位の検出を行った。
【０１２６】
（１）加水分解処理
製造例３にて作成したペプチドアレイをBacillus subtilis由来の微生物酵素製剤（150,000unit/g、天野エンザイム社製）の０．５％水溶液（750unit/mL）で５時間加水分解し、分解後に純水でリンスした後、７０％エタノールでリンスしてから乾燥させた。なお、加水分解は、時間を３分、３０分又は３００分（５時間）とした３通りの条件で行った。
【０１２７】
（２）酵素分解物の遊離・回収
実施例１の（２）酵素分解物の遊離・回収と同様の手順で、加水分解後の酵素分解物を紫外光照射によりセルロース膜から遊離させた後、回収した。
【０１２８】
（３）酵素分解物の構造解析
実施例１の（３）酵素分解物の構造解析と同様の手順で、液体クロマトグラフ質量分析により酵素分解物の構造を解析した。
【０１２９】
（４）結果
実施例１と同様の手順で、β‐ラクトグロブリンにおける切断部位を同定した結果、表７及び表８に示した通りとなった。３分の加水分解では４６カ所の切断部位が検出され、３０分の加水分解では５５カ所の切断部位が検出され、３００分の加水分解では７１カ所の切断部位が検出され、加水分解反応時間を長くすると、切断箇所が増加して切断強度も高くなることがわかった。
【０１３０】
【表７】
2019024372.tif 000010
【０１３１】
【表８】
2019024372.tif 000011
【０１３２】
化３に、B.subtilis由来酵素（それぞれ上から３分、３０分、３００分）と、当該酵素によるαｓ２‐カゼイン由来の配列番号２の切断部位の対応関係を示す。
化３において矢印で示した切断部位のうち、切断強度が「高」の場合には実線の矢印、切断強度が「中」の場合には点線の矢印で表記した。
【０１３３】
【化３】
2019024372.tif 000012
【０１３４】
以上のとおり、本技術によれば、タンパク質分解酵素によるタンパク質又はペプチドの切断部位を検出することが可能であり、加水分解反応の温度、反応時間といった条件の変化によるタンパク質分解酵素の分解特性をも把握することが可能であることが確認された。
したがって、本技術は、タンパク質分解酵素のタンパク質又はペプチドに対する切断部位を検出する方法として有用であり、とりわけ、酵素の基質特異性が未知の酵素組成物等に対して有用である。
さらに、前記方法により、複数種のタンパク質分解酵素についてのタンパク質又はペプチドの分解特性に係るデータを得ることで、任意のタンパク質から特定のアミノ酸配列を有するペプチドを含む加水分解物を製造する際に、標的部位を切断する特異性の高いタンパク質分解酵素を選択することができる。
かかる選択法を採用することで、タンパク質の過度な加水分解をせずに、所望のアミノ酸配列を含み、かつ苦味が抑制されたタンパク質加水分解物を製造することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本技術は、飲食品、機能性食品、医薬品等に利用可能なタンパク質又はペプチドの酵素分解物を設計することが可能であり、その設計に基づき目的とする酵素分解物を効率よく製造することができる。
本技術は、機能性ペプチド等の所望のアミノ酸配列を有するペプチドを含む加水分解物の製造にあたって、標的の部位を切断する特異性の高いタンパク質分解酵素を選択することができる。
本技術によれば、タンパク質の加水分解により抗原性を低下させるにあたって、エピトープ配列に対する分解特性の高いタンパク質分解酵素を選択することができる。そのため、機能性ペプチドの製造やタンパク質の抗原性を低減させる際に、タンパク質を過度に加水分解せずに、苦味の抑制されたタンパク質加水分解物の製造方法を提供することができる。
【符号の説明】
【０１３６】
１  ペプチドアレイ；２  固相担体；３  単位領域；３１  領域群；４  リンカー；５  検出用ペプチド；６  タンパク質分解酵素；７  酵素処理後の検出用ペプチド；８  酵素切断により遊離されたペプチド
【図１】
2019024372.tif 000013
【図２】
2019024372.tif 000014
【配列表】
2019024372000001.app