(57)【要約】【課題】安価、安全かつ簡便な手法により達成することが可能な酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法を提供する。【解決手段】ピロール化合物を含む培養促進剤を、酸素発生型光合成を行う生物が生育する培地に添加し、培地を生物の増殖条件に保持する。ここで、ピロール化合物はテトラピロール化合物を含むことが好ましく、酸素発生型光合成を行う生物として藻類を用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロール化合物を含む培養促進剤を、酸素発生型光合成を行う生物が生育する培地に添加し、該培地を前記生物の増殖条件に保持することを特徴とする酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法。
【請求項２】
請求項１記載の酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法において、前記ピロール化合物はテトラピロール化合物を含むことを特徴とする酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法において、前記生物は藻類であることを特徴とする酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法。
【請求項４】
請求項３記載の酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法において、前記培地に含まれる前記ピロール化合物を含む窒素化合物の濃度を１６〜５６０ミリグラム／リットルに調整することを特徴とする酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸素発生型光合成を行う生物から、コケ植物、シダ植物、及び種子植物を除いたもの（従って、水中に存在する酸素発生型光合成を行う生物）を藻類といい、その中で顕微鏡サイズ（ミクロン単位の大きさ）の藻類は微細藻類と呼ばれ、約１０万種が多様な環境中に生息している。近年、微細藻類は、光合成による二酸化炭素固定能力が高いこと、食品、医薬品、更にバイオ燃料等の原料となる有用物質（例えば、脂質）の生産能力が高いこと、通年での収穫が可能であること等の理由から、バイオマス資源として注目されている。
【０００３】
ここで、微細藻類による有用物質の生産量は、個々の微細藻類に含まれる有用物質の含有量と微細藻類の個体数との積に比例する。しかしながら、自然条件下では微細藻類の増殖速度は遅く、有用物質の生産効率も低いという問題がある。このため、微細藻類による有用物質生産の実用化（商業ベースで利用）に向けては、微細藻類による有用物質の生産効率向上と微細藻類の増殖速度向上（大量培養）を人工的に図る必要があり、特に微細藻類の大量培養の効率化（即ち、培養工程の経済性改善）が大きな課題となっている。
【０００４】
微細藻類の大量培養による有用物質生産の実用化に向けては、微細藻類のスクリーニングや微細藻類の遺伝子組換え等の様々な取り組みが国内外において報告されている。しかしながら、スクリーニングにより増殖速度の大きな微細藻類の有望種を選抜するには長い時間と多くの費用を要するという問題がある。一方、遺伝子組換え株を屋外で培養する場合は種々の制約が伴うと共に、遺伝子組換え株が培養地外に飛散した際の環境に及ぼす影響には不明な点が多いという問題がある。
そこで、有用物質の生産効率が高いと期待されている微細藻類を用いて、その培地に増殖を促進する化学物質を添加して微細藻類を大量培養して、有用物質生産の実用化を図ることが提案されている（例えば、非特許文献１〜３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】野上礼次郎、脇坂港、「アルギン酸オリゴマーの添加によるスピルリナの増殖促進」、第１７回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集、２０１５年５月３０日、ｐ．１０９
【非特許文献２】野上礼次郎、脇坂港、「アルギン酸オリゴマーの添加によるユーグレナの増殖促進」、第１６回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集、２０１４年５月３１日、ｐ．６１
【非特許文献３】野上礼次郎、脇坂港、CHE  MAAIL  Che  Mohd  Hakiman「アルギン酸オリゴマーの添加によるボトリオコッカスの増殖促進」、２０１４年生態工学会年次大会発表論文集、ｐ．８３−８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微細藻類の大量培養により有用物質生産の実用化を図るには、微細藻類の増殖率を、現状の増殖率に対して少なくとも２〜３倍に向上させる必要があるとされており、非特許文献１〜３に記載された方法では、微細藻類の増殖を更に向上させるには至っていない。このため、微細藻類の増殖速度を高位に維持し安定して培養できる培養条件が見出された際に、微細藻類の増殖速度を更に促進する作用を示す安価で安全（環境に及ぶす影響がなく）、かつ使用方法が簡便となる新たな化学物質が求められている。
【０００７】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、安価、安全かつ簡便な手法により達成することが可能な酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、酸素発生型光合成を担う葉緑素クロロフィルは、分子式Ｃ４Ｈ５Ｎの五員環構造（ピロール環構造）４個が炭素原子を１個ずつ挟んで結合したテトラピロール環構造の一つであるクロリン環を有する化合物であるため、葉緑素クロロフィルの原料となるピロール化合物を含む培地で微細藻類を培養すれば、光合成が促進されることによって微細藻類の増殖も促進されるとの仮設に基づき種々研究を重ねた結果、ＷＯ２００９／０６９８０６号公報に記載の大腸菌によるバイオ生産で得られたテトラピロール化合物を含むピロール化合物を微細藻類の培地に加えることにより、微細藻類の増殖の促進を安価、安全かつ簡便な手法により達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明に係る酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法は、ピロール化合物を含む培養促進剤を、酸素発生型光合成を行う生物が生育する培地に添加し、該培地を前記生物の増殖条件に保持することにより行っている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法においては、培養促進剤に含まれるピロール化合物は、葉緑素クロロフィルのクロリン環の構造の一部であるため安全である（自然界に存在している物質であるため、環境に与える影響はない）。そして、培養促進剤を酸素発生型光合成を行う生物の培地に添加し、培養促進剤が添加された培地を酸素発生型光合成を行う生物の増殖条件下に保持するだけなので、簡便な手法により酸素発生型光合成を行う生物の増殖を行うことができる。その結果、酸素発生型光合成を行う生物の大量増殖を、安価、安全かつ簡便な方法で行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１におけるユーグレナの培養結果の説明図である。
【図２】実施例２におけるボトリオコッカスの培養結果の説明図である。
【図３】実施例３におけるスピルリナの培養結果の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一実施の形態に係る酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法は、例えば、遺伝子ｙｐｊＤ（ｂ２６１１）が変異により発現できなくなった大腸菌によるバイオ生産で得られたピロール化合物を、酸素発生型光合成を行う生物の一例である微細藻類が生育する培地に添加し、培地を微細藻類の増殖条件に保持する。
なお、大腸菌によるバイオ生産ではピロール化合物が安価かつ大量に得られるので、培養促進剤を安価に製造することが可能になる。
【００１２】
本発明の方法で培養される微細藻類は、酸素発生型光合成を行い、主要な光合成色素としてクロロフィルを含有するものが好ましく、例えば、原核生物であるラン藻類、真核生物のスーパーグループにおける灰色植物、緑色植物、クリプト藻類、不等毛植物、ハプト藻類、渦鞭毛藻類、ユーグレナ藻類、クロララクニオン藻類、クロメラ藻類等が挙げられる。
また、微細藻類の増殖条件とは、微細藻類毎に従来から推奨されている一般的な増殖条件（増殖速度を高位に維持し安定して培養できる条件）であればよい。
【００１３】
大腸菌は貧栄養培地中で培養する。このとき、大腸菌を貧栄養培地以外の適当な培地、例えば、ＬＢ培地等の培地中で前培養し（１５〜４０℃の温度で６〜２４時間培養した後）、得られた前培養物を貧栄養培地に接種して本培養（２０℃〜４０℃の温度で１２時間〜９６時間かけて培養）することが好ましい。大腸菌の培養条件は、大腸菌に対する一般的な条件であればよい。
なお、貧栄養培地として、例えば、脱イオン水１リットル中に、ＫＨ２ＰＯ４を９ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４を２１ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を２ｇ、クエン酸二水和物を１ｇ、グルコースを３．６ｇ、及びＭｇＳＯ４を１００ｍｇ溶解させた水溶液を使用することができる。
【００１４】
大腸菌の培養中に、大腸菌からはテトラピロール化合物、テトラピロール化合物前駆体等のピロール化合物（培養物）が菌体外に排出され、排出されたピロール化合物は貧栄養培地中に混入する。このため、大腸菌の培養が終了した貧栄養培地を遠心分離機にかけて懸濁物（大腸菌細胞の凝集体）を沈殿させ、得られた上澄液をフィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）で濾過することにより、大腸菌が除去された状態のピロール化合物を含む培養促進剤を得ることができる。
なお、培養促進剤中の水分量を調整することにより、培養促進剤中のピロール化合物の濃度を任意の値に調整することができる。これにより、培地に培養促進剤を添加した際における培地中のピロール化合物の含有量（より詳細には、ピロール化合物を含む窒素化合物の含有量）の調整が容易にできる。
【実施例】
【００１５】
（実施例１）
ユーグレナ（ＮＩＥＳ−４８株）の培養を行った。培養は、３０ミリリットルのスクリューキャップ試験管内に注入した１０ミリリットルの培地に一定重量のユーグレナを加え、スクリューキャップ試験管をインキュベーター庫内に静置し、空気を通気しながら温度を２２〜２６℃、白色蛍光灯を用いて照度を６０００〜６５００Ｌｕｘ、白色蛍光灯の点灯時間と消灯時間をそれぞれ１２時間とする明暗サイクルの条件下で、３５日間行った。なお、スクリューキャップ試験管は、１日おきに振盪させた。
【００１６】
培地は、Ａ１（ＡＦ−６培地が１０ミリリットル）、Ａ２（ＡＦ−６培地９ミリリットルと培養促進剤１ミリリットルの混合物）、Ａ３（ＡＦ−６培地５ミリリットルと培養促進剤５ミリリットルの混合物）、及びＡ４（培養促進剤１０ミリリットル）の４種類である。なお、ＡＦ−６培地１リットル当たりの組成は、ＮａＮＯ３が１４０ｍｇ、ＮＨ４ＮＯ３が２２ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏが３０ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４が１０ｍｇ、Ｋ２ＨＰＯ４が５ｍｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが１０ｍｇ、Fe−citrateが２ｍｇ、Citric  acidが２ｍｇ、Biotinが２μｇ、Thiamine  ＨＣｌが２μｇ、VitaminＢ６が１０μｇ、VitaminＢ１２が１μｇ、Ｎａ２EDTA・２Ｈ２Ｏが５ｍｇ、ＦｅＣｌ６・６Ｈ２Ｏが０．９８ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏが１８０μｇ、ＺｎＣｌ２が５２μｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏが２０μｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏが１２．５μｇ、Distilled  Waterが１リットルである。また、培養促進剤中のピロール化合物を含む窒素化合物の含有量は５６０ｍｇ／リットルであり、その中にはポルフィリン環構造を持つピロール化合物１６ｍｇ／リットルも含まれる。
【００１７】
培養が終了したＡ１〜Ａ４からそれぞれ５ミリリットルの細胞懸濁液をスウィネスフィルターホルダーに挿入したφ２５のＧＦ／Ｃフィルターを用いて濾過し、濾過後にＧＦ／Ｃフィルターから取り出した使用済み濾紙をシャーレ内に入れて、１０５℃の乾燥庫で５時間乾燥させた。乾燥後、使用済み濾紙を収容したシャーレをデシケータ内に移して冷却し、冷却後に使用済み濾紙を収容したシャーレの重量を測定した。そして、使用済み濾紙を収容したシャーレの重量から、予め求めておいた濾紙乾燥重量とシャーレ乾燥重量を差し引くことにより、５ミリリットルの細胞懸濁液中に存在していたユーグレナの乾燥重量を算出した。図１に、Ａ１〜Ａ４より採取した５ミリリットルの細胞懸濁液中にそれぞれ含まれていたユーグレナの乾燥重量を示す。
【００１８】
図１に示すように、Ａ１（ＡＦ−６培地のみ）で増殖させる場合の増殖速度に対して、培養促進剤を添加したすべての培地Ａ２〜Ａ４では大きな増殖速度を示すことが確認でき、培養促進剤を１０倍希釈した培地（Ａ２）では２倍、培養促進剤を２倍希釈した培地（Ａ３）では７．７倍、培養促進剤のみの培地（Ａ４）では６．７倍となった。
また、図１は、ユーグレナの増殖速度を増大させる培地中に含まれる培養促進剤の希釈率（ピロール化合物を含む窒素化合物の含有量）には最適値が存在することを示しており、ピロール化合物を含む窒素化合物を過剰に添加することは、培養促進剤のコスト増加につながり好ましくない。
【００１９】
（実施例２）
ボトリオコッカス（ＮＩＥＳ−２１９９株）の培養を行った。培養は、３０ミリリットルのスクリューキャップ試験管内に注入した１０ミリリットルの培地に一定重量のボトリオコッカスを加え、スクリューキャップ試験管をインキュベーター庫内に静置し、空気を通気しながら温度を２２〜２６℃、白色蛍光灯を用いて照度を６０００〜６５００Ｌｕｘ、白色蛍光灯の点灯時間と消灯時間をそれぞれ１２時間とする明暗サイクルの条件下で、６５日間行った。なお、スクリューキャップ試験管は、１日おきに振盪させた。
【００２０】
培地は、Ｂ１（ＢＧ１１培地が１０ミリリットル）、Ｂ３（ＢＧ１１培５ミリリットルと培養促進剤５ミリリットルの混合物）、及びＢ４（培養促進剤１０ミリリットル）の４種類である。なお、ＢＧ１１培地１リットル当たりの組成は、ＮａＮＯ３が１５００ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４・３Ｈ２Ｏが４０ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏが７５ｍｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが３６ｍｇ、Ferric  ammonium  citrateが６ｍｇ、Citric  acidが６ｍｇ、Ｎａ２EDTA−Ｍｇが１ｍｇ、Ｎａ２ＣＯ３が２０ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３が２．８６ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏが１．８１ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏが０．２２２ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏが０．３９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏが７９μｇ、Ｃｏ(ＮＯ３)２・６Ｈ２Ｏが４９μｇ、Distilled  Waterが１リットルである。また、培養促進剤中のピロール化合物を含む窒素化合物の含有量は５６０ｍｇ／リットルであり、その中にはポルフィリン環構造を持つピロール化合物１６ｍｇ／リットルも含まれる。
【００２１】
培養が終了したＢ１、Ｂ３、Ｂ４からそれぞれ５ミリリットルの細胞懸濁液をスウィネスフィルターホルダーに挿入したφ２５のＧＦ／Ｃフィルターを用いて濾過し、実施例１と同様の方法で、５ミリリットルの細胞懸濁液中に存在していたボトリオコッカスの乾燥重量を算出した。図２に、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４より採取した５ミリリットルの細胞懸濁液中にそれぞれ含まれていたボトリオコッカスの乾燥重量を示す。
【００２２】
図２に示すように、Ｂ１（ＢＧ１１培地のみ）で増殖させる場合の増殖速度に対して、培養促進剤を添加した培地Ｂ３、Ｂ４では大きな増殖速度を示すことが確認でき、培養促進剤を２倍希釈した培地（Ｂ３）では２３倍、培養促進剤のみの培地（Ｂ４）では５倍となった。
また、図２は、ボトリオコッカスの増殖速度を増大させる培養促進剤の希釈率（ピロール化合物を含む窒素化合物の含有量）には最適値が存在することを示しており、ピロール化合物を含む窒素化合物を過剰に添加することは、培養促進剤のコスト増加につながり好ましくない。
【００２３】
（実施例３）
スピルリナ（ＮＩＥＳ−３９株）の培養を行った。培養は、３０ミリリットルのスクリューキャップ試験管内に注入した１０ミリリットルの培地に一定重量のスピルリナを加え、スクリューキャップ試験管をインキュベーター庫内に静置し、空気を通気しながら温度を２２〜２６℃、白色蛍光灯を用いて照度を６０００〜６５００Ｌｕｘ、白色蛍光灯の点灯時間と消灯時間をそれぞれ１２時間とする明暗サイクルの条件下で行った。なお、スクリューキャップ試験管は、１日おきに振盪させた。
【００２４】
培地は、Ｓ１（ＳＯＴ培地が１０ミリリットル）、Ｓ２（ＳＯＴ培地９ミリリットルと培養促進剤１ミリリットルの混合物）、Ｓ３（ＳＯＴ培地５ミリリットルと培養促進剤５ミリリットルの混合物）、及びＳ４（培養促進剤１０ミリリットル）の４種類である。なお、ＳＯＴ培地１リットル当たりの組成は、ＮａＨＣＯ３が１６８００ｍｇ、Ｋ２ＨＰＯ３が５００ｍｇ、ＮａＮＯ３が２５００ｍｇ、Ｋ２ＳＯ４が１０００ｍｇ、ＮａＣｌが１０００ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏが２００ｍｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが４０ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏが１０ｍｇ、Ｎａ２EDTA・２Ｈ２Ｏが８０ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３が２．８６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏが２．５ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏが０．２２ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏが８０μｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏが２０μｇ、Distilled  Waterが１リットルである。また、培養促進剤中のピロール化合物を含む窒素化合物の含有量は５６０ｍｇ／リットルであり、その中にはポルフィリン環構造を持つピロール化合物１６ｍｇ／リットルも含まれる。
【００２５】
培養を開始してから１４日経過したＳ１〜Ｓ４からそれぞれ５ミリリットルの細胞懸濁液をスウィネスフィルターホルダーに挿入したφ２５のＧＦ／Ｃフィルターを用いて濾過し、実施例１と同様の方法で、５ミリリットルの細胞懸濁液中に存在していたスピルリナの乾燥重量を算出した。図３に、Ｓ１〜Ｓ４より採取した５ミリリットルの細胞懸濁液中にそれぞれ含まれていたスピルリナの乾燥重量を示す。
【００２６】
図３に示すように、Ｓ１（ＳＯＴ培地のみ）で増殖させる場合の増殖速度に対して、
培養促進剤を１０倍希釈した培地（Ｓ２）では１．０４倍、培養促進剤を２倍希釈した培地（Ｓ３）では１．７倍となったが、培養促進剤のみの培地（Ｓ４）では増殖が見られず、個体数の減少が生じた。
このことから、ピロール化合物を培地に加えてスピルリナの増殖速度を増大させる場合、培養促進剤の希釈率（ピロール化合物を含む窒素化合物の含有量）の最適値はかなり狭い範囲に存在することが分かった。
【００２７】
以上、本発明を、実施の形態を参照して説明してきたが、本発明は何ら上記した実施の形態に記載した構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載されている事項の範囲内で考えられるその他の実施の形態や変形例も含むものである。
例えば、本実施の形態では、ピロール化合物を含む培養促進剤は、大腸菌の培地からの抽出物を用いて作製したが、大腸菌の培養が終了した後の培地から大腸菌を除去した後、水分量を調整することにより作製することもできる。
【図１】
2019050731.tif 000002
【図２】
2019050731.tif 000003
【図３】
2019050731.tif 000004