(57)【要約】      （修正有）【課題】酵素の固体支持体上への固定化のための改良された方法、及び、水性反応条件下と有機性反応条件下の両方において有機合成に適用することができる安定な不均一生体触媒の提供。【解決手段】（ａ）担体、及び該担体上に固定化された少なくとも1つの酵素を準備する工程であって、前記担体が、キレートされた金属イオンを含有するアフィニティマトリックスが付着している多孔質有機ポリマーであり、前記少なくとも１つの酵素が、アフィニティタグを含有し、前記アフィニティマトリックスに対する特異的アフィニティ結合を介して前記担体上に固定化されている、工程、及び、（ｂ）前記固定化酵素を少なくとも１つの基質と接触させて、これによりに反応を触媒する工程を含む、酵素触媒反応を触媒するための方法。【選択図】図１
2019162133.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素触媒反応を触媒するための方法であって、
(a) 担体、及び該担体上に固定化された少なくとも1つの酵素を準備する工程であって、
前記担体が、キレートされた金属イオンを含有するアフィニティマトリックスが付着している多孔質有機ポリマーであり、
前記少なくとも1つの酵素が、アフィニティタグを含有し、該アフィニティマトリックスに対する特異的アフィニティ結合を介して前記担体上に固定化されている、工程、及び、
(b) 前記固定化された酵素を少なくとも1つの基質と接触させて、これによりに前記反応を触媒する工程、を含む、方法。
【請求項２】
前記アフィニティマトリックスが、リンカーを介して前記担体の表面に付着している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多孔質有機ポリマーが、ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン(UHMWPE)、高密度ポリエチレン(HDPE)、ポリプロピレン(PP)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、ポリスチレン、ポリメタクリレート、及びポリ(メチルメタクリレート)からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多孔質有機ポリマーがポリスチレンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多孔質有機ポリマーがポリメタクリレートである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記多孔質有機ポリマーが、膨張が限られた、多孔質粒子として存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも1つの酵素がポリヒスチジンタグを含み、前記キレートされた金属イオンに対する特異的アフィニティ結合を介して前記担体上に固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記キレートされた金属イオンがFe2+である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記キレートされた金属イオンがFe3+である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記キレートされた金属イオンがCo2+である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記キレートされた金属イオンがNi2+である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記キレートされた金属イオンがCu2+である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記キレートされた金属イオンがZn2+である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
2つ以上の異なる酵素が前記担体上に固定化され、前記異なる酵素のそれぞれが異なる反応を触媒することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記担体が金属ナノ粒子を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記金属ナノ粒子が遷移金属ナノ粒子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記金属ナノ粒子が、コバルト、ニッケル、及びパラジウムのナノ粒子からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵素触媒反応が水性条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素触媒反応が有機溶媒中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素触媒反応が連続フロー反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵素触媒反応がカスケード反応である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
第1の酵素のための基質が、第2の酵素のための基質へと変換される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
基質が第1の酵素によって変換され、かつ前記第1の酵素のための補助因子が第2の酵素によって再生される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
遷移金属が前記担体に固定化され、かつ前記方法が酵素触媒反応と遷移金属触媒反応を含む多段階反応である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも1つの基質が前記酵素触媒反応において生成物に変換される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティタグ結合を介してガラス材料又は有機ポリマー上に固定化されているタンパク質を含む固定化タンパク質材料に関する。ガラス材料は、(ハイブリッド)制御多孔性(controlled porosity)ガラス等の多孔質ガラス材料であり得る。本発明はまた、化学合成における不均一生体触媒としての固定化酵素材料の使用に関する。本発明は更に、ガラス材料又は有機ポリマー上へのアフィニティタグ付きタンパク質の固定化のための方法、及びガラス材料又は有機ポリマー上にアフィニティタグ付きタンパク質を固定化することによる、そのようなタンパク質の精製及び単離のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、アミノ酸残基の1個又は数個の直鎖によって構成される大きな生体分子である。酵素は、全ての生細胞の代謝において生物学的触媒として働く特定の群のタンパク質である。したがって、酵素は、有機分子を異なる分子に変換することができる。各特定の酵素の特異的な3次元構造のために、非常にわずかな有機分子のみが、変換が起こり得るように、酵素の活性部位と相互作用する。それゆえに、酵素は、通常、高選択性触媒であり、合成有機化学における触媒としての酵素の使用は、この理由から、非常に魅力的である。しかしながら、酵素は、細胞環境において進化した生体分子であるため、それらは他の環境に適さない場合が多い。有機溶媒中で用いられる場合、酵素は、凝集する傾向にあり、アンフォールドする(すなわち、変性する)場合が多い。したがって、酵素を固体支持体上に固定すること、及びそれらをこの固定化状態で触媒として用いることは魅力的である。これが、酵素の安定性を向上させ、酵素が通常耐性がない反応条件を可能にし、更にその材料の反応混合物からの分離及び回収を容易にし得るからである。
【０００３】
酵素の固体支持体上への固定化は、種々の技術及び種々の固体支持体を用いて達成されている(Tischer及びWedekind、「Immobilized Enzymes: Methods and Applications」、Topics in Current Chemistry、1999、200巻、95〜126頁; Brena及びBatista-Viera、「Immobilization of Enzymes: A Literature Survey」、Methods in Biotechnology: Immobilization of Enzymes and Cells、2006、第2版、15〜30頁)。
【０００４】
酵素の固体表面への吸着は、酵素と固体支持体との間の望ましくない相互作用をもたらし得る。シリカナノ粒子上へのタンパク質吸着は、タンパク質の2次構造の変化をもたらす可能性があり、それは、結果として、酵素の不活性化を生じ得る(Lundqvistら、Langmuir 2004、20巻、10639〜10647頁)。したがって、固体支持体が、固定化酵素の構造及び活性に干渉しないことが重要である。
【０００５】
固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー(IMAC)は、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、及びCo2+等の金属イオンに対するタンパク質のアフィニティに基づくタンパク質の精製のための技術である。金属イオンは、アガロースゲル上に固定化されており、ヒスチジン含有及びシステイン含有タンパク質を選択的に吸着することができる(Porathら、Nature 1975、258巻、598〜599頁)。この技術の改良版は、融合ポリヒスチジンペプチドを含有する組換えタンパク質を用いる。ポリヒスチジンペプチドは、単一のヒスチジン残基より固定化金属イオンに対してはるかに高いアフィニティを有するため、達成され得る精製のレベルははるかに高い(Hochuliら、Nat. Biotechnol. 1988、6巻、1321〜1325頁; Ljungquistら、Eur. J. Biochem. 1989、186巻、563〜569頁)。この技術は、タンパク質の精製及び単離についてのクロマトグラフ的手順にうまく適用することができるが、ゲル固定化酵素は、有機合成において不均一触媒としてあまり適していない。IMAC技術は更に、主に水性条件に制限される。
【０００６】
不均一触媒を調製する試みにおいて、アフィニティタグ結合のIMACに基づいた原理が、ポリヒスチジンタグ付き酵素の修飾シリカ上への固定化に適用されている(Cassimjeeら、Biotechnol. Bioeng. 2008、99巻、712〜716頁; Cassimjeeら、Biotechnol. J. 2011、6巻、463〜469頁)。これは、カンジダ・アンタルクティカ(Candida antarctica)リパーゼB(CalB)についてはよく機能したが、他のより不安定な酵素は、シリカの存在下で、特に有機溶媒の存在下で不活性化されることが見出された。シリカナノ粒子は、タンパク質へ不安定化効果を生じることが文献において知られている(Lundqvistら、Langmuir 2004、20巻、10639〜10647頁)。
【０００７】
制御多孔性ガラス(CPG)は、酵素の固定化のために用いられている別の材料である。CPGは、通常、3-アミノプロピルトリエトキシシランで処理され、その後、架橋剤としてグルタルアルデヒドを用い、酵素の表面上に存在するリジン残基を介して酵素をアミノプロピル-CPGと結合させる。これは結果として、酵素のCPGとの非特異的結合を生じ、同時に酵素活性の損失を伴う場合が多い。この方法の更なる欠点は、固定化されるべき酵素が、種々の酵素の混合物がCPG上に固定化されないようにするために、固定化工程の前に他の酵素から精製されなければならないことである。
【０００８】
有機チタン酸塩を用いる(米国特許第4,632,904号)、又は多糖層及び1,1'-ジカルボニルジイミダゾールを用いる(Rogalskiら、J. Mol. Catal. B: Enzym. 1999、6巻、29〜39頁)、酵素のCPG上への固定化もまた開示されている。
【０００９】
Engstromら(Angew. Chem. Int. Ed. 2013、52巻、14006〜14010頁)は、カンジダ・アンタルクティカリパーゼBとナノパラジウム種がメソポーラスなシリカのコンパートメント内へ同時固定化されているハイブリッド触媒を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第4,632,904号
【特許文献２】WO 2009/005631
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Tischer及びWedekind、「Immobilized Enzymes: Methods and Applications」、Topics in Current Chemistry、1999、200巻、95〜126頁
【非特許文献２】Brena及びBatista-Viera、「Immobilization of Enzymes: A Literature Survey」、Methods in Biotechnology: Immobilization of Enzymes and Cells、2006、第2版、15〜30頁
【非特許文献３】Lundqvistら、Langmuir 2004、20巻、10639〜10647頁
【非特許文献４】Porathら、Nature 1975、258巻、598〜599頁
【非特許文献５】Hochuliら、Nat. Biotechnol. 1988、6巻、1321〜1325頁
【非特許文献６】Ljungquistら、Eur. J. Biochem. 1989、186巻、563〜569頁
【非特許文献７】Cassimjeeら、Biotechnol. Bioeng. 2008、99巻、712〜716頁
【非特許文献８】Cassimjeeら、Biotechnol. J. 2011、6巻、463〜469頁
【非特許文献９】Rogalskiら、J. Mol. Catal. B: Enzym. 1999、6巻、29〜39頁
【非特許文献１０】Engstromら、Angew. Chem. Int. Ed. 2013、52巻、14006〜14010頁
【非特許文献１１】Cassimjeeら、ACS Catal. 2011、1巻、1051〜1055頁
【非特許文献１２】Sandstromら、Protein Eng Des Sel. 2009、22巻、413〜420頁
【非特許文献１３】Engstromら、Org. Biomol. Chem. 2011、9巻、81〜82頁
【非特許文献１４】Kadowら、AMB Express 2011、1:13
【非特許文献１５】Kadowら、Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013、2013年11月5日発行
【非特許文献１６】Muttiら、Eur. J. Org. Chem. 2012、5号、1003〜1007頁
【非特許文献１７】Schatzleら、Anal. Chem. 2009、81巻、8244〜8248頁
【非特許文献１８】Cassimjeeら、Org. Biomol. Chem. 2012、10巻、5466〜5470頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
化学工業における触媒としての酵素の使用、すなわち、生体触媒作用は、より高い持続可能性、より低い毒性の廃棄物、及びより高い費用効率を達成するために重要である。しかしながら、酵素の高い費用、及び酵素の固体支持体上への固定化により頻繁に観察される活性の損失は、この開発における障害となっている。酵素を再利用することを可能にする、酵素固定化のための標準化され、かつ一般的に実行可能な手順が非常に望ましい。近年、進歩したにも関わらず、酵素の固定化による不均一触媒の調製のための一般的かつ簡便な方法がまだない。したがって、酵素の固体支持体上への固定化のための改良された方法の必要性、及び水性反応条件下と有機性反応条件下の両方において有機合成に適用することができる安定な不均一生体触媒の必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことに、タンパク質を多孔質ガラス材料又は多孔質有機ポリマー上にアフィニティタグ結合を介して固定化することにより、固定化タンパク質の安定性に関して向上した性質を有する固定化タンパク質材料が得られ、かつそのタンパク質の生物学的機能が維持されることが、発見された。固定化酵素の調製は、高い触媒活性を有することが見出され、そのことにより、その固定化酵素は、生体触媒作用において有用であるといえる。
【００１４】
本発明によれば、アフィニティタグを含有するタンパク質は、多孔質ガラス材料又は多孔質有機ポリマーに付着（又は「結合」ともいう）したアフィニティマトリックス上の特定の基と結合することにより固定化される。マトリックス上の特定の基に対するアフィニティタグの高い結合アフィニティのために、タンパク質のマトリックスとの結合は、強くかつ非常に特異的である。したがって、本発明は、酵素等のタンパク質の精製及び固定化のための一般的な方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ポリヒスチジンタグ付き酵素、及びキレート金属としてのCo2+を用いる、アミノ-(Hyb)CPGからの固定化酵素CPG材料の調製を示す図である。R基は適切なリンカーであり、CPG製造物間で異なる。2,4-ジヒドロキシフェニル残基及びポリヒスチジンタグ付き酵素へのコバルトイオンのキレート化が概略的に描かれている。
【図２】ポリヒスチジンタグ付き酵素、キレート金属としてのCo2+、金属ナノ粒子としてのパラジウムを用いる、固定化酵素と金属ナノ粒子を含有するCPG材料のアミノ-(Hyb)CPGからの調製を示す図である。R基は適切なリンカーであり、CPG製造物間で異なる。パラジウムナノ粒子のCPG材料への結合、並びにコバルトイオンの2,4-ジヒドロキシフェニル残基及びポリヒスチジンタグ付き酵素とのキレート化の両方が概略的に描かれている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
第1の態様において、本発明は、担体、及び担体上に固定化された少なくとも1つのタンパク質を含む固定化タンパク質材料であって、担体が、アフィニティマトリックスが付着している担体材料を含み、前記担体材料が、
(a)制御多孔性ガラス(CPG);
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);及び
(c)多孔質有機ポリマー
からなる群から選択され、少なくとも1つのタンパク質がアフィニティタグを含有し、アフィニティマトリックスとの特異的アフィニティ結合を介して担体上に固定化されている固定化タンパク質材料に関する。
【００１７】
タンパク質のアフィニティタグを介しての担体上への固定化は、あらかじめ定められた部位でのタンパク質の特異的結合という利点を提供する。しかし同時に、その固定化方法は、一般的に、多くの異なるタンパク質に適用可能である。本発明に用いられるアフィニティタグは、それがアフィニティを有するマトリックスと特異的に結合することができる、任意のタグであり得る。アフィニティ結合は、例えば、ファンデルワールスの相互作用、水素結合、イオン結合、又は疎水性相互作用の結果であり得る。いずれにせよ、アフィニティ結合は、アフィニティタグとマトリックスが、少なくとも、アフィニティタグをマトリックスから解離させるためにある特定の特異的条件が適用されるまで、お互いに堅く結合したままであることを可能にするほど十分強くあるべきである。
【００１８】
別の態様において、本発明は、タンパク質の固定化のための担体であって、アフィニティマトリックスが付着している担体材料を含み、前記担体材料が、
(a)制御多孔性ガラス(CPG);
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);及び
(c)多孔質有機ポリマー
からなる群から選択され、タンパク質が、アフィニティマトリックスとの特異的アフィニティ結合を介して担体上に固定化される担体に関する。
【００１９】
担体上に固定化され得るタンパク質は、アフィニティタグを含有する(組換え)タンパク質又は酵素等の、アフィニティタグを含有する任意のタンパク質であり得る。好ましくは、タンパク質は、アフィニティタグを含有する酵素である。タグは、担体に付着したアフィニティマトリックスに対して特異的アフィニティを有するべきであることは理解されたい。
【００２０】
いくつかのアフィニティタグ及び対応するマトリックスは当技術分野において知られている。本発明において有用であり得るアフィニティタグの例、及びマトリックス上の対応する基は、下記の表に列挙されている:
【００２１】
【表１】
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【００２２】
好ましい実施形態において、タンパク質上のアフィニティタグはポリヒスチジンタグであり、担体に付着したアフィニティマトリックスは、キレートされた金属イオンを含有する。キレートされた金属イオンは、好ましくは、Fe2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、及びZn2+からなる群から選択される金属イオンであり、より好ましくは、Fe3+、Ni2+、及びCo2+からなる群から選択される。好ましい実施形態において、キレートされた金属イオンはCo2+である。別の好ましい実施形態において、キレートされた金属イオンはFe3+である。
【００２３】
キレートされた金属イオンの選択は、意図された使用に依存し得る。例えば、担体が、アフィニティタグ付きタンパク質の精製及び単離のために用いられることになっている場合には、酵素の担体との結合は、可逆的であるべきである。そのような場合、キレートされた金属イオンはNi2+又はCo2+であることが好ましく、最も好ましくは、Co2+である。これらの金属イオンは、ポリヒスチジンタグ付き酵素を固定化するのに十分強く結合するが、イミダゾール又はエチレンジアミン四酢酸塩(EDTA)を含有する緩衝溶液での処理等の特定の条件が適用された場合には、固定化酵素を放出する能力もある。
【００２４】
不均一生体触媒作用における固定化酵素の使用について、酵素の担体との強い結合が望ましい。そのような場合、キレートされた金属イオンはCo2+又はFe3+であることが好ましく、最も好ましくは、Fe3+である。これが、ポリヒスチジンタグの担体との特に強い結合を生じるからである。実施例に実証されているように、キレートされた金属イオンとしてFe3+を含む固定化タンパク質材料からの酵素又は金属イオンのいずれの浸出もほとんど無視できる。浸出がないことは、固定化タンパク質材料(生体触媒)が触媒量で用いられることを可能にする。触媒量の使用は、連続フロー反応において特に重要である。
【００２５】
キレートされた金属イオンとしてのFe3+の更なる利点は、この金属が無毒であることである。したがって、生じた固定化タンパク質材料は、例えば、食品産業において安全に適用され得る。
【００２６】
アフィニティタグ付きタンパク質のためのマトリックスは、適切なリンカーを介して担体の表面に付着している。制御多孔性ガラス(CPG)の表面は、遊離シラノール(Si-OH)基を含有し、その基は、共有結合を介してリンカー分子に付着することができる。典型的には、表面は、二官能性アルキルシランリンカー分子(その鎖長及び構造は様々であり得る)と反応させられ、これにより、シリコン原子がガラス表面シラノール基と共有結合するが、ここで、シランの末端基は、アルデヒド、アミン、エポキシ基、ハロゲン化物、又はカルボン酸誘導体等の官能基である。用いられるべきである適切な官能基は、CPGの表面に付着し得るマトリックスの性質に依存する。適切なリンカーを介してマトリックスをCPGの表面に付着させるための方法は、当業者に知られている。
【００２７】
CPGは、サイズ制御されたマクロポア又はメソポアの粒子として作製することができる頑強かつ不活性なガラス材料である。CPGのシャープなポアサイズ分布は、直径約10〜300nmのポアサイズとして様々であり得る。これは、立体障害による複雑化を生じることなく、都合よい微小環境を提供する。相互接続するポア構造は、低い溶液流抵抗を生じ、その材料全体にわたる反応物と生成物の物質移動を促進する。CPGの強固な構造は、ハイスループットリアクター設計及び高流速での線形スケールアップに適した頑丈な非圧縮性媒体を提供する。その材料は、溶媒中、限られた膨張を示し、たいていの有機媒体及び10未満のpHでの水性環境において化学的かつ寸法的に安定である。
【００２８】
従来のCPGは、それのポアサイズに反比例するリガンド充填能力を示す。したがって、大きなポアサイズのCPG支持体は、より小さいポアサイズのCPG支持体と同じくらい多いタンパク質を負荷することができない。これは、一つにはポアサイズと表面積の間の反比例関係により、一つには、表面積の単位あたり限定された密度、およそ4.5μmol/m2を有する官能化部分としての役割を果たす表面アクセス可能なシラノール基による。従来のCPGは、不均一なシラノール分布を示し、立体障害のシラノール部位は官能性付着点としての役割を果たし得ない。
【００２９】
ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG又はHybCPG)は、WO 2009/005631に記載されているように、CPGの内部表面と外部表面が、架橋有機ポリマーのおよそ10nmフィルムでコーティングされているCPGのバリアントである。ハイブリッドCPGのポリマーコーティングは、マトリックスが付着することができる、アルデヒド、アミノ基、エポキシ基、ハロゲン化物、カルボン酸及びカルボキシルエステル、又はそれらの混合物等の官能基を含有し得る。マトリックスを適切な官能基に付着させるための方法は、当業者に知られている。
【００３０】
ハイブリッドCPGは、従来のCPGに優るある特定の利点を提供する。ポリマーコーティングの結果として、負荷とポアサイズの間の依存関係は、最小化され得、官能化部位間のスペーシングは、より正確かつ均一に制御することができる。タンパク質固定化のための担体材料としてのハイブリッドCPGは、更なる利益を提供し得る。ポリマーコーティングの設計を、所与の適用に望ましい又は必要な表面特性が得られるように調整することができるからである。例えば、ポリスチレン等の均一なポリマーは、より疎水性の高い担体表面を生じる一方、ポリアクリロニトリル等の均一なポリマーは、より親水性の高い担体表面を生じる。2つ以上の異なるポリマーの混合物を用いることにより、コポリマーコーティングが達成され得、担体表面の特性は、所定の適用に特異的に適応している。薄層コーティングは、有機溶媒中、ある程度の微視的膨張を許容するが、ハイブリッドCPGベッドのかさ拡大も背圧の増加も生じさせない。そのコーティングはまた、pH10より高い水性環境におけるハイブリッドCPGの使用を可能にする。
【００３１】
本説明の残りの部分及び添付の特許請求の範囲を通じて、CPGへのいかなる言及も、具体的に他に指示がない限り、(従来の)CPGとハイブリッドCPGの両方を含むものとして解釈されるべきである。
【００３２】
CPG及びHybCPG以外の他の担体材料は、より高い費用効率又は特定のプロセス要求等の理由により望まれる場合がある。そのような材料としては、多孔質有機ポリマー(プラスチック)材料が挙げられる。これらのポリマーは、マトリックスが付着することができる、アルデヒド、アミノ基、エポキシ基、ハロゲン化物、カルボン酸若しくはカルボキシルエステル、又はそれらの混合物等の官能基で官能化される。マトリックスを適切な官能基に付着させるための方法は当業者に知られている。官能化プラスチックは、膨張が限られた、多孔質粒子として作製することができる。適切な有機ポリマーは、スチレン、エチレン、プロピレン、アクリル酸、メタアクリル酸、アクリル酸メチル、及びメタアクリル酸メチル等のモノマーに基づき得る。そのような有機ポリマーの例としては、官能化ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン(UHMWPE)、高密度ポリエチレン(HDPE)、ポリプロピレン(PP)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、並びにポリビニリデンフルオリド(PVDF)、ポリスチレン、ポリメタクリレート及びポリ(メチルメタクリレート)が挙げられる。好ましい実施形態において、多孔質有機ポリマーは、官能化ポリスチレン又は官能化ポリメタクリレートである。
【００３３】
アフィニティタグ付きタンパク質の本明細書に記載されたHybCPGへの付着は、多孔質有機ポリマー担体を用いる可能性を実証している。HybCPGにおける多孔質表面が、有機ポリマー、それ自体であるからである。HybCPGは、概して、CPGの非圧縮性及び非膨張性を維持し、その上、有機ポリマーの表面性質を利用することができる。CPGの強剛性が必要とされない場合、有機ポリマー単独がより良い選択であるというのは妥当と思われる。したがって、アフィニティタグ付着をそのような材料に適用する方法は、本明細書で実証されている。
【００３４】
CPG固定化タンパク質材料は、図1に概略が示されているように、アミノ-CPGか又はアミノ-HybCPGのいずれかから出発して、ほんの数工程で容易に作製することができる。例えば、CPG材料を2,4-ジヒドロキシアセトフェノンで処理し、それにより、フェニル基をCPGにイミンを介して連結することができる。必要なら、その後、イミン官能性を、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、又は水素化アルミニウムリチウム等の適切な還元剤を用いて対応するアミンに還元することができる。続いて、CoCl2又はFeCl3、それぞれの水溶液中にこの材料を懸濁することにより、Co2+又はFe3+等のキレートされた金属イオンを導入することができる。乾燥後、得られた材料は、1つ又は複数のポリヒスチジンタグ付きタンパク質のための結合マトリックスとして直接、用いることができる。
【００３５】
担体材料が有機ポリマーである、固定化タンパク質材料は、CPG及びHybCPGについて上で記載されているのと同じような方法で、作製することができる。
【００３６】
ポリヒスチジンタグのCo2+又はFe3+等の金属イオンに対する高いアフィニティによって、ポリヒスチジンタグ付きタンパク質の固定化を、固定化工程の前に溶液の大規模な精製を必要とすることなしに、タンパク質を含有する粗溶液から実施することが可能になる。ポリヒスチジンタグを含有しない有機材料は、キレートされた金属イオンと弱くのみ結合するか、又は全く結合せず、例えば、水又は緩衝水溶液で洗浄することにより、最終の固定化タンパク質材料から容易に除去されるであろう。したがって、ポリヒスチジンタグ付きタンパク質が、細胞内過剰発現により調製される場合には、タンパク質固定化は、細胞可溶化物から直接、実施され得る。或いは、ポリヒスチジンタグ付きタンパク質が、宿主生物体によって分泌される場合には、タンパク質固定化は、細胞培養上清から直接、実施され得る。
【００３７】
したがって、別の態様において、本発明は、アフィニティタグ付きタンパク質の固定化のための方法であって、
i)アフィニティマトリックスが付着している担体材料を含む担体上にアフィニティタグ付きタンパク質を固定化する工程であって、前記担体材料が、
(a)制御多孔性ガラス(CPG);
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);及び
(c)多孔質有機ポリマー
からなる群から選択される工程;並びに
ii)任意選択で、固定化タンパク質材料を水又は適切な緩衝液で洗浄する工程
を含む方法に関する。
【００３８】
なお更なる態様において、本発明は、固定化タンパク質材料の調製のための方法であって、
i)アミノ基を含有する担体材料を用意する工程であって、前記担体材料が、
(a)制御多孔性ガラス(CPG);
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);及び
(c)多孔質有機ポリマー
からなる群から選択される工程;
ii)担体材料を2.4-ジヒドロキシアセトフェノンと反応させ、それにより、ジヒドロキシフェニル基を担体材料に連結する工程;
iii)ポリヒスチジンタグ付きタンパク質に結合する能力があるキレート複合体を、ジヒドロキシフェニル基と金属イオンとの間で形成する工程;並びに
iv)前記金属イオンを含む担体材料に、ポリヒスチジンタグ付き酵素を結合させる工程
を含む方法を提供する。
【００３９】
任意選択で、上記のような固定化タンパク質材料の調製のための方法は更に、遷移金属ナノ粒子を担体材料と結合させる工程を含む。
【００４０】
一実施形態において、担体は制御多孔性ガラス(CPG)である。別の実施形態において、担体は、ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG)である。更に別の実施形態において、担体は、多孔質有機ポリマーである。
【００４１】
好ましい実施形態において、本方法は、アフィニティタグ付きタンパク質のCPG又はハイブリッドCPG上への固定化を含む。別の好ましい実施形態において、アフィニティタグ付きタンパク質は、ポリヒスチジンタグ付き酵素であり、アフィニティマトリックスはキレートされた金属イオンを含有する。より好ましい実施形態において、本方法は、ポリヒスチジンタグ付き酵素のCPG又はハイブリッドCPG上への固定化を含み、用いられるキレートされた金属イオンがCo2+又はFe3+である。
【００４２】
別の態様において、本発明は、上記のような方法により得られる固定化タンパク質材料を提供する。
【００４３】
結合したタンパク質の解離は、標準IMAC方法を用いて達成することができる。結合したタンパク質は、pHを低下させることにより、又はポリヒスチジン基より、キレートされた金属イオンに対する同等以上のアフィニティを有する競合的分子を加えること、例えば、イミダゾール若しくはエチレンジアミン四酢酸塩(EDTA)を含有する緩衝溶液をアプライすることにより、担体から放出され得る。精製タンパク質の担体からの解離後、ポリヒスチジンタグは、必要ならば、当技術分野において知られた技術、例えば、特異的プロテアーゼ等の適切な酵素でアフィニティタグを切断することにより、タンパク質から除去され得、それにより、純粋かつタグを含まないタンパク質が得られる。
【００４４】
したがって、更に別の態様において、本発明は、アフィニティタグ付きタンパク質の精製及び単離のための方法であって、
i)アフィニティマトリックスが付着している担体材料を含む担体上にアフィニティタグ付きタンパク質を固定化する工程であって、前記担体材料が、
(a)制御多孔性ガラス(CPG);
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);及び
(c)多孔質有機ポリマー
からなる群から選択される工程;
ii)任意選択で、固定化タンパク質材料を水又は適切な緩衝液で洗浄する工程;並びに
iii)精製タンパク質をアフィニティマトリックスから解離させる工程
を含む方法に関する。
【００４５】
固定化工程は適切な緩衝液中で実施され得る。必要ならば、固定化タンパク質材料を、その後、いかなる結合していないタンパク質も、他の望ましくない化合物も固定化タンパク質材料から除去するために、水又は適切な緩衝液で洗浄してもよい。精製タンパク質のアフィニティマトリックスからの解離は、特定のアフィニティタグに適している条件を適用することにより達成され得る。異なるアフィニティタグの解離のための適切な条件は当技術分野において知られている。
【００４６】
本方法は、任意選択で、iv)アフィニティタグを精製タンパク質から除去する追加の工程を含んでもよい。
【００４７】
好ましい実施形態において、本方法は、アフィニティタグ付きタンパク質のCPG又はハイブリッドCPG上での精製及び単離を含む。別の好ましい実施形態において、アフィニティタグ付きタンパク質はポリヒスチジンタグ付き酵素であり、アフィニティマトリックスはキレートされた金属イオンを含有する。より好ましい実施形態において、本方法は、ポリヒスチジンタグ付き酵素のCPG又はハイブリッドCPG上での精製及び単離を含み、用いられるキレートされた金属イオンがCo2+である。
【００４８】
上記のように担体上に固定化されたタンパク質が酵素である場合には、それらは、化学反応を触媒することができる活性部位を含有する。それとして、固定化酵素材料は、有機合成において生体触媒として有用である可能性がある。したがって、別の態様において、本発明は、例えば、合成有機変換における、不均一生体触媒としての本明細書に開示されているような固定化酵素材料の使用に関する。本発明は更に、酵素触媒反応を触媒するための方法であって、本発明による固定化タンパク質材料を用意する工程、及び前記固定化タンパク質材料を少なくとも1つの基質と接触させる工程であって、その接触後に、担体上に固定化されている酵素が作用することができる工程を含む方法を提供する。
【００４９】
本明細書に開示されているように、酵素の担体上へのアフィニティタグ結合を介しての固定化は、用いられる酵素の安定性を向上させる。固定化酵素が、水性条件と様々な有機溶媒の両方に耐性があることが見出されている。これは、固定化酵素材料を、遊離の非固定化酵素が安定ではないであろう反応条件で用いることを可能にする。固定化酵素材料がまた、遊離の非固定化酵素が耐えられるであろうpH範囲より広いpH範囲で用いることができる、ということも考えられる。
【００５０】
酵素を粗(未精製)調製物から結合させる場合、生じた固定化タンパク質材料は、濃縮された酵素からなる。酵素方法(enzyme method)の天然の活性は保持されているため、固定化調製物は、最初の非固定化タンパク質材料よりタンパク質質量あたりより高い触媒活性を示す。
【００５１】
本発明のもう一つの利点は、固定化酵素材料を容易にリサイクルし得ることである。固定化酵素材料は不均一触媒であるため、その材料は、反応混合物から濾過により簡単に収集することができる。その後、その材料は、必要ならばその材料の精製後、更なる反応に再利用することができる。特に、培養するのに高い費用がかかり、及び/又は培養するのが困難である酵素について、固定化酵素材料をリサイクルするという可能性は、重要な側面である。
【００５２】
担体上に固定化される酵素は、有機合成変換において生体触媒として有用である任意の酵素であり得る。担体上に固定化される酵素としては、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼとして作用する酵素が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、固定化酵素材料は、固定化酵素が反応を特異的に触媒することができる、任意の有機反応において不均一生体触媒として用いることができる。そのような生体触媒反応の例としては、酵素的酸化及び還元反応、酵素的加水分解反応、並びに酵素的異性化反応が挙げられるが、それらに限定されない。特に有用な生体触媒反応は、エナンチオ選択的反応である。生体触媒反応の具体的な例としては、リパーゼでのアルコール又はアミンの選択的アシル化、ω-トランスアミナーゼでのアミノ基転移、CYP P450又はBaeyer-Villigerモノオキシゲナーゼでの一酸素添加、アルコールデヒドロゲナーゼでのアルコールの酸化又はケトン/アルデヒドの還元、及びモノアミンオキシダーゼでのアミンの酸化が挙げられる。
【００５３】
一実施形態において、2つ以上の異なる酵素は、担体上に固定化され得、異なる酵素のそれぞれが異なる反応を触媒することができる。それゆえに、多段階又はカスケード反応において不均一生体触媒として2つ以上の異なる固定化酵素を含有する材料を用いることは、可能であり得る。そのようなカスケード反応は、例えば、2つ以上の酵素触媒反応が2つ以上の引き続きの段階において基質に対し実施される反応(すなわち、第1の酵素についての基質が、第2の酵素についての基質へと変換される等々の反応)、例えば、ω-トランスアミナーゼによるアミノ基転移反応、続いて、リパーゼによるアシル化反応であり得る。或いは、そのようなカスケード反応は、基質が第1の酵素によって変換され、かつ第1の酵素についての補助因子が第2の酵素によって再生される反応、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼによるケトン/アルデヒドの選択的/特異的還元、それと同時に、ギ酸デヒドロゲナーゼによる、消費されたNADHの再生であり得る。
【００５４】
2つ以上の異なる酵素が担体上に固定化される場合、異なる酵素が同じアフィニティタグ、例えば、ポリヒスチジンタグを含有するならば、便利である。キレートされた金属イオンに対する結合アフィニティは、酵素のそれぞれについて等しいため、異なる酵素は、同程度に強く担体と結合する。したがって、理論上、同じアフィニティタグを有するn個の異なる酵素の等量を用いる場合、担体上の各異なる酵素の量は1/nとなるであろう(いかなる拡散効果も考慮しない場合)。
【００５５】
2つ以上の異なる固定化酵素を含む固定化タンパク質材料を用い、かつその異なる酵素が触媒活性の差を示すカスケード反応では、より高い触媒活性を有する酵素の量と比較してより多い量の、より低い触媒活性を有する酵素を固定化することは有利である可能性がある。これは、律速段階をスピードアップし、反応カスケードの全体的速度を増加させるであろう。
【００５６】
或いは、カスケード反応は、1つ又は複数の異なる固定化酵素材料を所望の比率で混合することにより実施してもよい。
【００５７】
別の態様において、本発明は、酵素触媒による多段階又はカスケード反応を触媒するための方法を提供する。この態様において、本方法は、本発明による2つ以上の固定化酵素を含む固定化タンパク質材料を用意する工程、及び前記固定化タンパク質材料を少なくとも1つの基質と接触させる工程であって、その接触後に、担体に固定化されている酵素が作用することができる工程を含む。
【００５８】
別の実施形態において、固定化酵素材料は、追加として、非限定的に、コバルト、ニッケル、又はパラジウム等の遷移金属のナノ粒子等の金属ナノ粒子を含む。金属ナノ粒子を含む材料は、例えば、アセトニトリル若しくは水中、又はそれらの混合物中のCoCl2、NiCl2、Li2PdCl4、PdCl2、又はPd(TFA)2等の適切な量の金属塩の溶液にアミノ-CPG又はアミノ-HybCPGを浸漬することにより調製することができる。その後、金属イオンは、水素化ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、又は水素化アルミニウムリチウム等の過剰量の適切な還元剤の添加により金属ナノ粒子へ還元される。2,4-ジヒドロキシアセトフェノンの添加で、最初に形成されたイミンは、すぐに、対応するアミンに還元される。洗浄による還元剤の除去後、Co2+、Fe3+、又はNi2+等の金属イオンは、その後、それぞれCoCl2、FeCl3、又はNiCl2の水溶液中に材料を懸濁することによりマトリックス上にキレート化される。乾燥後、得られた材料は、1つ又は複数のポリヒスチジンタグ付き酵素に対するマトリックスとして直接、用いることができる;図2参照。
【００５９】
理論によって縛られることは望まないが、金属ナノ粒子はCPG材料と、CPG材料上のアミノ基を介して結合することが考えられる。金属イオンの還元により形成される金属ナノ粒子が、CPG材料のポア内に捕捉されるのに十分大きなサイズであることもまた想像できる。
【００６０】
固定化酵素と金属ナノ粒子の両方を含有する固定化タンパク質材料は、酵素触媒反応と遷移金属触媒反応が組み合わされた反応において不均一生体触媒として適用することができる。そのような反応の例としては動的速度論的分割反応が挙げられるが、それに限定されない。そのような反応の具体的な例は、添付の実施例に示されているように、Pdナノ粒子によるアミンのラセミ化、続いてリパーゼでのアシル化によるアミンの動的速度論的分割である。
【００６１】
したがって、更に別の態様において、本発明は、酵素触媒反応と遷移金属触媒反応が組み合わされた反応を触媒するための方法を提供する。この態様において、本方法は、追加として、本発明による遷移金属ナノ粒子を含む固定化タンパク質材料を用意する工程、並びに前記固定化タンパク質材料を少なくとも1つの基質と接触させる工程であって、その接触後に、担体に固定化されている酵素及び遷移金属が作用することができる工程を含む。
【００６２】
本明細書に開示された固定化タンパク質材料及びそのような材料の使用の例は、実験セクションに記載されている。
【００６３】
定義
用語「アフィニティタグ」は、組換えタンパク質に付着し、かつマトリックス上に固定化された特定の基と結合することができる、有機又は有機金属分子、タンパク質断片等の限定された基を指す。アフィニティタグの例は、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)タグ、キチン結合タンパク質(CBP)タグ、マルトース結合タンパク質(MBP)タグ、FLAGタグ、アビジンタグ、又はストレプトアビジンタグである。アフィニティタグはまた、融合タグと呼ばれる場合もある。
【００６４】
本明細書に用いられる場合、用語「アフィニティタグ付きタンパク質」は、上記で定義されているようなアフィニティタグが標的タンパク質に付加されている組換えタンパク質を指す。アフィニティタグ付きタンパク質は、DNA断片のライゲーションによる、又はPCR技術による等の、当技術分野において知られた方法を用いる組換えDNAテクノロジーにより調製することができる。アフィニティタグ付きタンパク質はまた、「融合タグタンパク質」又は「融合タンパク質」と呼ばれる場合もある。
【００６５】
用語「ポリヒスチジンタグ」は、少なくとも2個のヒスチジン残基の鎖を指し、それは、タンパク質のC末端又はN末端に付着する。ポリヒスチジンタグは、好ましくは、少なくとも6個のヒスチジン残基の鎖である。ポリヒスチジンタグについて一般的に用いられる他の名前は、ポリHisタグ、ヒスチジンタグ、ヘキサヒスチジンタグ、6xHisタグ、及びHis6タグ、加えてHisタグ(商標)である。
【００６６】
用語「ポリヒスチジンタグ付き酵素」は、標的酵素が、上記で定義されているようなポリヒスチジンタグと融合している組換え酵素を指す。
【００６７】
本明細書に用いられる場合、用語「アミノ-CPG」は、適切なリンカーを介してアミノ基で官能化されているCPG材料を指す。本明細書に用いられる場合の用語「アミノ-HybCPG」は、ポリマーコーティングがアミノ基を含有する、ハイブリッドCPG材料を指す。
【００６８】
本発明は、以下の実施例によって更に例証され、これらの実施例は、本発明をいかなる点においても限定するものではない。全ての引用された文書及び参考文献は、参照により本明細書に組み入れられている。
【００６９】
略語
aw 水分活性
AlaDH 枯草菌(B. subtilis)由来のアラニンデヒドロゲナーゼ
CalA カンジダ・アンタルクティカリパーゼA(別名シュードジマ・アンタルクティカ(Pseudozyma antarctica)リパーゼA)
CalB カンジダ・アンタルクティカリパーゼB(別名シュードジマ・アンタルクティカリパーゼB)
DCM ジクロロメタン
2,5-DKCMO シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)由来2,5-ジケトカンファン
equiv. 当量
EtOAc 酢酸エチル
FMN フラビンモノヌクレオチド
FRE 大腸菌(E. coli)由来フラビンリダクターゼ
GC ガスクロマトグラフィー
HEPES 4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸
IPTG イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド
min 分
MOPS 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸
MTBE メチルtert-ブチルエーテル(又はtert-ブチルメチルエーテル)
NADH ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(還元型)
PLP ピリドキサール5-リン酸
SDS-PAGE ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
Tris トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
ω-TA クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum)由来ω-トランスアミナーゼ
【００７０】
実験方法
CPG材料をPrime Synthesis, Inc. (Aston、PA、USA)から入手した。以下の制御多孔性ガラス材料を実施例に用いた:
・LCAA CPGは、長鎖アルキルアミンで誘導体化されたCPGである(CPG-0502-N12)。
・コポリ-HybCPGアミン(以下においては、「HybCPGコポ」とも呼ばれる)は、インサイチュで1:1アクリロニトリル:塩化ビニルベンジルから形成され、かつ架橋されたコポリマーでコーティングされたハイブリッドCPGである。
・VBC HybCPG-アミン(以下において、「HybCPG VBC」とも呼ばれる)は、インサイチュで塩化ビニルベンジルモノマーから形成され、かつ架橋されたポリマーでコーティングされたハイブリッドCPGである。
コーティング剤の(コ)ポリマーは、WO 2009/005631に記載されているように、二官能性アミンで架橋されている。その後、アミン基は、フタルイミドナトリウムとの反応、続いてヒドラジンでの脱フタロイルにより、クロロポリマーコーティング剤上へ導入される。
【００７１】
以下の多孔質有機ポリマーを実施例に用いた:
・「中膨張度ポリスチレン」(3-Prime LLC、USAから購入;部品番号04-02-03-32)、アミノ官能化ポリスチレン支持体。ポアサイズ約1000Å(非常に広い分布)、粒子サイズ100μm、アミン負荷222μmol/g
・「低膨張度メタクリレートコポリマー」(SPRIN Technologies S.p.A.、Italyから購入;部品番号1A02BN)、アミン官能化メタクリレート支持体。ポア直径不明、粒子サイズ100〜300μm、アミン負荷270μmol/g。
【００７２】
クロモバクテリウム・ビオラセウム由来の過剰発現したω-トランスアミナーゼの培養を、Cassimjeeら(ACS Catal. 2011、1巻、1051〜1055頁)に記載されているように実施した。過剰発現したカンジダ・アンタルクティカリパーゼAの培養を、Sandstromら(Protein Eng Des Sel. 2009、22巻、413〜420頁)に記載されているように実施した。過剰発現したカンジダ・アンタルクティカリパーゼB及びCalB Trp104Ala(リパーゼBの不安定な変異体)の培養をEngstromら(Org. Biomol. Chem. 2011、9巻、81〜82頁)に記載されているように実施した。シュードモナス・プチダ由来の過剰発現した2,5-ジケトカンファンモノオキシゲナーゼの培養を、Kadowら(AMB Express 2011、1:13)に記載されているように実施した。大腸菌由来の過剰発現したフラビンリダクターゼの培養を、Kadowら(Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013、2013年11月5日発行)に記載されているように実施した。枯草菌由来の過剰発現したアラニンデヒドロゲナーゼの培養を、Muttiら(Eur. J. Org. Chem. 2012、5号、1003〜1007頁)に記載されているように実施した。His6タグは、存在しない場合、PCRによって遺伝子に付加した。ポリヒスチジンタグ付きCalA及びCalBを、Engstromら(Org. Biomol. Chem. 2011、9巻、81〜82頁)に記載されている手順に従ってAccurel上に固定化した。
【実施例】
【００７３】
(実施例1)
ポリヒスチジンタグ付き酵素の固定化及び精製のためのキレートCPG担体の調製
所望のタイプのアミノ-CPG(5g)を、メタノール(200mL)中2,4-ジヒドロキシアセトフェノン(CPGのアミノ官能基の1.5当量)で、連続撹拌しながら60分間、処理した。形成されたイミンを、水素化ホウ素ナトリウム(4当量)の逐次添加により、連続撹拌しながら60分間、還元した。この固体材料を濾過し、飽和炭酸ナトリウム水溶液、水、その後、エタノールですすぎ、その後、80℃で2時間、乾燥させた。その後、この粒子を、CoCl2の飽和水溶液(100mL)中に浸漬した。濾過、並びに水及びエタノールでのすすぎ後、この粒子を80℃で2時間、乾燥させた。異なるキレートCPG担体の性質を表1に示す。
【００７４】
【表２】
2019162133.tif 000004
【００７５】
キレートされた金属イオンとしてFe3+を含有する担体を、上記の手順と同様に調製したが、CoCl2の代わりにFeCl3の水溶液を用いた。
【００７６】
(実施例2)
ポリヒスチジンタグ付き酵素の固定化及び精製のためのキレート多孔質ポリスチレン及びポリメタクリレート担体の調製
洗浄し(水/エタノール1:1、400mL)、かつ乾燥させた(濾過後、減圧16時間)、所望のタイプ(下記参照)のアミノ官能化多孔質有機ポリマー粒子(2g)を、メタノール(50mL)中2,4-ジヒドロキシアセトフェノン(プラスチックのアミノ官能基の1.5当量)で、連続撹拌しながら60分間、処理した。形成されたイミンを、水素化ホウ素ナトリウム(4当量)の逐次添加により、連続撹拌しながら60分間、還元した。この固体材料を濾過し、飽和炭酸ナトリウム水溶液、水、その後、エタノールですすぎ、その後、25℃で16時間、減圧中、乾燥させた。
【００７７】
その後、この粒子を、CoCl2の飽和水溶液(100mL)中に浸漬した。濾過、並びに水及びエタノールでのすすぎ後、この粒子を減圧中、25℃で16時間、乾燥させた。異なるキレート多孔質プラスチック担体の性質を表2に示す。
【００７８】
【表３】
2019162133.tif 000005
【００７９】
(実施例3)
ポリヒスチジンタグ付き酵素のキレート担体上への固定化
CalA又はCalBを含有する細胞培養上清を、緩衝化せずに用いた。ω-TAの細胞可溶化物を、HEPES緩衝液(50mM、500mM NaCl、pH8.3)中に細胞を再懸濁することによりにより調製した。界面活性剤(BugBuster(商標)10X、Novagen)の添加後、細胞片を遠心分離により除去した。キレートCPG担体を、その可溶化物又は上清中に浸漬し、続いて、オービタルシェーカー(150rpm)上で撹拌した。固定化中、溶液のブラッドフォード分析される試料によって、タンパク質濃度の減少が止まったら、キレートCPG担体の結合及び飽和の完了が確認された。活性アッセイもまた、CPG担体の濾過による除去後、溶液に実施した。その後、固定化調製物を、緩衝液(CalA及びCalBについてはMOPS(50mM、pH7.4);ω-TAについてはHEPES(上記参照))ですすぎ、減圧下で16時間、乾燥させた。
【００８０】
CPG担体からの固定化酵素の抽出を、この粒子を溶出緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、500mMイミダゾール、pH7.5)中に浸漬し、オービタルシェーカー上で20分間、インキュベートすることにより実施した。抽出された酵素の存在及び純度を、SDS-PAGEにより可視化した;His6タグ付き酵素に対応するバンドのみが視認できた。
【００８１】
溶媒におけるω-TAの活性部位定量化を、前に記載されているように(Cassimjeeら、ACS Catal. 2011、1巻、1051〜1055頁)実施した。溶媒における固定化されたω-TAの活性部位定量化を、ω-TA-CPGを1-フェニルエチルアミン(1mM、1mL、MTBE aw=0.6、1mMペンタデカン)に加えることにより実施した。反応混合物を、オービタルシェーカー上で撹拌した(150rpm、24時間、22℃)。溶媒の水分活性は、塩の水和物ペア(Na2HPO4、2H2O/7H2O)によって設定したが、ω-TA-CPGの添加後、又は反応中、制御しなかった。変換を、GCによって測定し(200μL試料をEtOAc、3滴の無水酢酸、及びトリエチルアミンに加え、22℃で8時間、インキュベート)、内部標準としてペンタデカンを用いた。
【００８２】
緩衝液における固定化ω-TAの活性部位定量化を、ω-TA-CPGを1-フェニルエチルアミン(1mM、1mL、50mM HEPES、pH7.0)に加えることにより実施した。反応混合物を、オービタルシェーカー上で撹拌した(150rpm、24時間、22℃)。試料(400μL)を、NaOH水溶液(1%)で処理し、DCMで抽出し、ペンタデカン(1mM、EtOAc)の添加後、GCにより分析した。変換を、全ての場合において、(酵素が結合していない)キレートCPGについてのブランク反応と比較した。
【００８３】
固定化の収率、すなわち、可溶化物から取り出された活性酵素の量対洗浄後のCPG上に保持された活性酵素の量は、活性部位定量化に基づいて99%より高かった。結果を表3に示す。
【００８４】
【表４】
2019162133.tif 000006
【００８５】
ポリヒスチジンタグ付き酵素(CalA及びCalB)のキレート多孔質ポリスチレン及びポリメタクリレート担体上への固定化を、CPG担体について上で記載されているように、実施した。
【００８６】
(実施例4)
ω-TA-CPGの触媒としての使用
実施例3において調製されたω-TA-CPGを、フェノキシ-2-プロパノンのエナンチオ特異的アミノ基転移における触媒として適用した:
【００８７】
【化１】
2019162133.tif 000007
【００８８】
20mgのω-TA-CPGを、100mMラセミの1-フェニルエチルアミン及び50mM 2-フェノキシプロパノンを含む3mLのMTBEの溶液(aw=0.6)に加え、その反応混合物を、50℃でオービタル振盪(150rpm)しながらインキュベートした。ペンタデカン(50mM)を内部標準として用いた。1-フェニルエチルアミンの変換及び鏡像体過剰率を、記録された時点での試料(50μL)の採取後のキラルガスクロマトグラフィーによって追跡した;試料を、上記のように、無水酢酸及びトリエチルアミンで誘導体化した。1-フェノキシプロパン-2-アミンの形成を、誘導体化せずに測定した。結果を表4に示す。
【００８９】
【表５】
2019162133.tif 000008
【００９０】
(実施例5)
固定化CalA及びCalBの触媒としての使用
実施例3において調製されたCalA-CPG、CalB-CPG、CalB-ポリスチレン、及びCalB-ポリメタクリレートを、1-フェニルエタノールのエナンチオ選択的アシル化における触媒として適用した(速度論的分割):
【００９１】
【化２】
2019162133.tif 000009
【００９２】
リパーゼ触媒される速度論的分割反応を、10mM 1-フェニルエタノール及び100mM酪酸ビニルを含む3mLのトルエンの溶液(aw=0.1)への固定化酵素(20mg)の添加により実施し、この混合物を、22℃(CalA及びCalBについて)又は50℃(CalB Trp104Alaについて)でオービタル振盪(200rpm)しながらインキュベートした。ペンタデカン(5mM)を内部標準として用いた。1-フェニルエタノール及び1-フェニルエチルブチレートの変換及び鏡像体過剰率を、記録された時点で試料(50μL)を採取することによりキラルGCによって測定した。以下の反応は、比較のために含めた:
-  Accurel(登録商標)(多孔質ポリプロピレン粉末)上に固定化されたCalB
-  非修飾型(すなわち、実施例1に従って処理されていない)のアミノ-HybCPGコポ上に固定化されたCalB
【００９３】
CalB(及びCalB Trp104Ala)のエタノール活性化Accurel(登録商標)(Accurel MP1001、粒子サイズ<1000μm、Membrana GmbH、Wuppertal、Germany)上への固定化を、酵素の量(タンパク質含有量を、ブラッドフォード方法により測定した)に対して50:1の比で多孔質材料を濃縮上清に加え、続いて、少なくとも8時間インキュベートすることにより実施した。結果を表5に示す。
【００９４】
【表６】
2019162133.tif 000010
【００９５】
(実施例6)
3つの異なる酵素を含むカスケード-CPG(「BV-カスケード-CPG」)の調製
2,5-DKCMO、FRE、及びAlaDHの細胞可溶化物を、リン酸ナトリウム緩衝液(50mM、500mM NaCl、pH7.5)中での細胞再懸濁、及びBugBuster(商標)10Xの添加により調製した。遠心分離し細胞片を除去した後、キレートCo2+ CPG担体を、同体積の3つの細胞可溶化物の混合物中に浸漬し、続いて、オービタルシェーカー(150rpm)上で撹拌した。固定化中、溶液のブラッドフォード分析される試料によって、タンパク質濃度の減少が止まったら、CPG担体の結合及び飽和の完了が確認された。活性アッセイもまた、CPGの濾過による除去後、溶液に実施した。その後、固定化調製物を、リン酸ナトリウム緩衝液(上記参照)ですすぎ、その後、減圧下で16時間、乾燥させた。
【００９６】
(実施例7)
触媒としてBV-カスケード-CPGを用いる酵素的カスケード反応
実施例6において調製されたカスケード-CPGを、(+)-カンファーのBaeyer-Villiger酸化における触媒として適用した:
【００９７】
【化３】
2019162133.tif 000011
【００９８】
65mg BV-カスケード-CPGを、5.0mLの液体総体積で、2.0mM(+)-カンファー、5.0mM L-アラニン、0.3mM FMN、及び0.5mM NADHを含むリン酸緩衝液(100mM、pH7.5)の反応混合物に加えた。その後、酸素を溶解し(30秒間泡立てた)、続いて容器を密封した;この混合物をオービタルシェーカー(150rpm)上、22℃でインキュベートした。試料(500μL)を、内部標準として安息香酸エチルを含むEtOAcへ抽出し、GCによって分析した。3時間後、変換を測定した。24時間後、酸素を加え、反応を、更に3時間、継続させ、その後、変換を再び、測定した(27時間)。
【００９９】
(細胞可溶化物由来の)遊離(非固定化)2,5-DKCMO、FRE、及びAlaDHとの比較反応もまた実施した。その酵素の割合及び量を測定しなかった。結果を表6に示す。
【０１００】
【表７】
2019162133.tif 000012
【０１０１】
多相反応を、5.0mLの液体総体積で、160mM L-アラニン、0.3mM FMN、及び0.5mM NADHを含むリン酸緩衝液(100mM、pH7.5)の反応混合物に1.0g BV-カスケード-CPGを加えることにより実施した。その後、(+)-カンファー(100mM)を含む5mLシクロヘキサンを、第2の液相として加えた。密封した容器を、オービタルシェーカー(100rpm)上、22℃で撹拌し、酸素を水相へ連続的に添加した。有機相からの試料(50μL)を、記録された時点で採取し、内部標準としての安息香酸エチル(EtOAc中2.0mM)の添加後、GCにより分析した。72時間後の変換を、全ての成分のEtOAc(20mL)での抽出後、測定した。
【０１０２】
(細胞可溶化物由来の)遊離(非固定化)2,5-DKCMO、FRE、及びAlaDHとの比較反応もまた実施した。その酵素の割合及び量を測定しなかった。結果を表7に示す。
【０１０３】
【表８】
2019162133.tif 000013
【０１０４】
(実施例8)
CalB及びPd-ナノ粒子を含むカスケード-CPG(「Pd-CalB-CPG」)の調製
アミノ-CPG(5g)を、水(200mL)中Pd(TFA)2(CPGのアミノ官能基の0.5当量)の溶液中に浸漬し、この混合物を、連続して10分間、撹拌した。その後、NaBH4(7当量)を加え、この混合物を更に30分間、撹拌した。その後、2,4-ジヒドロキシアセトフェノン(0.5当量)を加え、その後、この混合物を30分間、撹拌した。この固体材料を濾過し、水で入念にすすぎ、その後、CoCl2の飽和水溶液(100mL)中に浸漬した。濾過及び水での洗浄後、固体材料を、(精製された、又は上清由来の)ポリヒスチジンタグ付きCalBの溶液中に浸漬し、30分間、撹拌した。その後、その固定化調製物を濾過し、緩衝液(20mM MOPS、pH7.4)ですすぎ、その後、減圧下で16時間、乾燥させた。
【０１０５】
(実施例9)
Pd-CalB-CPGを用いるカスケード反応
実施例8において調製された材料を、1-フェニルエチルアミンのエナンチオ選択的アシル化(速度論的分割)における触媒として適用した:
【０１０６】
【化４】
2019162133.tif 000014
【０１０７】
100mgのPd-CalB-CPGを、20mMラセミの1-フェニルエチルアミン及び100mM酪酸イソプロピルを含有する1.0mLトルエンの溶液中に浸漬した。1mg NaBH4を加え、反応容器を密封した。その系を65℃で、オービタルシェーカー(100〜800rpm)上で連続的に撹拌しながら、24〜48時間、インキュベートした。基質及び生成物(例えば、(R)-N-(1-フェニルエチル)ブチルアミド)の変換及び鏡像体過剰率を、記録された時点で試料を採取することによりキラルGCによって測定した。
【０１０８】
相の分離、残留するアシル供与体及びアミンを除去するための1N HClとの有機相の振盪(3回)、及びそれに続く、洗浄相のEtOAcでの逆抽出により、生成物が得られる。合わせた有機相を、真空内で蒸発させて、生成物を得、それを、フラッシュクロマトグラフィーによって更に精製する。
【０１０９】
(実施例10)
A.金属イオン浸出の決定
所定の条件において担体から浸出する金属イオンの量を決定するために、CPG及びHybCPGに基づき、かつCo2+か又はFe3+のいずれかを含有する担体を、水性緩衝液中での長時間のインキュベーションに供した。
【０１１０】
結合したCo2+か又はFe3+のいずれかを含む、LCAA CPG、HybCPG VBC、及びHybCPGコポのそれぞれ250mgを、室温、振盪台上、3mLの水性緩衝液(HEPES 20mM、pH7.0)中、72時間のインキュベーションに供した。
【０１１１】
1の割合のインキュベートされた溶液を、1の割合のNH4SCN溶液(1.0M)、1の割合のHCl溶液(6.0M)、及び2の割合のアセトンと混合することにより、Co2+の量を測定した。この手順により、Co2+の濃度に比例した青色が呈示され、それを、620nmでの分光測定により定量化した。緩衝液のみを含むブランク試料も試験した。
【０１１２】
1の割合のインキュベートされた溶液を、1の割合のNH4SCN溶液(1.0M)及び1の割合のHCl溶液(6.0M)と混合することにより、Fe3+の量を測定した。この手順により、Fe3+の濃度に比例した赤色が呈示され、それを、480nmでの分光測定により定量化した。緩衝液のみを含むブランク試料も試験した。
【０１１３】
インキュベートされた担体材料から溶液の2分の1(1.5mL)を取り出した後、1.5mLの6.0M HCl溶液を加え、その材料を、シェーカー上で1時間、インキュベートした;この手順により、全ての結合した金属イオンが効果的に脱着される。その後、1の割合のこのインキュベートされた溶液を、1の割合のHCl溶液(3M)及び1の割合のNH4SCN溶液(1.0M)と混合した。Co2+を定量化しようとしている試料に、2の割合のアセトンもまた加えた。Co2+定量化について620nmでの吸光度、及びFe3+定量化について480nmの吸光度を記録した。吸光度測定値に基づいて、金属イオンの総量に対応する値を、2つの異なるインキュベーションで(最初pH7.0で、その後、3.0M HCl中で)試験された体積について計算し、取り出された体積(最初のインキュベーション後の1.5mL)について補正した。それにより、pH7.0での浸出した金属イオンの割合を定量化することができた。結果を、下記の表8に示す。
【０１１４】
【表９】
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【０１１５】
CPG及びHybCPG担体材料に結合したFe3+はCo2+より浸出しにくいことがわかる。
【０１１６】
B.酵素浸出の決定
所定の条件において担体から解離する酵素の量を決定するために、CPG又はHybCPG上のω-TAの固定化調製物を、水性緩衝液中での長時間のインキュベーションに供した。
【０１１７】
酵素がCo2+か又はFe3+のいずれかによって結合されている、ω-TA-LCAA CPG、ω-TA-HybCPG VBC、及びω-TA-HybCPGコポのそれぞれ12〜16mgを、オービタルシェーカー上、4mLの水性緩衝液(HEPES 100mM、pH7.0)中で1分間、インキュベートした。この時間後、溶液中において酵素は検出することができなかった。これは、活性アッセイによって測定され、そのアッセイにおいて、固定化材料の沈降後、1mLの溶液を用いた。残りの3mLを含む調製物を、オービタルシェーカー上で24時間、インキュベートし、その後、調製物のいくつかは、溶液中において、測定可能な量の酵素を示した。
【０１１８】
1mLの溶液を採取し、1mLのアッセイ混合物(同じ緩衝液中に溶解された、1-フェニルエチルアミン(10mM)、ピルビン酸ナトリウム(5mM)、及びPLP(1μM))を加え、245nmにおける時間経過による吸光度変化を5分間、測定することにより、活性アッセイを実施した。純粋な緩衝液でのブランク反応も試験した。この波長において、アミノ基転移反応からの生成物である、アセトフェノンの形成が、吸光度の増加としてモニターすることができ、12mM-1cm-1の消衰係数であった(Schatzleら、Anal. Chem. 2009、81巻、8244〜8248頁)。速度定数は知られているため(Cassimjeeら、Org. Biomol. Chem. 2012、10巻、5466〜5470頁)、浸出した酵素の量は計算することができる。浸出実験の前に、固定化調製物における結合した酵素の量を、活性部位定量化によって測定した。各材料についての24時間後の浸出の量を表9に示す。
【０１１９】
【表１０】
2019162133.tif 000016
【０１２０】
その値により、試験された条件において、キレートされた金属イオンとしてのFe3+が、より少ない酵素浸出を生じることが示されている。担体としてのHybCPGコポは、キレートされた金属イオンとしてのCo2+又はFe3+のいずれに関しても、選択された条件で少しの検出可能な酵素浸出も生じなかった。ガラス表面を有するLCAA CPGは、酵素浸出の最も高い量を示した。これは、ガラス表面への非特異的酵素結合の結果である可能性がある。
【０１２１】
(実施例11)
ポリヒスチジンタグ付きω-TAのHybCPGコポ(Co2+)での精製
50μg/mLカナマイシンを添加した100mL Luria-Bertani培地中でのω-TAのペレット化IPTG誘導化24時間培養からの細胞可溶化物(5.0mL)を、BugBuster(商標)の使用によって調製した。過剰量の補酵素(PLP)を加え、溶液を、37℃で1時間、インキュベートした。その後、過剰な(酵素によって結合されていない)PLPは、PD10カラムを用いてHEPES緩衝液(50mM、500mM NaCl、pH8.2(緩衝液1))に緩衝液交換(2ラウンド)することによって除去し、標的ホロ酵素、天然タンパク質、及び他の不純物を含有する7.0mLの溶液が得られた。
【０１２２】
26μmol/g Co2+を含有する204mg HybCPGコポ(Co2+)でカラムを充填した。その材料を、7.0mLの緩衝液1を加えることによりあらかじめ湿らせ、通過画分を捨てた。
【０１２３】
活性ホロ酵素を、395nm、ε=8.1mM-1cm-1で分光光度的に測定する(Cassimjeeら、ACS Catal. 2011、1巻、1051〜1055頁)。吸光度測定後、可溶化物をカラムに加え、通過画分を収集した。カラムを通過させる前と後の可溶化物のこの波長における吸光度差は、0.62と測定された(全ての測定を、1.0cm経路長で実施した)。これは、カラム中のHybCPGコポ(Co2+)担体に今や結合している29mgの酵素に相当する。
【０１２４】
その後、カラムを7.0mLの緩衝液1で洗浄した。通過画分を収集し、その吸光度は、0.11と測定され、ブランクとして緩衝液1を用いた。これは、おそらく非特異的に結合した、又は結合していない酵素による、カラムから洗い出された5mgの酵素に相当し、カラム中には24mgの結合した酵素が残った。
【０１２５】
カラム中の結合した酵素の解離を、5.0mLのTris緩衝液(50mM、500mMイミダゾール、pH7.5(緩衝液2))をアプライすることにより実施した。通過画分を収集し、再び、過剰量の補酵素を加えた。上記で論じられているように、過剰なPLPは、PD10カラムを用いて緩衝液1に緩衝液交換することによって除去し、ホロ酵素が溶解した総体積7.0mLの溶液が得られた。吸光度は0.465と測定された。これは、22mgの精製酵素に相当し、すなわち、92%の収率である。この溶液は、混入する宿主細胞タンパク質がかなり除去されていたようであり、このことは、SDS-PAGEによっても確認された。
【図１】
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【図２】
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【外国語明細書】
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