(57)【要約】【課題】滑膜炎に罹患しているか否かを簡便に判定する技術を提供する。【解決手段】Ｖ−Ｓｅｔ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ４（ＶＳＴＭ４）遺伝子又はＶＳＴＭ４遺伝子にコードされるタンパク質からなる、滑膜炎マーカー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｖ−Ｓｅｔ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ４（ＶＳＴＭ４）遺伝子又はＶＳＴＭ４遺伝子にコードされるタンパク質からなる、滑膜炎マーカー。
【請求項２】
ＶＳＴＭ４遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマー、
ＶＳＴＭ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は
ＶＳＴＭ４遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質、
を備える、滑膜炎診断用キット。
【請求項３】
患者由来の生体試料中のＶＳＴＭ４遺伝子又はＶＳＴＭ４遺伝子にコードされるタンパク質の発現量を測定する工程を備える、前記患者が滑膜炎に罹患しているか否かを診断するためのデータ収集方法。
【請求項４】
ＶＳＴＭ４タンパク質によるシグナル伝達を制御する物質からなる、滑膜炎治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、滑膜炎マーカー及びその使用に関する。より具体的には、滑膜炎マーカー、滑膜炎診断用キット、患者が滑膜炎に罹患しているか否かを診断するためのデータ収集方法及び滑膜炎治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節に痛みや腫れが生じる疾患には、変形性関節症、関節リウマチ等が存在する。いずれの疾患も関節に起こる症状は似ているが、その原因や疾患の進み方には違いがあり、その治療法もそれぞれ異なっている。
【０００３】
具体的には、変形性関節症は、主に関節にかかる負担や関節の使いすぎによって関節の軟骨が損傷し、そこから症状が進行していく疾患である。このため、薬物療法で症状をやわらげながら、運動療法で関節の周りの筋肉を鍛えて関節の機能を保つ等の対策が取られる。また、関節を保護するために装具を使うこともある。一方、関節リウマチは、免疫の異常が強く関係して生じる疾患である。関節リウマチの治療では、免疫の異常を抑える薬剤を投与する等の対策が取られる。
【０００４】
超高齢化社会を迎え、変形性関節症患者は増加の一途をたどっている。しかしながら、その病態を把握するためのマーカーは存在しない。滑膜炎は、変形性関節症の進行や疼痛に関与する可能性が示唆されている。
【０００５】
ところで、Ｖ−Ｓｅｔ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ４（ＶＳＴＭ４）はヒト第１０番染色体長腕に座位する遺伝子であるが、その機能はよくわかっていない。
【０００６】
近年、ＶＳＴＭ４遺伝子にコードされるタンパク質から生成されるペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｖ）が、光受容体に存在するＬ型電位依存性カルシウムチャネルの発現を制御する神経ペプチドであることが報告されている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Shi L., et al., Identification of Peptide lv, a novel putative neuropeptide that regulates the expression of L-type voltage-gated calcium channels in photoreceptors., PLoS One, 7 (8), e43091, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来、滑膜炎に罹患しているか否かを簡便に判定する技術は存在しなかった。そこで、本発明は、滑膜炎に罹患しているか否かを簡便に判定する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ＶＳＴＭ４遺伝子又はＶＳＴＭ４遺伝子にコードされるタンパク質からなる、滑膜炎マーカー。
［２］ＶＳＴＭ４遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマー、ＶＳＴＭ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＶＳＴＭ４遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、滑膜炎診断用キット。
［３］患者由来の生体試料中のＶＳＴＭ４遺伝子又はＶＳＴＭ４遺伝子にコードされるタンパク質の発現量を測定する工程を備える、前記患者が滑膜炎に罹患しているか否かを診断するためのデータ収集方法。
［４］ＶＳＴＭ４タンパク質によるシグナル伝達を制御する物質からなる、滑膜炎治療剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、滑膜炎に罹患しているか否かを簡便に判定する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）〜（ｃ）は、実験例１の結果を示すグラフである。
【図２】実験例２の結果を示すグラフである。
【図３】実験例３の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［滑膜炎マーカー］
１実施形態において、本発明は、ＶＳＴＭ４遺伝子又はＶＳＴＭ４遺伝子にコードされるタンパク質からなる、滑膜炎マーカーを提供する。本実施形態のマーカーを用いることにより、滑膜炎を容易に診断することが可能となる。以下、本明細書において、ＶＳＴＭ４遺伝子にコードされるタンパク質のことをＶＳＴＭ４タンパク質という場合がある。
【００１３】
実施例において後述するように、発明者らは、複数種類の滑膜炎モデルマウスを用いた検討により、滑膜炎を発症すると滑膜組織中のＶＳＴＭ４遺伝子の発現量が有意に上昇することを明らかにした。また、変形性膝関節症患者の滑膜組織を用いた検討においても、関節炎の発症とＶＳＴＭ４遺伝子の発現量の上昇が有意に相関することを明らかにした。
【００１４】
本実施形態は、ＶＳＴＭ４遺伝子又はＶＳＴＭ４タンパク質の滑膜炎マーカーとしての使用を提供するものであるということもできる。
【００１５】
［滑膜炎診断用キット］
１実施形態において、本発明は、ＶＳＴＭ４遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマー、ＶＳＴＭ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＶＳＴＭ４タンパク質に対する特異的結合物質、を備える、滑膜炎診断用キットを提供する。本実施形態のキットにより、患者又は患畜の滑膜炎を容易に診断することができる。
【００１６】
本実施形態のキットは、ＶＳＴＭ４遺伝子又はＶＳＴＭ４タンパク質として、診断対象の種の遺伝子又はタンパク質を検出するものであることが好ましい。例えば、診断対象がヒトである場合には、ヒトＶＳＴＭ４遺伝子又はヒトＶＳＴＭ４タンパク質を検出するものであることが好ましい。患畜としては、特に限定されず、例えば、ウシ、ウマ、マウス等が挙げられる。
【００１７】
（プライマーセット）
プライマーセットとしては、診断対象の種のＶＳＴＭ４遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができるものであれば特に限定されない。
【００１８】
（プローブ）
プローブとしては、診断対象の種のＶＳＴＭ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。
【００１９】
（特異的結合物質）
特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に、診断対象の種のＶＳＴＭ４タンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫することにより作製してもよい。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することもできる。また、抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。
【００２０】
アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。ＶＳＴＭ４タンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、ＶＳＴＭ４タンパク質に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００２１】
特異的結合物質は、ＶＳＴＭ４タンパク質に特異的に結合することができれば特に制限されず、市販のものであってもよい。また、特異的結合物質は、担体上に固定されてプロテインチップ等を構成していてもよい。
【００２２】
［データ収集方法］
１実施形態において、本発明は、患者由来の生体試料中のＶＳＴＭ４遺伝子又はＶＳＴＭ４タンパク質の発現量を測定する工程を備える、前記患者が滑膜炎に罹患しているか否かを診断するためのデータ収集方法を提供する。なお、データ収集方法は医師が判断する工程を含まない。
【００２３】
本実施形態の方法において、生体試料としては、滑膜組織、関節液、血清、血漿等が挙げられる。また、生体試料中のＶＳＴＭ４遺伝子の発現量の測定は、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ解析等により行うことができる。また、生体試料中のＶＳＴＭ４タンパク質の発現量の測定は、例えば、免疫組織染色、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
【００２４】
ＶＳＴＭ４遺伝子又はＶＳＴＭ４タンパク質の発現量が、健常者におけるＶＳＴＭ４遺伝子又はＶＳＴＭ４タンパク質の発現量と比較して多いことは、当該患者が滑膜炎に罹患していることを示す。
【００２５】
［滑膜炎治療剤］
１実施形態において、本発明は、ＶＳＴＭ４タンパク質によるシグナル伝達を制御する物質からなる、滑膜炎治療剤を提供する。ＶＳＴＭ４タンパク質によるシグナル伝達を制御する物質は、例えば、ＶＳＴＭ４タンパク質の発現量を上昇又は減少させる物質であってもよいし、ＶＳＴＭ４タンパク質の機能を活性化又は阻害する物質であってもよい。
【００２６】
より具体的には、ＶＳＴＭ４遺伝子又はタンパク質の発現量を上昇又は減少させる化合物、ＶＳＴＭ４遺伝子に対する阻害性ＲＮＡ、ＶＳＴＭ４タンパク質又はその断片、ＶＳＴＭ４タンパク質の機能を阻害する特異的結合物質等が挙げられる。ここで、阻害性ＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。また、ＶＳＴＭ４タンパク質の機能を阻害する特異的結合物質としては、ＶＳＴＭ４タンパク質に対する中和抗体等が挙げられる。
【実施例】
【００２７】
次に、実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００２８】
［実験例１］
（滑膜炎マウスモデルを用いた検討１）
滑膜炎マウスモデルを用いて、滑膜炎の発症とＶＳＴＭ４遺伝子の発現量との関連性を検討した。滑膜炎マウスモデルとしては、正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の膝蓋骨を恒久的に脱臼させる滑膜炎モデルを用いた。
【００２９】
膝蓋骨を脱臼させてから７日後の滑膜炎モデルマウス（ｎ＝１０）の滑膜組織からＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＶＳＴＭ４遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。また、比較のために、炎症性のサイトカインであるＴＮＦ−α遺伝子のｍＲＮＡの発現量も定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。また、対照として、正常マウスの滑膜組織からＲＮＡを抽出し、同様の操作を行った（ｎ＝１０）。また、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現量を用いてＶＳＴＭ４遺伝子及びＴＮＦ−α遺伝子の発現量を基準化した。
【００３０】
マウスＶＳＴＭ４遺伝子のＰＣＲには、配列番号１に示すセンスプライマー及び配列番号２に示すアンチセンスプライマーを使用した。また、マウスＴＮＦ−α遺伝子のＰＣＲには、配列番号３に示すセンスプライマー及び配列番号４に示すアンチセンスプライマーを使用した。また、マウスＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲには、配列番号５に示すセンスプライマー及び配列番号６に示すアンチセンスプライマーを使用した。
【００３１】
図１（ａ）〜（ｃ）は、検討結果を示すグラフである。図１（ａ）は、ＶＳＴＭ４遺伝子の発現量を示すグラフである。また、図１（ｂ）は、ＴＮＦ−α遺伝子の発現量を示すグラフである。図１（ａ）及び（ｂ）では、マン・ホイットニーのＵ検定を用いて２群間の差を検定し、Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。図１（ａ）及び（ｂ）中、「＊」は有意差が存在することを示す。
【００３２】
また、図１（ｃ）は、ＶＳＴＭ４遺伝子の発現量とＴＮＦ−α遺伝子の発現量との相関性を示すグラフである。相関性は、ピアソンの相関係数を算出することにより検討し、Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。
【００３３】
その結果、滑膜炎モデルでは対照と比較してＶＳＴＭ４遺伝子及びＴＮＦ−α遺伝子の発現の有意な上昇が認められることが明らかとなった。また、ＶＳＴＭ４遺伝子の発現量とＴＮＦ−α遺伝子の発現量との間には有意な相関が認められることが明らかとなった。
【００３４】
以上の結果は、ＶＳＴＭ４遺伝子又はタンパク質の発現量を測定することにより、滑膜炎に罹患しているか否かを判定することができることを示す。
【００３５】
［実験例２］
（滑膜炎マウスモデルを用いた検討２）
続いて、実験例１とは異なる滑膜炎マウスモデルを用いて滑膜炎の発症とＶＳＴＭ４遺伝子の発現量との関連性を検討した。滑膜炎マウスモデルとしては、変形性膝関節症自然発症マウスである（ＳＴＲ／Ｏｒｔ、日本チャールスリバー）を用いた。ＳＴＲ／Ｏｒｔマウスは、約３ヶ月齢で軽度滑膜炎を発症し、６ヶ月齢では中等度滑膜炎を認め、１８ヶ月齢では高度滑膜炎を認める。
【００３６】
６ヶ月齢及び１８ヶ月齢の滑膜炎モデルマウス（ｎ＝１０）の滑膜組織からＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＶＳＴＭ４遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。また、対照として、正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の滑膜組織からＲＮＡを抽出し、同様の操作を行った（ｎ＝１０）。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を用いてＶＳＴＭ４遺伝子の発現量を基準化した。各遺伝子を増幅するプライマーとしては、実験例１と同様のものを使用した。
【００３７】
図２は、結果を示すグラフである。マン・ホイットニーのＵ検定を用いて２群間の差を検定し、Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。図２中、「＊」は有意差が存在することを示す。その結果、滑膜炎モデルでは対照と比較してＶＳＴＭ４遺伝子の発現の有意な上昇が認められることが明らかとなった。
【００３８】
以上の結果は、ＶＳＴＭ４遺伝子又はタンパク質の発現量を測定することにより、滑膜炎に罹患しているか否かを判定することができることを更に支持するものである。
【００３９】
［実験例３］
（ヒト患者由来試料を用いた検討）
本実験例は、北里大学医学部・病院倫理委員会に「整形外科疾患における滑膜・骨軟骨組織由来疼痛に関する探索的研究」という課題名で申請し、承認を得て実施した（承認番号：Ｂ３−１１３）。
【００４０】
まず、変形性膝関節症患者１３７名より、人工膝関節全置換術時に滑膜組織を採取した。患者の性別は、男性２９名、女性１０８名であった。また、患者の年齢は７２．８±８．２歳であった。また、患者のＢｏｄｙ  Ｍａｓｓ  Ｉｎｄｅｘは２６．１±０．４ｋｇ／ｍ２であった。
【００４１】
続いて、採取した滑膜組織からそれぞれＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＶＳＴＭ４遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。また、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α遺伝子のｍＲＮＡの発現量も測定した。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を用いてＶＳＴＭ４遺伝子及びＴＮＦ−α遺伝子の発現量を基準化した。続いて、ＶＳＴＭ４遺伝子のｍＲＮＡの発現量とＴＮＦ−αの遺伝子のｍＲＮＡの発現量の相関を検討した。
【００４２】
ヒトＶＳＴＭ４遺伝子のＰＣＲには、配列番号７に示すセンスプライマー及び配列番号８に示すアンチセンスプライマーを使用した。また、ヒトＴＮＦ−α遺伝子のＰＣＲには、配列番号９に示すセンスプライマー及び配列番号１０に示すアンチセンスプライマーを使用した。また、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲには、配列番号１１に示すセンスプライマー及び配列番号１２に示すアンチセンスプライマーを使用した。
【００４３】
図３は、ＶＳＴＭ４遺伝子の発現量とＴＮＦ−α遺伝子の発現量との相関性を示すグラフである。相関性は、ピアソンの相関係数を算出することにより検討し、Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。
【００４４】
その結果、変形性膝関節症患者の滑膜組織におけるＶＳＴＭ４遺伝子の発現量は、ＴＮＦ−αの遺伝子の発現量と有意に相関することが明らかとなった。
【００４５】
この結果は、ヒトにおいても、ＶＳＴＭ４遺伝子又はタンパク質の発現量を測定することにより、滑膜炎に罹患しているか否かを判定することができることを更に支持するものである。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、滑膜炎に罹患しているか否かを簡便に判定する技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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