(57)【要約】【課題】嫌気性処理槽の高級脂肪酸濃度について運転制御をしなくとも、嫌気性処理槽内における高級脂肪酸の蓄積が抑制され、メタン発酵が効率よくなされる廃水の嫌気性処理方法及びこの方法において用いられるメタン発酵促進用の微生物製剤を提供する。【解決手段】本発明の廃水の嫌気性処理方法は、油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水の嫌気性処理方法であって、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物を添加して嫌気性処理を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水の嫌気性処理方法であって、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物を添加して嫌気性処理を行うことを特徴とする廃水の嫌気性処理方法。
【請求項２】
前記Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物が、Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属又はＡｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物であることを特徴とする請求項１に記載の廃水の嫌気性処理方法。
【請求項３】
さらに、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ目に属する微生物を添加して嫌気性処理を行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の廃水の嫌気性処理方法。
【請求項４】
前記廃水中に含まれる前記油脂を酵素で加水分解する前処理工程を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の廃水の嫌気性処理方法。
【請求項５】
Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物を含有する嫌気条件下での高級脂肪酸分解又はメタン発酵促進用の微生物製剤。
【請求項６】
前記Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物がＡｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属又はＡｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物であることを特徴とする請求項５に記載の嫌気条件下での高級脂肪酸分解又はメタン発酵促進用の微生物製剤。
【請求項７】
さらに、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ目に属する微生物を含有する請求項５又は６に記載の嫌気条件下での高級脂肪酸分解又はメタン発酵促進用の微生物製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水の嫌気性処理（メタン発酵）方法に関するものであり、特に、高級脂肪酸を高濃度に含有する廃水に対する嫌気性処理を促進させる微生物製剤及びそれを用いた嫌気性処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタン発酵（嫌気性処理）は、有機性廃棄物からメタンガスをエネルギーとして回収できる優れた方法である。しかしながら、油脂を高濃度に含む廃水は効率的なメタン発酵が困難であることが知られている。というのも、油脂のメタン発酵過程においては、油脂はいったん高級脂肪酸とグリセロールに分解され、引き続いて、それらが低級脂肪酸にまで分解された後にメタンガスが生成する。このうち、油脂の分解過程中に生じる高級脂肪酸は、メタン発酵で働く微生物に阻害的な作用を及ぼすことが知られており、高級脂肪酸が嫌気性処理槽内に蓄積するとメタン発酵が停止してしまう（特許文献１、２参照）。
【０００３】
そこで、効率的に油脂含有廃水の嫌気性処理を行うことを目的として、特許文献１では、嫌気性若しくは好気性の微生物体を嫌気性処理工程に導入し、嫌気性処理工程からサンプルを採取して、サンプル中の高級脂肪酸濃度／微生物濃度の比率値を求め、比率値をフィードバックして、嫌気性処理工程に導入する嫌気性若しくは好気性の微生物体の量を調節する油脂含有廃水の嫌気性処理方法が記載されている。また、特許文献２では、嫌気性処理工程において反応槽内汚泥中の水素生産性酢酸生成菌濃度（ａ）と水素資化性メタン生成菌濃度（ｂ）と酢酸資化性メタン生成菌濃度（ｃ）の比率（ａ：ｂ：ｃ）をモニターし、当該比率が所定の範囲内に保持されるように運転条件を制御する油脂含有汚濁物質の嫌気性処理方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４００９０６９号公報
【特許文献２】特開２００３−２６０４９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１、２に記載されている嫌気性処理方法では、嫌気性処理槽内に高級脂肪酸が蓄積しないよう、高級脂肪酸濃度や各種微生物濃度を定期的にモニターし、モニター結果をフィードバックしている。このように、油脂含有廃水のメタン発酵を効率よく行うにあたっては、嫌気性処理槽内に高級脂肪酸が蓄積しないよう注意を払う必要があり、そのために、定期的に高級脂肪酸濃度や各種微生物濃度の定量を行い、嫌気性処理槽内の高級脂肪酸濃度が一定割合となるよう運転制御を行う必要があった。
【０００６】
したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、嫌気性処理槽の高級脂肪酸濃度について運転制御をしなくとも、嫌気性処理槽内における高級脂肪酸の蓄積が抑制され、メタン発酵が効率よくなされる廃水の嫌気性処理方法及びこの方法において用いられるメタン発酵促進用の微生物製剤を提供することにある。
【０００７】
また、本発明の他の目的は、嫌気性処理槽内で高級脂肪酸を分解させてメタン発酵を促進させる廃水の嫌気性処理方法及びこの方法において用いられる高級脂肪酸分解用の微生物製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者は、油脂含有廃水の嫌気性処理工程において、嫌気性処理槽内に高級脂肪酸を蓄積させずに効率よくメタン発酵を行う汚泥を長期間の馴養により見出し、その汚泥から高級脂肪酸を分解してメタン生成を促進させる微生物を特定することに成功した。そして、この微生物を用いることによって、油脂を高濃度に含む廃水からのメタン生成が加速されることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明の廃水の嫌気性処理方法は、油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水の嫌気性処理方法であって、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物を添加して嫌気性処理を行うものである。Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物を廃水に接種して嫌気性処理を行うことにより、高級脂肪酸が分解されて反応槽内の高級脂肪酸の蓄積が抑制されるため、メタン発酵が効率よく進行し、メタン生成が加速される。
【００１０】
また、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物は、Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属又はＡｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物であることも好ましい。Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物として、特に好適な微生物が選択される。
【００１１】
さらに、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ目に属する微生物を添加して嫌気性処理を行うことも好ましい。油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水のメタン発酵に適したメタン菌を合わせて接種することにより、メタン発酵が効率よく進行し、メタン生成が加速される。
【００１２】
また、廃水中に含まれる油脂を酵素で加水分解する前処理工程を有することも好ましい。油脂が酵素で加水分解されることにより、迅速に高級脂肪酸が生成するが、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物を添加することにより、高級脂肪酸が分解され、反応槽内の高級脂肪酸の蓄積が抑制されるため、メタン発酵が効率よく進行し、メタン生成が加速される。
【００１３】
さらに、本発明の微生物製剤は、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物を含有する嫌気条件下での高級脂肪酸分解又はメタン発酵促進用の微生物製剤である。本発明の微生物製剤を接種して嫌気処理することにより、反応槽内の高級脂肪酸が分解されて反応槽内の高級脂肪酸の蓄積が抑制されるため、メタン発酵が効率よく進行し、メタン生成を促進することができる。
【００１４】
また、本発明の微生物製剤のＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物は、Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属又はＡｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物であることも好ましい。Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物として、特に好適な微生物が選択される。
【００１５】
さらに、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ目に属する微生物を含有することも好ましい。油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水のメタン発酵に適したメタン菌を合わせて接種することにより、メタン発酵が効率よく進行し、メタン生成が加速される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、以下のような優れた効果を有する廃水の嫌気性処理方法及び微生物製剤を提供することができる。
（１）高級脂肪酸が分解されて嫌気性処理槽内の高級脂肪酸の蓄積が抑制されるため、油脂を高濃度に含有する廃水であってもメタン発酵が効率よく行われる。
（２）メタン生成が加速されるため、嫌気性処理槽中の滞留期間が短くなり、嫌気性処理槽の容量を小さくすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１で用いたメタン発酵装置を示す概略図である。
【図２】実施例１の油脂前処理液によるメタン発酵汚泥の馴養過程における、一日あたりのメタン発生速度の実測値「in total）、及び、油脂前処理液に由来するメタン発生速度の計算値「from oil」の変化を示すグラフである。
【図３】実施例１の油脂前処理液によるメタン発酵汚泥の馴養過程における、発酵液のｐＨの変化を示すグラフである。
【図４】実施例２において、油脂前処理液で馴養された汚泥を用いた試験区（Ｒｕｎ  Ａ）及びＧＡＬ溶液で馴養された汚泥を用いた対照区（Ｒｕｎ  Ｂ）の高級脂肪酸からの累積メタン発生量の経時変化を示すグラフである。
【図５】油脂前処理液によるメタン発酵の馴養過程で変化する微生物叢の解析結果を示す表である。
【図６】油脂前処理液によるメタン発酵の馴養過程における微生物叢の変化を示すグラフである。
【図７】油脂前処理液によるメタン発酵の馴養過程におけるＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓの存在度と実施例１で測定した油脂前処理液由来のメタン発生速度の相関を示すグラフである。
【図８】実施例４において、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目の細菌２種をそれぞれ添加した試験区（Ｒｕｎ  Ｃ及びＲｕｎ  Ｄ）の高級脂肪酸からの累積メタン発生量の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の廃水の嫌気性処理方法は、油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水に、高級脂肪酸を分解することができるＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物を添加して、嫌気性処理することにより行われる。メタン発酵槽の新規立ち上げ時や、油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水を処理する場合および高級脂肪酸が蓄積してメタン生成が停止してしまった場合等に、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物を用いることにより、メタン生成が開始するまでの時間を短縮することができ、メタン生成を促進させることができる。
【００１９】
本明細書において、嫌気性処理とは嫌気的条件下で行われる微生物による有機物の分解処理を意味し、メタンが生成する前の有機物の分解処理も当然に含まれる。また、油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水とは、油脂又は高級脂肪酸が含まれる産業廃水等の流入廃水のほか、嫌気性処理槽に流入する前に前処理が行われた結果、油脂又は高級脂肪酸が含まれるようになった廃水、および、嫌気性処理槽中で嫌気性処理が行われた結果、油脂又は高級脂肪酸が含まれるようになった廃水も含まれる。
【００２０】
Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物としては、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｃｅａｅ科に属するものが好適である。後述する実施例において、油脂前処理液で汚泥を馴養させて、嫌気条件下で高級脂肪酸を分解し、メタン発酵を促進する能力を有する汚泥を得たところ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物の存在度が上昇することが見出された。このＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓは絶対嫌気性菌で増殖速度が遅い微生物ということが知られている。Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物としては、具体的には、Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｍｉｎｉｐｈｉｌｕｓ属、Ａｍｉｎｉｖｉｂｒｉｏ属及びＡｍｉｎｏｍｏｎａｓ属等が挙げられ、単独又は複数種を組み合わせて添加することも可能である。
【００２１】
また、上述したＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物と併せて、メタン生成古細菌であるＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ目に属する微生物を添加することも好ましい。後述する実施例において、メタン発酵を促進する能力を有する汚泥を得たところ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目と併せてＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ目の微生物の存在度も高くなっていることがわかった。それゆえ、これらの微生物が高級脂肪酸存在下におけるメタン発酵の促進に寄与するものと考えられる。Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ目に属する微生物としては、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａｃｅａｅ科、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｃｅａｅ科、及びＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｅｒｅｄｅｎａｃｅａｅ科等が挙げられる。
【００２２】
さらに、その他の微生物として、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目に属する微生物、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ目に属する微生物を併せて添加することも好ましい。これらの微生物も、後述する実施例において得られたメタン発酵を促進する能力を有する汚泥中に高い存在割合で含まれており、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目やＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ目等の微生物と協働して、メタン発酵の促進に寄与することが考えられる。なお、このうち、ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓはＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門に含まれ、糸状成長する桿菌であり、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａは亜硝酸を酸化して硝酸を生成する性質を有する菌である。
【００２３】
これらの微生物の添加にあたっては、あらかじめ事前に培養し、増殖させた相当量の微生物を添加することが好ましい。添加形態としては、培養液そのものを添加するほか、乾燥体状としたもの、液体状、ゲル状、微生物担体に固定された形態、グラニュール状等が挙げられる。また、微生物の添加時に微生物の維持に適した栄養成分等を一緒に添加することも可能である。
【００２４】
上述した微生物は、嫌気性処理が行われる嫌気性処理槽に添加することが好ましいが、嫌気性処理槽の前に廃水が貯留される貯留槽などに添加することも可能である。上述した微生物を添加することにより、油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水からのメタン発酵に有用な微生物が嫌気性処理槽で培養され、油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水からの安定したメタン発酵を実現でき、メタン生成を促進することができる。また、高級脂肪酸が蓄積してメタン生成が停止してしまったようなトラブル時にも対応することができる。
【００２５】
また、油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水が嫌気性処理槽に流入する前の前処理工程として、廃水中に含まれる油脂が酵素で加水分解される工程が設けられていてもよい。排水中の油脂が前処理工程で高級脂肪酸とグリセロールに分解されることにより、嫌気性処理槽での油脂によるスカム生成が抑制され、嫌気性処理槽での有機物の分解反応も促進される。酵素による油脂の加水分解は、リパーゼ等の加水分解酵素と接触させること、又は加水分解酵素を生産する酵母等の微生物と接触させることにより行われる。加水分解酵素を生産する酵母としては、特に限定されないが、疎水基の脂肪酸と親水基の糖で構成される糖型界面活性剤を生産し、リパーゼの作用を促進するＰ．ｒｕｇｕｌｏｓａ等が好適である。加水分解酵素を用いる際には、油脂含有廃水を導入した前処理槽に酵素を添加すればよいが、酵母を用いる際には、好気性処理槽にて酵母を培養しておき、その中に油脂含有廃水を導入すればよい。
【００２６】
本発明の微生物製剤は、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物を含有している。油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水を処理する場合や高級脂肪酸が蓄積してメタン生成が停止してしまった場合、メタン発酵槽の新規立ち上げ時等に、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物を含有する微生物剤を用いることにより、嫌気条件下での高級脂肪酸分解又はメタン発酵が促進され、メタン生成が開始するまでの時間を短縮することができる。Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物としては、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｃｅａｅ科に属するものが好適である。Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物としては、具体的には、Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｍｉｎｉｐｈｉｌｕｓ属、Ａｍｉｎｉｖｉｂｒｉｏ属及びＡｍｉｎｏｍｏｎａｓ属等が挙げられ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物を複数種組み合わせて含有させることも可能である。
【００２７】
また、本発明の微生物製剤には、上述したＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目に属する微生物と併せて、メタン生成古細菌であるＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ目に属する微生物が含有されていることも好ましい。Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ目に属する微生物としては、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａｃｅａｅ科、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｃｅａｅ科、及びＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｅｒｅｄｅｎａｃｅａｅ科等が挙げられ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ目に属する微生物を複数種を組み合わせて含有させることも可能である。
【００２８】
さらに、その他の微生物として、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目に属する微生物、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ目に属する微生物を併せて含有されていることも好ましい。これらの微生物を配合させることにより、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目やＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ目等の微生物と協働して、メタン発酵の促進に寄与することが考えられる。
【００２９】
本発明の微生物製剤は、含有する微生物を混合して１剤としたものであっても、含有する微生物毎に分けて包装されたものであってもよい。剤形としては、液体状、粉体状としたもの、ペースト状、ゲル状、微生物担体に固定された形態、グラニュール状等が挙げられる。また、各微生物の維持に適した栄養成分や微量成分が含有されていてもよい。
【００３０】
上述した微生物製剤は、嫌気性処理が行われる嫌気性処理槽に添加することが好ましいが、嫌気性処理槽の前に廃水が貯留される貯留槽などに添加することも可能である。上述した微生物製剤を用いることにより、油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水からの高級脂肪酸の分解及びメタン発酵に有用な微生物が嫌気性処理槽に接種されて生育し、油脂又は高級脂肪酸を含有する廃水中に含まれる高級脂肪酸の分解及びメタン生成が促進される。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に特に限定されるものではない。
【００３２】
［実施例１］
１．汚泥の馴養
（１）油脂含有廃水の前処理（油脂前処理液の調整）
油脂含有廃水の前処理として、廃水中に含まれる油脂を高級脂肪酸とグリセロールとに加水分解させて、油脂前処理液を得た。本実施例では、油脂含有廃水として、以下表１に示す組成の混合液を用いた。
【００３３】
【表１】
2019081149.tif 000002
【００３４】
本実施例においては、油脂の加水分解酵素であるリパーゼを生産する酵母を、油脂含有廃水を模した混合液（表１）に接種し、培養することによって前処理を行った。酵母としては、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｒｕｇｕｌｏｓａ  ＮＢＲＣ  １０８７７株を用いた。Ｐ．ｒｕｇｕｌｏｓａは疎水基の脂肪酸と親水基の糖で構成される糖型界面活性剤（Mannosylerythritol lipids；ＭＥＬ）を生産するために、リパーゼの作用を促進する。混合液（表１）への酵母の接種にあたっては、ＹＭ液体培地を用いて２５℃、１５０ｓｐｍで２日間、前培養したものを用いた。また、前培養で用いたＹＭ液体培地成分の持ち込みの影響を避けるために、前培養液１ｍＬを２５℃、３５００ｇ、５分間の条件で遠心分離して上澄みを除き、表１に示す混合液から大豆油を除いたものを１ｍＬ加えて懸濁させることによって洗菌した。洗菌は３回繰り返し行い、その後、油脂含有廃水を模した混合液１０ｍＬに接種し、２５℃、１５０ｓｐｍで７日間培養し、油脂前処理液を得た。
【００３５】
（２）汚泥の準備
メタン発酵の立ち上げには、食品工場の廃水をメタン発酵処理しているプラントから入手したグラニュール汚泥を用いた。グラニュール汚泥は、本試験に使用する前に、グルコース、酢酸ナトリウム及び乳酸を主成分とし、他の栄養素として微量元素（無機塩）とビタミンを含む培養液（ＧＡＬ溶液）で馴養した。ＧＡＬ溶液、微量元素溶液及びビタミン溶液の組成をそれぞれ以下表２〜４に示す。
【００３６】
【表２】
2019081149.tif 000003
【００３７】
【表３】
2019081149.tif 000004
【００３８】
【表４】
2019081149.tif 000005
【００３９】
（３）油脂前処理液によるメタン発酵汚泥の馴養
本実施例で用いたメタン発酵装置の概略図を図１に示す。発酵槽（嫌気性処理槽）３は流入口４及びポンプ２ａ等を介して基質タンク１と連結しており、ＧＡＬ溶液又はＧＡＬ溶液と油脂前処理液との混合液からなる基質液Ｓが発酵槽３に流入するように構成されている。また、発酵槽３は、流出口１０及びポンプ２ｂ等を介して廃液タンク１１と連結しており、発酵槽３から引き抜かれた発酵液Ｒの上澄みの消化廃液Ｅが廃液タンク１１に貯留されるように構成されている。発酵槽３はウォータージャケット６に覆われており、循環装置１２がジャケット６内の水を循環することにより、発酵槽３内の温度を調整するように構成されている。発酵槽３内には、グラニュール汚泥Ｇを含むメタン発酵液Ｒが収容され、発酵液Ｒは攪拌機８で攪拌されながら発酵処理され、発酵処理により得られたバイオガスＭは消化ガス捕集バッグ９に回収されるように構成されている。発酵槽３内の状況は、ｐＨ及び温度センサー５で測定され、ｐＨ及び温度モニター７で確認することができる。
【００４０】
容積２．５Ｌの発酵槽３（ＭＢＦ−２５０Ｍ；東京理科器械株式会社）内に、ＧＡＬ溶液に馴養させたグラニュール汚泥Ｇを８００ｍＬ注ぎ込み、ＧＡＬ溶液を２００ｍＬ、蒸留水を１０００ｍＬ加えた。発酵槽３のふたを覆って密閉し、窒素ガスを２５０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通気して、発酵槽３内部の酸素をパージし嫌気状態とした。引き続いて、発酵槽３の外周に備えたウォータージャケット６で温度を３９℃に維持しながら、攪拌機８で発酵槽３内を攪拌速度１００ｒｐｍで攪拌してメタン発酵を開始した。発酵操作は発酵槽３内の発酵液Ｒを毎日１／１０量（２００ｍＬ）入れ換える半回分操作とし、ＨＲＴを１０日間とした。発酵槽３中の発酵液Ｒの入れ換えは１日に１度行い、具体的には次のようにして行った。発酵槽３内の攪拌機８を止めて２時間静置し、グラニュール汚泥Ｇを沈殿させた後、２００ｍＬの上澄み液を定量送液ポンプ２ｂ（ＭＰ−３Ｎ；東京理科器械株式会社）で抜き取った。次に基質タンク１から２００ｍＬの基質液Ｓを定量送液ポンプ２ａ（ＭＰ−３Ｎ；東京理科器械株式会社）で発酵槽３に供給し、発酵槽３中の攪拌を再開させた。また、発酵槽３が攪拌されている状態で、ポンプ２ｂでグラニュール汚泥Ｇを含む発酵液Ｒを１ｍＬ抜き取り、その汚泥Ｇを含む発酵液Ｒから固形分を遠心分離（１７７００ｇ、５ｍｉｎ、２５℃）して、実施例３にて詳述する微生物叢解析に用いた。発酵開始から２０日目までは発酵槽３内に供給する基質液ＳをＧＡＬ溶液単独としたが、発酵開始から２１日目に発酵槽３内に供給する基質液Ｓを油脂前処理液とＧＡＬ溶液との混合液に変更し、さらに発酵開始から９７日目に油脂前処理液の割合を上昇させた。具体的には、基質液Ｓの全炭素量に占める油脂前処理液に由来する炭素の割合を、発酵開始から２０日目は０％、２１日目〜９６日目は２５％、９７日目〜３７０日目は５０％とした。なお、基質液Ｓの全炭素量は、発酵期間全般に亘って１．８７ｇ−ＴＯＣ／Ｌ／ｄと一定になるように設定している。表５に発酵槽３に供給した基質液Ｓの炭素含有成分の組成を示す。
【００４１】
【表５】
2019081149.tif 000006
【００４２】
発酵槽３から発生したバイオガスは１０Ｌのポリエチレンテレフタレート製の消化ガス捕集バッグ９（Ｆｌｅｋ−Ｓａｍｐｌｅｒ；近江オドエアーサービス株式会社）に捕集し、２４時間毎にバッグを取り替えた。捕集したバイオガスＭ中のＣＨ４およびＣＯ２濃度はＧＣ−ＴＣＤ（ＧＣ３２３；ＧＬサイエンス株式会社）を用いて測定した。測定にはパックドカラム  ＳＵＳ  ２ｍ  ｐｏｒａｐａｋ  Ｑ  ６０／８０（Agilent Technologies）を用い、キャリアーガスにはヘリウムを用いた。測定条件は、カラム槽温度５０℃、気化室温度８０℃、検出器温度８０℃とし、検出器の電流は６０ｍＡに設定した。消化ガス捕集バッグ９中のバイオガス体積はポンプ（ＤＡＰ−６Ｄ；アルバック機工株式会社）を接続したガスメーター（ＤＣ−１；株式会社シナガワ）を用いて計測した。メタン発生速度の実測値は、一日あたりのバイオガス発生量とバイオガス中のメタン濃度の積として求めた。また、油脂前処理液に由来するメタン発生速度は、発酵開始日（０日）から２０日目におけるメタン発生速度の平均値（０．８０６Ｌ／ｄ）が、ＧＡＬ溶液１００％のときのメタン発生速度と考えて、油脂前処理液とＧＡＬ溶液とを混合したときには、ＧＡＬ溶液の混合割合に比例するメタン発生速度の値がＧＡＬ溶液に由来するメタン発生速度とみなし、それを実測値から差し引くことによって計算した。図２に一日あたりのメタン発生速度の実測値（図中の「in total」）、および油脂前処理液に由来するメタン発生速度の計算値（図中の「from oil」）を示す。図２において、縦軸はメタン発生速度（Ｌ／ｄ）を示し、横軸は発酵開始（馴養開始）からの日数を示している。図２に示すように、メタン発生速度の実測値、油脂前処理液に由来するメタン発生速度の計算値は、発酵時間の経過と共に次第に上昇した。
【００４３】
発酵期間中に発酵槽３から抜き取った発酵液Ｒの上澄み液について、ガラス電極を備えたｐＨメータ（Ｄ−５１；株式会社堀場製作所）を用いてｐＨを測定した。図３にメタン発酵過程におけるｐＨの経時変化を示す。図３において、縦軸はｐＨを示し、横軸は発酵開始（馴養開始）からの日数を示している。ｐＨは、発酵開始当初や弱アルカリ性寄りの７．５〜８を示したが、発酵時間の経過と共に次第に低下し、７〜７．５と安定して中性を示した。
【００４４】
［実施例２］
２．油脂前処理液で馴養された汚泥を用いた高級脂肪酸のメタン発酵
実施例１で得られた、油脂前処理液で馴養された汚泥が高級脂肪酸のメタン発酵を促進する能力を有するか確認するため、油脂前処理液で馴養された汚泥と、馴養する前の汚泥の高級脂肪酸からのメタン生成を比較した。具体的には、試験は以下のようにして行った。油脂前処理液で馴養された汚泥による試験区（Ｒｕｎ  Ａ）として、実施例１（３）の試験で得られた発酵開始から３７０日経過後のグラニュール汚泥を用い、対照区（Ｒｕｎ  Ｂ）として、実施例１（２）の試験で用いたＧＡＬ溶液でのみ馴養されたグラニュール汚泥を用いた。各グラニュール汚泥６０ｍＬを１２０ｍＬ容量のバイアルビン（アズワン株式会社）に注ぎ込み、窒素ガスを２５０ｍＬ／ｍｉｎで５分間曝気して、ブチルゴム栓でふたをし、アルミキャップ（株式会社マルエム）で密閉して嫌気状態とした。その後、バイアルビンを３９℃に温度調整した恒温振盪水槽（Ｔ−２２ＬＡＳ；Thomas Kagaku Corp.）内に浸漬した。バイアルビンに、高級脂肪酸塩を含むＬＣＦＡ溶液（以下表６に組成を示す）を高級脂肪酸濃度が８００ｍｇ／Ｌとなるように添加して、３９℃、１１０ｓｐｍの条件で、メタン発酵をおこなった。試験区（Ｒｕｎ  Ａ）、対照区（Ｒｕｎ  Ｂ）とも再現性を確認するために試行数は２とした。メタン発酵の期間はＲｕｎ  Ａでは７日間、Ｒｕｎ  Ｂでは１２日間とした。
【００４５】
【表６】
2019081149.tif 000007
【００４６】
バイアルビン中に発生したバイオガスは、その体積が５０ｍＬ以上と予想されたときには、０．２５Ｌのポリエチレンテレフタレート製のプラスチックバッグに捕集し、実施例１と同様の方法でバイオガス体積を計測した。一方、バイアルビン中に発生したバイオガスの体積が５０ｍＬ以下と予想されたときには、注射器をバイアルビン上部のブチルゴム栓に刺すと、注射筒のピストンが押し出されて発生したバイオガス容積を知ることができる。注射筒（アズワン株式会社）を用いてバイオガスを採取し、その容積を計測した。採取されたバイオガス中に含まれるＣＨ４およびＣＯ２濃度は実施例１と同様の条件でＧＣ−ＴＣＤにより測定した。これらの結果を図４に示す。図４において、縦軸は累積メタン発生量（ｍＬ）を示し、横軸はメタン発酵の日数を示している。
【００４７】
図４は、油脂前処理液で馴養したグラニュール汚泥を用いて高級脂肪酸のメタン発酵をおこなった試験区（Ｒｕｎ  Ａ−１、Ｒｕｎ  Ａ−２）と、ＧＡＬ溶液で馴養したグラニュール汚泥を用いた対照区（Ｒｕｎ  Ｂ−１、Ｒｕｎ  Ｂ−２）の累積メタン発生量を示している。いずれの試験も２回行ったが、どちらも高い再現性が見られた。累積メタン発生量の曲線は、Ｒｕｎ  Ａの方がＲｕｎ  Ｂに比べて立ち上がりが速く、累積メタン発生量が５０ｍＬを達成するのに要する時間は、油脂前処理液で馴養したグラニュール汚泥を用いることにより、４〜５日程度も速くなっていることが明らかとなった。これらの結果は、実施例１で得られた油脂前処理液で馴養された汚泥が高級脂肪酸のメタン発酵を促進する能力を有することを示しており、この油脂前処理液で馴養したグラニュール汚泥を用いることで、油脂含有廃水のメタン発酵を加速できることを示している。
【００４８】
［実施例３］
３．微生物叢の解析
実施例１の油脂前処理液によるメタン発酵の馴養過程における微生物叢の変化を、次世代シーケンシング（Next Generation Sequencing，ＮＧＳ）の方法により解析した。実施例１（３）の試験において、発酵槽内を撹拌して懸濁状態を維持した状態で採取した各発酵液サンプル１ｍＬを２５℃、１７７００ｇ、５分間の条件で遠心分離し、微生物を含む沈殿を得た。得られた沈殿の５０ｍｇから、ＤＮＡ抽出キット（ISOIL for Beads Beating；株式会社ニッポンジーン）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡについて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の一部（Ｖ３、Ｖ４領域を含む遺伝子領域）をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲには、ホットスタートＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa EX Taq（登録商標） Hot Start Version；タカラバイオ株式会社）を用い、ＰＣＲ装置（TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（登録商標） Standard、ＴＰ６００；タカラバイオ株式会社）にて行った。ＰＣＲ試薬の組成、プライマーの配列と増幅条件をそれぞれ表７および表８に示す。なお、表８の各プライマー配列のうちの下線部は各サンプルを識別するインデックス付与のための配列であり、下線部以外の配列が原核生物１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ３、Ｖ４領域を含む遺伝子領域に対応している。各ＰＣＲ産物について、Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）アガロースゲル（寒天濃度２％）電気泳動を行い、目的配列である原核生物１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ３、Ｖ４領域を含む遺伝子領域が増幅されたことを確認した。
【００４９】
【表７】
2019081149.tif 000008
【００５０】
【表８】
2019081149.tif 000009
【００５１】
各ＰＣＲ産物は、ＤＮＡ精製キット（Wizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up System；プロメガ株式会社）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物に対し、Nextera XT Index kit（イルミナ株式会社）及びＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa EX Taq（登録商標） Hot Start Version；タカラバイオ株式会社）を用いて多サンプル解析のためのインデックスを付与した。その後、インデックスを付与したＤＮＡ断片を精製し、１５サンプル分のＤＮＡ断片を１本のチューブに混合し、次世代シーケンサー（Illumina Miseq；イルミナ株式会社）を用いてシーケンス解析を行った。まず、Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ法によって３００塩基の塩基配列データを取得し、次世代シークエンサーデータ解析ツールであるＭａｃ  ＱＩＩＭＥ（ver 1.9.1）を用いて取得したデータを解析した。Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ法で得られた約３００塩基の配列をＦＡＳＴＱ−Ｊｏｉｎツール（Erik Aronesty, 2011. ea-utils）を用いて結合させ、約４６５塩基の配列にした。約４６５塩基の配列はＵＣＬＵＳＴ法によって９７％の閾値で類似度が高い配列データを一つのＯＴＵに分類した。代表配列は１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列のデータベース（Greengene database）に対して相同性検索を行うことで系統分類を推定した。
【００５２】
実施例１の油脂前処理液によるメタン発酵の馴養過程で変化する微生物叢をＮＧＳで解析した結果を図５及び図６に示す。ここでは分類群としてｏｒｄｅｒ（目）レベルを用いた。図６において、縦軸は各分類群の存在度（％）を示し、横軸は実施例１の発酵開始（馴養開始）からの日数を示している。分類群のうち、馴養過程で特徴的な変化を示し、馴養された汚泥で相対的な存在度が高いものとして、真正細菌のＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ及びＮｉｔｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、古細菌（メタン菌）のＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓが見出された。このうち、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ及びＮｉｔｒｏｓｐｉｒａｌｅｓは、ＧＡＬ溶液で馴養したグラニュール汚泥でも存在度が高いことから、油脂前処理液で馴養したときに存在度が上昇するＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓとＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓによって、あるいはこれらとＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｌｅｓが協働することによって、高級脂肪酸を含む油脂前処理液のメタン発酵が促進されたものと考えられた。
【００５３】
ここで、メタン発酵において活発なメタンガス発生が観察されているときには、メタン発生速度と古細菌（メタン菌）の濃度に強い相関があるが、これは、古細菌が多段階にわたるメタン発酵の最終段階の担い手、すなわち直接的なメタンの生産者であるためである。しかしながら、古細菌ではない特定の細菌の濃度がメタン生成速度と相関のある場合がある。これはその細菌が作用する反応過程が、メタン発酵の反応全体を律速しているからと説明することができる。本実施例３で解析されたメタン発酵の馴養過程におけるＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓの存在度と実施例１で測定した油脂前処理液由来のメタン発生速度の相関を図７に示す。図７の縦軸はメタン発生速度（Ｌ／ｄ）を示し、横軸はＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓの存在度（％）を示している。両者には正の相関がみられた（Ｒ＝０．７５７）。この結果より、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓは油脂前処理液の分解、すなわち、高級脂肪酸の分解に大きく貢献しているものと推測された。
【００５４】
［実施例４］
４．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目細菌の接種によるメタン発酵の促進
国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンターからＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｃｅａｅ科の細菌として、Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ  ＪＣＭ１２２２１株及びＡｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｕｎｎａｒｉｕｍ  ＪＣＭ１９３２０株の分譲を受けた。これら２種のＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｃｅａｅ科細菌による高級脂肪酸のメタン発酵促進効果について、実施例２と同様の方法で試験を行った。具体的には、試験は以下のようにして行った。Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ  ＪＣＭ１２２２１株及びＡｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｕｎｎａｒｉｕｍ  ＪＣＭ１９３２０株は、あらかじめ、ＪＣＭ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅに記載されているＰＹＸ  ＭＥＤＩＵＭ及びＩＲＤ  ＡＭＩＮＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ  ＭＥＤＩＵＭをそれぞれ用いて純粋培養した。培養温度は３７℃、培養期間は７日間とした。試験汚泥には、実施例１（２）の試験で用いたＧＡＬ溶液で馴養されたグラニュール汚泥を用いた。各グラニュール汚泥５５ｍＬを１２０ｍＬ容量のバイアルビン（アズワン株式会社）に注ぎ込み、窒素ガスを２５０ｍＬ／ｍｉｎで５分間曝気して、ブチルゴム栓でふたをし、アルミキャップ（株式会社マルエム）で密閉して嫌気状態とした。その後、バイアルビンを３９℃に温度調整した恒温振盪水槽（Ｔ−２２ＬＡＳ；Thomas Kagaku Corp.）内に浸漬した。バイアルビンに、１０８＞ＣＦＵ／ｍＬ程度になるまで純粋培養しておいたＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｃｅａｅ科細菌の培養液５ｍＬを添加し、高級脂肪酸塩を含むＬＣＦＡ溶液（表６参照）を高級脂肪酸濃度が８００ｍｇ／Ｌとなるように添加して、３９℃、１１０ｓｐｍの条件で、１０日間メタン発酵をおこなった。Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ  ＪＣＭ１２２２１株を接種した試験区をＲｕｎ  Ｃ、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｕｎｎａｒｉｕｍ  ＪＣＭ１９３２０株を接種した試験区をＲｕｎ  Ｄとした結果を図８に示す。図８において、縦軸は累積メタン発生量（ｍＬ）を示し、横軸はメタン発酵の日数を示している。なお、参考のために、実施例２における対照区（Ｒｕｎ  Ｂ）の結果を併せて示す。
【００５５】
この結果によれば、Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ  ＪＣＭ１２２２１株、およびＡｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｕｎｎａｒｉｕｍ  ＪＣＭ１９３２０株を汚泥に接種することにより、いずれも高級脂肪酸溶液からのメタン発生が促進されることがわかった。よって、これらのＳｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ目細菌には高級脂肪酸分解及びメタン発酵促進効果があることが明らかとなった。
【００５６】
本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含まれるものである。
【符号の説明】
【００５７】
１  基質タンク
２ａ，２ｂ  ポンプ
３  発酵槽（嫌気性処理槽）
４  流入口
５  ｐＨ及び温度センサー
６  ウォータージャケット
７  ｐＨ及び温度モニター
８  攪拌機
９  消化ガス捕集バッグ
１０  流出口
１１  廃液タンク
１２  循環装置
Ｓ  基質液（ＧＡＬ溶液、又は、ＧＡＬ溶液と油脂前処理液との混合液）
Ｇ  グラニュール汚泥
Ｒ  メタン発酵液
Ｍ  消化ガス
Ｅ  消化廃液
【図１】
2019081149.tif 000010
【図２】
2019081149.tif 000011
【図３】
2019081149.tif 000012
【図４】
2019081149.tif 000013
【図５】
2019081149.tif 000014
【図６】
2019081149.tif 000015
【図７】
2019081149.tif 000016
【図８】
2019081149.tif 000017
【配列表】
2019081149000001.app