(57)【要約】      （修正有）【課題】口腔内で使用される新規の再吸収可能な架橋された形状安定膜、前記膜を製造する方法及び前記膜のインプラントとしての使用方法の提供。【解決手段】口腔で使用するための再吸収可能な架橋された形状安定膜であって、１重量部のコラーゲン材料に対して１．５〜３．５重量部の無機セラミックを含むコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を含み、前記複合層は予備延伸した弾性コラーゲン材料（その応力・ひずみ曲線の線形／弾性領域になるように延伸したコラーゲン材料）の二つの層で挟まれ、前記コラーゲン材料は５０〜１００％（w/w）のコラーゲン及び０〜５０％（w/w）のエラスチンを含む、再吸収可能な架橋された形状安定膜。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔で使用するための再吸収可能な架橋された形状安定膜であって、１重量部のコラーゲン材料に対して１．５〜３．５重量部の無機セラミックを含むコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を含み、前記複合層は予備延伸した弾性コラーゲン材料（その応力・ひずみ曲線の線形／弾性領域になるように延伸したコラーゲン材料）の二つの層で挟まれ、前記コラーゲン材料は５０〜１００％（w/w）のコラーゲン及び０〜５０％（w/w）のエラスチンを含む、再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項２】
コラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層が１重量部のコラーゲン材料に対して２．０〜３．０重量部の無機セラミックを含む、請求項１記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項３】
コラーゲン材料が７０〜９０％（w/w）のコラーゲン及び１０〜３０％（w/w）のエラスチンを含む、請求項１又は２記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項４】
コラーゲン材料が、哺乳類の腹膜又は心膜、胎盤膜、小腸粘膜下層組織（ＳＩＳ）、真皮、硬膜、靭帯、腱、隔膜（例えば横隔膜）、網、及び筋肉又は臓器の筋膜からなる群から選択される天然起源の組織に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項５】
コラーゲン材料が、豚、牛、又は馬の、腹膜又は心膜、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）又は筋肉の筋膜に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項６】
予備延伸した弾性コラーゲン材料が、２〜１５０ＭＰａの弾性率を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項７】
予備延伸した弾性コラーゲン材料が、５〜５００μｍの孔を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項８】
無機物粒子が、１５０〜５００μｍの大きさを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項９】
無機セラミックが、ヒドロキシアパタイトである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項１０】
無機セラミックが、ヒドロキシアパタイトの骨無機物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項１１】
化学的に架橋された、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項１２】
脱水加熱処理（ＤＨＴ）により架橋された、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜を製造する方法であって、
（ａ）無機セラミック粒子及びコラーゲン材料の複合層を製造し、場合によりその複合層を架橋する工程、
（ｂ）コラーゲン材料の延伸を応力・ひずみ曲線の線形領域に導く張力がけに付したコラーゲン材料の二つの層の間に、前記コラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を組み立て、及び接着し、それにより予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層の間に挟まれたコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を提供する工程、並びに
（ｃ）予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層の間に挟まれたコラーゲン材料及び無機セラミック粒子のその複合層を架橋し、その後親水性化処理を行う工程
を含む、方法。
【請求項１４】
親水化処理が、予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層の間に挟まれたコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の架橋された複合層を塩化ナトリウム溶液に浸すことを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ヒト又は動物の、何も含まない歯骨欠損部位における、骨形成、骨再生、骨修復、及び／又は骨置換を支援するためのインプラントとして使用する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔内で使用される新規の再吸収可能な架橋された形状安定膜（ｒｅｓｏｂａｂｌｅ ｃｌｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｆｏｒｍ ｓｔａｂｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、その膜を製造する方法、並びにヒト又は動物の、何も含まない（囲まれていない）歯骨欠損部位（non-containing dental bony defect site）における、骨形成、骨再生、骨修復、及び／又は骨置換を支援するためのインプラントとしてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
何も含まない（囲まれていない）骨欠損（non-containing bony defect）を骨形成によって再生するためには、例えば上顎又は下顎中の水平又は垂直方向の増強の際に、その欠損の機械的な安定化が求められる。（Ｂｅｎｄｋｏｗｓｋｉ ２００５「成長のための空間（Ｓｐａｃｅ ｔｏ Ｇｒｏｗ）」Ｔｈｅ Ｄｅｎｔｉｓｔ：３；Ｍｅｒｌｉ，Ｍｉｇａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｉｍｐｌａｎｔｓ２２（３）：３７３−８２；Ｂｕｒｇｅｒ ２０１０ Ｊ．Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．６８（７）：１６５６−６１；Ｌｏｕｉｓ ２０１０ Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．２２（３）：３５３−６８）。実際に、口腔組織は咀嚼、嚥下、舌の動き、発話、歯の動き、及び矯正治療の間に、複雑な機械的な力に曝される。特に外科手術後の創傷治癒の間に、再生デバイス及び新規に形成された組織の上に圧力、せん断力、曲げモーメントを引き起こす、内部及び外部の力が発生しうる。
【０００３】
それらの力に耐える形状安定膜はその機械的安定性をもたらすための有効な手段である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この目的のために、チタンメッシュ（Ｔｉ‐Ｍｅｓｈｅｓ）、チタンプレート（Ｔｉ‐ｐｌａｔｅｓ）、又はチタン強化ＰＴＦＥ（Ｔｉ‐Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ ＰＴＦＥ）形状安定膜を使用することは公知であるが、それらは骨再生後に第２の手術の間に除去される必要がある。市販のチタン強化ＰＴＦＥ形状安定膜の例としてＣｙｔｏｐｌａｓｔ（登録商標）膜がＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃｓより販売されている。しかしながら、拡張されたチタン強化膜を使用した時に、離開（開裂）又は他の困難な事態の発生が高くなることが報告されている（Ｓｔｒｉｅｔｚｅｌ ２００１ Ｍｕｎｄ Ｋｉｅｆｅｒ Ｇｅｓｉｃｈｔｓｃｈｉｒ．５（１）：２８−３２；Ｍｅｒｌｉ，Ｍｉｇａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００７ ｓｕｐｒａ；Ｒｏｃｃｈｉｅｔｔａ，Ｆｏｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．３５（８ Ｓｕｐｐｌ）：２０３−１５）。
【０００５】
非強化ＰＴＦＥ膜は、１９９６年の再吸収可能なコラーゲン膜の採用に先立って広く使用されたが、コラーゲン膜の採用後は急速に消滅した。
【０００６】
第２の手術での形状安定膜又はメッシュの除去の必要性を避けるために、再吸収可能な形状安定膜が興味を引いている。実質的にＰＬＡ（ポリ乳酸）又はＰＬＧＡ（乳酸、グリコール酸コーポリマー）から作られた、いくつかの再吸収可能な形状安定膜又はメッシュが記載されている。例としてはとりわけ、（１）ＫＬＳ Ｍａｒｔｉｎ社からの“Ｓｏｎｉｃ  Ｗｅｌｄ ＲＸ（登録商標）”及び“Ｒｅｓｏｒｂ‐Ｘ（登録商標）”、（２）Ｓｕｎｓｔａｒ Ａｍｅｒｉｃａｓ社からの“Ｇｕｉｄｏｒ（登録商標）”、（３）Ｃｕｒａｓａｎ社からの“Ｉｎｉｏｎ ＧＴＲ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）”、（４）Ｄｅｐｕｙ Ｓｙｎｔｈｅｓ社からの“ＲａｐｉｄＳｏｒｂ（登録商標）”、がある。それらの膜の不都合な点は、それらのインビボでの加水分解の間に、それらが組織の刺激及び阻害された創傷治癒の組織学的兆候の原因となる乳酸、及び／又はグリコール酸を放出することである（Ｃｏｏｎｔｓ，Ｗｈｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４２（２）：３０３−１１；Ｈｅｉｎｚｅ ２００４ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ｂｒｉｅｆｉｎｇ：Ｌｏｂａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ：４；Ｐｉｌｌｉｎｇ，Ｍａｉ ｅｔ ａｌ．２００７ ＢｒＪ．Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．４５（６）：４４７−５０）。
【０００７】
ＰＬＧＡ／ＰＬＡの創傷治癒に関連した問題を克服するために、患者からの自家骨ブロック及び部分的又は完全に精製した骨ブロック、たとえば、Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｏｓｓ（登録商標）Ｂｌｏｃｋ（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｐｈａｒｍａ Ａ．Ｇ．）又はＰｕｒｏｓ（登録商標）Ａｌｌｏｇｒａｆｔ Ｂｌｏｃｋ（ＲＴＩ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）、などの使用が広く容認されている。自家骨ブロックはそれらの別の部位からの採取が、さらなる痛みを引き起こすという欠点を有している（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｇｒｕｓｏｖｉｎ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｅｕｒ．Ｊ Ｏｒａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ．２（３）：１６７−８４）。
【０００８】
手術中に採取した自家骨片の使用を可能にするために、通常異種骨移植片との組み合わせで、下顎からの自家皮質骨を利用する、いわゆる骨保護（ｂｏｎｅ ｓｈｉｅｌｄ）技術が開発された（Ｋｈｏｕｒｙ，Ｈａｄｉ  ｅｔ ａｌ．２００７「口腔インプラント学における骨増強（Ｂｏｎｅ Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｏｒａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｏｌｏｇｙ）」，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｑｕｉｎｔｅｓｓｅｎｃｅ）。この方法の欠点は、それが極めて炎症を起こしやすい技法であり、かつ他の部位の合併症及びさらなる痛みと関連していることである。さらに骨保護は横方向のみに適用され、そのために欠損の歯冠面からの機械的な保護は得られないことである。用語「骨保護」はＰＬＡ／ＰＬＧＡ膜並びに部分的に脱灰された皮質骨保護（Ｓｅｍｉ‐Ｓｏｆｔ ａｎｄ Ｓｏｆｔ Ｌａｍｉｎａ Ｏｓｔｅｏｂｉｏｌ（登録商標）Ｔｅｃｎｏｓｓ社製）の宣伝のために使用された。この脱灰された骨保護の欠点は、この湾曲した骨保護を常に固定しなければならないこと、それらが例えばＴｉ強化ＰＴＦＥ膜と比較して相対的に厚いこと、及びそれらが骨欠損の歯冠面上に曲がった端を伴い唯一円形状で付随することである。歯科医にとって歯槽堤（ｒｉｄｇｅ）の歯冠面には６〜８mm幅の平坦域（ｐｌａｔｅａｕ）がよりいっそう好ましい（Ｗａｎｇ ａｎｄ  ＡＬ−Ｓｈａｍｍａｒｉ２００２  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｓ Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｄｅｎｔ．２２（４）：３３５−４３）。
【０００９】
無事な治癒及び形状安定性を兼ね備える試みとして、米国特許公報第８３５３９６７−Ｂ２号に開示されている再吸収可能な形状安定膜があるが、その膜は５〜２５％エタノール／水中のコラーゲン懸濁液を型に入れ、凍結乾燥し、１００から１４０℃に加熱することで製造される。そのような膜が米国Ｏｓｓｅｏｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により製造され、そして商標名“Ｚｉｍｍｅｒ ＣｕｒＶ Ｐｒｅｓｈａｐｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ”のもとにＺｉｍｍｅｒ社より市販されている。その業務用膜は弱い形状安定性、及び食塩水中のインキュベートの後におおよそ約２．３mmに膨張する約１．５mmの厚みを有しているが、これは高い離開率の危険性につながる可能性がある。
【００１０】
要約すれば、現在の解決法は、上に述べたように、歯科医又は患者にとって十分に満足するものではない。あるいは第２の手術が必要になり、及び／又は、多事な創傷治癒の高い危険性がある。多事な創傷治癒の高い危険性に関与しない解決法は、第２の手術を要求する又は他の不都合を有する形状安定膜ではない。
【００１１】
米国特許出願公開第２０１３／０１９７６６２号は、ａ）コラーゲンを含む適量のゲルを非多孔質でコラーゲンをベースとした材料の接合表面に適合し、多孔質のコラーゲンベースの材料を、接合表面に適用したゲルと接触させて、材料間の境界面でその多孔質の材料の一部分を部分的に水和すること、ｂ）それらの材料を一緒に接合するためにゲルを乾燥すること、及びｃ）接合層中のコラーゲンを架橋すること、を含む生体材料の製造方法を開示している。製造し得られた生体材料は多孔質のコラーゲンをベースとした材料（それは無機質化されてもよいが[００４２]、[００４８]）と、機械的強度のある非多孔質のコラーゲンをベースとする材料を結びつけるが、この結果として耐力組織（とりわけ半月板、関節軟骨、腱、および靭帯）の再生のための骨組を提供し、それは多孔性及び機械強度を共に有する、すなわち圧縮及び引張りの力に耐えうる。その結合された生体材料の曲げモーメントに対する耐性、又は無機質化した多孔質のコラーゲンをベースとした材料の組成については何も開示していない。
【００１２】
米国特許出願公開第２０１４／０１９３４７７号は可溶性コラーゲンから得られたコラーゲンマットの製造において、架橋する前にそのコラーゲンを引き伸ばすと機械的強度、とりわけ、最大抗張力（ＵＴＳ）、剛性及び弾性率（ヤング率）が増加することを教示している（特に[０１０９]、[０１１０]を参照のこと）。
【００１３】
Ｌａｎｇｄｏｎ,Ｓｈａｒｉ Ｅ ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １９９８，２０（２），１３７−１５３ ＣＯＤＥＮ、及びＣｈａＣｈｒａ，Ｄｅｂｂｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １９９６，１７（１９），１８６５−１８７５ ＣＯＤＥＮは、心膜由来の膜を架橋前に引き伸ばすと引っ張り強度及び剛性が増加することを開示している。
【００１４】
本発明の目的は、圧力、剪断力、及び曲げモーメントに対して適切に耐え、例えば、何も含まない（囲まれていない）骨欠損部位（non-containing bony defect site）における、骨形成、骨再生、骨修復、及び／又は骨置換などを適切に支援する、特に上顎又は下顎の水平又は垂直方向の増強の際、口腔内で使用される再吸収可能な形状安定膜を提供することであるが、この膜は上記の欠点を有しない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本目的は特許請求の範囲において定義される本発明により達成される。
【００１６】
本発明は予備延伸した弾性コラーゲン材料（ｅｌａｓｔｉｃ ｐｒｅｔｅｎｓｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍａｔｅｒｉａｌ）の２つの層の間に挟まれた１重量部のコラーゲン材料に対して１．５〜３．５重量部の無機セラミックを含むコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を含む、口腔に用いられる再吸収可能な架橋された形状安定膜を提供するが、ここで、このコラーゲン材料は５０〜１００％（w/w）のコラーゲン及び０〜５０％（w/w）のエラスチンを含む。
【００１７】
用語「コラーゲン材料」はここで５０〜１００％（w/w）のコラーゲンと０〜５０％（w/w）のエラスチンを含むコラーゲンをベースとする材料を意味する。エラスチン含量は、ここで加水分解及びＲＰ−ＨＰＬＣを伴う公知の方法を改良した方法にしたがったデスモシン／イソデスモシンの定量により測定される。（例えばＧｕｉｄａ  Ｅ．ｅｔ ａｌ．１９９０ 「組織中のデスモシンの定量のための高性能クロマトグラフィー法の開発と検証（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｓｍｏｓｉｎｅｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ）」ｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、又はＲｏｄｒｉｇｕｑｅ Ｐ ２００８ 「出産前発達中のマウス肺のエラスチン定量化（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ Ｌｕｎｇ Ｅｌａｓｔｉｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｍｅｎｔ）」ｉｎ Ｔｈｅ Ｏｐｅｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｊｏｕｒｎａｌを参照のこと）。乾燥エラスチンのデスモシン／イソデスモシンの含量を測定するために、コラーゲン材料のエラスチンは１９７６年にＳｔａｒｃｈｅｒ及びＧａｌｉｏｎｅにより記述されたエラスチン単離工程に供される（「異なる動物種からのエラスチンの精製と比較（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｅｌａｓｔｉｎ ｆｒｏｍ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ａｎｉｍａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ）」ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）。
【００１８】
このコラーゲン材料はそのようなコラーゲンとエラスチンの比率を含む天然起源の組織から適切に抽出される。そのような組織の例としては脊椎動物の、特に哺乳類（例えば豚、牛、馬、羊、ヤギ、ウサギ）の腹膜又は心膜、胎盤の膜組織、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、真皮、硬膜、靭帯、腱、隔膜（横隔膜）、網、筋肉又は臓器の筋膜を含む。上記組織で好ましくは豚、牛、馬のものである。興味深い組織は豚、牛、馬の腹膜の膜組織である。
【００１９】
通常このコラーゲンは主にコラーゲンＩ型、コラーゲンIII型、又はそれらの混合物である。そのコラーゲンはまた、とりわけコラーゲンII型、IV型、VI型、若しくはVIII型、又はそれらのいかなる組み合わせ、又はいかなるコラーゲンの型を一定割合含んでいてもよい。
【００２０】
好ましくは、このコラーゲン材料は７０〜９０％（w/w）のコラーゲン及び３０〜１０％（w/w）のエラスチンを含む。
【００２１】
そのようなコラーゲン材料を製造するための適切な出発材料の例は、欧州特許第Ｂ１-１６７６５９２号の実施例に記載されたものと同様の方法で製造された豚、牛、又は馬の腹膜若しくは心膜からのコラーゲン膜、又は同様の方法で豚の腹膜から製造された膜Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｇｉｄｅ（登録商標）（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｐｈａｒｍａ Ａ．Ｇ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄより入手可能）である。
【００２２】
好ましくは、コラーゲン材料は豚、牛、又は馬の、腹膜又は心膜、小腸粘膜組織（ＳＩＳ）、または、筋肉筋膜由来のものである。
【００２３】
このコラーゲン材料は通常及び好ましくは、天然の線維構造を伴うか、又は断裁されたコラーゲン線維としての線維状のコラーゲン材料である。
【００２４】
しかしながら、十分な生体適合性及び再吸収可能性を有する分子コラーゲン又は架橋されたコラーゲン断片から再構成された原線維のような非線維状のコラーゲン材料はまた、コラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層に使用されてもよく、又は予備延伸した弾性コラーゲン材料の層に使用されてよいが、ただしそのコラーゲン材料は弾性率並びに最大引っ張り強度について十分な機械的安定性を有するコラーゲン材料である（以下を参照のこと）。
【００２５】
用語「再吸収可能な」はここで、架橋された形状安定膜が、特にコラゲナーゼ及びエラスターゼの働きを通してインビボで吸収されることが可能であることを意味する。架橋された形状安定膜の制御されたインビボでの再吸収可能性は過度な炎症又は離開の無い治癒に不可欠である。以下に詳細を記述したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼを用いた酵素分解試験はインビボでの再吸収可能性の良い予測を与える。
【００２６】
本発明の再吸収可能な架橋された形状安定膜のすべての試験されたプロトタイプは、試験４時間後に、（コラーゲンＩ型を標準として用いたＤＣタンパク質分析により評価した時に）少なくとも１０％のコラーゲンの分解を示したが、このコラーゲン分解速度は（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｇｉｄｅ（登録商標）膜より低いが）用いられた架橋条件に依存する。
【００２７】
用語「架橋された」は再吸収可能な形状安定膜が少なくとも一つの架橋工程、通常化学架橋（例えばＥＤＣ及びＮＨＳを使用する）又は脱水加熱処理（ＤＨＴ）による架橋の工程に従ったことを意味するが、この工程は、予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層の間に挟まれるように組み立てられたコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層について、通常化学架橋（例えばＥＤＣ及びＮＨＳを使用する）又は脱水加熱処理（ＤＨＴ）により行われる。場合によっては、このコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層は、通常は化学架橋又は脱水加熱処理によって、本発明の膜に組み立てる前に架橋される。
【００２８】
用語「口腔内で使用される形状安定膜」は再吸収可能な架橋された膜が、ヒト又は動物の、何も含まない（囲まれていない）歯骨欠損部位（non-containing dental bony defect site）における、骨形成、骨再生、骨修復、及び／又は骨置換をその欠損の機械的安定性（すなわち口腔内で発生する圧力、剪断力、及び曲げモーメントに対する耐性）を提供することで支援することが可能であることを意味する。本発明の膜の形状安定性は、以下に詳細を記述する（実施例４２中で）３点１軸曲げ試験により評価される：その試験はＥＮ ＩＳＯ１７８及びＡＳＴＭ Ｄ６２７２−１０に記載された方法と同様であるが、本発明の膜は温度３７℃及びｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に沈められる。その試験では本発明による膜は競合のＰＬＡ膜Ｒｅｓｏｒｂ-Ｘ（登録商標）（ＫＬＳ Ｍａｒｔｉｎ）よりも実質的により強い安定性をもたらした。
【００２９】
通常その３点１軸曲げ試験において、再吸収可能な架橋された形状安定膜は８mmのひずみのための少なくとも０．２０N、好ましくは少なくとも０．３０Nの力に対して耐える。
【００３０】
用語「予備延伸した弾性コラーゲン材料層」は、架橋に先立って、そのコラーゲン層が応力・ひずみ曲線のつま先（ｔｏｅ）領域から線形（弾性とも呼ばれる）領域にコラーゲン材料層の初期の寸法を伸張又は延伸に導く張力がけ（ｔｅｎｓｉｏｎｉｎｇ）に付したことを意味する（Ｂｌａｙｎｅ Ａ．Ｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２４，２１４−２２２，具体的にはＦｉｇ．３，２１６ページ，又は本願のＦｉｇ．５を参照のこと）。この線形領域内で弾性率は最も高く、それ故に最も高い剛性が達成されうる。その張力がけはコラーゲン材料片に、例えば、ばね類により放射状に行われてもよい。コラーゲン材料を応力・ひずみ曲線の線形領域への伸張又は延伸に導く上記の張力がけに適用される力は、そのコラーゲン材料に依存する。コラーゲン材料が豚、牛、又は馬の腹膜の膜組織由来の場合、そのコラーゲン材料の応力・ひずみ曲線の線形領域に導く張力がけは、コラーゲン材料片に放射状に、ばねにより１〜３Ｎで行われてもよく、コラーゲン材料層の初期の寸法の４０〜１００％の伸張又は延伸に導く。
【００３１】
用語「予備延伸した弾性コラーゲン材料」は、かくして、応力・ひずみ曲線の線形／弾性領域になるように延伸したコラーゲン材料を意味する。
【００３２】
この予備延伸した弾性コラーゲン材料の弾性率（ヤング率とも呼ばれる）、すなわちＭＰａで表現される応力・ひずみ曲線の線形領域の傾きは通常１〜１０００ＭＰａであり、好ましくは２〜１５０ＭＰａであり、とりわけ５〜８０ＭＰａである。
【００３３】
コラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を挟み込む「予備延伸した弾性コラーゲン材料」の二つの層の存在は、その膜が引っ張り、圧縮、剪断の力及び曲げモーメントに付されるとき、複合層を破壊から守るために必要であるように思われる。
【００３４】
好ましくは、予備延伸した弾性コラーゲン材料層の一つは５〜５００μｍの孔を含む。その膜が所定の位置にあるとき、予備延伸した弾性コラーゲン材料の穿孔された層は骨欠損の方向に向い、その孔は造骨細胞が無機セラミックコラーゲン複合材料に容易に侵入することを可能にする。
【００３５】
この無機セラミックは例えばヒドロキシアパタイト又は天然骨無機物のような骨再生を促進する生体適合性材料である。
【００３６】
歯、歯周、あご顔面の骨の欠損において骨の成長を促進する周知の自然骨無機物はＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｐｈａｒａ ＡＧより購入可能なＧｅｉｓｔｌｉｃ Ｂｉｏ-ＯＳＳ（登録商標）である。そのヒドロキシアパタイトをベースとした骨無機物材料は米国特許第５，１６７，９６１号に記載の方法により自然骨から製造されるが、これは、その自然骨の小柱構造及びナノ結晶構造の維持を可能にする。
【００３７】
好ましくは、この無機セラミックはヒドロキシアパタイトをベースとする、例えばＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｏｓｓ（登録商標）などの自然骨無機物である。
【００３８】
この無機セラミック粒子は通常５０〜６００μｍ、好ましくは１５０〜５００μｍ、とりわけ２５０〜４００μｍの大きさを有する。
【００３９】
コラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合材料は１重量部のコラーゲン材料に対して、１．５〜３．５重量部、好ましくは２．０〜３．０重量部の無機セラミックを含む。
【００４０】
実際に、１重量部のコラーゲン材料に対して無機セラミックが１．５重量部未満、又は１重量部のコラーゲン材料に対して無機セラミックが３．５重量部を上回ると、その膜は、上記に規定され、かつ以下に詳細に記述する３点１軸の曲げ試験（実施例４．２）により評価された「形状安定」ではないことが予想外に見出された。形状安定性はコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合材料が１重量部のコラーゲン材料に対して２．０〜３．０重量部の無機セラミックを含むときに特に高い。
【００４１】
本発明の再吸収可能な架橋された形状安定膜は親水性であり、通常ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中に５〜１０分で完全に湿潤される。
【００４２】
本発明の再吸収可能な架橋された形状安定膜は、離開（開裂）又は過度の炎症の割合の低い良好な治癒特性により知られているＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｇｉｄｅ（登録商標）のそれらと同様な細胞接着特性を有する。これは離開又は過度の炎症のような不利な出現のない良好な治癒特性を暗示している。
【００４３】
このような良好な治癒特性は、本発明の架橋された形状安定膜をウサギの頭蓋骨に起こった骨欠損を保護するために移植する際に観察された。
【００４４】
本発明の再吸収可能な架橋された形状安定膜の厚みは通常０．５〜２．５mm、好ましくは１．０〜２．０mm、とりわけ１．２〜１．８mmである。
【００４５】
本発明の再吸収可能な架橋された形状安定膜の通常の形状及び通常の寸法は図１に示される。
【００４６】
本発明はまた、ヒト又は動物の、何も含まない（囲まれていない）歯骨欠損部位（non-containing dental bony defect site）における、骨形成、骨再生、骨修復、及び／又は骨置換を支援するためのインプラントとして使用される上記再吸収可能な架橋された形状安定膜に関する。
【００４７】
本発明はまた予備延伸された弾性コラーゲン材料の二つの層の間に挟まれたコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を含む、上に定義された再吸収可能な架橋された形状安定膜を製造する方法に関するが、その工程は
（ａ）コラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層（場合によってその複合層は架橋される）を製造する工程、
（ｂ）コラーゲン材料を応力・ひずみ曲線の線形領域への延伸に導く張力がけに付した二つのコラーゲン材料の層の間にコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を組み立て、接着し、それにより予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層の間に挟まれた、コラーゲン材料及び無機セラミック材料の複合層を提供する工程、及び
（ｃ）予備延伸した弾性コラーゲン材料の２つの層の間に挟まれたコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を架橋し、その後親水化処理を施す工程を含む。
【００４８】
工程（ａ）は以下によって行われてもよい：
‐無機セラミック粒子として、米国特許公開公報第Ａ−５４１７９７５号に記載の方法と同様の工程により、又はその代りにＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｏｓｓ Ｓｍａｌｌ Ｇｒａｎｕｌｅｓ（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｐｈａｒｍａ  ＡＧより入手可能）を更に微粒子に粉砕することにより、皮質又は網状の骨から得たヒドロキシアパタイト骨無機物粒子を製造し、それら粒子を所望の範囲の（例えば１５０〜５００μｍ又は２５０〜４００μｍ）篩にかけ、それにより篩別されたヒドロキシアパタイト骨無機物粒子を提供する。
‐線維状のコラーゲン材料を、
・豚、牛、又は馬の腹膜又は心膜からのコラーゲン豊富な組織を欧州登録特許公報第１６７６５９２号（Ｂ１）の実施例に記載されたものと同様の工程にかけること、又はそれに代えて同様の工程で豚の腹膜から調製されたＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｇｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｐｈａｒｍａ ＡＧより入手可能）又はＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｇｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅの工業生産時の滅菌前に入手した中間製品、ここでは非滅菌Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｇｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅと呼ぶ、から開始すること、
・上記に記載した方法で得たコラーゲン線維組織を（例えばはさみにより）裁断片にし、それらコラーゲン線維組織の裁断片をドライアイスと共にナイフミルを用いて混合し、この方法で断裁したコラーゲン線維を供給すること、
・コラーゲン線維組織片を篩別を伴うカッティングミルで断裁し、この方法でコラーゲン線維断片の篩別された分別物を提供すること、
により製造する。
‐線維状のコラーゲン材料及びヒドロキシアパタイト骨無機物粒子の複合層を、
・０〜４０重量％の断裁したコラーゲン線維及び上記で得られた６０〜１００重量％の篩別したコラーゲン線維断片の篩別された分別物をリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ中で混合及び振とうすること、
・上のパラグラフの中で得られた１重量部の線維状のコラーゲンに１．５〜３．５重量部、とりわけ２．０〜３．０重量部の上記で得られた篩別されたヒドロキシアパタイト骨無機物粒子を加え、２０００〜６０００xg（遠心加速度）、好ましくは３０００〜５０００xgで遠心分離し、得られたペレットを長方形の型に注ぎ、へらを用いて板状に成形すること、その線維状のコラーゲン材料及びヒドロキシアパタイト骨無機物粒子の複合層を真空乾燥器中で乾燥する、
により製造する。
【００４９】
（ａ）の最後で乾燥したコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を架橋することは必須ではないが、このことは、工程（ｂ）の間にその複合層の扱いを容易にする利点を有する。
【００５０】
その架橋は化学的に行われてもよく、又は脱水加熱処理（ＤＨＴ）によって行われてもよい。
【００５１】
化学薬品を用いる架橋は、架橋された形状安定膜に要求される機械的強度を付与することの可能ないかなる薬学的に許容できる架橋剤を用いて行われてもよい。かかる適切な架橋剤は、グルタルアルデヒド、グリオキサール、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、１，４‐ブタンジグリシジルエーテル（ＢＤＤＧＥ）、Ｎ‐スルホサクシニミジル‐６‐（４’‐アジド‐２’-ニトロフェニルアミノ）ヘキサノアート、ヘキサメチレンジイソシアナート（ＨＭＤＣ）、シアナミド（cynamide）、ジフェニルホスホリルアジド、ゲニピン、ＥＤＣ（１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐カルボジイミド）並びにＥＤＣ及びＮＨＳ（Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド）の混合物を含む。
【００５２】
化学薬品を用いる架橋はＥＤＣ及びＮＨＳの混合物を使用し都合よく行われる。
【００５３】
その場合、上記により得られた乾燥された線維状のコラーゲン材料及びヒドロキシアパタイト骨無機物粒子の複合層は、０．１Ｍ ＭＥＳ（２‐（Ｎ‐モルホリノ）‐エタンスルホン酸）及び４０％エタノール溶液中の１０〜４００mＭ ＥＤＣ及び１３〜５２０mＭ ＮＨＳの中でｐＨ５．５、室温で１〜３時間、架橋されてもよい。その反応はその後０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４の緩衝液でｐＨ９．５、１〜３時間を２回、プロトタイプをインキュベートすることで停止されてもよい。極性の残渣は１Ｍ 塩化ナトリウム溶液で１時間及び２Ｍ 塩化ナトリウム溶液で１時間を２回、プロトタイプをインキュベートすることにより除去されてもよい。化学的に架橋されたプロトタイプは蒸留水中で３０〜６０分間合計８回洗浄してもよい。次に乾燥はエタノール中で１５分間合計５回の浸漬により実施し、その後５分間のジエチルエーテル処理を３回行い、続く乾燥を４０℃及び１０mbarで一晩行ってもよいが、又は凍結乾燥（標準の凍結乾燥処理による−５℃未満の凍結及び乾燥）によってもよい。あるいは架橋は０．１〜１０mbar及び８０〜１６０℃で１〜４日間の脱水加熱処理（ＤＨＴ）で行ったが、この場合は続く乾燥方法は不必要である。
【００５４】
工程（ｂ）は以下によって行われてもよい：
‐コラーゲン線維の接着剤を、
・上記コラーゲン線維断片の篩別された分別物を３％濃度でｐＨ３．５のＨ３ＰＯ４水溶液中で高圧ホモジナイザーを用いて１５００〜２０００barで混合し、その混合を数回繰り返すこと、
・結果として得られたスラリーを水酸化ナトリウム溶液を加えることによりｐＨ７．０に中和し、そのコラーゲンを凍結乾燥により濃縮し、そしてその後者をナイフミルで均質化すること、
・それをｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ中で２〜１０％の溶液とし、６０℃で更なる粒子が見えなくなるまで加熱し得られたスラリーからコラーゲン線維接着剤を製造すること、そして
‐たとえば図２と同様の装置を用いて、コラーゲン材料の二つの予備湿潤した層を応力・ひずみ曲線の線形領域にコラーゲン材料を延伸に導く張力がけに付し、それにより湿潤した予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層を提供し、
上記のコラーゲン線維接着剤で膨潤した（ａ）で得られたコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を、上記湿潤した予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層の間に差し挟み、
例えば図３のそれと同様の装置を用いて、湿潤した予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層を、コラーゲン線維接着剤で膨潤したコラーゲン材料及び無機セラミック材料の複合層に対してプレスし、そして、
湿潤した予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層の間に挟まれたコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を減圧下（たとえば２０〜１mbar）で乾燥すること。
【００５５】
上記に記載された手法において、予備湿潤したコラーゲン材料層の一つは５〜５００μｍの孔を含むように針で穿孔されてもよい。
【００５６】
工程（ｃ）において、予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層の間に挟まれたコラーゲン材料及び無機セラミック粒子のその複合層の架橋は化学薬品（例えばＥＤＣ及びＮＨＳを用いる）を用いて行ってもよく、又は脱水加熱処理ＤＨＴにより行ってもよい。
【００５７】
化学架橋は、架橋された形状安定膜に要求される機械的強度を付与することの可能ないかなる薬学的に許容できる架橋剤を用いて行ってもよい。かかる最適な架橋剤は、グルタルアルデヒド、グリオキサール、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、１，４‐ブタンジグリシジルエーテル（ＢＤＤＧＥ）、Ｎ‐スルホサクシニミジル‐６‐（４’‐アジド‐２’‐ニトロフェニルアミノ）ヘキサノアート、ヘキサメチレンジイソシアナート（ＨＭＤＣ）、シアナミド（cynamide）、ジフェニルホスホリルアジド、ゲニピン、ＥＤＣ（１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐カルボジイミド）並びにＥＤＣ及びＮＨＳ（Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド）の混合物を含む。
【００５８】
この化学薬品を使用する架橋はＥＤＣ及びＮＨＳの混合物を使用し都合よく行われる。
【００５９】
その場合、上記により得られた乾燥された線維状のコラーゲン材料及びヒドロキシアパタイト骨無機物粒子の複合層は、０．１Ｍ ＭＥＳ（２‐（Ｎ‐モルホリノ）‐エタンスルホン酸）及び４０％エタノール溶液中の１０〜４００mＭ ＥＤＣ及び１３〜５２０mＭ ＮＨＳの中において、ｐＨ５．５、室温で１〜３時間架橋してもよい。その反応はその後プロトタイプを０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４の緩衝液でｐＨ９．５、１〜３時間で２回インキュベートすることにより停止してもよい。極性の残渣は１Ｍ 塩化ナトリウム溶液で１時間及び２Ｍ 塩化ナトリウム溶液で１時間で２回プロトタイプをインキュベートすることにより除去してもよい。化学的に架橋されたプロトタイプは蒸留水中で３０〜６０分間、合計８回洗浄してもよい。次に脱水及び乾燥はエタノール中で、１５分間合計５回浸漬し、その後５分間のジエチルエーテル処理を３回行い、続く乾燥を１０mbar及び４０℃で３０分間行い実施してもよいが、或いは溶剤処理を用いず凍結乾燥（従来の凍結乾燥処理による−１０℃未満の凍結及び乾燥）により実施してもよい。
【００６０】
あるいは、架橋は０．１〜１０mbar及び８０〜１６０℃で１〜４日間の脱水加熱処理（ＤＨＴ）で行ったが、この場合は続く乾燥方法は不必要である。
【００６１】
工程（ｃ）の親水化処理は通常、予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層に挟まれた架橋されたコラーゲン材料及び無機セラミック材料の複合層を塩化ナトリウム溶液（好ましくは１００〜３００g／ｌ、とりわけ１５０〜２５０ｇ／ｌの塩化ナトリウム溶液である）のような生理学的に許容される塩溶液に、親水化するよう浸漬することを含む。
【００６２】
好ましくは、この親水化処理は、予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層に挟まれた架橋されたコラーゲン材料及び無機セラミック材料の複合層を塩化ナトリウム水溶液に、親水化するよう浸漬することを含む。
【００６３】
本発明の再吸収可能な架橋された形状安定膜はＸ線、β線、γ線照射により滅菌してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
本発明は、本発明の好ましい実施態様の具体例となる実施例及び添付図面を参照にして更なる詳細が後述の中で説明されるが、そのなかで：
【図１】図１は本発明による再吸収可能な架橋された形状安定膜の代表的な形状及び代表的な寸法を示す。それらの膜は、前面、左側若しくは右側の湾曲、又は義歯の後部に位置している１〜３の歯（切歯類、犬歯、小臼歯、又は大臼歯類）の歯槽空間に合致している、平面状の（１）、（１’）、Ｕ字形状で直線状の（２）、（２’）、又はＵ字形状で曲線状の（３）、（３’）でもよい。前部の製品の寸法は後部の製品のサイズに類似しているが、湾曲の半径は歯槽堤に合致するようになっている。代表的な寸法はａ＝５〜２０mm、ｂ＝８〜２０mm、ｃ＝６〜１０mm、ｄ＝２５〜４０mm、ｅ＝１５mm、ｆ＝２０〜４０mmである。
【図２】図２は本発明の形状安定膜を平面形状又はＵ字形状に組み立てる前に、そのポリマー層を張力がけすることを可能にするために適切な装置の模式図である。
【図３】図３は平面形状の形状安定膜の組み立て（集合体）を示すが、ここで（１）は鋼板、（２）は圧縮されたポリウレタンスポンジ、（３）はポリアミドの網（ネット）、（４）は予備延伸した弾性コラーゲンの層、及び（５）は架橋されたヒドロキシアパタイト‐コラーゲンの板である。
【図４】図４はＰＬＡ膜Ｒｅｓｏｒｂ‐Ｘ（登録商標）（ＫＬＳ Ｍａｒｔｉｎ）と比較したＥＤＣ／ＮＨＳ又はＤＨＴにより架橋された本発明の再吸収可能な形状安定膜の３点曲げ試験のひずみの作用の関数としての応力の変化を示す。
【図５】図５は本発明による再吸収可能な架橋された形状安定膜の、予備延伸した弾性コラーゲン材料の層中で使用可能ないくつかの市販されている、湿潤し、滅菌したコラーゲン材料の応力・ひずみ曲線を示すが、これらの材料は、すなわち、豚の腹膜由来のＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｇｉｄｅ（登録商標）コラーゲン膜（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｐａｒｍａ ＡＧ）、豚の心膜由来のＪａｓｏｎ（登録商標）コラーゲン膜（ａａｐ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ／Ｂｏｔｉｓｓ）、豚のＳＩＳ由来のＤｙｎａｍａｔｒｉｘ（登録商標）コラーゲン膜（Ｃｏｏｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、及び筋肉の筋膜由来のコラーゲン材料である。それらの応力・ひずみ曲線のそれぞれには、最小の応力値での大きなひずみによって特徴づけられるつま先領域、単位応力あたりのひずみの直線的増加によって特徴づけられる線形すなわち弾性領域、及び高分子線維の断裂により特徴づけられる破断領域がある。この図に表示される応力・ひずみ曲線において、弾性率（又はヤング率、すなわち応力・ひずみ曲線の直線領域の傾き）はＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｇｉｄｅ（登録商標）膜で約８ＭＰａ、Ｊａｓｏｎ膜で約６４ＭＰａ、Ｄｙｎａｍａｔｒｉｘ（登録商標）膜で約５４ＭＰａ、及び筋肉の筋膜由来のコラーゲン材料で約５６ＭＰａである。
【図６】図６はＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｇｉｄｅ（登録商標）コラーゲン膜、ＤＨＴにより架橋された本発明の再吸収可能な形状安定膜（ＦＲＭ）のプロトタイプ、及びＣｙｓｔｏｐｌａｓｔ（登録商標）ＰＴＦＥ膜（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｄｅｎｔａｌ）について３７℃のリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳで２４時間インキュベートした後に、膜に接着していた、ヒトの歯肉の線維芽細胞を百分率の単位で示した棒グラフである。
【００６５】
以下の実施例は、その範囲を限定せず、本発明を説明する。
【実施例１】
【００６６】
原材料の製造
２５０〜４００μｍの大きさを有するヒドロキシアパタイト微粒子（Ａ）の製造
ヒドロキシアパタイトの骨の無機物微粒子は、米国特許公報第Ａ‐５４１７９７５号の実施例１〜４に記載のように、２５０〜４００μｍの間の篩別工程を用いながら、皮質又は網状骨から製造した。
【００６７】
別法として、ヒドロキシアパタイトの骨の無機物微粒子はＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｏｓｓ（登録商標）Ｓｍａｌｌ Ｇｒａｎｕｌｅｓ（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｐｈａｍａ ＡＧ，ＣＨ‐６１１０，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄより入手可能）を、ピストルを使用して、注意深く衝撃を与えることにより粉砕し、そしてさらに２５０〜４００μｍで篩別する工程を用いて製造した。
【００６８】
上記により製造した２５０〜４００μｍの大きさを有するヒドロキシアパタイト骨の無機物微粒子（Ａ）は使用するまでガラス瓶に保管した。
【００６９】
コラーゲン線維（Ｂ）の製造
欧州特許出願公開公報第１６７６５９２号の実施例に記載のとおり、若い豚からの腹膜の膜組織を機械的方法で肉及び油脂を完全に除去し、流水で洗浄後、２％のＨａＯＨ水溶液で１２時間処理した。その膜を、その後、流水で水洗し、０．５％のＨＣｌで酸性にした。その膜を全体の厚みを通して（約１５分）酸処理した後、その材料をｐＨ３．５になるまで水洗した。その材料を７％の食塩水で収縮させ、１％の炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）溶液で中和し、流水で洗浄した。この材料はその後アセトンで脱水し、そしてｎ‐ヘキサンで脱脂し、そしてエタノールエーテルを用いて乾燥した。
【００７０】
このようにして得られたコラーゲン膜を、はさみを用いて、手で２×２ｃｍ片に裁断した。
【００７１】
別法として、Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｇｉｄｅ（登録商標）（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｐａｒｍａ ＡＧより入手可能）を、はさみを用いて、手で２×２cm片に裁断した。
【００７２】
上記より得られたコラーゲン膜の２×２cm片１ｇを２００ｍｌのドライアイスと混合し、ナイフミル（Ｒｅｔｓｃｈ（登録商標）Ｇｒｉｎｄｏｍｉｘ）中で５０００rpmでブロッキングが起こらなくなるまで混合した。その後２０〜３０秒で６０００、７０００、９０００、及び１０，０００ｒｐｍと速度を上げ、それぞれの時間にドライアイスを５０mｌずつ加えた。
【００７３】
ドライアイスを気化し、このようにして得られたコラーゲン線維（Ｂ）はＭｉｎｉｇｒｉｐ  Ｐｌａｓｔｉｃ ｗｒａｐで包装し、先の使用まで保管した。
【００７４】
ミル断裁したコラーゲン線維断片（Ｃ）の製造
上記により得られた２×２cmコラーゲン線維片を１５００rpm、０．８mm篩でカッティングミル中で断裁し、ミル断裁したコラーゲン線維断片（Ｃ）の篩別された分別物を得た。
【００７５】
コラーゲン線維接着剤（Ｄ）の製造
ミル断裁したコラーゲン線維断片（Ｃ）の篩別された分別物を水中で混合し、３％の溶液を得、ｐＨをリン酸Ｈ３ＰＯ４を加えることにより３．５に調整し、そしてその懸濁液を１５００〜２０００baｒで高圧均質化し、これを３〜５回繰り返した。
得られたスラリーに水酸化ナトリウム溶液ＮａＯＨを加え、ｐＨを約７に中和し、４℃で一晩かけゲル化した。そのコラーゲンを−４０℃で４時間凍結させた後−１０℃、０．３１０mbaｒで凍結乾燥により濃縮し、そしてナイフミルで均質化した。
【００７６】
コラーゲン線維接着剤（Ｄ）はｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水中で更なる粒子が見えなくなるまで６０℃で加熱することにより、２〜１０％の溶液として得られたスラリーから製造した。
【実施例２】
【００７７】
場合により架橋されたヒドロキシアパタイト／コラーゲン板（Ｅ）の製造
実施例１で製造された４ｇのコラーゲン線維（Ｂ）及び６gのミル断裁したコラーゲン線維断片（Ｃ）を１４０ｇのリン酸緩衝食塩水と混合し、混合ミキサー中で振とうした。別の実施例ではコラーゲン線維を完全にミル断裁したコラーゲン線維断片に置き換えた。
実施例１で製造した２０ｇのヒドロキシアパタイト微粒子（Ａ）を加え、手で混合した。
３４．１４ｇのこの混合物を７０００ｇ（重力加速度の７０００倍）で２分間遠心分離した。
【００７８】
その沈殿物を８×１２cmの平らな長方形の型の中の２枚のポリアミドの網（細孔径２１μｍ及び合計１７％の開口構造）の間に注ぎ、実験用匙で過剰の水を除去することでその中身を濃縮した。得られた平板を１〜１．７ｋＰａの圧で圧縮し、真空乾燥機中で３０℃／５０mbarで２時間、その後３０℃／１０mbarで８時間乾燥した。ポリアミドの網は除去した。
【００７９】
場合により架橋されたヒドロキシアパタイト‐コラーゲン板
このヒドロキシアパタイト‐コラーゲン板の扱いを容易にするために、後者を化学的に又は脱水加熱処理（ＤＨＴ）により架橋した。
【００８０】
ＥＤＣ／ＮＨＳを用いてそのコラーゲンの化学架橋を行ない、ヒドロキシアパタイト‐コラーゲン板の全体の安定性を増加させた。乾燥した板はその後０．１ＭのＭＥＳ（２‐（Ｎ‐モルホリノ）‐エタンスルホン酸）及び４０％のエタノールの中の１０〜４００mＭのＥＤＣ及び１３〜５２０mＭＮＨＳ中で室温、ｐＨ５．５で２時間架橋した。
【００８１】
その反応を、プロトタイプを０．１mol／ｌのＮａ２ＨＰＯ４緩衝剤中ｐＨ９．５で１時間のインキュベートを２回行うことにより停止した。極性の残渣は、そのプロトタイプを１mol／ｌの塩化ナトリウム溶液中で１時間、及び２mol／ｌの塩化ナトリウム溶液中で１時間２回インキュベートすることにより除去した。化学的に架橋されたプロトタイプを蒸留水中で３０〜６０分間の洗浄を合計８回行い、その後エタノール中で１５分間の浸漬を合計５回行い脱水した。その後５分間のジエチルエーテル処理を３回行ない、次いで１０mbarで４０℃３０分間の乾燥を行うか、又は凍結乾燥（従来の凍結乾燥処理による−１０℃未満の凍結及び乾燥）を行った。
【００８２】
別法として、架橋は０．１〜１０mbar及び８０〜１２０℃で脱水加熱処理（ＤＨＴ）により行った。この場合は続く乾燥方法は不要であった。
【実施例３】
【００８３】
予備延伸した弾性コラーゲン層の二つをヒドロキシアパタイト／コラーゲン板（Ｅ）の２つの相対する面を合わせて接着することによる再吸収可能な架橋された形状安定膜（Ｍ）の製造
以下の記述は図２及び３を参照することでより理解されるであろう。
【００８４】
平面又はＵ字形状のプロトタイプの組み立ては、コラーゲン材料層の張力がけを可能にする固定され又は曲がることの可能な枠の使用を必要とする。
【００８５】
平面又はＵ字形状のプロトタイプ（Ｆ）の形成
図２はコラーゲン材料層を本発明の平面又はＵ字形状の形状安定膜に組み立てる前に張力がけすることを可能にするための適切な装置の模式図である。
【００８６】
その装置はいかなる適切な材料、例えば鋼、又はアルミニウム、からも製造可能な枠（ａ）からなる。その枠の主な目的は二つのコラーゲン層（ｃ）に張力がけする、ばね（ｂ）をしっかりと固定することである。そのヒドロキシアパタイト／コラーゲン板（Ｅ）は二つのコラーゲン層（ｃ）の間に置かれる。
【００８７】
もしＵ字形状の再吸収可能な架橋された形状安定膜が所望される場合、コラーゲン板（Ｅ）を曲げるための雌型（ｅ）及び蝶番（ｆ）を伴った枠台が使用されるが、この方法がＵ字形状で直線状のプロトタイプをもたらす。
【００８８】
未滅菌のＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｇｉｄｅコラーゲン層のコラーゲン材料層を、そのコラーゲン材料の応力・ひずみ曲線の線形領域になるように、各ばねあたり２〜３Ｎでの張力がけを通して初期の長さの４０〜１００％の伸張又は延伸になるまで予備延伸した。この線形領域内で弾性率は最も高く、そしてそれゆえ最も高い剛性が達成される。
【００８９】
コラーゲン組織の粘弾性の性質により、濡れてかつ張力がけした材料を３０分間張力がけした状態で保持した。その予備延伸したコラーゲン材料の緩和性により、コラーゲン材料の応力・ひずみ曲線の線形領域になるよう、そのばねを再び１〜３Ｎに張力がけをした。
【００９０】
未滅菌のＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）コラーゲン膜から切り出した直径１０cmの二つの円形片を使用したが、その一つは０．８８mmの軸直径を伴う１cm２あたり５０個の孔を含むニードルドラムで穿孔した。それら二つのコラーゲンの円形片を濡らし、それぞれ１〜３Nで張力をかけた１２のばねにより、放射状に張力がけを行ったが、それはコラーゲン片の初期の寸法の４０〜１００％の伸張をもたらした。
【００９１】
この工程の完了後、ヒドロキシアパタイト／コラーゲン板（Ｅ）をコラーゲン線維接着剤（Ｃ）で両面を濡らし、そしてその後ヒドロキシアパタイト／コラーゲン板を二つの予備延伸した弾性コラーゲン層の間に置いた。中央の桟（ｅ）並びに蝶番（ｆ）はＵ字形状のプロトタイプの製造に必要である（下記参照のこと）。
【００９２】
その予備延伸した弾性膜を加熱板の上に置き、４０℃に予熱した。
【００９３】
実施例２で得られた架橋したＢｉｏ‐Ｏｓｓ 板（Ｅ）を予熱したコラーゲン線維接着剤（Ｄ）に短時間浸し、二つの予備延伸した弾性コラーゲン膜の間に置いた。
ポリアミドの網、並びにスポンジ（厚さ５cm、比重約２０〜２５mg／cm３、連通細孔を含む、ポリウレタン製）を両面に置き、最大１２０ＫＰａの圧縮圧で５０〜９５％まで圧縮した。
【００９４】
図３参照のこと、これは平面状の形状安定膜の集合体を示しているが、その中で、（１）は鋼板であり、（２）は圧縮されたポリウレタンスポンジであり、（３）はポリアミドの網であり、（４）は予備延伸した弾性コラーゲン層であり、そして（５）は架橋されたヒドロキシアパタイト‐コラーゲンの板である。
【００９５】
その後、その構成物を真空乾燥機で４０℃で常圧から１０mbarに一定の減少率で下げ、合計３２時間乾燥した。
【００９６】
Ｕ字形状のプロトタイプの形成
当業者は図２及び３の装置並びに上記方法を、その構成物を最適な雌型にわたって曲げ、一つのスポンジをより薄いポリウレタンスポンジ又は繊維の無い紙タオルで置き換えることにより、Ｕ字形状のプロトタイプを直線状又は曲線状にするために容易に適合させるであろう。
【００９７】
平面又はＵ字形状のプロトタイプの架橋（Ｇ）
平面又はＵ字形状のプロトタイプ（Ｆ）をはさみ又は小型の丸のこで所望の寸法に裁断した。その後プロトタイプを化学的又は脱水加熱処理（ＤＨＴ）により架橋した。
【００９８】
化学架橋は０．１mol／ｌのＭＥＳ緩衝液でｐＨ５．５、並びにＥＤＣ及びＮＨＳの濃度がそれぞれ１０〜４００mＭ及び１３〜５２０mＭの４０体積％濃度のエタノール中で行った。プロトタイプの架橋溶液中の濃度は１０％であった。均質の架橋を可能にするために、板は当初（＜４０mbar）の真空で処理し、そしてその架橋反応を４℃で２時間行い、すべての緩衝剤をこの温度まで予備冷却した。
【００９９】
その反応を０．１mol／ｌＮａ２ＨＰＯ４緩衝液中ｐＨ９．５で１時間、２回インキュベートすることで停止した。極性の残渣はそのプロトタイプを１mol／ｌの塩化ナトリウム溶液で１時間、及び２mol／ｌの塩化ナトリウム溶液で１時間、２回インキュベートすることで除去した。プロトタイプは蒸留水中で３０〜６０分間を合計８回洗浄した。脱水及び乾燥はその後５回の１５分間のエタノール処理及び３回の５分間のジエチルエーテル処理、並びにその後１０mbar及び４０℃で一晩若しくはその製品が完全に乾燥するまで乾燥し、又は製品を溶剤処理しない従来の凍結乾燥（従来の凍結乾燥処理による−１０℃未満の凍結及び乾燥）により乾燥した。
【０１００】
あるいは、架橋は０．１〜１０mbar及び８０〜１６０℃で１〜４日間脱水加熱処理（ＤＨＴ）により行ったが、この場合その後の乾燥方法は不必要であった。
【０１０１】
上記記載の方法で得られたプロトタイプは食塩水又はリン酸緩衝食塩水中で１又は２時間濡らした。
【０１０２】
１０分以内での濡れを可能にするために、プロトタイプは蒸留水でおおよそ１〜２時間再び濡らす。この時に上記記載のニードルドラムを用いた片面の穿孔もまた可能である。塩化ナトリウムはプロトタイプを２００g／ｌの塩化ナトリウム溶液中で４０分間を３回インキュベートすることにより適用される。その塩化ナトリウムは下記記述（Ｈ）のように沈殿する。
【０１０３】
架橋された平面状又はＵ字形状のプロトタイプの乾燥（Ｈ）
この架橋されたプロトタイプを１５分間、エタノール中で合計５回浸漬することにより脱水した。それらをその後溶剤乾燥（５分間のジエチルエーテル処理を３回並びにその後の１０mbar及び４０℃の乾燥）又は従来の凍結乾燥（従来の凍結乾燥処理による−１０℃未満の凍結及び乾燥）のいずれかで乾燥した。
【０１０４】
濡れた状態での種々のプロトタイプの架橋された形状安定膜の厚みは１．０〜２．０mmで、ほとんどは１．２〜１．８mmであった。
【０１０５】
乾燥したプロトタイプは場合により２７〜３３ｋＧｙのＸ線照射により滅菌した。
【実施例４】
【０１０６】
再吸収可能な架橋された形状安定膜の性質
実施例３で得られた再吸収可能な架橋された形状安定膜の次の特性を測定した。：（１）ＰＢＳ中の濡れ性、（２）機械的強度、（３）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼを用いた酵素分解、及び（４）細胞接着、（５）予備延伸した弾性コラーゲン材料層の伸びの測定、（６）コラーゲン‐ヒドロキシアパタイト板及び最終プロトタイプの厚さの測定
【０１０７】
（１）リン酸緩衝食塩水中の濡れ性
再吸収可能な架橋された形状安定膜の種々のプロトタイプについて、リン酸緩衝食塩水中で完全に濡れる時間を目視で観察し評価したが、それは５〜１０分であった。その時間は主にエタノールでの脱水及び乾燥の前の塩化ナトリウムの処理に依存した。
【０１０８】
（２）機械的強度
本発明の膜の形状安定性はＥＮ ＩＳＯ１７８及びＡＳＴＭ Ｄ６２７２‐１０に記載の方法と同様の方法の３点１軸曲げ試験により評価したが、本発明の膜は、温度３７℃、ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水中に浸して評価した。
【０１０９】
何も含まない（囲まれていない）部位（non-containing site）における骨の欠損を機械的に安定させるために設計されたすべての形状安定膜は、曲げモーメントを経験するであろうから、この試験は最も有効であると考えられた。それ故、３又は４点曲げは、使用した材料を特徴付け、そして更に、例えば種々の厚みを有する種々の製品を比較する試験として使用し得る。材料の特徴付けにとって、曲げ弾性率が最も適したパラメーターである。しかしながら、種々の厚みを有する種々の製品を比較するために、８〜１０mm圧入した後の最大の力がさらに妥当であり、それ故製品を特長付けるために使用される。
【０１１０】
用いた３点１軸曲げ試験において、試料は５０×１３mmの寸法に裁断し、そして目視による観察で完全に濡れるまで３７℃のリン酸緩衝食塩水中でインキュベートした。
【０１１１】
機械的試験は１分あたり５mmの速度で、支持支点間距離幅２６mm、及び各支持台半径５mmの３点支持曲げ試験機で実施した。曲げ弾性率は１〜５％の曲げひずみの中で計算した。得られた最大の力は中央圧子を８〜１０mm下げた後に読み出した。
【０１１２】
この試験は、ＥＤＣ／ＮＨＳで架橋された厚さ１．５mmの本発明の膜、ＤＨＴで架橋された厚さ１．６mmの本発明の膜、及び厚さ０．１３７mmのＫＬＳ Ｍａｒｔｉｎ社からのＰＬＡ膜Ｒｅｓｏｒｂ-Ｘ（登録商標）について行った。
【０１１３】
図４はそれら膜のひずみの作用に応じた応力の変化を示すが、本発明のＥＤＣ／ＮＨＳで架橋された膜（８mmひずみで約０．６５Ｎ）、又はＤＨＴで架橋された膜（８mmひずみで約０．４０Ｎ）の機械的安定性は実質的にＰＬＡ膜Ｒｅｓｏｒｂ-Ｘ（登録商標）（８mmひずみで約０．１０Ｎ）のそれよりも優れていることを示している。本発明の膜はそれ故に、何も含まない（囲まれていない）部位（non-containing site）の骨欠損をより安定にするであろう。
【０１１４】
（３）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼを用いた酵素分解試験
人体において、コラーゲンはヒト組織のマトリクス・メタロプロテナーゼ（ＭＭＰ）、カテプシン類、及び推定されるいくつかのセリン・プロテナーゼにより分解される。最も研究されたものはＭＭＰ類であるが、そこでコラゲナーゼ（とりわけＭＭＰ-１、ＭＭＰ-８、ＭＭＰ-１３及びＭＭＰ-１８）は直接のコラーゲン分解にとって最も重要な酵素類である（Ｌａｕｅｒ-Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔａｌ．２００２「マトリクス・メタロプロテナーゼ及びコラーゲンの異化（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ）」ｉｎ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ-Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｃｔｉｏｎ、及びＳｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２００６「マトリクス・メタロプロテナーゼに依存する又は依存しないコラーゲン分解（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）」ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
【０１１５】
コラゲナーゼがコラーゲン組織及び膜を分解する能力は、その基質の柔軟性及びコラーゲンの型、ＭＭＰの活性部位並びにＭＭＰのエキソサイト（ｅｘｏｓｉｔｅｓ）に依存する。
【０１１６】
コラゲナーゼ類は３重らせん状のコラーゲンに対し整列し、それをほぐし、続いて実質的にそれを開裂する（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２００６，上記参照）。
【０１１７】
種々のコラーゲン型の間の分解の違いを克服する観点から、コラゲナーゼのコラーゲン分解は、高い触媒速度を有するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼを用いてしばしば評価されている（Ｋａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｔ ａ ｇｌａｎｃｅ ｉｎ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ）。一般的に、天然コラーゲン生成物は化学的に架橋されたコラーゲン生成物と比較して早く分解する。
【０１１８】
この試験において、コラーゲン生成物（１mg／mｌコラーゲンの再吸収可能な架橋された形状安定膜の試料）をカルシウムを含むトリス緩衝液中のＣｌｏｓｔｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍから得た５０単位／ｍｌ（１単位は、カルシウムイオンの存在下、３７℃、ｐＨ７．４、５時間での、ニンヒドリン色で１．０マイクロモルのロイシンと等価の牛のアキレス腱由来のコラーゲンからの遊離ペプチドとして定義される）と共に３７℃でインキュベートし、そしてコラーゲン基質の分解を、比較材料としてコラーゲンＩ型を用いて、目視及び“ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ”（Ｂｉｏ-Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より）（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ，ＯｒｄｅｒＮｏ．５００-０１１６）で測定した。コラーゲン濃度はマイクロウエルプレート分光計Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ社より入手可能）により測定した。
【０１１９】
本発明の再吸収可能な架橋された形状安定膜のすべてのプロトタイプは４時間後に少なくとも１０％のコラーゲン分解（コラーゲンＩ型を標準としてＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いて評価した）を示したが、そのコラーゲン分解の速度は（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ‐Ｇｉｄｅ（登録商標）よりも低い）使用した架橋条件に依存する。
【０１２０】
（４）細胞接着
種々の膜の細胞接着は、第一に、前もって蛍光脂溶性染料で標識化した１００，０００のヒト歯肉線維芽細胞を８mmのメンブレンパンチに播種し、リン酸緩衝食塩水中で３７℃、２４時間インキュベートし、その膜をリン酸緩衝食塩水中で洗浄することで非接着性の細胞を除去し、接着性細胞を溶解し、そしてそれらを４８５nmの蛍光発光を測定することで定量した。蛍光発光は溶解する前の洗浄していない細胞播種されたメンブレンパンチで規定した基準曲線を標準化した。その形状安定な再吸収可能な膜について得られた結果を図５に示すが、それは種々のタイプの歯科用膜、本発明の再溶解可能な架橋された形状安定膜及びＣｙｓｔｏｐｌａｓｔ（登録商標）ＰＴＦＥ膜（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｄｅｎｔａｌ）に接着可能な細胞を百分率で横軸に表示した棒グラフである。
【０１２１】
図５は本発明の再吸収架橋された形状安定膜への接着は約１０．５％であり、約４％のＣｙｓｔｏｐｌａｓｔ（登録商標）ＰＴＦＥ膜への接着より約１３％のＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ-Ｇｉｄｅ（登録商標）膜への接着により近いことを示している。Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ-Ｇｉｄｅ（登録商標）膜はその低い離開速度（Ｚｉｔｚｍａｎｎ，Ｎａｅｆ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｔａｌ，Ｋｏｚｌｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．２００８）又は過度の炎症の無い（Ｊｕｎｇ，２０１２）良好な治癒特性により知られている。本発明の再吸収可能な架橋された形状安定膜に対するヒト歯肉線維芽細胞の接着の測定値は、過度な炎症又は離開のような不利な出現の無い軟組織の治癒を予測するものである。
【０１２２】
（５）予備延伸した弾性コラーゲン材料層の伸びの測定
このコラーゲン層の張力がけの量を測定するために、乾燥したコラーゲン層を張力がけ環（図２のａ部）にまだ張力がけされていないばね（図２のｂ部）を使用して取り付ける。その膜の中心に少なくとも４点（それらは互いに数センチメートル離れている）、鉛筆又はペンを用いて印をつける。各点間の距離を定規で測定する。測定した距離は各点間の初期の長さと定義する。そのコラーゲン層を水中に沈め所望の力で張力がけする。そのコラーゲン層を水中で３０分間インキュベートする。ほとんどのコラーゲン層の粘弾性の性質により、張力は減少する。それ故コラーゲン層は再び張力がけする必要がある。３０〜４０分のインキュベート後に各点間の距離を定規で測定する。ひずみの百分率は、張力がけした後の長さから初期の長さを引いたものを初期の長さで割り１００を掛けることで決定する。
【０１２３】
通常、例えば未滅菌のＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ-Ｇｉｄｅの応力・ひずみ曲線の線形領域の結果は４０〜１００％のひずみ（伸張又は延伸）である。この方法で測定したひずみの値は通常の一軸伸び試験で得られるひずみの値と直接比較することはできない。
【０１２４】
（６）コラーゲンヒドロキシアパタイト板及び最終プロトタイプの厚みの測定
最終プロトタイプ又はコラーゲン／ヒドロキシアパタイト板（Ｅ）の厚みは上記に記載の方法又はノギスを用いて測定することができる。
【０１２５】
（７）異なったコラーゲン層の機械的特性の分析（図５）
種々の入手先からのコラーゲン層を比較し、それらの機械的特性を評価するために、標準の一軸張力がけした濡れた試料を用いた。一般的なそのような分析方法の設定はＡＳＴＭ８８２-０９「薄いプラスチックシートの張力特性のための標準試験方法（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｅｎｓｉｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｔｈｉｎ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｈｅｅｔｉｎｇ）」に記載されている。使用されるコラーゲン材料の高い費用により、いくつかのテストのパラメーターを適応した。試料は例えば２×１cmの長方形のシートに裁断し、等張のリン酸緩衝食塩水であらかじめ濡らし、それぞれの試料取り付け具の間の距離を１cmにして張力試験機に取り付けた。試料は１分間あたり初期の長さの３３％の一定速度で張力がけした。記録された１００％の初期の長さにおける予備張力を５０ｋＰａに設定した。試料の伸び率は二つの試料つかみ具間の距離を用いて計算した。
【０１２６】
図５の応力・ひずみ曲線はこの方法で得た。
【０１２７】
本発明は図面及び前述の記述により詳細に例示的に説明されかつ記述されるが、それらの例証及び説明は実例的又は例示的であり、限定的と考えられるべきはない。したがって、本発明はその開示された態様により限定されない。
【０１２８】
その開示された態様に対する他の変形例は、当業者が本発明のクレームを実施する中で、図面、開示内容、及び補正されたクレームを検討することから理解され、有効化されることが出来る。
【０１２９】
クレームの中で単語「含む」は他の要素を排除しない。定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は複数を排除しない。
【図１】
2019162503.tif 000002
【図２】
2019162503.tif 000003
【図３】
2019162503.tif 000004
【図４】
2019162503.tif 000005
【図５】
2019162503.tif 000006
【図６】
2019162503.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月18日(2019.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
再吸収可能な架橋された形状安定膜であって、１重量部のコラーゲン材料に対して１．５〜３．５重量部の無機セラミックを含むコラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層を含み、前記複合層は予備延伸した弾性コラーゲン材料の二つの層で挟まれ、前記予備延伸した弾性コラーゲン材料はその応力・ひずみ曲線の線形／弾性領域になるように延伸したコラーゲン材料であり、前記コラーゲン材料は５０〜１００％（w/w）のコラーゲン及び０〜５０％（w/w）のエラスチンを含む、再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項２】
コラーゲン材料及び無機セラミック粒子の複合層が１重量部のコラーゲン材料に対して２．０〜３．０重量部の無機セラミックを含む、請求項１記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項３】
コラーゲン材料が７０〜９０％（w/w）のコラーゲン及び１０〜３０％（w/w）のエラスチンを含む、請求項１又は２記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項４】
コラーゲン材料が、哺乳類の腹膜又は心膜、胎盤膜、小腸粘膜下層組織（ＳＩＳ）、真皮、硬膜、靭帯、腱、隔膜、網、及び筋肉又は臓器の筋膜からなる群から選択される天然起源の組織に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項５】
コラーゲン材料が、豚、牛、又は馬の、腹膜又は心膜、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）又は筋肉の筋膜に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項６】
予備延伸した弾性コラーゲン材料が、２〜１５０ＭＰａの弾性率を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項７】
予備延伸した弾性コラーゲン材料が、５〜５００μｍの孔を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項８】
無機物粒子が、１５０〜５００μｍの大きさを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項９】
無機セラミックが、ヒドロキシアパタイトである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項１０】
無機セラミックが、ヒドロキシアパタイトの骨無機物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項１１】
化学的に架橋された、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項１２】
脱水加熱処理（ＤＨＴ）により架橋された、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜。
【請求項１３】
ヒト又は動物の、何も含まない歯骨欠損部位における、骨形成、骨再生、骨修復、及び／又は骨置換を支援するために適した形状及び寸法を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の再吸収可能な架橋された形状安定膜を含む、骨インプラント。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
（４）細胞接着
種々の膜の細胞接着は、第一に、前もって蛍光脂溶性染料で標識化した１００，０００のヒト歯肉線維芽細胞を８mmのメンブレンパンチに播種し、リン酸緩衝食塩水中で３７℃、２４時間インキュベートし、その膜をリン酸緩衝食塩水中で洗浄することで非接着性の細胞を除去し、接着性細胞を溶解し、そしてそれらを４８５nmの蛍光発光を測定することで定量した。蛍光発光は溶解する前の洗浄していない細胞播種されたメンブレンパンチで規定した基準曲線を標準化した。その形状安定な再吸収可能な膜について得られた結果を図６に示すが、それは種々のタイプの歯科用膜、本発明の再溶解可能な架橋された形状安定膜及びＣｙｓｔｏｐｌａｓｔ（登録商標）ＰＴＦＥ膜（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｄｅｎｔａｌ）に接着可能な細胞を百分率で横軸に表示した棒グラフである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
図６は本発明の再吸収架橋された形状安定膜への接着は約１０．５％であり、約４％のＣｙｓｔｏｐｌａｓｔ（登録商標）ＰＴＦＥ膜への接着より約１３％のＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ-Ｇｉｄｅ（登録商標）膜への接着により近いことを示している。Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ-Ｇｉｄｅ（登録商標）膜はその低い離開速度（Ｚｉｔｚｍａｎｎ，Ｎａｅｆ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｔａｌ，Ｋｏｚｌｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．２００８）又は過度の炎症の無い（Ｊｕｎｇ，２０１２）良好な治癒特性により知られている。本発明の再吸収可能な架橋された形状安定膜に対するヒト歯肉線維芽細胞の接着の測定値は、過度な炎症又は離開のような不利な出現の無い軟組織の治癒を予測するものである。
【外国語明細書】
2019162503000001.pdf